(57)【要約】  適切な抗原−抗体を用いたウェスタンブロットアッセイまたはＥＬＩＳＡアッセイにより、糞便中のＨＭＧＢ１の存在を検出する分析プロトコルを含む、糞便抽出物中のＨＭＧＢ１タンパク質の存在によって、ヒトの腸の炎症状態を測定するための非侵襲法、並びに慢性炎症性腸疾患、特にクローン病（ＣＤ）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）の発病における当該タンパク質の関与。本発明はまた、この方法を実施するための比色分析キットも含む。
2013534313.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト患者の糞便サンプル中のＨＭＧＢ１レベルを検出することを特徴とする、ヒト患者の腸の炎症状態を検出し、診断し、予測する非侵襲法。
【請求項２】
糞便サンプル中のＨＭＧＢ１レベルの低下を、所与の処置に対する応答マーカーとして使用する方法。
【請求項３】
前記腸の炎症状態が、慢性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、特に、クローン病（ＣＤ）および潰瘍性大腸炎（ＣＵ）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒト患者が、ＩＢＤを患う小児患者である、請求項１および２に記載の方法。
【請求項５】
以下の工程
・糞便サンプルおよびＰＢＳ抽出バッファー中の懸濁物の重さを測ること、
・サンプルの均質化および糞便の上澄み抽出物を遠心分離した後の抽出、
・ブラッドフォードアッセイによるタンパク質濃度の評価、
・ウェスタンブロットによる糞便抽出物の分析
を想定することを特徴とする、前記請求項に記載の方法。
【請求項６】
ウェスタンブロットによる抽出物の分析中に、ＰＶＤＦフィルタ上に移した糞便抽出物を抗ＨＭＧＢ１ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体とともにインキュベートすることを特徴とする、前記請求項に記載の方法。
【請求項７】
前記抗ＨＭＧＢ１ポリクローナル抗体が、ヒトＨＭＧＢ１の１６５−１８０アミノ酸に対応する合成ペプチドを免疫原として用いてウサギ中で産生されたものであり、抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体が、マウス骨髄腫と、組み換えヒトＨＭＧＢ１タンパク質に由来する精製大腸菌で免疫化されたマウスから得たＢ細胞とを融合して得られるハイブリドーマのクローン１１５６０３に対応することを特徴とする、前記請求項に記載の方法。
【請求項８】
糞便抽出物の分析がＥＬＩＳＡアッセイによって行われることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ウェスタンブロットアッセイで用いられるのと同じ抗体を、ＥＬＩＳＡアッセイにおける抗体として使用することを特徴とする、前記請求項に記載の方法。
【請求項１０】
使用する抗ＨＭＧＢ１抗体が、ヒトＨＭＧＢ１の１６５−１８０アミノ酸に対応する合成ペプチドを免疫原として用いてウサギ中で産生された抗ＨＭＧＢ１ポリクローナル抗体、およびマウス骨髄腫と、組み換えヒトＨＭＧＢ１タンパク質に由来する精製大腸菌で免疫化されたマウスから得たＢ細胞とを融合して得られるハイブリドーマのクローン１１５６０３に対応する抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体であることを特徴とする、前記請求項に記載の方法。
【請求項１１】
抗ＨＭＧＢ１ポリクローナル抗体または抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体による特異的抗原−抗体反応に基いて、前記請求項に記載の方法にしたがって、ヒト糞便サンプル中のＨＭＧＢ１タンパク質を検出する、比色分析キット
【請求項１２】
使用する抗ＨＭＧＢ１抗体が、ヒトＨＭＧＢ１の１６５−１８０アミノ酸に対応する合成ペプチドを免疫原として用いてウサギ中で産生された抗ＨＭＧＢ１ポリクローナル抗体、およびマウス骨髄腫と、組み換えヒトＨＭＧＢ１タンパク質に由来する精製大腸菌で免疫化されたマウスから得たＢ細胞とを融合して得られるハイブリドーマのクローン１１５６０３に対応する抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体であることを特徴とする前記請求項に記載の比色分析キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトの慢性炎症性腸疾患（ＩＢＤ「炎症性腸疾患」）を検出し、診断する材料および方法に関する。更に詳しくは、糞便抽出物中のＨＭＧＢ１タンパク質の存在によってヒトの腸の炎症状態を測定するための非侵襲法、並びに慢性炎症性腸疾患、特にクローン病（ＣＤ）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）の発病における当該タンパク質の関与を記述する。また、本発明は、このような方法を実施するための比色分析キットも含む。
【背景技術】
【０００２】
高移動度グループボックス１（ＨＭＧＢ１）は、炎症応答を誘発することによって、組織損傷からの刺激に対し応答することができるＤＡＭＰ（損傷に関連する分子パターン）の分子原型として出現する、非ヒストンクロマチンに関連する非ヒストン核タンパク質である（非特許文献１）。ＨＭＧＢ１は、ＬＰＳ、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８のような炎症を誘発する刺激にしたがって（非特許文献４）、マクロファージ（非特許文献２）および腸細胞（非特許文献３）によって盛んに分泌され、壊死細胞によって放出されるが、アポトーシスを起こした細胞によっては放出されない（非特許文献５）。ＨＭＧＢ１は、細胞外領域に分泌されると、一本鎖ＤＮＡ、ＬＰＳ、ＩＬ−１βおよびヌクレオソームのような異なる分子と極めて炎症性の複合体を形成し、ＴＬＲ９、ＴＬＲ４、ＩＬ−１ＲおよびＴＬＲ２のようなそれぞれの受容体と相互作用し、自然免疫を活性化させる。あるいは、ＨＭＧＢ１は、複合体を形成することなく、終末糖化産物受容体ＲＡＧＥ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｕｃａｔｉｏｎ  Ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ）と結合することができる（非特許文献６）。
【０００３】
細胞外のＨＭＧＢ１は、炎症性メディエーターの産生を誘発し（非特許文献４）、自己免疫疾患または炎症性疾患（関節リウマチ（非特許文献７）、全身性エリテマトーデス（非特許文献８）、多発性筋炎（非特許文献９）を含む）の発病に重要な役割を果たすことがある。米国特許第６，３０３，３２１号に記載されている発明は、敗血症を治療するための医薬組成物に関する。この医薬組成物は、活性物質としてＨＭＧＢ１のアンタゴニストまたは阻害剤を有効量含む。好ましくは、ＨＭＧＢ１アンタゴニストの中で、ＨＭＧＢ１タンパク質に結合する抗体、ＨＭＧＢ１コード遺伝子のアンチセンス配列、ＨＭＧＢ１受容体のアンタゴニストを使用する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第６，３０３，３２１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Wang et al. Am J Respir Crit Care Med 164:1768-73, (2001)
【非特許文献２】Fink et al. J Intern Med. 261:349-62, (2007)
【非特許文献３】Hirschfeld at al. J Immunol. 165:618-22, (2000)
【非特許文献４】Andersson et al. J Exp Med. 192: 565-570, (2000)
【非特許文献５】Scaffidi et al. Nature. 418:191-5, (2002)
【非特許文献６】Bianchi et al. J Leukoc Biol. (2009)
【非特許文献７】Taniguchi et al . Arthritis Rheum. 48:971-81, (2003)
【非特許文献８】Jiang et al. Ann Rheum Dis. 67:727-8, (2008)
【非特許文献９】Ulfgren et al. Arthritis Rheum. 50:1586-94, (2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、また、本発明の課題は、有効量のＨＭＧＢ１アンタゴニストを投与することを含む、敗血症を治療する方法である。また、本発明は、患者の状態の重篤度をモニタリングし、ショック状態の症状を有するか、または関連する症状を示す患者について、敗血症のあり得る臨床経過および関連する状態を予想するための診断方法および予測方法も提供する。この診断方法および予測方法は、サンプル（特に、血清または全血）中のＨＭＧＢ１タンパク質の濃度を測定し、この濃度をＨＭＧＢ１の標準濃度と比較することを含む。ＨＭＧＢ１のレベルが高いことは、予後がよくないこと、または中毒反応が発生しそうであることの指標である。この診断方法は、脳脊髄液または尿のような他の組織または体液区分にも適用することができる。
【０００７】
（ＨＭＧＢ１および胃腸管：従来技術）
腸粘膜におけるストレス、組織損傷または微生物抗原の徴候は、自然免疫応答に関与する細胞（例えば、マクロファージおよび樹状細胞）を活性化させ、炎症応答の引き金となる。
【０００８】
炎症性刺激にしたがって細胞外マトリックスに放出されたＨＭＧＢ１の存在は、腸上皮細胞の透過性を変え、微生物抗原が入り込む量が増えることによって、腸の関門機能に顕著に影響を与えると思われる。実際に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験およびｉｎ  ｖｉｖｏ試験では、免疫刺激を受けた腸細胞または他の免疫細胞によって分泌されたＨＭＧＢ１の存在と、腸の関門機能不全が相関関係にある（１０〜１５）。さらに、炎症性サイトカインの放出に起因して、ＨＭＧＢ１は、動物モデル（１６、１７）、結腸炎の壊死形態の細胞（１８，１９）で示されているように、結腸の炎症にも関与している可能性がある。
【０００９】
抗ＨＭＧＢ１分子によって、分泌するＨＭＧＢ１が減ることは、腸の関門の損傷および粘膜の炎症が両方とも改善することと相関関係にあると思われる（１１、１３、１４、１６、１９、２０）。
【００１０】
患者から得た組織サンプル中のＨＭＧＢ１タンパク質の存在および量は、米国特許出願第２００６／０１８８８８３号に記載されているように、大腸癌（特に、結腸および直腸の癌）の診断マーカーおよび予測マーカーとしてすでに使用されている。しかし、癌という疾患は、炎症性腸疾患とは非常に異なる状態であることがよく知られている。さらに、この出願の目的は、生体組織の使用にのみ適用可能であり、糞便材料の使用と関連づけた参考文献は提供されていない。
【００１１】
Ｄａｖｅらの最近の文献（１６）には、慢性大腸炎のマウスモデルに抗炎症剤（例えば、ピルビン酸エチル）を使用し、ＨＭＧＢ１分泌が減ることに関連する結果が示されている。糞便サンプルで実施された試験は、ピルビン酸エチルを投与した後、排泄物のＨＭＧＢ１レベルが下がっていることを示している。
【００１２】
しかし、大腸炎に対するＤａｖｅの試験で行われた実験は、マウスモデルにしか言及しておらず、このようにして得られた結果を、ヒトおよびヒトの疾患に常に自動的に拡張することができるわけではないことが知られており、実際に、動物モデルを用いて得られた結果が、分子マーカーという観点で、また、疾患の臨床経過および特定の治療に対する応答という観点で、対応するヒト疾患と完全に一致しないことが非常に多い。
【００１３】
さらに、この試験で使用するマウスモデルは、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０をコードする遺伝子が欠失し、マウスに大腸炎を引き起こすように遺伝的に改変されたマウス株を使用している。これは、もっとかなり複雑な要因が疾患の発生を決定づけているヒト疾患と比較して、まったく関係なさそうな条件である。
【００１４】
実際に、ヒトの特性を決定する遺伝子および環境に関する多様性は、実験用動物モデルで完全に再現することができないことがよく知られている。特に、炎症性腸疾患は、遺伝子および環境に関する多様性が疾患の発生および進行に重要な役割を果たす多因子疾患である。
【００１５】
実際に、今日まで、ＣＤについて３０を超える感受性遺伝子座が特定されており、ＣＵについてはこれより少ないが、さらに、罹患した患者全てが同じ遺伝子改変体を発現しているわけではなく、その遺伝子改変体を有することが、疾患の進行に必要であることは暗示されておらず、すなわち、炎症性疾患を有する人々の中で、遺伝的等質性がほぼ全体にわたっているマウスモデルとは異なって、大きな遺伝的多様性が存在する。
【００１６】
それに加え、生活様式（食事、喫煙、ストレス）という観点での環境圧、および薬物の使用および有害な環境薬剤への暴露は人によって異なり、疾患の発生に対し、ある役割も果たし、腸内細菌叢の組成も、同様に個体によって異なる。この観点で、重要な国内のグループおよび国際的なグループによって行われた非常に最近の試験が、炎症性腸疾患における共生細菌叢の主要な役割を強調し、実際に、健康な個人と比較して罹患した個体では変わっていることを思い出すことが重要である。もう一度マウスモデルについて考えると、標準条件では、マウスモデルは、環境圧にまったく煩わされていないか、または少なくともかなり影響が少なく、微生物プロフィールは、同じ餌を摂取する個体の中で変動がかなり少ない。
【００１７】
（ヒトの腸の炎症におけるＨＭＧＢ１の役割）
ヒトにおける腸の炎症に対するＨＭＧＢ１の役割に関する研究はほとんど存在しない。近年の刊行物は、ＲＡＧＥのリガンド（したがってＨＭＧＢ１を含む）が、関節炎および大腸炎のような病的な状態の「バイオマーカー」となり得ることを示しており（２１）、第２の刊行物は、潰瘍性大腸炎患者の血清を観察したときに、ＨＭＧＢ１をＡＮＣＡ（抗好中球細胞質抗体）の新しい抗原であると特定している（２２）。
【００１８】
（腸の炎症のマーカーとして使用されるタンパク質）
生物学的マーカーは、炎症を客観的に測定するための非侵襲法を示し、炎症性腸疾患（ＩＢＤ、「Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ」）を含め、ある種の疾患の評価に対し、主要な役割または二次的な役割を果たすことがある（２３）。
【００１９】
このようなマーカーは、血清学的に、または糞便として特定することができ、このようなマーカーを使用し、特定のプロセスを診断することができ、疾患を異なる亜型に分類することができ、その活性、進化および予後を評価することができ、治療的な処置または再発に対する応答を予測することができる（２４）。
【００２０】
いくつかの炎症性疾患（ＩＢＤを含む）に利用可能な血清学的マーカーは、赤血球沈降速度（ＥＳＲ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）、抗出芽酵母抗体（ＡＳＣＡ）である（２４）。しかし、これらのマーカーは、腸の炎症に対する感度および特異性が低く、症状および疾患活動性の指標との相関関係が低い（２４）。
【００２１】
これとは対照的に、糞便マーカーのレベルは、消化系が関与しない疾患では増えないため、糞便マーカーは、胃腸疾患（例えば、ＩＢＤ）の診断に対する特異性が大きい（２５、２６）。さらに、糞便マーカーには、疾患活動性を評価するのに、必ずしも内視鏡による分析を必要としないという利点がある（２６、２７）。ラクトフェリンおよびカルプロテクチンは、当時、腸の炎症について最も使用されている糞便マーカーである（２４、２５、２８、２９）。実際に、排泄物中にこれらのタンパク質が存在することは、疾患活動性、再発の予測、患者の中で重篤な大腸炎を引き起こす高リスク群の特定、医薬による治療効果のモニタリングの合理的で正確な測定指標である。
【００２２】
胃腸の炎症を非侵襲的に、もっと高感度かつ特異的に、しかし同時に経済的に検出する方法を特定する必要性は増してきており、これらの特徴を満たす新規分子の特定に取り組むことへの多大な関心が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
（客観的かつ予備的な結果）
ＨＭＧＢ１には、細胞炎症体系の供給に関するシグナルを放出し、外的刺激または内的刺激に起因する免疫応答を活性化するというよく知られた能力があるため、本願発明者らは、ヒトの炎症性腸疾患（さらに特定的には、ＣＤおよびＵＣ）におけるこのタンパク質の関与としてありそうなものを調べることを提案してきた。
【００２４】
ＣＤは、口から肛門までの消化管の任意の領域に影響を及ぼし得る貫壁性炎症を特徴とする。典型的には、不連続的な様式で多くの領域が関与する。炎症は、罹患した領域の壁全体に及び、付近にある腸間膜およびリンパ節まで広がることが多い。最も高い頻度で、ＣＤは、回腸末端および結腸に起こる。
【００２５】
ＵＣにおいて、炎症プロセスは結腸に制限されており、粘膜にのみ影響を及ぼす。直腸の関わりは継続的であり、結腸の変化しやすい上流領域の関わりを伴うことがある。
【００２６】
現在、西側諸国（ヨーロッパおよび北アメリカ）でのこれらの疾患の有病率は、ＵＣの場合、住民１０万人に対し、ほぼ７０〜１５０例であり、ＣＤの場合、住民１０万人に対し、ほぼ２０〜４０例である。これは、主に青年期後期および若年層に生じる疾患であり、発症のピークは１５〜３５歳である。
【００２７】
これに関連して、ＨＭＧ１タンパク質は、細胞外マトリックスに分泌されると炎症活性を発揮することが知られており、糞便は、何が産生され、内臓から排泄されているのかを正確に伝えるため、本願発明者らが、ＩＢＤ小児患者の排泄物中にＨＭＧ１を発見したのは、非常に重要なことであった。次いで、得られたデータをコントロール群のデータと比較している。
【００２８】
驚くべきことに、ＩＢＤ患者の糞便中で観察されたＨＭＧＢ１のレベルは、健康なコントロール被験者群のレベルと比較して有意に高いということがわかった（図１）。これにより、患者の排泄物中のＨＭＧＢ１の決定を腸の炎症マーカーとして使用することができることを確立することができた。それに加え、疾病の重篤度が中程度である患者（疾患のＰＣＤＡＩ／ＰＵＣＡＩが≦２５／６０の群）は、処置を受けているため、疾患が重篤である患者と比較して、ＨＭＧＢ１の存在量が少ないことが明らかになっている。したがって、このタンパク質は、炎症の良好なマーカーであること以外に、治療に対する応答の良好な指標でもありそうである（図１）。この目的のために開発された方法論を以下に示す。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍの抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を用い、ウェスタンブロット分析によって検出された、排泄物サンプル中のＨＭＧＢ１タンパク質を示す。パネルＡは、ウェスタンブロットの結果を示し、パネルＢは、患者においてウェスタンブロットによって強調されたバンドの濃度測定値のグラフを示し、パネルＣは、疾患の重篤度にしたがってグループに分けた患者において、ウェスタンブロットによって強調されたバンドの濃度測定値のグラフを示す。
【図２】糞便中で検出されたＨＭＧＢ１タンパク質のレベルを、糞便カルプロテクチンのレベルと比較した分析の結果である。
【実施例】
【００３０】
（サンプリング）
ＩＢＤに罹患した４０人の小児患者（それぞれ、クローン病（ＣＤ）患者１９人、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者２１人、およびコントロール被験者１３人）から集めた糞便サンプルを分析し、ウェスタンブロットによってＨＭＧＢ１の存在を評価した。ウェスタンブロットの条件は、特に、ＨＭＧＢ１を検出するための２種類の特異的な抗体を使用するという目的のために開発された。
【００３１】
ＨＭＧＢ１タンパク質の存在に関連する強調されたバンドについて、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウエア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いることによって実施される濃度分析を行った。これにより、数値をＨＭＧＢ１レベルの範囲に割り当てることができた。
【００３２】
患者におけるＩＢＤの診断は、広く認識され、共有されている内視鏡による基準および組織学的な基準にしたがって行われた（３０）。ＣＤの活動性は、臨床および実験的なパラメータに基づく測定基準である「小児クローン病活動指数（ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｃｒｏｈｎ‘ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ）（ＰＣＤＡ）」によって測定された（３１）。この疾患は、この値が１０以下であるとき、不活性であるとされ、この値が１０より大きく３０未満であるとき、軽度から中程度であるとされ、この値が３０を超えるとき、重篤であるとされる。ＵＣの活動性は、「小児潰瘍性大腸炎活動指数（ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ）（ＰＵＣＡＩ）」にしたがってランク分けされた（３２）。後者は、近年正当性が認められた非侵襲的な多因子法であり、これによれば、疾患が回復している（スコアが１０未満）、軽度の疾患（スコアが１０〜３４）、中程度（スコアが３５〜６４）、重篤な疾患（スコアが６５〜８５）とされる。
【００３３】
内視鏡によるスコアは、ＳＥＳ−ＣＤ（３３）および潰瘍性大腸炎についてはＭａｔｔｓスコア（３４）を用いて決定された。ＳＥＳ−ＣＤを計算するために、大腸を５つの区画（回腸、左結腸、横行結腸、右結腸、直腸）に分け、それぞれの区画の疾患活動性の程度に、０〜１２の値を割り当てた（合計値の範囲：０〜６０）。Ｍａｔｔｓスコアを計算するために、腸を６つの区画（盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、Ｓ字結腸、直腸）に分け、それぞれの区画において、疾患活動性の程度に、１〜４の値を割り当てた（合計値の範囲：６〜２４）。
【００３４】
試験に登録された患者のこれらの指標に基づいて、疾患は、ＩＢＤ１３例が重篤であり（ＣＤ８例、ＵＣ５例）、１１例が軽度から中程度であり（ＣＤ３例、ＵＣ８例）、１６例が不活性である（ＣＤ８例、ＵＣ８例）ことがわかった（表１）。
【００３５】
表１には、治験に登録された患者を疾患の種類および重篤度にしたがって分類し、列挙している。
【００３６】
表１．試験した患者の集合における、ＩＢＤの疾患活動性の人口統計の特徴および指標。ＰＣＤＡＩ：「小児クローン病活動指数」、ＰＵＣＡＩ：「小児潰瘍性大腸炎活動指数」
【表１】
2013534313.tif 000003
2013534313.tif 000004
2013534313.tif 000005
【００３７】
（糞便サンプルの調製）
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  Ｕｎｉｔ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｒｏｍｅ「Ｌａ  Ｓａｐｉｅｎｚａ」に申し込んでくれた疾病の重篤度がさまざまなＩＢＤに罹患した小児患者および健康なコントロール被験者から、Ｓａｌｖａｔｏｒｅ  Ｃｕｃｃｈｉａｒａ教授の指示によって糞便サンプルを得た（表１）。
【００３８】
分子分析を行うまで、糞便用の滅菌容器に集めたサンプルを−２０℃〜−８０℃の温度で保存した。
【００３９】
（糞便サンプルのバッファー溶液の計量および懸濁）
各サンプル（糞便用の標準容器の内側のスプーンの内容物と等しい）を、滅菌チップで容器から取り出し、１．５ｍｌのエッペンドルフ管に入れ、デジタル秤を用いて計量した。このサンプルを、ＳｃｈｅＢｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社から販売されている洗剤およびナトリウムアジドが入った抽出バッファー（リン酸緩衝化食塩水溶液ＰＢＳ  ｐＨ７．２）に再び懸濁させ、最終濃度５００ｍｇ／ｍｌを得た。
【００４０】
（排泄物の均質化および抽出）
室温（ＲＴ）で、サンプルをボルテックスで１分間撹拌し、オービタルシェーカーに室温で約１時間入れた。１００００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離処理した後、上澄み（所定の抽出された糞便）を集め、タンパク質の濃度をブラッドフォードアッセイ（Ｂｉｏｌａｂｓ）によって測定した。得られたサンプルを、ウェスタンブロットアッセイによってすぐに分析してもよく、または−８０℃で保存し、後に分析してもよい。
【００４１】
（糞便抽出物のウェスタンブロットによる分析）
糞便タンパク質抽出物２０μｇに、同じ容積の２×サンプルバッファー（１００ｍＭ  トリス−Ｃｌ  ｐＨ６．８、１０％β−メルカプトエタノール、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．２％ブロモフェノールブルー）を加え、次いで、サンプルを５分間沸騰させ、ウェスタンブロット（ＷＢ）による抽出物の分析に進む前に軽く遠心分離処理した。糞便タンパク質抽出物を、１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し、次いで、７０ボルトで１時間、電子移動によってＰＶＤＦフィルタ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移した。フィルタ上の非特異的な部位は、ブロッキングバッファー（０．０２Ｍ  トリス−Ｃｌ  ｐＨ７．６、０．１３７Ｍ  ＮａＣｌ、５％無脂肪乳粉末）を用いて室温で１時間インキュベーションすることによってブロックされ、次いで、抗体バッファー（０．０２Ｍ  トリス−Ｃｌ  ｐＨ７．６、０．１３７Ｍ  ＮａＣｌ、３％無脂肪乳粉末）で１：１０００に希釈した抗ＨＭＧＢ１ポリクローナル抗体（カタログ番号Ｈ９５９３、Ｓｉｇｍａ）、または抗体バッファーで１：５００に希釈した抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体（カタログ番号ＭＡＢ  １６９０、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）を用い、このフィルタを４℃で１６時間インキュベーションした。次いで、ＴＢＳ−Ｔ  ０．１％  Ｔｗｅｅｎ（０．０２Ｍ  トリス−Ｃｌ  ｐＨ７．６、０．１３７Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ）で５分間洗浄を３回行い、その後に、Ｓｉｇｍａ製の抗ＨＭＧＢ１を用いるときは抗ウサギ二次抗体を用い、抗ＨＭＧＢ１抗体Ｒ＆Ｄシステムを用いてインキュベーションする場合には、抗マウス二次抗体を用い、フィルタを室温で１時間インキュベーションした。いずれの場合も、ペルオキシダーゼ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ）と複合体化しており、抗体バッファーで１：４０００に希釈した。ＴＢＳ−Ｔ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎで５分間洗浄をさらに３回行い、次いで、ＥＣＬｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびオートラジオグラフィー膜（Ｋｏｄａｋ）を用いた化学発光シグナルの検出へと進んだ。
【００４２】
図１は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍの抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を用い、ウェスタンブロット分析によって検出された、排泄物サンプル中のＨＭＧＢ１タンパク質を示す。具体的には、パネルＡは、ウェスタンブロットの結果を示し、パネルＢは、患者においてウェスタンブロットによって強調されたバンドの濃度測定値のグラフを示し、パネルＣは、疾患の重篤度にしたがってグループに分けた患者において、ウェスタンブロットによって強調されたバンドの濃度測定値のグラフを示す。
【００４３】
ウェスタンブロットによって強調されたバンドの濃度分析によって、糞便サンプル中に存在するＨＭＧＢ１のレベルに関連する数値を得ることができた。具体的には、健康な個体において、このような数値は、Ａｒｂｉｔｒａｒｙ  Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｕｎｉｔｓ（ＡＤＵ）としてあらわされるとき、１０００〜３０００の範囲であり、平均値は１２００ＡＤＵであり、ＣＤを有する被験者は、２００００〜３８００００ＡＤＵの数値範囲を示し、平均値は１９００００ＡＤＵであり、一方、ＵＣを患う全ての患者は、分析した糞便サンプル中に存在するＨＭＧＢ１のレベルに関連する数値が、６０００〜２８００００ＡＤＵであり、平均値が１２００００ＡＤＵに等しいことがわかった（図１−Ｂ）。図において、アステリスクは、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ統計検定によって評価された統計学的有意性を指し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【００４４】
この分析から、ＩＢＤ患者の糞便中のＨＭＧＢ１タンパク質の発現が、コントロール被験者と比較して有意に増えていることが示されており、コントロール被験者は、検出できない（ｐ＜０．００１）（図１）。この結果は、糞便中で検出されたＨＭＧＢ１タンパク質の存在が、ヒトの腸の炎症マーカーであることを示している。ＨＭＧＢ１タンパク質の存在は、ＰＣＤＡＩ指数およびＰＵＣＡＩ指数に基づいて疾患が不活性であると定義された１６人の患者の糞便からも検出された。しかし、内視鏡スコアの評価によれば、これらの患者は、ある程度、腸が炎症を起こしており、糞便中のＨＭＧＢ１の検出と一致する結果である。
【００４５】
特に、活性なＣＤおよびＵＣを有する患者において、ＳＥＳ−ＣＤおよびＭａｔｔスコアの中央値は、それぞれ２３．０（値の範囲：１４〜３４）および１８．０（値の範囲：８〜２４）であり、不活性なＣＤおよびＵＣを有する患者において、ＳＥＳ−ＣＤおよびＭａｔｔｓスコアの中央値は、それぞれ７．５（値の範囲：０〜１５）および１１．５（値の範囲：６〜１８）であった。これらの指標は、ＰＣＤＡＩ指数およびＰＵＣＡＩ指数にしたがって不活性な患者であると定義された場合であっても、ある程度の腸の炎症が存在し、ＨＭＧＢ１は、不活性な状態の疾患の指標を与えることがあることを示しており、したがって、このような不活性な炎症状態にとって非常に感度の高いマーカーであると考えられる。糞便中で検出されたＨＭＧＢ１タンパク質のレベルを、現時点で、ＥＬＩＳＡによる腸の炎症を診断するための信頼性が高いバイオマーカーの選択肢であると考えられている糞便カルプロテクチンのレベルと比較した（２９、３５）。この分析の結果を図２に示し、アステリスクは、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ統計検定による統計学的有意性を指し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。両タンパク質は、患者の糞便において、健康なコントロール被験者と比較して大きく増えた（ｐ＜０．００１）（図１−Ｂ、図２−Ａ）。しかし、不活性なＣＤおよびＵＣのグループは、カルプロテクチンのレベルは低かったが、コントロールと比較して、糞便中のＨＭＧＢ１のレベルが有意に多かった（ＣＤおよびＵＣにおいてｐ＜０．０１）（図１−Ｃ、図２−Ｂ）。まとめると、比較から、ＣＤおよびＵＣの両方で、活性な炎症性疾患だと診断された全ての患者において、糞便サンプル中の２種類のタンパク質のレベル間に有意な相関関係が示され（ＣＤにおいて、ｒ：０．７７、ＵＣにおいて、ｒ：０．７０、ｐ＜０．０１）、ｒ＝Ｓｐｅａｒｍａｎ検定によるランク相関係数である。不活性な炎症性疾患を有する患者のみを考慮すると、このような相関関係は消えた（ＣＤにおいて、ｒ：０．２２、ＵＣにおいて、ｒ：０．１８、徴候なし）。実際に、内視鏡スコアにしたがって、ある程度炎症がまだあるけれども、ＰＣＤＡＩ指数およびＰＵＣＡＩ指数にしたがって不活性な患者であると定義された１６人全ての患者において、ＨＭＧＢ１は、顕著に増加している。一方、カルプロテクチンは、これらの患者のうち、たった２人しか増加していなかった。このことは、ＨＭＧＢ１が、疾患活動性の分類指標によって明らかにするときは、臨床的には活動を停止している疾患を有する患者において、持続性の腸の炎症の非常に感度の高いマーカーであることを示しているだろう。しかし、後者は、臨床的な特徴と実験的な特徴の組み合わせであり、内視鏡検査によって検出される腸の炎症と常に相関関係にあるわけではない。
【００４６】
したがって、見かけ上は回復している疾患を有する患者の再発に対し、有望な分子予測パラメータとしてのＨＭＧＢ１タンパク質の使用が想像できる。図１において、ＩＢＤ患者は、健康なコントロール被験者と比較して、糞便中のＨＭＧＢ１の有意な増加が示されている。それに加え、ＨＭＧＢ１レベルと疾患の重篤度との直接的な相関関係が存在する。結論として、ＨＭＧＢ１は、炎症の良好なマーカーであること以外に、疾患の重篤度の良好な指標も与えると思われ、したがって、治療に対する応答のマーカーとして使用することができた。
【００４７】
ここに記載したことから、本発明の重要性は明らかである。生物学的マーカーとしてのＨＭＧＢ１の使用、排泄物サンプル中のその存在を検出する方法は、ヒトの腸の炎症の存在およびレベルを安全に非侵襲的に診断するための有意な工程であり、多くの患者にひどい外傷を与えてしまうことが多い画像化試験の繰り返しが避けられる。
【００４８】
さらに、タンパク質の発現レベルを、疾患再発の予測マーカーとして、また、治療に対する応答のマーカーとして使用することができる。
【００４９】
糞便抽出物の分析に使用できるのがウェスタンブロットアッセイだけではないことは言うまでもない。本願発明者らは、実際に、糞便中のＨＭＧＢ１の存在を、標的タンパク質の特異性および感度という観点で優れた結果が得られるような、ウェスタンブロットアッセイで使用するのと同じ抗体を用い、ＥＬＩＳＡを用いて検出する分析プロトコルの開発に注目した。したがって、ＷＢによる排泄物サンプル中のタンパク質の検出にすでに使用されている２種類の抗体を用いたＥＬＩＳＡキットの構築を進めている。ウェスタンブロットに加え、ＥＬＩＳＡプロトコルを提供するための選択肢は、この技術が単純であり、さらに、反応を良好に定量化することができるという事実によって述べられ、実際に、ＥＬＩＳＡプレートの色強度は、抗原−抗体複合体（一次）の数に比例し、したがって、分析したサンプル中の（一次抗体に結合することができる）抗原の濃度に比例する。
【００５０】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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