(57)【要約】  腫瘍阻害活性を有する哺乳動物の腫瘍細胞及び／又は癌細胞でコンディショニングされた基質製剤が開示される。いくつかの実施態様において、哺乳動物の腫瘍細胞及び／又は癌細胞でコンディショニングされた基質製剤は、実質的に細胞成分を有さない。これらの製剤は、コンディショニングされた異種の無細胞性膠原性組織製剤を含み、かつ哺乳動物の細胞外マトリックス基質を使用して製造されてよい。コンディショニングされた基質は、多くの異なる抗腫瘍生体分子及び／又は抗癌生体分子、例えば基質上で成長した哺乳動物の腫瘍細胞及び／又は癌細胞によって分泌及び／又は製造された抗腫瘍生体分子の集団を含み、従って本発明のコンディショニングされた基質に抗腫瘍性及び／又は抗癌性を付与することを含む。本発明は、哺乳動物の腫瘍細胞及び／又は癌細胞でコンディショニングされた基質を製造するための方法、並びに例えばワクチン又は傷の包帯で、腫瘍成長を阻害するための製剤を使用する方法を開示する。記載されたコンディショニングされた基質で前立腺腫瘍及び黒色腫を阻害する方法も記載される。コンディショニングされた哺乳動物の腫瘍細胞及び／又は癌細胞の基質製剤は、実質的に、生存可能な及び／又は発現性の又は侵襲性の腫瘍細胞及び／又は癌細胞を有さない。コンディショニングされた基質及び基質製剤は、癌の治療のための製剤及び調合物において使用されてよい抗腫瘍特性及び抗癌特性を含む。
2013544760.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンディショニングされた異種の無細胞性膠原性材料基質と、抗腫瘍性生体分子、抗癌性生体分子、又は抗腫瘍性生体分子及び抗癌性生体分子の組合せとを含む腫瘍阻害性のコンディショニングされた製剤であって、腫瘍細胞及び／又は癌細胞が、前記基質上での該細胞の成長に適した条件下で、前記製剤上で培養されている、腫瘍阻害性のコンディショニングされた製剤。
【請求項２】
前記腫瘍細胞及び／又は癌細胞が、前立腺腫瘍細胞である、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記腫瘍細胞及び／又は癌細胞が、黒色腫細胞である、請求項１に記載の製剤。
【請求項４】
前記前立腺腫瘍細胞が、ヒト前立腺細胞である、請求項２に記載の製剤。
【請求項５】
前記基質が、細胞外マトリックスである、請求項１に記載の製剤。
【請求項６】
前記基質が、実質的に、腫瘍細胞及び／又は癌細胞を有さない、請求項１に記載の製剤。
【請求項７】
以下、
請求項１に記載の腫瘍阻害性のコンディショニングされた製剤を製造すること、
該製剤を腫瘍細胞又は癌性細胞の成長が取り除かれた患者の部位に適用すること、及び
該部位で腫瘍の再成長を阻害すること
を含む、患者において腫瘍の再成長を阻害するための方法。
【請求項８】
さらに、前記製剤を加工して、該製剤の細胞外成分に分解せずに細胞材料を取り出す工程を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記加工工程が、化合物での処理を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記加工工程が、超音波処理を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記加工工程が、前記製剤を凍結し、そして該製剤を融解することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記腫瘍細胞又は癌性細胞の成長が、前立腺の哺乳動物腫瘍細胞を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記腫瘍細胞又は癌性細胞の成長が、黒色腫の哺乳動物細胞を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の腫瘍阻害性のコンディショニングされた製剤を含むワクチン。
【請求項１５】
請求項１に記載の腫瘍阻害性のコンディショニングされた製剤を含む腫瘍の傷の包帯材料。
【請求項１６】
製剤学的に認容性のキャリヤー中に、粒状の形で、請求項１に記載の基質を含む、ワクチンとして患者への皮下投与に適した注射可能な製剤。
【請求項１７】
以下、
腫瘍及び／又は癌の哺乳動物細胞を、該細胞の培養に適した基質上で、該基質上での細胞の成長に適した時間及び条件下で培養して、コンディショニングされた基質を提供すること、及び
該コンディショニングされた基質を加工して、前記培養物から細胞成分を取り出すこと
を含む腫瘍及び／又は癌でコンディショニングされた細胞外マトリックス基質を製造する方法。
【請求項１８】
前記腫瘍及び／又は癌の哺乳動物細胞が、ヒト前立腺腫瘍細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記腫瘍及び／又は癌の哺乳動物細胞が、黒色腫癌細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記基質が、細胞外マトリックスである、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
共同研究契約の言明
３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ． 第１．７１（ｇ）章（１）に則って、本発明において、請求された発明は、ノートルダム大学及びＣｏｏｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｉｎｃ． （Ｗｅｓｔ Ｌａｆａｙｅｔｔｅ， Ｉｎｄｉａｎａ）によって、又はノートルダム大学及びＣｏｏｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．の代理として、請求された発明を作成した日で、又はその前に、及びＪｏｉｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｇｒｅｅｍｅｎｔの範囲内で取られた活動の結果として、実施された、３５ 米国Ｃ． １０３ （ｃ） （３）において定義されたＪｏｉｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｇｒｅｅｍｅｎｔに準じて作成される。
【０００２】
本発明は、一般に、ワクチンの分野に、及びより特に抗腫瘍性ワクチン及び抗癌性ワクチン並びに抗腫瘍性生体材料及び／又は抗癌性生体材料を含む材料に関する。本発明は、ワクチン製剤において有用なコンディショニングされた基質（例えば細胞外マトリックス（ＥＣＭ））を提供するための腫瘍細胞及び／又は癌細胞に曝されている基質材料も提供する。
【０００３】
背景技術
治療及び予防の癌ワクチンには多くの関心がある。種々の方法が試験されている。例えば、全細胞に由来するワクチンは、多数の抗原を有することが試験され及び見出されており、かついくらかの成功を収めたことが報告されている。組織ワクチンは、腫瘍を有する個体から直接採取した腫瘍材料に由来し、かつ新生細胞に関連する抗原だけでなく、腫瘍結合組織及び細胞外マトリックスに関連する抗原の一覧も含む。
【０００４】
豚の小腸の粘膜下組織に由来する細胞外マトリックス材料から構成される、頭字語ＳＩＳによって公知の材料は、組織の足場として有用な材料として記載されている（Ｃｏｏｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．， Ｗｅｓｔ Ｌａｆａｙｅｔｔｅ， Ｉｎｄｉａｎａ）。
【０００５】
他の背景によって、種々の細胞外マトリックス材料は、医療移植、細胞培養、及び他の関連する適用における使用のために提案されている。例えば、小腸、胃又は膀胱の組織に由来する粘膜下組織を含む医療移植材料及び細胞培養材料が提案されている（例えば、米国特許番号第４，９０２，５０８号、第４，９５６，１７８号、第５，２８１，４２２号、第５，５５４，３８９号、第６，０９９，５６７号及び第６，２０６，９３１号を参照）。さらに、Ｃｏｏｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．（Ｗｅｓｔ Ｌａｆａｙｅｔｔｅ， Ｉｎｄｉａｎａ）は、現在、商標名ＳＵＲＧＩＳＩＳ（登録商標）、ＳＴＲＡＴＡＳＩＳ（登録商標）及びＯＡＳＩＳ（登録商標）での小腸の粘膜下組織を基礎とする種々の医療生成物を製造している。
【０００６】
肝臓基底膜に由来する医療材料は、例えば米国特許番号第６，３７９，７１０号においても提案されている。さらに、羊膜に由来するＥＣＭ材料（例えば米国特許番号第４，３６１，５５２号及び第６，５７６，６１８号を参照）及び副腎膜に由来するＥＣＭ材料（例えばＷＯ００３００２１６５号を参照）が、医療適用及び／又は細胞培養適用のために提案されている。
【０００７】
ある研究者は、小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）材料が、有用な組織の足場材料を作成する改良された生体適合性を有することを報告している（Ｗｏｏｄｓ， ｅｔ ａｌ．， （２００４）， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， ２５ （３）：５１５−５２５．）。Ｗｏｏｄｓにおいて、ＳＩＳ（ＨＵＶＥＣ）上で培養されたヒト臍静脈内皮細胞にヒト基底膜タンパク質を沈着させて、"コンディショニングされた"ＳＩＳ（ｃ−ＳＩＳ）と呼ばれるものを製造することが仮定される。ｃ−ＳＩＳの表面特性は、ｃ−ＳＩＳ基質上でのヒト臍静脈内皮細胞の蒔き直しに対して、細胞が、天然のコンディショニングされていないＳＩＳ（ｎ−ＳＩＳ）基質上で培養されたＨＵＶＥＣ細胞と比較して、細胞間結合の高められた組織化、及び代謝活性における増加を呈する方法で、変更されることが仮定されていた。ｃ−ＳＩＳ上で培養されたＨＵＶＥＣ細胞は、ｎ−ＳＩＳ基質上で成長させたＨＵＶＥＣと比較して、培地中に少量の炎症誘発プロスタグランジンＰＧＩ2を放出することが報告されていた。これらの効果は、組織足場材料として改良された特性を有するＳＩＳを提供することを結論づけていた。
【０００８】
研究者の１つのグループは、非癌性、非腫瘍性の板鰓類の魚の免疫細胞（すなわち、板鰓類の魚（例えば、サメ、ガンギエイ、及びエイ）の胚生殖腺器官又はライディッヒの器官から得られた細胞）の培養物から製造されたコンディショニングされた細胞培養培地を記載しており、かつ抗腫瘍活性を証明するための培地を報告している（米国特許番号第７，３０９，５０１号）。非腫瘍性の、非癌性の魚の免疫細胞は、これらの培養物の培地中に放出された免疫物質を有すると記載されている。これらの製剤は、非腫瘍性の、非癌性の魚の免疫細胞以外の細胞の使用を記載していない。さらに、これらの製剤は、細胞外マトリックス上での細胞の成長を含まず、又は関連しない。
【０００９】
癌細胞は、フィブリノゲンを沈着すると記載されている。フィブリノゲンは、腫瘍間質においてフィブリンに変換されない。腫瘍の微小環境は、分泌された可溶性因子、固体材料及び腫瘍細胞のアマルガムから構成される。分泌された可溶性因子は、ケモカイン、例えばＣＸＣＲ−４及びＣＸＣＬ−２、マトリックス改変酵素、例えばマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、プロテアーゼ阻害剤、及び成長因子（例えば、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ））を含み、これらの全ては周囲ＥＣＭにおいて貯蔵され、及び要求される場合に腫瘍細胞によって（ＥＣＭのプロテアーゼ媒介分解によって）放出される。間質マトリックス及び基底膜から構成される周囲ＥＣＭ自体は、悪性癌細胞の足場及び遊走において危険である非細胞固体材料を構成する（Ａｌｐｈｏｎｓｏ， ｅｔ ａｌ． （２００９）， Ｎｅｏｐｌａｓｉａ， １１ ： １２６４−１２７１）。
【００１０】
癌細胞は、腫瘍に関連するＥＣＭを再建するプロテアーゼ（例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ、エラスターゼ、カテプシン−Ｌ）を製造すると記載されている（Ｓｕｎｄ， ｅｔ ａｌ， （２００９）， Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．， ２８： １７７−１８３）。この再建は、ＥＣＭ中で分離された物質、並びにＥＣＭタンパク質、例えばコラーゲン及びプロテオグリカンからの生物活性開裂フラグメントの放出を導く。腫瘍ＥＣＭ中に放出されてよい分離された物質は、さらに腫瘍進行に影響するＶＥＧＦを含む。癌細胞は、可溶性因子の放出によって、及び細胞−マトリックス相互作用によって微小環境でも相互作用する。分泌物又は副生成物の例は、カドヘリン（ｃａｄｈｅｒｅｉｎ）、インテグリン、サイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ及びＴＧＦ−β）を含む。さらに、分泌された分子は、エンドセリン、プラスミン及びｕＰＡを含む（Ｚｉｇｒｉｎｏ， ｅｔ ａｌ． （２００５）， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ， ８７：３２１−３２８）。
【００１１】
ヒトの乳癌細胞は、ＥＣＭ中にフィブリノゲンを合成、分泌及び沈着することが示されている（Ｒｙｂａｒ［［ｄ］］ｃｚｙｋ， ｅｔ ａｌ． （２０００）， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ６０： ２０３３−２０３９）。前立腺癌細胞は、特に、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ及びＴＮＦ−αを分泌することが報告されている（Ｋａｍｉｎｓｋｉ， ｅｔ ａｌ． （２００６）， Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ． Ｔｈｅｒ． Ｔａｒｇｅｔｓ， １４， ７７−９４）。これらの生成物及び種々のタイプの癌細胞によって合成された他の生成物は、癌細胞の成長／拡散に寄与することが記載されている。しかしながら、腫瘍細胞／癌細胞の分泌物及び／又は副生成物が、任意の抗腫瘍活性及び／又は抗癌活性を示すかどうかは知られていないままである。
【００１２】
改良された抗癌性製剤／抗腫瘍性製剤は医療技術において存在し続ける必要がある。特に、腫瘍及び／又は癌の阻害活性を有する実質的に細胞を有さない（無細胞である）改良された製剤は、改良された抗癌性及び抗腫瘍性の医薬品及びワクチンについて追求され続けている。癌及び腫瘍の成長の処理及び封じ込めのための改良された道具は、開発されないままであり、かつ新たな世代のワクチンの見込みが存在する。
【００１３】
発明の要約
本発明は、多くの他の技術において前記の要求を満たす。本発明の種々の実施態様は、コンディショニングされた異種の無細胞性膠原性材料基質と、抗腫瘍性生体分子、抗癌性生体分子又は抗腫瘍性生体分子及び抗癌性生体分子の組合せとを含む腫瘍阻害性のコンディショニングされた製剤に関し、その際腫瘍細胞及び／又は癌細胞は、該基質上で該細胞の成長に適した条件下で、該製剤上で培養される。前記腫瘍細胞及び／又は癌細胞は、黒色腫細胞又は前立腺腫瘍細胞等を含んでよい。ある実施態様において、前記前立腺腫瘍細胞は、ヒト前立腺細胞である。本発明のいくつかの実施態様において、前記基質は、細胞外マトリックスである。他において、前記基質は、実質的に、腫瘍細胞及び／又は癌細胞を有さない。
【００１４】
本発明の他の実施態様において、本発明の腫瘍を阻害するコンディショニングされた製剤を製造すること、該製剤を腫瘍又は癌性細胞の成長が取り除かれた患者の部位に適用すること、及び該部位で腫瘍の再成長を阻害することを含む、患者において腫瘍の再成長を阻害するための方法が提供される。本発明のある実施態様において、前記方法は、さらに、製剤を加工して、製剤のコラーゲン成分に分解せずに細胞材料を取り出す工程を含む。この加工工程は、製剤を化学化合物で処理すること、超音波処理すること又は凍結すること、並びに製剤を融解すること等を含んでよい。
【００１５】
本発明のある実施態様は、本発明の腫瘍阻害性のコンディショニングされた製剤を含むワクチンに関する。
【００１６】
他の実施態様において、本発明の腫瘍阻害性のコンディショニングされた製剤を含む腫瘍傷の包帯材料を提供する。
【００１７】
本発明のさらに他の実施態様は、製剤学的に認容性のキャリヤー中に、粒状の形で、本発明の基質を含む、ワクチンとして患者に対する皮下投与に適した注射可能な製剤を提供する。
【００１８】
本発明の他の実施態様は、腫瘍及び癌の哺乳動物細胞を、該細胞の培養に適した基質上で、該基質に対して細胞の成長に適した時間及び条件下で培養して、コンディショニングされた基質を提供すること、及び該コンディショニングされた基質を加工して、該培養液から細胞成分を取り出すことを含む腫瘍及び／又は癌でコンディショニングされた細胞外マトリックス基質を製造する方法に関する。
【００１９】
本発明は、添付の図に関して次の本発明の種々の実施態様の詳細な説明を考慮してより完全に理解されてよい。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＳＩＳ上で成長した腫瘍細胞を示す組織の顕微鏡写真を示す図。
【図２】ＳＩＳ（図１において示されている）上で成長した腫瘍細胞が、本発明の一実施態様に従って、チオシアン酸カリウム処理によって取り出されたことを例証する組織の顕微鏡写真を示す図。
【図３】コンディショニングされた細胞外マトリックス（ＥＣＭ）培地による腫瘍の再成長の減少を証明する棒グラフを示す図。
【図４】外科的な腫瘍減量術後の黒色腫の再成長を証明する棒グラフを示す図。
【図５】動物を、培地（ＭＥＭ）、グルタルアルデヒドで固定した腫瘍細胞から製造されたワクチン（ＧＦＴ）、又はＳＩＳ上で成長し、そしてチオシアン酸カリウムで溶解させた腫瘍細胞から構成されるワクチン（ＴＣ／ＥＣＭ）でワクチン接種した研究を要約する棒グラフを示す図。
【００２１】
図１は、ＳＩＳ上で成長した腫瘍細胞を示す組織の顕微鏡写真であり、その際細胞外マトリックス材料は、本発明の一実施態様に従って、豚の小腸の粘膜下組織に由来する。
【００２２】
図２は、ＳＩＳ（図１において示されている）上で成長した腫瘍細胞が、本発明の一実施態様に従って、チオシアン酸カリウム処理によって取り出されたことを例証する組織の顕微鏡写真である。
【００２３】
図３は、コンディショニングされた細胞外マトリックス（ＥＣＭ）培地による腫瘍の再成長の減少を証明する棒グラフである。腫瘍が切除され、かつコンディショニングされた培地が投与された後に、腫瘍を再成長に関して監視した。棒は、未処理のＳＩＳ（ＳＩＳ）、チオシアン酸カリウムで処理されたＳＩＳ（ＳＩＳ／Ｌ）、腫瘍細胞が成長しており、かつグルタルアルデヒドで固定されたＳＩＳ（ＳＩＳ／ＧＦＴ）、及び腫瘍が成長しており、かつチオシアン酸カリウムで溶解させたＳＩＳ（ＳＩＳ／Ｃ／Ｌ）を示す。結果は、ＳＩＳ／ＧＦＴ及びＳＩＳ／Ｃ／Ｌの双方のワクチン接種が、腫瘍サイズにおける有意な（Ｐ＜０．０５）減少を促したことを示す。ラットにワクチン接種したＳＩＳ／ＧＦＴ及びＳＩＳ／Ｃ／Ｌについての腫瘍サイズの有意差はなかった（Ｐ＜０．０５）。
【００２４】
図４は、外科的な腫瘍減量術後の黒色腫の再成長を証明する棒グラフである。対照のマウスはＭＥＭを投与し、かつ大きな腫瘍が急速に再成長した。対照的に、黒色腫の再成長に対する保護免疫を刺激したＧＦＴ又はＴＣ／ＥＣＭでワクチン接種したことを示す、ＧＦＴワクチン又はＴＣ／ＥＣＭ（ＳＩＳ／細胞／ＰＴＥ）ワクチンでワクチン接種したマウスにおける腫瘍サイズにおける有意な（Ｐ＜０．００５）減少があった。ＧＦＴ又はＴＣ／ＥＣＭでワクチン接種した群間の腫瘍サイズにおける統計的な有意差はなかった。
【００２５】
図５は、動物を、培地（ＭＥＭ）、グルタルアルデヒドで固定した腫瘍細胞から製造されたワクチン（ＧＦＴ）、又はＳＩＳ上で成長し、そしてチオシアン酸カリウムで溶解させた腫瘍細胞から構成されるワクチン（ＴＣ／ＥＣＭ）でワクチン接種した研究を要約する棒グラフである。動物を接種の２１時間後に安楽死させ、そして腫瘍を検量した。結果は、対照と比較して、ＧＦＴで処理した動物における抗腫瘍性免疫を証明する。ＧＦＴワクチン接種した群におけるマウスの平均腫瘍質量は、ＭＥＭ群の平均腫瘍質量よりも著しく低く（Ｐ＜０．００５）、かつＴＣ／ＥＣＭワクチン接種した群の平均腫瘍質量よりも低かった（Ｐ＜０．０５）。ＴＣ／ＥＣＭワクチン接種した群におけるマウスの平均腫瘍質量は、ＭＥＭ対照群の平均腫瘍質量よりも著しく低かった（Ｐ＜０．０１）。
【００２６】
詳細な説明
本発明は、特有の抗腫瘍性及び／又は抗癌性のコンディショニングされた製剤、並びに効力のある腫瘍阻害性生体分子及び／又は癌阻害性生体分子と異種の無細胞性膠原性材料との組合せを含む材料を提供する。これらの腫瘍阻害性生体分子及び／又は癌阻害性生体分子は、さらに、特定の生体分子の群もしくは特定の生体分子の群の濃度、又は生理学的に検出可能な抗腫瘍性細胞活性及び／又は抗癌性細胞活性を証明する特定の抗腫瘍性生体分子及び／又は抗癌性生体分子の組合せ、濃度、又はその割合として記載されてよい。例えば、サイトカイン、例えばＶＥＧＦ及びＥＭＡＰ−ＩＩは、腫瘍によって変動量で製造されること、及び腫瘍新生血管に対する種々の効果を有することが報告されている。従って、本発明の腫瘍細胞及び／又は癌細胞でコンディショニングされた異種の無細胞性膠原性マトリックスが、生理学的環境で、例えば体内でもしくは体上で、又は特定の組織部位で提供及び／又は配置され、又は注入される場合に、抗腫瘍性細胞及び／又は抗癌性細胞でコンディショニングされた異種の無細胞性膠原性マトリックスは、組織及び／又は体の部位、又は細胞の特定の集団の微小環境と相互作用して、生理学的に証明できる腫瘍阻害、癌細胞阻害、並びに／又は観察可能な及び／又は定量可能な、腫瘍細胞／癌細胞の停滞反応（全くない及び／又は低減された、癌細胞及び／又は腫瘍細胞の成長又は複製）を顕在化することが構想される。これらの特性は、腫瘍及び／又は癌の成長が、サイズで、及び実質的に任意のｉｎ ｖｉｖｏ環境で、取り除かれ及び／又は低減されている（例えば、ワクチン製剤として動物中に注入される）、外科的部位での使用に適した本発明の製剤及び／又は調合物を提供し、その際腫瘍阻害性、癌細胞阻害性及び／又は癌細胞の停滞反応（全くない及び／又は低減された癌細胞及び／又は腫瘍の成長）が、患者の臨床的管理又は治療において所望され、又はそうでなければ要求される。
【００２７】
本明細書において記載されているような基質（例えば異種の、無細胞性膠原性基質材料）の抗腫瘍性生体分子及び／又は抗癌性生体分子でのコンディショニングは、基質材料内で及び／又は基質材料上で腫瘍細胞及び／又は癌細胞を阻害する生体分子の阻害の組合せ及び／又はその割合をもたらす。例えば、及びいくつかの実施態様において、異種の無細胞性膠原性材料基質上での及び該基質中での抗腫瘍性生体分子及び／又は抗癌性生体分子の分泌及び／又は放出は、腫瘍細胞又は癌細胞（例えば悪性黒色腫）の成長又は再成長を、コンディショニングされた材料／基質が置かれる部位でｉｎ ｖｉｖｏで阻害及び／又は阻止するために使用されてよい、コンディショニングされた抗腫瘍性材料及び／又は抗癌性材料を提供する。
【００２８】
従って、一般に及び全体的に、本発明は、抗腫瘍性及び／又は抗癌性のコンディショニングされた基質製剤を含む組成物を提供し、その際該基質は、例えば腫瘍細胞及び／又は癌細胞を基質上で培養することによって得られる１つ以上の抗腫瘍性細胞及び／又は抗癌性細胞の生体分子の沈着によってコンディショニングされる（"ｃ"）。一例として、基質は、さらにコンディショニングされた異種の無細胞性膠原性材料として記載されてよい。例えば、コンディショニングされた異種の無細胞性膠原性材料は、哺乳動物組織、例えば細胞外マトリックス（ＥＣＭ）組織から製造されてよい。腫瘍細胞及び／又は癌細胞でコンディショニングされた基質、並びにそれらから製造される材料は、いくつかの側面において、コンディショニングされた細胞外マトリックス材料として記載されてよく、その際腫瘍細胞及び／又は癌細胞は、細胞外マトリックス上に及び細胞外マトリックス中へ細胞の生体分子成分、副生成物、及び／又は他の抗癌性生体分子及び抗腫瘍性生体分子の補体を沈着し及び／又は分泌する。いくつかの実施態様において、基質／細胞外マトリックス材料は、実質的に生存可能な腫瘍細胞及び／又は癌細胞を有さないと記載されてよい。
【００２９】
他の側面において、患者における腫瘍成長を阻害するための方法は、腫瘍及び／又は癌の哺乳動物細胞でコンディショニングされた基質を含む組成物を患者に投与することを含み、その際該基質は、腫瘍細胞及び／又は癌細胞を、基質表面上で、腫瘍細胞及び／又は癌細胞の成長に適した条件下で培養することによってコンディショニングされる。コンディショニングされた基質は、それらの上に、哺乳動物の腫瘍組織及び／又は癌細胞の培養物から分泌及び／又は沈着された生体分子を沈着させる。一例として、生物活性材料は、フィブリノゲン、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ−α、エンドセリン、プラスミン又はｕＰＡの２種以上の組合せの抗癌又は抗腫瘍の有効量を含んでよいことが考えられている。
【００３０】
本発明の他の側面において、哺乳動物の腫瘍細胞及び／又は癌細胞でコンディショニングされた基質を含む組成物を製造する方法が提供される。
【００３１】
いくつかの実施態様において、哺乳動物の腫瘍組織は、哺乳動物の前立腺腫瘍組織もしくは前立腺腫瘍細胞、又は関心のある任意の他の腫瘍細胞又は細胞の集団を含む。特定の実施態様において、前立腺腫瘍組織は、外因性の前立腺腫瘍組織である。
【００３２】
いくつかの実施態様において、コンディショニングされた基質は、実質的に全体の腫瘍細胞及び／又は癌細胞を有さないように加工されているコンディショニングされた異種の無細胞性膠原性材料製剤、例えば細胞外マトリックスから製造された異種の無細胞性膠原性材料を含む。いくつかの実施態様において、腫瘍細胞及び／又は癌細胞は、プロセス、例えば洗浄、化学剤での処理、超音波処理、又は腫瘍細胞及び／又は癌細胞でコンディショニングされた基質の構造完全性を破壊しない及び／又は構造完全性に著しく影響せずに、コンディショニングされた基質／材料のコラーゲン種（例えばコラーゲンタイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶ）の完全性を維持する、他の適したプロセスによって、コンディショニングされた細胞外マトリックス材料から取り出されてよい。この状態において、加工された、コンディショニングされた基質マトリックスは、本記載内容において定義されるように、"脱細胞化された（ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ）"と記載されてよい。
【００３３】
いくつかの実施態様において、腫瘍及び／又は癌でコンディショニングされた基質材料、例えばコンディショニングされた異種の無細胞性膠原性材料は、生育不能な及び複製機能不全の基質上で存在する任意の腫瘍細胞及び／又は癌細胞を提供することが可能な作用剤で処理される。これは、一例としてチオシアン酸カリウム、グルタルアルデヒドを含む任意の種々の化学剤、あるいは当業者に公知のプロセス、例えば放射線、熱、超音波処理又は他の腫瘍細胞及び／又は癌細胞破壊プロセス（例えば凍結／破壊方法）を使用して得られてよい。さらに、コンディショニングされた基質材料のコラーゲン成分を破壊及び／又は著しく変性しない任意のプロセスが使用されてよい。
【００３４】
さらに他の実施態様において、本発明は、例えば、特に腫瘍及び／又は癌の成長が取り除かれている外科的部位での傷及び／又は手術部位の包帯として使用されてよいコンディショニングされた基質を提供する。例えば、腫瘍細胞及び癌細胞でコンディショニングされた基質材料、例えば腫瘍細胞及び／又は癌細胞を成長させる細胞外マトリックスから製造されたコンディショニングされた異種の無細胞性膠原性材料は、本記載内容において記載されているように加工されてよく、かつ腫瘍成長が取り除かれている患者に対して外科的部位を覆う又は治療するために使用されてよい。かかる実施態様において、コンディショニングされた基質は、腫瘍及び／又は癌の阻害特性を有する医療移植材料を提供する。種々の実施態様において、腫瘍再成長は、コンディショニングされた基質の使用によって阻害／予防される。
【００３５】
本発明の他の側面において、抗腫瘍性／抗癌性のコンディショニングされた基質は、表面を有する細胞外マトリックスを含み、かつ細胞外マトリックス材料の基質表面に対して非天然である腫瘍細胞及び／又は癌細胞から生じる生体分子である表面上で沈着されている（すなわち、細胞外マトリックス材料の源から保持されていることに対して、細胞外マトリックス材料の表面に付加されている）実質的に無細胞の、コンディショニングされた細胞外マトリックス基質を含むと記載されてよい。ある形で、本発明の複合材料は、実質的に、双方の腫瘍細胞及び／又は癌細胞並びに腫瘍細胞成分及び／又は癌細胞成分が欠けているが、しかし、基質上で培養されている間に腫瘍細胞／癌細胞によって分泌される抗癌性物質／抗腫瘍性物質を保持している。さらに、コンディショニングされた基質のコラーゲン成分は、実質的に保存される。
【００３６】
さらに他の実施態様において、コンディショニングされた基質の注射可能な製剤の形が提供される。いくつかの実施態様において、これらの抗腫瘍性基質／抗癌性基質の注射可能な形は、癌ワクチンとしての使用に適しているように調合されてよい。コンディショニングされた異種の無細胞性膠原性材料基質の粒状の製剤の無菌製剤が、かかる生成物型のための製剤学的に認容性のキャリヤーと共に調製されてよい。
【００３７】
本明細書において使用される専門用語は、特定の変法又は実施態様のみを記載する目的のためであり、かつ本発明の範囲を制限することを意図しない。特に定義されない限り、技術の全ての用語、表記及び他の科学的用語又は本明細書において使用される専門用語は、本発明に属する通常の当業者によって一般に理解されるものと同様の意味を有する。いくつかの場合において、一般に理解される意味を有する用語は、本明細書において、明確さのために及び／又は容易な参照のために定義され、かつ本明細書におけるかかる定義の包含は、一般に当業者に理解される実質的な差を示すと理解される必要はない。しかしながら、否定される場合に、定義を含む特許明細書が優位である。
【００３８】
特に明記されない限り、成分の量、特性、例えば分子量を示す全ての数、反応条件、及び明細書及び特許請求の範囲において使用されているものは、"約"の用語によって全ての例において修飾されていると解されるべきである。従って、特に明記されない限り、明細書及び付属の特許請求の範囲において記載されている数値パラメータは、本発明によって得られるために要求される所望の特性に依存して変動してよい近似値である。最後に、及び当量の教義の適用を特許請求の範囲まで制限せずに、それぞれの数値パラメータは、少なくとも、報告された有効数字の数を考えて、及び通常の丸め技術を適用することによって解釈されるべきである。
【００３９】
本発明の広い範囲を記載している数値範囲及びパラメータが近似値であるにもかかわらず、特定の実施例において記載されている数値は、できるだけ正確に報告されている。任意の数値範囲は、しかしながら、本質的に、必然的にそれらのそれぞれの試験測定において見出される標準偏差をもたらす一定の誤差を含む。
【００４０】
本発明の記載内容において（特に続く特許請求の範囲の記載ないようにおいて）使用されている"ａ"、"ａｎ"、"ｔｈｅ"及び同様の指示対象は、本明細書において特に明記されない限り、又は記載内容によって明らかに否定されない限り、単数及び複数を含むと解釈されるべきである。本発明における値の範囲の詳説は、個々に、範囲内で漸減するそれぞれの別々の値に関連する略記法として提供されることが単に意図される。特に明記されない限り、それぞれの個々の値は、本明細書において記載されている明細書中に組み込まれる。
【００４１】
本明細書において使用されるように、"無細胞"の用語は、生きている細胞を有さない、又は実質的に有さないことを意味する。
【００４２】
天然の状態で細胞を含む材料（例えば、天然の細胞を含むＥＣＭ材料）の記載に関する"脱細胞化"又は"脱細胞化された"の用語は、前記材料が、少なくとも約７０％の原細胞（生きている又は死んでいる）を取り除くために処理される、又は処理されていることを意味する。より有利には、少なくとも８０％、８５％又は９０％の細胞が取り除かれ、有利には９９％の細胞が本発明において含まれる脱細胞化プロセスにおいて取り除かれる。
【００４３】
本発明の目的のために、"異種の無細胞性膠原性材料"の用語は、少なくとも１つのコラーゲンタイプＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ及びＶ、成長因子、フィブロネクチン、糖タンパク質、グリコサミノグリカン及びラミンを含み、かつアジュバントとしての使用に適している無細胞性の膠原性材料として定義される。
【００４４】
本発明において使用されている"患者"の用語は、ヒト、及び他の高次動物、及び研究室モデル、例えばマウス及びラットを含む治療される被験体を言う。
【００４５】
"加工された"腫瘍及び／又は癌の哺乳動物細胞でコンディショニングされたマトリックス及び／又は材料は、腫瘍及び／又は癌の哺乳動物細胞が成長及び／又は培養され、続いて生育不能な及び複製機能不全の腫瘍細胞及び／又は癌細胞を提供するために処理されている基質、例えば異種の無細胞性膠原性組織製剤（本発明のいくつかの実施態様において、細胞外マトリックス成分を有する哺乳動物組織から製造されてよい）として定義される。コンディショニングされた異種の無細胞性膠原性組織製剤は、従って、"加工された"材料として記載されてよい。腫瘍細胞及び／又は癌細胞でコンディショニングされた基質及び／又はマトリックスは、細胞外マトリックス上に沈着した及び／又は分泌された生物学的に活性の分子及び代謝生成物を含む。
【００４６】
"実質的に細胞が欠けている"の用語は、細胞（生きている又は死んでいる）を有さない又は本質的に有さないことを意味する。実質的に細胞が欠けているＥＣＭ材料は、該材料が、被移植者、特に細胞が外因性又は異質遺伝子型である被移植者に移植される場合に、非免疫原性である十分に低いレベルでＥＣＭ材料を運搬する細胞を含むことを意図する。
【００４７】
本明細書において使用されているように、"腫瘍及び／又は癌の哺乳動物細胞でコンディショニングされたマトリックス"の用語は、細胞マトリックスであって、その上で腫瘍及び／又は癌の哺乳動物細胞が培養されている細胞マトリックスとして定義される。一例として、かかるマトリックスは、細胞外マトリックス材料を含む基質、例えばＳＩＳ基質を含んでよい。腫瘍及び／又は癌の哺乳動物細胞でコンディショニングされたマトリックスは、さらに、加工された及び／又は処理された腫瘍及び／又は癌の哺乳動物細胞でコンディショニングされたマトリックスとして定義される。
【００４８】
本発明における使用に適した基質材料は、ある形で血管由来の膠原性細胞外マトリックス材料を含む、制限されることなく生体栄養性又は再生可能性を有するものを含む、異種の無細胞性膠原性材料、例えば哺乳動物組織材料（例えばＥＣＭ材料）によって提供されうる。例えば、適した異種の膠原性材料は、ＥＣＭ材料、例えば粘膜下組織、副腎膜、皮膚コラーゲン（ヒトにおいて同種移植片として使用されうるヒトの死体から加工された皮膚コラーゲンを含む）、硬膜、心膜、大腿筋膜、漿膜、腹膜又は肝臓基底膜を含む基底膜層を含む。これらの目的のための例示的な粘膜下組織材料は、例えば、小腸粘膜下層、胃粘膜下組織、膀胱粘膜下組織層及び子宮粘膜下組織を含む腸粘膜下組織を含む。本発明の好ましい医療移植生成物は、粘膜下組織、例えば温血脊椎動物に由来する粘膜下組織を含む。哺乳動物の粘膜下組織材料が好ましい。特に、食肉又は他の生成物製造のために挙げられる動物（例えば豚、蓄牛又は羊）に由来する粘膜下組織材料の使用が有利である。豚の粘膜下組織は、本発明における使用のための特に好ましい材料を提供し、特に豚ＳＩＳ、より特に実質的にその天然の架橋を提供する豚の小腸粘膜下組織である。
【００４９】
粘膜下組織又は他のＥＣＭ基質材料は、例えば温血脊椎動物の消化管、呼吸器官、腸管、尿管又は生殖路に由来する粘膜下組織を含む、任意の適した器官又は他の生物学的構造に由来してよい。本発明において有用な粘膜下組織は、かかる組織源を採取すること、及び平滑筋層、粘膜層源及び／又は組織源において生じる他の層からの粘膜下組織を離層することによって得られる。本発明のある実施態様において有用な粘膜下組織及びその分離及び処理に関するさらなる情報に関しては、例えば米国特許番号第４，９０２，５０８号、第５，５５４，３８９号、第５，９９３，８４４号、第６，２０６，９３１号、及び第６，０９９，５６７号を参照でき、参照をもって本明細書に組み込まれたものとする。
【００５０】
本発明の粘膜下組織又は他のＥＣＭ材料は、任意の適した器官又は他の組織源、特に結合組織を含む源に由来してよい。本発明における使用のために加工されたＥＣＭ材料は、典型的に、最も一般に乾燥質量基準で少なくとも約８０質量％のコラーゲンから構成されている豊富なコラーゲンを含む。かかる天然由来のＥＣＭ材料は、ほとんどの部分について、無作為でなく指向された、例えば一般に単軸又は多軸であるが、しかし一様に指向された繊維として生じるコラーゲン繊維を含む。天然の生物活性因子を保持するために加工される場合に、ＥＣＭ材料は、コラーゲン繊維間、コラーゲン繊維上及び／又はコラーゲン繊維内の固体として散在したこれらの因子を保持することができる。本発明における使用のために特に所望される天然由来のＥＣＭ材料は、光顕微鏡検査下で容易に確かめられる顕著な量の散在した非膠原性固体を含む。かかる非膠原性固体は、例えば少なくとも約１質量％、少なくとも約３質量％、及び少なくとも約５質量％の、ある本発明の実施態様におけるＥＣＭ材料の乾燥質量の有意なパーセンテージを構成できる。
【００５１】
製造される及び使用されるために、基質又は他の粘膜下組織材料又は任意の他のＥＣＭ材料は、源組織に対して天然の成長因子又は他の生物活性成分を場合により保持する及び／又はそうでなければ含んでよい。例えば、粘膜下組織又は他のＥＣＭ材料は、１つ以上の成長因子、例えば塩基性繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−２）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、及び／又は血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を保持してよい。さらに、本発明のある実施態様において使用される粘膜下組織又は他のＥＣＭ材料は、他の生物学的材料、例えばヘパリン、ヘパリンスルフェート、ヒアルロン酸、フィブロネクチン等を保持又は含んでよい。従って、一般に言うと、粘膜下組織又は他のＥＣＭ材料は、直接又は間接的に、細胞応答、例えば細胞形態、増殖、成長、タンパク質又は遺伝子発現における変化を含む生物活性成分を保持する又はそうでなければ含んでよい。ある好ましい実施態様において、ＥＣＭ材料は、血管形成を促進する能力を呈する。
【００５２】
さらに、かかる天然生物活性成分の含有に加えて、又は該成分の含有の代わりとして、非天然生物活性成分、例えば組換え技術又は他の方法によって合成的に製造されたものは、粘膜下組織又は他のＥＣＭ材料中に導入されてよい。これらの非天然生物活性成分は、天然由来のタンパク質又はＥＣＭ材料において生じる天然のものに対応する組換えによって製造されたタンパク質であってよいが、しかしおそらく種々の種類（例えば、他の動物、例えば豚から膠原性ＥＣＭに適用されるヒトタンパク質）であってよい。非天然生物活性成分は、薬剤であってもよい。ＥＣＭ材料中に及び／又はＥＣＭ材料上に導入されてよい詳細な薬物は、例えば抗生物質及び／又は血栓促進物質、例えば血凝固因子（例えば、トロンビン、フィブリノゲン等）を含んでよい。これらの物質は、製造（例えば、適した抗生物質、例えばセファゾリンを含む溶液中で材料を浸漬することによる）直前に、又は患者内でのＥＣＭ材料の植え付け中もしくは植え付け後に、前製造工程としてＥＣＭ材料に適用されてよい。
【００５３】
本発明のある実施態様において使用される粘膜下組織又は他のＥＣＭ材料は、有利には、例えば米国特許番号第６，２０６，９３１号において記載されているように（参照をもって完全に本明細書に組み込まれたものとする）、高度に精製される。それ自体、ある好ましいＥＣＭ基質材料は、１グラム毎に約１２エンドトキシン単位（ＥＵ）未満、より有利には１グラム毎に約５ＥＵ未満、及び最も有利には１グラム毎に約１ＥＵ未満のエンドトキシンレベルを有する。さらに好ましくは、粘膜下組織又は他のＥＣＭ材料は、１グラム毎に約１コロニー形成単位（ＣＦＵ）未満、より有利には１グラム毎に約０．５ＣＦＵ未満の汚染微生物数を有してよい。菌レベルは、望ましくは同様に低く、例えば１グラム毎に約１ＣＦＵ未満、より有利には１グラム毎に約０．５ＣＦＵ未満である。核酸レベルは、有利には、約５μｇ／ｍｇ未満、より有利には約２μｇ／ｍｇ未満であり、かつウィルスレベルは、有利には１グラム毎に約５０プラーク形成単位（ＰＦＵ）未満、より有利には１グラム毎に約５ＰＦＵ未満である。本発明のある実施態様において使用されるＥＣＭ材料は、有利には、酸化剤、特に過酸（例えば過酢酸）で消毒される。米国特許番号第６，２０６，９３１号（参照をもって完全に本明細書に組み込まれたものとする）において教示されている粘膜下組織又は他のＥＣＭ材料のこれらの特徴及び追加の特徴は、本発明のある実施態様において使用される粘膜下組織の特徴であってよい。
【００５４】
出発ＥＣＭ材料は、場合により、例えば成長因子、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、核酸及び脂質を含む種々の生物活性又は他の非膠原性成分を含んでよい。前記材料のアルカリ物質での処理は、１種、複数又は全ての材料内で含まれるかかる非コラーゲン成分の量を減少してよい。ある実施態様において、アルカリ物質での調整された処理は、実質的に核酸及び脂質の、並びに潜在的に成長因子、糖タンパク質、グリコサミノグリカン及びプロテオグリカンが欠けている再建可能な膠原性材料を製造するために十分である。従って、本発明において記載されたようなアルカリ物質での処理は、その元の体積の少なくとも約２倍膨張した材料をもたらすことができ、材料の表面特性及び／又は多孔性を改変でき、かつある生物活性成分の材料を激減できる。いくつかの実施態様において、これは、そのままの膠原性シートとして材料を維持している間に得られ、その際該シートは、本明細書において記載されている、任意の種々の抗癌性製剤及び抗腫瘍性製剤、例えば癌ワクチン材料中でさらに加工されてよい。さらに、再建可能な膠原性材料、例えばＥＣＭシートを、アルカリ性培地で処理して、本明細書において記載されているように該材料を膨張できる一方で、該材料は、成長因子、例えばＦＧＦ−２、又はＥＣＭもしくは他の膠原性材料に関する源組織に対して天然である他の生物活性成分、例えばフィブロネクチン及び／又はヘパリンの量を維持する。
【００５５】
ある実施態様において、外因性又は内因性の１つ以上の生物活性成分、例えばアルカリ加工中に膨張した材料から取り出された同様のものが、材料に戻されてよい。例えば、膨張した材料は、核酸及び脂質を激減させているが、しかし成長因子、糖タンパク質、グリコサミノグリカン及び／又はプロテオグリカンで補充されている膠原性材料を含んでよい。これらの生物活性成分は、任意の適した方法によって材料に戻されてよい。例えばある形で、例えば米国特許番号第６，３７５，９８９号（参照をもって完全に本明細書に組み込まれたものとする）において議論されている、これらの成分を含む組織抽出物が製造され、かつ膨張した膠原性材料に適用されうる。一実施態様において、膨張した膠原性材料は、十分な時間、腫瘍及び／又は癌組織及び／又は癌細胞の製剤及び／又は培養物中でインキュベートされて、それらの中に含まれる生物活性成分を、膨張した膠原性材料と関連づけさせることができる。腫瘍及び／又は癌の組織及び／又は細胞の製剤は、例えば、患者が治療される、特定のタイプの腫瘍成長タイプ又は癌を有する患者の腫瘍組織から得られてよい。
【００５６】
生物活性成分を膨張した再建可能な膠原性材料に戻す又は導入するための他の方法は、当業者に公知の噴霧、含浸、浸漬等を含む。一例として、膨張した膠原性材料は、１つ以上の成長因子、例えば塩基性繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−２）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦベータ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、及び／又は骨化由来成長因子（ＣＤＧＦ）の添加によって改質されてよい。他の生物活性成分は、膨張した膠原性材料、例えばヘパリン、ヘパリンスルフェート、ヒアルロン酸、フィブロネクチン等に添加されてよい。従って、一般に言うと、膨張した膠原性材料は、直接又は間接的に、細胞応答、例えば細胞形態、増殖、成長、タンパク質又は遺伝子発現における変化を含む生物活性成分を関連づけた腫瘍細胞及び／又は癌細胞を含んでよい。
【００５７】
基質粘膜下組織抽出物の調製は、米国特許番号第６，３７５，９８９号において記載されており、参照をもって完全に本明細書に組み込まれたものとする。簡単に、粘膜下組織抽出物は、抽出賦形剤、例えば尿、グアニジン、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム又は界面活性剤を粘膜下組織に添加して、該組織から生物活性成分を単離することによって製造されうる。そして生物化生成分は、抽出賦形剤から分離される。好ましい一実施態様において、粘膜下組織抽出物は、粘膜下組織とリン酸緩衝溶液（例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ））とを混合することによって製造される。この混合物は、緩衝液循環としてスラリー中に加工され、かつ物理的圧力が適用される。組織に存在する生物活性成分は溶液中に入れられ、続いてスラリーから単離される。生物活性粘膜下組織抽出物は、さらに、当業者に認識されている方法（例えば透析及び／又はクロマトグラフィー技術）を使用してスラリーから溶液中で抽出された生物活性成分を分離することによって形成される。有利には、抽出溶液を透析して、抽出賦形剤の濃度を減少又は取り出して、抽出された生物活性成分の溶液を提供する。粘膜下組織の任意の源が、粘膜下組織抽出物を製造するために使用されうる。さらに、同様の抽出技術を、他の再建可能なＥＣＭ材料に適用して、本発明において使用するための生物学的活性抽出物を提供することができる。
【００５８】
天然の腫瘍及び／又は癌細胞及び／又は癌組織の生物活性成分、例えば粘膜下組織又は他のＥＣＭ抽出物において提供されるものの含有に加えて、又は該成分の含有の代わりとして、組換え技術又は他の方法によって合成的に製造されたものを含む生物活性成分を分泌する非天然の腫瘍及び／又は癌の細胞／組織を、膨張した再建可能な膠原性材料中に導入してよい。これらの生物活性成分を分泌する非天然腫瘍及び／又は癌の細胞／組織は、天然由来のタンパク質又は組み換えて製造されたタンパク質であってよく、かつ同様又は異なる種（例えば、他の動物、例えば豚から膠原性ＥＣＭに適用されるタンパク質を分泌するヒトの腫瘍及び／又は癌の細胞／組織）に対応してよい。生物活性成分を分泌する非天然の腫瘍及び／又は癌の細胞／組織に加えて、腫瘍及び／又は癌でコンディショニングされた基質は、薬物を含んでもよいことが考えられる。本発明において使用される腫瘍細胞及び／又は癌細胞でコンディショニングされた基質材料中に及び／又は該基質材料上に導入されてよい詳細な薬物は、例えば抗生物質、血栓促進物質、例えば血凝固因子、例えば、トロンビン、フィブリノゲン等を含む。前記の腫瘍及び／又は癌の細胞及び／又は組織の生物活性成分と同様に、これらの物質は、前製造工程として膨張した再建可能な膠原性材料に、製造（例えば、適した抗生物質、例えばセファゾリンを含む溶液中で材料を浸漬することによる）直前に、又は患者における材料の植え付け中もしくは植え付け後に、適用されてよい。
【００５９】
基質の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の基礎材料は、有利には、適した動物又はヒト組織源から単離された天然由来の膠原性ＥＣＭである。適した細胞がマトリックス材料は、例えば、粘膜下組織（例えば、小腸粘膜下組織、胃粘膜下組織、膀胱粘膜下組織又は子宮粘膜下組織、それぞれ幼い動物又は成体動物から単離されるもの）、副腎膜、羊膜、硬膜、心膜、漿膜、腹膜又は肝臓基底膜もしくは上皮基底膜材料を含む基底膜材料を含む。これらの材料は単離され、かつそのままの天然シートの形又は粒状の形として使用され、又はこれらの材料及び／又は他の膠原性材料に由来するコラーゲンを含む再構成コラーゲン層が使用されてよい。本発明において有用な粘膜下組織材料、並びにその単離及び処理に関するさらなる情報に関しては、米国特許番号第４，９０２，５０８号、第５，５５４，３８９号、第５，７３３，３３７号、第５，９９３，８４４号、第６，２０６，９３１号、第６，０９９，５６７号、及び第６，３３１，３１９号を参照できる。副腎膜は、ＷＯ０３００２１６５として発行された国際特許文献番号ＰＣＴ ＵＳ０２／２０４９９号においてより詳細に記載されている、温血脊椎動物から得られてもよい。それぞれの文献は、参照をもって完全に本明細書に組み込まれたものとする。
【００６０】
好ましいＥＣＭ基質材料は、該材料の組織源に由来する残留生物活性タンパク質又は他のＥＣＭ成分を含む。例えば、それらは、繊維芽細胞成長因子２（塩基性ＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）及び形質転換成長因子−ベータ（ＴＦＧ−ベータ）を含んでよい。本発明のＥＣＭ基礎材料は、例えば１つ以上のグリコサミノグリカン、糖タンパク質、プロテオグリカン及び／又は成長因子を含む追加の生物活性成分を含んでよい。
【００６１】
本発明の一実施態様に従って、腫瘍細胞及び／又は癌細胞は、分泌された腫瘍及び／又は癌の細胞及び／又は組織の生体材料／生体分子を、基質材料の一部又は該材料の全表面上に、例えばＥＣＭ材料の表面に沈着させることが十分に可能な条件下で、及び十分に可能な時間、ＥＣＭ材料上でｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される。基質材料中への／基質材料上への抗腫瘍性生体分子及び／又は抗癌性生体分子の所望量の沈着後に、得られたコンディショニングされたＥＣＭ基質材料は、さらに加工されて、目下の抗腫瘍性及び／又は抗癌性のコンディショニングされた基質を脱細胞化させうる。沈着した抗腫瘍性生体分子及び／又は抗癌性生体分子は、例えば、ＥＣＭ基質材料の機能化を（例えば、処理される患者において存在する非腫瘍性細胞及び／又は非癌性細胞による材料の再建を部分的に作用することによって）付随的に高めてもよい。さらに、播種後（例えば腫瘍細胞及び／又は癌細胞での培養中）に、播種した腫瘍細胞及び／又は癌細胞に加えてＥＣＭ基質は、機械的、化学的又は物理的応力を受け、細胞成長並びに腫瘍及び／又は癌の沈着した生成物の沈着に影響されうる。かかる力は、制限されること無く、機械的に、ＥＣＭ基質材料を、有利にはそれを引き裂くこと無く引っ張ること、ＥＣＭ基礎材料に拍動性の力を受けさせること（例えば、ＥＣＭ基礎材料の管を介して液体、例えば培養液を流すことによって）、培養雰囲気を（例えば、高い又は低い二酸化炭素含有率に）変化すること、又は細胞の成長速度、表現型、分泌機能又はアポトーシスを作用する特定の成長因子又はケモカインを添加して、それによって細胞によって沈着した分子を作用することを含んでよい。
【００６２】
基質、例えばＥＣＭ基質中で／上で生体分子を分泌するために使用されるべき腫瘍細胞及び／又は癌細胞は、任意の適した方法で構造を指示する基礎ＥＣＭの表面に適用されうる。詳述すれば、腫瘍細胞及び／又は癌細胞は、基礎ＥＣＭ上に細胞を置くための重力を与えることによって基礎ＥＣＭ材料に適用されうる。正圧は、ＥＣＭ材料を介して培地を押しつけるために使用されてもよい。腫瘍細胞及び／又は癌細胞をＥＣＭに適用するための他の適した方法は、制限されること無く、ＥＣＭ材料上に腫瘍及び／又は癌の哺乳動物細胞を引くための正圧を使用すること、及び走化剤を使用することを含む。
【００６３】
本記載内容において開示されている発明がより効果的に理解されるために、制限の無い例を以下に提供する。次の実施例は、本発明の方法の種々の実施態様を記載する。
【００６４】
実施例１−材料及び方法
本実施例は、本発明の実施に対する開発及び変形において使用される種々の材料及び方法を記載するために提供される。
【００６５】
方法動物。Ｌｏｂｕｎｄ Ｗｉｓｔａｒ（ＬＷ）ラットを、ノートルダム大学で管理した繁殖コロニーから得た。ＬＷラットは、肺に転移した前立腺癌の確立されたモデルである。ＰＡＩＩＩ細胞を、初めに、ＬＷラットにおける自発性の転移性前立腺癌から単離した（Ｐｏｌｌａｒｄ Ｍ， Ｓｕｃｋｏｗ ＭＡ． Ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｔｈｅ Ｌｏｂｕｎｄ−Ｗｉｓｔａｒ ｒａｔ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２３０：５２０−５２６， ２００５）。前記細胞を、ＬＷラットにおける腫瘍試料の逐次経過によって腫瘍として維持した。典型的に、これらは、１０グラムを超える重さの大きな皮下腫瘍となった。腫瘍の継代接種を、安楽死させたラットからの腫瘍の５グラムの部位を採取し、そして改良したＥａｇｌｅの培地（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ））１０ｍｌ中で組織を刻むことによって実施した。この細胞懸濁液０．３ｍｌの皮下投与は、一貫して、細胞懸濁液の投与の７日後の早くに触診可能な腫瘍塊をもたらした。この研究のための皮下ＰＡＩＩＩ腫瘍を作成するために、ラットに、右脇腹を覆った皮下に腫瘍細胞懸濁液０．３ｍｌを投与した。
【００６６】
細胞外マトリックス。小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）（ＳＵＲＧＩＳＩＳ（登録商標）， Ｃｏｏｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．， Ｗｅｓｔ Ｌａｆａｙｅｔｔｅ， Ｉｎｄｉａｎａ）を、細胞外マトリックスの無菌の凍結乾燥シートとして提供した。ＳＩＳは、豚由来のものであり、空腸の切片から全ての腸間膜組織、漿膜及び筋層の取り出しによってもたらされた。腫瘍細胞での培養及び動物中への移植前に、ＳＩＳを、２ｃｍ×２ｃｍの断片に切断した。
【００６７】
ワクチンの製造。２つのワクチン製剤を評価した。１つのワクチン製剤は、直接皮下ＰＡＩＩＩ腫瘍から採取した腫瘍細胞から構成され、かつＳＩＳ上で成長させ、続いてチオシアン酸カリウムでの溶解したＳＩＳワクチン（ＳＩＳ／Ｃ／Ｌ）を含んだ。もう１つのワクチン製剤は、腫瘍細胞を成長させ、そしてグルタルアルデヒド上で固定したＳＩＳ（ＳＩＳ／ＧＦＴ）を含み、皮下ＰＡＩＩＩ腫瘍から採取し、続いてグルタルアルデヒドでも固定した。さらに、未処理のＳＩＳでワクチン接種したラット（ＳＩＳ）及び細胞成長を有さないが、チオシアン酸カリウム処理を受けさせたＳＩＳでワクチン接種したラット（ＳＩＳ／Ｌ）を、対照群として含んだ。
【００６８】
ＳＩＳ／ＧＦＴワクチンを、３７℃で５％ＣＯ2下で、ＭＥＭ中でＳＩＳの２ｃｍ×２ｃｍ断片上で、１×１０6の採取した腫瘍細胞をインキュベートすることによって製造した。採取した腫瘍細胞を、皮下腫瘍３ｇを採取し、そして細かく刻み、続いて８０メッシュスクリーンを通過することによって機械的に皮下腫瘍を分離して、改良したＥａｇｌｅの培地（ＭＥＭ）（Ｓｕｃｋｏｗ， ２００５）中で細胞懸濁液を製造することによって得た。３日の成長に続いて、そして細胞を付着させたＳＩＳは、２．５％グルタルアルデヒド（ｖ／ｖ）中で、３７℃で６０分間インキュベートを受け、そして培地でゆっくりと洗浄させて、最終のワクチン製剤を製造した。ＳＩＳ／Ｃ／Ｌワクチン製剤を、ＭＥＭ中で、ＳＩＳ／ＧＦＴワクチンとして得られた、採取された腫瘍細胞１×１０6を、３７℃で、５％ＣＯ2下で、ＳＩＳの２ｃｍ×２ｃｍ断片上でインキュベートすることによって製造した。３日の成長に続いて、細胞を付着させたＳＩＳを、１ＭのＫＳＣＮ２０ｍｌ中に置き、そして３７℃で一昼夜インキュベートして、細胞を溶解した。インキュベート後に、ＳＩＳを、冷やした０．０１Ｍトリス緩衝液中に撹拌プレート上に置き、そして約４時間混合した。４時間の撹拌後に、その緩衝液を、次の４８時間にわたってさらに３回変えた。細胞成長を受けなかった対照ＳＩＳを、同様の方法でＫＳＣＮに曝した（ＳＩＳ／Ｌ）。ＳＩＳのいくつかの形で処理したそれぞれの群からのＳＩＳの試料を、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、断片化し、そしてヘマトキシリン及びエオシンで染色して、細胞の存在又は不在を確かめた。
【００６９】
試料を、細胞成長を受けたＳＩＳのチオシアン酸カリウム処理前に及びその後に、細胞がＳＩＳ上で成長していたことを確かめ、そして続いてチオシアネート処理後に取り出した。
【００７０】
腫瘍の外科的切除。ラットは、ＰＡＩＩＩ細胞の投与の１４日後に皮下腫瘍の外科的除去を受けた。ケモカイン（９０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与での外科的麻酔の導入に続いて、腫瘍を覆う体毛を刈り取り、そして皮膚をヨードフォルで洗浄した。無菌技術を使用して、腫瘍を、外科的に摘出し、そして皮膚を外科用ステープルで閉じた。ラットに、ブトルファノール（２ｍｇ／ｋｇ）の皮下投与量を後の外科的無痛法のために投与した。この技術で、小さい残留腫瘍床が残り、そして腫瘍は、典型的に１０〜１４日内に再成長する。
【００７１】
研究設計。本研究のための皮下ＰＡＩＩＩ腫瘍を生じるために、３〜４月齢の１６匹の雄のＬＷラットに、ＭＥＭ０．３ｍｌの体積で皮下に新鮮な採取した腫瘍細胞１×１０6を投与した。１４日後に、全てのラットは、触診可能な皮下腫瘍を有し、そして腫瘍の外科的切除を受けた。そしてラットを、次のＳＩＳ、ＳＩＳ／Ｌ、ＳＩＳ／ＧＦＴ又はＳＩＳ／Ｃ／Ｌの腫瘍床に配置することによって処理した６つの群に無作為に割り振った。２１日後に、ラットを、二酸化炭素麻酔によって安楽死させ、そして腫瘍を検量した。平均腫瘍質量における差異を、ｐ≦０．０５である場合に達せられた有意性を有する一方向の分散分析を使用して群間の有意性について評価した。
【００７２】
ＳＩＳ試料の組織学的試験。ＳＩＳ／ＧＦＴの試料及びラットの腫瘍を、切除及びワクチン接種に続いて、１０％中性緩衝ホルマリン中で固定した。試料を、７０％エタノールで洗浄して、そしてパラフィン中で包埋し、続いて４〜５μｍで断片化し、そしてヘマトキシリン及びエオシンで染色した。
【００７３】
ＳＩＳ上での細胞の成長及びチオシアン酸カリウム処理による除去。図１及び２において示されているように、ＳＩＳ試料の組織学的試験は、細胞が、ＳＩＳ上で成長し（図１）、そして続いてＳＩＳ／Ｃ／Ｌについてチオシアン酸カリウム処理によって除去したことを確認した（図２）。ＳＩＳ／ＧＦＴワクチンからの試料は、ＳＩＳ上での細胞の存在を確認し、かつＳＩＳ及びＳＩＳ／Ｌ群からの試料は、それらの材料上で細胞の不在を確認した。
【００７４】
実施例２−腫瘍細胞でコンディショニングされた基質（ＥＣＭ）のｉｎ ｖｉｖｏでの抗前立腺腫瘍活性
本実施例を、ｉｎ ｖｉｖｏで本発明の腫瘍細胞及び／又は癌細胞でコンディショニングされた基質の抗腫瘍活性及び／又は抗癌活性を証明するために提供する。
【００７５】
動物を、実施例１において記載されたように製造した。安楽死の時点で、腫瘍の切除及びワクチン接種の２１日後に、腫瘍の質量は以下であった。
【００７６】
【表１】
2013544760.tif 000003
ＳＩＳ／Ｃ／Ｌ＝ＳＩＳ上での腫瘍細胞の成長、そしてＫＳＣＮでの溶解
ＳＩＳ／ＧＦＴ＝ＳＩＳ上での腫瘍細胞の成長、そしてグルタルアルデヒドでの固定
ＳＩＳ／Ｌ＝細胞を有さない、ＫＳＣＮで処理したＳＩＳ
ＳＩＳ＝細胞を有さない、未処理のＳＩＳ。
【００７７】
腫瘍細胞及び／又は癌細胞でコンディショニングされた基質（ＥＣＭ）組成物は、腫瘍の切除及びワクチン接種に続いて、腫瘍の質量において統計学的に有意な（Ｐ＜０．０５）減少を刺激させた。この応答は、ＧＦＴ−Ｓワクチンによって刺激されたものと同等であった。
【００７８】
図３において図式的に示されているこのデータは、前立腺癌に対する保護的免疫応答を刺激するためのＳＩＳ−Ｖの本発明の組成物の有用性を証明する。
【００７９】
実施例３−腫瘍細胞でコンディショニングされたＥＣＭワクチンの研究
本実施例を、抗腫瘍組成物として本発明組成物（例えば腫瘍細胞でコンディショニングされた基質）の有用性を証明するために提供する。
【００８０】
ＰＡＩＩＩ前立腺癌細胞を、ＬＷラットに皮下に投与して、腫瘍を成長させた。細胞投与の２週間後に、かつ触診可能な腫瘍が存在したら、腫瘍を、小さい残りの腫瘍床を除いて外科的に切除した。外科治療の時点で、ラットに、腫瘍床に対して離れた部位で皮下にワクチンを投与した。
【００８１】
ラットを２６時間後に安楽死させ、そして腫瘍を検量した（Ｎ＝４／群；平均皮下腫瘍質量に関して表現）。
【００８２】
コンディショニングされた腫瘍細胞基質ワクチンを、実施例１において記載されたように調製した。簡単に、ラットから抽出された腫瘍組織を、ＥＣＭ上で培養した。ワクチン製剤の１つにおいて、培養物を、チオシアン酸カリウムで処理した。チオシアン酸カリウムでの処理は、細胞外マトリックス材料に対する固体の細胞成長を溶解する作用がある。これは、実質的に製剤を有さない（粒子を有さない）製剤を提供する。代わりに、及び使用されてよい入手可能な技術を制限することが製剤から粒状材料を除去することを意図せずに、製剤から粒状材料の除去は、チオシアン酸カリウム、オキシコール酸、製剤の凍結乾燥、超音波処理等を使用してよい。ホルマリン処理又は放射線照射のプロトコルがこの加工工程の実施においてほとんど好ましくないことも把握されている。
【００８３】
他のワクチン製剤において、腫瘍細胞培養物を、殺した腫瘍細胞製剤を提供するために処理した。これは、グルタルアルデヒドでの腫瘍細胞及び／又は癌細胞の処理によって達せられた。この方法において、腫瘍細胞及び／又は癌細胞は生存できないが、複製機能不全の固定された細胞の腫瘍細胞及び／又は癌細胞の抗原が、製剤（コンディショニングされた基質材料（例えばコンディショニングされたＥＣＭ））中に残っている。
【００８４】
細胞を溶解する組成物、例えば一例としてチオシアン酸塩（例えばチオシアン酸カリウム）での処理を含む腫瘍細胞及び／又は癌細胞でコンディショニングされた基質ＥＣＭワクチンは、細胞固定剤、例えばグルタルアルデヒド（少なくとも８０〜９９％、例えば９７％の阻害活性）で処理した腫瘍細胞から調製された製剤を含む腫瘍及び／又は癌の組織／細胞と同程度に機能した。腫瘍細胞をグルタルアルデヒドで固定した製剤において、固定した細胞及び細胞破片がまだ培地中に存在する一方で、チオシアン酸カリウムで処理した製剤において、細胞破片は、実質的に大量の洗浄によって取り除かれた。従って、ワクチンの一部としての細胞破片は、抗腫瘍原性を顕在化する必要が無いことが結論づけられた。
【００８５】
作用の任意の理論又は一次機構を制限することを意図しないと同時に、粒状の腫瘍細胞及び／又は癌細胞の材料及び／又は細胞破片は、抗腫瘍性製剤の成分として要求されないことが結論づけられた。
【００８６】
実施例４−腫瘍細胞でコンディショニングされた基質（ＥＣＭ）ワクチンでの黒色腫の阻害
本実施例は、癌、例えば黒色腫の阻害において使用するための腫瘍細胞でコンディショニングされたＥＣＭワクチン製剤を提供するための本発明の有用性を証明する。これらの製剤は、腫瘍細胞及び／又は癌細胞の粒状材料又は腫瘍細胞及び／又は癌細胞全体を実質的に有さないと記載されてよい。
【００８７】
方法。１×１０6のＢ１ ６Ｆ１０マウスの黒色腫細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ）を成長させて、ウシ血清を添加して、改良したＥａｇｌｅの培地（ＭＥＭ）中で合した。細胞を、培養フラスコから機械的に分離することによって採取した。細胞の採取後に、ＧＦＴワクチンを、グルタルアルデヒド固定によって、２．５％グルタルアルデヒド（ｖ／ｖ）中で３７℃で６０分間の採取した細胞をインキュベートすることによって、続いて最少必須培地（ＭＥＭ）で洗浄することによって調製した。腫瘍細胞でコンディショニングされたＥＣＭワクチン（ＴＣ）を製造するために、Ｂ１ ６Ｆ１０細胞を、ＭＥＭ中で３日間ＥＣＭの２×２ｃｍ細片（ＳＩＳ）上で成長させた。３日の成長に続いて、細胞を付着させたＳＩＳを、１ＭのＫＳＣＮ２０ｍｌ中に置き、そして３７℃で一昼夜インキュベートして、細胞を溶解した。インキュベート後に、ＳＩＳを、冷やした０．０１Ｍトリス緩衝液中に撹拌プレート上に置き、そして約４時間混合した。４時間の撹拌後に、その緩衝液を、次の４８時間にわたってさらに３回変えた。ＳＩＳのいくつかの形で処理したそれぞれの群からのＳＩＳの試料を、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、断片化し、そしてヘマトキシリン及びエオシンで染色して、細胞の存在又は不在を確かめた。
【００８８】
ワクチン接種群を以下のように設計した：
対照＝最少必須培地（ＭＥＭ）のみ
ＧＦＴ（グルタルアルデヒドで固定した培養したＢ１ ６Ｆ１０細胞）（黒色腫の腫瘍細胞）
ＴＣ（ＥＣＭ上でＢ１ ６Ｆ１０細胞を成長させ、そしてＫＳＣＮ溶解によって取り出し、そして洗浄した、ＥＣＭ）
２つの研究を、これらのワクチンを使用して実施した。
【００８９】
実施例５−黒色腫の処理
本実施例を、黒色腫の成長を阻害するための本発明の腫瘍及び／又は癌でコンディショニングされた基質製剤の有用性を証明するために提供する。これらの腫瘍製剤及び／又は癌製剤は、実質的に、粒状の腫瘍及び／又は癌の全ての細胞を有さない。
【００９０】
Ｃ５７Ｂ１６マウス（Ｈａｒｌａｎ， Ｉｎｃ．， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， Ｉｎｄｉａｎａ）の６匹の雌の群に、左の脾腹を覆って皮下に１×１０6のＢ１ ６Ｆ１０細胞を投与した。１２日後に、触診可能な皮下黒色腫腫瘍が存在した場合に、マウスを、ＭＥＭ；ＭＥＭ０．２５ｍｌ中で１×１０6のＧＦＴ黒色細胞（Ｂ１６Ｆ１０細胞）；又は約１×１０6のＧＦＴ細胞を含むＥＣＭワクチンの２×２ｃｍ断片（ＴＣ／ＥＣＭ）を０．２５ｍｌの容量で皮下にワクチン接種した。
【００９１】
ＳＩＳの２×２ｃｍ断片でワクチン接種した動物を、無菌の外科的技術によって処理した。簡単に、マウスを、塩酸ケタミン（９０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与で麻酔した。外科手術部位を覆う体毛の刈り取り後に、小さい皮下ポケットを、腫瘍の位置から離れて、背面の胸部にわたって外科的に作成した。ＥＣＭの断片をポケット内に置き、そして皮膚を外科用糊で閉じた。マウスに、術後鎮痛法のために酒石酸ブトルファノールの投与量（１．０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。動物は、ブースターワクチン接種を受けなかった。全てのマウスをワクチン接種の９日後に安楽死させ、そして腫瘍を腫瘍サイズの測定値として検量した。
【００９２】
これらの研究からの結果は、平均腫瘍質量における有意な（Ｐ＜０．０５）減少を、ＭＥＭ対照と比較してＧＦＴワクチンでワクチン接種したマウスの群において見出したことを証明した。さらに、ＴＣ／ＥＣＭワクチン群は、ＭＥＭ対照群と比較して平均腫瘍質量における有意な（Ｐ＜０．００５）減少を示し、かつＧＦＴワクチン群と比較して平均腫瘍質量における有意な（Ｐ＜０．０１）減少を示した（図５）。
【００９３】
これらの結果は、コンディショニングされたＥＣＭワクチンが、黒色腫について効果的な治療であることを証明する。
【００９４】
実施例６−外科的減量術後の腫瘍再成長の予防
本実施例は、組織部位からの腫瘍の除去、例えば患者から腫瘍成長の除去後に、腫瘍再発を予防するための本発明の有用性を証明する。
【００９５】
Ｃ５７Ｂ１６マウス（Ｈａｒｌａｎ， Ｉｎｃ．， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， Ｉｎｄｉａｎａ）の６匹の雌の群に、左の脾腹を覆って皮下に１×１０6のＢ１６Ｆ１０細胞を投与した。１２日後に、触診可能な皮下黒色腫腫瘍が存在した場合に、マウスは、外科的腫瘍減量術を受けた。簡単に、マウスを、塩酸ケタミン（９０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与で麻酔した。外科手術部位を覆う体毛の刈り取り後に、腫瘍を、結合組織付着を有さずに切開し、そして肉眼で認識できる腫瘍を切除した。
【００９６】
ワクチンを、ＭＥＭ；ＭＥＭ中で１×１０6のＧＦＴ黒色腫細胞０．２５ｍｌ；ＴＣ／ＥＣＭワクチンの２×２ｃｍ断片を含む０．２５ｍｌの体積で腫瘍床上に直接投与した。その皮膚を、外科用糊で閉じた。マウスに、術後鎮痛法のために酒石酸ブトルファノールの投与量（１．０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。
【００９７】
腫瘍減量術及びワクチン接種の１７日後に、マウスを安楽死させ、そして腫瘍を腫瘍サイズ及び再成長の測定値として検量した。
【００９８】
結果を、図４において図式的に示す。これらの結果は、ＴＣ／ＥＣＭ及びＧＦＴワクチンの投与が、対照と比較して抗腫瘍免疫をもたらしたことを証明する。これらのワクチン接種した群におけるマウスの平均腫瘍質量は、ＭＥＭ対照群の平均腫瘍質量よりも著しく低かった（Ｐ＜０．００５）。これらの結果は、コンディショニングされたＥＣＭワクチンが、外科的腫瘍減量術後に腫瘍再成長を予防するために十分であることを証明する。
【００９９】
データの裏付けのない実施例７−コンディショニングされた基質材料からの癌及び腫瘍の注射可能なワクチン
本実施例は、ワクチンについて注射可能な調合物において見出されるコンディショニングされた細胞外マトリックス材料の予想される有用性を証明することを提供する。
【０１００】
異種の無細胞性膠原性組織製剤でコンディショニングされた製剤を製剤学的に形成して、通常の製剤学的技術を使用して、例えば針注射によって注射されてよい製剤を提供してよい。かかる製剤を、粒状ＥＣＭ上で腫瘍細胞を成長させ、続いて化学溶解及び洗浄による細胞の除去によって製造した。代わりに、腫瘍細胞を、ＥＣＭのシート上で成長させ、続いて化学溶解及び洗浄によって細胞を除去し、続いてＥＣＭシートを機械的に破壊して、粒状物を形成してよい。
【０１０１】
本記載内容において開示されている全ての方法を、本記載内容において特に示されていない限り又は明確に否定されていない限り任意の適したオーダーで実施してよい。任意の及び全ての実施例、又は本明細書において提供される例示的な言語（例えば"例えば（ｓｕｃｈ ａｓ）"）の使用は、単に本発明をより明らかにすることを意図し、かつ本発明の特許請求の範囲に対する制限をもたらさない。明細書における言語は、本発明の実施に対して任意の請求されていない必須要素を示すと解釈されるべきである。
【０１０２】
本明細書において開示された本発明の変更要素又は実施態様の群分けは、制限すると解釈されるべきでない。それぞれの群の構成は、個々に、又は該群の他の構成とのもしくは本明細書において見出される他の要素との任意の組合せを言い、かつそれらを請求してよい。群の１つ以上構成が、便宜上及び／又は特許性の理由のために群に含まれるか、又は群から削除されることが予期される。任意のかかる包含又は削除が生じた場合に、明細書は、添付の特許請求の範囲において使用される全てのマーカッシュ群の記載された説明を満たすために群を含むと考えられる。
【０１０３】
本発明の特定の実施態様は、本明細書において開示されており、本発明を実施するための発明者に公知の最良の形態を含む。もちろん、これらの記述された実施態様に対する変法は、前記説明を読むと、即座に、当業者にとって明らかになる。発明者は、当業者が適宜かかる変法を使用することを予期しており、かつ、発明者は、特に本明細書において開示されているのとは別の方法で実施されるべき発明を意図する。従って、本発明は、準拠法によって許可されるように、本明細書に追加される特許請求の範囲において列挙される主題の全ての修正及び同等物を含む。さらに、それらの全ての可能な変法における前記要素の任意の組合せは、本記載内容において特に示されていない限り又は明確に否定されていない限り、本発明によって含まれる。
【０１０４】
本明細書において開示されている特定の実施態様は、言語のからなる又は及び本質的にからなる、を使用する特許請求の範囲においてさらに制限されてよい。特許請求の範囲において使用される場合に、"からなる"の変化する用語は、特許請求の範囲において明記されていない任意の要素、工程、又は成分を除く。"本質的にからなる"の変化する用語は、特定の材料又は工程、及び基本的な及び新規の特性に著しく影響しないものに対して特許請求の範囲を制限しない。請求された本発明の実施態様は、本明細書において固有に又は明白に記載され、かつ使用可能である。
【０１０５】
本明細書において開示された本発明の実施態様は、本発明の原理の例証である。使用されてよい他の改良は、本発明の範囲内である。従って、一例として、制限されることなく、本発明の代わりの形態は、本明細書における教示に従って使用されてよい。従って、本発明は、正確に示される、かつ記載されることを意図しない。本明細書において特に認識された材料のための変法及び置換は、本発明の範囲内で含まれる。
【０１０６】
さらに、本発明において記載された好ましい本実施態様に対する種々の変化及び改良は、当業者に明らかである。かかる変化及び改良は、本発明の主題の意図及び範囲から逸脱することなく、又はその意図された利点を縮小することなく実施されてよい。従って、かかる変化及び改良は、添付の特許請求の範囲によって含まれることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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2013544760.tif 000010
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