(57)【要約】  本発明は、配列番号５５のＴ２１９に対応する１つ以上の位置において突然変異を有するポリペプチドであって、配列番号５５と少なくとも５０％の配列同一性を有し、パーミアーゼ活性を有するポリペプチドに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５５のＴ２１９に対応する１つ以上の位置に対応する位置において突然変異を有するポリペプチドであって、配列番号５５と少なくとも５０％の配列同一性を有し、パーミアーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
置換Ｔ２１９ＮまたはＴ２１９Ｑを有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
置換Ｔ２１９Ｎを有する、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ＧＡＬ２活性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
以下のアミノ酸またはアミノ酸配列：
ｌ）Ｇ９０；
ｍ）Ｇ１３５；
ｎ）Ｇ１４７；
ｏ）Ｇ１８４−Ｘ（３）−Ｇ１８８−Ｘ（１１）−Ｅ２００−Ｘ（２）−Ｐ２０３−Ｘ（３）−Ｒ２０７−Ｘ（７）−Ｑ２１５
ｐ）Ｑ２１５；
ｑ）Ｇ３４５−Ｘ（１）−Ｎ３４７；
ｒ）Ｙ３５２；
ｓ）Ｙ４４６；
ｔ）Ｅ４６０；
ｕ）Ｆ５０４および／または
ｖ）Ｅ５２１
の１つ以上を含み、前記ポリペプチド中のａ）からｋ）の位置は、配列番号５５の位置に対応する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列ＧＸＸＸＧＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＥＸＸＰＸＸＸＲＸＸＸＸＸＸＸＱを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、配列番号５０と少なくとも５０％の同一性を有するポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む核酸構築物。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸構築物により形質転換された宿主細胞。
【請求項１０】
酵母である、請求項９に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項１１】
サッカロマイセス(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ)属に属する、請求項１０に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項１２】
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）種に属する、請求項１１に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項１３】
リグノセルロースまたはヘミセルロース材料を分解する方法であって、リグノセルロースまたはヘミセルロース材料を酵素組成物と接触させ、１つ以上の糖を生成し、生成された糖を発酵させて発酵生成物を生じさせ、前記発酵を請求項９〜１２のいずれか一項に記載の形質転換された宿主細胞を用いて実施する方法。
【請求項１４】
前記発酵生成物は、エタノール、ブタノール、乳酸、プラスチック、有機酸、溶媒、動物飼料補助剤、医薬品、ビタミン、アミノ酸、酵素または化学原料の１つ以上である、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、新規ポリペプチドおよびこのポリペプチドを発現する組換え生物を対象とする。一実施形態において、本発明は、新規パーミアーゼポリペプチド、より具体的にはサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における新規ＧＡＬ２に関する。
【０００２】
［背景技術］
パーミアーゼは、細胞中または細胞外での規定分子、本明細書において具体的には１つ以上の糖の拡散を受動輸送により促進する複数回膜貫通タンパク質のクラスの膜輸送タンパク質である。対照的に、活性トランスポーターは、分子膜貫通輸送をエネルギー源、例えばＡＴＰまたは好ましいイオン勾配と結びつける。
【０００３】
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、パーミアーゼＧＡＬ２は、ガラクトースを細胞膜を越えて輸送する。これは、膜を越えるグルコースのトランスポーターとしても公知である。
【０００４】
［発明の概要］
本発明の目的は、新規パーミアーゼポリペプチドを提供することである。本発明の別の目的は、パーミアーゼが細胞膜を越えて輸送する分子の改善された取り込みを有するパーミアーゼポリペプチドを発現する組換え株を提供することである。別の目的は、親ポリペプチドと比較してＣ５糖に対して高い親和性を有するパーミアーゼポリペプチドを提供することである。別の目的は、親ポリペプチドと比較してＣ６糖に対して低減された親和性を有するパーミアーゼポリペプチドを提供することである。
【０００５】
これらの目的の１つ以上が本発明により達成される。本発明によれば、配列番号５５のＴ２１９に対応する１つ以上の位置に対応する位置において突然変異を有するポリペプチドであって、配列番号５５と少なくとも５０％の配列同一性を有し、パーミアーゼ活性を有するポリペプチドが提供される。一実施形態において、ポリペプチドは置換Ｔ２１９ＮまたはＴ２１９Ｑを有する。一実施形態において、ポリペプチドは置換Ｔ２１９Ｎを有する。
【０００６】
これらの突然変異の１つ以上を有するポリペプチドが有利な糖消費および／または発酵生成を有することは、図１７、１９および２０から明白である。以下の実施例１８も参照のこと。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】株ＤＳ６２５０４（図１（ａ））、ＩＭＫ３０７（図１（ｂ））およびＩＭＫ３１１（図１（ｃ））の振とうフラスコ培養の間のグルコース（◆）、アラビノース（▲）およびエタノール（■）濃度ならびに６６０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６６０、●）を示す。
【図２】株ＤＳ６２５０４（図２（ａ））、ＩＭＫ３０７（図２（ｂ））およびＩＭＫ３１１（図２（ｃ））の嫌気的培養の間のグルコース（◆）、アラビノース（▲）およびエタノール（■）濃度ならびに排ガス中のＣＯ２百分率（黒色実線）を示す。発酵物にグルコースにより生育させた振とうフラスコ培養物を植菌した。
【図３】２％のアラビノースおよび種々の濃度のグルコース（０、０．１１、０．２３、０．６５、１．３および２．５％）を含有するＭＹ尿素中の株ＩＭＫ３１８の振とうフラスコ培養物についての６６０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６６０）を計測することにより決定された生育プロファイルを示す。
【図４】表３に従って継代された株ＩＭＫ３１８（系列Ａ：ＳＦ１、ＳＦ２およびＳＦ５）；この系列の振とうフラスコから選択された単一コロニー単離物ＩＭＷ０１８の振とうフラスコ培養の間のグルコース（◆）、アラビノース（▲）およびエタノール（■）濃度ならびに６６０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６６０、●）。
【図５】表３に従って継代された株ＩＭＫ３１８（系列Ｂ：ＳＦ１、ＳＦ２およびＳＦ３）；この系列の振とうフラスコから選択された単一コロニー単離物ＩＭＷ０１７の振とうフラスコ培養の間のグルコース（◆）、アラビノース（▲）およびエタノール（■）濃度ならびに６６０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６６０、●）を示す。
【図６】株ＩＭＷ０１７の連続嫌気的培養の間のグルコース（◆）、アラビノース（▲）およびエタノール（■）濃度ならびに排ガス中のＣＯ２百分率（灰色実線）を示す。
【図７】株ＩＭＷ０１７の連続嫌気的培養の間の排ガス中のＣＯ２百分率（灰色実線）および生育速度を示す。比生育速度は、グルコースおよびアラビノースの混合物（●）またはアラビノース単独（◆）のいずれかに対するバッチ培養の間のＣＯ２生成プロファイルから導かれる。
【図８】株ＩＭＷ０１７の嫌気的連続バッチ培養の間の、アラビノース（Ａ）ならびにグルコースおよびアラビノースの混合物（Ｂ）を補給した培地における個々のバッチのＣＯ２生成プロファイルを示す。ＣＯ２生成プロファイルは、等しい初期ＣＯ２生成レベルを想定してアラインされる。説明文中の数字は、連続バッチ数を示す。
【図９】株ＩＭＷ０１７の連続嫌気的バッチ培養のバッチ２４および２５の間のグルコース（◆）、アラビノース（▲）およびエタノール（■）濃度ならびに排ガス中のＣＯ２百分率（灰色実線）を示す。
【図１０】株ＤＳ６２５０４、ＩＭＫ３０７、ＩＭＫ３１１、ＩＭＫ３１８、ＩＭＷ０１７およびＩＭＷ０１８のヘキソキナーゼ酵素活性を示す。
【図１１】２％のグルコースおよび２％のアラビノースを補給したＭＹ培地中での株ＩＭＷ０２３の振とうフラスコ培養の間のＯＤ６６０（●）、アラビノース濃度（▲）、およびグルコース濃度（◆）を示す。
【図１２】２％のグルコースおよび２％のアラビノースを補給したＭＹ培地中の株ＩＭＷ０２３の継代された培養物の１代目（ＳＦ１）および２４代目（ＳＦ２４）の振とうフラスコ培養の間のＯＤ６６０（●）、アラビノース濃度（▲）、およびグルコース濃度（◆）を示す。
【図１３】２％のグルコースおよび２％のアラビノースを補給したＭＹ培地中の株ＩＭＷ０２３の継代された培養物の個々の振とうフラスコ培養において決定された推定比生育速度を示す。
【図１４】２０ｇ／リットルのグルコースおよび２０ｇ／リットルのアラビノースを補給したＭＹ培地中の株ＩＭＷ０２３の連続嫌気バッチ培養の間の排ガス中のＣＯ２百分率（灰色実線）および比生育速度、ならびに個々のバッチ培養の比生育速度（●）を示す。灰色陰影は、窒素の代わりに空気を補給した箇所を示す。矢印は、新たな連続バッチの開始を示す。
【図１５】２０ｇ／リットルのグルコースおよび２０ｇ／リットルのアラビノースを補給したＭＹ培地中の株ＩＭＷ０２３の連続的嫌気バッチ培養の間の排ガス中のＣＯ２百分率（灰色実線）、アラビノース濃度（▲）およびグルコース濃度（◆）を示す。
【図１６】２０ｇ／リットルのグルコースおよび２０ｇ／リットルのアラビノースを補給したＭＹ培地中の株ＩＭＷ０２３の嫌気的連続バッチ培養の間の個々のバッチのアラインされたＣＯ２生成プロファイルを示す。ＣＯ２生成プロファイルは、等しい初期ＣＯ２生成レベルを想定してアラインされる。説明文中の数字は、連続バッチ数を示す。
【図１７】株ＤＳ６２５０４（図１７（ａ））、ＩＭＫ３０７（図１７（ｂ）、ＩＭＫ３１１（図１７（ｃ））、ＩＭＷ０１７（図１７（ｄ））、ＩＭＷ０１８（図１７（ｅ））およびＩＭＷ０５８（図１７（ｆ））、ＩＭＷ０２４（図１７（ｇ））、ＩＭＷ０２５（図１７（ｈ））、ＩＭＷ０４７（図１７（ｉ））、ＩＭＷ０５９（図１７（ｊ））、ＩＭＷ０６０（図１７（ｋ））、ＩＭＷ０６１（ｌ））の振とうフラスコ培養の間のグルコース（◆）、アラビノース（▲）およびエタノール（□）濃度ならびに６６０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６６０、●）を示す。
【図１８】株ＩＭＷ０４７の振とうフラスコ培養の間のグルコース（◆）およびアラビノース（▲）濃度を示す。
【図１９】株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ、ＩＭＫ３１８、ＩＭＷ０１７およびＩＭＷ０１８のＧＡＬ１アミノ酸アラインメントを示す。
【図２０】株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ、ＩＭＫ３１８、ＩＭＷ０１７およびＩＭＷ０１８のＧＡＬ２アミノ酸アラインメントを示す。
【図２１】２０ｇ  ｌ−１のグルコースおよび２０ｇ  ｌ−１のアラビノースを補給したＭＹ培地中の株ＩＭＷ０５９の嫌気的培養の間のグルコース（◆）、アラビノース（▲）、エタノール（□）濃度、バイオマス乾燥重量（●）およびＣＯ２生成（灰色実線）を示す。
【図２２】２０ｇ  ｌ−１のグルコースおよび２０ｇ  ｌ−１のアラビノースを補給したＭＹ培地中の株ＩＭＷ０６０の嫌気的培養の間のグルコース（◆）、アラビノース（▲）、エタノール（□）濃度、バイオマス乾燥重量（●）およびＣＯ２生成（灰色実線）を示す。
【図２３】２０ｇ  ｌ−１のグルコースおよび２０ｇ  ｌ−１のアラビノースを補給したＭＹ培地中の株ＩＭＷ０６１の嫌気的培養の間のグルコース（◆）、アラビノース（▲）、エタノール（□）濃度、バイオマス乾燥重量（●）およびＣＯ２生成（灰色実線）を示す。
【図２４】２０ｇ  ｌ−１のグルコースおよび２０ｇ  ｌ−１のアラビノースの混合物中の嫌気的培養の間の株ＤＳ６２５０４のＣＯ２生成プロファイル（黒色点線）、ＩＭＷ０５９（黒色実線）、ＩＭＷ０６０（黒色実線）およびＩＭＷ０６１（黒色ストライプ線）を示す。
【図２５】培地ＣＦＭＭ２Ｍ上での株ＤＳ６２５０４の振とうフラスコ培養の間のグルコース（◆）、マンノース（◇）、アラビノース（▲）およびエタノール（□）濃度を示す。
【図２６】培地ＣＦＭＭ２Ｍ上での株ＩＭＷ０６０の振とうフラスコ培養の間のグルコース（◆）、マンノース（◇）、アラビノース（▲）およびエタノール（□）濃度を示す。
【図２７】培地ＣＦＭＭ２Ｍ上での株ＩＭＷ０６１の振とうフラスコ培養の間のグルコース（◆）、マンノース（◇）、アラビノース（▲）およびエタノール（□）濃度を示す。
【図２８】培地ＣＦＭＭ１Ｍ上での株ＤＳ６２５０４の振とうフラスコ培養の間のグルコース（◆）、マンノース（◇）、アラビノース（▲）およびエタノール（□）濃度を示す。
【図２９】培地ＣＦＭＭ１Ｍ上での株ＩＭＷ０６０の振とうフラスコ培養の間のグルコース（◆）、マンノース（◇）、アラビノース（▲）およびエタノール（□）濃度を示す。
【図３０】培地ＣＦＭＭ１Ｍ上での株ＩＭＷ０６１の振とうフラスコ培養の間のグルコース（◆）、マンノース（◇）、アラビノース（▲）およびエタノール（□）濃度を示す。
【０００８】
［配列表の簡単な説明］
遺伝子破壊カセットの構築に使用されるオリゴヌクレオチド：
配列番号１は、オリゴヌクレオチドＨＸＫ２−ｄｉｓＡの配列を説明する
配列番号２は、オリゴヌクレオチドＨＸＫ２−ｄｉｓＢの配列を説明する
配列番号３は、オリゴヌクレオチドＨＸＫ１−ｄｉｓＡの配列を説明する
配列番号４は、オリゴヌクレオチドＨＸＫ１−ｄｉｓＢの配列を説明する
配列番号５は、オリゴヌクレオチドＧＬＫ１−ｄｉｓＡの配列を説明する
配列番号６は、オリゴヌクレオチドＧＬＫ１−ｄｉｓＢの配列を説明する
診断目的に使用されるオリゴヌクレオチド：
配列番号７は、オリゴヌクレオチドＫａｎＡの配列を説明する
配列番号８は、オリゴヌクレオチドＫａｎＢの配列を説明する
配列番号９は、オリゴヌクレオチドＨＸＫ２−ＦＷの配列を説明する
配列番号１０は、オリゴヌクレオチドＨＸＫ２−ＲＶの配列を説明する
配列番号１１は、オリゴヌクレオチドＨＸＫ１−ＦＷの配列を説明する
配列番号１２は、オリゴヌクレオチドＨＸＫ１−ＲＶの配列を説明する
配列番号１３は、オリゴヌクレオチドＧＬＫ１−ＦＷの配列を説明する
配列番号１４は、オリゴヌクレオチドＧＬＫ１−ＲＶの配列を説明する
配列番号１５は、ＨＸＫ１のＤＮＡ配列を説明する
配列番号１６は、ＨＸＫ２のＤＮＡ配列を説明する
配列番号１７は、ＧＬＫ１のＤＮＡ配列を説明する
配列番号１８は、ＧＡＬ１のＤＮＡ配列を説明する
配列番号１９は、ＹＤＲ５１６ＣのＤＮＡ配列を説明する
配列番号２０は、ＹＬＲ４４６ＷのＤＮＡ配列を説明する
配列番号２１は、ＨＸＫ１のアミノ酸配列を説明する
配列番号２２は、ＨＸＫ２のアミノ酸配列を説明する
配列番号２３は、ＧＬＫ１のアミノ酸配列を説明する
配列番号２４は、ＧＡＬ１のアミノ酸配列を説明する
配列番号２５は、ＹＤＲ５１６Ｃのアミノ酸配列を説明する
配列番号２６は、ＹＬＲ４４６Ｗのアミノ酸配列を説明する
配列番号２７は、オリゴヌクレオチドＧＡＬ１−ＤｉｓＡの配列を説明する
配列番号２８は、オリゴヌクレオチドＧＡＬ１−ＤｉｓＢの配列を説明する
配列番号２９は、オリゴヌクレオチドＧＡＬ１−ＦＷ２の配列を説明する
配列番号３０は、オリゴヌクレオチドＧＡＬ１−ＲＶ２の配列を説明する
配列番号３１は、オリゴヌクレオチドＨＸＫ２−ＦＷ２の配列を説明する
配列番号３２は、オリゴヌクレオチドＨＸＫ２−ＲＶ２の配列を説明する
配列番号３３は、オリゴヌクレオチドＨＸＫ２−ＦＷ３の配列を説明する
配列番号３４は、オリゴヌクレオチドＨＸＫ２−ＲＶ３の配列を説明する
配列番号３５は、オリゴヌクレオチドＨＸＫ１−ＦＷ２の配列を説明する
配列番号３６は、オリゴヌクレオチドＨＸＫ１−ＲＶ２の配列を説明する
配列番号３７は、オリゴヌクレオチドＨＸＫ１−ＦＷ３の配列を説明する
配列番号３８は、オリゴヌクレオチドＨＸＫ１−ＲＶ３の配列を説明する
配列番号３９は、オリゴヌクレオチドＧＬＫ１−ＦＷ４の配列を説明する
配列番号４０は、オリゴヌクレオチドＧＬＫ１−ＲＶ４の配列を説明する
配列番号４１は、オリゴヌクレオチドＧＬＫ１−ＦＷ５の配列を説明する
配列番号４２は、オリゴヌクレオチドＧＬＫ１−ＲＶ５の配列を説明する
配列番号４３は、ＧＡＬ１（ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ）のＤＮＡ配列を説明する
配列番号４４は、ＧＡＬ１（ＩＭＫ３１８）のＤＮＡ配列を説明する
配列番号４５は、ＧＡＬ１（ＩＭＷ０１７）のＤＮＡ配列を説明する
配列番号４６は、ＧＡＬ１（ＩＭＷ０１８）のＤＮＡ配列を説明する
配列番号４７は、ＧＡＬ２（ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ）のＤＮＡ配列を説明する
配列番号４８は、ＧＡＬ２（ＩＭＫ３１８）のＤＮＡ配列を説明する
配列番号４９は、ＧＡＬ２（ＩＭＷ０１７）のＤＮＡ配列を説明する
配列番号５０は、ＧＡＬ２（ＩＭＷ０１８）のＤＮＡ配列を説明する
配列番号５１は、ＧＡＬ１（ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ）のアミノ酸配列を説明する
配列番号５２は、ＧＡＬ１（ＩＭＫ３１８）のアミノ酸配列を説明する
配列番号５３は、ＧＡＬ１（ＩＭＷ０１７）のアミノ酸配列を説明する
配列番号５４は、ＧＡＬ１（ＩＭＷ０１８）のアミノ酸配列を説明する
配列番号５５は、ＧＡＬ２（ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ）のアミノ酸配列を説明する
配列番号５６は、ＧＡＬ２（ＩＭＫ３１８）のアミノ酸配列を説明する
配列番号５７は、ＧＡＬ２（ＩＭＷ０１７）のアミノ酸配列を説明する
配列番号５８は、ＧＡＬ２（ＩＭＷ０１８）のアミノ酸配列を説明する
【０００９】
本明細書および添付の特許請求の範囲全体にわたり、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」ならびに変形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、包括的なものと解釈すべきである。すなわち、これらの語は、文脈が許容すれば具体的に引用されていない他の要素または整数の考えられる包含を伝えるものとする。冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書において、冠詞の文法的目的語の１つまたは２つ以上（すなわち、１つまたは少なくとも１つ）を指すものとして使用される。例として、「要素」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味し得る。
【００１０】
本発明は、配列番号５５のＴ２１９に対応する１つ以上の位置に対応する位置において突然変異を有するポリペプチドであって、配列番号５５と少なくとも５０％の配列同一性を有し、パーミアーゼ活性を有するポリペプチドに関する。一実施形態において、Ｔ２１９に対応する位置における突然変異は、Ｃ、Ｐ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒによる置換または欠失であり得る。Ｘは、任意のアミノ酸であり得、Ｘ（２）は２つのＸを意味する。
【００１１】
一実施形態において、ポリペプチドは置換Ｔ２１９ＮまたはＴ２１９Ｑを有する。一実施形態において、ポリペプチドは置換Ｎ３７６ＳまたはＮ３７６Ｔを有する。一実施形態において、本発明によるポリペプチドは置換Ｔ２１９ＮおよびＮ３７６Ｓを有する。
【００１２】
本明細書において、ＧＡＬ２は、高親和性ガラクトキナーゼ依存性および低親和性ガラクトキナーゼ非依存性ガラクトース輸送プロセスの両方に要求される促進拡散トランスポーターである。これは、メジャーファシリテータースーパーファミリー（ｍａｊｏｒ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）、糖トランスポーター（ＴＣ２．Ａ．１．１）ファミリーに属する。「パーミアーゼポリペプチド」は、本明細書において「ポリペプチドパーミアーゼ」または「ポリペプチド」とも命名される。「パーミアーゼポリペプチドポリヌクレオチド」は、本明細書において、パーミアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００１３】
本発明の一実施形態において、パーミアーゼポリペプチドは、配列番号５５と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００１４】
一実施形態において、本発明によるポリペプチドは、以下のアミノ酸またはアミノ酸配列：
ａ）Ｇ９０；
ｂ）Ｇ１３５；
ｃ）Ｇ１４７；
ｄ）Ｇ１８４−Ｘ（３）−Ｇ１８８−Ｘ（１１）−Ｅ２００−Ｘ（２）−Ｐ２０３−Ｘ（３）−Ｒ２０７−Ｘ（７）−Ｑ２１５
ｅ）Ｑ２１５；
ｆ）Ｇ３４５−Ｘ（１）−Ｎ３４７；
ｇ）Ｙ３５２；
ｈ）Ｙ４４６；
ｉ）Ｅ４６０；
ｊ）Ｆ５０４および／または
ｋ）Ｅ５２１
の１つ以上を含み、
ポリペプチド中のａ）からｋ）の位置は、配列番号５５の位置に対応する。一実施形態において、ポリペプチドは配列ＧＸＸＸＧＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＥＸＸＰＸＸＸＲＸＸＸＸＸＸＸＱを含む。
【００１５】
本発明において、突然変異は、１文字アミノ酸およびそれらのアミノ酸の位置により示される。例えば、Ａ６は、本明細書において、配列番号１のある位置におけるアミノ酸（１文字コード）を示し、この場合、タンパク質の６番目の位置におけるＡ（アラニン）である。Ａ６（Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｇ／Ｖ／ｌ／Ｙ／Ｓ／Ｅ／Ｋ）は、本明細書において、ある位置におけるアミノ酸の突然変異を示し、この場合、タンパク質の６番目の位置におけるＡ（アラニン）がＬ（ロイシン）、Ｎ（アスパラギン）、Ｑ（グルタミン）、Ｇ（グリシン）、Ｖ（バリン）、Ｉ（イソロイシン）、Ｙ（チロシン）、Ｓ（セリン）、Ｅ（グルタミン酸）またはＫ（リジン）のいずれかと交換されている。
【００１６】
本発明のパーミアーゼポリペプチドは、糖パーミアーゼ活性のそれ以外の１つ以上の代替的および／または追加の活性を有し得る。
【００１７】
上記説明のとおり、本発明のパーミアーゼポリペプチドは、典型的には、糖パーミアーゼ活性を有する。しかしながら、本発明のパーミアーゼポリペプチドは、その活性に加えてまたはその活性に代えて上記説明の活性の１つ以上を有し得る。
【００１８】
［ポリヌクレオチド配列］
本明細書に開示されるパーミアーゼポリペプチドおよびそのアミノ酸配列について、当業者は、このパーミアーゼポリペプチドをコードする好適なポリヌクレオチドを決定することができる。
【００１９】
したがって、本発明は、パーミアーゼポリペプチドをコードする遺伝子、およびそのコード配列を含むポリヌクレオチド配列を提供する。
【００２０】
本発明のポリヌクレオチドは、単離または合成することができる。本明細書におけるパーミアーゼポリペプチドおよびパーミアーゼポリペプチドポリヌクレオチドは、合成ポリペプチド、それぞれポリヌクレオチドであり得る。合成ポリヌクレオチドは、コドン使用において、好ましくは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００６／０７７２５８号パンフレットおよび／またはＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５５９４３号明細書に記載の方法に従って最適化することができる。ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５５９４３号明細書は、コドンペア最適化を取り上げる。
【００２１】
この用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかのリボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子であるポリヌクレオチド分子を指す。ポリヌクレオチドは、単離形態で存在し得、または組換え核酸分子もしくはベクター中に含まれ得、または宿主細胞中に含まれ得る。
【００２２】
用語「ポリペプチド」は、本明細書において、８つ以上のアミノ酸残基を含有する鎖に使用される。本明細書における全てのオリゴペプチドおよびポリペプチドの式または配列は、左から右に、アミノ末端からカルボキシ末端への方向において記述される。本明細書において使用されるアミノ酸の１文字コードは、当該技術分野において一般に公知である。
【００２３】
「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、天然環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質と意図される。例えば、宿主細胞中で発現される組換え生成ポリペプチドおよびタンパク質は、任意の好適な技術、例えばＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０（１９８８）に開示されている単一工程精製法などにより実質的に精製された天然または組換えポリペプチドと同様、本発明の目的のために単離されたものとみなされる。
【００２４】
本発明のポリヌクレオチド、例えばパーミアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、標準分子生物学技術および本明細書において提供される配列情報を使用して単離または合成することができる。
【００２５】
本発明のパーミアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、テンプレートとしてのｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは代替的に、ゲノムＤＮＡおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーを標準ＰＣＲ増幅技術に従って使用して増幅することができる。こうして増幅された核酸は、適切なベクター中にクローニングし、ＤＮＡ配列分析により特性決定することができる。
【００２６】
［形質転換］
本発明によるポリヌクレオチドは、好適な宿主中で発現させることができる。したがって、標準形質転換技術を使用することができる。
【００２７】
本発明はさらに、上記ポリヌクレオチドを含む核酸構築物、例えばベクターに関する。
【００２８】
したがって、本発明の別の態様は、パーミアーゼポリペプチドタンパク質またはその機能的等価物をコードする本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、例としてクローニングおよび発現ベクターならびにそのようなベクターを好適な宿主細胞中で、例えば本発明のパーミアーゼの発現が生じる条件下で生育させ、形質転換し、または形質移入する方法に関する。本明細書において使用される用語「ベクター」は、核酸分子が連結された別の核酸を輸送し得る核酸分子を指す。
【００２９】
本発明のポリヌクレオチドは、組換え複製ベクター、例えばクローニングまたは発現ベクター中に取り込むことができる。ベクターを使用して核酸を適合性宿主細胞中で複製することができる。したがってさらなる実施形態において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを複製ベクター中に導入し、ベクターを適合性宿主細胞中に導入し、宿主細胞をベクターの複製をもたらす条件下で生育させることにより本発明のポリヌクレオチドを作製する方法を提供する。ベクターは、宿主細胞から回収することができる。好適な宿主細胞は以下に記載する。
【００３０】
発現ベクターの設計が、形質転換すべき宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現のレベルなどのような要因に依存し得ることは、当業者により認識される。本発明のベクター、例えば発現ベクターは、宿主細胞中に導入してそれにより本明細書に記載の核酸によりコードされるタンパク質またはペプチドを生成することができる。本発明のベクター、例えば組換え発現ベクターは、原核または真核細胞中でのパーミアーゼポリペプチドタンパク質の発現のために設計することができる。
【００３１】
例えば、パーミアーゼポリペプチドは、細菌細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、糸状菌、酵母細胞または哺乳動物細胞中で発現させることができる。好適な宿主細胞は、好適な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）にさらに考察されている。適切な宿主の代表例を以下に記載する。
【００３２】
上記宿主細胞に適切な培養培地および条件は、当該技術分野において公知である。
【００３３】
ほとんどの糸状菌および酵母について、ベクターまたは発現構築物は、好ましくは、宿主細胞のゲノム中に統合されて安定な形質転換体が得られる。しかしながら、ある酵母については、発現構築物を安定な高レベルの発現のために取り込むことができる好適なエピソームベクターも利用可能であり、その例には、それぞれサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびクルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）の２μおよびｐＫＤ１プラスミド由来のベクター、またはＡＭＡ配列（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）からのＡＭＡ１）を含有するベクターが含まれる。発現構築物が宿主細胞ゲノム中に統合される場合、構築物は、ゲノム中のランダムな遺伝子座に、または相同性組換えを使用して所定の標的遺伝子座に統合され、この場合、標的遺伝子座は好ましくは高度に発現される遺伝子を含む。
【００３４】
したがって、本発明において有用な発現ベクターには、染色体由来、エピソーム由来およびウイルス由来ベクター、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント、ウイルス、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、天然痘ウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス由来のベクター、ならびにそれらの組合せ由来のベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝子エレメント由来のもの、例えばコスミドおよびファージミドが含まれる。
【００３５】
本発明によるポリペプチドを宿主細胞から培養培地中に分泌させるべき場合、適切なシグナル配列をポリペプチドに付加してデノボ合成ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に指向することができる。当業者は、規定の宿主に適切なシグナル配列を選択することを把握する。
【００３６】
ベクターはさらに、真核ゲノム配列またはウイルスゲノム配列と相同な配列を含むＲＮＡを生じさせるポリヌクレオチドをフランキングする配列を含み得る。このことは、宿主細胞のゲノム中への本発明のポリヌクレオチドの導入を可能とする。
【００３７】
統合クローニングベクターは、それを統合すべき宿主細胞の染色体中のランダムまたは所定の標的遺伝子座において統合し得る。
【００３８】
ベクター系は、単一ベクター、例えば単一プラスミド、または宿主細胞のゲノム中に導入すべきトータルＤＮＡを一緒に含有する２つ以上のベクター、例えば２つ以上のプラスミドであり得る。
【００３９】
ベクターは、アンチセンス方向に配向されてアンチセンスＲＮＡの生成を提供する本発明のポリヌクレオチドを含有し得る。
【００４０】
ベクターＤＮＡは、慣用の形質転換または形質移入技術を介して原核または真核細胞中に導入することができる。本明細書において使用される用語「形質転換」および「形質移入」は、種々の当該技術分野において認識される、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞中に導入する技術、例としてリン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン介在形質移入、形質導入、感染、リポフェクション、カチオン脂質介在形質移入またはエレクトロポレーションを指すものとする。宿主細胞を形質転換または形質移入する好適な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ，ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）および他の実験手引書に見出すことができる。
【００４１】
上記のとおり、本発明は、請求項１に示される突然変異を有する配列番号５５によるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドを提供する。
【００４２】
本発明によるパーミアーゼポリペプチドは、当該技術分野において公知の方法により組換え細胞培養物から回収および精製することができる。より好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製に用いられる。
【００４３】
本発明のポリペプチドには、天然に精製された生成物、化学合成手順の生成物、ならびに原核または真核宿主、例として、例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞から組換え技術により生成された生成物が含まれる。組換え生成手順において用いられる宿主に応じて、本発明のポリペプチドは、グリコシル化型または非グリコシル化型であり得る。さらに、本発明のポリペプチドは、一部の場合において宿主介在プロセスの結果として開始修飾メチオニン残基も含み得る。
【００４４】
本発明はさらに、本発明によるポリペプチドの生物活性断片を特徴とする。
【００４５】
本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞も提供される。ポリヌクレオチドは、宿主細胞のゲノムに対して異種性であり得る。用語「異種性」は、通常、宿主細胞に関して、ポリヌクレオチドが宿主細胞のゲノム中で天然に生じないことまたはポリペプチドがその細胞により天然に生成されないことを意味する。
【００４６】
別の実施形態において、本発明は、本発明により包含される核酸を含有する細胞、例えば形質転換宿主細胞または組換え宿主細胞を特徴とする。「形質転換細胞」または「組換え細胞」は、細胞（またはその細胞の祖先）に組換えＤＮＡ技術により本発明による核酸が導入された細胞である。原核および真核細胞の両方、例えば細菌、真菌、酵母などが含まれ、酵母、例として、例えばサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が特に好ましい。
【００４７】
挿入配列の発現をモジュレートし、または特異的な所望な様式で遺伝子生成物を修飾およびプロセシングする宿主細胞を選択することができる。タンパク質生成物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、開裂）は、タンパク質の最適な機能化を促進し得る。
【００４８】
種々の宿主細胞は、タンパク質および遺伝子生成物の翻訳後プロセシングおよび修飾についての特徴的および特異的な機序を有する。分子生物学および／または細菌生物学の当業者が精通する適切な細胞系または宿主系は、発現される外来タンパク質の所望のおよび正確な修飾およびプロセシングを確保するように選択することができる。この目的のため、一次転写物の適正なプロセシング、遺伝子生成物のグリコシル化、およびリン酸化のための細胞機構を保有する真核宿主細胞を使用することができる。そのような宿主細胞は、当該技術分野において周知である。
【００４９】
所望により、上記細胞を本発明によるポリペプチドの調製において使用することができる。そのような方法は、典型的には、宿主細胞（例えば上記発現ベクターにより形質転換または形質移入されたもの）を、ポリペプチドをコードするコード配列の発現（ベクターによる）を提供するための条件下で培養し、場合により発現されたポリペプチドを回収することを含む。本発明のポリヌクレオチドは、組換え複製ベクター、例えば発現ベクター中に取り込むことができる。このベクターを使用して核酸を適合性宿主細胞中で複製することができる。したがって、さらなる実施形態において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを複製ベクター中に導入し、ベクターを適合性宿主細胞中に導入し、宿主細胞をベクターの複製をもたらす条件下で生育させることにより本発明のポリヌクレオチドを作製する方法を提供する。ベクターは宿主細胞から回収することができる。
【００５０】
ベクターは、上記の好適な宿主細胞中に形質転換または形質移入して本発明のポリペプチドの発現を提供することができる。この方法は、上記発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を、ポリペプチドをコードするコード配列のベクターによる発現を提供するための条件下で培養することを含み得る。
【００５１】
本明細書において、標準的な単離、ハイブリダイゼーション、形質転換およびクローニング技術が使用される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載のもの）。
【００５２】
［相同性および同一性］
アミノ酸またはヌクレオチド配列は、あるレベルの類似性を示す場合に相同性であると考えられる。相同性である２つの配列は、共通の進化的起源を示す。２つの相同配列が近縁であるかより遠縁であるかは、それぞれ高いかまたは低い「同一性パーセント」または「類似性パーセント」により示される。議論されているが、「同一性パーセント」または「類似性パーセント」を示すため、「相同性のレベル」または「相同性パーセント」が互換的に使用されることが多い。
【００５３】
配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。当業者は、いくつかの異なるコンピュータプログラムが２つの配列のアラインメントおよび２つの配列間の相同性の決定に利用可能である事実を認識する（Ｋｒｕｓｋａｌ，Ｊ．Ｂ．（１９８３）Ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  Ｉｎ  Ｄ．Ｓａｎｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｊ．Ｂ．Ｋｒｕｓｋａｌ，（ｅｄ．），Ｔｉｍｅ  ｗａｒｐｓ，ｓｔｒｉｎｇ  ｅｄｉｔｓ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｔｈｅ  ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，ｐｐ．１−４４  Ａｄｄｉｓｏｎ  Ｗｅｓｌｅｙ）。２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、２つの配列のアラインメントのためのＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して決定することができる。（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３）。このアルゴリズムは、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列をアラインする。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムは、コンピュータプログラムＮＥＥＤＬＥに実装されている。本発明の目的のため、ＥＭＢＯＳＳパッケージからのＮＥＥＤＬＥプログラムを使用した（バージョン２．８．０以上、ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ（２０００）Ｒｉｃｅ，Ｐ．Ｌｏｎｇｄｅｎ  Ｉ．ａｎｄ  Ｂｌｅａｓｂｙ，Ａ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６，（６）ｐｐ２７６−２７７，ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／）。タンパク質配列については、置換マトリックスにＥＢＬＯＳＵＭ６２が使用される。ヌクレオチド配列については、ＥＤＮＡＦＵＬＬが使用される。他のマトリックスを規定することができる。アミノ酸配列のアラインメントに使用される任意選択のパラメータは、１０のギャップオープンペナルティおよび０．５のギャップエクステンションペナルティである。当業者は、これらの全ての異なるパラメータがわずかに異なる結果をもたらすが、２つの配列の全体の同一性パーセントは、異なるアルゴリズムを使用した場合に顕著には変化しないことを認識する。
【００５４】
［全体的相同性の定義］
相同性または同一性は、任意のギャップまたはエクステンションを含むアラインされた全領域にわたる２つの完全配列間の同一合致の百分率である。２つのアラインされた配列間の相同性または同一性は、以下のとおり算出される：両配列中の同一アミノ酸を示すアラインメント中の対応位置の数を、ギャップを含むアラインメントの全長により割る。本明細書に定義の同一性は、ＮＥＥＤＬＥから得ることができ、プログラムの出力において「ＩＤＥＮＴＩＴＹ」とラベルすることができる。
【００５５】
［最長同一性の定義］
２つのアラインされた配列間の相同性または同一性は、以下のとおり算出される：両配列中の同一アミノ酸を示すアラインメント中の対応位置の数を、アラインメント中のギャップの総数を引いた後のアラインメントの全長により割る。本明細書に定義の同一性は、ＮＯＢＲＩＥＦオプションを使用することによりＮＥＥＤＬＥから得ることができ、プログラムの出力において「ｌｏｎｇｅｓｔ−ｉｄｅｎｔｉｔｙ」とラベルすることができる。
【００５６】
本明細書に記載の本発明の種々実施形態は、相互に組み合わせることができる。
【００５７】
［糖組成物］
本発明による糖組成物は、グルコース、アラビノースおよびキシロースを含む。それらの基準を満たす任意の糖組成物を本発明において使用することができる。糖組成物中の任意選択の糖は、ガラクトースおよびマンノースである。好ましい実施形態において、糖組成物は、１つ以上のリグノセルロース材料の加水分解物である。本明細書におけるリグノセルロースには、ヘミセルロースおよびバイオマスのヘミセルロース部分が含まれる。リグノセルロースには、バイオマスのリグノセルロース画分も含まれる。好適なリグノセルロース材料は、以下の列記に見出すことができる：果樹園のプライミング処理物、シャパラル、ミル廃棄物、都市木材廃棄物、一般廃棄物、伐採廃棄物、森林間伐材、短期輪作木質作物、工業廃棄物、コムギ藁、オートムギ藁、イネ藁、オオムギ藁、ライムギ藁、アマ藁、ダイズ殻、籾殻、イネ藁、トウモロコシグルテン飼料、オートムギ殻、サトウキビ、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ茎、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ外皮、スイッチグラス、ススキ、サトウモロコシ、キャノーラ茎、ダイズ茎、プレリーグラス、ガマグラス、エノコログサ；サトウダイコンパルプ、柑橘果実パルプ、種子殻、セルロース性家畜排泄物、刈り取った芝草、ワタ、海藻、樹木、針葉樹、広葉樹、ポプラ、マツ、灌木、草、コムギ、コムギ藁、サトウキビバガス、トウモロコシ、トウモロコシ外皮、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ穀粒、穀粒からの繊維、穀物の湿式または乾式粉砕からの製品および副産物、一般固形廃棄物、古紙、庭ごみ、草質材料、農業残渣、林業残渣、一般固形廃棄物、古紙、パルプ、製紙工場残渣、枝、低木、トウ、トウモロコシ、トウモロコシ外皮、エネルギー作物、森林、果実、花、穀物、草、草本作物、葉、樹皮、針葉、原木、根、苗木、灌木、スイッチグラス、木、野菜、果皮、蔓植物、サトウダイコンパルプ、コムギ製粉物、オートムギ殻、広葉樹もしくは針葉樹、農業プロセスから生じる有機廃材、林業木材廃棄物、またはそれらの任意の２つ以上の組合せ。
【００５８】
リグノセルロースから誘導される一部の好適な糖組成物およびその加水分解物の糖組成物の概要を表１に挙げる。列記されるリグノセルロースには、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ繊維、籾殻、メロン皮、サトウダイコンパルプ、コムギ藁、サトウキビバガス、木材、草およびオリーブ圧搾物が含まれる。
【００５９】
【表１】
2013542724.tif 000002
【００６０】
これらのリグノセルロースに豊富な量の糖がグルコース、キシロース、アラビノースおよびガラクトースの形態で存在することは、表１から明白である。したがって、グルコース、キシロース、アラビノースおよびガラクトースの、発酵生成物への変換は非常に経済的に重要である。マンノースも一部のリグノセルロース材料中に存在し、通常、上記の糖よりも少ない量で存在する。したがって、有利には、マンノースも形質転換宿主細胞により変換される。
【００６１】
［形質転換宿主細胞］
一実施形態において、形質転換宿主細胞は、キシロースイソメラーゼ遺伝子の１つ以上のコピーならびに／またはキシロースレダクターゼおよび／もしくはキシリトールデヒドロゲナーゼの１つ以上のコピー、ならびにａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ遺伝子の２から１０個のコピーを含み得、それらの遺伝子は細胞ゲノム中に統合される。
【００６２】
一実施形態において、形質転換宿主細胞は、遺伝子、例えば上記のキシロースイソメラーゼ遺伝子ならびに／またはキシロースレダクターゼおよび／もしくはキシリトールデヒドロゲナーゼの１つ以上のコピーを含み、ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ遺伝子の２から１０個のコピーは形質転換宿主細胞ゲノム中に統合される。
【００６３】
コピーの数は、当業者が任意の公知の方法により決定することができる。実施例において、好適な方法を記載する。
【００６４】
一実施形態において、形質転換宿主細胞は、グルコース、アラビノース、キシロースおよびガラクトースを発酵し得る。
【００６５】
一実施形態において、細胞は、９０％以上の利用可能なグルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトースおよびマンノースを発酵生成物に変換し得る。一実施形態において、細胞は、利用可能な全てのグルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトースおよびマンノースの９１％以上、９２％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または１００％を発酵生成物に変換し得る。
【００６６】
本発明の一実施形態において、形質転換宿主細胞は、１つ以上の追加の糖、好ましくはＣ５および／またはＣ６糖、例えばマンノースを発酵し得る。本発明の一実施形態において、形質転換宿主細胞は、形質転換宿主細胞のキシロースの発酵を可能とするためにｘｙｌＡ遺伝子、ＸＹＬ１遺伝子およびＸＹＬ２遺伝子ならびに／またはＸＫＳ１遺伝子；アルドースレダクターゼ（ＧＲＥ３）遺伝子の欠失；細胞中のペントースリン酸経路を経る流束の増加を可能とするためにＰＰＰ遺伝子ＴＡＬ１、ＴＫＬ１、ＲＰＥ１およびＲＫＩ１の過剰発現の１つ以上を含む。
【００６７】
一実施形態において、形質転換宿主細胞は、工業細胞、好ましくは工業酵母である。工業細胞および工業酵母細胞は、以下のとおり定義することができる。工業プロセスにおける（酵母）細胞の生存環境は、実験室のそれとは顕著に異なる。工業酵母細胞は、プロセスの間に変動し得る複数の環境条件下で十分に機能し得なければならない。そのような変動には、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の細胞生育およびエタノール生成に対する潜在的影響を一緒に及ぼす栄養源、ｐＨ、エタノール濃度、温度、酸素濃度などの変化が含まれる。有害な工業条件下で、環境耐性株は堅牢な生育および生成を可能とすべきである。工業酵母株は、一般に、それらが使用される用途において、例えば製パン工業、醸造工業、ワイン生産およびエタノール工業において生じ得るそれらの環境条件の変化に対してより堅牢である。一実施形態において、工業形質転換宿主細胞は、工業宿主細胞を基礎として構築され、その構築は、以下に記載のとおり実施される。工業酵母（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））の例は、Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｒｅｄ（登録商標）（Ｆｅｒｍｅｎｔｉｓ）Ｆｅｒｍｉｏｌ（登録商標）（ＤＳＭ）およびＴｈｅｒｍｏｓａｃｃ（登録商標）（Ｌａｌｌｅｍａｎｄ）である。
【００６８】
一実施形態において、形質転換宿主細胞は阻害剤耐性である。阻害剤耐性は、阻害化合物に抵抗性である。リグノセルロース中の阻害化合物の存在およびレベルは、原料、前処理方法加水分解プロセスの変動により広範に変動し得る。阻害剤のカテゴリーの例は、カルボン酸、フランおよび／またはフェノール化合物である。カルボン酸の例は、乳酸、酢酸またはギ酸である。フランの例は、フルフラールおよびヒドロキシ−メチルフルフラールである。例またはフェノール化合物は、バニリン、シリンガ酸、フェルラ酸およびクマル酸である。阻害剤の典型的な量は、カルボン酸については、原料、前処理および加水分解条件に応じて１リットル当たり数グラム、最大で１リットル当たり２０グラム以上である。フランについては、原料、前処理および加水分解条件に応じて１リットル当たり数百ミリグラム、最大で１リットル当たり数グラムである。
【００６９】
フェノール化合物については、原料、前処理および加水分解条件に応じて１リットル当たり数十ミリグラム、最大で１リットル当たり１グラムである。
【００７０】
本発明による形質転換宿主細胞は、阻害剤耐性であり得、すなわち、それらは、形質転換宿主細胞を幅広く適用することができ、すなわち、それが異なる原料、異なる前処理方法および異なる加水分解条件についての高い適用性を有するように、それらが一般的な前処理および加水分解条件について典型的に有するレベルの一般的な阻害剤に耐え得る。
【００７１】
一実施形態において、工業用の形質転換宿主細胞は、阻害剤耐性宿主細胞を基礎として構築され、その構築は以下の記載のとおり実施される。阻害剤耐性宿主細胞は、阻害剤耐性Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＡＴＣＣ２６６０２が選択された、Ｋａｄａｒ  ｅｔ  ａｌ，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００７），Ｖｏｌ．１３６−１４０，８４７−８５８に説明されるような阻害剤含有材料上での生育について株をスクリーニングすることにより選択することができる。
【００７２】
一実施形態において、形質転換宿主細胞はマーカーフリーである。本明細書において使用される用語「マーカー」は、マーカーを含有する宿主細胞の選択、またはスクリーニングを可能とする形質または表現型をコードする遺伝子を指す。マーカーフリーは、マーカーが形質転換宿主細胞中に本質的に不存在であることを意味する。マーカーフリーであることは、抗生物質マーカーが形質転換宿主細胞の構築に使用され、その後に除去される場合に特に有利である。マーカーの除去は、任意の好適な先行技術、例えば分子内組換えを使用して行うことができる。マーカー除去の好適な方法は、実施例に説明する。
【００７３】
形質転換宿主細胞は、植物バイオマス、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン、デンプン、デンプン誘導体を例えば発酵性糖に変換し得る。したがって、形質転換宿主細胞は、セルロースのグルコースモノマーへの変換およびヘミセルロースのキシロースおよびアラビノースモノマーへの変換に必要な１つ以上の酵素、例えばセルラーゼ（エンドセルラーゼまたはエキソセルラーゼ）、ヘミセルラーゼ（エンドまたはエキソキシラナーゼまたはアラビナーゼ）、ペクチンをグルクロン酸およびガラクツロン酸に変換し得るペクチナーゼまたはデンプンをグルコースモノマーに変換するためのアミラーゼを発現し得る。
【００７４】
形質転換宿主細胞は、ピルビン酸の所望の発酵生成物、例えばエタノール、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸、イタコン酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム、抗生物質またはセファロスポリンへの変換に要求されるそれらの酵素活性をさらに含み得る。
【００７５】
一実施形態において、形質転換宿主細胞は、天然にアルコール発酵、好ましくは、嫌気的アルコール発酵し得る細胞である。形質転換宿主細胞は、好ましくは、エタノールに対する高い耐性、低ｐＨに対する高い耐性（すなわち、約５、約４、約３、または約２．５よりも低いｐＨにおいて生育し得る）および有機物に対する高い耐性ならびに／または高温に対する高い耐性を有する。
【００７６】
形質転換宿主細胞の上記の特徴または活性のいずれかは、細胞において天然に存在し得、または遺伝子改変により導入もしくは改変することができる。
【００７７】
［形質転換宿主細胞の構築］
一実施形態によれば、遺伝子は、
ａ）強力な構成性プロモーターの制御下の遺伝子ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤからなるクラスター
ｂ）場合により強力な構成性プロモーターの制御下のＰＰＰ遺伝子ＴＡＬ１、ＴＫＬ１、ＲＰＥ１およびＲＫＩ１からなるクラスター；およびアルドースレダクターゼ遺伝子の欠失；
ｃ）強力な構成性プロモーターの制御下のｘｙｌＡ遺伝子およびＸＫＳ１遺伝子からなるクラスター；
ｄ）複数の遺伝子座上のゲノム中に統合する能力を有する強力な構成性プロモーターの制御下のｘｙｌＡ遺伝子を含む構築物；
の宿主細胞中への導入および適応進化により宿主細胞中に導入して形質転換宿主細胞を生成することができる。上記の細胞は、組換え発現技術を使用して構築することができる。
【００７８】
［組換え発現］
形質転換宿主細胞は、組換え細胞である。すなわち、形質転換宿主細胞は、当該細胞中で天然に生じないヌクレオチド配列を含み、またはその配列により形質転換もしくは遺伝子改変されている。
【００７９】
細胞中の酵素の組換え発現のための技術、および形質転換宿主細胞の付加的遺伝子改変のための技術は、当業者に周知である。典型的には、そのような技術は、関連配列を含む核酸構築物による細胞の形質転換を含む。そのような方法は、例えば、標準的な教本、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ（２００１）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、またはＦ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）から公知である。宿主細胞の形質転換および遺伝子改変の方法は、例えば欧州特許出願公開第Ａ−０６３５５７４号明細書、国際公開第９８／４６７７２号パンフレット、国際公開第９９／６０１０２号パンフレット、国際公開第００／３７６７１号パンフレット、国際公開第９０／１４４２３号パンフレット、欧州特許出願公開第Ａ−０４８１００８号明細書、欧州特許出願公開第Ａ−０６３５５７４号明細書および米国特許第６，２６５，１８６号明細書から公知である。
【００８０】
典型的には、核酸構築物は、プラスミド、例えば低コピープラスミドまたは高コピープラスミドであり得る。本発明による細胞は、酵素をコードするヌクレオチド配列の単一または複数コピーを、例えばヌクレオチド構築物の複数のコピーまたは酵素配列の複数のコピーを有する構築物の使用により含み得る。
【００８１】
核酸構築物はエピソームに維持することができ、したがって自己複製のための配列、例えば常染色体複製配列配列を含む。好適なエピソームの核酸構築物は、例えば酵母２μまたはｐＫＤ１プラスミド（Ｇｌｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：９６８−９７５）、またはＡＭＡプラスミド（Ｆｉｅｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ．２９：４８２−４８９）をベースとし得る。あるいは、それぞれの核酸構築物は、１つ以上のコピーで細胞のゲノム中に統合することができる。細胞ゲノム中への統合は、非相同性組換えによりランダムに生じ得るが、好ましくは、核酸構築物は、当該技術分野において周知の相同性組換えにより細胞ゲノム中に統合することができる（例えば、国際公開第９０／１４４２３号パンフレット、欧州特許出願公開第Ａ−０４８１００８号明細書、欧州特許出願公開第Ａ−０６３５５７４号明細書および米国特許第６，２６５，１８６号明細書参照。）。
【００８２】
ほとんどのエピソームまたは２μプラスミドは、酵母中で比較的不安定であり、それぞれの世代後に約１０−２個以上の細胞中で失われる。選択的生育の条件下でも、細胞の６０％から９５％のみがエピソームプラスミドを保持するにすぎない。ほとんどのエピソームプラスミドのコピー数は、ｃｉｒ＋宿主の細胞当たり２０〜１００の範囲である。しかしながら、プラスミドは、細胞間で均等に分布されず、集団における細胞当たりのコピー数には大きい相違が存在する。統合プラスミドにより形質転換された株は、選択的圧力の不存在下でも極端に安定である。しかしながら、プラスミド損失は、タンデムリピートＤＮＡ間の相同性組換えにより約１０−３から１０−４の頻度において生じ得、ベクター配列のループアウトをもたらす。したがって、好ましくは、安定な統合の場合におけるベクター設計は、選択マーカー遺伝子の損失（分子内、相同性組換えによりさらに生じる）時に統合された構築物のそのループアウトがもはや可能でないことである。したがって、好ましくは、遺伝子は安定して統合される。安定的統合は、本明細書において、統合された構築物のループアウトがもはや可能ではない、ゲノム中への統合と定義される。好ましくは、選択マーカーは不存在である。典型的には、酵素をコードする配列は、酵素配列の転写および／または翻訳を提供または支援し得る１つ以上の核酸配列に作動可能に連結される。
【００８３】
用語「作動可能に連結される」は、記載される構成成分が、それらをその意図される様式で機能させることを可能とする関係にある並置を指す。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列に作動可能に連結され、前記プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を及ぼす。
【００８４】
本明細書において使用される用語「プロモーター」は、１つ以上の遺伝子の転写を制御するよう機能する核酸断片を指し、それは遺伝子の転写開始部位の転写方向に対して上流に局在し、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位、および任意の他の当業者に公知のＤＮＡ配列の存在により構造的に同定される。「構成性」プロモーターは、ほとんどの環境および発生条件下で活性のプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境または発生調節下で活性のプロモーターである。
【００８５】
本発明による酵素をコードするヌクレオチド配列の発現を達成するために使用することができるプロモーターは、発現させるべき酵素をコードするヌクレオチド配列由来でなくてよく、すなわち作動可能に連結されるヌクレオチド配列（コード配列）に対して異種性のプロモーターであり得る。しかしながら、プロモーターは宿主細胞に対して相同性、すなわち内在性であり得る。
【００８６】
プロモーターは広く入手可能であり、当業者に公知である。そのようなプロモーターの好適な例には、例えば解糖系遺伝子からのプロモーター、例えば酵母または糸状菌からのホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ、ＴＤＨ３またはＧＡＰＤＨ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが含まれ；そのような酵母からのプロモーターについてのさらなる詳細は、（国際公開第９３／０３１５９号パンフレット）に見出すことができる。他の有用なプロモーターは、リボソームタンパク質コード遺伝子プロモーター、ラクターゼ遺伝子プロモーター（ＬＡＣ４）、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ＡＤＨＩ、ＡＤＨ４など）、およびエノラーゼプロモーター（ＥＮＯ）である。構成性および誘導性の他のプロモーターの両方、およびエンハンサーまたは上流活性化配列は、当業者に公知である。本発明の宿主細胞中で使用されるプロモーターは、所望により修飾してそれらの制御特性に影響を及ぼすことができる。これに関して好適なプロモーターには、構成性および誘導性の天然プロモーターの両方ならびに当業者に周知の遺伝子組換えプロモーターが含まれる。真核宿主細胞中の好適なプロモーターは、ＧＡＬ７、ＧＡＬ１０、またはＧＡＬ１、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＡＤＨ１、ＰＧＬ、ＰＨ０５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ１、ＴＰＩ１、およびＡＯＸ１であり得る。他の好適なプロモーターには、ＰＤＣ１、ＧＰＤ１、ＰＧＫ１、ＴＥＦ１、およびＴＤＨ３が含まれる。
【００８７】
形質転換宿主細胞中では、酵素をコードするヌクレオチド酸配列の３’末端は、好ましくは転写ターミネーター配列と作動可能に連結される。好ましくはターミネーター配列は、厳選された宿主細胞、例えば厳選された酵母種などの中で作動可能である。いずれの場合もターミネーターの選択は重要でなく；それは例えば任意の酵母遺伝子からのものであり得るが、非酵母の真核生物遺伝子からのものであってもターミネーターが機能することがあり得る。通常、酵素をコードするヌクレオチド配列は、ターミネーターを含む。好ましくは、そのようなターミネーターは、宿主細胞中のナンセンス変異依存性ｍＲＮＡ分解機構を妨害する突然変異と組み合わせられる（例えば：Ｓｈｉｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６１：１４６５−１４８２参照）。
【００８８】
転写終結配列は、好ましくはポリアデニル化シグナルをさらに含む。
【００８９】
場合により、選択マーカーは、本発明における使用に好適な核酸構築物中に存在し得る。本明細書において使用される用語「マーカー」は、マーカーを含有する宿主細胞の選択またはスクリーニングを可能とする、形質または表現型をコードする遺伝子を指す。マーカー遺伝子は抗生物質耐性遺伝子であり得、それにより適切な抗生物質を使用して形質転換されていない細胞から形質転換された細胞を選択することができる。好適な抗生物質耐性マーカーの例には、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、３’−Ｏ−ホスホトランスフェラーゼＩＩ（カナマイシン、ネオマイシンおよびＧ４１８耐性）が含まれる。抗生物質耐性マーカーは、倍数体宿主細胞の形質転換のために最も都合良いことがあり、非抗生物質耐性マーカー、例えば栄養要求性マーカー（ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２）またはＳ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）ＴＰＩ遺伝子を使用することもできる（Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｐ  Ｒ，１９８５，Ｇｅｎｅ  ４０：１２５−１３０により記載）。好ましい実施形態において、核酸構築物により形質転換された宿主細胞は、マーカー遺伝子フリーである。組換えマーカー遺伝子フリー微生物宿主細胞を構築する方法は、欧州特許出願公開第Ａ−Ｏ６３５５７４号明細書に開示されており、二方向性マーカー、例えばＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）遺伝子または酵母ＵＲＡ３およびＬＹＳ２遺伝子の使用に基づく。あるいは、スクリーニング可能マーカー、例えば緑色蛍光タンパク質、ｌａｃＬ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、βグルクロニダーゼを本発明の核酸構築物中に取り込んで形質転換された細胞のスクリーニングを可能とすることができる。
【００９０】
本発明における使用に好適な核酸構築物中に存在し得る任意選択のさらなるエレメントには、限定されるものではないが、１つ以上のリーダー配列、エンハンサー、統合因子、および／またはレポーター遺伝子、イントロン配列、セントロメア、テロマーおよび／またはマトリックス付着（ＭＡＲ）配列が含まれる。本発明の核酸構築物は、自律複製のための配列、例えばＡＲＳ配列をさらに含み得る。
【００９１】
したがって、組換えプロセスは、公知の組換え技術により実施することができる。形質転換宿主細胞中での酵素の発現および過剰発現のための種々の手段が、当業者に公知である。特に、例えば遺伝子の付加的コピーを宿主細胞のゲノム中に統合することにより、エピソームマルチコピー発現ベクターからの遺伝子を発現させることにより、または遺伝子の複数コピーを含むエピソーム発現ベクターを導入することにより宿主細胞中で酵素をコードする遺伝子のコピー数を増加させることにより酵素を過剰発現させることができる。
【００９２】
あるいは、本発明の宿主細胞中の酵素の過剰発現は、過剰発現させるべき酵素をコードする配列由来でないプロモーター、すなわち作動可能に連結されるコード配列に対して異種性のプロモーターを使用することにより達成することができる。プロモーターは、好ましくはそれが作動可能に連結するコード配列に対して異種性であるが、プロモーターが宿主細胞に対して相同性である、すなわち内在性であることも好ましい。好ましくは、異種性プロモーターは、コード配列由来のプロモーターよりも、コード配列を含む転写物のより高い定常状態レベルを生成し得る（または単位時間当たりより多くの転写物分子、すなわちｍＲＮＡ分子を生成し得る）。これに関連して好適なプロモーターには、構成性および誘導性の天然プロモーターの両方ならびに遺伝子組換えプロモーターが含まれる。
【００９３】
一実施形態において、形質転換宿主細胞はマーカーフリーであり、それは栄養要求性または優性マーカー、特に抗生物質耐性マーカーが、ゲノム中または染色体外に存在しないことを意味する。
【００９４】
上記の酵素の過剰発現に使用されるコード配列は、好ましくは宿主細胞に対して相同性であり得る。しかしながら、本発明の宿主細胞に対して異種性のコード配列を使用することができる。
【００９５】
酵素の過剰発現は、遺伝子改変細胞中での酵素の生成を指す場合、同一条件下の未改変宿主細胞と比較して酵素が高レベルの特異的酵素活性において生成されることを意味する。通常、これは、酵素的に活性なタンパク質（またはマルチサブユニット酵素の場合は複数のタンパク質）が、同一条件下の未改変宿主細胞と比較して多量に、むしろ高い定常状態レベルにおいて生成されることを意味する。同様に、これは通常、酵素的に活性なタンパク質をコードするｍＲＮＡが、同一条件下の未改変宿主細胞と比較して多量に、同様にむしろ高い定常状態レベルにおいて生成されることを意味する。好ましくは、宿主中では、過剰発現させるべき酵素は、過剰発現を引き起こす遺伝子改変以外は遺伝的に同一の株と比較して、少なくとも約１．１、約１．２、約１．５、約２、約５、約１０または約２０倍過剰発現される。これらの過剰発現レベルは、酵素活性の定常状態レベルに、酵素タンパク質の定常状態レベルに、および酵素をコードする転写物の定常状態レベルに適用され得ると理解すべきである。
【００９６】
［適応］
適応は、それにより集団がその１つまたは複数の生息環境により良好に適する（適応する）進化的過程である。この過程は数世代から多世代にわたり生じ、生物学の基本的現象の１つである。
【００９７】
適応という用語は、生物の生存に特に重要な特徴を指すこともある。そのような適応は、より首尾良く繁殖するより良好に適した形態により、自然淘汰により可変集団中で生じる。
【００９８】
環境条件の変化は、自然淘汰の結果を変化させ、新たな条件下における生物の適応度を改善する後続の適応の選択的利点に影響を及ぼす。極端な環境変化の場合、有益な適応の出現および固定化が生存のために必須であり得る。多数の異なる要因、例えば養分利用性、温度、酸素利用性などが適応進化を推進し得る。
【００９９】
［適応度］
適応（生物が所与の一連の生息環境内で生存および繁殖し得る程度）と適応度との間には、明白な関係が存在する。適応度は、自然淘汰率の推定および予測因子である。自然淘汰の適用により、代替の表現型の相対頻度は、それらが遺伝性であるならば経時的に変動する。
【０１００】
［遺伝子変化］
自然淘汰が集団の遺伝子変動に作用する場合、遺伝子変化が基礎をなす機序である。これは集団が、その状況に遺伝的に適応することを意味する。遺伝子変化は、生息環境の変化に適するように、可視的構造をもたらし得、または生物の生理学的活性を調節し得る。
【０１０１】
生息環境の頻繁な変化が生じ得る。したがって、適応の過程は最終的に完了しないという結果となる。経時的に、環境が徐々に変化し、種のその環境への適応が次第に良好になることが起こり得る。他方、環境の変化が比較的急速に生じ、次いで種の適応が次第に不十分になることが起こり得る。適応は、集団が生息環境または環境を変えない場合でも、常にある程度まで進行する遺伝的過程である。
【０１０２】
［適応進化］
形質転換宿主細胞は、それらの調製中に適応進化を受け得る。形質転換宿主細胞は、好ましくは単独の炭素源としての所望の糖の上での、より好ましくは嫌気的条件下における生育について、自然発生または誘導性（例えば放射線または化学薬品による）のいずれかの突然変異体を選択することにより、糖利用のために適応させることができる。突然変異体の選択は、例えばＫｕｙｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４，ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．４：６５５−６６４）により記載される培養物の継代を含む技術により、またはケモスタット培養における選択的圧力下での培養により実施することができる。例えば、好ましい宿主細胞中で、上記の遺伝子改変の少なくとも１つ、例として突然変異体の選択により得られる改変は、炭素源としての、好ましくは単独の炭素源としてのキシロース上で、好ましくは嫌気的条件下で生育する能力を宿主細胞に付与する。キシロースを変換させるための遺伝子としてＸＩが使用される場合、好ましくは、細胞は本質的にキシリトールを生成せず、例えば生成されるキシリトールが検出限界未満であり、または例えばモル基準で消費される炭素の約５、約２、約１、約０．５、もしくは約０．３％未満である。
【０１０３】
適応進化は、例えばＷｉｓｓｅｌｉｎｋ  Ｈ．Ｗ．  ｅｔ  ａｌ，  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｕｇ．２００７，ｐ．４８８１−４８９１にも記載されている。
【０１０４】
適応進化の一実施形態において、異なる培地、例えば組成の異なる３つの培地（グルコース、キシロース、およびアラビノース；キシロースおよびアラビノース中における、連続生育の反復サイクルによる反復バッチ培養からなるレジメンが適用される。Ｗｉｓｓｅｌｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆｅｂ．２００９，ｐ．９０７−９１４参照。
【０１０５】
［酵母形質転換および遺伝的安定性］
組換えＤＮＡによる酵母細胞の遺伝子組換え、すなわち形質転換は、１９７８年に初めて実行可能になった［Ｂｅｇｇｓ，１９７８；Ｈｉｎｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８］。酵母中の組換えＤＮＡ技術は、それ以来地位を確立した。多数の異なるベクター構築物が利用可能である。一般にシャトルベクターと称されるこれらのプラスミドベクターは、酵母細胞中への形質転換前に、それらの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での増殖を可能とする複製起点および選択マーカー（βラクタマーゼ遺伝子、ａｍｐＲであることが多い）からなる、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ベクターに由来する遺伝子材料を含有する。さらにシャトルベクターは、酵母中における選択のための選択マーカーを含有する。マーカーは、対応するゲノムの欠失（または突然変異）を有する細胞が、栄養要求性または独立栄養性について補完されるように、特定のアミノ酸またはヌクレオチドの合成のための酵素をコードする遺伝子であり得る。あるいは、これらのベクターは、ｇ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）、ハイグロマイシンＢまたはフレオマイシンのようなある抗生物質に対する耐性を組換え酵母細胞（すなわちＤＮＡを利用し、マーカー遺伝子を発現する細胞）に提供する、異種性優性耐性マーカーを含有する。さらにこれらのベクターは、外来性ＤＮＡを（組み合わされた）制限部位中へのクローニングを可能とする（組み合わされた）制限部位（多重クローニング部位またはＭＣＳ）の配列を含有し得るが、代替法も存在する。
【０１０６】
伝統的に、追加的遺伝子エレメントの不存在または存在により４種のシャトルベクターを区別することができる：
・制限により開裂され、酵母細胞の形質転換に直線化ＤＮＡが使用される場合、マーカーまたは別の遺伝子の遺伝子座において、相同性組換えにより宿主ゲノム中に統合される統合プラスミド（ＹＩｐ）。これは一般に、ゲノム中のこの特定部位に挿入された外来性ＤＮＡの１つのコピーの存在をもたらす。
・酵母細胞中での自律複製に必要な２μプラスミドＤＮＡ配列の部分を有するエピソームプラスミド（ＹＥｐ）。形質転換プラスミドの複数コピーが酵母細胞中で増殖し、エピソームとして維持される。
・形質転換プラスミドの数百倍の増殖を可能とする、酵母複製起点（ＡＲＳ、自律複製配列）を有する自律複製プラスミド（ＹＲｐ）。
・ＡＲＳ配列に加えて、安定な有糸分裂分離を正常に保証し、通常、自己複製プラスミドのコピー数を１つだけに低減させるセントロメア配列（核染色体の１つに由来）を有するＣＥＮプラスミド（ＹＣｐ）。
【０１０７】
これらのプラスミドは、形質転換により酵母細胞中に導入されている。酵母細胞の形質転換は、いくつかの異なる技術、例えば酢酸リチウムによる細胞の易過化（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ，１９８３）およびエレクトロポレーション法により達成することができる。
【０１０８】
組換え微生物の商業的用途においては、プラスミドの不安定性が最重要課題である。不安定性は、形質転換細胞が、プラスミドの変化または損失のためにそれらの遺伝子組換え特性を失う傾向である。この問題は、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（Ｐｌａｓｍｉｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．４，ｐｐ．４０１−４３５，１９９６）により詳細に考察されている。統合プラスミドにより形質転換された株は、選択的圧力の不存在下でも極端に安定である（Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｆ．ｈｔｔｐ：／／ｄｂｂ．ｕｒｍｃ．ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ．ｅｄｕ／ｌａｂｓ／ｓｈｅｒｍａｎ＿ｆ／ｙｅａｓｔ／９．ｈｔｍｌおよびその中の参考文献）。
【０１０９】
異種性ＤＮＡは、通常、染色体外プラスミド（ＹＥｐ、ＹＣｐおよびＹＲｐ）の形態で生物中に導入される。残念ながら、特に淘汰圧が連続的にかからない場合は、細菌および酵母の両方について新たな特徴が保持されないことがあることが見出された。これは、組換え細胞が長期間生育した場合のハイブリッドプラスミドの分離不安定性に起因する。これは、集団不均一性およびクローン変動性、ならびに最終的には、大部分の細胞が形質転換により導入された特性を失う細胞集団をもたらす。栄養要求性マーカーを有するベクターが使用されている場合、ベクターは最少培地中でのみ維持されるため、富栄養培地中の培養はベクターの急速な損失をもたらすことが多い。代替的な優性抗生物質耐性マーカーの使用は、生成プロセスに適合性でないことが多い。抗生物質の使用は、登録の観点（微量の抗生物質が最終製品中に存在する可能性）から、または経済的理由（工業規模での抗生物質の使用コスト）のために、所望されないことがある。
【０１１０】
ベクターの損失は、大規模生成状況において問題をもたらす。ＤＮＡを導入する代替法、例えば統合プラスミド（ＹＩｐ）の使用が、酵母について存在する。ＤＮＡは組換えにより宿主ゲノム中に統合され、高い安定性がもたらされる。（Ｃａｕｎｔ，Ｐ．Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９（１９８８）１７３−１９２）。本発明者らは、宿主トランスポゾンを使用する統合法が、良好な代替案であることを見出した。一実施形態において、遺伝子は形質転換宿主細胞ゲノム中に統合することができる。当該技術分野において公知の任意の手法において実施される複数コピーの最初の導入（すなわち適応進化前）は、遺伝子の導入をもたらす。一実施形態において、これは宿主細胞の反復配列（トランスポゾン）に対して相同性の部分を有するベクターを使用して達成することができる。宿主細胞が酵母細胞である場合、好適な反復配列はδ配列として公知のＴｙ因子の長い末端反復（ＬＴＲ）である。Ｔｙ因子は、Ｔｙ１およびＴｙ２と称される、２つのかなり類似するサブファミリーに分類される。これらの因子は、約６キロベース（ｋｂ）の長さであり、約３３５塩基対の配列である長い末端反復（ＬＴＲ）と境を接する（Ｂｏｅｋｅ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｈｅ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｏｎｔａｉｎｓ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  Ｎｏｎｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｐｉｅｓ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  Ｔｙ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｐｒ．１９８８，ｐ．１４３２−１４４２  Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．４）。完全にシーケンシングされたＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株Ｓ２８８ｃ中で最も豊富なトランスポゾンは、Ｔｙ１（３１コピー）およびＴｙ２（１３コピー）である（Ｇａｂｒｉｅｌ  Ａ，Ｄａｐｐｒｉｃｈ  Ｊ，Ｋｕｎｋｅｌ  Ｍ，Ｇｒｅｓｈａｍ  Ｄ，Ｐｒａｔｔ  ＳＣ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｇｌｏｂａｌ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｌｏｃａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ  ２（１２）：ｅ２１２．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｇｅｎ．００２０２１２）。これらのトランスポゾンは、それぞれがいくつかのタンパク質をコードする２つの重複するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなる。コード領域は、上記のほぼ同一のＬＴＲによりフランキングされる。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中の他のＴｙ因子であるが、あまり豊富でなく、より区別されるＴｙ因子は、Ｔｙ３、Ｔｙ４およびＴｙ５を含む。全長Ｔｙ因子のそれぞれのファミリーについて、１桁多い単独のＬＴＲ因子がゲノム全体に分散する。これらは、内在性タンパク質コード領域のループアウトと共に、全長因子のＬＴＲ−ＬＴＲ組換えにより生じると考えられる。
【０１１１】
Ｔｙレトロトランスポゾンのレトロ転位機序は、ゲノム全体に複数コピーを統合するために利用されている（Ｂｏｅｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。δ配列として公知のＴｙ因子の長い末端反復（ＬＴＲ）も、Ｔｙ会合または単独部位のどちらかである約１５０〜２００コピーで存在するため、相同性組換えによる統合の良好な標的である（Ｂｏｅｋｅ，１９８９；Ｋｉｎｇｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｋｉｎｇｓｍａｎ，１９８８）。（Ｐａｒｅｋｈ  Ｒ．Ｎ．（１９９６）．Ａｎ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｔｕｎａｂｌｅ，Ｈｉｇｈ  Ｃｏｐｙ，Ｓｔａｂｌｅ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  Ｄｉｓｐｅｒｓｅｄ  Ｔｙ  ＤＥＬＴＡ  Ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１９９６，１２，１６−２１）。適応進化により、コピーの数は変化し得る。
【０１１２】
［宿主細胞］
宿主細胞は、有用な生成物の生成に好適な任意の宿主細胞であり得る。宿主細胞は、任意の好適な細胞、例えば原核細胞、例えば細菌、または真核細胞であり得る。典型的には、細胞は、真核細胞、例えば酵母または糸状菌である。
【０１１３】
酵母は、本明細書において真核微生物と定義され、大部分は単細胞形態で生育する下位分類ユーマイコチナ（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．，１９６２，Ｉｎ：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）の全ての種を含む。
【０１１４】
酵母は単細胞性葉状体の出芽により生育し得、または生物体の分裂により生育し得る。形質転換宿主細胞として好ましい酵母は、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、シュワニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）またはヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属に属し得る。好ましくは酵母は、嫌気的発酵し得るものであり、より好ましくは嫌気的アルコール発酵し得るものである。
【０１１５】
糸状菌は、本明細書において下位分類ユーマイコチナ（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）の全ての糸状形態を含む真核微生物と定義される。これらの真菌は、キチン、セルロース、および複合多糖から構成される栄養菌糸体を特徴とする。本発明の細胞としての使用に好適な糸状菌は、形態学的、生理学的、および遺伝的に酵母と区別される。ほとんどの真菌は増殖に無菌条件を要求せず、バクテリオファージ感染に非感受性であるため、有利には糸状菌細胞を使用することができる。糸状菌による栄養生育は菌糸伸長によるものであり、ほとんどの糸状菌の炭素異化作用は偏性好気性である。宿主細胞として好ましい糸状菌は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、アクレモニウラ（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｒｒａ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）またはペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属し得る。より好ましくは、糸状菌細胞は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ニホンコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、またはリゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）細胞であり得る。
【０１１６】
一実施形態において、宿主細胞は酵母であり得る。
【０１１７】
好ましくは宿主は、工業宿主、より好ましくは工業酵母である。工業宿主および工業酵母細胞は、以下のとおり定義することができる。工業プロセス中の酵母細胞の生存環境は、実験室のそれと顕著に異なる。工業酵母細胞は、プロセスの間に変動し得る複数の環境条件下で良好に機能し得なくてはならない。そのような変動には、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞生育およびエタノール生成に対する潜在的影響を一緒に及ぼす栄養源、ｐＨ、エタノール濃度、温度、酸素濃度などの変化が含まれる。有害な工業条件の下で、環境耐性株は堅牢な生育および生成を可能とすべきである。工業酵母株は、一般に、それらが使用される用途において、例えば製パン工業、醸造工業、ワイン生産およびエタノール工業において生じ得るこれらの環境条件の変化に対してより堅牢である。工業酵母（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））の例は、Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｒｅｄ（登録商標）（Ｆｅｒｍｅｎｔｉｓ）Ｆｅｒｍｉｏｌ（登録商標）（ＤＳＭ）およびＴｈｅｒｍｏｓａｃｃ（登録商標）（Ｌａｌｌｅｍａｎｄ）である。
【０１１８】
一実施形態において、宿主は阻害剤耐性である。阻害剤耐性宿主細胞は、阻害剤耐性Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＡＴＣＣ２６６０２が選択された、Ｋａｄａｒ  ｅｔ  ａｌ，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００７），Ｖｏｌ．１３６−１４０，８４７−８５８に説明されるような阻害剤含有材料上での生育について株をスクリーニングすることにより選択することができる。
【０１１９】
［ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ遺伝子］
形質転換宿主細胞は、アラビノースを使用し得る。したがって形質転換宿主細胞は、Ｌ−アラビノースをＬ−リブロースおよび／またはキシルロース−５−リン酸および／または所望の発酵生成物、例えば本明細書において挙げられるものに変換し得る。
【０１２０】
Ｌ−アラビノースからエタノールを生成し得る生物、例えばＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株は、好適な起源からのａｒａＡ（Ｌ−アラビノースイソメラーゼ）、ａｒａＢ（Ｌ−リブロキナーゼ）およびａｒａＤ（Ｌ−リブロース−５−Ｐ４−エピメラーゼ）遺伝子を導入して細胞を改変することにより、生成することができる。そのような遺伝子は、形質転換宿主細胞がアラビノースを使用し得るように形質転換宿主細胞中に導入することができる。そのようなアプローチは、国際公開第２００３／０９５６２７号パンフレットに挙げられ、記載されている。ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）からのａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ遺伝子を使用することができ、国際公開第２００８／０４１８４０号パンフレットに開示されている。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのａｒａＡ遺伝子ならびに大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）からのａｒａＢおよびａｒａＤ遺伝子を使用することができ、欧州特許第１４９９７０８号明細書に開示されている。別の実施形態において、ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ遺伝子は、クラビバクター（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）および／またはグラメラ（Ｇｒａｍｅｌｌａ）属の少なくとも１つ、特に国際公開第２００９０１１５９１号パンフレットに開示されているクラビバクター・ミシガンエンシス（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ）、アルスロバクター・アウレセンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｕｒｅｓｃｅｎｓ）、および／またはグラメラ・フォルセティ（Ｇｒａｍｅｌｌａ  ｆｏｒｓｅｔｉｉ）の１つに由来し得る。
【０１２１】
［ＰＰＰ遺伝子］
形質転換宿主細胞は、ペントースリン酸経路の流束を増加させる１つ以上の遺伝子改変を含み得る。特に遺伝子改変は、ペントースリン酸経路の非酸化的部分を介する流束の増加をもたらし得る。ペントースリン酸経路の非酸化的部分の流束の増加を引き起こす遺伝子改変は、本明細書において、流束の増加を引き起こす遺伝子改変以外は、遺伝的に同一の株中の流束と比較して、流束を少なくとも約１．１、約１．２、約１．５、約２、約５、約１０または約２０倍増加させる改変を意味するものと理解される。ペントースリン酸経路の非酸化的部分の流束は、いくらかでもキシリトールが生成される場合、単独の炭素源としてのキシロース上で改変宿主を生育させてキシロース比消費速度を測定し、キシロース比消費速度からキシリトール比生成速度を差し引くことにより計測することができる。しかしながら、ペントースリン酸経路の非酸化的部分の流束は、単独の炭素源としてのキシロース上での生育速度、好ましくは単独の炭素源としてのキシロース上での嫌気的生育速度に比例する。単独の炭素源としてのキシロース上での生育速度（μｍａｘ）とペントースリン酸経路の非酸化的部分の流束との間には線形関係が存在する。糖に対するバイオマス収率は一定であるため、キシロースの比消費速度（Ｑｓ）は、糖に対するバイオマス収率（Ｙｘｓ）により割った生育速度（μ）に等しい（嫌気性、生育培地、ｐＨ、株の遺伝的背景などの所与の一連の条件下；すなわちＱｓ＝μ／Ｙｘｓ）。したがって、ペントースリン酸経路の非酸化的部分の流束の増加は、輸送のない限り（取り込みが制限的）、これらの条件下の最大生育速度の増加から推定することができる。
【０１２２】
ペントースリン酸経路の流束を増加させる１つ以上の遺伝子改変は、種々の手法で宿主細胞中に導入することができる。例えばキシルロースキナーゼの、および／もしくは非酸化的部分ペントースリン酸経路の酵素の１つ以上のより高い定常状態活性レベルを達成すること、ならびに／または非特異的アルドースレダクターゼの低減した定常状態活性レベルを達成することを含むこれら。定常状態活性レベルにおけるこれらの変化は、（自然発生または化学薬品もしくは放射線により誘導される）突然変異体の選択により、および／または組換えＤＮＡ技術により、例えばそれぞれ遺伝子をコードする酵素またはそれらの遺伝子を調節する因子の過剰発現または不活性化により達成することができる。
【０１２３】
好ましい宿主細胞において、遺伝子改変は（非酸化的部分）ペントースリン酸経路の少なくとも１つの酵素の過剰発現を含む。好ましくは酵素は、リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼをコードする酵素からなる群から選択される。（非酸化的部分）ペントースリン酸経路の酵素の種々の組合せを過剰発現させることができる。例えば過剰発現される酵素は、少なくとも酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼおよびリブロース−５−リン酸エピメラーゼ；または少なくとも酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼおよびトランスケトラーゼ；または少なくとも酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼおよびトランスアルドラーゼ；または少なくとも酵素リブロース−５−リン酸エピメラーゼおよびトランスケトラーゼ；または少なくとも酵素リブロース−５−リン酸エピメラーゼおよびトランスアルドラーゼ；または少なくとも酵素トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ；または少なくとも酵素リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ；または少なくとも酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ；または少なくとも酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、およびトランスアルドラーゼ；または少なくとも酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、およびトランスケトラーゼであり得る。本発明の一実施形態において、酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼのそれぞれが、宿主細胞中で過剰発現される。遺伝子改変が少なくとも酵素トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼの両方の過剰発現を含む宿主細胞がより好ましく、それはそのような宿主細胞が既にキシロース上で嫌気的に生育し得るためである。実際、一部の条件下、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼのみを過剰発現する宿主細胞は、４つの酵素全て、すなわちリブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼを過剰発現する宿主細胞と同一の嫌気的生育速度をキシロース上で既に有する。さらに、酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼおよびリブロース−５−リン酸エピメラーゼの両方を過剰発現する宿主細胞が、イソメラーゼのみまたはエピメラーゼのみを過剰発現する宿主細胞よりも好ましいが、それはこれらの酵素の１つのみの過剰発現が代謝不均衡を生じ得るためである。
【０１２４】
本明細書において、酵素「リブロース５−リン酸エピメラーゼ」（ＥＣ５．１．３．１）は、Ｄ−キシルロース５−リン酸のＤ−リブロース５−リン酸へのエピマー化を触媒し、その逆も触媒する酵素と定義される。この酵素は、ホスホリブロースエピメラーゼ；エリスロース−４−リン酸イソメラーゼ；ホスホケトペントース３−エピメラーゼ；キシルロースリン酸３−エピメラーゼ；ホスホケトペントースエピメラーゼ；リブロース５−リン酸３−エピメラーゼ；Ｄ−リブロースリン酸−３−エピメラーゼ；Ｄ−リブロース５−リン酸エピメラーゼ；Ｄ−リブロース−５−Ｐ３−エピメラーゼ；Ｄ−キシルロース−５−リン酸３−エピメラーゼ；ペントース−５−リン酸３−エピメラーゼ；またはＤ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼとしても公知である。リブロース５−リン酸エピメラーゼは、そのアミノ酸配列によりさらに定義することができる。同様に、リブロース５−リン酸エピメラーゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列により、およびリブロース５−リン酸エピメラーゼをコードする参照ヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列により、定義することができる。リブロース５−リン酸エピメラーゼをコードするヌクレオチド配列は、本明細書においてＲＰＥ１と命名される。
【０１２５】
本明細書において、酵素「リブロース５−リン酸イソメラーゼ」（ＥＣ５．３．１．６）は、Ｄ−リボース５−リン酸のＤ−リブロース５−リン酸への直接異性化を触媒し、その逆も触媒する酵素と定義される。この酵素は、ホスホペントースイソメラーゼ；ホスホリボイソメラーゼ；リボースリン酸イソメラーゼ；５−ホスホリボースイソメラーゼ；Ｄ−リボース５−リン酸イソメラーゼ；Ｄ−リボース−５−リン酸ケトール−イソメラーゼ；またはＤ−リボース−５−リン酸アルドース−ケトース−イソメラーゼとしても公知である。リブロース５−リン酸イソメラーゼは、そのアミノ酸配列によりさらに定義することができる。同様にリブロース５−リン酸イソメラーゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列により、およびリブロース５−リン酸イソメラーゼをコードする参照ヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列により定義することができる。リブロース５−リン酸イソメラーゼをコードするヌクレオチド配列は、本明細書においてＲＫＩ１と命名される。
【０１２６】
本明細書において酵素「トランスケトラーゼ」（ＥＣ２．２．１．１）は、Ｄ−リボース５−リン酸＋Ｄ−キシルロース−５−リン酸＜−＞セドヘプツロース７−リン酸＋Ｄ−グリセルアルデヒド３−リン酸の反応を触媒し、その逆も触媒する酵素と定義される。この酵素は、グリコールアルデヒドトランスフェラーゼまたはセドヘプツロース−７−リン酸：Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸グリコールアルデヒドトランスフェラーゼとしても公知である。トランスケトラーゼは、そのアミノ酸によりさらに定義することができる。同様にトランスケトラーゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列により、およびトランスケトラーゼをコードする参照ヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列により定義することができる。トランスケトラーゼをコードするヌクレオチド配列は、本明細書においてＴＫＬ１と命名される。
【０１２７】
本明細書において酵素「トランスアルドラーゼ」（ＥＣ２．２．１．２）は、セドヘプツロース７−リン酸＋Ｄ−グリセルアルデヒド３−リン酸＜−＞Ｄ−エリスロース４−リン酸＋Ｄ−フルクトース６−リン酸の反応を触媒し、その逆も触媒する酵素と定義される。この酵素は、ジヒドロキシアセトントランスフェラーゼ；ジヒドロキシアセトンシンターゼ；ホルムアルデヒドトランスケトラーゼ；またはセドヘプツロース−７−リン酸：Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸グリセロントランスフェラーゼとしても公知である。トランスアルドラーゼは、そのアミノ酸配列によりさらに定義することができる。同様にトランスアルドラーゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列により、およびトランスアルドラーゼをコードする参照ヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列により定義することができる。トランスケトラーゼをコードするヌクレオチド配列は、本明細書においてＴＡＬ１と命名される。
【０１２８】
［キシロースイソメラーゼまたはキシロースレダクターゼ遺伝子］
本発明によれば、１つ以上のキシロースイソメラーゼ遺伝子ならびに／または１つ以上のキシロースレダクターゼおよびキシリトールデヒドロゲナーゼの１つ以上のコピーが、宿主細胞のゲノム中に導入される。これらの遺伝子エレメントの存在は、キシロースを異性化または還元により変換する能力を細胞に付与する。
【０１２９】
一実施形態において、１つ以上のキシロースイソメラーゼ遺伝子の１つ以上のコピーが宿主細胞のゲノム中に導入される。
【０１３０】
本明細書において「キシロースイソメラーゼ」（ＥＣ５．３．１．５）は、Ｄ−キシロースのＤ−キシルロースへの直接異性化を触媒し、および／またはその逆を触媒する酵素と定義される。この酵素は、Ｄ−キシロースケトイソメラーゼとしても公知である。本明細書においてキシロースイソメラーゼは、Ｄ−グルコースとＤ−フルクトースとの間の変換も触媒し得る（したがってグルコースイソメラーゼと適宜称することができる）。本明細書においてキシロースイソメラーゼは、二価のカチオン、例えばマグネシウム、マンガンまたはコバルトを補因子として要求し得る。
【０１３１】
したがって、そのような形質転換宿主細胞は、キシロースをキシルロースに異性化し得る。キシロースをキシルロースに異性化する能力は、定義されたキシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物により宿主細胞を形質転換することにより宿主細胞に付与される。形質転換宿主細胞は、キシロースのキシルロースへの直接異性化により、キシロースをキシルロースに異性化する。
【０１３２】
本明細書において、キシロースイソメラーゼ活性の単位（Ｕ）は、Ｋｕｙｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３，ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．４：６９−７８）により記載されている条件下で、１分当たり１ｎｍｏｌのキシルロースを生成する酵素量と定義することができる。
【０１３３】
キシロース異性化遺伝子は、種々の起源、例えば国際公開第２００６／００９４３４号パンフレットに開示されているピロマイセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）属種などを有し得る。他の好適な起源は、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、特にＰＣＴ／ＥＰ２００９／５２６２３号明細書に記載のバクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、特にＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５２６２５号明細書に記載のバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）である。
【０１３４】
別の実施形態において、１つ以上のキシロースレダクターゼおよびキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の１つ以上のコピーが宿主細胞のゲノム中に導入される。この実施形態において、キシロースの変換は、それぞれキシロースレダクターゼおよびキシリトールデヒドロゲナーゼにより触媒される、キシロースのキシリトール中間体を経由するキシルロースへの２工程変換で実施される。この一実施形態において、国際公開第２００４０８５６２７号パンフレットに開示されているとおりキシロースレダクターゼ（ＸＲ）、キシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）、およびキシルロキナーゼ（ＸＫ）を過剰発現させることができ、場合によりＮＡＤＰＨ生成酵素をコードする遺伝子の１つ以上が上方制御され、ＮＡＤＨ消費酵素をコードする遺伝子の１つ以上が上方制御される。
【０１３５】
［ＸＫＳ１遺伝子］
形質転換宿主細胞は、特異的キシルロースキナーゼ活性を増加させる１つ以上の遺伝子改変を含み得る。好ましくは１つまたは複数の遺伝子改変は、例えばキシルロースキナーゼをコードするヌクレオチド配列の過剰発現によりキシルロースキナーゼの過剰発現を引き起こす。キシルロースキナーゼをコードする遺伝子は宿主細胞に対して内在性であり得、または宿主細胞に対して異種性のキシルロースキナーゼであり得る。宿主細胞中におけるキシルロースキナーゼの過剰発現に使用されるヌクレオチド配列は、キシルロースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
【０１３６】
本明細書において酵素「キシルロースキナーゼ」（ＥＣ２．７．１．１７）は、ＡＴＰ＋Ｄ−キシルロース＝ＡＤＰ＋Ｄ−キシルロース５−リン酸の反応を触媒する酵素と定義される。この酵素は、ホスホリル化キシルロキナーゼ、Ｄ−キシルロキナーゼまたはＡＴＰ：Ｄ−キシルロース５−ホスホトランスフェラーゼとしても公知である。本発明のキシルロースキナーゼは、そのアミノ酸配列によりさらに定義することができる。同様にキシルロースキナーゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列により、およびキシルロースキナーゼをコードする参照ヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列により定義することができる。
【０１３７】
形質転換宿主細胞中では、特異的キシルロースキナーゼ活性を増加させる１つ以上の遺伝子改変は、上記のペントースリン酸経路の流束を増加させる改変のいずれかと組み合わせることができる。しかしながら、これは必須でない。
【０１３８】
したがって、宿主細胞は、特異的キシルロースキナーゼ活性を増加させる１つ以上の遺伝子改変のみを含み得る。本発明の宿主細胞中でのキシルロースキナーゼの過剰発現を達成および分析するための当該技術分野において利用可能な種々の手段は、ペントースリン酸経路の酵素について上記したものと同一である。好ましくは、本発明の宿主細胞中では、過剰発現させるべきキシルロースキナーゼは、過剰発現を引き起こす遺伝子改変以外は遺伝的に同一の株と比較して、少なくとも約１．１、約１．２、約１．５、約２、約５、約１０または約２０倍過剰発現される。これらの過剰発現のレベルは、酵素活性の定常状態レベルに、酵素タンパク質の定常状態レベルに、および酵素をコードする転写物の定常状態レベルに当てはまり得ると理解すべきである。
【０１３９】
［アルドースレダクターゼ（ＧＲＥ３）遺伝子欠失］
ＸＩがキシロースを変換するための遺伝子として使用される実施形態において、アルドースレダクターゼ活性を低減させることが有利であり得る。したがって、形質転換宿主細胞は、宿主細胞中での非特異的アルドースレダクターゼ活性を低減させる１つ以上の遺伝子改変を含み得る。好ましくは、非特異的アルドースレダクターゼをコードする遺伝子の発現を低減させ、またはその遺伝子を不活性化する１つ以上の遺伝子改変により、宿主細胞中での非特異的アルドースレダクターゼ活性が低減する。好ましくは、遺伝子改変は、宿主細胞中での非特異的アルドースレダクターゼをコードする遺伝子のそれぞれの内在性コピーの発現を低下させ、または不活性化する（本明細書においてＧＲＥ３欠失と称する）。形質転換宿主細胞は、二倍性、倍数性または異数性の結果として、非特異的アルドースレダクターゼをコードする遺伝子の複数コピーを含み得、および／または宿主細胞はアミノ酸配列が異なり、異なる遺伝子によりそれぞれコードされるアルドースレダクターゼ活性を有するいくつかの異なる酵素（アイソザイム）を含有し得る。またそのような場合、好ましくは、非特異的アルドースレダクターゼをコードするそれぞれの遺伝子の発現が低減し、または不活性化される。好ましくは、遺伝子は、遺伝子の少なくとも一部の欠失により、または遺伝子の破壊により不活性化され、それによりこれに関連して遺伝子という用語は、（部分的）欠失または不活性化が宿主細胞中での非特異的アルドースレダクターゼ活性の発現の低減をもたらすコード配列の上流または下流の、いかなる非コード配列も含む。
【０１４０】
宿主細胞中で活性を低減すべきアルドースレダクターゼをコードするヌクレオチド配列は、アルドースレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
【０１４１】
したがって、宿主細胞中の非特異的アルドースレダクターゼ活性を低減させる１つまたは複数の遺伝子改変のみを含む宿主細胞は、本発明に明確に含まれる。
【０１４２】
本明細書において、酵素「アルドースレダクターゼ」（ＥＣ１．１．１．２１）は、キシロースまたはキシルロースをキシリトールに還元し得る任意の酵素と定義される。本発明に関連して、アルドースレダクターゼは、本発明の宿主細胞由来（宿主細胞に対して内在性）であり、キシロースまたはキシルロースをキシリトールに還元し得る任意の非特異的アルドースレダクターゼであり得る。非特異的アルドースレダクターゼは、次の反応を触媒する：
アルドース＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋Ｈ＋⇔アルジトール＋ＮＡＤ（Ｐ）＋
【０１４３】
この酵素は広い特異性を有し、アルドースレダクターゼ；ポリオールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）；アルジトール：ＮＡＤＰオキシドレダクターゼ；アルジトール：ＮＡＤＰ＋１−オキシドレダクターゼ；ＮＡＤＰＨ−アルドペントースレダクターゼ；またはＮＡＤＰＨ−アルドースレダクターゼとしても公知である。
【０１４４】
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に対して内在性であり、ＧＲＥ３遺伝子によりコードされるそのような非特異的アルドースレダクターゼの特定の例（Ｔｒａｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：５６６８−７４）。したがって、本発明のアルドースレダクターゼは、そのアミノ酸配列によりさらに定義することができる。同様にアルドースレダクターゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列により、およびアルドースレダクターゼをコードする参照ヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列により定義することができる。
【０１４５】
［バイオ製品生成］
長年にわたり、作物糖からバイオエタノールを生成するために、種々な生物の導入が提案されてきた。しかしながら、実際、全ての主要なバイオエタノール生成プロセスは、エタノール生成菌としてサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母を使用し続けている。これは工業的プロセスのための、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種の多くの魅力的な特徴、すなわち高い酸、エタノールおよび浸透圧耐性、嫌気的生育能、ならびにもちろんその高いアルコール発酵能に起因する。宿主細胞として好ましい酵母種には、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ブルデリ（Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ）、Ｓ．バルネッチ（Ｓ．ｂａｒｎｅｔｔｉ）、Ｓ．エクシグウス（Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ）、Ｓ．ウバラム（Ｓ．ｕｖａｒｕｍ）、Ｓ．ディアスタティカス（Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、またはＫ．フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）が含まれる。
【０１４６】
形質転換宿主細胞は、エタノールの生成に好適な細胞であり得る。しかしながら、形質転換宿主細胞は、エタノール以外の発酵生成物の生成に好適であり得る。
【０１４７】
そのような非エタノール発酵生成物には、原則的には、真核微生物、例えば酵母または糸状菌により生成可能な任意のバルクまたはファインケミカルが挙げられる。
【０１４８】
非エタノール発酵生成物の生成に使用することができる形質転換宿主細胞は、アルコールデヒドロゲナーゼ活性の減少をもたらす遺伝子改変を含有する宿主細胞である。
【０１４９】
一実施形態において、形質転換宿主細胞は、リグノセルロースに由来する糖をエタノールに変換するプロセスにおいて使用することができる。
【０１５０】
［リグノセルロース］
潜在的な再生可能原料とみなすことができるリグノセルロースには、一般に、多糖セルロース（グルカン）およびヘミセルロース（キシラン、ヘテロキシランおよびキシログルカン）が含まれる。さらに、例えば木材由来原料中に、一部のヘミセルロースがグルコマンナンとして存在し得る。例えばこれらの多糖の、可溶性糖、例としてモノマーおよびマルチマーの両方、例えばグルコース、セロビオース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、ラムノース、リボース、ガラクツロン酸、グルクロン酸ならびに他のヘキソースおよびペントースへの酵素加水分解は、協調して作用する異なる酵素作用の下で生じる。
【０１５１】
さらにペクチン、および他のペクチン物質、例えばアラビナンが、典型的には非木本組織からの細胞壁の乾燥質量のかなりの比率を構成し得る（乾燥質量の約４分の１から２分の１がペクチンであり得る）。
【０１５２】
［前処理］
酵素処理前に、リグノセルロース材料を前処理することができる。前処理は、リグノセルロース材料を酸、塩基、溶媒、熱、過酸化物、オゾン、機械的破砕、研削、粉砕もしくは急速減圧、またはそれらの任意の２つ以上の組合せに曝露することを含み得る。この化学的前処理は、熱前処理、例えば１から３０分間の１５０〜２２０℃の処理と組み合わされることが多い。
【０１５３】
［酵素加水分解］
前処理された材料は、一般に、酵素加水分解に供して本発明により発酵することができる糖を放出させる。これは、慣用の方法、例えばセルラーゼ、例えばセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼおよび場合により他の酵素と接触させることにより実施することができる。セルラーゼによる変換は、周囲温度においてまたはより高温において、十分量の糖を放出させるための反応時間において実施することができる。酵素加水分解の結果は、本明細書において糖組成物として命名されるＣ５／Ｃ６糖を含む加水分解生成物である。
【０１５４】
［発酵］
発酵プロセスは、好気的または嫌気的発酵プロセスであり得る。嫌気的発酵プロセスは、本明細書において、酸素不存在下で実行される発酵プロセス、または実質的に酸素が消費されず、好ましくは約５、約２．５または約１ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ未満、より好ましくは０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ未満が消費され（すなわち酸素消費が検出可能でない）、有機分子が電子供与体および電子受容体の両方として機能する発酵プロセスと定義される。酸素の不存在下で、解糖およびバイオマス形成中に生成されたＮＡＤＨは、酸化的リン酸化により酸化され得ない。この問題を解決するため、多くの微生物は、電子および水素受容体としてピルビン酸またはその誘導体の１つを使用し、それによりＮＡＤ＋を再生する。
【０１５５】
したがって、好ましい嫌気的発酵プロセスにおいて、ピルビン酸が電子（および水素受容体）として使用され、発酵生成物、例えばエタノール、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム抗生物質、およびセファロスポリンに還元される。
【０１５６】
発酵プロセスは、好ましくは細胞に最適の温度において実行される。したがってほとんどの酵母または真菌宿主細胞について、発酵プロセスは、約４２℃未満、好ましくは約３８℃未満の温度において実施される。酵母または糸状菌宿主細胞について、発酵プロセスは好ましくは約３５、約３３、約３０または約２８℃よりも低い温度および約２０、約２２、または約２５℃よりも高い温度において実施される。
【０１５７】
プロセスにおけるキシロースおよび／またはグルコースに対するエタノール収率は、好ましくは少なくとも約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約９５または約９８％である。エタノール収率は、本明細書で理論的最大収率の百分率と定義される。
【０１５８】
本発明はまた、発酵生成物を生成する方法にも関する。
【０１５９】
本発明による発酵プロセスは、好気的および嫌気的条件下で実行することができる。一実施形態において、このプロセスは微好気的または酸素制限条件下で実施される。
【０１６０】
嫌気的発酵プロセスは、本明細書において、酸素不存在下で進行し、または実質的に酸素が消費されず、好ましくは約５、約２．５または約１ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ未満が消費され、有機分子が電子供与体および電子受容体の両方として機能する発酵プロセスと定義される。
【０１６１】
酸素制限発酵プロセスは、気体から液体への酸素移動により、酸素消費が制限されるプロセスである。酸素制限の程度は、流入ガス流の量および組成ならびに使用される発酵装置の実際の混合／質量移動特性により決定される。好ましくは、酸素制限条件下のプロセスにおいて、酸素消費速度は、少なくとも約５．５、より好ましくは少なくとも約６、例えば少なくとも７ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈである。本発明の方法は、発酵生成物の回収を含み得る。
【０１６２】
好ましい方法において、細胞はキシロースおよびグルコースの両方を好ましくは同時に発酵し、その場合、好ましくはジオーキシー生育を妨害するグルコース抑制に非感受性の細胞が使用される。炭素源としてのキシロース（およびグルコース）の源に加えて、発酵培地は、細胞の生育に要求される適切な成分をさらに含む。微生物、例えば酵母の生育のための発酵培地の組成物は、当該技術分野において周知である。
【０１６３】
発酵プロセスは、バッチ、流加または連続様式で実施することができる。加水分解・発酵分離（ＳＨＦ）プロセスまたは並行復発酵（ＳＳＦ）プロセスを適用することもできる。最適生産性のために、これらの発酵プロセス様式の組合せも可能であり得る。これらのプロセスを以下により詳細に記載する。
【０１６４】
［ＳＳＦ様式］
並行復発酵（ＳＳＦ）様式について、液化／加水分解または前糖化工程のための反応時間は、所望の収率、すなわちセルロースからグルコースへの変換収率を実現する時間に依存する。そのような収率は、好ましくは可能な限り高く、好ましくは６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、さらには９９．５％以上または９９．９％以上である。
【０１６５】
本発明によれば、ＳＨＦ様式における極めて高い糖濃度、およびＳＳＦ様式における極めて高い生成物濃度（例えばエタノール）が実現される。ＳＨＦ操作では、グルコース濃度は、２５ｇ／Ｌ以上、３０ｇ／Ｌ以上、３５ｇ／Ｌ以上、４０ｇ／Ｌ以上、４５ｇ／Ｌ以上、５０ｇ／Ｌ以上、５５ｇ／Ｌ以上、６０ｇ／Ｌ以上、６５ｇ／Ｌ以上、７０ｇ／Ｌ以上、７５ｇ／Ｌ以上、８０ｇ／Ｌ以上、８５ｇ／Ｌ以上、９０ｇ／Ｌ以上、９５ｇ／Ｌ以上、１００ｇ／Ｌ以上、１１０ｇ／Ｌ以上、１２０ｇ／Ｌ以上であり、または例えば２５ｇ／Ｌ〜２５０ｇ／Ｌ、３０ｇｌ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌであり得る。
【０１６６】
［ＳＳＦ様式における生成物濃度］
ＳＳＦ操作において、生成物濃度（ｇ／Ｌ）は生成されるグルコースの量に依存するが、糖はＳＳＦにおいて生成物に変換され、生成物濃度は、基礎グルコース濃度に理論的最大収率（Ｙｐｓ  ｍａｘは、１グラムのグルコース当たりの生成物のグラムである）を掛けたものに関連し得るため、これは可視的でない。
【０１６７】
発酵生成物の理論的最大収率（Ｙｐｓ  ｍａｘは、１グラムのグルコース当たりの生成物のグラムである）は、教本による生化学から導くことができる。エタノールについて、１モルのグルコース（１８０グラム）は、酵母中の通常解糖発酵経路に従って、２モルのエタノール（＝２×４６＝９２グラムのエタノール）を生じる。したがってグルコースに対するエタノールの理論的最大収率は、９２／１８０＝０．５１１グラムのエタノール／１グラムのグルコースである。
【０１６８】
ブタノール（ＭＷ７４グラム／モル）またはイソブタノールについて、理論的最大収率は１モルのグルコース当たり１モルのブタノールである。したがって（イソ−）ブタノールのＹｐｓ  ｍａｘ＝７４／１８０＝０．４１１グラムの（イソ−）ブタノール／１グラムのグルコースである。
【０１６９】
乳酸について、ホモ乳酸発酵の発酵収率は、１モルのグルコース当たり２モルの乳酸（ＭＷ＝９０グラム／モル）である。この化学量論によれば、Ｙｐｓ  ｍａｘ＝１グラムの乳酸／１グラムのグルコースである。
【０１７０】
他の発酵生成物について、同様の計算を行うことができる。
【０１７１】
［ＳＳＦ様式］
ＳＳＦ操作において、生成物濃度は、２５ｇ＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ／Ｌ以上、３０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、３５ｇ＊Ｙｐｓ／Ｌ以上、４０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、４５＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、５０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、５５＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、６０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、６５＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、７０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、７５＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、８０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、８５＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、９０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、９５＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、１００＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、１１０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、１２０ｇ／Ｌ＊Ｙｐｓ以上であり、または例えば２５＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ〜２５０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ、３０＊Ｙｐｓ  ｇｌ／Ｌ〜２００＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ、４０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ〜２００＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ、５０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ〜２００＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ、６０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ〜２００＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ、７０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ〜２００＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ、８０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ〜２００＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ、９０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ、８０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ〜２００＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌであり得る。
【０１７２】
したがって、本発明は発酵生成物を調製する方法であって、
ａ．本明細書に記載の方法を使用してリグノセルロースを分解すること；および
ｂ．得られた材料を発酵すること
を含み、それにより発酵生成物を調製する方法を提供する。
【０１７３】
［発酵生成物］
本発明の発酵生成物は、任意の有用な生成物であり得る。一実施形態において、これは、エタノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、イタコン酸、マレイン酸、クエン酸、アジピン酸、アミノ酸、例えばリジン、メチオニン、トリプトファン、スレオニン、およびアスパラギン酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム抗生物質およびセファロスポリン、ビタミン、医薬品、動物飼料補助剤、特殊化学薬品、化学原料、プラスチック、溶媒、燃料、例としてバイオ燃料およびバイオガスまたは有機ポリマー、ならびに工業酵素、例えばプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼまたはキシラナーゼからなる群から選択される生成物である。例えば、発酵生成物は、先行技術の細胞調製法および発酵プロセスに従って本発明による細胞により生成することができるが、この例は、本明細書において限定するものと解釈すべきでない。ｎ−ブタノールは、国際公開第２００８１２１７０１号パンフレットまたは国際公開第２００８０８６１２４号パンフレットに記載のとおり細胞により生成することができ；乳酸は、米国特許出願公開第２０１１０５３２３１号明細書または米国特許出願公開第２０１０１３７５５１号明細書に記載のとおり；３−ヒドロキシ−プロピオン酸は、国際公開第２０１００１０２９１号パンフレットに記載のとおり；アクリル酸は、国際公開第２００９１５３０４７号パンフレットに記載のとおり生成することができる。
【０１７４】
［発酵生成物の回収］
発酵生成物の回収のため、既存の技術が使用される。異なる発酵生成物について、異なる回収プロセスが適切である。水性混合物からエタノールを回収する既存の方法は、一般に分留および吸着技術を使用する。例えばビール蒸留器を使用して、エタノールを水性混合物中に含有する発酵生成物を処理して濃縮エタノール含有混合物を生成し、次いで分留（例えば分別蒸留または他の同様の技術）に供することができる。次に最高濃度のエタノールを含有する留分を吸収材に導通させ、エタノールから残りの水の全部ではないが大部分を除去することができる。
【０１７５】
以下の実施例は本発明を説明する。
【０１７６】
［実施例］
［株および維持］
本試験において使用される株（表１）の貯蔵のため、振とうフラスコ培養を１０ｇ  ｌ−１の酵母抽出物（ＢＤ  Ｄｉｆｃｏ）および２０ｇ  ｌ−１のペプトン（ＢＤ  Ｄｉｆｃｏ）からなり、２％のグルコース（ＹＰＤ）、２％のエタノール＋１．５％のグリセロール（ＹＰ−ＥｔＯＨ／Ｇｌｙｃ）または２％のアラビノース（ＹＰ−Ａｒａ）のいずれかを補給した複合培地（ＹＰ）中で実施した。培養物を、静止生育期までオービタルシェーカー（２００ｒｐｍ）中で３０℃においてインキュベートした。３０％（ｖ／ｖ）のグリセロールの添加後、振とうフラスコ培養物からの試料を２ｍｌのアリコートで−８０℃において貯蔵した。
【０１７７】
［振とうフラスコ培養］
振とうフラスコ中での培養を、２．３ｇ  ｌ−１の尿素、６．６ｇ  ｌ−１のＫ２ＳＯ４、３ｇ  ｌ−１のＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ  ｌ−１のＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、および微量元素を含有する合成培地（ＭＹ尿素）［７］中で３０℃において実施した。振とうフラスコ培養のため、培地ｐＨを滅菌前に２ＭのＫＯＨにより４．７に調整した。加熱滅菌（１２１℃、２０分）後、フィルター滅菌ビタミン溶液［７］および糖を添加した。振とうフラスコ培養物は、５００ｍｌの振とうフラスコ中の適切な糖を含有する１００ｍｌの培地に凍結ストック培養物を植菌することにより調製し、オービタルシェーカー（２００ｒｐｍ）中で３０℃においてインキュベートした。
【０１７８】
［嫌気的バッチ培養］
嫌気的バッチ培養は、１ｌの作業容積を有する２リットルの発酵槽（Ａｐｐｌｉｋｏｎ，Ｓｃｈｉｅｄａｍ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）中で３０℃において実施した。培養は、５ｇ  ｌ−１の（ＮＨ４）２ＳＯ４、３ｇ  ｌ−１のＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ  ｌ−１のＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏおよび微量元素を含有する合成培地［７］中で実施した。加熱滅菌（１２１℃、２０分）後、培地にエタノール中に溶解した０．０１ｇ−１のエルゴステロールおよび０．４２ｇ−１のＴｗｅｅｎ８０［１，２］、ケイ素消泡剤、微量元素、フィルター滅菌ビタミン溶液［７］、ならびに適切な炭素源を補給した。培養物を８００ｒｐｍにおいて撹拌し、０．５ｌ  ｍｉｎ−１の窒素ガス（＜１０ｐｐｍの酸素）によりスパージし、２ＭのＫＯＨの自動添加によりｐＨ５．０において維持した。酸素拡散を最小化するため、発酵槽にＮｏｒｐｒｅｎｅチューブ（Ｃｏｌｅ  Ｐａｌｍｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｖｅｒｎｏｎ  Ｈｉｌｌｓ，ＵＳＡ）を備えた。酸素の不存在は、酸素電極（Ａｐｐｌｉｓｅｎｓ，Ｓｃｈｉｅｄａｍ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）により確認した。バッチ培養は、１００ｍｌのグルコースにより生育させた振とうフラスコ培養物の植菌により開始した。
【０１７９】
［生育速度決定］
振とうフラスコ培養物について、６６０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６６０）を経時的に計測することにより生育プロファイルを作製した。発酵槽中の嫌気的培養について、比生育速度を排ガス中のＣＯ２濃度に基づき決定した。比生育速度は、データ点を指数曲線にフィットすることにより決定した。
【０１８０】
［二酸化炭素および細胞外代謝産物分析］
嫌気的発酵槽からの排ガスを、凝縮器（２℃）中で冷却し、Ｐｅｒｍａｐｕｒｅ乾燥器型ＭＤ−１１０−４８Ｐ−４（Ｐｅｒｍａｐｕｒｅ，Ｔｏｍｓ  Ｒｉｖｅｒ，ＵＳＡ）により乾燥させた。二酸化炭素濃度は、ＮＧＡ２０００分析器（Ｒｏｓｅｍｏｕｎｔ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ，Ｏｒｒｖｉｌｌｅ，ＵＳＡ）により測定した。排ガス流速および比二酸化炭素生成速度は、上記のとおり測定した［６，８］。
【０１８１】
グルコース、アラビノース、酢酸、乳酸、コハク酸、グリセロールおよびエタノールを、ＢｉｏＲａｄ  ＨＰＸ８７Ｈカラム（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＵＳＡ）、Ｗａｔｅｒｓ２４１０屈折率検出器およびＷａｔｅｒｓ２４８７ＵＶ検出器を搭載したＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ２６９０ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＵＳＡ）を使用するＨＰＬＣにより分析した。カラムは、６０℃において０．５ｇ  ｌ−１の硫酸により０．６ｍｌ  ｍｉｎ−１の流速において溶出させた。
【０１８２】
［ヘキソキナーゼ活性測定］
本試験において使用された株の細胞抽出物中のヘキソキナーゼ活性は、グルコースのグルコース−６−リン酸（反応１）への変換率を、形成されたグルコース−６−リン酸を酵素グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼにより６−ホスホグルコン酸に変換する連結酵素反応（反応２）を使用して計測することにより測定した。この連結反応において形成されるＮＡＤＰＨの速度は、ヘキソキナーゼ活性と等しく、３４０ｎｍにおける吸光度を計測することにより測定する。
Ｄ−グルコース＋ＡＴＰ．ＡＤＰ＋Ｄ−グルコース６−リン酸（１）
Ｄ−グルコース６−リン酸＋ＮＡＤＰ＋．６−ホスホグルコノラクトン＋ＮＡＤＰＨ（２）
【０１８３】
［実施例１］
［遺伝子欠失］
本実施例において、遺伝子欠失は、標的遺伝子を置き換えるＧ４１８耐性カセットの統合により達成した。ＨＸＫ２、ＨＸＫ１およびＧＬＫ１の欠失のため、ｐＵＧ６からのＫａｎＭＸカセットを、表２に示されるオリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲにより増幅した［４］。
【０１８４】
【表２】
2013542724.tif 000003
【０１８５】
ＰＣＲ生成物の精製後（ＧｅｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｋｉｔ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、一晩培養物を遺伝子破壊カセットにより形質転換［３］した。形質転換細胞は、１００μｇ  ｍｌ−のＧ４１８（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）を含有するＹＰＤ寒天上で選択した。ＫａｎＭＸカセットの正確な統合は、ＫａｎＭＸカセットならびに標的遺伝子の上流および下流領域に結合する診断オリゴヌクレオチドを使用して単一コロニーに対するＰＣＲにより確認した（表１）。
【０１８６】
複数の遺伝子欠失のため、隣接遺伝子の欠失前にＫａｎＭＸマーカーをレスキューした。この目的のため、細胞を、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼを発現し、フレオマイシン耐性遺伝子ｂｌｅｒを有するｐＳＨ６５により形質転換した［５］。形質転換細胞を、フレオマイシンを含有するＹＰＤプレート上にスプレッドし、コロニーが現れるまで３０℃においてインキュベートした。７．５μｇ／ｍｌのフレオマイシンを含有する液体ＹＰ−ガラクトース（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）に、いくつかのフレオマイシン耐性コロニーを植菌し、Ｃｒｅリコンビナーゼの誘導のために３０℃において一晩インキュベートし、フレオマイシンを有する固体ＹＰＤに植継ぎした。ＣｒｅリコンビナーゼによるＫａｎＭＸカセットの除去は、ＹＰＤおよびＹＰＤ−Ｇ４１８上のフレオマイシン耐性酵母コロニーのレプリカプレーティングにより、およびＧ４１８耐性を失った単一コロニーに対する診断ＰＣＲにより確認した。続いて、ｐＳＨ６５の損失を、細胞をフレオマイシンを有さないＹＰＤ中で非選択的に５〜１０世代生育させることにより達成し、その後、フレオマイシン耐性の損失を、フレオマイシンを有し、または有さない固体ＹＰＤ上の単一コロニーのレプリカプレーティングにより確認した。ＨＸＫ２、ＨＸＫ１およびＧＬＫ１の後続の欠失、ならびにそれぞれの欠失後のＫａｎＭＸ遺伝子の除去は、株ＩＭＫ３０６、ＩＭＫ３０７、ＩＭＫ３１１、ＩＭＫ３１２およびＩＭＫ３１８をもたらした（表３）。
【０１８７】
【表３】
2013542724.tif 000004
【０１８８】
グルコースおよびアラビノース消費に対するｈｘｋ２およびｈｘｋ２  ｈｘｋ１欠失の効果。グルコースおよびアラビノース消費に対するＨＸＫ２およびＨＸＫ１欠失の効果を決定するため、株ＤＳ６２５０４、ＩＭＫ３０７（ｈｘｋ２Δ）およびＩＭＫ３１１／ＩＭＫ３１２（ｈｘｋ２Δ  ｈｘｋ１Δ）を振とうフラスコ（図１）および嫌気的発酵槽（図２）の両方の中で３０℃において２％のアラビノースおよび２％のグルコースの混合物を補給したＭＹ中で培養した。
【０１８９】
振とうフラスコ培養は、ＭＹ−ｇｌｃ中で生育させた振とうフラスコ培養物の植菌により約０．０５の初期ＯＤ６６０において開始した。株ＤＳ６２５０４（図１）は、グルコースを２１時間内に消費し、グルコース枯渇時、アラビノース消費が開始した。両方の糖は、５０時間超の合計時間内に消費された。株ＩＭＫ３０７（図１）の培養物において、グルコースは、２５時間で全部消費され、アラビノースはその後１５時間未満で枯渇した。全ＩＭＫ３０７は、ＤＳ６２５０４と比較して合計発酵時間の少なくとも２０％の低減を実証した。株ＩＭＫ３１１（図１）は、２％のグルコースを約３０時間内で消費した。培養物中に依然として約１０ｍＭのグルコースが残り、アラビノース消費が観察された。アラビノースは、４８時間内に消費が完了した。ＩＭＫ３０７よりも緩慢であったが、ＩＭＫ３１１の全発酵時間はＤＳ６２５０４のそれよりも依然として短かった。
【０１９０】
嫌気的培養（図２）は、ＭＹ−ｇｌｃ中で生育させた振とうフラスコ培養物による植菌により約１の初期ＯＤ６６０において開始した。ＣＯ２生成プロファイルに基づき、株ＤＳ６４２０５がグルコースを１５時間未満内で完全に消費したことが推定することができた。グルコース消費の間の比生育速度は、０．２９ｈ−１であった。しかしながら、アラビノースは、かなり低い速度において消費された。８０時間後、アラビノースの約９０％が発酵ブロス中に依然として存在する。株ＩＭＫ３０７（ｈｘｋ２Δ）についてのグルコース消費はより緩慢であった。ＣＯ２生成プロファイルおよびグルコース計測の両方は、全てのグルコースが２０時間内に消費されることを示した。グルコース消費の間の比生育速度は、０．２０ｈ−１であった。アラビノース消費はグルコース枯渇時に開始し、アラビノースの９２％が６６時間内に消費され、それは株ＤＳ６２５０４と比較した場合に明白な改善である。ＨＸＫ２に加えてＨＸＫ１の欠失（株ＩＭＫ３１２）は、グルコース上での比生育速度に対して甚大な効果を有した。株ＩＭＫ３１２についての生育速度０．０５ｈ−１は、株ＩＭＫ３０７のそれよりも７５％低かった。グルコースは４６時間内に枯渇した。これらの４６時間内で、１３２ｍＭのアラビノースの合計の約１０％が消費された。アラビノースは、１１２時間未満内で完全に消費された。
【０１９１】
［実施例２］
［グルコースの存在下でアラビノース上で生育するＩＭＫ３１８の選択］
グルコース上での振とうフラスコ中の４５０時間の培養により、ヘキソキナーゼ／グルコキナーゼ欠失株ＩＭＫ３１８（ｈｘｋ１Δ  ｈｘｋ２Δ  ｇｌｋ１Δ）がグルコース単独上で生育し得ないことを確認した。したがって、この株をＹＰ−ＥｔＯＨ／Ｇｌｙｃ中で培養し、続いてグリセロールの添加後に−８０℃において貯蔵した。続いてＩＭＫ３１８を、２％のアラビノースを含有する１００ｍｌのＭＹ中で培養した。３日後、約１のＯＤ６６０において、２ｍｌの培養物を、２％のアラビノースを含有する１００ｍｌの新たなＭＹに植継ぎした。約１２日後、培養物のＯＤ６６０は＞５であり、試料を−８０℃においてグリセロールストックとして貯蔵した。株ＩＭＫ３１８は、３０℃においてＭＹ−ａｒａ中で数日間培養した。約５のＯＤ６６０において、２ｍｌの培養物を、２％のアラビノースを補給し、グルコース濃度が０、０．１１、０．２３、０．６５、１．３および２．５（ｗ／ｖ）％で変動する１００ｍｌのＭＹ尿素を含有する６つの別個の振とうフラスコに植継ぎした。これら６つの並行培養物の生育を、ＯＤ６６０計測により記録した（図３）。グルコースの存在下、生育が遅延することが観察された。グルコースの量の増加は、アラビノース上での次第に遅延する生育をもたらした。これらの並行培養物の２つ（系統Ａ、０．６５ｗ／ｖ％のグルコースにおいて開始；系統Ｂ、２．５ｗ／ｖ％のグルコースにおいて開始）を、表４に示される植継ぎスキームに従ってアラビノースおよびグルコースを補給した１００ｍｌのＭＹに継代した。
【０１９２】
【表４】
2013542724.tif 000005
【０１９３】
培養物を、増加濃度のグルコースを有する培地に植継ぎした系列Ａにおいて（表３）、アラビノースは完全に消費された一方、グルコースの１０％未満が消費された（図４）。ＳＦ７から、試料を、１００μｇ  ｍｌ−１のＧ４１８を補給した固体ＹＰ−ａｒａ上にスプレッドし、コロニーが現れるまで３０℃においてインキュベートした。別々のコロニーを固体ＹＰ−ａｒａに植継ぎした。単一コロニー単離物をＹＰ−ａｒａ中で培養し、−８０℃において貯蔵した。継代された振とうフラスコのこの系列の２つの単一コロニー単離物を試験し、混合培養物と質的に類似することが見出された。これらの単離物の１つを株ＩＭＷ０１８と命名した。
【０１９４】
系列Ｂ（表３）において、振とうフラスコ培養物を、２％のアラビノースおよび２％のグルコースの固定濃度を有するＭＹ培地中に植継ぎした（図５）。驚くべきことに、アラビノースおよびグルコースの同時消費は、第１の植継ぎ（ＳＦ１→ＳＦ２）後に観察された。ＳＦ３から、試料を、１００μｇ  ｍｌ−１のＧ４１８を補給した固体ＹＰ−ａｒａ上にスプレッドし、コロニーが現れるまで３０℃においてインキュベートした。別々のコロニーを固体ＹＰ−ａｒａに植継ぎした。単一コロニー単離物をＹＰ−ａｒａ中で培養し、グリセロールストックとして−８０℃において貯蔵した。継代された振とうフラスコのこの系列の２つの単一コロニー単離物を試験し、混合培養物と質的に類似することが見出された。これらの単離物の１つを株ＩＭＷ０１７と命名した。
【０１９５】
単一コロニー単離物株ＩＭＷ０１７およびＩＭＷ０１８の両方のグルコースおよびアラビノース消費を、振とうフラスコ培養物中で試験した（図４および５）。単一コロニー単離物は、それらが由来する継代された振とうフラスコ培養物に類似するグルコースおよびアラビノース濃度プロファイルを示した。興味深いことに、ヘキソキナーゼ／グルコキナーゼ欠失株ＩＭＫ３１８（ｈｘｋ１Δ  ｈｘｋ２Δ  ｇｌｋ１Δ）に基づくこの進化工学戦略において適用されたグルコース濃度レジームは、２つの異なる表現型をもたらした：（ｉ）株ＩＭＷ０１８によるグルコース非感受性アラビノース消費、および（ｉｉ）株ＩＭＷ０１７によるアラビノースおよびグルコースの同時消費。
【０１９６】
［実施例３］
［アラビノースおよびグルコースの嫌気的同時発酵］
株ＩＭＷ０１７を、連続バッチ発酵槽設定を使用してグルコースおよびアラビノースの混合物中で嫌気的に培養した。グルコース／アラビノース混合物中の３つの連続バッチを実施した（図６）。それぞれのバッチにおいて、グルコースおよびアラビノースは同時に消費され、エタノールに発酵された。ＣＯ２生成プロファイルから推定すると、グルコース／アラビノース混合物上での比生育速度が、第１のバッチにおける０．０５ｈ−１から第３のバッチにおける０．０７ｈ−１に増加することが観察された。
【０１９７】
さらなる連続バッチ発酵の間、生育速度はいっそうさらに増加する。最終バッチから採取された単一コロニー単離物株は、グルコースおよびアラビノース同時消費をＩＭＷ０１７と比較して増加した比消費速度において示す。
【０１９８】
［実施例４］
［ヘキソキナーゼ活性］
株ＤＳ６２５０４、ＩＭＫ３０７、ＩＭＫ３１２、ＩＭＫ３１８、ＩＭＷ０１７およびＩＭＷ０１８の細胞抽出物中のヘキソキナーゼ活性を測定する。ＩＭＫ３０７（ｈｘｋ２Δ）の細胞抽出物中のヘキソキナーゼ活性は、株ＤＳ６２５０４のそれよりも低い。ＩＭＫ３１２（ｈｘｋ２Δ  ｈｘｋ１Δ）のヘキソキナーゼ活性はＩＭＫ３０７のそれよりも低い一方、ＩＭＫ３１８（ｈｘｋ２Δ  ｈｘｋ１Δ  ｇｌｋ１Δ）は、ヘキソキナーゼ活性を示さず／最低のヘキソキナーゼ活性を示す。株ＩＭＷ０１８中のヘキソキナーゼ活性はＩＭＫ３１８について観察されるヘキソキナーゼ活性と類似する一方、ＩＭＷ０１７はＩＭＫ３１８よりも高いヘキソキナーゼ活性を有する。
【０１９９】
［実施例５］
［ＩＭＷ０１７における未知ヘキソキナーゼの同定］
進化させたｈｘｋｌ  ｈｘｋ２  ｇｌｋｌ株における計測されたヘキソキナーゼ活性に基づくと、ゲノム中に存在する糖キナーゼをコードする潜在性を有する別の遺伝子が活性になり、またはグルコースに対するその基質特異性を変えたことが予期される。この活性をコードする遺伝子をゲノム分析により同定する。この遺伝子の付加的欠失は、ヘキソキナーゼ活性の減少をもたらす。この四重ノックアウト株は、グルコースの存在下でのアラビノース消費の進化工学についてかなり強いプラットフォームを提供する。
【０２００】
［実施例６］
［ＩＭＫ３１８におけるヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼ活性の再導入］
グルコース上での生育を回復させるため、ＨＸＫ１、ＨＸＫ２またはＧＬＫ１のいずれかをＩＭＫ３１８中に再導入する。活性計測は、ＩＭＫ３１８におけるこれらの遺伝子の１つの再導入がヘキソ／グルコキナーゼ活性の増加をもたらすことを示す。単独の炭素源としてのグルコース上での生育が回復される。
【０２０１】
［実施例７］
［ＩＭＷ０１８におけるヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼ活性の再導入］
活性計測は、ＩＭＷ０１８におけるＨＸＫ１、ＨＸＫ２またはＧＬＫ１のいずれかの再導入が株ＩＭＷ０１８と比較してヘキソ／グルコキナーゼ活性の増加をもたらすことを示す。単独の炭素源としてのグルコース上での生育が回復される。ＨＸＫ１、ＨＸＫ２またはＧＬＫ１のいずれかの再導入は、単独の炭素源としてのグルコースおよびアラビノースの両方の上での生育をもたらす。得られた株は、グルコースおよびアラビノースの混合物中で生育し、グルコースおよびアラビノースの同時消費を示す。
【０２０２】
［実施例８］
［ＩＭＷ０１７およびＩＭＷ０１８のグルコース非感受性表現型の基礎をなす突然変異の同定］
株ＩＭＷ０１７およびＩＭＷ０１８のグルコース非感受性表現型は、グルコースおよびアラビノースを含有する培地中の株ＩＭＫ３１８の選択的生育の間に蓄積した突然変異により説明することができることが予測される。これらの突然変異を同定するため、株ＩＭＫ３１８、ＩＭＷ０１７およびＩＭＷ０１８のゲノムをシーケンシングする。ＩＭＷ０１７とＩＭＫ３１８およびＩＭＷ０１８とＩＭＫ３１８のゲノム配列を比較することにより、例えば単一ヌクレオチド多型などのゲノム改変を同定する。ＤＳ６２５０４におけるこれらの単一ヌクレオチド多型の導入は、アラビノース上での生育がグルコースに対して非感受性である表現型をもたらす。
【０２０３】
［実施例９］
［ＧＡＬ１の欠失］
ヘキソキナーゼ活性の維持を担うタンパク質を決定するための別のアプローチは、ｈｘｋ１  ｈｘｋ２  ｇｌｋ１株においてヘキソキナーゼ活性を潜在的にコードする遺伝子を欠失させることである。この目的のため、ＧＡＬ１遺伝子をｈｘｋ１  ｈｘｋ２  ｇｌｋ１株において欠失させる。得られた株は、親ｈｘｋ１  ｈｘｋ２  ｇｌｋ１株よりも低いヘキソキナーゼ活性を示し、または親ｈｘｋ１  ｈｘｋ２  ｇｌｋ１株と比較して単独の炭素源としてのグルコース上で生育する能力の減少を示す。この四重ノックアウト株は、グルコースの存在下でのアラビノース消費の進化工学についてかなり強いプラットフォームを提供する。
【０２０４】
［実施例１０］
［ＹＤＲ５１６ｃの欠失］
ヘキソキナーゼ活性の残留を担うタンパク質を決定するための別のアプローチは、ｈｘｋ１  ｈｘｋ２  ｇｌｋ１株においてヘキソキナーゼ活性を潜在的にコードする遺伝子を欠失させることである。この目的のため、ＹＤＲ５１６ｃ遺伝子をｈｘｋ１  ｈｘｋ２  ｇｌｋ１株において欠失させる。得られた株は、親ｈｘｋ１  ｈｘｋ２  ｇｌｋ１株よりも低いヘキソキナーゼ活性を示し、または親ｈｘｋ１  ｈｘｋ２  ｇｌｋ１株と比較して単独の炭素源としてのグルコース上で生育する能力の減少を示す。この四重ノックアウト株は、グルコースの存在下でのアラビノース消費の進化工学についてかなり強いプラットフォームを提供する。
【０２０５】
［実施例１１］
［ＹＬＲ４４６ｗの欠失］
ヘキソキナーゼ活性の残留を担うタンパク質を決定するための別のアプローチは、ｈｘｋ１  ｈｘｋ２  ｇｌｋ１株においてヘキソキナーゼ活性を潜在的にコードする遺伝子を欠失させることである。この目的のため、ＹＬＲ４４６ｗ遺伝子をｈｘｋ１  ｈｘｋ２  ｇｌｋ１株において欠失させる。得られた株は、親ｈｘｋ１  ｈｘｋ２  ｇｌｋ１株よりも低いヘキソキナーゼ活性を示し、または親ｈｘｋ１  ｈｘｋ２  ｇｌｋ１株と比較して単独の炭素源としてのグルコース上で生育する能力の減少を示す。この四重ノックアウト株は、グルコースの存在下でのアラビノース消費の進化工学についてかなり強いプラットフォームを提供する。
【０２０６】
［実施例１２］
［アラビノースおよびグルコースの嫌気的同時発酵］
株ＩＭＷ０１７のグルコースおよびアラビノースの同時消費を改善するため、株ＩＭＷ０１７を、２０ｇ／リットルのグルコースおよび２０ｇ／リットルのアラビノースの混合物を補給したＭＹ中で、連続バッチ発酵槽設定を使用して嫌気的に培養した。最初に、グルコース／アラビノース混合物中の４つの連続バッチを実施した。それぞれのバッチにおいて、グルコースおよびアラビノースは同時に消費され、エタノールに発酵された（図６、実施例３）。ＣＯ２生成プロファイルから推定すると、グルコース／アラビノース混合物上の比生育速度が、第１のバッチにおける０．０５ｈ−１から第４のバッチにおける０．０６ｈ−１に増加することが観察された。第４のバッチ後、連続バッチ培養をグルコースおよびアラビノースの混合物（バッチ番号６、７、９、１１、１３、１５、１７、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７および３９）またはアラビノース単独（バッチ番号５、８、１０、１２、１４、１６、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８および４０）の中で実施した。ＭＹ−アラビノースおよびＭＹ−グルコース／アラビノースそれぞれにおける１９および２１のバッチ後、嫌気的生育速度は単独の炭素源としてのアラビノース上で０．０９ｈ−１に増加し、グルコース／アラビノース混合物上で０．１０ｈ−１に増加した（図７）。個々のバッチ培養のＣＯ２生成プロファイルの比較は、反復バッチレジームがアラビノース単独またはグルコース／アラビノース混合物のいずれについても約１２０時間から約８０時間に発酵時間の減少をもたらしたことを示し、それぞれのバッチについて等しい初期植菌材料サイズが想定される（図８）。グルコース／アラビノース混合物中のバッチ培養について観察されたＣＯ２生成の単一ピークは、グルコースおよびアラビノースが連続的にではなく同時に消費されることを示す（図８および９）。
【０２０７】
［実施例１３］
［ヘキソキナーゼ活性］
株ＤＳ６２５０４、ＩＭＫ３０７、ＩＭＫ３１２、ＩＭＫ３１８、ＩＭＷ０１７およびＩＭＷ０１８のヘキソキナーゼ活性を、アラビノースを補給したＹＰ中で生育させた振とうフラスコ培養物の細胞抽出物において測定した。ヘキソキナーゼ反応混合物は、５０ｍＭのイミダゾール−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１ｍＭのＮＡＤＰ＋、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２Ｕのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、１０ｍｍのＤ−グルコースおよび細胞抽出物からなるものであった。反応は１ｍＭのＡＴＰの添加により開始し、ＮＡＤＰＨの形成は３４０ｎｍにおける反応混合物の吸光度を計測することにより測定した。株ＤＳ６２５０４およびＩＭＫ３０７（ｈｘｋ２Δ）の細胞抽出物におけるヘキソキナーゼ活性は、それぞれ１．２および１．３μｍｏｌ．ｍｉｎ−１．ｍｇ−１タンパク質であった（図１０）。ＩＭＫ３１２（ｈｘｋ２Δ  ｈｘｋ１Δ）の細胞抽出物における０．４μｍｏｌ．ｍｉｎ−１．ｍｇ−１タンパク質のヘキソキナーゼ活性は、ＩＭＫ３０７のそれよりも低かった。株ＩＭＫ３１８およびＩＭＷ０１８（ｈｘｋ２Δ  ｈｘｋ１Δ  ｇｌｋ１Δ）は、０．２μｍｏｌ．ｍｉｎ−１．ｍｇ−１タンパク質未満のヘキソキナーゼ活性を示した。三重のｈｘｋ２  ｈｘｋ１およびｇｌｋ１の欠失にかかわらずグルコースを消費し得る株ＩＭＷ０１７は、両方ともグルコースを消費し得ない株ＩＭＫ３１８およびＩＭＷ０１８と比較してより高いヘキソキナーゼ活性を有することが予期された。株ＩＭＷ０１７についてのヘキソキナーゼ活性は、アッセイ条件下で０．０２μｍｏｌ．ｍｉｎ−１．ｍｇ−１タンパク質未満でもあった。
【０２０８】
［実施例１４］
［ＩＭＷ０１７におけるヘキソキナーゼとしてのＧＡＬ１の同定］
グルコースおよびアラビノースの混合物上での進化させたｈｘｋ１Δ  ｈｘｋ２Δ  ｇｌｋ１Δ株ＩＭＷ０１７の生育実験に基づくと、ゲノム中に存在する糖キナーゼをコードする潜在性を有する別の遺伝子が活性になり、またはグルコースに対するその基質特異性を変えたことが予期された。未知のヘキソキナーゼ活性がＧＡＬ１によりコードされるか調査するため、ＧＡＬ１遺伝子をＩＭＷ０１７において欠失させた。ｐＳＨ６５（実施例１参照）を使用してｇｌｋ１遺伝子座からＫａｎＭＸカセットを除去した後、ＧＡＬ１欠失を、オリゴヌクレオチドＧＡＬ１−ＤｉｓＡおよびＧＡＬ１−ＤｉｓＢ（表５）を使用するＰＣＲにより増幅させたＧ４１８耐性カセットの統合により達成した。形質転換細胞は、１００μｇ  ｍｌ−のＧ４１８（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）ならびに炭素源としての１．５％（ｗ／ｖ）のエタノールおよび１．５％（ｗ／ｖ）のグリセロールを含有するＹＰ寒天上で選択した。ＫａｎＭＸカセットの正確な統合は、診断オリゴヌクレオチドＧＡＬ１−ＦＷ２／ＫａｎＡおよびＧＡＬ１−ＲＶ２／ＫａｎＢ（表４）の組合せを使用する単一コロニーに対するＰＣＲにより確認した。得られた株ＩＭＷ０２３におけるＧＡＬ１の欠失は、単独の炭素源としてのガラクトース上での生育不能により確認した。
【０２０９】
興味深いことに、ＩＭＷ０２３は、グルコースを炭素源として使用し得ず、それは、ＧＡＬ１がその親ｈｘｋ１Δ  ｈｘｋ２Δ  ｇｌｋ１Δ株ＩＭＷ０１７における未知のヘキソキナーゼ活性を担ったことを示す。グルコースおよびアラビノースの混合物中での振とうフラスコ培養の間、ＩＭＷ０２３はグルコースを消費しなかった一方、アラビノースは消費された（図１１）。
【０２１０】
【表５】
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【０２１１】
［実施例１５］
［グルコースの存在下でのアラビノースの嫌気的発酵について］
ＩＭＷ０１７におけるＧＡＬ１ｐもヘキソキナーゼ活性を示すことが見出されたため、ｈｘｋ１Δ  ｈｘｋ２Δ  ｇｌｋ１Δ  ｇａｌ１Δ株ＩＭＷ０２３は、進化工学によりグルコースを消費させずにグルコースの存在下でのアラビノース消費を改善するためのより堅実なプラットフォームを提供する。培地中のグルコースの存在下での改善されたアラビノース消費を選択するため、株ＩＭＷ０２３を、振とうフラスコ培養物中で、２％のアラビノースおよび２％のグルコースを補給したＭＹ培地中での継代により培養した。生育はＯＤ６６０計測によりモニタリングし、比生育速度は培養物当たり２または３つのいずれかのＯＤ６６０計測から推定した。グルコースおよびアラビノース濃度は、ＨＰＬＣ分析により測定した。６３日間におけるアラビノース／グルコース混合物上での２４代の継代後、株ＩＭＷ０２３の植継ぎされた培養物は、依然としてグルコースを消費せずに２％のグルコースの存在下でアラビノース上で生育し得た（図１２）。アラビノース上での比生育速度は、約０．０６ｈ−１から約０．１１ｈ−１に増加した（図１３）。
【０２１２】
嫌気的条件下でグルコースの存在下でアラビノースを消費し得る細胞を選択するため、およびグルコースの存在下でアラビノース消費をさらに改善するため、２％のアラビノースおよび２％のグルコースを補給したＭＹ培地中での株ＩＭＷ０２３の連続的植継ぎを嫌気的連続バッチ発酵設定中で継続した。このため、株ＩＭＷ０２３の継代された培養物の最終振とうフラスコ培養物（ＳＦ２４）を植菌材料として使用した。培養の最初の１０００時間において、発酵槽のヘッドスペースに窒素に代えて空気を補給した場合にＣＯ２生成の増加が観察されるにすぎなかった（図１４）。第４のバッチの間の培養の約１０００時間後、排ガス中のＣＯ２濃度の増加が観察された。ＣＯ２生成プロファイルから推定すると、嫌気的生育のこの第１のバッチは、約０．０３ｈ−１の比生育速度を示した。さらなる１０代の植継ぎ後、比生育速度は約０．０６ｈ−１に増加した（図１４）。連続的に植継ぎされたバッチ培養の間、アラビノースは消費された一方、グルコースは消費されなかった（図１５）。個々のバッチ培養のＣＯ２生成プロファイルは、ＣＯ２生成の速度、ひいてはアラビノース消費速度が連続的植継ぎの間に増加し、それはアラビノースを完全に消費するために必要とされる発酵時間の減少をもたらしたことを示す（図１６）。
【０２１３】
最終バッチから採取された単一コロニー単離物は、株ＩＭＷ０５８と命名し、ＩＭＷ０２３と比較してグルコースの存在下でアラビノース消費速度の増加を示した。
【０２１４】
［実施例１６］
［ＩＭＷ０１８におけるヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼ活性の再導入］
株ＩＭＷ０１８におけるＨＸＫ１、ＨＸＫ２またはＧＬＫ１のいずれかの再導入を、グルコース上での生育を回復させるために実施した。このため、ＨＸＫ２、ＨＸＫ１およびＧＬＫ１を、オリゴヌクレオチド組合せＨＸＫ２ＦＷ／ＨＸＫ２ＲＶ、ＨＸＫ１ＦＷ／ＨＸＫ１ＲＶおよびＧＬＫ１ＦＷ／ＧＬＫ１ＲＶを使用し、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮＰＫ１１３−７ＤのゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ生成物の精製後（（ＧｅｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｋｉｔ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＩＭＷ０１８の一晩培養物をこのＰＣＲ生成物により形質転換した（Ｇｉｅｔｚ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ  ２００２）。形質転換細胞は、２％のグルコースを含有するＭＹ寒天上のグルコース上での生育について選択した。相同性組換えによるＨＸＫ２、ＨＸＫ１およびＧＬＫ１のそれらの元の遺伝子座における正確な統合は、診断プライマーペア（表６）を使用する単一コロニーに対するＰＣＲにより確認した。
【０２１５】
得られた株ＩＭＷ０２４（ＨＸＫ２）、ＩＭＷ０２５（ＨＸＫ１）およびＩＭＷ０４７（ＧＬＫ１）を、振とうフラスコ中で３０℃において２％のグルコースおよび２％のアラビノースを補給したＭＹ−尿素培地（ｐＨ４．７）中で０．０５±０．０１の初期ＯＤ６６０で、グルコース上で生育させた予備培養物を使用して培養した。比較のため、株ＤＳ６２５０４、ＩＭＫ３０７およびＩＭＫ３１１を同一条件下で培養した。生育および糖消費は、６９時間モニタリングした。株ＩＭＷ０２４、ＩＭＷ０２５およびＩＭＷ０４７は、全てグルコースおよびアラビノースの両方を利用し得た（図１７）。ＩＭＷ０１８におけるＧＬＫ１の再導入（ＩＭＷ０４７）は、迅速なグルコースおよびアラビノース消費をもたらした。アラビノースおよびグルコースは、培養の４３時間内に消費が完了し、それはＩＭＫ３０７（ｈｘｋ２Δ）およびＩＭＫ３１１（ｈｘｋ１Δ  ｈｘｋ２Δ）について観察されたものと類似する。ＩＭＷ０２４（ＨＸＫ２）およびＩＭＷ０２５（ＨＸＫ１）について観察されたアラビノース消費は、両方ともＩＭＫ３０７およびＩＭＫ３１１について観察されたものよりも緩慢であるが、いかなるＨＸＫ／ＧＬＫ欠失も有さない親株ＤＳ６２５０４について観察されたものよりも迅速であった（図１７（ａ））。アラビノースおよびグルコースの同時消費は、株ＩＭＷ０４７についてのみ観察された（図１８）。グルコースが２２時間において枯渇される前、アラビノースの約７％が消費された。２５時間において、グルコースが完全に消費されたとき、アラビノースの１９％が利用された。
【０２１６】
【表６】
2013542724.tif 000007
【０２１７】
［実施例１７］
［ＩＭＷ０５８におけるヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼ活性の再導入］
株ＩＭＷ０５８におけるＨＸＫ１、ＨＸＫ２またはＧＬＫ１のいずれかの再導入を、グルコース上での生育を回復させるために実施した。このため、ＨＸＫ２、ＨＸＫ１およびＧＬＫ１を、オリゴヌクレオチド組合せＸＫ２ＦＷ／ＨＸＫ２ＲＶ、ＨＸＫ１ＦＷ／ＨＸＫ１ＲＶおよびＧＬＫ１ＦＷ／ＧＬＫ１ＲＶを使用し、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＣＥＮＰＫ１１３−７ＤのゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅させた。ＰＣＲ生成物の精製後（ＧｅｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｋｉｔ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＩＭＷ０５８の一晩培養物をこのＰＣＲ生成物により形質転換した（Ｇｉｅｔｚ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ  ２００２）。形質転換細胞は、２％のグルコースを含有するＭＹ寒天上のグルコース上での生育について選択した。相同性組換えによるＨＸＫ２、ＨＸＫ１およびＧＬＫ１のそれらの元の遺伝子座における正確な統合は、診断オリゴヌクレオチド（表５）を使用する単一コロニーに対するＰＣＲにより確認した。
【０２１８】
得られた株ＩＭＷ０５９（ＨＸＫ２）、ＩＭＷ０６０（ＨＸＫ１）およびＩＭＷ０６１（ＧＬＫ１）を、振とうフラスコ中で３０℃において２％のグルコースおよび２％のアラビノースを補給したＭＹ−尿素培地（ｐＨ４．７）中で０．０５±０．０１の初期ＯＤ６６０で、グルコース上で生育させた予備培養物を使用して培養した。生育および糖消費は、７２時間モニタリングした。株ＩＭＷ０５９、ＩＭＷ０６０およびＩＭＷ０６１は、全てグルコースおよびアラビノースの両方を利用し得た（図１７）。ＩＭＷ０５８におけるＨＸＫ２の再導入は、アラビノースおよびグルコースの迅速な連続的消費をもたらした。参照株ＤＳ６２５０４は６９時間内にアラビノースを完全に消費しなかった一方（図１７（ａ））、株ＩＭＷ０５９はアラビノースの９９％超を約４６時間内に消費した（図１７（ｊ））。
【０２１９】
株ＩＭＷ０６０（ＨＸＫ１）およびＩＭＷ０６１（ＧＬＫ１）について、グルコースおよびアラビノースの同時消費が観察された（図１７（ｋ）および（ｌ））。培養の最初の２２時間において、アラビノースの約１８％がグルコースの約４８％と一緒に同時消費された。培養の５０時間内に、アラビノースの９９％が消費された。
【０２２０】
［実施例１８］
［株ＩＭＫ３１８、ＩＭＷ０１７およびＩＭＷ０１８の比較全ゲノムシーケンシング］
株ＩＭＫ３１８、ＩＭＷ０１７およびＩＭＷ０１８についての全ゲノムＤＮＡシーケンシングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＧＡＩＩｘ技術（７５ｂｐのリード、ペアエンド）を使用して実施した。シーケンスリードは、ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈバージョン４．５を使用してＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄの参照ゲノム配列にアラインした。ＳＮＰ分析は、ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈバージョン４．５を使用して実施した。
【０２２１】
全体で、ＳＮＰ分析は、ＩＭＫ３１８、ＩＭＷ０１７およびＩＭＷ０１８をＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄの参照配列と比較した場合にアミノ酸変化をもたらすコード領域中の４つの突然変異を生じた。
【０２２２】
ガラクトキナーゼをコードするＧＡＬ１中のＡｓｐ３７６Ｖａｌアミノ酸変化をもたらす１つの突然変異。この突然変異は、参照配列と比較した場合にＩＭＫ３１８、ＩＭＷ０１７およびＩＭＷ０１８に見出された（図１９）。
【０２２３】
驚くべきことに、ＩＭＷ０１７について２つの特有の突然変異のみが見出された。それらの一方は、ＧＡＬ１中のＴｙｒ２７４Ｐｈｅ突然変異であり、Ｔｈｏｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）により記載されたガラクトキナーゼのガラクトース結合部位中に局在する。ＩＭＷ０１７におけるＧＡＬ１の欠失がグルコース上での生育を排除する観察と組み合わせると、この突然変異はＩＭＷ０１７におけるグルコース消費を可能とするＧＡＬ１のヘキソキナーゼ活性を担った可能性が高いと考えられる。第２の突然変異は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるガラクトースパーミアーゼをコードするＧＡＬ２の膜貫通モチーフ５に見出された（Ｔｈｒ２１９Ａｓｎ）。ＧＡＬ２ｐは、アラビノースを輸送し得ることが公知である（Ｋｏｕ  ｅｔ．ａｌ  １９７０；Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。アラビノースについての親和性を増加させ、またはグルコースについての親和性を減少させるＧＡＬ２における突然変異は、グルコースの存在下でのアラビノース消費の改善をもたらす。
【０２２４】
驚くべきことに、１つの特有の突然変異のみがＩＭＷ０１８のコード領域に見出された。この突然変異は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるガラクトースパーミアーゼをコードするＧＡＬ２の膜貫通モチーフ８中に局在した（Ａｓｎ３７６Ｓｅｒ）。ＧＡＬ２ｐは、アラビノースを輸送し得ることが公知である（Ｋｏｕ  ｅｔ．  ａｌ  １９７０；Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。アラビノースについての親和性を増加させ、またはグルコースについての親和性を減少させるＧＡＬ２における突然変異は、グルコースの存在下でのアラビノース消費の改善をもたらす。
【０２２５】
［実施例１９］
［ＩＭＷ０５９によるグルコースおよびアラビノースの迅速な嫌気的発酵］
株ＩＭＷ０５９を、２０ｇｌ−１のグルコースおよび２０ｇｌ−１のアラビノースを有するＭＹ培地中で嫌気的に培養した。糖消費は、ＨＰＬＣ計測によりモニタリングした。酵母の生育は、乾燥重量計測およびＯＤ６６０のモニタリングにより測定した。ＣＯ２生成は、排ガス中のＣＯ２濃度の計測により測定した。エタノール生成は、ＣＯ２生成に基づき算出した。エタノール蒸発を補正するため、生成されたエタノールの量は、ＣＯ２の計測された累積生成から、バイオマス合成に起因して生じたＣＯ２生成（１グラムのバイオマス当たり５．８５ｍｍｏｌのＣＯ２）および酢酸形成に伴うＣＯ２を差し引いたものに等しいと想定した。
【０２２６】
１９時間内に、グルコースは枯渇した。ＣＯ２生成プロファイルおよびアラビノース濃度（図２１）に基づくと、アラビノース消費はグルコースが完全に消費された後に開始した。グルコースおよびアラビノースの同時消費は観察されなかった。嫌気的培養の７４時間後、アラビノースの９９％が消費された。エタノールは、全糖１グラム当たり０．４３ｇの全体収率で生成された。このＣＯ２生成プロファイルとＤＳ６２５０４株のそれとの比較（図２４）は、グルコース／アラビノース混合物の嫌気的発酵の間の第１のＣＯ２生成ピークに基づき、グルコース消費が株ＩＭＷ０５９について緩慢であることを示す。しかしながら、アラビノースは、ＩＭＷ０５９によりかなり迅速に消費され、それは第２のＣＯ２生成ピークの間のより高いＣＯ２生成レベルおよびより短い合計発酵時間により反映される。
【０２２７】
［実施例２０］
［ＩＭＷ０６０によるグルコースおよびアラビノースの嫌気的同時消費］
株ＩＭＷ０６０を、２０ｇ  ｌ−１のグルコースおよび２０ｇ  ｌ−１のアラビノースを有するＭＹ培地中で嫌気的に培養した。糖消費は、ＨＰＬＣ計測によりモニタリングした。酵母の生育は、乾燥重量計測およびＯＤ６６０のモニタリングにより測定した。ＣＯ２生成は、排ガス中のＣＯ２濃度の計測により測定した。エタノール生成は、ＣＯ２生成に基づき算出した。エタノール蒸発を補正するため、生成されたエタノールの量は、ＣＯ２の計測された累積生成から、バイオマス合成に起因して生じたＣＯ２生成（１グラムのバイオマス当たり５．８５ｍｍｏｌのＣＯ２）および酢酸形成に伴うＣＯ２を差し引いたものに等しいと想定した。
【０２２８】
ＣＯ２生成プロファイルならびにグルコースおよびアラビノース濃度（図２２）に基づくと、アラビノースは最初の約４０時間内にグルコースと同時に消費された。最初の４３時間内に、グルコースは完全に消費される一方、アラビノースの４１％が消費された。嫌気的培養の７４時間後、アラビノースの８９％が消費された。嫌気的培養の１４０時間後、アラビノースの９８％が消費された。エタノールは、全糖１グラム当たり０．４３ｇの全体収率で生成された。このＣＯ２生成プロファイルとＤＳ６２５０４株のそれとの比較（図２４）は、グルコース／アラビノース混合物の嫌気的発酵の間の第１のＣＯ２生成ピークに基づき、グルコース消費が株ＩＭＷ０６０について緩慢であることを示す。しかしながら、グルコース／アラビノース混合物を発酵させるための合計時間は、ＤＳ６２５０４のそれよりも短い。
【０２２９】
［実施例２１］
［ＩＭＷ０６１によるグルコースおよびアラビノースの嫌気的同時消費］
株ＩＭＷ０６１を、２０ｇ  ｌ−１のグルコースおよび２０ｇ  ｌ−１のアラビノースを有するＭＹ培地中で嫌気的に培養した。糖消費は、ＨＰＬＣ計測によりモニタリングした。酵母の生育は、乾燥重量計測およびＯＤ６６０のモニタリングにより測定した。ＣＯ２生成は、排ガス中のＣＯ２濃度の計測により測定した。エタノール生成は、ＣＯ２生成に基づき算出した。エタノール蒸発を補正するため、生成されたエタノールの量は、ＣＯ２の計測された累積生成から、バイオマス合成に起因して生じたＣＯ２生成（１グラムのバイオマス当たり５．８５ｍｍｏｌのＣＯ２）および酢酸形成に伴うＣＯ２を差し引いたものに等しいと想定した。
【０２３０】
ＣＯ２生成プロファイルならびにグルコースおよびアラビノース濃度（図２３）に基づくと、アラビノースは最初の４３時間内にグルコースと同時に消費された。最初の４９時間内に、グルコースは完全に消費される一方、アラビノースの７３％が消費された。嫌気的培養の７４時間後、アラビノースの９５％が消費された。嫌気的培養の１４０時間後、アラビノースの９９％が消費された。エタノールは、全糖１グラム当たり０．４４ｇの全体収率で生成された。このＣＯ２生成プロファイルとＤＳ６２５０４株のそれとの比較（図２４）は、グルコース／アラビノース混合物の嫌気的発酵の間の第１のＣＯ２生成ピークに基づき、グルコース消費が株ＩＭＷ０６１について緩慢であることを示す。しかしながら、グルコース／アラビノース混合物を発酵させるための合計時間は、ＤＳ６２５０４のそれよりも短い。
【０２３１】
［ＢＡＭにおける性能試験］
株ＩＭＷ０６０およびＩＭＷ０６１の性能を試験するため、株を、２％のグルコースを補給したＶｅｒｄｕｙｎ培地において植菌した。対照として、株ＤＳ６２５０４を含めた。
【０２３２】
ロータリーシェーカー中で３０℃および２８０ｒｐｍにおいて一晩インキュベートした後、細胞を遠心分離により収集し、ＣＯ２生成のための培養をＢＡＭ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍｏｎｉｔｏｒ）中で３３℃において、表７に示される糖を補給した１００ｍｌのＶｅｒｄｕｙｎ培地中で実施した。細胞を、糖ならびに阻害剤の酢酸、クマル酸、フェルラ酸、フルフラール、ＨＭＦおよびギ酸を示された濃度において補給した１００ｍｌのＶｅｒｄｕｙｎ培地に添加した。第２の実験において、糖を補給したが阻害剤を使用しない１００ｍｌのＶｅｒｄｕｙｎ培地を使用した。ＣＯ２生成は常にモニタリングし、試料は分析（６００ｎｍにおける光学密度、エタノール、および残留糖）のために周期的に採取した。
【０２３３】
ＢＡＭ実験の結果を、阻害剤を有する培地については図２５、２６、および２７に示し、阻害剤を有さない培地については図２８、２９および３０に示す。ＩＭＷ０６０およびＩＭＷ０６１は両方とも、糖グルコースおよびアラビノースを迅速に同時にエタノールに変換し得る一方、株ＤＳ６２５０４は変換し得ず、すなわちＤＳ６２５０４は、グルコースが培地から排出された後にアラビノースを消費すると結論づけることができる。同一の結果、すなわちアラビノースおよびグルコースの同時消費は、阻害剤の存在下で得られるが、文献から公知のとおり全ての糖を消費させるためにかかる時間が阻害剤の存在下においてより緩慢である。
【０２３４】
【表７】
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【０２３５】
［１］    Ａ．Ａ．  Ａｎｄｒｅａｓｅｎ，  Ｔ．Ｊ．  Ｓｔｉｅｒ，  Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．  Ｉ．  Ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ａ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ４１  （１９５３）  ２３−３６．
［２］    Ａ．Ａ．  Ａｎｄｒｅａｓｅｎ，  Ｔ．Ｊ．  Ｓｔｉｅｒ，  Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．  ＩＩ．  Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ａ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ４３  （１９５４）  ２７１−２８１．
［３］    Ｒ．Ｄ．  Ｇｉｅｔｚ，  Ｒ．Ａ．  Ｗｏｏｄｓ，  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ  ｂｙ  ｌｉｔｈｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ／ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｃａｒｒｉｅｒ  ＤＮＡ／ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｍｅｔｈｏｄ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ３５０  （２００２）  ８７−９６．
［４］    Ｕ．  Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒ，  Ｓ．  Ｈｅｃｋ，  Ｔ．  Ｆｉｅｄｌｅｒ，  Ｊ．  Ｂｅｉｎｈａｕｅｒ，  Ｊ．Ｈ．  Ｈｅｇｅｍａｎｎ，  Ａ  ｎｅｗ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｆｏｒ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｂｕｄｄｉｎｇ  ｙｅａｓｔ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２４  （１９９６）  ２５１９−２５２４．
［５］    Ｕ．  Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒ，  Ｊ．  Ｈｅｉｎｉｓｃｈ，  Ｇ．Ｊ．  Ｋｏｅｈｌｅｒ，  Ｄ．  Ｖｏｓｓ，  Ｊ．Ｈ．  Ｈｅｇｅｍａｎｎ，  Ａ  ｓｅｃｏｎｄ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｌｏｘＰ  ｍａｒｋｅｒ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｇｅｎｅ  ｋｎｏｃｋｏｕｔｓ  ｉｎ  ｂｕｄｄｉｎｇ  ｙｅａｓｔ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０（６）  （２００２）  ｅ２３．
［６］    Ｈ．  Ｖａｎ  Ｕｒｋ，  Ｐ．Ｒ．  Ｍａｋ，  Ｗ．Ａ．  Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓ，  Ｊ．Ｐ．  Ｖａｎ  Ｄｉｊｋｅｎ，  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＢＳ  ８０６６  ａｎｄ  Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ  ＣＢＳ  ６２１  ｕｐｏｎ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｅｘｃｅｓｓ，  Ｙｅａｓｔ  ４  （１９８８）  ２８３−２９１．
［７］    Ｃ．  Ｖｅｒｄｕｙｎ，  Ｅ．  Ｐｏｓｔｍａ，  Ｗ．Ａ．  Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓ，  Ｊ．Ｐ．  Ｖａｎ  Ｄｉｊｋｅｎ，  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｏｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｆｌｕｘｅｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔｓ：  ａ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ−ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，  Ｙｅａｓｔ  ８  （１９９２）  ５０１−５１７．
［８］    Ｒ．Ａ．  Ｗｅｕｓｔｈｕｉｓ，  Ｗ．  Ｖｉｓｓｅｒ，  Ｊ．Ｔ．  Ｐｒｏｎｋ，  Ｗ．Ａ．  Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓ，  Ｊ．Ｐ．  Ｖａｎ  Ｄｉｊｋｅｎ，  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｏｘｙｇｅｎ  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｓｕｇａｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｙｅａｓｔｓ  −  ａ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ−ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｋｌｕｙｖｅｒ  ｅｆｆｅｃｔ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４０  （１９９４）  ７０３−７１５．
［９］    Ｓ．Ｃ．  Ｋｏｕ，    ｅｔ  ａｌ．  （１９７０）．  Ｊ．  Ｂａｃｔ．  １０２，  ６７１−６７８．
［１０］    Ｊ．  Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６９，  ４１４４−４１５０．
［１１］    Ｊ．Ｂ．  Ｔｈｏｄｅｎｅｔ  ａｌ．  （２００５）．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８０，  ３６９０５−３６９１１
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2013542724.tif 000040
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