(57)【要約】本開示は、ヘルペスウイルスタンパク質、特にｉｎ  ｖｉｖｏにおいて複合体を形成するタンパク質を細胞に送達するためのプラットフォームを提供する。いくつかの実施形態では、これらのタンパク質およびそれらが形成する複合体は、強力な中和抗体を引き起こす。したがって、開示されるプラットフォームを使用するヘルペスウイルスタンパク質の提示は、ワクチン開発に有用な広く強力な免疫応答の生成を可能にする。一態様では、本発明は、第１のヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）タンパク質またはその断片をコードする第１の配列および第２のヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）タンパク質またはその断片をコードする第２の配列を含有する組換えポリシストロニック核酸分子を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ヘルペスウイルス由来の第１のタンパク質もしくはその断片をコードする第１のヌクレオチド配列またはその断片および
ｂ）前記ヘルペスウイルス由来の第２のタンパク質もしくはその断片をコードする第２のヌクレオチド配列またはその断片
を含むポリヌクレオチドを含む自己複製ＲＮＡ分子であって、
前記自己複製ＲＮＡ分子が適した細胞の中に導入された場合に、前記第１のヘルペスウイルスタンパク質またはその断片および前記第２のヘルペスウイルスタンパク質またはその断片が、前記第１のタンパク質または断片および前記第２のタンパク質または断片を含有する前記細胞における複合体の形成に十分な量で産生されるように、前記第１のヌクレオチド配列および前記第２のヌクレオチド配列が１つまたは複数の制御エレメントに作動可能に連結されている、自己複製ＲＮＡ分子。
【請求項２】
前記第１のタンパク質および前記第２のタンパク質が、同じタンパク質でも同じタンパク質の断片でもなく、前記第１のタンパク質が、前記第２のタンパク質の断片ではなく、前記第２のタンパク質が、前記第１のタンパク質の断片ではないという条件を有する、請求項１に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
【請求項３】
前記第１のヌクレオチド配列が、第１の制御エレメントに作動可能に連結され、前記第２のヌクレオチド配列が、第２の制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項１または２に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
【請求項４】
前記ヘルペスウイルス由来の第３のタンパク質またはその断片をコードする第３のヌクレオチド配列をさらに含み、前記第３のヌクレオチド配列は、制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
【請求項５】
前記第３のヌクレオチド配列が、第３の制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項４に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
【請求項６】
前記ヘルペスウイルス由来の第４のタンパク質またはその断片をコードする第４のヌクレオチド配列をさらに含み、前記第４のヌクレオチド配列が、制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項４または５に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
【請求項７】
前記第４のヌクレオチド配列が、第４の制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項６に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
【請求項８】
前記ヘルペスウイルス由来の第５のタンパク質またはその断片をコードする第５のヌクレオチド配列をさらに含み、前記第５のヌクレオチド配列が、制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項６または７に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
【請求項９】
前記第５のヌクレオチド配列が、第５の制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項８に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
【請求項１０】
前記制御エレメントが、サブゲノムプロモーター、ＩＲＥＳ、およびウイルス２Ａ部位から成る群から独立して選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
【請求項１１】
前記ヘルペスウイルスが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
【請求項１２】
前記第１のタンパク質または断片、前記第２のタンパク質または断片、前記第３のタンパク質または断片、前記第４のタンパク質または断片、および前記第５のタンパク質または断片が、ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ；ｇＯ；ｇＭ、ｇＮ；ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１、および前述のもののいずれか１つの断片から成る群から独立して選択される、請求項１１に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
【請求項１３】
前記第１のタンパク質または断片が、ｇＨまたはその断片であり、前記第２のタンパク質または断片が、ｇＬまたはその断片である、請求項１１に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
【請求項１４】
前記第１のタンパク質または断片が、ｇＨまたはその断片であり、前記第２のタンパク質または断片が、ｇＬまたはその断片であり、前記第３のタンパク質または断片が、ｇＯまたはその断片である、請求項１１に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
【請求項１５】
前記第１のタンパク質または断片が、ｇＨまたはその断片であり、前記第２のタンパク質または断片が、ｇＬまたはその断片であり、前記第３のタンパク質または断片が、ＵＬ１２８またはその断片であり、前記第４のタンパク質または断片が、ＵＬ１３０またはその断片であり、前記第５のタンパク質または断片が、ＵＬ１３１またはその断片である、請求項１１に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
【請求項１６】
前記ヘルペスウイルスが、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）である、請求項１０に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
【請求項１７】
前記第１のタンパク質または断片、前記第２のタンパク質または断片、前記第３のタンパク質または断片、前記第４のタンパク質または断片、および前記第５のタンパク質または断片が、ｇＢ、ｇＥ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＬ、および前述のもののいずれか１つの断片から成る群から独立して選択される、請求項１６に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
【請求項１８】
前記第１のタンパク質または断片が、ｇＨまたはその断片であり、前記第２のタンパク質または断片が、ｇＬまたはその断片である、請求項１６に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
【請求項１９】
アルファウイルスレプリコンである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡ分子。
【請求項２０】
請求項１９に記載のアルファウイルスレプリコンを含むアルファウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）。
【請求項２１】
請求項２０に記載のＶＲＰおよび薬学的に許容されるビヒクルを含む組成物。
【請求項２２】
第２のＶＲＰをさらに含み、前記第２のＶＲＰは、前記ヘルペスウイルス由来のタンパク質またはその断片をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含有する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
アジュバントをさらに含む、請求項２１または２２に記載の組成物。
【請求項２４】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡおよび薬学的に許容されるビヒクルを含む組成物。
【請求項２５】
前記ヘルペスウイルス由来のタンパク質またはその断片をコードする第２の自己複製ＲＮＡ分子をさらに含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
ＲＮＡ送達系をさらに含む、請求項２４または２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ＲＮＡ送達系が、リポソーム、ポリマーナノ粒子、水中油型カチオン性ナノエマルジョン、またはその組み合わせである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記送達系が、水中油型カチオン性ナノエマルジョンである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２９】
タンパク質複合体を形成する方法であって、細胞に請求項２０に記載のＶＲＰを送達する工程およびアルファウイルスレプリコンの発現に適した条件下で前記細胞を維持する工程を含み、ここでタンパク質複合体が形成される、方法。
【請求項３０】
前記細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるものである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
タンパク質複合体を形成する方法であって、細胞に請求項１〜１９のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡを送達する工程および前記自己複製ＲＮＡの発現に適した条件下で前記細胞を維持する工程を含み、ここでタンパク質複合体が形成される、方法。
【請求項３２】
前記細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
細胞へのヘルペスウイルス侵入を阻害する方法であって、前記細胞を請求項１〜１９のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡと接触させる工程を含む、方法。
【請求項３４】
細胞へのヘルペスウイルス侵入を阻害する方法であって、前記細胞を請求項２０に記載のＶＲＰと接触させる工程を含む、方法。
【請求項３５】
前記細胞が、上皮細胞、内皮細胞、および線維芽細胞から成る群から選択される、請求項３３または請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞が、上皮細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるものである、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
個体において免疫応答を誘発する方法であって、請求項２０に記載のＶＲＰまたは請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の組成物を前記個体に投与する工程を含む、方法。
【請求項３９】
個体において免疫応答を誘発する方法であって、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡ分子または請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の組成物を前記個体に投与する工程を含む、方法。
【請求項４０】
前記免疫応答が、中和抗体の産生を含む、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記中和抗体が、補体非依存性である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡ分子をコードする組換えＤＮＡ分子。
【請求項４３】
前記組換えＤＮＡ分子が、プラスミドである、請求項４２に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項４４】
細胞においてタンパク質複合体を形成するための、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡまたは請求項２０に記載のＶＲＰの使用。
【請求項４５】
細胞へのヘルペスウイルス侵入を阻害するための、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡまたは請求項２０に記載のＶＲＰの使用。
【請求項４６】
個体において免疫応答を誘発するための、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡ、請求項２０に記載のＶＲＰ、または請求項２１〜２８のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１０年１０月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／３９１，９６０号（この全体の教示は、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
ヘルペスウイルスは、蔓延しており、最悪の場合、主に、免疫無防備状態の個体（たとえば移植レシピエントおよびＨＩＶに感染した個体）において、実質的な病的状態および死亡に至り得る、ヒトにおける広範囲の疾患を引き起こす。ヒトは、少なくとも８つのヘルペスウイルスによる感染に感受性である。単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１、ＨＨＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２、ＨＨＶ−２）、および水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ、ＨＨＶ−３）は、アルファサブファミリーウイルスであり、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ、ＨＨＶ−５）ならびにロゼオロウイルス（ＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７）は、ベータサブファミリーウイルスであり、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ、ＨＨＶ−４）およびカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ、ＨＨＶ−８）は、ヒトに感染するガンマサブファミリーウイルスである。
【０００３】
ＣＭＶ感染は、免疫無防備状態の個体（たとえば移植レシピエントおよびＨＩＶに感染した個体）において、実質的な病的状態および死亡に至り、先天性感染症は、新生児において、神経学的な発生において重篤な欠陥をもたらし得る。ＣＭＶエンベロープ糖タンパク質ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、ｇＭ、およびｇＮは、それらがウイルス表面上に発現されるので、魅力的なワクチン候補を代表し、防御的なウイルス中和体液性免疫応答を引き起こすことができる。いくつかのＣＭＶワクチン戦略は、有力な抗体応答を誘発することができる主な表面糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）を標的にしてきた。（非特許文献１）。ＣＭＶ糖タンパク質ｇＢは、中和抗体応答を誘発することができ、ＣＭＶ陽性患者由来の血清における線維芽細胞の感染を中和する抗体の大部分は、ｇＢに対して指向性である（非特許文献２）。同様に、ｇＨおよびｇＭ／ｇＮは、自然感染に対する免疫応答の標的であることが報告されている（非特許文献３；非特許文献４）。
【０００４】
ＣＭＶタンパク質の複合体もまた、それらがウイルス生活環における重要なプロセスに関与するように思われるので、魅力的なワクチン候補である。たとえば、ｇＨ／ｇＬ／ｇＯ複合体は、線維芽細胞および上皮／内皮細胞侵入の両方において重要な役割を有するように思われる。一般的なモデルは、ｇＨ／ｇＬ／ｇＯ複合体が線維芽細胞の感染を媒介することを示唆する。ｈＣＭＶ  ｇＯヌル突然変異体は、線維芽細胞上に小さなプラークおよび非常に低い力価のウイルスを産生し、侵入における役割を示す（Ｄｕｎｎ（２００３年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １００巻：１４２２３〜２８頁；Ｈｏｂｏｍ（２０００年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７４巻：７７２０〜２９頁）。最近の研究は、ｇＯが、ｇＨ／ｇＬと共にビリオンの中に組み込まれないが、分子シャペロンとして作用し得、ＥＲからゴルジ体へのｇＨ／ｇＬエクスポートおよびビリオンの中への組み込みを増大させることを示唆する（Ｒｙｃｋｍａｎ（２００９年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ  ８２巻：６０〜７０頁）。パルスチェイス実験によって、少量のｇＯは、長い期間、ｇＨ／ｇＬに結合したままであるが、ほとんどのｇＯは、それが細胞外のビリオンにおいて見いだされずまた細胞から分泌もされないので、ｇＨ／ｇＬ／ｇＯ複合体から解離するおよび／または分解されることが示された。ｇＯをＣＭＶ（ＴＲ）の臨床株から欠失させた場合、それらのウイルス粒子は、ビリオンの中に組み込まれるｇＨ／ｇＬの量が著しく低下した。さらに、また、ｇＯをＴＲウイルスから欠失させると、上皮および内皮細胞への侵入をも阻害され、ｇＨ／ｇＬもまた、上皮／内皮細胞侵入に必要とされることが示唆された（Ｗｉｌｌｅ（２０１０年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．８４巻（５号）：２５８５〜９６頁）。
【０００５】
ＣＭＶ  ｇＨ／ｇＬはまた、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１Ａ（本明細書でＵＬ１３１とも呼ばれる）と結合することができ、上皮細胞、内皮細胞、および樹状細胞を含むいくつかの細胞型への侵入に必要とされる五量体複合体を形成する（Ｈａｈｎら（２００４年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７８巻（１８号）：１００２３〜３３頁；ＷａｎｇおよびＳｈｅｎｋ（２００５年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２巻（５０号）：１８１５３〜８頁；Ｇｅｒｎａら（２００５年）．Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．８４巻（Ｐｔ  ６）：１４３１〜６頁；Ｒｙｃｋｍａｎら（２００８年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．８２巻：６０〜７０頁）。対照的に、この複合体は、線維芽細胞の感染に必要とされない。実験用ｈＣＭＶ分離株は、ＵＬ１２８〜ＵＬ１３１遺伝子座において突然変異を持ち、突然変異は、培養線維芽細胞におけるほんの数回の継代後に臨床分離株において生じる（Ａｋｔｅｒら（２００３年）Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．８４巻（Ｐｔ  ５）：１１１７〜２２頁）。自然感染の間に、五量体複合体は、非常に高い効力で、上皮細胞、内皮細胞（および五量体複合体がウイルス侵入を媒介する潜在的な任意の他の細胞型）の感染を中和する抗体を誘発する（Ｍａｃａｇｎｏら（２０１０年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．８４巻（２号）：１００５〜１３頁）。この複合体に対する抗体が、上皮細胞の感染を中和するヒト血清の能力に著しく寄与するようにも思われる（Ｇｅｎｉｎｉら（２０１１年）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｖｉｒｏｌ．５２巻（２号）：１１３〜８頁）。
【０００６】
特許文献１は、ｇＨおよびｇＬを含有するある種のＣＭＶタンパク質複合体を作製する方法を開示する。複合体は、ｇＨおよびｇＬが同時発現されるように、ｇＨをコードするＤＮＡ構築物およびｇＬをコードするＤＮＡ構築物を細胞の中に導入することによって産生される。
【０００７】
特許文献２は、ＣＭＶタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を記載する。この文書によれば、異なるＣＭＶタンパク質をコードする別個のＤＮＡ分子の組み合わせは、コードされるＣＭＶタンパク質の同時発現を引き起こすために細胞の中に導入することができる。ｇＭおよびｇＮがこのように同時発現された場合、それらは、ジスルフィド結合した複合体を形成した。ｇＭ／ｇＮ複合体を産生するＤＮＡ構築物またはｇＢをコードするＤＮＡ構築物により免疫化されたウサギは、等価な中和抗体応答をもたらした。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，７６７，２５０号明細書
【特許文献２】国際公開第２００４／０７６６４５号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ＧｏおよびＰｏｌｌａｒｄ、ＪＩＤ（２００８年）１９７巻：１６３１〜１６３３頁
【非特許文献２】Ｂｒｉｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９０年）６４：１０７９〜８５
【非特許文献３】Ｕｒｂａｎら、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．（１９９６年）７７巻（Ｐｔ．７）：１５３７〜４７頁
【非特許文献４】Ｍａｃｈら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．（２０００年）７４巻（２４号）：１１８８１〜９２頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
２つ以上のヘルペスウイルスタンパク質をコードする核酸、同じ細胞において２つ以上のヘルペスウイルスタンパク質を発現する方法、およびより良好な免疫応答をもたらす免疫化方法に対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）タンパク質などの２つ以上のヘルペスウイルスタンパク質、特に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて複合体を形成するタンパク質を細胞に同時送達（ｃｏ−ｄｅｌｉｖｅｒｙ）するためのプラットフォームに関する。一態様では、本発明は、第１のヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）タンパク質またはその断片をコードする第１の配列および第２のヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）タンパク質またはその断片をコードする第２の配列を含有する組換えポリシストロニック核酸分子である。
【００１２】
たとえば、本発明は、ａ）ヘルペスウイルス由来の第１のタンパク質またはその断片をコードする第１のヌクレオチド配列およびｂ）ヘルペスウイルス由来の第２のタンパク質またはその断片をコードする第２のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む自己複製ＲＮＡ分子を提供する。自己複製ＲＮＡ分子が適した細胞の中に導入された場合に、第１および第２のヘルペスウイルスタンパク質またはその断片が、第１および第２のタンパク質または断片を含有する細胞において複合体を形成するのに十分な量で産生されるように、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列が１つまたは複数の制御エレメントに作動可能に連結されている。好ましくは、第１のタンパク質および第２のタンパク質は、同じタンパク質でも同じタンパク質の断片でもなく、第１のタンパク質は、第２のタンパク質の断片ではなく、第２のタンパク質は、第１のタンパク質の断片ではない。第１のヌクレオチド配列は、第１の制御エレメントに作動可能に連結することができ、第２のヌクレオチド配列は、第２の制御エレメントに作動可能に連結することができる。
【００１３】
自己複製ＲＮＡ分子は、当該ヘルペスウイルス由来の第３のタンパク質またはその断片をコードする第３のヌクレオチド配列、任意選択で、当該ヘルペスウイルス由来の第４のタンパク質またはその断片をコードする第４のヌクレオチド配列、および任意選択で、当該ヘルペスウイルス由来の第５のタンパク質またはその断片をコードする第５のヌクレオチド配列をさらに含むことができる。ヘルペスウイルス由来の追加のタンパク質または断片をコードする配列（つまり第３のヌクレオチド配列、第４のヌクレオチド配列、および第５のヌクレオチド配列）が存在する場合、これらの配列は、１つまたは複数の制御エレメントに作動可能に連結されている。ペンタシストロニック（ｐｅｎｔａｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）構築物の一例では、第１のヌクレオチド配列は、第１の制御エレメントに作動可能に連結され、第２のヌクレオチド配列は、第２の制御エレメントに作動可能に連結され、第３のヌクレオチド配列は、第３の制御エレメントに作動可能に連結され、第４のヌクレオチド配列は、第４の制御エレメントに作動可能に連結され、第５のヌクレオチド配列は、第５の制御エレメントに作動可能に連結されている。構築物中に存在する制御エレメント（たとえば第１、第２、第３、第４、および第５の制御エレメント）は、サブゲノム（ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ）プロモーター、ＩＲＥＳ、およびウイルス（たとえばＦＭＤＶ）２Ａ部位から成る群から独立して選択することができる。
【００１４】
ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１、１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ１型、ＥＢＶ２型、ＣＭＶ、ＨＨＶ−６  Ａ型、ＨＨＶ−６  Ｂ型、ＨＨＶ−７、およびＨＨＶ−８であり得る。いくつかの実施形態では、組換えポリシストロニック核酸分子（たとえば自己複製ＲＮＡ）は、これらのヘルペスウイルスのいずれか１つのｇＨまたはその断片およびｇＬまたはその断片をコードする。より特定の実施形態では、ヘルペスウイルスは、ＣＭＶまたはＶＺＶである。
【００１５】
組換えポリシストロニック核酸分子（たとえば自己複製ＲＮＡ）が、２つ以上のＶＺＶタンパク質をコードする場合、タンパク質は、ｇＢ、ｇＥ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＬ、およびその断片（たとえば少なくとも１０アミノ酸の）から成る群から選択することができる。いくつかの実施形態では、組換えポリシストロニック核酸分子（たとえば自己複製ＲＮＡ）は、ＶＺＶ  ｇＨまたはその断片およびＶＺＶ  ｇＬまたはその断片をコードする。
【００１６】
具体例では、本発明は、ａ）第１のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）タンパク質またはその断片をコードする第１の配列およびｂ）第２のＣＭＶタンパク質またはその断片をコードする第２の配列を含むポリヌクレオチドを含む自己複製ＲＮＡ分子を提供する。自己複製ＲＮＡ分子が適した細胞の中に導入された場合に、第１および第２のＣＭＶタンパク質が、第１および第２のＣＭＶタンパク質または断片を含有する細胞において複合体を形成するのに十分な量で産生されるように、第１の配列および第２の配列が１つまたは複数の制御エレメントに作動可能に連結されている。
【００１７】
第１のＣＭＶタンパク質および第２のＣＭＶタンパク質は、ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ；ｇＯ；ｇＭ、ｇＮ；ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１、および前述のもののいずれか１つの断片から成る群から独立して選択される。好ましくは、第１のＣＭＶタンパク質および第２のＣＭＶタンパク質は、同じタンパク質でも同じタンパク質の断片でもなく、第１のＣＭＶタンパク質は、第２のＣＭＶタンパク質の断片ではなく、第２のＣＭＶタンパク質は、第１のＣＭＶタンパク質の断片ではない。所望の場合、自己複製ＲＮＡ分子は、第３のＣＭＶタンパク質をコードする第３の配列をさらに含むことができ、第３の配列は、制御エレメントに作動可能に連結されている。同様に、追加のＣＭＶタンパク質をコードする追加の配列（たとえば第４のＣＭＶタンパク質をコードする第４の配列、第５のＣＭＶタンパク質をコードする第５の配列）を含むことができる。制御エレメントは、サブゲノムプロモーターおよびＩＲＥＳおよびウイルス２Ａ部位から成る群から独立して選択することができる。
【００１８】
いくつかの実施形態では、自己複製核酸分子は、ＣＭＶタンパク質ｇＨおよびｇＬをコードする。他の実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子は、ＣＭＶタンパク質ｇＨ、ｇＬ、およびｇＯをコードする。他の実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子は、ＣＭＶタンパク質ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１をコードする。
【００１９】
自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルスレプリコンであり得る。そのような場合には、アルファウイルスレプリコンは、アルファウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の形態で送達することができる。自己複製ＲＮＡ分子はまた、「裸の」ＲＮＡ分子の形態とすることもできる。
【００２０】
本発明はまた、本明細書において記載される自己複製ＲＮＡ分子をコードする組換えＤＮＡ分子にも関する。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ分子は、プラスミドである。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ分子は、コードされる自己複製ＲＮＡ分子の転写を駆動する哺乳動物プロモーターを含む。
【００２１】
本発明はまた、本明細書において記載される自己複製ＲＮＡ分子および薬学的に許容されるビヒクルを含む組成物にも関する。自己複製ＲＮＡ分子は、「裸の」ものであり得る。いくつかの実施形態では、組成物は、ＣＭＶタンパク質ｇＨおよびｇＬをコードする自己複製ＲＮＡ分子を含む。他の実施形態では、組成物は、ＣＭＶタンパク質ｇＢをコードする自己複製ＲＮＡ分子をさらに含む。組成物はまた、リポソーム、ポリマーナノ粒子、水中油型カチオン性ナノエマルジョン、またはその組み合わせなどのＲＮＡ送達系を含有することができる。たとえば、自己複製ＲＮＡ分子は、リポソーム中に被包され得る。
【００２２】
ある実施形態では、組成物は、２つ以上のＣＭＶタンパク質をコードするアルファウイルスレプリコンを含有するＶＲＰを含む。いくつかの実施形態では、ＶＲＰは、ＣＭＶ  ｇＨおよびｇＬをコードするレプリコンを含む。所望の場合、組成物は、ＣＭＶ  ｇＢをコードするレプリコンを含有する第２のＶＲＰをさらに含むことができる。組成物はまた、アジュバントをも含むことができる。
【００２３】
本発明はまた、ＣＭＶタンパク質複合体を形成するための方法にも関する。いくつかの実施形態では、２つ以上のＣＭＶタンパク質をコードする自己複製ＲＮＡは、細胞に送達され、細胞は、ＣＭＶタンパク質の発現に適した条件下で維持され、ここで、ＣＭＶタンパク質複合体が形成される。他の実施形態では、２つ以上のＣＭＶタンパク質をコードする自己複製ＲＮＡを含有するＶＲＰは、細胞に送達され、細胞は、ＣＭＶタンパク質の発現に適した条件下で維持され、ここでＣＭＶタンパク質複合体が形成される。方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、細胞においてＣＭＶタンパク質複合体を形成するために使用することができる。
【００２４】
本発明はまた、個体において免疫応答を誘発するための方法にも関する。いくつかの実施形態では、２つ以上のＣＭＶタンパク質をコードする自己複製ＲＮＡは、個体に投与される。自己複製ＲＮＡ分子は、リポソームなどのＲＮＡ送達系を含有する組成物として投与することができる。他の実施形態では、２つ以上のＣＭＶタンパク質をコードする自己複製ＲＮＡを含有するＶＲＰは、個体に投与される。好ましい実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子は、ＣＭＶタンパク質ｇＨおよびｇＬをコードする。好ましくは、誘発された免疫応答は、中和抗ＣＭＶ抗体の産生を含む。より好ましくは、中和抗体は、補体非依存性である。
【００２５】
本発明はまた、細胞の中へのＣＭＶ侵入を阻害するための方法であって、細胞をｇＨおよびｇＬなどの２つ以上のＣＭＶタンパク質をコードする自己複製ＲＮＡ分子と接触させることを含む方法にも関する。細胞は、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、およびその組み合わせから成る群から選択することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、２つ以上のＣＭＶタンパク質をコードする自己複製ＲＮＡを含有するＶＲＰと接触させられる。
【００２６】
本発明はまた、免疫応答を誘発するまたは細胞の中へのＣＭＶ侵入を阻害するために、細胞においてＣＭＶタンパク質複合体を形成する、２つ以上のＣＭＶタンパク質をコードする自己複製ＲＮＡ分子（たとえばＶＲＰ、自己複製ＲＮＡ分子を含む組成物、およびリポソーム）の使用にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、標的細胞の中へのＣＭＶ侵入に関与する公知の糖タンパク質複合体を同定するＣＭＶの図である。エンベロープ糖タンパク質は、それらがウイルス表面上に発現され、防御的で長く持続するウイルス中和体液性免疫応答を引き起こすことができるので、魅力的なワクチン候補に相当する。これらのプロセスを媒介する構造糖タンパク質は、２つのクラスに分けることができる；ヘルペスウイルスファミリーの全体にわたって保存されるものおよびそうでないもの。保存されるものの中には、ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、ｇＭ、およびｇＮがある。これらの糖タンパク質の多くは、ウイルス表面への局在化を促進し、ウイルスの付着、侵入、および細胞融合においてそれらの機能を実行するために、互いに複合体を形成する（ｇＨ／ｇＬ／±ｇＯ；ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１；ｇＭ／ｇＮ）。
【図２−１】図２Ａ〜２Ｆは、ＣＭＶ構築物の図である。図２Ａ、実施例１において記載されるｇＢ構築物（「ｇＢ  ＦＬ」、完全長ｇＢ；可溶性ｇＢ「ｇＢ  ｓｏｌ  ７５０」および「ｇＢ  ｓｏｌ  ６９２」）の図。ｇＢの２つの異なる可溶性バージョンを構築した；ｇＢ  ｓｏｌ  ７５０は、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠き、ｇＢ  ｓｏｌ  ６９２もまた、疎水性領域を欠き、Ｒｅａｐら  （２００７年）Ｃｌｉｎ．  Ｖａｃｃ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４巻：７４８〜５５頁において記載されるｇＢ  ｓｏｌに類似する。図２Ｂ、ウイルス複製粒子（ＶＲＰ）を産生するために使用されるｇＢレプリコンベクターの図。図２Ｃ、実施例１において記載されるｇＨ構築物（「ｇＨ  ＦＬ」、完全長ｇＨ；可溶性ｇＨ「ｇＨ  ｓｏｌ」）の図。膜貫通ドメインを欠くｇＨの単一の可溶性バージョンを構築した。図２Ｄ、ＶＲＰを産生するために使用されるｇＨレプリコンベクターの図。図２Ｅ、実施例１において記載されるｇＬ構築物の図。図２Ｆ、ＶＲＰを産生するために使用されるｇＬレプリコンベクターの図。図２Ｂ、２Ｄ、および２Ｆにおいて、「ＮＳＰ１」、「ＮＳＰ２」、「ＮＳＰ３」、および「ＮＳＰ４」は、それぞれウイルスの複製に必要とされる、アルファウイルス非構造タンパク質１〜４である。
【図２−２】図２Ａ〜２Ｆは、ＣＭＶ構築物の図である。図２Ａ、実施例１において記載されるｇＢ構築物（「ｇＢ  ＦＬ」、完全長ｇＢ；可溶性ｇＢ「ｇＢ  ｓｏｌ  ７５０」および「ｇＢ  ｓｏｌ  ６９２」）の図。ｇＢの２つの異なる可溶性バージョンを構築した；ｇＢ  ｓｏｌ  ７５０は、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠き、ｇＢ  ｓｏｌ  ６９２もまた、疎水性領域を欠き、Ｒｅａｐら  （２００７年）Ｃｌｉｎ．  Ｖａｃｃ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４巻：７４８〜５５頁において記載されるｇＢ  ｓｏｌに類似する。図２Ｂ、ウイルス複製粒子（ＶＲＰ）を産生するために使用されるｇＢレプリコンベクターの図。図２Ｃ、実施例１において記載されるｇＨ構築物（「ｇＨ  ＦＬ」、完全長ｇＨ；可溶性ｇＨ「ｇＨ  ｓｏｌ」）の図。膜貫通ドメインを欠くｇＨの単一の可溶性バージョンを構築した。図２Ｄ、ＶＲＰを産生するために使用されるｇＨレプリコンベクターの図。図２Ｅ、実施例１において記載されるｇＬ構築物の図。図２Ｆ、ＶＲＰを産生するために使用されるｇＬレプリコンベクターの図。図２Ｂ、２Ｄ、および２Ｆにおいて、「ＮＳＰ１」、「ＮＳＰ２」、「ＮＳＰ３」、および「ＮＳＰ４」は、それぞれウイルスの複製に必要とされる、アルファウイルス非構造タンパク質１〜４である。
【図２−３】図２Ａ〜２Ｆは、ＣＭＶ構築物の図である。図２Ａ、実施例１において記載されるｇＢ構築物（「ｇＢ  ＦＬ」、完全長ｇＢ；可溶性ｇＢ「ｇＢ  ｓｏｌ  ７５０」および「ｇＢ  ｓｏｌ  ６９２」）の図。ｇＢの２つの異なる可溶性バージョンを構築した；ｇＢ  ｓｏｌ  ７５０は、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠き、ｇＢ  ｓｏｌ  ６９２もまた、疎水性領域を欠き、Ｒｅａｐら  （２００７年）Ｃｌｉｎ．  Ｖａｃｃ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４巻：７４８〜５５頁において記載されるｇＢ  ｓｏｌに類似する。図２Ｂ、ウイルス複製粒子（ＶＲＰ）を産生するために使用されるｇＢレプリコンベクターの図。図２Ｃ、実施例１において記載されるｇＨ構築物（「ｇＨ  ＦＬ」、完全長ｇＨ；可溶性ｇＨ「ｇＨ  ｓｏｌ」）の図。膜貫通ドメインを欠くｇＨの単一の可溶性バージョンを構築した。図２Ｄ、ＶＲＰを産生するために使用されるｇＨレプリコンベクターの図。図２Ｅ、実施例１において記載されるｇＬ構築物の図。図２Ｆ、ＶＲＰを産生するために使用されるｇＬレプリコンベクターの図。図２Ｂ、２Ｄ、および２Ｆにおいて、「ＮＳＰ１」、「ＮＳＰ２」、「ＮＳＰ３」、および「ＮＳＰ４」は、それぞれウイルスの複製に必要とされる、アルファウイルス非構造タンパク質１〜４である。
【図３Ａ】図３Ａおよび３Ｂは、ｇＢ（ＦＬ、ｓｏｌ  ７５０、ｓｏｌ  ６９２）またはｇＨ（ＦＬ、ｓｏｌ）ＶＲＰにより免疫化したマウスが、モルモット補体の存在下において、中和性である抗体応答を誘発したことを示す図である。中和アッセイは、ＡＲＰＥ−１９上皮細胞の感染前に、マウス血清およびモルモット補体と共に、ＣＭＶウイルス株ＴＢ４０ＵＬ３２Ｅ−ＧＦＰ（高感度緑色蛍光タンパク質−ＧＦＰをコードする、Ｓａｍｐａｉｏら（２００５年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７９巻（５号）：２７５４〜６７頁）をあらかじめインキュベートすることによって行った。感染の５日後に、ＧＦＰ陽性細胞の数を決定した。図３Ａ、補体の存在下においてＡＲＰＥ−１９細胞において分析したすべての血清についての血清希釈曲線（ｓｅｒｕｍ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｃｕｒｖｅ）。図３Ｂ、血清試料についての５０％中和力価。免疫前血清と共にインキュベートしたウイルスは、低希釈（１：４０〜１：８０）で低度の中和をもたらした。ｇＢ（ＦＬ、ｓｏｌ  ７５０、ｓｏｌ  ６９２）血清は、１：１８００〜１：２１００の５０％中和力価で非常に強力な中和活性を有した。ｇＢ免疫化マウスはすべて、同様の中和プロファイルをもたらした。ｇＨ（ＦＬ、ｓｏｌ）血清は、約１：１６０で５０％中和力価で中和活性を有した。実施例１を参照されたい。
【図３Ｂ】図３Ａおよび３Ｂは、ｇＢ（ＦＬ、ｓｏｌ  ７５０、ｓｏｌ  ６９２）またはｇＨ（ＦＬ、ｓｏｌ）ＶＲＰにより免疫化したマウスが、モルモット補体の存在下において、中和性である抗体応答を誘発したことを示す図である。中和アッセイは、ＡＲＰＥ−１９上皮細胞の感染前に、マウス血清およびモルモット補体と共に、ＣＭＶウイルス株ＴＢ４０ＵＬ３２Ｅ−ＧＦＰ（高感度緑色蛍光タンパク質−ＧＦＰをコードする、Ｓａｍｐａｉｏら（２００５年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７９巻（５号）：２７５４〜６７頁）をあらかじめインキュベートすることによって行った。感染の５日後に、ＧＦＰ陽性細胞の数を決定した。図３Ａ、補体の存在下においてＡＲＰＥ−１９細胞において分析したすべての血清についての血清希釈曲線。図３Ｂ、血清試料についての５０％中和力価。免疫前血清と共にインキュベートしたウイルスは、低希釈（１：４０〜１：８０）で低度の中和をもたらした。ｇＢ（ＦＬ、ｓｏｌ  ７５０、ｓｏｌ  ６９２）血清は、１：１８００〜１：２１００の５０％中和力価で非常に強力な中和活性を有した。ｇＢ免疫化マウスはすべて、同様の中和プロファイルをもたらした。ｇＨ（ＦＬ、ｓｏｌ）血清は、約１：１６０で５０％中和力価で中和活性を有した。実施例１を参照されたい。
【図４Ａ】図４Ａは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または赤色蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ）をコードするモノシストロニックレプリコンならびにＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙをコードするバイシストロニックレプリコンの略図である。「ＮＳＰ１」、「ＮＳＰ２」、「ＮＳＰ３」、および「ＮＳＰ４」は、それぞれ、アルファウイルス非構造タンパク質１〜４である。ポリシストロニックアルファウイルスレプリコン系は、目的の遺伝子を駆動する複数のサブゲノムプロモーターを収容するように既存のアルファウイルスレプリコン系に対して修飾を成すことによって設計した。
【図４Ｂ】図４Ｂは、モノおよびバイシストロニックＲＮＡを含有するＶＲＰに感染したＢＨＫＶ細胞のＦＡＣＳ分析を示す蛍光プロットである。ポリシストロニックアルファウイルスＶＲＰは、ＧＦＰ  ＶＲＰ＋ｍＣｈｅｒｒｙ  ＶＲＰの同時感染（２６．３０％）よりも、ほぼ等しい量で両方の目的の遺伝子を発現する、より多くの細胞をもたらす（ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ；７２．４８％）。実施例２を参照されたい。
【図５Ａ】図５Ａは、ｇＨ／ｇＬおよびｇＨ／ｇＬ／ｇＯをコードするポリシストロニックアルファウイルスレプリコン構築物の構築の略図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ｇＨ／ｇＬがｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて複合体を形成することを示す。ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｇＨ／ｇＬ、またはｇＨ／ｇＬ／ｇＯをコードするレプリコンを含有するＶＲＰは、ＢＨＫＶ細胞において産生した。結果として生じるＶＲＰは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて複合体形成を実証するためにＡＲＰＥ−１９細胞を感染させるために使用した。アルファウイルス感染ＡＲＰＥ−１９細胞を収集し、ｇＨおよびｇＬの存在について分析した。ｇＨ／ｇＬをコードするＶＲＰに感染したＡＲＰＥ−１９細胞は、ｇＨ／ｇＬのジスルフィド結合複合体を産生した（ＤＴＴ、熱の非存在下において見られる）。ｇＯは、ｇＨ／ｇＬ結合を検出可能な程度に改変しなかった。左手のブロットは、ｇＨタンパク質の発現を示す。右手のブロットは、ｇＬタンパク質の発現を示す。分子量マーカーは、ブロットの間に示す。●＝単量体ｇＨ、●●＝単量体ｇＬ、＜＝ヘテロ二量体（ｇＨ＋ｇＬ）、＊＝ヘテロ二量体の二量体。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＶＲＰに感染したＢＨＫＶ細胞由来のｇＨおよびｇＨ／ｇＬ複合体の免疫沈降を示す。免疫沈降は、対照としてマウスＩｇＧ抗体（レーン２、４、７、および１０）またはｇＨを免疫沈降させるマウス抗ｇＨ抗体（Ｇｅｎｗａｙ）（レーン３、５、８、および１１）を使用して実行した。ウエスタンブロットは、プールしたウサギ抗ｇＬ抗体およびウサギ抗ｇＨ抗体を使用して実行した。レーン１、６、および９は、参照のためのｇＨタンパク質（上方のバンド  約７５ｋＤａ）およびｇＬタンパク質（下方のバンド  約３０ｋＤａ）を示す。レーン２および３は、ｇＨ−ＶＲＰに感染した溶解産物である。レーン２は、対照抗体がｇＨを免疫沈降させなかったことを示す。レーン３は、抗ｇＨ抗体がｇＨを免疫沈降させたことを示す。レーン４および５は、ｇＬ−ＶＲＰのみに感染した溶解産物からのものである。ｇＨタンパク質は、免疫沈降しなかった。レーン７および８は、バイシストロニックｇＨ／ｇＬ−ＶＲＰに感染した溶解産物からのものである。レーン８は、ｇＬがｇＨ抗体を使用して免疫沈降したことを示す。（アスタリスクを参照されたい）。レーン１０および１１は、トリシストロニックｇＨ／ｇＬ／ｇＯ−ＶＲＰに感染した溶解産物からのものである。レーン１１は、ｇＬがｇＨ抗体を使用して免疫沈降したことを示す。（アスタリスクを参照されたい）。分子量マーカーもまた示す（ＭＷ）。実施例３を参照されたい。
【図６Ａ】図６は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてｇＨ／ｇＬ複合体形成に影響を及ぼすＶＲＰが、ｇＢ  ＶＲＰに対する応答より質的かつ量的に優れた、ＣＭＶに対する強力な免疫応答を誘発することを示す。図６Ａおよび図６Ｂは、補体の存在下（図６Ａ）または非存在下（図６Ｂ）においてＡＲＰＥ−１９細胞のＴＢ４０−ＵＬ３２−ＥＧＦＰ感染の中和における、ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｇＨ＋ｇＬ、ｇＨ＋ｇＬ＋ｇＯ、ｇＨ／ｇＬ、およびｇＨ／ｇＬ／ｇＯ  ＶＲＰ免疫化マウスについての血清希釈曲線を示す。血清の様々な希釈物は、モルモット補体の存在下または非存在下においてＴＢ４０ＵＬ３２Ｅ−ＧＦＰと共にあらかじめインキュベートし、その後、ＡＲＰＥ−１９上皮細胞に追加した。ウイルスによる５日の感染後に、ＧＦＰ陽性細胞を数えた。図６Ｃは、補体の存在下または非存在下において得られる５０％の中和力価を示すグラフである。「３ｗｐ３」、３回目の免疫化の３週間後。単一のＣＭＶタンパク質を発現するＶＲＰ（ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ  ＶＲＰまたはｇＨ、ｇＬ、およびｇＯ  ＶＲＰの同時投与）は、ｇＨのみのものを超えて中和活性を増強しなかった。対照的に、バイシストロニックｇＨ／ｇＬまたはトリシストロニックｇＨ／ｇＬ／ｇＯ  ＶＲＰにより免疫化したマウス由来の血清は、強力な中和応答を実証した。さらに、強力な中和応答は、モルモット補体の存在下および非存在下において類似しており、ポリシストロニックＶＲＰが補体非依存性免疫応答を成功裏に誘発したことを示した。実施例４を参照されたい。
【図６Ｂ】図６は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてｇＨ／ｇＬ複合体形成に影響を及ぼすＶＲＰが、ｇＢ  ＶＲＰに対する応答より質的かつ量的に優れた、ＣＭＶに対する強力な免疫応答を誘発することを示す。図６Ａおよび図６Ｂは、補体の存在下（図６Ａ）または非存在下（図６Ｂ）においてＡＲＰＥ−１９細胞のＴＢ４０−ＵＬ３２−ＥＧＦＰ感染の中和における、ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｇＨ＋ｇＬ、ｇＨ＋ｇＬ＋ｇＯ、ｇＨ／ｇＬ、およびｇＨ／ｇＬ／ｇＯ  ＶＲＰ免疫化マウスについての血清希釈曲線を示す。血清の様々な希釈物は、モルモット補体の存在下または非存在下においてＴＢ４０ＵＬ３２Ｅ−ＧＦＰと共にあらかじめインキュベートし、その後、ＡＲＰＥ−１９上皮細胞に追加した。ウイルスによる５日の感染後に、ＧＦＰ陽性細胞を数えた。図６Ｃは、補体の存在下または非存在下において得られる５０％の中和力価を示すグラフである。「３ｗｐ３」、３回目の免疫化の３週間後。単一のＣＭＶタンパク質を発現するＶＲＰ（ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ  ＶＲＰまたはｇＨ、ｇＬ、およびｇＯ  ＶＲＰの同時投与）は、ｇＨのみのものを超えて中和活性を増強しなかった。対照的に、バイシストロニックｇＨ／ｇＬまたはトリシストロニックｇＨ／ｇＬ／ｇＯ  ＶＲＰにより免疫化したマウス由来の血清は、強力な中和応答を実証した。さらに、強力な中和応答は、モルモット補体の存在下および非存在下において類似しており、ポリシストロニックＶＲＰが補体非依存性免疫応答を成功裏に誘発したことを示した。実施例４を参照されたい。
【図６Ｃ】図６は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてｇＨ／ｇＬ複合体形成に影響を及ぼすＶＲＰが、ｇＢ  ＶＲＰに対する応答より質的かつ量的に優れた、ＣＭＶに対する強力な免疫応答を誘発することを示す。図６Ａおよび図６Ｂは、補体の存在下（図６Ａ）または非存在下（図６Ｂ）においてＡＲＰＥ−１９細胞のＴＢ４０−ＵＬ３２−ＥＧＦＰ感染の中和における、ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｇＨ＋ｇＬ、ｇＨ＋ｇＬ＋ｇＯ、ｇＨ／ｇＬ、およびｇＨ／ｇＬ／ｇＯ  ＶＲＰ免疫化マウスについての血清希釈曲線を示す。血清の様々な希釈物は、モルモット補体の存在下または非存在下においてＴＢ４０ＵＬ３２Ｅ−ＧＦＰと共にあらかじめインキュベートし、その後、ＡＲＰＥ−１９上皮細胞に追加した。ウイルスによる５日の感染後に、ＧＦＰ陽性細胞を数えた。図６Ｃは、補体の存在下または非存在下において得られる５０％の中和力価を示すグラフである。「３ｗｐ３」、３回目の免疫化の３週間後。単一のＣＭＶタンパク質を発現するＶＲＰ（ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ  ＶＲＰまたはｇＨ、ｇＬ、およびｇＯ  ＶＲＰの同時投与）は、ｇＨのみのものを超えて中和活性を増強しなかった。対照的に、バイシストロニックｇＨ／ｇＬまたはトリシストロニックｇＨ／ｇＬ／ｇＯ  ＶＲＰにより免疫化したマウス由来の血清は、強力な中和応答を実証した。さらに、強力な中和応答は、モルモット補体の存在下および非存在下において類似しており、ポリシストロニックＶＲＰが補体非依存性免疫応答を成功裏に誘発したことを示した。実施例４を参照されたい。
【図７Ａ】図７は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてｇＨ／ｇＬ複合体形成に影響を及ぼすＶＲＰが、ＭＲＣ−５線維芽細胞の細胞の感染を強力に中和する抗体を誘発したことを示す図である。図７Ａは、補体の非存在下におけるＭＲＣ−５細胞における、ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｇＨ＋ｇＬ、ｇＨ＋ｇＬ＋ｇＯ、ｇＨ／ｇＬ、およびｇＨ／ｇＬ／ｇＯ  ＶＲＰ免疫化マウスについての血清希釈曲線を示す。血清の様々な希釈物は、モルモット補体の存在下または非存在下においてＴＢ４０ＧＦＰと共にあらかじめインキュベートし、その後、ＭＲＣ−５線維芽細胞の細胞に追加した。ウイルスによる５日の感染後に、ＧＦＰ陽性細胞を数えた。図７Ｂは、補体の非存在下においてＭＲＣ−５線維芽細胞の細胞モデルにおいて得られた５０％の中和力価を示すグラフである。「３ｗｐ３」、３回目の免疫化の３週間後。単一のＣＭＶタンパク質を発現するＶＲＰ（ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ  ＶＲＰまたはｇＨ、ｇＬ、およびｇＯ  ＶＲＰの同時投与）は、ｇＨのみのものを超えて中和活性を増強しなかった。対照的に、バイシストロニックｇＨ／ｇＬまたはトリシストロニックｇＨ／ｇＬ／ｇＯ  ＶＲＰにより免疫化したマウス由来の血清は、非常に強力な中和応答を実証した。実施例４を参照されたい。
【図７Ｂ】図７は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてｇＨ／ｇＬ複合体形成に影響を及ぼすＶＲＰが、ＭＲＣ−５線維芽細胞の細胞の感染を強力に中和する抗体を誘発したことを示す図である。図７Ａは、補体の非存在下におけるＭＲＣ−５細胞における、ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｇＨ＋ｇＬ、ｇＨ＋ｇＬ＋ｇＯ、ｇＨ／ｇＬ、およびｇＨ／ｇＬ／ｇＯ  ＶＲＰ免疫化マウスについての血清希釈曲線を示す。血清の様々な希釈物は、モルモット補体の存在下または非存在下においてＴＢ４０ＧＦＰと共にあらかじめインキュベートし、その後、ＭＲＣ−５線維芽細胞の細胞に追加した。ウイルスによる５日の感染後に、ＧＦＰ陽性細胞を数えた。図７Ｂは、補体の非存在下においてＭＲＣ−５線維芽細胞の細胞モデルにおいて得られた５０％の中和力価を示すグラフである。「３ｗｐ３」、３回目の免疫化の３週間後。単一のＣＭＶタンパク質を発現するＶＲＰ（ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ  ＶＲＰまたはｇＨ、ｇＬ、およびｇＯ  ＶＲＰの同時投与）は、ｇＨのみのものを超えて中和活性を増強しなかった。対照的に、バイシストロニックｇＨ／ｇＬまたはトリシストロニックｇＨ／ｇＬ／ｇＯ  ＶＲＰにより免疫化したマウス由来の血清は、非常に強力な中和応答を実証した。実施例４を参照されたい。
【図８Ａ】図８Ａおよび８Ｂは、ポリシストロニックＶＲＰの送達によって誘発された中和抗体が交差中和抗体であったことを示すグラフである。ｇＨ／ｇＬおよびｇＨ／ｇＬ／ｇＯ  ＶＲＰにより免疫化したマウス由来の血清は、ＩＥ−１中和アッセイにおいて、モルモット補体の非存在下において、ＡＲＰＥ−１９上皮細胞（図８Ａ）およびＭＲＣ−５線維芽細胞の細胞（図８Ｂ）の両方において、ＣＭＶのＴＢ４０ＵＬ３２Ｅ−ＧＦＰおよびＶＲ１８１４臨床株を中和することができた。
【図８Ｂ】図８Ａおよび８Ｂは、ポリシストロニックＶＲＰの送達によって誘発された中和抗体が交差中和抗体であったことを示すグラフである。ｇＨ／ｇＬおよびｇＨ／ｇＬ／ｇＯ  ＶＲＰにより免疫化したマウス由来の血清は、ＩＥ−１中和アッセイにおいて、モルモット補体の非存在下において、ＡＲＰＥ−１９上皮細胞（図８Ａ）およびＭＲＣ−５線維芽細胞の細胞（図８Ｂ）の両方において、ＣＭＶのＴＢ４０ＵＬ３２Ｅ−ＧＦＰおよびＶＲ１８１４臨床株を中和することができた。
【図９】図９は、ｇＨ  ＦＬ／ｇＬに対して引き起こされた中和抗体が、補体非依存性であり、力価において自然免疫に類似していたことを示すグラフである。マウスは、最終的な採血（ｂｌｅｅｄ）前に、１×１０６  ＩＵでｇＢ  ＦＬまたはｇＨ  ＦＬ／ｇＬ  ＶＲＰにより３回３週間間隔で免疫化した。血清は、中和アッセイにおいて、モルモット補体の存在下および非存在下において、ＡＲＰＥ−１９細胞のＴＢ４０ＵＬ３２Ｅ−ＥＧＦＰ  ＣＭＶ感染を中和する能力について分析した。ｇＢによって引き起こされた抗体と異なり、ｇＨ  ＦＬ／ｇＬによって引き起こされた抗体は、補体非依存性である。さらに、これらのワクチン接種したマウスにおけるｇＨ  ＦＬ／ｇＬ抗体は、自然に感染したヒト被験体において見つけられるものに力価において類似していた。
【図１０】図１０は、ｐＶＣＲ修飾ｇＨ−ＳＧＰｇＬ−ＳＧＰｇＯについてのプラスミドマップを示す。
【図１１】図１１は、ｐＶＣＲ修飾ｇＨ−ＳＧＰｇＬについてのプラスミドマップを示す。
【図１２】図１２は、ｐＶＣＲ修飾ｇＨ  ｓｏｌ−ＳＧＰｇＬについてのプラスミドマップを示す。
【図１３】図１３は、ｐＶＣＲ修飾ｇＨ  ｓｏｌ−ＳＧＰｇＬ−ＳＧＰｇＯについてのプラスミドマップを示す。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜１４Ｇは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）およびＣＭＶ表面糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）をコードするＡ１６０自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＨおよびｇＬをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。
【図１４Ｂ】図１４Ａ〜１４Ｇは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）およびＣＭＶ表面糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）をコードするＡ１６０自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＨおよびｇＬをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。
【図１４Ｃ】図１４Ａ〜１４Ｇは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）およびＣＭＶ表面糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）をコードするＡ１６０自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＨおよびｇＬをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。
【図１４Ｄ】図１４Ａ〜１４Ｇは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）およびＣＭＶ表面糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）をコードするＡ１６０自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＨおよびｇＬをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。
【図１４Ｅ】図１４Ａ〜１４Ｇは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）およびＣＭＶ表面糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）をコードするＡ１６０自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＨおよびｇＬをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。
【図１４Ｆ】図１４Ａ〜１４Ｇは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）およびＣＭＶ表面糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）をコードするＡ１６０自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＨおよびｇＬをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。
【図１４Ｇ】図１４Ａ〜１４Ｇは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）およびＣＭＶ表面糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）をコードするＡ１６０自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＨおよびｇＬをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜１５Ｈは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｈの可溶性形態（ｇＨｓｏｌ）およびＣＭＶ表面糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）をコードするＡ３２２自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＨｓｏｌおよびｇＬをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。
【図１５Ｂ】図１５Ａ〜１５Ｈは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｈの可溶性形態（ｇＨｓｏｌ）およびＣＭＶ表面糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）をコードするＡ３２２自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＨｓｏｌおよびｇＬをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。
【図１５Ｃ】図１５Ａ〜１５Ｈは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｈの可溶性形態（ｇＨｓｏｌ）およびＣＭＶ表面糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）をコードするＡ３２２自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＨｓｏｌおよびｇＬをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。
【図１５Ｄ】図１５Ａ〜１５Ｈは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｈの可溶性形態（ｇＨｓｏｌ）およびＣＭＶ表面糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）をコードするＡ３２２自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＨｓｏｌおよびｇＬをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。
【図１５Ｅ】図１５Ａ〜１５Ｈは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｈの可溶性形態（ｇＨｓｏｌ）およびＣＭＶ表面糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）をコードするＡ３２２自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＨｓｏｌおよびｇＬをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。
【図１５Ｆ】図１５Ａ〜１５Ｈは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｈの可溶性形態（ｇＨｓｏｌ）およびＣＭＶ表面糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）をコードするＡ３２２自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＨｓｏｌおよびｇＬをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。
【図１５Ｇ】図１５Ａ〜１５Ｈは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｈの可溶性形態（ｇＨｓｏｌ）およびＣＭＶ表面糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）をコードするＡ３２２自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＨｓｏｌおよびｇＬをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。
【図１５Ｈ】図１５Ａ〜１５Ｈは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｈの可溶性形態（ｇＨｓｏｌ）およびＣＭＶ表面糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）をコードするＡ３２２自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＨｓｏｌおよびｇＬをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。
【図１６Ａ】図１６Ａ〜１６Ｈは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）をコードするＡ３２３自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＢをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。
【図１６Ｂ】図１６Ａ〜１６Ｈは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）をコードするＡ３２３自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＢをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。
【図１６Ｃ】図１６Ａ〜１６Ｈは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）をコードするＡ３２３自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＢをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。
【図１６Ｄ】図１６Ａ〜１６Ｈは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）をコードするＡ３２３自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＢをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。
【図１６Ｅ】図１６Ａ〜１６Ｈは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）をコードするＡ３２３自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＢをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。
【図１６Ｆ】図１６Ａ〜１６Ｈは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）をコードするＡ３２３自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＢをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。
【図１６Ｇ】図１６Ａ〜１６Ｈは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）をコードするＡ３２３自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＢをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。
【図１６Ｈ】図１６Ａ〜１６Ｈは、ＣＭＶ表面糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）をコードするＡ３２３自己複製ＲＮＡ分子をコードするプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号＿＿＿＿＿＿）を示す。ｇＢをコードするヌクレオチド配列に下線を引く。
【図１７】図１７Ａおよび１７Ｂは、ＶＲＰまたは自己複製ＲＮＡにより免疫化されたマウス由来の血清の５０％の中和性の力価を示すヒストグラムである。図１７Ａは、ＡＲＰＥ−１９細胞上でのヒトＣＭＶ株ＴＢ４０ＵＬ３２Ｅ−ＥＧＦＰ（「ＴＢ４０）に対する５０％の中和性の力価を示し、図１７Ｂは、ＡＲＰＥ−１９細胞上でのヒトＣＭＶ株８８１９に対する５０％の中和性の力価を示す。
【図１８】図１８は、５つのＣＭＶタンパク質をコードするペンタシストロニックＲＮＡレプリコン、Ａ５２６、Ａ５２７、Ａ５５４、Ａ５５５、およびＡ５５６の図である。サブゲノムプロモーターは、矢印によって示され、他の制御エレメントは標識される。
【図１９】図１９は、Ａ５２７  ＲＮＡレプリコンによりトランスフェクトされたＢＨＫＶ細胞が、ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合体を発現することを示す蛍光ヒストグラムである。細胞染色は、五量体複合体上に存在するコンフォメーション性エピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ）に結合する抗体を使用して実行した（Ｍａｃａｇｎｏ（２０１０年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．８４巻（２号）：１００５〜１３頁）。
【図２０】図２０は、図およびグラフである。図は、ＣＭＶ  ｇＨおよびｇＬをコードするバイシストロニックＲＮＡレプリコン、Ａ１６０およびＡ５３１〜Ａ５３７を示す。グラフは、レプリコンを含有するＶＲＰにより免疫化されたマウス由来の免疫血清の中和活性を示す。
【図２１】図２１は、ＶＺＶタンパク質をコードしたモノシストロニックＲＮＡレプリコンまたはＶＺＶ  ｇＥおよびｇＩもしくはｇＨおよびｇＬをコードしたバイシストロニックＲＮＡレプリコンにより免疫化されたマウス由来の免疫血清において抗ＶＺＶタンパク質抗体応答を示すグラフである。マウスは、ＣＮＥと共に処方された７μｇ  ＲＮＡにより免疫化した（実施例７を参照されたい）。
【図２２】図２２は、ＶＺＶタンパク質をコードしたモノシストロニックＲＮＡレプリコンまたはＶＺＶ  ｇＥおよびｇＩもしくはｇＨおよびｇＬをコードしたバイシストロニックＲＮＡレプリコンにより免疫化されたマウス由来の免疫血清において抗ＶＺＶタンパク質抗体応答を示すグラフである。マウスは、ＣＮＥと共に処方された１μｇ  ＲＮＡにより免疫化した（実施例７を参照されたい）。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）タンパク質などのヘルペスウイルスタンパク質、特に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて複合体を形成するタンパク質を細胞に同時送達するためのプラットフォームを提供する。いくつかの実施形態では、これらのタンパク質およびそれらが形成する複合体は、強力な中和抗体を誘発する。ヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）タンパク質、特に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて複合体を形成するもの（たとえばｇＨ／ｇＬ）の同時送達によってもたらされる免疫応答は、他のアプローチを使用してもたらされる免疫応答より優れたものとなり得る。たとえば、ＣＭＶのｇＨおよびｇＬの両方をコードするＲＮＡ分子（たとえばレプリコン）は、ｇＢをコードするＲＮＡ分子、ｇＨをコードするＲＮＡ分子、ｇＬをコードするＲＮＡ分子、またはさらにｇＨまたはｇＬを個々にコードするＲＮＡ分子の混合物と比較して、より良好な中和性の力価および／または防御免疫を誘発することができる。さらに、ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１をコードするレプリコンは、ｇＨ／ｇＬのみをコードするものより優れた応答を提供することができる。
【００２９】
一般的な態様では、本発明は、２つ以上のヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）タンパク質を細胞に送達するためのプラットフォームに関する。プラットフォームは、第１のヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）タンパク質またはその断片をコードする第１の配列および第２のヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）タンパク質またはその断片をコードする第２の配列を含有する組換えポリシストロニック核酸分子を含む。所望の場合、追加のタンパク質をコードする１つまたは複数の追加の配列、たとえば、第３のヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）タンパク質またはその断片、第４のヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）タンパク質またはその断片、第５のヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）タンパク質またはその断片などは、組換えポリシストロニック核酸分子において存在することができる。ヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）タンパク質またはその断片をコードする配列は、ヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）タンパク質または断片が組換えポリシストロニック核酸を含有する細胞によって産生されるように、１つまたは複数の適した制御エレメントに作動可能に連結されている。
【００３０】
本明細書において記載されるポリシストロニック核酸において、コードされる第１および第２のヘルペスウイルスタンパク質または断片ならびにコードされる第３、第４、および第５のヘルペスウイルスタンパク質または断片は、存在する場合、一般的に、また好ましくは、同じヘルペスウイルス由来のものである。ある例において、ポリシストロニックベクターによってコードされるヘルペスウイルスタンパク質または断片はすべて、ＣＭＶタンパク質またはＶＺＶタンパク質である。
【００３１】
本明細書において記載される組換えポリシストロニック核酸分子は、細胞に、２つ以上のヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）タンパク質をコードする配列を送達し、かつｉｎ  ｖｉｖｏにおいて２つ以上のヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）タンパク質を含有するタンパク質複合体の形成をもたらすのに十分なレベルでヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）タンパク質の発現を駆動する利点を提供する。このアプローチを使用して、２つ以上のコードされるヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）タンパク質は、ヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）タンパク質複合体（たとえばｇＨ／ｇＬ）の形成に十分な細胞内レベルで発現させることができる。たとえば、コードされるヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）タンパク質またはその断片は、適切な発現制御配列（たとえばプロモーター、ＩＲＥＳ、２Ａ部位など）を選択することによって、実質的に同じレベルでまたは所望の場合、異なるレベルで発現させることができる。これは、非効率的で、非常に変わりやすいものとなり得る、異なるヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）をコードする２つ以上の個々のＤＮＡ分子を同じ細胞に同時送達することよりも、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてタンパク質複合体を産生するための著しくより効率的な方法である。たとえば、国際公開第２００４／０７６６４５号を参照されたい。
【００３２】
組換えポリシストロニック核酸分子は、ＤＮＡ（たとえばプラスミドもしくはウイルスＤＮＡ）またはＲＮＡなどの任意の所望の核酸に基づくものであり得る。任意の適したＤＮＡまたはＲＮＡは、ヘルペスウイルス（たとえばＣＭＶ）タンパク質またはその断片をコードするオープンリーディングフレームを持つ核酸ベクターとして使用することができる。適した核酸ベクターは、１つを超えるタンパク質遺伝子を持ち、その発現を駆動するための能力を有する。そのような核酸ベクターは、当技術分野において公知であり、たとえばプラスミド、ワクシニアウイルスベクター（たとえばＮＹＶＡＣ、米国特許第５，４９４，８０７号を参照されたい）およびポックスウイルスベクター（たとえばＡＬＶＡＣカナリアポックスベクター、Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ）などのＤＮＡウイルスから得られるＤＮＡ、ならびにアルファウイルスなどの適したＲＮＡウイルスから得られるＲＮＡを含む。所望の場合、組換えポリシストロニック核酸分子は、修飾することができる、たとえば、本明細書においてさらに記載される修飾核酸塩基および／または連結を含有することができる。好ましくは、ポリシストロニック核酸分子は、ＲＮＡ分子である。
【００３３】
いくつかの態様では、組換えポリシストロニック核酸分子は、プラスミドＤＮＡなどのＤＮＡ分子である。そのようなＤＮＡ分子は、たとえば、ポリシストロニックレプリコンをコードし、レプリコンの転写を駆動する哺乳動物プロモーターを含有することができる。組換えポリシストロニック核酸分子またはこのタイプは、哺乳動物に投与され得、その後、ヘルペスウイルスタンパク質を発現するポリシストロニックレプリコンを産生するようにｉｎ  ｓｉｔｕにおいて転写され得る。
【００３４】
いくつかの態様では、本発明は、ヘルペスウイルスｇＨまたはその断片およびヘルペスウイルスｇＬまたはその断片をコードする配列を含有するポリシストロニック核酸分子である。ｇＨおよびｇＬタンパク質またはその断片は、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶ、ＥＢＶ１型、ＥＢＶ２型、ＣＭＶ、ＨＨＶ−６  Ａ型、ＨＨＶ−６  Ｂ型、ＨＨＶ−７、ＫＳＨＶ、およびその他同種のものなどの任意の所望のヘルペスウイルス由来のものであり得る。好ましくは、ヘルペスウイルスは、ＶＺＶ、ＨＳＶ−２、ＨＳＶ−１、ＥＢＶ（１型もしくは２型）、またはＣＭＶである。より好ましくは、ヘルペスウイルスは、ＶＺＶ、ＨＳＶ−２、またはＣＭＶである。さらにより好ましくは、ヘルペスウイルスは、ＣＭＶである。ｇＨおよびｇＬタンパク質ならびにこれらのウイルス由来のタンパク質をコードする核酸の配列は、当技術分野において周知である。例示的な配列は、表１で特定される。ポリシストロニック核酸分子は、表１に開示されるｇＨタンパク質をコードする第１の配列もしくはその断片またはそれと少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含有することができる。ポリシストロニック核酸分子はまた、表１に開示されるｇＬタンパク質をコードする第２の配列もしくはその断片またはそれと少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列をも含有することができる。
【００３５】
【表１】
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本発明の本記載において、特定の配列成分は、核酸の明確な記載を容易にするために「第１の配列」、「第２の配列」などと呼ばれる。第１および第２の配列は、任意の所望の順序または方向で現れ得、特定の順序または方向は、「第１の」、「第２の」などの語によって意図されないことが理解される。同様に、タンパク質複合体は、複合体において存在するタンパク質、たとえばｇＨ／ｇＬを列挙することによって言及される。これは、複合体において存在するタンパク質によって複合体を記載するように意図され、タンパク質の相対量または組換え核酸上でタンパク質をコードする配列の順序もしくは方向を示すものではない。
【００３６】
ＣＭＶタンパク質をコードする配列を含有するアルファウイルスＶＲＰおよび自己複製ＲＮＡなどのある種の好ましい実施形態は、本明細書においてさらに記載される。そのような好ましい実施形態におけるＣＭＶタンパク質をコードする配列は、他のヘルペスウイルス由来のｇＨおよびｇＬなどのタンパク質をコードする配列と交換することができることが意図される。
【００３７】
アルファウイルスＶＲＰプラットフォーム
いくつかの実施形態では、ＣＭＶタンパク質は、下記に記載されるポリシストロニックレプリコン（またはベクター）を用いるアルファウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）を使用して、細胞に送達される。本明細書において使用されるように、「ポリシストロニック」は、バイシストロニックベクターおよび３つ以上のシストロンを含むベクターを含む。ポリシストロニックベクターにおけるシストロンは、同じＣＭＶ株または異なるＣＭＶ株由来のＣＭＶタンパク質をコードすることができる。シストロンは、任意の５’−３’の順序で方向づけることができる。ＣＭＶタンパク質をコードする任意のヌクレオチド配列は、タンパク質を産生するために使用することができる。２つ以上のＣＭＶタンパク質またはその断片をコードするポリシストロニック核酸を調製するのに有用な例示的な配列は、本明細書において記載される。
【００３８】
本明細書において使用されるように、用語「アルファウイルス」は、当技術分野におけるその通常の意味を有し、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ；たとえばＴｒｉｎｉｄａｄ  ｄｏｎｋｅｙ、ＴＣ８３ＣＲなど）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、シンドビスウイルス、ロスリバーウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、チクングニヤウイルス、Ｓ．Ａ．ＡＲ８６ウイルス、エバーグレイズウイルス、ムカンボウイルス、バーマ森林ウイルス、ミッデルブルグウイルス、ピクスナウイルス、オニオニオンウイルス、ゲタウイルス、サギヤマウイルス、ベバルウイルス、マヤロウイルス、ユナウイルス、アウラウイルス、ワタロアウイルス、バンバンキウイルス（Ｂａｎｂａｎｋｉ  ｖｉｒｕｓ）、キジラガチウイルス（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ  ｖｉｒｕｓ）、ハイランドＪウイルス、フォートモーガンウイルス（Ｆｏｒｔ  Ｍｏｒｇａｎ  ｖｉｒｕｓ）、ヌドゥムウイルス、およびバギークリークウイルス（Ｂｕｇｇｙ  Ｃｒｅｅｋ  ｖｉｒｕｓ）などの様々な種を含む。アルファウイルスという用語はまた、１つを超えるアルファウイルス由来のゲノム配列を含有するキメラアルファウイルス（たとえばＰｅｒｒｉら、（２００３年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７７巻（１９号）：１０３９４〜４０３頁によって記載されるもの）をも含んでいてもよい。
【００３９】
「アルファウイルスレプリコン粒子」（ＶＲＰ）または「レプリコン粒子」は、アルファウイルス構造タンパク質によりパッケージされたアルファウイルスレプリコンである。
【００４０】
「アルファウイルスレプリコン」（または「レプリコン」）は、標的細胞においてｉｎ  ｖｉｖｏにおいてそれ自体の増幅を指示することができるＲＮＡ分子である。レプリコンは、ＲＮＡ増幅を触媒するポリメラーゼ（複数可）（ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードし、コードされるポリメラーゼ（複数可）によって認識され、利用される、複製に必要とされるシスＲＮＡ配列を含有する。アルファウイルスレプリコンは、典型的に、次の順序付けられたエレメントを含有する：複製のためにシスで必要とされる５’ウイルス配列、生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質（ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードする配列、複製のためにシスで必要とされる３’ウイルス配列、およびポリアデニレートトラクト（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｔｒａｃｔ）。アルファウイルスレプリコンはまた、異種ヌクレオチド配列の発現を指示する１つまたは複数のウイルスサブゲノム「ジャンクション領域」プロモーターを含有してもよく、これは、ある実施形態において、発現されることとなるサブゲノム断片および異種配列（複数可）のウイルス転写を増大させるまたは低下させるために修飾されてもよい。下記に記載される他の制御エレメントを使用することができる。
【００４１】
ＣＭＶタンパク質をコードするアルファウイルスレプリコンは、ＶＲＰを産生するために使用される。そのようなアルファウイルスレプリコンは、少なくとも２つのＣＭＶタンパク質またはその断片をコードする配列を含む。これらの配列は、同じまたは異なるものであり得る、サブゲノムプロモーター、ＩＲＥＳ（たとえばＥＭＣＶ、ＥＶ７１）、およびウイルス２Ａ部位などの１つまたは複数の適した制御エレメントに作動可能に連結されている。本明細書において開示されるポリシストロニックベクターを使用するこれらの複合体の成分の送達は、所望の相対量で２つ以上のＣＭＶタンパク質をコードする核酸配列を提供するための効率的な方法であるのに対して、複数のアルファウイルス構築物が、複合体形成のための個々のＣＭＶタンパク質を送達するために使用される場合、ＶＲＰの効率的な同時送達が、必要とされるであろう。
【００４２】
適した制御エレメントの任意の組み合わせもまた、任意の順序で使用することができる。一例では、単一のサブゲノムプロモーターは、２つの異なるＣＭＶタンパク質をコードする２つの配列に作動可能に連結されており、ＩＲＥＳは、２つのコード配列の間に位置づけられる。他の例では、２つの異なるＣＭＶタンパク質をコードする２つの配列は、別々のプロモーターに作動可能に連結されている。他の例では、２つの異なるＣＭＶタンパク質をコードする２つの配列は、単一のプロモーターに作動可能に連結されている。２つの異なるＣＭＶタンパク質をコードする２つの配列は、ウイルス２Ａ部位をコードするヌクレオチド配列を通して互いに連結されており、したがって、両方のＣＭＶタンパク質のアミノ酸配列を含有する単一のアミノ酸鎖をコードする。この文脈におけるウイルス２Ａ部位は、コードされるポリプロテインから２つのＣＭＶタンパク質を生成するために使用される。
【００４３】
サブゲノムプロモーター
ジャンクション領域プロモーターとしても公知であるサブゲノムプロモーターは、タンパク質発現を調節するために使用することができる。アルファウイルスのサブゲノムプロモーターは、アルファウイルスの構造タンパク質の発現を調節する。ＳｔｒａｕｓｓおよびＳｔｒａｕｓｓ、「Ｔｈｅ  ａｌｐｈａｖｉｒｕｓｅｓ：  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．１９９４年  ９月；５８巻（３号）：４９１〜５６２頁を参照されたい。ポリシストロニックポリヌクレオチドは、任意のアルファウイルス由来のサブゲノムプロモーターを含むことができる。２つ以上のサブゲノムプロモーターがポリシストロニックポリヌクレオチドにおいて存在する場合、そのプロモーターは、同じかまたは異なるものであり得る。たとえば、サブゲノムプロモーターは、配列ＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡ（配列番号＿＿＿）を有することができる。ある実施形態では、サブゲノムプロモーターは、タンパク質のウイルス転写を増大させるまたは低下させるために修飾することができる。米国特許第６，５９２，８７４号を参照されたい。
【００４４】
内部リボソーム導入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）（ＩＲＥＳ）
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の制御エレメントは、内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）である。ＩＲＥＳは、複数のタンパク質が単一のｍＲＮＡ転写物から作製されるのを可能にする。なぜなら、リボソームがそれぞれのＩＲＥＳに結合し、真核細胞においてタンパク質の翻訳を開始するために通常必要とされる５’キャップの非存在下において翻訳を開始するからである。たとえば、ＩＲＥＳは、ＥＶ７１またはＥＭＣＶであり得る。
【００４５】
ウイルス２Ａ部位
ＦＭＤＶ  ２Ａタンパク質は、非構造タンパク質（ＦＭＤＶ  ２Ｂ）からＦＭＤＶの構造タンパク質を隔てるための役目をする短いペプチドである。このペプチドに対する初期の研究は、それが自己触媒プロテアーゼとして作用することを示唆したが、他の研究（たとえばＤｏｎｎｅｌｌｙら、（２００１年）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２巻、１０１３〜１０２５頁）は、この短い配列およびこれに続くＦＭＤＶ  ２Ｂの単一のアミノ酸（Ｇｌｙ）が、翻訳の停止−開始点（ｓｔｏｐ−ｓｔａｒｔ）として作用することを示唆する。厳密な作用様式にかかわらず、配列を、２つのポリペプチドの間に挿入し、単一のオープンリーディングフレームからの複数の個々のポリペプチドの産生を達成することができる。本発明との関連において、ＦＭＤＶ  ２Ａ配列を、少なくとも２つのＣＭＶタンパク質をコードする配列の間に挿入することができ、単一のオープンリーディングフレームの一部としてそれらの合成を可能にする。たとえば、オープンリーディングフレームは、ウイルス２Ａ部位をコードする配列によって隔てられたｇＨタンパク質およびｇＬタンパク質をコードしてもよい。単一のｍＲＮＡは、その後、翻訳ステップの間に転写され、ｇＨおよびｇＬペプチドは、ウイルス２Ａ部位の活性により別々に産生される。任意の適したウイルス２Ａ配列が使用されてもよい。多くの場合、ウイルス２Ａ部位は、コンセンサス配列Ａｓｐ−Ｖａｌ／Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏを含み、ここでＸは、任意のアミノ酸である（配列番号＿＿＿）。たとえば、口蹄疫ウイルス２Ａペプチド配列は、ＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号＿＿＿）である。Ｔｒｉｃｈａｓら、「Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖｉｒａｌ  ２Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｏｒ  ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ」  ＢＭＣ  Ｂｉｏｌ．２００８年９月１５日；６巻：４０頁およびＨａｌｐｉｎら、「Ｓｅｌｆ−ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ２Ａ−ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎｓ−−ａ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃｏ−ｏｒｄｉｎａｔｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｌａｎｔｓ」  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１９９９年２月；１７巻（４号）：４５３〜９頁を参照されたい。
【００４６】
いくつかの実施形態では、アルファウイルスレプリコンは、ＶＥＥ−シンドビスキメラレプリコン（ＶＣＲ）またはＶＥＥ株ＴＣ８３レプリコン（ＴＣ８３Ｒ）またはＴＣ８３−シンドビスキメラレプリコン（ＴＣ８３ＣＲ）などのキメラレプリコンである。いくつかの実施形態では、ＶＣＲは、ＶＥＥレプリコンのｎｓＰ３における配列の代わりに、また３’末端に、シンドビスレプリコン由来のパッケージングシグナルおよび３’ＵＴＲを含有する；Ｐｅｒｒｉら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７７巻、１０３９４〜４０３頁、２００３年を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＴＣ８３ＣＲは、ＶＥＥ株ＴＣ８３レプリコンのｎｓＰ３における配列の代わりに、また３’末端に、シンドビスレプリコン由来のパッケージングシグナルおよび３’ＵＴＲを含有する。
【００４７】
ＶＲＰの産生
ＶＲＰを調製するための方法は、当技術分野において周知である。いくつかの実施形態では、アルファウイルスは、パッケージング細胞を使用してＶＲＰに構築される。「アルファウイルスパッケージング細胞」（または「パッケージング細胞」）は、１つまたは複数のアルファウイルス構造タンパク質発現カセットを含有し、アルファウイルスレプリコン、真核生物層状ベクター開始系（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｌａｙｅｒｅｄ  ｖｅｃｔｏｒ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）（たとえば米国特許第５，８１４，４８２号）、または組換えアルファウイルス粒子の導入後に組換えアルファウイルス粒子を産生する細胞である。１つまたは複数の異なるアルファウイルス構造タンパク質カセットは、アルファウイルス構造タンパク質を提供することによって「ヘルパー」としての役目をする。「アルファウイルス構造タンパク質カセット」は、１つまたは複数のアルファウイルス構造タンパク質をコードし、アルファウイルスレプリカーゼ認識配列の少なくとも１つ、５つまでのコピー（つまり１、２、３、４、または５）を含む発現カセットである。構造タンパク質発現カセットは、典型的に、５’から３’に、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始する５’配列、任意選択のアルファウイルスサブゲノム領域プロモーター、アルファウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列、３’非翻訳領域（これはまた、ＲＮＡ転写をも指示する）、およびポリＡトラクト（ｐｏｌｙＡ  ｔｒａｃｔ）を含む。たとえば、国際公開第２０１０／０１９４３７号を参照されたい。
【００４８】
好ましい実施形態では、２つの異なるアルファウイルス構造タンパク質カセット（「分割された」不完全ヘルパー）は、複製能力のあるウイルスを産生し得る組換え事象を最小限にするために、パッケージング細胞において使用される。いくつかの実施形態では、アルファウイルス構造タンパク質カセットは、カプシドタンパク質（Ｃ）をコードするが、どちらの糖タンパク質（Ｅ２およびＥ１）もコードしない。いくつかの実施形態では、アルファウイルス構造タンパク質カセットは、カプシドタンパク質およびＥ１またはＥ２糖タンパク質のいずれか（両方ではない）をコードする。いくつかの実施形態では、アルファウイルス構造タンパク質カセットは、Ｅ２およびＥ１糖タンパク質をコードするが、カプシドタンパク質をコードしない。いくつかの実施形態では、アルファウイルス構造タンパク質カセットは、Ｅ１またはＥ２糖タンパク質（両方ではない）をコードするが、カプシドタンパク質をコードしない。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ＶＲＰは、様々な供給源の細胞の中へのレプリコンおよびヘルパーＲＮＡの同時の導入によって産生される。これらの条件下で、たとえば、ＢＨＫＶ細胞（１×１０７）は、１０μｇレプリコンＲＮＡ：６μｇ不完全ヘルパーＣａｐ  ＲＮＡ：１０μｇ不完全ヘルパーＧｌｙ  ＲＮＡを、たとえば２２０ボルト、１０００μＦ、２つの手動のパルスでエレクトロポレーションされ、アルファウイルス含有上清は、約２４時間後に収集される。レプリコンおよび／またはヘルパーはまた、トランスフェクトされた細胞内に適したＲＮＡを送り出すＤＮＡ形態で導入することもできる。
【００５０】
パッケージング細胞は、哺乳動物細胞または昆虫細胞（たとえばＳＦ９）またはトリの細胞（たとえば初代ニワトリもしくはアヒル線維芽細胞もしくは線維芽細胞細胞株）などの非哺乳動物細胞であってもよい。米国特許第７，４４５，９２４号を参照されたい。細胞のトリの供給源は、ＥＢ６６（登録商標）（ＶＩＶＡＬＩＳ）などのトリの胚性幹細胞；ＥＢｘ（登録商標）細胞、ニワトリ胚性線維芽細胞、およびニワトリ胚性生殖細胞などのニワトリ胚性幹細胞を含むニワトリ細胞；たとえばＶａｃｃｉｎｅ  ２７巻：４９７５〜４９８２頁（２００９年）および国際公開第２００５／０４２７２８号において記載されるＡＧＥ１．ＣＲおよびＡＧＥ１．ＣＲ．ｐＩＸ細胞株（ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ）などのアヒル細胞；ならびにガチョウ細胞を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、パッケージング細胞は、ＡＧＥ．ＣＲ（ＰＲＯＢＩＯＧＥＮ）などの初代アヒル線維芽細胞またはアヒル網膜細胞株である。
【００５１】
同時の核酸導入および／またはパッケージング細胞のための細胞の哺乳動物の供給源は、たとえば国際公開第０１／３８３６２号および国際公開第０２／４０６６５号において記載され、ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０下で寄託されるＰｅｒＣ６（ＰＥＲ．Ｃ６）細胞（ＣＲＵＣＥＬＬ  Ｎ．Ｖ．）；ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１７１）；ＷＩ−３８（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−７５）；胎児アカゲザル肺細胞（ＡＴＣＣ  ＣＬ−１６０）；ヒト胎児腎臓細胞（たとえば剪断されたアデノウイルス５型ＤＮＡによって典型的に形質転換された２９３細胞）；サル腎臓由来のＶＥＲＯ細胞を含むヒトまたは非ヒト霊長類細胞；ウマ、ウシ（たとえばＭＤＢＫ細胞）、ヒツジ、イヌ（たとえば、国際公開第９７／３７００１号において記載されるようなイヌ腎臓由来のＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４  ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）、またはＭＤＣＫ  ３３０１６、寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９）の細胞；ネコ、ならびにげっ歯類（たとえば、ＢＨＫ２１−Ｆ、ＨＫＣＣ細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などのハムスター細胞）を含むが、これらに限定されず、たとえば成体、新生児、胎児、および胚を含む種々様々の発生段階から取得され得る。
【００５２】
いくつかの実施形態では、パッケージング細胞は、１つまたは複数の構造タンパク質発現カセット（複数可）により安定して形質転換される。構造タンパク質発現カセットは、トランスフェリン−ポリカチオン媒介性のＤＮＡ移行（ＤＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）、裸の核酸または被包された核酸でのトランスフェクション、リポソーム媒介性の細胞融合、ＤＮＡでコーティングされたラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、エレクトロポレーション、「遺伝子銃」法、およびＤＥＡＥまたはリン酸カルシウム媒介性のトランスフェクションを含む、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、細胞の中に導入することができる。構造タンパク質発現カセットは、ＤＮＡ分子として宿主細胞の中に典型的に導入されるが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡとして導入することもできる。発現カセットはそれぞれ、別々にまたは実質的に同時に導入することができる。
【００５３】
いくつかの実施形態では、安定したアルファウイルスパッケージング細胞株は、組換えアルファウイルス粒子を産生するために使用される。これらは、それらのゲノムの中に安定して組み込まれる不完全ヘルパーＲＮＡを発現するＤＮＡカセットを含むアルファウイルス許容細胞である。Ｐｏｌｏら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６巻、４５９８〜６０３頁、１９９９年を参照されたい。ヘルパーＲＮＡは、構成的に発現されるが、アルファウイルス構造タンパク質は、遺伝子がアルファウイルスサブゲノムプロモーターの制御下にあるので、そうではない（Ｐｏｌｏら、１９９９年）。トランスフェクションまたはＶＲＰ感染によるパッケージング細胞のゲノムの中へのアルファウイルスレプリコンの導入に際して、レプリカーゼ酵素は、産生され、ヘルパーＲＮＡ上でカプシドおよび糖タンパク質遺伝子の発現を引き起こし、結果としてＶＲＰが産生される。レプリコンの導入は、アルファウイルスレプリコン粒子のシードストックによるトランスフェクションおよび感染の両方を含む様々な方法によって達成することができる。その後、パッケージング細胞は、培養上清中にパッケージされたアルファウイルスレプリコン粒子を産生するのに十分な条件下でかつ十分な時間、インキュベートされる。
【００５４】
したがって、パッケージング細胞は、ＶＲＰが自己増殖ウイルスとして作用するのを可能にする。この技術は、ＶＲＰが、弱毒化生ワクチンまたはアデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子を発現する細胞において成長させた複製能力がないアデノウイルスベクターなどの入手可能なプロデューサー細胞株を有する他のウイルスベクターに使用されるものとほとんど同じ様式で、また同じ設備を使用して産生されるのを可能にする。
【００５５】
いくつかの実施形態では、２ステップのプロセスが、使用され、第１のステップは、レプリコンＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡベースのレプリコンによりパッケージング細胞をトランスフェクトすることによってアルファウイルスレプリコン粒子のシードストックを産生することを含む。その後、レプリコン粒子のはるかに多くのストックは、シードストックによりパッケージング細胞の新鮮な培養物を感染させることによって、第２のステップにおいて産生される。この感染は、ＭＯＩ＝０．００００１、０．００００５、０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、３、５、１０、または２０を含む、様々な感染多重度（ＭＯＩ）を使用して実行することができる。いくつかの実施形態では、感染は、低いＭＯＩ（たとえば１未満）で実行される。ある期間にわたって、レプリコン粒子は、シードストックにより感染させたパッケージング細胞から収集することができる。いくつかの実施形態では、その後、レプリコン粒子は、繰り返しの低多重度の感染によって、ナイーブパッケージング細胞のさらにより多くの培養物において継代され得、同一の高い力価を有する商業規模の調製物をもたらすことができる。
【００５６】
自己複製ＲＮＡプラットフォーム
２つ以上のＣＭＶタンパク質は、被験体の細胞における、タンパク質をコードする組換え核酸の発現によって産生することができる。好ましくは、組換え核酸分子は、２つ以上のＣＭＶタンパク質をコードし、たとえばこれらはポリシストロニックである。上記に定義されるように、「ポリシストロニック」は、バイシストロニックを含む。ＣＭＶタンパク質の産生を引き起こすために被験体に投与することができる好ましい核酸は、自己複製ＲＮＡ分子である。本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡに基づくが、１つまたは複数の構造タンパク質をコードする遺伝子を欠く。自己複製ＲＮＡ分子は、自己複製ＲＮＡによってコードされるＲＮＡウイルスの非構造タンパク質およびＣＭＶタンパク質を産生するために翻訳することができる。
【００５７】
自己複製ＲＮＡは、一般的に、ウイルスレプリカーゼ、ウイルスプロテアーゼ、ウイルスヘリカーゼ、および他の非構造ウイルスタンパク質から成る群から選択される少なくとも１つまたは複数の遺伝子を含有し、また、５’および３’末端シス活性複製配列ならびに２つ以上の所望のＣＭＶタンパク質をコードする異種配列を含む。異種配列（複数可）の発現を指示するサブゲノムプロモーターは、自己複製ＲＮＡ中に含むことができる。所望の場合、異種配列は、自己複製ＲＮＡにおける他のコード領域に対してインフレームで融合されてもよいおよび／または内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）の制御下にあってもよい。
【００５８】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、自己複製ＲＮＡ分子が感染性ウイルス粒子の産生を誘発することができないように、設計することができる。これは、たとえば、自己複製ＲＮＡにおけるウイルス粒子の産生に必要な構造タンパク質をコードする１つまたは複数のウイルス遺伝子を取り除くことによって達成することができる。たとえば、自己複製ＲＮＡ分子が、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、セムリキ森林ウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）などのアルファウイルスに基づくものである場合、カプシドおよび／またはエンベロープ糖タンパク質などのウイルス構造タンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子は、取り除くことができる。所望の場合、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、弱毒化されたもしくは毒性のある感染性ウイルス粒子の産生を誘発するようにまたは１回の続く感染が可能なウイルス粒子を産生するように設計することができる。
【００５９】
自己複製ＲＮＡ分子は、あらゆるタンパク質がなくても、脊椎動物細胞に送達された場合、それ自体からの（またはそれ自体のアンチセンスコピーからの）転写によって複数の娘ＲＮＡの産生を導くことができる。自己複製ＲＮＡは、細胞に送達した後に、直接翻訳することができ、この翻訳は、送達されたＲＮＡから転写物をその後産生するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを提供する。したがって、送達されたＲＮＡは、複数の娘ＲＮＡの産生を導く。これらの転写物は、送達されたＲＮＡに関してアンチセンスであり、コードされるＣＭＶタンパク質のｉｎ  ｓｉｔｕ発現をもたらすためにそれら自体翻訳されてもよいまたはコードされるＣＭＶタンパク質（複数可）のｉｎ  ｓｉｔｕ発現を提供するために翻訳される、送達されたＲＮＡと同じセンスを有する転写物をさらに提供するために転写されてもよい。
【００６０】
自己複製を達成するのに適したある系は、本明細書において記載されるようなアルファウイルスレプリコンなどのアルファウイルスベースのＲＮＡレプリコンを使用することである。これらの＋鎖レプリコンは、レプリカーゼ（またはレプリカーゼ−トランスクリプターゼ）を産生するために細胞に送達した後に翻訳される。レプリカーゼは、＋鎖送達ＲＮＡのゲノム−鎖コピーを生成する複製複合体を提供するために自己切断するポリプロテインとして翻訳される。これらの−鎖転写物は、＋鎖の親ＲＮＡのコピーをさらに提供するために、また、２つ以上のＣＭＶタンパク質をコードする１つまたは複数のサブゲノム転写物をも生じさせるために、それら自体を転写することができる。サブゲノム転写物の翻訳は、したがって、感染細胞によるＣＭＶタンパク質（複数可）のｉｎ  ｓｉｔｕ発現を導く。適したアルファウイルスレプリコンは、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスなどに由来するレプリカーゼを使用することができる。
【００６１】
好ましい自己複製ＲＮＡ分子は、したがって、（ｉ）自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写することができるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび（ｉｉ）２つ以上のＣＭＶタンパク質またはその断片をコードする。ポリメラーゼは、たとえばアルファウイルスタンパク質ｎｓＰ４を含むアルファウイルスレプリカーゼであり得る。タンパク質ｎｓＰ４は、レプリカーゼの重要な触媒成分である。
【００６２】
天然アルファウイルスゲノムは、非構造レプリカーゼポリプロテインに加えて構造ビリオンタンパク質をコードするのに対して、本発明のアルファウイルスベースの自己複製ＲＮＡ分子は、すべてのアルファウイルス構造タンパク質をコードするわけではないことが好ましい。したがって、自己複製ＲＮＡは、ＲＮＡ含有アルファウイルスビリオンの産生ではなく、細胞におけるそれ自体のゲノムＲＮＡコピーの産生を導くことができる。これらのビリオンを産生することができないということは、野生型アルファウイルスと異なり、自己複製ＲＮＡ分子が感染性形態でそれ自体を永続させることができないことを意味する。野生型ウイルスにおいて永続化に必要なアルファウイルス構造タンパク質は、本発明の自己複製ＲＮＡに存在せず、それらの場所は、所望の遺伝子産物（ＣＭＶタンパク質またはその断片）をコードする遺伝子（複数可）によって使用され、サブゲノム転写物は、構造アルファウイルスビリオンタンパク質ではなく所望の遺伝子産物をコードする。
【００６３】
したがって、本発明による有用な自己複製ＲＮＡ分子は、異なるＣＭＶタンパク質またはその断片をコードする２つの配列を有する。ＣＭＶタンパク質または断片をコードする配列は、任意の所望の方向とすることができ、同じまたは別々のプロモーターに作動可能に連結することができる。所望の場合、ＣＭＶタンパク質または断片をコードする配列は、単一のオープンリーディングフレームの一部であり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、たとえば他の追加のＣＭＶタンパク質またはその断片をコードする、１つまたは複数の追加の（下流）配列またはオープンリーディングフレームを有していてもよい。自己複製ＲＮＡ分子は、コードされるレプリカーゼと適合性の５’配列を有することができる。
【００６４】
一態様では、自己複製ＲＮＡ分子は、本明細書において定義されるようなアルファウイルスレプリコンなどのアルファウイルスに由来するまたはそれに基づく。他の態様では、自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルス以外のウイルス、好ましくはプラス鎖ＲＮＡウイルスおよびより好ましくはピコルナウイルス、フラビウイルス、ルビウイルス、ペスチウイルス、ヘパシウイルス、カリシウイルス、またはコロナウイルスに由来するまたはそれに基づく。適した野生型アルファウイルス配列は、周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．などの配列保管機関から入手可能である。適したアルファウイルスの代表的な例は、アウラ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６８）、ベバルウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６００、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４０）、カバス（Ｃａｂａｓｓｏｕ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２２）、チクングニヤウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６４、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４１）、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６５、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４２）、フォートモーガン（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２４）、ゲタウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４３）、キジラガチ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２７）、マヤロウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６６；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２７７）、ミッデルブルグ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７０）、ムカンボウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−５８０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４４）、ヌドゥム（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７１）、ピクスナウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７２、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４５）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）、セムリキ森林（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、シンドビスウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６８、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４８）、トナテ（Ｔｏｎａｔｅ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２５）、トリニティ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−４６９）、ユナ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７４）、ベネズエラウマ脳脊髄炎（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０  ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２）、西部ウマ脳脊髄炎（ＡＴＣＣ  ＶＲ−７０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５１、ＡＴＣＣ  ＶＲ−６２２、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５２）、ワタロア（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２６）、およびＹ−６２−３３（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７５）を含む。
【００６５】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含有し、そのため、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて改善された安定性を有し、分解およびクリアランスに対して抵抗性であり、また他の利点を有することができる。あらゆる特定の理論によって束縛されることを望むものではないが、修飾ヌクレオチドを含有する自己複製ＲＮＡ分子は、自己複製ＲＮＡが細胞に送達される場合、エンドソームおよび細胞質内免疫受容体の刺激を回避するまたは低下させると考えられる。これは、自己複製、増幅、およびタンパク質の発現が起こるのを可能にする。修飾ヌクレオチドを含有する自己複製ＲＮＡが、自然免疫系の活性化および続く望まれない結果（たとえば注射部位の炎症、注射部位の刺激、痛み、およびその他同種のもの）を低下させるので、これはまた、修飾ヌクレオチドを含有しない自己複製ＲＮＡに関する安全性の問題をも低下させる。自己複製の結果として産生されるＲＮＡ分子が、細胞質内免疫受容体によって外来核酸として認識されることもまた、考えられる。したがって、修飾ヌクレオチドを含有する自己複製ＲＮＡ分子は、宿主細胞におけるＲＮＡの効率的な増幅およびＣＭＶタンパク質の発現ならびにアジュバント効果を提供する。
【００６６】
ＲＮＡ配列は、たとえば、ＲＮＡの翻訳の有効性および半減期を増大させるために、そのコドン使用頻度に関して修飾されてもよい。ポリＡテイル（たとえば約３０アデノシン残基以上の）は、その半減期を延長させるためにＲＮＡの３’末端に付加されてもよい。ＲＮＡの５’末端は、構造ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ（キャップ０構造）を有する修飾リボヌクレオチドまたはその誘導体によりキャップされてもよく、これは、ＲＮＡ合成の間に組み込むことができるまたはＲＮＡ転写後に酵素により操作することができる（たとえば、Ｎ７−モノメチル化キャップ０構造の構築を触媒する、ｍＲＮＡトリホスファターゼ、グアニリルトランスフェラーゼ、およびグアニン−７−メチルトランスフェラーゼ（ｇｕａｎｉｎｅ−７−ｍｅｔｈｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）から成るワクシニアウイルスキャッピング酵素（ＶＣＥ）を使用することによって）。キャップ０構造は、ＲＮＡ分子に対して、安定性および翻訳の有効性を提供することができる。ＲＮＡ分子の５’キャップは、翻訳の有効性をさらに増大させ得るキャップ１構造（ｍ７Ｇｐｐｐ［ｍ２’−Ｏ］Ｎ）の生成をもたらす２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼによってさらに修飾されてもよい。キャップ１構造はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける効力をも増大させてもよい。
【００６７】
本明細書において使用されるように、「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシド（たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）もしくはウラシル（Ｕ）、アデニン（Ａ）、またはグアニン（Ｇ））の窒素を含む塩基においてまたはその塩基上に１つまたは複数の化学修飾（たとえば置換）を含有するヌクレオチドを指す。所望の場合、自己複製ＲＮＡ分子は、ヌクレオシドの糖部分（たとえばリボース、デオキシリボース、修飾リボース、修飾デオキシリボース、６員環糖アナログ、もしくは鎖状糖アナログ）またはホスフェート中にまたはその上に化学修飾を含有することができる。
【００６８】
自己複製ＲＮＡ分子は、好ましくは５’キャップの一部ではない、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含有することができる（たとえば、５”キャップの一部である修飾に加えて）。したがって、自己複製ＲＮＡ分子は、単一の位置に修飾ヌクレオチドを含有することができるか、２つ以上の位置に特定の修飾ヌクレオチド（たとえばプソイドウリジン、Ｎ６−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジン）を含有することができるか、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含有することができる（たとえば、それぞれ１つもしくは複数の位置に）。好ましくは、自己複製ＲＮＡ分子は、窒素を含む塩基上にまたはその中に修飾を含有するが、修飾糖部分または修飾ホスフェート部分を含有しない修飾ヌクレオチドを含む。
【００６９】
いくつかの例では、自己複製ＲＮＡ分子におけるヌクレオチドの０．００１％〜９９％または１００％は、修飾ヌクレオチドである。たとえば、自己複製ＲＮＡ分子におけるヌクレオチドの０．００１％〜２５％、０．０１％〜２５％、０．１％〜２５％、または１％〜２５％は、修飾ヌクレオチドである。
【００７０】
他の例では、自己複製ＲＮＡ分子における特定の未修飾ヌクレオチドの０．００１％〜９９％または１００％は、修飾ヌクレオチドと交換される。たとえば、ウリジンを含有する自己複製ＲＮＡ分子におけるヌクレオチドの約１％は、ウリジンのプソイドウリジンとの交換によってなどのように、修飾することができる。他の例では、自己複製ＲＮＡ分子における所望の量（パーセンテージ）の２、３、または４つの特定のヌクレオチド（ウリジン、シチジン、グアノシン、またはアデニンを含有するヌクレオチド）は、修飾ヌクレオチドである。たとえば、自己複製ＲＮＡ分子における特定のヌクレオチドの０．００１％〜２５％、０．０１％〜２５％、０．１％〜２５、または１％〜２５％は、修飾ヌクレオチドである。他の例では、自己複製ＲＮＡ分子における特定のヌクレオチドの０．００１％〜２０％、０．００１％〜１５％、０．００１％〜１０％、０．０１％〜２０％、０．０１％〜１５％、０．１％〜２５、０．０１％〜１０％、１％〜２０％、１％〜１５％、１％〜１０％、または約５％、約１０％、約１５％、約２０％は、修飾ヌクレオチドである。
【００７１】
自己複製ＲＮＡ分子におけるヌクレオチドの１００％未満が、修飾ヌクレオチドであることが好ましい。自己複製ＲＮＡ分子における特定のヌクレオチドの１００％未満が、修飾ヌクレオチドであることもまた好ましい。したがって、好ましい自己複製ＲＮＡ分子は、少なくともいくつかの未修飾ヌクレオチドを含む。
【００７２】
哺乳動物ＲＮＡ上に見つけられる９６を超える天然に存在するヌクレオシド修飾がある。たとえばＬｉｍｂａｃｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２巻（１２号）：２１８３〜２１９６頁（１９９４年）を参照されたい。ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドならびにヌクレオシドの調製物は、当技術分野において、たとえば、すべてそれらの全体が参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第４３７３０７１号、第４４５８０６６号、第４５００７０７号、第４６６８７７７号、第４９７３６７９号、第５０４７５２４号、第５１３２４１８号、第５１５３３１９号、第５２６２５３０号、第５７００６４２号から周知であり、多くの修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドが、市販で入手可能である。
【００７３】
修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドの中に組み込むことができ、ＲＮＡ分子において存在することができる修飾核酸塩基は、ｍ５Ｃ（５−メチルシチジン）、ｍ５Ｕ（５−メチルウリジン）、ｍ６Ａ（Ｎ６−メチルアデノシン）、ｓ２Ｕ（２−チオウリジン）、Ｕｍ（２’−Ｏ−メチルウリジン）、ｍ１Ａ（１−メチルアデノシン）；ｍ２Ａ（２−メチルアデノシン）；Ａｍ（２−１−Ｏ−メチルアデノシン）；ｍｓ２ｍ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−メチルアデノシン）；ｉ６Ａ（Ｎ６−イソペンテニルアデノシン）；ｍｓ２ｉ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６イソペンテニルアデノシン）；ｉｏ６Ａ（Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｍｓ２ｉｏ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｇ６Ａ（Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン）；ｔ６Ａ（Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｔ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍ６ｔ６Ａ（Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｈｎ６Ａ（Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｈｎ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；Ａｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルアデノシン（ホスフェート））；Ｉ（イノシン）；ｍ１Ｉ（１−メチルイノシン）；ｍ’Ｉｍ（１，２’−Ｏ−ジメチルイノシン）；ｍ３Ｃ（３−メチルシチジン）；Ｃｍ（２Ｔ−Ｏ−メチルシチジン）；ｓ２Ｃ（２−チオシチジン）；ａｃ４Ｃ（Ｎ４−アセチルシチジン）；ｆ５Ｃ（５−ホルミルシチジン（ｆｏｎｎｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ）））；ｍ５Ｃｍ（５，２−Ｏ−ジメチルシチジン）；ａｃ４Ｃｍ（Ｎ４アセチル２ＴＯメチルシチジン）；ｋ２Ｃ（リシジン）；ｍ１Ｇ（１−メチルグアノシン）；ｍ２Ｇ（Ｎ２−メチルグアノシン）；ｍ７Ｇ（７−メチルグアノシン）；Ｇｍ（２’−Ｏ−メチルグアノシン）；ｍ２２Ｇ（Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン）；ｍ２Ｇｍ（Ｎ２，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）；ｍ２２Ｇｍ（Ｎ２，Ｎ２，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン）；Ｇｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルグアノシン（ホスフェート））；ｙＷ（ワイブトシン）；ｏ２ｙＷ（ペルオキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ（ヒドロキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ＊（非修飾（ｕｎｄｅｒｍｏｄｉｆｉｅｄ）ヒドロキシワイブトシン）；ｉｍＧ（ワイオシン）；ｍｉｍＧ（メチルグアノシン）；Ｑ（クエオシン）；ｏＱ（エポキシクエオシン）；ｇａｌＱ（ガルタクトシル−クエオシン）；ｍａｎＱ（マンノシル−クエオシン）；ｐｒｅＱｏ（７−シアノ−７−デアザグアノシン）；ｐｒｅＱｉ（７−アミノメチル−７−デアザグアノシン）；Ｇ＊（アーケオシン）；Ｄ（ジヒドロウリジン）；ｍ５Ｕｍ（５，２’−Ｏ−ジメチルウリジン）；ｓ４Ｕ（４−チオウリジン）；ｍ５ｓ２Ｕ（５−メチル−２−チオウリジン）；ｓ２Ｕｍ（２−チオ−２’−Ｏ−メチルウリジン）；ａｃｐ３Ｕ（３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン）；ｈｏ５Ｕ（５−ヒドロキシウリジン）；ｍｏ５Ｕ（５−メトキシウリジン）；ｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸）；ｍｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル）；ｃｈｍ５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン））；ｍｃｈｍ５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル）；ｍｃｍ５Ｕ（５−メトキシカルボニルメチルウリジン）；ｍｃｍ５Ｕｍ（Ｓ−メトキシカルボニルメチル−２−Ｏ−メチルウリジン）；ｍｃｍ５ｓ２Ｕ（５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン）；ｎｍ５ｓ２Ｕ（５−アミノメチル−２−チオウリジン）；ｍｎｍ５Ｕ（５−メチルアミノメチルウリジン）；ｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン）；ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ（５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン）；ｎｃｍ５Ｕ（５−カルバモイルメチルウリジン）；ｎｃｍ５Ｕｍ（５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン）；ｃｍｎｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン）；ｃｎｍｍ５Ｕｍ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２−Ｌ−Ｏメチルウリジン）；ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン）；ｍ６２Ａ（Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン）；Ｔｍ（２’−Ｏ−メチルイノシン）；ｍ４Ｃ（Ｎ４−メチルシチジン）；ｍ４Ｃｍ（Ｎ４，２−Ｏ−ジメチルシチジン）；ｈｍ５Ｃ（５−ヒドロキシメチルシチジン）；ｍ３Ｕ（３−メチルウリジン）；ｃｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルウリジン）；ｍ６Ａｍ（Ｎ６，Ｔ−Ｏ−ジメチルアデノシン）；ｒｎ６２Ａｍ（Ｎ６，Ｎ６，Ｏ−２−トリメチルアデノシン）；ｍ２’７Ｇ（Ｎ２，７−ジメチルグアノシン）；ｍ２’２’７Ｇ（Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン）；ｍ３Ｕｍ（３，２Ｔ−Ｏ−ジメチルウリジン）；ｍ５Ｄ（５−メチルジヒドロウリジン）；ｆ５Ｃｍ（５−ホルミル−２’−Ｏ−メチルシチジン）；ｍ１Ｇｍ（１，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）；ｍ’Ａｍ（１，２−Ｏ−ジメチルアデノシン）イリノメチルウリジン）；ｔｍ５ｓ２Ｕ（Ｓ−タウリノメチル−２−チオウリジン））；ｉｍＧ−１４（４−デメチルグアノシン）；ｉｍＧ２（イソグアノシン）；ａｃ６Ａ（Ｎ６−アセチルアデノシン）、ヒポキサンチン、イノシン、８−オキソ−アデニン、その７−置換誘導体、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−アミノウラシル、５−（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキルウラシル、５−メチルウラシル、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルケニルウラシル、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルキニルウラシル、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシシトシン、５−（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキルシトシン、５−メチルシトシン、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルケニルシトシン、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−クロロシトシン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、Ｎ２−ジメチルグアニン、７−デアザグアニン、８−アザグアニン、７−デアザ−７−置換グアニン、７−デアザ−７−（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニルグアニン、７−デアザ−８−置換グアニン、８−ヒドロキシグアニン、６−チオグアニン、８−オキソグアニン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，４−ジアミノプリン、２，６−ジアミノプリン、８−アザプリン、置換７−デアザプリン、７−デアザ−７−置換プリン、７−デアザ−８−置換プリン、水素（無塩基残基）、ｍ５Ｃ、ｍ５Ｕ、ｍ６Ａ、ｓ２Ｕ、Ｗ、または２’−Ｏ−メチル−Ｕを含む。これらの修飾核酸塩基のいずれか１つまたは任意の組み合わせは、本発明の自己複製ＲＮＡ中に含まれてもよい。これらの修飾核酸塩基およびそれらの対応するリボヌクレオシドの多くは、民間の供給者から入手可能である。
【００７４】
所望の場合、自己複製ＲＮＡ分子は、ホスホロアミデート、ホスホロチオエート、および／またはメチルホスホネート連結を含有することができる。
【００７５】
少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む自己複製ＲＮＡ分子は、任意の適した方法を使用して調製することができる。修飾ヌクレオチドを含有するＲＮＡ分子を産生するためのいくつかの適した方法は、当技術分野において公知である。たとえば、修飾ヌクレオチドを含有する自己複製ＲＮＡ分子は、Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ファージＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ファージＲＮＡポリメラーゼ、およびその他同種のものまたはＲＮＡ分子への修飾ヌクレオチドの効率的な組み込みを可能にするポリメラーゼの突然変異体などの適したＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、自己複製ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡを転写すること（たとえばｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写）によって、調製することができる。転写反応は、ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドならびに適した緩衝剤および適した塩などの、選択されるポリメラーゼの活性を支持する他の成分を含有するであろう。自己複製ＲＮＡへのヌクレオチドアナログの組み込みは、たとえば、そのようなＲＮＡ分子の安定性を改変するために、ＲＮアーゼに対する抵抗性を増大させるために、適切な宿主細胞に導入した後に複製を確立するために（ＲＮＡの「感染性」）、ならびに／または自然および適応免疫応答を誘発するもしくは低下させるために操作されてもよい。
【００７６】
適した合成方法は、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含有する自己複製ＲＮＡ分子を産生するために、単独でまたは１つもしくは複数の他の方法（たとえば組換えＤＮＡもしくはＲＮＡ技術）と組み合わせて使用することができる。デノボ合成に適した方法は、当技術分野において周知であり、特定の用途に適合させてもよい。例示的な方法は、たとえば、ＣＥＭなどの適した保護基を使用する化学合成（Ｍａｓｕｄａら、（２００７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５１巻：３〜４頁）、β−シアノエチルホスホラミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅ  Ｓ  Ｌら（１９８１年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２２巻：１８５９頁）；ヌクレオシドＨ−ホスホネート法（Ｇａｒｅｇｇ  Ｐら（１９８６年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２７巻：４０５１〜４頁；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ  Ｂ  Ｃら（１９８６年）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １４巻：５３９９〜４０７頁；Ｇａｒｅｇｇ  Ｐら（１９８６年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２７巻：４０５５〜８頁；Ｇａｆｆｎｅｙ  Ｂ  Ｌら（１９８８年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２９巻：２６１９〜２２頁）を含む。これらの化学反応は、実行することができるまたは市販で入手可能な自動核酸合成装置との使用に適合させることができる。追加の適した合成方法は、Ｕｈｌｍａｎｎら（１９９０年）Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  ９０巻：５４４〜８４頁およびＧｏｏｄｃｈｉｌｄ  Ｊ（１９９０年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  １巻：１６５頁において開示される。核酸合成はまた、ポリヌクレオチドおよびそのようなポリヌクレオチドによってコードされる遺伝子産物のクローニング、プロセシング、ならびに／または発現を含む、当技術分野において周知であり通常の適した組換え法を使用して実行することができる。無作為の断片化ならびに遺伝子断片および合成ポリヌクレオチドのＰＣＲ再構築によるＤＮＡシャフリングは、ポリヌクレオチド配列を設計し、操作するために使用することができる公知の技術の例である。部位特異的突然変異誘発は、核酸およびコードされるタンパク質を改変するために、たとえば、新しい制限部位を挿入する、グリコシル化パターンを改変する、コドン優先度（ｃｏｄｏｎ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を変化させる、スプライスバリアントを産生する、突然変異を導入する、およびその他同種のもののために、使用することができる。核酸配列の転写、翻訳、および発現に適した方法は、当技術分野において公知であり、通常のものである。（一般的に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈ．  Ａｓｓｏｃ．  ＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、第１３章、１９８８年；Ｇｌｏｖｅｒ、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第ＩＩ巻、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈ．，  Ｄ．Ｃ．、第３章、１９８６年；Ｂｉｔｔｅｒら、ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５３巻：５１６〜５４４頁（１９８７年）；Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒａｔｈｅｒｎら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、第Ｉ巻およびＩＩ巻、１９８２年；およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年を参照されたい）。
【００７７】
自己複製ＲＮＡ分子における１つまたは複数の修飾ヌクレオチドの存在および／または量は、任意の適した方法を使用して決定することができる。たとえば、自己複製ＲＮＡは、モノホスフェートに消化され得（たとえば、ヌクレアーゼＰ１を使用して）、脱リン酸化することができ（たとえば、ＣＩＡＰなどの適したホスファターゼを使用して）、結果として生じるヌクレオシドは、逆相ＨＰＬＣ（たとえばＹＭＣ  Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＱカラム（５ミクロン、４．６×２５０ｍｍ）を使用して、勾配、３０％Ｂ（０〜５分）〜１００％Ｂ（５〜１３分）を使用し、１００％Ｂ（１３〜４０）分、流量（０．７ｍｌ／分）、ＵＶ検出（波長：２６０ｎｍ）、カラム温度（３０℃）で溶離することによって分析することができる。緩衝液Ａ（２０ｍＭ酢酸−酢酸アンモニウムｐＨ３．５）、緩衝液Ｂ（２０ｍＭ酢酸−酢酸アンモニウムｐＨ３．５／メタノール［９０／１０］））。
【００７８】
自己複製ＲＮＡは、送達系と結合させてもよい。自己複製ＲＮＡは、アジュバントと共にまたはなしで、投与されてもよい。
【００７９】
ＲＮＡ送達系
本明細書において記載される自己複製ＲＮＡは、裸のＲＮＡ送達または細胞への侵入を容易にする脂質、ポリマー、もしくは他の化合物と組み合わせたものなどの様々なモダリティーの送達に適している。自己複製ＲＮＡ分子は、任意の適した技術を使用して、たとえば直接的な注射、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、微粒子銃（ｂｉｏｌｙｓｔｉｃｓ）、およびその他同種のものによって、標的細胞または被験体の中に導入することができる。自己複製ＲＮＡ分子はまた、受容体媒介性エンドサイトーシスによって細胞の中に導入されてもよい。たとえば米国特許第６，０９０，６１９号；ＷｕおよびＷｕ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６３巻：１４６２１頁（１９８８年）；およびＣｕｒｉｅｌら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８巻：８８５０頁（１９９１年）を参照されたい。たとえば、米国特許第６，０８３，７４１号は、それ自体インテグリン受容体結合部分（たとえば配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（配列番号＿＿＿＿）を有する環状ペプチド）にカップリングされているポリカチオン部分（たとえば３〜１００リシン残基を有するポリＬ−リシン）に核酸を結合することによって、哺乳動物細胞の中に外因性の核酸を導入することを開示する。
【００８０】
自己複製ＲＮＡ分子は、両親媒性物質によって細胞の中に送達することができる。たとえば米国特許第６，０７１，８９０号を参照されたい。典型的に、核酸分子は、カチオン性両親媒性物質と共に複合体を形成してもよい。複合体と接触させた哺乳動物細胞は、容易にそれを取り込むことができる。
【００８１】
自己複製ＲＮＡは、裸のＲＮＡとして（たとえば単にＲＮＡの水溶液として）送達することができるが、細胞への侵入およびまた続く細胞間の効果をも増強するために、自己複製ＲＮＡは、好ましくは、微粒子またはエマルジョン送達系などの送達系と組み合わせて投与される。多くの送達系は、当業者らに周知である。そのような送達系は、たとえばリポソームベースの送達（ＤｅｂｓおよびＺｈｕ（１９９３年）国際公開第９３／２４６４０号；ＭａｎｎｉｎｏおよびＧｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ（１９８８年）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６巻（７号）：６８２〜６９１頁；Ｒｏｓｅ  米国特許第５，２７９，８３３号；Ｂｒｉｇｈａｍ（１９９１年）ＷＯ  ９１／０６３０９；ならびにＦｅｌｇｎｅｒら（１９８７年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４巻：７４１３〜７４１４頁）ならびにウイルスベクターの使用（たとえばアデノウイルス（たとえばＢｅｒｎｓら（１９９５年）Ａｎｎ．  ＮＹ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．７７２巻：９５〜１０４頁；Ａｌｉら（１９９４年）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１巻：３６７〜３８４頁；およびＨａｄｄａｄａら（１９９５年）Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９巻（Ｐｔ  ３）：２９７〜３０６頁を検討のために参照されたい）、パピローマウイルス、レトロウイルス（たとえばＢｕｃｈｓｃｈｅｒら（１９９２年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６６巻（５号）２７３１〜２７３９頁；Ｊｏｈａｎｎら（１９９２年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６６巻（５号）：１６３５〜１６４０頁（１９９２年）；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら、（１９９０年）Ｖｉｒｏｌ．１７６巻：５８〜５９頁；Ｗｉｌｓｏｎら（１９８９年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６３巻：２３７４〜２３７８頁；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６５巻：２２２０〜２２２４頁（１９９１年）；Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌら、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００、ならびにＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＦａｕｃｉ（１９９３年）ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版  Ｐａｕｌ（編）Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｔｄ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋおよびその中の参考文献、ならびにＹｕら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４年）前掲を参照されたい）、ならびにアデノ随伴ウイルスベクター（Ｗｅｓｔら（１９８７年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６０巻：３８〜４７頁；Ｃａｒｔｅｒら（１９８９年）米国特許第４，７９７，３６８号；Ｃａｒｔｅｒら  ＷＯ  ９３／２４６４１（１９９３年）；Ｋｏｔｉｎ（１９９４年）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５巻：７９３〜８０１頁；Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９９４年）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｓｔ．９４巻：１３５１頁、およびＳａｍｕｌｓｋｉ（前掲）をＡＡＶベクターの概要について参照されたい；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ、米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８５年）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．５巻（１１号）：３２５１〜３２６０頁；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８４年）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，４巻：２０７２〜２０８１頁；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ（１９８４年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１巻：６４６６〜６４７０頁��ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８８年）、およびＳａｍｕｌｓｋｉら（１９８９年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６３巻：０３８２２〜３８２８頁もまた、参照されたい）、ならびにその他同種のものを含む。
【００８２】
３つの特に有用な送達系は、（ｉ）リポソーム、（ｉｉ）無毒性で生分解性のポリマー微粒子、および（ｉｉｉ）カチオン性サブミクロン水中油型エマルジョンである。
【００８３】
リポソーム
様々な両親媒性脂質は、リポソームとしてＲＮＡ含有水性コアを被包するために、水性環境において二重層を形成することができる。これらの脂質は、アニオン性、カチオン性、または両性イオン性の親水性頭部基（ｈｅａｄ  ｇｒｏｕｐ）を有することができる。アニオン性リン脂質からのリポソームの形成は、１９６０年代にさかのぼり、カチオン性リポソーム形成脂質は、１９９０年代から研究されてきた。いくつかのリン脂質は、アニオン性であるのに対して、他のものは、両性イオン性である。適したクラスのリン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびホスファチジルグリセロールを含むが、これらに限定されず、いくつかの有用なリン脂質は、表２に列挙される。有用なカチオン性脂質は、ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ  ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）を含むが、これらに限定されない。両性イオン性脂質は、アシル両性イオン性脂質およびエーテル両性イオン性脂質を含むが、これらに限定されない。有用な両性イオン性脂質の例は、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＣ、およびドデシルホスホコリンである。脂質は、飽和または不飽和であってもよい。
【００８４】
リポソームは、単一の脂質または脂質の混合物から形成することができる。混合物は、（ｉ）アニオン性脂質の混合物（ｉｉ）カチオン性脂質の混合物（ｉｉｉ）両性イオン性脂質の混合物（ｉｖ）アニオン性脂質およびカチオン性脂質の混合物（ｖ）アニオン性脂質および両性イオン性脂質の混合物（ｖｉ）両性イオン性脂質およびカチオン性脂質の混合物、または（ｖｉｉ）アニオン性脂質、カチオン性脂質、および両性イオン性脂質の混合物を含んでいてもよい。同様に、混合物は、飽和および不飽和脂質の両方を含んでいてもよい。たとえば、混合物は、ＤＳＰＣ（両性イオン性、飽和）、ＤｌｉｎＤＭＡ（カチオン性、不飽和）、および／またはＤＭＰＧ（アニオン性、飽和）を含んでいてもよい。脂質の混合物が使用される場合、混合物における成分脂質のすべてが、両親媒性である必要があるとは限らない、たとえば、１つまたは複数の両親媒性脂質は、コレステロールと混合することができる。
【００８５】
脂質の親水性部分は、ペグ化することができる（すなわち、ポリエチレングリコールの共有結合によって修飾することができる）。この修飾は、リポソームの安定性を増大させ、非特異的吸着を予防することができる。たとえば、脂質は、Ｈｅｙｅｓら（２００５年）Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０７巻：２７６〜８７頁において開示されるものなどの技術を使用してＰＥＧにコンジュゲートすることができる。
【００８６】
ＤＳＰＣ、ＤｌｉｎＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＭＰＧ、およびコレステロールの混合物は、リポソームを形成するために使用することができる。本発明の別の態様は、ＤＳＰＣ、ＤｌｉｎＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、およびコレステロールを含むリポソームである。このリポソームは、好ましくは、たとえば免疫原をコードする自己複製ＲＮＡなどのＲＮＡを被包する。
【００８７】
リポソームは、３つの群に通常分けられる：多重膜小胞（ＭＬＶ）；小型単層小胞（ＳＵＶ）；また大型単層小胞（ＬＵＶ）。ＭＬＶは、いくつかの別々の水性コンパートメントを形成する、それぞれの小胞において複数の二重層を有する。ＳＵＶおよびＬＵＶは、水性コアを被包する単一の二重層を有する；ＳＵＶは、典型的に、直径≦５０ｎｍを有し、ＬＵＶは、直径＞５０ｎｍを有する。本発明で有用なリポソームは、理想的には、５０〜２２０ｎｍの範囲の直径を有するＬＵＶである。異なる直径を有するＬＵＶの集団を含む組成物については：（ｉ）数の上で少なくとも８０％が、２０〜２２０ｎｍの範囲の直径を有するべきであり、（ｉｉ）集団の平均直径（Ｚａｖ、強度による）は、理想的には、４０〜２００ｎｍの範囲にあり、および／または（ｉｉｉ）直径は、多分散指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ）＜０．２を有するべきである。
【００８８】
適したリポソームを調製するための技術は、当技術分野において周知であり、たとえばＬｉｐｏｓｏｍｅｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第１巻：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．（Ｗｅｉｓｓｉｇ編）．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２００９年．ＩＳＢＮ  １６０３２７３５９Ｘ；Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ巻、ＩＩ巻、およびＩＩＩ巻．（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ編）．Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、２００６年；ならびにＦｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  第４巻（Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ  ＆  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）．（Ａｒｓｈａｄｙ  ＆  Ｇｕｙｏｔ編）．Ｃｉｔｕｓ  Ｂｏｏｋｓ、２００２年を参照されたい。１つの有用な方法は、（ｉ）脂質のエタノール性の溶液、（ｉｉ）核酸の水溶液、および（ｉｉｉ）緩衝剤を混合し、その後に、混合、平衡化、希釈、および精製を続けることを含む（Ｈｅｙｅｓら（２００５年）Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０７巻：２７６〜８７頁．）。
【００８９】
ＲＮＡは、好ましくは、リポソーム内に被包され、したがって、リポソームは、水性ＲＮＡ含有コアのまわりに外層を形成する。この被包は、ＲＮアーゼ消化からＲＮＡを保護することが分かっている。リポソームは、いくつかの外部ＲＮＡを含むことができる（たとえばリポソームの表面上に）が、好ましくは、少なくともＲＮＡの半分（理想的には、実質的にそのすべて）は、被包される。
【００９０】
ポリマー微粒子
様々なポリマーは、ＲＮＡを被包するまたは吸着するために微粒子を形成することができる。実質的に無毒性のポリマーの使用は、レシピエントが安全に粒子を受けることができることを意味し、生分解性ポリマーの使用は、粒子が、長期的な存続を回避するように送達後に代謝され得ることを意味する。有用なポリマーはまた、医薬グレードの処方物を調製するのを支援するために滅菌することもできる。
【００９１】
適した無毒性で生分解性のポリマーは、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリラクトン（ポリカプロラクトンを含む）、ポリジオキサノン、ポリバレロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリシアノアクリレート、チロシン由来ポリカーボネート、ポリビニルピロリジノン、またはポリエステルアミドおよびその組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【００９２】
いくつかの実施形態では、微粒子は、ポリ（ラクチド）（「ＰＬＡ」）などのポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（「ＰＬＧ」）などのラクチドおよびグリコリドのコポリマー、ならびにＤ，Ｌ−ラクチドおよびカプロラクトンのコポリマーから形成される。有用なＰＬＧポリマーは、たとえば２０：８０〜８０：２０、たとえば２５：７５、４０：６０、４５：５５、５５：４５、６０：４０、７５：２５の範囲のラクチド／グリコリドモル比を有するものを含む。有用なＰＬＧポリマーは、たとえば５，０００〜２００，０００Ｄａ、たとえば１０，０００〜１００，０００、２０，０００〜７０，０００、４０，０００〜５０，０００Ｄａの分子量を有するものを含む。
【００９３】
微粒子は、理想的には、０．０２μｍ〜８μｍの範囲の直径を有する。異なる直径を有する微粒子の集団を含む組成物については、数の上で少なくとも８０％が、０．０３〜７μｍの範囲の直径を有するべきである。
【００９４】
適した微粒子を調製するための技術は、当技術分野において周知であり、たとえばＦｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  第４巻（Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，  ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ  ＆  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）．（Ａｒｓｈａｄｙ  ＆  Ｇｕｙｏｔ編）．Ｃｉｔｕｓ  Ｂｏｏｋｓ、２００２年；Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．（Ｕｃｈｅｇｂｕ  ＆  Ｓｃｈａｔｚｌｅｉｎ編）．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、２００６年．（特に第７章）、およびＭｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．（Ｃｏｈｅｎ  ＆  Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ編）．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６年を参照されたい。ＲＮＡの吸着を容易にするために、微粒子は、たとえばＯ’Ｈａｇａｎら（２００１年）Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７５巻：９０３７〜９０４３頁；およびＳｉｎｇｈら（２００３年）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０巻：２４７〜２５１頁において開示されるように、カチオン性界面活性剤および／または脂質を含んでいてもよい。ポリマー微粒子を作製するための代替方法は、たとえば国際公開第２００９／１３２２０６号において開示されるように成形し、硬化することによるものである。
【００９５】
本発明の微粒子は、４０〜１００ｍＶのゼータ電位を有することができる。ＲＮＡは、微粒子に吸着することができ、吸着作用は、微粒子中にカチオン性材料（たとえばカチオン性脂質）を含めることによって容易になる。
【００９６】
水中油型カチオン性エマルジョン
水中油型エマルジョンは、インフルエンザワクチンのアジュバント添加（ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ）、たとえばＦＬＵＡＤ（商標）製品におけるＭＦ５９（商標）アジュバント、およびＰＲＥＰＡＮＤＲＩＸ（商標）製品におけるＡＳ０３アジュバントについて公知である。エマルジョンが１つまたは複数のカチオン性分子を含むという条件で、ＲＮＡ送達は、水中油型エマルジョンの使用により達成することができる。たとえば、カチオン性脂質は、負に荷電したＲＮＡが付着することができる正に荷電した液滴表面を提供するためにエマルジョン中に含むことができる。
【００９７】
エマルジョンは、１つまたは複数の油を含む。適した油（複数可）は、たとえば、動物（魚類など）供給源または植物供給源に由来するものを含む。油は、理想的には、生分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。植物油についての供給源は、堅果、種子、および穀類を含む。最も一般的に入手可能なラッカセイ油、ダイズ油、ヤシ油およびオリーブ油は、堅果油を例示する。たとえばホホバ豆から得られるホホバ油を使用することができる。種子油は、ベニバナ油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ油、およびその他同種のものを含む。穀類の群において、コーン油は、最も容易に入手可能であるが、コムギ、カラスムギ、ライムギ、イネ、テフ、ライコムギ、およびその他同種のものなどの他の穀物粒（ｃｅｒｅａｌ  ｇｒａｉｎ）の油もまた、使用されてもよい。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素脂肪酸エステルは、種子油中に天然に存在しないが、堅果および種子油から出発して、適切な材料の加水分解、分離、およびエステル化によって調製されてもよい。哺乳動物の乳由来の脂肪および油は、代謝可能であり、したがって、使用されてもよい。動物供給源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、けん化、および他の手段についての手順は、当技術分野において周知である。
【００９８】
ほとんどの魚は、容易に回収され得る代謝可能な油を含有する。たとえば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨ろうなどの鯨油は、本明細書において使用されてもよいいくつかの魚油を例示する。多くの分枝鎖油は、５−炭素イソプレン単位で生化学的に合成され、一般的にテルペノイドと呼ばれる。スクアラン（スクアレンに対する飽和アナログ）もまた、使用することができる。スクアレンおよびスクアランを含む魚油は、市販の供給源から容易に入手可能であるまたは当技術分野において公知の方法によって得られてもよい。
【００９９】
他の有用な油は、特にスクアレンと組み合わせたトコフェロールである。エマルジョンの油相がトコフェロールを含む場合、α、β、γ、δ、ε、またはζトコフェロールのいずれかを使用することができるが、α−トコフェロールが好ましい。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールは両方とも使用することができる。好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールである。スクアレンおよびトコフェロール（たとえばＤＬ−α−トコフェロール）を含む油の組み合わせを使用することができる。
【０１００】
好ましいエマルジョンは、スクアレン、分岐不飽和テルペノイドであるサメ肝油を含む（Ｃ３０Ｈ５０；［（ＣＨ３）２Ｃ［＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）］２＝ＣＨＣＨ２−］２；２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン；ＣＡＳ  ＲＮ  ７６８３−６４−９）。
【０１０１】
エマルジョン中の油は、油、たとえばスクアレンおよび少なくとも１つのさらなる油の組み合わせを含んでいてもよい。
【０１０２】
エマルジョンの水性成分は、淡水（ｐｌａｉｎ  ｗａｔｅｒ）（たとえばｗ．ｆ．ｉ．）であり得るか、または成分、たとえば溶質をさらに含むことができる。たとえば、それは、緩衝液を形成するための塩（たとえば、ナトリウム塩などのクエン酸塩またはリン酸塩）を含んでいてもよい。典型的な緩衝剤は、リン酸緩衝剤；Ｔｒｉｓ緩衝剤；ホウ酸緩衝剤；コハク酸緩衝剤；ヒスチジン緩衝剤；またはクエン酸緩衝剤を含む。緩衝化された水相が好ましく、緩衝剤は、典型的に、５〜２０ｍＭの範囲で含まれるであろう。
【０１０３】
エマルジョンはまた、カチオン性脂質をも含む。好ましくは、この脂質は、それがエマルジョンの形成および安定化を容易にすることができるように、界面活性剤である。有用なカチオン性脂質は、一般的に、たとえば第三級または第四級アミンとして生理学的条件下で正に荷電した窒素原子を含有する。この窒素は、両親媒性界面活性剤の親水性頭部基中にあり得る。有用なカチオン性脂質は、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、３’−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ、たとえばブロミド）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）を含むが、これらに限定されない。他の有用なカチオン性脂質は、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）、塩化ベンゼトニウム、セトラミド（ｃｅｔｒａｍｉｄｅ）（テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドならびにおそらく少量のドデシルトリメチルアンモニウム（ｄｅｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）ブロミドおよびヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドを含有する）、セチルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ポリオキシエチレン（１０）−Ｎ−獣脂（ｔａｌｌｏｗ）−１，３−ジアミノプロパン、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、混合アルキルトリメチルアンモニウムブロミド、ベンジルジメチルドデシルアンモニウムクロリド、ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウムクロリド、ベンジルトリメチルアンモニウムメトキシド、セチルジメチルエチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、メチルベンゼトニウムクロリド、デカメトニウムクロリド、メチル混合トリアルキルアンモニウムクロリド、メチルトリオクチルアンモニウムクロリド、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［２（２−メチル−４−（１，１，３，３テトラメチルブチル）−フェノキシ］−エトキシ）エチル］−ベンゼンメタンアミニウムクロリド（ＤＥＢＤＡ）、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、［１−（２，３−ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ，トリメチルアンモニウムクロリド、１，２−ジアシル−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（アシル基＝ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル）、１，２−ジアシル−３（ジメチルアンモニオ）プロパン（アシル基＝ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル）、１，２−ジオレオイル−３−（４’−トリメチルアンモニオ）ブタノイル−ｓｎ−グリセロール、１，２−ジオレオイル３−スクシニル−ｓｎ−グリセロールコリンエステル、コレステリル（４’−トリメチルアンモニオ）ブタノエート、Ｎ−アルキルピリジニウム塩（たとえばセチルピリジニウムブロミドおよびセチルピリジニウムクロリド）、Ｎ−アルキルピペリジニウム塩、ジカチオン性ボラホルム（ｂｏｌａｆｏｒｍ）電解質（Ｃ１２Ｍｅ６；Ｃ１２ＢＵ６）、ジアルキルグリセチルホスホリルコリン、リソレシチン、Ｌ−αジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、コレステロールヘミスクシネートコリンエステル、リポポリアミン（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミドスペルミン（ＤＰＰＥＳ）、リポポリＬ（またはＤ）−リシン（ＬＰＬＬ、ＬＰＤＬ）、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミンにコンジュゲートされたポリＬ（またはＤ）−リシン、ペンダントアミノ基を有するジドデシルグルタミン酸エステル（Ｃ＾ＧｌｕＰｈＣｎＮ）、ペンダントアミノ基を有するジテトラデシルグルタミン酸エステル（Ｃｌ４ＧＩｕＣｎＮ＋）を含むが、これらに限定されない）、コレステロールのカチオン性誘導体（コレステリル−３β−オキシスクシンアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、コレステリル−３β−オキシスクシンアミドエチレンジメチルアミン、コレステリル−３β−カルボキシアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、およびコレステリル−３β−カルボキシアミドエチレンジメチルアミンを含むが、これらに限定されない）である。他の有用なカチオン性脂質は、参照によって本明細書において組み込まれるＵＳ  ２００８／００８５８７０およびＵＳ  ２００８／００５７０８０において記載される。カチオン性脂質は、好ましくは、生分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。
【０１０４】
油およびカチオン性脂質に加えて、エマルジョンは、非イオン性界面活性剤および／または両性イオン性界面活性剤を含むことができる。そのような界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にＴｗｅｅｎと呼ばれる）、とりわけポリソルベート２０およびポリソルベート８０；線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマーなどの、ＤＯＷＦＡＸ（商標）商標下で販売されている、エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー；繰り返しのエトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が変動し得るオクトキシノール、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）などのリン脂質；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３０）などの、ラウリル、セチル、ステアリル、およびオレイルアルコールから誘導されるポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）；ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル；ならびにソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ  ８５）およびソルビタンモノラウレートなどのソルビタンエステル（Ｓｐａｎとして一般的に公知）を含むが、これらに限定されない。エマルジョン中に含むための好ましい界面活性剤は、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ  ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチン、およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【０１０５】
これらの界面活性剤の混合物、たとえばＴｗｅｅｎ８０／Ｓｐａｎ  ８５混合物またはＴｗｅｅｎ８０／Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００混合物は、エマルジョン中に含むことができる。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０）などのポリオキシエチレンソルビタンエステルおよびｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）などのオクトキシノールの組み合わせもまた、適している。他の有用な組み合わせは、ラウレス９ならびにポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。有用な混合物は、１０〜２０の範囲のＨＬＢ値を有する界面活性剤（たとえば、１５．０のＨＬＢを有するポリソルベート８０）および１〜１０の範囲のＨＬＢ値を有する界面活性剤（たとえば、１．８のＨＬＢを有するソルビタントリオレエート）を含むことができる。
【０１０６】
最終エマルジョン中の油の好ましい量（容積による％）は、２〜２０％、たとえば５〜１５％、６〜１４％、７〜１３％、８〜１２％である。約４〜６％または約９〜１１％のスクアレン含有量は、特に有用である。
【０１０７】
最終エマルジョン中の界面活性剤の好ましい量（重量による％）は、０．００１％〜８％である。たとえば、０．２〜４％、特に０．４〜０．６％、０．４５〜０．５５％、約０．５％、または１．５〜２％、１．８〜２．２％、１．９〜２．１％、約２％、または０．８５〜０．９５％、または約１％のポリオキシエチレンソルビタンエステル（ポリソルベート８０など）；０．０２〜２％、特に約０．５％または約１％のソルビタンエステル（ソルビタントリオレエートなど）；０．００１〜０．１％、特に０．００５〜０．０２％のオクチルまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００など）；０．１〜８％、好ましくは０．１〜１０％、特に０．１〜１％、または約０．５％のポリオキシエチレンエーテル（ラウレス９など）。
【０１０８】
油および界面活性剤の絶対量ならびにそれらの比は、なおエマルジョンを形成しながらも、広い範囲内で変動され得る。当業者は、所望のエマルジョンを得るために成分の相対的な割合を容易に変動し得るが、油および界面活性剤についての４：１〜５：１の重量比は、典型的である（過剰な油）。
【０１０９】
エマルジョンの免疫賦活性活性を確実にするための重要なパラメーターは、特に大型の動物において、油滴サイズ（直径）である。最も有効なエマルジョンは、サブミクロン（ｓｕｂｍｉｃｒｏｎ）範囲の液滴サイズを有する。適切には、液滴サイズは、範囲５０〜７５０ｎｍにあるであろう。最も有用には、平均液滴サイズは、２５０ｎｍ未満、たとえば２００ｎｍ未満、１５０ｎｍ未満である。平均液滴サイズは、有用には、８０〜１８０ｎｍの範囲にある。理想的には、エマルジョンの油滴の少なくとも８０％（数で）は、直径２５０ｎｍ未満であり、好ましくは少なくとも９０％がそうである。エマルジョン中の平均液滴サイズおよびサイズ分布を決定するための装置は、市販で入手可能である。これらは、典型的に、動的光散乱および／または単一粒子光学検知法（ｓｉｎｇｌｅ−ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｅｎｓｉｎｇ）の技術、たとえば、Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＵＳＡ）から入手可能な機器のＡｃｃｕｓｉｚｅｒ（商標）およびＮｉｃｏｍｐ（商標）シリーズ、またはＭａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（ＵＫ）からのＺｅｔａｓｉｚｅｒ（商標）機器、またはＨｏｒｉｂａ（Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）からのＰａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒ機器を使用する。
【０１１０】
理想的には、液滴サイズの分布（数による）は、１つの最大値だけを有する、すなわち、２つの最大値を有するのではなく、平均値（モード）のあたりで分布する液滴の単一の集団がある。好ましいエマルジョンは、＜０．４、たとえば０．３、０．２、またはそれ以下の多分散性を有する。
【０１１１】
サブミクロン液滴および狭いサイズ分布を有する適したエマルジョンは、マイクロフルイダイゼーションの使用によって得ることができる。この技術は、高圧および高速度で、幾何学的に固定されたチャネルを通して入力成分のストリームを推進させることによって、平均油滴サイズを低下させる。これらのストリームは、チャネル壁、チャンバー壁、および互いに接触する。その結果としての剪断力、衝撃力、およびキャビテーション力は、液滴サイズの低下を引き起こす。マイクロフルイダイゼーションの繰り返しのステップは、所望の液滴サイズ平均値および分布を有するエマルジョンが達成されるまで、実行することができる。
【０１１２】
マイクロフルイダイゼーションの代替物として、熱的方法は、転相を引き起こすために使用することができる。これらの方法もまた、厳密な粒度分布を有するサブミクロンエマルジョンを提供することができる。
【０１１３】
好ましいエマルジョンは、濾過滅菌することができる、すなわち、それらの液滴は、２２０ｎｍのフィルターを通過することができる。滅菌の提供と同様に、この手順はまた、エマルジョン中のあらゆる大きな液滴をも除去する。
【０１１４】
ある実施形態では、エマルジョン中のカチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含んでいてもよい。たとえば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２４ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．９ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１８ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２１．８ｍｇ／ｍｌ、約２４ｍｇ／ｍｌなどのＤＯＴＡＰを含んでいてもよい。例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、たとえば０．８ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、または１．６ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含む。
【０１１５】
ある実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＣコレステロールである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ  ＤＣコレステロールのＤＣコレステロールを含んでいてもよい。たとえば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．６２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２．４６ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４．９２ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２．４６ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約０．６２ｍｇ／ｍｌ、約０．１５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６２ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約２．４６ｍｇ／ｍｌ、約４．９２ｍｇ／ｍｌなどのＤＣコレステロールを含んでいてもよい。例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．６２ｍｇ／ｍｌ〜約４．９２ｍｇ／ｍｌ、たとえば２．４６ｍｇ／ｍｌのＤＣコレステロールを含む。
【０１１６】
ある実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＤＡである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含んでいてもよい。たとえば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．４５ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．７３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．４５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．４５ｍｇ／ｍｌなどのＤＤＡを含んでいてもよい。その代わりに、カチオン性水中油型エマルジョンは、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２１ｍｇ／ｍｌ、約２１．５ｍｇ／ｍｌ、約２１．６ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含んでいてもよい。例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．７３ｍｇ／ｍｌ〜約１．４５ｍｇ／ｍｌ、たとえば１．４５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含む。
【０１１７】
カテーテルまたは同様のデバイスは、標的器官または組織の中に、裸のＲＮＡとしてまたは送達系と組み合わせて、本発明の自己複製ＲＮＡ分子を送達するために使用されてもよい。適したカテーテルは、たとえば、すべてが参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第４，１８６，７４５号；第５，３９７，３０７号；第５，５４７，４７２号；第５，６７４，１９２号；および第６，１２９，７０５号において開示される。
【０１１８】
本発明は、単独でまたは他の高分子と組み合わせて、たとえば、免疫応答を引き起こすために、２つ以上のＣＭＶタンパク質をコードする自己複製ＲＮＡ分子を送達するために、被包されたまたは吸着された自己複製ＲＮＡを有するリポソーム、ポリマー微粒子、またはサブミクロンエマルジョン微粒子などの適した送達系の使用を含む。本発明は、吸着されたおよび／または被包された自己複製ＲＮＡ分子を有するリポソーム、微粒子、およびサブミクロンエマルジョンならびにその組み合わせを含む。
【０１１９】
リポソームおよびサブミクロンエマルジョン微粒子と結合した自己複製ＲＮＡ分子は、宿主細胞に有効に送達することができ、自己複製ＲＮＡによってコードされるタンパク質に対する免疫応答を誘発することができる。
【０１２０】
ＣＭＶタンパク質をコードするポリシストロニック自己複製ＲＮＡ分子およびポリシストロニックアルファウイルスレプリコンを使用して産生されるＶＲＰは、細胞においてＣＭＶタンパク質複合体を形成するために使用することができる。複合体は、ｇＢ／ｇＨ／ｇＬ；ｇＨ／ｇＬ；ｇＨ／ｇＬ／ｇＯ；ｇＭ／ｇＮ；ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１；およびＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１を含むが、これらに限定されない。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、ＶＲＰの組み合わせは、細胞に送達される。組み合わせは、
１．ｇＨ／ｇＬ  ＶＲＰおよび別のＶＲＰ；
２．ｇＨ／ｇＬ  ＶＲＰおよびｇＢ  ＶＲＰ；
３．ｇＨ／ｇＬ／ｇＯ  ＶＲＰおよびｇＢ  ＶＲＰ；
４．ｇＢ  ＶＲＰおよびｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１  ＶＲＰ；
５．ｇＢ  ＶＲＰおよびＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１  ＶＲＰ；
６．ｇＢ  ＶＲＰおよびｇＭ／ｇＮ  ＶＲＰ；
７．ｇＢ  ＶＲＰ、ｇＨ／ｇＬ  ＶＲＰ、およびＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１  ＶＲＰ；
８．ｇＢ  ＶＲＰ、ｇＨ／ｇＬｇＯ  ＶＲＰ、およびＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１  ＶＲＰ；
９．ｇＢ  ＶＲＰ、ｇＭ／ｇＮ  ＶＲＰ、ｇＨ／ｇＬ  ＶＲＰ、およびＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１  ＶＲＰ；
１０．ｇＢ  ＶＲＰ、ｇＭ／ｇＮ  ＶＲＰ、ｇＨ／ｇＬ／Ｏ  ＶＲＰ、およびＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１  ＶＲＰ；
１１．ｇＨ／ｇＬ  ＶＲＰおよびＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１  ＶＲＰ
を含むが、これらに限定されない。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子の組み合わせは、細胞に送達される。組み合わせは、
１．ｇＨ／ｇＬをコードする自己複製ＲＮＡ分子および他のタンパク質をコードする自己複製ＲＮＡ分子；
２．ｇＨおよびｇＬをコードする自己複製ＲＮＡ分子ならびにｇＢをコードする自己複製ＲＮＡ分子；
３．ｇＨ、ｇＬ、およびｇＯをコードする自己複製ＲＮＡ分子ならびにｇＢをコードする自己複製ＲＮＡ分子；
４．ｇＢをコードする自己複製ＲＮＡ分子ならびにｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１をコードする自己複製ＲＮＡ分子；
５．ｇＢをコードする自己複製ＲＮＡ分子ならびにＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１をコードする自己複製ＲＮＡ分子；
６．ｇＢをコードする自己複製ＲＮＡ分子ならびにｇＭおよびｇＮをコードする自己複製ＲＮＡ分子；
７．ｇＢをコードする自己複製ＲＮＡ分子、ｇＨおよびｇＬをコードする自己複製ＲＮＡ分子、ならびにＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１をコードする自己複製ＲＮＡ分子；
８．ｇＢをコードする自己複製ＲＮＡ分子、ｇＨ、ｇＬ、およびｇＯをコードする自己複製ＲＮＡ分子、ならびにＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１をコードする自己複製ＲＮＡ分子；
９．ｇＢをコードする自己複製ＲＮＡ分子、ｇＭおよびｇＮをコードする自己複製ＲＮＡ分子、ｇＨおよびｇＬをコードする自己複製ＲＮＡ分子、ならびにＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１をコードする自己複製ＲＮＡ分子；
１０．ｇＢをコードする自己複製ＲＮＡ分子、ｇＭおよびｇＮをコードする自己複製ＲＮＡ分子、ｇＨ、ｇＬ、およびｇＯをコードする自己複製ＲＮＡ分子、ならびにＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１をコードする自己複製ＲＮＡ分子；
１１．ｇＨおよびｇＬをコードする自己複製ＲＮＡ分子ならびにＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１をコードする自己複製ＲＮＡ分子
を含むが、これらに限定されない。
【０１２３】
ＣＭＶタンパク質
適したＣＭＶタンパク質は、ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、ｇＯを含み、任意のＣＭＶ株由来のものであり得る。他の適したＣＭＶタンパク質は、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１を含み、任意のＣＭＶ株由来のものであり得る。たとえば、ＣＭＶタンパク質は、ＣＭＶのＭｅｒｌｉｎ、ＡＤ１６９、ＶＲ１８１４、Ｔｏｗｎｅ、Ｔｏｌｅｄｏ、ＴＲ、ＰＨ、ＴＢ４０、またはＦｉｘ株由来のものであり得る。例示的なＣＭＶタンパク質および断片は、本明細書において記載される。これらのタンパク質および断片は、ヒト細胞などの所望の宿主における発現のためにコドン最適化された（ｃｏｄｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）かまたはコドン脱最適化された（ｃｏｄｏｎ  ｄｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）配列を含む任意の適したヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＣＭＶタンパク質およびそれらのタンパク質をコードする核酸の例示的な配列は、表２において提供される。
【０１２４】
【表２】
2013544504.tif 000003
ＣＭＶ  ｇＢタンパク質
ｇＢタンパク質は、完全長であり得るかまたはタンパク質の１つもしくは複数の領域を取り除くことができる。その代わりに、ｇＢタンパク質の断片を使用することができる。ｇＢアミノ酸は、９０７アミノ酸長である配列番号＿＿＿において示される完全長ｇＢアミノ酸配列（ＣＭＶ  ｇＢ  ＦＬ）に従ってナンバリングされる。完全長タンパク質から除くことができるまたは断片として含むことができるｇＢタンパク質の適した領域は、シグナル配列（アミノ酸１〜２４）、ｇＢ−ＤＬＤディスインテグリン様ドメイン（アミノ酸５７〜１４６）、フューリン切断部位（アミノ酸４５９〜４６０）、７アミノ酸繰り返し領域（６７９〜６９３）、膜通過ドメイン（アミノ酸７５１〜７７１）、およびアミノ酸７７１〜９０６由来の細胞質ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ｇＢタンパク質は、アミノ酸６７〜８６（中和エピトープＡＤ２）および／またはアミノ酸５３２〜６３５（免疫優性エピトープＡＤ１）を含む。ｇＢ断片の具体例は、ｇＢの最初の６９２アミノ酸を含む「ｇＢ  ｓｏｌ  ６９２」およびｇＢの最初の７５０アミノ酸を含む「ｇＢ  ｓｏｌ  ７５０」を含む。シグナル配列、アミノ酸１〜２４は、所望されるように、ｇＢ  ｓｏｌ  ６９２およびｇＢ  ｓｏｌ  ７５０に存在してもよいまたは存在しなくてもよい。任意選択で、ｇＢタンパク質は、１０アミノ酸長以上のｇＢ断片であり得る。たとえば、断片におけるアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、または８７５アミノ酸を含むことができる。ｇＢ断片は、残基番号：
【０１２５】
【化１】
2013544504.tif 000004
【０１２６】
【化２】
2013544504.tif 000005
のいずれからでも始まり得る。
【０１２７】
任意選択で、ｇＢ断片は、断片の出発残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｎ末端にさらに伸長することができる。任意選択で、ｇＢ断片は、断片の最後の残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｃ末端にさらに伸長することができる。
【０１２８】
ＣＭＶ  ｇＨタンパク質
いくつかの実施形態では、ｇＨタンパク質は、完全長ｇＨタンパク質（たとえば、７４３アミノ酸タンパク質であるＣＭＶ  ｇＨ  ＦＬ、配列番号＿＿＿）である。ｇＨは、７１６位から出発して７４３位までの膜通過ドメインおよび細胞質ドメインを有する。７１７〜７４３のアミノ酸の除去により、可溶性ｇＨ（たとえばＣＭＶ  ｇＨ  ｓｏｌ、配列番号＿＿＿）が提供される。いくつかの実施形態では、ｇＨタンパク質は、１０アミノ酸長以上のｇＨ断片であり得る。たとえば、断片におけるアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、または７２５アミノ酸を含むことができる。任意選択で、ｇＨタンパク質は、１０アミノ酸長以上のｇＨ断片であり得る。たとえば、断片におけるアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、または７２５アミノ酸を含むことができる。ｇＨ断片は、残基番号：
【０１２９】
【化３】
2013544504.tif 000006
【０１３０】
【化４】
2013544504.tif 000007
のいずれからでも始まり得る。
【０１３１】
ｇＨ残基は、配列番号＿＿＿において示される完全長ｇＨアミノ酸配列（ＣＭＶ  ｇＨ  ＦＬ）に従ってナンバリングされる。任意選択で、ｇＨ断片は、断片の出発残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｎ末端にさらに伸長することができる。任意選択で、ｇＨ断片は、断片の最後の残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｃ末端にさらに伸長することができる。
【０１３２】
ＣＭＶ  ｇＬタンパク質
いくつかの実施形態では、ｇＬタンパク質は、完全長ｇＬタンパク質（たとえば、２７８アミノ酸タンパク質であるＣＭＶ  ｇＬ  ＦＬ、配列番号＿＿＿）である。いくつかの実施形態では、ｇＬ断片を使用することができる。たとえば、断片におけるアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、または２５０アミノ酸を含むことができる。ｇＬ断片は、残基番号：
【０１３３】
【化５】
2013544504.tif 000008
のいずれからでも始まり得る。
【０１３４】
ｇＬ残基は、配列番号＿＿＿において示される完全長ｇＬアミノ酸配列（ＣＭＶ  ｇＬ  ＦＬ）に従ってナンバリングされる。任意選択で、ｇＬ断片は、断片の出発残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｎ末端にさらに伸長することができる。任意選択で、ｇＬ断片は、断片の最後の残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｃ末端にさらに伸長することができる。
【０１３５】
ＣＭＶ  ｇＯタンパク質
いくつかの実施形態では、ｇＯタンパク質は、完全長ｇＯタンパク質（たとえば、４７２アミノ酸タンパク質であるＣＭＶ  ｇＯ  ＦＬ、配列番号＿＿＿）である。いくつかの実施形態では、ｇＯタンパク質は、１０アミノ酸長以上のｇＯ断片であり得る。たとえば、断片におけるアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、または４５０アミノ酸を含むことができる。ｇＯ断片は、残基番号：
【０１３６】
【化６】
2013544504.tif 000009
のいずれからでも始まり得る。
【０１３７】
ｇＯ残基は、配列番号＿＿＿において示される完全長ｇＯアミノ酸配列（ＣＭＶ  ｇＯ  ＦＬ）に従ってナンバリングされる。任意選択で、ｇＯ断片は、断片の出発残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｎ末端にさらに伸長することができる。任意選択で、ｇＯ断片は、断片の最後の残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｃ末端にさらに伸長することができる。
【０１３８】
ＣＭＶ  ｇＭタンパク質
いくつかの実施形態では、ｇＭタンパク質は、完全長ｇＭタンパク質（たとえば、３７１アミノ酸タンパク質であるＣＭＶ  ｇＭ  ＦＬ、配列番号＿＿＿）である。いくつかの実施形態では、ｇＭタンパク質は、１０アミノ酸長以上のｇＭ断片であり得る。たとえば、断片におけるアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、または３５０アミノ酸を含むことができる。ｇＭ断片は、残基番号：
【０１３９】
【化７】
2013544504.tif 000010
のいずれからでも始まり得る。
【０１４０】
ｇＭ残基は、配列番号＿＿＿において示される完全長ｇＭアミノ酸配列（ＣＭＶ  ｇＭ  ＦＬ）に従ってナンバリングされる。任意選択で、ｇＭ断片は、断片の出発残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｎ末端にさらに伸長することができる。任意選択で、ｇＭ断片は、断片の最後の残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｃ末端にさらに伸長することができる。
【０１４１】
ＣＭＶ  ｇＮタンパク質
いくつかの実施形態では、ｇＮタンパク質は、完全長ｇＮタンパク質（たとえば、１３５アミノ酸タンパク質であるＣＭＶ  ｇＮ  ＦＬ、配列番号＿＿＿）である。いくつかの実施形態では、ｇＮタンパク質は、１０アミノ酸長以上のｇＮ断片であり得る。たとえば、断片におけるアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１２５アミノ酸を含むことができる。ｇＮ断片は、残基番号：
【０１４２】
【化８】
2013544504.tif 000011
のいずれからでも始まり得る。
【０１４３】
ｇＮ残基は、配列番号＿＿＿において示される完全長ｇＮアミノ酸配列（ＣＭＶ  ｇＮ  ＦＬ）に従ってナンバリングされる。任意選択で、ｇＮ断片は、断片の出発残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｎ末端にさらに伸長することができる。任意選択で、ｇＮ断片は、断片の最後の残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｃ末端にさらに伸長することができる。
【０１４４】
ＣＭＶ  ＵＬ１２８タンパク質
いくつかの実施形態では、ＵＬ１２８タンパク質は、完全長ＵＬ１２８タンパク質（たとえば、１７１アミノ酸タンパク質であるＣＭＶ  ＵＬ１２８  ＦＬ、配列番号＿＿＿）である。いくつかの実施形態では、ＵＬ１２８タンパク質は、１０アミノ酸長以上のＵＬ１２８断片であり得る。たとえば、断片におけるアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、または１５０アミノ酸を含むことができる。ＵＬ１２８断片は、残基番号：
【０１４５】
【化９】
2013544504.tif 000012
のいずれからでも始まり得る。
【０１４６】
ＵＬ１２８残基は、配列番号＿＿＿において示される完全長ＵＬ１２８アミノ酸配列（ＣＭＶ  ＵＬ１２８  ＦＬ）に従ってナンバリングされる。任意選択で、ＵＬ１２８断片は、断片の出発残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｎ末端にさらに伸長することができる。任意選択で、ＵＬ１２８断片は、断片の最後の残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｃ末端にさらに伸長することができる。
【０１４７】
ＣＭＶ  ＵＬ１３０タンパク質
いくつかの実施形態では、ＵＬ１３０タンパク質は、完全長ＵＬ１３０タンパク質（たとえば、２１４アミノ酸タンパク質であるＣＭＶ  ＵＬ１３０  ＦＬ、配列番号＿＿＿）である。いくつかの実施形態では、ＵＬ１３０タンパク質は、１０アミノ酸長以上のＵＬ１３０断片であり得る。たとえば、断片におけるアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、または２００アミノ酸を含むことができる。ＵＬ１３０断片は、残基番号：
【０１４８】
【化１０】
2013544504.tif 000013
のいずれからでも始まり得る。
【０１４９】
ＵＬ１３０残基は、配列番号＿＿＿において示される完全長ＵＬ１３０アミノ酸配列（ＣＭＶ  ＵＬ１３０  ＦＬ）に従ってナンバリングされる。任意選択で、ＵＬ１３０断片は、断片の出発残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｎ末端にさらに伸長することができる。任意選択で、ＵＬ１３０断片は、断片の最後の残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｃ末端にさらに伸長することができる。
【０１５０】
ＣＭＶ  ＵＬ１３１タンパク質
いくつかの実施形態では、ＵＬ１３１タンパク質は、完全長ＵＬ１３１タンパク質（たとえば、１２９アミノ酸タンパク質であるＣＭＶ  ＵＬ１３１、配列番号＿＿＿）である。いくつかの実施形態では、ＵＬ１３１タンパク質は、１０アミノ酸長以上のＵＬ１３１断片であり得る。たとえば、断片におけるアミノ酸の数は、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、または２００アミノ酸を含むことができる。ＵＬ１３１断片は、残基番号：
【０１５１】
【化１１】
2013544504.tif 000014
のいずれからでも始まり得る。
【０１５２】
ＵＬ１３１残基は、配列番号＿＿＿において示される完全長ＵＬ１３１アミノ酸配列（ＣＭＶ  ＵＬ１３１  ＦＬ）に従ってナンバリングされる。任意選択で、ＵＬ１３１断片は、断片の出発残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｎ末端にさらに伸長することができる。任意選択で、ＵＬ１３１断片は、断片の最後の残基から、５アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、または３０アミノ酸だけ、Ｃ末端にさらに伸長することができる。
【０１５３】
上記に述べられるように、本発明は、第１のヘルペスウイルスタンパク質またはその断片をコードする第１の配列および第２のヘルペスウイルスタンパク質またはその断片をコードする第２の配列を含有する組換えポリシストロニック核酸分子に関する。したがって、アルファウイルスＶＲＰおよび２つ以上のＣＭＶタンパク質またはその断片をコードする配列を含有する自己複製ＲＮＡなどのある好ましい実施形態の前述の記載は、本発明の例証となるが、本発明の範囲を限定するものではない。そのような好ましい実施形態におけるＣＭＶタンパク質をコードする配列は、ＨＨＶ−１、ＨＨＶ−２、ＨＨＶ−３、ＨＨＶ−４、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７、およびＨＨＶ−８などの他のヘルペスウイルス由来のｇＨおよびｇＬまたは１０アミノ酸長以上のその断片などのタンパク質をコードする配列と交換することができることが十分に理解されるであろう。たとえば、適したＶＺＶ（ＨＨＶ−３）タンパク質は、ｇＢ、ｇＥ、ｇＨ、ｇＩ、およびｇＬならびに１０アミノ酸長以上のその断片を含み、任意のＶＺＶ株由来のものであり得る。たとえば、ＶＺＶタンパク質またはその断片は、ＶＺＶのｐＯｋａ、Ｄｕｍａｓ、ＨＪＯ、ＣＡ１２３、またはＤＲ株由来のものであり得る。これらの例示的なＶＺＶタンパク質およびその断片は、ヒト細胞などの所望の宿主における発現のためにコドン最適化されたかまたはコドン脱最適化された配列を含む任意の適したヌクレオチド配列によってコードすることができる。ＶＺＶタンパク質の例示的な配列は、本明細書において提供される。
【０１５４】
たとえば、一実施形態では、ポリシストロニック核酸分子は、ＶＺＶ  ｇＨタンパク質またはその断片をコードする第１の配列およびＶＺＶ  ｇＬタンパク質またはその断片をコードする第２の配列を含有する。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、ポリシストロニック核酸分子中に存在するヘルペスウイルスタンパク質または断片をコードする配列のそれぞれは、それ自体の制御エレメントに作動可能に連結されている。たとえば、ヘルペスウイルスタンパク質または断片をコードするそれぞれの配列は、それ自体のサブゲノムプロモーターに作動可能に連結されている。したがって、アルファウイルスレプリコンなどのポリシストロニック核酸分子は、２、３、４、または５つのサブゲノムプロモーターを含有することができ、これらのそれぞれは、ヘルペスウイルスタンパク質または断片の発現を制御する。このタイプのポリシストロニック核酸分子がアルファウイルスレプリコンなどの自己複製ＲＮＡである場合、それは、ＶＲＰとしてパッケージすることができるまたはＲＮＡ送達系と結合することができるもしくはそれと共に処方することができる。
【０１５６】
方法および使用
いくつかの実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子またはＶＲＰは、免疫応答を刺激するために個体に投与される。そのような実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子またはＶＲＰは、典型的に、薬学的に許容される担体および任意選択でアジュバントを含んでいてもよい組成物中に存在する。たとえば米国特許第６，２９９，８８４号；米国特許第７，６４１，９１１号；米国特許第７，３０６，８０５号；およびＵＳ  ２００７／０２０７０９０を参照されたい。
【０１５７】
免疫応答は、体液性免疫応答、細胞媒介性免疫応答、またはその両方を含むことができる。いくつかの実施形態では、免疫応答は、それぞれの送達されるＣＭＶタンパク質に対して誘発される。細胞媒介性免疫応答は、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）応答、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答、またはその両方を含むことができる。いくつかの実施形態では、免疫応答は、体液性免疫応答を含み、抗体は、中和抗体である。中和抗体は、細胞のウイルス感染を遮断する。ＣＭＶは、上皮細胞におよびまた線維芽細胞の細胞にも感染する。いくつかの実施形態では、免疫応答は、両方の細胞型の感染を低下させるまたは予防する。中和抗体応答は、補体依存性または補体非依存性であってもよい。いくつかの実施形態では、中和抗体応答は、補体非依存性である。いくつかの実施形態では、中和抗体応答は、交差中和性である；すなわち、投与された組成物に対して生成される抗体は、組成物において使用される株以外の株のＣＭＶウイルスを中和する。
【０１５８】
当技術分野における抗体効力の有用な尺度は、「５０％中和力価」である。５０％の中和性の力価を決定するために、免疫化された動物由来の血清を希釈し、どれくらい希釈した血清が、依然として細胞への５０％のウイルスの侵入を遮断する能力を保持するかを評価する。たとえば、７００の力価は、血清が、７００倍に希釈された後にウイルスの５０％を中和する能力を保持したことを意味する。したがって、より高い力価は、より強力な中和抗体応答を示す。いくつかの実施形態では、この力価は、約２００、約４００、約６００、約８００、約１０００、約１５００、約２０００、約２５００、約３０００、約３５００、約４０００、約４５００、約５０００、約５５００、約６０００、約６５００、または約７０００の下限を有する範囲にある。５０％の中和力価範囲は、約４００、約６００、約８００、約１０００、約１５００、約２００、約２５００、約３０００、約３５００、約４０００、約４５００、約５０００、約５５００、約６０００、約６５００、約７０００、約８０００、約９０００、約１００００、約１１０００、約１２０００、約１３０００、約１４０００、約１５０００、約１６０００、約１７０００、約１８０００、約１９０００、約２００００、約２１０００、約２２０００、約２３０００、約２４０００、約２５０００、約２６０００、約２７０００、約２８０００、約２９０００、または約３００００の上限を有することができる。たとえば、５０％の中和力価は、約３０００〜約６５００であり得る。「約」は、記載される値のプラスまたはマイナス１０％を意味する。中和力価は、下記の具体例において記載されるように測定することができる。
【０１５９】
免疫応答は、個体、典型的に、ヒトを含む哺乳動物にＶＲＰまたは自己複製ＲＮＡを投与することによって刺激することができる。いくつかの実施形態では、誘発される免疫応答は、防御免疫応答である、つまり、応答は、ＣＭＶ感染の危険性または重症度を低下させる。防御免疫応答の刺激は、特にＣＭＶ感染および疾患の危険性のあるいくつかの集団において特に望ましい。たとえば、危険な状態にある集団は、実質臓器移植（ＳＯＴ）患者、骨髄移植患者、および造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）患者を含む。ＶＲＰは、移植前の移植ドナーまたは移植前および／もしくは後の移植レシピエントに投与することができる。母親から子供への垂直伝播が乳児を感染させるよくある原因であるので、妊娠し得る女性へのＶＲＰまたは自己複製ＲＮＡの投与は、特に有用である。
【０１６０】
投与の任意の適したルートを使用することができる。たとえば、組成物は、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、または経皮的に投与することができる。いくつかの実施形態は、口腔内に（ｉｎｔｒａ−ｏｒａｌｌｙ）、鼻腔内に、腟内に、および直腸内になどのように、粘膜内ルートを通して投与されるであろう。組成物は、任意の適したスケジュールに従って投与することができる。
【０１６１】
受託番号によって言及されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列を含む本開示において引用される特許、特許出願、および参考文献はすべて、参照によって本明細書において明確に組み込まれる。上記の開示は、全般的な説明である。より完全な理解は、例示のみの目的のために提供される次の特定の実施例に対する参照によって得ることができる。
【実施例】
【０１６２】
（実施例１）
ＶＲＰプラットフォームを使用する個々のＣＭＶ抗原の送達
それぞれのＣＭＶ糖タンパク質ｇＢおよびｇＨは、中和応答を誘発し、ｇＢは、線維芽細胞の感染を中和するヒト血清中の抗体の間で有力な抗原である（Ｂｒｉｔｔら（１９９０年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６４巻（３号）：１０７９〜８５頁）。次の実験は、マウスにおいてＶＲＰプラットフォームを使用して送達されたこれらの抗原に対する中和応答を実証する。
【０１６３】
ＣＭＶ抗原はそれぞれ、ｐｃＤＮＡ−６Ｈｉｓベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の中にクローニングし、図２において示される構築物をもたらす、Ｐｅｒｒｉら（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ  ７７巻（１９号）１０３９４〜１０４０３頁（２００３年））によって記載されるプラスミドに由来するアルファウイルスレプリコンベクター、ｐＶＣＲ  ２．１  ＳａｌＩ／ＸｂａＩの中にクローニングする前にタンパク質発現について試験した。ｐＶＣＲ  ２．１  ＳａｌＩ／ＸｂａＩは、不完全ヘルパーのカプシドおよび糖タンパク質ＲＮＡと共にエレクトロポレーションされた場合、感染性アルファウイルス粒子を形成する自己複製ＲＮＡベクターである。
【０１６４】
ｐＶＣＲベクターは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）に由来する不完全ヘルパーのカプシドおよび糖タンパク質ＲＮＡの存在下において、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫＶ）細胞の中にエレクトロポレーションされるＲＮＡを作製するために使用した。エレクトロポレーション後に、分泌されたアルファウイルスベクター粒子（ＶＲＰ）を含有する上清は、収集し、精製し、力価測定し（ｔｉｔｅｒ）、マウス免疫化研究に使用した。マウスは、３週間、間隔をあけた一連の２回の免疫化において１×１０６感染単位／マウス（ＩＵ）で免疫化した。最終的な採血は、２回目の免疫化の３週間後であった。
【０１６５】
モノシストロニックｇＢ、ｇＨ、およびｇＬ  ＶＲＰ
可溶性ｇＢの異なる２つのバージョンを構築した：「ｇＢ  ｓｏｌ  ７５０」は、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠き、「ｇＢ  ｓｏｌ  ６９２」もまた、疎水性領域を欠き（図２Ａ）、Ｒｅａｐらの構築物に類似する。膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠く可溶性ｇＨ（「ｇＨ  ｓｏｌ  ７１６」）もまた、構築した（図２Ｃ）。免疫化マウス由来の血清は、いくつかのアッセイにおいてスクリーニングした。免疫ブロット法（データ示さず）および免疫蛍光アッセイは、抗原に対する特異的な抗体応答を確認するために使用した。中和アッセイは、引き起こされた抗体応答が、ＣＭＶ感染を中和することができたことを実証するために使用した。
【０１６６】
免疫化マウス由来の血清は、ｇＢ−６Ｈｉｓを発現する構築物によりトランスフェクトした２９３Ｔ細胞においてｇＢの認識について免疫蛍光法によって検査した。細胞は、抗Ｈｉｓ抗体（「抗６Ｈｉｓ」）、モノクローナルｇＢ抗体（「抗ｇＢ  ２７〜１５６」）、または収集したプールマウス血清のいずれかによりプローブした。免疫前血清は、すべての場合において陰性であった。ｇＢ  ＦＬ−６Ｈｉｓを発現する構築物によりトランスフェクトし、固定し、透過処理した細胞において、抗６Ｈｉｓ染色は、エンドサイトーシス／エキソサイトーシス輸送経路に対応する可能性が最も高い点状の細胞質パターンと共に表面発現の発現パターンを明らかにした。抗ｇＢ  ２７〜１５６およびプールマウス血清の両方は、同様の発現パターンを示した。それぞれのｇＢ  ＦＬ  ＶＲＰ、ｇＢ  ｓｏｌ  ７５０  ＶＲＰ、およびｇＢ  ｓｏｌ  ６９２  ＶＲＰにより免疫化したマウス由来の血清は、同じ発現パターンを示した。
【０１６７】
ｇＨ  ＦＬ  ＶＲＰおよびｇＨ  ｓｏｌ  ７１６  ＶＲＰにより免疫化したマウスは、ｇＨに特異的な抗体を産生した。ｇＨ  ＦＬ−６Ｈｉｓを発現する構築物によりトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の免疫蛍光分析は、抗６Ｈｉｓ、抗ｇＨ、およびプールマウス血清によるｇＨの強力な認識を検出した。ｇＬ  ＶＲＰにより免疫化したマウスから収集された血清は、免疫ブロット法分析および免疫蛍光法によって決定されるように、特異的な抗体応答をもたらした。ｇＬ  ＶＲＰは、中和応答を引き起こさなかった。
【０１６８】
ｇＢ  ＶＲＰまたはｇＨ  ＶＲＰにより免疫化したマウス由来の血清は、ＣＭＶ中和アッセイを使用して、中和抗体の存在について分析した。様々に希釈した血清を、ＣＭＶウイルスＴＢ４０ＵＬ３２ＥＧＦＰ（「ＴＢ４０−ＧＦＰ」、ＧＦＰを発現するように操作した臨床分離株と共にあらかじめインキュベートし、その後、ＡＲＰＥ−１９上皮細胞を追加し、５日間インキュベートした。感染の５日後に、ＧＦＰ陽性細胞を数えた。このアッセイにおいて、中和抗体を含有する血清と共にインキュベートした細胞は、ウイルスのみと共にまたは免疫前血清と共にインキュベートしたウイルスと共にインキュベートした細胞と比較して、ＧＦＰ陽性細胞がより少ない。ｇＢ  ＶＲＰ、ｇＢ  ＦＬ  ＶＲＰ、ｇＢ  ｓｏｌ  ７５０  ＶＲＰ、またはｇＢ  ｓｏｌ  ６９２  ＶＲＰにより免疫化したマウス由来の血清は、モルモット補体の存在下において強力な中和活性を有した（１：１２８０〜１：２５６０の血清希釈で５０％の中和力価；図３）。ｇＨ  ＦＬ  ＶＲＰまたはｇＨ  ｓｏｌ  ＶＲＰにより免疫化したマウス由来の血清は、モルモット補体に非依存性のある程度の中和活性を有した（図３）。
【０１６９】
（実施例２）
ポリシストロニックアルファウイルスベクターの構築
ＣＭＶは、感染の間にいくつかの多タンパク質複合体を産生する。所望の複合体の成分をすべて発現する単一のレプリコンを、被験体においてＣＭＶ複合体を産生するために使用することができるかまたは複合体の成分を、複数のレプリコンベクターから同時送達することができるかどうかを決定するために、発明者らは、複数のＣＭＶタンパク質の発現の制御を可能にするプラットフォームを設計した。
【０１７０】
アルファウイルスベクター（ｐＶＣＲ  ２．１  ＳａｌＩ／ＸｂａＩ）は、複数のサブゲノムプロモーター（ＳＧＰ）および目的の遺伝子（ＧＯＩ）の構築を可能にするために修飾した。１１０２６〜３１ｂｐのｐＶＣＲ  ２．１  ＳａｌＩ／ＸｂａＩ  ＡｐａＩ部位は、
【０１７１】
【化１２】
2013544504.tif 000015
に変更した。ＣｌａＩおよびＰｍｌＩ制限部位は、第１のサブゲノムプロモーターおよびＳａｌＩ−ＸｂａＩ挿入部位の直ぐ下流の領域に追加した。７７２７〜７７５４ｂｐの配列は、
【０１７２】
【化１３】
2013544504.tif 000016
に変更した。
【０１７３】
シャトルベクター系は、ＳａｌＩ−ＸｂａＩ部位を使用してＳＧＰの直ぐ下流にＧＯＩの挿入を可能にするように設計した。ｐｃＤＮＡ  ３．１（−）Ｃは、以下のように修飾した。３つのＳａｌＩ部位を欠失させた：１０４６〜１０５１ｂｐ、３３３２〜３３３７ｂｐ、および５５１９〜２１、１〜３ｂｐ位を
【０１７４】
【化１４】
2013544504.tif 000017
ｐｃＤＮＡ  ３．１（−）Ｃは、
【０１７５】
【化１５】
2013544504.tif 000018
位置９１６〜９２１ｂｐのＸｂａＩ部位を突然変異させるために修飾した。ｐｃＤＮＡ  ３．１（−）Ｃは、
【０１７６】
【化１６】
2013544504.tif 000019
に、位置９４２〜９４７（ＣｌａＩ）および９５０〜９５５（ＳａｃＩＩ）ｂｐにＣｌａＩ部位およびＳａｃＩＩ部位を追加するために修飾した。
【０１７７】
一度、制限部位を追加し、結果として生じる配列を検証したら、ｂｐ  ７６１１〜７６８９からの領域
【０１７８】
【化１７】
2013544504.tif 000020
を次のプライマーを使用して、修飾ｐＶＣＲ  ２．１アルファウイルスベクターから増幅した。
【０１７９】
【化１８】
2013544504.tif 000021
増幅した領域は、適切な部位（ＮｏｔＩ−ＣｌａＩまたはＣｌａＩ−ＳａｃＩＩ）の間に、シャトルベクター（ｐｃＤＮＡ  ＳＶ）を作製するために、修飾ｐｃＤＮＡ  ３．１（−）Ｃベクターの中に追加した。ＮｏｔＩ−ＳＧＰ  Ｓａｌ−Ｘｂａ−ＣｌａＩの挿入により、ｐｃＤＮＡ  ＳＶカセット２を形成し、ＣｌａＩ−ＳＧＰ  Ｓａｌ−Ｘｂａ−ＳａｃＩＩの挿入によりｐｃＤＮＡ  ＳＶカセット３を形成する。これらのＳＶカセットは、配列決定した。ｐｃＤＮＡ  ＳＶカセット２は、ＣｌａＩ部位がｐｃＤＮＡ  ＳＶカセット２ベクターにおいてカットされなかったので、ＸｂａＩ部位およびＣｌａＩ部位の間に追加の１２ｂｐ（ＣＣＡＣＴＧＴＧＡＴＣＧ）（配列番号＿＿＿＿）を含有する。そのため、ＰｍｌＩ部位を追加した。ｐｃＤＮＡ  ＳＶカセット２については、ＰｍｌＩ部位は、ｂｐ  １０１２（ＣＡＣＧＴＧ）（配列番号＿＿）に挿入した。カセット３については、ＰｍｌＩ部位は、ｂｐ  ９３５〜９４０に追加した。
【０１８０】
【化１９】
2013544504.tif 000022
それぞれのポリシストロニックベクターについては、第１の遺伝子は、ＳａｌＩ−ＸｂａＩ部位を使用して、ｐＶＣＲ  ２．１修飾ベクターの中に直接挿入した。第２の遺伝子は、ＳａｌＩ−ＸｂａＩを使用して、ｐｃＤＮＡ  ＳＶカセット２の中にライゲーションし、ＮｏｔＩ−ＰｍｌＩ、ＮｏｔＩ−ＳａｃＩＩを使用して切り取ったまたはＮｏｔＩ−ＣｌａＩについてプライマーを使用してＰＣＲし、ＮｏｔＩおよびＣｌａＩを使用して消化した。結果として生じる挿入物ＳＧＰ−ＳａｌＩ−ＧＯＩ−Ｘｂａは、ＮｏｔＩ−ＰｍｌＩ、ＮｏｔＩ−ＳａｃＩＩ、またはＮｏｔＩ−ＣｌａＩ部位を使用して修飾ｐＶＣＲ  ２．１ベクターの中にライゲーションした。構築物中の所望の遺伝子がＰｍｌＩ部位を含有した場合に限り、ＮｏｔＩ−ＣｌａＩ挿入物を使用した。
【０１８１】
いくつかの場合には、第３の遺伝子は、ＳａｌＩ−ＸｂａＩを使用して、ｐｃＤＮＡ  ＳＶカセット３の中にライゲーションし、ＰｍｌＩ−ＳａｃＩＩを使用して切り取ったまたはＣｌａＩ−ＳａｃＩＩについてプライマーを使用してＰＣＲし、ＣｌａＩおよびＳａｃＩＩを使用して消化した。結果として生じる挿入物ＳＧＰ−ＳａｌＩ−ＧＯＩ−ＸｂａＩは、ＰｍｌＩ−ＳａｃＩＩまたはＣｌａＩ−ＳａｃＩＩを使用して、修飾ｐＶＣＲ  ２．１の中にライゲーションした。
【０１８２】
ＳａｌＩ−ＸｂａＩ消化は、ポリシストロニックベクターＤＮＡの構築を検証するために使用した。ＳａｌＩ−ＸｂａＩによる消化後に、アガロースゲル電気泳動は、ＧＯＩの存在を確認するために実行した。その後、ポリシストロニックベクターＤＮＡは、ＰｍｅＩにより一晩直線化し、ＱｉａｇｅｎのＰＣＲ精製キットを使用して精製し、Ａｍｂｉｏｎ  ｍＭｅｓｓａｇｅ  ｍＭａｃｈｉｎｅキットを使用して、ＲＮＡを作製するために鋳型として使用した。ＲＮＡ品質は、ＲＮＡアガロースゲル上に試料のアリコートを泳動することによってチェックした。
【０１８３】
ポリシストロニックベクターからの発現
蛍光タンパク質ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）およびｍＣｈｅｒｒｙ（赤色蛍光タンパク質）は、ポリシストロニックベクターが２つのタンパク質を発現する能力を評価するために、ＧＯＩとして使用した。発明者らは、ＧＦＰが第１のサブゲノムプロモーターを使用して、発現され、ｍＣｈｅｒｒｙが第２のサブゲノムプロモーターから発現されるバイシストロニックベクターを調製した（図４Ａ）。これらのタンパク質についてのコード配列を含有するポリヌクレオチドは、ＳａｌＩ−ＸｂａＩ部位を使用して挿入した。第１のポリヌクレオチド（ＧＦＰ）は、修飾アルファウイルスレプリコンベクターの中に直接挿入した。第２のポリヌクレオチド（ｍＣｈｅｒｒｙ）は、コード配列の直ぐ上流にサブゲノムプロモーターを含有するシャトルベクターの中に最初に挿入した。第２のサブゲノムプロモーターおよび第２のポリヌクレオチドの両方を含有する断片を単離し、第１のポリヌクレオチドを含有する修飾アルファウイルスレプリコンベクターの中にライゲーションし、複数のサブゲノムプロモーターを有するアルファウイルスレプリコンがもたらされた。
【０１８４】
ＶＲＰは、ＣａｐおよびＧｌｙについての不完全ヘルパーＲＮＡとともにレプリコンＲＮＡをエレクトロポレーションすることによって、ＢＨＫＶ細胞において産生した。ＶＲＰは、エレクトロポレーションの２４時間後に収集し、細胞当たり２０感染単位（ＩＵ）の感染多重度（ＭＯＩ）でＢＨＫＶ細胞を感染させるために使用した。
【０１８５】
実験により、４セットのＶＲＰを試験した：ＧＦＰのみを発現する１つのＶＲＰ；ｍＣｈｅｒｒｙを発現する１つのＶＲＰ；両方とも２０ＩＵ／細胞のＭＯＩで、ＧＦＰのみを発現する１つのＶＲＰおよびｍＣｈｅｒｒｙのみを発現する１つのＶＲＰ；ならびにバイシストロニックベクターＧＦＰ（１）−ＳＧＰｍＣｈｅｒｒｙ（２）を含有する１つのＶＲＰ。ＶＲＰ感染ＢＨＫＶ細胞は、共存のパーセントを決定するために感染の２４時間後に検査した。一つずつ感染させた場合、細胞は、ほぼすべて、ＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙについて陽性であった。２つの別々のＶＲＰを感染させた細胞は、緑色または赤色のいずれかに見えた。黄色の細胞はほとんどなく、少数の細胞が等しいレベルでＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙを発現し、同時感染のレベルが低かったことを示した。これらのデータは、ＦＡＣＳ分析を使用して確認した（図４Ｂ）。
【０１８６】
対照的に、バイシストロニックベクターＧＦＰ（１）−ＳＧＰｍＣｈｅｒｒｙ（２）を含有するアルファウイルスを感染させた細胞は、すべて黄色であり、これは、ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙのほぼ等しい発現を示す。本研究は、単一のポリシストロニックアルファウイルスレプリコンベクターから複数のタンパク質を成功裏に発現させることができることを実証する。
【０１８７】
（実施例３）
ＣＭＶ複合体の産生
本実施例は、ポリシストロニックアルファウイルスレプリコンベクターから、複合体成分の送達後に細胞においてＣＭＶタンパク質複合体を形成することができることを実証する。
【０１８８】
ｇＨ／ｇＬおよびｇＨ／ｇＬ／ｇＯ複合体
ポリシストロニックｇＨ／ｇＬおよびｇＨ／ｇＬ／ｇＯアルファウイルスレプリコンは、上記に記載される（図５Ａにおいて概略的に示される）ように構築した。ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、ｇＨ／ｇＬ、およびｇＨ／ｇＬ／ｇＯをコードするレプリコンを含有するＶＲＰは、上記に記載されるようにＢＨＫＶ細胞において産生し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける複合体形成を実証するためにＢＨＫＶ細胞を感染させるために使用した。ＶＲＰ感染ＡＲＰＥ−１９細胞は、ｇＨ／ｇＬのジスルフィド結合複合体を産生した。ｇＯは、ｇＨ／ｇＬ結合を検出可能な程度に改変しなかった（図５Ｂ）。
【０１８９】
免疫蛍光研究は、単独で送達されたｇＨおよびｇＬの局在化を評価し、ポリシストロニックアルファウイルスを使用して送達した場合に、同時発現された場合のタンパク質の再局在化を調べるために行なった。ｇＨ局在化は、ｇＬまたはｇＬ／ｇＯの存在下または非存在下において変化するように見えなかった。ｇＨおよびｇＨ／ｇＯの存在下における場合、ｇＬ局在化は変化した。
【０１９０】
最後に、ｇＨ／ｇＬの結合を、免疫沈降によって検査した。市販のｇＨ抗体（Ｇｅｎｗａｙ）は、ｇＨおよびｇＬの結合を調査するために使用した。すべての場合において、ｇＨ抗体は、ｇＨを効率的に免疫沈降させた（図５Ｃ）。ｇＨが存在しなかった場合、ｇＬは、免疫沈降しなかった。ｇＬがｇＨまたはｇＨ／ｇＯの存在下において発現した場合、ｇＨとｇＬが結合した（図５Ｃ）。
【０１９１】
ｇＨの存在下におけるｇＬの再局在化およびｇＨ／ｇＬの結合（ｇＯありまたはなし）は、ポリシストロニックアルファウイルスレプリコンの成分がすべて、発現され、複合体を形成するように結合することを示す。
【０１９２】
（実施例４）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてｇＨ／ｇＬ複合体形成を達成するＶＲＰは、ｇＢ  ＶＲＰに対して引き起こされる免疫応答より質的かつ量的に優れた、ＣＭＶに対する強力な免疫応答を誘発する
本実施例は、単一成分を送達するＶＲＰもしくは組み合わせて投与される単一成分ＶＲＰを使用して得られる免疫応答またはｇＢ  ＶＲＰによって引き起こされる応答と比較した、ポリシストロニックｇＨ／ｇＬ  ＶＲＰまたはｇＨ／ｇＬ／ｇＯ  ＶＲＰを送達することによって形成される複合体に対する頑健な免疫応答の誘発を実証する。
【０１９３】
マウスは、３週間間隔で投与したＶＲＰにより３回感染させた（マウス１匹あたり１０６ＩＵ；５匹のＢａｌｂＣマウス／群）。単一のおよびポリシストロニックＶＲＰによる免疫化から収集した血清は、上記に記載されるように、ＣＭＶ中和アッセイを使用して中和抗体についてスクリーニングした。中和力価は、以下のように測定した。血清の様々な希釈物は、モルモット補体の存在下または非存在下においてＴＢ４０−ＵＬ３２−ＥＧＦＰと共にあらかじめインキュベートし、その後、ＡＲＰＥ−１９上皮細胞またはＭＲＣ−５線維芽細胞の細胞に追加し、５日間インキュベートした。ウイルスによる５日の感染後に、ＧＦＰ陽性細胞を数えた。ＡＲＰＥ−１９細胞についての結果は、図６Ａ、図６Ｂ、および図６Ｃに示す。ＭＲＣ−５細胞についての結果は、図７Ａおよび図７Ｂに示す。
【０１９４】
ｇＨ  ＦＬ  ＶＲＰにより免疫化したマウス由来の血清は、低度の補体非依存性中和活性を有した（図６Ａおよび図６Ｂ）。中和活性は、モルモット補体の存在下または非存在下において、ｇＬまたはｇＯのみにより免疫化したマウス由来の血清を使用した場合観察されなかった（図６Ｃ）。いくつかのＣＭＶ  ｇＢタンパク質（ｇＢ  ＦＬ、ｇＢ  ｓｏｌ  ７５０、およびｇＢ  ｓｏｌ  ６９２）による免疫化由来のプール血清は、モルモット補体の存在下において強力な中和活性を実証し、１：１２８０血清希釈で５０％の中和力価であった。しかしながら、プールｇＢ血清についてＡＲＰＥ−１９細胞においてモルモット補体の非存在下における中和活性はなかった。単一のＣＭＶタンパク質を発現するＶＲＰ（１０６ＩＵ／マウス／ＶＲＰで、ｇＨ−もしくはｇＬ−ＶＲＰまたはｇＨ−、ｇＬ−、およびｇＯ−ＶＲＰの同時投与）は、ｇＨのみのものを超えて中和活性を増強しなかった。
【０１９５】
対照的に、バイシストロニックｇＨ／ｇＬまたはトリシストロニックｇＨ／ｇＬ／ｇＯ  ＶＲＰ（１×１０６ＩＵ／マウス）により免疫化したマウス由来の血清は、頑健な中和応答を実証した。さらに、応答は、モルモット補体の存在下および非存在下において類似しており、ポリシストロニックＶＲＰが補体非依存性免疫応答を成功裏に誘発したことを示した（図６Ｃ）。５０％の中和力価は、ＴＢ４０−ＧＦＰ  ＣＭＶウイルスを有するＡＲＰＥ−１９細胞において１：３５００〜６４００＋血清希釈であった。この力価は、ｇＢプール血清についての５０％の補体依存性中和力価のほぼ３〜４倍の力価である。
【０１９６】
ＭＲＣ−５線維芽細胞の細胞における結果は、ＡＲＰＥ−１９細胞における結果に類似した（図７Ａおよび７Ｂ）。バイシストロニックｇＨ／ｇＬまたはトリシストロニックｇＨ／ｇＬ／ｇＯ  ＶＲＰにより免疫化したマウス由来の血清は、ｇＨのみ、ｇＬのみ、またはｇＯのみをコードするＶＲＰにより免疫化したマウス由来の血清ならびにｇＨ  ＶＲＰおよびｇＬ  ＶＲＰの同時投与またはｇＨ  ＶＲＰ、ｇＬ  ＶＲＰ、およびｇＯ  ＶＲＰの同時投与によって免疫化したマウス由来の血清と比較して、強力な中和活性を実証した。これらの結果は、ポリシストロニックＶＲＰの投与が、線維芽細胞の細胞のＣＭＶ感染の好適な補体非依存性中和を提供する免疫応答を誘発したことを実証する。ＣＭＶの異なる株に対するｇＨ／ｇＬ免疫血清の広さ（ｂｒｅａｄｔｈ）および効力を評価するために、発明者らは、血清が、ＣＭＶの６つの異なる株による線維芽細胞および上皮細胞の感染を遮断する能力を比較した。図８は、ｇＨ／ｇＬ血清が、広範囲の株による両方の細胞型の感染を強力に中和することを示す。
【０１９７】
これらのデータはまた、１つのタンパク質のみを発現するＶＲＰの混合プールによってではなく、ポリシストロニックＶＲＰにより免疫化したマウス由来の血清についての強力な中和活性を実証する。これは、単一のレプリコン上にタンパク質複合体の成分をコードするポリシストロニックレプリコンがｉｎ  ｓｉｔｕにおいて複合体の効率的な産生をもたらすことを示す。さらに、Ｍｅｒｌｉｎ株ＣＭＶタンパク質をこれらの応答を刺激するために使用したので、ＴＢ４０株ＣＭＶウイルスを使用して得られたｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるデータは、ポリシストロニックＶＲＰの送達によって誘発される中和抗体が交差中和抗体であることを実証する。
【０１９８】
（実施例５）
ＲＮＡ合成
アルファウイルスレプリコンをコードするプラスミドＤＮＡ（図１４〜１６を参照されたい）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＲＮＡの合成のための鋳型としての役目をした。アルファウイルスレプリコンは、ＲＮＡ複製に必要とされる遺伝子エレメントを含有するが、粒子構築に必要な遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントを欠き、アルファウイルスゲノムの構造遺伝子は、異種タンパク質をコードする配列と交換する。真核細胞へのレプリコンの送達に際して、プラス鎖ＲＮＡは、４つの非構造タンパク質を産生するように翻訳され、これらは、ともに、ゲノムＲＮＡを複製し、異種遺伝子産物または目的の遺伝子（ＧＯＩ）をコードする大量のサブゲノムｍＲＮＡを転写する。アルファウイルス構造タンパク質の発現が欠如していることにより、レプリコンは、感染性粒子の生成を誘発することができない。アルファウイルスｃＤＮＡの上流のバクテリオファージプロモーター（Ｔ７またはＳＰ６）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるレプリコンＲＮＡの合成を容易にし、ポリ（Ａ）テイルの直ぐ下流のデルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムは、その自己切断活性を通して正確な３’末端を生成する。
【０１９９】
抗原性タンパク質複合体の形成を可能にするために、同じ細胞における当該複合体の個々の成分の発現は、最も重要である。理論上、これは、個々の成分をコードする遺伝子により細胞を同時トランスフェクトすることによって達成することができる。しかしながら、非ウイルスまたはＶＲＰ送達アルファウイルスレプリコンＲＮＡの場合には、この戦略は、複数のＲＮＡの同じ細胞への非効率的な同時送達によってか、あるいは個々の細胞における複数の自己複製ＲＮＡの非効率的な開始（ｌａｕｎｃｈ）によって妨げられる。タンパク質複合体の成分の同時発現を容易にするための潜在的により効率的な方法は、同じ自己複製ＲＮＡ分子の一部としてそれぞれの遺伝子を送達することである。この目的のために、発明者らは、目的の複数の遺伝子をコードするアルファウイルスレプリコン構築物を創出した。すべてのＧＯＩの前に、アルファウイルス転写機構によって認識されるそれ自体のサブゲノムプロモーターを置く。それによって、複数のサブゲノムメッセンジャーＲＮＡ種は、個々の細胞において合成され、多成分タンパク質複合体の構築を可能にする。
【０２００】
適した制限エンドヌクレアーゼによるＨＤＶリボザイムの下流のプラスミドＤＮＡの直線化の後に、ランオフ（ｒｕｎ−ｏｆｆ）転写物を、Ｔ７バクテリオファージ由来のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて合成した。転写は、製造者（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）によって提供される説明書に従って、７．５ｍＭのそれぞれのヌクレオシド三リン酸（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、およびＵＴＰ）の存在下において３７℃で２時間実行した。転写の後に、鋳型ＤＮＡは、ＴＵＲＢＯ  ＤＮアーゼ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）により消化した。レプリコンＲＮＡは、ＬｉＣｌにより沈殿させ、ヌクレアーゼを含まない水で再構成した。キャップがないＲＮＡは、ユーザーマニュアルにおいて概説されるように、ＳｃｒｉｐｔＣａｐ  ｍ７Ｇキャッピングシステム（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、ワクシニアキャッピング酵素（ＶＣＥ）により転写後にキャップした。転写後にキャップしたＲＮＡは、ＬｉＣｌにより沈殿させ、ヌクレアーゼを含まない水で再構成した。ＲＮＡ試料の濃度は、２６０ｎｍでの光学濃度を測定することによって決定した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける転写物の完全性は、変性アガロースゲル電気泳動によって確認した。
【０２０１】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）処方物
１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）は、以前に公開された手順を使用して合成した［Ｈｅｙｅｓ，  Ｊ．、Ｐａｌｍｅｒ，  Ｌ．、Ｂｒｅｍｎｅｒ，  Ｋ．、ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，  Ｉ．Ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  １０７巻：２７６〜２８７頁（２００５年）］。１，２−ジステアロイル（Ｄｉａｓｔｅａｒｏｙｌ）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）は、Ｇｅｎｚｙｍｅから購入した。コレステロールは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｉｓ、ＭＯ）から得た。１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（ＰＥＧ  ＤＭＧ  ２０００）は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓから得た。
【０２０２】
ＬＮＰ（ＲＶ０１（１４））は、次の方法を使用して処方した。１５０μｇバッチ、（ＰＥＳ中空繊維、ムスタング（ｍｕｓｔａｎｇ）なし）：エタノール中の新たな脂質ストック溶液を調製した。３７ｍｇのＤｌｉｎＤＭＡ、１１．８ｍｇのＤＳＰＣ、２７．８ｍｇのコレステロール、および８．０７ｍｇのＰＥＧ  ＤＭＧ  ２０００を秤量し、７．５５ｍＬのエタノール中に溶解した。新たに調製した脂質ストック溶液は、均質の混合物を形成するために約１５分間、３７℃で穏やかに揺り動かした。その後、２ｍＬの使用脂質ストック溶液を作製するために、４５３μＬのストックを、１．５４７ｍＬエタノールに追加した。脂質のこの量は、８：１  Ｎ：Ｐ（窒素  対  ホスフェート）比の１５０μｇ  ＲＮＡを有するＬＮＰを形成するために使用した。ＤｌｉｎＤＭＡ（カチオン性脂質）上のプロトン化可能な（ｐｒｏｔｏｎａｔａｂｌｅ）窒素およびＲＮＡ上のホスフェートは、この計算に使用される。自己複製ＲＮＡ分子  １μｇは、３ｎｍｏｌｅのアニオン性ホスフェートを含有することが想定され、ＤｌｉｎＤＭＡ  １μｇは、１．６ｎｍｏｌｅのカチオン性窒素を含有することが想定された。ＲＮＡの２ｍＬ使用溶液もまた、１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６）（Ｔｅｋｎｏｖａ）において約１μｇ／μＬのストック溶液から調製した。３つの２０ｍＬガラスバイアル（撹拌棒を含む）は、ＲＮａｓｅ  Ａｗａｙ溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）によりすすぎ、ＲＮアーゼからバイアルを除染するために使用の前に多量のＭｉｌｌｉＱ水により洗浄した。バイアルの１つは、ＲＮＡ使用溶液に使用し、他のものは脂質およびＲＮＡミックスを収集するために使用した（後に記載する）。使用脂質およびＲＮＡ溶液は、３ｃｃ  ｌｕｅｒ−ｌｏｋシリンジ（ＢＤ  Ｍｅｄｉｃａｌ）の中に装填する前に１０分間、３７℃で加熱した。２ｍＬのクエン酸緩衝液（ｐＨ６）を他の３ｃｃのシリンジ中に装填した。ＲＮＡおよび脂質を含有するシリンジは、ＦＥＰチューブ（［フッ化エチレンプロピレン］  ２ｍｍ  ＩＤ×３ｍｍ  ＯＤ、Ｉｄｅｘ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｏａｋ  Ｈａｒｂｏｒ、ＷＡ）を使用してＴミキサー（ＰＥＥＫ（商標）５００μｍ  ＩＤジャンクション）に接続した。Ｔミキサーからの出口もまた、ＦＥＰチューブ（２ｍｍ  ＩＤ×３ｍｍ）とした。クエン酸緩衝液を含有する第３のシリンジは、チューブの別々の部分（２ｍｍ  ＩＤ×３ｍｍ  ＯＤ）に接続した。その後、シリンジはすべて、シリンジポンプ（ｋｄＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製、モデル番号ＫＤＳ−２２０）を使用して、７ｍＬ／分の流量で駆動した。チューブの出口は、２０ｍＬガラスバイアル中に混合物を収集するように位置づけた（撹拌しながら）。撹拌棒を取り出し、１時間、室温でエタノール／水溶液を平衡化させた。その後、混合物は、ＦＥＰチューブ（２ｍｍ  ＩＤ×３ｍｍ  ＯＤ）の部分に取り付けた５ｃｃシリンジ（ＢＤ  Ｍｅｄｉｃａｌ）中に装填し、等しい長さのＦＥＰチューブを有する他の５ｃｃシリンジ中に、等しい容積の１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６）を装填した。２つのシリンジは、シリンジポンプを使用して７ｍＬ／分の流量で駆動し、最終混合物は、２０ｍＬガラスバイアル中���収集した（撹拌しながら）。次に、ＬＮＰは、２ｍＬまで濃縮し、最終生産物を回収する前に、タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）システムを使用して１０〜１５容積の１×ＰＢＳ（Ｔｅｋｎｏｖａ製）に対して透析した。ＴＦＦシステムおよび中空繊維濾過膜は、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓから購入し、製造者のガイドラインに従って使用した。１００ｋＤ孔径カットオフおよび２０ｃｍ２表面積を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）中空繊維濾過膜（部品番号Ｐ−Ｃ１−１００Ｅ−１００−０１Ｎ）を使用した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける実験のために、処方物は、１×ＰＢＳ（Ｔｅｋｎｏｖａ製）により、必要とされるＲＮＡ濃度まで希釈した。
【０２０３】
粒度
粒度は、製造者の説明書に従って、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を使用して測定した。粒度は、多分散指数（ｐｄｉ）によるＺ平均値として報告する。リポソームは、測定の前に１×ＰＢＳにおいて希釈した。
【０２０４】
被包効率およびＲＮＡ濃度
被包されたＲＮＡのパーセンテージおよびＲＮＡ濃度は、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ  ＲＮＡ試薬キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって決定した。アッセイにおいて製造者の説明書に従った。キット中に提供されるリボソームＲＮＡ標準物質は、標準曲線を生成するために使用した。方法１または方法２〜５から得たＬＮＰは、色素の追加前に、１×ＴＥ緩衝液（キットからの）においてそれぞれ１０倍または１００倍に希釈した。別々に、ＬＮＰは、色素の追加の前に、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する１×ＴＥ緩衝液中に１０または１００倍に希釈した。その後、等量の色素をそれぞれの溶液に追加し、その後、色素追加後の約１８０μＬのそれぞれの溶液を、９６ウェル組織培養プレート（ＶＷＲから得た、カタログ番号３５３０７２）の中に二連で入れた。蛍光（Ｅｘ４８５ｎｍおよびＥｍ５２８ｎｍ）は、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．製）上で読み取った。
【０２０５】
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘは、ＬＮＰを破壊するために使用し、全ＲＮＡ量に対応する蛍光の読み取り値を提供し、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘを用いない試料は、被包されていないＲＮＡに対応する蛍光を提供した。ＲＮＡ被包％は、以下のように決定した：ＬＮＰ  ＲＮＡ被包（％）＝［（Ｆｔ−Ｆｉ）／Ｆｔ］×１００、Ｆｔは、ｔｒｉｔｏｎ  Ｘの追加ありのＬＮＰの蛍光強度であり、Ｆｉは、洗浄剤の追加なしのＬＮＰ溶液の蛍光強度である。これらの値（ＦｔおよびＦｉ）は、ブランク（１×ＴＥ緩衝液）蛍光強度からの減算後に得た。被包されたＲＮＡの濃度は、生成された標準曲線とＦｔ−Ｆｉを比較することによって得た。ＬＮＰ処方物はすべて、被包用量に基づいてｉｎ  ｖｉｖｏにおいて投薬した。
【０２０６】
ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）
レポーター遺伝子または抗原のｉｎ  ｖｉｖｏにおける発現を達成するための従来のＲＮＡベクター（ＲＮＡ−ｖｅｃｔｏｒｅｄ）アプローチとＲＮＡワクチンを比較するために、発明者らは、対応するＲＮＡ構築物と同じ抗原の発現をコードする、Ｐｅｒｒｉら（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ  ７７巻（１９号）：１０３９４〜１０４０３頁（２００３年））によって記載される方法によってＢＨＫ細胞において産生されるウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）を利用した。この系において、抗原は、シンドビスウイルスの３’末端配列（３’ＵＴＲ）およびシンドビスウイルスパッケージングシグナル（ＰＳ）を含有するように操作された、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）のゲノムに由来するアルファウイルスキメラレプリコン（ＶＣＲ）から成った（Ｐｅｒｒｉらの図２を参照されたい）。レプリコンは、シンドビスウイルスのカプシドおよび糖タンパク質遺伝子をコードする不完全ヘルパーＲＮＡと共に、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞の中にそれらを同時にエレクトロポレーションすることによってＶＲＰにパッケージした（Ｐｅｒｒｉらの図２を参照されたい）。その後、ＶＲＰは、収集し、スクロースクッション上で超遠心分離法によって部分的に精製し、Ａｍｉｃｏｎ濃縮機で濃縮した。結果として生じるＶＲＰストックは、標準的な方法によって力価を測定し、培養液または他の等張性の緩衝液で動物に接種した。ベネズエラウマ脳炎およびシンドビスウイルスに由来するアルファウイルスレプリコン粒子キメラは、強力な遺伝子ベースのワクチン送達ベクターである。Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７７巻、１０３９４〜１０４０３頁。
【０２０７】
マウス免疫原性研究
８〜１０週齢で体重が約２０ｇである１０匹の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、０日目、２１日目、および４２日目に、１×１０６ＩＵ（ＶＲＰ）または１．０μｇ（ＲＮＡ）により免疫化し、２回目のワクチン接種の３週間後および３回目のワクチン接種の３週後に採血した。動物はすべて、それぞれ２本の後肢の四頭筋に注射し、等価な容積（部位当たり５０μｌ）を受けた。
【０２０８】
マイクロ中和アッセイ
血清試料は、感染低下中和試験によって中和抗体の存在について試験した。ＨＩ血清（１０％ＨＩ  ＦＢＳを有するＤＭＥＭ中）の２倍段階希釈物を、およそ２００ＩＵ／５０μｌを示すようにあらかじめ力価測定した等しい容積のＣＭＶ（株ＴＢ４０または臨床分離株８８１９）に追加した。ＶＲ１８１４、Ｔｏｗｎｅ、ＡＤ１６９株、および臨床分離株８８２２もまた、使用した。血清／ウイルス混合物は、ウイルス中和が起こるように、３７℃および５％ＣＯ２で２時間インキュベートし、その後、５０μｌのこの混合物（およそ２００ＩＵを含有する）を、９６ハーフウェルプレート中のＡＲＰＥ−１９細胞の二連のウェル上に接種した。プレートは、４０〜４４時間インキュベートした。その他に示されない限り、陽性感染した増殖巣（ｆｏｃｕｓ）の数は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲートＩＥ１  ＣＭＶモノクローナル抗体により免疫染色し、その後自動計数を続けることによって決定した。中和力価は、対照（血清なし）と比べた、ウェル当たりの陽性ウイルス増殖巣の数における５０％の低下をもたらす血清希釈の逆数として定義される。
【０２０９】
ｇＨ／ｇＬ  ＶＲＰおよびＬＮＰ処方ＲＮＡの免疫原性
ＣＭＶの表面糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）を発現するＡ３２３レプリコン、完全長糖タンパク質ＨおよびＬ（ｇＨ／ｇＬ）の膜複合体を発現するＡ１６０レプリコン、ならびに糖タンパク質ＨおよびＬの可溶性の形態の膜複合体（ｇＨｓｏｌ／ｇＬ）を発現するＡ３２２レプリコンを本実験に使用した。ＢＡＬＢ／ｃマウス、群当たり１０匹の動物に、ｇＢを発現するＶＲＰ（１×１０６ＩＵ）、ｇＨ／ｇＬを発現するＶＲＰ（１×１０６ＩＵ）、ｇＨｓｏｌ／ｇＬを発現するＶＲＰ（１×１０６ＩＵ）、および対照としてのＰＢＳにより、０日目、２１日目、および４２日目に、両側の筋肉内ワクチン接種（肢当たり５０μＬ）を与えた。３つの試験群は、ＬＮＰ（ＲＶ０１（１４）中に処方した自己複製ＲＮＡ（Ａ１６０、Ａ３２２、またはＡ３２３）を受けた。血清は、３９日目（３ｗｐ２）および６３日目（３ｗｐ３）に免疫学的分析のために収集した。
【０２１０】
結果
実験のために作製したＲＶ０１（１４）処方物における被包ＲＮＡのｓｉｖｅおよびパーセンテージを表３に示す。
【０２１１】
【表３】
2013544504.tif 000023
最終的な血清（６３日目、最終ワクチン接種の３週後）についての５０％の中和性の力価を表４に示す。
【０２１２】
【表４】
2013544504.tif 000024
ＨＣＭＶ  ｇＨ／ｇＬ複合体の完全長形態または推定される可溶性の形態を発現するＲＮＡは、２つの異なるＨＣＭＶ株を使用して上皮細胞上でアッセイされる場合、高い力価の中和抗体を引き起こす。ｇＨ／ｇＬ  ＲＮＡによって引き起こされる平均力価は、対応するｇＨ／ｇＬ  ＶＲＰについての平均力価と少なくとも同じくらい高い（図１７を参照されたい）。
【０２１３】
（実施例６）
ＣＭＶタンパク質をコードするバイシストロニックおよびペンタシストロニック核酸
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）由来の糖タンパク質複合体を発現する追加のバイシストロニックおよびペンタシストロニックアルファウイルスレプリコンを、調製した、また、図１８および２０に概略的に示す。アルファウイルスレプリコンは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）に基づいた。レプリコンは、ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の中にパッケージした、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に被包した、またはカチオン性ナノエマルジョン（ＣＮＥ）と共に処方した。レプリコンのそれぞれからのコードされたＨＣＭＶタンパク質およびタンパク質複合体の発現は、免疫ブロット法、免疫共沈降、およびフローサイトメトリーによって確認した。フローサイトメトリーは、五量体複合体上に存在するコンフォメーション性エピトープに特異的なヒトモノクローナル抗体を使用して、複合体のタンパク成分をコードする五量体のレプリコンからの五量体のｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１複合体の発現を検証するために使用した（Ｍａｃａｇｎｏら（２０１０年）、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．８４巻（２号）：１００５〜１３頁）。図１９は、これらの抗体が、ＨＣＭＶ  ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合体（Ａ５２７）を発現するレプリコンＲＮＡによりトランスフェクトされたＢＨＫＶ細胞に結合することを示す。細胞を同じレプリコン構築物から作製したＶＲＰにより感染させた場合、同様の結果が得られた。これは、五量体複合体を発現するように設計したレプリコンが、潜在的な副産物ｇＨ／ｇＬではなく所望の抗原を実際に発現することを示す。
【０２１４】
ＶＲＰ、ＬＮＰ中に被包したＲＮＡ、およびＣＮＥと共に処方したＲＮＡは、後方の四頭筋への筋肉内注射によってＢａｌｂ／ｃマウスを免疫化するために使用した。マウスは、３回、３週間間隔で免疫化し、血清試料は、それぞれの免疫化に先立ってならびに３回目および最終の免疫化の３週間後に収集した。血清は、ワクチン接種によって引き起こされる中和抗体応答の効力を測定するためにマイクロ中和アッセイにおいて評価した。力価は、５０％の中和性の力価として表現する。
【０２１５】
ＶＲＰにおける可溶性のＨＣＭＶ  ｇＨ／ｇＬ複合体についてのバイシストロニック発現カセットの多くの異なる構成の免疫原性を評価した。図２０は、膜に係留された完全長ｇＨ／ｇＬ複合体を発現するＶＲＰが、類似するバイシストロニック発現カセットから発現された可溶性複合体（ｇＨｓｏｌ／ｇＬ）よりもわずかに高度な力価で、強力な中和抗体を引き起こしたことを示す。ｇＨｓｏｌおよびｇＬをコードする遺伝子の順序の変更またはサブゲノムプロモーターのうちの１つのＩＲＥＳもしくはＦＭＤＶ  ２Ａ部位との交換は、実質的に免疫原性を改善しなかった。
【０２１６】
ｇＨ／ｇＬを発現するＶＥＥ／ＳＩＮ  ＶＲＰにより免疫化したマウス由来の血清におけるＨＣＭＶ中和活性の広さおよび効力は、ＨＣＭＶの異なる株による線維芽細胞および上皮細胞の感染を遮断するために血清を使用することによって評価した。表５は、ｇＨ／ｇＬ免疫血清が、補体の非存在下における両方の細胞型に対するＨＣＭＶの６つの異なる株に対して広くかつ強力に中和性であったことを示す。補体の追加は、血清の中和性の効力に対してわずかな陰性な影響を有した。
【０２１７】
【表５】
2013544504.tif 000025
ＬＮＰ被包ＲＮＡ（Ａ１６０）およびｇＨ／ｇＬを発現するＶＲＰ（ｐＶＣＲ修飾ｇＨ−ＳＧＰｇＬ）と比較した、五量体複合体をコードするＬＮＰ被包ＲＮＡ（Ａ５２６およびＡ５２７）の免疫原性を評価した。表６は、五量体複合体を発現するレプリコンがｇＨ／ｇＬを発現するレプリコンよりも強力に中和抗体を引き起こしたことを示す。
【０２１８】
【表６】
2013544504.tif 000026
中和抗体の最高の力価を引き起こしたペンタシストロニックＶＥＥベースのＲＮＡレプリコン（Ａ５２７）は、ＶＲＰとしてパッケージし、ＶＲＰの免疫原性は、ｇＨ／ｇＬ発現ＶＲＰおよびｇＨ／ｇＬおよび五量体複合体を発現するＬＮＰ被包レプリコンと比較した。表７は、五量体複合体を発現するＶＲＰがｇＨ／ｇＬを発現するＶＲＰよりも高度な力価の中和抗体を引き起こしたことを示す。さらに、ＶＲＰの１０６感染単位は、ＶＲＰおよびＲＮＡが同じタンパク質複合体をコードした場合、ＬＮＰ被包ＲＮＡの１μｇと少なくとも同じくらい強力である。
【０２１９】
【表７】
2013544504.tif 000027
五量体複合体をコードするＶＥＥベースのＲＮＡ（Ａ５２７）により免疫化したマウス由来の血清におけるＨＣＭＶ中和活性の広さおよび効力は、ＨＣＭＶの異なる株による線維芽細胞および上皮細胞の感染を遮断するために血清を使用することによって評価した。表８は、抗ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１免疫血清が広く強力に上皮細胞の感染を中和したことを示す。この効果は、補体非依存性であった。対照的に、血清は、線維芽細胞の感染に対して低下したまたは検出可能でない効果を有した。五量体複合体が線維芽細胞の感染に必要とされず、その結果として、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１に対する抗体が線維芽細胞の感染を遮断しないので、これらの結果は、ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合体に対して特異的な抗体をほとんど含有する免疫血清について期待されるものである（Ａｄｌｅｒら（２００６年）、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．８７巻（Ｐｔ．９）：２４５１〜６０頁；ＷａｎｇおよびＳｈｅｎｋ（２００５年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０２巻（５０号）：１８１５３〜８頁）。したがって、これらのデータは、ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合体をコードする五量体レプリコンがｉｎ  ｖｉｖｏにおいて複合体に対する抗体を特異的に引き起こすことを実証する。
【０２２０】
【表８】
2013544504.tif 000028
ｇＨ／ｇＬおよび五量体複合体を発現するバイシストロニックおよびペンタシストロニックレプリコンが異なる処方物において中和抗体を引き起こすかどうか確かめるために、コットンラットは、カチオン性ナノエマルジョン（ＣＮＥ）と混合したバイシストロニックまたはペンタシストロニックレプリコンにより免疫化した。表９は、ＣＮＥにおけるレプリコンが、ＬＮＰ中に被包された同じレプリコンと同等の中和抗体力価を引き起こしたことを示す。
【０２２１】
【表９】
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（実施例７）
ＶＺＶタンパク質をコードするレプリコン
ＶＺＶタンパク質をコードする核酸は、ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、ｇＥ、およびｇＩをコードするモノシストロニックレプリコンを産生するためにおよびｇＨ／ｇＬまたはｇＥ／ｇＩをコードするバイシストロニックレプリコンを産生するために、ＶＥＥレプリコンベクターの中にクローニングした。バイシストロニックレプリコンにおいて、それぞれのＶＺＶオープンリーディングフレームの発現は、別々のサブゲノムプロモーターによって駆動された。
【０２２２】
レプリコンＲＮＡを調製するために、レプリコンをコードするプラスミドは、ＰｍｅＩによる消化によって直線化し、直線化されたプラスミドは、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（ｉｓｏａｍｙｌａｌｃｈｏｈｏｌ）により抽出し、酢酸ナトリウム／エタノール中に沈殿させ、２０μｌのＲＮアーゼを含まない水において再懸濁した。
【０２２３】
ＲＮＡは、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７キット（ＡＭＢＩＯＮ＃  ＡＭ１３３３）を使用して、直線化されたＤＮＡの１μｇのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける転写によって調製した。２０μｌ反応は、キャップアナログを用いないで製造者の説明書に従って設定し、３２℃で２時間インキュベートした。ＴＵＲＢＯ  ＤＮアーゼ（１μｌ）を追加し、混合物を３２℃で３０分間インキュベートした。ＲＮアーゼを含まない水（３０μｌ）および酢酸アンモニウム溶液（３０μｌ）を追加した。溶液は混合し、−２０℃で少なくとも３０分間冷やした。その後、溶液は、４℃で２５分間、最高速度で遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットは７０％エタノールによりすすぎ、４℃で１０分間、最高速度で再び遠心分離した。ペレットは風乾し、５０μｌのＲＮアーゼを含まない水中に再懸濁した。ＲＮＡの濃度を測定し、品質は、変性ゲル上でチェックした。
【０２２４】
ＲＮＡは、ＳｃｒｉｐｔＣａｐ  ｍ７Ｇ  Ｃａｐｐｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  ＃ＳＣＣＥ０６２５）を使用してキャップした。反応は、ＲＮＡおよびＲＮアーゼを含まない水を組み合わせることによって調整した。その後、ＲＮＡは、６５℃で５〜１０分間変性させた。変性したＲＮＡは、氷に素速く移し、次の試薬を次の順序で追加した：ＳｃｒｉｐｔＣａｐ  Ｃａｐｐｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ、１０ｍＭ  ＧＴＰ、新たに調製した２ｍＭ  ＳＡＭ、ＳｃｒｉｐｔＧｕａｒｄ  ＲＮアーゼ阻害剤、およびＳｃｒｉｐｔＣａｐ  Ｃａｐｐｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ。混合物は、３７℃で６０分間インキュベートした。反応は、ＲＮアーゼを含まない水および７．５Ｍ  ＬｉＣｌを追加し、よく混合し、−２０℃で少なくとも３０分間、混合物を保存することによって停止させた。その後、混合物は、４℃で２５分間、最高速度で遠心分離し、ペレットは、７０％エタノールによりすすぎ、４℃で１０分間、最高速度で再び遠心分離した。ペレットは風乾させた。ペレットは、ＲＮアーゼを含まない水中に再懸濁した。ＲＮＡの濃度を測定し、品質は、変性ゲル上でチェックした。
【０２２５】
ＲＮＡトランスフェクション
細胞（ＢＨＫ−Ｖ細胞）は、６ウェルプレート上にまき、トランスフェクションの時に９０〜９５％コンフルエンスに至った。それぞれのトランスフェクションのために、３μｇのＲＮＡを第１のチューブにおいて５０ｍＬ  ＯＰＴＩＭＥＭ培地において希釈した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を、５０ｍＬ  ＯＰＴＩＭＥＭ培地を含有する第２のチューブに追加した。第１および第２のチューブを組み合わせ、室温で２０分間維持した。６ウェルプレート中の培養培地を、新たな培地と交換し、ＲＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ複合体を細胞上に配置し、プレートを穏やかに揺り動かすことによって混合した。プレートは、ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で２４時間インキュベートした。
【０２２６】
トランスフェクトした細胞におけるＶＺＶタンパク質の発現は、ウエスタンブロットおよび免疫蛍光法によって評価した。ウエスタンブロットのために、トランスフェクト細胞の溶解産物は、電気泳動（５μｇ総タンパク質／レーン）によって分離し、ブロットした。ＯＫＡ／Ｍｅｒｃｋワクチン株に由来する、透明なウイルス懸濁液（７μｇ総タンパク質／レーン）を、陽性対照として使用した。ブロットは、ＶＺＶタンパク質に結合する市販で入手可能な抗体（１：１０００希釈）を使用してプローブした。
【０２２７】
免疫蛍光法のために、トランスフェクトした細胞を、収集し、９６ウェルプレート中にまき、細胞内染色は、市販で入手可能なマウスｍＡｂ（希釈範囲１：１００  １：４００）を使用して実行した。細胞ペレットを固定し、Ｃｉｔｏｆｉｘ−Ｃｉｔｏｐｅｒｍ溶液により透過処理した。二次試薬、Ａｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２（１：４００最終希釈）を使用した。
【０２２８】
ＶＺＶタンパク質ｇＥおよびｇＩの発現は、モノシストロニック構築物（ｇＥまたはｇＩ）によりトランスフェクトした細胞において検出され、ｇＥおよびｇＩの両方の発現は、市販で入手可能なマウス抗体、ｇＥについては１３Ｂ１およびｇＩについては８Ｃ４を使用して、ウエスタンブロットにおいてバイシストロニックｇＥ／ｇＩ構築物によりトランスフェクトした細胞において検出された。ＶＺＶタンパク質ｇＢの発現は、市販で入手可能な抗体１０Ｇ６を使用して、免疫蛍光法によって、ｇＢをコードするモノシストロニック構築物によりトランスフェクトした細胞において検出された。ＶＺＶタンパク質複合体ｇＨ／ｇＬの発現は、モノシストロニックｇＨおよびモノシストロニックｇＬによりまたはバイシストロニックｇＨ／ｇＬ構築物によりトランスフェクトされた細胞において免疫蛍光法によって検出された。ｇＨ／ｇＬ複合体は、市販で入手可能な抗体ＳＧ３を使用して検出された。
【０２２９】
マウス免疫原性研究
６〜８週齢で体重が約２０ｇである８匹の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、０日目、２１日目、および４２日目に、ＣＮＥまたはＬＮＰ（ＲＶ０１）と共に処方した７．０または１．０μｇのレプリコンＲＮＡにより筋肉内で免疫化した。血液試料は、２回目の免疫化の３週間後および３回目の免疫化の３週間後に、免疫化した動物から取った。群を表１０に示す。
【０２３０】
【表１０】
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ＶＺＶ抗原に対する免疫応答
血清試料は、ＶＺＶレプリコンでトランスフェクトしたＭＲＣ−５細胞の細胞内染色によってｇＢに対する抗体の存在について試験した。ＭＲＣ−５細胞は、１０％ウシ胎仔血清を有するＤｕｌｂｅｃｃｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍにおいて維持した。ＶＺＶ  Ｏｋａ株接種材料（ＡＴＣＣから得た）は、ＭＲＣ−５細胞培養物を感染させるために使用し、感染した細胞全体は、ウイルスの二次継代（ｓｕｂｐａｓｓａｇｅ）のために使用した。感染した細胞および感染しなかった細胞の間の比は、１：１０であった。感染後３０時間の細胞は、免疫化後に得られたマウス血清（希釈範囲１：２００〜１：８００）のプールによる細胞内染色を実行するために、９６ウェルプレート中にまくためにトリプシンにより分散させた。市販のｍＡｂは、感染レベルを定量化するために対照として使用した。細胞ペレットを固定し、Ｃｉｔｏｆｉｘ−Ｃｉｔｏｐｅｒｍ溶液により透過処理した。二次試薬、Ａｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２を使用した（１：４００最終希釈）。
【０２３１】
ｇＢ（１０Ｇ６）、ｇＨ（ＳＧ３）、ならびにｇＥ（１３Ｂ１（ＳＢＡ）および８６１２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））に対する市販の抗体は、陽性対照として使用し、それぞれ、感染したＭＲＣ−５細胞を細胞内染色した。ＣＮＥまたはＬＮＰと共に処方した１または７μｇのＲＮＡによる３回目の免疫化の３週間後に得られた免疫血清は、１／２００、１／４００、および１／８００に希釈し、感染したＭＲＣ−５細胞を細胞内染色するために使用した。結果は、図２１（研究１、群１、５、７、９、１１、１３、および１５、ＣＮＥ処方物）ならびに図２２（研究２、群１〜７、ＬＮＰ処方物）に示す。
【０２３２】
中和アッセイ
免疫化マウス血清はそれぞれ、標準的な培地において１：２０から出発して、２倍の増分ずつ連続的に希釈し、モルモット補体の存在下において等しい容積のＶＺＶ懸濁液に追加した。３７℃での１時間のインキュベーション後に、ヒト上皮細胞株Ａ５４９を追加した。感染細胞は、顕微鏡下で培養物中に形成されたプラークを数えることによって培養の１週間後に測定することができる。プラーク数から、それぞれの血清希釈での阻害％を計算した。それぞれの血清試料のチャートは、希釈係数である対数目盛に対する阻害％の値をプロットすることによって作製した。続いて、希釈係数および阻害％の間の関係についての近似の線（approximate line）を引いた。その後、５０％の中和力価を、線が５０％の阻害の値で交差する希釈係数として決定した。
【０２３３】
表１１は、モノシストロニックｇＥ、バイシストロニックｇＥ／ｇＩ、およびバイシストロニックｇＨ／ｇＬにより免疫化したマウスから得られた血清が頑健な中和抗体力価を含有したことを示す。
【０２３４】
【表１１】
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【０２３５】
【化２０】
2013544504.tif 000032
【０２３６】
【化２１】
2013544504.tif 000033
【０２３７】
【化２２】
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【０２３８】
【数１】
2013544504.tif 000035
【０２３９】
【数２】
2013544504.tif 000036
【０２４０】
【数３】
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【０２４１】
【数４】
2013544504.tif 000038
【０２４２】
【数５】
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【０２４３】
【数６】
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【０２４４】
【数７】
2013544504.tif 000041
【０２４５】
【数８】
2013544504.tif 000042
【０２４６】
【数９】
2013544504.tif 000043
【０２４７】
【数１０】
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【０２４８】
【数１１】
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【０２４９】
【数１２】
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【０２５０】
【数１３】
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【０２５１】
【数１４】
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【０２５２】
【数１５】
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【０２５３】
【数１６】
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【０２５４】
【数１７】
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【０２５５】
【数１８】
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【０２５６】
【数１９】
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【０２５７】
【数２０】
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【０２５８】
【数２１】
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【０２５９】
【数２２】
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【０２６０】
【数２３】
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【０２６１】
【数２４】
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【０２６２】
【数２５】
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【０２６３】
【数２６】
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【０２６４】
【数２７】
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【０２６５】
【数２８】
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【０２６６】
【数２９】
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【０２６７】
【数３０】
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【０２６８】
【数３１】
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【０２６９】
【数３２】
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【０２７０】
【数３３】
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【０２７１】
【数３４】
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【０２７２】
【数３５】
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【０２７３】
【数３６】
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【０２７４】
【数３７】
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【０２７５】
【数３８】
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【０２７６】
【数３９】
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【０２７７】
【数４０】
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【０２７８】
【数４１】
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【０２７９】
【数４２】
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【０２８０】
【数４３】
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【０２８１】
【数４４】
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【０２８２】
【数４５】
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【０２８３】
【数４６】
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【０２８４】
【数４７】
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【０２８５】
【数４８】
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【０２８６】
【数４９】
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【０２８７】
【数５０】
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【０２８８】
【数５１】
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【０２８９】
【数５２】
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【０２９０】
【数５３】
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【０２９１】
【数５４】
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【０２９２】
【数５５】
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【０２９３】
【数５６】
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【０２９４】
【数５７】
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【０２９５】
【数５８】
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【０２９６】
【数５９】
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【０２９７】
【数６０】
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【０２９８】
【数６１】
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【０２９９】
【数６２】
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【０３００】
【数６３】
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【０３０１】
【数６４】
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【０３０２】
【数６５】
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【０３０３】
【数６６】
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【０３０４】
【数６７】
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【０３０５】
【数６８】
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【０３０６】
【数６９】
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【０３０７】
【数７０】
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【０３０８】
【数７１】
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【０３０９】
【数７２】
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【０３１０】
【数７３】
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【０３１１】
【数７４】
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【０３１２】
【数７５】
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【０３１３】
【数７６】
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【０３１４】
【数７７】
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【０３１５】
【数７８】
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【０３１６】
【数７９】
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【０３１７】
【数８０】
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【０３１８】
【数８１】
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【０３１９】
【数８２】
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【０３２０】
【数８３】
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【０３２１】
【数８４】
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【０３２２】
【数８５】
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【０３２３】
【数８６】
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【０３２４】
【数８７】
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【０３２５】
【数８８】
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【０３２６】
【数８９】
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【０３２７】
【数９０】
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【０３２８】
【数９１】
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【０３２９】
【数９２】
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【０３３０】
【数９３】
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【０３３１】
【数９４】
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【０３３２】
【数９５】
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【０３３３】
【数９６】
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【０３３４】
【数９７】
2013544504.tif 000131
【０３３５】
【数９８】
2013544504.tif 000132
【０３３６】
【数９９】
2013544504.tif 000133
【図２−３】
2013544504.tif 000134
【図１４Ａ】
2013544504.tif 000135
【図１４Ｂ】
2013544504.tif 000136
【図１４Ｃ】
2013544504.tif 000137
【図１４Ｄ−１】
2013544504.tif 000138
【図１４Ｄ−２】
2013544504.tif 000139
【図１４Ｅ】
2013544504.tif 000140
【図１４Ｆ】
2013544504.tif 000141
【図１５Ａ】
2013544504.tif 000142
【図１５Ｂ】
2013544504.tif 000143
【図１５Ｃ】
2013544504.tif 000144
【図１５Ｄ】
2013544504.tif 000145
【図１５Ｅ】
2013544504.tif 000146
【図１５Ｆ】
2013544504.tif 000147
【図１５Ｇ】
2013544504.tif 000148
【図１６Ａ】
2013544504.tif 000149
【図１６Ｂ】
2013544504.tif 000150
【図１６Ｃ】
2013544504.tif 000151
【図１６Ｄ】
2013544504.tif 000152
【図１６Ｅ】
2013544504.tif 000153
【図１６Ｆ】
2013544504.tif 000154
【図１６Ｇ】
2013544504.tif 000155
【図１８】
2013544504.tif 000156
【図１】
2013544504.tif 000157
【図２−１】
2013544504.tif 000158
【図２−２】
2013544504.tif 000159
【図３Ａ】
2013544504.tif 000160
【図３Ｂ】
2013544504.tif 000161
【図４Ａ】
2013544504.tif 000162
【図４Ｂ】
2013544504.tif 000163
【図５Ａ】
2013544504.tif 000164
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2013544504.tif 000168
【図６Ｃ】
2013544504.tif 000169
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2013544504.tif 000171
【図８Ａ】
2013544504.tif 000172
【図８Ｂ】
2013544504.tif 000173
【図９】
2013544504.tif 000174
【図１０】
2013544504.tif 000175
【図１１】
2013544504.tif 000176
【図１２】
2013544504.tif 000177
【図１３】
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【図１４Ｇ】
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【図１５Ｈ】
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【図１６Ｈ】
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【図１７】
2013544504.tif 000182
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年6月11日(2013.6.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2013544504000001.app
【国際調査報告】
2013544504.tif 000286
2013544504.tif 000287
2013544504.tif 000288
2013544504.tif 000289
2013544504.tif 000290