(57)【要約】  本発明の主題は、Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質の活性の制御を通じて抗癌剤の細胞内濃度を制御することを目的とした新規医薬である。当該発明は、癌の治療の改善に特に使用される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗癌剤の細胞内濃度を制御するインビトロの方法であり、Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質の活性の制御因子が細胞に接触することにより、抗癌剤の細胞内濃度を制御する、当該方法。
【請求項２】
Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質による抗癌剤の輸送の活性の刺激因子が細胞に接触する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質による抗癌剤の輸送の活性の阻害因子が細胞に接触する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
抗癌剤の細胞内濃度を制御するための医薬を調製するための、Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質の活性の制御因子の使用。
【請求項５】
前記Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質の活性の制御因子がＰａｔｃｈｅｄタンパク質の活性の活性化因子であり、そして、前記医薬が、抗癌剤の細胞内濃度を減少させるためのものである、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質の活性の制御因子がＰａｔｃｈｅｄタンパク質の活性の阻害因子であり、そして、前記医薬が、抗癌剤の細胞内濃度を増大させるためのものである、請求項４に記載の使用。
【請求項７】
前記抗癌剤が、抗腫瘍抗生物質、アルキル化剤、代謝拮抗物質、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤又は有糸分裂紡錘体毒素（ｍｉｔｏｔｉｃ  ｓｐｉｎｄｌｅ  ｐｏｉｓｏｎ）から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法又は請求項４〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記抗癌剤が、抗腫瘍抗生物質である、請求項７に記載の方法又は使用。
【請求項９】
前記抗腫瘍抗生物質が、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ハイドロキシウレア、イデルビシン、マイトマイシンＣ、又はマイトキサントロン、好ましくはドキソルビシンから選択される、請求項８に記載の方法又は使用。
【請求項１０】
抗癌治療の効率を改善することを意図する医薬の調製における、Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質の活性の制御因子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナリング経路は、胚発生の過程における成長及び構造形成に重要な役割を果たす。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類のＨｈシグナリング経路は、多くの作用因子を利用し、以下のものが挙げられる。
−Ｓｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  （Ｓｈｈ）、Ｉｎｄｉａｎ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  （Ｉｈｈ）及びＤｅｓｅｒｔ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  （Ｄｈｈ）の３つの異なる遺伝子によりコードされるＨｈファミリーのタンパク質、
−Ｄｉｓｐａｔｃｈｅｄ  （Ｄｉｓｐ）を含むＨｈタンパク質の分泌及び輸送に関与するタンパク質、
−広範な作用を有し、Ｈｈタンパク質の蓄積に必要なＳｈｉｆｔｅｄ、
−Ｈｈシグナルの受容体タンパク質：Ｐａｔｃｈｅｄ  （Ｐｔｃ），  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ相互作用タンパク質（Ｈｉｐ）、
−Ｈｈシグナルの受容細胞内への伝達に関与するＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ  （Ｓｍｏ）。
【０００３】
Ｓｍｏは、Ｈｈタンパク質の非存在下、Ｐｔｃにより構成的に阻害されていること、及びＨｈリガンドのその受容体であるＰｔｃへの結合が、ジンクフィンガー転写因子Ｇｌｉ因子を活性化させるＳｍｏの活性化をもたらすことは、当該技術分野で一般に受け入れられている。
【０００４】
Ｈｈシグナリング経路の異常が、ヒトのＧｏｒｌｉｎ症候群及び全前脳症等の先天性奇形を誘導することは、詳細に記述されている。
【０００５】
同様に、対応するタンパク質の活性の低下をもたらすＰＴＣＨ１遺伝子のアリルの異常を有する個体は、特に指、顔面、歯及び肋骨の形態異常を呈し、これがＧｏｒｌｉｎ症候群と称されるのは、公知である。
【０００６】
Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質は、細胞膜を１２回貫通し、Ｈｈタンパク質と２つの大型の細胞外ループで相互作用する、膜タンパク質である。
【０００７】
ＲＮＤ（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，  ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ，  ｄｉｖｉｓｉｏｎ）ファミリーの細菌トランスポーターの配列との相同性は、このタンパク質がトランスポーター機能を有し得ることを示唆している。
【０００８】
しかしながら、出願人の知る限り、Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質のトランスポーターとしての機能、特に抗癌剤トランスポーターとしての機能は、これまで示されていなかった。
【０００９】
驚くべきことに、長期の研究の末、細胞内抗癌剤のプロトタイプとしてドキソルビシンを使用して、出願人は、Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質が、細胞内抗癌剤、特にドキソルビシンに結合し、当該Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質が、細胞内抗癌剤、特にドキソルビシンの流出に関与することを、いくつかの異なる細胞モデルによる複数のアプローチ（実施例参照）により、実証することに成功した。
【００１０】
細胞内の抗癌剤及び／又はドキソルビシンが流出することは、Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質の影響下、細胞内の抗癌剤及び／又はドキソルビシンが細胞外に輸送されることを意味する。
【００１１】
Ｈｈタンパク質の非存在下、Ｐａｔｃｈｅｄ膜タンパク質は細胞の細胞質膜中に存在し、Ｐａｔｃｈｅｄにより誘導される、抗癌剤、特にドキソルビシンの流出が増大するにつれて、抗癌剤、特にドキソルビシンの細胞内濃度が低下する。
【００１２】
一方、Ｈｈタンパク質が細胞外媒体中に分泌されると、それがＰａｔｃｈｅｄと相互作用し、当該Ｐａｔｃｈｅｄ／Ｈｈ複合体は、吸収及び分解させられる。細胞質膜中のＰａｔｃｈｅｄタンパク質が減少することにより、抗癌剤、特にドキソルビシンの流出が低下し、その結果、抗癌剤、特にドキソルビシンの細胞内濃度が増大する。
【００１３】
出願人の綿密な研究の結果から、Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質が膜貫通トランスポーターとして機能し、抗癌剤、特にドキソルビシンの流出に関与し得ることが示唆された。
【００１４】
故に、Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質の活性の制御は、抗癌剤、特にドキソルビシンの細胞内濃度を制御することを可能とする。
【００１５】
このＰａｔｃｈｅｄタンパク質の新しい作用の発見は、抗癌剤、特にドキソルビシンの細胞内濃度の制御による抗癌治療の効率を改善させる新しい方法を構想することを可能とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
故に、本発明の第一の主題は、Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質の活性の制御因子が細胞に接触することを特徴とする、細胞内抗癌剤の細胞内濃度を制御するインビトロの方法である。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
当業者は、抗癌剤による治療、特に細胞内標的を用いた治療の過程で、様々な手段において、単一の抗癌剤又はいくつかの抗癌剤の組み合わせの使用が推奨されることを認識する。本発明においても、「抗癌剤」という表現は、１つ又は複数の細胞内抗癌剤を指す。
【００１８】
制御因子は、本発明において、活性化因子又は阻害因子を意味する。
【００１９】
本発明の変形において、当該方法は、Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質による抗癌剤の輸送の活性の阻害剤が細胞に接触することを特徴とする、抗癌剤の細胞内濃度を増大させるインビトロの方法である。
【００２０】
本発明の他の変形において、当該方法は、Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質による抗癌剤の輸送の活性の刺激因子が細胞に接触することを特徴とする、抗癌剤の細胞内濃度を減少させるインビトロの方法である。
【００２１】
治療的用途も想定される。
【００２２】
故に、本発明の主題は、抗癌剤の細胞内濃度を制御することを意図する医薬を調製するための、Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質の活性の制御因子の使用でもある。
【００２３】
一つの変形において、本発明は、抗癌剤の細胞内濃度を低下させることを意図する医薬を調製するための、Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質の活性の活性化因子の使用である。
【００２４】
他の変形において、本発明の主題は、抗癌剤の細胞内濃度を増大させることを意図する医薬の調製のためのＰａｔｃｈｅｄタンパク質の活性の阻害剤の使用である。
【００２５】
本発明において、Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質の阻害因子とは、以下のものを意味する。
−  Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質に対する抗体（例えばＮａｋａｍｕｒａ  Ｍａｓａｆｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７，  ３７４３−３７４８  （２００７））
−  コレステロール、オキシステロール又は他のコレステロールのアナログ。実際に、本発明者らは、Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質が、コレステロールを細胞内から細胞外に輸送することを示している（国際出願ＰＣＴ／ＦＲ２０１１／０００５５８，  出願日２０１１年１０月１８日、及びＢｉｄｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ，  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１１，  ｖｏｌ．  ６，  Ｉｓｓｕｅ  ９，  ２０１１）。十分量のコレステロール又はそのアナログの存在は、Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質上で抗癌剤と競合して、抗癌剤の排出を阻害する。
−  抗癌剤の輸送されないアナログ。
【００２６】
本発明において、抗癌剤は、抗腫瘍抗生物質、アルキル化剤、代謝拮抗物質、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤又は有糸分裂紡錘体毒素（ｍｉｔｏｔｉｃ  ｓｐｉｎｄｌｅ  ｐｏｉｓｏｎ）を意味する。
【００２７】
抗腫瘍抗生物質として、例えば、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ハイドロキシウレア、イデルビシン、マイトマイシンＣ、又はマイトキサントロンが挙げられる。
【００２８】
アルキル化剤として、例えば、ブスルファン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、メクロレタミン、オキサリプラチン、ウラムスチン、又はテモゾロミドが挙げられる。
【００２９】
代謝拮抗剤として、例えば、アザチオプリン、カペシタビン、シタラビン、フロキシウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、メトトレキサート、又はペメトレキセドが挙げられる。
【００３０】
植物アルカロイドとして、例えば、ブンブラスチン又はビンクリスチン（ビノレルビン）が挙げられる。
【００３１】
トポイソメラーゼ阻害剤として、例えば、イリノテカン、トポテカン、又はエトポシドが挙げられる。
【００３２】
そして有糸分裂紡錘体毒素として、例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン又はビノラルビンが挙げられる。
【００３３】
好ましくは、本発明において、特に重要な細胞内抗癌剤は、抗腫瘍抗生物質のファミリーに属するもので、より有利には、特に重要な細胞内抗癌剤は、ドキソルビシンである。
【００３４】
本発明において、Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質の活性の制御因子（活性化又は阻害）は、好ましくは、生理的に有効な用量で、医薬中に存在する。
【００３５】
本発明において、前記医薬は、内服又は非経口経路用に製剤化されてもよい。
【００３６】
本発明の医薬は、更に、Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質の活性の制御因子と組み合わせて、１つ以上の他の治療有効成分を含有してもよく、当該成分は、同一の病理又は異なる病理に対するものであってもよく、特に当該病理の１つに罹患した対象の治療期間中に、同時に、別箇に、又は交互に使用されてもよい。他の有効成分の一例として、スタチン、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ受容体のアンタゴニスト、又はＰａｔｃｈｅｄタンパク質の活性の制御因子とは別の抗癌剤の流出の活性の制御因子が挙げられる。故に、本発明の主題は、Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質の活性の制御因子、スタチン、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ受容体のアンタゴニスト、又はＰａｔｃｈｅｄタンパク質の活性の制御因子とは別の抗癌剤の流出の活性の制御因子の組み合わせ使用にも関する。好ましくは、Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質の活性の制御因子は、Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質の活性の阻害剤であってもよい。
【００３７】
本発明において、Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質の活性の制御因子（活性化又は阻害）は、医薬において、１つ以上の賦形剤、又は不活性、即ち医薬的に不活性かつ無毒性のビヒクルと混合して使用されてもよい。
【００３８】
例えば、生理食塩水、生理的、等張、緩衝等の溶液であって、医薬的使用に適合し、当業者に知られるものが挙げられる。当該組成物は、分散剤、可溶化剤、安定化剤、保存料から選択される１つ以上の薬剤又はビヒクルを含有してもよい。
【００３９】
製剤化（液体、注射剤又は固体）において使用される薬剤又はビヒクルとして、特に、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、シクロデキストリン、ポリソルベート８０、マンにトール、ゼラチン、ラクトース、植物又は動物油、アカシア等が挙げられる。好ましくは、植物油が使用される。前記組成物は、注射用懸濁物、ゲル、油、錠剤、座薬、粉末、ゲルカプセル、カプセル等の形態に製剤化されてもよく、任意で、本草薬形態（ｇａｌｅｎｉｃａｌ  ｆｏｒｍ）、又は放出期間を延長／遅延させるためのデバイスにより製剤化される。この種類の製剤化において、セルロース、炭酸塩又は澱粉を使用するのが好ましい。
【００４０】
当業者に知られた任意の方法により投与が実施され、好ましくは経口又は注射投与であり、典型的には、腹腔内、脳内、髄腔内、静脈内、動脈内、又は筋肉内経路による。経口経路による投与が好ましい。
【００４１】
本発明は、哺乳類、特にヒトに使用されてもよい。
【００４２】
一般に、前記化合物の日常用量は、所望の治療効果を得る最少の用量であり得る。場合によっては、当該日常用量は、１日に２、３、４、５、６又はそれ以上の回数に分けて投与されてもよく、又は適切な間隔で複数回投与されてもよい。
【００４３】
選択される用量は、特に投与経路、投与期間、投与回数、Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質の活性の制御因子の排出の割合、Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質の活性の制御因子と組み合わせて使用される物質、患者の年齢、体重及び生理的状態、及び病歴、並びにその他の医学分野で知られる情報等の、複数の要素に依存し得る。
【００４４】
また、本発明の主題は、抗癌治療、好ましくは抗癌治療の効率を改善するための、Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質の活性の制御因子の使用でもある。
【００４５】
本発明の他の特徴及び長所は、下記本発明の実施例及び図面を参照して明確になり得る。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、ヒトＰａｔｃｈｅｄタンパク質を発現する酵母（正方形）又はこれを発現しない酵母（Ｋ６９９）（黒菱型）のドキソルビシン耐性の効果を示す。１Ａ：ドキソルビシン非存在下の培養１Ｂ：ドキソルビシン１０μｇ／ｍＬ存在下の培養
【００４７】
【図２】図２は、Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質を発現する酵母（Ｐｔｃ）又はこれを発現しない酵母（Ｋ６９９）のドキソルビシンの流出の試験の結果を示す。蛍光値は、任意の単位で示される。
【００４８】
【図３】図３は、ＮＩＨ３Ｔ３マウスの繊維芽細胞の内在性Ｐａｔｃｈｅｄがドキソルビシンの流出を促進するか否かを判定するために行われた実験の結果を示す。蛍光値は、任意の単位で示される。（正方形）Ｓｈｈ無しの対照、（黒色菱型）Ｓｈｈ有り。
【００４９】
【図４】図４は、ゼノパス卵を用いて実施された、ドキソルビシンの流出に対するＰａｔｃｈｅｄタンパク質の影響を示す、実験の結果を示す。４Ａ：ヒトＰａｔｃｈｅｄタンパク質をコードするリボ核酸を異なる量で注射した卵の膜の調製物についてのウエスタンブロットを示す。４Ｂ：ヒトＰａｔｃｈｅｄタンパク質ＲＮＡを異なる量で注射したゼノパス卵におけるドキソルビシンの流出の測定を示す。蛍光値は、任意の単位で示される。
【００５０】
【図５】図５は、Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質を発現する又は発現しない酵母中に存在するＰａｔｃｈｅｄタンパク質へのドキソルビシンの結合の試験の結果を示す。
【実施例】
【００５１】
材料及び方法
細胞培養及び膜の調製
ＮＩＨ３Ｔ３マウス繊維芽細胞株を、１０％ウシ胎児血清、１００  Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００  μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培養培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ＵＳＡ）中、３７℃、５％ＣＯ２含有水飽和空気中で維持した。
【００５２】
当該細胞を９０〜１００％コンフルエントとなるまで単層で培養し、４〜５日置きに２０回未満継代した。
【００５３】
酵母培養及び膜の調製
サッカロマイケス・セレウィシアエのＫ６６９株（Ｍａｔａ，  ｕｒａ３，  及びｌｅｕ  ２−３）を、酢酸リチウム法を用いてプラスミドＹＥｐＰＭＡｈＰｔｃ−ＭＡＰ  （Ｊｏｕｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．．  ２００９，  ＢＢＡ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅ，  １７８８：  １８１３−１８２１；  ２０１０，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｍｕｓ−Ｖｅｔｅａｕ  （Ｅｄ．），  ６０１：  ８７−１０３）で形質転換し、最少培地及びロイシンを含有しないアミノ酸の混合物を含有する培養皿に播種した。
【００５４】
クローンを、６００ｎｍ（ＯＤ６００）で３に達するまで、２％のＤ−グルコースを添加した最少培地（ＭＭ）（０．６７％アミノ酸不含酵母窒素ベース、０．３  ｍＭアデニン、０．５  ｍＭウラシル、０．３  ｍＭチロシン及びロイシンを含有しないアミノ酸の混合物）中で、３０℃でプレカルチャーした。
【００５５】
このプレカルチャーをＯＤ６００が０．１〜０．２となるまで、２％Ｄ−グルコースを含有する富栄養培地（酵母抽出物、バクトペプトン、ペプチン）で希釈して、ＯＤ６００が５〜７になるまで１８℃、２００ｒｐｍで撹拌培養した。
【００５６】
膜の調製のために、全ての測定は、４℃で実施された。
【００５７】
酵母を冷水で洗浄し、５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ７．４）、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５  ｍＭ  ＥＤＴＡ、１  ｍＭ  ＰＭＳＦ及び４  ｍＭベンズアミジン中に再懸濁し、グラスビーズ（４２５〜６００  μｍ，  Ｓｉｇｍａ）を入れて１５分間ボルテックス撹拌により２回破壊した。
【００５８】
５分間２０００ｇで遠心分離して、破壊されなかった酵母及びガラスビーズを除去した。
【００５９】
取得された上澄を１時間１００，０００ｇで遠心分離して、膜を回収した。
【００６０】
当該ペレットを、ＥＤＴＡを含有しない同一の緩衝剤中で２回洗浄し、５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ７．４）、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１  ｍＭ  ＰＭＳＦ及び４  ｍＭベンズアミジンを含有する緩衝剤中に、５ｍｇ／ｍｇで再懸濁した。
【００６１】
ゲル電気泳動及びウエスタンブロット
試料中に含有されるタンパク質を、標準的な技術を使用して、８％ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル（８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による電気泳動で分離し、そしてニトロセルロースメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上に転写した。
【００６２】
当該ニトロセルロース麺部練を、まずブロッキング緩衝剤（２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ７．５），  ４５０  ｍＭ  ＮａＣｌ，  ０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０，  ４％スキムミルク）中、室温で１時間ブロッキングし、そしてウサギ抗ＰＣＴポリクローナル抗体（希釈１：１０００）（Ｊｏｕｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９）と接触させて４℃で一昼夜置いた。
【００６３】
当該ニトロセルロース膜を、前記ブロッキング緩衝剤中で２回洗浄した。
【００６４】
ホースラディッシュペルオキシダーゼを付加したヤギ抗ウサギ二次ポリクローナル抗体（希釈１：３０００）（Ｄａｋｏ）を、４℃で２時間適用した。反応の検出は、ウエスタンブロット用化学発光検出系のＥＣＬキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及びＦｕｓｉｏｎ  ＦＸ７（登録商標）（Ｖｉｌｂｅｒ−Ｌｏｕｒｍａｔ）を使用して実施された。
【００６５】
酵母のドキソルビシン耐性
ヒトＰａｔｃｈｅｄタンパク質を発現しない酵母（対照）Ｋ６９９及びヒトＰａｔｃｈｅｄタンパク質を発現する酵母を、通常の富栄養培地中で１８℃で培養し、これに培地１ｍｌあたり１０μｇのドキソルビシンを添加した。
【００６６】
培養期間中、６００ｎｍにおける酵母のＯＤが測定された。
【００６７】
ドキソルビシンの流出の測定
ＮＩＨ３Ｔ３細胞については、１０％ウシ胎児血清、１００  Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００  μｇ／ｍｌストレプトマイシンが添加されたＤＭＥＭ培養培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ＵＳＡ）を充填した２４ウェルプレートに播種され、５％ＣＯ２水飽和大気中、３７℃で維持された。８０％コンフルエントの時点で培地を除去し、１０μＭのドキソルビシンを含有する培地に置き換えた。そして細胞を、５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で２時間インキュベートした。そして細胞をＮａＣｌ緩衝剤（１４０  ｍＭ  ＮａＣｌ，  ５  ｍＭ  ＫＣｌ，  １  ｍＭ  ＣａＣｌ２，  １  ｍＭ  ＭｇＳＯ４，  ５  ｍＭ  グルコース，  ２０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，  ｐＨ  ７．４）で洗浄し、そして、３０、６０及び９０分間、３０ｎＭのＳｈｈの存在下、又は非存在下、２５０μＬのＮａＣｌ緩衝剤（１４０  ｍＭ  ＮａＣｌ，  ５  ｍＭ  ＫＣｌ，  １  ｍＭ  ＣａＣｌ２，  １  ｍＭ  ＭｇＳＯ４，  ５  ｍＭグルコース，  ２０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，  ｐＨ  ７．４）中でインキュベートした。
【００６８】
遠心分離（５分、６８００ｇ）で細胞の断片を全て除去した後、プレートリーダー（ＦＬＵＯｓｔａｒ，  Ｌａｂｔｅｃｈ）中の２００μＬの上澄において、ドキソルビシン蛍光の読み取り（λｅｘ＝４９０  ＋／−  １０  ｎｍ，  λｅｍ＝６１０  ＋／−  １０  ｎｍ）を実施した。
【００６９】
酵母においては、Ｋ６９９対照酵母及びＰａｔｃｈｅｄタンパク質を発現する酵母を、２％グルコース添加富栄養培地中で、ＯＤ６００が７になるまで培養した。
【００７０】
当該細胞を遠心分離し（５分、３０００ｇ）、水で４回洗浄し、そして最後に、５０  ｍＭ  ＮａＯＨ−Ｈｅｐｅｓ緩衝剤（ｐＨ７．０）中にＯＤ６００が１０となるように慎重に懸濁し、１０μＭドキソルビシン存在下で２時間インキュベートした。
【００７１】
洗浄後、当該酵母を、５０  ｍＭ  ＮａＯＨ−Ｈｅｐｅｓ緩衝剤（ｐＨ７．０）中に再懸濁した。
【００７２】
２０分後、酵母を遠心分離して、上澄中に含有されるドキソルビシンを、蛍光強度により測定した（λｅｘ＝４９０  ＋／−  １０  ｎｍ，  λｅｍ＝６１０  ＋／−  １０  ｎｍ）。
【００７３】
ゼノパス卵：卵の取得及び調製
卵は、倫理委員会に推奨される手順に従い、ＭＳ２２２（トリカイン  メタンスルホン酸）で麻酔した雌のゼノパス・ラエウィスから外科的に回収した。当該卵を、５０  Ｕ／ｍｌのペニシリン及び５０  μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加した、ｐＨ７．４のＭＢＳ生理食塩水溶液（ＮａＣｌ  ８５  ｍＭ，  ＫＣｌ  １ｍＭ，  ＮａＨＣＯ３  ２．４  ｍＭ，  ＭｇＳＯ４  ０．８２  ｍＭ，  Ｃａ（ＮＯ３）２  ０．３３  ｍＭ，  ＣａＣｌ２  ０．４１  ｍＭ，  ＨＥＰＥＳ  １０  ｍＭ，  ＮａＯＨ  ４．５  ｍＭ）で洗浄した。そして、当該卵を、１．８  ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ中で１９℃、１６時間、そしてカルシウムを含有しないＭＢＳ中で３０分間インキュベーションし、そしてＭＢＳ中に置いた。当該卵に、１個あたり１０又は２０ｎｇのヒトＰａｔｃｈｅｄタンパク質をコードするＲＮＡを注入した。当該卵を、ＭＢＳ中、１９℃で３日間インキュベーションした。１０個の対照卵（未注射）及びヒトＰａｔｃｈｅｄタンパク質をコードするＲＮＡを注入した卵を（４回試行）、１００μＭドキソルビシンの存在下、１６時間、１９℃でインキュベーションした。洗浄後、当該卵を、ＭＢＳ中に置いた。上澄を９０分後に採取し、当該試料中に存在するドキソルビシンを蛍光強度により測定した（λｅｘ＝４９０  ＋／−  １０  ｎｍ，  λｅｍ＝６１０  ＋／−  １０  ｎｍ）。
【００７４】
Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質へのドキソルビシンの結合
Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質へのドキソルビシンの結合は、Ｋ６９９対照酵母及びヒトＰａｔｃｈｅｄタンパク質を発現する酵母から取得した膜調製物のドキソルビシン蛍光を消光することにより示された。
【００７５】
５０ｎＭのドキソルビシンを３０μｇの膜に添加して、ドキソルビシン蛍光を、時間との関係で測定した。
【００７６】
実施例１：ヒトＰａｔｃｈｅｄタンパク質を発現する酵母は、発現しない酵母よりも、ドキソルビシンに対する耐性が強い（図１）。
【００７７】
通常の富栄養培地中で、Ｋ６９９対照酵母（黒色正方形）及びヒトＰａｔｃｈｅｄタンパク質を発現する酵母（黒色菱形）は、培養期間中、同程度の増殖を示した（１Ａ）。
【００７８】
ドキソルビシンの存在下、トＰａｔｃｈｅｄタンパク質を発現する酵母は、発現しない酵母よりも、ドキソルビシンに対して高い耐性を示した（１Ｂ）。
【００７９】
実施例２：酵母中で発現したヒトＰａｔｃｈｅｄタンパク質は、ドキソルビシンの流出を促進する（図２）。
【００８０】
酵母の膜上のヒトＰａｔｃｈｅｄタンパク質の存在は、ドキソルビシンの流出の増大を引き起こすことが観察された。
【００８１】
実施例３：内在的Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質は、マウス繊維芽細胞におけるドキソルビシンの流出を促進する（図３）。
【００８２】
Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質が内在系の中で同一の機能を有するか否かをチェックするため、ＮＩＨ３Ｔ３マウス繊維芽細胞を２４ウェルプレート中でコンフルエントとなるまで培養し、そしてドキソルビシンの存在下でインキュベーションした。
【００８３】
Ｓｈｈの存在は、ドキソルビシンの流出を、２０〜３０％まで阻害したことが観察された。細胞表面でＳｈｈはＰａｔｃｈｅｄタンパク質と相互作用して、その内面化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を引き起こす。
【００８４】
Ｓｈｈの存在下で観察されるドキソルビシンの流出の減少は、細胞表面からのＰａｔｃｈｅｄタンパク質の消失によると考えられる。
【００８５】
実施例４：ゼノパス卵中で発現するヒトＰａｔｃｈｅｄタンパク質は、ドキソルビシンの流出を促進する（図４）。
【００８６】
図４Ａは、１個あたり１０ｎｇ（トラック１）又は２０ｎｇ（トラック２）のヒトＰａｔｃｈｅｄタンパク質をコードするＲＮＡを注入した卵の膜の調製物について実施されたウエスタンブロットを示す。トラック３は、未注入卵対照の調製物に対応する。
【００８７】
ヒトＰａｔｃｈｅｄタンパク質が、卵の細胞質膜上に発現し、この発現量が、注入されたＲＮＡの量に比例することが観察された。
【００８８】
図４Ｂは、卵におけるドキソルビシンの流出の測定を示す。当該試験は、１０個の対照卵（未注入）及びヒトＰａｔｃｈｅｄタンパク質をコードするＲＮＡを注入した卵について実施され（４回試行）、４回試行の平均値を示す。
【００８９】
当該卵の細胞質膜上のヒトＰａｔｃｈｅｄタンパク質の存在は、細胞からのドキソルビシンの流出の増大を引き起こすことが観察された。
【００９０】
実施例５は、酵母において発現したヒトＰａｔｃｈｅｄタンパク質へのドキソルビシンンの結合を示す（図５）。
【００９１】
黒色菱形は、ヒトＰａｔｃｈｅｄタンパク質を発現しない対照酵母を示す。黒色正方形は、ヒトＰａｔｃｈｅｄタンパク質を発現する酵母（調製物１）を示す。×印は、は、ヒトＰａｔｃｈｅｄタンパク質を発現する酵母（調製物２）を示す。黒色三角形は、ヒトＰａｔｃｈｅｄタンパク質を発現する酵母（調製物３）を示す。
【００９２】
ヒトＰａｔｃｈｅｄタンパク質を含有する膜において、迅速かつ顕著なドキソルビシン蛍光の消光が観察され、これは、ヒトＰａｔｃｈｅｄタンパク質へのドキソルビシンの結合に対応する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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