(57)【要約】  本発明は、吸着剤の拡張ベッドの使用を含む、混合物から対象となるウイルス様粒子を捕捉する方法であり；好適には（ａ）吸着剤の拡張ベッドを提供する工程と；（ｂ）混合物の組成が吸着剤の拡張ベッドと接触するように、混合物を吸着剤と接触させる工程と；（ｃ）任意で吸着剤を洗浄する工程と；（ｄ）任意で対象となる粒子を吸着剤から溶出する工程とを含む、前記方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
吸着剤の拡張ベッドの使用を含む、混合物から対象となるウイルス様粒子を捕捉する方法であり；好適には、（ａ）吸着剤の拡張ベッドを提供する工程と；（ｂ）混合物中のウイルス様粒子が吸着剤に結合するように、混合物を吸着剤と接触させる工程と；（ｃ）任意で吸着剤を洗浄する工程と；（ｄ）任意で吸着剤からウイルス様粒子を溶出する工程とを含む前記方法。
【請求項２】
前記ウイルス様粒子がインフルエンザウイルスのタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウイルス様粒子が、赤血球凝集素；好適にはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５もしくはＨ１６またはその２つ以上の組み合わせからなる群から選択される赤血球凝集素サブタイプを含む、請求項１または請求項２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記混合物が植物の破壊細胞を含み；好適には前記植物がタンパク質を植物中で一過性に発現する核酸分子によりインフィルトレーションされたタバコ植物であり、前記タンパク質がウイルス様粒子中に存在し；より好適には前記混合物が植物の地上部であるかまたは植物の地上部に由来する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ビーズが、プラスチック、メタクリレート、陰イオン交換体、ジエチルアミノエチル、陽イオン交換体、多糖、シリカ、ポリ（スチレンジビニル）ベンゼン、ポリアクリルアミド、セラミックおよびその誘導体またはその２つ以上の組み合わせからなる群から選択される材料を含むか、それらからなるか、または本質的になり；好適には、前記ビーズが、セルロース、アガロースおよびデキストランならびにその誘導体またはその２つ以上の組み合わせからなる群から選択される多糖を含むか、それらからなるか、または本質的になる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ビーズが、石英、シリカ、Ｎｄ−Ｆｅ−Ｂ合金、ステンレス鋼、酸化ジルコニウム、ジルコニア、金属ケイ酸塩、金属硼ケイ酸塩、セラミック（二硼化チタン、炭化チタン、二硼化ジルコニウム、炭化ジルコニウム、炭化タングステン、炭化ケイ素、窒化アルミニウム、窒化ケイ素、窒化チタン、酸化イットリウム、シリコン金属粉末およびケイ化モリブデンを含む）；酸化マグネシウム、酸化アルミニウム、酸化チタン、酸化バナジウム、酸化クロミウム、酸化ジルコニウム、酸化ハフニウム、酸化マンガン、酸化鉄、酸化コバルト、酸化ニッケル、酸化銅および酸化銀を含む、金属酸化物および硫化物；非金属酸化物；硫酸バリウムを含む金属塩；タングステン、ジルコニウム、チタン、ハフニウム、バナジウム、クロミウム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、インジウム、銅、銀、金、パラジウム、プラチナ、ルテニウム、オスミウム、ロジウムおよびイリジウムを含む、金属元素、ならびに前記金属元素およびその誘導体またはその２つ以上の組み合わせの間に形成された合金等の金属元素の合金からなる群から選択される材料を含むか、それらからなるか、または本質的なる不活性コアを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
対象となる粒子を結合する前記ビーズのサイズが約２５μｍ〜１００μｍの間；好適には約５０μｍである、請求項５または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記方法が吸着剤の第１の拡張ベッドの使用を含む前捕捉工程を含み；好適には前記ビーズのサイズが約１２５μｍ〜２５０μｍの間；より好適には約１５０μｍである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記吸着剤がリガンドを含むか、それからなるか、または本質的になり；好適には前記リガンドが、（ｉ）ベンジルアミンまたはその誘導体；（ｉｉ）アルキルアミンもしくはその誘導体；（ｉｉｉ）アルケニルアミンもしくはその誘導体；（ｉｖ）アルキニルアミンもしくはその誘導体；（ｖ）アルコキシルアミンもしくはその誘導体；および（ｖｉ）単環式もしくは二環式の芳香族もしくはヘテロ芳香族のモイエティもしくはその誘導体のアミン、またはその２つ以上の組み合わせからなる群から選択されるリガンドを含むか、それらからなるか、または本質的になるか；または前記リガンドが陰イオン交換樹脂を含むか、それからなるか、または本質的になり；好適には前記陰イオン交換樹脂が、ジエチルアミノエチルセルロースベースのイオン交換樹脂を含むか、それからなるか、もしくは本質的になるか、またはジエチルアミノエチルセルロースデキストランベースのイオン交換樹脂を含むか、それからなるか、もしくは本質的になる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
吸着剤との接触の前の前記混合物の伝導率が約１ｍＳ／ｃｍ〜１０ｍＳ／ｃｍの間であり；および／または吸着剤との接触の前の前記混合物のｐＨが約ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０の間である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記拡張ベッドの拡張度が約１〜５の範囲であり：前記混合物を約１ｃｍ／分〜１５ｃｍ／分の間の範囲の直線的フロー率で拡張ベッドを介してフローさせる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
（ｉ）吸着剤の密度が約２．５ｇ／ｍｌ〜３．５ｇ／ｍｌの間であり、平均吸着剤粒子サイズが約５０である、ジエチルアミノエチルセルロースデキストランを含む吸着剤の拡張ベッドをカラム中に提供する工程と；
（ｉｉ）約ｐＨ６．０〜８．０範囲のｐＨで樹脂材料を平衡化する工程と；
（ｉｉｉ）タバコ植物材料を含む混合物であって、約２ｍＳ／ｃｍ〜３ｍＳ／ｃｍの間の伝導率を有する前記混合物を提供する工程と；
（ｉｖ）カラム中の拡張ベッドの拡張度が約２で、約２．５ｃｍ／分のフロー率で、混合物をカラム上にロードしてウイルス様粒子を結合させる工程と；
（ｖ）約ｐＨ６．０〜８．０の範囲のｐＨを有するバッファーを使用してロードしたカラムを洗浄する工程と；
（ｖｉ）１つまたは複数の画分でカラムから対象となる結合粒子を溶出する工程と
を含む、対象となるウイルス様粒子を混合物から捕捉する方法。
【請求項１３】
工程（ｉｉｉ）が、（ａ）ウイルス様粒子中に存在するタンパク質を一過性に発現する全体のタバコ植物を提供することと；（ｂ）タバコ植物の葉および茎の細胞を破壊してタバコ植物材料を産生することと；（ｃ）バッファーまたは純水による希釈によって混合物のｐＨおよび伝導率を合わせることとを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｉｖ）の前に、工程（ｉｉｉ）の混合物を濾過することおよび工程（ｉｉｉ）の濾過された混合物をビーズのサイズが約１５０μｍであるポリエチレンイミンを含む吸着剤の第１の拡張ベッドと接触させて所望されない物質を混合物から除去することを含む工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
それへ可逆的に結合されたウイルス様粒子を含む、吸着剤の拡張ベッド。
【請求項１６】
対象となるウイルス様粒子を混合物から捕捉するための、吸着剤の拡張ベッドの使用であり、混合物がタンパク質を一過性に発現する植物に由来し、前記タンパク質がウイルス様粒子中に存在する、吸着剤の拡張ベッドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス様粒子（例えば組換えにより発現させた自己集合ＶＬＰ）等の対象となる粒子の混合物からの捕捉に関する。本発明は、対象となる粒子を効果的に捕捉することを可能にし、工業規模での使用のために大量にスケールアップすることができる。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子工学革命は、ヒトおよび動物の治療剤を含む、様々な異なる適用において使用できる組換えタンパク質の開発にまで展開している。医学的使用のために米国ＦＤＡによって承認された１００をはるかに超えるバイオテクノロジー由来の治療剤およびワクチンがあり、１０００を超える追加の薬物およびワクチンが臨床試験の様々な相にある。細菌、酵母、昆虫、植物および哺乳類の細胞発現システムは、成功の程度は変動するが、組換えタンパク質の産生に現在使用されている。技術におけるこのような開発は医薬用および治療用の産物の産生および送達を革新したが、得られる分子の精製について問題がまだ残る。例えば、細菌からのタンパク質の精製は、数工程を必要とし得る細胞の溶解および溶液の清澄化を必要とする。精製プロセスにおいて使用されるクロマトグラフィー樹脂はそのとき詰まりがちであり、細胞抽出物は他のプロセス（遠心分離または濾過等）によるさらなる清澄化を必要とし得る。精製の複数ステージも必要となる可能性があり、それは時間をとり、サンプル損失および収率減少も引き起こし得る。対象となるタンパク質の精製は高価であり、技術的に難しくなり得る。下流の加工は全体の価格のうちの最大８０％を含み得る。
【０００３】
充填ベッド吸着クロマトグラフィーはタンパク質の精製のために広く用いられる。充填ベッドの使用は全細胞またはコロイド状残屑の除去を必要とする。実験室スケールプロセスの開発では多くの場合無視されているが、残屑の除去は高効率で達成するために最も挑戦的な操作の１つである。拡張ベッド吸着（ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｂｅｄ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）は、可溶性タンパク質の精製に使用できプロセス流の清澄化に対する要求がほとんどない、最近開発されている方法論である。それは、最初に充填されたベッド構造を通した流体のフローを使用して高流体空隙率で接触を達成する。
【０００４】
組換えタンパク質、特に免疫原性ウイルス組換えタンパク質等の免疫原性組換えタンパク質を産生するための１つのアプローチは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を使用することであった。多くのウイルスは、ＶＬＰの形成において構造タンパク質および組換えタンパク質が発現されるインビボの細胞内、ならびに単離および精製後に細胞の外側の両方で、個別に発現された構造タンパク質から集合させることができるカプシドを有する。しかしながら、典型的には植物に由来する材料を含む状況において、高懸濁固形内容物および変動サイズの粒子を含む混合物中のかかるＶＬＰの捕捉は、技術的に非常に挑戦的である。感染を遮断することができる抗ウイルス抗体の産生を誘導するために動物へと注射された場合ＶＬＰは免疫原性であり得る。従って、例えば、Ｈ５Ｎ１トリ系統からのタンパク質により産生されたウイルス様粒子によりワクチン接種されたマウスは、致死性Ｈ５Ｎ１ウイルスによる攻撃から保護され得る。改善された効率および収率で対象となる粒子を捕捉する方法についての必要性が産業界において残っている。コスト効率の良い様式で対象となる粒子を商業的レベルで捕捉するためのスケールアップ可能な方法についての必要性もある。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、拡張ベッド吸着（ＥＢＡ）クロマトグラフィーが対象となる粒子の混合物からの捕捉に特に効率的であると見出されたことに少なくとも部分的に基づいている。特定の実施形態において、方法は、商業的レベルにスケールアップ可能な１工程の結合および溶出プロセスにおいて対象となる粒子の捕捉に有利に使用することができる。
【０００６】
一般的な態様において、吸着剤の拡張ベッドの使用を含む、対象となる粒子を混合物から捕捉する方法が提供される。
【０００７】
一実施形態において、方法は、（ａ）吸着剤の拡張ベッドを提供する工程と；（ｂ）混合物の組成が吸着剤の拡張ベッドと接触し相互作用するように、混合物を吸着剤と接触させる工程と；（ｃ）任意で吸着剤を洗浄する工程と；（ｄ）任意で対象となる粒子を吸着剤から溶出する工程とを含む。
【０００８】
一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、対象となる粒子は対象となる生物学的粒子である。
【０００９】
一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、対象となる粒子は少なくとも１つのタンパク質を含む。
【００１０】
一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、対象となる粒子は少なくとも２つのタンパク質を含み、その少なくとも１つは対象となるタンパク質である。
【００１１】
一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、対象となる粒子はウイルス様粒子である。
【００１２】
本発明の第１の態様において、吸着剤の拡張ベッドの使用を含み；好適には、前記方法が、（ａ）吸着剤の拡張ベッドを提供する工程と；（ｂ）混合物中のウイルス様粒子が吸着剤に結合するように、混合物を吸着剤と接触させる工程と；（ｃ）任意で吸着剤を洗浄する工程と；（ｄ）任意で吸着剤からウイルス様粒子を溶出する工程とを含む、対象となるウイルス様粒子を混合物から捕捉する方法が提供される。
【００１３】
この第１の態様の一実施形態において、本発明は、ウイルス様粒子が、インフルエンザウイルスのタンパク質、特に赤血球凝集素；好適には、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５もしくはＨ１６またはその２つ以上の組み合わせからなる群から選択される赤血球凝集素サブタイプを含む、前述の実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせに記載の方法にさらに関する。
【００１４】
この第１の態様の実施形態を含む一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、吸着剤はカラム中に含まれる。
【００１５】
この第１の態様の実施形態を含む一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、混合物は植物であるかまたは植物に由来する。
【００１６】
この第１の態様の実施形態を含む一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、植物は、天然に存在する植物、突然変異植物、天然に存在しない植物または遺伝子導入植物である。
【００１７】
一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、混合物は植物の葉であるかまたは植物の葉に由来する。
【００１８】
この第１の態様の実施形態を含む一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、混合物は吸着剤との接触の前に植物材料を均質化することによって産生される。従って、この実施形態によれば、混合物は均質化された植物材料である。
【００１９】
この第１の態様の実施形態を含む一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、植物は、ニンジン細胞等の植物細胞（インビトロで成長させた植物細胞または細胞塊等の培養でまたは植物の外部で成長させた植物細胞等）である。
【００２０】
本発明の第１の態様の一実施形態において、本発明は、混合物が植物の破壊細胞を含み；好適には植物が、タンパク質を植物中で一過性に発現する核酸分子によりインフィルトレーションされたタバコ植物であり、前記タンパク質がウイルス様粒子中に存在し；より好適には混合物が植物の地上部であるかまたは植物の地上部に由来する、前述の実施形態または前述の実施形態（複数可）の組み合わせのいずれかに記載の方法を提供する。
【００２１】
この第１の態様の実施形態を含む一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、吸着剤は複数のビーズを含む。
【００２２】
この第１の態様の実施形態を含む一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、ビーズは不活性コア材料を含む複合ビーズである。
【００２３】
この第１の態様の実施形態を含む一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、ビーズは、プラスチック、メタクリレート、陰イオン交換体、ジエチルアミノエチル、陽イオン交換体、多糖、シリカ、ポリ（スチレンジビニル）ベンゼン、ポリアクリルアミド、セラミックおよびその誘導体またはその２つ以上の組み合わせからなる群から選択される材料を含むか、それらからなるか、または本質的になる。
【００２４】
この第１の態様の実施形態を含む一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、ビーズは、多糖；好適にはセルロース、アガロース、デキストランもしくはその誘導体、または２つ以上の前述のものの組み合わせを含むか、それらからなるか、または本質的になる。
【００２５】
この第１の態様の実施形態を含む一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、不活性コア材料は、石英、シリカ、Ｎｄ−Ｆｅ−Ｂ合金、ステンレス鋼、酸化ジルコニウム、ジルコニア、金属ケイ酸塩、金属硼ケイ酸塩、セラミック（二硼化チタン、炭化チタン、二硼化ジルコニウム、炭化ジルコニウム、炭化タングステン、炭化ケイ素、窒化アルミニウム、窒化ケイ素、窒化チタン、酸化イットリウム、ケイ素金属粉末および二ケイ化モリブデンを含む）；酸化マグネシウム、酸化アルミニウム、酸化チタン、酸化バナジウム、酸化クロミウム、酸化ジルコニウム、酸化ハフニウム、酸化マンガン、酸化鉄、酸化コバルト、酸化ニッケル、酸化銅および酸化銀を含む、金属酸化物および硫化物；非金属酸化物；硫酸バリウムを含む金属塩；タングステン、ジルコニウム、チタン、ハフニウム、バナジウム、クロミウム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、インジウム、銅、銀、金、パラジウム、プラチナ、ルテニウム、オスミウム、ロジウムおよびイリジウムを含む、金属元素、ならびに前記金属元素およびその誘導体またはその２つ以上の組み合わせの間に形成された合金等の金属元素の合金からなる群から選択される材料を含むか、それらからなるか、または本質的になる。
【００２６】
この第１の態様の実施形態を含む一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、ビーズのサイズは約５μｍ〜５００μｍの間またはそれ以上である。
【００２７】
この第１の態様の実施形態を含む一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、対象となる粒子を結合するビーズのサイズは約２５μｍ〜１００μｍの間；好適には約５０μｍである。
【００２８】
この第１の態様の実施形態を含む一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、対象となる粒子以外の材料（例えば植物材料）を結合するビーズのサイズは、約１２５μｍ〜２５０μｍの間；好適には約１５０μｍである。
【００２９】
この第１の態様の実施形態を含む一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、方法は追加の吸着剤の拡張ベッドの使用を含む前捕捉工程を含む。この第１の吸着剤の拡張ベッドは；好適には約１２５μｍ〜２５０μｍの間；より好適には約１５０μｍであるサイズ範囲のビーズを含む。
【００３０】
この第１の態様の実施形態を含む一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、吸着剤はリガンドを含む。
【００３１】
この第１の態様の実施形態を含む一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、リガンドは、（ｉ）ベンジルアミンもしくはその誘導体；（ｉｉ）アルキルアミンもしくはその誘導体；（ｉｉｉ）アルケニルアミンもしくはその誘導体；（ｉｖ）アルキニルアミンもしくはその誘導体；（ｖ）アルコキシルアミンもしくはその誘導体；および（ｖｉ）単環式もしくは二環式の芳香族もしくはヘテロ芳香族のモイエティもしくはその誘導体のアミン、またはその２つ以上の組み合わせからなる群から選択されるリガンドを含むか、それらからなるか、または本質的になる。
【００３２】
この第１の態様の実施形態を含む一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、リガンドは、陰イオン交換樹脂を含むか、それからなるか、または本質的になる。
【００３３】
この第１の態様の実施形態を含む一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、陰イオン交換樹脂は、ジエチルアミノエチルセルロースベースのイオン交換樹脂；好適にはジエチルアミノエチルセルロースデキストランベースのイオン交換樹脂を含むか、それらからなるか、もしくは本質的になるか、またはそれらである。
【００３４】
この第１の態様の実施形態を含む一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、吸着剤との接触の前の混合物の伝導率は、約１ｍＳ／ｃｍ〜１０ｍＳ／ｃｍ；好適には２ｍＳ／ｃｍ〜３ｍＳ／ｃｍの間である。
【００３５】
この第１の態様の実施形態を含む一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、吸着剤との接触の前の混合物のｐＨは約ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０の間である。
【００３６】
この第１の態様の実施形態を含む一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、混合物を約１ｃｍ／分〜１５ｃｍ／分の間の範囲の直線的フロー率でカラム上にロードして対象となる粒子を結合させる。
【００３７】
この第１の態様の実施形態を含む一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、吸着剤の密度は約１ｇ／ｍｌ〜２０ｇ／ｍｌの間の範囲である。
【００３８】
この第１の態様の実施形態を含む一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、拡張ベッドの拡張度は約１〜５の範囲である。
【００３９】
この第１の態様の実施形態を含む一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、前記方法は混合物を吸着剤と接触させる前に前捕捉工程を含む。
【００４０】
この第１の態様の実施形態を含む一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、前捕捉工程は、濾過、精密濾過、遠心分離、デカンテーションおよび沈降またはその２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。
【００４１】
この第１の態様の実施形態を含む一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、前捕捉工程は、（ｉ）材料をイオン交換樹脂と接触させる工程；または（ｉｉ）酸により沈殿させ、材料を濾過する工程を含む。
【００４２】
この第１の態様の実施形態を含む一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、材料は、静的結合またはバッチインキュベーションモードでイオン交換樹脂と接触させられる。
【００４３】
この第１の態様の実施形態を含む一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、工程（ｄ）において得られた溶出物または１つまたは複数のその画分はさらなる処理工程にかけられる。
【００４４】
この第１の態様の実施形態を含む一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、さらなる処理工程は、精製、濾過、精密濾過、遠心分離、デカンテーションおよび沈降またはその２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。
【００４５】
この第１の態様の実施形態を含む一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、対象となる粒子は対象となるタンパク質を含む。
【００４６】
この第１の態様の実施形態を含む一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、対象となるタンパク質は抗原である。
【００４７】
この第１の態様の実施形態を含む一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、対象となるタンパク質は赤血球凝集素である。
【００４８】
この第１の態様の実施形態を含む一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、赤血球凝集素は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５もしくはＨ１６またはその２つ以上の組み合わせからなる群から選択される赤血球凝集素サブタイプである。
【００４９】
この第１の態様の実施形態を含む一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、溶出工程の間の拡張ベッドの膨張率は約０．５〜５の間である。
【００５０】
第２の態様において、（ｉ）吸着剤の密度が約１ｇ／ｍｌ〜２０ｇ／ｍｌの間であり、拡張ベッドの拡張度が約１〜５の間であり、平均吸着剤粒子サイズが約５μｍ〜約５００μｍの間である、リガンドを含む吸着剤の拡張ベッドを１０ｃｍを超える沈降ベッド高でカラム中に提供する工程と；（ｉｉ）約ｐＨ６．０〜８．０範囲のｐＨで樹脂材料を平衡化する工程と；（ｉｉｉ）対象となる粒子を含む混合物であって、約１ｍＳ／ｃｍ〜１０ｍＳ／ｃｍの間の伝導率を有する前記混合物を提供する工程と；（ｉｖ）約１ｃｍ／分〜１５ｃｍ／分の間の範囲のフロー率（例えば直線的フロー率）でカラム上に混合物をロードして対象となる粒子を結合する工程と；（ｖ）約ｐＨ６．０〜８．０の範囲のｐＨを有するバッファーを使用してロードしたカラムを洗浄する工程と；（ｖｉ）１つまたは複数の画分でカラムから対象となる結合粒子を溶出する工程とを含む、対象となる粒子を混合物から捕捉する方法が提供される。
【００５１】
この第２の態様の一実施形態において、対象となる粒子はウイルス様粒子（ＶＬＰ）またはゴースト様粒子である。
【００５２】
この第２の態様の一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、混合物は植物であるかまたは植物に由来する。
【００５３】
この第２の態様の一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、植物は、天然に存在する植物、突然変異植物、天然に存在しない植物または遺伝子導入植物である。
【００５４】
この第２の態様の一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、混合物は植物の葉であるかまたは植物の葉に由来する。
【００５５】
この第２の態様の一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、対象となる粒子は対象となるタンパク質を含む。
【００５６】
この第２の態様の一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、対象となるタンパク質は抗原である。
【００５７】
この第２の態様の一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、対象となるタンパク質は赤血球凝集素である。
【００５８】
この第２の態様の一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、赤血球凝集素は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５もしくはＨ１６またはその２つ以上の組み合わせからなる群から選択される赤血球凝集素サブタイプである。
【００５９】
この第２の態様の一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、対象となる粒子を結合するビーズのサイズは約２５μｍ〜１００μｍの間；好適には約５０μｍである。
【００６０】
この第２の態様の一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、対象となる粒子以外の材料（例えば植物材料）を結合するビーズのサイズは、約１２５μｍ〜２５０μｍの間；好適には約１５０μｍである。
【００６１】
この第２の態様の一実施形態またはこの第２の態様の上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、方法は、
（ｉ）吸着剤の密度が約２．５ｇ／ｍｌ〜３．５ｇ／ｍｌの間であり、平均吸着剤粒子サイズが約５０である、ジエチルアミノエチルセルロースデキストランを含む吸着剤の拡張ベッドをカラム中に提供する工程と；
（ｉｉ）約ｐＨ６．０〜８．０範囲のｐＨで樹脂材料を平衡化する工程と；
（ｉｉｉ）タバコ植物材料を含む混合物であって、約２ｍＳ／ｃｍ〜３ｍＳ／ｃｍの間の伝導率を有する前記混合物を提供する工程と；
（ｉｖ）カラム中の拡張ベッドの拡張度が約２で、約２．５ｃｍ／分のフロー率で、混合物をカラム上にロードしてウイルス様粒子を結合させる工程と；
（ｖ）約ｐＨ６．０〜８．０の範囲のｐＨを有するバッファーを使用してロードしたカラムを洗浄する工程と；
（ｖｉ）１つまたは複数の画分でカラムから対象となる結合粒子を溶出する工程と
を含む、対象となるウイルス様粒子を混合物から捕捉するために提供される。
【００６２】
一実施形態において、この第２の態様の前述の実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせの方法は、（ａ）ウイルス様粒子中に存在するタンパク質を一過性に発現する全体のタバコ植物を提供することと；（ｂ）タバコ植物の葉および茎の細胞を破壊してタバコ植物材料を産生することと；（ｃ）バッファーまたは純水による希釈によって混合物のｐＨおよび伝導率を合わせることとを含む工程（ｉｉｉ）を含む。
【００６３】
一実施形態において、この第２の態様の前述の実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせの方法は、工程（ｉｖ）の前に、工程（ｉｉｉ）の混合物を濾過することおよび工程（ｉｉｉ）の濾過された混合物をビーズのサイズが約１５０μｍであるポリエチレンイミンを含む吸着剤の第１の拡張ベッドと接触させて所望されない物質を混合物から除去することを含む工程を含む。
【００６４】
第３のさらなる態様において、吸着剤へ可逆的に結合される対象となる粒子を含む吸着剤の拡張ベッドが提供される。
【００６５】
この第３の態様の一実施形態において、吸着剤は複数のビーズを含む。
【００６６】
この第３の態様の一実施形態または上述の実施形態（複数可）の組み合わせにおいて、対象となる粒子を結合するビーズのサイズは約２５μｍ〜１００μｍの間；好適には約５０μｍである。
【００６７】
第４のさらなる態様において、対象となる粒子（特に対象となるウイルス様粒子）を、混合物（より特にタンパク質を一過性に発現する植物に由来し、前記タンパク質がウイルス様粒子中に存在する混合物）から捕捉するための吸着剤の拡張ベッドの使用が提供される。
【００６８】
この第４の態様の一実施形態において、粒子はウイルス様粒子（ＶＬＰ）またはゴースト様粒子である。
【００６９】
第５の態様は、対象となる粒子；好適には吸着剤へ可逆的に結合される対象となるウイルス様粒子を含み、特に吸着剤が拡張ベッドクロマトグラフィーモードである、吸着剤の拡張ベッドに関する。
【００７０】
第６の態様は、対象となる粒子；好適にはウイルス様粒子を混合物から；捕捉するための拡張ベッドクロマトグラフィーの使用に関する。
【００７１】
本発明の一般的な第１の態様について上記された実施形態（複数可）および実施形態の組み合わせは、少なくとも本発明の第２、第３、第４、第５および第６の態様の実施形態も形成することができる。
定義
【００７２】
本出願の範囲内で使用される専門的な用語および表現は、概して植物生物学および分子生物学の関連技術において一般に適用される意味が与えられるべきである。すべての以下の定義は本出願の全部の内容へ適用される。単語「含むこと」は他のエレメントまたは工程を除外せず、不定冠詞「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は複数を除外しない。単工程は請求項中に列挙された複数の特徴の機能を満たすことができる。「本質的に」、「約」、「近似的に」という用語および同種のものは、特に属性または値と関連して、正確な属性または正確な値もそれぞれ定義する。「約」という用語は、与えられた数の値または範囲の文脈において、与えられた値または範囲の２０％内、１０％内、または５％内にある値または範囲を指す。「百万分の一」または「ｐｐｍ」という用語は本明細書において互換的に使用されて、対象となる粒子または精製された対象となるタンパク質の純度の測定値を指す。単位ｐｐｍは、ミリグラム／ミリリットルにおける対象となるタンパク質あたりのナノグラム／ミリリットルにおける宿主タンパク質の量を指し、タンパク質が溶液中にある場合、宿主タンパク質ｐｐｍ＝（宿主タンパク質ｎｇ／ｍｌ）／（対象となるタンパク質ｍｇ／ｍｌ）である。タンパク質が凍結乾燥等によって乾燥されている場合、ｐｐｍは（宿主タンパク質ｎｇ）／（対象となるタンパク質ｍｇ）を指す。
【００７３】
「拡張ベッド」という用語は、方向付けられた液体フロー；好適には吸着剤の最小の軸方向混合による上向きの液体フローによって、安定的に流動体化されて、分類された（階層化された）サイズ範囲、濃度範囲または両方である吸着剤のベッドによりクロマトグラフィープロセスが操作され、液体および液体中の固体の成分の両方がベッドを通して移動しながら吸着剤に接触することを可能にする実施形態に関する。好適には液体はほぼプラグフロー条件でベッドを通して移動する。
【００７４】
「吸着剤」は、分子間力によってその表面上に対象となる粒子を吸着することができる任意の物質を指す。典型的には、対象となる粒子の吸着剤への結合は、所望される時間で吸着剤から対象となる粒子を溶出することができるように可逆的であるだろう。
【００７５】
本明細書において使用される時、「対象となる粒子」という用語は、混合物からの捕捉が所望される分子的実体を指す。特定の実施形態において、対象となる粒子は１つまたは複数のタンパク質を含む。他の実施形態において、対象となる粒子は１つ以上または２つ以上（例えば複数）のタンパク質を含み、その少なくとも１つは対象となるタンパク質である。一実施形態において、捕捉される粒子は生物学的起源の複数のマクロ分子を含む粒子であり、それゆえ対象となる生物学的粒子である。別の実施形態において、捕捉される粒子はウイルス様粒子である。別の実施形態において、捕捉される粒子は細菌のゴースト粒子である。本明細書において使用される時、「捕捉された対象となる粒子」という用語は、調製物の重量で少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が対象となる所望される粒子である、対象となる粒子の調製物を指す。複数の実施形態において、本発明の方法は、混合物中に最初に存在する対象となる粒子の合計量の少なくとも５０％（対象となる粒子の少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％を含む）を捕捉する。少なくとも９２．５％、９５％、９６％、９７％、９８％または少なくとも９９％等のさらに高い捕捉率を達成することができる。「精製された対象となる粒子」という用語は、調製物の重量で少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が対象となる所望される粒子であり、精製された対象となる粒子と共に共精製され得る混入不純物または混入物、特に宿主細胞に由来するもの等の他のタンパク質、核酸、脂質もしくは炭水化物、またはその組み合わせが占める残りの重量を伴う、対象となる粒子の調製物を指す。一実施形態において、捕捉された対象となる粒子または精製された対象となる粒子は、マクロ分子の混入が実質的にない（溶媒は除外する）。本明細書において記載された粒子は、当該技術分野において公知の様々な方法（エレクトロスプレー微分型電気移動度分析（ＥＳ−ＤＭＡ）、多角度光散乱検出（ＡＦＦＦＦ−ＭＡＬＳ）による非対称のフローフィールドフロー分画および透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）等）によって特徴づけることができる。一実施形態において、対象となる粒子測定値は、直径で約１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４または０．０３μｍ未満（直径で１．０〜０．０３、０．８〜０．０３、０．６〜０．０３、０．４〜０．０３、０．２〜０．０３、０．１〜０．０３、０．０８〜０．０３、０．０６〜０．０３、０．０５〜０．０３または０．０４〜０．０３μｍ等）である。
【００７６】
本明細書において使用される時「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）、「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）または対象となるＶＬＰという用語は、自己集合によって形成され、少なくとも１つの対象となるタンパク質を含む複数のタンパク質を含み、少なくとも１つの属性の点でウイルスと類似する分子的実体を指す。特に、ウイルス粒子またはビリオンとは異なり、ＶＬＰはウイルスゲノム核酸を欠く。サイズ分布が製造プロセスにおける変化によって影響を受け得る場合、ＶＬＰは多様性のある多重モードのサイズ分布を有することができる。例えば、植物において産生されたＶＬＰのサイズ分布は異なる宿主において産生されたＶＬＰのサイズ分布とは異なり得る。複数の実施形態において、ＶＬＰ（例えば植物材料から捕捉されたＶＬＰ）は、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍまたは７５ｎｍの平均直径を有し得る。複数の実施形態において、本発明の方法を使用して、捕捉されたＶＬＰ（例えば植物材料から）の直径は、３５ｎｍ〜７５ｎｍ；好適には３５ｎｍ〜７０ｎｍ；より好適には３５ｎｍ〜６５ｎｍ；なおより好適には３５ｎｍ〜６０ｎｍ；特に好適には３５ｎｍ〜５５ｎｍ；なおより特に好適には３５ｎｍ〜５０ｎｍ；さらにより好適には３５ｎｍ〜４５ｎｍ；最も好適には３５ｎｍ〜４０ｎｍの範囲である。
【００７７】
本明細書において使用される時、「混合物」は、望まれない１つまたは複数の材料（不純物または混入物等）と共に対象となる粒子を含む。「不純物」および「混入物」という用語は互換的に使用されて、それが宿主生物から生じるかどうかにかかわらず、対象となる粒子を含む組成物から除去されることが所望される、対象となる粒子以外の任意の材料を意味する。混合物は対象となる粒子を産生している宿主生物または宿主細胞から直接得ることができる。限定されるものではないが、本発明の方法に記載の処理することができる混合物の実例は、原料、破壊した宿主細胞材料、宿主組織ホモジネート、宿主組織溶解物、宿主組織抽出物、発酵ブロスおよび宿主細胞培養上清を含む。不純物は、任意の生物学的マクロ分子（対象となるタンパク質以外のタンパク質、対象となるタンパク質、核酸（例えばＤＮＡおよびＲＮＡ）、脂質、多糖（例えばスターチ、セルロース）、リグニン、フェノール類、炭水化物および色素を含み得る対象となる粒子以外の粒子等）を含み得るが、これらに限定されない。
【００７８】
「条件付けた混合物」は、ｐＨ、伝導率範囲、バッファー条件または組み合わせをそれぞれ設定するために１つまたは複数のバッファー交換、希釈、塩添加、ｐＨ滴定または前述のものの組み合わせを混合物に行うことによって、本発明の方法において使用されるクロマトグラフィー工程のために調製されて、所望されるクロマトグラフィー性能を達成する混合物である。「条件付けた混合物」は原料であり得、クロマトグラフィーカラムへのローディング条件の標準化に使用することができる。
【００７９】
「対象となるタンパク質」という用語（本明細書において「標的タンパク質」という用語と互換的に使用される）は、対象となる粒子中に存在し、非集合タンパク質、タンパク質の多量体形態または部分的に集合した粒子として対象となる粒子と共に捕捉され得る、組換えにより産生された１つまたは複数のタンパク質を指す。
【００８０】
「宿主タンパク質」という用語は、標的タンパク質を含み、宿主のゲノムから発現される任意のタンパク質または組換えにより発現されるタンパク質（それらは対象となる粒子の組成でない）を含む、対象となる粒子（複数可）を産生する宿主の細胞に由来するタンパク質のいずれかを指す。少なくとも対象となる粒子または対象となるタンパク質を含む混合物中に存在する宿主タンパク質の量は純度の程度の尺度を提供する。典型的には、タンパク質混合物中の宿主タンパク質の量は、混合物中の対象となる粒子または対象となるタンパク質の量と比較して百万分の一で表現される。
【００８１】
「捕捉する」という用語およびその文法的な変化形は、対象となる粒子を混合物から保持または集めて、対象となる粒子が混合物中での濃度よりも高い濃度になることを意味するように本明細書において互換的に使用される。対象となる粒子の混合物からの捕捉は不完全であり得る。捕捉された対象となる粒子は、混合物中の対象となる粒子の合計のうちの一部分であり得、約２％、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％もしくは９０％またはそれ以上等であるがこれらに限定されない。
【００８２】
「精製する」および「単離する」という用語ならびにその文法的な変化形は、少なくとも１つの不純物を完全か部分的かにかかわらず混合物から分離または除去して、それによって組成物中の対象となる粒子の純度のレベルを改善することを意味するように使用される。対象となるタンパク質を精製して、典型的にはＥＬＩＳＡによって決定されるように、１００ｐｐｍ未満の宿主タンパク質および好適には９０ｐｐｍ未満、８０ｐｐｍ未満、７０ｐｐｍ未満、６０ｐｐｍ未満、５０ｐｐｍ未満、４０ｐｐｍ未満、３０ｐｐｍ未満、２０ｐｐｍ未満、１０ｐｐｍ未満、５ｐｐｍ未満の宿主タンパク質を含む組成物を達成することができる。
【００８３】
「リガンド」は、それを特異的に結合する１つまたは複数の対象となる粒子または対象となるタンパク質を捕捉することに使用することができる。好適には、生物学的に特異的なリガンドは、クロマトグラフィーシステムの静止相を形成する吸着剤または固体支持体に共有結合で付加され、移動相中に存在する対象となる粒子または対象となるタンパク質に接近可能である。対象となる粒子または対象となるタンパク質は、クロマトグラフィー工程の間にリガンドについてのその特異的な結合親和性を保持するが、混合物中の他の溶質およびタンパク質は、リガンドにあまりまたは特異的に結合しない。対象となる粒子または対象となるタンパク質の静止相中のリガンドへの結合は、対象となる粒子または対象となるタンパク質がリガンドに特異的に結合されている間に、移動相中の混入物または不純物が拡張ベッドを通して通過することを可能にする。特異的に結合された対象となる粒子またはタンパク質はリガンドから溶出することができる。一例として、これは低ｐＨ、高ｐＨ、低塩、高塩、競合するリガンドもしくは同種のものまたはさらにその１つまたは複数の組み合わせ、および溶出バッファーによる拡張ベッドを通した通過を使用して達成することができる。
【００８４】
「特異的に結合すること」および「結合特異性」という用語は、対象となる粒子または対象となるタンパク質とリガンドとの間の特異的および可逆的な相互作用を一般的に記載する。リガンドは、その結合活性を破壊せずに吸着剤または固体支持体に付加されることを可能にする化学的に修飾可能な基を有し得る。リガンドは自由溶液中で１０4〜１０8Ｍの範囲で典型的には対象となる粒子またはタンパク質への親和性を有するだろう。「植物」という用語はその生活環または発生の任意のステージでの任意の植物およびその子孫を指す。植物は、天然に存在する植物、突然変異植物、天然に存在しない植物または遺伝子導入植物であり得る。植物は、タンパク質をコードしインフィルトレーションされた植物中でタンパク質を発現する核酸分子によりインフィルトレーションすることができる。核酸分子が植物ゲノムへと挿入される必要がなく子孫へと伝達されないので、かかるインフィルトレーションされた植物は遺伝子導入植物ではない。「植物細胞」という用語は、植物の構造的および生理的な単位を指す。植物細胞は、細胞壁のないプロトプラスト、単離された単一細胞、培養された細胞、２つ以上の細胞の塊またはより高度に組織化された単位の一部としての形態（植物組織、植物器官または植物全体等であるがこれらに限定されない）であり得る。「植物材料」という用語は、葉、茎、根、花もしくは花部、果実、花粉、卵子、接合子、種子、切り枝、分泌物、抽出物、細胞または組織培養を含む、植物または植物の他の部分もしくは産物から得られるかまたは得ることができる任意の固形物もしくは液体の組成物またはその組み合わせを指す。一実施形態において、植物材料は葉（緑色葉等）であるかまたはそれに由来する。
【００８５】
範囲が本明細書において提供されるならば、範囲のより下側およびより上側の最大限の値が、前記範囲中に含まれていることが意味される。例えば、約１２５μｍおよび２５０μｍの間の範囲が提供されるならば、この範囲は最大限の値で１２５μｍおよび２５０μｍをそれぞれ含むことが意味される。
【発明を実施するための形態】
【００８６】
本発明は拡張ベッド吸着によって対象となる粒子を混合物から捕捉する方法を提供する。対象となる粒子は１つまたは複数の対象となるタンパク質を含み、そのうちの１つまたは複数は宿主細胞によって組換えにより産生することができる。
【００８７】
拡張ベッド吸着（ＥＢＡ）は固体−液体分離および産物精製を組み合わせる単位操作である。プロセスは、上向きの液体フローにより拡張された、異なるサイズ、密度または両方である吸着剤のベッドにより操作される。様々な実施形態において、カラムは、乱流および過剰な液体混合（特にカラムの軸に沿った逆混合）を回避し、一方個別のビーズは、カラム中の局所的ゾーンでのみ狭く移動する固定されない動的状態で維持されるようにデザインされる。拡張ベッドはカラムの下部において小さな混合ゾーンを有することができ、そこでは入って来る液体がカラムの断面の全体にわたって分布し；好適には拡張ベッドはプラグフロー条件下で一般的に操作される。ロセスは原料中の液体および固体の成分の両方が吸着剤と接触し相互作用することを可能にし、それによってカラム中での多段階クロマトグラフィー分離の実行を可能にする。ベッド拡張は、原料中の固形微粒子がベッドを通して差異的に通過することを可能にし、それによって清澄化機能を提供する。
【００８８】
従来の充填ベッドクロマトグラフィー法において、樹脂がカラムの下部とフローアダプターとの間で拘束されているところでは、微粒子物質および細胞残屑が緊密に充填された樹脂の周囲で流れることができない時に目詰まりが起こる。これとは対照的に、ＥＢＡにおける液体のフローは下から供給され、アダプターは充填された樹脂レベルから離れて保たれて、吸着剤の拡張する余地を与え、従って空間をその間に生ずる。ベッドの拡張度は、混合物のフロー率、混合物の粘度に加えて、吸着剤の密度によって影響を受ける。吸着剤がカラム中に充填される場合、それはともに密接して位置し、大きな凝集およびクランプが動く余地がほとんど残されない。バッファーが下から注入されるので、吸着剤は流動体化されるようになり、吸着剤の沈降速度が上向きの液体フロー速度と等しい場合安定した濃度勾配を形成する。ＥＢＡの様々な形式は利用可能であり、そのいくつかはカラムの基部での濾過手段を含み、他のものは含まない。一実施形態において、カラムは濾過手段をカラムの基部で含まない。
【００８９】
ベッドは好適な容器（カラム等）中に存在し得る。本文脈において、「カラム」という用語は、カラムへの混合物のインプットのための少なくとも１つの注入口、および続いて対象となる粒子または対象となるタンパク質を混合物から溶出するための少なくとも１つの流出口を供給することができる、任意の種類の容器に関する。一実施形態において、容器はカラム形状である。典型的には拡張ベッド吸着カラムは、吸着剤ベッドにおける最小のバックミキシングおよび乱流によるプラグフロー条件下で操作される。本発明によれば、混合物は吸着剤を含む拡張ベッドカラムへと導入され、そこで混合物の組成はカラム中で吸着剤と接触し相互作用する。当業者は、混合物のインプット体積に応じて、特定の直径および高さを備えたカラムをデザインすることができるだろう。
【００９０】
混合物がカラムの中へ導入されるにつれて、固体粒子および細胞残屑は吸着剤の周囲に自由に移動し、最終的にはカラムの上部を通して出る。任意のクロマトグラフィー工程と同様に、吸着剤は典型的には激しい洗浄を受けて非特異的相互作用を限定する。その間に、対象となる粒子および対象となるタンパク質は吸着剤と相互作用し、吸着剤に結合し、カラム上で保持される。次いでカラムを充填させ、フローを逆にし、対象となる粒子を従来の方法でのようにビーズから溶出させることができる。
【００９１】
さらなる態様は、吸着剤へ可逆的に結合された対象となる粒子を含む吸着剤の拡張ベッドに関する。吸着剤は、好適には吸着剤について本明細書において記載された１つまたは複数の特性を有する。さらなる態様は、拡張ベッド吸着剤の使用または対象となる粒子を混合物から捕捉するためのＥＢＡクロマトグラフィーの使用に関する。
【００９２】
対象となる粒子の混合物からの捕捉のためのプロセスは、ＥＢＡにおいて使用できる任意の形状および形式の任意のタイプの固相材料への吸着に基づく。さらに、吸着は、選択的吸着剤特徴、リガンド化学またはその組み合わせの使用によって特徴づけることができ、実質的に対象となる粒子のみの特異的な結合および後続の溶出を可能にするか、または代わりに少数の生体分子物質群に特異的な結合と続いて吸着剤からの対象となる粒子の選択的で連続的な溶出を可能にする。
【００９３】
様々な実施形態において、吸着剤はビーズの形態である。ビーズは、サイズ、密度、重量もしくは組み合わせにおいて一様であり得るか、またはサイズ、密度、重量もしくはその組み合わせにおいて変動し得る。一実施形態は、サイズにおいては一様であるが、変動する密度もしくは重量または両方を有するビーズに関する。この構成はビーズの分布を生成し得る。ビーズのサイズは典型的には５μｍ〜５００μｍにわたるだろう。ビーズの好適なサイズは、約５μｍ〜５００μｍ、約５μｍ〜４００μｍ等、または約５μｍ〜３００μｍ、または約５μｍ〜２００μｍ、約５μｍ〜１００μｍ、約５０μｍ〜４００μｍ、または約５０μｍ〜３００μｍ、または約５０μｍ〜２００μｍ、または約５０μｍ〜１５０μｍまたは５０μｍ〜１００μｍ、約２０μｍ〜８０μｍ等、約１５０μｍ、約１００μｍ、または約５０μｍの直径範囲であり得る。体積で少なくとも約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または１００％の個別のビーズがこの体積を有し得る。より大きなビーズは流動体化されたベッドのより下の部分を占め、一方より小さなビーズがより上の部分を占める。ビーズが小さすぎれば、微粒子混入物の脱出速度に匹敵する速度で拡張が起こり、捕捉効率を低下させる。同様に、ビーズが大きすぎるならば、流動化はより高いフロー率を必要とし、タンパク質結合はビーズの中での不適切な拡散のために損なわれる。ビーズは、本質的に球状、細長い形状、円筒状、柱状、または不規則な形状等であるがこれらに限定されない任意の形状であり得る。一実施形態において、ビーズは球状である。当業者は、使用されるプロセスに応じて、好適なビーズのサイズ、形状および孔隙率を選択することができる。
【００９４】
別の実施形態において、対象となる粒子を捕捉するビーズのサイズは約２５μｍ〜１２５μｍ；好適には約２５μｍ〜１００μｍ；より好適には約２５μｍ〜９５μｍ；さらにより好適には約２５μｍ〜９０μｍ；特に好適には約３０μｍ〜９０μｍ；より特に好適には約３０μｍ〜８５μｍ；さらにより特に好適には約３５μｍ〜８５μｍ；より好適には約３５μｍ〜８０μｍ；より好適には約４０μｍ〜８０μｍ；より好適には約４０μｍ〜７５μｍ；より好適には約４５μｍ〜７５μｍ；より好適には約４５μｍ〜７０μｍ；より好適には約４０μｍ〜７０μｍ；より好適には約４０μｍ〜６５μｍ；より好適には約４５μｍ〜６５μｍ；より好適には約４５μｍ〜６０μｍ；より好適には約４５μｍ〜５５μｍの間；最も好適には約５０μｍである。
【００９５】
別の実施形態において、対象となる粒子以外の材料（例えば植物材料）を捕捉するビーズのサイズは、約１３０μｍ〜２５０μｍ；好適には約１３５μｍ〜２５０μｍ；より好適には約１３５μｍ〜２２５μｍ；より好適には約１３５μｍ〜２００μｍ；より好適には約１３５μｍ〜１７５μｍ；より好適には約１３５μｍ〜１７０μｍ；より好適には約１４０μｍ〜１７０μｍ；より好適には約１４０μｍ〜１６５μｍ；より好適には約１４０μｍ〜１６０μｍ；より好適には約１４５μｍ〜１６０μｍ；より好適には約１４５μｍ〜１４５μｍの間；最も好適には約１５０μｍである。好適には、これらのビーズは、拡張ベッド吸着剤を使用して前捕捉する工程において使用することができる。
【００９６】
別の実施形態において、吸着剤粒子の密度は、約１ｇ／ｍｌ〜２０ｇ／ｍｌの範囲；より好適には約２ｇ／ｍｌから２０ｇ／ｍｌの範囲で；より好適には約３ｇ／ｍｌから２０ｇ／ｍｌの範囲で；より好適には約４ｇ／ｍｌから２０ｇ／ｍｌの範囲で；より好適には約４ｇ／ｍｌから２０ｇ／ｍｌの範囲で；より好適には約５ｇ／ｍｌから２０ｇ／ｍｌの範囲で；より好適には約６ｇ／ｍｌから２０ｇ／ｍｌの範囲で；より好適には約７ｇ／ｍｌから２０ｇ／ｍｌの範囲で；より好適には約８ｇ／ｍｌから２０ｇ／ｍｌの範囲で；より好適には約９ｇ／ｍｌから２０ｇ／ｍｌの範囲で；より好適には約１０ｇ／ｍｌから２０ｇ／ｍｌの範囲で；より好適には約１１ｇ／ｍｌから２０ｇ／ｍｌの範囲で；より好適には約１２ｇ／ｍｌから２０ｇ／ｍｌの範囲で；より好適には約１３ｇ／ｍｌから２０ｇ／ｍｌの範囲で；より好適には約１４ｇ／ｍｌから２０ｇ／ｍｌの範囲で；より好適には約１４ｇ／ｍｌから１９ｇ／ｍｌの範囲で；より好適には約１４ｇ／ｍｌから１８ｇ／ｍｌの範囲で；より好適には約１４ｇ／ｍｌから１７ｇ／ｍｌの範囲で；より好適には約１５ｇ／ｍｌから１７ｇ／ｍｌの範囲で；最も好適には１６ｇ／ｍｌであり得る。
【００９７】
本発明は吸着剤としての使用のために任意の特定の材料に限定されておらず、当業者は適切な材料を選択できるだろう。方法は、異なるビーズの新規の組み合わせまたは同じビーズ上の官能基もしくはリガンドの新規の組み合わせを使用することができる。ビーズは、非常に多孔性、マクロ多孔性、わずかに多孔性、非多孔性、親水性、疎水性、高荷電性、わずかに荷電性、非電荷性、剛性、または膨潤性であり得るが、これらに限定されない。ビーズは、プラスチック、メタクリレート、多糖（アガロースおよびセルロース等）、シリカ（例えば制御された孔径のガラス）、ポリ（スチレンジビニル）ベンゼン、ポリアクリルアミド、セラミックビーズおよびこれらのいずれかの誘導体であり得るが、これらに限定されない。さらなる例は、高結合能力、低結合能力（例えばＱ）を備えた強陰イオン交換体、弱陰イオン交換ビーズ（例えばジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、ＡＮＸ）、強陽イオン交換材料（例えばＳＰ）、または弱陽イオン交換材料（例えばＣＭ）を含む。
【００９８】
上向きのフローにおける原料中の吸着剤の速度と微粒子の速度との間の差異を強調するために、様々な吸着剤材料を使用することができる。極めて粘稠な原料を加工するために、または高フロー率を達成するために、サイズ、密度または両方での増加が所望される。本発明の様々な実施形態において、密度の増加は、高密度多孔性材料の使用によって、または多孔性材料により高密度非多孔性材料をコートすることによって遂行することができる。有機材料のみから作製されたビーズは限定された密度を有し、従来のクロマトグラフィーの考慮（高い沈降速度等）のためには非常に大きな直径を有する必要があるだろう。かかる大きなビーズ直径は長い拡散の経路長をもたらし、それは多くの物質移動抵抗を引き起こし、生産性を打ち消す。本発明は、有機材料よりも密度の高い不活性コア材料を含む複合ビーズの使用を意図する。本文脈において、「コア」という用語はビーズ内部に存在する非多孔性コアに関する。コアはビーズの中心に位置すると限定されていない。かかるビーズが本発明の方法に適する高密度およびビーズサイズを有することは利益がある。材料の密度は、約１．２〜約４．０、例えば石英（１．２）、シリカ（１．４〜１．６）、Ｎｄ−Ｆｅ−Ｂ合金（１．８〜２．１）、ステンレス鋼、炭化タングステン（２．５〜３．５）、酸化ジルコニウム（３．２）またはジルコニア（３．８５）にわたり得る。コアのコートに使用できる多孔性材料は、アガロース、セラミックハイドロキシアパタイト、セルロース、酸化ジルコニウムゲル、シリカゲルおよびヒドロキシエチルメタクリレート−エチレンジメチルアクリレートコポリマーを含むが、これらに限定されない。好適な非多孔性コア材料のさらなる例は、無機化合物、金属、重金属、非金属元素、金属酸化物、非金属酸化物、金属塩および金属合金である。かかるコア材料の例は、金属ケイ酸塩、金属硼ケイ酸塩；二硼化チタン、炭化チタン、二硼化ジルコニウム、炭化ジルコニウム、炭化タングステン、炭化ケイ素、窒化アルミニウム、窒化ケイ素、窒化チタン、酸化イットリウム、ケイ素金属粉末およびケイ化モリブデンを含む、セラミック；酸化マグネシウム、酸化アルミニウム、酸化チタン、酸化バナジウム、酸化クロミウム、酸化ジルコニウム、酸化ハフニウム、酸化マンガン、酸化鉄、酸化コバルト、酸化ニッケル、酸化銅および酸化銀を含む、金属酸化物および硫化物；非金属酸化物；硫酸バリウムを含む金属塩；タングステン、ジルコニウム、チタン、ハフニウム、バナジウム、クロミウム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、インジウム、銅、銀、金、パラジウム、プラチナ、ルテニウム、オスミウム、ロジウムおよびイリジウムを含む、金属元素、ならびに前記金属元素の間で形成された合金等の金属元素の合金、例えばステンレス鋼；グラファイト、カーボンブラックおよび活性炭を含む、炭素の結晶性形態および非晶性形態である。好適な非多孔性コア材料は、炭化タングステンビーズ、タングステンビーズ、鋼ビーズおよびチタンビーズ（ステンレス鋼ビーズ等）である。非多孔性コアは、典型的には吸着剤粒子の全体積のうちの多くとも７０％（多くとも６０％、好適には多くとも５０％、好適には多くとも４０％、好適には多くとも３０％、好適には多くとも２０％、好適には多くとも１５％、好適には多くとも１０％、最も好適には多くとも５％等）を構成する。
【００９９】
吸着剤として使用される一般に使用される材料はアガロースであり、工業規模のクロマトグラフィーについてうまく機能することが証明された材料である。従って、一実施形態において、吸着剤はアガロースまたはアガロースベースのものである。（おそらく高度に架橋された）アガロースマトリックスのマクロ多孔性構造は、高い化学的および機械的な高安定性と巨大分子（タンパク質等）についての良好な結合能力を組み合わせる。別の実施形態において、吸着剤はデキストランまたはデキストランベースのものである。高い機械的安定性は使用されるマトリックスの重要な特性であり、ビーズが自由に移動している時の消耗の効果を弱めるものである。拡張ベッド法のデザインはカラムクロマトグラフィーとは異なる考慮を可能にするので、アガロースビーズはより小さいかもしくはより大きいかまたは架橋量において標準的ビーズとは異なり得る。これらの変更または非変更はベッド材料中のすべての構造材料について意図される。修飾されたアガロースマトリックスは、無機材料（いくつかのガラスまたはセラミック材料等）よりも脆弱ではないだろう。
【０１００】
カラム内のビーズ多分散性は本発明によって意図される。サイズおよび密度勾配により、ビーズはカラムまたはベッドで特異的な所在に配置される。より小さくより軽ビーズはある位置におよびより大きくより重いビーズは異なる位置に移動する。他のビーズ特徴における多分散性または多様性は本発明によって意図される。サイズ、密度、結合能、排除孔サイズ、支持体材料の差異は、本発明の方法で使用される幅広いバラエティーの構成要素および因子の組み合わせのうちの少数である。
【０１０１】
本発明の特定の実施形態において、吸着剤は対象となる粒子を捕捉するのに好適なリガンドを含む。本発明の特定の実施形態において、吸着剤は対象となる粒子または対象となるタンパク質を精製するのに好適なリガンドを含む。
【０１０２】
本発明において使用されるリガンドは、（ｉ）ベンジルアミンまたはその誘導体と；（ｉｉ）直鎖状、分岐状、または環状であり得る１〜１２の炭素原子を有するアルキル基（例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、シクロペンチル、シクロヘキシルまたはデカリニル等であり、前記アルキル基は任意で酸性基以外の少なくとも１つの基により置換される）を有するアルキルアミンを含む、アルキルアミンと；（ｉｉｉ）直鎖状、分岐状、または環状であり得、二重結合（複数可）が鎖または環（複数可）中のどこでも存在し得る２〜１２の炭素原子を持つ一価不飽和、二価不飽和、または多価不飽和のアルキル基を含むアルケニル基（前記アルケニル基は任意で酸性基以外の少なくとも１つの基により置換される）を含む、アルケニルアミンと；（ｉｖ）酸性基以外の少なくとも１つの基により置換され得るアルキニル基（アルケニルアミンと本質的に同様に定義されたＣ2-12アルキニル基を含む）を含む、アルキニルアミンと；（ｖ）任意で酸性基以外の少なくとも１つの基と置換されるＣ2-12アルコキシ基を持つ、アルコキシルアミンと；（ｖｉ）任意で酸性基以外の少なくとも１つの基により置換される、単環式または二環式の芳香族またはヘテロ芳香族のモイエティのアミンとを含むか、それらからなるか、または本質的になるリガンドを含むが、これらに限定されない。
【０１０３】
さらなる実施形態において、対象となる粒子（ＶＬＰ等）を捕捉できるリガンドは、（ｉ）ベンジルアミンまたはその誘導体と；（ｉｉ）直鎖状、分岐状、または環状であり得る１〜１２の炭素原子を有するアルキル基（例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、ドデシル、シクロペンチル、シクロヘキシルまたはデカリニル等であり、前記アルキル基は任意で酸性基以外の少なくとも１つの基により置換される）を有するアルキルアミンを含む、アルキルアミンと；（ｉｉｉ）直鎖状、分岐状、または環状であり得、二重結合（複数可）が鎖または環（複数可）中のどこでも存在し得る２〜１２の炭素原子を持つ一価不飽和、二価不飽和、または多価不飽和のアルキル基を含むアルケニル基（前記アルケニル基は任意で酸性基以外の少なくとも１つの基により置換される）を含む、アルケニルアミンと；（ｉｖ）酸性基以外の少なくとも１つの基により置換され得るアルキニル基（アルケニルアミンと本質的に同様に定義されたＣ2-12アルキニル基を含む）を含む、アルキニルアミンと；（ｖ）任意で酸性基以外の少なくとも１つの基と置換されるＣ2-12アルコキシ基を持つ、アルコキシルアミンと；（ｖｉ）任意で酸性基以外の少なくとも１つの基により置換される、単環式または二環式の芳香族またはヘテロ芳香族のモイエティのアミンとまたはその組み合わせを含むか、それらからなるか、または本質的になるリガンドからなる群から選択される。
【０１０４】
さらなる実施形態において、リガンドは、カルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸およびボロン酸からなる群から選択される芳香族酸またはヘテロ芳香族酸を含むか、それらからなるか、または本質的になる。好適には、リガンドは、２−メルカプト安息香酸、２−メルカプトニコチン酸、２−アミノ安息香酸、３−アミノ安息香酸および４−アミノ安息香酸、４−ヒドロキシフェニル−メルカプト−酢酸、４−ヒドロキシフェニル−メルカプト−プロピオン酸、４−ヒドロキシフェニル−メルカプト−ブタン酸、２，３−ジヒドロキシ−安息香酸、２，４ジヒドロキシ−安息香酸、２，５ジ−ヒドロキシ−安息香酸、２，６ジヒドロキシ−安息香酸、３，４−ジヒドロキシ−安息香酸、３，５−ジヒドロキシ−安息香酸、メルカプトベンズイミダゾールスルホン酸、オルタニル酸、メタニル酸、スルファニル酸、４−メチルアニリン−２−スルホン酸、４−メトキシアニリン−２−スルホン酸、アニリン−２，５−ジスルホン酸、Ｎ−メチルメタニル酸、７−アミノ−１−ナフトール−３−スルホン酸、１−ナフトール−４−スルホン酸、２−ナフトール−６−スルホン酸および２−ヒドロキシ−３−ナフトエ酸および２−メルカプトベンズイミダゾール−スルホン酸からなる群から選択される。
【０１０５】
さらなる実施形態において、リガンドは、ｉ）安息香酸（２−アミノ安息香酸、３−アミノ安息香酸、４−アミノ安息香酸、２−メルカプト安息香酸、４−アミノ−２−クロロ安息香酸、２−アミノ−５−クロロ安息香酸、２−アミノ−４−クロロ安息香酸、４−アミノサリチル酸、５−アミノサリチル酸、３，４−ジアミノ安息香酸、３，５−ジアミノ安息香酸、５−アミノイソフタル酸および４−アミノフタル酸等）；桂皮酸（ヒドロキシ−桂皮酸等）；ニコチン酸（２−メルカプトニコチン酸等）；ナフトエ酸（２−ヒドロキシ−１−ナフトエ酸等）；キノリン（２−メルカプトキノリン等）；テトラゾール酢酸（５−メルカプト−１−テトラゾール酢酸等）；チアジアゾール（２−メルカプト−５−メチル−１，３，４−チアジアゾール等）；ベンズイミダゾール（２−アミノ−ベンズイミダゾール、２−メルカプトベンズイミダゾールおよび２−メルカプト−５−ニトロベンズイミダゾール等）；ベンゾチアゾール（２−アミノベンゾチアゾール、２−アミノ−６−ニトロベンゾチアゾール、２−メルカプトベンゾチアゾールおよび２−メルカプト−６−エトキシベンゾチアゾール等）；ベンズオキサゾール（２−メルカプトベンズオキサゾール等）；チオフェノール（チオフェノールおよび２−アミノチオフェノール等）；２−（４−アミノフェニルチオ）酢酸；芳香族またはヘテロ芳香族のスルホン酸およびホスホン酸（１−アミノ−２−ナフトール−４−スルホン酸等）ならびにフェノール（２−アミノ−４−ニトロ−フェノール等）の官能基タイプを含むリガンドと；ｉｉ）２−ヒドロキシ−桂皮酸、３−ヒドロキシ−桂皮酸および４−ヒドロキシ−桂皮酸を含むリガンドと；ｉｉｉ）置換基としてカルボン酸およびアミノ基（２−アミノ−ニコチン酸、２−メルカプト−ニコチン酸、６−アミノ−ニコチン酸および２−アミノ−４−ヒドロキシピリミジン−カルボン酸）を含むリガンドと；ｉｖ）ヘテロ芳香族環系と融合したベンゼン環に由来するラジカルを含むリガンド、例えば、ベンゾイミダゾール（２−メルカプト−ベンズイミダゾールおよび２−メルカプト−５−ニトロ−ベンズイミダゾール等）；ベンゾチアゾール（２−アミノ−６−ニトロベンゾチアゾール、２−メルカプトベンゾチアゾールおよび２−メルカプト−６−エトキシベンゾチアゾール等）；ベンズオキサゾール（２−メルカプトベンズオキサゾール等）；から選択されるリガンドと；ｖ）チオフェノール（チオフェノールおよび２−アミノチオフェノール等）の群から選択されたリガンドとからなる群から選択される芳香族基またはヘテロ芳香族基（ラジカル）を含むか、それらからなるか、または本質的になる。
【０１０６】
リガンドは対象となる粒子または対象となるタンパク質への親和性を有することができる。従って、リガンドは、高度に特異的な生物学的相互作用（抗原と抗体、酵素と基質、または受容体と受容体リガンド等との間に起こり得るもの）が可能であり得る。従って、リガンドは、抗体、抗原、酵素、酵素基質、受容体、受容体リガンドまたはアプタマーおよび同種のものであり得る。一実施形態において、リガンドは抗体である。生物学的リガンドは、単独でまたは本明細書において記載される１つもしくは複数の化学的リガンドと組み合わせて使用することができる。生物学的リガンドは、任意で本明細書において記載されるような１つまたは複数の化学的リガンドと組み合わせて１つまたは複数の同じまたは異なるリガンドを含むことができる。
【０１０７】
リガンドを含む吸着剤は、典型的には対象となる粒子の結合が最適に起こるｐＨ条件に平衡化される。平衡工程は、約３〜１０の範囲（約５〜７の範囲等）ｐＨ７のｐＨのバッファーを適用することによって典型的には実行される。
【０１０８】
リガンドを含むビーズは一般に複数のリガンドを含むだろう。特定の実施形態において、ビーズは、第２の種類のリガンドと組み合わせて上記のようなリガンドを含み、本発明に記載のリガンドは、全リガンド量のうちの少なくとも約３０％、好適には少なくとも約５０％、より好適には少なくとも約７０％および最も好適には少なくとも約９０％まで存在する。かかる組み合わせたリガンド分離マトリックスは、特定の事例のためにデザインすることができ、さらなる相互作用のエレメントはその分離特性を改善する。第２の種類のリガンドは、１つまたは複数の荷電基（電荷反発作用による化合物の溶出に使用する陽イオン交換体等）；疎水基；水素結合が可能な基；親和性基または同種のものを含み得る。従って、本明細書において記載されるような対象となる粒子を結合できる異なるリガンドの組み合わせも意図され、それは等しい比率または異なる比率であり得る。
【０１０９】
様々な実施形態において、原料中の微粒子の最終速度を上回るがビーズの最終速度は上回らないフロー率で方法を操作することが所望される。一実施形態において、拡張ベッドにおける直線的フロー率は少なくとも約２ｃｍ／分、少なくとも約３ｃｍ／分、少なくとも約４ｃｍ／分、少なくとも約５ｃｍ／分、少なくとも約６ｃｍ／分、少なくとも約７ｃｍ／分、少なくとも約８ｃｍ／分、少なくとも約１０ｃｍ／分、少なくとも約１２ｃｍ／分、少なくとも約１５ｃｍ／分、少なくとも約２０ｃｍ／分、少なくとも約２５ｃｍ／分、少なくとも約３０ｃｍ／分、少なくとも約４０ｃｍ／分、または少なくとも約５０ｃｍ／分である。別の実施形態において、直線的フロー率は、約１ｃｍ／分〜１５ｃｍ／分、（約２ｃｍ／分〜１０ｃｍ／分、または約２ｃｍ／分〜９ｃｍ／分、または約２ｃｍ／分〜８ｃｍ／分、または約３ｃｍ／分〜８ｃｍ／分、または約３．５ｃｍ／分〜７．５ｃｍ／分等）の範囲である。一実施形態において、フロー率は約３．８ｃｍ／分である。別の実施形態において、フロー率は約７．５ｃｍ／分である。定義された期間で排出口で液体の体積を採取することによって、フロー率を測定することができる。
【０１１０】
他の実施形態において、拡張ベッド中の原料のインプットは、少なくとも約１５０ｃｍ／時間（少なくとも約１８０ｃｍ／時間、少なくとも約２００ｃｍ／時間、少なくとも約２１０ｃｍ／時間、少なくとも約２２０ｃｍ／時間、少なくとも約２３０ｃｍ／時間、少なくとも約２４０ｃｍ／時間、少なくとも約２５０ｃｍ／時間、少なくとも約３００ｃｍ／時間、少なくとも約４００ｃｍ／時間、少なくとも約４２５ｃｍ／時間、少なくとも約４５０ｃｍ／時間、少なくとも約４７５ｃｍ／時間、少なくとも約５００ｃｍ／時間、または少なくとも約６００ｃｍ／時間等）の直線的フロー率により実行することができる。別の実施形態において、拡張ベッド中の原料のインプットは、約２００〜５００ｃｍ／時間（約３００〜５００ｃｍ／時間または約４００ｃｍ／時間等）の直線的フロー率により実行することができる。一実施形態において、フロー率は約２２８ｃｍ／時間である。別の実施形態において、フロー率は約４５０ｃｍ／時間である。
【０１１１】
方程式：高さ０／高さ１（式中、高さ１はカラムを通るフローのない充填ベッドモードにおけるベッドの高さであり、高さ０はカラムを通るフローのある拡張モードにおけるベッドの高さである）を使用して、ベッドの拡張度を測定することができる。一実施形態において、拡張度は１〜５の範囲例えば、１〜４または１〜３または１〜２（１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８または１．９等）である。いくつかの実施形態については、拡張度は多くとも約１．２である。別の実施形態において、フロー率は約５ｃｍ／分であり、拡張度は１〜２（１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８または１．９等）；好適には１．２である。別の実施形態において、フロー率は約６ｃｍ／分であり、拡張度は１〜２（１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８または１．９等）；好適には１．２である。別の実施形態において、フロー率は約７ｃｍ／分であり、拡張度は１〜２（１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８または１．９等）；好適には１．２である。別の実施形態において、フロー率は約８ｃｍ／分であり、拡張度は１〜２（１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８または１．９等）；好適には１．２である。別の実施形態において、フロー率は約９ｃｍ／分であり、拡張度は１〜２（１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８または１．９等）；好適には１．２である。別の実施形態において、フロー率は約１０ｃｍ／分であり、拡張度は１〜２（１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８または１．９等）；好適には１．２である。別の実施形態において、フロー率は約４ｃｍ／分（例えば約３．８ｃｍ／分）であり、拡張度は、１〜２（１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８または１．９等）；好適には１．２である。別の実施形態において、フロー率は約８ｃｍ／分（例えば約７．８ｃｍ／分）であり、拡張度は、１〜２（１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８または１．９等）；好適には１．２である。
【０１１２】
混合物からの対象となる粒子の捕捉のためにリガンドとカップルさせた拡張ベッド吸着剤の使用は、１つまたは複数の対象となる粒子を含む混合物を最初に提供する工程を含むことができる。混合物は定義されたｐＨを有するか、または混合物のｐＨを調整して所望されるｐＨを得ることができる。混合物は拡張ベッド吸着剤と接触させられ、任意で１つまたは複数のバッファーにより洗浄される。１つまたは複数の対象となる粒子は吸着剤に可逆的に結合されるようになり得るか、またはそれらは未結合のままであり得る。次いで吸着剤をバッファーにより洗浄して非結合材料を含む画分を得ることができる。次いで吸着剤を少なくとも１つの溶出バッファーにより洗浄して吸着剤に可逆的に結合された１つまたは複数の対象となる粒子を含む少なくとも１つの溶出物を得ることができる。洗浄工程、溶出工程または両方は、吸着剤と最初に接触させる混合物のｐＨよりも高いｐＨを有するバッファーにより実行することができる。バッファー（複数可）は１つまたは複数のさらなる化合物（１つまたは複数の界面活性剤等）を含み得る。吸着剤は各々の溶出工程間でバッファーにより洗浄することができる。溶出工程において得られる非結合材料もしくは対象となる粒子または両方を含む画分は、限定されずに、クロマトグラフィー、免疫精製、濾過、精密濾過、遠心分離、デカンテーション、沈降および同種のもの、または２つ以上の前述の技法の組み合わせを含む、本明細書において論じられるようなさらなる下流の加工にかけることができる。
【０１１３】
溶出工程の間のベッドの拡張度は、０．５〜５の範囲、例えば、１〜４または１〜３または１〜２（１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８または１．９等）である。いくつかの実施形態については、拡張度は多くとも約１．２である。
【０１１４】
一実施形態において、２つ以上の対象となる粒子は２つ以上の異なる吸着剤の使用によって混合物から捕捉することができ、そこで吸着剤の１つ以上（例えばすべて）は拡張ベッドモードである。従って、本発明は、対象となる粒子の捕捉のために２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上の異なる吸着剤の使用を意図する。
【０１１５】
さらなる態様において、本発明は、対象となる粒子を混合物から捕捉する方法であって、対象となる粒子が吸着剤に結合する条件下で混合物を拡張ベッド吸着剤と接触させることおよび対象となる粒子が吸着剤から溶出されるように条件を変化させることを含む方法に関する。複数の実施形態において、方法は、混合物中に最初に存在する対象となる粒子の合計量の少なくとも５０％（対象となる粒子の少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％を含む）を捕捉する。少なくとも９２．５％、９５％、９６％、９７％、９８％または少なくとも９９％等のさらに高い捕捉率を達成することができる。
【０１１６】
本発明のさらなる実施形態はここで記載される。捕捉の前に、対象となる粒子を含む宿主細胞を、溶解、均質化、破砕、粉末化、粉砕、乾燥（例えば凍結乾燥）、押出、または前述のものの２つ以上の組み合わせにかけることができる。バルク材のサイズを減少、細胞（複数可）を破壊、または細胞（複数可）の内容物を放出する他の公知の方法も使用することができる。宿主細胞が植物宿主細胞であるならば、細胞は、ねじプレス（例えばコーンに対して少なくとも４５ｐｓｉの圧力を使用して約１５ｋｇ／時間〜２０ｋｇ／時間で、Ｖｉｎｃｅｎｔ  ＣＰ−４ねじプレス）、パスタカッター、またはタバコの加工において一般に使用される１つまたは複数の機械（例えば押出し機）等であるがこれらに限定されない、当該技術分野において公知の方法を使用して、破壊またはホモジナイズすることができる。得られた抽出物は採取され、任意で保存される。緑色葉が出発材料において優勢な場合は、抽出物は緑色ジュースまたは緑色抽出物とも称される。かかる抽出物は、細胞間隙（すなわちアポプラスト）中の内容物だけでなく細胞の細胞内内容物も含む。一実施形態において、抽出物を１つまたは複数の化学物質または組成物および同種のものの添加によってさらに処理することができる。従って、一実施形態において、メタ重亜硫酸ナトリウムを抽出物に添加することができる。対象となる粒子が細胞から分泌され得るので、これはオプションの工程である。当該技術分野において公知の方法（Ｃｏｎｄｕｔｉｍｅｔｅｒ  Ｍｕｌｔｉ  ３５０ｉ／セットの使用によって等）を使用して、抽出物の伝導率を測定することができる。
【０１１７】
伝導率が所望される範囲でないならば、抽出物は使用前に純水により希釈することができる。例えば、タバコの茎および葉の均質化により約２０ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する植物材料がもたらされることが観察されている。この値は、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ  およびＮ．ｂｅｎｔａｍｉａｎａに由来するホモジナイズされた植物材料において一貫して観察された。一実施形態によれば、伝導率は、１ｍＳ／ｃｍ〜１０ｍＳ／ｃｍ；好適には２ｍＳ／ｃｍ〜８ｍＳ／ｃｍ；好適には３ｍＳ／ｃｍ〜７ｍＳ／ｃｍ；好適には４ｍＳ／ｃｍ〜６ｍＳ／ｃｍの範囲、例えば、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８または５．９ｍＳ／ｃｍでなくてはならない。他の実施形態によれば、伝導率は、１ｍＳ／ｃｍ〜５ｍＳ／ｃｍ；好適には２ｍＳ／ｃｍ〜３ｍＳ／ｃｍの範囲、例えば、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８または２．９ｍＳ／ｃｍでなくてはならない。別の実施形態において、抽出物のｐＨは、約ｐＨ６．０〜８．０の間；好適には約ｐＨ７．０である。
【０１１８】
捕捉の前に原料を前処理することは所望され得る。対象となる粒子が植物抽出物中に存在する場合、捕捉プロセスの間に目詰まりおよび閉塞を引き起こし得る植物に由来するマクロ分子のうちのいくつかを除去することは有利であろう。一実施形態によれば、イオン交換体（ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）イオン交換体等）を使用して所望されない植物由来マクロ分子を結合する。この工程は好適には第１のカラムにおいてバッチインキュベーションモードで行うことができ、それから得られた溶出材料は拡張ベッドを含む第２のカラムと任意で接触される。好適には、この前捕捉工程において使用されるイオン交換体は、約１００μｍ〜２００μｍ；好適には約ｐＨ７で約１５０μｍの平均吸着剤粒子サイズを有する。典型的には、イオン交換体は、好適なバッファー（０．５Ｍトリス／ＨＣｌバッファーｐＨ７、続いて１０ｍＭトリス／ＨＣｌバッファーｐＨ７．０等）により平衡化されるだろう。濾過、精密濾過、遠心分離（例えば低速遠心分離）、デカンテーションもしくは沈降またはこれらの方法の２つ以上の組み合わせを含み得る他の前捕捉工程が意図される。
【０１１９】
他の実施形態によれば、前捕捉工程は吸着剤の拡張ベッドの使用を含む。好適には、前捕捉工程において使用されるビーズのサイズは、約１３０μｍ〜２５０μｍ；好適には約１３５μｍ〜２５０μｍ；より好適には約１３５μｍ〜２２５μｍ；より好適には約１３５μｍ〜２００μｍ；より好適には約１３５μｍ〜１７５μｍ；より好適には約１３５μｍ〜１７０μｍ；より好適には約１４０μｍ〜１７０μｍ；より好適には約１４０μｍ〜１６５μｍ；より好適には約１４０μｍ〜１６０μｍ；より好適には約１４５μｍ〜１６０μｍ；より好適には約１４５μｍ〜１４５μｍの間；最も好適には約１５０μｍである。好適には、これらのビーズは、拡張ベッド吸着剤を使用して前捕捉する工程において使用することができる。従って、本発明のさらなる態様は、（ａ）吸着剤の第１の拡張ベッドを提供する工程と；（ｂ）混合物中の望まれない材料が第１の吸着剤に結合するような条件下で、混合物を第１の吸着剤と接触させる工程と；（ｃ）吸着剤の第２の拡張ベッドを提供する工程と；（ｄ）対象となる粒子が第２の吸着剤に結合するような条件下で、工程（ｂ）からの対象となる粒子を第２の吸着剤と接触させる工程と；（ｅ）任意で第２の吸着剤を洗浄する工程と；（ｆ）任意で対象となる粒子を第２の吸着剤から溶出する工程と；（ｇ）任意で１つまたは複数のさらなる回数で工程（ａ）〜（ｆ）を反復する工程とを含む、混合物から対象となる粒子を捕捉する方法に関する。
【０１２０】
一実施形態において、拡張ベッドモードにおいて使用される吸着剤は、陰イオン交換樹脂（ジエチルアミノエチルセルロースベースのイオン交換樹脂、好適にはジエチルアミノエチルセルロースデキストランベースのイオン交換樹脂等）である。樹脂は、典型的には、例えば、０．５Ｍトリス／ＨＣｌバッファーｐＨ７、続いて１０ｍＭトリス／ＨＣｌ  ｐＨ７．０を使用して、約ｐＨ６．０〜８．０の間；好適にはｐＨ７．０のｐＨにバッファーにより平衡化されるだろう。一実施形態において、吸着剤の平均吸着剤粒子サイズは、約２５μｍ〜２００μｍ；好適には約２５μｍ〜７５μｍの間、および最も好適には約５０μｍである。方法が拡張ベッドカラムにおいて実行されるならば、当業者は、カラムの様々なサイズを使用できることを認識するだろう。一実施形態において、カラムは、約７０ｃｍのカラム高および約１５ｃｍのベッド高で直径１ｃｍである。より大きなカラム（工業規模で使用できるカラム等）のこの使用も本発明によって包含される。例えば、カラムは、直径で直径約１ｃｍ〜少なくとも１５００ｃｍ（直径で最大約１０ｃｍ、直径で最大約１００ｃｍ、直径で最大約２５０ｃｍ、直径で最大約５００ｃｍ、直径で最大約７５０ｃｍ、直径で最大約１０００ｃｍ、直径で最大約１２５０ｃｍ、直径で最大約１５００ｃｍ、直径で最大約１７５０ｃｍまたは少なくとも直径で最大約２０００ｃｍ等）のサイズにわたり得る。他の直径は２ｃｍの直径、１０ｃｍの直径、４５ｃｍの直径および１５０ｃｍの直径を含む。本明細書において記載されるように、上清は所望されるフロー率でカラム上にロードされ、カラムはロード後に約ｐＨ６．０〜８．０の間；好適にはｐＨ７．０のｐＨを備えた洗浄バッファー（１０ｍＭトリス／ＨＣｌ  ｐＨ７．０等）により典型的には洗浄される。次いで結合された材料は典型的には洗浄バッファーより高いまたは低いｐＨの好適な溶出バッファーを使用して溶出することができる。一実施形態において、洗浄バッファーは５０ｍＭトリス／ＨＣｌおよび１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．０を含む。好適には、溶出物を１つの画分で回収し、ｐＨは、溶出物の回収前にチューブにバッファー（１Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐＨ６．５溶液等）を添加することによって、溶出の間にｐＨ７に調節する。
【０１２１】
操作の１つのモードによれば、植物抽出物中に存在する対象となる粒子の結合および溶出は、ＤＥＡＥイオン交換体、続いてＰＥＩイオン交換体による前捕捉を使用して達成される。
【０１２２】
別の実施形態において、抽出物は１工程の結合および溶出プロセスにおいて対象となる粒子を単離することができるように前処理されない。操作のこのモードは、拡張ベッド吸着を使用する対象となる粒子の大スケール捕捉のために、特に適している。従って、少なくとも１００リットル（例えば少なくとも２５０リットル、少なくとも５００リットル、少なくとも７５０リットル、少なくとも１０００リットル、少なくとも１２５０リットル、少なくとも１５００リットル、少なくとも１７５０リットル、および少なくとも２０００リットル）の抽出物は、この方法に従って加工され得る。
【０１２３】
一実施形態において、ビーズ組成物は、エピクロルヒドリン架橋アガロース（例えば４％ｗ／ｖで）等のアガロースベースである。ビーズは、残りのビーズに異なる組成物のコア（炭化タングステンコア等）を含み得る。好適なリガンドは、典型的には約５０μｍの平均直径を備えたＤＥＡＥイオン交換体である。吸着剤粒子の平均密度は好適には約１６ｋｇ／Ｌである。好適なカラム直径は約４５ｃｍであり、空隙体積は沈殿した状態で充填体積の約４０％を構成する。一実施形態において、カラムを０．５Ｍトリス−Ｃｌバッファー、ｐＨ７、続いて１０ｍＭトリス−Ｃｌバッファー、ｐＨ７により平衡化する。好適には、抽出物のローディングは、本明細書において記載されるようなフロー率で抽出物を上に向かってポンプで入れることによって達成される。拡張係数は典型的には２．０〜２．５の領域中であり、未結合の材料を同じ拡張率で１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７により洗浄する。ＥＢＡクロマトグラフィー工程に続いて、対象となる粒子は約１．２の拡張率で５０ｍＭトリス−Ｃｌおよび１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ９により溶出され得る。溶出された画分を、溶出ピークの回収前に１Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐＨ６．５を容器に添加することによって中和することができる。対象となる粒子を含むかまたはそれらから構成される画分は、さらなる捕捉および精製のためにプールすることができる。ビーズの平均密度は約１ｇ／ｍｌ〜２０ｇ／ｍｌであり得、直線的フロー率は少なくとも約１５０ｃｍ／時間であり得、拡張ベッドの拡張度は約１〜５であり得る。
【０１２４】
本発明の一実施形態において、吸着剤に、１つまたは複数の洗浄バッファーおよび平衡バッファーにより、任意でそれぞれ洗浄もしくは平衡化または両方を行うことができる。吸着剤に適用される混合物は条件付けた混合物であり得る。吸着剤がカラム内で保持されないケースにおいて、それは、固相（膜ベースの吸着のためのもの等で、例えば膜フィルター、繊維またはシート）であり得、リガンドはそこへカップルされる。
【０１２５】
従って、さらなる態様は、（ｉ）吸着剤の密度が約１ｇ／ｍｌ〜２０ｇ／ｍｌの間であり、拡張ベッドの拡張度が約１〜５の間であり、平均吸着剤粒子のサイズが約２５μｍ〜約２００μｍの間である、リガンドを含む吸着剤の拡張ベッドを１０ｃｍを超える沈降ベッド高でカラム中に提供する工程と；（ｉｉ）約ｐＨ６．０〜８．０範囲のｐＨで樹脂材料を平衡化する工程と；（ｉｉｉ）対象となる粒子を含む混合物であって、約１ｍＳ／ｃｍ〜１０ｍＳ／ｃｍの間の伝導率を有する前記混合物を提供する工程と；（ｉｖ）約１ｃｍ／分〜１５ｃｍ／分の間の範囲の直線的フロー率でカラム上に混合物をロードして対象となる粒子を結合する工程と；（ｉｖ）約ｐＨ６．０〜８．０の範囲のｐＨを有するバッファーを使用してロードしたカラムを洗浄する工程と；（ｖ）１つまたは複数の画分でカラムから対象となる結合粒子を溶出する工程とを含む、混合物から対象となる粒子を捕捉する方法に関する。
【０１２６】
本明細書において参照されるとき、「バッファー」は、その酸−塩基のコンジュゲート成分の作用による酸または塩基の添加によってｐＨにおける変化に耐える溶液である。様々なバッファーは、バッファーの所望されるｐＨおよび捕捉プロセスにおける特定の工程に応じて用いることができる。本発明の方法のためのｐＨ範囲の所望される制御に使用できるバッファー成分の非限定的例は、酢酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン、リン酸塩、アンモニウムバッファー（酢酸アンモニウム等）、コハク酸塩、ＭＥＳ、ＣＨＡＰＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、トリスおよび同種のものに加えて、これらのトリス−リンゴ酸−ＮａＯＨの組み合わせ、マレイン酸塩、クロロ酢酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、プロピオン酸塩、ピリジン、ピペラジン、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、トリシン、ビシン、ＴＡＰＳ、エタノールアミン、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ、メチルアミン、ピペリジン、ホウ酸、炭酸、乳酸、ブタンアンジオン酸（ｂｕｔａｎｅａｎｄｉｏｉｃ  ａｃｉｄ）、ジエチルマロン酸、グリシルグリシン、ＨＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、イミダゾール、フェノール、ＰＯＰＳＯ、コハク酸塩、ＴＡＰＳ、ベンジルアミン、トリメチルアミンもしくはジメチルアミンもしくはエチルアミンもしくはフェニルアミン、エチレンジアミン、またはモルホリンを含む。追加成分（添加剤）は、バッファー中に必要に応じて存在することができ、例えば、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウムおよび塩化カリウム等の塩；ならびにアミノ酸（グリシンおよびヒスチジン等）、カオトロープ（尿素等）、アルコール（エタノール、マンニトール、グリセロールおよびベンジルアルコール等）、界面活性剤（上を参照）および糖（ショ糖、マンニトール、マルトース、トレハロース、グルコースおよびフルクトース等）等の他の添加剤をバッファーのイオン強度の調節に使用することができる。バッファーの成分および添加剤ならびに使用される濃度は、本発明において実施されるクロマトグラフィーのタイプに従って変動させることができる。
【０１２７】
「界面活性剤」という用語はイオン性界面活性剤、両性イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤を指し、それはタンパク質の凝集を防止することおよび非特異的相互作用または対象となるタンパク質への混入物の結合を防止することに有用であり、清浄化バッファー、平衡化バッファー、ローディングバッファー、ロード洗浄（複数可）バッファー、溶出バッファーまたはストリップバッファーを含む本発明において使用される様々なバッファー中に存在することができる。特定の実施形態において、界面活性剤は洗浄バッファーへ添加される。本発明において使用することができる界面活性剤の例は、ポリソルベート（例えばポリソルベート２０または８０）；ポロキサマー（例えばポロキサマー１８８）；トリトン；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；ラウリル硫酸ナトリウム；オクチルグリコシドナトリウム；ラウリルスルホベタイン、ミリスチルスルホベタイン、リノレイルスルホベタイン、またはステアリルスルホベタイン；ラウリルサルコシン、ミリスチルサルコシン、リノレイルサルコシンまたはステアリルサルコシン；リノレイルベタイン、ミリスチルベタイン、またはセチルベタイン；ラウロアミドプロピルベタイン、コカミドプロピルベタイン、リノレアミドプロピルベタイン、ミリスタミドプロピルベタイン、パルミドプロピルベタイン、またはイソステアラミドプロピルベタイン（例えばラウロアミドプロピル）；ミリスタミドプロピルジメチルアミン、パルミドプロピルジメチルアミン、またはイソステアラミドプロピルジメチルアミン；ココイルメチルタウリンナトリウム、またはオレイルメチルタウリン二ナトリウム；ＭＯＮＡＱＵＡＴ（商標）シリーズ（Ｍｏｎａ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｐａｔｅｒｓｏｎ、ＮＪ．）；Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、トリトン、ＢＲＩＪ、Ａｔｌａｓ  Ｇ２１２７、Ｇｅｎａｐｏｌ、ＨＥＣＡＭＥＧ、ＬＵＢＲＯＬ  ＰＸ、ＭＥＧＡ、ＮＰ、ＴＨＥＳＩＴ、ＴＯＰＰＳ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ＤＤＭＡＵ、ＥＭＰＩＧＥＮ  ＢＢ、ＡＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴおよびＣ１２Ｅ８を含むが、これらに限定されない。界面活性剤は任意のワーキングバッファー中に添加することができ、対象となる分子を含むフィード中に含むことができる。界面活性剤は、本明細書において記載された方法での使用のために好適な任意の量、例えば、約０．００１％〜約２０％、および典型的には約０．０１％〜約１％で存在することができる。特定の実施形態において、ポリソルベート８０はＣＥＸＣのための洗浄バッファー中で使用される。
【０１２８】
クロマトグラフィー性能は、当該技術分野において周知の様々な方法を使用して（２８０ｎｍおよび６００ｎｍでのＵＶ吸収の測定によって、伝導率によってもしくはｐＨによってまたはその組み合わせによって等）、モニタリングすることができる。
【０１２９】
所望される対象となる粒子の捕捉は、対象となるタンパク質に特異的な適切なアッセイを使用してモニタリングすることができる。アッセイ（周知のＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ等）を使用して画分の全タンパク質含有量を決定することができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して純度を確立することができる。ウエスタンブロットは対象となるタンパク質の同定および特徴づけのために使用することができる。本明細書において記載されるような赤血球凝集素アッセイ等のタンパク質活性を測定する方法も使用することができる。
【０１３０】
他の実施形態によれば、拡張ベッドおよびカラムを使用後に浄化および再生する。従って、例えば、溶出後に、樹脂を０．５Ｍ  ＮａＯＨ続いて蒸留水による洗浄によって浄化および再生する。再平衡化は１０ｍＭトリス−Ｃｌバッファー、ｐＨ７を使用して達成することができる。
【０１３１】
従って、本発明の態様は対象となる粒子の植物からの捕捉に関する。従って、一態様は、拡張ベッドまたはＥＢＡのクロマトグラフィーの使用を含む、植物、植物細胞または植物抽出物から対象となる粒子を捕捉する方法に関する。一実施形態によれば、この方法は、（ａ）吸着剤；好適にはＤＥＡＥベースの吸着剤の拡張ベッドを提供する工程と；（ｂ）植物材料を吸着剤と接触させる工程と；（ｃ）任意で吸着剤をリンスする工程と；（ｄ）任意で対象となる粒子を吸着剤から溶出する工程とを含む。好適には、吸着剤との接触の前の植物抽出物の伝導率は、約１ｍＳ／ｃｍ〜１０ｍＳ／ｃｍ、好適には２ｍＳ／ｃｍ〜３ｍＳ／ｃｍである。好適には、吸着剤は複数のビーズ（アガロースおよび対象となる粒子を結合するのに好適なリガンドを含むビーズ等）を含む。ビーズは約５０μｍの平均直径を有し得る。好適には、リガンドは、陰イオン交換樹脂（ジエチルアミノエチルセルロースベースのイオン交換樹脂、好適にはジエチルアミノエチルセルロースデキストランベースのイオン交換樹脂等）を含むか、それらからなるか、または本質的になる。好適には、ビーズの平均密度は約１ｇ／ｍｌ〜２０ｇ／ｍｌである。好適には、直線的フロー率は少なくとも約１５０ｃｍ／時間である。好適には、拡張ベッドの拡張度は約１〜５である。
【０１３２】
ＶＬＰは一般的に感染において産生されるビリオンに抗原性的に類似するが、複製に十分な遺伝情報を欠き、従って典型的には非感染性である。ＶＬＰは感染において産生されるビリオンに形態学的に類似し得るが、必ずしもそうだとは限らない。ＶＬＰ（植物由来するＶＬＰ等）は多くのサイズ分布を有し、感染において産生されるビリオンと異なる形状であり得、球状ではないか、長い軸であるか、または押しつぶされた外観等を有する。
【０１３３】
ＶＬＰは、パルボウイルス科（例えばアデノ随伴ウイルス）、レトロウイルス科（例えばＨＩＶ）およびフラビウイルス科（例えばＣ型肝炎ウイルス）を含む、様々なウイルス科の構成要素から産生されている。ＶＬＰは、哺乳類細胞株、昆虫細胞株、酵母および植物細胞を含む様々な細胞培養システムにおいて産生することができる。特定の実施形態において、ＶＬＰ中に存在する１つまたは複数のタンパク種は、天然に存在する配列から修飾され得る。ＶＬＰは、哺乳類細胞、細菌細胞、植物細胞および昆虫細胞を含む好適な宿主細胞において産生され得る。一実施形態において、ＶＬＰは植物の細胞において産生される。ＶＬＰは多くの場合異種発現によって大量に産生することができる。ＶＬＰはインタクトな構造として宿主または宿主細胞から単離され得る。ＶＬＰは、例えば免疫アッセイ、機能的アッセイ（例えば凝集）、電子顕微鏡検査、またはサイズ排除クロマトグラフィーによって、構造およびサイズについて査定され得る。
【０１３４】
ＶＬＰは１つ以上または２つ以上の異なる対象となるタンパク質を含むことができる。タンパク質は異なる生物学的起源であり得るが、その少なくとも１つはウイルス起源である。１つ以上のタンパク種を含むＶＬＰについて、タンパク種は、ウイルスの同じ種からのものであり得るか、または異なる種、属、亜科または科のウイルスからのタンパク質を含み得る。ＶＬＰは、非タンパク性の他のタイプの分子（脂質および炭水化物等であるがこれらに限定されない）を加えて含み得る。
【０１３５】
一実施形態において、ＶＬＰは、対象となるタンパク質の単量体単位の多量体集合体である。様々な実施形態において、対象となるタンパク質はウイルスタンパク質（カプシド等であるがこれらに限定されない）である。大部分のウイルス構造はそれらのカプシドの構造に基づき、螺旋状形態、２０面体形態もしくは等軸形態またはエンベロープを有する形態で存在することができる。螺旋対称はウイルスの円周の周囲のタンパク質サブユニットをアレンジして、ディスクを形成する。２０面体対称のカプシドは疑似球状構造を形成し；エンベロープウイルスと共にタンパク質サブユニットは外部環境に曝露される。様々な実施形態において、ＶＬＰは３〜約２００のカプシドを含むカプシドから構成される。一実施形態において、ＶＬＰは、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも９０または少なくとも１２０のカプシドを含む。別の実施形態において、各々のＶＬＰは、少なくとも１５０のカプシド、少なくとも１６０、少なくとも１７０または少なくとも１８０のカプシドを含む。他の実施形態において、対象となるタンパク質は、ウイルスマトリックスタンパク質またはウイルス糖タンパク質および同種のものであり得る。
【０１３６】
一実施形態において、ＶＬＰは２０面体構造として発現される。別の実施形態において、ＶＬＰは、カプシド配列が由来する生来のウイルスと同じ幾何学的形状で発現される。別の実施形態において、ＶＬＰは生来のウイルスと同一の幾何学的形状を有していない。一実施形態において、カプシドの少なくとも１つは、少なくとも１つの対象となるタンパク質を含む。
【０１３７】
一実施形態において、本発明によって捕捉されたＶＬＰを使用して、ワクチン（インフルエンザまたは鳥インフルエンザのワクチン等）を含むがこれらに限定されない医薬組成物を作製することができる。かかるワクチンをはヒトまたは動物に投与して、病原体（ウイルス、細菌、原生動物、線虫、寄生動物等であるがこれらに限定されない）による感染を防止することまたはかかる病原体による感染を処理することができる。
【０１３８】
対象となる粒子は細菌のゴースト粒子であり得る。このタイプの粒子は、細菌（グラム陰性菌等）の空の細菌細胞エンベロープである。それらは、典型的には細菌（特にグラム陰性菌）の部分的溶解をもたらす遺伝子の制御された異種発現によって調製される。例えば、溶菌遺伝子はポリペプチドをコードするバクテリオファージφＸ１７４遺伝子Ｅであり得、このポリペプチドはグラム陰性菌の細胞エンベロープ複合体の中へ挿入され、内膜および外膜を介する膜貫通トンネル構造の形成を引き起こす。このトンネル構造の内径は、適用される溶解条件に応じて、約２０ｎｍ〜４００ｎｍ、特に４０ｎｍ〜２００ｎｍ、５００ｎｍ〜１，０００ｎｍの範囲中であり得る。細胞質成分はこのトンネル構造によって放たれ、インタクトな形態を有する空の細胞エンベロープ複合体（いわゆる細菌のゴースト）が得られる。ＷＯ９１／１３５５５およびＷＯ９３／０１７９１で細菌のゴーストの使用を開示する。細菌のゴースト粒子は組換えゴースト粒子であり得る。細菌のゴースト粒子は、その表面上で１つまたは複数の対象となるタンパク質（ワクチン抗原等）を提示する組換えゴースト粒子であり得る。
【０１３９】
プロセスはＶＬＰの形態で少なくとも０．１ｇ／Ｌのタンパク質を産生することができる。別の実施形態において、プロセスはＶＬＰの形態で０．１ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌのタンパク質を産生する。他の実施形態において、プロセスは、ＶＬＰの形態で少なくとも約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０ｇ／Ｌのタンパク質を産生する。一実施形態において、産生されたＶＬＰの全量は少なくとも１．０ｇ／Ｌである。
【０１４０】
対象となるタンパク質に作動可能に連結された発現されるウイルスカプシドの部分は、細胞中で不溶性の凝集物として形成され得る。一実施形態において、対象となるタンパク質は、本明細書において論じられるような不溶性の凝集物から復元される。一実施形態において、ウイルスカプシド配列に作動可能に連結されたタンパク質は少なくとも２つのアミノ酸を含む。別の実施形態において、タンパク質は、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６アミノ酸を含む。別の実施形態において、タンパク質は、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、または少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００またはそれ以上のアミノ酸長である。一実施形態において、タンパク質は、少なくとも２５ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａまたは１５０ｋＤａまたはそれ以上の分子量を有する。
【０１４１】
対象となるタンパク質は、ウイルスに由来せず、任意で宿主細胞と同じ種に由来しない異種タンパク質であり得る。
【０１４２】
対象となるタンパク質は機能的タンパク質；構造タンパク質；抗原；免疫原；毒素；ヒトまたは動物の疾患の処理もしくは防止または両方に有用な抗微生物タンパク質、治療的タンパク質または予防的タンパク質であり得る。本明細書において記載されたタンパク質の断片、融合タンパク質、前駆体またはコンカテマーも意図される。機能的タンパク質の非限定的例は、免疫活性タンパク質（例えば抗原性タンパク質、アレルゲン性タンパク質、免疫調節因子、免疫修飾因子）；シグナリングおよびシグナル伝達タンパク質ならびに阻害タンパク質（例えば、タンパク質毒素および抗微生物タンパク質等の、毒性タンパク質、殺生物性タンパク質、または静生物性タンパク質）を含むが、これらに限定されない。構造タンパク質は、アプタマー；折り畳みタンパク質、接着促進タンパク質、接触面タンパク質、マイクロ構造およびナノ構造の建築タンパク質ならびに前活性化タンパク質を含むが、これらに限定されない。触媒タンパク質は、例えばＲＮＡ編集タンパク質；ｔＲＮＡシンセターゼの触媒タンパク質；リボソーム不活性化タンパク質；およびウイルス触媒タンパク質を含む。対象となるタンパク質は、関連するタンパク質のエピトープ、ハプテン（例えば、抗原性ウイルスタンパク質；ウイルス関連タンパク質、抗体のイディオタイプドメイン；細胞表面タンパク質；ヒト、動物、原生生物、植物、真菌、細菌、または古細菌起源の抗原性タンパク質；アレルゲン性タンパク質およびアレルゲン脱感作タンパク質）であり得る。
【０１４３】
タンパク質は、免疫調節因子または免疫修飾因子（例えばインターフェロン、インターロイキン、免疫抑制因子および免疫強化因子）；抗体（例えば、単一鎖抗体；単一鎖抗体断片およびコンストラクト、例えば単一鎖Ｆｖ分子；抗体軽鎖分子、抗体重鎖分子、ドメイン欠失抗体の軽鎖分子または重鎖分子；単一鎖抗体のドメインおよび分子、例えばＣＨ１、ＣＨ１−３、ＣＨ３、ＣＨ１−４、ＣＨ４、ＶＨＣＨ１、ＣＬ、ＣＤＲ１、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２ドメイン；パラトープペプチド；マイクロ抗体）；他の結合タンパク質（例えば、アプタマー、細胞内および細胞表面の受容体タンパク質、受容体断片）でもあり得る。
【０１４４】
タンパク質は、酵素基質もしくは酵素抑制物質または細胞表面の受容体、リガンド、アゴニストおよびアンタゴニスト、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、ウイロカインおよびウイロセプター、ホルモン放出タンパク質およびホルモン放出阻害タンパク質、神経伝達物質またはチャンネルブロッカー、毒素または毒素前駆体であり得る。タンパク質は、代謝および消化に関連するタンパク質、細胞接着を修飾または媒介するタンパク質、細胞外基質タンパク質、神経保護因子または髄鞘形成促進タンパク質；または凝集阻害タンパク質でもあり得る。対象となるタンパク質は分泌タンパク質であり得る。
【０１４５】
タンパク質についてのコード配列は生来のコード配列であり得るが、より典型的には選択された発現宿主細胞中での使用のために、例えば、宿主動物種のコドン使用優先性を反映する遺伝子を合成することまたはシグナルペプチドを組み入れることによって、選択、改善または最適化されたコード配列であるだろう。
【０１４６】
一実施形態において、対象となるタンパク質はワクチンまたはワクチン組成物中で使用することができる抗原である。好適には、ワクチンは、薬学的に許容されるキャリアーもしくはアジュバントまたは両方も含む。ワクチンは予防的または治療的であることが意図される。「予防的」処理は、病変を生じるリスクを低下させる目的のために、疾患の徴候を示さないかまたは初期徴候のみを示す被験体に投与される処理である。ワクチンは、病変を生じる可能性を減少させるかまたはもし生じていれば病変の重症度を最小限にする予防的処理として与えることができる。「治療的」処理は、徴候または症状を減じるかまたは消失させる目的のために、病変の徴候または症状を示す被験体に投与される処理である。徴候または症状は、生化学的、細胞性、組織学的、機能的、主観的または客観的であり得る。
【０１４７】
一実施形態において、抗原は、赤血球凝集素（ＨＡ）またはその断片もしくは誘導体である。ＨＡは、約５６０アミノ酸を含むウイルス表面の糖タンパク質である。それは、感染の早期ステージにおけるウイルスの接着および宿主細胞の中への浸透に関与する。Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５またはＨ１６サブタイプとして分類される少なくとも１６の公知のＨＡサブタイプがある。赤血球凝集素は、インフルエンザウイルスに加えて他の多くの細菌およびウイルスの表面上で見出される。現在、ヒトにおけるインフルエンザ感染の最も重要な原因は、インフルエンザタイプＡのサブタイプＨ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２に起因するものである。しかしながら、パンデミック感染を引き起こし得る、典型的なインフルエンザワクチンによって保護されないインフルエンザ株は、例えばＨ５Ｎ１サブタイプである。Ｈ２、Ｈ７およびＨ９サブタイプもパンデミックの可能性を有する。高病原性鳥インフルエンザウイルスは、鳥類における、重篤な呼吸器疾患および死亡を引き起こし得る。この特徴は、Ｈ５およびＨ７のサブタイプのＨＡのみについて知られている。いくつかの鳥ウイルスにはヒトに伝達する能力があるので、ヒトの健康の不安にもなっている。鳥インフルエンザウイルスの病原性はポリジーンの特性であるが、ＨＡタンパク質が感染において主要な役割を有することが示されている。ＨＡタンパク質は単量体、二量体または、三量体の形態で発現され得る。任意のＨＡサブタイプおよびバリアントに加えて任意のＨＡの単量体、二量体または三量体の形態は、対象となるタンパク質であり得、本明細書において記載されたＶＬＰ中に存在することができる。
【０１４８】
赤血球凝集素タンパク質は、抗体の使用を含む標準的方法を使用して、ＥＬＩＳＡによって検出することができる。赤血球凝集の活性を測定する方法は、当該技術分野において周知であり、ＷＯ２００４／０９８５３３中に記載されるような赤血球によるインキュベーションを含む。
【０１４９】
対象となる粒子の産生のための宿主は、典型的にはウイルスタンパク質が細胞の複製または感染を可能にしないものであるだろう。一実施形態において、ウイルスタンパク質は、宿主細胞に由来する細胞種に感染しないウイルスに由来するだろう。例えば、一実施形態において、ウイルス種は哺乳動物に感染し、発現システムは植物宿主細胞を利用する。宿主細胞は対象となる粒子の集合を改善するように修飾され得る。宿主細胞は、例えば発現されたウイルスタンパク質から対象となる粒子の形成を促進するシャペロンタンパク質を含むように修飾され得る。別の実施形態において、宿主細胞をリプレッサータンパク質を含むように修飾し、より効率的にカプシドの発現を調節して対象となる粒子の調節された形成を促進する。
【０１５０】
宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、藻細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞および植物細胞を含む。
【０１５１】
本発明のいくつかの実施形態において、細菌宿主細胞は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属（例えばＡ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ、Ａ．ｒｕｂｉ）である。本発明のいくつかの実施形態において、細菌宿主細胞は、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属（例えばＡ．ａｕｒｅｓｃｅｎｓ、Ａ．ｃｉｔｒｅｕｓ、Ａ．ｇｌｏｂｆｏｒｍｉｓ、Ａ．ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ、Ａ．ｍｙｓｏｒｅｎｓ、Ａ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ、Ａ．ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ、Ａ．ｐｒｏｔｏｐｈｏｎｎｉａｅ、Ａ．ｒｏｓｅｏｐａｒｑｆｆｉｎｕｓ、Ａ．ｓｕｌｆｕｒｅｕｓおよびＡ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）である。本発明のいくつかの実施形態において、細菌宿主細胞は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属（例えばＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｅｎｔｏｓ、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｆｉｒｍｕｓ、Ｂ．ａｌｋａｏｐｈｉｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓおよびＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）である。特定の実施形態において、宿主細胞は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓを含むがこれらに限定されない産業用のＢａｃｉｌｌｕｓ系統であるだろう。いくつかの実施形態において、細菌宿主細胞は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属（例えばＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ  Ｅ８８、Ｃ．ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｓｅ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）である。いくつかの実施形態において、細菌宿主細胞は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属（例えばＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃ．ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）である。いくつかの実施形態において、細菌宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属（例えばＥ．ｃｏｌｉ）である。いくつかの実施形態において、細菌宿主細胞は、Ｅｒｗｉｎｉａ属（例えばＥ．ｕｒｅｄｏｖｏｒａ、Ｅ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｅ．ａｎａｎａｓ、Ｅ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａ、Ｅ．ｐｕｎｃｔａｔａ、Ｅ．ｔｅｒｒｅｕｓ）である。いくつかの実施形態において、細菌宿主細胞は、Ｐａｎｔｏｅａ属（例えばＰ．ｃｉｔｒｅａおよびＰ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）である。いくつかの実施形態において、細菌宿主細胞は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属（例えばＰ．ｐｕｔｉｄａ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ）である。いくつかの実施形態において、細菌宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属（例えばＳ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｅｓ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ）である。いくつかの実施形態において、細菌宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属（例えばＳ．ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔ���ｌｉｓ、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）である。いくつかの実施形態において、細菌宿主細胞は、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属（例えばＺ．ｍｏｂｉｌｉｓおよびＺ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である。組換えタンパク質には、迅速で効果的で低費用で多量の収率の可能性があるので、対象となる粒子（ＶＬＰ等の）の産生のための発現システムにおける宿主細胞として細菌を検査した。研究者は、非熱帯性腸内細菌において、組換えタンパク質挿入物のない特定の野生型ウイルスカプシドを遺伝子導入により発現させることができることを示している。研究者は、これらのカプシドをインビボおよびインビトロの両方で集合させて対象となる粒子（ＶＬＰ等）を形成できることも示している。
【０１５２】
酵母宿主細胞は、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属およびＹａｒｒｏｗｉａ属であるがこれらに限定されない細胞であり得る。本発明のいくつかの実施形態において、酵母細胞は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｄａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｑｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓおよびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである。
【０１５３】
真菌宿主細胞は、Ａｃｈｌｙａ属、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ属、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ属、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ属、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ属、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ属、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ属、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ属、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ属、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ属、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ属、Ｄｉｐｌｏｄｉａ属、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ属、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ属、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ属、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属、Ｈｙｐｏｃｒｅａ属、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ属、Ｍｕｃｏｒ属、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ属、Ｐｈｌｅｂｉａ属、Ｐｉｒｏｍｙｃｅ属「、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ属、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ属；Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ属、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ属、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ属、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ属、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ属、Ｔｒａｍｅｔｅｓ属、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ属、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ属、またはその有性世代もしくは無性世代および異名もしくは分類学的同等物であるがこれらに限定されない細胞であり得る。
【０１５４】
本発明のいくつかの実施形態において、宿主細胞は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ（例えばＣ．Ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）およびＰｈｏｒｍｉｄｉｕｍ（Ｐ．種ＡＴＣＣ２９４０９）等の藻細胞である。
【０１５５】
昆虫宿主細胞の例は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９またはＳｆ２１）またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉｏａｎｉ細胞（Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ）等の鱗翅目細胞株を含む。
【０１５６】
哺乳類宿主細胞の例は、チャイニーズハムスター（ＣＨＯ）細胞株（例えばＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、ミドリザル細胞株（ＣＯＳ）（例えばＣＯＳ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）、ＣＯＳ７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５１））；マウス細胞（例えばＮＳ／Ｏ）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞株（例えばＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６３２またはＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０）、およびヒト細胞（例えばＨＥＫ  ２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３））を含む。
【０１５７】
一実施形態において、宿主は植物であり、宿主細胞は植物細胞である。植物細胞は植物に由来または由来可能であるか、または植物の外部で培養された培養植物細胞であり得る。従って、一実施形態において、植物は、植物細胞（インビトロで成長させた植物細胞または細胞のクランプ等の培養でまたは植物の外部で成長させた植物細胞等）である。植物の非限定的例は、単子葉植物および双子葉植物（作物植物、観賞植物、および非栽培植物または野生植物等）を含む。さらなる例は、作物植物（特にヒト食品または動物食物のために使用される作物植物）、木材またはパルプを産生する樹木、野菜植物、果実植物および観賞用植物等の商業用または農業用に興味を持たれる植物を含む。
【０１５８】
植物の非限定的例は、穀類作物植物（コムギ、カラスムギ、オオムギ、トウモロコシ、ライムギ、ライコムギ、コメ、キビ、ソルガム、キノア、アマランサスおよびソバ等）；飼料作物植物（アルファルファ、カラスノエンドウ、クローバおよび同種のものを含む飼料用草および飼料用双子葉植物等）；脂肪種子作物植物（綿、ベニバナ、ヒマワリ、ダイズ、キャノーラ、ナタネ、アマ、ピーナッツおよびアブラヤシ等）；樹木の木の実（クルミ、カシュー、ヘーゼルナッツ、ピーカン、アーモンドおよび同種のもの等）；サトウキビ、ココナッツ、ナツメヤシ、オリーブ、テンサイ、茶およびコーヒー；木材またはパルプを産生する樹木；マメ科植物（例えばマメ、エンドウ、ヒラマメ、アルファルファ、ピーナッツ）、レタス、アスパラガス、アーティチョーク、セロリ、ニンジン、ラディッシュ、アブラナ科植物（例えばキャベツ、ケール、カラシナおよび他の葉が多いアブラナ科植物、ブロッコリ、カリフラワー、メキャベツ、カブ、コールラビ）、ウリ科植物（例えばキュウリ、メロン、夏カボチャ、冬カボチャ）、ネギ科植物（例えば玉ねぎ、ニンニク、リーキ、エシャロット、チャイブ）、ナス科植物のメンバー（例えばトマト、ナス、じゃがいも、胡椒、ホオズキ）、およびアカザ科の植物のメンバー（例えばビート、フダンソウ、ホウレンソウ、キノア、アマランサス）等の野菜作物植物；リンゴ、西洋ナシ、柑橘類（例えばオレンジ、ライム、レモン、グレープフルーツおよび他のもの）、核果（例えばアプリコット、モモ、プラム、ネクタリン）、バナナ、パイナップル、ブドウ、キーウィフルーツ、パパイア、アボカドおよびベリー等の果実作物植物；ならびに観賞用顕花植物、観賞用樹木および低木、観賞用地被植物ならびに観賞用草を含む観賞用植物を含む。双子葉植物のさらなる例は、キャノーラ、綿、ジャガイモ、キノア、アマランサス、ソバ、ベニバナ、ダイズ、テンサイおよびヒマワリ、より好適にはダイズ、キャノーラおよび綿を含むが、これらに限定されない。単子葉植物のさらなる例は、コムギ、カラスムギ、オオムギ、トウモロコシ、ライムギ、ライコムギ、コメ、観賞用草および飼料草、ソルガム、キビならびにサトウキビを含むが、これらに限定されない。組換えタンパク質産生宿主としての植物は、対象となる粒子の捕捉および精製の間に除去され得る混入物のユニークなセットを含む。さらに、植物固形物（抽出後の早期除去が要求される）は、一般的に従来の細菌および哺乳類の細胞培養残屑よりも、より高い濃度でより広い範囲でより稠密なものである。典型的な植物の加工および精製のスキームは、組換えタンパク質を含む植物組織の単離、粒子サイズ減少に加えて組織の分画、水性媒質の中への標的タンパク質の抽出、粗製抽出物の清澄化、および最終的な生産物の精製からなる。それゆえ、植物細胞からの対象となる粒子の捕捉における改良は、全体的な生産コストに有利な影響を与えるだろう。
【０１５９】
本発明において使用のために好適な植物材料は、以下の科のうちの１つからの種を含む単子葉植物もしくは双子葉植物またはそれらの植物細胞システムであり得るかまたはそれらに由来し得る。Ａｃａｎｔｈａｃｅａｅ、Ａｌｌｉａｃｅａｅ、Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａｃｅａｅ、Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ、Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ、Ａｒｅｃａｃｅａｅ、Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ、Ｂｅｒｂｅｒｉｄａｃｅａｅ、Ｂｉｘａｃｅａｅ、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ、Ｂｒｏｍｅｌｉａｃｅａｅ、Ｃａｎｎａｂａｃｅａｅ、Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ、Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘａｃｅａｅ、Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ、Ｃｏｌｃｈｉｃａｃｅａｅ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｃｅａｅ、Ｅｐｈｅｄｒａｃｅａｅ、Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌａｃｅａｅ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ、Ｆａｂａｃｅａｅ、Ｌａｍｉａｃｅａｅ、Ｌｉｎａｃｅａｅ、Ｌｙｃｏｐｏｄｉａｃｅａｅ、Ｍａｌｖａｃｅａｅ、Ｍｅｌａｎｔｈｉａｃｅａｅ、Ｍｕｓａｃｅａｅ、Ｍｙｒｔａｃｅａｅ、Ｎｙｓｓａｃｅａｅ、Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ、Ｐｉｎａｃｅａｅ、Ｐｌａｎｔａｇｉｎａｃｅａｅ、Ｐｏａｃｅａｅ、Ｒｏｓａｃｅａｅ、Ｒｕｂｉａｃｅａｅ、Ｓａｌｉｃａｃｅａｅ、Ｓａｐｉｎｄａｃｅａｅ、Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ、Ｔａｘａｃｅａｅ、またはＶｉｔａｃｅａｅ。
【０１６０】
好適な種は、属、Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ、Ａｂｉｅｓ、Ａｃｅｒ、Ａｇｒｏｓｔｉｓ、Ａｌｌｉｕｍ、Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａ、Ａｎａｎａｓ、Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ、Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ、Ａｒｕｎｄｏ、Ａｔｒｏｐａ、Ｂｅｒｂｅｒｉｓ、Ｂｅｔａ、Ｂｉｘａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ｃａｌｅｎｄｕｌａ、Ｃａｍｅｌｌｉａ、Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ、Ｃａｎｎａｂｉｓ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ、Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ、Ｃｉｎｃｈｏｎａ、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ、Ｃｏｆｆｅａ、Ｃｏｌｃｈｉｃｕｍ、Ｃｏｌｅｕｓ、Ｃｕｃｕｍｉｓ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｄａｔｕｒａ、Ｄｉａｎｔｈｕｓ、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ、Ｅｌａｅｉｓ、Ｅｐｈｅｄｒａ、Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ、Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｆｒａｇａｒｉａ、Ｇａｌａｎｔｈｕｓ、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ、Ｈｅｖｅａ、Ｈｏｒｄｅｕｍ、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ、Ｊａｔｒｏｐｈａ、Ｌａｃｔｕｃａ、Ｌｉｎｕｍ、Ｌｏｌｉｕｍ、Ｌｕｐｉｎｕｓ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ、Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ、Ｍａｎｉｈｏｔ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ、Ｍｅｎｔｈａ、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ、Ｍｕｓａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｏｒｙｚａ、Ｐａｎｉｃｕｍ、Ｐａｐａｖｅｒ、Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ、Ｐｅｔｕｎｉａ、Ｐｈａｌａｒｉｓ、Ｐｈｌｅｕｍ、Ｐｉｎｕｓ、Ｐｏａ、Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ、Ｐｏｐｕｌｕｓ、Ｒａｕｗｏｌｆｉａ、Ｒｉｃｉｎｕｓ、Ｒｏｓａ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ、Ｓａｌｉｘ、Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉａ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｓｏｒｇｈｕｍ、Ｓｐａｒｔｉｎａ、Ｓｐｉｎａｃｅａ、Ｔａｎａｃｅｔｕｍ、Ｔａｘｕｓ、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ、Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｕｎｉｏｌａ、Ｖｅｒａｔｒｕｍ、Ｖｉｎｃａ、Ｖｉｔｉｓ、およびＺｅａのメンバーを含み得る。
【０１６１】
好適な種は、Ｐａｎｉｃｕｍ属の種、Ｓｏｒｇｈｕｍ属の種、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ属の種、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ属の種、Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ属の種、Ｐｏｐｕｌｕｓ属の種、Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ  ｇｅｒａｒｄｉｉ（ビッグブルーステム）、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ（エレファントグラス）、Ｐｈａｌａｒｉｓ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ（クサヨシ）、Ｃｙｎｏｄｏｎ  ｄａｃｔｙｌｏｎ（バミューダグラス）、Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ（ヒロハノウシノケグサ）、Ｓｐａｒｔｉｎａ  ｐｅｃｔｉｎａｔａ（プレーリーコードグラス）、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ（アルファルファ）、Ａｒｕｎｄｏ  ｄｏｎａｘ（ダンチク）、Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ（ライムギ）、Ｓａｌｉｘ属の種（ヤナギ）、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ属の種（ユーカリ）、Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ属（コムギ類  −コムギ×ライムギ）、タケ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ（ヒマワリ）、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ（ベニバナ）、Ｊａｔｒｏｐｈａ  ｃｕｒｃａｓ（ジャトロファ）、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ（キャスター）、Ｅｌａｅｉｓ  ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ（ヤシ）、Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ（アマ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ、Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ（テンサイ）、Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ（キャッサバ）、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（トマト）、Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ（レタス）、Ｍｕｓａ  ｐａｒａｄｉｓｉａｃａ（バナナ）、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ジャガイモ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ（ブロッコリ、カリフラワー、メキャベツ）、Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ（茶）、Ｆｒａｇａｒｉａ  ａｎａｎａｓｓａ（イチゴ）、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ（ココア）、Ｃｏｆｆｅａアラビカ（コーヒー）、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ（ブドウ）、Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ（パイナップル）、Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｍ（トウガラシおよび甘トウガラシ）、Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ（玉ねぎ）、Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ（メロン）、Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ（キュウリ）、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍａｘｉｍａ（カボチャ）、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍｏｓｃｈａｔａ（カボチャ）、Ｓｐｉｎａｃｅａ  ｏｌｅｒａｃｅａ（ホウレンソウ）、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ（スイカ）、Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ（オクラ）、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｅｌｏｎｇｅｎａ（ナス）、Ｒｏｓａ属の種（バラ）、Ｄｉａｎｔｈｕｓ  ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ（カーネーション）、Ｐｅｔｕｎｉａ属の種（ペチュニア）、Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ（ポインセチア）、Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｌｂｕｓ（ルピナス）、Ｕｎｉｏｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（カラスムギ）、ベントグラス（Ａｇｒｏｓｔｉｓ属の種）、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ（アスペン）、Ｐｉｎｕｓ属の種（マツ）、Ａｂｉｅｓ属の種（モミ）、Ａｃｅｒ属の種（モミジ）、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ（オオムギ）、Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ（ブルーグラス）、Ｌｏｌｉｕｍ属の種（ライグラス）およびＰｈ��ｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ（オオアワガエリ）、Ｐａｎｉｃｕｍ  ｖｉｒｇａｔｕｍ（スイッチグラス）、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ（ソルガム、スーダングラス）、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ（ススキ）、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ属の種（エネルギー用サトウキビ）、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ（ポプラ）、Ｚｅａ  ｍａｙｓ（トウモロコシ）、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（ダイズ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ（キャノーラ）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ（コムギ）、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ（綿）、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ（コメ）、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ（ヒマワリ）、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ（アルファルファ）、Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ（テンサイ）またはＰｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ（トウジンヒエ）を含み得る。
【０１６２】
植物材料は、属Ｎｉｃｏｔｉａｎａ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ属の様々な種）の植物を含み、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａおよびＮ．ｔａｂａｃｕｍ（例えばＬＡ  Ｂ２１、ＬＮ  ＫＹ１７１、ＴＩ  １４０６、Ｂａｓｍａ、Ｇａｌｐａｏ、Ｐｅｒｉｑｕｅ、Ｂｅｉｎｈａｒｔ  １０００−１およびＰｅｔｉｃｏ）を含む、天然に存在、突然変異、天然に存在しない、またはトランスジェニックのタバコ植物であり得るかまたはそれらに由来し得る。他の種は、Ｎ．ａｃａｕｌｉｓ、Ｎ．ａｃｕｍｉｎａｔａ、Ｎ．ａｃｕｍｉｎａｔａ多花性変種、Ｎ．ａｆｒｉｃａｎａ、Ｎ．ａｌａｔａ、Ｎ．ａｍｐｌｅｘｉｃａｕｌｉｓ、Ｎ．ａｒｅｎｔｓｉｉ、Ｎ．ａｔｔｅｎｕａｔａ、Ｎ．ｂｅｎａｖｉｄｅｓｉｉ、Ｎ．ｒｕｓｔｉｃａ、Ｎ．ｂｉｇｅｌｏｖｉｉ、Ｎ．ｂｏｎａｒｉｅｎｓｉｓ、Ｎ．ｃａｖｉｃｏｌａ、Ｎ．ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉ、Ｎ．ｃｏｒｄｉｆｏｌｉａ、Ｎ．ｃｏｒｙｍｂｏｓａ、Ｎ．ｄｅｂｎｅｙｉ、Ｎ．ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ、Ｎ．ｆｏｒｇｅｔｉａｎａ、Ｎ．ｆｒａｇｒａｎｓ、Ｎ．ｇｌａｕｃａ、Ｎ．ｇｌｕｔｉｎｏｓａ、Ｎ．ｇｏｏｄｓｐｅｅｄｉｉ、Ｎ．ｇｏｓｓｅｉ、Ｎ．ｈｙｂｒｉｄ、Ｎ．ｉｎｇｕｌｂａ、Ｎ．ｋａｗａｋａｍｉｉ、Ｎ．ｋｎｉｇｈｔｉａｎａ、Ｎ．ｌａｎｇｓｄｏｒｆｆｉｉ、Ｎ．ｌｉｎｅａｒｉｓ、Ｎ．ｌｏｎｇｉｆｌｏｒａ、Ｎ．ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｎ．ｍｅｇａｌｏｓｉｐｈｏｎ、Ｎ．ｍｉｅｒｓｉｉ、Ｎ．ｎｏｃｔｉｆｌｏｒａ、Ｎ．ｎｕｄｉｃａｕｌｉｓ、Ｎ．ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ、Ｎ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｎ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ亜種ｈｅｓｐｅｒｉｓ、Ｎ．ｏｔｏｐｈｏｒａ、Ｎ．ｐａｎｉｃｕｌａｔａ、Ｎ．ｐａｕｃｉｆｌｏｒａ、Ｎ．ｐｅｔｕｎｉｏｉｄｅｓ、Ｎ．ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ、Ｎ．ｑｕａｄｒｉｖａｌｖｉｓ、Ｎ．ｒａｉｍｏｎｄｉｉ、Ｎ．ｒｅｐａｎｄａ、Ｎ．ｒｏｓｕｌａｔａ、Ｎ．ｒｏｓｕｌａｔａ亜種ｉｎｇｕｌｂａ、Ｎ．ｒｏｔｕｎｄｉｆｏｌｉａ、Ｎ．ｓｅｔｃｈｅｌｌｉｉ、Ｎ．ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｎ．ｓｏｌａｎｉｆｏｌｉａ、Ｎ．ｓｐｅｇａｚｚｉｎｉｉ、Ｎ．ｓｔｏｃｋｔｏｎｉｉ、Ｎ．ｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ、Ｎ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ、Ｎ．ｔｈｙｒｓｉｆｌｏｒａ、Ｎ．ｔｏｍｅｎｔｏｓａ、Ｎ．ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ、Ｎ．ｔｒｉｇｏｎｏｐｈｙｌｌａ、Ｎ．ｕｍｂｒａｔｉｃａ、Ｎ．ｕｎｄｕｌａｔａ、Ｎ．ｖｅｌｕｔｉｎａ、Ｎ．ｗｉｇａｎｄｉｏｉｄｅｓ、およびＮ．ｘｓａｎｄｅｒａｅを含む。
【０１６３】
栽培品種または選良栽培品種からのまたはそれらに由来する植物材料の使用も意図される。品種または栽培品種の非限定的例は、ＢＤ  ６４、ＣＣ  １０１、ＣＣ  ２００、ＣＣ  ２７、ＣＣ  ３０１、ＣＣ  ４００、ＣＣ  ５００、ＣＣ  ６００、ＣＣ  ７００、ＣＣ  ８００、ＣＣ  ９００、Ｃｏｋｅｒ  １７６、Ｃｏｋｅｒ  ３１９、Ｃｏｋｅｒ  ３７１  Ｇｏｌｄ、Ｃｏｋｅｒ  ４８、ＣＤ  ２６３、Ｄｅｎｚｉｚｌｉ、ＤＦ９１１、Ｇａｌｐａｏタバコ、ＧＬ  ２６Ｈ、ＧＬ  ３５０、ＧＬ  ６００、ＧＬ  ７３７、ＧＬ  ９３９、ＧＬ  ９７３、ＨＢ  ０４Ｐ、Ｋ  １４９、Ｋ  ３２６、Ｋ  ３４６、Ｋ  ３５８、Ｋ３９４、Ｋ  ３９９、Ｋ  ７３０、ＫＤＨ  ９５９、ＫＴ  ２００、ＫＴ２０４ＬＣ、ＫＹ１０、ＫＹ１４、ＫＹ  １６０、ＫＹ  １７、ＫＹ  １７１、ＫＹ  ９０７、ＫＹ９０７ＬＣ、ＫＴＹ１４ｘＬ８  ＬＣ、Ｋａｒａｂａｇｌａｒ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｒｉｔｔｅｎｄｅｎ、ＭｃＮａｉｒ  ３７３、ＭｃＮａｉｒ  ９４４、ｍｓＫＹ  １４ｘＬ８、Ｎａｒｒｏｗ  Ｌｅａｆ  Ｍａｄｏｌｅ、ＮＣ  １００、ＮＣ  １０２、ＮＣ  ２０００、ＮＣ  ２９１、ＮＣ  ２９７、ＮＣ  ２９９、ＮＣ  ３、ＮＣ  ４、ＮＣ  ５、ＮＣ  ６、ＮＣ７、ＮＣ  ６０６、ＮＣ  ７１、ＮＣ  ７２、ＮＣ  ８１０、ＮＣ  ＢＨ  １２９、ＮＣ  ２００２、Ｎｅａｌ  Ｓｍｉｔｈ  Ｍａｄｏｌｅ、ＯＸＦＯＲＤ  ２０７、「Ｐｅｒｉｑｕｅ」タバコ、ＰＶＨ０３、ＰＶＨ０９、ＰＶＨ１９、ＰＶＨ５０、ＰＶＨ５１、Ｒ  ６１０、Ｒ  ６３０、Ｒ  ７−１１、Ｒ  ７−１２、ＲＧ  １７、ＲＧ  ８１、ＲＧ  Ｈ５１、ＲＧＨ  ４、ＲＧＨ  ５１、ＲＳ  １４１０、Ｓｐｅｉｇｈｔ  １６８、Ｓｐｅｉｇｈｔ  １７２、Ｓｐｅｉｇｈｔ  １７９、Ｓｐｅｉｇｈｔ  ２１０、Ｓｐｅｉｇｈｔ  ２２０、Ｓｐｅｉｇｈｔ  ２２５、Ｓｐｅｉｇｈｔ  ２２７、Ｓｐｅｉｇｈｔ、Ｓｐｅｉｇｈｔ  Ｇ−２８  ２３４、Ｓｐｅｉｇｈｔ  Ｇ−７０、Ｓｐｅｉｇｈｔ  Ｈ−６、Ｓｐｅｉｇｈｔ  Ｈ２０、Ｓｐｅｉｇｈｔ  ＮＦ３、ＴＩ  １４０６、ＴＩ  １２６９、ＴＮ、ＴＮ８６ＬＣ  ８６、ＴＮ  ９０、ＴＮ  ９７、ＴＮ９７ＬＣ、ＴＮ  Ｄ９４、ＴＮ  Ｄ９５０、ＴＲ（Ｔｏｍ  Ｒｏｓｓｏｎ）Ｍａｄｏｌｅ、Ｔｕｒｋｉｓｈ  Ｓａｍｓｏｎ、ＶＡ  ３０９、ＶＡ３５９、ＤＡＣ、Ｍａｔａ、Ｆｉｎａ、ＰＯ２、ＢＹ−６４、ＡＳ４４、ＲＧ１７、ＲＧ８、ＨＢ０４Ｐ、Ｂａｓｍａ  Ｘａｎｔｈｉ  ＢＸ  ２Ａ、Ｃｏｋｅｒ  ３１９、Ｈｉｃｋｓ、ＭｃＮａｉｒ  ９４４（ＭＮ  ９４４）、Ｂｕｒｌｅｙ、Ｋ１４９、Ｙａｋａ  ＪＢ  １２５／３、Ｋａｓｔｕｒｉ  Ｍａｗａｒ  ２１、ＮＣ  ２９７、Ｃｏｋｅｒ  ３７１  Ｇｏｌｄ、ＰＯ２、Ｗｉｓｌｉｃａ、Ｓｉｍｍａｂａ、Ｔｕｒｋｉｓｈ  Ｓａｍｓｕｎ、ＡＡ３７−１、Ｂ１３Ｐ、ＢＵ２１×Ｈｏｊａ  Ｐａｒａｄｏ系統９７の交配からのＦ４、ＳａｍｓｕｎまたはＰＯ１である。Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ栽培品種の非限定的例は、ＡＡ  ３７−１、Ｂ  １３Ｐ、Ｘａｎｔｈｉ（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ−Ｍｏｒ）、ＫＴＲＤ＃３ハイブリッド１０７、Ｂｅｌ−Ｗ３、７９−６１５、Ｓａｍｓｕｎ  Ｈｏｌｍｅｓ  ＮＮ、ＫＴＲＤＣ＃２ハイブリッド４９、ＫＴＲＤＣ＃４ハイブリッド１１０、Ｂｕｒｌｅｙ  ２１、ＢＹ−６４、ＫＴＲＤＣ＃５  ＫＹ  １６０  ＳＩ、ＫＴＲＤＣ＃７  ＦＣＡ、ＫＴＲＤＣ＃６  ＴＮ  ８６  ＳＩ、Ｃｏｋｅｒ  ３７１  Ｇｏｌｄ、Ｋ  １４９、Ｋ  ３２６、Ｋ  ３４６、Ｋ  ３５８、Ｋ  ３９４、Ｋ  ３９９、Ｋ  ７３０、ＫＹ  １０、ＫＹ  １４、ＫＹ  １６０、ＫＹ  １７、ＫＹ  ８９５９、ＫＹ  ９、ＫＹ  ９０７、ＭＤ  ６０９、ＭｃＮａｉｒ  ３７３、ＮＣ  ２０００、ＰＧ  ０１、ＰＧ  ０４、Ｍ０６６、ＰＯ１、ＰＯ２、ＰＯ３、ＲＧ  １１、ＲＧ  １７、ＲＧ  ８、Ｓｐｅｉｇｈｔ  Ｇ−２８、ＴＮ  ８６、ＴＮ  ９０、ＶＡ  ５０９、ＡＳ４４、Ｂａｎｋｅｔ  Ａ１、Ｂａｓｍａ  Ｄｒａｍａ  Ｂ８４／３１、Ｂａｓｍａ  Ｉ  Ｚｉｃｈｎａ  ＺＰ４／Ｂ、Ｂａｓｍａ  Ｘａｎｔｈｉ  ＢＸ  ２Ａ、Ｂａｔｅｋ、Ｂｅｓｕｋｉ  Ｊｅｍｂｅｒ、Ｃ１０４、Ｃｏｋｅｒ  ３１９、Ｃｏｋｅｒ  ３４７、Ｃｒｉｏｌｌｏ  Ｍｉｓｉｏｎｅｒｏ、ＤＡＣ  Ｍａｔａ  Ｆｉｎａ、Ｄｅｌｃｒｅｓｔ、Ｄｊｅｂｅｌ  ８１、ＤＶＨ  ４０５、Ｇａｌｐａｏ  Ｃｏｍｕｍ、ＨＢ０４Ｐ、Ｈｉｃｋｓ  Ｂｒｏａｄｌｅａｆ、Ｋａｂａｋｕｌａｋ  Ｅｌａｓｓｏｎａ、Ｋａｓｔｕｒｉ  Ｍａｗａｒ、Ｋｕｔｓａｇｅ  Ｅ１、ＫＹ  １４ｘＬ８、ＫＹ  １７１、ＬＡ  ＢＵ  ２１、ＭｃＮａｉｒ  ９４４、ＮＣ  ２３２６、ＮＣ  ７１、ＮＣ  ２９７、ＮＣ  ３、ＰＶＨ  ０３、ＰＶＨ  ０９、ＰＶＨ  １９、ＰＶＨ  ２１１０、Ｒｅｄ  Ｒｕｓｓｉａｎ、Ｓａｍｓｕｎ、Ｓａｐｌａｋ、Ｓｉｍｍａｂａ、Ｔａｌｇａｒ  ２８、Ｔｕｒｋｉｓｈ  Ｓａｍｓｕｎ、Ｗｉｓｌｉｃａ、Ｙａｙａｌｄａｇ、ＮＣ、ＴＲ  Ｍａｄｏｌｅ  ４、Ｐｒｉｌｅｐ  ＨＣ−７２、Ｐｒｉｌｅｐ  Ｐ２３、Ｐｒｉｌｅｐ  ＰＢ  １５６／１、Ｐｒｉｌｅｐ  Ｐ１２−２／１、Ｙａｋａ  ＪＫ−４８、Ｙａｋａ  ＪＢ  １２５／３、ＴＩ−１０６８、ＫＤＨ−９６０、ＴＩ−１０７０、ＴＷ１３６、Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮ、Ｉｚｍｉｒ、Ｂａｓｍａ、ＴＫＦ  ４０２８、Ｌ８、ＴＫＦ  ２００２、ＴＮ９０、ＧＲ１４１、Ｂａｓｍａ  ｘａｎｔｈｉ、ＧＲ１４９、ＧＲ１５３、Ｐｅｔｉｔ  ＨａｖａｎａまたはＸａｎｔｈｉ  ＮＮである。
【０１６４】
一過性の発現システムは、本発明の方法において使用される植物を生成するのに特に好適である。かかる一過性の発現システム（好適にはＮｉｃｏｔｉａｎａ属の様々な種およびＮ．ｔａｂａｃｕｍの品種と共に使用される）は、当該技術分野において公知であり、アグロバクテリウムが植物細胞の中へ対象となるタンパク質をコードする核酸分子（典型的にはアグロバクテリウム中で複製することができる発現コンストラクト）を移行させる能力に依存する、物理的方法（例えば真空または大気圧を超える圧力の適用）を介する遺伝子操作されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの懸濁物の植物全体の葉の中へのインフィルトレーションを含む。インフィルトレーションされた植物細胞中での発現コンストラクトのコピー数は、遺伝子導入植物の生成に使用されるものよりも高い。アグロバクテリウムのインフィルトレーションは組み込みをもたらし得るが、本発明において使用される植物の生成に使用している一過性の発現は、植物ゲノムの中への発現コンストラクトの組み込みを要求しないことによって特徴づけられる。従って、大多数のインフィルトレーションしされた植物細胞は、組み込まれた発現コンストラクトを含むゲノムを含まない。一過性の発現は、子孫植物の中への発現コンストラクトの伝達も要求しない。一般的に、インフィルトレーション後の２〜１５日または好適には４〜６日内に、組換えタンパク質はインフィルトレーションされた植物細胞中に蓄積し、ウイルス様粒子を形成する。バイオマス（特にインフィルトレーションされた葉）をこの時に収穫し、粒子の単離のために加工することができる。従って、植物材料は、ウイルス様粒子中に存在するタンパク質を一過性に発現する植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａまたはＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍの品種等）、好適にはタンパク質をコードし、インフィルトレーションした植物細胞中でタンパク質の発現を一過性に可能にする発現コンストラクトを含むアグロバクテリウム細胞によりインフィルトレーションされた植物に由来し得る。
【０１６５】
原料としての植物材料の使用は、例えば５％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％ｗ／ｗを超える固形物の高含有量のためにさらなる難題となる。原料は、細胞培養上清中で見出されたものよりも高い、高濃度の材料、例えば、１０-4〜１０-2、１０-4〜１０-1、１０-3〜１０-1、１０-4〜１ｍｍ、１０-3〜１ｍｍ、または１０-2〜１ｍｍの範囲中の対象となる粒子を含み得る。原料は、典型的には、脂質、デンプン、リグニン、フェノール化合物および色素を含む化学的な複合体である。細胞培養と比較して植物中の組換えタンパク質の低い収率は、原料のより高い体積のローディングを要求する。
【０１６６】
混合物が植物であるかまたは植物に由来するならば、それは植物ジュース抽出物の形態であり得る。本明細書において使用される時、「植物ジュース抽出物」という用語は、葉緑素を含む植物に由来する液体材料を指す。植物ジュース抽出物は条件付けた植物ジュース抽出物であり得る。
【０１６７】
対象となるタンパク質が１つまたは複数の対象となる粒子中に含まれ得ることを当業者は理解するが、いくつかの実施形態については、対象となる粒子から対象となるタンパク質を単離または精製することが所望され得る。従って、本明細書において記載された方法は、対象となる粒子にタンパク質を精製する任意のさらなる工程を含むことができる。従って、対象となる粒子中に含まれる対象となるタンパク質は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ニッケルクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、分取電気泳動、界面活性剤可溶化、カラムクロマトグラフィーのような物質による選択的沈殿、免疫精製法、および他の物を含むがこれらに限定されない当該技術分野において周知の標準的技法によって、実質的な純度に精製することができる。例えば、確立された分子接着特性を有するタンパク質をリガンドに可逆的に融合させることができる。適切なリガンドにより、タンパク質は精製カラムに選択的に吸着され、次いで比較的純粋な形態でカラムから遊離させることができる。加えて、タンパク質は免疫親和性カラムまたはＮｉ−ＮＴＡカラムを使用して精製することができる。
【０１６８】
本発明の方法は、拡張ベッドとの接触の前または後のいずれかで材料を加工するさらなる工程を含み得ることも理解すべきである。従って、本明細書において記載された方法はさらに上流または下流の加工工程を含み得る。従って、一実施形態において、方法は、拡張ベッドとの接触の前または後に材料を処理する任意のさらなる工程を含む。別の実施形態において、方法は、対象となる粒子が吸着剤から溶出されたならばそれを処理する任意のさらなる工程を含む。従って、例示として、材料は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ニッケルクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、分取電気泳動、界面活性剤可溶化、カラムクロマトグラフィーのような物質による選択的沈殿、免疫精製法、濾過、精密濾過、遠心分離、デカンテーション、もしくは沈降または前述のものの組み合わせにかけられ得る。
【０１６９】
「陽イオン交換樹脂」は負に荷電しており、それは吸着剤または固相の上またはそれらを通って通過される水溶液中の陽イオンとの交換のための遊離陽イオンを有する。陽イオン交換樹脂の形成に好適な任意の負に荷電したリガンド、例えばカルボン酸塩、スルホン酸塩および以下で記載されるような他のものを使用することができる。商業的に入手可能な陽イオン交換樹脂は、例えば、スルホナートベースの基を有するもの（例えばＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＭｏｎｏＳ、ＭｉｎｉＳおよびＳｏｕｒｃｅ  １５Ｓおよび３ＯＳ、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（商標）、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＴｏｓｏｈからのＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳＰ−６５０ＳおよびＳＰ−６５０Ｍ、ＢｉｏＲａｄからのＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｓ、Ｐａｌｌ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＣｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ  Ｓ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ  Ｍ、およびＬＳ  ＳＰおよびＳｐｈｅｒｏｄｅｘ  ＬＳ  ＳＰ）；スルホエチルベースの基を有するもの（例えばＥＭＤからのＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＰｏｒｏｓ  Ｓ−１０およびＳ−２０）；スルホプロピルのベースの基を有するもの（例えばＴｏｓｏｈからのＴＳＫ  Ｇｅｌ  ＳＰ  ５ＰＷおよびＳＰ−５ＰＷ−ＨＲ、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＰｏｒｏｓ  ＨＳ−２０およびＨＳ  ５０）；スルホイソブチルベースの基を有するもの（例えばＥＭＤからのＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＯ3）；スルホキシエチルベースの基を有するもの（例えばＷｈａｔｍａｎからのＳＥ５２およびＳＥ５３およびＥｘｐｒｅｓｓ−Ｉｏｎ  Ｓ）、カルボキシメチルベースの基を有するもの（例えばＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．からのＨｙｄｒｏｃｅｌｌ  ＣＭ、ＢｉｏＲａｄからのＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ＣＭ、Ｐａｌｌ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＣｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ  ＣＭ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ  Ｍ  ＣＭ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ  ＬＳ  ＣＭ、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＭａｔｒｘ  Ｃｅｌｌｕｆｍｅ  Ｃ５００およびＣ２００、ＷｈａｔｍａｎからのＣＭ５２、ＣＭ３２およびＣＭ２３およびＥｘｐｒｅｓｓ−Ｉｏｎ  Ｃ、ＴｏｓｏｈからのＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＣＭ−６５０Ｓ、ＣＭ−６５０ＭおよびＣＭ−６５０Ｃ）；スルホンおよびカルボン酸ベースの基を有するもの（例えばＪ．Ｔ．ＢａｋｅｒからのＢＡＫＥＰＶＢＯＮＤカルボキシ−スルホン）；カルボン酸ベースの基を有するもの（例えばＪ．Ｔ  ＢａｋｅｒからのＷＰ  ＣＢＸ、Ｄｏｗ  Ｌｉｑｕｉｄ  ＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓからのＤＯＷＥＸ  ＭＡＣ−３、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈからのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  Ｗｅａｋ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ、ＤＯＷＥＸ  Ｗｅａｋ  Ｃａｔｉｏｎ  ＥｘｃｈａｎｇｅｒおよびＤｉａｉｏｎ  Ｗｅａｋ  Ｃａｔｉｏｎ  ＥｘｃｈａｎｇｅｒｓおよびＥＭＤからのＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＣＯＯ−）；スルホン酸ベースの基を有するもの（例えばＢｉｏｃｈｒｏｍ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．からのＨｙｄｒｏｃｅｌｌ  ＳＰ、Ｄｏｗ  Ｌｉｑｕｉｄ  ＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓからのＤＯＷＥＸ  Ｆｉｎｅ  Ｍｅｓｈ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ａｃｉｄ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｉｎ、Ｊ．Ｔ．ＢａｋｅｒからのＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｓ、ＷＰ  Ｓｕｌｆｏｎｉｃ、ＳａｒｔｏｒｉｕｓからのＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓ膜、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈからのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ、ＤＯＷＥＸ  Ｓｔｒｏｎｇ  ＣａｔｉｏｎおよびＤｉａｉｏｎ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒ）；ならびにオルトエステルのベースの基を有するもの（例えばＷｈａｔｍａｎからのＰＩ  １）を含むが、これらに限定されない。
【０１７０】
「陰イオン交換樹脂」は正に荷電しており、従ってそれへ付加された１つまたは複数の正に荷電したリガンドを有する。陰イオン交換樹脂の形成に好適な吸着剤または固相に付加された任意の正に荷電したリガンド（四級アミノ基等）を使用することができる。商業的に入手可能な陰イオン交換樹脂は、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＤＥＡＥセルロース、Ｐｏｒｏｓ  ＰＩ  ２０、ＰＩ  ５０、ＨＱ  １０、ＨＱ  ２０、ＨＱ  ５０、Ｄ  ５０、ＳａｒｔｏｒｉｕｓからのＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ、ＭｏｎｏＱ、ＭｉｎｉＱ、Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｑおよび３ＯＱ、Ｑ、ＤＥＡＥおよびＡＮＸ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＱＡＥ  ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）ならびにＦＡＳＴ  Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｊ．Ｔ．ＢａｋｅｒからのＷＰ  ＰＥＩ、ＷＰ  ＤＥＡＭ、ＷＰ  ＱＵＡＴ、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．からのＨｙｄｒｏｃｅｌｌ  ＤＥＡＥおよびＨｙｄｒｏｃｅｌｌ  ＱＡ、ＢｉｏｒａｄからのＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｑ、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ＤＥＡＥおよびＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｑ、Ｐａｌｌ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＣｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ  Ｑ、Ｃｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ  ＤＥＡＥ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ  ＭおよびＬＳ  ＤＥＡＥ、Ｓｐｈｅｒｏｄｅｘ  ＬＳ  ＤＥＡＥ、ＱＭＡ  Ｓｐｈｅｒｏｓｉｌ  ＬＳ、ＱＭＡ  Ｓｐｈｅｒｏｓｉｌ  ＭおよびＭｕｓｔａｎｇ  Ｑ、Ｄｏｗ  Ｌｉｑｕｉｄ  ＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓからのＤＯＷＥＸ  Ｆｉｎｅ  Ｍｅｓｈ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｂａｓｅ  Ｔｙｐｅ  ＩおよびＴｙｐｅ  ＩＩ  Ａｎｉｏｎ  ＲｅｓｉｎｓおよびＤＯＷＥＸ  ＭＯＮＯＳＰＨＥＲ  Ｅ  ７７、弱塩基陰イオン、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＩｎｔｅｒｃｅｐｔ  Ｑ膜、Ｍａｔｒｅｘ  Ｃｅｌｌｕｆｍｅ  Ａ２００、Ａ５００、Ｑ５００およびＱ８００、ＥＭＤからのＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＴＭＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＤＥＡＥおよびＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＤＭＡＥ、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈからのＡｍｂｅｒｉｉｔｅの弱および強陰イオン交換体タイプＩおよびＩＩ、ＤＯＷＥＸの弱および強陰イオン交換体タイプＩおよびＩＩ、Ｄｉａｉｏｎの弱および強陰イオン交換体タイプＩおよびＩＩ、Ｄｕｏｌｉｔｅ、ＴｏｓｏｈからのＴＳＫゲルＱおよびＤＥＡＥ  ５ＰＷおよび５ＰＷ−ＨＲ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｓ、６５０Ｍおよび６５０Ｃ、ＱＡＥ−５５０Ｃおよび６５０Ｓ、ＤＥＡＥ−６５０Ｍおよび６５０Ｃ、ＷｈａｔｍａｎからのＱＡ５２、ＤＥ２３、ＤＥ３２、ＤＥ５１、ＤＥ５２、ＤＥ５３、  Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｉｏｎ  ＤおよびＥｘｐｒｅｓｓ−Ｉｏｎ  Ｑを含む。
【０１７１】
チオフィリッククロマトグラフィーの使用も意図され、チオフィリック吸着クロマトグラフィーとして公知である。「チオフィリック」という用語は、チオエーテル基に近接して位置するスルホン基についてタンパク質が有する選択性を指す。これは非親和性クロマトグラフィーの１タイプであり、対象となるタンパク質（それはチオフィリック領域および芳香族アミノ残基を含む）は、タンパク質の単離のための硫黄含有リガンドに結合する。チオフィリックゲルはβ−メルカプトエタノールによりジビニルスルホン（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂにカップルされた）を還元することによって調製することができる。チオフィリック吸着クロマトグラフィーは電子供与体−受容体特性に基づき、疎水性に基づいたクロマトグラフィーとは異なる。チオ−エチルスルホン構造が明らかな疎水性またはイオン電荷を持たないので、疎水性会合およびイオン相互作用はチオフィリック吸着剤により起こらない。
【０１７２】
商業的に入手可能なチオフィリッククロマトグラフィー樹脂の例はＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＴＡ（Ｍｅｒｃｋ；Ｒａｈｗａｙ、ＮＪ）、ＵｎｉｆｌｏｗおよびＳｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびＴ−Ｇｅｌ（Ｐｉｅｒｃｅ）を含む。
【０１７３】
「親和性クロマトグラフィー」という用語は、対象となるタンパク質が、通常空間的相補性および１つまたは複数のタイプの化学的相互作用（例えば結合部位での静電力、水素結合、疎水性力および分子間力）の組み合わせとして、生物学的に特異的なリガンドに可逆的および特異的に結合される分離技法を指す。これらの相互作用は、分子の一般的特性（等電点、疎水性またはサイズ等）起因するものではないが、対象となるタンパク質とリガンドとの間の特異的な相互作用（例えばエピトープに結合する免疫グロブリン、免疫グロブリンに結合するプロテインＡ、生物学的応答修飾因子とその細胞表面受容体との間の相互作用）の結果である。多くの実例において、生物学的に特異的なリガンドはタンパク質またはポリペプチドでもあり、固相（ビーズ等）上に固定化され得る。
【０１７４】
「ミックストモードイオン交換樹脂」も本明細書において意図され、カチオン性モイエティ、アニオン性モイエティまたは疎水性モイエティにより共有結合で修飾される固相を指す。ミックストモードイオン交換樹脂の例は、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤ  ＡＢＸ（商標）（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ；Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）、セラミックハイドロキシアパタイトタイプＩおよびＩＩならびにフッ化ハイドロキシアパタイト（ＢｉｏＲａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）ならびにＭＥＰおよびＭＢＩ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ、ＮＹ）を含む。
【０１７５】
「疎水性電荷誘導クロマトグラフィー」（または「ＨＣＩＣ」）という用語は、添加塩（例えばリオトロピック塩）の非存在下において穏やかな疎水性相互作用を介してイオン化リガンドに混合物中の対象となるタンパク質が結合するタイプのミックストモードクロマトグラフィープロセスである。ミックストモードは、結合のための１つのモードおよび溶出のための他のモードを指す。例えば、ＨＣＩＣにおいて有用な固相は、その分離性能のためにチオフィリック効果（すなわち、チオフィリッククロマトグラフィーの特性を利用する）、疎水性およびイオン化基の組み合わせた特性を有するリガンドを含む。従って、本発明の方法において使用される吸着剤は、イオン化リガンドを含み、中性（生理的）または弱酸性のｐＨ（例えば約ｐＨ５〜１０、好ましくは約ｐＨ６〜９．５）で穏やかに疎水性である．このｐＨ範囲で、リガンドの大部分は非荷電であり、穏やかな非特異的疎水性相互作用によって対象となるタンパク質を結合する。ｐＨが減少するにつれて、リガンドは電荷を獲得し、疎水性結合はｐＨシフトに起因して溶質への静電荷反発作用によって破壊される。ＨＣＩＣで使用される好適なリガンドの例は、任意のイオン化芳香族または複素環構造（例えば２−アミノメチルピリジン、３−アミノメチルピリジンおよび４−アミノメチルピリジン、２−メルカプトピリジン、４−メルカプトピリジンまたは４−メルカプトエチルピリジン等のピリジン構造を有するもの）、メルカプト酸、メルカプトアルコール、メルカプトメチルイミダゾール、２−メルカプトベンズイミダゾール、アミノメチルベンズイミダゾール、ヒスタミン、メルカプトベンズイミダゾール、ジエチルアミノプロピルアミン、アミノプロピルモルホリン、アミノプロピルイミダゾール、アミノカプロン酸、ニトロヒドロキシ安息香酸、ニトロチロシン／エタノールアミン、ジクロロサリチル酸、ジブロモチラミン、クロロヒドロキシフェニル酢酸、ヒドロキシフェニル酢酸、チラミン、チオフェノール、グルタチオン、重硫酸塩、および色素を含み、その誘導体を含む。
【０１７６】
対象となる粒子中で発現される１つまたは複数のタンパク質は、配列が由来する生来のタンパク質の少なくとも２０％、３０％または４０％、および好適には少なくとも５０％、６０％または７０％、ならびに最も好適には少なくとも８０％、９０％または９５％の特異的な活性を有することができる。さらに、基質特異性（ｋcat／ｋm）は生来のタンパク質のものに任意で実質的に類似する。典型的には、ｋcat／ｋmは、生来のタンパク質の少なとも３０％、４０％または５０％；およびより好適には少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％になるだろう。タンパク質およびタンパク質活性ならびに基質特異性（ｋcat／ｋm）のアッセイおよび測定値の定量化の方法は、当業者に周知である。
【０１７７】
組換えタンパク質の活性は、従来確立されている生来のタンパク質標準活性と比較することができる。あるいは、組換えタンパク質の活性は、生来のタンパク質と共に同時または実質的に同時に、比較アッセイにおいて決定することができる。例えば、インビトロのアッセイを使用して、組換えタンパク質と標的との間の、例えば発現された酵素と基質との間の、発現されたホルモンとホルモン受容体との間の、発現された抗体と抗原との間のなどの任意の検出可能な相互作用を決定することができる。かかる検出は、熱量変化、増殖変化、細胞死、細胞反発、放射能の変化、可溶性の変化、ゲル電気泳動またはゲル排除方法によって測定された分子量の変化、リン酸化能力、ＥＬＩＳＡアッセイなどの抗体特異性アッセイの測定を含むことができる。加えて、インビボのアッセイは、産生されたタンパク質の生理的作用（例えば免疫反応または炎症の誘導）を、生来のタンパク質の生理的作用に比較して検出するアッセイを含むが、これらに限定されない。一般的に、任意のインビトロまたはインビボのアッセイを使用して、対象となる粒子の活性本質を決定することができる。あるいは、本発明において産生されたタンパク質は、タンパク質と、通常はタンパク質と相互作用する分子（例えば基質）との間の相互作用を刺激または阻害する能力についてアッセイすることができる。かかるアッセイは、典型的には相互作用を可能にする条件下で基質分子とタンパク質を組み合わせる工程を含み、相互作用の生化学的帰結を検出することができる。
【０１７８】
発現されたタンパク質が不溶性タンパクとして発現されるならば、次いでそれを復元または再び折り畳んで、二次および三次のタンパク質構造立体配座を生成することができる。タンパク質を再び折り畳む工程は、組換え生産物の立体配置の完成において必要に応じて使用することができる。再折り畳みおよび復元は、当該技術分野においてタンパク質の解離／会合を促進することが公知の薬剤を使用して遂行することができる。例えば、タンパク質をジチオスレイトールによりインキュベーション、続いて酸化されたグルタチオンジナトリウム塩によりインキュベーション、続いて再折り畳み薬剤（尿素等）を含むバッファーによりインキュベーションすることができる。
【０１７９】
組換えタンパク質は、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または５０ｍＭ  Ｎａ−酢酸塩、ｐＨ６バッファー＋２００ｍＭ  ＮａＣｌに対して透析することによっても復元することができる。あるいは、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％グリセロール、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．４、プロテアーゼ阻害剤含有中で、直線的６Ｍ−１Ｍ尿素勾配を使用することによって、カラム（Ｎｉ  ＮＴＡカラム等）上で固定化される間にタンパク質を再び折り畳むことができる。復元は１．５時間またはそれ以上の期間にわたって実行することができる。復元後に、タンパク質は２５０ｍＭイミダゾールの添加によって溶出することができる。イミダゾールは、ＰＢＳまたは５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ６バッファー＋２００ｍＭ  ＮａＣｌに対する最終的な透析工程によって除去することができる。精製されたタンパク質は、４℃で保存または−８０℃で凍結することができる。
【０１８０】
本発明に従って得られるかまたは得ることができる所望の純度を有する対象となる粒子の配合は、任意の薬学的に許容されるキャリアー、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）を参照）と混合することによって、凍結乾燥された配合または水溶液の形態で、保存のために調製することができる。許容可能なキャリアー、賦形剤または安定剤は、用いられた用量および濃度でレシピエントに無毒であり、バッファー（リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸等）；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム等；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール等）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン等）；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドン等）；アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン等）；単糖、二糖類、および他の炭水化物（グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む）；キレート試薬（ＥＤＴＡ等）；糖（ショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール等）；塩形成カウンターイオン（ナトリウム等）；金属複合体（例えばＺｎタンパク質複合体）；または非イオン性界面活性剤（ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等）を含む。
【０１８１】
本発明は以下の実施例中にさらに記載され、それは請求項中に記載される本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【０１８２】
以下の実施例は限定としてではなく例証として提供される。特別の指示の無い限り、本発明は、生化学、分子生物学および植物生物学の従来の技法および方法を用いる。
【０１８３】
実施例１  Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおけるインフルエンザウイルス様の粒子の一過性の発現
インフルエンザウイルス様粒子は、Ｄ’Ａｏｕｓｔ，Ｍ．−Ａ．，Ｌａｖｏｉｅ，Ｐ．−Ｏ．，Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ｍ．Ｍ．−Ｊ．，Ｔｒｅｐａｎｉｅｒ，Ｓ．，Ｇｕａｙ，Ｊ．−Ｍ．，Ｄａｒｇｉｓ，Ｍ．，Ｍｏｎｇｒａｎｄ，Ｓ．，Ｌａｎｄｒｙ，Ｎ．，Ｗａｒｄ，Ｂ．Ｊ．，Ｖｅｚｉｎａ，Ｌ．−Ｐ．Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ  ｉｎｄｕｃｅ  ａ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ａ  ｌｅｔｈａｌ  ｖｉｒａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６  （２００８）  ９３０−９４０中で記載されるようなＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物において生産される。
【０１８４】
実施例２  赤血球凝集素の検出
赤血球凝集はＷＯ２００４／０９８５３３中で記載されるような赤血球によるインキュベーションによって測定される。赤血球凝集素タンパク質は標準的方法を使用してＥＬＩＳＡによって検出される。赤血球凝集素Ｈ５タンパク質の検出については、Ｉｍｍｕｎｅｔｅｃｈからのウサギ抗Ｈ５抗体（カタログＩＴ−００３−００５Ｖ）およびＪａｃｋｓｏｎからのホースラディシュペルオキシダーゼ標識二次抗体（カタログ１１−０３５−０４６）を使用する。
【０１８５】
実施例３  Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの抽出
実施例１中におよびＤ’Ａｏｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００８年、前出）によって記載されるように、インフィルトレーションされたＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物を収穫前に６日間温室でインキュベーションする。葉の収穫に際して、バイオマスを暗所で４℃で一晩維持し、コーン上に少なくとも４５ｐｓｉの圧力を使用する１５〜２０ｋｇ／時間のねじプレス（Ｖｉｎｃｅｎｔ  ＣＰ−４）を使用してホモジナイズする。緑色ジュース抽出物を回収し、メタ重亜硫酸ナトリウムを１０ｍＭの最終濃度に緑色ジュースに添加する。伝導率を測定し、必要に応じて抽出物を捕捉実験での使用前に水で希釈する。
【０１８６】
実施例４  植物ジュース抽出物からのウイルス様粒子を結合するためのリガンド
抽出物。赤血球凝集素Ｈ５ウイルス様粒子（Ｄ’Ａｏｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）、前出）を含むＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ緑色ジュース抽出物を実施例３中に記載されるようなねじプレスを使用して得た。緑色ジュース抽出物を純水中で５倍に希釈し（最終ｐＨ７）、伝導率を測定した。伝導率は５．６ｍＳ／ｃｍであった。以下の異なる４つのリガンドを結合について試験した。ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）イオン交換体、デキストランベースのＤＥＡＥイオン交換体、デキストランベースのクロロメチル−２−ベンズイミダゾールおよびデキストランベースの１−（２−クロロエチル）塩酸ピペリジンリガンド。様々な吸着剤対使用されるサンプルの比率は１：５であった。静的モードにおけるバッチインキュベーション後に、上清を回収し、赤血球凝集を実施例２の手順に従って測定した。
【０１８７】
結果  ＤＥＡＥ、デキストランベースのＤＥＡＥ、デキストランベースのクロロメチル−２−ベンズイミダゾール、およびデキストランベースの１−（２−クロロエチル）塩酸ピペリジンリガンドとのインキュベーションに際して、赤血球凝集アッセイを使用して測定した、上清中の赤血球凝集素に加えてリガンドに結合した赤血球凝集素の量は、表１中に与えられる。この実験において、緑色植物ジュース抽出物中の赤血球凝集素を含むウイルス様粒子は、ＤＥＡＥベースのイオン交換体吸着剤に最も良好に結合した。
【０１８８】
表１  様々な吸着剤対赤血球凝集素ウイルス様粒子を含む緑色ジュース抽出物の比率、ならびに静的モードにおける様々な吸着剤との抽出物のインキュベーションに際して、上清および結合した材料の赤血球凝集活性（初期抽出物の％）。
【表１】
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【０１８９】
実施例５  ＤＥＡＥイオン交換体への結合への伝導率の影響
実施例１および３中の記述に従って得られるような、赤血球凝集素Ｈ５ウイルス様粒子を含む緑色ジュース抽出物の伝導率の、静的結合モードにおけるＤＥＡＥリガンドへのウイルス様粒子の結合に対する効果を測定して、どのくらい高い伝導率でも緑色ジュース抽出物中のウイルス様粒子がＤＥＡＥイオン交換体に結合できるかを調べる。
【０１９０】
ＤＥＡＥイオン交換体を、５ベッド体積の０．５Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７バッファー、続いて１０ベッド体積の２ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７により平衡化した。緑色ジュース抽出物を、脱イオン水により２．５、３、３．４、４、５、６および７倍に希釈し、ｐＨを７に調節した。様々に希釈された緑色ジュース抽出物の伝導率を測定し、抽出物を静的結合バッチモードにおいてＤＥＡＥイオン交換体により２時間インキュベーションした。様々な伝導率を表２中に示す。各々についての比率は希釈していない抽出物による１：１に対応した。バッチインキュベーション後に、上清を回収し、赤血球凝集を実施例２の方法に従って測定した。結果を表２中に示す。この実験において、緑色ジュース抽出物中のウイルス様粒子の結合は、低伝導率および高伝導率でならびに高希釈および低希釈の緑色ジュース抽出物において等しく効果的だった。
【０１９１】
表２  緑色ジュース抽出物の異なる伝導率での静的モードにおけるＤＥＡＥイオン交換体への赤血球凝集素の結合。
【表２】
2013544509.tif 000003
【０１９２】
実施例６  植物に由来するウイルス様粒子の２工程の捕捉プロセス
２工程プロセス。抽出物および特に緑色の原因となる抽出物中の任意の材料が、大部分のリガンドに粘着し、カラムの目詰まりおよび閉塞を引き起こすので、実施例３中に記載される方法に従って得られた緑色植物ジュース抽出物は、前捕捉を利用する。この目的のために、植物に由来するウイルス様粒子のための２工程の捕捉プロセスを設定した。プロセスは以下のものを含んでいた。
【０１９３】
工程１、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（ｐＨ７で１５０μｍの平均粒子径を備えたイオン交換体）を使用して、静的結合／バッチインキュベーションモードにおいて、緑色植物ジュース抽出物の緑色を決定する不純物および材料を結合させること；
工程２、ｐＨ７で５０μｍの平均粒子径を備えたＤＥＡＥイオン交換体を使用して、拡張ベッド吸着モードにおいて、工程１の上清からのウイルス様粒子を結合させること。
【０１９４】
実験的なセットアップ。実施例３において記載されるようにＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ抽出物を調製し、濾過し、使用前に脱イオン水により５倍に希釈した。最終ｐＨは７であり、工程１におけるインキュベーションの全体積は１５０ｍＬであった。伝導率は５．３ｍＳ／ｃｍであった。ＰＥＩイオン交換体を、５ベッド体積の０．５Ｍトリス／ＨＣｌバッファーｐＨ７、続いて１０ベッド体積の１０ｍＭトリス／ＨＣｌバッファーｐＨ７．０により平衡化した。静的モードにおいてＰＥＩ吸着剤対緑色ジュース抽出物の比率は１：１５であった。合計９．５ｍＬのＰＥＩ吸着剤が使用された。工程２について、インキュベーションは室温で３０分間であり、１４０ｍＬの上清をインキュベーション後に回収した。工程２において、１２０ｍＬの工程１の上清をｐＨ７．０に調整し、拡張ベッド吸着モードにおいて実行した。伝導率は５．４ｍＳ／ｃｍであり、拡張ベッドモードにおいて使用されるＤＥＡＥイオン交換体を、５ベッド体積の０．５Ｍトリス／ＨＣｌバッファーｐＨ７、続いて１０ベッド体積の１０ｍＭトリス／ＨＣｌバッファーｐＨ７．０により平衡化させた。合計１２ｍＬのＤＥＡＥ吸着剤が使用された。拡張ベッドカラムは７０ｃｍのカラム高で直径１ｃｍであった。ベッド高は１５ｃｍであった。ＤＥＡＥ吸着剤対サンプルの比率は１：１０であった。工程１の上清を３．８ｃｍ／分のフロー率でカラム上にロードし、ローディング後に、カラムを１０ｍＭトリス／ＨＣｌ  ｐＨ７．０を含む洗浄バッファーにより洗浄した。結合材料を、５０ｍＭトリス／ＨＣｌおよび１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．０を含む溶出バッファーを使用して溶出した。素通りおよび洗浄画分を２５ｍＬの体積で回収した。溶出物を１つの画分で回収し、ｐＨは、溶出物の回収前にチューブに１／１０体積の１Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐＨ６．５の溶液を添加することによって、溶出の間にｐＨ７に調節した。
【０１９５】
赤血球凝集素の検出。赤血球凝集素タンパク質の量を、実施例２において記載されるように、工程１に入る前に濾過されたＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ緑色ジュース抽出物、静的モードにおけるインキュベーション後の上清、フロースルー、拡張ベッドモード吸着および溶出後の洗浄物および溶出物について推測した。抽出物および画分中の全タンパク質含有量を標準的プロトコルを使用して推測した。
【０１９６】
結果  濾過された緑色ジュース抽出物、ＰＥＩイオン交換体による静的モードにおけるインキュベーションのための出発材料、ＰＥＩイオン交換体による抽出物のインキュベーションに由来する上清、ＤＥＡＥイオン交換体を使用する拡張ベッド吸着のための出発材料、拡張ベッドカラムの溶出の素通りおよび溶出物中の、赤血球凝集アッセイを使用して測定した赤血球凝集素の量を、前記画分およびサンプルの全タンパク質含有量と共に表３中に示す。この実験において、赤血球凝集素タンパク質の損失のないＰＥＩ吸着剤を使用して、カラムの緑色および目詰まりを引き起こす大部分の材料を工程１において除去することができ、ＤＥＡＥイオン交換体を使用して、赤血球凝集素タンパク質を含むウイルス様粒子を拡張ベッド吸着モードの間に捕捉することができた。
【０１９７】
表３  工程１および２の様々な抽出物および画分についての赤血球凝集活性（初期抽出物の％）および全タンパク質含有量（ｍｇ／ｍＬ）。ＮＤ、決定されない。
【表３】
2013544509.tif 000004
【０１９８】
実施例７  ＤＥＡＥのイオンの交換体の実験的なセットアップのための溶出条件の最適化。
実施例６中に記載されるような充填ベッドモードにおけるＤＥＡＥイオン交換体におよび続いてＰＥＩイオン交換体による前捕捉による、実施例３中に記載されていた方法に従って得られた緑色植物ジュース抽出物中に存在するウイルス様粒子の結合および溶出を、５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．５を含む溶出バッファーに１Ｍ  ＮａＣｌ、０．８Ｍ  ＮａＣｌ、０．６Ｍ  ＮａＣｌ、０．４Ｍ  ＮａＣｌ、０．２Ｍ  ＮａＣｌまたは０．１Ｍ  ＮａＣｌを添加したものを使用して試験した。抽出物のローディング前に、緑色植物ジュース抽出物を、脱イオン水中で５倍に希釈し、ｐＨをｐＨ７に調節した。伝導率は５．１ｍＳ／ｃｍであった。実施例６の工程１で記載されるように、濾過された緑色植物ジュース抽出物を、バッチインキュベーションモードにおいて、１５：１の抽出物対リガンドの比率で、１５０μｍの平均粒子径のＰＥＩイオン交換体により最初に３０分間インキュベーションした。使用されるＤＥＡＥイオン交換体は５０μｍの平均粒子径を有し、上清対吸着剤の比率は５：１であった。実施例２中に記載されるように赤血球凝集素タンパク質の量を測定した。素通りおよび洗浄物、ＤＥＡＥイオン交換体に結合したもの、ならびに溶出物中の赤血球凝集素の相対量を、表４中に示す。この実験において、０．４、０．６、０．８または１．０ＭのＮａＣｌを含む溶出バッファーの使用は、赤血球凝集アッセイを使用して測定されるウイルス様粒子の類似した捕捉をもたらした。
【０１９９】
表４  ＤＥＡＥイオン交換体を使用する充填ベッドモードにおいて異なる溶出バッファーを使用する、素通りおよび洗浄物、結合ならびに溶出物画分中の相対的赤血球凝集活性。
【表４】
2013544509.tif 000005
【０２００】
実施例８  異なるフロー率での拡張ベッド吸着モードにおける破過曲線
緑色植物ジュース抽出物中に存在し、実施例３中に記載される方法に従って得られたウイルス様粒子の結合を、拡張ベッド吸着モードの１工程の結合プロセスにおいて、２２８ｃｍ／時間および４５０ｃｍ／時間のフロー率で測定した。５ベッド体積の０．５Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７バッファーおよび１０ベッド体積の１０ｍＭトリス、ｐＨ７を使用して平衡化したＤＥＡＥイオン交換体を使用した。使用されるＤＥＡＥイオン交換体は５０μｍの平均粒子径を有していた。吸着剤対緑色植物ジュース抽出物の比率は常に１：２０だった。ベッド高は５０ｃｍであり、カラムは３９．３ｍＬの吸着剤ＤＥＡＥイオン交換体を含んでいた。緑色植物ジュース抽出物を脱イオン水中で５倍に希釈し、ローディング前に伝導率を測定した。洗浄バッファーは１０ｍＭトリス、ｐＨ７．０、および溶出バッファーは５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．０であった。
【０２０１】
２２８ｃｍ／ｈでロードした緑色ジュース抽出物の伝導率は４．９６ｍＳ／ｃｍであった。合計７８６ｍＬを３．８ｃｍ／分（２２８ｃｍ／時間と等しい）のフロー率でロードした。洗浄および溶出も３．８ｃｍ／分のフロー率で実行した。
【０２０２】
４５０ｃｍ／時間でロードした緑色ジュース抽出物の伝導率は４．６１ｍＳ／ｃｍであった。合計７８６ｍＬを７．６ｃｍ／分（４５０ｃｍ／時間と等しい）のフロー率でロードした。洗浄は７．６ｃｍ／分および溶出は３．８ｃｍ／分であった。
【０２０３】
素通りおよび洗浄物を４画分で回収した。溶出画分の回収前に容器に１／１０体積の１Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐＨ  ６．５バッファーを添加することによって、溶出物をｐＨ７に中和した。溶出物を１つのピークで回収した。
【０２０４】
赤血球凝集素の量を実施例２中に記載される方法に従って測定した。
【０２０５】
全タンパク質含有量をＢｒａｄｆｏｒｄに従って測定した。
【０２０６】
両方のフロー率についての赤血球凝集アッセイの結果を、素通り画分１〜３、組み合わせた素通りおよび洗浄物画分、ならびに組み合わせた素通りおよび洗浄物、ならびに溶出物について表５中に示す。注入された抽出物、全素通りおよび洗浄物ならびに溶出物中の全タンパク質のＢｒａｄｆｏｒｄ測定についての結果を表６中に示す。この実験において、１工程の結合および溶出プロセスでは、抽出物のローディングについて４５０ｃｍ／時間のフロー率が最もよく動作し、インプットの緑色ジュース抽出物に関して４５％の赤血球凝集活性の回収をもたらした。
【０２０７】
表５  相対的赤血球凝集活性Ｃ／Ｃ0（％で）であり、式中、Ｃは排出された画分（素通り１〜３、組み合わせた素通りおよび洗浄物４、全素通りおよび洗浄物、または溶出物）の赤血球凝集活性であり、Ｃ0は１００％に設定された注入された溶液のものである。
【表５】
2013544509.tif 000006
【０２０８】
表６  異なるフロー率でロードおよび溶出された様々な画分の全タンパク質含有量。
【表６】
2013544509.tif 000007
【０２０９】
実施例９  ４５０ｃｍ／時間のフロー率で前処理されたサンプルの破過曲線
前処理された緑色植物ジュース抽出物中に存在し、実施例３中に記載される方法に従って得られたウイルス様粒子の結合を、本質的に実施例８中に記載されるように、拡張ベッド吸着モードの１工程の結合プロセスにおいて、４５０ｃｍ／時間のフロー率で測定した。すべての実験条件は、初期抽出物の伝導率が希釈後に５．３６ｍＳ／ｃｍだったことおよび抽出物が拡張ベッド吸着モードにおける１工程の結合プロセスに適用する前に酸沈殿および濾過されたこと以外は、実施例８において使用されたものに類似していた。独立した２つの実験を実行した。両方の実験についての赤血球凝集アッセイの結果を、素通り画分１〜３、組み合わせた素通りおよび洗浄物画分、および組み合わせた素通りおよび洗浄物、および溶出物について表７中に示す。
【０２１０】
注入された抽出物、全素通りおよび洗浄物ならびに溶出物中の全タンパク質のＢｒａｄｆｏｒｄ測定についての結果を表８中に示す。この実験において、赤血球凝集アッセイを使用して測定されるような緑色植物ジュース抽出物からのウイルス様粒子の捕捉は、１工程の結合および溶出プロセスにおいて１００％であった。
【０２１１】
表７  相対的赤血球凝集活性Ｃ／Ｃ0（％で）であり、式中、Ｃは排出された画分（素通り１〜３、組み合わせた素通りおよび洗浄物４、全素通りおよび洗浄物、または溶出物）の赤血球凝集活性であり、Ｃ0は１００％に設定された注入された溶液のものである。
【表７】
2013544509.tif 000008
【０２１２】
表８  ４５０ｃｍ／時間のフロー率でロードおよび溶出された様々な画分の全タンパク質含有量。ＮＤ、決定されない。
【表８】
2013544509.tif 000009
【０２１３】
実施例１０  拡張ベッドクロマトグラフィーを使用するウイルス様粒子の大スケール捕捉
抽出物。記載される（Ｄ’Ａｏｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）、前出）ように、７，５００のＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物をインフィルトレーションして、赤血球凝集素Ｈ５ウイルス様粒子を含む２５０ｋｇの粗製バイオマスを生成する。インフィルトレーション後に、植物を収穫前に６日間温室でインキュベーションする。本質的に実施例３中に記載されるように、葉の収穫に際して、バイオマスを暗所で４℃で一晩維持し、コーン上に少なくとも４５ｐｓｉの圧力を使用する１５〜２０ｋｇ／時間のねじプレス（Ｖｉｎｃｅｎｔ  ＣＰ−４）を使用してホモジナイズする。緑色ジュースを回収し、メタ重亜硫酸ナトリウムを１０ｍＭの最終濃度で緑色ジュースに添加する。伝導率を測定し、使用前に抽出物を約１０の最終伝導率に水により希釈する。抽出物を室温で維持する。希釈後の全体積は約１２５０Ｌの抽出物である。
【０２１４】
カラム特性。ビーズ組成物：エピクロルヒドリンで架橋したアガロース（４％ｗ／ｖ）。コア：炭化タングステン（ビーズの体積の約１０〜１５％を占める）。リガンド：ＤＥＡＥイオン交換体。粒子の平均直径：５０μｍ。吸着剤粒子の平均密度：１６ｋｇ／Ｌ。カラム直径：４５ｃｍ。沈殿した状態における空隙体積：充填体積の約４０％。全体積：６３Ｌの吸着剤材料を４５ｃｍの直径カラムに添加する。カラムを５カラム体積の０．５Ｍトリス−Ｃｌバッファー、ｐＨ７、続いて１０カラム体積の１０ｍＭトリス−Ｃｌバッファー、ｐＨ７により平衡化する。
【０２１５】
ローディング。実施例８および９中に記載されるように、４５０ｃｍ／時間（６５３Ｌ／時間と本質的に等しい）のフロー率で１２５０Ｌの抽出物を上に向かってポンプで入れることによってローディングを実行する。拡張係数を２．０〜２．５で維持し、未結合の材料を同じ拡張率で１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７により洗浄する。
【０２１６】
溶出。インフルエンザウイルス様粒子を１．２の拡張率で５０ｍＭトリス−Ｃｌおよび１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ９による溶出によって回収する。溶出された画分を、溶出ピークの回収前に１／１０体積の１Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐＨ６．５を容器に添加することによって中和する。実施例２の方法に従って測定されるような赤血球凝集素を含むウイルス様粒子を含む画分を、さらなる捕捉および精製のためにプールする。
【０２１７】
性能モニタリング。クロマトグラフィー性能を、２８０ｎｍおよび６００ｎｍでのＵＶ吸収、伝導率およびｐＨの測定によってモニタリングする。赤血球凝集素Ｈ５を含むウイルス様粒子の捕捉は、実施例２中でまたはＤ’Ａｏｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００８年、前出）に従って記載されるようなＥＬＩＳＡおよび赤血球凝集によって定量的に測定される。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを使用して画分の全タンパク質含有量を決定する。実施例２中でおよびＤ’Ａｏｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００８年、前出）によって記載されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを純度を確立するためにならびに赤血球凝集素Ｈ５特異的抗体を使用するウエスタンブロットを同定および特徴づけのために使用する。
【０２１８】
実施例１１  拡張ベッドカラムの洗浄および再生
溶出後に、樹脂を４カラム体積の０．５Ｍ  ＮａＯＨ続いて４カラム体積の蒸留水による洗浄によって浄化および再生する。再平衡を１０ｍＭトリス−Ｃｌバッファー、ｐＨ７中で行う。
【０２１９】
実施例１２  さらなる最適化
アグロ−インフィルトレーションの６日後に収穫されたＨ５−ＶＬＰを発現するＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物を、４℃で一晩暗所で維持する。葉および茎を含む植物バイオマスを、ねじプレス（Ｇｒｅｅｎ  Ｓｔａｒ  Ｃｏｒｒｕｐａｄ、ＧＳ、Ｋｏｒｅａ  Ｃｏ．１０００）を使用してホモジナイズする。ＭＢＳを１０ｍＭの最終濃度で添加してサンプル酸化を回避する。ねじプレスから得られた粗製ジュースを、２０％に希釈した酢酸を使用してｐＨ５．３に迅速に調節する。抽出物は部分的清澄化のために撹拌せずに室温で２０〜３０分間放置する。濾過は、高さ３ｍｍのＣｅｌｐｕｒｅ  Ｐ３００（ＭＢＳ  １０ｍＭ中の１０％Ｃｅｌｐｕｒｅ  Ｐ３００スラリー）により前コートされたＷｈａｔｍａｎの濾紙を通して実行する。真空を５０８ｍｂａｒで維持した。Ｃｅｌｐｕｒｅ  Ｐ３００（１０％）を抽出物に添加し、１分間混合する。最終的に、抽出物−ｃｅｌｐｕｒｅスラリーを穏やかに添加して、抽出物を小分けにして濾過する（濾過ケーキにわたって２ｃｍ以下の液相）。可能性のある４つの吸収剤を選択し、それらの結合条件をバッチモードにおける静的結合条件下で最適化する。表９中の結果は、イオン交換体吸着剤の結合能力が以下の２つの因子によって影響を受けることを示す。（ｉ）低イオン強度（２．３ｍＳ／ｃｍ以下）および従って（ｉｉ）吸着剤の単位質量あたりの植物抽出物の高体積（２０ｍｌの抽出物に対して１ｇの吸着剤）。
【０２２０】
追加の実験を静的結合条件下のバッチモードにおいて実行して、ビーズサイズ、およびプロセスにおける初期の負の吸着工程の組み入れを調べる。１つの実験において、負の吸収の第１の工程は、リガンドのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む２５０μｍ未満の範囲中の寸法の粒子を使用して適用され、５０μｍ未満のＰＥＩ粒子の上への正の吸収の第２の工程が続く。１５０μｍの平均粒子径を備えたＰＥＩを使用して、清澄化した抽出物から５０％を超える可溶性タンパク質不純物および色を除去できる、Ｈ５−ＶＬＰは小さな粒子サイズの吸収剤にのみ吸収されることが実証される。抽出物の希釈も１：１０および１：２０の間の比率に最適化され、このときＨ５の１００％が吸収されるが、比率１：４０ではＨ５の７０％のみが結合される。しかしながら、ＰＥＩを良好な吸収剤として判断することができたが、Ｈ５−ＶＬＰの溶出は最適ではなかった。
【０２２１】
静的結合条件下のバッチモードにおける他の実験において、ＤＥＡＥデキストランを１工程および２工程の方法における最適化のために使用する。約５０μｍの平均寸法を備えたＤＥＡＥイオン交換ビーズ上にＨ５−ＶＬＰの約８７％を吸収できることが示される。しかしながら、１工程の結合プロセスにおいてＶＬＰの溶出は不良である。第２の実験において、ＰＥＩビーズによる第１の負の吸収工程が適用され、ＤＥＡＥデキストランビーズを使用する第２の正の吸収工程が続き、ＶＬＰの１７％が溶出および回収される。
【０２２２】
次いで、さらなる実験を２工程プロセスを使用して実行する。１つの実験において、ホモジナイズされた植物材料（緑色ジュースとも称される）を水中で５倍に希釈し、５．９ｍＳ／ｃｍの伝導率にし、Ｃｅｌｐｕｒｅ  ３０００を使用して濾過する。ＰＥＩイオン交換樹脂を１５ｍｌの緑色ジュースに対して１ｇの吸着剤の比率で吸着剤として使用して、植物材料から色素および不純物を除去する。ＰＥＩイオン交換樹脂はｐＨ７で１５０μｍの平均粒子径を有する。第２の工程は、１５ｃｍのベッド高、３．８ｃｍ／分のフロー率および溶出バッファー（５０ｍＭトリスおよび１Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ９）で、約５０μｍの平均粒子径を備えたＤＥＡＥイオン交換体を使用するフロー条件下の拡張ベッドモードにおいて、この様式で得られたタバコ材料をフローすることを含む。素通りおよび洗浄物を回収し、ＶＬＰを含む樹脂を、単一ピークとして溶出物を回収する前に１／１０体積の１Ｍトリス／ＨＣｌ  ｐＨ６．５を添加することによってｐＨ７に中和する。溶出物は６７％で赤血球凝集素の収率を提供した（出発材料中の１００％と比較して）。他の実験において、ホモジナイズされた植物材料は濾過なしに使用され、同じ条件下で２工程のプロセスを用い、全赤血球凝集素の２２％は溶出物中に回収されるが、１３％は素通りおよび洗浄物画分中に検出される。
【０２２３】
上記の明細書中で言及された出版物はすべて、参照として本明細書に援用される。本発明の様々な修飾および変形は本発明の範囲および趣旨から逸脱せずに当業者に明らかであろう。本発明は好適な実施形態に関して記載されたが、請求の範囲に記載される本発明は、かかる特定の実施形態に過度に限定されるべきでないことを理解すべきである。実際、細胞生物学、分子的生物学および植物生物学または関連する分野における当業者に明らかな、本発明の実行のために記載されるモードの様々な修飾は、以下の請求項の範囲内であることが意図される。
【表９】
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【国際調査報告】
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