(57)【要約】投与単位は、それぞれの処置しようとする個体のために増殖させた線維芽細胞から構成される自己細胞療法製品からなる。それぞれの個体自体の皮膚のバイオプシーから、現行適正製造基準（ＣＧＭＰ）および標準的な組織培養の手順を使用して増殖させた自己線維芽細胞の懸濁物を、少なくとも９８％の線維芽細胞の純度および少なくとも８５％の生存率を有する、凍結保存した線維芽細胞またはその前駆体を含有するバイアルとして供給して、１．０〜２．０×１０７細胞／ｍＬの濃度で、１〜６ｍＬ、好ましくは、２ｍＬの細胞を投与する。鼻唇溝のひだ（口角まで伸長する鼻の側面上の溝）内に注射すると、自己線維芽細胞は、コラーゲンを含めた、細胞外マトリックス構成成分の合成を増加させ、これらのひだの重症度を低下させると考えられている。投与量および投与のタイミングは、臨床的に顕著な結果を達成するのに重要であることを示した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１．０〜２．７×１０７細胞／ｍＬ、および場合により
凍結保存用培地
を含む投与処方物であって、該細胞の少なくとも９８％は自己ヒト線維芽細胞またはその前駆体であり、該細胞の少なくとも８５％は生存している、投与処方物。
【請求項２】
イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）およびＰｒｏｆｒｅｅｚｅＴＭおよび７．５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）からなる凍結保存用培地を含む、請求項１に記載の投与処方物。
【請求項３】
前記細胞の９８％以上が線維芽細胞である、請求項１に記載の投与処方物。
【請求項４】
１、２、３または６ｍＬを含む、請求項１に記載の投与処方物。
【請求項５】
皮膚欠陥を処置する方法であって、４週または５週±７〜１０日間離した２回または３回の処置において、１．０〜２．７×１０７細胞／ｍＬを含む有効量の投与処方物を、処置しようとする部位に注射するステップを含み、ここで、該細胞の少なくとも９８％は自己ヒト線維芽細胞またはその前駆体であり、該細胞の少なくとも８５％は生存している、方法。
【請求項６】
しわ、鼻唇溝、および頬と唇との間の溝、口周囲のライン、外側眼角のライン、眼窩周囲のライン、ならびに眉間のラインの処置のための、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
１リニアセンチメートル当たり０．０５〜０．５ｍＬの前記投与処方物を注射するステップを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
各処置において、２〜６ｍＬを注射するステップを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
鼻唇溝のひだの処置のための請求項５に記載の方法であって、５週±７〜１０日間離した３回の処置セッションにおいて、処置セッション１回当たり１〜２ｍＬの前記投与処方物を投与するステップを含み、該投与処方物を、該ひだの表層真皮乳頭内に、１リニアｃｍ当たり０．１ｍＬの用量分布で注射する、方法。
【請求項１０】
複数の顔面領域におけるしわの処置のための請求項５に記載の方法であって、５週±７〜１０日間離した１回または２回の処置セッションにおいて、処置セッション１回当たり５〜６ｍＬを、表層真皮乳頭内に、１リニアｃｍ当たり０．０５ｍＬの用量分布で注射するステップを含む、方法。
【請求項１１】
ざ瘡瘢痕の処置のための請求項５に記載の方法であって、１４日±３日間離した１〜３回の処置セッションにおいて、処置セッション１回当たり２〜１２ｍＬを、表層真皮乳頭内に、瘢痕化領域１ｃｍ２当たり０．１ｍＬの用量分布で注射するステップを含む、方法。
【請求項１２】
制限性の熱傷瘢痕の処置のための請求項５に記載の方法であって、２〜６週間離した１〜５回の処置において、処置セッション１回当たり１〜１０ｍＬを、該熱傷瘢痕の触診により認められる制限帯内に、瘢痕化領域１ｃｍ２当たり０．１〜０．５ｍＬの用量分布で注射するステップを含む、方法。
【請求項１３】
組織の修復または再生のための多能性細胞を提供するための方法であって、
１．０〜２．７×１０７細胞／ｍＬを含む投与処方物を提供するステップであって、該細胞の少なくとも９８％は自己ヒト線維芽細胞またはその前駆体であり、該細胞の少なくとも８５％は生存している、ステップと、
該細胞を脱分化させるための手段を提供するステップと
を含む、方法。
【請求項１４】
前記細胞を、細胞のプログラミング、細胞融合または体細胞の移植により脱分化させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
１．０〜２．７×１０７細胞／ｍＬを含む投与処方物の脱分化により調製された多能性細胞処方物であって、該細胞の少なくとも９８％は自己ヒト線維芽細胞またはその前駆体であり、前記細胞の少なくとも８５％は生存している、多能性細胞処方物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
これは、ヒト被験体の皮膚および軟部組織の欠陥の修復、ならびに／または皮膚および軟部組織の長期的増大についての部位に注射するための、単離および調製された自己真皮線維芽細胞の投与単位処方物に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１、特許文献２、特許文献３および特許文献４に記載されているように、被験体の皮膚の美容上および審美的な欠陥を、自己真皮線維芽細胞の懸濁物を欠陥にほぼ隣接する（ｓｕｂａｄｊａｃｅｎｔ）真皮および皮下組織内に注射することによって修正することができる。この方法により修正することができる典型的な欠陥は、しわ、皮膚線条、陥没した瘢痕、非外傷性起源の皮膚の陥没、尋常性ざ瘡由来の瘢痕、および唇の形成不全を含む。細胞は、被験体に関して組織適合性であり、好ましくは、被験体から採取したバイオプシー検体の培養により誘導され、細胞培養系における継代により拡大増殖されている。
【０００３】
審美的な結果を生み出すための、身体内、特に、顔面への材料（「注入物」）の注射は、１９世紀近くまで遡る。例えば、顔面の輪郭の欠陥を修正するためのパラフィンの注射は、第一次世界大戦前の数年間、短期間許容された。しかし、合併症、および長期的結果が不満足であるという現実により、実施されなくなった。１９６０年代前半以降、注射可能なシリコーンが利用できるようになり、これらの事象の事実上の繰り返しが起きた。特別に製造された「医療用」シリコーン溶液、例えば、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＭＤＸ  ４．４０１１が、米国内の承認を得ている試験センターのいくつかで実験的に使用されている。合併症、例として、シリコーンに対する局所性および全身性の反応、注入物の移動、ならびに局所性の組織の分解により、シリコーン注射の使用が制限されている。非生物学的材料の注射により得られた芳しくない結果から、外来性タンパク質、特に、ウシコラーゲンを注入物として使用する試みが促された。未処理のウシコラーゲンは、ヒトへの注射には高過ぎる免疫原性を示すが、ウシコラーゲンのＣ末端およびＮ末端のペプチドを酵素分解により除去することによって、患者をあらかじめスクリーニングして免疫反応性である患者を除外する場合には、限定された量で使用することができる材料（「アテロコラーゲン」）が得られる。この材料は、広く使用されたが、約９０％の被験体における抗ウシ抗体の発生および約１〜３％の被験体における明らかな免疫性合併症と関連があった（非特許文献１）。溶液中のアテロコラーゲンは、完全には満足ではないことが証明された。これは、この材料が、被験体により注射部位から比較的短時間で吸収され、宿主の材料により置き換えられることがなかったことによる。体内の滞留は、グルタルアルデヒド架橋結合、それに続く、微細なメッシュの通過によるろ過およびせん断により増加した。しかし、増加した、変則的な粘度は、この材料の使用を困難にした。被験体自体の組織の試料に完全に由来する注射のためのヒトコラーゲンは入手可能であるが、ヒトコラーゲンの注射がウシコラーゲンの注射よりも持続性であるという証拠はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第５，５９１，４４４号明細書
【特許文献２】米国特許第５，６６０，８５０号明細書
【特許文献３】米国特許第５，６６５，３７２号明細書
【特許文献４】米国特許第５，８５８，３９０号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ＤｅＬｕｓｔｒｏ，  Ｆ．ら、Ｐｌａｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｓｕｒｇｅｒｙ、１９８７年、７９巻：５８１頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これらの問題は、自己線維芽細胞の調製物の開発を通して克服された。しかし、問題に対する解答を有することは、試行錯誤により確証され、かつ臨床試験により確認された既定の投与量において保存するのに安定であり、米国食品医薬品局の要件に従って製造および包装されている製品を有することと同じではない。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、皮膚欠陥の修復および皮膚の長期的増大のために患者内に注射するための、自己真皮線維芽細胞の既定の投与単位処方物を提供することである。
【０００８】
さらなる本発明の目的は、皮膚欠陥の修復および皮膚の長期的増大のために使用することができる幹細胞、前駆細胞または部分的に分化した細胞を含有する投与単位処方物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
投与単位は、それぞれの処置しようとする個体のために増殖させた線維芽細胞から構成される自己細胞療法製品からなる。それぞれの個体自体の皮膚のバイオプシーから、現行適正製造基準（ｃｕｒｒｅｎｔ  ｇｏｏｄ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＣＧＭＰ））および標準的な組織培養の手順を使用して増殖させた自己線維芽細胞の懸濁物を、少なくとも９８％の線維芽細胞の純度および少なくとも８５％の生存率を有する、凍結保存した線維芽細胞またはその前駆体を含有するバイアルとして供給し、１．０〜２．０×１０７細胞／ｍＬの濃度で、１〜６ｍＬ、好ましくは、２ｍＬを、１リニアセンチメートル（ｌｉｎｅａｒ  ｃｅｎｔｉｍｅｔｅｒ）当たり０．０５〜０．５ｍＬで注射して、およそ５週間空けて３回投与して、細胞を投与する。継代した真皮線維芽細胞を、拡大増殖した線維芽細胞をタンパク質を含有しない培地中で一定期間インキュベートすることによって、培地中に存在する免疫原性タンパク質を実質的に含有しない状態にする。自己線維芽細胞を、鼻唇溝のひだ（ｗｒｉｎｋｌｅ）（口角まで伸長する鼻の側面の溝）内に注射すると、自己線維芽細胞は、コラーゲンを含めた細胞外マトリックス構成成分の合成を増加させ、これらのひだの重症度を低下させると考えられている。投与量および投与のタイミングが、臨床的に顕著な結果を達成するのに重要であることを実証するに至った。
【００１０】
鼻唇溝のひだの処置のための、米国（ＵＳ）内で承認を得ている療法がいくつかあるが（例として、Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）、ＪｕｖｅｄｅｒｍＴＭおよびＲａｄｉｅｓｓｅ（登録商標））、線維芽細胞の細胞懸濁物は、これらの製品と同じ薬理学的クラスには属さない。これらの製品は、顔面組織内に注射して、顔面組織にボリュームを一時的に足すことによってひだおよび溝を滑らかにする構造的な充填剤である。線維芽細胞の投与処方物は、提案された非常に様々な作用機構により機能する。本明細書に記載する投与処方単位は、しわ、鼻唇溝、および頬と唇との間の溝（ｍｅｌｏｌａｂｉａｌ  ｆｏｌｄ）、口周囲のライン、外側眼角のライン、眼窩周囲のライン、ならびに眉間のラインの処置に有用である。
【００１１】
また、線維芽細胞の投与処方物は、組織の修復および再生ための多能性細胞を提供するのにも有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１−１】図１は、標準的な製造プロセスの流れ図である。
【図１−２】図１は、標準的な製造プロセスの流れ図である。
【図１−３】図１は、標準的な製造プロセスの流れ図である。
【図２】図２は、Ｂｙｒｎｅ、２００８年、Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．、１７巻：Ｒ３７〜Ｒ４１頁からの概略図であり、皮膚から誘導された線維芽細胞を、エピジェネティックなリプログラミングを使用して多能性幹細胞に脱分化させることができ、次いで、これらの細胞を、ニューロン、心筋細胞、ベータ膵島細胞および造血細胞に分化させることができる様子を示す。
【図３】図３は、線維芽細胞を、多能性細胞に脱分化させることができる方法、すなわち、細胞融合（Ｃｏｗａｎら、２００５年）、ダイレクトリプログラミング（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７年）、および体細胞核移植（Ｂｙｒｎｅら、２００７年）の概略図である。
【図４】図４は、ざ瘡の瘢痕化の重症度を客観的に、医師の評価により、目の前でグレードを決定するスケール、すなわち、「評価担当者による目の前でのざ瘡瘢痕の評価スケール（Ｅｖａｌｕａｔｏｒ  Ｌｉｖｅ  Ａｃｎｅ  Ｓｃａｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｓｃａｌｅ）」において使用するための略図である。このスケールは、直接的な照明および接線方向の照明下における相対的な瘢痕化の外観の比較評価を利用する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
自己線維芽細胞製品が開発された。細胞療法製品は、それぞれの個体自体の皮膚のバイオプシーから標準的な組織培養の手順を使用して増殖させた自己線維芽細胞の懸濁物から構成される。皮膚組織（真皮層および表皮層）を、患者の耳後部領域からバイオプシーとして採取し、製造施設まで２〜８℃で翌日送達により発送する。組織から酵素消化により単離した線維芽細胞を、患者の標的処置領域内に注射するのに十分な量まで拡大増殖させる。細胞療法製品は、拡大増殖した線維芽細胞であって、細胞療法製品の標的細胞濃度に処方され、クライオバイアル中で凍結保存された、細胞からなり、バルク薬物物質−クライオバイアル（Ｂｕｌｋ  Ｄｒｕｇ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ−Ｃｒｙｏｖｉａｌ）と呼ばれる。最終的な細胞療法製品は、解凍したバルク細胞療法製品−クライオバイアル（Ｂｕｌｋ  Ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｐｒｏｄｕｃｔ−Ｃｒｙｏｖｉａｌ）細胞であって、解凍し、洗浄し、患者に注射するために調製した、細胞からなる。
【００１４】
最初の販売承認は、中等度から重度の鼻唇溝のひだの処置のための承認である。現在の臨床開発は、真皮性の輪郭の変形、声帯の瘢痕化、歯肉退縮、制限性の熱傷瘢痕およびざ瘡の瘢痕化の処置に焦点を合わせている。投与量および投与レジメンは、下記に論じるように、処置しようとする状態に応じて異なる。正確な機構は不明であるが、線維芽細胞投与処方物の活性な構成成分を含む自己線維芽細胞は、患者の皮膚内に注射されると、細胞外マトリックス構成成分、例として、コラーゲンの合成を増加させ、したがって、皮膚の完全性を増加させ、最終的に、細かいラインおよびひだの減少をもたらすと考えられている。
【００１５】
以下の定義を、本明細書において使用する。
ＡＴＭ      分析試験方法
ＡＺＦＩＣＥＬ−Ｔ      自己培養線維芽細胞についてのＵＳＡＮ名
バルク収集物（ＢＵＬＫ  ＨＡＲＶＥＳＴ）      最終的な収集後の、凍結保存用培地中に処方する前の材料
ＣＧＭＰ      現行適正製造基準
ＣＳ      Ｃｅｌｌ  ｓｔａｃｋ
ＤＭＥＭ      ダルベッコ改変イーグル培地
ＤＭＳＯ      ジメチルスルホキシド
薬物製品−注射用（ＤＲＵＧ  ＰＲＯＤＵＣＴ−ＩＮＪＥＣＴＩＯＮ）      洗浄し、ＤＭＥＭ中に再処方し、バイアルに充填し、臨床サイトへの発送の準備が整っている材料
薬物物質−クライオバイアル（ＤＲＵＧ  ＳＵＢＳＴＡＮＣＥ−ＣＲＹＯＶＩＡＬ）      凍結保存用培地中に処方し、クライオバイアル中に分注した材料
ＥＤＴＡ      エチレンジアミン四酢酸
ＦＡＣＳ      蛍光標識細胞分取
ＦＢＳ      ウシ胎仔血清
ＧＡ      ゲンタマイシンおよびアンホテリシンＢ
ＩＭＤＭ      イスコフ改変ダルベッコ培地
ＩＮＤ      新薬治験申請
ＰＢＳ      リン酸緩衝生理食塩水
ＰＣＡ      個人の細胞の分析
ＱＣ      品質管理
ＵＳＰ      米国薬局方。
【００１６】
Ｉ．投与単位処方物
Ａ．細胞供給源
１．自己真皮線維芽細胞
処方物中の細胞は、単層培養で増殖させると、典型的な線維芽細胞の形態を示す。具体的には、細胞は、か細い伸長部を有する、細長い、紡錘状もしくはスピンドルの外観を示すことができ、または細胞は、より大きく、平坦な星状細胞として出現することができ、後者は、細胞質性のリーディングエッジを有する場合がある。また、これらの形態の混合物も観察することができる。細胞は、線維芽細胞特異的マーカー、すなわち、ＣＤ９０（Ｔｈｙ−１）、３５キロダルトンの細胞表面糖タンパク質、および細胞外マトリックスタンパク質のコラーゲンを含めた、正常な線維芽細胞に特徴的なタンパク質を発現する。線維芽細胞の投与処方物は、それぞれの個体自体の皮膚のバイオプシーから標準的な組織培養の手順を使用して増殖させた自己線維芽細胞の懸濁物から構成される自己細胞療法製品である。皮膚組織（真皮層および表皮層）を、患者の耳後部領域からバイオプシーとして採取する。
【００１７】
２．前駆細胞
また、線維芽細胞を使用して、組織の修復または再生のために、その他の細胞型を生み出すこともできる。患者と遺伝的に同一の胚性幹（ＥＳ）細胞の、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）による誘導は、多くの変性疾患の症状を治癒させるかまたは軽減し、かつ宿主免疫系による拒絶に関する懸念も回避する可能性を秘めている。Ｂｙｒｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ、２００７年１１月２２日；４５０巻（７１６９号）：４９７〜５０２頁は、改変されたＳＣＮＴのアプローチを使用して、アカゲザル成体の真皮線維芽細胞から未分化胚芽細胞を生成し、これらの胚から２つのＥＳ細胞系を首尾よく単離した。ＤＮＡ分析により、核ＤＮＡはドナー体細胞と同一であり、ミトコンドリアのＤＮＡは卵母細胞が起源であることが確認された。両方の細胞株が、正常なＥＳ細胞の形態を示し、主要な幹細胞マーカーを発現し、転写に関して対照のＥＳ細胞に類似し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて複数の細胞型に分化した。また、Ｓｐａｒｍａｎら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２００９年；２７巻（６号）：１２５５〜６４頁も参照されたい。図２は、Ｂｙｒｎｅ、２００８年、Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．、１７巻：Ｒ３７〜Ｒ４１頁からの概略図であり、皮膚から誘導した線維芽細胞を、エピジェネティックなリプログラミングを使用して多能性幹細胞に脱分化させることができ、次いで、これらの細胞を、ニューロン、心筋細胞、ベータ膵島細胞および造血細胞に分化させることができる様子を示す。Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．、２００９年２月；１３６巻（４号）：５０９〜２３頁、およびＫａｎａｗａｔｙら、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ．、２００９年２月；３１巻（２号）：１３４〜８頁を参照されたい。
【００１８】
図３は、線維芽細胞を、多能性細胞に脱分化させることができる方法、すなわち、細胞融合（Ｃｏｗａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．、２００５年８月２６日；３０９巻（５７３９号）：１３６９〜７３頁）、ダイレクトリプログラミング（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ．、２００７年、３０；１３１巻（５号）：８６１〜７２頁）、および体細胞核移植（Ｂｙｒｎｅら、２００７年）の概略図である。Ｔａｋａｈａｓｈｉらは、ｉＰＳ細胞の、成体ヒト真皮線維芽細胞からの、同じ４つの因子、すなわち、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃを用いる生成を実証している。ヒトｉＰＳ細胞は、形態、増殖、表面抗原、遺伝子発現、多能性細胞に特異的な遺伝子のエピジェネティックな状態、およびテロメラーゼ活性においてヒト胚性幹（ＥＳ）細胞に類似した。さらに、これらの細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいても、テラトーマにおいても、３つの胚葉の細胞型に分化することができた。これらの知見は、ｉＰＳ細胞を、成体ヒト線維芽細胞から生成することができることを実証している。
【００１９】
Ｂ．細胞の調製
薬物物質中の自己線維芽細胞は、レシピエント自体の皮膚のバイオプシー、続いて、標準的な細胞培養技法を使用する、培養における拡大増殖を行って増殖させることによって誘導する。皮膚組織（真皮層および表皮層）を、被験体の耳後部領域からバイオプシーとして採取する。出発材料は、標準的な無菌の実施手順を使用して集めた３つの３ｍｍの皮膚のパンチバイオプシーから構成される。バイオプシーは、担当医により集められ、無菌のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含有するバイアル内に置かれる。バイオプシーは、２〜８℃の冷蔵発送で製造施設に発送される。
【００２０】
バイオプシーは、製造施設に到着後、検査され、容認されれば、製造領域に直接移される。次いで、プロセスの開始に際し、酵素消化の前に、バイオプシー組織を洗浄する。洗浄後、刻まずに、Ｌｉｂｅｒａｓｅ  Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、バイオプシー組織を、３７．０±２℃で１時間インキュベートする。バイオプシー組織の消化時間は、培養中の細胞の生存率および増殖率に影響を及ぼすことができる、重要なプロセスパラメータである。Ｌｉｂｅｒａｓｅは、コラーゲナーゼ／中性プロテアーゼの酵素カクテルであり、処方したものとしては、Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から、および処方されていないものとしては、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から得られる。あるいは、その他の市販されているコラーゲナーゼ、例として、Ｓｅｒｖａ  Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ＮＢ６（Ｈｅｌｉｄｅｌｂｕｒｇ、ドイツ）も使用することができる。消化後、開始増殖培地（ＩＭＤＭ、ＧＡ、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ））を添加して、酵素を中和し、細胞を、遠心分離によりペレット化し、５．０ｍＬの開始増殖培地中に再懸濁する。あるいは、遠心分離は実施せず、酵素の完全な不活性化を開始増殖培地の添加のみにより起こす。開始増殖培地を添加してから、細胞懸濁物をＴ−１７５細胞培養フラスコ内に播種して、細胞の増殖および拡大増殖を開始する。Ｔ−７５フラスコの代わりに、Ｔ−７５、Ｔ−１５０、Ｔ−１８５またはＴ−２２５フラスコを使用することができる。
【００２１】
細胞を、５．０±１．０％ＣＯ２を用いて３７±２．０℃でインキュベートし、新鮮な完全増殖培地を３〜５日毎に供給する。このプロセスにおける供給は全て、完全増殖培地の半分を除去し、同じ容積を新鮮な培地で置き換えることによって実施する。あるいは、完全な供給を実施することもできる。細胞を、継代するまでに、Ｔ−１７５フラスコ中に３０日超維持してはならない。コンフルエンスを、このプロセス全体を通してモニターして、適切な播種密度を培養物の分割において確保する。細胞のコンフルエンスがＴ−１７５フラスコ中で４０％以上になったら、使用済みの培地を除去し、細胞を洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて処理して、フラスコ中の接着性の細胞を溶液内に放出させることによって、細胞を継代する。次いで、細胞を、トリプシン処理し、Ｔ−５００フラスコ中に播種して、細胞の拡大増殖を継続する。代替として、Ｔ−５００フラスコの代わりに、１つまたは２つのＴ−３００フラスコ、１層のＣｅｌｌ  Ｓｔａｃｋ（１ＣＳ）、１層のＣｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ（１ＣＦ）、または２層のＣｅｌｌ  Ｓｔａｃｋ（２ＣＳ）を使用することもできる。
【００２２】
形態を各継代時および収集の前に評価して、このプロセス全体を通して培養物の純度をモニターする。形態は、観察試料を、細胞培養物の形態学的検査のための視覚的な標準と比較することによって評価する。細胞は、単層培養で増殖させると、典型的な線維芽細胞の形態を示す。細胞は、か細い伸長部を有する、細長い、紡錘状もしくはスピンドルの外観を示すか、またはより大きく、平坦な星状細胞として出現することができ、後者は、細胞質性のリーディングエッジを有する場合がある。また、これらの形態の混合物も観察することができる。低いコンフルエンス領域中の線維芽細胞も、同様の形状を示し得るが、ランダムに方向付けられる場合がある。また、細胞培養物中のケラチノサイトの存在も評価する。ケラチノサイトは、円形かつ変則的な形状を示し、高いコンフルエンスでは、丸石様の構成体に構成されているように見える。より低いコンフルエンスでは、ケラチノサイトは、小型のコロニーとして観察可能である。
【００２３】
細胞を、５．０±１．０％ＣＯ２を用いて３７±２．０℃でインキュベートし、３〜５日毎にＴ−５００フラスコ中に、５〜７日毎に１０層のｃｅｌｌ  ｓｔａｃｋ（１０ＣＳ）中に供給する。細胞を、継代するまでに、Ｔ−５００フラスコ中に１０日間超維持してはならない。バルク薬物物質の安全性についての品質管理（ＱＣ）リリース試験は、無菌性試験および内毒素試験を含む。Ｔ−５００フラスコ中の細胞のコンフルエンスが≧９５％になったら、細胞を、１０ＣＳ培養容器に継代する。代替として、１０ＣＳの代わりに、２つの５層のＣｅｌｌ  Ｓｔａｃｋ（５ＣＳ）、または１０層のＣｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ（１０ＣＦ）も使用することができる。１０ＣＳ。１０ＣＳへの継代は、使用済みの培地を除去し、細胞を洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて処理して、フラスコ中の接着性の細胞を溶液内に放出させることによって実施する。次いで、細胞を、１０ＣＳに移す。追加の完全増殖培地を添加して、トリプシンを中和し、細胞を、Ｔ−５００フラスコから、新鮮な完全増殖培地を含有する２Ｌのボトル内にピペットで入れる。２Ｌのボトルの内容物を、１０ＣＳ内に移し、全ての層にわたり播種する。次いで、細胞を、５．０±１．０％ＣＯ２を用いて３７±２．０℃でインキュベートし、新鮮な完全増殖培地を５〜７日毎に供給する。細胞を、継代するまでに、１０ＣＳ中に２０日間超維持してはならない。
【００２４】
タンパク質を含有しない培地中で、拡大増殖した線維芽細胞を一定期間インキュベートすることによって、継代した真皮線維芽細胞を、培養培地中に存在する免疫原性タンパク質を実質的に含有しない状態にする。
【００２５】
初代収集物：１０ＣＳ中の細胞のコンフルエンスが９５％以上になったら、細胞を収集する。収集を、使用済みの培地を除去し、細胞を洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて処理して、接着性の細胞を溶液内に放出させ、追加の完全増殖培地を添加して、トリプシンを中和することによって実施する。細胞を、遠心分離により集め、再懸濁し、インプロセスＱＣ試験を実施して、総生存細胞数および細胞生存率を決定する。
【００２６】
鼻唇溝の処置のためには、総細胞数は３．４×１０８細胞、生存率は８５％以上でなければならない。あるいは、その他の適応症ための総細胞収量は、３．４×１０８〜１×１０９細胞の範囲に及ぶこともできる。収集時の細胞数および生存率は、薬物物質の処方のために、生存細胞の適切な量を確保するのに重要なパラメータである。総生存細胞数が、意図する処置に十分である場合、細胞および使用済みの培地の一定分量を、マイコプラズマ汚染について試験する。マイコプラズマ試験を実施する。収集した細胞を、処方し、凍結保存する。
【００２７】
初代１０ＣＳ収集物から得られた細胞数の結果を受け取った後に、追加の細胞が必要となる場合、複数のｃｅｌｌ  ｓｔａｃｋ（最高４つの１０ＣＳ）内への追加の継代を実施する（図１のステップ５ａ）。追加の継代のために、初代収集物から得られた細胞を、新鮮な完全増殖培地を含有する２Ｌの培地用ボトルに添加する。再懸濁した細胞を、複数のｃｅｌｌ  ｓｔａｃｋに添加し、５．０±１．０％ＣＯ２を用いて３７±２．０℃でインキュベートする。上記の記載に従って、ｃｅｌｌ  ｓｔａｃｋに供給し、収集を行う。ただし、細胞のコンフルエンスは、細胞を収集する前には、８０％以上でなければならない。収集手順は、上記の初代収集物についての記載と同じである。細胞および使用済みの培地から得られたマイコプラズマのための試料を集め、上記の初代収集物についての記載に従って、細胞数および生存率を実施する。
【００２８】
この方法は、動物を供給源とする試薬からの導入を回避すべき免疫原性タンパク質を減少させるかまたは排除する。プロセスの残留物を低下させるためには、細胞を、タンパク質を含有しない凍結用培地中に凍結保存し、次いで、最終的な注射に備える前に、解凍し、洗浄して、残存する残留物をさらに低下させる。
【００２９】
追加の継代から得られた細胞の収集および凍結保存が完了した後に、追加の薬物物質が必要となる場合（図１のステップ５ａ）、凍結した薬物物質−クライオバイアルの一定分量を解凍し、５ＣＳ培養容器または１０ＣＳ培養容器に播種するために使用する（図１のステップ７ａ）。あるいは、５ＣＳまたは１０ＣＳの代わりに、４層のｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒｙ（４ＣＦ）、２つの４ＣＦ、または２つの５ＣＳを使用することもできる。細胞の凍結クライオバイアル（複数可）を、上記の記載に従って、解凍し、洗浄し、新鮮な完全増殖培地を含有する２Ｌの培地用ボトルに添加し、培養し、収集し、凍結保存する。細胞懸濁物を添加する。細胞のコンフルエンスは、細胞を収集する前には、８０％以上でなければならない。
【００３０】
Ｃ．細胞懸濁物の調製
培養物の拡大増殖の完了時に、細胞を、収集し、洗浄し、次いで、１．０〜２．７×１０７細胞／ｍＬを含有するように処方する（標的は、２．２×１０７細胞／ｍＬである）。あるいは、標的を、異なる適応症のための用量に対応するための処方物の範囲内に調節することもできる。薬物物質は、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）およびＰｒｏｆｒｅｅｚｅ−ＣＤＭＴＭ（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｖｉｌｌｅ、ＭＤ）および７．５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）からなる凍結保存用培地中に懸濁させた、生存している、自己ヒト線維芽細胞の細胞集団からなる。あるいは、７．５％の代わりに、より低いＤＭＳＯの濃度も使用することができ、またはＩＭＤＭ／Ｐｒｏｆｒｅｅｚｅ／ＤＭＳＯの代わりに、ＣｒｙｏＳｔｏｒＴＭＣＳ５もしくはＣｒｙｏＳｔｏｒＴＭＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）も使用することができる。凍結プロセスは、以下の勾配プログラムに対して速度が制御された凍結のステップからなる。
ステップ１：４．０Ｃで待機する
ステップ２：１．０℃／分Ｃ／ｍで、−４．０℃に（試料プローブ）
ステップ３：２５．０℃／分Ｃ／ｍで、−４０℃に（チャンバープローブ）
ステップ４：１０．０℃／分Ｃ／ｍで、−１２．０℃に（チャンバープローブ）
ステップ５：１．０℃／分Ｃ／ｍで、−４０℃に（チャンバープローブ）
ステップ６：１０．０℃／分Ｃ／ｍで、−９０℃に（チャンバープローブ）
ステップ７：終了。
【００３１】
速度が制御された凍結ステップの完了後、バルク薬物物質バイアルを、低温貯蔵フリーザーに移して、気相中に保存する。低温貯蔵凍結後、薬物物質に対して、品質管理試験を行う。薬物物質の水準はまた、細胞数および細胞生存率の試験を含み、これらの試験は、凍結保存前に実施し、薬物物質−クライオバイアルについても再び実施する。細胞の生存率は、製品のリリースのためには、８５％以上でなければならない。細胞数および生存率は、自動細胞計数システム（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実施し、このシステムは、ＤＮＡにインターカレートする透過性の蛍光染料と不透過性の蛍光染料との組合せを活用して、生きた細胞および死んだ細胞を検出し、両者を見分ける。あるいは、上記の自動化された細胞の方法の代わりに、トリパンブルー排除法を利用する手動の細胞計数アッセイを使用することもできる。あるいは、その他の自動細胞計数システムを使用して、細胞数および生存率の方法を実施することもでき、それらのシステムとしては、Ｃｅｄｅｘ（Ｒｏｃｈｅ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ  ＡＧ、Ｂｉｅｌｅｆｉｅｌｄ、ドイツ）、ＶｉａＣｅｌｌＴＭ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）、ＮｕｃｅｌｏＣｏｕｎｔｅｒＴＭ（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ）、Ｃｏｕｎｔｌｅｓｓ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの１部門、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、またはＣｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（登録商標）（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌａｗｒｅｎｃｅ、ＭＡ）が挙げられる。薬物物質−クライオバイアルの試料は、リリースに先立って、１．０〜２．７×１０７細胞／ｍＬの細胞数の水準を満たさなければならない。また、無菌性試験および内毒素試験も、リリース試験の間に実施する。
【００３２】
細胞数および生存率に加えて、薬物物質の純度／同一性を実施し、懸濁物が９８％以上の線維芽細胞を含有することを確認しなければならない。通常の細胞汚染物は、ケラチノサイト細胞を含む。純度／同一性のアッセイは、ＣＤ９０およびＣＤ１０４（それぞれ、線維芽細胞およびケラチノサイトについての細胞表面マーカー）に対する蛍光タグ付きの抗体を利用して、線維芽細胞の細胞集団のパーセント純度を定量化する。ＣＤ９０（Ｔｈｙ−１）は、３５キロダルトンの細胞表面糖タンパク質である。ＣＤ９０タンパク質に対する抗体は、ヒト線維芽細胞に対して高い特異性を示すことが示されている。ＣＤ１０４、すなわち、インテグリンβ４鎖は、２０５キロダルトンの膜貫通糖タンパク質であり、インテグリンα６鎖（ＣＤ４９ｆ）と会合して、α６／β４複合体を形成する。この複合体は、ケラチノサイト細胞についての分子マーカーとして作用することが示されている（ＡｄａｍｓおよびＷａｔｔ、１９９１年）。
【００３３】
ＣＤ１０４タンパク質に対する抗体は、１００％のヒトケラチノサイト細胞に結合する。試料をＶｉａｃｏｕｎｔ  Ｄｙｅ試薬と共にインキュベートし、試料を、Ｇｕａｖａ  ＰＣＡシステムを使用して分析することによって、細胞数および生存率を決定する。試薬は、２つの染料、すなわち、全ての有核細胞を染色する膜透過性染料および損傷した細胞または死にかけている細胞のみを染色する膜不透過性染料から構成される。この染料の組合せの使用は、Ｇｕａｖａ  ＰＣＡシステムが、試料中に存在する細胞の総数を推定し、どの細胞が、生存しているか、アポトーシス性か、または死滅しているかを決定するのを可能にする。この方法は、自己の培養線維芽細胞の純度／同一性の決定において特に使用するために、カスタム開発された。具体的な手順を、以下に示す。
【００３４】
手順
ＰＢＳ中の２５％（Ｗ／Ｖ）アジ化ナトリウムの調製
ＦＡＣＳ（蛍光標識細胞分取）用緩衝液の調製
１０００ｍＬのＮａｌｇｅｎｅボトル中に、９６６ｍＬのＰＢＳ、３０ｍＬのＦＢＳ、およびＰＢＳ中の２５％アジ化ナトリウム溶液４ｍＬを組み合わせる。
【００３５】
ＰＢＳ中の１％（ｖ／ｖ）ＨｕＳの調製
試験試料１つ当たり、ＰＢＳ中の１％ＨｕＳ、１ｍＬを調製する。１．５ｍＬのチューブ内に、標識１％ＨｕＳの一定分量９９０μＬ（ＰＢＳ）を入れる。１％ＨｕＳ標識チューブに、１０μＬのヒト血清を添加する。
【００３６】
試料の受取りおよび調製
日毎のＧｕａｖａチェックが、継代の結果を有する日について、実施されていることを確かめる。試験バイアルに対して、細胞数および生存率のアッセイを、Ｇｕａｖａ  ＰＣＡを使用して実施する。得られた平均細胞数の値を記録する。
【００３７】
各試料セットについて、試験バイアル１つ当たり、４つの１．５ｍＬの微量遠心チューブに、以下に従ってラベルを付ける：「ＣＤ９０」、「ＣＤ１０４」、「マウス」（マウスＩｇＧ１アイソタイプの対照に対応する）、および「ラット」（ラットＩｇＧ２ｂアイソタイプの対照に対応する）。
【００３８】
平均細胞数の結果を使用して、各チューブが１×１０５生存細胞を受容するように分注するのに適切な細胞容積を計算する。
【００３９】
例
記載されている平均生存細胞数の結果が、１．５×１０７細胞／ｍＬである場合、１×１０５を１．５×１０７細胞／ｍＬで割って、適切な容積を求める。この容積（ｍＬ）に１０００をかけて、単位をμＬに変換する。
【００４０】
１×１０５／１．５×１０７細胞／ｍＬ＝０．００６６ｍＬ×１０００＝７μＬの細胞溶液の一定分量。
【００４１】
総容積が１ｍＬになるように、十分なＦＡＣＳ用緩衝液を各チューブに添加する。
【００４２】
例
添加する細胞溶液が７μＬである場合には、１ｍＬまたは１０００μＬから７μＬを減じる。１０００μＬ−７μＬ＝９９３μＬのＦＡＣＳ用緩衝液を添加する。
【００４３】
試験バイアルを、ボルテックスの設定を８にして、連続的に３秒間ボルテックスすることによって混合する。
【００４４】
適切な量の細胞溶液を、ＦＡＣＳ用緩衝液に添加する。ボルテックスの設定を８にして、連続的に３秒間ボルテックスすることによって混合する。
【００４５】
各試料チューブ中の細胞を、３，０００ｒｐｍで３分間遠心分離することによってペレット化する。ペレットの形成が困難である場合には、チューブを再び３，０００ｒｐｍで３分間遠心分離する。第２の遠心分離の後に、ペレットの形成が適切である場合、上清の吸引に進む。ピペットの助けを借りて、上清を、ＤＩ水中に２０％のブリーチを含有する廃棄物用容器内に吸引する。およそ５０μＬの上清を各チューブ中に残して、不注意な細胞の吸引を最小限に留める。
【００４６】
ＰＢＳ中の１％ＨｕＳ、２００μＬを添加する。ボルテックスの設定を８にして、連続的に３秒間ボルテックスすることによって混合する。
【００４７】
チューブを、２〜８℃で２５分±５分間インキュベートする。
【００４８】
５．０μＬの抗体またはアイソタイプ対照を、それぞれのチューブに添加する。ボルテックスの設定を８にして、連続的に３秒間ボルテックスすることによって混合する。
【００４９】
チューブを、２〜８℃で２５分±５分間インキュベートする。遮光する。
【００５０】
８００μＬのＦＡＣＳ用緩衝液を、各チューブに添加する。ボルテックスの設定を８にして、連続的に３秒間ボルテックスすることによって混合する。
【００５１】
ピペットの助けを借りて、上清を吸引し、およそ５０μＬの上清を各チューブ中に残して、不注意な細胞の吸引を最小限に留める。４００μＬのＦＡＣＳ用緩衝液を添加する。ボルテックスの設定を８にして、連続的に３秒間ボルテックスすることによって混合する。
【００５２】
Ｇｕａｖａ  ＰＣＡを使用する、試料の取得
ＣｙｔｏＳｏｆｔ  ２．１．５を開き、メインメニューからＧｕａｖａ  Ｅｘｐｒｅｓｓをクリックする。Ｎｅｗ  Ｄａｔａ  Ｓｅｔをクリックし、スクリーンのコマンドに従って、新しいファイルを作成する。確実に、Ｇｕａｖａ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＡｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎスクリーンのＥｖｅｎｔｓ  Ｔｏ  Ａｃｑｕｉｒｅセクション中に２０００を入力する。設定を、マウスＩｇＧ１アイソタイプの対照に調節する。試料情報コントロールパネル内に、試料のパート、ロット、およびアイソタイプ対照または抗体（例えば、「ＤＲ０１  ２００５０２００１＿ｍｏｕｓｅ」）を入力して、Ｓａｍｐｌｅ  ＩＤフィールド中で各試料を同定する。
【００５３】
マウスＩｇＧ１アイソタイプの対照のチューブを、ボルテックスの設定を８にして、連続的に３秒間ボルテックスし、それをＧｕａｖａ  ＰＣＡ内にロードし、Ｓｅｔｔｉｎｇをクリックする。メッセージウィンドウが出現し、Ａｄｊｕｓｔ  Ｓｅｔｔｉｎｇを選ぶ。別のメッセージウィンドウが出現し、対照試料をロードするように求め、ＯＫを選ぶ。
【００５４】
「Ａｄｊｕｓｔ  Ｓｅｔｔｉｎｇｓ」スクリーンが出現するはずであり、システムが、閾値を自動的に設定して、バックグラウンドの蛍光を除外する。
【００５５】
ＦＳＣ  Ｇａｉｎ強度を選択して、既定の細胞クラスターの中心を、ＦＳＣ対生存率（ＰＭ１）プロットのＸ軸上の右下四分円中の１０ｅ３上に位置付ける（例えば、「×２」）。ＦＳＣ閾値バーを、ＦＳＣ対生存率（ＰＭ１）プロット上に位置付けて、デブリを除外する。
【００５６】
ＰＭ２を３００Ｖに調節する。陰性対照集団が、ＦＳＣ対ＰＭ１ドットプロットおよびＰＭ１対ＰＭ２ドットプロットの両方上で、１０ｅ０と１０ｅ１との間に位置するように、ＰＭ１を３００〜４００Ｖの間に調節する。
【００５７】
マウスＩｇＧ１アイソタイプの対照を取得する
マウスＩｇＧ１アイソタイプの対照のチューブを、ボルテックスの設定を８にして、連続的に３秒間ボルテックスし、それをＧｕａｖａ  ＰＣＡ内にロードし、Ａｃｑｕｉｒｅ  Ｎｅｘｔ  Ｓａｍｐｌｅをクリックする。デフォルトのゲーティングの選択肢の全てが、非ゲートに設定されていることを確かめる。ＰＭ１蛍光対計数ヒストグラム上で、マーカーをデフォルト位置に設定する。マーカー上をクリックして、ＰＭ１ゲート化試料についてのＨｉｓｔｏｇｒａｍ  Ｅｖｅｎｔの％がおよそ１．０％であるように設定する。
【００５８】
ＣＤ９０試料を取得する
試料情報コントロールパネル内に試料のパート、ロット、およびアイソタイプ対照または抗体（例えば、「ＤＲ０１  ２００５０２００１＿ＣＤ９０」）を入力して、Ｓａｍｐｌｅ  ＩＤフィールド中で各試料を同定する。ＰＭ１蛍光マーカーが、マウスＩｇＧ１アイソタイプの対照試料と同じ設定に設定されていることを確かめる。
【００５９】
ラットＩｇＧ２ｂアイソタイプの対照について、設定を調節する
ラットＩｇＧ１アイソタイプの対照のチューブを、ボルテックスの設定を８にして、連続的に３秒間ボルテックスし、それをＧｕａｖａ  ＰＣＡ内にロードし、設定をクリックする。「Ａｄｊｕｓｔ  Ｓｅｔｔｉｎｇｓ」スクリーンが出現するはずであり、システムが、閾値を自動的に設定して、バックグラウンドの蛍光を除外する。ＦＳＣ  Ｇａｉｎ強度を選択して、既定の細胞クラスターの中心を、ＦＳＣ対生存率（ＰＭ１）プロットのＸ軸上の右下四分円中の１０３上に位置付ける（例えば、「×２」）。ＦＳＣ閾値バーを、ＦＳＣ対生存率（ＰＭ１）プロット上に位置付けて、デブリを除外する。ＰＭ２を３００Ｖに調節する。陰性対照集団が、ＦＳＣ対ＰＭ１ドットプロットおよびＰＭ１対ＰＭ２ドットプロットの両方上で、１０ｅ０と１０ｅ１との間に位置するように、ＰＭ１を３００〜４００Ｖの間に調節する。
【００６０】
ラットＩｇＧ１アイソタイプの対照の試料を取得する
ラットＩｇＧ１アイソタイプの対照のチューブを、ボルテックスの設定を８にして、連続的に３秒間ボルテックスし、それをＧｕａｖａ  ＰＣＡ内にロードし、Ａｃｑｕｉｒｅ  Ｎｅｘｔ  Ｓａｍｐｌｅをクリックする。ゲーティングの選択肢の全てを、非ゲートに設定する。ＰＭ１蛍光対計数ヒストグラム上で、マーカーをデフォルト位置に設定する。マーカー上をクリックして、ＰＭ１ゲート化試料についてのＨｉｓｔｏｇｒａｍ  Ｅｖｅｎｔの％がおよそ１．０％であるように設定する。マーカーの位置が、「Ｍａｒｋｅｒ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎ」ボックス中に数値として表示される。
【００６１】
ＣＤ１０４試料を取得する
ＣＤ１０４チューブを、ボルテックスの設定を８にして、連続的に３秒間ボルテックスし、それをＧｕａｖａ  ＰＣＡ内にロードし、Ａｃｑｕｉｒｅ  Ｎｅｘｔ  Ｓａｍｐｌｅをクリックする。ＰＭ１蛍光マーカーが、ラットＩｇＧ１アイソタイプの対照の試料と同じ設定に設定されていることを確かめる。
【００６２】
Ｇｕａｖａ  ＰＣＡを使用する試料の分析
Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎスクリーンから、Ｇｏ  ｔｏ  Ａｎａｌｙｓｉｓをクリックする。Ｐｒｉｎｔ、次いで、ＯＫをクリックする。印刷されたレポートのそれぞれに、頭文字を記し、日付を付ける。
【００６３】
純度の計算
ＰＭ１事象の数［ＣＤ９０で標識した総事象（ＣＤ９０）］−ＰＭ１事象の数［抗ＣＤ９０で標識した総事象（マウスＩｇＧ１）］＝ＣＤ９０で標識した（バックグラウンド／非特異的な蛍光について正規化した）総事象（例えば、１９１８事象−２０事象＝１８９８事象）。
【００６４】
ＰＭ１事象の数［ＣＤ１０４で標識した総事象（ＣＤ１０４）］−ＰＭ１事象の数［抗ＣＤ１０４で標識した総事象（ラットＩｇＧ２ｂ）］＝ＣＤ１０４で標識した（バックグラウンド／非特異的な蛍光について正規化した）総事象（例えば、３１事象−２３事象＝８事象）。
【００６５】
ＣＤ９０で標識した（バックグラウンド／非特異的な蛍光について正規化した）総事象＋ＣＤ１０４で標識した（バックグラウンド／非特異的な蛍光について正規化した）総事象＝標識した、正規化した総事象（例えば、１８９８事象＋８事象＝１９０６事象）。
【００６６】
％純度を、以下に従って計算する：１８９８のＣＤ９０総事象／１９０６の標識した、正規化した総事象×１００＝９９．５８、または１００％。
【００６７】
システムの適切性および水準
アッセイの開始前に、ビーズによるチェックを首尾よく実施しなければならない。
【００６８】
総粒子数は、２０００を取得しなければならない。
【００６９】
純度パーセントは、全ての試料について、≧９８％でなければならない。
【００７０】
代替の製造方法
あるいは、細胞を、Ｔ−１７５フラスコ（もしくは代替物）またはＴ−５００フラスコ（もしくは代替物）のいずれかから、マイクロキャリアを細胞を増殖させる表面として含有するスピナーフラスコ内に継代することもできる。マイクロキャリアは、小型のビーズ様構造であり、浮遊培養における足場依存性細胞のための増殖表面として使用される。それらは、小さな容積中で大きな細胞収量をもたらすように設計されている。
【００７１】
この装置において、５０ｍＬ〜３００ｍＬの範囲に及ぶ容積の完全増殖培地を、５００ｍＬ、ＩＬまたは２Ｌの無菌の使い捨てスピナーフラスコに添加する。無菌のマイクロキャリアを、スピナーフラスコに添加する。細胞のキャリアへの接着を可能にするために、３７±２．０℃の、５．０±１．０％ＣＯ２を有するインキュベーターにおいて、培養物を、放置して静止状態を維持するか、または低いＲＰＭ（１５〜３０ＲＲＭ）の撹拌プレート上に短期間（１〜２４時間）置く。付着期間の後、スピンプレートのスピードを増加させる（３０〜１２０ＲＰＭ）。１〜５日毎に、または培地が、色の変化により使用済みのように見える場合に、細胞に新鮮な完全増殖培地を供給する。
【００７２】
細胞を、マイクロキャリアを試料採取することによって規則的な間隔で集め、細胞を単離し、細胞数および生存率の分析を実施する。キャリア１つ当たりの細胞濃度を使用して、いつ培養の規模を拡大すべきかを決定する。十分な細胞を産生したら、細胞を、ＰＢＳを用いて洗浄し、マイクロキャリアからトリプシン−ＥＤＴＡを使用して収集し、再びスピナーフラスコ内において、より多い量のマイクロキャリアおよびより大きな容積の完全増殖培地（３００ｍＬ〜２Ｌ）中に播種する。あるいは、追加のマイクロキャリアおよび完全増殖培地を、既存のマイクロキャリア培養物を含有するスピナーフラスコに直接添加することもでき、こうすることにより、トリプシン処理および再播種を使用することなく、細胞の直接的なビーズ間の移動が可能になる。あるいは、最初のＴ−１７５またはＴ−５００フラスコから、十分な細胞が産生される場合には、細胞を、規模を拡大した量のマイクロキャリアに直接播種することもできる。
【００７３】
付着期間の後、スピンプレートのスピードを増加させる（３０〜１２０ＲＰＭ）。１〜５日毎に、または培地が、色の変化により使用済みのように見える場合に、細胞に新鮮な完全増殖培地を供給する。濃度が意図する適応症に所望される細胞数に達したら、細胞を、ＰＢＳを用いて洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡを使用して収集する。リリース試験、凍結保存および薬物製品−注射用の調製は全て、セクションＣおよびＤに記載するプロセスに従う。
【００７４】
使い捨てスピナーフラスコ内で使用するマイクロキャリアは、ポリブレンド、例として、ＢｉｏＮＯＣ  ＩＩ（登録商標）（Ｃｅｓｃｏ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｂｅｌｌｃｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖｉｎｅｌａｎｄ、ＮＪにより流通されている）およびＦｉｂｒａＣｅｌ（登録商標）（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ）、ゼラチン、例として、Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ−Ｇ（Ｐｅｒｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｙｔｉｃａ、Ａｓｔｒｏｐ、スウェーデン）、セルロース、例として、ＣｙｔｏｐｏｒｅＴＭ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、またはコーティングされている／コーティングされていないポリスチレン、例として、２Ｄ  ＭｉｃｒｏＨｅｘＴＭ（Ｎｕｎｃ、Ｗｅｉｓｂａｄｅｎ、ドイツ）、Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）またはＨｙ−Ｑ  ＳｐｈｅｒｅＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）から作製することができる。
【００７５】
あるいは、スピナーフラスコ装置の代わりに、細胞を、ポリブレンド２Ｄマイクロキャリア、例として、ＢｉｏＮＯＣ  ＩＩ（登録商標）およびＦｉｂｒａＣｅｌ（登録商標）上で、自動蛇腹システム（ｂｅｌｌｏｗ  ｓｙｓｔｅｍ）、例として、ＦｉｂｒａＳｔａｇｅＴＭ（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ）またはＢｅｌｌｏＣｅｌｌ（登録商標）（Ｃｅｓｃｏ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｂｅｌｌｃｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖｉｎｅｌａｎｄ、ＮＪにより流通されている）を使用して処理することもできる。Ｔ−１７５（もしくは代替物）またはＴ−５００フラスコ（もしくは代替物）から得られた細胞を、適切な量の完全増殖培地を有する、マイクロキャリアを含有する蛇腹ボトル内に継代し、システム内に置く。システムは、一定のサイクルを繰り返す間に、培地をマイクロキャリア上にポンプで供給して細胞に供給し、培地を引き出して、酸素添加を可能にする。細胞に対して、上記と同じ順序で、モニター、供給、洗浄および収集を行う。
【００７６】
あるいは、自動システムを使用して、細胞を処理することもできる。バイオプシー組織の消化後、または最初の継代の完了後（Ｔ−１７５フラスコもしくは代替物）、細胞を、自動化されたデバイス内に播種することができる。１つの方法が、自動細胞拡大増殖（ＡＣＥ）システムであり、これは、市販されているかまたはカスタム製作された一連の構成成分であり、一緒にして連結されて、細胞を増殖させるプラットフォームを形成し、この場合、細胞を、ヒトの介入なしで拡大増殖することができる。細胞を、足場依存性の細胞の付着を支持することが可能であるディスクの積重ねからなる細胞タワー中で拡大増殖させる。システムが自動的に、培地を循環させ、細胞の拡大増殖の段階が完了すると、収集のためのトリプシン処理を実施する。
【００７７】
あるいは、ＡＣＥシステムは、規模が縮小された、単一ロットのユニットのバージョンともなり得、これは、細胞を増殖させる表面、送達チューブ、培地および試薬からなる使い捨ての構成成分と、加熱／冷却、培地の移動および自動化されたプログラミングサイクルの実施のための機構およびコンピュータプロセシングの機能を内蔵する永久的なベースとから構成される。受取り時に、それぞれの無菌の照射済みのＡＣＥの使い捨てユニットのパッケージングの包装を解き、あらかじめ充填されているバッグをつるし、バッグを、無菌のコネクターを介して、既存のチューブに接続することによって、培地および試薬をロードする。以下に従って、プロセスを継続する。
【００７８】
生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）内で、酵素により消化されたバイオプシー由来の細胞の懸濁物を、抗生物質を含有する開始増殖培地がすでに充填されている「増殖前チャンバー」（細胞タワーの上部の小型のユニット）内に導入する。ＢＳＣから、使い捨ての構成成分を、すでに準備が整っている永久的なＡＣＥユニットに移す。
【００７９】
およそ３日後、増殖前チャンバー内の細胞を、トリプシン処理し、完全増殖培地があらかじめ充填されている細胞タワー自体内に導入する。ここで、ＣＯ２の注入により引き起こされた「泡立て作用」が、均等に分配させる様式で、細胞を下方にらせん状に動かし、ディスク表面上に落ち着かせるような速度で、培地が循環するのを押し進める。
【００８０】
およそ７日間かけて、細胞を殖やす。この時点で、コンフルエンスを、（記載時には未知の方法で）チェックして、培養物が増殖していることを確かめる。また、この時点で、完全増殖培地を、新鮮な完全増殖培地で置き換える。ＣＧＭを、３〜４週間の間、７日毎に置き換える。培養期間の終わりに、コンフルエンスをもう一度チェックして、十分な増殖があり、意図する処置に所望される量の細胞を得られるであろうことを確かめる。
【００８１】
培養物が十分にコンフルエントになったら、培養物を収集する。使用済みの培地（上清）を、容器から流す。次いで、ＰＢＳを、容器内にポンプでくみ上げ（細胞から、培地、ＦＢＳを洗浄するため）、ほぼすぐに流す。トリプシン−ＥＤＴＡを容器内にポンプでくみ上げて、増殖表面から細胞を引き離す。トリプシン／細胞の混合物を、容器から流し、スピン分離器に入れる。凍結保存剤を、容器内にポンプでくみ上げ、ディスク表面からの任意の残余の細胞を濯ぎ、これも同様に、スピン分離器に送る。スピン分離器により、細胞を集め、次いで、細胞を発送／注射用培地中に均等に再懸濁する。スピン分離器から、細胞を、インラインで自動細胞計数デバイスに送るか、または試料を集めて、実験室における分析により細胞数および生存率の試験を行う。特定の細胞数を計数し、適切な細胞濃度に達していたら、収集した細胞を、コレクションバイアルに送達する。このバイアルを取り出して、低温貯蔵凍結のために試料を分注することができる。
【００８２】
あるいは、自動化されたロボットシステムを使用して、プロセスの全長または一部にわたり、細胞への供給、細胞の継代および収集を実施することもできる。細胞を、消化後、直接ロボットデバイス内に導入することができ、Ｔ−１７５フラスコ（または代替物）内に播種する。デバイスは、細胞をインキュベートし、細胞数および生存率の分析を実施し、供給およびより大きな培養容器への移動を実施する能力を有し得る。また、システムは、個々のロットを追跡するためのコンピュータ制御の目録作成機能も有し得る。ロボットのオプションのために、既存の技術またはカスタマイズされたシステムを使用することができる。
【００８３】
Ｄ．投与単位
最終的な投与単位を調製するために使用する薬物物質−クライオバイアルは、線維芽細胞からなり、これらの線維芽細胞は、最終的な培養容器から収集され、所望される細胞濃度に処方され、クライオバイアル中で凍結保存されている。薬物物質−クライオバイアルは、ＩＭＤＭおよびＰｒｏｆｒｅｅｚｅＴＭおよび７．５％ＤＭＳＯからなる凍結保存用培地中に、２．２×１０７細胞／ｍＬを標的として保存する。速度が制御された凍結サイクルへの曝露の後、クライオバイアル中の薬物物質を、液体窒素のフリーザーの気相中に、凍結状態で保存する。
【００８４】
収集した細胞を、プールし、Ｐｒｏｆｒｅｅｚｅ、ＤＭＳＯおよびＩＭＤＭ培地を含む凍結保存用培地中に処方し、クライオバイアル中に分注し、速度が制御された凍結を経た薬物物質−クライオバイアル材料として、液体窒素中に凍結状態で保存する。
【００８５】
キャップおよびバイアルは放射線滅菌され、これらを、製造元から無菌状態で受け取る。処置に必要とされる、バルク材料の必要な容積を、凍結保存から取り出し、解凍し、プールする。細胞を、４×バルク容積のＰＢＳを用いて洗浄し、１５０×ｇで１０分間遠心分離する（５±３℃）。これに続いて、細胞を、４×バルク容積のＤＭＥＭを用いて洗浄し、再懸濁し、１５０×ｇで１０分間遠心分離する（５±３℃）。洗浄した細胞を、フェノールレッドを有さないＤＭＥＭ中に、標的濃度を１．０〜２．０×１０７細胞／ｍＬとして再懸濁する。あるいは、第２の４×洗浄および最終的な再懸濁は、Ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標）−ＦＲＳ（ＢｉｏＬｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）を用いて実施することもできる。次いで、最終的な無菌のクライオバイアル容器に、生物学的安全キャビネット中で手作業で充填して、１．２ｍＬ／容器の容積を得る。薬物製品−注射用は、２〜８℃の冷蔵発送で投与サイトに発送するまで、２〜８℃で保存する。
【００８６】
あるいは、薬物物質バイアルを、低温保存から取り出し、投与サイトに直接発送して、希釈および投与を行うこともできる。直接注射の概念では、細胞を、収集および調製して、（現在の標的である２．２×１０７細胞／ｍＬと比較して）より高い細胞濃度（３．０〜４．０×１０７細胞／ｍＬ）で凍結保存する。注射が予定される場合、凍結バイアルを、ドライアイス上または液体窒素デュワー中で、研究サイトに発送する。投与サイトでは、バイアルが、手動でまたは加熱ブロックを用いて解凍され、研究サイトでは、凍結細胞が、典型的な注射用希釈剤、例として、静菌水、滅菌水、塩化ナトリウムまたはリン酸緩衝生理食塩水を使用して１：１の比で希釈される。あるいは、ＤＭＥＭを、希釈剤として使用することもできる。この概念は、研究サイトに一晩で発送するために、洗浄し、注射用の新鮮な懸濁物を調製する必要性を排除する。
【００８７】
あるいは、フラスコまたはｃｅｌｌ  ｓｔａｃｋから用時収集した細胞を、ＤＭＥＭ中の１．０〜２．０×１０７細胞／ｍＬの標的濃度に調節し、上記に記載したバルク収集物および薬物物質−クライオバイアルの試験を全て行い、最終的な注射用製品として、２〜８℃の冷蔵発送において投与サイトに用時に一晩で発送することもできる。このシナリオでは、無菌性およびマイコプラズマの試験を、収集の上流において実施して、発送前に結果を得るための時間を有することを可能にし得る。
【００８８】
ＩＩ．投与方法
Ａ．投与単位の調製
ａｚｆｉｃｅｌ−Ｔ  Ａｚｆｉｃｅｌ−Ｔ薬物製品−注射用は、フェノールレッドを有さないダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に処方した、それぞれの患者自体の生きている自己線維芽細胞の懸濁物からなる。Ａｚｆｉｃｅｌ−Ｔ線維芽細胞投与処方物を、２つの２ｍＬのバイアルとして供給し、各バイアルが、１．０〜２．０×１０７細胞／ｍＬの薬物製品、１．２ｍＬを含有する。無菌の細胞懸濁物は、真皮内注射を意図する。最初、Ａｚｆｉｃｅｌ線維芽細胞投与処方物の細胞投与量は、Ａｚｆｉｃｅｌ−Ｔ線維芽細胞投与処方物がＦＤＡによる規制を受ける前に臨床医により投与された細胞数に基づいた。注射１．２〜１．４ｍＬ当たり１．５〜７．０×１０７細胞の投与量範囲が首尾よく使用された。この範囲よりも高い濃度においては、粘度が、線維芽細胞の投与処方物の注射についての懸案事項となった。この用量範囲は、１．１〜５．８×１０７細胞／ｍＬに変換される。
【００８９】
ＩＮＤ下における最初の臨床研究では、０．５〜３．０×１０７細胞／ｍＬを処方した。第２の臨床研究では、１．０〜３．０×１０７細胞／ｍＬを処方した。標準的なリリースの水準は、その後の全ての臨床研究については、１．０〜２．０×１０７細胞／ｍＬであった。
【００９０】
後の臨床研究、すなわち、ＩＴ−Ｒ−００５およびＩＴ−Ｒ−００６では、２つの２．０ｍＬのクライオバイアルのそれぞれ中に、１．０〜２．０×１０７細胞／ｍＬに処方した、１．２ｍＬの線維芽細胞溶液を提供した。提供した２．４ｍＬのうち、顔面の両側における全部で２０ｃｍの鼻唇溝の予測される最大の長さのために、１リニアｃｍ当たり０．１ｍＬの投与量で、２．０ｍＬを注射することを意図した。０．２ｍＬの超過は、最高１０リニアセンチメートルの鼻唇溝（ｎａｓｌａｂｉａｌ）を処置するために、バイアルから確実に１．０ｍＬを得ることができるようするためのものである。
【００９１】
Ｂ．投与単位の投与
バイアルを、室温に温め、穏やかに反転させて、沈んでいる細胞を再懸濁させる。細胞懸濁物を、着脱可能な針または固定された針を備えた少量単位のシリンジを使用して、容器から抜き取る。短い、シャープな針および少量単位のシリンジ（例えば、０．５ｍＬのインスリン用シリンジ）の使用が、注射をより良好に制御するためおよび炎症のリスクを低下させるために推奨される。２９ゲージまたは３０ゲージの針が、製品の真皮内注射には必要である。しかし、より大きな内径を有する２１ゲージの着脱可能な針を有するシリンジを使用して、容器から製品を抜き取るのを援助することができる。抜き取ったら、２１ゲージの針を３０ゲージの針に切り換え、製品を投与することができる。
【００９２】
バッチは、３回の、注射による処置からなる。鼻唇溝のひだの処置のためには、単一の注射による処置（バッチ）が、１．２ｍＬのａｚｆｉｃｅｌＡｚｆｉｃｅｌ−Ｔ線維芽細胞投与処方物／バイアルを含有する２ｍＬのバイアル２つを必要とする。
【００９３】
Ｃ．処置しようとする状態
皮膚の加齢のプロセスは、内因性および外因性の両方の要因の結果として生じる。内因性または自然の加齢に寄与する要因は、構造的な要因でもあり、機能的な要因でもある。構造的には、表皮がより薄くなり、角質細胞の接着性がより低くなり、真皮−表皮の間の接合部が平坦になる。機能的には、線維芽細胞の数および生合成能力が低下し、真皮が、萎縮性、比較的無細胞性かつ無血管性になる。紫外光照射に対する曝露が、外因性または光老化の主要な原因である。外因性の加齢の特徴は、弾性の喪失、粗さおよび乾燥の増加、変則的な色素沈着、深いひだの発生、革様の外観、水疱の形成、ならびに創傷治癒が損なわれることである。加齢の目に見える外観、とりわけ、顔面のひだおよび溝を軽減することは、患者が求める共通の効果である。顔面のライン、ひだおよび溝の処置のための選択肢は、手術、神経毒、充填剤、レーザー、非切除性の療法、マイクロダーマブレージョン（ｍｉｃｒｏｄｅｒｍａｂｒａｓｉｏｎ）およびケミカルピーリングを含む。これらの処置のうちの多くは、加齢の徴候の処置において、安全性、有効性、および効果の持続期間が変化する。本明細書に記載する処方物は、真皮中のコラーゲン産生細胞の数を増加させ、このことは、皮膚の改善についての多因子性の効果を有し得ると考えられている。
【００９４】
Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｋ．Ｂｏｓｓ、ＭＤ（Ｈａｃｋｅｎｓａｃｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒの形成外科部門の副主任）は、輪郭の変形の処置のための、自己ヒト線維芽細胞の使用の先駆者であった。真皮修復の領域における彼の研究は、１９９２年に開始された。彼は、患者の手首から皮膚の小片を取り出し、バイオプシーから得られた自己線維芽細胞を培養し、患者の手首の皮膚の溝内に自己の細胞を注射し、溝の消失を経時的に観察した。彼は、その領域を連続的に数年間観察し、試験部位の溝が修正された状態を維持することを認めた。この単一の処置に対する有害反応はなかった。
【００９５】
小規模の臨床試験が１９９５年３月に実施された。最初は、およそ１２人の被験体に、自己の培養線維芽細胞が、選択されたしわおよび瘢痕中に２〜３回注射された。１２カ月間の経過観察の後、進行性の改善が各被験体に認められた。Ｄｒ．ＢｏｓｓおよびＤｒ．Ｍａｒｋｏは、１００人超の患者を処置したが、アレルギー反応の徴候も有害反応の徴候も２年半の観察の期間にわたり観察しなかったことを報告した。１９９５年１２月に、自己線維芽細胞は、米国で市販されるようになった。米国における商業的な経験は、皮膚科、顔面の形成外科および再建形成外科の分野のおよそ１００人の臨床医であって、顔面のしわ、瘢痕、形成不全の唇、熱傷およびその他の問題を有する患者を処置した、臨床医を含んだ。報告によれば、ほぼ１，０００人の患者が処置を経験し、そのうちの３５４人が、情報の遡及的報告の効力集団に含まれた。
【００９６】
顕著な顔面のしわおよび陥没した顔面の瘢痕の処置のための、線維芽細胞の細胞懸濁物の真皮内注射を使用するパイロット研究が、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ（ＵＣＬＡ）で、１０人の健常な成人において実施された。（２つの）注射のセッションを３週間離して実施した後に、１０人の患者のうち９人が、処置に関する６０〜１００％の改善を認めた。類似の観察が、臨床医によっても得られた。全ての処置した変形において、１０〜８５％のサイズの低下が、光学的な測定（レーザー）により実証された。顕微鏡的には、真皮層の厚さおよび密度の増加の証拠があった。
【００９７】
研究は、線維芽細胞の細胞懸濁物の、真皮性の輪郭の欠損内への注射により、損傷した真皮および皮下組織の修正が生じる得ることを示すに至った。皮膚の真皮は、線維芽細胞を含有し、これらの細胞は主として、細胞外マトリックス構成成分、例として、コラーゲンおよびエラスチンの分泌に関与し、これらの構成成分は、機械的強度および完全性を皮膚にもたらす。正確な機構は不明であるが、線維芽細胞の細胞懸濁物は、自己線維芽細胞を含有し、これらの細胞は、患者の皮膚内に注射すると、細胞外マトリックス構成成分の合成を増加させ、したがって、皮膚の完全性を増加させ、最終的に、細かいラインおよびひだの減少をもたらすことができる。療法の効果は、即時の効果ではないが、代わりに、ラインおよびひだの外観を経時的に徐々に改善する。
【００９８】
線維芽細胞の細胞懸濁物は、最初に、１９９５年にＤｒ．Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｂｏｓｓにより実施された臨床研究において評価され、次いで、顔面の輪郭の変形のための美容的処置として、１９９５年１２月から１９９９年２月まで米国で販売された。１９９９年２月以降、ＰＨＳ法の下、ＦＤＡは、全ての体細胞療法を規制するように求められた。
【００９９】
線維芽細胞の細胞懸濁物は、細胞および組織の新しい規制に該当するというＦＤＡの通知に基づいて、商業的な流通を停止し、臨床開発を、新薬治験申請（ＩＮＤ）♯８６４１の下で開始した。顔面のひだおよび溝の処置のための研究を、２つの第二相研究（研究ＩＴ−Ｒ−００１およびＩＴ−Ｒ−００７）および５つの第三相研究（研究ＩＴ−Ｒ−００２、ＩＴ−Ｒ−００３Ａ、ＩＴ−Ｒ−００３Ｂ、ＩＴ−Ｒ−００５およびＩＴ−Ｒ−００６）において実施した。研究ＩＴ−Ｒ−００３Ａ、ＩＴ−Ｒ−００３Ｂ、ＩＴ−Ｒ−００５およびＩＴ−Ｒ−００６は、線維芽細胞の細胞懸濁物の安全性および有効性のプロファイルを実証する堅調な、適切な対照を置いたデータをもたらした。線維芽細胞の細胞懸濁物は、ざ瘡瘢痕の処置において研究された（研究ＩＴ−Ａ−００８；ＩＮＤ♯１３４５５）。９９人の被験体が、研究ＩＴ−Ａ−００８の間に、線維芽細胞の細胞懸濁物を用いる処置を受けた。また、線維芽細胞の細胞懸濁物は、制限性の熱傷瘢痕の処置（ＩＮＤ♯１３３０８）、声帯の瘢痕化（ＩＮＤ♯９８９２）、および歯肉の修復（ＩＮＤ♯１０８０５）を含めた、その他の適応症において使用するためにも開発された。
【０１００】
より早期の００１治験および００２治験は、支持的、探索的なデータをもたらし、これらのデータは、００３Ａ／Ｂ治験および００５／００６治験の設計を導いた。研究ＩＴ−Ｒ−００１は、しわの処置のための、線維芽細胞の細胞懸濁物の二重盲検、無作為化およびプラセボ対照の第二相研究であった（鼻唇溝、および頬と唇との間の溝、口周囲のライン、眉間のライン、ざ瘡瘢痕、ならびに前頭部を処置した）。研究の急性相では、各被験体が、線維芽細胞の細胞懸濁物（０．５×１０７、１．０×１０７もしくは２．０×１０７細胞／ｍＬ）またはプラセボの、およそ２週間離して投与する３回の処置を受けた。研究の急性相では、被験体（４０人）を、線維芽細胞の細胞懸濁物（Ｎ＝３０）またはプラセボ（Ｎ＝１０）を用いて処置した。
【０１０１】
研究ＩＴ−Ｒ−００２は、顔面の輪郭の変形および瘢痕の処置のための、線維芽細胞の細胞懸濁物の二重盲検、無作為化およびプラセボ対照の第三相研究であった。この研究の急性相では、各被験体が、２．０×１０７細胞／ｍＬを含有する線維芽細胞の細胞懸濁物またはプラセボの、１４±７日毎に投与する３回の処置を受けた。研究の急性相では、被験体（１５１人）を、線維芽細胞の細胞懸濁物（Ｎ＝１１２）またはプラセボ（Ｎ＝３９）を用いて処置した。両方の研究にわたり、治験の急性相では、被験体（２１３人）を、線維芽細胞の細胞懸濁物（Ｎ＝１００）またはプラセボ（Ｎ＝１１３）を用いて処置した。
【０１０２】
研究ＩＴ−Ｒ−００３Ｂは、共主要エンドポイント（ｃｏ−ｐｒｉｍａｒｙ  ｅｎｄｐｏｉｎｔ）の両方について有効性を示したが、研究ＩＴ−Ｒ−００３Ａでは、共主要エンドポイントのうちの１つが（治験責任医師の評価について）統計学的有意性の判断基準を満たすことができなかったことから、線維芽細胞の細胞懸濁物についての極めて重要な第三相試験としての２つ新しいプロトコールが得られた（研究ＩＴ−Ｒ−００５およびＩＴ−Ｒ−００６）。００３Ａにおいて目的に達しなかったエンドポイントについての理由として、最適を下回る投与量を含んでいたことが考えられる。細胞濃度は同じに維持したが、送達する容積を増加させた。トレーニングの技法および一連の注射間の時間を含めて、その他の理由が同定された。
【０１０３】
研究ＩＴ−Ｒ−００５およびＩＴ−Ｒ−００６は、鼻唇溝のひだの処置における線維芽細胞の細胞懸濁物の有効性および安全性の多施設、二重盲検、無作為化、プラセボ対照の第三相研究であった。これらの研究は、ＦＤＡ  ＳＰＡ  Ａｇｒｅｅｍｅｎｔに従う同一のプロトコールの下で実施した。これらの研究の急性相では、各被験体が、１．０〜２．０×１０７細胞／ｍＬを含有する線維芽細胞の細胞懸濁物またはプラセボの、５週±１週毎に投与する３回の処置を受けた。研究ＩＴ−Ｒ−００５では、８３人の被験体を、線維芽細胞の細胞懸濁物を用いて、９２人の被験体を、プラセボを用いて処置した。研究ＩＴ−Ｒ−００６では、９８人の被験体を、線維芽細胞の細胞懸濁物を用いて、９９人の被験体を、プラセボを用いて処置した。
【０１０４】
研究ＩＴ−Ｒ−００７は、顔面のひだおよび溝の処置における線維芽細胞の細胞懸濁物の安全性および有効性の多施設、非盲検の第二相研究であり、鼻唇溝以外に使用するために、線維芽細胞の細胞懸濁物の使用について安全性および有効性のデータを得るように設計された。この研究の急性相では、各被験体が、１．０〜２．０×１０７細胞／ｍＬを含有する線維芽細胞の細胞懸濁物、最高６ｍＬの２回の処置（５週±１０日毎に投与する）を受けた。研究の急性相の間に、４５人の被験体を、線維芽細胞の細胞懸濁物を用いて処置した。この研究は、被験体を、００５／００６研究で使用した線維芽細胞の細胞懸濁物の総用量よりも３倍多い総用量に曝露した。
【０１０５】
線維芽細胞の有効性の極めて重要な第三相試験、すなわち、研究ＩＴ−Ｒ−００５およびＩＴ−Ｒ−００６（００５／００６）に登録した被験体集団は主に、年齢が５０代から６０代の白人女性であった。被験体の年齢は、２３〜８２歳の範囲に及び、平均年齢は５６．１歳であった。研究への登録時の被験体の鼻唇溝のひだの重症度は、評価担当者によるひだ重症度評価スケール（Ｅｖａｌｕａｔｏｒ  Ｗｒｉｎｋｌｅ  Ｓｅｖｅｒｉｔｙ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｓｃａｌｅ）上のグレード３〜５の範囲に及び、平均スコアは、右のひだについては３．７、および左のひだについては３．６であった。
【０１０６】
第三相のＩＴ−Ｒ−００３ＡおよびＩＴ−Ｒ−００３Ｂ（００３Ａ／Ｂ）研究に登録した集団は、００５／００６に属した集団に類似した。００３Ａ／Ｂ研究では、女性が集団の９４％を構成し、集団の９５％が白人であった。２つの研究にわたる被験体の平均年齢は５４．１歳であった。００３Ａ／Ｂのプロトコールは、設計の点で００５／００６のプロトコールに非常に類似したが、００３Ａ／００３Ｂは、より広い範囲のひだ重症度を有する被験体の登録を認め、登録時の主要な鼻唇溝変形についてのスコアは、評価担当者によるスケール上のグレード２〜５の範囲に及んだが、平均重症度スコアは３．９で類似した。
【０１０７】
全ての極めて重要な有効性研究が、被験体による自己評価手段および臨床治験責任医師による評価からなる共主要エンドポイントを使用した。
【０１０８】
００５／００６研究では、有効性の共主要エンドポイントは、以下の、被験体によるひだの評価および評価担当者によるひだ重症度の評価であった。
【０１０９】
被験体によるひだの評価：５点のひだの評価スケールを使用する、来診６時点の、顔面の下方部分のひだの被験体による目の前での包括的評価。応答を、ベースラインと比較した場合の、スケール上の２点以上の改善と定義する。
【０１１０】
評価担当者によるひだ重症度の評価：フォトガイド（ｐｈｏｔｏｇｕｉｄｅ）を用いる、６点のひだ重症度順位スケールを使用する来診６時点の、安静時、両側の鼻唇溝のひだの盲検の評価担当者による目の前での評価。応答を、ベースラインと比較して、スケール上の２点以上の改善と定義する。これらのエンドポイントは、偏らない評価（盲検の医師によるグレードの決定）および臨床的妥当性（自身の外観の被験体の意見）の両方をもたらすように選択した。評価担当者によるひだ重症度の評価のために使用したスケールは、Ｌｅｍｐｅｒｌｅら、Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ．、２００１年、１０８巻（６号）：１７３５〜５０頁により開発され、確証付けられている鼻唇溝（ＮＬＦ）の評価のための６点のひだ重症度順位スケールであった。Ｌｅｍｐｅｒｌｅのスケールでは、鼻唇溝のひだの重症度の１点の改善の検出が有効であると認められている。しかし、外観の評価は、主観的であり得、変動する傾向があることから、このエンドポイントを首尾よく満たす場合を、各ＮＬＦについて２点の改善がある場合と定義した。すなわち、応答者とみなすためには、所与の患者について、左および右の両方のＮＬＦの評価において、担当者の評価において、２点改善しなければならなかった。Ｌｅｍｐｅｒｌｅのスケールは、皮膚科分野において認められている測定の標準であり、類似の適応症においてＦＤＡの承認を得ている製品についての極めて重要な臨床試験で首尾よく利用されている。
【０１１１】
被験体によるひだの評価のために使用したスケールは、ＣｏｈｅｎおよびＨｏｌｍｅｓ、Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ．、２００４年、１５；１１４巻（４号）：９６４〜７６頁により使用された公開されているスケールに基づいている。評価担当者による評価と同様、処置に対する良好な応答についての判断基準として、２点の改善を確立した。
【０１１２】
００３Ａ／Ｂ研究を、類似の共主要エンドポイントを有するように設計したが、これらの研究は、００５／００６研究とは異なる、被験体による評価ツールを使用した。００３Ａ／Ｂのプロトコールに記述したように、有効性の共主要エンドポイントは、治験責任医師による６点の順位スケールおよび被験体によるＶＡＳ評価を使用する、６カ月の来診時の、線維芽細胞の投与処方物の主要な鼻唇溝中への注射の有効性である。
【０１１３】
このプロトコールで参照した６点の順位スケールは、００５／００６研究で使用したスケールと同じＬｅｍｐｅｒｌｅのスケールであるが、００５／００６研究では、スケール上のそれぞれの点について、００３Ａ／Ｂ研究で使用した文章よりも記述的な文章を提供した。視覚的なアナログスケールを、被験体による評価のために使用した。このスケールでは、被験体に、それぞれの輪郭の変形を、１０ｃｍのライン上に印を付けることによって、０（欠陥なし）〜１００（非常に重度の欠陥）に評定するように求めた。両方の研究が、この評価ツールを使用して、改善についての統計学的有意性を満たしたが、被験体による評価データの臨床的妥当性および説明力を改善するために、００５／００６研究では、ＶＡＳスケールを、被験体によるひだの評価の順位スケールで置き換えた。
【０１１４】
両方の共主要エンドポイントにより測定した場合、００５／００６研究の両方の結果から、ＩＴ−処置被験体とプラセボ処置被験体との間における応答の非常に有意な差が実証された。
【０１１５】
００３Ａ／Ｂ研究では、ＩＴ−処置被験体とプラセボ処置被験体との間において、応答の統計学的に有意な差を、４つのエンドポイントのうちの３つについて観察した。研究ＩＴ−Ｒ−００３Ａでは、プラセボ−処置被験体よりも高いパーセントのＩＴ−処置被験体が、評価担当者による評価により、応答者としてスコア化されたが、この差は、統計学的有意性を満たさなかった。
【０１１６】
研究ＩＴ−Ｒ−００５およびＩＴ−Ｒ−００６は、同じ研究プロトコールを使用して同時に行った。したがって、研究デザインに差はなかった。また、研究ＩＴ−Ｒ−００３ＡおよびＩＴ−Ｒ−００３Ｂも、別個のプロトコール下で同時に行った。にもかかわらず、それぞれの研究群内において、結果に差があった。００５／００６研究では、全ての主要エンドポイントが首尾よく満たされたが、００５研究は、線維芽細胞の細胞懸濁物−処置群における応答者の率を、被験体による評価および評価担当者による評価それぞれについて、５７％および３３％であると報告し、一方、００６研究は、応答者の率を、同じ測定法について、４６％および１９％であると報告した。この測定法に従うと、００３Ａ研究では、ＩＴ−処置群中、２１％の被験体が、評価担当者による評価において、応答者としてスコア化され、一方、研究ＩＴ−Ｒ−００３Ｂでは、線維芽細胞投与処方物群中、４８％の被験体が応答した。
【０１１７】
００５／００６研究では、２つの治験間において、患者の人口統計学的（性別、人種、年齢またはベースラインの重症度）有意差を認めなかった。しかし、各研究内において、サイトを越えて、応答率の変動性を観察した。続いて、参加する全ての治験責任医師には、鼻唇溝注射を、同じ技法を使用して実施するように訓練を受けさせた。これらの医師は、真皮乳頭内への注射に予想される「膨疹」を起こし得ることを理解することが予想された。このことは、ＩＴ−Ｒ−００３治験前には行われなかった。また、評価方法の差も観察された。サイトの差は、これらの観察と組み合わせると、サイト間の多くの不一致が、注射技法および評価の両方における共通のトレーニングの欠如により引き起こされ得るという結論を導いた。
【０１１８】
００５／００６研究は、００３Ａ／Ｂ研究から得られたデータの検討および分析の後に設計された。この検討の結果として、００３Ａ／Ｂ研究と比較して、００５／００６のプロトコールの設計には、いくつかの改変がもたらされた。もたらされた改変の概要を、表６に示す。これらの改変は、主要エンドポイントの結果における観察された差に寄与した可能性がある。
【０１１９】
用量および投与レジメンの影響
顔面のしわおよび鼻唇溝
鼻唇溝の処置のために選択された用量（１．０〜２．０×１０７細胞／ｍＬ、最高２ｍＬを、１リニアセンチメートル当たり０．１ｍＬで投与する）は、ＩＮＤ８６４１下で実施した臨床試験において得られたデータのみならず、線維芽細胞の投与処方物の商業的な使用を通して米国および海外の両方で得られた情報にも基づいている。研究ＩＴ−Ｒ−００１は、プラセボ対照、第二相の用量範囲研究であり、顔面のしわの処置における安全性および予備的な有効性について、０．５、１．０および２．０×１０７細胞／ｍＬの線維芽細胞の細胞懸濁物を、１リニアセンチメートル当たり０．１ｍＬにおいて、プラセボと比べて評価した。ベースラインと比べた、最初の注射の４カ月後（研究ＩＴ−Ｒ−００１についての有効性の主要タイムポイント）が、最も高い用量群（２．０×１０７細胞／ｍＬ）において、最良の結果を示した。したがって、これが、その後の全ての研究において使用する細胞密度となった。
【０１２０】
００３Ａ／Ｂ研究では、１リニアセンチメートル当たりの用量は、この適応症についてのその他のａｚｆｉｃｅｌ−Ｔ線維芽細胞投与処方物の研究で使用した用量と同じであった（１リニアセンチメートル当たり０．１ｍＬ）。しかし、各処置についての総用量は、全部で１０ｃｍの総処置領域にわたり１ｍＬに制限された。この差は、研究００３Ａ／Ｂでは、頬と唇との間の溝（ｍｅｓｏｌａｂｉａｌ  ｆｏｌｄ）のひだと時には呼ばれるひだ（口角から下方に顎に向かって伸長する溝またはひだ）の処置が可能でなかったことによる。頬と唇との間の溝のひだは、頻繁に鼻唇溝のひだに近接し、したがって、全体的な審美的結果に寄与する構成成分であるため、頬と唇との間の溝のひだの処置を可能にするために、００５／００６では、総用量を２ｍＬに増加させた。認められた総用量は、００３Ａ／Ｂのプロトコールと００５／００６のプロトコールとの間の差であったのみならず、投与する製品の容積のこの増加は、００５／００６研究から得られた良好な結果に寄与する要因でもあるとみなされている。
【０１２１】
５週±１週の推奨される投与間隔は、００３Ａ／Ｂ研究から治験責任医師により提供されたフィードバック、および００５／００６治験の結果に基づいて決定した。００３Ａ／Ｂの治験責任医師は、アイソラゲン（Ｉｓｏｌａｇｅｎ）について、それらの研究における処置間の時間（７〜１４日）は、１回の注射が誘発する炎症が次の注射を投与する前に弱まるのを可能とするには不十分であると忠告した。炎症のこの持続は、注射のプロセスの間にのみに認められ、有害事象としては報告されなかった。より長い間隔で注射を順次投与した場合（プロトコールによって認められる）、治験責任医師は、注射部位が、正常な皮膚により近い状態を示す可能性が高いことを報告した。このことは、注射の深度および容積の両方のより大きな制御につながった。このことから、注射間の間隔を、００５／００６研究では、最初は、４週、次いで、５±１週に伸ばすことになった。この変化もまた、００５／００６研究の良好な結果に寄与する要因であるとみなされている。
【０１２２】
００５／００６研究では、Ｉｎｔｅｎｔ  ｔｏ  Ｔｒｅａｔ集団の有効性の一次分析は、線維芽細胞の細胞懸濁物処置群とプラセボ処置群との間において、有効性の共主要エンドポイントにより測定した処置に対する応答を評価した。来診６時点の評価担当者によるひだ重症度の評価（有効性の共主要エンドポイント）については、２６％のＩＴ−無作為化被験体対７％のプラセボ−無作為化被験体が、両側の鼻唇溝のひだについて、２点の改善を示した。線維芽細胞の投与処方物またはプラセボを用いる処置を少なくとも１回実際に受けた被験体のみを分析に含めた場合（改変されたＩｎｔｅｎｔ  ｔｏ  Ｔｒｅａｔ（ＭＩＴＴ）集団）、評価担当者によるひだ重症度の評価に関する２点の応答のパーセントは、ＩＴ−処置被験体中、３０％であり、それに比較して、プラセボ−処置被験体については、８％であった。ＭＩＴＴ集団における評価担当者によるひだ重症度の評価に関する１点の応答率は、線維芽細胞の投与処方物を用いて処置した被験体中では６４％であり、プラセボを用いて処置した被験体中では３６％であった。最後に、ＩＴの使用に関して観察された効果のかすかな開始の実証においては、評価担当者および被験体の両方による写真による有効性の評価が、ＩＴ−処置被験体とプラセボ−処置被験体との間において、処置に対する応答の極めて統計学的に有意な差を示した。評価担当者が、ベースラインにおいて撮影した被験体の写真と有効性の最後の来診時に撮影した写真とを並べて比較した場合、ＭＩＴＴ集団中のＩＴ−処置被験体の５７％が、およびこの集団中のプラセボ−処置被験体の２０％のみが、改善したとしてスコア化された。被験体による写真による評価（被験体による改善評価）に関しては、被験体が、自身のベースラインの写真と有効性の最後の来診時に撮影した写真とを比較した場合、ＩＴ−処置被験体の６７％およびプラセボ−処置被験体の２６％が、改善を示した。この評価手段を使用すると、目の前での評価の結果と比較して、応答率が増加することから、かすかに、徐々に開始する効果が実証されている。このことは、外観をベースラインと比較するまで、被験体にも評価担当者にも明らかにならない可能性がある。
【０１２３】
要約すると、上記で論じた理由により、鼻唇溝のひだの処置のための好ましい投与は、処置セッション１回当たり１〜２ｍＬの投与処方物を、ひだの表層真皮乳頭内に、１リニアｃｍ当たり０．１ｍＬの用量分布で注射し、好ましくは、３回の処置セッションを、５週±７〜１０日離して行う。
【０１２４】
複数の顔面領域（すなわち、「顔面全体」）におけるしわの処置のための好ましい投与は、処置セッション１回当たり５〜６ｍＬの投与処方物を、表層真皮乳頭内に、図４の処置マップに従って、１リニアｃｍ当たり０．０５ｍＬの用量分布で注射し、好ましくは、１または２回の処置セッションを、５週±７〜１０日離して行う。
【０１２５】
ざ瘡瘢痕
ざ瘡瘢痕の処置のための適切な投与量を、ざ瘡の瘢痕化の重症度について、客観的に、医師の評価により、目の前でグレードを決定するための確証されている方法およびスケール、すなわち、「評価担当者による目の前でのざ瘡瘢痕の評価スケール」を使用して決定することができ、これは、図２に示すように、直接的な照明および接線方向の照明下における相対的な瘢痕化の外観の比較評価を利用する。
【０１２６】
【表１】
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ＬａｙｔｏｎらによりＬｅｅｄｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｉｎｆｉｒｍａｒｙにおいて実施された研究では、ざ瘡の瘢痕化の重症度を、萎縮性および肥厚性／ケロイド性の瘢痕の病変カウントにより評価した。萎縮性瘢痕（アイスピック瘢痕、斑状萎縮性瘢痕または小胞性斑状萎縮性瘢痕として形態学的に定義された）は、１〜６の範囲に及ぶスコアに言い換えられ、各スコアがそれぞれ、１〜５、６〜１０、１１〜２５、２６〜５０、５１〜１００および１００超個の瘢痕を示す。アイスピック瘢痕は、変則的な境界、ギザギザの端、および急勾配の側面を有し、繊維性の基礎につながるシャープな周辺部分をもつ瘢痕と記載された。斑状萎縮性瘢痕は、基礎がしばしば容易にしわになる、柔らかくかつ膨張性の瘢痕であった。小胞性斑状萎縮性瘢痕は、小さな白色の毛包周囲の丘疹または斑と記載された。発明者らは、ケロイド性瘢痕および肥厚性瘢痕を、美観を損なう状態のより大きなレベルによって、別個に定量化した。２、４および６のスコアの割当てはそれぞれ、１〜３つ、４〜７個および７個超の、このタイプの瘢痕を示す。ケロイド性瘢痕は、硬化し、炎症性ざ瘡病変開始の境界を超えて伸長している瘢痕と記載され、一方、肥厚性瘢痕は、盛上がりが低く、原発のざ瘡病変の領域に一致している瘢痕と定義された。次いで、総瘢痕スコアを、萎縮性のカテゴリーおよび肥厚性のカテゴリーの両方からのスコアを足すことによって得た。そのような総スコアを、顔面、胸部および背中について別個に計算して、瘢痕評価のための包括的なシステムを提供することができ、また、有効な投与量および処置レジメンを評価するための手段を提供することもできる。
【０１２７】
好ましい実施形態では、ざ瘡瘢痕を、処置セッション１回当たり２〜１２ｍＬの線維芽細胞の投与処方物を、表層真皮乳頭内に、瘢痕化領域１ｃｍ２当たり０．１ｍＬの用量分布で注射し、１〜３回の処置セッションを、１４日±３日離して行うことによって処置する。
【０１２８】
熱傷
深い真皮に対する熱傷傷害の潜在的に重大な長期の結果が、傷害後の瘢痕である。重大な熱傷に起因する制限性瘢痕の形成は、影響を受けた領域の正常な動作を阻止し、運動（屈曲、内転および／または伸長）の範囲を制限する恐れがある。実際に、「機能に影響を及ぼす熱傷による瘢痕化および拘縮は、熱傷傷害の最もいらだたしい後期合併症を残す」（Ｉｗｕａｇｗｕ、Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ．、１９９９年４月；１０３巻（４号）：１１９８〜２０４頁）。これらの瘢痕は、疼痛および機能の低下を引き起こすことによって、生活の質に対して顕著に負の影響をもたらす恐れがある。制限性の熱傷瘢痕から、それらの場所によっては、上肢の顕著な機能的障害および機能の喪失がもたらされ得る。線維芽細胞の投与処方物は、上肢の制限性の熱傷瘢痕の処置において、特に有用であり、とりわけ、被験体が経験する機能的障害および関連の身体障害のレベルを低下させる。
【０１２９】
制限性の熱傷瘢痕の処置のための好ましい投与では、処置セッション１回当たり１〜１０ｍＬの投与処方物を、熱傷瘢痕の触診により認められる制限帯（ｐａｌｐａｔｅｄ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｂａｎｄ）内に、瘢痕化領域１ｃｍ２当たり０．１〜０．５ｍＬの用量分布で注射し、好ましくは、１〜５回の処置を、２〜６週間離して行う。
【０１３０】
英国からの症例報告（以前は、利用可能な線維芽細胞処方物が手に入った）は、熱傷の瘢痕および創傷について、成功を実証し、有害作用はなかった。
【０１３１】
ロンドンのＤｒ．Ｃｈｒｉｓ  Ｉｎｇｌｅｆｉｅｌｄは、頚部、下方顔面、眼および耳の所々に複数の熱傷を有する男性の症例を報告した。被験体は以前に、顔面のしわのために線維芽細胞処方物を投与されたことがあり、したがって、熱傷時には、細胞が保存されていた。このことにより、この男性の顔面の熱傷を、最初の傷害から６週間以内に処置することが可能であった。続いて、この男性は、傷害の３カ月後に３回の追加の処置を受けた。各処置は、表面麻酔下で実施され、３〜４ｍｌの細胞から構成され、３０〜４０回の注射において与えられた。この被験体は以前に、皮膚移植片を用いて処置されたことがあった。この被験体は、最初の処置から３週間以内に、顔面および頚部の動作の改善ならびに皮膚の質感および柔軟性の改善を報告した。
【０１３２】
また、Ｉｎｄｉａｎａ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＤｒ．Ｗ．Ｇｒｅｇｏｒｙ  Ｃｈｅｒｎｏｆｆも、１０個の非治癒性のレーザー熱傷の創傷において、線維芽細胞処方物を使用したことがある。これらの創傷は、線維芽細胞を用いて処置するまで、３〜９カ月にわたり治癒しなかったという事実にもかかわらず、この医師は、細胞の最終的な注射の６週間後には、完全な治癒を認めた（Ｂｏｓｓら、２０００年、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｓｕｒｇｅｒｙ、２７巻：６１３〜６２６頁）。
【０１３３】
米国では、２人の熱傷犠牲者が、線維芽細胞処方物の特別な配慮により認められた使用から利益を得ており、彼らの非治癒性の熱傷による創傷が大きく改善した。オクラホマシティ爆破事件（Ｏｋｌａｈｏｍａ  Ｃｉｔｙ  Ｂｏｍｂｉｎｇ）の犠牲者には、爆発から、悲劇的な瘢痕が残った。数カ月に及ぶ、命を救い、そして外観を改善するための手術、レーザーによるリサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）およびその他の処置の後に、皮膚移植片の失敗、ならびに顔面および頚部上に依然として存在するその他の非治癒性の創傷を支援するために、この犠牲者を、線維芽細胞を用いて処置した。処置後、非治癒性の創傷が閉じ、治癒した。さらに、この犠牲者は、瘢痕の外観の改善も認めるようになった。
【０１３４】
前頭部および頬部領域上に、レーザー由来の熱傷からの１２個の非治癒性の創傷を有する別の被験体を、特別な配慮により認められた使用に基づいて、線維芽細胞処方物を用いて処置した。当時、この被験体には、処置の唯一の代替案として、ウシ皮膚移植片しかなかった。処置後、創傷のうちのほとんどが、注射から６週間以内に治癒した。
【０１３５】
以下の症例報告は、線維芽細胞処方物が、亜急性のまたは治癒しつつある熱傷による創傷のみならず、長年の、十分に治癒しているが、消耗性の制限性熱傷瘢痕も改善することができることを示している。
【０１３６】
英国、ロンドンのＤｒ．Ｃｈｒｉｓ  Ｉｎｇｌｅｆｉｅｌｄは、発表の２年前に、複数の熱傷を被り、結果として、左側の顔面の表情を制限する大きな顔面の瘢痕が生じた女性の症例を報告した。被験体の傷害は、重度の負の心理学的結果をもたらし、被験体は、「自己を喪失した（ｌｏｓｔ  ｗｈｏ  ｓｈｅ  ｗａｓ）」と感じていた。被験体は、顔面に、各３ｍＬの３回の処置を受けた。６〜８週間以内に、被験体、家族および担当医が、目覚しい改善を認めた。それは、その母親が、昔の娘が「帰ってきた」と感じるほどであった。顔面を動かす被験体の能力が改善し、同様に、皮膚の質感および外観も改善した。次いで、同じ被験体が、手の萎縮性の瘢痕および非治癒性の創傷のための療法を受けた。療法を受けるまでは、被験体は、宝石作製の講座で小さな物体を扱うのが困難であった。処置から４週間以内に、創傷は治癒し、宝石作製タスクを実施する能力が改善した。
【０１３７】
英国、ＬｅｅｄｓのＤｒ．Ｍａｒｋ  Ｐａｌｍｅｒは、１０年間続く、頚部、肩部および上腕の慢性創傷について処置した別の被験体に関して報告した。処置するまで、被験体は、頚部および肩部に重度に制限された運動の範囲を有し、慢性疼痛のために、アヘン剤による鎮痛が毎日必要であった。被験体は、頚部領域中に、総数２回の４ｍＬの処置を受けた。最初の処置後でさえ、被験体は、運動の範囲および皮膚の質感の改善を報告した。第２の処置までに、被験体の運動の範囲は、ほぼ正常になり、劇的な変化が、瘢痕の外観および質感に認められた。
【０１３８】
続いて、同じ被験体が、上腕の瘢痕の処置を受けた。処置するまで、これらの瘢痕は、重度に身体障害性であった。それは、被験体が、疼痛のために、腕を９０°を超えて持ち上げることができないほどであった。腕の２つの萎縮性瘢痕の帯に対する各１．５ｍＬの単一の処置から３カ月が経過するまでに、瘢痕は、ほとんど姿を消しており、被験体には、１８０°の運動の範囲が戻り、疼痛は消失した。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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