(57)【要約】本発明は、甲状腺結節又は甲状腺癌などの特定の状態に関するｍｉＲＮＡプロファイルを同定するための方法及び組成物、並びに、甲状腺結節又は甲状腺癌などの状態に関する患者の診断における該プロファイルの使用に関する。2013544098.tif 000159
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において前悪性甲状腺結節又は悪性甲状腺結節を検出するための方法であって、該対象に由来する甲状腺試料中の、ｍｉＲ−１２７４ａ、ｍｉＲ−１２７４ｂ、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−１２６０、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−９２ｂ＊、ｍｉＲ−１２０２、ｍｉＲ−１３００、ｍｉＲ−６６３、ｍｉＲ−１４９＊、ｍｉＲ−６３１、ｍｉＲ−９３６、ｍｉＲ−１８７＊、ｍｉＲ−１１８２、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−７６５、ｍｉＲ−６４８、ｍｉＲ−９３４、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−２＊、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−１３５ｂ＊、ｍｉＲ−１３２２、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４７０、ｍｉＲ−１２２７、ｍｉＲ−１８２＊、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−４９１−３ｐ、ｍｉＲ−５５４、ｍｉＲ−１２２８、ｍｉＲ−１２５８、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１９１２、ｍｉＲ−２００ａ＊、ｍｉＲ−３７６ａ又はｍｉＲ−３７９から選択される１種類以上のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程を含み、基準レベルに対する該試料中のｍｉＲＮＡ発現レベルの変化が、前悪性甲状腺結節又は悪性甲状腺結節であることを示す、方法。
【請求項２】
基準レベルに対する前記試料中のｍｉＲ−１２７４ａ、ｍｉＲ−１２７４ｂ、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−１２６０レベルの増加、又は基準レベルに対するｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−９２ｂ＊、ｍｉＲ−１２０２、ｍｉＲ−１３００、ｍｉＲ−６６３、ｍｉＲ−１４９＊、ｍｉＲ−６３１、ｍｉＲ−９３６、ｍｉＲ−１８７＊、ｍｉＲ−１１８２、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−７６５、ｍｉＲ−６４８、若しくはｍｉＲ−９３４レベルの低下、又はそれらの組み合わせが、前悪性甲状腺結節又は悪性甲状腺結節であることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｍｉＲ−１２７４ａ、ｍｉＲ−１２７４ｂ、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−１２６０、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−９２ｂ＊、ｍｉＲ−１２０２、ｍｉＲ−１３００、ｍｉＲ−６６３、ｍｉＲ−１４９＊、ｍｉＲ−６３１、ｍｉＲ−９３６、ｍｉＲ−１８７＊、ｍｉＲ−１１８２、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−７６５、ｍｉＲ−６４８、及びｍｉＲ−９３４のレベルを測定する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記悪性甲状腺結節が、甲状腺乳頭癌（ＰＴＣ）、甲状腺濾胞癌（ＦＴＣ）、又は甲状腺乳頭癌濾胞亜型（ＦＶＰＴＣ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
基準レベルに対する前記試料中のｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、若しくはｍｉＲ−１８１ａ−２＊レベルの増加、又は基準レベルに対する該試料中のｍｉＲ−７、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−１３５ｂ＊、ｍｉＲ−１３２２、ｍｉＲ−１４５、若しくはｍｉＲ−１４７０レベルの低下、又はそれらの組み合わせが、悪性甲状腺結節であることを示す、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−２＊、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−１３５ｂ＊、ｍｉＲ−１３２２、ｍｉＲ−１４５、及びｍｉＲ−１４７０のレベルを測定する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前悪性甲状腺結節が濾胞腺腫（ＦＡ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
基準レベルに対する前記試料中のｍｉＲ−１２２７、ｍｉＲ−１８２＊、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−４９１−３ｐ、若しくはｍｉＲ−５５４レベルの増加、又は基準レベルに対する該試料中のｍｉＲ−１２２８、ｍｉＲ−１２５８、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１９１２、ｍｉＲ−２００ａ＊、ｍｉＲ−３７６ａ若しくはｍｉＲ−３７９レベルの低下、又はそれらの組み合わせが、前悪性甲状腺結節であることを示す、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ｍｉＲ−１２２７、ｍｉＲ−１８２＊、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−４９１−３ｐ、ｍｉＲ−５５４、ｍｉＲ−１２２８、ｍｉＲ−１２５８、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１９１２、ｍｉＲ−２００ａ＊、ｍｉＲ−３７６ａ及びｍｉＲ−３７９のレベルを測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記基準レベルが、過形成結節（ＮＯＤ）基準試料中の測定した前記ｍｉＲＮＡの発現レベルの平均である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記基準レベルが、濾胞腺腫（ＦＡ）基準試料中の測定した前記ｍｉＲＮＡの発現レベルの平均である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ｍｉＲＮＡ発現の増加が、基準レベルの少なくとも４、６、８、１０、２０、又は４０倍である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料が、甲状腺結節由来の、単離したＲＮＡ、新鮮な組織若しくは新鮮な細胞、凍結した組織若しくは凍結した細胞、固定した組織若しくは固定した細胞、又は包埋した組織若しくは包埋した細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記試料が生検材料である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記生検が外科的切除又は微細針吸引である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象から試料を得る工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記試料由来のｍｉＲＮＡを標識する工程をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
標識した前記ｍｉＲＮＡを１種類以上のｍｉＲＮＡプローブにハイブリダイズさせる工程をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ｍｉＲＮＡプローブが支持体に結合している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記支持体が、ガラス、プラスチック、金属、又はラテックスである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記支持体が平面である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記支持体がビーズである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記ｍｉＲＮＡレベルのプロファイルが悪性甲状腺結節であることを示す場合に、対象が甲状腺癌であると診断する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
予後予測を提供する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ｍｉＲＮＡレベルの報告を提供する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
測定した前記ｍｉＲＮＡレベルに基づいて悪性甲状腺結節を分類する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
治療に対する甲状腺結節の応答性を評価する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記ｍｉＲＮＡの発現を、増幅アッセイ法又はハイブリダイゼーションアッセイ法によって測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
増幅アッセイ法が定量的増幅アッセイ法である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記定量的増幅アッセイ法が、定量的ＲＴ−ＰＣＲである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ハイブリダイゼーションアッセイ法が、アレイハイブリダイゼーションアッセイ法又は溶液ハイブリダイゼーションアッセイ法である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
試料に関するｍｉＲＮＡプロファイルを評価することによって甲状腺試料を解析するためのキットであって、請求項１に記載のｍｉＲＮＡのうちの１種類以上を含む２つ以上のｍｉＲＮＡハイブリダイゼーション試薬又はｍｉＲＮＡ増幅試薬を好適な容器中に含む、キット。
【請求項３３】
ｍｉＲＮＡハイブリダイゼーション試薬が、請求項１に記載のｍｉＲＮＡに結合するハイブリダイゼーションプローブを含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
ｍｉＲＮＡ増幅試薬が、請求項１に記載のｍｉＲＮＡのための増幅用プライマーを含む、請求項３２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１０年１１月１７日に出願の米国仮特許出願第６１／４１４，７７８号の優先権を主張し、その全体は参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
Ｉ．  発明の分野
本発明は全体として、分子生物学及び腫瘍学の分野に関する。より具体的には、本発明は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子を伴う方法及び組成物並びに癌の診断及び／又は予後予測に関する。特定の側面には、甲状腺癌の診断及び予後予測におけるｍｉＲＮＡの使用が含まれる。
【背景技術】
【０００３】
ＩＩ．  背景
大部分の甲状腺癌はランダムに発生する。しかしながら、疾患（例えば、ホジキン病及びグレーブス病）の治療による放射線の照射又は偶発的な放射線への曝露にかかわらず、放射線を浴びた個体では甲状腺癌の発生率がより高いことを、複数の報告が示している。小児期の放射線被曝は、唯一、十分に裏付けられている甲状腺癌発症のリスク因子である。さらに、まれな症状の甲状腺癌である甲状腺髄様癌は遺伝的素因と関連しており、また、およそ５％の非甲状腺髄様癌が遺伝性である。グレーブス病、甲状腺炎、甲状腺腫の病歴、又は家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）の家族歴を有する患者は甲状腺癌発症のリスクが高い。多くの甲状腺癌は進行が遅く、一般的に、初期に検出されれば治療可能である。しかしながら、一部の甲状腺腫瘍は急速に進行する場合がある。
【０００４】
甲状腺腫瘍には、良性腺腫から悪性腫瘍までの様々な病変が包含される。癌は、高分化型、低分化型、又は未分化型（退形成）となる可能性がある。９５％を超える甲状腺癌は甲状腺の濾胞細胞に由来し、癌の２〜３％（甲状腺髄様癌）は甲状腺のＣ細胞に由来し、腫瘍のおよそ１％は退形成性である。全甲状腺癌のおよそ８０％は濾胞細胞由来の甲状腺乳頭癌（ＰＴＣ）であり、これは局所リンパ節に広がる可能性がある。ＰＴＣの高細胞型変異体（ＴＣＶ）は、ＰＴＣの最も一般的な形態であり、かつ、急速に進行する。２番目によく見られる型の腫瘍、すなわち全癌のおよそ１５％は甲状腺濾胞癌（ＦＴＣ）であり、これは従来型又は膨大性（ハースル）細胞性である場合もある。ＦＴＣは正常細胞又は既存の良性濾胞腺腫のいずれからも発生する可能性があり、血行性伝播を特徴とする。ＰＴＣとＦＴＣは両方とも高分化型の癌であり、一般に進行が遅く、予後が良い。対照的に低分化型の癌（ＰＤＣ）及び退形成性の甲状腺癌（ＡＴＣ）は急速に進行し、正常細胞から、又は既存のＰＴＣ若しくはＦＴＣが進行した結果発生する可能性のある、致死的な腫瘍である。幸いなことにＡＴＣは甲状腺癌の約５％とまれな疾患であり、診断が容易である。
【０００５】
甲状腺癌は比較的まれな疾患であるが、甲状腺結節は非常によく見られる。甲状腺結節の大部分が良性であるため、医師にとって引き続き課題となっているのは、良性結節と悪性結節を正確に区別することである。甲状腺結節の悪性度を評価するための現行の基準である微細針吸引生検の細胞学は特異性に欠けることが多く、最大４０％の例で悪性度を決定することができない。最近では、ＢＲＡＦ、ＲＡＳ、ＲＥＴ／ＰＴＣ、及びＰＡＸ８／ＰＰＡＲγなどの遺伝子の突然変異又は転座に関する分子検査が甲状腺癌の診断に使用されてきている。しかしながら、いくつかの甲状腺癌はこれらの遺伝子に突然変異をもたず、またこれらのマーカーのいくつかは悪性度に関する特異性が低い。
【０００６】
近年、マイクロＲＮＡが甲状腺癌を含む様々な癌の原因となっている。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、タンパク質をコードしていない遺伝子から転写されるより長い前駆体から生じる、短い（１６〜２９ヌクレオチドの長さ）ＲＮＡ分子である（Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎら、２００３）。前駆体は細胞内のタンパク質によって処理され、短い２本鎖ｍｉＲＮＡが生成される。ｍｉＲＮＡの鎖のうちの１本は、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれる、タンパク質とｍｉＲＮＡとの複合体中に組み入れられる。このｍｉＲＮＡがＲＩＳＣ複合体を標的ｍＲＮＡに誘導し、その後、ｍｉＲＮＡ又はその標的ｍＲＮＡの配列相補性の度合に応じて、標的ｍＲＮＡを分解するか或いは翻訳段階で抑制する（Ｂａｇｇａら、２００５；Ｌｉｍら、２００５）。
【０００７】
良性甲状腺結節と悪性甲状腺結節を区別でき、かつ、異なる型の甲状腺癌を区別できる甲状腺癌マーカーがさらに必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
甲状腺結節の術前評価を改善するために、既存の方法とは別の方法が強く必要とされていることを本発明者らは認識した。新しい評価方法は、不必要な甲状腺手術の数とそれに伴う費用及び疾病を低減することで、臨床ケアに大きな影響を及ぼすと考えられる。特定の側面では、正常な甲状腺、状態の良い甲状腺、及び様々な型の甲状腺癌を含むがこれらには限定されない、様々な型の病気の組織、正常な組織、癌組織、及び／又は異常な組織で発現に違いがある又は適切に制御されていないｍｉＲＮＡを同定することによって、甲状腺癌を診断する及び予後を予測するためのさらなる方法を提供する。さらに、患者由来の試料に関して決定した、選択したｍｉＲＮＡのレベル（増加又は低下）に基づく甲状腺癌の診断方法及び甲状腺癌の型を同定する方法もまた記述する。
【０００９】
特定の態様において、方法は、対象由来の甲状腺試料中の、ｍｉＲ−１２７４ａ、ｍｉＲ−１２７４ｂ、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−１２６０、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−９２ｂ＊、ｍｉＲ−１２０２、ｍｉＲ−１３００、ｍｉＲ−６６３、ｍｉＲ−１４９＊、ｍｉＲ−６３１、ｍｉＲ−９３６、ｍｉＲ−１８７＊、ｍｉＲ−１１８２、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−７６５、ｍｉＲ−６４８、ｍｉＲ−９３４、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−２＊、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−１３５ｂ＊、ｍｉＲ−１３２２、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４７０、ｍｉＲ−１２２７、ｍｉＲ−１８２＊、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−４９１−３ｐ、ｍｉＲ−５５４、ｍｉＲ−１２２８、ｍｉＲ−１２５８、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１９１２、ｍｉＲ−２００ａ＊、ｍｉＲ−３７６ａ又はｍｉＲ−３７９から選択される１種類以上のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程を含み、基準レベルに対する試料中のｍｉＲＮＡ発現レベルの変化が前悪性又は悪性甲状腺結節であることを示す、対象における前悪性又は悪性甲状腺結節の検出に関する。
【００１０】
バイオマーカー、例えばｍｉＲＮＡに関する場合、「基準レベル」とは、健常個体又は対照集団におけるバイオマーカーのレベル又は量を指す。基準レベル又は基準量は、健常個体の生体試料を得てバイオマーカーを検出することによって、又は既知のレベル若しくは量又は対照集団から予め決定しておいたレベル若しくは量を考慮することによって決定することができる。
【００１１】
特定の側面では、試料中のｍｉＲ−１２７４ａ、ｍｉＲ−１２７４ｂ、ｍｉＲ−７２０、若しくはｍｉＲ−１２６０レベルの基準レベルに対する増加、又はｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−９２ｂ＊、ｍｉＲ−１２０２、ｍｉＲ−１３００、ｍｉＲ−６６３、ｍｉＲ−１４９＊、ｍｉＲ−６３１、ｍｉＲ−９３６、ｍｉＲ−１８７＊、ｍｉＲ−１１８２、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−７６５、ｍｉＲ−６４８、若しくはｍｉＲ−９３４レベルの基準レベルに対する低下、又はそれらの組み合わせが、前悪性又は悪性甲状腺結節であることを示す。
【００１２】
特定の側面では、ｍｉＲ−１２７４ａと、ｍｉＲ−１２７４ｂ、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−１２６０、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−９２ｂ＊、ｍｉＲ−１２０２、ｍｉＲ−１３００、ｍｉＲ−６６３、ｍｉＲ−１４９＊、ｍｉＲ−６３１、ｍｉＲ−９３６、ｍｉＲ−１８７＊、ｍｉＲ−１１８２、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−７６５、ｍｉＲ−６４８、若しくはｍｉＲ−９３４のうちの１種類以上と；又は
ｍｉＲ−１２７４ｂと、ｍｉＲ−１２７４ａ、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−１２６０、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−９２ｂ＊、ｍｉＲ−１２０２、ｍｉＲ−１３００、ｍｉＲ−６６３、ｍｉＲ−１４９＊、ｍｉＲ−６３１、ｍｉＲ−９３６、ｍｉＲ−１８７＊、ｍｉＲ−１１８２、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−７６５、ｍｉＲ−６４８、若しくはｍｉＲ−９３４のうちの１種類以上と；又は
ｍｉＲ−７２０と、ｍｉＲ−１２７４ａ、ｍｉＲ−１２７４ｂ、ｍｉＲ−１２６０、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−９２ｂ＊、ｍｉＲ−１２０２、ｍｉＲ−１３００、ｍｉＲ−６６３、ｍｉＲ−１４９＊、ｍｉＲ−６３１、ｍｉＲ−９３６、ｍｉＲ−１８７＊、ｍｉＲ−１１８２、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−７６５、ｍｉＲ−６４８、若しくはｍｉＲ−９３４のうちの１種類以上と；又は
ｍｉＲ−１２６０と、ｍｉＲ−１２７４ａ、ｍｉＲ−１２７４ｂ、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−９２ｂ＊、ｍｉＲ−１２０２、ｍｉＲ−１３００、ｍｉＲ−６６３、ｍｉＲ−１４９＊、ｍｉＲ−６３１、ｍｉＲ−９３６、ｍｉＲ−１８７＊、ｍｉＲ−１１８２、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−７６５、ｍｉＲ−６４８、若しくはｍｉＲ−９３４のうちの１種類以上と；又は
ｍｉＲ−２０６と、ｍｉＲ−１２７４ａ、ｍｉＲ−１２７４ｂ、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−１２６０、ｍｉＲ−９２ｂ＊、ｍｉＲ−１２０２、ｍｉＲ−１３００、ｍｉＲ−６６３、ｍｉＲ−１４９＊、ｍｉＲ−６３１、ｍｉＲ−９３６、ｍｉＲ−１８７＊、ｍｉＲ−１１８２、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−７６５、ｍｉＲ−６４８、若しくはｍｉＲ−９３４のうちの１種類以上と；又は
ｍｉＲ−９２ｂ＊と、ｍｉＲ−１２７４ａ、ｍｉＲ−１２７４ｂ、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−１２６０、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−１２０２、ｍｉＲ−１３００、ｍｉＲ−６６３、ｍｉＲ−１４９＊、ｍｉＲ−６３１、ｍｉＲ−９３６、ｍｉＲ−１８７＊、ｍｉＲ−１１８２、１５ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−７６５、ｍｉＲ−６４８、若しくはｍｉＲ−９３４のうちの１種類以上と；又は
ｍｉＲ−１２０２と、ｍｉＲ−１２７４ａ、ｍｉＲ−１２７４ｂ、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−１２６０、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−９２ｂ＊、ｍｉＲ−１３００、ｍｉＲ−６６３、ｍｉＲ−１４９＊、ｍｉＲ−６３１、ｍｉＲ−９３６、ｍｉＲ−１８７＊、ｍｉＲ−１１８２、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−７６５、ｍｉＲ−６４８、若しくはｍｉＲ−９３４のうちの１種類以上と；又は
ｍｉＲ−１３００と、ｍｉＲ−１２７４ａ、ｍｉＲ−１２７４ｂ、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−１２６０、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−９２ｂ＊、ｍｉＲ−１２０２、ｍｉＲ−６６３、ｍｉＲ−１４９＊、ｍｉＲ−６３１、ｍｉＲ−９３６、ｍｉＲ−１８７＊、ｍｉＲ−１１８２、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−７６５、ｍｉＲ−６４８、若しくはｍｉＲ−９３４のうちの１種類以上と；又は
ｍｉＲ−６６３と、ｍｉＲ−１２７４ａ、ｍｉＲ−１２７４ｂ、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−１２６０、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−９２ｂ＊、ｍｉＲ−１２０２、ｍｉＲ−１３００、ｍｉＲ−１４９＊、ｍｉＲ−６３１、ｍｉＲ−９３６、ｍｉＲ−１８７＊、ｍｉＲ−１１８２、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−７６５、ｍｉＲ−６４８、若しくはｍｉＲ−９３４のうちの１種類以上と；又は
ｍｉＲ−１４９＊と、ｍｉＲ−１２７４ａ、ｍｉＲ−１２７４ｂ、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−１２６０、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−９２ｂ＊、ｍｉＲ−１２０２、ｍｉＲ−１３００、ｍｉＲ−６６３、ｍｉＲ−６３１、ｍｉＲ−９３６、ｍｉＲ−１８７＊、ｍｉＲ−１１８２、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−７６５、ｍｉＲ−６４８、若しくはｍｉＲ−９３４のうちの１種類以上と；又は
ｍｉＲ−６３１と、ｍｉＲ−１２７４ａ、ｍｉＲ−１２７４ｂ、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−１２６０、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−９２ｂ＊、ｍｉＲ−１２０２、ｍｉＲ−１３００、ｍｉＲ−６６３、ｍｉＲ−１４９＊、ｍｉＲ−９３６、ｍｉＲ−１８７＊、ｍｉＲ−１１８２、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−７６５、ｍｉＲ−６４８、若しくはｍｉＲ−９３４のうちの１種類以上と；又は
ｍｉＲ−９３６と、ｍｉＲ−１２７４ａ、ｍｉＲ−１２７４ｂ、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−１２６０、ｍｉＲ−５２０６、ｍｉＲ−９２ｂ＊、ｍｉＲ−１２０２、ｍｉＲ−１３００、ｍｉＲ−６６３、ｍｉＲ−１４９＊、ｍｉＲ−６３１、ｍｉＲ−１８７＊、ｍｉＲ−１１８２、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−７６５、ｍｉＲ−６４８、若しくはｍｉＲ−９３４のうちの１種類以上と；又は
ｍｉＲ−１８７＊と、ｍｉＲ−１２７４ａ、ｍｉＲ−１２７４ｂ、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−１２６０、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−９２ｂ＊、ｍｉＲ−１２０２、ｍｉＲ−１３００、ｍｉＲ−６６３、ｍｉＲ−１４９＊、ｍｉＲ−６３１、ｍｉＲ−９３６、ｍｉＲ−１１８２、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−７６５、ｍｉＲ−６４８、若しくはｍｉＲ−９３４のうちの１種類以上と；又は
ｍｉＲ−１１８２と、ｍｉＲ−１２７４ａ、ｍｉＲ−１２７４ｂ、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−１２６０、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−９２ｂ＊、ｍｉＲ−１２０２、ｍｉＲ−１３００、ｍｉＲ−６６３、ｍｉＲ−１４９＊、ｍｉＲ−６３１、ｍｉＲ−９３６、ｍｉＲ−１８７＊、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−７６５、ｍｉＲ−６４８、若しくはｍｉＲ−９３４のうちの１種類以上と；又は
ｍｉＲ−１９８と、ｍｉＲ−１２７４ａ、ｍｉＲ−１２７４ｂ、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−１２６０、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−９２ｂ＊、ｍｉＲ−１２０２、ｍｉＲ−１３００、ｍｉＲ−６６３、ｍｉＲ−１４９＊、ｍｉＲ−６３１、ｍｉＲ−９３６、ｍｉＲ−１８７＊、ｍｉＲ−１１８２、ｍｉＲ−７６５、ｍｉＲ−６４８、若しくはｍｉＲ−９３４のうちの１種類以上と；又は
ｍｉＲ−７６５と、ｍｉＲ−１２７４ａ、ｍｉＲ−１２７４ｂ、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−１２６０、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−９２ｂ＊、ｍｉＲ−１２０２、ｍｉＲ−１３００、ｍｉＲ−６６３、ｍｉＲ−１４９＊、ｍｉＲ−６３１、ｍｉＲ−９３６、ｍｉＲ−１８７＊、ｍｉＲ−１１８２、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−６４８、若しくはｍｉＲ−９３４のうちの１種類以上と；又は
ｍｉＲ−６４８と、ｍｉＲ−１２７４ａ、ｍｉＲ−１２７４ｂ、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−１２６０、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−９２ｂ＊、ｍｉＲ−１２０２、ｍｉＲ−１３００、ｍｉＲ−６６３、ｍｉＲ−１４９＊、ｍｉＲ−６３１、ｍｉＲ−９３６、ｍｉＲ−１８７＊、ｍｉＲ−１１８２、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−７６５、若しくはｍｉＲ−９３４のうちの１種類以上と；又は
ｍｉＲ−９３４と、ｍｉＲ−１２７４ａ、ｍｉＲ−１２７４ｂ、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−１２６０、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−９２ｂ＊、ｍｉＲ−１２０２、ｍｉＲ−１３００、ｍｉＲ−６６３、ｍｉＲ−１４９＊、ｍｉＲ−６３１、ｍｉＲ−９３６、ｍｉＲ−１８７＊、ｍｉＲ−１１８２、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−７６５、若しくはｍｉＲ−６４８のうちの１種類以上とのレベルが測定される。
【００１３】
さらなる側面では、ｍｉＲ−１２７４ａ、ｍｉＲ−１２７４ｂ、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−１２６０、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−９２ｂ＊、ｍｉＲ−１２０２、ｍｉＲ−１３００、ｍｉＲ−６６３、ｍｉＲ−１４９＊、ｍｉＲ−６３１、ｍｉＲ−９３６、ｍｉＲ−１８７＊、ｍｉＲ−１１８２、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−７６５、ｍｉＲ−６４８、及びｍｉＲ−９３４のレベルが測定される。
【００１４】
特定の側面では、悪性甲状腺結節とは、甲状腺乳頭癌（ＰＴＣ）、甲状腺濾胞癌（ＦＴＣ）、又は甲状腺乳頭癌濾胞亜型（ＦＶＰＴＣ）である。さらなる側面では、試料中のｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、若しくはｍｉＲ−１８１ａ−２＊レベルの基準レベルに対する増加；又は試料中のｍｉＲ−７、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−１３５ｂ＊、ｍｉＲ−１３２２、ｍｉＲ−１４５、又はｍｉＲ−１４７０レベルの基準レベルに対する低下；又はそれらの組み合わせが悪性甲状腺結節であることを示す。
【００１５】
さらなる側面では、ｍｉＲ−１４２−５ｐと、ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−２＊、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−１３５ｂ＊、ｍｉＲ−１３２２、ｍｉＲ−１４５、若しくはｍｉＲ−１４７０のうちの１種類以上と；又は
ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐと、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−２＊、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−１３５ｂ＊、ｍｉＲ−１３２２、ｍｉＲ−１４５、若しくはｍｉＲ−１４７０のうちの１種類以上と；又は
ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐと、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−２＊、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−１３５ｂ＊、ｍｉＲ−１３２２、ｍｉＲ−１４５、若しくはｍｉＲ−１４７０のうちの１種類以上と；又は
ｍｉＲ−１８１ａ−２＊と、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−１３５ｂ＊、ｍｉＲ−１３２２、ｍｉＲ−１４５、若しくはｍｉＲ−１４７０のうちの１種類以上と；又は
ｍｉＲ−７と、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−２＊、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−１３５ｂ＊、ｍｉＲ−１３２２、ｍｉＲ−１４５、若しくはｍｉＲ−１４７０のうちの１種類以上と；又は
ｍｉＲ−２０４と、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−２＊、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−１３５ｂ＊、ｍｉＲ−１３２２、ｍｉＲ−１４５、若しくはｍｉＲ−１４７０のうちの１種類以上と；又は
ｍｉＲ−１３５ｂ＊と、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−２＊、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−１３２２、ｍｉＲ−１４５、若しくはｍｉＲ−１４７０のうちの１種類以上と；又は
ｍｉＲ−１３２２と、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−２＊、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−１３５ｂ＊、ｍｉＲ−１４５、若しくはｍｉＲ−１４７０のうちの１種類以上と；又は
ｍｉＲ−１４５と、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−２＊、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−１３５ｂ＊、ｍｉＲ−１３２２、若しくはｍｉＲ−１４７０のうちの１種類以上と；又は
ｍｉＲ−１４７０と、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−２＊、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−１３５ｂ＊、ｍｉＲ−１３２２、若しくはｍｉＲ−１４５のうちの１種類以上とのレベルが測定される。
【００１６】
特定の側面では、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−２＊、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−１３５ｂ＊、ｍｉＲ−１３２２、ｍｉＲ−１４５、及びｍｉＲ−１４７０のレベルが測定される。
【００１７】
特定の側面では、試料中のｍｉＲ−１２２７、ｍｉＲ−１８２＊、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−４９１−３ｐ、ｍｉＲ−５５４レベルの基準レベルに対する増加；又は試料中のｍｉＲ−１２２８、ｍｉＲ−１２５８、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１９１２、ｍｉＲ−２００ａ＊、ｍｉＲ−３７６ａ若しくはｍｉＲ−３７９レベルの基準レベルに対する低下；又はそれらの組み合わせが、前悪性甲状腺結節であることを示す。
【００１８】
特定の側面では、ｍｉＲ−１２２７と、ｍｉＲ−１８２＊、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−４９１−３ｐ、ｍｉＲ−５５４、ｍｉＲ−１２２８、ｍｉＲ−１２５８、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１９１２、ｍｉＲ−２００ａ＊、ｍｉＲ−３７６ａ若しくはｍｉＲ−３７９のうちの１種類以上と、又は
ｍｉＲ−１８２＊と、ｍｉＲ−１２２７、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−４９１−３ｐ、ｍｉＲ−５５４、ｍｉＲ−１２２８、ｍｉＲ−１２５８、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１９１２、ｍｉＲ−２００ａ＊、ｍｉＲ−３７６ａ若しくはｍｉＲ−３７９のうちの１種類以上と、又は
ｍｉＲ−３７２と、ｍｉＲ−１２２７、ｍｉＲ−１８２＊、ｍｉＲ−４９１−３ｐ、ｍｉＲ−５５４、ｍｉＲ−１２２８、ｍｉＲ−１２５８、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１９１２、ｍｉＲ−２００ａ＊、ｍｉＲ−３７６ａ若しくはｍｉＲ−３７９のうちの１種類以上と、又は
ｍｉＲ−４９１−３ｐと、ｍｉＲ−１２２７、ｍｉＲ−１８２＊、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−５５４、ｍｉＲ−１２２８、ｍｉＲ−１２５８、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１９１２、ｍｉＲ−２００ａ＊、ｍｉＲ−３７６ａ若しくはｍｉＲ−３７９のうちの１種類以上と、又は
ｍｉＲ−５５４と、ｍｉＲ−１２２７、ｍｉＲ−１８２＊、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−４９１−３ｐ、ｍｉＲ−１２２８、ｍｉＲ−１２５８、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１９１２、ｍｉＲ−２００ａ＊、ｍｉＲ−３７６ａ若しくはｍｉＲ−３７９のうちの１種類以上と、又は
ｍｉＲ−１２２８と、ｍｉＲ−１２２７、ｍｉＲ−１８２＊、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−４９１−３ｐ、ｍｉＲ−５５４、ｍｉＲ−１２５８、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１９１２、ｍｉＲ−２００ａ＊、ｍｉＲ−３７６ａ若しくはｍｉＲ−３７９のうちの１種類以上と、又は
ｍｉＲ−１２５８と、ｍｉＲ−１２２７、ｍｉＲ−１８２＊、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−４９１−３ｐ、ｍｉＲ−５５４、ｍｉＲ−１２２８、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１９１２、ｍｉＲ−２００ａ＊、ｍｉＲ−３７６ａ若しくはｍｉＲ−３７９のうちの１種類以上と、又は
ｍｉＲ−１３０ａと、ｍｉＲ−１２２７、ｍｉＲ−１８２＊、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−４９１−３ｐ、ｍｉＲ−５５４、ｍｉＲ−１２２８、ｍｉＲ−１２５８、ｍｉＲ−１９１２、ｍｉＲ−２００ａ＊、ｍｉＲ−３７６ａ若しくはｍｉＲ−３７９のうちの１種類以上と、又は
ｍｉＲ−１９１２と、ｍｉＲ−１２２７、ｍｉＲ−１８２＊、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−４９１−３ｐ、ｍｉＲ−５５４、ｍｉＲ−１２２８、ｍｉＲ−１２５８、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−２００ａ＊、ｍｉＲ−３７６ａ若しくはｍｉＲ−３７９のうちの１種類以上と、又は
ｍｉＲ−２００ａ＊と、ｍｉＲ−１２２７、ｍｉＲ−１８２＊、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−４９１−３ｐ、ｍｉＲ−５５４、ｍｉＲ−１２２８、ｍｉＲ−１２５８、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１９１２、ｍｉＲ−３７６ａ若しくはｍｉＲ−３７９のうちの１種類以上と、又は
ｍｉＲ−３７６ａと、ｍｉＲ−１２２７、ｍｉＲ−１８２＊、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−４９１−３ｐ、ｍｉＲ−５５４、ｍｉＲ−１２２８、ｍｉＲ−１２５８、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１９１２、ｍｉＲ−２００ａ＊、若しくはｍｉＲ−３７９のうちの１種類以上と、又は
ｍｉＲ−３７９と、ｍｉＲ−１２２７、ｍｉＲ−１８２＊、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−４９１−３ｐ、ｍｉＲ−５５４、ｍｉＲ−１２２８、ｍｉＲ−１２５８、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１９１２、ｍｉＲ−２００ａ＊、若しくはｍｉＲ−３７６ａのうちの１種類以上とのレベルが測定される。
【００１９】
特定の側面では、ｍｉＲ−１２２７、ｍｉＲ−１８２＊、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−４９１−３ｐ、ｍｉＲ−５５４、ｍｉＲ−１２２８、ｍｉＲ−１２５８、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１９１２、ｍｉＲ−２００ａ＊、ｍｉＲ−３７６ａ及びｍｉＲ−３７９のレベルが測定される。
【００２０】
特定の側面において、前悪性甲状腺結節は、濾胞腺腫（ＦＡ）である。
【００２１】
特定の側面において、基準レベルは、基準となる過形成結節（ＮＯＤ）試料において測定されたｍｉＲＮＡの発現レベルの平均である。さらなる側面において基準レベルは、基準となる濾胞腺腫（ＦＡ）試料において測定されたｍｉＲＮＡの発現レベルの平均である。
【００２２】
特定の側面において、ｍｉＲＮＡの発現レベルは、基準レベルの少なくとも４、６、８、１０、２０、又は４０倍未満である場合、又は基準レベルの少なくとも４、６、８、１０、２０、又は４０倍を上回る場合に、低下又は増加している。
【００２３】
試料は、甲状腺結節由来の単離したＲＮＡ、新鮮な組織若しくは新鮮な細胞、凍結した組織若しくは凍結した細胞、固定した組織若しくは固定した細胞、又は包埋した組織若しくは包埋した細胞であってよい。特定の側面では、試料は外科的切除又は微細針吸引などの生検材料である。
【００２４】
態様は、対象から試料を得る工程、試料由来のｍｉＲＮＡを標識する工程、及び／又は標識したｍｉＲＮＡを１種類以上のｍｉＲＮＡプローブにハイブリダイズさせる工程、のうちの１つ以上をさらに含んでいてもよい。特定の側面では、ｍｉＲＮＡプローブを支持体に結合させる。支持体は、ガラス、プラスチック、金属、又はラテックスであってよいが、これらには限定されない。さらなる側面では、支持体は平面又はビーズである。
【００２５】
方法は、ｍｉＲＮＡレベルのプロファイルが悪性甲状腺結節を示す場合に、対象が甲状腺癌であると診断する工程；予後予測を提供する工程；ｍｉＲＮＡレベルに関する報告を提供する工程；測定したｍｉＲＮＡレベルに基づいて悪性甲状腺結節を分類する工程；及び／又は治療に対する甲状腺結節の応答性を評価する工程；のうちの１種類以上をさらに含む場合がある。本明細書で使用する場合、用語「診断」は、悪性甲状腺新生物と良性甲状腺新生物を区別することを指す。本明細書で使用する場合、用語「予後予測の提供」は、甲状腺癌の予想される経過及び見通しを提供することを指す。
【００２６】
特定の側面では、ｍｉＲＮＡの発現レベルは、増幅アッセイ法又はハイブリダイゼーションアッセイ法によって測定される。増幅アッセイ法は、定量的ＲＴ−ＰＣＲ等の定量的増幅アッセイ法であってよいが、これには限定されない。ハイブリダイゼーションアッセイ法は、アレイハイブリダイゼーションアッセイ法又は溶液ハイブリダイゼーションアッセイ法であってよい。
【００２７】
いくつかの態様では、１種類以上のｍｉＲＮＡ若しくはｍｉＲＮＡ前駆体の発現レベル、又は１種類以上のｍｉＲＮＡの標的の発現レベルを測定する工程を含む、甲状腺試料を評価するための方法を提供する。いくつかの態様では、甲状腺試料は、悪性度と関連するいずれの突然変異についても評価されていない。他の態様では、甲状腺試料は、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異について試験されている。特定の例では、患者由来の甲状腺試料は、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異陰性であることが分かっている。さらなる態様では、甲状腺試料は、Ｎ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ若しくはＫ−Ｒａｓのうちの１種類以上の点変異、及び／又はＲＥＴ／ＰＴＣ１（転座）、ＲＥＴ／ＰＴＣ３（転座）、及び／又はＰＡＸ８−ＰＰＡＲｇ融合タンパク質（ＰＰＦＰ）（転座）の遺伝子変化についても、代わりに又は加えて試験されており、これらはまとめて変異として見なされる。特定の態様では、甲状腺試料は、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異陰性であることが分かっている。他の態様では、甲状腺試料は、Ｎ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ、ＲＥＴ／ＰＴＣ１（転座）、ＲＥＴ／ＰＴＣ３（転座）、ＰＡＸ８−ＰＰＡＲｇ融合タンパク質（ＰＰＦＰ）（転座）に変異がないことが分かっている。しかしながらさらなる態様では、甲状腺試料は、Ｎ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ、ＲＥＴ／ＰＴＣ１（転座）、ＲＥＴ／ＰＴＣ３（転座）、ＰＡＸ８−ＰＰＡＲｇ融合タンパク質（ＰＰＦＰ）（転座）等の甲状腺の悪性度に関連する変異をもつことが分かっている。いくつかの態様において患者は、ｍｉＲ−１４６ｂの発現に関して甲状腺試料を試験されることにより（Ｃｈｏｕら、２０１０、参照することにより本明細書に組み込まれる）、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅの変異について試験される。
【００２８】
いくつかの態様では、以下で議論される方法及び工程は、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異陰性であることが分かっている甲状腺試料、Ｎ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ、ＲＥＴ／ＰＴＣ１（転座）、ＲＥＴ／ＰＴＣ３（転座）、及び／又はＰＡＸ８−ＰＰＡＲｇ融合タンパク質（ＰＰＦＰ）（転座）中に変異があることがわかっている甲状腺試料、又はＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ、ＲＥＴ／ＰＴＣ１（転座）、ＲＥＴ／ＰＴＣ３（転座）、及びＰＡＸ８−ＰＰＡＲｇ融合タンパク質（ＰＰＦＰ）（転座）中に変異がないことが分かっている甲状腺試料、又はＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ、ＲＥＴ／ＰＴＣ１（転座）、ＲＥＴ／ＰＴＣ３（転座）、及びＰＡＸ８−ＰＰＡＲｇ融合タンパク質（ＰＰＦＰ）（転座）に関連する変異の状態が分かっていない甲状腺試料に対して実施される。いくつかの態様において方法は、甲状腺試料がＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異をもつか否かを決定する工程を含む。一層さらなる態様において方法は、試料をＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異について試験する工程を含む。このアッセイ法は、１種類以上のｍｉＲＮＡ又は他のバイオマーカーの発現レベルを測定する前、測定した後、又は測定するのと同時に実施してもよい。また、このアッセイ法は、試料のＮ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、及び／又はＫ−Ｒａｓ及び／又はＲＥＴ／ＰＴＣ１（転座）、ＲＥＴ／ＰＴＣ３（転座）、及び／又はＰＡＸ８−ＰＰＡＲｇ融合タンパク質（ＰＰＦＰ）（転座）変異についての試験の前、試験の後、又は試験と同時に実施してもよい。
【００２９】
マイクロＲＮＡ、すなわちｍｉＲＮＡを測定するとは、成熟したマイクロＲＮＡすなわちｍｉＲＮＡの量を測定することを指すが、いくつかの態様では、２本鎖ＲＮＡ分子又はＲＮＡヘアピン構造などの未成熟な又は未処理の形態のｍｉＲＮＡのレベルを測定することによって、成熟ｍｉＲＮＡが間接的に決定され得ると企図される。さらにいくつかの態様では、成熟ｍｉＲＮＡの量は、ｍｉＲＮＡの標的又は標的相補体のうちの１種類以上の量を測定することによって決定される。ｍｉＲＮＡの標的とは、ｍｉＲＮＡの標的でありかつその発現がｍｉＲＮＡに影響される、甲状腺細胞の内因性ＲＮＡを指す。従って、マイクロＲＮＡ（すなわち成熟した形態のマイクロＲＮＡ）の量の決定に関連して本明細書で議論したいずれの態様も、いくつかの態様においては、ｍｉＲＮＡ前駆体又はｍｉＲＮＡの標的（又はその相補体）のうちの１種類以上を測定することで、実施することができる。限定される場合を除き、用語「測定する」とは、直接測定することを指す。マイクロＲＮＡ分子の前駆体を直接決定することによって、成熟ｍｉＲＮＡを間接的に決定することができる。ｍｉＲに関連する用語「スター」がアスタリスク（＊）を指すことに留意されたい。例えば、ｍｉＲ−２２２−スターはｍｉＲ−２２２＊と同じものである。
【００３０】
方法はまた、比較した発現レベルに基づいてスコアを算出することによって甲状腺試料を評価する工程を含み、このスコアは、甲状腺試料が良性、前悪性、又は悪性である確率を示す。
【００３１】
甲状腺癌の患者を治療するための方法もまた提供する。いくつかの態様では、そのような方法は、（ａ）患者由来の甲状腺試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルに基づく診断スコアを得る工程、及び、（ｂ）悪性甲状腺癌を示す診断スコアを有すると決定された患者に対し、甲状腺摘出術を実施する工程を含み、ここで非悪性、良性、又は正常な甲状腺細胞と悪性甲状腺癌細胞の発現レベルは異なり、かつ、甲状腺試料はＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異陰性であることが分かっている。特定の態様では、診断スコアはその試料が前悪性であることを示す。
【００３２】
いくつかの態様において、患者は、治療計画の一環として、放射製ヨウ素の投与、放射線治療及び／又は化学療法も受ける。さらなる態様では、方法は、患者が良性の状態の甲状腺を有する若しくは有する可能性があると決定するか、又は患者が悪性腫瘍を有していない若しくは有していない可能性があると決定する工程を伴っていてもよい。そのような例では、臨床医はその後、対象に対する外科手術を行わないと決定してもよい。そのような例では、患者を継続して監視してもよい。特定の態様では、方法は、切除していない甲状腺増殖を画像化する工程、又はｍｉＲＮＡレベルを測定する前及び／若しくは後に生検を実施する工程を含む。さらなる態様では、画像化又は生検は、１種類以上のｍｉＲＮＡの発現レベルの測定を含む試験の１、２、３、４、５、６ヶ月後に行われる。
【００３３】
いくつかの態様では、方法は、１種類以上のｍｉＲＮＡの発現レベルに関するデータに基づいて診断スコアを決定する又は算出する工程を含む。つまり、１種類以上のｍｉＲＮＡの発現レベルは少なくとも、スコアの基礎になる因子の１つである。診断スコアは、その甲状腺試料が悪性及び／若しくは進行性の腫瘍であるか、又はその甲状腺試料が前悪性であるか、又はその甲状腺試料が良性若しくは正常であるかの一般的な確率などの、生体試料についての情報を提供する。いくつかの態様では、診断スコアは、その甲状腺試料が、おそらく悪性又は非悪性のいずれかである可能性が高いという確率を表す。特定の態様では、確率値は、患者が甲状腺の悪性腫瘍を有する又は患者の甲状腺の状態が非癌性である見込みを０％から１００％までの整数で表す。いくつかの態様では、確率値は、患者が有する甲状腺の状態又は増殖が特定の型にある見込みを、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の確率を表す整数（又はこれらの中において導き出される任意の範囲）で表す。
【００３４】
いくつかの態様では、方法は、スコア付けアルゴリズムを使用して、ｍｉＲＮＡの発現の差に関する１種類以上の値を評価し、悪性である若しくは良性であるという観点から、又は正常若しくは非癌性の観点から、甲状腺の増殖に関する診断スコアを生成する工程を含み、このスコアに基づいて患者がそのような増殖を有する又は有さないと判断する。スコアが甲状腺増殖の分類に関する予測値であることが当業者には明らかである。いくつかの態様では、診断スコア又はそのスコアに含まれる因子の値を明らかにした報告書が作成及び／又は提供される。いくつかの態様では、カットオフスコアを使用して、試料がおそらく甲状腺の悪性腫瘍を含むであろうということを（あるいは試料の甲状腺の状態が良性であろうということを）特徴付ける。いくつかの態様では、患者のリスクスコアをカットオフスコアと比較し、悪性度又は良性又は正常の状態の観点から、患者由来の生体試料を特徴付ける。
【００３５】
方法は、患者から甲状腺試料を得る工程を含んでいてもよい。つまり、試料は患者から直接得られる。他の態様では、患者の甲状腺組織試料を患者ではなく、例えば医師、臨床医、病院又は研究室にあるものから得ることができる。特定の態様では、方法は、甲状腺組織試料又は甲状腺嚢胞又は結節試料を含む。特定の態様において試料は組織試料であるが、他の態様では試料は嚢胞液試料である。いくつかの例では、方法は、試料中の１種類以上のｍｉＲＮＡの発現レベル又はｍｉＲＮＡの発現の差を測定する前に、組織試料をホルマリンで固定する工程及びそれをパラフィンに包埋する工程を含む。さらなる態様では、試料は微細針吸引、すなわちＦＮＡで得られる。他の態様では、試料は、微細針吸引生検（ＦＮＡＢ）又は針吸引生検（ＮＡＢ）などの生検材料から回収される。
【００３６】
さらに別の態様では、方法は、１種類以上のｍｉＲＮＡの発現レベル、特に発現の差に基づいて、患者に対する治療法を決定する工程を含む。いくつかの態様において方法は、算出された診断スコアに基づいて、患者に対する治療法を決定する工程を含む。いくつかの態様では、患者は甲状腺の悪性腫瘍を有していると推測され得る。他の態様では、その患者の甲状腺の状態は悪性だと既に推測されており、その後治療されている可能性がある。他の態様では、その患者は甲状腺増殖を再発しており、その再発は悪性の又は悪性ではない可能性がある。その上さらに別の態様では、その患者は甲状腺増殖の、特に悪性甲状腺増殖の家族歴を有する。状況次第で患者は、疲労、食欲の変化、及び甲状腺ホルモンレベルの変化に関連する他の症状等の甲状腺増殖の症状もまた呈する。
【００３７】
特定の態様は、試料に関するｍｉＲＮＡのプロファイルを評価することによって甲状腺試料を解析するためのキットに関し、このキットは、好適な容器に入った、本明細書に記載のｍｉＲＮＡのうちの１種類以上を含む、２種以上のｍｉＲＮＡハイブリダイゼーション試薬又は増幅試薬を含む。ｍｉＲＮＡハイブリダイゼーション試薬は、本明細書に記載のｍｉＲＮＡに結合するハイブリダイゼーションプローブを含む可能性がある。ｍｉＲＮＡ増幅試薬は、本明細書に記載のｍｉＲＮＡのための増幅用プライマーを含む可能性がある。
【００３８】
本出願を通じて、他の態様についても議論する。本発明の一側面について議論したいずれの態様も、同様に他の側面に適用され、逆もまた同じである。実施例部分に記載した態様は、本発明の全ての側面に適用可能な本発明の態様であると理解される。
【００３９】
いくつかの態様は、生体試料からリボ核酸、すなわちＲＮＡを単離する工程をさらに含む。他の工程は、試料に含まれる核酸を増幅する工程及び／又は１種類以上のプローブを増幅した若しくは増幅していない核酸にハイブリダイズさせる工程を含んでも又は含まなくてもよい。特定の態様では、マイクロアレイを使用して試料に含まれるｍｉＲＮＡの発現レベルを測定又はアッセイしてもよい。
【００４０】
用語「ｍｉＲＮＡ」又は「ｍｉＲ」は、通常の、単純な意味に従って使用され、かつ、真核生物に見られ、ＲＮＡによる遺伝子制御に関与するマイクロＲＮＡ分子を指す。例えば、Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎら、２００３（ここで参照することにより組み込まれる）を参照のこと。この用語は、前駆体から生じた一本鎖ＲＮＡ分子を指す場合に使用される。態様に関連するｍｉＲＮＡの名称及びそれらの配列を本明細書で提供する。
【００４１】
個々のｍｉＲＮＡは別々の生物から同定され、配列が決定されてきており、それぞれに名前がつけられている。開示した方法及び組成物に関連するｍｉＲＮＡの名称及びそれらの配列を本明細書で提供する。方法及び組成物で使用したｍｉＲＮＡの名称は、本明細書で列挙したそれらの成熟配列に基づいて命名されたｍｉＲＮＡと少なくとも９０％同一であり、かつ、ＡＢＩの品番がつけられたプローブを使用して本明細書に記載の条件において検出することができる、ｍｉＲＮＡを指す。態様の多くでは、本明細書で提供した配列は本明細書に記載の方法で測定される配列である。いくつかの方法において工程は、任意の配列番号の相補鎖のいずれか若しくは本明細書中に見られる任意の核酸配列を含む又はそれらからなる配列を使用して、試料に含まれるｍｉＲＮＡの発現を測定する工程を含んでもよい。あるいは、これらのｍｉＲＮＡの未成熟形態に対するプローブを使用してもよく、同様にｍｉＲＮＡの標的に対するプローブを使用してもよい。
【００４２】
本明細書に記載の方法はいずれも、コンピューターで測定可能なコードを含むコンピューターで測定可能な有形の媒体を用いて実施してもよく、コンピューターを使用して実行した場合、コンピューターは１つ以上の操作を実施する。いくつかの態様では、コンピューターを使用して実行した場合にコンピューターが、（ａ）患者由来の甲状腺試料中の、ｍｉＲ−１２７４ａ、ｍｉＲ−１２７４ｂ、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−１２６０、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−９２ｂ＊、ｍｉＲ−１２０２、ｍｉＲ−１３００、ｍｉＲ−６６３、ｍｉＲ−１４９＊、ｍｉＲ−６３１、ｍｉＲ−９３６、ｍｉＲ−１８７＊、ｍｉＲ−１１８２、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−７６５、ｍｉＲ−６４８、ｍｉＲ−９３４、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−２＊、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−１３５ｂ＊、ｍｉＲ−１３２２、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４７０、ｍｉＲ−１２２７、ｍｉＲ−１８２＊、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−４９１−３ｐ、ｍｉＲ−５５４、ｍｉＲ−１２２８、ｍｉＲ−１２５８、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１９１２、ｍｉＲ−２００ａ＊、ｍｉＲ−３７６ａ又はｍｉＲ−３７９のうちの少なくとも１種類の発現レベルに相当する情報を受信する工程であって、少なくとも１種類のｍｉＲＮＡがバイオマーカーｍｉＲＮＡである、工程、及び（ｂ）その発現レベルを基準レベルと比較する工程であって、差が、甲状腺結節が悪性又は良性であるかということを示す、工程、を含む操作を実施する、コンピューターで測定可能なコードを含むコンピューターで測定可能な有形の媒体である。いくつかの態様では、情報を受信する工程は、患者由来の甲状腺試料中の、ｍｉＲ−１２７４ａ、ｍｉＲ−１２７４ｂ、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−１２６０、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−９２ｂ＊、ｍｉＲ−１２０２、ｍｉＲ−１３００、ｍｉＲ−６６３、ｍｉＲ−１４９＊、ｍｉＲ−６３１、ｍｉＲ−９３６、ｍｉＲ−１８７＊、ｍｉＲ−１１８２、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−７６５、ｍｉＲ−６４８、ｍｉＲ−９３４、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−２＊、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−１３５ｂ＊、ｍｉＲ−１３２２、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４７０、ｍｉＲ−１２２７、ｍｉＲ−１８２＊、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−４９１−３ｐ、ｍｉＲ−５５４、ｍｉＲ−１２２８、ｍｉＲ−１２５８、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１９１２、ｍｉＲ−２００ａ＊、ｍｉＲ−３７６ａ又はｍｉＲ−３７９のうちの少なくとも１種類のｍｉＲＮＡの発現レベルに相当する情報を、有形のデータ記憶装置から受信する工程を含み、癌性の結節では、ｍｉＲＮＡのうちの少なくとも１種類の発現は、基準マーカー又は基準レベルと異なる。さらなる態様では、この媒体はコンピューターで測定可能なコードをさらに含み、コンピューターを使用して実行した場合にコンピューターは、バイオマーカーの発現の差の値に相当する情報を有形のデータ記憶装置に送信する工程を含む、１つ以上の操作をさらに実施する。特定の態様では、媒体は、コンピューターで測定可能なコードをさらに含み、コンピューターを使用して実行した場合にコンピューターは、発現レベルの違いに相当する情報を有形のデータ記憶装置に送信する工程を含む、１つ以上の操作をさらに実施する。特定の態様では、情報を受信する工程は、患者由来の甲状腺試料中のｍｉＲＮＡ、すなわちｍｉＲ−１２７４ａ、ｍｉＲ−１２７４ｂ、ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−１２６０、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−９２ｂ＊、ｍｉＲ−１２０２、ｍｉＲ−１３００、ｍｉＲ−６６３、ｍｉＲ−１４９＊、ｍｉＲ−６３１、ｍｉＲ−９３６、ｍｉＲ−１８７＊、ｍｉＲ−１１８２、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−７６５、ｍｉＲ−６４８、ｍｉＲ−９３４、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−２＊、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−１３５ｂ＊、ｍｉＲ−１３２２、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４７０、ｍｉＲ−１２２７、ｍｉＲ−１８２＊、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−４９１−３ｐ、ｍｉＲ−５５４、ｍｉＲ−１２２８、ｍｉＲ−１２５８、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１９１２、ｍｉＲ−２００ａ＊、ｍｉＲ−３７６ａ又はｍｉＲ−３７９のうちの少なくとも１種のｍｉＲＮＡの発現レベルに相当する情報を、有形のデータ記憶装置から受信する工程を含み、基準との発現の違いが癌であることを示し得る。一層さらなる態様では、コンピューターで測定可能な有形の媒体はコンピューターで測定可能なコードを有し、コンピューターを使用して実行した場合にコンピューターは、（ｃ）甲状腺試料に関する診断スコアを算出する工程であって、その診断スコアが、甲状腺試料が悪性又は癌性又は正常である確率を示す工程、をさらに含む操作を実施する。上述した方法はいずれも、コンピューターで測定可能なコードを含む、コンピューターで測定可能な有形の媒体を用いて実施してもよく、コンピューターを使用して実行した場合にコンピューターは、甲状腺の状態が悪性か或いは良性かの確率に関する測定、比較、及び／又は診断スコアの算出に関連する操作を実施すると考えられる。
【００４３】
本明細書で開示したコンピューター可読の有形の媒体の例によって駆動される処理装置を、操作の実施において使用することができる。あるいはハードウェアによる制御下で、又はハードウェアとソフトウェアによる制御下で、処理装置がそれらの操作を実施する可能性がある。例えば処理装置は、それらの操作を１つ以上実施するように特定の構成に、例えば特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）又はフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）になっていてもよい。処理装置を使用することで、処理装置の助けがなければ不可能な情報の処理、又は、少なくとも、処理装置がなければ達成できない速度での情報（例えばデータ）の処理が可能になる。そのような操作の実施のいくつかの態様は、一定の時間内、例えば、１時間以内、３０分以内、１５分以内、１０分以内、１分以内、１秒以内、及び１秒〜１時間の範囲で秒単位を超える間隔を開けないで、など、コンピューターシステム又は処理装置を使用しない場合にかかる時間よりも短い時間内で達成され得る。
【００４４】
コンピューターで測定可能な本有形の媒体のいくつかの態様は、例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、フラッシュドライブ、ハードドライブ、又はいかなる他の物理的記憶装置であってもよい。本方法のいくつかの態様は、コンピューターで測定可能な有形の媒体に、コンピューターを使用して実行した場合にコンピューターが、本明細書で議論した操作のいずれかを実施するための、コンピューターで測定可能な有形の媒体に関連するコードを含むコンピューターで測定可能なコードを記録する工程を含んでいてもよい。コンピューターで測定可能な有形の媒体に記録する工程は例えば、ＣＤ−ＲＯＭ若しくはＤＶＤ−ＲＯＭにデータを焼き込む工程、あるいは、そうでなければ、物理的記憶装置にデータを読み込む工程を含んでもよい。
【００４５】
特許請求の範囲及び／又は明細書において、用語「含む」に関連して使用される語「１つ／１種（ａ）」又は「１つ／１種（ａｎ）」は「１つ（ｏｎｅ）」を意味する場合があるが、「１つ／１種類以上の」、「少なくとも１つの」、及び「１つ又は１つより多い」の意味とも一致する。
【００４６】
本明細書で議論した態様はいずれも、本発明のいずれの方法又は組成物に関して実施することができ、また、逆もまた同じであると企図される。さらに、本発明の組成物及びキットは、本発明の方法を達成するために使用することができる。
【００４７】
本出願を通じて、用語「約」は、その値が、値の決定に使用した装置又は方法による標準偏差を含むことを示すために使用される。
【００４８】
本開示は、用語「又は」がどちらか一方及び「及び／又は」を指すという定義を支持するが、特許請求の範囲において用語「又は」は、どちらか一方だけを指すこと、若しくは両者が相容れないことが明確に記載されていない限り、「及び／又は」の意味で使用される。さらに、用語「又は」を使用して列挙されたものはいずれも、具体的に排除してもよいと企図される。
【００４９】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、語「含む」（及び「含んでいる」及び「含める」などのいずれの形の含む）、「有する」（及び「有している」及び「有す」などのいずれの形の有する）、「含有する」（及び「含有している」及び「含有させる」などのいずれの形の含有する）又は「包含する」（及び「包含している」及び「包含させる」などのいずれの形の包含する）は、包括的又は制約のない語であり、付加的な、記載していない要素又は方法工程を排除しない。
【００５０】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかし当然のことながら、詳細な説明及び特定の実施例では本発明の特定の態様を記載してはいるが、これらは説明する目的のためだけに示されており、この詳細な説明から、本発明の精神及び範囲内での様々な変更及び修正が当業者には明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
添付の図面は本明細書の一部を構成しており、かつ、本発明の特定の側面をさらに示すために含められている。これらの図面のうちの１種類以上を、本明細書に示した特定の態様の詳細な説明と併せて参照することで、本発明をより深く理解できるであろう。
【図１】正常、良性及び悪性の甲状腺組織におけるｍｉＲＮＡの発現プロファイル。８群の甲状腺試料間で検出した全てのｍｉＲＮＡプローブに関する主成分分析（ＰＣＡ）を行った。ＮＯＲ、正常、Ｎ＝４；ＮＯＤ、過形成結節、Ｎ＝４；ＦＡ、濾胞腺腫、Ｎ＝５；ＦＴＣ、甲状腺濾胞癌、Ｎ＝５；ＰＴＣ、甲状腺乳頭癌、Ｎ＝５；ＦＶＰＴＣ、甲状腺乳頭癌濾胞亜型、Ｎ＝４；ＡＴＣ、退形成甲状腺癌、Ｎ＝１；ＭＴＣ、甲状腺髄様癌腫、Ｎ＝３。
【図２Ａ】過形成結節（ＮＯＤ）及び濾胞腺腫（ＦＡ）との間で発現に差のある、選択したｍｉＲＮＡについてのアレイデータとｑＲＴ−ＰＣＲデータの比較。関連するｐ値も示す。
【図２Ｂ】過形成結節（ＮＯＤ）及び濾胞腺腫（ＦＡ）との間で発現に差のある、選択したｍｉＲＮＡの組み合わせについてのアレイデータとｑＲＴ−ＰＣＲデータの比較。関連するｐ値も示す。
【図３Ａ】アレイデータとｑＲＴ−ＰＣＲデータの相関を示す、発現に差のあるｍｉＲＮＡの組み合わせの例。発現に差のあるｍｉＲＮＡをアレイ解析で同定し、ｑＲＴ−ＰＣＲで確認した。図の上に示すように、発現に差のあるｍｉＲＮＡを選択して、３通りに組み合わせた。三角は、ｑＲＴ−ＰＣＲのみで試験した、追加の独立した１１組の試料（Ｎｏｄ、１；ＦＡ２、膨大性ＦＡ；１、ＰＴＣ；４、ＦＶＰＴＣ；１、膨大性ＦＴＣ；１、及び橋本甲状腺炎（Ｈａｓｈ）；１）に対応する。灰色の四角と三角は、甲状腺癌に最も共通の突然変異又は遺伝子転座のいずれかが陽性の試料に相当する。
【図３Ｂ】アレイデータとｑＲＴ−ＰＣＲデータの相関を示す、発現に差のあるｍｉＲＮＡの組み合わせの例。発現に差のあるｍｉＲＮＡをアレイ解析で同定し、ｑＲＴ−ＰＣＲで確認した。図の上に示すように、発現に差のあるｍｉＲＮＡを選択して、３通りに組み合わせた。三角は、ｑＲＴ−ＰＣＲのみで試験した、追加の独立した１１組の試料（Ｎｏｄ、１；ＦＡ２、膨大性ＦＡ；１、ＰＴＣ；４、ＦＶＰＴＣ；１、膨大性ＦＴＣ；１、及び橋本甲状腺炎（Ｈａｓｈ）；１）に対応する。灰色の四角と三角は、甲状腺癌に最も共通の突然変異又は遺伝子転座のいずれかが陽性の試料に相当する。
【図３Ｃ】アレイデータとｑＲＴ−ＰＣＲデータの相関を示す、発現に差のあるｍｉＲＮＡの組み合わせの例。発現に差のあるｍｉＲＮＡをアレイ解析で同定し、ｑＲＴ−ＰＣＲで確認した。図の上に示すように、発現に差のあるｍｉＲＮＡを選択して、３通りに組み合わせた。三角は、ｑＲＴ−ＰＣＲのみで試験した、追加の独立した１１組の試料（Ｎｏｄ、１；ＦＡ２、膨大性ＦＡ；１、ＰＴＣ；４、ＦＶＰＴＣ；１、膨大性ＦＴＣ；１、及び橋本甲状腺炎（Ｈａｓｈ）；１）に対応する。灰色の四角と三角は、甲状腺癌に最も共通の突然変異又は遺伝子転座のいずれかが陽性の試料に相当する。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
発明の詳細な説明
態様は、ｍｉＲＮＡの調製及び特徴解析に関する組成物及び方法、並びに予後的な応用及び／又は診断的な応用、特に甲状腺疾患の評価及び／又は同定に関する方法及び組成物へのｍｉＲＮＡの使用に関する。本発明は、甲状腺癌の診断のための、及び異なる型の甲状腺癌を区別するための新規ｍｉＲＮＡマーカーの使用について記載することで、甲状腺癌の現行の診断技術を発展させる。
【００５３】
Ｉ．甲状腺の状態
甲状腺癌は前悪性疾患の１％、神経内分泌腫瘍の９０％を構成する。人口の５〜１０％が、生きている間に臨床上明らかな甲状腺結節を発症すると予測されている。甲状腺結節の患者を評価するために最も使用されている試験は微細針吸引生検（ＦＮＡ）である。悪性のＦＮＡの大部分は、乳頭甲状腺癌（ＰＴＣ）又はその濾胞亜型（ＦＶＰＴＣ）に由来する。これらは、それらが、豊富な細胞充実性、肥大した核を含む核内溝、及び封入体等の典型的な細胞学的な特徴を示す場合には容易に診断できる。実際に、これらの診断の３分の１はＦＮＡで明らかになっている。甲状腺結節の微細針吸引生検は、甲状腺手術の必要性を大幅に減少させ、かつ、切除した結節中の悪性腫瘍の検出を増加させた。加えて、悪性甲状腺腫瘍の診断と有効な治療は合わせて、甲状腺癌による死亡率を著明に低下させた。残念なことに良性か悪性が確実でないため、多くの甲状腺ＦＮＡは「未確定」診断又は「疑わしい」診断となる。未確定なＦＮＡの確率は様々であるが、一般的にはＦＮＡの１０〜２５％である。通常、甲状腺ＦＮＡは、良性の病変と悪性の病変が重複していること若しくは形態学的な基準が不確定であること、又は重要な核異型が他の良性の標本にも含まれていることから、不確定となる。注目すべきは、悪性病変（５％）の２倍多くの疑わしい病変の患者（１０％）に手術が勧められていることであるが、ＦＮＡの多くが良性であれば、手術が広く勧められるものではない。その結果、ＦＮＡでは診断が確定しない場合、これらの患者は疑わしい又は未確定の病変だけを有すると分類される。凍結切片の解析からは付加的な情報を得ることができない場合が多いということが周知である。
【００５４】
術前及び術中の両方で診断が確定しない場合、外科医は、甲状腺肺葉切除をいつ行うか、どれが良性病変又は甲状腺の全摘出術に適しているか、どれが悪性病変に適しているかを決定する。ＦＮＡで疑わしいとされた全ての患者に対する最初の手術を甲状腺肺葉切除とすれば、癌患者は、甲状腺を完全に摘出するための第二の手術を受けることができる。反対に、ＦＮＡで疑わしいとされた全ての患者に対する甲状腺の全摘出術では、患者の大部分が不必要な手術を受け、手術固有の危険性に曝され、一生涯続く甲状腺ホルモンの補充を必要とすることになる。
【００５５】
標準的な組織病理学的解析に基づく甲状腺癌の分類と治療に関するコンセンサスを明確に示すための複数の試みによって、診断と初期の疾患管理に関する指針が発表された。ＦＮＡによる甲状腺癌、特に疑わしい又は未確定の甲状腺病変の識別診断は、過去数十年の間、全く改善されていない。このことは、甲状腺病変の識別診断に対する新しいアプローチを探る必要があることを示唆している。従って、甲状腺結節を評価するための、より正確な初期診断試験の開発が切実に必要とされている。
【００５６】
濾胞上皮細胞に由来する甲状腺癌は、最も一般的な内分泌癌である。甲状腺の悪性腫瘍全体の大部分を、甲状腺乳頭癌（ＰＴＣ）及び甲状腺濾胞癌（ＦＴＣ）が占める。成人人口の推定７％（１９９９年には、米国単独で２７５，０００人）が、一生の間に臨床上有意な甲状腺結節を発症する。甲状腺超音波検査の登場によって診断される結節の数が増加し、現在では、一般集団の推定５０％に結節が認められ、無症状のレベルで検出されることが分かっている。
【００５７】
ＩＩ．ｍｉＲＮＡレベルの評価
甲状腺試料のｍｉＲＮＡの解析には、多数のアッセイ法が使用できることが企図される。そのようなアッセイ法には、これらには限定されないが、アレイハイブリダイゼーション、溶液ハイブリダイゼーション、核酸増幅、ポリメラーゼ連鎖反応、定量的ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションプロテクションアッセイ法（ＨＰＡ）（ＧｅｎＰｒｏｂｅ）、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）法（Ｃｈｉｒｏｎ）、ローリングサイクル型増幅法（ＲＣＡ）、単一分子ハイブリダイゼーション検出（ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）（ＵＳ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、インベーダーアッセイ法（ＴｈｉｒｄＷａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び／又はオリゴライゲーションアッセイ法（ＯＬＡ）、ハイブリダイゼーション、及びアレイ解析が含まれる。
【００５８】
２００５年５月３１日に出願の米国特許出願第１１／１４１，７０７号、２００７年９月１９日出願の同第１１／８５７，９４８号、２００５年１１月１４日出願の同第１１／２７３，６４０号、及び２００６年１２月８日に出願の米国仮特許出願第６０／８６９，２９５号の全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５９】
Ａ．試料の調製
組成物及び方法では内因性ｍｉＲＮＡを企図しつつ、本明細書に記載の通り、組換えｍｉＲＮＡ、つまり内因性ｍｉＲＮＡ又は前駆ｍｉＲＮＡに相補的な又は同一の核酸を含む組換えｍｉＲＮＡもまた取扱い、分析する。試料は生体試料であってよく、そのような例では、生体試料は、洗浄、生検、微細針吸引、剥離物、血液、喀痰、組織、器官、精液、唾液、涙液、尿、髄液、体液、毛包、皮膚に由来してもよいか、又は目的の生体細胞を含むか或いはそれらからなるいずれの試料であってよい。特定の態様では、試料は、これらには限定されないが、新鮮な、凍結した、固定した、ホルマリン固定した、保存した、ＲＮＡｌａｔｅｒで保存した、パラフィン包埋した、又はホルマリンで固定しかつパラフィン包埋した、甲状腺試料であってよい。
【００６０】
Ｂ．差次的な発現の解析
方法を、２つの試料間の、又は試料と基準（例えば、非癌性状態を表す、組織又は他の生物学的な基準又は計数的な基準）の間のｍｉＲＮＡの発現の差又はレベルの差を検出するために使用することができる。特に企図される用途としては、正常な試料と正常でない試料間の、癌性状態と非癌性状態の間の、又は異なる処理を行った２つの試料間（例えば、治療前と治療後の試料）のｍｉＲＮＡの差の同定及び／又は定量が挙げられる。また、特定の治療、疾患、又は状態に感受性であると考えられている試料とその治療、疾患、又は状態に感受性でないと考えられている試料間でｍｉＲＮＡを比較してもよい。正常でない試料とは、疾患又は状態の表現型形質を示している試料、或いはその疾患又は状態について正常でないと考えられている試料である。そのような試料を、その疾患又は状態について正常な細胞と比較してもよい。表現型形質には、構成要素が遺伝的なものである若しくは構成要素が遺伝的である可能性がある、若しくは構成要素が遺伝的ではない可能性がある疾患又は状態の症状、或いは、結節又は腫瘍などの、過剰増殖性の若しくは腫瘍性の細胞によって生じる疾患又は状態の症状が含まれる。
【００６１】
疾患のステージ間の、例えば、過形成、新形成、全癌及び癌の間の、又は原発巣と転移巣の間の差を評価するために態様を使用してもよいことが特に企図される。
【００６２】
表現型形質には、長命、死亡率、特定の薬剤若しくは治療（薬物効果）に対する感受性又は受容性、及び薬物毒性の危険性などの特徴もまた含まれる。
【００６３】
特定の態様では、ｍｉＲＮＡのプロファイルを生成し、それらのプロファイルを評価し、薬物動態と相関させてもよい。例えば、患者を治療する前又は治療中に患者の腫瘍及び血液試料に関するｍｉＲＮＡのプロファイルを作製及び評価し、治療の結果と相関して発現するｍｉＲＮＡがあるかを決定してもよい。ｍｉＲＮＡの差の同定は、どのような投薬計画を患者に提供すべきかを決定するための腫瘍及び／又は血液試料の評価に使用することができるｍｉＲＮＡを含む診断アッセイ法となる。加えて、それを用いて特定の臨床試験に好適な患者を同定又は選抜することができる。ｍｉＲＮＡのプロファイルが薬効又は薬物毒性と相関していることが決定される場合には、その決定は、患者が、その薬剤又は特定の用量のその薬剤を投与されるのに適切な患者であったかどうかに関係すると考えられる。
【００６４】
上述したアッセイ法に加えて、患者からの血液試料をｍｉＲＮＡレベルに基づいて評価し、疾患又は状態、例えば転移性疾患を同定することができる。医師が疾患に罹患している個体又は疾患を発症するリスクのある個体を同定するために使用することができるプロファイルに基づいて、診断検査を作ることができる。あるいは、ｍｉＲＮＡプロファイリングに基づいて治療を計画することができる。そのような方法及び組成物の例は、２００５年５月２３日に出願された「ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ阻害分子を含む方法及び組成物（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｍｉＲＮＡ  ａｎｄ  ｍｉＲＮＡ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」という名称の米国仮特許出願に記載されおり、その全体はここで参照することにより組み込まれる。
【００６５】
Ｃ．増幅
ｍｉＲＮＡ、例えば成熟ｍｉＲＮＡ、前駆ｍｉＲＮＡ、及び初期ｍｉＲＮＡの核酸配列の全体又は一部を増幅することによって、ｍｉＲＮＡレベルを評価するための方法は数多く存在する。適した核酸の重合及び増幅技術としては、逆転写（ＲＴ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（定量的ＰＣＲ（ｑ−ＰＣＲ））、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、リガーゼ連鎖反応、多様なライゲーション可能なプローブを用いる増幅（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｌｉｇａｔａｂｌｅ  ｐｒｏｂｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、インベーダーテクノロジー（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ）、ローリングサイクル型増幅法、インビトロ転写（ＩＶＴ）、鎖置換増幅、転写介在性増幅（ＴＭＡ）、ＲＮＡ（Ｅｂｅｒｗｉｎｅ）増幅、及び当業者に知られている他の方法が挙げられる。特定の態様では例えば、逆転写の後のリアルタイムＰＣＲのような、２種類以上の増幅方法を用いてもよい（Ｃｈｅｎら、２００５及び／又は２００６年１２月５日出願の米国特許出願第１１／５６７，０８２号、その全体は参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【００６６】
一般的なＰＣＲ反応には、複数の増幅工程、すなわち標的となる核酸種を選択的に増幅するサイクルが含まれる。一般的なＰＣＲ反応には３つの工程、すなわち、標的核酸が変性される変性工程、１組のＰＣＲプライマー（フォワードプライマーとリバースプライマー）が相補的なＤＮＡ鎖にアニールするアニーリング工程、及び耐熱性のＤＮＡポリメラーゼがプライマーを伸長させる伸長工程が含まれる。これらの工程を複数回繰り返すことで、ＤＮＡ断片が増幅されて、標的ＤＮＡ配列に相当する単位複製配列が生成される。一般的なＰＣＲ反応は、２０回以上の、変性、アニーリング及び伸長のサイクルを含む。多くの場合、アニーリング工程と伸長工程は同時に実施することができ、そのような場合には、サイクルは２つの工程だけを含む。成熟ｍｉＲＮＡは１本鎖であるため、ＰＣＲ反応の前に、逆転写反応（相補的なｃＤＮＡ配列を生成する反応）を行う。逆転写反応では、例えば、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）及びプライマーを使用する。
【００６７】
ＰＣＲ及びｑ−ＰＣＲ法では例えば、各標的配列用の１組のプライマーが使用される。特定の態様では、プライマーの長さは、これらには限定されないが、所望されるプライマー間のハイブリダイゼーション温度、標的核酸の配列、及び増幅される異なる該標的核酸配列の複雑度を含む多くの因子に依存する。特定の態様では、プライマーの長さは約１５〜約３５ヌクレオチドである。他の態様では、プライマーの長さは、１５、２０、２５、３０、又は３５ヌクレオチド以下である。さらなる態様では、プライマーの長さは少なくとも３５ヌクレオチドである。
【００６８】
さらなる側面では、フォワードプライマーは、標的ｍｉＲＮＡにアニールする少なくとも１つの配列を含むか、あるいはさらに５'非相補的領域を含む場合がある。別の側面では、リバースプライマーを、逆転写されたｍｉＲＮＡの相補鎖にアニールするように設計することができる。リバースプライマーはｍｉＲＮＡ配列に無関係であってもよく、同じリバースプライマーを使用して、複数のｍｉＲＮＡが増幅される場合がある。あるいは、リバースプライマーはｍｉＲＮＡ特異的であってもよい。
【００６９】
いくつかの態様では、単一の反応容積又は複数の反応容積中で２種類以上のｍｉＲＮＡ又は核酸が増幅される。特定の側面では、１種類以上のｍｉＲＮＡ又は核酸が、正規化のための正規化対照又は基準となる核酸として使用され得る。正規化は、他の増幅反応とは別々の又は同じ反応容積中で行うことができる。一側面は、一対以上のプライマー及び／又は１種類以上のプローブを使用することで、１つの反応容積中で、少なくとも１種類の目的とするｍｉＲＮＡと少なくとも１種類の基準となる核酸を同時に増幅及び定量することができる、マルチプレックスｑ−ＰＣＲ、例えばｑＲＴ−ＰＣＲを含む。プライマー対はそれぞれの核酸に特異的に結合する少なくとも１つの増幅プライマーを含み、かつ、プローブはそれぞれが区別できるように標識されているため、複数のｍｉＲＮＡを同時に定量することができる。マルチプレックスｑＲＴ−ＰＣＲには、診断、予後予測、及び治療への応用のためのｍｉＲＮＡの検出を含むがこれには限定されない研究用途及び診断用途がある。
【００７０】
ｑ−ＰＣＲとして１つにまとめられた反応は、（１）実験誤差の危険性を減少させるため、（２）アッセイ法間の変動を低下させるため、（３）標的又は産物が混入する危険性を減少させるため、及び（４）アッセイ速度を上げるために使用され得る。ｑＲＴ−ＰＣＲ反応はさらに、逆転写酵素と耐熱性のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの両方を含めることよって、逆転写反応とまとめることができる。２種類のポリメラーゼを使用する場合には、アッセイ法の成績を最大にするために「ホットスタート」法を用いてもよい（米国特許第５，４１１，８７６号及び同第５，９８５，６１９号）。例えば、逆転写酵素の反応及びＰＣＲ反応の成分を１回以上の熱による活性化法又は化学的な変化によって不活性化し、重合効率を改善することができる（米国特許第５，５５０，０４４号、同第５，４１３，９２４号、及び同第６，４０３，３４１号）。
【００７１】
マイクロＲＮＡの発現を評価するために、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ検出を使用して、隣接する正常な組織（ＮＡＴ）試料などだがこれには限定されない目的の試料及び関連する基準から単離された核酸又はＲＮＡをスクリーニングすることができる。
【００７２】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで定量するために、増幅標的のパネルを選抜する。パネル又は標的の選抜は、例えばｍｉｒＶａｎａ（商標）ｍｉＲＮＡバイオアレイＶ１（Ａｍｂｉｏｎ）、ヒトｍｉＲＮＡマイクロアレイ（Ｖ３）（アジレント）、ｍｉＲＬｉｎｋ（商標）アレイ（Ａｓｕｒａｇｅｎ）、又は他の適したマイクロアレイのいずれかを用いたマイクロアレイによる発現解析の結果に基づく可能性がある。一側面では、標的のパネルは、本明細書に記載のｍｉＲＮＡを１つ以上含む。正規化標的の一例としては５Ｓ  ｒＲＮＡがあり、その他の標的が含まれる場合もある。通常、逆転写（ＲＴ）反応の成分を氷上で合わせ、その後ＲＮＡ鋳型を加える。トータルＲＮＡの鋳型を加えて混合する。ＲＴ反応液を適切なＰＣＲシステムに入れ、適切な温度（１５〜３０℃、その間の全ての値と範囲を含む）で適切な時間、１５〜３０分以上、次いで３５〜４２〜５０℃の温度で１０〜３０〜６０分間、その後８０〜８５〜９５℃で５分間インキュベートし、その後氷浴中に置く。通常、逆転写反応の成分は、ヌクレアーゼを含まない水、逆転写用緩衝液、ｄＮＴＰ混合液、ＲＴプライマー、リボヌクレアーゼ阻害剤、逆転写酵素、及びＲＮＡを含む。
【００７３】
通常、ＰＣＲ反応の成分を氷上で合わせ、その後ＲＴ反応由来のｃＤＮＡを加える。ＰＣＲ反応の成分を合わせたら、ＲＴ反応の一部をそのＰＣＲ混合液に移す。その後、ＰＣＲ反応液は通常、ＰＣＲシステム中、高温（例えば、９５℃）で１分程度、次いで変性、アニーリング及び伸長のサイクルを何回も行う間（例えば、９５℃で５秒及び６０℃で３０秒のサイクルを４０回）インキュベートする。結果は、例えば、ＳＤＳ  Ｖ２．３（アプライドバイオシステムズ）で解析することができる。通常、リアルタイムＰＣＲの成分は、ヌクレアーゼを含まない水、ＭｇＣｌ２、ＰＣＲ緩衝液、ｄＮＴＰ混合液、１種類以上のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＴ反応由来のｃＤＮＡ、及び１種類以上の検出可能な標識を含む。
【００７４】
ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ（Ａｎｄｅｒｓｅｎら、２００４）などのソフトウェアツールを使用して、目的の標的及び組織試料のセットを用いて正規化に使用する標的を決定する。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果を正規化するには、正規化標的のサイクル閾値（Ｃｔ、対数値）の幾何平均から、目的のマイクロＲＮＡのＣｔ値を引く。評価する試料のｄＣｔ（Ｔ）を対応する正常な基準のｄＣｔ（Ｎ）から引き、各試料に関するｄｄＣｔ（Ｔ−Ｎ）値を算出することで倍率変化（fold change）を決定することができる。全試料にわたるｄｄＣｔ（Ｔ−Ｎ）の平均値を２ｄｄＣｔで倍率変化に変換する。試料及び正常の基準のｄＣｔ値から、対応のあるスチューデントの両側ｔ検定によって代表的なｐ値を決定する。
【００７５】
Ｄ．核酸アレイ
特定の側面は、ｍｉＲＮＡアレイ又はｍｉＲＮＡプローブアレイの調製及び使用に関する。ｍｉＲＮＡアレイ又はｍｉＲＮＡプローブアレイは、特注のマイクロアレイであるか或いは、複数のｍｉＲＮＡ分子又は前駆ｍｉＲＮＡ分子に完全に若しくはほぼ相補的な、又は同一の核酸分子（プローブ）が、支持体又は支持体基盤上に空間的に分離して配置されたマクロアレイである。マクロアレイは一般的にニトロセルロース又はナイロンのシートであり、その上にプローブがスポットされている。マイクロアレイでは、核酸プローブはより高密度で配置されており、通常、１〜４平方センチメートルあたり、最大で１０，０００の核酸分子を搭載させることができる。
【００７６】
マイクロアレイを調製するための代表的な方法及び装置は、例えば、米国特許第５，１４３，８５４号；同第５，２０２，２３１号；同第５，２４２，９７４号；同第５，２８８，６４４号；同第５，３２４，６３３号；同第５，３８４，２６１号；同第５，４０５，７８３号；同第５，４１２，０８７号；同第５，４２４，１８６号；同第５，４２９，８０７号；同第５，４３２，０４９号；同第５，４３６，３２７号；同第５，４４５，９３４号；同第５，４６８，６１３号；同第５，４７０，７１０号；同第５，４７２，６７２号；同第５，４９２，８０６号；同第５，５０３，９８０号；同第５，５１０，２７０号；同第５，５２５，４６４号；同第５，５２７，６８１号；同第５，５２９，７５６号；同第５，５３２，１２８号；同第５，５４５，５３１号；同第５，５４７，８３９号；同第５，５５４，５０１号；同第５，５５６，７５２号；同第５，５６１，０７１号；同第５，５７１，６３９号；同第５，５８０，７２６号；同第５，５８０，７３２号；同第５，５９３，８３９号；同第５，５９９，６９５号；同第５，５９９，６７２号；同第５，６１０；２８７号；同第５，６２４，７１１号；同第５，６３１，１３４号；同第５，６３９，６０３号；同第５，６５４，４１３号；同第５，６５８，７３４号；同第５，６６１，０２８号；同第５，６６５，５４７号；同第５，６６７，９７２号；同第５，６９５，９４０号；同第５，７００，６３７号；同第５，７４４，３０５号；同第５，８００，９９２号；同第５，８０７，５２２号；同第５，８３０，６４５号；同第５，８３７，１９６号；同第５，８７１，９２８号；同第５，８４７，２１９号；同第５，８７６，９３２号；同第５，９１９，６２６号；同第６，００４，７５５号；同第６，０８７，１０２号；同第６，３６８，７９９号；同第６，３８３，７４９号；同第６，６１７，１１２号；同第６，６３８，７１７号；同第６，７２０，１３８号，並びにＷＯ ９３／１７１２６；ＷＯ ９５／１１９９５；ＷＯ ９５／２１２６５；ＷＯ ９５／２１９４４；ＷＯ ９５／３５５０５；ＷＯ ９６／３１６２２；ＷＯ ９７／１０３６５；ＷＯ ９７／２７３１７；ＷＯ ９９／３５５０５；ＷＯ ０９９２３２５６；ＷＯ ０９９３６７６０；ＷＯ ０１３８５８０；ＷＯ ０１６８２５５；ＷＯ ０３０２０８９８；ＷＯ ０３０４０４１０；ＷＯ ０３０５３５８６；ＷＯ ０３０８７２９７；ＷＯ ０３０９１４２６；ＷＯ ０３１０００１２；ＷＯ ０４０２００８５；ＷＯ ０４０２７０９３；ＥＰ ３７３ ２０３；ＥＰ ７８５ ２８０；ＥＰ ７９９ ８９７及びＵＫ ８ ８０３ ０００に記載されており、その全ての開示は参照することにより本明細書に組み込まれる。さらに、当業者はアレイを用いて生成されたデータを容易に解析することができる。そのようなプロトコールは上記で開示されており、かつ、ＷＯ ９７４３４５０；ＷＯ ０３０２３０５８；ＷＯ ０３０２２４２１；ＷＯ ０３０２９４８５；ＷＯ ０３０６７２１７；ＷＯ ０３０６６９０６；ＷＯ ０３０７６９２８；ＷＯ ０３０９３８１０；ＷＯ ０３１００４４８Ａ１（これらは全て具体的に参照することにより組み込まれる）に見られる情報を含む。
【００７７】
Ｅ．ハイブリダイゼーション
アレイ又は１セットのｍｉＲＮＡプローブを調製し、試料中のｍｉＲＮＡを標識した後、標的核酸の集団をハイブリダイゼーション条件下でアレイ又はプローブと接触させる。そのような条件は必要に応じて、行われる特定のアッセイ法を考慮して、特異性のレベルを最適化するために調整することができる。適したハイブリダイゼーション条件は当業者に周知であり、かつ、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）及びＷＯ ９５／２１９４４に見られる。ハイブリダイゼーションを行う間、多くの態様ではストリンジェント条件が使用されることに注意する。当業者は、ストリンジェント条件を理解している。
【００７８】
ＩＩＩ．核酸
特定の側面では、核酸、例えばｍｉＲＮＡは、通常、配列の一部分又はマイクロＲＮＡ（「ｍｉＲＮＡ」又は「ｍｉＲ」）分子に相補的な配列を含む。マイクロＲＮＡ（「ｍｉＲＮＡ」又は「ｍｉＲ」）分子としては、１６〜３５までのヌクレオチドの長さのものが報告されているが、通常は２１〜２２ヌクレオチドの長さである。ｍｉＲＮＡはそれぞれ、より長い前駆ＲＮＡ分子（「前駆ｍｉＲＮＡ」）からプロセシングされる。前駆ｍｉＲＮＡはタンパク質をコードしていない遺伝子から転写される。前駆ｍｉＲＮＡは相補的な２つの領域を含み、それによって、ステムループ様又はフォールドバック様構造を形成することができる。これらの構造は、動物において、ダイサーと呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩ様の酵素によって切断される。プロセシングされたｍｉＲＮＡは通常はステムの一部分である。
【００７９】
プロセシングされたｍｉＲＮＡ（「成熟ｍｉＲＮＡ」とも呼ばれる）は、大きな複合体の一部分となり、特定の標的遺伝子を下方制御する。動物のｍｉＲＮＡの例としては、標的とは完全に一致していないが翻訳を停止させるものが挙げられる（Ｏｌｓｅｎら、１９９９；Ｓｅｇｇｅｒｓｏｎら、２００２）。ｓｉＲＮＡ分子もまた、長い二本鎖ＲＮＡ分子からダイサーによってプロセシングされる。ｓｉＲＮＡは動物細胞中に天然には見られないが、これらはＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を介してｍＲＮＡ標的の配列−特異的な開裂を行うことができる（Ｄｅｎｌｉら、２００３）。特定の側面では、いくつかの態様における核酸はＲＮＡ又はＲＮＡ類似体である。
【００８０】
いくつかの態様では、合成ｍｉＲＮＡ又は単離されたｍｉＲＮＡは、１７〜１３０残基の範囲の長さである。態様は、少なくとも或いは最大でも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１４０、１４５、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００残基以上（この中のいずれの整数又はここから誘導可能な任意の範囲をも含む）残基の長さの合成ｍｉＲＮＡ分子又は非合成ｍｉＲＮＡ分子に関する。
【００８１】
特定の態様において核酸は、（ａ）５'から３'の配列が、成熟ｍｉＲＮＡ配列の全体又はセグメントと同一の「ｍｉＲＮＡ領域」、及び／又は（ｂ）５'から３'の配列が、そのｍｉＲＮＡ配列と６０％〜１００％相補的な「相補領域」を有する。特定の態様ではこれらの合成ｍｉＲＮＡもまた、上述のように単離される。用語「ｍｉＲＮＡ領域」は、天然に存在する成熟ｍｉＲＮＡ配列の配列全体と、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、又は１００％（この間の全ての整数を含む）相同な合成ｍｉＲＮＡ上の領域を指す。特定の態様では、ｍｉＲＮＡ領域は、天然に存在するｍｉＲＮＡの配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９若しくは１００％同一であるか、又は、天然に存在するｍｉＲＮＡの配列と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９若しくは１００％同一である。あるいはｍｉＲＮＡ領域は、当該分野で周知の配列整列アルゴリズム及び方法によって比較した場合に、天然に存在するｍｉＲＮＡと同じ位置にある１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７以上のヌクレオチドを含む場合がある。
【００８２】
用語「相補領域」は、合成ｍｉＲＮＡのある領域であって、そのｍｉＲＮＡ領域が同一である、天然に存在する成熟ｍｉＲＮＡの配列と６０％相補的な又は少なくとも６０％相補的な合成ｍｉＲＮＡの領域を指す。相補領域は、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９若しくは１００（ここから誘導可能な任意の範囲も含む）％相補的であるか、又は少なくとも６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９若しくは１００（ここから誘導可能な任意の範囲も含む）％相補的である。一本鎖ポリヌクレオチド配列は、ｍｉＲＮＡ領域と相補領域との化学結合の結果、ヘアピンループ構造をとる場合がある。他の態様では、相補領域は、ｍｉＲＮＡ領域とは別の核酸分子上の領域である。この場合、相補領域は相補的鎖上にあり、かつ、ｍｉＲＮＡ領域が活性鎖上にある。
【００８３】
合成ｍｉＲＮＡが置換、糖修飾、又は非相補的な設計のうちの１つ以上を有する場合があることも企図される。特定の例では、合成ＲＮＡ分子はそれらのうちの２つを有するが、別の例ではこれらの分子は、所定の位置に３つ全ての設計を有する。
【００８４】
ＲＮＡ分子が一本鎖ポリヌクレオチドの場合、ｍｉＲＮＡ領域と相補領域の間にはリンカー領域がある。いくつかの態様において一本鎖ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ領域と相補領域との化学結合の結果、ヘアピンループ構造を形成することができる。リンカーはヘアピンループを構成する。いくつかの態様では、リンカー領域は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、若しくは４０残基の長さ、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、若しくは４０残基の長さ、又は最大でも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、若しくは４０残基の長さ、又はここから誘導可能な任意の範囲であると企図される。特定の態様では、リンカーは３〜３０残基（全ての整数を含む）の長さである。
【００８５】
ｍｉＲＮＡ領域と相補領域を有することに加えて、領域の５'又は３'末端のいずれかに隣接配列がある場合もある。いくつかの態様では、これらの領域の一方又は両方の末端に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上、若しくはここから誘導可能な任意の範囲のヌクレオチド、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上、若しくはここから誘導可能な任意の範囲のヌクレオチドが隣接している。
【００８６】
いくつかの態様では、ｍｉＲＮＡを含む方法及び組成物は、ｍｉＲＮＡ及び／又は他の核酸に関する場合がある。核酸は、少なくとも又は最大でも、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、又は１０００ヌクレオチドの長さ、若しくはここから誘導可能な任意の範囲の長さであってよい。そのような長さは、プロセシングされたｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡプローブ、前駆ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ含有ベクター、対照核酸、並びに他のプローブ及びプライマーの長さを対象として含む。多くの態様においてｍｉＲＮＡは、１９〜２４ヌクレオチドの長さであり、ｍｉＲＮＡプローブは、５、１０、１５、１９、２０、２５、３０〜３５ヌクレオチドの長さである。長さは、プロセシングされたｍｉＲＮＡ及び付加される任意の隣接領域の長さに応じて、この間の全ての数値及び範囲を含む。ヒトのｍｉＲＮＡ前駆体は通常、６２〜１１０ヌクレオチドである。
【００８７】
態様で使用される核酸は、別の核酸と同一の又は相補的な領域を含んでいてもよい。相補的な又は同一な領域は少なくとも５つの連続した残基である可能性があると企図されるが、この領域は特に、少なくとも又は最大でも、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、又は１１０個の連続したヌクレオチドであると企図される。さらに、前駆ｍｉＲＮＡの中に含まれる、又はｍｉＲＮＡプローブとｍｉＲＮＡ若しくはｍｉＲＮＡ遺伝子の間の相補性の長さもこのような長さであると理解されたい。さらに、プローブと標的の間の相補性が、プローブの全長にわたって９０％以上同一であるということをいう、百分率で相補性を表してもよい。いくつかの態様では、相補性は９０％、９５％又は１００％同一であるか、又は少なくとも９０％、９５％又は１００％同一である。そのような長さは具体的には、本明細書で開示される任意の核酸中に認められる核酸配列を含む、いずれもの核酸に適用され得る。
【００８８】
「組換え」という用語が使用される場合があり、この用語は通常、インビトロで操作された分子、又は複製された分子、若しくはそのような分子の発現産物を指す。
【００８９】
用語「ｍｉＲＮＡ」は通常一本鎖の分子を指すが、特定の態様においては、別々の態様で完成された分子は、同じ一本鎖分子の別の領域又は別の核酸に部分的に（鎖の全長にわたって１０〜５０％相補的な）、実質的に（鎖の全長にわたって５０％を超えるが１００％未満相補的な）又は完全に相補的な領域又は別の鎖を含んでいてもよい。従って核酸は、１種類以上の相補的な若しくは自己相補的な鎖を含む分子、又は分子を含む特定の配列の「相補鎖」を包含し得る。例えば、前駆ｍｉＲＮＡは、最大で１００％相補的な自己相補領域を含んでいてもよい。ｍｉＲＮＡプローブ又は核酸は、標的に対して６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９若しくは１００％の相補性を含んでいてもよいか、標的に対して６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９若しくは１００％相補的であることができるか、又は標的に対して少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９若しくは１００％相補的であることができる。
【００９０】
当業者に知られているいずれの技術によって核酸を作製してもよい。そのような技術には例えば、化学合成、酵素を用いた製造又は生物学的な生産がある。いくつかの態様では、ｍｉＲＮＡプローブの化学合成を特に企図する。
【００９１】
いくつかの態様では、ｍｉＲＮＡを生体試料から回収又は単離する。ｍｉＲＮＡは、組み換えたものであってもよいか、又は細胞にとって天然の若しくは内因性の（その細胞のゲノムから生産された）ものであってもよい。ｍｉＲＮＡなどのＲＮＡ小分子の回収を高めるような方法で生体試料を処理してもよいことを企図する。米国特許出願第１０／６６７，１２６号にはそのような方法が記載されており、具体的に参照することにより本明細書に組み込まれる。通常、方法は、グアニジンと界面活性剤を含む溶液で細胞を溶解する工程を含む。
【００９２】
Ａ．核酸の単離
核酸は当業者に周知の方法で単離することができるが、特定の態様では、核酸小分子を単離するための方法及び／又はＲＮＡ分子を単離するための方法を用いることもできる。クロマトグラフィーは、タンパク質又は他の核酸から核酸を分離又は単離するために多用される方法である。そのような方法は、ゲルマトリックスを用いた電気泳動、フィルターカラム、アルコール沈殿、及び／又は他のクロマトグラフィーを含む場合がある。細胞由来のｍｉＲＮＡを使用又は評価する場合には、方法は通常、カオトロピック剤（例えばグアニジンイソチオシアネート）及び／又は界面活性剤（例えば、Ｎ−ラウロイルサルコシン）で細胞を溶解する工程を含み、その後、特定のＲＮＡ集団を単離するための方法を実施する。
【００９３】
他の核酸からｍｉＲＮＡを分離する特定の方法では、ゲルマトリックスはポリアクリルアミドを使用して調製されるが、アガロースもまた使用可能である。ゲルは濃度勾配があるものでも又は均一なものであってもよい。プレート又は管を使用して、電気泳動用のゲルマトリックスを保持することができる。核酸の分離には一般的に、一次元電気泳動が用いられる。平面のゲルの調製にはプレートが、管状のゲルの調製には管（一般的にはガラス又はゴム）が用いられる。「管電気泳動」という句は、ゲルを作製するのにプレートの代わりに管又は管状材料を使用することを指す。当業者は管電気泳動を実施するための材料を容易に調製することができるか、又はＣ．Ｂ．Ｓ．  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．，  Ｉｎｃ．或いはＳｃｉｅ−Ｐｌａｓなどから購入することができる。
【００９４】
方法は、特にｍｉＲＮＡが使用される本発明の方法及び組成物では、有機溶媒及び／又はアルコールを使用して核酸を単離してもよい。米国特許出願第１０／６６７，１２６号にいくつかの態様が記載されており、この出願はここで参照することにより組み込まれる。この開示は基本的に、細胞からＲＮＡ小分子を効率的に単離するための方法を提供しており、この方法は、細胞溶解物にアルコール溶液を添加する工程、及びアルコールと溶解物の混合物を固相支持体に添加する工程、次いで固相支持体からＲＮＡ分子を溶出する工程を含む。いくつかの態様では、細胞溶解物に加えられるアルコールの量によって、アルコールの濃度は約５５％〜６０％となる。様々なアルコールを使用することができるが、エタノールがよく効果を現す。固相支持体は、ビーズ、フィルター、及びカラムなど、どのような構造であってもよく、電気陰性基を有する鉱物支持体又は重合体支持体を含んでいてもよい。このような単離方法では、ガラス繊維のフィルター又はカラムが特によく効果を現す。
【００９５】
特定の態様では、ｍｉＲＮＡの単離方法には、（ａ）グアニジンを含む溶解溶液を使用して、試料に含まれる細胞を溶解する工程であって、少なくとも約１Ｍの濃度のグアニジンを含む溶解物が生じる、工程、（ｂ）フェノールを含む抽出溶液を使用して、溶解物からｍｉＲＮＡ分子を抽出する工程、（ｃ）溶解物をアルコール溶液に添加して、溶解物／アルコール混合物を形成する工程（混合物中のアルコール濃度が約３５％〜約７０％）、(ｄ）溶解物／アルコール混合物を固相支持体にアプライする工程、（ｅ）イオン溶液を使用して、固相支持体からｍｉＲＮＡ分子を溶出する工程、及び、（ｆ）ｍｉＲＮＡ分子を捕捉する工程が含まれる。通常、この試料を乾燥し、液体に再懸濁して、次の操作に適した量にする。
【００９６】
Ｂ．核酸の調製
あるいは、標準的な方法に従って核酸合成を行う。例えば、ＩｔａｋｕｒａとＲｉｇｇｓ（１９８０）を参照のこと。加えて米国特許第４，７０４，３６２号、同第５，２２１，６１９号及び同第５，５８３，０１３号にはそれぞれ、合成核酸を調製する様々な方法が記載されている。合成核酸（例えば合成オリゴヌクレオチド）の非限定的な例としては、ＥＰ ２６６，０３２（参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されている、リン酸トリエステル、ホスファイト、又はホスホロラミダイト化学及び固相を使用したインビトロでの化学的合成によって合成された核酸、又はＦｒｏｅｈｌｅｒら（１９８６）及び米国特許第５，７０５，６２９号（それぞれ、参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されている、デオキシヌクレオシドＨ−ホスホン酸中間体を介して合成される核酸が挙げられる。いくつかの方法では、１種類以上のオリゴヌクレオチドが使用され得る。例えば、米国特許第４，６５９，７７４号、同第４，８１６，５７１号、同第５，１４１，８１３号、同第５，２６４，５６６号、同第４，９５９，４６３号、同第５，４２８，１４８号、同第５，５５４，７４４号、同第５，５７４，１４６号、同第５，６０２，２４４号（これらのそれぞれは、参照することにより本明細書に組み込まれる）には、オリゴヌクレオチド合成の多用な機構が開示されている。
【００９７】
酵素を用いて生産される核酸の非限定的な例としては、ＰＣＲ（商標）（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号及び同第４，６８２，１９５号を参照のこと。これらはそれぞれ、参照することにより本明細書に組み込まれる）等の酵素を用いた増幅反応で生産される核酸、又は米国特許第５，６４５，８９７号（参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されているオリゴヌクレオチドの合成によって生産される核酸が挙げられる。生物学的に生産される核酸の非限定的な例としては、細菌の中で複製される組換えＤＮＡベクターなどの、生細胞中で生産される（すなわち複製される）組換え核酸が挙げられる（例えば、参照することにより本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋら、２００１を参照のこと）。
【００９８】
オリゴヌクレオチドの合成は当業者に周知である。例えば、米国特許第４，６５９，７７４号、同第４，８１６，５７１号、同第５，１４１，８１３号、同第５，２６４，５６６号、同第４，９５９，４６３号、同第５，４２８，１４８号、同第５，５５４，７４４号、同第５，５７４，１４６号、同第５，６０２，２４４号（これらはそれぞれ、参照することにより本明細書に組み込まれる）に、オリゴヌクレオチド合成の多用な機構が開示されている。
【００９９】
細胞中で核酸を生産するための組換え方法は当業者に周知である。これらには、ベクター（ウイルス性及び非ウイルス性）、プラスミド、コスミド、及び核酸を細胞に輸送するための他の媒体の使用が含まれ、細胞は標的細胞（例えば、癌細胞）であっても、又は単に宿主細胞（所望のＲＮＡ分子を大量に生産するための）であってもよい。あるいは、そのような媒体は、ＲＮＡ分子を生成するための試薬が存在する限りにおいて、細胞を含まないシステムに関して使用される場合もある。そのような方法には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（２００３）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（２００１）及びＳａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）（ここで参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されている方法が含まれる。
【０１００】
特定の態様において、本発明は、合成のものではない核酸分子に関する。いくつかの態様では、核酸分子は、一本鎖の初期ｍｉＲＮＡ（Ｌｅｅ、２００２を参照のこと）、一本鎖の前駆ｍｉＲＮＡ、又は一本鎖の成熟ｍｉＲＮＡの全長に完全に一致する配列などの、天然に存在する核酸の構造を有し、かつ、天然に存在する核酸の配列を有する。組み換え技術の使用に加え、そのような合成のものではない核酸を、オリゴヌクレオチドを作出する技術を使用するなどによって、化学的に生成してもよい。
【０１０１】
Ｃ．標識及び標識法
いくつかの態様では、方法は、直接又は間接的に標識されたｍｉＲＮＡに関する。まずｍｉＲＮＡを単離及び／又は精製し、その後標識してもよいことを企図する。このことによって、標識する前にｍｉＲＮＡが単離又は精製されていない試料中の他のＲＮＡと比較して、ｍｉＲＮＡがより効率的に標識されるようになる可能性がある。多くの態様において標識は非放射性である。通常、標識したヌクレオチドの付加（１段階工程）、又はヌクレオチドの付加と付加したヌクレオチドの標識（２段階工程）によって、核酸は標識され得る。
【０１０２】
いくつかの態様では、触媒作用を利用して既に標識してあるヌクレオチドを核酸に付加することよって、核酸は標識される。標識したヌクレオチドを１つ以上、ｍｉＲＮＡ分子に付加することができる。米国特許第６，７２３，５０９号（ここで参照することにより組み込まれる）を参照のこと。
【０１０３】
他の態様では、触媒作用を利用して標識されていないヌクレオチドをｍｉＲＮＡに付加し、次いでその標識されていないヌクレオチドを、後で標識することが可能な化学部分によって修飾する。いくつかの態様においてヌクレオチドは、化学部分が反応性アミンのアミン修飾ヌクレオチドである。アミン修飾ヌクレオチドの例は当業者には良く知られており、その多くは、例えば、Ａｍｂｉｏｎ、シグマ、Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、及びＴｒｉＬｉｎｋから購入することができる。
【０１０４】
合成中のｃＤＮＡの標識とは対照的に、ｍｉＲＮＡの標識に関する問題は、既に存在している分子をどのようにして標識するかということである。いくつかの方法では、態様は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド二リン酸又は三リン酸を基質として使用可能な酵素を用いた、ｍｉＲＮＡへの酵素の付加に関する。さらに特定の態様において態様は、修飾されているリボヌクレオチド二リン酸又は三リン酸の使用を含み、リボヌクレオチド二リン酸又は三リン酸はｍｉＲＮＡの３'末端に付加される。酵素の供給源は限定されない。酵素の供給源の例としては、酵母、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）などのグラム陰性細菌、乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、及び羊痘ウイルスが挙げられる。
【０１０５】
そのようなヌクレオチドを付加することが可能な酵素には、これらには限定されないが、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、及びポリヌクレオチドホスホリラーゼが含まれる。特定の態様では、リガーゼは標識の付加に使用される酵素ではないと企図されるが、その代わり、リガーゼではない酵素が用いられる。
【０１０６】
ターミナルトランスフェラーゼは、核酸の３'末端へのヌクレオチドの付加を触媒する。
【０１０７】
ポリヌクレオチドホスホリラーゼは、プライマーを必要とせずに、ヌクレオチド二リン酸を重合させることができる。
【０１０８】
ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡプローブの標識は、発色性（蛍光などの可視光及びＵＶ光を含む）であっても、発光性であっても、酵素的なものであっても、又は陽電子放出性（放射性を含む）であってもよい。標識を直接又は間接的に検出することができる。放射性標識には、１２５Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ、及び３５Ｓが含まれる。酵素的な標識の例としては、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、及びβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。標識はまた、発光性を有するタンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質及びフィコエリトリンである可能性もある。
【０１０９】
コンジュゲートとしての使用が企図される発色性及び蛍光標識としては、これらには限定されないが、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬなどのＢＯＤＩＰＹ色素；Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ；Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ；クマリンとその誘導体、例えば７−アミノ−４−メチルクマリン、アミノクマリン及びヒドロキシクマリン；シアニン色素、例えばＣｙ３及びＣｙ５；エオシン及びエリスロシン；フルオレセインとその誘導体、例えばフルオレセインイソチオシアネート；ランタニドイオンの大環状封鎖剤、例えばＱｕａｎｔｕｍ  Ｄｙｅ（商標）；Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ；Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ；ローダミン色素、例えばローダミンレッド、テトラメチルローダミン及びローダミン６Ｇ；Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ；、蛍光エネルギー移動色素、例えばチアゾールオレンジ−エチジウムヘテロ二量体；及びＴＯＴＡＢが挙げられる。
【０１１０】
色素の特定の例としては、これらには限定されないが、上記で確認した色素及び、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７００、及び、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７５０；アミン反応性ＢＯＤＩＰＹ色素、例えばＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６５５、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹＲ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹＴＭＲ、及び、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ；Ｃｙ３、Ｃｙ５、６−ＦＡＭ、フルオレセインイソチオシアネート、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ５００、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ＲＥＧ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、Ｒｅｎｏｇｒａｐｈｉｎ、ＲＯＸ、ＳＹＰＲＯ、ＴＡＭＲＡ、２'，４'，５'，７'−テトラブロモスルホンフルオロセイン、及びＴＥＴが挙げられる。
【０１１１】
蛍光標識されたリボヌクレオチドの特定の例は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅから購入可能であり、かつ、これらには、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８−５−ＵＴＰ、フルオレセイン−１２−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ−１４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−１４−ＵＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ＵＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６−１４−ＵＴＰ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−５−ＵＴＰ、及びＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−１４−ＵＴＰが含まれる。他の蛍光リボヌクレオチド、例えばＣｙ３−ＵＴＰ及びＣｙ５−ＵＴＰはＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓより購入可能である。
【０１１２】
蛍光標識されたデオキシリボヌクレオチドの例としては、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）−１１−ｄＵＴＰ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ−７−ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８−５−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−１２−ｄＵＴＰ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ４８８−５−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ−１４−ｄＵＴＰ、ローダミングリーン−５−ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５３２−５−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−１４−ｄＵＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６−１４−ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８−５−ｄＵＴＰ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−１２−ｄＵＴＰ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−５−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−１４−ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４−５−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０−１４−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５−１４−ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８−７−ＯＢＥＡ−ｄＣＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６−１６−ＯＢＥＡ−ｄＣＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４−７−ＯＢＥＡ−ｄＣＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７−１２−ＯＢＥＡ−ｄＣＴＰが挙げられる。
【０１１３】
核酸を２種類の標識で標識してもよいことを企図する。さらに方法では、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いてもよい（例えば、Ｋｌｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら、２００２；Ｅｍｐｔａｇｅ、２００１；Ｄｉｄｅｎｋｏ、２００１。それぞれ、参照することにより組み込まれる）。
【０１１４】
あるいは、標識は、それ自体を検出することはできないが、間接的に検出が可能なもの又は標的核酸の単離若しくは分離を可能にするものであってもよい。例えば標識は、ビオチン、ジゴキシゲニン、多価陽イオン、封鎖基、及び抗体に対するリガンドを含むその他のリガンドである場合がある。
【０１１５】
標識された核酸を可視化する又は検出するための数多くの方法が容易に使用できる。そのような技術には、顕微鏡法、アレイ、蛍光定量法、ライトサイクラー又は他のリアルタイムＰＣＲ装置、ＦＡＣＳ解析、シンチレーションカウンター、ホスホイメージャー、ガイガーカウンター、ＭＲＩ、ＣＡＴ、抗体に基づく検出法（ウェスタン、免疫蛍光法、免疫組織化学）、組織化学的技術、ＨＰＬＣ（Ｇｒｉｆｆｅｙら、１９９７）、分光法、キャピラリーゲル電気泳動（Ｃｕｍｍｉｎｓら、１９９６）、分光法、質量分析、放射線学的技術、及び質量収支技術が含まれる。
【０１１６】
２色以上の異なる色の標識を用いる場合には、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）技術を使用して、１種類以上の核酸の関連を解析してもよい。さらに当業者は、標識されている核酸の可視化、同定、及び解析方法を熟知しているため、いくつかの態様の一部として、そのようなプロトコールを使用してもよい。使用され得るツールの例には、蛍光顕微鏡法、バイオアナライザ、プレートリーダー、Ｓｔｏｒｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）、アレイスキャナー、ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター）、又は蛍光分子を励起して検出する能力を有するいかなる装置をもまた含まれる。
【０１１７】
ＩＶ．キット
本明細書に記載の組成物又は構成要素はいずれも、キットに含めることができる。非限定的な例においては、ｍｉＲＮＡの単離、ｍｉＲＮＡの標識、及び／又はアレイ、核酸増幅、及び／又はハイブリダイゼーションを用いたｍｉＲＮＡ集団の評価に使用する試薬、さらに結腸試料から試料を調製するための試薬がキットに含まれる場合もある。キットはさらに、ｍｉＲＮＡプローブを作製又は合成するための試薬を含んでいてもよい。従ってキットは、標識されたヌクレオチドを組み込むことで、又は、その後標識される、標識されていないヌクレオチドを組み込むことでｍｉＲＮＡを標識するための酵素を、好適な容器中に含む。特定の側面においてキットは、増幅試薬を含む場合がある。他の側面においてキットは、ガラス、ナイロン、高分子ビーズ、磁気ビーズなどの様々な支持体、及び／又はプローブ及び／又は標的核酸を結合させるための任意の試薬を含んでいてもよい。キットはまた、反応緩衝液、標識緩衝液、洗浄緩衝液、又はハイブリダイゼーション緩衝液などの１種類以上の緩衝液、ｍｉＲＮＡプローブを調製するための化合物、及びｍｉＲＮＡを単離するための構成要素を含んでいてもよい。本発明の他のキットは、ｍｉＲＮＡを含む核酸アレイを作製するための構成要素を含んでいてもよく、そのため、例えば、固相支持体を含み得る。
【０１１８】
本明細書に記載の本発明の方法を実施するためのキットが特に企図される。いくつかの態様には、多色標識用にｍｉＲＮＡを調製するためのキット、及びｍｉＲＮＡプローブ及び／又はｍｉＲＮＡアレイを調製するためのキットがある。これらの態様においてキットは、好適な容器中に、（１）ポリ（Ａ）ポリメラーゼ；（２）未修飾ヌクレオチド（Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ、及び／又はＵ）；（３）修飾ヌクレオチド（標識された又は標識されていない）；（４）ポリ（Ａ）ポリメラーゼ緩衝液；及び（５）少なくとも１つのマイクロフィルター；（６）ヌクレオチドに結合可能な標識；（７）少なくとも１つのｍｉＲＮＡプローブ；（８）反応緩衝液；（９）ｍｉＲＮＡアレイ又はそのようなアレイを作製するための構成要素；（１０）酢酸；（１１）アルコール；（１２）ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡプローブ又はアレイを調製、単離、濃縮、精製するための溶液、のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２以上を含む。他の試薬としては、ＲＮＡの操作に一般的に使用されている試薬、例えばホルムアミド、泳動用色素液、リボヌクレアーゼ阻害剤、及びＤＮａｓｅが挙げられる。
【０１１９】
特定の態様では、本発明のキットは、本明細書に記載の、ｍｉＲＮＡプローブのアレイを含む。アレイは、特定の条件における生物又は特定の組織若しくは器官について知られている全ｍｉＲＮＡに対応するプローブ、又はそのようなプローブの部分集団を有していてもよい。本発明のアレイ上におけるプローブの部分集団は、特定の診断、治療、又は予後への応用に関連があると確認されているプローブであっても、又はそのようなプローブを含んでいてもよい。例えばアレイは、（１）疾患又は状態（甲状腺癌）、（２）特定の薬剤又は治療に対する感受性又は耐性、（３）薬剤又は物質に由来する毒性への感受性、（４）疾患又は状態の進展又は重篤度のステージ（予後）、及び（５）疾患又は状態の遺伝的素因、を示す又は示唆する１種類以上のプローブを含んでいてもよい。
【０１２０】
アレイを含むいずれのキットの態様についても、本明細書に記載の任意の配列の全体又は一部分の変異体、又はそれらの配列に同一な若しくは相補的な配列を含むか、或いはそれらの配列を増幅するために使用することができる核酸分子が含まれている可能性がある。上記で議論したいずれの核酸もキットの一部として組み入れることができる。
【０１２１】
キットの構成要素は、水性媒体中で又は凍結乾燥した状態のいずれかで梱包することができる。キットの容器は一般的に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジ、又は構成要素、好ましくは好適な部分量を入れた他の容器を含む。キット中に２つ以上の構成要素が含まれる場合（標識試薬と標識は一緒に梱包されてもよい）、キットは通常、その他の構成要素を個別に入れてもよい、第二、第三又はさらに別の容器もまた含む。しかしながら、構成要素の様々な組み合わせをバイアル中に入れることもできる。本発明のキットは通常、市販用に厳重に管理された、核酸を入れるための手段及び他の試薬を入れるための任意の容器もまた含む。そのような容器としては、注射、又は所望のバイアルが保持されているブロー成形プラスチック容器があり得る。
【０１２２】
キットの構成要素が１つ及び／又は２つ以上の溶液として提供される場合には、この溶液は水溶液であり、無菌的な水溶液であることが特に好ましい。
【０１２３】
しかしながら、キットの構成要素を乾燥した粉末として提供することもできる。試薬及び／又は構成要素が乾燥粉末として提供される場合、この粉末は適切な溶媒を加えることで再構成することができる。溶媒を別の容器に入れて提供してもよいこともまた企図される。いくつかの態様では、標識色素は乾燥した粉末として提供される。本発明のキットでは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００μｇの量の乾燥した色素、又は少なくとも若しくは最大でも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００μｇの量の乾燥した色素が提供されると企図される。その後、この色素を任意の好適な溶媒、例えばＤＭＳＯで再懸濁することができる。
【０１２４】
容器には通常、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジ及び／又は、核酸製剤を、好ましくは適切に配分した核酸製剤を入れた他の容器が含まれる。キットはさらに、無菌的な、薬学上許容可能な緩衝液及び／又は他の希釈剤を入れるための第二の容器を含んでいてもよい。
【０１２５】
本発明のキットは通常、市販用に厳重に管理されたバイアルを入れるための手段、例えば注射及び／又は所望のバイアルが保持されているブロー成形プラスチック容器をさらに含む。
【０１２６】
そのようなキットはまた、標識されたｍｉＲＮＡの単離を容易にする構成要素も含む。さらに、ｍｉＲＮＡを保存若しくは維持する構成要素、又は分解から保護する構成要素を含んでいてもよい。そのような構成要素は、リボヌクレアーゼを含まないか、或いはリボヌクレアーゼに対して阻害的なものであってよい。そのようなキットは通常、好適な方法で、個々の試薬又は溶液のそれぞれを入れるための別個の容器を含む。
【０１２７】
キットはまた、キットに含まれる構成要素、並びにキットに含まれていない任意の他の試薬を使用するための説明書を含む。説明書は、実行可能な変更を含んでいてもよい。
【０１２８】
本発明のキットはまた、対照ＲＮＡ、ヌクレアーゼを含まない水、１．５ｍｌ管などのリボヌクレアーゼを含まない容器、リボヌクレアーゼを含まない溶出管、ＰＥＧ又はデキストラン、エタノール、酢酸、ナトリウム酢酸塩、酢酸アンモニウム、グアニジン、界面活性剤、核酸のサイズマーカー、リボヌクレアーゼを含まない管チップ、及びリボヌクレアーゼ阻害剤若しくはデオキシリボヌクレアーゼ阻害剤のうちの１種類以上を含んでいてもよい。
【０１２９】
そのような試薬は本発明のキットの態様であると企図される。しかしながら、そのようなキットは、上記で確認した特定の品目には限定されず、ｍｉＲＮＡの操作又は解析に使用されるいかなる試薬をも含み得る。
【０１３０】
（表１）マイクロＲＮＡの受入番号。２０１０年１１月１６日の時点で、マイクロＲＮＡのＳａｎｇｅｒ  ｍｉＲＢａｓｅ  バージョン１２．０  データベース（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、２００６、ここで参照することによりその全体は本明細書に組み込まれる）に記載されている番号に相当する受入番号、及びデータベースに登録されている各配列を表す。
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【実施例】
【０１３１】
Ｖ．  実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を示すために包含される。以下の実施例で開示される技術が、本発明の実施において上手く機能することが本発明者によって発見された技術を表していること、従って、本発明を実施するための好ましい形態を構成していると見なすことができることが、当業者には理解される。しかしながら、本開示を考慮して、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、開示された特定の態様に多くの変更を加えることができ、それでもなお、同じような又は同様の結果が得られることが当業者には理解される。
【０１３２】
実施例１  正常な甲状腺試料及び甲状腺新生物に由来するｍｉＲＮＡのマイクロアレイ解析
同じ組織型から回収した癌試料と正常な試料において、高い頻度で発現の違いを示す発癌の現象に、ｍｉＲＮＡが関連している可能性がある。加えて、正常な試料と癌試料において発現の違いを示すｍｉＲＮＡは、良性病変と癌病変の診断に、及び異なる型の悪性病変の診断に使用することができる。本発明者らは、甲状腺癌の診断、良性病変と癌病変を識別するため、及び様々な甲状腺の悪性腫瘍の型を区別するために有用なマーカーとなり得るｍｉＲＮＡを同定するために、様々な甲状腺組織試料におけるｍｉＲＮＡの発現を評価した。
【０１３３】
ｍｉＲＮＡアレイの発現解析：
ｍｉＲＮＡ発現のプロファイリングを、ヒトｍｉＲＮＡマイクロアレイ（Ｖ３）（カタログ番号Ｇ４４７１Ａ−０２１８２７；アジレント  テクノロジー、サンタクララ、カリフォルニア、米国）を使用し、製造業者が推奨するプロトコールに従って、Ａｓｕｒａｇｅｎ，Ｉｎｃ．（オースティン、テキサス、米国）によって行われた。Ｖ３ヒトｍｉＲＮＡマイクロアレイは、Ｓａｎｇｅｒ  ｍｉＲＢａｓｅ  ｖ．１２（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、２００６）に基づく、８６６種類のヒトプローブと８９種類のヒトウイルスｍｉＲＮＡプローブを搭載している。ｍｉｒＶａｎａ（商標）ｍｉＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ；オースティン、テキサス、米国）を使用して、各試料からトータルＲＮＡを単離した。精製したトータルＲＮＡをＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ウィルミントン、デラウェア、米国）で定量した。各試料のトータルＲＮＡ（２００ｎｇ）を脱リン酸化し、ｐＣｐ−Ｃｙ３標識分子をＲＮＡ分子の３'末端に結合させた。標識したＲＮＡをＢｉｏ−ＳｐｉｎＰ−６カラム（バイオ  ラッドラボラトリーズ；ハーキュリーズ、カリフォルニア、米国）で精製した。アレイのハイブリダイゼーション、洗浄、染色、画像化、及びシグナル抽出はアジレントの推奨法に従って行った。
【０１３４】
ｍｉＲＮＡアレイのシグナル処理：
アジレントｍｉＲＮＡアレイについて行われるシグナル処理は、プローブ特異的なシグナル検出コール、バックグランド補正、及びグローバル正規化を含む、多段階工程である。データファイル出力の一環として、アジレント  Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェアにより、各プローブについてバックグランドによるシグナルの寄与を評価し、減算した。同様に、検出コールもアジレントのＦｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェアに基づくものとした。特定の解析実験に使用したアレイはまとめて、Ｈｕｂｅｒら（２００２）によって記載されているＶＳＮ法に従って正規化した。
【０１３５】
バックグランドの推定と補正及びプローブの検出：
各ハイブリダイゼーションを評価するために３種類のデータが提供される。「全遺伝子シグナル（Ｔｏｔａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｓｉｇｎａｌ）」は、１遺伝子当たりのプローブ数を掛け合わせた、プローブ全てのシグナルであり、バックグランドの影響を考慮した後で算出される。「全遺伝子誤差（Ｔｏｔａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｅｒｒｏｒ）」は、１遺伝子当たりのプローブ数を掛け合わせた、プローブ全ての誤差の平方根である。「全プローブ誤差（Ｔｏｔａｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｅｒｒｏｒ）」は、プローブの複製の総数を掛け合わせた、複製されたプローブそれぞれについてのおおよその平均である。「検出コール」は、その遺伝子がｍｉＲＮＡマイクロアレイ上に検出されたかを示す、二進数である。実験中、全ての試料にわたって少なくとも１回は検出されたプローブを統計分析において考慮した。
【０１３６】
グローバル正規化：
本発明者らは、シグナルの感受性及び特異性を最適化する間に、分散安定正規化（Ｖａｒｉａｎｃｅ  Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）(ＶＳＮ)アルゴリズムが正確度と精密度の理想的なバランスをもたらすことを発見した。ＶＳＮの利点の一つは、一般的なｌｏｇ２変換を使用することによって、負の値を調節することである。
【０１３７】
一般的なｌｏｇ２変換：
正規化後のデータスケールは、一般化されたｌｏｇ２データとして報告される。マイクロアレイデータの分布は通常、対数正規である（すなわち、ｌｏｇ変換の後には、正規分布のパターンをとる傾向にある）。正規分布データは、ｔ−検定及び１要因の若しくは２要因のＡＮＯＶＡを含む、従来型の統計処理で修正することができる。
【０１３８】
統計的仮説検定には、等分散を仮定した２標本ｔ検定を適用した。この検定は、偽陽性の割合（ｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ）を０．０５に設定して、どのプローブの発現が有意に異なったか、又は「意味があるか」を明らかにするために使用した。加えて、発現の差を、標準的なスチューデントのｔ検定によって評価し、ｐ値が０．０５以下の場合に統計的に有意であると見なした。
【０１３９】
３１種類の正常な甲状腺及び様々な甲状腺新生物の新鮮な凍結組織試料を、アステランド（デトロイト、ミシガン、米国）から購入した。試料は、正常な甲状腺組織（ＮＯＲ） ５種類、過形成結節（ＮＯＤ） ４種類、濾胞腺腫（ＦＡ） ５種類、甲状腺濾胞癌（ＦＴＣ） ５種類、甲状腺乳頭癌（ＰＴＣ） ５種類、甲状腺乳頭癌濾胞亜型（ＦＶＰＴＣ） ４種類、退形成性甲状腺癌（ＡＴＣ） １種類、及び甲状腺髄様癌（ＭＴＣ） ３種類に由来するものであった（表２）。
【０１４０】
（表２）甲状腺組織試料に関する組織病理学的データ及び患者情報。正常な甲状腺組織（ＮＯＲ）、過形成結節（ＮＯＤ）、濾胞腺腫（ＦＡ）、甲状腺濾胞癌（ＦＴＣ）、甲状腺乳頭癌（ＰＴＣ）、甲状腺乳頭癌濾胞亜型（ＦＶＰＴＣ）、退形成性甲状腺癌（ＡＴＣ）、甲状腺髄様癌（ＭＴＣ）。
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【０１４１】
マイクロアレイ解析で決定した各群におけるｍｉＲＮＡの平均発現レベルを表３に示す。
【０１４２】
（表３）甲状腺各組織試料群におけるｍｉＲＮＡ発現に関する正規化したアレイデータ。Ａｖｇ、試料のセットにおける平均発現レベル；ＳＤ、標準偏差；％、バックグランドよりも高い発現レベルを示した試料のパーセンテージ。
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【０１４３】
実施例２  ｍｉＲＮＡ発現のプロファイリングは正常な甲状腺組織と過形成甲状腺結節を区別する
正常な甲状腺組織試料では、合計４１５種類のヒトｍｉＲＮＡがバックグランドレベルよりも高く発現していた。このことは、ヒトｍｉＲＮＡの４８％がアレイ上に存在していることを示している。過形成甲状腺結節試料では、合計４０９種類のｍｉＲＮＡがバックグランドレベルよりも高く発現していた。このことは、アレイ上に４７％のｍｉＲＮＡが存在していることを示している。
【０１４４】
正常な組織試料と過形成結節試料の間では、合計１７３種類のヒトｍｉＲＮＡの発現が有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）（表４）。ＮＯＲと比較してＮＯＤでは、これらのうち、８９種類のｍｉＲＮＡの発現が少なくとも２倍増加し（Ｌｏｇ２差（ＮＯＤ対ＮＯＲ）≧１）、１４種類の発現が少なくとも２分の１に低下していた（Ｌｏｇ２差（ＮＯＤ対ＮＯＲ）≦１）。これらのうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２０２、−９３４、及び−６６３が、ＮＯＤではＮＯＲより５倍を超えて高く発現した。
【０１４５】
（表４）ＮＯＤ及びＮＯＲ試料間で発現に有意な差のあるマイクロＲＮＡ。ＡＶＧ、一群の試料における発現の平均；ＳＤ、標準偏差。
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【０１４６】
実施例３  ｍｉＲＮＡ発現のプロファイリングは正常な甲状腺組織と濾胞腺腫を区別する
正常な甲状腺組織試料では、合計で４１５種類のヒトｍｉＲＮＡがバックグランドレベルよりも高く発現していた。このことは、ヒトｍｉＲＮＡの４８％がアレイ上に存在していることを示している。濾胞腺腫試料では、合計で３３４種類のｍｉＲＮＡがバックグランドレベルよりも高く発現していた。このことは、アレイ上に３９％のｍｉＲＮＡが存在していることを示している。
【０１４７】
正常な試料とＦＡ試料の間では、合計で１１４種類のヒトｍｉＲＮＡの発現が有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）（表５）。ＮＯＲと比較してＦＡでは、これらのうち、６種類のｍｉＲＮＡの発現が少なくとも２倍増加し（Ｌｏｇ２差（ＦＡ対ＮＯＲ）≧１）、且つ７９種類の発現が少なくとも２分の１に低下していた（Ｌｏｇ２差（ＦＡ対ＮＯＲ）≦１）。これらのうち、５種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、−２０６、−２００ｂ、−４２９、及び−１９９ｂ−５ｐ）が、ＦＡではＮＯＲよりも１０〜２０倍高く発現し、６種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ＊、−４８６−３ｐ、−３７６ａ、−２００ａ＊、−３７６ｃ、及び−３８１）の発現がＦＡ試料ではＮＯＲ試料よりも５分の１〜１０分の１に低下していた（表５）。
【０１４８】
（表５）ＦＡ及びＮＯＲ試料間で発現に有意な差のあるマイクロＲＮＡ。ＡＶＧ、一群の試料における発現の平均；ＳＤ、標準偏差。
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【０１４９】
実施例４  ｍｉＲＮＡ発現のプロファイリングは正常な甲状腺組織と甲状腺濾胞癌を区別する
正常な甲状腺組織試料では、合計で４１５種類のヒトｍｉＲＮＡがバックグランドレベルよりも高く発現していた。このことは、ヒトｍｉＲＮＡの４８％がアレイ上に存在していることを示している。甲状腺濾胞癌試料では、合計で３５３種類のｍｉＲＮＡがバックグランドレベルよりも高く発現していた。このことは、アレイ上に４１％のｍｉＲＮＡが存在していることを示している。
【０１５０】
正常な試料と濾胞癌試料の間では、合計で１００種類のヒトｍｉＲＮＡの発現が有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）（表６）。ＮＯＲと比較してＦＴＣでは、これらのうち、１３種類のｍｉＲＮＡの発現が少なくとも２倍増加し（Ｌｏｇ２差（ＦＴＣ対ＮＯＲ）≧１）、３６種類の発現が少なくとも２分の１に低下していた（Ｌｏｇ２差（ＦＴＣ対ＮＯＲ）≦１）。これらのうち、８種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−３７５、−２００ａ、−２００ｂ、−４２９、−８７３、−２００ｂ＊、−１９９ｂ−５ｐ、及び−２００ａ＊）の発現が、ＦＴＣ試料ではＮＯＲ試料よりも５分の１〜１０分の１に低下していた（表６）。
【０１５１】
（表６）ＦＴＣ及びＮＯＲ試料間で発現に有意な差のあるマイクロＲＮＡ。ＡＶＧ、一群の試料における発現の平均；ＳＤ、標準偏差。
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【０１５２】
実施例５  ｍｉＲＮＡ発現のプロファイリングは正常な甲状腺組織と甲状腺乳頭癌を区別する
正常な甲状腺組織試料では、合計で４１５種類のヒトｍｉＲＮＡがバックグランドレベルよりも高く発現していた。このことは、ヒトｍｉＲＮＡの４８％がアレイ上に存在していることを示している。甲状腺乳頭癌試料では、合計で３５４種類のｍｉＲＮＡがバックグランドレベルよりも高く発現していた。このことは、アレイ上に４１％のｍｉＲＮＡが存在していることを示している。
【０１５３】
正常な試料と乳頭癌試料の間では、合計で２１９種類のヒトｍｉＲＮＡの発現が有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）（表７）。ＮＯＲと比較してＰＴＣでは、これらのうち、２２種類のｍｉＲＮＡの発現が少なくとも２倍増加し（Ｌｏｇ２差（ＰＴＣ対ＮＯＲ）≧１）、１２１種類の発現が少なくとも２分の１に低下していた（Ｌｏｇ２差（ＰＴＣ対ＮＯＲ）≦１）。これらのうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐの発現がＰＴＣ試料では１１０倍を超えて増加し；５種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−５５１ｂ、−１４６ｂ−３ｐ、−２２２、−２２１、及び−２２１＊）の発現がＰＴＣ試料では１０〜３０倍増加し、３種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−３１＊、−３１、及び−２１）の発現がＰＴＣ試料では５〜１０倍増加していた。ＰＴＣ試料では、ＰＴＣ試料で平均レベルより低い発現を示したｍｉＲＮＡのうち、６種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１、−７、−２０６、−７、−２＊、−８７３、及び−２０４）の発現が１０分の１〜２０分に低下し、１３種類のｍｉＲＮＡの発現が５分の１〜１０分の１に低下していた。
【０１５４】
（表７）ＰＴＣ及びＮＯＲ試料間で発現に有意な差のあるマイクロＲＮＡ。ＡＶＧ、一群の試料における発現の平均；ＳＤ、標準偏差。
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【０１５５】
実施例６  ｍｉＲＮＡ発現のプロファイリングは正常な甲状腺組織と乳頭甲状腺癌濾胞亜型を区別する
正常な甲状腺組織試料では、合計で４１５種類のヒトｍｉＲＮＡがバックグランドレベルよりも高く発現していた。このことは、ヒトｍｉＲＮＡの４８％がアレイ上に存在していることを示している。甲状腺乳頭癌濾胞亜型の試料では、合計で３４６種類のｍｉＲＮＡがバックグランドレベルよりも高く発現していた。このことは、アレイ上に４０％のｍｉＲＮＡが存在していることを示している。
【０１５６】
正常な試料と乳頭癌濾胞亜型の試料の間では、合計で１２６種類のヒトｍｉＲＮＡの発現が有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）。ＮＯＲと比較してＦＶＰＴＣでは、これらのうち、１４種類のｍｉＲＮＡの発現が少なくとも２倍増加し（Ｌｏｇ２差（ＦＶＰＴＣ対ＮＯＲ）≧１）、５０種類の発現が少なくとも２分の１に低下していた（Ｌｏｇ２差（ＦＶＰＴＣ対ＮＯＲ）≦１）（表８）。ＦＶＰＴＣ試料では、これらのうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐの発現が５０倍増加し、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２、−５５１ｂ、−２２１、及び−１４６ｂ−３ｐの発現がＦＶＰＴＣ試料で１０〜１４倍増加し、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１＊、−３１＊、及び−３１の発現がＦＶＰＴＣ試料で５〜１０倍増加していた。ＦＶＰＴＣ試料で平均レベルより低い発現を示したｍｉＲＮＡのうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−７及び−８７３のＦＶＰＴＣ試料中の発現が１０分の１〜２０分の１に低下し、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０４、−７−２＊、及び−１９９ｂ−５ｐのＦＶＰＴＣ試料中の発現が５分の１〜１０分の１に低下していた。
【０１５７】
（表８）ＦＶＰＴＣ試料とＮＯＲ試料との間で発現に有意な差のあるマイクロＲＮＡ。ＡＶＧ、一群の試料における発現の平均；ＳＤ、標準偏差。
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【０１５８】
実施例７  ｍｉＲＮＡ発現のプロファイリングは正常な甲状腺組織と退形成性甲状腺癌を区別する
正常な甲状腺組織試料では、合計で４１５種類のヒトｍｉＲＮＡがバックグランドレベルよりも高く発現していた。このことは、ヒトｍｉＲＮＡの４８％がアレイ上に存在していることを示している。退形成性甲状腺癌試料では、合計で３３０種類のｍｉＲＮＡがバックグランドレベルよりも高く発現していた。このことは、アレイ上に３８％のｍｉＲＮＡが存在していることを示している。
【０１５９】
正常な試料と退形成性甲状腺癌試料の間では、合計で１７８種類のヒトｍｉＲＮＡの発現が有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）。ＮＯＲと比較してＡＴＣでは、これらのうち、３２種類のｍｉＲＮＡの発現が少なくとも２倍増加し（Ｌｏｇ２差（ＡＴＣ対ＮＯＲ）≧１）、１２４種類の発現が少なくとも２分の１に低下していた（Ｌｏｇ２差（ＡＴＣ対ＮＯＲ）≦１）。これらのうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−３ｐ及びｈｓａ−ｍｉＲ−９＊の発現はＡＴＣ試料で３０〜４０倍高く、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−５ｐ、−３４ｃ−５ｐ、１２４の発現がＡＴＣ試料で１０〜２０倍高く、ｈｓａ−ｍｉＲ−９、−３４ｂ、−２１、及び−２１０の発現がＡＴＣ試料で５〜１０倍高かった（表９）。ＮＯＲ試料と比較してＡＴＣ試料では、ＡＴＣ試料で平均レベルより低い発現を示したｍｉＲＮＡのうち、８種類（ｍｉＲ−４２９、−１４１、−２００ｃ、２００ａ、−２００ｂ、−１３５ｂ、−１３５ａ、及び−２０５）の発現が１００分の１〜４２０分の１に低下し、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３８及びｈｓａ−ｍｉＲ−７−２＊の発現が５０分の１〜１００分の１に低下し、２２種類のｍｉＲＮＡの発現レベルが１０分の１から４０分の１の範囲に低下していた（表９）。
【０１６０】
（表９）ＡＴＣ及びＮＯＲ試料間で発現に有意な差のあるマイクロＲＮＡ。ＡＶＧ、一群の試料における発現の平均；ＳＤ、標準偏差。
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【０１６１】
実施例８  ｍｉＲＮＡ発現のプロファイリングは正常な甲状腺組織と甲状腺髄様癌を区別する
正常な甲状腺試料では、合計で４１５種類のヒトｍｉＲＮＡがバックグランドレベルよりも高く発現していた。このことは、ヒトｍｉＲＮＡの４８％がアレイ上に存在していることを示している。甲状腺髄様癌試料では、合計で４１８種類のｍｉＲＮＡがバックグランドレベルよりも高く発現していた。このことは、アレイ上に４８％のｍｉＲＮＡが存在していることを示している。
【０１６２】
正常な試料と甲状腺髄様癌の間では、合計で１６５種類のヒトｍｉＲＮＡの発現が有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）（表１０）。ＭＴＣとＮＯＲを比較すると、これらのうち、９１種類のｍｉＲＮＡの発現が少なくとも２倍増加し（Ｌｏｇ２差（ＭＴＣ対ＮＯＲ）≧１）、３０種類の発現が少なくとも２分の１に低下していた（Ｌｏｇ２差（ＭＴＣ対ＮＯＲ）≦１）。これらのうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７５とｈｓａ−ｍｉＲ−１２４の発現がＭＴＣ試料で１００〜５２０倍増加し、２１種類のｍｉＲＮＡの発現がＭＴＣ試料では１０〜５４倍増加し、３１種類のｍｉＲＮＡの発現がＮＯＲ試料と比較してＭＴＣ試料では５〜１０倍増加していた。ＭＴＣ試料で平均レベルより低い発現を示したｍｉＲＮＡのうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１及びｈｓａ−ｍｉＲ−３１＊の発現がＭＴＣ試料では１０分の１に低下し、６種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１３８、−７−２＊、−２０４、−３０ａ＊、−３０ｃ−２＊、及び−３０ａ）の発現がＭＴＣ試料で５分の１〜１０分の１に低下していた（表１０）。
【０１６３】
（表１０）ＭＴＣ及びＮＯＲ試料間で発現に有意な差のあるマイクロＲＮＡ。ＡＶＧ、一群の試料における発現の平均；ＳＤ、標準偏差。
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【０１６４】
実施例９  ｍｉＲＮＡ発現のプロファイリングは過形成甲状腺結節と濾胞腺腫を区別する
過形成結節試料と濾胞腺腫の間では、合計で１６０種類のヒトｍｉＲＮＡの発現が有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）（表１１）。ＮＯＤ試料と比較してＦＡ試料では、これらのうち、１１種類のｍｉＲＮＡの発現が少なくとも２倍増加し（Ｌｏｇ２差（ＦＡ対ＮＯＤ）≧１）、１２８種類が少なくとも２分の１に低下していた（Ｌｏｇ２差（ＦＡ対ＮＯＤ）≦１）。ＮＯＤ試料と比較してＦＡ試料では、これらのうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７４ａ、−７２０、及び−１２７４ｂが５〜６倍高い発現を示した。ＦＡ試料で平均レベルより低い発現を示したｍｉＲＮＡのうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０６とｈｓａ−ｍｉＲ−１２０２の発現がＦＡ試料で２０分の１〜５０分の１に低下し、１６種類のｍｉＲＮＡの発現が１０分の１〜２０分の１に低下し、４７種類のｍｉＲＮＡの発現がＮＯＤ試料と比較してＦＡ試料では５分の１〜１０分の１に低下していた。
【０１６５】
（表１１）ＦＡ及びＮＯＤ試料間で発現に有意な差のあるマイクロＲＮＡ。ＡＶＧ、一群の試料における発現の平均；ＳＤ、標準偏差。
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【０１６６】
実施例１０  ｍｉＲＮＡ発現のプロファイリングは過形成甲状腺結節と甲状腺濾胞癌を区別する
過形成結節試料と甲状腺濾胞癌試料の間では、合計で１５０種類のヒトｍｉＲＮＡの発現が有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）。ＮＯＤ試料と比較してＦＴＣ試料では、これらのうち、２４種類のｍｉＲＮＡの発現が少なくとも２倍増加し（Ｌｏｇ２差（ＦＴＣ対ＮＯＤ）≧１）、１２６種類の発現が少なくとも２分の１に低下していた（Ｌｏｇ２差（ＦＴＣ対ＮＯＤ）≦１）（表１２）。これらのうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７４ａの発現はＦＴＣ試料で１０倍を超えて高く、６種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７４ｂ、−１２６０、−７２０、−１８２、−１４２−３ｐ、及び−９６）の発現が５〜１０倍増加していた。
【０１６７】
（表１２）ＦＴＣ及びＮＯＤ試料間で発現に有意な差のあるマイクロＲＮＡ。ＡＶＧ、一群の試料における発現の平均；ＳＤ、標準偏差。
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【０１６８】
実施例１１  ｍｉＲＮＡ発現のプロファイリングは過形成甲状腺結節と乳頭甲状腺癌を区別する
過形成結節試料と甲状腺乳頭癌試料の間では、合計で２６２種類のヒトｍｉＲＮＡの発現が有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）（表１３）。ＮＯＤ試料と比較してＰＴＣ試料では、これらのうち、４８種類のｍｉＲＮＡの発現が少なくとも２倍増加し（Ｌｏｇ２差（ＮＯＤ対ＰＴＣ）≦１）、１５２種類の発現が少なくとも２分の１に低下していた（Ｌｏｇ２差（ＮＯＤ対ＰＴＣ）≧１）。ＮＯＤ試料と比較してＰＴＣ試料では、これらのうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐの発現が１００倍を超えて増加し、７種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、−５５１ｂ、−２２１、−２２２、−２２１＊、−３１＊、及び−３１）の発現が１０〜３０倍増加し、８種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７４ａ、−１２７４ｂ、−１４２−３ｐ、−３７５、−７２０、−２１、−２１＊、−１８１ａ−２＊）の発現が５〜１０倍増加していた。ＮＯＤ試料と比較してＰＴＣ試料では、ＰＴＣ試料で平均レベルより低い発現を示したｍｉＲＮＡのうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０６の発現が少なくとも４０分の１に低下し、３４種類のｍｉＲＮＡの発現が１０分の１〜２０分の１に低下し、４７種類のｍｉＲＮＡの発現が５分の１〜１０分の１に低下していた。
【０１６９】
（表１３）ＰＴＣ及びＮＯＤ試料間で発現に有意な差のあるマイクロＲＮＡ。ＡＶＧ、一群の試料における発現の平均；ＳＤ、標準偏差。
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【０１７０】
実施例１２  ｍｉＲＮＡ発現のプロファイリングは過形成甲状腺結節と甲状腺乳頭癌濾胞亜型を区別する
過形成結節試料と甲状腺乳頭癌濾胞亜型の試料の間では、合計で１９５種類のヒトｍｉＲＮＡの発現が有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）（表１４）。ＮＯＤ試料と比較してＦＶＰＴＣでは、これらのうち、４０種類のｍｉＲＮＡの発現が少なくとも２倍増加し（Ｌｏｇ２差（ＦＶＰＴＣ対ＮＯＤ）≧１）、１１７種類の発現が少なくとも２分の１に低下していた（Ｌｏｇ２差（ＦＶＰＴＣ対ＮＯＤ）≦１）。ＦＶＰＴＣ試料では、これらのうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐの発現が４０倍を超えて増加し、１１種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−５５１ｂ、−１４６ｂ−３ｐ、−３１、−２２１、−３１＊、−２２２、−２２１＊、−１２７４ａ、−１２７４ｂ、−７２０、及び−５０３）の発現が５〜１０倍増加していた。ＮＯＤ試料と比較してＦＶＰＴＣ試料では、ＰＴＣ試料で平均レベルより低い発現を示したｍｉＲＮＡのうち、４種類（ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ｂ、−６３１、−５５１ｂ＊、及び−９３４）の発現が１０分の１〜２０分の１に低下し、３３種類のｍｉＲＮＡの発現が５分の１〜１０分の１に低下していた。
【０１７１】
（表１４）ＦＶＰＴＣ及びＮＯＤ試料間で発現に有意な差のあるマイクロＲＮＡ。ＡＶＧ、一群の試料における発現の平均；ＳＤ、標準偏差。
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【０１７２】
実施例１３  ｍｉＲＮＡ発現のプロファイリングは過形成甲状腺結節と退形成性甲状腺癌を区別する
過形成結節試料と退形成性甲状腺癌の間では、合計で１６６種類のヒトｍｉＲＮＡの発現が有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）。ＮＯＤ試料と比較してＡＴＣ試料では、これらのうち、２９種類のｍｉＲＮＡの発現が少なくとも２倍増加し（Ｌｏｇ２差（ＡＴＣ対ＮＯＤ）≧１）、１２１種類の発現が少なくとも２分の１に低下していた（Ｌｏｇ２差（ＡＴＣ対ＮＯＤ）≦１）（表１５）。ＮＯＤ試料と比較してＡＴＣ試料では、これらのうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−９＊、−５８２−３ｐ、及び−５８２−５ｐの発現が３０〜５０倍増加し、６種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７４ａ、−１５５、−７２０、−１２７４ｂ、−９、及び−１２６０）の発現が１０〜３０倍増加し、６種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、−５９２、−１０ａ、−２１、−２１＊、及び−２１０）の発現が５〜１０倍増加していた。ＮＯＤ試料と比較してＡＴＣ試料では、ＡＴＣ試料で平均レベルより低い発現を示したｍｉＲＮＡのうち、９種類（ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ、−１４１、−４２９、−２００ａ、−２００ｂ、−１３５ａ、−１３５ｂ、−１３８、及び−２０５）の発現が８０分の１〜３００分の１に低下し、６種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ｂ、−７−２＊、−５１２−３ｐ、−９３４、−２００ｂ＊、及び−１４１＊）の発現が２０分の１〜３５分の１に低下し、１０種類のｍｉＲＮＡの発現が１０分の１〜２０分の１に低下し、４０種類のｍｉＲＮＡの発現が５分の１〜１０分の１に低下していた。
【０１７３】
（表１５）ＡＴＣ及びＮＯＤ試料間で発現に有意な差のあるマイクロＲＮＡ。ＡＶＧ、一群の試料における発現の平均；ＳＤ、標準偏差。
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【０１７４】
実施例１４  ｍｉＲＮＡ発現のプロファイリングは過形成甲状腺結節及び髄様甲状腺癌を区別する
過形成結節試料と甲状腺髄様癌の間では、合計で２２２種類のヒトｍｉＲＮＡの発現が有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）。ＮＯＤ試料と比較してＭＴＣ試料では、これらのうち、１０８種類のｍｉＲＮＡの発現が少なくとも２倍増加し（Ｌｏｇ２差（ＭＴＣ対ＮＯＤ）≧１）、７９種類の発現が少なくとも２分の１に低下していた（Ｌｏｇ２差（ＭＴＣ対ＮＯＤ）≦１（表１６））。ＮＯＤ試料と比較してＭＴＣ試料では、これらのうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７５の発現が９００倍を超えて増加し、６種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１５３、−３２３−３ｐ、−１２４、−４８７ｂ、−４１０、及び−５９２）の発現が５０〜１１０倍増加し、３５種類のｍｉＲＮＡの発現が１０〜３０倍増加し、２３種類のｍｉＲＮＡの発現が５〜１０倍増加していた。ＭＴＣ試料では、ＭＴＣ試料で平均レベルより低い発現を示したｍｉＲＮＡのうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ｂ＊及びｈｓａ−ｍｉＲ−１２０２の発現が１０分の１〜１５分の１に低下し、１９種類のｍｉＲＮＡの発現が５分の１〜１０分の１に低下していた。
【０１７５】
（表１６）ＭＴＣ及びＮＯＤ試料間で発現に有意な差のあるマイクロＲＮＡ。ＡＶＧ、一群の試料における発現の平均；ＳＤ、標準偏差。
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【０１７６】
実施例１５  ｍｉＲＮＡ発現のプロファイリングは濾胞腺腫と甲状腺濾胞癌を区別する
濾胞腺腫と甲状腺濾胞癌の間では、合計で１９種類のヒトｍｉＲＮＡの発現が有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）（表１７）。これらのうち、４種類（ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ＊及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ、−５９５、及び−１２２７）の発現がＦＡではＦＴＣよりも少なくとも２倍のレベルに増加し（Ｌｏｇ２差（ＦＡ対ＦＴＣ）≧１）、７種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−３２、−１９ａ、−１０５＊、−２０ａ＊、−２０ｂ、−１７＊、及び−１２０８）の発現が、ＦＴＣ試料と比較してＦＡ試料では、少なくとも２分の１に低下していた（Ｌｏｇ２差（ＦＡ対ＦＴＣ）≦１）。
【０１７７】
（表１７）ＦＡ及びＦＴＣ試料間で発現に有意な差のあるマイクロＲＮＡ。ＡＶＧ、一群の試料における発現の平均；ＳＤ、標準偏差。
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【０１７８】
実施例１６  ｍｉＲＮＡ発現のプロファイリングは濾胞腺腫と乳頭甲状腺癌を区別する
濾胞腺腫試料と乳頭癌試料の間では、合計で７６種類のヒトｍｉＲＮＡの発現が有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）（表１８）。ＦＡ試料と比較してＰＴＣ試料では、これらのうち、３４種類のｍｉＲＮＡの発現が少なくとも２倍増加し（Ｌｏｇ２差（ＦＡ対ＰＴＣ）≦１）、１５種類のｍｉＲＮＡの発現が少なくとも２分の１に低下していた（表１８）。ＦＡ試料と比較してＰＴＣ試料では、ＰＴＣ試料で高いレベルで発現したｍｉＲＮＡのうち、１種類のｍｉＲＮＡ（ｈａｓ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ）の発現が５０倍を超えて増加し；５種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−３１、−３１＊、−３７５、−２００ａ、−２００ｂ）の発現が２０〜４０倍増加し；３種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、−４２９、及び−５５１ｂ）の発現が１５〜２０倍増加し、３種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ＊、−２００ｂ＊、及び−２２２）の発現が５〜１０倍増加し、及び２２種類のｍｉＲＮＡの発現が２〜５倍増加していた。ＦＡ試料と比較してＰＴＣ試料では発現レベルが低かったｍｉＲＮＡのうち、ｈｓａ−ｍｉｒ−８８５−５ｐの発現が５分の１未満に低下し、１４種類のｍｉＲＮＡの発現が２分の１〜５分の１に低下していた。
【０１７９】
（表１８）ＦＡ及びＰＴＣ試料間で発現に有意な差のあるマイクロＲＮＡ。ＡＶＧ、一群の試料における発現の平均；ＳＤ、標準偏差。
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【０１８０】
実施例１７  ｍｉＲＮＡ発現のプロファイリングは濾胞腺腫と甲状腺乳頭癌濾胞亜型を区別する
濾胞腺腫試料と甲状腺乳頭癌濾胞亜型試料の間では、合計で３２種類のヒトｍｉＲＮＡの発現が有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）（表１９）。ＦＡ試料と比較してＦＶＰＴＣ試料では、これらのうち、１７種類のｍｉＲＮＡの発現が２倍高いレベルであった（Ｌｏｇ２差（ＦＡ対ＦＶＰＴＣ）≦１）。ＦＡ試料と比較してＦＶＰＴＣ試料では、これらのうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１の発現が３０倍増加し、５種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−３１＊、−１４６ｂ−５ｐ、−２００ｂ、−２００ａ、及び−４２９）の発現が２０〜３０倍増加し、２種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−３７５、及び−２００ｂ＊）の発現が１０〜２０倍増加し、及び９種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ＊、−１４６ｂ−３ｐ、−２２２、−９２３、−４４９ａ、−２１＊、−５０３、−１３５ａ＊、及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ）の発現が２〜１０倍増加していた。
【０１８１】
（表１９）ＦＡ及びＦＶＰＴＣ試料間で発現に有意な差のあるマイクロＲＮＡ。ＡＶＧ、一群の試料における発現の平均；ＳＤ、標準偏差。
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【０１８２】
実施例１８  ｍｉＲＮＡ発現のプロファイリングは濾胞腺腫と退形成性甲状腺癌を区別する
濾胞腺腫試料と退形成性甲状腺癌試料の間では、合計で４３種類のヒトｍｉＲＮＡの発現が有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）（表２０）。ＦＡ試料と比較してＡＴＣ試料では、これらのうち、２１種類のｍｉＲＮＡの発現が少なくとも２倍高いレベルであった（Ｌｏｇ２差（ＡＴＣ対ＦＡ≧１）。ＦＡ試料と比較してＡＴＣ試料では、これらのうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−９＊の発現が７５倍増加し、３種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−３ｐ、−５８２−５ｐ、及び−９）の発現が２０〜３０倍増加し、４種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、−２１０、−１２４、及び−３４ｃ−３ｐ）の発現が１０〜２０倍増加し、１３種類のｍｉＲＮＡの発現が２〜１０倍増加していた。
【０１８３】
（表２０）ＦＡ及びＡＴＣ試料間で発現に有意な差のあるマイクロＲＮＡ。ＡＶＧ、一群の試料における発現の平均；ＳＤ、標準偏差。
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【０１８４】
実施例１９  ｍｉＲＮＡ発現のプロファイリングは退形成性甲状腺癌と髄様甲状腺癌を区別する
退形成性甲状腺癌試料と甲状腺髄様癌試料の間では、合計で１１４種類のヒトｍｉＲＮＡの発現が有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）（表２１）。ＡＴＣ試料では、これらのうち、４種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−３ｐ、−５８２−５ｐ、−１５５＊、及び−７ｂ＊）の発現がＭＴＣ試料よりも２〜１５倍高かった（Ｌｏｇ２差（ＡＴＣ対ＭＴＣ≧１））。ＭＴＣ試料と比較してＡＴＣ試料ではさらに、９９種類のｍｉＲＮＡの発現が少なくとも２分の１に低下していた。ＭＴＣ試料と比較してＡＴＣ試料では、これらのうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７５の発現が６，０００分の１未満に低下し、５種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９、−２００ａ、−２００ｂ、−２００ｃ、及び−１４１）の発現が５００分の１〜１，０００分の１に低下し、４種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１３５ｂ、−１３５ａ、−３２３−３ｐ、及び−２０５）の発現が５０分の１〜２００分の１に低下し、３９種類のｍｉＲＮＡの発現が１０分の１〜５０分の１に低下し、５０種類のｍｉＲＮＡの発現が２分の１〜５０分の１に低下していた。
【０１８５】
（表２１）ＭＴＣ及びＡＴＣ試料間で発現に有意な差のあるマイクロＲＮＡ。ＡＶＧ、一群の試料における発現の平均；ＳＤ、標準偏差。
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【０１８６】
実施例２０  ｍｉＲＮＡ発現のプロファイリングは甲状腺濾胞癌と甲状腺乳頭癌を区別する
甲状腺濾胞癌試料と甲状腺乳頭癌試料の間では、合計で７９種類のヒトｍｉＲＮＡの発現が有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）（表２２）。ＰＴＣ試料と比較してＦＴＣ試料では、これらのうち、２７種類のｍｉＲＮＡの発現が少なくとも２分の１に低下していた（Ｌｏｇ２差（ＦＴＣ対ＰＴＣ）≦１）。これらのうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐの発現がＦＴＣ試料では８０分の１未満に低下し、５種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−５５１ｂ、−３７５、−１４６ｂ−３ｐ、−２００ｂ、及び−３１）の発現がＦＴＣでは１０分の１〜３３分の１のレベルに低下し；７種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−３１＊、−２００ａ、−４２９、−２００ａ＊、−２００ｂ＊、−２２２、及び−５１４）の発現がＦＴＣ試料では５分の１〜１０分の１のレベルに低下し、１４種類のｍｉＲＮＡの発現が、ＰＴＣ試料と比較してＦＴＣ試料では２分の１〜５分の１に低下していた。加えて、合計で３３種類のｍｉＲＮＡの発現が、ＰＴＣ試料と比較してＦＴＣ試料では、２〜５倍高いレベルであった。
【０１８７】
（表２２）ＦＴＣ及びＰＴＣ試料間で発現に有意な差のあるマイクロＲＮＡ。ＡＶＧ、一群の試料における発現の平均；ＳＤ、標準偏差。
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【０１８８】
実施例２１  ｍｉＲＮＡ発現のプロファイリングは甲状腺濾胞癌と乳頭甲状腺癌濾胞亜型を区別する
甲状腺濾胞癌試料と甲状腺乳頭癌濾胞亜型の試料の間では、合計で４７種類のヒトｍｉＲＮＡの発現が有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）（表２３）。ＦＶＰＴＣ試料と比較してＦＴＣ試料では、これらのうち、７種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ＊、−１４８ａ、−２２＊、−１２９５、−３２、−１５２、及び−１２６０）の発現が少なくとも２倍高いレベルであった（Ｌｏｇ２差（ＦＴＣ対ＦＶＰＴＣ）−１）。ＦＶＰＴＣ試料と比較してＦＴＣ試料中では、ＦＶＰＴＣ試料中よりもＦＴＣ試料中での発現が低かったｍｉＲＮＡのうち、２種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ及びｈｓａ−ｍｉＲ−３７５）の発現が２０分の１〜４０分の１に低下し、４種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−５５１ｂ、−２００ｂ、−１４６ｂ−３ｐ、及び−３１）の発現が１０分の１〜２０分の１に低下し、６種類のｍｉＲＮＡ（ｈａｓ−ｍｉＲ−４２９、−２００ｂ＊、−２００ａ＊、−２００ａ、−３１＊、及び−１３３ｂ）の発現が５分の１〜１０分の１に低下し、９種類のｍｉＲＮＡの発現が２分の１〜５分の１に低下していた。
【０１８９】
（表２３）ＦＴＣ及びＦＶＰＴＣ試料間で発現に有意な差のあるマイクロＲＮＡ。ＡＶＧ、一群の試料における発現の平均；ＳＤ、標準偏差。
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【０１９０】
実施例２２  ｍｉＲＮＡ発現のプロファイリングは甲状腺濾胞癌と退形成性甲状腺癌を区別する
甲状腺濾胞癌試料と退形成性甲状腺癌試料の間では、合計で７３種類のヒトｍｉＲＮＡの発現が有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）（表２４）。ＡＴＣ試料と比較してＦＴＣ試料では、これらのうち、４５種類のｍｉＲＮＡの発現が少なくとも２倍増加していた（Ｌｏｇ２差（ＦＴＣ対ＡＴＣ）≧１）。これらのうち、４種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１、−２００ｃ、−１３５ｂ、及び１３５ａ）の発現がＦＴＣでは２００〜６００倍増加し、３種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１＊、−１３８、−及び２００ｃ＊）の発現がＦＴＣでは１０〜６０倍増加し、１２種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ、−７ｉ＊、−９９ａ、−１４５、−１４８＊、−１２６＊、−２１８、−１４５＊、−１４３、−３２、−４５２、及び５５１ｂ）の発現がＦＴＣでは５〜１０倍増加し、２６種類のｍｉＲＮＡの発現がＡＴＣ試料に比べてＦＴＣ試料では２〜５倍増加していた。加えて、１５種類のｍｉＲＮＡの発現レベルが、ＡＴＣ試料に比べてＦＴＣ試料では低下していた。これらのうち、６種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−９＊、−５８２−３ｐ、−１２４、−９、−１０ａ、及び３４ｃ−５ｐ）の発現がＦＴＣ試料では１０分の１〜４０分の１に低下し、９種類のｍｉＲＮＡの発現が、ＡＴＣ試料に比べてＦＴＣ試料では２分の１〜１０分の１に低下していた。
【０１９１】
（表２４）ＦＴＣ及びＡＴＣ試料間で発現に有意な差のあるマイクロＲＮＡ。ＡＶＧ、一群の試料における発現の平均；ＳＤ、標準偏差。
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【０１９２】
実施例２３  ｍｉＲＮＡ発現のプロファイリングは甲状腺濾胞癌と甲状腺髄様癌を区別する
甲状腺濾胞癌試料と甲状腺髄様癌（ＭＴＣ）試料の間では、合計で１３６種類のヒトｍｉＲＮＡの発現が有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）（表２５）。ＭＴＣ試料と比較してＦＴＣ試料では、これらのうち、１７種類のｍｉＲＮＡの発現が２〜１０倍増加していた（Ｌｏｇ２差（ＦＴＣ対ＭＴＣ）≧１）。加えて、１００種類のｍｉＲＮＡの発現レベルが、ＦＴＣ試料ではＭＴＣ試料よりも低下していた。これらのうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７５の発現がＦＴＣ試料では１０００分の１未満に低下し、３種類のｍｉＲＮＡの発現がＦＴＣ試料では１００分の１〜３００分の１に低下し、４４種類のｍｉＲＮＡの発現が１０分の１〜１００分の１に低下し、５２種類のｍｉＲＮＡの発現がＭＴＣ試料よりもＦＴＣ試料では、２分の１〜１０分の１に低下していた。
【０１９３】
（表２５）ＦＴＣ及びＭＴＣ試料間で発現に有意な差のあるマイクロＲＮＡ。ＡＶＧ、一群の試料における発現の平均；ＳＤ、標準偏差。
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【０１９４】
実施例２４  ｍｉＲＮＡ発現のプロファイリングは甲状腺乳頭癌と甲状腺乳頭癌濾胞亜型を区別する
甲状腺乳頭癌試料と甲状腺乳頭癌濾胞亜型の試料の間では、合計で４８種類のヒトｍｉＲＮＡの発現が有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）（表２６）。ＰＴＣ試料と比較してＦＶＰＴＣ試料では、これらのうち、２８種類のｍｉＲＮＡの発現が２〜５倍増加していた（Ｌｏｇ２差（ＦＶＰＴＣ対ＰＴＣ）≧１）（表２６）。
【０１９５】
（表２６）ＦＶＰＴＣ及びＰＴＣ試料間で発現に有意な差のあるマイクロＲＮＡ。ＡＶＧ、一群の試料における発現の平均；ＳＤ、標準偏差。
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【０１９６】
実施例２５  ｍｉＲＮＡ発現のプロファイリングは甲状腺乳頭癌と退形成性甲状腺癌を区別する
甲状腺乳頭癌試料と退形成性甲状腺癌試料の間では、合計で１５４種類のヒトｍｉＲＮＡの発現が有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）（表２７）。ＡＴＣ試料と比較してＰＴＣ試料では、これらのうち、８９種類の発現が少なくとも２倍増加していた（Ｌｏｇ２差（ＰＴＣ対ＡＴＣ）≧１）。これらのうち、８種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１、−４２９、−２００ｃ、−２０、−２００ａ、−１３５ｂ、−５５１ｂ、及び−１３５ａ）の発現がＦＴＣ試料では１００〜５００倍増加し、８種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、−１４１＊、−３７５、−１４６ｂ−５ｐ、−２００ｂ＊、−２００ａ＊、−１３８、−及び−３１）の発現がＰＴＣ試料では２０〜６０倍の間で増加し、７３種類のｍｉＲＮＡの発現がＡＴＣ試料よりもＰＴＣ試料で２〜２０倍増加していた。加えて、４２種類のｍｉＲＮＡの発現が、ＡＴＣ試料と比較してＰＴＣ試料では低かった。これらのうち、２種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−３ｐ及び−９＊）の発現がＰＴＣ試料では３０分の１〜５０分の１に低下し、８種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−５ｐ、−８７３、−１２４、−９、−３４ｃ−５ｐ、−２０４、−３４ｃ−３ｐ、及び−３４ｂ）の発現がＰＴＣ試料では１０分の１〜３０分の１に低下し、３２種類のｍｉＲＮＡの発現がＡＴＣ試料よりもＰＴＣ試料では２分の１〜１０分の１に低下していた。検出された全プローブについての教師なしクラスタリング並びに主成分解析（ＰＣＡ）（図１）からは、正常な甲状腺（Ｎｏｒｍ）と過形成結節（Ｎｏｄ）との間の分離及び、異なる細胞由来の腫瘍に関連する（Ｃ細胞対濾胞細胞）、甲状腺髄様癌（ＭＥＤ）試料と濾胞細胞由来の全新生物（ＦＡ、ＦＴＣ、ＰＴＣ、及びｆｖＰＴＣ）との間分離が明らかになった。異なる試料群間のペアワイズ比較により、以下の実施例で議論するような、発現に違いのあるｍｉＲＮＡを同定することができた。
【０１９７】
（表２７）ＰＴＣ及びＡＴＣ試料間で発現に有意な差のあるマイクロＲＮＡ。ＡＶＧ、一群の試料における発現の平均；ＳＤ、標準偏差。
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【０１９８】
実施例２６  ｍｉＲＮＡ発現のプロファイリングは甲状腺乳頭癌及び甲状腺髄様癌を区別する
甲状腺乳頭癌試料と甲状腺髄様癌試料の間では、合計で１８８種類のヒトｍｉＲＮＡの発現が有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）（表２８）。ＭＴＣ試料と比較してＰＴＣ試料では、これらのうち、２９種類のｍｉＲＮＡの発現レベルが少なくとも２倍増加していた（Ｌｏｇ２差（ＭＴＣ対ＰＴＣ）≦１）。これらのうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐの発現レベルはＭＴＣ試料と比較してＰＴＣ試料では１００倍を超えて高く、４種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−５５１ｂ、−３１、−３１＊、及び−１４６ｂ−３ｐ）の発現がＰＴＣ試料では２５〜１００倍増加し、２４種類のｍｉＲＮＡの発現がＭＴＣ試料と比較してＰＴＣ試料では２〜１０倍増加していた。加えて、１２４種類のｍｉＲＮＡの発現が、ＭＴＣ試料と比較してＰＴＣ試料では低下していた。これらのうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４、−３７５、及び−３２３−３ｐの発現がＰＴＣでは１００分の１〜３００分の１に低下し、５種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−７、−１５３、−４１０、−１２９−３ｐ、及び−１２９−５ｐ）の発現がＰＴＣでは５０分の１〜１００分の１に低下し、１９種類のｍｉＲＮＡの発現がＰＴＣでは２０分の１〜５０分の１に低下し、９７種類のｍｉＲＮＡの発現が、ＭＴＣ試料と比較してＰＴＣ試料では２分の１〜２０分の１に低下していた。
【０１９９】
（表２８）ＰＴＣ及びＭＴＣ試料間で発現に有意な差のあるマイクロＲＮＡ。ＡＶＧ、一群の試料における発現の平均；ＳＤ、標準偏差。
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【０２００】
実施例２７  ｍｉＲＮＡ発現のプロファイリングは退形成性甲状腺癌と甲状腺乳頭癌濾胞亜型を区別する
退形成性甲状腺癌試料（ＡＴＣ）と甲状腺乳頭癌濾胞亜型試料の間では、合計で９３種類のヒトｍｉＲＮＡの発現が有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）（表２９）。ＦＶＰＴＣ試料と比較してＡＴＣ試料では、これらのうち、２７種類のｍｉＲＮＡの発現が少なくとも２倍増加していた（Ｌｏｇ２差（ＡＴＣ対ＦＶＰＴＣ）≧１）。これらのうち、１種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−９＊）の発現はＡＴＣでは７０倍を超えて高く、６種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−５ｐ、−５８２−３ｐ、−９、−１２４、−３４ｃ−３ｐ、及び−２１０）の発現はＡＴＣでは１０〜３０倍増加し、２０種類のｍｉＲＮＡの発現がＦＶＰＴＣ試料と比較してＡＴＣ試料では２〜１０倍増加していた。加えて、ＦＶＰＴＣ試料と比較してＡＴＣ試料では５３種類のｍｉＲＮＡの発現が少なくとも２分の１に低下していた。これらのうち、８種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９、−２００ｂ、−１４１、−２００ａ、−２００ｃ、−１３５ｂ、−１３５ａ、及び−２０５）の発現がＡＴＣでは１００分の１〜６００分の１に低下し、８種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−５５１ｂ、−２００ｂ＊、−１４１＊、−３７５、−２００ａ＊、−１３８、−３１、及び−１）の発現がＡＴＣでは２０分の１〜８０分の１に低下し、６種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、−５１２−３ｐ、−１２５ｂ、−２２２、−７ｉ＊、及び−９９ａ）の発現がＡＴＣでは１０分の１〜２０分の１に低下し、３１種類のｍｉＲＮＡの発現がＦＶＰＴＣ試料と比較してＡＴＣ試料では、２分の１〜１０分の１に低下していた。
【０２０１】
（表２９）ＦＶＰＴＣ及びＡＴＣ試料間で発現に有意な差のあるマイクロＲＮＡ。ＡＶＧ、一群の試料における発現の平均；ＳＤ、標準偏差。
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【０２０２】
実施例２８  ｍｉＲＮＡ発現のプロファイリングは甲状腺乳頭癌濾胞亜型と甲状腺髄様癌を区別する
甲状腺乳頭癌濾胞亜型の試料と甲状腺髄様癌試料の間では、合計で１４２種類のヒトｍｉＲＮＡの発現が有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）（表３０）。ＭＴＣ試料と比較してＦＶＰＴＣ試料では、これらのうち、１９種類のｍｉＲＮＡの発現レベルが少なくとも２倍高かった（Ｌｏｇ２差（ＦＶＰＴＣ対ＭＴＣ）≧１）。これらのうち、４種類のｍｉＲＮＡ（ｈａｓ−ｍｉＲ−３１、−３１＊、１４６ｂ−５ｐ、及び−５５ｂ）の発現はＦＶＰＴＣで４０〜９０倍増加し、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐの発現がＦＶＰＴＣでは少なくとも１０倍高く、１４種類のｍｉＲＮＡの発現がＭＴＣ試料と比較してＦＶＰＴＣ試料では２〜１０倍増加していた。加えて、９６種類のｍｉＲＮＡの発現が、ＭＴＣ試料と比較してＦＶＰＴＣ試料では、少なくとも２分の１に低下していた。これらのうち、４種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４、−３７５、−３２３−３ｐ、及び−７）の発現がＦＶＰＴＣでは１００分の１〜２５０分の１に低下し、６種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５ｐ、−１５３、−４１０、−４８７ｂ、−４３２、及び−４３３）の発現がＦＶＰＴＣでは４００分の１〜１００分の１に低下し、１７種類のｍｉＲＮＡの発現がＦＶＰＴＣでは２０分の１〜４０分の１に低下し、１７種類のｍｉＲＮＡの発現がＦＶＰＴＣでは１０分の１〜２０分の１に低下し、５２種類のｍｉＲＮＡの発現が、ＭＴＣ試料と比較してＦＶＰＴＣ試料では、２分の１〜１０分の１に低下していた。
【０２０３】
（表３０）ＦＶＰＴＣ及びＭＴＣ試料間で発現に有意な差のあるマイクロＲＮＡ。ＡＶＧ、一群の試料における発現の平均；ＳＤ、標準偏差。
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【０２０４】
実施例２９  ｍｉＲＮＡ発現のプロファイリングは過形成結節（ＮＯＤ）と濾胞細胞由来の新生物（ＦＡ、ＦＴＣ、ＰＴＣ、及びＦＶＰＴＣ）を区別する
本発明者らは、ｍｉＲＮＡが良性の過形成結節（ＮＯＤ）と病気になった甲状腺結節（ＦＡ、ＦＴＣ、ＰＴＣ、及びＦＶＰＴＣ）を区別することができるか否かの決定を試みた。この区別は、術前評価及び甲状腺結節患者の管理に関する臨床用途に重要なものである。過形成結節（ＮＯＤ）のｍｉＲＮＡの発現プロファイルと、最も一般的な濾胞細胞由来の新生物（ＦＡ、ＦＴＣ、ＰＴＣ、及びＦＶＰＴＣ）のｍｉＲＮＡの発現プロファイルを比較した。過形成結節試料と濾胞細胞由来の新生物試料との間では、合計で２０１種類のヒトｍｉＲＮＡの発現が有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）。濾胞細胞由来の新生物試料と比較してＮＯＤ試料では、これらのうち、１４４種類のｍｉＲＮＡの発現レベルが少なくとも２倍増加し（Ｌｏｇ２差（ＮＯＤ対ＦＡ、ＦＴＣ、ＰＴＣ、及びＦＶＰＴＣ）≧１）、２２種類のｍｉＲＮＡの発現レベルが少なくとも２分の１に低下していた（表３１）。ＮＯＤ中の発現レベルの平均が高かったｍｉＲＮＡのうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０６の発現が２７倍増加し、１３種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ｂ＊、−１２０２、−１３００、−６６３、−１４９＊、−６３１、−９３６、−１８７＊、−１１８２、−１９８、−７６５、−６４８、及び−９３４）の発現が１０〜２０倍増加し、４５種類のｍｉＲＮＡの発現が５〜１０倍増加し、８５種類のｍｉＲＮＡの発現が２〜５倍増加していた。ＮＯＤ中の発現レベルの平均が低かったｍｉＲＮＡのうち、５種類（ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７４ａ、−１２７４ｂ、−２２１、−７２０、及び−１２６０）の発現が少なくとも５分の１に低下し、１７種類のｍｉＲＮＡの発現が２分の１〜５分の１に低下していた（表３１）。
【０２０５】
（表３１）ＮＯＤと濾胞細胞由来の新生物（ＦＡ、ＦＴＣ、ＰＴＣ、及びＦＶＰＴＣ）との間で発現に有意な差のあるマイクロＲＮＡ。Ａｖｇ、一群の試料における発現の平均；ＳＤ、標準偏差。
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【０２０６】
実施例３０  ｍｉＲＮＡ発現のプロファイリングは良性及び前悪性病変（ＮＯＤ及びＦＡ）と濾胞細胞由来の分化型腫瘍（ＦＴＣ、ＰＴＣ、ＦＶＰＴＣ）とを区別する
本発明者らはさらに、ｍｉＲＮＡの発現レベルが、良性及び前悪性状態の甲状腺と、悪性の甲状腺癌とを区別することができるか否かの決定を試みた。良性過形成結節（ＮＯＤ）と前悪性の濾胞腺腫（ＦＡ）試料のｍｉＲＮＡの発現プロファイルと、悪性甲状腺癌、具体的には分化型甲状腺癌（ＦＴＣ、ＰＴＣ、及びＦＶＰＴＣ）のｍｉＲＮＡの発現プロファイルを比較した。ＮＯＤ＋ＦＡ試料と濾胞細胞由来の腫瘍（ＦＴＣ、ＰＴＣ、ＦＶＰＴＣ）試料との間では、合計で１１１種類のヒトｍｉＲＮＡの発現が有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）。ＣＡＮＣＥＲ試料に対してＮＯＤ＋ＦＡ試料では、これらのうち、３９種類のｍｉＲＮＡの発現レベルが少なくとも２倍増加し（Ｌｏｇ２差（ＮＯＤ＋ＦＡ対ＣＡＮＣＥＲ）≧１）、２１種類のｍｉＲＮＡの発現レベルが少なくとも２分の１に低下していた（表３２）。ＮＯＤ＋ＦＡ試料中の発現レベルの平均が高かったｍｉＲＮＡのうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０８の発現が５倍増加し、３８種類のｍｉＲＮＡの発現が２〜５倍増加していた。ＮＯＤ＋ＦＡ試料中の発現レベルの平均が低かったｍｉＲＮＡのうち、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ＊の発現が少なくとも１０分の１に低下し、３種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４４及び−１２４６、及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ）の発現が５分の１〜１０分の１に低下し、１７種類のｍｉＲＮＡの発現が２分の１〜５分の１に低下していた（表３２）。
【０２０７】
（表３２）ＮＯＤ＋ＦＡと濾胞細胞由来の分化型腫瘍（ＣＡＮＣＥＲ）との間で発現に有意な差のあるマイクロＲＮＡ。Ａｖｇ、一群の試料における発現の平均；ＳＤ、標準偏差。
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【０２０８】
実施例３１  ｍｉＲＮＡ発現のプロファイリングは過形成結節（ＮＯＤ）と濾胞細胞由来の分化型腫瘍（ＦＴＣ、ＰＴＣ、ＦＶＰＴＣ）を区別する
過形成結節（ＮＯＤ）試料と濾胞細胞由来の腫瘍（ＦＴＣ、ＰＴＣ、ＦＶＰＴＣ）試料との間では、合計で２９１種類のヒトｍｉＲＮＡの発現が有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）。ＮＯＤ試料では、これらのうち１８０種類のｍｉＲＮＡの発現レベルが少なくとも２倍増加し（Ｌｏｇ２差（ＮＯＤ対ＣＡＮＣＥＲ）≧１）、３０種類のｍｉＲＮＡの発現レベルが少なくとも２分の１に低下していた（表３３）。ＮＯＤ試料中では、ＮＯＤ中の発現レベルの平均が高かったｍｉＲＮＡのうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０６の発現が２０倍増加し、１３種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ｂ＊、−６３１、−１２０２、−１３００、−１４９＊、−６３３、−９３６、−７６５、−６４８、−１８７＊、−９３４、−１１８２、及び−１９８）の発現が１０〜２０倍増加し、４５種類のｍｉＲＮＡの発現が５〜１０倍増加し、１２１種類のｍｉＲＮＡの発現が２〜５倍増加していた。ＮＯＤ中の発現レベルの平均が低かったｍｉＲＮＡのうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐの発現が少なくとも１５分の１低下し、９種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７４ａ、−２２１、−１２７４ｂ、−７２０、−１４６ｂ−３ｐ、−２２１＊、−２２２、−１４２−３ｐ、及び−１２６０）の発現が５分の１〜１０分の１に低下し、２０種類のｍｉＲＮＡの発現が２分の１〜５分の１に低下していた（表３３）。
【０２０９】
（表３３）過形成結節（ＮＯＤ）と濾胞細胞由来の分化型腫瘍（ＣＡＮＣＥＲ）との間で発現に有意な差のあるマイクロＲＮＡ。Ａｖｇ、一群の試料における発現の平均；ＳＤ、標準偏差。
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【０２１０】
実施例３２  ｍｉＲＮＡ発現のプロファイリングは濾胞腺腫（ＦＡ）と濾胞細胞由来の分化型腫瘍（ＦＴＣ、ＰＴＣ、ＦＶＰＴＣ）を区別する
濾胞腺腫試料と濾胞細胞由来の腫瘍（ＦＴＣ、ＰＴＣ、ＦＶＰＴＣ）試料との間では、合計で９４種類のヒトｍｉＲＮＡの発現が有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）。ＦＡ試料では、これらのうち、１９種類のｍｉＲＮＡの発現レベルが２〜５倍高かった（Ｌｏｇ２差（ＦＡ対ＣＡＮＣＥＲ）≧１）。加えて、１３種類のｍｉＲＮＡの発現レベルがＦＡ試料では少なくとも２分の１に低下していた（表３４）。ＦＡ試料では、これらのうち、５種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−３１、−３１＊、−２００ａ、−２００ｂ、及び−４２９）の発現が８分の１〜２０分の１に低下し、８種類のｍｉＲＮＡの発現が２分の１〜５分の１に低下していた（表３４）。
【０２１１】
（表３４）濾胞腺腫と濾胞細胞由来の分化型腫瘍（ＣＡＮＣＥＲ）との間で発現に有意な差のあるマイクロＲＮＡ。Ａｖｇ、一群の試料における発現の平均；ＳＤ、標準偏差。
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【０２１２】
実施例３３  発現に差があったｍｉＲＮＡのＱＲＴ−ＰＣＲ解析
正常な甲状腺組織と病気になっている甲状腺組織の８種類のサブグループ間で、発現に最も共通して差があった３３種類のｍｉＲＮＡについてｑＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。ＴａｑＭａｎｅ（登録商標）マイクロＲＮＡアッセイ法（アプライドバイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア、米国）を使用し、製造業者の説明に従ってｑＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。反応液には一反応当たり５ｎｇのトータルＲＮＡを加え、７９００ＨＴ  ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ）でインキュベートした。ｑＲＴ−ＰＣＲにおいても、ｍｉＲＮＡのマイクロアレイ発現解析で最初に評価した、３１人の患者試料について解析した。加えて、１１人の患者の甲状腺試料（ＮＯＤ  １人、ＦＡ  ２人、膨大性ＦＡ  １人、ＰＴＣ  ４人、ＦＶＰＴＣ  １人、膨大性ＦＴＣ  １人、及び橋本甲状腺炎（Ｈａｓｈ）  １人）の独立したセットについてもｑＲＴ−ＰＣＲで解析した。４２種類の甲状腺試料について得られたｑＲＴ−ＰＣＲの生データを表３５に示す。ｑＲＴ−ＰＣＲのデータを用いて、２つの解析を行った。本発明者らはまず、ＮＯＤ試料中とＦＡ試料中でのｍｉＲ−２０６及びｍｉＲ−１３００（図２Ａ）について示したように、異なる試料群間においてそれぞれ個別のｍｉＲＮＡの発現レベルを比較した。これらの実験に関しては、８種類の試料サブグループ間での発現レベルが非常に類似していたｍｉＲ−１９１を標準としてｍｉＲＮＡの発現レベルを正規化した。次に本発明者らは、２種類の試料群間における発現が逆方向であった２種類のｍｉＲＮＡ間（すなわち、一方の発現は増加し、もう一方の発現が低下していたｍｉＲＮＡ間）の発現の差を決定した。この型の評価では正規化が必要とされず、特定の２種類の試料群間の違いが大きくなる。甲状腺結節と甲状腺の濾胞細胞由来の新生物（ＦＡ、ＦＴＣ、ＰＴＣ、及びＦＶＰＴＣ）を区別するｍｉＲＮＡに関する２種類のｍｉＲＮＡ間の発現の違いの例を、図２Ｂ及び図３Ａ〜Ｃに示す。突然変異及び遺伝子の再編成が甲状腺癌の病理発生に重要なため、ＡｓｕｒａｇｅｎのＬｕｍｉｎｅｘ−ｂａｓｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈアッセイ法を使用し、甲状腺癌によく見られるＤＮＡの変異（ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、ＮＲＡＳ、ＨＲＡＳ、及びＫＲＡＳ）又は転座（ＲＥＴ／ＰＴＣ１及び３、並びにＰＡＸ８／ＰＰＡＲγ）の有無について４２種類の試料を解析した。
【０２１３】
試料の変異状態にかかわらず試料を正確に分類したということが重要である（図３）。ｍｉＲＮＡの発現レベルの相対差は、アレイデータとｑＲＴ−ＰＣＲデータの両方で全体的に非常に類似しており、このことは２つのプラットフォームの間に非常に良い相関があることを示している。
【０２１４】
（表３５）４２個の甲状腺試料中の３３種類のｍｉＲＮＡの発現に関するＱＲＴ−ＰＣＲデータ
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【０２１５】
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に示した説明の例となる手順の詳細又は捕捉となる他の詳細を提供する範囲において、参照することにより具体的に組み込まれる。
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【国際調査報告】
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