(57)【要約】【課題】ＨＳＣ移植に使用される末梢血造血幹細胞動員剤を提供すること。【解決手段】本発明は、末梢血造血幹細胞を動員する薬物の生産における、コードネームＴＡ０１を有する飽和アミン化合物の使用を提供する。飽和アミン化合物は、末梢血において造血幹細胞を効果的に動員することができ、末梢血造血幹細胞を動員する薬物の研究及び開発において重要な役割を果たす。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血幹細胞移植のための末梢血造血幹細胞動員剤の生産における、飽和アミン化合物の使用。
【請求項２】
前記飽和アミン化合物が、式Ｉ：
【化１】
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（式中、Ｒ１＝Ｈ、ＣＨ３又はＣＨ２ＣＨ３であり、Ｒ２＝Ｈ、ＣＨ３又はＣＨ２ＣＨ３である）
によって表される化学式を有する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記飽和アミン化合物の前記式において、Ｒ１＝Ｒ２＝ＣＨ３であり、該化合物の名称がトリ（２−（ジメチルアミノ）エチル）アミンである、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記動員剤が注射剤の形態である、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記注射剤用の媒体が、ＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５〜８．５を有する）、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は滅菌蒸留水である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
末梢血におけるＣＤ３４＋細胞の百分率を増大させる薬剤の生産における、請求項２又は３に記載の化合物の使用。
【請求項７】
末梢血におけるＷＢＣの数を増大させる薬剤の生産における、請求項２又は３に記載の化合物の使用。
【請求項８】
末梢血における単核細胞によって産生されるＣＦＵ及び／又はＣＦＵ−ＧＭの数を増大させる薬剤の生産における、請求項２又は３に記載の化合物の使用。
【請求項９】
末梢血におけるＣＤ３４＋細胞の百分率、並びにＷＢＣの数、ＭＮＣによって産生されるＣＦＵ及びＣＦＵ−ＧＭの数を増大させる造血幹細胞動員剤の生産における、請求項２又は３に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、末梢血造血幹細胞動員剤の生産における、化合物、特に飽和アミン化合物（コード番号ＴＡ０１）の新たな使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
成体の骨髄（ＢＭ）は、血液細胞の再生のための場所である。骨髄は、幹細胞又は前駆細胞、例えば血管を形成する内皮前駆細胞、並びに脂肪細胞、軟骨細胞及び骨芽細胞に分化することができる間葉系幹細胞の貯蔵場所でもある。初期の研究によって、化学療法によって回復した患者の末梢血において造血前駆細胞が増加していることが示された。したがって、造血幹細胞及び造血前駆細胞をＢＭから出てくるように誘導することができることが認識された。このプロセスは幹細胞動員と呼ばれる。動員された細胞は、集合してＢＭに戻り、血液細胞を産生することができる。血液中に誘導されたこれらの造血細胞は、移植に使用することができる。幹細胞の誘導及び単離に関する最近の研究によって、造血幹細胞（ＨＳＣ）の定量研究及び定性研究並びに潜在的な機能、並びに末梢血ＨＳＣ移植の治療効率が現在熱心に研究されていることが示された。
【０００３】
末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）誘導に対する顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の効果
様々な因子が末梢血中に幹細胞を動員する能力を有しており、幹細胞動員を調節するメカニズムが複数存在することを示唆している。複数の因子の相乗作用の下で、或る特定数の幹細胞及び（又は）或る特定の特性を有する幹細胞を誘導して、移植することができる。Ｇ−ＣＳＦは、臨床幹細胞移植に適用される主要な誘導因子である。Ｇ−ＣＳＦは、ＢＭ幹細胞及び臍帯血幹細胞と比較してＰＢＳＣをより容易に誘導することができ、好中性顆粒球及び血小板をより迅速に回復させて血小板輸血の要求をより小さくすることができ、リンパ球再構成を促進することができ、関連する炎症発生率及び死亡率を低減させることができる。Ｇ−ＣＳＦと比較すると、化学的に誘導したＰＢＳＣの移植は、血液細胞の回復時間をより多く必要とし、発熱等の合併症をより多く誘導し、輸血をより多く必要とする。加えて、化学的に回収したＰＢＳＣは、同種移植に使用する際には既に不活性となっている。ＰＢＳＣ収集によって、ＢＭ収集に関する侵襲性手術及び通常の麻酔関連のリスクが回避される。移植片ペアリング及びＨＬＡマッチングのために、ＰＢＳＣの１つ〜３つの成分を排除することができ、ハプロ同一性（haploidentity）を確実なものとすることができる。Ｇ−ＣＳＦに基づく幹細胞移植は、脾臓破裂が時々起こるものの、良好な移植免疫寛容を示す。大抵のドナーは、移植に十分な幹細胞の収集を達成することができる。成功する移植におけるＰＢＳＣの移植量に関して最小閾値は存在しないが、２×１０６／ｋｇ未満のＣＤ３４＋細胞の輸注は、移植の失敗につながることがある。多数のＣＤ３４＋細胞は、急性／慢性の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発症率を増大させることを含む負の効果を有することがあるが、患者の生存率を増大させることを含む正の効果を有することもある。移植は、細胞サブタイプ、特にＴ細胞及びＣＤ１４＋単核細胞によって影響を受けることがある。移植は、ＰＢＳＣの質及び量の変動によって影響を受けることもある。
【０００４】
２５％の患者、特にリンパ腫、多発性骨髄腫及び急性白血病に罹患している患者、並びに１０％〜２０％の正常なドナーは、Ｇ−ＣＳＦにあまり応答しないため、より多くの成分を除去することが必要とされる。加えて、広範な治療を受けているがん患者、及びファンコニー貧血等の遺伝的欠陥に罹患している患者は、いずれもＧ−ＣＳＦにほとんど応答しない。再生不良性貧血を治療するためのＰＢＳＣ動員及び自己移植に関する最近の研究によって、Ｇ−ＣＳＦによるＰＢＳＣの収集はごく一部の患者にしか適用可能でなく、ドナーと患者との間に大きな個体差が存在することが示されている。特にペアリングした移植片を移植した重度の患者、寛容原性の臓器を移植した患者、及び非致死性遺伝的欠陥を有する患者における同種移植の適用を拡張するために、より多くの幹細胞が、永久的な幹細胞移植を達成するようにＨＬＡ障壁を克服するための、白血球（ＷＢＣ）の活性回復を促進するための、ＧＶＨＤの発症率を低減させるための動員に必要とされる。今日までに、ＨＳＣ移植は、白血病の主要な治療の１つとなっている。しかしながら、高額の治療費用が、白血病に罹患しているほとんどの患者の希望を奪っている。本発明者らの国においては、毎年４００００人〜５００００人の患者が白血病に罹患していると新たに診断されており、過去の累積でほぼ１００万人の患者がＨＳＣ移植療法を必要としている。しかしながら、ＨＳＣ移植のための３０００００ＲＭＢの費用は、一般家庭にとってあまりにも高額である。現在では、臨床的に幹細胞を収集する一般的な方法としては、Ｇ−ＣＳＦを使用してＢＭから末梢血中に造血幹細胞／造血前駆細胞を動員することによって、患者との血縁を有するドナーからＨＳＣを収集することが挙げられる。しかしながら、この方法のための手順は非常に複雑であり、移植のための量的要求を満たすために外科処置が必要とされることがある。これは、Ｇ−ＣＳＦが、ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１の相互作用を妨害する、メタロプロテアーゼの放出を誘導し、それにより幹細胞を最終的に動員することによって、造血幹細胞／造血前駆細胞を間接的に動員するためである。幹細胞ドナーは、４日間〜６日間、薬剤注射を受ける必要がある。その間、病院内における種々の部門及び専門家の協力も必要となる。
【０００５】
Ｇ−ＣＳＦは適用に成功しているが、依然として、明らかな臨床上のブレイクスルーを達成するために解決する必要がある多くの問題が存在し、該問題としては、幹細胞の用量、誘導の最適化、及び種々の患者の個体差、除去すべき成分、最良の動員時間、並びに移植部分に対する制御等が挙げられる。
【０００６】
ＢＭは、成体幹細胞の貯蔵所として組織修復に寄与することができる。問題は、動員剤がＨＳＣに加えて他の幹細胞を動員することができるかどうか、及び成体幹細胞を特異的に動員することができる新たな薬剤が存在するかどうかである。
【０００７】
飽和アミン化合物は、新種の医薬品中間体であり（非特許文献１）、小分子化合物ライブラリ内に挙げられている。飽和アミン化合物は、水素結合の受容体であり、水素結合及び特別な空間的部位を介してタンパク質及び炭水化物と相互作用する。飽和アミン化合物は、Ｔ細胞中へのＨＩＶウイルスの侵入、炎症、関節リウマチ、喘息、及び血管損傷等に対して適用されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Rozenbaum  W,  Antimoniotungstate  (HPA-23)  treatment  of  three  patients  with  AIDS  and  one  with  prodrome,  Lancet,1985,1:450-451
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、ＨＳＣ移植に使用される末梢血造血幹細胞動員剤の生産における、ＴＡ０１と称される飽和アミン化合物の新たな使用を提供する。
【００１０】
化合物ＴＡ０１は、式Ｉ：
【化１】
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（式中、Ｒ１＝Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３であり、Ｒ２＝Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３であり、好ましくは、Ｒ１＝Ｒ２＝ＣＨ３（すなわち、トリス［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミン）である）
によって表される構造式を有する。
【００１１】
具体的には、本発明は、末梢血におけるＣＤ３４＋細胞及び白血球を増加させること、並びに末梢血における単核細胞（ＭＮＣ）によって産生されるコロニー形成単位（ＣＦＵ）及び顆粒球マクロファージコロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）を増大させることによって末梢血中にＨＳＣを動員する際の、上記の化合物の使用を提供する。
【００１２】
本発明の動員剤は、注射剤の形態で使用することができる。
【００１３】
上記注射剤は、様々な媒体、例えばＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５〜８．５）、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は滅菌蒸留水等、好ましくはＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５〜８．５）を採用し得る。
【００１４】
必要に応じて、従来の希釈剤、吸収促進剤、界面活性剤等を含む１つ又は複数の薬学的に許容可能な担体を、上記の動員剤に添加することができる。
【００１５】
概して、上記の動員剤は１日当たり重量１ｋｇ当たり５ｍｇの投与量で使用され、治療の期間（course）は１日〜２日である。投与量及び治療の期間は、実際の病態に従って調整することができる。
【００１６】
本発明は、末梢血におけるＣＤ３４＋細胞の百分率、ＷＢＣの数、ＭＮＣによって産生されるＣＦＵ及び／又はＣＦＵ−ＧＭの数を増大させることができる薬剤の生産における、上記化合物の使用を更に含む。
【００１７】
本発明は、ＨＳＣ移植のための末梢血造血幹細胞動員剤の生産における、飽和アミン化合物ＴＡ０１の使用を提供する。実験によって、新種の動員剤であるこの化合物が、末梢血におけるＣＤ３４＋細胞の百分率及びＷＢＣの数を共に増大させることができ、かつ末梢血中にＨＳＣを効率的に動員することができることが示されている。ＴＡ０１は、大量のＨＳＣを動員することができ、ＰＢＳＣの収集はより簡便なものであり、これは麻酔が不要であり、複数の部位での穿刺及び骨髄吸引によって引き起こされる疼痛も防止される。部分骨髄侵入及び多発性骨髄腫に罹患している患者に対しては、骨の破壊、腫瘍細胞浸潤、骨盤放射線療法等のために骨髄を収集することができないので、ＰＢＳＣが収集され得る。造血は移植後迅速に回復し、感染症、出血を含む合併症は移植後稀にしか起こらず、抗生物質の適用及び成分輸血が低減され、移植に関連する死亡率が低下し、入院期間が短縮化され、費用が節約される。一方、骨髄と比較して末梢血中の腫瘍細胞の存在数はより小さく、これによって移植に伴うリスクが低下する。本発明は、末梢血中にＨＳＣを動員する薬剤の研究及び開発において重要な役割を果たすことができ、有望な適用の展望を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＴＡ０１の合成の概略的なフローチャートである。
【図２】ＴＡ０１がマウスの末梢血におけるＣＤ３４＋細胞の百分率を増大させることができるという結果を示す図である。
【図３】ＴＡ０１がマウスの末梢血におけるＷＢＣの数を増大させることができるという結果を示す図である。
【図４】ＴＡ０１がマウスの末梢血におけるＭＮＣによって産生されるＣＦＵ及びＣＦＵ−ＧＭの両方を増大させることができるという結果を示す図である。
【図５】ＴＡ０１によって動員される末梢血中のＭＮＣが、致死量の照射を受けたマウスの生存率を上昇させることができるという結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、造血幹細胞移植のための末梢血造血幹細胞動員剤の生産における、飽和アミン化合物ＴＡ０１の使用を提供する。造血幹細胞移植において、動員剤は、レシピエントにとって十分な造血幹細胞を産生するために造血幹細胞ドナーに供給されるものである。本発明は、末梢血中に造血幹細胞を主に動員する薬剤を提供する。本実施例の結果は、造血幹細胞移植における使用に限定されず、実験的要因と関連する他の考え得る疾患の治療、又は病理学的研究及び薬理学的研究に適用可能であることを理解する。
【００２０】
以下の実施例において使用される方法は、特に他の記載がない限り、従来の方法である。
【実施例】
【００２１】
実施例１：ＴＡ０１の合成
ＴＡ０１は、図１に示される手順に従って合成される。参考文献：（１）Mei  GQ,  An  Improved  Method  For  the  Preparation  of  β,β',β''-Triaminotriethylamine,  Journal  of  Gannan  Teachers  College,  2002,  3:  55-56、（２）Kimura  E,  et  al.,  Cleavage  of  amino  acid  esters  and  peptides  with  hydroxoaque  (2,2',2''-triaminotriethylamine)cobalt(III)ion,  Inorg.Chem,  1970,  9(5):  1187。この方法は具体的には、以下の工程を含む：
【００２２】
カリウムフタルイミド（Ｉ）の合成
１６００ｍｌの無水エタノールを入れた丸底フラスコに、８０．０ｇのフタルイミドを添加した。溶解していない原材料がごく小量となるまで、内容物を加熱し、０．５時間還流した。高温の溶液を３０．５ｇのＫＯＨ溶液（３０ｍｌのＨ２Ｏ＋９０ｍｌのエタノール）中に静かに移すと、直ぐに白色の沈殿が生成した。得られたものを冷却した後、ろ過し、エタノールを再利用した。２００ｍｌのアセトンで洗浄した後、生成物を、９８．０ｇの重量及び９８．０％の収率で得た。
【００２３】
Ｎ−β−ブロモエチル−フタルイミド（ＩＩ）の合成
１５０ｇのカリウムフタルイミド及び４５０ｇの１，２−ジブロモエタンを、撹拌器及び還流冷却管を備える丸底フラスコ中で混合した。丸底フラスコを油浴中、１８０℃〜１９０℃の温度で１２時間加熱した。引き続き、得られたものを減圧下で蒸留して、冷却管を用いて２９０ｇの重量を有する過剰の１，２−ジブロモエタンを再利用した。上記の得られた生成物（すなわち、粗Ｎ−β−ブロモエチル−フタルイミド及びＫＢｒの混合物）に３０ｍｌのエタノールを添加して、引き続き、黒色の油状物質が完全に溶解するまで０．５時間還流した。得られた混合物をろ過した後冷却し、ＫＢｒ沈殿を小量の高温のエタノールで洗浄した。ろ液を合わせて収集し、減圧下で蒸留してエタノールを除去した。
【００２４】
上記の乾燥残留物を、５００ｍｌのＣＳ２中に添加し、１５分間〜２０分間還流し、ろ過した後冷却した。ろ液を減圧下で蒸留してＣＳ２を除去し、７８℃〜８０℃の融点を有する１３１．０ｇのベージュ色の結晶を６３．６％の収率で得た。
【００２５】
β，β’，β’’−トリフタルイミドトリエチルアミン（ＩＩＩ）の合成
４６．０ｇの生成物（ＩＩ）を高温で融解し、１４０℃〜１５０℃に維持した。過剰の乾燥ＮＨ３を投入して、生成物（ＩＩ）と５時間〜８時間反応させた。４５０ｍｌのエタノールを上記の混合物に添加し、新たな混合物を加熱し、０．５時間還流した。ろ過した後、沈殿を高温のエタノール、引き続き小量の水で洗浄した。氷酢酸を再結晶化に使用して、１８７．５℃の融点を有する２５．２ｇの白色結晶を７８．０％の収率で得た。
【００２６】
β，β’，β’’−トリアミノトリエチルアミン塩酸塩（ＩＶ）の合成
５０ｍｌの濃ＨＣｌを２０．０ｇの生成物（ＩＩＩ）に液滴で添加し、混合物を１５０℃の温度で２時間反応させた。得られたものを、その体積が元の体積の半分となるまで濃縮し、引き続きろ過して、フタル酸沈殿を除去した。ろ液を、該ろ液の体積の４倍の体積を有する高温のエタノールで処理し、２４時間放置して、２８３℃の融点を有する８．０ｇの白色結晶を８４．０％の収率で沈殿させた。
【００２７】
β，β’，β’’−トリアミノトリエチルアミン（Ｖ）の合成
６．０ｇの生成物（ＩＶ）を、振動させながら２．６ｇのＫＯＨと均一に混合した（モル比１：２）。小量のＫ２ＣＯ３を添加してＨ２Ｏを吸収させ、それによって強い刺激臭を発するアミンを水相から分離した。引き続き、容器に栓をした。２４時間後、得られたものをろ過し、ろ液の２つの層を分離漏斗から収集した（アミンは上層の黄色がかった溶液中に存在していた）。上記溶液を減圧下で蒸留して、清澄で透明な液体を得た。液体を金属ナトリウムで乾燥させ、引き続き、減圧下で蒸留した。１３５℃／９ｍｍＨｇでの画分を収集して、１．６ｇの無色の濃厚な液体を４７．２％の収率で得た。
【００２８】
トリ（２−（ジメチルアミノ）エチル）アミン（Ｍｅ６ＴＲＥＮ）（ＶＩ）の合成
化合物ＶＩを、化合物Ｖのメチル化によって得た。
【００２９】
この合成した飽和アミン化合物がＭｅ６ＴＲＥＮであることを確認し、以下の実験において一例として使用した。この化合物は、他の公表済の文献に記載の方法によって合成することもできる。
【００３０】
本明細書に記載されていない、式Ｉによって表される他の化合物も、他の公表済の文献に記載の方法によって、又は上記の手順を参照して、幾つかの対応する基を変化させることによって合成することができる。
【００３１】
実施例２：ＴＡ０１は、末梢血におけるＣＤ３４＋細胞の百分率を増大させることができる。
９匹の雄性Ｃ５７マウス（実験動物センター、軍事医学科学院（Academy  of  Military  Medical  Sciences））を、無作為に３群に分割した：ＤＭＳＯ（Beijing  Chemical  Inc.）群（マウス３匹）、Ｇ−ＣＳＦ（Xiamen  Baote  Biotechnology  Inc.）群（マウス３匹）、ＴＡ０１群（マウス３匹）。注射剤の体積は、体重１ｋｇ当たり５ｍｇを基礎として算出し、注射剤用の媒体は、ＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５〜８．５）とした。皮下注射後４時間の時点で、１００μＬの血液を尾から採取し、ＲＢＣ溶解緩衝液（Jingmei  Biotechnology  Inc.）で処理した。ここで、血液のＲＢＣ溶解緩衝液に対する体積比は１：１０とした。上記２つのものを均一に混合し、室温で１０分間〜１５分間放置し、引き続き、１５００ｒｐｍ／分で６分間遠心分離した。上清を除去した後、１００ｕｌの１％（ｖ／ｖ）血清（Hyclone  Inc.）を添加し、混合した。引き続き、０．７５ｕｌの精製抗マウスＣＤ３４（Biolegend  Inc）を添加し（スーパークリーンベンチで操作した）、混合し、室温で１時間〜２時間インキュベートした。混合物に、１％（ｖ／ｖ）血清を含有するＰＢＳを添加して１．５ｍｌとし、引き続き、１５００ｒｐｍ／分で５分間遠心分離した。上清を除去した後、１００ｕｌの１％（ｖ／ｖ）血清を添加し、混合した。引き続き、２ｕｌのＦＩＴＣで標識したヤギ抗マウス抗体（Beijing  Zhongshanjinqiao  Biotechnology  Limited  Co.）を添加し、混合し、室温で３０分間インキュベートした。混合物に、１％（ｖ／ｖ）血清を含有するＰＢＳを添加して１．５ｍｌとし、引き続き、１５００ｒｐｍ／分で５分間遠心分離した。上清を除去した後、５００ｕｌの１％（ｖ／ｖ）血清を添加し、混合した。混合物を、フローサイトメトリーによってアッセイした。ＴＡ０１がＤＭＳＯ及びＧ−ＣＳＦと比較して末梢血におけるＣＤ３４＋細胞の百分率を増大させることができることを、図２に示される結果から理解することができる。
【００３２】
実施例３：ＴＡ０１は、末梢血におけるＷＢＣの数を増大させることができる。
９匹の雄性Ｃ５７マウスを、無作為に３群に分割した：ＤＭＳＯ群（マウス３匹）、Ｇ−ＣＳＦ群（マウス３匹）、及びＴＡ０１群（マウス３匹）。注射剤の体積は、体重１ｋｇ当たり５ｍｇを基礎として算出し、注射剤用の媒体は、ＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５〜８．５）とした。皮下注射後４時間の時点で、１０μｌの血液を尾から採取し、２ｍｌの細胞希釈緩衝液（Jinnan  Bolai  Biotechnology  Limited  Co.）で処理した。ＷＢＣの数を、Ｓｙｓｍｅｘ  Ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒによって決定した。ＴＡ０１がＤＭＳＯ及びＧ−ＣＳＦと比較して末梢血におけるＷＢＣの数を増大させることができることを、結果（図３に示される。＊は、ＤＭＳＯ群と比較して有意差が存在したことを表す）から理解することができる。
【００３３】
実施例４：ＴＡ０１は、マウスの末梢血におけるＭＮＣによって産生されるＣＦＵ及びＣＦＵ−ＧＭ（顆粒球マクロファージコロニー形成単位）の両方の数を増大させることができる。
９匹の雄性Ｃ５７マウスを、無作為に３群に分割した：ＤＭＳＯ群（マウス３匹）、Ｇ−ＣＳＦ群（マウス３匹）、ＴＡ０１群（マウス３匹）。注射剤の体積は、体重１ｋｇ当たり５ｍｇを基礎として算出し、注射剤用の媒体は、ＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５〜８．５）とした。皮下注射後４時間の時点で、眼球を取り出し、予めヘパリン（Tianjin  Haoyang  Bioproduct  Technology  Limited  Co.）でリンスした１０ｍｌ遠心管中に末梢血を収集し、引き続き、ＰＢＳ（Hyclone  Inc.）を添加して５ｍｌとし、混合した。マウスパーコール液（Tianjin  Haoyang  Bioproduct  Technology  Limited  Co.）を、５ｍｌ／バイアルでバイアル中に予め入れておき（スーパークリーンベンチで操作した）、引き続き、ＰＢＳと混合した血液を、パーコール液の上層中に僅かに含浸させ、２０００ｒｐｍ／分で２０分間遠心分離した。中間層の細胞を、１０ｍｌまでＰＢＳを満たした新たな１０ｍｌ遠心管中に移し、１５００ｒｐｍ／分で５分間遠心分離して、上清中のＰＢＳを除去した。該遠心管を、１０ｍｌまでＰＢＳで満たし、１５００ｒｐｍ／分で更に５分間遠心分離して、上清中のＰＢＳを除去した。引き続き、該遠心管を、１ｍｌまでＰＢＳで満たした。引き続き、細胞の数を計測し、溶液１ｍｌ当たりの単核細胞（ＭＮＣ）の数を算出した。引き続き、得られたものを、５００μｌの半固体の媒体（成分：０．９％  メチルセルロース、１５％  ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン／ストレプトマイシン、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  グルタミン、２ｍＭ  ＰＦＨＭＩＩ、２００μｇ／ｍｌ  トランスフェリン、１％  ＢＳＡ、０．４５ｍＭ  ＭＴＧ、３０％  ＩＭＤＭ、５０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１１、１０ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ、３Ｕ／ｍｌ  ＥＰＯ）と混合し、５％  ＣＯ２を含む３７℃のインキュベーター中において７日間培養した。最後に、ＣＦＵ及びＣＦＵ−ＧＭを計測した。ＴＡ０１がＤＭＳＯ及びＧ−ＣＳＦと比較してマウスの末梢血におけるＭＮＣによって産生されるＣＦＵ及びＣＦＵ−ＧＭの両方の数を増大させることができることを、図４に示される結果から理解することができる（*は、ＤＭＳＯ群と比較して有意差が存在したことを表す）。
【００３４】
実施例５：ＴＡ０１によって動員される末梢血中のＭＮＣは、致死量の照射を受けたマウスの生存率を増大させることができる。
９匹の雄性Ｃ５７マウスを、無作為に３群に分割し、引き続き、２．７２Ｇｙ／分、７．０Ｇｙの量で６０Ｃｏγ線による全身照射を行った。９匹の雄性Ｃ５７マウスを、無作為に３群に分割した：ＤＭＳＯ群（マウス３匹）、Ｇ−ＣＳＦ群（マウス３匹）、ＴＡ０１群（マウス３匹）。注射剤の体積は、体重１ｋｇ当たり５ｍｇを基礎として算出し、注射剤用の媒体は、ＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５〜８．５）とした。皮下注射後４時間の時点で、眼球を取り出し、予めヘパリンでリンスした１０ｍｌ遠心管中に末梢血を収集し、引き続き、ＰＢＳを添加して５ｍｌとし、混合した。マウスパーコール液（Tianjin  Haoyang  Bioproduct  Technology  Limited  Co.）を、５ｍｌ／バイアルでバイアル中に予め入れておき（スーパークリーンベンチで操作した）、引き続き、ＰＢＳと混合した血液を、パーコール液の上層中に僅かに含浸させ、２０００ｒｐｍ／分で２０分間遠心分離した。中間層の細胞を、１０ｍｌまでＰＢＳを満たした新たな１０ｍｌ遠心管中に移し、１５００ｒｐｍ／分で５分間遠心分離して、上清中のＰＢＳを除去した。該遠心管を、１０ｍｌまでＰＢＳで満たし、１５００ｒｐｍ／分で更に５分間遠心分離して、上清中のＰＢＳを除去した。引き続き、該遠心管を、０．５ｍｌまでＰＢＳで満たした。引き続き、得られたＭＮＣを、尾静脈注射によって、致死量の照射を受けたマウスに注射した。３０日内の生存マウスの数を計測した。致死量の照射を受けたマウスの生存率を、ＴＡ０１によって動員される末梢血中のＭＮＣを注射することによって、ＤＭＳＯ及びＧ−ＣＳＦと比較して増大させることができることを、図５に示される結果から理解することができる。
【００３５】
トリ（２−（ジメチルアミノ）エチル）アミンを一例として用いる上記の実験によって、式Ｉによって表される化合物が末梢血中に造血幹細胞を効率的に動員することができることが実証された。本発明は、式Ｉによって表される他の化合物が同様の効果をもたらすことも確認した（その確認のプロセスは、本明細書には記載していない）。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は、造血幹細胞移植のための末梢血造血幹細胞動員剤の生産における、飽和アミン化合物ＴＡ０１の新たな使用を提供する。実験によって、この化合物が、末梢血中に造血幹細胞を効率的に動員することができ、新種の造血幹細胞動員剤であることが示されている。本発明は、末梢血中に造血幹細胞を動員する動員剤の研究及び開発において重要な役割を果たすことができ、有望な適用の展望を示す。
【図１】
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【図４】
2013512932.tif 000006
【図５】
2013512932.tif 000007
【図２】
2013512932.tif 000008
【図３】
2013512932.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成24年10月15日(2012.10.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
飽和アミン化合物を含む、末梢血造血幹細胞動員剤。
【請求項２】
前記飽和アミン化合物が、式Ｉ：
【化１】
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（式中、Ｒ１＝Ｈ、ＣＨ３又はＣＨ２ＣＨ３であり、Ｒ２＝Ｈ、ＣＨ３又はＣＨ２ＣＨ３である）
によって表される化学式を有する、請求項１に記載の末梢血造血幹細胞動員剤。
【請求項３】
前記飽和アミン化合物の前記式において、Ｒ１＝Ｒ２＝ＣＨ３であり、該化合物の名称がトリ（２−（ジメチルアミノ）エチル）アミンである、請求項２に記載の末梢血造血幹細胞動員剤。
【請求項４】
注射剤の形態である、請求項１から３のいずれかに記載の末梢血造血幹細胞動員剤。
【請求項５】
前記注射剤用の媒体が、ＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５〜８．５を有する）、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は滅菌蒸留水である、請求項４に記載の末梢血造血幹細胞動員剤。
【請求項６】
末梢血におけるＣＤ３４＋細胞の百分率を増大させる薬剤である、請求項２から５のいずれかに記載の末梢血造血幹細胞動員剤。
【請求項７】
末梢血におけるＷＢＣの数を増大させる薬剤である、請求項２から５のいずれかに記載の末梢血造血幹細胞動員剤。
【請求項８】
末梢血における単核細胞によって産生されるＣＦＵ及び／又はＣＦＵ−ＧＭの数を増大させる薬剤である、請求項２から５のいずれかに記載の末梢血造血幹細胞動員剤。
【請求項９】
末梢血におけるＣＤ３４＋細胞の百分率、並びにＷＢＣの数、ＭＮＣによって産生されるＣＦＵ及びＣＦＵ−ＧＭの数を増大させる造血幹細胞動員剤である、請求項２から５のいずれかに記載の末梢血造血幹細胞動員剤。
【国際調査報告】
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