(57)【要約】  本発明は、水、アルコール及びさらに別の有機溶媒を含む組成物（LPS抽出組成物）における細胞培養液からのLPSの抽出のステップを含む、グラム陰性菌からのリポポリサッカライド（LPS）の抽出方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水、アルコール及びさらに有機溶媒を含むLPS抽出組成物。
【請求項２】
LPS抽出組成物が単層である請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
抽出組成物の水の量が約0.1と約1.5%（v/v）の間である請求項1又は2に記載の組成物。
【請求項４】
水の量が約1%（v/v）である請求項1から3のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
水の量が約0.5%（v/v）である請求項1から3のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
アルコールが、メタノール、エタノール、イソプロパノール又はブタノール、のリストから選択される請求項1から5のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
LPS抽出組成物中のアルコールの割合が約5%と約40%（v/v）の間である請求項1から6のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
アルコールの割合が約10%と約30%（v/v）の間である請求項7に記載の組成物。
【請求項９】
さらに有機溶媒が、クロロホルム、アルカン、トルエン及び石油エーテル、のグループから選択される前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
アルカンが、イソオクタン、エタン、ヘプタン及びヘキサンのグループから選択される請求項9に記載の組成物。
【請求項１１】
LPS抽出組成物中の有機溶媒の割合が、さらに約60%と約95%（v/v）の間である前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
有機溶媒の割合がさらに約75%と約90%（v/v）の間である請求項11に記載の組成物。
【請求項１３】
LPS抽出溶液が、クロロホルム、メタノール及び水を含む請求項1から12のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
LPS抽出組成物が、アルカン、エタノール及び水を含む請求項1から12のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
グラム陰性菌の細胞からのLPS抽出における使用のための請求項1から14のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
グラム陰性菌の細胞からのLPS抽出のための方法における請求項1から14のいずれかに記載のLPS抽出組成物の使用。
【請求項１７】
請求項1から14のいずれかに記載のLPS抽出組成物における細胞からのLPS抽出のステップを含む、グラム陰性菌の細胞からのリポポリサッカライド（LPS）の抽出方法。
【請求項１８】
LPSの抽出が約35℃と約65℃の間の温度で行われる請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
温度が約45℃と約55℃の間である請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
温度が約50℃である請求項18又は19に記載の方法。
【請求項２１】
LPS抽出が7.8と9の間のpHで行われる請求項16から20のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
pHが約8.6である請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
LPS抽出が約1時間から約30時間行われる請求項16から22のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
LPS抽出が約0.5時間から約20時間行われる請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
LPS抽出が約1時間行われる請求項23又は24に記載の方法。
【請求項２６】
（i）エタノール又はエタノール溶液による細胞の洗浄、及び任意に、（ii）エタノール又はメタノールによる二度目の細胞の洗浄、のステップをさらに含む請求項16から25のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
（i）及び／又は（ii）において、約75％と約95%（v/v）の間のエタノール又はメタノール溶液により細胞を洗浄する請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
ステップ（i）において細胞を約85%（v/v）のエタノール又はメタノール溶液により洗浄する請求項26又は27に記載の方法。
【請求項２９】
ステップ（ii）において細胞約90%（v/v）のエタノール又はメタノール溶液により洗浄される請求項26又は27に記載の方法。
【請求項３０】
メタノール溶液による細胞の洗浄のステップさらに含む請求項16から29のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
LPS溶液から水、アルコール及びさらに有機溶媒を蒸発させて、その結果乾燥LPS残渣を得るステップ、をさらに含む請求項16から30のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
細菌細胞がサルモネラ属又は大腸菌属のディープラフ変異体菌株である請求項16から31のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
細菌細胞が大腸菌である請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
細菌細胞がサルモネラミネソタである請求項32に記載の方法。
【請求項３５】
細菌細胞がサルモネラミネソタR595である請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
請求項16から35のいずれかに記載の方法によって生産されるLPS組成物。
【請求項３７】
連続的に酸加水分解及び塩基加水分解に供試し、3D−MPLを生産するステップを含む、請求項16から35のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
請求項37に記載の方法によって生産される3D−MPL組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はリポポリサッカライド(LPS)の生合成生産の分野に関する。本発明は特に、細菌の細胞培養によって得られる細胞等の細菌細胞からの、LPSの抽出のための改善された方法及び組成物に関する。本発明のこれらの方法及び組成物はLPS、LPS誘導体、及び特に3−O−脱アシル化モノホスホリルリピッドA(3D−MPL)の生産に有用である。
【背景技術】
【０００２】
リポポリサッカライド(LPS)はグラム陰性菌の外膜における外側のリーフレットの主要な表面分子であり、主としてそこに存在する。LPSは血清補体及び貪食細胞による細菌の破壊を防ぎ、並びにコロニー形成のための付着に関与する。LPSはおよそ10000ダルトンのサイズの構造的に関連する複合体分子のグループであり、共有結合で連結された三つの領域で構成される（図5を参照）:
(i)外側の領域のO−特異的多糖鎖（O−抗原）、
(ii)中央領域のコアオリゴ糖、及び
(iii)疎水的なアンカーとしての役割を有し、長鎖脂肪酸を有するグルコサミンの二糖単位を含む、最も内側の領域のリピッドA。
【発明の概要】
【０００３】
本発明の目的は、細菌のLPS収率の改善をもたらす、LPS抽出のための組成物及び方法を提供することである。LPS収率は生産された細菌細胞の量（バイオマス）から計算され得る。LPS収率の改善は既存の設備で生産できるLPSの量をより増加させるか、又はより小さな設備を用いて生産できるLPSの量を同等にすることを可能とする。本発明のさらなる目的は、細菌細胞から抽出されるLPSの収率がより優れた信頼性及び／又は再現性を示す、LPS抽出のためのプロセスを提供することである。本発明の更なる目的はLPS抽出のためのより迅速なプロセスを提供することである。
【０００４】
したがって、水、アルコール及びさらに有機溶媒を含む組成物（LPS抽出組成物）を用いた細菌の細胞膜からのLPS抽出のステップを含む、グラム陰性菌細胞からのリポポリサッカライド(LPS)の抽出方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】細胞培養液101Bからの50℃における抽出の動態
【図２】培養液101Bからの再現性データ
【図３Ａ】水を含まない80回の試験における抽出収率の分布
【図３Ｂ】1%の水を含む55回の試験における抽出収率の分布
【図４】pHの影響
【図５】LPS分子の共有結合で連結された三つの領域を示す：(i)外側の領域のO−特異的多糖鎖（O−抗原）、(ii)中央領域のコアオリゴ糖、及び(iii)リピッドA
【図６】変異体サルモネラミネソタ(S. minnesota)R595によって生産される切断されたLPSを示し、LPSの完全長に対する切断部位を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
LPS抽出の公知の技術はガラノス(Galanos)法を含み、ガラノス法はフェノール、クロロホルム及び石油エーテルの混合物(PCP)によるLPS抽出に続いて、クロロホルム及び石油エーテルの蒸発、アセトン及び水の添加によるLPSの沈殿、並びに遠心又はろ過によるLPSの回収を含む(Galanos et al., Eur. J. Biochem. 9: 245 (1969))。チェン（Chen）法はクロロホルム及びメタノールの混合物(CM)によるLPS抽出に続いて、一連のメタノール沈降ステップを含む。ガラノス法はLPSの商業的生産には適していない。というのも、ガラノス法は大規模な生産には不向きであり、健康上及び安全上の懸念がある溶媒混合物（例えばフェノール：クロロホルム：石油エーテル）を使用するからである。チェン法では、例えばワクチンアジュバントとしての使用等の免疫賦活化への応用に用いるのに十分な純度のLPSを得るために一般に複数の沈降ステップを必要とする、LPS−リン脂質の豊富なCM相が生じる。WO02/078637はグラム陰性菌（特にサルモネラミネソタ（Salmonella minnesota）R595）のディープラフ(deep rough)変異体株を用いたLPS及び3D−MPLの生産のための方法を開示している。WO02/078637の方法は収率2%から12%まで変動する収率の大きなばらつきを示す。LPS抽出の改善法が必要である。
【０００７】
本発明者はLPS抽出ステップにおいて、アルコール及び有機溶媒に加えて水を用いることによって、LPS抽出ステップに水を用いない同等のプロセスと比較してLPSの高収率が達成され得ることを示した。本発明者は、水を含む抽出組成物を用いることによって、水を含まない同等の組成物と比較して、より多くのLPSが得られ、優れた再現性及びより短い時間で、かつ、他の抽出法に伴ういくらかの不利益を伴わないで、グラム陰性菌からリポポリサッカライドを抽出可能であることを示した。LPS収率の増加に加えて、本発明者はLPS抽出組成物（水、アルコール及び有機溶媒）中に水を用いることで、この収率の増加が、水を用いない方法よりも優れた信頼性で、より短い時間で達成され得ることを示した。
【０００８】
本明細書で用いられる用語「LPS収率」は、乾燥細菌細胞重量（dry bacterial cell weight (DCW)）に対する割合としての、得られるLPSの量を意味する。
【０００９】
したがって、水、アルコール及びさらに別の有機溶媒を含むLPS抽出組成物を用いた細胞からのLPS抽出のステップを含む、細菌細胞培養液からのリポポリサッカライド(LPS)の抽出方法が提供される。「LPS抽出」又は「細菌細胞からのLPS抽出」は細菌の外膜からLPSが直接的に取り出されることを意味する。
【００１０】
本発明のさらなる側面は、LPS抽出組成物を提供することである。「LPS抽出組成物」は、リポポリサッカライドが細菌の膜から直接的に抽出されるLPS抽出ステップにおいて用いられる組成物／混合物を意味する。本発明のLPS抽出組成物は水、アルコール及びさらに別の有機溶媒を含み、本発明のLPS抽出法に有用である。本発明のLPS抽出組成物は単相の抽出組成物である。「単相」は液体が非混和性である混合物ではなく、液体が単一の均質な溶液を形成することを意味する。
【００１１】
用語「水」（H2O）は当業者によく知られている。「水」は純水及び実質的に純粋な水（H2O）（蒸留、脱イオン化、イオン交換処理又は逆浸透によって得られる水を含む）、並びに、当業者には明らかなように水は一般にいくらかの不純物を含むので少量の不純物を含む水を包含する。水の不純物は当業者によく知られており、無機イオン、有機分子、微粒子、コロイド、溶解した気体、微生物及びその副産物を含む。特定の実施形態では水は、実質的にいずれの生きた細菌も含まないという意味で無菌である。別の実施形態では、水はろ過される。
【００１２】
本発明はさらに、例えば、アルカリを含む水等の水溶液を使用しても良い。一つの実施形態では、本発明の組成物は酸が溶解している水を含まない。したがって、一つの実施形態では水のpHは中性、すなわち約pH7である。本発明の一つの実施形態では、pHが7より高い水、アルコール及び有機溶媒を含むLPS抽出組成物が提供される。本発明の特定の実施形態では、LPS抽出組成物のpHが7より低くないLPS抽出組成物が提供される。特定の実施形態では、水酸化ナトリウム（NaOH）、トリエチルアミン（TEA）及び炭酸水素カリウム（KHCO3）、のグループから選択される一以上のアルカリの添加によって水のpHを上げても良い。
【００１３】
用語「水」は脱イオン水もまた含む。脱イオン水は当業者によく知られる用語であるが、手短に言って、脱イオン水は実質的に全てのミネラルイオンが除かれた水である。脱イオン化の程度は電気伝導度によって測定することができ、特定の実施形態では脱イオン水は1μジーメンス／cmの最大導電率を有する。本発明の水はLPS抽出組成物の他の成分と分けて添加する必要はない。例えば、LPS抽出組成物中の水は、アルコール及び水の両方を含むアルコール溶液に由来しても良く、したがって当業者はアルコールと有機溶媒を混合するだけで、アルコール、有機溶媒、及び水を含むLPS組成物を調製することができる。
【００１４】
既に述べたように、本発明者はアルコール及びさらに別の有機溶媒を含む抽出組成物への水の添加が、LPS収率の増加及び／又はLPS収率の一貫性の向上をもたらすことを示した。したがって、LPS抽出組成物中の水の量が約0.1〜約1.5%(v/v)である、水、アルコール、及びさらに別の有機溶媒を含むLPS抽出組成物が提供される。本発明のLPS抽出組成物は0.4%から1.5%(v/v)の水、例えば0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4又は1.5%（v/v）の水を含んでも良い。特に、本発明のLPS抽出組成物中の水の量は約1%（v/v）、すなわち0.8%から1.2%（v/v）である。
【００１５】
本発明のLPS抽出組成物はアルコールに加えて有機溶媒を含む。用語「有機溶媒」は当業者によく知られている。有機溶媒は固体、液体、又は気体の溶質を溶かして溶液にすることができる、炭素を含む化学物質である。
【００１６】
本発明のLPS抽出組成物は、クロロホルム、アルカン、トルエン及び石油エーテルのグループから選択できる有機溶媒を含む。クロロホルムは当業者によく知られており、化学式CHCl3で表される。アルカンもまた本技術分野においてよく知られている。アルカンはいずれの環構造も有しない飽和炭化水素である。本発明のLPS抽出組成物はイソオクタン、エタン、ヘプタン及びヘキサンのグループから選択されるアルカンを含んでも良い。
【００１７】
本発明のLPS抽出組成物中におけるアルコールを除く有機溶媒の割合は約60%〜約95%（v/v）であることができ、本発明の特定の実施形態ではLPS抽出組成物は、アルコールに加えて約75%〜約90%（v/v）の溶媒を含む。本発明のLPS抽出組成物はアルコールに加えて特に、約70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89又は90%（v/v）の溶媒を含む。
【００１８】
本発明のLPS抽出組成物はアルコールを含む。本明細書で用いられる用語「アルコール」は、アルキル基又は置換アルキル基の炭素原子にヒドロキシル基（−OH）が結合した非環式有機化合物として定義される。明確に言えば、フェノール（環式アルコール）のような芳香族不飽和アルコールは本発明に含まれず、したがって水、フェノール等の芳香族不飽和アルコールではないアルコール、及びさらに別の有機溶媒を含むLPS抽出組成物が提供される。
【００１９】
本発明のLPS抽出組成物におけるアルコールの割合は約5%〜約40%であることができ、本発明の特定の実施形態ではLPS抽出組成物は約10%（v/v）〜約30%（v/v）のアルコールを含む。本発明のLPS抽出組成物は特に6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30%（v/v）のアルコールを含む。
【００２０】
本発明のLPS抽出組成物中のアルコールは、イソプロパノール、メタノール、エタノール及びブタノールのリストから選択する事ができる。アルコールの選択は、特定のLPS抽出組成物中の特定の有機溶媒、をはじめとするいくつかの要因に依存し得、というのも、ある種のアルコールはある種の有機溶媒に溶けないからである。したがって、本発明の一つの実施形態では水、クロロホルム及びメタノールを含むLPS抽出組成物が提供される。本発明の別の実施形態では水、アルカン及びエタノールを含むLPS抽出組成物が提供される。
【００２１】
明細書で定義した本発明のLPS抽出組成物は、明細書で記載したLPS抽出方法のために用いられる。したがって、明細書で定義した水、アルコール及びさらに有機溶媒を含むLPS抽出組成物における細胞からのLPS抽出、のステップを含む、細菌細胞からのリポポリサッカライド（LPS）抽出の方法が提供される。LPS抽出の方法は当業者によく知られている。
【００２２】
本発明の範囲内にとどまる限り、温度、時間及びpHをはじめとする本発明の方法の様々なパラメーターが変更されても良い。水、アルコール及びさらに有機溶媒を含むLPS抽出組成物における細胞からのLPS抽出のステップ（LPS抽出ステップ）を含む本発明の方法は、約35℃〜約65℃の温度で行われ得る。本発明の特定の実施形態ではLPS抽出ステップは約45℃〜約55℃の温度、特に45、46、47、48、49、50、51、52、53、54又は55℃で行われる。本発明の特定の方法では抽出ステップは約50℃で行われる。
【００２３】
本発明の方法は水、アルコール及びさらに有機溶媒を含むLPS抽出組成物における細胞からのLPS抽出のステップを含んで行われてもよく、前記抽出ステップは約7〜約9のpH、例えば約7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8又は8.9で行われる。本発明の特定の実施形態ではLPS抽出ステップは約7.8〜約9のpHで行われ、本発明のさらに特定の方法では、抽出ステップはpH約8.6で行われる。
【００２４】
水、アルコール及びさらに有機溶媒を含むLPS抽出組成物における細胞からのLPS抽出のステップを含む本発明の方法は、約0.5時間から約30時間行われてもよい。本発明の特定の実施形態ではLPS抽出ステップは1時間から20時間、特に0.5時間から1.5時間、1時間から2時間、1.5時間から2.5時間又は2時間から2.5時間、例えば0.75時間、1時間、1.25時間、1.5時間、1.75時間、2時間又は2.25時間行われる。本発明の特定の方法では抽出ステップは約1時間行われる。
【００２５】
本発明の方法は、（i）エタノール溶液による細胞の洗浄、及び任意に（ii）エタノールによる二度目の洗浄のステップをさらに含んでも良い。抽出ステップの前のエタノールによる洗浄は、LPS抽出ステップおいてLPSと共に抽出されるリン脂質の量を減少させる事ができ、したがって洗浄はLPS抽出における不純物の量を減少させる事ができる。したがって、
（i）エタノール溶液による細胞の洗浄、
（ii）エタノールによる二度目の細胞の洗浄、及び
（iii）水、アルコール及びさらに有機溶媒を含むLPS抽出組成物における細胞からのLPS抽出、のステップを含む、細菌細胞からのリポポリサッカライド（LPS）の抽出方法が提供される。
【００２６】
本発明の方法における洗浄ステップは、約75%〜95%（v/v）のエタノール溶液を用いて行われても良く、洗浄液の残部は水により調製される。本発明のある実施形態では最初の洗浄（i）は約85%（v/v）エタノール溶液により行われる。本発明の方法の別の実施形態では二度目の洗浄(ii)は約90%（v/v）のエタノール溶液により行われる。
【００２７】
本発明の方法の別の実施形態は、メタノール溶液による細胞の洗浄のステップをさらに含んでも良い。したがって、
（i）エタノール溶液による細胞の洗浄、
（ii）エタノールによる二度目の細胞の洗浄、
（iii）メタノールによる細胞の洗浄、並びに
（iv）水、アルコール及びさらに有機溶媒を含むLPS抽出組成物における細胞からのLPS抽出、のステップを含む、細菌細胞からのリポポリサッカライド（LPS）の抽出方法が提供される。
【００２８】
本発明の方法は細菌細胞の培養液から得られたものをはじめとする、細菌細胞からのLPSを抽出するために用いられ、抽出されたLPSは用いることができ、及び／又はさらに処理することができる。したがって、本発明の方法の別の実施形態は、水、アルコール及びさらなる有機溶媒のLPS溶液からの蒸発、のステップをさらに含み、その結果、抽出ステップに続いて乾燥LPS残渣が得られる。好適には、
（i）エタノール溶液による細胞の洗浄、
（ii）エタノールによる二度目の細胞の洗浄、
（iii）メタノールによる細胞の洗浄、
（iv）水、アルコール及びさらに有機溶媒を含むLPS抽出組成物における細胞からのLPS抽出、並びに
（v）LPS溶液からの水、アルコール及びさらなる有機溶媒を蒸発させ、結果として乾燥LPS残渣を得るステップを含む、細菌細胞からのリポポリサッカライド（LPS）の抽出方法が提供される。
【００２９】
本発明のさらなる側面は、本発明の方法によって生産されるLPS組成物を提供することである。致死的な毒性、発熱性及びアジュバント活性等のLPSの生物活性は、リピッドA部分に関係することが示されている。対照的に、免疫原生はO−特異的多糖成分（O−抗原）に関連する。LPS及びリピッドAは、共にその強いアジュバント効果が古くから知られていたが、これら分子の強い毒性がワクチン製剤への利用を妨げていた。したがって、LPS又はリピッドAのアジュバント活性を維持しながらその毒性を減少させるための多大な努力がなされてきた。
【００３０】
サルモネラミネソタ変異体R595は1966年に親（スムース（smooth））株の培養物から単離された(Luderitz et al. 1966 Ann. N. Y. Acad. Sci. 133:349−374)。選択されたコロニーはファージのパネルによる溶解に対する感受性により選抜され、狭い範囲の感受性（一又は二のファージに対してのみ感受性）を示したコロニーのみが、さらなる研究のために選択された。この試みによって、LPS生合成に欠陥があり、サルモネラミネソタR595と呼ばれるディープラフ（deep rough）変異株が単離された。
【００３１】
他のLPSと比較して、サルモネラミネソタR595が生産するLPSは切断されており、比較的単純な構造を有している（図6参照）。すなわち、サルモネラミネソタR595が生産するLPSは、
（i）O−特異的領域を含まず（この特徴は、野生型のスムース表現型から変異型のラフ表現型への変更に関与し、病原性の喪失をもたらす）、
（ii）コア領域がとても短く（この特徴は様々な化学物質への感受性を高める）、かつ、
（iii）リピッドA部分が7までの脂肪酸により、高度にアシル化されている。
【００３２】
したがって、本発明の方法で用いられる細菌細胞はサルモネラ属又は大腸菌属のディープラフ変異体菌株であっても良い。用語「ディープラフ変異体菌株」は、ディープラフ表現型を有するグラム陰性菌の株を意味する。ディープラフ表現型においては、リピッドAに結合する多糖部分が、約2−3残基の2−ケト−3−デオキシ−D−マンノオクツロン酸（KDO）のみで構成される。特にディープラフ変異体菌株はサルモネラ属から選択される。ディープラフ変異体菌株がサルモネラ属から選択される場合は、サルモネラミネソタ種、特にサルモネラミネソタR595株であっても良い。他のディープラフ変異体菌株として、例えば、カンピロバクタージェジュニ（Compylobacter jejuni）（Kanipes et al. 2004 Infection and Immunity 72:2452−2455）、E. coli K12 CS2429株（Klena et al. 2005 J. Bact. 187:1710−1715）、E. coli D31m4（Qureshi et al.1988 J. Biol. Chem. 263:11971−11976）、E. coli F515株（Wiese et al. 1997 Biochemistry 36:10311−10319）及びプロテウスミラビリス(Proteus mirabilis)R45株（Wiese et al. 1997 Biochemistry 36:10311−10319）を用いることができる。
【００３３】
グラム陰性菌のディープラフ変異体株から抽出されるLPSの酸加水分解によって得ることができる4'−モノホスホリルリピッドA（MPL）は、LPSのアジュバント特性を保持する一方で、1000倍以上の毒性の抑制が認められる（トリ胚における致死量によって測定される）(Johnson et al. 1987 Rev. Infect. Dis. 9 Suppl:S512−S516)。LPSは一般に中程度の強さの無機酸溶液（例えば0.1M HCl）中でおよそ30分間還流される。このプロセスは1位での脱リン酸化及び6'位での脱炭酸化をもたらし、MPLを生ずる。MPLの穏和なアルカリ加水分解によって得ることができる3−O−脱アシル化モノホスホリルリピッドA（3D−MPL）は、さらに毒性が抑制されており、なおかつアジュバント活性を維持している（米国特許第4912094号（Ribi Immunochemicals）を参照）。アルカリ加水分解は一般に、pH 10.5、0.5M炭酸ナトリウム等の弱塩基性水溶液で飽和させた、クロロホルム／メタノール混合物等の有機溶媒中で行われる。3D−MPLの調製に関するさらなる情報は、例えば米国特許第4912094号及び国際公開第02/078637号(Corixa Corporation)から入手可能である。
【００３４】
したがって本発明の方法は、LPSを連続的に酸加水分解及び塩基加水分解に供し、3D−MPLを生産するステップをさらに含んでも良い。したがって本発明の別の実施形態では、
（i）エタノール溶液による細胞の洗浄、
（ii）エタノールによる二度目の細胞の洗浄、
（iii）メタノールによる細胞の洗浄、
（iv）水、アルコール及びさらに有機溶媒を含むLPS抽出組成物における細胞からのLPS抽出、
（v）LPS溶液からの水、アルコール及びさらなる有機溶媒を蒸発させ、結果として乾燥LPS残渣を得、
（vi）LPSを連続的に酸加水分解及び塩基加水分解に供し、3D−MPLを形成するステップを含む、グラム陰性菌からのLPS誘導体の製造法が提供される。
【００３５】
本発明の別の側面は、本明細書に記載した本発明の方法によって生産される3D−MPL組成物を提供することである。
【００３６】
特許及び特許出願を含めて、本出願に引用される全ての引用文献を、可能な限り広い範囲で、参照により本明細書に組み込む。
【００３７】
本明細書及び特許請求の範囲において、文脈上他に必要としない限り、用語「含む」などは、記載した要素、ステップ、要素群又はステップ群を含むことを意味し、他のいずれの要素、ステップ、要素群又はステップ郡を除くことを意味するものではないと理解されたい。
【００３８】
本発明のプロセスを、以下の制限するものではない実施例を参照して説明する。
【実施例】
【００３９】
実施例1 LPS抽出プロセス
1.1 標準的な洗浄プロセス（以下の洗浄プロセスは実施例2と類似する）
この洗浄手順は以下のLPS抽出の実施例1、2及び3で用いられる細胞培養液90A、101B及び128Aにおいて適用する。
【００４０】
不活性化された培養液の一部（3kgから5kgのDCW、360gから600gのLPS（ガラノスフェノール全抽出法によってアッセイしたR595細胞の最大LPS含量12%に基づく）を含み、典型的には容量200L）をプロペラ及び温度プローブを備え、窒素雰囲気中、25mbarのN2下の、二重ジャケット付き300Lステンレス反応容器に入れる。
【００４１】
培養液は、反応容器の二重の覆いの中を循環する熱水によって、攪拌しながら50℃に加熱する。
【００４２】
0.22μmのポアサイズ及び0.15m2の表面積を有する7チャネルの円柱状KERASEP（登録商標）セラミック膜（内径6mm）を備えたタンジェンシャルフローフィルトレーション（Tangential Flow Filtration (TFF)）ユニットによるろ過（持続時間〜1.5時間）によって75Lまで混合物を濃縮する（参照供給者はKERMBB−XM2（Groupe Novasep France））。乾燥残渣重量を分析し、透過液が透明であることを確認した後、透過液を廃棄する。
【００４３】
残余保持分をメタノール（158L）及び水（18L）で希釈して全容量を250Lとする。混合物を50℃に加熱し、次にこの温度で30分間攪拌する。その後、混合物をタンジェンシャルフローフィルトレーションにより50Lまで濃縮し（持続時間〜2時間）、透過液を分析のために回収する。
【００４４】
保持分をエタノール（180L）及び水（18L）の添加により、50℃でさらに洗浄する（持続時間〜2時間）。30分の攪拌後50Lまでろ過を行う。両洗浄における透過液は乾燥残渣を分析し、廃棄する。その後、保持分に含まれるエタノール／水（〜90/10）を、TFFユニットにより、50℃で透析モードにおいてメタノールで置換する。
【００４５】
全容量360Lのメタノールを、20Lずつ、混合物のろ過中に保持混合物に加え、実質的に疎水性不純物（リン脂質）を含まないメタノールの細胞懸濁液（一般に残留エタノール量＜1%）を50L得る（持続時間〜3時間）。透過液は乾燥残渣を分析し、廃棄する。
【００４６】
一般に全DCWの20%が、エタノール洗浄及びメタノールによるエタノールの置換ステップの間に透過液中に除去される。この時点で、保持混合物はDCWを決定するためにサンプルを採取することができ、またラボスケール（137ml）又はパイロットプラントスケール（260L）でさらに処理することができる。
【００４７】
1.2 水を用いない抽出プロセス（パイロットプラントスケール）(培養液90Bからの抽出のために行われる)
上述の洗浄ステップの後、（4kg DCWを含む培養液90Aの144Lの場合）、洗浄した50Lのメタノール細胞懸濁液をクロロホルム／メタノールで抽出した。190Lのクロロホルム及び20Lのメタノールを加えた。混合物をさらに16時間50℃に加熱した。抽出の間にグラブサンプルを採取し、ろ過した。次に、培養液で測定されたDCWと比較した収率の計算が可能となるように、抽出されたLPSの量を、ろ液の溶媒を蒸発させることによって評価した。
【００４８】
その後、懸濁液をTFFユニットによりろ過し、透過液を、窒素雰囲気中で25mbarのN2下の300Lの二重ジャケット付きステンレス鋼回収容器に送った。透過液は、容器の二重ジャケット中に冷水（8℃）を循環させることにより冷却した。
【００４９】
保持分残余量50Lが得られたとき、ろ過を終了した（持続時間〜3時間）。
【００５０】
1.3 標準的な濃縮プロセス（パイロットプラントスケールのみ）
回収した透過液（ろ液）を、真空連続供給上昇管エバポレーター（30℃、200mbar）で、容量17L（この装置で可能な最小容量）になるまで濃縮する。クロロホルムの蒸発しやすさ、及びメタノールの濃縮によって、蒸発の間に部分的に沈殿が生じた。典型的な蒸発速度は、真空度／冷却器温度に応じて50−150L/hである（持続時間：2−4時間）。
【００５１】
エバポレーターを空にし、その後新しいクロロホルム（17L）により洗浄し、蒸発中に沈殿した全ての物質を可溶化させる。
【００５２】
洗浄液及び濃縮液を合わせ（全容量：34L）、さらに、初期圧力350mbarで、50℃のウォーターバスを備えた20LのBuchi ROTAVAPOR（登録商標）R−220 (BUCHI Labortechnik AG)により蒸発させる。典型的な蒸発速度は8−10L/hである（持続時間：3−4h）。
【００５３】
およそ3Lの容量が得られたら、水（3L）を添加し混合物を3Lまで再び濃縮する。水のみが残っている（全ての溶媒が除去されている）ことを示す最終圧力40mbarとなるまで、この操作を2回繰り返す。このメタノール／水置換の間、典型的な蒸発速度は2.5L/hである（典型的な持続時間〜3時間）。
【００５４】
さらに3Lの水を添加し、〜6LのLPSの水懸濁液を得て、4°Cで通常7日間保管する。懸濁液のサンプルを採取し、乾燥残渣を分析し、それによりLPSの量（クロロホルム／メタノール中抽出物（CME）の量とも呼ぶ）を推定する。
【００５５】
培養液90Aからの抽出では189gのLPSが得られる。
【００５６】
抽出中に水を含まないで行われた実験のN=80の平均収率（図3を参照）は6.5%であり、結果の95%は収率1%〜12%でとても広範な分布を示す。
【００５７】
実施例2 水を用いる抽出
5kgのDCWを含む培養液131Aからの222Lの細胞の洗浄は、セクション1.1で記載した通りに行った。
【００５８】
2.1 方法
2.1.1 抽出（1%の水を含むパイロットプラントスケール）（131A培養液からの抽出のために行った）
CHCl3/MeOH/H2Oの溶媒比が78/22/1となるように、クロロホルム（195L）及び水（2.5L）を、洗浄したR595細胞（メタノール中50L）に加えた。混合物を50℃に加熱し、その後この温度で一晩（16h）攪拌した。
【００５９】
その後、懸濁液をTFFユニットによりろ過し、透過液を、窒素雰囲気中25mbarのN2下で二重ジャケット付き300Lのステンレス鋼回収容器に送った。透過液を、容器の二重のジャケット中に冷水（8℃）を循環させることによって冷却した。
【００６０】
保持残余量50Lが得られたとき、ろ過を終了した（持続時間〜3時間）。クロロホルム（40L）及びメタノール（10L）を更なる抽出のために保持液に添加し、その混合物を50℃に再加熱し、容量50Lまでろ過した。また追加の透過液50Lも回収容器に送った。その後、残った50Lの保持液を廃棄した。
【００６１】
濃縮はセクション1.3で記載した通りに行い、568gのLPSを得た。
【００６２】
これらの条件での平均収率は9.1%であり、図3に示すように結果の95%が収率6%〜12%に含まれる。
【００６３】
実施例3 水を含む、及び水を含まないラボ抽出
不活性化した130Lの培養液101B（2.99kg DCW）を1.1に記載の手順を用いて洗浄し、50Lの洗浄した細胞を得た。洗浄した細胞のサンプルを、規模を小さくしたラボ抽出のために採取した。
【００６４】
抽出プロセスをより良く理解するために、このステップの規模を小さくし、異なる抽出条件を試験し、及び48時間までの抽出動態を確立した。培養液101Bからの洗浄した細胞をこれらの試験に用いた。
【００６５】
洗浄したR595細胞のメタノール懸濁液30mlに対して、106mlのクロロホルム、及び必要であれば1.36mlの水を、還流管を付けた窒素の不活性雰囲気下の丸底フラスコに加えた。懸濁液を50℃で攪拌した。グラブサンプル（10ml）を抽出中に（48時間まで）採取し、0.22μmポリテトラフルオロエチレン（PTFE）フィルターによりろ過した。ろ液を乾燥するまで蒸発させ、それにより抽出されたLPS量を決定し、抽出動態を追跡した。収率は、（試験の全容量×LPS量）／（もとの培養液中のDCW）によって計算した。
【００６６】
2.2 結果
表１はクロロホルム：メタノール抽出バッファー中の1%の水の収率への影響を示す。
【表１】
2013527289.tif 000002
【００６７】
水を用いない抽出後のLPS量（90A）と比べて、1%の水を用いる抽出後のLPS量（131A）が有意に増加したことが認められる。
【００６８】
動態：LPS収率の増加に加えて、これらの実施例は、抽出バッファーへの水の添加が抽出の動態を増加させることを示す（図1及び図2、細胞培養液101Bからのラボスケール実験を参照）。
【００６９】
1%の水存在下で行われた抽出では8時間後にプラトー（1.15g/l）に達したことが示されている。しかしながら、水のない状況では8時間後に0.17g/Lしか溶解しておらず、30時間後では溶解量は0.47g/Lであった（そしてまだ増加し、仮定上の高い値まで増加するが、長い時間がかかる）。
【００７０】
これらの試験は同じ培養液（101B）において二度繰り返した。サンプルは抽出の1時間、2時間、4時間、8時間、24時間、30時間及び48時間後に採取した。
【００７１】
再現性:LPSが抽出され得る収率及び速度に加えて、1%の水はまたLPS抽出の際の再現性を高めた（図3Aと3B及び図2を参照）。
【００７２】
図3は1%の水によって分布及び標準偏差が鋭くなることを示す。
【００７３】
表2は1%の水を用いることで再現性が改善されることを示し、水を用いない場合には１回目と2回目の試験で得られる収率の間に40％の差違が認められる。
【表２】
2013527289.tif 000003
【００７４】
実施例3 pHの影響
130Lの不活性化された培養液101B（2.99kg DCW）を、1.1に記載の手順を用いて洗浄し、50Lの洗浄した細胞を得た。洗浄した細胞のサンプルを、規模を小さくしたラボ抽出のために採取した。
【００７５】
120mlのクロロホルム及び1.5mlの水を、所望の塩基を含む（例えば、15.15mgのTEA、50mgのKHCO3、25μlの32%NaOH）洗浄した細胞のメタノール懸濁液25mlに対して、窒素の不活性雰囲気下で還流管を付けた丸底フラスコ中で添加した。懸濁液は16時間〜18時間、50℃で攪拌した。サンプルを採取し（10ml）、0.22μmPTFEフィルターでろ過した。ろ液を蒸発によって乾燥させ、それにより抽出されたLPSの量（g/L）を決定した。
【００７６】
pHの影響を、pH 8.61（NaOH）、pH 8.29（TEA）、pH 7.84（KHCO3）、及びpH 4（酢酸）で試験した。
【００７７】
結果をpH7.1の水1%を含む抽出と比較した。
【００７８】
pHの上昇は水の中に、1.6当量の所望の塩基（12%LPS含量に基づく）を溶解することによってなされ、C:M:W比が1%に達するように用いた。水溶液をメタノール懸濁液に加えて1時間攪拌し、その後CHCl3を添加し50℃に加熱した。酢酸の場合には、酸はメタノール水混合物に直接添加した。
【００７９】
図4には、LPS収率が、pH4（酢酸）における7.8%からpH8.6（NaOH）における11.1%までpHと共に増加したことが示されている（KHCO3及びNaOHの添加による乾燥重量の増加は、収率の計算に考慮してある点に注意）。TEA及び酢酸は、もしまだ存在する場合には、蒸発によって除去した。
【００８０】
3. 結論
本発明者は、水の添加が、より信頼性の高い抽出条件（再現性）を生じ、かつ、LPS収率を増加させることを示した。
【００８１】
さらに、本発明者は、水性の抽出バッファーにおけるpHの上昇がLPS収率を増加させることを示した。
【図１】
2013527289.tif 000004
【図２】
2013527289.tif 000005
【図３Ａ】
2013527289.tif 000006
【図３Ｂ】
2013527289.tif 000007
【図４】
2013527289.tif 000008
【図５】
2013527289.tif 000009
【図６】
2013527289.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成25年1月22日(2013.1.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水、アルコール及びさらなる有機溶媒を含むLPS抽出組成物であって、LPS抽出組成物が単相であり、LPS抽出組成物中の水の量が約0.8〜1.2%(v/v)である前記組成物。
【請求項２】
水の量が約1%（v/v）である請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
アルコールが、メタノール、エタノール、イソプロパノール又はブタノールから選択される請求項1又は2に記載の組成物。
【請求項４】
LPS抽出組成物中のアルコールの割合が約5%〜約40%（v/v）である請求項1から3のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
LPS抽出組成物が、クロロホルム、メタノール及び水を含む請求項1から4のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
LPS抽出組成物が、アルカン、エタノールおよび水を含む請求項1から4のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
グラム陰性菌の細胞からのLPS抽出における使用のための請求項1から6のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
グラム陰性菌の細胞からのLPS抽出のための方法における請求項1から6のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項９】
請求項1から6のいずれかに記載のLPS抽出組成物における細胞からのLPS抽出、のステップを含む、グラム陰性菌の細胞からのリポポリサッカライド（LPS）の抽出方法。
【請求項１０】
LPSの抽出が約35℃〜約65℃の温度で行われる請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
LPS抽出が7.8〜9のpHで行われる請求項9又は10に記載の方法。
【請求項１２】
LPS抽出が約0.5時間から約20時間行われる請求項9から11のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
（i）エタノール又はエタノール溶液による細胞の洗浄、及び任意に、（ii）エタノール又はメタノールによる二度目の細胞の洗浄、のステップをさらに含む請求項9から12のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
LPS溶液から水、アルコールおよびさらなる有機溶媒を蒸発させて、その結果乾燥LPS残渣を得るステップ、をさらに含む請求項9から13のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
LPSを連続的に酸加水分解及び塩基加水分解に供し、3D-MPLを形成するステップ、をさらに含む請求項9から14のいずれかに記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成25年4月16日(2013.4.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】削除
【補正の内容】
【国際調査報告】
2013527289.tif 000011
2013527289.tif 000012
2013527289.tif 000013
2013527289.tif 000014