(57)【要約】本開示は、細胞毒性化学療法剤、放射線療法または両方との併用での脳転移の予防または処置における使用のためのエンドセリン受容体拮抗薬に関する。そのエンドセリン受容体拮抗薬は、例えばボセンタン、マシテンタンまたはボセンタンおよびマシテンタンの混合物であってよい。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞毒性化学療法剤、放射線療法、または両方との併用での、脳転移の予防または処置における使用のためのエンドセリン受容体拮抗薬。
【請求項２】
二重エンドセリン受容体拮抗薬である、請求項１に記載の脳転移の予防または処置における使用のためのエンドセリン受容体拮抗薬。
【請求項３】
ボセンタン、マシテンタンならびにボセンタンおよびマシテンタンの混合物からなるグループから選択される、請求項１または２に記載の脳転移の予防または処置における使用のためのエンドセリン受容体拮抗薬。
【請求項４】
それによりそのエンドセリン受容体拮抗薬がボセンタン、マシテンタンおよびそれらの混合物からなるグループから選択され、それが細胞毒性化学療法剤と共に用いられることが意図されている、請求項１〜３の内の１項に記載の脳転移の予防または処置における使用のためのエンドセリン受容体拮抗薬。
【請求項５】
その細胞毒性化学療法剤がパクリタキセル、テモゾロミドならびにパクリタキセルおよびテモゾロミドの混合物からなるグループから選択される、請求項４に記載の脳転移の予防または処置における使用のためのエンドセリン受容体拮抗薬。
【請求項６】
そのエンドセリン受容体拮抗薬がボセンタン、マシテンタンならびにボセンタンおよびマシテンタンの混合物からなるグループから選択される、請求項４に記載の脳転移の予防または処置における使用のためのエンドセリン受容体拮抗薬。
【請求項７】
星状細胞に仲介される脳転移細胞の細胞毒性化学療法に誘導される細胞死からの保護を阻害する方法であって、その方法が有効量のエンドセリン受容体拮抗薬を脳転移細胞および星状細胞に投与して星状細胞に仲介される保護を阻害する工程を含む、前記方法。
【請求項８】
星状細胞に仲介される脳転移細胞の細胞毒性化学療法に誘導される細胞死からの保護を阻害する方法であって、その方法が、有効量のエンドセリン受容体拮抗薬を脳転移細胞および星状細胞に投与して星状細胞に仲介される保護を阻害し、さらにその脳転移細胞を細胞毒性化学療法に誘導される細胞死に対して過敏化する工程を含む、前記方法。
【請求項９】
さらに少なくとも１種類の細胞毒性化学療法剤を脳転移細胞に投与する工程を含む、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
その脳転移細胞が対象中の既存の脳転移腫瘍中に含まれるか、またはその脳転移細胞が単離された細胞であるかのどちらかである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
その細胞毒性化学療法剤がパクリタキセル、ドキソルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、５−フルオロウラシル、シスプラチン、シクロフォスファミド、エトポシド、テニポシド、マイトマイシン、イリノテカン、ビノレルビン、イホスファミドおよび／またはテモゾロミドの少なくとも１種類である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
そのエンドセリン受容体拮抗薬がマシテンタン、シタキセンタン、テゾセンタン、クラゾセンタン、アブリセンタン（ａｂｂｒｉｓｅｎｔａｎ）、ボセンタンおよび／またはアトラセンタンの内の１種類以上である、請求項７〜１１の内の１項に記載の方法。
【請求項１３】
その対象がヒトであり、場合によりさらにそのヒトの対象において既存の脳転移腫瘍のケア緩和および／または療法処置の標準を施す工程を含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
ケア療法処置の標準が与えられ、そのケア療法処置の標準が全脳放射線療法または定位放射線手術の一方または両方である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
対象において既存の脳転移腫瘍を処置する方法であって、前記の対象にエンドセリン受容体拮抗薬および少なくとも１種類の細胞毒性化学療法剤の組み合わせを投与することを含む、前記方法。
【請求項１６】
ヒト癌転移細胞脳腫瘍を有するマウスであって、そのマウスがさらにａ）そのヒト癌転移脳腫瘍を処置するのに療法的に有効な量の少なくとも１種類の細胞毒性化学療法剤およびｂ）星状細胞に仲介されるヒト癌転移脳腫瘍の保護を阻害するのに十分な量の少なくとも１種類のエンドセリン受容体拮抗薬を含む、前記マウス。
【請求項１７】
単離された星状細胞が単離された癌細胞とギャップ結合コミュニケーションしている、単離された星状細胞−癌細胞複合体。
【請求項１８】
その単離された星状細胞がマウスの星状細胞であり、その単離された癌細胞がヒトの癌細胞である、請求項１７に記載の単離された星状細胞−癌細胞複合体。
【請求項１９】
その単離された癌細胞株の細胞がＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＰＣ１４Ｂｒ４である、請求項１８に記載の単離された星状細胞−癌細胞複合体。
【請求項２０】
ａ）単離された星状細胞を提供し、ｂ）癌細胞を提供し、ｃ）その提供された細胞を、その細胞の間でギャップ結合が形成されるのに十分な時間の間共培養し、それにより星状細胞−癌細胞複合体が形成される工程を含む、単離された星状細胞−癌細胞複合体を形成する方法。
【請求項２１】
その単離された星状細胞がマウスの星状細胞であり、その単離された癌細胞がヒトの癌細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
その単離された癌細胞株がＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＰＣ１４Ｂｒ４である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
さらに１種類以上の候補化学療法剤を添加してその化学療法剤の細胞毒性作用に対する星状細胞に仲介される保護の程度を評価する工程を含む、請求項２０、２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
さらに分子診断工程を実施してその化学療法剤の細胞毒性作用に対する星状細胞に仲介される保護に対応する分子プロフィールの同定を提供する工程を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
その分子診断工程が差次的遺伝子発現測定または差次的細胞タンパク質濃度測定の内の１種類以上である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
その差次的遺伝子発現測定が遺伝子チップを用いて実施される、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
脳転移は腫瘍学が直面している最も困難な問題の１つである。転移性腫瘍はほとんどの化学療法剤に抵抗性である。脳転移の処置は主に全脳および焦点放射線療法であり、少数の症例において腫瘍の外科的切除である。ほとんどの化学療法計画は２〜３種類の薬剤、例えばシスプラチン、シクロフォスファミド、エトポシド、テニポシド、マイトマイシン、イリノテカン、ビノレルビン、エトポシド、イホスファミド、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）およびフルオロウラシル（５−ＦＵ）を含む。これらは放射線療法と組み合わせて投与される。これらの化学療法の生存の延長への効果は一般に１年未満である。脳腫瘍に関するかなり新しい化学療法は、全脳照射と共に用いられるテモゾロミドである。結果は予備段階であるが、テモゾロミドは放射線照射単独と比較して奏効率にいくらかの限られた効果を有するようであり、第ＩＩ相試験において放射線照射との併用でいくらかの臨床活性を有するようである。
【０００２】
熱心な努力にも関わらず、脳転移に関して利用可能な限られた医学の選択肢は乏しいままであり、療法的に有効であるよりも一時しのぎである場合が多すぎる。この状況は長く認識されてきたが、現在までに著しい進歩は実現していない。従って、脳転移の処置において有効な新規の療法的アプローチおよび医薬に関する大きな、および目下の医学的必要性が存在する。
【０００３】
下記の開示は、脳転移に関するエンドセリン受容体拮抗薬を論じる。血管作動性ペプチドであるエンドセリン−１（以下“ＥＴ−１”）は、主に内皮、血管平滑筋、および上皮細胞において産生される。ＥＴ−１は２種類の高親和性Ｇタンパク質共役型受容体であるエンドセリン−Ａ（以下“ＥＴＡ”）およびエンドセリン−Ｂ（以下“ＥＴＢ”）受容体を介してその生理的作用を及ぼす。エンドセリン受容体拮抗薬（ＥＲＡ）は、これらのエンドセリン受容体（以下“ＥＴＲ”）を阻害することができる十分に確立されたクラスの化合物である。このクラス内にあるのが、ＥＴＡまたはＥＴＢに特異的な拮抗薬のサブクラスおよび両方に対して有効な（二重特異性）サブクラスである。その二重特異性サブクラスの１つのメンバーであるボセンタン（ｂｏｓｅｎｔａｎ）は、肺動脈高血圧の処置における使用に関して現在承認されている。
【０００４】
特定のＥＲＡが癌療法における使用に関して調べられた。[Nelson JB, et al., 非転移性のホルモン不応性前立腺癌を有する患者における、アトラセンタンの第３相のランダム化され制御された試験。Cancer, 2008 Nov 1;113(9):2376-8.；Chiappori AA, et al. 進行性非小細胞肺癌における第一選択療法としての、パクリタキセルおよびカルボプラチンとの併用での、ＥＴＡ受容体拮抗薬であるアトラセンタンの第Ｉ／ＩＩ相試験。Clin Cancer Res, 2008 Mar 1; 14(5): 1464-9.]これらの試験は、活性な脳転移を有する患者を大部分除外してきた。同誌。この除外は、既存の脳転移は処置に反応しないと考えられ、従ってこれらの転移による死亡率および症状が原発腫瘍に対する試験処置の効果を見えなくするであろうという一般的な見解に基づいてなされた。[Carden CP, et al., 第Ｉ相試験に関する脳転移を有する患者の適格性：再考すべき時か？ The Lancet Oncology, Vol 9, Issue 10, Pages 1012-1017, October 2008 doi:10.1016/S1470-2045(08)70257-2.]この標準的な臨床試験設計戦略は、原発腫瘍およびさらには非脳転移腫瘍に対して有効な療法は脳転移腫瘍に影響を及ぼす（ｅｆｆｅｃｔ）のに失敗するであろうという一般的な予想を強調する役目を果たす。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Nelson JB, et al., 非転移性のホルモン不応性前立腺癌を有する患者における、アトラセンタンの第３相のランダム化され制御された試験。Cancer, 2008 Nov 1;113(9):2376-8.
【非特許文献２】Chiappori AA, et al. 進行性非小細胞肺癌における第一選択療法としての、パクリタキセルおよびカルボプラチンとの併用での、ＥＴＡ受容体拮抗薬であるアトラセンタンの第Ｉ／ＩＩ相試験。Clin Cancer Res, 2008 Mar 1; 14(5): 1464-9.
【非特許文献３】Carden CP, et al., 第Ｉ相試験に関する脳転移を有する患者の適格性：再考すべき時か？ The Lancet Oncology, Vol 9, Issue 10, Pages 1012-1017, October 2008 doi:10.1016/S1470-2045(08)70257-2.
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞（Ｔ）およびマウス星状細胞（Ａ）のインビトロ培養物を、走査電子顕微鏡により評価した。星状細胞（ポッドフット（ｐｏｄｓ−ｆｅｅｔ）を伸ばしている）と腫瘍細胞の間の直接的な接触は明らかである；
【図２】図２：星状細胞−転移癌細胞の共培養は、共培養された細胞間での染料の移動を示した；
【図３】図３：ヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞またはヒトＰＣ１４Ｂｒ４肺癌細胞を星状細胞と共に培養すると、パクリタキセル（５ｎｇ／ｍｌ）と共に７２時間培養した腫瘍細胞の相対的アポトーシス指数がそれぞれ５８．３＋８．９％（平均±標準偏差、Ｐ＜０．０１）および６１．８±６．７％（平均±標準偏差、Ｐ＜０．０５）低減した（耐性が増大した）（が、３Ｔ３線維芽細胞と共に培養しても低減しなかった）（アポトーシス指数はスチューデントのｔ検定により比較された）；
【図４】図４：ヒト肺癌ＰＣ１４Ｂｒ４細胞を、単独で、または星状細胞と共に（直接的な細胞間接触）、Ｐ−糖タンパク質と会合するアドリアマイシン（２００ｎｇ／ｍｌ）、パクリタキセル（５ｎｇ／ｍｌ）、ビンブラスチン（３ｎｇ／ｍｌ）、ビンクリスチン（８ｎｇ／ｍｌ）、およびＰ−糖タンパク質と解離する５−ＦＵ（５００ｎｇ／ｍｌ）またはシスプラチナム（２．４μｇ／ｍｌ）を含有する培地中で培養した；
【図５】図５：星状細胞に仲介される脳転移細胞の細胞毒性化学療法に誘導される細胞死からの保護は、直接的な星状細胞−脳転移細胞の接触が失われた後７２時間より長くは続かない；
【図６】図６：マウスおよびヒトのｍＲＮＡの間で相違が示された遺伝子転写プロファイリングの状況；
【図７】図７：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において１０６９個の遺伝子が、およびＰＣ１４Ｂｒ４細胞において５９４個の遺伝子が差次的に発現していた。２つの遺伝子リストの比較は、抗アポトーシスおよび生存と関係することが周知であるいくつかの遺伝子：グルタチオンＳトランスフェラーゼ５（ＧＳＴＡ５）、ＢＣＬ２Ｌ１、ＴＷＩＳＴの増大した発現を明らかにした；
【図８】図８：いくつかの抗アポトーシスおよび生存遺伝子の発現を、ウェスタンブロット分析によりタンパク質レベルで確かめた；
【図９】図９：２サイクルの共培養実験から遺伝子転写データを収集した；
【図１０】図１０：星状細胞と共培養したＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞において増大したが、線維芽細胞（３Ｔ３）とでは増大しなかったＥＴＡ−Ｒの発現；
【図１１】図１１：星状細胞／タキソールと共培養したＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞によるｐＡＫＴの発現；
【図１２】図１２：単独で、または星状細胞と共に、または３Ｔ３線維芽細胞と共にＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞に添加されたＡＣＴ−０６４９９２は、測定可能な細胞毒性作用を全くもたらさなかった；
【図１３】図１３：単独で、または星状細胞と共に、または３Ｔ３線維芽細胞と共にＰＣ１４肺癌細胞に添加されたＡＣＴ−０６４９９２は、測定可能な細胞毒性作用を全くもたらさなかった；
【図１４Ａ】図１４Ａ〜Ｄ：転移性脳癌に関するいくつかのインビボ実験モデルにおけるＥＴＡＲおよびＥＴＢＲに関する免疫染色は、腫瘍と特異的に関係し、正常な脳組織とは関係しない、比較的高い発現を示す；
【図１４Ｂ】図１４Ａ〜Ｄ：転移性脳癌に関するいくつかのインビボ実験モデルにおける、ＥＴＡＲおよびＥＴＢＲに関する免疫染色は、腫瘍と特異的に関係し、正常な脳組織とは関係しない、比較的高い発現を示す；
【図１４Ｃ】図１４Ａ〜Ｄ：転移性脳癌に関するいくつかのインビボ実験モデルにおける、ＥＴＡＲおよびＥＴＢＲに関する免疫染色は、腫瘍と特異的に関係し、正常な脳組織とは関係しない、比較的高い発現を示す；
【図１４Ｄ】図１４Ａ〜Ｄ：転移性脳癌に関するいくつかのインビボ実験モデルにおける、ＥＴＡＲおよびＥＴＢＲに関する免疫染色は、腫瘍と特異的に関係し、正常な脳組織とは関係しない、比較的高い発現を示す；
【図１５】図１５：星状細胞と、または３Ｔ３線維芽細胞と共培養されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞に対する、パクリタキセルおよびＡＣＴ−０６４９９２の併用療法；
【図１６】図１６：星状細胞と、または３Ｔ３線維芽細胞と共培養されたヒト肺癌細胞ＰＣ１４Ｂｒ４に対するパクリタキセルおよびＡＣＴ−０６４９９２の併用療法；
【図１７】図１７：星状細胞および腫瘍細胞の共培養物へのＡＣＴ−０６４９９２の添加は、生存因子ｐＡＫＴおよびｐＭＡＰＫの発現を阻害した；
【図１８Ａ】図１８：脳転移の可視化のために、脳切片を固定し、染色した。対照（ビヒクル）（図１８Ａ）；テモゾロミド（“ＴＭＺ”）、毎日経口で１０ｍｇ／ｋｇ（図１８Ｂ）；ＡＣＴ−０６４９９２、毎日経口で５０ｍｇ／ｋｇ（図１８Ｃ）；またはＴＭＺ＋ＡＣＴ−０６４９９２の併用（図１８Ｄ）；より高い倍率でのＴＭＺ＋ＡＣＴ−０６４９９２の併用（図１８Ｅ）；
【図１８Ｂ】図１８：脳転移の可視化のために、脳切片を固定し、染色した。対照（ビヒクル）（図１８Ａ）；テモゾロミド（“ＴＭＺ”）、毎日経口で１０ｍｇ／ｋｇ（図１８Ｂ）；ＡＣＴ−０６４９９２、毎日経口で５０ｍｇ／ｋｇ（図１８Ｃ）；またはＴＭＺ＋ＡＣＴ−０６４９９２の併用（図１８Ｄ）；より高い倍率でのＴＭＺ＋ＡＣＴ−０６４９９２の併用（図１８Ｅ）；
【図１８Ｃ】図１８：脳転移の可視化のために、脳切片を固定し、染色した。対照（ビヒクル）（図１８Ａ）；テモゾロミド（“ＴＭＺ”）、毎日経口で１０ｍｇ／ｋｇ（図１８Ｂ）；ＡＣＴ−０６４９９２、毎日経口で５０ｍｇ／ｋｇ（図１８Ｃ）；またはＴＭＺ＋ＡＣＴ−０６４９９２の併用（図１８Ｄ）；より高い倍率でのＴＭＺ＋ＡＣＴ−０６４９９２の併用（図１８Ｅ）；
【図１８Ｄ】図１８：脳転移の可視化のために、脳切片を固定し、染色した。対照（ビヒクル）（図１８Ａ）；テモゾロミド（“ＴＭＺ”）、毎日経口で１０ｍｇ／ｋｇ（図１８Ｂ）；ＡＣＴ−０６４９９２、毎日経口で５０ｍｇ／ｋｇ（図１８Ｃ）；またはＴＭＺ＋ＡＣＴ−０６４９９２の併用（図１８Ｄ）；より高い倍率でのＴＭＺ＋ＡＣＴ−０６４９９２の併用（図１８Ｅ）；
【図１８Ｅ】図１８：脳転移の可視化のために、脳切片を固定し、染色した。対照（ビヒクル）（図１８Ａ）；テモゾロミド（“ＴＭＺ”）、毎日経口で１０ｍｇ／ｋｇ（図１８Ｂ）；ＡＣＴ−０６４９９２、毎日経口で５０ｍｇ／ｋｇ（図１８Ｃ）；またはＴＭＺ＋ＡＣＴ−０６４９９２の併用（図１８Ｄ）；より高い倍率でのＴＭＺ＋ＡＣＴ−０６４９９２の併用（図１８Ｅ）；
【図１９】図１９：脳転移の可視化のために、脳切片を固定し、染色した。Ａ．対照（ビヒクル溶液を注入）；Ｂ．パクリタキセル（１週につき１回腹腔内に８ｍｇ／ｋｇを投与）；Ｃ．ＡＣＴ−０６４９９２（１日につき１回経口で５０ｍｇ／ｋｇを投与）；ならびにＤ．ＡＣＴ−０６４９９２およびパクリタキセルの併用；
【図２０】図２０：４つの処置グループからの代表的な脳組織薄片を、ＣＤ３１（内皮細胞のマーカー）およびＫｉ６７（細胞増殖のマーカー）に関して染色した：Ａ．対照のマウス；Ｂ．パクリタキセルのみで処置したマウス；Ｃ．ＡＣＴ−０６４９９２；Ｄ．パクリタキセルおよびＡＣＴ−０６４９９２；
【図２１】図２１：異なる処置グループからのマウスの脳組織薄片（ｓｉｃｅｓ）を、インサイチュでの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）により分析した：Ａ．対照；Ｂ．パクリタキセルで処置した；Ｃ．ＡＣＴ−０６４９９２で処置した；Ｄ．ＡＣＴ−０６４９９２＋パクリタキセルの併用；
【図２２】図２２：４つの処置グループからのマウスの脳組織薄片を、ＥＴＡ（赤）およびホスホセリン（緑）に関して免疫染色し、同時局在は橙〜黄色をもたらした。Ａ．対照の脳；Ｂ．パクリタキセルで処置したマウスからの脳；Ｃ．ＡＣＴ−０６４９９２のみで処置したマウスからの脳；Ｄ．ＡＣＴ−０６４９９２＋パクリタキセルで処置したマウスからの脳。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
定義
本明細書で用いられる際、“ａ”または“ａｎ”という単語の使用は、特許請求の範囲および／または明細書中で用語“含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”と共に用いられた場合、“１”を意味してよいが、それは“１以上”、“少なくとも１”、および“１または１より多く”の意味とも一致する。さらに、用語“有する”、“含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）”、“含まれる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）”および“含む”は互いに交換可能であり、当業者はこれらの用語が拡張可能な（ｏｐｅｎ  ｅｎｄｅｄ）用語であることを認識している。
【０００８】
用語“処置する”および“処置”は、本明細書で用いられる際、対象に療法的に有効な医学的介入、例えば化学療法を、その対象が癌に関するパラメーターにおける改善を有するように施すことを指す。その改善は、癌、腫瘍の大きさの変化、癌、腫瘍の成長の速度、または癌、腫瘍と関係する痛みの主観的もしくは客観的な測定における低減が含まれる、あらゆる観察可能または測定可能な改善である。従って、当業者は、処置は患者の状態を改善することができるがその疾患の完全な治癒でなくてもよいことを理解する。
【０００９】
用語“有効量”または“療法上有効量”は、本明細書で用いられる際、結果としてその疾患または病気の症状の改善または治療をもたらす量を指す。
用語“既存の脳転移腫瘍”は、本明細書で用いられる際、ＧＦＡＰ陽性星状細胞に取り囲まれ、浸潤されている多細胞脳腫瘍および脳転移を指す。既存の脳転移腫瘍は、２つの臨床的に異なるタイプである微小転移巣（小さすぎて放射線医学的手段により可視化できない）および可視転移（臨床的な放射線医学的手段、例えば磁気共鳴映像法、コンピューター断層撮影法、または陽電子射出断層撮影法により識別可能であるのに十分に大きい腫瘍）からなる。これらの転移巣は、全身循環中の転移癌細胞および脳組織中に血管外遊出している、または静止してその中に存在している単一の癌細胞とは異なる。[一般に、Johanna A. Joyce & Jeffrey W. Pollard, 転移の微小環境的制御, Nat Rev Cancer 9, 239-252 (April 2009) | doi:10.1038/nrc2618を参照。]“微小転移巣”は、本明細書で用いられる際、好ましくは大きさが０．２ｍｍより大きい、および／または２００個より多くの細胞を有するものから最大幅２ｍｍまでの集密的な癌細胞のグループとして定義される。より好ましくは、“微小転移巣”は、最大幅が０．２ｍｍから２ｍｍまでの集密的な癌細胞のグループとして定義される。The AJCC Cancer Staging Manual and Handbook, 第７版 (2010), Edge, S.B.; Byrd, D.R.; Compton, CC; Fritz, A.G.; Greene, F.L.; Trotti, A. (Eds.), ISBN: 978-0-387-88440-0参照。“微小転移巣”の代わりの好ましい定義は、少なくとも１０００個の癌細胞の、最も幅広い寸法において少なくとも０．１ｍｍ〜最も幅広い寸法において１ｍｍまでの集密的なグループである。微小転移巣は一般には標準的なコントラストＭＲＩ画像化または他の臨床的な画像化技法では見えない。しかし、特定の癌において、腫瘍選択的抗原（例えば乳癌転移に関してＨｅｒ２）に向けられた放射性抗体は、微小転移巣の可視化を可能にするであろう。他の間接的検出法には、ＶＥＧＦに誘導される血管漏出による脳微小転移部位における造影剤の漏出が含まれる。Yano S; et al. (2000), 血管内皮成長因子の発現は脳転移の生成および成長に必要であるが十分ではない。 Cancer research 2000;60(17):4959-67。微小転移巣を検出するために、より高感度な画像化技法を適用することもできる。例えば、微小転移巣を検出するために、代わりの造影剤ＵＳＰＩＯ（Molday Iron, Biopal、マサチューセッツ州ウースター、Molday ION（商標）として販売されている）を用いてＭＲＩにより血液量を画像化することができる。Juan Yin J, et al. 実験的脳転移モデルにおける、抗ＶＥＧＦ療法の腫瘍細胞血管外遊出および局部血液量への機能的効果の非侵襲的画像化。 Clin Exp Metastasis. 2009;26(5):403-14. Epub 2009 Mar 11。
【００１０】
用語“星状細胞に仲介される保護”は、本明細書で用いられる際、星状細胞の、その星状細胞と直接物理的に接触している別の細胞型に関して化学物質の細胞毒性を低減する能力を指す。この物理的接触には、特にギャップ結合コミュニケーション（ＧＪＣ）を介して癌細胞に接続された星状細胞が含まれる。
【００１１】
用語“細胞毒性化学療法に誘導される細胞死”は、本明細書で用いられる際、細胞毒性化学物質によるアポトーシスまたは壊死性の細胞死の誘導を指す。ほとんどの医学的に用いられる化学療法剤は、急速に分裂する腫瘍細胞をこの方法で殺すように機能する。
【００１２】
用語“エンドセリン受容体拮抗薬”は、本明細書で用いられる際、当技術でそのようなものとして認識されているクラスの化合物を指し、特に、本特許出願において記述されている“ＥＴＡまたはＥＴＢのＩＣ５０の決定のための試験”に委ねた場合にＥＴＡに対して、ＥＴＢに対して、またはＥＴＡおよびＥＴＢの両方に対して１μＭ以下のＩＣ５０を有する化合物を指す。ＥＲＡは、エンドセリン受容体がＥＴ−１と相互作用するのを妨害する、またはＥＴＲが結合したＥＴ−１に応答するのを妨げる薬物である。２つの主な種類のＥＲＡが存在する：ＥＴＡ受容体に作用する選択的ＥＲＡ、例えばシタキセンタン（ｓｉｔａｘｅｎｔａｎ）、アンブリセンタンおよびアトラセンタン、ならびにＥＴＡおよびＥＴＢ受容体の両方に作用する二重ＥＲＡ、例えばボセンタン。ＥＲＡクラスの化合物の典型的なメンバーは、[HAM Mucke “小分子エンドセリン受容体拮抗薬：療法領域を越える特許活動の総説”IDrugs 2009 12:366-375.]において引用されている特許文献において見つけることができる。既にヒトの臨床試験において調べられた、または医学的使用に関して承認された代表的なＥＲＡには、シタキセンタン、テゾセンタン（ｔｅｚｏｓｅｎｔａｎ）、クラゾセンタン（ｃｌａｚｏｓｅｎｔａｎ）、アブリセンタン（ａｂｂｒｉｓｅｎｔａｎ）、ボセンタン、マシテンタン（ｍａｃｉｔｅｎｔａｎ）（ＡＣＴ−０６４９９２としても知られている）および／またはアトラセンタンが含まれる。
【００１３】
用語“ＥＴＡ拮抗薬”は、本明細書で用いられる際、本特許出願において記述されている“ＥＴＡまたはＥＴＢのＩＣ５０の決定のための試験”に委ねた場合にＥＴＡに対して１μＭ以下のＩＣ５０を有する化合物を指す。
【００１４】
用語“ＥＴＢ拮抗薬”は、本明細書で用いられる際、本特許出願において記述されている“ＥＴＡまたはＥＴＢのＩＣ５０の決定のための試験”に委ねた場合にＥＴＢに対して１μＭ以下のＩＣ５０を有する化合物を指す。
【００１５】
用語“二重エンドセリン受容体拮抗薬”または“二重“ＥＲＡ”は、本明細書で用いられる際、本特許出願において記述されている“ＥＴＡまたはＥＴＢのＩＣ５０の決定のための試験”に委ねた場合にＥＴＡに対して１μＭ以下のＩＣ５０およびＥＴＢに対して１μＭ以下のＩＣ５０を有する化合物を指す。二重ＥＲＡにはボセンタンおよびマシテンタンが含まれる。
【００１６】
用語“細胞毒性化学療法剤”は、本明細書で用いられる際、アポトーシスまたは壊死性の細胞死を誘導する物質を指す。本発明に従ってＥＲＡと組み合わせて用いることができる細胞毒性化学療法剤の例には、以下のものが含まれる：
・アルキル化剤（例えばメクロレタミン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、ストレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）、カルムスチン、ロムスチン、メルファラン、ブスルファン、ダカルバジン、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）またはアルトレタミン）；
・白金系薬物（例えばシスプラチン、カルボプラチンまたはオキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ））；
・代謝拮抗薬（例えば５−フルオロウラシル、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、６−メルカプトプリン、メトトレキセート、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、シタラビン、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）またはペメトレキセド（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ））；
・抗腫瘍抗生物質（例えばダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、アクチノマイシン−Ｄ、ブレオマイシン、マイトマイシン−Ｃまたはミトキサントロン）；および
・有糸分裂阻害剤（例えばパクリタキセル、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、イキサベピロン（ｉｘａｂｅｐｉｌｏｎｅ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）またはエストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ））；および
・トポイソメラーゼ阻害剤（例えばエトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、ジフロモテカン（ｄｉｆｌｏｍｏｔｅｃａｎ）またはエロモテカン（ｅｌｏｍｏｔｅｃａｎ））。
【００１７】
“過敏化”または“過敏化する”は、星状細胞の非存在下か、または星状細胞との直接的な物理的接触が無いかのどちらかである細胞において見られる細胞死を超える、星状細胞と物理的に接触した状態で細胞毒性化学療法剤（単数または複数）により引き起こされる細胞死の相対的な増大として定義される。
【００１８】
“同時に”または“同時の”は、療法的使用を指す場合、本出願において、関係する療法的使用が２種類以上の有効成分を同じ経路により同時に投与することにあることを意味する。
【００１９】
“別々に”または“別々の”は、療法的使用を指す場合、本出願において、関係する療法的使用が２種類以上の有効成分を少なくとも２つの異なる経路によりおおよそ同時に投与することにあることを意味する。
【００２０】
“ある期間にわたる”療法的投与により、本出願において、２種類以上の成分の異なる時点での投与、特にそれに従ってその有効成分の内の１種類の全投与がそれ以外の、または他の有効成分の投与が始まる前に完了する投与法を意味する。このようにして、その有効成分の内の１種類を、他の有効成分（単数または複数）を投与する前に数日、数週間または数ヶ月間投与することが可能である。この場合、同時投与は起こらない。
【００２１】
開示
脳実質において、ホメオスタシスの維持における星状細胞の役割は十分に認識されている。星状細胞は全ての血管を特殊化したエンドフィート（ｅｎｄ−ｆｅｅｔ）で包み、他の脳細胞、例えばニューロンとコミュニケーションする。この独特の構造は、星状細胞が必須栄養素、例えばグルコースおよびアミノ酸を循環から依存するニューロンへと輸送することを可能にし、星状細胞における解糖はニューロンの活動を制御していることが最近示されており、それがいわゆる“ニューロン−星状細胞代謝カップリング”である。低酸素、虚血および変性条件のような病的条件下では、星状細胞は活性化され、ＧＦＡＰと呼ばれるタンパク質を発現するであろう。ＧＦＡＰ反応性星状細胞は、ニューロンを様々な負荷から保護し、ニューロンをグルタミン酸の蓄積によりもたらされる興奮毒性から救うことが示されている。活性化された星状細胞は、ニューロンをエタノール、過酸化水素、および銅に触媒されるシステイン細胞毒性によりもたらされるアポトーシスから保護することもできる。
【００２２】
臨床での脳転移は、一般には活性化された（ＧＦＡＰ−陽性）星状細胞により取り囲まれ、浸潤される。[Yoshimine T, et al. (1985) グリア特異的タンパク質であるアストロタンパク質（ａｓｔｒｏｐｒｏｔｅｉｎ）（ＧＦＡＰ）を有する転移性脳腫瘍の免疫組織化学的研究。組織構造および血管の起源。J Neurosurg 62: 414-418.]本発明者は、この現象が下記の異物移植モデルで再現されることを確認した。
【００２３】
本発明の様々な態様を以下に示す：
１）本発明は第１に、細胞毒性化学療法剤、放射線療法、または両方との併用での、脳転移の予防または処置における使用のためのエンドセリン受容体拮抗薬に関する。
【００２４】
２）態様１）の１つの主な変形に従って、そのエンドセリン受容体拮抗薬は細胞毒性化学療法剤との併用での使用のためのものであろう。
３）態様２）の１つの下位態様（ｓｕｂ−ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）に従って、その細胞毒性化学療法剤はアルキル化剤を含むであろう（そして特にアルキル化剤であろう）。
【００２５】
４）特に、態様３）のアルキル化剤は、メクロレタミン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、ストレプトゾシン、カルムスチン、ロムスチン、メルファラン、ブスルファン、ダカルバジン、テモゾロミド、チオテパおよびアルトレタミンからなるグループから選択されるであろう。
【００２６】
５）態様２）の別の下位態様に従って、その細胞毒性化学療法剤は白金系系薬物を含むであろう（そして特に白金系系薬物であろう）。
６）特に、態様５）の白金系系薬物は、シスプラチン、カルボプラチンおよびオキサリプラチンからなるグループから選択されるであろう。
【００２７】
７）態様２）のさらに別の下位態様に従って、その細胞毒性化学療法剤は代謝拮抗薬を含むであろう（そして特に代謝拮抗薬であろう）。
８）特に、態様７）の代謝拮抗薬は、５−フルオロウラシル、カペシタビン、６−メルカプトプリン、メトトレキセート、ゲムシタビン、シタラビン、フルダラビンおよびペメトレキセドからなるグループから選択されるであろう。
【００２８】
９）態様２）のさらなる下位態様に従って、その細胞毒性化学療法剤は抗腫瘍抗生物質を含むであろう（そして特に抗腫瘍抗生物質であろう）。
１０）特に、態様９）の抗腫瘍抗生物質は、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アクチノマイシン−Ｄ、ブレオマイシン、マイトマイシン−Ｃおよびミトキサントロンからなるグループから選択されるであろう。
【００２９】
１１）態様２）の別の下位態様に従って、その細胞毒性化学療法剤は有糸分裂阻害剤を含むであろう（そして特に有糸分裂阻害剤であろう）。
１２）特に、態様１１）の有糸分裂阻害剤は、パクリタキセル、ドセタキセル、イキサベピロン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ビンデシンおよびエストラムスチンからなるグループから選択されるであろう。
【００３０】
１３）態様２）のさらに別の下位態様に従って、その細胞毒性化学療法剤はトポイソメラーゼＩＩ阻害剤を含むであろう（そして特にトポイソメラーゼＩＩ阻害剤であろう）。
１４）特に、態様１３）のトポイソメラーゼＩＩ阻害剤は、エトポシド、テニポシド、トポテカン、イリノテカン、ジフロモテカンおよびエロモテカンからなるグループから選択されるであろう。
【００３１】
１５）態様２）の好ましい下位態様に従って、その細胞毒性化学療法剤はパクリタキセル、ドキソルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、５−フルオロウラシル、シスプラチン、シクロフォスファミド、エトポシド、テニポシド、マイトマイシン−Ｃ、イリノテカン、ビノレルビン、イホスファミドおよびテモゾロミドからなるグループから（ならびに特にパクリタキセルおよびテモゾロミドから）選択されるであろう。
【００３２】
１６）特に、態様１５）の細胞毒性化学療法剤はパクリタキセル、テモゾロミドならびにパクリタキセルおよびテモゾロミドの混合物から選択されるであろう。
１７）態様１６）の好ましい変形に従って、態様１６）のエンドセリン受容体拮抗薬は、ボセンタン、マシテンタンならびにマシテンタンおよびボセンタンの混合物からなるグループから選択されるであろう（そして特にマシテンタンであろう）。
【００３３】
１８）本発明は、態様２）〜１７）の１つで言及された細胞毒性化学療法剤の少なくとも１種類との、および放射線療法との併用での使用のためのエンドセリン受容体拮抗薬にも関する。
【００３４】
１９）この発明の好ましい態様に従って、態様１）〜１８）で用いられるエンドセリン受容体拮抗薬は、二重エンドセリン受容体拮抗薬を含むであろう（そして特に二重エンドセリン受容体拮抗薬であろう）。
【００３５】
２０）特に、態様１９）の二重エンドセリン受容体拮抗薬は、ボセンタン、マシテンタンならびにボセンタンおよびマシテンタンの混合物からなるグループから選択されるであろう。
【００３６】
２１）特に好ましい態様において、態様２０）の二重エンドセリン受容体拮抗薬はマシテンタンであろう。
２２）態様１）〜２１）の１つの変形に従って、そのエンドセリン受容体拮抗薬および細胞毒性化学療法剤は別々に投与されるであろう。
【００３７】
２３）態様１）〜２１）の別の変形に従って、そのエンドセリン受容体拮抗薬および細胞毒性化学療法剤は同時に投与されるであろう。
２４）態様１）〜２１）のさらに別の変形に従って、そのエンドセリン受容体拮抗薬および細胞毒性化学療法剤はある期間をかけて投与されるであろう。
【００３８】
２５）態様１）のさらに別の主な変形に従って、そのエンドセリン受容体拮抗薬は放射線療法との併用での使用のためのものであろう（それによりこの放射線療法は好ましくは全脳放射線療法または定位放射線手術である）。
【００３９】
２６）この発明の好ましい態様に従って、態様２５）において用いられるエンドセリン受容体拮抗薬は二重エンドセリン受容体拮抗薬を含むであろう（そして特に二重エンドセリン受容体拮抗薬であろう）。
【００４０】
２７）特に、態様２６）の二重エンドセリン受容体拮抗薬は、ボセンタン、マシテンタンならびにボセンタンおよびマシテンタンの混合物からなるグループから選択されるであろう。
【００４１】
２８）特に好ましい態様において、態様２７）の二重エンドセリン受容体拮抗薬はマシテンタンであろう。
２９）この発明の別の主な変形において、態様２）〜２３）の１つに従う細胞毒性化学療法剤と共に使用するためのエンドセリン受容体拮抗薬は、放射線療法と一緒に使用するためのものであろう（それによりこの放射線療法は好ましくは全脳放射線療法または定位放射線手術である）。
【００４２】
３０）前記の態様１）〜２９）のいずれか１つ以上と組み合わせることができるこの発明の別の主な変形は、対象における既存の脳転移腫瘍の処置における使用のためのエンドセリン受容体拮抗薬であり、ここでその既存の脳転移腫瘍は微小転移腫瘍、例えば肺癌、乳癌、大腸癌、黒色腫または腎癌脳微小転移腫瘍からなるグループから選択される微小転移腫瘍である。
【００４３】
３１）本発明は、星状細胞に仲介される脳転移細胞の保護を阻害する方法にも関し、その方法は、有効量のエンドセリン受容体拮抗薬を脳転移細胞および星状細胞に投与して星状細胞に仲介される保護を阻害することを含む。
【００４４】
３２）本発明はさらに、さらに有効量の少なくとも１種類の細胞毒性化学療法剤をその脳転移細胞に投与することを含む、態様３１）の方法に関する。
３３）本発明はさらに、さらにその脳転移細胞に放射線療法を施す（それによりこの放射線療法は好ましくは全脳放射線療法または定位放射線手術である）ことを含む、態様３１）の方法に関する。
【００４５】
３４）本発明はさらに、さらに有効量の少なくとも１種類の細胞毒性化学療法剤をその脳転移細胞に投与することおよびその脳転移細胞に放射線療法を施す（それによりこの放射線療法は好ましくは全脳放射線療法または定位放射線手術である）ことを含む、態様３１）の方法に関する。
【００４６】
３５）本発明はさらに、前記の１）〜３４）のいずれかおよびそのあらゆる組み合わせに従う使用のための医薬品を製造する方法に関する。好ましくは、前記により製造される医薬品はさらに、１）〜３４）の１つ以上およびそのあらゆる組み合わせを実施するための説明書と共に商業的な包装中に包装される。
【００４７】
３６）本発明はさらに、１）〜３４）の１つ以上およびそのあらゆる組み合わせに従う、細胞毒性化学療法剤、放射線療法または両方との併用での、脳微小転移を含む脳転移の危険性の低減および／または脳転移の拡大の速度の低減における使用のためのエンドセリン受容体拮抗薬に関する。
【実施例】
【００４８】
実験１−脳転移の免疫蛍光分析
材料および方法
実験用の脳転移を、ヒト肺腺癌細胞ＰＣ１４Ｂｒ４のヌードマウスの内頚動脈中への注入により生成した（Ｓ１）。マウスを５週間後に殺し、凍結切片のために組織試料を以前に記述したようにＯＣＴ化合物中で処理した（Ｓ２）。組織を薄切し（８〜１０μｍ）、正に荷電したスライドの上にマウントし、３０分間空気乾燥させた。組織の固定を、アセトン、５０：５０（ｖ／ｖ）アセトン：クロロホルム、およびアセトンの氷冷溶液中に３回（それぞれ５分間）順次浸すことからなるプロトコルを用いて実施した。次いで試料をＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中で５％正常ウマ血清および１％正常ヤギ血清を含有するタンパク質ブロッキング溶液と共に室温で２０分間保温し、次いでウサギ抗ＧＦＡＰポリクローナル抗体（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ、カリフォルニア州コンコード）の１：４００希釈液と共に４℃で１８時間保温した。その試料をＰＢＳで４回、それぞれ３分間すすぎ、次いでヤギ抗ウサギＣｙ５抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ペンシルバニア州ウェストグローブ）の１：１５００希釈液と共に１時間保温した。対照試料を同じ濃度のアイソタイプ対照抗体およびヤギ抗ウサギＣｙ５抗体で標識した。全ての試料をすすぎ、次いでｓｙｔｏｘ緑色核酸染色剤（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）と共に短時間保温した。そのスライドを、蛍光の退色を最小限にするために、０．１ｍｏｌ／Ｌ没食子酸プロピル（Ｓｉｇｍａ）を含有するグリセロール／ＰＢＳ溶液と共にマウントした。モーター付きＡｘｉｏｐｌａｎ顕微鏡、アルゴンレーザー、ＨｅＮｅレーザー、ＬＳＭ５１０制御および画像取得ソフトウェア、ならびに適切なフィルター（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．、バーモント州ブラットルボロ）を備えたＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０レーザ走査顕微鏡システム（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，  Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ソーンウッド）上で共焦点画像を収集した。Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．カリフォルニア州マウンテンビュー）を用いて、１８個の合成画像を構築した。
【００４９】
結果
結果を免疫組織化学的に反応させた試料のカラー画像（示していない）から決定した。腫瘍細胞はＧＦＡＰ陽性の（赤）星状細胞に取り囲まれ、浸潤されていた。この実験は、以前の臨床での脳転移試料の星状細胞の浸潤の観察を確証した。ＧＦＡＰ陽性の星状細胞による同じ浸潤が、同質遺伝子のマウスのマウスモデルに関して見られた。Ｃ５７マウスの脳におけるマウスルイス肺癌（３ＬＬ）の免疫組織化学的分析。分裂している３ＬＬ細胞（ＰＣＮＡ陽性、青）は、活性化された星状細胞（ＧＦＡＰ陽性、茶色）により浸潤され、取り囲まれていた。まとめると、これらの実験はマウス−ヒト異種移植モデルを検証し、それは臨床でのヒトの試料において、および同質遺伝子のマウスモデルにおいて見られた現象を再現した。従って、本発明の１観点は、例えばヒトの転移性脳癌の現象の研究において有用であるインビボマウス−ヒト脳転移細胞モデルである。
【００５０】
実験２−走査電子顕微鏡での研究
主なヒトの臨床標本において見られたのと同様に、脳転移の形成においてマウスの星状細胞はヒトの腫瘍細胞とインビボで相互作用することを証明したので、本発明者はこれらの２種類の細胞型の相互作用をインビトロで、単純化された共培養系において試験した。上記のインビボの状況に対してはるかに少ない直接的な生理学的関連性を有するそのような系が結果として何らかの細胞間相互作用をもたらすかどうかは不確かであった。従って、ヒトの転移癌細胞株およびマウスの星状細胞の間の細胞間相互作用がインビトロで達成されたことは驚くべき発見であった。
【００５１】
材料および方法
細胞株および培養条件。ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−２３１（Ｓ３）、ヒト肺腺癌細胞株ＰＣ１４Ｂｒ４の脳転移変種（Ｓｉ）およびマウスＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、ピルビン酸Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、２倍ビタミン溶液、およびペニシリンストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を補った完全イーグル最小必須培地（ＣＭＥＭ）中で単層培養として維持した。組織培養のために用いた全ての試薬はエンドトキシンを含まず、それはカブトガニアメーバ様細胞ライセートアッセイ（ｌｉｍｕｌｕｓ  ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  ｌｙｓａｔｅ  ａｓｓａｙ）（Ａｓｓｏｃｉａｔｅ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ、マサチューセッツ州ウッズホール）により決定され、その細胞株は次のマウス病原体を含まなかった：マイコプラスマ種、ハンタン（Ｈａｎｔａｎ）ウイルス、肝炎ウイルス、マイニュートウイルス、アデノウイルス（ＭＡＤ１、ＭＡＤ２）、サイトメガロウイルス、エクトロメリアウイルス、乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス、ポリオーマウイルス（ｐｏｌｙｍａ  ｖｉｒｕｓ）、および仙台ウィルス（研究動物診断研究所、ミズーリ大学、ミズーリ州コロンビアによりアッセイされた）。この研究において用いられた細胞は凍結されたストックからのものであり、全ての実験は、解凍した後インビトロでの１０回の継代以内で実施された。
【００５２】
マウス星状細胞の単離および維持。温度感受性ＳＶ４０ラージＴ抗原に関してホモ接合型の新生仔マウス（Ｈ−２Ｋｂ−ｔｓＡ５８マウス；ＣＢＡ／ｃａ  ｘ  Ｃ５７ＢＬ／１０ハイブリッド；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ研究所、マサチューセッツ州ウィルミントン）を、二酸化炭素チャンバーの中で安楽死させ、その皮膚を標準的な様式で手術のために準備した（Ｓ４）。無菌のマイクロピンセット（Ｒｏｂｏｚ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．、メリーランド州ゲイザースバーグ）を用いて頭骨から皮膚を除去し、小さいハサミを用いて左耳の開口部から右耳の開口部までの円形の後部の切り込みを作った。脳の正中線に沿って別の切り込みを作り、頭蓋腔にアクセスすることを可能にするために頭骨を分割した。視神経を切り、先端が鋭くないピンセットを用いて脳を取り出し、１００ｍｍ氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に置いた。新皮質全体を切開し、海馬および内部構造を取り外して皮質シートのみを残した。髄膜を剥がして外し、皮質シートをメスで細かく切り、０．１％コラゲナーゼ（１５０  Ｕ／ｍｌ；  Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．、ニュージャージー州レイクウッド）および４０ｐｇ／ｍｌデオキシリボヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、ミズーリ州セントルイス）を含有するダルベッコ変法必須培地（ＤＭＥＭ）中で３７℃で３０分間消化した。次いでその皮質組織を１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中ですりつぶし、５０−ｐｍ無菌メッシュを通してこした。得られた単細胞懸濁液を、前もって５μｇ／ｍｌマウスラミニン（Ｓｉｇｍａ）でコートした７５ｃｍ２組織培養フラスコ上に蒔いた。その細胞を、１０％ＦＢＳおよび補助剤（上記参照）を含有するＤＭＥＭ中で、（３３℃においてｐＨの適切な緩衝を達成するために）８％二酸化炭素の雰囲気中で、７日間増殖させた。この時点で、星状グリア細胞はコンフルエントな単層を形成し、ニューロン、乏突起膠細胞、および線維芽細胞がその上で増殖していた。これらの混入している細胞を、そのフラスコを暖かい部屋で２５０毎分回転数で一夜回転振盪することにより除去した。得られた培養物は９５％より多くの星状細胞で構成されており、それはＧＦＡＰに対して向けられた抗体との免疫反応性により決定された。これらの培養物を増殖させ（ｅｘｐａｎｄｅｄ）、その手順を繰り返し、これらの培養物中の星状細胞の百分率は９９％を超えていると決定された。
【００５３】
培養した腫瘍細胞および星状細胞の走査電子顕微鏡画像化法。ヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞およびマウス星状細胞を、５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で、２４ウェルプレート中の滅菌されたカバーガラス上に、２．４×１０４細胞の密度で蒔いた。４８時間後、そのカバーガラスを取り出し、０．１Ｍカコジル酸緩衝液（ｐＨ  ７．３）中で３％グルタルアルデヒド／２％パラホルムアルデヒド（ｐａｒｐｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）／７．５％スクロースを含有する溶液中で室温で１時間固定した。次いでその試料を０．１ｍカコジル酸緩衝液で洗浄し、７．５％スクロースを含有する１％カコジル酸緩衝四酸化オスミウムで１時間後固定した（ｐｏｓｔ−ｆｉｘｅｄ）。その試料を０．１Ｍカコジル酸緩衝液、続いて蒸留水で洗浄し、ミリポア濾過した水性１％タンニン酸で暗所において３０分間、蒸留水中で洗浄、そしてミリポア濾過した１％水性酢酸ウラニルで暗所において１時間、連続的に処理した。その試料を蒸留水で完全にすすぎ、エタノールの上昇系列を通して脱水し、次いで増大する濃度のヘキサメチルジシラザンの段階的な系列にそれぞれ５分間移し、一夜空気乾燥させた。試料を、アルミニウムの標本台（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ペンシルバニア州フォートワシントン）上に前もって据え付けた二重厚（ｄｏｕｂｌｅ−ｔｈｉｃｋ）カーボンタブ（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ，  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州レディング）の上にマウントした。次いでその試料を、Ｂａｌｚｅｒ  ＭＥＤ  ０１０エバポレーター（Ｔｅｃｈｎｏｔｒａｄｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ニューハンプシャー州マンチェスター）を用いた真空の下で、プラチナ合金で２５ｎｍの厚さに被覆し、次いですぐに真空下でフラッシュ炭素被覆した。その試料を、後日の試験のためにデシケーターに移した。試料をＪＳＭ−５９１０走査電子顕微鏡（ＪＥＯＬ，  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ピーボディ）を用いて５ｋＶの加速電圧で試験した。
【００５４】
結果
結果を図１に示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞（Ｔ）およびマウス星状細胞（Ａ）のインビトロ培養物を、走査電子顕微鏡により評価した。星状細胞（ポッドフットを伸ばしている）と腫瘍細胞の間の直接的な接触は明らかである。単一の星状細胞は多数の腫瘍細胞と接触することができる。これらは、完全に形成された中枢神経系の星状細胞およびニューロンの間で見られる種類のギャップ結合であるように見える。類似の結果が、黒色腫、乳癌、および肺癌細胞株に関して見られる（示していない）。
【００５５】
実験３−ギャップ結合アッセイ
図１で示したギャップ結合の機能的性質をさらに検証するため、本発明者らは染料移動実験を実施して実験２で見られたギャップ結合のような構造が機能しているかどうかを確かめた。
【００５６】
材料および方法
ギャップ結合コミュニケーション。受容側の腫瘍細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）と供与側の細胞（星状細胞、３Ｔ３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）の間のギャップ結合コミュニケーションを、染料の移動を測定するフローサイトメトリーにより分析した。簡潔には、受容側の細胞（３００，０００細胞／ウェル）を６ウェルプレート中に蒔き、一夜培養した。その時点で、供与側の細胞を１μｇ／ｍｌのグリーンカルセイン−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で４５分間標識し、続いて十分に洗浄した。供与側の細胞（６０，０００細胞／ウェル）を受容側の細胞と、直接またはトランスウェルチャンバー（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ−Ｂｏｙｄｅｎ  Ｃｈａｍｂｅｒ、０．４ｐ．ｍ孔径；Ｃｏｓｔａｒ、ニューヨーク州コーニング）中でのどちらかで５時間共培養した。細胞を収集し、洗浄し、エタノール中で固定し、フローサイトメトリーにより分析した。ギャップ結合の形成を、シフトしたＦＩＴＣのピークのパーセントとして算出した（Ｓ９〜Ｓ１１）。
【００５７】
結果
図２に示したように、星状細胞−転移癌細胞の共培養物は、共培養された細胞の間での染料の移動を示した。従って、本発明者の共培養系は、マウスの星状細胞およびヒトの転移癌細胞株の間で形成された有効なギャップ結合をもたらした。対照のトランスウェル実験は、これが真の細胞間相互作用であることを実証した。従って、本発明の第２観点は、例えば操作可能な生体外での設定におけるヒトの転移性脳癌の星状細胞との相互作用の現象の研究において有用である、インビトロマウス星状細胞−ヒト転移細胞共培養系である。
【００５８】
実験４−化学保護アッセイ
脳転移の化学療法抵抗性のモデル化は、前述のインビボモデル系およびインビトロ細胞共培養系の両方に関する主要な用途であり、主要な用途であろう。細胞に基づく共培養系は実験操作をより受け入れやすいため、インビボで見られた脳転移の化学療法抵抗性が細胞に基づく培養系により再現されるかどうかを決定するために、それをさらに評価した。
【００５９】
材料および方法
インビトロ共培養化学保護アッセイ。星状細胞およびＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞に、以前に記述したようにＧＦＰ遺伝子を形質移入した（Ｓ５、Ｓ６）。標的の腫瘍細胞、星状細胞、または３Ｔ３線維芽細胞を、６０〜７０％コンフルエント培養物から、０．１％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ中０．２５％トリプシン溶液への短時間（２分間）の曝露により収集した。その細胞を、培養フラスコを威勢よく（ｂｒｉｓｋｌｙ）軽くたたくことにより取り外し、ＣＭＥＭ中で再懸濁した。マウス星状細胞、３Ｔ３線維芽細胞、および腫瘍細胞を、無菌の６ウェル組織培養マルチウェルディッシュの直径３５ｍｍのウェルのそれぞれの上に、単独で、または１：２の腫瘍細胞／星状細胞／３Ｔ３細胞の比率での共培養物として蒔いた。その細胞を、加湿した３７℃の培養器中で、６．４％二酸化炭素＋空気の雰囲気中で一夜接着させた。次いでその培養物を洗浄し、新しいＣＭＥＭ（陰性対照）または様々な濃度のＴＡＸＯＬ（登録商標）（パクリタキセル；ＮＤＣ  ００１５−３４７６−３０，  Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ、ニュージャージー州プリンストン）および他の化学療法薬（下記参照）を含有する培地と共に培養した。７２時間後、ＧＦＰ標識された星状細胞またはＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を選り分け、ヨウ化プロピジウム染色およびＦＡＣＳ分析により腫瘍細胞のアポトーシス画分を決定した（下記参照）。腫瘍細胞および星状細胞（または対照の役目を果たす線維芽細胞）の間の直接的な接触が化学療法への耐性の誘導をもたらすのに必須であるかどうかを決定するため、我々はＴｒａｎｓｗｅｌｌ−Ｂｏｙｄｅｎチャンバーを用いてその共培養アッセイを実施し、すなわち、腫瘍細胞をチャンバー中に、Ｉｍｍｏｒｔｏ星状細胞（ＩｍｍｏｒｔｏＡｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）（または線維芽細胞）をウェル中に蒔いた。７２時間の培養の後、腫瘍細胞の相対的アポトーシス指数を下記で記述するように決定した。
【００６０】
インビトロでの研究の第２セットにおいて、我々は、星状細胞に仲介される腫瘍細胞の化学療法薬に対する耐性の誘導が一時的であるか永久的であるかを決定した。ヒト肺癌ＰＣ１４Ｂｒ４細胞を、培地のみまたは５ｎｇ／ｍｌパクリタキセルを含有する培地中で、星状細胞または３Ｔ３線維芽細胞のどちらかと共培養した。７２時間後、その星状細胞または３Ｔ３細胞を腫瘍細胞からＦＡＣＳにより分離し、腫瘍細胞の相対的アポトーシス指数を、多数のウェルにおいて、下記のようなヨウ化プロピジウム染色により決定した。並行するウェルから、我々は生存している腫瘍細胞を回収し、それらを星状細胞または３Ｔ３細胞の異なる単層の上に再度蒔いた。これらの共培養は、最初は星状細胞と、次いで星状細胞もしくは３Ｔ３細胞のどちらかと共培養された腫瘍細胞の、または最初は３Ｔ３細胞と共に、次いで３Ｔ３細胞もしくは星状細胞のどちらかと共に培養された腫瘍細胞の共培養であった。次いでその第２ラウンドの共培養物に５ｎｇ／ｍｌのパクリタキセルを含有する培地を与えた。７２時間後、腫瘍細胞の相対的アポトーシス指数を、ヨウ化プロピジウム染色およびＦＡＣＳ分析により決定した。
【００６１】
ヨウ化プロピジウム染色およびＦＡＣＳ分析のための調製。浮遊している細胞を含有する上清の培地をそれぞれのディッシュから１５ｍｌコニカル遠心チューブの中に集めた。付着した細胞を、細胞を０．１％ＥＤＴＡ／ＰＢＳを含有する溶液中の０．２５％トリプシンに短時間曝露することにより収集した。細胞を対応する上清培地と組み合わせた。その試料を１００ｇで５分間の遠心分離によりペレットにした。そのペレットを１０ｍｌのＨＢＳＳ中で再懸濁し、さらに１００ｇで５分間でペレットにした。その試料をボルテックスにより再懸濁し、その細胞を１ｍｌの１％パラホルムアルデヒド中で室温で１０分間固定した。次いでその試料をポリプロピレン微量遠心チューブの中に移し、固定された細胞を１ｍｌのＰＢＳ中で洗浄し、次いで１０，０００ｇで１分間でペレットにした。そのペレットをボルテックスにより再懸濁し、その細胞を１ｍｌのエタノール中で−２０℃で一夜固定した。続いてその細胞をボルテックスし、微量遠心機により１０，０００ｇで１分間によりペレットにした。次いでその試料をボルテックスし、そのペレットを、ＲＮアーゼ（１５μｇ／ｍｌ；カタログ番号Ａ７９７３，Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を含有する３００のヨウ化プロピジウム（５０μｇ／ｍｌ；カタログ番号Ｐ４８６４，Ｓｉｇｍａ）中で再懸濁し、３７℃で２０〜３０分間染色した。その試料を、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＥＰＩＣＳ血球計算器（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州フラトン）を用いるＦＡＣＳ分析のために、最終的に５ｍｌのプラスチック培養チューブに移した。相対的アポトーシス指数を、腫瘍細胞のアポトーシス指数／腫瘍細胞およびＩｍｍｏｒｔｏ星状細胞または腫瘍細胞およびＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞のアポトーシス指数×１００（％）を比較することにより決定した（Ｓ７）。
【００６２】
結果
ヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞またはヒトＰＣ１４Ｂｒ４肺癌細胞を星状細胞と共に培養すると、パクリタキセル（５ｎｇ／ｍｌ）と共に７２時間培養した腫瘍細胞の相対的アポトーシス指数がそれぞれ５８．３＋８．９％（平均±標準偏差、Ｐ＜０．０１）および６１．８±６．７％（平均±標準偏差、Ｐ＜０．０５）低減した（化学療法抵抗性が増大した）（が、３Ｔ３線維芽細胞と共に培養しても低減しなかった）（アポトーシス指数はスチューデントのｔ検定により比較された）（図３）。この低減は、腫瘍細胞と星状細胞の間の直接的な接触に依存していた。本発明者は、この結論の基礎を、腫瘍細胞と星状細胞を半透膜（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ−Ｂｏｙｄｅｎ  Ｃｈａｍｂｅｒ、０．４ｐｍ孔径の膜；Ｃｏｓｔａｒ、ニューヨーク州コーニング）により分離した場合、星状細胞の化学保護作用が観察されなかったことを示すデータに置いている。腫瘍細胞の３Ｔ３線維芽細胞との共培養は、腫瘍細胞を化学療法から保護しなかった（図３）。ヒト腫瘍細胞の、Ｈ−２ｋｂ−ｔｓＡ５８マウスから単離された線維芽細胞を用いた代わりの対照との共培養は、その腫瘍細胞を化学療法剤から保護しなかった（データは示していない）。細胞毒性の程度を決定するための標準的なＭＴＴアッセイを用いて、類似の結果が見られた（データは示していない）。[Cory AH, Owen TC, Barltrop JA, Cory JG (July, 1991) “培養中の細胞増殖アッセイのための、水溶性テトラゾリウム／ホルマザンアッセイの使用。” Cancer Communications 3 (7): 207-212.]
これらのデータは、本明細書で開示する細胞に基づく共培養系が脳転移の化学療法抵抗性の現象を再現することを実証している。従って、その共培養系の化学療法抵抗性を再現する意外な能力は、それを化学療法抵抗性の機序およびインビボでの既存の脳転移における化学療法抵抗性を抑止するための可能性のある療法的介入の研究における使用に十分に適したものにする。
【００６３】
これらの最初の実験に基づいて拡張するため、本発明者らは今日用いられている薬物の主要なクラスを代表するいくつかの追加の化学療法剤を試験した。ヒト肺癌ＰＣ１４Ｂｒ４細胞を、単独で、または星状細胞と共に（直接的な細胞間接触）、Ｐ−糖タンパク質と会合するアドリアマイシン（２００ｎｇ／ｍｌ）、パクリタキセル（５ｎｇ／ｍｌ）、ビンブラスチン（３ｎｇ／ｍｌ）、ビンクリスチン（８ｎｇ／ｍｌ）、およびＰ−糖タンパク質と解離する５−ＦＵ（５００ｎｇ／ｍｌ）またはシスプラチナム（２．４μｇ／ｍｌ）を含有する培地中で培養した。星状細胞との共培養は、全ての薬物に対する有意な（Ｐ＜０．０１）保護を誘導した（図４）。この意外な発見は、その細胞に基づく共培養系をさらに実証した。この細胞培養系は、星状細胞により誘導される化学療法抵抗性の頑強性を、臨床設定においてインビボで見られる脳転移の化学療法抵抗性と直接比較可能である様式で示す。従って、本発明の第３観点は、例えば星状細胞に仲介される脳転移細胞の細胞毒性化学療法に誘導される細胞死からの保護の現象の研究において有用である、インビトロでの細胞に基づく化学療法抵抗性アッセイである。特定の態様において、そのインビトロでの細胞に基づく化学療法抵抗性アッセイは、１種類以上の候補化学療法剤をスクリーニングしてその化学療法剤の細胞毒性作用に対する星状細胞に仲介される保護の程度を評価するために用いることができる。
【００６４】
図５で要約した追加の実験は、星状細胞に仲介される脳転移細胞の細胞毒性化学療法に誘導される細胞死からの保護は、直接的な星状細胞−脳転移細胞の接触が失われた後７２時間より長くは続かないことを示している。さらに、前の星状細胞接触により与えられた保護作用を失った細胞は、星状細胞との第２の共培養により再度保護されて化学療法剤の細胞毒性作用に対する星状細胞に仲介される保護を再獲得することができる。これは、原発腫瘍およびさらに他の非脳転移が化学療法反応性である一方で、それらに由来する脳転移は化学療法抵抗性であるという臨床での観察を反映している。
【００６５】
実験５−星状細胞に仲介される化学療法抵抗性の機序
本発明者らは、上記の細胞に基づく化学療法抵抗性アッセイを、その現象の基礎をなしている可能性のある機序を調べるために適用した。遺伝子発現プロファイリング＋タンパク質産生のウェスタンブロットでの確認を用いて、星状細胞に仲介される脳転移細胞の細胞毒性化学療法に誘導される細胞死からの保護を調べた。
【００６６】
材料および方法
ＲＮＡマイクロアレイ分析による遺伝子発現プロフィール。この第１セットの実験において、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＰＣ１４Ｂｒ４細胞を単独で、マウス星状細胞と共に、またはＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞と共に、直径３５ｍｍの６ウェルプレート（カタログ番号３５３０４６、ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ  ＴＭ、カリフォルニア州サンノゼ）中で培養した。細胞間接触を確かめるため、腫瘍細胞のマウス星状細胞またはＮＩＨ  ３Ｔ３細胞に対する比率は１：２であった。７２時間後、ＧＦＰ標識されたマウス星状細胞または線維芽細胞をＦＡＣＳにより選り分け、腫瘍細胞をマイクロアレイ分析のために処理した。第２セットの実験において、我々は腫瘍細胞の化学療法薬に対する抵抗性と関係する遺伝子の発現が星状細胞との連続的な接触に依存しているのかどうかを決定した。ＭＤＡ−２３１またはＰＣ１４Ｂｒ４細胞をマウス星状細胞またはＮＩＨ  ３Ｔ３細胞のどちらかと７２時間共培養した。マウス星状細胞またはＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を選り分け、腫瘍細胞をマイクロアレイ分析により遺伝子発現プロフィールを決定するために処理し、またはマウス星状細胞もしくは線維芽細胞のどちらかとの第２ラウンドの共培養のために蒔いた。従って、最初にマウス星状細胞と共に培養された腫瘍細胞を、マウス星状細胞と、または線維芽細胞と再度共培養し、逆に、最初に線維芽細胞と共に培養された腫瘍細胞を、線維芽細胞または星状細胞と再度共培養した。７２時間の培養の後、マウス星状細胞または線維芽細胞を選り分け、腫瘍細胞をマイクロアレイ分析のために処理した。
【００６７】
マイクロアレイ分析。全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を、製造業者のプロトコル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）に従う標識およびハイブリダイゼーションのために用いた。簡潔には、ＩｌｌｕｍｉｎａＲ  Ｔｏｔａｌ  Ｐｒｅｐ  ＲＮＡ増幅キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、テキサス州オースティン）を用いて全ＲＮＡからｃＤＮＡを生成した。次に、３７℃で４時間インビトロ転写を行ってビオチン標識ヌクレオチドをｃＲＮＡの中に組み込んだ。合計で１５００ｎｇのビオチン標識ｃＲＮＡを、製造業者の説明書に従って、ＩｌｌｕｍｉｎａのＳｅｎｔｒｉｘＲ  ｈｕｍａｎ  ６−ｖ２  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＢｅａｄＣｈｉｐに５８℃で一夜（１６時間）ハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたビオチン化ｃＲＮＡを、１μｇ／ｍｌのシアニン３−ストレプトアビジン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いて検出し、そのＢｅａｄＣｈｉｐをＩｌｌｕｍｉｎａ  ＢｅａｄＡｒｒａｙ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，  Ｉｎｃ．）を用いて走査した。マイクロアレイデータの結果を、正規化またはバックグラウンドの減算は一切無しで、Ｂｅａｄ  Ｓｔｕｄｉｏ  ３．７（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，  Ｉｎｃ．）を用いて抽出した。遺伝子発現データを、Ｒ（ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）中のＬＩＭＭＡパッケージ中の変位値正規化法を用いて正規化した（Ｓ１２）。さらなる分析の前に、それぞれの遺伝子の発現レベルをＩｏｇ２に変換した。組織の２つのグループにおいて差次的に発現している遺伝子を選択するため、我々はＢＲＢ  Ａｒｒａｙ  Ｔｏｏｌｓ（ｖ  ３．６；  Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｒａｎｃｈ、国立癌研究所、メリーランド州ベセスダ）中のクラス比較ツールをＦＤＲの見積もりによる２標本ｔ検定のための方法として用いた。
【００６８】
ウェスタンブロット分析。ウェスタンブロットを用いてマイクロアレイの結果を確認した。簡潔には、ＦＡＣＳで選り分けられた腫瘍細胞の全細胞溶解物を、プロテアーゼ阻害剤混合物（Ｒｏｃｈｅ、インディアナ州インディアナポリス）を含有する１ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭトリス［ｐＨ  ８．０］、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＳＤＳ、１％デオキシコレート、１％  ＮＰ４０、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌアプロチニン、および１μｇ／ｍｌペプスタチン）を用いて調製した。等しい量のタンパク質（３０ｆａｇ）を含有する試料を、４〜１２％  Ｎｕ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上での電気泳動により分離し、ニトロセルロース膜に転写した。５％脱脂乳を含有するＴＴＢＳ（ＴＢＳ  ＋  ０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）を用いたブロッキングの後、その膜をＢＣＬ２に対するマウスモノクローナル抗体（１：１，０００、ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）、ＢＣＬ２Ｌ１に対するウサギポリクローナル抗体（１：１，０００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、マサチューセッツ州ビバリー）、ＴＷＩＳＴに対するウサギポリクローナル抗体（１：１０００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼに対するマウスモノクローナル抗体（１：１，０００、ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、Ｉ３−アクチンに対するマウスモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）と共に４℃で一夜保温した。次いでブロットをホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体（１：３０００）にさらし、Ａｍｅｒｓｈａｍ（ニュージャージー州ピスカタウェイ）からの増強された化学発光システムにより可視化した。等しいタンパク質の装填（ｌｏａｄｉｎｇ）は、ブロットを剥がして抗１３−アクチン抗体を用いてそれらを再検出する（ｒｅ−ｐｒｏｂｉｎｇ）ことにより確認された。
【００６９】
統計分析。遺伝子発現プロフィールの統計分析のため、それぞれの遺伝子の発現レベルをさらなる分析の前にｌｏｇ２に変換した。ＦＤＲの見積もりによる２標本ｔ検定のためのＢＲＢ  Ａｒｒａｙ  Ｔｏｏｌｓ（ｖ３．６；Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｒａｎｃｈ、国立癌研究所、メリーランド州ボルチモア)中のクラス比較ツールは、異なる宿主細胞と共培養された腫瘍細胞の間で差次的に発現していた遺伝子の統計的有意性を決定するために用いられた方法であった。ベン図のための遺伝子を、一変量検定（２標本ｔ検定）と多変量並べ替え検定（１０，０００のランダムな並べ替え）により選択した。我々は、その発現が試験した組織の２個のグループの間で有意に異なっている遺伝子を保持するために、０．００１未満のカットオフＰ値を適用した。
【００７０】
結果
本発明者らは、その発現が一般に星状細胞との共培養の後に変化する腫瘍細胞の遺伝子を、２標本ｔ検定を適用することにより同定した（Ｐ＜０．００１）。この手順を用いて、本発明者らは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において差次的に発現している１０６９個の遺伝子、およびＰＣ１４Ｂｒ４細胞において差次的に発現している５９４個の遺伝子を同定した（図７）。２つの遺伝子リストの比較は、抗アポトーシスおよび生存と関係することが周知であるいくつかの遺伝子：グルタチオンＳトランスフェラーゼ５（ＧＳＴＡ５）、ＢＣＬ２Ｌ１、ＴＷＩＳＴの増大した発現を明らかにした（図７）。これらの遺伝子の発現は、ウェスタンブロット分析によりタンパク質レベルで確認された（図８）。次いで本発明者らは、星状細胞と共培養された腫瘍細胞におけるその変化した（線維芽細胞とでは変化しなかった）遺伝子発現パターンが永久的であるか一時的であるかを決定した。本発明者らは、腫瘍細胞を星状細胞または線維芽細胞と１サイクル共培養し、次いでその腫瘍細胞を回収し、それらを第２ラウンドにおいて星状細胞または線維芽細胞上に蒔いた。その２サイクルの共培養実験から遺伝子実験データを収集した際、その癌細胞の遺伝子発現パターンにおいて２度目の共培養の影響が優勢であった。１度目の共培養条件にかかわらず、第２サイクルにおいて星状細胞と共培養された癌細胞は、第１サイクルの培養実験において検出されたものと違いを示す遺伝子発現サインを示し（ＧＳＴＡ５、ＢＣＬ２Ｌ１、およびＴＷＩＳＴの高発現）、一方で第１ラウンドにおいて星状細胞と共培養された癌細胞は、それらが第２ラウンドにおいて線維芽細胞と共培養された場合、その特異的な遺伝子発現サインを失った（図９）。この結果は、図５で要約したインビトロ化学保護アッセイの結果のそれと類似しており、腫瘍細胞における遺伝子発現パターンが星状細胞との絶え間ない接触に依存することを証明している。第２ラウンドにおいて星状細胞と共培養された腫瘍細胞は、高レベルのＴＣＦ４、ＣＤ２４、ＣＡＲＤ１４、およびＥＦＮＢ２遺伝子も発現していた（データは示していない）。腫瘍細胞のこれらの遺伝子の発現は乏しい予後と相関していることが臨床試験により示されている。従って、本発明の第４観点は、例えば生体外での設定における星状細胞に仲介される脳転移細胞の細胞毒性化学療法に誘導される細胞死からの保護の現象の研究において有用である分子診断構成要素を有する、インビトロでの細胞に基づく化学療法抵抗性アッセイである。特定の態様において、その分子診断構成要素は、遺伝子発現プロファイリング工程および細胞のタンパク質濃度の分析の１つ以上である。特定の態様において、予め決められた遺伝子発現サインを用いて、実験的介入が例えば星状細胞に仲介される保護を抑止する作用を評価する。本発明の第５観点は、星状細胞に仲介される脳転移細胞の細胞毒性化学療法に誘導される細胞死からの保護を示す遺伝子発現サインまたはタンパク質発現プロフィールの組み合わせである。第６観点は、上記で記述し、例証したような、前記の遺伝子サインまたはタンパク質レベルのプロフィールを生成するプロセスである。
【００７１】
実験６−腫瘍細胞および星状細胞によるエンドセリン受容体の発現
３００，０００個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞を、６００，０００個のＧＦＰ標識した星状細胞と共に、またはＧＦＰ標識した３Ｔ３線維芽細胞と共に２４時間培養した。次いでその細胞を収集し、選り分けてＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を分離した。タンパク質を抽出し、ウェスタンブロットにより分析し、抗ＥＴＡＲ抗体とハイブリダイズさせた。図１０に示したデータは、星状細胞と共培養された腫瘍細胞がより高いレベルのＥＴＡＲを発現していることを明確に示している。
【００７２】
研究の次のセットにおいて、１０，０００個のＧＦＰ標識したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を２０，０００個の星状細胞とチャンバースライド中で共培養した。２４時間後、その培養物をタキソール（１５ｎｇ／ｍｌ）で２４時間処理し、次いでリン酸化されたｐＡＫＴに関して染色した（４％  ＰＦＡ固定）。図１１に示したように、星状細胞（およびタキソール）と共培養された腫瘍細胞は高レベルのｐＡＫＴを発現していた。従って、星状細胞との共培養は、腫瘍細胞の化学療法薬に対する増大した耐性と相関している腫瘍細胞によるＥＴＲおよび生存因子の発現を増大させた。抗ＥＴＢＲ抗体を用いた類似の研究は、ＥＴＢＲの発現を明らかにした。
【００７３】
実験７−エンドセリン受容体拮抗薬は腫瘍細胞に対して細胞毒性作用をもたらさない
上記のインビトロでの細胞に基づく化学療法抵抗性アッセイのスキームを用いて、本発明者らは二重ＥＴＡＲおよびＥＴＢＲ親和性を有する２種類のエンドセリン受容体拮抗薬を試験し、その化学療法剤の細胞毒性作用に対する星状細胞に仲介される保護の程度を評価した。試験した１つのＥＴＲ拮抗薬は、ＥＭＥＡにより肺動脈高血圧（ＰＡＨ）の処置における使用に関して承認されているボセンタンであった。試験した第２の薬物はＡＣＴ−０６４９９２と呼ばれ、それはやはり二重ＥＴＡＲ／ＥＴＢＲ親和性を有するボセンタンの誘導体である。ＡＣＴ−０６４９９２は正式にはマシテンタンと呼ばれ、構造［Ｎ−［５−（４−ブロモフェニル）−６−（２−（５−ブロモピリミジン−２−イルオキシ）エトキシ）−ピリミジン−４−イル］−Ｎ’−プロピルアミノスルホンアミド］を有する：
【００７４】
【化１】
2013501791.tif 000003
【００７５】
Iglarz M, et al., 経口で有効な組織標的化二重エンドセリン受容体拮抗薬であるマシテンタンの薬理学, J Pharmacol Exp Ther. 2008 Dec;327(3):736-45. Epub 2008 Sep 9。ＡＣＴ−０６４９９２分子、それの合成およびそれの薬理学的活性の最初の開示は、ＷＯ０２／０５３５５７において見つけることができる。ＡＣＴ−０６４９９２はボセンタンよりもおおよそ３倍医薬的に有効である（すなわち、それは１／３の用量を必要とする）。本明細書における詳細なデータはＡＣＴ−０６４９９２の実験に言及するが、より高い用量のボセンタンの実験により類似の結果が得られる。
【００７６】
ＡＣＴ−０６４９９２（１００ｎＭ）を、上記の細胞に基づく共培養アッセイに、１：２の腫瘍細胞：星状細胞または腫瘍細胞：３Ｔ３線維芽細胞の比率で４８時間添加し、アポトーシスの程度を上記のように測定した。図１２（ＭＤＡ−２３１乳癌）および図１３（ＰＣ１４肺癌）において示したように、単独で、または星状細胞と共に、または３Ｔ３線維芽細胞と共に添加されたＡＣＴ−０６４９９２は、測定可能な細胞毒性作用を全くもたらさなかった。
【００７７】
実験８−化学療法剤との併用でのエンドセリン受容体拮抗薬
上記で示したようなＥＴＲ拮抗薬は、単剤化学療法としては効果がない。この否定的な結果は、併用療法の構成要素としてのＥＴＲ拮抗薬に関して見られた劇的な作用を非常に意外なものにした。共培養実験において、細胞培養の比率は１：２  腫瘍細胞：星状細胞（５０，０００：１００，０００）であり、処理はパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））（６ｎｇ／ｍｌ）および／またはＡＣＴ−０６４９９２（１００ｎＭ）を用いて４８時間であった（図１５；＊ｐ＜０．０１）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を用いた対照実験に関して、前の実験におけるものと同じ星状細胞に仲介されるパクリタキセルからの保護が起こった。これらの併用実験から２つの驚くべき結果があった。第１に、星状細胞を欠く対照におけるパクリタキセルおよびＡＣＴ−０６４９９２の併用は、パクリタキセル単独を超える細胞死の有意な増大をもたらさなかった。これは少なくとも３つの独立した実験において見られた（図１５）。これらの結果はヒト肺癌細胞ＰＣ１４Ｂｒ４を用いて再現された（図１６）。従って、試験した条件の下で、ＥＴＲ拮抗薬は、単剤として実験６で観察されたように、併用でも効果がなかった。腫瘍細胞−星状細胞の共培養において、ＡＣＴ−０６４９９２は星状細胞に仲介されるパクリタキセルからの保護を無効にする意外な能力を示した。さらにもっと驚いたことに、ＡＣＴ−０６４９９２は実際には星状細胞無しの対照実験と比較してパクリタキセルの有効性を高め、転移腫瘍細胞をパクリタキセルに対して過敏化した。ＡＣＴ−０６４９９２の星状細胞および腫瘍細胞の共培養物への添加は、生存因子ｐＡＫＴおよびｐＭＡＰＫの発現を阻害した（図１７）。この阻害は、化学療法薬により仲介される腫瘍細胞の死の増大と直接相関していた。星状細胞を欠く実験は相加効果すら示さなかったため、この相乗作用はさらにもっと驚くべきものになった。併用療法におけるＥＴＲ拮抗薬の作用は、共培養された星状細胞を欠く標準的な腫瘍細胞株のアッセイスキームでは見られなかったであろうから、これらの劇的な結果は本明細書で開示する新規の共培養スクリーニング法の重要性を示している。従って、本発明の第７観点は、対象において既存の脳転移腫瘍を処置するための、１種類以上の他の細胞毒性化学療法剤および／または放射線療法との併用でのエンドセリン受容体拮抗薬の使用である。特定の態様において、この併用療法は既存の脳転移をＥＴＲ拮抗薬と同時投与された細胞毒性化学療法剤および／または放射線療法に対して過敏化する。
【００７８】
既存の脳転移のためのインビボでのエンドセリン受容体拮抗薬療法
エンドセリン受容体拮抗薬（単数または複数）および同時投与される化学療法剤のインビボでの送達は、このクラスの化合物の様々なメンバーに関して既に開発され、前の臨床試験で用いられた同じ経口および／または全身送達により達成することができる。そのような療法計画の開発および最適化は、当技術において型にはまった手順である。[臨床試験：設計、分析および報告のための実用的な手引き Ameet Bakhai and Duolao Wang編。Remedica, London 2005.]脳癌に特有の１つの問題は、血液脳関門の影響である。これは長い間脳転移に関する全身処置を妨げる技術的な問題として挙げられてきたが、当技術は今日、微小転移巣においてさえも血液脳関門が部分的に混乱している（ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ）ことを認識している。[Cavaliere R. and Schiff D., 化学療法および脳転移：誤解か真実か？ Neurosurg Focus. 2007 Mar 15;22(3):E6.]従って、エンドセリン受容体拮抗薬（単数または複数）の全身送達は脳転移腫瘍に浸透し、療法的作用を有するであろうと期待するのは理にかなっている。加えて、エンドセリン受容体拮抗薬（単数または複数）ファミリーの特定のメンバーは完全な血液脳関門さえも越える能力を有しており、従って、それらをインビボでの脳転移腫瘍療法における使用に特に適したものにする。[Vatter H, et al., 脳血管痙攣の処置に関して臨床的に有効であることが示された最初の非ペプチド性エンドセリン受容体拮抗薬であるクラゾセンタンの脳血管的特性付け。第２部：エンドセリン（Ｂ）受容体に仲介される弛緩への作用。 J Neurosurg. 2005 Jun;102(6):1108-14.]最後に、エンドセリン受容体拮抗薬（単数または複数）の直接的な腫瘍への注入または注射は、その転移腫瘍の大きさがそのようなアプローチを実現可能にする場合は適切である可能性がある。
【００７９】
マウスにおける脳転移に関するインビボ療法
既存の脳転移に関するエンドセリン受容体拮抗薬療法の有効性をさらに検証するため、本発明者らはマウスを用いて典型的なインビボでの実験を実施した。ヌードマウスに１０，０００個の生存可能なＭＤＡ２３１細胞を、内頚動脈を経由して注射した。予備的な病理学研究は、注射後２週間で視認できる確立された転移が形成されたことを明らかにした（データは示していない）。従って、本発明者はこの時点で処置を開始した。
【００８０】
実験９−インビボでの腫瘍成長へのＡＣＴ−０６４９９２およびテモゾロミドの作用
ヌードマウスに、１００００個の生存可能なＭＤＡ２３１細胞を、内頚動脈中に注射した。注射後２週間における処置グループは以下のものであった：対照（ビヒクル）（図１８Ａ）；テモゾロミド（“ＴＭＺ”）、経口で毎日１０ｍｇ／ｋｇ（図１８Ｂ）；ＡＣＴ−０６４９９２、経口で毎日５０ｍｇ／ｋｇ（図１８Ｃ）；またはＴＭＺ＋ＡＣＴ−０６４９９２の併用（図１８Ｄ）。
【００８１】
全てのマウスを処置の２８日目に殺した。脳切片を固定し、染色した。脳転移を視覚的に評価した。典型的な標本を図１８Ａ〜Ｄにおいて同じ倍率で示す。図１８Ｅにおいてより詳細に見られるように、ＴＭＺおよびＡＣＴ−０６４９９２の併用はＴＭＺ単独と比較して転移腫瘍の大きさおよび密度を劇的に低減させた。これは、上記の細胞培養系の結果がインビボで観察された作用と直接相関していることを示している。
【００８２】
実験１０−インビボでの腫瘍成長へのＡＣＴ−０６４９９２およびパクリタキセルの作用
メスのヌードマウス（１０〜１２週齢）に、１０，０００個の生存可能なＭＤＡ２３１細胞を、内頚動脈中に注射した。脳転移が確立された注射の２週間後に、マウスを４つの処置グループ（ｎ＝１０）中に無作為に分けた：１）対照（ビヒクル溶液を注射した）；２）パクリタキセル（１週間につき１回腹腔内に８ｍｇ／ｋｇを投与した）；３）ＡＣＴ−０６４９９２（１日につき１回経口で５０ｍｇ／ｋｇを投与した）；ならびに４）ＡＣＴ−０６４９９２およびパクリタキセルの併用。全てのマウスを処置の２８日後に安楽死させ、検死解剖した。脳を組織学的研究および免疫組織化学のために集めた。典型的な結果を図１９Ａに示す。対照（１９Ａ）、ＡＣＴ−０６４９９２（１９Ｂ）およびパクリタキセル（１９Ｃ）全てが明確な転移腫瘍を有している。対照的に、ＡＣＴ−０６４９９２＋パクリタキセルのグループ（１９Ｄ）は、はるかに小さい腫瘍細胞のコロニーを有していた。
【００８３】
テモゾロミドおよびパクリタキセルに関する結果は、エンドセリン受容体拮抗薬療法が脳転移を化学療法剤に対して広く敏感にすることを示している。
実験１１−インビボでの腫瘍細胞増殖へのＡＣＴ−０６４９９２およびパクリタキセルの作用
４つの処置グループからの代表的な脳組織薄片を、ＣＤ３１（内皮細胞のマーカー）およびＫｉ６７（細胞増殖のマーカー）に関して染色した。対照のマウス、パクリタキセルのみ、またはＡＣＴ−０６４９９２のみで処置したマウスの脳は、多数の増殖している細胞を含有していた。はっきりと対照的に、パクリタキセルおよびＡＣＴ−０６４９９２の両方で処置したマウスの脳は、ごく少数の分裂している細胞しか含有していなかった。それぞれ図２０Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ。
【００８４】
実験１２−インビボでの腫瘍細胞のアポトーシスへのＡＣＴ−０６４９９２およびパクリタキセルの作用
異なる処置グループからのマウスの脳組織薄片を、インサイチュでの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）により分析した。Negoescu A, et al., J Histochem Cytochem. 1996 Sep;44(9):959-68。対照のマウス、タキソールで処置したマウス、およびＡＣＴ−０６４９９２で処置したマウスの脳は、アポトーシス性の細胞をほとんど〜全く有していなかった。図２１Ａ〜Ｃ。はっきりと対照的に、ＡＣＴ−０６４９９２＋タキソールの併用で処置したマウスの脳は、多数のアポトーシス性の腫瘍細胞（緑）および内皮細胞（黄色）を有していた（図２１Ｄ）。
【００８５】
実験１３
４つの処置グループからのマウスの脳組織薄片を、ＥＴＡＲ（赤）およびホスホセリン（緑）に関して免疫染色し、同時局在は橙〜黄色をもたらした。対照の脳はリン酸化されたＥＴＡＲを発現しており、パクリタキセルで処置したマウスからの脳も同様であった（図２２Ａ〜Ｂ）。ＡＣＴ−０６４９９２のみでの、およびＡＣＴ−０６４９９２＋パクリタキセルでの処置はＥＴＡＲのリン酸化を妨げた（図２２Ｃ〜Ｄ）。この結果は、エンドセリン受容体拮抗薬活性と転移腫瘍の化学療法剤への敏感化の相関を確証している。
【００８６】
実験１４
実験的なヒトＭＤＡ２３１乳癌脳転移のＡＣＴ０６４９９２およびタキソールを用いた処置に関する生存研究
実験の詳細
５×１０３個のＭＤＡ２３１細胞を、実験１０のプロトコルに従って注射した。注射後１４日目に実験１０のプロトコルに従って処置を開始した。生存曲線を引き、ｐ値を得て、処置グループの間で統計的有意性を比較した。
【００８７】
処置グループ
対照（ビヒクル）：毎日の経口投与および週１回の腹腔内注射。
パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）：毎日の経口でのビヒクル投与および週１回のパクリタキセルの腹腔内注射。
【００８８】
ＡＣＴ０６４９９２（１０ｍｇ／ｋｇ）：毎日の経口でのＡＣＴ０６４９９２投与および週１回のパクリタキセルの腹腔内注射。
結果
死亡日（処置後）
対照：４２、４３、５３、６０、６４、６８、６８、６９、６９
パクリタキセル：４９、５３、６０、６３、７４、７４、７８
ＡＣＴ０６４９９２：５１、６３、６８、７５、７８、８２
パクリタキセル＋ＡＣＴ：４８
【００８９】
【化２】
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【００９０】
ＥＴＡまたはＥＴＢのＩＣ５０の決定のための試験：
競合結合の試験のため、ヒトの組み換えＥＴＡまたはＥＴＢ受容体を発現しているＣＨＯ細胞の膜を用いた。組み換えＣＨＯ細胞からのミクロソーム膜を調製し、以前に記述されたように結合アッセイを行った(Breu V., et al, FEBS Lett. (1993), 334, 210)。
【００９１】
アッセイは、ポリプロピレンマイクロタイタープレートにおいて、２００μＬの２５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む５０ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４中で実施された。０．５ｕｇのタンパク質を含有する膜を８ｐＭ  ［１２５Ｉ］ＥＴ−１（４０００ｃｐｍ）および増大する濃度の未標識の拮抗薬と共に２０℃で２時間保温した。ＥＴ−１を含まない、および１００ｎＭ  ＥＴ−１を含む試料において、それぞれ最大および最小の結合が見積もられた。２時間後、その膜をＧＦ／Ｃフィルターを含有するフィルタープレート（Ｃａｎｂｅｒｒａ  Ｐａｃｋａｒｄ  Ｓ．Ａ．  スイス、チューリヒからのＵｎｉｆｉｌｔｅｒｐｌａｔｅ）上で濾過した。それぞれのウェルに、５０μＬのシンチレーション混合物を添加し（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ  ２０，  Ｃａｎｂｅｒｒａ  Ｐａｃｋａｒｄ  Ｓ．Ａ．  スイス、チューリヒ）、そのフィルタープレートをマイクロプレート計数器（ＴｏｐＣｏｕｎｔ，  Ｃａｎｂｅｒｒａ  Ｐａｃｋａｒｄ  Ｓ．Ａ．  スイス、チューリヒ）で計数した。
【００９２】
全ての試験化合物は、ＤＭＳＯ中で溶解させ、希釈し、添加した。そのアッセイは２．５％ＤＭＳＯの存在下で行われ、それは結合を有意に妨げないことが分かっている。ＩＣ５０を、ＥＴ−１の特異的な結合の５０％を阻害する拮抗薬の濃度として計算した。
【００９３】
背景の参考文献：
【００９４】
【化３】
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【００９５】
【化４】
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【００９６】
技術的参考文献：
【００９７】
【化５】
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【００９８】
本明細書で引用された、またはそうでなければ同定された全ての参考文献をそのまま、そして特にそのためにそれらが引用されたあらゆる特定の情報に関して、本明細書に援用する。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１】
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【図２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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