(57)【要約】  本発明は、間質性肺疾患を処置するための方法を提供し、該方法は、個体に有効量の第XII凝固因子の阻害剤を投与することを含む。本発明はさらに、使用及びその処置のための医薬キットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維増殖性間質性肺疾患を処置及び／又は予防するための、第ＸＩＩ因子及び／又は第ＸＩＩａ因子（ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ）の細胞活性の非内在性阻害剤。
【請求項２】
第ＸＩＩａ因子の触媒活性を阻害できる化合物である、請求項１に記載の阻害剤。
【請求項３】
細胞における第ＸＩＩ因子の発現を低減できるか又は消失させ得る化合物である、請求項１に記載の阻害剤。
【請求項４】
第ＸＩＩ因子の第ＸＩＩａへの変換を阻害できる化合物である、請求項１に記載の阻害剤。
【請求項５】
セリンプロテアーゼ阻害剤である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項６】
（ｉ）  野生型インフェスチン（Ｉｎｆｅｓｔｉｎ）−４ポリペプチド配列（配列番号３３）、又はその変異体［ここで、変異体は
（ａ）野生型インフェスチン−４配列のＮ末端アミノ酸２〜１３、及び野生型インフェスチン−４配列との差を生じる、該Ｎ末端アミノ酸の外側での少なくとも１つでかつ最大で５つまでのアミノ酸変異；及び／又は
（ｂ）  野生型インフェスチン−４配列からの６つの保存されたシステイン残基、及び野生型インフェスチン−４配列に対する少なくとも７０％の相同性
を含む］；
（ｉｉ）野生型インフェスチン−４配列のＮ末端アミノ酸２〜１３を含むように変異されたＳＰＩＮＫ−１（配列番号２９）、又は該変異されたＳＰＩＮＫ−１の変異体［ここで、変異体は
ａ）野生型インフェスチン−４配列のＮ末端アミノ酸２〜１３；及び野生型ＳＰＩＮＫ−１配列との差を生じ、かつ野生型インフェスチン−４配列に対する変異体の相同性を増加させる、該Ｎ末端アミノ酸の外側での少なくとも１つでかつ最大で５つまでのアミノ酸変異；及び／又は
ｂ）野生型ＳＰＩＮＫ−１配列からの６つの保存されたシステイン残基、及び野生型ＳＰＩＮＫ−１配列に対する少なくとも７０％の相同性
を含む］；
（ｉｉｉ）ＳＰＩＮＫ  Ｋ１、Ｋ２又はＫ３（配列番号３０、３１、又は３２）；
（ｉｖ）  アプロチニン、トウモロコシトリプシンインヒビター（ＣＴＩ）、ウシ膵臓トリプシンインヒビターの変異体、及びＰｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−クロロメチル−ケトン（ＰＣＫ）；
（ｖ）前記ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａに結合することができる抗体；
からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項７】
半減期増大ポリペプチドに連結されている、請求項６に記載の阻害剤であって、ここで該半減期増大ペプチドは場合によりアルブミン、アファミン、アルファ−フェトプロテイン又はビタミンＤ結合タンパク質、ヒトアルブミン、又はその変異体、免疫グロブリン又はその変異体、ＩｇＧのＦｃである、阻害剤。
【請求項８】
半減期増大ポリペプチドがリンカーを介してＦＸＩＩ阻害剤に連結される、請求項７に記載の阻害剤。
【請求項９】
リンカーが、
（ｉ）切断可能である；
（ｉｉ）内因系、外因系、又は共通の凝固経路の凝固プロテアーゼにより切断可能である；
（ｉｉｉ）ＦＸｌｌａにより切断可能である、
請求項８に記載の阻害剤。
【請求項１０】
前記線維増殖性間質性肺疾患が肺線維症である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項１１】
前記肺線維症が特発性肺線維症である、請求項１０に記載の阻害剤。
【請求項１２】
前記処置が、コルチコステロイド薬、ピルフェニドン、アザチオプリン、シクロホスファミド、アセチルシステイン、抗繊維化薬の投与及び／又は酸素療法を含む第二の療法との組み合わせ処置を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項１３】
線維増殖性間質性肺疾患を処置及び／又は予防する方法であって、個体に薬学的に有効な量のＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａの細胞活性の非内在性阻害剤を投与することを含む、上記方法。
【請求項１４】
線維増殖性間質性肺疾患に罹患した患者の生存期間を延長する方法であって、該患者に薬学的に有効な量のＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａの細胞活性の非内在性阻害剤を投与することを含む、上記方法。
【請求項１５】
線維増殖性間質性肺疾患が特発性肺線維症である、請求項１３又は１４に記載の阻害剤の使用方法。
【請求項１６】
ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａの細胞活性の非内在性阻害剤、並びに線維増殖性間質性肺疾患を処置及び／又は予防するためのさらなる薬物を含む、間質性肺疾患を処置するための医薬キット。
【請求項１７】
線維増殖性間質性肺疾患を処置及び／又は予防するためのさらなる薬物が、コルチコステロイド薬、アザチオプリン、ピルフェニドン、シクロホスファミド、アセチルシステイン、及び抗繊維化薬からなる群より選択される、請求項１６に記載の医薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特発性肺線維症のような線維増殖性間質性肺疾患を処置及び／又は予防するための、第XII因子及び／又は第XIIa因子の細胞活性の非内因系阻害剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
びまん性実質性肺疾患(DPLD)としても知られる間質性肺疾患(ILD)は、間質(肺胞周囲の組織及び空間)を冒す肺疾患の群を指す。これは、肺胞上皮、肺毛細血管内皮、基底膜、血管周囲組織及びリンパ周囲組織に関係する。特発性肺線維症(IPF)は、肺に限定された未知の原因の、そして通常型間質性肺炎(UIP)の組織学的パターンを伴う、慢性繊維化間質性肺炎の独特の型として定義される。IPF肺は、構造的破壊、蜂巣状の密な瘢痕及び散在した線維芽細胞病巣(集中的な線維芽細胞増殖の領域)を特徴とする。IPFは、生存期間中央値が診断後２〜３年の進行性で通常は致死的な経過を有する。IPF患者は通常50〜70歳であり、そして発生率は１年につき女性100,000人あたり7.4症例であり、そして男性100,000人あたり10.7症例である。発生率、有病率及び死亡は年齢と共に増加する。これまでに、大部分の治療方針は、炎症性要素の排除又は抑制に基づいていた。IPF処置において有効であると証明された薬理療法はなかった。IPFにおける全ての現在利用可能な治験は、疾患の原因の明瞭な理解がないことにより大幅に制限されている。IPFの病因の元々の仮説は、未知の病原因子に応じた慢性炎症(特発性）が組織破壊、創傷治癒反応の開始及び伝播をもたらし、その後進行性の線維症に至るということである。最近の提案は、炎症は繊維症プロセスの開始に必要であるが、疾患の進行において果たす役割は小さいということを示す。サルコイドーシス及び過敏性肺炎のような慢性間質性肺疾患の他の形態と対照的に、IPFは限定された炎症のみを特徴とする。
【０００３】
近年、IPFが主に肺胞上皮損傷、異常な肺胞損傷修復及びリモデリングの障害であるということが示された。
【０００４】
形質転換増殖因子−β1(TGF−β1)は、高度に多面的なサイトカインであり、これは創傷治癒、胚発生並びに炎症及び増殖に関連する疾患状態、例えば組織線維症において基本的役割を果たす。成体マウスにおいて、肺におけるTGF−β過剰発現は進行性肺線維症を生じる。TGF−βは、肺胞上皮細胞増殖の抑制、線維芽細胞増殖の刺激、上皮細胞を含む常在肺細胞の活性化（これらはコラーゲン産生筋線維芽細胞に分化する）に主に起因して、肺における線維症応答を促進すると考えられている。TGF−β1は細胞外マトリックス成分の合成を増強し、そして分解を阻害する。さらに、最近の研究は、TGF−β1が凝固促進（procoagulant）活性及び繊維素溶解活性を調節することにより線維症状態に寄与し得るといことを示した。特に、TGF−β1は外因性凝固経路の鍵となるイニシエーターである組織因子、及び線維芽細胞を含む様々な細胞集団におけるプラスミノゲン活性化因子阻害剤(PAI)−1の発現を上方調節することが示されている。
【０００５】
TGF−β1に対する細胞応答は、II型TGF−β受容体(TβR−II)へのリガンド結合を含み、これがI型TGF−β受容体(TβR−I)をリン酸化する。活性化TβR−Iは、受容体に結合したSmad(Smad1、2、3、5、及び8)をリン酸化し、それらの共通メディエータSmad(Smad4)とのヘテロ二量化及び細胞質から核への移行を促進する。核内で、このSmadヘテロ複合体は標的遺伝子の標準（canonical）smad結合エレメント(SBE)と相互作用して、それらの転写を活性化する。ヒトSmad3及びSmad4はCAGA boxを含むSBEに結合することが示されている。
【０００６】
肺胞止血バランス（haemostatic balance）の変更及び肺胞内フィブリンの過剰沈着がIPF患者の肺において観察されている。これらの状態下で観察される肺胞内フィブリン蓄積は、肺胞腔中への血漿タンパク質（フィブリノゲンを含む）の漏出と併せて、局所的に産生された凝固促進因子と抗凝固因子との間の不均衡から生じる。IPF患者の気管支肺胞洗浄(BAL)液における増加した凝固促進活性は、減少した繊維素溶解活性を伴う。肺胞腔における止血バランスの同じ変更が肺線維症のブレオマイシン動物モデルにおいて観察された。臨床及び実験的な肺線維症において、凝固促進反応は、主に第VIIa因子と関連する組織因子(TF)に起因するが、一方減少した繊維素溶解活性は、プラスミノゲン活性化因子阻害剤(PAI)−1によるウロキナーゼ型(u−PA)及び組織型(t−PA)プラスミノゲン活性化因子の阻害、さらにはα2−プラスミン阻害剤によるプラスミンの遮断に起因する。フィブリンは修復プロセス及び通常の創傷治癒に必要であるが、血管外フィブリンの持続した過度の沈着はいくつかの様式で線維性肺疾患の病理機序に寄与すると考えられている。フィブリンは繊維化促進（profibrotic）増殖因子の貯蔵所として役立ち得る。これは、低い肺胞表面張力を維持するために欠かせない肺リポタンパク質複合体である肺サーファクタントを取り込んで不活化する。サーファクタントの機能不全は無気肺及び肺コンプライアンスの損失をもたらす。さらに、フィブリンによる隣接肺胞壁の「接着」と併せたサーファクタント系の不活化は、線維芽細胞が増殖してコラーゲンを産生する仮のマトリックスを生じると考えられている。
【０００７】
さらに、u−PA／PAI−1系は、細胞遊走、細胞接着及び細胞増殖の調節により肺線維症の発生に寄与し得る。さらに、様々な凝固プロテアーゼ、例えばトロンビン、第Xa因子及びTF／第VIIa因子複合体は、肺における線維症プロセスにも寄与し得る細胞活性を示す。これらの機能の大部分は、プロテアーゼ活性化受容体(PAR)のタンパク質分解活性により媒介される。例えば、トロンビン及び第Xa因子は、 線維芽細胞増殖及びプロコラーゲン産生をPAR−1依存性の様式で刺激する。さらにトロンビンは、正常肺線維芽細胞のPAR−1活性化を介した筋線維芽細胞への分化を誘導する。さらに、トロンビン、第Xa因子及びTF／第VIIa因子複合体によるPAR−1の活性化は、繊維化促進及び炎症促進サイトカインの発現を増大し得る。肺線維症におけるPAR−1の潜在的な役割は、PAR−1欠損マウスがブレオマイシン誘導肺線維症に対して保護されるということを実証した最近の知見により強調される。肺線維症の発生における止血因子により媒介される細胞作用の重要性の根拠になるさらなる証拠は、フィブリノゲン欠損マウスにおいてブレオマイシン誘導肺線維症に対する保護がないことを示した最近の知見に由来する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要旨
本発明者らは驚くべきことに、第XII因子(FXII)が実験的に誘導された肺損傷の線維化期の間に役割を果たすということを見出した。さらに、肺線維芽細胞増殖のFXII依存性誘導は、ERK1／2経路の薬理的遮断及びFXIIaの特異的阻害により減弱されるということが観察された。
【０００９】
これらの結果は、肺線維症の病理においてFXII／FXIIaを中心的位置に据えた。それ故、FXII活性化又はFXIIa活性を妨害及び遮断することができる物質は、肺における繊維化プロセス及びその臨床的結果を遮断するように適合され得、すなわち、このような物質は、FXII／FXIIaの細胞活性を特異的に阻害することにより肺の線維形成性（fibroplast）増殖を制限するために適切であり得る。
【００１０】
第一の局面において、本発明は、特発性肺線維症のような線維増殖性間質性肺疾患の処置及び／又は予防のための、第XII因子及び／又は第XIIa因子(FXII／FXIIa)の細胞活性の非内因系阻害剤に関する。
【００１１】
本発明の第二の局面は、特発性肺線維症のような線維増殖性間質性肺疾患を処置及び／又は予防する方法であり、該方法は、個体に薬学的に有効な量の、FXII及び／又はFXIIaの細胞活性の非内因系阻害剤を投与することを含む。
【００１２】
本発明の特別な局面において、処置は、間質性肺疾患を処置するための第二の治療剤又は治療原理との組み合わせ処置を含む。上記第二の治療原理は、酸素療法療法であり得る。間質性肺疾患の処置のための上記第二の治療剤は、コルチコステロイド薬、アザチオプリン、ピルフェニドン、シクロホスファミド、アセチルシステイン、及び／又は抗繊維化薬（anti−fibrotics）であり得る。
【００１３】
本発明のさらなる局面は、線維増殖性間質性肺疾患に罹患した患者の生存期間を延長する方法であって、該方法は、該患者に薬学的に有効な量のFXII／FXIIaの細胞活性の非内因系阻害剤を投与することを含む。
【００１４】
本発明のさらに別の局面は、特発性肺線維症のような線維増殖性間質性肺疾患に関連する症状を低減させる方法であって、該方法は、薬学的に有効な量のFXII及び／又はFXIIaの細胞活性の非内因系阻害剤を患者に投与することを含む。
【００１５】
本発明のさらに別の局面は、特発性肺線維症のような線維増殖性間質性肺疾患を処置及び／又は予防するための医薬キットであり、該キットは、(1) FXII及び／又はFXIIaの細胞活性の非内因系阻害剤、並びに(2) 間質性肺疾患を処置するためのさらなる薬物を含む。上記さらなる薬物は、コルチコステロイド薬、アザチオプリン、ピルフェニドン、シクロホスファミド、アセチルシステイン、及び抗繊維化薬からなる群から選択され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】FXII、FXI及びHMWKのmRNAレベルはIPF患者の肺において上昇する。(A) FXII、FXI及びHMWK mRNAの発現を、ドナー及びIPF肺組織ホモジネート(LH)、さらにはドナー(n＝10)及びIPF(n＝10)肺から単離された肺線維芽細胞及び肺胞上皮II型細胞(AT II)においてRT−PCRにより評価した。ドナーサンプルについて得られた値に対してIPF検体におけるmRNA発現(β−アクチン発現に対して正規化)が何倍増加したか（fold−increase）を示す。(B) IPF肺の健常(H)及び線維化(F)領域におけるFXII、FXI及びHMWKの発現。ドナーサンプルについて得られた値(C)に対してIPF検体におけるmRNA発現(β−アクチン発現に対して正規化)が何倍増加したかを示す。結果を平均値±標準誤差（s.e.m.）、*p＜0.05；スチューデントt−検定。ND；不検出。
【図２】FXII、FXI及びHMWKのタンパク質レベルはIPF患者の肺ホモジネートにおいて増加する。(A)ドナー及びIPF患者の肺ホモジネートにおけるFXII、FXI及びHMWKの発現を示す代表的な免疫ブロット。β−アクチンはローディングコントロールとして役立つ。(B)発色性基質を使用するFXII活性アッセイ(B)。トウモロコシトリプシンインヒビターをFXII活性を特異的に遮断するために使用した。 結果は10人のドナー及び10人のIPF患者からのものである。データを箱ヒゲ図で示し、ここで各箱内の水平の線は中央値を表し、各箱の境界は四分位範囲を表し、そしてヒゲは最大値及び最小値を表す。マンホイットニー検定により統計学的有意性について試験した。有意性レベルを示す。
【図３】ドナー及びIPF患者の肺組織におけるFXII、FXI及びHMWKの発現及び局在。免疫組織化学染色をドナー及びIPF患者から得られたパラフィン肺組織切片に対して行った。グループあたり５つからの１つの代表的なIPF患者及び１つのコントロールを示す。バーサイズを示す。
【図４】FXII、FXI及びHMWKのmRNAレベルはブレオマイシン処理マウスの肺において上昇する。コントロール及びブレオマイシン肺ホモジネート、さらにはコントロール(n＝10)及びブレオマイシンチャレンジ(n＝10)マウスの肺から単離された肺線維芽細胞及び肺胞上皮II型細胞(AT II)におけるFXII、FXI及びHMWK発現の定量的RT−PCR分析。コントロール肺について得られた値に対してブレオマイシン肺におけるmRNA発現（β−アクチン発現に対して正規化）が何倍増加したかを示す。結果を平均値±標準誤差で示す、***p＜0.0005、**p＜0.005、*p＜0.05；スチューデントｔ−検定。
【図５】コントロール及びブレオマイシンチャレンジマウスの肺ホモジネートにおけるFXII、FXI及びHMWKの増加したタンパク質レベル。食塩水コントロール及びブレオマイシン肺の肺ホモジネートにおけるFXII、FXI及びHMWKの発現を示す代表的な免疫ブロット。β−アクチンはローディングコントロールとして役立つ。
【図６】コントロール及びブレオマイシン処理マウスの肺におけるFXII、FXI及びHMWKの発現及び局在。食塩水又はブレオマイシン処理マウスからの肺におけるFXII、FXI及びHMWKの免疫学的局在決定を示す代表的な組織学的切片。グループあたり１０からの１つの代表的なブレオマイシンマウス及び１つのコントロールを示す。バーサイズを示す。
【図７】FXII−/−マウスはブレオマイシン誘導肺線維症に対して保護される。ブレオマイシンチャレンジの２１日後の(A)野生型及び(C)FXII−/−マウスの肺のヘマトキシリン及びエオシン染色。ブレオマイシンチャレンジの２１日後の(B)野生型及び(D)FXII−/−マウスのトリクローム染色。緑色はコラーゲン染色を示す。バーサイズを示す。(E)ブレオマイシンチャレンジ後のWT及びFXII−/−マウスの死亡率を示す生存曲線（n＝20マウス／グループ）。ログランク検定による有意な差、P＝0.007 FXII−/−対WT生存。
【図８】FXII−/−マウスの肺におけるフィブリン沈着はブレオマイシン適用後は障害されない。ブレオマイシン点滴注入の３週間後のブレオマイシン処理WT及びFXII−/−マウスからの肺組織におけるフィブリン免疫染色。赤色はフィブリンを示す。各実験グループについての肺の異常領域及び正常領域におけるフィブリン沈着のパターン及び程度を例示するために顕微鏡写真を選択した。バーサイズを示す。
【図９】FXIIa阻害剤はブレオマイシン誘導肺線維症を減弱する。(C,G)ブレオマイシン適用又は(A,E)食塩水適用後２１日目における肺のヘマトキシリン及びエオシン染色。ブレオマイシン点滴注入(D,H)又は食塩水点滴注入(B,F)の２１日後における肺のトリクローム染色。緑色はコラーゲン染色を示す。バーサイズを示す。(I)ブレオマイシンチャレンジ後のWT及びFXII−/−マウスの死亡率を示す生存曲線、n＝20マウス／グループ。ログランク検定による有意な差、P＝0.007。(J)ブレオマイシン又は食塩水投与の２１日後のコンプライアンス測定。データを箱ヒゲ図で示し、ここで各箱内の水平の線は中央値を表し、各箱の境界は四分位範囲を表し、そしてヒゲは最大値及び最小値を表す。n＝5マウス／グループ；***P＜0.05；ANOVA、チューキー事後検定。
【図１０】B1B2−/−マウスはブレオマイシン誘導肺線維症に対して保護されない。(A)ブレオマイシン点滴注入の２１日後のWT及びB1B2−/−処理マウスの肺のH&E及びマッソントリクローム染色。緑色はコラーゲン染色を示す。バーサイズを示す。(B)ブレオマイシンチャレンジ後のWT及びB1B2−/−マウスの死亡率を実証する生存曲線、n＝20マウス／グループ。ログランク検定により有意な差、p＝0.86。(C)ブレオマイシン投与の２１日後のコンプライアンス測定。データを箱ヒゲ図で示し、ここで各箱内の水平の線は中央値を表し、各箱の境界は四分位範囲を表し、そしてヒゲは最大値及び最小値を表す。n＝20マウス／グループ；差は有意でない；マンホイットニー検定。
【図１１】FXIIaはマウス肺線維芽細胞の増殖を刺激する。(A)FXIIaに曝露されたマウス肺線維芽細胞における[3H]−チミジン取り込み。少なくとも３つのうち１つの実験内で行われた４つの測定の平均値±SEMとして値を示す。**P＜0.0005；*P＜0.05；ANOVA、チューキー事後検定  (B)6μg／ml FXIIa刺激の６時間後のマウス肺線維芽細胞におけるサイクリンD1発現を示す代表的な免疫ブロット。β−アクチンはローディングコントロールとして役立つ。
【図１２】p44／42キナーゼはマウス肺線維芽細胞のFXII誘導増殖を調節する。(A)マウス肺線維芽細胞を示された時点の間FXIIaで処理し、そして p44／42、JNK、c−jun、p38及びAktキナーゼの活性及び発現をウェスタンブロットにより分析した。リン酸化タンパク質をリン酸化型特異的抗体により示されるように検出した。等しいローディングを特異的抗体により確認した。データは３つの独立した実験の代表である。(B)FXIIa刺激の前にJNK、PI3K、MEK及びp38キナーゼの特異的阻害剤(それぞれSP600125、ウォルトマニン、PD98059、及びSB203580)で前処理されたマウス肺線維芽細胞における[3H]−チミジン取り込み。少なくとも３つのうち１つの実験内で行われた４つの測定の平均値±SEMとして値を示す；*P＜0.05；ANOVA、チューキー事後検定。
【図１３】uPARはFXIIa誘導マウス肺線維芽細胞増殖を媒介する。(A)uPAR遮断抗体又はIgGアイソタイプコントロール抗体でFXIIa刺激前に前処理されたマウス肺線維芽細胞における[3H]−チミジン取り込み。(B)uPARのドメイン2からのペプチド(LRG又はTCK)又はランダムなペプチドの存在下でのFXIIaへの曝露後のマウス肺線維芽細胞における[3H]−チミジン取り込み。少なくとも３つのうち１つの実験内で行われた４つの測定の平均値±SEMとして値を示す。**P＜0.0005；*P＜0.05；ANOVA、チューキー事後検定。
【図１４】uPARはFXIIa分裂促進活性に必要である。(A)FXIIa刺激後の野生型(WT)又はuPAR欠損(uPAR−/−)マウスから単離されたマウス肺線維芽細胞における[3H]−チミジン取り込み。TGFβ曝露はポジティブコントロールとして役立つ。CTI、トウモロコシトリプシンインヒビター。少なくとも３つのうち１つの実験内で行われた４つの測定の平均値±SEMとして値を示す。**P＜0.0005；ANOVA、チューキー事後検定。(B)FXIIの免疫沈降（Immunnoprecipitation）。uPARに特異的な抗体を、FXIIaで刺激されたか又は刺激されていないいずれかの細胞からの溶解産物と共に30分間インキュベートした。免疫複合体を、プロテインA−アガロースビーズを使用して沈殿させて、FXIIに対する抗体を使用してウェスタンブロットにより分析した。uPARはローディングコントロールとして役立った。IgG LCh、IgG軽鎖；IgGHCh、IgG重鎖。
【図１５】α5β1インテグリンはFXIIa媒介マウス肺線維芽細胞増殖を調節する。(A)  (A)β1又は(B)α5インテグリン遮断抗体又はIgGアイソタイプコントロールでFXIIa刺激前に前処理されたマウス肺線維芽細胞における[3H]−チミジン取り込み。少なくとも３つのうち１つの実験内で行われた４つの測定の平均値±SEMとして値を示す。***p＜0.0005；**p＜0.005；*p＜0.05；ANOVA、チューキー事後検定。
【図１６】TGF−β1はHLFにおけるFXII発現を上方調節する。(A,B)  (A)実時間PCR及び(B)ウェスタンブロットで評価した、TGF−β1刺激後のHLFにおけるFXII発現の時間経過。実時間PCRの結果を、刺激していない細胞について得られた値に対して、FXII発現(β−アクチン発現に対して正規化)が何倍増加したかとして表し、そしてこれらは平均値±SDである；n＝3；**p＜0.01。３つから代表的なブロットを図示する。(C) (B)に示されるブロットのデンシトメトリー（Densytometric）分析；**p＜0.01。
【図１７】TGF−β1はMAPK、Akt及びSmad3のリン酸化を誘導する。(A) HLFを示された時点の間TGF−β1で処理し、そしてp44／42、JNK、p38及びAktキナーゼの活性及び発現をウェスタンブロットにより分析した。リン酸化タンパク質を示されるリン酸化型特異的抗体により検出した。pan特異的抗体により等しいローディングを確認した。データは４つの独立した実験の代表である。(B) ホスホ−Smad3の核への移行のTGF−β1依存性。HLFをTGF−β1と共に１時間インキュベートし、次いで洗浄し、固定し、そしてホスホ−Smad 3抗体で染色した。矢印はSmad 3の核局在化を示す。元の倍率40×／1.25−0.75油浸対物レンズ（oil−objective）。バーサイズ10μm。データは３つの独立した実験の代表である。(C) ホスホ−Smad3の核へのTGF−β1駆動移行のウェスタンブロット分析。HLFを１時間TGF−β1で処理し、核抽出物を調製し、そしてホスホ−Smad3、ラミンB、及びチューブリンに対する抗体を用いて免疫ブロットした。ラミンBをローディングコントロールとして使用し、そしてチューブリンを核フラクションの純度を評価するために使用した。データは３つの独立した実験の代表である。
【図１８−１】Smad3及びJNKキナーゼはHLFにおけるTGF−β1誘導FXII発現を調節する。(A) HLFにおけるTGF−β1誘導FXII発現のウェスタンブロット分析。HLFをTGF−β1との４８時間のインキュベーションの前にSB431542、SP600125、ウォルトマニン（Wortmannin）(Wort)、PD98059、又はSB203580で１時間処理した。細胞溶解産物を調製し、そしてFXII発現を調べた。β−アクチンをローディングコントロールとして使用した。３つからの代表的なブロットを示す。(B) (A)で示されるブロットのデンシトメトリー分析；**p＜0.01；***p＜0.001。
【図１８−２】(C) JNK1に対するsiRNAトランスフェクションによるHLFにおけるノックダウン効率のウェスタンブロットによる決定。データは３つの独立した実験の代表である。(D) HLFにおけるTGF−β1誘導FXII発現に対するJNK1ノックダウンの効果。データは３つの独立した実験の代表である。
【図１８−３】(E) (D)に示されるブロットのデンシトメトリー分析；*p＜0.05；**p＜0.01、***p＜0.001。siR、スクランブル（scrumble）siRNA；wort、ウォルトマニン。(F)  Smad3に対するsiRNAトランスフェクションによるHLFにおけるノックダウン効率のウェスタンブロットによる決定。データは３つの独立した実験の代表である。
【図１８−４】(G) HLFにおけるTGF−β1誘導FXII発現に対するSmad3ノックダウンの効果。データは３つの独立した実験の代表である。(H) (G)に示されるブロットのデンシトメトリー分析；*p＜0.05；**p＜0.01、***p＜0.001。siR、スクランブル（scrumble）siRNA；wort、ウォルトマニン。
【図１９】JNK1キナーゼはSmad3リン酸化及び核への移行を調節しない。(A, B) HLFを、示されるように(A)JNK阻害剤(SP600125)又は(B)TβRI阻害剤(SB431542)の存在しない場合又は存在下でTGF−β1で処理し、そしてSmad3及びJNKの活性及び発現をウェスタンブロットにより分析した。データは４つの独立した実験の代表である。(C) ホスホ−Smad3の核へのTGF−β1駆動移行のウェスタンブロット分析。HLFをSB431542又はSP600125で前処理し、次いで刺激しないか又はTGF−β1で１時間刺激し、核抽出物を調製し、そしてホスホ−Smad3、ラミンB、及びチューブリンに対する抗体で免疫ブロットした。ラミンBをローディングコントロールとして使用し、そしてチューブリンを核フラクションの純度を評価するために使用した。データは３つの独立した実験の代表である。
【図２０】TGF−β1は−272位に位置するSBEを介してFXIIプロモーター活性を誘導する。(A) FXIIプロモーター欠失ルシフェラーゼレポーター構築物の略図。曲がった矢印は転写開始部位を示す。(B) NIH3T3細胞を示されたFXIIプロモーター欠失構築物でトランスフェクトし、次いで刺激しない(白い棒)かTGF−β1で刺激した(黒い棒)。ルシフェラーゼ活性を「実験手順」に記載されるように測定した。データは、それぞれ三連で行われた４つの独立した実験からの平均値±SDを表す；**p＜0.01。(C) −272位に推定smad結合部位(SBE)を含有するFXIIプロモーター領域の略図。pGL3−299 C／Tは−273位のC残基をTで置き換えることにより変異した構築物を表す。(D) NIH3T3細胞をpGL3−299又はpGL3−299 C／T構築物でトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性を未処理（白い棒）及びTGF−β1処理した(黒い棒)細胞において決定した。データは、それぞれ三連で行われた４つの独立した実験からの平均値±SDを表す；**p＜0.01。
【図２１】TGF−β1は−272位に位置するSBEを介してFXIIプロモーター活性を誘導する。(A) pGL3−299構築物及びSBE−272を欠いた構築物(pGL3−183DSBE−272)の略図。(B) NIH3T3細胞をpGL3−299又はpGL3−183DSBE−272でトランスフェクトし、そしてルシフェラーゼ活性を刺激していない(白い棒)細胞及びTGF−β1で刺激した(黒い棒)細胞において測定した。データは、それぞれ三連で行われた３つの独立した実験からの平均値±SDを表す；**p＜0.01。(C) pGL3−399構築物でトランスフェクトされたNIH3T3細胞をSB431542、SP600125、ウォルトマニン(Wort)、PD98059又はSB203580で、TGF−β1とのインキュベーションの前に１時間前処理した。ルシフェラーゼ活性を未処理(白い棒)及びTGF−β1処理(黒い棒)細胞において決定した。データは、それぞれ三連で行われた３つの独立した実験からの平均値±SDを表す；*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001。wort、ウォルトマニン。
【図２２】Smad3−SBE−272相互作用はJNK阻害剤の存在下で抑制される。(A) HLFを刺激しないか又はTGF−β1で刺激して、ChIP分析をSmad3抗体又はアイソタイプIgGコントロールを使用して行った。「実験手順」に記載されるように免疫沈降DNAを用いてPCRを行った。PCR産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、そして臭化エチジウム染色により検出した。データは３つの独立した実験の代表である。(B) 未処理の細胞又はTGF−β1処理細胞からの核抽出物をビオチン化テンプレート(SBE−283／−258又はSBE−283／−258 C／T)と共にインキュベートし、そしてSmad3をウェスタンブロットにより検出した。データは３つの独立した実験の代表である。(C) HLFをSB431542又はSP600125で１時間、TGF−β1とのインキュベーションの前に前処理した。ChIP分析を、Smad3抗体またはアイソタイプIgGコントロールを使用して行った。PCRを、「実験手順」に記載されるように免疫沈降したクロマチンを用いて行った。データは３つの独立した実験の代表である。(D) HLFをSB431542又はSP600125と共に１時間、TGF−β1を加える前にプレインキュベートした。核抽出物を調製し、次いでビオチン化テンプレート(SBE−283／−258)と共にインキュベートした。Smad3をウェスタンブロットにより検出した。データは３つの独立した実験の代表である。
【図２３−１】マウスにおける実験的肺線維症におけるFXIIの発現及び分布。(A) ブレオマイシン適用を使用して特発性肺線維症(IPF)型疾患をマウスにおいて誘導し、そして処理された動物の気管支肺胞洗浄液におけるFXIIの濃度を定量した。(B) ブレオマイシン処理後１４日目及び２１日目のマウス肺におけるFXIIの発現(ウェスタンブロット分析)を示す。
【図２３−２】(C) ブレオマイシン処理マウスにおけるβ−アクチンmRNAとの関連でFXII mRNAの発現を示し、またブレオマイシン適用後１４日目及び２１日目において何倍増加したかも示す。(D) ブレオマイシン処理マウスにおける組織構造及びFXIIの分布(赤色)を示す。
【図２３−３】(E)ブレオマイシン処理マウスにおける組織構造及びFXIIの分布(赤色)を示す。
【図２４−１】マウスにおけるブレオマイシン誘導IPFに対するFXII欠損の影響。(A) 野生型(WT)及びFXII欠損動物における第XII因子の分布(赤色)を示す。また、コラーゲン沈着の分布を示す。注：FXII欠損マウスにおいて、肺組織構造はほとんど冒されておらず、生理学的状況は似ており、深刻なコラーゲン沈着は見られない。
【図２４−２】(B) FXII欠損マウスと比較した野生型マウスの生存曲線(カプラン−マイヤープロット)をブレオマイシン処理グループについて示す。(C) ブレオマイシン処理野生型又はFXII欠損マウスの肺機能のコンプライアンスを示し、これはIPF状況に対するFXII欠損マウスのほぼ完全な保護を示している。
【図２４−３】(D,E) 中隔厚、さらにはコラーゲン含量は、野生型グループと比較してブレオマイシン処理FXII欠損マウスにおいて増大していない。
【図２５−１】FXIIa阻害剤「トウモロコシトリプシンインヒビター」(CTI)の投与は、マウスにおいてブレオマイシン誘導IPF状況に対して保護する。(A) ブレオマイシン投与に対して、未処置の野生型マウスは顕著に増加したFXII発現、さらにはコラーゲン沈着も示すが、一方でCTI処置マウスは肺リモデリング及びコラーゲン沈着に対してかなり保護される。
【図２５−２】(B) 生存曲線(カプラン−マイヤープロット)は、FXII阻害剤CTIを投与されたブレオマイシン処理マウスがIPF型肺線維症に対して有意に保護されるということを示す。(C) CTIを投与された処置グループにおいて、肺コンプライアンスは有意に改善される。
【図２５−３】(D,E) ブレオマイシン適用により引き起こされる中隔厚及びコラーゲン含量の増加の両方がマウスの治療的CTIグループにおいて有意に予防される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、間質性肺疾患を処置及び／又は予防するための方法に関し、該方法は、被験体に薬学的に有効な量の、FXII／FXIIaの細胞活性の非内在性阻害剤を投与することを含み、すなわち、このような阻害剤を投与することが肺線維芽細胞の増殖を防止及び／又は限定する。同様に、本発明は間質性肺疾患を処置及び／又は予防するための医薬の製造のための非内在性細胞性FXII阻害剤の使用に関する。
【００１８】
第XII因子
FXIIは、単鎖78kDチモーゲンとして肝臓で産生されるポリペプチドである。活性化されるとFXIIは重鎖及び軽鎖からなる二本鎖形態に変換される。重鎖は以下のドメインを含有する：リーダーペプチド、フィブロネクチンII型ドメイン、上皮増殖因子(EGF)ドメイン、フィブロネクチンI型ドメイン、クリングルドメイン、及びプロリンリッチドメイン（これはFXIIに特有である）。軽鎖はセリンプロテアーゼに典型的な触媒ドメインを含有し、これによりFXIIは、セリンプロテアーゼファミリーの他のメンバー、例えば組織型プラスミノゲン活性化因子(t−PA)、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子(u−PA)、又は第VII因子活性化プロテアーゼと類似したドメイン構成を有する。重鎖は、アミノ末端に局在し、フィブロネクチンI型領域に沿って、そして場合により第二EGF様ドメイン又はクリングルドメインに局在化した、負に荷電した表面に対する結合領域を含有する。軽鎖におけるFXIIの活性部位は、His40、Asp89及びSer191残基を含む標準的触媒三連構造（canonical catalytic triad）からなる。この部位は、主要な内因系凝固経路阻害剤であるC1阻害剤の標的でもある。カリクレイン又はその自己活性化によるFXIIの切断は、FXIIチモーゲンにおいて結合しているArg353−Val354の分裂を生じ、活性アルファXIIa形態の生成をもたらし、これはジスルフィド結合により連結された重鎖及び軽鎖を含有する。アルファXIIa形態における２つのさらなるペプチド結合の加水分解は、軽鎖及び重鎖の切断型フラグメントを含有する30kDのベータXIIaを生じる。アルファXIIaは負に荷電した表面に結合することができ、そしてFXI及びプレカリクレイン(PK)を活性化する。ベータXIIaは表面結合能を有していないがPKを活性化することができる。
【００１９】
本明細書で使用される用語「第XII因子」又は「FXII」は、第XII因子の上記の形態のいずれかを指す。特に、この用語は活性化形態の第XIIa因子(FXIIa)を含む。
【００２０】
間質性肺疾患
びまん性実質性肺疾患(DPLD)としても知られる間質性肺疾患(ILD)は、間質(肺胞周囲の組織及び空間)を冒す肺疾患の群を指す。これは、肺胞上皮、肺毛細血管内皮、基底膜、血管周囲組織及びリンパ周囲組織に関係する。本出願という意味ではILDは特に肺線維芽細胞増殖に関連し、従って用語「線維増殖性ILD」が使用される。この肺線維芽細胞増殖は、本発明により処置及び／又は予防されるはずである。
【００２１】
好ましくは、本発明に従って処置しようとするILDは肺線維症である。最も好ましくは、肺線維症は特発性肺線維症である。特発性肺線維症(IPF)は、肺に限定された未知の原因の、そして通常型間質性肺炎(UIP)の組織学的パターンを伴う、慢性繊維化間質性肺炎の独特の型として定義される。IPF肺は、構造的破壊、蜂巣状の密な瘢痕及び散在した線維芽細胞病巣(集中的な線維芽細胞増殖の領域)を特徴とする。
【００２２】
FXIIの細胞活性の非内因系阻害剤
用語「FXIIの細胞活性の非内因系阻害剤」又は「非内因系細胞性FXII阻害剤」は、FXII及び／若しくはFXIIaの細胞活性又はその量を低減することができるいずれかの非内因系化合物を指す。本発明という意味でFXII阻害剤は、FXIIaの触媒活性を妨げる化合物を含む。インビボでFXII又はFXIIaの量を低減することができる化合物がさらに含まれる。このような阻害剤は、FXIIの発現を低減することができる化合物を含む。さらに、FXIIのFXIIaへの変換を妨げる阻害剤が含まれる。
【００２３】
このような阻害剤は、FXII及び／又はFXIIaの生物学的機能を、少なくとも50％、好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも90％そしてさらにより好ましくは少なくとも95％、例えば少なくとも98％又は少なくとも99％も低減する。生物学的機能は、FXII／FXIIaの公知の細胞作用を意味する。上記細胞機能の例は、細胞、特に肺線維芽細胞又は平滑筋細胞に対する増殖性及び／又はマイトジェン作用である。
【００２４】
本発明という意味での「非内因系」阻害剤は、FXII／FXIIaが阻害されるべき種において天然で存在しないFXII／FXIIa阻害剤である。FXII／FXIIaの内因系阻害剤は、例えば抗トロンビン、C1阻害剤、アルファ−1プロテアーゼ阻害剤である。本発明の非内因系FXII／FXIIa阻害剤は、内因系FXII／FXIIa阻害剤よりもかなり特異的であり、すなわち、本発明に従う阻害剤はFXII／FXIIaに対して非常に特異的である。この特異性は、FXII／FXIIaの活性の５０％の低減を得るために必要とされるFXII／FXIIaに対する特定の阻害剤のモル比として表され得る。これは本発明という意味ではモル阻害比と呼ばれる。0.5のモル阻害比は、FXII／FXIIa  1pmolに対して加えられた阻害剤0.5pmolがFXII／FXIIa活性の５０％の低減をもたらすということを意味する。本発明の特異的な、すなわち非内因系阻害剤は、10若しくはそれ以下、又は好ましくは5若しくはそれ以下、又はより好ましくは2若しくはそれ以下、又はさらにより好ましくは1若しくはそれ以下、例えば0.5若しくはそれ以下のモル阻害比を有する阻害剤である。
【００２５】
FXIIaの触媒活性を決定するための試験は、Kannemeier C, Shibamiya A, Nakazawa F, Trusheim H, Ruppert C, Markart P, Song Y, Tzima E, Kennerknecht E, Niepmann M, Bruehl ML, Sedding D, Massberg S, Gunther A, Engelmann B, Preissner KT. Extracellular RNA constitutes a natural procoagulant cofactor in blood coagulation. Proc Natl Acad Sci USA. 104：6388−6393, 2007に記載されている。手短には、FXIIaサンプル及び発色性基質ペプチドを混合し、そしてp−ニトロアニリンの放出を光度計で405nmにて経時的に追跡する。化合物は、そのアッセイにおいて触媒活性を有意な様式で、好ましくは少なくとも10％、より好ましくは少なくとも25％、最も好ましくは少なくとも50％、例えば少なくとも75％又は少なくとも90％も低減することができる場合、FXIIaの触媒活性、特に酵素活性の阻害剤として適切である。
【００２６】
FXIIのFXIIaへの変換の程度を決定するための試験は、上記と同様のやり方で、発色性ペプチドアッセイにおけるFXIIaの増加を追跡することにより説明される。化合物は、その化合物がこの変換をそのアッセイにしたがって有意な程度まで阻害することができる場合に、FXIIのFXIIaへの変換を妨害する阻害剤として適切である；好ましくは、阻害剤により影響を及ぼされる変換における減少は、少なくとも10％、より好ましくは少なくとも25％、最も好ましくは少なくとも50％である。
【００２７】
FXII及び／又はFXIIaの量を決定する方法が記載されており、その方法において、FXII／FXIIaの総量は、酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)によりFXII特異的抗体を使用して定量され、そして活性化FXIIの部分は、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりサンプルを分析し、続いてウェスタンブロットによりタンパク質バンド形成パターンを定量することにより決定される。このような方法は、ELISA及び他の免疫学的技術のようなタンパク質検出の公知の方法を含む。
【００２８】
抗FXII抗体
FXII及び／又はFXIIaに特異的な抗体は、FXIIaの機能を阻害するために使用され得る。このような抗体としては、例えば抗FXII抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む）が挙げられる。
【００２９】
抗体はまた、阻害活性を保持している、同じもののフラグメント又は模倣物、例えば米国特許第6,613,890号の特に第4〜８欄に開示されるようなアミロイド前駆体タンパク質のKunitzプロテアーゼ阻害剤ドメインのアナログであってもよい。
【００３０】
プロテアーゼ阻害剤
FXIIa活性を阻害するための効率的な方法は、特異的非内因系プロテアーゼ阻害剤、例えばセリンプロテアーゼ阻害剤の使用である。例としては、アプロチニン、Z−Pro−Pro−アルデヒド−ジメチルアセテート、DX88(Dyax Inc., 300 Technology Square, Cambridge, MA 02139, USA；Williams A. and Baird LG., Transfus Apheresis Sci. 2003 Dec: 29 (3):255−8において引用される)、プロリルオリゴペプチダーゼの阻害剤、例えばFmoc−Ala−Pyr−CN、トウモロコシトリプシンインヒビター(CTI)、ウシ膵臓トリプシンインヒビターの変異体及びPro−Phe−Arg−クロロメチル−ケトン(PCK)が挙げられる。
【００３１】
他の適切な阻害剤は、H.Isawaら(J Biol Chem 277:27651−27658, 2002)ににより開示されるHamadarinであり得る。適切なトウモロコシトリプシンインヒビター及びその製造方法は、Z.Y. Chenら(Appl Environm Microbiol 65:1320−1324, 1999 及び同書に引用される参考文献19)において開示される。引用される全ての参考文献は、それらの内容全体を含めて参照のために本出願に加入される。最後に述べるが決して軽んずべきでなく、その選択が基づいているアッセイとしてそれぞれFXII、FXIIaの使用を介して例のために単離される小分子は、本発明の一部であり、上記又は下記のそれらのそれぞれの使用も同様である。これらの小分子FXIIa阻害剤は、FXIIの結晶構造に基づいて設計され得る。従って、いくつかのFXIIドメイン又は軽鎖は、E.coli、酵母又は哺乳動物細胞のような発現系で組み換え的に発現され得る。次いでタンパク質を精製し、そしてFXII基質FXIについて記載されるように(Jin L et al. J Biol Chem. 280:4704−4712, 2005)標準的な手順を使用して結晶化させる。エコチン変異体との複合体におけるFXIa触媒ドメインの結晶構造は、基質様相互作用を明らかにした。あるいは、小分子セリンプロテアーゼ阻害剤は、FXII構造を安定化するために含まれ得る。
【００３２】
最近、FXII／FXIIaの新規な阻害剤が昆虫において発見された：吸血性昆虫であるブラジルサシガメ（Triatoma infestans）の中腸由来のインフェスチンドメイン3−4(Infestin3−4)及びインフェスチンドメイン4(Infestin−4)(Campos ITN et al. 2002. Infestin, a thrombin inhibitor present in Triatoma infestans midgut, a Chagas' disease vector: gene cloning, expression and characterization of the inhibitor. Insect Biochem. Mol. Biol. 32:991−997；Campos ITN et al. 2004. Identification and characterization of a novel factor XIIa inhibitor in the hematophagous insect, Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae). FEBS Lett. 577:512−516)。これらのタンパク質は、Kazal型セリンプロテアーゼ阻害剤である強力なFXIIa阻害剤として知られており、活性化部分トロンボプラスチン時間を約３倍延長する。
【００３３】
国際特許出願WO2008／098720において、インフェスチン 3−4及びインフェスチン−4、さらにはインフェスチン4のアルブミン融合タンパク質(rHA−Infestin−4)のFXIIaの強力な阻害剤としての使用が記載されており、これらの分子自体も同様に記載される。さらに、インフェスチン−4と非常に高い類似性を有するヒトタンパク質は、膵臓で発現されるKazal型セリンプロテアーゼ阻害剤であるSPINK−1(膵臓分泌トリプシンインヒビターPSTIとしても知られる)であると記載された。野生型SPINK−1配列に基づいて、３つの異なる変異体は、インフェスチン−4に対するSPINK−1の増加した相同性と共に記載されている。成熟SPINK−1野生型タンパク質、３つの変異体及びインフェスチン−4のアミノ酸配列は配列番号29〜33として示される。一実施態様において、本発明のFXII阻害剤は、SPINK−1から誘導された変異Kazal阻害剤を含み、ここでこの阻害剤はインフェスチン−4に対する増加した相同性を有する。用語「それぞれ増加した相同性の増加した（with increasing respective increased homology）SPINK−1変異体」は、インフェスチン−4と同一のアミノ酸、又は同一性の代わりに保存的置換（同一のアミノ酸の代わりの保存的置換を意味する）を２０より多く含有する変異体を指す。好ましくは、変異Kazal阻害剤と阻害されるFXIIaとの接触部位はKazal型阻害剤インフェスチンのドメイン４由来である。WO2008／098720の記載全体が本出願に参照により加入される。
【００３４】
従って、インフェスチン（infestin）若しくはそのフラグメント、又はインフェスチン3−4若しくはインフェスチン−4、又はSPINK−1由来の上記変異Kazal阻害剤[ここでこの阻害剤はインフェスチン−4に対する増加した相同性を有する］、及び以下に記載されるような融合タンパク質rHA−Infestin−4は、本発明に従うFXII／FXIIaの細胞活性の適切な非内因系阻害剤である。
【００３５】
言い換えれば、一実施態様において、本出願はインフェスチンドメイン4を含むFXII阻害剤、インフェスチン−4を提供する。一実施態様において、FXII阻害剤はインフェスチン−4の変異体を含む。別の実施態様において、FXII阻害剤はインフェスチンドメイン4、並びに場合によりインフェスチンドメイン1、2、及び／又は3を含む；これらのタンパク質はFXIIの強力な阻害剤であることが知られている。インフェスチン−4の野生型ポリペプチド配列が提供される(配列番号33)。本明細書で使用される用語「変異体（variant）はアミノ酸変異を有するポリペプチドを指し、ここで「変異」は、野生型インフェスチン−4配列に対する置換、欠失又は付加として定義され、ここでこのような変化はそのポリペプチドがFXIIを阻害する機能的能力を変更しない。用語「変異体」は、野生型又は変異インフェスチン−4配列のフラグメントを含む。このような変異体のさらなる例は以下に示される。
【００３６】
一実施態様において、インフェスチン−4変異体は、野生型インフェスチン−4配列のＮ末端アミノ酸2−13、及びＮ末端アミノ酸の外側に野生型インフェスチン−4配列との差を生じる少なくとも１つでかつ５つまでのアミノ酸変異、又は６つの保存されたシステイン残基、及び野生型インフェスチン−4配列に対する少なくとも70％の相同性を含む。インフェスチン−4配列のＮ末端アミノ酸2−13は、トロンビンに結合する関連した阻害剤ベネズエラサシガメ（Rhodnius prolixus）(PDB:1 TSO)についての構造データ分析、及びキモトリプシンに結合するSPINK−1の分析（これらは両方ともＮ末端領域における接触部位の集積という共通の特徴を共有する）に基づいて、FXIIに対する結合に重要であり得る。従って、一実施態様において、インフェスチン−4の変異体は、野生型インフェスチン−4配列のアミノ酸2−13の保存されたＮ末端領域、及び野生型インフェスチン−4配列との差を生じるこれらの保存されたＮ末端アミノ酸の外側に少なくとも１つでかつ５つまでのアミノ酸変異を含む。変異は置換でも欠失でも付加でもよい。本明細書で使用される「上記Ｎ末端アミノ酸の外側」は、配列VRNPCACFRNYV、すなわち野生型インフェスチン−4配列からのアミノ酸2−13を含むアミノ酸の連続した配列以外の、変異体のポリペプチド鎖に沿ったいずれかのアミノ酸を指す。別の実施態様において、インフェスチン−4変異体は６つの保存されたシステイン残基を含み、そして野生型インフェスチン−4配列に対して少なくとも70％の相同性を有する。一実施態様において、６つの保存されたシステイン残基は、野生型インフェスチン−4配列の6位、8位、16位、27位、31位及び48位におけるアミノ酸である。一実施態様において、変異体は最終的な保存されたシステインを含む。他の実施態様において、システイン残基の正確な位置、及び互いの相対的な位置は、インフェスチン−4変異体における挿入又は欠失に起因して、野生型インフェスチン−4配列の6位、8位、16位、27位、31位及び48位から変化し得る。それにもなお、これらの実施態様において、インフェスチン−4変異体は全ての６つのシステインを含み、そして野生型インフェスチン−4配列に対して70％、75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の相同性を共有し得る。
【００３７】
実施態様において、インフェスチン−4の変異体は、それがFXIIを阻害するということを特徴とする。FXIIを阻害する機能的活性は、例えばインビトロ及び／又はインビボでの特徴付けにより評価され得、これらとしては、FXII酵素活性の阻害、延長された凝固時間、すなわち活性化部分トロンボプラスチン時間(aPTT)を試験するための直接的なアッセイ、又は凝固を評価するインビボでの方法が挙げられる。インフェスチン−4変異体のさらなる例はSPINK−1変異体であり、これは以下に記載される。
【００３８】
一実施態様は、ヒトにおける治療的使用のためのFXII阻害剤を含む。インフェスチン−4に対する高い類似性を有するヒトタンパク質が使用され得る。例えば、インフェスチン−4に対して最も高い類似性を有するヒトタンパク質は、膵臓において発現されるKazal型セリンプロテアーゼ阻害剤であるSPINK−1である(膵分泌性トリプシンインヒビター、PSTIとしても知られる)。Kazal型セリンプロテアーゼ阻害剤ファミリーは、セリンプロテアーゼ阻害剤の多数のファミリーのうちの１つである。様々な種からの多数のタンパク質が記載されている(Laskowski M and Kato I, 49 Ann. Rev. Biochem. 593−626, 1980)。インフェスチン−4とSPINK−1との間のアミノ酸配列類似性は図12において概要を示される。
【００３９】
野生型SPINK−1配列(配列番号29)に基づいて、インフェスチン−4に対するSPINK−1配列の相同性を増加させるために様々な変異体が生成され得る。句「インフェスチン−4に対する増加した相同性」は、それによりSPINK−1配列をインフェスチン−4配列に近づけるためにSPINK−1に対してアミノ酸変異が作製されるプロセスを指す。
【００４０】
一実施態様において、SPINK−1を、野生型インフェスチン−4配列のＮ末端アミノ酸2−13を含むように変異させる；ポリペプチド配列が示され、そしてこれはK1(配列番号30)と称される。上記のように、Infesin−4配列のＮ末端部分は、FXII阻害機能に重要であると考えられる。
【００４１】
従って、一実施態様において、変異SPINK−1の変異体はまた、野生型インフェスチン−4配列のＮ末端アミノ酸2−13、及び野生型SPINK−1配列との差を生じ、かつ野生型インフェスチン−4配列に対する変異体の相同性を増加させる、上記Ｎ末端アミノ酸の外側に少なくとも１つでかつ５つまでのアミノ酸変異を含む。別の実施態様において、変異SPINK−1の変異体は、６つの保存されたシステイン残基を含み、そして野生型SPINK−1配列に対して少なくとも70％の相同性を有する。変異は置換でも、欠失でも、付加でもよい。上で定義されたように、用語「上記Ｎ末端アミノ酸の外側」は、配列VRNPCACFRNYV、すなわち野生型インフェスチン−4配列からのアミノ酸2−13からなるアミノ酸の連続した配列以外の、変異体のポリペプチド鎖に沿ったいずれかのアミノ酸を指す。用語「変異体」は、上記の変異SPINK−1配列のフラグメントを含む。一実施態様において、６つの保存されたシステイン残基は、野生型SPINK−1配列の9位、16位、24位、35位、38位及び56位のアミノ酸であり得る。一実施態様において、変異体は最終的な保存されたシステインを含む。別の実施態様において、システインの正確な位置、及び互いの相対的な位置は、SPINK−1変異体における挿入又は欠失に起因して、野生型SPINK−1配列の9位、16位、24位、35位、38位及び56位から変化し得る。それでもなお、これらの実施態様において、SPINK−1変異体は６つのシステイン全てを含む。実施態様において、SPINK−1変異体はまたそれがFXIIを阻害するということも特徴とする。
【００４２】
このようなSPINK−1変異体の例が示され、これらはK2、及びK3(それぞれ配列番号31及び32)と名付けられる。SPINK−1変異体K2及びK3において、Ｎ末端の外側のさらなるアミノ酸置換が、インフェスチン−4に対する相同性を増加させるために作製され、ここで変異体はまた、それらがFXII活性を阻害することを特徴とする。WO2008／098720を参照のこと。SPINK−1変異体K3の場合、５つのアミノ酸置換がインフェスチン−4に対する相同性を増加させるために作製された。従って実施態様において、SPINK−1変異体は野生型SPINK−1配列と70％、75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の相同性を共有し得る。
【００４３】
延長された半減期を有する阻害剤
本発明の好ましい実施態様は、延長された半減期を有する、FXII／FXIIa阻害剤、特にインフェスチン−4及びインフェスチンホモログに基づく改変された哺乳動物Kazal型セリンプロテアーゼ阻害剤又はそれらのフラグメントの使用である。Kazal型セリンプロテアーゼ阻害剤はかなり小さなタンパク質であり、他の小さいタンパク質について公開されているように速い腎クリアランスが期待され得る(Werle M. and Bernkop−Schnurch A. 2006. Strategies to improve plasma half−life time of peptide and protein drugs. Amino Acids 30:351−367)。ポリペプチド化合物の短い血漿半減期を克服するための１つの方法は、それを繰り返し、又は持続注入により注射することである。好ましくは、ポリペプチド自体の固有の血漿半減期が増加される。従って、半減期延長タンパク質(HLEP)に融合されたFXII阻害剤、特にセリンプロテアーゼ阻害剤を使用することが好ましい。
【００４４】
本明細書で使用されるHLEPは、アルブミン、アルブミンファミリーのメンバー、免疫グロブリンGの定常領域及びそのフラグメント、並びに生理的条件下でアルブミン、アルブミンファミリーのメンバー、さらには免疫グロブリン定常領域の部分に結合することができるポリペプチドからなる群より選択される。具体例として、アルブミン及び免疫グロブリン並びにそれらのフラグメント又は誘導体がHLEPとして記載される。
【００４５】
Ballanceら(WO 01／79271)は、ヒト血清アルブミンに融合された場合にインビボで増加した機能的半減期及び延長された貯蔵寿命を有すると予測される多数の異なる治療的ポリペプチドの融合ポリペプチドを記載した。治療的タンパク質は、直接的に、又はアルブミン部分へのペプチドリンカーを介して融合され得、そしてＣ末端及びＮ末端融合が記載される。
【００４６】
用語ヒト血清アルブミン(HSA)及びヒトアルブミン(HA)は本出願において交換可能に使用される。用語「アルブミン」及び「血清アルブミン」はより広範であり、ヒト血清アルブミン(並びにそのフラグメント及び変異体)、さらには他の種からのアルブミン(並びにそのフラグメント及び変異体)を包含する。
【００４７】
本明細書で使用される「アルブミン」は、集合的に、アルブミンポリペプチド若しくはアミノ酸配列、又はアルブミンの１つ若しくはそれ以上の機能的活性（例えば生物学的活性）を有するアルブミンフラグメント若しくは変異体を指す。特に、「アルブミン」はヒトアルブミン又はそのフラグメント、特に配列番号３４に示されるようなヒトアルブミンの成熟形態若しくは他の脊椎動物由来のアルブミン若しくはそれらのフラグメント、又はこれらの分子のアナログ若しくは変異体若しくはそれらのフラグメントを指す。
【００４８】
アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、上記のようなHA配列の全長を含んでいてもよく、又は治療活性を安定化若しくは延長することができる１つ若しくはそれ以上のそのフラグメントを含んでいてもよい。このようなフラグメントは、１０若しくはそれ以上のアミノ酸長のものであり得、又はHA配列からの約15、20、25、30、50、若しくはそれ以上の連続したアミノ酸を含み得、又はHAの特定のドメインの一部若しくは全てを含み得る。
【００４９】
本発明に従って使用され得るアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は通常のHAの変異体であり得る。本発明の融合タンパク質の治療的ポリペプチド部分はまた、本明細書に記載されるような対応する治療的ポリペプチドの変異体であってもよい。用語「変異体」は挿入、欠失および保存的又は非保存的のいずれかの置換を含み、この場合、このような変化は、治療的ポリペプチドの治療的活性をもたらす活性部位又は活性ドメインを実質的に変更しない。
【００５０】
特に、本発明にしたがって使用され得るアルブミン融合タンパク質は、ヒトアルブミンの天然に存在する多型変異体及びヒトアルブミンのフラグメントを含み得る。アルブミンはいずれかの脊椎動物、特にいずれかの哺乳動物、例えばヒト、サル、ウシ、ヒツジ、又はブタ由来のものであり得る。非哺乳動物アルブミンとしては、限定されないが、ニワトリ及びサケに由来するものが挙げられる。アルブミン連結ポリペプチドのアルブミン部分は、治療的ポリペプチド部分と異なる動物由来であってもよい。本発明に従って使用され得るアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、HAの少なくとも１つのサブドメイン若しくはドメイン又はその保存的修飾を含み得る。
【００５１】
一般的に言えば、アルブミンフラグメント又は変異体は、少なくとも20アミノ酸長、好ましくは少なくとも40アミノ酸長、最も好ましくは70アミノ酸長より長い。アルブミン変異体は、優先的に少なくとも１つのアルブミンのドメイン全体又はそのドメインのフラグメント、例えばドメイン1(配列番号34のアミノ酸1−194)、2(配列番号34のアミノ酸195−387)、3(配列番号34のアミノ酸388−585)、1＋2(配列番号34の1−387)、2＋3(配列番号34の195−585)又は1＋3(配列番号34のアミノ酸1−194＋配列番号34のアミノ酸388−585)からなるか、あるいはこれらを含む。各ドメインはそれ自体、残基Lys106〜Glu119、Glu292〜Val315及びGlu492〜Ala511を含む可動性のサブドメイン間リンカー領域と共に、２つの相同なサブドメイン、すなわち1−105、120−194、195−291、316−387、388−491及び512−585から構成される。
【００５２】
アルブミンに加えて、アルブミンファミリーの別のメンバーであるアルファ−フェトプロテインは、結合した治療的ポリペプチドのインビボでの半減期を延長させると主張された(WO2005／024044)。進化的に関連する血清輸送タンパク質であるタンパク質のアルブミンファミリーは、アルブミン、アルファ−フェトプロテイン(AFP；Beattie & Dugaiczyk 1982. Structure and evolution of human alpha−fetoprotein deduced from partial sequence of cloned cDNA. Gene 20:415−422)、アファミン（afamin）(AFM；Lichenstein et al. 1994. Afamin is a new member of the albumin、alpha−fetoprotein、and vitamin D−binding protein gene family. J. Biol. Chem. 269:18149−18154)及びビタミンD結合タンパク質(DBP；Cooke & David 1985. Serum vitamin D−binding protein is a third member of the albumin and alpha fetoprotein gene family. J. Clin. Invest. 76:2420−2424)からなる。それらの遺伝子は、ヒト、マウス及びラットにおいて同じ染色体領域に位置し、構造的及び機能的類似性を有する多重遺伝子クラスターを示す。アルブミンファミリーメンバーの構造的類似性は、HLEPとしてのそれらの有用性を示唆する。従って、このようなアルブミンファミリーメンバー、それらのフラグメント及び変異体をHLEPとして使用することは本発明の別の実施態様である。用語「変異体」は、挿入、欠失および保存的又は非保存的のいずれかの置換を含み、この場合、このような変化は、治療的ポリペプチドの治療的活性をもたらす活性部位又は活性ドメインを実質的に変更しない。
【００５３】
アルブミンファミリーメンバーは、それぞれのタンパク質AFP、AFM及びDBPの全長を含み得、又は治療活性を安定化若しくは延長することができるそれらの１つ若しくはそれ以上のフラグメントを含み得る。このようなフラグメントは、10又はそれ以上のアミノ酸長であっても、それぞれのタンパク質配列の約15、20、25、30、50、又はそれ以上の連続したアミノ酸を含んでいても、それぞれのタンパク質の特定のドメインの一部又は全てを含んでいてもよい。
【００５４】
本発明のアルブミンファミリーメンバー融合タンパク質は、AFP、AFM及びDBPの天然に存在する多型変異体を含み得る。これらのタンパク質はいずれかの脊椎動物、特にいずれかの哺乳動物、例えばヒト、サル、ウシ、ヒツジ、又はブタ由来であり得る。非哺乳動物アルブミンファミリーメンバーとしては、限定されないが、ニワトリ及びサケ由来の物が挙げられる。
【００５５】
IgG及び抗原結合ドメインを有していないIgGフラグメントもまたHLEPとして使用され得る。治療的ポリペプチド部分は、好ましくはなお切断可能であり得る抗体又はペプチドリンカーのヒンジ領域を介してIgG又はIgGフラグメントに接続される。いくつかの特許及び特許出願が、治療的タンパク質のインビボでの半減期を延長させるための治療的タンパク質の免疫グロブリン定常領域に対する融合を記載する。US2004／0087778及びWO2005／001025は、免疫グロブリン定常領域のFcドメイン又は 少なくとも一部と、ペプチドの半減期を増加させる増加させる生物的に活性なペプチドとの融合タンパク質を記載し、これはそうでなければインビボで急速に分解するだろう。Fc−IFN−β融合タンパク質は、増強された生物学的活性、延長された循環半減期及びより高い溶解度を達成すると記載された(WO2006／000448)。延長された血清半減期及び増加したインビボでの効力を有するFc−EPOタンパク質が開示され(WO2005／063808)、さらにG−CSF(WO2003／076567)、グルカゴン様ペプチド−1(WO2005／000892)、凝固因子(WO2004／101740)及びインターロイキン−10(US6,403,077)とのFc融合も開示され、全て半減期延長特性を有する。
【００５６】
従って、このような免疫グロブリン配列、好ましくはFcフラグメント及びそれらの変異体はHLEPとして使用することができる。インフェスチン−4のようなKazal型セリンプロテアーゼ阻害剤、及びSPINK−1変異体のようなFXIIaに対する増強された阻害特異性を有する改変されたKazal型セリンプロテアーゼ阻害剤は、HLEPとしてのFcドメイン又は免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部に融合され得、そしてE.coli、酵母、昆虫、植物若しくは脊椎動物細胞、又はトランスジェニック動物において発現され得る。SPINK−K2−Fc融合タンパク質は例として配列番号53に示される。
【００５７】
本発明に従って好ましいFXII阻害剤は、形成される融合タンパク質がHLEPに連結されていない対応するKazal型セリンプロテアーゼ阻害剤と比較して増加したインビボ半減期を有するように、インフェスチン−4のようなKazal型セリンプロテアーゼ阻害剤及びSPINK−1変異体のような改変されたKazal型セリンプロテアーゼ阻害剤又はそれらのフラグメント若しくは変異体を、HLEP又はそのフラグメント若しくは変異体のＮ末端又はＣ末端に連結した融合タンパク質である。介在するペプチドリンカーは、治療的ポリペプチドとHLEPとの間に導入され得る。HLEPが例えば立体障害により治療的ポリペプチドの特定の活性を妨害する場合は、切断可能なリンカーが導入され得る。リンカー切断のために好ましい酵素は、内因性の凝固経路の凝固プロテアーゼ、FXIIa、FXIa、FIXa、FVIIIa又はFXaであり、ここで最も好ましい切断酵素はFXIIaである。
【００５８】
Kazal型セリンプロテアーゼ阻害剤ファミリーは、セリンプロテアーゼ阻害剤の多数のファミリーのうちの１つである。様々な種由来の多くのタンパク質が記載されている(Laskowski M and Kato I. 1980. Protein inhibitors of proteinases. Ann. Rev. Biochem. 49: 593−626)。
【００５９】
上記の定義内の「インフェスチン−4及び改変されたKazal型セリンプロテアーゼ阻害剤」は、天然のアミノ酸配列又は配列番号30〜33若しくは49〜52を有するポリペプチドを含む。しかし、上記定義は、それらのポリペプチドがそれぞれのKazal型セリンプロテアーゼ阻害剤の活性を実質的に保持している限り、わずかに改変されたアミノ酸配列、例えば末端アミノ酸欠失又は付加を含む改変されたＮ末端又はＣ末端を有するポリペプチドも含む。上記定義内の「Kazal型セリンプロテアーゼ阻害剤」は、存在し得るか又はある個体から別の個体へと発生し得る天然の対立遺伝子変異も含む。上記定義内の「Kazal型セリンプロテアーゼ阻害剤」は、Kazal型セリンプロテアーゼ阻害剤の変異体をさらに含む。このような変異体は、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基において野生型配列と異なる。このような差の例は、１つ若しくはそれ以上のアミノ酸残基によるＮ末端及び／若しくはＣ末端の短縮(例えば1〜10個のアミノ酸残基)、又はＮ末端及び／若しくはＣ末端における１つ若しくはそれ以上の追加の残基の付加、さらには保存的アミノ酸置換、すなわち類似した特徴を有するアミノ酸のグループ、例えば(1)小さいアミノ酸、(2)酸性アミノ酸、(3)極性アミノ酸、(4)塩基性アミノ酸、(5)疎水性アミノ酸、及び(6)芳香族アミノ酸内で行われる置換を含み得る。このような保存的置換の例を表１に示す。
【００６０】
【表１】
2013527143.tif 000002
【００６１】
本発明のKazal型セリンプロテアーゼ阻害剤及び改変されたKazal型セリンプロテアーゼ阻害剤は、原核生物若しくはは真核生物の宿主細胞、例えば細菌、酵母、植物、動物(昆虫を含む)若しくはヒトの細胞株において、又はWO2008／098720に従ってトランスジェニック動物において組み換え分子として産生され得る。場合により、ポリペプチドは宿主細胞から分泌される。
【００６２】
投薬量、製剤、及び投与経路
本発明のFXII阻害剤、特にセリンプロテアーゼ阻害剤を、80％より高い純度まで、より好ましくは95％より高い純度まで精製することが好ましく、そして混入している高分子、特に他のタンパク質及び核酸に関して99.9％より高い純度で、かつ感染性及び発熱性の因子を含まない薬学的純粋状態が特に好ましい。好ましくは、本発明の単離されたか又は精製されたセリンプロテアーゼ阻害剤は、他のポリペプチドを実質的に含まない。
【００６３】
本発明において記載される治療的FXII阻害剤は、治療用途のために医薬製剤へと製剤化され得る。精製されたタンパク質又は抗体は、医薬製剤を提供するために、従来の生理的に適合性の水性緩衝溶液に溶解され得、これには医薬添加剤及び担体が場合により添加され得る。
【００６４】
広範な種々の薬学的に許容しうる添加剤及び担体が当該分野で公知である。このような医薬担体及び添加剤、さらには適切な製剤処方が、様々な刊行物に十分に記載されている(例えば「Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins」、Frokjaer et al.、Taylor & Francis (2000)又は「Handbook of Pharmaceutical Excipients」、3rd edition、Kibbe et al.、Pharmaceutical Press (2000) A. Gennaro (2000) 「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」、20th edition、Lippincott、Williams、＆Wilkins；Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel et al.、eds 7th ed.、Lippincott、Williams、& Wilkins；及びHandbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al.、eds.、3rd ed. Amer. Pharmaceutical Assocを参照のこと)。特に、本発明のポリペプチドを含む医薬組成物は、凍結乾燥形態又は安定な可溶形態で製剤化され得る。ポリペプチドは当該分野で公知の様々な手順により凍結乾燥され得る。凍結乾燥製剤は、注射用滅菌水又は滅菌生理食塩溶液のような１つ又はそれ以上の薬学的に許容しうる希釈剤を加えることにより、使用前に再構成される。
【００６５】
本発明の方法において、阻害剤（単数又は複数）は、所望の治療効果を生じることができるいずれかの都合のよい手段を使用して個体に投与され得る。従って、薬剤は治療的投与のための様々な製剤中に組み込まれ得る。より詳細には、本発明の薬剤は、適切な薬学的に許容しうる担体又は希釈剤と組み合わせることにより医薬組成物へと製剤化され得、そして固形、半固形、液状又は気体の形態の製剤、例えば錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤及びエアロゾル剤へと製剤化され得る。
【００６６】
このように、薬剤の投与は、経口、頬側、直腸、非経口、腹腔内、皮内、経皮、気管内（intracheal）などの投与を含む様々なやり方で達成され得、すなわち組成物の製剤は、いずれかの薬学的に適切な投与手段により個体に送達される。様々な送達系が公知であり、そしていずれかの従来の経路により組成物を投与するために使用され得る。優先的に、本発明の組成物は全身投与される。全身性の使用のために、本発明の治療的タンパク質は、従来の方法にしたがって、非経口(例えば静脈内、皮下、筋内、腹腔内、脳内、肺内（intrapulmonar）、鼻腔内又は経皮)又は 経腸(例えば、経口、膣又は直腸)の送達のために製剤化される。最も優先の投与経路は静脈内投与又は肺内投与である。製剤は注入により、又はボーラス注射により連続的に投与され得る。いくつかの製剤は徐放（slow release）系を包含する。
【００６７】
経口投与のための錠剤及びカプセル剤は、結合剤、フィラー、滑沢剤及び湿潤剤などのような従来の添加剤を含有し得る。経口液状製剤は、水性若しくは油性の懸濁剤、液剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤などの形態であっても、水若しくは他の適切なビヒクルで使用のために再構成するための乾燥製品として提供されてもよい。このような液状製剤は、従来の添加剤、例えば懸濁化剤、乳化剤、非水性ビヒクル及び保存料を含有し得る。
【００６８】
一般に、経口製剤については、薬剤は単独で、又は錠剤、散剤、顆粒剤若しくはカプセル剤を作製するために適した添加剤と組み合わせて、例えば従来の添加剤、例えばラクトース、マンニトール、コーンスターチ、若しくはジャガイモデンプンと；結合剤、例えば結晶性セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチ若しくはゼラチンと；崩壊剤、例えばコーンスターチ、ジャガイモデンプン、若しくはカルボキシメチルセルロースナトリウムと；滑沢剤、例えばタルク若しくはステアリン酸マグネシウムと；そして必要に応じて希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存料及び矯味矯臭剤と組み合わせて使用され得る。
【００６９】
局所適用に適した製剤は、水性又は油性の懸濁剤、液剤、乳剤、ゲル、又は好ましくは乳剤性軟膏の形態であり得る。スプレー適用に有用な製剤は、噴霧可能な液体又は乾燥粉末の形態であり得る。
【００７０】
薬剤は、それらを水性又は非水性の溶媒、例えば植物油若しくは他の同様な油、合成脂肪族系酸グリセリド、高級脂肪族系酸のエステル又はプロピレングリコール中に；そして必要な場合は従来の添加剤、例えば可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤及び保存料と共に、溶解、懸濁又は乳化することにより、注射のための製剤へと製剤化され得る。
【００７１】
さらに、薬剤は、様々な基剤、例えば乳化基剤又は水溶性基剤と混合することにより坐剤にされ得る。本発明の化合物は坐剤により直腸投与され得る。坐剤は、体温で溶融するが室温では凝固する、カカオ脂、カーボワックス及びポリエチレングリコールのようなビヒクルを含み得る。
【００７２】
医薬投薬形態において、薬剤はそれらの薬学的に許容しうる塩の形態で投与され得、又はそれらは単独で、若しくは他の薬学的に活性な化合物との適切に会合して、さらには組み合わせても使用され得る。以下の方法及び添加剤は単に例となるものであり、決して限定ではない。
【００７３】
本発明のFXII阻害剤は、治療的に有効な用量で患者に投与され、これは耐えられない有害な副作用を生じる用量に達することなく、処置される状態又は適応症の重症度又は拡散を予防するか又は減少させて、所望の効果を生じるために十分な用量を意味する。正確な用量は、多くの因子、例えば適応症、処方及び投与形式に依存し、そしてそれぞれの適応症について前臨床及び臨床試験において決定されなければならない。
【００７４】
経口又は直腸投与のための単位投薬形態、例えばシロップ剤、エリキシル剤、及び懸濁剤が提供され得、ここで各投薬単位、例えば茶さじ一杯分のもの、テーブルスプーン一杯分のもの、錠剤又は坐剤は、１つ又はそれ以上の阻害剤を含む組成物を所定量含有する。同様に、注射又は静脈投与のための単位投薬形態は、滅菌水、生理食塩水又は別の薬学的に許容しうる担体中の溶液として組成物中に阻害剤を含み得る。
【００７５】
本明細書で使用される用語「単位投薬形態」は、ヒト及び動物被験体のための単一の投薬形態として適した物理的に個別の単位を指し、各単位は、所望の効果を生じるために十分な量で計算された所定量の本発明の化合物を、薬学的に許容しうる希釈剤、担体またはビヒクルと併せて含有する。本発明の新規な単位投薬形態の仕様は使用される特定の化合物及び達成しようとする効果、並びに宿主における各化合物に関連する薬力学に依存する。
【００７６】
当業者は、用量レベルが特定の化合物の機能、症状の重症度及び副作用に対する被験体の感受性によって変わり得るということを容易に理解するだろう。所定の化合物について好ましい投薬量は、様々な手段により当業者により容易に決定可能である。好ましい手段は、所定の化合物の生理学的効力を測定することである。
【００７７】
適用様式に依存して、静脈内（iv）注射による全身投与と比較してかなり低い用量が吸入又はスプレーには適しているだろう。
【００７８】
医薬組成物は、単独で、又は他の治療剤と関連して投与され得る。これらの薬剤は同じ医薬の一部として組み込まれ得る。
【００７９】
本発明の様々な製品は、線維増殖性間質性肺疾患の治療のための医薬として有用である。従って、本発明は、上記の治療、特に肺線維症、好ましくは特発性肺線維症のための、本明細書に記載するFXII阻害剤、特に本明細書に記載されるKazal型セリンプロテアーゼ阻害剤ポリペプチドを含む医薬組成物に関する。
【００８０】
本発明の改変されたDNAはまた、ヒト遺伝子治療における使用のために導入ベクター中に一体化され得る。
【００８１】
FXIIに対する特異的siRNAを、FXII発現の下方調節又はノックダウンのために使用することができる。
【００８２】
上記の実施態様のいずれも、それらが本発明の阻害剤、本発明の方法、本発明の使用及び本発明のキットのカテゴリーのうちの１つとの組み合わせだけで記載されているかどうかにかかわらず本発明の阻害剤、本発明の方法、本発明の使用及び本発明のキットに適用可能である。
【実施例】
【００８３】
方法
マウスにおける気管内ブレオマイシン投与
20〜22gの間の体重の雄性マウスを全ての実験で使用した。動物をNIHガイドラインに従って飼育し、そして実験を地方自治体の許可を得て行った。動物をケタミン塩酸塩及びキシラジン塩酸塩の混合物の腹腔内注射により麻酔した。5U／体重kgの用量のブレオマイシンをエアロゾルとして投与した。ブレオマイシン送達のために、動物を経口気管内挿管し、そして機械的に換気した。マイクロ噴霧器（microsprayer）(Penn−Century Inc、Philadelphia、PA)にブレオマイシンを含有する食塩水100μlを充填し、気管分岐部のわずかに上に位置づけられた気管カニューレに導入し、そしてエアロゾル生成を終末呼気（end−expiratory）呼吸停止下で急速にシリンジを空にすることにより達成した。コントロールマウスにはビヒクルのみ(0.9％食塩水)を投与した。5mg／kg CTI及び8mg／kg PCK（両方とも0.9％食塩水で希釈）をそれぞれ9、12、15及び18日目に用量で又はマウス体重の（in dosis or of mouse body weight）気管内投与した。マウスを（文章中に示されていなければ）適用の２１日後に致死量のケタミン及びキシラジンを用いて屠殺した。
【００８４】
肺コンプライアンス測定
マウスを気管切開し（tracheotomised）、そして容積駆動（volume driven）様式で呼気終末陽圧0kPaにて通気した。呼吸速度を20呼吸・分-1に設定し、そして通気圧を肺の膨張の間、一回換気量200μLで記録した。
【００８５】
肺調製
動物の屠殺後、開胸し、そして肺動脈中に配置したカテーテルを介して肺にPBS緩衝液を流した。流出液から血液が消えたら肺を取り出し、そしてさらなる検査のためにパラホルムアルデヒド又は窒素中に置いた。細胞単離のために肺をPBS緩衝液中に置いた。
【００８６】
マウス及びヒトの肺線維芽細胞の単離及び細胞培養
肺実質のヒト肺検体及びマウス肺を刻んで1mm3より小さい小片にした。刻んだ小片をPBSで２回洗浄し、次いで100mmの皿(Greiner−bio−one、Frickenhausen、Germany)に置いた。検体を、10％ウシ胎児血清(FCS；HyClone、South Logan、UT)、及び1％ペニシリン／ストレプトマイシン(Invitrogen）を補充したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM；Invitrogen、Karlsruhe、Germany)を用いて5％ CO2の加湿雰囲気下で37℃にて培養した。単離された線維芽細胞の純度をビメンチン、フィブロネクチン及びIV型コラーゲンに対するポジティブ染色により検証した。全ての実験を3〜4の継代からの肺線維芽細胞を用いて行った。マウスNIH3T3線維芽細胞を、10％FCS、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したDMEM中で5％CO2の加湿雰囲気下で37℃にて培養した。
【００８７】
肺組織及び肺胞上皮II型細胞の顕微解剖
肺の凍結検体をクリオスタットで10μmの薄片にし、非コーティング薄ガラススライド上に載せ、そしてヘマラン（haemalaun）(Roth)で45秒間染色した。次いでこれらの切片を70％及び96％エタノールに使用するまで浸した。貯蔵期間を制限するために、一度に１０より多くの切片は調製しなかった。肺検体の選択された領域を視覚制御下でレーザー顕微解剖した(PALM、Bernried、Germany)。組織をシリンジニードルで採取して、10μlフィストストランド（fist strand）緩衝液(52mM Tris pH8.3、78mM KCl、3.1mM MgCl2)を入れた反応チューブ中に移した。 サンプルを液体窒素中で凍結させ、そしてさらなる調製のために貯蔵した。肺胞II型細胞顕微解剖のために、クリオスタット切片(厚さ10μm)をポリ−L−リジン(0.01％；Sigma、Deisenhofen、Germany)被覆スライド上に載せてアセトン中で５分間保存した。proSP−C染色のために、ポリクローナルウサギ抗bpro−SP−C抗体を塗布し(PBS中1:100；Chemicon、Temecula、CA)、続いてFITC−標識ヤギ抗ウサギIgG(PBS中1:40、Santa Cruz Biotechnology、CA)と共にインキュベートした。貯蔵期間を制限するために、一度に２つより多くの切片を調製しなかった。肺胞II型細胞をそれらの染色パターンに従って選択し、そして視覚制御下でレーザー顕微解剖した。５０の細胞輪郭を含むサンプルをそれぞれ液体窒素中で即座に凍結させ、そしてさらなる調製のために貯蔵した。
【００８８】
RNA単離及び逆転写酵素反応
全RNAをPeqGOLD Total RNAキット(PeqLab、Erlangen、Germany)を使用して製造者の指示書に従って抽出した。肺ホモジネート、顕微解剖した肺検体、単離された線維芽細胞又は顕微解剖したATII細胞からそれぞれ得られたRNA  １ｇを4μl 5xファーストストランド緩衝液(FSB、52mM TRIS pH 8.3、78mM KCl、3.1mM MgCl2)、2μl dNTP(それぞれ10mM、Fermentas、St. Leon−Rot、Germany)、1μlランダムヘキサマー(50μM)、1μl DDT(0.1M)、1μl Rnase阻害剤(40U／μl)及び1μl MuLV逆転写酵素(200U／μl、全てApplied Biosystems製、Foster City、CA)を含有する、Rnaseを含まない水(最終体積20μl)中の反応において使用した。反応混合物を43℃で１時間インキュベートし、次いで94℃で２分間インキュベートした(TGradient Thermocycler、Biometra、Goettingen、Germany)。
【００８９】
リアルタイムPCR
リアルタイムPCRをSequence Detection System 7700(PE Applied Biosystems、Foster City、CA)により行った。Platinum SYBR Green qPCR Super Mix−UDG(Invitrogen Karlsr
uhe、Germany)を用いてcDNA  2mlを使用して反応を行った。β−アクチン遺伝子を参照遺伝子として使用した。サイクリング条件は９５℃６分間、続いて９５℃２０秒、５５℃３０秒、そして７３℃３０秒を４５サイクルであった。融解曲線分析及びゲル電気泳動を行って期待されるPCR産物だけの増幅を確認した。既に記載されたように 2−ΔΔCT法を使用して遺伝子発現を評価した。内因系コントロールβ−アクチンと比較して標的遺伝子が何倍変化したか（fold change）を、等式 何倍変化したか＝2−ΔΔCT、[ここで−ΔΔCT＝処理された(Ct標的−Ctアクチン)−コントロール(Ct標的−Ctアクチン)］を使用することにより決定した。プライマー配列を表２に列挙する。
【００９０】
【表２】
2013527143.tif 000003
【００９１】
タンパク質単離及び定量
採取した細胞及び凍結肺検体を、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche、Mannheim、Germany)を含有するRIPA緩衝液(50mM TRIS−HCl pH 7.4、150mM NaCl、1mM EDTA、1％ Triton−X−100、1％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％ SDS)中で溶解した。溶解産物を氷上で３０分間インキュベートし、次いで遠心分離した(10000 rpm、４℃で１０分間)。上清を新しいチューブに入れて−80℃で保存した。BCATMタンパク質アッセイキット(Pierce、Rockford、IL)を使用して製造者の指示書にしたがってタンパク質の定量を行った。標準として様々なウシ血清アルブミン(BSA)濃度を使用した。
【００９２】
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動
タンパク質サンプルを5xSDS−ローディングバッファ(0.25mol／l Tris−HCl pH 6.8、10％(質量／体積)SDS、50％グリセロール、10％ β−メルカプトエタノール)と混合し、10分間煮沸し、SDSアクリルアミドゲル(濃縮用ゲル：4％アクリルアミド：ビスアクリルアミド、125mM Tris−HCl pH6.8、0.1％(質量／体積)SDS、0.1％(質量／体積)APS、0.1％(体積／体積）TEMED；分離ゲル(10％)：10％アクリルアミド：ビスアクリルアミド、375mM Tris−HCl pH8.8、0.1％(質量／体積)SDS、0.1％(質量／体積)APS、0.1％(体積／体積）TEMED)にロードし、そしてSDS−ランニングバッファ(25mM Tris、250mMグリシン、0.1％(質量／体積)SDS)で100Vで実行した。
【００９３】
免疫ブロット
SDSポリアクリルアミドゲル上で分離されたタンパク質を、転写バッファ(25mM Tris、192mMグリシン、20％(体積／体積）メタノール)中で湿式転写技術を使用してPVDF膜(Amersham Biosciences、Freiburg、Germany)に１時間100Vで転写した。0.1％(体積／体積）Tween20(TBS−T)を含有するtris緩衝化食塩水(TBS；25 mM Tris−Cl、150 mM NaCl、pH 7.5)中5％脱脂粉乳を用いてブロッキングした後、膜を4℃で終夜、TBS−T中1％BSAで希釈した適切な一次抗体とともにインキュベートした。ペルオキシダーゼ標識二次抗体(全てDako、Gostrup、Denmarkより)と共に１時間インキュベートした後、タンパク質をECL Plusキット(Amersham Biosciences、Freiburg、Germany)を使用して検出した。ゲルにロードされたタンパク質の量を決定するために、ブロットを１時間にし(抗体除去（stripping）バッファ：100mMグリシン、1％ HCl)、そして抗β−アクチン抗体又は適切な抗pan抗体を使用して再検出した。
【００９４】
免疫細胞化学
免疫細胞化学的分析のために、HLFを4％パラホルムアルデヒドを用いて１０分間固定し、リン酸緩衝化食塩水(PBS；137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、pH7.4)中0.2％TritonX−100を用いて10分間透過処理し、PBS中3％BSAで１時間室温にてブロッキングし、そして以下の抗体のうちの１つと共に終夜４℃でインキュベートした：マウス抗FXII、ウサギ抗IV型コラーゲン、マウス抗フィブロネクチン(全てAbcamから)、ヤギ抗ビメンチン(Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA)、及びウサギ抗ホスホ−Smad3(Cell Signaling)。スライドをローダミン結合二次抗体(Dianova、Hamburg、Germany)と共にインキュベートし、そしてVectashield封入剤(Vector、Burlingame、CA)を用いて封入した。核を4’，6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI；Sigma)染色により可視化した。一次抗体を非特異的抗体で置き換えることによりコントロールとした。画像を40×／1.25−0.75油浸対物レンズ（oil−objective）を備えたLeica DMR顕微鏡(Leica、Heidelberg、Germany)により室温で捕捉し、そしてMetaMorph7.0(Molecular Devices、Downingtown、PA)を使用して撮影した。例示した全ての画像は、少なくとも３つの独立した切片で見られた、１切片につき少なくとも４つの他の領域の代表である。
【００９５】
免疫組織化学
パラフィン包埋ホルマリン固定肺組織を5ミクロンの切片にし、そして適切な一次抗体及びZytoChem Plus AP−Fast Redキットを製造者の指示書(Zytomed Systems、Berlin、Germany)にしたがって使用して免疫組織化学染色のために処理した。ネガティブコントロールを、全ての場合において一次抗体を含めないことによって得た。
【００９６】
増殖アッセイ
初代マウス肺線維芽細胞を48ウェルプレートに播種し、そしてFXIIa(American Diagnostica、Stamford、CT)刺激の前に２４時間、無血清DMEM(ダルベッコ変法イーグル培地)で飢餓状態にした。いくつかの実験において、細胞を5μg／ml抗uPAR(R&D Systems、Wiesbaden、Germany)、抗β1−インテグリン又は抗α5−インテグリン(両方ともMillipore、Billerica、MAから)ブロッキング抗体と共に、FXIIaに曝露する前に１〜２時間プレインキュベートした。さらにいくつかの実験において、10.0μM PD98059、5μM SP600125、0.7μMウォルトマニン、3μM SB203580(全てCalbiochem、Darmstadt、Germanyから)を、FXIIaを加える１〜２時間前に細胞培養培地に加えた。細胞を3〜9μg／ml FXIIaのみで、又はその特異的阻害剤：トウモロコシトリプシンインヒビター(CTI、Calbiochem)、H−D−Pro−Phe−Arg−クロロメチルケトン(PCK、Bachem、Weil am Rhein、Germany)又はuPAR合成ペプチドの存在下で処理した。24〜36時間後に細胞を[3H]チミジン(１ウェルあたり0.2μCi)に6〜12時間曝露し、PBSで３回すすぎ、そして0.2ml 0.5M水酸化ナトリウムを用いて可溶化した。可溶化した物質0.1mlを液体シンチレーション測定(TRI−CARB(R)1500、A Canbera Company、Meriden、CT)により定量した。[3H]チミジン取り込みを絶対放射能として表した(１ウェルあたりのカウント毎分)。
【００９７】
免疫沈降
初代マウス線維芽細胞を、刺激しないか、又は6μg／ml FXIIaで30分間刺激し、そして20mM HEPES pH＝7.5、10mM EGTA、40mM β−グリセロホスフェート、1％TritonX−100、2.5mM MgCl2、1mM DTT、2mM PMSF、20μg／mlアプロチニン、20μg／mlロイペプチン、2mMバナジン酸ナトリウムを含有する緩衝液中で溶解した。３７℃で30分インキュベートした後、不溶性物質を10000rpmで４℃にて10分間の遠心分離によりペレット化した。細胞溶解物100μlをさらに終夜４℃でヤギ抗uPAR抗体(Santa Cruz)5μgと共に、又はヤギIgGコントロール抗体(R&D Systems)と共にインキュベートした。次にG−セファロース100μl(Amersham Biosciences)を加え、そして免疫複合体を１時間４℃で結合させた。次に、ビーズを溶解緩衝液で４回洗浄し、そして吸着物質を2xSDSローディングバッファで溶出した。煮沸した後、uPAR結合タンパク質をウェスタンブロットによりマウス抗FXII抗体(Abcam)を使用して分析した。
【００９８】
FXIIプロモーター構築物の生成及び部位特異的変異誘発
ヒトFXIIプロモーターフラグメントをPCRによりヒト肺DNAからロングPCR酵素ミックス(Fermantas、St. Leon−Rot、Germany)を使用して製造者の指示書にしたがって増幅した。サイクリング条件は：95℃5分間、続いて95℃で30秒間、55℃で30秒間、そして72℃で3分間を３５サイクルであった。以下のプライマーを使用した：
【化１】
2013527143.tif 000004
PCRフラグメントをpGL3エンハンサーベクター(Promega、Mannheim、Germany)にXhoI及びHindIII制限部位(太字)を使用してクローン化した。点変異をpGL3−299構築物中のCAGA
boxにQuikChange部位特異的変異誘発キット(Stratagene、La Jolla、CA)を使用して製造者の指示書に従って導入した。以下のプライマーを使用した：
【化２】
2013527143.tif 000005
成功したクローン化及び変異のCAGA boxへの挿入を配列決定により確認した。
【００９９】
一過性形質転換及びルシフェラーゼアッセイ
NIH3T3細胞を示されたプラスミドを用いてFuGene6(Roche、Mannheim、Germany)を使用して製造者の指示書に従ってトランスフェクトした。48時間後に、細胞を刺激しないか又は10ng／ml TGF−β1(R&D Systems)を用いてさらに24時間刺激した。その後、細胞を採取し、そしてルシフェラーゼレポーター活性についてPromegaルシフェラーゼアッセイキットを使用して製造者の指示書に従ってアッセイした。pEGF−N1(Clontech、Mountain View、CA)コントロールベクターを用いた同時トランスフェクションを使用してトランスフェクション効率について正規化した。
【０１００】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
ヒトSmad3(Dharmacon、Chicago、IL)、ヒトJNK1(Abnova、Heidelberg、Germany)に特異的な予め設計された市販のsiRNA配列、及び万能（universal）ネガティブコントロールsiRNA(Ambion、Austin、TX)を使用した。細胞をsiRNA(それぞれ250nM)でX−treme Gene siRNAトランスフェクション試薬(Roche)を使用して処理した。標的遺伝子のsiRNA媒介下方調節をトランスフェクションの７２時間後にウェスタンブロットにより評価した。この時点で細胞を刺激しないか又は 10ng／ml TGF−β1で24時間刺激し、そしてFXIIについてのウェスタンブロットを上記のように作製した。
【０１０１】
クロマチン免疫沈降(ChIP)
Millipore(Schwalbach、Germany)からのクロマチン免疫沈降アッセイキットを使用して製造者の指示書に従ってChIPを行った。簡単には、刺激されていないか又は10ng／ml TGF−β1(R&D Systems)で刺激されたNIH3T3細胞を1％ホルムアミドで10分間処理した。次いで架橋したクロマチンを製造し、そして平均サイズ500〜800bpまで超音波処理した。DNAフラグメントをウサギ抗Smad3抗体(Cell Signaling)又はIgGアイソタイプコントロールを用いて終夜４℃で免疫沈降させた。架橋から回復させた後、免疫沈降したクロマチンを以下のプライマーを使用するPCRにより増幅した：ヒトFXII−299 bp順方向：5'−CTTAACCTCCTGATCTCC−3'（配列番号25）；ヒトFXII−299bp逆方向：5'−CGTTGGTCCAGCTGCCTATC−3'（配列番号26）。PCR産物を2％アガロースゲルで分離し、そして臭化エチジウム染色により可視化した。
【０１０２】
ストレプトアビジンプルダウンアッセイ
二本鎖ビオチン化DNAフラグメント（SBE−283／−258：
【化３】
2013527143.tif 000006
又はSBE−283／−258 C／T：
【化４】
2013527143.tif 000007
に及ぶSBEをタンパク質相互作用について核抽出物20μg、20pmol／μlのビオチン化テンプレート、及びポリ(dI−dC)  1μgを含有する結合反応系100mlにおいてアッセイした。1時間30℃でインキュベートした後、結合緩衝液(20mM Hepes(pH7.9)、80mM KCl、10mM MgCl2、10％(体積／体積）グリセロール、2mM DTT、500μg／mlのBSA及び0.05％(体積／体積）Nonidet P−40)中で予め平衡化したストレプトアビジンMagneSphere常磁性粒子(Promega)を反応系に加え、そしてさらに１時間３０℃でインキュベートした。DNA−タンパク質複合体を洗浄緩衝液(20 mM HEPES(pH7.9)、50mM KCl、6.25mM MgCl2、0.5mM EDTA、2mM DTT、及び8.5％(体積／体積）グリセロール)で磁気デバイス(Dynal MPC(R)−E、磁気粒子濃縮装置)を使用して３回洗浄した。煮沸後に、DNA結合タンパク質をウェスタンブロットによりウサギ抗ホスホSmad3抗体(Cell Signaling)を使用して分析した。核抽出物を
【化５】
2013527143.tif 000008
核及び細胞質抽出試薬(Pierce、Rockford、IL)を使用して製造者の指示書に従って調製した。
【０１０３】
統計
そうではないと記載されていなければデータは平均値±SDとして示される。正規分布をシャピロ−ウィルク検定により分析した。２つの集団間の統計的比較を独立スチューデントｔ検定を使用して行った。複数のグループ間の差を一元配置分散分析法（One−way ANOVA）、続いてチューキー事後検定又はクラスカル−ワリス、続いてダンの事後検定（Dunn's post test）により比較した。p＜0.05のレベルを統計的に有意であるとみなした。生存曲線間の統計的有意性をログランク検定により評価した。
【０１０４】
結果
FXII、FXI及びHMWKの発現は、特発性肺線維症肺において変更される。
【０１０５】
特発性肺線維症(IPF)の病理発生における内因系凝固経路構成要素の潜在的役割を明らかにするために、IPF患者及びドナー由来の肺組織におけるFXII、FXII及びHMWKの発現を定量的リアルタイム(q)RT−PCRを使用して分析した。図1Aに示されるように、FXII及びHMWK mRNAレベルはIPF肺検体において顕著に上方調節された。内因系凝固経路構成要素の細胞特異的発現を、初代ヒト肺胞上皮細胞II型(ATII)並びにIPF患者及びドナーの肺由来の線維芽細胞において定量した。IPF肺組織から単離された肺線維芽細胞は、FXII mRNAをドナー肺由来の細胞よりも高いレベルで発現した。FXII mRNAはATII細胞において検出されなかった。IPF患者の肺由来のATII細胞及び肺線維芽細胞におけるFXI及びHMWK発現は、ドナーサンプルと比較して変化しなかった。さらに、IPF組織の線維性領域(図1F) 及び健康な領域(図1H)から顕微解剖された（microdesected）肺胞間中隔（alveolar septae）におけるFXII、FXI及びHMWKの発現を分析した(図1B)。IPF肺由来の健康な領域におけるFXII、FXI及びHMWKのmRNAレベルはドナー組織と比較して変化しなかった(図1C)。対照的に、IPF肺の線維性領域におけるFXII、FXI及びHMWK遺伝子の有意な上方調節があった。
【０１０６】
mRNA発現と一致して、FXII及びHMWKのタンパク質レベルはIPF肺において上方調節された。IPF肺におけるFXIタンパク質の発現は変化しなかった(図2A)。FXII発色性基質を使用した活性アッセイは、IPF患者由来の気管支肺胞（broncholaveolar）洗浄液(BALF)における増加した酵素活性FXIIを示した(図2B)。行われたアッセイの特異性は、その阻害剤であるトウモロコシトリプシンインヒビター(CTI)によるFXII活性の遮断により証明された。
【０１０７】
FXII、FXI及びHMWKの免疫組織化学染色を、ドナー及びIPF肺におけるこれらの因子の局在化を特徴付けるために行った。図3に示されるように、全ての内因系凝固因子の発現は、ドナー組織と比較してIPF切片において顕著に増加していた。FXIIの最も強い免疫反応性は、線維芽細胞において、及びATII細胞の表面上で観察された。FXIは主にATII細胞及び線維芽細胞において発現されたが、HMWKは単球に大部分存在していた。
【０１０８】
ブレオマイシン肺においてFXII、FXI及びHMWKの発現は高くなる。
【０１０９】
IPF肺における知見が肺線維症の動物モデルに変換可能であるか否かを決定するために、FXII、FXI及びHMWKの発現をブレオマイシンチャレンジマウスの肺において定量した。RT−PCRは、ブレオマイシン処理マウスからの肺ホモジネートにおいてブレオマイシン点滴注入後４日目及び２０日目でのFXII、FXI及びHMWKの上方調節を明らかにした(図4)。興味深いことに、FXII mRNAは初代マウス肺線維芽細胞及びATII細胞において検出されなかった。ブレオマイシン肺由来のATII細胞におけるFXI発現は変化しなかったが、肺線維芽細胞におけるその発現はブレオマイシン投与後１２日目に上方調節された。ブレオマイシン適用後２０日目に肺線維芽細胞におけるHMWK mRNAの有意な上方調節があったが、HMWK発現の変化はATII細胞において観察されなかった。
【０１１０】
IPF組織検体からの知見と比較して、免疫ブロットは、ブレオマイシン適用後４日目及び２０日目に肺ホモジネートにおけるFXII、FXI及びHMWKタンパク質レベルの同様な上方調節を示した（図5)。
【０１１１】
免疫学的局在決定研究により、食塩水で処理したマウスの肺において観察された弱いシグナルと比較して、ブレオマイシン損傷肺(適用の２０日後)におけるFXII、FXI及びHMWKの強い発現を確認した(図6)。正常コントロール肺における弱いFXII、FXI及びHMWK染色は、主に肺胞マクロファージにおいて観察された。ブレオマイシン適用後、FXII、FXI及びHMWKの強い免疫反応性は、線維性領域及び肺胞マクロファージにおいて明白であった。
【０１１２】
FXIIノックアウト又は阻害は、ブレオマイシン誘導肺線維症に対して保護する。
【０１１３】
肺線維症におけるFXIIの役割を決定するために、FXII欠損マウスをブレオマイシンでチャレンジした。ヘマトキシリン及びエオシン染色により明らかにされたように、２１日目に、ブレオマイシンで処理された野生型(WT)動物は、正常な肺構造のゆがみ、増加した間質壁厚、及び線維芽細胞数の増加を特徴とする顕著な肺線維症を示した(図7A)。対照的に、FXII欠損(FXII−/−)マウスは、肺における顕著に減少した線維性変化を有していた(図7C)。
【０１１４】
マッソントリクローム染色を行って、ブレオマイシンチャレンジ後の肺コラーゲン沈着における異常性を評価した。コラーゲンの蓄積は、FXII−/−マウス(図7D)と比較してWT動物(図7B)においてより顕著であった。最終的に、FXII−/−マウスの死亡率はWTマウスと比較して有意に低かった(図7E)。ブレオマイシンチャレンジ後２１日目に、WTマウスの死亡率は40％であったが、FXII−/−の死亡率は5％であった。フィブリン沈着におけるいずれかの変化がブレオマイシン適用後にWTマウス及びFXII−/−マウスにおいて生じるかどうかを決定するために、肺切片を抗フィブリン抗体を用いて染色した(図8)。ブレオマイシンを投与されたWT動物は、線維性領域において極度のフィブリン沈着を示した。フィブリン染色が線維症の領域のすぐ近傍、及び線維症の領域における肺胞腔において観察された。同様のパターンがブレオマイシンでチャレンジされたFXII−/−マウスの肺において明白であった。
【０１１５】
ブレオマイシン誘導肺損傷に対するFXII阻害の可能な治療効果を評価するために、食塩水コントロールマウス及びブレオマイシンチャレンジマウスに特異的FXII活性阻害剤であるトウモロコシトリプシンインヒビターを投与した。食塩水又はCTIを用量5mg／体重で9、12、15及び18日目に気管内投与した。２１日目にマウスを屠殺し、肺コンプライアンスを測定し、そして肺組織検体を集めた。食塩水を投与されたブレオマイシン処理マウスは、正常構造の損失及び広範なコラーゲン沈着を伴う重篤な線維性変化を示した(図9C、D)。コンプライアンスの強い減少は、広範な線維症の発症を反映していた(図9J)。対照的に、CTIを投与されたブレオマイシン処理マウスの肺における組織学的知見は、より少ない線維性病変を示した(図9G)。マッソン−トリクローム染色により評価したコラーゲン蓄積は、FXII阻害剤で処理した動物において顕著に減少していた(図9H)。さらに、CTI処理動物のコンプライアンスは有意に改善された(図9J)。ブレオマイシンチャレンジの２１日後に、食塩水処理マウスの死亡率は80％であったが、一方CTIを投与された動物の死亡率は20％であった(図9I)。CTIを投与されたコントロール動物は肺において組織学的変化を有していなかったが、それらは気腔中への炎症細胞の軽度の浸潤を示した(図9E)。CTIのこの副作用はその治療適用を制限するかもしれない。
【０１１６】
ブラジキニン受容体1／2ノックアウトマウスはブレオマイシン誘導肺線維症に対して保護されない。
【０１１７】
FXIIaは血漿プレカリクレインの強力な活性化因子である。活性化されたカリクレインはさらにHMWKをHKa及びブラジキニン(BK)に切断し、これが２つのGタンパク質共役受容体：B1及びB2を介して血管拡張剤及び炎症促進性ペプチドとして作用する。FXII誘導ブラジキニン送達が肺線維症の発症に寄与するかどうかを決定するために、ブラジキニン1及び2受容体欠損マウス(B1B2−/−)をブレオマイシンでチャレンジした。ブレオマイシン適用の２１日後に、WT及びB1B2−/−動物の両方が、H&E染色及びマッソン−トリクローム染色によりそれぞれ証明されるように、肺における強い線維性変化及びコラーゲン蓄積を生じた(図10A)。ブレオマイシン投与後のWTマウスと比較して、肺コンプライアンス(図10C)及び生存(図10B)の改善はB1B2−／−において見られなかった。
【０１１８】
FXIIは肺線維芽細胞の増殖を刺激する。
【０１１９】
FXIIは、ヒトヘパトーム(Hep2)細胞、平滑筋細胞、II型肺胞細胞及び内皮細胞に対してマイトジェンとして作用することが報告されている。集中的な線維芽細胞増殖が肺線維症の特徴であることを考慮して、FXIIが肺線維芽細胞増殖も制御し得るかどうかを確認することは興味が持たれる。この問いに答えるために、マウス肺線維芽細胞を増加する濃度のFXIIaで刺激し、そして[3H]−チミジン取り込みを測定した。DNA合成の用量依存性増加がFXIIa処理の後に観察された(図11A)。FXII誘導増殖はFXIIa特異的阻害剤であるCTIにより遮断された。さらに、FXIIaへの曝露後の増加したサイクリンD発現により、マウス肺線維芽細胞に対するFXIIaマイトジェン活性が確認された(図11B)。
【０１２０】
マウス肺線維芽細胞のFXIIa誘導増殖に対する様々なシグナル伝達経路の寄与を調べるために、FXIIa刺激に応じたMAPKs及びAktリン酸化動力学を分析した。p38、p44／42及びAkt活性における顕著な増加が１５分後に見られたが、一方JNK及びc−junのリン酸化は観察されなかった。FXIIa曝露の３０分後に、CTIはp44／42及びAktリン酸化を減弱させた。リン酸化動力学の決定の後、次にこれらの経路の妨害がマウス肺線維芽細胞のFXII誘導増殖に影響を及ぼすかどうかを分析した。この問題を評価するために、JNK、PI3K、MEK及びp38キナーゼの特異的阻害剤(それぞれSP600125、ウォルトマニン、PD98059、及びSB203580)を使用し、そしてFXIIaマイトジェン活性に対するそれらの効果を評価した。図12A、Bに示されるように、PD98059によるMEK活性の阻害は、FXIIaに応じたマウス肺線維芽細胞増殖の減少をもたらした。DNA合成における変化は、細胞をPI3K、JNK、及びp38キナーゼの阻害剤で前処理した場合に見られなかった。
【０１２１】
FXIIは、gC1qR、ウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子受容体(uPAR)及びサイトケラチン1(CK1)との複合で内皮細胞表面に結合すると報告された。さらに、uPARがFXII融合内皮細胞増殖に関与しているということを示す研究がある。uPARがマウス肺線維芽細胞に対するFXIIaマイトジェン活性を媒介するかどうかを調べるために、FXIIa刺激の前に細胞を抗uPARブロッキング抗体で細胞を処理した。[3H]−チミジン取り込みにより測定された細胞増殖は、抗uPAR抗体により遮断された(図13A)。さらに、uPARのドメイン２に対応するペプチドを使用した実験により、FXIIaマイトジェン活性に関するこの受容体の重要性が確認され、そしてuPAR上の潜在的なFXII結合部位が明らかとなった。uPARのドメイン2からのペプチドLRG20(166〜185位)は、FXIIa刺激後のDNA合成の増加を遮断した(図13B)。相対的に、ドメイン2由来の(196〜214位)ペプチドTCK及びランダムなペプチドはFXIIa誘導増殖に対して効果を有していなかった。
【０１２２】
前の知見を確認するために、本発明者らは、uPAR欠損マウス(uPAR−/−)からマウス肺線維芽細胞を単離し、そしてそれらをFXIIaに曝露した。野生型細胞と対照的に、uPAR欠損肺線維芽細胞はFXIIaに応答しなかった(図14A)。これらのデータは、uPARがFXIIaマイトジェン活性に必要であるということを示した。この観察から、uPARがFXIIaタンパク質と相互作用するかどうかという疑問が生じた。この問題を調べるために、免疫沈降アッセイを行った。免疫沈降のために、刺激されていないか又はFXIIaで３０分間刺激された細胞から溶解物を調製した。抗uPAR抗体を使用して、FXIIをFXIIaに曝露した細胞の溶解物から免疫沈降させた。uPARはアイソタイプコントロール抗体と共に免疫沈降しなかった。これらを元に、これらの結果はuPAR依存性の様式でFXIIがマウス肺線維芽細胞増殖を誘導するということを実証した。uPARはキナーゼ活性を有しておらず、そして細胞内経路と直接的に相互作用しないという事実に基づいて、他のタンパク質がこの機構に関与しているか否かという疑問が生じた。膜貫通構造のないグリコシルホスファチジルイノシトール固定uPARがどのようにシグナル伝達を媒介するのかということが不明である。uPARは、結合したタンパク質としてのインテグリンとのｃｉｓ−相互作用を形成し、そしてそれにより、そのリガンドであるウロキナーゼが結合すると細胞に増殖シグナル又は遊走シグナルを伝達すると提案されている。共鳴エネルギー移動顕微鏡観察法及び精製された組み換えタンパク質との同時免疫沈降（co−immunoprecipitation）を使用した研究は、uPARがβ1−インテグリン及びβ2−インテグリンのサブセットと複合体を形成し、そしてこれらの分子のシグナル伝達能を調節するということを示した。これらの報告、及びFXIIa刺激後にフィブロネクチンに対する線維芽細胞の増加した接着を示した本発明者ら自身の研究に基づいて、フィブロネクチン受容体α5β1インテグリンがFXIIマイトジェン活性に影響を及ぼすかどうかを調べた。α5又はβ1インテグリンブロッキング抗体を用いた肺線維芽細胞の前処理は、FXIIに対する曝露後の[3H]−チミジン取り込みを消失させたが、IgGコントロール抗体は効果を有していなかった(図15)。この観察は、α5β1インテグリンがFXIIa誘導マウス肺線維芽細胞増殖に関与しているということを示唆した。
【０１２３】
TGF−β1はヒト肺線維芽細胞においてFXII発現を調節する。
【０１２４】
TGF−β1はHLFにおいてFXII mRNA及びタンパク質レベルを上方調節する。
HLFの10ng／ml TGF−β1への曝露は、時間依存性の様式でFXIIの合成を刺激した。リアルタイムRT−PCR分析は、処置の４時間後にFXII mRNA発現の最も強い誘導を実証した(図16A)。最大FXIIタンパク質レベルは、48時間の刺激時間内に達成され、７２時間を過ぎてわずかに減少した(図16B、C)。免疫蛍光染色により、TGF−β1に応じたFXIIの顕著な発現が明らかとなった。FXIIを細胞表面、さらにはHLFの細胞質画分で検出した。単離されたHLFの純度を、フィブロネクチン、ビメンチン、及びIV型コラーゲンについてのポジティブ染色により確認した。
【０１２５】
TGF−β1はMAPK、Akt及びSmad3のリン酸化を誘導する。
HLFにおけるTGF−β1誘導FXII産生への様々なシグナル伝達経路の寄与を細かく調べるために、TGF−β1刺激に応じたMAPKs、Akt、及びSmadのリン酸化動力学を分析した。p42／44及びp38キナーゼのリン酸化は６０分にピークに達し、次いで徐々に減少した。JNK活性の顕著な増加が６０分後に見られたが、一方でAktの増強されたリン酸化は１２０分後に確認された(図17A)。期待されたように、TGF−β1は30〜60分以内の最大応答を伴うSmad3の急速なリン酸化を誘導した(図17B)。c−junの活性化は検出できなかった(データは示していない)。免疫蛍光分析により、ホスホ−Smad3の核へのTGF−β1誘導移行が実証された。従って、増加したレベルのホスホ−Smad3がTGF−β1処理後の核抽出物において観察された(図17C)。ラミンB及びチューブリンをローディングコントロールとして使用して核画分の純度を評価した。
【０１２６】
Smad3及びJNKキナーゼはHLFにおけるTGF−β1誘導FXII発現を調節する。
リン酸化動力学を決定した後、次に本発明者らは、これらの経路への干渉がHLFにおけるTGF−β1誘導FXII発現に影響を与えるか否かを分析しようとした。これを特徴付けるために、TβRI、JNK、PI3K、MEK及びp38キナーゼの特異的阻害剤(それぞれSB431542、SP600125、ウォルトマニン、PD98059、及びSB203580)を使用し、そしてFXIIのTGF−β1刺激発現に対するそれらの効果を評価した。図18A、Bに示すように、それぞれSB431542及びSP600125によるTβRI及びJNK活性の阻害は、TGF−β1に応じたFXII発現の減少をもたらした。HLFをAkt、p44／42、及びp38キナーゼの阻害剤で前処理した場合はFXIIの発現の変化は見られなかった。これらの結果をさらに確認するために、HLFをJNK1特異的又はSmad3特異的siRNAでトランスフェクトし、これらはウェスタンブロットにより実証されたように、これらのタンパク質の有意なノックダウンを生じた(図18C、F)。図18D及びEに示されるように、JNK1のノックダウンはTGF−β1刺激後のFXII発現の阻害を生じた。Smad3を枯渇させた場合に同様の結果が得られた(図18G、H)。
【０１２７】
JNKキナーゼは、Smad3のリン酸化及び核への移行を調節しない。
次の実験において、Smad3のリン酸化及び核への移行におけるJNKキナーゼの役割を調べた。HLFをJNK阻害剤(SP600125)と共にインキュベートしてもSmad3リン酸化は減少しなかったが、JNK活性は完全に消滅した(図19A)。TβRI阻害剤(SB431542)はTGF−β1に応じたSmad3及びJNK1のリン酸化を減弱させ、このことはSmad3及びJNKのリン酸化がTGF−β1シグナル伝達経路における最も近位の分子であるTβRIから始まることを示唆している(図19B)。さらに、HLFのSP600125への曝露は、TGF−β1誘導Smad3核移行に対して効果を有していなかったが、一方でSB431542はこのプロセスを完全に遮断する(図19C)。同様の結果が免疫蛍光分析により得られた。SB431542及びSP600125は単独で核におけるSmad3の蓄積に影響を及ぼさなかった(データ示していない)。これらの結果は、JNKキナーゼが、Smad3のリン酸化及び核への移行に対するいずれの効果も存在しない場合にTGF−β1誘導FXII発現を調節することができるということを示す。
【０１２８】
TGF−β1は、−272位に位置するSBEを介してFXIIプロモーター活性を誘導する。
TGF−β1誘導FXII産生に必要なDNAエレメントを同定するために、一連のヒトFXIIプロモーター欠失構築物(−1630bp；−907bp；−577bp；−299bp；図20A)を用いてNIH3T3細胞を一過性トランスフェクトし、次いで未処理の細胞及びTGF−β1処理細胞におけるルシフェラーゼ活性を測定した。それらの高いトランスフェクション効率のためにNIH3T3細胞をこれらの研究で使用した。pGL3−1630；pGL3−907；及びpGL3−577構築物でトランスフェクトされた細胞は、TGF−β1に応じたルシフェラーゼ活性の増加を示さなかったが、一方でFXIIプロモーター活性の強い誘導がpGL3−299でトランスフェクトした細胞において観察された(図20B)。これらの結果は、ヒトFXIIプロモーターにおける−299／＋1bp内の TGF−β1応答エレメントの存在を示した。さらに、データは、−299bpの上流の領域に位置する抑制エレメントがTGF−β1の刺激作用を弱め得るということを示唆した。
【０１２９】
−299／+1bp間にあるFXIIプロモーターのTGF−β1応答エレメントを同定するために、このDNA領域をコンセンサスsmad結合エレメント(SBE)に付いて調べた。この分析により、−272bpの位置での推定SBEが同定された(SBE−272、図20C)。期待されたように、SBE−272の点変異は、TGF−β1に応じたFXIIプロモーター活性を完全に消滅させた(図20D)。これらの結果を確認するために、SBE−272を欠いた構築物を生成した(図21A)。−299と−183との間の配列の欠失は、FXIIプロモーターがTGF−β1に対する応答性をもたらす能力を抑制した(図21B)。同様の結果が、初代HLFを使用した場合に観察された(データは示していない)。次に、FXII発現の調節におけるJNK／Smad3シグナル伝達経路の役割を、遺伝子ルシフェラーゼ活性アッセイにより試験した。細胞をpGL3−299構築物でトランスフェクトし、示された阻害剤で前処理し、次いで刺激しないか、又は10ng／ml TGF−β1で刺激した。図21Cに示されるように、TGF−β1駆動ルシフェラーゼ活性は、SB431542及びSP600125阻害剤の存在下でのみ強く減少した。
【０１３０】
Smad3はFXIIプロモーター内のSBE−272と相互作用する。
Smad3のSBE−272との相互作用を調べるために、ChIP及びストレプトアビジンプルダウンアッセイを行った。ChIPアッセイは、SBE−272に隣接するFXIIプロモーター領域(−299／+1 bp)とのSmad3のTGF−β1誘導相互作用を明らかに実証した(図22A)。Smad3のSBE−272への結合をさらに分析するために、FXIIの−283及び−258bp領域にわたるビオチン化テンプレートを使用してストレプトアビジンプルダウンを行った。期待されたように、Smad3はこのテンプレートから溶出されたが、SBE−272を変異させた場合は相互作用が起こらなかった(図22B)。これらの知見は、Smad3−SBE−272がTGF−β1を用いたHLFの刺激後に複合体を形成するということを示した。
【０１３１】
JNKキナーゼはSmad3のSBE−272への結合に影響を及ぼす。
JNKキナーゼの阻害はリン酸化及びSmad3の核への移行に対して影響を有していなかったので、このキナーゼのSmad3−SBE−272複合体の形成への関与をChIP及びストレプトアビジンプルダウンアッセイにより調べた。TβRI阻害剤又はJNK1阻害剤(それぞれSB431542又はSP600125)で前処理したHLFを、刺激しないか又はTGF−β1で刺激し、溶解し、そして抗Smad3抗体及びIgGアイソタイプ（isotyp）コントロールを使用してChIPアッセイを行った。TGF−β1はSmad3−DNA複合体形成を誘導した。この相互作用はSB431542を使用した場合に完全に消滅し、そしてSP600125の存在下では劇的に減少した(図22C)。SB431542及びSP600125は単独ではSmad3とDNAとの相互作用に影響を及ぼさなかった(データは示していない)。ストレプトアビジンプルダウンアッセイを行った場合に同様の結果が得られた(図22D)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２４−３】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２５−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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