(57)【要約】  本発明は、ＤＮＡ結合ドメインなどのポリヌクレオチド結合ドメイン、およびＤＮＡリガーゼ・ドメインなどのリガーゼ・ドメインを含む融合ポリペプチド、こうした融合ポリペプチドを産生するための方法、ならびに例えば、分子生物学的技術の範囲、ならびに診断、タンパク質産生、薬学的、栄養的、および医学的分野における適用における、該融合ポリペプチドの使用にもまた関する。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのポリヌクレオチド結合ポリペプチドに融合した少なくとも１つのポリヌクレオチド−リガーゼ・ポリペプチドを含む、単離、精製、または組換え融合ポリペプチド。
【請求項２】
少なくとも１つのポリヌクレオチド−リガーゼ・ポリペプチドの少なくとも１つが、ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドである、請求項１の融合ポリペプチド。
【請求項３】
少なくとも１つのポリヌクレオチド−リガーゼ・ポリペプチドの少なくとも１つが、ＲＮＡリガーゼ・ポリペプチドである、請求項１の融合ポリペプチド。
【請求項４】
少なくとも１つのポリヌクレオチド結合ポリペプチドの少なくとも１つがＤＮＡ結合ポリペプチドである、請求項１〜３のいずれか１項の融合ポリペプチド。
【請求項５】
少なくとも１つのポリヌクレオチド結合ポリペプチドの少なくとも１つがＲＮＡ結合ポリペプチドである、請求項１〜４のいずれか１項の融合ポリペプチド。
【請求項６】
ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドが、原核ＤＮＡリガーゼ、原核ＤＮＡリガーゼ変異体、またはその機能性断片である、請求項２〜５のいずれか１項の融合ポリペプチド。
【請求項７】
ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドが、細菌ＤＮＡリガーゼ、細菌ＤＮＡリガーゼ変異体、またはその機能性断片である、請求項６の融合ポリペプチド。
【請求項８】
ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドが、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドまたはその機能性変異体または機能性断片であるか、あるいはこれらを含む、請求項７の融合ポリペプチド。
【請求項９】
ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドが、バクテリオファージＤＮＡリガーゼ、その変異体または機能性断片を含む、ウイルスＤＮＡリガーゼ、ウイルスＤＮＡリガーゼ変異体、またはその機能性断片である、請求項２〜５のいずれか１項の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドが、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、またはその機能性変異体または機能性断片であるか、あるいはこれらを含む、請求項９の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドが、真核ＤＮＡリガーゼ、その機能性変異体、または機能性断片である、請求項２〜５のいずれか１項の融合ポリペプチド。
【請求項１２】
ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドが、真菌ＤＮＡリガーゼ、哺乳動物ＤＮＡリガーゼ、またはその機能性変異体または機能性断片である、請求項１１の融合ポリペプチド。
【請求項１３】
少なくとも１つのポリヌクレオチド結合ポリペプチドの少なくとも１つが、配列非特異的ＤＮＡ結合ポリペプチドである、請求項１〜１２のいずれか１項の融合ポリペプチド。
【請求項１４】
少なくとも１つのポリヌクレオチド結合ポリペプチドの少なくとも１つが、配列特異的ＤＮＡ結合ポリペプチドである、請求項１〜１２のいずれか１項の融合ポリペプチド。
【請求項１５】
ＤＮＡ結合ポリペプチドが、染色体タンパク質、ヒストン、ＨＭｆ様タンパク質、および古細菌（ａｒｃｈｅａｌ）低分子塩基性ＤＮＡ結合タンパク質を含む群より選択される、請求項４〜１４のいずれか１項の融合ポリペプチド。
【請求項１６】
ＤＮＡ結合ポリペプチドが
デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）のＰｐｒＡタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＢＡＡ２１３７４）；
ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）由来のＮＦ−カッパＢタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿００３９８９）、または１もしくはそれより多いその断片、例えばＮＦ−カッパＢ  ｐ５０タンパク質、もしくはヒトＮＦ−カッパＢタンパク質のアミノ酸４０〜３６６を含む断片を含む、哺乳動物ＮＦ−カッパＢタンパク質；
結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のＫｕタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿２１５４５２）；
スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）由来のＳｓｏ７ｄタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿３４３８８９）；
スルホロブス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）由来のＳａｃ７ｄタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｐ１３１２３）；
デイノコッカス・ラディオデュランスのＤｄｒＡタンパク質；
哺乳動物ＮＦＡＴｃタンパク質、例えば、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）由来のＮＦＡＴｃ１タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿０５８０７１）、またはマウス由来のＮＦＡＴｃ１タンパク質のアミノ酸４０３〜７０３を含む断片を含む１もしくはそれより多い機能性断片、または１もしくはそれより多い機能性変異体；
あるいは１もしくはそれより多いその相同体、機能性変異体もしくは機能性断片、またはその２もしくはそれより多い組み合わせ
を含む群より選択される、請求項４〜１５のいずれか１項の融合ポリペプチド。
【請求項１７】
ＤＮＡ結合ポリペプチドがＮＦＡＴ−Ａｌａ−ｐ５０ハイブリッドＤＮＡ結合タンパク質（ｃＴＦ）である、請求項１６の融合ポリペプチド。
【請求項１８】
ＤＮＡリガーゼがＴ４  ＤＮＡリガーゼである、請求項１６または１７の融合ポリペプチド。
【請求項１９】
ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＰｐｒＡ、Ｓｓｏ７ｄ、およびｐ５０より選択される、請求項１６または請求項１８の融合ポリペプチド。
【請求項２０】
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよびｐ５０を含む、請求項１９の融合ポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号６、８、１０、または１６の１つの１０またはそれより多い連続アミノ酸を含む、請求項１の融合ポリペプチド。
【請求項２２】
融合ポリペプチドが：
配列番号６のアミノ酸１８〜３４４；
配列番号８のアミノ酸１８〜３００；
配列番号１０のアミノ酸１８〜７９；または
配列番号１６のアミノ酸５１４〜８４２
を含む群より選択される配列由来の少なくとも１０の連続アミノ酸；
および：
配列番号６のアミノ酸３５８〜８４３；
配列番号８のアミノ酸３１１〜７９６；
配列番号１０のアミノ酸９０〜５７５；または
配列番号１６のアミノ酸１８〜５０３
を含む群より選択される配列由来の少なくとも１０の連続アミノ酸
を含む、請求項２１の融合ポリペプチド。
【請求項２３】
実施例に関連して本明細書に記載されるような、請求項１の融合ポリペプチド。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか１項に請求するような融合ポリペプチドをコードする、単離、精製または組換えポリペプチド。
【請求項２５】
配列番号５、７、９、および１５の１つの１０またはそれより多い連続するヌクレオチドを含む、単離、精製または組換えポリヌクレオチド。
【請求項２６】
ポリヌクレオチドが：
配列番号５のヌクレオチド１６６〜１１４６；
配列番号５のヌクレオチド１６６〜１１８５；
配列番号７のヌクレオチド１６６〜１０１４；
配列番号７のヌクレオチド１６６〜１０４４；
配列番号９のヌクレオチド１６６〜３５１；
配列番号９のヌクレオチド１６６〜３８１；
配列番号１５のヌクレオチド１６２４〜２６４０；または
配列番号１５のヌクレオチド１６５４〜２６４０
を含む群より選択される配列由来の少なくとも１０の連続ヌクレオチド；
および：
配列番号５のヌクレオチド１１４７〜２６４３；
配列番号５のヌクレオチド１１８６〜２６４３；
配列番号７のヌクレオチド１０１５〜２５０２；
配列番号７のヌクレオチド１０４５〜２５０２；
配列番号９のヌクレオチド３５２〜１８３９；
配列番号９のヌクレオチド３８２〜１８３９；
配列番号１５のヌクレオチド１６６〜１６２３；または
配列番号１５のヌクレオチド１６６〜１６５３
を含む群より選択される配列由来の少なくとも１０の連続ヌクレオチド
を含む、請求項２５のポリヌクレオチド。
【請求項２７】
ポリヌクレオチド−リガーゼ・ポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸配列；および
ポリヌクレオチド結合ポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸配列
を含む、発現構築物。
【請求項２８】
ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項２７の発現構築物。
【請求項２９】
ＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項２７または請求項２８の発現構築物。
【請求項３０】
ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドおよびＤＮＡ結合ポリペプチドを含む、融合ポリペプチドをコードする、請求項２８または２９の発現構築物。
【請求項３１】
ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列およびＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列が、単一オープンリーディングフレームとして存在する、請求項２９または３０の発現構築物。
【請求項３２】
請求項６〜２３のいずれか１項に請求されるような融合ポリペプチドをコードする、請求項２７〜３１のいずれか１項の発現構築物。
【請求項３３】
配列番号５、７、９、または１５の１つの１０またはそれより多い連続ヌクレオチドを含む、請求項２７〜３２のいずれか１項の発現構築物。
【請求項３４】
請求項２７〜３３のいずれか１項の発現構築物を含むベクター。
【請求項３５】
請求項２７〜３３のいずれか１項の発現構築物または請求項３４のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項３６】
請求項１〜２３のいずれか１項に請求されるような融合タンパク質、請求項２４〜２６のいずれか１項に請求されるようなポリヌクレオチド、請求項２７〜３３のいずれか１項に請求されるような発現構築物、請求項３４に請求されるようなベクター、または請求項３５に請求されるような宿主細胞を含む、組成物。
【請求項３７】
融合ポリペプチドを産生するための方法であって：
ポリヌクレオチド−リガーゼ・ポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸配列；および
ポリヌクレオチド結合ポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸配列
を含む少なくとも１つの発現構築物を含む宿主細胞を提供し；
発現構築物の発現に、そして融合ポリペプチドの形成に適した条件下で、宿主細胞を維持し；そして
宿主細胞から融合ポリペプチドを分離する
工程を含む、前記方法。
【請求項３８】
発現構築物が、請求項２７〜３３のいずれか１項記載の発現構築物である、請求項３７の方法。
【請求項３９】
１またはそれより多い核酸分子を連結する方法であって、１またはそれより多い融合ポリペプチドと１またはそれより多い核酸分子を接触させる工程を含む、ここで、１またはそれより多い融合ポリペプチドが、少なくとも１つのポリヌクレオチド結合ポリペプチドに融合した少なくとも１つのポリヌクレオチド−リガーゼ・ポリペプチドを含む、前記方法。
【請求項４０】
融合ポリペプチドが、少なくとも１つのＤＮＡ結合ポリペプチドに融合した少なくとも１つのＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドを含む、請求項３９の方法。
【請求項４１】
融合ポリペプチドが、少なくとも１つのＲＮＡ結合ポリペプチドに融合した少なくとも１つのＲＮＡリガーゼ・ポリペプチドを含む、請求項３９または４０の方法。
【請求項４２】
核酸分子の１またはそれより多くがＤＮＡ分子である、請求項３９〜４１のいずれか１項の方法。
【請求項４３】
１またはそれより多い核酸分子が少なくとも２つのＤＮＡ分子である、請求項３９〜４１のいずれか１項の方法。
【請求項４４】
核酸分子の１またはそれより多くがＲＮＡ分子である、請求項３９〜４３のいずれか１項の方法。
【請求項４５】
融合ポリペプチドと１またはそれより多い核酸分子を接触させる工程を含む、ホスホジエステル結合の形成を触媒する方法であって、ここで、１またはそれより多い融合ポリペプチドが、少なくとも１つのポリヌクレオチド結合ポリペプチドに融合した少なくとも１つのポリヌクレオチド−リガーゼ・ポリペプチドを含む、前記方法。
【請求項４６】
融合ポリペプチドが、少なくとも１つのＤＮＡ結合ポリペプチドに融合した少なくとも１つのＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドを含む、請求項４５の方法。
【請求項４７】
融合ポリペプチドが、少なくとも１つのＲＮＡ結合ポリペプチドに融合した少なくとも１つのＲＮＡリガーゼ・ポリペプチドを含む、請求項４５の方法。
【請求項４８】
ホスホジエステル結合が分子内結合である、請求項４５〜４７のいずれか１項の方法。
【請求項４９】
ホスホジエステル結合が分子間結合である、請求項４５〜４７のいずれか１項の方法。
【請求項５０】
請求項１〜２３のいずれか１項に請求されるような融合ポリペプチド、請求項２４〜２６のいずれか１項に請求されるようなポリヌクレオチド、請求項２７〜３３のいずれか１項に請求されるような発現構築物、請求項３４に請求されるようなベクター、請求項３５に請求されるような宿主細胞、または請求項３６に請求されるような組成物を、場合によって使用説明書、１またはそれより多い緩衝剤、補因子、陽性対照、陰性対照、基質、あるいは本発明の融合ポリペプチドの活性に必要な他の試薬とともに含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本発明は、分子生物学の分野に、より詳細には、融合ポリペプチドおよびその使用に関する。特に、本発明は、ＤＮＡ結合ドメインなどのポリヌクレオチド結合ドメイン、およびＤＮＡリガーゼ・ドメインなどのポリヌクレオチド−リガーゼ・ドメインを含む融合ポリペプチドに関する。こうした融合ポリペプチドを産生するための方法、ならびに例えば、分子生物学技術の範囲における、該融合ポリペプチドの使用もまた提供する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]ＤＮＡリガーゼなどのポリヌクレオチド・リガーゼは、分子生物学的酵素のうち、最も広く用いられるものの１つである。非常に多様な分子生物学方法論が、ＤＮＡリガーゼの効率的な活性に頼っている。
【０００３】
[0003]ある範囲の供給源由来のリガーゼが、分子生物学における適用に関して、そしてまた医学、薬学および食品産業を含めて、分子生物学的方法論を使用するますます多くの産業において、研究されてきている。それにもかかわらず、ＤＮＡリガーゼなどのリガーゼの活性を修飾する方法に関する研究はほとんどされてこなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
[0004]本発明の目的は、ＤＮＡリガーゼ活性などのポリヌクレオチド・リガーゼ活性を含む融合ポリペプチドを提供するか、こうした融合ポリペプチドを用いる方法を提供するか、または少なくとも公共に有用な選択肢を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
[0005]したがって、第一の側面において、本発明は、融合ポリペプチドを産生するための方法であって：
ポリヌクレオチド−リガーゼ・ポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸配列；および
ポリヌクレオチド結合ポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸配列
を含む少なくとも１つの発現構築物を含む宿主細胞を提供し；
発現構築物の発現に、そして融合ポリペプチドの形成に適した条件下で、宿主細胞を維持し；そして
宿主細胞から融合ポリペプチドを分離する
工程を含む、前記方法を提供する。
【０００６】
[0006]１つの態様において、ポリヌクレオチド−リガーゼ・ポリペプチドは、ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドである。別の態様において、ポリヌクレオチド−リガーゼ・ポリペプチドは、ＲＮＡリガーゼ・ポリペプチドである。
【０００７】
[0007]１つの態様において、ポリヌクレオチド結合ポリペプチドはＤＮＡ結合ポリペプチドである。別の態様において、ポリヌクレオチド結合ポリペプチドはＲＮＡ結合ポリペプチドである。例えば、ポリヌクレオチド−リガーゼ・ポリペプチドがＲＮＡリガーゼ・ポリペプチドである特定の態様において、ポリヌクレオチド結合ポリペプチドは、好適に、ＲＮＡ結合ポリペプチドであってもよい。
【０００８】
[0008]したがって、１つの態様において、融合ポリペプチドを産生するための方法は：
ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸配列；および
ＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸配列
を含む少なくとも１つの発現構築物を含む宿主細胞を提供し；
発現構築物の発現に、そして融合ポリペプチドの形成に適した条件下で、宿主細胞を維持し；そして
宿主細胞から融合ポリペプチドを分離する
工程を含む。
【０００９】
[0009]１つの態様において、発現構築物は、高コピー数ベクター中にある。
[0010]１つの態様において、ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列は、強いプロモーターに機能可能であるように連結される。
【００１０】
[0011]１つの態様において、ＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列は、強いプロモーターに機能可能であるように連結される。
[0012]１つの態様において、強いプロモーターは、ウイルス・プロモーターまたはファージ・プロモーターである。
【００１１】
[0013]１つの態様において、プロモーターは、ファージ・プロモーター、例えばＴ５ファージ・プロモーターまたはＴ７ファージ・プロモーターである。
[0014]別の態様において、本発明は、融合ポリペプチドを産生するための方法であって：
ポリヌクレオチド−リガーゼ・ポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸配列；および
ポリヌクレオチド結合ポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸配列
を含む少なくとも１つの発現構築物を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系を提供し；
発現構築物の発現に、そして融合ポリペプチドの形成に適した条件下で、発現系を維持する
工程を含む、前記方法を提供する。
【００１２】
[0015]特定の態様において、該方法は、発現系から融合ポリペプチドを分離する工程をさらに含む。
[0016]本発明の別の側面は：
ポリヌクレオチド−リガーゼ・ポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸配列；および
ポリヌクレオチド結合ポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸配列
を含む発現構築物に関する。
【００１３】
[0017]１つの態様において、ポリヌクレオチド−リガーゼ・ポリペプチドは、ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドである。別の態様において、ポリヌクレオチド−リガーゼ・ポリペプチドは、ＲＮＡリガーゼ・ポリペプチドである。
【００１４】
[0018]１つの態様において、ポリヌクレオチド結合ポリペプチドはＤＮＡ結合ポリペプチドである。別の態様において、ポリヌクレオチド結合ポリペプチドはＲＮＡ結合ポリペプチドである。
【００１５】
[0019]したがって、１つの態様において、発現構築物は：
ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸配列；および
ＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸配列
を含む。
【００１６】
[0020]１つの態様において、発現構築物は、ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドおよびＤＮＡ結合ポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードする。
[0021]１つの態様において、ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列およびＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列は、単一オープンリーディングフレームとして存在する。
【００１７】
[0022]１つの態様において、ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列は、プロモーター、例えば強いプロモーターに機能可能であるように連結される。
【００１８】
[0023]１つの態様において、ＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列は、プロモーター、例えば強いプロモーターに機能可能であるように連結される。
[0024]本発明の別の側面は、本発明の発現構築物を含むベクターに関する。
【００１９】
[0025]１つの態様において、ベクターは、高コピー数ベクターである。
[0026]１つの態様において、ベクターは、低コピー数ベクターである。
[0027]１つの態様において、ベクターは、宿主細胞ゲノム内に安定に組み込まれるためのものである。
【００２０】
[0028]本発明の別の側面は、上に定義するような発現構築物またはベクターを含む、宿主細胞に関する。
[0029]本発明の別の側面は、少なくとも１つのポリヌクレオチド結合ポリペプチドに融合した少なくとも１つのポリヌクレオチド−リガーゼ・ポリペプチドを含む、融合ポリペプチドに関する。
【００２１】
[0030]１つの態様において、融合ポリペプチドは、少なくとも１つのＤＮＡ結合ポリペプチドに融合した少なくとも１つのＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドを含む。
[0031]本発明の別の側面は、上に定義する方法にしたがって産生された融合ポリペプチドに関する。
【００２２】
[0032]本発明の別の側面は、融合ポリペプチドを含む組成物であって、該融合ポリペプチドが、少なくとも１つのポリヌクレオチド結合ポリペプチドに融合した少なくとも１つのポリヌクレオチド−リガーゼ・ポリペプチドを含む、前記組成物に関する。
【００２３】
[0033]１つの態様において、組成物は、少なくとも１つのＤＮＡ結合ポリペプチドに融合した少なくとも１つのＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドを含む、融合ポリペプチドを含む。
【００２４】
[0034]本発明の別の側面は、上に定義する方法にしたがって産生された融合ポリペプチドを含む、組成物に関する。
[0035]本発明の別の側面は、上に定義するような、発現構築物、ベクター、または宿主細胞を含む組成物に関する。
【００２５】
[0036]本発明の別の側面は、上に定義するような組成物を含む試薬に関する。
[0037]１つの態様において、試薬は診断試薬である。別の態様において、試薬は実験室試薬である。
【００２６】
[0038]本発明の別の側面は、上に定義するような組成物を含むキットに関する。
[0039]１つの態様において、キットは診断キットである。別の態様において、キットは実験室キットである。多様な態様において、キットは、１またはそれより多い他の試薬、使用説明書等を場合によって含む。
【００２７】
[0040]１つの態様において、組成物は、融合ポリペプチドの均質な集団を含む。
[0041]１つの態様において、組成物は、融合ポリペプチドの混合集団を含む。
[0042]１つの態様において、組成物は、以下：
１またはそれより多いポリヌクレオチド結合ポリペプチド、例えば１またはそれより多いＤＮＡ結合ポリペプチド、
１またはそれより多いポリヌクレオチド−リガーゼ・ポリペプチド、例えば１またはそれより多いＤＮＡリガーゼ・ポリペプチド、
１またはそれより多い補因子、あるいは
１またはそれより多い補酵素
の１またはそれより多くをさらに含む。
【００２８】
[0043]本発明の別の側面は、１またはそれより多い核酸分子を連結する方法であって、１またはそれより多い融合ポリペプチドと１またはそれより多い核酸分子を接触させる工程を含む、ここで、１またはそれより多い融合ポリペプチドが、少なくとも１つのポリヌクレオチド結合ポリペプチドに融合した少なくとも１つのポリヌクレオチド−リガーゼ・ポリペプチドを含む、前記方法に関する。
【００２９】
[0044]１つの態様において、１またはそれより多い核酸分子を連結する方法は、１またはそれより多い融合ポリペプチドと１またはそれより多い核酸分子を接触させる工程を含み、ここで、１またはそれより多い融合ポリペプチドは、少なくとも１つのＤＮＡ結合ポリペプチドに融合した少なくとも１つのＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドを含む。
【００３０】
[0045]１つの態様において、１またはそれより多い核酸分子はＤＮＡ分子である。別の態様において、１またはそれより多い核酸分子は少なくとも２つのＤＮＡ分子である。
[0046]１つの態様において、１またはそれより多い核酸分子は１またはそれより多いＤＮＡ二重鎖である。
【００３１】
[0047]１つの態様において、ＤＮＡ二重鎖の１またはそれより多くは、５’または３’オーバーハングを含む。
[0048]１つの態様において、１またはそれより多いＤＮＡ二重鎖は、５’または３’オーバーハングを含まない。
【００３２】
[0049]１つの態様において、１またはそれより多い核酸分子を連結する方法は、１またはそれより多い融合ポリペプチドと１またはそれより多い核酸分子を接触させる工程を含み、ここで、１またはそれより多い融合ポリペプチドは、少なくとも１つのＲＮＡ結合ポリペプチドに融合した少なくとも１つのＲＮＡリガーゼ・ポリペプチドを含む。
【００３３】
[0050]１つの態様において、１またはそれより多い核酸分子はＲＮＡ分子である。別の態様において、１またはそれより多い核酸分子は少なくとも２つのＲＮＡ分子である。１つの態様において、１またはそれより多い核酸分子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子および少なくとも１つのＲＮＡ分子である。
【００３４】
[0051]多様な態様において、１またはそれより多い融合ポリペプチドは、少なくとも１つのＲＮＡ結合ポリペプチドに融合した少なくとも１つのポリヌクレオチド−リガーゼ・ポリペプチドを含むか、あるいは１またはそれより多い融合ポリペプチドは、少なくとも１つのＤＮＡ結合ポリペプチドに融合した少なくとも１つのポリヌクレオチド−リガーゼ・ポリペプチドを含む。
【００３５】
[0052]多様な態様において、１またはそれより多い融合ポリペプチドは、少なくとも１つのポリヌクレオチド結合ポリペプチドに融合した少なくとも１つのＲＮＡリガーゼ・ポリペプチドを含むか、あるいは１またはそれより多い融合ポリペプチドは、少なくとも１つのポリヌクレオチド結合ポリペプチドに融合した少なくとも１つのＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドを含む。
【００３６】
[0053]本発明の別の側面は、ホスホジエステル結合の形成を触媒する方法であって、融合ポリペプチドと１またはそれより多い核酸分子を接触させる工程を含む、ここで、融合ポリペプチドが、少なくとも１つのポリヌクレオチド結合ポリペプチドに融合した少なくとも１つのポリヌクレオチド−リガーゼ・ポリペプチドを含む、前記方法に関する。
【００３７】
[0054]１つの態様において、ホスホジエステル結合の形成を触媒する方法は、融合ポリペプチドと１またはそれより多い核酸分子を接触させる工程を含み、ここで、融合ポリペプチドは、少なくとも１つのＤＮＡ結合ポリペプチドに融合した少なくとも１つのＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドを含む。
【００３８】
[0055]１つの態様において、ホスホジエステル結合の形成を触媒する方法は、融合ポリペプチドと１またはそれより多い核酸分子を接触させる工程を含み、ここで、融合ポリペプチドは、少なくとも１つのＲＮＡ結合ポリペプチドに融合した少なくとも１つのＲＮＡリガーゼ・ポリペプチドを含む。
【００３９】
[0056]１つの態様において、ホスホジエステル結合は分子内結合である。別の態様において、ホスホジエステル結合は分子間結合である。
[0057]１つの態様において、方法は、５’または３’オーバーハングを含む、１またはそれより多いＤＮＡ二重鎖の連結を含む。特に意図されるのは、適合するオーバーハング末端を持つ１またはそれより多いＤＮＡ二重鎖の連結（すなわち、いわゆる「粘着性（ｓｔｉｃｋｙ）」または「付着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ−ｅｎｄｅｄ）」連結）を含む方法である。
【００４０】
[0058]１つの態様において、方法は、５’または３’オーバーハングを含まない、１またはそれより多いＤＮＡ二重鎖の連結（すなわち、いわゆる「平滑端連結」）を含む。
[0059]適合するオーバーハング末端を含む１またはそれより多いＤＮＡ二重鎖の連結を含む態様において、好ましい融合ポリペプチドは、ｐ５０−リガーゼ、リガーゼ−ｐ５０、ＮＦＡＴ−リガーゼ、リガーゼ−ｃＴＦ、ＰｐｒＡ−リガーゼ、リガーゼ−ＰｐｒＡ、ｐ５０−ＬｉｇＡ、およびＬｉｇＡ−ｐ５０を含む群より選択可能であり、ｐ５０−リガーゼ、リガーゼ−ｃＴＦ、リガーゼ−ＰｐｒＡ、ｐ５０−ＬｉｇＡ、およびＬｉｇＡ−ｐ５０が特に好ましい。
【００４１】
[0060]５’または３’オーバーハングを持たないか、あるいは適合する末端を持たない、１またはそれより多いＤＮＡ二重鎖の連結を含む態様において、好ましい融合ポリペプチドは、ｐ５０−リガーゼ、リガーゼ−ｃＴＦ、リガーゼ−ｐ５０、ＮＦＡＴ−リガーゼ、リガーゼ−ＰｐｒＡ、およびＬｉｇＡ−ｐ５０を含む群より選択可能であり、ｐ５０−リガーゼ、リガーゼ−ｃＴＦ、およびリガーゼ−ＰｐｒＡが特に好ましい。
【００４２】
[0061]本発明の別の側面は、１またはそれより多い核酸分子を連結するための融合ポリペプチドであって、少なくとも１つのポリヌクレオチド結合ポリペプチドに融合した少なくとも１つのポリヌクレオチド−リガーゼ・ポリペプチドを含む、前記融合ポリペプチドに関する。
【００４３】
[0062]１つの態様において、１またはそれより多い核酸分子を連結するための融合ポリペプチドは、少なくとも１つのＤＮＡ結合ポリペプチドに融合した少なくとも１つのＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドを含む。
【００４４】
[0063]１つの態様において、融合ポリペプチドは、Ｓｓｏ７ｄ−リガーゼ、ｐ５０−リガーゼ、リガーゼ−ｐ５０、ＮＦＡＴ−リガーゼ、リガーゼ−ＮＦＡＴ、ｃＴＦ−リガーゼ、リガーゼ−ｃＴＦ、ＰｐｒＡ−リガーゼ、リガーゼ−ＰｐｒＡ、ｐ５０−ＬｉｇＡおよびＬｉｇＡ−ｐ５０を含む群より選択され、その代表的な例を、本明細書において、実施例に記載する。
【００４５】
[0064]１つの態様において、１またはそれより多い核酸分子を連結するための融合ポリペプチドは、少なくとも１つのＲＮＡ結合ポリペプチドに融合した少なくとも１つのＲＮＡリガーゼ・ポリペプチドを含む。
【００４６】
[0065]１またはそれより多い核酸分子の連結のための、あるいはホスホジエステル結合の形成を触媒するための、組成物の調製における、上記のような融合ポリペプチドの使用もまた、特に予期される。
【００４７】
[0066]以下の態様は、上記側面のいずれに関連することも可能である。
[0067]多様な態様において、ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドは、原核ＤＮＡリガーゼ、原核ＤＮＡリガーゼ変異体、またはその機能性断片である。
【００４８】
[0068]１つの態様において、ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドは、細菌ＤＮＡリガーゼ、細菌ＤＮＡリガーゼ変異体、またはその機能性断片である。
[0069]１つの態様において、ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドは、ウイルスＤＮＡリガーゼ、ウイルスＤＮＡリガーゼ変異体、またはその機能性断片であり、例えばバクテリオファージＤＮＡリガーゼ、その変異体、もしくは機能性断片を含む。
【００４９】
[0070]特に意図されるのは、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチド（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ２４２７８）、その変異体または機能性断片、あるいはバクテリオファージＴ４  ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチド（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ０００３９）、その変異体または機能性断片である。
【００５０】
[0071]多様な態様において、ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドは、真核ＤＮＡリガーゼ、その変異体、または機能性断片であり、真菌ＤＮＡリガーゼ、または哺乳動物ＤＮＡリガーゼ、あるいはその変異体または機能性断片を含む。いくつかの態様において、ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドは、哺乳動物ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩ、ＤＮＡ修復タンパク質ＸＲＣＣ１と組み合わされたＤＮＡリガーゼＩＩＩを含むＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ＸＲＣＣ４と組み合わされたＤＮＡリガーゼＩＶを含むＤＮＡリガーゼＩＶ、あるいはその変異体または機能性断片を含む群より選択される。
【００５１】
[0072]多様な態様において、ＲＮＡリガーゼ・ポリペプチドは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、例えばＴ４  ＲＮＡリガーゼＩまたはＴ４  ＲＮＡリガーゼＩＩである。
[0073]多様な態様において、ＤＮＡ結合ポリペプチドは、配列非特異的ＤＮＡ結合ポリペプチドである。
【００５２】
[0074]多様な態様において、ＤＮＡ結合ポリペプチドは、染色体タンパク質、ヒストン、ＨＭｆ様タンパク質、および古細菌（ａｒｃｈｅａｌ）低分子塩基性ＤＮＡ結合タンパク質を含む群より選択される。
【００５３】
[0075]特定の態様において、ＤＮＡ結合ポリペプチドは、
デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）のＰｐｒＡタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＢＡＡ２１３７４）；
ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）由来のＮＦ−カッパＢタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿００３９８９）、または１もしくはそれより多いその断片、例えばＮＦ−カッパＢ  ｐ６５タンパク質、ＮＦ−カッパＢ  ｐ５０タンパク質、もしくはヒトＮＦ−カッパＢタンパク質のアミノ酸４０〜３６６を含む断片を含む、哺乳動物ＮＦ−カッパＢタンパク質；
結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のＫｕタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿２１５４５２）；
スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）由来のＳｓｏ７ｄタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿３４３８８９）；
スルホロブス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）由来のＳａｃ７ｄタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｐ１３１２３）；
デイノコッカス・ラディオデュランスのＤｄｒＡタンパク質（本明細書にその全体が援用される、米国特許第７５５０５６４号に記載されるようなもの）；
哺乳動物ＮＦＡＴｃタンパク質、例えば、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）由来のＮＦＡＴｃ１タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿０５８０７１）、またはマウス由来のＮＦＡＴｃ１タンパク質のアミノ酸４０３〜７０３を含む断片などの１もしくはそれより多い機能性断片、または１もしくはそれより多い機能性変異体；
あるいは１もしくはそれより多いその相同体、機能性変異体もしくは機能性断片、またはその２もしくはそれより多い組み合わせ、例えば、ヒトＮＦ−カッパＢ由来のアミノ酸２４９〜３６６に、アラニン残基を通じて融合した、マウス由来のＮＦＡＴｃのアミノ酸４０３〜５７９を含む、ＮＦＡＴ−Ａｌａ−ｐ５０ハイブリッドＤＮＡ結合タンパク質（本明細書においてｃＴＦと称される；本明細書にその全体が援用される、ｄｅ  Ｌｕｍｌｅｙら（２００４），  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３３９，  １０５９−１０７５を参照されたい）
を含む群より選択される。
【００５４】
[0076]１つの態様において、ＤＮＡ結合ポリペプチドは、配列特異的ＤＮＡ結合ポリペプチド、あるいはその機能性変異体または機能性断片である。
[0077]多様な態様において、ＤＮＡ結合ポリペプチドは、ジンクフィンガー・ポリペプチド、ヘリックス−ターン−ヘリックス・ポリペプチド、ヘリックス−ループ−ヘリックス・ポリペプチド、ロイシンジッパー・ポリペプチド、およびＲｅｌファミリー転写因子を含む転写因子を含む群より選択される。
【００５５】
[0078]多様な態様において、融合ポリペプチドをコードする核酸配列は：
ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドをコードする核酸配列の５’もしくは３’端と連続した、ＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする核酸配列、または
ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドをコードする核酸配列の５’もしくは３’端と、所望の長さのポリヌクレオチド・リンカーもしくはスペーサー配列を通じて、間接的に融合した、ＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする核酸配列；または
ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドをコードする核酸配列内に、場合によって所望の長さのポリヌクレオチド・リンカーもしくはスペーサー配列を通じて挿入された、ＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする核酸配列；または
ＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする核酸配列内に、場合によって所望の長さのポリヌクレオチド・リンカーもしくはスペーサー配列を通じて挿入された、ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドをコードする核酸配列；または
ＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする核酸配列およびＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドをコードする核酸配列の間に配置された、プロテアーゼ切断部位をコードする核酸配列；または
ＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする核酸配列およびＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドをコードする核酸配列の間に配置された、自己スプライシング要素をコードする核酸配列；あるいは
その２またはそれより多い任意の組み合わせ
を含む。
【００５６】
[0079]多様な態様において、少なくとも１つの融合ポリペプチドは：
ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドを含むアミノ酸配列のＮもしくはＣ末端と連続した、ＤＮＡ結合ポリペプチドを含むかもしくはＤＮＡ結合ポリペプチド結合ドメインを含むアミノ酸配列；または
ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドを含むアミノ酸配列のＮもしくはＣ末端と、所望の長さのペプチド・リンカーもしくはスペーサー配列を通じて、間接的に融合した、ＤＮＡ結合ポリペプチドを含むアミノ酸配列；または
ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドを含むアミノ酸配列内に、所望の長さのペプチド・リンカーもしくはスペーサー配列を通じて挿入された、ＤＮＡ結合ポリペプチドを含むアミノ酸配列；または
ＤＮＡ結合ポリペプチドを含むアミノ酸配列およびＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドをコードするアミノ酸配列の間に配置された、プロテアーゼ切断部位を含むアミノ酸配列；または
ＤＮＡ結合ポリペプチドを含むアミノ酸配列およびＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドをコードするアミノ酸配列の間に配置された、自己スプライシング要素を含むアミノ酸配列；あるいは
その２またはそれより多い任意の組み合わせ
を含む。
【００５７】
[0080]多様な態様において、少なくとも１つの融合ポリペプチドは、改善された安定性、例えば室温での改善された安定性、あるいは、２０℃、１９℃、１８℃、１７℃、１６℃、１５℃、１４℃、１３℃、１２℃、１１℃、１０℃、９℃、８℃、７℃、６℃、５℃、４℃、３℃、２０℃、２℃、１℃、または０℃での改善された安定性を有する。例えば、融合ポリペプチドは、室温で、あるいは２０℃、１９℃、１８℃、１７℃、１６℃、１５℃、１４℃、１３℃、１２℃、１１℃、１０℃、９℃、８℃、７℃、６℃、５℃、４℃、３℃、２０℃、２℃、１℃、または０℃で保存された際、少なくとも約２４時間、少なくとも約２０時間、約１６時間、約１２時間、約１１時間、約１０、９、８、７、６、５、４、３、または約２時間または約１時間、活性を保持する。
【００５８】
[0081]多様な態様において、発現構築物は、恒常的または制御可能プロモーター系を含む。
[0082]多様な態様において、制御可能プロモーター系は、誘導可能または抑制可能プロモーター系である。
【００５９】
[0083]多様な態様において、制御可能プロモーター系は、ＬａｃＩ、Ｔｒｐ、ファージλ、ファージＲＮＡポリメラーゼ、および大腸菌ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター系より選択される。
【００６０】
[0084]１つの態様において、プロモーターは、当業者に知られる、任意の強いプロモーターである。適切な強いプロモーターは、アデノウイルスプロモーター、例えばアデノウイルス主要後期プロモーター；または異種プロモーター、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター；誘導可能プロモーター、例えばＭＭＴプロモーター、メタロチオネイン・プロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミン・プロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒト・グロビン・プロモーター；ウイルス・チミジン・キナーゼ・プロモーター、例えば単純ヘルペス・チミジン・キナーゼ・プロモーター；レトロウイルスＬＴＲ；ｂ−アクチン・プロモーター；ヒト成長ホルモン・プロモーター；ファージ・プロモーター、例えばＴ５、Ｔ７、ＳＰ６およびＴ３  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、およびカリフラワー・モザイク３５Ｓ（ＣａＭＶ  ３５Ｓ）プロモーターを含む。
【００６１】
[0085]多様な態様において、プロモーターは、配列番号５のヌクレオチド１〜９５に示すような配列を有するプロモーターである。
[0086]多様な態様において、融合ポリペプチドは、配列番号６、８、１０、または１６の１つに由来する１０またはそれより多い連続アミノ酸を含む。好ましくは、融合ポリペプチドは、配列番号６、８、１０、または１６の１つに由来する少なくとも１５、少なくとも２０、より好ましくは少なくとも３０、より好ましくは少なくとも４０、より好ましくは少なくとも５０、より好ましくは少なくとも６０、より好ましくは少なくとも７０、より好ましくは少なくとも８０、より好ましくは少なくとも９０、より好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも１５０、またはより好ましくは少なくとも２００の連続アミノ酸を含む。
【００６２】
[0087]１つの態様において、融合ポリペプチドは、配列番号６、８、１０、または１６の１つの配列を含むポリペプチドの機能性変異体または機能性断片である。
[0088]多様な例示的態様において、融合ポリペプチドは：
配列番号６のアミノ酸１８〜３４４；
配列番号８のアミノ酸１８〜３００；
配列番号１０のアミノ酸１８〜７９；または
配列番号１６のアミノ酸５１４〜８４２
を含む群より選択される配列由来の少なくとも１０の連続アミノ酸；
および：
配列番号６のアミノ酸３５８〜８４３；
配列番号８のアミノ酸３１１〜７９６；
配列番号１０のアミノ酸９０〜５７５；または
配列番号１６のアミノ酸１８〜５０３
を含む群より選択される配列由来の少なくとも１０の連続アミノ酸
を含む。
【００６３】
[0089]多様な例示的態様において、融合ポリペプチドは、配列番号６、８、１０、または１６の１つの配列を含む。
[0090]多様な態様において、本発明は、配列番号５、７、９、または１５の１つに由来する少なくとも１０の連続ヌクレオチドを含む、単離、精製または組換えポリヌクレオチドを提供する。
【００６４】
[0091]多様な例示的態様において、ポリヌクレオチドは：
配列番号５のヌクレオチド１６６〜１１４６；
配列番号５のヌクレオチド１６６〜１１８５；
配列番号７のヌクレオチド１６６〜１０１４；
配列番号７のヌクレオチド１６６〜１０４４；
配列番号９のヌクレオチド１６６〜３５１；
配列番号９のヌクレオチド１６６〜３８１；
配列番号１５のヌクレオチド１６２４〜２６４０；または
配列番号１５のヌクレオチド１６５４〜２６４０
を含む群より選択される配列由来の少なくとも１０の連続ヌクレオチド；
および：
配列番号５のヌクレオチド１１４７〜２６４３；
配列番号５のヌクレオチド１１８６〜２６４３；
配列番号７のヌクレオチド１０１５〜２５０２；
配列番号７のヌクレオチド１０４５〜２５０２；
配列番号９のヌクレオチド３５２〜１８３９；
配列番号９のヌクレオチド３８２〜１８３９；
配列番号１５のヌクレオチド１６６〜１６２３；または
配列番号１５のヌクレオチド１６６〜１６５３
を含む群より選択される配列由来の少なくとも１０の連続ヌクレオチド
を含む。
【００６５】
[0092]１つの態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号５のヌクレオチド１６６〜１１４６を含むか、またはポリヌクレオチドは、配列番号５のヌクレオチド１６６〜１１８５を含む。別の態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号５のヌクレオチド１１４７〜２６４３を含む。
【００６６】
[0093]さらなる態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号５のヌクレオチド１６６〜２６４３を含む。例示的な態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号５の配列を含む。
【００６７】
[0094]多様な態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号７のヌクレオチド１６６〜１０１４を含むか、またはポリヌクレオチドは、配列番号７のヌクレオチド１６６〜１０４４を含むか、またはポリヌクレオチドは、配列番号７のヌクレオチド１０１５〜２５０２を含む。
【００６８】
[0095]例示的な態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号７のヌクレオチド１６６〜２５０２を含む。さらなる例示的な態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号７の配列を含む。
【００６９】
[0096]多様な態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号９のヌクレオチド１６６〜３５１を含むか、またはポリヌクレオチドは、配列番号９のヌクレオチド１６６〜３８１を含むか、またはポリヌクレオチドは、配列番号９のヌクレオチド３５２〜１８３９を含む。
【００７０】
[0097]１つの例示的な態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号９のヌクレオチド１６６〜１８３９を含む。さらなる例示的な態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号９の配列を含む。
【００７１】
[0098]多様なさらなる態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号１５のヌクレオチド１６６〜１６２３を含むか、またはポリヌクレオチドは、配列番号１５のヌクレオチド１６６〜１６５３を含むか、またはポリヌクレオチドは、配列番号１５のヌクレオチド１６２４〜２６４０を含むか、またはポリヌクレオチドは、配列番号１５のヌクレオチド１６５４〜２６４０を含む。
【００７２】
[0099]例示的な態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号１５のヌクレオチド１６６〜２６４０を含む。さらなる例示的な態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号１５の配列を含む。
【００７３】
[00100]多様な態様において、細胞は、各々、異なる融合ポリペプチドをコードする、２またはそれより多い異なる発現構築物を含む。
[00101]本明細書に開示する数の範囲（例えば、１〜１０）に対する言及はまた、その範囲内のすべての有理数（例えば、１、１．１、２、３、３．９、４、５、６、６．５、７、８、９および１０）、およびまたその範囲内の任意の範囲の有理数（例えば、２〜８、１．５〜５．５および３．１〜４．７）も取り込み、そしてしたがって、本明細書に明らかに開示されるすべての範囲のすべての下位範囲が、本明細書に明らかに開示される。これらは、特に意図されるものの単なる例であり、そして列挙される最低値および最高値の間の数値のすべてのありうる組み合わせが、同様の方式で、本出願に明らかに言及されると見なされるものとする。
【００７４】
[00102]本明細書において、特許明細書、他の外部文書、または他の情報供給源に言及する場合、これは一般的に、本発明の特徴を論じるための背景を提供する目的のためである。特に別に言及しない限り、こうした外部文書に対する言及は、こうした文書、またはこうした情報供給源が、いかなる権威においても、先行技術であるか、または当該技術分野における共通の一般的な知識の一部を形成することの承認として解釈されないものとする。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
[00103]本発明のさらなる側面は、例示のみによって提供される以下の説明から、そして付随する図を参照すると、明らかとなるであろう。
【図１】[00104]図１ａは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ融合タンパク質を用いた付着端連結に関する、ゲルに基づくｉｎ  ｖｉｔｒｏ連結活性アッセイの代表を示す。装填された試料は：分子マーカー（レーン１および９）、Ｓｓｏ７ｄ−リガーゼ（レーン２）、ｃＴＦ−リガーゼ（レーン３）、リガーゼ−ｃＴＦ（レーン４）、ｐ５０−リガーゼ（レーン５）、リガーゼ−ｐ５０（レーン６）、ＮＦＡＴ−リガーゼ（レーン７）、リガーゼ−ＮＦＡＴ（レーン８）、ＰｐｒＡ−リガーゼ（レーン１０）、リガーゼ−ＰｐｒＡ（レーン１１）、Ｋｕ−リガーゼ（レーン１２）、リガーゼ−ｋｕ（レーン１３）、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（レーン１４）、陰性対照（レーン１５）である。[00105]図１ｂは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ融合タンパク質を用いた平滑端連結に関する、ゲルに基づくｉｎ  ｖｉｔｒｏ連結活性アッセイの代表を示す。図１ａに関するものと同じ試料を装填する。
【図２】[00106]図２ａは、大腸菌ＬｉｇＡリガーゼ融合タンパク質を用いた付着端連結に関する、ゲルに基づくｉｎ  ｖｉｔｒｏ連結活性アッセイの代表を示す。装填された試料は：分子マーカー（レーン１および５）、ＬｉｇＡ（レーン２）、ＬｉｇＡ−ｐ５０（レーン３）、ｐ５０−ＬｉｇＡ（レーン４）、陽性対照（レーン６）、陰性対照（レーン７）、商業的対照（レーン８）である。 [00107]図２ｂは、大腸菌ＬｉｇＡリガーゼ融合タンパク質を用いた平滑端連結に関する、ゲルに基づくｉｎ  ｖｉｔｒｏ連結活性アッセイの代表を示す。図２ａに関するものと同じ試料を装填する。
【図３】[00108]図３は、本明細書において実施例５に記載するような定量的ＰＣＲに基づく連結活性アッセイの結果を示すグラフである。
【図４】[00108]図４は、本明細書において実施例５に記載するような定量的ＰＣＲに基づく連結活性アッセイの結果を示すグラフである。
【図５】[00109]図５は、平滑端連結に関する、ゲルに基づくｉｎ  ｖｉｔｒｏ連結活性アッセイの代表を示す。装填された試料は：Ｓｓｏ７ｄ−リガーゼ（レーン１）、ｐ５０−リガーゼ（レーン２）、リガーゼ−ＰｐｒＡ（レーン３）、リガーゼ−ｃＴＦ（レーン４）、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（レーン５）、陰性対照（レーン６）、陽性対照（レーン７）、分子マーカー（レーン８）である。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
[00110]本発明は、融合ポリペプチドおよびその使用に関する。特に、本発明は、ポリヌクレオチド結合ポリペプチド、例えばＤＮＡ結合ポリペプチドと融合した、ポリヌクレオチド−リガーゼ・ポリペプチド、例えばＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドを含む融合ポリペプチドとともに、こうした融合物を産生する方法、および多様な分子生物学的方法におけるその使用に関する。
【００７７】
１．定義
[00111]句「古細菌低分子塩基性ＤＮＡ結合タンパク質」は、通常、５０〜７５アミノ酸の間のタンパク質であって、天然古細菌低分子塩基性ＤＮＡ結合タンパク質、例えばスルホロブス・ソルファタリカス由来のＳｓｏ−７ｄに、少なくとも約５０％同一性を有するか、または天然古細菌低分子塩基性ＤＮＡ結合タンパク質に対して生成され、そして該タンパク質に特異的である抗体に結合するかいずれかのタンパク質を指す。
【００７８】
[00112]用語「コーディング領域」または「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）は、適切な制御配列の調節下で、転写産物および／またはポリペプチドを産生可能なゲノムＤＮＡ配列のセンス鎖またはｃＤＮＡ配列を指す。コーディング配列は、５’翻訳開始コドンおよび３’翻訳停止コドンの存在によって同定される。遺伝子構築物内に挿入された場合、「コーディング配列」は、プロモーターおよびターミネーター配列に機能可能であるように連結された際に発現されることが可能である。
【００７９】
[00113]用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本明細書において、「少なくとも一部〜からなる」を意味する。用語「含む」を含む、本明細書中の各言及を解釈する際、該用語によって前置きされる単数または複数のもの以外の特徴もまた、存在可能である。関連する用語、例えば「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」は、同じ方式で解釈されるものとする。
【００８０】
[00114]当業者は、いくつかのポリヌクレオチド結合ポリペプチドが、ＤＮＡおよびＲＮＡ両方に（そして実際、他のポリヌクレオチド類似体に）対して活性を有することを認識するであろう。したがって、用語「ポリヌクレオチド結合ポリペプチド」は、１またはそれより多いポリヌクレオチド、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその類似体に結合可能なポリペプチドを指す。
【００８１】
[00115]用語「ＤＮＡ結合ポリペプチド」は、本明細書において、ＤＮＡに結合可能なポリペプチドを指し、そして一本鎖ＤＮＡに結合するポリペプチド、二本鎖ＤＮＡに結合するもの、および別の立体配置のＤＮＡに結合するものを含む。本明細書に記載するとおり、ＤＮＡ結合ポリペプチドまたはリガーゼのいずれも不活性化することなく、ＤＮＡ結合ポリペプチドを、ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチド、例えばＤＮＡリガーゼのＮ末端またはＣ末端に融合させることも可能である。ＤＮＡ結合ポリペプチドがまた、ＤＮＡ以外のポリヌクレオチド、例えばＲＮＡ、または天然ヌクレオチドの既知の類似体にもまた結合可能であることを認識しなければならない。
【００８２】
[00116]当業者は、いくつかのポリヌクレオチド−リガーゼ・ポリペプチドが、ＤＮＡおよびＲＮＡ両方に（そして実際、他のポリヌクレオチド類似体に）対して活性を有することを認識するであろう。したがって、用語「ポリヌクレオチド−リガーゼ・ポリペプチド」は、ホスホジエステル結合の形成を触媒可能なポリペプチドを指す。
【００８３】
[00117]用語「ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチド」は、本明細書において、主に、ＤＮＡポリヌクレオチドに対する優先的な活性を示すポリペプチドに関して用いられる可能性もあり、本明細書において、該用語は、一般的に、ホスホジエステル結合の形成を触媒可能なポリペプチドを指す。
【００８４】
[00118]用語「ドメイン」は、タンパク質またはタンパク質複合体の単位であって、その単位が定義された機能を有する場合、ポリペプチド下位配列、完全ポリペプチド配列、または複数のポリペプチド配列を含む、前記単位を指す。機能は、広く定義されることが理解され、そしてリガンド結合、触媒活性であってもよいし、あるいはタンパク質の構造に対する、安定化された効果を有してもよい。
【００８５】
[00119]用語「発現構築物」は、挿入されたポリヌクレオチド分子の転写を可能にし、そして場合によって、転写物を翻訳してポリペプチドにすることを可能にするのに必要な要素を含む、遺伝子構築物を指す。発現構築物は、典型的には、５’から３’方向に：
（１）構築物が導入されるであろう宿主細胞において機能性であるプロモーター、
（２）発現しようとするポリヌクレオチド、および
（３）構築物を導入しようとする宿主細胞において機能性であるターミネーター
を含む。
【００８６】
[00120]本発明の発現構築物を、クローニング用または発現用の複製可能ベクター内に挿入してもよいし、あるいは宿主ゲノム内に取り込ませてもよい。
[00121]ポリペプチドの「断片」は、酵素活性または結合活性に必要である機能を果たし、そして／またはポリペプチドの３つの三次元構造を提供するポリペプチドの下位配列である。
【００８７】
[00122]用語「融合ポリペプチド」は、本明細書において、融合されて（例えば、それぞれのアミノ残基およびカルボキシル残基を通じたペプチド連結によって）単一の連続ポリペプチドを形成する、２またはそれより多いアミノ酸下位配列、例えば２またはそれより多いポリペプチドドメインを含むポリペプチドを指す。２またはそれより多いアミノ酸配列を直接融合させるか、あるいはリンカーまたはスペーサーまたはさらなるポリペプチドを通じて、それぞれのアミノ末端およびカルボキシル末端を通じ、間接的に融合させるかいずれかが可能であることが理解されなければならない。
【００８８】
[00123]１つの態様において、融合ポリペプチドを含むアミノ酸配列の１つは、ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドを含む。１つの態様において、融合ポリペプチドを含むアミノ酸配列の１つは、ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む。ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドおよびＤＮＡ結合ポリペプチドを含む、例示的な融合ポリペプチドは、実施例および配列ＩＤ表において、本明細書に提示され、そして本明細書において具体的に予期される。
【００８９】
[00124]１つの態様において、融合ポリペプチドのアミノ酸下位配列は、リンカーまたはスペーサーを通じて間接的に融合され、前記融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、ＤＮＡリガーゼ−リンカー−ＤＮＡ結合ポリペプチドまたはＤＮＡ結合ポリペプチド−リンカー−ＤＮＡリガーゼ、あるいはＤＮＡリガーゼ−リンカー−ＤＮＡ結合ポリペプチド結合ドメインまたはＤＮＡ結合ポリペプチド結合ドメイン−リンカー−ＤＮＡリガーゼの順に配置される。他の態様において、融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＤＮＡリガーゼ−さらなるポリペプチド−ＤＮＡ結合ポリペプチドまたはＤＮＡリガーゼ−さらなるポリペプチド−ＤＮＡ結合ポリペプチド結合ドメイン、あるいはＤＮＡリガーゼ−リンカー−ＤＮＡ結合ポリペプチド−さらなるポリペプチドまたはＤＮＡリガーゼ−リンカー−ＤＮＡ結合ポリペプチド結合ドメイン−さらなるポリペプチドの順に配置された、さらなるポリペプチドを通じて間接的に融合しても、またはこうしたものを含んでもよい。再び、ポリヌクレオチド−リガーゼ・ポリペプチド、例えばＤＮＡリガーゼのＮ末端伸長およびＣ末端伸長の両方が、本明細書に明らかに予期される。
【００９０】
[00125]本発明記載の融合ポリペプチドはまた、別のポリペプチドの配列内に挿入された、１またはそれより多いポリペプチド配列も含んでもよい。例えば、プロテアーゼ認識配列などのポリペプチド配列を、ＤＮＡ結合ドメインを含むタンパク質の可変領域内に挿入してもよい。
【００９１】
[00126]好適には、本発明の融合ポリペプチドは、単一の核酸配列によってコードされてもよく、ここで、該核酸配列は、各々、ポリペプチドまたはポリペプチドドメインをコードする、少なくとも２つの下位配列を含む。特定の態様において、少なくとも２つの下位配列は、単一のオープンリーディングフレームを含むように「インフレーム」で存在し、そしてしたがって、本明細書に予期するような融合ポリペプチドをコードするであろう。他の態様において、少なくとも２つの下位配列は、「アウトオブフレーム」で存在してもよく、そしてリボソームフレームシフト部位、または翻訳の際に融合ポリペプチドが形成されるように、リーディングフレームにおけるシフトを促進する他の配列によって、分離されていてもよい。特定の態様において、少なくとも２つの下位配列は連続である。他の態様において、少なくとも２つのポリペプチドまたはポリペプチドドメインが、さらなるポリペプチドを通じて間接的に融合されているような、上に論じるものなどの他の態様において、少なくとも２つの下位配列は、連続でない。
【００９２】
[00127]用語「遺伝子構築物」は、ポリヌクレオチド分子、通常、限定されるわけではないが、ｃＤＮＡ分子またはＰＣＲ産物などの別のポリヌクレオチド分子（挿入ポリヌクレオチド分子）が挿入されていていてもよい二本鎖ＤＮＡを指す。遺伝子構築物は、挿入ポリヌクレオチド分子を転写し、そして場合によって転写物がポリペプチドに翻訳されることを可能にするのに必要な要素を含有してもよい。挿入ポリヌクレオチド分子は、宿主細胞由来であってもよいし、あるいは異なる細胞または生物由来であってもよいし、そして／あるいは組換えポリヌクレオチドであってもよい。ひとたび宿主細胞内部に入ると、遺伝子構築物は、宿主染色体ＤＮＡ内に組み込まれてもよい。遺伝子構築物は、ベクターに連結されてもよい。
【００９３】
[00128]用語「宿主細胞」は、発現構築物の発現を補助可能な細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞または動物細胞、例えば哺乳動物宿主細胞を指す。
[00129]用語「リンカー」または「スペーサー」は、本明細書において、２またはそれより多いポリペプチド、あるいは２またはそれより多いポリペプチドをコードする２またはそれより多い核酸配列を間接的に融合させるアミノ酸またはヌクレオチド配列に関する。いくつかの態様において、リンカーまたはスペーサーは、長さ約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または約１００アミノ酸またはヌクレオチドである。他の態様において、リンカーまたはスペーサーは、長さ約１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または約１０００アミノ酸またはヌクレオチドである。さらに他の態様において、リンカーまたはスペーサーは、長さ約１〜約１０００アミノ酸またはヌクレオチド、約１０〜約１０００、約５０〜約１０００、約１００〜約１０００、約２００〜約１０００、約３００〜約１０００、約４００〜約１０００、約５００〜約１０００、約６００〜約１０００、約７００〜約１０００、約８００〜約１０００、または約９００〜約１０００アミノ酸またはヌクレオチドである。
【００９４】
[00130]１つの態様において、リンカーまたはスペーサーは、制限酵素認識部位を含んでもよい。別の態様において、リンカーまたはスペーサーは、プロテアーゼ切断認識配列、例えばエンテロキナーゼ、トロンビンまたは因子Ｘａ認識配列、あるいは自己スプライシング要素、例えばインテインを含んでもよい。別の態様において、リンカーまたはスペーサーは、融合ポリペプチドの独立のフォールディングを促進する。
【００９５】
[00131]用語「混合集団」は、本明細書において、混合集団内の各実体集団が、混合集団内の別の実体集団とは、ある点で異なる、２またはそれより多い実体集団を指す。例えば、発現構築物の混合集団に関連して用いた際、これは、各発現構築物集団が、その集団のメンバーによってコードされる融合ポリペプチドに関して異なるか、または構築物のいくつかの他の側面、例えば構築物中に存在するプロモーターの同一性に関して異なる、発現構築物の２またはそれより多い集団を指す。あるいは、融合ポリペプチドの混合集団に関連して用いた際、これは、融合ポリペプチドの各集団が、その集団メンバーが含有するポリペプチド、例えばポリヌクレオチド−リガーゼ・ポリペプチド、例えばＤＮＡリガーゼ、またはポリヌクレオチド結合ポリペプチド、例えばＤＮＡ結合ポリペプチドに関して異なる、融合ポリペプチドの２またはそれより多い集団を指す。
【００９６】
[00132]用語「核酸」は、本明細書において、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド塩基または天然ヌクレオチドの既知の類似体、あるいはその混合物の一本鎖または二本鎖ポリマーを指す。該用語には、別に示さない限り、明記された配列、ならびに該配列に相補的な配列への言及が含まれる。用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書において、交換可能に用いられる。
【００９７】
[00133]「機能可能であるように連結された」は、発現しようとする配列が、プロモーター、組織特異的制御要素、時間的制御要素、エンハンサー、リプレッサーおよびターミネーターを含む制御要素の調節下に置かれることを意味する。
【００９８】
[00134]用語「過剰発現」は、一般的に、正常または非形質転換宿主細胞における産生レベルを超える、宿主細胞中の遺伝子産物の産生を指す。用語「過剰発現」は、メッセンジャーＲＮＡレベルと関連して用いた際、好ましくは、対照または非形質転換細胞の宿主細胞において典型的に観察されるものよりも、少なくとも約３倍高い発現レベルを示す。より好ましくは、発現レベルは、対照宿主細胞または非形質転換細胞において典型的に観察されるものよりも、少なくとも約５倍高い、約１０倍高い、約１５倍高い、約２０倍高い、約２５倍高い、約３０倍高い、約３５倍高い、約４０倍高い、約４５倍高い、約５０倍高い、約５５倍高い、約６０倍高い、約６５倍高い、約７０倍高い、約７５倍高い、約８０倍高い、約８５倍高い、約９０倍高い、約９５倍高い、または約１００倍高いか、またはそれより高い。
【００９９】
[00135]限定されるわけではないが、ノーザンブロット分析および定量的ＲＴ−ＰＣＲを含むＲＴ−ＰＣＲを含む、当業者に知られる多くの技術のいずれかを用いて、ｍＲＮＡレベルを測定する。
【０１００】
[00136]用語「ポリペプチド」は、本明細書において、全長タンパク質を含む、任意の長さであるが好ましくは少なくとも５アミノ酸のアミノ酸鎖を含み、ここで、アミノ酸残基は共有ペプチド結合によって連結されている。本発明のポリペプチドは精製天然産物であってもよいし、あるいは組換えまたは合成技術を用いて、部分的にまたは全体が産生されてもよい。該用語は、ポリペプチド、二量体または他の多量体などのポリペプチド凝集体、融合ポリペプチド、ポリペプチド変異体、あるいはその誘導体を指してもよい。
【０１０１】
[00137]用語「プロモーター」は、遺伝子転写を制御するコード領域上流の転写されないシス制御要素を指す。プロモーターは、転写開始部位および保存されたボックス、例えばＴＡＴＡボックス、ならびに転写因子が結合するモチーフを特定する、シス開始要素を含む。
【０１０２】
[00138]本発明のポリペプチドに関して用いた際、句「活性を保持する」、ならびにその文法的同等物および派生物は、ポリペプチドがなお、有用なリガーゼ活性、有用なポリヌクレオチド結合活性（例えばＤＮＡ結合活性）、または有用なリガーゼ活性および有用なポリヌクレオチド結合活性の両方を有することを意味するよう意図される。好ましくは、保持された活性は、元来の活性の少なくとも約３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９または１００％であり、そして有用な範囲は、これらの値いずれかの間（例えば約３５〜約１００％、約５０〜約１００％、約６０〜約１００％、約７０〜約１００％、約８０〜約１００％、および約９０〜約１００％）から選択可能である。例えば、本発明の好ましいポリペプチドは、所定の保存期間に渡って活性を保持し、例えば、４℃で約１時間置いた後、ポリペプチドの元来の活性の少なくとも約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９または１００％を保持する。同様に、本発明の好ましい組成物は、これらが含むポリペプチドの有用な活性の維持を補助可能であり、そして理想的には、本明細書において予期される方法を用いて適用されるまで、活性を保持すると言うことも可能である。
【０１０３】
[00139]本明細書において、用語「改善された安定性」は、本発明のポリペプチドまたは組成物に関連して用いた際、所定の期間に渡って、または特定の条件下で、あるいはその両方で、例えば４℃で１時間、活性を保持可能なポリペプチド、またはポリペプチドの活性を補助可能な組成物を意味する。特定の態様において、本発明の融合ポリペプチドの保持されたリガーゼ活性は、同じ期間に渡って同じ条件下で維持された際に天然リガーゼ・ポリペプチドによって示されるものよりも高い。他の態様において、本発明の融合ポリペプチドの保持されたポリヌクレオチド結合活性は、同じ期間に渡って同じ条件下で維持された際に天然ポリヌクレオチド結合ポリペプチドによって示されるものよりも高い。
【０１０４】
[00140]句「配列非特異的ＤＮＡ結合ドメイン」は、ヌクレオチド配列独立方式で、ＤＮＡ（および場合によって他の核酸）に有意なアフィニティで結合する、ポリペプチドドメインを指す。例えば、同じヌクレオチド組成であるが異なるヌクレオチド配列を持つ別の核酸よりも、１０倍より高い、または２０倍より高い、５０倍より高い、または１００倍より高いアフィニティで該ポリペプチド・ドメインに結合可能な核酸は知られていない。
【０１０５】
[00141]句「配列特異的ＤＮＡ結合ドメイン」は、ヌクレオチド配列依存方式で、ＤＮＡ（および場合によって他の核酸）に有意なアフィニティで結合する、ポリペプチドドメインを指す。例えば、同じヌクレオチド組成であるが異なるヌクレオチド配列を持つ別の核酸よりも、１０倍より高い、または２０倍より高い、５０倍より高い、または１００倍より高いアフィニティで該ポリペプチド・ドメインに結合可能な核酸が知られている。
【０１０６】
[00142]用語「物質」は、融合ポリペプチドに結合したかまたはその中に吸収されたかもしくは取り込まれたものに関して言及する際、融合パートナーが結合した物質またはポリマー融合ポリペプチドの中に吸収されたかもしくは取り込まれた物質を意味するよう意図される。
【０１０７】
[00143]用語「ターミネーター」は、転写を終結させる配列であって、翻訳される配列下流の遺伝子の３’非翻訳端に見られるものを指す。ターミネーターは、ｍＲＮＡ安定性の重要な決定因子であり、そしていくつかの場合、空間的制御機能を有することが見出されてきている。
【０１０８】
[00144]本明細書に提供するポリヌクレオチド配列の「断片」は、好ましくは、長さ少なくとも１５ヌクレオチドである、連続ヌクレオチドの下位配列である。本発明の断片は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも２０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも３０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも４０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、そして最も好ましくは少なくとも６０の連続ヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチド配列の断片を、アンチセンス、遺伝子サイレンシング、三重らせんまたはリボザイム技術において、あるいはプライマー、マイクロアレイに含まれるプローブとして、あるいはポリヌクレオチドに基づく選択法において、用いてもよい。
【０１０９】
[00145]用語「断片」は、断片が機能可能であるように連結されているポリヌクレオチド配列の発現を制御可能なプロモーター・ポリヌクレオチド配列のシス要素および領域を含む配列を含むように意図される。
【０１１０】
[00146]好ましくは、本発明のポリヌクレオチド配列の断片は、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも２０、より好ましくは少なくとも３０、より好ましくは少なくとも４０、より好ましくは少なくとも５０、より好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも２００、より好ましくは少なくとも３００、より好ましくは少なくとも４００、より好ましくは少なくとも５００、より好ましくは少なくとも６００、より好ましくは少なくとも７００、より好ましくは少なくとも８００、より好ましくは少なくとも９００、および最も好ましくは少なくとも１０００の連続ヌクレオチドを含む。
【０１１１】
[00147]用語「機能性変異体」および「機能性断片」は、本明細書において、例えばＤＮＡリガーゼ（単数または複数）またはＤＮＡ結合ポリペプチド（単数または複数）に関して、特に同定する配列（単数または複数）とは異なり、１またはそれより多いアミノ酸残基が欠失されるか、置換されるか、または付加されているポリペプチド配列、あるいは特に同定する配列（単数または複数）の断片を含む配列を指す。機能性変異体は、天然存在アレル変異体、または非天然存在変異体であってもよい。機能性変異体は、同じ種由来か、または他の種由来であってもよく、そして相同体、パラログおよびオルソログを含んでもよい。ポリペプチドの機能性変異体または機能性断片は、天然に特に同定するポリペプチドの生物学的活性の１またはそれより多く、例えば天然ポリペプチドによって誘発される１またはそれより多い生物学的効果を誘発する能力の１またはそれより多くを所持する。例えば、ＤＮＡリガーゼの機能性断片は、典型的には、ホスホジエステル結合形成を触媒可能であるであろう。
【０１１２】
[00148]機能性変異体または機能性断片は、天然ポリペプチドより高いか、またはより低い活性を有してもよい。１つの例において、機能性変異体または機能性断片が所持する、特に同定する天然ポリペプチドの生物学的活性の１またはそれより多くが、天然ポリペプチドで見られるものよりも、より高いまたはより低い度合いまで、機能性変異体または機能性断片に存在してもよい。別の例において、機能性変異体または機能性断片が所持する、特に同定する天然ポリペプチドの生物学的活性の各々が、天然ポリペプチドで見られるものよりも、より高いまたはより低い度合いまで、機能性変異体または機能性断片に存在する。さらにさらなる例において、天然ポリペプチドの生物学的活性の１またはそれより多くが、天然ポリペプチドに見られるよりも、より高い度合いまで維持されるかまたは存在するが、天然ポリペプチドの生物学的活性の１またはそれより多くの他の生物学的活性が、存在しないか、あるいは天然ポリペプチドに見られるよりも、より低い度合いまで維持されるかまたは存在する、機能性変異体または機能性断片を提供することが望ましい可能性もある。こうした機能性断片の例には、本明細書に記載されるＮＦ−カッパＢおよびＮＦＡＴ  ＤＮＡ結合ポリペプチド断片が含まれる。
【０１１３】
[00149]ポリヌクレオチド−リガーゼ・ポリペプチド、例えばＤＮＡリガーゼ（単数または複数）、またはポリヌクレオチド結合ポリペプチド、例えばＤＮＡ結合ポリペプチドによって誘発される１またはそれより多い生物学的効果を決定するための方法およびアッセイは、当該技術分野に周知であり、そして例が本明細書に記載され、そしてこうした方法およびアッセイを用いて、ポリヌクレオチド・リガーゼ（単数または複数）またはポリヌクレオチド結合ポリペプチドの１またはそれより多い機能性変異体または機能性断片を同定するかまたは検証してもよい。例えば、ＤＮＡリガーゼが２つの直鎖ＤＮＡ断片の連結を触媒して、単一のより大きい断片を形成する能力のアッセイ、例えば本明細書において実施例に記載するようなものは、ＤＮＡリガーゼの１またはそれより多い機能性変異体または機能性断片を同定することが可能である。
【０１１４】
[00150]機能性断片の例には、触媒活性、例えば配列非特異的ＤＮＡ結合、またはホスホジエステル結合形成に関与するアミノ酸配列を含むポリペプチド断片が含まれる。
[00151]好ましくは、本発明のポリペプチド配列の断片（付随する配列同一性リストに特に同定する配列を含む）は、本発明のポリペプチドの少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、より好ましくは少なくとも３０、より好ましくは少なくとも４０、より好ましくは少なくとも５０、より好ましくは少なくとも６０、より好ましくは少なくとも７０、より好ましくは少なくとも８０、より好ましくは少なくとも９０、より好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも１５０、より好ましくは少なくとも２００、より好ましくは少なくとも２５０、より好ましくは少なくとも３００、より好ましくは少なくとも３５０、より好ましくは少なくとも４００、そして最も好ましくは少なくとも４５０の連続アミノ酸を含む。
【０１１５】
[00152]用語「プライマー」は、テンプレートにハイブリダイズし、そしてテンプレートに相補的なポリヌクレオチドの重合をプライミングするのに用いられる、通常、未結合（ｆｒｅｅ）３’ＯＨ基を有する、低分子ポリヌクレオチドを指す。こうしたプライマーは、好ましくは、長さ少なくとも５、より好ましくは少なくとも６、より好ましくは少なくとも７、より好ましくは少なくとも８、より好ましくは少なくとも９、より好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも１１、より好ましくは少なくとも１２、より好ましくは少なくとも１３、より好ましくは少なくとも１４、より好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも１６、より好ましくは少なくとも１７、より好ましくは少なくとも１８、より好ましくは少なくとも１９、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドである。
【０１１６】
[00153]用語「プローブ」は、ハイブリダイゼーションに基づくアッセイにおいて、プローブに相補的なポリヌクレオチド配列を検出するために用いられる、低分子ポリヌクレオチドを指す。プローブは、本明細書に定義するようなポリヌクレオチドの「断片」からなってもよい。好ましくは、こうしたプローブは、長さ少なくとも５、より好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０、より好ましくは少なくとも３０、より好ましくは少なくとも４０、より好ましくは少なくとも５０、より好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも２００、より好ましくは少なくとも３００、より好ましくは少なくとも４００、そして最も好ましくは少なくとも５００ヌクレオチドである。
【０１１７】
[00154]用語「変異体」は、本明細書において、１またはそれより多いヌクレオチドまたはアミノ酸残基が欠失されているか、置換されているか、または付加されている、特に同定する配列と異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指す。変異体は、天然存在アレル変異体、または非天然存在変異体であってもよい。変異体は、同じ種由来か、または他の種由来であってもよく、そして相同体、パラログおよびオルソログを含んでもよい。特定の態様において、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの変異体は、野生型ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのものと同じかまたは類似の生物学的活性を所持する。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関する用語「変異体」は、本明細書に定義するようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドのすべての型を含む。
【０１１８】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド変異体
[00155]用語「ポリヌクレオチド（単数または複数）」は、本明細書において、任意の長さであるが、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドである一本鎖または二本鎖デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド・ポリマーを意味し、そしてこれには、限定されない例として、遺伝子のコードおよび非コード配列、センスおよびアンチセンス配列相補体、エクソン、イントロン、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボザイム、組換えポリペプチド、単離および精製天然存在ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、合成ＲＮＡおよびＤＮＡ配列、核酸プローブ、プライマーおよび断片が含まれる。多くの核酸類似体が当該技術分野で周知であり、そしてまた予期される。
【０１１９】
ポリヌクレオチド変異体
[00156]変異体ポリヌクレオチド配列は、明記するポリヌクレオチド配列に対して、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を示す。同一性は、明記するポリヌクレオチド配列の少なくとも２０ヌクレオチド位、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド位、少なくとも１００ヌクレオチド位の比較ウィンドウに渡って、または全長に渡って、見られる。
【０１２０】
[00157]ポリヌクレオチド配列同一性を以下の方式で決定可能である。ＮＣＢＩ（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）より公的に入手可能なｂｌ２ｓｅｑ（Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．  Ｔａｔｕｓｏｖａ，  Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．  Ｍａｄｄｅｎ（１９９９），  “Ｂｌａｓｔ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  −  ａ  ｎｅｗ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”，  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．  １７４：２４７−２５０）中のＢＬＡＳＴＮ（ＢＬＡＳＴプログラム組、バージョン２．２．１０［２００４年１０月］由来））を用いて、対象ポリヌクレオチド配列を候補ポリヌクレオチド配列に比較する。低複雑度部分のフィルタリングをオフにしなければならないことを除いて、ｂｌ２ｓｅｑのデフォルトパラメーターを利用する。
【０１２１】
[00158]以下のｕｎｉｘコマンド・ラインパラメータを用いて、ポリヌクレオチド配列の同一性を調べてもよい。
[00159]ｂｌ２ｓｅｑ−ｉ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑ１−ｊ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑ２−Ｆ  Ｆ  −ｐ  ｂｌａｓｔｎ
[00160]パラメータ−Ｆ  Ｆは、低複雑度セクションのフィルタリングをオフにする。パラメータ−ｐは、配列対に関して、適切なアルゴリズムを選択する。ｂｌ２ｓｅｑプログラムは、ライン「同一性＝」中に、同一ヌクレオチドの数および割合の両方として、配列同一性を報告する。
【０１２２】
[00161]ポリヌクレオチド配列同一性はまた、広域配列整列プログラム（例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ，  Ｓ．  Ｂ．およびＷｕｎｓｃｈ，  Ｃ．Ｄ．（１９７０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８，  ４４３−４５３）を用いて、候補および対象ポリヌクレオチド配列間の重複全体の長さに渡って計算可能である。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ広域整列アルゴリズムの完全実装は、ＥＭＢＯＳＳパッケージのｎｅｅｄｌｅプログラムに見られ（Ｒｉｃｅ，  Ｐ．  Ｌｏｎｇｄｅｎ，  Ｉ．およびＢｌｅａｓｂｙ，  Ａ．  ＥＭＢＯＳＳ：  Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｊｕｎｅ  ２０００，  ｖｏｌ  １６，  Ｎｏ  ６．  ｐｐ．２７６−２７７）、該パッケージは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＥＭＢＯＳＳ／より入手可能である。Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅサーバーもまた、ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｌｉｇｎ／で、２つの配列間のＥＭＢＯＳＳ−ｎｅｅｄｌｅ広域整列プログラムをオンラインで実行する設備を提供する。
【０１２３】
[00162]あるいは、末端ギャップにペナルティを課さずに、２つの配列の最適広域整列を計算する、ＧＡＰプログラムを用いてもよい。ＧＡＰは以下の論文に記載される：  Ｈｕａｎｇ，  Ｘ．（１９９４）  Ｏｎ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ．  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０，  ２２７−２３５。
【０１２４】
[00163]本発明のポリヌクレオチド変異体はまた、これらの配列の機能性同等性を保持するようであり、そしてランダムな確率によって生じたとは合理的に予期されえない、特に同定する配列の１またはそれより多くに類似性を示すものも含む。ポリペプチドに関するこうした配列類似性は、ＮＣＢＩ（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）より公的に入手可能なＢＬＡＳＴプログラム組（バージョン２．２．１０［２００４年１０月］）由来のｂｌ２ｓｅｑプログラムを用いて、決定可能である。
【０１２５】
[00164]以下のｕｎｉｘコマンド・ラインパラメータを用いて、ポリヌクレオチド配列の類似性を調べてもよい：
[00165]ｂｌ２ｓｅｑ−ｉ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑ１−ｊ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑ２−Ｆ  Ｆ  −ｐ  ｔｂｌａｓｔｘ
[00166]パラメータ−Ｆ  Ｆは、低複雑度セクションのフィルタリングをオフにする。パラメータ−ｐは、配列対に関して、適切なアルゴリズムを選択する。このプログラムは、配列間の類似性領域を発見し、そしてこうした領域各々に関して、ランダム配列を含有する固定された参照サイズのデータベース中、偶然こうしたマッチが見られると予期されうる、期待数である「Ｅ値」を報告する。このデータベースのサイズは、ｂｌ２ｓｅｑプログラムにおいて、デフォルトで設定される。１よりはるかに小さいＥ値に関しては、Ｅ値は、ほぼ、こうしたランダムマッチの確率である。
【０１２６】
[00167]変異体ポリヌクレオチド配列は、好ましくは、特に同定する配列の任意の１つと比較した際、１ｘ１０−１０未満、より好ましくは１ｘ１０−２０未満、１ｘ１０−３０未満、１ｘ１０−４０未満、１ｘ１０−５０未満、１ｘ１０−６０未満、１ｘ１０−７０未満、１ｘ１０−８０未満、１ｘ１０−９０未満、１ｘ１０−１００未満、１ｘ１０−１１０未満、１ｘ１０−１２０未満、または１ｘ１０−１２３未満のＥ値を示す。
【０１２７】
[00168]あるいは、本発明の変異体ポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で、明記するポリヌクレオチド配列、またはその相補体にハイブリダイズする。
[00169]用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」、およびその文法的同等物は、ポリヌクレオチド分子がターゲット・ポリヌクレオチド分子（例えばＤＮＡまたはＲＮＡブロット、例えばサザンブロットまたはノーザンブロット上に固定されたターゲットポリヌクレオチド分子）に、温度および塩濃度の定義された条件下でハイブリダイズする能力を指す。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする能力は、まず、よりストリンジェントでない条件下でハイブリダイズさせ、次いで、所望のストリンジェンシーまでストリンジェンシーを増加させることによって、決定可能である。
【０１２８】
[00170]長さ約１００塩基より大きいポリヌクレオチド分子に関しては、典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、天然二重鎖の融点（Ｔｍ）よりも２５〜３０℃を超えない（例えば１０℃）高さである(一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら監修，  １９８７，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；  Ａｕｓｕｂｅｌら，  １９８７，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇを参照されたい）。約１００塩基より大きいポリヌクレオチド分子に関するＴｍは、式、Ｔｍ＝８１．５＋０．４１％（Ｇ＋Ｃ）−ｌｏｇ（Ｎａ＋）によって計算可能である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら監修，  １９８７，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；  ＢｏｌｔｏｎおよびＭｃＣａｒｔｈｙ，  １９６２，  ＰＮＡＳ  ８４：１３９０）。長さ１００塩基を超えるポリヌクレオチドに関する典型的なストリンジェントな条件は、６ＸＳＳＣ、０．２％ＳＤＳの溶液中の前洗浄；６５℃、６ＸＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中で一晩のハイブリダイゼーション；その後、各々、１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃３０分間の２回の洗浄、および各々、０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃３０分間の２回の洗浄などのハイブリダイゼーション条件であろう。
【０１２９】
[00171]１００塩基未満の長さを有するポリヌクレオチド分子に関しては、例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、Ｔｍの５〜１０℃下である。平均して、１００ｂｐ未満の長さのポリヌクレオチド分子のＴｍは、およそ（５００／オリゴヌクレオチド長）℃に減少する。
【０１３０】
[00172]ペプチド核酸（ＰＮＡ）として知られるＤＮＡ模倣体（Ｎｉｅｌｓｅｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  １９９１  Ｄｅｃ  ６；２５４（５０３７）：１４９７−５００）に関しては、Ｔｍ値は、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに関するものよりも高く、そしてＧｉｅｓｅｎら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９９８  Ｎｏｖ  １；２６（２１）：５００４−６に記載される式を用いて計算可能である。１００塩基未満の長さを有するＤＮＡ−ＰＮＡハイブリッドに関する、例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、Ｔｍの５〜１０℃下である。
【０１３１】
[00173]本発明の変異体ポリヌクレオチドはまた、本発明の配列と異なるが、遺伝暗号の縮重の結果として、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと類似の活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた含む。ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない配列改変は、「サイレント変異」である。ＡＴＧ（メチオニン）およびＴＧＧ（トリプトファン）を除いて、当該技術分野に認識される技術によって、同じアミノ酸に対応する他のコドンを変化させて、例えば特定の宿主生物におけるコドン発現を最適化してもよい。
【０１３２】
[00174]生物学的活性を有意に改変させることなく、コードされるポリペプチド配列中の１またはいくつかのアミノ酸の保存的置換を生じるポリヌクレオチド配列改変もまた、本発明に含まれる。当業者は、表現型的にサイレントであるアミノ酸置換を作製するための方法を知っているであろう（例えば、Ｂｏｗｉｅら，  １９９０，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７，  １３０６を参照されたい）。いくつかの態様において、非保存的アミノ酸置換を生じるポリヌクレオチド配列改変は、望ましくは、本明細書に予期されるような機能性変異体を生じ、そしてこうした配列改変もまた、本発明に含まれる。
【０１３３】
[00175]先に記載するように、ｔｂｌａｓｔｘアルゴリズムを通じて、ＮＣＢＩ（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）より公的に入手可能なＢＬＡＳＴプログラム組（バージョン２．２．１０［２００４年１０月］）由来のｂｌ２ｓｅｑプログラムを用いて、コードされるポリペプチド配列におけるサイレント変異および保存的置換による変異体ポリヌクレオチドを決定してもよい。
【０１３４】
ポリペプチド変異体
[00176]ポリペプチドに関する用語「変異体」は、天然存在、組換えおよび合成産生ポリペプチドを含む。変異体ポリペプチド配列は、本発明の配列に対して、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を示す。同一性は、本発明のポリペプチドの少なくとも２０アミノ酸位、好ましくは少なくとも５０アミノ酸位、少なくとも１００アミノ酸位の比較ウィンドウに渡って、または全長に渡って、見られる。
【０１３５】
[00177]ポリペプチド配列同一性を以下の方式で決定可能である。ＮＣＢＩ（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）より公的に入手可能なｂｌ２ｓｅｑ中のＢＬＡＳＴＰ（ＢＬＡＳＴプログラム組、バージョン２．２．１０［２００４年１０月］由来）を用いて、対象ポリペプチド配列を候補ポリペプチド配列に比較する。低複雑度領域のフィルタリングをオフにしなければならないことを除いて、ｂｌ２ｓｅｑのデフォルトパラメーターを利用する。
【０１３６】
[00178]また、広域配列整列プログラムを用いて、候補および対象ポリヌクレオチド配列間の重複の全長に渡って、ポリペプチド配列同一性を計算してもよい。上に論じるようなＥＭＢＯＳＳ−ｎｅｅｄｌｅ（ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｌｉｇｎ／で入手可能）およびＧＡＰ（Ｈｕａｎｇ，  Ｘ．（１９９４）  Ｏｎ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ．  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０，  ２２７−２３５）もまた、ポリペプチド配列同一性を計算するのに適した広域配列整列プログラムである。
【０１３７】
[00179]本発明のポリペプチド変異体はまた、これらの配列の機能性同等性を保持するようであり、そしてランダムな確率によって生じたとは合理的に予期されえない、特に同定する配列の１またはそれより多くに類似性を示すものも含む。ポリペプチドに関するこうした配列類似性は、ＮＣＢＩ（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）より公的に入手可能なＢＬＡＳＴプログラム組（バージョン２．２．１０［２００４年１０月］）由来のｂｌ２ｓｅｑプログラムを用いて、決定可能である。以下のｕｎｉｘコマンド・ラインパラメータを用いて、ポリペプチド配列の類似性を調べてもよい：
ｂｌ２ｓｅｑ−ｉ  ｐｅｐｔｉｄｅｓｅｑ１−ｊ  ｐｅｐｔｉｄｅｓｅｑ２−Ｆ  Ｆ  −ｐ  ｂｌａｓｔｐ
[00180]変異体ポリペプチド配列は、好ましくは、特に同定する配列の任意の１つと比較した際、１ｘ１０−１０未満、より好ましくは１ｘ１０−２０未満、１ｘ１０−３０未満、１ｘ１０−４０未満、１ｘ１０−５０未満、１ｘ１０−６０未満、１ｘ１０−７０未満、１ｘ１０−８０未満、１ｘ１０−９０未満、１ｘ１０−１００未満、１ｘ１０−１１０未満、１ｘ１０−１２０未満、または１ｘ１０−１２３未満のＥ値を示す。
【０１３８】
[00181]パラメータ−Ｆ  Ｆは、低複雑度セクションのフィルタリングをオフにする。パラメータ−ｐは、配列対に関して、適切なアルゴリズムを選択する。このプログラムは、配列間の類似性領域を発見し、そしてこうした領域各々に関して、ランダム配列を含有する固定された参照サイズのデータベース中、偶然こうしたマッチが見られると予期されうる、期待数である「Ｅ値」を報告する。１よりはるかに小さいＥ値に関しては、Ｅ値は、ほぼ、こうしたランダムマッチの確率である。
【０１３９】
[00182]生物学的活性を有意に改変させない、記載するポリペプチド配列の１またはいくつかのアミノ酸の保存的置換もまた、本発明に含まれる。当業者は、表現型的にサイレントであるアミノ酸置換を作製するための方法を知っているであろう（例えば、Ｂｏｗｉｅら，  １９９０，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７，  １３０６を参照されたい）。同様に、非保存的置換を含む、１またはそれより多いアミノ酸の置換から生じる機能性変異体もまた、本発明に含まれる。
【０１４０】
[00183]本発明のポリペプチド変異体はまた、ポリペプチドをコードする核酸から産生されるが、改変されたアミノ酸配列を有するように、異なってプロセシングされる点で、野生型ポリペプチドとは異なるものも含む。例えば、野生型ポリペプチドを産生するものに対して、一次ＲＮＡ転写物の別のスプライシングパターンによって、変異体を産生することも可能である。
【０１４１】
[00184]用語「ベクター」は、宿主細胞内に遺伝子構築物を輸送するのに用いられるポリヌクレオチド分子、通常二本鎖ＤＮＡを指す。ベクターは、少なくとも１つのさらなる宿主系、例えば大腸菌において、複製可能であってもよい。
【０１４２】
２．ポリヌクレオチド・リガーゼ
[00185]ポリヌクレオチド・リガーゼ（本明細書において、ポリヌクレオチド−リガーゼ・ポリペプチドとも呼ばれる）は、１つのヌクレオチドの３’ヒドロキシル端および別のヌクレオチドの５’リン酸端間のホスホジエステル結合の形成を触媒可能なポリペプチドである。例えば、ＤＮＡリガーゼ（本明細書において、ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドとも呼ばれる）は、１つのデオキシリボース・ヌクレオチドの３’ヒドロキシル端および別のデオキシリボース・ヌクレオチドの５’リン酸端間のホスホジエステル結合の形成を触媒可能なポリペプチドである。ＤＮＡリガーゼは、本明細書にその全体が援用される、Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら（２００６），  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．，  １０６，  ６８７−６９９に有用に概説される。同様に、ＲＮＡリガーゼは、１つのリボース・ヌクレオチドの３’ヒドロキシル端および別のリボース・ヌクレオチドの５’リン酸端間のホスホジエステル結合の形成を触媒する。
【０１４３】
２．１  ウイルスＤＮＡリガーゼ
[00186]最も単純なＤＮＡリガーゼは、バクテリオファージを含むウイルス由来のものである。ウイルスＤＮＡリガーゼは、２つのドメイン：ヌクレオチド結合ドメインおよびＯＢ−フォールド・ドメインを含む（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら，  ２００６）。ウイルスＤＮＡリガーゼは、活性のため、ヌクレオチド補因子アデノシン−５’−三リン酸（ＡＴＰ）を必要とする。バクテリオファージＴ４由来のＤＮＡリガーゼは、平滑端および付着端ＤＮＡ末端を連結するとともに、二重鎖ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド中の一本鎖ニックを修復するため、一般的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ適用に用いられる。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを含むウイルス・リガーゼは、本発明で使用可能でありうる。
【０１４４】
２．２  原核ＤＮＡリガーゼ
[00187]細菌は、活性のため、ＡＴＰよりも補因子ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）を必要とするＤＮＡリガーゼを所持する。ＮＡＤ＋依存性ＤＮＡリガーゼは、ヌクレオチド結合およびＯＢ−フォールド・ドメインからなるコア・モジュールに加えて、ＤＮＡ結合および／または触媒を補助する、１またはそれより多いさらなるドメインを所持する（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら，  ２００６）。大腸菌由来のＮＡＤ＋依存性リガーゼは、平滑端ＤＮＡ末端を連結せず；ＤＮＡをＲＮＡに連結することもない。したがって、該リガーゼは、付着端の選択的連結が必要であるｉｎ  ｖｉｔｒｏ適用に使用可能である。大腸菌ＤＮＡリガーゼを含むＮＡＤ＋依存性細菌リガーゼは、本発明で使用可能でありうる。
【０１４５】
２．３  真核および古細菌ＤＮＡリガーゼ
[00188]真核生物および古細菌由来のＤＮＡリガーゼは、ＡＴＰ依存性マルチドメイン酵素である。真核ゲノムは、各々、１より多いＤＮＡリガーゼをコードする。細胞での異なる役割のための異なるリガーゼの補充は、さらなるタンパク質パートナーとの特異的相互作用によって仲介される（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら，  ２００６）。非常に多数の真核ＤＮＡリガーゼが性質決定されてきており、そしてこれらは、本発明で使用可能でありうる。これらには、一般的に以下の４つのファミリーに属すると見なされる、哺乳動物ＤＮＡリガーゼが含まれる：哺乳動物ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩ（ＤＮＡリガーゼＩＩＩの選択的スプライシング型）、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ（ＤＮＡ修復タンパク質ＸＲＣＣ１と組み合わされたＤＮＡリガーゼＩＩＩを含む）、およびＤＮＡリガーゼＩＶ（ＸＲＣＣ４と組み合わされたＤＮＡリガーゼＩＶを含む）。多くの古細菌ＤＮＡリガーゼもまた性質決定されてきており、そしてこれらは、本発明で使用可能でありうる。これらには、好熱性古細菌リガーゼ、例えば、Ｎｉｓｈｉｄａら（２００６），  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３６０，  ９５６−９６７によって記載されるようなパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来のリガーゼが含まれる。
【０１４６】
２．４  ＲＮＡリガーゼ
[00189]ＲＮＡリガーゼは当該技術分野に周知であり、そして本発明において有用である。バクテリオファージＴ４由来のＲＮＡリガーゼは、適度によく性質決定されており、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏ適用に、例えばＲＮＡの３’末端放射標識、オリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドの環状化、オリゴマーおよびニックの連結、ハイブリッドおよびキメラＤＮＡ／ＲＮＡ分子の生成、ならびにｍｉＲＮＡクローニングのために提唱されてきており、これは、これらが適度に広い基質特異性を示すためである。例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼＩは、ＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖３’ヒドロキシル末端への、ＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖５’ホスホリル末端のＡＴＰ依存性共有結合を触媒する。Ｔ４  ＲＮＡリガーゼＩＩは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼＩと類似の活性を有するが、二本鎖基質を好む。Ｔ４  ＲＮＡリガーゼＩおよびＴ４  ＲＮＡリガーゼＩＩを含むウイルスリガーゼは、その機能性断片とともに、本発明で使用可能でありうる。
【０１４７】
３．ポリヌクレオチド結合ポリペプチド
[00190]ポリヌクレオチド結合ポリペプチドは、配列特異的または配列非特異的方式いずれかで、ポリヌクレオチドに結合可能なポリペプチドである。例えば、ＤＮＡ結合ポリペプチドは、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、または別の立体配置のＤＮＡに結合するポリペプチドを含む、ＤＮＡに結合可能なポリペプチドである。当業者が認識するであろうように、本発明の目的のため、ＤＮＡ結合ポリペプチドは、配列非特異的ＤＮＡ結合ポリペプチド、および配列特異的ＤＮＡ結合ポリペプチドに、広く分けられうる。
【０１４８】
３．１  配列非特異的ＤＮＡ結合ポリペプチド
[00191]配列非特異的核酸結合ポリペプチド、好ましくは配列非特異的ＤＮＡ結合ポリペプチドは、配列独立方式で、核酸に結合する、ポリペプチドまたはポリペプチドの定義される領域（例えばドメイン）である。すなわち、ヌクレオチドへのポリペプチドの結合は、特定のヌクレオチド配列に対する有意な優先性を示さない。
【０１４９】
[00192]本発明で使用するのに特に適した配列非特異的ＤＮＡ結合ポリペプチドの例には、限定されるわけではないが、デイノコッカス・ラディオデュランスのＰｐｒＡタンパク質（寄託番号ＢＡＡ２１３７４）、結核菌由来のＫｕタンパク質（寄託番号ＮＰ＿３４３８８９）、Ｓａｃ７ｄおよびＳｓｏ７ｄ（それぞれ、寄託番号Ｐ１３１２３、およびＮＰ＿３４３８８９）を含む古細菌低分子塩基性ＤＮＡ結合タンパク質、デイノコッカス・ラディオデュランスのＤｄｒＡタンパク質（本明細書にその全体が援用される、米国特許第７５５０５６４号に記載されるようなもの）；古細菌ＨＭｆ様タンパク質（限定されるわけではないが、寄託番号Ｕ０８８３８およびＮＰ＿６３３８４９を含む）、ならびにＰＣＮＡ相同体（限定されるわけではないが、寄託番号ＮＰ＿５７８７１２およびＮＰ＿６１５０８４を含む）が含まれる。
【０１５０】
[00193]ＰｐｒＡは、ＤＮＡ損傷の修復に関与すると報告される、デイノコッカス・ラディオデュランス由来のほぼ３２ｋＤａのタンパク質である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、ＰｐｒＡは、ＤＮＡ分子の末端に優先的に結合し（Ｍｕｒａｋａｍｉら（２００６），  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ−  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，  １７６４，  ２０−２３）、そしてｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＤＮＡ破損部位にＤＮＡ修復タンパク質を補充するのに重要であるようである（Ｎａｒｕｍｉら（２００４）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ５４，  ２７８−２８５）。
【０１５１】
[00194]Ｓｓｏ７ｄおよびＳａｃ７ｄは、それぞれ、好熱性古細菌スルホロブス・ソルファタリカスおよびＳ．アシドカルダリウス由来のほぼ７ｋＤａの塩基性染色体タンパク質である。これらのタンパク質は、リジンリッチであり、そして高い熱、酸および化学薬品安定性を有する。これらは、配列独立方式でＤＮＡに結合することが報告されてきており、そして上昇した温度でゲノムＤＮＡの安定化に関与すると考えられる。
【０１５２】
[00195]ＨＭｆ様タンパク質は、真核生物Ｈ４ヒストンと、アミノ酸配列および構造の両方で相同性を共有すると報告される、古細菌ヒストンである。タンパク質のＨＭｆファミリーは、溶液中で安定な二量体を形成すると報告されてきており、そしていくつかのＨＭｆ相同体が、好熱性微生物から同定されてきている。
【０１５３】
[00196]多くのファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、アクセサリータンパク質と相互作用して、例えば効率的なＤＮＡ合成を達成すると報告されてきている。アクセサリータンパク質の１つのクラスは、スライディング・クランプと呼ばれる。多量体クランプが二本鎖ＤＮＡに適合可能なトーラス様構造を形成可能であることが示唆されてきている。スライディング・クランプが、特定のＤＮＡポリメラーゼのＣ末端と相互作用し、そして合成中のＤＮＡテンプレートへのこれらのポリメラーゼの固定を補助することが報告されてきている。
【０１５４】
[00197]真核生物におけるスライディング・クランプは、増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）と称され、他のドメインにおける類似のタンパク質は、しばしば、ＰＣＮＡ相同体と称される。これらの相同体は、顕著な構造的類似性を有するが、限定された配列類似性しか持たない。ＰＣＮＡ相同体は、スルホロブス・ソルファタリカス、パイロコッカス・フリオサス等の好熱性古細菌を含む、非真核生物から同定されてきている。ＰＣＮＡおよびＰＣＮＡ相同体は、本発明に有用な配列非特異的ＤＮＡ結合ポリペプチドである。
【０１５５】
[00198]本発明で使用するのに適した配列非特異的ＤＮＡ結合ドメインは、配列独立方式で（好ましくは二本鎖）核酸に結合する。すなわち、本発明の結合ドメインは、同等のヌクレオチド組成であるが異なる配列を持つ任意の既知の核酸が、結合において１００倍を超える相違がなく、該ドメインに結合するであろうように、有意なアフィニティで核酸に結合する。例えば、同じヌクレオチド組成であるが、異なる核酸配列を持つ競合剤ヌクレオチドを用いて実行可能な、結合の特異性を決定するフィルター結合アッセイまたはゲル移動度シフトアッセイを含む、当該技術分野に周知の方法論を用いて、非特異的結合をアッセイすることも可能である。
【０１５６】
[00199]配列非特異的ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む配列非特異的核酸結合ポリペプチドは、一本鎖または二本鎖核酸に対する優先性を示してもよい。典型的には、鎖特異的結合ポリペプチドは、場合によっては、二本鎖または一本鎖核酸に対して、１０倍またはそれより高いアフィニティを示すであろう。当業者は、特定の適用に関して、二本鎖特異的、配列非特異的ＤＮＡ結合ポリペプチドが好ましい可能性もあることを認識するであろう。
【０１５７】
[00200]例えば、一般の当業者に知られる多様なアッセイを用いて、二本鎖核酸への結合に関する特異性を試験してもよい。これらには、フィルター結合アッセイまたはゲルシフトアッセイのようなアッセイが含まれる。例えば、フィルター結合アッセイにおいて、二本鎖ＤＮＡへの結合活性に関して評価しようとするポリペプチドを、適切な緩衝液中、二本鎖または一本鎖の放射標識ＤＮＡとあらかじめ混合する。タンパク質およびタンパク質−ＤＮＡ複合体を保持する膜（例えばニトロセルロース）で、混合物をろ過する。フィルター上に保持されるＤＮＡの量は、タンパク質に結合している量の指標となる。標識ＤＮＡの結合が、増加する量の非標識ＤＮＡの添加によって競合される競合分析によって、結合を定量化してもよい。一本鎖ＤＮＡよりも１０倍またはそれより高いアフィニティで、二本鎖ＤＮＡに結合するポリペプチドは、本明細書において、二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質と定義される。あるいは、放射標識ＤＮＡを試験ポリペプチドとインキュベーションする、ゲルシフトアッセイによって、結合活性を評価してもよい。タンパク質−ＤＮＡ複合体は、未結合ＤＮＡよりも、ゲル中でより遅く移動し、シフトしたバンドを生じる。増加する量の二本鎖または一本鎖非標識ＤＮＡと試料をインキュベーションし、そしてシフトしたバンド中の放射能の量を定量化することによって、結合量を評価する。
【０１５８】
３．２  配列特異的ＤＮＡ結合ポリペプチド
[00201]一般的に、本発明の融合ポリペプチドにおいて、中程度から高い度合いの配列特異性を示すＤＮＡ結合ポリペプチドの使用は、より望ましくない。しかし、当業者は、特定の態様において、配列特異性の度合いが、例えばＤＮＡ結合ポリペプチドによって優先的に結合される特定の配列モチーフを含む部位で、連結効率を改善することが有用でありうることを認識するであろう。例えば、特定の融合ポリペプチドと組み合わせて用いようとする高効率連結ベクターを設計することも可能であり、ここで、連結部位には、融合ポリペプチドの配列特異的ＤＮＡ結合ポリペプチドドメインによって結合される認識配列が含まれる。
【０１５９】
[00202]非常に多くの配列特異的ＤＮＡ結合ポリペプチドが知られており、これには例えば、転写因子、制限エンドヌクレアーゼ、およびポリメラーゼが含まれる。配列特異的ＤＮＡ結合ポリペプチドは、そのＤＮＡ結合ドメイン（単数または複数）の二次構造にしたがって分類可能である。特徴的なＤＮＡ結合ドメインの例には、ジンクフィンガーモチーフ、ヘリックス−ターン−ヘリックス・モチーフ、ロイシンジッパー、およびヘリックス−ループ−ヘリックス・モチーフが含まれる。これらのドメインの１またはそれより多くを含む、配列特異的ＤＮＡ結合ポリペプチドは、本発明で使用するのに適している。
【０１６０】
[00203]本発明で使用するのに特に適している配列特異的ＤＮＡ結合ポリペプチドの例には、限定されるわけではないが、哺乳動物ＮＦ−カッパＢ  ｐ５０タンパク質、例えばヒトＮＦ−カッパＢ  ｐ５０タンパク質（寄託番号ＮＰ＿００３９８９）、およびネズミＮＦ−カッパＢ  ｐ５０タンパク質（寄託番号ＮＰ＿０３２７１５）、ならびに哺乳動物ＮＦＡＴタンパク質などの転写因子、例えば、ＮＦＡＴｃ１，ＮＦＡＴｃ２、ＮＦＡＴｃ３、ＮＦＡＴｃ４、またはＮＦＡＴｃ５の１つまたはそれより多くが含まれる。
【０１６１】
[00204]ＮＦ−カッパＢ（Ｂ細胞におけるカッパ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーの核因子１としてもまた知られる）は、Ｒｅｌファミリー由来の配列特異的ＤＮＡ結合転写因子である。ＮＦ−カッパＢ  ｐ５０が８ｐＭの解離定数（ＫＤ）で特異的コンセンサス配列に結合し、そして非特異的ＤＮＡには、約１０００倍弱く結合する（ＫＤ＝５．７ｎＭ、ｄｅ  Ｌｕｍｌｅｙら，  ２００４）ことが報告されてきている。
【０１６２】
[00205]転写因子のＮＦＡＴファミリー（活性化Ｔ細胞の核因子としても知られる）は、５つのメンバーＮＦＡＴｃ１、ＮＦＡＴｃ２、ＮＦＡＴｃ３、ＮＦＡＴｃ４、およびＮＦＡＴ５からなり、そして各々、本発明において、ＤＮＡ結合ポリペプチドとして使用するのに適している。
【０１６３】
[00206]他の態様において、配列特異的ＤＮＡ結合ポリペプチドの機能性変異体を利用してもよい。例えば、天然配列特異的ＤＮＡ結合ポリペプチドによって示される高アフィニティ結合を保持するが、同じ度合いの配列特異性をもはや示さない機能性変異体が、本発明で使用可能である。こうした機能性変異体の例が当該技術分野に知られ、そしてこれには、本明細書にその全体が援用される、ｄｅ  Ｌｕｍｌｅｙら（２００４），  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３３９，  １０５９−１０７５に記載される、ｃＴＦ−ＮＦＡＴ−Ａｌａ−ｐ５０ハイブリッドＤＮＡ結合タンパク質が含まれる。このハイブリッドは、ＮＦ−カッパＢのアミノ酸２４９〜３６６にアラニン残基を介して融合されるＮＦＡＴｃ１のアミノ酸４０３〜５７９を含む。著者らは、このハイブリッドが、ＮＦ−カッパＢに特徴的なＤＮＡに対する高アフィニティを保持するが、配列特異性を喪失していることを報告する：  ｄｅ  Ｌｕｍｌｅｙは、カッパＢコンセンサス配列に関して、ＫＤが２８ｎＭであり、そして非特異的ＤＮＡ結合に関して４０ｎＭであると測定した。
【０１６４】
４．  発現構築物
[00207]微生物、植物細胞または動物細胞（細胞発現系）において、あるいは細胞不含発現系において、融合ポリペプチドを発現するための発現構築物を産生し、そして用いるためのプロセス、ならびに本発明で使用するための融合ポリペプチドを形成するのに有用な発現構築物を含む宿主細胞が、当該技術分野に周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  １９８７；  Ａｕｓｕｂｅｌら，  １９８７）。
【０１６５】
[00208]本発明の方法で使用するための発現構築物を、クローニング用または発現用の複製可能ベクター内に挿入してもよいし、あるいは宿主ゲノム内に取り込ませてもよい。多様なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス融合ポリペプチド、またはファージの形であってもよい。適切な核酸配列を、多様な方法によってベクター内に挿入してもよい。一般的に、ＤＮＡは、当該技術分野に知られる技術を用いて、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（単数または複数）内に挿入される。ベクター構成要素には、一般的に、限定されるわけではないが、シグナル配列、複製起点、１またはそれより多くの選択可能マーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結配列の１またはそれより多くが含まれる。これらの構成要素の１またはそれより多くを含有する、適切なベクターの構築は、当該技術分野に知られる標準的連結技術を使用する。
【０１６６】
[00209]発現ベクターおよびクローニングベクターは、どちらも、１またはそれより多い選択された宿主細胞においてベクターが複製するのを可能にする核酸配列を含有する。こうした配列は、多様な細菌、酵母、およびウイルスに関して周知である。
【０１６７】
[00210]１つの態様において、発現構築物は、高コピー数ベクター上に存在する。
[00211]１つの態様において、高コピー数ベクターは、宿主細胞あたり２０〜３０００コピーで存在可能なものより選択される。
【０１６８】
[00212]１つの態様において、高コピー数ベクターは、高コピー数複製起点（ｏｒｉ）、例えばＣｏｌＥ１またはＣｏｌＥ１由来複製起点を含有する。例えば、ＣｏｌＥ１由来複製起点は、ｐＵＣ１９複製起点を含んでもよい。
【０１６９】
[00213]本発明のベクター中で使用するのに適した多くの高コピー数複製起点が、当業者に知られる。これらには、ｐＢＲ３２２由来のＣｏｌＥ１由来複製起点およびその誘導体、ならびに他の高コピー数複製起点、例えばＭ１３  ＦＲ  ｏｒｉまたはｐ１５Ａ  ｏｒｉが含まれる。２μプラスミド起点は酵母に適しており、そして多様なウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
【０１７０】
[00214]好ましくは、高コピー数複製起点は、ＣｏｌＥ１由来ｐＵＣ１９複製起点を含む。
[00215]発現ベクターおよびクローニングベクターは、典型的には、形質転換宿主細胞におけるベクターの存在を検出する、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含有するであろう。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、またはテトラサイクリンに対する耐性を与えるか、（ｂ）栄養要求性不全を補うか、あるいは（ｃ）複合培地から入手可能でない必須栄養素を供給するタンパク質をコードし、例えばバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）に関するＤ−アラニン・ラセマーゼをコードする遺伝子がある。
【０１７１】
[00216]植物形質転換で一般的に用いられる選択可能マーカーには、カナマイシン耐性を与えるネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子（ＮＰＴ  ＩＩ）、スペクチノマイシンおよびストレプトマイシン耐性を与えるａａｄＡ遺伝子、Ｉｇｎｉｔｅ（ＡｇｒＥｖｏ）およびＢａｓｔａ（Ｈｏｅｃｈｓｔ）耐性のためのホスフィノトリシン・アセチル・トランスフェラーゼ（ｂａｒ遺伝子）、ならびにハイグロマイシン耐性のためのハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）が含まれる。
【０１７２】
[00217]哺乳動物細胞に適した選択可能マーカーの例は、発現構築物を取り込む能力がある細胞の同定を可能にするもの、例えばＤＨＦＲまたはチミジンキナーゼである。野生型ＤＨＦＲを使用する場合に適した宿主細胞は、Ｕｒｌａｕｂら，  １９８０に記載されるように調製され、そして増殖された、ＤＨＦＲ活性に欠陥を有するＣＨＯ細胞株である。酵母で使用するのに適した選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら，  １９７９；  Ｋｉｎｇｓｍａｎら，  １９７９；  Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら，  １９８０）。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の突然変異体株に関する選択マーカー、例えばＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１［Ｊｏｎｅｓ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ８５：  １２（１９７７）］を提供する。
【０１７３】
[00218]融合ポリペプチドを形成するのに有用な発現構築物には、好ましくは、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡ結合ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸の発現を調節するプロモーターが含まれる。
【０１７４】
[00219]多様な潜在的な宿主細胞によって認識されるプロモーターが周知である。原核宿主で使用するのに適したプロモーターには、β−ラクタマーゼおよびラクトース・プロモーター系［Ｃｈａｎｇら，  １９７８；  Ｇｏｅｄｄｅｌら，  １９７９）、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系［Ｇｏｅｄｄｅｌ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ８：４０５７（１９８０）；  ＥＰ  ３６，７７６］、ならびにｔａｃプロモーター［ｄｅＢｏｅｒら，  １９８３）などのハイブリッドプロモーターが含まれる。細菌系で使用するためのプロモーターはまた、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードする核酸に、機能可能であるように連結されたシャイン−ダルガノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含有するであろう。
【０１７５】
[00220]酵母宿主で使用するのに適した促進配列の例には、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ［Ｈｉｔｚｅｍａｎら，  １９８０）または他の解糖酵素［Ｈｅｓｓら，  １９６８；  Ｈｏｌｌａｎｄ，  １９７８）、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコース・イソメラーゼ、およびグルコキナーゼのプロモーターが含まれる。
【０１７６】
[00221]増殖条件によって調節される転写のさらなる利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコール・デヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素のプロモーター領域である。
【０１７７】
[00222]単子葉植物または双子葉植物の組織または器官を含む、植物宿主細胞で使用するのに適したプロモーターの例には、細胞、組織および器官特異的プロモーター、細胞周期特異的プロモーター、時間的プロモーター、誘導性プロモーター、大部分の植物組織で活性である恒常的プロモーター、および組換えプロモーターが含まれる。プロモーターの選択は、クローニングされたポリヌクレオチドの望ましい時間的および空間的発現に応じるであろう。プロモーターは宿主細胞由来のものであってもよく、あるいは、他の植物、ウイルス、ならびに植物病原性細菌および真菌遺伝子由来であるプロモーターであってもよい。当業者は、過度の実験を伴わずに、本発明のポリヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を用いて発現構築物を修飾し、そして調節する際に使用するのに適しているプロモーターを選択可能であろう。恒常的植物プロモーターの例には、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター、ノパリン・シンターゼ・プロモーターおよびオクトピン・シンターゼ・プロモーター、およびトウモロコシ（ｍａｉｚｅ）由来のＵｂｉ  １プロモーターが含まれる。特定の組織において活性であり、内部発生シグナルあるいは外部非生物的または生物的ストレスに反応する植物プロモーターは、科学的文献中に記載される。例示的なプロモーターは、例えば、本明細書に援用されるＷＯ  ０２／００８９４に記載される。
【０１７８】
[00223]昆虫宿主細胞で使用するのに適したプロモーターの例は、バキュロウイルスなどのウイルスゲノムから得られるものを含む。商業的に入手可能なバキュロウイルス発現系には、ｆｌａｓｈＢＡＣ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれる。
【０１７９】
[00224]哺乳動物宿主細胞で使用するのに適したプロモーターの例は、宿主細胞系と適合するという条件で、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシ・パピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスゲノムから、異種哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、そして熱ショックプロモーターから得られるものを含む。
【０１８０】
[00225]より高次の真核生物による発現構築物の転写は、ベクター内にエンハンサー配列を挿入することによって増加しうる。エンハンサーは、プロモーターに作用して転写を増加させる、通常１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用要素である。現在、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインスリン）に由来する多くのエンハンサー配列が知られる。しかし、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを用いるであろう。例には、複製起点の後期側（ｂｐ  １００〜２７０）上のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーター・エンハンサー、複製起点の後期側上のポリオーマ・エンハンサー、およびアデノウイルス・エンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドまたは融合ポリペプチド・コード配列の５’または３’の位置でベクター内にスプライシングされてもよいが、好ましくは、プロモーターの５’側に位置する。
【０１８１】
[00226]真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物由来の有核細胞）中で用いられる発現ベクターはまた、転写を終結させるのに、そしてｍＲＮＡを安定化するのに必要な配列も含有するであろう。こうした配列は、一般的に、真核またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’、および時に３’の非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分において、ポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチド・セグメントを含有する。
【０１８２】
[00227]１つの態様において、発現構築物は、アラビノースに誘導されるＢＡＤプロモーターなどの上流誘導性プロモーターを含む。
[00228]１つの態様において、発現構築物は、恒常的または制御可能プロモーター系を含む。
【０１８３】
[00229]１つの態様において、制御可能プロモーター系は、誘導可能または抑制可能プロモーター系である。
[00230]組換えタンパク質の産生において、強いプロモーターを使用することがしばしば望ましいが、異種タンパク質の恒常的な過剰産生は、増殖速度、プラスミド安定性および培養生存性の減少を導くため、通常、これらのプロモーターの制御が必須である。
【０１８４】
[00231]リプレッサー・タンパク質とオペレーター（プロモーターの下流の領域）の相互作用によって、いくつかのプロモーターが制御される。最もよく知られるオペレーターは、ｌａｃオペロン由来のものおよびバクテリオファージ・ラムダ由来のものである。大腸菌において制御されるプロモーターの概説が、Ｆｒｉｅｈｓ  ＆  Ｒｅａｒｄｏｎ，  １９９１の表１に提供される。
【０１８５】
[00232]標準的細菌培養および組換え大腸菌を伴うものの間の主な相違は、増殖期および産生期または誘導期の分離である。組換えタンパク質産生は、しばしば、制御されるプロモーターを利用して、増殖期に高い細胞密度を達成し（プロモーターが「オフ」であり、そして宿主細胞に対する代謝負荷がわずかである場合）、そして次いで、誘導期に高い異種タンパク質産生速度を達成する（プロモーターを「オン」にする誘導後）。
【０１８６】
[00233]１つの態様において、制御可能プロモーター系は、ＬａｃＩ、Ｔｒｐ、ファージ・ラムダおよびファージＲＮＡポリメラーゼより選択される。
[00234]１つの態様において、プロモーター系は、ｌａｃまたはＰｔａｃプロモーターおよびｌａｃＩリプレッサー、またはｔｒｐプロモーターおよびＴｒｐＲリプレッサーより選択される。
【０１８７】
[00235]１つの態様において、活性リプレッサーに結合してオペレーターからの解離を引き起こし、発現を可能にする、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって、ＬａｃＩリプレッサーが不活性化される。
【０１８８】
[00236]１つの態様において、ｔｒｐプロモーター系は、系が自己誘導可能になる閾値レベルより低いトリプトファン濃度になるように、定義されたトリプトファン濃度を持つ合成培地を用いる。１つの態様において、３−β−インドール−アクリル酸を添加して、ＴｔｒＲリプレッサーを不活性化してもよい。
【０１８９】
[00237]１つの態様において、プロモーター系は、バクテリオファージ・ラムダ・リプレッサーｃＩを利用してもよい。このリプレッサーは、ラムダ・プロファージを利用して、そしてＯＬおよびＯＲと称される２つのオペレーターと相互作用することによって、溶解遺伝子すべての発現を防止する。これらのオペレーターは、２つの強いプロモーター、ＰＬおよびＰＲと、それぞれ重複する。ｃＩリプレッサーの存在下で、ＲＮＡポリメラーゼの結合が防止される。ｃＩリプレッサーは、ＵＶ照射またはマイトマイシンＣでの細胞の処理によって不活性化可能である。組換えポリペプチドの発現を可能にする、より好適な方法は、ｃＩリプレッサーｃＩ８５７の温度感受性型の適用である。ラムダに基づく発現系を所持する宿主細胞を低温で中期対数期まで増殖させ、そして次いで、高温に移して、組換えポリペプチドの発現を誘導してもよい。
【０１９０】
[00238]広く用いられる発現系は、Ｔ７  ＤＮＡ上で見られるプロモーターのみを認識し、そして宿主細胞染色体上に存在するプロモーターは認識しないファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを利用する。したがって、発現構築物は、組換え遺伝子が融合されるであろうＴ７プロモーター（通常、遺伝子１０の直前に存在するプロモーター）の１つを含有してもよい。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子は、発現構築物上に存在するか、第二の適合する発現構築物上に存在するか、あるいは宿主細胞染色体内に組み込まれるか、いずれかである。３つすべての場合で、遺伝子は、誘導性プロモーターに融合し、発現期中のその転写および翻訳が可能になる。
【０１９１】
[00239]大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）およびＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア）が、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を所持する宿主細胞の例である。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を所持する他の細胞株が当該技術分野に知られ、例えばゲノム内に組み込まれたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を宿する緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＡＤＤ１９７６（Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＆  Ｄａｒｚｉｎｓ，  １９９２）がある。
【０１９２】
[00240]本発明で使用するのに適した別のプロモーター系は、本明細書に例示するＴ５プロモーター系である。有用なことに、このプロモーターは、宿主大腸菌ＲＮＡポリメラーゼによって認識される。適切な大腸菌宿主株は、本明細書において実施例中に記載される。
【０１９３】
[00241]１つの態様において、プロモーター系は、温度シフトによって、例えば約３０〜３７℃から４２℃に温度を上昇させて、誘導周期を開始することによって、誘導周期を開始するように誘導するかまたは「スイッチをオンにする」ことが可能なＡＰＩまたはＡＰＲなどのプロモーターを利用する。
【０１９４】
[00242]好ましい融合ポリペプチドは、少なくとも１つのＤＮＡリガーゼおよび少なくとも１つのＤＮＡ結合ポリペプチドを含む。
[00243]本明細書で使用するための融合ポリペプチドをコードする核酸配列は、ポリヌクレオチド−リガーゼ・ポリペプチド、例えばＤＮＡリガーゼをコードする少なくとも１つの核酸、およびポリヌクレオチド結合ポリペプチド、例えばＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を含む。ひとたび発現されると、融合ポリペプチドは、ホスホジエステル結合を形成するか、または形成を促進することが可能である。
【０１９５】
[00244]１つの態様において、少なくともＤＮＡリガーゼをコードする核酸配列は、所望の長さのポリヌクレオチド・リンカーまたはスペーサー配列を通じて、ＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする核酸配列と間接的に融合される。
【０１９６】
[00245]１つの態様において、少なくとも１つのＤＮＡ結合ポリペプチドを含む融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドを含むアミノ酸配列のＮ末端と連続する。
【０１９７】
[00246]１つの態様において、少なくとも１つのＤＮＡ結合ポリペプチドを含む融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＤＮＡリガーゼを含むアミノ酸配列のＣ末端と連続する。
[00247]１つの態様において、少なくとも１つのＤＮＡ結合ポリペプチドを含む融合タンパク質のアミノ酸配列は、所望の長さのペプチド・リンカーまたはスペーサー、例えば融合ポリペプチドを含むポリペプチドの独立のフォールディングを促進するリンカーまたはスペーサーを通じて、ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドを含むアミノ配列のＮ末端と間接的に融合される。
【０１９８】
[00248]１つの態様において、少なくとも１つのＤＮＡ結合ポリペプチドを含む融合タンパク質のアミノ酸配列は、所望の長さのペプチド・リンカーまたはスペーサー、例えば融合ポリペプチドの独立のフォールディングを促進するリンカーまたはスペーサーを通じて、ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドを含むアミノ酸配列のＣ末端と間接的に融合される。
【０１９９】
[00249]本発明記載の好ましい融合ポリペプチドの１つの利点は、融合ポリペプチドを含むポリペプチドの修飾が、その機能に影響を及ぼさないことである。例えば、本明細書記載の例示的なＤＮＡリガーゼの機能は、組換えポリペプチドが、そのＮ末端またはＣ末端と融合された際に保持される。
【０２００】
[00250]融合ポリペプチド中のタンパク質の配置が、プラスミド中に含有される核酸中の遺伝子配列の順序に応じうることを認識しなければならない。例えば、ポリヌクレオチド結合ポリペプチド、例えばＤＮＡ結合ポリペプチドを間接的にポリヌクレオチド・リガーゼに融合させて、融合ポリペプチドを産生することが望ましい可能性もある。用語「間接的に融合させる」は、融合ポリペプチド中で発現されることが望ましい任意のタンパク質であってもよいさらなるタンパク質によって分離された、ポリヌクレオチド・リガーゼ・ポリペプチドおよびポリヌクレオチド結合ポリペプチドを含む融合ポリペプチドを指す。
【０２０１】
[00251]１つの態様において、さらなるタンパク質は、上に論じるような、ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチド、ＤＮＡ結合ポリペプチド、補因子または補酵素、あるいは融合ポリペプチド、あるいは融合ポリペプチドの独立のフォールディングを促進するリンカーまたはスペーサーより選択される。この態様において、融合ポリペプチドの所望の配置を反映するように発現構築物中の遺伝子配列を順序づけることが必要であろう。
【０２０２】
[00252]１つの態様において、ポリヌクレオチド結合ポリペプチド、例えばＤＮＡ結合ポリペプチドを、ポリヌクレオチド−リガーゼ・ポリペプチド、例えばＤＮＡリガーゼに直接融合させてもよい。用語「直接融合させる」は、本明細書において、２またはそれより多いペプチドが、ペプチド結合を通じて連結される場合を示す。
【０２０３】
[00253]少なくとも２つの別個の融合ポリペプチドを含む組成物を形成することもまた可能でありうる。例えば、第一の融合ポリペプチドは、ＤＮＡリガーゼに融合した一本鎖ＤＮＡ結合ポリペプチドを含んでもよく、一方、第二の融合ポリペプチドは、ＤＮＡリガーゼに融合した二本鎖ＤＮＡ結合ポリペプチドを含んでもよい。本明細書記載の融合ポリペプチドの任意の組み合わせが可能であり、そして特定の適用をターゲットとするように、任意の組み合わせを産生してもよい。実際、１またはそれより多い融合ポリペプチドが、平滑端ＤＮＡ末端を含むＤＮＡ断片に、または付着端ＤＮＡ末端に対して、改善された連結活性を示す可能性もある。同様に、融合ポリペプチドの１またはそれより多くが、ＲＮＡ断片、またはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに対して、改善された連結活性を示す可能性もある。こうした融合ポリペプチドを単独で、または組み合わせて用いて、例えば特定の適用をターゲットとしてもよい。
【０２０４】
[00254]１つの態様において、発現構築物はｉｎ  ｖｉｖｏで発現される。好ましくは、発現構築物は、微生物、好ましくは大腸菌において発現されるプラスミドである。
[00255]１つの態様において、発現構築物はｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現される。好ましくは、発現構築物は、細胞不含発現系を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現される。
【０２０５】
[00256]１つの態様において、１またはそれより多くの遺伝子を単一の発現構築物内に挿入してもよいし、あるいは１またはそれより多い遺伝子を宿主細胞ゲノム内に組み込んでもよい。すべての場合で、発現は、上述のようにプロモーターを通じて調節可能である。
【０２０６】
[00257]１つの態様において、発現構築物は、少なくとも１つのさらなるポリペプチド、場合によって、上に論じるような、ポリヌクレオチド結合ポリペプチド、例えばＤＮＡ結合ポリペプチド、およびポリヌクレオチド−リガーゼ・ポリペプチド、例えばＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードする。
【０２０７】
[00258]多様な態様において、発現構築物には、本発明の発現されるポリペプチドの精製を促進する１またはそれより多いポリペプチド・タグが含まれる。こうしたタグの例は当該技術分野に周知であり、そしてこれには、ポリヒスチジン・タグ、ＦＬＡＧエピトープ、ｃ−ｍｙｃエピトープ等が含まれる。こうした精製補助を所持するポリペプチドを精製する方法もまた、当該技術分野で周知であり、そしてこれには、クロマトグラフィー、例えばポリヒスチジン・タグの場合、ニッケルまたはコバルト結合に頼るものを含めた固定化金属アフィニティ・クロマトグラフィーが含まれる。
【０２０８】
[00259]発現されるタンパク質からこうした精製補助を除去する方法もまた、当該技術分野に周知である。例えば、エンドペプチダーゼ認識配列、インテイン・スプライス部位、またはエンドペプチダーゼを用いてポリヒスチジン−タグの除去を促進する任意の他のアミノ酸配列によって、関心対象のポリペプチドから、タグまたはエピトープを分離してもよい。末端タグ化ポリペプチドの場合、エキソペプチダーゼを好適に用いてもよく、例えばＴＡＧＺｙｍｅ（Ｑｉａｇｅｎ）などのエキソペプチダーゼを用いて、発現されたポリペプチドからＮ末端ポリヒスチジンタグを除去してもよい。
【０２０９】
５．宿主細胞
[00260]本発明の融合ポリペプチドは、宿主細胞において、本明細書に記載するような、１またはそれより多い発現構築物を用いて、好適に産生される。宿主細胞が発現構築物を発現することを可能にすることによって、本発明の融合ポリペプチドを産生してもよい。これは、まず、例えば宿主細胞または宿主細胞子孫を発現構築物で形質転換するかまたはトランスフェクションすることによって、あるいは別の方式で、発現構築物が宿主細胞中に存在することを確実にすることによって、宿主細胞または宿主細胞子孫内に、発現構築物を導入することによって、達成可能である。
【０２１０】
[00261]形質転換後、発現構築物からの融合ポリペプチドの発現に適した、そして融合ポリペプチドの形成に適した条件下で、形質転換宿主細胞を維持する。こうした条件は、当該技術分野に知られるように、プラスミドなどの選択された発現構築物の、適切な生物における発現に適したものを含む。例えば、そして高収量または過剰発現が望ましい場合は特に、適切な培地を提供すると、融合ポリペプチドの合成が可能になる。
【０２１１】
[00262]したがって、本発明は、融合ポリペプチドを産生するための方法であって：
ポリヌクレオチド−リガーゼ・ポリペプチド、例えばＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸配列；および
ポリヌクレオチド結合ポリペプチド、例えばＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸配列
を含む少なくとも１つの発現構築物を含む宿主細胞を提供し；
発現構築物の発現に適した条件下で、宿主細胞を維持し；そして
宿主から融合ポリペプチドを分離する
工程を含む、前記方法を提供する。
【０２１２】
[00263]好ましくは、宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞または動物細胞、好ましくは単離または非ヒト宿主細胞である。組換え融合ポリペプチドの産生のために当該技術分野に周知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  １９８７；  Ａｕｓｕｂｅｌら，  １９８７）で有用な宿主細胞は、本明細書に論じる考察を踏まえれば、本発明の方法で使用するのにしばしば適している。
【０２１３】
[00264]適切な原核生物宿主細胞は、真正細菌、例えばグラム陰性またはグラム陽性生物、例えば大腸菌などの腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）を含む。多様な大腸菌株が公的に入手可能であり、例えば大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）およびＫ５  ７７２（ＡＴＣＣ  ５３，６３５）、およびＤＨ５α−Ｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）がある。他の適切な原核宿主細胞には、他の腸内細菌科、例えばエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例えばネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、例えばセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、およびシゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ならびにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）、例えば枯草菌（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびＢ．リケニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、例えば緑膿菌、および放線菌類（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）、例えばストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）およびマイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｔｅｒｉｕｍ）が含まれる。
【０２１４】
[00265]いくつかの態様において、大腸菌株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ産物発酵のための一般的な宿主株であるため、これを用いてもよい。好ましくは、宿主細胞は、タンパク質分解酵素の最小量を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０を修飾して、宿主に内因性であるタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子突然変異を達成してもよく、こうした宿主の例には、完全遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ  ５５，２４４）；完全遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅｌ５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７  ｉｌｖＧ  ｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失突然変異を伴う株３７Ｄ６である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４が含まれる。
【０２１５】
[00266]いくつかの態様において、好ましくは、リポ多糖内毒素を産生しないか、または低レベルしか産生しない細菌宿主を用いてもよい。例えば、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）株ＭＧ１３６３およびラクトコッカス・ラクティス下位種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ  ｃｒｅｍｏｒｉｓ）ＮＺ９０００を含むラクトコッカス・ラクティス株が使用可能である。
【０２１６】
[00267]原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物が、本発明の方法で使用するのに適したクローニングまたは発現宿主である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、一般的に用いられる真核宿主微生物である。その他には、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ，  １９８１；  ＥＰ  １３９，３８３）、クロイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主（米国特許第４，９４３，５２９号；  Ｆｌｅｅｒら，  １９９１）、例えばＫ．ラクティス（Ｋ．  ｌａｃｔｉｓ）（ＭＷ９８−８Ｃ、ＣＢＳ６８３、ＣＢＳ４５７４；  Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら，  １９８３）、Ｋ．フラジリス（Ｋ．  ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、Ｋ．ブルガリクス（Ｋ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、Ｋ．ウィッカーラミイ（Ｋ．  ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ  ２４，１７８）、Ｋ．ワルティイ（Ｋ．  ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．  ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ  ３６，９０６；  Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら，  １９９０）、Ｋ．テルモトレランス（Ｋ．  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、およびＫ．マルキシアヌス（Ｋ．  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）；ヤロウイア属（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ  ４０２，２２６）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ  １８３，０７０；  Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら，  １９８８）；カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）；  トリコデルマ・リーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ  ２４４，２３４）；アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）（Ｃａｓｅら，  １９７９）；シュワニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えばシュワニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）（ＥＰ  ３９４，５３８  １９９０年１０月３１日公開）；ならびに糸状菌、例えばアカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、青カビ属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）（ＷＯ  ９１／００３５７  １９９１年１月１０日公開）、およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えばＡ．ニデュランス（Ａ．  ｎｉｄｕｌａｎｓ）（Ｂａｌｌａｎｃｅら，  １９８３；  Ｔｉｌｂｕｒｎら，  １９８３；  Ｙｅｌｔｏｎら，  １９８４）およびクロコウジカビ（Ａ．  ｎｉｇｅｒ）（ＫｅｌｌｙおよびＨｙｎｅｓ，  １９８５）が含まれる。メチロトローフ酵母は、本明細書において適切であり、そしてハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ属、クロエケラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、ピキア属、サッカロミセス属、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、およびロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）からなる属より選択される、メタノール上で増殖可能な酵母を含む。酵母のこのクラスの例示である特定の種のリストが、Ａｎｔｈｏｎｙ，  １９８２に見出されうる。
【０２１７】
[00268]無脊椎宿主細胞の例には、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびスポドプテラ属（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９などの昆虫細胞、ならびに、ワタ（ｃｏｔｔｏｎ）、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）、ジャガイモ（ｐｏｔａｔｏ）、ダイズ（ｓｏｙｂｅａｎ）、ペチュニア（ｐｅｔｕｎｉａ）、トマト（ｔｏｍａｔｏ）、およびタバコ（ｔｏｂａｃｃｏ）の細胞培養などの植物細胞が含まれる。多くのバキュロウイルス株および変異体、ならびにスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモムシ）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）、およびカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）などの宿主由来の対応する許容昆虫宿主細胞が同定されてきている。トランスフェクションのための多様なウイルス株、例えばオートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１変異体、およびカイコＮＰＶのＢｍ−５株が公的に入手可能であり、そしてこうしたウイルスは、本発明にしたがって、本明細書において、ウイルスとして、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションに使用可能である。
【０２１８】
[00269]有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚性腎臓株（２９３または懸濁培養中での増殖のため、サブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら，  Ｊ．  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．  ３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら，  １９８０）；マウス・セルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，  １９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ  ｇｒｅｅｎ  ｍｏｎｋｅｙ）腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット（ｂｕｆｆａｌｏ  ｒａｔ）肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；  ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら，  １９８２）；  ＭＲＣ  ５細胞；  ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞腫株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０２１９】
[00270]例えば、ＤＮＡ結合ポリペプチドまたはＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドが、１またはそれより多い翻訳後修飾、例えばグリコシル化を必要とする場合、真核細胞株、そして特に哺乳動物細胞株が、好ましいであろう。例えば、１またはそれより多いＤＮＡ結合ポリペプチドは、最適活性を有するために、翻訳後修飾を必要とする可能性もあり、そしてしたがって、こうした翻訳後修飾が可能な発現宿主において、有用に発現されうる。
【０２２０】
[00271]１つの態様において、宿主細胞は、酸化性細胞質ゾルを伴う、例えば大腸菌オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）株（Ｎｏｖａｇｅｎ）である。
[00272]別の態様において、宿主細胞は、還元性細胞質ゾルを伴う細胞、好ましくは大腸菌である。
【０２２１】
[00273]融合ポリペプチドはまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでも形成可能である。好ましくは、細胞不含発現系を用いる。本明細書に論じる考察を踏まえて、多くの細胞不含翻訳系は、商業的に入手可能であり、そして本発明の融合ポリペプチドの産生において使用するのに適している。
【０２２２】
[00274]適切な場合、固定金属アフィニティ精製を含む、遠心分離、ろ過、またはアフィニティ・クロマトグラフィを用いて、溶解細胞から融合ポリペプチドを精製してもよい。
【０２２３】
[00275]融合ポリペプチドが産生される条件を調節することによって、融合ポリペプチドの発現特性に影響を及ぼすか、またはこれを調節することも可能であることが認識されるであろう。これには、例えば、宿主細胞が維持される条件、例えば温度、基質の存在等が含まれる。
【０２２４】
[00276]本発明のいくつかの態様において、宿主細胞において発現構築物の過剰発現を達成することが望ましい。特定の発現構築物を過剰発現させるための機構は、当該技術分野に周知であり、そして構築物自体、構築物を発現させようとする宿主細胞、および過剰発現が望ましいかまたは必要とされる度合いを含む他の要因に応じるであろう。例えば、ｉ）強いプロモーター系、例えば原核宿主におけるＴ５プロモーター系またはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター系の使用；ｉｉ）高コピー数プラスミド、例えばｃｏｌＥ１複製起点を含有するプラスミドの使用；あるいはｉｉｉ）例えば融合配列の使用を通じたメッセンジャーＲＮＡの安定化、あるいはｉｖ）例えば、リボソーム結合部位、または終結部位のコドン使用の最適化を通じた翻訳の最適化等によって、過剰発現を達成してもよい。過剰発現の利点は、融合ポリペプチドのより高い収量の産生が可能になりうることである。
【０２２５】
６．本発明の融合ポリペプチドの使用
[00277]本発明は、核酸に結合する際の、またはホスホジエステル結合形成を触媒する際の改善された効率を含む１またはそれより多い改善された活性を示すか、あるいは１またはそれより多い改善された特性、例えば改善された安定性、変性、分解または不活性化に対する改善された耐性を示すか、あるいは改善された活性および改善された特性の両方を示す、融合ポリペプチドを提供する。その結果、本発明の融合ポリペプチドは、ホスホジエステル結合形成が望ましいかまたは必要とされる任意の適用において、有用性を有する。本発明の融合ポリペプチドを配置可能な、例示的な限定されない使用例には、以下が含まれる。
【０２２６】
クローニング
[00278]クローニングは、核酸配列を複製し、そして／または組換える際、分子生物学者が利用して、例えば組換えタンパク質の産生を補助可能な発現ベクターを生成するか、またはＤＮＡ配列決定を促進するなどの、一組の技術に関する、当該技術分野に認識される用語である。クローニングは、遺伝子同定、タンパク質性質決定、遺伝子フィンガープリンティングから、大規模タンパク質産生までに渡る非常に多様な適用において使用される。タンパク質発現、タグ化、一本鎖ＲＮＡおよびＤＮＡ産生、ならびに多くの他の操作を可能にする、関心対象の核酸断片をクローニング可能な、非常に多様な特殊化ベクターが存在する。任意のＤＮＡ断片のクローニングは、本質的に、４つの工程を伴う：１）断片化−ＤＮＡの鎖または二重鎖の分断；２）連結−ＤＮＡピースをともに付着させる；３）トランスフェクションまたは形質転換−新規に形成されたＤＮＡピースの宿主細胞への挿入；４）スクリーニングまたは選択−新規に形成されたＤＮＡピースで成功裡にトランスフェクションされた細胞の選択。
【０２２７】
[00279]これらの工程は、クローニング法の中で不変であるが、いくつかの代替経路を選択可能であり、これらは「クローニング戦略」と要約される。
連結ビット分析
[00280]連結ビット分析を用いて、一塩基多型などの、特定の多型部位でのヌクレオチドの同一性が決定されてきている。この分析は、プライマー間の１ヌクレオチドギャップを持つターゲットにハイブリダイズする２つのプライマーを必要とする。４つのヌクレオチド各々を、ＤＮＡポリメラーゼ、リガーゼ、ターゲットＤＮＡおよびプライマーを含有する、別個の反応混合物に添加する。ポリメラーゼは、ＳＮＰに相補的な第一のプライマーの３’端にヌクレオチドを付加し、そして次いで、リガーゼが２つの隣接プライマーをともに連結する。試料を加熱すると、連結が起こっていた場合は、ここで、より大きいプライマーはハイブリダイズしたままであり、そしてシグナル、例えば蛍光が検出可能である。これらの方法のさらなる考察が、米国特許第５，９１９，６２６号；第５，９４５，２８３号；第５，２４２，７９４号；および第５，９５２，１７４号に見られうる。
【０２２８】
ｍＲＮＡディスプレイ
[00281]ｍＲＮＡディスプレイにおいて、ｍＲＮＡ変異体の巨大ライブラリーが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写され、そして翻訳される。遺伝子変異体の各々は、３’端に共有結合したピューロマイシン部分を有する。翻訳中のリボソームがｍＲＮＡテンプレートの３’端に到達すると、ピューロマイシン部分がリボソームのＡ部位に進入し、そして産生中のポリペプチド内に取り込まれる。その結果、下流スクリーニングおよび選択実験で使用可能なｍＲＮＡ−ポリペプチド融合物が生じる。ｍＲＮＡディスプレイライブラリーを調製する際に非常に重要な工程は、３’ピューロマイシン・オリゴヌクレオチド・スペーサーに対するｍＲＮＡテンプレートの連結である。この場合、ＤＮＡリガーゼを用いて、通常、連結接合部に渡る一本鎖ＤＮＡ「スプリント」の補助を伴って、一本鎖ＲＮＡ分子を一本鎖ＤＮＡスペーサーに連結する。該方法のさらなる考察は、Ｌｉｕら（２０００），  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ３１８，  ２６８−２９３ならびに米国特許第６，２１４，５５３号および第６，２０７，４４６号に見られうる。
【０２２９】
[00282]本発明はまた、本発明にしたがった使用のためのキットの調製も予期する。適切なキットには、チューブ、バイアル、ならびにシュリンクラップおよびブロー成形パッケージを含む、適切な容器およびパッケージング材料中の、本発明にしたがって使用するための多様な試薬が含まれる。
【０２３０】
[00283]本発明にしたがった例示的キット中に包含するのに適した材料は、１またはそれより多い本発明の融合ポリペプチド、あるいは本発明の１またはそれより多い組成物、本発明の融合ポリペプチドの基質を含み、例えば１またはそれより多い陽性対照（その例は本明細書に援用される）、緩衝剤、補因子、および本発明の融合ポリペプチドの有効活性に必要な他の試薬を含む。
【０２３１】
[00284]特に予期されるのは、マイクロ流体デバイス、マイクロキュベット、マイクロアレイ、ポリマービーズ、磁気粒子を含むナノまたはマイクロ粒子等などの１またはそれより多い固体支持体に結合した、本発明の１またはそれより多いポリペプチドまたは組成物を含むキットである。キットはまた、アッセイし、そして試験試料を含有するものと比較可能である、対照試料または一連の対照試料も含有してもよい。キットを用いて行ったアッセイまたは反応の結果を解釈するための使用説明書とともに、キットの各構成要素は、個々の容器内に被包されてもよく、そして多様な容器のすべては、単一のパッケージ内にあってもよい。
【０２３２】
[00285]本発明は、前述のものからなり、そしてまた以下に例のみを提供する構築物も含む。
【実施例】
【０２３３】
実施例１−プラスミドの構築および融合ポリペプチドの産生
[00286]本実施例は、以下の表１に列挙するような、多様なＤＮＡ結合ポリペプチドに融合した、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（リガーゼ）または大腸菌リガーゼ（ＬｉｇＡ）を含む融合ポリペプチドの、大腸菌における産生のためのプラスミドの構築を記載する。互いに対するリガーゼ活性を含むポリペプチドおよびＤＮＡ結合活性を含むポリペプチドの配向を、融合ポリペプチドの名称において、ポリペプチドが列挙される順序によって表す−例えばｐ５０−リガーゼは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドのＮ末端に（場合によって連結ポリペプチドを介して）融合したｐ５０  ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む融合ポリペプチドを指し、一方、リガーゼ−ｐ５０は、ｐ５０  ＤＮＡ結合ポリペプチドのＮ末端に（やはり場合によって連結ポリペプチドを介して）融合したＴ４  ＤＮＡリガーゼ・ポリペプチドを含む融合ポリペプチドを指す。
【０２３４】
表１：リガーゼ−ＤＮＡ結合融合ポリペプチド
【０２３５】
【表１】
2013505016.tif 000003
【０２３６】
材料および方法
１．大腸菌株ＤＨ５α−Ｅの増殖
[00287]大腸菌株ＤＨ５α−Ｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をすべての実験に用いた。以下に記載する箇所を除いて、標準条件下（ＬＢ培地、３７℃インキュベーション）で細胞を増殖させた。
【０２３７】
２．プラスミドの構築
[00288]本明細書で用いる代表的なプラスミドよびオリゴヌクレオチドを表２に列挙する。
【０２３８】
[00289]ヒトＮＦ−カッパＢのアミノ酸４０〜３６６（すなわちｐ５０）をコードするＤＮＡ断片を、オリゴヌクレオチドプライマーｐ５０＿Ｓｆｉ．ｆｏｒ（配列番号１）およびｐ５０−リガーゼ．ｒｅｖ（配列番号２）を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、プラスミドｐＲＥＳ１１２から増幅した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼをコードするＤＮＡ断片を、オリゴヌクレオチドプライマーｐ５０−リガーゼ．ｆｏｒ（配列番号３）およびリガーゼ＿Ｓｆｉ．ｒｅｖ（配列番号４）を用いたＰＣＲにおいて、プラスミドｐＥＴ１４ｂ−リガーゼから増幅した。プライマーｐ５０＿Ｓｆｉ．ｆｏｒ（配列番号１）およびリガーゼ＿Ｓｆｉ．ｒｅｖ（配列番号４）を用いた重複組み立てＰＣＲ（参考文献：  Ｈｏｒｔｏｎら（１９８９）  Ｇｅｎｅ，  ７７，  ６１−６８）を用いて、ｐ５０遺伝子およびリガーゼ遺伝子を一緒にスプライシングして、ｐ５０−リガーゼ融合ポリペプチドをコードする遺伝子を生じた。組み立てたｐ５０−リガーゼ遺伝子を、制限酵素ＳｆｉＩで消化して、そして発現ベクターｐＣＡ２４Ｎ（同じ制限酵素で処理されているもの）に連結して、ｐＣＡ２４Ｎ−ｐ５０−リガーゼを生じた。Ｔ５−ｌａｃプロモーターおよび（Ｈｉｓ）６タグ（どちらもベクターにコードされているもの）を含む完全発現構築物を配列番号５として記載し、そして融合ポリペプチドの得られるアミノ酸配列を、配列番号６として配列ＩＤリストに示す。
【０２３９】
[00290]Ｇｅｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒソフトウェア・パッケージ（Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓら（２００６），  ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，  ７，  ２８５）を用いて、大腸菌における発現増進のために、デイノコッカス・ラディオデュランス由来のｐｐｒＡ遺伝子を最適化した。これは発現されるタンパク質のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＢＡＡ２１３７４）を変化させないが、ｐｐｒＡ遺伝子配列内に、１６４の同義の突然変異を導入した。隣接する制限部位（ＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩ）を伴う最適化された遺伝子は、ＤＮＡ  ２．０（カリフォルニア州メンロパーク）によって合成され、そしてそのクローニングベクター、ｐＪ２０４中で供給された。コドン最適化されたｐｐｒＡ遺伝子を、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩでの消化によって、ｐＪ２０４−ｐｐｒＡより除去した。同じ制限酵素での消化によって、ｐＣＡ２４Ｎ−ｐ５０−リガーゼからｐ５０部分を除去した（配列番号５を参照されたい）。消化したｐｐｒＡ挿入物を、リガーゼ含有ｐＣＡ２４Ｎ骨格に連結して、ｐＣＡ２４Ｎ−ｐｐｒＡ−リガーゼを得た。Ｔ５−ｌａｃプロモーターおよび（Ｈｉｓ）６タグ（どちらもベクターにコードされる）を含む完全発現構築物を配列番号７として記載し、そして融合ポリペプチドの得られるアミノ酸配列を、配列番号８として配列ＩＤリストに示す。
【０２４０】
[00291]Ｇｅｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒソフトウェア・パッケージ（Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓら（２００６），  ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，  ７，  ２８５）を用いて、大腸菌における発現増進のために、スルホロブス・ソルファタリカス由来のｓｓｏ７ｄ遺伝子を最適化した。これは発現されるタンパク質のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿３４３８８９）を変化させないが、ｐｐｒＡ遺伝子配列内に、４７の同義の突然変異を導入した。ｓｓｏ７ｄ遺伝子の５’末端から４つのコドンを欠失させた。隣接する制限部位（ＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩ）を伴う最適化された遺伝子は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（アイオワ州コーラルビル）によって合成され、そしてそのクローニングベクター、ｐＩＤＴＳｍａｒｔ中で供給された。コドン最適化されたｓｓｏ７ｄ遺伝子を、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩでの消化によって、ｐＩＤＴＳｍａｒｔ−ｓｓｏ７ｄより除去した。同じ制限酵素での消化によって、ｐＣＡ２４Ｎ−ｐ５０−リガーゼからｐ５０部分を除去した（配列番号５を参照されたい）。消化したｓｓｏ７ｄ挿入物を、リガーゼ含有ｐＣＡ２４Ｎ骨格に連結して、ｐＣＡ２４Ｎ−ｓｓｏ７ｄ−リガーゼを得た。Ｔ５−ｌａｃプロモーターおよび（Ｈｉｓ）６タグ（どちらもベクターにコードされる）を含む完全発現構築物を配列番号９として記載し、そして融合ポリペプチドの得られるアミノ酸配列を、配列番号１０として配列ＩＤリストに示す。
【０２４１】
[00292]ヒトＮＦ−カッパＢのアミノ酸４０〜３６６（すなわちｐ５０）をコードするＤＮＡ断片を、オリゴヌクレオチドプライマー、リガーゼ−ｐ５０．ｆｏｒ（表２、配列番号１１を参照されたい）およびｐ５０＿Ｓｆｉ．ｒｅｖ（表２、配列番号１２を参照されたい）を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、プラスミドｐＲＥＳ１１２から増幅した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼをコードするＤＮＡ断片を、オリゴヌクレオチドプライマー、リガーゼ＿Ｓｆｉ．ｆｏｒ（表２、配列番号１３を参照されたい）およびリガーゼ−ｐ５０．ｒｅｖ（表２、配列番号１４を参照されたい）を用いたＰＣＲにおいて、プラスミドｐＥＴ１４ｂ−リガーゼから増幅した。プライマー、リガーゼ＿Ｓｆｉ．ｆｏｒ（配列番号１３）およびｐ５０＿Ｓｆｉ．ｒｅｖ（配列番号１２）を用いた重複組み立てＰＣＲ（参考文献：  Ｈｏｒｔｏｎら（１９８９）  Ｇｅｎｅ，  ７７，  ６１−６８）を用いて、リガーゼ遺伝子およびｐ５０遺伝子を一緒にスプライシングして、リガーゼ−ｐ５０融合ポリペプチドをコードする遺伝子を生じた。組み立てたリガーゼ−ｐ５０遺伝子を、制限酵素ＳｆｉＩで消化して、そして発現ベクターｐＣＡ２４Ｎ（同じ制限酵素で処理されているもの）に連結して、ｐＣＡ２４Ｎ−リガーゼ−ｐ５０を生じた。Ｔ５−ｌａｃプロモーターおよび（Ｈｉｓ）６タグ（どちらもベクターにコードされる）を含む完全発現構築物を配列番号１５として記載し、そして融合ポリペプチドの得られるアミノ酸配列を、配列番号１６として配列ＩＤリストに示す。
【０２４２】
表２．プラスミドおよびオリゴヌクレオチド
【０２４３】
【表２−１】
2013505016.tif 000004
【０２４４】
【表２−２】
2013505016.tif 000005
【０２４５】
３．融合ポリペプチドの産生および単離
[00293]プラスミドｐＣＡ２４Ｎ−ｐ５０−リガーゼ、ｐＣＡ２４Ｎ−ｐｐｒＡ−リガーゼ、ｐＣＡ２４Ｎ−ｓｓｏ７ｄ−リガーゼおよびｐＣＡ２４Ｎ−リガーゼ−ｐ５０を大腸菌ＤＨ５α−Ｅ細胞内に導入し、そして形質転換体を融合ポリペプチドの産生に適した条件下で培養した（２８℃、０．４ｍＭの濃度まで添加されたＩＰＴＧを含む）。細胞をペレットにし、カラム緩衝液（ＣＢ：  ４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；  ３００ｍＭ塩化ナトリウム；  １０ｍＭイミダゾール；  １０％グリセロール；および１ｍＭベータ−メルカプトエタノール）に再懸濁し、そして超音波によって溶解した。清澄な溶解物を、コバルトに基づく金属アフィニティ樹脂（Ｔａｌｏｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に適用した。洗浄して、非（Ｈｉｓ）６タグ化細胞性タンパク質を除去した後、１５０ｍＭイミダゾールを含有するＣＢで、（Ｈｉｓ）６タグ化融合ポリペプチドを溶出させた。溶出分画をプールし、そして保存緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．８；  ２００ｍＭ塩化ナトリウム；  １０％グリセロール）に対して徹底的に透析した。
【０２４６】
４．リガーゼ活性
[00294]３つのアッセイ−アガロースゲルに基づくアッセイ（実施例２および３を参照されたい）、細胞形質転換アッセイ（実施例４を参照されたい）および定量的ＰＣＲアッセイ（実施例５を参照されたい）を用いて、融合ポリペプチドのリガーゼ活性を決定した。
【０２４７】
実施例２−Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ融合タンパク質の連結活性の分析
ゲルに基づく活性アッセイ
[00295]付着端連結に関しては、プラスミドｐＣＡ２４Ｎ−ｏｍｐＣを、プライマーｐＣＡ２４Ｎ．ｆｏｒ（５’−ＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＴＡＡＡＧＡＧ−３’，［配列番号１９］）およびｐＣＡ２４Ｎ．ｒｅｖ（５’−ＣＣＣＡＴＴＡＡＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴＡＡＴＴＣＡＡＣ−３’［配列番号２０］）で増幅することによって、１，２７７ｂｐのＰＣＲ産物を生成した。制限酵素ＳｐｅＩでＰＣＲ産物を切断して、非常に類似のサイズ（６３８ｂｐおよび６３９ｂｐ）の２つの直鎖断片を生じた。切断反応の２つの産物を同時精製し、そして多様なリガーゼ・タンパク質の存在下または非存在下でインキュベーションした。１５０ｎｇの基質ＤＮＡを、２０ｐｍｏｌの酵素と１６℃で１０分間インキュベーションした。６５℃でさらに１５分間加熱することによって、反応を停止した。Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムを用いて試料を精製し、そして次いで、アガロースゲル上で泳動することによって、リガーゼ活性を決定した。１，２７７ｂｐの連結産物の出現、および６３８／６３９ｂｐの基質バンドの消滅として、活性を測定した。
【０２４８】
[00296]平滑端連結に関しては、制限酵素ＳｆｉＩおよびＳｍａＩで、プラスミドｐＣＡ２４Ｎ−ｔｉｇを切断し、３つの直鎖断片（５，２３２ｂｐ、７１７ｂｐおよび５８９ｂｐ）を生じた。７１７ｂｐ断片を精製し、そして１５０ｎｇのＤＮＡを、２０ｐｍｏｌのリガーゼ酵素と１６℃で２０分間インキュベーションすることによって連結アッセイで用いた。６５℃でさらに１５分間加熱することによって、反応を停止した。Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムを用いて試料を精製し、そして次いで、アガロースゲル上で泳動することによって、リガーゼ活性を決定した。１，４３４ｂｐの連結産物の出現、および７１７ｂｐの基質バンドの消滅として、活性を測定した。
【０２４９】
結果
[00297]多様な融合ポリペプチドの付着端および平滑端連結活性を、それぞれ、図１ａおよび１ｂに示す。図１ａのレーン２、４、５および１１に示される単一バンド（１，２７７ｂｐ）は、Ｓｓｏ７ｄ−リガーゼ、リガーゼ−ｃＴＦ、ｐ５０−リガーゼ、およびリガーゼ−ＰｐｒＡ融合タンパク質の非常に有効な付着端連結活性を示す。１，２７７ｂｐバンドはまた、レーン３、６〜８、および１０で非常に明らかであり、これらの融合ポリペプチドがやはり、頑強な付着端リガーゼ活性を有することを示した。上記の融合ポリペプチドの大半で観察されたものよりも低いが、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ対照で、連結活性が観察された（図１ａ、レーン１４）。
【０２５０】
[00298]図１ｂにおいて、単一バンド（１，４３４ｂｐ）がレーン３および４に示され、リガーゼ−ｃＴＦおよびｐ５０−リガーゼ融合タンパク質の非常に有効な平滑端連結活性が示される。１，４３４ｂｐバンドはまた、レーン１、５、６、１０および１１で非常に明らかであり、これらの融合ポリペプチドがやはり、頑強な平滑端リガーゼ活性を有することを示した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ対照では、上記の融合ポリペプチドで観察されたものより顕著に低い、最小限の平滑端連結活性しか観察されなかった（図ｌｂ、レーン１４）。
【０２５１】
考察
[00299]上記のゲルに基づくアッセイの結果は、融合パートナーの選択および融合の性質が、ＤＮＡリガーゼの活性を調節可能であることを示す。
【０２５２】
[00300]特に、付着端連結に関しては、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼとＳｓｏ７ｄ、ｃＴＦ、ｐ５０およびＰｐｒＡ  ＤＮＡ結合タンパク質の融合は、ＤＮＡ結合タンパク質融合を欠く、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼに比較して、顕著に改善された連結活性を示した。平滑端連結活性は、リガーゼがｃＴＦおよびｐ５０タンパク質に融合した際、特に改善された。
【０２５３】
実施例３−大腸菌ＬｉｇＡ融合タンパク質の連結活性の分析
ゲルに基づく活性アッセイ
[00301]付着端連結のため、１７０ｎｇのＳｐｅＩ消化ｏｍｐＣ基質（実施例２に記載するとおり）を、２０ｐｍｏｌの各ＬｉｇＡ酵素と１６℃で１７時間インキュベーションした。反応を熱停止し（６５℃、１５分間）、そしてアガロースゲル上で泳動した。ＬｉｇＡ−ｐ５０およびｐ５０−ＬｉｇＡ融合ポリペプチドに加えて、天然ＬｉｇＡリガーゼおよび３つの対照試料もまたアッセイした。
【０２５４】
・陽性対照−商業的に入手可能なＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）
・陰性対照−リガーゼ添加なし
・商業的対照−１μＬの大腸菌ＬｉｇＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）
[00302]平滑端連結のため、１２０ｎｇのＳｆｉＩ／ＳｍａＩ消化ｔｉｇ基質（実施例２に記載するとおり）を、２０ｐｍｏｌの各酵素と１６℃で１７時間インキュベーションした。反応を熱停止し（６５℃、１５分間）、そしてアガロースゲル上で泳動した。
【０２５５】
結果
[00303]ＬｉｇＡ融合タンパク質の付着端および平滑端連結活性を、それぞれ、図２ａおよび２ｂに示す。天然ＬｉｇＡは、平滑端連結に関して、商業的に入手可能なＬｉｇＡ酵素に匹敵する活性を示した（図２ａ、レーン２および８）。ｐ５０  ＤＮＡ結合タンパク質への融合（図２ａ、レーン３および４）は、非融合ＬｉｇＡに比較して、連結活性に対する改善を示した。
【０２５６】
[00304]予期されるように、商業的に入手可能なＬｉｇＡ酵素は、平滑端アッセイにおいて、無視できる程度の活性を示した（図２ｂ、レーン８）。天然ＬｉｇＡは、わずかな活性を示した（図２ｂ、レーン２）。ＬｉｇＡ−ｐ５０融合構築物で、平滑端アッセイにおける頑強な連結活性が示されたが、ｐ５０−ＬｉｇＡ融合物では示されなかった。
【０２５７】
[00305]付着端および平滑端アッセイの両方で、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ陽性対照は優れた活性を示した。陰性対照試料では、活性はまったく観察されなかった。
考察
[00306]当該技術分野で認識されるように、大腸菌ＬｉｇＡは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼと比較して、減少した連結活性を示す。しかし、ＤＮＡ結合ポリペプチドをＬｉｇＡに融合させると、連結活性が改善され、そして実際、ＬｉｇＡのＣ末端にｐ５０  ＤＮＡポリペプチドを融合させると、ＬｉｇＡに平滑端連結活性が与えられ、ここで、天然酵素では平滑端連結活性はまったく観察されなかった。
【０２５８】
実施例４−形質転換アッセイ
形質転換アッセイ
[00307]プラスミドｐＣＡ２４Ｎ−ｏｍｐＣをＨｉｎｄＩＩおよびＳｐｅＩ制限酵素で直線化して、相補性付着端を伴う５，０３２ｂｐベクター主鎖および１，３１１ｂｐ挿入断片を産生した。直線化プラスミド（１００ｎｇの脱リン酸化ベクターおよび７８ｎｇの挿入物断片）を、上記のように産生されたｐ５０−リガーゼ、リガーゼ−ＰｐｒＡ、Ｓｓｏ７ｄ−リガーゼ、またはＴ４  ＤＮＡリガーゼの存在下または非存在下でインキュベーションした。１６℃で６０分間インキュベーションした後、ＱｉａＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて各試料を精製し、そしてアリコットを用いて、大腸菌ＤＨ５α−Ｅ細胞を形質転換した。クロラムフェニコールを含有するＬＢ培地上に、形質転換細胞をプレーティングし、そして３７℃で一晩インキュベーションした。各プレート上のコロニー数を測定し、そしてこれは、再環状化されたプラスミド分子の数に正比例し、そしてしたがって、リガーゼ融合タンパク質の活性に正比例した。
【０２５９】
結果
[00308]形質転換アッセイの結果を以下の表３に示す。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよびリガーゼ−ＰｐｒＡ融合タンパク質は、Ｓｓｏ７ｄ−リガーゼおよびｐ５０−リガーゼ融合タンパク質より性能が優れていることが示された。陰性対照において、わずかな数のコロニーが観察された。
【０２６０】
表３：形質転換アッセイ
【０２６１】
【表３】
2013505016.tif 000006
【０２６２】
実施例５−定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いた連結活性の分析
[00309]本実施例は、多様な融合ポリペプチドのリガーゼ活性を定量化するためのｑＰＣＲの使用を記載する。
【０２６３】
材料および方法
[00310]付着端連結のため、実施例２に上述する切断されたＰＣＲ産物（ＳｐｅＩ消化ｏｍｐＣ）を、多様なリガーゼ融合タンパク質の存在下でインキュベーションした。第一の実験において、４０ｎｇ基質を、２０ｐｍｏｌのｐ５０−リガーゼ、リガーゼ−ｐ５０、ＰｐｒＡ−リガーゼ、Ｓｓｏ７ｄ−リガーゼまたはＴ４  ＤＮＡリガーゼいずれかとインキュベーションした。第二の実験において、４２０ｎｇの基質を１ｐｍｏｌのリガーゼ−ｃＴＦ、リガーゼ−ＰｐｒＡ、ｐ５０−リガーゼ、またはＳｓｏ７ｄ−リガーゼのいずれかとインキュベーションした。１６℃で１０分間インキュベーションした後、ＱｉａＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、各試料を脱塩した。陽性対照反応は、１６℃で１６時間インキュベーションした（連結反応が完了するのを可能にするため）ＰＣＲ産物およびＴ４  ＤＮＡリガーゼからなった。陰性対照反応は、いかなるリガーゼ・タンパク質も欠いていた。連結部位に渡る１６５ｂｐ断片を増幅するプライマーを用いたｑＰＣＲによって、各反応中の連結産物量（そしてしたがって各リガーゼの活性）を測定した。ＳＹＢＲグリーン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を結合させることによって、各ｑＰＣＲ中の産物を検出した。ｑＰＣＲプライマー：  ｏｍｐＣ．ｆｏｒ、５’−ＧＧＣＴＴＣＧＣＧＡＣＣＴＡＣＣＧＴＡＡＣＡＣＴＧＡＣ−３’［配列番号１７］；  ｏｍｐＣ．ｒｅｖ、５’−ＧＣＣＧＡＣＧＣＣＧＴＣＧＣＣＧＴＴＴＴＧＡＣ−３’［配列番号１８］。
【０２６４】
[00311]平滑端連結のため、ＳｆｉＩ／ＳｍａＩ消化ｔｉｇ基質（実施例２に記載するとおり）を、同じリガーゼ融合酵素（リガーゼ−ｃＴＦ、リガーゼ−ＰｐｒＡ、ｐ５０−リガーゼ、またはＳｓｏ７ｄ−リガーゼ）とインキュベーションした。各反応のため、１００ｎｇの基質を１ｐｍｏｌの酵素と１６℃で５時間インキュベーションした。反応を熱停止し（６５℃、１５分間）、断片を精製し、そしてアガロースゲル上で泳動した。
【０２６５】
結果
[00312]ｑＰＣＲ実験の結果を図３および４に示す。データは、３回の独立の実験の平均（＋／−ＳＥＭ）に相当し、各々は、３つ組でアッセイした試料からなった。各実験のため、すべての活性を陽性対照反応（すなわち１０分間ではなく、１６時間実行した連結反応）の活性に対して規準化した。実験１において、最も活性である融合タンパク質はｐ５０−リガーゼおよびＰｐｒＡ−リガーゼ（図３）であり、これらは基質のおよそ６０％を連結可能であった。実験２において、最も活性である融合タンパク質は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、リガーゼ−ｃＴＦおよびリガーゼ−ＰｐｒＡ（図４）であり、これらは、およそ６２％〜６９％の間の基質ＤＮＡ分子を連結可能であった。対照的に、Ｓｓｏ７ｄ−リガーゼは、基質のおよそ３０％を連結可能であった。
【０２６６】
[00313]平滑端連結のためのゲルに基づくアッセイの結果を図５に示す。Ｓｓｏ７ｄ−リガーゼ（レーン１）およびＴ４  ＤＮＡリガーゼ（レーン５）に関しては、無視できる連結しか観察されなかった。リガーゼ−ＰｐｒＡ（レーン３）に関しては、わずかな量の連結活性が観察され、一方、ｐ５０−リガーゼ（レーン２）およびリガーゼ−ｃＴＦ（レーン４）は、最大の活性を示した。
【０２６７】
考察
[00314]上記のｑＰＣＲアッセイは、ＤＮＡリガーゼの連結活性が、該リガーゼをＤＮＡ結合ポリペプチドに融合することによって改善可能であることのさらなる確証を提供する。ｐ５０−リガーゼ、リガーゼ−ｃＴＦおよびリガーゼ−ＰｐｒＡ融合ポリペプチドに関して、リガーゼ単独に比較して２倍の改善が観察された。さらに、融合ポリペプチドの性質−ＤＮＡ結合ポリペプチドの同一性およびリガーゼ・ポリペプチドに対するＤＮＡ結合ポリペプチドの配向−が、融合ポリペプチドの連結活性に影響を及ぼす。
【０２６８】
産業上利用性
[00315]本発明の融合ポリペプチドおよび方法は、広い範囲の分子生物学的技術、ならびに診断、タンパク質産生、薬学、栄養学および医学分野における適用において、有用性を有する。
【図１】
2013505016.tif 000007
【図２】
2013505016.tif 000008
【図３】
2013505016.tif 000009
【図４】
2013505016.tif 000010
【図５】
2013505016.tif 000011
【配列表】
2013505016000001.xml
【国際調査報告】
2013505016.tif 000041
2013505016.tif 000042
2013505016.tif 000043
2013505016.tif 000044
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