(57)【要約】  レプチン受容体への結合親和性の増大したレプチン突然変異タンパク質、特にレプチンアンタゴニストが提供される。これらの化合物並びにそれらを含む医薬組成物は、内因性レプチンの望ましくないか有害な活性又は変更された自然免疫応答が関係する任意の障害の処置で有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）改変哺乳動物レプチンポリペプチドであって、
（ｉ）野生型ヒトレプチンの３９〜４２位に対応する位置のＬＤＦＩ疎水性結合部位の２つから４つのアミノ酸残基が、前記疎水性結合部位の疎水性が低くなるように異なるアミノ酸残基で置換されるように、前記部位が改変されており、前記改変哺乳動物レプチンポリペプチドがレプチンアンタゴニストであり、
（ｉｉ）野生型ヒトレプチンの２３位に対応する位置のアスパラギン酸（Ｄ２３）が、負荷電していない異なるアミノ酸残基で置換されているか、若しくは野生型ヒトレプチンの１２位に対応する位置のトレオニン（Ｔ１２）が、疎水性である異なるアミノ酸残基で置換されている
上記改変哺乳動物レプチンポリペプチド、
（ｂ）（ａ）の前記改変哺乳動物レプチンポリペプチドの断片であって、Ｄ２３が負荷電していない異なるアミノ酸残基で置換されているか、若しくはＴ１２が疎水性である異なるアミノ酸残基で置換されており、前記断片がそれ自体レプチンアンタゴニストである上記断片、又は
（ｃ）（ａ）若しくは（ｂ）の薬学的に許容される塩
を含む、合成レプチンアンタゴニスト。
【請求項２】
Ｄ２３が疎水性であるか正荷電したアミノ酸残基で置換されている、請求項１に記載の合成レプチンアンタゴニスト。
【請求項３】
前記疎水性のアミノ酸残基がロイシン、グリシン、アラニン、トリプトファン、ヒスチジン又はフェニルアラニンから選択され、前記正荷電したアミノ酸残基がアルギニン又はリシンから選択される、請求項２に記載の合成レプチンアンタゴニスト。
【請求項４】
Ｄ２３がロイシンで置換されている、請求項３に記載の合成レプチンアンタゴニスト。
【請求項５】
さらなるアミノ酸残基が、以下の通りに置換されている：
（ａ）野生型ヒトレプチンの６８位に対応する位置のロイシン（Ｌ６８）がメチオニンで置換されており、野生型ヒトレプチンの９７位に対応する位置のセリン（Ｓ９７）がフェニルアラニンで置換されており、野生型ヒトレプチンの１３２位に対応する位置のセリン（Ｓ１３２）がチロシンで置換されているか、
（ｂ）野生型ヒトレプチンの１１２位に対応する位置のグリシン（Ｇ１１２）がセリンで置換されているか、
（ｃ）野生型ヒトレプチンの３７位に対応する位置のトレオニン（Ｔ３７）がアラニンで置換されており、野生型ヒトレプチンの４４位に対応する位置のグリシン（Ｇ４４）がアスパラギン酸で置換されている、請求項２に記載の合成レプチンアンタゴニスト。
【請求項６】
Ｔ１２がイソロイシンで置換されている、請求項１に記載の合成レプチンアンタゴニスト。
【請求項７】
（ｉ）の前記２つから４つのアミノ酸残基が、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、リシン及びセリンからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、請求項１に記載の合成レプチンアンタゴニスト。
【請求項８】
前記アミノ酸残基がアラニンである、請求項７に記載の合成レプチンアンタゴニスト。
【請求項９】
前記４つのアミノ酸残基の３つがアラニンで置換されている、請求項８に記載の合成レプチンアンタゴニスト。
【請求項１０】
（ｉ）野生型ヒトレプチンの３９〜４２位に対応する位置のＬＤＦＩ疎水性結合部位が、３９位に対応する位置のロイシンがアラニンで置換され、４０位に対応する位置のアスパラギン酸がアラニンで置換され、４１位に対応する位置のフェニルアラニンがアラニンで置換されるように改変されており、
（ｉｉ）Ｄ２３がロイシンで置換されている、
請求項１から９までのいずれか一項に記載の合成レプチンアンタゴニスト。
【請求項１１】
配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる、請求項１０に記載の合成レプチンアンタゴニスト。
【請求項１２】
前記哺乳動物レプチンポリペプチドがヒト、ヒツジ又はマウスのレプチンである、請求項１に記載の合成レプチンアンタゴニスト。
【請求項１３】
野生型ヒトレプチンの３９〜４２位に対応する位置のＬＤＦＩ疎水性結合部位の２つから４つのアミノ酸残基が、前記疎水性結合部位の疎水性が低くなるように異なるアミノ酸残基で置換されるように、前記部位だけで改変されている改変哺乳動物レプチンの親和性より最高１００倍、９０倍、８０倍、７０倍、５０倍、３０倍又は２０倍高い親和性でレプチン受容体に結合する、請求項１に記載の合成レプチンアンタゴニスト。
【請求項１４】
ペグ化形態の、請求項１又は１１に記載の合成レプチンアンタゴニスト。
【請求項１５】
配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は薬学的に許容されるその塩からなる合成レプチンアンタゴニスト。
【請求項１６】
ペグ化形態の、請求項１５に記載の合成レプチンアンタゴニスト。
【請求項１７】
請求項１又は１１に記載の合成レプチンアンタゴニストをコードする単離されたＤＮＡ分子。
【請求項１８】
請求項１５に記載の合成レプチンアンタゴニストをコードする単離されたＤＮＡ分子。
【請求項１９】
配列番号４のＤＮＡ配列を有する、請求項１８に記載の単離されたＤＮＡ分子。
【請求項２０】
請求項１又は１１に記載の合成レプチンアンタゴニスト、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１５又は１６に記載の合成レプチンアンタゴニスト、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２２】
ペグ化形態の前記合成レプチンアンタゴニストを含む、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
（ａ）改変哺乳動物レプチンポリペプチドであって、Ｄ２３が負荷電していない異なるアミノ酸残基で置換されているか、若しくはＴ１２が疎水性である異なるアミノ酸残基で置換されている上記改変哺乳動物レプチンポリペプチド、
（ｂ）（ａ）の前記改変哺乳動物レプチンポリペプチドの断片であって、Ｄ２３が負荷電していない異なるアミノ酸残基で置換されているか、若しくはＴ１２が疎水性である異なるアミノ酸残基で置換されており、前記断片がそれ自体レプチンアゴニストである上記断片、又は
（ｃ）（ａ）若しくは（ｂ）の薬学的に許容される塩
を含む合成レプチンアゴニスト。
【請求項２４】
ペグ化形態の、請求項２３に記載の合成レプチンアゴニスト。
【請求項２５】
請求項２３に記載の合成レプチンアゴニストをコードする単離されたＤＮＡ分子。
【請求項２６】
請求項２３又は２４に記載の合成レプチンアゴニスト、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２７】
メタボリックシンドローム、非アルコール性脂肪肝炎、アテローム硬化症、ＩＩ型糖尿病、食欲不振、悪液質、癌、並びに多発硬化症、炎症性腸症候群又は慢性関節リウマチなどの自己炎症性及び自己免疫性疾患からなる群から選択される疾患又は状態の処置のための方法であって、必要とする患者に有効量の請求項１５又は１６に記載の合成レプチンアンタゴニストを投与することを含む上記方法。
【請求項２８】
肥満、過食関連症候群、１型糖尿病、メタボリックシンドローム及びアテローム硬化症からなる群から選択される異常なレプチンシグナル伝達が関係している疾患若しくは状態の処置のため、又は血管形成の促進における方法であって、必要とする患者に有効量の請求項２３又は２４に記載の合成レプチンアゴニストを投与することを含む上記方法。
【請求項２９】
前記患者にＳＹＭＬＩＮ（登録商標）（酢酸プラムリンチド）などのアミリン類似体又はブフェニル（４−ＰＢＡ）若しくはタウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）などの化学的シャペロンを投与することをさらに含む、肥満の処置のための請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記患者にインスリンを投与することをさらに含む、１型糖尿病の処置のための請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
そのゲノムが、誘導可能なプロモーターに作動可能に連結される、請求項１７又は１８に記載のＤＮＡ分子を含む遺伝子を含む、トランスジェニックマウス。
【請求項３２】
前記ＤＮＡ分子が配列番号４のＤＮＡ配列を有する、請求項３１に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項３３】
そのゲノムが、
（ａ）改変哺乳動物レプチンポリペプチドであって、野生型ヒトレプチンの３９〜４２位に対応する位置のＬＤＦＩ疎水性結合部位の２つから４つのアミノ酸残基が、前記疎水性結合部位の疎水性が低くなるように異なるアミノ酸残基で置換されるように、前記部位が改変されており、前記改変哺乳動物レプチンポリペプチドがレプチンアンタゴニストである上記改変哺乳動物レプチンポリペプチド、
（ｂ）（ａ）の前記改変哺乳動物レプチンポリペプチドの断片であって、前記断片それ自体がレプチンアンタゴニストである上記断片、又は
（ｃ）（ａ）若しくは（ｂ）の薬学的に許容される塩
を含む合成レプチンアンタゴニストをコードするＤＮＡ分子を含む遺伝子を含むトランスジェニックマウス。
【請求項３４】
インスリン抵抗性並びに血中インスリン及び血糖のレベルの増大を示す、請求項３１又は３３に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項３５】
高血糖、高脂血症、真性糖尿病２型及びインスリン抵抗性からなる群から選択される疾患又は障害のための治療活性を有する物質をスクリーニングする方法であって、（１）請求項３４に記載のトランスジェニックマウスに試験物質を投与する工程と、（２）前記疾患又は障害が前記トランスジェニックマウスで抑制されるかどうか確認する工程と、（３）前記疾患又は障害が前記トランスジェニックマウスで抑制される場合に、前記試験物質を、前記疾患又は障害のための治療活性を有する物質として選択する工程とを含む上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はレプチン受容体への結合親和性の増大したレプチン突然変異タンパク質、特にレプチンアンタゴニスト、及びそれらを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、多くの癌のリスクとみなされている。血清レプチンレベルは、肥満の人々でしばしば上昇している。レプチンは、多くの組織で分裂促進剤として作用する。したがって、それは、癌細胞増殖を促進するように作用しうる。実際、レプチンはｉｎ  ｖｉｔｒｏで前立腺癌細胞の増殖因子として作用すること、前立腺癌細胞の移動の増大並びに血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、形質転換成長因子ベータ１（ＴＧＦ−β１）及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）などの増殖因子の発現の増大を誘導すること、並びに前立腺癌の成長を増強することが明らかにされた。（Ｓｏｍａｓｕｎｄａｒら、２００４；Ｆｒａｎｋｅｎｂｅｒｒｙら、２００４）。
【０００３】
食物摂取及び脳でのエネルギー消費の調節で重要な役割を演ずる他に、レプチンは正常細胞及び腫瘍乳癌細胞で潜在的な増殖刺激因子としても作用する。それは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて卵巣癌細胞で細胞増殖を誘導することが最近さらに明らかにされた（Ｃｈｏｉら、２００４）。
【０００４】
レプチンは、いくつかの疾患の動物モデルでＴヘルパー１（Ｔｈ１）細胞分化を促進し、自己免疫性応答の開始及び進行を調整することが最近明らかにされている（Ｌａ  Ｃａｖａ及びＭａｔａｒｅｓｅ、２００４）。レプチンの役割が炎症性腸症候群などのＴｈ１媒介自己免疫性疾患又は炎症性疾患で根本的であるならば、末梢レプチン作用を妨害することによる治療効果を予測することができる（Ｍａｔａｒｅｓｅら、２００５）。レプチンは慢性関節リウマチの発病、及び多発硬化症のマウスモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の発生に関与することがさらに明らかにされている（Ｐｅｅｌｍａｎら、２００５）。
【０００５】
したがって、レプチン及びレプチンアンタゴニストの両方は、治療潜在能を有する。レプチンは肥満の処置のための潜在的薬剤としては過去に退けられていたが、最近、アミリン類似体（Ｔｕｒｅｋら、２０１０）又は化学的シャペロン（Ｏｚｃａｎら、２００９）と併用して有効なことが報告されている。インスリンと併用するレプチンは、１型糖尿病のマウスで改善をもたらすことが同様に明らかにされた（Ｗａｎｇら、２０１０）。
【０００６】
本明細書で完全に開示されるかのように参照により本明細書に完全に組み込まれる国際出願ＰＣＴ／ＩＬ２００５／００１２５０は、野生型ヒトレプチンの３９〜４２位に対応する位置の疎水性結合部位の配列ＬＤＦＩの少なくとも２つのアミノ酸残基が、それらの部位の疎水性が低くなるように、異なるアミノ酸残基で置換されている合成レプチンアンタゴニストの使用を開示している。レプチンアンタゴニストは、例えばメタボリックシンドローム、非アルコール性脂肪肝炎、アテローム硬化症、ＩＩ型糖尿病、食欲不振、悪液質、癌、自己炎症性及び自己免疫性疾患、例えば多発硬化症、炎症性腸症候群又は慢性関節リウマチの処置で有用である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
より低い用量で効率的な処置を促進するために、これらのレプチンアンタゴニスト及びアゴニストのそれらの標的受容体への親和性を増大させる、満たされていない必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明により、哺乳動物の天然のレプチン、又はＷＯ２００６／０５６９８７に開示されているレプチンアンタゴニストへの特定の突然変異の導入は、レプチン受容体へのレプチン又はレプチンアンタゴニストの結合親和性を増大させることを我々は今回見出した。
【０００９】
したがって、一態様では、本発明は、負荷電していない異なるアミノ酸残基で置換された野生型ヒトレプチンの２３位に対応する位置にアスパラギン酸（Ｄ２３）を有するか、又は疎水性である異なるアミノ酸残基で置換された野生型ヒトレプチンの１２位に対応する位置にトレオニン（Ｔ１２）を有することによってさらに改変されている、ＷＯ２００６／０５６９８７に開示されている改変哺乳動物レプチンのポリペプチド；前記改変哺乳動物レプチンポリペプチドの、それ自体レプチンアンタゴニストである断片；又は改変哺乳動物レプチンポリペプチド若しくはその断片の薬学的に許容される塩からなる合成レプチンアンタゴニストに関する。
【００１０】
特定の実施形態では、Ｄ２３はロイシンで置換されており、特に、合成レプチンアンタゴニストは配列番号１に示すアミノ酸配列からなる。
【００１１】
別の態様では、本発明は、Ｄ２３が負荷電していない異なるアミノ酸残基で置換されているか、又はＴ１２が疎水性である異なるアミノ酸残基で置換されている改変哺乳動物レプチンポリペプチド；Ｄ２３が負荷電していない異なるアミノ酸残基で置換されているか、又はＴ１２が疎水性である異なるアミノ酸残基で置換されている、それ自体レプチンアゴニストである前記改変哺乳動物レプチンポリペプチドの断片；又は改変哺乳動物レプチンポリペプチド若しくはその断片の薬学的に許容される塩を含む合成レプチンアゴニストに関する。
【００１２】
さらに別の態様では、本発明は、前記レプチンアンタゴニスト又はアゴニストをコードする単離されたＤＮＡ分子を提供する。
【００１３】
さらなる態様では、本発明は、前記合成レプチンアンタゴニスト若しくはアゴニスト、又はその断片、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１４】
アンタゴニストを含む医薬組成物は、過剰なレプチン又はレプチンシグナル伝達が関係する状態、例えばメタボリックシンドローム、非アルコール性脂肪肝炎、アテローム硬化症、ＩＩ型糖尿病、食欲不振、悪液質、癌又は多発硬化症、炎症性腸症候群若しくは慢性関節リウマチなどの自己炎症性及び自己免疫性疾患の処置で用いることができ、アゴニストを含む医薬組成物は、肥満、過食関連の症候群、１型糖尿病、メタボリックシンドローム及びアテローム硬化症から選択される、異常なレプチンシグナル伝達が関係する疾患若しくは状態の処置、又は血管形成の促進において用いることができる。
【００１５】
さらに別の態様では、本発明は、そのゲノムが、誘導可能なプロモーターに作動可能に連結される、本発明による合成レプチンアンタゴニスト、又はＤ２３及びＴ１２を有する合成レプチンアンタゴニストをコードするＤＮＡ分子を含む遺伝子を含む、トランスジェニックマウスを提供する。
【００１６】
本発明のトランスジェニックマウスは、好ましくはインスリン抵抗性、並びに増大したレベルの血中インスリン及び血糖を示し、したがって、高血糖、高脂血症２型真性糖尿病及びインスリン抵抗性からなる群から選択される疾患又は障害のための治療活性を有する物質をスクリーニングする方法で用いることができ、前記方法は、（１）トランスジェニックマウスに試験物質を投与する工程と；（２）前記疾患又は障害又は前記疾患若しくは障害の症状がトランスジェニックマウスで抑制されるかどうか確認する工程と；（３）前記疾患又は障害又は前記疾患若しくは障害の症状がトランスジェニックマウスで抑制されるとき、前記疾患又は障害のための治療活性を有する物質として試験物質を選択する工程とを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】酵母細胞でレプチンを発現するプラスミドの模式構造を表す図である。Ａｇａ２、Ａｇａ２タンパク質；ＨＡ、血球凝集素。
【図２Ａ】マウスレプチンの酵母表面提示のフローサイトメトリー分析を示す図である。マウスモノクローナル抗体９ｅ１０及びＦＩＴＣとコンジュゲートしたヤギ抗マウス抗体を用いて、ｃ−ｍｙｃエピトープタグが検出された。
【図２Ｂ】マウスレプチンの酵母表面提示のフローサイトメトリー分析を示す図である。発現されたレプチンは、ビオチン化可溶性ヒトレプチン受容体（ｈＬＢＤ）及びストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＳＡ−ＰＥ）コンジュゲートを用いて検出された。
【図２Ｃ】マウスレプチンの酵母表面提示のフローサイトメトリー分析を示す図である。２つの標識は、ＦＡＣＳＡＲＩＡフローサイトメトリー系を用いて、同時に検出することができた。
【図３Ａ】選別実験の１つからの代表的な図面を示す図である。図３Ａは、非標識ｈＬＢＤとの競合の前のライブラリーを示す図である。競合に負けなかった酵母細胞は、さらなる２サイクルの増殖及び選択のために収集された。ＦＬ１−Ｈ及びＦＬ２−Ｈは、フローサイトメトリー実験（励起４８８ｎｍ）で用いられた２つの放出フィルターを指す。
【図３Ｂ】選別実験の１つからの代表的な図面を示す図である。図３Ｂは、非標識ｈＬＢＤとの競合の後のライブラリーを示す図である。競合に負けなかった酵母細胞は、さらなる２サイクルの増殖及び選択のために収集された。ＦＬ１−Ｈ及びＦＬ２−Ｈは、フローサイトメトリー実験（励起４８８ｎｍ）で用いられた２つの放出フィルターを指す。
【図４Ａ】３回目のスクリーニングサイクルの後に選択された１３個の酵母クローンでの可溶性ヒトレプチン受容体（ｈＬＢＤ）に対する親和性の測定を表す図である。ＭＦＩ、平均蛍光強度；ｍｌｅｐ  ｗｔ、マウス野生型レプチン。
【図４Ｂ】３回目のスクリーニングサイクルの後に選択された１３個の酵母クローンでの可溶性ヒトレプチン受容体（ｈＬＢＤ）に対する親和性の測定を表す図である。ＭＦＩ、平均蛍光強度；ｍｌｅｐ  ｗｔ、マウス野生型レプチン。
【図５Ａ】β−メルカプトエタノールの存在下（＋）又は不在下（−）で１５％ゲルに流した、Ｄ２３で突然変異させたマウスレプチンアンタゴニスト（ＭＬＡ）の８つの変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。ＷＴマウスレプチン（ｍｌｅｐ  ｗｔ）を対照として流した。分子質量マーカーのサイズ（上から下までｋＤａで）は：２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、２０、１５及び１０であった。
【図５Ｂ】β−メルカプトエタノールの存在下（＋）又は不在下（−）で１５％ゲルに流した、Ｄ２３で突然変異させたマウスレプチンアンタゴニスト（ＭＬＡ）の８つの変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。ＷＴマウスレプチン（ｍｌｅｐ  ｗｔ）を対照として流した。分子質量マーカーのサイズ（上から下までｋＤａで）は：２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、２０、１５及び１０であった。
【図５Ｃ】β−メルカプトエタノールの存在下（＋）又は不在下（−）で１５％ゲルに流した、Ｄ２３で突然変異させたマウスレプチンアンタゴニスト（ＭＬＡ）の８つの変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。ＷＴマウスレプチン（ｍｌｅｐ  ｗｔ）を対照として流した。分子質量マーカーのサイズ（上から下までｋＤａで）は：２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、２０、１５及び１０であった。
【図６Ａ】ＴＮ緩衝液ｐＨ８中で０．８ｍｌ／分でＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムの上で展開した、Ｄ２３で突然変異させたＭＬＡの８つの変異体のゲル濾過分析を表す図である。
【図６Ｂ】ＴＮ緩衝液ｐＨ８中で０．８ｍｌ／分でＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムの上で展開した、Ｄ２３で突然変異させたＭＬＡの８つの変異体のゲル濾過分析を表す図である。
【図６Ｃ】ＴＮ緩衝液ｐＨ８中で０．８ｍｌ／分でＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムの上で展開した、Ｄ２３で突然変異させたＭＬＡの８つの変異体のゲル濾過分析を表す図である。
【図６Ｄ】ＴＮ緩衝液ｐＨ８中で０．８ｍｌ／分でＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムの上で展開した、Ｄ２３で突然変異させたＭＬＡの８つの変異体のゲル濾過分析を表す図である。
【図６Ｅ】ＴＮ緩衝液ｐＨ８中で０．８ｍｌ／分でＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムの上で展開した、Ｄ２３で突然変異させたＭＬＡの８つの変異体のゲル濾過分析を表す図である。
【図６Ｆ】ＴＮ緩衝液ｐＨ８中で０．８ｍｌ／分でＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムの上で展開した、Ｄ２３で突然変異させたＭＬＡの８つの変異体のゲル濾過分析を表す図である。
【図６Ｇ】ＴＮ緩衝液ｐＨ８中で０．８ｍｌ／分でＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムの上で展開した、Ｄ２３で突然変異させたＭＬＡの８つの変異体のゲル濾過分析を表す図である。
【図６Ｈ】ＴＮ緩衝液ｐＨ８中で０．８ｍｌ／分でＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムの上で展開した、Ｄ２３で突然変異させたＭＬＡの８つの変異体のゲル濾過分析を表す図である。
【図７Ａ】マウスレプチンアンタゴニスト（ＭＬＡ）及び超活性ＭＬＡ（ＳＭＬＡ）の生物的活性の比較を示す図である。ＦＩ、蛍光強度。
【図７Ｂ】ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−ＭＬＡ及びＰＥＧ−ＳＭＬＡの生物的活性の比較を示す図である。ＦＩ、蛍光強度。
【図７Ｃ】マウスレプチンアンタゴニスト（ＭＬＡ）及び超活性ＭＬＡ（ＳＭＬＡ）の結合特性の比較を示す図である。ＦＩ、蛍光強度。
【図７Ｄ】ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−ＭＬＡ及びＰＥＧ−ＳＭＬＡの結合特性の比較を示す図である。ＦＩ、蛍光強度。
【図８Ａ】マウスＯＢＲｂで安定してトランスフェクトさせたＣＨＯ細胞でＳＭＬＡ及びＭＬＡによるＳＴＡＴ３リン酸化の阻害を比較するウェスタンブロットを示す図である。Ｐ−ＳＴＡＴ、リン酸化ＳＴＡＴ；ｔ−ＳＴＡＴ、全ＳＴＡＴ。
【図８Ｂ】棒グラフで表される図８Ａのバンドの定量化を示す図である。ＦＩ、蛍光強度；Ｄ２３Ｌ、ＳＭＬＡ。
【図９Ａ】β−メルカプトエタノールの存在下（＋）又は不在下（−）で１２％ゲルに流したＰＥＧ−ＳＭＬＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である（分子質量マーカー（上から下までｋＤａで）は：１５０、１００、７５、５０、３７、２５及び２０であった）。
【図９Ｂ】ＴＮ緩衝液ｐＨ８中での０．７ｍｌ／分でのＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム上のＰＥＧ−ＳＭＬＡのゲル濾過分析を示す図である。
【図１０】マウスの体重増大に及ぼすＰＥＧ−ＭＬＡ及びＰＥＧ−ＳＭＬＡ（ｓｕｐｅｒＡＮＴと印される）の影響の比較を示す図である。両方の物質を６．２５ｍｇ／ｋｇで毎日注射した。２０日後、注射を中止し、マウスの体重をさらに１０日間調べた。
【図１１】用量反応実験におけるマウスの体重増大に及ぼすＰＥＧ−ＭＬＡ及びＰＥＧ−ＳＭＬＡの影響の比較を示す図である。両方の物質を２０、６．７、２．２及び０．７２ｍｇ／ｋｇで１７日間毎日注射した。結果は、平均±ＳＥＭ、ｎ＝８である。
【図１２Ａ】ＨＬＡ、ＳＨＬＡ、ＳＭＬＡ、ＰＥＧ−ＨＬＡ及びＰＥＧ−ＳＨＬＡの生物的活性の比較を示す図である。ＦＩ、蛍光強度。
【図１２Ｂ】ＨＬＡ、ＳＨＬＡ、ＳＭＬＡ、ＰＥＧ−ＨＬＡ及びＰＥＧ−ＳＨＬＡの生物的活性の比較を示す図である。ＦＩ、蛍光強度。
【図１２Ｃ】ＨＬＡ、ＳＨＬＡ、ＳＭＬＡ、ＰＥＧ−ＨＬＡ及びＰＥＧ−ＳＨＬＡの結合特性の比較を示す図である。
【図１２Ｄ】ＨＬＡ、ＳＨＬＡ、ＳＭＬＡ、ＰＥＧ−ＨＬＡ及びＰＥＧ−ＳＨＬＡの結合特性の比較を示す図である。
【図１３Ａ】雌マウスでの体重増大に及ぼすＰＥＧ−ＳＭＬＡ及びＰＥＧ−ＳＨＬＡの影響の比較を示す図である。両方の物質を、０日目（矢印）から開始して１７日間、６．２５ｍｇ／ｋｇで毎日注射した。＊で印した全ての箇所で、両方の処置はビヒクルから有意に異なった（ｐ＜０．０５）が、それら相互間では有意に異ならなかった。結果は、平均±ＳＥＭ、ｎ＝８である。ＰＥＧ−ＳＭＬＡ、ＰＥＧ−スーパーマウスレプチンアンタゴニスト；ＰＥＧ−ＳＨＬＡ、ＰＥＧ−スーパーヒトレプチンアンタゴニスト。
【図１３Ｂ】平均の比較した食物及び水の摂取量を示す図である。両方の物質を、０日目（矢印）から開始して１７日間、６．２５ｍｇ／ｋｇで毎日注射した。＊で印した全ての箇所で、両方の処置はビヒクルから有意に異なった（ｐ＜０．０５）が、それら相互間では有意に異ならなかった。結果は、平均±ＳＥＭ、ｎ＝８である。ＰＥＧ−ＳＭＬＡ、ＰＥＧ−スーパーマウスレプチンアンタゴニスト；ＰＥＧ−ＳＨＬＡ、ＰＥＧ−スーパーヒトレプチンアンタゴニスト。
【図１４】マウスレプチンの結合部位ＩＩの分子モデルを表す図である。ＣＲＨ２への結合に影響を及ぼす結合部位ＩＩ中の残基は、黄色である。レプチン受容体のＣＲＨ２サブドメインへの結合及びレプチン受容体活性化の両方に影響を及ぼす結合部位ＩＩ中の残基はオレンジ色であり、Ｄ２３は緑色である。Ｔ１２残基は、結合ドメインＩＩの一部である。Ｉｓｅｒｅｎｔａｎｔら（２００５）から。
【図１５Ａ】超活性レプチンアンタゴニストが浸入する単核食細胞の阻害によって自然炎症からの保護を誘導することを示す図である。ＰＥＧ−ＳＭＬＡ（２０ｍｇ／ｋｇ）又はＰＥＧ−レプチン（ＰＥＧ−Ｌｅｐ；０．４ｍｇ／ｋｇ）を、雌Ｃ５７ｂｌマウスに腹腔内へ４日間投与した。０分時のリポ多糖（ＬＰＳ；１０μｇ／ｋｇ）及びＤ−ガラクトースアミン（ＤｇａｌＮ；６００ｍｇ／ｋｇ）の投与による自然免疫応答の活性化によって誘導される肝炎の誘導がこれに続いた。
【図１５Ｂ】超活性レプチンアンタゴニストが浸入する単核食細胞の阻害によって自然炎症からの保護を誘導することを示す図である。定常状態、ＬＰＳ及びＤｇａｌＮの投与前の時期の細胞集団；１．５時間時のＬＰＡ／Ｄ−ＧａｌＮ、ＬＰＳ及びＤｇａｌＮの投与の１．５時間後の細胞集団；肝ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１−Ｆ４／８０＋浸入性及び常在性マクロファージ集団の集団を、それぞれゲートＰ４及びゲートＰ５に表す；ＣＤ１１ｂ及びＦ４／８０は、マクロファージのマーカーである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
ＷＯ２００６／０５６９８７は、その部位の疎水性が低くなるように、他のアミノ酸による野生型のヒト又はヒト以外の哺乳動物のレプチン配列の３９〜４２位のＬＤＦＩ疎水性結合部位のアミノ酸の少なくとも２つの置換が、野生型レプチンアゴニストをレプチンアンタゴニストに形質転換することを教示する。このアンタゴニストは、レプチン受容体に対して元のアゴニストと同じ親和性を有する。レプチン受容体に対して野生型ホルモンと同じ親和性を有するレプチンアンタゴニストを用いてｉｎ  ｖｉｖｏで効率的にレプチン作用を阻害するために、１０〜１００倍過剰のアンタゴニストが必要である。この高い比を低下させるために２つの方法がある：（１）ペグ化によってアンタゴニストの半減期を延長すること；及び（２）レプチン受容体に対するアンタゴニストの親和性を増大させ、その後両方の手法を組み合わせること。後者の手法が本出願で実施された。
【００１９】
本研究で、レプチン（アゴニスト）遺伝子のＰＣＲの誤りがちなランダム突然変異生成を用い、続いて酵母表面提示方法を用いる高親和性レプチン突然変異体の選択及び同定、その後大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）での組換え型タンパク質としての高親和性突然変異体の調製が続いた。
【００２０】
スクリーニングでは、単一の突然変異を有する高親和性突然変異タンパク質及び多重突然変異を有する突然変異タンパク質を同定した。哺乳動物への突然変異タンパク質の投与の後、それらの免疫原性が弱くなる可能性があり、したがって中和抗体の生成を誘導する可能性が低くなるので、突然変異をほとんど有しない親和性の増大した突然変異タンパク質は、多重突然変異を有する突然変異タンパク質より有利である。３回目のスクリーニングでは、以下に示す、単一の突然変異を有する２つの高親和性突然変異タンパク質が発見された：ヒスチジンで置換されたＤ２３を有する突然変異タンパク質及びイソロイシンで置換されたＴ１２を有する突然変異タンパク質（例１を参照）。
【００２１】
その後、レプチンアゴニストをレプチンアンタゴニストに形質転換する突然変異を、レプチン受容体に対して高い親和性を有するレプチン突然変異体に導入した。この方法で、レプチン受容体に対して高い親和性を有するレプチンアゴニスト及びレプチンアンタゴニストの両方が生成された。下の例３に示すように、負荷電していないアミノ酸残基によるＤ２３の合理的な突然変異生成による置換は、最も強力なレプチンアンタゴニストをもたらした。
【００２２】
ＷＯ２００６／０５６９８７のレプチンアゴニストは、本明細書でＭＬＡ（マウスレプチンアンタゴニスト）又はＨＬＡ（ヒトレプチンアンタゴニスト）と呼ばれるが、本発明の改良されたレプチンアゴニスト及びアンタゴニストは、本明細書で接頭辞「超活性」を加えて呼ばれる。したがって、例えば、改良されたマウスレプチンアンタゴニストは「ＳＭＬＡ」又は超活性マウスレプチンアンタゴニストと呼ばれ、改良されたヒトレプチンアンタゴニストは本明細書で「ＳＨＬＡ」又は超活性ヒトレプチンアンタゴニストと呼ばれる。
【００２３】
本明細書で開示されるタンパク質又はその断片中の特定のアミノ酸残基の位置は、配列番号２に表される野生型ヒトレプチンのナンバリングによるものであり、そのアミノ酸残基の一文字コード、及び野生型ヒトレプチンでのその位置を参照することによって命名される。したがって、例えば、本明細書でＤ２３とも呼ばれる野生型ヒトレプチンの２３位に対応する位置のアスパラギン酸は、タンパク質化学の分野で周知である整列アルゴリズムに従って、レプチン断片又は異なるサイズの相同的哺乳動物レプチンでもＤ２３と呼ばれる。別のアミノ酸残基による特定の位置のアミノ酸残基の置換は、アミノ酸残基の一文字コード、上で規定されるその位置、及び元のアミノ酸残基を置換するアミノ酸残基の一文字コードを参照することによって命名される。したがって、例えば、グリシンによるＤ２３の置換は、Ｄ２３Ｇと命名される。
【００２４】
三次元レプチン構造は１３年前（Ｚｈａｎｇら  １９９７）に報告されたが、レプチンとレプチン受容体の間の結晶化複合体はこれまで明らかにされなかった。そのような構造の欠如は、本出願で報告されるＤ２３Ｌ又は他のＤ２３突然変異の有効な構造解読を妨げる。したがって、提案された解読は、過去の年に報告された理論的複合体モデルに基づく（Ｐｅｅｌｍａｎら  ２００４、Ｉｓｅｒｅｎｔａｎｔら  ２００５、Ｐｅｅｌｍａｎら  ２００６）。それらの報告は、レプチンがレプチン受容体と相互作用している３つの結合部位を有することを示唆した。部位Ｉの記載は十分でなく、その重要性は４つのレプチン受容体と反応する２分子のレプチンで構成される推定上の六量体複合体の形成に関連付けされている。主要な結合部位である結合部位ＩＩはヘリックスＡ及びＣの表面に見出され、それはレプチン受容体のＣＲＨ２サブドメインに結合する。ヒトレプチン受容体のこのサブドメインを我々の研究室でサブクローニングし、ヒト又は他の哺乳動物のレプチンと高親和性１：１複合体を形成することが可能な、レプチン結合ドメイン（ＬＢＤ）と呼ばれる可溶性組換え型タンパク質として発現させた（Ｓａｎｄｏｗｓｋｉら  ２００２）。ＣＨＲ２（サイトカイン相同領域ＩＩ）とも呼ばれるこのタンパク質は、前記のように酵母細胞の表面に発現される高親和性レプチン突然変異体を引き出すフックとして本出願で用いられた。部位ＩＩＩは、おそらくＬＲのＩｇ様ドメインに結合し（Ｐｅｅｌｍａｎら  ２００４、Ｚａｂｅａｕら  ２００３）、レプチン受容体の活性化のために必要である。分子モデリング及び突然変異生成手法を用いて（Ｐｅｅｌｍａｎら  ２００４）、構造的に近く、同じ方向に面する、ヘリックスＡに位置するＤ９、Ｔ１２、Ｋ１５、Ｔ１６及びＲ２０、並びにヘリックスＣに位置するＱ７５、Ｎ８２、Ｄ８５及びＬ８６（図１４を参照）が、ＣＨＲ２との相互作用に関与する可能性が非常に高いことが明らかにされた。Ｄ９Ｓ、Ｔ１２Ｑ、Ｋ１５Ｓ、Ｔ１６Ｎ、Ｒ２０Ｎ、Ｑ７５Ｓ、Ｎ８２Ｓ、Ｄ８５Ｓ並びにＬ８６Ａ、Ｌ８６Ｓ、Ｌ８６Ｎ及びＬ８６Ｑなどのそれらの残基の突然変異は、ＣＲＨ２に対するレプチンの親和性を有意に低下させ、ＣＲＨ２への結合及びＬＲシグナル伝達の両方に影響を及ぼした。（Ｐｅｅｌｍａｎら  ２００４、Ｉｓｅｒｅｎｔａｎｔら  ２００５）。ここまで、Ｄ２３の推定上の役割に関する報告は公表されていないが、本発明による知見（表７を参照）は、負電荷を保持しない任意のアミノ酸によるＤ２３の置換が、ヒトレプチン結合ドメイン（ｈＬＢＤ；ＣＨＲ２）に対する親和性及び以降の生物的活性を増大させるのに十分であったことを強く示す。結合及び細胞アッセイ（表６及び７並びに図７Ａ〜Ｄ）においてＤ２３Ｌ突然変異体で最も高い効果が観察され、マウスでの体重増大ｉｎ  ｖｉｖｏ実験で確認された（図１０及び図１１）。結合アッセイによって測定される親和性の増大は最高５０倍であったが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏバイオアッセイでの増大は、たぶんそれらのアッセイで用いられた細胞が過剰の余剰受容体を有するので、わずか約１３〜１４倍であった。ｉｎ  ｖｉｖｏ実験での効力の増大は計算するのがより困難であるが、上で明ら���にされるように、それは９倍から２７倍の範囲である。明白に示されるように、ヒト及びヒツジのレプチンアンタゴニストでの同一のＤ２３Ｌ突然変異は、類似した結果を与えた。ヘリックスＡでのマウス及びヒトの配列のアミノ酸配列は同一であることに注意すべきである。さらに、Ｄ２３は全ての哺乳動物の配列で保存され、ヘリックスＡでのアミノ酸配列はほとんど同一である。
【００２５】
Ｄ２３はヘリックスＡのＣ末端に位置し、Ｒ２０、Ｔ１６、Ｔ１２のように同じ方向に配向される（図１４）。負荷電していないアミノ酸によるその置換は、一部のまだ特定されていない拒絶作用をおそらく無効にし、したがってＬＢＤとの相互作用を増大させる。親和性の増大は、アンタゴニスト及びアゴニスト両方の突然変異体で起こったが、アンタゴニストと対照的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞に基づくアッセイでのアゴニストの生物的活性は増大しなかった。そのような不一致の理由は、ＳＭＬＡ及びＳＨＬＡの親和性の増大は、ｋｏｎの増大でなくｋｏｆｆの減少に主に由来し（図示せず）、長期にわたる受容体の占有をもたらすという事実にたぶん関連する。そのような長期にわたる占有はアンタゴニストをより有効にするが、アゴニストの活性をおそらく増大させない。ファージディスプレイによって選択されるその突然変異体がｈＧＨ受容体に対して最大４００倍の親和性の増大をさらに示したが、細胞バイオアッセイではより活性でなかったヒト成長ホルモンの場合とこれは類似している（Ｌｏｗｍａｎ及びＷｅｌｌｓ  １９９３、Ｐｅａｒｃｅら  １９９９）。
【００２６】
したがって、本発明は、改変哺乳動物レプチンポリペプチドであって、（ｉ）野生型ヒトレプチンの３９〜４２位若しくは３９〜４１位に対応する位置のＬＤＦＩ疎水性結合部位の２つから４つのアミノ酸残基が、前記疎水性結合部位の疎水性が低くなるように異なるアミノ酸残基で置換されるように、前記部位が改変されており、前記改変哺乳動物レプチンポリペプチドがレプチンアンタゴニストであり；（ｉｉ）野生型ヒトレプチンの２３位に対応する位置のアスパラギン酸（Ｄ２３）が、負荷電していない異なるアミノ酸残基で置換されているか、若しくは野生型ヒトレプチンの１２位に対応する位置のトレオニン（Ｔ１２）が、疎水性である異なるアミノ酸残基で置換されている上記改変哺乳動物レプチンポリペプチド；前記改変哺乳動物レプチンポリペプチドの断片であって、Ｄ２３が負荷電していない異なるアミノ酸残基で置換されているか、若しくはＴ１２が疎水性である異なるアミノ酸残基で置換されており、前記断片それ自体がレプチンアゴニストである上記断片；又は前記改変哺乳動物レプチンポリペプチド若しくはその断片の薬学的に許容される塩を含む合成レプチンアンタゴニストを提供する。
【００２７】
特定の実施形態では、Ｄ２３は疎水性であるか正荷電したアミノ酸残基で置換されており、疎水性のアミノ酸残基はロイシン、グリシン、アラニン、トリプトファン、ヒスチジン又はフェニルアラニンであってよく；正荷電したアミノ酸残基はアルギニン又はリシンであってよい。詳細には、以降の例２で明らかにされるように、試験される突然変異タンパク質の中でレプチン受容体に対して最も高い親和性を有する突然変異タンパク質では、Ｄ２３はロイシンで置換される。したがって、特定の実施形態では、Ｄ２３はロイシンで置換される。
【００２８】
他の実施形態では、Ｔ１２はイソロイシンで置換される。
【００２９】
グリシンによるＤ２３の置換に加えてさらなる突然変異が導入されていた、野生型レプチンと比較してレプチン受容体に対する増大した親和性を有する突然変異タンパク質がさらに同定された。例えば、１つの突然変異タンパク質では、野生型ヒトレプチンのＬ６８位、Ｓ９７位及びＳ１３２位に対応する位置のアミノ酸残基は、他のアミノ酸残基で置換されていた。別の突然変異タンパク質では、野生型レプチンのＧ１１２位に対応する位置のアミノ酸残基は、別のアミノ酸残基で置換されていた。さらに別の突然変異タンパク質では、野生型レプチンのＴ３７位及びＧ４４位に対応する位置のアミノ酸残基は、他のアミノ酸残基で置換されていた。
【００３０】
したがって、特定の実施形態では、疎水性であるか正荷電したアミノ酸残基によるＤ２３の置換に加えて、さらなるアミノ酸残基が以下の通りに置換されている：（ａ）野生型ヒトレプチンの６８位に対応する位置のロイシン（Ｌ６８）はメチオニンで置換されており、野生型ヒトレプチンの９７位に対応する位置のセリン（Ｓ９７）はフェニルアラニンで置換されており、野生型ヒトレプチンの１３２位に対応する位置のセリン（Ｓ１３２）はチロシンで置換されているか、（ｂ）野生型ヒトレプチンの１１２位に対応する位置のグリシン（Ｇ１１２）はセリンで置換されているか、又は（ｃ）野生型ヒトレプチンの３７位に対応する位置のトレオニン（Ｔ３７）はアラニンで置換されており、野生型ヒトレプチンの４４位に対応する位置のグリシン（Ｇ４４）はアスパラギン酸で置換されている。
【００３１】
さらに、任意選択でＤ２３の置換に加えて、合成レプチンアンタゴニストは、Ｔ１２Ｉ、Ｌ６８Ｍ、Ｓ９７Ｆ、Ｓ１３２Ｙ、Ｇ１１２Ｓ、Ｔ３７Ａ及びＧ４４Ｄ、並びにこれらの置換の２つ以上の任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの置換を有することができる。
【００３２】
上記のように、その部位の疎水性が低くなるように、他のアミノ酸による野生型のヒト又はヒト以外の哺乳動物のレプチン配列のＬＤＦＩ疎水性結合部位のアミノ酸の２つから４つの置換は、野生型レプチンアゴニストをレプチンアンタゴニストに形質転換する。特定の実施形態では、２つから４つのアミノ酸残基は、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、リシン及びセリンからなる群から選択されるアミノ酸、特にアラニンで置換される。以降に提供される例では、レプチンアンタゴニストは、４つのアミノ酸残基のうちの３つがアラニンで置換された。したがって、特定の実施形態では、４つのアミノ酸残基のうちの３つはアラニンで置換される；特にＬ３９Ａ、Ｄ４０Ａ及びＦ４１Ａ。
【００３３】
試験した中で最も高い親和性を有するレプチンアンタゴニストは、Ｄ２３がロイシンで置換されていた。したがって、特定の実施形態では、合成レプチンアンタゴニストは、（ｉ）野生型ヒトレプチンの３９〜４２位に対応する位置のＬＤＦＩ疎水性結合部位が、野生型ヒトレプチンの３９位に対応する位置のロイシンがアラニンで置換されるように改変されており（Ｄ３９Ａ）；野生型ヒトレプチンの４０位に対応する位置のアスパラギン酸がアラニンで置換されており（Ｄ４０Ａ）；野生型ヒトレプチンの４１位に対応する位置のフェニルアラニンがアラニンで置換されており（Ｆ４１Ａ）；（ｉｉ）Ｄ２３がロイシンで置換されている（Ｄ２３Ｌ）突然変異タンパク質である。
【００３４】
特定の実施形態では、突然変異Ｄ２３Ｌを保持するヒトレプチンアンタゴニストは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、突然変異Ｄ２３Ｌを保持するマウスレプチンアンタゴニストは、配列番号３に示すアミノ酸配列を有する。
【００３５】
本明細書で用いるように、用語「哺乳動物」には、ヒト哺乳動物並びにヒト以外の哺乳動物が含まれる。したがって、本発明により、天然のレプチンは、ヒトレプチン又は、それらに限定されないが、ヒツジ、ラット、マウス、ウマ及びブタのレプチンなどのヒト以外の哺乳動物のレプチンであってよく、ＬＤＦＩ配列はヒトレプチン又はヒト以外の哺乳動物のレプチンの３９〜４２ＬＤＦＩ配列を表す。特定の実施形態では、レプチンはヒト、マウス又はヒツジのレプチンである。
【００３６】
以下の表６で分かるように、最初のスクリーニングアッセイで同定されたレプチンアゴニスト及びアンタゴニストのレプチン受容体への親和性は、野生型マウスレプチンと比較して約１．５倍から約３５倍に及ぶ。レプチンアンタゴニストでのＤ２３の合理的な突然変異生成は、レプチン受容体に対して約１８から約６４に及ぶ親和性範囲を有する突然変異タンパク質を次に明らかにした（表７）。したがって、特定の実施形態では、本発明による合成レプチンアンタゴニストは、野生型ヒトレプチンの３９〜４２位に対応する位置のＬＤＦＩ疎水性結合部位の２つから４つのアミノ酸残基が、その疎水性結合部位の疎水性が低くなるように異なるアミノ酸残基で置換されるように、その部位だけで改変されている改変哺乳動物レプチンのそれより最高１００倍、９０倍、８０倍、７０倍、５０倍、３０倍又は２０倍高い親和性でレプチン受容体に結合する。
【００３７】
さらなる実施形態では、本発明の合成レプチンアンタゴニストは、ペグ化形態であり、それに結合する可変数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を有する。約２０ｋＤａの分子量のＰＥＧが、この目的のために適する。本発明のレプチンアンタゴニストのペグ化は、それらの安定性、それらの血漿半減期及び薬物動態を増大させる。
【００３８】
本発明の改変哺乳動物レプチンポリペプチドの塩も、本発明の範囲に含まれる。本明細書で用いるように、用語「塩」は、カルボキシル基の塩及びペプチド分子のアミノ基の酸付加塩の両方を指す。カルボキシル基の塩は当技術分野で公知の手段によって形成することができ、無機塩、例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、第二鉄又は亜鉛の塩、及び有機塩基との塩、例えばトリエタノールアミンなどアミンと形成されるもの、アルギニン又はリシン、ピペリジン、プロカインなどと形成されるものなどが含まれる。酸付加塩には、例えば、鉱酸、例えば塩酸又は硫酸との塩、及び有機酸、例えば酢酸又はシュウ酸との塩が含まれる。好ましくは、そのような塩は、安定性、溶解性などが関係する限り、ポリペプチドの医薬特性を改変するために用いられる。
【００３９】
別の態様では、本発明は、本発明のレプチンアンタゴニストをコードする単離されたＤＮＡ分子に関する。特定の実施形態では、このアンタゴニストは、野生型ヒトレプチンの３９〜４２位に対応する位置で、置換Ｌ３９Ａ、Ｄ４０Ａ及びＦ４１Ａによって改変されているＬＤＦＩ疎水性結合部位を有し、さらにＤ２３がロイシンで置換されている。詳細には、このＤＮＡ分子は、ＤＮＡ分子の発現を作動させることが可能な、誘導可能であるか構成的に活性であるプロモーターに作動可能に連結される、配列番号４のＤＮＡ配列を含む。
【００４０】
さらに別の態様では、本発明は、本発明の合成レプチンアンタゴニスト及び薬学的に許容される担体、特に配列番号１で表されるアミノ酸配列の合成レプチンアンタゴニストを含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、医薬組成物はペグ化形態の合成レプチンアンタゴニストを含む。
【００４１】
さらに、本発明と一致して、自然免疫応答の活性化によって肝炎が誘導されたマウスに投与される超活性レプチンアンタゴニストは、炎症を起こした器官への単核マクロファージ浸入の阻害によって媒介されるかなりの保護効果を提供することが見出された。自然免疫応答の変更は、その例としては炎症性腸疾患及び非アルコール性脂肪肝炎が含まれる、多くの自己炎症性及び代謝性障害の初期の発生病理の中心事象であると考えられている。レプチン経路などの代謝経路は、複数の機構を通して相互作用して、自然免疫群を調整すると仮定される。
【００４２】
したがって、本発明の合成レプチンアンタゴニストを含む医薬組成物は、例えばメタボリックシンドローム、非アルコール性脂肪肝炎、アテローム硬化症、ＩＩ型糖尿病、食欲不振（食欲不振で苦しむ対象の食欲を増進することによる）、悪液質、癌、自己炎症性及び自己免疫性疾患、例えば多発硬化症、炎症性腸症候群又は慢性関節リウマチのように、内因性レプチンの望ましくないか有害な活性又は変更された自然免疫応答が関係する任意の障害の処置で有用である。
【００４３】
したがって、特定の実施形態では、本発明はＩＩ型糖尿病の処置、及びインスリン抵抗性、特にヒト又はヒト以外の哺乳動物の肥満と関連するものの処置のための医薬組成物を提供する。
【００４４】
他の特定の実施形態では、医薬組成物は悪性の細胞増殖の阻止のために用いることができ、したがって、それらに限定されないが乳房、結腸、卵巣及び前立腺の癌などの癌の処置で役立つことができる。
【００４５】
本発明に従った使用のための医薬組成物は、１つ又は複数の生理的に許容される担体又は賦形剤を用いる従来の方法で製剤化することができる。担体（単数又は複数）は、組成物の他の成分に適合するという意味において「許容」されなければならず、そのレシピエントに有害であってはならない。
【００４６】
本発明の医薬組成物の投与方法には、それらに限定されないが、非経口、例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、粘膜（例えば口腔、鼻腔内、口内、膣、直腸、眼内）、髄腔内、局所及び皮内経路が含まれる。投与は全身投与でも局部投与でもよい。
【００４７】
別の態様では、本発明は、メタボリックシンドローム、非アルコール性脂肪肝炎、アテローム硬化症、ＩＩ型糖尿病、食欲不振、悪液質、癌、自己炎症性及び自己免疫性疾患、例えば多発硬化症、炎症性腸症候群又は慢性関節リウマチの処置のための方法であって、必要とする患者に有効量の本発明の合成レプチンアンタゴニストを投与することを含む方法に関する。
【００４８】
さらに別の態様では、本発明は、メタボリックシンドローム、非アルコール性脂肪肝炎、アテローム硬化症、ＩＩ型糖尿病、食欲不振、悪液質、癌、又は自己炎症性及び自己免疫性疾患、例えば多発硬化症、炎症性腸症候群若しくは慢性関節リウマチの処置で用いるための、本発明の合成レプチンアンタゴニストに関する。
【００４９】
それらの潜在的な医薬用途の他に、本発明のレプチンアンタゴニストは、レプチンホルモンの生物的活性の試験のための研究手段として有用である。
【００５０】
本発明は、野生型ヒトレプチンの３９〜４２位に対応する位置に元の状態の改変されていないＬＤＦＩ疎水性結合部位を有する改変哺乳動物レプチンポリペプチドからなる合成レプチンアゴニストであって、レプチンポリペプチドは、合成レプチンアンタゴニストについて先に記載の通り、レプチン受容体へのその結合親和性を向上させるように改変されている上記合成レプチンアゴニストを提供する。換言すると、本発明は、Ｄ２３が負荷電していない異なるアミノ酸残基で置換されているか、若しくはＴ１２が疎水性である異なるアミノ酸残基で置換されている改変哺乳動物レプチンポリペプチド；Ｄ２３が負荷電していない異なるアミノ酸残基で置換されているか、若しくはＴ１２が疎水性である異なるアミノ酸残基で置換されている、それ自体レプチンアゴニストである前記改変哺乳動物レプチンポリペプチドの断片；又は改変哺乳動物レプチンポリペプチド若しくはその断片の薬学的に許容される塩からなる合成レプチンアゴニストを提供する。レプチン受容体に対する改変レプチンポリペプチドの親和性を向上させる特定の改変は、Ｄ２３Ｌ、Ｄ２３Ｇ、Ｄ２３Ａ、Ｄ２３Ｔ、Ｄ２３Ｈ、Ｄ２３Ｆ、Ｄ２３Ｒ、Ｄ２３Ｋ及びＴ１２Ｉからなる群から選択される。任意選択でＤ２３及び／又はＴ１２の置換に加えて、Ｌ６８Ｍ、Ｓ９７Ｆ、Ｓ１３２Ｙ、Ｇ１１２Ｓ、Ｔ３７Ａ及びＧ４４Ｄ、並びにこれらの置換の２つ以上の任意の組合せなどの他の置換をレプチンポリペプチドに導入することもできる。
【００５１】
他の態様では、薬学的に許容される担体、及びレプチン受容体への向上した結合親和性を有する本発明の合成レプチンアゴニストを含む医薬組成物が提供される。これまでは、レプチンの遺伝子欠損が特定された限られた場合に（Ｂｌｕｈｅｒら  ２００９）、又はヒト脂肪増加症で実験的に（Ｃｈｏｎｇら  ２０１０）レプチン療法が用いられた。しかし、肥満防止薬としてレプチンを利用するための継続的努力は続き、失敗にもかかわらず、レプチン及びアミリン療法の組合せの成功を記載する最近の報告が公表された（Ｔｕｒｅｋら  ２０１０）。別の報告は、ブフェニル（４−ＰＢＡ）又はタウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）などの化学的シャペロンによるマウスの前処置が、レプチン感受性を増大させたことを明らかにした（Ｏｚｃａｎら、２００９）。
【００５２】
さらに、インスリンと一緒にレプチンで処置された１型糖尿病マウスでは、インスリン単独で処置された１型糖尿病マウスでより血糖の変動が少なく、コレステロールレベルが低く、体脂肪沈着が少ないことを明らかにしている最近の報告（Ｗａｎｇら、２０１０）を考慮すると、１型糖尿病の処置において、インスリン又はグルコースホメオスタシスを媒介する他の剤と併用して、高親和性レプチンアゴニストを用いることができる。
【００５３】
したがって、医薬組成物は、１つ又は複数のさらなる活性剤を含むことができる。例えば、糖尿病Ｉ型の処置のために、医薬組成物はレプチンアゴニストに加えてインスリンを含むことができ、肥満の処置のために、医薬組成物はレプチンアゴニストに加えてＳＹＭＬＩＮ（登録商標）（酢酸プラムリンチド）などのアミリンアゴニスト又はブフェニル（４−ＰＢＡ）若しくはタウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）などの化学的シャペロンを含むことができる。
【００５４】
さらなる態様では、本発明は、肥満、過食関連症候群、１型糖尿病、メタボリックシンドローム及びアテローム硬化症からなる群から選択される異常なレプチンシグナル伝達が関係している疾患若しくは状態の処置のため、又は血管形成の促進における方法であって、必要とする患者に有効量の本発明の合成レプチンアンタゴニストを投与することを含む方法に関する。
【００５５】
特定の実施形態では、この方法は肥満の処置のためであり、前記患者にＳＹＭＬＩＮ（登録商標）（酢酸プラムリンチド）などのアミリン類似体又はブフェニル（４−ＰＢＡ）若しくはタウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）などの化学的シャペロンを投与することをさらに含む。
【００５６】
特定の実施形態では、この方法は１型糖尿病の処置のためであり、前記患者にインスリンを投与することをさらに含む。
【００５７】
同様に、本発明の合成レプチンアゴニストは、肥満、過食関連症候群、１型糖尿病、メタボリックシンドローム及びアテローム硬化症からなる群から選択される異常なレプチンシグナル伝達が関係している疾患若しくは状態の処置における、又は血管形成の促進における使用のためである。合成レプチンアゴニストは、アミリン類似体若しくは化学的シャペロンの投与と併用される肥満の処置での使用のため、又はインスリンの投与と併用される１型糖尿病の処置のためであってよい。
【００５８】
本発明と一致して、ペグ化レプチンアンタゴニスト（ＰＥＧ−ＭＬＡ又はＰＥＧ−ＳＭＬＡ）の注射が雄及び雌両方のマウスで非常に強力な食欲促進作用、すなわち食欲に対する刺激作用を誘導し、主に脂肪蓄積に由来する非常に速い体重増大をもたらしたことが見出されている（例４及び７を参照）。ＰＥＧ−ＭＬＡ又はＰＥＧ−ＳＭＬＡの注射を中止すると、この体重増大を反転させることができた。ＰＥＧ−ＭＬＡを長期間注射された雄マウスは、対照と比較してインスリン抵抗性並びにインスリンレベル及びホメオスタシスモデル評価（ＨＯＭＡ）スコアの有意な差を徐々に発達させたことが、本明細書でさらに明らかにされた（ＨＯＭＡはインスリン抵抗性及びβ細胞機能を定量化するために用いられる方法である）。血糖、血中トリグリセリド及び総コレステロールの有意な増大がさらに観察された−糖尿病前症メタボリックシンドロームの出現の指標。
【００５９】
高血糖、高脂血症及びインスリン抵抗性と関連する、レプチンアンタゴニストによって誘発されるこの可逆的な肥満は、マウスの真性糖尿病２型の迅速可逆的モデルの役目を果たすことができる。そのようなモデルは、ＰＥＧ−ＳＭＬＡの注射によって、又はＳＭＬＡをコードするＤＮＡ配列を条件付きで発現するトランスジェニックマウスの作製によって達成することができる。
【００６０】
したがって別の態様では、本発明は、そのゲノムが、誘導可能なプロモーターに作動可能に連結される、本発明による合成レプチンアンタゴニストをコードするＤＮＡ分子を含む遺伝子を含む、トランスジェニックマウスを提供する。
【００６１】
特定の実施形態では、ＤＮＡ分子は配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる合成レプチンアンタゴニストをコードし、好ましくは配列番号４である。
【００６２】
ＷＯ２００６／０５６９８７に示されるように、機能的レプチンアンタゴニストを生成するために、野生型哺乳動物レプチンの３９〜４２位のアミノ酸残基の少なくとも２つは、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、リシン及びセリンからなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸残基で置換することができる。したがって、本発明のトランスジェニックマウスのゲノムは、本明細書の上に規定されるＤ２３又はＴ１２の突然変異をさらに有するこれらのレプチンアンタゴニストをコードする遺伝子を含むことができる。
【００６３】
当然ながら、ＷＯ２００６／０５６９８７のレプチンアンタゴニストをコードする遺伝子を、トランスジェニックマウスに導入することもできる。したがって、哺乳動物レプチンポリペプチド配列の３９〜４２位のいずれかのアミノ酸残基のいずれか２つ、例えば３９と４０、又は３９と４１、又は３９と４２、又は４０と４１、又は４０と４２、又は４１と４２がアラニンによって置換されるレプチンアンタゴニスト。
【００６４】
特定の実施形態では、単離されたＤＮＡ分子は、ヒトレプチンに由来するレプチンアンタゴニストをコードする。詳細には、ＤＮＡ分子は配列番号５であり、二重ヒトレプチン突然変異体Ｌ３９Ａ／Ｄ４０Ａをコードする。別の実施形態では、ＤＮＡ分子は配列番号６であり、二重ヒトレプチン突然変異体Ｆ４１Ａ／Ｉ４２Ａをコードする。
【００６５】
別の実施形態では、単離されたＤＮＡ分子は、ヒツジレプチンに由来するレプチンアンタゴニストをコードする。詳細には、ＤＮＡ分子は配列番号７であり、ヒツジレプチンの二重突然変異体Ｌ３９Ａ／Ｄ４０Ａをコードする。或いは、ＤＮＡ分子は配列番号８であり、ヒツジレプチンの二重突然変異体Ｆ４１Ａ／Ｉ４２Ａをコードする。
【００６６】
本発明の別の実施形態では、ＤＮＡ分子は配列番号９であり、ヒトレプチンの三重突然変異体Ｌ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａをコードする。別の実施形態では、ＤＮＡ分子は配列番号１０であり、ヒツジレプチンの三重突然変異体Ｌ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａをコードする。
【００６７】
さらに別の実施形態では、ＤＮＡ分子は配列番号１１であり、ヒトレプチンの四重突然変異体Ｌ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａ／Ｉ４２Ａをコードする。
【００６８】
さらなる実施形態では、ＤＮＡ分子は配列番号１２であり、ヒツジレプチンの四重突然変異体Ｌ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａ／Ｉ４２Ａをコードする。
【００６９】
空間時間的制御を可能にするために、レプチンアンタゴニスト遺伝子の発現を制御するプロモーターは、誘導可能であることが重要である。例えば、遺伝子が発達の成人期にだけオンにされ、特定の作用が達成された後にそれをオフにすることができることが望ましい。
【００７０】
現在まで、トランスジェニックマウスで２つの主要な系、すなわちテトラサイクリンにより誘導可能な系及びＣｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系（構成的であるか誘導可能であるかのいずれか）の使用に成功している。ｉｎ  ｖｉｖｏでこれらの系を用いるために、２組のトランスジェニック動物を作製することが必要である。１つのマウス系統は、選択される一般的又は組織特異的プロモーターの制御下で活性化因子（ｔＴＡ、ｒｔＴＡ又はＣｒｅリコンビナーゼ）を発現する。別の組のトランスジェニック動物は、レプチンアンタゴニスト導入遺伝子の発現がｔＴＡ／ｒｔＴＡトランス活性化因子の標的配列の制御下である（又はｌｏｘＰ配列に挟まれている）、「アクセプター」構築物を発現する。２系統のマウスの交配は、導入遺伝子発現の空間時間的制御を可能にする。
【００７１】
他の誘導可能な系、例えば合成ステロイドホルモン結合ドメインを含むプロモーターが記載されており、本発明に従って用いることができる。
【００７２】
したがって、特定の実施形態では、誘導可能なプロモーターはテトラサイクリンによって制御されるトランス活性化因子依存性のプロモーターであり、トランスジェニックマウスのゲノムは、テトラサイクリンによって制御されるトランス活性化因子をさらに含む。トランス活性化因子は、２種類のトランス活性化因子から選択することができる；テトラサイクリンが存在しない場合にだけ転写を可能にするもの、又はその存在下でだけ転写を可能にするもの。
【００７３】
トランスジェニックマウスの生成方法は周知の事項であり、本発明のトランスジェニックマウスを生成するために、例えば本明細書に完全に組み込まれる「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｈａｎｄｂｏｏｋ、第２版（Ｃａｒｌ  Ａ．Ｐｉｎｋｅｒｔ編、Ｇｕｌｆ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２００２）に教示されるように、任意の適当な方法を選択することができる。
【００７４】
上記のように、本発明のトランスジェニックマウスは、インスリン抵抗性並びに血中インスリン及び血糖のレベルの増大を好ましくは示す。
【００７５】
したがって、さらなる態様では、本発明は、高血糖、高脂血症２型真性糖尿病及びインスリン抵抗性からなる群から選択される疾患又は障害のための治療活性を有する物質をスクリーニングする方法であって、（１）トランスジェニックマウスに試験物質を投与する工程と、（２）前記疾患又は障害がトランスジェニックマウスで抑制されるかどうか確認する工程と、（３）前記疾患又は障害がトランスジェニックマウスで抑制される場合に、試験物質を、前記疾患又は障害のための治療活性を有する物質として選択する工程とを含む上記方法を提供する。
【００７６】
本発明は、次に以下の非限定例で例示される。
【実施例】
【００７７】
材料及び方法。
材料−  組換え型ヒトレプチン結合ドメイン（ｈＬＢＤ）（Ｓａｎｄｏｗｓｋｉら、２００２）並びにマウス及びレプチン、並びにマウス及びヒトのレプチンアンタゴニストを前記の通りに我々の研究所で調製した（Ｓａｌｏｍｏｎら  ２００６、Ｎｉｖ−Ｓｐｅｃｔｏｒら  ２００５）。大腸菌での発現のために最適化された合成マウスレプチン野生型（ＷＴ）ｃＤＮＡは、Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ  Ｃｏ．Ｒｅｎｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙによって合成された（Ｓａｌｏｍｏｎら  ２００６）。ヒトレプチン及びマウスインターロイキン３（ｍＩＬ３）は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｒｅｈｏｖｏｔ（Ｒｅｈｏｖｏｔ、Ｉｓｒａｅｌ）から購入した。分子生物学実験で用いられた制限酵素は、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ（Ｖｉｌｎｉｕｓ、Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）からのものであった。高純度のＤＮＡプライマーは、Ｓｙｎｔｅｚｚａ（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、Ｉｓｒａｅｌ）に注文された。溶解緩衝液、ナリジキシン酸、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（チアゾリルブルー、ＭＴＴ）、ピューロマイシン及びカナマイシンは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ、Ｉｓｒａｅｌ）から購入した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ＨＲ  １０／３０、２６／６０及びＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ＨＲ  １０／３０カラム並びにＱ−セファロース及びＳＰ−セファロースは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）からのものであった。ＳＤＳゲル電気泳動及びＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイのための分子マーカーは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｉｓｒａｅｌ）から購入した。Ｂａｃｔｏ−トリプトンは、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｃｏｎｄａ（Ｍａｄｒｉｄ、Ｓｐａｉｎ）からのものであった。Ｂａｃｔｏ−酵母抽出物及びＢａｃｔｏカザミノ酸（−Ｔｒｐ、−Ｕｒａ）は、Ｄｉｆｃｏ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ）からのものであった。スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンは、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）から購入した。プラスミドｐＣＴ３０２及び酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＥＢＹ１００株は、Ｅ．Ｔ．Ｂｏｄｅｒ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ  Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ、ＴＮ、ＵＳＡ）からの快い寄贈であった。モノクローナルＡｂ  ９ｅ１０は（Ｃｏｖａｎｃｅ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）から購入し、ＦＩＴＣ標識Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗マウスＩｇＧは（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）から、ストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＳＡ−ＰＥ）コンジュゲートは（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）からのものであった。ｐ−ＳＴＡＴ−３（Ｔｙｒ７０５）及びＳＴＡＴ−３抗体は（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）からのものであり、ｍＰＥＧ−プロピオニル−ＡＬＤ  ２０ｋＤａは、Ｊｅｎｋｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．（Ａｌｌｅｎ、ＴＸ）から購入した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（「ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ」；１０，０００単位／ｍｌ及び１０��０００ｍｇ／ｍｌ）及び強化化学発光試薬（ＥＣＬ）は、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．（Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、Ｉｓｒａｅｌ）からのものであった。ＲＰＭＩ−１６４０及びＤＭＥＭ培地はＧＩＢＣＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ．）から、ＰｅｌｌｅｔＰａｉｎｔ共沈殿剤は（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からのものであった。ルシフェラーゼ検定用試薬はＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）から、ペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジンはＪａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、ＵＳＡ）から、ＴＭＢはＤａｋｏ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）からのものであった。トリス、システイン、アルギニン、ＮａＯＨ、ＨＣｌ、ホウ酸、ツイーン２０、超純粋尿素、スキムミルクなどの他の試薬は、全て分析用であった。
【００７８】
以下のキットを購入した：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ（登録商標）キット、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ突然変異生成キット及びＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ−Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）。Ｑｉａｇｅｎミニプレップ及びＱｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）。Ｚｙｍｏｐｒｅｐ  ＩＩ酵母プラスミドミニプレップキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｏｒａｎｇｅ、ＣＡ）。
【００７９】
以下の試薬は、我々の研究室で調製した：ＬＢ（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、滅菌済）、ＴＢ（８０ｇ／Ｌトリプトン、１６０ｇ／Ｌ酵母抽出物、３３．３ｇ／Ｌグリセロール、滅菌済）、ＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌペプトン、２０ｇ／Ｌブドウ糖、滅菌済）、ＳＤ−ＣＡＡ培地（２０ｇ／Ｌブドウ糖、６．７ｇ／Ｌ  Ｄｉｆｃｏ酵母窒素ベース、５ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏカザミノ酸、５．４ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４及び８．５６ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４、滅菌済）、ＳＧ−ＣＡＡ培地（ＳＤ−ＣＡＡに関しては、ブドウ糖の代わりに２０ｇ／Ｌガラクトースを含む）、ＦＡＣＳ緩衝液−ＰＢＳ緩衝液（８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．２ｇ／Ｌ  ＫＣｌ、１．４４ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．２４ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４）ｐＨを７．４に調整し、５％ウシ血清アルブミン及び０．０５％アジドを追加した、ルシフェラーゼ活性のための溶解緩衝液（２５ｍＭトリスホスフェート、２ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＣＤＴＡ、１０％グリセロール、１％トリトン１００、ｐＨ７．８）、ゲル濾過実験のためのＴＮ緩衝液（２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８又は９、３００ｍＭ  ＮａＣｌを含む）。
【００８０】
ｈＬＢＤのビオチン化−ｈＬＢＤ（０．１２ｍｇ／ｍｌ）をＰＢＳ（ｐＨ７．５）に対して透析し、１０倍のモル過剰のビオチン化試薬、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンと室温で４０分間インキュベートした。ＰＢＳ緩衝液に対して透析することによって、過剰の未反応ビオチンを除去した。ビオチン化ＬＢＤは、非ビオチン化ＬＢＤと同様にレプチン又はレプチンアンタゴニストと１：１の複合体を形成することが可能であった（図示せず）。
【００８１】
マウスレプチンの酵母表面提示−  ＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩ制限部位をそれぞれ５’末端及び３’末端に導入し、ＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩで線状化させたアクセプターベクターｐＣＴ３０２への以降のサブクローニングを可能にするために、マウスレプチン野生型（ＷＴ）ｃＤＮＡをＰＣＲによって改変した。ＰＣＲで用いたプライマーは、５’末端へは５’−ＧＴＡＣＧＣＡＡＧＣＴＡＧＣＧＣＴＧＴＴＣＣＧＡＴＣＣＡＧＡＡＡＧＴＴＣＡＧＧ−３’（配列番号５）、３’末端へは５’−ＣＧＴＡＧＧＡＴＣＣＧＣＡＴＴＣＣＧＧＡＧＡＡＡＣＧＴＣＣＡＡＣＴＧ−３’（配列番号６）であった。マウスレプチンのＰＣＲ生成物をＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩで消化し、抽出し、線状化ｐＣＴ３０２発現ベクターに連結した。ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞を新しいプラスミドで形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに平板培養した。４つの大腸菌コロニーが単離され、ＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素による消化によって、マウスレプチンｃＤＮＡを含むことが確認された。コロニーの全ては陽性であり、それらの１つを配列決定した。
【００８２】
マウスレプチンは、ガラクトースを含む培地での誘導によって、酵母サッカロミセス・セレビシエのＥＢＹ１００株でＡｇａ２ｐタンパク質融合体として発現された（Ｂｏｄｅｒ  ＥＴ、Ｗｉｔｔｒｕｐ  ＫＤ、１９９７）。血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグはレプチンをコードするＤＮＡの５’の上流で発現されるが、ｃ−ｍｙｃエピトープタグはＡｇａ２ｐ−レプチン融合構築物の３’に結合し、その模式構造を図１に提示する。マウスｍＡｂ  ９ｅ１０及びＦＩＴＣとコンジュゲートしたヤギ抗マウス抗体を用いて、ｃ−ｍｙｃエピトープタグを検出することができる。Ａｇａ２ｐ−レプチン融合体のＣ末端のｃ−ｍｙｃエピトープタグの検出は、酵母細胞表面での完全長レプチン融合体の提示を示している。
【００８３】
ｐＣＴ３０２／マウスレプチンｗｔで形質転換された酵母細胞を、３ｍｌの選択的グルコース培地ＳＤ−ＣＡＡで振盪させながら３０℃で一晩増殖させた。約１８〜２０時間後、５ｍｌの選択的ガラクトース培地（ＳＧ−ＣＡＡ、ＳＤ−ＣＡＡのグルコースが２％ガラクトースに交換される）で振盪させながら、３０℃でＡｇａ１ｐ（膜酵母タンパク質）＋Ａｇａ２ｐ−レプチン発現を誘導した。約２０〜２４時間（１〜２回の倍加）後に培養物を遠心分離によって収集し、５％ウシ血清アルブミン及び０．０５％アジドを含むＰＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）で洗浄し、抗ｃ−ｍｙｃ  ｍＡｂ  ９ｅ１０（１：１００の希釈）及びビオチン化ｈＬＢＤ（約５０ｎＭの最終濃度）と一緒に氷上で６０分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、ＦＩＴＣ標識Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：５０）若しくはストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＳＡ−ＰＥ）コンジュゲート（１：５０）のいずれか又は両方と一緒に氷上で３０分間インキュベートした。標識酵母細胞は、Ｗｅｉｚｍａｎｎ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＦｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ＣｅｎｔｅｒでＢｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで分析した。
【００８４】
マウスレプチンライブラリーの構築−  高い突然変異生成率を与えるために、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ（登録商標）キットを用いて野生型マウスレプチンｗｔ遺伝子をランダムな突然変異生成にかけた。Ｒａｙｍｏｎｄら（１９９９）による試験に記載されているように、最高の形質転換効率を得るために、挿入断片が各末端に、切断アクセプターベクターとの約５０ｂｐの重複を有するように相同組換えプライマーを設計した。切断ベクターと５’相同性を有する挿入断片を作製するために用いたプライマーは５’−ＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＣＴＡＧＣＧＣＴＧＴＴＣＣＧＡＴＣＣＡＧＡＡＡＧＴＴＣ−３’（配列番号７）であり、切断ベクターと３’相同性を有する挿入断片を作製するために用いたプライマーは５’−ＧＡＴＣＴＣＧＡＧＣＴＡＴＴＡＣＡＡＧＴＣＣＴＣＴＴＣＡＧＡＡＡＴＡＡＧＣＴＴＴＴＧＴＴＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＴＴＣＣＧＧＡＧＡＡＡＣＧＴＣＣＡＡＣＴＧ−３’（配列番号８）であった。Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＰＣＲ生成物をゲル精製し、抽出した。ランダム突然変異生成キットを用いて、得られたＰＣＲ生成物をさらに増幅し、再び抽出した。線状化ｐＣＴ−マウスレプチンと一緒に、最終ＰＣＲ生成物を酵母に形質転換した。酵母におけるギャップのあるプラスミドを有するＰＣＲ生成物の５’及び３’に隣接する５０塩基対の間のｉｎ  ｖｉｖｏ相同組換えは、約５×１０５個のマウスレプチン変異体のライブラリーをもたらした。４１μｇの変異原性ＤＮＡ挿入断片及び８．２μｇの制限酵素線状化ｐＣＴ３０２ベクター骨格をＰｅｌｌｅｔ  Ｐａｉｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）で濃縮し、５回のエレクトロポレーションによってＥＢＹ１００コンピテント酵母細胞（Ｂｏｄｅｒ及びＷｉｔｔｒｕｐ  １９９７）に形質転換した（Ｍｅｉｌｈｏｃら  １９９０）。ライブラリーの一定量を平板培養してコロニーを計数することによって推定されるように、５×１０５個の酵母形質転換体のライブラリーが得られた。切断アクセプターベクターに対する全挿入断片の比は、全ての形質転換で５：１に維持された。
【００８５】
相同組換えのためのエレクトロコンピテント酵母の調製−  酵母調製の方法は、Ｍｅｉｌｈｏｃら（１９９０）によって記載される方法に厳密に従う。先ず、ＹＰＤでのＥＢＹ１００の一晩の培養物から、０．１の光学濃度（ＯＤ）まで５０ｍｌのＹＰＤにＳ．セレビシエ株ＥＢＹ１００（Ｂｏｄｅｒ及びＷｉｔｔｒｕｐ  １９９７）を接種した。次に、１．３〜１．５のＯＤ（約６時間の増殖）まで、細胞を振盪させながら３０℃で増殖させた。細胞を遠心によって収集し、５０ｍｌの滅菌冷水に懸濁した。細胞を２５ｍｌの滅菌冷水で洗浄し、２ｍｌの滅菌氷冷１Ｍソルビトールに懸濁した。細胞を遠心によって収集し、５０μｌの滅菌１Ｍソルビトールに懸濁した。その後、０．２ｃｍキュベットを備えたＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（電圧１．５ｋＶ、キャパシタンス２５μＦ）を用いて、懸濁細胞のエレクトロポレーションを実行した。パルスした後に、細胞の一定分量を１ｍｌの冷１Ｍソルビトールに直ちに再懸濁し、全体の形質転換混合物をカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）及びｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ（１：１００の希釈）を含む５０ｍｌのＳＤＣ−ＡＡ選択培地に移し、３０℃で増殖させた。細胞の小分量を取り出してＳＤＣ−ＡＡプレートに平板培養し、形質転換効率を判定した。
【００８６】
フローサイトメトリーによるマウスレプチンライブラリーのスクリーニング−  ＳＤ−ＣＡＡ選択培地中の形質転換プールの５０ｍｌ容量を振盪させながら３０℃で一晩増殖させ、ＯＤ６００が０．０５になるまで希釈し、ＯＤ６００が１．０を超えるまで３０℃で一晩増殖させた。５ｍｌ容量のＳＧ−ＣＡＡを次に約０．５のＯＤ６００まで接種し、３〜４のＯＤ６００まで一晩増殖させた。酵母ポリペプチドライブラリーのスクリーニングのための詳細なプロトコルが記載されている（Ｂｏｄｅｒ及びＷｉｔｔｒｕｐ  ２０００）。簡潔には、３×１０８個の誘導された酵母細胞を、次にＦＡＣＳ緩衝液中で５０ｎＭの濃度のビオチン化ｈＬＢＤによって３７℃で１時間標識した。Ｃ末端のｃ−ｍｙｃエピトープタグの発現を検出するために、モノクローナル抗体９ｅ１０（１：１００の希釈で）を同じインキュベーションに同時に加えた。次に、酵母細胞を氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、２０００ｎＭの濃度の過剰の冷たい非ビオチン化ｈＬＢＤを含むＦＡＣＳ緩衝液に３７℃で２時間再懸濁した。細胞を洗浄し、二次抗体：Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）（１：５０）とコンジュゲートさせたストレプトアビジン、及びＦＩＴＣ（１：５０）とコンジュゲートさせたヤギ抗マウス抗体で１時間標識した。野生型レプチンと比較して、可溶性ｈＬＢＤへの向上した結合を有するクローンを単離するために、細胞を洗浄し、Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩＩセルソーターで、酵母について２色フローサイトメトリー選別によってスクリーニングした。収集した酵母細胞を培養し、発現を誘導した。各選別間の再増殖及び表面発現の再誘導で、フローサイトメトリーによる３回の選別を実行した。初回の選別の間に合計約１×１０７個の細胞を検査し、集団の約５％を収集した。第２回目の選別の後、０．５〜１％のストリンジェンシーで１．６×１０５個の細胞を収集し、第３回目のスクリーニングの後、０．１％のストリンジェンシーで５０００個の細胞を収集した。プロトコル（Ｃｈａｏら  ２００６）に従って、各ライブラリーを冷凍し、−８０℃で保存した。
【００８７】
ＤＮＡ単離及び配列決定−  ３回の選別の後、収集した細胞を選択培地プレートで平板培養して、個別クローンを単離した。製造業者のプロトコルに従ってＺｙｍｏｐｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、４０個の個別クローンからのＤＮＡを抽出した。ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換することによって、ＤＮＡを増幅した。１００μｇ／ｍｌアンピシリンを追加した選択的ＬＢプレートで、細胞を平板培養した。これらのプレートからのコロニーは、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを足したＬＢ培地で３７℃で一晩増殖させ、Ｑｉａｇｅｎミニプレップキットを製造業者の説明書に従って用いてＤＮＡを単離し、ＤＮＡを配列決定した。
【００８８】
３回目のスクリーニングサイクルの後に選択された酵母クローンでの可溶性ヒトレプチン受容体（ｈＬＢＤ）に対する親和性の測定−  ３回目のスクリーニングの後の個別酵母細胞クローン及びｗｔマウスレプチンを増殖させ、誘導した。前記のように抗ｃ−ｍｙｃ  Ａｂ及び二次蛍光Ａｂと一緒に異なる濃度（１０００、３３３、１１１、３７、１２、４、１．３７ｎＭ）のビオチン化ｈＬＢＤを用いて、１×１０６個の細胞を標識した。ｃ−ｍｙｃ陽性の酵母の蛍光データは、Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを用いて得られた。解離定数Ｋｄを計算するために、試験したビオチン化ｈＬＢＤ濃度の各々で得られた平均蛍光強度（ＭＦＩ）を次にｈＬＢＤ濃度に対してプロットし、双曲線方程式と非線形回帰（曲線適合度）を用いて、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｐｒｉｓｍａ、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（商標）バージョン４．０：ＧｒａｐｈＰＡＤ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって分析した。
【００８９】
マウスレプチン突然変異タンパク質をコードする細菌性発現プラスミドの調製−  ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位をそれぞれ５’−及び３’−末端に導入し、ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで線状化したｐＭＯＮ３４０１ベクターへの最高の突然変異体マウスレプチン結合剤ＤＮＡの以降のサブクローニングを可能にするために、ＰＣＲを実行した。用いたプライマーは、レプチン突然変異体の５’末端についてはＡＡＡＡＡＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＴＣＣＧＡＴＣＣＡＧＡＡＡＧ（配列番号９）、３’末端についてはＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＴＴＣＡＧＣＡＴＴＣＣＧＧＡＧＡＡＡＣＧＴＣＣ（配列番号１０）であった。ｐＣＴ３０２のマウスレプチン突然変異タンパク質のｃＤＮＡをＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、抽出し、線状化ｐＭｏｎ３４０１発現ベクターに連結した。大腸菌ＭＯＮ１０５コンピテント細胞を新しい発現プラスミドで形質転換し、プラスミド選択のための７５μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天プレートに平板培養した。４つの大腸菌コロニーが単離され、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素による消化によってマウスレプチンｃＤＮＡを含むことが確認された。コロニーの全ては陽性であり、それらの１つを配列決定した。
【００９０】
マウスレプチン突然変異タンパク質へのＬ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａ突然変異の挿入−  レプチンアンタゴニストを作製するためにレプチンに突然変異を挿入する手法は、本明細書で完全に開示されているかのように参照により完全に本明細書に組み込まれる、国際出願ＰＣＴ／ＩＬ２００５／００１２５０に開示される。アンタゴニスト活性を有するレプチン突然変異体を調製するために、６つの選択されたマウスレプチン突然変異タンパク質（上のセクションを参照）をコードするｐＭｏｎ３４０１発現プラスミドを出発物質として用いた。２つの相補プライマー（表１）を用い、製造業者の説明書に従ってＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ突然変異生成キット（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）でレプチン挿入断片を改変した。プライマーは、それぞれの突然変異を得るが、適当なアミノ酸配列をなお保存するように塩基変化（太字で印される）を含むように、及びコロニースクリーニングのために特定の制限部位（下線が引かれる）を改変するように設計された。この手法は、Ｐｆｕポリメラーゼを用いる１８回のＰＣＲサイクルを含んでいた。鋳型を消化して、合成されたＤＮＡを含む突然変異を選択するために、メチル化及び半メチル化ＤＮＡ（標的配列：５’−Ｇｍ６ＡＴＣ−３’）に特異的であるＤｐｎＩ制限酵素で突然変異した構築物を次に消化した。ＸＬ−１コンピテント細胞を突然変異プラスミドで形質転換し、５ｍｌのＬＢ培地で増殖させ、プラスミドを単離した。特定の設計された制限部位を使用して各突然変異体の５つのコロニーが突然変異についてスクリーニングされ、少なくとも８０％の効率を現した。各突然変異体の２つのコロニーが配列決定され、突然変異を含むがヌクレオチドの望ましくない誤組込みを含まないことが確認された。Ｍｏｎ１０５コンピテント細胞を次にプラスミドで形質転換し、発現のために用いた。
【００９１】
マウスレプチンアンタゴニストをコードするプラスミドへのＤ２３突然変異体の挿入−  Ｄ２３Ａ、Ｄ２３Ｇ、Ｄ２３Ｌ、Ｄ２３Ｒ、Ｄ２３Ｋ、Ｄ２３Ｆ及びＤ２３Ｗ突然変異体が前の段落に記載される通りに調製され、マウスレプチンアンタゴニスト（ＭＬＡ）をコードするｐＭｏｎ３４０１発現プラスミドが出発物質として用いられた。プライマーの詳細は表１に掲載される。
【００９２】
マウスレプチン突然変異タンパク質の発現、リフォールディング及び精製−  Ｎ末端に追加のＭｅｔ−Ａｌａ（メチオニンは細菌によって切断される）を有する組換え型突然変異マウスレプチンを、ナリジキシン酸による誘導において、２．５Ｌの培養で発現させ、さらに４時間増殖させた。前に記載（Ｇｅｒｔｌｅｒら  １９９８、Ｓａｌｏｍｏｎら  ２００６）の通りに封入体（ＩＢ）を次に調製し、冷凍した。その後、０．３Ｌの細菌培養から得られた封入体（ＩＢ）を、５０ｍｌの４．５Ｍ尿素、１ｍＭのシステインを含む４０ｍＭトリス塩基に可溶化させた。溶液のｐＨをＮａＯＨで１１．３に調整した。４℃で２時間の撹拌の後、３容量の０．６７Ｍ  Ａｒｇを０．５Ｍの最終濃度まで加え、さらなる１．５時間撹拌した。次に、５回又は６回の外部溶液との交換で、その溶液を１０Ｌの１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ９に対して６０時間透析した。ＮａＣｌを１００ｍＭの最終濃度まで加え、次に１００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ９で前平衡化させたＱ−セファロースカラム（５ｍｌビーズ容量）に、タンパク質溶液を最大流速（４００〜５００ｍｌ／時間）で適用した。
【表１】
2013524807.tif 000002
それぞれのレプチン突然変異タンパク質を含んだ破過分画を収集し、２〜３ｍｇタンパク質／ｍｌに濃縮した。次に、３００ｍＭのＮａＣｌを含む２５ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ９で前平衡化させた調製用Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５カラム（２６／６０ｃｍ）に、１８ｍｌ分を適用した。分析的Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ＨＲ  １０／３０カラム（１／３０ｃｍ）でのゲル濾過によって判定されたモノマータンパク質を含む分画をプールし、４：１のタンパク質対塩比を確保するためにＮａＨＣＯ３に対して透析し、凍結乾燥した。
【００９３】
ヒトスーパーレプチンアンタゴニストの調製。改良されたマウスレプチンアンタゴニストを調製するために用いたものに類似した戦略を用いて、改良されたレプチン受容体結合を有するヒトレプチンアンタゴニストを調製した。用いたプライマーは、５’−ＣＡＡＴＴＧＴＣＡＣＣＡＧＧＡＴＴＡＡＴＣＴＧＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＣＧＣＡＧ（改変制限部位＝ＶｓｐＩ（＋））（配列番号２９）及び３’−ＣＴＧＣＧＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＣＡＧＡＴＴＡＡＴＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＡＴＴＧ（配列番号３０）であった。
【００９４】
マウス及びヒトのレプチンＤ２３Ｌ／Ｌ３９Ａ／Ｄ４０Ｌ／Ｆ４１Ａアンタゴニストの大規模精製−  手法は、以下の変更を伴うが前の段落で事実上記載された：３Ｌの細菌培養から得られたＩＢを、４００ｍｌの４．５Ｍ尿素、１ｍＭのシステインを含む４０ｍＭトリス塩基に可溶化させた。溶液のｐＨをＮａＯＨで１１．３に調整した。４℃で４８時間の撹拌の後、３容量の０．６７Ｍ  Ａｒｇを０．５Ｍの最終濃度まで加えた。次に、５回又は６回の外部溶液との交換で、その溶液を１０Ｌの１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ９に対して６０時間透析した。Ｑ−セファロースカラム（３０ｍｌビーズ容量）へのタンパク質の適用の前に、ＮａＣｌを１５０ｍＭまで加えた。調製用ゲル濾過とその後の透析及び凍結乾燥は、前記のように行われた。ＳＨＬＡと呼ばれるヒトレプチンスーパーアンタゴニスト（Ｄ２３Ｌ／Ｌ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａ）を、ヒトＬ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａ（ＨＬＡ）のための前記のプロトコルに従って調製した（Ｎｉｖ−Ｓｐｅｃｔｏｒら  ２００５）。
【００９５】
純度及び単量体含有量の測定−  Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０）に従い、還元及び非還元条件下で１５％ポリアクリルアミドゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥを実行した。ゲルは、クーマシーブリリアントブルーＲで染色した。ＴＮ緩衝液（２５ｍＭトリスＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）を用いて、Ｑセファロースカラム溶出分画の０．２ｍｌ分量により、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ＨＲ  １０／３０カラムでゲル濾過クロマトグラフィーを実行した。
【００９６】
ＳＭＬＡ及びＳＨＬＡのペグ化−  Ｎ末端アミノ基が優先的にペグ化される条件下で、ペグ化のためにｍＰＥＧ−プロピオニル−ＡＬＤ  ２０ｋＤａを用いた。１５０ｍｇのＳＭＬＡ又はＳＨＬＡを１１１ｍｌの０．１Ｍ酢酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ５）に溶解し、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して不溶物質を除去した。次に、０．２ＭのＮａＢＨ３ＣＮ（２．７ｍｌ）を加え、溶解したタンパク質を１５ｍｌの１ｍＭ  ＨＣｌに溶解させた１．５ｇのｍＰＥＧ−プロピオニル−ＡＬＤ  ２０ｋＤａとコンジュゲートさせた。４℃で２０時間の撹拌後に、１６０μｌの酢酸（１７Ｍ）を加えた。溶液を数秒間撹拌し、１ＬのｄｄＨ２Ｏで希釈し、１０ｍＭ酢酸Ｎａ、ｐＨ４で前平衡化させたＳＰセファロースカラム（２０ｍｌのビーズ容量）に最大流速（４００〜５００ｍｌ／時間）で適用した。カラムは４００ｍｌの１０ｍＭ酢酸Ｎａ、ｐＨ４で次に洗浄し、ペグ化タンパク質を５０及び７５ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭ酢酸Ｎａ、ｐＨ５で溶出させた。分析的Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（１０／３０ｃｍ）でのゲル濾過によって判定されたペグ化タンパク質を含む分画をプールし、２：１のタンパク質対塩比を確保するためにＮａＨＣＯ３に対して透析し、凍結乾燥した。タンパク質濃度は、ＳＭＬＡのために０．２００ｍｇ／ｍｌ及びＳＨＬＡのために０．８８７の吸光係数（ペグ化タンパク質の０．１％溶液のための）を用いて、２８０ｎｍでの吸光度によって判定した。それらの値は、ペグ化生成物のタンパク質部分に適用される。
【００９７】
結合アッセイ−  ビオチン化マウスレプチンは全ての競合実験でリガンドとして役目を果たし、それぞれのマウスレプチン又はマウス若しくはヒトのレプチンアンタゴニスト突然変異タンパク質は、競合者として役目を果たした。ｈＬＢＤは、受容体供給源として用いられた。ポリスチレン９６穴マイクロタイタープレートは、ＰＢＳｐＨ７．４中の４０ｐＭのｈＬＢＤの１００μｌによって４℃で一晩コーティングした。ウェルは、次にＰＢＳＴ（０．０５％ツイーン２０を含むＰＢＳ）で１回洗浄し、３％スキムミルクを含むＰＢＳで室温で２時間ブロックした。全てのさらなるインキュベーションは、室温で実行した。ウェルはＰＢＳＴで１回洗浄し、異なる濃度の非標識レプチン（５０μｌ／ウェル）と３０分間インキュベートし、次に５０μｌの６２．５ｐＭのビオチン化マウスレプチンをさらに２時間各ウェルに加えた。次に、ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、１％ツイーン２０を含むＰＢＳ中の１：３０，０００のストレプトアビジン−ＨＲＰと１時間インキュベートした。その後、ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、反応は、製造業者の説明書に従ってＴＭＢを用いて、マイクロプレートリーダーＥＬＩＳＡ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ  ＥＬｘ８０８−Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｉｎｃ．（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ、ＵＳＡ）によって４５０ｎｍで定量化した。
【００９８】
ＢＡＦ／３増殖アッセイ−  前記（Ｎｉｖ−Ｓｐｅｃｔｏｒら  ２００５、Ｓａｌｏｍｏｎら  ２００６）の通り、レプチン及びレプチン突然変異タンパク質のアゴニスト活性及びアンタゴニスト活性の両方を推定するために、長形のｈＬＥＰＲで安定してトランスフェクトされたレプチン感受性ＢＡＦ／３細胞の増殖速度を用いた。アンタゴニスト活性を判定するために、０．０５ｎｇのＷＴ相同的レプチンを、異なる濃度の突然変異タンパク質も含む各ウェルに加えた。レプチンのないウェル（陰性対照）での平均吸光度をブランク値として用い、他の吸光度値から引いて吸光度補正値を出した。陰性対照を引いた後のＷＴレプチンを有するウェルでの平均吸光度は、阻止百分率を計算するための陽性対照として用いられた。Ｐｒｉｓｍａ（４．０）非線形回帰Ｓ字１部位競合プログラム（Ｐｒｉｓｍａ、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（商標）バージョン４．０；ＧｒａｐｈＰＡＤ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて阻止曲線を描き、ＩＣ５０値を計算した。全ての哺乳動物のレプチンは、ほとんど同一の程度でヒトレプチン受容体を活性化させることが可能であることが指摘されるべきである（Ｇｅｒｔｌｅｒら  １９９８、Ｒａｖｅｒら  ２０００、Ｎｉｖ−Ｓｐｅｃｔｏｒ  ２００５）。
【００９９】
ルシフェラーゼレポーター遺伝子を活性化することによる生物的活性の測定−  Ｍ．Ｅｉｎａｔ博士（ＡＲＯ、Ｉｓｒａｅｌ）から受け取ったＨ−４９細胞系は、前記（Ｇｅｒｔｌｅｒら  ２００７）の通りに４：４：１の比の３つの構築物：ｐｈＯＢ−Ｒｂ（長形のヒトレプチン受容体）、ｐＡＨ３２（ルシフェラーゼリポーター構築物）及びｐｇｋＰｕｒｏ（ピューロマイシン抵抗性遺伝子を含む発現ベクター）によって安定してトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞である。Ｈ−４９細胞をトリプシンで短時間に解離し、１０％ＦＣＳ、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０単位／ｍｌのペニシリン及び２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを追加したＤＭＥＭに再懸濁させた。再懸濁させた細胞を、５００μｌの最終容量で、１ウェルにつき５×１０５個の細胞で２４穴組織培養プレートに平板培養した。１６時間後、各ウェルの培地を３００μｌのＤＭＥＭと交換した。ＷＴマウスレプチンの濃度を一定にして、マウスレプチン突然変異体を異なる濃度で加えた。希釈溶液は、０．５％ＢＳＡを追加したＤＭＥＭで作製した。各濃度のために３反復を用い、レプチン無しの３連は陰性対照としての役目を果たした。３７℃（ＣＯ２／Ｏ２  ５：９５）で１８時間のインキュベーションの後、細胞を１００μｌの溶解緩衝液で収集し、−８０℃で冷凍した。各細胞溶解物（５０μｌ）をＰｒｏｍｅｇａルシフェラーゼ検定用試薬と混合し、ルシフェラーゼ活性を測定した。測定された発光は、各ウェルのタンパク質の量に標準化した。タンパク質濃度は、製造業者のプロトコル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｉｓｒａｅｌ）に従ってＢｒａｄｆｏｒｄアッセイで測定した。結果は、非線形回帰１部位競合曲線によってＰｒｉｚｍソフトウェアで分析した。
【０１００】
ＳＴＡＴ−３リン酸化阻害−  長形のマウスレプチン受容体（ＯｂＲｂ）を安定して発現するＣＨＯ細胞を２４穴プレートで８０％集密まで増殖させ、次に無血清培地で１６時間増殖させてからホルモンで刺激した。次に、様々な濃度（０．２〜１２．８μｇ／ｍｌ）のマウスレプチン突然変異体及び１濃度のマウスレプチンＷＴ（０．１μｇ／ｍｌ）の存在下又は不在下で、２４ウェルプレート中の０．５ｍｌで細胞を無血清培地で２０分間インキュベートした。これらの処理の後、細胞を７５μｌの氷冷溶解緩衝液で収集した。溶解物を１０分間の１２０００ｒｐｍでの遠心によって清澄化し、上清をウェスタンブロット分析のために保存した。上清のタンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて測定した。細胞タンパク質（２０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分解し、その後ｐ−ＳＴＡＴ−３（Ｔｙｒ７０５）（カタログ＃９１３８）及びＳＴＡＴ−３（カタログ＃９１３２）抗体を用いるウェスタンブロットを実行した。次に、ウェスタンブロットのバンドを強化化学発光（ＥＣＬ）によって露わにした。
【０１０１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験−  雌Ｃ５７Ｂ１マウスに、ペグ化されたマウス若しくはヒトのレプチンアンタゴニスト（ＰＥＧ−ＭＬＡ又はＰＥＧ−ＨＬＡ）又は超活性ＰＥＧ−ＭＬＡ（ＰＥＧ−ＳＭＬＡ）又はヒト超活性ＰＥＧ−ＨＬＡ（ＰＥＧ−ＳＨＬＡ）を６．２５ｍｇ／ｋｇ／日で２０日間腹腔内に投与した。この期間中に、食物摂取及び体重増大を毎日記録し、７日間で平均した。２０日目に、各群の３匹のマウスを屠殺し、脂肪分、肝酵素及びリンパ球亜集団を測定した。実験の離脱部分では、２０日後に処置を中止し、レプチン欠乏表現型の可逆性を記録した。ＰＥＧ−ＭＬＡ又はＰＥＧ−ＳＭＬＡのいずれかの４つの用量：２０、６．７、２．２及び０．７２ｍｇ／ｋｇ／日を用いて第二の実験を同様の方法で実行し、１７日間継続された。全ての実験で、Ｔｅｌ  Ａｖｉｖ  Ｓｏｕｒａｓｋｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒの施設内動物管理当局（ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ａｎｉｍａｌ  ａｎｄ  ｃａｒｅ  ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）の規則に従って、動物は１２時間明暗周期の下で維持された。
【０１０２】
（例１）
可溶性ヒトレプチン受容体への向上した結合を有するレプチン突然変異体のスクリーニング。
（ｉ）酵母細胞の表面でのレプチンの機能的発現。マウスレプチンは、酵母表面のＡｇａ２ｐアグルチニンサブユニットへの融合体として、酵母細胞の表面で発現された（Ｂｏｄｅｒ及びＷｉｔｔｒｕｐ  ＫＤ、１９９７）。酵母表面でのＡｇａ２ｐ＋レプチン融合体の発現は、フローサイトメトリーにより、Ａｇａ２ｐ＋レプチン融合体のＣ末端に結合したｃ−ｍｙｃエピトープタグの免疫蛍光標識で測定され、ｃ−ｍｙｃのインフレーム発現を示した（図２Ａ）。ｃ−ｍｙｃタグの存在は、ビオチン化ｈＬＢＤと相互作用することが可能な完全長レプチン融合体が、酵母細胞表面に提示されることを示す。（図２Ｂ）、一方、無関係なＥＧＦＲを提示している陰性対照酵母は、いかなるシグナルも示さなかった（図示せず）。さらに、２色標識は、ｃ−ｍｙｃエピトープの提示とのｈＬＢＤ結合の強い相関を実証した（図２Ｃ）。
【表２】
2013524807.tif 000003
【０１０３】
（ｉｉ）ｈＬＢＤへの向上した結合を有するクローンを選択するためにレプチンライブラリーをスクリーニングする。多様な５×１０５個のクローンを有する、酵母によって提示されるレプチン突然変異体のライブラリーは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ（登録商標）ランダム突然変異生成キットを用いて構築された。ｈＬＢＤへの向上した結合を有するクローンを単離するために、このライブラリーはフローサイトメトリーによる３回の選別によってスクリーニングされ、各選別サイクルの間には、再増殖及び表面発現の再誘導が起きた。酵母ライブラリーは、レプチン（Ｃ末端のｃ−ｍｙｃエピトープタグの間接免疫蛍光法で測定される）を提示し、且つビオチン化ｈＬＢＤに結合したクローンについて、２色フローサイトメトリーでスクリーニングされた。スクリーニング手法は、蛍光標識ｈＬＢＤで飽和まで酵母を標識し、その後過剰な非蛍光ｈＬＢＤ競合者の存在下でインキュベートすることによって、動態学的結合スクリーニングを用いた。選別ウインドウの設定及びライブラリー濃縮の進行の確認を支援するために、標識野生型対照培養を各選別サイクルで調製した。非ビオチン化ｈＬＢＤを競合によって除いた後に、蛍光を示した細胞を、再増殖のために収集した（図３、右パネルを参照）。３回目の選択サイクルで得られた４０の突然変異体を配列決定し（表２）、その結果、１３の新しい異なる配列が同定され、１アミノ酸変化から６アミノ酸変化にまで及ぶ、合計２３箇所のアミノ酸変化があった（表２）。４０個のクローン中１８で起こった最も高い頻度の突然変異は、Ｇ、Ｈ又はＮへのＤ２３の交換であった。
【０１０４】
（ｉｉｉ）平衡結合滴定曲線を用いる親和性測定。表面提示マウスレプチン突然変異体のおよその親和性は、様々な濃度のビオチン化ｈＬＢＤで全細胞を滴定することによって、細胞壁上でｉｎ  ｓｉｔｕで測定された。平衡結合は、フローサイトメトリーによって１３つの異なるクローン（表２で特定される）で細胞結合ｈＬＢＤ及びｃ−ｍｙｃ陽性を分析することで測定された。これらのデータの非線形回帰（曲線適合度）は、図４Ａ〜Ｂ並びに表３及び４（それぞれ図４Ａ及び４Ｂに由来する）で示すように、１３のレプチン突然変異体中７つ（Ｈ３０、Ｈ１５、Ｈ２２、Ｈ１２、Ｈ１６、Ｈ１９及びＨ７）で最高約２．３倍増大した親和性を示す。それらの７つのマウスレプチン突然変異体は、大腸菌で発現されるそれぞれ突然変異したレプチンの調製のために選択された。
【表３】
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【表４】
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【０１０５】
（例２）
マウスレプチン及びマウスレプチンアンタゴニストの６つのそれぞれの突然変異体の調製及び特徴付。
酵母表面提示スクリーニング（上記及び表５を参照）によって選択されたマウスレプチンの７つの突然変異体を大腸菌で発現させ、リフォールディングさせ、連続陰イオン交換並びに材料及び方法のセクションに記載のゲル濾過クロマトグラフィーによって組換え型タンパク質として精製した。最初の実験のように、Ｈ７突然変異体は親和性の増大を示さず、対応するＬ３９Ａ／Ｌ４０Ａ／Ｆ４１Ａ突然変異体は調製されなかった。それぞれの６つのマウスレプチンアンタゴニスト（ＭＬＡ）を得るために、全ての６つの突然変異体もＬ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａ突然変異と挿入され、それぞれ精製された。全ての１３個のタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて純度について試験され、９９％を超える純度であると見出され、それらの単量体含有量は９５％を超えた（図示せず）。
【０１０６】
親和性及び生物的活性の変化の測定。全ての１３個の組換え型突然変異タンパク質（７つのアゴニスト及び６つのアンタゴニスト）は、固定化ｈＬＢＤへの結合によって結合特性の最終的な変化について、並びにＢＡＦ／３細胞増殖アッセイを用いて、及び材料及び方法のセクションに記載のＨ−４９細胞でのルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性化によってそれらのそれぞれのアゴニスト又はアンタゴニスト活性について試験された。
【表５】
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表６に示すように、最も強力な突然変異タンパク質は、突然変異Ｄ２３Ｈを抱えるクローンＨ３０に由来した。しかし、高い活性は、表３に示すようにＧｌｙに突然変異したＤ２３を全て有し、さらなる突然変異も有する、クローンＨ１５、Ｈ１６及びＨ１９に由来するタンパク質でも見出された。対照的に、クローンＨ１２に由来するタンパク質は、親和性及び生物活性の増大を示さなかった。Ｄ２３突然変異を欠くがただ１つの突然変異（Ｔ１２Ｉ）を有するクローンＨ２２に由来する１つのタンパク質だけが、親和性及び生物活性（後者はアンタゴニストだけで見出された）の中程度の増大を示した。
【０１０７】
Ｄ２３のそれに対してＴ１２Ｉ突然変異が相加効果を有することができるかどうか調べるために、ＭＬＡの３つの二重突然変異体（Ｔ１２Ｉ／Ｄ２３Ｈ、Ｔ１２Ｉ／Ｄ２３Ｒ及びＴ１２Ｉ／Ｄ２３Ｌ）を調製したが、ＢＡＦ／３バイオアッセイでのそれらの阻害活性もｈＬＢＤに対するそれらの結合親和性も、それぞれＤ２３Ｈ又はＤ２３Ｒ又はＤ２３ＬのＭＬＡのそれより優れることはなかった（図示せず）。興味深いことに、アゴニスト及びアンタゴニストの結合特性の変化が高度に同等だったのに対して、生物的活性はアンタゴニストだけで上昇した。
【０１０８】
（例３）
７つの変異体へのＭＬＡのＤ２３の合理的な突然変異生成。
Ｄ２３Ｈ突然変異だけがＭＬＡの生物的活性の最大増大に十分であったことを示す前の結果（上記参照）を考慮して、Ｄ２３が小さい（Ｇ、Ａ）か、疎水性である（Ｌ、Ｆ、Ｗ）か、正荷電した（Ｋ、Ｒ）アミノ酸によって置換された合計７つの突然変異プラスミドを材料及び方法に記載の合理的な突然変異生成によって調製した。
【表６】
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全ての７つの突然変異体を連続したリフォールディング、透析、陰イオン交換及びゲル濾過クロマトグラフィーによって組換え型タンパク質として精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純粋であること、及び９８％を超える単量体を含むことが見出された（図５Ａ〜Ｃ、６Ａ及び６Ｈ）。全てのそれらの突然変異体は、ｈＬＢＤに対する結合親和性及びＢＡＦ／３増殖アッセイでのそれらの生物的阻害能力について試験された。表７に要約される結果は、Ｄ２３Ｌ突然変異が最も高い活性をもたらしたことを示す。したがって、この突然変異体を大規模実験で調製し、ペグ化して、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験で用いることが決定された。
【表７】
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【０１０９】
マウスレプチンＤ２３Ｌ／Ｌ３９Ａ／Ｄ４０Ｌ／Ｆ４１Ａアンタゴニストの大規模な精製及びペグ化。透析前の４．５Ｍ尿素でのリフォールディングを２時間から４８時間に長くすること（材料及び方法を参照）は、Ｄ２３Ｌ／Ｌ３９Ａ／Ｄ４０Ｌ／Ｆ４１Ａマウスレプチンアンタゴニストの単量体分画の収率を劇的に向上させ、３Ｌの発酵混合物に対応するＩＢから精製されるタンパク質の最終収量は４００から５００ｍｇの間であった。超活性ＭＬＡ（ＳＭＬＡ）として設計されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって９９％を超える純度であり、９５％を超える単量体を含んでいた（図５Ａ〜Ｃ及び６Ａのそれぞれの突然変異体を参照）。ｈＬＢＤに対するその結合親和性は６４倍増大し、ＢＡＦ／３又はＨ−４９細胞バイオアッセイでのそのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生物的活性は、１３．９倍及び１３．４倍増大した（表７並びに図７Ａ及び７Ｃを参照）。ＭＬＡ及びＳＭＬＡの比較生物的活性を半定量的ＳＴＡＴ３リン酸化バイオアッセイでさらに試験し、それによって、後者の少なくとも５倍高い活性が示された（図８Ａ〜Ｂ）。ＭＬＡのペグ化のために前に記載した方法によって実行されたこのタンパク質のペグ化は、４００ｍｇの非ペグ化ＳＭＬＡからの５５から７５ｍｇのペグ化タンパク質のより低い収率をもたらした。
【０１１０】
ＰＥＧ−ＳＭＬＡの最終調製物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ基準により純粋であり、約９％の二重ペグ化ＳＭＬＡ、８５％の一ペグ化ＳＭＬＡ及び１％未満の非ペグ化ＳＭＬＡを含んでいた（図９Ａ〜Ｂ）。しかし、図７Ｂ及び７Ｄの代表的実験で示すように、Ｈ−４９細胞での生物的活性及びペグ化ＳＭＬＡのｈＬＢＤに対する親和性は、非ペグ化ＳＭＬＡと比較してそれぞれ９倍及び６．２倍低減された。それらの変化は、図７Ａ及び７Ｃ（それぞれ７及び６．３）並びに我々の最近の刊行物（Ｅｌｉｎａｖら  ２００９ｂ）に示すＭＬＡのペグ化効果と同等であった。
【０１１１】
（例４）
マウスでの体重増大実験。
ＳＭＬＡのｉｎ  ｖｉｖｏ活性の評価のために、６．２５ｍｇ／ｋｇのビヒクル、ペグ化ＭＬＡ又はペグ化ＳＭＬＡを、７週齢雌Ｃ５７ｂｌマウスへ腹腔内に投与した。図１０で表されるように、及び前に公表されたように（Ｅｌｉｎａｖら、２００９）、対照マウスは安定した体重（９９％±０．５）を維持し、ＰＥＧ−ＭＬＡは、５日目までに統計的に有意であって、１２１％±１．４のレベルに到達し、処置の８日後に安定した、有意な体重増大を誘導した。比較すると、ＰＥＧ−ＳＭＬＡは、１７日目に１４３．４％±３．１５（平均±ＳＥＭ）のピークに達し、その後安定した体重増大を誘導した。ＰＥＧ−ＭＬＡとＰＥＧ−ＳＭＬＡの間の体重増大の差は、６日目以降に統計的に有意であった。体重増大は、ペグ化ＭＬＡ（３．１７±０．５６ｇ／日／マウス）及び対照マウス（２．５４±０．１４ｇ／日／マウス、Ｐ＜０．０１）と比較して、ペグ化ＳＭＬＡ処置マウス（４．０２±０．１７ｇ／日／マウス）で有意に高かった摂食量の差によって媒介された。実験全体で、マウスはストレスの肉眼的徴候もなく、健康で活動的に見えた。２０日目に、各群３匹のマウスを屠殺した。各群の残りのマウスを処置から外し、体重増大の解消を監視した。次の１７日以内に（図１０）、マウス体重は大幅に低下した。ＰＥＧ−ＭＬＡ及びＰＥＧ−ＳＭＬＡの用量関連比較を目的にしたさらなる実験では、両方のタンパク質のいくつかの日用量（２０、６．７、２．２及び０．７３ｍｇ／ｋｇ）を比較した。結果を図１１に提供する。全ての４つの濃度で、ＰＥＧ−ＳＭＬＡによって誘導された体重増大は、ＰＥＧ−ＭＬＡのそれぞれの効果より有意に高かった。最大のほとんど同一の効果（４５％増）が、２０及び６．７ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ−ＳＭＬＡによって得られた。２．２ｍｇ／日のＰＥＧ−ＳＭＬＡでは、効果はより低かったが、２０ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ−ＭＬＡよりも優れ、前者の少なくとも１０倍高い効力を示した。興味深いことに、最高１１日で、両方の処置は同等の結果を与えたが、その後ＰＥＧ−ＭＬＡの効果は横ばいになり、一方ＰＥＧ−ＳＭＬＡで処置されたマウスは、１６日目に差が有意に（Ｐ＜０．０５）なるまで体重を増やし続けた。７〜１１日目に、ＰＥＧ−ＳＭＬＡの最も低い用量（０．７２ｍｇ／ｋｇ）は２０ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ−ＭＬＡより有意に小さい体重増大を誘導したが、１５日目及び１６日目に同じ値に到達した。ＰＥＧ−ＳＭＬＡの実際の効力がＰＥＧ−ＭＬＡのそれより最高２７倍高いことをこれは示す。
【表８】
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【０１１２】
表８に示すように、体重増大と食物摂取量の間に強力な相関があった。対照的に、水分摂取量には差がほとんどなく、渇き調節経路ではなく食欲に対するレプチンアンタゴニストの特異的作用が確認された。
【０１１３】
（例５）
レプチン受容体に対して増大した親和性を有するヒト及びヒツジのレプチンアンタゴニスト（ＨＬＡ）の調製及び特徴付。
Ｄ２３Ｌ突然変異がレプチン受容体へのレプチンアンタゴニストの親和性を、及びＭＬＡだけでなく類似したレプチンアンタゴニストでの以降の生物的活性を増大させることを検証するために、対応する突然変異体（Ｄ２３Ｌ／Ｌ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａ）を合理的な突然変異生成によって調製し、大腸菌で大規模に発現させ、均一に精製し、ＳＨＬＡ（ヒト）又はＳＯＬＡ（ヒツジ）と名付けた。精製したタンパク質は、還元及び非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で純粋であり、ゲル濾過実験では９８％を超える単量体として出現した（図示せず）。ｉｎ  ｖｉｖｏ実験のためにＳＨＬＡ及びＳＯＬＡの使用を促進するために、それらをＳＭＬＡ（上記参照）と同様にペグ化し、それぞれＰＥＧ−ＳＨＬＡ及びＰＥＧ−ＳＯＬＡと名付けた。ＭＬＡ、ＳＭＬＡ及びそれらのペグ化誘導体のために前に記載した方法に従って、ＳＨＬＡ、ＰＥＧ−ＳＨＬＡ、ＳＯＬＡ及びＰＥＧ−ＳＯＬＡを結合及び阻害活性について試験した（ヒトタンパク質については図１２を参照；ヒツジのタンパク質の結果は図示せず）。示すように（図１２Ａ）、ＳＭＬＡ及びＳＨＬＡは、ＨＬＡのそれより９倍を超えて高かった同一の生物的活性を示した。この結果はさらなる実験で検証され、活性の類似した相対的増大がＰＥＧ−ＳＨＬＡ対ＰＥＧ−ＨＬＡでも観察された（図１２Ｂ）。図１２Ｃ及び図１２Ｄは、Ｄ２３Ｌ突然変異による生物的活性の増大は、固定化ｈＬＢＤへの親和性の劇的な（４４倍及び８０倍）増大に由来することを示す。
【０１１４】
マウスでの予備的ｉｎ  ｖｉｖｏ体重増大実験（１２．５ｍｇ／ｋｇ／日、２週間継続）では、ＰＥＧ−ＭＬＡ及びＰＥＧ−ＨＬＡが比較され、両方とも同じ体重増大効果を示した（図示せず）。したがって、Ｄ２３Ｌ突然変異の効果を検証するために、類似した比較ｉｎ  ｖｉｖｏ実験をＰＥＧ−ＳＨＬＡ及びＰＥＧ−ＳＭＬＡで実行した。結果は図１３Ａ〜Ｂで提示され、両物質が類似した体重増大効果を示したことを示す。
【０１１５】
（例６）
超活性レプチンアンタゴニストは、浸入する単核食細胞の阻害によって自然炎症からの保護を誘導する。
ＰＥＧ−ＳＭＬＡ（２０ｍｇ／ｋｇ）又はＰＥＧ−レプチン（０．４ｍｇ／ｋｇ）を、雌Ｃ５７ｂｌマウスへ腹腔内に４日間投与した。これの後に、リポ多糖（１０μｇ／ｋｇ）及びＤ−ガラクトースアミン（６００ｍｇ／ｋｇ）の投与を通した自然肝炎の誘導が続き、これは、単核食細胞による浸入及びＴＮＦ−ａ分泌を通した自然免疫応答の活性化によって誘導される肝炎の誘導のための公知のモデルである。図１５Ａに表されているように、ＰＥＧ−レプチンの投与は、ビヒクル処置マウスと比較して有意に高まった死亡率をもたらした。対照的に、ＰＥＧ−ＳＭＬＡの投与は、マウスの向上した生存として現れたかなりの保護をもたらした。
【０１１６】
レプチン拮抗作用のエフェクターに対する効果を試験するために、浸入マクロファージ（図１５Ｂ）、肝ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１−Ｆ４／８０＋浸入（図１５Ｂ、ゲートＰ４）及びレジデント（図１５Ｂ、ゲートＰ５）マクロファージ集団の集団を、ビヒクル、レプチンアンタゴニスト及びレプチンアゴニスト処置マウスで試験した。図１５Ｂの下のパネルに見られるように、レプチンアンタゴニストによって媒介される保護効果には、ビヒクル処置されたマウスと比較して、炎症によって誘発される肝臓浸入マクロファージ集団の劇的な減少が付随した。逆表現型がＰＥＧ−レプチン処置マウスで示され、そこにおいて、肝臓へのマクロファージ浸入はビヒクル処置マウスと比較してレプチンアゴニスト処置マウスで強かった。
【０１１７】
重要なことに、自然炎症（図１５Ｂ、上のパネル）の誘導前の定常状態でさえ、超活性レプチンアンタゴニスト処置マウスでの浸入マクロファージの減少は、未処置のマウスと比較して実質的に小さかった。レプチンアゴニスト処置マウスでの定常状態でも逆表現型が見られ、それは、既に定常状態の間の拡張したマクロファージ浸入を特徴とした。
【０１１８】
結局、これらの結果は、炎症器官への単核マクロファージ浸入の阻害によって媒介される、自然免疫介在性炎症での超活性レプチンアンタゴニストのかなりの保護効果を実証する。
【０１１９】
（例７）
マウスでのインスリン抵抗性及び糖尿病ＩＩ型モデル。
ペグ化レプチンアンタゴニスト（ＰＥＧ−ＭＬＡ）、さらに強くは（ＰＥＧ−ＳＭＬＡ）は、雄及び雌の両方のマウスで非常に強力な食欲促進作用を誘導し、主に脂肪蓄積に由来する非常に速い（４０〜５０％までの）体重増大につながった（図１３Ａ）。ＰＥＧ−ＭＬＡ又はＰＥＧ−ＳＭＬＡの注射を中止すると、この体重増大を反転させることができた。さらなる実験では、２１日の間ＰＥＧ−ＭＬＡ（２０ｍｇ／ｋｇ／日）を注射された雄マウス（ｎ＝１６）は、インスリン抵抗性を徐々に発達させ、対照と比較したインスリンレベル及びホメオスタシスモデル評価（ＨＯＭＡ）スコアの差は有意であった（ｐ＜０．０５）。ＨＯＭＡはインスリン抵抗性及びβ細胞機能を定量化するために用いられる方法である。より長い期間の実験（最高６０日）では、血糖、血中トリグリセリド及び総コレステロールの有意な増大も観察された−糖尿病前症メタボリックシンドロームの出現の指標。しかし、血中肝酵素のレベルによって明示されるように、最高２カ月の処置は肝傷害に至らなかった。
【０１２０】
短期代謝実験では、代謝チャンバーへ順化させた雄マウスは、朝にＰＥＧ−ＳＭＬＡ（５ｍｇ／ｋｇ／日）又はビヒクルのいずれかの皮下注射を受けた。これらの注射を２４時間後に繰り返し、最初の注射から始めて２回目の注射の２４時間後に終了するまで４８時間、マウスを代謝チャンバーで研究した。第２の２４時間周期の末までには、ＳＭＬＡを受けたマウスはビヒクルを受けたマウスより３ｇ重く（ｐ＜０．０５）、体脂肪量の保存と一致するＲＱの増大（ｐ＜０．０５）及び活性の低下（ｐ＜０．０５）を有した。
【０１２１】
結論として、高血糖、高脂血症及びインスリン抵抗性と関連するこの可逆的なレプチンアンタゴニストによって誘発される肥満は、マウスの真性糖尿病２型の迅速可逆的モデルの役目を果たすことができる。そのようなモデルは、ＰＥＧ−ＳＭＬＡの注射によって、又はＳＭＬＡをコードするＤＮＡ配列を条件付きで発現するトランスジェニックマウスの作製によって達成することができる。
【０１２２】
トランスジェニックマウスの生成方法は周知の事項であり、本発明のトランスジェニックマウスを生成するために任意の適当な方法を選択することができ、例えば以下のステップに従う：
【０１２３】
マイクロインジェクション又はエレクトロポレーションのためのＤＮＡ調製
１）ＤＮＡ消化物をアガロースゲルで分離する：操作が完了すると、ゲルをかなり低い濃度のＥｔＢｒで染色する。染色を終了すると、長波ＵＶを用いてゲルを可視化し、対象のバンドを切断する。
２）ＤＮＡ断片は、例えばＧｅｎｅＣｌｅａｎスピンカラム（ＢＩＯ  １０１のＧｅｎｅＣｌｅａｎ  Ｓｐｉｎｋｉｔ）を用いて精製する
３）ＤＮＡを沈殿させ、適当な溶媒に再懸濁させる。
【０１２４】
前核注射：
１）注射のための卵生成：注射のために大量の卵（＞２５０）を得るために、連続した妊馬血清（ＰＭＳ）及びヒトコリオゴナドトロピン（ＨＣＧ）ホルモン注射を用いて、性的に未熟なＦＶＢ／Ｎ雌を過剰排卵させる。ＨＣＧ注射の後、雌を直ちに種畜雄と交尾させる。
２）卵を収集する：その翌日、交尾させた雌の輸卵管の膨大部から卵を収集する。卵をヒアルロニダーゼで処理してナース細胞を切り離し、次に洗浄する。
３）卵に注射する：注射のために３０〜５０個の卵を一度にインキュベーターから取り出す。各卵に、高倍率下でその日のＤＮＡ断片を個別に注射する。その群の各卵に注射すると、全ての卵をインキュベーターに戻す。全ての卵に注射するまで、この手順を繰り返す。注射期間の終わりに、注射を生き延びなかった卵は各群から除去する。
４）卵を着床させる：注射された卵を１０〜１５匹の群で、偽妊娠雌（精管切除雄と交尾させた雌）の輸卵管の両側に次に着床させる。加温板の上で動物を麻酔から回復させ、動物室に次に戻す。それらは、妊娠期間中無菌条件下で飼育される。
【０１２５】
ゲノムサザンブロット分析のための尾部ＤＮＡプレップ：
１）尾部クリップの消化：約５０〜１００ｍｇの尾部を切断してエッペンドルフ管に入れ、プロテアーゼで消化する。
２）フェノール／クロロホルムでＤＮＡを単離し、エタノールで洗い流す。
３）適当な制限酵素でＤＮＡを切断して、サザンブロットを実施する。
【０１２６】
交配プロトコル
１）マウスの年齢を判定する：最低交配年齢：雄：３５〜４２日；雌：２１日。最初の交配のための最高年齢：雄及び雌：６カ月。
２）交配するために、雌を雄のケージに入れる。この順序を逆にすると、雄が雌を殺傷する（又は、稀に雌が雄を殺傷する）可能性がある。雌を雄のケージに入れることができない場合、清潔なケージを用い、先ず雄をケージに置く。予想される交配の１週前にこれを行うことができるならば、これは雄がそのテリトリーに印を付け、フェロモンレベルが上昇することを可能にし、このことは交配過程の助けとなる。
【０１２７】
上記のプロトコルは、例である。他の例、及びさらなる詳細は、例えば本明細書に完全に組み込まれる「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｈａｎｄｂｏｏｋ、第２版（Ｃａｒｌ  Ａ．Ｐｉｎｋｅｒｔ編、Ｇｕｌｆ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２００２）で見出される。
【０１２８】
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【図２Ａ】
2013524807.tif 000010
【図２Ｂ】
2013524807.tif 000011
【図２Ｃ】
2013524807.tif 000012
【図３Ａ】
2013524807.tif 000013
【図３Ｂ】
2013524807.tif 000014
【図５Ａ】
2013524807.tif 000015
【図５Ｂ】
2013524807.tif 000016
【図５Ｃ】
2013524807.tif 000017
【図８Ｂ】
2013524807.tif 000018
【図９Ａ】
2013524807.tif 000019
【図１４】
2013524807.tif 000020
【図１】
2013524807.tif 000021
【図４Ａ】
2013524807.tif 000022
【図４Ｂ】
2013524807.tif 000023
【図６Ａ】
2013524807.tif 000024
【図６Ｂ】
2013524807.tif 000025
【図６Ｃ】
2013524807.tif 000026
【図６Ｄ】
2013524807.tif 000027
【図６Ｅ】
2013524807.tif 000028
【図６Ｆ】
2013524807.tif 000029
【図６Ｇ】
2013524807.tif 000030
【図６Ｈ】
2013524807.tif 000031
【図７Ａ】
2013524807.tif 000032
【図７Ｂ】
2013524807.tif 000033
【図７Ｃ】
2013524807.tif 000034
【図７Ｄ】
2013524807.tif 000035
【図８Ａ】
2013524807.tif 000036
【図９Ｂ】
2013524807.tif 000037
【図１０】
2013524807.tif 000038
【図１１】
2013524807.tif 000039
【図１２Ａ】
2013524807.tif 000040
【図１２Ｂ】
2013524807.tif 000041
【図１２Ｃ】
2013524807.tif 000042
【図１２Ｄ】
2013524807.tif 000043
【図１３Ａ】
2013524807.tif 000044
【図１３Ｂ】
2013524807.tif 000045
【図１５Ａ】
2013524807.tif 000046
【図１５Ｂ】
2013524807.tif 000047
【配列表】
2013524807000001.app
【国際調査報告】
2013524807.tif 000048
2013524807.tif 000049
2013524807.tif 000050