(57)【要約】  本発明は、圧力−流動特性の向上したクロマトグラフィー媒体の製造方法及び手段に関する。具体的には、本発明は、クロマトグラフィー媒体の圧力−流動特性を変える手段としての二峰性粒度分布及び層官能化の使用に関する。本発明は、内部コアと外側官能化シェル／リッドとを含む大形ビーズ／粒子と小形ビーズ／粒子とを混合することを含む、圧力−流動特性の向上したクロマトグラフィー媒体の製造方法であって、大形ビーズと小形ビーズの粒度の比［大形粒子のＤ５０Ｖ／小形粒子のＤ５０Ｖ］が＞１．２であり、カラム中の大形ビーズと小形ビーズの体積比［大形ビーズの全体積／ビーズの全体積］が０．０５〜０．９である方法に関する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部コアと外側官能化シェル／リッドとを含む大形ビーズ／粒子を小形ビーズ／粒子と混合することを含む、圧力−流動特性の向上したクロマトグラフィー媒体の製造方法であって、大形ビーズと小形ビーズの粒度の比［大形粒子のＤ５０Ｖ／小形粒子のＤ５０Ｖ］が＞１．２であり、カラム中の大形ビーズと小形ビーズの体積比［大形ビーズの全体積／ビーズの全体積］が０．０５〜０．９である、方法。
【請求項２】
前記コアが多孔質である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記コアが非多孔質である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
大形ビーズと小形ビーズの粒度の比［大形粒子のＤ５０Ｖ／小形粒子のＤ５０Ｖ］が＞３である、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記大形粒子のシェル及び小形粒子が同じ種類のリガンドで官能化されている、請求項１乃至請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記リガンドが、イオン交換リガンド、ＨＩＣ、キレート、タンパク質Ａ、アフィニティ又はＲＰＣリガンドである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
多孔質コアが、試料中の標的分子と相互作用しないリガンドで官能化される、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記大形ビーズのシェルの厚さ（ＳＴ）が、ＳＴ＜［小形粒子のＤ５０Ｖ／２］である、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
内部コアと外側シェルとを含む大形ビーズ／粒子を小形粒子との混合物として含むクロマトグラフィー媒体であって、大形ビーズと小形ビーズの粒度の比［大形粒子のＤ５０Ｖ／小形粒子のＤ５０Ｖ］が＞１．２であり、カラム中の大形ビーズと小形ビーズの体積比［大形ビーズの全体積／ビーズの全体積］が０．０５〜０．９である、クロマトグラフィー媒体。
【請求項１０】
前記コアが多孔質である、請求項９記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項１１】
前記コアが非多孔質である、請求項９記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項１２】
大形ビーズと小形ビーズの粒度の比［大形粒子のＤ５０Ｖ／小形粒子のＤ５０Ｖ］が＞３である、請求項９乃至請求項１１のいずれか１項記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項１３】
多孔質コアが、試料中の標的分子と相互作用しないリガンドで官能化されている、請求項１０記載のクロマトグラフィー媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、圧力−流動特性の向上したクロマトグラフィー媒体の製造方法及び手段に関する。具体的には、本発明は、クロマトグラフィー媒体の圧力−流動特性を変える手段として二峰性粒度分布及び層官能化の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
所望の結合容量及び効率を有するクロマトグラフィー媒体の粒度及び剛性は、標準的なカラムにおいてその圧力仕様範囲で使用するのに十分高い流速を与えることができないことがある。極めて剛性なビーズであってもこのようなことが起こりかねない。充填ビーズでの圧力損失が粒度の増大に伴って減少することは周知である。しかし、背圧を低減するために媒体を粒度の大きなビーズに変えると、分離能が低下し、動的結合容量が低下してしまう。そこで、当技術分野では、クロマトグラフィーの性能を犠牲にすることなく背圧を低減するための代替の充填ビーズに対するニーズが存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】C. Dewaele and M. Verzele, "Influence of the particle size distribution of the packing material in reversed-phase high-performance liquid chromatography", Journal of Chromatography, Volume 260, 1983, Pages 13-21; abstract; Conclusion
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、充填床における流動抵抗を減少させるための簡便な方法を提供する。これは、充填床における流動抵抗を減少させるために、小形ビーズと同じ種類の官能基（リガンド）でシェルを官能化したはるかに大形シェル粒子を、例えば１０〜２０％、小形粒子に追加することによって実現することができる。この混合戦略の大きな利点は、効率及び吸着速度を小形粒子と近いレベルに維持することができることである。シェル官能化大形粒子を使用することによって、溶出効率を何ら損なうことなく圧力−流動特性の向上が得られる。大形シェルビーズは、多孔質ビーズであっても、非多孔質コアと外面の多孔質固定相とを有するように設計してもよい。
【０００５】
目的が充填床の背圧を低減させることだけであれば、当然のことながら官能化されていない大形ビーズを使用することができる。十分に官能化した大形ビーズを使用すると、分離能に悪影響を与えかねない。しかし、平衡状態での結合容量の損失は最小限に抑えられる。シェル官能化大形ビーズを代わりに使用することによって、効率は保持されるが、平衡結合容量は十分に官能化した大形ビーズと比較すると低減する。しかし、動的結合容量は、一般に使用される滞留時間で多くの場合同じである。混合ビーズ充填ビーズという概念を用いて、背圧及び吸着速度に関してカラムパッキングを最適化することができ、またシェル官能化大形ビーズを使用することで、小形ビーズの場合と同じレベルに高い溶出効率（分離能）を維持することができる。これが重要であるのは、分離能が高いと、ポリッシング用途においてある種のサイズのカラムの可能な試料負荷量を増加させることが見込まれるためである。
【０００６】
よって、第１の態様では、本発明は、外側官能化シェル／リッドと内部コアとを含む大形ビーズ／粒子と小形ビーズ／粒子とを混合することを含む、圧力−流動特性の向上したクロマトグラフィー媒体の製造方法であって、大形ビーズと小形ビーズの粒度の比［大形粒子のＤ５０Ｖ／小形粒子のＤ５０Ｖ］が＞１．２、好ましくは＞３であり、カラム中の大形ビーズと小形ビーズの体積比［大形ビーズの全体積／ビーズの全体積］が０．０５〜０．９である方法に関する。Ｄ５０Ｖは、累積体積分布のメジアン粒度である。
【０００７】
リガンドの性質は、本発明の広範な態様を限定しない。よって、本分離マトリックスの一実施形態では、リガンドは、陰イオン交換リガンド、陽イオン交換リガンド、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）リガンド、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）リガンド、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）リガンド、チオフィリックリガンド、アフィニティリガンド、核酸系リガンド、パイ相互作用、水素結合、及び／又はファンデルワールス力によって作用するリガンド、並びにマルチモーダルリガンド（混合モードクロマトグラフィーリガンドとも呼ばれる）からなる群から選択される。
【０００８】
リガンドは、担体に直接カップリングしてもよいし、エクステンダーを介してカップリングしてもよい。エクステンダーは従来のものであり、よって、直鎖、枝分れ、環状の飽和、不飽和基及び芳香族基（例えば、炭素原子数１〜１０のように、炭素原子数１〜２０の基を有するもの）を含んでもよい。これらの基は、純粋な炭化水素基、ヒドロキシル基、アルコキシ及びアリールオキソ及びチオ類似体及び／又はアミノ基を含んでもよい。炭化水素基中の炭素鎖には、１以上の位置に、窒素、エーテル酸素及びチオエーテル硫黄が介在していてもよい。また、アミド基及びケトン基にあるものなどのカルボニル基、及び加水分解に対して比較的安定な他の基であってもよい。表面エクステンダーを官能化したビーズ外側部分は、相互作用するリガンドを含有する外側シェルとしても存在／機能し得る。
【０００９】
官能化シェルは、コアより高い及び低い多孔質、コアにあるものより大きい及び小さいサイズの細孔のいずれを有していてもよく、同じであってもよい。
【００１０】
ビーズ（ベースマトリックス）は、有機及び／又は無機材料を基にする。
【００１１】
ベースマトリックスは、生体分子用途の場合、好ましくは親水性であり、水に不溶性で多少は膨潤可能なポリマーの形態である。誘導体化して親水性となった疎水性ポリマーは、この定義に含まれる。適切なポリマーは、例えば多糖類に基づく、アガロース、デキストラン、セルロース、デンプン、プルランなどのポリヒドロキシポリマー、並びに完全に合成のポリマー、例えばポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリ（ヒドロキシアルキルビニルエーテル）、ポリ（ヒドロキシアルキルアクリレート）及びポリメタクリレート（例えばポリグリシジルメタクリレート）、ポリビニルアルコール、スチレンやジビニルベンゼンに基づくポリマー、及び上述のポリマーに対応するモノマーのうち２種以上を含むコポリマーである。水溶性のポリマーを、例えば架橋結合によって、また吸着又は共有結合を介して不溶性物体をカップリングすることによって、誘導体化して、不溶性にしてもよい。ＯＨに変換することができる基を呈するモノマーを重合することによって、又は最終ポリマーを親水化することによって、例えば親水性ポリマーなどの適切な化合物を吸着させることによって、疎水性ポリマー上に（例えば、モノビニル及びジビニルベンゼンのコポリマー上に）親水基を導入してもよい。
【００１２】
ベースマトリックスに使用するのに適した無機材料は、シリカ、酸化ジルコニウム、グラファイト、酸化タンタルなどである。
【００１３】
小形及び大形シェルビーズに、異なるベースマトリックス材料を使用することができる。
【００１４】
生体分子以外の分子を分離するクロマトグラフィー用途では、ほぼ疎水性のベースマトリックスを使用することができる。
【００１５】
分離能を最適化するために、大形及び小形シェル活性化ビーズを両方使用することもできる。３０μｍのシェルビーズを、１０μｍのビーズに極めて近い分離能を有するように設計してもよい。かかるビーズを９０μｍのシェルビーズと混合すれば、分離能及び圧力−流動特性に関して並外れたクロマトグラフィー特性を有するポリッシングカラムを充填することができるであろう。
【００１６】
本発明によれば、大形シェルビーズと同じリガンドを均一に又はシェルに官能化した多孔質小形ビーズで、大形ビーズのうちの一部を置き換えることによって、大形シェルビーズを充填したカラムに対する試料の動的結合容量を増加させる方法が提供される。
【００１７】
本発明の有利な態様は、本発明による高容量、高効率、低背圧流の充填分離クロマトグラフィーカラムを調製する方法であって、大形シェルビーズに、ビーズ全体に渡って均一に分布するリガンドで置換した多孔質小形ビーズを混合する方法を提供することである。
【００１８】
本発明は、官能化された外側シェルと、官能化されていないことが多い多孔質又は非多孔質の内部コアとを含む、大形ビーズ／粒子を含む、クロマトグラフィー媒体に関する。コア又はビーズの内側部分も官能化してもよい。この場合、コアのリガンドは標的分子と相互作用しない（例えば、シェルには陰イオン交換リガンド、コアには陽イオン交換リガンド）。
【００１９】
第２の態様では、本発明は、内部コアと外側シェルとを含む大形ビーズ／粒子を小形粒子との混合物として含み、大形ビーズと小形ビーズの粒度の比［大形粒子のＤ５０Ｖ／小形粒子のＤ５０Ｖ］が＞１．２であり、カラム中の大形ビーズと小形ビーズの体積比［大形ビーズの全体積／ビーズの全体積］が０．０５〜０．９である、クロマトグラフィー媒体に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】Ｓｅｐｈａｏｓｅ  ＨＰ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを充填した充填ビーズ（カラム：Ｔｒｉｃｏｒｎ  ５／５０）、及びこれらの媒体の混合物（５０／５０  ｖ／ｖ）を充填したビーズでの圧力損失の影響を示すグラフである。
【図２】ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ及びＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ上でのリゾチームの分離を示すクロマトグラムのグラフである。媒体はいずれもＴｒｉｃｏｒｎ  ５／５０カラムに充填した。２０分以内に、流速は１．０ｍＬ／分、勾配は０〜１００％  Ｂ。緩衝液Ａ：２０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ６．１）。緩衝液Ｂ：緩衝液Ａ＋０．２０Ｍ  ＮａＣｌ。
【図３】Ｓｈｅｌｌ  Ｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗと呼ばれる、本発明によるシェルビーズの概略図である。
【図４】ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰを充填したＴｒｉｃｏｒｎ  ５／５０上のリボヌクレアーゼＡ、シトクロムＣ、及びリゾチームの分離を示すクロマトグラムのグラフである。２０分以内に、流速は１．０ｍＬ／分、勾配は０〜１００％  Ｂ。緩衝液Ａ：２０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．８）。緩衝液Ｂ：緩衝液Ａ＋０．２５Ｍ  ＮａＣｌ。
【図５】ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰとＳｈｅｌｌ  Ｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗとの５０／５０混合物を充填したＴｒｉｃｏｒｎ  ５／５０上の、リボヌクレアーゼＡ、シトクロムＣ、及びリゾチームの分離を示すクロマトグラムのグラフである。２０分以内に、流速は１．０ｍＬ／分、勾配は０〜１００％  Ｂ。緩衝液Ａ：２０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．８）。緩衝液Ｂ：緩衝液Ａ＋０．２５Ｍ  ＮａＣｌ。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
添付の図面に関連して本発明をさらに詳細に記述する。本実施例は例示目的のためだけに本明細書に提示するものであり、添付の特許請求の範囲によって定義される通りの本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００２２】
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗに基づくシェル媒体−Ｓｈｅｌｌ  Ｓ  ６ＦＦの調製
全般
マトリックスの体積は沈降ベッド体積を指し、グラムで示すマトリックスの重量は吸引乾燥重量を指す。磁気撹拌子を使用するとビーズが傷つきやすいので、反応物撹拌には電動攪拌器を使用する。ビーズ上の官能基の分析及びアリル化度又はリガンド（−ＳＯ３-基）含有度の決定には、従来法を使用した。
【００２３】
アリルグリシジルエーテルを用いたＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗのアリル活性化
ガラスフィルター上でＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを蒸留水で洗浄した。水切りしたＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ５０ｍＬを反応容器に移し、蒸留水２５ｍＬ、ＮａＯＨ１４．５ｇ、Ｎａ２ＳＯ４６．５ｇ、及びＮａＢＨ４１ｇを添加した。
【００２４】
５０℃で０．５時間撹拌した後、アリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）７０ｍＬを添加した。
【００２５】
反応スラリーを５０℃で１８時間撹拌し、続いてガラスフィルター漏斗上で、蒸留水、エタノール、及び最後に蒸留水で洗浄した。
【００２６】
次いで、アリル含有量を滴定によって決定した。２５８μｍｏｌ／ｍＬであった。
【００２７】
シェル活性化（部分的臭素化を介する３μｍシェル）
アリル化した水切り済みゲルアリル化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（全部で１２．９ｍｍｏｌのアリル基に相当する）５０ｇ及び酢酸ナトリウム３ｇを、蒸留水５００ｍＬ中で強力に撹拌した。密閉ガラス容器内で、０．２当量の臭素（１３５μＬ）を蒸留水１１０ｍＬに溶解した。この臭素溶液を、激しく撹拌している間にアリルゲルスラリーに添加した。５分間撹拌した後に、ガラスフィルター上でこのゲルを蒸留水で洗浄した。
【００２８】
Ｓ−リッドカップリング
部分的に臭素化したゲル（上記参照）５０ｇをフラスコに移し、蒸留水４０ｍＬに溶解した２０ｇの亜硫酸ナトリウムと混合した。撹拌しながら、５０％ＮａＯＨを添加してｐＨ１２．５とし、続いて５０℃で１８時間撹拌し、ガラスフィルター上で蒸留水で洗浄する。次いで、ガラスフィルター上でこのゲルを蒸留水で洗浄した。
【００２９】
コアのアリル除去
Ｓ−シェルゲル（上記参照）５０ｍＬを、蒸留水（５０ｍＬ）及び酢酸ナトリウム０．５ｇに、ビーカー中でオーバーヘッド撹拌しながら混合した。スラリーに濃い橙色／黄色が残るまで臭素を添加した。３分間撹拌した後、スラリーが完全に変色するまでギ酸ナトリウムを添加した。次いで、ガラスフィルター上でゲルを蒸留水で洗浄し、次に１Ｍ  ＮａＯＨ中５０℃で１６〜１８時間撹拌し、続いて蒸留水で洗浄した。
【００３０】
次いで、Ｈ+容量を滴定によって決定した。４９μｍｏｌ／ｍＬであった。
【００３１】
混合媒体（ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰとＳｈｅｌｌ  Ｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）のクロマトグラフィー評価
材料及び方法（全般）
大形ビーズと小形ビーズを混合することによる圧力／流速効果を試験するために、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（平均粒度３４μｍ）をＳｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（平均粒度９０μｍ）に混合し、カラム（Ｔｒｉｃｏｒｎ  ５／５０）に充填した。圧力−流動特性を、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ及びＳｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗをそれぞれ充填したカラムと比較した（図１）。
【００３２】
タンパク質を分離するための試験法の原理は、分離媒体（１種又は複数）を含有する、Ａ緩衝液で平衡化したＴｒｉｃｏｒｎ  ５／５０カラムに、タンパク質を注入する。次いで、約５カラム体積のＡ緩衝液をポンプでカラムに通し、次いでＡ緩衝液からＢ緩衝液（Ａ緩衝液＋ＮａＣｌ）の２０ｍＬの直線勾配をかける。次いで、クロマトグラフィーのプロファイルを２８０ｎｍでモニターする。図２〜４に、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、及びＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰと  Ｓｈｅｌｌ  Ｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗとの混合物のクロマトグラフィーの結果を示す。
【００３３】
実験
圧力−流動特性を、クロマトグラフィーシステムソフトウェアＵＮＩＣＯＲＮを有するＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００で試験した。検討すべき媒体を、ＮｅｘｔＡＫＴＡ  ７／１０ｍｍカラムに充填した。移動相としてＭｉｌｌｉ−Ｑ水を使用し、漸増線流速（６０分間に０から１０ｍｌ／分）をカラムに適用した。
【００３４】
クロマトグラフィー特性を評価するために、幾つかの異なるタンパク質を使用した。評価した媒体はＴｒｉｃｏｒｎ  ５／５０カラムに充填し、適用したタンパク質は勾配溶出で溶出した（上記参照）。２種類の異なる緩衝系を使用した。
１．
緩衝液Ａ：１００ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ５．８）
緩衝液Ｂ：１００ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ５．８）＋０．２５Ｍ  ＮａＣｌ
２．
緩衝液Ａ：１００ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ６．１）
緩衝液Ｂ：１００ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ６．１）＋０．２０Ｍ  ＮａＣｌ。
【００３５】
使用した試料は、リボヌクレアーゼＡ（１．５ｍｇ／ｍＬ）、シトクロムＣ（０．４ｍｇ／ｍＬ）及びリゾチーム（０．４ｍｇ／ｍＬ）であった。これらのタンパク質はＡ緩衝液に溶解し、２００μＬを適用した。クロマトグラフィーシステムにおける性能を、以下に示す装置及び設定を利用してモニターした。
装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ）
ＬＣシステム：ＡＫＴＡ（登録商標）  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０  ＸＴ
ソフトウェア：ＵＮＩＣＯＲＮ（登録商標）
注入ループ：２００μｌ
カラム：Ｔｒｉｃｏｒｎ  ５／５０
機器パラメータ
流速：１．０ｍＬ／分
検出セル：１０ｍｍ
波長：２８０ｎｍ。
【００３６】
結果及び考察
本発明は、「小形」ビーズに基づくクロマトグラフィー媒体の圧力−流動特性を、より大きい粒度を有するシェルビーズを追加することによって調節する方法を提案する。粒度が上がればカラムに充填したビーズでの圧力損失が低下することは周知である。図１に、それぞれ３４μｍ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ）及び９０μｍ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）の平均粒度を有するアガロース粒子の背圧を示す。この図は、流速とともにどのように背圧が増加するか（詳細については実験の部を参照）を図示しており、大形ビーズであればはるかに低い背圧になることを明白に示している。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰに認められる背圧の急上昇は小形ビーズに起因し、高流速でのビーズの圧縮にも起因する。図１は、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  ＦｌｏｗビーズをＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰビーズに混合すると、背圧が低減することも明白に示している。こうした結果は予期される。しかし、ビーズを大きくするとカラムの効率が低下する（ピークが広くなる）ことも周知である。こうした現象は、図２にＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（平均粒度３４μｍ）及びＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（平均粒度９０μｍ）で図示される。
【００３７】
これは、小形ビーズの場合に得られるのと同じ効率を保持しながらこの種のビーズを混合することが不可能であることを意味している。本発明者らは、小形ビーズと同じ官能基（同じリガンド）で官能化した大形シェルビーズを混合することを提案するが、リガンドは、薄い外側シェル、又は固定した表面エクステンダーから構成することができる、外側部分に付着する（図３）。こうしたビーズ設計は、溶出段階での物質移動速度の高速化をもたらし、よって、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗのような、リガンドで均一に置換した同じサイズのビーズと比較して、ピークが狭くなるであろう。図４と図５を比較してみれば、この種のシェルビーズは、ピーク幅を劣化させることなく、均一にリガンドで置換した小形ビーズと混合することができることが明白に実証される。図４に、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰを充填したカラム上で分離した３種類のタンパク質のクロマトグラムを示し、図５に、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰと  Ｓｈｅｌｌ  Ｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗとの混合物を充填したカラムからの結果を示す。
【図１】
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【図２】
2013527447.tif 000004
【図３】
2013527447.tif 000005
【図４】
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【図５】
2013527447.tif 000007
【国際調査報告】
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2013527447.tif 000009
2013527447.tif 000010