(57)【要約】  本発明は、マイクロ撮像システムに結合されたFTIRまたはラマンスペクトロメーターによる被検体の皮膚上の癌腫を識別し、分類するための方法に関する。
2013527913.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織試料のスペクトル画像を処理するためのファジーC-平均法(FCM)クラスタリングアルゴリズムであって、K(非冗長性FCMクラスタの数)の最適値、およびm(ファジー指数)を、FCMクラスタ間の冗長性に基づき、自動的にかつ同時に推定するファジーC-平均法(FCM)クラスタリングアルゴリズム。
【請求項２】
前記冗長性は
【数１】
2013527913.tif 000051
によって計算され、
式中、Rijは冗長性の尺度としての2つのクラスタiおよびjの間の相互相関係数であり、
【数２】
2013527913.tif 000052
は対(K,m)についてFCMによって与えられたクラスタiおよびjのメンバーシップ値の間の共分散であり、
【数３】
2013527913.tif 000053
および
【数４】
2013527913.tif 000054
はクラスタiおよびjの前記メンバーシップ値の分散であり、平均は
【数５】
2013527913.tif 000055
および
【数６】
2013527913.tif 000056
である請求項1に記載のアルゴリズム。
【請求項３】
前記アルゴリズムは、1)結果としてL個の曲線を構成する、前記相関係数のL個の異なる閾値についてmの関数における非冗長クラスタの数を決定するためのクラスタ数を減らす反復プロセスと、2)前記L個の曲線からFCMパラメータの最適な推定を行うステップと、3)クラスタの前記数の最終的な最適値
【数７】
2013527913.tif 000057
を確定するステップと、4)前記ファジー指数の最適値
【数８】
2013527913.tif 000058
を計算するステップとを含む請求項2に記載のアルゴリズム。
【請求項４】
Kおよびmの前記最適値は、データセットを先験的に知らなくても推定される請求項3に記載のアルゴリズム。
【請求項５】
前記スペクトル画像のそれぞれのスペクトルは、特定のメンバーシップ値を持つクラスタ毎に割り当てられる請求項4に記載のアルゴリズム。
【請求項６】
病変部の腫瘍不均一性を特徴付けるための方法であって、a)マイクロ撮像システムに結合されたFTIRまたはラマンスペクトロメーターによって組織試料上の病変を走査するステップと、b)前記病変の一連のデジタル画像のスペクトルを取得し、格納するステップと、c)ファジーC-平均法(FCM)クラスタリングアルゴリズムによって前記スペクトルをクラスタ化するステップとを含み、前記アルゴリズムは、K(非冗長性FCMクラスタの数)の最適値、およびm(ファジー指数)を、FCMクラスタ間の冗長性に基づき自動的にかつ同時に推定する方法。
【請求項７】
前記冗長性は
【数９】
2013527913.tif 000059
によって計算され、
式中、Rijは冗長性の尺度としての2つのクラスタiおよびjの間の相互相関係数であり、
【数１０】
2013527913.tif 000060
は対(K,m)についてFCMによって与えられたクラスタiおよびjのメンバーシップ値の間の共分散であり、
【数１１】
2013527913.tif 000061
および
【数１２】
2013527913.tif 000062
はクラスタiおよびjの前記メンバーシップ値の分散であり、平均は
【数１３】
2013527913.tif 000063
および
【数１４】
2013527913.tif 000064
である請求項6記載の方法。
【請求項８】
前記アルゴリズムは、1)結果としてL個の曲線を構成する、前記相関係数のL個の異なる閾値についてmの関数における非冗長クラスタの数を決定するためのクラスタ数を減らす反復プロセスと、2)前記L個の曲線からFCMパラメータの最適な推定を行うステップと、3)クラスタの前記数の最終的な最適値
【数１５】
2013527913.tif 000065
を確定するステップと、4)前記ファジー指数の最適値
【数１６】
2013527913.tif 000066
を計算するステップとを含む請求項7に記載の方法。
【請求項９】
【数１７】
2013527913.tif 000067
および
【数１８】
2013527913.tif 000068
の前記最適値は、データセットを先験的に知らなくても推定される請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
スペクトル画像のそれぞれのスペクトルは、特定のメンバーシップ値を持つクラスタ毎に割り当てられる請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法は、d)前記クラスタ-メンバーシップ情報をさまざまな腫瘍組織のスペクトルライブラリと比較し、皮膚腫瘍のそれぞれの組織の種類のスペクトルマーカーを識別するステップと、e)色をそれぞれの異なるクラスタに割り当てることによって前記スペクトルマーカーをマッピングするステップとをさらに含む請求項6に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法は、前記腫瘍組織および腫瘍/腫瘍周辺組織の界面を区別する請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法は、腫瘍周辺組織のピクセルのメンバーシップ値の漸進的勾配を明らかにする請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記腫瘍組織は、皮膚癌の組織である請求項12に記載の方法。
【請求項１５】
前記腫瘍組織は、浸潤性SCCの組織である請求項12に記載の方法。
【請求項１６】
前記腫瘍組織は、表在型BCCの非浸潤性状態の組織である請求項12に記載の方法。
【請求項１７】
前記腫瘍組織は、ボーエン病の組織である請求項12に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ファジークラスタリングアルゴリズムと癌腫組織への応用に関する。
【０００２】
本出願には、2010年3月26日に出願した米国仮特許出願第61/282767号の優先権を受ける資格がある。出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれている。
【背景技術】
【０００３】
癌組織と周辺組織の領域間の発癌に関係する生化学的変化はわずかなものである。結果として、IRおよびラマンスペクトルなどのスペクトル画像は、強力なデジタル信号処理およびパターン認識方法によってこれらの変化を強調するために処理される必要がある。今まで、他の組織構造(正常、炎症性、線維性、...)によって囲まれた腫瘍組織を特定することを可能にする色分けされた画像を作成するために、K-平均法(KM)または凝集型階層的(AH)クラスタリングを含む教師なし「ハード」クラスタリング法(unsupervised "hard" clustering techniques)が通常適用されてきた。
【０００４】
「ハード」クラスタリング法の特徴は、それぞれのピクセル(スペクトル)が1つのクラスタにのみ割り当てられることである。その結果、非癌組織と癌病変部との間の進行性の移行を考慮することができないだけでなく、腫瘍内不均一性のすべての微妙な差異を明らかにできない。Wolthuis, R.、Travo, A.、Nicolet, C.、Neuville, A.、Gaub, M. P.、Guennot, D.、Ly, E.、Manfait, M.、Jeannesson, P.、Piot, O.「Analytical Chemistry 2008」、80、8461〜8469頁を参照されたい。
【０００５】
この欠点に対処するために、ファジーC-平均法(FCM)などのファジークラスタリング法が、「ハード」クラスタリングアルゴリズム代わりに使用されうる。Bezdek, J. C.「Pattern recognition with fuzzy objective function algorithms」、Plenum: New York、USA、1981年を参照のこと。実際、FCMでは、それぞれのピクセルを、関連付けられているメンバーシップ値が0(クラスメンバーシップなし)から1(最高度のクラスタメンバーシップ)までの範囲内で変化するクラスタ毎に割り当てることができる。IR分光法では、データ解析にFCMが使用されている。
【０００６】
しかし、「ハード」KMクラスタリングの場合などでは、クラスタの数Kは、ユーザーによって先験的に定義されなければならない。そのため、FCMの結果は、操作者の経験に頼ったものである。それに加えて、FCMの結果は、ファジー論理の文献においてファジー指数mと称される、別の重要なパラメータに依存する。m=1の場合、FCMはKMと同一になり、mが大きくなると、クラスタリングはよりファジー性を増す。mの値が非常に高い場合、データは、すべてのクラスタについて等しいメンバーシップを有することになる。IRまたはラマンデータ処理では、これにより、クラスタ同士でいくつかのピクセルのみが異なる、冗長クラスタ画像が形成されうる。しかし、ファジー指数は、以前から、文献において2に固定されている。ハイパースペクトル画像の情報内容を全面的に利用するのに必要な、Kとmとの間の効率的なトレードオフの関係の選択は、いぜんとして、未解決の問題である。Mansfield, J. R.、Sowa, M. G.、Scarth, G. B.、Somorjai, R. L.、Mantsch, H. H.、「Analytical Chemistry」1997年、69、3370〜3374頁、およびRichter, T.、Steiner, G.、Abu-Id, M. H.、Salzer, R.、Bergmann, R.、Rodig, H.、Johannsen, B.、「Vibrational Spectroscopy」2002年、28、103〜110頁を参照のこと。実際、直腸結腸腺癌について近年示されているように、対(k,m)が最適化されていない場合、FCMクラスタリングは、組織の病理組織学的認識に関してAHクラスタリングより効率が低いことが実証されている。Lasch, P.、Haensch, W.、Naumann, D.、Diem, M.、Biochimica et Biophysica Acta 2004年、1688、176〜186頁を参照のこと。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Wolthuis, R.、Travo, A.、Nicolet, C.、Neuville, A.、Gaub, M. P.、Guennot, D.、Ly, E.、Manfait, M.、Jeannesson, P.、Piot, O.「Analytical Chemistry 2008」、80、8461〜8469頁
【非特許文献２】Bezdek, J. C.「Pattern recognition with fuzzy objective function algorithms」、Plenum: New York、USA、1981年
【非特許文献３】Mansfield, J. R.、Sowa, M. G.、Scarth, G. B.、Somorjai, R. L.、Mantsch, H. H.、「Analytical Chemistry」1997年、69、3370〜3374頁
【非特許文献４】Richter, T.、Steiner, G.、Abu-Id, M. H.、Salzer, R.、Bergmann, R.、Rodig, H.、Johannsen, B.、「Vibrational Spectroscopy」2002年、28、103〜110頁
【非特許文献５】Lasch, P.、Haensch, W.、Naumann, D.、Diem, M.、Biochimica et Biophysica Acta 2004年、1688、176〜186頁
【非特許文献６】Ly, E.、Piot, O.、Wolthuis, R.、Durlach, A.、Bernard, P.、およびManfait, M.、(Analyst 2008、133、197〜205頁)
【非特許文献７】Vijaya, P. A.、Murty, M. N.、Subramanian, D. K.、「Lecture Notes in Computer Science」、2005年、3776/2005、583〜588頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、データセットを先験的に知ることなく、Kの最適値、非冗長性FCMクラスタの数、およびファジー指数mを自動的に推定することができる、腫瘍組織のスペクトル画像専用の新規性のあるアルゴリズムを提供する。この革新的アルゴリズムは、FCMクラスタ間の冗長性に基づく。このアルゴリズムは、腫瘍領域を特定し、また腫瘍構造と周辺組織構造との間の移行領域を強調することに特に最適化されている。浸潤性腫瘍では、腫瘍周辺組織のピクセルのメンバーシップ値の漸進的勾配も明らかにされる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、組織試料のスペクトル画像を処理するためのファジーC-平均法(FCM)クラスタリングアルゴリズムを提供する。このアルゴリズムは、K(非冗長性FCMクラスタの数)の最適値、およびm(ファジー指数)を、FCMクラスタ間の冗長性に基づき自動的にかつ同時に推定する。
【００１０】
本発明は、病変部の腫瘍不均一性を特徴付けるための方法も提供する。本発明によると、この特徴付けは、a)マイクロ撮像システムに結合されたFTIRまたはラマンスペクトロメーターによって組織試料上の病変部を走査するステップと、b)病変部の一連のデジタル画像のスペクトルを取得し、格納するステップと、c)ファジーC-平均法(FCM)クラスタリングアルゴリズムによってスペクトルをクラスタ化するステップとによって実行された。さらに、このアルゴリズムは、K(非冗長性FCMクラスタの数)の最適値、およびm(ファジー指数)を、FCMクラスタ間の冗長性に基づき自動的にかつ同時に推定する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】EMSCベースの前処理の前後の2つの代表的IRスペクトルの図である。この方法を適用した後、パラフィンの寄与分は、すべての記録されたスペクトル上で同じ振幅に固定され、そのため、中和されていると考えられる。図1(b)では、パラフィン帯域は、1340〜1480cm-1のスペクトル範囲内に、組織帯域は、1030〜1340および1500〜1720cm-1のスペクトル範囲内に局在化される。
【図２】mの関数としての非冗長クラスタの数
【数１】
2013527913.tif 000003
の曲線を構成することを可能にする冗長性ベースのアルゴリズム(RBA)の一般的スキームの図である。
【図３】表在型ヒト皮膚BCC試料のFT-IRデータセットに基づく「ハード」クラスタリング色分け画像である。パネル(a):H&E染色切片(*表皮、+真皮、BCCは輪郭が描かれている)。パネル(b):KM色分け画像。パネル(cおよびd):HHAC色分け画像および対応する系統樹。それぞれの色は1つのクラスタに対応する。
【図４】ヒト皮膚BCC試料のFT-IRデータセットに基づく最適化されていないパラメータ(K=11およびm=2)を持つFCM画像である。クラスタ1、2、3、および4は、表皮および腫瘍を関連付ける冗長クラスタであり、5、6、7、8、および9は、真皮の冗長クラスタである。クラスタ10および11は、真皮を記述する非冗長クラスタである。カラーバーは、それぞれのピクセルに対するメンバーシップ値のスケールを表す。対応するH&E染色切片では、BCCは輪郭が描かれ、表皮(*)および真皮(+)が示されている。
【図５】ヒト皮膚ボーエン病試料のFT-IRデータセットに基づく「ハード」クラスタリング色分け画像である。パネル(a):H&E染色切片(*表皮、+真皮、ボーエン病は輪郭が描かれている)。パネル(b):KM色分け画像。パネル(cおよびd):HHAC色分け画像および対応する系統樹。それぞれの色は1つのクラスタに対応する。
【図６】ヒト皮膚ボーエン病試料のFT-IRデータセットに基づく最適化されていないパラメータ(K=11およびm=2)を持つFCM画像である。クラスタ1および4は、真皮の冗長クラスタであり、クラスタ2および9、ならびにクラスタ6および7も同様である。クラスタ5、8、および10は、表皮に対して冗長である。クラスタ3および11は、ボーエン病を記述する。カラーバーは、各ピクセルに対するメンバーシップ値のスケールを表す。対応するH&E染色切片では、ボーエン病は輪郭が描かれ、表皮(*)および真皮(+)が示されている。
【図７】浸潤性ヒト皮膚SCC試料のFT-IRデータセットに基づく「ハード」クラスタリング色分け画像である。パネル(a):H&E染色切片、腫瘍は輪郭が描かれている。パネル(b):KM色分け画像。パネル(cおよびd):HHAC色分け画像および対応する系統樹。それぞれの色は1つのクラスタに対応する。
【図８】ヒト皮膚SCC試料のFT-IRデータセットに基づく最適化されていないパラメータ(K=11およびm=2)を持つFCM画像である。クラスタ1および4は、表皮の冗長クラスタであり、3は、非冗長クラスタである。真皮については、2、5、および11は、クラスタ7および9の場合のように、冗長である。クラスタ6、8、および10は、腫瘍を記述する分離されたクラスタである。カラーバーは、それぞれのピクセルに対するメンバーシップ値のスケールを表す。対応するH&E染色切片では、腫瘍は輪郭が描かれている。
【図９】SCC試料についてRBAによって推定されたファジー指数mの関数としての非冗長クラスタの数
【数２】
2013527913.tif 000004
を示す図である。それぞれの曲線は、閾値slの所定の値に対応する。
【図１０】RBA最適化パラメータ
【数３】
2013527913.tif 000005
=6(クラスタの数)および
【数４】
2013527913.tif 000006
=2.06(ファジー指数)を用いて構成されたヒト皮膚SCC試料のFT-IRデータセットに基づくFCM画像である。クラスタの割り当て:クラスタ1(腫瘍)、2(腫瘍周辺領域)、3、4、および5(真皮)、6(表皮)。カラーバーは、それぞれのピクセルに対するメンバーシップ値のスケールを表す。対応するH&E染色切片では、SCCは輪郭が描かれている。
【図１１】図10に示されているFCM画像をズームすることによる腫瘍/周辺真皮界面の分析結果を示す図である。腫瘍の侵潤先進部を特徴付けるクラスタ2も3D表現で示されている。カラーバーは、それぞれのピクセルに対するメンバーシップ値のスケールを表す。
【図１２】RBAクラスタリングの後のヒト皮膚表在型BCC試料のFT-IRデータセットに基づくFCM画像である。FCM画像(パネルa)は、最適化されたパラメータ
【数５】
2013527913.tif 000007
=5および
【数６】
2013527913.tif 000008
=1.6で構築された。これらのパラメータは、RBAによる結果の曲線(パネルb)および表2を使用して定義された。クラスタの割り当て:クラスタ1(表皮)、2、3、および4(真皮)、5(腫瘍領域)。カラーバーは、それぞれのピクセルに対するメンバーシップ値のスケールを表す。対応するH&E染色切片では、BCCは輪郭が描かれ、表皮(*)および真皮(+)が示されている。
【図１３】RBAクラスタリングの後のボーエン病試料のFT-IRデータセットに基づくFCM画像である。FCM画像(パネルa)は、最適化されたパラメータ
【数７】
2013527913.tif 000009
=5および
【数８】
2013527913.tif 000010
=1.77で構築された。これらのパラメータは、RBAによる結果の曲線(パネルb)および表3を使用して定義された。クラスタの割り当て:クラスタ1(表皮)、2、3、および4(真皮)、5(ボーエン病)。カラーバーは、それぞれのピクセルに対するメンバーシップ値のスケールを表す。対応するH&E染色切片では、ボーエン病は輪郭が描かれ、表皮(*)および真皮(+)が示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
(実施例)
実施例1  材料と方法
試料調製
開発したアルゴリズムを、ホルマリンで固定されたパラフィン包埋ヒト皮膚癌の13の生検、つまり、扁平上皮細胞癌(SCC、n=3)、基底細胞癌(BCC、n=4)、ボーエン病(n=6)に関して得られたIRデータベース上で適用した。試料は、ランス大学(フランス)病理学部の腫瘍バンクから入手した。FT-IR撮像を行うため、試料を厚さ10ミクロンに薄切りしたスライスを、特に調製することなく、フッ化カルシウム(CaF2)(英国ドーセット州所在のCrystran Ltd.社)窓の上に載せた。隣接するスライスを切断し、従来の方法の組織検査を行うためにヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で染色した。
【００１３】
FTIRデータ収集
空間分解能が6.25μm、スペクトル分解能が4cm-1であるSpectrum one FT-IRスペクトロメーター(フランス所在のPerkin Elmer Life Sciences社)に結合されたSpectrum Spotlight 300 FT-IR撮像システムを用いてFT-IRハイパースペクトル画像を記録した。このデバイスは、撮像用に窒素冷却水銀カドミウムテルル16ピクセル線検出器を装備した。データセットとも称されるスペクトル画像を、16回の累算を使用して収集した。それぞれの収集の前に、大気環境およびCaF2窓の基準スペクトルを、240回の累算で記録した。この基準スペクトルは、その後、Perkin Elmer Spotlightというソフトウェアの内蔵機能によってそれぞれのデータセットから自動的に減算された。それぞれの画像ピクセルは、900から1800cm-1までの範囲内に一様に分布する451個の波数上の1つの測定点(6.25×6.25μm2)の吸収度である、IRスペクトルを表した。指紋領域として特徴付けられる、このスペクトル範囲は、実際には、生体試料の最も情報量の多い領域に対応する。
【００１４】
データ処理
前の化学的脱鑞なしで試料を分析したが、記録されたFT-IRハイパースペクトル画像はパラフィンスペクトル寄与分についてデジタル補正されなければならない。この目的のために、拡張乗法信号補正(EMSC)に基づく自動処理をそれぞれの記録されたデータセット上で適用した。対応する分析手法の詳細は、参照により本明細書に組み込まれている、Ly, E.、Piot, O.、Wolthuis, R.、Durlach, A.、Bernard, P.、およびManfait, M.、(Analyst 2008、133、197〜205頁)で完全に説明された。簡単に言うと、平均スペクトルIは、それぞれのデータセットのすべてのQ個の記録されたスペクトルIqを平均することによって計算されたということである。4次多項式関数Pで光散乱効果をモデル化した。パラフィンのスペクトル変動を考慮するために、干渉行列Mを、パラフィンの平均スペクトルと純パラフィンブロック上で記録されたFT-IRスペクトル画像から抽出された最初の9つの主成分とで構成した。それぞれの記録されたスペクトルIqは、以下のように最小二乗法を使用することによってI、P、およびMでフィッティングした。
Iq=αqI+βqP+γqM+eq, q=1,..., Q
残差eqは、フィッティングモデルの精度の推定値を与えるもので、EMSC補正スペクトル
【００１５】
【数９】
2013527913.tif 000011
【００１６】
を得るために使用される。
【００１７】
EMSCベースの前処理を適用した後、パラフィン寄与分を中和して、組織のスペクトル変動のみをデータセット内に保持し、平均スペクトルを中心として補正スペクトルを正規化することができた。EMSCベースの前処理の前後の2つのIRスペクトルが図1に示されている。
【００１８】
それに加えて、この前処理により、分析結果から信号対雑音比が劣る外れ値となるスペクトルを捨てることが可能になった。対応するピクセルは、見やすいようにクラスタリング色分け画像で白色にした。
【００１９】
実施例2  既存のクラスタリング手法による実験
クラスタリングの主目的は、スペクトルデータセット間の類似性を見つけ、次いで類似のスペクトルをグループ化してまとめることにより組織切片内の注目領域を明らかにすることである。癌研究では、クラスタリング手法を使用することで、コントラストが高い色分けされた画像を作成し、複雑な組織内の腫瘍領域を特定することが可能になる。クラスタリング手法の詳細は、参照により本明細書に組み込まれているLy, E.、Piot, O.、Wolthuis, R.、Durlach, A.、Bernard, P.、およびManfait, M.、(Analyst 2008、133、197〜205頁)およびLasch, P.、Haensch, W.、Naumann, D.、およびDiem, M.(Biochimica et Biophysica Acta 2004、1688、176〜186頁)で説明されている。
【００２０】
「ハード」クラスタリング
KMクラスタリングは、非階層的分割クラスタリング手法である。KMの目的は、それぞれのスペクトルとスペクトルが影響を受けるクラスタの重心との間の距離測度に基づき目的関数を最小化することであった。このアルゴリズムは、データを反復的に分割してK個の異なるクラスタに分ける。ここで、KMクラスタリングは数回(n>10)実行され、これにより、安定解に到達することを確実にし、ランダムな初期化の依存性を解消した。この研究では、古典的なユークリッド距離を用いMatlab Statistics Toolboxを使用してKMを適用した。このプロセスは、反復を続けてもスペクトルの再割り当てが行われなくなるまで続けられ、さもなければ104回の反復後に停止した。
【００２１】
AHクラスタリングは、階層的分割クラスタリングであり、それぞれの対象(この場合にはスペクトル)はアルゴリズムの開始時の1つのクラスタである。それぞれの反復ステップで、AHは最も類似している2つのクラスタを新しい1つのクラスタに再グループ化する。アルゴリズムは、すべてのスペクトルが1つの単一クラスタに組み合わされたときに停止される。Q個のスペクトルについて、反復回数は、Q-1に等しい。AHクラスタリングプロセスは、初期化から独立している。しかし、KMの場合のように、AHクラスタリングでは、クラスタの数Kは、経験的に選択される。KMと比較して、AHクラスタリングは、著しく時間がかかり、またリソースも食う。
【００２２】
本発明における大きなデータセット上のAHクラスタリングの計算時間を短縮するために、ここでは、参照により本明細書に組み込まれている、Vijaya, P. A.、Murty, M. N.、Subramanian, D. K.「Lecture Notes in Computer Science 2005」、3776/2005、583〜588頁で説明されている、ユークリッド距離およびウォードのアルゴリズムを使用して、KMクラスタリングとAHクラスタリングとを組み合わせた効率的なハイブリッド階層的凝集型クラスタリング(HHAC)法を使用した。KMは、データセットを1000個のクラスタ中心に縮小するために最初に適用された。次いで、これらの1000個のKM重心に対してAHを実行した。
【００２３】
FCMクラスタリング
FCMクラスタリングは、メンバーシップ値uqkで重み付けされた、クラスタ内誤差の総和として定義された(Q個の利用可能な補正スペクトルIqcorrとK個のクラスタ重心vkとの間のユークリッド距離、つまり、L2ノルム||.||として計算された)目的関数Jm
【００２４】
【数１０】
2013527913.tif 000012
【００２５】
の最小化に基づく。この目的関数を最小化するクラスタ重心およびメンバーシップ値は、反復最適化手順を使用することによって得られる(Bezdek, J. C.「Pattern recognition with fuzzy objective function algorithms」、Plenum: New York、USA、1981年を参照のこと)。重みは、ファジー指数mによって制御される。したがって、「ハード」クラスタリングとは逆に、FCMでは、それぞれのスペクトルIqcorrを関連付けられているメンバーシップ値uqkが0と1の間で変化するすべてのクラスタk(k=1,...,K)に及ぼすことができ、それぞれのスペクトルに対するK個のクラスタメンバーシップ値の総和は1に等しい、つまり、
【００２６】
【数１１】
2013527913.tif 000013
【００２７】
となる。
【００２８】
ここで、Matlab Statistics Toolbox.からのFCM機能を適用した。停止基準として、最大500回の反復、および最小量の改善に対する設定10-5(それぞれのスペクトル/重心距離の総和のレベルで)を使用した。しかし、FCMでは、クラスタの数Kおよびファジー指数mを固定することを必要とした。これらのパラメータの選択が不適切だと、データのクラスタリングが解釈不可能になるおそれがある。そのため、これらのデータの最適な推定を行う自動化された方法を開発することが不可欠であった。
【００２９】
実施例3  FCMパラメータの最適な推定のための冗長性ベースのアルゴリズムの開発
この革新的なアルゴリズム(RBA)は、FCMクラスタ冗長性に基づくものであり、データセットの先験的知識を有することなく最適な対(Kopt,mopt)を求めることを目指した。われわれは、ここで、2つのクラスタiおよびjの間の相互相関係数Rij(K,m)
【００３０】
【数１２】
2013527913.tif 000014
【００３１】
を冗長性の尺度として選択したが、ただし、式中、
【００３２】
【数１３】
2013527913.tif 000015
【００３３】
は、対(K,m)についてFCMによって与えられるクラスタiおよびjのメンバーシップ値の間の共分散であり、
【００３４】
【数１４】
2013527913.tif 000016
【００３５】
および
【００３６】
【数１５】
2013527913.tif 000017
【００３７】
は、クラスタiおよびjのメンバーシップ値の分散であり、
【００３８】
【数１６】
2013527913.tif 000018
【００３９】
および
【００４０】
【数１７】
2013527913.tif 000019
【００４１】
は平均である。RBAは、3つのステップからなる。
最初に、クラスタの数を減らす反復プロセスを実行した。このステップについて、集合m={m1,...,mn,...,mN}に属すファジー指数のN個の異なる値および集合s={s1,...,sl,...,sL}に属すL個の異なる閾値を考察した。mは、古典的な値m=2を中心として一様に分布する、ファジー指数mのN個の異なる値からなり、sは、高い相関係数範囲50%から95%内に一様に分布するL個の異なる閾値からなる。FCMクラスタリングは、m1、sL、およびクラスタの数Kの大きな値、つまり、K=Kmaxで開始した。一般的な方法では、値の3組(mn,sl,K)に対して、1≦i,j≦Kとして相互相関係数Rij(K,mn)を計算した。Rij(K,mn)値の1つが、slより大きい場合、K=K-1として新しいFCMを実行した。さもなければ、Rij(K,mn)のすべての値が閾値slより小さい場合、非冗長クラスタの数
【００４２】
【数１８】
2013527913.tif 000020
【００４３】
(Kの最後の値に対応する)を得た。添字「nr」は、クラスタの非冗長性を表すために以下で使用される。
【００４４】
mの異なる値および固定閾値slに対してこの手順を実行することによって、非冗長クラスタの数の曲線
【００４５】
【数１９】
2013527913.tif 000021
【００４６】
をmの関数として得た。次のm(つまり、集合mに属すmn+1)に対するクラスタの数を減らす反復プロセスは、前のmについて推定された非冗長クラスタの数に等しいKの初期値、つまり
【００４７】
【数２０】
2013527913.tif 000022
【００４８】
からリスタートすべきである。しかし、FCMアルゴリズムはランダムに初期化されるので、非冗長クラスタの推定される数は、一方のクラスタリングと他方のクラスタリングとで異なる可能性がある。この可能な変動を考慮するために、次のmに対するKの初期値を前のmに対する非冗長クラスタの数に2を加えた値に、つまり、
【００４９】
【数２１】
2013527913.tif 000023
【００５０】
に設定したが、Kmaxを超えることはない。集合sのすべての値についてこの手順を実行することによって、その結果
【００５１】
【数２２】
2013527913.tif 000024
【００５２】
の曲線が閾値sl毎に得られた。大域的手順が、図2に示されている。
第2に、RBAは得られた曲線からクラスタの数の最適な推定である。結果と説明の節に示されているように、これらの曲線は、急激に減少し、
【００５３】
【数２３】
2013527913.tif 000025
【００５４】
の値のところで安定するが、ただし、式中、「^」は(こことこれ以降で)推定量を表す。閾値slが何であれ、われわれは、通常、近い値
【００５５】
【数２４】
2013527913.tif 000026
【００５６】
に対し、また多くの場合に同じ値に対して、これらの曲線内に切れ目が現れることを観察した。クラスタの数の最終的な最適値
【００５７】
【数２５】
2013527913.tif 000027
【００５８】
を確定するために多数決アルゴリズムが使用される。
【００５９】
最後に、ファジー指数の最適値
【００６０】
【数２６】
2013527913.tif 000028
【００６１】
は、最小値
【００６２】
【数２７】
2013527913.tif 000029
【００６３】
を平均することによって計算され、これらの値に対して曲線
【００６４】
【数２８】
2013527913.tif 000030
【００６５】
は
【００６６】
【数２９】
2013527913.tif 000031
【００６７】
のところに切れ目を示している、つまり、
【００６８】
【数３０】
2013527913.tif 000032
【００６９】
である、ただし、
【００７０】
【数３１】
2013527913.tif 000033
【００７１】
とする。
【００７２】
これ以降、これらのRBA最適化パラメータを用いて実行されるFCMクラスタリングは、FCM-RBAと定義される。
【００７３】
結果および説明
FCM-RBAクラスタリングは、13のヒト皮膚癌の薄い組織切片上で撮ったEMSC前処理済みFT-IRハイパースペクトル画像において評価された。結果をKM、HHAC、および古典的なFCMの結果と比較した。この切片の読み取りを改善するために、浸潤性SCCに対するこれらの比較結果を提示した。それに加えて、FCM-RBAクラスタリングデータを、表在型BCCおよびボーエン病の非浸潤状態について与えたが、対応するKM、HHAC、およびFCMの結果は、図3〜図6に提示した。
【００７４】
「ハード」クラスタリングの結果
腫瘍の輪郭が描かれている研究されたSCC試料のH&E染色組織画像は、図7(a)に示されている。
【００７５】
このパラフィン包埋組織切片の明確に区別できる組織領域を強調するために、11個のクラスタの経験的選択によりKMクラスタリングを適用した。その結果得られた、それぞれの色が1つのクラスタに関連付けられた色分けされた画像が図7(b)に示されている。
【００７６】
KMおよびHHAC画像を対応するH&E染色切片と比較することで、クラスタの割り当てを行うことができた。KMクラスタリングについてここで示されているように(図7(b))、腫瘍に属すピクセルをクラスタ1、7、および9にグループ分けし、腫瘍内不均一性を明らかにした。真皮はクラスタ2、3、および6で表し、潰瘍のある表皮はクラスタ4、5、8、10、および11で表した。図7(c)に示されているように、HHACクラスタリングの結果は、KMの結果と極めてよく似ており、HHAC色分け画像を構成するために使用される対応する系統樹は、図7(d)に表されている。
【００７７】
これらの結果は、「ハード」クラスタリングアルゴリズムが、組織構造の情報を取り出し、特に、組織切片内の腫瘍領域を特定することができたことを示している。しかし、クラスタの数の選択は、通常は経験的に解決する難しい問題であった。11個未満のクラスタを選択した場合、クラスタリングアルゴリズムによって識別される組織領域が混合され、腫瘍内不均一性はもう明らかにならなかった。11個を超えるクラスタでは、さらなる解釈可能な情報が得られなかった。さらに、これらの「ハード」クラスタリング法の主要な欠点は、それぞれの個別スペクトルのクラスタメンバーシップグレードが0または1に等しく、このためピクセルメンバーシップの微妙な差異を区別することができないという点である。その結果、これらの手法では、腫瘍の侵潤先進部(invasion front)のところに、または不均一な腫瘍内領域の間に進行性の移行が存在する可能性が高いと考えることはできなかった。
【００７８】
古典的なFCMクラスタリング
同じデータセット上で最適化パラメータなしでFCMアルゴリズムを使用することによって得られた結果を図8に示す。ファジー指数mは、他のグループの調査結果に応じて、一般に使用されるデフォルト値2に固定された。11個のクラスタを選択したが、これらは「ハード」クラスタリングですでに説明されているようにH&Eベースの組織の明確な再生を可能にする(図7)。それぞれのクラスタを、ただ1つの色分け画像に重ね合わせる代わりに、別の画像内に提示した。実際、重ね合わせ表示により、移行構造の強調表示が難しくなった。
【００７９】
図8に提示されているクラスタの視覚的な比較の結果、重要な冗長性が明らかになった。これは、計算された画像の間の相互相関係数Rijによって確認される。実際、クラスタ7および9は、98.3%に等しいRijと、クラスタ5および7は、82.6%に等しいRijと、クラスタ5および11は、78.6%に等しいRijと、最後にクラスタ1および4は、76.7%に等しいRij係数と相関した。研究された皮膚癌の集合に関して収集されたすべてのIRハイパースペクトル画像に関して類似の冗長性が観察されており、それらのうちの2つが図4および図6に示されている。
【００８０】
これらの結果から、古典的なFCMは、一方のクラスタと他方のクラスタとで数ピクセルしか異ならない非情報的な冗長画像を形成することが実証された。したがって、生物学的に関連したクラスタリングを得るためにKパラメータとmパラメータの最適な対を選択することが不可欠であった。
【００８１】
RBAを使用したFCMパラメータの最適化
革新的なアルゴリズム(RBA)を使用して最適なKパラメータおよびmパラメータの同時決定を実行した。われわれの調査では、値Kmax=20、ファジー指数の集合m={1.4,1.5,...,2.5}、および閾値の集合s={0.5,0.55,...,0.95}をテストした。閾値slの異なる値に対してこの方法により得られるmの関数として非冗長クラスタの数を表す曲線
【００８２】
【数３２】
2013527913.tif 000034
【００８３】
は、SCC試料について図9に示されている。それぞれの曲線は、曲線がきわめて安定する値
【００８４】
【数３３】
2013527913.tif 000035
【００８５】
に向かって速く減少する傾向があった。これらの閾値に対する値
【００８６】
【数３４】
2013527913.tif 000036
【００８７】
および対応する値
【００８８】
【数３５】
2013527913.tif 000037
【００８９】
は、表1に示されている。そこで、クラスタの最適な数
【００９０】
【数３６】
2013527913.tif 000038
【００９１】
は、多数決アルゴリズムを使用することによって6に等しいものとして推定されている。その結果得られる最適な値
【００９２】
【数３７】
2013527913.tif 000039
【００９３】
は、
【００９４】
【数３８】
2013527913.tif 000040
【００９５】
=6について得られた
【００９６】
【数３９】
2013527913.tif 000041
【００９７】
の値の平均として決定され、2.06に等しかった。開発されたRBAが、研究された皮膚癌の集合に関して収集されたすべてのIRハイパースペクトルデータセット上での適用に成功した。
【００９８】
表1:クラスタの最適な数
【数４０】
2013527913.tif 000042
およびファジー指数の対応する最適な値
【数４１】
2013527913.tif 000043
。これらのデータは、図9に提示されている曲線からの10個の異なる閾値slについて決定されている。
【００９９】
【表１】
2013527913.tif 000044
【０１００】
われわれの事例において、FCMクラスタの最適な数Kを決定するために使用される古典的な有効性指数は、標準的な組織病理学と相関しえなかったことについて言及されなければならない。実際、m=2で適用される分割係数および分類エントロピー(Bezdek, J. C.「Pattern recognition with fuzzy objective function algorithms」、Plenum: New York、USA、1981年を参照のこと)は、異なる組織構造を明らかにすることができなかったK=2の異常値を与える。これらのデータは、組織構造の区別に関するわれわれが開発したRBAの関連性を強化した。
【０１０１】
FCM-RBAを使用した皮膚癌の組織病理学的認識
ヒト浸潤性皮膚SCCに対するFCM-RBAによって生成される画像が図10に示されている。組織画像と比較した後、それぞれの生成されたクラスタを正確な組織構造に割り当て、腫瘍領域(クラスタ1)、腫瘍周辺領域(クラスタ2)、真皮(クラスタ3、4、および5)、および表皮(クラスタ6)とした。さらに、FCM-RBAは、従来の組織または古典的「ハード」クラスタリング法によってアクセス可能でない新しい情報を明らかにした。実際、これは、クラスタ1について示されているような腫瘍内およびクラスタ2について示されているような腫瘍周辺領域内の両方のマークされている不均一性の存在を強調した。「ハード」クラスタリングと比較すると、FCM-RBAでは、これらのクラスタのそれぞれの中で、ピクセルのメンバーシップグレード変動に対応するスペクトルの微妙な差異を視覚化することができた。これらのスペクトルの差は、これらの領域内に存在する腫瘍細胞の構造/機能の変化を反映する可能性のある組織構造内の分子変化に依存した。興味深いことに、腫瘍周辺領域(クラスタ2)の3D表現を使用する図11に示されているように、FCM-RBAは、ピクセルのメンバーシップ値に漸進的勾配の存在を明らかにした。腫瘍から真皮の方へ向かうにつれ、それぞれのピクセルのメンバーシップ値は次第に大きくなって最大値に到達し、次いで真皮の縁のところで急に減少する。これは、腫瘍(クラスタ1)とその侵潤先進部(クラスタ2)との間の緊密な結び付き、および侵潤先進部(クラスタ2)と周辺真皮(クラスタ3、4、および5)との間の驚くほど明快な差を示した。病理学的観点では、腫瘍周辺領域に大きな関心があったが、それは、腫瘍細胞が周囲の正常組織に浸潤する可能性がある腫瘍の侵潤前面を表していたからである。このアプローチは、癌腫から転移への腫瘍進行を探ることに関する大きな可能性を示しており、そのため、腫瘍の攻撃性の初期決定のための魅力的なツールとなりうる。
【０１０２】
浸潤性皮膚癌のモデルとしてSCC試料を分析した後、表在型BCCおよびボーエン病試料についてFCM-RBAの結果を提示したが、両方とも非侵潤性皮膚癌を表している。RBAによるFCMパラメータの最適化は、これらの試料については図12(b)および13(b)に、BCCおよびボーエン病の試料については表2および表3に、それぞれ示されている。
【０１０３】
表2:クラスタの最適な数
【数４２】
2013527913.tif 000045
およびファジー指数の対応する最適な値
【数４３】
2013527913.tif 000046
。これらのデータは、図10(b)に提示されている曲線からの10個の異なる閾値slについて決定されている。
【０１０４】
【表２】
2013527913.tif 000047
【０１０５】
表3:クラスタの最適な数
【数４４】
2013527913.tif 000048
およびファジー指数の対応する最適な値
【数４５】
2013527913.tif 000049
。これらのデータは、図13(b)に提示されている曲線からの10個の異なる閾値slについて決定されている。
【０１０６】
【表３】
2013527913.tif 000050
【０１０７】
図12(a)に示されているように、表在型BCCについて、FCM-RBAは、組織構造を分離するために容易に割り当て可能である5つのクラスタを明らかにした、つまり、表皮(クラスタ1)、真皮(クラスタ2、3、および4)、および腫瘍領域(クラスタ5)である。「ハード」クラスタリングと比較して(図3)、ファジークラスタリングでは、前のSCC試料のクラスタ1についてすでに説明されているように、クラスタ5内の腫瘍内不均一部分を識別した。腫瘍(クラスタ5)/正常な表皮(クラスタ1)の界面のところで追加の元の情報が証拠となった。実際、腫瘍から表皮への進行性の移行が観察されており、これは、これら2つの領域の間の相互関連性を反映している。これは、BCCが表皮角化細胞の細胞形質転換に由来するという事実によって説明できる。われわれの知る限りにおいて、従来の組織病理学によって識別されない、そのような組織相互依存性は、まだ説明されたことがないことに留意されたい。それに加えて、浸潤性SCCとは反対に、腫瘍(クラスタ5)/真皮(クラスタ2、3、および4)の界面は、いかなる中間腫瘍周辺構造も示していないが、むしろ、BCCの非浸潤性表現型を確認する明確な縁の存在を示していた。
【０１０８】
ボーエン病試料について、FCM-RBAは、以下の組織構造に割り当てられた5つのクラスタを明らかにしている、つまり、表皮(クラスタ1)、真皮(クラスタ2、3、および4)、および腫瘍(クラスタ5)である。クラスタ1および5の視覚的比較分析は、腫瘍が正常な表皮内にきわめて限局されていることを示した。それに加えて、FCM-RBAは、腫瘍/隣接表皮の界面のところでピクセルのメンバーシップ値の勾配が存在することを明らかにしなかった。SCCおよびBCC研究試料とは反対に、このように相互関連性が存在しないことは、ボーエン病がきわめて限局されている上皮内癌に対応するという事実によるものであった。
【０１０９】
結論
クラスタリング法に関連付けられているスペクトルマイクロ撮像法は、ヒト皮膚癌のパラフィン包埋組織切片の直接的分析の潜在的可能性が大きいことを示した。われわれの結果から、FCMクラスタリングは、古典的な「ハード」クラスタリング(KMおよび階層的分類)よりも強力であり、腫瘍不均一性および侵潤性に関係する生物学的に関連した情報を明らかにすることが実証された。そこで、われわれは、最適なFCMパラメータ(クラスタの数K、およびファジー指数m)の同時決定を行う専用オリジナルアルゴリズムを開発した。この新規性のあるデータ処理方法により、FT-IRまたはラマンマイクロ撮像機能は、日常的診断医学における用途向けの、観測者内変動性に無関係である、有望なツールとなる。
【符号の説明】
【０１１０】
sl  固定閾値
【図１】
2013527913.tif 000069
【図２】
2013527913.tif 000070
【図３】
2013527913.tif 000071
【図４】
2013527913.tif 000072
【図５】
2013527913.tif 000073
【図６】
2013527913.tif 000074
【図７】
2013527913.tif 000075
【図８】
2013527913.tif 000076
【図９】
2013527913.tif 000077
【図１０】
2013527913.tif 000078
【図１１】
2013527913.tif 000079
【図１２】
2013527913.tif 000080
【図１３】
2013527913.tif 000081
【国際調査報告】
2013527913.tif 000082
2013527913.tif 000083