(57)【要約】  本発明は、融合ループ1(FL1)ドメイン及び融合ループ2(FL2)ドメインを含むgBタンパク質細胞外ドメインの少なくとも一部分を含むサイトメガロウイルス(CMV)gBポリペプチドであって、FL1及びFL2ドメインの少なくとも一つが少なくとも一つのアミノ酸欠失又は置換を含む、サイトメガロウイルス(CMV)gBポリペプチドに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合ループ1(FL1)ドメイン及び融合ループ2(FL2)ドメインを含むgBタンパク質細胞外ドメインの少なくとも一部分を含むサイトメガロウイルス(CMV)gBポリペプチドであって、前記FL1及びFL2ドメインの少なくとも一つが少なくとも一つのアミノ酸欠失又は置換を含む、前記サイトメガロウイルス(CMV)gBポリペプチド。
【請求項２】
前記細胞外ドメインのアミノ酸の少なくとも50%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%を含むか又は前記細胞外ドメイン全体を含む、請求項１に記載のCMV gBポリペプチド。
【請求項３】
非機能性膜貫通(TM)ドメインを含む、請求項１又は２に記載のCMV gBポリペプチド。
【請求項４】
前記TMドメインの少なくとも一部分の欠失を含む、請求項３に記載のCMV gBポリペプチド。
【請求項５】
前記TMドメインのアミノ酸の少なくとも50%、少なくとも70%、少なくとも80%又は少なくとも90%が欠失されている、請求項４に記載のCMV gBポリペプチド。
【請求項６】
配列番号１に記載の配列の位置725〜775の又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置のアミノ酸の欠失を含む、請求項４又は５に記載のCMV gBポリペプチド。
【請求項７】
配列番号１に記載の配列の位置701〜775の又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置のアミノ酸の欠失を含む、請求項４又は５に記載のCMV gBポリペプチド。
【請求項８】
前記FL1ドメインに少なくとも一つのアミノ酸欠失又は置換を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のCMV gBポリペプチド。
【請求項９】
前記FL2ドメインに少なくとも一つのアミノ酸欠失又は置換を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のCMV gBポリペプチド。
【請求項１０】
前記FL1及びFL2ドメインの両方に少なくとも一つのアミノ酸欠失又は置換を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のCMV gBポリペプチド。
【請求項１１】
細胞質ドメインの少なくとも一部分の欠失を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のCMV gBポリペプチド。
【請求項１２】
前記細胞質ドメインの少なくとも一つの疎水性アミノ酸領域の欠失を含む、請求項１１に記載のCMV gBポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号１に記載の配列のアミノ酸825〜877の又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置のアミノ酸の欠失を含む、請求項１２に記載のCMV gBポリペプチド。
【請求項１４】
前記細胞質ドメインのアミノ酸の少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%の欠失又は前記細胞質ドメイン全体の欠失を含む、請求項１１に記載のCMV gBポリペプチド。
【請求項１５】
前記融合ループFL1ドメインにおける少なくとも一つのアミノ酸置換が、配列番号１に記載の配列の位置155〜157に又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置にあるY.I.Yから選択される少なくとも一つのアミノ酸の、芳香族アミノ酸以外の極性アミノ酸での置換を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のCMV gBポリペプチド。
【請求項１６】
前記置換が、配列番号１に記載の配列の位置155〜157又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置にあるY.I.Yから選択される少なくとも二つのアミノ酸の、芳香族アミノ酸以外の極性アミノ酸での置換を含む、請求項１５に記載のCMV gBポリペプチド。
【請求項１７】
前記極性アミノ酸がリシン(K)、ヒスチジン(H)及びアルギニン(R)から成る正に荷電したアミノ酸の群から選択される、請求項１５又は１６に記載のCMV gBポリペプチド。
【請求項１８】
配列番号１に記載の配列の位置156に又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置にあるイソロイシン(I)がヒスチジン(H)で置換されている、請求項１７に記載のCMV gBポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号１に記載の配列の位置157に又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置にあるチロシン(Y)がアルギニン(R)で置換されている、請求項１７又は１８に記載のCMV gBポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号１に記載の配列の位置155に又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置にあるチロシン(Y)がグリシン(G)で置換されている、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載のCMV gBポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号１に記載の配列の融合ループFL1ドメインにおける位置155〜157に又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置にあるアミノ酸Y.I.Yがアミノ酸G.H.Rでそれぞれ置換されている、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のCMV gBポリペプチド。
【請求項２２】
配列番号１に記載の配列の融合ループFL1ドメインにおける位置155〜157に又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置にあるアミノ酸Y.I.Yがカイト及びドーリトルスケール(Kyte and Doolittle scale)で測定される疎水性スコア-3未満、-7未満、-8未満を有するアミノ酸のストレッチで置換されている、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のCMV gBポリペプチド。
【請求項２３】
前記融合ループFL2ドメインにおける少なくとも一つのアミノ酸置換が、配列番号１に記載の配列の位置240〜242に又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置にあるW.L.Yから選択される少なくとも一つのアミノ酸の、リシン(K)、ヒスチジン(H)及びアルギニン(R)から成る群から選択される正に荷電したアミノ酸での置換を含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のCMV gBポリペプチド。
【請求項２４】
配列番号１に記載の配列の位置240〜242に又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置にあるW.L.Yから選択されるアミノ酸が、ヒスチジン(H)で置換されている、請求項２３に記載のCMV gBポリペプチド。
【請求項２５】
配列番号１に記載の配列の位置242に又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置にあるチロシン(Y)が、ヒスチジン(H)で置換されている、請求項２３又は２４に記載のCMV gBポリペプチド。
【請求項２６】
配列番号１に記載の配列の融合ループFL2ドメインにおける位置240〜242に又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置にあるアミノ酸W.L.Yが、アミノ酸A.F.Hでそれぞれ置換されている、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のCMV gBポリペプチド。
【請求項２７】
リーダー配列の少なくとも一部分の欠失を含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のCMV gBポリペプチド。
【請求項２８】
リーダー配列のアミノ酸の少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又はリーダー配列全体の欠失を含む、請求項２７に記載のCMV gBポリペプチド。
【請求項２９】
リーダー配列のアミノ酸の少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又はリーダー配列全体の欠失を含むCMV gBポリペプチド。
【請求項３０】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の一つ以上の特徴をさらに含む、請求項２９に記載のCMV gBポリペプチド。
【請求項３１】
配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１に記載の配列から成る群から選択される配列を有するCMV gBポリペプチド。
【請求項３２】
CMV gBポリペプチドの集団を含む調製物であって、前記集団の少なくとも50%、少なくとも60%又は少なくとも70%が三量体形態である、前記調製物。
【請求項３３】
適切な薬学的担体と混合した請求項１〜３１のいずれか１項に記載のCMV gBポリペプチドを含む免疫原性組成物。
【請求項３４】
pUL131、gL、gH、pUL128、pUL130又はこれらのいずれかの組合せから成る群から選択される少なくとも1個以上のCMV抗原をさらに含む、請求項３３に記載の免疫原性組成物。
【請求項３５】
アジュバントをさらに含む、請求項３３又は３４に記載の免疫原性組成物。
【請求項３６】
アジュバントがリポソーム製剤中の3D-MPL及びQS21を含む、請求項３５に記載の免疫原性組成物。
【請求項３７】
アジュバントが水中油型乳剤を含む、請求項３５に記載の免疫原性組成物。
【請求項３８】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載のCMV gBポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３９】
配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５及び配列番号１７に記載の配列から成る群から選択される配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項４０】
請求項３８又は３９に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項４１】
請求項４０に記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項４２】
CMV感染の予防及び/又は治療における使用のための、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のCMV gBポリペプチド又は請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４３】
CMV感染を予防及び/又は治療するための医薬の調製における請求項１〜３１のいずれか１項に記載のCMV gBポリペプチド又は請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項４４】
新生児における先天性CMV感染を予防するための請求項４２又は４３に記載の使用。
【請求項４５】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載のCMV gBポリペプチドを含む組成物又は請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の組成物の免疫学的有効量を対象に投与するステップを含む、CMVに対する免疫応答を誘発するための方法。
【請求項４６】
請求項１〜３１及び３３〜３７のいずれか１項に記載のCMV gBポリペプチドを含む組成物の免疫学的有効量を対象に投与するステップを含む、新生児においてCMVの先天性感染を予防するための方法。
【請求項４７】
対象がCMV血清陰性対象である、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の使用又は請求項４５若しくは４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記CMV血清陰性対象が出産年齢の女性である、請求項４７に記載の使用又は方法。
【請求項４９】
前記CMV血清陰性対象が青年期の女子である、請求項４７に記載の使用又は方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学の分野に関する。詳細には、本発明は、サイトメガロウイルス(Cytomegalovirus)(CMV)に特異的な免疫応答を誘発するための例えばワクチンなどの組成物並びに方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)は、ヘルペスウイルス科に属する遍在性DNAウイルスである。HCMVは、DNAコア、外側カプシドから構成されており、ウイルス特異的糖タンパク質を組み込んだ脂質膜によって覆われている。
【０００３】
HCMVは、ほぼ世界中で風土性である。しかし一次感染は通常不顕性疾患に終わり、その後ウイルスはいずれかの後に再活性化する能力を保持して潜在性になる。しかし二つの集団においてHCMVは深刻な医学的状態に関与する。HCMVは子宮内で感染した新生児における先天性欠損の主な原因である。それは、開発世界における先天性感染の最も一般的な原因である。先天性感染は、新生児の誕生の前に母親から胎児に伝染する感染を意味する。先天性に感染した新生児において5-10%が誕生時に、小頭症、頭蓋内石灰化及び肝炎などの主要な臨床症状を有する。先天性HCMV感染を有する多くの乳児は、誕生時には無症候性である。しかし追跡調査はそのような乳児の15%が聴力喪失又は(詳細には知的能力不足を生じる)中枢神経系の異常などの後遺症を有することを示している。
【０００４】
危険性のある第2の集団は、HIV感染症を罹患している者及び臓器移植を受けている者などの免疫不全患者である。この状況においてウイルスは、日和見病原体になり、高い罹患率及び死亡率を伴う重度の疾患を生じる。臨床疾患は、熱、肝炎、間質性肺炎及び伝染性単核症を含む種々の症状を生じる。
【０００５】
HCMV関連疾患に取り組むために、弱毒生ワクチン及びサブユニットワクチンを含む候補ワクチンが開発されている。詳細には近年、MF59(商標)乳剤と組み合わされ、膜貫通ドメインが除去された改変された糖タンパク質B(gB)を含むサブユニットワクチンが第二相臨床試験において検査された(WO2009/037359、N.Engl.J.Med.2009;360:1191-9)。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第一の態様では、融合ループ1(FL1)ドメイン及び融合ループ2(FL2)ドメインを含むgBタンパク質細胞外ドメインの少なくとも一部分を含むサイトメガロウイルス(CMV)gBポリペプチドであって、前記FL1及びFL2ドメインの少なくとも一つが少なくとも一つのアミノ酸欠失又は置換を含むCMV gBポリペプチドが提供される。
【０００７】
第二の態様では、リーダー配列のアミノ酸の少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又はリーダー配列全体の欠失を含むCMV gBポリペプチドが提供される。
【０００８】
第三の態様では、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号19、配列番号20及び配列番号21に記載の配列からなる群から選択される配列を有するCMV gBポリペプチドが提供される。
【０００９】
第四の態様では、CMV gBポリペプチドの集団を含む調製物であって、前記集団の少なくとも50%、少なくとも60%又は少なくとも70%が三量体形態である調製物が提供される。
【００１０】
第五の態様では、適切な薬学的担体と混合した本発明のCMV gBポリペプチドを含む免疫原性組成物が提供される。
【００１１】
さらなる態様では、本発明のCMV gBポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００１２】
なおさらなる態様では、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15及び配列番号17に記載の配列からなる群から選択される配列を有するポリヌクレオチドが提供される。
【００１３】
なおさらなる態様では、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターが提供される。
【００１４】
なおさらなる態様では、本発明の組換えベクターで形質転換された宿主細胞が提供される。
【００１５】
なおさらなる態様では、CMV感染を予防及び/又は治療するための医薬の調製における本発明のCMV gBポリペプチドの使用が提供される。
【００１６】
なおさらなる態様では、CMV感染の予防及び/又は治療における使用のための本発明のCMV gBポリペプチドが提供される。
【００１７】
なおさらなる態様では、本発明のCMV gBポリペプチドを含む組成物の免疫学的有効量を対象(被験体)に投与するステップを含む、CMVに対する免疫応答を誘発するための方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】膜貫通ドメインを欠いているAD169株由来のCMV gBポリペプチド(gB-DeltaTM)及び本明細書において開示する三種の例示的CMV gBポリペプチドを模式的に示す図である:(i)膜貫通ドメインが除去されたCMV gBであって、融合ループFL1及びFL2の両方が突然変異しているCMV gB(gB-SLP12)(配列番号3を参照されたい)、(ii)膜貫通ドメインが除去されたCMV gBであって、融合ループFL1及びFL2の両方の突然変異がプロリンリッチドメイン、保存された疎水性パターン及び高度に親水性で陰性に荷電した領域を含むC末端細胞質ドメインにおける領域の欠失(Del2)と組み合わされているCMV gB(gB-SLP12-Del2)(配列番号4を参照されたい)、並びに(iii)膜貫通ドメインが除去されたCMV gBであって、融合ループFL1突然変異がポリペプチドのC末端細胞質ドメインにおける上に記載の領域(Del2)の欠失と組み合わされているCMV gB(gB-SLP1-Del2)(配列番号5を参照されたい)。gB-SLP12、gB-SLP12-Del2及びgB-SLP1-Del2は、すべて、アルギニン(R)をセリン(S)で置換する二つの追加的点突然変異を位置50及び357に含む。gB-SLP12-Del2及びgB-SLP1-Del2の両方は、システイン(C)をアラニン(A)で置換するさらなる点突然変異を位置778に含む。TMは、膜貫通ドメインである。FL1は融合ループ1である。FL2は融合ループ2である。Del2欠失は、アミノ酸825で始まり、877で終わる、すなわちこれらの二つのアミノ酸は、除去される領域のそれぞれ最初と最後である。表示される数字は、AD169株に由来し、配列番号1に記載のCMV gBの配列のアミノ酸の位置を意味する。
【図２】本明細書において開示されるさらなる例示的CMV gBポリペプチドを模式的に示す図である。すべてのポリペプチドは、突然変異した融合ループFL1及びFL2を含む。gB-SLP12-Delta113は、追加的に膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインのC末端部分(すなわちアミノ酸794から906)の両方が除去されている。gB-SLP12-Delta725は、追加的に細胞質ドメイン全体が除去されており、膜貫通ドメインの一部を保持している。LVL759(又はgB-SLP12-Delta725-LVL759)、LVL776(又はgB-SLP12-Delta725-LVL776)及びCD33(又はgB-SLP12-Delta725-CD33)は、示すとおりにアミノ酸配列が変化しているN末端を除いてgB-SLP12-Delta725と同じ骨格を有する。表示される数字は、AD169株に由来し、配列番号1に記載するCMV gBの配列のアミノ酸の位置を意味する。
【図３】構築物gB-SLP12に対応するpMaxプラスミドマップを示す図である。
【図４】構築物gB-SLP12-Delta725に対応するpTT5プラスミドマップを示す図である。
【図５】CHO細胞中で組換え的に発現された3種の異なる例示的gBポリペプチドの発現及び分泌レベルを膜貫通ドメインが除去された先行技術のCMV gBポリペプチドの発現及び分泌レベルと比較して示す図である。示されるのは、抗gB抗体を用いるウエスタンブロット分析であり、表示のgB構築物を形質移入された異なる培養物から生じた細胞性画分(gBの非分泌形態を表す)及び培養上清(gBの分泌形態を表す)の両方について存在するgBタンパク質(150kDaから100kDaの間のブロット上にある)のレベルを示している。レーンMW:分子量ラダー、レーンA:gB-DeltaTMを形質移入された培養物の細胞性画分(C-Fr)、レーンB:gB-SLP12を形質移入された培養物のC-Fr、レーンC:gB-SLP1-Del2を形質移入された培養物のC-Fr、レーンD:gB-SLP12-Del2を形質移入された培養物のC-Fr、レーンE:gB-DeltaTMを形質移入された培養物の培養上清(C-Sn)、レーンF:gB-SLP12を形質移入された培養物のC-Sn、レーンG:gB-SLP1-Del2を形質移入された培養物のC-Sn、レーンH: gB-SLP12-Del2を形質移入された培養物のC-Sn。
【図６】CHO細胞で組換え的に発現された本発明による3種の異なる例示的gBポリペプチドgB-SLP12、gB-SLP12-Delta113及びgB-SLP12-Delta725の発現及び分泌レベルを、膜貫通ドメインが除去された先行技術CMV gBポリペプチドの発現及び分泌レベルと比較して示す図である。示されるのは、抗gB抗体を用いる定量的Elisaアッセイであり、細胞性画分(黒色バー-gBの非分泌形態を表す)及び培養上清(灰色バー-gBの分泌形態を表す)の両方において存在するgBタンパク質のレベルを示している。
【図７】CHO細胞で組換え的に発現された本発明によるさらなる例示的gBポリペプチドの発現及び分泌レベルを示す図である。示されるのは、抗gB抗体を用いる3種のウエスタンブロット分析であり、表示のgB構築物で形質移入された別々の培養物から生じた細胞性画分(C-Fr、gBの非分泌形態を表す)及び培養上清(C-Sn、gBの分泌形態を表す)の両方において存在するgBタンパク質(150kDaから100kDaの間のブロット上にある)レベルを示している。図7A-レーンA、B、E、F、I、J、M及びNは、細胞合計2600個中に存在するタンパク質の量を表す。レーンC、D、G、H、K、L、O及びPは、細胞合計520個中に存在するタンパク質の量を表す。レーンMW:分子量ラダー、レーンA及びC:gB-DeltaTMで形質移入した培養物のC-Fr、レーンB及びD:gB-DeltaTMで形質移入した培養物のC-Sn、レーンE及びG:gB-SLP12で形質移入した培養物のC-Fr、レーンF及びH:gB-SLP12で形質移入した培養物のC-Sn、レーンI及びK:gB-SLP12-Delta725で形質移入した培養物のC-Fr、レーンJ及びL:gB-SLP12-Delta725で形質移入した培養物のC-Sn、レーンM及びO:gB-Delta725(インタクトな融合ループを有する)で形質移入した培養物のC-Fr、レーンN及びP:gB-Delta725(インタクトな融合ループを有する)で形質移入した培養物のC-Sn。図7B-レーン1、2、5、6、1'、2'、5'及び6'は、細胞合計2600個中に存在するタンパク質の量を表す。レーン3、4、7、8、3'、4'、7'及び8'は、細胞合計520個中に存在するタンパク質の量を表す。レーンMW:分子量ラダー、レーン1及び3:gB-SLP12-Delta725で形質移入した培養物のC-Fr、レーン2及び4:gB-SLP12-Delta725で形質移入した培養物のC-Sn、レーン5及び7:gB-Delta725(インタクトな融合ループを有する)で形質移入した培養物のC-Fr、レーン6及び8:gB-Delta725(インタクトな融合ループを有する)で形質移入した培養物のC-Sn、レーン1'及び3':gB-SLP12-Delta113で形質移入した培養物のC-Fr、レーン2'及び4':gB-SLP12-Delta113で形質移入した培養物のC-Sn、レーン5'及び7':gB-Delta113(インタクトな融合ループを有する)で形質移入した培養物のC-Fr、レーン6'及び8':gB-SLP12-Delta113(インタクトな融合ループを有する)で形質移入した培養物のC-Sn。
【図８】CHO細胞で組換え的に発現された本発明によるさらなる例示的gBポリペプチドの発現及び分泌レベルを示す図である。図8A-示されるのは、抗gB抗体を用いるウエスタンブロット分析であり、表示のgB構築物で形質移入された別々の培養物から生じた細胞性画分(C-Fr、gBの非分泌形態を表す)及び培養上清(C-Sn、gBの分泌形態を表す)の両方において存在するgBタンパク質の(150kDaから100kDaの間のブロット上にある)レベルを示している。レーンa、b、c、d、i、j、k及びlは、細胞合計11700個中に存在するタンパク質の量を表しており、レーンe、f、g、h、m、n、o及びpは、細胞合計5100個中に存在するタンパク質の量を表している。レーンMW:分子量ラダー、レーンa及びe:gB-SLP12-Delta725で形質移入した培養物のC-Sn、レーンi及びm:gB-SLP12-Delta725で形質移入した培養物のC-Fr、レーンb及びf:CD33で形質移入した培養物のC-Sn、レーンj及びn:CD33で形質移入した培養物のC-Fr、レーンc及びg:LVL759で形質移入した培養物のC-Sn、レーンk及びo:LVL759で形質移入した培養物のC-Fr、レーンd及びh:LVL776で形質移入した培養物のC-Sn、レーンl及びp:LVL776で形質移入した培養物のC-Fr。図8B-示されるのは、抗gB抗体を用いる定量的Elisaアッセイであり、細胞性画分(黒色バー-gBの非分泌形態を表す)及び培養上清(灰色バー-gBの分泌形態を表す)の両方において存在するgBタンパク質のレベルを示している。
【図９】CHO細胞での組換え発現におけるグルタルアルデヒド誘導架橋結合によって分析したポリペプチドgB-DeltaTM、gB-SLP12及びgB-SLP1-Del2の生成物プロファイルを示す図である。示されるのは、ポリアクリルアミドゲルの画像である。矢印は、異なるサイズの多量体を示す。グルタルアルデヒドの用量は漸増(0、0.5、1%)された。レーンMW:分子量ラダー、レーンA:gB-DeltaTM-0%グルタルアルデヒド、レーンB:gB-DeltaTM-0.5%グルタルアルデヒド、レーンC:gB-DeltaTM-1%グルタルアルデヒド、レーンD:gB-SLP12-0%グルタルアルデヒド、レーンE:gB-SLP12-0.5%グルタルアルデヒド、レーンF:gB-SLP12-1%グルタルアルデヒド、レーンG:gB-SLP1-Del2-0%グルタルアルデヒド、レーンH:gB-SLP1-Del2-0.5%グルタルアルデヒド、及びレーンI:gB-SLP1-Del2-1%グルタルアルデヒド。
【図１０】CHO細胞での組換え発現における分析的超遠心分離法(AUC)によって分析したポリペプチドgB-DeltaTM、gB-SLP12及びgB-SLP1-Del2の生成物プロファイルを示す図である。ピークは、表示のとおりさまざまなサイズの多量体を表す。各ポリペプチド集団内で同定された多量体の百分率も、表示のとおり特定される。
【図１１Ａ】CHO細胞での組換え発現における分析的超遠心分離法(AUC)によって分析した表示のさらなる例示的CMV gBポリペプチドの生成物プロファイルを示す図である。ピークは、表示のとおりさまざまなサイズの多量体を表す。各ポリペプチド集団において同定された多量体の百分率も、表示のとおり特定される。図11A-プルロニック(Pluronic)の存在下又は非存在下で得られたgB-SLP12-Delta113ポリペプチド(図中ではgB-Delta113と表示)の生成物プロファイルを示す。図11B-プルロニックの存在下又は非存在下で得られたgB-SLP12-Delta725ポリペプチド(図中ではgB-Delta725と表示)の生成物プロファイルを示す。
【図１１Ｂ】図１１Ａの続きである。
【図１２Ａ】CHO細胞での組換え発現及び分泌において生成され、シグナル配列が切断された後の表示のポリペプチドのN末端のMS/MSマッピングによるペプチド分析を示す図である。図12Aは、組換え発現されたgB-SLP12-Delta725の集団内でシグナル配列が切除された後にさまざまなN末端アミノ酸を有するさまざまなポリペプチドの相対的存在量を示す。図12Bは、組換え発現されたgB-SLP12-Delta725-LVL759の集団内にシグナル配列が切除された後に存在するさまざまなN末端アミノ酸を有するさまざまなポリペプチドの相対的存在量を示す。図12Cは、組換え発現されたgB-SLP12-Delta725-776の集団内にシグナル配列が切除された後に存在するさまざまなN末端アミノ酸を有するさまざまなポリペプチドの相対的存在量を示す。図12Dは、組換え発現されたgB-SLP12-Delta725-CD33の集団内にシグナル配列が切除された後に存在するさまざまなN末端アミノ酸を有するさまざまなポリペプチドの相対的存在量を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ａの続きである。
【図１２Ｃ】図１２Ｂの続きである。
【図１２Ｄ】図１２Ｃの続きである。
【図１３】UV(SEC-UV)に基づくサイズ排除クロマトグラフィーによって分析された、CHO細胞での組換え発現におけるポリペプチドgB-DeltaTM、gB-S50-DeltaTM及びgB-SLP12の生成物プロファイルを示す図である。ピークは、表示するサイズの多量体を表す。
【図１４−１】抗gB抗体又は抗His抗体のいずれかを用いるウエスタンブロット分析を示す図であり、表示のポリペプチドが組換え的に発現、分泌、精製及び脱グリコシル化された後のgBタンパク質のレベルを示す。図14Aは、gB-DeltaTMに対応し、抗gB抗体で探索したウエスタンブロットを示す。図14Bは、gB-SLP12に対応し、抗His抗体(レーン2)及び抗gB抗体(レーン3)で探索したウエスタンブロットを示す。図14Cは、gB-SLP12-Delta113に対応し、抗His抗体(レーンA)及び抗gB抗体(レーンB)で探索したウエスタンブロットを示す。図14Dは、gB-SLP12-Delta725に対応し、抗His抗体(レーンC)及び抗gB抗体(レーンD)で探索したウエスタンブロットを示す。
【図１４−２】図１４−１の続きである。
【図１５】免疫原性データを示す図である。図15Aは、注射用に製剤された表示のポリペプチドの投与後に誘導された中和力価を示す。図15Bは、注射用に製剤された表示のポリペプチドの投与後に誘導されたELISA抗gB抗体力価を示す。
【図１６−１】下に記載する配列番号1から配列番号21の配列を示す図である。
【図１６−２】図１６−１の続きである。
【図１６−３】図１６−２の続きである。
【図１６−４】図１６−３の続きである。
【図１６−５】図１６−４の続きである。
【図１６−６】図１６−５の続きである。
【図１６−７】図１６−６の続きである。
【図１６−８】図１６−７の続きである。
【図１６−９】図１６−８の続きである。
【図１６−１０】図１６−９の続きである。
【図１６−１１】図１６−１０の続きである。
【図１６−１２】図１６−１１の続きである。
【図１６−１３】図１６−１２の続きである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
配列表の説明
配列番号1-CMV AD169株由来の全長gBポリペプチドのアミノ酸配列。
【００２０】
配列番号2-CMV AD169株由来のgB-DeltaTMポリペプチドのアミノ酸配列。
【００２１】
配列番号3-CMV AD169株由来のgB-SLP12ポリペプチドのアミノ酸配列。
【００２２】
配列番号4-CMV AD169株由来のgB-SLP12-Del2ポリペプチドのアミノ酸配列。
【００２３】
配列番号5-CMV AD169株由来のgB-SLP1-Del2ポリペプチドのアミノ酸配列。
【００２４】
配列番号6-CMV AD169株由来のgB-SLP12ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【００２５】
配列番号7-CMV AD169株由来のgB-SLP1-Del2ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【００２６】
配列番号8-CMV AD169株由来のgB-SLP12-Del2ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【００２７】
配列番号9-CMV AD169株由来のgB-SLP12-Delta725ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【００２８】
配列番号10-CMV AD169株由来のgB-SLP12-Delta725ポリペプチドのアミノ酸配列。
【００２９】
配列番号11-CMV AD169株由来のgB-SLP12-Delta113ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【００３０】
配列番号12-CMV AD169株由来のgB-SLP12-Delta113ポリペプチドのアミノ酸配列。
【００３１】
配列番号13-CMV AD169株由来のgB-SLP12-Delta725-LVL759(又はLVL759)ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【００３２】
配列番号14-CMV AD169株由来のgB-SLP12-Delta725-LVL759(又はLVL759)ポリペプチドのアミノ酸配列。
【００３３】
配列番号15-CMV AD169株由来のgB-SLP12-Delta725-LVL776(又はLVL776)ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【００３４】
配列番号16-CMV AD169株由来のgB-SLP12-Delta725-LVL776(又はLVL776)ポリペプチドのアミノ酸配列。
【００３５】
配列番号17-CMV AD169株由来のgB-SLP12-Delta725-CD33(又はCD33)ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【００３６】
配列番号18-CMV AD169株由来のgB-SLP12-Delta725-CD33(又はCD33)ポリペプチドのアミノ酸配列。
【００３７】
配列番号19-CMV AD169株由来のgB-SLP12-Delta725-LVL759(又はLVL759)ポリペプチドの成熟形態でのアミノ酸配列。
【００３８】
配列番号20-CMV AD169株由来のgB-SLP12-Delta725-LVL776(又はLVL776)ポリペプチドの成熟形態でのアミノ酸配列。
【００３９】
配列番号21-CMV AD169株由来のgB-SLP12-Delta725-CD33(又はCD33)ポリペプチドの成熟形態でのアミノ酸配列。
【００４０】
詳細な説明
本発明は、優れた免疫原性及び良好な加工特徴を示す新規CMV gBポリペプチドに関する。本発明のgBポリペプチドは、ワクチンなどの免疫原性組成物への包含のための抗原として特に適切である。詳細には、本発明のgBポリペプチドは、改善された均一な生成物プロファイルを示す。実際、本発明者らは発現において、膜貫通ドメインを欠いているgBポリペプチド(gB-DeltaTM)などの先行技術のgBポリペプチドが高分子量多量体を含む、集団を不均一にするさまざまなサイズの多量体に会合したことを認めた。本発明者らは多量体プロファイルが安定でなく、所与のサイズの多量体の割合が実験ごとに変化したことも認めた。この種の可変性と不安定性はワクチン製剤の観点においては許容されない。したがって改善された均一かつ安定な生成物プロファイルを表すCMV gBポリペプチドに対する必要性は残っている。同様に高分子量多量体への凝集も(詳細には凝集がポリペプチドの低溶解性形態をもたらす場合があることから)組換えポリペプチドの続く精製のプロセスに悪影響を有する場合がある。したがって改善された加工特徴を表すCMV gBポリペプチドに対する必要性は残っている。
【００４１】
膜貫通ドメインを欠いているCMV gBポリペプチドは、EP0802979に記載されている。
【００４２】
驚くべきことに本発明者らは、膜貫通ドメインを欠いているCMV gBポリペプチドなどの特定の領域における突然変異の導入が、対応する非突然変異ポリペプチドよりも集団がさらに均一であるだけでなく実験ごとで安定しているプロファイルも示すなどの改善されたプロファイルの生成物をもたらすことを認めた。詳細には、高分子量多量体は減少し、三量体の割合が2倍増加している。典型的には、三量体は、本発明のCMV gBポリペプチド集団の少なくとも50%、適切には少なくとも60%、より適切には少なくとも70%に相当する。膜貫通ドメインを欠いているCMV gBポリペプチドと比較してこれらの突然変異は、得られた突然変異体の発現レベルに影響を与えず、分泌レベルにも影響しない。これらの突然変異は、免疫応答を誘導することに関与すると周知であるCMV gBの抗原性エピトープの外側にある。膜貫通ドメインを欠いている先行技術のポリペプチドなどポリペプチドが高分子量多量体に会合する集団から、ポリペプチドのより簡便でより良い精製に関連する改善された三量体化プロファイルをポリペプチドが有する集団への移行が認められた。詳細には、本発明者らは、本発明によるポリペプチドの精製収率が膜貫通ドメインを欠いている先行技術のCMV gBポリペプチドで得られた精製収率より顕著に高いことを認めた。収率の改善は、少なくとも2倍、おそらく少なくとも3から5倍である。付加的に本発明による新規ポリペプチドにおけるさらなる突然変異が、先行技術のポリペプチドよりもさらに効率的に発現及び分泌されるポリペプチドをもたらすために示される。そのような特性は、抗原産生が典型的には限定因子である分野、ワクチン製造に関する抗原産生の観点において顕著な利点を示す。
【００４３】
本発明者らは、膜貫通ドメインを欠いているCMV gBポリペプチドなどの先行技術gBポリペプチドが、ポリペプチドのN末端及びC末端に不均一性を示したことも認めた。実際に本発明者らは、細胞中での組換え発現及び分泌後に異なるサイズを有するポリペプチドの少なくとも二つの異なる形態をもたらすクリッピング(clipping)がgBのC末端細胞質ドメインにおいて生じたことを認めた。ワクチンへのなどの免疫原性組成物中への包含の目的のために、主に一つの単一形態からなるという意味でgBポリペプチドの均一な集団を有することは好ましい。本発明者らは、C末端細胞質ドメインの少なくとも一部を欠失させると、クリッピングはもはや生じず、gBの単一形態から主になるポリペプチドの集団をもたらすことを見出した。
【００４４】
同様に、膜貫通ドメインを欠いているCMV gBポリペプチドなどの先行技術gBポリペプチドが、ポリペプチドのN末端部分において不均一性を示すことが認められた。実際に本発明者らは、ポリペプチドの組換え発現及び分泌後にシグナル配列がシグナルペプチダーゼによってさまざまなアミノ酸位置で切断され、したがって、さまざまなN末端を有するgB成熟ポリペプチドの集団(すなわちN末端に異なるアミノ酸を有するgBポリペプチドからなる集団)が生じたことを認めた。この現象は、シグナルペプチダーゼの「ゆらぎ(woobling)」とも称される。効率化の目的で、詳細には安定のために、抗原が可能な限り均一で、可能な限り未分解であるようにワクチンに含まれ、それによりワクチンロットに再現性があり、安定であることはワクチン分野において重要である。
【００４５】
改善された均一な生成物プロファイルが(組換え発現において)本発明のCMV gBポリペプチドの集団が(例えば分析的超遠心分離法によって測定される際に)少なくとも50%の三量体からなることを意味することは、本発明の意味において理解される(実施例2、1.2節を参照されたい)。典型的には、本発明のCMV gBポリペプチド集団を含む調製物は、少なくとも50%、適切には少なくとも60%、より適切には少なくとも70%の三量体からなる。そのような少なくとも50%の三量体のプロファイルも本明細書において「改善された三量体化プロファイル」又は「三量体に富んだプロファイル」と称される。これらの用語は、同義かつ互換的であると考えられる。
【００４６】
ポリペプチドのC末端部分における「均一性/不均一性」に関して、不均一集団は、集団が異なるサイズを有する少なくとも二つのポリペプチドからなることを意味し、一方、均一集団は所与のサイズの単一ポリペプチドから主になる集団として理解される。
【００４７】
ポリペプチドのN末端部分における「均一性/不均一性」に関して、不均一集団は、集団がN末端の異なるアミノ酸でそれぞれ始まるさまざまな成熟ポリペプチドからなることを意味する。反対に本発明により均一集団は、N末端が所与の同一のアミノ酸で不変的に始まる単一の成熟ポリペプチドから主になる集団として理解される。本発明において「成熟」ポリペプチドは、シグナル配列が切除されているポリペプチドを意味する。典型的には本発明の意味でのN末端均一集団においてシグナル配列の切断後に産生された成熟ポリペプチドの30%を超える、適切には少なくとも80%、より適切には80%から90%、より適切には少なくとも99%はN末端が同じアミノ酸で始まる。したがって一実施形態では、シグナル配列の切断後に産生された成熟CMV gBポリペプチドの集団であって、成熟gBポリペプチドの少なくとも30%、少なくとも80%、80%から90%がN末端に同じアミノ酸を含む集団を含む調製物が提供される。詳細には、本発明の成熟ポリペプチドは、適切にはN末端位置がセリン又はヒスチジンで始まる。
【００４８】
gBは、多数の役割(その一つはサイトメガロウイルスの宿主細胞との融合への関与である)を有するエンベロープ糖タンパク質Bである。それは、HCMVゲノムのUL55遺伝子によってコードされている。gBの天然形態のサイズは、株ごとに若干変わる場合があるオープンリーディングフレーム(ORF)のサイズに依存する。例えば2717bp長のAD169株のORFは906アミノ酸の全長gBをコードするが、Towne株のORFは907アミノ酸の全長gBをコードしている。本発明は、任意のCMV株に由来するgBタンパク質に適用可能であるが、理解を容易にするために本明細書におけるアミノ酸位置に関して番号付けは、他に記載する場合を除いて、AD169株に由来する配列番号1のgBポリペプチドのアミノ酸配列との関係で与えられる。しかし本発明は、AD169株に限定されない。任意の他のCMV株のgBポリペプチドの同等のアミノ酸位置は、容易に利用可能な十分に周知のアラインメントアルゴリズム(BLASTなど)を用いてアミノ酸配列をアラインすることにより当業者によって決定され得る。したがって「他のCMV gBポリペプチド」に言及する場合、それはAD169とは異なる任意の株のCMV gBポリペプチドとして理解される。AD169 gBの天然形態は、タンパク質のN末端からC末端方向に(図1も参照されたい)(i)ポリペプチドを分泌へ標的化することを含むポリペプチドの細胞内輸送に関与することが周知であるアミノ酸シグナル配列、又はシグナルペプチド、に続いて(ii)リーダー配列と称される領域、(iii)配列番号1に記載の配列のアミノ酸456と460との間のフューリン型の内部タンパク質分解(endoproteolytic)切断部位を含有する細胞外ドメイン、(iv)膜貫通ドメイン及び(v)C末端細胞質ドメインを含有する。さらにアミノ酸のストレッチが別のヘルペスウイルス(HSVなど)由来のgBタンパク質との配列アラインメントに基づいて推定融合ループとしてCMV gBのアミノ酸配列中に同定されている(Backovic et al.2007.J.Virol.81(17):9596-600)。HSV融合ループは実験的に決定された(Hannah,B.P.et al.2009.J.Virol.83(13):6825-6836)。前記ストレッチは、宿主細胞とのウイルスの融合にそれらが関与するためにそう呼ばれた。上の文献により、本明細書の残りにおいてFL1及びFL2と称される二つの推定ループがCMV gBにおける配列アラインメントによって同定された。前記融合ループは、膜貫通ドメイン上流のタンパク質の細胞外ドメインにある。
【００４９】
驚くべきことに、本発明者らは、特定のアミノ酸を突然変異させることによって非機能性膜貫通ドメインを有するCMV gBポリペプチドの融合ループFL1及びFL2を破壊することが、非機能性膜貫通ドメインを有するがインタクトな融合ループを有するCMV gBポリペプチドと比較して発現において改善された三量体化プロファイルを示す生成物を生じることを認めた。したがって一部の実施形態では、本発明のCMV gBポリペプチドは、融合ループFL1又はFL2の少なくとも一つ(場合により両方)に例えばアミノ酸置換又は欠失などの突然変異を含む。適切には、本発明のポリペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸置換又は欠失を融合ループFL1に含む。適切には、本発明のポリペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸置換又は欠失を融合ループFL2に含む。より適切には、本発明のCMV gBポリペプチドは、融合ループFL1及びFL2の両方の突然変異を含み、そのような突然変異したCMV gBポリペプチドは本発明の目的を形成する。例えば本発明のgBポリペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸置換又は欠失を融合ループFL1に及び少なくとも一つのアミノ酸置換又は欠失を融合ループFL2に含む。
【００５０】
本発明の意味において、CMV AD169の融合ループFL1を包含するアミノ酸、すなわちFL1のアミノ酸配列は、配列番号1に記載の配列の155Y.I.Y157と定義される。同様に融合ループFL2を包含するアミノ酸、すなわちFL2のアミノ酸配列は、本発明の意味において配列番号1に記載の配列の240W.L.Y242と定義される。対応する融合ループFL1及びFL2配列は、例えば配列アラインメントによって他のCMV株由来のgBポリペプチドにおいて同定され得る。前記融合ループの破壊は、欠失又はアミノ酸置換などの点突然変異によるかにかかわらず、これらのアミノ酸トリプレットに関連する任意の種類の突然変異を含むことができ、非突然変異形態と比較して三量体形態にあるポリペプチドの高い割合を有する生成物である、組換え発現において三量体に富み、改善されたプロファイルを有する生成物を生じる。
【００５１】
FL1に関する非限定的な適切な突然変異は、配列番号1に記載の配列の155Y.I.Y157アミノ酸から選択される、又は異なる株に由来する他のCMV gBポリペプチドの対応する位置のアミノ酸の、少なくとも一つの、適切には少なくとも二つの欠失又は極性アミノ酸(詳細には非芳香族極性アミノ酸、より詳細にはリシン(K)、ヒスチジン(H)及びアルギニン(R)からなる正に荷電したアミノ酸の群から選択されるアミノ酸)での置換である。したがって一部の実施形態では、本発明のCMV gBポリペプチド、詳細には非機能性膜貫通ドメインを有するポリペプチドは、少なくともイソロイシン(I156)、適切には少なくともチロシン(Y155)、適切には少なくともチロシン(Y157)がヒスチジン(H)で置換されている又は欠失している突然変異した融合ループFL1を有する。代替的に本発明のCMV gBポリペプチドは、少なくともチロシン(Y157)がアルギニン(R)で置換されている突然変異した融合ループFL1を有する。詳細な実施形態では、本発明のCMV gBポリペプチド、詳細には非機能性膜貫通ドメインを有するポリペプチドは、少なくともイソロイシン(I156)及びチロシン(Y157)がヒスチジン(H156)及びアルギニン(R157)でそれぞれ置換されている又は欠失している突然変異した融合ループFL1を有する。さらなる実施形態では、非機能性膜貫通ドメインを有する本発明のCMV gBポリペプチドは、少なくともチロシン(Y155)がグリシン(G)で置換されている又は欠失している場合によりイソロイシン(I156)のヒスチジン(H)での置換若しくは欠失又はチロシン(Y157)のアルギニン(R)での置換若しくは欠失と組み合わされている、或いは両方の置換又は欠失と組み合わされている突然変異した融合ループFL1を有する。具体的な実施形態では、非機能性膜貫通ドメインを有する本発明のCMV gBポリペプチドは、配列番号1に記載の配列の3アミノ酸155Y.I.Y157又は異なる株に由来する他のCMV gBポリペプチドの対応する位置がアミノ酸155G.H.R157で置換されている又は欠失している突然変異した融合ループFL1を有する。FL1ドメインの突然変異は、代替的方法においても定義され得る。下に記載のとおり、具体的なアミノ酸配列の疎水
性度は、カイト及びドーリトルスケールなどの疎水性スケールを用いて決定され得る(Kyte et al.1982.J.Mol.Bio.157:105-132)。アミノ酸155Y.I.Y157を包含するFL1ドメインは、そのスケールで+1.9を達成する。一実施形態では、本発明のCMV gBポリペプチドにおいて、配列番号1に記載の配列の位置155〜157に、又は他のCMV gBポリペプチドの対応する位置にあるアミノ酸Y.I.Yのストレッチは、カイト及びドーリトルスケール(Kyte and Doolittle scale)を用いて測定された疎水性スコア-3未満、詳細には-7未満、より詳細には-8未満を有する3アミノ酸のストレッチで置換される。アミノ酸のストレッチ全体でのスコアが上に記載の値に達する限り三つすべてのアミノ酸が同時に置換されなくてもよい。例えば3アミノ酸長のストレッチの一つだけの又は二つのアミノ酸が置換される場合があり、スコアは、置換されたアミノ酸(すなわち一つ又は二つ)の性質に元(二つ又は一つ)の性質をそれぞれ足したものに基づいて算出される。
【００５２】
融合ループFL2に関する非限定的な適切な突然変異は、配列番号1に記載の配列の240W.L.Y242から選択される、又は異なる株に由来する他のCMV gBポリペプチドの対応する位置のアミノ酸の、少なくとも一つの、適切には少なくとも二つの欠失又はリシン(K)、ヒスチジン(H)及びアルギニン(R)からなる群から選択される正に荷電したアミノ酸、適切にはヒスチジン(H)での置換である。したがって一部の実施形態では、本発明のCMV gBポリペプチドは、少なくともチロシン(Y242)、適切には少なくともロイシン(L241)、適切には少なくともトリプトファン(W240)がヒスチジン(H)で置換されている又は欠失しており、場合により上に記載の突然変異した融合ループFL1と組み合わされている突然変異した融合ループFL2を有する。詳細な実施形態では、本発明のCMV gBポリペプチドは、配列番号1に記載の配列の3アミノ酸240W.L.Y242又は異なる株に由来する他のCMV gBポリペプチドの対応する位置がアミノ酸240A.F.H242で置換されており、場合により上に記載のFL1突然変異と組み合わされている突然変異した融合ループFL2を有する。
【００５３】
FL1及び/又はFL2融合ループに関連する突然変異は、上に記載の突然変異に限定されない。さらなる突然変異は、上に記載のものに付加的であるか否かにかかわらず、例えば配列番号1に記載の配列の上のトリプレット155Y.I.Y157及び240W.L.Y242の周辺の、又は異なる株に由来する他のCMV gBポリペプチドの対応する位置のアミノ酸を突然変異させることなどは、生じる突然変異体ポリペプチドが改善された、三量体に富むプロファイルを示し、前記さらなる突然変異がポリペプチドが宿主細胞で組換え的に発現される際にその産生(発現若しくは分泌)、プロセシング又は安定性を妨げない限り実施され得る。
【００５４】
本発明者らは、少なくとも一つの融合ループ(FL1及び/又はFL2)の突然変異(任意の上に記載の突然変異など)とポリペプチドのC末端細胞質ドメインにおける付加的突然変異とを組み合わせることも改善された三量体化プロファイルを有するCMV gBポリペプチドを提供することも認めた。本発明の意味においてgB CMVポリペプチドのC末端細胞質ドメインは、膜貫通ドメインの下流にあるドメインとして理解される(図1も参照されたい)。詳細には、C末端細胞質ドメインにおける追加的突然変異は、疎水性領域、適切にはプロリンリッチ領域、適切には高度に親水性で陰性に荷電した領域、場合によりこれらすべての欠失に適切には関する。非限定的例として、適切な突然変異は配列番号1に記載の配列のアミノ酸825〜877の欠失に対応し、Del2と称される。除去された上の配列の記述は、アミノ酸位置825〜877に厳密には限定されず、得られた突然変異体ポリペプチドが改善された三量体に富んだプロファイルを表し、宿主細胞において組換え的に発現される際に産生、プロセシング又は安定性に関して影響しない限り変更できる。したがって一部の実施形態では、本発明のCMV gBポリペプチドは、少なくとも一つの融合ループ(FL1及び/又はFL2)、適切にはFL1の突然変異、及び少なくとも一つの疎水性領域、一つのプロリンリッチ領域及びC末端細胞質ドメインにおける一つの高度に親水性の領域の欠失、詳細には配列番号1に記載の配列のアミノ酸825から877(Del2)の欠失の両方を含む。
【００５５】
アミノ酸配列又はその断片の疎水性度は、この配列又はその断片を構成するアミノ酸の種類によって決められる。アミノ酸は一般にそれらの側鎖により異なる群に分類される。例えばいくつかの側鎖は、非極性(すなわち疎水性)と考えられ、他のいくつかは極性と考えられる。本発明の意味においてアラニン(A)、グリシン(G)、バリン(V)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、プロリン(P)、フェニルアラニン(F)及びトリプトファン(W)は疎水性アミノ酸の一員であると考えられ、一方セリン(S)、スレオニン(T)、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、チロシン(Y)、システイン(C)、リシン(K)、アルギニン(R)、ヒスチジン(H)、アスパラギン酸(D)及びグルタミン酸(E)は、極性アミノ酸の一員であると考えられる。それらの疎水性度にかかわらず、アミノ酸はそれらの側鎖が共有する一般的特性に基づいてサブグループにも分類される。例えばフェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは一緒に芳香族アミノ酸として分類され、本発明の意味において芳香族アミノ酸として考えられる。アスパラギン酸(D)及びグルタミン酸(E)は、酸性又は負に荷電したアミノ酸の一員であり、一方リシン(K)、アルギニン(R)及びヒスチジン(H)は、塩基性又は正に荷電したアミノ酸の一員であり、それらは本発明の意味においてそのように考えられる。20個のアミノ酸のそれぞれの疎水性及び親水性特性を利用し、各アミノ酸に疎水性スコアを割り当て、それにより疎水性順位を作る疎水性スケールは利用可能である。例示的例としてのみ、カイト及びドーリトルスケールが以前に論じられ、引用され得る(Kyte et al.1982.J.Mol.Bio.157:105-132)。このスケールは、予め決定された長さのセグメント内の平均疎水性度を算出することを可能にする。したがってアミノ酸配列中の疎水性領域は、本発明による突然変異のための潜在的標的として当業者によって同定され得る。生じる突然変異体タンパク質の改善された生成物プロファイルを導く(すなわち集団内の三量体割合を有利にする)ための前記領域の突然変異の能力は、次いで下に記載のとおり検査され得る。疎水性領域の突然変異は、上に表示の前記領域若しくはその部分の欠失、又は前記領域中の疎水性アミノ酸を極性アミノ酸で置換する点突然変異からなる場合がある。突然変異の関連性は、宿主細胞での組換え発現において突然変異したポリペプチドの生成物プロファイルに前記突然変異がもたらした影響を分析することによって決定される、すなわち関連突然変異は、突然変異したポリペプチドの集団内に少なくとも50%、適切には少なくとも60%、より適切には少なくとも70%の三量体が存在する改善された、三量体に富むプロファイルを誘導する。本発明者らは、上に記載の改善された生成物プロファイルを維持しながらさまざまな程度にC末端細胞質ドメインが除去され得ることを認めた。したがって本発明は、細胞質ドメインのアミノ酸が適切には10%、より適切には20%、より適切には60%、より適切には80%、より適切には90%が除去されたCMV gBポリペプチドを検討する。場合により細胞質ドメイン全体が除去され得る。詳細には、本発明者らは、細胞質ドメインの少なくとも70%、適切には少なくとも80%又はそれ以上を除去すると、得られたCMV gBポリペプチドは宿主細胞で組換え的に発現される際により良い発現及��分泌レベルを示すことを認めた。したがって一部の実施形態では、本発明のCMV gBポリペプチドは、少なくとも一つの融合ループ(FL1及び/又はFL2)、適切にはFL1又は場合により両方の突然変異並びに細胞質ドメイン全体、例えば配列番号1に記載の配列のアミノ酸776から906又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置の欠失の両方を含む。
【００５６】
互いに凝集する場合がある精製されたポリペプチドなどの集団内の構成要素の識別をそれらのサイズ又は密度により可能にする任意の方法は、生成物プロファイルをモニタリングするため及び所与の突然変異が上に記載の改善された生成物プロファイルを付与しているかどうかを決定するために用いられ得る。適切な方法は、分析的超遠心分離法(AUC)などの沈降又はクロマトグラフィー、詳細にはサイズ排除クロマトグラフィー(UVに基づくサイズ排除クロマトグラフィー(SEC-UV)など)に基づき得る。代替的にタンパク質又はポリペプチド試料中の凝集レベルを評価するための方法は、二つのタンパク質若しくはポリペプチド又はそれ以上の間に共有結合を形成するように架橋結合剤で試料を処置することからなる場合がある。グルタルアルデヒドは、架橋結合剤として適切に用いられ得る。架橋結合後、試料を変性条件でゲルにロードするステップ(SDS-PAGEなど)及びタンパク質の存在について例えばCoomassie blue又は硝酸銀でゲルを染色するステップは、それらの分子量に応じて分離された凝集物を(存在すれば)呈示する。周知の分子量を有するタンパク質からなるラダーを平行してロードするステップは、さまざまな凝集物の分子量を決定することを可能にする。単量体形態でのポリペプチドなどの最小単位の分子量が周知であれば、次いで凝集物の観察された分子量は、凝集物内の多量体化レベルの指標となる。例えば膜貫通ドメインが除去されたCMV AD169 gBポリペプチドは、838アミノ酸長である。アミノ酸の平均分子量が110kDaであることを考慮すると、このポリペチドの予測される分子量は92kDaである。したがってそのようなポリペプチドが凝集すると、生じる多量体の平均分子量は92の倍数であると予測される。詳細には三量体を形成する場合、膜貫通ドメインが除去されたgBの3分子からなるそのような三量体の予測される平均分子量は276kDaである。
【００５７】
融合ループFL1及び/又はFL2における上に記載の任意の突然変異は、さらなる突然変異と組み合わされ得る。詳細には、本発明によるCMV gBポリペプチドは、非機能的膜貫通ドメインを有し、融合ループ突然変異などのさらなる特異的突然変異を含むと理解される。ポリペプチド内の膜貫通ドメインの位置は、アミノ酸20個の疎水性及び親水性特性を用いてアミノ酸配列からハイドロパシー(hydropathy)スケールを算定できるコンピュータープログラムの使用を通じて予測され得る(Kyte et al.1982.J.Mol.Bio.157:105-132)。配列の予め決定された長さのセグメント内の平均ハイドロパシーは、プログラムが配列中を移動して連続的に算出される。これらの連続的疎水親水性指標スコアは、次いでN末端からC末端へプロットされ、ほとんどの周知の配列決定されたタンパク質において見出されたアミノ酸組成の総平均ハイドロパシーに対応する中間点線が印刷される。膜結合タンパク質は、膜の脂質二重層中に包埋される配列部分に対応して線の疎水性側に大きな連続した領域を呈する。膜貫通ドメインは、ポリペプチドの細胞膜への固着に関与する。ウイルスエンベロープ糖タンパク質において、膜貫通ドメインは、典型的には、ポリペプチドのC末端部分付近に20-27個の無電荷の、主に疎水性アミノ酸のストレッチを含有する。CMV gBに関して上に記載のハイドロパシー分析の適用の例は、引用されるSpaeteらによる刊行物(Spaete et al.,1988,Virology 167:207-225)である。実際に著者らは、株AD169及びTowne由来のCMV gBポリペプチド中に、gBポリペプチドのC末端付近に二つの広い、近接する疎水性ピークとして明らかである推定疎水性膜貫通ドメインを同定した。最初のものはアミノ酸715から748を含み、二番目のものはアミノ酸752から772を含む(番号付けは配列番号1に記載のAD169株由来のgBポリペプチドのアミノ酸配列に対応する)。Reschkeらによる刊行物(Reschke et al.,1995,J.of Gen.Virology 76:113-122)は、代替的にアミノ酸751-771の第2のストレッチをAD169 CMV gBの推定膜貫通ドメインとして同定した。したがってこ
れら二つの刊行物は、AD169 CMV gBの推定膜貫通ドメインが少なくともアミノ酸751-771及び場合によりアミノ酸714-771を含むことを示唆する。本発明の意味では、CMV gBポリペプチドの膜貫通ドメインは、配列番号1に記載の配列の少なくともアミノ酸701-775又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置のアミノ酸を包含し、したがって74アミノ酸長である。
【００５８】
「非機能的膜貫通ドメイン」によって、宿主細胞における発現で生じるポリペプチドの前記細胞からの分泌が可能になるように推定膜貫通ドメインの少なくとも一部が変更されていることが本発明の意味において理解される。一実施形態では、本発明のgBポリペプチドは、膜貫通ドメイン全体が除去されている。代替的実施形態では、本発明のCMV gBポリペプチドは、膜貫通ドメインの部分を保持している。詳細には、CMV gBポリペプチドは、膜貫通ドメインのアミノ酸の少なくとも5%、適切には少なくとも10%、より適切には少なくとも20%、より適切には少なくとも30%又は少なくとも50%を保持している。したがって一部の実施形態では、膜貫通ドメインのアミノ酸数の少なくとも50%が本発明のCMV gBポリペプチドにおいて除去されており、膜貫通ドメインのアミノ酸数の適切には少なくとも70%、より適切には少なくとも80%、より適切には少なくとも90%、さらには95%が除去されている。詳細な一実施形態により本発明のCMV gBポリペプチドの膜貫通ドメインは、配列番号1に記載の配列のアミノ酸701-775、又は他のCMV gBポリペプチドの対応する位置のアミノ酸を除去することによって非機能的にされる。ポリペプチド内の膜貫通ドメインの位置を決定するための上に記載の推定に基づいて欠失の程度は、宿主細胞中での発現で生じる欠失CMV gBポリペプチドが前記細胞から分泌される限りさらに変更され得る。膜貫通ドメインの機能変更は、アミノ酸の欠失に限定されない。変更は、挿入及び/又は置換など任意の他の種類のアミノ酸突然変異からなり得る。アミノ酸の欠失、挿入及び置換は、宿主細胞中での発現で生じる突然変異したCMV gBポリペプチドが宿主細胞から分泌される限りどのような方法とも組み合わされ得る。生じた突然変異したポリペプチドが細胞から分泌される能力についての、例えば膜貫通ドメインの所与の部分の欠失などの所与の突然変異の影響を評価することは当業者の能力の範囲内である。ポリペプチドの分泌は検出されることができ、分泌レベルは当技術分野において周知の任意の技術によって評価され得る。非限定的な例示的例として、発現において細胞内に保持される及び細胞培養上清又は細胞培養培地に分泌される発現されたポリペプチドの存在量を別々に測定することは可能である。典型的には、発現において、任意の一般的溶解方法により細胞が溶解される前に細胞培養上清は回収され、二つの(細胞性及び上清)画分を提供する。次いでポリペプチドの存在量は、当技術分野において周知の任意のタンパク質検出技術によって各画分において測定され得る。例えばポリペプチドはウエスタンブロットによって又はELISAアッセイによって検出され得る。
【００５９】
「細胞外ドメインの少なくとも一部分を含む」は、融合ループFL1及びFL2を含む又は包含する細胞外ドメインの少なくとも一部として本発明の意味において理解される。細胞外ドメイン中の融合ループ外の追加的アミノ酸の数は、変化し得る。本発明のポリペプチドにおいて存在する細胞外ドメインのアミノ酸の適切な数又はアミノ酸の百分率は、得られたポリペプチドが抗原エピトープを含み、改善された三量体化プロファイルを示すものであるべきである。適切には細胞外ドメインのアミノ酸の少なくとも50%、より適切には少なくとも70%、より適切には少なくとも80%、さらには90%が本発明のポリペプチドにおいて保持され、その百分率は必然的に融合ループFL1及びFL2を包含する。一実施形態では、本発明のCMV gBポリペプチドは、二つの融合ループFL1及びFL2の内の一つに、場合により両方に少なくとも一つの突然変異を含む細胞外ドメイン全体を保持する。
【００６０】
「細胞質ドメイン少なくとも一部分」の保持とは、発現及び分泌のために必要なアミノ酸の数を意味する。適切には、本発明のCMV gBポリペプチドは、細胞質ドメインのアミノ酸の少なくとも5%、より適切には少なくとも10%を含み、20%又はそれ以上であり得る。したがって一部の実施形態では、本発明のCMV gBポリペプチドにおける細胞質ドメインのアミノ酸の少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%が除去(欠失)されている。さらなる実施形態では、本発明のCMV gBポリペプチドは、細胞外ドメイン全体が除去されている。
【００６１】
例えばその少なくとも一部の欠失などの膜貫通ドメインの突然変異は、細胞質ドメインの例えばその少なくとも一部の欠失などの突然変異と組み合わされ得る。任意の組合せが、上に記載のとおり生じる突然変異したCMV gBポリペプチドが宿主細胞での発現において前記細胞から分泌され、改善された三量体化プロファイルを示す限り本発明において企図される。したがって詳細な実施形態では、本発明のCMV gBポリペプチドは、膜貫通ドメイン全体及び細胞質ドメイン全体の両方が除去されている。代替的実施形態では、本発明のCMV gBポリペプチドは、膜貫通ドメイン全体が除去され、細胞質ドメインの少なくとも一部、例えばその10%などを保持する。さらなる代替的な実施形態では、本発明のCMV gBポリペプチドは、細胞質ドメイン全体が除去され、膜貫通ドメインの少なくとも30%を保持している。
【００６２】
驚くべきことに本発明者らは、融合ループFL1及び/又はFL2の突然変異を細胞質ドメインの少なくとも一部の欠失、場合によりその全体の欠失並びに膜貫通ドメインの少なくとも一部の欠失、場合によりその全体の欠失と組み合わせることが、先行技術のポリペプチドよりもより効率的に発現及び分泌されるポリペプチドを提供することを認めた。
【００６３】
同様に本発明者らは、先行技術のCMVポリペプチドのシグナル配列が、ポリペプチドの組換え発現及び分泌後に、シグナルペプチダーゼによってさまざまなアミノ酸位置で切除され、それによりN末端にさまざまな末端を有する成熟gBポリペプチドの集団(すなわちN末端に異なるアミノ酸を有するgBポリペプチドからなる集団)を生成することを認めた。驚くべきことに本発明者らは、gBポリペプチドのリーダー配列に突然変異を導入することが主に一つの部位で切除されるシグナル配列を生じ、それによりN末端に同じアミノ酸を有する成熟gBポリペプチドの均一な集団を生成することを認めた。したがって一実施形態では、シグナル配列の切断後に産生される成熟gBポリペプチドの集団を含む調製物であって、成熟gBポリペプチドの少なくとも30%、少なくとも80%、80%から90%がN末端に同じアミノ酸を含む調製物が提供される。詳細には、本発明の成熟ポリペプチドは、適切にはN末端位置はセリン又はヒスチジンで始まる。リーダー配列のアミノ酸の少なくとも40%、適切には少なくとも50%、より適切には少なくとも70%、より適切には少なくとも80%又はさらには少なくとも90%の欠失を含むCMV gBポリペプチドを提供することは、本発明の目的である。一実施形態では、リーダー配列全体の欠失を含むCMV gBポリペプチドが提供される。本発明者らは、リーダー配列の上記の欠失がシグナル配列に生じる、少なくとも一つのアミノ酸の置換(適切にはシグナルペプチドのC末端部分に)などの突然変異と組み合わされ得ることも認めた。代替的に前記シグナル配列は、少なくとも一つのアミノ酸挿入(適切にはシグナルペプチドのC末端部分に)を含み得る。リーダー配列の欠失の程度及びシグナル配列における突然変異の種類は、組換え発現及び分泌後に生じるgBポリペプチドが一つの主な部位でシグナルペプチダーゼによって切除され、それによりN末端に同じアミノ酸を有する成熟gBポリペプチドの集団を生成する限り変更できる。ポリペプチド集団内のN末端アミノ酸の同一性は、当技術分野において周知の任意の配列決定技術を通じて決定され得る。代替的にポリペプチド集団内のポリペプチドの異なる形態は、トリプシン消化に供されてよく、生成されたさまざまなペプチドは、MS/MSなどの質量分析によって分析され得る。周知の配列の標準ペプチドとの比較は、消化されたペプチドのアミノ酸組成の決定を可能にする。
【００６４】
本発明者らは、改善された三量体化プロファイル、より良い発現及び分泌、C末端クリッピングの欠如、並びにシグナル配列切断後のN末端の均一性などの突然変異の各種類によって(先行技術のCMV gBポリペプチド(gB-DeltaTMなど)と比較して)付与される特性をいまだ維持したまま、リーダー配列の上記の欠失及び/又はシグナル配列の突然変異が融合ループFL1及びFL2ドメイン及び/又はTMドメインの少なくとも一部分の欠失及び/又は細胞質ドメインの少なくとも一部分の欠失に関連する上に記載の突然変異いずれとも組み合わされ得ることに注目した。したがって一部の実施形態では、本発明のCMV gBポリペプチドは、リーダー配列に変更を、場合によりシグナル配列における突然変異、任意の既に記載のFL1及び/又はFL2ドメイン突然変異並びに細胞質ドメインにおける及び本明細書において開示のTMドメインにおける任意の突然変異と組み合わされて含む。
【００６５】
本発明のCMV gBポリペプチドは、それらが天然においてと同じ状態では存在しないこという意味において「天然に存在」しない、すなわちそれらの配列は人工的に改変されている。用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、モノマーがアミド結合を介して相互に結合されたアミノ酸であるポリマーを意味する。本明細書において用いられる用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、任意のアミノ酸配列を包含し、糖タンパク質などの修飾された配列を含むことを意図する。用語「ポリペプチド」は、天然に存在するタンパク質及び天然に存在しない(組換え的に又は合成的に産生された)タンパク質の両方を網羅することを具体的には意図する。用語「断片」は、ポリペプチドに関して、ポリペプチドの部分(すなわちサブ配列)を意味する。用語「免疫原性断片」は、全長基準タンパク質又はポリペプチドの少なくとも一つの主な免疫原性エピトープを保持するポリペプチドのすべての断片を意味する。ポリペプチド内の方向は、個々のアミノ酸のアミノ成分及びカルボキシ成分の方向によって定義されるN末端からC末端への方向で一般に列挙される。ポリペプチドはN末端又はアミノ末端からC末端又はカルボキシ末端に向けて翻訳される。
【００６６】
さらなる突然変異、例えば内部タンパク質分解部位の突然変異などを保有する上に記載のgBポリペプチドを本発明において用いることもでき、その結果前記部位は無効となる。例えば配列番号1に記載の配列のアミノ酸456から460付近、又は異なる株に由来する他のCMV gBポリペプチドの対応する位置にあるフューリン切断部位は、突然変異し得る。適切には、配列番号1に記載の配列と関連して、T456で置換されたR456、Q458で置換されたR458及びT459で置換されたR459からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸置換が実施される。したがって特定の実施形態では、本発明のCMV gBポリペプチドは、配列番号1に記載の配列のアルギニンR456、R458及びR459又は異なる株に由来する他のCMV gBポリペプチドの対応する位置がそれぞれスレオニン(T456)、グルタミン酸(Q458)及びスレオニン(T459)で置換されるさらなる点突然変異を含む。一部の他の実施形態では、配列番号1に記載の配列の位置50及び357のアルギニンは、セリンで置換された。なおさらなる実施形態では、本発明のgBポリペプチド、詳細にはC末端細胞質ドメイン中の疎水性領域の欠失を含むものは、配列番号1に記載の配列の位置778のシステインがアラニンで置換されるさらなる点突然変異を含む。
【００６７】
場合により、発現及び回収を促進するために本発明のgBポリペプチドは、N末端にシグナルペプチドを含み得る。シグナルペプチドは、当技術分野において周知の多数のシグナルペプチドから選択されることができ、典型的には本発明のgBポリペプチドの組換え発現のために選択された系における産生及びプロセシングを促進するために選ばれる。特定の実施形態では、シグナルペプチドは、AD169株由来の天然gBタンパク質に天然に存在するもの、すなわち配列番号1に記載の配列のアミノ酸1-20である。代替的にシグナルペプチドは、配列がgBとは異なるタンパク質から生じる異種性配列であってよい。本発明のCMV gBポリペプチドのコンテクストにおける使用のために適切な例示的シグナルペプチドは、組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)、単純ヘルペスウイルス(Herpes Simplex Virus)(HSV)gDタンパク質、ヒトエンドスタチン、HIV gp120、CD33、ヒトHer2Neu又はエプスタイン・バーウイルス(Epstein Barr Virus)(EBV)gp350のシグナルペプチドを含む。「シグナルペプチド」は、新たに合成された分泌性タンパク質又は膜タンパク質を(例えば小胞体の)膜に及び膜を通り抜けるように方向付ける短いアミノ酸配列(例えば、長さおよそ18-25アミノ酸)である。シグナルペプチドは、ポリペプチドのN末端にしばしばであるが普遍的にではなくあり、タンパク質が膜を通った後にシグナルペプチダーゼによってしばしば切除される。この切断は、タンパク質「成熟」のプロセスにおけるステップとして一般に考えられる。詳細には、一度シグナルペプチドが切除されると、タンパク質は「成熟」形態にあると称される。典型的には、シグナル配列は、三つの一般的構造的特徴:N末端極性塩基性領域(n-領域)、疎水性コア及び親水性c-領域を含有する。一実施形態により本発明のgBポリペプチドは、天然gBに天然で存在するシグナルペプチドを含む。代替的実施形態では、本発明のgBポリペプチドは、タンパク質CD33のシグナルペプチドなどの異種性シグナルペプチドを含む。シグナル配列は、非天然性であってよく、アミノ酸の置換、挿入又は欠失などの突然変異を含んでもよい。したがって本発明のgBポリペプチドがシグナルペプチド、詳細には天然シグナルペプチドを含む一部の実施形態では、前記シグナルペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸置換を適切にはシグナルペプチドのC末端部分に含む。代替的に前記シグナルペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸挿入を、適切にはシグナルペプチドのC末端部分に含む。
【００６８】
場合により、本明細書に開示の本発明のCMV gBポリペプチドは、組換え的に発現されたポリペプチドの続くプロセシング又は精製を促進するタグを構成するアミノ酸配列の付加を含み得る。そのようなタグは、抗原性又はエピトープタグ、酵素的タグ又はポリヒスチジンタグであってよい。典型的には、タグは、ポリペプチドのC末端又はN末端などのポリペプチドの一つの又は他方の末端に位置付けられる。したがって一部の実施形態では、本発明のCMV gBポリペプチドは、ポリペプチドのC末端にあるポリヒスチジンタグを含む。
【００６９】
特定の実施形態では、本発明のCMV gBポリペプチドは、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16及び配列番号18又はこれらのサブ配列(例えばアミノ酸のシグナル配列を欠いている又は異なるシグナル配列の置換を有するサブ配列)から選択されるアミノ酸配列を有する。代替的に別の実施形態では、本発明のCMV gBポリペプチドは、配列番号19、配列番号20、配列番号21から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００７０】
本開示の別の態様は、本発明のCMV gBポリペプチドをコードする核酸に関する。そのような核酸又はベクターが導入される細胞(すなわち宿主細胞)も本発明の一部である。宿主細胞は細菌細胞であってよいが、より一般的には酵母細胞(例えばピキア(pichia))、植物細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞(例えばCHO細胞)などの真核細胞である。一実施形態により本発明のCMV gBポリペプチドはCHO細胞で組換え的に発現される。
【００７１】
用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸配列」は、長さ少なくとも10塩基のヌクレオチドの重合体形態を意味する。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又はいずれかのヌクレオチドの修飾された形態であってよい。用語はDNAの一本鎖及び二本鎖形態を含む。「単離されたポリヌクレオチド」とは、それが由来する生物の天然に存在するゲノムでは直に近接しているコード配列の両側(一つは5'末端及び一つは3'末端)と直に近接していないポリヌクレオチドを意味する。一実施形態では、ポリヌクレオチドはポリペプチドをコードする。核酸の5'及び3'方向は、個々のヌクレオチド単位の結合性を参照することによって定義され、デオキシリボース(又はリボース)糖環の炭素位置により指定される。ポリヌクレオチド配列の情報(コード)内容は、5'から3'方向に読み取られる。
【００７２】
「組換え」核酸は、天然に存在しない配列を有するもの又は配列の二つの別々のセグメントの人工的な組合せからなる配列を有するものである。この人工的な組合せは、化学合成又はより一般的には核酸の単離されたセグメントの、例えば遺伝子工学技術による人工的な操作によって達成され得る。「組換え」タンパク質は、細菌細胞又は真核細胞などの宿主細胞に導入されている異種性(例えば組換え)核酸によってコードされるものである。核酸は、導入された核酸によってコードされるタンパク質を発現できるシグナルを有する発現ベクターに導入することができ、又は核酸は宿主細胞染色体に組み込むことができる。
【００７３】
特定の実施形態では、組換え核酸は、選択された原核細胞宿主又は、哺乳動物、植物若しくは昆虫の細胞などの真核細胞宿主における発現のためにコドン最適化される。複製及び発現を促進するために、核酸は原核細胞又は真核細胞の発現ベクターなどのベクターに組み込まれ得る。本明細書において開示される核酸は、多様なベクター(例えば細菌性プラスミド;ファージDNA;バキュロウイルス;酵母プラスミド;プラスミドとファージDNAの組合せに由来するベクター、ワクチニア、アデノウイルス(adenovirus)、鶏痘ウイルス(fowl pox virus)、仮性狂犬病(pseudorabies)、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(adeno-associated virus)、レトロウイルス(retroviruses)及び他多数などのウイルス性DNAを含む)の任意の一つに含まれ得るが、最も一般的には、ベクターは、ポリペプチド発現産物を生成するために適する発現ベクターである。発現ベクターでは、CMV gBポリペプチドをコードする核酸は典型的には近接して、mRNA合成を方向付ける適切な転写制御配列(プロモーター及び場合により一個以上のエンハンサー)の向きに配置される。すなわち目的のポリヌクレオチド配列は、適切な転写制御配列に作動可能に連結される。そのようなプロモーターの例は:CMVの初期プロモーター(immediate early promoter)、LTR又はSV40プロモーター、バキュロウイルス(baculovirus)の多角体プロモーター、大腸菌(E.coli)lac又はtrpプロモーター、ファージT7及びラムダPLプロモーター並びに原核細胞又は真核細胞又はそれらのウイスルにおいて遺伝子の発現を制御することが周知である他のプロモーターを含む。典型的には、発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位及び転写ターミネーターも含有する。場合によりベクターは、発現を増幅するための適切な配列を含む。付加的に発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型形質を提供するために、ジヒドロ葉酸還元酵素、真核細胞培養のためのネオマイシン耐性若しくはカナマイシン耐性又は大腸菌におけるテトラサイクリン若しくはアンピシリン耐性などの一個以上の選択可能マーカー遺伝子を場合により含む。
【００７４】
発現ベクターは、例えば翻訳の効率を改善するために付加的発現要素も含み得る。これらのシグナルは、ATG開始コドン及び隣接配列を含み得る。一部の場合では、例えば翻訳開始コドン及び関連する配列要素は適切な発現ベクターに目的のポリヌクレオチド配列と同時に挿入される(例えば天然の開始コドン)。そのような場合では、付加的翻訳制御シグナルは必要無い。しかし配列をコードするポリペプチドだけ又はその部分が挿入される場合、(ATG開始コドンを含む)異種性翻訳制御シグナルがCMV gB配列の発現のために提供される。開始コドンは、目的のポリヌクレオチド配列の翻訳を確実にするために正しい読み枠で位置する。異種性転写要素及び開始コドンは、種々の由来(天然及び合成の両方)であってよい。所望により発現の効率は、用いる細胞系に適切なエンハンサーの包含によってさらに増大され得る (Scharf et al(1994)Results Probl Cell Differ 20:125-62、Bitter et al.(1987) Methods in Enzymol 153:516-544)。
【００７５】
当業者を組換えCMV gB核酸の産生に導くために十分な例示的手順は、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3d ed.,Cold Spring Harbor Press,2001、Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates,1992(and Supplements to 2003)及びAusubel et al.,Short Protocols in Molecular Biology、A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,4th ed.,Wiley & Sons,1999において見出され得る。
【００７６】
本発明のCMV gBポリペプチドをコードする例示的核酸は、配列番号6、7、8、9、11、13、15及び17によって示される。例示的変異体と配列同一性を共有する追加的配列変異体は当業者によって産生され得る。典型的には、核酸変異体は、ヌクレオチド又はアミノ酸の1%、又は2%、又は5%、又は10%、又は15%、又は20%未満だけ異なるポリペプチドをコードする。すなわちコードされるポリペプチドは少なくとも80%、又は85%、より一般的には少なくとも約90%以上、95%など、又はさらには98%又は99%の配列同一性を共有する。CMV gBポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が遺伝暗号重複性によりそれ自体はより少ない配列同一性を共有する場合があることは当業者によって直ちに理解されるであろう。
【００７７】
CMV gBポリペプチドとポリヌクレオチド配列との間の類似性は、ポリペプチドとヌクレオチド配列全般に関して、配列間の類似性の意味において表されることができ、他には配列同一性と称されることは当業者によって理解されるであろう。配列同一性は同一性(又は類似性)百分率の意味においてしばしば測定され、百分率が高いほど、二つの配列の一次構造はより類似している。一般的に二つのアミノ酸(又はポリヌクレオチド)配列の一次構造が類似しているほど、より類似するのは、フォールディング及び会合から生じるより高次の構造である。CMV gBポリペプチド及びポリヌクレオチド配列の変異体は、一つ又は少数のアミノ酸欠失、付加又は置換を有し得るが、それにもかかわらずそれらのアミノ酸及び一般にそれらのポリヌクレオチド配列の非常に高い百分率を共有する。配列同一性を決定する方法は当技術分野において十分に周知である。種々のプログラム及びアラインメントアルゴリズムは、Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981、Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970、Higgins and Sharp,Gene 73:237,1988、Higgins and Sharp,CABIOS 5:151,1989、Corpet et al.,Nucleic Acids Research 16:10881,1988及びPearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444,1988.に記載されている。Altschul et al.,Nature Genet.6:119,1994は、配列アラインメント方法及び相同性算出の詳細な検討を示す。The NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403,1990)は、配列分析プログラムblastp、blastn、blastx、tblastn及びtblastxに関連する使用のためにthe National Center for Biotechnology Information(NCBI,Bethesda,MD)及びインターネットを含むいくつかの供給源から入手可能である。このプログラムを用いてどのように配列同一性を決定するかの記載は、インターネット上のNCBIウェブサイトで入手可能である。
【００７８】
二つの核酸間の配列類似性の別の徴候は、ハイブリダイズする能力である。二つの核酸の配列が類似しているほどそれらがハイブリダイズする条件はよりストリンジェントになる。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは配列依存的であり、異なる環境パラメーター下で異なる。したがって特定の程度のストリンジェンシーにおいて生じるハイブリダイゼーション条件は、選んだハイブリダイゼーション方法の性質並びにハイブリダイズする核酸配列の組成及び長さに応じて変化する。一般的にハイブリダイゼーションの温度及びハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度(特にNa+及び/又はMg++濃度)は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定するが、洗浄時間もストリンジェンシーに影響する。一般的にストリンジェントな条件は、規定のイオン強度及びpHにおいて具体的な配列に対する熱融解点(Tm)より約5℃から20℃低くなるように選択される。Tmは、(規定のイオン強度及びpH下で)完全に一致するプローブに標的配列の50%がハイブリダイズする温度である。核酸ハイブリダイゼーションのための条件及びストリンジェンシーの算出は、例えばSambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,2001、Tijssen,Hybridization With Nucleic Acid Probes,Part I:Theory and Nucleic Acid Preparation,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,Elsevier Science Ltd.,NY,NY,1993.及びAusubel et al.Short Protocols in Molecular Biology,4th ed.,John Wiley & Sons,Inc.,1999において見出され得る。
【００７９】
本開示の目的のために「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション分子と標的配列との間に25%未満のミスマッチがある場合にだけハイブリダイゼーションが生じる条件を包含する。「ストリンジェントな条件」は、より正確な定義のためにストリンジェンシーの詳細なレベルに分割され得る。したがって本明細書において用いられる「中程度のストリンジェンシー」条件は、25%を超える配列ミスマッチを有する分子はハイブリダイズしない条件であり;「中度のストリンジェンシー」の条件は、15%を超えるミスマッチを有する分子はハイブリダイズしない条件であり、「高ストリンジェンシー」の条件は、10%を超えるミスマッチを有する配列はハイブリダイズしない条件である。「非常に高ストリンジェンシー」の条件は、6%を超えるミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件である。対照的に「低ストリンジェンシー」な条件下でハイブリダイズする核酸は、配列同一性がより少ないもの又は核酸の短いサブ配列にだけ配列同一性を有するものを含む。したがって本開示に包含される核酸の種々の変異体が、実質的にその全長にわたって配列番号6、7、8、9、11、13、15及び17の少なくとも一つにハイブリダイズできることは理解されるであろう。
【００８０】
本明細書において開示されるCMV gBポリペプチドは、組換えタンパク質の発現及び精製のために十分確立された手順を用いて産生される。当業者を導くために十分な手順は、例えば上に引用した参考文献Sambrook and the Ausubelにおいて見出され得る。追加的及び具体的な詳細は、本明細書以下に提供される。配列番号6、7、8、9、11、13、15及び17によって表される(しかし限定されない)例示的核酸などのCMV gBポリペプチドをコードする組換え核酸は、ベクター及び宿主細胞の選択に応じて電気穿孔法、リポソーム媒介形質移入、リン酸カルシウム沈殿、感染、形質移入などの任意の種々の十分に周知の手順によって宿主細胞に導入される。それにより組換えCMV gBポリペプチドコード核酸を含む宿主細胞も本開示の特徴である。有利な宿主細胞は、大腸菌などの原核(すなわち細菌)宿主細胞並びに、真菌(例えばサッカロマイセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)及びピキア・パストリス(Picchia pastoris)などの酵母)細胞、昆虫細胞、植物細胞及び哺乳動物細胞(CHO細胞など)を含む多数の真核宿主細胞を含む。組換えCMV gB核酸は、例えば発現ベクターなどのベクターを介して宿主細胞に導入(例えば形質導入、形質転換又は形質移入)される。上に記載のとおりベクターは、最も典型的にはプラスミドであるが、しかしそのようなベクターは例えばウイルス粒子、ファージなどであってもよい。適切な発現ホストの例は:大腸菌、ストレプトマイセス(Streptomyces)及びサルモネラ・チフィリウム(Salmonella typhimurium)などの細菌細胞;サッカロマイセス・セレビジエ、ピキア・パストリス及びアカパンカビ(Neurospora crassa)などの真菌細胞;ショウジョウバエ(Drosophila)及びスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperd)などの昆虫細胞;3T3、COS、CHO、BHK、HEK 293又はボウズメラノーマ(Bowes melanoma)などの哺乳動物細胞;藻類細胞を含む植物細胞などを含む。
【００８１】
宿主細胞は、プロモーターの活性化のため、形質転換体を選択するため又は挿入されたポリヌクレオチド配列を増幅するために適切であるように改変された従来技術の栄養培地で培養され得る。温度、pHなどの培養条件は、典型的には発現のために選択された宿主細胞で以前用いられたものであり、当業者に並びに、例えばFreshney(1994) Culture of Animal Cells,a Manual of Basic Technique,third edition,Wiley-Liss,New York及びこれに引用されている参考文献を含む本明細書に引用される参考文献において明らかである。本発明の核酸に対応する発現産物は、植物、酵母、真菌、細菌などの非動物細胞においても産生され得る。Sambrook, Berger and Ausubelに加えて、細胞培養に関する詳細は、Payne et al.(1992)Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons,Inc.New York,NY、Gamborg and Phillips(eds)(1995)Plant Cell,Tissue and Organ Culture;Fundamental Methods Springer Lab Manual,Springer-Verlag(Berlin Heidelberg New York)及びAtlas and Parks(eds)The Handbook of Microbiological Media(1993)CRC Press,Boca Raton,FLにおいて見出され得る。細菌系では多数の発現ベクターが発現産物の使用目的に応じて選択され得る。例えば多量のポリペプチド又はその断片が抗体産生のために必要である場合、容易に精製されるタンパク質の高レベル発現を導くベクターが好ましくは用いられる。そのようなベクターは、これだけに限らないが、目的のコード配列(例えば上に記載の本発明のポリヌクレオチド)がアミノ末端の翻訳を開始するメチオニン及び続く触媒活性ベータガラクトシダーゼ融合タンパク質を産生するためのベータ-ガラクトシダーゼの7残基の配列を伴ってベクターにインフレームでライゲーションされ得るBLUESCRIPT(Stratagene);pIN vectors(Van Heeke & Schuster(1989)J Biol Chem 264:5503-5509);アミノ末端メチオニンがヒスチジンタグを伴ってインフレームでライゲーションされるpET vectors(Novagen,Madison WI)などの多機能性大腸菌クローニング及び発現ベクターを含む。同様にサッカロマイセス・セレビジエなどの酵母では、アルファ因子、アルコールオキシダーゼ及びPGHなどの構成的又は誘導性プロモーターを含有する多数のベクターが望まれる発現産物の産生のために用いられ得る。概説に関してBerger、Ausubel及び例えばGrantら(1987;Methods in Enzymology 153:516-544)を参照されたい。哺乳動物宿主細胞では、プラスミド及びウイルスに基づく系の両方を含む多数の発現系が利用され得る。
【００８２】
宿主細胞は、場合により挿入された配列の発現を調節する又は発現されたタンパク質を望まれる様式にプロセシングするその能力に関して選ばれる。タンパク質のそのような修飾は、これだけに限らないがグリコシル化(及び例えばアセチル化、カルボキシル化、リン酸化、脂質付加(lipidation)及びアシル化)を含む。タンパク質の前駆体形態を成熟形態に切断する(例えばフューリンプロテアーゼによる)翻訳後プロセシングは、場合により宿主細胞の背景において実施される。3T3、COS、CHO、HeLa、BHK、MDCK、293、WI38などのさまざまな宿主細胞は、そのような翻訳後活性に関して特定の細胞性機構及び特徴的機序を有し、導入された外来性タンパク質の正確な修飾及びプロセシングを確実にするために選ばれ得る。本明細書で開示の核酸によってコードされる組換えCMV gBポリペプチドの長期間、高収量の産生のために、安定発現系が典型的には用いられる。例えば本発明のCMV gBポリペプチドを安定に発現する細胞系は、ウイルス性複製開始点又は内在性発現エレメント及び選択可能マーカー遺伝子を含有する発現ベクターを宿主細胞に導入することによって得られる。ベクターの導入に続いて、細胞は、選択培地に交換される前に1-2日間、濃縮培地で増殖される。選択可能マーカーの目的は、選択に耐性を付与することであり、その存在は導入された配列を順調に発現する細胞の増殖及び回収を可能にする。例えば安定に形質転換された細胞の耐性群又はコロニーは、細胞種に適する組織培養技術を用いて増殖され得る。CMV gBをコードする核酸で形質転換された宿主細胞は、場合によりコードされたタンパク質の細胞培養物からの発現及び回収に適する条件下で培養される。
【００８３】
適切な宿主細胞系の形質導入及び適切な細胞密度への宿主細胞の増殖に続いて、選択されたプロモーターは、適切な手段(例えば温度変化又は化学的誘導)によって誘導され、細胞は追加的な期間培養される。分泌されたポリペプチド産物は、次いで培養培地から回収され、精製される。代替的に細胞は遠心分離によって収集され、物理的又は化学的手段によって破壊され、得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。タンパク質の発現において用いられる真核又は微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊又は細胞の使用を含む任意の簡便な方法によって破壊され得る。CMV gBポリペプチドは、硫酸アンモニウム又はアルコール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー(例えば本明細書に記載の任意のタグ系を用いる)、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む当技術分野において十分に周知の任意の多数の方法によって組換え細胞培養物から回収及び精製され得る。所望によりタンパク質リフォールディングステップは、成熟タンパク質の立体配置を完了させるために用いられ得る。最後に高速液体クロマトグラフィー(HPLC)が最終的な精製ステップにおいて用いられ得る。上に記載の参照事項に加えて、例えばSandana(1997)Bioseparation of Proteins,Academic Press,Inc.及びBollag et al.(1996)Protein Methods,2nd Edition Wiley-Liss,NY、Walker(1996)The Protein Protocols Handbook Humana Press,NJ、Harris and Angal(1990)Protein Purification Applications:A Practical Approach IRL Press at Oxford,Oxford,U.K.、Scopes(1993)Protein Purification:Principles and Practice 3rd Edition Springer Verlag,NY、Janson and Ryden(1998)Protein Purification:Principles,High Resolution Methods and Applications,Second Edition Wiley-VCH,NY及びWalker(1998)Protein Protocols on CD-ROM Humana Press,NJにおいて記載のものを含む種々の精製方法が当技術分野において周知である。
【００８４】
一例では、CMV gBポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞(例えばCHO細胞)への導入に適するベクター中にクローン化される。この例示的実施形態ではCMV gBポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、Amaxaによって開発されたpMAXベクターに導入される。ポリペプチドは構成的プロモーター、初期CMVプロモーター下で発現される。チャイマー(chimer)を発現している安定に形質移入された細胞の選択は、カナマイシンの存在下で増殖する形質移入された細胞の能力に基づいて行われる。pMAXの組み込みに成功した細胞は、pMAXベクターがカナマイシン耐性遺伝子を発現することからカナマイシンの存在下で増殖できる。選択された細胞は、クローン的に増やされ、CMV gBポリペプチドの発現について特徴付けられる。代替的に本発明のCMV gBポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、アンピシリン耐性遺伝子を発現するNRCによって開発されたpTT5ベクターに導入されてもよい。
【００８５】
形質移入及び発現の(選択されたプロモーター及び/若しくはエンハンサー又は他の制御因子に応じた)誘導に続いて、発現されるポリペプチドは回収される(例えば精製される又は濃縮される)。以下は、CMV gBポリペプチドを精製するための例示的手順である。精製を促進するためにCMV gBポリペプチドはC末端ポリヒスチジンタグを含む。簡潔には、細胞培養上清は、形質移入の6日後に回収された。清澄化後、上清はニッケルカラムにロードされた。
【００８６】
用語「精製」は、その存在が望まれない構成成分を組成物から除去するプロセスを意味する。精製は相対的用語であり、望ましくない構成成分のすべての痕跡を組成物から除去することを必要としない。ワクチン産生のコンテクストにおいて精製は、遠心分離、透析、イオン交換クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティー精製又は沈殿などのプロセスを含む。したがって用語「精製された」は、絶対的な純度を必要とせず、むしろ相対的用語として意図される。実質的に純粋な核酸又はタンパク質の調製物は、望まれる核酸又はタンパク質が調製物の全核酸含有量の少なくとも50%に相当するように精製され得る。特定の実施形態では、実質的に純粋な核酸又はタンパク質は、調製物の全核酸又はタンパク質含有量の少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又はそれ以上に相当する。
【００８７】
本発明の意味では、「単離された」生物学的構成成分(核酸分子又はタンパク質など)は、(他の染色体及び染色体外DNA及びRNA、タンパク質及び小器官などの)構成成分が天然で存在する生物の細胞中の他の生物学的構成成分から実質的に分離又は精製されている。「単離」されている核酸及びタンパク質は、標準的精製方法によって精製された核酸及びタンパク質を含む。用語は、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸及びタンパク質並びに化学的に合成された核酸及びタンパク質も包含する。
【００８８】
本発明のCMV gBポリペプチド及び核酸は、CMV感染を治療するための医薬の調製において有用である。本発明のCMV gBポリペプチドは、ワクチンなどの免疫原性組成物への包含のための抗原として特に適切である。したがって本発明は、本発明の任意のCMV gBポリペプチドを含有する組成物の免疫学的有効量を対象(被験体)に投与することによってCMVに対する免疫応答を誘発するための方法も包含する。対象は、HCMV-血清陽性又はHCMV-血清陰性対象のいずれであってもよい。一部の実施形態では、対象は、典型的には12から16歳の青年期の女子である。代替的に対象は出産年齢の女性である。典型的には、出産年齢の女性の群は、妊娠可能である16から45歳の間の女性を表す。詳細な実施形態では、本発明は、HCMV-血清陰性の出産年齢の女性に本発明のgBポリペプチドを含む組成物の免疫学的有効量を投与するステップを含む、CMVに対する免疫応答を誘発するための方法を企図する。代替的実施形態では、本発明のCMV gBポリペプチドは、CMV感染を予防及び/又は治療するための医薬の調製において用いられる。適切には、組成物又は医薬は、CMVでの感染を減少させる若しくは予防する防御免疫応答及び/又はCMVでの感染に続く病理学的応答を減少させる若しくは予防する防御免疫応答を誘発する。詳細には、出産年齢の女性が本発明の任意のCMV gBポリペプチドを含有する組成物の免疫学的有効量を投与される本発明の方法は、母親から胎児へのCMV伝染を予防する、すなわちCMV先天性感染を予防する。用語「新生児でのHCMV先天性感染の予防」は、新生児が誕生時にHCMV感染していないことを意味する。代替的に本発明の免疫学的組成物を受ける適切な対象は、例えば臓器移植患者などの免疫無防備状態の対象である。したがって一部の実施形態では、本発明は、免疫無防備状態の対象においてCMV感染を減少及び/又は予防するための本発明のCMV gBポリペプチドの使用を企図する。さらなる実施形態では、本発明は、免疫無防備状態の対象に本発明のCMV gBポリペプチドを投与するステップを含む、CMVに対する免疫応答を誘発するための方法を企図する。
【００８９】
「対象(被験体)」は、生存している多細胞性脊椎生物である。本開示の状況において対象は、ヒト以外の動物、例えばマウス、コットンラット又はヒト以外の霊長類などの実験的対象であってよい。代替的に対象は、上に記載のとおりヒト対象であってよい。
【００９０】
「抗原」は、動物において抗体を産生することによる免疫応答及び/又はT細胞応答を刺激できる化合物、組成物又は物質であり、動物に注射される、吸収される又は他に導入される組成物を含む。用語「抗原」は、すべての関連する抗原性エピトープを含む。用語「エピトープ」又は「抗原決定基」は、B及び/又はT細胞が応答する抗原上の部位を意味する。「主な抗原性エピトープ」は、機能的に重要な宿主免疫応答(例えば抗体応答又はT-細胞応答)が生じるエピトープである。したがって病原体に対する防御免疫応答に関して、主な抗原性エピトープは宿主免疫系によって認識される場合に病原体によって生じる疾患からの防御をもたらす抗原成分である。用語「T-細胞エピトープ」は、適切なMHC分子に結合した場合にT細胞によって(例えばT細胞受容体を介して)特異的に結合されるエピトープを意味する。「B-細胞エピトープ」は、抗体(又はB細胞受容体分子)によって特異的に結合されるエピトープである。
【００９１】
「免疫応答」は、B細胞、T細胞又は単球などの免疫系の細胞の刺激に対する応答である。免疫応答はB細胞応答であってよく、抗原特異的中和抗体などの特異的抗体の産生を生じる。免疫応答は、CD4+応答又はCD8+応答などのT細胞応答であってもよい。いくつかの場合では、応答は、ある種の抗原、詳細にはCMVに特異的である(すなわち「抗原特異的応答」)。抗原が病原体由来である場合、抗原特異的応答は「病原体特異的応答」である。「防御免疫応答」は、病原体の有害な機能若しくは活性を妨げ、病原体による感染を減少させる又は病原体による感染から生じる症状(死亡を含む)を低下させる免疫応答である。防御免疫応答は、例えばプラーク減少アッセイ若しくはELISA中和アッセイにおけるウイルス複製若しくはプラーク形成の阻害によって又はin vivoでの病原体チャレンジへの耐性を測定することによって測定され得る。
【００９２】
典型的には、免疫応答は、Th1型サイトカインの産生、例えばTh1型免疫応答によって特徴付けられる免疫応答を誘発する。「Th1」型免疫応答は、IL-2及びIFN-γを産生するCD4+ Tヘルパー細胞によって特徴付けられる。対照的に「Th2」型免疫応答は、IL-4、IL-5及びIL-13を産生するCD4+ヘルパー細胞によって特徴付けられる。
【００９３】
「免疫学的有効量」は、対象において免疫応答を誘発するために用いられる組成物(典型的には免疫原性組成物)の量である。一般に望まれる結果は、CMVなどの病原体に対して対象を防御できる又は防御に寄与する抗原(例えば病原体)特異的免疫応答の産生である。しかし病原体に対する防御免疫応答を得ることは、免疫原性組成物の複数回投与を必要とする場合がある。したがって本開示の状況において用語、免疫学的有効量は、防御免疫応答を達成するために以前の又は続く投与と組み合わされて寄与する分割用量を包含する。
【００９４】
同様に提供されるのは、CMV gBポリペプチド及び薬学的に許容される希釈剤、担体又は賦形剤を含むワクチンなどの免疫原性組成物である。「免疫原性組成物」は、例えばCMVなどの病原体に対する、特異的免疫応答を誘発できるヒト又は動物対象への投与に適する物質の組成物である。そのように免疫原性組成物は、一つ以上の抗原(例えばポリペプチド抗原)又は例えば本発明のCMV gBポリペプチドなどの抗原性エピトープを含む。免疫原性組成物は、賦形剤、担体及び/又はアジュバントなどの免疫応答を誘発又は増強できる一つ以上の追加的構成成分も含み得る。特定の場合では、免疫原性組成物は、病原体によって引き起こされる症状又は状態に対して対象を防御する免疫応答を誘発するために投与される。いくつかの場合では、病原体によって生じる症状又は疾患は、病原体への対象の曝露後に病原体(例えばCMV)の複製を妨げることによって予防(又は減少又は回復)される。本開示の状況において用語免疫原性組成物は、CMVに対する防御的又は緩和的な免疫応答を誘発する目的で対象に又は対象の集団に投与することを目的とする組成物を包含して理解される(すなわちワクチン組成物又はワクチン)。本発明による免疫原性組成物は、CMV gBポリペプチドを含有する組成物に限定されない。本発明は、本発明のCMV gBポリペプチド及び、pp6、IE1、pUL131、gL、gH、pUL128、pUL130又はこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも一つ以上のCMV抗原を含む、ワクチンなどの免疫原性組成物も企図する。本発明は、本発明のCMV gBポリペプチド及び、HPV、クラミジア(Chlamydia)、RSV、トキソプラズマ・ゴンディ(Toxoplasma gondii)、帯状疱疹及びアスペルギルス(Aspergillus)からなる群から選択される少なくとも一つ以上の抗原を含む、ワクチンなどの免疫原性組成物も企図する。
【００９５】
多数の薬学的に許容される希釈剤及び担体及び/又は薬学的に許容される賦形剤が当技術分野において周知であり、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences,by E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,PA,15th Edition(1975)に記載されている。形容詞「薬学的に許容される」は、希釈剤又は担体又は賦形剤が対象(例えばヒト又は動物対象)への投与に適切であることを示す。一般に希釈剤、担体及び/又は賦形剤の性質は、用いられる投与の具体的な様式に依存する。例えば非経口製剤は、通常、水、生理食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロースなどの薬学的及び生理学的に許容される液体をビヒクルとして含む注射可能な液体を含む。特定の製剤(例えば粉末形態などの固体組成物)では、液体希釈剤は用いられない。そのような製剤では、例えば医薬用グレードのトレハロース、マンニトール、乳糖、デンプン又はステアリン酸マグネシウムを含む無毒性固体担体が用いられ得る。
【００９６】
したがって、適切な賦形剤及び担体は、選択された投与経路によって対象に送達されるために適する製剤を産生するために当業者によって選択され得る。賦形剤は、非限定的に:グリセロール、ポリエチレングリコール(PEG)、ガラス形成ポリオール(ソルビトール、トレハロースなど)N-ラウロイルサルコシン(例えばナトリウム塩)、L-プロリン、非界面活性剤スルホベタイン、塩酸グアニジン、尿素、トリメチルアミンオキシド、KCl、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+(及び他の二価カチオン関連塩)、ジチオスレイトール(DTT)、ジチオエリトロール(dithioerytrol)、β-メルカプトエタノール、界面活性剤(例えばTween80、Tween20、Triton X-100、NP-40、Empigen BB、オクチルグルコシド、ラウロイルマルトシド、Zwittergent3-08、Zwittergent3-10、Zwittergent3-12、Zwittergent3-14、Zwittergent3-16、CHAPS、デオキシコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム及び臭化セチルトリメチルアンモニウムを含む。
【００９７】
特定の例では、免疫原性組成物は、アジュバントも含む。本発明のCMV gBポリペプチドを含有する免疫原性組成物における使用のための適切なアジュバントは、本明細書で開示の前記ポリペプチドとの組合せにおいて安全であり、対象に投与される場合に最小限の反応原性であるアジュバントである。
【００９８】
「アジュバント」は、非特異的様式で免疫応答の産生を増強する薬剤である。一般的なアジュバントは、抗原が吸着される無機質(ミョウバン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム)の懸濁液;油中水型及び水中油型を含む乳剤(及び二重乳剤(double emulsions)及び可逆的乳剤(reversible emulsions)を含むその変異体)、リポ糖(liposaccharides)、リポ多糖、免疫賦活性核酸(CpGオリゴヌクレオチドなど)、リポソーム、Toll受容体アゴニスト(詳細にはTLR2、TLR4、TLR7/8及びTLR9アゴニスト)及びそのような構成成分の種々の組合せを含む。
【００９９】
本発明のCMV gBポリペプチドとの組合せでの使用に適するアジュバントは、サポニンである。したがって本発明の免疫原性組成物は、サポニンQS21を含み得る(WO8809336A1、米国特許第5,057,540A号)。QS21は、キラヤ・サポナリア・モリナ(Quillaja saponaria Molina)の樹皮由来の天然サポニンとして当技術分野において十分に周知であり、CD8+細胞傷害性T細胞(CTLs)、Th1細胞及び主にIgG2a抗体応答を誘導する。疑念を避けるためにQS21に対する基準はOPT-821を含む。本発明の適切な形態では、本発明の免疫原性組成物は、QS21を実質的に純粋な形態で含む、すなわちQS21は、純度少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、例えば純度少なくとも95%又は純度少なくとも98%である。本発明の組成物は、QS21を約1μgから約100μgの間、例えば約1μgから約60μgの間又は10μgから約50μgの間で、例えば約10μg、約12.5μg、約15μg、約20μg、約25μg、約30μg、約40μg又は詳細には約50μgの量で含み得る。詳細には、QS21は、約40μgから60μgの間又は45から55μgの間又は47から53μgの間又は48から52μgの間又は49から51の間又は約50μgの量で存在する。代替的に、QS21は、21μgから29μgの間又は約22μgから約28μgの間又は約23μgから約27μgの間又は約24μgから約26μgの間又は約25μgの量で存在する。一部の実施形態では、本発明のCMV gBポリペプチドを含む免疫原性組成物は、QS21を約10μg、例えば約5μgから15μgの間、約6μgから約14μg、約7μgから約13μg、約8μgから約12μg又は約9μgから約11μg又は約10μgの量で含む。さらなる実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、QS21を約5μg程度、例えば約1μgから9μgの間、約2μgから約8μg、約3μgから約7μg、約4μgから約6μg又は約5μgの量で含む。本発明の組成物のヒト用量におけるQS21の適切な量は、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49又は50μgのいずれかである。
【０１００】
本発明のCMV gBポリペプチドを含む免疫原性組成物は、QS21及びステロール、詳細にはコレステロールを含み得る。そのような組成物は、ステロールが存在しない組成物と比較して、アジュバント効果は維持されているが減少した反応原性を示す。反応原性研究は、WO 96/33739に開示の方法に従って評価され得る。本発明によるステロールは、外来性ステロール(すなわちβ-アミロイド抗原調製物が採取され得る生物に内在性でないステロール)を意味すると受け取られる。適切には、外来性ステロールはWO 96/33739に記載のサポニンアジュバントと関連する。詳細な実施形態では、コレステロールは、QS21の量を超えて存在し、例えばQS21:ステロールの比は、典型的には1:100から1:1(w/w)の程度、適切には1:10から1:1(w/w)の間及び好ましくは1:5から1:1(w/w)である。詳細には、QS21:ステロールの比は、少なくとも1:2(w/w)である。詳細な実施形態では、QS21:ステロールの比は1:5(w/w)である。適切なステロールはβ-シトステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、エルゴカルシフェロール及びコレステロールを含む。詳細な一実施形態では、本発明の組成物はステロールとしてコレステロールを含む。これらのステロールは当技術分野において十分周知であり、例えばコレステロールはMerck Index,11th Edn,341頁において動物性脂肪中に発見された天然に存在するステロールとして開示されている。したがって特定の実施形態では、本発明のCMV gBポリペプチドを含む免疫原性組成物は、QS21を(例えばコレステロールなどの外来性ステロールで抑制される)その低反応原性組成物において含む。QS21が外来性コレステロールで抑制されている低反応原性組成物の数個の詳細な形態が存在する。特定の実施形態では、サポニン/ステロールは、リポソーム構造の形態にある(WO 96/337391)。したがって例えば本発明のCMV gBポリペプチドは、QS21及びコレステロールの組合せを含むアジュバントを含む免疫原性組成物において適切に用いられ得る。
【０１０１】
用語「リポソーム(複数可)」は、一般に水性の内部を封入している単層状又は多層状(詳細には形成される脂質膜の数に依存して2、3、4、5、6、7、8、9又は10層状)脂質構造を意味する。リポソーム及びリポソーム製剤は、当技術分野において十分に周知である。リポソームを形成できる脂質は、脂肪性又は脂肪性様の特性を有するすべての物質を含む。リポソーム中の脂質を構成できる脂質は、グリセリド、グリセロリン脂質、グリセロホスフィノリピド、グリセロホスホノリピド、スルホリピド、スフィンゴ脂質、リン脂質、イソプレノリド(isoprenolid)、ステロイド、ステアリン、ステロール、アルケオリピド(archeolipid)、合成カチオン性脂質及び脂質含有炭水化物を含む群から選択され得る。リポソームは、適切にはリン脂質を含み得る。適切なリン脂質は(これだけに限らないが):ホスファチジルコリンの合成の中間体であるホスホコリン(PC);天然リン脂質誘導体;タマゴホスホコリン、タマゴホスホコリン、ダイズホスホコリン、水素添加ダイズホスホコリン、天然のリン脂質としてのスフィンゴメエリン;及び合成リン脂質誘導体;ホスホコリン(ジデカノイル-L-α-ホスファチジルコリン[DDPC]、ジラウロイルホスファチジルコリン[DLPC]、ジミリストイルホスファチジルコリン[DMPC]、ジパルミトイルホスファチジルコリン[DPPC]、ジステアロイルホスファチジルコリン[DSPC]、ジオレオイルホスファチジルコリン[DOPC]、1-パルミトイル、2-オレオイルホスファチジルコリン[POPC]、ジエライドイルホスファチジルコリン[DEPC])、ホスホグリセロール(1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール[DMPG]、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール[DPPG]、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール[DSPG]、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール[POPG])、ホスファチジン酸(1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジン酸[DMPA]、ジパルミトイルホスファチジン酸[DPPA]、ジステアロイル-ホスファチジン酸[DSPA])、ホスホエタノールアミン(1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン[DMPE]、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン[DPPE]、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンDSPE 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン[DOPE])、ホスホセリン、ポリエチレングリコール[PEG]リン脂質(mPEG-リン脂質、ポリグリセリン-リン脂質、機能性リン脂質、末端活性化リン脂質)を含む。一実施形態では、リポソームは1-パルミトイル-2-オレオイル-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンを含む。一実施形態では、高度に精製されたホスファチジルコリンが用いられ、ホスファチジルコリン(EGG)、水素添加ホスファチジルコリン(EGG)、ホスファチジルコリン(SOY)、水素添加ホスファチジルコリン(SOY)を含む群から選択され得る。さらなる実施形態では、リポソームはホスファチジルエタノールアミン[POPE]又はその誘導体を含む。リポソームサイズは、リン脂質組成及びそれらの調製のために用いられる方法に応じて30nmから数μmまで変化し得る。本発明の詳細な実施形態では、リポソームサイズは、50nmから500nmの範囲となり、さらなる実施形態では50nmから200nmとなる。動的レーザー光散乱法は、リポソームサイズを測定するために用いられる当業者に十分周知の方法である。���発明のリポソームは、ジオレオイルホスファチジルコリン[DOPC]及びステロール、詳細にはコレステロールを含み得る。したがって詳細な実施形態では、非機能性膜貫通ドメイン並びに融合ループFL1及びFL2の少なくとも一つ、場合により両方を有するgBポリペプチドなどの本発明のCMV gBポリペプチドを含む免疫原性組成物は、QS21を本明細書に記載の任意の量でリポソームの形態で含み、前記リポソームはジオレオイルホスファチジルコリン[DOPC]及びステロール、詳細にはコレステロールを含む。
【０１０２】
本発明の免疫原性組成物は、一つ以上のさらなる免疫賦活剤を含み得る。一実施形態では、本明細書に記載の本発明のCMV gBポリペプチドを含む免疫原性組成物は、リポ多糖、適切にはリピドAの無毒性誘導体、詳細にはモノホスホリルリピドA又はより詳細には3-脱アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)をさらに含む。3D-MPLは、GlaxoSmithKline Biologicals N.A.によってMPLの名称で販売されており、明細書全体においてMPL又は3D-MPLと称される。例えば米国特許第4,436,727号、第4,877,611号、第4,866,034号及び第4,912,094号を参照されたい。3D-MPLは、主にIFN-γ(Th1)表現型を有するCD+4 T細胞応答を促進する。3D-MPLは、GB2220211 Aに開示の方法により産生され得る。化学的には、それは、3、4、5又は6アシル化鎖を有する3-脱アシル化モノホスホリルリピドAの混合物である。本発明の組成物では小粒子3D-MPLが用いられ得る。小粒子3D-MPLは、0.22μmフィルターを通して滅菌的にろ過され得るような粒子サイズを有する。そのような調製物はWO94/21292に記載されている。
【０１０３】
本発明の組成物は、3D-MPLを約1μgから約100μgの間、例えば約1μgから約60μgの間、又は10μgから約50μgの間、例えば約10μg、約12.5μg、約15μg、約20μg、約25μg、約30μg、約40μg又は詳細には約50μgの量で含み得る。詳細には、3D-MPLは、約40μgから60μgの間、又は45から55μgの間、又は47から53μgの間、又は48から52μgの間、又は49から51の間、又は約50μgの量で存在する。代替的に3D-MPLは、21μgから29μgの間、又は約22μgから約28μgの間、又は約23μgから約27μgの間、又は約24μgから約26μgの間、又は約25μgの量で存在する。
【０１０４】
別の実施形態では、免疫原性組成物のヒト用量は、3D-MPLを約10μg、例えば5から15μgの間、適切には6から14μgの間、例えば7から13μgの間、又は8から12μgの間、又は9から11μgの間、又は10μgのレベルで含む。さらなる実施形態では、免疫原性組成物のヒト用量は、3D-MPLを約5μg、例えば1から9μgの間、又は2から8μgの間、又は適切には3から7μgの間、又は4から6μgの間、又は5μgのレベルで含む。本発明の組成物における3D-MPLの適切な量は、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49又は50μgのいずれかである。他の実施形態では、リポ多糖は、米国特許第6,005,099号及び欧州特許第0 729 473 B1号に記載のとおりβ1-6)グルコサミン二糖であってよい。当業者は、3D-MPLなどの種々のリポ多糖をこれらの参考文献の教示に基づいて容易に産生できるであろう。前述の(LPS又はMPL若しくは3D-MPLの構造と類似の構造である)免疫賦活剤に加えて、MPLの上記の構造の一部であるアシル化単糖及び二糖誘導体も適切なアジュバントである。他の実施形態では、アジュバントは、リピドAの合成誘導体であり、そのいくつかはTLR-4アゴニストとして記載され、これだけに限らないが:
OM174(2-デオキシ-6-o-[2-デオキシ-2-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラ-デカノイルアミノ]-4-o-ホスホノ-□-D-グルコピラノシル]-2-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-□-D-グルコピラノシルジヒドロゲンホスフェート)(WO 95/14026)
OM 294 DP(3S,9 R)-3--[(R)-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9(R)-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]デカン-1,10-ジオール,1,10-ビス(ジヒドロゲノホスフェート)(WO 99/64301及びWO 00/0462)
OM 197 MP-Ac DP(3S-,9R)-3-□(R)-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]デカン-1,10-ジオール,1-ジヒドロゲノホスフェート10-(6-アミノヘキサノエート)(WO 01/46127)
を含む。
【０１０５】
本明細書上に記述したなどのさまざまなアジュバントの組合せもCMV gBポリペプチドを含む組成物において用いられ得る。例えば既に記載のとおり、QS21は3D-MPLと共に製剤され得る。QS21:3D-MPLの比は、1:5から5:1及びしばしば実質的に1:1など典型的には1:10から10:1程度となる。典型的には、比は、3D-MPL:QS21、2.5:1から1:1の範囲である。したがって一部の実施形態では、本発明のCMV gBポリペプチドを含む免疫原性組成物は少なくともQS21及び3D-MPLを含む。
【０１０６】
本発明のCMV gBポリペプチドを含む免疫原性組成物は、水中油型乳剤(エマルジョン)とも適切に製剤され得る。水中油型乳剤は代謝可能な(すなわち生分解性)油を含む。油は、レシピエントに無害であり代謝によって変換され得る任意の植物油、魚油、動物油又は合成油であってよい。木の実、種子及び穀物は植物油の一般的な供給源である、合成油も適切である。したがって本発明のCMV gBポリペプチドとの組合せで用いられる水中油型乳剤は、代謝可能な油を含む。詳細な実施形態では、水中油型乳剤は、スクアレンを含む(例えば約4%から6%[v/v]の間)。水中油型乳剤は、表面活性物質をさらに含み得る。本発明の水中油型乳剤は、一つ以上の表面活性物質を含む。適切な表面活性物質は、当業者に十分周知であり、これだけに限らないがポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(Tween 80、ポリソルベート80)、ソルビタントリオレエート(スパン85)、ホスファチジルコリン(レシチン)、ポリオキシエチレン(12)セトステアリルエーテル及びオクトキシノール-9(Triton X-100)を含む。本発明の詳細な実施形態では、水中油型乳剤に含まれるのは、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(Tween 80、ポリソルベート80)である。さらなる実施形態では、本発明の水中油型乳剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(Tween 80)及びさらなる表面活性物質、詳細にはソルビタントリオレエート(スパン85)を含む。本発明の水中油型乳剤は、トコール(tocol)を含んでもよい。トコールは当技術分野において十分周知であり、EP0382271に記載されている。詳細にはトコールはα-トコフェロール又はアルファ-トコフェロールコハク酸エステル(ビタミンEコハク酸としても周知)などのその誘導体である。本発明の詳細な実施形態では、本発明のCMV gBポリペプチドを、スクアレン(例えば約5%[v/v])及びα-トコフェロール(例えば約5%[v/v])を含む水中油型乳剤との組合せで含む免疫原性組成物が提供される。詳細な実施形態では、水中油型乳剤は、代謝可能な油(例えばスクアレン)、トコール(例えばα-トコフェロール)及び表面活性物質(例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート[ポリソルベート80])を含む。本発明のさらなる実施形態では、本発明の水中油型乳剤は、代謝可能な油(例えばスクアレン)、表面活性物質(例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート[ポリソルベート80])、及び場合により第二の表面活性物質(例えばソルビタントリオレエート[スパン85])を含む。本発明のさらなる実施形態では、本発明の水中油型乳剤は、代謝可能な油(例えばスクアレン)、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性表面活性物質(例えばポリオキシエチレン(12)セトステアリルエーテル)及び疎水性非イオン性表面活性物質(例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート[ポリソルベート80])又はソルビタントリオレエート[スパン85]を含む。一部の実施形態では、非機能性膜貫通ドメイン並びに突然変異した融合ループFL1及びFL2の少なくとも一つ、場合により両方を有するgBポリペプチドなどの本発明のCMV gBポリペプチドを含む免疫原性組成物は、スクアレン、アルファ-トコフェロール及びポリソルベート80を含む水中油型乳剤を含む。
【０１０７】
適切には、水中油型は、ワクチンの一用量当たり11mg又はそれ以下、例えば0.5-11mg、0.5-10mg又は0.5-9mg、1-10mg、1-11mg、2-10mg、4-8mg又は4.5-5.5mgの間の代謝可能な油(例えばスクアレン)及び5mg又はそれ以下、例えば0.1-5mg、0.2-5mg、0.3-5mg、0.4-5mg、0.5-4mg、1-2mg又は2-3mgの間の乳化剤(ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなど)を含む。適切には、存在する場合はトコール(例えばアルファ-トコフェロール)は、ヒトワクチン用量当たり12mg以下、例えば0.5-12mg、10-11mg、1-11mg、2-10mg、4-9mg又は5-7mgの間である。
【０１０８】
用語「ワクチンヒト用量」とは、ヒトへの使用に適合する容積である用量を意味する。一般的にはこれは0.25から1.5mlの間である。一実施形態では、ヒト容量は0.5mlである。さらなる実施形態では、ヒト容量は0.5mlより多い、例えば0.6、0.7、0.8、0.9又は1 mlである。さらなる実施形態では、ヒト容量は1mlから1.5mlの間である。別の実施形態では、詳細には免疫原性組成物が小児科用である場合、ヒト容量は0.25から0.5mlの間などの0.5ml未満であってよい。
【０１０９】
典型的には、免疫原性組成物は、抗原の免疫防御量(又はその分割用量)を含有し、従来技術によって調製され得る。ヒト対象への投与用のものを含むワクチンなどの免疫原性組成物の調製は、一般にPharmaceutical Biotechnology,Vol.61 Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach,edited by Powell and Newman,Plenurn Press,1995、New Trends and Developments in Vaccines,edited by Voller et al.,University Park Press Baltimore,Maryland,U.S.A.1978に記載されている。リポソーム中への封入は、例えばFullertonによる米国特許第4,235,877号に記載されている。タンパク質のマクロ分子へのコンジュゲーションは、例えばLikhiteによる米国特許第4,372,945号及びArmorらによる米国特許第4,474,757号によって開示されている。典型的には、免疫原性組成物の各用量中のタンパク質の量は、典型的な対象において顕著な有害な副作用を伴わずに免疫防御的応答を誘導する量として選択される。本状況における免疫防御は、感染に対する完全な防御を必然的には意味せず、症状又は疾患、特にウイルスに関連する重度の疾患に対する防御を意味する。抗原の量は、用いられる具体的な免疫原に応じて変化し得る。一般に各ヒト用量は、約1μgから約100μg、例えば約1μg、約2μg、約5μg、約10μg、約15μg、約20μg、約25μg、約30μg、約40μg又は約50μgなどの約1μgから約50μg、などの1-1000μgのタンパク質を含むことが予測される。免疫原性組成物中で利用される量は、対象集団(例えば乳児又は高齢者)に基づいて選択される。具体的な組成物についての最適量は、抗体力価及び対象における他の応答の観察を含む標準的研究によって確認され得る。初回ワクチン接種に続いて対象は約4週間以内に追加免疫を受けることができる。
【０１１０】
他に説明する場合を除いて、本明細書において用いられるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学における一般的用語の定義は、Benjamin Lewin,Genes V,published by Oxford University Press,1994 (ISBN 0-19-854287-9)、Kendrew et al.(eds),The Encyclopedia of Molecular Biology,published by Blackwell Science Ltd;1994(ISBN 0-632-02182-9)及びRobert A.Meyers(ed.),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,published by VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)において見出し得る。
【０１１１】
単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈上他に明確に示す場合を除いて複数の参照事項を含む。核酸又はポリペプチドに与えられるすべての塩基サイズ又はアミノ酸サイズ及びすべての分子量又は分子質量値は、およそであり記載のために提供されることはさらに理解される。用語「複数の」は、二つ以上を意味する。核酸又はポリペプチドに与えられるすべての塩基サイズ又はアミノ酸サイズ及びすべての分子量又は分子質量値は、およそであり記載のために提供されることはさらに理解される。付加的に、抗原などの物質の濃度又はレベルに関して示された数的限定は、およそであることが意図される。したがって濃度が少なくとも(例えば)200pgであると示された場合、濃度は少なくともおよそ(又は「約」若しくは「程度」)200pgであると理解されることが意図される。
【０１１２】
本明細書に記載のものと類似の又は等価の方法及び物質は本開示の実施又は検査において用いられ得るが、適切な方法及び物質は下に記載される。用語「含む(comprises)」は「含む(includes)」を意味する。したがって文脈上他に要求する場合を除いて用語「含む(comprises)」及び「含む(comprise)」「含んでいる(comprising)」などの変化形は、述べられた化合物若しくは組成物(例えば核酸、ポリペプチド、抗原)又はステップ、或いは化合物又はステップの群の包含を意味すると理解されるが、任意の他の化合物、組成物、ステップ又はそれらの群の排除とは理解されない。略字「例えば(e.g.)」はラテン語exempli gratiaに由来し、本明細書において非限定的例を示して用いられる。したがって略字「例えば(e.g.)」は用語「例えば」と同義である。
【０１１３】
続く実施形態が、本発明において企図される:
a)N末端からC末端への方向で、融合ループ1(FL1)ドメイン及び融合ループ2(FL2)ドメインを含む細胞外ドメインの少なくとも一部分、場合により膜貫通ドメイン(TM)の少なくとも一部分、並びに細胞質ドメインの少なくとも一部分を含み、FL1ドメインの少なくとも一つのアミノ酸が置換又は欠失されており、存在する場合はTMドメイン又はその部分が非機能性である、サイトメガロウイルス(CMV) gBポリペプチド。
【０１１４】
b)配列番号1に記載の配列に関連して位置701〜775の又は他のCMV gBポリペプチドの対応する位置のアミノ酸を欠失することによって前記TMドメインが非機能的にされている、実施形態a)のCMV gBポリペプチド。
【０１１５】
c)前記融合ループFL2ドメインに少なくとも一つのアミノ酸置換又は欠失をさらに含む、実施形態a)又はb)のCMV gBポリペプチド。
【０１１６】
d)前記ポリペプチドの前記細胞質ドメイン中の一つの疎水性アミノ酸領域の欠失を少なくともさらに含む、実施形態a)からc)のいずれかのCMV gBポリペプチド。
【０１１７】
e)前記融合ループFL1ドメイン中の一つのアミノ酸置換が、配列番号1に記載の配列に関連して位置155〜157に又は他のCMV gBポリペプチド中の対応する位置にあるY.I.Y中の少なくとも一つのアミノ酸の、芳香族性ではない極性アミノ酸での置換からなる、実施形態a)からd)のいずれか一つのCMV gBポリペプチド。
【０１１８】
f)前記置換が、配列番号1に記載の配列に関連して位置155〜157に又は他のCMV gBポリペプチド中の対応する位置にあるY.I.Y中の少なくとも二つのアミノ酸の、芳香族性ではない極性アミノ酸での置換からなる、実施形態e)のCMV gBポリペプチド。
【０１１９】
g)前記極性アミノ酸がリシン(K)、ヒスチジン(H)及びアルギニン(R)からなる正に荷電したアミノ酸の群から選択される、実施形態e)又はf)のCMV gBポリペプチド。
【０１２０】
h)配列番号1に記載の配列に関連して位置156に又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置にあるイソロイシン(I)がヒスチジン(H)で置換されている、実施形態g)のCMV gBポリペプチド。
【０１２１】
i)配列番号1に記載の配列に関連して位置157に又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置にあるチロシン(Y)がアルギニン(R)で置換されている、実施形態g)又は請求項h)のCMV gBポリペプチド。
【０１２２】
j)配列番号1に記載の配列に関連して位置155に又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置にあるチロシン(Y)がグリシン(G)で置換されている、実施形態e)からi)のいずれかのCMV gBポリペプチド。
【０１２３】
k)配列番号1に記載の配列に関連して融合ループFL1ドメインにおける位置155〜157に又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置にあるアミノ酸Y.I.Yがアミノ酸G.H.Rでそれぞれ置換されている、実施形態a)からd)のいずれかのCMV gBポリペプチド。
【０１２４】
l)配列番号1に記載の配列に関連して前記融合ループFL1ドメインにおける位置155〜157に又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置にあるアミノ酸Y.I.Yのストレッチがカイト及びドーリトルスケールによって測定される+1.9の疎水性スコアを有し、カイト及びドーリトルスケールによって測定される-3未満、-7未満、-8未満の疎水性スコアを有する3アミノ酸のストレッチで置換されている、実施形態a)からd)のいずれかのCMV gBポリペプチド。
【０１２５】
m)前記融合ループFL2ドメインにおけるアミノ酸置換が、配列番号1に記載の配列に関連して位置240〜242に又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置にあるW.L.Yの内の少なくとも一つのアミノ酸の、リシン(K)、ヒスチジン(H)及びアルギニン(R)からなる群から選択される正に荷電したアミノ酸での置換からなる、実施形態c)からl)のいずれかのCMV gBポリペプチド。
【０１２６】
n)配列番号1に記載の配列に関連して位置240〜242に又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置にあるW.L.Yの内のアミノ酸が、ヒスチジン(H)で置換されている、実施形態m)のCMV gBポリペプチド。
【０１２７】
o)配列番号1に記載の配列に関連して位置242に又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置にある少なくともチロシン(Y)がヒスチジン(H)で置換されている、実施形態m)又はn)のCMV gBポリペプチド。
【０１２８】
p)配列番号1に記載の配列に関連して融合ループFL2ドメインにおける位置240〜242に又は他のCMV gBポリペプチドにおける対応する位置にあるアミノ酸W.L.Yがアミノ酸A.F.Hでそれぞれ置換されている、実施形態c)からn)のいずれか一つのCMV gBポリペプチド。
【０１２９】
q)細胞質ドメインにおける欠失が配列番号1に記載の配列に関連してアミノ酸825から877の領域に対応する、実施形態d)からp)のいずれか一つのCMV gBポリペプチド。
【０１３０】
r)前記ポリペプチドが内部タンパク質分解部位で突然変異している、実施形態a)からq)のいずれか一つのCMV gBポリペプチド。
【０１３１】
s)配列番号1に記載の配列に関連して又は異なるCMV gBポリペプチドの対応する位置のT456で置換されたR456、Q458で置換されたR458及びT459で置換されたR459からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸置換が実施されている、実施形態r)のCMV gBポリペプチド。
【０１３２】
t)配列番号1に記載の配列に関連してR456、R458及びR459又は異なるCMV gBポリペプチドの対応する位置がT456、Q458及びT459でそれぞれ置換されている、実施形態s)のCMV gBポリペプチド。
【０１３３】
u)配列番号1に記載の配列に関連してアルギニン(R357)がセリン(S357)で置換されている、実施形態a)からt)のいずれかのCMV gBポリペプチド。
【０１３４】
v)配列番号1に記載の配列に関連してアルギニン(R50)がセリン(S50)で置換されている、実施形態a)からu)のいずれかのCMV gBポリペプチド。
【０１３５】
w)配列番号1に記載の配列に関連してシステイン(C778)がアラニン(A778)で置換されている、実施形態a)からv)のいずれかのCMV gBポリペプチド。
【０１３６】
x)配列番号3に記載の配列のCMVポリペプチド。
【０１３７】
y)配列番号4に記載の配列のCMVポリペプチド。
【０１３８】
z)配列番号5に記載の配列のCMVポリペプチド。
【０１３９】
aa)AUC(分析的超遠心分離法)による測定でCMV gBポリペプチドの50%より多くが三量体形態にある、前記ポリペプチドを含む調製物。
【０１４０】
bb)適切な薬学的担体と混合した実施形態a)からz)のいずれか一つのCMV gBポリペプチドを含む免疫原性組成物。
【０１４１】
cc)アジュバントをさらに含む、実施形態bb)の免疫原性組成物。
【０１４２】
dd)実施形態a)-z)のいずれか一つのCMV gBポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【０１４３】
ee)実施形態dd)のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【０１４４】
ff)実施形態ee)の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
【０１４５】
gg)CMV感染の予防及び/又は治療における使用のための、実施形態a)からz)のいずれかのCMV gBポリペプチド。
【０１４６】
hh)CMV感染を予防及び/又は治療するための医薬の調製における実施形態a)からz)のいずれか一つのCMV gBポリペプチドの使用。
【０１４７】
ii)実施形態a)からz)のいずれかのCMV gBポリペプチドを含む組成物の免疫学的有効量を対象に投与するステップを含む、CMVに対する免疫応答を誘発するための方法。
【０１４８】
本発明は続く非限定的実施例を参照することによってさらに記載される。
【実施例】
【０１４９】
[実施例1]
CMV gBポリペプチド
下に示すすべてのgBポリペプチド変異体(模式的表示について図1及び2を参照されたい)は、CMV株AD169由来のgBのアミノ酸配列に由来する。したがって突然変異の位置を特定する場合のアミノ酸の番号付けは配列番号1に記載のAD169 CMV gBの配列に関連する。同様に下に記載のそれらそれぞれが含有する特定の突然変異に加えて、続く構築物は(i)すべて膜貫通ドメインが除去(欠失)されている(アミノ酸701から775の欠失)及び(ii)すべて次の点突然変異:アミノ酸Sで置換されたアミノ酸R50及びR357を含む。
【０１５０】
下の変異体が一過性形質移入のためのヒスチジンタグをポリペプチドのC末端に含むが、前記タグの配列は本明細書に開示の配列番号に含まれない。
【０１５１】
1.1 gB-SLP12
gB-SLP12変異体は、gBの推定融合ループ、FL1及びFL2それぞれを標的化する2系列の点突然変異を含む。FL1は、アミノ酸155Y.I.Y157をアミノ酸155G.H.R157で置換することによって突然変異させ、一方FL2はアミノ酸240W.L.Y242をアミノ酸240A.F.H242で置換することによって突然変異させた。この構築物は830アミノ酸長のタンパク質をコードする。gB-SLP12の完全アミノ酸配列は配列番号3に示される。
【０１５２】
1.1.1発現ベクターpMax-AD169-gB-SLP12の構築
gB-SLP12遺伝子配列(配列番号6)はGeneart companyによって合成された。コード配列をCHO細胞での発現のためにコドン最適化した。HindIII及びBamHI制限部位を5'末端(開始コドンの前)及び3'末端(終止コドンの直後)にそれぞれ導入した。コドン最適化遺伝子配列は、第一推定融合ループ(155G.H.R157で置き換えられた155Y.I.Y157)及び第二推定融合ループ(240A.F.H242で置き換えられた240W.L.Y242)の両方において突然変異を保有する。合成DNA断片は、KpnI及びSacIクローニング部位を用いてAD169-gB-SLP12-pMAプラスミドを生成するようにpMAベクター(GeneArt所有plasmid)にクローン化された2558bp長DNA挿入物として受け取った。AD169-gB-SLP12-pMAプラスミドをHindIII及びBamHIで制限した。gB-SLP12遺伝子を含有する2530bp DNA断片をゲル精製し、哺乳動物発現ベクターpMax(AmaxaのpMaxCloning vectorの改変バージョン)にライゲーションした。pMaxCloning vector骨格は、Amaxa商業的ベクターの多重クローニング部位(KpnIとHindIIIとの間)に存在するATG開始コドンを除くために改変されている。自動化DNA配列決定機による配列検証後、pMax-AD169-gB-SLP12組換えプラスミドをCHO-S細胞を一過的に形質移入するために用いた。
【０１５３】
1.2 gB-SLP12-Del2
アミノ酸Pro825からLys877を包含する一つの疎水性領域の欠失をgB-SLP12変異体に導入し、gB-SLP12-Del2変異体を生成した。この構築物は777アミノ酸長のタンパク質をコードする。gB-SLP12-Del2変異体の完全なアミノ酸配列を配列番号4に示す。gB-SLP12-Del2をコードするヌクレオチド配列を配列番号8に示す。
【０１５４】
1.2.1  発現ベクターpMax-AD169-gB-SLP12-Del2の構築
AD169-gB-SLP12コード配列中に存在する特有の制限部位HindIII及びClaIを包含する2159bp DNA断片を、AD169-gB-SLP12-pMAプラスミドを鋳型として並びにプライマーSLP-Fw(配列番号22)(5'-GAAAGCGGGCAGTGAGCGGAAGGC-3')及びSLP-Rv(配列番号23)(5'-TGTCCTCCACGTACTTCACGCGCTGC-3')を用いてPCRによって増幅した。AD169-gB-SLP12-Del2遺伝子のC末端部分もClaI及びSacI制限部位を包含する745bp断片として、Del2-pMAベクターを鋳型として並びにプライマーDel-Fw(配列番号24)(5'-CCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCA-3')及びDel-Rv(配列番号25)(5'-CCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGC-3')を用いてPCR増幅した。gB-SLP12-Del2遺伝子のC末端部分をコードする合成DNA断片を保有しているDel2-pMAベクターは、GeneArt companyによって構築された。適切な酵素での制限後、PCR断片をHindIII及びSacIで制限したpMaxベクターにクローン化した。自動化DNA配列決定機による配列検証後、pMax-AD169-gB-SLP12組換えプラスミドをCHO-S細胞を一過的に形質移入するために用いた。
【０１５５】
1.3 gB-SLP1-Del2
アミノ酸Pro825からLys877を包含する一つの疎水性領域の欠失をgB-SLP1変異体に導入し、gB-SLP1-Del2変異体を生成した。この変異体は、777アミノ酸長タンパク質をコードする。gB-SLP1-Del2変異体の完全なアミノ酸配列を配列番号5に示す。
【０１５６】
1.3.1  発現ベクターpMax-AD169-gB-SLP1-Del2の構築
gB-SLP1遺伝子は、GeneArtによって最初に合成された。コドン最適化遺伝子配列は、第一推定融合ループ(155G.H.R157で置き換えられた155Y.I.Y157)に突然変異を保有する。この合成遺伝子は、KpnI及びSacIクローニング部位を用いてAD169-gB-SLP1-pMAプラスミドを生成するようにpMAベクターにクローン化された2558bp DNA断片として受け取った。発現ベクターpMax-AD169-gB-SLP1-Del2をAD169-gB-SLP1-pMA及びベクタープラスミドDel2-pMAから構築した。pMA-gB-SLP21ベクターをHindIII及びClaIで制限し、SLP1-Del2タンパク質のN末端部分をコードする1964bp DNA断片をゲル精製によって単離した。ベクタープラスミドDel2-pMAをClaI及びSacIで消化し、gB-SLP1-Del2タンパク質のC末端部分をコードする420bp DNA断片をゲル精製によって単離した。これら二つの断片をHindIII及びSacIで制限したpMax発現ベクターに一緒にライゲーションし、最終的発現ベクターpMax-AD169-gB-SLP1-Del2を生成した。自動化DNA配列決定機による配列検証後、pMax-AD169-gB-SLP1-Del2組換えプラスミドをCHO-S細胞を一過的に形質移入するために用いた。gB-SLP1-Del2をコードするヌクレオチド配列を配列番号7に示す。
【０１５７】
1.4 gB-SLP12-Delta113
アミノ酸793で始まる細胞質ドメインのC末端部分の欠失及び膜貫通ドメインのアミノ酸701-775の欠失をgB-SLP12-Delta113変異体で実施した。変異体は717アミノ酸長タンパク質をコードする。gB-SLP12-Delta113変異体の完全なアミノ酸配列を配列番号12に示す。
【０１５８】
1.4.1  ベクターpTT5-gB-SLP12-Delta113の構築
pTT5-gB-SLP12-Delta113発現ベクターを構築するために用いた戦略は続くとおりである。最初にpMax-AD169-gB-SLP1ベクター(1.1.1節を参照されたい)をHindIII及びClaIで制限した。得られた1970bp gB断片(gB-SLP12-Delta113構築物のN末端部分に対応する)をゲル精製で単離した。ClaI及びBamHI部位(終止コドンの直後)を包含するgB-SLP12-Delta113構築物のC末端はGeneartによって合成され、pMAベクター(GeneArt所有plasmid)にクローン化された230bp長DNA挿入物(new-2と名付けた)として受け取った。New-2-pMAベクターをClaI及びBamHIで制限し、230bp挿入物をゲル精製した。二つのゲル精製DNA断片を、予めHindIII及びBamHIで制限したpMax発現ベクターに一緒にライゲーションし、pMax-AD169-gB-SLP12-Delta113プラスミドを生成した。次いでAD169-gB-SLP12-Delta113構築物の位置50及び357のセリンをStratagene(No. 200513)からの「QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis」キットを用いて両方とも天然のアルギニンに復帰させた。得られたプラスミドを(配列検証後)制限酵素HindIII及びBamHIで消化した。2200bp gB断片をゲル精製し、予めHindIII及びBamHIで制限したpTT5ベクター(NRC、カナダ)にライゲーションし、最終pTT5-gB-SLP12-Delta113発現ベクターを生成した。このベクターをCHO-S細胞を一過的に形質移入するために用いた。gB-SLP12-Delta113をコードするヌクレオチド配列を配列番号11に示す。
【０１５９】
1.5 gB-SLP12-Delta725
アミノ酸725で始まる膜貫通ドメインの部分の欠失及び細胞質ドメイン全体の欠失をgB-SLP12-Delta725で実施した。この変異体は724アミノ酸長タンパク質をコードする。gB-SLP12-Delta725変異体の完全なアミノ酸配列を配列番号10に示す。
【０１６０】
1.5.1  発現ベクターpTT5-gB-SLP12-Delta725の構築
最初にgB-SLP12-Del2構築物(1.2節を参照されたい)の位置50及び357のセリンをStratagene(No. 200513)からの「QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis」キットを用いて両方とも天然のアルギニンに復帰させた。得られたプラスミドを(配列確認後)制限酵素HindIII及びClaIで消化し、得られた1970-bp gB断片をゲル精製によって単離した。ClaI及びBamHI制限部位(配列番号26)を包含し、続く配列:
ATCGATCCCCTGGAGAACACCGACTTCAGGGTGCTGGAGCTGTACTCCCAGAAGGAACTGAGGTCCAGCAACGTGTTCGACCTGGAGGAAATCATGAGAGAGTTCAACAGCTACAAGCAGCGCGTGAAGTACGTGGAGGACAAGGTGGTGGACCCCCTGC CCCCCTACCT GAAGGGCCTGGACGACCTGA TGAGCGGACTCGGGGCTGCTGGAAAGGCCTGAGGATCC
を含むPCR断片も生成した。1970bp HindIII-ClaI断片並びにClaI及びHindIIIで制限したPCR DNAを一緒にpTT5ベクター(NRC、カナダ)のHindIIIとBamHIとのクローニング部位の間に最終pTT5-gB-SLP12-Delta725発現ベクターを生成するためにライゲーションした。自動化DNA配列決定機による配列確認後、pTT5-gB-SLP12-Delta725組換えプラスミドをCHO-S細胞を一過的に形質移入するために用いた。gB-SLP1-Delta725をコードしているヌクレオチド配列を配列番号9に示す。
【０１６１】
1.6 gB-SLP12-Delta725-LVL759
この変異体は683アミノ酸長タンパク質をコードしている。gB-SLP12-Delta725-LVL759の完全なアミノ酸配列を配列番号14に示す。
【０１６２】
1.6.1  発現ベクターpTT5-AD169-Delta725-LVL759の構築
pTT5-gB-SLP12-Delta725-RR-leader2プラスミドをStratagene (No.200522)からのQuickChange II XL Site-Directed Mutagenesisキット並びにプライマーCAN1498 5'-gtgcatcgtgtgcctgggatccgaggccgtgagccacagg-3'及びCAN1499 5'-cctgtggctcacggcctcggatcccaggcacacgatgcac-3'を用いて突然変異させ、中間体プラスミドpTT5-649-13を得た。この中間体プラスミドを同じQuickChange II XL Site-Directed Mutagenesisキット並びにプライマーCAN1650 5'-gtgaacctgtgcatcgtgtgcctggccctggccagccaccgggccaacgagacaa-3'及びCAN1651 5'-ttgtctcgttggcccggtggctggccagggccaggcacacgatgcacaggttcac-3'を用いて突然変異させ、最終発現ベクターpTT5-SLP12-725-LVL759を得た。gB-SLP12-Delta725-LVL759をコードするヌクレオチド配列を配列番号13に示す。
【０１６３】
1.7 gB-SLP12-Delta725-LVL776
この変異体は683アミノ酸長タンパク質をコードしている。gB-SLP12-Delta725-LVL776変異体の完全なアミノ酸配列を配列番号16に示す。
【０１６４】
1.7.1  発現ベクターpTT5-AD169-Delta725-LVL776の構築
上の中間体プラスミドpTT5-694-13を同じQuickChange II XL Site-Directed Mutagenesisキット並びにプライマーCAN1648 5'-cctgtgcatcgtgtgcctgggagccctggccagccaccgggccaacgagacaatc-3'及びCAN1649 5'-gattgtctcgttggcccggtggctggccagggctcccaggcacacgatgcacagg-3'を用いて突然変異させ、さらなる中間体プラスミドpTT5-LVL758-1を得た。この中間体プラスミドを同じQuickChange II XL Site-Directed Mutagenesisキット並びにプライマーCAN1697 5'-tggtgtgcgtgaacctgtgcatcgtgctcctgggagccctggcccaccgggccaacgagacaatctac-3'及びCAN1698 5'-gtagattgtctcgttggcccggtgggccagggctcccaggagcacgatgcacaggttcacgcacacca-3'を用いて突然変異させ、最終発現ベクターpTT5-gB-SLP12-Delta725-LVL776を得た。gB-SLP12-Delta725-LVL759をコードするヌクレオチド配列を配列番号15に示す。
【０１６５】
1.8 gB-SLP12-Delta725-CD33
gB-SLP12-Delta725-CD33変異体は677アミノ酸長タンパク質をコードする。この構築物は、ヌクレオチド1から192(シグナル配列及び成熟gBタンパク質の最初の64アミノ酸)を包含するgB遺伝子のN末端部分がCD33のシグナル配列で置き換えられたことを除いてgB-SLP12-Delta725構築物とほとんど同一である(Taylor et al.1999,Vol.274,No.17:p11505-11512)。gB-SLP12-Delta725-CD33変異体の完全なアミノ酸配列を配列番号18に示す。
【０１６６】
1.8.1  発現ベクターpTT5-gB-SLP12-Delta725-CD33の構築
gB-SLP12-Delta725-CD33遺伝子を、pTT5-gB-SLP12-Delta725プラスミドを鋳型として、並びにプライマーCD33(配列番号27)(5'-AATCAAAAGCTTACTAGTGCCGCCACCATGGCCCCCCTGCTGCTTCTGCTGCCCCTGCTTTGGGCAGGGGCCCTGGCCCACCGGGGCAACG-3')及びCMO578(配列番号28)(5'-GTAATAGGATCCGGTACCTCATCAGGCCTTTCCAGCAG-3')を用いるPCR増幅によって構築した。フォワードプライマーはHindIII部位及びCD33シグナル配列を含有する。リバースプライマーは終止コドン及びBamHI部位を含有する。適切な酵素での制限後、PCR断片をHindIII及びBgIIIで制限したpEE14ベクターにクローン化した。pEE14-gB-SLP12-Delta725-CD33組換えプラスミドを配列検証後に選択した。最終的にgB-SLP12-Delta725-CD33遺伝子を次のとおりpTT5ベクターにサブクローン化した。コード配列をpEE14-gB-SLP12-Delta725-CD33ベクターを鋳型として、並びにプライマーCD33F(配列番号29)(5'-AATCAAAAGCTTACTAGTGCCGCCACCATGGCCCCCCTGCTG-3')及びEcto-Rv(配列番号30)(5'-GACTTATAGGATCCTCATCAGTGGTGGTGATGATGGTGGCCGCCGGCCTTTCCAGCAGC-3')を用いてPCR増幅した。フォワード及びリバースプライマーはHindIII及びBamHIクローニング部位をそれぞれ含有する。増幅されたDNA及びpTT5ベクターをライゲーションの前にHindIII及びBamHIで制限した。得られたpTT5-gB-SLP12-Delta725-CD33発現ベクターを配列検証後にCHO-S細胞を一過的に形質移入するために用いた。gB-SLP12-Delta725-CD33をコードするヌクレオチド配列を配列番号17に示す。
【０１６７】
[実施例2]
CMV gBポリペプチドの発現
上に記載のさまざまなDNA構築物をInvitrogenのFreeStyle(商標)MAX CHO発現システムを用いてCHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞に一過的に形質移入した。ポリペプチドgB-DeltaTMをコードする構築物を対照として用いた。gB-DeltaTMのアミノ酸配列を配列番号2に示す。gB-DeltaTMを発現するために用いた発現ベクターはpMax-AD169であった。FreeStyle(商標)MAX CHOシステムは、CHO-S細胞系(懸濁に適応させた一般的CHO-K1細胞系の分離サブクローン)及び形質移入試薬としての合成カチオン性脂質に基づくポリマーを用いる。形質移入のためのプラスミドDNAをQiagen Maxiprepキット(Qiagen、Valencia、CA)を製造者のプロトコールに従って用いて単離した。形質移入複合体をInvitrogenによって推奨されるとおり調製した。簡潔には、37.5μgのプラスミド及び37.5μlのFreeStyle MAX形質移入試薬を別々に0.6mlのOpti-Pro(商標)SFM培地中に希釈した。直後に希釈したFreeStyle MAX形質移入試薬を希釈したDNA溶液に添加した。DNA-FreeStyle MAX混合物を細胞培養物に添加する前に10分間、室温でインキュベートした。形質移入した培養物を37℃で3日間インキュベートした。次いで培養物を29℃でさらに3日間維持した。形質移入後6日目に、懸濁液中の形質移入された細胞及び細胞培養培地を含む細胞培養物各1mlを回収した。細胞培養上清を12,000gでの遠心分離によって懸濁された細胞から分離した。上清を回収し、細胞性ペレットを溶解緩衝液(1%Triton-X100を補充したPBS)1mlに溶解した。12,000g、4℃、5分間の遠心分離によって細胞可溶化液から不溶性物質を除去した。培養上清及び可溶化した細胞性画分の一定分量(15μl)をMOPS緩衝液を用いてCriterion XT 4-12% Bis Tris gel(Biorad)にかけた。タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、膜を抗gB抗体MAb 27-156で探索した(Spaete et al., 1990)。代替的に発現及び分泌レベルを抗gB抗体を用いるElisaアッセイによって検出した。アッセイは96ウエルプレートで実施した。プレートをポリクローナル抗gB抗体(抗体はポリペプチドgB**-EP0759995に記載-をウサギに注射することによって産生した)でコートした。3%スキムミルク、1時間、37℃での飽和ステップ後、抗体を一晩4℃でインキュベートした。次いでウエルを4回洗浄した。検査する各試料の2倍希釈系列の一連の10個(所与のgB構築物で形質移入した上清及び細胞性画分)を、コートしたプレートにビオチンコンジュゲートしたモノクローナル抗gB抗体(抗体はCMVウイルス全体をマウスに注射することによって産生した)の存在下で2時間、37℃で添加した。PBS/0.1% Tween 20で4回洗浄後、ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ100μlを添加し、30分間、37℃でインキュベートした。プレートをPBS/0.1% Tween 20で4回及び水で1回洗浄した。次いでプレートを0.1Mクエン酸緩衝液pH5.8(25%)中の75%テトラ-メチル-ベンジジン(TMB)の100μlで10分間、37℃でインキュベートした。この反応を100μlの0.4N H2SO4で停止し、比色定量を分光光度計450/620nmで読み取った。濃度が既知である精製gB-DeltaTMの以前のロットをこの実験において標準として用いた。ソフトウエアSoftMax Proを用いて検査した各試料の濃度を定量した。
【０１６８】
2.1 gB-SLP12、gB-SLP1-Del2及びgB-SLP12-Del2の発現及び分泌-ウエスタンブロット分析
図3に示すのは、独立して実施した3回の実験からの代表的ウエスタンブロットである。レーンA、B、C及びDは、gB-DeltaTM、gB-SLP12、gB-SLP1-Del2及びgB-SLP12-Del2で形質移入した培養物の細胞性画分をそれぞれ表す。前記細胞性画分中に存在するgBのレベルは、細胞内にあるgBのレベルを示す。レーンE、F、G及びHは、gB-DeltaTM、gB-SLP12、gB-SLP1-Del2及びgB-SLP12-Del2で形質移入した培養物の上清をそれぞれ表す。前記上清中に存在するgBのレベルは、分泌されたgBのレベルを示す。レーンB、C及びDに存在するgBのレベルをレーンAに存在するgBのレベルと比較すると、細胞内gBのレベルが融合ループを突然変異させても変化しないままであることが示される、すなわち本発明のポリペプチドは、インタクトな融合ループを有するgB-DeltaTM(すなわち先行技術のポリペプチド)と比較して融合ループ内の突然変異が分泌に影響しないことを示唆している。実際にレーンF、G及びHに存在するgBのレベルをレーンEに存在するgBのレベルと比較すると、本発明のgBポリペプチド(突然変異した融合ループを有する)の発現及びそれらの分泌は、先行技術のgBポリペプチド(インタクトな融合ループを有するgB-DeltaTM)の発現及び分泌と少なくとも同様に効率的であることが認められる。
【０１６９】
2.2 gB-SLP12, gB-SLP12-Delta113及びgB-SLP12-Delta725の発現及び分泌-Elisaアッセイ
Elisaアッセイによって得られた結果の定量及びグラフの形態での表示を図4に示す-黒色バーはそれぞれgB-DeltaTM、gB-SLP12、gB-SLP12-Delta113及びgB-Delta725で形質移入した培養物の細胞性画分を表し、灰色バーは同じ培養物の上清を表す。したがって発現された変異体ごとの灰色バーと黒色バーとの合計は、CHO細胞への形質移入後に達成された総発現レベルを表す。gB-DeltaTMに関して、発現されたポリペプチド集団内で、ポリペプチドのおよそ半分が細胞内(灰色バー)に保持され、ポリペプチドのおよそ半分が分泌された(黒色バー)ことを認めた。驚くべきことにgB-SLP12が発現された場合、総発現レベルがgB-DeltaTMよりも顕著に(およそ2倍)高かったことが認められた。さらに細胞内形態及び分泌形態のそれぞれのレベルを比較すると、80%を超えるポリペプチドが分泌された一方で10-20%だけが細胞内に残ったことが認められ、gB-SLP12もgB-DeltaTMよりもより効率的に分泌されたことを示唆している。この結果は、融合ループの突然変異は発現及び分泌に肯定的な影響を有することを示唆している。gB-DeltaTMを超える高い発現及び分泌レベルは、ポリペプチドgB-SLP12-Delta113及びgB-SLP12-Delta725でも同様に認められた。しかし驚くべきことにこれら二つのポリペプチドは、gB-SLP12よりもさらにより顕著に、2倍を超えて及びおよそ1.6倍でそれぞれ発現され、細胞質ドメインの少なくとも一部の欠失を融合ループ突然変異と組み合わせることが発現を及びしたがって得られる分泌されたポリペプチドの最終収量をさらに改善することを示唆している。
【０１７０】
2.3 gB-SLP12、gB-SLP12-Delta113、gB-SLP12-Delta725、gB-SLP12の発現及び分泌-融合ループの役割
ウエスタンブロットを図5に示す。図5Aは、gB-SLP12がgB-SLP12-Delta725と同様に効率的に分泌されることを示し、両方ともgB-DeltaTM(レーンF及びJをレーンBと比較されたい)よりも高い分泌レベルを示しており、Elisaアッセイによって認められた結果を確認している。レーンM及びNは、インタクトな融合ループFL1及びFL2を有するgB-SLP12-Delta725で形質移入した培養物の細胞性画分及び上清を表している。培養物上清中のgBの検出の欠如(レーンNを参照されたい)は、gBの良い発現/分泌レベルは融合ループが突然変異することを必要とすることを示唆しており、同様の観察が図5B(インタクトな融合ループFL1及びFL2を有するgB-Delta725で形質移入した培養物の上清において(gB-SLP12-Delta725で形質移入した培養物の上清と比較して)gBタンパク質が検出できなかった(レーン6と2とをそれぞれ比較されたい))においてなされた。gB-DeltaTMよりも良い分泌を達成するための融合ループFL1及びFL2の突然変異の必要性は、ポリペプチドgB-SLP12-Delta113について同様に観察された。gBは、インタクトな融合ループFL1及びFL2を有するgB-SLP12-Delta113で形質移入した培養物の上清において、gB-SLP12-Delta113で形質移入した培養物の上清と比較してほとんど観察されなかった(レーン6'と4'とをそれぞれ比較されたい)。
【０１７１】
2.4 gB-SLP12-Delta725、gB-SLP12-Delta725-LVL759及びgB-SLP12-Delta725-LVL776の発現及び分泌
ウエスタンブロットを図5Cに示す。gB-SLP12-Delta725-LVL759で形質移入した培養物の上清に存在するgBのレベルは、gB-SLP12-Delta725で形質移入した培養物の上清に存在するgBのレベルと少なくとも同様である(レーンf及びhをレーンb及びdとそれぞれ比較されたい)。gB-SLP12-Delta725-LVL776で形質移入した培養物の上清に存在するgBのレベルは、gB-SLP12-Delta725で形質移入した培養物の上清に存在するgBのレベルよりわずかに低い(レーンj及びlをレーンb及びdとそれぞれ比較されたい)。これらの結果は、本発明のポリペプチドのN末端部分における突然変異(図2を参照されたい)が前記ポリペプチドの分泌レベルに顕著な影響を与えないことを示す。
【０１７２】
[実施例3]
CMV gBポリペプチドの生成物プロファイル
gB-DeltaTM、gB-SLP12及びgB-SLP1-Del2を実施例2に記載のとおりCHO細胞において一過的に発現させ、培養上清を形質移入後6日目に回収した。清澄化後、上清に350mM NaCl及び0.4% Empigenを補充し、次いで0.22μmろ過した。ニッケルカラムを細胞に対応する培養上清から形質移入及び分泌されたポリペプチドを精製するために用いた。XK 16カラム(Qiagen)を10mM TRIS-HCl、350mM NaCl、10mMイミダゾール及び0.4% Empigenを含む緩衝液pH 8.0で平衡化した。予め清澄化、補充及びろ過した細胞培養上清を流速4ml/分でロードし、保持されたタンパク質を平衡化緩衝液で洗浄した。溶出は流速4ml/分で、10mM TRIS-HCl、350mM NaCl、350mMイミダゾール及び0.4% Empigenを含む緩衝液pH 8.0で実施した。次いで溶出された画分を、10mMリン酸(K)緩衝液及び0.4% Empigenを含む緩衝液pH 7.2で平衡化したXK 26カラム(GE)に流速2ml/分で注入した。最初のタンパク質ピークをさらなる分析のために回収した。次いでこのピークに対応する溶出画分を、10mMリン酸(K)及び0.4% Empigenを含む緩衝液pH 7.2で平衡化したセルファインサルフェートカラム(チッソ株式会社)にロードした。溶出は流速3ml/分で、5mMリン酸(K)、1M NaCl及び0.1% プルロニック(Pluronic) F68を含む緩衝液pH 7.2で実施した。次いで上の精製プロセスから得られた精製ポリペプチドを続く実験に供した。
【０１７３】
3.1  グルタルアルデヒド架橋結合実験
グルタルアルデヒドの最終濃度0.5%及び1%となるように各精製ポリペプチドの15μl(総タンパク量およそ7μgに相当する)にグルタルアルデヒドを直接添加した。対照として各精製ポリペプチドの試料をグルタルアルデヒドを添加しないままにした。混合物を150分間インキュベートし、次いでグルタルアルデヒド反応をNaBH4(Aldrich)を添加することによって停止し、試料を氷上、20分間インキュベートした。次いで試料をMOPS緩衝液を用いてCriterion XT 4-12% Bis Trisゲル(Biorad)にかけた。ゲルをCoomassie blue R-250で染色し、図9に示す。
【０１７４】
結果
ポリペプチドの多量体がグルタルアルデヒドで処置するより前に試料中に存在した場合、任意の所与のサイズの多量体が(二量体、三量体又は任意の他のより高分子量の多量体であるかにかかわらず)架橋結合され、次いで変性条件でゲル上を移動する場合にそのように維持される。したがって前記多量体はそれらの分子量に応じて移動した。反対に、グルタルアルデヒドで処置しなかった対照試料では、前記試料中に存在する任意の多量体は、変性条件でゲル上を移動する際に単量体に変性され、対照試料中のポリペプチドはポリペプチドの単量体と等しい分子量に応じて移動した(レーンA、D及びGの150kDaよりわずかに低い単一バンドを参照されたい)。gB-DeltaTM(レーンA、B及びC)の多量体プロファイルを考慮すると、グルタルアルデヒドで処置した試料中に非常に高分子量の二つのバンド(矢印で示す)を認める。これらの二つのバンドが同じ強度であることが認められ、gB-DeltaTM試料が主に2種類の多量体を含み、試料中の各多量体の割合がほぼ同じであることが示唆される。反対に試料がグルタルアルデヒドで処置されたgB-SLP12のプロファイル、詳細にはレーンE及びFを考慮すると、二つの高分子量バンドが同様に認められたが、各バンドの強度は顕著に異なっている。実際に低分子量バンドの強度は、最も高分子量のものより少なくとも3〜5倍強く、gB-SLP12試料中の低分子量多量体集団は、高分子量多量体の集団よりも大きいことを示唆している。同様の観察が、低い方のバンドの強度が高い方のバンドの強度よりもおよそ2〜3倍強いgB-SLP2-Del2試料を考慮する場合になされた(レーンG、H及びI)。これは、gB-SLP12とgB-SLP1-Del2とが、先行技術のポリペプチドgB-DeltaTMとは異なる低分子量多量体に富んだ割合を有する類似の多量体プロファイルを有することを示唆している。この実験で用いたゲルは、gB-DeltaTMに関するレーンにおいて認められた低分子量バンドがgB-SLP12及びgB-SLP1-Del2に関するレーンにおいて認められたものと同じサイズであるかどうかを決定するために十分な分解能を提供しないことを指摘する。同じ理由で、各バンドの実際のサイズを正確に決定することは不可能であり、認められた多量体を二量体又は三量体などに同定することはこの実験からは困難である。この情報を入手するために、続く二つの実験を精製ポリペプチドで実施した。
【０１７５】
3.2  分析的超遠心分離法-gB-DeltaTM、gB-SLP12、gB-SLP1-Del2
分析的超遠心分離法(AUC)を、遠心力に反応して分子が移動する速度を測定することによって、精製ポリペプチド試料中のさまざまな分子種(例えば凝集している精製ポリペプチドのさまざまなサイズの多量体)の溶液中での均一性及びサイズ分布を決定するために用いた。これは、沈降速度実験によって得られるさまざまな分子種の沈降係数の算出に基づく(それらの分子の形状及び質量に依存する)。精製後、10mMリン酸ナトリウム、1M NaCl、0.1% Pluronic、pH 7.2に再懸濁したgB-DeltaTM、gB-SLP12及びgB-SLP1-Del2をAN-60Tiローターを15°Cに平衡化させた後に、Beckman-Coulter ProteomeLab XL-1  分析的超遠心分離機にて28000rpmで回転させた。データ収集のために160スキャンを280nm及び230nmで5分ごとに記録した。データ分析をC(S)分布を決定するためにプログラムSEDFITを用いて実施した。タンパク質の偏比容の決定を、それらのアミノ酸配列及び予測されるグリカン組成と組み合わせたSEDNTERPソフトウエアで実施した。SEDNTERPを、(このソフトウエアのデータベースでは表されない)Pluronic F68の寄与を無視することによって緩衝液の粘度及び密度を決定するためにも用いた。結果を、分子量に対してプロットした各分子種の濃度を示すグラフの形態で示す。すべての分子種の相対的存在量の決定を分布全体の曲線下総面積を試料の100%とみなし、分子種ごとの寄与により表される総面積の百分率を算出することによって実施した。
【０１７６】
結果
図10は、分析的超遠心分離法によって分析した精製gB-DeltaTM、gB-SLP12及びgB-SLP1-Del2のプロファイルを連続的に示す。gB-DeltaTM試料に対応するグラフは、複数のピークによって表される不均一な分布を示す。詳細には、前記試料中に認められる主な集団は、417kDa(35%)及び723kDa(30%)の分子種である(おそらくそれぞれ三量体及び四量体を表す)。より高分子量の多量体も前記試料中に存在する。反対に融合ループFL1及びFL2を突然変異させると、対応する精製gB-SLP12ポリペプチドのプロファイルは、主な集団が327kDa(63%)の分子種である(おそらく三量体を表す)より均一な集団を示す。より高分子量の多量体の存在はかろうじて認められた。類似のプロファイルが、主な集団が311kDa(67%)の分子種である(おそらく同様に三量体を表す)gB-SLP1-Del2試料において認められたが、より高分子量の多量体の存在はわずかである。
【０１７７】
結論として本発明のgBポリペプチド(gB-SLP12及びgB-SLP1-Del2)は、三量体集団が、先行技術のgBポリペプチド(gB-DeltaTM)の三量体集団と比較しておよそ2倍増加している改善された生成物プロファイルを示す。
【０１７８】
3.3  分析的超遠心分離法-gB-SLP12-Delta725、gB-SLP12-Delta113
精製ポリペプチドgB-SLP12-Delta725及びgB-SLP12-Delta113中のさまざまな分子種の溶液中での均一性及びサイズ分布を決定するために分析的超遠心分離法を3.2節に記載のとおり実施した。ポリペプチドは、実施例2に記載のとおり組み換え的に発現させ、本実施例3の最初の段落に記載のとおり精製した。精製後、gB-SLP12-Delta725及びgB-SLP12-Delta113をそれぞれ0.1% プルロニック(Pluronic)を含む緩衝液又はPluronicを含まない緩衝液のいずれかに再懸濁した。
【０１７９】
結果
図11Aは、0.1% Pluronicの存在下又は非存在下での分析的超遠心分離法によって分析した精製gB-SLP12-Delta113ポリペプチドのプロファイルを連続的に示す。Pluronic非存在下で認められたプロフィルは、精製ポリペプチドの集団内で三量体を表す類似の72%の集団を有して、図10においてgB-SLP12及びgB-SLP12-Del2について認められたプロファイル(すなわち先行技術のgBポリペプチド(gB-DeltaTM)と比較して改善された生成物プロファイル)と同様であった。しかし、Pluronicの存在下では、三量体の百分率は単量体の百分率(25%)の増加及び230kDa付近の多量体の存在に伴って低下した。Pluronicの存在下でのgB-SLP12-Delta113ポリペプチドの単量体化の傾向は、界面活性剤への感受性を示している。
【０１８０】
-図11Bは、0.1% Pluronicの存在下又は非存在下での分析的超遠心分離法によって分析した精製gB-SLP12-Delta725ポリペプチドのプロファイルを連続的に示す。Pluronicが存在するか否かにかかわらずこの精製ポリペプチドで認められたプロファイルは類似している。実際に三量体の百分率は両方の場合において70%程度である、すなわち上のgB-SLP12及びgB-SLP12-Del2ポリペプチドで認められた三量体百分率と同様に高く、したがってgB-SLP12-Delta725も先行技術のgBポリペプチド(gB-DeltaTM)と比較して改善された生成物プロファイルを示す。
【０１８１】
結論
gB-SLP12-Delta113及びgB-SLP12-Delta725の両方が三量体に富む割合を有して改善された生成物プロファイルを示すが、得られた結果は(その三量体プロファイルがPluronicの存在又は非存在において維持されたことから)gB-SLP12-Delta725が溶液中での増大した構造安定性を有する追加的利点を表すことを示す。実際に界面活性剤処置は、このポリペプチドの沈降特性に観察可能な影響を有さなかった。
【０１８２】
3.4  サイズ排除クロマトグラフィー
精製gB-DeltaTM及びgB-SLP12のタンパク質サイズを、280nmでのUV検出器及びTSK G5000PWXLカラム(東ソーバイオサイエンス)を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによっても決定した。試料を室温、流速0.5ml/分でロードした。溶出は同じ流速、室温でPBS+0.1% Pluronicで実施した。サイログロブリン(669kDa)、フェリチン(440kDa)、カタラーゼ(232kDa)、アルドラーゼ(158kDa)、アルブミン(68kDa)、コンアルブミン(75kDa)、オボアルブミン(43kDa)、炭酸脱水素酵素(29kDa)及びリボヌクレアーゼ(13.7kDa)を較正のために用いた。
【０１８３】
結果
図13に示すとおり、gB-SLP12はサイズ排除クロマトグラフィーによって測定された357kDaのサイズ(おそらく三量体形態を表す)を有する。先行技術の二つのポリペプチド、gB-DeltaTM及びgB-S50-DeltaTM(すなわちインタクトな融合ループを有するポリペプチド)は710kDaの類似するサイズ(より高い分子量の多量体を表す)を有する。これらの結果は、本発明のポリペプチド(gB-SLP12)が先行技術のポリペプチド(gB-DeltaTM)とは異なる生成物プロファイルを有するという分析的超遠心分離法で得られた上の結果を確認する。
【０１８４】
[実施例4]
gB-SLP12ポリペプチドのC末端クリッピング
4.1  発現及び精製
gB-DeltaTM、gB-SLP12、gB-SLP12-Delta113及びgB-SLP12-Delta725ポリペプチドを実施例2に記載のとおり一過的に形質移入し、発現させた。gB-SLP12、gB-SLP12-Delta113及びgB-SLP12-Delta725ポリペプチドを実施例3の最初の段落に記載のとおり精製した。形質移入後6日目に回収した後、gB-DeltaTM上清にBis-Tris及びEmpigen BBをそれぞれ最終濃度20mM及び0.4%に達するまで補充した。次いでそれを、20mM Bis-Tris-0.4% Empigen BBを含む緩衝液pH6.0で平衡化したQ-Seharose XLカラム(GE Healthcare)にロードした。結合したペプチドを20mM Bis-Tris-0.4% Empigen BBを含む緩衝液pH6.0を75%と20mM Bis-Tris-0.4% Empigen BB-1M NaClを含む緩衝液pH6.0を25%との混合液でカラムから溶出させた。次いで溶出液にリン酸ナトリムを最終濃度10mMに達するまで補充し、pH6.8に調整した。次いでそれを10mMリン酸ナトリウム-0.4% Empigen BB-0.25M NaClを含む緩衝液pH6.8で平衡化したヒドロキシアパタイトtype IIカラム(Bio-Rad)にロードした。ポリペプチドを含有する素通り画分を回収し、10mMリン酸ナトリウム-0.4% Empigen BB-0.25M NaClを含む緩衝液pH6.8で平衡化したCellufine Sulfateカラム(JNC Corporation)にロードした。ポリペプチドを含有する素通り画分を回収し、100kD Pellicon XL膜(Millipore)を用いる限外ろ過によって濃縮し、10mMリン酸ナトリウム-0.4% Empigen BBを含む緩衝液pH7.2で平衡化したSuperdex 200カラム(GE Healthcare)にロードした。溶出物を回収し、濃縮及び10mMリン酸カリウムpH7.2で透析ろ過(diafiltered)した。
【０１８５】
4.2  ウエスタンブロット分析
上の精製ポリペプチドをN-グリコシダーゼF脱グリコシル化キット(Roche、No. 11836552001)を製造者の説明書に従って用いて脱グリコシル化した。精製した各脱グリコシル化ポリペプチドの等量をMOPS緩衝液を用いてCriterion XT 4-12% Bis Trisゲル(Biorad)にかけた。タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、膜を抗gB抗体MAb 27-156(Spaete et al.,Virology 167,207-225(1988)(図14A、図14B、レーン3、図14C、レーンB及び図14D、レーンD)又は抗6X Hisタグ抗体(Abcam,No.ab9108)(図14B、レーン2、図14C、レーンA及び図14D、レーンC)のいずれかで探索した。
【０１８６】
結果
図14Aは、抗gB抗体が精製gB-DeltaTMポリペプチドの集団における二つの異なる形態を認識することを示し、ポリペプチドが精製された集団において異なるサイズの少なくとも二つの形態、それぞれ92kDa及び80kDaで存在することを示唆している。アミノ酸の分子量の平均値(110Da)に基づいて、830アミノ酸を含むgB-DeltaTMの分子量は91kDa付近であるはずである。したがって92kDaのバンドはおそらく全長gB-DeltaTMポリペプチドに対応し、一方80kDaのバンドはポリペプチドの短縮バージョンに対応し、集団内でいくらかのポリペプチドが切断され、80kDa付近のクリップされた生成物が産生されていることを示唆している。
【０１８７】
-図14Bは、細胞中でのgB-SLP12ポリペプチドの組換え発現において、抗gB抗体(レーン3)が類似するサイズの二つの形態、92kDa及び80kDaをそれぞれ認識する同一プロファイルを提供することを示し、このポリペプチドにおいて類似の切断が生じていることを示唆している。本明細書において、gB-SLP12の予測される分子量も(アミノ酸の数がgB-DeltaTMと同じであることから)91kDa付近であることに注目する。膜を抗Hisタグ抗体(レーン2)で探索すると、92kDa付近のバンドだけが検出された。HisタグがポリペプチドのC末端にあることから、これらのデータは切断がポリペプチドのC末端部分で生じ、したがってC末端を失った80kDaの断片が生じることを示唆する。
【０１８８】
-図14Cは、細胞中でのgB-SLP12-Delta113ポリペプチドの組換え発現において、抗gB抗体(レーンB)が一つのバンドだけ(80kDa付近)を認識することを示している。gB-SLP12-Delta113がアミノ酸717個を含むことから、平均分子量が79kDa付近であるはずであると予測される。したがって80kDa付近の一つのバンドだけの観察結果はこの精製ポリペプチドの集団が全長ポリペプチドだけからなっていることを示し、以前認められたC末端部分での切断がポリペプチドのこの集団においてはもはや生じていないことを示唆している。これは、膜を抗Hisタグ抗体で探索し(レーンA)、80kDa付近の同一バンド(ポリペプチドのC末端が存在することを示す)を観察することによって確認された。
【０１８９】
-同様の結論が、ポリペプチドgB-SLP12-Delta725に関して図14Dに示すウエスタンブロットから得られた。レーンDは、一つのバンド(80kDa付近)だけを認識する抗gB抗体で探索した膜を表す。アミノ酸824個を含むこのポリペプチドの予測される平均分子量も79kDaであるはずである。レーンCは、抗Hisタグ抗体で探索した膜を表し、同様に80kDa付近の一つのバンドだけを認識し、ポリペプチドのC末端が存在することを示している。
【０１９０】
-ポリペプチドは脱グリコシル化の過程で沈殿する場合があり、不完全な脱グリコシル化を生じる場合がある。脱グリコシル化が不完全である場合、いくらかのポリペプチドはそのグリコシル化形態で残り、その形態は典型的には(図14C及び14Dに示すウエスタンブロットでのポリペプチドgB-SLP12-Delta113及びgB-SLP12-Delta725に関して観察されるように)ゲル中を拡散して移動する。
【０１９１】
結論
図14に示すデータは、ポリペプチドgB-DeltaTM及びgB-SLP12のポリペプチドのC末端部分で生じるクリッピングが細胞質ドメインの少なくとも一部を除去すると生じないことを示している。
【０１９２】
[実施例5]
ポリペプチドgB-SLP12-Delta725のN末端不均一性
図12Aに示すとおり、CMV gB-SLP12-Delta725ポリペプチドは、細胞中で組換え発現されると、N末端で不均一である成熟ポリペプチドの集団を生じる。実際にシグナルペプチダーゼは、示すとおり異なるアミノ酸位置でシグナル配列を切断する。この現象はシグナルペプチダーゼの「ゆらぎ(woobling)」とも称される。
【０１９３】
5.1  発現及び精製
実施例1に記載のとおりHisタグを含有するgB-SLP12-Delta725、gB-SLP12-Delta725-LVL759、gB-SLP12-Delta725-LVL776及びgB-SLP12-Delta725-CD33ポリペプチドを実施例2に記載のとおり組換え発現させた。形質移入後6日目に培養上清を回収した。EDTA-free protease inhibitor cocktail(Roche、No.11873580001)を上清に添加し、NaCl濃度を500mMに、最終pHを8.3に調整した。IMAC sepharose 6 FF(GE Healthcare)を直径5cmのガラスカラム(Waters)に詰めた。カラムを5カラム容積の結合緩衝液(10mM Tris、500mM NaCl、10mMイミダゾール、pH8.3)で平衡化した。上清を平衡化したカラムに流速10ml/分でロードした。未結合物質を2カラム容積の上の結合緩衝液で洗浄した。50mlの画分で回収した。カラムを追加的に2カラム容積の上の結合緩衝液でさらに洗浄した。10mlの画分で回収した。カラムに結合したタンパク質を6カラム容積の溶出緩衝液(Tris、500mM NaCl、350mMイミダゾール、pH8.30)で溶出した。10mlの画分で回収した。画分をSDS-PAGEゲルにロードし、陽性画分をプールし、Centricon Ultrafiltration device(Millipore)で濃縮した。濃縮したタンパク質をRCDC modified Lowry colorimetric assay(Biorad)で定量した。5から10μgの精製タンパク質をN-グリコシダーゼF脱グリコシル化キット(Roche,No.11836552001)を製造者の説明書に従って用いて脱グリコシル化した。脱グリコシル化タンパク質をRCDC precipitation reactant (BioRad)によって沈殿させ、SDS-PAGE還元ローディング緩衝液に再懸濁し、SDS-PAGEにロードした。脱グリコシル化タンパク質に対応する位置に移動したタンパク質バンドをトリプシン消化及びMS/MSペプチドマッピング分析のために切った。
【０１９４】
5.2  トリプシン消化
精製タンパク質を含有するゲル片をアセトニトリル(ACN)で脱水した。タンパク質を還元緩衝液(10mM DTT、100mM重炭酸アンモニウム)を添加することによって30分間、40℃で還元し、アルキル化緩衝液(55mMヨードアセトアミド、100mM重炭酸アンモニウム)を添加することによって20分間、40℃でアルキル化した。次いでゲル片を、(すべての試薬を除去する前に)ACNを添加することによってさらに5分間、40℃で脱水及び洗浄した。次いでゲル片を5分間、40℃乾燥し、次いでトリプシン溶液(6ng/μlのトリプシン配列決定グレード(Promegaから)、25mM重炭酸アンモニウム)で4℃、40分間再水和させた。タンパク質消化を、58℃、1時間実施し、1%ギ酸及び2% ACNの混合液15μlで停止させた。上清を96ウエルプレートに移し、トリプシン消化ペプチドの抽出を室温で抽出緩衝液(1%ギ酸及び50% ACN)を用いる2回の30分間抽出ステップで実施した。すべての抽出ペプチドを96ウエルプレートにプールし、次いで真空遠心分離で完全に乾燥させた。プレートをシールし、LC-MS/MS分析へのさらなるプロセスまで-20℃で保存した。
【０１９５】
5.3  質量分析
LC-MS/MS分析の前に、抽出ペプチドを0.2%ギ酸12μl中で15分間撹拌して再溶解し、次いで2000rpm、1分間遠心分離した。LCカラムは、高圧充填セルで充填したC18逆相カラムである。長さ100mmの75lm i.d.フューズドシリカキャピラリーにC18 Jupiter 5 lm300Åreverse-phase material (Phenomenex)を充填した。このカラムをnano LC-2Dシステム(Eksigent)に設置し、LTQ Orbitrap (ThermoFisher Scientific)に繋いだ。クロマトグラフィーに用いた緩衝液は、0.2%ギ酸(緩衝液A)及び100%ACN/0.2%ギ酸(緩衝液B)であった。最初の12分間、試料5μlを流速650nl/分でカラムにロードし、続いて緩衝液Bを20分間で2-80%にし、次いで10分間で緩衝液Bを2%に戻す勾配をかけた。LC-MS/MSデータ取得をOrbitrapで取得されたスキャンイベント1についての完全スキャンMSからなす4スキャンイベントサイクルを用いて遂行した。
【０１９６】
結果
-図12は、検査したさまざまなポリペプチドのシグナル配列の切断部位に生じたシグナルペプチダーゼの「ゆらぎ」の定量的評価の結果を示す。シグナルペプチダーゼのゆらぎは、表示のポリペプチドの各集団内でそれらのN末端が異なるアミノ酸から始まるさまざまな成熟ポリペプチド形態の生成をもたらす。
【０１９７】
-図12Aは、全タンパク質抽出物のトリプシン消化後に続く、MS/MSによるN末端を含む得られたペプチドの相対的定量を示し、gB-SLP12-Delta725ポリペプチドの集団が(シグナル配列の切除後に)表示のとおりそれぞれ異なるアミノ酸で始まる比較的等量の割合(約10%から約30%の範囲)の五つの異なるポリペプチド形態として溶液内に主に存在したことを認めた。
【０１９８】
-図12B及び12Cは、それぞれgB-SLP12-Delta725-LVL759及びgB-SLP12-Delta725-LVL776の集団に存在するポリペプチドのさまざまな形態のMS/MS相対的定量の同様の分析を示す。これら二つのポリペプチドの集団は(シグナル配列の切除後に)99%より高い百分率で一つの主なポリペプチドの形態(それぞれ配列番号14に記載の配列の位置23のアミノ酸で及び配列番号16に記載の配列の位置24のアミノ酸で始まる)として溶液内に主に存在したことが認められた。二つの代替的切断部位がシグナルペプチダーゼによって切断され、ポリペプチドのそれぞれの集団内のわずか1%未満を表すN末端に別のアミノ酸を有する二つの追加的ポリペプチド形態を生成する。
【０１９９】
-図12Dは、gB-SLP12-Delta725-CD33ポリペプチドの集団に存在するポリペプチドのさまざまな形態のMS/MS相対的定量の同様の分析を示す。この集団は(シグナル配列の切除後に)99%より高い百分率で一つの主なポリペプチドの形態(配列番号18に記載の配列の位置18のアミノ酸で始まる)として溶液内に主に存在したことが認められた。他の切断部位がシグナルペプチダーゼによって切断され、gB-SLP12-Delta725-CD33ポリペプチドの集団内のわずか1%未満を表すN末端に別のアミノ酸を有する一つの追加的ポリペプチド形態を生成する。
【０２００】
結論
これらの結果は、シグナルペプチダーゼが一貫して一つの主な切断部位だけを認識することから、gB-SLP12-Delta725-LVL759、gB-SLP12-Delta725-LVL776及びgB-SLP12-Delta725-CD33ポリペプチドではもはやゆらぎは生じなかったことを示している。これは、gBポリペプチドのシグナル配列及びリーダー配列になされた改変が、顕著な肯定的影響を成熟ポリペプチド集団の不均一性に有し、前記ポリペプチド集団を、99%を超える程度に均一にしたことを示唆している。
【０２０１】
[実施例6]
本発明の例示的CMV gBポリペプチドを含有する免疫原性組成物の免疫原性
C末端Hisタグを含み、節で記載されたとおり発現及び精製された次のポリペプチドgB-DeltaTM、gB-SLP12、gB-SLP12-Delta113、gB-SLP12-Delta725、LVL759、LVL776及びCD33を含有する免疫原性組成物の免疫原性を次のとおり検査した。
【０２０２】
6.1  実験設計
C57BL/6マウス10匹の群を21日間隔での2回投与で上記の例示的免疫原性組成物(表1に示す)でワクチン接種した。免疫処置は、筋肉内に行った(合計容積50μ中でリポソーム製剤中に各gBポリペプチド1.5μgを、2.5μgの3D-MPL及び2.5μgのQS21を含むアジュバント系ASAでアジュバント化した)。
【表１】
2013544074.tif 000002
【０２０３】
免疫原性は、免疫処置1の21日後及び免疫処置2の14日後での中和(NT)アッセイ及びELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay))によって測定されるワクチン接種への体液性免疫応答を分析することによって評価した(6.3節及び6.4節をそれぞれ参照されたい)。
【０２０４】
6.2  統計的分析
C57BL/6マウス10匹の群を初期読み取りで2倍の差異を有する90%の検出力を得るように設計した。統計的分析を免疫処置2の14日後のデータにUNISTATを用いて実施した。分散の分析のために適用したプロトコールは次のとおり簡潔に記載され得る:データの対数変換;正規性を検証するための各集団(群)でのシャピロ・ウイルク検定;異なる集団(群)間の分散の均一性を検証するためのコクラン検定;選択されたデータについての分散分析(ANOVA 1又は2);多重比較のためのチューキー-HSD検定。
【０２０５】
6.3  中和アッセイ
アッセイの前に、MRC5細胞を96ウエルプレートに播種し、3日間、37℃でインキュベートした。熱不活性化血清の系列希釈物を一定量のヒトCMV AD169ウイルスと1時間、37℃でインキュベートした。インキュベーション後、血清とウイルスとの混合物を、MRC5細胞を含む96ウエルプレートに添加した。プレートを2000rpmで1時間、37℃で遠心分離した。一晩37℃でインキュベーションした後、プレートを80%アセトン溶液で固定した(20-30分間、4℃)。アセトン溶液を除去し、CMV陽性ウエルを特異的モノクローナルビオチンコンジュゲート抗初期I(IE-I)抗体を用いて1時間、37℃で検出した。プレートをPBSで3回洗浄した。洗浄後、ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼを追加的に30分間、37℃で添加した。プレートを3回洗浄し、True-Blue溶液と10分間インキュベートした。特異的な有色シグナルを顕微鏡下の目視検査によって記録した。中和力価を、血清を含まないウイルス投与対照と比較して、CMV陽性ウエルの数を50%低下させる血清の最も高い希釈度の逆数として表した。
【０２０６】
結果
中和抗体応答を最初の免疫処置の21日後及び2回目の免疫処置の14日後に収集した血清試料について測定した。試料をヒトCMV AD169に対するそれらの中和活性に関して検査した。結果を図15Aに示す。検査したすべてのポリペプチドは、免疫処置2の14日後に有意な応答を誘導した(灰色バーを参照されたい)。gB-SLP12、gB-SLP12-Delta113、gB SLP12-Delta725及びLVL759は、gB-DeltaTMと有意には*異ならない力価を誘導した。CD33(p-値:0.0006)及びLVL776(p-値:0.0116)は、gB-DeltaTMより有意に低い力価を誘導した。
【０２０７】
*p-値≧0.05→統計的に異ならない(95%の信頼で)。
【０２０８】
**p-値<0.05→統計的に異なる。
【０２０９】
6.4 ELISAアッセイ
抗gB抗体の定量をコーティング抗原としてgB**と称するgBポリペプチド(EP0759995に記載)を用いてELISAによって実施した。抗原をPBS中に最終濃度4μg/mlに希釈し(100μl/ウエル)、96ウエルプレートで一晩、4℃でインキュベートした。次いでプレートを1%ウシ血清アルブミンを含有するPBS 200μlで1時間、37℃で飽和させた。血清の2倍希釈系列をウエルに添加し(100μl/ウエル)、1時間30分、37℃でインキュベートした。プレートをPBS/0.1% Tween 20で4回洗浄した。100μlのビオチン-コンジュゲート抗マウスIgを各ウエルに添加し、1時間、37℃でインキュベートした。PBS/0.1% Tween 20での4回洗浄後、100μlのストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼを添加し、追加的に30分間、37℃でインキュベーション。プレートをPBS/0.1% Tween 20で4回及び水で1回洗浄した。次いでプレートを0.1クエン酸緩衝液pH5.8中の75%テトラメチルベンジジンの100μlと10分間、22℃でインキュベートした。この反応を100μlの0.4N H2SO4で停止し、比色定量を分光光度計450/620nmで読み取った。濃度が既知である精製gB-DeltaTMの以前のロットをこの実験における標準として用いた。ソフトウエアSoftMax Proを用いて、ELISA力価を決定し、ELISA Unit/mlで表した。
【０２１０】
結果
ELISA力価を最初の免疫処置の21日後及び2回目の免疫処置の14日後に回収した血清試料について測定した。結果を図15Bに示す。検査したすべてのポリペプチドは、免疫処置2の14日後に有意な応答を誘導した(灰色バーを参照されたい)。gB-SLP12-Delta113及びgB SLP12-Delta725は、gB-DeltaTMによって誘導された力価と有意には*異ならない力価を誘導した。gB-SLP12、CD33、LVL759及びLVL776は有意には*異ならない力価を誘導した。gB-DeltaTMは、gB-SLP12(p-値:0.0002)、CD33(p-値:0.0226)、LVL759(p-値:0.0002)及びLVL776(p-値:0.0001)より有意に高い力価を誘導した。
【０２１１】
*p-値≧0.05→統計的に異ならない(95%の信頼で)。
【０２１２】
**p-値<0.05→統計的に異なる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１６−５】
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【図１６−６】
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【図１６−７】
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【図１６−８】
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【図１６−９】
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【図１６−１０】
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【図１６−１１】
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【図１６−１２】
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【図１６−１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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