(57)【要約】  本発明は、発色性インサイツハイブリダイゼーション(ＣＩＳＨ)のための系及び方法、特に単一アッセイにおける２以上の色検出系間の干渉を防止する方法に関するものである。また、本発明は、ブレイクアパートプローブを利用するスコア化アッセイのための方法にも関する。
2013524812.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の核酸の検出方法であって、
少なくとも第１及び第２核酸プローブを前記サンプル中の第１及び第２標的核酸にハイブリダイズさせ；
酵素と第１発色性基質系を含み前記第１核酸プローブに特異的な第１発色性検出試薬に前記サンプルを接触させ、ここで、該接触は、前記酵素が前記第１発色性基質系に作用して検出可能な第１色素原を生じる条件下でなされ；
前記酵素を変性させ；
酵素と第２発色性基質系を含み前記第２核酸プローブに特異的な第２発色性検出試薬に前記サンプルを接触させ、ここで、該接触は、前記酵素が前記第２発色性基質系に作用して検出可能な第２色素原を生じる条件下でなされ；及び
第１及び第２の検出可能な色素原を検出する
ことを含む方法。
【請求項２】
前記変性が、変性剤を含む溶液で前記サンプルを処理することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記変性剤が、ホルムアミド、アルキル置換アミド、尿素、又は尿素系変性剤、チオ尿素、塩酸グアニジン、及びその誘導体からなる群から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記変性剤がホルムアミドである請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記第１核酸プローブが第１ハプテンを含み、前記第２核酸プローブが第２ハプテンを含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１ハプテンがＤＩＧとＤＮＰの一方であり、第２ハプテンがＤＩＧとＤＮＰの他方である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第１及び第２発色性基質系が、ジアミノベンジジン(ＤＡＢ)、４-ニトロフェニルホスフェート(ｐＮＰＰ)、ナフトールホスフェート／ファーストレッド(及びその変形体、例えばファーストレッドＫＬ／ナフトールＡＳ-ＴＲ、ナフトールホスフェート／フクシン、ナフトールホスフェート／ファーストブルーＢＢ(４-(ベンゾイルアミノ)-２,５-ジエトキシベンゼンジアゾテトラクロロジンケート)、ブロモクロロインドリルホスフェート(ＢＣＩＰ)／ナフトールホスフェート、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、ＢＣＩＰ／ＩＮＴ、テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ)、２,２'-アジノ-ジ-[３-エチルベンゾチアゾリンスルホネート](ＡＢＴＳ)、ｏ-ジアニシジン、４-クロロナフトール(４-ＣＮ)、ニトロフェニル-β-Ｄ-ガラクトピラノシド(ＯＮＰＧ)、ｏ-フェニレンジアミン(ＯＰＤ)、５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル-β-ガラクトピラノシド(Ｘ-Ｇａｌ)、メチルウンベリフェリル-β-Ｄ-ガラクトピラノシド(ＭＵ-Ｇａｌ)、ｐ-ニトロフェニル-α-Ｄ-ガラクトピラノシド(ＰＮＰ)、５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル-β-Ｄ-グルクロニド(Ｘ-Ｇｌｕｃ)、及び３-アミノ-９-エチルカルバゾール(ＡＥＣ)を含む系からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１発色性基質系が、ファーストブルーＢＢ又はナフトールホスフェート／ファーストレッドの一方であり、前記第２発色性基質系が、ファーストブルーＢＢ／ナフトールホスフェート及びナフトールホスフェート／ファーストレッドの他方から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルが細胞を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞がスライドに固定される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が組織である請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１及び第２の検出可能な色素原が明視野顕微鏡によって検出される請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１核酸プローブに特異的な前記第１発色性検出試薬が、前記第１ハプテンに特異的な第１抗体と該第１抗体に特異的な第２抗体をさらに含み、ここで前記第２抗体が酵素にコンジュゲートしている請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
前記酵素が、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ及びβ-ラクタマーゼからなる群から選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２の核酸プローブに対して特異的な前記第２発色性検出試薬が、前記第２ハプテンに特異的な第１抗体と、該第１抗体に特異的な第２抗体をさらに含み、ここで前記第２抗体が酵素にコンジュゲートしている請求項５に記載の方法。
【請求項１６】
前記酵素が、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ及びβ-ラクタマーゼからなる群から選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１及び第２発色性検出試薬中の前記酵素が同じ酵素である請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記酵素がアルカリホスファターゼである請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１核酸プローブに特異的な前記第１発色性検出試薬が、前記第１ハプテンに特異的であり、酵素にコンジュゲートしている第１抗体と、前記第２ハプテンに特異的であり、酵素にコンジュゲートしている第２抗体をさらに含む請求項５に記載の方法。
【請求項２０】
前記酵素が、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ及びβ-ラクタマーゼからなる群から選択される請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ハイブリダイズ工程及び接触工程が自動化されている請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
酵素と第１発色性基質系を含み第１核酸プローブに特異的な第１発色性検出試薬と；
酵素と第２発色性基質系を含み第２核酸プローブに特異的な第２発色性検出試薬と；
変性試薬
を含んでなるキット。
【請求項２３】
患者における癌を診断し、癌を患ってる患者の予後を提供し、患者における癌の再発の可能性を予測し、癌に対する患者の素因を予測し、又は患者が治療処置の候補であることを示し、癌がＡＬＫ遺伝子再構成に関連している方法であって、
患者サンプルに５'及び３'ＡＬＫブレイクアパートプローブをハイブリダイズさせ；
前記５'及び３'ＡＬＫブレイクアパートプローブでのハイブリダイゼーションに関連したシグナルを検出し；
融合型非再構成シグナル以外の任意のシグナルを異常なシグナルとしてスコア化し；
前記スコアを使用して、前記患者における癌を診断し、前記患者に対する予後を提供し、前記患者における癌の再発の可能性を予測し、癌に対する前記患者の素因を予測し、又は患者が特定の治療法の候補であることを示す方法。
【請求項２４】
前記癌が非小細胞肺癌である請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記５'及び３'ＡＬＫブレイクアパートプローブが、ＡＬＫ再構成に関連したブレイクポイントに５'又は３'のいずれかでハイブリダイズするプローブセットである請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記５'及び３'ＡＬＫブレイクアパートプローブが、前記５'及び３'ＡＬＫブレイクアパートプローブに対して異なる色素原を用いる発色性検出により検出される請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記発色性検出が、前記５'及び３'ＡＬＫブレイクアパートプローブに特異的な第１及び第２発色性検出試薬それぞれを用いて５'及び３'ＡＬＫブレイクアパートプローブを検出することを含む請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記５'ＡＬＫブレイクアパートプローブに特異的な前記第１発色性検出試薬が酵素と第１発色性基質系を含み、前記５'ＡＬＫブレイクアパートプローブに特異的な前記第２発色性検出試薬が、酵素と第２発色性基質系を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記発色性検出が、
前記酵素が前記第１発色性基質系に作用して検出可能な第１色素原を生じる条件下で、前記サンプルを前記第１発色性検出試薬と接触させ；
前記酵素を変性させ；及び
前記酵素が前記第２発色性基質系に作用して検出可能な第２色素原を生じる条件下で前記サンプルを第２発色性検出試薬と接触させる
ことを含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記変性が、変性剤を含む溶液で前記サンプルを処理することをさらに含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記変性剤が、ホルムアミド、アルキル置換アミド、尿素又は尿素系変性剤、チオ尿素、塩酸グアニジン、及びその誘導体からなる群から選択される請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記変性剤がホルムアミドである請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記酵素がアルカリホスファターゼである請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記基質がアルカリホスファーゼ基質である請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記アルカリホスファーゼ基質が、ナフトールホスフェート／ファーストレッド(及び、その変形、例えばファーストレッドＫＬ／ナフトールＡＳ-ＴＲ)、ナフトールホスフェート／フクシン、ナフトールホスフェート／ファーストブルーＢＢ(４-(ベンゾイルアミノ)-２,５-ジエトキシベンゼンジアゾテトラクロロジンケート)、５-ブロモ,４-クロロ,３-インドリルホスフェート(ＢＣＩＰ)／ナフトールホスフェート、ＢＣＩＰ／ニトロブルーテトラゾリウム(ＮＢＴ)、及びＢＣＩＰ／ｐ-ヨードニトロテトラゾリウム(ＩＮＴ)からなる群から選択される系である請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
前記５'及び３'ＡＬＫブレイクアパートプローブが蛍光検出により検出される請求項２３に記載の方法。
【請求項３７】
前記５'及び３'ＡＬＫブレイクアパートプローブの少なくとも一つが、シルバーインサイツハイブリダイゼーションにより検出される請求項２３に記載の方法。
【請求項３８】
前記５'及び３'ＡＬＫブレイクアパートプローブの一方がシルバーインサイツハイブリダイゼーションにより検出され、前記５'及び３'ＡＬＫブレイクアパートプローブの他方が発色性インサイツハイブリダイゼーションにより検出される請求項２３に記載の方法。
【請求項３９】
前記スコア化が、前記サンプル中において約１５％〜７５％、２０％〜６０％、２５％〜４５％、及び２７％〜３８％の異常なシグナルを有する細胞からなる群から選択されるカットオフ範囲を適用することを含み、ここでカットオフ範囲内のサンプルが、前記患者における癌の診断、前記患者に対する良好な又は不良な予後、前記患者における癌の再発可能性の予測、前記患者の癌に対する素因の予測、又は特定の治療に対して前記患者が候補であることの指標に相関している請求項２３に記載の方法。
【請求項４０】
前記カットオフ範囲が適用される場合、前記方法が、９０％を超え、９５％を超え、９９％を超え、又は１００％からなる群から選択される感度及び／又は特異性を有する請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記カットオフ範囲に対する理想値からの距離（Distance From Ideal value）が、≦０．２、≦０．１、及び０からなる群から選択される請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
サンプルが前記スコア化に基づきＡＬＫ再構成に対してポジティブ又はネガティブであるか否かに基づき前記患者に対する予後を提供することをさらに含む請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
サンプルが前記スコア化に基づきＡＬＫ再構成に対してポジティブ又はネガティブであるか否かに基づき前記患者に対する診断を提供することをさらに含む請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
サンプルが前記スコア化に基づきＡＬＫ再構成に対してポジティブ又はネガティブであるか否かに基づき前記患者に対する再発可能性の予測を提供することをさらに含む請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
サンプルが前記スコア化に基づきＡＬＫ再構成に対してポジティブ又はネガティブであるか否かに基づき前記患者の癌に対する素因の予測を提供することをさらに含む請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
サンプルが前記スコア化に基づきＡＬＫ再構成に対してポジティブ又はネガティブであるか否かに基づき前記患者に対して特定の治療法を提供することをさらに含む請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
前記サンプル中において約１０％〜約４０％の異常なシグナルを有する細胞のカットオフを適用することをさらに含み、ここで、カットオフを超えるサンプルが、前記患者における癌の診断、前記患者に対する良好な又は不良な予後、前記患者における癌の再発可能性の予測、前記患者の癌に対する素因の予測、又は前記患者が特定の治療法に対する候補であることの指標に相関している請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願とのクロスリファレンス）
この発明は、その全内容を出典明示によりここに援用する２０１０年４月２０日出願の米国仮特許出願第６１／３２６０３７号及び２０１０年６月２日出願の米国仮特許出願第６１／３５０５６０号の優先権を主張するものである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、発色性インサイツハイブリダイゼーションのためのシステム及び方法、特に単一アッセイで２以上の呈色検出系の間の干渉を防止する方法に関し、さらにはブレイクアパートプローブを利用するスコア化アッセイ方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
分子の細胞遺伝学的技術、例えば色素生成性インサイツハイブリダイゼーション(ＣＩＳＨ)は、分子技術と染色体の視覚的評価(核型分析)とを組合せたものである。分子細胞遺伝学的方法は、核酸プローブの、細胞内でのその相補的核酸へのハイブリダイゼーションをベースにしている。特定の染色体領域に対するプローブは、中期染色体又は間期核における、その相補的配列を認識し、そこにハイブリダイズするであろう(例えば、組織サンプルにおいて)。プローブは、多様な診断及び研究目的用に開発されている。
【０００４】
配列プローブは、特定の染色体領域又は遺伝子における、単一のコピーＤＮＡ配列にハイブリダイズする。これらは関心ある症候群又は病状に関連した、染色体の重要な領域又は遺伝子を同定するために使用される。中期染色体において、このようなプローブは、各染色分体にハイブリダイズし、通常は、染色体毎に２つの小さな離散的シグナルが生じる。
【０００５】
配列プローブ、例えば反復枯渇プローブ又は唯一の配列プローブのハイブリダイゼーションは、構成遺伝子異常、例えば微小欠失症候群、染色体転座、遺伝子増幅及び異数性症候群、腫瘍性疾患、並びに病原体感染を含む、多くの疾患及び症候群に関連した染色体異常の検出を可能にさせた。最も一般的には、これらの技術は、顕微鏡用スライド上の標準的な細胞遺伝学的調製物に適用される。さらに、これらの手順は、ホルマリン固定されたパラフィン包埋組織、血液、又は骨髄スメア、及び直接的に固定された細胞又は他の核単離物のスライドに使用することができる。
【０００６】
例えば、これらの技術は癌の診断及び予後の双方に対して腫瘍細胞を特徴付けるためにしばしば使用される。多くの染色体異常は癌の発生に関連している(例えば、異数性、例えばある種の骨髄疾患に関連した８番染色体トリソミー：転座、例えば慢性骨髄性白血病におけるＢＣＲ／ＡＢＬ再構成；及び腫瘍化に関連した特定の核酸配列の増幅)。分子技術は、このような後天的な染色体異常の検出及び特徴付けにおける標準的な細胞遺伝学的試験を増強することができる。
【０００７】
２色ＣＩＳＨ用のシステムが紹介されている。これらには、Dako DuoCISHＴＭシステム及びZytoVision ZytoDot(登録商標)2Cシステムが含まれる。これらのシステムは双方とも、２色検出工程に別々の酵素(アルカリホスファターゼ及び西洋わさびペルオキシダーゼ)を使用する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、発色性インサイツハイブリダイゼーション(ＣＩＳＨ)のためのシステム及び方法、特に単一アッセイにおける２以上の色調検出システム間の干渉を防止する方法に関し、さらにはブレイクアパートプローブを利用するアッセイをスコア化するための方法にも関する。
【０００９】
いくつかの実施態様では、本発明は、サンプル中の核酸を検出するための方法であって、少なくとも第１及び第２の核酸プローブをサンプル中の第１及び第２の標的核酸にハイブリダイズさせ；酵素と第１発色性基質系を含み第１核酸プローブに特異的な第１発色性検出試薬にサンプルを接触させ、ここで、該接触は、酵素が第１発色性基質系に作用して検出可能な第１色素原を生じる条件下でなされ；酵素を変性させ；酵素と第２発色性基質系を含み第２核酸プローブに特異的な第２発色性検出試薬にサンプルを接触させ、ここで、該接触は、酵素が前記第２発色性基質系に作用して検出可能な第２色素原を生じる条件下でなされ；第１及び第２の検出可能な色素原を検出することを含む方法を提供する。いくつかの実施態様では、変性は、変性剤を含む溶液でサンプルを処理することをさらに含む。いくつかの実施態様では、変性剤は、ホルムアミド、アルキル置換アミド、尿素、又は尿素系変性剤、チオ尿素、塩酸グアニジン、及びその誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施態様では、変性剤はホルムアミドである。
【００１０】
いくつかの実施態様では、第１核酸プローブは第１のハプテンを含み、第２の核酸プローブは第２のハプテンを含む。いくつかの実施態様では、第１のハプテンはＤＩＧ及びＤＮＰの一方であり、第２のハプテンはＤＩＧ及びＤＮＰの他方である。いくつかの実施態様では、第１及び第２の発色性基質系は、ジアミノベンジジン(ＤＡＢ)、４-ニトロフェニルホスフェート(ｐＮＰＰ)、ナフトールホスフェート／ファーストレッド(Fast Red)(及び、その変形、例えばファーストレッドＫＬ／ナフトールＡＳ-ＴＲ、ナフトールホスフェート／フクシン(fuschin)、ナフトールホスフェート／ファーストブルーＢＢ(４-(ベンゾイルアミノ)-２,５-ジエトキシベンゼンジアゾテトラクロロジンケート)、ブロモクロロインドリルホスフェート(ＢＣＩＰ)／ナフトールホスフェート、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、ＢＣＩＰ／ＩＮＴ、テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ)、２,２'-アジノ-ジ-[３-エチルベンゾチアゾリンスルホネート](ＡＢＴＳ)、ｏ-ジアニシジン、４-クロロナフトール(４-ＣＮ)、ニトロフェニル-β-Ｄ-ガラクトピラノシド(ＯＮＰＧ)、ｏ-フェニレンジアミン(ＯＰＤ)、５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル-β-ガラクトピラノシド(Ｘ-Ｇａｌ)、メチルウンベリフェリル-β-Ｄ-ガラクトピラノシド(ＭＵ-Ｇａｌ)、ｐ-ニトロフェニル-α-Ｄ-ガラクトピラノシド(ＰＮＰ)、５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル-β-Ｄ-グルクロニド(Ｘ-Ｇｌｕｃ)、及び３-アミノ-９-エチルカルバゾール(ＡＥＣ)を含む系からなる群から選択される。いくつかの実施態様では、第１の発色性基質系は、ファーストブルーＢＢ又はナフトールホスフェート／ファーストレッドの一方であり、第２の発色性基質系は、ファーストブルーＢＢ／ナフトールホスフェート及びナフトールホスフェート／ファーストレッドの他方から選択される。
【００１１】
いくつかの実施態様では、サンプルは細胞を含む。いくつかの実施態様では、細胞はスライドに固定される。いくつかの実施態様では、細胞は組織である。いくつかの実施態様では、第１及び第２の検出可能な色素原は明視野顕微鏡によって検出される。
【００１２】
いくつかの実施態様では、第１核酸プローブに対して特異的な第１の発色性検出試薬は、第１のハプテンに対して特異的な第１の抗体、及び第１の抗体に対して特異的な第２の抗体をさらに含み、ここで第２の抗体は酵素にコンジュゲートされる。いくつかの実施態様では、酵素は、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ及びβ-ラクタマーゼからなる群から選択される。いくつかの実施態様では、第２の核酸プローブに対して特異的な第２の発色性検出試薬は、第２のハプテンに対して特異的な第１の抗体、及び第１の抗体に対して特異的な第２の抗体をさらに含み、ここで第２の抗体は酵素にコンジュゲートされる。いくつかの実施態様では、酵素は、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ及びβ-ラクタマーゼからなる群から選択される。いくつかの実施態様では、第１及び第２の発色性検出試薬における酵素は、同じ酵素である。いくつかの実施態様では、酵素はアルカリホスファターゼである。いくつかの実施態様では、第１核酸プローブに対して特異的な第１の発色性検出試薬は、第１のハプテンに対して特異的であり、酵素にコンジュゲートしている第１の抗体、及び第２のハプテンに対して特異的であり、酵素にコンジュゲートしている第２の抗体をさらに含有している。いくつかの実施態様では、酵素は西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ及びβ-ラクタマーゼからなる群から選択される。
【００１３】
いくつかの実施態様では、ハイブリダイズ工程及び接触工程は自動化される。
【００１４】
いくつかの実施態様では、本発明は、酵素と第１発色性基質系を含み第１核酸プローブに特異的な第１発色性検出試薬；酵素と第２発色性基質系を含み第２核酸プローブに特異的な第２発色性検出試薬；及び変性試薬を含むキットを提供する。
【００１５】
いくつかの実施態様では、本発明は、患者における癌を診断し、癌を患ってる患者の予後を提供し、患者における癌の再発の可能性を予測し、癌に対する患者の素因を予測し、又は患者が治療法での治療の候補であることを示し、ここで、癌が、ＡＬＫ遺伝子の再構成に関連している方法であって、患者サンプルに５'及び３'ＡＬＫブレイクアパートプローブをハイブリダイズさせ；５'及び３'ＡＬＫブレイクアパートプローブのハイブリダイゼーションに関連したシグナルを検出し；融合した非再構成シグナル以外の任意のシグナルを異常なシグナルとしてスコア化し；スコアを使用して、患者における癌を診断し、患者に対する予後を提供し、患者における癌の再発の可能性を予測し、癌に対する患者の素因を予測し、患者が処置の対象であることを示すことを含む方法を提供する。いくつかの実施態様では、癌は非小細胞肺癌である。いくつかの実施態様では、５'及び３'ＡＬＫブレイクアパートプローブは、５'又は３'のいずれかが、ＡＬＫ再構成に関連したブレイクポイントにハイブリダイズするプローブセットである。いくつかの実施態様では、５'及び３'ＡＬＫブレイクアパートプローブは、５'及び３'ＡＬＫブレイクアパートプローブに対して異なる色素原を用い、発色性検出することにより検出される。いくつかの実施態様では、発色性検出は、５'及び３'ＡＬＫブレイクアパートプローブそれぞれに対して特異的な第１及び第２の発色性検出試薬を用い、５'及び３'ＡＬＫブレイクアパートプローブを検出することを含む。いくつかの実施態様では、５'ＡＬＫブレイクアパートプローブに特異的な第１の発色性検出試薬は、酵素と第１の発色性基質系を含み、５'ＡＬＫブレイクアパートプローブに特異的な第２の発色性検出試薬は、酵素と第２の発色性基質系を含む。
【００１６】
いくつかの実施態様では、発色性検出は、酵素が第１発色性基質系に作用して検出可能な第１色素原を生じる条件下でサンプルを第１発色性検出試薬と接触させ；酵素を変性させ；酵素が第２発色性基質系に作用して検出可能な第２色素原を生じる条件下でサンプルを第２発色性検出試薬と接触させることを含む。いくつかの実施態様では、変性は、変性剤を含む溶液でサンプルを処理することをさらに含む。いくつかの実施態様では、変性剤は、ホルムアミド、アルキル置換アミド、尿素、又は尿素系変性剤、チオ尿素、塩酸グアニジン、及びその誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施態様では、変性剤はホルムアミドである。いくつかの実施態様では、酵素はアルカリホスファターゼである。いくつかの実施態様では、基質はアルカリホスファーゼ基質である。いくつかの実施態様では、アルカリホスファーゼ基質は、ナフトールホスフェート／ファーストレッド(及び、その変形、例えばファーストレッドＫＬ／ナフトールＡＳ-ＴＲ)、ナフトールホスフェート／フクシン、ナフトールホスフェート／ファーストブルーＢＢ(４-(ベンゾイルアミノ)-２,５-ジエトキシベンゼンジアゾテトラクロロジンケート)、５-ブロモ,４-クロロ,３-インドリルホスフェート(ＢＣＩＰ)／ナフトールホスフェート、ＢＣＩＰ／ニトロブルーテトラゾリウム(ＮＢＴ)、及びＢＣＩＰ／ｐ-ヨードニトロテトラゾリウム(ＩＮＴ)からなる群から選択される。いくつかの実施態様では、５'及び３'ＡＬＫブレイクアパートプローブは、蛍光検出により検出される。いくつかの実施態様では、少なくとも１の５'及び３'ＡＬＫブレイクアパートプローブは、シルバーインサイツハイブリダイゼーションにより検出される。いくつかの実施態様では、５'及び３'ＡＬＫブレイクアパートプローブの一方は、シルバーインサイツハイブリダイゼーションにより検出され、５'及び３'ＡＬＫブレイクアパートプローブの他方は、発色性インサイツハイブリダイゼーションにより検出される。
【００１７】
いくつかの実施態様では、スコア化は、サンプル中の約１５％〜７５％、２０％〜６０％、２５％〜４５％、及び２７％〜３８％の異常なシグナルを持つ細胞からなる群から選択されるカットオフ範囲を適用することをさらに含み、ここでカットオフ範囲内のサンプルは、患者における癌の診断、患者に対する予後良好又は予後不良、患者における癌の再発可能性の予測、癌に対する患者の素因の予測、及び特定の治療に対して患者が候補であることの指標に相関している。いくつかの実施態様では、該方法は、カットオフ範囲が適用される場合、９０％を超え、９５％を超え、９９％を超え、又は１００％からなる群から選択される感度及び／又は特異性を有する。いくつかの実施態様では、カットオフ範囲に対する理想値からの距離(Distance From Ideal value)は、≦０．２、≦０．１、及び０からなる群から選択される。
【００１８】
いくつかの実施態様では、方法は、サンプルがスコア化をベースにしたＡＬＫ再構成に対してポジティブ（陽性）であるかネガティブ（陰性）であるかに基づく、患者に対する予後を提供することをさらに含む。いくつかの実施態様では、方法は、サンプルがスコア化をベースにしたＡＬＫ再構成に対してポジティブであるかネガティブであるかに基づく、患者に対する診断を提供することをさらに含む。いくつかの実施態様では、方法は、サンプルがスコア化をベースにしたＡＬＫ再構成に対してポジティブであるかネガティブであるかに基づく、患者に対する再発可能性の予測を提供することをさらに含む。いくつかの実施態様では、方法は、サンプルがスコア化をベースにしたＡＬＫ再構成に対してポジティブであるかネガティブであるかに基づく、癌に対する患者の素因の予測を提供することをさらに含む。いくつかの実施態様では、方法は、サンプルがスコア化をベースにしたＡＬＫ再構成に対してポジティブであるかネガティブであるかに基づく、患者に対する特定の治療を提供することをさらに含む。いくつかの実施態様では、方法は、サンプル中の約１０％〜４０％の異常なシグナルを有する細胞からのカットオフの適用をさらに含み、ここで、カットオフを超えるサンプルは、患者における癌の診断、患者に対する予後良好又は予後不良、患者における癌の再発可能性の予測、癌に対する患者の素因の予測、又は特定の治療に対して患者が候補であることの指標に相関している。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、２つのアルカリホスファターゼ(ＡＰ)検出を使用する明視野ブレイクアパートインサイツハイブリダイゼーションシグナル検出スキームである。ジゴキシゲニン(ＤＩＧ)標識ニックトランスレーション化プローブ及び２,４ ジニトロフェニル(ＤＮＰ)標識ニックトランスレーション化プローブを、同時ハイブリダイズさせた(工程１)。先ず、ＤＩＧ標識プローブのシグナルを、アルカリホスファターゼ(ＡＰ)ベースの青色検出を用いて可視化した(工程２)。ついで、ＡＰ酵素をハイブリダイゼーション用バッファーでブロックした(工程３)。２,４ ジニトロフェニル(ＤＮＰ)プローブのシグナルをＡＰベースの赤色検出を用いて可視化した(工程４)。最後に、組織切片をヘマトキシリンで対比染色した。
【図２】図２は、２色検出システム間をブロックすることなく、明視野ブレイクアパートインサイツハイブリダイゼーション２色検出を使用する、組織サンプルにおける代表的標的検出を示す。
【図３】図３は、ＡＰベースの２色インサイツハイブリダイゼーションシグナルにおけるブロック工程の代表的効果を示す。
【図４】図４は、明視野ブレイクアパートインサイツハイブリダイゼーション用のＡＬＫプローブセットの設計を示す。２つの無反復ＡＬＫプローブを、ＡＬＫ遺伝子の隣接セントロメア領域(５'プローブ、７７０ｋｂ)、及びテロメア領域(３'プローブ、６８３ｋｂ)を標的にするように生じせしめた。５'ＡＬＫプローブをジゴキシゲニン(ＤＩＧ)で標識し、３'プローブを２,４ ジニトロフェニル(ＤＮＰ)で標識した。
【図５】図５は、明視野ブレイクアパートインサイツハイブリダイゼーション用のＭＡＬＴ１プローブセットの設計を示す。２つの無反復ＭＡＬＴ１プローブを、ＭＡＬＴ１遺伝子の隣接セントロメア領域(５'プローブ、４９９ｋｂ)、及びテロメア領域(３'プローブ、６９３ｋｂ)を標的にするように生じせしめた。５'ＭＡＬＴ１プローブをジゴキシゲニン(ＤＩＧ)で標識し、３'プローブを２,４ ジニトロフェニル(ＤＮＰ)で標識した。
【図６】図６は、比較ゲノムハイブリダイゼーション中期コントロールスライドにおける、染色体１８セントロメアプローブを有するＭＡＬＴ１プローブと、染色体２セントロメアプローブを有するＡＬＫプローブのための、２色蛍光インサイツハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)を示す。５'ＡＬＫ ＦＩＳＨシグナル(緑)を、染色体２セントロメアプローブ(赤)で標識された同じ染色体において検出した(Ａ)。３'ＡＬＫ ＦＩＳＨシグナル(緑)を、染色体２セントロメアプローブ(赤)で同定された染色体２において検出した(Ｂ)。ＭＡＬＴ１ ＦＩＳＨシグナル(緑)を、同様の染色体において、染色体１８セントロメアプローブ(赤)と同時検出した(Ｃ)。また、３'ＭＡＬＴ１ ＦＩＳＨシグナル(緑)を、染色体１８において、染色体１８セントロメアシグナル(赤)と同時検出した(Ｄ)。１００×。
【図７】図７は、ＡＬＫ及びＭＡＬＴ１遺伝子に対する、明視野ブレイクアパートインサイツハイブリダイゼーション(ｂａ-ＩＳＨ)アッセイの最適化を示す。ホルマリン固定され、パラフィン包埋された扁桃腺を、ｂａ-ＩＳＨ適用を最適化するために利用した。ジゴキシゲニン(ＤＩＧ)標識５'ＡＬＫプローブ(Ａ)と、２,４ ジニトロフェニル(ＤＮＰ)標識３'ＡＬＫプローブ(Ｂ)を、それぞれアルカリホスファターゼ(ＡＰ)ベースの青色検出及び赤色検出で検出した。ＡＬＫ遺伝子に対する青色及び赤色双方の検出を実施し、紫色のドットが作製された(Ｃ)。ＤＩＧ標識３'ＭＡＬＴ１プローブ(Ｄ)と、ＤＮＰ標識５'ＭＡＬＴ１プローブ(Ｅ)を、それぞれＡＰ青色検出及びＡＰ赤色検出で検出した。５'及び３'ＭＡＬＴ１プローブの同時検出を、紫色ドットとして認識した(Ｆ)。ＡＬＫプローブの共局在化により、青色及び赤色ドットにわずかな分離が生じるが(Ｃ)、ＭＡＬＴ１プローブは、同一の紫色ドットになった(Ｆ)。１００×。
【図８】図８は、記録された臨床ケースにおける、明視野ＡＬＫ及びＭＡＬＴ１ブレイクアパートインサイツハイブリダイゼーション(ｂａ-ＩＳＨ)を示す。未分化大細胞リンパ腫(ＡＬＣＬ)サンプルの非腫瘍細胞は、共局在化した５'及び３'ＡＬＫプローブシグナルを示し(Ａ)、腫瘍細胞は黄色の星印で示した。明るく対比染色された腫瘍細胞では、青色及び赤色ドット(青色及び赤色矢印)として認識される、ＡＬＫ遺伝子の破損が示された(Ｂ)。正常なＭＡＬＴ１遺伝子を、粘膜関連リンパ腫組織(ＭＡＬＴ)のリンパ腫のケースで、５'及び３'ＭＡＬＴ１プローブの共局在化として観察した(Ｃ)。ＭＡＬＴ１遺伝子の破損を、ＭＡＬＴリンパ腫のケースで、単離された青色及び赤色ドット(青色及び赤色矢印)として観察した(Ｄ)。１００×。
【図９Ａ−Ｄ】図９Ａ−Ｄは、青色検出とついで赤色検出(Ａ及びＢ)、赤色検出とついで青色検出(Ｃ及びＤ)を使用する、２色ｂａ-ＩＳＨの比較を示す。Ａ５４９は、野生型ＡＬＫ遺伝子を有する肺癌細胞系異種移植である。ＮＣＩ-Ｈ２２２８は再構成したＡＬＫ遺伝子を有する肺癌細胞系異種移植である。
【図１０】図１０は、２色ＣＩＳＨ用のＩＳＨパラメーターを比較するための受信機運用特性(ＲＯＣ)曲線のプロットである(単一リーダー、試料に対して一つの複製物)。
【図１１】図１１は、２色ＣＩＳＨ用のＩＳＨパラメーターのＤＦＩ対カットオフ比較のプロットである(単一リーダー、試料に対して一つの複製物)。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、発色性インサイツハイブリダイゼーション(ＣＩＳＨ)のためのシステム及び方法、特に単一アッセイにおける２以上の色調検出システム間の干渉を防止する方法に関し、さらにはブレイクアパートプローブを利用するアッセイをスコア化するための方法にも関する。インサイツハイブリダイゼーションは、中期又は間期の染色体調製物(例えば、スライド上に乗せられた細胞又は組織サンプル)における、標的核酸配列(例えば、ゲノム標的核酸配列)を含有するサンプルと、標的核酸配列(例えば、ゲノム標的核酸配列)に対して特異的であるか、又は特異的にハイブリダイズ可能なプローブ(すなわち、上述した標的核酸プローブ)とを接触させることを含む。スライドは、場合によっては前処理されて、例えば均一なハイブリダイゼーションに干渉するおそれのある、パラフィン固定され、パラフィン包埋された組織に存在するパラフィン又は他の物質が除去される。染色体サンプル及びプローブを双方とも、例えば加熱により処理し、二本鎖核酸を変性させる。ハイブリダイゼーションを生じせしめるのに十分な時間(典型的には平衡に達するまで)及び条件下で、プローブ(適切なハイブリダイゼーションバッファーにおいて処方)とサンプルとを組合せる。染色体調製物を洗浄し、過度の標的核酸プローブを除去し、染色体標的の特異的標識を実施する。インサイツハイブリダイゼーション手順の一般的記述については、例えば米国特許第4,888,278号を参照のこと。蛍光インサイツハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)、発色性インサイツハイブリダイゼーション(ＣＩＳＨ)及びシルバーインサイツハイブリダイゼーション(ＳＩＳＨ)についての多くの手順が、当該技術分野で知られている。例えばＦＩＳＨを実施するための手順は、米国特許第５４４７８４１号、同５４７２８４２号、同５４２７９３２号、及び例えばPinkelら, Proc. Natl. Acad. Sci. 83:2934-2938, 1986; Pinkelら, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:9138-9142, 1988, 及びLichterら,Proc. Natl. Acad. Sci. 85:9664-9668, 1988に記載されている。ＣＩＳＨは、例えばTannerら, Am. J. Pathol. 157:1467-1472, 2000、及び米国特許第６９４２９７０号に記載されている。さらなる検出方法は米国特許第６２８０９２９号に提供される。インサイツハイブリダイゼーションによるウイルスを検出するための例示的手順は、Poddigheら, J. Clin. Pathol. 49:M340-M344, 1996に見いだすことができる。
【００２１】
いくつかの実施態様では、本発明の方法は、サンプル中で、少なくとも第１及び第２の核酸プローブを、第１及び第２の標的核酸にハイブリダイズさせることを含む。ついで、サンプルを、第１核酸プローブに特異的な第１の発色性検出試薬に接触させる。発色性検出試薬は、好ましくは酵素と第１の発色性基質を含む。この工程は、酵素が第１の発色性基質において、検出可能な第１の色素原を生成するように作用するのに適切な条件下でなされる。いくつかの実施態様では、第１及び第２の発色性検出試薬は、直接検出用の試薬を含む。いくつかの好ましい直接検出実施態様では、核酸プローブは、好ましくはハプテンで標識される。これらの実施態様では、試薬は、以下に詳細に記載するように、酵素に対する発色性基質(類)及び酵素にコンジュゲートした抗ハプテン抗体を含む。いくつかの実施態様では、第１及び第２の発色性検出試薬は、間接検出用の試薬を含む。いくつかの好ましい直接検出実施態様では、核酸プローブは、好ましくはハプテンで標識される。これらの実施態様では、試薬は、以下に詳細に記載するように、酵素に対する発色性基質(類)及び酵素にコンジュゲートした一次抗ハプテン抗体及び二次抗種抗体(例えば、適切であるならば、抗マウス、抗ウサギ、抗ヤギ、抗ヒト抗体)を含む。
【００２２】
いくつかの好ましい実施態様では、酵素は、第１核酸プローブに特異的な第１発色性検出試薬の適用後に変性される。ついで、サンプルを、第２核酸プローブに特異的な第２発色性検出試薬と接触させる。発色性検出試薬は、好ましくは酵素と第２発色性基質を含む。この工程は、酵素が第２発色性基質において、検出可能な第２色素原を生成するように作用するのに適切な条件下でなされる。ついで第１及び第２色素原は、例えば明視野顕微鏡によって検出される。いくつかの実施態様では、第１及び第２発色性検出試薬は同じ酵素、例えばアルカリホスファターゼである。本発明の例示的方法(及び例示的試薬)の模式図を図１に提供する。このシステムは任意のＣＩＳＨシステムに有用であり、ここでは１以上の標的が所望される。色調検出の順番は可逆的であり、例えば赤色検出が青色検出の前に実施されてよく、またその逆もしかりである。いくつかの実施態様では、システムではブレイクアパートプローブセットが使用される。標的遺伝子がバラバラになった場合(転座のため)、別個の色調シグナル(例えば、赤色及び青色)が可視化されるが、プローブが共局在化しているならば(すなわち、転座なし)、色の組合せ(例えば紫)が可視化される。
【００２３】
変性工程により、第１発色性検出試薬のセットに使用される酵素が、第２発色性基質に作用することが防止される。同様に、これにより、２つの異なる有色色素原の可視化及び検出が改善される。いくつかの好ましい実施態様では、変性剤は、第１の発色性検出試薬セットにおいて酵素を変性させる物質である。いくつかの実施態様では、変性剤は、例えばホルムアミド、アルキル置換アミド、尿素、又は尿素系変性剤、チオ尿素、塩酸グアニジン、又はその誘導体である。アルキル置換アミドの例には、限定されるものではないが、Ｎ-プロピルホルムアミド、Ｎ-ブチルホルムアミド、Ｎ-イソブチルホルムアミド、及びＮ,Ｎ-ジプロピルホルムアミドが含まれる。いくつかの実施態様では、変性剤はバッファーに提供される。例えば、ホルムアミドは、２０ｍＭの硫酸デキストラン(５０−５７％の％ホルムアミド(UltraPureホルムアミドストック)、２Ｘ ＳＳＣ(０．３Ｍのシトラート及び３ＭのＮａＣｌを含有する、２０Ｘ ＳＳＣストック)、２．５ｍＭのＥＤＴＡ(０．５ＭのＥＤＴＡストック)、５ｍＭのトリス、ｐＨ７．４(１ｍＭのトリス、ｐＨ７．４ストック)、０．０５％のブリジ(Brij)-３５(ポリオキシエチレン(２３)ラウリルエーテルを含有する１０％原液)、ｐＨ７．４を含有するハイブリダイゼーション用バッファーで提供されうる。好ましい実施態様では、サンプルは、第１の標的プローブ検出酵素、例えばアルカリホスファターゼを変性させるのに十分な期間及び条件下で、変性剤で処理される。いくつかの実施態様では、サンプルは、約１５〜約３０分、好ましくは約２０〜２４分、約３７℃で、変性剤で処理される。いくつかの実施態様では、サンプルは、標的酵素を変性させ、第２の核酸プローブの標的へのハイブリダイゼーションを保存するのに十分な期間及び条件下で、変性剤で処理される。
【００２４】
本発明の方法及びプロセスを実施するための付加的な試薬及び系を、以下にさらに詳細に記載する。
【００２５】
１．核酸プローブ
本発明は、一又は複数の標的核酸配列にハイブリダイズする核酸プローブを利用する。核酸プローブは、好ましくはハイブリダイゼーションに適した条件下、例えばインサイツハイブリダイゼーション、サウザンブロット、又はノーザンブロットに適した条件下で、標的核酸配列にハイブリダイズする。好ましくは、検出プローブ部分は、任意の適切な核酸、例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、又はその組合せを含み、双方の標準的なヌクレオチド、例えばリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチド、並びにヌクレオチド類似体を含むこともできる。ＬＮＡ及びＰＮＡは、ＤＮＡとＤＮＡ、又はＤＮＡとＲＮＡの間に形成されるものよりも安定した(すなわち、増加したＴｍを有する)ハイブリダイゼーション複合体を形成する、２つの核酸類似体の例である。ＬＮＡとＰＮＡ類似体は、化学合成中に、伝統的なＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオシドと組合せられ、プローブとして使用可能なハイブリッド核酸分子が提供される。ＬＮＡ及びＰＮＡ類似体の使用により、ハイブリダイゼーションパラメーター、例えばハイブリダイゼーション複合体のＴｍを変更することができる。これにより、標的核酸配列への標的プローブ部分のハイブリダイゼーションに必要な条件と同様又は類似した条件下で、標的核酸プローブの検出標的配列にハイブリダイズする検出プローブの設計が可能になる。
【００２６】
適切な核酸プローブは、所望のパラメーター、例えば温度、長さ、ＧＣ含有量等に基づき、プローブの選択を最適にする、コンピュータ実行アルゴリズムにより、又は手動で選択することができる。インターネット又はパーソナルコンピューターを介して使用するための、多くのコンピュータ実行アルゴリズム又はプログラムが入手可能である。例えば、標的核酸配列(例えば、ゲノム標的核酸配列)から複数の結合領域を生じさせるために、反復(又は他の所望しない、例えばバックグラウンド生成)核酸配列を欠く配列領域が、手動で、又はコンピュータアルゴリズム、例えばRepeatMaskerを使用することで同定される。反復部を枯渇した、唯一の特異的プローブを作製する方法は、例えば米国特許出願公開第２００１／００５１３４２号及び同２００８／００５７５１３号、及び米国特許第６１／２９１７５０号及び同６１／３１４６５４号に見いだされる。数個から数百キロベースに及ぶ標的核酸配列(例えば、ゲノム標的核酸配列)、典型的には、実質的又は好ましくは完全に反復(又は他の所望しない、例えばバックグランド生成)のない多くの結合領域において、核酸配列が同定される。
【００２７】
いくつかの実施態様では、ハプテンは、例えば、ハプテニル化ヌクレオシドの使用により、核酸プローブに導入される。(例えば、標識プローブへの導入を容易にするための)ハプテンと他のｄＮＴＰへの標識をコンジュゲートさせるための方法は、当該技術でよく知られている。手順の例は、例えば米国特許第５２５８５０７号、同４７７２６９１号、同５３２８８２４号、及び同４７１１９５５号を参照。実際、多くの標識ｄＮＴＰが、例えばDetection Technologies (Molecular Probes, Eugene, Oreg.)から商業的に入手可能である。標識は、ホスフェート(例えば、α、β又はγホスフェート)又は糖等、ｄＮＴＰの任意の位置に、直接又は間接的に結合可能である。プローブは、任意の適切な公知の核酸合成方法により合成可能である。いくつかの実施態様では、検出プローブは、ホスホラミダイトヌクレオシド及び／又はホスホラミダイトヌクレオシド類似体を使用し、化学的に合成することができる。例えばいくつかの実施態様では、プローブは、標準的なＲＮＡ又はＤＮＡホスホラミダイトヌクレオシドを使用することにより合成される。いくつかの実施態様では、プローブは、ＬＮＡホスホラミダイト又はＰＮＡホスホラミダイトのいずれかの、単独で又は標準的ホスホラミダイトヌクレオシドとの組合せを使用して合成される。いくつかの実施態様では、ハプテンは、所望の検出可能部分を有する脱塩基性ホスホラミダイトに導入される。また、検出プローブを合成するための他の方法を使用することもできる。例えば、ＬＮＡ類似体、又はＬＮＡ類似体と標準的なヌクレオチドとの組合せから作製されるプライマーを、プローブの残りの部分の転写に使用することができる。他の例として、検出可能部分を有するプライマーは、プローブの残りの部分の転写に使用することができる。さらなる他の実施態様では、例えば転写又は化学的合成により生成されたプローブのセグメントは、酵素的又は化学的ライゲーションにより、結合させてもよい。
【００２８】
多くのハプテンが、検出プローブの検出可能部分に使用されている。このようなハプテン類には、限定されるものではないが、ピラゾール、特にニトロピラゾール；ニトロフェニルK；ベンゾフラザン；トリテルペン類；尿素及びチオ尿素、特にフェニル尿素、及びフェニルチオ尿素；ロテノン、及びここではロテノイドと称されるロテノン誘導体；オキサゾール及びチアゾール、特にオキサゾール及びチアゾールスルホンアミド；クマリン及びクマリン誘導体；ポドフィロトキシン及びポドフィロトキシン誘導体により例証されるシクロリグナン；及びその組合せが含まれる。ハプテンの特定の例には、限定されるものではなが、２,４-ジニトロフェニル(ＤＮＰ)、ビオチン、フルオレセイン誘導体(ＦＩＴＣ、ＴＡＭＲＡ、テキサスレッド等)、ジゴキシゲニン(ＤＩＧ)、５-ニトロ-３-ピロゾールカルバミド(ニトロピラゾール、ＮＰ)、４,５,-ジメトキシ-２-ニトロシンナミド(ニトロシンナミド、ＮＣＡ)、２-(３,４-ジメトキシフェニル)-キノリン-４-カルバミド(フェニルキノロン、ＤＰＱ)、２,１,３-ベンゾキシアジアゾール-５-カルバミド(ベンゾフラザン、ＢＦ)、３-ヒドロキシ-２-キノキサリンカルバミド(ヒドロキシキノキサリン、ＨＱ)、４-(ジメチルアミノ)アゾベンゼン-４'-スルホンアミド(DABSYL)、ロテノンイソオキサゾリン(Ｒｏｔ)、(Ｅ)-２-(２-(２-オキソ-２,３-ジヒドロ-１Ｈ-ベンゾ[ｂ][１，４]ジアゼピン-４-イル)フェノキシ)アセトアミド(ベンゾジアゼピン、ＢＤ)、７-(ジエチルアミノ)-２-オキソ-２Ｈ-クロメン-３-カルボン酸(クマリン３４３、ＣＤＯ)、２-アセトアミド-４-メチル-５-チアゾールスルホンアミド(チアゾールスルホンアミド、ＴＳ)、及びｐ-メトキシフェニルピラゾポドフィルアミド(Podo)が含まれる。これらのハプテン類及びプローブにおけるそれらの使用は、それらの全体が出典明示によりここに援用される共有に係る米国特許出願公開第２００８０３０５４９７号、同２００８０２６８４６２号、及び同２００８００５７５１３号に、さらに詳細に記載されている。
【００２９】
２．発色性検出試薬
本発明の方法は発色性検出試薬を利用する。発色性検出試薬は、酵素と、酵素の発色性基質を含有する。酵素は、発色性基質において作用し、有色の検出可能なシグナルを生成する。適切な酵素の例には、限定されるものではないが、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ又はβ-ラクタマーゼが含まれる。発色性検出アッセイに有用な酵素基質及び酵素基質系の特定の例には、限定されるものではないが、ジアミノベンジジン(ＤＡＢ)、４-ニトロフェニルホスフェート(ｐＮＰＰ)、ナフトールホスフェート、ナフトールホスフェート／ファーストレッド(例えば、４-クロロ-２-メチルベンゼンジアゾニウム塩及びその変形、例えばファーストレッドＫＬ／ナフトールＡＳ-ＴＲ、ナフトールホスフェート／フクシン、ファーストブルーＢＢ(４-(ベンゾイルアミノ)-２,５-ジエトキシベンゼンジアゾテトラクロロジンケート)／ ナフトールホスフェート(例えば、ナフトールＡＳ-ＴＲホスフェート(Ｎ-４-クロロ-２-メチルフェニル)３-(ホスホノキシ)ナフタレン-２-カルボキシアミド)、ブロモクロロインドリルホスフェート(ＢＣＩＰ)、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ(ニトロブルーテトラゾリウム)、ＢＣＩＰ／ＩＮＴ(ｐ-ヨードニトロテトラゾリウム)、テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ)、２,２'-アジノ-ジ-[３-エチルベンゾチアゾリンスルホネート](ＡＢＴＳ)、ｏ-ジアニシジン、４-クロロナフトール(４-ＣＮ)、ニトロフェニル-β-Ｄ-ガラクトピラノシド(ＯＮＰＧ)、ｏ-フェニレンジアミン(ＯＰＤ)、５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル-β-ガラクトピラノシド(Ｘ-Ｇａｌ)、メチルウンベリフェリル-β-Ｄ-ガラクトピラノシド(ＭＵ-Ｇａｌ)、ｐ-ニトロフェニル-α-Ｄ-ガラクトピラノシド(ＰＮＰ)、５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル-β-Ｄ-グルクロニド(Ｘ-Ｇｌｕｃ)、及び３-アミノ-９-エチルカルバゾール(ＡＥＣ)が含まれる。いくつかの好ましい実施態様では、酵素がアルカリホスファターゼである場合、発色性基質系はナフトールホスフェート／ファーストレッド(及びその変形、例えばファーストレッドＫＬ／ナフトールＡＳ-ＴＲ)、ナフトールホスフェート／フクシン、ナフトールホスフェート／ファーストブルーＢＢ(４-(ベンゾイルアミノ)-２,５-ジエトキシベンゼンジアゾテトラクロロジンケート)、５-ブロモ,４-クロロ,３-インドリルホスフェート(ＢＣＩＰ)／ナフトールスルファート、ＢＣＩＰ／ニトロブルーテトラゾリウム(ＮＢＴ)、及びＢＣＩＰ／ｐ-ヨードニトロテトラゾリウム(ＩＮＴ)からなる群から選択される。他の適切なアルカリホスファターゼ基質は当該技術分野で知られており、限定されるものではないが、WarpRedＴＭ、バルカンファーストレッド、フェランギ(Ferangi)ブルー、及びベクター(登録商標)ブルー、ブラック及びレッドが含まれる。特に好ましい実施態様では、ナフトールホスフェートのジアゾニウム塩は、発色性赤色検出システムに利用される。最も好ましい実施態様では、ファーストブルーＢＢ及びナフトールホスフェート／ファーストレッド発色性検出システムが、同様の組織で利用され、よって、組織サンプルにおいて、２つの標的分子を検出する２色発色性アッセイが提供される。
【００３０】
いくつかの実施態様では、酵素は抗ハプテン抗体にコンジュゲートされる。これらの実施態様では、抗ハプテン抗体は、ハプテニル化核酸プローブに結合する。他の実施態様では、付加的な抗体が使用される。例えばいくつかの実施態様では、第１の抗体は、ウサギ、マウス又はヤギ抗ハプテン抗体であり、第２の抗体は、それぞれ酵素にコンジュゲートした抗ウサギ、抗マウス、又は抗ヤギ抗体である。適切なリンカー又は付着化学物質は、米国特許出願公開第２００６／０２４６５２４号；同２００６／０２４６５２３号、及び米国仮特許第６０／７３９，７９４号に記載される。
【００３１】
本発明は、抗体の使用を制限しない。任意の適切な抗原結合タンパク質を利用することができる。適切な抗原結合分子の例には、限定されるものではないが、抗体、免疫グロブリン又は免疫グロブリン様分子(例えば、限定しないが、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ)、抗体断片、例えば当該技術分野で知られているＦ(ａｂ')２断片、Ｆａｂ'断片、Ｆａｂ'-ＳＨ断片、及びＦａｂ断片、組換え抗体断片(例えば、ｓＦｖ断片、ｄｓＦｖ断片、二重特異性ｓＦｖ断片、二重特異性ｄｓＦｖ断片、Ｆ(ａｂ)'２断片、単鎖Ｆｖタンパク質(「ｓｃＦｖ」)、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質(「ｄｓＦｖ」)、ダイアボディ、及びトリアボディ（当該技術分野で知られているもの）、及びラクダ抗体（例えば、米国特許第６０１５６９５号；同６００５０７９−５８７４５４１号；同５８４０５２６号；同５８００９８８号；及び同５７５９８０８号を参照）が含まれる。
【００３２】
３．標的
標的核酸分子は、任意の選択された核酸、例えばＤＮＡ又はＲＮＡとすることができる。いくつかの実施態様では、標的核酸はスライドに固定された細胞において検出される。いくつかの実施態様では、標的核酸はスライドに固定された組織において検出される。
【００３３】
特定の実施態様では、標的配列は、ゲノム標的配列又はゲノムサブ配列、例えば真核生物ゲノム、例えばヒトゲノムからのものである。いくつかの実施態様では、標的核酸は細胞質ＲＮＡである。いくつかの実施態様では、標的核酸分子は、病原体、例えばウイルス、最近、又は細胞内寄生体、、例えばウイルスゲノムから選択される。いくつかの実施態様では、標的核酸配列はゲノム配列、例えば真核生物(例えば哺乳動物)又はウイルスのゲノム配列である。唯一の無反復ＤＮＡの少なくとも一部を含む、本質的に任意のゲノム標的配列に相当する標的核酸プローブを、生成させることができる。例えば、ゲノム標的配列は、真核生物ゲノム、例えば哺乳動物(例えばヒト)、真菌又は細胞内寄生体のゲノムの一部とすることができる。また、ゲノム標的配列はウイルス又は原核生物ゲノム(例えば細菌ゲノム)、又はその一部とすることもできる。特定の実施例において、ゲノム標的配列は、感染生物(例えば、ウイルス、細菌、真菌)に関連している。
【００３４】
いくつかの実施態様では、標的核酸分子は、病気に関連した(相関した、一般的には関与した)配列とすることができる。いくつかの実施態様では、病気又は病状に関連した標的配列は、ハイブリダイゼーションの検出は、病気又は病状に関連した情報(例えば、サンプルを得た被験者についての、診断又は予後情報)を推測するのに使用することができるように選択される。ある実施態様では、選択される標的核酸分子は、腫瘍性の病気(又は癌)に関連した標的核酸分子である。いくつかの実施態様では、ゲノム標的配列には、癌に関連した少なくとも１の遺伝子(例えば、ＨＥＲ２、ｃ-Ｍｙｃ、Ｎ-Ｍｙｃ、Ａｂ１、Ｂｃ１２、Ｂｃ１６、Ｒ１、ｐ５３、ＥＧＦＲ、ＴＯＰ２Ａ、ＭＥＴ、又は他のレセプター及び／又はシグナル伝達分子をコードする遺伝子等)、又は癌に関連した染色体領域が含まれる。いくつかの実施態様では、標的核酸配列は、癌に相関している、染色体構造異常、例えば転座、欠失、又は倍加(例えば遺伝子増幅又は多染色体性)に関連している可能性がある。いくつかの実施態様では、標的核酸配列は、少なくともいくつかの腫瘍性細胞において倍加又は欠失しているゲノム配列を含む。標的核酸配列は、実質的に、全体長において、少なくとも２０塩基対長さ、少なくとも１００塩基対長さ、少なくとも１０００塩基対長さ、少なくとも５００００、少なくとも１０００００、又は少なくとも２５００００塩基対の大きさで変化しうる。
【００３５】
標的核酸配列(例えば、ゲノム標的核酸配列)は、任意の数の塩基対に及ぶことができる。いくつかの実施態様では、標的核酸配列(例えば、ゲノム標的核酸配列)は、少なくとも１００００、少なくとも５００００、少なくとも１０００００、少なくとも１５００００、少なくとも２５００００、又は少なくとも５０００００の塩基対長さ(例えば、１００ｋｂ〜６００ｋｂ、２００ｋｂ〜５００ｋｂ、又は３００ｋｂ〜５００ｋｂ)である。具体例において、標的核酸配列が真核生物ゲノム(例えば、哺乳動物ゲノム、特にヒトゲノム)からのものである場合、標的配列は、典型的には生物体のゲノムの小さな部分(又は単一染色体の小さな部分)(例えば、生物体のゲノムＤＮＡ(又は単一染色体)の２０％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、又は１％未満)を表す。いくつかの例において、標的配列(例えば、ゲノム標的核酸配列)が感染生物(例えばウイルス)からのものである場合、標的配列は、感染生物のゲノムの全て又はより大きな割合(例えば５０％以上)を表すことができる。
【００３６】
特定の非限定例においては、腫瘍(例えば癌)に関連した標的核酸配列(例えば、ゲノム標的核酸配列)が選択される。多くの染色体異常(転座、他の再構成、倍加又は欠失を含む)が、腫瘍細胞、特に癌細胞、例えばＢ細胞及びＴ細胞白血病、リンパ腫、乳癌、結腸癌、胃癌、食道癌、神経性の癌において同定されている。よって、いくつかの例において、標的核酸配列(例えば、ゲノム標的核酸配列)の少なくとも一部は、サンプル中の細胞の少なくともサブセットにおいて倍加又は欠失している。
【００３７】
癌遺伝子に関連した転座は、いくつかのヒト悪性腫瘍について知られている。例えば、染色体１８ｑ１１.２のブレイクポイント領域に位置するＳＹＴ遺伝子に関与する染色体再構成は、滑膜軟組織腫瘍においては一般的である。ｔ(１８ｑ１１.２)転座は、例えば異なる標識を有するプローブを使用して同定することができ、第１のプローブは、ＳＹＴ遺伝子から遠位的に伸長する標的核酸配列から生じる核酸分子を含み、第２のプローブは、ＳＹＴ遺伝子に対して３'又は近接して伸長する標的核酸配列から生じる核酸を含む。これらの標的核酸配列(例えば、ゲノム標的核酸配列)に対応するプローブが、インサイツハイブリダイゼーション手順に使用される場合、ＳＹＴ遺伝子領域にｔ(１８ｑ１１.２)を欠く正常細胞は、２つの融合(近接近した２つの標識により生じる)シグナルを示し、ＳＹＴの２つの無傷コピーを反映する。ｔ(１８ｑ１１.２)を有する異常細胞は、単一の融合シグナルを示す。
【００３８】
腫瘍形質転換に関与する遺伝子倍加の多くの例が観察されており、開示されたプローブを使用するインサイツハイブリダイゼーションにより、細胞遺伝学的に検出することができる。一例において、選択された標的核酸配列(例えば、ゲノム標的核酸配列)は、一又は複数の悪性腫瘍(例えば、ヒト悪性腫瘍)において倍加した遺伝子(例えば、癌遺伝子)を含む。例えば、ｃ-ｅｒｂＢ２又はＨＥＲ２／ｎｅｕとしても公知のＨＥＲ２は、細胞成長(代表的なヒトＨＥＲ２ゲノム配列は、GENBANKＴＭ受託番号ＮＣ＿００００１７、ヌクレオチド３５０９７９１９-３５１３８４４１で提供されている)の調節における役割を担っている遺伝子である。遺伝子はチロシンキナーゼファミリーのメンバーである、１８５ｋｄの膜貫通細胞表面レセプターをコードしている。ＨＥＲ２はヒトの乳癌、卵巣癌、胃癌及び他の癌において増幅している。よってＨＥＲ２遺伝子(又はＨＥＲ２遺伝子を含む染色体１７の領域)は、ゲノム標的核酸配列として使用可能であり、ＨＥＲ２に対して特異的な結合領域を有する核酸分子を含むプローブが生成される。
【００３９】
他の例においては、悪性細胞において欠失(喪失)している腫瘍抑制遺伝子である標的核酸配列(例えば、ゲノム標的核酸配列)が選択される。例えば、染色体９ｐ２１に位置するｐ１６領域(Ｄ９Ｓ１７４９、Ｄ９Ｓ１７４７、ｐ１６(ＩＮＫ４Ａ)、ｐ１４(ＡＲＦ)、Ｄ９Ｓ１７４８、ｐ１５(ＩＮＫ４Ｂ)、及びＤ９Ｓ１７５２)は、ある種の膀胱癌で欠失している。(例えば、ＳＨＧＣ５７２４３、ＴＰ７３、ＥＧＦＬ３、ＡＢＬ２、ＡＮＧＰＴＬ１、及びＳＨＧＣ-１３２２を含む)染色体１の短腕の遠位領域、及び(例えば、ＭＡＮ２Ｂ１、ＺＮＦ４４３、ＺＮＦ４４、ＣＲＸ、ＧＬＴＳＣＲ２、及びＧＬＴＳＣＲ１を含む)染色体１９の動原体周囲領域(例えば、１９ｐ１３-１９ｑ１３)に含まれる染色体欠失は、中枢神経系のある種の固形腫瘍の特徴的分子特色である。
【００４０】
従って、いくつかの実施態様では、本発明は「ブレイクアパート」プローブセットを提供する。いくつかの実施態様では、ブレイクアパートプローブセットは、染色体転座に対する公知のブレイクポイントに一方の側でハイブリダイズする第１のプローブ、及び公知のブレイクポイントの他方の側でハイブリダイズする第２のプローブを含む。転座が検出可能なように、ブレイクアパートプローブセットの各プローブに対して、種々の発色性検出試薬が利用される。ブレイクアパートプローブセットの例には、限定されるものではないが、粘膜関連リンパ組織(ＭＡＬＴ)、未分化リンパ腫キナーゼ(ＡＬＫ)、ＥＴＳ-関連遺伝子(ＥＲＧ)、及びアンドロゲン関連再構成パートナー様ＴＭＰＲＳＳ２(アンドロゲン調節前立腺特異的セリン２プロテアーゼ)で、前立腺癌を示唆するものが含まれる。
【００４１】
上述の例は、単に例証目的でのみ提供されるものであり、制限することを意図したものではない。腫瘍の形質転換及び／又は成長に相関する多くの他の細胞遺伝学的異常は、当業者には知られている。また、腫瘍の形質転換に相関しており、開示された方法において有用であり、開示されたプローブが調製可能な標的核酸配列(例えば、ゲノム標的核酸配列)には、ＥＧＦＲ遺伝子(７ｐ１２；例えば、GENBANKＴＭ受託番号ＮＣ＿０００００７、ヌクレオチド５５０５４２１９−５５２４２５２５)、Ｃ-ＭＹＣ遺伝子(８ｑ２４．２１；例えば、GENBANKＴＭ受託番号ＮＣ＿０００００８、ヌクレオチド１２８８１７４９８−１２８８２２８５６)、Ｄ５Ｓ２７１(５ｐ１５．２)、リポタンパク質リパーゼ(ＬＰＬ)遺伝子(８ｐ２２；例えば、GENBANKＴＭ受託番号ＮＣ＿０００００８、ヌクレオチド１９８４１０５８−１９８６９０４９)、ＲＢ１(１３ｑ１４；例えば、GENBANKＴＭ受託番号ＮＣ＿００００１３、ヌクレオチド４７７７５９１２-４７９５４０２３)、ｐ５３(１７ｐ１３．１；例えば、GENBANKＴＭ受託番号ＮＣ＿００００１７、相補鎖、ヌクレオチド７５１２４６４-７５３１６４２))、Ｎ-ＭＹＣ(２ｐ２４；例えば、GENBANKＴＭ受託番号ＮＣ＿０００００２、相補鎖、ヌクレオチド１５１８３５２３１−１５１８５４６２０)、ＣＨＯＰ(１２ｑ１３；例えば、GENBANKＴＭ受託番号ＮＣ＿００００１２、相補鎖、ヌクレオチド５６１９６６３８−５６２００５６７)、ＦＵＳ(１６ｐ１１．２；例えば、GENBANKＴＭ受託番号ＮＣ＿００００１６、ヌクレオチド３１０９８９５４-３１１１０６０１)、ＦＫＨＲ(１３ｐ１４；例えば、GENBANKＴＭ受託番号ＮＣ＿００００１３、相補鎖、ヌクレオチド４００２７８１７−４０１３８７３４)、並びに例えば：ＡＬＫ(２ｐ２３；例えば、GENBANKＴＭ受託番号ＮＣ＿０００００２、相補鎖、ヌクレオチド２９２６９１４４-２９９９７９３６)、Ｉｇ重鎖、ＣＣＮＤ１(１１ｑ１３；例えば、GENBANKＴＭ受託番号ＮＣ＿００００１１、ヌクレオチド６９１６５０５４...６９１７８４２３)、ＢＣＬ２(１８ｑ２１．３；例えば、GENBANKＴＭ受託番号ＮＣ＿００００１８、相補鎖、ヌクレオチド５８９４１５５９−５９１３７５９３)、ＢＣＬ６(３ｑ２７；例えば、GENBANKＴＭ受託番号ＮＣ＿０００００３、相補鎖、ヌクレオチド１８８９２１８５９−１８８９４６１６９)、ＭＡＬＦ１、ＡＰ１(１ｐ３２-ｐ３１；例えば、GENBANKＴＭ受託番号ＮＣ＿０００００１、相補鎖、ヌクレオチド５９０１９０５１−５９０２２３７３)、ＴＯＰ２Ａ(１７ｑ２１-ｑ２２；例えば、GENBANKＴＭ受託番号ＮＣ＿００００１７、相補鎖、ヌクレオチド３５７９８３２１−３５８２７６９５)、ＴＭＰＲＳＳ(２１ｑ２２．３；例えば、GENBANKＴＭ受託番号ＮＣ＿００００２１、相補鎖、ヌクレオチド４１７５８３５１−４１８０１９４８)、ＥＲＧ(２１ｑ２２．３；例えば、GENBANKＴＭ受託番号ＮＣ＿００００２１、相補鎖、ヌクレオチド３８６７５６７１−３８９５５４８８)；ＥＴＶ１(７ｐ２１．３；例えば、GENBANKＴＭ受託番号ＮＣ＿０００００７、相補鎖、ヌクレオチド１３８９７３７９−１３９９５２８９)、ＥＷＳ(２２ｑ１２．２；例えば、GENBANKＴＭ受託番号ＮＣ＿００００２２、ヌクレオチド２７９９４２７１−２８０２６５０５)；ＦＬＩ１(��１ｑ２４．１-ｑ２４．３；例えば、GENBANKＴＭ受託番号ＮＣ＿００００１１、ヌクレオチド１２８０６９１９９−１２８１８７５２１)、ＰＡＸ３(２ｑ３５-ｑ３７；例えば、GENBANKＴＭ受託番号ＮＣ＿０００００２、相補鎖、ヌクレオチド２２２７７２８５１−２２２８７１９４４)、ＰＡＸ７(１ｐ３６．２-ｐ３６．１２；例えば、GENBANKＴＭ受託番号ＮＣ＿０００００１、ヌクレオチド１８８３００８７−１８９３５２１９、ＰＴＥＮ(１０ｑ２３．３；例えば、GENBANKＴＭ受託番号ＮＣ＿００００１０、ヌクレオチド８９６１３１７５-８９７１６３８２)、ＡＫＴ２(１９ｑ１３．１-ｑ１３．２；例えば、GENBANKＴＭ受託番号ＮＣ＿００００１９、相補鎖、ヌクレオチド４５４３１５５６−４５４８３０３６)、ＭＹＣＬ１(１ｐ３４．２；例えば、GENBANKＴＭ受託番号ＮＣ＿０００００１、相補鎖、ヌクレオチド４０１３３６８５-４０１４０２７４)、ＲＥＬ(２ｐ１３-ｐ１２；例えば、GENBANKＴＭ受託番号ＮＣ＿０００００２、ヌクレオチド６０９６２２５６−６１００３６８２)、及びＣＳＦ１Ｒ(５ｑ３３-ｑ３５；例えば、GENBANKＴＭ受託番号ＮＣ＿０００００５、相補鎖、ヌクレオチド１４９４１３０５１−１４９４７３１２８)が含まれる。開示された標的核酸プローブ又は方法は、外来遺伝子の少なくとも任意の１つ(規定通りにはそれ以上)を含有するそれぞれのヒト染色体の領域を含む。例えば、いくつかの開示されたプローブ又は方法用の標的核酸配列は、外来遺伝子の任意の一つ、及び十分に付加的な近接ゲノム配列(遺伝子の５'、遺伝子の３'、又はその組合せにかかわりなく)を、全体で少なくとも１０００００塩基対(例えば、少なくとも２５００００、又は少なくとも５０００００塩基対)、又は全体で１０００００〜５００００塩基対含む。
【００４２】
ある種の実施態様では、標的核酸分子に特異的なプローブを、染色体数の指標を提供する第２のプローブ、例えば染色体特異性(例えばセントロメア)プローブとの組合せでアッセイする(同一又は異なってはいるが、類似したサンプルにおいて)。例えば、少なくともＨＥＲ２遺伝子を含有する染色体１７の領域に特異的なプローブ(ＨＥＲ２プローブ)は、染色体１７(１７ｐ１１．１−ｑ１１．１)のセントロメアに位置するアルファサテライトＤＮＡにハイブリダイズする染色体１７(ＣＥＰ１７)プローブと組合せて使用することができる。ＣＥＰ１７プローブの包含により、相対コピー数のＨＥＲ２遺伝子が測定できるようになる。例えば通常のサンプルは、２未満のＨＥＲ２／ＣＥＰ１７比率であるが、ＨＥＲ２遺伝子が倍加されているサンプルは、２以上のＨＥＲ２／ＣＥＰ１７比率を有するであろう。同様に、任意の他の選択されたゲノム標的配列の位置に対応するＣＥＰセントロメアプローブも、同様(又は異なる)染色体における唯一の標的に対するプローブと組合せて使用することができる。
【００４３】
他の例において、標的核酸配列(例えば、ゲノム標的核酸配列)は、病気又は病状と関連したウイルス又は他の微生物から選択される。細胞又は組織サンプルにおける、ウイルス-又は微生物-誘導性標的核酸配列(例えば、ゲノム標的核酸配列)は、生物体の存在の指標となる。例えば、プローブは、癌遺伝子又は病原体ウイルス、細菌又は細胞内寄生体(例えば、熱帯熱マラリア原虫及び他のマラリア種、リーシュマニア(種)、クリプトスポリジウム・パルバム、赤痢アメーバ、及びランブル鞭毛虫、並びにトキソプラズマ、エイメリア、タイレリア、及びバベシア種)のゲノムから選択することができる。
【００４４】
いくつかの例において、標的核酸配列(例えば、ゲノム標的核酸配列)はウイルスゲノムである。例示的なウイルス及び対応するゲノム配列(GENBANKＴＭ 括弧中の RefSeq受託番号)には、ヒトアデノウイルスＡ(ＮＣ＿００１４６０)、ヒトアデノウイルスＢ(ＮＣ＿００４００１)、ヒトアデノウイルスＣ(ＮＣ＿００１４０５)、ヒトアデノウイルスＤ(ＮＣ＿００２０６７)、ヒトアデノウイルスＥ(ＮＣ＿００３２６６)、ヒトアデノウイルスＦ(ＮＣ＿００１４５４)、ヒトアストロウイルス(ＮＣ＿００１９４３)、ヒトＢＫポリオーマウイルス(Ｖ０１１０９；ＧＩ：６０８５１)  ヒトボカウイルス(ＮＣ＿００７４５５)、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ(ＮＣ＿００２６４５)、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１(ＮＣ＿００６５７７)、ヒトコロナウイルスＮＬ６３(ＮＣ＿００５８３１)、ヒトコロナウイルスＯＣ４３(ＮＣ＿００５１４７)、ヒトエンテロウイルスＡ(ＮＣ＿００１６１２)、ヒトエンテロウイルスＢ(ＮＣ＿００１４７２)、ヒトエンテロウイルスＣ(ＮＣ＿００１４２８)、ヒトエンテロウイルスＤ(ＮＣ＿００１４３０)、ヒトエリスロウイルスＶ９(ＮＣ＿００４２９５)、ヒト泡沫状ウイルス(ＮＣ＿００１７３６)、ヒトヘルペスウイルス１(単純ヘルペスウイルス１型)(ＮＣ＿００１８０６)、ヒトヘルペスウイルス２(単純ヘルペスウイルス２型)(ＮＣ＿００１７９８)、ヒトヘルペスウイルス３(水痘帯状疱疹ウイルス)(ＮＣ＿００１３４８)、ヒトヘルペスウイルス４ １型(エプスタイン-バーウイルス１型)(ＮＣ＿００７６０５)、ヒトヘルペスウイルス４ ２型(Ｅエプスタイン-バーウイルス２型)(ＮＣ＿００９３３４)、ヒトヘルペスウイルス５菌株ＡＤ１６９(ＮＣ＿００１３４７)、ヒトヘルペスウイルス５菌株メルリン(Merlin)菌株(ＮＣ＿００６２７３)、ヒトヘルペスウイルス６Ａ(ＮＣ＿００１６６４)、ヒトヘルペスウイルス６Ｂ(ＮＣ＿０００８９８)、ヒトヘルペスウイルス７(ＮＣ＿００１７１６)、ヒトヘルペスウイルス８Ｍ型(ＮＣ＿００３４０９)、ヒトヘルペスウイルス８Ｐ型(ＮＣ＿００９３３３)、ヒト免疫不全ウイルス１(ＮＣ＿００１８０２)、ヒト免疫不全ウイルス２(ＮＣ＿００１７２２)、ヒト免疫不全ウイルス(ＮＣ＿００４１４８)、ヒトパピローマウイルス−１(ＮＣ＿００１３５６)、ヒトパピローマウイルス−１８(ＮＣ．＿００１３５７)、ヒトパピローマウイルス−２(ＮＣ＿００１３５２)、ヒトパピローマウイルス−５４(ＮＣ＿００１６７６)、ヒトパピローマウイルス−６１(ＮＣ＿００１６９４)、ヒトパピローマウイルス−ｃａｎｄ９０(ＮＣ＿００４１０４)、ヒトパピローマウイルスＲＴＲＸ７(ＮＣ＿００４７６１)、ヒトパピローマウイルス１０型(ＮＣ＿００１５７６)、ヒトパピローマウイルス１０１型(ＮＣ＿００８１８９)、ヒトパピローマウイルス１０３型(ＮＣ＿００８１８８)、ヒトパピローマウイルス１０７型(ＮＣ＿００９２３９)、ヒトパピローマウイルス１６型(ＮＣ＿００１５２６)、ヒトパピローマウイルス２４型(ＮＣ＿００１６８３)、ヒトパピローマウイルス２６型(ＮＣ＿００１５８３)、ヒトパピローマウイルス３２型(ＮＣ＿００１５８６)、ヒトパピローマウイルス３４型(ＮＣ＿００１５８７)、ヒトパピローマウイルス４型(ＮＣ＿００１４５７)、ヒトパピローマウイルス４１型(ＮＣ＿００１３５���)、ヒトパピローマウイルス４８型(ＮＣ＿００１６９０)、ヒトパピローマウイルス４９型(ＮＣ＿００１５９１)、ヒトパピローマウイルス５型(ＮＣ＿００１５３１)、ヒトパピローマウイルス５０型(ＮＣ＿００１６９１)、ヒトパピローマウイルス５３型(ＮＣ＿００１５９３)、ヒトパピローマウイルス６０型(ＮＣ＿００１６９３)、ヒトパピローマウイルス６３型(ＮＣ＿００１４５８)、ヒトパピローマウイルス６ｂ型(ＮＣ＿００１３５５)、ヒトパピローマウイルス７型(ＮＣ＿００１５９５)、ヒトパピローマウイルス７１型(ＮＣ＿００２６４４)、ヒトパピローマウイルス９型(ＮＣ＿００１５９６)、ヒトパピローマウイルス９２型(ＮＣ＿００４５００)、ヒトパピローマウイルス９６型(ＮＣ＿００５１３４)、ヒトパラフルエンザウイルス１(ＮＣ＿００３４６１)、ヒトパラインフルエンザウイルス２(ＮＣ＿００３４４３)、ヒトパラインフルエンザウイルス３(ＮＣ＿００１７９６)、ヒトパレコウイルス(ＮＣ＿００１８９７)、ヒトパルボウイルス４(ＮＣ＿００７０１８)、ヒトパルボウイルスＢ１９(ＮＣ＿０００８８３)、ヒト呼吸器多核体ウイルス(ＮＣ＿００１７８１)、ヒトライノウイルスＡ(ＮＣ＿００１６１７)、ヒトライノウイルスＢ(ＮＣ＿００１４９０)、ヒトスプマレトロウイルス(ＮＣ＿００１７９５)、ヒトＴ−リンパ球向性ウイルス１(ＮＣ＿００１４３６)、ヒトＴ−リンパ球向性ウイルス２(ＮＣ＿００１４８８)が含まれる。
ある種の例では、標的核酸配列(例えば、ゲノム標的核酸配列)は、癌遺伝子ウイルス、例えばエプスタイン-バーウイルス(ＥＢＶ)又はヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ、例えば、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８)からのものである。他の例では、標的核酸配列(例えば、ゲノム標的核酸配列)は病原体ウイルス、例えば呼吸器多核体ウイルス、肝炎ウイルス(例えば、Ｃ型肝炎ウイルス)、コロナウイルス(例えば、ＳＡＲＳウイルス)、アデノウイルス、ポリオーマウイルス、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)、又は単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ)からのものである。
【００４５】
４．サンプルを分析するための方法
いくつかの実施態様では、本発明は、サンプルの分析、ハイブリダイゼーション及びシグナルプロセシング及び検出のための方法を提供する。これらの方法は、特にサンプルに適用され、ここでブレイクアパートプローブセットが、サンプル中の遺伝子の再構成、例えばＡＬＫ遺伝子の再構成を検出するために使用される。ブレイクアパートプローブセットは、一般的に、再構成に関連インサイツ例えばブレイクポイントに対してそれぞれ５'及び３'である、標的配列領域を指向する、少なくとも５'及び３'プローブセットを含む。いくつかの好ましい実施態様では、プローブは、それらが異なる色調の色素原、例えば青色及び赤色色素原又は色素原(例えば、青色又は赤色色素原)と銀(例えば、銀ＩＳＨを用いる)の組合せで検出されるように標識される。例として、非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)においてＡＬＫ再構成を使用すると、再構成されていない配列ＡＬＫ遺伝子は、紫色のシグナル、又は場合によってはわずかに分離した赤色と青色のシグナルとして可視化される、赤色と青色の色素原の「融合シグナル」を示す。ＡＬＫ遺伝子が再構成されている場合、赤色及び青色のシグナルは分離している。
【００４６】
ＩＳＨ結果の臨床的使用は、好ましくは広いカットオフ範囲にわたる感度及び特異性により決定されるような、方法のロバスト性に依存し、ここでカットオフは、再構成が存在する場合のスコアである、サンプル内の細胞のパーセンテージである。本発明は、臨床サンプルに容易に適用され、自動化に適したロバスト試験を提供する。本発明の方法において、サンプル中の細胞は、融合シグナル又は異常シグナルを有する場合にスコア化される。好ましい実施態様では、融合シグナル以外の任意のシグナルの存在は、異常としてスコア化される。このような異常シグナルの例には、シグナルの分割、５'シグナルの損失、３'シグナルの損失、融合及び分割の組合せ等が含まれる。このシステムは、異常シグナルが別々に分類されるシステムと比較して、かなり単純である(例えば、Kwakら, N Eng J Med 363(18):1693-1703 (2010); Eunheeら, J. Thor. Onc. 6(3):459-465 (2011)を参照)。驚くべきことに、本発明の方法は、臨床サンプルからのＲＮＡ及びタンパク質発現データと比較して、広範囲のカットオフで１００％特異性及び感度を提供する。
【００４７】
複数のＡＬＫインヒビターは、ＡＬＫ再構成を用いた、ＮＳＣＬＣを処置するための癌用薬剤として開発されている。本発明の方法は、ＡＬＫインヒビターも用いた処置に適切な患者を同定するのに有用である。いくつかの実施態様では、５'及び３'ＡＬＫブレイクアパートプローブは、患者のサンプルにハイブリダイズし、例えば５'プローブ用に１色、３'プローブ用に１色生成する、発色性検出システムを用いて検出される。上述したように、サンプルは分析され、サンプル内の細胞が、正常な融合シグナル又は異常なシグナルを有する場合にスコア化され、ここで異常なシグナルは、正常な融合シグナル以外の任意のシグナルである。異常なシグナルを有し、細胞の約１５％〜７５％、２０％〜６０％、２５％〜４５％、及び２７％〜３８％からなる群から選択されるカットオフ範囲に入る異常なシグナルを有するサンプルは、ＡＬＫ再構成に対してポジティブであるとスコア化される。いくつかの実施態様では、ポジティブサンプルが取られた患者は、ＡＬＫインヒビターを用いた処置の対象であると同定されている。いくつかの実施態様では、ＡＬＫインヒビターが患者に投与される。
【実施例】
【００４８】
実施例１
この実施例は、アルカリホスファターゼを変性させ、続く第１の発色性検出反応に必要な時間に関するデータを提供する。
2013524812.tif 000003
＊ 抗ＤＩＧ抗体＋抗マウスＡＰ抗体＋ブロック＋赤色検出
＊＊ ブロック＋抗ＤＮＰ抗体＋抗ウサギＡＰ抗体＋赤色検出
【００４９】
実施例２
この実施例は、いくつかの異なる２色ＣＩＳＨプロトコルからのデータを提供する。データには、ブロック工程後、青色発色性沈殿物が残存していることが示されており(プロトコル１に対してプロトコル２を比較、参照)、３７℃での付加的なブロック工程は、第１の検出システムからの有色沈積物に悪影響を及ぼさなかった。ブロック工程が使用される場合、青色及び赤色のＩＳＨシグナルの双方がはっきりと生成され(プロトコル６に対してプロトコル７を比較、参照)、近接近しているプローブは、紫色の組合せた色調を生じせしめた。
2013524812.tif 000004
＊ ＤＩＧ標識５'ＡＬＫプローブ及びＤＮＰ標識３'ＡＬＫプローブの同時ハイブリダイゼーション
【００５０】
実施例３
ホルムアミドを用いた変性工程を、２色検出プロトコルにおいて、いくつかのプローブセットを使用した。図２は、ブロック工程が２つの異なる色調検出システム(紫色のＩＳＨシグナル中)で使用されない場合の、明視野ブレイクアパートインサイツハイブリダイゼーションの色調概略図(赤及び青)を示す写真を提供する。図３は、ＡＰベースの２色インサイツハイブリダイゼーションシグナルにおける、ブロック工程(すなわち、ホルムアミドを用いた処理)の影響を示す、例示的写真を提供する。図３は、ブロックが色調検出システム間で使用される場合に、バックグランド染色が大きく低下することをさらに例証する。
【００５１】
物質及び方法
ＡＬＫ及びＭＡＬＴ１プローブの設計。ブレイクアパートアッセイを、ＡＬＫ遺伝子座の配列を評価するように設計した。２つの無反復プローブを生成させ、ＡＬＫ遺伝子の隣接セントロメア領域(７７０ｋｂ)及びテロメア領域(６８３ｋｂ)にハイブリダイズさせた。生物情報学的ツール(Human Genome Browser and Repeat Masker)を使用し、反復エレメントを除去した。プライマー３プログラム(http://primer3.sourceforge.net)を使用し、領域を横切る唯一の配列に対してプライマーを設計した。設計されたＰＣＲ断片及びプライマーを、ヒトゲノムに対する類似性について分析し、ヒトＢＬＡＴ及びＢｌａｓｔｎｔプログラムにより転写した(ワールドワイドウェブのgenome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat)。他の領域に対する高度な類似性を示す断片を除外し、全てのＰＣＲ断片を、配列決定により検証した。５'ＡＬＫプローブ(全サイズ１１３ｋｂ)に対するＰＣＲ断片をライゲーションし、ランダム増幅させ、ジゴキシゲニン(ＤＩＧ)にコンジュゲートしたｄＵＴＰを使用するニックトランスレーションにより標識した(Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN)。同様に、３'ＡＬＫプローブ(全サイズ１５４ｋｂ)を、２,４ ジニトロフェニル(ＤＮＰ)にコンジュゲートしたｄＣＴＰを使用するニックトランスレーションにより標識した(Ventana Medical Systems, Inc. Tucson, AZ)。
【００５２】
同じ技術を適用することにより、ＭＡＬＴ１ブレイクアパートプローブを、ＭＡＬＴ１遺伝子の公知のブレイクポイント領域に隣接する、６９３ｋｂのテロメア領域(３'ＭＡＬＴ１プローブ用の標的配列)、及び〜５００ｋｂのセントロメア領域(５'ＭＡＬＴ１プローブ用の標的配列)をカバーするように設計した。反復枯渇した５'ＭＡＬＴ１プローブ(全サイズ１６０ｋｂ)をＤＮＰで、３'ＭＡＬＴ１プローブ(全サイズ１４８ｋｂ)をＤＩＧで、それぞれ標識した。
【００５３】
ＡＬＫ及びＭＡＬＴ１プローブ特異性試験。５'及び３'ＡＬＫのＤＮＡプローブの種子を、Vysisニックトランスレーションキット(Abbott Molecular Inc., Des Plaines, IL)を使用し、スペクトルグリーンｄＵＴＰを用いて個々に標識し、NucAwayスピンカラム(Ambion, Austin, TX)を使用して精製し、５'ＤＩＧ標識ＡＬＫプローブ及び３'ＤＮＰ標識ＡＬＫプローブと同様の緊縮性で処方した。Vysis CEP2スペクトルオレンジ標識プローブ(ＣＥＰ２オレンジ色プローブ)(Abbott Molecular Inc., Des Plaines, IL)を使用し、５'ＡＬＫスペクトルグリーン標識プローブ(５'ＡＬＫ緑色プローブ)及び／又は３'ＡＬＫスペクトルグリーン標識プローブ(３'ＡＬＫ緑色プローブ)を評価するために、同容量のＣＥＰ２オレンジ色プローブと５'ＡＬＫ緑色プローブ(又は３'ＡＬＫ遺伝子プローブ)を、アルコール脱水後に、比較ゲノムハイブリダイゼーション中期御トロールスライド(Abbott Molecular Inc., Des Plaines, IL)に適用した。標的中期のプローブを８４℃で同時変性させ、密封された加湿チャンバー(StatSpin, Inc., Westwood, MA)内にて、４２℃で一晩ハイブリダイズさせた。２Ｘ ＳＳＣを用い、７２℃で２分、緊縮洗浄を実施し、空気乾燥後にＤＡＰＩ ＩＩ(Abbott Molecular Inc.)でカバースライドをかけた。ＡＬＫプローブと同様、５'及び３'ＭＡＬＴ１ ＤＮＡプローブの種子を、スペクトルグリーンｄＵＴＰで個々に標識し、ＡＬＫプローブと同様の方式で、Vysis  CEP18スペクトルオレンジ(Abbott Molecular Inc.)プローブに対する、それらの共局在性を評価した。適切なフィルターを具備するZeiss Axioskop蛍光顕微鏡(Carl Zeiss MicroImaging, Inc., Thornwood, NY)を使用し、SPOT CCD顕微鏡デジタルカメラ(Diagnostic Instruments, Inc., Sterling Heighs, MI)にて写真を撮った。
【００５４】
コントロール及び試験臨床組織サンプル。常套的にプロセシングされ、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された扁桃腺のサンプルを、共局在化した５'及び３'ＡＬＫ又はＭＡＬＴ１プローブセットを可視化するための、ネガティブコントロールとして使用した。記録されたＡＬＣＬ及びＭＡＬＴのリンパ腫のケースを、それぞれＡＬＫ又はＭＡＬＴ１ｂａ-ＩＳＨアッセイの性能試験により分析した。組織ブロックを４μｍに切断し、荷電したガラススライド上に配した。
【００５５】
自動化された明視野ブレイクアパートインサイツハイブリダイゼーションプロトコル。明視野インサイツハイブリダイゼーションＡＬＫ及びＭＡＬＴ１遺伝子のブレイクアパートアッセイについての、全ての最適化及び性能評価を、BenchMark(登録商標)XT自動化スライドプロセシングシステム(Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, Arizona, United States)を用いて実施した。対比染色に対するベーキングからの全ての工程を、中断なしに実施可能なように、ｂａ-ＩＳＨ機器ソフトウェアを作製した。機器においてスライドを６５℃で２０分ベーキングし、その後Liquid CoverslipＴＭ(Ventana)プライムドEZ PrepＴＭ脱パラフィン工程を実施した。１ｘの反応用バッファーを用いた加熱処理(トリスベースのｐＨ７．６バッファー、Ventana)と、ＩＳＨプロテアーゼ２又はＩＳＨプロテアーゼ３(Ventana)を用いた組織消化の組合せにより、ＤＮＡ標的を回収した。５'及び３'ＡＬＫ又はＭＡＬＴプローブ(各１５μｇ／ｍｌ)の混合物を、Ventanaハイブリダイゼーション用バッファーにおいて、ヒト胎盤ＤＮＡ(２ｍｇ／ｍｌ)と共に処方した。プローブと標的ＤＮＡを８５℃で２０分同時変性させ、４４℃で５時間ハイブリダイゼーションを実施した。緊縮洗浄工程を、２Ｘ ＳＳＣ(Ventana)を用い、７２℃で実施した。ＡＬＫ及びＭＡＬＴ ｂａ-ＩＳＨ適用の双方にとっての、ＩＳＨシグナル検出のシーケンスを、青色検出、続いて赤色検出を用いて実施した(図１)。ＤＩＧハプテンをマウス抗ＤＩＧ抗体で標識し、ＤＩＧ抗体をＡＰ-コンジュゲートしたヤギ抗マウス抗体と反応させ、ＡＰ酵素をファーストブルーで着色させた。ついで、ＡＰ酵素をハイブリダイゼーション用バッファーを用いて３０分変性させた。２Ｘ ＳＳＣを用いてスライドを洗浄させた後、第２のＩＳＨ検出を実施した。ＤＮＰハプテンをウサギ抗ＤＮＰ抗体で標識し、ＤＮＰ抗体をＡＰコンジュゲートしたヤギ抗ウサギ抗体と反応させ、ＡＰ酵素をファーストレッド検出で着色させた。全てのスライドを、ヘマトキシリンＩＩ(Ventana)及び青化試薬(Ventana)で対比染色した。対比染色されたスライドを、スライドを洗浄するために、DAWN(登録商標)(Proctor & Gamble Company, Cincinnati, OH)を含有する蒸留水ですすいだ。最後に、空気乾燥されたスライドに、Tissue-Tek(登録商標)フィルムカバースライド(Sakura Finetek Japan, Tokyo, Japan)をかけた。ｂａ-ＩＳＨスライドを分析し、ニコンデジタルカメラＤＳ-Ｆｉ１(Nikon)を具備するNikon ECLPSE 90i顕微鏡(Nikon Instruments Inc., Melville, NY)を用いて写真を撮った。
【００５６】
結果及び分析
ＡＬＫ及びＭＡＬＴプローブ特異性
５'及び３'ＡＬＫのＤＮＡプローブの染色体２への局在化。スペクトルグリーン(５'ＡＬＫ緑色プローブと３'ＡＬＫ緑色プローブ)、及びVysis CEP2 スペクトルオレンジ(ＣＥＰ２オレンジ色プローブ)でニックトランスレーションされた５'又は３'ＡＬＫのＤＮＡプローブの同時ハイブリダイゼーションを、正常なリンパ球中期展伸において実施した(図６Ａ及びＢ)。５'ＡＬＫ緑色プローブとVysis CEP 2オレンジ色プローブを同じ染色体に局在化させると、予期するように、５'ＡＬＫプローブが染色体２の短(ｐ)腕に検出された(図６Ａ)。３'ＡＬＫ緑色プローブ、及びVysis CEP 2オレンジ色プローブも、同じ染色体に局在化させると、３'ＡＬＫプローブが染色体２の短(ｐ)腕にハイブリダイズした(図６Ｂ)。５'ＡＬＫ緑色プローブ又は３'ＡＬＫ緑色プローブのいずれかと、他の染色体とのクロス-ハイブリダイゼーションは、観察されなかった。よって、５'及び３'ＡＬＫプローブの、正常なリンパ球中期展伸における、標的配列に対する独立した特異性が示された。
【００５７】
５'及び３'ＭＡＬＴ１のＤＮＡプローブの染色体１８への局在化。スペクトルグリーン(５'ＭＡＬＴ１緑色プローブと３'ＭＡＬＴ１緑色プローブ)、及びVysis CEP 18スペクトルオレンジ(ＣＥＰ１８オレンジ色プローブ)でニックトランスレーションされた５'又は３'ＭＡＬＴ１のＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションを、正常なリンパ球中期展伸において実施した(図７Ｃ及びＤ)。５'ＭＡＬＴ１緑色プローブとVysis CEP 18オレンジ色プローブを、染色体１８の長(ｑ)腕に局在化させた(図６Ｃ)。３'ＭＡＬＴ１緑色プローブ、及びVysis CEP 18オレンジ色プローブも、染色体１８の長(ｑ)腕に局在化していることが示された。５'ＭＡＬＴ１緑色プローブ又は３'ＭＡＬＴ１緑色プローブのいずれかと、他の染色体とのクロス-ハイブリダイゼーションは、観察されなかった。よって、５'ＭＡＬＴ１及び３'ＭＡＬＴ１プローブの、染色体１８における、標的配列に対する特異性が示された。
【００５８】
ＡＬＫ及びＭＡＬＴ１明視野ブレイクアパートＩＳＨ性能
扁桃腺における正常なＡＬＫ及びＭＡＬＴ１遺伝子。ホルマリン固定され、パラフィン包埋された扁桃腺切片における各プローブの性能を確認するために、５'ＡＬＫプローブの青色検出(図８Ａ)及び３'ＡＬＫプローブの赤色検出(図７Ｂ)を別々に実施した。１-２の青色又は赤色ドットは、正常の扁桃腺細胞において観察されるため、我々は、５'ＡＬＫ及び３'ＡＬＫプローブが正しくＤＮＡ標的にハイブリダイズしており、ＡＰベースのＩＳＨ検出を使用し、各標的に対して適切な感度が達成されていることを確認した。ＡＬＫ ｂａ-ＩＳＨが正常な扁桃腺切片で実施されている場合、５'ＡＬＫプローブ及び３'ＡＬＫプローブは同時局在化しており、紫色ドットとして、青色及び赤色ドットの重複が生じた(図７Ｃ)。よって、この観察により、５'及び３'ＡＬＫプローブの双方が、標的ＤＮＡ配列に成功裏にハイブリダイズしていることが確認された。正常な扁桃腺細胞において、青色又は赤色のみのドットを示す、いくつかの細胞が存在することを記しておくべきである。全細胞におけるＩＳＨアッセイとは異なり、組織切片でのＤＮＡ ＩＳＨにおいて、多くの細胞は、組織切片内に部分的に現れるのみである。また、３'ＭＡＬＴ１プローブに対する青色検出(図７Ｄ)及び５'ＭＡＬＴ１プローブに対する赤色検出(図８Ｅ)を、正常な扁桃腺切片における各プローブのアッセイ性能を試験するために、別々に実施した。ＡＬＫプローブを用いて見られるように、正常な扁桃腺細胞の核には、１-２の青色又は赤色ＭＡＬＴ１ ＩＳＨシグナルが存在した。よって、我々は、５'及び３'ＭＡＬＴ１プローブが、自動化されたＩＳＨプロトコルを用いて正しい標的配列と認識し、各ＭＡＬＴ１プローブハイブリダイゼーションに対する感度が十分であることを確認した。３'ＭＡＬＴ１及び５'ＭＡＬＴ１プローブは、ｂａ-ＩＳＨにおいて共に試験され、アッセイでは、扁桃腺切片において青色と赤色とが重複した結果として、紫色ドットのシグナルが生じた(図８Ｆ)。ＡＬＫ ｂａ-ＩＳＨアッセイにおいては、青色又は赤色のＩＳＨシグナルのみを含む、正常な扁桃腺細胞が存在した。上述したように、この現象は、スライスされた組織切片における部分的細胞の故である。このことは、ＦＩＳＨベースの融合シグナル及びブレイクアパート／スプリット-シグナルアッセイ(Van Dongenら. 2005)における問題点である。融合シグナルＩＳＨ及びブレイクアパートＩＳＨアッセイには、「擬陽性」及び「擬陰性」のバックグランドが常に存在するであろう。ＡＰベースのシグナルの組合せは、種々のブロック法を使用することにより、免疫組織化学適用において多重化しており(van der Loos and Teeling, 2008; Patersonら, 2008; Piriciら, 2009)、２つのＩＳＨアッセイ間の熱処理が効果的である。しかしながら、２つのプローブの混合物を使用する、明視野２色ＩＳＨ適用について、２つのＡＰ検出間の熱ブロック工程により、プローブと標的との間のハイブリダイゼーションが変性する。よって、我々は、別のブロック法を見つける必要がある。我々は、プローブとＤＮＡ標的との間の特異的ハイブリダイゼーションを保存しつつ、ハイブリダイゼーション用バッファーが、ＡＰ酵素用のブロック／変性試薬として有用であることを観察した。
【００５９】
リンパ腫における転座したＡＬＫ及びＭＡＬＴ１遺伝子。ＡＬＫ及びＭＡＬＴ１遺伝子に対する明視野ｂａ-ＩＳＨを、それぞれ  ＡＬＫ＋ＡＬＣＬ及びＭＡＬＴリンパ腫のケースに適用した(図８)。紫色のドットに見える、重複した青色及び赤色のＡＬＫ ＩＳＨシグナルが、ホルマリン固定され、パラフィン包埋されたＡＬＫ＋ＡＬＣＬ組織切片の正常なリンパ球で観察された(図８Ａ)。単離された青色及び赤色のブレイクアパートＩＳＨシグナルがＡＬＫ＋リンパ腫細胞で見られ、無傷のＡＬＫ遺伝子は、同様の細胞において、重複した青色及び赤色シグナルと伴い可視化された。よって、ＡＬＫ転座は、光学顕微鏡を使用する、自動化された明視野ｂａ-ＩＳＨを用いて示され、組織形態及びＩＳＨシグナルと相関している。正常な扁桃腺切片で観察されるように、５'及び３'ＭＡＬＴ１ＩＳＨシグナルは、ＭＡＬＴリンパ腫のケースの正常なリンパ球の核において、紫色のドットとして見える(図８Ｃ)。しかしながら、別の５'及び３'ＭＡＬＴ１ ＩＳＨシグナルは、それぞれ赤色及び青色ドットとしてはっきりと可視化され、ＭＡＬＴリンパ腫細胞において重複した５'及び３'ＭＡＬＴ１ ＩＳＨシグナルも同様である(図８Ｄ)。ＡＬＫ ｂａ-ＩＳＨアッセイに使用される同様のｂａ-ＩＳＨ適用を、任意のプロトコル変更をすることなく、ＭＡＬＴ１遺伝子の再構成を示すために、成功裏に使用した。
【００６０】
再構成した５'及び３'ＡＬＫ又はＭＡＬＴ１領域の間の距離は一定ではなく、遺伝子のブレイクポイントの展伸性に依存する。各ケースの全てのリンパ腫細胞が同様の遺伝子の再配置パターンを示すことが明らかであるため、リンパ腫における遺伝子の再構成はランダム事象であるか、又はリンパ腫細胞の不均一性が存在すると推測される。ＡＬＫ＋ＡＬＣＬ間のリンパ腫細胞、及びＭＡＬＴリンパ腫の大きさは、有意に異なっている。細胞が大きくなればなるほど、切片化からのブレイクアパートＩＳＨシグナルのトランケーションアーチファクト「擬陽性」の可能性が大きくなる。よって、ｂａ-ＩＳＨスライドが読まれる場合、一方の単色ＩＳＨシグナルが：１）トランケーションアーチファクト、２）遺伝子欠失、又は３）遺伝子転座の故である場合、一方は注意深く考慮しなければならない。病理学者の間でスコア化される、高い一致率のブレイクアパートＩＳＨスライドが達成可能なように、単純なスコア化方法を開発しなければならない。また、２つの単色ＩＳＨシグナル間の距離をさらに分析することが、特定の病気に対する正確な遺伝子ブレイクアパート状態に必要である。
【００６１】
実施例４
まず、赤色検出を実施し、続いて青色検出を実施することを除き、実施例２の手順を繰り返した。結果を図９に与える。
【００６２】
実施例５
青色及び赤色検出工程の間に、変性のためのＳＤＳを使用することを除き、実施例２の手順を繰り返した。結果は示さないが、不満足なものであった。
【００６３】
実施例６
この実施例は、ＡＬＫ座位の５'-及び３'-領域にハイブリダイズする１対のプローブを使用して、ＮＳＣＬＣを煩っている患者からの、固定され包埋された肺腫瘍組織における、２色ＣＩＳＨ及びＳＩＳＨ／ＣＩＳＨインサイツハイブリダイゼーションの評価を記載する。ＡＬＫの発現の増加に至るＡＬＫ遺伝子再構成を検出するために、プローブを使用し、ＡＬＫインヒビター治療に対する反応性が高い可能性が示されている。２色ＣＩＳＨ(青-赤)及びＳＩＳＨ／ＣＩＳＨ(黒-赤)を、複製物に２０の肺腫瘍組織が入った組織マイクロアレイにおいて実施し、そのうちの１０は、ＡＬＫ発現に対してポジティブであると予定しており、１０は、ＩＨＣ及び逆転写酵素ＰＣＲ(ＲＴ-ＰＣＲ)により、ＡＬＫ発現に対してネガティブであると予定している。得られた染色された試料を明視野条件で評価し、５'-及び３'-ＡＬＫシグナルの数及び相対的位置について、試料毎に５０の細胞を列挙した。２色ＣＩＳＨで染色されたアレイは、単一リーダーにより列挙され、複製物毎に１つの組織試料を評価し、次のＩＳＨパラメーターを測定した：
Ｐ１．  融合した５'-及び３'-ＡＬＫシグナルのみを有する細胞パーセント
Ｐ２．  融合及び分割した５'-及び３'-ＡＬＫシグナルの双方を有する細胞パーセント
Ｐ３．  分割した５'-及び３'-ＡＬＫシグナルのみを有する細胞パーセント
Ｐ４．  融合した５'-及び３'-ＡＬＫシグナル及び孤立した５'-シグナルの双方を有する細胞パーセント
Ｐ５．  融合した５'-及び３'-ＡＬＫシグナル及び孤立した３'-シグナルの双方を有する細胞パーセント
Ｐ６．  孤立した５'-ＡＬＫシグナルのみを有する細胞パーセント
Ｐ７．  孤立した３'-ＡＬＫシグナルのみを有する細胞パーセント
Ｐ８．  任意の非融合の５'-及び３'-ＡＬＫシグナルを有する細胞パーセント
Ｐ９．  任意の分割した５'-及び３'-ＡＬＫシグナル又は孤立した３'-シグナルを有する細胞パーセント
Ｐ１０．  任意の分割した５'-及び３'-ＡＬＫシグナル又は孤立した５'-シグナルを有する細胞パーセント
Ｐ１１．  任意の分割した５'-及び３'-ＡＬＫシグナルを有する細胞パーセント
【００６４】
０〜１００％細胞のカットオフ値を各パラメーターに適用し、ＡＬＫ再構成について、ＩＳＨによりポジティブ(パラメーター値≧カットオフ値)、又はＩＳＨによりネガティブ(パラメーター値＜カットオフ値)として、各試料を分類した。カットオフ値にて、感度及び特異性をＡＬＫの再構成能力について算出し、ＩＨＣ／ＲＴ-ＰＣＲにより測定されるようにして、ＡＬＫ発現を同定した。４つの最も良好な実行パラメータについての受信機運用特性(ＲＯＣ)曲線を図１０にプロットした。各パラメーターに対するカットオフ値の最適範囲を同定するために、ＤＦＩ＝((１−感度)２＋(１−特異性)２)１／２であるＤＦＩ(理想値からの距離)を、ＲＯＣプロットにおける全ての点について、図１１に対カットオフ値でプロットした(ＤＦＩの記載については、Heselmeyer-Haddadら.(2003) Am J Pathol, 163, 1405-1416を参照)。これらの図から、１００％感度及び特異性(ＤＦＩ＝０)を提供する孤立した３'-シグナル又は任意の分割した５'-及び３'-ＡＬＫシグナルを有する細胞パーセント、及び任意の非融合の５'-及び３'-ＡＬＫシグナル(すなわち、任意の分割した又は孤立したシグナル)を有する細胞パーセントのみがわかる。図１１から、これら２つのパラメーターの前者が、最も高いレベルの感度及び特異性を提供する最も広い範囲のカットオフ値により測定される場合、最もロバスト性のあるアッセイを提供することがわかる。前者のパラメーターについて、２７〜３８％の細胞のカットオフが、完全な性能(１００％感度及び特異性、ＤＦＩ＝０)を提供し、非常に良好な性能は、２７〜５０％の細胞のカットオフ(ＤＦＩ≦０．１)、及び２７〜７４％のカットオフ(ＤＦＩ≦０．２)に見いだされた。
【００６５】
ついで、２色ＣＩＳＨ及びＳＩＳＨ／ＣＩＳＨハイブリダイゼーションが、４人の病理学者により列挙され、各試料の複製物、及び評価されたパラメーターの数の双方の評価を拡大し、以下のように命名した：
Ｐ２：  任意の非融合シグナルを有する細胞％
Ｐ３：  対になった分割シグナルのみを有する(融合又は非対シグナルを有さない)細胞％
Ｐ４：  融合し対になった分割シグナルを有する(非対シグナルを有さない)細胞％
Ｐ５：  対になった分割シグナルを有し、融合シグナルを有する又は有さない(非対シグナルを有さない)細胞％
Ｐ６：  他の融合又は非対シグナルにかかわらず、対になった分割シグナルを有する細胞％
Ｐ７：  任意の非対５'-ＡＬＫシグナル(類)を有する細胞％
Ｐ８：  融合シグナル及び任意の非対５'-ＡＬＫシグナル(類)を有する細胞％
Ｐ９：  任意の非対３'-ＡＬＫシグナル(類)を有する細胞％
Ｐ１０：  融合シグナル及び任意の非対３'-ＡＬＫシグナル(類)を有する細胞％
Ｐ１１：  ＞２の全５'-ＡＬＫシグナルを有する細胞％
Ｐ１２：  ＞２の全３'-ＡＬＫシグナルを有する細胞％
Ｐ１３：  ＞２の融合シグナルを有する細胞％
Ｐ１４：  ＞２の対になった分割シグナルを有する細胞％
Ｐ１５：  ＞１の非対５'-ＡＬＫシグナルを有する細胞％
Ｐ１６：  ＞１の非対３'-ＡＬＫシグナルを有する細胞％
Ｐ１７：  対になった分割シグナル又は非対の５'-ＡＬＫシグナル(類)のみを有する(融合又は孤立した３'-ＡＬＫシグナルを有さない)細胞％
Ｐ１８：  融合シグナル(類)及び対になった分割シグナル又は非対の５'シグナル(類)を有する(非対の３'シグナル(類)を有さない)細胞％
Ｐ１９：  任意の対になった分割又は非対の５'シグナル(類)を有する(非対の３'シグナル(類)を有さない)細胞％
Ｐ２０：  対になった分割シグナル又は非対の３'-ＡＬＫシグナル(類)のみを有する(融合又は孤立した５'-ＡＬＫシグナルを有さない)細胞％
Ｐ２１：  融合シグナル(類)及び対になった分割シグナル又は非対の３'シグナル(類)を有する(非対の５'シグナル(類)を有さない)細胞％
Ｐ２２：  任意の対になった分割シグナル又は非対の３'シグナル(類)を有する(非対の５'シグナル(類)を有さない)細胞％
Ｐ２３：  平均の全５-ＡＬＫシグナル／細胞
Ｐ２４：  平均の全３'-ＡＬＫシグナル／細胞
Ｐ２５：  平均の融合シグナル／細胞
Ｐ２６：  平均の対になった分割シグナル／細胞
Ｐ２７：  平均の非対５'-ＡＬＫシグナル／細胞
Ｐ２８：  平均の非対３'-ＡＬＫシグナル／細胞
Ｐ２９：  平均の非融合５'-ＡＬＫ／細胞
Ｐ３０：  平均の非融合３'-ＡＬＫ／細胞
Ｐ３１：  平均の対になった分割＋過度の５'-又は３'-ＡＬＫ／細胞
【００６６】
第１の分析により、各試料の双方の複製において、４人の病理学者の組合せた結果を使用し、ＲＯＣ曲線を作製した。病理学者の組合せでは、２色ＣＩＳＨ又はＳＩＳＨ／ＣＩＳＨの染色した試料のいずれかで、１００％感度及び特異性が達成されなかった。最も良好なパラメーター性能で測定されたように、また最初の単一リーダー研究で見出されたように、ＲＯＣ曲線下の領域(ＡＵＣ)を、各曲線について算出したところ、任意の非融合５'-及び３'-ＡＬＫシグナルを有する細胞パーセント(４-リーダー研究におけるＰ２)が、ＳＩＳＨ／ＣＩＳＨの染色した試料において、ＡＵＣ＝０．８３３を有する最も良好な性能(最も高いＡＵＣ値)を提供した。このパラメーターにより、４５〜６６％のカットオフ値に見出される最も良好な性能を有する他のパラメーターと比較して、ＤＦＩ対カットオフ曲線における広範囲の最低値が提供された。分割３'-及び５'-ＡＬＫシグナル、及び非対５'-又は３'-ＡＬＫシグナル／細胞の平均数の関連パラメーター(４-リーダー研究におけるＰ３１)により、ＳＩＳＨ／ＣＩＳＨの染色した試料での、４-リーダー研究におけるＰ２に近い、良好な性能(ＡＵＣ＝０．８２３)が提供された。一般的に、４-リーダーは、単一リーダーよりも２色ＣＩＳＨ染色を列挙するのがより困難である。２色ＣＩＳＨシグナルの列挙に伴いよく知られていることは、４-リーダーについての問題である可能性があり、さらに訓練することで、それらの結果が改善されることが予期される。
【００６７】
上の明細書で述べた全ての刊行物及び特許は、ここでは出典明示により援用される。本発明の記載された方法及びシステムの様々な修正及び変形は、本発明の範疇及び趣意を逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明は特定の好ましい実施態様に関連して記載したが、請求された本発明は、このような特定の実施態様に過度に限定されるべきではないと理解される。実際、この発明の分野の当業者にとって明らかな、本発明を実施するための記載の方法の種々の変形は、以下の請求の範囲の範疇に入ることを意図している。
【図１】
2013524812.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2013524812.tif 000012
【図９Ａ−Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年12月20日(2012.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の核酸の検出方法であって、
少なくとも第１及び第２核酸プローブを前記サンプル中の第１及び第２標的核酸にハイブリダイズさせ；
酵素と第１発色性基質系を含み前記第１核酸プローブに特異的な第１発色性検出試薬に前記サンプルを接触させ、ここで、該接触は、前記酵素が前記第１発色性基質系に作用して検出可能な第１色素原を生じる条件下でなされ；
前記酵素を変性させ；
酵素と第２発色性基質系を含み前記第２核酸プローブに特異的な第２発色性検出試薬に前記サンプルを接触させ、ここで、該接触は、前記酵素が前記第２発色性基質系に作用して検出可能な第２色素原を生じる条件下でなされ；及び
第１及び第２の検出可能な色素原を検出する
ことを含む方法。
【請求項２】
前記第１核酸プローブが第１ハプテンを含み、前記第２核酸プローブが第２ハプテンを含み、場合によっては、前記第１ハプテンがＤＩＧとＤＮＰの一方であり、第２ハプテンがＤＩＧとＤＮＰの他方である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１発色性基質系が、ファーストブルーＢＢ又はナフトールホスフェート／ファーストレッドの一方であり、前記第２発色性基質系が、ファーストブルーＢＢ／ナフトールホスフェート及びナフトールホスフェート／ファーストレッドの他方から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルがスライドに固定された組織サンプルを含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１及び第２の検出可能な色素原が明視野顕微鏡によって検出される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１核酸プローブに特異的な前記第１発色性検出試薬が、前記第１ハプテンに特異的な第１抗体と該第１ハプテンに特異的な該第１抗体に特異的な第２抗体をさらに含み、ここで前記第１ハプテンに特異的な前記第１抗体に特異的な前記第２抗体が酵素にコンジュゲートし、前記第２核酸プローブに特異的な前記第２発色性検出試薬が、前記第２ハプテンに特異的な第１抗体と前記第２ハプテンに特異的な前記第１抗体に特異的な第２抗体を更に含み、前記２ハプテンに特異的な前記第１抗体に特異的な前記第２抗体が酵素にコンジュゲートしている請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記第１核酸プローブに特異的な前記第１発色性検出試薬が、前記第１ハプテンに特異的であり、酵素にコンジュゲートしている第１抗体と、前記第２ハプテンに特異的であり、酵素にコンジュゲートしている第２抗体をさらに含む請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記酵素が、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ及びβ-ラクタマーゼからなる群から選択される請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
ハイブリダイズ工程及び接触工程が自動化されている請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
酵素と第１発色性基質系を含み第１核酸プローブに特異的な第１発色性検出試薬と；
酵素と第２発色性基質系を含み第２核酸プローブに特異的な第２発色性検出試薬と；
変性試薬
を含んでなるキット。
【請求項１１】
患者における非小細胞肺癌を診断し、癌を患ってる患者の予後を提供し、患者における癌の再発の可能性を予測し、癌に対する患者の素因を予測し、又は患者が治療処置の候補であることを示し、癌がＡＬＫ遺伝子再構成に関連している方法であって、
患者サンプルに５'及び３'ＡＬＫブレイクアパートプローブをハイブリダイズさせ；
前記５'及び３'ＡＬＫブレイクアパートプローブでのハイブリダイゼーションに関連したシグナルを検出し；
融合型非再構成シグナル以外の任意のシグナルを異常なシグナルとしてスコア化し；
前記スコアを使用して、前記患者における癌を診断し、前記患者に対する予後を提供し、前記患者における癌の再発の可能性を予測し、癌に対する前記患者の素因を予測し、又は患者が特定の治療法の候補であることを示す方法。
【請求項１２】
前記５'及び３'ＡＬＫブレイクアパートプローブが、ＡＬＫ再構成に関連したブレイクポイントに５'又は３'のいずれかでハイブリダイズするプローブセットである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記５'及び３'ＡＬＫブレイクアパートプローブが、前記５'及び３'ＡＬＫブレイクアパートプローブに対して異なる色素原を用いる発色性検出により検出され、ここで、前記発色性検出が、
酵素と第１発色性基質系を含み前記５'ＡＬＫブレイクアパートプローブに特異的な第１発色性検出試薬に、前記酵素が前記第１発色性基質系に作用して検出可能な第１色素原を生じる条件下で、前記サンプルを接触させ；
前記酵素を変性させ；及び
酵素と第２発色性基質系を含み前記３'ＡＬＫブレイクアパートプローブに特異的な第２発色性検出試薬に、前記酵素が前記第２発色性基質系に作用して検出可能な第２色素原を生じる条件下で前記サンプルを接触させる
ことを含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記変性が、変性剤を含む溶液で前記サンプルを処理することをさらに含み、前記変性剤が、ホルムアミド、アルキル置換アミド、尿素又は尿素系変性剤、チオ尿素、塩酸グアニジン、及びその誘導体からなる群から選択される請求項１又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１及び第２発色性検出試薬中の前記酵素が同じ酵素であり、場合によっては前記酵素はアルカリホスファターゼであり、場合によっては前記基質はアルカリホスファターゼ基質である請求項１又は１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記アルカリホスファーゼ基質が、ナフトールホスフェート／ファーストレッド(及び、その変形、例えばファーストレッドＫＬ／ナフトールＡＳ-ＴＲ)、ナフトールホスフェート／フクシン、ナフトールホスフェート／ファーストブルーＢＢ(４-(ベンゾイルアミノ)-２,５-ジエトキシベンゼンジアゾテトラクロロジンケート)、５-ブロモ,４-クロロ,３-インドリルホスフェート(ＢＣＩＰ)／ナフトールホスフェート、ＢＣＩＰ／ニトロブルーテトラゾリウム(ＮＢＴ)、及びＢＣＩＰ／ｐ-ヨードニトロテトラゾリウム(ＩＮＴ)からなる群から選択される系である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記５'及び３'ＡＬＫブレイクアパートプローブが蛍光検出により検出され、又は前記５'及び３'ＡＬＫブレイクアパートプローブの少なくとも一つがシルバーインサイツハイブリダイゼーションにより検出され、又は前記５'及び３'ＡＬＫブレイクアパートプローブの一方がシルバーインサイツハイブリダイゼーションにより検出され、前記５'及び３'ＡＬＫブレイクアパートプローブの他方が発色性インサイツハイブリダイゼーションにより検出される請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記スコア化が、前記サンプル中において約１５％〜７５％、２０％〜６０％、２５％〜４５％、及び２７％〜３８％の異常なシグナルを有する細胞からなる群から選択されるカットオフ範囲を適用することを含み、ここでカットオフ範囲内のサンプルが、前記患者における癌の診断、前記患者に対する良好な又は不良な予後、前記患者における癌の再発可能性の予測、前記患者の癌に対する素因の予測、又は特定の治療に対して前記患者が候補であることの指標に相関している請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記カットオフ範囲が適用される場合、前記方法が、９０％を超え、９５％を超え、９９％を超え、及び１００％からなる群から選択される感度及び／又は特異性を有する請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記カットオフ範囲に対する理想値からの距離が、≦０．２、≦０．１、及び０からなる群から選択される請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
サンプルが前記スコア化に基づきＡＬＫ再構成に対してポジティブ又はネガティブであるか否かに基づき前記患者に対する予後を提供することをさらに含み、又はサンプルが前記スコア化に基づきＡＬＫ再構成に対してポジティブ又はネガティブであるか否かに基づき前記患者に対する診断を提供することをさらに含み、又はサンプルが前記スコア化に基づきＡＬＫ再構成に対してポジティブ又はネガティブであるか否かに基づき前記患者に対する再発可能性の予測を提供することをさらに含み、又はサンプルが前記スコア化に基づきＡＬＫ再構成に対してポジティブ又はネガティブであるか否かに基づき前記患者の癌に対する素因の予測を提供することをさらに含み、又はサンプルが前記スコア化に基づきＡＬＫ再構成に対してポジティブ又はネガティブであるか否かに基づき前記患者に対して特定の治療法を提供することをさらに含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記サンプル中において約１０％〜約４０％の異常なシグナルを有する細胞のカットオフを適用することをさらに含み、ここで、カットオフを超えるサンプルが、前記患者における癌の診断、前記患者に対する良好な又は不良な予後、前記患者における癌の再発可能性の予測、前記患者の癌に対する素因の予測、又は前記患者が特定の治療法に対する候補であることの指標に相関している請求項１１に記載の方法。
【国際調査報告】
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