(57)【要約】標的分子に結合可能な分子の提供方法で使用するための、一組のポリペプチドに基づく分子ツール。配列番号１〜３２から選択される配列を有するポリペプチド。このポリペプチドを、リガンドに対する標的分子に結合可能なリガンド−ポリペプチドコンジュゲートのスクリーニング方法で使用してもよい。リガンド−ポリペプチドコンジュゲートは、例えば治療に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子に結合可能な分子の提供方法で使用するための分子ツールであって、前記ツールは、配列番号１〜３２のいずれか１個又は数個に従う複数のポリペプチドを含み、各ポリペプチドは、標的分子に結合可能で、該ポリペプチド配列の８、１７、２２、及び３４番目から選択される位置のアミノ酸にアミド結合で連結されているリガンド、及び標的分子への結合を検出するためのもので、該ポリペプチド配列の１５、１０、２５及び３７番目から選択される位置のアミノ酸にアミド結合で連結されているレポーター基を有する、分子ツール。
【請求項２】
該ポリペプチドが、配列番号１〜３２から選択される少なくとも２個の異なる配列番号に従うものである、請求項１に記載の分子ツール。
【請求項３】
各ポリペプチドの該リガンドがリシン、オルニチン及び２，４−ジアミノ酪酸から独立して選択される、８、１７、２２、又は３４番目のアミノ酸に連結されており、かつ、各ポリペプチドの該レポーター基がリシン、オルニチン及び２，４−ジアミノ酪酸から独立して選択される、１５、１０、２５又は３７番目のアミノ酸に連結されている、請求項１又は２に記載の分子ツール。
【請求項４】
標的分子に結合可能なリガンド−ポリペプチドコンジュゲートのスクリーニング方法であって、
配列番号１〜３２から選択される配列を有するポリペプチドを含む少なくとも１つのコンジュゲート分子を提供する工程、
該標的分子と該コンジュゲート分子を接触させる工程；及び
レポーター基由来のシグナルを検出する工程を含み、
該ポリペプチドは該標的分子に対するリガンドを有し、該リガンドはこのリガンドとアミド結合を形成することができるアミノ酸とアミド結合によって連結されており、該アミノ酸は該ポリペプチド配列の８、１７、２２、及び３４番目から選択される位置にあり、かつ、該ポリペプチドは該レポーター基を有し、該レポーター基はこのレポーター基とアミド結合を形成することができるアミノ酸とアミド結合で連結されており、該アミノ酸は該ポリペプチド配列の１５、１０、２５及び３７番目から選択される位置にある、スクリーニング方法。
【請求項５】
配列番号１〜３２から選択される異なるポリペプチド配列を有する２〜１６個のコンジュゲート分子の組を提供する工程を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
配列番号１〜３２から選択される配列を有するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが標的分子に対するリガンドを有し、当該リガンドが、８、１７、２２、及び３４番目から選択される位置に、アミド結合を形成することができるアミノ酸とアミド結合で連結している、リガンド−ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項７】
治療で使用するための、請求項６に記載のリガンド−ポリペプチドコンジュゲート。
【請求項８】
請求項６又は７に記載のリガンド−ポリペプチドコンジュゲート、及び薬学上許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項９】
配列番号１〜３２から選択される配列を有するポリペプチド。
【請求項１０】
標的分子と結合可能なリガンドが、該リガンドとアミド結合を形成することができるアミノ酸とアミド結合で連結されており、該アミノ酸が該ポリペプチド配列の８、１７、２２、及び３４番目から選択される位置にある、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
該標的分子がタンパク質又はポリペプチドである、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
標的分子への結合を検出するためのレポーター基が、該レポーター基とアミド結合を形成することができるアミノ酸とアミド結合で連結されており、該アミノ酸が該ポリペプチド配列の１５、１０、２５及び３７番目から選択される位置にある、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
請求項９〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドから独立して選択される２つのポリペプチドの二量体である、ポリペプチド。
【請求項１４】
請求項９〜１３のいずれか１項に記載の少なくとも２種の異なるポリペプチドを含む、複数のポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号１〜３２から選択される異なる配列番号を有するポリペプチドを含む、請求項１４に記載の複数のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物工学の分野に関する。より具体的には本発明は、新規ポリペプチド並びにこれらポリペプチドに基づく分子ツール及びそのようなツールが使用されている方法、及びこれらのツールを使用して得られる製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
認識と報告の重要な生物学的感知事象を結びつけるリガンドによって修飾されているいくつかの折りたたみヘリックス−ループ−ヘリックス構造が国際公開第０３／０８０６５３号に記載されており、同公報はまた、前記ポリペプチド構造の生物分析／バイオセンサー用途での使用や、タンパク質濃度及び／又はタンパク質の親和性を決定するためのバイオセンサーとしての使用についても教示している。
【０００３】
さらに、リガンドによって修飾されている別のポリペプチドが、多数の特定の標的分子と結合可能であることについても既に記載がある。国際公開第０７／１１７２１５号で開示されているポリペプチド二量体には少なくとも１つのホスホコリン誘導体が結合しているため、生じたペプチドはＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）への特異的な結合を示す。同様に、上述の国際公開第０３／０８０６５３号では、リガンド−ポリペプチドコンジュゲートがヒト炭酸脱水酵素ＩＩに結合することが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第０７／１１７２１５号
【特許文献２】国際公開第０３／０８０６５３号
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らはここで、僅か１６種類のポリペプチド配列から選択される一組のポリペプチドを使用することで、様々な標的分子に対して高い選択性及び／又は親和性をもつ、ポリペプチドコンジュゲート結合剤が得られることを発見した。
【０００６】
従って、本発明のこの組のポリペプチドによって強力なツールが提供され、これにより、多様な標的分子に対する結合剤としてのリガンド−ポリペプチドコンジュゲートを得ることができる。この結合剤は、リガンドそのものよりも、実質的に高い親和性及び選択性を有する。
【０００７】
本発明のツールを使用することによって得られるリガンド−ポリペプチドコンジュゲートは、ポリペプチドに連結している標的分子に結合可能なリガンドを含む。リガンドそのもの（すなわち本発明のポリペプチドに連結していないリガンド）は、標的分子に対して中程度の親和性及び／又は選択性しか示さない可能性があるが、本発明によって提供されるコンジュゲート分子は都合よく、実質的に高い親和性及び／又は選択性を示すということが、本発明の非常に優れた利点である。
【０００８】
顕著な特徴は、本発明のこの組のポリペプチドは、非常に多用途な分子ツールとして使用することができ、それにより広範囲の標的分子に対する最適な結合剤を見出すことが可能になるということである。
【０００９】
そのため、本発明の第一の側面に従い、配列番号１〜３２より選択される配列を有するポリペプチドを提供する。
さらなる側面に従い、本発明による少なくとも２種類の異なるポリペプチドを含む、複数のポリペプチドを提供する。
【００１０】
さらに、標的分子に結合可能な分子の提供方法で使用するための分子ツールを提供する。前記ツールは、配列番号１〜３２のいずれか１個又は数個に従う複数のポリペプチドを含み、各ポリペプチドは、標的分子に結合可能で、該ポリペプチド配列の８、１７、２２、及び３４番目から選択される位置のアミノ酸にアミド結合で連結されているリガンド、及び標的分子への結合を検出するためのもので、該ポリペプチド配列の１５、１０、２５及び３７番目から選択される位置のアミノ酸にアミド結合で連結されているレポーター基を有する。
【００１１】
選択した一組のポリペプチドの各メンバーに標的分子に対するリガンドを連結させ、得られた一組のリガンド−ポリペプチドコンジュゲートを、コンジュゲート分子に対する結合親和性と選択性を指標にスクリーニング（例えば大規模なスクリーニング方法で）することで、標的分子に対する結合剤として最適なリガンド−ポリペプチドコンジュゲートを同定することができる。本明細書で示すように、本発明の利点は、たとえ親和性及び／又は選択性が中程度なリガンドを使用したとしても、このスクリーニング方法によって標的分子に対する親和性及び／又は選択性が高い結合剤、又は親和性及び選択性の組み合わせが最適な結合剤を提供できることである。
【００１２】
そのため別の側面は、標的分子に結合可能なリガンド−ポリペプチドコンジュゲートのスクリーニング方法を提供し、この方法は、
−配列番号１〜３２から選択される配列を有するポリペプチドを含む少なくとも１つのコンジュゲート分子を提供する工程、
−標的分子とコンジュゲート分子を接触させる工程、及び
−レポーター基からの信号を検出する工程、を含み
前記ポリペプチドは標的分子に対するリガンドを有し、該リガンドはこのリガンドとアミド結合を形成することができるアミノ酸とアミド結合によって連結されており、前記アミノ酸はポリペプチド配列の８、１７、２２、及び３４番目から選択される位置にあり、かつ、前記ポリペプチドはレポーター基を有し、該レポーター基はこのレポーター基とアミド結合を形成することができるアミノ酸とアミド結合で連結されており、前記アミノ酸はポリペプチド配列の１５、１０、２５及び３７番目から選択される位置にある。
【００１３】
さらなる側面では、リガンド−ポリペプチドコンジュゲートを提供する。このリガンド−ポリペプチドコンジュゲートは、配列番号１〜３２から選択される配列を有するポリペプチドを含み、前記ポリペプチドはリガンドとアミド結合を形成することができるアミノ酸にアミド結合によって連結されている標的分子に対するリガンドを有し、前記アミノ酸は、ポリペプチド配列の８、１７、２２、及び３４番目から選択される位置にある。
【００１４】
また、治療に使用する本明細書で定義するリガンド−ポリペプチドコンジュゲート、及び本明細書で定義するリガンド−ポリペプチドコンジュゲートを含む医薬組成物も提供する。
【００１５】
さらに、本発明に従うリガンド−ポリペプチドコンジュゲート、及びそのようなコンジュゲートを使用する診断又は治療法、並びに本発明に従うリガンド−ポリペプチドコンジュゲートを含む医薬組成物又は例えば診断キットを提供する。
【００１６】
本発明のさらなる側面並びにその態様は、以下の詳細な説明及び添付の特許請求の範囲から、容易に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本発明の１６種類一組のポリペプチドの１字記号表記であり、配列の左側にはそのポリペプチドに対して本明細書で使用している名称、配列の右側にはそのポリペプチドの正味電荷を示している。リガンド連結部位であるリシン残基を太字で示している。
【図２】図２は、実施例１で得られた電気泳動のゲルを示している。左より、１．ＣＳＦ（１０倍希釈）、２．ＰＳ−Ｆ１０８−４−Ｃ１０Ｌ１７−ＡｃでＣＳＦから捕捉したタンパク質、３．プルロニックＦ１０８結合粒子による非特異的な取り込み、４．ｈＡＣｈＥ（シグマ）、５．分子量標準（９７（非常に薄い）、６５、４０、３０、２０．１、１４．４ｋＤａ）、６．予め染色されている分子量標準。
【図３】図３は、実施例２で標的分子として使用した、ヒト炭酸脱水素酵素ＩＩ（ＨＣＡＩＩ）のリボン図を示している。酵素活性部位の中にあるＺｎ２＋イオンを黒丸で示した。また、リガンドＬ（この場合はＨＣＡＩＩの阻害剤として知られているベンゼンスルホンアミド）、スペーサーアームに連結しているリガンドＬの活性エステル誘導体、及び本発明のポリペプチド（３−Ｃ１５Ｌ８）（８番目の位置にＬを有するスペーサーアームが連結し、かつ、１５番目にレポーター基である蛍光色素分子も連結している）も示している。
【図４】図４は、実施例２で溶血から抽出したタンパク質を示す、電気泳動し、銀染色したゲルを示している。左から順に、１：血清由来のタンパク質（５００倍希釈）、２．溶血由来のタンパク質（５００倍希釈）、３．結合剤３−Ｃ１５Ｌ８−Ｂで捕捉したタンパク質、４．４−Ｃ３７Ｌ３４−Ｂで捕捉したタンパク質、５．市販のＨＣＡＩ及びＨＣＡＩＩの混合物、６．ＨＣＡＩ、７．ＨＣＡＩＩ、８．分子量基準（上から順に、９７、６５、４０、３０、２０．１及び１４．４ｋＤａ）、９．予め染色されている分子量基準。バンドは切り出し、ゲル内でトリプシンによって消化し、その後ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ解析を行ったが、これらのバンドの出所を示している。７０ｋＤａのバンドはＨＳＡを含み、３０ｋＤＡのバンドはＨＣＡＩとＨＣＡＩＩの両方を含み、２０ｋＤａのバンドはヘモグロビン断片を含んでいる。全試料で７０ｋＤａのバンドが現れたが、これはＨＳＡとビーズの非特異的な相互作用によるものである。ヘモグロビンのバンドは、遠心分離中にビーズに追随する凝固ヘモグロビン断片に由来する。
【図５ａ】図５ａは、結合剤３−Ｃ１５Ｌ８−Ｂ及び４−Ｃ３７Ｌ３４−ＢのＳＰＲ解析から得られた曲線を示している。別々のフローセル中で、ＨＣＡＩ及びＨＣＡＩＩを固定したＣＭ５チップ上に、それぞれが異なる７水準の濃度（３−Ｃ１５Ｌ８−Ｂについては２．４ｎＭ〜２４０ｎＭ、４−Ｃ３７Ｌ３４−Ｂについては３．６ｎＭ〜３６０ｎＭ）を有する２種類の結合剤を流した。Ａ：固定したＨＣＡＩに３−Ｃ１５Ｌ８−Ｂを流した。
【図５ｂ】図５ｂは、結合剤である３−Ｃ１５Ｌ８−Ｂ及び４−Ｃ３７Ｌ３４−ＢのＳＰＲ解析から得られた曲線を示している。別々のフローセル中で、ＨＣＡＩ及びＨＣＡＩＩを固定したＣＭ５チップ上に、それぞれが異なる７水準の濃度（３−Ｃ１５Ｌ８−Ｂについては２．４ｎＭ〜２４０ｎＭ、４−Ｃ３７Ｌ３４−Ｂについては３．６ｎＭ〜３６０ｎＭ）を有する２種類の結合剤を流した。Ｂ：固定したＨＣＡＩに４−Ｃ３７Ｌ３４−Ｂを流した。
【図５ｃ】図５ｃは、結合剤である３−Ｃ１５Ｌ８−Ｂ及び４−Ｃ３７Ｌ３４−ＢのＳＰＲ解析から得られた曲線を示している。別々のフローセル中で、ＨＣＡＩ及びＨＣＡＩＩを固定したＣＭ５チップ上に、それぞれが異なる７水準の濃度（３−Ｃ１５Ｌ８−Ｂについては２．４ｎＭ〜２４０ｎＭ、４−Ｃ３７Ｌ３４−Ｂについては３．６ｎＭ〜３６０ｎＭ）を有する２種類の結合剤を流した。Ｃ：固定したＨＣＡＩＩに３−Ｃ１５Ｌ８を流した。
【図５ｄ】図５ｄは、結合剤である３−Ｃ１５Ｌ８−Ｂ及び４−Ｃ３７Ｌ３４−ＢのＳＰＲ解析から得られた曲線を示している。別々のフローセル中で、ＨＣＡＩ及びＨＣＡＩＩを固定したＣＭ５チップ上に、それぞれが異なる７水準の濃度（３−Ｃ１５Ｌ８−Ｂについては２．４ｎＭ〜２４０ｎＭ、４−Ｃ３７Ｌ３４−Ｂについては３．６ｎＭ〜３６０ｎＭを有するの２種類の結合剤を流した。Ｄ：固定したＨＣＡＩＩに４−Ｃ３７Ｌ３４−Ｂを流した。
【図６】図６は、実施例３で準備した本発明のリガンド−ポリペプチドである４−Ｃ１５Ｌ８−ＰＰ１と、Ｄｐａ基でキレートされている亜鉛イオンの位置を示しているこのポリペプチドのアミノ酸配列を示している。小分子ＰＰ１をリシン８の側鎖に連結し（下線）、蛍光色素分子をリシン１５の側鎖に連結した。
【図７】図７は、実施例３でリガンドとして使用した、リン酸結合剤ＰＰ１の合成を示す模式図である。
【図８】３段滴定による４系列ポリペプチドからのα−カゼインに対する高親和性結合剤の同定。蛍光プローブとして機能するように、７−メトキシクマリン−３−カルボン酸を各ポリペプチドにコンジュゲートさせた。α−カゼインを加えていない５００ｎＭの結合剤の発光スペクトル（最大値が約２０００の曲線）と、５００ｎＭ、１０００ｎＭ及び１５００ｎＭのα−カゼインを加えた結合剤の発光スペクトル（最大値が約１０００〜１２００の曲線）を示している。結合すると発光強度が低下し、５００ｎＭのタンパク質存在下では、５００ｎＭの濃度で結合が飽和した。このことは、結合が強く、Ｋｄが低ナノモル濃度以下の領域であることを示唆している。
【図９】３段階滴定による３系列ポリペプチドからのα−カゼインに対する高親和性結合剤の同定。蛍光プローブとして機能するように、７−メトキシクマリン−３−カルボン酸を各ポリペプチドにコンジュゲートさせた。α−カゼインを加えた５００ｎＭの結合剤の発光スペクトル（強度が最も弱い曲線）と、５００ｎＭ（中程度の強度曲線）、１０００ｎＭ（中程度の強度曲線）及び１５００ｎＭ（強度が最も高い曲線）のα−カゼインを加えた結合剤の発光スペクトルを示している。結合すると強度が上昇し、α−カゼイン量が増えるにつれて結合も増加し、飽和には達しなかった。このことは、結合が弱く、Ｋｄが高ナノモル領域からマイクロモルの領域であることを示唆している。α−カゼインの濃度が１０００ｎＭの場合には、結合剤３−Ｃ１０Ｌ１７−ＰＰ１は飽和に達したようであり、このことは、解離定数が６０ｎＭであることを示している。
【図１０】亜鉛イオン非存在下における、ＰＰ１が連結していないポリペプチド（上段）及び強力な結合剤である４−Ｃ１０Ｌ１７−ＰＰ１（下段）のα−カゼインによる滴定。α−カゼインを加えると蛍光の発光強度に僅かに影響が生じる。両方の実験とも、全てが組み合わせられた結合剤分子の非存在下では、結合は全く見られないか或いは結合は僅かである。
【図１１Ａ】リン酸陰イオン（１０ｍＭのＰＢＳ緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で競合した、４−Ｃ１５Ｌ８−ＰＰ１によるα−カゼインのプルダウン。レーン１、陽性対照であるα−カゼイン；レーン２、１０ｍＭのＰＢＳ緩衝液に溶解したα−カゼイン溶液（５００ｎＭ）からの抽出物。
【図１１Ｂ】配列中にホスホチロシンを１つ有するＰｈｏｓＰｅｐペプチド対照で競合した、４−Ｃ１５Ｌ８−ＰＰ１によるα−カゼインのプルダウン。レーン１、陽性対照であるα−カゼイン；レーン２、α−カゼイン溶液（５００ｎＭ）とリン酸化ペプチドであるＰｈｏｓＰｅｐｌ（４００μΜ）由来の抽出物；レーン３、α−カゼイン溶液（５００ｎＭ）とリン酸化ペプチドであるＰｈｏｓＰｅｐｌ（４０μΜ）由来の抽出物；レーン４、α−カゼイン溶液（１００ｎＭ）とリン酸化ペプチドであるＰｈｏｓＰｅｐｌ（８０μΜ）由来の抽出物；レーン５、α−カゼイン溶液（１００ｎＭ）とリン酸化ペプチドであるＰｈｏｓＰｅｐｌ（８μΜ）由来の抽出物；レーン６、α−カゼイン（５００ｎＭ）とリン酸化ペプチドであるＰｈｏｓＰｅｐｌ（４００μΜ）からの、結合剤をもたないビーズ由来の抽出物である陰性対照。
【図１１Ｃ】４−Ｃ１５Ｌ８−ＰＰ１によるリン酸を枯渇させたα−カゼインのプルダウン。レーン１、陽性対照のα−カゼイン；レーン２、α−カゼイン溶液（５００ｎＭ）の抽出物；レーン３、８０％脱リン酸化したα−カゼイン溶液（５００ｎＭ）の抽出物。
【図１２】α−カゼインの総濃度（左側）及びα−カゼインの遊離濃度（右側）に対してプロットした蛍光強度。１７ｎＭの解離定数は１：１複合体の解離について記述している式の実験結果に対する最良適合から得られた。
【図１３】プルダウン実験のタンパク質混合物から抽出したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。このタンパク質混合物は、リゾチーム（１５ｋＤａ）、ホスホリラーゼＢ（９７ｋＤａ）、β−ガラクトシダーゼ（１１６ｋＤａ）、α−カゼイン及びオバルブミンを含んでいた。レーン１、プルロニックに共有結合させた４−Ｃ１５Ｌ８−ＰＰ１でコーティングしたビーズによる抽出物；レーン２、対照。α−カゼイン溶液（５００ｎＭ）中でインキュベートした、プルロニックでコーティングしたビーズによる抽出物；レーン３、５００ｎＭのタンパク質混合物；レーン４、α−カゼイン溶液（５００ｎＭ）中のキレート化Ｚｎ２＋を含まない４−Ｃ１５Ｌ８−ＰＰ１を担持するビーズによる抽出物；レーン５、タンパク質混合物中でインキュベートした、キレート化Ｚｎ２＋を含まない４−Ｃ１５Ｌ８−ＰＰ１を担持するビーズによる抽出物；レーン６、タンパク質混合物中で、Ｌｙｓ８がアセチル化された４−Ｃ１５Ｌ８ペプチドを担持するビーズによる抽出物。ゲル底部の弱いバンドは、分子量５ｋＤの結合剤分子のものである。４−Ｃ１５Ｌ８−ＰＰ１は、タンパク質混合物からα−カゼインを特異的に抽出する。
【図１４】４−Ｃ１５Ｌ８−ＰＰ１によるβ−カゼインのプルダウン。レーン１、対照であるβ−カゼイン；レーン２、１５０ｍＭのＮａＣｌを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．２、）に溶解したβ−カゼイン溶液（１００ｎＭ）からの抽出物；レーン３、陰性対照。５００ｎＭのβ−カゼイン溶液中、プルロニックでコーティングしたビーズによる抽出物。
【図１５Ａ】４−Ｃ１５Ｌ８−ＰＰ１による、牛乳及びヒト血清からのα−カゼインのプルダウン。Ａ）レーン１、陽性対照であるα−カゼイン。レーン２、１０倍希釈した牛乳からの抽出物。
【図１５Ｂ】牛乳及びヒト血清を用いた、４−Ｃ１５Ｌ８−ＰＰ１によるα−カゼインのプルダウン。Ｂ）レーン１、陽性対照であるα−カゼイン；レーン２、１００倍希釈し、５００ｎＭ濃度のα−カゼインを加えた陽性対照のヒト血清；レーン３、緩衝液で１００倍希釈し、５００ｎＭ濃度のα−カゼインを加えたヒト血清からの抽出物；レーン４、５００ｎＭのα−カゼインを加えた、希釈していないヒト血清からの抽出物；レーン５、１００倍希釈し、５００ｎＭのα−カゼインを加えたヒト血清からの、プルロニックのみでコーティングしたビーズによる抽出物。
【図１６】図１６は、ウレアプラズマ・ウレアリチクム（Ureaplasma urealyticum）由来のチミジンとＴＫの相互作用を示す棒状模型である。
【図１７】図１７は、ヌクレオチド並びに、ヌクレオチド一リン酸、二リン酸及び三リン酸の組成を示している。この図では核酸塩基はグアニンである。
【図１８】緩衝液Ａ（ＡＴＰを含まない）に溶解している３−Ｃ１５Ｌ８−ｄＴの、４５分後の蛍光スペクトル。データ点は４回個別に行った測定の平均値に相当する。
【図１９】緩衝液Ｂ（ＡＴＰを含まない）に溶解している３−Ｃ１５Ｌ８−ｄＴの、４５分後の蛍光スペクトル。データ点は４回個別に行った測定の平均値に相当する。
【図２０】緩衝液Ａ（ＡＴＰを含まない）に溶解している４−Ｃ１０Ｌ１７−ｄＴの、４５分後の蛍光スペクトル。データ点は４回個別に行った測定の平均値に相当する。
【図２１】緩衝液Ｂ（ＡＴＰを含まない）に溶解している４−Ｃ１０Ｌ１７−ｄＴの、４５分後の蛍光スペクトル。データ点は４回個別に行った測定の平均値に相当する。
【図２２】緩衝液Ａ（ＡＴＰを含まない）に溶解している４−Ｃ２５Ｌ２２−ｄＴの、４５分後の蛍光スペクトル。データ点は４回個別に行った測定の平均値に相当する。
【図２３】緩衝液Ｂ（ＡＴＰを含まない）に溶解している４−Ｃ２５Ｌ２２−ｄＴの、４５分後の蛍光スペクトル。データ点は４回個別に行った測定の平均値に相当する。
【図２４】ｄＴのＴＫに対する競合試験における３−Ｃ１５Ｌ８−ｄＴの蛍光スペクトル。試験は２０ｍＭのトリス緩衝液中で、２μΜの濃度のペプチドを用いて行った。データ点は３回個別に行った測定の平均値に相当する。
【図２５】ｄＴのＴＫに対する競合試験における２−Ｃ１０Ｌ１７−ｄＴの蛍光スペクトル。試験は２０ｍＭのトリス緩衝液中で、２μΜの濃度のペプチドを用いて行った。データ点は３回個別に行った測定の平均値に相当する。
【図２６】ｄＴのＴＫに対する競合試験における４−Ｃ１０Ｌ１７−ｄＴの蛍光スペクトル。試験は２０ｍＭのトリス緩衝液中で、２μΜの濃度のペプチドを用いて行った。データ点は３回個別に行った測定の平均値に相当する。図をより明瞭にするために、４２０〜４７５ｎｍのデータ点は除外している。
【図２７】ｄＴのＴＫに対する競合試験における３−Ｃ２５Ｌ２２−ｄＴの蛍光スペクトル。試験は２０ｍＭのトリス緩衝液中で、２μΜの濃度のペプチドを用いて行った。データ点は３回個別に行った測定の平均値に相当する。
【図２８】ＤＭＳＯ−ｄ６に溶解した１９の１Ｈ／１Ｈ−ＣＯＳＹ。
【図２９】図２９は、ビタミンＤ結合タンパク質に対する結合剤分子の模式図である。小分子リガンドが炭素８個のスペーサーを介して、ペプチド配列中のリシン残基の側鎖に連結されている。定量及びタンパク質に対する親和性を蛍光滴定するために、ダンシル蛍光色素分子が取り込まれている。
【図３０】図３０は、設計概念の模式図である。ビタミンＤ結合タンパク質と複合体を形成しているビタミンＤの結晶構造は、ビタミンＤの炭素１１が露出していることを示している。そのため、スペーサーを炭素１１と共有結合させた。
【図３１】図３１は、Ｄ二量体と複合体を形成しているＧＰＲＰの結晶構造を詳細に示すための模式図である。この場合、Ｎ−末端のグリシン残基が結合に必須である。ＧＰＲＰは、Ｃ末端のプロリンに連結している炭素６個のスペーサーを介してポリペプチド配列のリシン残基の側鎖に結合している。ポリペプチドのＮ−末端はアセチル化されており、配列にそれ以外のリシン残基が含まれていないことでＧＰＲＰ活性型エステルの特異的な反応を保障している。
【図３２】図３２は、Ｄ二量体に対する結合剤のスクリーニングから得た複数のセンサーグラムである。１ｎＭ、１０ｎＭ及び１００ｎＭの濃度の結合剤のみを使用した。注入は３分目に行い、排出時間を１０分とした。
【図３３Ａ】図３３Ａは、最も好ましい結合剤７種のＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ｐＨ７．４）中での、固定したＤ二量体への結合を示す複数のセンサーグラムである。Ａは、最も好ましい７種の単量体結合剤について示している。上段左から、３−Ｄ１５Ｌ８−ＧＰＲＰ、３−Ｄ１０Ｌ１７−ＧＰＲＰ、３−Ｄ２５Ｌ２２−ＧＰＲＰ、３−Ｄ３７Ｌ３４−ＧＰＲＰの結果である。下段は、４−Ｄ１５Ｌ８−ＧＰＲＰ、４−Ｄ１０Ｌ１７−ＧＰＲＰ、４−Ｄ２５Ｌ２２−ＧＰＲＰの結果である。
【図３３Ｂ】図３３Ｂは、最も好ましい結合剤７種のＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ｐＨ７．４）中での、固定したＤ二量体への結合を示す複数のセンサーグラムである。Ｂは、ＰＥＧスペーサーを有する二官能性リンカーによって二量体化した、Ａと同じ結合剤について示している。結合剤毎の取り込みを直接比較できるように、軸の単位を統一している。注入は３分目に行い、排出時間を１０分とした。
【図３４】図３４は、４−Ｄ１０Ｌ１７−ＧＰＲＰのＤ二量体への結合に及ぼすＧＰＲＰの阻害作用を示す複数のセンサーグラムである。左のセンサーグラムは、泳動用緩衝液中での、固定したＤ二量体への４−Ｄ１０Ｌ１７−ＧＰＲＰの結合を示している。緩衝液はｐＨ７．４とし、結合剤の濃度は０ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、４０ｎＭ、８０ｎＭ及び１６０ｎＭとした。中央のセンサーグラムは、泳動用緩衝液中での、固定したＤ二量体へのＧＰＲＰの結合を示している。緩衝液はｐＨ７．４で、結合剤の濃度は０μΜ、１μΜ、１０μΜ、１００μΜ及び１ｍＭとした。右側のセンサーグラムは、固定したＤ二量体への４−Ｄ１０Ｌ１７−ＧＰＲＰの結合を示している。結合剤の濃度はＧＰＲＰと競合する０ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、４０ｎＭ、８０ｎＭ及び１６０ｎＭとした。結合剤毎の取り込みを直接比較できるように、軸の単位を統一している。注入は３分目に行い、排出時間は１０分とした。
【図３５】図３５は、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）中での、４−Ｃ１５Ｌ８−ＧＰＲＰのＤ二量体タンパク質による滴定曲線を示している。実験データに１：１複合体の解離について記述している式を最良適合させると、解離定数Ｋｄは３ｎＭとなる。
【図３６】図３６は、スペーサーを有するＧＰＲＰリガンドの合成を示している。
【発明の詳細な説明】
【００１８】
本発明の目的のために、アミノ酸に関するＩＵＰＡＣの３字記号及びＩＵＰＡＣの１字記号の両方が使用され、それらは以下の通りである。
【００１９】
【表１】
2013542182.tif 000002
【００２０】
本発明のポリペプチド
いくつかの態様において本発明のポリペプチドは、配列番号１７〜３２のいずれか１種の配列を有し、必要に応じて、末端の片方又は両方を適切な保護基で保護してもよい。
【００２１】
本発明のいくつかの態様において本発明のポリペプチドは、配列番号１〜１６のいずれか１種の配列を有する。
一態様において本発明のこの組のポリペプチドは、
【００２２】
【化１】
2013542182.tif 000003
【００２３】
【化２】
2013542182.tif 000004
【００２４】
又はこれらのうちいずれかの、Ｃ−末端アミド化産物若しくはＮ−末端アシル化産物から選択される。
本発明の各ポリペプチドは、短いループで接続された２つの両親媒性らせんに折り畳まれるように設計されている。ポリペプチドのアミノ酸は、らせん又はループの形成性向に基づいて選択される。さらに、塩橋の形成、Ｎ−末端とＣ−末端のキャッピング、及びらせん双極子を安定させることが可能な残基を導入してらせん部分を安定化させた。ＮＭＲやＣＤ分光器、及び分析用超遠心による広範囲にわたる試験から、近縁のポリペプチド配列のファミリーはヘリックス−ループ−ヘリックスモチーフに折り畳まれ、これが二量体化して溶融球様の性質をもつ逆並行の４本のヘリックス束を形成することが確認された。一組１６種類のメンバーの内のコンジュゲートしていない配列の平均残基楕円率が、ヘリックス−ループ−ヘリックス二量体を形成する類似した配列の楕円率の範囲内に入ることが既に報告されている。ＣＤ及びＮＭＲ分光試験から、ヒト炭酸脱水酵素ＩＩに結合するように設計されたポリペプチドコンジュゲートは、溶融球様のヘリックス−ループ−ヘリックス二量体を象徴する特性をもつことが明かになっている。溶融球様特性をもつヘリックス−ループ−ヘリックス二量体を形成することが既に示されている数個の配列との相同性に基づき、本発明のポリペプチドも同様の折り畳み構造を形成すると仮定される。
【００２５】
本発明のポリペプチドの改変は、主に２つの点、電荷分布とリガンドの連結部位に焦点を当てて行われている。一態様において本発明のポリペプチドは、図１に示す配列を有する。図１で示すポリペプチドでは、ポリペプチドの全電荷は−７〜＋２と多様であり、かつ、改変された残基は全て、溶媒に曝される位置にある。リガンドに連結される残基、例えばリシン残基（図１では太字で示している）は、８、１７、２２及び３４番目の位置にある。ポリペプチドはヘリックス−ループ−ヘリックス二次構造（ヘリックスＩ−ループ−ヘリックスＩＩ）を形成し、指示位置にリガンドを連結することで、ヘリックスＩの先頭部分、ヘリックスＩの末端、ループ中、及びヘリックスＩＩの中程それぞれへの組み込みが可能になる。リガンドが連結する各部位の全電荷が４種類あり、リガンドの連結部位が４つあることから、合計で１６種類の配列が生じる。
【００２６】
ペプチド−タンパク質相互作用における結合エネルギーの大部分は、タンパク質表面の疎水性残基と折り畳まれたらせんの疎水性表面との疎水性相互作用によって生じると考えられる一方、電荷間の相互作用は選択性をもたらすと予測される。
【００２７】
ポリペプチドのアミノ酸のいくつかを、固体担体への連結部位を提供するように改変してもよい。例えばＡｌａ（例えば２４番目又は２５番目或いは改変することが可能な他のいずれかの部位にあるＡｌａ）を、適切な表面材料、例えば遊離チオール官能基と反応する反応性ジスルフィド基をもつ表面材料にジスルフィド結合を形成すること、又は例えば金表面に付着させることにより結合させることができるように、Ｃｙｓで置換してもよい。Ｃｙｓはまた、必要に応じて、さらなる官能基との連結部位として、例えば当業者には周知のマレイミド−チオール結合化学を用いた、例えばさらなるレポーター基との連結部位として、使用することができる。
【００２８】
本明細書で上述したように、好ましくはポリペプチドのＮ−末端及びＣ−末端のキャッピングが使用される。そのようなキャッピングが好ましくはあるが、絶対条件とは見なすべきではない。
【００２９】
当業者に周知のように、他の保護基を使用してＮ−末端及びＣ−末端の保護を行ってもよい。Ｎ−末端保護基の例としては、アセチル基の他に任意のアシル基、例えばＣ２−Ｃ６アルコキシカルボニル基が挙げられる。さらに、保護基はまた、例えばアルコキシカルボニル若しくはアリールオキシカルボニル基（例えばＣ２−Ｃ６アルコキシカルボニル基）、又はフェノキシ又はベンジルオキシカルボニル基であってもよい。Ｃ−末端のカルボキシル基は、アミド化（すなわち、一級アミド、二級アミド、又は三級アミド）による保護に加えて、例えばエステル化（すなわち必要に応じて置換されるアルキル又はアリールエステル）によっても保護することができる。他の保護基や、本発明のポリペプチドに含まれる任意の基の保護方法を、当業者は容易に考えつくことができ、かつ、文献、例えばPeter G. M. Wuts及びTheodora W. Greeneの「Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis」第４版、２００７、John Wiley and Sons編の中に見ることができる（その教示は参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【００３０】
いくつかの態様において本発明のポリペプチドは、配列番号１〜３２のポリペプチドのいずれか、例えば配列番号１〜１６、又は配列番号１７〜３２ではあるが、Ａｌａの代わりにＣｙｓを含む、具体的には２４番目の位置にＣｙｓを含む配列をも含む。
【００３１】
いくつかの態様では、本発明のポリペプチドのアミノ酸のいくつかを、例えば保護基と反応させることによって、又は類似の化学特性及び／又は構造特性をもつアミノ酸（天然に存在する又は天然に存在しないアミノ酸のいずれであってもよい）と置き換えること（すなわち保存的置換）によって誘導体化してもよい。
【００３２】
例えば、いくつかの態様では、リガンド及び／又はレポーター基とのアミド結合を形成する選択された残基をそれぞれ誘導体化する前に、ポリペプチドのアミノ酸を保護する必要がある場合がある。
【００３３】
周知のように、天然に存在するアミノ酸は、それらの側鎖の化学特性及び／又は構造特性に基づいて、いくつかの群（すなわち脂肪族アミノ酸であるＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅ；ヒドロキシ基又は硫黄を含む側鎖をもつアミノ酸であるＳｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、及びＭｅｔ；芳香族アミノ酸であるＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ及びＨｉｓ（Ｈｉｓは塩基性アミノ酸に分類してもよい）；塩基性アミノ酸であるＬｙｓ及びＡｒｇ（及びＨｉｓ）並びに酸性アミノ酸及びそれらのアミドであるＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ及びＡｓｎ）に分類することができる。従っていくつかの態様では、配列番号１〜３２に従ういずれか１種のポリペプチドのアミノ酸のいずれかを保存的置換、すなわち類似の化学特性及び／又は構造特性をもつアミノ酸、例えば本明細書上記で概略を示した同じ群に属するアミノ酸と置き換えること、によって置き換えてもよい。
【００３４】
さらに、上述の群に分類することができる多数の天然に存在しないアミノ酸が存在し、そのようなアミノ酸の多くが市販されている。例えば、アラニン（２−アミノプロパン酸）を２−メチルアラニン（２−アミノ−２−メチルプロパン酸）で置換してもよく、ロイシン（２−アミノ−４−メチルペンタン酸）をノルロイシン（２−アミノヘキサン酸）又はｔｅｒｔ−ロイシン（２−アミノ−３，３−ジメチル酪酸）などで置換してもよい。
【００３５】
いくつかの態様では、３系列及び４系列の５、１６及び２７番目の位置にあるロイシンはそれぞれ、ノルロイシンで置換されている。
ポリペプチドの１以上のアミノ酸を他のアミノ酸（天然の又は非天然のアミノ酸）で置換する場合、ポリペプチドの正味電荷の合計が保持されることが好ましい。しかしながらいくつかの態様では、正味電荷の合計は変わってもよい。
【００３６】
リガンドとの連結部位になっているアミノ酸（すなわち、８、１７、２２及び３４番目のそれぞれ）及びレポーター基との連結部位になっているアミノ酸（すなわち、１０、１５、２５及び３７番目それぞれのアミノ酸）は、リガンド及びレポーター基のそれぞれと、アミド結合を形成することができるものを選択すべきである。そのため、前記アミノ酸は好ましくは、一級アミン官能基を有するペンダント基（ポリペプチド鎖、又は「アミノ酸残基」の形成には含まれない残基）を含む。このアミノ酸は天然であっても非天然であってもよい。
【００３７】
連結部位になっているアミノ酸を、リガンド又はレポーター基それぞれとのアミド結合を形成することができるようにするには、好ましくは、本明細書で後述するように、レポーター又はリガンド基を、その活性エステルを形成することによって誘導体化する。
【００３８】
上述したことを踏まえて、配列番号１〜１６に従ういずれか１種のポリペプチドでは、任意のリシンを適切な相同物又は誘導体で置換してもよいことを検討する。ただしそのリシンがリガンド又はレポーターとの連結部位となっている場合には、リガンド又はレポーターの活性エステルとの結合形成能を保持する。例えば、リシン（２，６−ジアミノヘキサン酸）をオルニチン（２，５−ジアミノペンタン酸）で、又は２，４−ジアミノ酪酸で或いはこれらの他の炭素鎖相同物のいずれかで、例えば分岐鎖を有するもので置換してもよい。
【００３９】
さらに、いくつかの態様では、配列番号１〜３２に従ういずれか１種のポリペプチドの任意のアミノ酸を、類似の化学特性及び／又は構造特性を有する修飾されたアミノ酸のいずれかで置換してもよい。
【００４０】
いくつかの態様において本発明のポリペプチドは、当業者には周知のように、保護基を組み込むことで修飾したアミノ酸を含んでもよい。「Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis」（上記）もまた参照のこと。例えば、リガンドの活性エステルが結合する時に、リガンドが連結するリシンのみに接続できるように、適切な保護基が用いられる。
【００４１】
８、１０、１５、１７、２２、２５、３４及び３７番目に位置するアミド結合形成アミノ酸は好ましくはリシンである。しかしながらいくつかの態様では、リガンド及びレポーター基それぞれが連結している８、１０、１５、１７、２２、２５、３４及び３７番目のいずれか１つは、同等のアミノ酸若しくはアミノ酸類似物、又は修飾されたアミノ酸のいずれかであってもよい。ただし、このアミノ酸又はアミノ酸類似物が選択したリガンドやレポーター基と連結することができる場合に限る。そのため、例えばアミド形成アミノ酸は、オルニチン又は２，４−ジアミノ酪酸若しくはこれらの炭素鎖相同物のいずれか、例えば分岐鎖をもつものと同等のものであってもよい。
【００４２】
いくつかの態様において配列番号１〜３２に従ういずれか１種のポリペプチドについて述べる場合には、上述した置換又は修飾のいずれかによって得られるこれらのいかなる変異体をも含む。
【００４３】
いくつかの態様では、本発明のポリペプチドは二量体形態である。この場合この二量体は、配列番号１〜３２に従ういずれか１種のポリペプチドを２つ、例えば配列番号１〜１６に従ういずれか１種のポリペプチド、又は本明細書で上述したこれらの変異体のいずれか２つを含んでいてもよい。二量体のポリペプチドは、非共有結合（本発明のポリペプチド溶液中で自然に形成される可能性のある結合）、又は共有結合（１つ若しくは数個のジスルフィド結合による）のいずれかを介して互いが結合されていてもよい。
【００４４】
分子ツール
本明細書で上述したように、一側面では、本明細書上記で定義した複数のポリペプチドを含む分子ツールを提供する。例えば、本発明の一組のポリペプチドは、本明細書上記で定義した、１６種類のヘリックス−ループ−ヘリックスポリペプチド、例えばリガンドが８、１７、２２又は３４番目の位置に、レポーター基が１０、１５、２５及び３７番目の位置にそれぞれ連結することができるアミノ酸を有し、かつ、正味電荷が通常、負（例えば−７）から正（例えば＋２）と多様である、１６種類の４２−アミノ酸ポリペプチドを含んでいてもよい。そのようなポリペプチドの例を配列表で提供しているが、当業者はこれらポリペプチドの修飾変異体を、例えばこれらのポリペプチドのアミノ酸のうちの１つ又は数個を保存的置換することによって、又はポリペプチドのアミノ酸を化学修飾することによって、調製することができる。さらに、当然のことながら本発明の１６種類のポリペプチドの部分集団を使用してもよく、又はより大きな集団、例えばさらなるポリペプチドを含む集団を用いてもよい。これら全変異体が本発明の範囲内にあると見なされる。
【００４５】
一態様において分子ツールは、配列番号１〜３２に従う配列を有する一組のポリペプチドを含む。
一態様において分子ツールは、配列番号１〜１６に従う配列を有する一組のポリペプチドを含む。
【００４６】
いくつかの態様において分子ツールは、配列番号１７〜３２に従う配列を有する一組のポリペプチドを含む。
他の態様において分子ツールは、図１に従う配列を有する一組のポリペプチドを含む。
【００４７】
いくつかの他の態様において分子ツールは、配列番号１〜３２から選択されるが３系列及び４系列の５、１６及び２７番目のロイシンがそれぞれノルロイシン（１字記号はＪ）で置換されている、一組のポリペプチドを含む。
【００４８】
その上さらに他の態様において分子ツールは、配列番号１〜１６から選択されるが、３系列及び４系列の５、１６及び２７番目のロイシンがそれぞれノルロイシン（１字記号はＪ）で置換されている、一組のポリペプチドを含む。
【００４９】
その上さらに他の態様において分子ツールは、配列番号１〜３２から選択され、片方又は両方のポリペプチド末端が保護基を有している、一組のポリペプチドを含む。
従って、一態様において分子ツールは、一組のポリペプチド
【００５０】
【化３】
2013542182.tif 000005
【００５１】
【化４】
2013542182.tif 000006
【００５２】
又はこれらいずれかのＣ−末端アミド化産物又はＮ−末端アシル化産物を含む。
この組のポリペプチドは好ましくは、２〜１６種類の異なるポリペプチド、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６種類の異なるポリペプチドを含む。例えばこの組は、配列番号１〜３２、例えば１〜１６のいずれか１種から選択される少なくとも２種の異なる配列番号の配列を有するポリペプチドを含む。
【００５３】
例えば、適切な一組は、少なくとも３種の異なる配列番号、又は少なくとも４種の異なる配列番号、例えば少なくとも５種の異なる配列番号、少なくとも６種の異なる配列番号、少なくとも７種の異なる配列番号、少なくとも８種の異なる配列番号、少なくとも９種の異なる配列番号、少なくとも１０種の異なる配列番号、少なくとも１１種の異なる配列番号、少なくとも１２種の異なる配列番号、少なくとも１３種の異なる配列番号、少なくとも１４種の異なる配列番号、又は少なくとも１５種の異なる配列番号のポリペプチドを含んでいてもよい。いくつかの好ましい態様においてこの組は、１６種類の配列番号、例えば配列番号１〜１６又は配列番号１７〜３２に従うポリペプチドを含む。
【００５４】
少なくとも１６種類のポリペプチド（リガンドを組み込むための部位を４箇所有し、リガンドを組み込むための各部位の電荷が４箇所とも異なる）を含むツールを使用することが好ましい。この理由は、所定のリガンドと組み合わせた場合に、どのポリペプチドが最適な結合親和性及び選択性を生じるかを予測することは、不可能とは言わないまでも、非常に難しいからである。そのため、配列表にある１６種類の配列全てに基づいた一組のポリペプチドを分子ツールとして使用することが、最もよい結果を生じると考えられる。しかしながら、この配列のうちのいくつかのみに基づく部分集団ポリペプチドの使用、又はさらなるポリペプチド（例えば、保存的置換でアミノ酸を変化させることによって得られる）を含めることもまた可能であると考えられる。
【００５５】
いくつかの態様においてこの組は、アミノ酸配列中の電荷が全て同じポリペプチドを含むが（図１参照）、他の態様では、この組に含まれるポチペプチドのうちのいくつかは異なる電荷を有する。その上さらに他の態様においてこの組は、電荷が全て異なるポリペプチド、例えば、電荷は異なるがアミノ酸配列中のリガンド連結位置が同じポリペプチドを含む。
【００５６】
小分子リガンドは、８、１７、２２及び３４番目にあるリシン残基の側鎖に連結している。根底にある設計原理は、最適な選択性及び親和性には、小分子とポリペプチドが協調して結合に寄与しなければならないというものである。リガンドはスペーサーを介してポリペプチドに連結されていてもよく、スペーサーの機能は、小分子先端部の結合部位に隣接している相補的な結合部位の形状と電荷を、ポリペプチド構造が見つけられるようにすることである。従って、スペーサーの選択は一般に、結合剤開発の重要な側面である。
【００５７】
用いることができるスペーサーの例を実施例で、特定のリガンドとの関連で示しているが、これらのスペーサーはまた、他のリガンドと共に用いることができる。当業者は、用いることができる他のスペーサー分子を容易に考えつくだろう。例えばスペーサーは、炭素原子が１〜１２個の脂肪族鎖であってもよく、この脂肪族鎖を親水性の基で置換して、溶解度を高めてもよい。いくつかの例では、スペーサーが１２炭素原子よりも長くなければならないかも知れないが、その場合には、溶解度の問題が生じる可能性がある。このような問題を緩和するためには、スペーサーの骨格に１つ又は数個の極性基を導入するか、或いはスペーサーの骨格を１つ又は数個の極性基で置換することができる。
【００５８】
リガンドの活性エステル（必要に応じてスペーサーを含む）及びレポーターそれぞれにポリペプチドを接触させることによって、リガンド（必要に応じてスペーサーを含む）及びレポーター基をポリペプチドに連結させることができる。リガンドＬ（又はレポーターＲ）の活性エステル誘導体は、一般式（Ｉ）
Ｑ−ＣＯＯＲ１（Ｉ）
を有し、式中、ＱはリガンドＬ又はレポーターＲであり、Ｒ１はｐｅａが約６〜８の脱離基、例えばニトロフェニルである。
【００５９】
リガンドＬがスペーサーを介してポリペプチドに連結されている例では、活性エステル誘導体は式（Ｉ’）
Ｌ−Ｘ−ＣＯＯＲ１（Ｉ’）
で表される場合があり、式中、Ｘはスペーサーを表す。例えばＸが、炭素原子が１〜１２個の脂肪族鎖である例では、活性エステル誘導体は式（Ｉ’）
Ｌ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＲ１（Ｉ’）
で表される場合があり、式中、ｎは１〜１２の整数である。
【００６０】
ｎが４、６又は１１であり、かつ、Ｒ１がｐ−ニトロ−フェニルの活性エステルの合成例が国際公開第０７／１１７２１５号に記載されており、その内容は全て本明細書に組み込まれる。
【００６１】
レポーター基はアミド形成残基の側鎖、例えば１０、１５、２５及び３７番目の位置にあるリシン残基に連結されており、かつ、ポリペプチド又はポリペプチドコンジュゲートに連結された場合には通常、標的分子とポリペプチド又は標的分子とポリペプチドコンジュゲートそれぞれの間の相互作用の指標となる検出可能なシグナルを生成可能な基である。レポーター基の好ましい例としては、蛍光プローブ、例えばダンシル、クマリン、フルオレセイン、ローダミン及びオレゴングリーン誘導体が挙げられる。レポーター基はまた、ホスホエノールピルビン酸キナーゼなどの酵素であってもよい。レポーター基を製造業者の説明に従って、又は他の慣習的な方法で、例えば活性エステル誘導体として、アミド形成残基に連結させることができる。
【００６２】
４２−アミノ酸ポリペプチドを以下のように分類してもよい。
【００６３】
【表２】
2013542182.tif 000007
【００６４】
本発明の一側面では、標的分子に結合可能なリガンド−ポリペプチドコンジュゲートのスクリーニング方法を提供し、この方法は、
配列番号１〜３２から選択される配列を有するポリペプチドを含む少なくとも１つのコンジュゲート分子を提供する工程、
標的分子とコンジュゲート分子を接触させる工程；及び
レポーター基由来のシグナルを検出する工程を含み、
前記ポリペプチドは標的分子に対するリガンドを有し、該リガンドはこのリガンドとアミド結合を形成することができるアミノ酸とアミド結合によって連結されており、前記アミノ酸はこのポリペプチド配列の８、１７、２２、及び３４番目から選択される位置にあり、かつ、前記ポリペプチドはレポーター基を有し、該レポーター基はこのレポーター基とアミド結合を形成することができるアミノ酸とアミド結合で連結されており、前記アミノ酸はこのポリペプチド配列の１５、１０、２５及び３７番目から選択される位置にある。
【００６５】
本発明の方法で使用するポリペプチドは本明細書上記で記述したものである。例えば、リガンド又はレポーター基とアミド結合を形成することができるアミノ酸は好ましくは一級アミン官能基（すなわち−ＮＨ２）を含み、いくつかの態様では、前記アミノ酸はリシン、オルニチン又は２，４−ジアミノ酪酸から選択される。
【００６６】
従って、一態様においてこのスクリーニング方法は、
配列番号１〜１６から選択される配列を有するポリペプチドを含む少なくとも１つのコンジュゲート分子を提供する工程、
標的分子をコンジュゲート分子と接触させる工程；及び
レポーター基由来のシグナルを検出する工程を含み、
前記ポリペプチドは標的分子に対するリガンドを有し、該リガンドは８、１７、２２、及び３４番目から選択される位置のリシンに連結されており、かつ、前記ポリペプチドはレポーター基を有し、該レポーター基は１５、１０、２５及び３７番目の位置から選択される位置のリシンに連結されている。
【００６７】
本発明の一態様は一組のコンジュゲート分子を提供する工程を含み、このコンジュゲート分子は、
対応する一組のリガンド−レポーター−ポリペプチドコンジュゲートを得るために、本発明の一組のポリペプチドの１つ１つのポリペプチドに、標的分子に対するリガンドと標的分子への結合を検出するためのレポーターを連結させること、
標的分子と１つ１つのリガンド−レポーター−ポリペプチドコンジュゲートを接触させること、及び
レポーター基由来のシグナルを検出することによって得られる。
【００６８】
さらなる側面において本発明は、リガンドがポリペプチドに連結されていない場合と比較して高い親和性及び選択性をもつ、標的分子に結合可能なリガンド−ポリペプチドコンジュゲートのスクリーニングによって得られる製品に関する。この製品は例えばリガンド−ポリペプチドコンジュゲートであっても、又はリガンド−ポリペプチドコンジュゲートに加えて１以上の他の基、例えばレポーター基、ポリペプチドの固体担体への連結を可能にする基などを含むものであってもよい。本発明のスクリーニング方法で得られる製品としてのリガンド−ポリペプチドコンジュゲートの数例を、本明細書下記で提供する。また、これらの製品及びその可能な変異体、例えばコンジュゲートのポリペプチドのアミノ酸の保存的置換で得られる変異体も、全て本発明の範囲に含まれる。
【００６９】
本発明のリガンド−ポリペプチドは、生物工学の分野及び医薬の分野に広く応用することができる。一側面では、本発明によるリガンド−ポリペプチドの治療での使用を提供する。例えば、一側面において本発明は、診断法で使用するための本発明に従うリガンド−ポリペプチドコンジュゲートを提供する。別の側面では本発明は、生体内画像化法で使用するための本発明に従うリガンド−ポリペプチドコンジュゲートを提供する。
【００７０】
本発明のリガンド−ポリペプチドコンジュゲートのいくつかの例を以下に提供するが、本発明の分子ツールが多様であることから、応用分野が非常に多岐にわたっていること、及び医学的に興味が持たれている多数のタンパク質（例えば病態に関わることが知られている又は予測されている様々な酵素や受容体）に対する、高親和性で紺選択性の結合剤の開発が可能であることを当業者は理解するだろう。
【００７１】
本発明で提供されるリガンド−ポリペプチドコンジュゲートは、治療で使用される可能性のあるものだけに限定されるものではない。むしろ本発明のリガンド−ポリペプチドコンジュゲートは、あらゆる生物工学的な用途において、例えば法医学的な方法又はタンパク質の精製、例えば大規模（工業規模）なタンパク質の精製において有用となる可能性がある
【実施例】
【００７２】
実施例１
実施例１では、ヒトアセチルコリンエステラーゼ、ｈＡＣｈＥ、を標的分子として用いた。
【００７３】
ｈＡＣｈＥは、神経信号の伝達に重要な反応でアセチルコリンを加水分解してコリンを形成するため、化学兵器戦争の標的である。サリン、ソマン及びＶＸなどの神経ガスは、ｈＡＣｈＥを阻害し、曝露された人が重傷を負う又は死亡する程度までその活性を低下させることで作用する（Evison, D., Hinsley, D. and P. Rice. British Medical Journal.2002, 324, 332-335. Marrs, T. Pharmacy. Ther. 1993, 58, 51-66）。さらに、アセチルコリンの減少がアルツハイマー病の一因であり（Talesa, V. N. Mechanisms of Ageing and Development 2001,122, 1961-1969. Perry, E. K.;Tomlinson, B. E.; Blessed, G.; Bergmann, K.; Gibson, P.H.; Perry, R. H. British Medical Journal, 1978, 2, 1457-1459. Perry, E. K.; Perry, R. H.; Blessed, G.; Tomlinson, B. E.. Neuropathology and Applied Neurobiology 1978, 4, 273-277）、ｈＡＣｈＥを阻害すると症状が軽減される（Polinsky R. J. Clin .Ther. 1998, 20, 4, 634-647）ことから、ｈＡＣｈＥは重要な薬物標的である。そのためｈＡＣｈＥに対する選択的で高親和性の結合剤は、多くの生物医学用途で非常に関心をもたれている。
【００７４】
結果及び考察
設計と合成
結合剤の設計への活性部位阻害剤の使用は魅力的である。というのも、標的酵素、特に、確立・検証されているタンパク質に対する親和性が中程度で選択性のよい有機小分子が得られることが多いからである。ｈＡＣｈＥの例では、数種の阻害剤が文献で報告されており（Mooser, G.; Sigman, D .S. Biochemistry 1974, 13, 2299-2307; Taylor, P.; Lappi, S. Biochemistry, 1975, 14, 1989-1997; Nolte, H.-J.; Rosenberry, T. L.; Neumann, E. Biochemistry, 1980, 19, 3705-3711）、既知の阻害剤で、報告されている親和性が３０〜１００ｎＭの範囲にある９−アミノアクリジン（Steinberg, G.M.; Mednick, M.L.; Maddox, J.; Rice, R.:Cramer, J. J Med Chem 1975, 18, 1056-1061. Radic, Z., Taylor, P. J Biol. Chem. 2001, 276, 4622-4633, 2001）を選択した。しかしながら活性部位阻害剤を使用したｈＡＣｈＥに対する結合剤は、ｈＡＣｈＥの活性部位が深さ２０Åの穴の中に位置していることから、特有の問題を生じる（Sussman, J. L.; Harel, M.; Frolow, F.; Oefner, C; Goldman, A.; Toker, L.; Silman, I. Science 1991, 253, 872-9. Shafferman A.; Kronman C; Flashner Y.; Leitner; Grosfeld H; Ordentlich A.; Gazes H; Cohen S.; Ariel N.; Barak D.; Hare M.; Silman I.; Sussman J. L.; Vela B. J.Biol.Chem. 1992, 267, 17640-17648）。そのため、ｈＡＣｈＥに対する阻害剤をポリペプチド構造に結合させるには、活性部位阻害剤とポリペプチドを、それら固有の結合エピトープに同時に結合させることが可能な長さのスペーサーが必要である。そのためポリペプチドコンジュゲートの設計には、適切なスペーサーと、スペーサーをリガンドに連結させるための適切な部位を選択する工程が含まれる。脂肪族スペーサーは穴の中でも親密に結合し、疎水性相互作用によって活性部位に至ると予測されるが、２０Åの脂肪族鎖の疎水性はまた、溶解度に関する懸念をもたらす。さらに、構造と阻害剤を組み合わせることによるエントロピーの増大は、より短いスペーサーによるものほど大きくない可能性がある。
【００７５】
本発明の、一組１６種類のポリペプチド配列（図１）を使用した。各ポリペプチドの全電荷を４工程で−７〜＋２の範囲で変化させ、かつ、変化させた残基は全て、溶媒に曝される位置にあった。リガンドを連結させるために用いたリシン残基は８、１７、２２及び３４番目の位置にあり、これによって、ヘリックスＩの先頭部分、ヘリックスＩの末端部分、ループ中、及びヘリックスＩＩの中程それぞれへの組み込みが可能になった。
【００７６】
選択的に脱保護したリシン残基、すなわち１０、１５、２５及び３７番目に位置しているそれぞれのリシン残基の側鎖に７メトキシクマリン−３−カルボン酸を結合させることによって、各ポリペプチドをレポーター基、すなわちクマリンプローブで修飾した。タンパク質に結合すると分子環境が変化して蛍光強度に影響を及ぼすため、蛍光色素分子によって標的分子との結合を測定することが可能になった。
【００７７】
９−アミノアクリジンリガンドは、よく研究されている活性部位阻害剤である（Shafferman A.; Kronman C; Flashner Y.; Leitner ; Grosfeld H.; Ordentlich A.; Gazes H; Cohen S.; Ariel N.; Barak D.; Hare M.; Silman I.; Sussman J. L.; Vela B. J.Biol.Chem. 1992, 267, 17640-17648. Olofsson, S.; Johansson, G.; Baltzer, L. J. Chem. Soc, Perkin Trans. 2 1995, 2047-56. Olofsson, S.; Baltzer, L. Fold. Des. 1996, 1, 347-356. Andersson, L.; Stenhagen, G.; Baltzer, L. J. Org. Chem. 1998, 63, 1366-1367. Broo, K. S.; Brive, L.; Ahlberg, P.; Baltzer, L. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 11362-11372）。ｈＡＣｈＥの結晶構造の解析により、活性部位がタンパク質の中に、深さ２０Åのポケットの中に埋め込まれていることが明らかになった（Dupre, D. J.; Robinson, F. A. J. Chem. Soc. 1945, 549-51）。従ってスペーサーは、互いが２０Åの距離にある、タンパク質表面上のエピトープに結合することができるポリペプチドと活性部位に結合することができるアクリジン残基とを適合させることができるものである必要がある。そのようなスペーサーは、標的親和性だけを考慮した場合には、好ましくは脂肪族である。しかしながら、メチレン基が１５を越える脂肪族スペーサーの疎水性は、合成及びポリペプチド結合で溶解度の問題を生じるレベルであり、かつ、溶解特性が向上した、そのような長いスペーサーを構築するための別の方法では、中央に極性基をもつ２本のセグメントを調製することになる。
【００７８】
ポリペプチド複合結合剤とタンパク質のコンジュゲートの高分解能構造はまだ利用可能ではなく、結合を制御する正確な相互作用は推測することしかできない。阻害剤が活性部位に結合すると直観的に予測されたが、ヒト炭酸脱水素酵素ＩＩの例（Perry, E. K.;Tomlinson, B. E.; Blessed, G.; Bergmann, K.; Gibson, P.H.;Perry,R. H. British Medical Journal, 1978, 2, 1457-1459）及びＣ反応性タンパク質の例（Talesa, V. N. Mechanisms of Ageing and Development 2001,122, 1961-1969）で検証された仮説では、ポリペプチドとタンパク質との相互作用は未だ推測である。スペーサーを高エネルギー配座にさせることなく、さらに先端部の活性部位中での位置を変えることなく、スペーサーがポリペプチドと先端部を同時に結合させることができる場合にのみ、コンジュゲートは密に結合する。ポリペプチド構造に対する結合エピトープを正確に予測することが難しいため、スペーサー法では、大きさにある程度の柔軟性をもたせることができるようにしなければならない。ポリペプチドに結合させるためのスペーサーは、６−アミノヘキサン酸と８−アミノオクタン酸の全４種類の組み合わせを合成することによって調製した（模式図１）。
【００７９】
長さが異なる３種のスペーサーを提供することに加え、中間アミド基の位置が異なる２種のスペーサーを得た。スペーサーの長さが短いほど選択性が高くなると予測したが、ｈＡＣｈＥの結晶構造からはスペーサーの最適な長さが予測できなかったこと、及びその後の応用にも関心がもたれることから、４種全てのスペーサーを合成した。リガンドが迅速かつ部位特異的にポリペプチドに結合するように、配列に含まれる遊離リシン残基を１つのみとし、リガンドを活性エステルとして調製した。
【００８０】
模式図１に示すように、リガンドとスペーサーの組み合わせ、９、１０、１１及び１２を合成した。
【００８１】
【化５】
2013542182.tif 000008
【００８２】
模式図１。ａ）ｉ．ＳＯＣｌ２、無水ベンゼン、Ｎ２、加熱、ｉｉ．フェノール、Ｋ２ＣＯ３、無水ＤＭＦ、Ｎ２、加熱。ｂ）６−アミノヘキサン酸又は８−アミノオクタン酸、無水ＤＭＦ、Ｎ２、加熱。ｃ）ｉ．ＤＩＰＥＡ、ＨＡＴＵ、ｉｉ．６−アミノヘキサン酸又は８−アミノオクタン酸、Ｎ２、無水ＤＭＦ、室温。ｄ）ｉ．Ｅｔ３Ｎ、ｉｉ．クロロギ酸４−ニトロフェニル、０℃。ｉｉｉ．ＤＭＡＰ、０℃〜室温、ＭｅＣＮ。
【００８３】
模式図１を参照し、文献で報告されているように（Dupre, D. J.; Robinson, F. A. J. Chem. Soc. 1945, 549-51. Ghaneolhosseini, H.; Tjarks, W.; Sjoberg, S. Tetrahedron 1998, 54, 3877-3884）９−クロロアクリジンをその場で形成し、次いでフェノールで芳香族求核置換を行うことにより、９−フェノキシアクリジン（２）を合成した。９−フェノキシアクリジン（２）を６−アミノヘキサン酸又は８−アミノオクタン酸と反応させて３又は４をそれぞれ形成する。６−アミノヘキサン酸又は８−アミノオクタン酸と３又は４中のカルボン酸官能基とをカップリングさせるために最も有効な試薬はＨＡＴＵであり、化合物５、６、７及び８を生じた。カルボン酸は、相当する酸をＨＡＴＵ及びＤＩＰＥＡと共に約１時間撹拌することで予め活性化させておいた。未反応の出発材料と２個目のアミンのカップリングを最小限に抑えるには、ＨＡＴＵを１．１〜１．５当量とするのが最もよい。他のカルボン酸のための文献に記載されている方法により（Gagnon, P.; Huang, X.; Therrien, E.; Keillor, J. W. Tetrahedron Lett. 2002, 43, 7717-7719）、酸５、６、７及び８をそれらのｐ−ニトロフェノールエステルとして活性化させた。エステルの加水分解を最小限に抑えるために、ＨＰＬＣ精製の後、生成物を含む画分を直接液体窒素中で凍結させ、その後、凍結乾燥によって溶媒を除去した。
【００８４】
従って、以下のリガンド−スペーサー部分がポリペプチドのリシンに連結した。
【００８５】
【化６】
2013542182.tif 000009
【００８６】
ｈＡＣｈＥに対するポリペプチドコンジュゲート結合剤の同定と親和性
活性エステル９を、本発明の１６種類のポリペプチドのこの組のメンバーそれぞれにカップリングさせ、スクリーニング手順内で、ｈＡＣｈＥに対するそれぞれの親和性を評価した。各ポリペプチド結合剤候補を５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、タンパク質を加えた後の最終濃度が５００ｎＭになるように、マイクロ滴定プレートの９つのウェルに分配した。貯蔵液からのｈＡＣｈＥ分割量を、３つのウェルではタンパク質の最終濃度が５００ｎＭになるように、その他の３つのウェルではタンパク質の最終濃度が１０００ｎＭになるように加えた。簡単に言うと、各結合剤を３工程で滴定し、各測定を３回重複して行った。結合剤に１当量のタンパク質を加えると、タンパク質を加えない結合剤と比較して強度が有意に変化するが、１当量のタンパク質をさらに加えても、それ以上強度の変化は起こらないことから、最初のタンパク質添加後の結合が９０％を越えたと仮定した。その仮定に基づくと、解離定数Ｋｄは１０ｎＭ以下であると推測でき、これらの基準を満たした結合剤を「的中」と見なした。ポリペプチド４−Ｃ１０Ｌ１７−Ａｃ（４−Ｃ１０Ｌ１７のＣ−末端をアシル化したもの）を選抜し、選択性に関してもこのスクリーニング手順中で評価し、このポリペプチドを９−アミノアクリジンに結合させると、小分子よりも親和性が高い結合剤が得られたことが示された。マイクロ滴定プレートリーダーを用い、励起３５０ｎｍ、発光４２０ｎｍとして、２９８Ｋで蛍光強度を測定した。
【００８７】
ウプサラ大学病院（Uppsala University hospital）から提供された髄液（ＣＳＦ）からのｈＡＣｈＥの捕捉を監視することによって、４−Ｃ１０Ｌ１７−Ａｃの選択性を決定した。ＣＳＦは、高濃度では他の数種のタンパク質と共に複雑な生物的環境を構成し、その後の応用に関して非常に興味の持たれるものの１つである。選択した結合剤を、２４番目の位置にＡｌａの代わりにアセトアミドメチル−（Ａｃｍ−）で保護されたＣｙｓ残基を加えて再合成し、Ａｃｍ脱保護の後、プルロニック（登録商標）Ｆ１０８−ＰＤＳでコーティングされたポリスチレン製のナノ粒子にジスルフィド結合形成によって連結した。コーティング剤は、２−メルカプロピリジン放出下で遊離チオールと自発的に反応する、活性型のジスルフィド基を有するＰＥＧの単層を形成する。官能性ナノ粒子をＣＳＦ中で１時間インキュベートし、その後遠心分離して上清を除去した。粒子を緩衝液に入れてインキュベートすることで３回洗浄し、その後遠心分離して上清を除去した。洗浄工程の後、粒子をＥＬＩＳＡとゲル電気泳動で解析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析用には、ジチオスレイトールを使用して結合剤を粒子から切断し、遠心分離によって粒子から分離して上清を電気泳動ゲルに負荷した。残念ながら、高濃度で含まれ、ポリスチレン製ビーズに非特異的に吸着されるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のバンドからｈＡＣｈＥ由来のバンドを分離することはできなかった（図２）。ＨＳＡの吸着は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの対照実験で示された。この対照実験では非官能性ビーズを同じ患者ＣＦＳと、結合剤コンジュゲートについて記載したのと同じようにインキュベートし、同一の方法で処理した。
【００８８】
４−Ｃ１０Ｌ１７−ＡｃによるｈＡＣｈＥの捕捉を、発光に基づくナノ粒子ＥＬＩＳＡによっても解析した。ＥＬＩＳＡ実験では、洗浄したビーズの分割量を、西洋ワサビペルオキシダーゼと予めコンジュゲートさせておいた抗ｈＡＣｈＥポリクローナル抗体と共にインキュベートした。３回の洗浄工程の後、基質であるルミノールを加え、得られた発光シグナルを記録した。参照として結合剤の付いていない粒子を、結合剤を有する粒子と同様に同じ患者由来のＣＳＦ中でインキュベートし、処理した。サンドイッチＥＬＩＳＡでは、結合剤がコンジュゲートしている粒子がｈＡＣｈＥを捕捉し、４−Ｃ１０Ｌ１７−ＡｃがｈＡＣｈＥをＣＳＦから選択的に、ＣＳＦ中に見られる全タンパク質と競合して、抽出できたことが示された（図２）。参照粒子由来の上清からもシグナルが得られたが、機能性ビーズのシグナルよりもずっと弱かった。バックグランドシグナルは、使用した抗体コンジュゲートのレベルが高かったことが原因の可能性があり、それを完全に除去するのは難しいと思われる。この結果は、患者から回収したＣＳＦからｈＡＣｈＥが選択的に抽出されたこと、及び結合剤である４−Ｃ１０Ｌ１７−Ａｃが、ＨＳＡなどの高濃度タンパク質やＣＳＦに含まれる他の全てのタンパク質との相当な競合がある測定環境でもｈＡＣｈＥに対する高い親和性及び選択性をもつことを示している。
【００８９】
結論
９−アミノアクリジンを一組のポリペプチド構造の各メンバーに結合させることで、ｈＡＣｈＥに対する高い親和性及び選択性をもつ結合剤である４−Ｃ１０Ｌ１７−Ａｃを得ることが可能になった。その特性は抗体の特性と同等であるが、大きさはＩｇＹの僅か１／３０である。この結果は、結合剤の開発に、覆われた結合ポケットをもつ酵素に対する小分子阻害剤を使用できることを示している。
【００９０】
実験
一般
精製ヒトアセチルコリンエステラーゼをシグマ・アルドリッチから購入した。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを、Varian Unity Inova 500分光計を４９９．９ＭＨｚで操作し、ＣＤＣl３（７．２６ｐｐｍ）、ＣＤ３ＯＤ（３．３１ｐｐｍ）、９：１のＣＤ３ＣＮ：Ｄ２Ｏ（１．９４ｐｐｍ）、アセトン−ｄ６（２．０５ｐｐｍ）又はＤＭＳＯ−ｄ６（２．５０ｐｐｍ）で記録した。１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、Varian Unity 400分光計を１００．６ＭＨｚで操作し、ＣＤＣｌ３（７７．０ｐｐｍ）、ＣＤ３ＯＤ（４９．０ｐｐｍ）、９：１のＣＤ３ＣＮ：Ｄ２Ｏ（１．３２ｐｐｍ）、アセトン−ｄ６（２９．８４ｐｐｍ）又はＤＭＳＯ−ｄ６（３９．５２ｐｐｍ）で記録した。スペクトルは全て２５℃で記録した。ＮＭＲスペクトルの割当に使用した番号付けを模式図２に示す。フラッシュクロマトグラフィーにはメルクのシリカゲル６０（２３０〜４００メッシュ）を使用した。ＴＬＣはメルクのシリカ６０Ｆ２５４ゲルを使用して実施した。ＴＬＣ又は分析用ＨＰＬＣ−ＭＳ−ＥＬＳＤを使用して反応を監視した。分析用逆相ＨＰＬＣ−ＭＳ−ＥＬＳＤはThermoquestのFinnigan AQAとSEDEX 85 LT-ELSDを取り付けたGilsonで実施した。PhenomenexのGemini C18カラム（５μｍ、１１０Å、１５０×３．０ｍｍ）を使用し、分析用ＨＰＬＣの移動相としては、Ｈ２Ｏ＋ＨＣＯ２Ｈ（０．１％）／ＭｅＣＮ＋ＨＣＯ２Ｈ（０．１％）を流速１ｍＬ／分で用いた。分取逆相ＨＰＬＣはPhenomenex Luna C8カラム（５μｍ、１００Å、２５０×３０．０ｍｍ）を使用し、Gilsonで行った。分取ＨＰＬＣの移動相としては、Ｈ２Ｏ＋ＨＣＯ２Ｈ（０．０５％）／ＭｅＣＮ＋ＨＣＯ２Ｈ（０．０５％）又はＨ２Ｏ＋ＴＦＡ（０．１％）／ＭｅＣＮ＋ＴＦＡ（０．１％）を流速３０ｍＬ／分で使用した。凍結乾燥にはHeto Lyolab 3000を使用した。ＤＭＦとベンゼンを標準的な方法（Perrin, D. D.; Armarego, W. L. F. Purification of Laboratory Chemicals; 3 ed.; Pergamon Press: Oxford, 1992）で乾燥した。
【００９１】
リガンドの合成
９−フェノキシアクリジン（２）。無水ベンゼン（４５０ｍＬ）を１．５０ｇのアクリドン（１当量）にＮ２雰囲気下で加えた。ＳＯＣｌ２（３．３７ｍＬ、６当量）を加え、反応混合物を一晩還流し、その後溶媒を蒸発させて除去した。無水ＤＭＦ（７５ｍＬ）、フェノール（２．１７ｇ、３当量）及びＫ２ＣＯ３（４．２６ｇ、３当量）をＮ２雰囲気下で加えた。反応液を６０℃で３．５日間撹拌した。ろ過及び蒸発の後、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２〜ＣＨ２Ｃｌ２：Ｅｔ２Ｏ、６：１）で精製し、２．０４ｇの２を得た（収率９８％）。１Ｈ−ＮＭＲ(CDCl3)：
【００９２】
【化７】
2013542182.tif 000010
【００９３】
６−（９’−アクリジニルアミノ）ヘキサン酸（３）。９−フェノキシアクリジン（２）（０．０９９ｇ、１当量）の無水ＤＭＦ溶液（１５ｍＬ）を６−アミノヘキサン酸（０．６１７ｇ、１２当量）の無水ＤＭＦ溶液（５０ｍＬ）にＮ２雰囲気下で加えた。反応混合物を７０℃で２日間、次いで１００℃で１日加熱した。室温（ｒｔ）まで冷却した後、溶媒を蒸発させた。粗生成物をＲＰ−ＨＰＬＣで、ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ＋ＴＦＡ（０．１％）で勾配溶出（３５分間でＭｅＣＮを２５から３０％に）して精製し、０．１４８ｇの３を得た（収率７６％）。１Ｈ−ＮＭＲ(CD3OD):
【００９４】
【化８】
2013542182.tif 000011
【００９５】
13C NMR(DMSO-d6):
【００９６】
【化９】
2013542182.tif 000012
【００９７】
８−（９’−アクリジニルアミノ）オクタン酸（４）。９−フェノキシアクリジン（２）（０．２１８ｇ、１当量）の無水ＤＭＦ溶液（２５ｍＬ）を８−アミノオクタン酸（１．５８０ｇ、１２当量）の無水ＤＭＦに溶液（２５ｍＬ）にＮ２雰囲気下で加えた。反応混合物を１００℃で２日間加熱した。室温まで冷却した後、溶媒を蒸発させた。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーで、ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：ＨＣｌ（６：１：０．００７）を使用して精製し、０．２７１ｇの４を得た（収率６６％）。１Ｈ−ＮＭＲ(CD3OD):
【００９８】
【化１０】
2013542182.tif 000013
【００９９】
６−［６’−（９’’−アクリジニルアミノ）ヘキサノイルアミド］ヘキサン酸（５）。６−（９’−アクリジニルアミノ）ヘキサン酸（３）（０．０２６ｇ、１当量）をＮ２雰囲気下で無水ＤＭＦ（６ｍＬ）に溶解した。ＤＩＰＥＡ（６８μＬ、８当量）とＨＡＴＵ（０．０２９ｇ、１．５当量）を加え、反応混合物を室温で約１時間撹拌した。６−アミノヘキサン酸（０．０１３ｇ、２当量）を加え、反応混合物をさらに１８時間撹拌した。Ｈ２Ｏ（２ｍＬ）を加え、その後溶媒を蒸発して除去した。粗生成物をＲＰ−ＨＰＬＣを使用し、ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ＋ＨＣＯ２Ｈ（０．０５％）で勾配溶出（３０間でＭｅＣＮを１５から１８％に）して精製し、１１．４ｍｇの５を得た（収率５６％）。１Ｈ−ＮＭＲ(CD3CN:D20 9:1):
【０１００】
【化１１】
2013542182.tif 000014
【０１０１】
13C NMR (CD3CN:D20 9:1):
【０１０２】
【化１２】
2013542182.tif 000015
【０１０３】
８−［６’−（９’’−アクリジニルアミノ）ヘキサノイルアミド］オクタン酸（６）。６−（９’−アクリジニルアミノ）ヘキサン酸（３）（０．０２２ｇ、１当量）をＮ２雰囲気下で無水ＤＭＦ（６ｍＬ）に溶解した。ＤＩＰＥＡ（５６μＬ、８当量）とＨＡＴＵ（０．０２４ｇ、１．５当量）を加え、反応混合物を室温で約１時間撹拌した。８−アミノオクタン酸（０．０１３ｇ、２当量）を加え、反応混合物をさらに１８時間撹拌した。Ｈ２Ｏ（１ｍＬ）を加え、溶媒を蒸発して除去した。粗生成物をＲＰ−ＨＰＬＣを使用し、ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ＋ＴＦＡ（０．１％）で勾配溶出（３０分間でＭｅＣＮを２５から４０％に）して精製し、１２ｍｇの６を得た（収率４４％）。１Ｈ−ＮＭＲ(CD3CN:D20 9:1):
【０１０４】
【化１３】
2013542182.tif 000016
【０１０５】
13C NMR (CD3CN:D20 9:1):
【０１０６】
【化１４】
2013542182.tif 000017
【０１０７】
６−［８’−（９’’−アクリジニルアミノ）オクタノイルアミド］ヘキサン酸（７）。８−（９’−アクリジニルアミノ）オクタン酸（４）（０．０２９ｇ、１当量）をＮ２雰囲気下で１７ｍＬの無水ＤＭＦに溶解した。ＤＩＰＥＡ（７１μＬ、８当量）とＨＡＴＵ（０．０２５ｇ、１．１当量）を加え、反応混合物を室温で約１時間撹拌した。８−アミノヘキサン酸（０．０１５ｇ、２当量）を加え、反応混合物をさらに３時間撹拌した。Ｈ２Ｏ（２ｍＬ）を加え、溶媒を蒸発して除去した。粗生成物をＲＰ−ＨＰＬＣを使用して、均一濃度のＭｅＣＮ（３０％）／Ｈ２Ｏ＋ＴＦＡ（０．１％）で３０分間溶出して精製し、７．３ｍｇの７を得た（収率２１％）。１Ｈ−ＮＭＲ(CD3CN:D20 9:1):
【０１０８】
【化１５】
2013542182.tif 000018
【０１０９】
13C NMR (CD3CN:D20 9:1):
【０１１０】
【化１６】
2013542182.tif 000019
【０１１１】
８−［８’−（９’’−アクリジニルアミノ）オクタノイルアミド］オクタン酸（８）。約５ｍＬのＭｅＯＨに溶解した４（０．０１２ｇ、１当量）にＫ２ＣＯ３（０．０１５ｇ、２当量）を加えて５分間撹拌することでＴＦＡ塩を除去した。沈殿物をろ過して除き、溶媒を蒸発して除去した。無水ＤＭＦ（２５ｍＬ）をＮ２雰囲気下で加えた。ＤＩＰＥＡ（３２μＬ、５当量）とＨＡＴＵ（０．０２２ｇ、１．５当量）を加え、反応混合物を室温で約１時間撹拌した。８−アミノオクタン酸（０．０１３ｇ、２当量）を加え、反応混合物をさらに３時間撹拌した。Ｈ２Ｏ（２ｍＬ）を加え、溶媒を蒸発して除去した。粗生成物をＲＰ−ＨＰＬＣ使用して、ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ＋ＴＦＡ（０．１％）で勾配溶出（３０分間でＭｅＣＮを３０から４０％に）して精製し、８．９ｍｇの８を得た（収率５８％）。１Ｈ−ＮＭＲ(CD3OD):
【０１１２】
【化１７】
2013542182.tif 000020
【０１１３】
13C NMR (CD3OD):
【０１１４】
【化１８】
2013542182.tif 000021
【０１１５】
６−［６’−（９’’−アクリジニルアミノ）ヘキサノイルアミド］ヘキサン酸ｐ−ニトロフェニルエステル（９）。５（１１．４ｍｇ、１当量）を約１０ｍＬのＭｅＣＮに溶解し、その後Ｅｔ３Ｎ（４．１５μＬ、１．１当量）を加えた。反応混合物を０℃まで冷却した。クロロギ酸４−ニトロフェニル（６．２ｍｇ、１．１当量）を加えて５分間撹拌した後、ＤＭＡＰ（０．７ｍｇ、０．２当量）を加え、冷却槽を除去した。反応を室温で３．５時間撹拌した。反応混合物をグラスウールのプラグを通してろ過し、ＲＰ−ＨＰＬＣに直接注入してＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ＋ＨＣＯ２Ｈ（０．０５％）で勾配溶出した（３０分間でＭｅＣＮを２５から３５％）。溶出後、生成物を含む画分を液体窒素中で直接凍結し、凍結乾燥で溶媒を除去して６．３ｍｇの９を得た（収率４３％）。１Ｈ−ＮＭＲ(アセトン-d6):
【０１１６】
【化１９】
2013542182.tif 000022
【０１１７】
13C NMR (アセトン-d6):
【０１１８】
【化２０】
2013542182.tif 000023
【０１１９】
13C NMRスペクトルの共鳴が広く、シグナル対ノイズ比が低く、５ａ＋４ａ、８ａ＋９ａは見られなかった。
８−［６’−（９’’−アクリジニルアミノ）ヘキサノイルアミド］オクタン酸ｐ−ニトロフェニルエステル（１０）。約５ｍＬのＭｅＯＨに溶解した６（６．６ｍｇ、１当量）にＫ２ＣＯ３（２．６ｍｇ、２当量）を加えて５分間撹拌することで、ＴＦＡ塩を除去した。沈殿物をろ過して除き、溶媒を蒸発して除去した。ＭｅＣＮ（約１０ｍＬ）をフラスコに加え、その後Ｅｔ３Ｎ（１．５μＬ、１．１当量）を加えた。反応混合物を０℃まで冷却した。クロロギ酸４−ニトロフェニル（２．７ｍｇ、１．１当量）を加えて５分間撹拌した後、ＤＭＡＰ（０．４ｍｇ、０．２当量）を加え、冷却槽を除去した。反応を室温で４時間撹拌した。反応混合物をグラスウールのプラグを通してろ過し、ＲＰ−ＨＰＬＣに直接注入して、ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ＋ＨＣＯ２Ｈ（０．０５％）で勾配溶出した（３０分間でＭｅＣＮを２５から４１％）。溶出後、生成物を含む画分を液体窒素中で直接凍結し、凍結乾燥して溶媒を除去し、３．７ｍｇの１０を得た（収率５７％）。１Ｈ−ＮＭＲ(アセトン-d6):
【０１２０】
【化２１】
2013542182.tif 000024
【０１２１】
13C NMR (アセトン-d6):
【０１２２】
【化２２】
2013542182.tif 000025
【０１２３】
６−［８’−（９’’−アクリジニルアミノ）オクタノイルアミド］ヘキサン酸ｐ−ニトロフェニルエステル（１１）。約５ｍＬのＭｅＯＨに溶解した７（６．８ｍｇ、１当量）にＫ２ＣＯ３（２．８ｍｇ、２当量）を加えて５分間撹拌することにより、ＴＦＡ塩を除去した。沈殿物をろ過して除き、溶媒を蒸発して除去した。ＭｅＣＮ（約１０ｍＬ）をフラスコに加え、次いでＥｔ３Ｎ（１．５μＬ、１．１当量）を加えた。反応混合物を０℃まで冷却した。クロロギ酸４−ニトロフェニル（２．８ｍｇ、１．１当量）を加えて５分間撹拌した後、ＤＭＡＰ（０．４ｍｇ、０．２当量）を加えて冷却槽を除去した。反応を室温で４．５時間撹拌した。反応混合物をグラスウールのプラグを通してろ過し、ＲＰ−ＨＰＬＣに直接注入してＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ＋ＨＣＯ２Ｈ（０．０５％）で勾配溶出した（３０分間でＭｅＣＮを２５から４０％）。溶出後、生成物を含む画分を液体窒素中で直接凍結し、凍結乾燥で溶媒を蒸発して２．５ｍｇの１１を得た（収率３８％）。１Ｈ−ＮＭＲ(アセトン-d6):
【０１２４】
【化２３】
2013542182.tif 000026
【０１２５】
13C NMR (アセトン-d6):
【０１２６】
【化２４】
2013542182.tif 000027
【０１２７】
８−［８’−（９’’−アクリジニルアミノ）オクタノイルアミド］オクタン酸ｐ−ニトロフェニルエステル（１２）。約５ｍＬのＭｅＯＨに溶解した８（１３．７ｍｇ、１当量）にＫ２ＣＯ３（６．７ｍｇ、２当量）を加え、５分間撹拌することによりＴＦＡ塩を除去した。沈殿物をろ過して除き、溶媒を蒸発して除去した。ＭｅＣＮ（約１５ｍＬ）をフラスコに加え、次いでＥｔ３Ｎ（３．７μＬ、１．１当量）を加えた。反応混合物を０℃まで冷却した。クロロギ酸４−ニトロフェニル（６．０ｍｇ、１．１当量）を加えて５分間撹拌した後、ＤＭＡＰ（０．６ｍｇ、０．２当量）を加えて冷却槽を除去した。反応を室温で３時間撹拌した。粗生成物をＲＰ−ＨＰＬＣで、ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ＋ＨＣＯ２Ｈ（０．０５％）を使用して勾配溶出した（２５分間でＭｅＣＮを２５から５０％にした）。溶出後、生成物を含む画分を液体窒素中で直接凍結し、溶媒を凍結乾燥で除去して４．４ｍｇの１２を得た（収率２６％）。lH NMR (DMSO-d6):
【０１２８】
【化２５】
2013542182.tif 000028
【０１２９】
13C NMR (DMSO-d6):
【０１３０】
【化２６】
2013542182.tif 000029
【０１３１】
ペプチド合成
Pioneer自動ペプチド合成機で、活性化剤としてＯ−（７−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート（ＨＢＴＵ、Iris Biotech GmbH）とジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、アルドリッチ）を使用し、標準的なフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学反応によってペプチドを合成した。アミノ末端のＦｍｏｃ脱保護は、ピペリジン（２０％）のＤＭＦ溶液を使用して行った。各カップリングにＦｍｏｃ−グリシン−ポリエチレングリコール−ポリスチレン（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ−ＰＳ）樹脂と４倍量のアミノ酸を使用し、０．２ｍｍｏｌのスケールで合成を行った。アミノ酸（Calbiochem- Novabiochem AG、Iris Biotech GmbH）の側鎖を、塩基に安定な基、すなわちｔｅｒｔ−ブチルエステル（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、トリチル（Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ）及び２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ａｒｇ）で保護した。リシン残基の直交保護を用いて選択的に脱保護できるようにし、次いで蛍光プローブを連結させた。蛍光色素分子をコンジュゲートさせるべきリシン残基をアリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）基で保護し、リガンドをコンジュゲートさせるべきリシン残基をｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基で保護した。無水酢酸（０．５Ｍ）のＤＭＦ溶液でＮ−末端をアセチル化した。
【０１３２】
Ｎ２雰囲気下、室温で、樹脂をテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（Ｏ）（Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、２当量）のＤＣＭ溶液、酢酸及びＮ−メチルモルホリン（容積比３７：２：１、樹脂１グラム当たり１０ｍＬ）で２時間処理することにより、Ａｌｌｏｃ基を脱保護した。次いで樹脂をＤＩＰＥＡ（０．５％）のＤＭＦ溶液及びジエチルジチオカルバミン酸（容積率０．５％）のＤＭＦ溶液で洗浄した。リシン残基への７−メトキシクマリン−３−カルボン酸（３当量）のカップリングは、室温、ＤＭＦ中で２時間、ゆっくりと撹拌しながら行った。ＤＩＰＥＡ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を含むカップリング混合物（比率１２：６：６）でクマリンを活性化した。２時間後、カップリング混合物の別の分割量を加え、反応混合物を一晩放置した。全例で脱保護とカップリングの間に、樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで洗浄した。完全な脱保護と切断は、ＴＦＡ、水及びＴＩＳ（容積比９５：２．５：２．５、重合体１グラム当たり１０ｍＬ）を室温で３時間かけて加えることによって達成した。ろ過し、濃縮した後、冷ジエチルエーテルを加えてペプチドを沈殿させ、遠心分離し、ジエチルエーテルで洗浄して風乾した。
【０１３３】
粗ペプチドを逆相ＨＰＬＣで、半分取Hypersil C-18 Goldカラム（１５０×２０ｍｍ、孔径１７５Å、粒子径５Å）又は半分取Kromasil C8 Hichromカラム（２５０×２１．２ｍｍ、孔径１００Å、粒子径１０Å）を使用し、０．１％のＴＦＡを加えたアセトニトリル水溶液で徐々に勾配をかけながら（アセトニトリル濃度を３５から５５％とし）、流速１０ｍＬ／分で溶出して精製した。回収した画分をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（Bruker Daltonics Ultraflex II TOF/TOF）で確認し、濃縮し、２回凍結乾燥した。
【０１３４】
対応するエステル（３〜５当量）のＤＭＳＯ溶液（約０．１Ｍ）を、ポリペプチド（２ｍＭ）のＤＭＳＯ溶液（１％のＤＩＰＥＡを含む）に加えることにより、リガンドをポリペプチドにコンジュゲートさせた。反応混合物を室温で１２〜４８時間放置し、その後分析用ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行った。分析用ＨＰＬＣにはGenesis C-18カラム（２５０×４．６ｍｍ、孔径１２０Å、粒子径４Å）を用いた。０．１％のＴＦＡを加えた３０〜６０％アセトニトリル水溶液を用い、流速１ｍＬ／分で９０分間勾配溶出した。コンジュゲートしたポリペプチドをその後精製せずに蛍光スクリーニングに用いた。さらに反応工程に使用する場合には（例えばＡｃｍの脱保護）、ポリペプチドを冷メチル−ｔｅｒｔブチルエーテル中で沈殿させて精製し、トリフルオロ酢酸に再溶解し、その後冷ジエチルエーテルで沈殿させて風乾した。
【０１３５】
ナノ粒子に連結できるように、２４番目の位置にＡｃｍで保護したシステインを含む結合剤を合成した。トリフルオロメタンスルホン酸銀（ＡｇＯＴｆ）で処理してＡｃｍ基を除去した。ペプチド（２ｍｇ、０．３μｍｏｌ）を０．５ｍＬのＴＦＡ／アニソール（９９：１）に溶解した。トリフルオロメタンスルホン酸銀（１０ｍｇ、１００当量）をこの溶液に加え、混合物を０℃で１時間撹拌し、次いで室温で２〜１２時間撹拌した。冷ジエチルエーテルでペプチド銀塩を沈殿させ、遠心分離した。上清を除去し、残留しているペプチド銀塩を、酢酸水溶液（容積率５０％）に溶解したジチオトレイトール（ＤＴＴ）（５０当量）と共に、室温で２〜１２時間撹拌した。混合物を遠心分離し、上清の溶液をＨＰＬＣで精製し、その後凍結乾燥した。
【０１３６】
蛍光測定
SpectraMax GeminiXPSプレートリーダーを使用し、ポリペプチドをヒトＡＣｈＥで滴定した。使用前に、プルロニック（登録商標）F108NF Prillポロキサマー３３８（ＢＡＳＦ）とポリペプチドでNUNC（商標）ポリスチレン３８４プレートをコーティングした。すなわち、プレートを１％のプルロニック水溶液中で一晩インキュベートし、その後水で洗浄してから０．４ｍｇ／ｍＬのブロッキングペプチド溶液とインキュベートした。貯蔵液（濃度２ｍＭ）を５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈して得た、濃度５００ｎＭのポリペプチド（９０μＬ）を使用した。１及び２当量の分割量の酵素を加えることで、ポリペプチドを滴定した。酵素を加えた後、プレートを２０分間かけて平衡化した。クマリン蛍光色素分子を３５０ｎｍで励起し、３７０〜４５０ｎｍの発光を記録した。酵素溶液の代わりに同じ量の緩衝液を加えたブランクと何も加えないブランクを各ポリペプチドにつき１つずつ用意した。
【０１３７】
ポリスチレンナノ粒子への結合とＣＳＦからの抽出
２％（ｗ／ｖ）のポリスチレン・ラテックスナノ粒子（Bangs laboratories Inc.）懸濁液を１０ｍｇ／ｍＬのプルロニックF108-PDS（Allvivo Inc.）と室温で一晩、一定に振とうしながらインキュベートすることで、プルロニックF108-PDSを粒子に吸着させた。吸着させた後、Eppendorffの卓上型遠心分離器を使用し、１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより、コーティングした粒子から過剰な界面活性剤を分離した。上清を除去し、粒子を１０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）に再懸濁した。この洗浄手順を３回繰り返し、次いで１０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した、システインを脱保護したポリペプチドコンジュゲート（１ｍｇ／ｍＬ）を加えた。反応混合物をゆっくりと振とうしながら、１〜１２時間放置した。緩衝液でナノ粒子を２回洗浄し、１００μＬの緩衝液に再懸濁し、その後、２００〜５００μＬの髄液（ウプサラ大学病院より）と共に、室温でゆっくりと振とうしながらインキュベートした。１時間後、混合物を遠心分離して上清を除去し、粒子を緩衝液で２回洗浄した。ナノ粒子を２群に分け、１群をＥＬＩＳＡに使用し（下記参照）、もう１群を以下の通りに処理した。結合剤とそれらが捕捉したタンパク質を共に、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した５０ｍＭのＤＴＴを使った還元切断によって粒子から切り離し、その後遠心分離（１４０００ｒｐｍ、５分）して粒子を試料から除去した。上清の８μＬ分割量を、勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動で、NuPAGE（登録商標）Novex Bis-Tris 4-12％（ｖ／ｗ）ゲルとＭＥＳ電気泳動用緩衝液（インビトロジェン）を使用して解析した。電気泳動後、ゲルを１００ｍＬの固定用緩衝液（４０％エタノール、１０％酢酸）で固定し、SilverQuest（商標）銀染色キット（インビトロジェン）で銀染色するか、或いは１００ｍＬの固定用緩衝液（３５％メタノール、１０％酢酸）で固定して、Colloidal Blue染色キット（インビトロジェン）で染色した。
【０１３８】
ＥＬＩＳＡ用抗体−酵素コンジュゲートの準備
２０ｍＭの６−（３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサン酸スクシンイミジル（ＬＣ−ＳＰＤＰ、サーモサイエンティフィック）の１０μＬ分割量を０．５ｍｇの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（シグマ）に加え、室温で３０分間インキュベートした。NAP5カラム（ＧＥヘルスケア）を使用して脱塩することで過剰な試薬を除去した。さらに１０μＬ分割量のＬＣ−ＳＰＤＰを０．５ｍＬの抗ＡＣｈＥヒツジポリクローナルＩｇＧ抗体（ｌｍｇ／ｍＬ、アブカム）に加えて混合物を３０分間インキュベートし、その後NAP5カラムを使用した脱塩工程を行った。得られた溶液の一部（０．５ｍＬ）を、ＤＴＴ（０．２５Ｍ、２５μＬ）で還元し（室温、２０分）、再度脱塩（NAP5カラム）した後すぐに、ＬＣ−ＳＰＤＰで修飾したＨＲＰに移した。室温で１時間結合させた。
【０１３９】
ＥＬＩＳＡ
ナノ粒子に固定した結合剤によってＣＳＦから捕捉されたｈＡＣｈＥの有無をＥＬＩＳＡでも解析した。これは、ＣＳＦ中でインキュベートした後に、粒子懸濁液から１５μＬをとり、その後洗浄することによって行った。基準としては、プルロニックF108でコーティングしたが結合剤を結合させていない同量の粒子を使用した。希釈したコンジュゲート（２０μＬ）を２群の粒子懸濁液に加えて２０分間インキュベートした。上の項で記載したように、粒子を４回洗浄することによって結合しなかったコンジュゲートを除去し、粒子を最終的に１００μＬのＰＢＳに再懸濁した。１００μＬの基質（ルミノール＋増強剤：５０／５０、及び過酸化物、サーモフィッシャー）を加えたあと、SpectraMax Gemeni XPSプレートリーダーで４２５ｎｍの蛍光を測定した。
【０１４０】
実施例２
実施例２では、ヒト炭酸脱水素酵素ＩＩ（ＨＣＡＩＩ）を標的分子として使用した。
設計と合成
ＨＣＡへの結合には、ＨＣＡＩ及びＨＣＡＩＩの阻害剤であり、ＨＣＡＩに対する解離定数（Ｋｄ）が１．１〜３．９μΜであり（DeGrado, W.F., Summa, C. M., Pavone, V., Nastri, F. & Lombardi. A. Ann. Rev. Biochem. 68, 779-819 (1999). Jeckling, M. C.;, Schauer, S.; Dumelin, C. E.; Zenobi, R. J. Mol. Recognit. 2009; 22: 319-329）、ＨＣＡＩＩに対する解離定数が１．３〜１．５μΜ（Enander, K.; Dolphin, G.T.; Liedberg, B.; Lundstrom, I.; Baltzer, L Chem Eur J, 2004, 10, 2375-2385. Baltzer, L. Topics in Current Chemistry 2007, 277, 89-106. DeGrado, W.F., Summa, C. M., Pavone, V., Nastri, F. & Lombardi. A. Ann. Rev. Biochem. 68, 779-819 (1999)）のカルボン酸ベンゼンスルホンアミドを小分子先端部として用い、これを、アミノヘキサン酸スペーサーを介して本発明のポリペプチドに結合させた。このアミノヘキサン酸スペーサーがベンゼンスルホンアミド残基と足場配列ＫＥ２が協調してＨＣＡＩＩと相互作用できるようすることが既に示されている（Krebs, H.A. Biochem. J. 1948, 43, 525-528）（図３）。阻害剤であるベンゼンスルホンアミドがＨＣＡＩＩの活性部位に結合し、ポリペプチド構造がタンパク質の表面に結合するだろうと仮定した。折り畳まれたポリペプチドはＨＣＡＩＩの結合ポケットには適合しないため、表面残基と相互作用するはずである。小分子とポリペプチド構造が同時に結合する場合の全体的な親和性は、小分子単独の場合よりも数桁高いため、タンパク質に対して高い親和性をもつ結合剤を簡便に得るための方法を提供することになる。
【０１４１】
自動固相ペプチド合成機を使用し、標準的なＦｍｏｃ手順に従ってポリペプチドを合成し、逆相ＨＰＬＣで精製してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析で確認した。各ポリペプチドはＨＰＬＣによれば純粋であり、我々は＞９５％と推定し、かつ、精製したペプチドの分子量は全て、理論値の１質量単位の範囲内であった。各ポリペプチドには、リシン残基側鎖のＡｌｌｏｃ保護基をＰｄ（ＰＰｈ３）４で選択的に除去した後、固相で７−メトキシクマリン蛍光プローブを導入した。蛍光色素分子を導入して、標的タンパク質との結合を蛍光強度の測定によって検出できるようにした。蛍光色素分子を各配列中のリガンド連結部位の近傍、すなわち１５、１０、２５及び３７番目の位置に、小分子リガンドを８、１７、２２及び３４番目の位置にそれぞれ導入した。結合による分子環境の変化はこれらの位置で最も顕著であり、最大の強度変化を生じると予測した。これまでに、同様の配列の設計、並びにＮＭＲやＣＤ分光法及び分析超遠心による構造解析について詳細に記述されている（Olofsson, S.; Johansson, G.; Baltzer, L. J. Chem. Soc, Perkin Trans. 2 1995, 2047-2056. Broo, K. S., Brive, L., Ahlberg, P. and Baltzer, L., J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 11362-11372）。それらはヘリックス−ループ−ヘリックスモチーフに折り畳まれ、溶融球(molten globule)様特性をもつ４本のヘリックス束を形成するように二量体化する。
【０１４２】
１６種類の構造ポリペプチドの２２２ｎｍにおける平均残基楕円率（［θ］２２２）を２種類の濃度（約３０μΜと約１μΜ）で記録し、凝集状態を解析した。表１を参照のこと。
【０１４３】
表１．低濃度及び高濃度の、本発明のポリペプチドライブラリーの平均残基楕円率。実験誤差は±１０００deg cm2 dmol-1であると見積もった。
【０１４４】
【表３】
2013542182.tif 000030
【０１４５】
単量体はヘリックス含量が低く構造が不規則だが、二量体はヘリックス含量が高いため、ヘリックス形成の度合は単量体−二量体平衡に関係している。全ての配列は２種類の濃度のうちの濃度が高い方で高度にヘリックス構造をとっており、その平均残基楕円率は約２００００deg cm2 dmol-1であり、いくつかは低濃度で部分的な解離を示した。そのため全ての配列は、低マイクロモル濃度で主に二量体を形成した。選択した配列の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを既に記録したが、１つの驚くべき例外を除いて、全ての配列が溶融球の特徴を示した。１５番目のリシンの側鎖にダンシル基を連結した配列であるＫＥ２−Ｃ１５の融解挙動はよく分かっていないが、非常に分散したＮＭＲスペクトルを示した。全配列及び全ポリペプチドコンジュゲートの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを記録してはいないが、ここに示した配列は溶融球と称するのが最もふさわしいと考えられる。
【０１４６】
スペーサーをもつベンゼンスルホンアミドとその活性エステルの合成については既に記載されている（Winum, J-Y.; Vullo, D. Casini, A.; Montero, J-L.; Scozzafava, A.; Supuran, C.T. J. Med. Chem. 2003, 46, 2197-2204）。
【０１４７】
ベンゼンスルホンアミド残基のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを１６メンバーのこの組の各メンバーと、緩衝液中或いはＤＭＳＯ溶液中で行う１段反応で反応させ、コンジュゲート分子を形成させた。
【０１４８】
ポリペプチドコンジュゲート結合剤のＨＣＡＩＩに対する親和性
各ポリペプチドコンジュゲートのＨＣＡＩＩに対する親和性をスクリーニング手順内で評価した。この手順では、ポリペプチドコンジュゲートを入れたウェルに１、２及び３当量のＨＣＡＩＩを加えてプレートリーダーで解析し、クマリンの蛍光強度を、タンパク質を加えていない試料と比較した。５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む）を使用し、ＨＣＡＩＩの最終濃度が５００ｎＭ、１μΜ及び１．５μΜになり、結合剤の最終濃度が５００ｎＭなるように実験を設計した。３８４マイクロ滴定プレートの別個のウェルに、全ての溶液を２つずつ準備し、各ウェルの強度を同時に測定してインキュベート時間の差による強度差を回避した。マイクロ滴定プレートリーダーを使用し、３５０ｎｍで励起した後、２８０〜５００ｎｍの蛍光強度を測定した。ポリスチレンプレートをプルロニック（登録商標）F-108NF Prill（１％水溶液）と４２−残基ペプチド（０．４ｍｇ／ｍＬ、２時間、配列４−Ｃ１５Ｌ８−Ａｃ、すなわちＡｃ−ＮＡＡＤＪＥＡＫＩＲＨＬＲＥＫＪＡＡＲＧＰＲＤＡＡＱＪＡＥＱＬＡＲＲＦＥＲＦＡＲＡＧ−ＣＯＮＨ２）の溶液で予めコーティングして、結合剤とタンパク質がポリスチレン表面に接着するのを回避した。タンパク質−結合剤混合物の蛍光強度（すなわち最大４１０ｎｍの蛍光強度）とタンパク質を含まない結合剤の強度を比較し、１当量のタンパク質を加えた場合の蛍光強度がタンパク質を加えていない結合剤の蛍光強度と比較して有意に変化した場合に、結合剤がＨＣＡＩＩに結合したと見なした。５００ｎＭのＨＣＡＩＩが含まれる場合には強度の変化を示したが、１μΜのＨＣＡＩＩが含まれても強度がそれ以上変化しなかった結合剤をその後の試験用に選抜した。従って、タンパク質の濃度が５００ｎＭで、かつ、結合剤の濃度が５００ｎＭの場合に、９０％を越える結合剤が結合すると仮定した。この仮定に基づくと、生体分子コンジュゲートに関する一般的な式（Ｋｄ＝［Β］＊［Ρ］／［ＰＢ］）によれば、解離定数（Ｋｄ）は１０ｎＭ以下であると推測できる。
【０１４９】
上述した手順に従って調製し、解析したこの１６種類の候補結合剤の組のうち、３種類のポリペプチドコンジュゲート、１−Ｃ１０Ｌ１７−Ｂ、３−Ｃ１５Ｌ８−Ｂ及び４−Ｃ３７Ｌ３４−Ｂをその後の試験用に選抜した。
【０１５０】
蛍光滴定とＳＰＲ解析によって、１−Ｃ１０Ｌ１７−Ｂ、３−Ｃ１５Ｌ８−Ｂ及び４−Ｃ３７Ｌ３４−ＢのＨＣＡＩＩに対する親和性を決定した（図５）。低ナノモルの解離定数を正確に決定できるようにするためには、測定は、桁が同じ濃度で行わなくてはならない。７−メトキシクマリンのシグナル強度は非常に弱く、約１０ｎＭ以下で正確な滴定を行うには７−メトキシクマリンの感度は十分ではない。そのため、１−Ｃ１０Ｌ１７−Ｂ及び３−Ｃ１５Ｌ８−Ｂのループ領域にアセトアミドメチル（Ａｃｍ）で保護したＣｙｓ残基を導入して、より強い蛍光色素分子を導入することができるようにした。Ｃｙｓ側鎖を脱保護し（Fuiji, N.; Otaka, A.; Watanbe, T.; Okamachi, A.; Tamamura, H.; Yajima, H.; Inagaki, Y.; Nomizu, M.; Asano, K. Chem. Soc, Chem. Commun. 1989, 283-284）、次いでフルオレセインとコンジュゲートさせたマレイミドと脂肪族スペーサーを介して反応させ、プレートリーダー中で約５０ｎＭ以下（７−メトキシクマリンで測定可能な桁よりも低い）の親和性を正確に測定できるようにした。蛍光滴定には、７−メトキシクマリンよりもダンシル基にコンジュゲートさせたポリペプチドを使用して行った。この理由はフルオレセインとの重複を避けるためであるが、合成及び精製工程での確認と定量を容易にするために構造ライブラリーの各配列には蛍光色素分子が含まれている。３８４マイクロ滴定プレートの別個のウェルに全ての溶液を２つずつ準備し、インキュベート時間の差による強度差を回避するために、各ウェルの強度を同時に測定した。マイクロ滴定プレートを使用して、励起後の蛍光強度を４２０ｎｍで測定した。ポリスチレンプレートを上述のように予めコーティングした。タンパク質−結合剤混合物の蛍光強度を、タンパク質を含まない結合剤の強度と比較した。５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む）中で解析を行った。５０ｎＭ濃度の結合剤に、２０ｐＭ〜１μΜの濃度範囲のＨＣＡＩＩを２５段階で加え、曲線に当てはめることで結果を解析した。ダンシルと７−メトキシクマリンの構造は異なるが差は比較的小さく、測定される親和性に及ぼす影響は小さいと仮定した。１−Ｃ１０Ｌ１７−Ｂの親和性が測定した親和性のうちで最も高く、Ｋｄは５±３ｎＭであり、３−Ｃ１５Ｌ８−ＢのＫｄが２９±１０ｎＭであることが分かった。フルオレセインプローブにコンジュゲートさせた配列４−Ｃ３７Ｌ３４−Ｂは緩衝液への溶解度が低かったため、滴定しなかった。
【０１５１】
１６種類のポリペプチドコンジュゲートを、ＳＰＲバイオセンサー解析（Biacore（登録商標）、ＧＥヘルスケア）によっても解析した。この解析は、Biacore（登録商標）２０００装置とBiacore（登録商標）ＣＭ−５チップを使用し、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ｐＨ７．４、Biacore（登録商標）、ＧＥヘルスケア）に、相互作用試験には１％のＤＭＳＯを加えて行った。ＤＭＳＯに溶解した貯蔵液（２０μΜ）を緩衝液で希釈し、ペプチド溶液を準備した。酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解した標準的なＥＤＣ／ＮＨＳカップリングを使用してＨＣＡＩＩをチップに固定した。７段階の濃度範囲（１ｎＭ〜５００ｎＭ）の結合剤をチップに流し、１：１結合モデル（BiaEvaluation）で相互作用を評価した。
【０１５２】
ＳＰＲバイオセンサー解析によって決定した、３−Ｃ１５Ｌ８−Ｂ及び４−Ｃ３７Ｌ３４−ＢのＨＣＡＩＩに対する親和性はそれぞれ、４３ｎＭ及び１５ｎＭであり、ＫＥ２−Ｄ（１５）−６５について報告されている親和性とほぼ一致した。決定方法や、結合剤に使用した蛍光色素分子によって、解離定数には僅かに差が見られたが、基本的にはそれぞれの測定結果は一致し、ベンゼンスルホンアミド基をポリペプチド構造に結合させることで、小分子先端部よりも２桁より高い親和性をもつ結合剤が生じると結論付けた。ＳＰＲ解析による親和性の決定では、結合剤１−Ｃ１０Ｌ１７−ＢのＫｄが８０ｎＭであることが分かったため、その後の選択性の評価は行わなかった。
【０１５３】
候補結合剤の選択性
血液という複雑な培地中で、結合剤３−Ｃ１５Ｌ８−Ｂ及び４−Ｃ３７Ｌ３４−ＢのＨＣＡＩＩに対する選択性を試験した。２４番目の位置にＡｃｍで保護したＣｙｓ残基を加えて選択した結合剤を再合成した。Ａｃｍ基を除去した後、１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む）中で１時間インキュベートすることにより、プルロニック（登録商標）F108-PDSでコーティングしたポリスチレンナノ粒子に結合剤を固定した。コーティング材は、２−メルカプトピリジン放出下で遊離チオールと自発的に反応する、活性型のジスルフィド基を有するＰＥＧの単層を形成する（Fromell, K., Hulting, G., Ilichev, A., Larsson, A. & Caldwell, K. C. Analytical Chemistry 79, 8601-07 (2007)）。
【０１５４】
約６０μＬの新たに採取した血液を２４０μＬの蒸留水で希釈して溶解し、その後遠心分離して細胞片を除去した。ＨＣＡＩＩは赤血球内に含まれるため、そのタンパク質を利用するには細胞を溶解しなければならない。上清を単離し、機能化ナノ粒子と３０分間インキュベートして、ナノ粒子がＨＣＡＩＩを捕捉できるようにした。ＰＢＳ中で粒子を３回洗浄し、各洗浄後に遠心分離した。ジチオスレイトールを使用して、結合剤と捕捉したタンパク質を粒子から切断し、遠心分離して粒子から分離した。上清を電気泳動ゲルに負荷し、電気泳動後のゲルを銀染色で展開した（図４）。３本のバンドが見られ、質量分析によって、ヘモグロビンサブユニット、ＨＳＡ及びヒト炭酸脱水素酵素であることを確認した。ヘモグロビンサブユニット及びＨＳＡは両方とも、結合剤を連結させていないビーズの対照のレーンでも見られるため、ポリスチレンナノ粒子によって非特異的に吸着されたもので、ポリペプチド結合剤によって抽出されたものではない。従って、結合剤分子である３−Ｃ１５Ｌ８−Ｂ及び４−Ｃ３７Ｌ３４−Ｂは主に炭酸脱水素酵素を抽出する。
【０１５５】
ＨＣＡＩＩの抽出をＥＬＩＳＡで確認した。ＥＬＩＳＡでは、機能化ナノ粒子を使用してＨＣＡＩＩを捕捉し、検出にはＨＲＰをコンジュゲートさせた抗ＨＣＡＩＩ抗体を使用した（データは示さない）。
【０１５６】
血中のヒト炭酸脱水素酵素には、ＨＣＡＩ及びＨＣＡＩＩの２種類のイソ型がある。これら２種類のイソ型はほぼ同一の分子量を有し、配列全体にかけての同一性は６０％であるが、接近可能な表面残基の同一性は僅かに低く、４５％である。ＨＣＡＩとＨＣＡＩＩは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによっては、またはゲルからは分離することができないため（図４）、ＨＣＡＩ又はＨＣＡＩＩのどちらが、あるいは両方が３−Ｃ１５Ｌ８−Ｂ及び４−Ｃ３７Ｌ３４−Ｂによって血液から抽出されたかを結論づけることはできない。切り出し、トリプシンで消化し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで解析したバンドは、両方のイソ型が含まれていたことを示している。ヒトでは、ＨＣＡＩがＨＣＡＩＩよりも５〜７倍多いため、ＨＣＡＩＩに特異的に結合させるには、親和性に数桁の差がある必要がある。これらのイソ型は両方とも、ベンゼンスルホンアミド阻害剤にＫｄ約１〜４μΜで結合するため、２種類のイソ型の親和性の差はいずれも、ポリペプチドと２つのタンパク質間の相互作用の差の結果である。ＨＣＡＩ又はＨＣＡＩＩのいずれかに対する結合剤を、所望のイソ型に特異的な小分子阻害剤を使用して設計する多数の方法があるが、本明細書で取り扱う問題は、ヒト炭酸脱水素酵素の２つのイソ型を区別するどのような違いをポリペプチドによって達成することができるかである。このことは、この新しい部類のタンパク質結合剤によって達成される選択性レベルの試験に重要であるため、この合成結合剤の識別能力をＳＰＲバイオセンサー（Biacore）解析によってさらに解析した。
【０１５７】
ＨＣＡＩ及びＨＣＡＩＩを別個のフローセル中で、酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）中での標準的なＥＤＣ／ＮＨＳカップリングにより、ＣＭ−５（Biacore）チップ上に固定した。結合剤の濃度範囲を１ｎＭ〜５００ｎＭとして（全てに１％のＤＭＳＯを加えて）、３−Ｃ１５Ｌ８−Ｂ及び４−Ｃ３７Ｌ３４−Ｂの親和性測定を行い、１：１相互作用モデルについて説明している式の実験結果に対する最良適合を使用して解離定数を決定した。結果を表２に示す。
【０１５８】
表２．ＳＰＲ解析による親和性のデータ
【０１５９】
【表４】
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【０１６０】
ポリペプチドコンジュゲートである３−Ｃ１５Ｌ８−Ｂは、ＨＣＡＩには解離定数３９０ｎＭで、ＨＣＡＩＩには解離定数６０ｎＭで結合し、４−Ｃ３７Ｌ３４−ＢはＨＣＡＩには４７０ｎＭの、ＨＣＡＩＩに対しては１７ｎＭの解離定数を示している。従って、結合剤分子４−Ｃ３７Ｌ３４−Ｂは約３０の係数、１桁を越える、でＨＣＡＩとＨＣＡＩＩを識別することができる。交差反応性があるため、この結合剤は完全には特異的でないが、示された識別は、結合剤分子の単純さを考慮すると顕著である。ＨＣＡＩ及びＨＣＡＩＩは両方ともベンゼンスルホンアミドと結合し、ポリペプチドコンジュゲートとの結合の差は、ポリペプチドとの相互作用に起因することが明かである。何故タンパク質表面との相互作用に差が生じるかについての手がかりは、表面の静電ポテンシャルのマッピングによって得られる（図４）。表面に曝されている残基は４５％のみが同一であり、ＨＣＡＩＩの活性部位の周辺領域はＨＣＡＩよりも疎水性で、かつ、より正に帯電していない。ＨＣＡＩの表面がより負に帯電していれば、僅かにより正に帯電しているポリペプチド４−Ｃ３７Ｌ３４と強く相互作用すると予想されるが、ＨＣＡＩＩと４−Ｃ３７Ｌ３４−Ｂとの間の相互作用の大部分は疎水性の相互作用であるようである。
【０１６１】
結論
この実施例では、本発明に従うポリペプチドと、ＨＣＡＩＩに対する中程度の親和性をもつ有機小分子を組み合わせることで、タンパク質に対する特定の高親和性結合剤を形成することができることを示している。具体的には、結合剤分子によってヒト炭酸脱水素酵素のみが血液から抽出されるように、合成結合剤分子の特異性はモノクローナル抗体の特異性に匹敵する。観察された、ヘモグロビンサブユニットとＨＳＡの抽出は、ポリスチレンビーズへの非特異的な吸着によるものである。６０％の相同性を有するこのタンパク質の２つのイソ型の識別は大きな課題であったが、達成された、約１桁異なる親和性の差は、この型の結合剤分子の識別能力の強力な証拠である。体系的な方法で改変され、親和性と選択性の元素でコード化されたポリペプチド小集団の使用は、良い結合剤分子を探索するために大規模な結合剤候補のライブラリーが使用されている、分子生物学で十分に確立されている典型的な手順とは対照的である。ＨＣＡＩＩに結合することが示されたポリペプチドコンジュゲートの大きさはＩｇＧモノクローナル抗体の１／３０未満であり、かつ、標的タンパク質と形状及び電荷が相補的な表面を形成するような構造をもっていない。これらの外観上は不利な特性にもかかわらず本明細書で示した結合剤分子は、ヒト血液という複雑な環境中でもタンパク質の認識と結合において非常によく機能する。タンパク質に対する特異的で高親和性な結合剤の探索に、ポリペプチド構造の小集団を使用することは、特異性と高親和性に効果的な方法を提供し、中程度の親和性を持つ小分子又はペプチドを探索するための結合剤の探索を減らす。ＨＣＡＩＩを用いたこの試験で、［θ］２２２我々は、高い親和性をもつ数種の結合剤を得るための迅速な方法を示した。従ってこの方法を、濃度測定のための結合剤のアレイをチップ上に構築するために使用することもできる。
【０１６２】
このスクリーニング手順は、蛍光色素分子周辺の分子環境が変化すること、及び蛍光の変化が標的タンパク質への結合を反映しているという仮説に依存している。タンパク質−結合剤複合体の構造を予測することはできないため、これは全ての例においては事実でない可能性がある。しかしながら、本明細書で記載の手順によって、高い親和性をもつ３種類の候補結合剤を同定することができたため、このスクリーニング手順は、緊密な結合剤の同定に非常に有望である。この組の１６種類のポリペプチドから、３種類を的中として同定した。良い結合剤を逃している可能性もあるが、他の方法では、結合剤候補のセットの探索には実施するには長すぎる時間がかかるという点を考慮すると、同定は許容可能である。
【０１６３】
タンパク質の認識に関して最も要求の多い側面は、結合に非常に多くの生体分子が競合している複雑な生物環境中での特異性である。合成ポリペプチドコンジュゲート４−Ｃ３７Ｌ３４−Ｂが、炭酸脱水素酵素と他のタンパク質とを識別するだけでなく、２種類のイソ型、ＨＣＡＩとＨＣＡＩＩを識別することからも、高い特異性をもつことが証明された。このことから、化学的に生成した結合剤分子は、分子生物学的な手法によって生成した結合剤分子よりも高い機能をもつことが示唆され、また、診断用途及び医薬用途において多くの利点を有していると期待できる。
【０１６４】
実験
一般
ＨＣＡＩ及びＨＣＡＩＩの凍結乾燥粉末をシグマから購入した。使用直前に溶液を調製した。
【０１６５】
リガンドの合成
既に記述されている通りにベンゼンスルホンアミドリガンドを合成した（Winum, J-Y.; Vullo, D. Casini, A.; Montero, J-L.; Scozzafava, A.; Supuran, C.T. J. Med. Chem. 2003, 46, 2197-2204）。
【０１６６】
ペプチド合成
Pioneer自動ペプチド合成機で、活性化剤としてテトラフルオロホウ酸Ｏ−（７−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム（ＨＢＴＵ、Iris Biotech GmbH）とジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、アルドリッチ）を使用し、標準的なフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学反応によってペプチドを合成した。アミノ末端のＦｍｏｃ脱保護は、ピペリジン（２０％）のＤＭＦ溶液を使用して行った。各カップリングＦｍｏｃ−グリシン−ポリエチレングリコール−ポリスチレン（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ−ＰＳ）樹脂と４倍量のアミノ酸を使用し、０．２ｍｍｏｌのスケールで合成を行った。アミノ酸（Calbiochem- Novabiochem AG、Iris Biotech GmbH）の側鎖を、塩基に安定な基、すなわちｔｅｒｔ−ブチルエステル（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、トリチル（Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ）及び２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ａｒｇ）で保護した。蛍光色素分子を結合させるリシン残基をアリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）基で直交保護し、リガンドをコンジュゲートさせるリシンをｔｅｒｔ−ブトキシメチル（Ｂｏｃ）基で保護した。無水酢酸（０．５Ｍ）のＤＭＦ溶液でＮ−末端をアセチル化した。
【０１６７】
Ｎ２雰囲気下、室温で、樹脂をテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(0)（Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、２当量）のＤＣＭ溶液、酢酸及びＮ−メチルモルホリン（容積比３７：２：１、樹脂１グラム当たり１０ｍＬ）で２時間処理することにより、Ａｌｌｏｃ基を脱保護した。次いで樹脂をＤＩＰＥＡ（０．５％）のＤＭＦ溶液及びジエチルジチオカルバミン酸（容積率０．５％）のＤＭＦ溶液で順次洗浄した。リシン残基への７−メトキシクマリン−３−カルボン酸（３当量）のカップリングは、室温、ＤＭＦ中で２時間ゆっくりと撹拌しながら行った。ＤＩＰＥＡ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を含むカップリング混合物（比率１２：６：６）でクマリンを活性化した。２時間後、別の分割量のカップリング混合物を加え、反応混合物を一晩放置した。全ての例において、脱保護とカップリングの間に樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで洗浄した。完全な脱保護と樹脂からの切断は、ＴＦＡ、水及びトリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）（容積率９５：２．５：２．５、重合体１グラム当たり１０ｍＬ）を室温で３時間加えることによって達成した。ろ過し、濃縮した後、冷ジエチルエーテルを加えてペプチドを沈殿させ、遠心分離し、ジエチルエーテルで洗浄して風乾した。
【０１６８】
粗ペプチドを逆相ＨＰＬＣで、半分取Hypersil C-18 Goldカラム（１５０×２０ｍｍ、孔径１７５Å、粒子径５Å）又は半分取Kromasil C8 Hichromカラム（２５０×２１．２ｍｍ、孔径１００Å、粒子径１０Å）を使用し、０．１％のＴＦＡを加えたアセトニトリル水溶液で徐々に勾配をかけ（アセトニトリル濃度を３５から５５％とし）、流速１０ｍＬ／分で溶出して精製した。回収した画分をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（Bruker Daltonics Ultraflex II TOF/TOF）で同定し、濃縮し、２回凍結乾燥した。
【０１６９】
対応するエステル（４当量）のＤＭＳＯ溶液（約０．１Ｍ）をポリペプチド溶液（２ｍＭ、３０μＬ）のＤＭＳＯ溶液（１％のＤＩＰＥＡを含む）に加えることにより、リガンドをポリペプチドに結合させた。反応を室温で一晩放置し、次いで機能化の度合を分析用ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで確認した。分析用ＨＰＬＣにはGenesis C-18カラム（２５０×４．６ｍｍ、孔径１２０Å、粒子径４Å）を用いた。０．１％のＴＦＡを加えた３０〜６０％アセトニトリル水溶液を用い、流速１ｍＬ／分で９０分間勾配溶出した。
【０１７０】
反応混合物をさらには精製せずに蛍光スクリーニング実験に使用した（５０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ７、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む）で希釈し、１０μΜの貯蔵液とした）。
【０１７１】
結合剤４−Ｃ３７Ｌ３４−Ｂと３−Ｃ１５Ｌ８−Ｂ（「−Ｂ」は、このポリペプチドが選択した分子に対するリガンドに連結していることを示す）を合成し、ループ領域にＡｃｍで保護されたシステイン残基を含むＣ３７Ｌ３４−Ｂ−Ｃｙｓ２４及び３−Ｃ１５Ｌ８−Ｂ−Ｃｙｓ２４で精製した。
【０１７２】
蛍光滴定実験用の結合剤である１−Ｃ１０Ｌ１７−Ｂ及び３−Ｃ１５Ｌ８−Ｂをベンゼンスルホンアミド残基にコンジュゲートさせ、Ａｃｍ基を脱保護した。
一般的な標識実験を以下のように行った。Ａｃｍを脱保護したポリペプチドを、最終濃度が１．０ｍＭになるように、０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５、６Ｍのグアニジン塩酸を含む）に溶解した。３モル当量のＮ−（５−フルオレセイニル）マレイミド（シグマ・アルドリッチ）を最小量のＤＭＳＯに予め溶解しておき、これを反応混合物に直接加えた。反応を分析用ＨＰＬＣで監視し、反応は本質的に４時間後に完了した。生成物をＨＰＬＣで精製し、生成物の質量をＭＡＬＤＩ−ＭＳで確認した。
【０１７３】
最終的なＳＰＲ実験用の結合剤である４−Ｃ３７Ｌ３４−Ｂと３−Ｃ１５Ｌ８−Ｂ及び選択性試験用の結合剤である４−Ｃ３７Ｌ３４−Ｂ−Ｃｙｓ２４と３−Ｃ１５Ｌ８−Ｂ−Ｃｙｓ２４を５ｍｇスケールでベンゼンスルホンアミド残基にコンジュゲートさせ、逆相ＨＰＬＣで、半分取Hypersil C-18 Goldカラム（１５０×２０ｍｍ、孔径１７５Å、粒子径５Å）を使用し、０．１％のＴＦＡを加えたアセトニトリル水溶液で徐々に勾配をかけ（アセトニトリル濃度を３０から６０％とし）、流速１０ｍＬ／分で溶出して精製した。回収した画分をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（アプライドバイオシステムズ、Voyager PRO）で確認し、濃縮して凍結乾燥した。ＤＭＳＯを用いて４−Ｃ３７Ｌ３４−Ｂと３−Ｃ１５Ｌ８−Ｂの貯蔵液を調製し、アミノ酸の定量分析によって解析した。４−Ｃ３７Ｌ３４−Ｂ及び３−Ｃ１５Ｌ８−Ｂの貯蔵液の濃度はそれぞれ、３５μΜ及び２４μΜであった。
【０１７４】
Ａｃｍ基の脱保護は、凍結乾燥したペプチド（１μｍｏｌ）を２％（容積率）のアニソールを含む０．５０ｍＬのＴＦＡに溶解することで行った。この溶液を０℃まで冷却し、ＡｇＯＴｆ（２６ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、１００当量）のＴＦＡ溶液（０．５ｍＬ）を加えた。反応混合物を０℃で１時間撹拌し、周囲温度に戻して周囲温度で２時間撹拌した。冷ジエチルエーテルを加えることで反応混合物からペプチド銀塩を沈殿させ、遠心分離して単離した。沈殿物を０．５ｍＬの蒸留水に溶解し、このペプチド溶液にジチオスレイトール（８ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ、５０当量）の氷酢酸（０．５ｍＬ）溶液を加えた。この混合物を２時間撹拌し、その後遠心分離した。上清に含まれるペプチドをＨＰＬＣで精製した。
【０１７５】
蛍光測定
GeminiXPSプレートリーダーを使用して蛍光スペクトルを記録した。使用前に、プルロニック（登録商標）F108NF Prillポロキサマー３３８（ＢＡＳＦ）でＮＵＮＣ（商標）ポリスチレン３８４プレートをコーティングした。すなわち、プレートを１％のプルロニック水溶液中で一晩インキュベートし、水で完全に洗浄してから０．４ｍｇ／ｍＬのペプチド溶液で２時間ブロッキングし、その後水で１０回洗浄した。５０ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ７、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む）で１０μΜの貯蔵液を希釈して得た、濃度５００ｎＭのポリペプチド（９５μＬ）を使用した。マイクロ滴定プレートのウェルに、ＨＣＡＩＩを１４μΜの貯蔵液から加えた。濃度はＵＶ分光法により、吸光係数５４０００Ｍ−１ｃｍ−１、２８０ｎｍで決定した。
【０１７６】
クマリンプローブを３５０ｎｍで励起し、３８０〜５００ｎｍの領域の発光を記録した。測定は全て室温で実施し、３回重複して行った。ウェルの測定は５分後と３０分後に行った。
【０１７７】
ＳＰＲ測定
ＳＰＲ測定を、Biacore（登録商標）２０００装置とタンパク質を固定したBiacore（登録商標）ＣＭ−５センサーチップ（ＧＥヘルスケア）を使用して行った。相互作用試験は全て、１％（容積率）のＤＭＳＯを加えたBiacore（登録商標）ＨＳＢ−ＥＰ緩衝液中で行った。ＨＣＡＩＩ（シグマ、凍結乾燥粉末）を酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解して２ｍｇ／ｍＬ溶液とした。酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）中でのＥＤＣ／ＮＨＳカップリング反応により、ＨＣＡＩＩを表面にコンジュゲートさせた。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を使用して、ＤＭＳＯに溶解した貯蔵液（２０μΜ）からポリペプチド結合剤溶液を調製し、流速２０μＬ／分で表面に流した。各系列の後にはブランクを注入した。含まれるＤＭＳＯの量が１％（容積率）になるように全試料を調節した。注入は３０秒間かけて行い、解離は３０００秒まで進めた。１：１結合モデルによって評価した。
【０１７８】
ポリスチレンナノ粒子への結合と血液からの抽出
２％（ｗ／ｖ）のポリスチレン・ラテックスナノ粒子（Bangs laboratories Inc.）懸濁液を１０ｍｇ／ｍＬのプルロニックF108-PDS（Allvivo Inc.）と室温で一晩、一定に振とうしながらインキュベートすることで、プルロニックF108-PDSを粒子に吸着させた。吸着させた後、Eppendorffの卓上型遠心分離器を使用し、１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより、過剰の界面活性剤をコーティングした粒子から分離した。上清を除去し、粒子を１０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）に再懸濁した。この洗浄手順を３回繰り返し、次いで１０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した、システインを脱保護したポリペプチドコンジュゲート（１ｍｇ／ｍＬ）を加えた。反応混合物をゆっくりと振とうしながら、１〜１２時間インキュベートした。ナノ粒子を緩衝液で３回洗浄し、１００μＬの緩衝液に再懸濁した。新鮮な血液（我々の内の１人から採取した）に２倍量のミリＱ等級の水を加え、１５分間、ゆっくりと振とうして溶解した。溶血を遠心分離し、上清を回収した。結合剤にコンジュゲートさせたナノ粒子の再懸濁液を１００〜５００μＬの溶解物と、室温でゆっくりと振とうしながらインキュベートした。１時間後に混合物を遠心分離し、上清を除去し、次いで粒子を緩衝液で３回洗浄した。Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した５０ｍＭのＤＴＴを使用し、粒子から結合剤をそれらが捕捉したタンパク質と共に切断し、その後遠心分離（１４０００ｒｐｍ、５分）して試料から粒子を除去した。上清の８μＬ分割量を、勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動で、NuPAGE（登録商標）Novex Bis-Tris 4-12%(v/w)ゲルとＭＥＳ電気泳動用緩衝液（インビトロジェン）を使用して解析した。電気泳動後、ゲルを１００ｍＬの固定用緩衝液（４０％エタノール、１０％酢酸）で固定し、SilverQuest（商標）銀染色キット（インビトロジェン）で銀染色するか、或いは１００ｍＬの固定用緩衝液（３５％メタノール、１０％酢酸）で固定して、Colloidal Blue染色キット（インビトロジェン）で染色した。
【０１７９】
実施例３
この実施例は、リン酸化タンパク質に対する結合剤の開発における本発明の分子ツールの使用を対象とする。
【０１８０】
タンパク質のリン酸化は、生命に必須の機能を推進し、方向付けるのに重要な役割を担っている。リン酸化は、キナーゼ及びホスファターゼに制御されている可逆的な共有結合による修飾であり、かつ、シグナル伝達カスケード、アポトーシスの進行、代謝の変化及び遺伝子発現に「分子トリガー」として機能する。異常なリン酸化が起こると必ず、変異原性の、神経病原性の又は発癌性の活性が開始されるため、これらは重要な薬剤標的である。
【０１８１】
リン酸化を監視することは、多くの複雑な生物機能の理解や、医薬品開発における調剤の効果の理解にとってきわめて重要である。
タンパク質のリン酸化は全ての翻訳後調節の中で最も広く研究されており、また、リン酸化タンパク質を選択的に決定する方法及び分析する方法に対する需要は高く、ホスホプロテオミクスにおける最近の進歩によって大幅に促進されている。リン酸化部位特異的抗体は、免疫沈降又はウェスタンブロットでリン酸化エピトープを認識するのに慣習的に使用されており、また、抗ホスホチロシン抗体は十分な効率を示すが、抗ホスホセリン抗体及び抗ホスホトレオニン抗体は概して中程度の特異性しか示さない。リン酸基の非特異的な捕捉は、質量分析と組み合わせて用いられている。固定化金属イオンクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）では、正電荷をもつ金属イオンが、リン酸基などの負電荷の種を静電相互作用により引き寄せる。定量解析又は定性解析の前に複合試料中のリン酸化タンパク質を濃縮するために、ＴｉＯ２などの金属酸化物が用いられる。リン酸部分を、より検出が容易なより安定な基で置換する場合には、間接的なリン酸の検出方法もまた用いられる。これらの方法では通常、捕捉と質量分光学的な解析の前に、タンパク質をトリプシンで消化する必要がある。
【０１８２】
ホスホチロシンが細胞のシグナル伝達に関与することから、例えば癌研究で興味をもたれているが、ホスホセリン及びホスホトレオニンの方が約２０００倍も多い。セリンとトレオニンのリン酸化は、チロシンのリン酸化の下流で起こり、相当に興味深い。抗ホスホセリン抗体と抗ホスホトレオニン抗体の機能が比較的低いことは、下流のリン酸化事象の監視を向上させることができる、セリン及びトレオニン側鎖のタンパク質リン酸化に対する高親和性で、選択的で、頑強でかつ効率的な結合剤が必要とされていることを示唆している。強力な結合剤を利用することで、生物機能やタンパク質リン酸化の機序に関する理解の範囲、及びインビトロ診断の開発の範囲が広げられる。生物分析のツールとして使用するために、結合剤は特異性と高い親和性を示すだけでなく、保存条件及び生理学的条件で長期間の安定性を示し、かつ、毒性が最小限であり、調製が容易である必要がある。
【０１８３】
特異性の高い結合剤分子を利用することが望ましいことが多く、リン酸化タンパク質の基の同定と定量に用いる一般的な試薬が生物分析の用途で、特に質量分析との併用でリン酸化タンパク質を富化するため、及び電気泳動ゲル、例えばウェスタンブロットでリン酸化タンパク質を検出するための固定化高親和性試薬として非常に興味をもたれている。ポリペプチドコンジュゲート結合剤分子の原理は、小分子の先端部が結合剤とタンパク質の相互作用を左右し、かつ、ポリペプチドが上述の特性を導入し、さらに親和性と選択性を高めるというものである。小分子先端部が特定のタンパク質でなく特定の官能基に対して選択性をもつ条件では、得られた結合剤分子はそのような官能基をもつタンパク質の大部分、あるいは全てを認識することができると期待される。我々は、リン酸化したアミノ酸側鎖及びリン酸化タンパク質の結合の基特異的な認識の問題に取り組み、原理の証明実験では、この結合原理をモデルタンパク質であるα−カゼイン、β−カゼイン及びオバルブミンに当てはめた。この目的のために本発明の分子ツールを使用し、リン酸基に結合することが知られている小分子であるＰＰ１と結合させることによって結合剤分子を調製する。
【０１８４】
【化２７】
2013542182.tif 000032
【０１８５】
ここでは、図１に示す１６種類のポリペプチドのうちの８種、すなわち全電荷がそれぞれ−１（すなわち３系列）、及び＋２（すなわち４系列）のポリペプチドを使用した。変動する複雑さの培地中で、結合剤の親和性、結合機序、及び選択性を評価した。結果は、リン酸化事象が重要な役割を担っている例では、これらの結合剤分子が診断用途の有力な候補であることを示唆している。
【０１８６】
結果と考察
結合剤の設計。リガンドとレポーター基への連結部位として使用したリシンをそれぞれ、直交保護基で保護した。固定又は官能基をさらに連結するために、２４番目のアラニンをシステインで置換した。修飾は、ペプチド合成中の固相上でも、開裂と精製後の溶液中でも実施可能である。折り畳み構造の模式図と結合剤４−Ｃ１５Ｌ８−ＰＰ１のアミノ酸配列を図６に示す。
リン酸基に対する選択性を示す、利用可能な多くの分子の中から（Aoki, S.,Kimura, E., Rev. Mol. Biotechnol. 2002, 90, 129-155）、リン酸陰イオンに結合することがＨａｍａｃｈｉらによって既に報告されている、Ｚｎ（ＩＩ）−２，２’−ジピコリルアミン（Ｄｐａ）錯体を使用することを決めた（Ojida, A., Inoue M., Mito-oka Y., Hamachi I., J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 10184-10185. Ojida A., Inoue M., Mito-oka Y., Tsutsumi H., Sada K., Hamachi I., J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 2052-2058. Ojida A., Mito-oka Y., Sada K., Hamachi I., J. Am. Chem. Soc, 2004, 126, 2454-2463. Ishida, Y., Inoue, M., Inoue, T., Ojida, A., Hamachi, I., Chem. Commun. 2009, 2848-2850）。別の選択的リン酸認識単位であるフォスタグはリン酸化されたペプチドやタンパク質に高い親和性を有することがＫｉｎｏｓｈｉｔａらによって報告された（Kinoshita, E., Yamada, A., Takeda, H., Kinoshita-Kikuta, E., Koike, T., J. Sep. Sci. 2005, 28, 155-162. Kinoshita, E., Takahashi, M., Takeda, H., Shiro, M., Koike T., Dalton Trans. 2004, 1189-1193. Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike T., Mol. Cell. Proteomics 2006, 5, 749-757）。結合剤の開発には、ジメチル安息香酸（ＰＰ１）によって結合されている２つのＤｐａ基を含む分子を選択した。この分子はこれまでにもリン酸受容体の構築に使用されており、リン酸酸素に配位する２つのＺｎ２＋イオンに結合する。この分子はリンペプチド類にμΜ（マイクロモル）領域である解離定数で結合することが報告されている（Yamaguchi, S., Yoshimura, I., Kohira, T., Tamaru, S., Hamachi, I., J. Am. Chem.Soc. 2005, 127, 11835-11841. Mangalum, A., Smith, R. C, Tetrahedron 2009, 65, 4298-4303）。
【０１８７】
図７にＰＰ１合成の模式図を示す。最初に、化合物１をＮＢＳでラジカル二臭素化し、その後、過剰に臭素化した望ましくない化合物を除去するために亜リン酸ジエチルで処理した（Liu, P., Chen, Y., Deng, J., Tu, Y., Synthesis 2001, 14, 2078-2080）。次の工程では、Ｄｐａ−Ｈ断片で２を求核攻撃して化合物３を生成し、さらにこれを加水分解してカルボン酸４を形成させた。このような極性化合物は精製が難しいため、カルボン酸４を水と有機層とで分配して精製し、最後に対応するＴＥＡ塩に変換した。ＴＥＡ塩は対イオンの疎水性により、有機相に溶けやすい。上述の合成経路を最適化し、文献で報告されているよりも非常に良い収率で標的化合物を生産した。
【０１８８】
リン酸化は折り畳まれたタンパク質の表面で起こり、この例にはスペーサーが含まれないため、ＰＰ１の先端部をリシン８の側鎖に直接コンジュゲートさせた。
構造解析。ＰＰ１とＺｎ２＋イオンの導入がポリペプチドの溶液構造に影響を与えるか否かを決定するために、様々な凝集段階の結合剤分子４−Ｃ１５Ｌ８−ＰＰ１を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）を用いて１、１０及び５０μΜの濃度にし、円二色性分光法によって解析した（表３）。
表３．様々な凝集段階にある結合剤分子、４−Ｃ１５Ｌ８−ＰＰ１の平均残基楕円率。１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む、ｐＨ７．２）に溶解し、２２２ｎｍの楕円率を２９８Ｋで測定した。
【０１８９】
【表５】
2013542182.tif 000033
【０１９０】
ペプチド濃度を重量から推定した。ペプチド濃度には大きな誤差がつきまとう可能性があるが、溶液は貯蔵液から調製したため、相対測定は正確である。Ｚｎ（ＮＯ３）２をペプチド濃度よりも２０％多く加えた。
【０１９１】
ペプチドは全て、２０９ｎｍと２２２ｎｍに極小値をもつヘリックスの特徴を示した。このことは、これらのペプチドがこれらの濃度で少なくとも部分的に二量体化し、４本のヘリックス束を形成していることを示唆している。親ペプチドである４−Ｃ１５Ｌ８と、ＰＰ１のＺｎ２＋錯体を担持している完全に修飾された４−Ｃ１５Ｌ８は、単量体−二量体平衡を表す適度な濃度依存性を示したが、ＰＰ１で機能化された４−Ｃ１５Ｌ８はＺｎ２＋の非存在下では濃度依存性を示さなかった。修飾の有無にかかわらずポリペプチドは、マイクロモル領域の濃度で４本のヘリックス束に二量体化するヘリックス−ループ−ヘリックスモチーフに折り畳まれ、溶液構造は官能基の導入に強く影響を受けると結論づけた。
【０１９２】
結合親和性。原理の証明実験では、モデルタンパク質であるα−カゼイン、β−カゼイン及びオバルブミンの結合を試験した。最も広く研究され、性質が明らかにされているリンタンパク質はおそらくα−カゼインである。α−カゼインは８〜１３個のリン酸基を有するが、β−カゼインは５個、オバルブミンは１個のリン酸基をもつ。これらのタンパク質では、リン酸化はセリン側鎖で起こる。これらは商業的な供給源から容易に調達できるため、体系的な調査に適している。カゼインとオバルブミンの等電点は両方とも約５であり、α−カゼイン、β−カゼイン、及びオバルブミンのＩＥＰはそれぞれ４．６、５．１及び４．６である。
【０１９３】
親和性の決定には、結合によって生じる疎水性環境の変化による量子収量の変化に応答することが予測される２種類の蛍光プローブを使用した。
マイクロ滴定プレートの形式で実施可能な予備的で単純な試験では、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む、ｐＨ７．２）に溶解した濃度５００ｎＭの８種類の結合剤候補（蛍光色素分子である７−メトキシクマリン−３−カルボン酸を有する）それぞれを、α−カゼインで３段滴定した（図８）。クマリンプローブの吸光度からペプチドの濃度を決定して濃度５μΜの貯蔵液を調製し、その分割量をマイクロ滴定プレートに移した。Ｚｎ（ＮＯ３）２を最終濃度が１２μΜになるように加えた。蛍光の発光スペクトルをタンパク質非存在下、及び５００ｎＭ、１０００ｎＭ及び１５００ｎＭのタンパク質存在下で記録し、結合剤とタンパク質両方の濃度が５００ｎＭの場合に結合が飽和したか否かを定性的に決定した。それらの濃度での、実験誤差範囲内での飽和は低ナノモルの親和性及び緊密な結合と矛盾しない。
【０１９４】
４系列結合剤の蛍光発光の強度はα−カゼインが存在すると、結合の結果、低下することが分かった（図８）。対照的に３系列の結合剤の蛍光発光強度は、α−カゼインが存在すると上昇することが分かった。この応答の差は、結合状態と遊離状態における、蛍光色素分子周辺の相対的な疎水性の差によるものであり、結合強度と蛍光発光強度の相対変化の間には何の関係もない。応答の差は、結合していないポリペプチドコンジュゲート内の相互作用の差に起因する可能性があることから、これはα−カゼインを含む複合体の構造の違いを示しているのでもない。
【０１９５】
一方、α−カゼインの濃度上昇に対する相対的な応答の差は、親和性の差と関係がある。４系列の結合剤分子は、α−カゼインの濃度にかかわらず、ほぼ同一の蛍光発光スペクトルを示した。このことは、結合剤とタンパク質の濃度が５００ｎＭの場合に結合が飽和することを示している。実験誤差を１０％以下と仮定すると、結合剤−タンパク質複合体の濃度が４５０ｎＭであり、遊離タンパク質と遊離結合剤の濃度はそれぞれ５０ｎＭと推定することができる。これらの数値から、見かけの親和性を５ｎＭと計算することができる。この予測は明かに大まかなものであり、実験誤差はおそらく１０％を越え、解離定数の上限（親和性の下限）が得られるだけである。それにもかかわらず、これは迅速で有益な実験である。蛍光滴定から、４系列の結合剤候補の解離定数が約５ｎＭ以下であると推定した。一方、３系列結合剤の強度はα−カゼイン濃度の上昇に伴って増加し、３Ｃ１０Ｌ１７−ＰＰ１以外は、この実験条件では飽和に達しなかった（図９）。３系列結合剤の解離定数は高ナノモルからマイクロモルの領域にあると結論付けた。３系列の親和性と４系列の親和性がほぼ同一なのは、おそらく偶然である。
【０１９６】
陰性対照として、無修飾の４−Ｃ１７Ｌ１０ポリペプチドと、Ｚｎ２＋イオン非存在下の４−Ｃ１０Ｌ１７−ＰＰ１をα−カゼインで滴定した（図１０）。蛍光発光スペクトルには何の影響も見られず、かつ、ＰＰ１及びＺｎ２＋イオンが結合に必要であることが示されている。α−カゼインに対するポリペプチドの親和性は低いが、公表されているＰＰ１の解離定数からは、ポリペプチドがＰＰ１に接合するとＰＰ１よりも数桁高く結合するポリペプチドコンジュゲートが生じると結論付けることができる。従って一般的な結合剤の概念から予期されるように、ポリペプチドはコンジュゲート中で有意に結合に寄与する。
【０１９７】
結合剤とα−カゼインとの間の相互作用をさらに探索するために、競合実験を行い、プルダウン実験とその後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって解析した。２％のポリスチレン・ラテックスナノ粒子懸濁液と１０ｍｇ／ｍＬのプルロニックF108-PDSを、一定に振とうしながら室温で一晩インキュベートすることで、粒子にプルロニックを吸着させた。チオールを脱保護した結合剤である４−Ｃ１５Ｌ８−ＰＰ１をポリスチレン粒子の表面に、ピリジルジスルフィド（ＰＤＳ）末端基を有する固定したプルロニックを用いた反応によって、ジスルフィド架橋を介して結合させた。このように調製した粒子をタンパク質溶液中でインキュベートし、洗浄と遠心分離を繰り返した後、ビーズから捕捉されたタンパク質が放出されるようにＤＴＴで処理した。得られた上清を電気泳動解析のためのゲルに負荷した。
【０１９８】
リン酸基への配位を介してリン酸化されたアミノ酸側鎖に結合するように、Ｚｎ２＋でキレートされたＰＰ１を設計したため、ホスホセリンに対して３桁多いリン酸陰イオンに相当する１０ｍＭのＰＢＳ緩衝液は、５００ｎＭのタンパク質濃度ではα−カゼインの捕捉を阻害しなかった（図１１）。このことは、リン酸陰イオン濃度が高い場合の診断目的の用途を大きく拡大するものである（Rapoport, S., Guest, G. M., J. Biol. Chem. 1941, 138, 269-282. Lehman, E. P., J. Biol. Chem. 1921, 48, 293-303.Gustin, P., Detry B., Cao M. L., Chenut F., Robert A., Ansay M., Frans A., Clerbaux, T., J Appl Physiol, 1994, 77, 202-208）。結合剤に対して、５００ｎＭのα−カゼインと、濃度が４００μΜのホスホチロシン側鎖をもつ合成ペプチド（ＰｈｏｓＰｅｐ）とを競合させると、明らかにα−カゼインが有利に作用する。α−カゼインの濃度だけを１００ｎＭに低下させ、ペプチド濃度を高マイクロモルレベルに維持すると、結合事象は抑制される。２０％レベルまで脱リン酸化されている市販のα−カゼインもまた、結合剤によって容易に抽出された。この結果は、この結合剤がポリペプチドとＰＰ１との相乗効果を介してα−カゼインに対する高い親和性をもたらすという有力な証拠を提供するものである。
【０１９９】
解離定数をより正確に決定するために、結合剤の濃度を１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む、ｐＨ７．２）に溶解して１００ｎＭとし、タンパク質で滴定を行った（図１２）。この濃度では、より強く発光するプローブが必要とされるため、アセトアミドメチル（Ａｃｍ）保護基を除去した後に、マレイミド基をポリペプチドの遊離チオールと反応させることによってＣｙｓ−２４の側鎖にフルオレセインを連結した。結合剤の濃度を一定（１００ｎＭ）に維持し、α−カゼインの濃度のみを変えた一連の試料を調製した。おそらく多くの解離定数が含まれていたが、１：１複合体の解離について記述している式に対する実験結果の最良適合から得られた見かけの解離定数は１７ｎＭであった。α−カゼインと４−Ｃ１５Ｌ８−ＰＰ１の１以上のコピーの複雑な解離挙動を単一の解離定数の観点から説明することは、明らかに単純化し過ぎである。いくつの結合剤分子がα−カゼインのリン酸基に結合するのかは分かっておらず、またこれらの結合剤分子が親和性の差に関係しているかも分かっていないが、その可能性が高い。
【０２００】
測定値はおそらく、真のＫｄを過小評価している。より信頼性の高い解離定数を得るためには解離定数の値に近い濃度で測定を実施する必要がある。この例では、蛍光発光の変化が十分な大きさではなかったため、１７ｎＭ以下では所望の正確さで測定することはできなかった。また、α−カゼインの濃度が変曲点の近辺及びそれ以下では４−Ｃ１５Ｌ８−ＰＰ１の濃度よりも低かったため、蛍光発光の変化から見積もられた結合強度は低い。見かけの解離定数は、雑種の結合剤分子がα−カゼインに強く結合していることを示しており、我々は、１７ｎＭでは結合剤の効率が過小評価されているものであると結論付けた。実施上の制限から、より正確なＫｄ値を確認することは残念ながら不可能である。
【０２０１】
結合剤の選択性。α−カゼイン及びオバルブミンをそれぞれ５００ｎＭ、並びに非リン酸化タンパク質であるリゾチーム、ホスホリラーゼＢ及びｂ−ガラクトシダーゼを含むタンパク質混合物からの抽出物の分析を図１３に示す。プルロニックでコーティングしたビーズ（非特異的結合を決定するため）、プルロニックでコーティングし、４−Ｃ１５Ｌ８（８番目のリシンがアセチル化されている）を固定したビーズ（ペプチド構造への非特異的な結合を決定するため）、及びプルロニックでコーティングし、Ｚｎ２＋イオンのない４−Ｃ１５Ｌ８−ＰＰ１を固定したビーズの３種類の陰性対照を用いた。錯体から確実にＺｎ２＋イオンを除去するために、実験を１ｍＭのＥＤＴＡ存在下で行った。
【０２０２】
非リン酸化タンパク質であるホスホリラーゼＢに相当するバンドは見られるが、結合剤４−Ｃ１５Ｌ８−ＰＰ１は混合物からα−カゼインを選択的に抽出し、非特異的な取り込みは僅かである。対照実験は、ホスホリラーゼＢはプルロニックでコーティングしたビーズに非特異的に結合することを示している（結果は示さない）。重要な成果は、α−カゼインへの結合に亜鉛が必須であることを示したことである。
【０２０３】
また、α−カゼインよりもリン酸化のレベルが低いリンタンパク質の結合を評価するために、１００ｎＭ溶液からのβ−カゼインの抽出を示した（図１４）。このタンパク質は、α−カゼインの約半数のリン酸基を有する。しかしながら、濃度１００ｎＭのオバルブミン（モノリン酸化タンパク質）は抽出できなかった。ポリリン酸化タンパク質の結合力はモノリン酸化タンパク質の結合力よりも高いと予想されることから、この違いは親和性の違いによると考えられる。また、ポリペプチドとタンパク質との相互作用が最適ではなかったことが原因である可能性もあるため、別のポリペプチドを選択することで改善できる可能性がある。
【０２０４】
より複雑な培地中での４−Ｃ１５Ｌ８−ＰＰ１の選択性を、牛乳及びヒト血清中でのプルダウン実験によって評価した（図１５）。牛乳は、非常に多くのタンパク質に加えて多数のカゼインを含み、中でもα−カゼインが最も豊富である。ヒト血清は数千種類のタンパク質を含み、ヒト血清からの抽出は、リン酸化タンパク質の生物医学用途での測定に関連する結合剤の選択性に関する重要な評価を提供する。ヒト血清を培地として選択したが、ヒト血清にはα−カゼインが含まれないため、これを加える必要があった。牛乳からのα−カゼインのプルダウンは上手くいき、β−カゼインに相当する小さなバンドのみが得られた。１００倍希釈したヒト血清を加えたα−カゼインのプルダウンを示すのに成功し、希釈していないヒト血清を加えたプルダウンも成功したが、ゲルには数個のバンドが見られた。希釈していないヒト血清という複雑な培地中では、ビーズによる非特異的な取り込みを回避することはできないため、希釈していない血清中での４−Ｃ１５Ｌ８−ＰＰ１の選択性のレベルをはっきりを規定することはできない。しかしながら、合成結合剤分子である４−Ｃ１５Ｌ８−ＰＰ１が数千ものタンパク質と競合して、α−カゼインを抽出することが示された。
【０２０５】
本明細書で報告している結合剤は、緩衝液中並びに牛乳及び血清中でモデルリンタンパク質であるα−カゼインとβ−カゼインに対する高い親和性と選択性を示し、さらに、結合剤の開発に使用した一連のポリペプチド配列は、事実上、いかなるタンパク質に対する結合剤の開発にも一般に適用可能であることを示している。この概念は、抗体やアプタマーなど、分子量が大きく、非常に複雑で、かつ、予め組織化された構造をとっていることが必要とされる生物学的な結合剤とは異なり、また、溶液中及び固形担体上で、特にセリン及びトレオニンを伴うリン酸化事象の監視に関するリンタンパク質の捕捉及び検出の選択肢を提供する。この種の結合剤は、頑強な捕捉技術が非常に重要となる生物工学や生物医学での幅広い用途に非常に適している。これは特別な予防策を講じることなく室温で保管することができ、確立している化学的な方法と試薬を使用して容易に誘導体化される。リン酸化タンパク質が、対応する非リン酸化タンパク質よりもイオン化されないことを踏まえると、この技術の魅力的な用途としては、質量分光学的な解析の前の生物試料の濃縮がある。結合剤は「プルダウン」実験でも非常によく機能し、医薬品への曝露によって生じる細胞内のリン酸化事象の監視にも広く使用されることが期待される。我々は、この結合剤が生体内及び生体外で造影剤として機能し得ると考えている。なぜならば、結合機能を乱すことなく有機分子を共有結合させることができるため、この結合剤が柔軟であるからである。特に、蛍光プローブ及び放射性核種部位を結合できることは、この技術を非常に柔軟で適合性のあるものにしている。最後に、結合小分子を典型的な抗体と比較した。
【０２０６】
実験項
小分子の合成
一般情報
試薬は全て市販されているものを購入し、さらに精製することなく使用した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）には、シリカゲルコーティング済み（０．２５ｍｍ）の酸化アルミニウム板（メルク）を使用し、スポットを紫外線（λ＝２５４ｎｍ）で可視化した。５００ＭＨｚ（４９９．９ＭＨｚ）の分光計で１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを記録し、４００ＭＨｚ（１００．６ＭＨｚ）の分光計で１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを記録した。重水素化クロロホルムを使用して、又は溶媒として、２５℃でスペクトルを記録した。残留クロロホルムを内部標準（１Ｈδ７．２６、１３Ｃδ７７．０）として化学シフト（δ）をｐｐｍで報告し、結合定数（Ｊ）をＨｚで報告した。パーキンエルマーSCIEX API 150EX分光計で陽イオンモードを使用し、低分解能質量スペクトルを記録した。
【０２０７】
３，５−ビス（ブロモメチル）安息香酸メチル（２）
工程１
３，５−ジメチル安息香酸（５ｇ、３０ｍｍｏｌ）をＣＣｌ４（５０ｍＬ）に溶解し、次いでＮＢＳ（１６．２ｇ、９０ｍｍｏｌ）及び過酸化ベンゾイル（０．２ｇ、０．８ｍｍｏｌ）を３等分して１時間かけて加えた。反応混合物を一晩還流させた。沈殿物（スクシンイミド）をろ過して除去し、ＤＣＭで洗浄した。ろ液をまとめて、飽和ＮａＨＣＯ３溶液と塩水で洗浄した。溶媒を減圧蒸留し、黄色油を得た。これをさらには検査せずに次の工程に使用した。
【０２０８】
工程２
工程１の生成物を無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解し、０℃まで冷却し、その後亜リン酸ジエチル（１２．６ｇ、９０ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１１．７８ｇ、９０ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温まで徐々に温め、一晩撹拌を続けた。混合物を約半量になるまで濃縮し、氷と水の混合物にあけ、Ｅｔ２Ｏ（２×５０ｍＬ）で抽出した。有機層を１ＭのＨＣｌと塩水で洗浄し、蒸発させた。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル：ＡｃＯＥｔ／ｎ−ペンタン、１：９）で精製し、白色粉末を得た。収量：５．５ｇ（５６％）。
【０２０９】
【化２８】
2013542182.tif 000034
【０２１０】
ＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値：３２１．９、実測値：３４４．２［Ｍ＋Ｎａ］＋。
３，５−ビス［［ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］メチル］安息香酸メチル（３）
３，５−ビス（ブロモメチル）安息香酸メチル（５００ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）とジ（２−ピコリル）アミン（８００ｍｇ、７２５μＬ、４ｍｍｏｌ）をＡＣＮに溶解し、次いで無水Ｋ２ＣＯ３（１．１ｇ、７．９ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、ＣａＣｌ２管を取り付けた還流冷却器で一晩還流した。反応混合物をろ過し、ろ液を減圧蒸発させた。黄色の残留物をフラッシュクロマトグラフィー（Ａｌ２Ｏ３中性、最初にＡｃＯＥｔを使用して不純物を溶出し、その後ＭｅＯＨ／ＡｃＯＥｔ＝１：９（容積比））で精製し、純粋な生成物を黄色油として得た。収量：８５０ｍｇ（９５％）。
【０２１１】
【化２９】
2013542182.tif 000035
【０２１２】
ＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値：５５８．７、実測値：５５９．５［Ｍ＋Ｈ］＋。
３，５−ビス［［ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］メチル］安息香酸＊ＴＥＡ塩／ＰＰ１（４）
３，５−ビス［［ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］メチル］安息香酸メチル（１ｇ、１．８ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（５０ｍＬ）に溶解し、ＮａＯＨの１０％溶液（５ｍＬ）を加えた。反応混合物を２時間還流した（反応の進行をＴＬＣ、Ａｌ２Ｏ３、ＭｅＯＨ／ＡｃＯＥｔ、１：９（容積比）で監視した）。反応混合物を０℃まで冷却し、次いで１０ＭのＨＣｌをｐＨが２になるまで加え、その後溶媒を減圧蒸発させた。得られた黄色の油状懸濁液を水（５０ｍＬ）に再度溶解し、ＴＥＡ（３．６ｇ、３６ｍｍｏｌ）を１滴ずつ加えた。水溶液をＤＣＭ（２×５０ｍＬ）で抽出し、有機層をまとめて蒸発して高真空乾燥し、生成物を粘性のある油として得た。収量：１．１ｇ（９５％）。
【０２１３】
【化３０】
2013542182.tif 000036
【０２１４】
ペプチド合成とペプチド合成後の修飾
一般情報
ペプチドの合成を、自動化された固相法を用い、アプライドバイオシステムズ４３３Ａペプチド合成機で、Fast Moc合成プログラムを使用した標準的なＦｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）化学反応を利用して行った。合成は０．１ｍｍｏｌスケールで行い、固相担体としてはH2N-RinkAmide-ChemMatrix（PCAS BioMatrix Inc）樹脂を１グラム当たり０．５４ｍｍｏｌ負荷して使用した。全てのカップリング工程は、ＨＣＴＵ／６Ｃｌ−ＨＯＢｔ／ＤＩＰＥＡ（Iris Biotech GmbH及びPepnet Inc.）活性化混合物と共に行った。ペプチド合成に使用した全ての試薬は、製造業者の手順に変更を加えずに調製した。アミノ酸（Calbiochem- Novabiochem AG、Iris Biotech GmbH）の側鎖を塩基に安定な基、すなわちｔｅｒｔ−ブチルエステル（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、トリチル（Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ）及び２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ａｒｇ）で保護した。結合サブユニットおよび蛍光プローブの連結又はポリスチレンビーズへの連結が柔軟に直交性をもつように、Ｌｙｓ１５とＬｙｓ８の主鎖をトリフルオロアセチル及び４−メチルトリチルで保護した。Ｃｙｓ側鎖はアセチル−アミノメチルで保護した。ペプチドを、ＨＰＬＣ（半分取hypersil C-18カラム２５０×２０ｍｍ、粒子径５μｍ）により、２種類の溶媒、Ａ（１０％ＡＣＮ／９０％Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ）、Ｂ（９０％ＡＣＮ／１０％Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ）を使用して精製した。移動相の組成については、以下の手順で詳細に記載する。ペプチドの確認は、MALDI-TOF MS（アプライドバイオシステムズ、Voyager-DE PRO）でα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして使用して行った。５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解した濃度５０μΜ〜１μΜのペプチドを使用し、ＣＤ分光法（JASCO J-810）を２５℃で行った。測定の前にｐＨを７．２に調整した。ＣＤの測定は全て、１ｍｍ及び１０ｍｍの石英キュベット内で行った。
【０２１５】
Ｍｔｔの切断。合成後、Ｌｙｓ８のＭｔｔを脱保護するためにペプチド含有樹脂をＴＦＡ／ＤＣＭ（３：９７、容積比）を含む混合液で、１０分ずつ２回洗浄した。樹脂をＤＣＭで洗浄し、真空乾燥した。
【０２１６】
ペプチド構造へのＰＰ１（４）の組み込み。約１／４量のペプチド含有樹脂（ペプチド０．０２５ｍｍｏｌ）を、４（８０ｍｇ、０．１２５ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（６５ｍｇ、０．１２５ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（３２ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（１．５ｍＬ）溶液に浸漬して一晩インキュベートした。樹脂をＤＭＦで３回、次いでＤＣＭで３回洗浄した。ＴＦＡ／トリイソプロピルシラン／Ｈ２Ｏ（９５：２．５：２．５、容積比）を含む混合液で３時間かけて樹脂からペプチドを切り出し、その後氷冷したＭＴＢＥで沈殿させた。ペプチドの塊を最小量のＴＦＡに再溶解し、冷Ｅｔ２Ｏで再沈殿させた。ペプチドを水に溶解し、凍結乾燥し、その後ＨＰＬＣにより、移動相Ｂを使用して勾配溶出（１７分間で３０％〜４５％、流速８ｍＬ／分）することで精製した。
【０２１７】
Ａｃｍの脱保護。ペプチド（１μｍｏｌ）を２％（容積率）のアニソールを含む０．５０ｍＬのＴＦＡに溶解した。この溶液を０℃まで冷却し、ＡｇＯＴｆ（２６ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、１００当量）のＴＦＡ溶液（０．５ｍＬ）を加えた。反応混合物を０℃で１時間撹拌し、周囲温度まで戻した。室温で１２時間撹拌し続けた。冷ジエチルエーテルを加えることで反応混合物からペプチドの銀塩を沈殿させ、遠心分離した。上清を捨て、残留物を０．５ｍＬの蒸留水に溶解する。このペプチド溶液にＤＬ−ジチオスレイトール（８ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ、５０当量）の氷酢酸（０．５ｍＬ）溶液を加える。この混合物を２時間撹拌し、その後遠心分離する。残留物を捨て、上清に含まれるペプチドを、Sep-Pak Plus（C-18カートリッジ、ウォーターズ）とＨＰＬＣ用の溶媒Ａ及びＢを使用して精製する。ＨＰＬＣ用の溶媒Ａで試料を１０ｍＬに希釈し、SEP-PACKカートリッジに負荷した。移動相の極性を徐々に上げながら、カートリッジを洗浄した。回収した画分をＭＡＬＤＩで分析し、所望の生成物を含む画分をまとめて凍結乾燥した。
【０２１８】
Ｔｆａの脱保護。ペプチド（１μｍｏｌ）を水（１ｍＬ）に溶解し、この溶液を０℃まで冷却した。撹拌されている溶液にピペリジン（２００μＬ、２ｍｍｏｌ）を加え、０℃で２時間撹拌し続けた。冷ＴＦＡ（１５４μＬ、２ｍｍｏｌ）を加えることでこの溶液を中和し、Sep-Pak Plus（C-18カートリッジ、ウォーターズ）とＨＰＬＣ用の溶媒Ａ及びＢを使用して精製した。ＨＰＬＣ用の溶媒Ａで試料を１０ｍＬに希釈し、SEP-PACKカートリッジに負荷した。移動相の極性を徐々に上げながら、カートリッジを洗浄した。回収した画分をＭＡＬＤＩで分析し、所望の生成物を含む画分をまとめて凍結乾燥した。
【０２１９】
蛍光実験
一般情報
蛍光実験は全て、９６ウェルのポリスチレンプレート内で行った。測定は全て、モレキュラーデバイスのプレートリーダー、Spectra max GEMINI XPSを使用し、２５℃で行った。各プレートには３００μＬの分析物を加えた。全ポリスチレンプレートは測定の前に、分析物の非特異的な結合を最小限に抑えるために特別に調製した。全ウェルをプルロニックの１％水溶液で満たし、一晩放置した。完全に洗浄した後、その後の実験で使用するペプチドに構造が類似しているペプチドを含む溶液（０．３ｍｇ／ｍＬ）でウェルを満たした。プレートを一晩インキュベートし、その後完全に洗浄して乾燥した。
【０２２０】
予備的な蛍光スクリーニング。３種類の溶液を調製した。１つ目には、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ）に溶解した５００ｎＭのＰＰ１＿４−Ｃ１５Ｌ８Ｃｙｓ２４を、２つ目にはＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０のｍＭのＮａＣｌ）に溶解した５００ｎＭのＰＰ１＿４−Ｃ１５Ｌ８Ｃｙｓ２４と５００ｎＭのα−カゼインを、３つ目にはＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ）に溶解した５００ｎＭのＰＰ１＿４−Ｃ１５Ｌ８Ｃｙｓ２４と１０００ｎＭのα−カゼインを含めた。各溶液はウェル内で、測定の直前に調製した。それぞれの系について３つずつ試料を準備して平均値をとった。緩衝液に溶解したタンパク質のみを含む溶液の蛍光が記録されたが、応答はノイズレベルであった（報告せず）。
【０２２１】
蛍光分光法による親和性の決定。一連の溶液を調製した。溶液はそれぞれ、濃度１００ｎＭの結合剤４−Ｃ１５Ｌ８−ＰＰ１＊を含み、α−カゼインの濃度を１ｎＭから最大１０μΜに変えた。溶液は全てＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で調製した。５２５ｎｍの蛍光をタンパク質の総濃度の関数として観測し、式（１）を適合して解離定数Ｋｄを決定した。
【０２２２】
【数１】
2013542182.tif 000037
【０２２３】
・・・式１
式１中、ＦＯｂｓは観測された蛍光強度であり、Ｆｂｏｕｎｄはα−カゼインに結合したペプチド結合剤の蛍光であり、Ｆｆｒｅｅは遊離ペプチドの蛍光であり、かつ、［αＣ］は遊離α−カゼインの濃度である。［αＣ］は式２から導くことができ、式中、［Ｐ］ｔｏｔはペプチドの総濃度であり、かつ、［ａＣ］ｔｏｔはα−カゼインの総濃度である。
【０２２４】
【数２】
2013542182.tif 000038
【０２２５】
・・・式２
数値適合はIGOR Pro 4.03（WaveMetrics Inc.）で行った。
プルダウン実験と蛍光実験
一般情報
ポリスチレンビーズ（名目上の直径は１μｍ）の懸濁水をBangs Laboratories,Inc.から購入した。プルロニックはBASFから購入し、プルロニックF108-PDSはAllvivo Inc.（レークフォレスト、ＣＡ、米国）から供給された。タンパク質は全てシグマ・アルドリッチから購入した。全試薬及びゲル電気泳動に使用したゲルはインビトロジェンから購入した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動はNuPAGE（登録商標）Novex 4-12％ビス−Trisゲル、１．５ｍｍを使用して行った。ゲルはＭＥＳ緩衝液中で展開した。ゲルは全て、銀染色用のキットであるSilverQuest（商標）キットを使って染色した。
【０２２６】
ポリスチレン粒子へのプルロニックの吸着。ポリスチレンビーズ（１μｍ、１０ｍｇ）をミリＱ水で１回洗浄し、その後遠心分離した（１４，０００ｒｐｍ、７分）。粒子をF108-PDS（１ｍＬ、２％）の水溶液に再懸濁し、２４時間回転撹拌した。その後プルロニックでコーティングした粒子を遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、７分）によって過剰の界面活性剤から分離した。次いでビーズをＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁し、超音波処理し、再度遠心分離した。この手順を３回繰り返した。
【０２２７】
ポリスチレンビーズへのポリペプチドの固定。プルロニック−PDSでコーティングしたポリスチレンビーズ（１μｍ、１０ｍｇ）をＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で洗浄し、窒素でパージした。その後ビーズを、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）の窒素飽和水溶液に溶解した、遊離システインを有するペプチド（０．５ｍｇ）の溶液（１ｍＬ）に浸漬した。操作は全て無酸素条件下で行った。１２時間インキュベートした後、ビーズをＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ）水溶液で３回洗浄し、次いでＺｎイオンを含むＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ＝８）の水溶液（ｐＨ＝８．２、１０ｍＭのＴＲＩＳ、５ｍＭのＺｎ（ＮＯ３）２）で洗浄した。ビーズを洗浄し、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ）に再懸濁した。
【０２２８】
プルダウン実験。上述のようにコーティングしたポリスチレンビーズ（０．５ｍｇ〜１ｍｇ）を緩衝液、牛乳又は血清（０．５ｍＬ〜１ｍＬ）と共にインキュベートした。懸濁液を９０分間回転撹拌し、その後遠心分離した（１４，０００ｒｐｍ、７分）。ビーズの塊を少なくとも４回１ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ）に順次再懸濁することで洗浄し、その後遠心分離した（１４，０００ｒｐｍ、７分）。洗浄手順の合間に随時、表面への非特異的な結合を減らすために超音波処理を行った。洗浄手順の後、ビーズを遠心分離し、塊をＤＴＴ溶液（１ｍＭ）のＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ）（２０μＬ）に再懸濁し、その後随時超音波処理を行いながら、１時間インキュベートした。その後、懸濁液を遠心分離し、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、銀染色した。ゲル電気泳動用の試料は、製造業者の説明に従って調製した。
【０２２９】
実施例４
実施例４では、チミジンキナーゼ（ＴＫ）を標的分子として選択した。
ＴＫは、２−デオキシチミジンの５’−一リン酸−２’−デオキシチミジンへのリン酸化に関与する。ウレアプラズマ・ウレアリチクム（Ureaplasma urealyticum）に由来するＴＫの結合ポケットに関する洞察を図１６に示す。
【０２３０】
高等生物は、化学的に非常に異なる２種類のアイソザイムであるＴＫ１とＴＫ２をもつ。ＴＫ１は細胞分裂性の細胞質のみに存在するが、ＴＫ２はミトコンドリアに局在し、細胞周期非依存性である。
【０２３１】
ＴＫ１のレベルは低分化細胞や高度に増殖している細胞（例えば癌細胞）で高いため、ＴＫ１は抗癌剤の設計や診断への応用に魅力的な標的となっている。さらに、異なる種のＴＫ１の形状（例えばヒトのＴＫ１と細菌のＴＫ１）を識別できる緊密なＴＫ１結合剤が非常に関心をもたれている。
【０２３２】
ヌクレオシドは、リボース糖又はデオキシリボース糖との核酸塩基結合を含むグリコシルアミンである（図１７）。非常に重要なことに、それらはＤＮＡ鎖及びＲＮＡ鎖の構成要素として役立っている。さらにそれらは、一リン酸、二リン酸、又は三リン酸と異なる形で、多数の細胞内過程に関与している。
【０２３３】
模式図３に示すように、チミジンキナーゼに対する結合剤をデオキシ−チミジンから合成した。
【０２３４】
【化３１】
2013542182.tif 000039
【０２３５】
模式図３。条件：ａ：１４（１．５当量）、ＮａＨ（１．５当量）、ＤＭＦ、室温、２０時間。ｂ：１ＭのＮａＯＨ、ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ、０℃、１時間。ｃ：ｐ−ニトロフェノール（２．５当量）、ＤＩＰＣＤＩ（３当量）、ピリジン、室温、２時間。
【０２３６】
１０−ブロモデカン酸メチルエステルを、再度、水素化ナトリウム条件を使用し、中程度の収率で核酸塩基のＮ３位に結合させた。ＴＬＣによって、このリンカーが他の位置にも、微量の副産物としてではあるが、連結されていることが明らかになる。１８の構造をCOSY NMR実験で確認した（実験部分を参照のこと）。その後鹸化し、ｐ−ニトロフェノールを導入してデオキシ−チミジンプローブ１９を高収率で得た。
【０２３７】
チミジンキナーゼ（ＴＫ）を検討するために、試験研究でデオキシ−チミジン（ｄＴ）プローブ１９を２Ｄ１０Ｌ１７にコンジュゲートさせた。ＨＰＬＣにより、２時間後には約８０％が所望のコンジュゲートに変換されたことが示された。短期間でのスクリーニング実験用にｄＴを、Ｔｒｉｓ−緩衝液中で３時間かけてライブラリーペプチドのうちの８つにコンジュゲートさせた（表４）（詳細は実験部分を参照のこと）。
【０２３８】
【表６】
2013542182.tif 000040
【０２３９】
ＴＫを用いた蛍光結合試験
その後、少なくとも６０％のペプチドがリガンドを有していると推定されたため、溶液を濃度２μΜに希釈し、タンパク質ＴＫを加えた。蛍光反応を１５分後、４５分後、２時間後、及び２０時間後にスクリーニングした。最大の反応は、２時間インキュベートした後に見られた。
【０２４０】
４種類のペプチド、すなわち３−Ｃ１５Ｌ８−ｄＴ、２−Ｃ１０Ｌ１７−ｄＴ、４−Ｃ１０Ｌ１７−ｄＴ及び３−Ｃ２５Ｌ２２−ｄＴを「的中」として同定した。なぜならば、さらに当量のＴＫを加えても蛍光強度がそれ以上は高まらなかったためである。Ｋｄは２０ｎＭ以下であると推定される。
【０２４１】
選抜したその他４種類のペプチド、すなわち４−Ｃ１５Ｌ８−ｄＴ、３−Ｃ１０Ｌ１７−ｄＴ、４−Ｃ２５Ｌ２２−ｄＴ及び２−Ｃ３７Ｌ３４−ｄＴは、１当量のＴＫを加えた場合と比較して、２当量のＴＫを加えた場合に強度の上昇を示したため、緊密な結合剤とは見なされない。
【０２４２】
ＴＫを用いた、ＡＴＰ存在下での結合試験
緩衝液に１、２及び３当量のＴＫを溶解し、ＡＴＰを加えて或いは加えないで蛍光強度を測定した。ＡＴＰは生物試料中に含まれるため、ＡＴＰの導入は実際的な測定状況を表し、ＴＫが存在するとＡＴＰはプローブと反応すると考えられる。酵素を加えて１５分後、４５分後及び２時間後にデータを収集した。酵素を加えて約５分後、４５分後及び２時間後にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ用の試料を回収し、質量の変化を測定した。
【０２４３】
３−Ｃ１５Ｌ８−ｄＴ
３−Ｃ１５Ｌ８−ｄＴの強度は、ＡＴＰが存在する場合にはＡＴＰがない場合よりも高い。このペプチドはＡＴＰを加えて４５分後に完全にリン酸化されることがＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって分かった。一方非リン酸化ペプチドの大きなピークは、質量分析では５〜１０分後に見られた。そのため、実際の結合剤はリン酸化された形態の３−Ｃ１５Ｌ８−ｄＴである。結合親和性は高かったが４−Ｃ１０Ｌ１７−ｄＴほどではない。図１８及び１９を参照のこと。
【０２４４】
４−Ｃ１０Ｌ１７−ｄＴ
ＡＴＰが存在する場合の４−Ｃ１０Ｌ１７−ｄＴの強度は、ＡＴＰがない場合の強度と大きく異なった。ＡＴＰ存在下では、いずれのＴＫ濃度でも強度は類似しており、完全飽和レベルを示している。質量分析ではリン酸化されたｄＴ−結合剤の大きなピークと非リン酸化ペプチドのより小さいピークが５〜１０分後に示され、４５分後には本質的に、リン酸化された結合剤のみが存在した。この結果は、リン酸化された４−Ｃ１０Ｌ１７−ｄＴのＴＫに対する結合親和性が強いことを示している。４−Ｃ１０Ｌ１７−ｄＴの蛍光スペクトルを図２０及び２１に示す。
【０２４５】
４−Ｃ２５Ｌ２２−ｄＴ
４−Ｃ２５Ｌ２２−ｄＴの強度の違いは、ＡＴＰの有無にかかわらずＴＫに対する結合親和性が概して良いことを示唆している。しかしながら、ＴＫの濃度の違いによって強度は様々であり、１当量のＴＫで最も高い値を示している。ＡＴＰ存在下では、このペプチドが５〜１０分後に完全にリン酸化されたことが分かった。これは最速のリン酸化率であったが、測定中に大きな差は観測されなかった。４−Ｃ２５Ｌ２２−ｄＴの蛍光スペクトルを図２２及び２３に示す。
【０２４６】
ｄＴを使用した「良い」結合剤の競合実験
蛍光スクリーニングの追跡実験で我々は、ＴＫの天然の基質、すなわちデオキシ−チミジン（ｄＴ）を使用して、ペプチド−結合剤の競合を試みた。この目的のために２種類の試験を行った。これらの試験では、ペプチド結合剤に対して１、１０、１００、及び１０００当量のｄＴを混合物に加えた。試験Ｉではまず、タンパク質を「良い」ペプチド結合剤と共に１時間インキュベートし、その後ｄＴを加えた。いずれの例においても蛍光の低下は観測されず、このことは、このペプチド−結合剤がｄＴに対しては競合できないことを示している。試験ＩＩではまず、タンパク質を異なる濃度のｄＴと共にインキュベートし、その後結合剤−ペプチドを加えた。すぐに蛍光の変化が観測され、このことは重ねて、ペプチド−プローブコンジュゲートがｄＴよりもＴＫに緊密に結合することを示している。
【０２４７】
試験Ｉ及び試験ＩＩ両方の蛍光スペクトルを図２４、２５、２６及び２７に図示する。青色の曲線はデオキシ−チミジンを含むペプチドの蛍光の吸光度を表し、桃色の曲線は１当量のＴＫを加えたペプチド−ｄＴコンジュゲートについて測定した蛍光の吸光度に相当する。緑色の曲線は試験Ｉの結果であり、橙色の曲線は試験ＩＩの結果である。
【０２４８】
実験項
一般
装置
クロマトグラフィー
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）：
シリカゲル薄層クロマトグラフィーは、Flukaのシリカゲル（２５４ｎｍで蛍光測定、０．２ｍｍ厚、アルミニウム板）を使用して行った。可視化はＵＶ光（２５４ｎｍ）で、及び／又はプレートをアニスアルデヒド（１０ｍＬのｐ−アニスアルデヒド、１０ｍＬの濃Ｈ２ＳＯ４、２ｍＬの濃酢酸、１８０ｍＬのエタノール）で染色することによって行った。
【０２４９】
フラッシュクロマトグラフィー（ＦＣ）：
フラッシュクロマトグラフィー（ＦＣ）はシリカゲル（Matrexシリカゲル６０Å、３５〜７０μｍ、アミコン）を使用して行った。
【０２５０】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）：
オリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ精製は、Varian ProStarシステムで逆相の分析用及び／又は分取用Ｃ−１８カラムを使用して行った。溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ（９０％）＋ＡＣＮ（１０％）＋ＴＦＡ（０．１％）。溶媒Ｂ：ＡＣＮ（９０％）＋Ｈ２Ｏ（１０％）＋ＴＦＡ（０．１％）。
【０２５１】
ＮＭＲ分光法
ＮＭＲスペクトルは全て、Varian Unity 400ＭＨｚ分光器を使用して室温で測定した。化学シフト（δ）はｐｐｍで、重水素化されていない残留溶媒のピーク（ＣＨＣｌ３：７．２７ｐｐｍ、ＣＨＤ２ＯＤ：３．３５ｐｐｍ、ｄ６−ＤＭＳＯ：２．４９ｐｐｍ）との相対値として報告する。結合定数Ｊは、Ｈｚで示す。多重度は以下のように略す：ｓ＝一重線、ｄ＝二重線、ｔ＝三重線、ｑ＝四重線、ｍ＝多重線、ｂｒ＝広幅。
【０２５２】
ＣＯＳＹ実験により、シグナルを割り当てた。
１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは１０１ＭＨｚで記録した。化学シフト（δ）はｐｐｍで、中央の溶媒ピーク（ＣＤＣｌ３：７７．０ｐｐｍ）との相対値として報告する。
【０２５３】
質量分析
エレクトロスプレーイオン化質量スペクトル（ＥＳＩ）はパーキンエルマーAPI 150 EX装置で記録した。
【０２５４】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ
ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルは、アプライドバイオシステムズのVoyager-DE PROシステムで記録した。
【０２５５】
蛍光分光法
蛍光の測定は、GeminiXPSプレートリーダーを使用し、NUNC（商標）のポリスチレン製９６−ウェル又は３８４ウェルプレートで行った。プレートは使用前にプルロニック（登録商標）F108NF Prillポロキサマー３３８（ＢＡＳＦ）でコーティングした。
【０２５６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動は、インビトロジェンのNuPAGE MES-SDSキットを使用して行った。インビトロジェンのSilverQuest銀染色キットVersion Fでゲルを染色した。
【０２５７】
反応、化学薬品、ペプチド及びタンパク質
反応は全て、加熱したガラス容器中、Ｎ２雰囲気下で行った。溶媒は減圧下で濃縮した（液槽温度＜４０℃）。反応用溶媒（ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ピリジン）は、アルドリッチから、王冠で蓋をされた瓶入りのものを購入した。抽出用及びＦＣ用の溶媒は使用前に蒸留した。化学薬品は全てアルドリッチから購入した（入手可能な最高等級のもの）。
【０２５８】
Ｎ−デカン酸−メチルエステル−２’−デオキシチミジン１８
【０２５９】
【化３２】
2013542182.tif 000041
【０２６０】
２’−デオキシチミジン（５００ｍｇ、２．０６ｍｍｏｌ）及びブロモデカン酸メチルエステル１４（８００ｍｇ、３．０９ｍｍｏｌ、１．５当量）を無水ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解し、０℃まで冷却した。ＮａＨ（油中に５０〜６０％、１４８．６ｍｇ、３．０９ｍｍｏｌ、１．５当量）をゆっくりと加えた。懸濁液をＮ２雰囲気下、０℃で１５分間撹拌し、その後室温まで戻した。１６時間後に飽和塩水を加えて反応を停止させた。水相をＥｔＯＡｃ（３×）で抽出し、ＭｇＳＯ４で有機相を乾燥し、ろ過し、その後濃縮した。ＦＣ（シリカゲル、純ＣＨ２Ｃｌ２〜ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９３：７）での精製により、標題化合物１８（無色油、３５８．１ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ、４０．７％）を主生成物として得た。
【０２６１】
ＴＬＣ（シリカゲル、９７：３のＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ）、Ｒｆ：０．２１。
ＬＲ−ＥＳＩ＋−ＴＯＦ−ＭＳ（メタノール）：Ｃ２１Ｈ３４Ｏ７Ｎ２Ｎａの計算値：４４９．４９；実測値：４４９．０。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、δ（ｐｐｍ））：
【０２６２】
【化３３】
2013542182.tif 000042
【０２６３】
１３Ｃ−ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、δ（ｐｐｍ））：
【０２６４】
【化３４】
2013542182.tif 000043
【０２６５】
Ｎ３−デカン酸−ｐ−ニトロフェニルエステル−２’−デオキシチミジン１９
【０２６６】
【化３５】
2013542182.tif 000044
【０２６７】
２’−デオキシチミジン−誘導体１８（２６０ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ）を１ＭのＮａＯＨ（２ｍＬ、１：１のＨ２Ｏ／ＭｅＯＨに溶解）に溶解し、０℃で１時間撹拌した。その後、１．２５ＭのＨＣｌ溶液（ＭｅＯＨに溶解）をｐＨが５になるまで加えてこの溶液を中和した。溶媒を蒸発させ（２５℃を越えて加熱しない）、残留物を一晩凍結乾燥した。残留物を無水ピリジン（３ｍＬ）に溶解し、ｐ−ニトロフェノール（２１２．３ｍｇ、１．５３ｍｍｏｌ、２．５当量）とジイソプロピルカルボジイミド（０．２８ｍＬ、１．８３ｍｍｏｌ、３当量）を加えた。黄色溶液をＮ２雰囲気下、室温で２時間撹拌し、その後塩水を加えて反応を停止させた。ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、濃縮して粗生成物を得た。ＦＣ（シリカゲル、ＣＨ２Ｃｌ２〜ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９０：１０）で精製して、標題化合物１９（２１３．４ｍｇ、０．４００ｍｍｏｌ、６５．６％）を黄色油として得た。
【０２６８】
ＴＬＣ（シリカゲル、９７：３のＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ）、Ｒｆ：０．１２。
ＬＲ−ＥＳＩ＋−ＴＯＦ−ＭＳ（メタノール）：Ｃ２６Ｈ３５Ｏ９Ｎ３Ｎａの計算値：５５６．５８；実測値：５５６．４。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、δ（ｐｐｍ））：
【０２６９】
【化３６】
2013542182.tif 000045
【０２７０】
ペプチド構造へのヌクレオシド−プローブの結合
ＤＭＳＯ中におけるｄＴ−結合剤カップリングの一般手順
ポリペプチド（３ｍｇ、０．５２μｍｏｌ）を、１０％のピリジンを含むＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解し、ＡＭＰ−又はｄＴ−結合剤（３当量）を加えた。ＤＩＰＥＡ（３μＬ）を加え、この溶液を室温で４〜２０時間撹拌した。反応は分析用ＨＰＬＣで監視した。冷ジエチルエーテルをゆっくりと加えて反応を停止した。遠心分離した後、沈殿したペプチドを水（０．０１％ＴＦＡを含む）に溶解し、その後凍結乾燥した。粗ペプチドを半分取ＨＰＬＣで精製し、約２ｍｇの標的ペプチドを得た。精製した画分をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析した。
分析用ＨＰＬＣ：Ｃ−１８カラム、１０〜６０％のＢで３０分、又は２０〜８０％のＢで４０分。
【０２７１】
分取ＨＰＬＣ：半分取Ｃ−１８カラム、１０〜５０％のＢで４０分、又は２０〜９０％のＢで４０分。
ａｃｍ脱保護の一般手順
トリフルオロメタンスルホン酸銀（１００当量）をＴＦＡ／アニソール（９９：１）に溶解し、１ｍＬを０℃で、ａｃｍを脱保護したポリペプチドに加えた。２時間後、反応混合物を室温まで温め、一晩撹拌した。冷ジエチルエーテルでペプチドを沈殿させ、遠心分離し、上清を捨てた。銀塩を５０当量のＤＴＴと共に５０％（容積率）酢酸に溶解し、室温で一晩撹拌した。ａｃｍ−を脱保護したペプチドを凍結乾燥し、ＨＰＬＣ（１０〜７０％のＢで３０分）で精製した。
【０２７２】
緩衝液中でのｄＴ−結合剤カップリングの一般手順
ポリペプチド（０．５ｍｇ、０．１μｍｏｌ）を１ｍＭの濃度になるようにＴｒｉｓ−緩衝液（０を参照のこと、９７．５μＬ）に溶解し、ＡＭＰ−又はｄＴ−結合剤（２当量）及びＤＩＰＥＡ（０．５μＬ）を加えた。蛍光スクリーニング用のプローブを２〜４時間後に取り外した。
【０２７３】
蛍光実験
ＴＫを用いた結合試験
NUNC（商標）ポリスチレン３８４ウェルプレート（１００μＬ容量）とピペットチップをプルロニック（登録商標）で一晩コーティングし、その後Ｈ２Ｏで洗浄し、乾燥した。蛍光の測定は、Ｔｒｉｓ−緩衝液（ＴＫ試験用の緩衝液：２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、０．４ＭのＮａＣｌ、０．３Ｍのイミダゾール、２ｍＭのＤＴＴ、５０％グリセロール、ｐＨ７．６）中で行った。少なくとも６０％のｄＴ−結合剤がポリペプチドにコンジュゲートしたと仮定して（０を参照のこと）、濃度６０μΜの貯蔵液を調製した。ＴＫ貯蔵液の濃度は０．１０ｍＭとした。濃度２μΜのポリペプチド（９５ｍＬ）を使用した。ペプチドコンジュゲートを入れたウェルにタンパク質を加えてＴＫの最終濃度を２又は４μΜとした。タンパク質−結合剤混合物の蛍光強度を、タンパク質を加えていない結合剤の強度と比較した。１当量のタンパク質が存在する場合の蛍光強度が、タンパク質を加えてない場合の結合剤の蛍光強度と比較して有意に変化した場合に、標的タンパク質が結合剤によって複合体を形成したと解釈した。２μΜのタンパク質存在下で強度変化を示すが、４μΜのタンパク質存在下でそれ以上の強度変化を示さない結合剤を「的中」と考えた。９０％を越える結合剤が、濃度２μΜのタンパク質と結合していると仮定すると、Ｋｄは２０ｎＭ以下であると推定される（Ｋｄ＝［Ｐ］［Ｂ］／［ＰＢ］）。
【０２７４】
ダンシルプローブを３３５ｎｍで励起し、発光を４２０〜６００ｎｍで記録した。測定は全て室温で行い、試料は３つ重複して準備した。ウェルを１５分後、４５分後、及び２時間後に測定した。
【０２７５】
プルダウン実験
ポリスチレン・ラテックスナノ粒子（０．９６μΜ、Bangs laboratories Inc.）を１ｍＬのＭＱで３回洗浄し、その後プルロニックF108-PDS（Allvivo Inc.）を加えて一定に振とうさせながら、一晩室温でインキュベートした。吸着させた後、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することで、過剰の界面活性剤を粒子から分離した。ビーズを３００μＬのＭＱで洗浄し、次いで３００μＬのＨＥＰＥＳ−緩衝液１（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．９）で２回洗浄した。その後ビーズを３００μＬのＨＥＰＥＳ−緩衝液１に溶解し、ａｃｍを脱保護したポリペプチド２−Ｃ１０Ｌ１７−ＡＭＰ（約２５μｇ）を加えて１時間反応させた。遠心分離した後、ビーズをＨＥＰＥＳ−緩衝液２（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．９）で３回洗浄した。ブロッキングペプチド（１００μＬ、０．４ｍｇ／ｍＬ、４−Ｃ１５Ｌ８Ｋ２４Ｔｆａ）を加えて１時間インキュベートした。遠心分離した後、２００μＬのＨＥＰＥＳ２で３回洗浄し、ビーズを２００μＬのＨＥＰＥＳ２に溶解した。核呼吸細胞質基質ヒーラ抽出物（BIOTECH）（１５０μＬ）をビーズに加えて１時間インキュベートした。ビーズを遠心分離し、ＨＥＰＥＳ２（各回３００μＬ）で６回洗浄し、その後１００ｍＭのＤＴＴ（１００μＬ）に再懸濁して２０分間インキュベートすることで、ポリペプチド−タンパク質コンジュゲートを切断した。ビーズを１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を回収した（K. Fromell, Hulting G., Ilichev A., Larsson A., Caldwell K.D., Anal. Chem. 2007, 79, 86019）。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで、試料緩衝液を５μＬ、プローブを１５μＬウェルに負荷して解析した。ゲルは３５分間、２００Ｖで泳動した。
【０２７６】
実施例５
この実施例では、ビタミンＤ結合タンパク質を標的分子として用いた。
ビタミンＤファミリーの分子は、高等生物におけるカルシウム代謝及び亜リン酸代謝の制御に関連しており、また、様々なビタミンＤ誘導体が、くる病、骨粗鬆症、乳癌、前立腺癌、乾癬、及びアルツハイマー病等の病状に影響を与えることが示されている。ビタミンＤ誘導体がこれらの疾患や他の疾患に影響を及ぼすことが、ビタミンＤ誘導体を多数合成し、生物学的に評価する広範囲に及ぶ研究努力を加速させている。ビタミンＤ誘導体の生物学的な評価は生体内試験及び生体外試験の両方に関わっており、生体外試験では、様々なビタミンＤ誘導体の受容体タンパク質への結合能が解析されることが多い。そのような受容体タンパク質のうち、広く研究されているのはビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）とビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）の２種類である。後者は、ビタミンＤとその血清中での代謝の主要な担体であり、かつ、それ自体が体内のビタミンＤレベルの重要な制御因子である。健康及び疾患へのビタミンＤの重要性を考慮すると、血清ＤＢＰレベルの異常が病状と関連していることは驚くに値しない（Finehout, E. J.; Franck, Z.; Choe, L. H; Relkin, N.; Lee, K. H. Ann Neurol 2007, 61, 120-129. Zhang, J.; Sokal, I.; Peskind, E. R.; Quinn, J. F.; Jankovic, J.; Kenney, C; Chung, K. A.; Millard, S. P.; Nutt, J. G.; Montine, T. J. Am J Clin Pathol 2008, 129, 526-529. Liu, X.-D.; Zeng, B.-F.; Xu, J.-G.; Zhu, H.-B.; Xia, Q.-C. Proteomics 2006, 6, 1019-1028）。アルツハイマー病、ＡＬＳ、及びパーキンソン病のバイオマーカーとしての体液中のＤＢＰレベルの使用が非常に関心をもたれている。そのため、ＤＢＰを正確かつ迅速に測定することが必要不可欠であり、本発明の分子ツールの一応用では、結合強度及び多機能性が高いことによって可能性のあるビタミンＤ誘導体のペプチドコンジュゲートを提供する。このようにして提供されるポリペプチドコンジュゲートは、アルツハイマー病、ＡＬＳ、及びパーキンソン病並びに体液中のＤＢＰレベルと関連する他の疾患のいずれに対しても、体液中のＤＢＰレベル測定のバイオマーカーとして重要なツールになると考えられる。
【０２７７】
最近、スペーサーを有する小分子リガンドの合成が報告された（Q.;Zhang, T.; Norberg, J.; Bergquist, L.; Baltzer. Tetrahedron 2010, 66, 4577-4586）。小分子リガンド２５ＯＨＶＤ３（すなわち炭素原子２５でヒドロキシル化されたビタミンＤ）の合成に最も有効な合成経路の概要を模式図４に示す。
【０２７８】
【化３７】
2013542182.tif 000046
【０２７９】
模式図４。（ａ）ＮａＩＯ４／ＲｕＣｌ３／ＣＣｌ４−ＣＨ３ＣＮ−リン酸塩緩衝液／４５℃／２〜４日、４３％〜５５％；（ｂ）ＴＥＳＣｌ／イミダゾール／ＤＭＦ／室温／一晩、９７％；（ｃ）（ｉ）ＬＤＡ／ＴＨＦ／−７８℃／１時間；（ｉｉ）ＴＭＳＣｌ／−７８℃〜０℃；（ｄ）Ｐｄ（ＯＡｃ）２／ＴＨＦ−ＣＨ３ＣＮ／室温／一晩、７５％（２２から）；（ｅ）（ｉ）１０／ｔ−ＢｕＬｉ／−８５℃／Ｅｔ２Ｏ／１．５時間；（ｉｉ）ＣｕＩ−ｎ−Ｂｕ３Ｐ／−８５℃〜−５０℃／１時間；（ｉｉｉ）２３／−７８℃／２時間、７３％；（ｆ）ＰＰＴｓ／アセトン−Ｈ２Ｏ／還流／１７時間；（ｇ）Ｐｈ３Ｐ＝ＣＨＣＯ２Ｅｔ／ＣＨ２Ｃｌ２／室温／一晩、８３％（２４から）；（ｈ）Ｐｄ−Ｃ／Ｈ２／ＭｅＯＨ／２時間、１００％；（ｊ）ＴＥＳＣｌ／イミダゾール／ＤＭＦ／室温／６時間、９７％；（ｋ）ＴＥＳＣｌ／イミダゾール／ＤＭＦ／室温／一晩、６９％；（ｌ）（ｉ）２８／ｎ−ＢｕＬｉ／−７８℃／４０分；（ｉｉ）２７／−７８℃／２ｈ、８４％；（ｍ）ＰＰＴｓ／アセトン−Ｈ２Ｏ／還流／３時間、１００％；（ｎ）ＬｉＯＨ−Ｈ２Ｏ／ＴＨＦ−Ｈ２Ｏ／室温／４４時間；（ｏ）ｐ−ニトロフェノール／ＤＣＣ／ＤＭＡＰ／ＣＨ２Ｃｌ２／室温／２．５時間、７６％（３０から）。
【０２８０】
組み合わせた結合剤分子の模式図を図２９に示し、その設計概念を図３０に示す。
ビタミンＤ結合タンパク質に対する親和性を、ビアコア２０００装置（ビアコア、ウプサラ、スウェーデン）を用いた表面プラズモン共鳴によって決定した。ビタミンＤ結合タンパク質をアミンカップリングによってＣＭ５センサーチップ（ビアコア）の表面に固定した。固定及び相互作用試験は２５℃で、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．００５％の界面活性剤Ｐ２０（ポリオキシエチレンソルビタン）を含む）（ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液、ビアコア）で行い、泳動用緩衝液にはこれに５％（容積率）のＤＭＳＯを加えた。結合剤を泳動用緩衝液で希釈し、濃度系列１０〜８５ｎＭの結合剤を３分間かけて流速３０μＬ／分で、固定したタンパク質に注入した。１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４）を注入することで、タンパク質センサーの表面を効果的に再生させた。実験を少なくとも３回繰り返した。
【０２８１】
１：１相互作用モデルの式を実験結果に適合することによって得られた解離定数値を表５に示す。親和性が最も高かったのは４−Ｃ１５Ｌ８−６Ｃ−２５ＯＨＶＤ３（すなわち、ポリペプチドが４−Ｃ１５Ｌ８、リガンドが炭素２５でヒドロキシル化されているビタミンＤ３であって、炭素６個のスペーサーを介してリガンドがポリペプチドに連結されているリガンド−ポリペプチドコンジュゲート）であった。系列全体には係数４０の差があり、このことは、親和性に及ぼすポリペプチド結合の効果をはっきりと示している。
【０２８２】
【表７】
2013542182.tif 000047
【０２８３】
＊ＶＤ３はビタミンＤ３；２５ＯＨＶＤ３は炭素２５にヒドロキシル基を有するビタミンＤ３誘導体。
実施例６
実施例６では標的分子としてＤ二量体タンパク質を、リガンドとしてＧＰＲＰペプチドを選択した。
【０２８４】
ヒト血液の凝固過程は分子事象のカスケードであり、これにはフィブリノゲンの酵素切断が含まれる。フィブリノゲンを酵素切断するとフィブリンが形成され、フィブリンは凝集して原繊維となる。原繊維はＤ断片部位と架橋すると不溶性のゲルを形成し、その後血液が凝固する（Furie, B., and Furie, B. C. (2005) Thrombus formation in vivo. J. Clin. Invest. 115, 3355-3362. Davie, E.W. (1964) Waterfall sequence for intrinsic blood clotting. Science 145, 1310-1312）。血塊を酵素分解すると、Ｄ二量体として知られる架橋したＤ断片が放出される。Ｄ二量体は通常、凝固が起こっていない血液中には存在しないため、Ｄ二量体は血栓症のバイオマーカーとなる（Lippi, G., Cervellin, G., Franchini, M., and Favaloro, E. J. (2010) Biochemical markers for the diagnosis of venous thromboembolism: the past, present and future. J Throm. Thrombolysis 30, 459-471. Wada, H, and Sakuragawa, N. (2008) Are fibrin-related markers useful for diagnosis of thrombosis? Semin. Thromb. Hemost. 34, 33-38）。血液中のＤ二量体濃度の測定は、認知されている一般的な診断試験であり、一般的には、血栓塞栓性疾患の可能性を排除するために用いられている（Linkins, L.-A., Bates, S. M., Ginsberg, J. S., and Kearon, C. (2004) Use of different D-dimer levels to exclude venous thromboembolism depending on clinical pretest probability. J. Throm. Haemost. 2, 1256-1260）。
【０２８５】
生物分析用途での、特に生体外診断の分野でのＤ二量体レベルの測定に、Ｄ二量体タンパク質に対する特異的で高親和性の結合剤が必要とされている。診断用途では、モノクローナル抗体が最高の判断基準であり、モノクローナル抗体はタンパク質表面の特定のエピトープを認識し、高い親和性及び選択性で結合する。我々は最近、タンパク質の認識と結合に関する別の方法論を報告した。この方法は有機小分子を４２−残基ポリペプチドに結合させることに基づき、この技術が平均的な抗体と同等かそれよりもよく機能する、小さくて頑強な結合剤分子を提供することが示された（Baltzer, L. (2011) Crossing borders to bind proteins-a new concept in protein recognition based on the conjugation of small organic molecules or short peptides to polypeptides from a designed set. Anal. Bioanal. Chem. 400, 1653-1664）。有機分子が有するタンパク質に対する親和性及び選択性は高くなくてよく、ポリペプチドは、いかなるタンパク質に対する親和性及び選択性をも高めるように設計された僅か１６種類のメンバーの組から選択される。結合させた後、小分子リガンドとポリペプチドがＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及びヒト炭酸脱水素酵素ＩＩ（ＨＣＡＩＩ）のようなタンパク質に協調して結合することが示された（Tegler, L.T., Nonglaton, G., Buttner, F., Caldwell, K., Christopeit, T., Danielson, U.H., Fromell, K., Gossas, T., Larsson, A., Longati, P., Norberg, T., Ramapanicker, R., Rydberg, J. and Baltzer, L. (2011) Powerful Protein Binders from Designed Polypeptides and Small Organic Molecules-A General Concept for Protein Recognition. Angew Chemie Int Ed. 50, 1823-1827. Enander, K., Dolphin, G., and Baltzer, L. (2004) Designed, functionalized helix-loop-helix motifs that bind Human Carbonic Anhydrase II: a new class of synthetic receptor molecules. J. Am. Chem. Soc. 126, 4464-4465. Tegler, L.T., Fromell, K., Jonsson, B.-H., Viljanen, J., Winander, C, Carlsson, J. and Baltzer, L. (2011) Polypeptide conjugate binders that discriminate between two isoforms of human Carbonic anhydrase in human blood. ChemBioChem. 12, 559-566. Andersson, T., Lundquist, M., Dolphin, G. T., Enander, K., Jonsson, B-H., Nilsson, J. W. and Baltzer, L. (2005) The binding of Human Carbonic Anhydrase II by functionalized folded polypeptide receptors. Chem. Biol. 12, 1245-1252）。ポリペプチドは結合前にはＣＲＰ又はＨＣＡＩＩとはいかなる関係ももたず、かつ、独立して測定するのに十分な強度では結合しなかったが、結合剤の親和性は小分子の親和性よりも２〜４桁高かった。ポリペプチドコンジュゲートの分子量は５〜６ｋＤの範囲内であるため、ＩｇＹの約１／３０である。ポリペプチドコンジュゲートは組織化された構造をもたないため、生物標的の表面に適合する。この概念は生物学的に生成された結合剤分子とは異なる。有機小分子は頑強であり、天然の酵素によっては認識されないため、それらを官能基として使用することはタンパク質に対する高親和性結合剤の設計にとって魅力的な方法であると同時に、利用可能なペプチドプールは本質的に無制限で、相当数の配列を、例えばファージディスプレイ法によって同定することができる（Smith, G. P., and Petrenko, V. A. (1997) Phage display. Chem. Rev. 97, 391-410）。そのため、短いペプチドを有機小分子の代わりに結合させることで、緊密な結合剤を得ることができるか否かを決定することは非常に重要である。なぜならば、利用可能な結合剤候補のプールを劇的に拡大する可能性があるためである。
【０２８６】
Ｄ二量体に対する結合剤の開発は、ペプチドを使用したポリペプチドコンジュゲートの原理の証明実験にとって、魅力的な目標である。なぜならば、Ｄ二量体は確立されたバイオマーカーであり、かつ、性質が明らかにされていてＤ二量体にＫｄが２５μΜで結合することが知られている短いペプチドであるＧＰＲＰが存在するためである（Laudano, A. P., and Doolittle, R. F. (1980) Studies on synthetic peptides that bind to fibrinogen and prevent fibrin polymerization. Structural requirements, number of binding sites, and species differences. Biochemistry 19, 1013-1019. Laudano, A. P., and Doolittle, R. F. (1981) Influence of calcium ion on the binding of fibrin amino terminal peptides to fibrinogen. Science 212, 457-459）。フィブリノゲンのＥドメインのＧＰＲＶ配列が、フィブリンを形成する活性化したフィブリノゲンの凝集と、その後のより高度な凝集に関与し、また、Ｄ−ドメインの結合部位に特異的に結合することが分かっている（Olexa, S. A., and Budzynski, A. Z. (1980) Evidence for four different polymerization sites involved in human fibrin formation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 1374-1378. Pratt, K. P., Cote, H. C. F., Chung, D. W., Stenkamp, R. E., and Davie, E. W. (1997) The primary fibrin polymerization pocket: three-dimensional structure of a 30-kDa C-terminal γ chain fragment complexed with the peptide GLy-Pro-Arg-Pro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 7176-7181）。ＧＰＲＰ配列が開発され、ＧＰＲＶよりも高い親和性でＤ二量体に結合することが分かった。Ｄ二量体とＧＰＲＰの複合体の構造が解明され、ＧＰＲＰ結合間隙中のアミノ酸残基への水素結合がＮ−末端のＧｌｙ残基を伴うことが示された（Spraggon, G., Everse, S. J., and Doolittle, R. F. (1997) Crystal structures of fragment D from human fibrinogen and its crosslinked counterpart from fibrin, Nature 389, 455-462. Everse, S. J., Spraggon, G., Veerapandian, L., Riley, M., and Doolittle, R. F. (1998) Crystal structure of fragment double-D from human Fibrin with two different bound ligands. Biochemistry 37, 8637-8642）。
【０２８７】
この実施例では、本発明に従ってＧＰＲＰペプチドを４２−残基の配列として設計したこの組由来のポリペプチドと結合させると、Ｄ二量体に対する強力な結合剤が形成されることを示す（図３１）。
【０２８８】
結果及び考察
設計
図１に示すように、１６メンバーの組のポリペプチドを使用した。
【０２８９】
本明細書で上述したように、スペーサーの選択が結合剤開発の重要な側面である。スペーサーの大きさが、どの程度までタンパク質表面がポリペプチドに接近できるかを制御する。スペーサーの長さを伸ばすと選択性は下がるが、親和性は上がるということが直感的に予測できる。実験により、脂肪族スペーサーによって最も高い親和性が生じ、それはおそらくタンパク質との疎水性接触が付加されたためだということを示唆しているが、一方、ポリエチレングリコールスペーサーはより弱い結合を示す（Gao, J., Qiao, S., and Whitesides, G. M. (1995) Increacing binding constants of ligands to carbonic anhydrase by using "greasy tails". J. Med. Chem. 38, 2292-2301. Jain, A., Huang, S. G., and Whitesides, G. M. (1994) Lack of effect of the length of oligoglycine- and oligo(ethylene glycol)-derived para-substituents on the affinity of benzenesulfonamides for carbonic anhydrase II in solution. J. Am. Chem. Soc. 116, 5057-5062）。Ｄ二量体に対する結合剤の設計では、Ｃ反応性タンパク質との類推に基づき、ＧＰＲＰのポリペプチドへの連結には炭素が６個のスペーサーを導入した。
【０２９０】
ＧＰＲＰのＤ二量体への結合を複合体の結晶構造から解析し、最も重要なこととして、Ｎ−末端のＧｌｙが結合に伴われることを発見した。そのため、スペーサーをＣ末端のＰｒｏ残基に連結させる必要があった。加えて、スペーサーを有する小分子リガンドをペプチドに連結させるために、スペーサーのカルボキシル基にＧｌｙ残基を組み込んだ。これは主に、短いペプチドの固相ペプチド合成に最適な樹脂がＧｌｙを予め負荷して提供されるため、合成を容易にするためである。
【０２９１】
合成
ポリペプチドの合成は、既に詳細に報告されている、標準的なＳＰＰＳ−Ｆｍｏｃ手順に従った（Tegler, L.T., Nonglaton', G., et al. (2011)、上記参照）。それらを半分取逆相ＨＰＬＣで精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析で確認した。ｐ−ニトロフェニルエステルに変換されたＧｌｙ残基で伸長されたカプリル酸スペーサーを有するＧＰＲＰも、以下の実験項で記載するように、固相で合成し、精製して確認した。結合反応はＤＭＳＯ中、本質的に定量的な反応として行い、最終的な結合剤分子を精製し、上述のペプチドとして確認した（実験項を参照のこと）。
【０２９２】
結合剤の選択
スペーサーを有するＧＰＲＰにそれぞれのポリペプチドを結合させることで得られた１６メンバーの組の結合剤候補をビアコアアッセイで評価した。このアッセイではＤ二量体をチップに固定し、結合剤分子を標準的な泳動用緩衝液で０、１、１０及び１００ｎＭの濃度にしてチップ上に流した。得られた予備的な結果から、結合剤４Ｄ１５Ｌ８−ＧＰＲＰ、４Ｄ１０Ｌ１７−ＧＰＲＰ、４Ｄ２５Ｌ２２−ＧＰＲＰがＤ二量体に強く結合したことが示された。センサーグラムと、Ｄ二量体タンパク質と１５ポリペプチドコンジュゲートとの相互作用について説明している解離定数の予測については表６及び図３２を参照のこと。１００ｎＭの濃度では相当な取り込みが見られ、１０ｎＭの濃度でもいくらかの取り込みが見られたが、１ｎＭの溶液では結合は全く見られなかった。効率化のためにペプチドの計量から結合剤溶液を調製したため、報告した濃度は２０〜３０％誤っている可能性がある。滴定間隔が大きいため、このことはどの結合剤が最も緊密化についての結論には影響を及ぼさないが、最良の結合剤の順位付けを不正確なものにする可能性がある。そのため、最大の取り込みだけでなく、実験データに対する１：１結合モデルの最良適合から得られたＫｄ値に基づき、その後の結合解析には７種類の結合剤を選択した。１：１モデルの適合は決して優れたものではないため、得られたＫｄ値の取扱いには注意が必要であるが、ビアコアによる取り込みの予測とＫｄ「値」の予測から組み合わせた順位付けはほぼ一致した。解離定数の予測については表６を参照のこと。
【０２９３】
【表８】
2013542182.tif 000048
【０２９４】
Biaevaluationプログラムversion 3.2（ビアコア）を使用し、及び単純な１：１のラングミュア結合機序と仮定することで解離定数（Ｋｄ）を得た。
ビアコアスクリーニング実験で１００ＲＵを越える取り込みを示し、かつ、見た目のＫｄ値が１μΜ未満の結合剤を中程度から強度の結合剤と見なし、一方、取り込みが１００ＲＵ未満で、かつ、Ｋｄ値が１μΜよりも高い結合剤を弱い結合剤と見なした。弱い結合剤についてはそれ以上の検討は行わなかった。
【０２９５】
Ｄ二量体タンパク質と選択した７種類の結合剤との相互作用をより高い分解能で解析した。ＳＰＲ相互作用解析（図３３Ａ）には、０ｎＭ（純粋な緩衝液）、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、４０ｎＭ、８０ｎＭ及び１６０ｎＭの濃度の結合剤を使用し、濃度は定量的アミノ酸解析によって決定した。センサーグラムは４系列の結合剤が３系列の結合剤よりも高い親和性で結合することを示しており、このことは、より正に帯電しているポリペプチドの方が、Ｄ二量体表面の結合部位の近くに強く結合することを示唆している。結合剤分子が設計通りに結合することを示すために、ビアコアを使用して競合実験を行った。この実験では、ある濃度範囲にわたるＧＰＲＰを泳動用緩衝液に加えて、Ｄ二量体への結合を阻害した（図３４）。対照として、ＧＰＲＰの結合も監視した。１００ｎＭの４−Ｄ１０Ｌ１７−ＧＰＲＰの結合は、標準的な泳動用緩衝液に溶解した１ｍＭのＧＰＲＰによって完全に阻害され、５０％阻害を示すＧＰＲＰの濃度の関数として低下した。５０％阻害はＧＰＲＰの濃度が約５０μΜの時に観察され、このことは、結合剤の親和性がＧＰＲＰと比較して５００倍高いことに相当する。この結果は、全て設計通りに、ＧＰＲＰ残基が結合に重要であること、結合剤分子はＧＰＲＰ結合に特異的に結合すること、及びポリペプチドがＧＰＲＰの親和性をほぼ３桁高めることを示している。表面効果の影響を受けない、溶液中での解離定数を決定するために、フルオレセイン蛍光色素分子を結合剤４−Ｃ１５Ｌ８−ＧＰＲＰのＣｙｓ側鎖にコンジュゲートさせた。対応する結合剤分子をＤ二量体タンパク質で注意深く滴定し、その後データを解析し、実験結果に対する１：１複合体の解離について記述している式の最良適合を決定した（図３５）。解離定数が３ｎＭであること、すなわちＧＰＲＰテトラペプチドの溶液親和性の解離定数よりも４桁高いことが分かった（Laudano, A. P., and Doolittle, R. F. (1980)、上記参照）。
【０２９６】
結合機能をさらに高めるために、ヘリックス−ループ−ヘリックスモチーフのループ領域中にある脱保護されているＣｙｓ残基を二官能性リンカーと反応させることによってポリエチレングリコールで結合したヘリックス−ループ−ヘリックス二量体を形成し、４系列の結合剤を二量体化させた。最も強力な結合剤であることが示された、３系列と４系列由来の７種類の結合剤を二量体化させ、それらのＤ二量体への結合をビアコアによって解析した（図３３Ｂ）。取り込みの増加が観察されたことから、単量体の結合剤分子と比較すると、全ての結合剤の機能が概して向上したことが観察された。ビアコアのデータから、すなわち解離定数の低下から、親和性の実際の量的な上昇を決定することは難しい。なぜならば、実験データに１：１ラングミュアモデルが上手く当てはまらないからである。しかしながら、取り込みが明かに増加したことと、実験データに対して１：１ラングミュアモデルを適合することによって得られた解離定数は、二量体化したことによって親和性が２〜４の係数で相対的に上昇すること示唆している（表７を参照のこと）。
【０２９７】
【表９】
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【０２９８】
Biaevaluationプログラムversion 3.2（ビアコア）を使用し、及び単純な１：１のラングミュア結合機序と仮定することで解離定数（Ｋｄ）を得た。
ジスルフィド架橋は結合剤４−Ｃ２５２２−ＧＰＲＰの機能をＰＥＧスペーサーよりも向上させ、さらに親和性を２の係数で、従って合計してほぼ１桁高める。結合剤分子の二量体化という単純な化学的手段が、このように親和性を５〜１０の係数でさらに高めることが示された。このことにより、ファージディスプレイの初期世代のペプチドから容易に入手可能な低マイクロモル〜中マイクロモルの親和性をもつペプチドから、高ピコモルの親和性をもつ、ペプチドを使用した結合剤分子を開発することができる。設計したポリペプチドにより発展したファージディスプレイペプチドを連結させると、比例して親和性が高い結合剤分子が生じると期待される。
【０２９９】
Ｄ二量体の結合から得られたセンサーグラムは、他のタンパク質のセンサー解析から得られた図と同様に飽和を示さず、実験結果は標準的な動力学的モデルに上手く当てはまらない。一方、蛍光滴定実験の結果並びにＲｉｆ（反射干渉分光法、Albrecht, C, Fechner, P., Honcharenko, D., Baltzer, L., and Gauglitz, G. (2010) A new assay design for clinical diagnostics based on alternative recognition elements. Biosens. Bioelectron. 25, 2302-2308）は予測された挙動を示し、ビアコア測定から得られた適合不良の原因は明らかになっていない。反応曲線は、単一指数関数挙動をはっきりとは示していないが、結合動態を明らかにするには、非常に複雑なモデルが必要である。それにもかかわらずこのデータは、ＧＰＲＰペプチドを使用した結合剤の強力な取り込みと緊密な結合を示している。
【０３００】
実験項
試薬及び溶媒は全て、市販されているものを購入し、さらに精製することなく使用した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は６０Ｆ２５４シリカと６０Ｆ２５４酸化アルミニウム板（メルク）を使用して行い、スポットをＵＶ光（λ＝２５４ｎｍ）で可視化した。Varian Inova 500MHz（４９９．９ＭＨｚ）分光計で１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを記録し、Varian Unity 400MHz（１００．６ＭＨｚ）分光計で１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを記録した。重水素化クロロホルムを溶媒として使用し、２５℃でスペクトルを記録した。ＴＭＳを内部標準（１Ｈδ０．０）として化学シフト（δ）をｐｐｍで報告し、残留クロロホルムのシグナル（１３Ｃδ７７．０）及び結合定数（Ｊ）をＨｚで報告した。パーキンエルマーSCIEX API 150EX分光計で陽イオンモードを使用し、低分解能質量スペクトルを記録した。ヒトＤ二量体タンパク質はアブカム社（英国）から入手した。
【０３０１】
ペプチド合成
Pioneer自動ペプチド合成機で、標準的なフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）の手順により、活性化剤としてＯ−（７−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロボラート（ＨＢＴＵ、Iris Biotech GmbH）とジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、アルドリッチ）を使用してペプチドを合成した。Ｆｍｏｃ保護基を、ピペリジン（２０％）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液で脱保護した。各カップリングはＦｍｏｃ−グリシン−ポリエチレングリコール−ポリスチレン（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ−ＰＳ）又はＦｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ（アプライドバイオシステムズ）樹脂と４倍量のアミノ酸を使用し、０．１ｍｍｏｌのスケールで合成を行った。アミノ酸（Calbiochem- Novabiochem AG、Iris Biotech GmbH）の側鎖を、塩基に安定な基、すなわちｔｅｒｔ−ブチルエステル（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、トリチル（Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ）、ｔｅｒｔ−ブトキシメチル（Ｌｙｓ）及び２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ａｒｇ）で保護した。配列Ｃ１５Ｌ８、Ｃ１０Ｌ１７、Ｃ２５Ｌ２２及びＣ３７Ｌ３４の１５、１０、２５及び３４番目のリシン残基をそれぞれアリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）基で直交保護することで、部位特異的に蛍光プローブを各ポリペプチドに導入することができる。Ｎ２雰囲気下、室温で、樹脂をテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（Ｐｄ（ＰＰｈ３）４）のトリクロロメタン溶液、酢酸及びＮ−メチルモルホリン（容積比３７：２：１、樹脂１グラム当たり１０ｍＬ）で２時間処理することにより、アリルオキシカルボニル基を脱保護した。樹脂をＤＩＰＥＡ（０．５％）のＤＭＦ溶液、ジエチルジチオカルバミン酸（０．５）のＤＭＦ溶液、ＤＭＦ及びＤＣＭで順次洗浄し、乾燥した。
【０３０２】
リシン側鎖のアミノ基への７−メトキシクマリン−３−カルボン酸のカップリングは、Ｎ−Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を含むカップリング混合物（比率１２：６：６）によって活性化した２倍量の酸と共に、室温、ＤＭＦ中でゆっくりと振とうしながら２時間かけて行った。２時間後、カップリング混合物の別の分割量を加え、反応混合物を一晩放置した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、水及びトリイソプロピルシラン（容積比９５：２．５：２．５、重合体１グラム当たり１０ｍＬ）の混合物と共に室温で２時間処理することによって、各ペプチドを脱保護し、樹脂から切断した。ろ過し、濃縮した後、冷ジエチルエーテルを加えてペプチドを沈殿させ、遠心分離し、ジエチルエーテルで洗浄して風乾した。粗ペプチドを逆相ＨＰＬＣで、半分取Hypersil C-18 Goldカラム（孔径１７５Å、粒子径５Å）又は半分取Kromasil C8 Hichromカラム（孔径１００Å、粒子径１０Å）を使用し、０．１％のＴＦＡを加えたアセトニトリル水溶液で徐々に勾配をかけ（アセトニトリル濃度を３５から５５％とし）、流速１０ｍＬ／分で溶出して精製した。回収した画分をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（Bruker Daltonics Ultraflex II TOF/TOF）で確認し、濃縮し、その後２回凍結乾燥した。
【０３０３】
スペーサーをもつＧＰＲＰリガンドの合成（図３６）
ヘキサペプチドリガンドの調製
Ｃ−末端のプロリン残基に６−アミノカプロン酸残基を連結することによって、ＧＰＲＰリガンド用の６炭素スペーサーを合成した。グリシン（０．７５ｍｍｏｌ／ｇ）を予め負荷したクロロトリチル樹脂上で手動ＳＰＰＳ（活性化用のＰｙＢＯＰ、２倍量のアミノ酸、及びカップリング試薬を使用したＦｍｏｃ／’Ｂｕ法）を使用し、０．５ｍｍｏｌスケールでペプチドを合成した。アルギニン側鎖とＮ−末端のグリシンをそれぞれＰｂｆ及びＢｏｃ基として保護した。ＳＰＰＳによって得られたヘキサペプチドをＴＦＡ（１．５％）のＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液で５分間処理して樹脂から切り出した。樹脂をＴＦＡ（１％）のＣＨ２Ｃｌ２（２×５ｍＬ）溶液で洗浄し、ペプチドを完全に切り出した。ペプチド溶液を飽和クエン酸で洗浄し、溶液中に含まれている遊離アミン（Ｐｂｆ又はＢｏｃ基の脱保護によって生じる）を除去し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗残留物を活性エステルの調製に直接使用した。
【０３０４】
結合に使用する活性エステルの調製
粗ヘキサペプチドを無水ＣＨ３ＣＮ（１０ｍＬ）に溶解し、０℃で撹拌した。ピリジン（２ｍＬ）、ＤＩＣ（０．３ｍＬ、４当量）及びｐ−ニトロフェノール（０．２８ｇ、４当量）をペプチド溶液に加え、１５時間（一晩）撹拌し続けた。反応混合物を減圧濃縮し、残留物をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）に溶解し、その後飽和クエン酸（２×５０ｍＬ）で洗浄した。この活性エステルのＣＨ２Ｃｌ２溶液をＭｇＳＯ４で乾燥し、蒸発させて溶液の体積を１０ｍＬまで減らした。粗生成物をシリカゲル（６０〜９０メッシュ）カラムクロマトグラフィーで、アセトン（０〜１００％）のＣＨ２Ｃｌ２溶液で溶出して精製した。ペプチドの活性エステルを白色固体として得た（１５０ｍｇ、全収率３０％）。
【０３０５】
ビアコア測定
固定。固定の前に、Ｄ二量体タンパク質の保存用緩衝液を１０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．６、ＮＡＰ５（GE Healthcare Bio-Sciences、ウプサラ、スウェーデン）を含む）に変えた。その後タンパク質を１０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．６）でさらに希釈し、濃度を約３２μｇ／ｍＬとした。ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ及び０．００５％のＰ２０）（GE Healthcare Bio-Sciences、ウプサラ、スウェーデン）を泳動用緩衝液とし、Ｄ二量体タンパク質をアミンカップリングでセンサーチップ表面に共有結合で固定した。ＥＤＣ／ＮＨＳ（２００ｍＭのｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩／５０ｍＭのＮ−ヒドロキロスクインイミド）（GE Healthcare Bio-Sciences、ウプサラ、スウェーデン）溶液を７分間注入することで、ＣＭ５センサーチップの表面を活性化した。活性化表面上にＤ二量体タンパク質を流速５μＬ／分で１．５分間注入し、その後、１Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．５）を７分間注入し、残留した活性エステルを失活させた。最終的な固定レベルは６０００〜７５００レゾナンスユニット（ＲＵ）の間であった。
【０３０６】
相互作用解析。Ｄ二量体タンパク質と結合剤との相互作用、及び表面の競合実験をビアコア２０００装置（GE Healthcare Bio-Sciences、ウプサラ、スウェーデン）で試験し、２５℃で平衡状態にした。ＣＭ５センサーチップ（研究用等級、ビアコア）と試薬はGE Healthcare Bio-Sciences（ウプサラ、スウェーデン）から入手した。固定したＤ二量体タンパク質とポリペプチドコンジュゲートとの間の相互作用を直接試験する場合には、ＨＢＳ−ＥＰを泳動用緩衝液として使用した。泳動用緩衝液でポリペプチドコンジュゲートを希釈し、最初のスクリーニングとして、濃度系列が５〜１６０ｎＭ又は１〜１００ｎＭの固定したタンパク質に注入して３分間接触させた。試料の分散を最小限に抑えるために、試料は流速５０μＬ／分で注入した。解離の１０分後に１０ｍＭのグリシン（ｐＨ３．０）を３０秒注入して表面を再生した。注入は全て連続して行い、最初に失活させたデキストラン表面を、次いで固定した表面を通過させた。各測定系列の合間にブランクを注入し、データから除算した。特に明記しない限り実験は少なくとも２回行った。表面競合試験では、結合剤４−Ｄ１０Ｌ１７−ＧＰＲＰ（１００ｎＭ）と様々な濃度（０〜１ｍＭの範囲）のＧＰＲＰとの一連の混合物を、固定したＤ二量体タンパク質上に注入した。Biaevaluationプログラムversion 3.2（ビアコア）を使用し、及び単純な１：１のラングミュア結合機序と仮定することで解離定数（Ｋｄ）を得た。
【０３０７】
フルオレセインの４−Ｄ１５Ｌ８−ＧＰＲＰへの結合
ループ領域に遊離システインを含む４−Ｄ１５Ｌ８−ＧＰＲＰ（１．２７ｍｇ、２２．０μｍｏｌ）を、０．１ＭのＮａＰｉ（ｐＨ７．３、１ｍＭ）に溶解し、Ｎ２ガスで泡立てた６ＭのＧｕＨＣｌ（２１０μＬ）に溶解し、４モル当量（０．３８ｍｇ）のフルオレセイン−５−マレイミド（Pierce Biotechnology、１０μＬのＤＭＳＯに予め溶解させておいた）と室温で４時間インキュベートした。反応混合物をその後、分析用逆相ＨＰＬＣでGrace VydacのMS Qgカラム（４．６ｘ１５０ｍｍ）を使用し、徐々に勾配をかけて（ＡＣＮ：Ｈ２Ｏ、ＡＣＮを３０から５５％）精製した。生成物をＭＡＬＤＩ−ＭＳ（Voyager PRO、アプライドバイオシステムズ）で、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸と２−（４−ヒドロキシ−フェニルアゾ）−安息香酸の混合物をマトリックスとして使用してポジティブモードで確認した。反応が完了した後、フルオレセイン−ペプチドコンジュゲートを逆相ＨＰＬＣで精製し、画分をまとめて蒸発させ、凍結乾燥した。
【０３０８】
蛍光分光法による親和性の決定
Fluoromax Gemini XPSマイクロプレートリーダーを用い、２５℃で蛍光スペクトルを記録した。４９５ｎＭの波長で励起し、５１０〜６００ｎＭの領域の発光を監視した。実験を設定する前に、全てのプラスチック製品（試験管、チップ及びマイクロプレート）をプルロニック（登録商標）F108NF Prillポロキサマー３３８（ＢＡＳＦ）の１％水溶液で１２時間かけてコーティングし、その後、非特異的な表面相互作用を最小限に抑えるために水でよく洗浄した。親和性の決定には、Ｎ２ガスで泡立てたリン酸緩衝生理食塩水（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）に溶解した１００ｎＭのフルオレセイン標識４−Ｄ１５Ｌ８−ＧＰＲＰ試料を、黒色の３８４ウェルマイクロプレート（Nunc）に準備した。次に、Ｄ二量体溶液（アブカム、英国、３．０μΜ、０．６μΜ、０．１μΜ及び１０ｎＭ）の分割量を１．０ｎＭ〜１．５μΜの範囲でウェルに加えた。リン酸緩衝生理食塩水で３．０μΜの貯蔵液を希釈し、０．６μΜ〜１０ｎＭの溶液とした。全ウェルの総量は１００μＬで、緩衝液で容量を補った。５２５ｎｍの蛍光強度をタンパク質総濃度の関数として監視し、１：１結合モデルを前提とし、実験結果に以下の式を適合させて解離定数（Ｋｄ）を決定した。
【０３０９】
【数３】
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【０３１０】
Ｆｏｂｓは観測された蛍光強度、ＦｂｏｕｎｄはＤ二量体に結合したペプチドの蛍光、Ｆｆｒｅｅは遊離ペプチドの蛍光であり、かつ、［Ｄｄｉｍ］は遊離Ｄ二量体の濃度である。［Ｄｄｉｍ］は以下の式から導くことができる。
【０３１１】
【数４】
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【０３１２】
式中、［Ｐ］ｔｏｔはペプチドの総濃度であり、［Ｄｄｉｍ］ｔｏｔはＤ二量体の総濃度である。適合は、IGOR Pro 6.0ソフトウェア（Wave Metrics Inc.）を使用して行った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３２−３】
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【図３２−４】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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