(57)【要約】  この発明は、炎症及び／又は過度の血液凝固の処置又は予防における使用のための、血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質に由来するアミノ酸配列、又はその断片、変異体、融合体若しくは誘導体、又は前記断片の融合体、その変異体若しくは誘導体を含んでなるか、又はこれらから成るポリペプチドを提供する。本発明の関連する局面は、抗炎症活性を示す、配列番号１〜３のアミノ酸配列、又はその断片、変異体、融合体又は誘導体、あるいは前記断片の融合体、その変異体又は誘導体を含んでなるか、又はこれらから成る単離されたポリペプチド、並びにそれを製造するための単離された核酸分子、ベクター及び宿主細胞を提供する。これに加えて、本発明のポリペプチドを含んでなる医薬組成物、並びに炎症及び／又は過度の血液の凝固の処置及び／又は予防におけるその使用方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症及び／又は過度の血液の凝固の処置又は予防における使用のための、ヘパリンコファクターIIに由来するアミノ酸配列、又はその断片、変異体若しくは誘導体を含んでなるか、又はこれらから成るポリペプチドであって、
該断片、変異体若しくは誘導体は、抗炎症活性及び／又は抗凝固活性を示し、
該ポリペプチドは、１５〜１００個のアミノ酸の長さである、
上記ポリペプチド。
【請求項２】
ポリペプチドが天然に存在するタンパク質ではない、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
ヘパリンコファクターIIが、ヒトヘパリンコファクターIIである、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ヘパリンコファクターIIがスイスプロットアクセッション番号Ｐ０５５４６である、請求項３に記載ののポリペプチド。
【請求項５】
下記の配列番号１〜３のいずれか１つのアミノ酸配列：
“ＫＹＥ２８”：ＫＹＥＩＴＴＩＨＮＬＦＲＫＬＴＨＲＬＦＲＲＮＦＧＹＴＬＲ［配列番号１］
“ＫＹＥ２１”：ＫＹＥＩＴＴＩＨＮＬＦＲＫＬＴＨＲＬＦＲＲ［配列番号２］
“ＮＬＦ２０”：ＮＬＦＲＫＬＴＨＲＬＦＲＲＮＦＧＹＴＬＲ［配列番号３］
又はその断片、変異体若しくは誘導体を含んでなるか、又はこれらから成るポリペプチドであって、該断片、変異体若しくは誘導体は、配列番号１〜３のいずれか１つの抗炎症活性を保持している、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号１〜３のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
ポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体が、Ｌ−アミノ酸を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
ポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体が、修飾されているか、あるいは誘導体化されている１つ又はそれより多いアミノ酸を含んでなる、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
１つ又はそれより多いアミノ酸が、ＰＥＧ化、アミド化、エステル化、アシル化、アセチル化及び／又はアルキル化によって、修飾されているか又は誘導体化されている請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列の断片を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
断片が、配列番号３の少なくとも５個の連続したアミノ酸、例えば少なくとも、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６又は２７個の連続したアミノ酸を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
ポリペプチドが、配列番号１〜３のいずれか１つのアミノ酸配列の変異体を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
変異体が、配列番号１〜３のいずれか１つのアミノ酸配列と、アミノ酸配列で少なくとも５０％の同一性、例えば少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％の同一性を有する、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
ポリペプチドが１５〜５０個のアミノ酸の長さ、例えば１５〜３０、１７〜３０、又は１７〜２８個のアミノ酸の長さである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
ポリペプチドが少なくとも２０個のアミノ酸の長さである、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
ポリペプチドが線状である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
ポリペプチドが組み換え型ポリペプチドである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
ポリペプチドがヒト単球由来のマクロファージに起源する１つ又はそれより多い炎症誘発性サイトカインの放出を抑制することができる、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
炎症誘発性サイトカインが、マクロファージ阻害因子、ＴＮＦ−α、ＨＭＧＢ１、Ｃ５ａ、ＩＬ−１７、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＩＦＮ−γ、Ｉｌ−６、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−１２から成る群より選択される、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
ポリペプチドが血小板活性化を遮断することができる、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
ポリペプチドが、白血球、上皮細胞（ケラチノサイトを含む）及び／又は間葉細胞（線維芽細胞を含む）におけるトル様受容体（ＴＬＲ）シグナル伝達を妨害することができる、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
ポリペプチドが、１つ又はそれより多い以下のモデル：
（ａ）刺激剤として、ＬＰＳ、ＬＴＡ、ザイモサン、フラジェリン、ダニ、ウイルス若しくは細菌のＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はペプチドグリカンを用いるインビトロマクロファージモデル；
及び／又は
（ｂ）エンドトキシン・ショックのインビボマウスモデル；
（ｃ）抗微生物療法と組み合わせるか、又は単独で与える、インビボ感染症モデル
において抗炎症活性を示す、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
ポリペプチドが抗凝固活性を示す、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
炎症及び凝固の併用処置又は予防に使用するための、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
ポリペプチドがトル様受容体（ＴＬＲ）遮断活性を示す、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
感染症に関連する炎症の処置又は予防に使用するための、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
下記から選択される疾患、状態又は適応の処置又は予防に使用するための請求項１〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド：
ｉ）感染性要素の有無にかかわらず、急性全身性炎症疾患、例えば全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、ＡＲＤＳ、敗血症、重症敗血症、及び敗血症性ショック；丹毒、髄膜炎、関節炎、トキシックショック症候群、憩室炎、中垂炎、膵炎、胆嚢炎、大腸炎、蜂巣炎、火傷感染症、肺炎、尿路感染症、術後感染症、及び腹膜炎を含む、他の全身性又は限局性で侵襲性の感染性及び炎症性疾患：
ｉｉ）下記を含む慢性炎症性及び／又は感染性疾患；嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ及び他の肺疾患、慢性皮膚及び胃潰瘍を含む胃腸疾患、アトピー性皮膚炎、口腔内潰瘍（アフタ性潰瘍）、陰部潰瘍及び炎症性変化、歯周炎、結膜炎及び角膜炎を含む眼の炎症、外耳炎、中耳炎、泌尿生殖器の炎症などの他の上皮炎症性及び／又は感染性疾患：
ｉｉｉ）術後炎症；血栓症、ＤＩＣ、術後凝固異常、並びに体外循環、及び生体材料の使用を含む異物との接触に関連する凝固異常を含む、炎症性及び凝固異常；更に、血管炎関連炎症性疾患、並びにアレルギー性鼻炎及び喘息を含むアレルギー：
ｉｖ）過度の接触活性化及び／又は脳卒中（これらに限定されない）に関連する凝固：
ｖ）抗微生物剤処置との併用での過度の炎症；使用される抗微生物剤は、種々のルートによって投与することができる；静脈内（ｉｖ）、動脈内、硝子体内、皮下（ｓｃ）、筋肉内（ｉｍ）、腹腔内（ｉｐ）、膀胱内、髄こう内、硬膜外、経腸（経口、直腸、胃内、及び他の経腸ルートを含む）、又は局所的（皮膚、鼻への適用、例えば滴剤による眼又は耳内の適用、及び肺吸入を含む）；薬剤の例には、ペニシリン系、セファロスポリン系、カルバセフェム系、セファマイシン系、カルバペネム系、モノバクタム系、アミノグリコシド系、グリコペプチド系、キノロン系、テトラサイクリン系、マクロライド系、及びフルオロキノロン系がある；防腐剤には、ヨウ素、銀、銅、クロルヘキシジン、ポリヘキサニド及び他のビグアニド類、キトサン、酢酸、及び過酸化水素が含まれる。
【請求項２８】
急性炎症、敗血症、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、喘息、アレルギー性及び他のタイプの鼻炎、皮膚血管炎及び全身性血管炎、血栓症及び播種性血管内凝固（ＤＩＣ）の処置又は予防に使用するための、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
敗血症の処置又は予防に使用するための、請求項２８に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の処置又は予防に使用するための、請求項２８に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
１つ又はそれより多い別の治療薬と組み合わせて使用するための、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
別の治療薬が、抗生剤、抗真菌剤、防腐剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、血管作用薬、受容体遮断薬、受容体作動薬及び防腐剤から成る群より選択される、請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
抗生剤が、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤及び駆虫剤から成る群より選択される、請求項３２に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
抗炎症活性及び／又は抗微生物活性及び／又は抗凝固活性を示す、ヘパリンコファクターIIに由来するアミノ酸配列、又はその断片、変異体若しくは誘導体を含んでなるか、これらから成る単離されたポリペプチドであって、
該ポリペプチドは、１５〜１００個のアミノ酸の長さであり、
但し、該ポリペプチドは天然に存在するタンパク質ではないことを条件とする、上記単離されたポリペプチド。
【請求項３５】
ヘパリンコファクターIIが、ヒトヘパリンコファクターIIである、請求項３４に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
ヘパリンコファクターII（ＨＣII）が、スイスプロットアクセション番号Ｐ０５５４６に該当する、請求項３４又は３５に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
下記の配列番号１〜３のいずれか１つのアミノ酸配列：
“ＫＹＥ２８”：ＫＹＥＩＴＴＩＨＮＬＦＲＫＬＴＨＲＬＦＲＲＮＦＧＹＴＬＲ  ［配列番号１］
“ＫＹＥ２１”：ＫＹＥＩＴＴＩＨＮＬＦＲＫＬＴＨＲＬＦＲＲ  ［配列番号２］
“ＮＬＦ２０”：ＮＬＦＲＫＬＴＨＲＬＦＲＲＮＦＧＹＴＬＲ  ［配列番号３］、
又は配列番号１〜３のいずれか１つの抗炎症活性及び／又は抗微生物活性及び／又は抗凝固活性を保持している、その断片、変異体若しくは誘導体を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
配列番号１〜３のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項３７に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
ポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体がＬ−アミノ酸を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項３４〜３８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
ポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体が、修飾されているか、又は誘導体化されている１つ又はそれより多いアミノ酸を含んでなる、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
１つ又はそれより多いアミノ酸が、ＰＥＧ化、アミド化、エステル化、アシル化、アセチル化及び／又はアルキル化によって、修飾されているか又は誘導体化されている、請求項４０に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
ポリペプチドが、１５〜５０、１５〜３０、１７〜３０、又は１７〜２８個のアミノ酸の長さである、請求項３４〜４１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
ポリペプチドが、少なくとも２０個のアミノ酸の長さである、請求項４２に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
ポリペプチドが線状である、請求項３４〜４３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
ポリペプチドが組み換えポリペプチドである、請求項３４〜４４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
ポリペプチドが、ヒト単球由来のマクロファージに起源する１つ又はそれより多い炎症誘発性サイトカインの放出を抑制することができる、請求項３０〜４２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４７】
炎症誘発性サイトカインが、マクロファージ阻害因子、ＴＮＦ−α、ＨＭＧＢ１、Ｃ５ａ、ＩＬ−１７、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＩＦＮ−γ、Ｉｌ−６、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−１２から成る群より選択される、請求項４６に記載のポリペプチド。
【請求項４８】
ポリペプチドが、血小板活性化を遮断することができる、請求項３４〜４７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４９】
ポリペプチドが、白血球、上皮細胞（ケラチノサイトを含む）及び／又は間葉細胞（線維芽細胞を含む）におけるトル様受容体（ＴＬＲ）シグナル伝達を妨害することができる、請求項３４〜４８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５０】
ポリペプチドが、１つ又はそれより多い以下のモデル：
（ａ）刺激剤として、ＬＰＳ、ＬＴＡ、ザイモサン、フラジェリン、ダニ、ウイルス若しくは細菌のＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はペプチドグリカンを用いるインビトロマクロファージモデル；
（ｂ）エンドトキシン・ショックのインビボマウスモデル；
及び／又は
（ｃ）抗微生物療法と組み合わせるか、又は単独で与える、インビボ感染症モデル；
において抗炎症活性を示す、請求項３０〜４６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５１】
ポリペプチドが抗凝固活性を示す、請求項３４〜５０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５２】
ポリペプチドがトル様受容体（ＴＬＲ）遮断活性を示す、請求項３４〜５１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５３】
請求項３４〜５２のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項５４】
請求項５３に記載の核酸分子を含んでなる、ベクター。
【請求項５５】
ベクターが発現ベクターである、請求項５４に記載のベクター。
【請求項５６】
請求項５３に記載の核酸分子、又は請求項５４又は５５に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項５７】
前記ポリペプチドが発現される条件下で、請求項５６に記載の宿主細胞の集団を培養し、そしてそれからポリペプチドを単離することを含んでなる、請求項３４〜５２のいずれか１項に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項５８】
ポリペプチドの液相又は固相合成を含んでなる、請求項３４〜５２のいずれか１項に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項５９】
請求項３４〜５２のいずれか１項に記載のポリペプチドを、製薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、担体、バッファー又はアジュバントと一緒に含んでなる、医薬組成物。
【請求項６０】
局所、眼内、経鼻、経肺、口腔、非経口（静脈内、皮下、髄こう内及び筋肉内）、経口、膣内及び直腸から成る群より選択される経路を介して投与するのに適している、請求項５９に記載の医薬組成物。
【請求項６１】
インプラントを介する投与に適している、請求項５９に記載の医薬組成物。
【請求項６２】
医薬組成物が、医療に使用されるデバイス又は材料に関連する、請求項６０又は６１に記載の医薬組成物。
【請求項６３】
デバイスが、バイパス手術、体外循環、創傷ケア及び／又は透析において使用されるデバイスである、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６４】
医薬組成物が、縫合糸、人工補綴物、インプラント、創傷被覆材、カテーテル、レンズ、皮膚移植片、代用皮膚、フィブリン接着剤又は包帯に、被覆されるか、塗られるか、噴霧されるか、又はその他の方法で適用される、請求項６２又は６３に記載の医薬組成物。
【請求項６５】
デバイス又は材料が、ポリマー、金属、金属酸化物及び／又はセラミックを含んでなるか、又はこれらから成る、請求項６２〜６４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６６】
医療に使用するための、請求項３４〜５２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６７】
炎症及び／又は過度の凝固の処置又は予防に使用するための、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
急性及び／又は慢性炎症の処置及び／予防に使用するための、請求項６６又は６７に記載のポリペプチド。
【請求項６９】
微生物感染症（例えば、細菌感染症）の処置及び／予防に使用するための、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項７０】
血液凝固のモジュレーションに使用するための、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項７１】
創傷の処置に使用するための、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項７２】
下記から選択される疾患、状態又は適応の処置又は予防に使用するための請求項６６又は７１のいずれか１項に記載のポリペプチド：
ｉ）感染性要素の有無にかかわらず、急性全身性炎症疾患、例えば全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、ＡＲＤＳ、敗血症、重症敗血症、及び敗血症性ショック；丹毒、髄膜炎、関節炎、トキシックショック症候群、憩室炎、中垂炎、膵炎、胆嚢炎、大腸炎、蜂巣炎、火傷感染症、肺炎、尿路感染症、術後感染症、及び腹膜炎を含む、他の全身性又は限局性で侵襲性の感染性及び炎症性疾患：
ｉｉ）下記を含む慢性炎症性及び／又は感染性疾患；嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ及び他の肺疾患、慢性皮膚及び胃潰瘍を含む胃腸疾患、アトピー性皮膚炎、口腔内潰瘍（アフタ性潰瘍）、陰部潰瘍及び炎症性変化、歯周炎、結膜炎及び角膜炎を含む眼の炎症、外耳炎、中耳炎、泌尿生殖器の炎症などの他の上皮炎症性及び／又は感染性疾患：
ｉｉｉ）術後炎症；血栓症、ＤＩＣ、術後凝固異常、並びに体外循環、及び生体材料の使用を含む異物との接触に関連する凝固異常を含む、炎症性疾患及び凝固異常；更に、血管炎関連炎症性疾患、並びにアレルギー性鼻炎及び喘息を含むアレルギー：
ｉｖ）過度の接触活性化及び／又は脳卒中（これらに限定されない）に関連する凝固：
ｖ）抗微生物剤処置との併用での過度の炎症；使用される抗微生物剤は、種々のルートによって投与することができる；静脈内（ｉｖ）、動脈内、硝子体内、皮下（ｓｃ）、筋肉内（ｉｍ）、腹腔内（ｉｐ）、膀胱内、髄こう内、硬膜外、経腸（経口、直腸、胃内、及び他の経腸ルートを含む）、又は局所的（皮膚、鼻への適用、例えば滴剤による眼又は耳内の適用、及び肺吸入を含む）；薬剤の例には、ペニシリン系、セファロスポリン系、カルバセフェム系、セファマイシン系、カルバペネム系、モノバクタム系、アミノグリコシド系、グリコペプチド系、キノロン系、テトラサイクリン系、マクロライド系、及びフルオロキノロン系がある；防腐剤には、ヨウ素、銀、銅、クロルヘキシジン、ポリヘキサニド及び他のビグアニド類、キトサン、酢酸、及び過酸化水素が含まれる。
【請求項７３】
炎症及び／又は過度の凝固の処置又は予防のための薬剤の製造における、請求項３４〜５２のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項７４】
薬剤が、急性炎症、敗血症、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、喘息、アレルギー性及び他のタイプの鼻炎、皮膚血管炎及び全身性血管炎、血栓症及び播種性血管内凝固（ＤＩＣ）の処置又は予防における使用のためである、請求項７３に記載の使用。
【請求項７５】
薬剤が敗血症の処置又は予防における使用のためである、請求項７４に記載の使用。
【請求項７６】
薬剤が慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の処置又は予防における使用のためである、請求項７４に記載の使用。
【請求項７７】
薬剤が１つ又はそれより多い別の治療薬と組み合わせて使用するためである、請求項７３〜７６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７８】
別の治療薬が、抗生剤、抗真菌剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、血管作用薬及び防腐剤から成る群より選択される、請求項７７に記載の使用。
【請求項７９】
抗生剤が、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤及び駆虫剤から成る群より選択される、請求項７８に記載の使用。
【請求項８０】
別の治療薬がステロイドである、請求項７８に記載の使用。
【請求項８１】
患者の炎症を処置又は予防する方法であって、治療的に有効な量の請求項１〜５２のいずれか１項に記載のポリペプチド、又は請求項５９〜６５のいずれか１項に記載の医薬組成物を患者に投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項８２】
患者がヒトである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
急性炎症、敗血症、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、喘息、アレルギー性及び他のタイプの鼻炎、皮膚血管炎及び全身性血管炎、血栓症及び播種性血管内凝固（ＤＩＣ）の処置又は予防のための、請求項９５又は９６に記載の方法。
【請求項８４】
敗血症の処置又は予防のための、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の処置又は予防のための、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
１つ又はそれより多い別の治療薬を患者に更に投与する、請求項８１〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
別の治療薬が、抗生剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、血管作用薬、受容体遮断薬、受容体作動薬及び防腐剤から成る群より選択される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
抗生剤が、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤及び抗寄生虫剤から成る群より選択される、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
別の治療薬がステロイドである、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
明細書及び図面を参照して実質的にここに記載されている、ポリペプチド。
【請求項９１】
明細書及び図面を参照して実質的にここに記載されている、医薬組成物。
【請求項９２】
明細書及び図面を参照して実質的にここに記載されている医療用インプラント若しくはデバイス、又は生体材料に使用するための、医療用インプラント若しくはデバイス、又は生体材料。
【請求項９３】
明細書及び図面を参照して実質的にここに記載されている、ポリペプチドの使用。
【請求項９４】
明細書及び図面を参照して実質的にここに記載されている、炎症を処置又は予防する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ポリペプチド及びその使用
発明の分野
この発明は、血液凝固をモジュレートする、天然に存在するタンパク質、ヘパリンコファクターII（ＨＣII）に由来する新規なポリペプチド、及び炎症及び／又は過度の血液の凝固の処置及び予防におけるその使用に関する。特に、本発明は、医療における、例えば、炎症及び／又は過度の血液の凝固の処置又は予防におけるその使用のための、配列番号１〜３のアミノ酸配列、又はその断片、変異体、融合体若しくは誘導体、又は前記断片の融合体、その変異体若しくは誘導体を含んでなるか、又はこれらから成るポリペプチドを提供する。
【背景技術】
【０００２】
序論
感染性及び炎症性疾患は毎年世界で何百万もの死亡例を占めており、途方もなく多い医療コストを招いている。この疾患の範囲は広く、所与の病原体と直接の関連を有する丹毒、敗血症、肺炎及び他の数え切れないほど多い感染症などの急性疾患、並びに微生物がしばしば長期間の炎症状態を引き起こす慢性疾患を含んでいる。敗血症は、全身性炎症状態を特徴とする感染によって誘発される症候群であり、外科患者で、免疫が低下した患者で、あるいは熱傷に関連して頻繁に起こる合併症の典型である。重篤な敗血症は、よく起こる、費用がかかる、そしてしばしば致命的である状態であり、そして世界で文書化されているものでは毎年１８０万の発生率を有しているが、この数は多くの国で敗血症を追跡する診断率が低いこと、及び困難であることによって混乱している。１０００人に３人という発生率では、この状況での毎年の実際の数は１８００万人に達し、そしてほぼ３０％の死亡率では、世界で死因の第一位になることが推定される。敗血症のコストは、患者当たり、平均で２２，０００ＵＳ＄かかっており、それ故、米国内だけで、毎年１６７億ＵＳ＄が費やされており、この処置は病院の財源に大きなインパクトを与えている。敗血症に罹患しているＩＣＵ患者を処置するコストは、敗血症に罹患していない患者を処置するコストと比較して６倍多い。他の状況では、有害な炎症カスケードは、例えば、外傷、手術、体外循環、虚血、熱傷、薬物反応、出血性ショック、中毒性表皮壊死症、輸血反応中、細菌以外の他のメカニズムによって開始され、その結果ＡＲＤＳ又はＳＩＲＳに繋がることになる。慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）とは、不可逆的で、かつ進行する肺毛細血管への空気の流れの減少を特徴とする気道における広範囲の慢性障害を意味する。いくつかのファクターがＣＯＰＤの進行の一因であるけれども、喫煙及び再発性感染症は最も重大な原因である。ＣＯＰＤは、長期にわたる喫煙者で３０代後半から主に発症し、そして次第に不可逆的な形に進行する。ＷＨＯの２００７年の推定によれば、現在ＣＯＰＤに罹患している患者は２億１０００万人存在し、そして２００５年には３００万人の人がＣＯＰＤで死亡している。ＷＨＯはまた、ＣＯＰＤは、２０３０年までに世界で死亡の第４位の原因になるであろうと予測している。診断率の増加、炎症性疾患の進行を後退させる処置の欠如、及び世界的な老年人口の負担を含む、いくつかのファクターがこの増加の一因であると見られる。細菌は、細菌性結膜炎、及び角膜炎、中耳炎、術後及び熱傷創感染症、慢性下肢潰瘍、肺炎、並びに嚢胞性線維症を含む幅広い疾患を引き起こし、かつ／又はいっそう悪化させる。
【０００３】
それ故、感染症に立ち向かう新規な薬剤が必要であり、そして新規な処置手段としてＡＭＰの有効利用へのかなりの関心がある（非特許文献１）。従来から使用されている抗生物質に対する耐性問題の増加を考慮して、抗菌ペプチドが最近になって有効な治療候補として浮上してきた。ＡＭＰによって、ほとんどすべての有機体に侵入する微生物に対する防御の最前線が提供される（非特許文献２；３；４；５；６）。理想的には、ＡＭＰは、高い殺菌能を示すべきであるが、（ヒト）真核細胞に対して低い毒性を示すべきである。コンビナトリアルライブラリーアプローチ（combinational library approaches）（非特許文献７）、Ｄ−アミノ酸から成る立体異性体（非特許文献８）又は環状Ｄ，Ｌ−α−ペプチド（非特許文献９)、ハイスループットベーススクリーニングアッセイ(非特許文献１０；１１）、定量的構造活性相関（ＱＳＡＲ）アプローチ（非特許文献１２；１３；１４；１５）、及び内因性ペプチドの同定（非特許文献１６；１７；１８；１９；２０）の使用などの様々なストラティジーが、現在、選択的、かつ治療的に興味のあるＡＭＰを特定化する場合に使用されている（非特許文献２１；２２）。こうしたアプローチの可能性にもかかわらず、天然に存在するペプチドエピトープは、低免疫原性並びに固有の更なる生物学的機能を考慮すると、治療的状況において利点を示しうる。
【０００４】
血液凝固カスケード（coagulation cascade）はまた、傷害及び感染に応答して活性化された基本組織系を表す（非特許文献２３；２４）。一連のカスケード様プロテイナーゼ活性段階を通じてトロンビンが形成され、そしてフィブリノゲン分解及びクロット形成がもたらされる。この血液凝固カスケードは、ヘパリンコファクターII（ＨＣII）、アンチトロンビンIII（ＡＴIII）（２つのセリンプロテイナーゼ阻害剤、セルピン）、プロテインＣインヒビター及び組織因子プロテイナーゼインヒビター（ＴＦＰＩ）などの種々の調節タンパク質によって制御されている。更に、ヒスチジンリッチグリコプロテイン（histidine-rich glycoprotein）は、フィブリノゲン及びプラスミノゲンと相互作用することによって血液凝固をモジュレートしうる。
【０００５】
ヘパリンコファクターIIは、血漿中に約８０μｇ／ｍｌで存在する６６．５ｋＤａの４８０個のアミノ酸からなる糖タンパク質である。しかしながら、ＨＣIIは、遊離かつクロット結合トロンビンをブロックするけれども、この正確な生理学的な役割は完全にはわかっているわけではない。アンチトロンビンIIIと同様に、ＨＣIIによるトロンビンの阻害は、ヘパリンなどのグリコサミノグリカンによって加速される（非特許文献２５）。ＡＴIII欠損は、血栓と結びついていることは明瞭であるが、ＨＣIIホモ接合体欠損マウスは通常条件下で血栓形成傾向を患ってはいない。ＨＣIIの血漿濃度は、炎症及び感染症の間には顕著に減少している（非特許文献２６）。実際に、最近の証拠によれば、ＨＣIIの主要な生理学的機能は、アテローム硬化症の発症の場合のように、トロンビンの非止血性役割を阻害することである（非特許文献２７）。また、ＨＣIIは、血管外のトロンビン阻害剤として作用しえ、そして傷の治癒の調節における役割を演じうるということが示されており（非特許文献２８）、更に、化学遊走物質がＨＣIIのタンパク質分解に関連して述べられており（非特許文献２９）、更に、このアンチプロテイナーゼの可能性のある潜在的な生物学的な活性を説明している。ＨＣIIに関する構造的な検討において、この分子はコンフォメーション（conformation）の独特な変化を受けていることが明らかにされ、これをストレスから緩和への（Ｓ ｔｏ Ｒ）転移（Stressed to Relaxed (S to R) transition）と呼んでいる。本発明者らは、すなわち、ＨＣIIに由来するペプチドの以前に知られていない特性である、ＨＣIIに由来する一連のペプチドが抗炎症及び抗凝固作用を有するという予測できない発見をした。
【０００６】
この発明は、医療における、例えば、炎症及び／又は過度の血液凝固の処置又は予防におけるその使用のための、ヘパリンコファクターIIに由来する新規なポリペプチド作用物質を提供しようとするものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Marr, A. K., W. J. Gooderham, et al. (2006). Curr Opin Pharmacol 6(5): 468-472
【非特許文献２】Tossi, A., L. Sandri, et al. (2000). Biopolymers 55(1): 4-30
【非特許文献３】Lehrer, R. I. and T. Ganz (2002). Curr Opin Hematol 9(1): 18-22
【非特許文献４】Zasloff, M. (2002). Nature 415(6870): 389-95
【非特許文献５】Yount, N. Y., A. S. Bayer, et al. (2006). Biopolymers 84: 435-458
【非特許文献６】Harder, J., R. Glaser, et al. (2007). J Endotoxin Res 13(6): 317-38
【非特許文献７】Blondelle, S. E. and K. Lohner (2000). Biopolymers 55(1): 74-87
【非特許文献８】Sajjan, U. S., L. T. Tran, et al. (2001). Antimicrob Agents Chemother 45(12): 3437-44
【非特許文献９】Fernandez-Lopez, S., H. S. Kim, et al. (2001). Nature 412(6845): 452-5
【非特許文献１０】Hilpert, K., R. Volkmer-Engert, et al. (2005). Nat Biotechnol 23(8): 1008-12
【非特許文献１１】Taboureau, O., O. H. Olsen, et al. (2006). Chem Biol Drug Des 68(1): 48-57
【非特許文献１２】Hilpert, K., R. Volkmer-Engert, et al. (2005). Nat Biotechnol 23(8): 1008-12
【非特許文献１３】Marr, A. K., W. J. Gooderham, et al. (2006). Curr Opin Pharmacol 6(5): 468-472
【非特許文献１４】Jenssen, H., T. Lejon, et al. (2007). Chem Biol Drug Des 70(2): 134-42
【非特許文献１５】Pasupuleti, M., B. Walse, et al. (2008). Biochemistry 47(35): 9057-70
【非特許文献１６】Papareddy, P., V. Rydengard, et al. PLoS Pathog 6(4): e1000857
【非特許文献１７】Nordahl, E. A., V. Rydengard, et al. (2005). J Biol Chem 280(41): 34832-9
【非特許文献１８】Malmsten, M., M. Davoudi, et al. (2006). Matrix Biol 25(5): 294-300
【非特許文献１９】Malmsten, M., M. Davoudi, et al. (2007). Growth Factors 25(1): 60-70
【非特許文献２０】Pasupuleti, M., B. Walse, et al. (2007). J Biol Chem 282(4): 2520-8
【非特許文献２１】Hancock, R. E. and H. G. Sahl (2006). Nat Biotechnol 24(12): 1551-7
【非特許文献２２】Marr, A. K., W. J. Gooderham, et al. (2006). Curr Opin Pharmacol 6(5): 468-472
【非特許文献２３】Davie, E.W. and J.D. Kulman, Semin Thromb Hemost, 2006. 32 Suppl 1: p. 3-15
【非特許文献２４】Bode, W., Semin Thromb Hemost, 2006. 32 Suppl 1: p. 16-31
【非特許文献２５】Tollefsen, 1995 Thromb Haemost. 74(5): 1209-14.
【非特許文献２６】Noda et al. (2002), Clin. Appl. Thromb. Hemost., 8(3): 265-271
【非特許文献２７】Rau, J. C., L. M. Beaulieu, et al. (2007). J Thromb Haemost 5 Suppl 1: 102-15
【非特許文献２８】Hoffman, Loh et al. 2003
【非特許文献２９】Hoffman, M., C. W. Pratt, et al. (1990）． J Leukoc Biol 48(2): 156-62
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本発明の第一の局面は、炎症及び／又は過度の血液の凝固の処置又は予防における使用のための、血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質、すなわち、ヘパリンコファクターIIに由来するアミノ酸配列、又はその断片、変異体、融合体若しくは誘導体、又は前記断片の融合体、その変異体若しくは誘導体を含んでなるか、又はこれらから成るポリペプチドであって、該断片、変異体、融合体若しくは誘導体は、抗炎症及び／又は抗凝固活性を示す、上記ポリペプチドを提供する。
【０００９】
本発明は、血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質（例えば、ヘパリンコファクターII）が、それらの内部領域内に“クリプティックペプチド（cryptic peptides）”を含んでなり、これは抗炎症作用を示すという本発明者による予測できない発見に由来する。こうしたペプチドは、傷害及び生理学的な他のチャレンジに応答して親であるアンチプロテイナーゼホロタンパク質の切断によって‘放出され（released）’うるか、あるいはそれらはタンパク質分解及びＲ体の形成の間に活性化されるホロタンパク質の活性なエピトープに相当するということが信じられている。すなわち、本発明のポリペプチドは、炎症に関連する障害及び状態に対して治療可能性を有する、新規であり、かつ以前に開示されていない種類の宿主防御ペプチド（ＨＤＰ）を構成する。
【００１０】
我々が、“血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質（naturally occurring protein which modulates blood coagulation）”というのは、血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質をすべて含み、血液凝固プロセスをポジティブに、又はネガティブにモジュレートすることを含んでいる。こうしたモジュレート（調節）活性（modulatory activity）は、当技術分野で周知の方法によって、例えば、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）試験、プロトロンビン時間（ＰＴ）試験、又はトロンビン凝固時間（ＴＣＴ）試験を用いて決定することができる。更に、プレカリクレイン活性、又は第Ｘ因子及び他の血液凝固因子の活性に関する特定の測定が行なわれうる。天然に存在するタンパク質が直接的、又は間接的に血液凝固をモジュレートしうることは当技術分野の当業者であれば理解するところである。
【００１１】
我々が、血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質に“由来する（derived from）”アミノ酸配列というのは、そのアミノ酸配列が、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列内に見出されることを意味している。例えば、一実施態様では、アミノ酸配列は、血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質の領域に起源しうる。
【００１２】
我々が、“抗炎症活性（anti-inflammatory activity）”というのは、炎症事象に関連する１つ又はそれより多い生物学的プロセスを減少又は予防することができることを意味している。ポリペプチドのこうした抗炎症活性は、当技術分野で周知の方法を用いて、例えば、マクロファージ（例えば、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＦ−γ）、又は好中球（下記の実施例参照）からの炎症誘発性サイトカイン（pro-inflammatory cytokines）のＬＰＳ誘発性の放出を測定することによって決定されうる。関連する他のアッセイは、上記系におけるリポタイコ酸、ザイモサン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、フラジェリン又はペプチドグリカンの影響、並びに転写レベル（例えば、ジーンアレイ、ｑＰＣＲなど）での調節の判定を含む。更に、樹状細胞活性又は栓球（血小板）の活性もまた、抗炎症活性の測定として使用することができる。
【００１３】
我々が、“抗凝固活性（anti-coagulant activity）”というのは、プロトロンビン時間（ＰＴ）、トロンビン凝固時間（ＴＣＴ）、及び／又は活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を増加させることができることを意味している。あるいは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）を、ペプチド及び組織因子を加えるか又は加えずにエッシェリヒア・コリ（E. coli）（大腸菌）ＬＰＳによって刺激し、そしてヒト血漿を添加した後クロッ
ト形成を起こさせることができ、又は、全血液の凝固時間（clotting times）を測定することができる。
【００１４】
本発明は、血液凝固をモジュレートするヘパリンコファクターIIに由来するアミノ酸配列含んでなるか、又はこれらから成るポリペプチド、並びに抗炎症活性を保持しているこうしたアミノ酸配列の断片、変異体、融合体及び誘導体を包含するということは当技術分野の当業者によって理解されるところである。しかしながら、好ましくは、このポリペプチドは、天然に存在するタンパク質、例えば、ホロタンパク質（holoprotein）ではない（但し、このポリペプチドが天然に存在するタンパク質の不完全な部分又は断片を構成する場合があることは当然理解されるところである）。
【００１５】
本発明のポリペプチドの一実施態様では、このポリペプチドは、ヘパリン結合ドメインを含んでなる。我々が、“ヘパリン結合ドメイン（heparin-binding domain）”というのは、生理学的な条件下でヘパリンに結合することができるポリペプチド内のアミノ酸配列を意味する。こうした配列は、しばしば、ＸＢＢＸＢ及びＸＢＢＢＸＸＢ（上記において、Ｂ＝塩基性残基であり、そしてＸ＝ヒドロパシック（hydropathic）又は電荷を持たない残基である）を含むか、又は塩基性アミノ酸（ＸＢＸ、ＸＢＢＸ、ＸＢＢＢＸ）のクラスターを含んでなる。非塩基性残基（ＢＸＢ、ＢＸＸＢ）の場合のこうしたクラスターの間隔もまた存在しうる。これに加えて、塩基性アミノ酸の間のおよそ２０Åの距離は、ヘパリン結合の必須要件を構成している。
【００１６】
ヘパリンコファクターIIは、ヒト又は非ヒトの供給源からのものでありうることは当技術分野の当業者によって理解されるところである。例えば、ヘパリンコファクターIIは、類人猿（例えば、チンパンジー、ピグミーチンパンジー、ゴリラ、テナガザル及びオランウータン）、サル（例えば、マカク、ヒヒ及びコロブス属）、げっし動物（例えば、マウス、ラット）又は有蹄動物（例えば、ブタ、ウマ及びウシ）などの非ヒト哺乳類から取り出す（直接的又は間接的に）ことができる。
【００１７】
１つの好ましい実施態様では、ヘパリンコファクターIIは、ヒトのヘパリンコファクターIIである（例えば、スイスプロットアクセッション番号Ｐ０５５４６（Swiss Port Accession No. P05546参照）。
【００１８】
例えば、このポリペプチドは、配列番号１〜３のいずれか１つのアミノ酸配列：
“ＫＹＥ２８”：ＫＹＥＩＴＴＩＨＮＬＦＲＫＬＴＨＲＬＦＲＲＮＦＧＹＴＬＲ  ［配列番号１］
“ＫＹＥ２１”：ＫＹＥＩＴＴＩＨＮＬＦＲＫＬＴＨＲＬＦＲＲ  ［配列番号２］
“ＮＬＦ２０”：ＮＬＦＲＫＬＴＨＲＬＦＲＲＮＦＧＹＴＬＲ  ［配列番号３］
又は配列番号１〜３のいずれか１つの抗炎症及び／又は抗凝固活性を保持している、その断片、変異体、融合体若しくは誘導体、又は前記断片の融合体、その変異体若しくは誘導体を含んでなるか、又はこれらから成ることができる。
【００１９】
本明細書中で使用される際には、用語‘アミノ酸（amino acid）’は、標準的な２０個の遺伝的にコードされたアミノ酸及びそれらの対応する‘Ｄ’型の立体異性体（天然の‘Ｌ’型と比較して）、他の天然に存在するアミノ酸、オメガ−アミノ酸、非在来型アミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸など）、並びに化学的に誘導化されたアミノ酸（下記参照）を含んでいることが、当技術分野の当業者に理解されるところである。
【００２０】
‘アラニン（alanine）’又は‘Ａｌａ’又は‘Ａ’のように、アミノ酸が具体的に列挙されるときには、この用語は、別段明確に述べられていない限り、Ｌ−アラニンとＤ−アラニンはどちらも意味する。他の非在来型アミノ酸もまた、所望の機能特性がポリペプチドによって維持されている限り、この発明のポリペプチドの適切な構成要素でありうる。ペプチドが示される場合には、それぞれのコードされたアミノ酸残基は、適宜、在来アミノ酸の慣用名に相当する１つの文字記号表示によって表される。
【００２１】
一実施態様では、本発明のポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸を含んでなるか、又はこれらから成る。
【００２２】
ポリペプチドが参照配列（例えば、配列番号１〜３）によるアミノ酸配列を含む場合には、これはそのＮ末端及び／又はＣ末端で、参照配列のアミノ酸のほかに追加のアミノ酸を含むことができ、例えば、このポリペプチドは、Ｎ末端で追加のアミノ酸を含んでなることができる。同様に、ポリペプチドが参照配列によるアミノ酸配列の断片、変異体若しくは誘導体を含む場合には、これはそのＮ末端及び／又はＣ末端で、追加のアミノ酸を含むことができる。
【００２３】
更なる実施態様では、ポリペプチドは、参照配列（例えば、配列番号１〜３）によるアミノ酸配列の断片を含んでなるか、又はこれらから成る。すなわち、このポリペプチドは、参照配列の少なくとも５個の連続したアミノ酸を含んでなるか、又はこれらから成りえ、例えば、配列番号１の少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６又は２７個の連続したアミノ酸を含んでなりうるか、又はこれらから成りうる。
【００２４】
一実施態様では、ポリペプチド断片は、配列番号１のアミノ酸残基の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２及び２３番から選択されるアミノ酸残基で開始される。あるいは／これに加えて、ポリペプチド断片は、配列番号１のアミノ酸残基の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６又は２７番から選択されるアミノ酸残基で終了しうる。
【００２５】
例えば、ポリペプチド断片は、配列番号１の９〜２８番のアミノ酸を含んでなりうるか、又はこれらから成りうる。
【００２６】
本発明のポリペプチドは、参照配列（例えば、配列番号１〜３）によるアミノ酸配列の変異体、又は前記変異体の断片含んでなるか、又はこれらから成りうるということは、当技術分野の当業者によって理解されるところである。こうした変異体は天然に存在しないものでありうる。
【００２７】
我々が、ポリペプチドの‘変異体（variants）’というのは、挿入、欠失、及び保存性（conservative）あるいは非保存性（non-conservative）置換を含んでいる。例えば、保存性置換とは、同じクラス内の別のアミノ酸による、同じ一般的クラス内のアミノ酸（例えば、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、非極性アミノ酸、極性アミノ酸又は芳香族アミノ酸）の置換を意味する。すなわち、保存性アミノ酸置換及び非保存性アミノ酸置換の意味するところは、当技術分野で周知である。特に、我々は、抗炎症活性を示すポリペプチドの変異体を含めている。
【００２８】
更なる実施態様では、この変異体は、参照配列（例えば、配列番号１〜３）又はその断片によるアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％の同一性（identity）、例えば、少なくとも、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有している。
【００２９】
２つのポリペプチド間の配列の同一性％は、適切なコンピュータープログラム、例えば、University of Wisconsin Genetic Computing GroupのＧＡＰプログラムを用いて決定することができ、同一性パーセントは、その配列を最適にアラインメントしたポリペプチドと比較して算出されることは理解されるところである。
【００３０】
このアラインメントは、これに代えて、クラスタルＷ プログラム（Clustal W program） （Thompson et al., 1994, Nuc. Acid Res. 22：4673-4680中に述べられた通りであり、これは引用によって本明細書中に組み込まれる）を用いて行うことができる。
【００３１】
使用されるパラメーターは次の通りでありうる：
高速ペアワイズアラインメントパラメーター（Fast pairwise alignment parameters）：Ｋ−タプル（ワード）サイズ（K-tuple(word) size）；１，ウィンドウ・サイズ（window size）；５，ギャップペナルティ（gap penalty）；３，トップダイアゴナルの数（number of top diagonals）；５．スコアリング法（scoring method）；ｘパーセント（x percent）。
マルティプルアラインメントパラメーター（Multiple alignment parameters）：ギャップ開始ペナルティ（gap open penalty）；１０，ギャップ伸長ペナルティ（gap extension penalty）；０．０５。
スコアリングマトリックス（Scoring matrix）：BLOSUM。
【００３２】
ほかには、BESTFITプログラムが配列のローカルアラインメント（local sequence alignments）を決定するのに用いられうる。
【００３３】
一実施態様では、上記参照配列に起源するアミノ酸は、ポリペプチドのタンパク質分解を減少させるために、例えば、Ｉ、ＦからＷへの置換（modifications）によって変異させうる（Stroemstedt et al, Antimicrobial Agents Chemother 2009, 53, 593参照）。
【００３４】
変異体は、組換えポリヌクレオチドを用いる当技術分野で周知のプロテインエンジニアリング及び特定部位の突然変異誘発方法を用いて作製される（例えば、引用によって本明細書中に組み込まれるMolecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rd edition, Sambrook & Russell, 2000, Cold Spring Harbor Laboratory Press参照）。
【００３５】
一実施態様では、このポリペプチドは、上記のアミノ酸配列（例えば、配列番号１〜３）のいずれか１つの１種のホモログであるアミノ酸を含んでなるか、又はこれらから成る。我々が、“ホモログ種（species homologue）”というのは、ポリペプチドが非ヒト種に起源する等価のタンパク質内の同じアミノ酸配列に相当し、すなわち、このポリペプチドは、配列番号１〜３のいずれか１つと最大の配列同一性を示す（例えば、ＧＡＰ又はＢＬＡＳＴ配列比較によって判定される）ということを含んでいる。通例、このホモログ種ポリペプチドは、ヒト参照配列（すなわち、配列番号１〜３）と同じ長さであろう。
【００３６】
なお更なる実施態様では、このポリペプチドは、融合タンパク質を含んでなるか、又はこれらから成る。
【００３７】
我々が、ポリペプチドの‘融合体（fusion）’というのは、他の任意のポリペプチドに融合した参照配列に相当するアミノ酸配列を含めている（例えば、配列番号１〜３、又はその断片又はその変異体）。例えば、前記ポリペプチドは、前記ポリペプチドの精製を容易にするためにグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）又はプロテインＡなどのポリペプチドに融合しうる。こうした融合体の例は、当技術分野の当業者に周知である。同様に、前記ポリペプチドは、Ｈｉｓ６などのオリゴヒスチジンタグに、又は周知のＭｙｃエピトープタグ（Myc tag epitope）などの抗体が認識するエピトープに融合しうる。これに加えて、疎水性オリゴペプチド末端タグを含んでなる融合体が使用されうる。前記ポリペプチドの任意の変異体若しくは誘導体との融合体はまた、本発明の範囲内に含まれる。抗炎症活性などの望ましい特性を維持している融合体（又はその変異体若しくは誘導体）が好ましいことは理解されるところである。
【００３８】
この融合体は、望ましい特徴を前記本発明のポリペプチドに与える更なる部分を含めることができる；例えば、この部分はポリペプチドを検出し、若しくは単離し、又はポリペプチドの細胞内取り込みを促進する際に有用でありうる。この部分は、例えば、当技術分野の当業者に周知であるように、ビオチンモイエティ、ストレプトアビジンモイエティ、放射性モイエティ、蛍光モイエティ、例えば、小蛍光体（small fluorophore）又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）蛍光体でありうる。このモイエティは、当技術分野の当業者に知られているような免疫原性タグ（immunogenic tag）、例えば、Ｍｙｃタグでありえ、あるいは、当技術分野の当業者に知られているように、ポリペプチドの細胞内取り込みを促進することができる親油性分子又はポリペプチドドメインでありうる。
【００３９】
本発明のポリペプチドは、例えば、ＰＥＧ化、アミド化、エステル化、アシル化、アセチル化及び／又はアルキル化によって修飾されるか、又は誘導体化されている１つ又はそれより多いアミノ酸を含むことができることは、当技術分野の当業者が理解しているところである。
【００４０】
当技術分野において理解されているように、ＰＥＧ化タンパク質は、腎クリアランス及びタンパク質分解の低下、毒性の減少、免疫原性の減少及び溶解性の増大を示すことができる［Veronese, F.M. and J.M. Harris, Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4): p. 453-6., Chapman, A.P., Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4): p. 531-45.］。ＰＥＧ化は、最初のＰＥＧ化分子であるアスパラギナーゼ及びアデノシンデアミナーゼを含む、いくつかのタンパク質ベース薬物のために使用されてきた［Veronese, F.M. and J.M. Harris, Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4): p. 453-6., Veronese, F.M. and G. Pasut, Drug Discov Today, 2005. 10(21): p. 1451-8.］。
【００４１】
半減期を最大に増加させ、かつ生物活性を維持したＰＥＧ化タンパク質を得るのに成功させるためには、結果に影響しうるいくつかのパラメーターが重要であり、かつ考慮されるべきである。このＰＥＧ分子類では異なりえ、そしてタンパク質のＰＥＧ化のために使用されているＰＥＧ変異体（PEG variant）には、ＰＥＧ及びモノメトキシ−ＰＥＧが含まれる。これに加えて、これらは線状であるか、又は分岐鎖状でありうる［Wang, Y.S., et al., Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4): p. 547-70］。使用されるＰＥＧ分子のサイズは変化しえ、１と４０ｋＤａの間のサイズ範囲のＰＥＧモイエティがタンパク質にリンクしている［Wang, Y.S., et al., Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4): p. 547-70., Sato, H., Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4): p. 487-504, Bowen, S., et al., Exp Hematol, 1999. 27(3): p. 425-32, Chapman, A.P., et al., Nat Biotechnol, 1999. 17(8): p. 780-3］。加えて、タンパク質に結合しているＰＥＧ分子の数は変化しえ、１と６個の間のＰＥＧ単位がタンパク質に結合している例が報告されている［Wang, Y.S., et al., Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4): p. 547-70., Bowen, S., et al., Exp Hematol, 1999. 27(3): p. 425-32］。更に、ＰＥＧ間のリンカーの存在若しくは不存在、並びに結合のための様々な反応性基が利用されてきた。すなわち、ＰＥＧは、直接的か、あるいはリンカーとしてγ−アミノ酪酸を用いることによって、Ｎ末端アミノ基にリンクすることもできるし、又は反応性アミノ基若しくはヒドロキシル基を有するアミノ酸残基（Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｙｒ）にリンクすることもできる。これに加えて、ＰＥＧは、カルボキシル（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｃ末端）、又はスルフヒドリル（Ｃｙｓ）基に結合することができる。最後に、Ｇｌｎ残基は、とりわけ酵素であるトランスグルタミナーゼを用いてＰＥＧ化することができ、そしてＰＥＧのアルキルアミン誘導体については述べられている［Sato, H., Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4): p. 487-504］。
【００４２】
ＰＥＧ化の程度を増加させると、インビボでの半減基を増加させることになることが示されている。しかしながら、ＰＥＧ化プロセスには、個々のベースで特定のタンパク質のために最適化することが必要であることは当技術分野の当業者が理解しているところである。
【００４３】
ＰＥＧは、ＷＯ ２００５／００７１９７中で述べられているように、天然に存在するジスルフィド結合の場所で結合することができる。ジスルフィド結合は、タンパク質の三次構造を傷つけない化学架橋を加えることすることによって安定化させることができる。これはＰＥＧの部位特異的結合のための架橋を作り出すのに使用されるジスルフィド結合を含んで、２つの硫黄のコンジュゲートに与るチオール選択性を可能にする。この結果、標的分子に結合させるため、ペプチドの中に残基を作製する必要性は回避される。
【００４４】
種々の代替的ブロックコポリマーはまた、ＷＯ ２００３／０５９９７３中に述べられているように共有結合でコンジュゲートすることができる。治療ポリマーコンジュゲートによって、熱特性の改善、結晶化、粘着、膨潤、被覆、ｐＨ依存性コンフォメーション（conformation）及び体内分布が発揮されうる。更に、これらは、長期循環、ピノシトーシスによるコンジュゲートの細胞内取り込み後の二次リソソームのタンパク質分解及び酸性環境での生物活性の放出、並びに大きな分子の特徴による、より好都合な物理化学的特性（例えば、生体液中の薬物溶解性の増加）を達成することができる。親水性及び疎水性ブロックを含むブロックコポリマーは、溶液中で高分子ミセルを形成する。ミセル解離すると、個々のブロックコポリマー分子は安全に排出される。
【００４５】
１つ又はそれより多いアミノ酸の化学的誘導体（chemical derivatives）はまた、官能側基との反応によって達成することができる。こうした誘導化分子は、例えば、遊離のアミノ基が誘導体化されて、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボキシベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基又はホルミル基を形成するそうした分子を含む。遊離カルボキシル基は誘導体化されて、塩、メチル及びエチルエステル又は他のタイプのエステル及びヒドラジドを形成し得る。遊離ヒドロキシル基は誘導体化されて、Ｏ−アシル又はＯ−アルキル誘導体を形成し得る。また、化学的誘導体として、２０の標準アミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体を含むそうしたペプチドも含まれる。例えば：４−ヒドロキシプロリンはプロリンと置換し得る；５−ヒドロキシリシンはリシンと置換し得る；３−メチルヒスチジンはヒスチジンと置換し得る；ホモセリンはセリンと、そしてオルニチンはリシンと置換し得る。誘導体にはまた、必須活性が維持される限り、１つ若しくは複数の付加又は欠失を含むペプチドが含まれる。他に含まれる修飾には、アミド化、アミノ末端アシル化（例えば、アセチル化又はチオグリコール酸アミド化）、末端カルボキシルアミド化（例えば、アンモニア又はメチルアミンと共に）、及び同様の末端修飾がある。
【００４６】
更に、ペプチド模倣化合物もまた有用であり得ることは当技術分野の当業者に理解されているところである。従って、我々が‘ポリペプチド（polypeptide）’というのは、抗炎症活性を有するペプチド模倣化合物（peptidomimetic compounds）を含んでいる。用語‘ペプチド模倣薬（peptidomimetic）’とは、治療剤として特定のペプチドのコンフォメーション及び望ましい特徴を模倣する化合物を意味する。
【００４７】
例えば、本発明のポリペプチドは、アミノ酸残基がその中でペプチド（−ＣＯ−ＮＨ−）結合により連結している分子だけでなく、ペプチド結合がその中で反転している分子をも含む。こうしたレトロ−インベルソペプチド模倣薬（retro-inverso peptidomimetics）は、当技術分野で知られている方法、例えば、引用によって本明細書中に組み込まれるMeziere et al. (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237に記載の方法を用いて製造することができる。このアプローチでは、主鎖が関与する変化を含み、そして側鎖の配向性に関係しない擬ペプチド（pseudopeptides）を製造することが必要である。ＣＯ−ＮＨペプチド結合の代わりにＮＨ−ＣＯ結合を含有するレトロ−インバースペプチド（retro-inverse peptides）は、タンパク質分解に対してずっと抵抗性がある。これに代えて、本発明のポリペプチドは、１つ又はそれより多いアミノ酸残基が、一般に行なわれているアミド結合の代わりに−ｙ（ＣＨ2ＮＨ）−結合によって結合する、ペプチド模倣化合物であってもよい。
【００４８】
更にほかでは、アミノ酸残基の炭素原子間に間隔（spacing）を維持する適切なリンカー部分を使用するならば、ペプチド結合は全くなくてもよく；リンカー部分がペプチド結合と、実質的に同じ電荷分布を有し、かつ実質的に同じ平面性を有するならば、有利でありうる。
【００４９】
ポリペプチドは、好都合には、外部タンパク質分解消化に対する感受性を減少させるのに役立つように、Ｎ末端又はＣ末端領域でブロックされてもよいことは理解されるところである。
【００５０】
Ｄ−アミノ酸及びＮ−メチルアミノ酸などの種々の非コード化又は修飾アミノ酸はまた、哺乳動物ペプチドを修飾するのに使用されている。これに加えて、推定される生物活性コンフォメーションは、環化などの共有結合修飾によって、又はラクタムの取り込み若しくは他のタイプの架橋によって安定化しうるが、例えば、引用によって本明細書中に組み込まれる、Veber et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75：2636 and Thursell et al., 1983, Biochem. Biophys. Res. Comm. 111:166を参照されたい。
【００５１】
多くの合成ストラティジーの中で共通のテーマは、ペプチドベース骨格へのある種の環状部分の導入である。環状部分はペプチド構造のコンフォメーション空間を制限し、そしてこのことによって、頻繁に特定の生物学的受容体に対するペプチドの特異性（specificity）の増加がもたらされる。このストラティジーの別の利点は、ペプチドへの環状部分の導入ではまた、細胞ペプチダーゼに対する感受性の低下を有するペプチドがもたらされうるということである。
【００５２】
従って、本発明の例示となるポリペプチドは、末端システインアミノ酸を含んでなる。こうしたポリペプチドは、末端システインアミノ酸中のメルカプチド基のジスルフィド結合形成による、ヘテロデチック（heterodetic）環状形態、又は末端アミノ酸間のアミドペプチド結合形成によるホモデチック（homodetic）形態で存在しうる。上記に示した通り、Ｎ−及びＣ末端領域のシステイン間でのジスルフィド又はアミド結合を介した小分子ペプチドの環化は、タンパク質分解を減少させ、またより高い特異性化合物を生じさせうる構造剛性（rigidity）を増加させることにより、線状ペプチド（linear peptides）でときどき観察される特異性及び半減期の問題を回避することができる。ジスルフィド結合によって環化したポリペプチドは、タンパク質分解（proteolytic degradation）に依然として感受性を有しうる遊離アミノ及びカルボキシ末端を有し、一方、Ｎ末端アミンとＣ末端カルボキシル間のアミド結合の形成により環化したペプチドは、従ってもはや遊離アミノ又はカルボキシ末端を含まない。すなわち、この発明のペプチドは、Ｃ−Ｎ結合か又はジスルフィド結合によって連結しうる。
【００５３】
この発明は、ペプチドの環化方法によって決して限定されるものではなく、その環状構造が、任意の適切な合成方法によって達成されうるペプチドをも包含しうる。従って、ヘテロデチック結合は、ジスルフィド、アルキレン又はスルフィド架橋を介する形成を含みうるが、これに限定されない。ジスルフィド、スルフィド及びアルキレン架橋を含む、環状ホモデチックペプチド及び環状ヘテロデチックペプチドの合成方法は、引用により本明細書中に組み込まれる、米国特許第５，６４３，８７２号に開示されている。環化方法の他の例には、クリックケミストリーによる環化、エポキシド、アルデヒド−アミン反応、並びに引用により本明細書中に組み込まれる、米国特許第６，００８，０５８号に開示されている方法が含まれる。
【００５４】
環状安定化ペプチド模倣化合物の合成の更なるアプローチは、閉環メタセシス（ＲＣＭ）である。この方法では、ペプチド前駆体を合成する工程、そしてそれをＲＣＭ触媒と接触させてコンフォメーションが制限されたペプチドを生じさせる工程が必要である。適切なペプチド前駆体は、２つ又はそれより多い不飽和Ｃ−Ｃ結合を含有しうる。この方法は、固相ペプチド合成法を用いて行うことができる。この実施態様では、固体支持体に固定した前駆体をＲＣＭ触媒と接触させ、次いで生成物を固体支持体から切断してコンフォメーションが制限されたペプチドを生ぜしめる。
【００５５】
引用によって本明細書中に組み入れられる、D. H. Rich in Protease Inhibitors, Barrett and Selveson, eds., Elsevier (1986）によって開示されている別のアプローチでは、酵素阻害剤の設計における遷移状態アナログ・コンセプトの応用によって、ペプチド模倣体を設計することである。例えば、スタリン（staline）の第二級アルコールが、ペプシン基質の切断することができるアミド結合の４面体遷移状態に類似していることが知られている。
【００５６】
要約すれば、周知の通り、末端修飾はプロテイナーゼ消化により感受性を低下させ、それ故、溶液中、特にプロテアーゼが存在しうる生体液中のペプチドの半減期を延長するのに有用である。ポリペプチド環化はまた、環化によって形成される安定な構造のために、そして環状ペプチドの場合に観察される生物学的活性から鑑みて有用な修飾である。
【００５７】
従って、一実施態様では本発明の第一の局面のポリペプチドは、線状である。しかしながら、代替的実施態様では、このポリペプチドは環状である。
【００５８】
本発明のポリペプチドは、種々の長さでありうることは当技術分野の当業者が理解しているところである。しかしながら、通例、このポリペプチドは、１０〜２００個のアミノ酸の長さであり、例えば、１０〜１５０個、１５〜１００個、１５〜５０個、１５〜３０個、１７〜３０個、又は１７〜２８個のアミノ酸の長さである。例えば、このポリペプチドは、少なくとも２０個のアミノ酸の長さでありうる。
【００５９】
はじめに述べたように、抗炎症活性が本発明のポリペプチドに共通の特徴である。一実施態様では、このポリペプチドは、単球由来マクロファージなどのヒト単球由来マクロファージからの、マクロファージ阻害因子、ＴＮＦ−α、ＨＭＧＢ１、Ｃ５ａ、ＩＬ−１７、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＩＦＮ−γ、Ｉｌ−６、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−１２を含む、１つ又はそれより多い炎症誘発性サイトカインの放出を抑制することができる。抗炎症性のＩＬ−１０は、影響を受けないか、又は一時的に増加しうる。
【００６０】
他のマーカーもまた影響を受けうる：こうしたものには、単球及び内皮細胞上の組織因子、プロカルシトニン、ＣＲＰ、活性酸素種（reactive oxygen species）、ブラディキニン、一酸化窒素、ＰＧＥ１、血小板活性化因子、アラキドン酸代謝物、ＭＡＰキナーゼ活性化（MAP kinase activation）が含まれる。
【００６１】
特に、このポリペプチドは、１つ又はそれより多い下記のモデルにおいて抗炎症活性を示しうる：
（ｉ）刺激剤（stimulants）として、ＬＰＳ、ＬＴＡ、ザイモサン、フラジェリン、ダニ（dust mites）、ウイルス若しくは細菌ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はペプチドグリカンを用いるインビトロマクロファージモデル；
（ｉｉ）エンドトキシン・ショックのインビボマウスモデル；及び／又は
（ｉｉｉ）抗微生物療法と組み合わせるか、又は単独で与える、インビボ感染症モデル。
【００６２】
本発明の更なる実施態様では、このポリペプチドは抗凝固活性を示す。
【００６３】
我々が、“抗凝固活性（anti-coagulant activity）”というのは、凝固（すなわち、血液の凝固）又は関連するシグナル又は影響を減少させるか、又は予防することができることを意味している。こうした活性は当技術分野で周知である方法によって、例えば、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）試験、プロトロンビン時間（ＰＴ）試験、又はトロンビン凝固時間（ＴＣＴ）試験を用いて決定することができる。更に、プレカリクレイン活性化、又は第Ｘ因子及び他の血液凝固因子の活性に関する特定の測定が行なわれうる。このポリペプチドは、外因系凝固経路及び／又は内因系凝固経路を阻害しうることは当業者であれば理解するところである。しかしながら、好ましい実施態様では、このポリペプチドは内因系凝固経路を（少なくとも一部分）阻害する。
【００６４】
本発明のなお更なる実施態様では、このポリペプチドは、トル（Toll）様受容体（ＴＬＲ）遮断活性を示す。こうした受容体遮断活性は、当技術分野で周知である方法を用いて測定することができ、例えば、ｉＮＯＳ、核内因子κＢ及びサイトカインなどの適切な下流エフェクターを分析することによる。
【００６５】
抗炎症活性を有していることに基づいて、本発明の第一局面のポリペプチドは、炎症の処置又は予防における使用を意図している。
【００６６】
我々が、“炎症の処置又は予防（treatment or prevention of inflammation）”というのは、本発明のポリペプチドが、炎症を構成しているか、又は炎症に関連している１つ又はそれより多い症状、シグナル又は影響を予防するか、又は抑制する（少なくとも一部）ことができるということを意味している。
【００６７】
炎症を抑制することが全部又は一部分でありうることは、当技術分野の当業者であれば理解するところである。好ましい実施態様では、このポリペプチドは、１つ又はそれより多い炎症のマーカーを、このポリペプチドの作用を受けていない細胞又は個体と比較して２０％以上、例えば、少なくとも３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上抑制することができる。
【００６８】
有利なことには、本発明のポリペプチドは、炎症を選択的に処置又は予防することができる。
【００６９】
我々が、‘選択的に（selectively）’というのは、このポリペプチドが、それが生物学的な他の機能をモジュレートするのと比較して、より大きな程度に至るまで炎症を抑制し、又は予防するということを意味している。このポリペプチド、又はその断片、変異体、融合体若しくは誘導体は、炎症のみを抑制し、又は予防することが好ましい。
【００７０】
しかしながら、更なる実施態様では、このポリペプチドはまた（あるいは、ほかに）、血液の凝固を抑制し、又は予防する。上記の通り、凝固の抑制は全部又は一部でありうることは当技術分野の当業者であれば理解するところである。好ましい実施態様では、このポリペプチドは、１つ又はそれより多い凝固の尺度及び／又はマーカーを、このポリペプチドの作用を受けていない細胞又は個体と比較して２０％以上、例えば、少なくとも３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上抑制することができる。
【００７１】
一実施態様では、このポリペプチドは、感染症に関連する（すなわち、感染症によって引き起こされているか、又は単に感染症を併発している過ぎない）炎症の処置又は予防の際に使用する目的のためにある。
【００７２】
本発明の好ましいが、非限定的な実施態様では、このポリペプチドは、下記から選択される疾患、状態又は適応の処置又は予防の際に使用する目的のためにある：
ｉ）感染性要素の有無にかかわらず、急性全身性炎症疾患、例えば全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、ＡＲＤＳ、敗血症、重症敗血症、及び敗血症性ショック。丹毒、髄膜炎、関節炎、トキシックショック症候群、憩室炎、中垂炎、膵炎、胆嚢炎、大腸炎、蜂巣炎、火傷感染症、肺炎、尿路感染症、術後感染症、及び腹膜炎を含む、他の全身性又は限局性で侵襲性の感染性及び炎症性疾患。
ｉｉ）下記を含む慢性炎症性及び／又は感染性疾患；嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ及び他の肺疾患、慢性皮膚及び胃潰瘍を含む胃腸疾患、アトピー性皮膚炎、口腔内潰瘍（アフタ性潰瘍）、陰部潰瘍及び炎症性変化、歯周炎、結膜炎及び角膜炎を含む眼の炎症、外耳炎、中耳炎、泌尿生殖器の炎症などの他の上皮炎症性及び／又は感染性疾患。
ｉｉｉ）術後炎症。血栓症、ＤＩＣ、術後凝固異常、並びに体外循環、及び生体材料の使用を含む異物との接触に関連する凝固異常を含む、炎症性及び凝固異常；更に、血管炎関連炎症性疾患、並びにアレルギー性鼻炎及び喘息を含むアレルギー。
ｉｖ）過度の接触活性化及び／又は脳卒中（これらに限定されない）に関連する凝固。
ｖ）抗微生物剤処置との併用での過度の炎症。使用される抗微生物剤は、種々のルートによって投与することができる；静脈内（ｉｖ）、動脈内、硝子体内、皮下（ｓｃ）、筋肉内（ｉｍ）、腹腔内（ｉｐ）、膀胱内、髄こう内、硬膜外、経腸（経口、直腸、胃内、及び他の経腸ルートを含む）、又は局所的（皮膚、鼻への適用、例えば滴剤による眼又は耳内の適用、及び肺吸入を含む）。薬剤の例には、ペニシリン系、セファロスポリン系、カルバセフェム系、セファマイシン系、カルバペネム系、モノバクタム系、アミノグリコシド系、グリコペプチド系、キノロン系、テトラサイクリン系、マクロライド系、及びフルオロキノロン系がある；防腐剤には、ヨウ素、銀、銅、クロルヘキシジン、ポリヘキサニド及び他のビグアニド類、キトサン、酢酸、及び過酸化水素が含まれる。
【００７３】
例えば、このポリペプチドは、急性炎症、敗血症、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、傷、喘息、アレルギー性及び他のタイプの鼻炎、皮膚及び全身性血管炎、血栓症及び／又は播種性血管内凝固（ＤＩＣ）の処置又は予防に使用されうる。
【００７４】
一実施態様では、このポリペプチドは、抗炎症及び抗凝固活性を示し、炎症及び凝固を同時に処置又は予防するのに用いることができる。こうしたポリペプチドは、炎症と凝固進行の双方を同時に抑制することが望ましい状態、例えば、敗血症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、血栓症、ＤＩＣ及び急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の処置及び予防に特に適しうる。更に、過度の炎症及び凝固病変に関連する他の疾患、例えば、嚢胞性線維症、喘息、アレルギー性及び他のタイプの鼻炎、皮膚及び全身性血管炎は、このポリペプチドによる処置の利益を享受することができる。
【００７５】
更なる実施態様では、本発明のポリペプチドは、１つ又はそれより多い更なる治療薬と組み合わせて使用される。例えば、本発明のポリペプチドは、抗生剤、抗炎症剤、免疫抑制剤及び／又は防腐剤と、並びに血管作用薬及び／又は受容体遮断剤又は受容体作動薬と組み合わせて投与することができる。使用される抗微生物剤は、ｉｖ、ｓｃ、ｉｍ、髄こう内、経口、又は局所的に適用することができる。薬剤の例には、ペニシリン系、セファロスポリン系、カルバセフェム系、セファマイシン系、カルバペネム系、モノバクタム系、アミノグリコシド系、グリコペプチド系、キノロン系、テトラサイクリン系、マクロライド系、及びフルオロキノロン系がある。防腐剤には、ヨウ素、銀、銅、クロルヘキシジン、ポリヘキサニド及び他のビグアニド類、キトサン、酢酸、及び過酸化水素が含まれる。例えば、本発明のペプチドは、例えば、ＬＰＳ作用を抑制するために傷を銀／ＰＨＭＢ処置で処置する、防腐剤処置のアジュバントとして機能を果たしうる。
【００７６】
従って、本発明のペプチドは、内部及び外部感染症（例えば、丹毒、真菌感染を含む肺感染症、敗血症、ＣＯＰＤ、傷、及び他の上皮感染症）の抗生物質、防腐剤及び／又は抗真菌剤処置を（炎症を阻止するために）補完するアジュバントとしての機能を果たしうる。同様に、本発明のペプチドは、例えば、ＬＰＳ作用を抑制するために傷を銀／ＰＨＭＢ処置で処置する、防腐剤処置のアジュバントとして機能を果たしうる。
【００７７】
一実施態様では、本発明のポリペプチドは、ステロイド、例えば、グルココルチコイド（例えば、デキサメタゾン）と組み合わせて使用する。
【００７８】
本発明の第二の関連する局面では、血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質、すなわち、ヘパリンコファクターIIに由来するアミノ酸配列、又はその断片、変異体、融合体若しくは誘導体、又は前記断片の融合体、その変異体若しくは誘導体を含んでなるか、又はこれらから成る単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは抗炎症及び／又は抗菌及び／又は抗凝固活性を示し、但し、該ポリペプチドは天然に存在するタンパク質（例えば、ホロタンパク質）ではない、上記ポリペプチドが提供される。
【００７９】
我々が、この文脈で“天然に存在するタンパク質（naturally occurring protein）”というのは、このポリペプチドがデノボ（de novo）合成されるということを意味している。しかしながら、インビボで生じるこうした天然に存在するホロタンパク質の断片は排除されていない。
【００８０】
断片、変異体、融合体若しくは誘導体のような用語は、本発明の第一の局面に関連して上記で議論された通り解釈されるべきであることは当技術分野の当業者であれば理解するところである。
【００８１】
一実施態様では、このポリペプチドは、配列番号１〜３、又は前記配列の断片、変異体、融合体若しくは誘導体、又は前記断片の融合体、その変異体若しくは誘導体から成る群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるか、又はこれらから成る。例えば、このポリペプチドは、配列番号１〜３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるか、又はこれらから成りうる。
【００８２】
本発明の第一の局面でのポリペプチドに関連して上記で議論された所望の特徴はまた、本発明の第二の局面の関連するポリペプチドに該当するということは当技術分野の当業者であれば理解するところである。
【００８３】
例えば、１つの好ましい実施態様では、このポリペプチドは、ヒト単球由来のマクロファージに起源する１つ又はそれより多い炎症誘発性サイトカイン（例えば、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＩＬ−１及び／又はＩＬ−１８）の放出を阻害することができる。
【００８４】
別の好ましい実施態様では、このポリペプチドは、抗凝固活性を示す。
【００８５】
この発明はまた、上述したポリペプチドの製薬学的に許容される酸又は塩基付加塩をも含む。この発明において有用な、上述の塩基化合物の製薬学的に許容される酸付加塩を調製するのに使用される酸は、とりわけ、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩（acid phosphate）、酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酸性クエン酸塩（acid citrate）、酒石酸塩、酒石酸水素塩（bitartrate）、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、サッカラート（saccharate）、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩及びパモン酸塩［すなわち、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトアート）］塩などの非毒性酸付加塩、すなわち、薬理学的に許容されるアニオンを含有する塩を形成する酸である。
【００８６】
製薬学的に許容される塩基付加塩もまた、このポリペプチドの製薬学的に許容される塩の形態を製造するのに使用しうる。事実上酸性であるこの発明の化合物の製薬学的に許容される塩基塩を調製するための試薬として使用することができる化学塩基は、こうした化合物と非毒性の塩基塩を形成する塩基である。こうした非毒性塩基塩には、とりわけ、アルカリ金属カチオン（例えば、カリウム及びナトリウム）及びアルカリ土類金属カチオン（例えば、カルシウム及びマグネシウム）などのそうした薬理学的に許容されるカチオンから誘導される塩基塩、アンモニウム又はＮ−メチルグルカミン（メグルミン）などの水溶性アミン付加塩、並びに低級アルカノールアンモニウム及び製薬学的に許容される有機アミンの他の塩基塩が含まれるが、それらに限定されない。
【００８７】
本発明のポリペプチドは、保存のために、例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥、スプレー冷却によって、又は超臨界二酸化炭素に起源する粒子形成（沈殿）を使用することによって、凍結乾燥することができ、そして使用前に適切な担体中で復元することができるということは理解されるところである。あらゆる適切な凍結乾燥（lyophilisation）方法（例えば、フリーズドライ（freeze-drying）、噴霧乾燥、ケーキ乾燥（cake drying））及び／又は復元手法を使用することができる。凍結乾燥及び復元は、様々な程度の活性損失をもたらしうるということ、そして使用レベルによってそれを補うように上方に調節する必要があることは当技術分野の当業者であれば理解するところである。好ましくは、この凍結乾燥（フリーズトライ）したこのポリペプチドの損失は、元にもどしたとき、その活性（凍結乾燥前）の約１％に過ぎないか、あるいは元にもどしたとき、その活性（凍結乾燥前）の約５％、１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％にすぎないか、あるいは約５０％にすぎない。
【００８８】
本発明のポリペプチドの製造方法は、当技術分野で周知である。
【００８９】
好都合には、このポリペプチドは、組み換えポリペプチドであるか、又は組み換えポリペプチドを含んでなる。こうした組み換えポリペプチドの適切な製造方法は、当技術分野において周知であり、例えば、原核生物又は真核生物の宿主細胞内で発現させる（例えば、Sambrook & Russell, 2000, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照されたい。なお、この書籍中の該当する開示は引用することにより本明細書中に組み込まれる）。
【００９０】
本発明のポリペプチドはまた、商業上入手可能なインビトロの翻訳システムを用いて製造することができ、例えば、ウサギ網状赤血球溶解液（rabbit reticulocyte lysate）又は小麦胚芽溶解液（wheatgerm lysate）（Promegaから入手可能）がある。好ましくは、この翻訳システムは、ウサギ網状赤血球溶解液である。好都合なことには、この翻訳システムは、ＴＮＴ転写／翻訳システム（Promega）などの翻訳システムと連動させることができる。このシステムは、コード化しているＤＮＡポリヌクレオチドから適切なｍＲＮＡ転写物を、翻訳と同じ反応で作製する利点を有する。
【００９１】
あるいは、本発明のポリペプチドは人工的に、例えば、周知の液相又は固相合成手法（例えば、ｔ−Ｂｏｃ又はＦｍｏｃ固相ペプチド合成）を用いて合成することができることは当技術分野の当業者であれば理解するところである。
【００９２】
従って、この発明の範囲内には、下記が含まれる：
（ａ）本発明の第三の局面は、本発明の第二の局面によるポリペプチドをコードしている、単離された核酸分子を提供する；
（ｂ）本発明の第四の局面は、本発明の第三の局面による核酸分子を含んでなるベクター（例えば、発現ベクター）を提供する；
（ｃ）本発明の第五の局面は、本発明の第三の局面による核酸分子、又は本発明の第四の局面によるベクターを含んでなる宿主細胞を提供する；そして
（ｄ）本発明の第六の局面は、本発明の第二の局面によるポリペプチドを製造する方法であって、本発明の第五の局面による宿主細胞の集団を、前記ポリペプチドが発現される条件下で培養すること、そしてそれからポリペプチドを単離することを含んでなる、上記方法を提供する。
【００９３】
本発明の第七の局面は、本発明の第一の局面によるポリペプチドを、製薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と一緒に含んでなる、医薬組成物を提供する。
【００９４】
本明細書中で使用されている際は、‘医薬組成物（pharmaceutical composition）’とは、炎症に関連する障害及び状態の処置又は予防における使用のための治療的に有効な製剤を意味する。
【００９５】
本明細書中で使用されている際は、‘医薬組成物（pharmaceutical composition）’とは、炎症に関連する障害及び状態の処置又は予防における使用のための治療的に有効な製剤を意味する。
【００９６】
別のペプチド、低分子量免疫調節剤、受容体アゴニスト及びアンタゴニスト、及び抗微生物剤などの更なる化合物もまた、医薬組成物中に含みうる。他の例には、ＥＤＴＡ、シトラート（citrate）、ＥＧＴＡ又はグルタチオンなどのキレート化剤が含まれる。
【００９７】
十分に保存安定性があり、かつヒト及び動物に投与するのに適しているこの医薬組成物は、当技術分野において知られている方法で製造することができる。医薬組成物は、例えば、フリーズドライ、噴霧乾燥、スプレー冷却によって、又は超臨界粒子形成に起源する粒子形成を使用することによって、凍結乾燥することができる。
【００９８】
我々が、“製薬学的に許容される（pharmaceutically acceptable）”というのは、活性成分、すなわち、抗炎症性ポリペプチドの生物学的活性の有効性が減少しない非毒性成分を意味している。こうした製薬学的に許容される緩衝液、担体又は賦形剤は、当技術分野において周知である（Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A.R Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990) and handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed ., Pharmaceutical Press (2000）参照）。
【００９９】
用語“バッファー（buffer）”は、酸塩基混合物を、ｐＨを安定させる目的で含む水溶液を意味することを意図している。緩衝液の例には、トリズマ（Trizma）、ビシン、トリシン、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＢＳ、トリス（Tris）、ヘペス（Hepes）、ＨＥＰＢＳ、ＭＥＳ、ホスファート、カルボナート、アセタート、シトラート、グリコラート、ラクタート、ボラート、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、タートラート、ＡＭＰ、ＡＭＰＤ、ＡＭＰＳＯ、ＢＥＳ、ＣＡＢＳ、カコジラート、ＣＨＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＥＰＰＳ、エタノールアミン、グリシン、ＨＥＰＰＳＯ、イミダゾール、イミダゾール乳酸、ＰＩＰＥＳ、ＳＳＣ、ＳＳＰＥ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＢＳ、ＴＡＰＳＯ及びＴＥＳがある。
【０１００】
用語“希釈剤（diluent）”は、医薬製剤中のペプチドを希釈する目的の、水溶液又は非水溶液を意味することを意図している。この希釈剤は、１つ又はそれより多い生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール又は油類（例えば、サフラワー油、コーンオイル、ピーナツ油、綿実油又はゴマ油）でありうる。
【０１０１】
用語“アジュバント（adjuvant）”は、ペプチドの生物学的作用を増加させるために製剤に加えられる任意の化合物を意味することを意図している。このアジュバントには、１つ又はそれより多いコロイド銀、又は種々のアニオンとの亜鉛、銅又は銀塩がありえ、例えば、フルオリド、クロリド、ブロミド、ヨージド、チオシアナート、亜硫酸塩、ヒドロキシド、ホスファート、カルボナート、ラクタート、グリコラート、シトラート、ボラート、タートラート、及び種々のアシル成分のうちのアセタート（acetates of different acyl composition）があるが、これらに限定されない。このアジュバントはまた、ＰＨＭＢ、カチオン性セルロースエーテル、カチオン性セルロースエステル、脱アセチル化ヒアルロン酸、キトサン、カチオン性デンドリマー、ポリ（ビニルイミダゾール）などのカチオン性合成ポリマー及びポリヒスチジンなどのカチオン性ポリペプチド、ポリリシン、ポリアルギニン、及びこうしたアミノ酸を含むペプチドなどのカチオン性ポリマーでありうる。
【０１０２】
賦形剤には、１つ又はそれより多い炭水化物、ポリマー、脂質及びミネラルがありうる。炭水化物の例には、乳糖、スクロース、マンニトール、及びシクロデキストリンが含まれ、これらはこの組成物に、例えば、凍結乾燥を容易にするために加えられる。ポリマーの例には、澱粉、セルロースエーテル、セルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、エチルセルロース、メチルセルロース、プロピルセルロース、アルギナート、カラギーナン、ヒアルロン酸及びその誘導体、ポリアクリル酸、ポリスルホナート、ポリエチレングリコール／ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドコポリマー、ポリビニルアルコール／種々の程度の加水分解されたポリビニルアセタート、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）又は種々の成分とのそのコポリマー、及びポリビニルピロリドンがあるが、これらはすべて、種々の分子量であり、例えば、粘性制御のため、生物接着を得るため、又は化学分解及びタンパク質分解から活性成分（Ａ〜Ｃにも適用される）を保護するためにこの組成物に加えられる。脂質の例には、脂肪酸、リン脂質、モノ−、ジ−、及びトリグリセリド、セラミド、スフィンゴ脂質及び糖脂質（これらはすべて、種々のアシル鎖長さ及び飽和度がある）、卵黄レシチン、大豆レシチン、水素添加卵黄及び大豆レシチンがあり、これらはポリマーのそれと同様な理由で組成物に加えられる。ミネラルの例には、タルク、酸化マグネシウム、酸化亜鉛及び酸化チタンがあり、これらは液体貯留の減少又は着色剤特性を有利にするなどの効果を得るために組成物に加えられる。
【０１０３】
この医薬組成物はまた、１つ又はそれより多い単糖類又は二糖類、例えば、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、ラクチトール（lactitiol）、イソマルト、マルチトール若しくはキシロシド、及び／又はモノラウリンなどのモノアシルグリセロールを含む。この担体の特徴は、投与ルートに左右されることである。１つの投与ルートは、局所投与である。例えば、局所投与の場合に好ましい担体は、活性ペプチドを含んでなる乳剤性クリームであるが、ある種のワセリン／ミネラルベース及び植物ベース軟膏、並びにポリマーゲル、液晶相及びマイクロエマルションなどの一般的な他の担体を使用することができる。
【０１０４】
この医薬組成物は、１つ又はそれより多い本発明のポリペプチド、例えば、１つ、２つ、３つ又は４つの異なったペプチドを含めることができるということは理解されるところである。異なるペプチドの組み合わせ物を使用することによって抗炎症作用が増強されうる。
【０１０５】
上記で議論したように、このポリペプチドは、塩、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、臭化水素酸、リン酸、過塩素酸、チオシアン酸、ホウ酸などの無機酸との酸付加物、あるいはギ酸、酢酸、ハロ酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、クエン酸、酒石酸、琥珀酸、グルコン酸、乳酸、マロン酸、フマル酸、アントラニル酸、安息香酸、桂皮酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、スルファニル酸などの有機酸との酸付加物として提供されうる。すべて対応するアニオンと一緒になる一価のナトリウム、カリウム又は二価の亜鉛、マグネシウム、銅、カルシウムなどの無機塩は、抗菌組成物の生物学的活性を改善するために加えられうる。
【０１０６】
本発明の医薬組成物はまた、その中でポリペプチドが、製薬学的に許容される担体のほかに、ミセル、不溶単分子層及び液晶のように凝集した形態で存在する脂質などの両親媒性剤と結合するリポソームの形態でありうる。リポソーム製剤のための適切な脂質には、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などが含まれるが、これらに限定されない。適切な脂質にはまた、血流循環時間を長くするために極性頭基をポリ（エチレングリコール）修飾した上記の脂質が含まれる。こうしたリポソーム製剤の調製は、例えば、米国特許第４，２３５，８７１号中に見い出すことができる。
【０１０７】
本発明の医薬組成物はまた、生体分解性のマイクロスフェアの形態でありうる。ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ＰＬＡとＰＧＡのコポリマー（ＰＬＧＡ）又はポリ（カルプロラクトン）（ＰＣＬ）、及びポリ無水物などの脂肪族ポリエステルが、マイクロスフェアを製造する際、生体分解性ポリマーとして広く使用されている。こうしたマイクロスフェアの調製は、米国特許第５，８５１，４５１号及びＥＰ ２１３３０３中に見出すことができる。
【０１０８】
本発明の医薬組成物はまた、界面活性剤及びブロックコポリマーによって形成されるミセル系、好ましくは、血流循環時間を長くするためにポリ（エチレンオキシド）部分を含むミセル系を用いて製剤化することができる。
【０１０９】
本発明の医薬組成物はまた、ポリマーゲルの形態でありえ、その場合、澱粉、セルロースエーテル、セルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、エチルセルロース、メチルセルロース、プロピルセルロース、アルギナート、キトサン、カラギーナン、ヒアルロン酸及びその誘導体、ポリアクリル酸、ポリビニルイミダゾール、ポリスルホナート、ポリエチレングリコール／ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドコポリマー、ポリビニルアルコール／種々の程度の加水分解されたポリビニルアセタート、及びポリビニルピロリドンなどのポリマーがペプチドを含む溶液を増粘するために使用される。このポリマーはまた、ゼラチン又はコラーゲンを含んでいてもよい。
【０１１０】
他に、本発明のポリペプチドは、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール又は油類（例えば、サフラワー油、コーンオイル、ピーナツ油、綿実油又はゴマ油）、トラガントゴム、及び／又は様々なバッファーに溶解させてもよい。
【０１１１】
この医薬組成物はまた、抗炎症性ポリペプチドの作用の増強のためにイオン類を含んでいてもよく、そしてｐＨを規定することを含んでいてもよい。
【０１１２】
本発明の組成物は、滅菌などの一般に行なわれている製薬操作に付されてもよく、及び／又は、例えば、本明細書中のいずれかで開示されている保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、バッファー、増量剤など一般に使用されているアジュバントを含有していてもよい。
【０１１３】
本発明の医薬組成物は、局所的、又は全身的に投与することができるということは当技術分野の当業者に理解されるところである。投与ルートには、局所、眼、鼻、肺、口腔、非経口（静脈内、皮下、及び筋肉内）、経口、膣及び直腸が含まれる。また、インプラント投与も可能である。適切な製剤形態には、例えば、顆粒、散剤、錠剤、コーティング錠剤、（マイクロ）カプセル、座剤、シロップ、エマルション、マイクロエマルション（水、油及び界面活性剤から成る光学的に等方性の熱力学的に安定な系と定義される）、液晶相（短距離無秩序以外の長距離秩序を特徴とする系と定義される）（例には、ラメラ、ヘキサゴナル及びキュービック相が含まれる（水連続相あるいは油連続相））、又はそれらが分散したカウンターパート、ゲル、軟膏、分散系、懸濁液、クリーム、エアロゾル、液滴又はアンプル形態の注入可能な溶液及び、活性化合物の遅延放出を備えた製剤もあり、こうした製剤には、賦形剤、希釈剤、アジュバント又は担体が通例、上記に述べられているように使用される。この医薬組成物はまた、包帯、プラスター中、あるいは縫合糸中などにも提供が可能でありうる。
【０１１４】
好ましい実施態様では、この医薬組成物は、非経口投与又は局所投与に適している。
【０１１５】
これに代わる好ましい実施態様では、この医薬組成物は、肺投与又は鼻内投与に適している。
【０１１６】
例えば、本発明の医薬組成物は、鼻内又は吸入によって投与することができ、そして適切なプロペラント、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ １３４Ａ３又は１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ ２２７ＥＡ３）などのヒドロフルオロアルカン、炭酸ガス又は他の適切なガスを使用して、乾燥粉末吸入器あるいは加圧容器、ポンプ、スプレー又はネブライザーからのエアロゾルスプレー供給の形態で送達するのが好都合である。加圧エアロゾルの場合には、投与単位は、計量を送達するバルブを供給することによって決定することができる。この加圧容器、ポンプ、スプレー、又はネブライザーは、例えば、エタノールと溶媒としてのプロペラントの混合物を用いる活性化合物の溶液又は懸濁液を含むことができ、これには、更に、滑沢剤、例えば、ソルビタントリオレアートを含めることができる。吸入器又は吹きつけ器（insufflator）で使用するためのカプセル及びカートレッジ（例えば、ゼラチンから作られる）は、本発明のポリペプチドと乳糖又は澱粉などの適切な粉末ベースの粉末ミックスを含むように製剤化することができる。
【０１１７】
エアロゾル又は乾燥粉末製剤は、好ましくは、各計量用量又は‘パフ（puff）’が患者に供給するために本発明のポリペプチドを少なくとも０．１ｍｇ含むように準備しておくことが好ましい。１つのエアロゾルで一日の全投与量は、患者によって異なるが、一日を通じて、単回投与によるか、又はより普通には、分割投与によって投与することができることは理解されるところである。
【０１１８】
この医薬組成物は、医薬的に有効な投与量で患者に投与するものである。“医薬的に有効な投与量（pharmaceutically effective dose）”というのは、投与される条件に応じて、所望の効果をもたらすために十分な投与量を意味している。正確な投与量は、化合物の活性、投与方法、障害の性質及び重篤度、異なった投与量が必要とされうる患者の年齢及び体重によって左右される。この用量投与は、個々の投与単位、さもなければ、いくつかのより少ない投与単位の形で単回投与によって、並びにまた特定の間隔をおいて細分割した投与量の複数回投与による双方で行うことができる。
【０１１９】
本発明の医薬組成物は、単独、又は別の治療剤と組み合わせて投与することができ、別の治療薬には、例えば、更なる抗生物質、抗炎症剤、免疫抑制剤、血管作用薬、及び／又は防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、及び駆虫剤）がある。適切な抗菌剤の例には、ペニシリン系、セファロスポリン系、カルバセフェム系、セファマイシン系、カルバペネム系、モノバクタム系、アミノグリコシド系、グリコペプチド系、キノロン系、テトラサイクリン系、マクロライド系、及びフルオロキノロン系が含まれる。防腐剤には、ヨウ素、銀、銅、クロルヘキシジン、ポリヘキサニド及び他のビグアニド類、キトサン、酢酸、及び過酸化水素が含まれる。同様に、医薬組成物はまた、ステロイド及びマクロラクタム誘導体などの更なる抗炎症薬を含むことができる。
【０１２０】
一実施態様では、本発明の医薬組成物はステロイド、例えば、グルココルチコイド（例えば、デキサメタゾン）と組み合わせて投与される。
【０１２１】
更なる治療剤は、同じ医薬組成物の一部分として組み込まれることができるか、あるいは別々に投与されることができることは当技術分野の当業者であれば理解するところである。
【０１２２】
本発明の第七の局面の一実施態様では、この医薬組成物は、医療に使用されるデバイス又は材料と‘関連している（associated with）’（体外又は体内に）。我々が‘関連している（associated with）’というのは、本発明の医薬組成物（又はそのポリペプチド）を、被覆する、染み込ませる（impregnated）、共有結合で結合させる、又はそうでなければ混合させるデバイス又は材料を含んでいる。
【０１２３】
例えば、この組成物は、バイパス手術、体外循環、傷のケア、及び／又は透析において使用されるデバイスなどのヒトの体又はその構成部分（例えば、血液）に接触するデバイスの表面に被覆することができる。すなわち、この組成物は、縫合糸、人工補綴物、インプラント、創傷被覆材、カテーテル、レンズ、皮膚移植片、代用皮膚、フィブリン接着剤又は包帯などに被覆すること、塗ること、噴霧すること、あるいはその他の方法で塗布するか、又は混合することができる。そうすることにより、この組成物は該デバイス又は材料に抗炎症及び／又は抗凝固特性の改善を付与することができる。
【０１２４】
好ましくは、このデバイス又は材料は、本発明の医薬組成物（又は、そのポリペプチド成分）で被覆される。我々が、‘被覆された（coated）’というのは、この医薬組成物が、デバイス又は材料の表面に塗布されているということを意味している。すなわち、このデバイス又は材料は、本発明の医薬組成物（又は、そのポリペプチド）を含んでなる溶液を塗るか、又は噴霧することができる。これに代えて、このデバイス又は材料は、本発明のポリペプチドを含んでなる溶液のリザーバ（reservoir）に浸漬することができる。
【０１２５】
有利には、このデバイス又は材料には、本発明の医薬組成物（又は、そのポリペプチド）が染み込まれている。我々が、‘染み込まれた（impregnated）’というのは、医薬組成物が全体にわたって分布されているように、医薬組成物が取り込まれているか、そうでなければこのデバイス又は材料と混合していることを意味している。
【０１２６】
例えば、このデバイス又は材料は、本発明のポリペプチドを含んでなる溶液中、４℃で終夜インキュベートすることができる。これに代えて、本発明の医薬組成物（又は、そのポリペプチド）が、蒸発によるか、又は室温でインキュベーションされることによってデバイス又は材料の表面上で固定することができる。
【０１２７】
代替的実施態様では、本発明のポリペプチドは、デバイス又は材料に、例えば、デバイス又は材料の外部表面で共有結合によって結合している。すなわち、共有結合が、このポリペプチドの適切な官能基と、デバイス又は材料上の官能基の間で形成される。例えば、ポリペプチドをポリマー支持体と共有結合させる方法には、ペプチド結合の形成によって、結合タンパク質上のフェノール、アミン及びスルフヒドリル（sulphydryl）基のアルキル化によって、多官能性中間体、例えば、グルタルジアルデヒド（glutardialdehyde）を用いることによって、ジアゾニウム中間体を介して共有結合すること、並びに他の様々な方法、例えば、ジ−及びトリアルコキシシランの反応が、ガラス表面を多くの異なった官能基で誘導体化することを可能にするシリル化したガラス又は石英を用いることが含まれる。詳細は、Enzyme immobilisation by Griffin, M., Hammonds, E.J. and Leach, C.K. (1993) In Technological Applications of Biocatalysts (BIOTOL SERIES), pp. 75-118, Butterworth-Heinemannを参照されたい。また、次の表題がつけられている総説も参照されたい：'Biomaterials in Tissue Engineering' by Hubbell, J.A. (1995) Science 13:565-576。
【０１２８】
好ましい実施態様では、このデバイス又は材料は、ポリマーを含んでなるか、又はこれから成る。このポリマーは、ポリエステル（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸又は種々の組成のポリ乳酸−グリコール酸コポリマー）、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリウレア、ポリカーボネート（polycarbonates）、ポリウレタン、ポリアミド）及び多糖類成分（polysaccharide materials）（例えば、架橋アルギナート（cross-linked alginates）、ヒアルロン酸、カラギーナン、ゼラチン、澱粉、セルロース誘導体）から成る群より選択することができる。
【０１２９】
これに代えて、あるいはこれに加えて、このデバイス又は材料は、金属（例えば、チタン、ステンレス鋼、金、チタン）、金属酸化物（酸化シリコン、酸化チタン）及び／又はセラミック（アパタイト、ヒドロキシアパタイト）を含んでなるか、又はこれらから成ってもよい。
【０１３０】
こうした材料は、化学的又は物理化学的に架橋したゲルのように、多孔性材料のように、又は粒子のように、巨視的固体／モノリスの形態でありうる。
【０１３１】
すなわち、この発明は更に医療において使用される本発明のポリペプチド又はそれを含んでなる、医薬組成物が適用されたデバイス及び材料を提供する。
【０１３２】
こうしたデバイス及び材料は、当技術分野において周知の方法を用いて作製することができる。
【０１３３】
本発明の第八の局面は、本発明の第二の局面によるポリペプチド、又は医療における使用のための本発明の第七の局面による医薬組成物を提供する。
【０１３４】
好ましい実施態様では、本発明の第二の局面によるポリペプチド、又は本発明の第七の局面による医薬組成物が使用される：
（ａ）急性及び／又は慢性炎症の処置及び／予防；
（ｂ）微生物感染症（例えば、細菌感染症）の処置及び／予防；
（ｃ）血液凝固の調節（モジュレーション：modulation）；及び／又は
（ｄ）傷の処置。
【０１３５】
好ましい実施態様では、本発明の第二の局面によるポリペプチド、又は本発明の第七の局面による医薬組成物は、下記から選択される疾患、状態又は適応を処置及び予防する際の使用である：
ｉ）感染性要素の有無にかかわらず、急性全身性炎症疾患、例えば全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、ＡＲＤＳ、敗血症、重症敗血症、及び敗血症性ショック。丹毒、髄膜炎、関節炎、トキシックショック症候群、憩室炎、中垂炎、膵炎、胆嚢炎、大腸炎、蜂巣炎、火傷感染症、肺炎、尿路感染症、術後感染症、及び腹膜炎を含む、他の全身性又は限局性で侵襲性の感染性及び炎症性疾患。
ｉｉ）下記を含む慢性炎症性及び／又は感染性疾患；嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ及び他の肺疾患、慢性皮膚及び胃潰瘍を含む胃腸疾患、アトピー性皮膚炎、口腔内潰瘍（アフタ性潰瘍）、陰部潰瘍及び炎症性変化、歯周炎、結膜炎及び角膜炎を含む眼の炎症、外耳炎、中耳炎、泌尿生殖器の炎症などの他の上皮炎症性及び／又は感染性疾患。
ｉｉｉ）術後炎症。血栓症、ＤＩＣ、術後凝固異常、並びに体外循環、及び生体材料の使用を含む異物との接触に関連する凝固異常を含む、炎症性疾患及び凝固異常；更に、血管炎関連炎症性疾患、並びにアレルギー性鼻炎及び喘息を含むアレルギー。
ｉｖ）過度の接触活性化及び／又は脳卒中（これらに限定されない）に関連する凝固。
ｖ）抗微生物剤処置との併用での過度の炎症。使用される抗微生物剤は、種々のルートによって投与することができる；静脈内（ｉｖ）、動脈内、硝子体内、皮下（ｓｃ）、筋肉内（ｉｍ）、腹腔内（ｉｐ）、膀胱内、髄こう内、硬膜外、経腸（経口、直腸、胃内、及び他の経腸ルートを含む）、又は局所的（皮膚、鼻への適用、例えば滴剤による眼又は耳内の適用、及び肺吸入を含む）。薬剤の例には、ペニシリン系、セファロスポリン系、カルバセフェム系、セファマイシン系、カルバペネム系、モノバクタム系、アミノグリコシド系、グリコペプチド系、キノロン系、テトラサイクリン系、マクロライド系、及びフルオロキノロン系がある；防腐剤には、ヨウ素、銀、銅、クロルヘキシジン、ポリヘキサニド及び他のビグアニド類、キトサン、酢酸、及び過酸化水素が含まれる。
【０１３６】
例えば、このポリペプチドは、急性炎症、敗血症、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、傷、喘息、アレルギー性及び他のタイプの鼻炎、皮膚及び全身性血管炎、血栓症及び／又は播種性血管内凝固（ＤＩＣ）の処置又は予防に使用されうる。
【０１３７】
例えば、配列番号１又は２のアミノ酸配列、又はその断片、変異体、融合体若しくは誘導体、又は前記断片の融合体、その変異体若しくは誘導体を含んでなるか、又はこれらから成るポリペプチドは、急性及び／又は慢性炎症を処置及び／又は予防するために使用することができる。
【０１３８】
更なる例では、配列番号３のアミノ酸配列、又はその断片、変異体、融合体若しくは誘導体、又は前記断片の融合体、その変異体若しくは誘導体を含んでなるか、又はこれらから成るポリペプチドは、微生物感染症（例えば、細菌感染症）を処置及び／又は予防するために使用することができる。
【０１３９】
本発明の関連する第九の局面は、炎症及び／又は過度の凝固（上記で述べられている通り）を処置又は予防するための薬剤の製造における、本発明の第二の局面によるポリペプチド、又は本発明の第七の局面による医薬組成物の使用を提供する。
【０１４０】
本発明の第十の局面は、患者における炎症及び／又は過度の凝固を処置し、または予防する方法であって、その方法が、治療的に有効な量の本発明の第二の局面によるポリペプチド、又は本発明の第七の局面による医薬組成物（上記で述べられている通り）を、患者に投与することを含んでなる、上記方法を提供する。好ましいが、しかし非限定的実施態様では、この方法は、急性炎症、敗血症、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、喘息、アレルギー性及び他のタイプの鼻炎、皮膚及び全身性血管炎、血栓症及び／又は播種性血管内凝固（ＤＩＣ）を処置又は予防するためである。
【０１４１】
更に、当技術分野の当業者は、この発明の使用及び方法が医学及び獣医学双方の分野に有用性を有することを理解するところである。すなわち、このポリペプチド薬剤は、ヒト及び非ヒト動物（例えば、ウマ、イヌ及びネコ）の双方の処置に使用することができる。しかしながら、有利には、患者はヒトである。
【０１４２】
本発明の好ましい局面は、次の図に準拠して次の非限定的な実施例に述べられている：
【０１４３】
図１：ＴＦＰＩのＣ末端ペプチドのＮＯブロッキング作用。
ＲＡＷ ２６４．７マクロファージを、１０ｎｇ／ｍｌのエッシェリヒア・コリ ＬＰＳ（E.coli LPS）で刺激し、そして１０μＭのペプチド ＧＧＬ２７、ＬＩＫ１７及びＴＫＲ２２を加えた。ＮＯをグリエス（Griess）試薬を用いて測定した。
【０１４４】
図２：ヘパリンコファクターIIのペプチドのＮＯブロッキング作用。
ＲＡＷマクロファージを、１０ｎｇ／ｍｌのエッシェリヒア・コリ ＬＰＳ（E.coli LPS）で刺激し、そしてペプチドＫＹＥ２８、ＮＬＦ２０、及びＫＹＥ２１を指定用量で加えた。ＬＬ−３７をポジティブコントロールとして提示した。ＮＯを、グリエス試薬を用いて測定した。
【０１４５】
図３：ヘパリンコファクターIIのペプチドの抗炎症作用。
ＫＹＥ２８、ＫＹＥ２１及びＮＬＦ２０は、種々の微生物生産物で刺激されたＲＡＷ２６４．７マクロファージのＮＯ産生をブロックする。細胞は、指定濃度のエッシェリヒア・コリ ＬＰＳ（E.coli LPS）、スタフィロコッカス・アウレウス（S.aureus）に起源するリポタイコ酸（ＬＴＡ）及びペプチドグリカン（ＰＧＮ）、並びにサッカロミセス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に起源するザイモサンＡに処された。ＮＯ産生を、１０μＭ ＧＫＹ２５を加えるか、又は加えずに、グリエス試薬を用いることによって決定した。
【０１４６】
図４：ＴＦＰＩのＣ末端ペプチドは、凝固をブロックする。
（Ａ）ＴＦＰＩのＣ末端ペプチド；ＧＧＬ２７、ＬＩＫ１７、及びＴＫＲ２２は、正常ヒト血漿における凝固の外因系経路を弱める。これは活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を測定することによって決定した。ＧＧＬ２７及びＬＩＫ１７はまた、凝固の内因系経路をモニタリングするプロトロンビン時間（ＰＴ）に影響を与えた。トロンビン誘発フィブリンネットワーク形成を測定するトロンビン凝固時間（ＴＣＴ）は、ペプチド類によっては有意に影響されなかったが、（Ｂ）ＧＧＬ−２７では、用量依存の形で凝固を弱め、このことは正常ヒト血漿におけるａＰＴＴ、ＰＴ及びＴＣＴを測定することによってモニタリングされた。
【０１４７】
図５：ヘパリンコファクターIIのペプチドは、凝固をブロックする。
ＫＹＥ２８及びＮＬＦ２０は、正常ヒト血漿における凝固の内因系経路を弱め、このことは活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を測定することによって決定された。ＫＹＥ２１は、ａＰＴＴのわずかなブロックを示したに過ぎなかった。凝固システムの他の部分では、凝固の外因系経路をモニタリングするプロトロンビン時間（ＰＴ）、及びトロンビン誘発フィブリンネットワーク形成を測定するトロンビン凝固時間（ＴＣＴ）によって判断して、有意に影響が与えられなかった。
【０１４８】
図６：ＴＦＰＩの構造を図解している略画。
酵素による切断部位が指定されている。
【０１４９】
図７：ＴＦＰＩに由来するペプチドの抗微生物活性。
指定微生物に対する選択されたペプチド（１００μＭ（ＲＤＡ中））の抗微生物活性。抗微生物活性を決定するために、エッシェリヒア・コリ（E. coli） ATCC 25922、スタフィロコッカス・アウレウス S. aureus ATCC 29213分離株（isolates）（４×１０6cfu）又はカンジダ・パラプシロシス（C. parapsilosis）ATCC 90018（１×１０5cfu）を０．１％ＴＳＢ アガロースゲル中に接種した。それぞれ、４ｍｍ直径のウェルに６μｌのペプチドをローディングした。３７℃で１８〜２４時間インキュベーションした後、クリアランスゾーンがそれぞれのペプチドの抑制効果に相当する（平均値が提示される、ｎ＝３）。
【０１５０】
図８：ＴＦＰＩに由来するペプチドの抗菌活性。
生菌数アッセイ（viable count assays）においてエッシェリヒア・コリ（E.coli）に対するＴＦＰＩに由来するペプチド及びＬＬ−３７の作用。２×１０6ｃｆｕ／ｍｌの細菌を、正常又は加熱不活性化した２０％ヒト血漿を含んでいる、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４バッファー（Ｔｒｉｓ）中、あるいは０．１５ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中、ペプチドを指定濃度で含む５０μｌ中でインキュベートした（ｎ＝３、ＳＤは指定されている）。
【０１５１】
図９：速度論分析。
２０％血漿を含んでいる０．１５ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中のＴＦＰＩに由来するペプチド（６及び３０μＭ）による時間依存的殺菌をエッシェリヒア・コリ（E.coli）を用いる生菌数アッセイによって分析した。
【０１５２】
図１０：細菌膜に対する作用。
（Ａ）シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）及びエッシェリヒア・コリ（E. coli）に対するペプチドの透過性作用。（Ａ）細菌を指定のペプチドと共にインキュベートし、そして、透過性を不透過性プローブＦＩＴＣを用いて評価した。（Ｂ）電子顕微鏡分析。シュードモナス・エルギノーサ及びスタフィロコッカス・アウレウス細菌を、３０μＭのＧＫＹ２５及びＬＬ−３７で、３７℃で２時間インキュベートし、そして電子顕微鏡で解析した。スケールバーは１μｍであった。コントロール；バッファーコントロール。
【０１５３】
図１１：ＴＦＰＩペプチド ＬＩＫ１７の構造。
マイナスに荷電されたリポソーム（ＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ）の存在下でのＴＦＰＩに由来するＣ末端ペプチドのへリックス含量。ＬＩＫ１７構造は、リポソームの添加によってほとんど影響されなかった。
【０１５４】
図１２：トリスバッファー中及びＬＰＳの存在下でのＬＩＫ１７のＣＤスペクトル。
コントロールのために、バッファーとＬＰＳのみのＣＤスペクトルも提示された。
【０１５５】
図１３：リポソーム漏出（liposome leakage）に対する指定ペプチドの作用。
膜透過性作用は、ＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ（マイナスに荷電されている）リポソームに起源するカルボキシフルオレセインの蛍光放出を測定することによって記録した。この実験は、０．１５Ｍ ＮａＣｌの不存在及び存在下、１０ｍＭトリスバッファー中で行なわれた。値は３連のサンプルの平均に相当する。
【０１５６】
図１４：真核生物細胞に対する活性。
指定ペプチドの溶血作用。細胞をこのペプチドの種々の濃度でインキュベートし、２％トリトンＸ−１００（Sigma-Aldrich）をポジティブコントロールとして機能させた。ヘモグロビン放出の吸光度をλ５４０ｎｍで測定し、そしてトリトンＸ−１００で誘発された溶血の％として表現した（ｙ軸のスケールに留意する）。ＬＬ−３７の作用を比較のために示す。
【０１５７】
図１５：ＨａＣａＴケラチノサイトを指定ＴＦＰＩ−ペプチド並びにＬＬ−３７に処した。細胞の透過性作用をＬＤＨベースＴＯＸ−７キットによって測定した。細胞からのＬＤＨ放出は、λ４９０ｎｍでモニタリングし、そして全ＬＤＨ放出％としてプロットした。
【０１５８】
図１６：ＭＴＴアッセイを、指定ペプチドの存在下（６０μＭ）で、ＨａＣａＴケラチノサイトの生存能力を測定するのに使用した。このアッセイでは、ＭＴＴは、代謝活性に関連する酵素によって、１つの色素、青色のホルマザンに変化する。色素の吸光度をλ５５０ｎｍで測定した。
【０１５９】
図１７：ヘパリンコファクターIIに由来するペプチドの抗微生物活性。
ＲＤＡにおける選択されたペプチド（１００μＭ）の指定の微生物に対する抗微生物活性。エッシェリヒア・コリ（E. coli）ATCC 25922、スタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus） ATCC 29213分離株（４×１０6cfu）又はカンジダ・パラプシロシス（C. parapsilosis）ATCC 90018（１×１０5cfu）を、０．１％ ＴＳＢアガロースゲル中に接種した。それぞれ、４ｍｍ直径のウェルに６μｌのペプチドをローディングした。３７℃で１８〜２４時間インキュベーションした後、クリアランスゾーンがそれぞれのペプチドの抑制効果に相当する（平均値が提示される、ｎ＝３）。
【０１６０】
図１８：（上方）生菌数アッセイにおけるヘパリンコファクターIIに由来するペプチド及びＬＬ−３７のエッシェリヒア・コリ（E. coli）、シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）及びスタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）に対する抗菌作用。２×１０6ｃｆｕ／ｍｌの細菌を、２０％ヒト血漿を含んでいる、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４バッファー（Ｔｒｉｓ）中、あるいは０．１５ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中、ペプチドを指定濃度で含む５０μｌ中でインキュベートした（ｎ＝３、ＳＤは指定されている）。（下方）２０％血漿を含んでいる０．１５ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中のＧＫＲ２２（６及び３０μＭで）による時間依存的殺菌をE.coliを用いる生菌数アッセイによって解析した。ＬＬ−３７（３０μＭ）が比較のために使用された。
【０１６１】
図１９：細菌膜に対する作用。
（Ａ）シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）及びエッシェリヒア・コリ（E. coli）に対するペプチドの透過性作用。（Ａ）細菌を指定のペプチドと共にインキュベートし、そして、透過性を、不透過性プローブＦＩＴＣを用いて評価した。（Ｂ）電子顕微鏡分析。シュードモナス・エルギノーサ及びスタフィロコッカス・アウレウス細菌を、３０μＭのＮＬＦ２０及びＬＬ−３７と共に３７℃で２時間インキュベートし、そして電子顕微鏡で解析した。スケールバーは１μｍであった。コントロール；バッファーコントロール。
【０１６２】
図２０：構造及びリポソームに対する作用。
（Ａ）マイナスに荷電されたリポソーム（ＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ）の存在下でのヘパリンコファクターIIに由来するＣ末端ペプチドのへリックス含量。ＬＩＫ１７構造は、リポソームの添加によってほとんど影響されなかった。（Ｂ）Ｔｒｉｓバッファー中及びＬＰＳの存在下でのＮＬＦ２０のＣＤスペクトル。コントロールのために、バッファーとＬＰＳのみの場合のＣＤスペクトルも提示された。（Ｃ）リポソーム漏出（liposome leakage）に対するＮＬＦ２０の作用。膜透過性作用は、ＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ（マイナスに荷電されている）リポソームに起源するカルボキシフルオレセインの蛍光放出を測定することによって記録した。この実験は、０．１５Ｍ ＮａＣｌの不存在及び存在下、１０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー中で行なわれた。値は３連のサンプルの平均に相当する。
【０１６３】
図２１：シュードモナス・エルギノーサ敗血症の動物モデルにおけるＮＬＦ２０の作用。
トロンビンＨＣIIペプチドＮＬＦ２０は、生存を顕著に増加させた。マウスに、i.p.でシュードモナス・エルギノーサ細菌を注入し、引き続いて、１時間後、及びその後次の３日間にわたって２４時間間隔でＮＬＦ２０又はバッファーのみを皮下注入した。このペプチドでの処置は、顕著に生存を増加させた。
【０１６４】
図２２：真核生物細胞に対する活性。
（Ａ）指定ペプチドの溶血作用。細胞を種々の濃度のこのペプチドでインキュベートし、２％ トリトンＸ−１００（Sigma-Aldrich）をポジティブコントロールとして機能させた。ヘモグロビン放出の吸光度をλ５４０ｎｍで測定し、そしてトリトンＸ−１００で誘発された溶血の％として表現した（ｙ軸のスケールに留意する）。ＬＬ−３７の作用を比較のために示す。（Ｂ）ＨａＣａＴケラチノサイトを指定ＨＣII−ペプチド並びにＬＬ−３７に処した。細胞の透過性作用をＬＤＨベースＴＯＸ−７キットによって測定した。細胞からのＬＤＨ放出は、λ４９０ｎｍでモニタリングし、そして全ＬＤＨ放出の％としてプロットした。（Ｃ）ＭＴＴアッセイを、指定ペプチドの存在下（６０μＭで）で、ＨａＣａＴケラチノサイトの生存能力を測定するのに使用した。このアッセイでは、ＭＴＴは、代謝活性に関連する酵素によって、１つの色素、青色のホルマザンに変化する。色素の吸光度をλ５５０ｎｍで測定した。右パネルは、２０％血漿（溶血）又は２０％血清（ＬＤＨ及びＭＴＴ）の存在下での結果を示す。
【０１６５】
図２３：アンチトロンビンIIIに由来するペプチドＦＦＦ２１は凝固をブロックする。
ＦＦＦ２１は、正常ヒト血漿における凝固の内因系経路を弱め、このことは活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を測定することによって決定された。凝固システムの他の部分では、凝固の外因系経路をモニタリングするプロトロンビン時間（ＰＴ）、及びトロンビン誘発フィブリンネットワーク形成を測定するトロンビン凝固時間（ＴＣＴ）によって判断して、有意に影響が与えられなかった。
【０１６６】
図２４：ＨＣIIの構造。
ＫＹＥ２８が示されているＨＣIIを図解している略画。
【０１６７】
図２５：ＨＣIIに由来するペプチドの抗微生物活性。
（Ａ）抗微生物活性（指定の微生物に対するＫＹＥ２８、ＫＹＥ２１、及びＬＬ−３７のＲＤＡを用いて）。抗微生物活性の判定のために、エッシェリヒア・コリ（E. coli）ATCC 25922、シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）ATCC 27853、スタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）ATCC 29213、又はバチルス・サブチリス（B. subtilis）ATCC 6633分離株（４×１０6cfu）、又はカンジダ・アルビカンス（C. albicans）ATCC 90028及びカンジダ・パラプシロシス（C. parapsilosis）ATCC 90018（１×１０5cfu）を、０．１％ ＴＳＢアガロースゲル中に接種した。それぞれ、４ｍｍ直径のウェルに６μｌのペプチド（１００μＭで）をローディングした。３７℃で１８〜２４時間インキュベーションした後、クリアランスゾーンがそれぞれのペプチドの抑制効果に相当する（平均値が提示される、ｎ＝３）。（Ｂ）生菌数アッセイにおけるＫＹＥ２８、ＫＹＥ２１及びＬＬ−３７のエッシェリヒア・コリ（E. coli）ATCC 25922、シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）ATCC 27853、及びスタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）ATCC 29213に対する抗菌作用。２×１０6ｃｆｕ／ｍｌの細菌［２×１０6ｃｆｕ／ｍｌ中、指定された濃度でのペプチドと共に、５０μｌ中でインキュベートした］を、２０％ヒトクエン酸血漿（human citrate plasma）（ＣＰ）を含んでいる、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４（バッファー）中、あるいは、０．１５ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中、２×１０6ｃｆｕ／ｍｌの細菌中、指定濃度でペプチドと共に、５０μｌ中でインキュベートし（ｎ＝３、ＳＤは指定されている）、そしてｃｆｕを決定した。（Ｃ）２０％血漿を含んでいる０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中のＫＹＥ２９及びＫＹＥ２１（３０μＭで）による時間依存的殺菌を指定の細菌を用いる生菌数アッセイによって解析した。
【０１６８】
図２６：細菌膜に対する作用。
エッシェリヒア・コリ（E. coli）に対するペプチドの透過性作用。細菌をＫＹＥ２１と共にインキュベートし、そして、透過性を不透過性プローブＦＩＴＣを用いて評価した。
【０１６９】
図２７：構造及びリポソームに対する作用。
（Ａ）マイナスに荷電されたリポソーム（ＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ）の存在下でのＫＹＥ２１のへリックス含量。へリックス含量は、リポソーム添加後増加した。（Ｂ）トリスバッファー中及びＬＰＳの存在下でのＫＹＥ２１のＣＤスペクトル。リポソームでの結果が比較のために示された。コントロールのために、バッファーとＬＰＳのみの場合のＣＤスペクトルも提示された。（Ｃ）リポソーム漏出（liposome leakage）に対するＫＹＥ２１の作用。膜透過性作用は、ＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ（マイナスに荷電されている）リポソームに起源するカルボキシフルオレセインの蛍光放出を測定することによって記録した。この実験は、１０ｍＭトリスバッファー中で行なわれた。値は３連のサンプルの平均に相当する。
【０１７０】
図２８：真核生物細胞に対する活性。
（Ａ）指定ペプチドの溶血作用。細胞を種々の濃度のこのペプチドと共にインキュベートし、２％ トリトンＸ−１００（Sigma-Aldrich）をポジティブコントロールとして機能させた。ヘモグロビン放出の吸光度をλ５４０ｎｍで測定し、そしてトリトンＸ−１００で誘発された溶血の％として表現した（ｙ軸のスケールに留意する）。ＬＬ−３７の作用を比較のために示す。（Ｂ）ＨａＣａＴケラチノサイトをＫＹＥ２８、ＫＹＥ２１、又はＬＬ−３７に処した。（上方パネル）細胞の透過性作用をＬＤＨベースＴＯＸ−７キットによって測定した。細胞からのＬＤＨ放出は、λ４９０ｎｍでモニタリングし、そして全ＬＤＨ放出％としてプロットした。（下方パネル）ＭＴＴアッセイを、ＮＬＦ２０又はＬＬ−３７の存在下（６０μＭで）で、ＨａＣａＴケラチノサイトの生存能力を測定するのに使用した。このアッセイでは、ＭＴＴは、代謝活性に関連する酵素によって、１つの色素、青色のホルマザンに変化する。色素の吸収をλ５５０ｎｍで測定した。（Ｃ）ＰＢＳで希釈した５０％ヒト血液中で行なった以外は、上記のごとく溶血。（Ｄ）２０％ヒト血清の存在下でＨａＣａＴケラチノサイトを用いるＬＤＨ放出（上方パネル）及びＭＴＴ（下方パネル）。
【０１７１】
図２９：ＨＣIIによって誘導されたペプチドはインビトロにおけるＬＰＳに対するサイトカイン応答をモジュレートする。
（Ａ）ＫＹＥ２８及びＫＹＥ２１は、ニトライト（nitrite）産生を有意にブロックする。ＲＡＷ ２６４．７マクロファージを、指定濃度のこの２つのペプチドと一緒に、１０ｎｇ／ｍｌのエッシェリヒア・コリＬＰＳ（E.coli LPS）で刺激した。（Ｂ）シュードモナス・エルギノーサＬＰＳ（P. aeruginosa LPS）を用いることのほかは、上記と同様である。（Ｃ）ＫＹＥ２８は、マクロファージにおいて、ＴＮＦ−α産生、ＭＣＰ−１及びＩＬ−１０産生を減少させた。ＲＡＷ ２６４．７細胞を、１０ｎｇ／ｍｌ エッシェリヒア・コリＬＰＳ（E.coli LPS）で刺激し、そしてサイトカインを細胞上清液中で解析した。
【０１７２】
図３０：インビボにおけるＨＣIIに由来するペプチドの抗炎症作用。
Ｃ５７ＢＬ６マウスにおける敗血症性ショックを１８ｍｇ／ｋｇのエッシェリヒア・コリＬＰＳ（E.coli LPS）の腹腔内注入によって誘発した。６０分後、ＫＹＥ２８及びＫＹＥ２１（０．２及び０．５ｍｇ；（ＰＢＳ中））又はバッファーのみを投与した。（Ａ）ペプチド処理によって、コントロールマウスと比較してＬＰＳ誘発ショックにおける生存が有意に増加することがもたらされた（コントロール群；ｎ＝、ＧＫＹ２５；ｎ＝、ＨＶＦ；ｎ＝（ｐ＜０．００１））。（Ｂ）体重が７日間追跡調査され、そして処理マウスの場合には十分な回復を示した。（Ｃ）ペプチド処理によって、ＬＰＳによって誘発されたショックモデルにおいて血小板の数が影響された。（Ｄ）別の実験では、マウスにＬＰＳを注入し、引き続いて０．５ｍｇのＫＹＥ２８若しくはＫＹＥ２１、又はバッファーを投与した。動物は、８時間、２０時間、又は７日後に犠死させ、血液中の血小板の数を、VetScanSystemを用いてカウントした。（Ｄ）ＫＹＥ２８及びＫＹＥ２１（０．５ｍｇ）の投与によって、コントロールマウスに比較してサイトカイン応答が有意に弱められた。サイトカインをＬＰＳ注入の８又は２０時間後に犠死した動物の血液中で測定した。（Ｅ）ＫＹＥ２８は、シュードモナス・エルギノーサＬＰＳ（P. aeruginosa LPS）によって誘発された敗血症性ショックにおけるサイトカインレベルを減少させた。Ｃ５７ＢＬ６に、３６ｍｇ／ｋｇＬＰＳ、引き続いて０．５ｍｇのＫＹＥ２８を用いてｉ．ｐ．注入した。２０時間後、マウスは犠死させ、そして血液中のサイトカインレベルを決定した。（ＫＹＥ２８；ｎ＝１０）。データはすべて、２つの独立した実験を表示している。
【０１７３】
図３１：ＫＹＥ２８及びＫＹＥ２１は、インビボでＬＰＳモデルにおける臓器障害を防止する。
肺をヘマトキシリン・エオシン染色後、光学顕微鏡検査法によって解析し、あるいは、ＬＰＳのｉ．ｐ．注入、引き続いて指定ペプチド（０．５ｍｇ）又はバッファーで処理した２０時間後、走査電子顕微鏡検査法によって解析した。ペプチドＫＹＥ２８及びＫＹＥ２１での処理は、タンパク質及び赤血球の漏出をブロックした（ｎ＝３（双方のグループ）、そして代表的な肺断片を示す）。
【０１７４】
図３２：マウスにおけるシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）感染の速度論及びサイトカインに対する作用。
マウスにシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）を接種し、そしてＫＹＥ２８（０．５ｍｇ）を感染の１時間後にｓｃ投与した。（Ａ）指定臓器における細菌数を４、８、及び１２時間の期間後、解析した。（Ｂ）並行して、血液中の指定のサイトカインを解析した。
【０１７５】
図３３：シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）敗血症におけるＫＹＥ２８の治療有効性。
マウスにシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）を腹腔内接種し、そしてＫＹＥ２８を、細菌を接種した１時間、又は１時間及び７時間後にｓｃ投与した。（Ａ）指定臓器中の細菌数を１２時間後に解析した。（Ｂ）血小板、リンパ球、単球及び好中球に対する作用が示された。（Ｃ）並行して、血液中の指定のサイトカインを解析した。（Ｄ）マウスにシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）を接種し、そしてＫＹＥ２８を、細菌を接種した１時間、又は１時間及び７時間後にｓｃ投与し、動物の生存を登録した。ＫＹＥ２８の２回投与（感染の、１時間及び７時間後）によって死亡率が有意に減少した。
【０１７６】
図３４：ＮＬＦ２０の抗微生物活性。
（Ａ）ＲＤＡを用いる、ＮＬＦ２０の指定の微生物に対する抗微生物活性。抗微生物活性を決定するために、エッシェリヒア・コリ（E. coli）ATCC 25922、シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）ATCC 27853、スタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus ATCC）29213又はバチルス・サブチリス（B. subtilis）ATCC 6633 分離株（４×１０6ｃｆｕ）又はカンジダ・アルビカンス（C. albicans）ATCC 90028及びカンジダ・パラプシロシス（C. parapsilosis）ATCC 90018（１×１０5cfu）を、０．１％ ＴＳＢアガロースゲル中に接種した。それぞれ、４ｍｍ直径のウェルに６μｌのペプチド（１００μＭで）をローディングした。３７℃で１８〜２４時間インキュベーションした後、クリアランスゾーンがそれぞれのペプチドの抑制効果に相当する（平均値が提示される、ｎ＝３）。ＬＬ−３７が比較のために示されている。（Ｂ）生菌数アッセイにおけるＮＬＦ２０及びＬＬ−３７の、エッシェリヒア・コリ（E. coli）ATCC 25922、シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）ATCC 27853、及びスタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）ATCC 29213に対する抗微生物作用。２×１０6ｃｆｕ／ｍｌの細菌を［２×１０6ｃｆｕ／ｍｌ中、指定された濃度でのペプチドと共に、５０μｌ中でインキュベートした］、２０％ヒトクエン酸血漿（ＣＰ）を含んでいる、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４（バッファー）中、あるいは０．１５ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中、指定濃度でのペプチドと共に、５０μｌ中でインキュベートし（ｎ＝３、ＳＤは指定されている）、ｃｆｕを決定した。（Ｃ）２０％血漿を含んでいる０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中のＮＬＦ２０（３０μＭで）による時間依存的殺菌を指定された細菌を用いる生菌数アッセイによって解析した。
【０１７７】
図３５：細菌膜に対する作用。
（Ａ）エッシェリヒア・コリ（E. coli）に対するペプチドの透過性作用。細菌をＮＬＦ２０と共にインキュベートし、そして、透過性を、不透過性プローブＦＩＴＣを用いて評価した。（Ｂ）電子顕微鏡分析。シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）及びスタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）細菌を、３０μＭのＮＬＦ２０と共に、３７℃で２時間インキュベートし、そして逆染色法によって可視化した。ＬＬ−３７が比較のために示された。スケールバーは１μｍであった。コントロール；バッファーコントロール。
【０１７８】
図３６：構造とリポソームに対する作用。
（Ａ）マイナスに荷電されたリポソーム（ＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ）の存在下でのＮＬＦ２０のへリックス含量。へリックス含量は、リポソーム添加後増加した。（Ｂ）トリスバッファー中及びＬＰＳの存在下でのＮＬＦ２０のＣＤスペクトル。リポソームの場合の結果が比較のために示された。コントロールのために、バッファーとＬＰＳのみの場合のＣＤスペクトルも提示された。（Ｃ）リポソーム漏出に対する指定ペプチドの作用。膜透過性作用は、ＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ（マイナスに荷電されている）リポソームに起源するカルボキシフルオレセインの蛍光放出を測定することによって記録した。この実験は、１０ｍＭトリスバッファー中で行なわれた。値は３連のサンプルの平均に相当する。
【０１７９】
図３７：真核生物細胞に対する活性。
（Ａ）指定ペプチドの溶血作用。細胞を種々の濃度でこのペプチドと共に、インキュベートし、２％ トリトンＸ−１００（Sigma-Aldrich）をポジティブコントロールとして機能させた。ヘモグロビン放出の吸光度をλ５４０ｎｍで測定し、そしてトリトンＸ−１００で誘発された溶血の％として表現した（ｙ軸のスケールに留意する）。ＬＬ−３７の作用を比較のために示す。（Ｂ）ＨａＣａＴケラチノサイトをＮＬＦ２０又はＬＬ−３７に曝した。細胞の透過性作用をＬＤＨベースＴＯＸ−７キットによって測定した。細胞からのＬＤＨ放出は、λ４９０ｎｍでモニタリングし、そして全ＬＤＨ放出の％としてプロットした。（Ｃ）ＭＴＴアッセイを、ＮＬＦ２０又はＬＬ−３７の存在下（６０μＭで）で、ＨａＣａＴケラチノサイトの生存を測定するのに使用した。このアッセイでは、ＭＴＴは、代謝活性に関連する酵素によって、１つの色素、青色のホルマザンに変化する。色素の吸光度をλ５５０ｎｍで測定した。
【０１８０】
図３８：細菌によって感染されたヒト血液中のＮＬＦ２０の活性。
（Ａ）ヒト血液中（５０％（ＰＢＳ中）でなされた）の指定された細菌の存在下でのＮＬＦ２０の抗菌作用が提示された。指定微生物（２×１０8ｃｆｕ／ｍｌ）を５０％クエン酸血液に加え、引き続いて３０、６０又は１２０μＭでペプチドを添加した。ｃｆｕ数を、１時間にわたるインキュベーションの後に決定した。（Ｂ）同一の設定で、溶血作用が検討された。細菌を５０％クエン酸血液に加え、引き続いてペプチドを添加した。１時間後に溶血を評価した。ヘモグロビン放出の吸光度をλ５４０ｎｍで測定し、そしてトリトンＸ−１００で誘発された溶血の％として表現した（ｙ軸のスケールに留意する）。右端のパネルは、血液と共にインキュベートしたＮＬＦ２０のみでの作用を示す。
【０１８１】
図３９：侵襲的なシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）感染のＮＬＦ２０での処置
（Ａ）シュードモナス・エルギノーサ P. aeruginosa 15159 細菌（（ＰＢＳ中）、約２×１０4又は２×１０8ｃｆｕ／ｍｌ）を、注入するまで氷上に保持した。１００μｌの細菌懸濁液を、Ｃ５７／Ｂｌ６マウスに腹腔内（ｉｐ）に注入した。細菌注入の約１０分後に、０．５ｍｇのＮＬＦ２０又はＰＢＳのみをマウスにｉｐ注入した。肝臓、脾臓、及び腎臓を回収し、氷の上に置き、均一化し、そして注入の１２時間後にコロニー形成単位（ｃｆｕ）を決定した。（Ｂ）同様な感染モデル（２×１０8ｃｆｕ／ｍｌのシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa））において、３０分後の腹腔内（ｉｐ）投与が１時間後の皮下注入（ｓｃ）と比較された。０．５ｍｇのＮＬＦ２０を使用した。（Ｃ）ＮＬＦ２０は、シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）敗血症の間、有意に生存を増加させた。マウスにシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）を上記の通り腹腔内注入し、引き続いてＮＬＦ２０（５００μｇ）をｉｐ又はｓｃ投与した。生存を７日間にわたって追跡した。ｓｃ投与は生存を延長するのに対して、ｉｐ投与は、死亡率を有意に減少させた（ｎ＝コントロールの場合、ｎ＝処置動物の場合、Ｐ＜０．０００１（ｉｐ投与の場合））。（Ｄ）血中のＴＮＦ−α及びＩＬ−１０に対するＮＬＦ２０の作用が解析された。（Ｅ）血液中の栓球（血小板）が解析された。ＮＬＦ２０（ｉｐ及びｓｃ）での処置によって、血小板レベルが増加した。
【０１８２】
図４０：インビトロ及びインビボのＮＬＦ２０の抗炎症及び抗凝固作用。
（Ａ）ＮＬＦ２０は、ニトライトの産生を有意にブロックする。ＲＡＷ ２６４．７マクロファージを、１０ｎｇ／ｍｌのエッシェリヒア・コリ(E.coli）又はシュードモナス・エルギノーサ ＬＰＳで、指定濃度のＮＬＦ２０と一緒に刺激した。（Ｂ）（Ｂ）ＮＬＦ２０は、インビトロで活性化部分トロビン時間（ａＰＴＴ）を有意に延長した。凝固時間（clotting times）は、２０μＭのペプチドを加えないか（コントロール）、あるいは加えて決定した。活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）は、このペプチドを指定された濃度で、１分間クエン酸化ヒト血漿中でインキュベートし、引き続いて、３７℃で６０秒間にわたって１００μｌのａＰＴＴ試薬（aPTT Automate, Diagnostica Stago）を添加した。凝固はＣａＣｌ2溶液を添加することによって開始された。プロトロンビン時間アッセイ（ＰＴ）及びトロンビン凝固時間（ＴＣＴ）を図解している結果も提示されている。（Ｃ）Ｃ５７ＢＬ６マウスの敗血症性ショックは、１８ｍｇ／ｋｇのエッシェリヒア・コリ(E. coli）ＬＰＳを腹腔内注入することによって誘発された。ＮＬＦ２０（０．２又は０．５ｍｇ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４中））又はバッファーのみが投与された。ＮＬＦ２０処置では、コントロールマウスと比較して有意に生存が増加した（それぞれ、ｐ＜０．００１及び０．００３）。（Ｅ）体重が７日間にわたって追跡された。（Ｄ）ペプチド処置では、ＬＰＳによって誘発されたショックモデルにおける血小板の数が有意に増加した。別の実験では、マウスに、ＬＰＳを注入し、引き続いて、０．５ｍｇのＮＬＦ２０、又はバッファーを投与した。動物を８時間、２０時間の時点、及び７日後の生存動物を犠死させ、そして血液中の血小板の数（VetScanSystemを用いる）をカウントした。（Ｆ）ＮＬＦ２０（０．５ｍｇ）を投与すると、コントロールマウスと比較してサイトカイン応答が選択的にモジュレートされる。ＬＰＳ注入の８又は２０時間後に犠死した動物に起源する血液中のサイトカインを測定した。（Ｇ）ＮＬＦは肺の炎症を抑制する。肺をヘマトキシリン・エオシン染色後、光学顕微鏡検査法によって解析し、あるいは、ＬＰＳのｉ．ｐ．注入、引き続いてＮＬＦ２０（０．５ｍｇ）又はバッファーで処理した２０時間後、走査電子顕微鏡検査法によって解析した。ペプチドでの処理は、タンパク質及び赤血球の漏出（leakage）をブロックした（ｎ＝３（双方のグループ））、そして代表的な肺断片を示す）。
【０１８３】
図４１：ヘパリンコファクターIIのペプチドは、凝固をブロックする。
ＫＹＥ２８及びＮＬＦ２０は、正常ヒト血漿における凝固の内因系経路を弱め、このことは活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を測定することによって決定された。ＫＹＥ２１は、ａＰＴＴのわずかなブロッキングを示したに過ぎなかった。凝固システムの他の部分では、凝固の外因系経路をモニタリングするプロトロンビン時間（ＰＴ）、及びトロンビン誘発フィブリンネットワーク形成を測定するトロンビン凝固時間（ＴＣＴ）によって判断して、有意に影響が与えられなかった。
【発明を実施するための形態】
【０１８４】
実施例
実施例Ａ
序論
ヘパリンコファクターII
セルピンは、プロテアーゼを阻害することができる一連のタンパク質として最初に特定された類似の構造を有する一群のタンパク質である。頭字語であるセルピン（serpin）は、多くのセルピンがキモトリプシン様セリンプロテアーゼを阻害する（セリンプロテアーゼインヒビター）という理由で当初作られた。広範囲に研究されたセルピンスーパーファミリーの当初のメンバーは、ヒト血漿タンパク質であるアンチトロンビン及びアンチトリプシンであり、これらはそれぞれ、血液凝固及び炎症を制御する際に重要な役割を演じている。
【０１８５】
セルピンに関する構造研究によって、このファミリーの阻害メンバーは、ストレスから緩和へ（S to R）の転移と呼ばれている他とは異なるコンフォメーション変化を受けることが明らかとなった。セルピンのこのコンフォメーション可動性は、静止した鍵と鍵穴であるプロテアーゼインヒビターより勝る重要な利点を提供している。特に、阻害性セルピンの機能はヘパリンのような特異的なコファクターによって容易に制御することができる。こうした状況の典型的な例は、アンチトロンビンであり、該アンチトロンビンは、比較的不活性な状態で血漿中を循環する。長鎖ヘパリン内で高親和性ヘパリンペンタサッカライド配列に結合すると、アンチトロンビンは、コンフォメーション変化を受け、このメカニズムに重要なキーとなる残基が露出される。従って、アンチトロンビンのこのヘパリンペンタサッカライド結合形態は、トロンビン及び第Ｘａ因子のより有効なインヒビターである。更に、こうした双方の凝固プロテアーゼは、ヘパリンの結合部位（エキソサイト（exosites）と呼ばれている）を含んでいる。それ故、ヘパリンはまた、プロテアーゼとセルピンの双方の結合のためのテンプレートとして機能し、更に２つの相手間の相互作用を劇的に促進する。最初の相互作用の後、最終的にはセルピン複合体が形成され、そしてこのヘパリン部分が放出される。
【０１８６】
こうしたタンパク質中のヘパリン結合部位に相当するペプチドは、抗菌、抗炎症及び抗凝固特性を有している。
【０１８７】
組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）
組織因子経路インヒビター（すなわち、ＴＦＰＩ）は、クニッツ型プロテイナーゼイン
ヒビター（Kunitz-type protinase inhibitor）であり、該インヒビターは、第Ｘ因子（ＦＸ）依存性の形で組織因子−第ＶＩＩ因子（ＴＦ−ＶＩＩ）複合体を可逆的に阻害し、ＦＸとＦＩＸの双方の活性化の阻害をもたらす。ＴＦＰＩは、高度にマイナスに荷電されたアミノ末端、３つの縦列に連鎖するクニッツ型ドメイン、及び高度にプラスに荷電されたカルボキシ末端から成っている。血漿では、ＴＦＰＩは、全長及び可変Ｃ末端トランケート形態の双方に存在する［２８］。最初及び２番目のクニッツドメインは、それぞれ、ＴＦ−ＶＩＩ複合体及び第Ｘａ因子に結合し、そしてこれらを阻害することに関与している［２９］。３番目のクニッツドメインは、Ｃ末端のアミノ酸配列を含むそのカチオン性残基を介して、ヘパリンと相互作用しうる［３０］。このＣ末端領域はまた、血漿リポタンパク質、トロンボスポンジン−１、クリアランス受容体（［３１］）、リポポリサッカライド［３２］との相互作用に関与しており、そして細胞増殖［３３］並びに血液凝固［３４］、［３５］を阻害しうる。種々のＣ末端トランケート形態がインビボで存在するので、Ｃ末端のタンパク質分解の潜在的な役割が関与しており、そしてデータによれば、ＴＦＰＩは、トロンビン［３６］、プラスミン［３７］、及びマトリックスメタロプロテイナーゼ−８［３８］などの種々のプロテイナーゼによって切断されえ、その結果Ｃ末端断片をリリースしうるということが示されている。ＴＦＰＩ発現のアップレギュレーターには、エンドトキシン、ＩＬ−１、ＴＮＦ−α、血小板由来成長因子、ヘパリン、及び塩基性線維芽細胞増殖因子が含まれ、すべての生理学的メカニズムは、感染、炎症、及び増殖に関与している［３１］。
【０１８８】
この上記に報告したＴＦＰＩの多機能性、及び露出したカチオン性、かつヘパリン結合性のＣ末端の存在によって、ＴＦＰＩのＣ末端領域が直接的な抗微生物活性を発揮しうるか否かという問題が我々に提起される。我々は、Ｃ末端ＴＦＰＩペプチドが実際にグラム陰性及びグラム陽性菌及び真菌のいずれも直接殺すことができることをここに示す。更に、このペプチドはまた、抗凝固及び抗炎症作用を発揮することができるという証拠が提示されている。
【０１８９】
材料及び方法
ヘパリン及びＬＰＳの放射ヨウ素標識。ヘパリン（ブタの腸粘膜由来，Sigma-Aldrich）の放射ヨウ素標識が以前に述べられている通りに行なわれた［５９］。ＬＰＳのヨウ素化は、Ulevitchによって述べられている通りに行なわれた［６０］。１ｍｇのエッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）０１１１：Ｂ４ ＬＰＳをホウ酸塩バッファーにおいて、５０ｍＭ ｐ−ＯＨ ベンズイミデート（benzimidate）を加え（ｐＨ８）、４℃で終夜にわたってインキュベートし、次いでＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して透析した。次いでクロラミンＴ法を用いてＬＰＳを125Ｉで放射標識し、次に非標識125Ｉを透析によって除去した。
【０１９０】
ヘパリン及びＬＰＳ結合アッセイ。１００μｌ ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の１、２及び５μｇの合成ペプチドを、スロットブロット装置を用いて、ニトロセルロース膜（Hybond-C,Amersham Biosciences）上に塗布した。膜を、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の２％ウシ血清アルブミンを用いて、室温で１時間ブロッキングし、次いで放射標識したＬＰＳ（約４０μｇ・ｍＬ-1，０．１３×１０6ｃｐｍ・μｇ-1）又は放射標識したヘパリン（約１０μｇ・ｍＬ-1，０．４×１０6ｃｐｍ・μｇ-1）を加え、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中、室温で１時間インキュベートした。非標識ヘパリン（６ｍｇ／ｍｌ）を結合競合のために加えた。この膜をＰＢＳ、ｐＨ７．４中で３回洗浄した。Bas 2000放射イメージングシステム（radio-imaging system）（富士フィルム，東京，日本）が放射能を可視化するのに用いられた。
【０１９１】
細胞培養。マウスマクロファージセルライン，ＲＡＷ ２６４．７（Dr.H Bjoerkbackaから厚意により提供された）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（Dulbeccos Modified Eagle Medium）（DMEM）（Gibco）中で増殖させた。
実験はすべて、血清のない条件下で行なわれた。
【０１９２】
ＲＡＷ マクロファージにおける一酸化窒素の誘導。コンフルエント細胞を回収し、そして９６ウェルプレートに移した（３．５×１０5／ウェル）。接着細胞をフェノールレッド不含ＤＭＥＭ（Gibco）で洗浄した後、エッシェリヒア・コリＬＰＳ（E. Coli LPS）（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＬＬ−３７（２若しくは１０μＭ）又はＨＲＧ（２若しくは１０μＭ）を、３７℃で３０分間プレインキュベートし、次いでこの細胞に移した。ＮＯ誘導の抑止のため、５μｇ／ｍｌの抗マウスＴＬＲ４抗体、１０若しくは１００μＭのＧＨＨ２５又は１００μｇ／ｍｌのヘパリンを使用した。この細胞を２４時間刺激し、そして一酸化窒素をグリエス（Griess）化学方法を用いて決定した［６１］。
【０１９３】
ヒトマクロファージに起源するＴＮＦ−α放出。ヒト単球由来のマクロファージ（ｈＭＤＭｓ）を、Lymphoprep（Axis-Shield PoC AS）密度勾配を用いて健常ドナーの血液から得られた末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣｓ）から得た。ＰＢＭＣｓを３×１０6細胞／ウェルの濃度で２４ウェルプレートに播種し、そして５％ＣＯ2の加湿雰囲気中で、１０％加熱不活性化した自家移植ヒト血漿（heat-inactivated autologous human plasma）、２ｍＭ
Ｌ−グルタミン、及び５０μｌ／ｍｌ 抗生物質−抗真菌薬を補充したＲＰＭＩ １６４０培地（Gibco）中で培養した。２４時間後、非接着細胞を除去し、そして隔日にフレッシュな培地と交換して、接着単球を１０日間にわたって分化させるとマクロファージになった。この細胞を無血清条件下でＨＲＧ（２μＭ）及びＧＨＨ２５（１００μＭ）を加えるか、又は加えずに、２４時間、１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激した。刺激の後、上清を吸引し、そしてＴＮＦ−αを、ＴＮＦ−α ヒトＥＬＩＳＡキット（Invitrogen）を用いて測定した。
【０１９４】
動物実験。初代ノックアウトマウス１２９／Ｂ６−ＨＲＧtm1wja1を、１４世代にわたってＣ５７ＢＬ／６マウス（Taconic）と交配して、均一な遺伝子バックグラウンドを得た。こうしたＨＲＧ−欠乏マウス株は、ＩＬＡＲ（研究用動物資源協会（Institute of Laboratory Animal Resources））規則に従ってＢ６−ＨＲＧtm1wja1と呼ばれた。野生型Ｃ５７ＢＬ／６コントロールマウス及びＣ５７ＢＬ／６Ｈｒｇ-/-マウス（８〜１２週齢、２７＋／−４ｇ）を、ルンド大学（Lund University）の動物施設で繁殖させた。Ｃ５７ＢＬ／６Ｈｒｇ-/-では、Ｈｒｇ遺伝子のエクソン１の翻訳開始点が欠如している［５４］。動物を光と温度の標準条件下で収納し、そして標準的な研究用のエサと水に自由にアクセスさせた。敗血症を誘発させるために、１８□ｇ／ｇのエッシェリヒア・コリ ０１１１：Ｂ４ ＬＰＳを、体重及び性別対応群に分割して、Ｃ５７ＢＬ／６又はＣ５７ＢＬ／６Ｈｒｇ-/-マウスに腹腔内注入した。生存及び状況を７日間にわたって追跡した。
【０１９５】
ＧＨＨ２５ペプチドで処理する場合、１ｍｇのペプチド（１０ｍＭ Ｔｒｉｓに希釈した，ｐＨ７．４）又はバッファーのみをＬＰＳチャレンジの３０分後に腹腔内注入し、次いで生存及び状況を追跡した。
【０１９６】
ＴＦＰＩ及びヘパリンコファクターII
ペプチド。ＬＬ−３７（ＬＬＧＤＦＦＲＫＳＫＥＫＩＧＫＥＦＫＲＩＶＱＲＩＫＤＦＬＲＮＬＶＰＲＴＥＳ［配列番号４］）のほかは、ＴＦＰＩ及びＨＣIIより誘導されるペプチドが、Biopeptide Co., San Diego, USAによって合成され、ＬＬ−３７は、Innovagen AB, Lund, Swedenから得られた。こうしたペプチドの純度（＞９５％）は、マススペクトル分析（MALDI-ToF Voyager）によって確認された。
【０１９７】
微生物。細菌分離株、エッシェリヒア・コリATCC 25922、シュードモナス・エルギノーサ
ATCC 27853、スタフィロコッカス・アウレウス ATCC 29213、バチルス・サブチリス ATCC 6633 、カンジダ・アルビカンス ATCC 90028及びカンジダ・パラプシロシス ATCC 90018は、ルンド大学病院・細菌学部（Department of Bacteriology, Lund University Hospital）から得られた。
【０１９８】
生菌数解析。エッシェリヒア・コリ（E. coli）ATCC 25922細菌を、トッド・ヒューウイット（ＴＨ）培地（Todd-Hewitt (TH) medium）中で対数増殖期中期（mid-logarithmic phase）まで増殖させた。細菌を洗浄し、そして５ｍＭ グルコースを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中に希釈した。エッシェリヒア・コリ（E. coli）ATCC 25922（５０μｌ；２×１０6ｃｆｕ／ｍｌ）を、指定の濃度でペプチドと共に３７℃で２時間インキュベートした。ＴＦＰＩ−ペプチド及びＬＬ−３７での他の実験は、正常な、又は加熱不活性化した２０％クエン酸（citrate）−血漿（ＰＰ）と共に、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中で行なわれた。インキュベーション混合物の階段希釈液をＴＨ寒天上でプレーティングし、引き続いて３７℃で終夜インキュベーションし、そしてｃｆｕ決定をした。
【０１９９】
放射拡散アッセイ（Radial diffusion assay）。本質的に、先に述べた通り［６２，６３］、細菌を、１０ｍｌの１倍の（full strength）（３％ｗ／ｖ）トリプチケースソイブロス（ＴＳＢ）（Becton-Dickinson）中で対数増殖期中期まで増殖させた。次いで微生物を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４で１回洗浄した。続いて、４×１０6ｃｆｕを１５ｍｌの、アンダーレイ（underlay）アガロースゲル［０．０３％（ｗ／ｖ） ＴＳＢ、１％（ｗ／ｖ） 電気浸透度が低いタイプ（ＥＥＯ）のアガロース（Sigma-Aldrich）及び０．０２％（ｖ／ｖ）ツイーン２０（Sigma-Aldrich）から成る］に加えた。このアンダーレイを直径（φ）１４４ｍｍのペトリ皿に注いだ。アガロースの凝固後、４ｍｍの直径のウェルに穴をあけ、そして必要な濃度のペプチド溶液６μｌを各ウェルに加えた。プレートを３７℃で３時間インキュベートし、ペプチド拡散させた。次いでこのアンダーレイゲルを１５ｍｌの融解したオーバーレイ（overlay）（６％ ＴＳＢ及び１％低ＥＥＯアガロース（蒸留Ｈ2Ｏ中））で覆った。ペプチドの抗微生物活性を３７℃でのインキュベーションの１８〜２４時間後に各ウェル周辺の透明帯として可視化した。
【０２００】
蛍光顕微鏡検査法。不透過性プローブＦＩＴＣ（Sigma-Aldrich, St. Louis, USA）を、細菌膜透過化をモニタリングするために使用した。スタフィロコッカス・アウレウス（S.
aureus） ATCC 29213細菌を、ＴＳＢ培地中で対数増殖期中期まで増殖させた。細菌を洗浄し、そしてバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，５ｍＭ グルコース）中で再懸濁すると、１×１０7CFU／mlの懸濁液が生じた。１００μｌの細菌懸濁液を、３０μＭのそれぞれのペプチドを加えて、３０℃で３０分間インキュベートした。次いで微生物を、３０℃で４５分間インキュベートすることによって、ポリ（Ｌ−リシン）−被覆スライドガラス上に固定化し、引き続いてバッファー中の２００μｌのＦＩＴＣ（６μｇ／ｍｌ）をスライド上に添加し、３０℃で３０分間最後のインキュベーションをした。スライドを洗浄し、そして細菌をインキュベーションによって固定した（最初に氷上で１５分間、次に４％パラホルムアルデヒド中、室温で４５分間）。次にこのスライドガラスをプロロングゴールド褪色防止剤入り封入剤（Prolong Gold antifade reagent mounting medium）（Invitrogen, Eugene, USA）を用いてスライド上にマウントした。浜松 Ｃ４７４２−９５冷却型ＣＣＤカメラ（Hamamatsu C4742-95 cooled CCD camera）（Hamamatsu, Bridgewater, USA）及びPlan Apochromat ×100 objective（１００倍対物レンズ）（Olympus, Orangeburg, USA）を備えたNikon Eclipse TE300（Nikon, Melville, USA）倒立型蛍光顕微鏡を用いて、細菌を可視化した。微分干渉顕微鏡（Nomarski）イメージングが微生物自体の可視化のために使用された。
【０２０１】
溶血アッセイ。ＥＤＴＡ血を８００ｇで１０分間遠心分離し、その後血漿及びバフィーコート（buffy coat）を除去した。赤血球を３回洗浄し、そしてＰＢＳ、ｐＨ７．４中で再懸濁して、５％懸濁液を得た。次いでこの細胞を転倒回転により、ペプチド（６０μＭ）の存在下、３７℃で６０分間インキュベートした。２％トリトン（Triton）Ｘ−１００（Sigma-Aldrich）がポジティブコントロールとして機能した。次いでこのサンプルを８００ｇで１０分間遠心分離し、そして上清を９６ウェルマイクロタイタープレートに移した。ヘモグロビン放出の吸光度をλ５４０ｎｍで測定し、そしてプロットし、トリトンＸ−１００によって誘発された溶血％として表現した。
【０２０２】
乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）アッセイ。ＨａＣａＴケラチノサイトを、牛脳下垂体抽出物及び組み換えＥＧＦ（ＢＰＥ−ｒＥＧＦ）（Invitrogen, Eugene, USA）を補充した無血清ケラチノサイト培地（ＳＦＭ）中、９６ウェルプレート（３０００細胞／ウェル）中で細胞がコンフルエンシー（confluency）に達するまで増殖させた。次いでこの培地を除去し、そして１００μｌの検討するペプチド（６０μＭ、（ＳＦＭ／ＢＰＥ−ｒＥＧＦ中に希釈するか、又は２０％ヒト血清を補充したケラチノサイト−ＳＦＭ中））を加えた。ＬＤＨベースＴＯＸ−７キット（Sigma-Aldrich, St. Louis, USA）を細胞からのＬＤＨ放出の定量化のために用いた。結果は、３連測定からの平均値に相当し、そして１％ トリトンＸ−１００から成るポジティブコントロール（１００％ＬＤＨ放出を生ぜしめる）と比較して分画ＬＤＨ放出として与えられた。
【０２０３】
スロットブロットアッセイ。ペプチドのＬＰＳ結合能力をスロットブロットアッセイによって検討した。ペプチド（２及び５μｇ）を、真空で、予めＰＢＳに浸したニトロセルロース膜（Hybond-C, GE Healthcare BioSciences, UK）に結合させた。次いで膜を２ｗｔ％ ＢＳＡ（ＰＢＳ中）、ｐＨ７．４によって、室温で１時間ブロッキングし、次に125Ｉ標識ＬＰＳ（４０μｇ／ｍＬ；０．１３×１０6ｃｐｍ／μｇ）、あるいは125Ｉ標識ヘパリン（Sigma）を加え、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、あるいは１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ中で、室温で１時間インキュベートした。ＬＰＳ結合後、膜を３回（毎回１０分）上記のバッファー中で洗浄し、そしてBas 2000放射イメージングシステム（Fuji，日本）を用いて放射能の有無を可視化した。
【０２０４】
リポソーム調製及び漏出アッセイ。検討するリポソームは、アニオン性であった（ＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ ７５／２５ｍｏｌ／ｍｏｌ）。ＤＯＰＧ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール，一ナトリウム塩）、及びＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）はすべてAvanti Polar Lipids（Alabaster, USA）に起源し、＞９９％の純度であった。こうしたリン脂質の長く、対称で、かつ不飽和のアシル鎖によって、いくつかの方法論的利点が達成された。特に、膜接着（membrane cohesion）が良好であり、このことは非常に安定な、単ラメラ（unilamellar）の、そしてほとんど欠点のないリポソーム（cryo-TEMから観察）、及び輪郭のはっきりした支持脂質二重膜（偏光解析及びＡＦＭによって観察）を調製しやすいようにし、漏出に関する詳細な値及び吸着密度を得ることが可能となった。この脂質混合物は、クロロホルムに溶解し、その後、溶媒を真空下で終夜蒸発によって除去した。次に、１０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ７．４を、０．１Ｍ カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）（Sigma, St. Louis, USA）と一緒に加えた。水和の後、この脂質混合物を液体窒素中で凍結させ、６０℃に加熱することから成る８回の凍結・融解のサイクルに付した。約φ１４０ｎｍの単ラメラリポソームが、LipoFast miniextruder（Avestin, Ottawa, Canada）に搭載されているポリカーボネートフィルター（ポアサイズ１００ｎｍ）を通して２２℃でマルチプル押し出し（multiple extrusions）によって生じた。非捕捉ＣＦを２回のその後のゲルろ過（Sephadex G-50, GE Healthcare, Uppsala, Sweden）によって、溶離剤としてＴｒｉｓバッファーを用い２２℃で除去した。リポソームからのＣＦ放出は、リポソーム分散（１０ｍＭ 脂質（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中））から５２０ｎｍで放出する蛍光をモニタリングすることによって決定した。絶対漏出の程度については、０．８ｍＭ トリトンＸ−１００（Sigma-Aldrich, St. Louis, USA）の添加によって各実験の最後にリポソームを破壊することによって得られた。SPEX-fluorolog 1650 0.22-m double spectrometer（SPEX Industries, Edison, USA）が、上記に述べられている条件下でリポソームの不存在下及び存在下でＴｒｉｓバッファー中、リポソーム漏出アッセイのために用いられた。測定は３７℃、３連で行なわれた。
【０２０５】
ＣＤスペクトル測定。溶液中のペプチドのＣＤスペクトルを、Jasco J-810 Spectropolarimeter（Jasco, U.K.）を用いて測定した。この測定は撹拌しながら、１０ｍｍ石英キュベット中、３７℃で行なわれ、そしてこのペプチドの濃度は１０μＭであった。１００μＭの脂質濃度でのリポソームのペプチドの二次構造に対する影響が、２００〜２５０ｎｍの範囲でモニタリングされた。検討される条件下で観察されたペプチドのコンフォメーション（conformation）はα−ヘリックスとランダムコイルのみであった。α−ヘリックスコンフォメーションのペプチドの断片Ｘαは、次の式から算出された。
Ｘα＝（Ａ−ＡC）／（Ａα−ＡC）
［上式で、Ａは、２２５ｎｍで記録されたＣＤシグナルであり、そしてＡα及びＡCは、それぞれ、１００％α−へリックス及び１００％ランダムコイルのコンフォメーションの参照ペプチドの２２５ｎｍでのＣＤシグナルである］。
【０２０６】
１００％α−へリックス及び１００％ランダムコイル参照は、それぞれ、０．１Ｍ ＮａＯＨ及び０．１Ｍ ＨＣｌ中の０．１３３ｍＭ（モノマー濃度）ポリ−Ｌ−リシンから得られた［６４、６５］。ペプチド構造に対するリポポリサッカライドの影響を決定する場合には、このペプチドの二次構造を、Ｔｒｉｓバッファー中並びにエッシェリヒア・コリ リポポリサッカライド（０．０２ｗｔ％）（Escherichia coli ０１１１：Ｂ４、高純度、１％未満タンパク質／ＲＮＡ、Sigma, UK）の存在下の双方で、１０μＭのペプチド濃度でモニタリングした。測定間の器械誤差を説明するために、バックグラウンド値（ペプチドシグナルが存在しない場合の２５０ｎｍで検出された）を差し引いた。バルク溶液に起源するシグナルもまた、補正された。
【０２０７】
インビトロでのマクロファージに対する種々の微生物産生物の作用並びにＨＣII及びＴＦＰＩの種々のペプチドによる抗炎症作用
３．５×１０5細胞を、１０％ＦＢＳ及び抗生物質を補充したフェノールレッド不含ＤＭＥＭ（Gibco）を含む９６ウェル組織培養プレート（Nunc, 167008）中に播種した。接着を可能にするためにインキュベーションの６時間後、細胞を、指定された用量でペプチドの添加、及び無添加の双方（図の凡例参照）で、１０ｎｇ／ｍＬのエッシェリヒア・コリ（E. coli）（０１１１：Ｂ４）ＬＰＳ（Sigma）、リポタイコ酸、ペプチオグリカン、又はザイモサンで刺激した。培養の上清中のＮＯレベルを刺激から２４時間後にグリエス反応を用いて決定した［６６］。手短に言えば、ニトライト（nitrite）、ＮＯ分解の安定な産生物を、５０μｌの培養上清を同じ量のグリエス試薬（Sigma, G4410）と混和し、そして１５分後に５５０ｎｍでの吸光度を読み取ることによって測定した。ＦＢＳ及び抗生物質を加えたフェノールレッド不含ＤＭＥＭがブランクとして使用された。標準曲線をｄｄＨ２０中の０〜８０μＭの亜硝酸ナトリウム溶液を用いて調製した。
【０２０８】
凝固アッセイ。凝固時間はすべて、Amelung凝固計（coagulometer）を用いて測定された。活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）は、指定濃度で滅菌水中で希釈されたペプチドを、１００μＬのクエン酸添加ヒト血漿と共に１分間インキュベートし、引き続いて１００μＬのａＰＴＴ試薬（aPTT Automate, Diagnostica Stago）を３７℃で６０秒間にわたって添加することによって測定された。凝固は１００μＬの２５ｍＭ ＣａＣｌ2溶液を添加することによって開始された。プロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイでは、凝固はカルシウムを加えた１００μＬのThrombomax（ＰＴ試薬；Sigma-Aldrich）を添加することによって開始された。トロンビン凝固時間（ＴＣＴ）を測定する場合は、凝固は１００μＬのAccuclotトロンビン時間試薬（Accuclot thrombin time reagent）（ＴＣＴ試薬；Sigma-Aldrich）を添加することによって開始された。
【０２０９】
結果及び結論
要約すれば、ＨＣII、ＡＴIII及びＴＦＰＩなどのセルピン中の隠されたクリプティックな（cryptic）ヘパリン結合部位に相応する上記に報告したペプチドは、抗菌、抗炎症及び抗凝固特性を有している（図１〜８，１９〜２３）。特に重要なことは、ＨＣIIペプチドがＴＬＲ媒介性ＬＰＳ応答並びに凝固の内因系経路をブロックするという発見である。更に、ＴＦＰＩペプチドは、ユニークであり、かつ以前に開示されていない、凝固の内因系並びに外因系経路の双方に対する阻害活性を示した。従って、この結果により、このペプチドは、細菌感染、及びマクロファージ活性化を妨害することを包含する関連する炎症応答を減弱させるのみならず、重要なことは、凝固をまた妨害し、それ故、敗血症、ＣＯＰＤ及び、他の炎症及び凝固を含む、病原性段階を包含する多因子疾患のために顕著な治療的潜在能力を示すことが実証されたことである。
【０２１０】
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【０２１１】
実施例Ｂ−新規なヘパリンコファクターIIの宿主防御ペプチドは、エンドトキシン媒介ショック及び侵襲的シュードモナス・エルギノーサ感染に治療効果を有する
要約
背景：ヘパリンコファクターIIは、セリンプロテイナーゼインヒビターであり、これは、例えば、トロンビンを阻害する。しかしながら、ヒトのＨＣII欠損では血栓形成傾向が存在しないということは、こうしたセルピンの更なる役割を示唆している。ＨＣIIのＤ−へリックス中のカチオン性、ヘパリン結合、そして両親媒性領域の存在、多くの宿主防御ペプチドを特徴付けている特徴を考慮し、それ故、我々は、ＨＣIIのこの領域のペプチドが宿主防御機能を発揮しているかどうかを検討した。
【０２１２】
方法論及び主要な発見：ＨＣIIのヘパリン結合ペプチドは、グラム陰性菌であるエッシェリヒア・コリ及びシュードモナス・エルギノーサ、グラム陽性菌であるバチルス・サブチリス及びスタフィロコッカス・アウレウス、並びに真菌であるカンジダ・アルビカンスを効果的に殺す。ペプチド処理細菌の蛍光及び電子顕微鏡研究と、リポソームに対するペプチドの効果の分析をペアリングさせると、このペプチドは、“古典的な（classical）”ヒトの抗微生物ペプチドであるＬＬ−３７で処置した後見られる作用と同様な膜破壊作用を発揮することが示された。ＬＬ−３７と同様に、顕著なへリックス誘発によって、マイナスに荷電された（細菌模倣）リポソーム並びにリポポリサッカライドの存在下でＨＣIIペプチドの有無が検証された。このペプチドはインビトロ及びインビボでエンドトキシン作用を防止し、そして侵襲的なシュードモナス・エルギノーサ感染の間の死亡率を原減少させることが示され、その効果は、炎症のモジュレーション及び減弱化に左右されるということが示された。
【０２１３】
結論：この結果によって、エンドトキシン媒介性ショック並びにシュードモナス・エルギノーサの処置に潜在能力を示す新規なＨＣIIの宿主防御ペプチドが始めて示された。
【０２１４】
概要
感染性疾患は毎年世界で何百万もの死亡例を占めており、途方もなく多い医療コストを招いている。この疾患の範囲は広く、所与の病原体と直接の関連を有する丹毒、敗血症、肺炎及び他の数え切れないほど多い感染症などの急性疾患、並びに微生物がしばしば長期間の炎症状態を引き起こす慢性疾患を含んでいる。ヒト病原体、シュードモナス・エルギノーサは、細菌性結膜炎及び角膜炎、耳炎、術後及び熱傷創感染症、慢性下肢潰瘍、肺炎、並びに嚢胞性線維症を含む幅広い疾患を引き起こし、かつ／又はいっそう悪化させる。それ故、シュードモナス・エルギノーサに対して強力な新規な抗菌・殺菌剤が必要であり、そして新規な処置療法としてＡＭＰの可能性のある使用へのかなりの関心がある（Marr, Gooderham et al. 2006）。従来から使用されている抗生物質に対する増加する耐性問題を考慮して、抗微生物ペプチドが最近になって可能性のある治療候補として浮上してきた。ＡＭＰによって、ほとんどすべての有機体に侵入する微生物に対する防御の最前線が提供される（Tossi, Sandri et al. 2000; Lehrer and Ganz 2002; Zasloff 2002; Yount, Bayer et al. 2006; Harder, Glaser et al. 2007）。ここ数年になって、デフェンシン及びカテリシジンなどの多くのカチオン性であり、かつ両親媒性の抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）は、多機能性であり、また免疫調節の役割及び血管形成をも媒介し（Elsbach 2003; Ganz 2003; Zanetti 2004）、すなわち、自然免疫系のそうしたメンバーに対する宿主防御ペプチド（ＨＤＰ）の最近のより広い定義を促している。ＡＭＰは、高い殺菌能力を示すべきであるが、（ヒト）真核生物細胞に対しては、毒性は低くあるべきである。コンビナトリアルライブラリーアプローチ（Blondelle and Lohner 2000）、Ｄ−アミノ酸から構成される立体異性体（Sajjan, Tran et al. 2001）又は環状Ｄ，Ｌ−α−ペプチド（Fernandez-Lopez, Kim et al. 2001）、ハイスループットベーススクリーニングアッセイ（Hilpert, Volkmer-Engert et al. 2005; Taboureau, Olsen et al. 2006）、定量的構造活性相関（ＱＳＡＲ）アプローチ（Hilpert, Volkmer-Engert et al. 2005; Marr, Gooderham et al. 2006; Jenssen, Lejon et al. 2007; Pasupuleti, Walse et al. 2008）、及び内因性ペプチドの同定（Papareddy, Rydengard et al. ; Nordahl, Rydengard et al. 2004; Nordahl, Rydengard et al. 2005; Malmsten, Davoudi et al. 2006; Malmsten, Davoudi et al. 2007; Pasupuleti, Walse et al. 2007）の使用などの種々のストラティジーが、選択的であり、かつ治療的に関心のあるＡＭＰを特定化するために現在使用されている（Hancock and Sahl 2006; Marr, Gooderham et al. 2006）。こうしたアプローチの可能性にもかかわらず、天然に存在するペプチドエピトープは、低免疫原性並びに免疫調節活性などの固有の更なる生物学的機能を考慮すると、治療的状況においていくつかの利点を示しうる。
【０２１５】
ヘパリンコファクターIIは、血漿中に約８０μｇ／ｍｌで存在する６６．５ｋＤａの４８０個のアミノ酸からなる糖タンパク質である。しかしながら、ＨＣIIは、遊離かつクロット結合トロンビン（clot-associated thrombin）をブロックするけれども、この正確な生理学的な役割は完全にはわかっているわけではない。アンチトロンビンIIIと同様に、ＨＣIIによるトロンビンの阻害は、ヘパリンなどのグリコサミノグリカンによって加速される（Tollefsen, 1995）。ＡＴIII欠損は、血栓形成と結びついていることは明瞭であるが、ＨＣIIホモ接合体欠損マウスは通常条件下で血栓形成傾向を患ってはいない。ＨＣIIの血漿濃度は、炎症及び感染症の間には顕著に減少している（ＲＥＦ）。実際に、最近の証拠によれば、ＨＣIIの主要な生理学的機能は、アテローム硬化症の発症の場合のように、トロンビンの非止血性役割を阻害することである（Rau, Beaulieu et al. 2007）。また、ＨＣIIは、血管外のトロンビン阻害剤として作用しえ、そして傷の治癒の調節における役割を演じうるということが示されており（Hoffman, Loh et al. 2003）、更に、化学遊走物質がＨＣIIのタンパク質分解に関連して述べられており（Hoffman, Pratt et al. 1990）、更に、このアンチプロテイナーゼの可能性のある潜在的な生物学的な活性を説明している。ＨＣIIに関する構造的な検討において、この分子はコンフォメーションの独特な変化を受けていることが明らかにされ、これをストレスから緩和への転移（Stressed to Relaxed (S to R） transition）と呼んでいる。先行研究では、ＨＣIIは、Ｒ状態であると、強力な抗微生物活性を発揮することを確認した。我々はここに、強力な抗菌及び抗炎症活性を有している、ＨＣIIのＤ−ヘリックスに由来する新規な宿主防御ペプチドを特定化することについてレポートする。
【０２１６】
材料及び方法
ペプチド
ＫＹＥ２８及びＫＹＥ２１ペプチド（それぞれ、ＮＨ2−ＫＹＥＩＴＴＩＨＮＬＦＲＫＬＴＨＲＬＦＲＲＮＦＧＹＴＬＲ−ＣＯＯＨ［配列番号１］及びＮＨ2−ＫＹＥＩＴＴＩＨＮＬＦＲＫＬＴＨＲＬＦＲＲ−ＣＯＯＨ［配列番号２］）がBiopeptide Co., San Diego, USAによって合成され、一方、ＬＬ−３７（ＬＬＧＤＦＦＲＫＳＫＥＫＩＧＫＥＦＫＲＩＶＱＲＩＫＤＦＬＲＮＬＶＰＲＴＥＳ［配列番号４］）が、Innovagen AB, Lund, Swedenから得られた。こうしたペプチドの純度（＞９５％）は、マススペクトル分析（MALDI-ToF Voyager）によって確認された。
【０２１７】
微生物
細菌分離株（Bacterial isolates）、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ATCC
25922、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）ATCC 27853、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）ATCC 29213、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ATCC 6633、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）ATCC 90028及びカンジダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）ATCC 90018が、ルンド大学病院・細菌学部（the Department of Bacteriology, Lund University Hospital）から得られた。
【０２１８】
放射拡散アッセイ（Radial diffusion assay）
本質的に、先に述べた通り（Lehrer, Rosenman et al. 1991; Andersson, Rydengard et al. 2004）、細菌を、１０ｍｌの１倍の（full strength）（３％ｗ／ｖ）トリプチケースソイブロス（ＴＳＢ）（Becton-Dickinson）中で対数増殖期中期まで増殖させた。次いで微生物を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４で１回洗浄した。続いて、４×１０6ｃｆｕを１５ｍｌの、アンダーレイ（underlay）アガロースゲル［０．０３％（ｗ／ｖ） ＴＳＢ、１％（ｗ／ｖ） 電気浸透度が低いタイプの（ＥＥＯ）アガロース（Sigma-Aldrich）及び０．０２％（ｖ／ｖ）ツイーン２０（Sigma-Aldrich）から成る］に加えた。このアンダーレイを直径（φ）１４４ｍｍのペトリ皿に注いだ。アガロースの凝固後、４ｍｍの直径のウェルに穴をあけ、そして必要な濃度のペプチド溶液６μｌを各ウェルに加えた。プレートを３７℃で３時間インキュベートし、ペプチド拡散させた。次いでこのアンダーレイゲルを１５ｍｌの融解したオーバーレイ（overlay）（６％ ＴＳＢ及び１％ 電気浸透度が低ＥＥＯのアガロース（蒸留Ｈ2Ｏ中））で覆った。ペプチドの抗微生物活性を３７℃でのインキュベーションの１８〜２４時間後に各ウェル周辺の透明帯として可視化した。
【０２１９】
生菌数解析
エッシェリヒア・コリ（E. coli）ATCC 25922、シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）15159、又はスタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）ATCC 29213細菌を、トッド・ヒューウイット（ＴＨ）（Todd-Hewitt（TH））培地（Becton and Dickinson, Maryland, USA）中で対数増殖期中期（mid-logarithmic phase）まで増殖させた。次いで微生物を洗浄し、そして５ｍＭ グルコースを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中に希釈した。この後、細菌（５０μｌ；２×１０6ｃｆｕ／ｍｌ）を、２０％ヒトクエン酸血漿を添加又は非添加で、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ中のＫＹＥ２８、ＫＹＥ２１又はＬＬ−３７（０．０３、０．０６、０．３、０．６、３、６、３０、６０μＭ）を加えて、３７℃で２時間インキュベートした。殺菌活性を定量化するために、インキュベーション混合物の階段希釈液をＴＨアガー上でプレーティングし、引き続いて３７℃で終夜インキュベーションし、コロニー形成単位の数を決定した。１００％生存は、ペプチドの不存在下で、同じバッファー及び同じ条件下での細菌の全生存として定義づけられた。有意性を統計ソフトウェアSigmaStat（SPSS Inc., Chicago, IL, USA）を用いて決定した。
【０２２０】
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の決定
ＭＩＣアッセイを、先のＮＣＳＬＡガイドライン中の記載と同様なマイクロタイターブロス希釈法によって行なった(Wiegand, I., Hilpert, K. & Hancock, R.E. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat Protoc 3, 163-175 (2008))。簡単に言えば、フレッシュな終夜にわたるコロニーを０．５単位の濁度間に懸濁し、更にミューラーヒントンブロス（Mueller-Hinton broth） (Becton Dickinson)中で希釈した。ＭＩＣを決定するために、ペプチドを、ストック溶液からの階段希釈により要求範囲と比較して１０倍高い濃度で水中に溶解した。各濃度の１０μｌを、それぞれ、９６ウェルマイクロタイタープレート(polypropylene, Costar Corp.)の相当するウェルに加え、そしてＭＨ培地中の９０μｌの細菌（1×１０5）を加えた。このプレートを３７℃で１６〜１８時間インキュベートした。ＭＩＣは細菌の視覚による増殖が見られなくなる最も低い濃度として受け止められている。
【０２２１】
蛍光顕微鏡検査法
不透過性プローブＦＩＴＣ（Sigma-Aldrich, St. Louis, USA）を、細菌の膜透過性をモニタリングするために使用した。スタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）ATCC 29213細菌をＴＳＢ培地中で対数増殖期中期まで増殖させた。細菌を洗浄し、そしてバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，５ｍＭ グルコース）中に再懸濁すると、１×１０7ＣＦＵ／ｍｌの懸濁液が生じた。１００μｌの細菌懸濁液を３０μＭのそれぞれのペプチドを加えて、３０℃で３０分間インキュベートした。次いで微生物を、３０℃で４５分間インキュベートすることによって、ポリ（Ｌ−リシン）−被覆スライドガラス上に固定化し、引き続いてバッファー中の２００μｌのＦＩＴＣ（６μｇ／ｍｌ）をスライド上に添加し、３０℃で３０分間最後のインキュベーションをした。スライドを洗浄し、そして細菌をインキュベーションによって固定した（最初に氷上で１５分間、次に４％パラホルムアルデヒド中、室温で４５分間）。次にこのスライドガラスをプロロングゴールド褪色防止剤入り封入剤（Prolong Gold antifade reagent mounting medium）（Invitrogen, Eugene, USA）を用いてスライド上にのせた。浜松Ｃ４７４２−９５冷却型ＣＣＤカメラ（Hamamatsu C4742-95 cooled CCD camera）（Hamamatsu, Bridgewater, USA）及びPlan Apochromat ×100 objective（１００倍対物レンズ）（Olympus, Orangeburg, USA）を備えたNikon Eclipse TE300（Nikon, Melville, USA）倒立型蛍光顕微鏡を用いて、細菌を可視化した。微分干渉顕微鏡（Nomarski）イメージングが微生物自体の可視化のために使用された。
【０２２２】
溶血アッセイ
ＥＤＴＡ血を８００ｇで１０分間遠心分離し、その後血漿及びバフィーコート（buffy coat）を除去した。赤血球を３回洗浄し、そしてＰＢＳ、ｐＨ７．４中で再懸濁して、５％懸濁液を得た。次いでこの細胞を転倒回転により、ペプチド（６０μＭ）の存在下、３７℃で６０分間インキュベートした。２％トリトン（Triton）Ｘ−１００（Sigma-Aldrich）がポジティブコントロールとして機能した。次いでこのサンプルを８００ｇで１０分間遠心分離し、そして上清を９６ウェルマイクロタイタープレートに移した。
【０２２３】
乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）アッセイ
ＨａＣａＴケラチノサイトを、牛脳下垂体抽出物及び組み換えＥＧＦ（ＢＰＥ−ｒＥＧＦ）（Invitrogen, Eugene, USA）を補充した無血清ケラチノサイト培地（ＳＦＭ）中、９６ウェルプレート中で細胞がコンフルエンシーに達するまで増殖させた（３０００細胞／ウェル）。次いでこの培地を除去し、そして１００μｌの検討するペプチド（６０μＭ、（ＳＦＭ／ＢＰＥ−ｒＥＧＦ中に希釈するか、又は２０％ヒト血清を補充したケラチノサイト−ＳＦＭ中））を加えた。ＬＤＨベースＴＯＸ−７キット（Sigma-Aldrich, St. Louis, USA）を細胞からのＬＤＨ放出の定量化のために用いた。結果は、３連測定からの平均値に相当し、そして１％トリトンＸ−１００から成るポジティブコントロール（１００％ＬＤＨ放出を生ぜしめる）と比較して分画ＬＤＨ放出として与えられた。
【０２２４】
ＭＴＴアッセイ
滅菌ろ過したＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾリル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド；Sigma-Aldrich）溶液（５ｍｇ／ｍｌ（ＰＢＳ中））を、使用するまで−２０℃で光から保護して保存した。ＨａＣａＴケラチノサイト、３０００細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種し、そして無血清ケラチノサイト−ＳＦＭ／ＢＰＥ−ｒＥＧＦ培地中で、コンフルエンシー（confluency）に達するまで増殖させた。次いで検討ペプチドを、６０μＭ及び１２０μＭで加えた。終夜インキュベーションさせた後、２０μｌのＭＴＴ溶液を各ウェルに加え、そしてプレートをＣＯ2中、３７℃で１時間インキュベーションした。次いでこのＭＴＴを含んでいる培地を吸引によって除去した。生じた青色のホルマザン生成物にウェル当たり１００μｌの１００％ ＤＭＳＯを添加し溶解した。次いでこのプレートを、沈殿物を溶解させるために１０分間、室温で静かにかきまぜた。吸光度を５５０ｎｍでモニタリングし、所与の結果は３連の測定からの平均値に相当する。
【０２２５】
インビトロにおけるマクロファージに対するＬＰＳの作用
３．５×１０5細胞を、１０％ＦＢＳ及び抗生物質を補充したフェノールレッド不含ＤＭＥＭ（Gibco）中、９６ウェル組織培養プレート（Nunc, 167008）中に播種した。接着を可能にするためにインキュベーションの６時間後、細胞を、種々の用量のペプチドの添加、及び無添加で、１０ｎｇ／ｍＬのエッシェリヒア・コリ（E. coli）ＬＰＳ（０１１１：Ｂ４）で刺激した。培養上清中のＮＯレベルを刺激から２４時間後にグリエス反応（Pollock, Forstermann et al. 1991）を用いて決定した。手短に言えば、ニトライト（nitrite）、ＮＯ分解の安定な産生物を、５０μｌの培養上清を同じ量のグリエス試薬（Sigma, G4410）と混和し、そして１５分後に５５０ｎｍでの吸光度を読み取ることによって測定した。ＦＢＳ及び抗生物質を加えたフェノールレッド不含ＤＭＥＭがブランクとして使用された。標準曲線をｄｄＨ２０中の０〜８０μＭの亜硝酸ナトリウム溶液を用いて調製した。
【０２２６】
リポソーム調製及び漏出アッセイ
検討するリポソームは、双性イオン性（ＤＯＰＣ／コレステロール ６０／４０ｍｏｌ／ｍｏｌ又はコレステロールを含まないＤＯＰＣ）であるか、又はアニオン性（ＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ ７５／２５ｍｏｌ／ｍｏｌ）であった。ＤＯＰＧ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール，一ナトリウム塩）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、及びＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）はすべてAvanti Polar Lipids（Alabaster, USA）に起源し、＞９９％の純度であり、一方コレステロール（＞９９％純度）は、Sigma-Aldrich（St. Louis, USA）に起源した。こうしたリン脂質の長く、対称で、かつ不飽和のアシル鎖のため、いくつかの方法論的利点が達成された。特に、膜接着（membrane cohesion）が良好であり、このことは非常に安定な、単ラメラの、そしてほとんど欠点のないリポソーム（ｃｒｙｏ−ＴＥＭから観察）、及び輪郭のはっきりした支持脂質二重膜（偏光解析及びＡＦＭによって観察）を調製しやすいようにし、漏出に関する詳細な値及び吸着密度を得ることが可能となった。この脂質混合物は、クロロホルムに溶解し、その後、溶媒を真空下で終夜蒸発によって除去した。次に、１０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ７．４を、０．１Ｍ カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）（Sigma, St. Louis, USA）と一緒に加えた。水和の後、この脂質混合物を液体窒素中で凍結させ、６０℃に加熱することから成る８回の凍結・融解のサイクルにかけた。約φ１４０ｎｍの単ラメラリポソームが、LipoFast miniextruder（Avestin, Ottawa, Canada）に搭載されているポリカルボネートフィルター（ポアサイズ１００ｎｍ）を通して２２℃でマルチプル押し出し（multiple extrusions）によって生じた。非捕捉ＣＦを２回のその後のゲルろ過（Sephadex G-50, GE Healthcare, Uppsala, Sweden）によって、溶離剤としてＴｒｉｓバッファーを用い２２℃で除去した。リポソームからのＣＦ放出は、リポソーム分散（１０ｍＭ 脂質（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中））から５２０ｎｍで放出する蛍光をモニタリングすることによって決定した。絶対漏出の程度については、０．８ｍＭ トリトンＸ−１００（Sigma-Aldrich, St. Louis, USA）の添加によって各実験の最後にリポソームを破壊することによって得られた。SPEX-fluorolog 1650 0.22-m double spectrometer（SPEX Industries, Edison, USA）が、上記に述べられている条件下でリポソームの不存在下及び存在下でＴｒｉｓバッファー中、リポソーム漏出アッセイのために用いられた。測定は３７℃、３連で行なわれた。
【０２２７】
ＣＤスペクトル測定
溶液中のペプチドのＣＤスペクトルを、Jasco J-810 Spectropolarimeter（Jasco, U.K.）を用いて測定した。この測定は撹拌しながら、１０ｍｍ石英キュベット中、３７℃で行なわれ、そしてこのペプチドの濃度は１０μＭであった。１００μＭの脂質濃度でのリポソームのペプチドの二次構造に対する影響が、２００〜２５０ｎｍの範囲でモニタリングされた。検討される条件下で観察されたペプチドのコンフォメーション（conformation）はα−ヘリックスとランダムコイルにのみであった。α−ヘリックスコンフォメーションのペプチドの断片は、２２５ｎｍでのＣＤシグナルから算出された。１００％α−ヘリックス及び１００％ランダムコイル参照は、それぞれ、０．１Ｍ ＮａＯＨ及び０．１Ｍ ＨＣｌ中の、０．１３３ｍＭ（モノマー濃度）ポリ−Ｌ−リシンから得られた。ペプチド構造に対するリポポリサッカライドの影響の決定のために、このペプチドの二次構造が、Ｔｒｉｓバッファー中、及びエッシェリヒア・コリ（E. coli）リポポリサッカライド（０．０２ｗｔ％）（エッシェリヒア・コリ ０１１１：Ｂ４、高度に精製され、タンパク質／ＲＮＡ（１％未満）、Sigma, UK）存在下の双方において、１０μＭのペプチド濃度でモニタリングされた。測定間の器械誤差を説明するために、バックグラウンド値（ペプチドシグナルが存在しない場合の２５０ｎｍで検出された）を差し引いた。バルク溶液に起源するシグナルもまた、補正された。測定は３７℃で、３連で行なわれた。
【０２２８】
臨床パラメーター
マウス血液（ＥＤＴＡを用いる抗凝固）が、心臓穿刺術によって取られ、そしてVetScan HM5 System（TRIOLAB）によって解析された。白血球細胞の数、リンパ球、好中球、単球及び血小板の百分率が決定された。
【０２２９】
サイトカインアッセイ
サイトカイン、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−１、ＩＮＦ−γ、及びＴＮＦ−αを、ＲＡＷ２６４．７細胞からの細胞培養上清、並びにＬＰＳ又はシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）（ペプチド添加又は非添加処理で）を注入したマウスに起源する血漿中で、サイトメトリックビーズアレイ（Cytometric bead array）；製造業者の指示に従ってマウス炎症キット（Becton Dickinson AB）を用いて測定した。血漿サンプルはすべて、解析前は−２０℃で保存した。
【０２３０】
インビボにおけるＬＰＳモデル
雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８〜１０週齢、２２＋／−５ｇ）に、体重１ｋｇ当たり、１８ｍｇのエッシェリヒア・コリ（E. coli） ０１１１：Ｂ４ ＬＰＳ（Sigma）を腹腔内注入した。ＬＰＳ注入の３０分後に、０．５ｍｇのＫＹＥ２８、ＫＹＥ２１又はバッファーのみをマウスに腹腔内注入した。生存及び状態を７日間追跡した。血液回収及び組織化学のために、マウスをＬＰＳチャレンジの２０時間後に犠死させ、そして肺を除去し固定化した。こうした実験は、Malmoe/Lundの研究動物倫理委員会（the Laboratory Animal Ethics Committee）が承認していた。
【０２３１】
シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）感染モデル
動物を光と温度の標準条件下で収納し、そして標準的な研究用のエサと水に自由にアクセスさせた。シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）１５１５９細菌を対数増殖期まで増殖させ（ＯＤ620約０．５）、回収し、ＰＢＳ中で洗浄し、２×１０8ｃｆｕ／ｍｌまで同じバッファー中で希釈し、そして注入するまで氷上に保持した。この細菌の懸濁液１００μｌを雌性ｂｌ６マウスに腹腔内（i.p.）注入した。細菌注入の１時間、又は１時間及び７時間後、０．５ｍｇのＫＹＥ２８又はバッファーのみをこのマウスにｓｃ注入した。標的臓器への細菌伝播を検討するために、脾臓、肝臓及び腎臓を回収し、氷上に置き、均質化し、そしてコロニー形成単位を決定した。Ｐ値をマン・ホイットニーのＵ検定（Mann-Whitney U-test）を用いて決定した。３個の独立した実験からのデータをプールした。
【０２３２】
組織化学
ＬＰＳ注入の２０時間後に回収した臓器を速やかに４％パラホルムアルデヒドで固定し、その後それらをパラフィンに包埋し、そして薄片化した。薄片を１０分、メイヤーズヘマトキシリン（Mayers Hematoxilin）（Histolab AB）で、そして７分、エオシン（Eosin）（Merck）を用いて染色した。薄片化及び染色はHistocenter, Gothenburg, Swedenで行なわれた。
【０２３３】
走査型電子顕微鏡検査法
走査型電子顕微鏡検査法のために、肺をＬＰＳ注入の２０時間後に摘出した。サンプルを０．１５Ｍ カコジル酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）中の２．５％グルタルアルデヒド中、室温で終夜固定した。被検査物をカコジル酸バッファーで洗浄し、そして５０％（ｖ／ｖ）から無水エタノールまでエタノールを連続的に上昇させて脱水した。次いで被検査物を、無水エタノールを中間溶媒として用いて、二酸化炭素中で臨界点乾燥に処し、アルミニウムホルダーに取り付け、３０ｎｍパラジウム／金を用いてスパッタリングして、そしてJEOL JSM-350走査型電子顕微鏡で検討した。
【０２３４】
結果
ＨＣII（図２４）のヘパリン結合エピトープに由来するＫＹＥ２８及びＫＹＥ２１が抗微生物活性を発揮するか否かを解明するために、我々は、グラム陰性菌であるエッシェリヒア・コリ及びシュードモナス・エルギノーサ、グラム陽性菌であるバチルス・サブチリス及びスタフィロコッカス・アウレウス、並びに真菌であるカンジダ・アルビカンス及びカンジダ・パラシロシスに対する効果を放射拡散アッセイ（ＲＤＡ）において検討した（図２５Ａ）。この活性は、“古典的な（classical）”ヒトのカテリシジン、ＬＬ−３７の場合に観察される活性と同様であることは注目に値することである。上述の抗菌結果は更に、マトリックスを用いない生菌数アッセイ（matrix-free viable count assays）によって実証された。こうしたエッシェリヒア・コリ（E. coli）、シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）及びスタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）を利用するこうした用量反応実験からの結果によって、２つのＨＣII由来ペプチド、特により長い形態であるＫＹＥ２８は、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含んでいるバッファー中、並びにヒト血漿の存在下で顕著な抗菌活性を示す（図２５Ｂ）ことが立証された。特にＫＹＥ２８の場合には、速度論的研究によれば、ヒト血漿の存在下で評価された殺菌は、５〜２０分以内でおこり、このことは多くの抗菌ペプチドと互換性がある早期の直接的作用が示されていることを証明した（図２５Ｃ）。不透過性プローブＦＩＴＣを使用する研究では、ヘパリン結合ヘリックスエピロープに相当するモデルペプチドとしてここで使用されているＫＹＥ２１は、エッシェリヒア・コリの細菌膜を透過したことが示された（図２６）。このエピトープがリポソームへの結合に関してヘリックス含量の顕著な増加（図２７Ａ）、及びエッシェリヒア・コリ ＬＰＳと一緒に顕著なコンフォメーション変化（図２７Ｂ）を示したことは注目に値することである。ＫＹＥ２１はまた、ＣＦ放出を引き起こし（図２７Ｃ）、したがって脂質膜に対する直接的な影響を示した。速度論的分析では、最大放出の約８０％は５〜１０分以内におき、ＬＬ−３７で得られた結果（示されていない）と比較しても遜色なかったことが示された。細菌を殺すＡＭＰはまた、真核生物細胞に対して溶血性及び膜透過性活性を示しうる。この結果によると、特にＫＹＥ２８は、より高い用量（３０〜６０μＭ）で顕著な溶血性活性を発揮したということが示された（図２８Ａ）。しかしながら、このペプチドは、ＨａＣａｔ細胞に関してＫＹＥ２１及びＬＬ−３７と同様な透過性活性（図２８Ｂ）、並びに生存に対する作用（図２８Ｂ）を示した。生理学的な条件下で、それに続くインビボ検討に重要である溶血性及び細胞毒性作用を探索するためにこのペプチドをヒト血液に加え（５０％（ＰＢＳ中））、並びにヒト血清の存在下でＨａＣａｔ細胞に関して検討した。全体的に見れば、この結果によると、このペプチドでは、こうした条件（図２８Ｃ及びＤ）においてほとんど透過性作用は生じなかったということが示された。ＫＹＥ２８のＭＩＣレベルは、標準的なＮＣＳＬＡ−プロトコルによると、ＬＬ−３７及びオミガナンの場合に観察されるＭＩＣレベルに肩を並べるものであった（表１）。後者は、現在臨床試験フェーズIIIである高活性で、かつ広範囲スペクトルのデザインされた抗微生物ペプチドであるので、ＫＹＥ２８のデータはまた、このペプチドの治療的役割の可能性を示唆しているものである。総合すれば、こうした結果によれば、ＫＹＥ２８は、膜破壊能力を有する、ＨＣIIの以前に開示されていない抗微生物構造を構成しており、そして生理学的条件下インビトロでの顕著な抗微生物活性を発揮することを示している。
【０２３５】
上述したごとく、最近の証拠によれば、抗微生物ペプチドは、広範な免疫調節応答を引き起こすことが示されている。ＫＹＥ２１のＬＰＳ結合（図２７Ｂ）を観察すると、ＫＹＥ２８及びＫＹＥ２１は、我々がエンドトキシン中和作用の可能性を検討することを促している。マウスのマクロファージモデルでは、２つのペプチドは、エッシェリヒア・コリ又はシュードモナス・エルギノーサ ＬＰＳのいずれかによって刺激されたマクロファージのＮＯ放出を顕著に阻害した（図２９Ａ）。ＫＹＥ２８は、ＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１、並びにＩＬ−１０（図２９）を減少させ、そして同様な所見がＫＹＥ２１の場合にも観察された（示していない）。
【０２３６】
ＬＰＳによって誘発されたショックのマウスモデルでは（図３０Ａ）、ＫＹＥ２８及びＫＹＥ２１はどちらも生存に関して劇的な改善を示した（図３０Ａ）。処置動物はまた、体重の完全な回復を示した（図３０Ｂ）。８時間後及び２０時間後の血小板数の解析では、特にＫＹＥ２８は、２０時間後の血小板レベルを増加させ、この具体的なＬＰＳ−モデルにおいて消費の減少を示唆していることが示された（図３０Ｃ）。このレベルは、生存動物において完全に正常化された（図３０Ｃ）。ＬＰＳ注入の８時間及び２０時間後のサイトカインの解析では、炎症性のＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＭＣＰ−１の顕著な減少が示され、一方、ＩＬ−１０の増加が、双方のペプチドの場合の８時間後に観察された（図３０Ｄ）。ＫＹＥ２８は、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、並びにＭＣＰ−１レベルを減少させる際に、特に有効であることは注目すべきである。ＫＹＥ２８での処置後、同様な減少が、シュードモナス・エルギノーサ ＬＰＳを用いる同様なショックモデルで見られ、このことはＫＹＥ２８の効果に関してグラム陰性菌間の株のばらつきが制限されていることを示唆している。同様に、一方では、ＬＰＳ処理動物に起源する肺の組織学的及びＳＥＭ解析では、タンパク質及び赤血球細胞の肺漏出が示され（図３１）、ＫＹＥ２８及びＫＹＥ２１処置動物の肺では、ＬＰＳで処理された動物とは対照的に、こうしたＬＰＳによって誘発される作用の著しい減少が示された。したがって、この結果によれば、ＬＰＳショックのこの動物モデルにおいて特にＫＹＥ２８及びＫＹＥ２１の著しい抗炎症作用が示された。
【０２３７】
細菌敗血症における、後者のペプチドの治療効果の可能性を更に探索するために、シュードモナス・エルギノーサを用いるモデルが使用された。初期の検討では、細菌レベルは、分析される臓器（脾臓、腎臓及び肝臓）中で４〜１２時間の間で増加したことが示された。このペプチドでの処置では、このペプチド処置動物の間で細菌減少傾向は観察されたけれども、細菌レベルを顕著には減少させなかった（図３２Ａ）。しかしながら、サイトカインレベルの随伴する減少が、特に１２時間後に観察され、そして炎症性ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＭＣＰ−１の場合に示されたことは注目すべきことではあった。ＩＬ−１０の場合には、１２時間後の増加は、このペプチドによって顕著に調節されなかった（図３２Ｂ）。こうした初期の結果に基づいて、ＧＫＹ２５の１回投与対２回投与の有効性がシュードモナス・エルギノーサ敗血症モデルにおいて評価された。図３０Ａに見られるように、１回投与での処置は、細菌ｃｆｕを顕著には減少させなかったが、しかしながら、連続処置では、評価される臓器においてｃｆｕ数の中程度の減少が生じた。血小板の増加では、わずかではあるが、しかし有意な増加が観察されたことは注目すべきである（図３３Ｂ）。このことは血液中のサイトカインの劇的であり、かつ極めて有意な減少によって対応していた（図３３Ｃ）。ＫＹＥ２８の１回投与での処置では、生存は増加しなかった。しかしながら、上記のように２回投与のレジメンでは、敗血症症状の顕著な遅延並びに死亡の遅延、最終的にはまた、生存の増加をもたらした（図３３Ｄ）。
【０２３８】
【表１】
2013505030.tif 000002
【０２３９】
参照
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【０２４０】
実施例Ｃ−ＮＬＦ２０；侵襲的シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）感染に対する治療能力を有する新規な抗生物質ペプチド
概要
微生物叢を制御するために、ヒト並びに実質的にすべての生命体は、短いカチオン性及び両親媒性抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）に基づく即効性抗微生物系を装備している。従来から使用されている抗生物質に対する耐性の問題の増加を考慮すると、最近になって、ＡＭＰが、可能性のある治療候補として浮上してきた。理想的には、ＡＭＰは、高い殺菌能力を示すべきであるが、（ヒト）真核細胞に対して低い毒性を示すべきである。コンビナトリアルライブラリーアプローチ（Blondelle and Lohner 2000）、Ｄ−アミノ酸から構成される立体異性体（Sajjan, Tran et al. 2001）、又は環状Ｄ，Ｌ−α−ペプチド（Fernandez-Lopez, Kim et al. 2001）、ハイスループットベーススクリーニングアッセイ（Hilpert, Volkmer-Engert et al. 2005; Taboureau, Olsen et al. 2006）、定量的構造活性相関（ＱＳＡＲ）アプローチ（Hilpert, Volkmer-Engert et al. 2005; Marr, Gooderham et al. 2006; Jenssen, Lejon et al. 2007; Pasupuleti, Walse et al. 2008)、及び内因性ペプチドの同定(Papareddy, Rydengard et al. ; Nordahl, Rydengard et al. 2004; Nordahl, Rydengard et al. 2005; Malmsten, Davoudi et al. 2006; Malmsten, Davoudi et al. 2007; Pasupuleti, Walse et al. 2007）の使用などの種々のストラティジーが、選択的であり、かつ治療的に関心のあるＡＭＰを特定化するために現在使用されている（Hancock and Sahl 2006; Marr, Gooderham et al. 2006）。感染性疾患は毎年世界で何百万もの死亡例を占めており、途方もなく多い医療コストを招いている。この疾患の範囲は広く、所与の病原体と直接の関連を有する丹毒、敗血症、肺炎及び他の数え切れないほど多い感染症などの急性疾患、並びに微生物がしばしば長期間の炎症状態を引き起こす慢性疾患を含んでいる。ヒト病原体、シュードモナス・エルギノーサは、細菌性結膜炎及び角膜炎、耳炎、術後及び熱傷創感染症、慢性下肢潰瘍、肺炎、並びに嚢胞性線維症を含む幅広い疾患を引き起こし、かつ／又はいっそう悪化させる。それ故、シュードモナス・エルギノーサに対して強力な新規な抗菌・殺菌剤が必要であり、そして新規な処置療法としてＡＭＰの可能性のある使用へのかなりの目下の関心がある（Marr, Gooderham et al. 2006）。しかしながら、この関連でＡＭＰの使用は、例えば、こうした細菌は、ＡＭＰに対する防御として、タンパク質分解酵素、並びにＡＭＰを捕捉する細胞外ポリサッカライドを排泄することができるので（Schmidtchen, Holst et al. 2003; Werthen, Davoudi et al. 2004）、ささいな問題ではない。
【０２４１】
セルピンは、プロテアーゼを阻害することができる一連のタンパク質として最初に特定された類似の構造を有する一群のタンパク質である。頭字語であるセルピン（serpin）は、多くのセルピンがキモトリプシン様セリンプロテアーゼを阻害する（セリンプロテアーゼインヒビター）という理由で当初作られた。広範囲に研究されたセルピンスーパーファミリーの当初のメンバーは、ヒト血漿タンパク質であるアンチトロンビン及びアンチトリプシンであり、これらはそれぞれ、血液凝固及び炎症を制御する際に重要な役割を演じている。セルピンに関する構造研究によって、このファミリーの阻害メンバーは、ストレスから緩和への（S to R）転移と呼ばれている他とは異なるコンフォメーション変化を受けることが明らかとなった。以前には未発表である研究では、ＨＣIIは、Ｒ状態であると、強力な抗微生物活性を発揮することを確認した。更にこうした作用を検討しようという努力の一環として、我々はここに、強力な抗菌、抗炎症及び抗凝固特性を有しているＨＣII、ＮＬＦ２０の新規なペプチドの特定化についてレポートする。
【０２４２】
材料及び方法
ペプチド
ＮＬＦ２０ペプチド（ＮＨ2−ＮＬＦＲＫＬＴＨＲＬＦＲＲＮＦＧＹＴＬＲ−ＣＯＯＨ［配列番号３］）は、Biopeptide Co., San Diego, USAによって合成され、一方、ＬＬ−３７（ＬＬＧＤＦＦＲＫＳＫＥＫＩＧＫＥＦＫＲＩＶＱＲＩＫＤＦＬＲＮＬＶＰＲＴＥＳ［配列番号４］）は、Innovagen AB, Lund, Swedenから得られた。こうしたペプチドの純度（＞９５％）は、マススペクトル分析（MALDI-ToF Voyager）によって確認された。
【０２４３】
微生物
細菌分離株（Bacterial isolates）、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ATCC
25922、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）ATCC 27853、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）ATCC 29213、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ATCC 6633、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）ATCC 90028及びカンジダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）ATCC 90018が、ルンド大学病院・細菌学部（the Department of Bacteriology, Lund University Hospital）から得られた。
【０２４４】
生菌数解析
エッシェリヒア・コリ（E. coli）ATCC 25922、シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）15159、又はスタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）ATCC 29213細菌を、トッド・ヒューウイット（ＴＨ）（Todd-Hewitt (TH））培地（Becton and Dickinson, Maryland, USA）中で対数増殖期中期（mid-logarithmic phase）まで増殖させた。次いで微生物を洗浄し、そして５ｍＭ グルコースを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中に希釈した。この後、細菌（５０μｌ；２×１０6ｃｆｕ／ｍｌ）を、２０％ヒトクエン酸血漿を添加又は非添加で、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ中のＮＬＦ２０又はＬＬ−３７（０．０３、０．０６、０．３、０．６、３、６、３０、６０μＭ）と共に、３７℃で２時間インキュベーションした。５０％全血をを用いる実験では、スタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）ATCC 29213及びシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）ATCC 27853細菌（５０μｌ；２×１０8ｃｆｕ／ｍｌ）を、６０（シュードモナス・エルギノーサの場合）及び１２０μＭ（シュードモナス・エルギノーサ及びスタフィロコッカス・アウレウスの場合）で、ペプチドの存在下、３７℃で１時間インキュベーションした。殺菌活性を定量化するために、インキュベーション混合物の階段希釈液をＴＨアガー上にプレーティングし、引き続いて３７℃で終夜インキュベーションし、コロニー形成単位の数を決定した。１００％生存は、ペプチドの不存在下で、同じバッファー中及び同じ条件下での細菌の全生存として定義づけられた。有意性を統計ソフトウェアSigmaStat（SPSS Inc., Chicago, IL, USA）を用いて決定した。
【０２４５】
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の決定
ＭＩＣアッセイを、先のＮＣＳＬＡガイドライン中の記載と同様なマイクロタイターブロス希釈法によって行なった(Wiegand, I., Hilpert, K. & Hancock, R.E. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat Protoc 3, 163-175 (2008))。簡単に言えば、フレッシュな終夜にわたるコロニーを０．５単位の濁度間に懸濁し、更にミューラーヒントンブロス（Mueller-Hinton broth） (Becton Dickinson)中で希釈した。ＭＩＣを決定するために、ペプチドを、ストック溶液からの階段希釈により要求範囲と比較して１０倍高い濃度で水中に溶解した。各濃度の１０μｌを、それぞれ、９６ウェルマイクロタイタープレート(polypropylene, Costar Corp.)の相当するウェルに加え、そしてＭＨ培地中の９０μｌの細菌（1×１０5）を加えた。このプレートを３７℃で１６〜１８時間インキュベートした。ＭＩＣは細菌の視覚による増殖が見られなくなる最も低い濃度として受け止められている。
【０２４６】
放射拡散アッセイ（Radial diffusion assay）
本質的に、先に述べた通り（Lehrer, Rosenman et al. 1991; Andersson, Rydengard et al. 2004）、細菌を、１０ｍｌの１倍の（full strength）（３％ｗ／ｖ）トリプチケースソイブロス（ＴＳＢ）（Becton-Dickinson）中で対数増殖期中期まで増殖させた。次いで微生物を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４で１回洗浄した。続いて、４×１０6ｃｆｕを１５ｍｌの、下に敷かれたアガロースゲル［０．０３％（ｗ／ｖ） ＴＳＢ、１％（ｗ／ｖ） 電気浸透度が低いタイプのアガロース（（ＥＥＯ）agarose）（Sigma-Aldrich）及び０．０２％（ｖ／ｖ）ツイーン２０（Sigma-Aldrich）から成る］に加えた。このアンダーレイ（underlay）を直径（φ）１４４ｍｍのペトリ皿に注いだ。アガロースの凝固後、４ｍｍの直径のウェルに穴をあけ、そして必要な濃度のペプチド溶液６μｌを各ウェルに加えた。プレートを３７℃で３時間インキュベートし、ペプチド拡散させた。次いでこのアンダーレイゲルを１５ｍｌの融解したオーバーレイ（overlay）（６％ ＴＳＢ及び１％低ＥＥＯのアガロース（蒸留Ｈ2Ｏ中））で覆った。ペプチドの抗微生物活性を３７℃でのインキュベーションの１８〜２４時間後に各ウェル周辺の透明帯として可視化した。
【０２４７】
蛍光顕微鏡検査法
不透過性プローブＦＩＴＣ（Sigma-Aldrich, St. Louis, USA）を、細菌の膜透過性をモニタリングするために使用した。スタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）ATCC 29213細菌をＴＳＢ培地中で対数増殖期中期まで増殖させた。細菌を洗浄し、そしてバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，５ｍＭ グルコース）中に再懸濁すると、１×１０7ＣＦＵ／ｍｌの懸濁液が生じた。１００μｌの細菌懸濁液を３０μＭのそれぞれのペプチドを加えて、３０℃で３０分間インキュベートした。次いで微生物を、３０℃で４５分間インキュベートすることによって、ポリ（Ｌ−リシン）−被覆スライドガラス上に固定化し、引き続いてバッファー中の２００μｌのＦＩＴＣ（６μｇ／ｍｌ）をスライド上に添加し、３０℃で３０分間最後のインキュベーションをした。スライドを洗浄し、そして細菌をインキュベーションによって固定した（最初に氷上で１５分間、次に４％パラホルムアルデヒド中、室温で４５分間）。次にこのスライドガラスをプロロングゴールド褪色防止剤入り封入剤（Prolong Gold antifade reagent mounting medium）（Invitrogen, Eugene, USA）を用いてスライド上にのせた。浜松Ｃ４７４２−９５冷却型ＣＣＤカメラ（Hamamatsu C4742-95 cooled CCD camera）（Hamamatsu, Bridgewater, USA）及びPlan Apochromat ×100 objective（１００倍対物レンズ）（Olympus, Orangeburg, USA）を備えたNikon Eclipse TE300（Nikon, Melville, USA）倒立型蛍光顕微鏡を用いて、細菌を可視化した。微分干渉顕微鏡（Nomarski）イメージングが微生物自体の可視化のために使用された。
【０２４８】
溶血アッセイ
ＥＤＴＡ血を８００ｇで１０分間遠心分離し、その後血漿及びバフィーコート（buffy coat）を除去した。赤血球を３回洗浄し、そしてＰＢＳ、ｐＨ７．４中で再懸濁して、５％懸濁液を得た。次いでこの細胞を転倒回転により、ペプチド（６０μＭ）の存在下、３７℃で６０分間インキュベートした。２％トリトン（Triton）Ｘ−１００（Sigma-Aldrich）がポジティブコントロールとして機能した。次いでこのサンプルを８００ｇで１０分間遠心分離し、そして上清を９６ウェルマイクロタイタープレートに移した。細菌によって感染した血液を用いる実験では、クエン酸血液をＰＢＳで希釈した（１：１）。次いでこの細胞を転倒回転により、ペプチド（６０及び１２０μＭ）及びスタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）(２×１０8ｃｆｕ／ｍｌ）又はシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）（２×１０8ｃｆｕ／ｍｌ）細菌の存在下、３７℃で１時間インキュベートした。ヘモグロビン放出の吸光度をλ５４０ｎｍで測定し、そしてプロットし、トリトンＸ−１００によって誘発された溶血の％として表現した。
【０２４９】
乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）アッセイ
ＨａＣａＴケラチノサイトを、牛脳下垂体抽出物及び組み換えＥＧＦ（ＢＰＥ−ｒＥＧＦ）（Invitrogen, Eugene, USA）を補充した無血清ケラチノサイト培地（ＳＦＭ）中、９６ウェルプレート中での細胞がコンフルエンシーに達するまで増殖させた（３０００細胞／ウェル）。次いでこの培地を除去し、そして１００μｌの検討するペプチド（６０μＭ、（ＳＦＭ／ＢＰＥ−ｒＥＧＦ中に希釈するか、又は２０％ヒト血清を補充したケラチノサイト−ＳＦＭ中））を加えた。ＬＤＨベースＴＯＸ−７キット（Sigma-Aldrich, St.
Louis, USA）を細胞からのＬＤＨ放出の定量化のために用いた。結果は、３連測定からの平均値に相当し、そして１％トリトンＸ−１００から成るポジティブコントロール（１００％ＬＤＨ放出を生ぜしめる）と比較して分画ＬＤＨ放出として与えられた。
【０２５０】
ＭＴＴアッセイ
滅菌ろ過したＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾリル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド；Sigma-Aldrich）溶液（５ｍｇ／ｍｌ（ＰＢＳ中））を、使用するまで−２０℃で光から保護して保存した。ＨａＣａＴケラチノサイト、３０００細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種し、そして無血清ケラチノサイト−ＳＦＭ／ＢＰＥ−ｒＥＧＦ培地中で、コンフルエンシー（confluency）に達するまで増殖させた。次いで検討ペプチドを、６０μＭ及び１２０μＭで加えた。終夜インキュベーションさせた後、２０μｌのＭＴＴ溶液を各ウェルに加え、そしてプレートをＣＯ2中、３７℃で１時間インキュベーションした。次いでこのＭＴＴを含んでいる培地を吸引によって除去した。生じた青色のホルマザン生成物にウェル当たり１００μｌの１００％ ＤＭＳＯを添加し溶解した。次いでこのプレートを、沈殿物を溶解させるために１０分間、室温で静かにかきまぜた。吸光度を５５０ｎｍでモニタリングし、所与の結果は３連の測定からの平均値に相当する。
【０２５１】
インビトロにおけるマクロファージに対するＬＰＳの作用
３．５×１０5細胞を、１０％ＦＢＳ及び抗生物質を補充したフェノールレッド不含ＤＭＥＭ（Gibco）中、９６ウェル組織培養プレート（Nunc, 167008）中に播種した。接着を可能にするインキュベーションの６時間後、細胞を、種々の用量のペプチドの添加、及び無添加で、１０ｎｇ／ｍＬのエッシェリヒア・コリ（E. coli）ＬＰＳ（０１１１：Ｂ４）（Sigma）で刺激した。培養上清中のＮＯレベルを刺激から２４時間後にグリエス反応（Pollock, Forstermann et al. 1991）を用いて決定した。手短に言えば、ニトライト（nitrite）、ＮＯ分解の安定な産生物を、５０μｌの培養上清を同じ量のグリエス試薬（Sigma, G4410）と混和し、そして１５分後に５５０ｎｍでの吸光度を読み取ることによって測定した。ＦＢＳ及び抗生物質を加えたフェノールレッド不含ＤＭＥＭがブランクとして使用された。標準曲線をｄｄＨ２０中の０〜８０μＭの亜硝酸ナトリウム試液を用いて調製した。
【０２５２】
リポソーム調製及び漏出アッセイ
アニオン性のＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ （７５／２５ｍｏｌ／ｍｏｌ）リポソームが、ペプチドによって誘発された膜破壊に関して検討された。ＤＯＰＧ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール，一ナトリウム塩）、及びＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）はAvanti Polar Lipids（Alabaster, USA）に起源し、＞９９％の純度であり、一方コレステロール（＞９９％純度）は、Sigma-Aldrich（St. Louis, USA）に起源した。この脂質混合物をクロロホルムに溶解し、その後、溶媒を真空下で終夜蒸発によって除去した、次に、１０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ７．４を、０．１Ｍ カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）（Sigma, St. Louis, USA）と一緒に加えた。水和の後、この脂質混合物を液体窒素中で凍結させ、６０℃に加熱することから成る８回の凍結・融解のサイクルにかけた。約φ１４０ｎｍの単ラメラリポソームが、LipoFast miniextruder（Avestin, Ottawa, Canada）に搭載されているポリカルボネートフィルター（ポアサイズ１００ｎｍ）を通して２２℃でマルチプル押し出し（multiple extrusions）によって生じた。非捕捉ＣＦを２回のその後のゲルろ過（Sephadex G-50, GE Healthcare, Uppsala, Sweden）によって、溶離剤としてＴｒｉｓバッファーを用い２２℃で除去した。リポソームからのＣＦ放出は、リポソーム分散（１０ｍＭ 脂質（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中））から５２０ｎｍで放出する蛍光をモニタリングすることによって決定した。絶対漏出の程度については、０．８ｍＭ トリトンＸ−１００（Sigma-Aldrich, St. Louis, USA）の添加によって各実験の最後にリポソームを破壊することによって得られた。SPEX-fluorolog 1650 0.22-m double spectrometer（SPEX Industries, Edison, USA）が、リポソーム漏出アッセイのために用いられた。測定は３７℃、３連で行なわれた。
【０２５３】
ＣＤスペクトル測定
溶液中のペプチドのＣＤスペクトルを、Jasco J-810 Spectropolarimeter（Jasco, U.K.）を用いて測定した。この測定は撹拌しながら、１０ｍｍ石英キュベット中、３７℃で行なわれ、そしてこのペプチドの濃度は１０μＭであった。１００μＭの脂質濃度でのリポソームのペプチドの二次構造に対する影響が、２００〜２５０ｎｍの範囲でモニタリングされた。検討される条件下で観察されたペプチドのコンフォメーション（conformation）はα−ヘリックスとランダムコイルにのみであった。α−ヘリックスコンフォメーションのペプチドの断片は、２２５ｎｍでのＣＤシグナルから算出された。１００％α−ヘリックス及び１００％ランダムコイル参照は、それぞれ、０．１Ｍ ＮａＯＨ及び０．１Ｍ ＨＣｌ中の、０．１３３ｍＭ（モノマー濃度）ポリ−Ｌ−リシンから得られた。ペプチド構造に対するリポポリサッカライドの影響の決定のために、このペプチドの二次構造が、Ｔｒｉｓバッファー中、及びエッシェリヒア・コリ（E. coli）リポポリサッカライド（０．０２ｗｔ％）（エッシェリヒア・コリ ０１１１：Ｂ４、高度に精製され、タンパク質／ＲＮＡ（１％未満）、Sigma, UK）存在下の双方において、１０μＭのペプチド濃度でモニタリングされた。測定間の器械誤差を説明するために、バックグラウンド値（ペプチドシグナルが存在しない場合の２５０ｎｍで検出された）を差し引いた。バルク溶液に起源するシグナルもまた、補正された。測定は３７℃で、３連で行なわれた。
【０２５４】
臨床パラメーター
マウス血液（ＥＤＴＡを用いる抗凝固）が、心臓穿刺術によって取られ、そしてVetScan HM5 System（TRIOLAB）によって解析された。白血球細胞の数、リンパ球、好中球、単球及び血小板の百分率が決定された。
【０２５５】
サイトカインアッセイ
サイトカイン、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−１、ＩＮＦ−γ、及びＴＮＦ−αを、ＲＡＷ２６４．７細胞からの細胞培養上清、並びにＬＰＳ又はシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）（ペプチド添加又は非添加処理で）を注入したマウスに起源する血漿中で、サイトメトリックビーズアレイ（Cytometric bead array）；製造業者の指示に従ってマウス炎症キット（Becton Dickinson AB）を用いて測定した。血漿サンプルはすべて、解析前は−２０℃で保存した。
【０２５６】
凝固アッセイ
凝固時間はすべて、凝固計（Amelung, Lemgo, Germany）を用いて解析された。プロトロンビン時間（ＰＴ）及びトロンビン凝固時間（ＴＣＴ）は次のように測定した：１００μｌのフレッシュなヒトクエン酸血漿と指定濃度のＮＬＦ２０を一緒にし、これを３７℃で６０秒間、予め暖め、その後１００μｌの凝固試薬（clotting reagent）［ＰＴ−トロンボプラスチン試薬（PT-thromboplastin reagent）（Trinity Biotech），ＴＣＴ：トロンビン試薬（Thrombin reagent）（Technoclonｅ）］を加えることによってクロット形成が開始した。活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を記録するために、１００μｌのカオリン含有溶液（Technoclone）を血漿−ペプチドミックスに加え、そして２００秒間インキュベートし、その後クロット形成が１００μｌのフレッシュＣａＣｌ2溶液（３０ｍＭ）を加えることによって開始した。
【０２５７】
インビボにおけるＬＰＳモデル
雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８〜１０週齢、２２＋／−５ｇ）に、体重１ｋｇ当たり、１８ｍｇのエッシェリヒア・コリ（E. coli） ０１１１：Ｂ４ ＬＰＳ（Sigma）を腹腔内注入した。ＬＰＳ注入の３０分後に、０．５ｍｇのＮＬＦ２０又はバッファーのみをマウスに腹腔内注入した。生存及び状態を７日間追跡した。血液回収及び組織化学のために、マウスをＬＰＳチャレンジの２０時間後に犠死させ、そして肺を除去し固定化した。こうした実験は、Malmoe/Lundの研究動物倫理委員会（the Laboratory Animal Ethics Committee）が承認している。
【０２５８】
シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）感染モデル
動物を光と温度の標準条件下で収納し、そして標準的な研究用のエサと水に自由にアクセスさせた。シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）１５１５９細菌を対数増殖期まで増殖させ（ＯＤ620約０．５）、回収し、ＰＢＳ中で洗浄し、２×１０8ｃｆｕ／ｍｌまで同じバッファー中で希釈し、そして注入するまで氷上に保持した。この細菌の懸濁液１００μｌを雌性ｂｌ６マウスに腹腔内（i.p.）注入した。細菌注入後すぐに、０．５ｍｇのＮＬＦ２０（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中）又はバッファーのみをこのマウスにi.p.注入した。標的臓器への細菌伝播を検討するために、脾臓、肝臓及び腎臓を回収し、氷上に置き、均質化し、そしてコロニー形成単位を決定した。Ｐ値をマン・ホイットニーのＵ検定（Mann-Whitney U-test）を用いて決定した。３個の独立した実験からのデータをプールした。
【０２５９】
組織化学
ＬＰＳ注入の２０時間後に回収した臓器を速やかに４％パラホルムアルデヒドで固定し、その後それらをパラフィンに包埋し、そして薄片化した。薄片を１０分、メイヤーズヘマトキシリン（Mayers Hematoxilin）（Histolab AB）で、そして７分、エオシン（Eosin）（Merck）を用いて染色した。薄片化及び染色はHistocenter, Gothenburg, Swedenで行なわれた。
【０２６０】
走査型電子顕微鏡検査法
走査型電子顕微鏡検査法のために、肺をＬＰＳ注入の２０時間後に摘出した。サンプルを０．１５Ｍ カコジル酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）中の２．５％グルタルアルデヒド中、室温で終夜固定した。被検査物をカコジル酸バッファーで洗浄し、そして５０％（ｖ／ｖ）から無水エタノールまでエタノールを連続的に上昇させて脱水した。次いで被検査物を、無水エタノールを中間溶媒として用いて、二酸化炭素中で臨界点乾燥に処し、アルミニウムホルダーに取り付け、３０ｎｍパラジウム／金を用いてスパッタリングして、そしてJEOL JSM-350走査型電子顕微鏡で検討した。
【０２６１】
結果
ＮＬＦ２０が抗微生物活性を発揮するか否かを解明するために、我々は、グラム陰性菌であるエッシェリヒア・コリ及びシュードモナス・エルギノーサ、グラム陽性菌であるバチルス・サブチリス及びスタフィロコッカス・アウレウス、並びに真菌であるカンジダ・アルビカンス及びカンジダ・パラシロシスに対する効果を放射拡散アッセイ（ＲＤＡ）において検討した（図３４Ａ）。以上のように、ＮＬＦ２０活性は、“古典的な（classical）”ヒトのカテリシジン、ＬＬ−３７の場合に観察される活性を完全に凌駕している。上述の抗菌結果は更に、マトリックスを用いない生菌数アッセイ（matrix-free viable count assays）によって実証された。エッシェリヒア・コリ（E. coli）、シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）及びスタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）を利用するこうした用量反応実験からの結果によって、ＮＬＦ２０は、有意な抗菌活性を示すことが確認された。この活性が維持され、そしてエッシェリヒア・コリ（E. coli）及びスタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）の場合には、ヒトクエン酸血漿の存在下では更に強化させされることは注目に値することである（図３４Ｂ）。これに加えて、速度論的研究によれば、ＮＬＦ２０の殺菌は、５〜２０分以内でおこり、このことは多くの抗菌ペプチドと互換性がある早期の直接的作用が示されていることが示された（図３４Ｃ）。不透過性プローブＦＩＴＣを使用する研究では、ＮＬＦ２０は、ＬＬ−３７での処置の後に見られるのと同様にエッシェリヒア・コリ（E. coli）の細菌膜を透過したことが示された（図３５，上方パネル）。シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）を用いる電子顕微鏡検査法によると、シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）の細胞外皮はそれらの細胞質の内容を欠いており、そして細胞内物質は細胞外で見出され、広範な細胞膜損傷が実証されていた（図３５，下方パネル）。更にＬＬ−３７でも同様な所見が得られた。こうしたデータによって、ＮＬＦ２０は、細菌の膜に作用することが示された。一方、ＮＬＦ２０は、リポソームへの結合に対するヘリックス含量の比較的わずかの増加を示し（図３６Ａ）、顕著なコンフォメーションの変化がエッシェリヒア・コリ（E. coli）ＬＰＳの存在下で観察された（図３６Ｂ）。ＮＬＦ２０はまた、ＣＦ放出を引き起こし（図３６Ｃ）、従って脂質膜に対する直接的作用を示している。速度論的分析によれば、最大放出の約８０％は、５〜１０分以内におき、ＬＬ−３７で得られた結果（示されていない）と比較しても遜色なかった。
【０２６２】
細菌を殺すＡＭＰはまた、真核生物細胞に対して溶血性及び膜透過性活性を示しうる。この結果により、ＮＬＦ２０は、高用量（３０〜６０μＭ）で溶血活性を発揮することが示された（図３７Ａ）。しかしながら、この溶血活性は、内因性のＬＬ−３７の場合観察される溶血活性と比較してより低いものであった。同様に、ＨａＣａＴ細胞透過性（図３７Ｂ）、並びにＭＴＴアッセイによりモニタリングされた生存率に対する効果に関して同様の所見が観察された（図３７Ｃ）。生理学的条件下で、その後のインビボ研究にとって重要である、溶血性並びに抗微生物効果を同時に探索するために、ＮＬＦ２０を、種々のグラム陽性及びグラム陰性病原体、並びに真菌に感染させたヒト血液に加えた。ＮＬＦ２０は顕著な選択性を示し、１２０μｌのペプチド用量で付随する溶血がほとんどなく（約２％以下）、シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）、エッシェリヒア・コリ（E. coli）、並びにストレプトコッカス・ピオゲネス（S. pyogenes）をほとんど完全に根絶させることを示すことが観察された（図３８）。ＬＬ−３７の場合には、対応する数は約８％（Malmsten et al., 原稿の形である）であった。この関連で目立つことはこうした条件下で、細菌に対するペプチドの非常に明白な選択性を示し、ＮＬＦ２０の溶血性が低いことである。また、ＮＬＦ２０は、グラム陽性菌であるスタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）、並びに真菌であるカンジダ・アルビカンス（C. albicans）に対しては活性ではないということも注目すべきである。こうした上記のもの、並びに他の病原体に対するＮＣＳＬＡによるＭＩＣ分析は表２に提示した。全体的に見れば、ＮＬＦ２０は、現在臨床試験の後期のデザイナーペプチドであるオミガナンの場合に観察される活性に匹敵する活性を示した。
【０２６３】
ＮＬＦ２０が、インビボにおける侵襲的なシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）感染に対して効果がありうるか否かを探索するために、我々は、このペプチドをシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）に感染したマウスに注入した。コントロールと比較して、ＮＬＦで処置したものは、両者及び高用量の細菌を用いて感染させた動物の脾臓、肝臓及び腎臓において生じた細菌数は有意に低いものであった（図３９Ａ）。重要なことは、ｃｆｕの減少によって明らかなごとく、処置が感染の１時間後に遅延され、そして皮下的に与えられてもこの抗微生物作用は存在した。また、たった１回の用量のｓｃ又はｉｐで付与する、ＮＬＦ２０の処置でも、それぞれ、生存を延長し、そして顕著に死亡率を減少させるのに十分であったことは注目に値する（図３９Ｃ）。これに関連して、ｉｐ処置後でもその減少が認められているＴＮＦ−α、そしてその増加（双方の投与）を示しているＩＬ−１０の付随する変化が観察された（図３９Ｄ）。並行して、血小板が増加した（図３９Ｅ）。
【０２６４】
更にＮＬＦ２０の保護作用の根拠をなしている、可能性のあるメカニズムを詳述するために、そして上記で提示したＮＬＦ２０のＬＰＳ結合特性を考慮して、我々は、このペプチドがインビトロ及びインビボで抗エンドトキシン作用を発揮しうるかどうかを検討した。ＮＬＦ２０のこの抗炎症作用は、当初マクロファージモデルで検討された。図４０Ａで見られるごとく、ＮＬＦ２０によって、２０〜４０μＭでＬＰＳによって誘発されたＮＯ−応答が除去された。次に、ＮＬＦ２０の、凝固に対する作用が検討された。活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）の測定から、ＮＬＦ２０は、正常ヒト血漿の凝固の内因系経路を弱めた。凝固系の他の部分は、プロトロンビン時間（ＰＴ；凝固の外因系経路をモニタリングする）、及びトロンビン凝固時間（ＴＣＴ；トロンビン誘発フィブリンネットワーク形成を測定する）で判断して、顕著には影響されなかった（図４０Ｂ）。ＬＰＳ誘発ショックのマウスモデルでは（図４０Ｃ）、ＮＬＦ２０は、生存の劇的な改善を示した（図４０Ｃ）。処置動物はまた、体重の完全な回復を示した（図４０Ｅ）。８及び２０時間後の血小板数の解析では、このペプチドはこの特定のＬＰＳモデルにおいて消費の減少を示し、顕著な血小板の増加を示した（図４０Ｄ）。このレベルは、生存動物において完全に正常化した。ＬＰＳ注入の８及び２０時間後のサイトカイン解析では、炎症性ＩＦＮ−γが顕著に減少することが示され、一方、ＩＬ−１０の増加が８時間及び２０時間後に観察された（図４０Ｆ）。同様に、一方では、ＬＰＳ処置動物に起源する肺の組織化学及びＳＥＭ解析によって、タンパク質及び赤血球細胞の肺漏出が示され（図４０Ｇ）、ＮＬＦ２０処置の肺によって、こうしたＬＰＳによって誘発された作用が著しく減少したことが示された。すなわち、この結果により、ＬＰＳショックのこの動物モデルにおいてＮＬＦ２０の顕著な抗炎症作用が示された。
【０２６５】
【表２】
2013505030.tif 000003
【０２６６】
参照
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【０２６７】
実施例Ｄ
材料及び方法
凝固アッセイ
凝固時間はすべて、凝固計（Amelung, Lemgo, Germany）を用いて解析された。プロトロンビン時間（ＰＴ）及びトロンビン凝固時間（ＴＣＴ）は次のように測定した：１００μｌのフレッシュなヒトクエン酸血漿と指定濃度のＮＬＦ２０を一緒にし、これを３７℃で６０秒間、予め暖め、その後１００μｌの凝固試薬［ＰＴ−トロンボプラスチン試薬（PT-thromboplastin reagent）（Trinity Biotech），ＴＣＴ：トロンビン試薬（Technoclonｅ）］を加えることによってクロット形成を開始した。活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を記録するために、１００μｌのカオリン含有溶液（Technoclone）を血漿−ペプチドミックスに加え、そして２００秒間インキュベートし、その後クロット形成が１００μｌのフレッシュＣａＣｌ2溶液（３０ｍＭ）を加えることによって開始した。
【０２６８】
結果
ＫＹＥ２８及びＮＬＦ２０は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）の測定によって決定された正常ヒト血漿の凝固の内因系経路を弱めた。ＫＹＥ２１は、ごくわずかのａＰＴＴのブロッキングを示した(図４１)。凝固系の他の部分は、凝固の外因系経路をモニタリングするプロトロンビン時間（ＰＴ）、及びトロンビン誘発フィブリンネットワーク形成を測定するトロンビン凝固時間（ＴＣＴ）で判断して、顕著には影響されなかった。
【図面の簡単な説明】
【０２６９】
【図１】ＴＦＰＩのＣ末端ペプチドのＮＯブロッキング作用。  ＲＡＷ ２６４．７マクロファージを、１０ｎｇ／ｍｌのエッシェリヒア・コリ ＬＰＳ（E.coli LPS）で刺激し、そして１０μＭのペプチド ＧＧＬ２７、ＬＩＫ１７及びＴＫＲ２２を加えた。ＮＯをグリエス（Griess）試薬を用いて測定した。
【図２】ヘパリンコファクターIIのペプチドのＮＯブロッキング作用。  ＲＡＷマクロファージを、１０ｎｇ／ｍｌのエッシェリヒア・コリ ＬＰＳ（E.coli LPS）で刺激し、そしてペプチドＫＹＥ２８、ＮＬＦ２０、及びＫＹＥ２１を指定用量で加えた。ＬＬ−３７をポジティブコントロールとして提示した。ＮＯを、グリエス試薬を用いて測定した。
【図３】ヘパリンコファクターIIのペプチドの抗炎症作用。  ＫＹＥ２８、ＫＹＥ２１及びＮＬＦ２０は、種々の微生物生産物で刺激されたＲＡＷ２６４．７マクロファージのＮＯ産生をブロックする。細胞は、指定濃度のエッシェリヒア・コリ ＬＰＳ（E.coli LPS）、スタフィロコッカス・アウレウス（S.aureus）に起源するリポタイコ酸（ＬＴＡ）及びペプチドグリカン（ＰＧＮ）、並びにサッカロミセス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に起源するザイモサンＡに処された。ＮＯ産生を、１０μＭ ＧＫＹ２５を加えるか、又は加えずに、グリエス試薬を用いることによって決定した。
【図４】ＴＦＰＩのＣ末端ペプチドは、凝固をブロックする。  （Ａ）ＴＦＰＩのＣ末端ペプチド；ＧＧＬ２７、ＬＩＫ１７、及びＴＫＲ２２は、正常ヒト血漿における凝固の外因系経路を弱める。これは活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を測定することによって決定した。ＧＧＬ２７及びＬＩＫ１７はまた、凝固の内因系経路をモニタリングするプロトロンビン時間（ＰＴ）に影響を与えた。トロンビン誘発フィブリンネットワーク形成を測定するトロンビン凝固時間（ＴＣＴ）は、ペプチド類によっては有意に影響されなかったが、（Ｂ）ＧＧＬ−２７では、用量依存の形で凝固を弱め、このことは正常ヒト血漿におけるａＰＴＴ、ＰＴ及びＴＣＴを測定することによってモニタリングされた。
【図５】ヘパリンコファクターIIのペプチドは、凝固をブロックする。  ＫＹＥ２８及びＮＬＦ２０は、正常ヒト血漿における凝固の内因系経路を弱め、このことは活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を測定することによって決定された。ＫＹＥ２１は、ａＰＴＴのわずかなブロックを示したに過ぎなかった。凝固システムの他の部分では、凝固の外因系経路をモニタリングするプロトロンビン時間（ＰＴ）、及びトロンビン誘発フィブリンネットワーク形成を測定するトロンビン凝固時間（ＴＣＴ）によって判断して、有意に影響が与えられなかった。
【図６】ＴＦＰＩの構造を図解している略画。  酵素による切断部位が指定されている。
【図７】ＴＦＰＩに由来するペプチドの抗微生物活性。  指定微生物に対する選択されたペプチド（１００μＭ（ＲＤＡ中））の抗微生物活性。抗微生物活性を決定するために、エッシェリヒア・コリ（E. coli） ATCC 25922、スタフィロコッカス・アウレウス S. aureus ATCC 29213分離株（isolates）（４×１０6cfu）又はカンジダ・パラプシロシス（C. parapsilosis）ATCC 90018（１×１０5cfu）を０．１％ＴＳＢ アガロースゲル中に接種した。それぞれ、４ｍｍ直径のウェルに６μｌのペプチドをローディングした。３７℃で１８〜２４時間インキュベーションした後、クリアランスゾーンがそれぞれのペプチドの抑制効果に相当する（平均値が提示される、ｎ＝３）。
【図８】ＴＦＰＩに由来するペプチドの抗菌活性。  生菌数アッセイ（viable count assays）においてエッシェリヒア・コリ（E.coli）に対するＴＦＰＩに由来するペプチド及びＬＬ−３７の作用。２×１０6ｃｆｕ／ｍｌの細菌を、正常又は加熱不活性化した２０％ヒト血漿を含んでいる、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４バッファー（Ｔｒｉｓ）中、あるいは０．１５ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中、ペプチドを指定濃度で含む５０μｌ中でインキュベートした（ｎ＝３、ＳＤは指定されている）。
【図９】速度論分析。  ２０％血漿を含んでいる０．１５ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中のＴＦＰＩに由来するペプチド（６及び３０μＭ）による時間依存的殺菌をエッシェリヒア・コリ（E.coli）を用いる生菌数アッセイによって分析した。
【図１０】細菌膜に対する作用。  （Ａ）シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）及びエッシェリヒア・コリ（E. coli）に対するペプチドの透過性作用。（Ａ）細菌を指定のペプチドと共にインキュベートし、そして、透過性を不透過性プローブＦＩＴＣを用いて評価した。（Ｂ）電子顕微鏡分析。シュードモナス・エルギノーサ及びスタフィロコッカス・アウレウス細菌を、３０μＭのＧＫＹ２５及びＬＬ−３７で、３７℃で２時間インキュベートし、そして電子顕微鏡で解析した。スケールバーは１μｍであった。コントロール；バッファーコントロール。
【図１１】ＴＦＰＩペプチド ＬＩＫ１７の構造。  マイナスに荷電されたリポソーム（ＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ）の存在下でのＴＦＰＩに由来するＣ末端ペプチドのへリックス含量。ＬＩＫ１７構造は、リポソームの添加によってほとんど影響されなかった。
【図１２】トリスバッファー中及びＬＰＳの存在下でのＬＩＫ１７のＣＤスペクトル。  コントロールのために、バッファーとＬＰＳのみのＣＤスペクトルも提示された。
【図１３】リポソーム漏出（liposome leakage）に対する指定ペプチドの作用。  膜透過性作用は、ＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ（マイナスに荷電されている）リポソームに起源するカルボキシフルオレセインの蛍光放出を測定することによって記録した。この実験は、０．１５Ｍ ＮａＣｌの不存在及び存在下、１０ｍＭトリスバッファー中で行なわれた。値は３連のサンプルの平均に相当する。
【図１４】真核生物細胞に対する活性。  指定ペプチドの溶血作用。細胞をこのペプチドの種々の濃度でインキュベートし、２％トリトンＸ−１００（Sigma-Aldrich）をポジティブコントロールとして機能させた。ヘモグロビン放出の吸光度をλ５４０ｎｍで測定し、そしてトリトンＸ−１００で誘発された溶血の％として表現した（ｙ軸のスケールに留意する）。ＬＬ−３７の作用を比較のために示す。
【図１５】ＨａＣａＴケラチノサイトを指定ＴＦＰＩ−ペプチド並びにＬＬ−３７に処した。細胞の透過性作用をＬＤＨベースＴＯＸ−７キットによって測定した。細胞からのＬＤＨ放出は、λ４９０ｎｍでモニタリングし、そして全ＬＤＨ放出％としてプロットした。
【図１６】ＭＴＴアッセイを、指定ペプチドの存在下（６０μＭ）で、ＨａＣａＴケラチノサイトの生存能力を測定するのに使用した。このアッセイでは、ＭＴＴは、代謝活性に関連する酵素によって、１つの色素、青色のホルマザンに変化する。色素の吸光度をλ５５０ｎｍで測定した。
【図１７】ヘパリンコファクターIIに由来するペプチドの抗微生物活性。  ＲＤＡにおける選択されたペプチド（１００μＭ）の指定の微生物に対する抗微生物活性。エッシェリヒア・コリ（E. coli）ATCC 25922、スタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus） ATCC 29213分離株（４×１０6cfu）又はカンジダ・パラプシロシス（C. parapsilosis）ATCC 90018（１×１０5cfu）を、０．１％ ＴＳＢアガロースゲル中に接種した。それぞれ、４ｍｍ直径のウェルに６μｌのペプチドをローディングした。３７℃で１８〜２４時間インキュベーションした後、クリアランスゾーンがそれぞれのペプチドの抑制効果に相当する（平均値が提示される、ｎ＝３）。
【図１８】（上方）生菌数アッセイにおけるヘパリンコファクターIIに由来するペプチド及びＬＬ−３７のエッシェリヒア・コリ（E. coli）、シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）及びスタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）に対する抗菌作用。２×１０6ｃｆｕ／ｍｌの細菌を、２０％ヒト血漿を含んでいる、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４バッファー（Ｔｒｉｓ）中、あるいは０．１５ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中、ペプチドを指定濃度で含む５０μｌ中でインキュベートした（ｎ＝３、ＳＤは指定されている）。（下方）２０％血漿を含んでいる０．１５ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中のＧＫＲ２２（６及び３０μＭで）による時間依存的殺菌をE.coliを用いる生菌数アッセイによって解析した。ＬＬ−３７（３０μＭ）が比較のために使用された。
【図１９】細菌膜に対する作用。  （Ａ）シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）及びエッシェリヒア・コリ（E. coli）に対するペプチドの透過性作用。（Ａ）細菌を指定のペプチドと共にインキュベートし、そして、透過性を、不透過性プローブＦＩＴＣを用いて評価した。（Ｂ）電子顕微鏡分析。シュードモナス・エルギノーサ及びスタフィロコッカス・アウレウス細菌を、３０μＭのＮＬＦ２０及びＬＬ−３７と共に３７℃で２時間インキュベートし、そして電子顕微鏡で解析した。スケールバーは１μｍであった。コントロール；バッファーコントロール。
【図２０】構造及びリポソームに対する作用。  （Ａ）マイナスに荷電されたリポソーム（ＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ）の存在下でのヘパリンコファクターIIに由来するＣ末端ペプチドのへリックス含量。ＬＩＫ１７構造は、リポソームの添加によってほとんど影響されなかった。（Ｂ）Ｔｒｉｓバッファー中及びＬＰＳの存在下でのＮＬＦ２０のＣＤスペクトル。コントロールのために、バッファーとＬＰＳのみの場合のＣＤスペクトルも提示された。（Ｃ）リポソーム漏出（liposome leakage）に対するＮＬＦ２０の作用。膜透過性作用は、ＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ（マイナスに荷電されている）リポソームに起源するカルボキシフルオレセインの蛍光放出を測定することによって記録した。この実験は、０．１５Ｍ ＮａＣｌの不存在及び存在下、１０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー中で行なわれた。値は３連のサンプルの平均に相当する。
【図２１】シュードモナス・エルギノーサ敗血症の動物モデルにおけるＮＬＦ２０の作用。  トロンビンＨＣIIペプチドＮＬＦ２０は、生存を顕著に増加させた。マウスに、i.p.でシュードモナス・エルギノーサ細菌を注入し、引き続いて、１時間後、及びその後次の３日間にわたって２４時間間隔でＮＬＦ２０又はバッファーのみを皮下注入した。このペプチドでの処置は、顕著に生存を増加させた。
【図２２】真核生物細胞に対する活性。  （Ａ）指定ペプチドの溶血作用。細胞を種々の濃度のこのペプチドでインキュベートし、２％ トリトンＸ−１００（Sigma-Aldrich）をポジティブコントロールとして機能させた。ヘモグロビン放出の吸光度をλ５４０ｎｍで測定し、そしてトリトンＸ−１００で誘発された溶血の％として表現した（ｙ軸のスケールに留意する）。ＬＬ−３７の作用を比較のために示す。（Ｂ）ＨａＣａＴケラチノサイトを指定ＨＣII−ペプチド並びにＬＬ−３７に処した。細胞の透過性作用をＬＤＨベースＴＯＸ−７キットによって測定した。細胞からのＬＤＨ放出は、λ４９０ｎｍでモニタリングし、そして全ＬＤＨ放出の％としてプロットした。（Ｃ）ＭＴＴアッセイを、指定ペプチドの存在下（６０μＭで）で、ＨａＣａＴケラチノサイトの生存能力を測定するのに使用した。このアッセイでは、ＭＴＴは、代謝活性に関連する酵素によって、１つの色素、青色のホルマザンに変化する。色素の吸光度をλ５５０ｎｍで測定した。右パネルは、２０％血漿（溶血）又は２０％血清（ＬＤＨ及びＭＴＴ）の存在下での結果を示す。
【図２３】アンチトロンビンIIIに由来するペプチドＦＦＦ２１は凝固をブロックする。  ＦＦＦ２１は、正常ヒト血漿における凝固の内因系経路を弱め、このことは活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を測定することによって決定された。凝固システムの他の部分では、凝固の外因系経路をモニタリングするプロトロンビン時間（ＰＴ）、及びトロンビン誘発フィブリンネットワーク形成を測定するトロンビン凝固時間（ＴＣＴ）によって判断して、有意に影響が与えられなかった。
【図２４】ＨＣIIの構造。  ＫＹＥ２８が示されているＨＣIIを図解している略画。
【図２５】ＨＣIIに由来するペプチドの抗微生物活性。  （Ａ）抗微生物活性（指定の微生物に対するＫＹＥ２８、ＫＹＥ２１、及びＬＬ−３７のＲＤＡを用いて）。抗微生物活性の判定のために、エッシェリヒア・コリ（E. coli）ATCC 25922、シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）ATCC 27853、スタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）ATCC 29213、又はバチルス・サブチリス（B. subtilis）ATCC 6633分離株（４×１０6cfu）、又はカンジダ・アルビカンス（C. albicans）ATCC 90028及びカンジダ・パラプシロシス（C. parapsilosis）ATCC 90018（１×１０5cfu）を、０．１％ ＴＳＢアガロースゲル中に接種した。それぞれ、４ｍｍ直径のウェルに６μｌのペプチド（１００μＭで）をローディングした。３７℃で１８〜２４時間インキュベーションした後、クリアランスゾーンがそれぞれのペプチドの抑制効果に相当する（平均値が提示される、ｎ＝３）。（Ｂ）生菌数アッセイにおけるＫＹＥ２８、ＫＹＥ２１及びＬＬ−３７のエッシェリヒア・コリ（E. coli）ATCC 25922、シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）ATCC 27853、及びスタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）ATCC 29213に対する抗菌作用。２×１０6ｃｆｕ／ｍｌの細菌［２×１０6ｃｆｕ／ｍｌ中、指定された濃度でのペプチドと共に、５０μｌ中でインキュベートした］を、２０％ヒトクエン酸血漿（human citrate plasma）（ＣＰ）を含んでいる、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４（バッファー）中、あるいは、０．１５ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中、２×１０6ｃｆｕ／ｍｌの細菌中、指定濃度でペプチドと共に、５０μｌ中でインキュベートし（ｎ＝３、ＳＤは指定されている）、そしてｃｆｕを決定した。（Ｃ）２０％血漿を含んでいる０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中のＫＹＥ２９及びＫＹＥ２１（３０μＭで）による時間依存的殺菌を指定の細菌を用いる生菌数アッセイによって解析した。
【図２６】細菌膜に対する作用。  エッシェリヒア・コリ（E. coli）に対するペプチドの透過性作用。細菌をＫＹＥ２１と共にインキュベートし、そして、透過性を不透過性プローブＦＩＴＣを用いて評価した。
【図２７】構造及びリポソームに対する作用。  （Ａ）マイナスに荷電されたリポソーム（ＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ）の存在下でのＫＹＥ２１のへリックス含量。へリックス含量は、リポソーム添加後増加した。（Ｂ）トリスバッファー中及びＬＰＳの存在下でのＫＹＥ２１のＣＤスペクトル。リポソームでの結果が比較のために示された。コントロールのために、バッファーとＬＰＳのみの場合のＣＤスペクトルも提示された。（Ｃ）リポソーム漏出（liposome leakage）に対するＫＹＥ２１の作用。膜透過性作用は、ＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ（マイナスに荷電されている）リポソームに起源するカルボキシフルオレセインの蛍光放出を測定することによって記録した。この実験は、１０ｍＭトリスバッファー中で行なわれた。値は３連のサンプルの平均に相当する。
【図２８】真核生物細胞に対する活性。  （Ａ）指定ペプチドの溶血作用。細胞を種々の濃度のこのペプチドと共にインキュベートし、２％ トリトンＸ−１００（Sigma-Aldrich）をポジティブコントロールとして機能させた。ヘモグロビン放出の吸光度をλ５４０ｎｍで測定し、そしてトリトンＸ−１００で誘発された溶血の％として表現した（ｙ軸のスケールに留意する）。ＬＬ−３７の作用を比較のために示す。（Ｂ）ＨａＣａＴケラチノサイトをＫＹＥ２８、ＫＹＥ２１、又はＬＬ−３７に処した。（上方パネル）細胞の透過性作用をＬＤＨベースＴＯＸ−７キットによって測定した。細胞からのＬＤＨ放出は、λ４９０ｎｍでモニタリングし、そして全ＬＤＨ放出％としてプロットした。（下方パネル）ＭＴＴアッセイを、ＮＬＦ２０又はＬＬ−３７の存在下（６０μＭで）で、ＨａＣａＴケラチノサイトの生存能力を測定するのに使用した。このアッセイでは、ＭＴＴは、代謝活性に関連する酵素によって、１つの色素、青色のホルマザンに変化する。色素の吸収をλ５５０ｎｍで測定した。（Ｃ）ＰＢＳで希釈した５０％ヒト血液中で行なった以外は、上記のごとく溶血。（Ｄ）２０％ヒト血清の存在下でＨａＣａＴケラチノサイトを用いるＬＤＨ放出（上方パネル）及びＭＴＴ（下方パネル）。
【図２９】ＨＣIIによって誘導されたペプチドはインビトロにおけるＬＰＳに対するサイトカイン応答をモジュレートする。  （Ａ）ＫＹＥ２８及びＫＹＥ２１は、ニトライト（nitrite）産生を有意にブロックする。ＲＡＷ ２６４．７マクロファージを、指定濃度のこの２つのペプチドと一緒に、１０ｎｇ／ｍｌのエッシェリヒア・コリＬＰＳ（E.coli LPS）で刺激した。（Ｂ）シュードモナス・エルギノーサＬＰＳ（P. aeruginosa LPS）を用いることのほかは、上記と同様である。（Ｃ）ＫＹＥ２８は、マクロファージにおいて、ＴＮＦ−α産生、ＭＣＰ−１及びＩＬ−１０産生を減少させた。ＲＡＷ ２６４．７細胞を、１０ｎｇ／ｍｌ エッシェリヒア・コリＬＰＳ（E.coli LPS）で刺激し、そしてサイトカインを細胞上清液中で解析した。
【図３０】インビボにおけるＨＣIIに由来するペプチドの抗炎症作用。  Ｃ５７ＢＬ６マウスにおける敗血症性ショックを１８ｍｇ／ｋｇのエッシェリヒア・コリＬＰＳ（E.coli LPS）の腹腔内注入によって誘発した。６０分後、ＫＹＥ２８及びＫＹＥ２１（０．２及び０．５ｍｇ；（ＰＢＳ中））又はバッファーのみを投与した。（Ａ）ペプチド処理によって、コントロールマウスと比較してＬＰＳ誘発ショックにおける生存が有意に増加することがもたらされた（コントロール群；ｎ＝、ＧＫＹ２５；ｎ＝、ＨＶＦ；ｎ＝（ｐ＜０．００１））。（Ｂ）体重が７日間追跡調査され、そして処理マウスの場合には十分な回復を示した。（Ｃ）ペプチド処理によって、ＬＰＳによって誘発されたショックモデルにおいて血小板の数が影響された。（Ｄ）別の実験では、マウスにＬＰＳを注入し、引き続いて０．５ｍｇのＫＹＥ２８若しくはＫＹＥ２１、又はバッファーを投与した。動物は、８時間、２０時間、又は７日後に犠死させ、血液中の血小板の数を、VetScanSystemを用いてカウントした。（Ｄ）ＫＹＥ２８及びＫＹＥ２１（０．５ｍｇ）の投与によって、コントロールマウスに比較してサイトカイン応答が有意に弱められた。サイトカインをＬＰＳ注入の８又は２０時間後に犠死した動物の血液中で測定した。（Ｅ）ＫＹＥ２８は、シュードモナス・エルギノーサＬＰＳ（P. aeruginosa LPS）によって誘発された敗血症性ショックにおけるサイトカインレベルを減少させた。Ｃ５７ＢＬ６に、３６ｍｇ／ｋｇＬＰＳ、引き続いて０．５ｍｇのＫＹＥ２８を用いてｉ．ｐ．注入した。２０時間後、マウスは犠死させ、そして血液中のサイトカインレベルを決定した。（ＫＹＥ２８；ｎ＝１０）。データはすべて、２つの独立した実験を表示している。
【図３１】ＫＹＥ２８及びＫＹＥ２１は、インビボでＬＰＳモデルにおける臓器障害を防止する。  肺をヘマトキシリン・エオシン染色後、光学顕微鏡検査法によって解析し、あるいは、ＬＰＳのｉ．ｐ．注入、引き続いて指定ペプチド（０．５ｍｇ）又はバッファーで処理した２０時間後、走査電子顕微鏡検査法によって解析した。ペプチドＫＹＥ２８及びＫＹＥ２１での処理は、タンパク質及び赤血球の漏出をブロックした（ｎ＝３（双方のグループ）、そして代表的な肺断片を示す）。
【図３２】マウスにおけるシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）感染の速度論及びサイトカインに対する作用。  マウスにシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）を接種し、そしてＫＹＥ２８（０．５ｍｇ）を感染の１時間後にｓｃ投与した。（Ａ）指定臓器における細菌数を４、８、及び１２時間の期間後、解析した。（Ｂ）並行して、血液中の指定のサイトカインを解析した。
【図３３】シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）敗血症におけるＫＹＥ２８の治療有効性。  マウスにシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）を腹腔内接種し、そしてＫＹＥ２８を、細菌を接種した１時間、又は１時間及び７時間後にｓｃ投与した。（Ａ）指定臓器中の細菌数を１２時間後に解析した。（Ｂ）血小板、リンパ球、単球及び好中球に対する作用が示された。（Ｃ）並行して、血液中の指定のサイトカインを解析した。（Ｄ）マウスにシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）を接種し、そしてＫＹＥ２８を、細菌を接種した１時間、又は１時間及び７時間後にｓｃ投与し、動物の生存を登録した。ＫＹＥ２８の２回投与（感染の、１時間及び７時間後）によって死亡率が有意に減少した。
【図３４】ＮＬＦ２０の抗微生物活性。  （Ａ）ＲＤＡを用いる、ＮＬＦ２０の指定の微生物に対する抗微生物活性。抗微生物活性を決定するために、エッシェリヒア・コリ（E. coli）ATCC 25922、シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）ATCC 27853、スタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus ATCC）29213又はバチルス・サブチリス（B. subtilis）ATCC 6633 分離株（４×１０6ｃｆｕ）又はカンジダ・アルビカンス（C. albicans）ATCC 90028及びカンジダ・パラプシロシス（C. parapsilosis）ATCC 90018（１×１０5cfu）を、０．１％ ＴＳＢアガロースゲル中に接種した。それぞれ、４ｍｍ直径のウェルに６μｌのペプチド（１００μＭで）をローディングした。３７℃で１８〜２４時間インキュベーションした後、クリアランスゾーンがそれぞれのペプチドの抑制効果に相当する（平均値が提示される、ｎ＝３）。ＬＬ−３７が比較のために示されている。（Ｂ）生菌数アッセイにおけるＮＬＦ２０及びＬＬ−３７の、エッシェリヒア・コリ（E. coli）ATCC 25922、シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）ATCC 27853、及びスタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）ATCC 29213に対する抗微生物作用。２×１０6ｃｆｕ／ｍｌの細菌を［２×１０6ｃｆｕ／ｍｌ中、指定された濃度でのペプチドと共に、５０μｌ中でインキュベートした］、２０％ヒトクエン酸血漿（ＣＰ）を含んでいる、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４（バッファー）中、あるいは０．１５ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中、指定濃度でのペプチドと共に、５０μｌ中でインキュベートし（ｎ＝３、ＳＤは指定されている）、ｃｆｕを決定した。（Ｃ）２０％血漿を含んでいる０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中のＮＬＦ２０（３０μＭで）による時間依存的殺菌を指定された細菌を用いる生菌数アッセイによって解析した。
【図３５】細菌膜に対する作用。  （Ａ）エッシェリヒア・コリ（E. coli）に対するペプチドの透過性作用。細菌をＮＬＦ２０と共にインキュベートし、そして、透過性を、不透過性プローブＦＩＴＣを用いて評価した。（Ｂ）電子顕微鏡分析。シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）及びスタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）細菌を、３０μＭのＮＬＦ２０と共に、３７℃で２時間インキュベートし、そして逆染色法によって可視化した。ＬＬ−３７が比較のために示された。スケールバーは１μｍであった。コントロール；バッファーコントロール。
【図３６】構造とリポソームに対する作用。  （Ａ）マイナスに荷電されたリポソーム（ＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ）の存在下でのＮＬＦ２０のへリックス含量。へリックス含量は、リポソーム添加後増加した。（Ｂ）トリスバッファー中及びＬＰＳの存在下でのＮＬＦ２０のＣＤスペクトル。リポソームの場合の結果が比較のために示された。コントロールのために、バッファーとＬＰＳのみの場合のＣＤスペクトルも提示された。（Ｃ）リポソーム漏出に対する指定ペプチドの作用。膜透過性作用は、ＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ（マイナスに荷電されている）リポソームに起源するカルボキシフルオレセインの蛍光放出を測定することによって記録した。この実験は、１０ｍＭトリスバッファー中で行なわれた。値は３連のサンプルの平均に相当する。
【図３７】真核生物細胞に対する活性。  （Ａ）指定ペプチドの溶血作用。細胞を種々の濃度でこのペプチドと共に、インキュベートし、２％ トリトンＸ−１００（Sigma-Aldrich）をポジティブコントロールとして機能させた。ヘモグロビン放出の吸光度をλ５４０ｎｍで測定し、そしてトリトンＸ−１００で誘発された溶血の％として表現した（ｙ軸のスケールに留意する）。ＬＬ−３７の作用を比較のために示す。（Ｂ）ＨａＣａＴケラチノサイトをＮＬＦ２０又はＬＬ−３７に曝した。細胞の透過性作用をＬＤＨベースＴＯＸ−７キットによって測定した。細胞からのＬＤＨ放出は、λ４９０ｎｍでモニタリングし、そして全ＬＤＨ放出の％としてプロットした。（Ｃ）ＭＴＴアッセイを、ＮＬＦ２０又はＬＬ−３７の存在下（６０μＭで）で、ＨａＣａＴケラチノサイトの生存を測定するのに使用した。このアッセイでは、ＭＴＴは、代謝活性に関連する酵素によって、１つの色素、青色のホルマザンに変化する。色素の吸光度をλ５５０ｎｍで測定した。
【図３８】細菌によって感染されたヒト血液中のＮＬＦ２０の活性。  （Ａ）ヒト血液中（５０％（ＰＢＳ中）でなされた）の指定された細菌の存在下でのＮＬＦ２０の抗菌作用が提示された。指定微生物（２×１０8ｃｆｕ／ｍｌ）を５０％クエン酸血液に加え、引き続いて３０、６０又は１２０μＭでペプチドを添加した。ｃｆｕ数を、１時間にわたるインキュベーションの後に決定した。（Ｂ）同一の設定で、溶血作用が検討された。細菌を５０％クエン酸血液に加え、引き続いてペプチドを添加した。１時間後に溶血を評価した。ヘモグロビン放出の吸光度をλ５４０ｎｍで測定し、そしてトリトンＸ−１００で誘発された溶血の％として表現した（ｙ軸のスケールに留意する）。右端のパネルは、血液と共にインキュベートしたＮＬＦ２０のみでの作用を示す。
【図３９】侵襲的なシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）感染のＮＬＦ２０での処置  （Ａ）シュードモナス・エルギノーサ P. aeruginosa 15159 細菌（（ＰＢＳ中）、約２×１０4又は２×１０8ｃｆｕ／ｍｌ）を、注入するまで氷上に保持した。１００μｌの細菌懸濁液を、Ｃ５７／Ｂｌ６マウスに腹腔内（ｉｐ）に注入した。細菌注入の約１０分後に、０．５ｍｇのＮＬＦ２０又はＰＢＳのみをマウスにｉｐ注入した。肝臓、脾臓、及び腎臓を回収し、氷の上に置き、均一化し、そして注入の１２時間後にコロニー形成単位（ｃｆｕ）を決定した。（Ｂ）同様な感染モデル（２×１０8ｃｆｕ／ｍｌのシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa））において、３０分後の腹腔内（ｉｐ）投与が１時間後の皮下注入（ｓｃ）と比較された。０．５ｍｇのＮＬＦ２０を使用した。（Ｃ）ＮＬＦ２０は、シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）敗血症の間、有意に生存を増加させた。マウスにシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）を上記の通り腹腔内注入し、引き続いてＮＬＦ２０（５００μｇ）をｉｐ又はｓｃ投与した。生存を７日間にわたって追跡した。ｓｃ投与は生存を延長するのに対して、ｉｐ投与は、死亡率を有意に減少させた（ｎ＝コントロールの場合、ｎ＝処置動物の場合、Ｐ＜０．０００１（ｉｐ投与の場合））。（Ｄ）血中のＴＮＦ−α及びＩＬ−１０に対するＮＬＦ２０の作用が解析された。（Ｅ）血液中の栓球（血小板）が解析された。ＮＬＦ２０（ｉｐ及びｓｃ）での処置によって、血小板レベルが増加した。
【図４０】インビトロ及びインビボのＮＬＦ２０の抗炎症及び抗凝固作用。  （Ａ）ＮＬＦ２０は、ニトライトの産生を有意にブロックする。ＲＡＷ ２６４．７マクロファージを、１０ｎｇ／ｍｌのエッシェリヒア・コリ(E.coli）又はシュードモナス・エルギノーサ ＬＰＳで、指定濃度のＮＬＦ２０と一緒に刺激した。（Ｂ）（Ｂ）ＮＬＦ２０は、インビトロで活性化部分トロビン時間（ａＰＴＴ）を有意に延長した。凝固時間（clotting times）は、２０μＭのペプチドを加えないか（コントロール）、あるいは加えて決定した。活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）は、このペプチドを指定された濃度で、１分間クエン酸化ヒト血漿中でインキュベートし、引き続いて、３７℃で６０秒間にわたって１００μｌのａＰＴＴ試薬（aPTT Automate, Diagnostica Stago）を添加した。凝固はＣａＣｌ2溶液を添加することによって開始された。プロトロンビン時間アッセイ（ＰＴ）及びトロンビン凝固時間（ＴＣＴ）を図解している結果も提示されている。（Ｃ）Ｃ５７ＢＬ６マウスの敗血症性ショックは、１８ｍｇ／ｋｇのエッシェリヒア・コリ(E. coli）ＬＰＳを腹腔内注入することによって誘発された。ＮＬＦ２０（０．２又は０．５ｍｇ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４中））又はバッファーのみが投与された。ＮＬＦ２０処置では、コントロールマウスと比較して有意に生存が増加した（それぞれ、ｐ＜０．００１及び０．００３）。（Ｅ）体重が７日間にわたって追跡された。（Ｄ）ペプチド処置では、ＬＰＳによって誘発されたショックモデルにおける血小板の数が有意に増加した。別の実験では、マウスに、ＬＰＳを注入し、引き続いて、０．５ｍｇのＮＬＦ２０、又はバッファーを投与した。動物を８時間、２０時間の時点、及び７日後の生存動物を犠死させ、そして血液中の血小板の数（VetScanSystemを用いる）をカウントした。（Ｆ）ＮＬＦ２０（０．５ｍｇ）を投与すると、コントロールマウスと比較してサイトカイン応答が選択的にモジュレートされる。ＬＰＳ注入の８又は２０時間後に犠死した動物に起源する血液中のサイトカインを測定した。（Ｇ）ＮＬＦは肺の炎症を抑制する。肺をヘマトキシリン・エオシン染色後、光学顕微鏡検査法によって解析し、あるいは、ＬＰＳのｉ．ｐ．注入、引き続いてＮＬＦ２０（０．５ｍｇ）又はバッファーで処理した２０時間後、走査電子顕微鏡検査法によって解析した。ペプチドでの処理は、タンパク質及び赤血球の漏出（leakage）をブロックした（ｎ＝３（双方のグループ））、そして代表的な肺断片を示す）。
【図４１】ヘパリンコファクターIIのペプチドは、凝固をブロックする。  ＫＹＥ２８及びＮＬＦ２０は、正常ヒト血漿における凝固の内因系経路を弱め、このことは活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を測定することによって決定された。ＫＹＥ２１は、ａＰＴＴのわずかなブロッキングを示したに過ぎなかった。凝固システムの他の部分では、凝固の外因系経路をモニタリングするプロトロンビン時間（ＰＴ）、及びトロンビン誘発フィブリンネットワーク形成を測定するトロンビン凝固時間（ＴＣＴ）によって判断して、有意に影響が与えられなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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