(57)【要約】  本発明は、被験者から得られる生体試料中に存在するバイオマーカー又はバイオマーカー群のレベルを測定することによる、２,２-ジメチル-Ｎ-((Ｓ)-６-オキソ-６,７-ジヒドロ-５Ｈ-ジベンゾ[ｂ,ｄ]アゼピン-７-イル)-Ｎ'-(２,２,３,３,３-ペンタフルオロ-プロピル)-マロンアミドを用いた治療に対する被験者の耐性を判定する方法であって、該バイオマーカーがＩＬ６又はＩＬ８である方法に関する。本発明はまた患者に２,２-ジメチル-Ｎ-((Ｓ)-６-オキソ-６,７-ジヒドロ-５Ｈ-ジベンゾ[ｂ,ｄ]アゼピン-７-イル)-Ｎ'-(２,２,３,３,３-ペンタフルオロ-プロピル)-マロンアミドと抗ＩＬ６及び／又は抗ＩＬ８を投与することを含む増殖性疾患に罹患した患者のための併用療法にも関する。
2013527454.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物２,２-ジメチル-Ｎ-((Ｓ)-６-オキソ-６,７-ジヒドロ-５Ｈ-ジベンゾ[ｂ,ｄ]アゼピン-７-イル)-Ｎ'-(２,２,３,３,３-ペンタフルオロ-プロピル)-マロンアミドを用いた治療に対する被験者の耐性を判定する方法であって、前記被験者から得られる生体試料中に存在するバイオマーカーのレベルを測定することを含み、該バイオマーカーがＩＬ６又はＩＬ８である方法。
【請求項２】
前記被験者が哺乳動物である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被験者がヒトである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記バイオマーカーがＩＬ６である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記バイオマーカーがＩＬ８である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＩＬ６及びＩＬ８の双方のレベルが測定される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記生体試料が血液である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記生体試料が血清である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記生体試料が尿である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記バイオマーカーが、前記試料中に存在するタンパク質の量を測定することにより測定される請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記バイオマーカーが、該バイオマーカーをコードするｍＲＮＡのレベルを測定することにより測定される請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記試料中に存在するバイオマーカーのレベルを、該バイオマーカーの閾値レベルと比較し、大きいならば、前記被験者は、２,２-ジメチル-Ｎ-((Ｓ)-６-オキソ-６,７-ジヒドロ-５Ｈ-ジベンゾ[ｂ,ｄ]アゼピン-７-イル)-Ｎ'-(２,２,３,３,３-ペンタフルオロ-プロピル)-マロンアミドを用いた治療に対してインビボ耐性を有していると考えられる請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記バイオマーカーがＩＬ６であり、ＩＬ６に対する前記閾値レベルが約５００ｐｇ／ｍｌである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記バイオマーカーがＩＬ８であり、ＩＬ８に対する前記閾値レベルが約５０ｐｇ／ｍｌである請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
化合物２,２-ジメチル-Ｎ-((Ｓ)-６-オキソ-６,７-ジヒドロ-５Ｈ-ジベンゾ[ｂ,ｄ]アゼピン-７-イル)-Ｎ'-(２,２,３,３,３-ペンタフルオロ-プロピル)-マロンアミドを用いた治療に対する被験者の耐性の判定の補助に使用されるキットであって、被験者から得られる生体試料中における、ＩＬ６又はＩＬ８であるバイオマーカーを検出するための薬剤を含むキット。
【請求項１６】
医薬、特に癌等の増殖性疾患の治療に使用される医薬として使用される、（Ａ）化合物Ｉ；及び（Ｂ）抗ＩＬ６及び／又は抗ＩＬ８剤の逐次の又は同時の組合せ。
【請求項１７】
前記組合せが抗ＩＬ６剤及び抗ＩＬ８剤の双方を含む請求項１６に記載の組合せ。
【請求項１８】
前記抗ＩＬ６剤が抗ＩＬ６抗体である請求項１６又は１７に記載の組合せ。
【請求項１９】
前記抗ＩＬ８剤が抗ＩＬ８抗体である請求項１６又は１７に記載の組合せ。
【請求項２０】
前記抗ＩＬ６剤が、ＩＬ６をコードする核酸の発現に干渉する核酸である請求項１６から１８のいずれか一項に記載の組合せ。
【請求項２１】
ＩＬ６をコードする核酸の発現に干渉する前記核酸がアンチセンスＲＮＡである請求項２０に記載の組合せ。
【請求項２２】
ＩＬ６をコードする核酸の発現に干渉する前記核酸がｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡである請求項２０に記載の組合せ。
【請求項２３】
前記抗ＩＬ８剤が、ＩＬ８をコードする核酸の発現に干渉する核酸である請求項１６、１７又は１９のいずれか一項に記載の組合せ。
【請求項２４】
ＩＬ８をコードする核酸の発現に干渉する前記核酸がアンチセンスＲＮＡである請求項２３に記載の組合せ。
【請求項２５】
ＩＬ８をコードする核酸の発現に干渉する前記核酸がｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡである請求項２３に記載の組合せ。
【請求項２６】
（Ａ）化合物Ｉ；及び（Ｂ）抗ＩＬ６及び／又は抗ＩＬ８剤を含むキット。
【請求項２７】
増殖性疾患、特に癌の治療のための医薬の製造のための、（Ａ）化合物Ｉ；及び（Ｂ）抗ＩＬ６及び／又は抗ＩＬ８剤の組合せの使用。
【請求項２８】
実質的にここに記載された新規方法、組合せ、使用及びキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２,２-ジメチル-Ｎ-((Ｓ)-６-オキソ-６,７-ジヒドロ-５Ｈ-ジベンゾ[ｂ,ｄ]アゼピン-７-イル)-Ｎ'-(２,２,３,３,３-ペンタフルオロ-プロピル)-マロンアミドを用いた治療に対する被験者の耐性を判定するための方法及びキットに関する。また本発明は、２,２-ジメチル-Ｎ-((Ｓ)-６-オキソ-６,７-ジヒドロ-５Ｈ-ジベンゾ[ｂ,ｄ]アゼピン-７-イル)-Ｎ'-(２,２,３,３,３-ペンタフルオロ-プロピル)-マロンアミドと、抗ＩＬ６剤及び抗ＩＬ-８剤の少なくとも一つを投与することを含む増殖性疾患に罹患した患者を治療するための併用療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｎｏｔｃｈタンパク質は、遺伝子発現の調節に役割を有する哺乳動物を含むほとんどの生物に存在している膜貫通タンパク質である。Ｎｏｔｃｈの細胞外ドメインへリガンドが結合すると、Ｎｏｔｃｈタンパク質は、腫瘍壊死因子アルファ転換酵素（ＴＡＣＥ）によって膜の丁度外側で切断され、リガンドと相互作用したまま残る細胞外ドメインが切り離される。ついで、ガンマ-セクレターゼが、膜の丁度内側でタンパク質を切断し、細胞内ドメイン（活性細胞内Ｎｏｔｃｈ又は「ＩＣＮ」として知られている）が放出される。ＩＣＮは細胞核に転位置し、転写因子ＣＳＬを活性化させ、よって遺伝子転写を誘導する。
【０００３】
欠陥のあるＮｏｔｃｈシグナル伝達が、増殖性疾患を含む様々な疾患に関係している。而して、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の阻害は、腫瘍学において多大な興味のある領域である。ガンマ-セクレターゼ阻害は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路をブロックし、よってガンマ-セクレターゼインヒビターが抗増殖活性を有する。
【０００４】
２,２-ジメチル-Ｎ-((Ｓ)-６-オキソ-６,７-ジヒドロ-５Ｈ-ジベンゾ[ｂ,ｄ]アゼピン-７-イル)-Ｎ'-(２,２,３,３,３-ペンタフルオロ-プロピル)-マロンアミド（ここでは「化合物Ｉ」とも称す）は、腫瘍細胞におけるＮｏｔｃｈシグナル伝達を阻害するガンマ-セクレターゼの強力な選択的阻害剤である。化合物Ｉを用いて処置された異種移植片が、化合物Ｉの腫瘍血管新生を阻害する能力と一致して、血管新生に関連した遺伝子の発現低減を示すことは知られている。Luistroら, Cancer Research, 69:7672-80 (2009)。興味深いことに、これらの研究は、Ｈ４６０ａ異種移植に対する血管新生遺伝子プロファイルにほとんど変化がないことを示している。
【０００５】
インターロイキン-６（ＩＬ６）及びインターロイキン-８（ＩＬ８）は、感染及び免疫、炎症、自己免疫疾患、及び癌などの多様な疾患において重要な役割を担っている強力なサイトカインである。本出願人は、ＩＬ６及びＩＬ８のそれぞれの発現の上昇が、化合物Ｉでの治療に対して耐性を付与することを見出した。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、被験者から得られた生体試料中に存在するバイオマーカーのレベルを測定することを含む、２,２-ジメチル-Ｎ-((Ｓ)-６-オキソ-６,７-ジヒドロ-５Ｈ-ジベンゾ[ｂ,ｄ]アゼピン-７-イル)-Ｎ'-(２,２,３,３,３-ペンタフルオロ-プロピル)-マロンアミドを用いた治療に対する被験者の耐性を判定する方法に関し、該バイオマーカーはＩＬ６又はＩＬ８である。
【０００７】
また、本発明は、２,２-ジメチル-Ｎ-((Ｓ)-６-オキソ-６,７-ジヒドロ-５Ｈ-ジベンゾ[ｂ,ｄ]アゼピン-７-イル)-Ｎ'-(２,２,３,３,３-ペンタフルオロ-プロピル)-マロンアミドを用いた治療に対する被験者の耐性の判定の補助に使用されるキットに関し、該キットは、ＩＬ６又はＩＬ８であるバイオマーカーを検出するための薬剤を含む。
【０００８】
さらに、本発明は、患者に（Ａ）化合物Ｉ；及び（Ｂ）抗ＩＬ６又は抗ＩＬ８剤を投与することを含む、増殖性疾患に罹患している患者を治療する方法に関する。
【０００９】
本発明は、さらに、医薬として、特に癌等の増殖性疾患、中でも固形腫瘍、より特定的には乳腺腫瘍、結腸直腸腫瘍、肺腫瘍、及び前立腺腫瘍の治療に使用される医薬としての、（Ａ）化合物Ｉ；及び（Ｂ）抗ＩＬ６及び／又は抗ＩＬ８剤の逐次の又は同時の併用に関する。
【００１０】
本発明のさらなる態様は、（Ａ）化合物Ｉ；及び（Ｂ）抗ＩＬ６又は抗ＩＬ８剤を含むキットである。
【００１１】
またさらなる態様では、本発明は、癌等の増殖性疾患、特に固形腫瘍、より特定的には乳腺腫瘍、結腸直腸腫瘍、肺腫瘍、及び前立腺腫瘍を治療する医薬の製造のための、（Ａ）化合物Ｉ；及び（Ｂ）抗ＩＬ６及び／又は抗ＩＬ８剤の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ＮＣＩ-Ｈ４６０ａ及びＡ５４９細胞株で実施されるサイトカインアレイアッセイの結果を示す。
【図２】図２は、ＥＬＩＳＡを使用して様々な細胞株から測定された分泌ＩＬ６及びＩＬ８の量を示す。
【図３】図３は、ｑＲＴ-ＰＣＲを使用して様々な細胞株から測定された、ＩＬ６及びＩＬ８をコードするｍＲＮＡの量を示す。
【図４】図４は、ＥＬＩＳＡを使用して、Ｈ４６０ａ細胞、Ａ５４９親細胞、Ａ５４９コントロール細胞、Ａ５４９ ＩＬ６過剰発現細胞、及びＡ５４９ ＩＬ８過剰発現細胞から測定された、分泌ＩＬ６及びＩＬ８の量を示す。
【図５】図５は、Ｈ４６０ａ細胞、Ａ５４９親細胞、Ａ５４９コントロール細胞、Ａ５４９ ＩＬ６過剰発現細胞、Ａ５４９ ＩＬ８過剰発現細胞、及びＡ５４９ ＩＬ６過剰発現細胞とＡ５４９ ＩＬ８過剰発現細胞の１：１混合物を受容した異種移植モデルでの腫瘍増殖に対する化合物Ｉを用いた治療の効果とタキソール(Taxol)(登録商標)を用いた治療の効果を示す。
【図６】図６は、親Ｈ４６０ａ細胞、コントロールベクターを受容したＨ４６０ａ細胞、及びＩＬ８-ノックダウンＨ４６０ａ細胞から測定された、分泌ＩＬ８の量及びＩＬ８をコードするｍＲＮＡの量を示す。
【図７】図７は、Ｈ４６０ａ及びＩＬ-８ノックダウンＨ４６０ａ異種移植モデルにおいて測定された、化合物Ｉ処置の腫瘍増殖に対する効果を示す。
【図８】図８は、化合物Ｉを用いた治療、抗ＩＬ８抗体を用いた治療、及び化合物ＩとＩＬ-８抗体を用いた併用療法の、Ｈ４６０ａ異種移植モデルにおける腫瘍増殖に対する効果を示す。
【図９】図９は、化合物Ｉを用いた治療、抗ＩＬ６抗体を用いた治療、及び化合物ＩとＩＬ-６抗体を用いた併用療法の、Ｈ４６０ａ異種移植モデルにおける腫瘍増殖に対する効果を示す。
【図１０】図１０は、ｑＲＴ-ＰＣＲを使用して測定された、様々な細胞株におけるＩＬ６及びＩＬ８をコードするｍＲＮＡのレベルを示す。
【図１１】図１１は、ＥＬＩＳＡを使用して測定された、様々な細胞株により分泌されたＩＬ６及びＩＬ８のレベルを示す。
【図１２】図１２は、化合物Ｉを用いた治療後の、Ｕ８７ＭＧ及びＬＯＸ細胞における、ＨｅｓＩ ｍＲＮＡのダウンレギュレーションを示す。
【図１３】図１３は、Ｕ８７ＭＧ及びＬＯＸ細胞における腫瘍増殖に対する化合物Ｉでの治療の効果を示す。
【図１４】図１４は、Ｈ４６０ａ細胞、化合物Ｉを用いて処置されたＨ４６０ａ細胞、ＩＬ８-ノックダウンＨ４６０ａ細胞、化合物Ｉを用いて処置されたＩＬ８-ノックダウンＨ４６０ａ細胞、Ｕ８７ＭＧ細胞、及び化合物Ｉを用いて処置されたＵ８７ＭＧ細胞における、ＥＬＩＳＡを使用して測定された、分泌ＩＬ６及びＩＬ８の量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
特に他の定義を述べない限り、明細書及び特許請求の範囲を含むこの出願で使用される次の用語は、以下に付与する定義を有する。明細書及び添付の特許請求の範囲に使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他の意味を示すものでなければ、複数の指示対象を含むことに留意されなければならない。
【００１４】
ここで使用される場合、「化合物Ｉ」は、ガンマ-セクレターゼ阻害剤として有用な２,２-ジメチル-Ｎ-((Ｓ)-６-オキソ-６,７-ジヒドロ-５Ｈ-ジベンゾ[ｂ,ｄ]アゼピン-７-イル)-Ｎ'-(２,２,３,３,３-ペンタフルオロ-プロピル)-マロンアミドを意味する。化合物Ｉは次の構造を有している。
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【００１５】
「バイオマーカー」なる用語は、生物学的状態の指標となる客観的に測定可能な実体を意味する。
【００１６】
「生体試料」なる用語は、バイオマーカーが測定され得る被験者から得られた部分（例えば、血液、血清、組織、痰、尿、唾液）を意味する。
【００１７】
バイオマーカーに関連した「レベル」なる用語は、存在しているバイオマーカーの濃度、活性、発現レベル、又は量の測定値を意味する。レベルは、例えば、試料中に存在するバイオマーカーの濃度又は質量を測定することにより、又は例えば、関連する細胞集団又は組織において発現されるバイオマーカーをコードするｍＲＮＡの量を測定することにより、定量的に測定することができる。あるいは、レベルは、例えば、設定された閾値レベルより多い又は少ないとして、より定性的に測定することもできる。閾値レベルは、健常な被験者のバイオマーカーの平均又は中央値レベルに対応し得、又は疾患の診断がなされるレベルに対応しうる。バイオマーカーは、測定されるレベルが設定された閾値レベルを越える場合に「上昇したレベル」で存在していると言われる。
【００１８】
「被験者」は哺乳動物及び鳥を含む。「哺乳動物」は、限定されるものではないが、ヒト；非ヒト霊長類、例えばチンパンジー及び他の類人猿及びサル種；家畜、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、及びブタ；飼育動物、例えばウサギ、イヌ、及びネコ；齧歯類を含む実験動物、例えばラット、マウス、及びモルモット等々を含む哺乳類クラスの任意のメンバーを意味する。「被験者」なる用語は、特定の年齢又は性別を示すものではない。
【００１９】
ここで使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」なる用語は、示された担体が、合理的に賢明な医療従事者が、治療されるべき疾患又は症状、及びそれぞれの投与経路を考慮し、患者へのその投与を避ける原因となり得る特性を有していないことを示す。
【００２０】
ここで使用される場合、「治療的有効量」なる用語は、患者への投与の際に、所望される治療効果を生じせしめ、例えば癌性腫瘍の増殖をくい止め、癌性腫瘍の収縮を生じせしめ、又は患者の寿命を延ばすのに効果的な化合物又はその組合せ又は組成物の量を意味する。
【００２１】
「細胞増殖性疾患」及び「増殖性疾患」なる用語は、ある程度の異常な細胞増殖に関連した疾患を意味する。一実施態様では、増殖性疾患は癌である。
【００２２】
「癌」及び「癌性」なる用語は、典型的には調節されない細胞成長／増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態を意味するか記述する。癌の例は、限定されるものではないが、結腸直腸癌、メラノーマ、及び甲状腺癌を含む。
【００２３】
「細胞成長又は増殖を阻害」とは、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％、細胞成長又は増殖を低減させることを意味し、細胞死の誘導を含む。
【００２４】
ここで使用される「実質的に低減」又は「実質的に異なる」なる語句は、当業者が、２つの値の間の差が、該値によって測定される生物学的特徴の内容において統計的に有意であると考える程の、２つの数値（一般的には、一方は分子に関連し、他方は参照／比較分子に関連）の間の十分に高度な差異を意味する。
【００２５】
「腫瘍」なる用語は、悪性か良性かにかかわらず、全ての新生物細胞成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。「癌」、「癌性」、「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」及び「腫瘍」なる用語は、ここで言及される場合は相互に排他的ではない。
【００２６】
耐性の測定方法
本発明は、部分的には、２,２-ジメチル-Ｎ-((Ｓ)-６-オキソ-６,７-ジヒドロ-５Ｈ-ジベンゾ[ｂ,ｄ]アゼピン-７-イル)-Ｎ'-(２,２,３,３,３-ペンタフルオロ-プロピル)-マロンアミド（ここでは、「化合物Ｉ」とも称される）を用いた治療に対する被験者の耐性を判定する方法であって、前記被験者から得られる生体試料中に存在するバイオマーカーのレベルを測定することを含む方法に関し、前記バイオマーカーはＩＬ６又はＩＬ８である。
【００２７】
本発明の一実施態様では、前記試料中に存在するバイオマーカーのレベルは、該バイオマーカーの閾値レベルと比較され、大きいならば、前記被験者は、化合物Ｉを用いた治療に対してインビボ耐性を有していると考えられる。特許請求の範囲を含むここでの目的に対して、「インビボ耐性」とは、化合物Ｉを用いた治療の低減したインビボ有効性を意味する。
【００２８】
本発明の実施態様では、バイオマーカーはＩＬ６であり、ＩＬ６に対する前記閾値レベルは約５００ｐｇ／ｍｌである。
本発明の実施態様では、バイオマーカーはＩＬ８であり、ＩＬ８に対する前記閾値レベルは約５００ｐｇ／ｍｌである。
バイオマーカーのレベルは、タンパク質自体、又はそのそれぞれのｍＲＮＡの量に基づいて測定することができる。
【００２９】
タンパク質は、物理的／化学的技術、例えばゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、質量分析、及びプロテオミクス技術；イムノアッセイ技術、例えばＥＬＩＳＡ、競合アッセイ、サンドイッチアッセイ等；及び生物活性（例えば、リガンド及び／又は酵素として）のアッセイにより、ツーハイブリッドアッセイ系を介し、当該技術分野で知られている方法で生体試料中の活性を測定することにより、直接測定することができる。商業的アッセイは上述したバイオマーカーの多く又は殆どで利用可能であるか、又は当該技術に記載されている。適切な生体試料には、血液、血清、尿等が含まれる。
【００３０】
また、上述したタンパク質バイオマーカーに相当する、ｍＲＮＡのレベルを測定することも可能である。ｍＲＮＡ転写レベルの測定は、限定されるものではないが、ノーザンブロット；マイクロアレイ技術；ＲＴ-ＰＣＲ、ｑＲＴ-ＰＣＲ及び他の定量的及び半定量的ＤＮＡ及びｍＲＮＡ増幅方法等を含む、任意の適切な定量的又は半定量的方法を使用して実施することができる。例えば、ＲＴ-ＰＣＲを実施するためには、生体試料から全ＲＮＡを抽出し、デオキシリボヌクレアーゼ１で処理し、逆転写酵素、例えばマルチスクライブ(Multiscribe)逆転写酵素(Applied Biosystems Inc., Foster City, Calif.)を使用し、ｃＤＮＡに転換させることができる。ついで、テンプレートとして、ｃＤＮＡを使用し、ｃＤＮＡ「ＳＹＢＲグリーン」のリアルタイム定量ＰＣＲアッセイを実施し、ABI PRISM 7900配列検出器を使用して分析することができる。
【００３１】
本発明の一実施態様では、被験者は哺乳動物、例えばヒトである。
【００３２】
本発明の一実施態様では、測定されるバイオマーカーはＩＬ６である。
【００３３】
本発明の一実施態様では、測定されるバイオマーカーはＩＬ８である。
【００３４】
本発明の一実施態様では、ＩＬ６及びＩＬ８の双方が測定される。
【００３５】
本発明の一実施態様では、生体試料は血液である。
【００３６】
本発明の一実施態様では、生体試料は血清である。
【００３７】
本発明の一実施態様では、生体試料は尿である。
【００３８】
本発明の一実施態様では、バイオマーカーは、前記試料に存在するタンパク質の量を測定することにより測定される。
【００３９】
本発明の一実施態様では、バイオマーカーは、バイオマーカーをコードするｍＲＮＡのレベルを測定することにより測定される。
【００４０】
耐性を測定するためのキット
また本発明は、２,２-ジメチル-Ｎ-((Ｓ)-６-オキソ-６,７-ジヒドロ-５Ｈ-ジベンゾ[ｂ,ｄ]アゼピン-７-イル)-Ｎ'-(２,２,３,３,３-ペンタフルオロ-プロピル)-マロンアミドを用いた治療に対する、被験者の耐性の測定の補助に使用されるキットであって、被験者から得られた生体試料中のＩＬ６又はＩＬ８であるバイオマーカーを検出するための薬剤を含むキットに関する。
【００４１】
併用療法
一実施態様では、本発明は、患者に：(Ａ)化合物Ｉ；及び(Ｂ)抗ＩＬ６又は抗ＩＬ８剤を投与することを含む、増殖性疾患を患っている患者を処置する方法に関する。本発明の一実施態様では、抗ＩＬ６及び抗ＩＬ８の双方が投与される。
【００４２】
さらなる実施態様では、本発明は、医薬として、特に癌等の増殖性疾患、中でも固形腫瘍、さらには乳腺腫瘍、結腸直腸腫瘍、肺腫瘍、及び前立腺腫瘍の処置に使用される医薬としての、(Ａ)化合物Ｉ；及び(Ｂ)抗ＩＬ６及び／又は抗ＩＬ８剤の逐次又は同時組合せに関する。
【００４３】
増殖性疾患の処置は、腫瘍サイズの維持又は低減、腫瘍退縮(部分的又は完全)、腫瘍増殖の阻害、及び／又は疾患を被った患者の寿命の延長を含むと理解されるべきである。
【００４４】
また本発明は、(Ａ)化合物Ｉ；及び(Ｂ)抗ＩＬ６又は抗ＩＬ８剤を含有するキットに関する。本発明の一実施態様では、キットは抗ＩＬ６剤及び抗ＩＬ８剤の双方を含有する。
【００４５】
本発明の一実施態様では、増殖性疾患は固形腫瘍である。
【００４６】
本発明の他の実施態様では、固形腫瘍は、脳、肝臓、前立腺、卵巣、膵臓、皮膚
乳腺、結腸直腸、肺、及び前立腺の腫瘍からなる群から選択される。
【００４７】
本発明の他の実施態様では、固形腫瘍は、乳腺、結腸直腸、肺、及び前立腺の腫瘍からなる群から選択される。
【００４８】
本発明の一実施態様では、抗ＩＬ６剤は、患者におけるＩＬ６のレベルを低減するのに有効な量で投与される。
【００４９】
本発明の一実施態様では、抗ＩＬ８剤は、患者におけるＩＬ８のレベルを低減するのに有効な量で投与される。
【００５０】
本発明の一実施態様では、抗ＩＬ６剤は抗ＩＬ６抗体である。
【００５１】
本発明の一実施態様では、抗ＩＬ８剤は抗ＩＬ８抗体である。
【００５２】
本発明の一実施態様では、抗ＩＬ６剤は、ＩＬ６をコードする核酸の発現に干渉する核酸である。ＩＬ６をコードする核酸の発現に干渉する核酸は、例えばアンチセンスＲＮＡであってよい。また核酸は、例えばｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡであってもよい。
【００５３】
本発明の一実施態様では、抗ＩＬ８剤は、ＩＬ８をコードする核酸の発現に干渉する核酸である。ＩＬ８をコードする核酸の発現に干渉する核酸は、例えばアンチセンスＲＮＡであってよい。また核酸は、例えばｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡであってもよい。
【００５４】
本発明の方法の一実施態様では、化合物Ｉは、増殖性疾患を治療するために治療的に有効な量で投与される。その量は、例えば約４００ｎｇ-ｈｒ／ｍｌから約９０００ｎｇ-ｈｒ／ｍｌ、約１１００ｎｇ-ｈｒ／ｍｌから約４１００ｎｇ-ｈｒ／ｍｌ、又は約１３８０ｎｇ-ｈｒ／ｍｌから約２３３０ｎｇ-ｈｒ／ｍｌでありうる。本発明の実施態様では、化合物Ｉは、約２１日までの期間にわたって約４００ｎｇ-ｈｒ／ｍｌから約９０００ｎｇ-ｈｒ／ｍｌ、約２１日までの期間にわたって約１１００ｎｇ-ｈｒ／ｍｌから約４１００ｎｇ-ｈｒ／ｍｌ、約２１日までの期間にわたって約１３８０ｎｇ-ｈｒ／ｍｌから約２３３０ｎｇ-ｈｒ／ｍｌの量で投与されうる。
【００５５】
本発明の方法の一実施態様では、化合物Ｉは２１日サイクルの１、２、３、８、９、及び１０日目に１日１回投与される。他の実施態様では、投与は、２１日サイクルの１から７日目に１日１回なされうる。さらなる実施態様では、投与は、毎日基準で１日１回なされうる。
【００５６】
本発明の方法及びキットの実施態様では、化合物Ｉは薬学的経口単位投与形態である。
【００５７】
本発明の方法の一実施態様では、患者は放射線治療もさらに受ける。
【００５８】
本発明の方法の一実施態様では、化合物Ｉは、約４００ｎｇ-ｈｒ／ｍｌから約９０００ｎｇ-ｈｒ／ｍｌの量で、２１日サイクルの１、２、３、８、９、及び１０日目に１日１回投与される。
【００５９】
本発明の方法の一実施態様では、化合物Ｉは、約４００ｎｇ-ｈｒ／ｍｌから約９０００ｎｇ-ｈｒ／ｍｌの量で、２１日サイクルの１から７日目に１日１回投与される。
【００６０】
本発明の一実施態様では、抗ＩＬ６抗体は、患者におけるＩＬ６のレベルを低減するのに有効な量で投与される。
【００６１】
本発明の方法の一実施態様では、抗ＩＬ６抗体は、約１から約１００ｍｇ／ｋｇの量で、週２回投与される。
【００６２】
本発明の方法の一実施態様では、抗ＩＬ６抗体は、約１から約５０ｍｇ／ｋｇの量で、週２回投与される。
【００６３】
本発明の方法の一実施態様では、抗ＩＬ６抗体は、約１０から約３０ｍｇ／ｋｇの量で、週２回投与される。
【００６４】
本発明の方法の一実施態様では、抗ＩＬ６抗体は、約２０ｍｇ／ｋｇの量で、週２回投与される。
【００６５】
本発明の一実施態様では、抗ＩＬ８抗体は、患者におけるＩＬ８のレベルを低減するのに有効な量で投与される。
【００６６】
本発明の方法の一実施態様では、抗ＩＬ８抗体は、約１から約１００ｍｇ／ｋｇの量で、週２回投与される。
【００６７】
本発明の方法の一実施態様では、抗ＩＬ８抗体は、約１から約５０ｍｇ／ｋｇの量で、週２回投与される。
【００６８】
本発明の方法の一実施態様では、抗ＩＬ８抗体は、約１０から約３０ｍｇ／ｋｇの量で、週２回投与される。
【００６９】
本発明の方法の一実施態様では、抗ＩＬ８抗体は、約２０ｍｇ／ｋｇの量で、週２回投与される。
【００７０】
本発明の一実施態様では、抗ＩＬ６ｓｈＲＮＡは、患者におけるＩＬ６のレベルを低減するのに有効な量で投与される。
【００７１】
本発明の一実施態様では、抗ＩＬ８ｓｈＲＮＡは、患者におけるＩＬ８のレベルを低減するのに有効な量で投与される。
【００７２】
本発明の一実施態様では、抗ＩＬ６ｓｉＲＮＡは、患者におけるＩＬ６のレベルを低減するのに有効な量で投与される。
【００７３】
本発明の一実施態様では、抗ＩＬ８ｓｉＲＮＡは、患者におけるＩＬ８のレベルを低減するのに有効な量で投与される。
【００７４】
化合物Ｉ、抗ＩＬ６剤、及び／又は抗ＩＬ８剤の投薬量レベルは、患者の必要性、及び治療に対する患者の反応に応じて、ここに記載したものより低く又は高くなるように医師により修正されうる。
【実施例】
【００７５】
以下の調製物及び実施例は、当業者が本発明をより明確に理解し、実施することができるようにするために与えられる。それらは、発明の範囲を限定すると見なされるべきではなく、単にその例証で代表例である。
【００７６】
実施例１
この実施例は、化合物Ｉでの治療に対する様々な異なった異種移植モデルの応答を示す。
Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Wilmington, MA）から得た雌のｎｕ／ｎｕ（ヌード）マウス、又は雌のＳＣＩＤ-ベージュマウス（Taconic, Germantown, NY）を、約８〜１４週齢で、約２３〜２５グラムの体重のときに使用した（１０マウス／群）。全ての動物実験は、Ｒｏｃｈｅ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＲＡＣＵＣ）で承認されたプロトコルに従って実施した。
【００７７】
ヒト癌細胞株ＬＯＶＯ、ＢｘＰＣ３、ＨＣＴ-１１６、Ａ５４９、ＡｓＰＣ-１、ＭｉａＰａＣａ-２、及びＣａｌｕ-６を、American Type Culture Collectionから購入した。Ｈ４６０ａ細胞株は、Ｊａｃｋ Ｒｏｔｈ博士（M. D. Anderson Medical Center）から贈られた。
【００７８】
異種移植片の移植のために、細胞を０．０５％トリプシンを使用して収集し、培養培地で洗浄し、遠心分離し、リン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)及びマトリゲル(ＢｘＰＣ-３)の１：１混合物、又はＰＢＳ単独(Ａ５４９、Ｈ４６０ａ、ＬＯＶＯ、Ｃａｌｕ-６、ＨＣＴ-１１６、ＭｉａＰａｃａ-２、及びＡｓＰＣ-１）のいずれかに、ｍＬ当たり１．５−５×１０７細胞の濃度で再懸濁させた。マウス当たり０．２ｍＬ体積の細胞懸濁液（Ａ５４９については７．５×１０６細胞、Ｈ４６０ａについては１×１０７細胞、Ｃａｌｕ-６及びＨＣＴ１１６細胞については３×１０６細胞、ＢｘＰＣ３及びＡｓＰＣ-１細胞については５×１０６細胞、ＭｉａＰａｃａ-２については６×１０６細胞、ＬＯＶＯについては５×１０６)を、右側腹部に皮下的に移植した。全ての異種移植モデルを、ＢｘＰＣ３を除いてヌードマウスに移植し、ＢｘＰＣ３はＳＣＩＤ-ベージュマウスに移植した。腫瘍を、平均体積が〜１００−１５０ｍｍ３に達するまで、移植後８から２６日間成長させ、その後、動物を治療群に無作為化した。
【００７９】
（国際特許第２００５／０２３７７２号に記載の手順に従い合成した）化合物Ｉを、経口（ｐｏ）投与用に、０．２％のＴｗｅｅｎ(登録商標)-８０を用い、水中１．０％Ｋｌｕｃｅｌの懸濁液として処方した。処方した化合物及びビヒクルを毎週調製し、４℃で保存した。
【００８０】
Ｃａｌｕ-６異種移植モデルにおいて、化合物Ｉを４週間の間、隔週で毎日６０ｍｇ／ｋｇ投与した（７＋／７−×２サイクル）。全ての他の異種移植モデルに、毎日１０ｍｇ／ｋｇで化合物Ｉを投与した。
【００８１】
腫瘍の測定及びマウスの体重を週２回実施した。統計的解析を、マン・ホイットニーの順位和検定、１方向分散分析、及び事後ボンフェローニｔ検定により決定した（SigmaStat, version 2.0, Jandel Scientific, San Francisco, CA）。群間の差異は、確率値（ｐ）が≦０．０５であった場合に有意であると考えた。
【００８２】
腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ％）を治療開始から２１日で測定した。結果を以下の表１に示した。
2013527454.tif 000004
【００８３】
分かるように、Ｈ４６０ａ異種移植片では、化合物Ｉでの治療後の腫瘍増殖阻害は最小量が示された（８％）。
【００８４】
実施例２
実施例１において、Ｈ４６０ａ異種移植モデルが化合物Ｉｄでの治療後の最小量の腫瘍増殖阻害を示すことを同定した後、Ｈ４６０ａ細胞株を分離させるバイオマーカーがあったかどうかを決定するためにＨ４６０ａ及びＡ５４９ ＮＳＣＬＣ細胞株の双方についてサイトカインアレイアッセイを実施した。
【００８５】
サイトカインアレイは、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社（Norcross, GA.）から購入し、製造者のプロトコルに従って使用した。細胞を５日間増殖させ、細胞培地を収集し、剥離させ、遠心分離により細胞を取り除いた。４ミリリットルの培地を一晩インキュベートし、アレイを複数のＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、シグナルを発現させた。
【００８６】
Ｈ４６０ａ細胞株が、Ａ５４９又は血清コントロールよりも、ＩＬ６及びＩＬ８の双方を高レベル発現していたことが測定された。図１を参照。
【００８７】
実施例３
ついで、ＩＬ６及びＩＬ８の発現を、ＥＬＩＳＡを使用し、分泌されたＩＬ６及びＩＬ８タンパク質のレベルを測定することにより、ＢｘＰＣ３、ＨＣＴ-１１６、Ａ５４９、ＡｓＰＣ-１、ＭｉａＰａＣａ-２、及びＣａｌｕ-６細胞株において定量した。
【００８８】
ＩＬ６ ＥＬＩＳＡキットは、Ｂｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ（ＢＭＳ２１３／２又はＢＭＳ２１３ＩＮＳＴ）から購入した。ＩＬ８ ＥＬＩＳＡキットは、Ｂｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ（ＢＭＳ２０４／３ＩＮＳＴ）又はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｄ８０００Ｃ）から購入した。組織培養培地に分泌されたＩＬ６及びＩＬ８を測定するために、３５ｍｍプレートに１００万の半分の密度で細胞を播種した。次の日、細胞を２ｍｌのＰＢＳで洗浄した後、１ｍｌの新鮮培地を補充した。２４時間後、培地及び収集し、直ぐにＥＬＩＳＡ分析に使用した。
【００８９】
結果から分かるように（図２を参照）、Ｈ４６０ａ細胞は、Ａ５４９細胞と比較した場合、４倍高いＩＬ６タンパク質、及び１０倍高いＩＬ８タンパク質を含み、試験された他の細胞株よりも多くの量のＩＬ６及びＩＬ８タンパク質を分泌している。
【００９０】
実施例４
ついで、ＩＬ６及びＩＬ８の発現を、ｑＲＴ-ＰＣＲを使用し、ｍＲＮＡのレベルを測定することにより、ＢｘＰＣ３、ＨＣＴ-１１６、Ａ５４９、ＡｓＰＣ-１、ＭｉａＰａＣａ-２、及びＣａｌｕ-６細胞株において定量した。標準的な実験法を使用し、ＲＮＡ単離及び逆転写-ＰＣＲ（ＲＴ-ＰＣＲ）を実施した。各プローブセットに対するカタログ番号は、Ｈｅｓ１（Ｈｓ００１７２８７８＿ｍ１）、ＡＣＴＢ（４３３３７６２Ｆ）、ＩＬ６（Ｈｓ００１７４１３１＿ｍ１）、ＩＬ８（Ｈｓ００１７４１０３＿ｍ１）及び１８Ｓ（４３１９４１３Ｅ）であった。
【００９１】
結果から分かるように（図３を参照）、Ｈ４６０ａ細胞は、Ａ５４９細胞と比較した場合、１２倍高いＩＬ６ｍＲＮＡ、及び８倍高いＩＬ８ｍＲＮＡを含み、試験された他の細胞株よりも多くの量のＩＬ６及びＩＬ８ｍＲＮＡを発現している。
【００９２】
実施例５
ＩＬ６又はＩＬ８の発現が、化合物Ｉの処置の効能を変化させるかどうかを試験するために、ＩＬ６又はＩＬ８を過剰発現するＡ５４９細胞株を操作し、このような過剰発現が化合物Ｉの処置に対する細胞の感度を変えるかどうかを決定するために研究する異種移植モデルを作製するために使用した。
【００９３】
ＩＬ６及びＩＬ８レンチウイルスは、それぞれＩＬ６及びＩＬ８プラスミド（Genecopoeia, Rockville, Maryland, USAから入手可能）を使用して作製した。Ａ５４９細胞を３群に分け、一つの群はベクターコントロールを受容し、一つの群はＩＬ６レンチウイルスに感染させられており、第３の群はＩＬ８レンチウイルスに感染させられている。後の２つの群は、それぞれ外来性ＩＬ６及びＩＬ８の安定した発現を伴う細胞プールを形成した。
【００９４】
ＩＬ６及びＩＬ８タンパク質の過剰発現はＥＬＩＳＡにより定量した。図４を参照。Ｈ４６０ａと比較して、ＩＬ６を過剰発現するＡ５４９細胞は、７倍高いＩＬ６を分泌した。ＩＬ８を過剰発現するＡ５４９細胞は、Ｈ４６０ａより、わずかに少ないＩＬ８タンパク質を分泌した。ＩＬ６及びＩＬ８を過剰発現するＡ５４９細胞は、Ａ５４９ベクターコントロール細胞と同様の形態を有している。
【００９５】
ついで、ＩＬ６過剰発現Ａ５４９細胞と、ＩＬ８過剰発現Ａ５４９細胞の一部を組合せ、このような細胞の１：１混合物を含む第４群を形成した。
【００９６】
ベクターコントロールを受容するＡ５４９細胞、ＩＬ６を過剰発現するＡ５４９細胞、ＩＬ８を過剰発現するＡ５４９細胞、及びＩＬ６を過剰発現するＡ５４９細胞とＩＬ８を過剰発現するＡ５４９細胞の１：１混合物を、６つのウェルプレートに播種し、各群は、０日目にウェル当たり約１×１０５で播種した。４、６、１０及び１２日目に、全ての細胞をトリプシン処理し、計数し、ついで同じ希釈度で、さらなる増殖のために再播種した。コントロール細胞は１００％増殖として任意にセットした。全ての他の細胞型の増殖は、コントロール細胞の増殖に対する比として表した。試験した全ての細胞株、同様の増殖率を示した。表２を参照。
【００９７】
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【００９８】
化合物Ｉの効能に対するＩＬ６及びＩＬ８過剰発現のインビボ効果をこれらの細胞群のそれぞれついて評価した。
【００９９】
上述の４群の細胞と親Ａ５４９及びＨ４６０ａ細胞を使用し、実施例１に記載の手順を使用して異種移植モデルを作製した。
【０１００】
異なった治療群（１０マウス／群）：１日１回ビヒクル（Ｋｌｕｃｅｌ及びＴｗｅｅｎ）を受容する親Ａ５４９マウス、１日１回１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｉを受容する親Ａ５４９マウス、１日４回３０ｍｇ／ｋｇのタキソール(登録商標)を受容する親Ａ５４９マウス、１日１回ビヒクル（Ｋｌｕｃｅｌ及びＴｗｅｅｎ）を受容するベクターコントロールＡ５４９マウス、１日１回１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｉを受容するベクターコントロールＡ５４９マウス、１日４回３０ｍｇ／ｋｇのタキソール(登録商標)を受容するベクターコントロールＡ５４９マウス、１日１回ビヒクル（Ｋｌｕｃｅｌ及びＴｗｅｅｎ）を受容するＩＬ６-過剰発現Ａ５４９マウス、１日１回１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｉを受容するＩＬ６-過剰発現Ａ５４９マウス、１日４回３０ｍｇ／ｋｇのタキソール(登録商標)を受容するＩＬ６-過剰発現Ａ５４９マウス、１日１回ビヒクル（Ｋｌｕｃｅｌ及びＴｗｅｅｎ）を受容するＩＬ８-過剰発現Ａ５４９マウス、１日１回１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｉを受容するＩＬ８-過剰発現Ａ５４９マウス、１日４回３０ｍｇ／ｋｇのタキソール(登録商標)を受容するＩＬ６-過剰発現Ａ５４９マウス、１日１回ビヒクル（Ｋｌｕｃｅｌ及びＴｗｅｅｎ）を受容するＩＬ６及びＩＬ８-過剰発現Ａ５４９細胞の１：１異種移植混合物を含有するＡ５４９マウス、１日１回１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｉを受容するＩＬ６及びＩＬ８-過剰発現Ａ５４９細胞の１：１異種移植混合物を含むＡ５４９マウス、１日４回３０ｍｇ／ｋｇのタキソール(登録商標)を受容するＩＬ６及びＩＬ８-過剰発現Ａ５４９細胞の１：１異種移植混合物を含むＡ５４９マウス、１日１回ビヒクル（Ｋｌｕｃｅｌ及びＴｗｅｅｎ）を受容するＨ４６０ａマウス、１日１回１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｉを受容するＨ４６０ａマウス、及び１日４回３０ｍｇ／ｋｇのタキソール(登録商標)を受容するＨ４６０ａマウスにおいて、マウスを無作為化した。
【０１０１】
１日１回１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｉで処置されたＨ４６０ａ（ＩＬ６及びＩＬ８の双方が高レベル）からの異種移植腫瘍では、２１日後に、９％のＴＧＩが生じた。この耐性は、Ａ５４９腫瘍について観察された７１％ＴＧＩ、Ａ５４９ベクターコントロール腫瘍についての６１％ＴＧＩ（ＩＬ６及びＩＬ８も低レベル）に対して、明らかに対照的であり、過去の実験とも一致する。Ａ５４９におけるＩＬ６又はＩＬ８の過剰発現は、それぞれ３２％及び４５％まで、ＴＧＩを低減させた。ＩＬ６又はＩＬ８が過剰発現したＡ５４９の１：１混合物で開始された腫瘍は、親Ｈ４６０ａ異種移植の耐性と一致して、化合物Ｉに対して十分な耐性（８％ＴＧＩ）を示した。タキソール(登録商標)は、様々なモデルにわたって一致したＴＧＩを示すポジティブ薬剤コントロールとして含めた。
【０１０２】
化合物Ｉに対するＩＬ６又はＩＬ８過剰発現Ａ５４９の耐性は、インビトロでの化合物Ｉの処置後のＨｅｓ１ ｍＲＮＡのダウンレギュレーション、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達ブロックの特徴が、これらの細胞において適切に保持されているため、Ｎｏｔｃｈ阻害の損失により生じたわけではない。
【０１０３】
実施例６
この実施例は、ＩＬ８の発現が、Ｈ４６０ａ細胞の耐性の維持に必要であるかどうかを調査するために実施された研究を記述する。
【０１０４】
レンチウイルスは、ｐＬＫＯ．１ベースの抗ＩＬ８ｓｈＲＮＡ（Open Biosystemsから購入）を使用して作製し、Ｈ４６０ａ細胞におけるＩＬ８発現を安定にノックダウンするために使用した。
【０１０５】
図６に示されるように、ｓｈＲＮＡは、Ｈ４６０ａ親細胞と比較して、ＩＬ８発現（ｍＲＮＡ及びタンパク質の双方）の７５％ノックダウンを与えた。しかしながら、ＩＬ８-ノックダウンＨ４６０ａ細胞は、Ａ５４９細胞と比較して２倍高いＩＬ８レベルをなおも有していた。
【０１０６】
ついで、親Ｈ４６０ａ細胞とＩＬ８-ノックダウンＨ４６０ａ細胞を、実施例１に記載された手順を使用し、マウスに異種移植片として移植した。ついで、マウスを、異なった治療群（１０マウス／群）：１日１回ビヒクルを受容するＨ４６０ａ異種移植マウス、１日１回１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｉを受容するＨ４６０ａ異種移植マウス、１日１回ビヒクルを受容するＨ４６０ａ異種移植マウス、１日１回１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｉを受容するＩＬ８-ノックダウンＨ４６０ａ異種移植マウス、及び１日１回１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｉを受容するＩＬ８-ノックダウンＨ４６０ａ異種移植マウスに無作為化した。
【０１０７】
図７に示されるように、２１日の間、１日１回１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｉで治療された場合、ＩＬ８-ノックダウンＨ４６０ａ細胞から誘導された腫瘍は、親Ｈ４６０ａ細胞からの腫瘍と比較して、改善された応答性を示した（５％ＴＧＩ対２４％ＴＧＩ）。
【０１０８】
実施例７
この実施例は、ＩＬ８の発現がＨ４６０ａ細胞の耐性の維持に必要であるかどうかを調査するために実施されたさらなる研究を記述する。
【０１０９】
中和抗ＩＬ８抗体を、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号：ＭＡＢ２０８）から購入した。まず、この抗体をインビトロで試験し、この抗体で処置されたＨ４６０ａ細胞からは何の増殖阻害も観察されなかった。
【０１１０】
Ｈ４６０ａ異種移植モデルは実施例１に記載した手順を使用して作製した。ついで、マウスを、異なった治療群（１０マウス／群）：週２回ビヒクルを受容するＨ４６０ａ異種移植マウス、１日１回１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｉを受容するＨ４６０ａ異種移植マウス、週２回２０ｍｇ／ｋｇの抗ＩＬ８抗体を受容するＨ４６０ａ異種移植マウス、及び１日１回１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｉと週２回２０ｍｇ／ｋｇの抗ＩＬ８抗体を受容するＨ４６０ａ異種移植マウスに無作為化した。
【０１１１】
化合物Ｉと抗体との組合せにより、化合物Ｉに対するＨ４６０ａ腫瘍の感受性が改善した（１０％ＴＧＩ対４３％ＴＧＩ）。これは、ＩＬ８ｓｈＲＮＡを利用する過去のデータと一致している。図８を参照。
【０１１２】
実施例８
この実施例は、ＩＬ６の発現が、Ｈ４６０ａ細胞の耐性の維持に必要であるかどうかを調査するために実施された研究を記述する。
【０１１３】
中和抗ＩＬ６抗体を、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号：ＭＡＢ２０６１）から購入した。まず、この抗体をインビトロで試験し、この抗体で処置されたＨ４６０ａ細胞からは何の増殖阻害も観察されなかった。
【０１１４】
Ｈ４６０ａ異種移植モデルは実施例１に記載した手順を使用して作製した。ついで、マウスを、異なった治療群（１０マウス／群）：週２回ビヒクルを受容するＨ４６０ａ異種移植マウス、１日１回１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｉを受容するＨ４６０ａ異種移植マウス、週２回２０ｍｇ／ｋｇの抗ＩＬ６抗体を受容するＨ４６０ａ異種移植マウス、及び１日１回１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｉと週２回２０ｍｇ／ｋｇの抗ＩＬ６抗体を受容するＨ４６０ａ異種移植マウスに無作為化した。
【０１１５】
化合物Ｉと抗体との組合せにより、化合物Ｉに対するＨ４６０ａ腫瘍の感受性が改善した（４３％ＴＧＩ対４７％ＴＧＩ）。図９を参照。
【０１１６】
実施例９
任意の応答マーカーの重要な側面は、レスポンダー及び非レスポンダー腫瘍型を成功裏に予め同定する能力である。この実施例では、異なった細胞株を、それらが高発現レベルのＩＬ６及び／又はＩＬ８を有しているかどうかを決定するために分析した。ついで、高レベルのＩＬ６及びＩＬ８を発現する細胞を使用し、異種移植を作製した（よって、化合物Ｉの治療に対する非レスポンダーであると予測された）。ついで、異種移植モデルを化合物Ｉで処置し、治療の効能に対して高レベルのＩＬ６及びＩＬ８が何らかの効果を有しているかどうかを調べた。
【０１１７】
複数の腫瘍型にわたっておよそ１００の細胞株を、ｑＲＴ-ＰＣＲにより、ＩＬ６及びＩＬ８の発現についてスクリーニングした。約１３％の細胞株が、Ａ５４９よりも少なくとも１０倍高いＩＬ６又はＩＬ８の発現を有していた。２つの細胞株、つまり高レベルのＩＬ６（Ａ５４９よりも３５倍高いＩＬ６ｍＲＮＡ）及びＩＬ８（Ａ５４９よりも８５倍高いＩＬ８ｍＲＮＡ）を発現するＵ８７ＭＧ(神経膠芽腫)と、高レベルのＩＬ８（Ａ５４９より５０倍高いＩＬ８ｍＲＮＡ）及びＩＬ６（Ａ５４９よりも２倍高いＩＬ６ｍＲＮＡ）を発現するＬＯＸ（メラノーマ）（図１０）を、さらなる研究のために選択した。これらの２つの細胞株からのＩＬ６及び／又はＩＬ８のより高い発現レベルが、ＥＬＩＳＡによりさらに確認された（図１１）。
【０１１８】
ヒト癌細胞株Ｕ８７ＭＧ及びＬＯＸは、American Type Culture Collectionから購入した。
【０１１９】
ついで、Ｕ８７ＭＧ及びＬＯＸ細胞株を使用し、異種移植モデルを作製した。
【０１２０】
Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Wilmington, MA）から得た雌ｎｕ／ｎｕ（ヌード）マウスに、約８から１４週齢で、およそ２３から２５グラムの重量のときに、異種移植片を移植した（１０マウス／群）。全ての動物実験は、Ｒｏｃｈｅ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＲＡＣＵＣ）で承認されているプロトコルに従い実施した。
【０１２１】
異種移植片の移植のために、細胞を０．０５％のトリプシンを使用して収集し、培養培地で洗浄し、遠心分離し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）及びマトリゲル（Ｕ８７ＭＧ）の１：１混合物、又はＰＢＳ単独(ＬＯＸ)のいずれかに、ｍＬ当たり１．５−５×１０７細胞の濃度で再懸濁させた。マウス当たり０．２ｍＬ体積の細胞懸濁液（Ｕ８７ＭＧについては５×１０６細胞、ＬＯＸについては２×１０６細胞）を、右側腹部に皮下的に移植した。腫瘍を、平均体積が〜１００−１５０ｍｍ３に達するまで、移植後８〜２６日間成長させ、その後、動物を治療群：１日１回ビヒクル（Ｋｌｕｃｅｌ及びＴｗｅｅｎ）を受容するＵ８７ＭＧ異種移植マウス、２１日間１日１回１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｉを受容するＵ８７ＭＧ異種移植マウス、１日１回ビヒクル（Ｋｌｕｃｅｌ及びＴｗｅｅｎ）を受容するＬＯＸ異種移植マウス、及び１１日間１日１回１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｉを受容するＬＯＸ異種移植マウスに無作為化した。
【０１２２】
Ｕ８７ＭＧ及びＬＯＸモデルの双方とも、予測したように、化合物Ｉを用いた治療耐性が証明され、Ｕ８７ＭＧ腫瘍については−１７％ＴＧＩ、ＬＯＸ腫瘍については１５％であった。図１２を参照。
【０１２３】
化合物Ｉに対するＵ８７ＭＧ及びＬＯＸ細胞の耐性は、インビトロでの化合物Ｉの処置後のＨｅｓ１ ｍＲＮＡのダウンレギュレーション、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達ブロックの特徴が、これらの細胞において適切に保持されているため、Ｎｏｔｃｈ阻害の損失により生じたわけではない。図１３を参照。
【０１２４】
実施例１０
異種移植モデルにおけるＩＬ６及びＩＬ８の血清レベルを測定し、それらが、細胞培地からインビトロで観察される発現差を反映しているかどうかを決定した。得られたデータは、血清収集物が、ＩＬ６及びＩＬ８の患者の腫瘍レベルをモニターするための、臨床的に実施可能なアプローチでありうることを示唆している。
【０１２５】
次の異種移植モデル：Ａ５４９、Ｈ４６０ａ、ＩＬ８-ノックダウンＨ４６０ａ、Ｕ８７ＭＧ及びＬＯＸ（モデルは、上述の方法を使用して作製）を使用し、腫瘍を有するマウスからマウス血清を収集した。これは、ＢＤ Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ血清分別チューブ（カタログ＃３６５９５６、Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）での後眼窩出血又は心臓パンクチャーにより達成した。血液を放置し、最小１０分間で凝集させ、微小遠心分離器で１０分間、９０００ｒｐｍでスピンさせた。血清を収集し、１．５ｍｌの微小遠心分離用チューブに配し、−８０℃で保存した。
【０１２６】
Ａ５４９腫瘍からのマウス血清に分泌されたヒトＩＬ６及びＩＬ８は、あまりに少なくて、ＥＬＩＳＡでは検出することができなかった。しかしながら、Ｈ４６０ａ、ＬＯＸ及びＵ８７ＭＧ異種移植モデル由来のヒトＩＬ６及びＩＬ８は、ＥＬＩＳＡを使用し、血清において容易に検出された（図１４）。さらに、分泌されたＩＬ８血清レベルにおける予期される変化が、ＩＬ８-ノックダウンＨ４６０ａモデル及びＨ４６０ａモデルの間に観察された。
【０１２７】
一般的に、血清中、インビボで観察されたＩＬ６及びＩＬ８のレベルは、細胞培養からインビトロで観察される量を反映していた。しかしながら、マウス血清対細胞培地から測定されたＩＬ６及びＩＬ８の間には、ある程度の矛盾も観察された。例えば、Ｕ８７ＭＧは、プラスチック上の同数の細胞に播種した場合、Ｈ４６０ａよりも５−６倍高いレベルでＩＬ６及びＩＬ８を分泌した；これはマウス血清では反映されなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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