(57)【要約】  本発明は、医薬組成物に関する。一層詳細には、この発明は、望ましいｐｈで凝集物の形成を伴わない安定な医薬組成物を与える成長ホルモン(ＧＨ)とインスリン様成長因子(ＩＧＦ−１)との組合せ組成物の配合物に関し、また、それらの製造方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＧＦ−１とＧＨと下記を含む医薬組成物
非凝集剤；
緩衝剤；
界面活性剤；
任意の防腐剤；及び
任意の浸透圧調節剤又は増量剤
(但し、非凝集剤は、組成物中に、少なくとも約８０ｍＭの濃度で存在する)。
【請求項２】
非凝集剤が、アルギニン(アルギニウムイオン)又はリジンである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
非凝集剤が、約８０〜２００ｍＭ、好ましくは約１００〜１５０ｍＭの範囲の濃度のアルギニンである、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
緩衝剤が、約１〜５０ｍＭの、好ましくは約１０〜２０ｍＭの範囲の濃度の、ヒスチジン、コハク酸塩又はクエン酸塩から選択される、請求項１〜３の何れか一つに記載の医薬組成物。
【請求項５】
界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、請求項１〜４の何れか一つに記載の医薬組成物。
【請求項６】
非イオン性界面活性剤が、約０．１〜０．３％(ｗ／ｗ)の範囲の、好ましくは約０．２％(ｗ／ｗ)の濃度のポリソルベート２０である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
非イオン性界面活性剤が、約０．１〜０．５％(ｗ／ｗ)の範囲の、好ましくは約０．３％(ｗ／ｗ)の濃度のポロキサマー１８８である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項８】
浸透圧調節剤が、塩化ナトリウムである、請求項１〜７の何れか一つに記載の医薬組成物。
【請求項９】
増量剤が、マンニトール及び／又はスクロースである、請求項１〜８の何れか一つに記載の医薬組成物。
【請求項１０】
浸透圧調節剤が、約１〜５０ｍＭの範囲の濃度の塩化ナトリウムである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
防腐剤が、ベンジルアルコール又はフェノールである、請求項１〜１０の何れか一つに記載の医薬組成物。
【請求項１２】
防腐剤が、約０．２〜２％(ｗ／ｗ)の範囲の、好ましくは約１％の濃度のベンジルアルコールである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
重量比ＩＧＦ−１：ＧＨ(ｗ／ｗ)が、約１：１〜１：９(ｗ／ｗ)の範囲である、請求項１〜１２の何れか一つに記載の医薬組成物。
【請求項１４】
重量比ＩＧＦ−１：ＧＨ(ｗ／ｗ)が、約１：１〜７：１(ｗ／ｗ)に及び、好ましくは、１．１：１(ｗ／ｗ)、２．２：１(ｗ／ｗ)、３．３：１(ｗ／ｗ)又は６．６：１(ｗ／ｗ)の値である、請求項１〜１２の何れか一つに記載の医薬組成物。
【請求項１５】
医薬組成物のｐＨが、約５．０〜６．５、好ましくは、約５．４〜６．２、一層好ましくは、約５．８〜６．２に及ぶ、請求項１〜１４の何れか一つに記載の医薬組成物。
【請求項１６】
予備充填された注射器内の又は注入用器具内で用いられるべきカートリッジ内に充填済みの配合物である、請求項１〜１４の何れか一つに記載の医薬組成物。
【請求項１７】
下記を含む、医薬組成物の製造のための方法：
ａ）ｈＧＨ溶液を、非凝集剤及び浸透圧調節剤又は増量剤を含むｐＨ５〜６．５の緩衝液中に製造し；
ｂ）前記の非凝集剤及び前記の浸透圧調節剤を含む工程(ａ)で用いた緩衝液中にＩＧＦ−１調製物を透析することによりＩＧＦ−１の溶液を製造し；
ｃ）界面活性剤及び任意の防腐剤を両ストック溶液に加え；そして
ｄ）これらのｈＧＨの溶液とＩＧＦ−１の溶液とを一緒に混合する。
【請求項１８】
非凝集剤が、アルギニン又はリジンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
下記を含む、医薬組成物の製造のための方法：
ａ）緩衝剤、好ましくはヒスチジン緩衝剤、
非凝集剤、好ましくはアルギニン、
界面活性剤、好ましくはポリソルベート２０、
任意の防腐剤、好ましくはベンジルアルコール
を混合することにより、及び場合により水を用いて体積調節を行うことにより溶液Ｉを製造し、この溶液Ｉは、ｐＨ約５．８を有し又は該ｐＨに調節され；
ｂ）工程(ａ)で用いた緩衝剤及び非凝集剤にてＩＧＦ−１の溶液を製造して、溶液ＩＩを得；
ｃ）溶液ＩＩを溶液Ｉに加えて溶液ＩＩＩを得；
ｄ）緩衝剤、好ましくはヒスチジン、
非凝集剤、好ましくはアルギニン、
界面活性剤、好ましくはポリソルベート２０、
任意の防腐剤、好ましくはベンジルアルコール、
を混合することにより、及び場合により水を用いて体積調節を行うことにより溶液ＩＶを製造し、この溶液ＩＶは、ｐＨ約５．８を有し又は該ｐＨに調節され；
ｅ）溶液Ｖを得るために、工程(ｄ)で用いた緩衝剤及び非凝集剤にてＧＨの溶液を製造し、このＧＨは、任意の重炭酸ナトリウム緩衝剤を含み；
ｆ）溶液Ｖを溶液ＩＶに加えて、溶液ＶＩを得；
ｇ）場合により、溶液ＩＩＩ及びＶＩを別々に濾過し；
ｈ）濾過した溶液ＩＩＩとＶＩを、ＩＧＦ−１：ＧＨ比(ｗ／ｗ)約１：１〜７：１(ｗ／ｗ)で、好ましくは１．１：１(ｗ／ｗ)、３．３：１(ｗ／ｗ)、又は６．６：１で混合して、溶液ＶＩＩを得；そして
ｉ）場合により、溶液ＶＩＩを濾過する。
【請求項２０】
工程(ｅ)を行なわずに、液体ＧＨ薬物物質を、溶液ＩＶと直接混合する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ＧＨ薬物物質が、重炭酸ナトリウム緩衝剤を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
濾過工程を、ＰＶＤＦ(ポリビニリデンフルオライド)フィルター上で行なう、請求項１８〜２０の何れか一つに記載の方法。
【請求項２３】
非凝集剤が、約８０〜２００ｍＭ、好ましくは約１００〜１５０ｍＭの範囲の濃度のアルギニンである、請求項１８〜２０の何れか一つに記載の方法。
【請求項２４】
ｒｈＩＧＦ−１及びｒｈＧＨを含む液体医薬組成物における非凝集剤としてのアルギニンの使用であって、アルギニンの濃度が、約８０〜２００ｍＭ、好ましくは、１００〜１５０ｍＭに及ぶ、当該使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬組成物に関する。一層詳細には、この発明は、成長ホルモン(ＧＨ)とインスリン様成長因子(ＩＧＦ−１)の組合せ組成物の配合物に関する。これらの組合せ組成物は、望ましいｐＨで可視的な不溶性凝集物を形成しない安定な液体の医薬組成物を与える。
【０００２】
本発明は、更に、インスリン様成長因子１(ＩＧＦ−１)と成長ホルモン(ＧＨ)のための配合物を与え、そこでは、タンパク質は、注射可能な形態で一緒に配合されてもよいし、又は別々に配合して投与前に単一の投与用の注射形態に混合することもできる。
【背景技術】
【０００３】
インスリン様成長ホルモンは、ソマトメジンとして知られるポリペプチドのファミリーに属しており、ヒトの体液中の天然ポリペプチドである。殆どの組織、特に肝臓は、ＩＧＦ−１を、特異的ＩＧＦ結合性タンパク質と共に産生する。ＩＧＦ−１は、様々な種類の細胞の成長と分裂を、特に発生中に刺激し、従って、骨の成長及び細胞の複製などの過程は、ＩＧＦ−１レベルによって影響を受ける。これらの分子は、成長ホルモン(ＧＨ)の制御下にある。
【０００４】
ＩＧＦ−１は、骨におけるＧＨの成長促進効果を媒介する主たるタンパク質ホルモンである。ＩＧＦ−１は、ＧＨに応答して生成されて、骨における細胞応答を含む後続の細胞応答を誘導する。ＩＧＦ−１は、一本鎖の７０アミノ酸よりなり、３つの分子内ジスルフィド架橋を有する。ＩＧＦ−１は、７６４９ダルトンの分子量を有し、主として肝臓により内分泌ホルモンとして生成され、並びに標的組織において、パラクリン／オートクリン様式で生成される。ＩＧＦ−１は、酵母及び大腸菌の両者を用いて、組換え技術により、大規模に製造されている(ｒｈＩＧＦ−１)。
【０００５】
成長ホルモン又はヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)は、１９１アミノ酸よりなる一本鎖ポリペプチドである。ジスルフィド結合が、５３位及び１６５位及び１８２位及び１８９位にある。ヒトＧＨは、強力な同化剤である。下垂体機能低下症(ＧＨ欠乏)患者におけるその最も著しい効果の中で、骨端軟骨（bone growth plate cartilage）の直線的成長を加速して、結果的に背丈が伸びるという効果がある。
【０００６】
両タンパク質の組合せの有利且つ相乗的な効果は、国際特許出願ＷＯ９１１８６２１に記載されている。ＩＧＦ−１とＧＨの哺乳動物への同時投与は、ＩＧＦ−１又はＧＨを単独で用いて達成される成長を超える増進された成長を生じる。この増進は、ＩＧＦ−１を投与したときに認められる成長とＧＨを投与したときに認められる成長の合計に等しい。
【０００７】
成長速度を増大させるための方法及び組成物も又、国際特許出願ＷＯ２００６／１３０７６９に記載されている。治療方法及びその結果に本質的に関係する研究は、患者の反応に着目して行われた。医薬組成物は記載されており、特に、ＩＧＦ−１とＧＨの混合物は、ｐＨ７．４でマンニトール、グリシン及び／又はホスフェート中に配合される。もしこの混合物を貯蔵しようとするときは、ｐＨが約６の緩衝液(クエン酸緩衝液など)に、このｐＨでＧＨの溶解度を増大させる界面活性剤（例えばポリソルベート２０又はポロキサマー１８８）と共に配合する。上記文献では、無機塩及び安定剤の添加の可能性も記載している。ＷＯ２００６／１３０７６９に開示された配合物において、非凝集剤(non-aggregating agent)は、用いられていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
一溶液中で２種類のタンパク質を組み合わせる場合に頻繁に起きる問題は、タンパク質−タンパク質相互作用による複合体(complexes)の形成である。かかる複合体の形成は、特に、タンパク質含有溶液の濃度、温度、ｐＨ及び緩衝剤の変化によって影響を受ける。このタンパク質複合剤は、その後、不溶性の凝集物を形成する可能性があり、これは、これらのタンパク質の効能と活性の喪失を引き起こす。
【０００９】
その上、医薬配合物において、治療用タンパク質の投薬量は、重要であり、長期間にわたって制御された範囲内に維持しなければならない。タンパク質の溶液中での正しい濃度を得て維持するために、特に多量のタンパク質を可溶化するために可溶化剤の使用が必要になることが多い。米国特許第６，７６７，８９２号は、ＩＧＦ−１とその類似体の医薬組成物を開示した。それは、可溶化化合物（例えばアルギニン、Ｎ−アセチルアルギニン又は塩酸グアニジンＩＧＦ−１）を含む。組成物を試験し、比較データでは、５．０より高いｐＨで且つ冷蔵温度でＩＧＦ−１溶解度が増大することが示された。しかしながら、この文献は、ＩＧＦ−１を更なる治療用タンパク質と組み合わせて含む組成物を開示していない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一つの目的は、ＩＧＦ−１と成長ホルモン(ＧＨ)の両者を含む液体配合物であって、４℃で少なくとも３０日間安定であり、溶液が視覚的に澄んでいることにより証明されるように有意の凝集物を含まない当該液体配合物を製造することである。本発明の更なる目的は、ＩＧＦ−１とＧＨの両者を含む液体配合物の製造方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ＩＧＦ−１溶液、ＧＨ溶液、及びこれら２種類の溶液の１：１混合物の、分析用超遠心分離により得られた沈降速度プロフィルの重ね合わせを示している。第一のプロフィルセット(図１)は、２５ｍＭクエン酸緩衝液(ｐＨ６)中に配合されたタンパク質を用いて得られたものであり、これらのタンパク質間で相当の関連があるという証拠を示している。
【図２】図２は、１００ｍＭアルギニウムイオン(アルギニン)を含む溶液の沈降プロフィルを示している。これらのプロフィルは、アルギニンの存在が、溶液中の高分子量の凝集物の量の減少を示す変化を引き起こすことを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
下記の定義は、本明細書中の発明を記載するべく用いられる様々な用語の意味及び範囲を説明し定義するために示される。
【００１３】
本発明によれば、用語「非凝集剤」（凝集防止剤）は、複数のタンパク質を一の溶液内に存在させたときに、不溶性タンパク質凝集物の形成を防止又は低減させる化合物に関連する。
【００１４】
用語「ＩＧＦ−１」は、インスリン様成長因子−１を指し、それは、ウシ、ヒツジ、ブタ、トリ及び特にヒトを含む如何なる種由来であってもよいが、これらに限られず、天然配列であっても改変形態であってもよく、また、天然に合成されたもの、組換えによるものに関わらず如何なる起源であってもよい。
【００１５】
好ましくは、ＩＧＦ−１は、例えば米国特許第６，３３１，４１４号に記載されたように、組換えにより生成される。一層好ましくは、ＩＧＦ−１は、ＩＮＣＲＥＬＥＸ(商標)として市販されている製品中の活性医薬成分である。
【００１６】
用語「ｒｈＩＧＦ−１」は、組換えヒトＩＧＦ−１を指す。
【００１７】
用語「ＧＨ」は、成長ホルモンを指し、それは、ウシ、ヒツジ、ブタ、トリ及び特にヒトを含む如何なる種由来であってもよいが、これらに限られず、天然配列であっても改変形態であってもよく、また、天然に合成されたもの、組換えによるものに関わらず如何なる起源であってもよい。
【００１８】
用語「ヒト成長ホルモン」及び「ｈＧＨ」は、天然起源からの抽出及び精製を含む方法により生成されたヒト成長ホルモン、及び例えば「Direct expression in Escherichia coli of a DNA sequence coding for human growth hormone」Goeddel & al, Nature Vol. 281, October 1979に記載されたように、組換え細胞培養系によるものを指す。ｈＧＨの配列は、例えば、Hormone Drugs, Gueriguian等、ＵＳＰコンベンション、Rockville, ＭＤ (1982)に示されている。これらの用語は又、生物学的に活性な、例えば全配列中に一つ以上の異なるアミノ酸を含むヒトホルモン同等物（均等物）をもカバーする。その上、これらの用語は、この出願中で用いる場合、ｈＧＨのアミノ酸置換、欠失及び挿入変異体、即ち、ｈＧＨの類似体及び／若しくは同族体又は翻訳後修飾を有するｈＧＨをカバーすることを意図している。次の２種が、しばしば用いられる：１９１アミノ酸の天然種(ソマトロピン)及び１９２アミノ酸のＮ末端がメチオニンの種(両者とも、一般に、組換えにより得られる)。
【００１９】
大腸菌で生成されたメチオニルヒト成長ホルモン(ｍｅｔ−ｈＧＨ)を用いるのが好ましく、それは、商標ＰＲＯＴＲＯＰＩＮ（登録商標）にて、Genentech, Inc.から販売されており、Ｎ末端のメチオニン残基の存在以外では天然ポリペプチドと同じである。Genentech, Inc.から、商標ＮＵＴＲＯＰＩＮ（登録商標）にて入手できる組換えｈＧＨも又好ましい。一層好ましいのは、Genentech, Inc.から、商標ＮＵＴＲＯＰＩＮ ＡＱ（登録商標）にて入手できる、組換えｒｈＧＨ注射用液である。
【００２０】
用語「バッファ」（緩衝剤、緩衝液）は、ここで用いる場合、好ましくはｐＨ５〜６．５を与える製薬上許容しうるバッファを意味する。適当なバッファは、酢酸バッファ、クエン酸バッファ、リン酸バッファ、コハク酸バッファ及びアミノ酸バッファ（例えばヒスチジンバッファ）及びこれらのすべての塩を含むが、これらに限られない。
【００２１】
用語「防腐剤」は、ここで用いる場合、微生物の成長又は望ましくない化学変化による分解を防止するための製薬上許容しうる物質を意味する。
【００２２】
用語「界面活性剤」は、ここで用いる場合、溶媒(例えば、水)の表面張力又は２つの混和できない液体間の界面張力を減じることにより、分散又は懸濁液を与える製薬上許容しうる物質を意味する。適当な界面活性剤は、例えば、非イオン性界面活性剤（例えばポリソルベート又はポロキサマー）である。
【００２３】
用語「増量剤」は、ここで用いる場合、固体の量を増大させるために用いられる製薬上許容しうる物質を意味し、それは、例えば、スクロース、トレハロース及びマンニトールであるが、これら列挙したものに限られない。
【００２４】
用語「浸透圧調節剤(tonicity modifier)」は、緩衝液にオスモル濃度を与える等張調節剤又は浸透調節剤又はオスモライト(osmolyte)を指す。オスモル濃度は、無機塩（例えば塩化ナトリウム及び塩化カリウム）、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリプロピレングリコール、グリシン、グリセロールを含む溶液に対するイオン及び非イオン化分子が寄与する全浸透活性を指す。
【００２５】
用語「凍結乾燥された」は、ここで用いる場合、当分野で凍結乾燥として知られる工程を受けた配合物を指し、該工程は、配合物を凍結すること及びその後、凍結した内容物から氷を除去することを含む。
【００２６】
用語「アミノ酸」は、ここで用いる場合、アミノ酸(遊離のアミノ酸、即ちペプチド又はタンパク質配列中のアミノ酸でないもの)を意味する。アミノ酸は、ここで用いる場合、例えば、アルギニン、グリシン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、メチオニン及びプロリンを包含するが、これらに限られない。
【００２７】
用語「ＩＲＦ」又は「直接放出配合物」（immediate release formulation）は、薬物組成物又は薬物組成物の混合物(好ましくは、液体形態)を指し、該組成物又は混合物は、患者の身体中で薬物投与の部位で、薬物の活性物質の組織に対するバイオアベイラビリティに影響するキャリアを有さない。
【００２８】
用語「非凝集剤」は、ここで用いる場合、複数のタンパク質が一溶液中に混合されたときに、複合体及び／又は凝集物を形成するタンパク質間の相互作用を防止する生成物を指す。
【００２９】
本発明によれば、この医薬組成物は、ｒｈＩＧＦ−１とｒｈＧＨと下記を含む
非凝集剤；
緩衝剤；
界面活性剤；
場合により、防腐剤；及び
場合により、浸透圧調節剤又は増量剤
(ここに、非凝集剤は、組成物中に、少なくとも８０ｍＭの濃度で存在する)。
【００３０】
２つの活性成分ＩＧＦ−１とＧＨが単一配合物中に存在することは、本発明の医薬組成物の特徴である。「単一配合物」は、ここで用いる場合、「共配合物(co-formulation)」又は「共混合物(co-mix)」をも指す。用語共配合物又は共混合物は、ここでは、交換可能に用いられる。
【００３１】
好ましくは、これらの２種の活性成分は、ヒトＩＧＦ−１とＧＨであり、ここでは、ｈＩＧＦ−１及びｈＧＨとも呼ばれる。両活性成分が、組換え手法によって生成されることは、一層好ましい。
【００３２】
好適実施形態において、本発明の医薬組成物は、液体組成物である。それが多数回投与される組成物であることは更に好ましい。多数回投与用組成物の実施形態において、防腐剤が好ましくは存在する。
【００３３】
更なる態様において、この発明は、ＩＧＦ−１及びＧＨを含む医薬組成物の製造のための方法に関する。該医薬組成物の製造のための、本発明による一つの方法は、次のように実施することができる：
ａ）ｈＧＨ（ストック）溶液を、非凝集剤、浸透圧調節剤又は増量剤を含むｐＨ５〜６．５の緩衝液中に製造し；
ｂ）前記の非凝集剤及び前記の浸透圧調節剤又は増量剤を含む工程(ａ)で用いた緩衝液中にＩＧＦ−１調製物を透析することによりＩＧＦ−１の（ストック）溶液を製造し；
ｃ）界面活性剤及び場合により防腐剤を両ストック溶液に加え；そして
ｄ）これらのｈＧＨの溶液とＩＧＦ−１の溶液とを一緒に混合する。
【００３４】
この方法の実施形態において、工程(ａ)では、凍結乾燥したｈＧＨを緩衝液に溶解させ、又は液体ｈＧＨ(例えば、重炭酸緩衝液中の約２０ｍｇ／ｍｌ溶液)を他の緩衝液（好ましくは、クエン酸、コハク酸又はヒスチジン緩衝液である適当なｐＨ（好ましくは約５〜６．５）の緩衝液）に交換し、該他の緩衝液は、非凝集剤を８０〜２００ｍＭ（好ましくは約１００〜１５０ｍＭの範囲）の濃度で含む緩衝液である。工程(ａ)、(ｂ)、(ｃ)又は(ｄ)のいずれかで製造された少なくとも一の溶液は、任意で防腐剤、好ましくはフェノール又はベンジルアルコールを含む。
【００３５】
用語「約」は、本明細書に記載した成分量に関する文脈において、その量が、±２０％未満、又は±１５％未満、又は±１０％未満、又は±５％未満だけ変化してよいことを意味する。
【００３６】
工程(ｂ)において、凍結乾燥したＩＧＦ−１は、緩衝液に溶解され、又は液体ＩＧＦ−１(例えば、クエン酸緩衝液中の約２０〜３５ｍｇ／ｍｌ溶液)は、緩衝液を、他の緩衝液（好ましくは、クエン酸、コハク酸又はヒスチジン緩衝液である適当なｐＨの、好ましくは約５〜６．５の緩衝液）に交換し、該他の緩衝液は、非凝集剤を約８０〜２００ｍＭの濃度範囲で含む緩衝液である。
【００３７】
これらの別々に製造された二溶液は、その後、一緒に混合される。
【００３８】
この医薬組成物の製造のための別法も又、本発明に含まれる。
【００３９】
本発明によれば、本発明の医薬組成物の製造のための別法は、下記を含む：
ａ）緩衝剤（好ましくはヒスチジン緩衝剤）、非凝集剤（好ましくはアルギニン）、界面活性剤（好ましくはポリソルベート２０）、及び場合により防腐剤（好ましくはベンジルアルコール）、及び場合により水を用いて体積調節を行うことにより溶液Ｉを製造し、この溶液Ｉは、ｐＨ約５．８を有し又は該ｐＨに調節され；
ｂ）工程(ａ)で用いた緩衝剤及び非凝集剤にてＩＧＦ−１の溶液を製造して、溶液ＩＩを得；
ｃ）溶液ＩＩを溶液Ｉに加えて溶液ＩＩＩを得；
ｄ）緩衝剤（好ましくはヒスチジン）、非凝集剤（好ましくはアルギニン）、界面活性剤（好ましくはポリソルベート２０）、場合により防腐剤（好ましくはベンジルアルコール）を混合することにより、及び場合により水を用いて体積調節を行うことによりことにより溶液ＩＶを製造し、この溶液ＩＶは、ｐＨ約５．８を有し又は該ｐＨに調節され；
ｅ）溶液Ｖを得るために、工程(ｄ)で用いた緩衝剤及び非凝集剤にてＧＨの溶液を製造し、このＧＨは、場合により重炭酸ナトリウム緩衝剤を含み；
ｆ）溶液Ｖを溶液ＩＶに加えて、溶液ＶＩを得；
ｇ）場合により、溶液ＩＩＩ及びＶＩを別々に濾過し；
ｈ）濾過した溶液ＩＩＩとＶＩを、ＩＧＦ−１：ＧＨ比(ｗ／ｗ)約１：１〜７：１(ｗ／ｗ)で、好ましくは１．１：１(ｗ／ｗ)で、３．３：１(ｗ／ｗ)で、そして６．６：１で混合して、溶液ＶＩＩを得；そして
ｉ）場合により、溶液ＶＩＩを濾過する。
【００４０】
工程(ｂ)及び(ｅ)は、例えば、ＩＧＦ−１又はＧＨを含む溶液の、適当な緩衝液及び非凝集剤又は他の適当な溶液中への透析濾過(diafiltration)により実施して、溶液ＩＩ及びＩＶを得ることができる。
【００４１】
一実施形態において、溶液Ｉと溶液ＩＶは、同じである。該実施形態においては、工程(ｄ)は、用いられず(即ち、溶液ＩＶは製造されない)、溶液Ｖが単に溶液Ｉと混合されて、溶液ＶＩが得られる。
【００４２】
一実施形態において、溶液ＩＩ及びＩＶは、増量剤（例えばスクロース又はマンニトール）を含むことができる。
【００４３】
一実施形態において、液体ＧＨ薬物物質(即ち、ＧＨ（好ましくはｈＧＨ、一層好ましくはｒｈＧＨ）を含む溶液)は、如何なる事前の緩衝剤(バッファ)交換又は工程(ｅ)の緩衝液及び非凝集剤への透析濾過を行うことなく、溶液ＩＶと直接混合される(即ち、上記の工程(ｅ)は行なわれない)。
【００４４】
それ故、該実施形態においては、本発明の方法は、下記の工程を含む：
ａ）緩衝剤（好ましくはヒスチジン緩衝剤）、非凝集剤（好ましくはアルギニン）、界面活性剤（好ましくはポリソルベート２０）、場合により防腐剤（好ましくはベンジルアルコール）を混合することにより、及び場合により水を用いて体積調節を行うことにより溶液Ｉを製造し、この溶液Ｉは、ｐＨ約５．８を有し又は該ｐＨに調節され；
ｂ）工程(ａ)で用いた緩衝剤及び非凝集剤中にてＩＧＦ−１の溶液を製造して、溶液ＩＩを得；
ｃ）溶液ＩＩを溶液Ｉに加えて、溶液ＩＩＩを得；
ｄ）緩衝剤（好ましくはヒスチジン）、非凝集剤（好ましくはアルギニン）、界面活性剤（好ましくはポリソルベート２０）、場合により防腐剤（好ましくはベンジルアルコール）を混合することにより、及び場合により水を用いて体積を調節を行うことにより溶液ＩＶを製造し、この溶液ＩＶは、ｐＨ約５．８を有し又は該ｐＨに調節され；
ｅ）−変法：重炭酸ナトリウム緩衝剤を場合により含むＧＨ薬物物質を溶液ＩＶに加えて、溶液ＶＩを得；
ｆ）場合により、溶液ＩＩＩ及びＶＩを別々に濾過し；
ｇ）濾過した溶液ＩＩＩ及びＶＩを、ＩＧＦ−１：ＧＨ比(ｗ／ｗ)約１：１〜７：１(ｗ／ｗ)で、好ましくは１．１：１(ｗ／ｗ)で、３．３：１(ｗ／ｗ)又は６．６：１で混合して、溶液ＶＩＩを得；そして
ｈ）場合により、溶液ＶＩＩを濾過する。
【００４５】
この変法の一実施形態において、溶液Ｉと溶液ＩＶは同じである。該実施形態において、工程(ｄ)は、用いられず(即ち、溶液ＩＶは製造されない)、ＧＨ薬物物質は、単に、溶液Ｉに混合されて、溶液ＶＩが得られる。
【００４６】
好ましくは、この液体ｈＧＨ薬物物質は、約６〜１０ｍＭ（好ましくは７．５ｍＭ）の濃度の重炭酸緩衝液中の約２０ｍｇ／ｍｌ ｈＧＨ溶液であり、緩衝液（好ましくは、適当なｐＨ、好ましくは約５〜６．２のクエン酸、コハク酸又はヒスチジン緩衝液であり、場合により非凝集剤を約８０〜２００ｍＭ、好ましくは約１００〜１５０ｍＭの濃度範囲で含む緩衝液）への予備的透析濾過なしで希釈される。
【００４７】
他の実施形態において、液体ＩＧＦ−１(例えば、２００ｍＭクエン酸緩衝液中の約２０〜３５ｍｇ／ｍｌ溶液)は、緩衝剤を、他の緩衝剤（適当なｐＨ、好ましくは約５〜６．５の、好ましくはクエン酸、コハク酸又はヒスチジン緩衝液であり、場合により非凝集剤を約８０〜２００ｍＭ、好ましくは約１００〜１５０ｍＭの濃度範囲で含む緩衝液）に交換される。これらの別々に製造された二溶液は、その後、一緒に混合される。
【００４８】
任意の適当な手段（例えばセルロースベースのフィルター又はＰＥＳ(ポリエーテルスルホン)フィルター）によって、濾過を行なうことができる。好適実施形態において、すべての溶液の濾過(溶液の混合の前後)は、タンパク質に対して低親和性の０．２２ミクロンフィルター（例えばポリフッ化ビニリデン(ＰＶＤＦ)フィルター）によって行なうことができる。これらのフィルターの膜は、好ましくは、約５ｋＤａの又は約３ｋＤａの分子量限界を有する。
【００４９】
有利なことには、本発明の医薬組成物は、少なくとも、１月、３月、６月、９月、１年間又は最大で２年まで安定である。
【００５０】
更なる面において、本発明は、ＩＧＦ−１及びＧＨ、好ましくはｈＩＧＦ−１及びｈＧＨ、一層好ましくはｒｈＩＧＦ−１及びｒｈＧＨを含む液体医薬組成物における、アルギニンの非凝集剤としての利用を包含し、ここに、アルギニンの濃度は、約８０〜２００ｍＭに及ぶ(即ち、それは、例えば、約８０、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１７０ｍＭ、約１８０ｍＭ、約１９０ｍＭ又は２００ｍＭである)。
【００５１】
この医薬組成物中にアミノ酸を含有させることにより、ＩＧＦ−１とＧＨの混合物を、澄んだ澄明溶液配合物中に一緒に配合することを可能にし、その後２〜８℃で少なくとも３０日間、好ましくは少なくとも６月、一層好ましくは、少なくとも１２月間冷蔵している間、混合物中での視覚的透明性が損なわれないということが見出された。
【００５２】
本発明の好適実施形態において、この配合物は、−２０℃、又は２〜８℃の温度での貯蔵において、少なくとも１８月間にわたって安定である。
【００５３】
一実施形態において、本発明は、活性成分ヒトインスリン様成長因子１(ｈＩＧＦ−１)及びヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の安定な共溶性(co-miscible)配合物を意図する。好適実施形態において、これらの活性成分は、組換え手法により製造され、ｒｈＩＧＦ−１及びｒｈＧＨと呼ばれる。
【００５４】
これらの配合物は、ｒｈＩＧＦ−１及びｒｈＧＨ，非凝集剤、並びに緩衝剤を含む。これらの配合物は、界面活性剤、好ましくは、非イオン性界面活性剤、場合により防腐剤、並びに場合により浸透圧調節剤及び／又は増量剤を含むことができる。
【００５５】
好ましくは、ＩＧＦ−１及びＧＨの混合物を一の透明溶液配合物に一緒に配合可能とするアミノ酸は、アルギニン又はリジンであり、一層好ましくはアルギニンである(例えば、アルギニウムイオン)。
【００５６】
好ましくは、非凝集剤として作用するアミノ酸は、各溶液に別々に加えられた後に、一緒に、透明な溶液配合物中にて混合する。一層好ましくは、この透明溶液中の非凝集剤の最終濃度は、約８０〜２００ｍＭの濃度範囲又は約１００〜１８０ｍＭの濃度範囲又は約１２０〜１６０ｍＭの濃度範囲又は約１５０ｍＭの濃度である。
【００５７】
ｐＨは、約５〜７、好ましくは約５．５〜６．５、一層好ましくは約５．８〜６．２に及ぶ値に調節される。ｐＨ値に関連する文脈において、用語「約」は、ｐＨ値が±０．２又は±０．１だけ変化してよいことを意味する。溶液のｐＨは、任意の適当な手段によって（例えば、適当量の酸性溶液（例えばクエン酸塩溶液又は好ましくはＨＣｌ溶液）の添加によって）調節することができる。
【００５８】
本発明により用いられるべきｐＨは、例えば、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５であってよく、好ましくは、５．８、６．２又は約６．５である。
【００５９】
追加的実施形態において、オスモライト又は浸透圧調節剤は、無機塩であってよい。もし含まれるならば、その無機塩は、例えば塩化ナトリウム又は塩化カリウム、好ましくは塩化ナトリウムであってよく、この組成物中に、０〜１５０ｍＭの濃度、好ましくは１〜５０ｍＭの濃度で存在することができる。
【００６０】
加えて、随意の防腐剤は、フェノール、ベンジルアルコール、ｍ−クレゾール、クロロブタノールの一覧から選択することができる。好適な防腐剤は、フェノール又はベンジルアルコールである。この防腐剤は、組成物中に、約０．１〜５％(ｗ／ｗ)、好ましくは約０．２〜２％(ｗ／ｗ)、更に好ましくは約１％の濃度で存在してよい。
【００６１】
本発明に開示された組成物の界面活性剤は、例えば、ポリソルベート(ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ツイーン（登録商標）)又はポロキサマー（ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロック共重合体、例えばポリソルベート８０、ポリソルベート２０又はポロキサマー１８８）の一覧から選択される。好ましくは、この界面活性剤は、非イオン性、一層好ましくは、ポリソルベート(ツイーン)（例えばポリソルベート８０、ポリソルベート２０）又はポロキサマー（例えばポロキサマー１８８）であり、一層好ましくは、約０．０１〜３％(ｗ／ｗ)（好ましくは約０．０３〜０．５０％(ｗ／ｗ)、更に好ましくは約０．２％(ｗ／ｗ)）の濃度範囲のポリソルベート２０又はポロキサマー１８８である。
【００６２】
加えて、緩衝剤は、ｐＨ５〜６．５を与える適当な製薬上許容しうる緩衝剤（例えばクエン酸ナトリウム又はヒスチジン又は両者）から選択することができ；好ましくは、酢酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、ヒスチジンなどのアミノ酸及びこれらのすべての塩から選択することができ、好適な緩衝剤は、クエン酸塩又はヒスチジンである。好ましくは、この緩衝剤は、１〜１００ｍＭの、好ましくは１〜５０ｍＭの、一層好ましくは約１０ｍＭ又は２０ｍＭの濃度で最終的組成物中に存在する。
【００６３】
本発明によれば、ＩＧＦ−１及びＧＨの量は、それぞれ、約２〜４０ｍｇ／ｍｌ(ＩＧＦ−１)及び約１〜１２ｍｇ／ｍｌ(ｈＧＨ)であり、好適な量は、約５〜２０ｍｇ／ｍｌ(ＩＧＦ−１)及び約２〜８ｍｇ／ｍｌ(ｈＧＨ)である。更なる好適な量は、約１０ｍｇ／ｍｌのＩＧＦ−１及び約３ｍｇ／ｍｌのｈＧＨであり、又は約１３．２ｍｇ／ｍｌのＩＧＦ−１及び２ｍｇ／ｍｌのＧＨである。
【００６４】
重量比ＩＧＦ−１：ＧＨ(ｗ／ｗ)は、好ましくは、１：１〜９：１に及び、或は、約１：９〜１：１に及ぶ。一層好ましくは、重量比ＩＧＦ−１：ＧＨ(ｗ／ｗ)は、９：１(ｗ／ｗ)；６：１(ｗ／ｗ)；３：１(ｗ／ｗ)；２：１；３：７(ｗ／ｗ)；１：１(ｗ／ｗ)；１：２(ｗ／ｗ)；１：５(ｗ／ｗ)；７：３(ｗ／ｗ)；９：１(ｗ／ｗ)から選択される。
【００６５】
一層好適な重量比ＩＧＦ-1：ＧＨ(ｗ／ｗ)は、１．１：１、２．２：１、３．３：１及び６．６：１から選択される。一具体例において、この組成物は、ｒｈＩＧＦ−１とｒｈＧＨの組合せを、約１０〜３０ｍｇ／ｍｌ(ＩＧＦ−１)と約１〜１２ｍｇ／ｍｌ(ｒｈＧＨ)の濃度でそれぞれ含み(ＩＧＦ−１：ＧＨの重量比、約９：１〜１：９(ｗ／ｗ))、約０．０１〜３％(ｗ／ｗ)の界面活性剤、場合により約０．１〜５％(ｗ／ｗ)の防腐剤、約１〜１５０ｍＭの緩衝剤（好ましくはクエン酸塩又はヒスチジン）、濃度範囲８０〜２００ｍＭの非凝集剤（例えばアルギニン又はリジン）を含む。場合により、この組成物は、一種又は二種の浸透圧調節剤（例えば約０〜１５０ｍＭの濃度のＮａＣｌ、ＫＣｌ）及び／又は増量剤（例えばトレハロース、マンニトール、ソルビトール又はスクロース (１〜１０％(ｗ／ｗ)のマンニトール、ソルビトール、トレハロース又はスクロース)）をも含むことができる。
【００６６】
その上、本発明は、ＩＧＦ-１とＧＨの組合せを含む医薬組成物の製造のための方法に関する。
【００６７】
本発明の医薬配合物において、ヒト成長ホルモン及びインスリン様成長因子は、好ましくは、組換え手法によって製造される。
【００６８】
更なる実施形態において、好ましくは、本発明の組成物中のＩＧＦ-１とＧＨの両者は、各々有効量で、又は各々は最適量に満たないが合わされれば有効である量で、患者に投与されうる。好ましくは、かかる量は、約２５〜２５０マイクログラム／ｋｇ体重／日のＩＧＦ−１及び０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重／週のＧＨである。
【００６９】
好ましくは、この医薬配合物の投与は、注射により行われ、その注射は、好ましくは、非経口投与（例えば皮下注射、筋肉内注射、静脈注射又は点滴経路）であり、この医薬組成物は、最も好ましくは、毎日のボーラス注射として用いられ、好ましくは、即時的放出用配合物(ＩＲＦ)である。
【００７０】
治療されるべき患者は、好ましくは哺乳動物であり、特にヒトであるが、動物であってもよい。
【００７１】
更なる実施形態において、本発明は、血漿中の成長ホルモンの量の増加又は制御によって特徴付けられる病気を治療するための医薬の製造における組成物の使用を提供する。
【００７２】
特に、本発明は、成長ホルモン欠乏症(ＧＤＨ)；ターナー症候群、プラダー−ウィリ症候群(ＰＷＳ)；極低出生体重(ＶＬＢＷ)で生まれた子供の低身長、成人のＧＤＨの治療のための方法及び組成物を提供する。また、本発明は、エンドクリン疾患のための方法及び組成物も提供し、該方法及び組成物は、例えば、部分的内因性成長ホルモン活性又はある量のインスリン様成長因子−１(ＩＧＦ−１)及びある量の成長ホルモン(ＧＨ)のシグナリングにより特徴付けられる代謝異常を患っている患者に投与することを含み、それらは、組合せ療法において、患者の代謝異常を改善するのに有効である。また、本発明は、以下の特徴を有する方法及び組成物を提供する：患者が、成人で特発性低身長(ＩＳＳ)症候群を有する；、患者が、一日当たり単一投与のＩＧＦ−１及びＧＨを受ける；、及び患者が、同時に、ＩＧＦ−１及びＧＨの投与を受ける。
【００７３】
本発明は又、部分的内因性成長ホルモン活性又はシグナリング状態により特徴付けられる成長異常を患っている子供のための方法及び組成物をも提供する。これらの幼児期に異常を引き起こす成長は成人期にまで及び、その影響を受けた成人は、様々な代謝異常を患いうる。
【００７４】
本発明によれば、ｈＧＨ及びｈＩＧＦ−１は、薬剤として又は医薬組成物として用いられる。
【００７５】
本発明の価値ある利点は、注射器などの容器に予備充填して使用することができる組成物又は充填済み（ready-to-use）配合物を提供することである。
【００７６】
下記の実施例は、本発明を制限することなく説明するために寄与するものである。
【実施例】
【００７７】
実施例１
溶解度試験
Ｉｎｃｒｅｌｅｘ(登録商標)(１０ｍｇ／ｍｌ溶液、ｐＨ５．４の５０ｍＭ酢酸緩衝液中で配合)とＮｕｔｒｏｐｉｎ ＡＱ(登録商標)(５ｍｇ／ｍｌ溶液、ｐＨ６の１０ｍＭクエン酸緩衝液中で配合)の混合物を、体積比９：１〜１：９で調製した。これらの混合物は、直ちに又は混合後数時間以内に、可視的沈澱を様々な度合いで示した。Ｎｕｔｒｏｐｉｎ ＡＱ(登録商標)とＩｎｃｒｅｌｅｘ(登録商標)との混合物中で形成された沈澱の質量分析は、両タンパク質が沈澱中に存在することを示した。表１には、市販品のＩＧＦ−１(Ｉｎｃｒｅｌｅｘ(登録商標))とＧＨ(Ｎｕｔｒｏｐｉｎ ＡＱ（登録商標）)から調製した共混合物の透明度に関する観察と結果が集められている。
【００７８】
【表１】
2013510893.tif 000002
【００７９】
ＩＧＦ−１の溶解度は、これらの混合物のｐＨ範囲(５．４〜５．９)中で２０ｍｇ／ｍｌより大きいことが確認された。これは、ＩＧＦ−１の溶解度が、観察された沈澱の原因となっていないことを示しており、観察された沈澱は、ＩＧＦ−１ではない。このｐＨ範囲におけるクエン酸緩衝液、酢酸緩衝液又はヒスチジン緩衝液中でのＧＨの溶解度は、緩衝液に依存することが見出された。これらの結果は、酢酸緩衝液中のＧＨの、５．６より低いｐＨ値での溶解度の激しい低下を示しており、これは、これらの溶液を生じる混合物において観察された沈澱に寄与する可能性がある。
【００８０】
しかしながら、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ ＡＱ(登録商標)のＩｎｃｒｅｌｅｘ(登録商標)偽薬(ＩＧＦ−１を含まないが、それ以外では、Ｉｎｃｒｅｌｅｘ(登録商標)と同じ組成)との混合物、又は、Ｉｎｃｒｅｌｅｘ(登録商標)のＮｕｔｒｏｐｉｎ ＡＱ(登録商標)偽薬(ＧＨを含まないが、それ以外では、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ ＡＱ(登録商標)と同じ組成)との混合物は、比較例では透き通ったっままであり、これは、これらのタンパク質の減少した溶解度は、これらの二種のタンパク質間の相互作用にも関係しうることを示している。
【００８１】
その上、Ｉｎｃｒｅｌｅｘ(登録商標)偽薬により最終濃度２．５ｍｇ／ｍＬまで希釈されたＩｎｃｒｅｌｅｘ(登録商標)は、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ ＡＱ(登録商標)と沈澱を生じることなく、ＩＧＦ−１：ｈＧＨ比２．２：１以上で混合することができ、これは、これらのタンパク質間の相互作用が可逆的であることを示している。
【００８２】
実施例２
様々なｐＨでのシトレート（クエン酸塩）で緩衝された共混合物組成物の比較及び製造
凍結乾燥したｈＧＨを、ｐＨ６の、１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び０．２％ポリソルベート２０を含む１０ｍＭクエン酸緩衝液に、最終濃度５ｍｇ／ｍｌまで溶解させた。表１の一列目に示した種々の配合物緩衝液中のＩＧＦ−１溶液を、それぞれの緩衝液中へのＩＧＦ−１の透析により又は凍結乾燥されたＩＧＦ−１の緩衝液中への再構成によって製造した。ＧＨ溶液と混合する前のＩＧＦ−１溶液の最終濃度は、１０ｍｇ／ｍｌであった。これらのＧＨ及びＩＧＦ−１溶液を、表２に示した様々な比で一緒に混合した。
【００８３】
ＩＧＦ−１を含む様々な緩衝液(ｐＨ５．４及び６)を用いて、クエン酸緩衝液中のＧＨから調製した共混合物の視覚的外観を表２に集めてある。
【００８４】
【表２−１】
2013510893.tif 000003
【表２−２】
2013510893.tif 000004
【００８５】
表２に記録した観察は、様々な緩衝液中のＩＧＦ−１の溶液が、ｐＨ６のクエン酸緩衝液中で配合されたＧＨと混合された場合に、沈澱を生成することを示している。
【００８６】
実施例３
組成物の製造及びシトレート緩衝された組成物の透明度試験
各タンパク質(ＩＧＦ−１及びｈＧＨ)の約１９ｍｇ／ｍｌ溶液を、別々に、１０ｍＭアルギニンを含むｐＨ６．０の１０ｍＭクエン酸緩衝液中に透析した。一晩の透析の後、溶液濃度を、２８０ｎｍでの紫外線(ＵＶ)吸光度測定により測定した。ＩＧＦ−１及びｈＧＨ溶液の最終濃度は、それぞれ１４及び２１ｍｇ／ｍｌであった。各溶液の個々のアリコートは、表３に示した残りの賦形剤で構成されて、最終的タンパク質濃度１０ｍｇ／ｍｌまで希釈された。個々に配合されたタンパク質溶液の各ペア(ＩＧＦ−１及びｈＧＨ)は、１：１の比で混合されて、各タンパク質５ｍｇ／ｍｌを含む混合物を生成した。２種のタンパク質の混合物を製造した後、２種の界面活性剤の一つを個々のタンパク質配合物及び共混合物の両者に最終濃度まで加えた。これらの溶液を、７２時間の冷蔵の後に検査した。この時点で透明なままの２つの混合物(表３のＡ２及びＡ１０と示した配合組成物)を冷蔵庫に保存して、７０日間の貯蔵の後に再び検査して、それらが透明なままであることを確認した。表３には、クエン酸配合物の５℃で７２時間後の外観試験の結果をまとめた。
【００８７】
【表３】
2013510893.tif 000005
【００８８】
透明な配合物(Ａ２及びＡ１０)の両者は、１００ｍＭの追加されたアルギニウムイオンを含んだが、追加された塩化ナトリウムは殆ど又は全く含まれなかった。表３でＡ１及びＡ９と標示された２つの配合物は、それぞれ、Ａ２及びＡ１０と組成において殆ど同じであったが、一層少量の追加のアルギニウムイオン(１０ｍＭ)を含み、透明を維持しなかった。
【００８９】
実施例４
ヒスチジン緩衝された組成物の製造及び比較透明度試験
ＩＧＦ−１の１９ｍｇ／ｍｌ溶液を、１０ｍＭアルギニンを含むｐＨ５．６の１０ｍＭヒスチジン緩衝液中に透析した。透析後、溶液濃度を、紫外線(ＵＶ)吸光度を２８０ｎｍで測定することにより、１８ｍｇ／ｍｌであると決定した。この溶液は、表４にＢ１〜Ｂ８で標示された配合組成物を調製するために、適当量の追加のアルギニン、ベンジルアルコール、界面活性剤(ポリソルベート２０又はポロキサマー１８８)、塩化ナトリウム、及びマンニトールから構成された。ＩＧＦ−１のみの配合物のアリコートを用いて、凍結乾燥された成長ホルモンを再構成して、各タンパク質５ｍｇ／ｍｌを含む対応する配合物を調製した。これらの溶液の外観を、５℃で２４時間冷蔵した後に観察した。表４でＢ３、Ｂ４及びＢ８と示された３つの配合物を除くすべての配合物は、この時点で、幾らかの沈澱を示した。これらの配合物は、冷蔵庫内に更に６５日間貯蔵され、その時点で透明なままであった。表４に、ｐＨ５．６にてヒスチジン緩衝された配合物をまとめた(５℃で、２４時間後)。
【００９０】
【表４】
2013510893.tif 000006
【００９１】
透明なままだった３つの配合混合物は、すべて、１００ｍＭアルギニウムイオンを含んだ。Ｂ７と示された配合混合物は、添加されたアルギニン以外では表４のＢ８の配合の組成物と正確に対応し、２４時間冷蔵後の観察では沈澱を示したが、Ｂ８配合物は、透明なままであった。同様に、表４のＢ４と標示された配合混合物は、長期冷蔵後に透明なままであったが、１０ｍＭアルギニン及び追加の塩化ナトリウムのみを含むＢ２配合物は、透明なままでなかった。
【００９２】
実施例５
ｐＨ６にヒスチジン緩衝された組成物の調製
各タンパク質(ＩＧＦ−１及びｈＧＨ)の約１９ｍｇ／ｍｌ溶液を、別々に、１０ｍＭアルギニンを含むｐＨ６の１０ｍＭヒスチジン緩衝液中に透析した。一晩の透析の後に、溶液の濃度を、紫外線(ＵＶ)の吸光度を２８０ｎｍで測定することによって決定した。透析後の、ＩＧＦ−１及びｈＧＨ溶液の最終濃度は、それぞれ、１１及び２１ｍｇ／ｍｌであった。これらの溶液は、表５のＣ１及びＣ２と示された２つの配合組成物を調製するために、個別に、適当量の追加のアルギニン、ベンジルアルコール、界面活性剤(ポリソルベート２０又はポロキサマー１８８)、塩化ナトリウム、及びマンニトールにより構成された。これらの個々のタンパク質配合物を、１：１の比で混合して共混合物を調製し、６つのすべての溶液の外観を、５℃で７２時間の冷蔵後に観察した。成長ホルモン配合物及び共混合物の両セットは、幾らかの沈澱を示した。これは、おそらく、これらの配合物中の高塩濃度(１５０ｍＭ)のためであろう。表５に、ｐＨ６にヒスチジン緩衝された配合物をまとめた(５℃で７２時間後)。
【００９３】
【表５】
2013510893.tif 000007
【００９４】
実施例６
クエン酸塩及びヒスチジン緩衝された組成物の調製及び比較
各タンパク質(ＩＧＦ−１及びＧＨ)を含む２種の配合物を、それぞれ、タンパク質最終濃度２０ｍｇ／ｍｌ(ＩＧＦ−１)及び６ｍｇ／ｍｌ(ＧＨ)で、下記のように調製した：
配合物１：  １０ｍＭ  クエン酸、０．２％  ポリソルベート２０、１％  ベンジルアルコール、１００ｍＭ  アルギニン、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．２
配合物２：  １０ｍＭ  ヒスチジン、１００ｍＭ  アルギニン、０．３％  ポロキサマー１８８、１％  ベンジルアルコール、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．８
【００９５】
これらの配合物は、２種の各緩衝液(緩衝液１及び２)中への接線方向の流れの濾過（タンジェンシャル・フロー・フィルトレーション）による各タンパク質の緩衝剤交換により、表６に示した濃度の４つのストック溶液を生成するように調製された。表６に、配合物のためのストック溶液の調製物をまとめた。
【００９６】
【表６】
2013510893.tif 000008
【００９７】
追加の緩衝剤及び界面活性剤ストック溶液を、各ストック溶液に、穏やかに混合しながら加えた後、適当量の生のＢｚＯＨ(ベンジルアルコール)を加えて、各タンパク質を含む配合物１及び２の最終組成物を達成した。ＩＧＦ−１及びｈＧＨ配合物のタンパク質濃度は、それぞれ、２０ｍｇ／ｍｌ及び６ｍｇ／ｍｌであった。これら４種の配合物(２種のＩＧＦ−１配合物及び２種のｈＧＨ配合物)は、次いで、希釈され且つ／又は混合されて、表７の最終的配合物及び共混合物を達成する。これらの溶液は、次いで、更なる希釈／瓶詰めまで２〜８℃で保存された。全タンパク質溶液を、ＰＥＳ膜を用いて除菌濾過してから、アリコートを３ｍｌの硝子小瓶に取った。これらの小瓶に栓をして、クリンプ・シールして、最長８週間、冷蔵庫内に貯蔵した。各溶液の外観を、２週おきに、８週間にわたって評価した。８週間の終りに、１４のすべての溶液は、依然として、透明で無色であった。表７には、１００ｍＭアルギニンを含むシトレート及びヒスチジン配合物の視覚的外観の結果をまとめた。
【００９８】
【表７】
2013510893.tif 000009
【００９９】
これらの組成物の８週間にわたる化学的安定性は、これらの配合物及び共混合物の周期的分析により確認された。それらは、ＩＧＦ−１(ｄｅｓ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−ＩＧＦ−１)及びＧＨ(脱アミド化ＧＨ)の主たる安定性限界の分解産物を検出するために、そして登録されている長期間安定なＩｎｃｒｅｌｅｘ(登録商標)(ＩＧＦ−１、注射用液)及びＮｕｔｒｏｐｉｎ ＡＱ(登録商標)(ＧＨ、注射用液)対照について確立された速度との分解速度の比較のために、５℃冷蔵され及び２５℃保存された。これらの分解速度は、表８及び９に示す。これらの配合物は（対照も含めて）、５℃で８週間の間は、ＩＧＦ−１のゆっくりした分解傾向を示さない。しかしながら、２５℃で貯蔵された本発明の新規な配合物及び共混合物は、Ｉｎｃｒｅｌｅｘ(登録商標)で観察される典型的な加速された分解と比較可能な安定性を示す。新規な配合物及び共混合物におけるＧＨの脱アミド化は、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ ＡＱ(登録商標)対照と比較可能な速度を、５℃及び２５℃の両方で示す。
【０１００】
【表８】
2013510893.tif 000010
【０１０１】
【表９】
2013510893.tif 000011
【０１０２】
実施例７
ＩＧＦ−１のヒスチジン緩衝された組成物の製造及び比較
２種の配合物を、タンパク質最終濃度２０ｍｇ／ｍｌのＩＧＦ−１を用いて調製した(ＩＧＦ−１)：
配合物１：  ２０ｍＭヒスチジン、０．２％ポリソルベート２０、１％ベンジルアルコール、１５０ｍＭアルギニン、ｐＨ５．８
配合物２：  ５０ｍＭヒスチジン、０．２％ポリソルベート２０、１％ベンジルアルコール、１５０ｍＭアルギニン、ｐＨ５．８
【０１０３】
これらの配合物は、タンパク質の２緩衝液の各々への緩衝剤交換により調製され、界面活性剤及び防腐剤を添加して配合され、安定性を対照のＩｎｃｒｅｌｅｘ(登録商標)と一緒に評価した。５℃、２５℃及び４０℃での安定性データを表１０に示す。
【０１０４】
【表１０】
2013510893.tif 000012
【０１０５】
実施例８
組合せ配合物における安定性データ
【０１０６】
【表１１】
2013510893.tif 000013
【０１０７】
これらのデータは、サイズ排除クロマトグラフィーによって取得したものであり、１、３及び６月の安定性結果を提供する。
【０１０８】
実施例９
ｒｈＩＧＦ−１とｒｈＧＨの別の共配合法の確立
１．材料と方法
１．１ 原料
次の原料は、この研究で用いられて、表１２に示される。
【０１０９】
【表１２】
2013510893.tif 000014
【０１１０】
１．２．装置
下記の装置を、この研究のために用いた:
−  オートクレーブ  ＦＥＤＥＧＡＲＩ(社製）、
−  滅菌したポリエチレン(ＰＥ)製瓶 Ｎａｌｇｅｎｅ （商品名）ｒｅｆ.２０１９、
−  透析濾過用のＢＩＯＭＡＸ ＰＥＳ カセット（商品名）ｒｅｆ．：ＰＸＢ００５Ａ５０、
−  クリーンルーム、層流フード
−  Ｃｏｇｅｎｔ μＳｃａｌｅ（商品名） ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ(社製）タンジェンシャル・フロー・フィルトレーション装置、
−  ＭＩＬＬＥＸ（商品名）(３３ｍｍ)ＰＥＳ０．２２μｍフィルター(ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ)
−  ＭＩＬＬＥＸ(３３ｍｍ) ＰＶＤＦ  ０．２２μｍフィルター(ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ)
−  ガラスビーカー、
−  メスシリンダー、
−  マグネチックスターラー、
−  マイクロピペット Ｐ１０００、
−  オーブン ＦＥＤＥＧＡＲＩ(社製）、
−  薬局方準拠の小瓶観察装置、
−  ＦＬＥＸＩＣＯＮ （商品名）ＰＦ６ No.２１２１１８ポンプ、
−  注射器 ＰＥ ５０ｍＬ、
−  １．５ｍＬ エッペンドルフ試験管、
−  ５０ｍＬ 及び １５ｍＬ ファルコン試験管、
−  タイゴン管 (１．６ｍｍ ＋ 専用針)
−  洗浄機 ＣＯＲＩＭＡ(社製）。
【０１１１】
２．組成物の最適化のための方法及び処方
方法及び配合の最適化の予備的研究を行なった。配合組成物は、下記の表１３に記載の通りである。
【０１１２】
【表１３】
2013510893.tif 000015
【０１１３】
２．１．ｒｈＩＧＦ−１のタンジェンシャル・フロー・フィルトレーション (ＴＦＦ)工程
このｒｈＩＧＦ−１ＴＦＦ工程は、下記のパラメーターを用いて行われた：
使用したＩＧＦ−１量：２５ｍｇ／ｍＬで、８０ｍＬのｒｈＩＧＦ−１、
透析濾過濃度：２５ｍｇ／ｍＬ、
交換緩衝液：２０ｍＭシトレート、１５０ｍＭ Ａｒｇ．ｐＨ６．０、
ペリコンＸＬカセット：再生したセルロース膜、５ｋＤａカットオフ、
ＴＭＰ：１８〜２２ａｔｍ、
ポンプ：最大容量の１２％に設定、
透析濾過容量（diavolume）：６、
ｒｈＩＧＦ−１最終濃度：３０ｍｇ／ｍＬ。
【０１１４】
２．２．タンパク質の配合物：
１．この別法においては、すべての賦形剤を先ず一緒に混合し、その後、タンパク質をそれらの賦形剤に加えた。
２．賦形剤の溶液を６．０より低いｐＨで調製し、７未満のｐＨで溶液が形成されるまでに、ＧＨ ＤＳの添加(ｐＨ約７．５〜８)が終了するようにした。
【０１１５】
２．２．１．ＩＧＦ−１配合物
１．８．４４％の最終容積となるように８０ｍＭクエン酸塩／アルギニン６００ｍＭ、ｐＨ５．５(ガラスビーカー中)の重量を測定した。
２．１０％最終容積となるように３．７％フェノール溶液を加えた。
３．１０％最終容積となるように２％ポロキサマー１８８溶液を加えた。
４．混合して均質化した。
５．３．８４ｇのスクロースを加えた。
６．可溶化及び均質化するために混合した。
７．ｐＨ値を測定した：５．８６。
８．この溶液を穏やかに攪拌しながら、透析濾過したｒｈＩＧＦ−１を１．６ｇに対応する体積で加えた。その体積は下記のように計算した：
９．５２．７(ｍＬ)(透析濾過したＩＧＦ−１の体積)＝１６００[ｍｇ](必要なｒｈＩＧＦ−１の量)／３０．３６[ｍｇ／ｍＬ](ＩＧＦ−１濃度)
１０．均質化するまで混合した。
１１．ｐＨ値を測定した：６．０５、従って、ｐＨ補正は不要だった。
１２．最終体積をＷＦＩ（注射用蒸留水）を用いて、８０ｍＬにした。
１３．ｐＨ値を測定した：６．０５。
１４．０．２２μｍＰＥＳフィルターを用いて濾過した。
１５．０．２２μｍＰＶＤＦフィルターを用いて濾過した。
【０１１６】
２．２．２．ＧＨの配合物
１．２５％の最終容積となる８０ｍＭクエン酸塩／アルギニン６００ｍＭ、ｐＨ５．５をガラスビーカーに加えた。
２．１０％最終容積となる３．７％フェノール溶液を加えた。
３．１０％最終容積となる２％ポロキサマー１８８溶液を加えた。
４．１０％最終容積となるＷＦＩを加えた。
５．均質化させるために撹拌した。
ａ．混合液中に、（周囲環境由来と考えられる）少数の粒子はほとんど無く透明であり、
ｂ．測定されたｐＨ値：５．９だった。
６．４．８３ｇのスクロースを加えた。
７．混合して可溶化し、均質化した。
ａ．ｐＨ：５．８７；
８．３０ｍＬのＧＨＤＳを、溶液を穏やかに撹拌しながら加えた。
９．混合して均質化した。
ａ．測定されたｐＨ値：６．６。
ｂ．最終ｐＨ ６．０。
１０．０．２２μｍＰＥＳフィルターを用いた濾過した。
１１．０．２２μｍＰＶＤＦフィルターを用いた濾過した。
【０１１７】
２．２．３．共配合（又は共混合）
４５ｍＬの最終的共混合ｒｈＩＧＦ-1／ｒｈＧＨ（２．２：１）を生成するために：
１．１７．９ｍＬのＩＧＦ−１配合物を、マグネチックスターラーで撹拌しながら２７．１ｍＬのｒｈＧＨに加えた。
２．混合して均質化した。
３．溶液は、透明な外観であって、可視的粒子を伴わなかった。
４．建物２のクリーンルーム中で０．２２μｍＰＥＳフィルターを用いて濾過し：可視的粒子を含まない透明な溶液が得られ／注射器により容易に吸引することができた。
【０１１８】
３．選択した配合物へのヒスチジンを緩衝剤として用いる別法の適用
３．１．配合可能性
この配合を、ｒｈＩＧＦ−１につき２．２．１節に、ｒｈＧＨにつき２．２．２節に、そして共配合物２．２：１(共混合物)につき２．２．３節に記載したように行なった。但し、下記を用いた：
−  緩衝剤としての、クエン酸塩の代わりのヒスチジン、
−  ｐＨ５．８の代わりのｐＨ６．０
−  界面活性剤としての、ポロキサマー１８８の代わりのポリソルベート２０、
−  防腐剤としての、１０％フェノール溶液の代わりの純粋ベンジルアルコール、
−  ｐＨを修正するための、２．５％クエン酸溶液の代わりの２．５％ＨＣｌ溶液、
−  単独のタンパク質生成物及び共混合配合物を濾過するためのＰＶＤＦフィルター、
−  比１．１：１及び６．６：１の共配合物が、配合混合物２．２：１の代わりに製造された。
【０１１９】
３．２ 濾過反復可能性の最適化
この工程を、３．１節に記載のように行なった(２１℃の実験室内で)。但し、濾過工程は、下記のシーケンスに従って行った：
１５０ｍＬのｒｈＧＨ配合物を、ＰＥＳ０．２２μｍフィルターによる第一の清澄化濾過及びＰＶＤＦフィルターによる第二の除菌濾過にかける。
１５０ｍＬのｒｈＧＨ配合物を、ＰＶＤＦ０．２２μｍフィルターによる第一の清澄化濾過及びＰＶＤＦフィルターによる第二の除菌濾過にかける。
【０１２０】
下記の観察がなされた：
清澄化濾過前のｒｈＧＨ溶液は、穏やかにオパール色に光り、沈澱を含まない外観であった。
上記両方の濾過シリーズを行った後、これらのｒｈＧＨ配合物は、粒子を含まないように見えた。
目視検査分析は、配合物及び共配合物の最終的除菌濾過にＰＶＤＦフィルターを用いることの正の効果、即ち、この型のフィルターを用いた場合の、可視的粒子の十分な減少及び良好な安定性を確認した。
【０１２１】
【表１４】
2013510893.tif 000016
【０１２２】
実施例１０
ｒｈＩＧＦ−１及びｒｈＧＨ共配合物の製造方法
ｒｈＧＨ本体(薬物物質(Drug Substance)、即ちＤＳ)は、濃度７．５ｍＭの重炭酸塩緩衝液中の２０ｍｇ／ｍｌ溶液である。ｒｈＩＧＦ−１本体(ＤＳ)は、２００ｍＭクエン酸緩衝液中の２５〜３５ｍｇ／ｍｌ溶液である。
【０１２３】
３つの異なる型の方法が、下記のように作成された(下記において、方法Ｉ、並びに別法Ａ及びＢと示されている)：
【０１２４】
方法Ｉの工程： 
−  ｒｈＧＨ及びｒｈＩＧＦ−１を透析濾過して緩衝液（バッファ）を交換する(オリジナルＤＳ用緩衝液vs.２０ｍＭヒスチジン(Ｈｉｓ)／１５０ｍＭアルギニン(Ａｒｇ)、ｐＨ５．８)。
−  各個別のタンパク質につき、配合を、下記の導入順序で行なった。
交換緩衝液を添加してＤＳ濃度を調節する、
ポリソルベートＰＳ２０溶液を添加する。
ベンジルアルコール(ＢＡ)溶液を添加する。
−  個々の配合物を共混合して、安定な共配合物を生成した。
【０１２５】
方法Ａの工程：
−  ｒｈＧＨ及びｒｈＩＧＦ−１を透析濾過して緩衝液を交換する(オリジナル  ＤＳ用緩衝液、vs.２０ｍＭヒスチジン(Ｈｉｓ)／１５０ｍＭアルギニン(Ａｒｇ) ｐＨ５．８)。
−  各タンパク質についての最終的配合を、下記の導入順序で行った。
濃縮緩衝液、
界面活性剤の溶液、
防腐剤の溶液、
ＷＦＩ(注射用水)、
増量剤(任意成分)、
透析濾過された薬物物質（ＤＳ）、
クエン酸(又はＨＣｌ)によるｐＨの修正、
最終体積にするためのＷＦＩ。
−  個々の配合物を共混合して、安定な共配合物を生成した。
【０１２６】
方法Ｂの工程：
−  ｒｈＩＧＦ−１を透析濾過して緩衝液を交換する(オリジナルＤＳ用緩衝液vs.２０ｍＭヒスチジン(Ｈｉｓ)／１５０ｍＭアルギニン(Ａｒｇ) ｐＨ５．８)、
−  ｒｈＧＨ本体の透析濾過なしの直接的配合(即ち、ｒｈＧＨＤＳの、賦形剤混合物への、緩衝液交換なしでの添加)。
−  最終的配合を、方法Ａにおけるものと同じ導入順序で行なった。
−  個々の配合物を共混合して、安定な共配合物を生成する。
【図１】
2013510893.tif 000017
【図２】
2013510893.tif 000018
【国際調査報告】
2013510893.tif 000019
2013510893.tif 000020
2013510893.tif 000021