(57)【要約】  方法およびキットは、アルブミン結合タンパク質／ペプチド複合体（ＡＢＰＰＣ）を含むバイオマーカーを使用することによる虚血の診断または予後診断を提供する。【選択図】図４
2013542453.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の虚血を診断する方法であって、
（ａ）前記対象から得られる生物学的試料中の、表２のリストから選択される、アルブミン結合タンパク質／ペプチド複合体（ＡＢＰＰＣ）を含む少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを決定すること、および
（ｂ）前記生物学的試料中の決定されたレベルを正常対象集団における対照レベルに対して定量し、対照レベルと比較したレベルの増加または減少が虚血を示すこと
を含む、方法。
【請求項２】
診断アッセイである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
予後診断またはモニタリングアッセイである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
虚血が、心筋虚血、臓器虚血、腎虚血および脳虚血からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＡＢＰＰＣが、アネキシンＡ２、プラコグロビンおよびセルピンＢ３からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記対象試料が、血液、血漿または体液に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記バイオマーカーが、質量分析法を使用して検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記バイオマーカーが、ＳＥＣ、ＨＰＬＣ、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル方法および／またはイムノアッセイを使用して検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記対象が哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象がヒトである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
診断または予後診断キットであって、
生物学的試料中のアルブミンを特異的に捕捉または富化する抗体または化学的部分；
表２のリストから選択されるアルブミンに結合した１つ以上の特定の修飾または非修飾タンパク質またはペプチドに対する二次抗体または化学的部分；および
結合した二次抗体の量の検出および／または定量のための少なくとも１つの成分
を含むキット。
【請求項１２】
複数の二次抗体を含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
表２のリストから選択されるタンパク質またはタンパク質断片に対する少なくとも１つの抗体；および
質量分析標識された内部タンパク質標準
を含む質量分析キット。
【発明の詳細な説明】
【政府の権利についての記述】
【０００１】
本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）によって与えられた、ＮＨＬＢＩのプロテオミクス助成の政府支援によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【関連出願への相互参照】
【０００２】
本出願は、２０１０年１１月１２日出願の米国仮出願番号６１／４１２，９３１に基づく優先権を主張し、その全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００３】
本発明は、独特のアルブミン結合タンパク質／ペプチド複合体（ＡＢＰＰＣ；ａｌｂｕｍｉｎ−ｂｏｕｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ）を含むバイオマーカーを使用した診断方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
血清アルブミンは、血清および血漿中で最も量の多いタンパク質であり、典型的には４５〜５０ｍｇ／ｍｌで存在する。アルブミンは、細胞内空間においてタンパク質、脂質および小分子に結合する「分子スポンジ」として機能し（Ｍｉｌｌｅａ，Ｋ．、Ｋｒｕｌｌ，Ｉ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ２００３、２６、２１９５〜２２２４；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎ．Ｌ．、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎ．Ｇ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００２、１、８４５〜８６７；Ｃａｒｔｅｒ，Ｄ．Ｃ．、Ｈｏ，Ｊ．Ｘ．Ａｄｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ  １９９４、４５、１５３〜２０３）、ペプチドホルモン、血清アミロイドＡ、インターフェロン、グルカゴン、ブラジキニン、インスリンおよび連鎖球菌のプロテインＧと会合を形成することが見出されているが（Ｐｅｔｅｒｓ，Ｔ．Ｊｒ．、Ａｌｌ  Ａｂｏｕｔ  Ａｌｂｕｍｉｎ；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９６；  Ｂａｃｚｙｎｓｋｙｊ，Ｌ．、Ｂｒｏｎｓｏｎ，Ｇ．Ｅ．、Ｋｕｂｉａｋ，Ｔ．Ｍ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  １９９４、８、２８０〜２８６；Ｃａｒｔｅｒ，Ｗ．Ａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １９８１、７８、５７６〜５８２；Ｓｊｏｂｒｉｎｇ，Ｕ．、Ｂｊｏｒｃｋ，Ｌ．、Ｋａｓｔｅｒｎ，Ｗ．ＪＢｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９１、２６６、３９９〜４０５）、結合パートナーの広範囲のリスト、およびこれらのパートナーが疾患によって変化するかどうかは調査されてこなかった。以前の研究では、変性条件下で高分子量種を除去したときに、低分子量種の高い回収率が示されており、アルブミンなどのより大きなタンパク質がペプチドと結合していることがさらに確認されている（Ｔｉｒｕｍａｌａｉ，Ｒ．Ｓ．、Ｃｈａｎ，Ｋ．Ｃ．、Ｐｒｉｅｔｏ，Ｄ．Ａ．、Ｉｓｓａｑ，Ｈ．Ｊ．、Ｃｏｎｒａｄｓ，Ｔ．Ｐ．、Ｖｅｅｎｓｔｒａ，Ｔ．Ｄ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００３、２、１０９６〜１１０３）。さらに、アルブミンは、血清中のパラオキシナーゼ１（Ｏｒｔｉｇｏｚａ−Ｆｅｒａｄｏ，Ｊ．、Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｒ．Ｊ．、Ｈｏｒｎｕｎｇ，Ｓ．Ｋ．、Ｍｏｔｕｌｓｋｙ，Ａ．Ｇ．、Ｆｕｒｌｏｎｇ，Ｃ．Ｅ．Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  １９８４、３６、２９５〜３０５）、α−１−酸性糖タンパク質（Ｋｒａｕｓｓ，Ｅ．、Ｐｏｌｎａｓｚｅｋ，Ｃ．Ｆ．、Ｓｃｈｅｅｌｅｒ，Ｄ．Ａ．、Ｈａｌｓａｌｌ，Ｈ．Ｂ．、Ｅｃｋｆｅｌｄｔ，Ｊ．Ｈ．、Ｈｏｌｔｚｍａｎ，Ｊ．Ｌ．ＪＰｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  １９８６、２３９、７５４〜７５９）、クラステリン（Ｋｅｌｓｏ，Ｇ．Ｊ．、Ｓｔｕａｒｔ，Ｗ．Ｄ．、Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｒ．Ｊ．、Ｆｕｒｌｏｎｇ，Ｃ．Ｅ．、Ｊｏｒｄａｎ−Ｓｔａｒｃｋ，Ｔ．Ｃ．、Ｈａｒｍｏｎｙ，Ｊ．Ａ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９４、３３、８３２〜８３９）（パラオキシナーゼ１を介した間接的相互作用）およびアポリポタンパク質Ｅなどの少数の特定のタンパク質に結合することが報告されている。血清中のアルブミン結合ペプチド（３０ｋＤａ未満）が研究されてきたが、その結合の程度は��在も不明である（Ｚｈｏｕ，Ｍ．、Ｌｕｃａｓ，Ｄ．Ａ．、Ｃｈａｎ，Ｋ．Ｃ．；  Ｉｓｓａｑ，Ｈ．Ｊ．、Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ，Ｅ．Ｆ．，３rd、Ｌｉｏｔｔａ，Ｌ．Ａ．、Ｖｅｅｎｓｔｒａ，Ｔ．Ｄ．、Ｃｏｎｒａｄｓ，Ｔ．Ｐ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２００４、２５、１２８９〜１２９８）。現在まで、虚血性疾患においてアルブミンに結合したタンパク質／ペプチドの包括的な研究は行われていない。
【０００５】
アルブミンは、その金属への結合を変更させる疾患によって変化することが見出されており、現在、虚血に対するバイオマーカーとして機能している。以前に心筋虚血に対するバイオマーカーとして特定されているアルブミンの修飾は、アルブミンのＮ末端Ｎ−アセチル化であり、これは、コバルトおよびニッケルに対してアルブミンの結合親和性を減少させる（Ｂａｒ−Ｏｒ，Ｄ．、Ｃｕｒｔｉｓ，Ｇ．、Ｒａｏ，Ｎ．、Ｂａｍｐｏｓ，Ｎ．、Ｌａｕ，Ｅ．ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ  ２００１、２６８、４２〜４７；  Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｎ．、Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｙ．、Ｐｕｔｎａｍ，Ｆ．Ｗ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １９８７、８４、７４０３〜７４０７；  Ｃｈａｎ，Ｂ．、Ｄｏｄｓｗｏｒｔｈ，Ｎ．、Ｗｏｏｄｒｏｗ，Ｊ．、Ｔｕｃｋｅｒ，Ａ．、Ｈａｒｒｉｓ，Ｒ．Ｅｕｒ  ＪＢｉｏｃｈｅｍ  １９９５、２２７、５２４〜５２８）。現時点での特許出願は（ＰＣＴ国際出願のＣｒｏｓｂｙ，Ｐ．Ａ．Ｍ．、Ｄｅｂｏｒａｈ  Ｌ：ＵＳＡ、２００２；  Ｂａｒ−ｏｒ，Ｄ．Ｌ．、Ｅｄｗａｒｄ；ＰＣＴ国際のＷｉｎｋｌｅｒ，Ｊａｍｅｓ  Ｖ  ：ＵＳ、２００４）、虚血のためのアルブミンのこのＮ末端修飾の使用法を開示しており、アルブミンコバルト結合のための臨床アッセイ（ＡＣＢアッセイ）につなげている。Ｎ末端修飾に加えて、アルブミンの酸化が酸化ストレスのマーカーとして提案されている（Ｍｅｒａ，Ｋ．、Ａｎｒａｋｕ，Ｍ．、Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｋ．、Ｎａｋａｊｏｕ，Ｋ．、Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｔ．、Ｔｏｍｉｔａ，Ｋ．、Ｏｔａｇｉｒｉ，Ｍ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ  Ｒｅｓ  ２００５、２８、９７３〜９８０）。腎障害および末期腎疾患の患者におけるアルブミンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型）は、疾患に伴ってアルブミンの分子量（ＭＷ）の増加を示す（Ｔｈｏｒｎａｌｌｅｙ，Ｐ．Ｊ．、Ａｒｇｉｒｏｖａ，Ｍ．、Ａｈｍｅｄ，Ｎ．、Ｍａｎｎ，Ｖ．Ｍ．、Ａｒｇｉｒｏｖ，Ｏ．、Ｄａｗｎａｙ，Ａ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ２０００、５８、２２２８〜２２３４）。最後に、アルブミンの脂肪酸輸送機能は、アテローム性動脈硬化症および糖尿病において修飾される（Ｍｕｒａｖｓｋａｙａ，Ｅ．Ｖ．、Ｌａｐｋｏ，Ａ．Ｇ．、Ｍｕｒａｖｓｋｉｉ，Ｖ．Ａ．Ｂｕｌｌ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  ２００３、１３５、４３３〜４３５）。糖尿病患者において、アルブミンの脂肪酸に対する結合能力は増加しており、アテローム性動脈硬化症患者においてこの能力は減少している。結論として、アルブミンが疾患に伴って変化しているという証拠は明らかである。虚血性疾患におけるアルブミンと特定のタンパク質／ペプチド複合体（ＡＢＰＰＣ）との結合の変更は特定されていない。虚血性疾患におけるそのような新規なＡＢＰＰＣ複合体の特定は、虚血性疾患を診断する方法のための新たなバイオマーカーをもたらすであろう。
【０００６】
虚血性イベントにおける血清、血漿または他の体液中のアルブミンに対するタンパク質および／またはペプチドの結合の変更は、虚血性疾患を診断するために使用されていない。この取り組みは、虚血患者において質量範囲を排除することなく、インタクトなタンパク質、分解されたタンパク質およびペプチドの分析を含むという理由から独特なものである。さらにこの取り組みは、虚血性疾患状態における、アルブミンに結合するタンパク質およびペプチドの変化に焦点を当てる。
【発明の概要】
【０００７】
虚血が疑われる対象における特定のアルブミン結合タンパク質／ペプチド複合体（ＡＢＰＰＣ）のレベルを決定すること、および正常対象集団の対照レベルに対して決定されたレベルを定量することを含む、虚血を診断する方法が提供される。特定のＡＢＰＰＣのレベルの変動、およびＡＢＰＰＣのプロファイルの変動は虚血を示すことが見出された。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】表に列挙された分子量および保持時間（分）を有する標準タンパク質についてのサイズ排除クロマトグラム。赤色のトレースは、ベースラインで対照患者から採取されたアルブミノーム（ａｌｂｕｍｉｎｏｍｅ）試料のものである。
【図２】ＰＴＣＡを受けた患者についてのＡＢＰＰＣのサイズ排除クロマトグラム。
【図３Ａ】対照および罹患患者から採取されたアルブミノームのＳＥＣ画分についての一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図３Ｂ】対照および罹患患者から採取されたアルブミノームのＳＥＣ画分についての一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図３Ｃ】対照および罹患患者から採取されたアルブミノームのＳＥＣ画分についての一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図３Ｄ】対照および罹患患者から採取されたアルブミノームのＳＥＣ画分についての一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図４】Ａ）時点１、ベースラインでの対照および罹患群におけるタンパク質のｌｏｇ１０スペクトルカウントの比較。Ｂ）時点８、ＰＴＣＡ後２４時間での対照および罹患群におけるタンパク質のｌｏｇ１０スペクトルカウントの比較。分析はＳｔａｔａソフトウェアを使用して行った。
【発明の詳細な説明】
【０００９】
本発明者らは、健康な個体および罹患した個体におけるアルブミン結合タンパク質を決定するために、ヒト血清のアルブミンを富化した画分を試験した。
【００１０】
したがって、心筋虚血を有すると疑われる対象における特定のアルブミン結合タンパク質／ペプチド複合体（ＡＢＰＰＣ）のレベルを決定すること、および決定されたレベルを正常対象集団の対照レベルに対して定量することを含む、虚血を診断する方法が提供される。特定のＡＢＰＰＣのレベルの変動、およびＡＢＰＰＣプロファイルの変動は虚血を示すことが見出された。
【００１１】
目的は、虚血患者および健康な受診者におけるアルブミンへ示差的に結合するタンパク質／タンパク質断片／ペプチドを、現在の血液採取プロトコールに適合した、費用対効果の高い迅速かつ高感度な方法で特徴付けることである。本発明者らはいかなる特定の仮説にも拘束されないが、これは、アルブミンが疾患に伴って変化し、その結果、アルブミンとその結合タンパク質およびペプチドとの複合体が変化するという仮説に基づく。ＡＢＰＰＣアッセイは、アルブミンの修飾またはＡＢＰＰＣ組成の変化（すなわち１以上のタンパク質の存在または非存在）、１以上のタンパク質の変更した濃度（または化学量論比もしくはモル比）、タンパク質のＰＴＭ（翻訳後修飾）の変化（たとえば、タンパク質分解断片対アルブミンを含むインタクトなタンパク質）を測定することができる。翻訳後修飾は、酸化、シトルリン化、リン酸化およびグリコシル化を含み得る。
【００１２】
ＡＢＰＰＣは、心筋虚血（細胞壊死前）および心筋梗塞の患者において変更し、ＡＢＰＰＣは、血管炎患者および虚血、心筋梗塞患者および健康な個体において異なることが発見された。しかし、関与する実際のタンパク質およびペプチドは、以前には特定されていない。実際のタンパク質およびペプチドの特定は、特定のタンパク質／ペプチドを考慮してアルブミン結合タンパク質／ペプチド複合体についてアッセイすることによって、虚血の診断を改善するであろう。虚血診断の分野における進歩はこの点にある。
【００１３】
本発明者らは、安定した狭心症の患者（ＳＡ、対照群）および血管形成を受けた（ある程度の心筋虚血を含む）心筋壊死または心筋梗塞の患者（ＭＩ、罹患群、細胞壊死および血液中のｃＴｎＩまたはｃＴｎＴの検出に基づく）から得たＡＢＰＰＣを分析した。ＡＢＰＰＣタンパク質は、質量分析法を使用して定量した。全スペクトルカウントが決定され、ＳＡ患者とＭＩ患者との間で比較された。ある特定のタンパク質またはペプチドは、ＳＡ患者と比較してＭＩ患者において増加または減少し、これらのタンパク質は、ＡＢＰＰＣを変化させる虚血性ならびに非虚血性疾患のための潜在的なバイオマーカーである。結果は表１に示される。
【表１−１】
2013542453.tif 000003
【表１−２】
2013542453.tif 000004
【表１−３】
2013542453.tif 000005
【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
2013542453.tif 000008
【００１４】
虚血群において、増加または減少した特定のタンパク質／ペプチドを表２に示す。
【表２−１】
2013542453.tif 000009
【表２−２】
2013542453.tif 000010
【表２−３】
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【表２−４】
2013542453.tif 000012
【表２−５】
2013542453.tif 000013
【表２−６】
2013542453.tif 000014
【００１５】
ここに開示された方法は、単独で、または他の診断試験と組み合わせて使用して、診断の精度と特異性を向上させることができる。これらは、ｃＴｎＩ、ｃＴｎＴ、ミオグロビン、ＣＫＭＢのような一般的に用いられている心筋損傷バイオマーカーを含む。方法はまた、スクリーニング目的で使用して、この手段または他の手段によるさらなる試験のための「リスクがある」と思われる個体を特定することもできる。
【００１６】
したがって、一形態において、方法は、（ａ）前記対象から得られる生物学的試料中の、表２において特定されているタンパク質またはペプチドを含む少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを決定すること、および（ｂ）ある特定のタンパク質またはペプチドの対照レベルと比較したバイオマーカーのレベルの上昇または減少が、疾患または障害を示すことを含む。一態様において、疾患は虚血である。他の態様において、疾患は心筋虚血である。他の態様において、疾患は腎虚血である。他の態様において、疾患は骨格筋虚血である。他の態様において、疾患は脳虚血である。他の態様において、疾患は臓器虚血である。
【００１７】
他の形態において、方法は、表２のタンパク質／ペプチドを含む少なくとも１つのバイオマーカーの存在について対象試料をアッセイすることを含み；前記バイオマーカーの検出は疾患または障害の診断と相関しており、相関は、正常対象と比較した対象試料中のバイオマーカーの存在およびレベルを考慮している。
【００１８】
バイオマーカーは、当業者に知られている任意の適した手段によって、たとえば、タンパク質またはペプチドアッセイ、結合アッセイまたはイムノアッセイを使用して検出することができる。バイオマーカーはまた、任意選択でＡＢＢＰＣの単離後の試料の適切な初期の処理の後に、質量分析（ＭＳ）を使用してインタクトなまたは消化されたペプチドのピークとして、または、たとえばサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用してゲルバンドとして、特定することができる。陽性診断では、バイオマーカーは、健康な対照の値と比較して上昇または減少し、または経時的な同じ個体における変化を使用することができる。多重反応モニタリング（ＭＲＭ）は、他の態様において有用な、選択されたイオンのモニタリングを可能とする質量分析技術である。この技術を使うことにより、非常に特異的な化学的または生物学的な種をモニタリングすることができ、絶対的な定量値を得ることができる。たとえば、あるタンパク質の濃度を、そのタンパク質に独特の１以上のペプチドのモニタリングにより決定することができる。
【００１９】
対象試料は、たとえば、血液、血漿、血清または他の体液からなる群から選択することができる。好ましくは、試料は、アルブミンが富化された血清または血漿である。
【００２０】
この診断アッセイは、たとえば、緊急処置室に居る患者を評価するため、または病院内での長期継続ケアのため、または開業医の診察室において、または緊急移送（たとえば救急車）において、手術または治療上の処置の間またはその後（たとえば、血管形成または血栓溶解処置の間またはその後）に使用することができる。アッセイは、アルブミンが血清中に非常に豊富であるため（４０〜５０ｍｇ／ｍｌ）、個体から容易かつ再現可能に得ることができるという利点を有する。アルブミンに対する特異的抗体が利用可能であり、ＡＢＰＰＣは複雑なアッセイの必要なく、容易に富化または捕捉される。液体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーおよびゲルに基づく方法を含む他の生化学的方法も同様に使用することができる。この天然に存在するサブプロテオームの捕捉は、試料の複雑性を低減させ、低いタンパク質濃度でのアッセイ感度に付随する問題を回避する。ＡＢＰＰＣ中のいくつかのタンパク質は、アルブミンを枯渇させた血清中では観察されていないので、いくつかのバイオマーカーは、ＡＢＰＰＣに独特であるようである。
【００２１】
本明細書に記載されている方法を実施するためのキットも提供される。一態様において、キットは、以下のいずれかを含んでよい：内因性のアルブミンを特異的に捕捉または富化するための抗体（または化学的成分）、アルブミンに結合した１以上の特定のタンパク質（またはペプチドもしくは修飾タンパク質）に対する二次抗体（または化学的成分）、および結合している二次抗体の量の検出および／または定量のための成分。一態様において、二次抗体は、虚血において特定のタンパク質と共に変化することによってＡＢＰＰＣのタンパク質含有量の変化を定量する、表１または表２に列挙されたタンパク質（複数可）に対するものであり得る。
【００２２】
ある態様において、内因性のＡＢＰＰＣは（抗体または化学的部分により）捕捉され、続いて、インタクトなまたは酵素分解されたタンパク質の質量分析（ＭＳ）を使用して、目的のタンパク質を直接検出する。この態様において、キットは、ＡＢＰＰＣが、インタクトな質量についてはＭＳ中への溶出後に富化され、または消化およびその後の（分析物についてのすべてのペプチドまたは特定の特徴的ペプチドの）ＭＳ分析については溶出されるであろうマトリックスにカップリングした抗アルブミン抗体（たとえば、小型カラム中のまたはピペットチップの先端に充填された）を含有してもよい。キットは、標識された内部タンパク質標準をさらに含んでいてもよい。本発明のキットは、複数のＡＢＰＰＣ成分が同時に評価できるように、複数の抗体を含有してもよい。
【００２３】
結合しているＡＢＰＰＣと遊離している（循環している）ＡＢＰＰＣとの比も重要であり得ると考えられる。方法およびキットは、特定のタンパク質が、血清アルブミンに結合しているか遊離していると測定されるように修飾されてもよい。たとえば、いくつかのタンパク質は、ともにアルブミンに結合していることが観察されたが、血清のアルブミン枯渇画分においても観察され、遊離形態で存在し得ることを示している。これらのタンパク質の例は、アンチトロンビンＩＩＩ、アポリポタンパク質、ＡＩＩ、ＡＩＶ、ＣＩＩ、クラステリン、トランスサイレチンおよびビタミンＤ結合タンパク質を含む。実践者は、常法通りの実験により、特定の疾患状態においてその比がどのように変更するのかを決定することができる。
【００２４】
本発明の方法および組成物が有用であることが予期される疾患または障害は、虚血を含む。心筋虚血、臓器虚血、腎虚血および脳虚血を含む、異なる形態の虚血が検出可能であってよい。
【００２５】
定義
以下の用語は、ほかに示されていない限り、この出願において、以下に定義されるように用いられる。
【００２６】
「マーカー」または「バイオマーカー」は、本明細書において互換的に使用され、本発明との関連において、対照値と比較して特定の疾患または障害を有する患者から採取される試料中に示差的に存在する、（特に特定の同一性または見かけの分子量の）ＡＢＰＰＣを指し、対照値は、たとえば、対照対象（たとえば、陰性診断を有する人、正常なまたは健康な対象）から採取される、比較可能な試料における平均または算術平均値からなる。バイオマーカーは、アルブミンと現在結合しているまたはそれから切断された特定のペプチドまたはタンパク質（表１または表２）として、または質量分析、サイズ排除クロマトグラフィー、もしくは他の分離プロセスまたは抗体検出における特定のピーク、バンド、画分などとして決定されてもよい。いくつかの適用において、たとえば、質量分析もしくは他のプロファイルまたは複数の抗体を使用して、複数のバイオマーカーを決定してもよく、個々のバイオマーカー間の差異および／または部分的なもしくは完全なプロファイルを、診断のために使用してもよい。
【００２７】
「示差的に存在する（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｐｒｅｓｅｎｔ）」という句は、対照対象と比較した特定の疾患または障害を有する患者から採取した試料中に存在するマーカーの量および／または頻度の差異を指す。たとえば、マーカーは、疾患または障害を有する患者の試料中の、対照値（たとえば、対照対象の試料により決定された値）と比較して上昇したレベルまたは減少したレベルで存在するＡＢＰＰＣとすることができる。代替として、マーカーは、対照対象の試料と比較して、患者の試料中に高頻度または低頻度で検出されるＡＢＰＰＣとすることができる。マーカーは、量、頻度またはその両方の観点から示差的に存在していればよい。マーカーは、単なる存在／検出量の増減ではなく、マーカーであるタンパク質の物理的な変化／修飾であってもよい。たとえば、それは、変化しているタンパク質の翻訳後修飾、切断、またはアイソフォームであってよく、アッセイによって検出されるのはこの変化である。これは、疾患対対照の異なる量の決定とは区別される。
【００２８】
試料中のマーカー、化合物、組成物または物質の量が、他の試料におけるマーカー、化合物、組成物または物質の量と、または対照値と統計的に有意に異なる場合、試料中のマーカー、化合物、組成物または物質は、試料中に示差的に存在している。たとえば、化合物は、それが、他の試料（たとえば対照）中に存在するよりも少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約５００％、少なくとも約７００％、少なくとも約９００％、または少なくとも約１０００％多くまたは少なく存在している場合、または、１つの試料においては検出できるが他の試料では検出できないという場合、示差的に存在している。
【００２９】
代替としてまたはさらに、マーカー、化合物、組成物または物質は、たとえば特定の疾患または障害を有する患者の試料におけるマーカー等の検出の頻度が、健康な個体から得られる対照試料または対照値よりも統計的に有意に高いまたは低い場合、試料間で示差的に存在している。たとえば、バイオマーカーは、一方の試料が他の試料よりも少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約５００％、少なくとも約７００％、少なくとも約９００％、または少なくとも約１０００％高頻度または低頻度で観察される場合、２セットの試料間で示差的に存在している。これらの例示的な値にもかかわらず、当業者は、マーカーが示差的に存在しているか否かを決定する統計的に有意な差異を現すカットオフポイント等を決定できることが予期される。
【００３０】
「診断的」とは、病的状態の存在または性質を特定することを意味し、特定の疾患または障害を発症するリスクのある患者を特定することを含む。診断方法は、その感度および特異性において異なる。診断アッセイの「感度」とは、試験で陽性となった者のうちの患者のパーセントである（「真陽性」のパーセント）。アッセイによって検出されない罹患個体は、「偽陰性」である。罹患しておらずアッセイにおいて陰性である対象は、「真陰性」と呼ばれる。診断アッセイの「特異性」は、１−偽陽性率であり、「偽陽性」率は、試験で陽性であり疾患を有さない対象の比率と定義される。特定の診断方法は、状態の確定診断を提供しないが、方法が診断に役立つ陽性を示すものであれば十分である。
【００３１】
「検出」、「検出する」等の用語は、バイオマーカーの検出、または疾患または障害の検出（たとえば、陽性のアッセイ結果が得られたとき）との関連において使用されてよい。後者の関連では、「検出」および「診断」は同義語とみなされる。
【００３２】
「のリスクがある」は、正常な対象と比較してまたは対照群、たとえば患者集団と比較して増加したリスクがあることを意味することが意図されている。したがって、特定のマーカーを保有する対象は、特定の疾患または障害について増加したリスクを有してもよく、さらなる試験を必要とすると特定されてもよい。「増加したリスク」または「上昇したリスク」は、たとえばその対象がその障害を有するという、確率の統計学的に有意な増加を意味する。リスクは、好ましくは、比較している対照群に対して少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％増加する。
【００３３】
マーカーの「試験量」は、試験されている試料中に存在するマーカーの量を指す。試験量は、絶対的な量（たとえば、μｇ／ｍｌ）または相対的な量（たとえば、シグナルの相対強度）のいずれかとすることができる。
【００３４】
マーカーの「診断量」とは、特定の疾患または障害の診断と一致する対象の試料中のマーカーの量を指す。診断量は、絶対量（たとえば、μｇ／ｍｌ）または相対量（たとえば、シグナルの相対強度）のいずれかとすることができる。
【００３５】
マーカーの「対照量」は、マーカーの試験量に対して比較される任意の量または量の範囲とすることができる。たとえば、マーカーの対照量は、診断される疾患または障害に罹患していない人におけるマーカーの量とすることができる。対照量は、絶対量（たとえば、μｇ／ｍｌ）または相対量（たとえば、シグナルの相対強度）のいずれかとすることができる。
【００３６】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書において互換的に使用されて、α−アミノ酸残基の、特に天然に存在するα−アミノ酸のポリマーを指す。この用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーと同様に、１以上のアミノ酸残基が、天然に存在するアミノ酸に対応する類似体または模倣物であるアミノ酸ポリマーにも適用される。ポリペプチドは、たとえば、炭水化物残基の付加による糖タンパク質の形成、リンタンパク質を形成するリン酸化、および多くの化学的修飾（たとえば、酸化、脱アミド、アミド化、メチル化、ホルミル化、ヒドロキシメチル化、グアニジン化）により修飾されていても、ならびに分解、還元、架橋されていてもよい。「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、タンパク質のすべての非修飾および修飾形態を含む。
【００３７】
「検出可能な部分」または「標識」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段により検出可能な組成物を指す。たとえば、有用な標識は、32Ｐ、35Ｓ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（たとえば、ＥＬＩＳＡで一般的に使用されるような）、ビオチン−ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、ハプテンおよび抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能なタンパク質、または標的に相補的な配列を有する核酸分子である。検出可能な部分は、しばしば、試料における結合している検出可能な部分の量を定量するために使用することができる、測定可能なシグナル、たとえば放射線、色素、または蛍光シグナルなどを発生する。シグナルの定量は、たとえば、シンチレーション計数、デンシトメトリー、フローサイトメトリー、またはインタクトなもしくはその後消化されたペプチド（１つ以上のペプチドを評価することができる）の質量分析による直接分析によって達成される。
【００３８】
「抗体」とは、エピトープ（たとえば抗原）に特異的に結合および認識する１つもしくは複数の免疫グロブリン遺伝子、またはそれらの断片により実質的にコードされるポリペプチドリガンドを指す。認識された免疫グロブリン遺伝子は、κおよびλ軽鎖の定常領域遺伝子、α、γ、δ、υおよびμ重鎖定常領域遺伝子、および無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。抗体は、たとえば、インタクトな免疫グロブリンまたは種々のペプチダーゼによる消化により生成される多くのよく特徴付けられたその断片として存在する。これは、たとえば、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ）’２断片を含む。「抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、抗体全体の修飾、または組み換えＤＮＡ手法を使用してデノボ合成されたもののいずれかによって生成された抗体断片も含む。それはまた、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体または一本鎖抗体も含む。抗体の「Ｆｃ」部分は、１以上の重鎖定常領域ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含むが、重鎖可変領域を含まない、免疫グロブリン重鎖の部分を指す。
【００３９】
「結合アッセイ」は、バイオマーカーが、作用物質、たとえば抗体などへの結合によって検出され、それにより検出プロセスが実施される生化学的アッセイを意味する。検出プロセスは、放射性または蛍光標識などを含んでもよい。アッセイは、バイオマーカーの固定を含んでもよく、溶液中で行われてもよい。
【００４０】
「イムノアッセイ」は、抗原（たとえば、マーカー）に特異的に結合する抗体を使用するアッセイである。イムノアッセイは、抗原を単離、補足および／または定量するために、特定の抗体の特異的結合特性を利用することによって特徴付けられる。
【００４１】
タンパク質またはペプチドを指すときの、抗体「に特異的に（または選択的に）結合する」またはそれ「と特異的に（または選択的に）免疫反応性の」という句は、タンパク質および他の生物製剤の不均一な集団におけるタンパク質の存在を決定する結合反応を指す。したがって、指定されたイムノアッセイ条件下で、指定の抗体は特定のタンパク質にバックグラウンドで少なくとも２回結合し、試料中に存在する他のタンパク質には有意な量では実質的に結合しない。そのような条件下での抗体への特異的な結合は、特定のタンパク質ついてのその特異性のために選択される抗体を必要としてもよい。種々のイムノアッセイフォーマットが、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選択するために使用されてもよい。たとえば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選択するために常法として使用されている（たとえば、特定の免疫反応性を決定するために使用することができるイムノアッセイフォーマットおよび条件の説明については、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８）を参照されたい）。
【００４２】
「対象」、「患者」または「個体」という用語は一般にヒトを指すが、本発明の方法はヒトに限定されず、アルブミンは種間で相同であるため、他の動物（たとえば、鳥類、爬虫類、両生類、哺乳類）において、特に哺乳動物において有用であるべきである。
【００４３】
「試料」は、その最も広い意味で、本明細書において使用される。試料は、血液、血清、血漿、涙液、房水および硝子体液、髄液を含む体液；細胞もしくは組織調製物の可溶性画分、または細胞を増殖させた培地；細胞小器官、または細胞もしくは組織から単離もしくは抽出された膜；溶液中のまたは基板に結合しているポリペプチド、またはペプチド；細胞；組織；組織プリント；フィンガープリント、皮膚または毛髪；その断片および誘導体を含んでいてもよい。対象試料は通常、血液、血漿および血清を含む血液製剤の誘導体を含む。
【００４４】
「アルブミン富化された血清または血漿」は、処理されて、アルブミン以外の成分ならびにそれに結合している関連ペプチドおよびタンパク質を低減または除去された血清または血漿を意味する。
【実施例】
【００４５】
血清または血漿からアルブミンを単離するための利用可能な２つの主な方法：親和性ベースの（たとえば、抗体、Ｃｉｂａｃｒｏｎブルー）および化学物質ベースの方法（たとえば、ＮａＣｌ／ＥｔＯＨ（Ｆｕ，Ｑ．、Ｇａｒｎｈａｍ，Ｃ．Ｐ．、Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｓ．Ｔ．、Ｂｏｖｅｎｋａｍｐ，Ｄ．Ｅ．ら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００５、５、２６５６〜２６６４．Ｃｏｌａｎｔｏｎｉｏ，Ｄ．Ａ．、Ｄｕｎｋｉｎｓｏｎ，Ｃ．、Ｂｏｖｅｎｋａｍｐ，Ｄ．Ｅ．、Ｖａｎ  Ｅｙｋ，Ｊ．Ｅ．、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００５、５、３８３１〜３８３５．）ＴＣＡ／アセトン（Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｙ．、Ｌｉｎ，Ｓ．Ｙ．、Ｙｅｈ，Ｙ．Ｙ．、Ｈｓｉａｏ，Ｈ．Ｈ．ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２００５、２６、２１１７〜２１２７））がある。親和性ベースの方法の多くが比較されており、アルブミンを効率的に除去することが示されている（Ｚｏｌｏｔａｒｊｏｖａ，Ｎ．、Ｍａｒｔｏｓｅｌｌａ，Ｊ．、Ｎｉｃｏｌ，Ｇ．、Ｂａｉｌｅｙ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００５、５、３３０４〜３３１３；Ｂｊｏｒｈａｌｌ，Ｋ．、Ｍｉｌｉｏｔｉｓ，Ｔ．、Ｄａｖｉｄｓｓｏｎ，Ｐ．、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００５、５、３０７〜３１７；Ｃｈｒｏｍｙ，Ｂ．Ａ．、Ｇｏｎｚａｌｅｓ，Ａ．Ｄ．、Ｐｅｒｋｉｎｓ，Ｊ．、Ｃｈｏｉ，Ｍ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．２００４、３、１１２０〜１１２７）。しかしながら、これらの方法は、ＬＣカラムの場合、タンパク質／ペプチドのリガンドおよびカラム材料に対する非特異的結合ならびに実験間のキャリーオーバーに対して弱い（Ｚｏｌｏｔａｒｊｏｖａ，Ｎ．、Ｍａｒｔｏｓｅｌｌａ，Ｊ．、Ｎｉｃｏｌ，Ｇ．、Ｂａｉｌｅｙ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００５、５、３３０４〜３３１３；Ｃｏｌａｎｔｏｎｉｏ，Ｄ．Ａ．、Ｄｕｎｋｉｎｓｏｎ，Ｃ．、Ｂｏｖｅｎｋａｍｐ，Ｄ．Ｅ．、Ｖａｎ  Ｅｙｋ，Ｊ．Ｅ．、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００５、５、３８３１〜３８３５；Ｂｊｏｒｈａｌｌ，Ｋ．、Ｍｉｌｉｏｔｉｓ，Ｔ．、Ｄａｖｉｄｓｓｏｎ，Ｐ．、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００５、５、３０７〜３１７；Ｃｈｒｏｍｙ，Ｂ．Ａ．、Ｇｏｎｚａｌｅｓ，Ａ．Ｄ．、Ｐｅｒｋｉｎｓ，Ｊ．、Ｃｈｏｉ，Ｍ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．２００４、３、１１２０〜１１２７；Ｓｔｅｅｌ，Ｌ．Ｆ．、Ｔｒｏｔｔｅｒ，Ｍ．Ｇ．、Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｐ．Ｂ．、Ｍａｔｔｕ，Ｔ．Ｓ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００３、２、２６２〜２７０；Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｂ．Ａ．、Ｇｕｎｄｒｙ，Ｒ．Ｌ．、Ｃｏｔｔｅｒ，Ｒ．Ｊ．、Ｖａｎ  Ｅｙｋ，Ｊ．Ｅ．、Ｄｉｓ．Ｍａｒｋｅｒｓ  ２００４、２０、１６７〜１７８）。代替として、アルブミンは、１９４０年代からＮａＣｌ／ＥｔＯＨ沈殿を使用して精製されており（Ｃｏｈｎ，Ｅ．Ｊ．、Ｓｔｒｏｎｇ，Ｌ．Ｅ．、Ｈｕｇｈｅｓ，Ｗ．Ｌ．、Ｍｕｌｆｏｒｄ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９４６，６８，４５９〜４７５）、この方法は、医薬品グレードのアルブミンを単離するために常法として使用されている。最近、このプロセスが、アルブミンの効率的な精製および除去のために必要とされるステップを最小化するために、プロテオミクス分野で最適化されたが（Ｆｕ，Ｑ．、Ｇａｒｎｈａｍ，Ｃ．Ｐ．、Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｓ．Ｔ．、Ｂｏｖｅｎｋａｍｐ，Ｄ．Ｅ．ら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００５、５、２６５６〜２６６４）、他のタンパク質の同時精製は依然として問題になり得る。
【００４６】
例１
コホート：ヒト血清を、待機的な血管形成術（ＰＴＣＡ）を受けている患者から得た。血清を、手順の全体にわたって様々な時点で大腿動脈から取り出した。患者試料を、心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）の非存在または存在にそれぞれ基づいて非罹患（対照）または罹患（心筋梗塞、ＭＩ）に分類した。分析のために、各群から３つの時点、Ｔ０−ベースライン、Ｔ７−ＰＴＣＡ後１時間、およびＴ８−ＰＴＣＡ後２４時間を選んだ。
【００４７】
材料：すべての試薬および溶媒は、利用可能な最高グレードであった。サイズ排除標準はすべて、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、少なくとも９０％純粋であった。
【００４８】
サイズ排除クロマトグラフィー：ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を、ＮａＣｌ／ＥｔＯＨ溶媒系を使用して非ＨＳＡ関連タンパク質を沈殿させ、ＨＳＡおよびその関連タンパク質／ペプチドは上清中にとどまる化学的枯渇によって、血清試料から除去した。次いでＨＳＡを含有する上清を、ＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ−Ｓ２０００  ３００×７．８ｍｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ、米国）を使用してＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ  ＰＦ２Ｄ  ＨＰＬＣシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ、米国）において実施される非変性サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供した。移動相は、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８であり、これをアイソクラティックで０．２５ｍＬ／ｍｉｎの流速で流した。各試料について、２００μｇの全タンパク質をＳＥＣカラム上に２回ロードし、両方のランの画分を合わせた。画分を０．５分毎に回収し、関連タンパク質／ペプチドが結合しているＨＳＡを含有する画分を集め、１０分間にわたって２分間の画分プールずつ一緒にプールした（画分はＡ→Ｅとラベルした）。次いで画分ＡおよびＢを合わせて画分ＡＢとし、これにより、各試料について４つの全プールＳＥＣ画分が存在した。各プールした画分（ＡＢ、Ｃ、ＤおよびＥ）についての全タンパク質濃度を、製造業者のプロトコールに従ってマイクロＢＣＡアッセイキット（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）を使用して決定した。６つの分子量標準もまた、同じ実験条件を使用して流した（アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来β−ガラクトシダーゼ１１６．３ｋＤａ、ヒト血清アルブミン６７ｋＤａ、ニワトリのオボアルブミン４５ｋＤａ、ウシ赤血球由来炭酸脱水酵素３０ｋＤａ、ウマ心臓由来ミオグロビン１６．７ｋＤａおよびウシ酸化インスリンβ−鎖３．５ｋＤａ）。
【００４９】
１−Ｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびトリプシン消化：次いで、各画分プールの３７５ナノグラムの全タンパク質を凍結乾燥し、タンパク質を、２０ｍＭ  ＤＴＴ：４×Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎローディング緩衝液の３：１混合物中に再懸濁した。次いで試料を９５℃で５分間沸騰させ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上にロードした。ゲルを、１×ＭＥＳランニング緩衝液中で、１４０Ｖで２０分間、次いで２００Ｖで追跡色素がゲルの底部に到達するまで流した。Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏらのプロトコールに従ってゲルを銀染色した（ＳｈｅｖｃｈｅｎｋｏらＡｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９６、６８：８５０〜８５８）。アルブミンおよびアルブミン二量体に対応するバンドをゲルから切り取り、廃棄した。次いで、各レーンの残っているゲルを２．０ｍＬエッペンドルフチューブ中に入れ、トリプシンで消化した。
【００５０】
質量分析：各プールした画分について、製造業者のプロトコールに従ってＯｍｉｘ  Ｃ１８ＺｉｐＴｉｐｓ（Ｖａｒｉａｎ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、米国）を使用してペプチド溶液を脱塩し、３０μｌの７０％アセトニトリル（ＭｅＣＮ）、０．１％ギ酸（ＦＡ）で溶出した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の前に、２マイクロリットルの画分ＡＢおよびＣを合わせ、２μｌの画分ＤおよびＥを合わせた。各組合せの２つのテクニカルレプリケートを、ナノエレクトロスプレーイオン源を備えたＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）に接続されたＡｇｉｌｅｎｔ１２００ナノ−ＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、米国）において分析した。ペプチドを、移動相Ａが水中０．１％ｖ／ｖギ酸であり、移動相Ｂが水中９０％アセトニトリル、０．１％ギ酸であるＣ１８ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（５μｍ、２００Å  Ｍａｇｉｃ  Ｃ１８を自己充填した７５μｍ×１０ｃｍ；Ｍｉｃｈｒｏｍ  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ、米国）において、３００ｎｌ／ｍｉｎの流速で分離した。直線勾配は、４０分間で１０〜４５％のＢとした。各ＭＳ１スキャンの後に、７つの最も豊富なプレカーサーイオンの衝突誘起解離（ＣＩＤ、ＬＴＱ部分において取得した）を２４秒間の動的排除で行った。ＭＳ１シグナルが１０００カウントを超える場合のみ、ＭＳ２スキャンを開始した。ＭＳ１では、５００ｍｓの最大時間にわたって２×１０５イオンをＯｒｂｉｔｒａｐ中に蓄積し、６０，０００ＦＷＨＭ（３７５〜２０００ｍ／ｚ）の分解能でスキャンした。ＭＳ２スペクトル（衝突誘起解離（ＣＩＤ）を介した）を、ＬＴＱにおいて通常のスキャンモードで、１０４イオンの標的設定および３０ｍｓの蓄積時間で取得した。正規化された衝突エネルギーは、３５％に設定し、各スペクトルについて１つのマイクロスキャンを取得した。ヒト血清アルブミンおよびウシ膵臓トリプシンペプチドに対応する１３４ｍ／ｚ値の排除リストを以前のＭＳランに基づいて作成し、これによりこれらの値がＭＳ２分析のために選択されることを排除した。
【００５１】
データベース検索。生のＭＳデータをＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｄｅｘヒトｖ．３．６２データベースに対して検索し、これは、Ｓｏｒｃｅｒｅｒ  ２（商標）−ＳＥＱＵＥＳＴ（登録商標）（Ｓａｇｅ−Ｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｍｉｌｐｉｔａｓ、ＣＡ、米国）を使用して実施し、検索後分析は、Ｓｃａｆｆｏｌｄ３（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ、米国）を使用して実施した。すべての生データピーク抽出は、Ｓｏｒｃｅｒｅｒ２−ＳＥＱＵＥＳＴデフォルト設定を使用して実施した。データベース検索パラメータは以下の通りであった：切断失敗が最大で２回までのトリプシン（ＬｙｓまたはＡｒｇの後）での半酵素消化；４００〜４５００ａｍｕのモノアイソトピックプレカーサー質量範囲；メチオニンの示差的な酸化およびシステインの静的なカルボアミドメチル化は許容された。ペプチド質量許容誤差は５０ｐｐｍに設定し、断片質量タイプはモノアイソトピックに設定し、修飾の最大数はペプチド１つ当たり４個に設定した。可能にした高度な検索オプションは、以下を含んでいた：１．５のＸＣｏｒｒスコアカットオフ；１．００３３５５ａｍｕの質量シフトを使用した同位体チェック；最終的なスコアリングのために上位２０００の予備段階の結果を保持しておく；結果ファイルで最大２００個までのペプチドの結果を表示する；結果ファイルで最大５個までの完全なタンパク質の説明を表示する；結果ファイルで最大１個までの二重測定タンパク質参照を表示する。エラー率（偽発見率）およびタンパク質確率（ｐ）はＳｃａｆｆｏｌｄによって計算した。各試料についての各ＡＢ−ＣおよびＤ−Ｅ二重測定の生データを、単一のデータベース検索に組み合わせた。
【００５２】
結果
待機的な血管形成術（ＰＴＣＡ）を受けている６人の患者（３対照、３罹患）の血清を、上述した通り３つの時点で集めた。これらの試料のそれぞれのＡＢＰＰＣを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、１−Ｄ電気泳動およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。分子量標準を、ＡＢＰＰＣ試料の分析の前にＳＥＣカラム上に流し、クロマトグラムを図１に示している。各ＡＢＰＰＣ試料についてのサイズ排除クロマトグラムを、図２に示している。
【００５３】
図２のＳＥＣクロマトグラムを見ると、ＡＢＰＰＣが個体間で実際に異なることが明白であり、これは、患者間でＡＢＰＰＣの生物学的変動が存在することを示す。加えて、ＡＢＰＰＣはまた、一部の患者についての２２分から２８分の間の小さいピークの変化によって分かるように、患者内でも変化している。ＳＥＣ画分についての１−ＤＥゲルプロファイルもまた、特に、それぞれ２２．５〜２６および２６．５〜２８分の間に集めたＡＢおよびＣ画分において、患者間で異なる（図３）。これらの画分は、図１において示されているように、６６ｋＤａより大きいＭＷ範囲で溶出する小さいピークに対応する。ＳＥＣのこの領域は、ＡＢＰＰＣの大部分が位置している可能性が最も高く、そのためこのことは、個体間で生物学的変動が存在するというさらなる証拠である。
【００５４】
ＳＥＣクロマトグラムのいくつかにおいて見られる４５〜５０分の間の大きいピーク（ＭＷ標準のクロマトグラムから決定される約３，５００ＤａのＭＷに対応する）はまだ特定されていない。４４〜５０分の範囲の画分を集め、これらのプールした画分はＢＣＡ方法によってアッセイした場合５９５ｎｍの吸光度を報告したが、１−ＤＥ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、銀染色した場合この画分についてバンドを示さなかった（結果は示さず）。加えて、これらの画分のトリプシン消化およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は、ヒトタンパク質またはペプチドの存在を示さなかった。
【００５５】
各画分についてゲル片（アルブミンを引いたもの）をトリプシンで消化し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。ヒトＩＰＩデータベースの検索は、試料全体にわたって分布している１８７の全タンパク質を返した。これらのタンパク質の大部分は、疾患＃２のＰＴＣＡ後２４時間の試料にのみ存在していた。ゼロのスペクトルカウントを報告したタンパク質は、０．５の値を任意に割り当てた。データ分析のために、各群の患者についてすべての３つの時点で各タンパク質について平均スペクトルカウントを使用した。次いで、対照群における各タンパク質についての平均スペクトルカウントのｌｏｇ１０を計算し、罹患群における各タンパク質についての平均スペクトルカウントのｌｏｇ１０に対して、時点１および８についてプロットした（それぞれ図４ａおよび４ｂ）。上部の赤色破線より上にあるタンパク質は、罹患群において上昇するタンパク質であり、下部の赤色破線より下にあるタンパク質は、対照群において上昇するタンパク質である。２つの赤色破線の間にあるタンパク質は、２つの群間で顕著に異ならないが、この領域にあるタンパク質はさらなる評価において依然として興味深いものである可能性がある。
【００５６】
図４Ａを見ると、破線の外側にあるタンパク質は多くなく、このことは、これがベースライン時点であるため予期することができる。しかしながら、図４ｂを見ると、破線の外側のタンパク質の数は劇的に増加する。「非常に興味深いタンパク質」と考えられる、時点８で罹患群において増加する３つのタンパク質が存在し、それらはタンパク質７、８および３１であり、これは、それぞれアネキシンＡ２、プラコグロビンおよびセルピンＢ３に対応する。これらのタンパク質は、表１においてボールド体である。時点８で罹患群において減少するタンパク質もまた興味深いタンパク質であり、それらは表１においてイタリック体である。ボールド体またはイタリック体でないタンパク質は、さらなる調査から排除されず、重要である可能性がある。特に、タンパク質１、３および６は、それらが血清中で遊離していることが分かったため興味深く、これらのタンパク質について、ならびに列挙されている他のタンパク質のいずれかについて、遊離対結合の比が疾患プロセスを示す可能性がある。最終的に、補遺の表において列挙されているいずれかのタンパク質は、潜在的な臨床用途を有し得るタンパク質である可能性がある。
【００５７】
「非常に興味深い」３つのタンパク質は、それらが既知の疾患に関与しており、時点８で罹患患者において上昇するため、特に興味を引く。プラコグロビンは、それが、中間フィラメントを原形質膜にアンカーしている主要な細胞内接着ジャンクションであるデスモソームの成分であるため興味を引く（ＧｒｅｅｎらＮａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０００、１：２０８〜２１６）。心臓のデスモソームタンパク質をコードしている遺伝子中の突然変異は、不整脈を伴う右心室異形成症／心筋症（ＡＲＶＤ／Ｃ）、特定の電気的、機能的および構造的な右心室の異常の存在によって臨床的に、および線維または線維脂肪組織による心筋細胞の置換によって組織学的に定義される遺伝性の心疾患を有する患者に多い（Ｂａｓｓｏら、Ｌａｎｃｅｔ  ２００９、３７３：１２８９〜１３００；ＭｃＫｅｎｎａら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｈｅａｒｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １９９４、７１：２１５〜２１８）。過去１０年間にわたる取り組みは、ＡＲＶＣが、デスモソーム内で見出される重要な構造タンパク質をコードする遺伝子中の突然変異によって頻繁に引き起こされる常染色体優性の形質であることを示している（Ａｗａｄら、Ｎａｔ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｍｅｄ  ２００８、５：２５８〜２６７）。最近の取り組みは、デスモソームタンパク質をコードしている遺伝子中の突然変異はまた、拡張型心筋症患者にも多いことを示している（Ｅｌｌｉｏｔｔら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａ  ｒＧｅｎｅｔｉｃｓ２０１０、３：３１４〜３２２）。
【００５８】
罹患患者においてＡＢＰＰＣに結合しているプラコグロビンの量の増加が観察されるという事実は、これらの患者においてデスモソームの分解が存在すること、したがって心筋内の細胞間相互作用の構造完全性の喪失を示し、このことは、この群における患者は上昇したレベルのｃＴｎＩを示しているため、非常にもっともらしい。アルブミンは、分解されたデスモソームから放出されるこれらのタンパク質を結合するためのスポンジとして機能し得る。そうであるなら、また、これらのならびに他のデスモソームタンパク質、たとえば、プラコフィリン、デスモグレインおよびデスモコリン（そのすべてはＡＢＰＰＣにおいて提示される）が心筋虚血の結果としてＡＢＰＰＣにおいて上昇するなら、それらがまた、他の心臓障害を有する患者についてもＡＢＰＰＣにおいて上昇し、心血管医学において強力なバイオマーカーとして使用することできることは当然考えられる。
【００５９】
セルピンＢ３は、ＴＧＦ−βのそのモジュレーション（Ｔｕｒａｔｏら、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ２０１０、９０：１０１６〜１０２３）によって、扁平上皮癌細胞の生存（Ａｈｍｅｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２００９、３７８：８２１〜８２５）および慢性肝臓疾患に関与するペプチダーゼ阻害剤である。アネキシンＡ２は、細胞増殖の制御においておよびシグナル伝達経路において役割を果たすカルシウム依存性リン脂質結合タンパク質のファミリーであるアネキシンファミリーのメンバーである。アネキシンは、小胞のトラフィッキングおよび組織化、エキソおよびエンドサイトーシスを含む様々な細胞プロセスに、ならびにカルシウムイオンチャネル形成に関わることが示されており（Ｇｅｒｋｅら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００５、６：４４９〜４６１）、アネキシンＡ２は、肝細胞腫瘍の示差的な診断マーカーとして提案されている（Ｊｉら、Ｉｎｔｅｒ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ２００９、２４：７６５〜７７１；Ｌｏｎｇｒｉｃｈら、Ｐａｔｈｏｌ  Ｒｅｓ  Ｐｒａｃｔ  ２０１０、Ａｒｔｉｃｌｅ  ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｐｒｐ．２０１０．０９．００７）。疾患におけるこれらのタンパク質の遊離形態の潜在的重要性により、それらがＡＢＰＰＣにおいて観察されるという事実は非常に興味を引くものであり、これらのタンパク質のＡＢＰＰＣに結合している形態（またはＡＢＰＰＣにおいて観察されるタンパク質のいずれか）は、大きな診断の潜在能力を有し得る。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【国際調査報告】
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