(57)【要約】本発明は、ガードネレラ  バジナリスの核酸配列の検出のための核酸増幅アッセイに関する。本発明は、ＧＶのｖｌｙ遺伝子の核酸配列に相補的であるかまたはＧＶのｖｌｙ遺伝子の核酸配列にアニールするオリゴヌクレオチドを提供する。また、本発明は、核酸増幅反応中で使用することができる内部増幅対照（ＩＡＣ）も提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガードネレラ  バジナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｉｌｓ）の標的配列を、試料中に存在する場合に検出するための方法であって、
（ａ）少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーであって、配列番号２０および配列番号２１からなる群から選択されるガードネレラ  バジナリスのｖｌｙ遺伝子の標的領域の少なくともある部分にアニールするオリゴヌクレオチドプライマーを用意するステップと、
（ｂ）前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを、生物学的試料と合わせるステップと、
（ｃ）前記試料中に前記標的配列部分が存在すれば、前記標的配列部分の増幅を引き起こす条件下に、前記試料を置くステップと、
（ｄ）増幅した標的配列の有無を決定するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号３〜１３、配列番号３〜１３の相補鎖ならびに配列番号３〜１３およびそれらの相補鎖と少なくとも７０％の配列類似性を共有する配列のうちの１つから選択される標的結合配列を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号３〜１３、配列番号３〜１３の相補鎖ならびに配列番号３〜１３およびそれらの相補鎖と少なくとも８０％の配列類似性を共有する配列のうちの１つから選択される標的結合配列を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号３〜１３、配列番号３〜１３の相補鎖ならびに配列番号３〜１３およびそれらの相補鎖と少なくとも９０％の配列類似性を共有する配列のうちの１つから選択される標的結合配列を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーは、オリゴヌクレオチドプライマーのセットであり、
（ａ）第１の増幅プライマーは、配列番号３、６、８または１１から本質的になる標的結合配列を有し、
（ｂ）第２の増幅プライマーは、配列番号４、７、９または１２の結合配列から本質的になる標的を有する、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記増幅は、鎖置換増幅（ＳＤＡ）反応およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）からなる群から選択される増幅反応により達成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記増幅は、直接的な検出、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、インサイツハイブリダイゼーション、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）ローリングサークル増幅または核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）からなる群から選択される増幅反応または検出反応により達成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記増幅プライマーは、ヘアピン、Ｇ−四量体、制限部位、またはレポータープローブにハイブリダイズする配列をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記レポータープローブは、検出可能な標識をさらに含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記標識は、蛍光標識であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記増幅プライマーは、制限エンドヌクレアーゼの認識部位またはＲＮＡポリメラーゼのプロモーターをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
内部増幅対照（ＩＡＣ）を増幅するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ガードネレラ  バジナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｉｌｓ）標的配列を検出するための方法であって、
（ａ）生物学的試料を用意するステップと、
（ｂ）ガードネレラ  バジナリスのｖｌｙ遺伝子の標的領域であって、配列番号２１および配列番号２２からなる群から選択される配列を有するガードネレラ  バジナリスのｖｌｙ遺伝子の標的領域のための１つまたは複数の増幅プライマーを、生物学的試料と合わせるステップと、
（ｃ）前記１つまたは複数の増幅プライマーと合わせた前記生物学的試料を、前記１つまたは複数の増幅プライマーが前記ガードネレラ  バジナリスのｖｌｙ遺伝子の前記標的領域にハイブリダイズする条件下に置くステップと、
（ｄ）前記生物学的試料中のハイブリダイズした増幅プライマーの有無を決定するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
前記１つまたは複数の増幅プライマーは、配列番号３〜１３およびそれらの相補鎖ならびに配列番号３〜１３およびそれらの相補鎖と少なくとも７０％の配列類似性を共有する配列のうちのいずれか１つの標的結合配列を有することを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つまたは複数の増幅プライマーは、配列番号３〜１３およびそれらの相補鎖ならびに配列番号３〜１３およびそれらの相補鎖と少なくとも８０％の配列類似性を共有する配列のうちのいずれか１つの標的結合配列を有することを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記１つまたは複数の増幅プライマーは、配列番号３〜１３およびそれらの相補鎖ならびに配列番号３〜１３およびそれらの相補鎖と少なくとも９０％の配列類似性を共有する配列のうちのいずれか１つの標的結合配列を有することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１つの増幅プライマーは、検出可能な標識をさらに含むレポータープローブであることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記検出可能な標識は、ＴＡＭＲＡ、６ＲＯＸまたは６ＦＡＭであることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
増幅反応または検出反応のためのキットであって、配列番号３〜１３およびそれらの相補鎖ならびに配列番号３〜１３およびそれらの相補鎖と少なくとも７０％の配列類似性を共有する配列のうちのいずれか１つの標的結合配列から本質的になる標的結合配列を有するオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするキット。
【請求項２０】
増幅反応または検出反応のためのキットであって、配列番号３〜１３およびそれらの相補鎖ならびに配列番号３〜１３およびそれらの相補鎖と少なくとも８０％の配列類似性を共有する配列のうちのいずれか１つの標的結合配列から本質的になる標的結合配列を有するオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするキット。
【請求項２１】
増幅反応または検出反応のためのキットであって、配列番号３〜１３およびそれらの相補鎖ならびに配列番号３〜１３およびそれらの相補鎖と少なくとも９０％の配列類似性を共有する配列のうちのいずれか１つの標的結合配列から本質的になる標的結合配列を有するオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするキット。
【請求項２２】
増幅反応または検出反応のためのキットであって、配列番号３〜１３およびそれらの相補鎖のうちのいずれか１つの標的結合配列から本質的になる標的結合配列を有するオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガードネレラ  バジナリス（また、本明細書においては、ＧＶとも呼ぶ）の核酸配列の検出および／または定量のための核酸増幅の方法に関する。本発明は、ガードネレラ  バジナリスの核酸配列に相補的であるかまたはガードネレラ  バジナリスの核酸配列にアニールするオリゴヌクレオチドを提供して、当該核酸配列を増幅および／または検出する。本発明は、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）アッセイまたはＰＣＲアッセイを提供して、ガードネレラ  バジナリスの核酸配列を増幅および／または検出する。ＳＤＡアッセイは、場合により、内部増幅対照（ＩＡＣ）を含むダイプレクス（ｄｉｐｌｅｘ）ＳＤＡであり得る。
【背景技術】
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年１１月１日出願の米国特許仮出願第６１／４０８，８４０号の出願日の利益を主張し、その開示は、参照により本明細書に組み込まれている。
【０００３】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットとしてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出してある配列表を含有し、その全体が、参照により本明細書に組み込まれている。前記ＡＳＣＩＩのコピーは、２０１１年１０月１９日に作成され、Sequence Listing for Gardnerella vaginails_ST25.txtと名付けられ、１５．６キロバイトのサイズである。
【０００４】
ガードネレラ  バジナリス（ＧＶ）は、グラム不定球桿菌であり、非特異的膣炎の唯一の原因物質であると論じられている。この微生物(organism)の診断および検出はしばしば、病理学的または臨床的な知見に基づいて行われ、単離および染色の技法により確認することができる。例えば、Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒら（例えば、非特許文献１参照）においては、ＧＶの検出および特徴付けのための根拠は、この微生物が産生する細胞外ヘモリジンであった。Ｇｅｌｂｅｒ  Ｓ．ら（例えば、非特許文献２参照）は、ＧＶが産生する細胞外ヘモリジンのうちの別の１つをバジノリジン（ｖａｇｉｎｏｌｙｓｉｎ）と同定した。Ｒｏｔｔｉｎｉ，Ｇ．ら（例えば、非特許文献３参照）は、ＧＶが産生するヘモリジンを細胞溶解素と同定している。ＧＶが産生するこれらの毒素を単離することが困難であることは、Ｃｕａｃｉ  Ｓら（例えば、非特許文献４参照）に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第４，６８３，１９５号明細書
【特許文献２】米国特許第４，６８３，２０２号明細書
【特許文献３】米国特許第４，８００，１５９号明細書
【特許文献４】米国特許第４，９６５，１８８号明細書
【特許文献５】米国特許第５，２７０，１８４号明細書
【特許文献６】欧州特許第０６８４３１５号明細書
【特許文献７】米国特許第５，１３０，２３８号明細書
【特許文献８】米国特許第５，４２７，９３０号明細書
【特許文献９】国際公開第９０／１００６４号明細書
【特許文献１０】国際公開第９１／０３５７３号明細書
【特許文献１１】米国特許第５，１０２，７８４号明細書
【特許文献１２】米国特許第５，４５５，１６６号明細書
【特許文献１３】米国特許第５，６４８，２１１号明細書
【特許文献１４】米国特許第５，９６２，２７３号明細書
【特許文献１５】米国特許第５，７１２，１２４号明細書
【特許文献１６】米国特許第５，７４４，３１１号明細書
【特許文献１７】米国特許第６，３７９，８８８号明細書
【特許文献１８】欧州特許第０６２４６４３号明細書
【特許文献１９】米国特許第５，９２８，８６９号明細書
【特許文献２０】米国特許第５，９５８，７００号明細書
【特許文献２１】米国特許第５，４７０，７２３号明細書
【特許文献２２】米国特許第５，８１４，４９０号明細書
【特許文献２３】米国特許第６，３１６，２００号明細書
【特許文献２４】欧州特許第０６７８５８２号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Kretzschmar Uら、“Purification and Characterization of Gardnerella vaginalis Hemolysin”, Curr. Microbiol. 23 (1): 7 13 (1991)
【非特許文献２】Gelber S.ら、“Functional and Phylogenetic Characterization of Vaginolysin, the Human Specific Cytolysin from Gardnerella vaginalis”, J. Bacteriol. 190 (11): 3896 3903 (2008)
【非特許文献３】Rottini, G.ら、“Identification and Partial Characterization of a Cytolytic Toxin Produced by Gardnerella vaginalis”, Infect. and Immun. 58 (11): 3751 3758 (1990)
【非特許文献４】Cuaci Sら、“Pore forming and haemolytic properties of the Gardnerella vaginalis cytolysin”, Mole. Microbio. 9 (6): 1143 1155 (1993)
【非特許文献５】Walkerら、Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 89: 392 (1992)
【非特許文献６】Walkerら、Nucl. Acids Res., 20: 1691 (1992)
【非特許文献７】Guatelliら、Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 87: 1874-78 (1990)
【非特許文献８】Lizardiら、BioTechnology, 6: 1197 (1988)
【非特許文献９】Lizardiら、Nat Genet, 19: 225-232 (1998)
【非特許文献１０】Kwohら、Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 86: 1173-77 (1989)
【非特許文献１１】Walkerら、PNAS (1992) 89: 392-396
【非特許文献１２】Walkerら、Nuc. Acids Res. (1992)20: 1691-1696
【非特許文献１３】Littleら、Clinical Chemistry, 45 (6):777-784(1999)
【非特許文献１４】Dr. Perry Haaland, Experimental Design in Biotechnology (Marcell Dekker, NY, 1989)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＧＶを検出するための、ＧＶが産生する毒素の測定および検出については、多くの記載がある。しかし、ＧＶが産生する毒素とは対照的に、ＧＶをその微生物自体に基づいて検出するための方法の探求は続いている。したがって、偽陰性(false negative)の結果の可能性を減少させるアッセイが求められている。
【０００８】
本明細書における参考文献の引用または論述を、そのような参考文献が本発明の先行技術であることを認めるものであると解釈してはならない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
試料中のガードネレラ  バジナリスの有無を定性的および／または定量的に検出するための方法を本明細書に記載し、前記方法は、（ａ）本明細書に開示するいずれかの増幅プライマーの標的結合配列から本質的になる配列を有する第１の増幅プライマーを使用して、標的配列を増幅するステップと、（ｂ）増幅した標的配列を検出するステップとを含む。特定の実施形態ではまた、本明細書に開示するいずれかの増幅プライマーの標的結合配列から本質的になる第２の増幅プライマーの使用も記載する。
【００１０】
本明細書に記載するオリゴヌクレオチドを使用して、毒素、すなわち、バジノリジンおよび細胞溶解素／ヘモリジンを産生する遺伝子中に見出される、増幅した核酸配列を選択することによって、ＧＶの存在を検出することができる。この点に関して、本発明者らは、この標的をｖｌｙ遺伝子と呼ぶことに決めるに至った。しかしまた、文献では、ＧＶの細胞溶解素遺伝子およびヘモリジン遺伝子も指している。これらが異なる遺伝子であるかまたは同じ遺伝子についての単に異なる名前であるか否かは、本明細書に記載する本発明にとって重要ではない。本明細書においては、標的配列を、「ｖｌｙ遺伝子」または「ｖｌｙ標的」と呼ぶが、本発明の焦点となるのは、標的自体（すなわち、前述の毒素のうちの１つを産生する遺伝子）であり、遺伝子標的の名前ではない。出願人らは、特定の理論に縛られる意図はないが、これらの毒素は全て、同じ遺伝子により産生されると考えている。しかし、本発明は、その中に標的配列が位置するＧＶ遺伝子の名前に制限されるものではない。
【００１１】
一実施形態では、ガードネレラ  バジナリスの標的配列を検出するための方法を本明細書に開示する。この方法においては、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーであって、ＧＶのｖｌｙ遺伝子の少なくともある部分を増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを用意し、増幅の後に、増幅した標的配列を検出する。ＧＶのｖｌｙ遺伝子の例として、配列番号１、２、２３、２４および２５が挙げられる。
【００１２】
ｖｌｙ遺伝子の高度に保存された領域が同定されている。（本明細書に記載する１４０１８株、１４０１９株および４９１４５株については）高度に保存された配列が、ｖｌｙ遺伝子上のおよそ塩基対３２８〜５２３の間の場所にある。好ましい実施形態では、標的配列は、ｖｌｙ遺伝子の高度に保存された領域である。
【００１３】
１４０１８株、１４０１９株および４９１４５株（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ５２２４８６、ＥＵ５２２４８７およびＥＵ５２２４８８に相当する）についての高度に保存された標的ｖｌｙ遺伝子は、配列番号１、２３および２４である。配列番号２および２５は、２つのクローン（それぞれ、Ｔ１０およびＴ１１）についての高度に保存された標的ｖｌｙ遺伝子である。クローンは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ６９７８１１およびＥＵ６９７８１２を有する。クローン中の高度に保存された領域の場所は、およそ塩基対３３１〜５２６にある。ｖｌｙ遺伝子は、株およびクローンの間で高度に保存されているが、株およびクローンの間で変異がある。
【００１４】
ｖｌｙ遺伝子内に、好都合な標的領域があり、それら自体が高度に保存されている。１つのそのような標的領域を、図１に示し、また、配列番号２０と同定する。配列番号２０は、配列番号１の塩基対３２５〜５２４である。ｖｌｙの３つの株の間では、配列番号２０中の変異はない。しかし、図１は、ＧＶの株とクローンとの間には、この標的領域中の小さな配列の変異があることを示している。配列は、３つの株全てについて同一であるが、各株についての配列を、図１に（１００、１１０および１２０として）示す。配列番号２１は、２つのクローン（Ｔ１０およびＴ１１）についての標的領域の配列であり、２つのクローンのそれぞれについて同一である。しかし、配列番号２０と配列番号２１との間には、小さな差がいくつかある。配列番号２１の（配列番号２０に関する）これらの変異を、図１の１３０および１４０に示す。変異は、非常に少なく、好都合な標的配列中、１９６個の塩基対中７つの塩基対である。また、変異は、全てについて、配列の同じ場所にある。当業者であれば、変異が見出される標的領域上の場所には整列しないプライマーおよびプローブを設計することができる。
【００１５】
図１から認められるように、ｖｌｙ遺伝子の高度に保存された標的領域は、上記で同定した種々の株およびクローンについて、実質的に同一である。標的領域のセンス鎖のみを、図１に示す。アンチセンス鎖はセンス鎖の相補鎖であるので、アンチセンス鎖は、図１に具体的に示さないが、図１に示す配列から分かる。図１の配列は、配列番号２０および２１よりも４ヌクレオチド長いが、これ以外は同一である。標的配列の末端におけるプライマーと標的との間の関係をより明らかに示すために、図１には、これらの追加のヌクレオチドを示している。
【００１６】
この高度に保存された領域を選択し、検出のための機構を提供するように設計するオリゴヌクレオチドのプローブのセットを本明細書に記載する。プローブのセットを、いくつかの要因に基づいて設計し、最も重要な要因は、プローブのセットを使用するアッセイである。ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列の検出のためのアッセイは、当技術分野で周知である。これらのアッセイは典型的には、何らかのタイプの増幅または何らかのタイプの画像法を使用して、標的ＤＮＡの存在を確認する。増幅反応の例として、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＳＤＡ（鎖置換増幅）、ＴＭＡ（転写媒介増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ））およびＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応（ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ））が挙げられる。
【００１７】
一実施形態では、検出のために選択する増幅機構は、ＳＤＡである。ＳＤＡは、等温増幅機構であり、したがって、温度サイクリングが関与しない。したがって、ＳＤＡのプローブのセットを、所定の狭い範囲内の標的融解温度（Ｔｍ）について設計する。標的融解温度（Ｔｍ）は、少なくとも５０パーセントのオリゴヌクレオチドが、その完璧な相補鎖にアニールする温度である。当業者であれば、オリゴヌクレオチド配列のＴｍは、配列中の塩基対の数および配列中の塩基のタイプにより決定されることを知っている。オリゴヌクレオチドを設計するためのこれらの指針は、当業者に周知であり、本明細書に詳細には記載しない。
【００１８】
本発明の一実施形態では、ＳＤＡアッセイのためのプライマーおよびプローブの部分が、配列番号２０により示すｖｌｙ遺伝子の標的領域に相補的である。最初に、標的を変性させる。順方向プライマーおよびプローブが、変性させた標的のアンチセンス鎖に結合し（すなわち、変性させた標的のアンチセンス鎖に相補的である）、逆方向プライマーが、変性させた標的のセンス鎖に結合するように、プローブのセットを構成する。ＳＤＡのプローブのセットの一実施形態についての標的に結合するプライマーおよびプローブの部分が、ｖｌｙ遺伝子の高度に保存された部分上のそれらの場所と併せて、以下の表１に列挙されている。ｖｌｙ遺伝子の高度に保存された領域は、種々のＧＶ株について事実上同一であるので、それぞれの株またはクローンについてのｖｌｙ遺伝子の高度に保存された領域を別個には示さない。
【００１９】
本明細書に記載するオリゴヌクレオチドのＳＤＡのプライマー／プローブのセットは、遺伝子のこれらの部分に十分に相補的であり、これらの部分に選択的に結合する。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
本明細書に記載するＳＤＡの実施形態の場合、オリゴヌクレオチドのプローブのセットは、左および右のバンパープライマー（ｂｕｍｐｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ）、左および右の増幅プライマー、ならびにプローブを有する。上記に示したように、左または順方向のプライマーおよびプローブは、ｖｌｙ遺伝子のアンチセンス鎖に結合し、逆方向または右のプライマーは、センス鎖に結合する。したがって、これらのプライマーおよびプローブが結合するｖｌｙ遺伝子の部分は、配列番号３〜７の標的結合配列に十分に相補的であり、それらの配列に対するプライマーおよびプローブのハイブリダイゼーションを促進する。
【００２２】
プライマーおよびプローブは、それらにつながる追加のヌクレオチドまたは配列を有することができる。また、プローブは、それに添付した追加のイメージング用の部分も有する。これらの部分は、標的ＤＮＡ配列の検出を促進する。そのようなオリゴヌクレオチドのプローブのセットを使用して、ほとんどのＧＶ株の有無を決定するために、ＳＤＡアッセイを試料に対して実施することができる。例示的な一実施形態では、ｖｌｙ遺伝子のおよそ１４４個の塩基対の領域を、ｖｌｙ遺伝子のおよそ塩基対３４３からおよそ塩基対４８６のｖｌｙ遺伝子のセクションの間において増幅する。
【００２３】
本発明のその他の実施形態は、上記記載のｖｌｙ遺伝子の領域に結合する、異なるオリゴヌクレオチド配列を使用する。プライマー／プローブのセットを、ｖｌｙ遺伝子のこの領域中に選択的に結合するのみならず、ｖｌｙ遺伝子配列の何らかの部分を増幅して、検出を行うように構成する。本明細書に記載するオリゴヌクレオチドは、変性させた標的核酸配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかに十分に相補的であり、オリゴヌクレオチドが標的に結合するのを可能にする配列を有する。また、本明細書に記載するオリゴヌクレオチドは、単独でまたは組み合わせてのいずれかで使用して、ｖｌｙ遺伝子の核酸配列の増幅による検出を促進することもできる。一実施形態では、遺伝子の標的部分に対してＴａｑｍａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲアッセイを実施するように、プローブを設計する。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲアッセイのために使用する２つのプローブのセットの例を、それらのオリゴヌクレオチド配列の観点から記載する。
【００２４】
【表２】
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【００２５】
ＰＣＲアッセイにおいては、順方向プライマーおよびプローブは、標的核酸のアンチセンス鎖に（適切な条件下で）ハイブリダイズするのに十分に相補的であり、逆方向プライマーは、標的核酸のセンス鎖に（適切な条件下で）ハイブリダイズするのに十分に相補的である。図２は、表２に記載したプライマーおよびプローブの結合する場所を、標的配列のセンス鎖に関して示す（配列のボックスで示した部分により、ボックスと関連がある特異的なプライマー／プローブの場所を示す）。
【００２６】
さらに別の実施形態では、オリゴヌクレオチドを、試料中のＧＶの有無を検出するための方法において使用することができる。さらなる実施形態では、この方法は、核酸増幅反応中で標的配列に特異的な１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを使用して、試料を処理するステップと、増幅された核酸生成物の有無を検出するステップとを含む。
【００２７】
例示的な一実施形態では、ＳＤＡを、増幅反応として選択する。この実施形態の状況においては、ＳＤＡアッセイにおいて使用するのに適切であると本明細書に記載するオリゴヌクレオチドを、増幅プライマー、バンパープライマー、およびそのアッセイ中の検出体として組み合わせて使用する。
【００２８】
別の実施形態では、キットを、ＧＶの検出のために提供する。キットは、本明細書に記載するオリゴヌクレオチドであって、ＧＶのｖｌｙ遺伝子に選択的に結合し、その微生物の検出のために使用することができる標的配列を増幅することが可能であるオリゴヌクレオチドのうちの１つまたは複数を含む。キットは、オリゴヌクレオチドのうちの１つまたは複数および増幅アッセイを実施するための緩衝剤試薬を備える。
【００２９】
キットの一態様では、ＳＤＡのためのオリゴヌクレオチドおよび試薬を提供することができる。この態様では、２つのオリゴヌクレオチドを、増幅プライマーとして提供し、２つのオリゴヌクレオチドを、バンパープライマーとして提供し、１つのオリゴヌクレオチドを、検出体として使用するために提供することができる。
【００３０】
キットのさらに別の態様では、ＳＤＡのためのオリゴヌクレオチドを、乾燥したまたは液体のフォーマットで提供することができる。乾燥したフォーマットでは、試料および適切なＳＤＡ用緩衝液を添加して、アッセイを実施することができる適切な容器に、組成物を適用することができる。
【００３１】
キットのさらに別の態様では、Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲのためのオリゴヌクレオチドおよび試薬を提供することができる。この態様では、３つのオリゴヌクレオチドを提供する。３つのうち２つは、増幅プライマーであり、第３のオリゴヌクレオチドは、検出体として構成する。
【００３２】
例示的な実施形態では、増幅反応または検出反応のためのキットは、配列番号３〜１３およびそれらの相補鎖ならびに配列番号３〜１３およびそれらの相補鎖と少なくとも７０％の配列類似性を共有する配列のうちのいずれか１つである標的結合配列を有するオリゴヌクレオチドを有する。その他の実施形態では、キットは、配列番号３〜１３およびそれらの相補鎖ならびに配列番号３〜１３およびそれらの相補鎖と少なくとも８０％の配列類似性を共有する配列のうちのいずれか１つである標的結合配列を有するオリゴヌクレオチドを有する。その他の実施形態では、キットは、配列番号３〜１３およびそれらの相補鎖ならびに配列番号３〜１３およびそれらの相補鎖と少なくとも９０％の配列類似性を共有する配列のうちのいずれか１つである標的結合配列を有するオリゴヌクレオチドを有する。その他の実施形態では、キットは、配列番号３〜１３およびそれらの相補鎖のうちのいずれか１つである標的結合配列を有するオリゴヌクレオチドを有する。
【００３３】
また、本発明は、ガードネレラ  バジナリスの標的配列を検出するための方法も提供し、この方法は、（ａ）本明細書に開示する１つまたは複数の増幅プライマーを、ＧＶについての標的ｖｌｙ遺伝子中の標的配列にハイブリダイズさせるステップと、（ｂ）前記ハイブリダイズさせた増幅プライマーを検出するステップとを含む。この方法においては、少なくとも１つの増幅プライマーが、検出可能な標識をさらに含むレポータープローブである。検出可能な標識の例として、ＴＡＭＲＡ、６ＲＯＸまたは６ＦＡＭが挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ＧＶのｖｌｙ遺伝子の標的領域のセンス鎖、ならびに種々のＧＶの株およびクローンについてのセンス鎖配列中の変異を示し、本明細書に記載するプライマーおよびプローブの実施形態のハイブリダイゼーションの位置を、センス鎖に関連して示す図である。
【図２】標的領域のｎｔ３２８〜５２３のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方、ならびに２つの例示的なＰＣＲのプローブのセットの、標的領域中の相対的なハイブリダイゼーションの位置を示し、プライマーおよびプローブのハイブリダイゼーションの位置を、センス鎖上で線で囲むことによってさらに示す図である。
【図３】標的領域のｎｔ３２８〜５２３のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方、ならびに例示的なＳＤＡのプライマー／プローブのプローブのセットの、標的領域中の相対的なハイブリダイゼーションの位置を示し、プライマーおよびプローブのハイブリダイゼーションの位置を、標的領域のセンス鎖上で線で囲むことによってさらに示す図である。
【図４】本明細書に記載する方法のためのＩＡＣのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方、ならびに例示的なＳＤＡのプライマー／プローブのプローブのセットの、標的領域中の相対的なハイブリダイゼーションの位置を示し、プライマーおよびプローブのハイブリダイゼーションの位置を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
定義はいずれも、明確にするために提供するものであって、限定するためのものであるとみなしてはならない。記載がない限り、本明細書において使用する科学技術用語は、本発明が関係する当業者が一般に理解するのと同じ意味を有することを意図する。
【００３６】
ガードネレラ  バジナリス（ＧＶ）の核酸配列の検出および／または定量化のための核酸増幅の方法およびアッセイを本明細書に記載する。本発明は、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドであって、ガードネレラ  バジナリスの核酸配列に相補的であるかまたはガードネレラ  バジナリスの核酸配列にアニールするオリゴヌクレオチドを用意して、前記配列を増幅および／または検出する。本発明の一実施形態では、内部増幅対照（ＩＡＣ）を提供する。ＩＡＣを、本発明の核酸増幅アッセイにおいて使用して、アッセイの条件が標的配列の増幅および／または検出に許容されるかどうかを決定することができる。オリゴヌクレオチドを、全てタイプの増幅反応、例えば、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応、核酸配列ベース増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル増幅（Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＲＣＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、およびＱＢレプリカーゼに媒介された増幅（ＱＢ  Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等において使用することができる。
【００３７】
本発明の方法は、微生物自体を検出するので、微生物自体ではなく微生物が産生する毒素（例えば、バジノリジン）を検出する先行技術の検出方法およびキットを使用する、ガードネレラ  バジナリスの検出のために使用される伝統的な方法よりも特に好都合である。
【００３８】
アッセイの感度は、偽陰性の許容度に関係する。実際には試料が標的配列を含有するが、試験結果は陰性である場合、試験結果は偽陰性である。アッセイが検出できる標的配列の量がより少ないほど、アッセイはより高い感度を有する。
【００３９】
アッセイの特異性は、偽陽性の許容度に関係する。実際には試料が標的配列を含有しないが、試験結果は陽性であるが、場合、試験結果は偽陽性である。したがって、アッセイがより特異的であるほど、偽陽性の結果のレベルはより低い。
【００４０】
本発明のある実施形態によれば、ＩＡＣを活用する、試料中のガードネレラ  バジナリスを検出するためのアッセイの結果を、表３の記載に従って解釈することができる。
【００４１】
【表３】
2013544515.tif 000005
【００４２】
従来の増幅対照（ＡＣ）の代わりにおよび／または従来の増幅対照（ＡＣ）に加えて、ＩＡＣを使用することができる。当業者であれば、従来のＡＣ反応は、試験しようとする試料とは別個の反応混合物中で実施されることを理解する。従来のＡＣ反応は、増幅試薬および標的ＤＮＡを含む。ＡＣ反応における標的ＤＮＡの増幅および／または検出が抑制される場合、標的配列が試験試料に存在しないことが指し示されるのは、反応中の阻害性のシグナルによるものである恐れがある。この形態の対照の反応は、有効であるが、最も望ましいものではない。ＡＣ反応は、別個に実施されるので、試験試料を含有する反応の条件を厳密には反映し得ない。本発明の方法は、ＩＡＣを有し、対照の反応を、標的配列の増幅および／または検出と同一の空間的および時間的な条件下で実施し、それにより、人的エラーが最低限に留まるという点で、特に有用である。
【００４３】
標的配列（すなわち、ガードネレラ  バジナリスの配列）にアニールする増幅プライマーを本明細書に記載する。ＩＡＣを使用する実施形態では、ＩＡＣにアニールする増幅プライマーを提供する。本発明のいくつかの実施形態では、表１または図１、３および４に記載したバンパープライマーまたはそのそれぞれの標的結合配列を、増幅プライマーとして使用することができる。本発明のいくつかの実施形態では、増幅プライマーを、本明細書の開示に従って、表１および２、または図１〜４に記載した増幅プライマーから選ぶ。本発明の別の実施形態では、増幅プライマーを、本明細書の開示に従って、図１〜４に記載した増幅プライマーの標的結合配列から選ぶ。
【００４４】
増幅方法
本明細書に開示するオリゴヌクレオチドを、当技術分野で公知の核酸増幅の任意の方法において使用することができる。
【００４５】
適切な増幅方法として、これらに限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」；文献を参照されたい（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３および特許文献４参照））、鎖置換増幅（「ＳＤＡ」；文献を参照されたい（例えば、非特許文献５、非特許文献６およびその開示全体が参照により本明細書に組み込まれている特許文献５を参照））、好熱性鎖置換増幅（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（「ｔＳＤＡ」；文献を参照されたい（例えば、特許文献６参照））、自家持続配列複製（Ｓｅｌｆ−Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（「３ＳＲ」；文献を参照されたい（例えば、非特許文献７参照））、核酸配列ベース増幅（「ＮＡＳＢＡ」；文献を参照されたい（例えば、特許文献７参照））、Ｑβレプリカーゼ系（文献を参照されたい（例えば、非特許文献８参照））；リガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」；文献を参照されたい（例えば、特許文献８参照））；ローリングサークル増幅（文献を参照されたい（例えば、非特許文献９参照））、ならびに転写ベース増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（文献を参照されたい（例えば、非特許文献１０参照））が挙げられる。本発明の増幅プライマーを使用して、ＰＣＲ、ＳＤＡまたはｔＳＤＡを実施することができる。
【００４６】
伝統的に、核酸増幅の技法は、増幅プロセスの温度要件に従って分類される。等温増幅は、高い温度と低い温度との間におけるサイクリングを必要とする増幅とは対照的に、一定温度で実施する。等温増幅の技法の例は、ＳＤＡ、３ＳＲ、Ｑβレプリカーゼ系、ならびに文献（例えば、特許文献９および特許文献１０参照）に開示されている技法である。温度サイクリングを必要とする技法の例は、ＰＣＲ、ＬＣＲ、転写ベース増幅、および制限増幅（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（例えば、特許文献１１参照）である。
【００４７】
ＳＤＡは一般に、以下の経路に沿って進行する。第１に、増幅プライマーが、標的配列に結合するか、またはこれまでに重合している、置換された一本鎖伸長生成物に結合する。第２に、５’−３’エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼが、α−チオデオキシヌクレオシド三リン酸（「α−チオｄＮＴＰ」）を、伸長生成物中に組み込む。例えば、α−チオｄＮＴＰがα−チオｄＣＴＰである場合、α−チオｄＣＴＰは、鋳型中に相補的なＧ残基がある限りその場所で、伸長生成物中に組み込まれる。制限エンドヌクレアーゼの認識部位における伸長生成物中へのα−チオｄＮＴＰの組込みにより、半修飾された（ｈｅｍｉｍｏｄｉｆｉｅｄ）部位、すなわち、伸長生成物鎖上のみにおいて修飾された部位が生み出される。次いで、制限エンドヌクレアーゼが、半修飾された二本鎖の制限部位に切れ目を入れる。次に、制限エンドヌクレアーゼが、切れ目の部位から解離する。最後に、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が欠損しているポリメラーゼにより、切れ目の３’末端から伸長し、下流のＤＮＡ鎖を置換する。切れ目からの伸長部が、切れ目を入れることが可能な別の制限部位を再生するので、切れ目を入れること、鎖の伸長、および鎖の置換が、同時かつ連続的に生じる。一対の増幅プライマーであって、それぞれが、標的配列を含む二本鎖の二重鎖の２つの鎖のうちの１つにハイブリダイズする増幅プライマーを使用する場合、増幅は指数関数的であり、その理由は、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方が、増幅の各回において鋳型として働くからである。単一の増幅プライマーを使用する場合、増幅は線形であり、その理由は、１つの鎖のみが、プライマーの伸長のための鋳型として働くからである。α−チオｄＮＴＰが組み込まれると、それらの二本鎖の認識部位に切れ目を入れる、ＳＤＡに適している制限エンドヌクレアーゼの例として、ＢｓｏＢ１、ＢｓｒＩ、ＢｓｔＮＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｔＯＩ、Ｂｓ１Ｉ、ＡｖａＩ、ＨｉｎｃＩＩおよびＮｃｉＩが挙げられる。ＳＤＡは、文献（例えば、特許文献５、特許文献１２および特許文献１３参照）にさらに記載されており、それらの全体が、参照により本明細書に組み込まれている。ＳＤＡアッセイは、これらに限定されないが、伝統的な（または従来の）ＳＤＡ（それぞれが、参照により本明細書に組み込まれている文献（例えば、非特許文献１１、特許文献１４、特許文献１５および特許文献１６参照）に記載されている）、好熱性ＳＤＡ（＋ＳＤＡ、それぞれが、参照により本明細書に組み込まれている文献（例えば、非特許文献１２、特許文献１３および特許文献１６参照）に記載されている）、ならびに均一リアルタイム蛍光好熱性ＳＤＡ（参照により本明細書に組み込まれている文献（（例えば、特許文献１７参照）に記載されている）であり得る。
【００４８】
試薬、ピペット操作デバイスおよび実験室表面中のこれまでの増幅反応から持ち越された増幅生成物による相互汚染を、伸長生成物中に種々の残基を組み込むことによって低下させることができる。例えば、文献（例えば、特許文献１８参照）の教示に従って、チミンを、２’−デオキシウリジン５’三リン酸（「ｄＵ」）で置換することができる。増幅生成物中に組み込まれているｄＵの切除が、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（「ＵＤＧ」）により触媒され、この反応により、ｄＵを含有する増幅生成物のさらなる増幅が不可能になる。適切であれば、ＵＤＧ自体を不活性化して、増幅を継続することができる。
【００４９】
ｔＳＤＡの場合には、プライマーおよびそれらの標的配列を、好ましくは、それらのＧＣ含有量が全ヌクレオチド組成の７０％未満となるように選択して、標的の増幅効率を制限する恐れがある二次構造の相互作用およびプライマー間の相互作用を最小限に留める。ｔＳＤＡに適切な増幅プライマーは、プローブの３’末端から５’末端の順番に、標的結合配列、制限エンドヌクレアーゼの認識部位、および「テール」を含む。標的結合配列は、標的核酸の相補配列に特異的にハイブリダイズする。文献（例えば、非特許文献５および非特許文献６参照）により記載されているように、制限エンドヌクレアーゼの認識部位は、認識部位の半修飾されると、ＤＮＡ二重鎖の１つの鎖に切れ目を入れる制限エンドヌクレアーゼにより認識される。ｔＳＤＡの間に、増幅プライマーの残部に切れ目が入り、置換されると、５’テールは、ポリメラーゼのリプライミング部位として機能する。テールのリプライミングの機能により、ｔＳＤＡ反応が維持され、単一の標的分子からの複数のアンプリコンの合成が可能になる。テールが、切れ目が入った後に、標的にハイブリダイズした状態を維持し、標的結合配列またはその他のプライマーのいずれかにハイブリダイズする配列を含有しないならば、テール領域の長さおよび配列は変化し得る。
【００５０】
いくつかの増幅方法、例として、ｔＳＤＡは、「バンパープライマー」または「外部プライマー」を使用して、プライマーの伸長生成物を置換する。「バンパープライマー」または「外部プライマー」は、増幅反応中の増幅プライマーおよびその伸長生成物を置換するために使用するプライマーである。バンパープライマーは、増幅プライマーの上流の標的配列にアニールし、したがって、バンパープライマーの伸長により、下流の増幅プライマーおよびその伸長生成物が置換される。あるいは、プライマーの伸長生成物を、加熱することによって置換してもよい。増幅プライマーの上流にあり、増幅プライマーの結合部位に十分に近く、バンパープライマーの伸長時に、増幅プライマーの伸長生成物を置換する標的配列のいずれかに、バンパープライマーはハイブリダイズすることができる。バンパープライマー配列と標的配列との間のミスマッチは一般に、バンパープライマーが標的配列に依然としてハイブリダイズするならば、増幅効率に影響を及ぼさない。さらに、標的配列のその他の核酸に優先する増幅についてのＳＤＡ系の特異性は、標的核酸に対するハイブリダイゼーションについてのバンパープライマー（複数可）の特異性に依存しない。標的配列についてのＳＤＡ系の特異性は、増幅した生成物の検出のために使用するＳＤＡのプライマーおよびプローブまたはオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの忠実度に由来する。
【００５１】
本発明に従って使用する増幅反応がｔＳＤＡ反応である場合、使用することができるポリメラーゼとして、これらに限定されないが、ｅｘｏ−  Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ｅｘｏ−  Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｂｓｔ（ＢｉｏＲａｄ）、ｅｘｏ−  Ｐｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｂｃａ（Ｐａｎｖｅｒａ）、およびＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｇｒａｄｅ  Ｔａｑ（Ｐｒｏｍｅｇａ）が挙げられる。その他ポリメラーゼを、前述の伸長アッセイを使用して日常的に同定することができる。ポリメラーゼであるＴｔｈ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、Ｔｆｉ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、ＲＥＰＬＩＮＡＳＥ（ＤｕＰｏｎｔ）およびＲＥＰＬＩＴＨＥＲＭ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）は、切れ目から鎖を置換することが可能であるが、これらのポリメラーゼはまた、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性も有する。これらのポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性を、例えば、遺伝子工学により除去した後に、本発明の方法に有用になる。好熱性の制限エンドヌクレアーゼの熱安定性は一般に、６５℃未満に制限されるので、この温度付近またはこの温度未満で最適な活性を示す好熱性ポリメラーゼ（例えば、ＢｓｔおよびＢｃａ）が、反応中の好熱性の制限エンドヌクレアーゼに、より適合する。
【００５２】
各構成成分を、乾燥させ、必要に応じて、当技術分野で公知の任意の技法を使用することによって水を加えて元に戻すことができるであろう形態に、本発明の構成成分を最適化することができる。（参照により本明細書に組み込まれている文献を参照されたい（例えば、非特許文献１３参照））。
【００５３】
プライマーの設計
「増幅プライマー」は、標的配列に対するハイブリダイゼーションの後のオリゴヌクレオチドの伸長によってか、または標的配列にハイブリダイズした場合に隣接する複数のオリゴヌクレオチドのライゲーションによって、標的配列を増幅するためのオリゴヌクレオチドである。増幅プライマーの少なくとも一部が、標的配列にハイブリダイズする。この部分を標的結合配列と呼び、この部分がプライマーの標的特異性を決定する。本発明において例示する標的結合配列はまた、ＧＶの検出のための多様なその他の方法において使用することもできることを理解すべきである。例えば、代わって、本明細書に開示する標的結合配列を、事前の増幅なしでまたは増幅後のアッセイにおいて、ＧＶの直接的な検出のためのハイブリダイゼーションのプローブとして使用してもよい。そのようなハイブリダイゼーションの方法は、当技術分野で周知であり、典型的には、標的結合配列と結合するまたは標的結合配列に連結する検出可能な標識を利用して、ハイブリダイゼーションの検出を促進する。
【００５４】
増幅プライマーの設計を、それぞれの増幅方法について最適化することができる。増幅反応を推進するのに特別な配列も構造も必要としないので、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための増幅プライマーは、鋳型に結合する配列のみからなり得る。しかし、その他の増幅反応は、反応が進行するためには、標的結合配列に加えて、特殊化したヌクレオチド配列を必要とする。例えば、ＳＤＡアッセイにおいて使用するための増幅プライマーは、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を、標的結合配列に対して５’にさらに含む（文献を参照されたい（例えば、特許文献１２および特許文献５参照））。また、増幅プライマーは、３’−ＯＨ基を含むこともでき、この基は、増幅プライマーの鋳型結合配列が標的配列にアニールすると、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長可能になる。対照的に、自家持続配列複製（３ＳＲ）および核酸配列ベースアッセイ（ＮＡＳＢＡ）のための増幅プライマーは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを、５’末端付近に含む。（３ＳＲアッセイは、文献（例えば、非特許文献７参照）に記載されている）。プロモーターは、標的結合配列に付加され、鋳型の複数のＲＮＡコピーの転写を導くことによって増幅反応を推進するために働く。標的結合配列に加えて、特定の増幅反応に必要となるそのような配列は、当技術分野で周知である。
【００５５】
本発明の増幅プライマーおよびバンパープライマーを設計する際には、当技術分野で公知の一般的な懸念を考慮に入れるべきである。例えば、多数のＧＣリピートおよびＡＴリピートを含む標的配列を、プライマーを設計するために使用する場合には、二量体の相互作用の可能性を最小限に留めて、プライマーの自己ハイブリダイゼーションを回避するように注意を払うべきである。自己と４つ以上の連続した結合を形成することまたはその他のプライマーと８つ以上の鎖間結合を形成することができるプライマーは一般に、回避すべきである。とりわけ、３’二量体を形成することができるプライマーは回避すべきであり、その理由は、プライマーの３’末端におけるハイブリダイゼーションは、一過性であっても、ポリメラーゼの作用によるプライマーの伸長をもたらし、プライマーを台無しにするであろうという理由からである。特定のコンピュータソフトウエアプログラム（例えば、Ｏｌｉｇｏ（商標）、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ、Ｍｉｎｎ）を、プライマーを設計する際に使用して、問題を回避することができる。また、プライマーの組合せもスクリーニングして、最適条件を得る。
【００５６】
また、当技術分野で公知であるように、相補的な核酸配列および部分的に相補的な核酸配列のアニーリングまたはハイブリダイゼーションを、反応条件を調節して（例えば、緩衝液の温度または塩含有量を調節する）、厳密度を増加または減少させることによって得ることもできる。本発明は、開示する配列のそのような改変、および条件の任意の必要な調節を網羅する。緩衝液の条件に関連する情報を、全体が参照により本明細書に組み込まれている文献（例えば、非特許文献１４参照））に見出すことができる。
【００５７】
ＩＡＣを展開する実施形態、すなわち、ダイプレクス増幅反応においては、増幅プライマーを、ＧＶ標的配列およびＩＡＣ配列の両方にハイブリダイズすることが可能であり、増幅プライマーがハイブリダイズする配列を増幅するように設計する。この状態を、ＧＶ標的配列とＩＡＣ配列との間で共有される核酸配列を使用することによって達成して、増幅プライマーを設計する。選択された増幅反応の性能に必要であれば、本明細書の開示に従って、その他の配列を増幅プライマーに場合により追加してもよい。
【００５８】
例として、限定されないが、ＳＤＡアッセイにおいて使用するための増幅プライマーは一般に、３’鋳型結合配列、鋳型結合配列に対して５’の、切れ目を入れることが可能な制限エンドヌクレアーゼの認識部位、および制限エンドヌクレアーゼの認識部位に対して５’の、約１０〜２５ヌクレオチド長のテール配列を含む。そのような増幅プライマーは、制限エンドヌクレアーゼＢｓｏＢＩのための認識部位を含有することができ、この認識部位には、ＳＤＡ反応の間に切れ目が入る。切れ目を入れることが可能な制限エンドヌクレアーゼのその他の認識部位が、ＢｓｏＢＩの認識部位の代わりになり得ることは当業者に明らかであろう。テール配列は、ＳＤＡのために使用する制限部位も、それ自体の標的結合配列またはその他のプライマー（例えば、バンパープライマー）のいずれかにアニールする配列も含有してはならない。
【００５９】
いくつかの実施形態では、一対の増幅プライマーを使用し、それぞれのプライマーが、二本鎖の標的配列またはＩＡＣ配列の２つの鎖のうちの１つにアニールする。この場合には、増幅は指数関数的であり、その理由は、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方が、増幅のその後の回において、反対のプライマーのための鋳型として働くからである。単一の増幅プライマーを使用する場合、増幅は線形であり、その理由は、１つの鎖のみが、プライマーの伸長のための鋳型として働くからである。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、配列番号３および４またはそれらのそれぞれの標的結合配列から本質的になるヌクレオチド配列を含む増幅プライマーを包含する。その他の実施形態では、本発明の方法は、少なくとも２つの増幅プライマーを包含し、第１の増幅プライマーは、配列番号３またはそのそれぞれの標的結合配列から本質的になるヌクレオチド配列を含み、第２の増幅プライマーは、配列番号４またはそのそれぞれの標的結合配列から本質的になるヌクレオチド配列を含む。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、１つまたは複数のバンパープライマーを包含する。バンパープライマーは、増幅反応中の増幅プライマーおよびその伸長生成物を置換するために使用するプライマーである。バンパープライマーは、増幅プライマーの上流の標的配列にアニールし、したがって、バンパープライマーの伸長により、下流の増幅プライマーおよびその伸長生成物が置換される。また、バンパープライマーは、増幅プライマーとして機能することもできる。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、１つまたは複数のバンパープライマーを包含する。特定の実施形態では、バンパープライマーは、配列番号６または７を含む配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。一実施形態では、バンパープライマーは、配列番号６または７の部分的な配列または完全な配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態では、本発明の方法は、少なくとも２つのバンパープライマーを包含し、第１のプライマーは、配列番号６から本質的になるヌクレオチド配列を含み、第２のプライマーは、配列番号７から本質的になるヌクレオチド配列を含む。
【００６２】
本明細書に記載するプライマー／プローブは、それらの標的結合配列に１００％相補的であるとして記載する。しかし、上記に記載した、プライマーの設計条件に基づくと、プライマーおよびプローブは、標的配列に、それらの領域とのプライマーおよびプローブの相補性が１００％未満であるにもかかわらず結合することができる。相補性の必要な程度は、結合条件の厳密度を含めた、多様な要因に依存する。利用する厳密度の条件に応じて、プライマーおよびプローブを、それらの配列中に異なる塩基を含み、依然として十分に相補的であり、標的領域に結合するように改変することができる。十分に相補的は、本明細書で使用する場合、７０％以上の相補性を含む。好ましい実施形態では、プライマー／プローブのそれらの標的配列に対する相補性は、プライマー／プローブの結合部分の長さにわたり、少なくとも８０％である。より好ましくは、プライマーおよびプローブのそれらの標的配列に対する相補性は、９０％以上である。
【００６３】
標的配列
「標的」または「標的配列」は、増幅および／または検出しようとするＧＶ核酸配列を指す。標的または標的配列は、増幅しようとするＧＶ核酸配列および任意の相補的な第２の鎖を含む。いくつかの実施形態では、標的配列は、一本鎖であってもまたは二本鎖であってもよく、二本鎖の場合、一方の鎖または両方の鎖のいずれかが、増幅プライマーに結合することができる。また、標的または標的配列は、アダプターオリゴヌクレオチドが認識するヌクレオチド配列（すなわち、アダプター結合配列）も含むことができる。本発明のプライマーは、ＧＶのｖｌｙ遺伝子の、配列番号１、２および２３〜２５中に同定する領域にアニールするように設計する。標的配列は、好ましくは、配列番号２０および２１中に同定する標的領域である。
【００６４】
内部増幅対照
「内部増幅対照」、「ＩＡＣ」または「ＩＡＣ配列」は、増幅プライマーにアニールする配列および標的配列とは別個に検出することができる配列を含む核酸配列を指す。当技術分野で公知の任意の検出方法を利用することができる。
【００６５】
本発明に従って、核酸配列を、ＧＶ標的配列と共有するように、ＩＡＣ配列を設計し、したがって、同じ増幅プライマー（複数可）が、ＩＡＣ配列が試料中に存在する場合には、ＩＡＣ配列および標的配列の両方を増幅することができる。また、ＧＶ標的配列とは異なるいくつかの核酸配列を有するようにも、ＩＡＣ配列を設計し、したがって、ＩＡＣ配列の検出と標的配列の検出とを差別化することができる。ＩＡＣ配列を、標的配列と同じ反応混合物中で増幅および／または検出するので、ダイプレクスアッセイは、人的エラー、または阻害性反応条件、例えば、阻害剤の存在もしくは重要な意味をもつ試薬の不在を検出する利点を有する。ＩＡＣが、試験しようとする試料と同じ反応中に存在することよって、現在のモノプレックス（ｍｏｎｏｐｌｅｘ）ＳＤＡアッセイが必要とするような別個の増幅対照反応の必要性が排除される。
【００６６】
特定の作用機構に縛られる意図はないが、ＩＡＣが標的配列と同じ反応中に存在することによって、本発明の増幅アッセイにより、反応の阻害剤および／または偽陰性の結果を示す恐れがある条件の存在を検出するのが可能になる。本明細書で使用する場合、偽陰性の結果は、標的配列が検出されないことを示す結果を指すが、そのような結果が示されるのは、試料中の標的配列の不在に起因するのではなく、しかし、人的エラーまたは反応条件、例えば、重要な意味をもつ反応要素の欠如もしくは反応の阻害剤の存在またはアッセイの実施における誤りに起因する。
【００６７】
標的配列の増幅生成物とＩＡＣ配列の増幅生成物とを差別化する検出方法を使用する。一実施形態では、標的配列の増幅生成物およびＩＡＣの増幅生成物を、異なる色素で標識した検出プローブにより検出することができる。１つの例では、フルオレセインを使用して、標的配列の増幅生成物を検出し、ローダミンの蛍光を使用して、ＩＡＣの増幅生成物を検出する。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ＩＡＣ配列を、その３’末端または５’末端のいずれかが、ＧＶのＤＮＡ配列と共通する配列を含有するように設計する。いくつかのその他の実施形態では、ＩＡＣを、３’末端および５’末端の両方が、増幅プライマーが結合するＤＮＡ配列と共通する配列を含有するように設計する。
【００６９】
また、ＩＡＣ配列を、増幅しようとするＧＶ標的配列とは異なる核酸配列を含むようにも設計し、したがって、ＩＡＣの増幅生成物の検出と標的配列の検出とを差別化することができる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、配列番号１９から本質的になるヌクレオチド配列を含むＩＡＣを活用する。配列番号１９は、検出体（ＧＶｖｌｙＡＣＤ２ｂ）がＩＡＣ標的に結合する領域を除いて、配列番号２０および２１（好ましい標的結合配列）に極めて類似することに留意されたい。本明細書においては、ＧＶｖｌｙＡＣＤ２ｂを、配列番号２２と同定する。検出体以外は、ＩＡＣ標的についてのバンパーおよびプライマーは、ＳＤＡについてのバンパーおよびプライマーと同じである（配列番号１４〜１７）。
【００７１】
上記に記載したプライマーは、それらの標的結合配列に１００％相補的であるとして記載する。下記に記載するように、プライマーおよびプローブは、標的配列に、それらの領域とのプライマーおよびプローブの相補性が１００％未満であるにもかかわらず結合することができる。相補性の必要な程度は、結合条件の厳密度を含めた、多様な要因に依存する。利用する厳密度の条件に応じて、プライマーおよびプローブを、それらの配列中に異なる塩基を含み、依然として十分に相補的であり、標的ｖｌｙ遺伝子に結合するように改変することができる。十分に相補的は、本明細書で使用する場合、７０％以上の相補性を含む。好ましい実施形態では、プライマー／プローブのそれらの標的配列に対する相補性は、プライマー／プローブの結合部分の長さにわたり、少なくとも８０％である。より好ましくは、プライマーおよびプローブのそれらの標的配列に対する相補性は、９０％以上である。
【００７２】
本明細書に記載するオリゴヌクレオチドは、十分に相補的であり、それらのそれぞれの部分の標的に結合しなければならないが、ある時点で、オリゴヌクレオチドの配列は、標的配列に対する相補性が低下し、その他の核酸配列に結合する恐れがあることが認識されている。したがって、オリゴヌクレオチドのプローブは、そのそれぞれの部分の標的と十分に相補的である状態を維持し、そのそれぞれの標的結合部位についての選択性を失わないことが望ましい。
【００７３】
核酸の検出
１つまたは複数の本発明のプライマーを使用して生成した増幅生成物を、当技術分野で公知の任意の方法により検出することができる。本明細書で使用する場合、増幅生成物は、増幅した標的配列および増幅したＩＡＣ配列の両方を含む。従来の技法を使用する、標識したプローブに対するハイブリダイゼーションにより、増幅生成物を検出することができ、例えば、１つのプローブは、増幅プライマー間に存在する配列において、増幅した核酸にハイブリダイズする。あるいは、増幅生成物を、それらの特徴的なサイズにより、例えば、電気泳動、続いて、核酸を可視化するための臭化エチジウム染色を行うことによって検出することもできる。さらなる選択肢として、標識した増幅プライマーも使用される。その上さらなる選択肢として、文献（例えば、非特許文献５または非特許文献６参照）による記載に従って、標識した増幅プライマー／内部プローブを、標的配列上で伸長する。別の実施形態では、文献（例えば、特許文献１９および特許文献２０参照）の記載に従って、標識したレポータープローブのハイブリダイゼーションおよび伸長により、検出を直接達成する。また、検出方法は、化学発光の方法も含み、文献（例えば、特許文献２１参照）の記載に従って、ビオチン化した捕捉プローブおよび酵素をコンジュゲートした検出体プローブを使用して、増幅した生成物を検出する。これら２つのプローブを、２つの増幅プライマー結合部位の間の異なる部位でハイブリダイズさせた後、複合体を、ストレプトアビジンでコーティングしたマイクロタイタープレート上に捕捉し、化学発光シグナルを、発生させ、ルミノメーター中で読み取る。
【００７４】
本発明ある実施形態では、検出方法は、標的の増幅生成物および（存在する場合には）ＩＡＣの増幅生成物の両方を検出し、検出した増幅生成物間で差別化を行うべきである。この目的を達成することが可能である当技術分野で公知の任意の方法を使用することができる。例えば、文献（例えば、非特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４、特許文献２２、特許文献１９、特許文献２３および特許文献２４参照）（それらのそれぞれが、参照により本明細書に組み込まれている）に開示されている検出方法を、本発明に従って使用することができる。別の実施形態では、核酸の検出のための普遍的なプローブおよび方法を使用する（参照により本明細書に組み込まれている文献を参照されたい（例えば、特許文献１７参照））。
【００７５】
当技術分野で公知の多くのドナー／クエンチャー色素の対が本発明に有用である。これらとして、限定されないが、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）／テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ＦＩＴＣ／Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、ＦＩＴＣ／ローダミンＸ、ＦＩＴＣ／テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシフルオセイン（６ＦＡＭ）／ＴＡＭＲＡ、およびその他が挙げられる。特定のドナー／クエンチャーの対を選択することは重要な意味をもたない。エネルギー移動による消光機構のためには、ドナーの発蛍光団の放射波長が、クエンチャーの励起波長と重複することのみが必要であり、すなわち、２つの色素間に、効率的なエネルギー移動、電荷移動または蛍光の消光を可能にするのに十分なスペクトルオーバーラップがなければならない。Ｐ−（ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）は、非蛍光性のクエンチャー色素であり、この色素は、隣接する発蛍光団、例えば、フルオレセインまたは５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン（ＥＤＡＮＳ）からの蛍光を有効に消光する。本発明の検出プローブにおいて蛍光の消光をもたらす任意の色素の対を、消光が生じる機構にかかわらず、本発明のこの方法において使用することができる。また、末端および内部を標識する方法も当技術分野で公知であり、それらの方法を日常的に使用して、ドナーおよびクエンチャーの色素を、検出プローブ中のそれらのそれぞれの部位において連結することができる。
【００７６】
本発明は、配列番号５、１０または１３および標識を含む一本鎖オリゴヌクレオチドである検出プローブを提供する。特定の実施形態では、標識は、オリゴヌクレオチドに連結する少なくとも１つの蛍光ドナー／クエンチャーの対を含み、蛍光部分は、ＴＡＭＲＡまたは６−ＦＡＭである。ＩＡＣの場合、蛍光部分はＲＯＸである。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本発明は、ダイプレクス、均一、リアルタイム、蛍光、好熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）を提供する。均一、リアルタイム、蛍光、好熱性ＳＤＡは、改変されたｔＳＤＡであり、このＳＤＡは、核酸標的配列を、蛍光を消光する機構により検出する（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている文献を参照されたい（例えば、特許文献１７参照））。例えば、一実施形態では、検出プローブが、蛍光ドナー／アクセプターの対を含むことができ、したがって、蛍光の消光が、標的配列の不在下で生じる。特定の作用機構に縛られる意図はないが、検出プローブの、（標的配列の増幅により生成される）第２のオリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションが生じなければ、ドナーとクエンチャーとを空間的に密接に近接させ、その結果、ドナーの蛍光が消光する立体構造をプローブはとる。プローブは、折り畳まれ、秩序ある二次構造（例えば、Ｇ−四量体、ヘアピンもしくは三重らせん）、ランダムコイル、またはドナーとクエンチャーとを十分に密接に近接させて、蛍光の消光をもたらす任意のその他の立体構造をなすことができる。しかし、検出プローブが、第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすると、検出プローブの分子内で塩基対を形成する二次構造が開き、または直線化し、この変化により、ドナーとクエンチャーとの間の距離が増加し、それによって、蛍光の消光が低下するかまたは排除される。あるいは、検出プローブを、直鎖の検出プローブとして設計することができ（すなわち、検出プローブは、二次構造に折り畳まれない）、ドナーとクエンチャーとの間の距離は、十分に短く、蛍光の消光をもたらす。この場合には（および場合により、本明細書に記載する非直鎖の検出プローブを使用する事例では）、検出プローブはまた、蛍光ドナー／クエンチャーの対の間に、制限エンドヌクレアーゼの認識部位（ＲＥＲＳ）も含有する。検出プローブと第２のオリゴヌクレオチドとの間の分子間における塩基対の形成により、ＲＥＲＳが二本鎖になり、それによって、制限エンドヌクレアーゼにより、切断可能または切れ目を入れることが可能になる。特定の作用機構に縛られる意図はないが、制限エンドヌクレアーゼによる切断または切れ目によって、ドナーとアクセプターとが別個の核酸断片上に分離され、この分離により、消光が減少する。
【００７８】
本発明の方法に従って、蛍光パラメータの関連の変化（例えば、ドナーの蛍光強度の増加、アクセプターの蛍光強度の減少、またはドナーの蛍光強度および／またはアクセプターの蛍光強度の比）をモニターして、標的配列の存在を検出および／またはモニターすることができる。通常、ドナーの蛍光強度の変化をモニターするのが好ましく、その理由は、この変化が典型的には、アクセプターの蛍光強度の変化よりも大きいからである。また、その他の蛍光パラメータ、例として、蛍光寿命の変化を、本発明に従ってモニターしてもよい。
【００７９】
キット
また、本発明は、ＧＶ核酸の増幅および／または検出のためのキットも提供し、これらのキットは、配列番号８〜１８またはそれらのそれぞれの標的結合配列から本質的になる１つまたは複数の増幅プライマー、およびそのようなプライマーを含有する少なくとも１つの容器を含む。キットは、場合により、ＩＡＣ、アダプターオリゴヌクレオチドまたは検出プローブのうちのいずれか１つまたは複数を含んでもよい。キットは、ハイブリダイゼーションまたは増幅反応、例として、サザンハイブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーション、ＰＣＲまたはＳＤＡを実施するためのその他の構成成分および試薬をさらに含んでもよい。ハイブリダイゼーションによる検出の場合、ハイブリダイゼーションを実施するのに適切な溶液、例えば、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳを含むことができる。また、検出方法のための構成成分、例えば、第２のプローブ、放射標識、酵素の基質、抗体等を、キット中に含めることもできる。また、核酸増幅の方法に関して使用するのに適切な試薬も含むことができる。典型的には、本明細書において開示する方法の選択された特定の実施形態を実施するための指示を含めて、キットの構成成分を、共通の容器中に一緒に包装する。
実施例
【実施例１】
【００８０】
ＳＤＡのプライマーのセットの設計
ＧＶについては、ｖｌｙ遺伝子の部分を、増幅アッセイによる標的とするために、配列決定し、特徴付けするに至った。このアッセイのために、以前には増幅アッセイのための標的とされたことがないＧＶゲノムの一部（すなわち、ｖｌｙ遺伝子）を選択した。ＧＶゲノムのこのサブ領域を、現在のＧｅｎＢａｎｋデータベース中で、ＧＶの特異性について分析した。ＧＶについてのｖｌｙ遺伝子を、配列番号１、２および２３〜２５により示す。
【００８１】
表１に記載するように、ＧＶ標的配列を増幅するために、増幅プライマーを設計した。選択したオリゴヌクレオチド（増幅プライマー、バンパープライマーおよびアダプターオリゴヌクレオチド）がアニールするＧＶのｖｌｙ遺伝子の領域の位置を、図１、３および４に示す。ＳＤＡのプライマーおよびプローブのセットの１つの例を、下記の表４に記載する。プライマー配列／プローブ配列の下線を引いた部分は、標的結合配列を示す。制限エンドヌクレアーゼの認識部位（ＲＥＲＳ）の部位を太字で示す。
【００８２】
【表４】
2013544515.tif 000006
【実施例２】
【００８３】
３つのＧＶ株を用いる感度試験
ＧＶのｖｌｙのアッセイの感度を、検出限界（ＬＯＤ）実験を実施することによって決定した。３つのＧＶ株から単離されたゲノムＤＮＡを試験し、ＬＯＤを、各株について計算した。各標的レベルについて２４回の反復を行い、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＆  Ｃｏ．製のＬＯＤ計算機を使用して、データを分析した。データは、アッセイが、感度が高く、かつＧＶに特異的であることを示している。
【００８４】
３つの株全てについて、ＤＮＡを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中に希釈し、５分間沸騰させ、１０分間放置して冷却した。ＤＮＡを、下記の表５に記載する溶出液中で、適切な作業希釈度まで希釈した。試験した標的レベルは、１００、５０、２０、５、１および０コピー／反応（ｃ／ｒｘｎ）であった。試料（１５９μＬ）を、適切な延長用マイクロウエルに添加した。
【００８５】
【表５】
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【００８６】
マイクロウエルプレートを、７２℃の加熱ブロックに移動させた。対応する増幅用マイクロウエルプレートを、５４℃の加熱ブロック上に置いた。次いで、マイクロウエルを１０分間インキュベートした。予備刺激反応から、一定分量（１００μＬ）のマイクロウエルの内容物を、増幅用マイクロウエルに移動させた。
【００８７】
増幅用マイクロウエルの内容物を、３×５０ｕＬで混合した。増幅用マイクロウエルを密封し、マイクロウエルプレートを、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、Ｎｅｗ  ＪｅｒｓｅｙのＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＆  Ｃｏ．により供給されたＢＤ  ＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ計測器中に移動させた。
【００８８】
最終的な反応条件は、以下の通りであった。
【００８９】
【表６】
2013544515.tif 000008
【００９０】
外来のヒトＤＮＡを伴わない、きれいな、非抽出系中の各株について計算した検出レベル（ＬＯＤ）は、以下の通りであった。
【００９１】
【表７】
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【００９２】
であった。
【００９３】
ＧＶのｖｌｙのアッセイの感度を、表７に示す。このアッセイは、試験した３つのＧＶ株を検出することが可能である。データから、本発明に記載するＳＤＡアッセイは、１反応当たり、ガードネレラ  バジナリスゲノムの少なくとも５８コピーを検出することができ、この場合、９５％ＬＯＤは、１反応当たり、ゲノムの５５コピーとなるであろうことが示されている。
【実施例３】
【００９４】
交差反応性試験
交差反応性のスクリーニングを実施した。３４個の微生物から得られた核酸を、抽出し、Ｖｉｐｅｒ  ＸＴＲ機器上で試験した。それぞれについて、陰性の結果を得た。
【００９５】
微生物を、ブロス培養液中で１マクファーランドまで増殖し、直接プレートをカウントすることによって定量した。細胞ペレットを、一定分量のブロス培養液を遠心分離することによって調製して、細胞を収集した。上清を廃棄した後、細胞ペレットを、−７０℃で保存した。この実験のために、細胞ペレットを、１ｍＬの試料用希釈液中に再懸濁した。Ｖｉｐｅｒ  ＸＴＲ機器上でプロセスした後、各試料を、およそ２×ｌ０７ＣＦＵ／反応で試験した。その濃度では、表９に列挙する微生物を、２つの微生物を除いて試験した。腟トリコモナス（Ｔ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）は、ブロス培養液中で増殖し、直接カウントすることによって定量化し、２×ｌ０５細胞／反応で試験した。クラミジア  トラコマティス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）は、ＢＧＭＫ細胞中で培養し、超音波処理および分画遠心により収集し、免疫細胞化学的検査により定量した。クラミジア  トラコマティスは、５×ｌ０６ＥＢ／反応で試験した。陽性対照の試料を、ＧＶのゲノムＤＮＡを１０００コピー／ｍＬの濃度まで希釈することによって調製して、陽性対照として使用した。未添加の試料用希釈液（表８）を、陰性対照として使用した。
【００９６】
【表８】
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【００９７】
試料棚を、１１４℃で１５分間あらかじめ温め、次いで、室温で１５分間冷却した。調製した試料を、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、Ｎｅｗ  ＪｅｒｓｅｙのＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＆  Ｃｏ．製のＶｉｐｅｒ（商標）ＸＴＲ機器に移動させて、抽出および分析を行った。Ｖｉｐｅｒ  ＸＴＲシステム中で、核酸を、試料から、磁気粒子を使用して抽出した。磁気粒子による分離によって、試料の非核酸性の構成要素が除去される。次いで、核酸を、磁気粒子から、表５に記載する溶液を使用して溶出した。次いで、溶出液を、ＳＤＡを使用して、上記の表４に記載するプローブのセットを用いて試験した。
【００９８】
交差反応性パネルは、表９の微生物を含んでいた。結果から、検出された微生物は、ＧＶ陽性対照だけであったことが実証されている。その他の微生物は検出されず、このことにより、上記の表４に記載するＳＤＡのプライマーのプローブのセットは、他の微生物と非常に低い交差反応性を有することが実証された。
【００９９】
【表９−１】
2013544515.tif 000011
【０１００】
【表９−２】
2013544515.tif 000012
【０１０１】
【表９−３】
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【０１０２】
【表１０】
2013544515.tif 000014
【実施例４】
【０１０３】
カンジダ属の６つの種に対する追加の交差反応性の試験
臨床の場において、細菌性膣炎と膣カンジダ症とを識別することが可能であることが、臨床医にとって重要である。ＧＶのＳＤＡアッセイが、そうした識別に有用であることを実証するために、ＳＤＡアッセイを、カンジダ属の６つの医学的に関連性のある種から得られたゲノムＤＮＡを用いて評価した。ＧＶのＳＤＡアッセイは、試験したカンジダ属の種のうちのいずれとも交差反応しなかった。具体的には、カンジダ属の６つの種から得られたゲノムＤＮＡを、上記の実施例１に記載したＧＶのｖｌｙのアッセイにおいて試験した。それぞれの標的について、６回の反復を行った。
【０１０４】
使用した微生物の種を、下記の表１０に列挙する。
【０１０５】
【表１１】
2013544515.tif 000015
【０１０６】
ＤＮＡを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中に希釈し、５分間沸騰した。溶液を、１０分間放置して冷却した。次いで、ＤＮＡを、表５に記載する溶出液を使用して希釈した。試料（１５９μＬ）を、適切な延長用マイクロウエルに添加した。マイクロウエルプレートを、７２℃の加熱ブロックに移動させた。対応する増幅用マイクロウエルプレートを、５４℃の加熱ブロック上に置いた。次いで、マイクロウエルを１０分間インキュベートした。延長反応から、一定分量（１００ｕＬ）のマイクロウエルの内容物を、増幅用マイクロウエルに移動させた。増幅用マイクロウエルを密封し、マイクロウエルプレートを、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、Ｎｅｗ  ＪｅｒｓｅｙのＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＆  Ｃｏ．により供給されたＢＤ  ＰｒｏｂｅＴｅｃ  ＥＴ計測器中に移動させた。
【０１０７】
引用した参考文献および均等物
本明細書に引用する参考文献は全て、それぞれの個々の刊行物または特許もしくは特許出願の全体が全ての目的のために参照により組み込まれていることを具体的かつ個々に示すのと同じ程度に、それらの全体が全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれている。
【０１０８】
本発明の多くの改変形態および変更形態を、本発明の精神および範囲から逸脱することなく作製することができ、このことは、当業者には明らかである。本明細書に記載した特定の実施形態は、例示のためのみに提供し、本発明は、添付の特許請求の範囲により権利を与えられる均等物の完全な範囲と併せて、そのような特許請求の範囲の条項によってのみ限定されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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