(57)【要約】  本発明は、反復的エキソ核酸切断反応によるターゲット核酸配列の検出に関する。プライマーの助け無しに、プローブ切断によりシグナルを発生させて、同時的ターゲット増幅反応無しにシグナルを増幅させる本発明の方法は、従来リアルタイムＰＣＲ反応で現れる問題点、例えば、擬陽性シグナルやオリゴヌクレオチド（プライマー及びプローブ）の選択及び反応条件最適化の困難などを伴うことなく、多重ターゲット配列検出を可能にする。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ターゲット核酸配列をプローブにハイブリッド形成させる工程であって、前記プローブは、前記ターゲット核酸配列の第１位置（Ｆｉｒｓｔ  ｓｉｔｅ）に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列、蛍光レポーター分子及び前記レポーター分子の蛍光をクエンチングできるクエンチャー分子を含む工程と、
（ｂ）プローブの切断のために前記プローブを、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素と接触させる工程であって、前記蛍光レポーター分子又は前記クエンチャー分子は前記プローブから解離され、前記レポーター分子の蛍光が脱消光（ｕｎｑｕｅｎｃｈｅｄ）されて、前記ターゲット核酸配列の存在を示す蛍光シグナルが発生する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の前記プローブ−ターゲット核酸配列の二本鎖（ｄｕｐｌｅｘ）を変性させる工程と、
（ｄ）前記工程（ａ）−（ｃ）を少なくとも２回繰り返して、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを増幅させる工程と、
（ｅ）前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルを検出する工程であって、前記検出は、前記工程（ｄ）の反復のサイクル毎に行われるか、工程（ｄ）の反復の終了時点で行われるか、あるいは前記反復の間、所定の時間間隔のそれぞれにおいて行われて、前記シグナルは、ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、
を含むことを特徴とする、反復的エキソ核酸切断反応を利用してＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法。
【請求項２】
前記エキソヌクレアーゼ活性を有する前記酵素は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性酵素である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法は、液相で行われる請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記方法は、固相で行われ、前記プローブは、その３’−末端を通じて固相基質の表面上に固定化され、前記プローブは、前記酵素の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断される切断部位及び切断されない非切断部位を有し、前記非切断部位は、前記固相基質の表面に残存し、前記プローブ上の前記蛍光レポーター分子は、前記非切断部位に位置し、前記レポーター分子の前記蛍光をクエンチングできる前記クエンチャー分子は、前記切断部位に位置し、前記プローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合、前記プローブの前記切断部位は、前記酵素の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により前記プローブから解離されて、前記プローブの前記非切断部位上にある前記レポーター分子の前記蛍光が脱消光され、これにより、前記固相基質上で蛍光シグナルを検出して前記ターゲット核酸配列の存在を決定する請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記プローブは、その５’−末端にマッチヌクレオチドを含む請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼである請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記工程（ａ）は、追加的な逆方向プライマーを用いた、前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼによる前記追加的な逆方向プライマーの伸長反応により行われ、工程（ｂ）で前記プローブとハイブリッド形成されるターゲット核酸配列を生成させる請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記工程（ａ）は、前記ターゲット核酸配列上の第２位置に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する上流プライマーをさらに含み、前記上流プライマーの３’−末端は、前記プローブの５’−末端の上流に存在する請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記工程（ａ）は、前記ターゲット核酸配列に前記プローブ及び前記上流プライマーをハイブリッド形成させて行われて、これにより、前記ターゲット核酸配列及び前記プローブによる第１二本鎖が形成され、かつ前記ターゲット核酸配列、前記プローブ及び前記上流プライマーによる第２二本鎖が形成される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記工程（ｂ）は、工程（ａ）の結果物を５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼに接触させることにより行われ、前記プローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合、前記プローブは、（ｉ）前記上流プライマー又は上流プライマーの伸長産物との相互作用とは独立である前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断され、前記蛍光レポーター分子又は前記クエンチャー分子は、前記プローブから解離されて前記レポーター分子の蛍光が脱消光され、第１蛍光シグナルが発生し、そして（ｉｉ）前記上流プライマー又は上流プライマーの伸長産物との相互作用に依存的である前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断され、前記蛍光レポーター分子又は前記クエンチャー分子は、前記プローブから解離されて前記レポーター分子の蛍光が脱消光され、第２蛍光シグナルが発生し、これにより、同時的方式で前記蛍光シグナルが二重に発生される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程（ｄ）は、前記工程（ａ）−（ｃ）を少なくとも２回繰り返して前記第１蛍光シグナル及び前記第２蛍光シグナルが増幅されるように行われ、これにより、同時的に二重−シグナル増幅がなされる請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記上流プライマー又は前記上流プライマーの伸長産物との相互作用とは独立である前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、前記第１二本鎖に作用して前記プローブを切断し、これにより、前記第１蛍光シグナルが発生する請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記上流プライマー又は前記上流プライマーの伸長産物との相互作用とは独立である前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、前記第２二本鎖に作用し、前記上流プライマーとの相互作用無しに前記プローブを切断して、これにより、前記第１蛍光シグナルが発生する請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記上流プライマー又は前記上流プライマーの伸長産物との相互作用に依存的である前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、（ｉ）前記第２二本鎖の前記上流プライマー又は（ｉｉ）前記第２二本鎖の前記伸長産物と相互作して前記プローブを切断し、これにより、前記第２蛍光シグナルが発生する請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記上流プライマー又は前記上流プライマーの伸長産物との相互作用とは独立である前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による切断反応は、（ｉ）前記ターゲット核酸配列及び前記プローブによる前記第１二本鎖で発生し、（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列、前記プローブ及び前記上流プライマーによる前記第２二本鎖で発生し、前記上流プライマーは伸長されず、前記上流プライマーの３’−末端は、前記プローブの５’−末端から離隔されており、これは、前記プローブが前記上流プライマーとの相互作用に依存的である前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって切断されない程度に離隔されたもので、又は（ｉｉｉ）前記ターゲット核酸配列、前記プローブ及び前記上流プライマーによる前記第２二本鎖で発生し、前記上流プライマーは、前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼにより伸長されて、前記伸長された上流プライマーの３’−末端は、前記プローブの５’−末端から離隔されて、これは、前記プローブが前記上流プライマーの伸長産物との相互作用に依存的である前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって切断されない程度に離隔されたものである請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２二本鎖において、前記プローブの５’−末端は、前記上流プライマーの３’−末端から少なくとも２５ヌクレオチド離隔された請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記プローブ上の前記レポーター分子又は前記クエンチャー分子は、その５’−末端に位置するか、あるいはその５’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔された位置にある請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記プローブ上の前記レポーター分子又は前記クエンチャー分子は、その５’−末端に位置する請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記工程（ａ）は、追加的に逆方向プライマーを用いたＰＣＲ反応により行われ、前記ターゲット核酸配列を増幅させる請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
前記エキソヌクレアーゼ活性を有する前記酵素は、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性酵素である請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法は、液相で行われる請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記方法は、固相で行われ、前記プローブは、その５’−末端を通じて固相基質の表面上に固定化され、前記プローブは、前記酵素の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性により切断される切断部位及び切断されない非切断部位を有し、前記非切断部位は、前記固相基質の表面に残存し、前記切断部位は、前記ミスマッチヌクレオチドを含み、前記プローブ上の前記蛍光レポーター分子は、前記非切断部位に位置し、前記レポーター分子の前記蛍光をクエンチングできる前記クエンチャー分子は、前記切断部位に位置し、前記プローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合、前記プローブの前記切断部位は、酵素の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性により前記プローブから解離されて、前記プローブの前記非切断部位上にある前記レポーター分子の前記蛍光が脱消光され、これにより、前記固相基質上で蛍光シグナルを検出して前記ターゲット核酸配列の存在を決定する請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記プローブは、その３’−末端部位上に少なくとも１個の人為的ミスマッチヌクレオチドを含む請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記プローブの前記人為的ミスマッチヌクレオチドは、その３’−末端又はその３’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔された位置にある請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記プローブの前記人為的ミスマッチヌクレオチドは、その３’−末端にある請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記プローブの前記人為的ミスマッチヌクレオチドは、単一ミスマッチヌクレオチドである請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記プローブは、下記一般式ＩＩのミスマッチ−保有二重特異性オリゴヌクレオチド構造を有する請求項２３に記載の方法。
５’−Ｘｐ−Ｙｑ−Ｚｒ−Ｄａ−３’  （ＩＩ）
（式中、Ｘｐは、ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第１ハイブリダイゼーション部位であり、Ｙｑは、少なくとも三つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚｒは、ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第２ハイブリダイゼーション部位であり、Ｄａは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による切断部位であり、前記切断部位は、前記ミスマッチヌクレオチドを含み、前記プローブは、蛍光レポーター分子及び前記レポーター分子の蛍光をクエンチングできるクエンチャー分子で二重標識され、前記蛍光レポーター分子又は前記クエンチャー分子は、前記切断部位上に位置して、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ、Ｙ、Ｚ及びＤは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、５’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、３’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍより高く、前記分割部位は、前記Ｘｐ、Ｙｑ及びＺｒの三つの部位のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、ターゲット核酸配列に対するハイブリッド形成に関して、前記５’−第１ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第２ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記プローブのハイブリダイゼーション特異性は、前記５’−第１ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第２ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記プローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させる。）
【請求項２８】
前記工程（ｂ）は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性酵素及び３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性酵素を両方とも利用して行われる請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記工程（ａ）は、（ｉ）前記ターゲット核酸上の第１位置に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列、蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子を有する第１プローブ及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸上の第２位置に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列、その３’−末端部位上の人為的ミスマッチヌクレオチド配列、蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子を有する第２プローブを利用して行われ、前記第１プローブは、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する前記酵素により切断され、前記第２プローブは、前記３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する前記酵素により切断され、前記蛍光レポーター分子又は前記クエンチャー分子が前記第１プローブと前記第２プローブの両方から解離されて前記レポーター分子の蛍光が脱消光され、前記ターゲット核酸配列の存在を示す蛍光シグナルが発生される請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記工程（ａ）で利用された前記ターゲット核酸配列は、増幅プライマーを利用して前増幅された核酸配列である請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み、かつ前記プローブは、少なくとも２種のプローブを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記工程（ｄ）は、工程（ａ）−（ｃ）を少なくとも３回繰り返して行われる請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記工程（ｅ）は、前記工程（ｄ）の反復のサイクル毎に行い、前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記蛍光シグナルをリアルタイム方式で検出する請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記上流プライマー、前記逆方向プライマー又は前記増幅プライマーは、下記一般式Ｉの二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有する請求項７から１０、１２から１６、１９及び３０のいずれかに記載の方法。
５’−Ｘｐ−Ｙｑ−Ｚｒ−３’  （Ｉ）
（式中、Ｘｐは、ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第１プライミング部位であり、Ｙｑは、少なくとも三つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚｒは、ターゲット配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第２プライミング部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ、Ｙ及びＺは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、５’−第１プライミング部位のＴｍは、３’−第２プライミング部位のＴｍより高く、前記分割部位は、前記三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記分割部位は、ターゲット核酸配列に対するアニーリングに関して、５’−第１プライミング部位を３’−第２プライミング部位から分割し、これにより、前記オリゴヌクレオチドの前記アニーリング特異性は、５’−第１プライミング部位及び３’−第２プライミング部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記プライマーの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させる。）
【請求項３６】
（ａ）前記ターゲット核酸上の第１位置に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列、蛍光レポーター分子及び前記レポーター分子の蛍光をクエンチングできるクエンチャー分子を含むプローブと、
（ｂ）前記プローブの切断のためのエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素と、
を含む、反復的エキソ核酸切断反応を利用したＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するキット。
【請求項３７】
前記エキソヌクレアーゼ活性を有する前記酵素は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性酵素である請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
前記キットは、液相反応用キットである請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
前記キットは、固相反応用であり、前記プローブは、その３’−末端を通じて固相基質の表面上に固定化され、前記プローブは、前記酵素の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断される切断部位及び切断されない非切断部位を有し、前記非切断部位は、前記固相基質の表面に残存し、前記プローブ上の前記蛍光レポーター分子は、前記非切断部位に位置し、前記レポーター分子の前記蛍光をクエンチングできる前記クエンチャー分子は、前記切断部位に位置し、前記プローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合、前記プローブの前記切断部位は、前記酵素の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により前記プローブから解離されて前記プローブの前記非切断部位上にある前記レポーター分子の前記蛍光が脱消光され、これにより、前記固相基質上で蛍光シグナルを検出して前記ターゲット核酸配列の存在を決定する請求項３７に記載のキット。
【請求項４０】
前記プローブは、その５’−末端にマッチヌクレオチド配列を含む請求項３７に記載のキット。
【請求項４１】
前記エキソヌクレアーゼ活性を有する前記酵素は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼである請求項３７に記載のキット。
【請求項４２】
前記キットは、追加的な逆方向プライマーを含み、前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼによる前記追加的な逆方向プライマーの伸長反応により前記プローブとハイブリッド形成されるターゲット核酸配列を生成させる請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
前記キットは、前記ターゲット核酸配列上の第２位置に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する上流プライマーをさらに含み、前記上流プライマーの３’−末端は、前記プローブの５’−末端の上流に存在する請求項４１に記載のキット。
【請求項４４】
前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼは、（ｉ）ポリメラーゼ活性、（ｉｉ）前記上流プライマー又は前記上流プライマーの伸長産物との相互作用とは独立である５’→３’エキソヌクレアーゼ活性、及び（ｉｉｉ）前記上流プライマー又は前記上流プライマーの伸長産物との相互作用に依存的である５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を含む請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
前記プローブは、前記ターゲット核酸配列とハイブリッド形成され、前記プローブは、（ｉ）前記上流プライマー又は上流プライマーの伸長産物との相互作用とは独立である前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断され、前記蛍光レポーター分子又は前記クエンチャー分子は、前記プローブから解離されて前記レポーター分子の蛍光が脱消光され、第１蛍光シグナルが発生し、そして（ｉｉ）前記上流プライマー又は上流プライマーの伸長産物との相互作用に依存的である前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断され、前記蛍光レポーター分子又は前記クエンチャー分子は、前記プローブから解離されて前記レポーター分子の蛍光が脱消光され、第２蛍光シグナルが発生し、これにより、同時的方式で前記蛍光シグナルが二重に発生される請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
前記プローブ上の前記レポーター分子又は前記クエンチャー分子は、その５’−末端、あるいはその５’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔された位置にある請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
前記プローブ上の前記レポーター分子又は前記クエンチャー分子は、その５’−末端に位置する請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
前記キットは、追加的に逆方向プライマーを含み、ＰＣＲ反応により前記ターゲット核酸配列を増幅させる請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記エキソヌクレアーゼ活性を有する前記酵素は、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性酵素である請求項３６に記載のキット。
【請求項５０】
前記キットは、液相反応用である請求項４９に記載のキット。
【請求項５１】
前記キットは、固相反応用であり、前記プローブは、その５’−末端を通じて固相基質の表面上に固定化され、前記プローブは、前記酵素の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性により切断される切断部位及び切断されない非切断部位を有し、前記非切断部位は、前記固相基質の表面に残存し、前記切断部位は、前記ミスマッチヌクレオチドを含み、前記プローブ上の前記蛍光レポーター分子は、前記非切断部位に位置し、前記レポーター分子の前記蛍光をクエンチングできる前記クエンチャー分子は、前記切断部位に位置し、前記プローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合、前記プローブの前記切断部位は、酵素の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性により前記プローブから解離されて前記プローブの前記非切断部位上にある前記レポーター分子の前記蛍光が脱消光され、これにより、前記固相基質上で蛍光シグナルを検出して前記ターゲット核酸配列の存在を決定する請求項４９に記載のキット。
【請求項５２】
前記プローブは、その３’−末端部位上に少なくとも１個の人為的ミスマッチヌクレオチドを含む請求項５０又は５１に記載のキット。
【請求項５３】
前記プローブの前記人為的ミスマッチヌクレオチドは、その３’−末端又はその３’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔された位置にある請求項５２に記載のキット。
【請求項５４】
前記プローブの前記人為的ミスマッチヌクレオチドは、その３’−末端にある請求項５３に記載のキット。
【請求項５５】
前記プローブの前記人為的ミスマッチヌクレオチドは、単一ミスマッチヌクレオチドである請求項５２に記載のキット。
【請求項５６】
前記プローブは、下記一般式ＩＩのミスマッチ−保有二重特異性オリゴヌクレオチド構造を有する請求項５２に記載のキット。
５’−Ｘｐ−Ｙｑ−Ｚｒ−Ｄａ−３’  （ＩＩ）
（式中、Ｘｐは、ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第１ハイブリダイゼーション部位であり、Ｙｑは、少なくとも三つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚｒは、ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第２ハイブリダイゼーション部位であり、Ｄａは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による切断部位であって、前記切断部位は、前記ミスマッチヌクレオチドを含み、前記プローブは、蛍光レポーター分子及び前記レポーター分子の蛍光をクエンチングできるクエンチャー分子で二重標識されて、前記蛍光レポーター分子又は前記クエンチャー分子は、前記切断部位上に位置して、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ、Ｙ、Ｚ及びＤは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、５’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、３’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍより高く、前記分割部位は、前記Ｘｐ、Ｙｑ及びＺｒの三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記分割部位は、ターゲット核酸配列に対するハイブリッド形成に関して、前記５’−第１ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第２ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記プローブのハイブリダイゼーション特異性が前記５’−第１ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第２ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記プローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させる。）
【請求項５７】
前記エキソヌクレアーゼ活性を有する前記酵素は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性酵素及び３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性酵素を含む請求項３６に記載のキット。
【請求項５８】
前記プローブは、（ｉ）前記ターゲット核酸上の第１位置に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列、蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子を有する第１プローブ及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸上の第２位置に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列、その３’−末端部位上の人為的ミスマッチヌクレオチド配列、蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子を有する第２プローブを含み、前記第１プローブは、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する前記酵素により切断され、前記第２プローブは、前記３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する前記酵素により切断され、前記蛍光レポーター分子又は前記クエンチャー分子が前記第１プローブと前記第２プローブの両方から解離されて前記レポーター分子の蛍光が脱消光され、前記ターゲット核酸配列の存在を示す蛍光シグナルが発生される請求項５７に記載のキット。
【請求項５９】
前記ターゲット核酸配列は、増幅プライマーを利用して前増幅された核酸配列である請求項３６に記載のキット。
【請求項６０】
前記ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み、かつ前記プローブは、少なくとも２種のプローブを含む請求項３６に記載のキット。
【請求項６１】
前記ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む請求項３６に記載のキット。
【請求項６２】
前記上流プライマー、前記逆方向プライマー又は前記増幅プライマーは、下記一般式Ｉの二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有する請求項４２から４５及び４８から５９のいずれかに記載のキット。
５’−Ｘｐ−Ｙｑ−Ｚｒ−３’  （Ｉ）
（式中、Ｘｐは、ターゲット配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第１プライミング部位であり、Ｙｑは、少なくとも三つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚｒは、ターゲット配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第２プライミング部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ、Ｙ及びＺは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、５’−第１プライミング部位のＴｍは、３’−第２プライミング部位のＴｍより高く、前記分割部位は、前記三つの部位のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、ターゲット核酸配列に対するアニーリングに関して、５’−第１プライミング部位を３’−第２プライミング部位から分割し、これにより、前記オリゴヌクレオチドの前記アニーリング特異性は、５’−第１プライミング部位及び３’−第２プライミング部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記プライマーの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させる。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、反復的エキソ核酸切断反応によるターゲット核酸配列を検出する技術である。
【背景技術】
【０００２】
ターゲット核酸増幅過程は、ターゲット核酸を検出するための大部分の技術に広く関与している。核酸増幅は、分子生物学分野で利用される必須的な過程であって、多様な増幅方法が提示された。例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈ．Ｉ．ら（特許文献１）は、プロモーター／プライマー配列をターゲット一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）にハイブリッド形成させた後、前記配列の多いＲＮＡコピーを転写する過程を含む核酸配列増幅方法を開示している。他の公知の核酸増幅方法は、転写に基づく増幅システムを含む（非特許文献１；及び特許文献２（Ｇｉｎｇｅｒａｓ  Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，））。
【０００３】
ポリメラーゼ連鎖反応（以下、‘ＰＣＲ’という）として公知された、最もよく利用される核酸増幅方法は、二本鎖ＤＮＡの変性、ＤＮＡ鋳型へのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング及びＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長の繰り返されたサイクル過程を含む（Ｍｕｌｌｉｓら、特許文献３〜５；非特許文献２）。
【０００４】
ＰＣＲ関連技術は、ターゲットＤＮＡ配列の増幅だけではなく、生物学と医学の研究分野で科学的応用又は方法に広く利用されており、例えば、ターゲット配列の検出、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、ディファレンシャルディスプレイ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｄｉｓｐｌａｙ）ＰＣＲ（ＤＤ−ＰＣＲ）、公知あるいは未知の遺伝子のＰＣＲを利用したクローニング、ｃＤＮＡ末端の高速増幅（ＲＡＣＥ）、任意的プライミングＰＣＲ（ＡＰ−ＰＣＲ）、マルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＰＣＲ、ＳＮＰゲノムタイピング、及びＰＣＲ関与ゲノム分析（非特許文献３）がある。
【０００５】
また、多様なリアルタイムＰＣＲ方法がターゲット核酸の検出のために提示された。リアルタイムＰＣＲは、リアルタイム方式でターゲット配列を増幅して検出することができるという側面で大きく注目を浴びている。リアルタイムＰＣＲ方法は、一般に標識−プライマー又は標識−プローブを利用する。リアルタイムＰＣＲ方法の例は、ＴａｑＭａｎＴＭプローブ方法（特許文献６）、セルフクエンチングプローブ方法（特許文献７）、分子的ビーコン方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ）（非特許文献４）、及びライオン方法（Ｌｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ、特許文献８）を含む。
【０００６】
ＴａｑＭａｎＴＭプローブ方法において、プローブは、ＰＣＲ産物の内部領域（ｒｅｇｉｏｎ）にハイブリッド形成されるように製作される。ＴａｑＭａｎプローブが結合された鋳型をポリメラーゼが複製する間、前記ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、プローブを切断する。これは、蛍光及びクエンチング染料を分離させて、ＦＲＥＴがそれ以上起こらないようにする（非特許文献５）。ＴａｑＭａｎＴＭプローブ方法によると、ポリメラーゼが上流プライマー又はこれらの伸長産物に結合する場合にのみ、ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、エキソ核酸切断反応を触発する。プライマー及びプローブが互いに隣接した位置にあるように製作する場合、プライマーに結合した５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、重合反応無しにプライマーに隣接したプローブを切断して、これは、重合反応−独立的切断という。一方、プライマー及びプローブが離隔された位置にある場合、ポリメラーゼはプライマーを伸長して、プライマー伸長産物に結合された５’→３’エキソヌクレアーゼ活性はプローブを切断し、これは、重合−依存的切断という（特許文献９、第６欄、第４１行〜第７欄、第１０行）。
【０００７】
セルフ−クエンチングプローブ方法又は分子的ビーコン方法は、ＰＣＲ産物の内部領域にハイブリッド形成される配列を有する二重−標識プローブを利用する。二つの方法において、プローブがターゲット配列とハイブリッド形成されると、シグナルが脱消光されて蛍光シグナルが発生する。
【０００８】
ライオン方法（Ｌｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）は、プライマーの３’−末端に少なくとも１個のヌクレオチドを人為的にミスマッチさせた標識プライマーを利用する。ハイブリッド形成がなされるに十分な条件下で標識プライマー及び試料がインキュベーションされて、次いで試料は、３’→５’校正活性を有する核酸ポリメラーゼに露出されて、これにより標識又は標識システムの一部が解離される。
【０００９】
シグナル発生の観点で、ＴａｑＭａｎＴＭプローブ方法は、プローブ切断のためのプライマーの要件と関連し、幾つかの問題点を有する。例えば、プローブだけではなくプライマーに対する要件は、多数のターゲット検出時、深刻な障害となる。セルフ−クエンチングプローブ方法又は分子的ビーコン方法は、ＰＣＲ反応のサイクルの間にシグナルが累積されず、これは、シグナル発生において非効率的なものと判断される。加えて、ハイブリダイゼーションに基づいた前記二つの方法は、ターゲット配列とのハイブリダイゼーション条件下でシグナルを検出して行う。このようなシグナル検出プロトコールは、多様な条件における前記二つの方法の劣悪な応用性の原因である。
【００１０】
一方、前述の方法を含むリアルタイムＰＣＲ方法は、基本的にターゲット配列の増幅だけではなく、増幅産物の同時検出のためのターゲットシグナルの増幅のために増幅プライマーを必要とする。したがって、これらの方法を同次分析（Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ａｓｓａｙ）という。しかし、リアルタイムＰＣＲ方法において増幅プライマーに対する要件は、マルチプルターゲット配列の検出のための応用に限界点を引き起こし、例えば、擬陽性シグナル、オリゴヌクレオチド（プライマー及びプローブ）選択及び反応条件最適化の問題である。
【００１１】
したがって、同時的ターゲット増幅の助け無しにシグナルを増幅する新規な接近方法は、従来リアルタイムＰＣＲ方法で発生する上述の問題点を排除して、マルチプルターゲット配列を検出することができる。
【００１２】
本明細書全体にかけて多数の特許文献及び論文が参照されて、その引用が表示されている。引用された特許文献及び論文の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第８９／０６７００号パンフレット
【特許文献２】国際公開第８８／１０３１５号パンフレット
【特許文献３】米国特許第４，６８３，１９５号明細書
【特許文献４】米国特許第４，６８３，２０２号明細書
【特許文献５】米国特許第４，８００，１５９号明細書
【特許文献６】米国特許第５，２１０，０１５号明細書
【特許文献７】米国特許第５，７２３，５９１号明細書
【特許文献８】米国特許第６，２４８，５２６号明細書
【特許文献９】米国特許第５，２１０，０１５号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｋｗｏｈ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６：１１７３（１９８９）
【非特許文献２】Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０，１３５０−１３５４
【非特許文献３】ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍｏｌｌｅｒ，（２０００）ＰＣＲ．ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ＮＹ
【非特許文献４】Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｖ．１４  ＭＡＲＣＨ  １９９６
【非特許文献５】Ｐａｒａｓｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ  １２４：３８５−３９８（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明者らは、ターゲット核酸配列に対するシグナルを効果的に増幅して、リアルタイム方式でターゲット核酸配列を検出できる新規なアプローチを開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、プローブ及びエキソヌクレアーゼ活性を利用すると、ターゲット増幅反応がなくてもシグナルを増幅させて、ターゲット核酸配列を非常に高い敏感度及び特異度で検出することができることを見出した。また、本発明者らは、本発明の新規なアプローチがターゲット検出用液相及び固相の反応に全て成功的に適用されることを見出した。
【００１６】
したがって、本発明の目的は、反復的エキソ核酸切断反応を利用して、ＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供することにある。
【００１７】
本発明の他の目的は、反復的エキソ核酸切断反応を利用して、ＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するキットを提供することにある。
【００１８】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１ａ】液相における本発明の反復的エキソ核酸切断反応を図式的に示す。図１ａは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用した反復的エキソ核酸切断反応を示す。
【図１ｂ】液相における本発明の反復的エキソ核酸切断反応を図式的に示す。図１ｂは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用した反復的エキソ核酸切断反応を示す。
【図２ａ】５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用した固相における反復的エキソ核酸切断反応を図式的に示す。図２ａの（ａ）は、ターゲット核酸の前増幅工程を示す。図２ａの（ｂ）は、増幅された産物及び二重−標識プローブ間のハイブリダイゼーション工程を示す。
【図２ｂ】５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用した固相における反復的エキソ核酸切断反応を図式的に示す。図２ｂの（ｃ）は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による二重−標識プローブの切断及びシグナル発生工程を示す。図２ｂの（ｄ）は、変性、ハイブリダイゼーション及び切断の反復によるターゲットシグナル増幅工程を示す。
【図３ａ】３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用した固相における反復的エキソ核酸切断反応を図式的に示す。図３ａの（ａ）は、ターゲット核酸の前増幅工程を示す。図３ａの（ｂ）は、増幅された産物及びミスマッチ−保有二重−標識プローブ間のハイブリダイゼーション工程を示す。
【図３ｂ】３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用した固相における反復的エキソ核酸切断反応を図式的に示す。図３ｂの（ｃ）は、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による二重−標識プローブの切断及びシグナル発生工程を示す。図３ｂの（ｄ）は、変性、ハイブリダイゼーション及び切断の反復によるターゲットシグナル増幅工程を示す。
【図４ａ】５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素及び３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を両方とも利用した固相における反復的エキソ核酸切断反応を図式的に示す。図４ａの（ａ）は、それぞれ増幅されたターゲット核酸と二重−標識プローブのハイブリダイゼーション及び増幅されたターゲット核酸とミスマッチ−保有二重−標識プローブのハイブリダイゼーションを示す。
【図４ｂ】５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素及び３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を両方とも利用した固相における反復的エキソ核酸切断反応を図式的に示す。図４ｂの（ｂ）は、それぞれ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素及び３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による二重−標識プローブ及びミスマッチ−保有二重−標識プローブの切断及びシグナル発生を示す。図４ｂの（ｃ）は、変性、ハイブリダイゼーション及び切断の反復によるターゲットシグナル増幅工程を示す。
【図５】上流プライマー又は上流プライマーの伸長産物との相互作用とは独立である二重−標識プローブの切断に対する三つの異なる場合を示す。
【図６】上流プライマー又は上流プライマーの伸長産物との相互作用に依存的である二重−標識プローブの切断に対する二つの異なる場合を示す。
【図７】５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ及び上流プライマーを利用した反復的エキソ核酸切断反応を図式的に示す。（ａ）は、ターゲット核酸、二重−標識プローブ及び上流プライマーにより第１二本鎖及び第２二本鎖が形成されるハイブリダイゼーション工程を示す。（ｂ）は、二つの異なる５’→３’エキソヌクレアーゼ活性（独立的切断及び依存的切断）による二重−標識プローブの切断及びシグナル発生工程を示す。（ｃ）は、変性、ハイブリダイゼーション及び切断の反復による同時的二重−シグナル増幅工程を示す。
【図８】Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ遺伝子の検出のために、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを利用した反復的エキソ核酸切断反応の結果を示す。１）  鋳型は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ遺伝子に対する合成オリゴヌクレオチドである。２）  二重−標識プローブは、レポーター分子及びクエンチャー分子を有する。３）  酵素は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【図９】Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ遺伝子の検出のために、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを利用した反復的エキソ核酸切断反応の結果を示す。１）  鋳型は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ遺伝子に対する合成オリゴヌクレオチドである。２）  二重−標識プローブは、レポーター分子及びクエンチャー分子を有する。３）  酵素は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【図１０】Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子の検出のために、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼを利用した反復的エキソ核酸切断反応の結果を示す。１）  鋳型は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子に対する合成オリゴヌクレオチドである。２）  ミスマッチ−運搬−二重−標識プローブは、レポーター分子及びクエンチャー分子を有する。３）  酵素は、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ  ＩＩ  ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【図１１】Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ遺伝子の検出のために、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを利用した反復的エキソ核酸切断反応の結果を示す。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅゲノムＤＮＡの増幅された産物を鋳型として利用した。１）  鋳型は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ゲノムＤＮＡの増幅された産物である。２）  二重−標識プローブは、レポーター分子及びクエンチャー分子を有する。３）  酵素は５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【図１２】Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ遺伝子の検出のために、一対のプライマー及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを利用した反復的エキソ核酸切断反応の結果を示す。１）  鋳型はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  遺伝子に対する合成オリゴヌクレオチドである。２）  二重−標識プローブは、レポーター分子及びクエンチャー分子を有する。３）  酵素は５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、反復的エキソ核酸切断反応を利用して、リアルタイム方式でターゲット核酸配列を検出できる新規方法に関する。
【００２１】
本発明の一様態によると、本発明は、（ａ）ターゲット核酸配列をプローブにハイブリッド形成させる工程であって、前記プローブは、前記ターゲット核酸配列の第１位置（Ｆｉｒｓｔ  ｓｉｔｅ）に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列、蛍光レポーター分子及び前記レポーター分子の蛍光をクエンチングできるクエンチャー分子を含む工程と、
（ｂ）プローブの切断のために前記プローブを、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素と接触させる工程であって、前記蛍光レポーター分子又は前記クエンチャー分子は前記プローブから解離され、前記レポーター分子の蛍光が脱消光（ｕｎｑｕｅｎｃｈｅｄ）されて、前記ターゲット核酸配列の存在を示す蛍光シグナルが発生する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の前記プローブ−ターゲット核酸配列の二本鎖（ｄｕｐｌｅｘ）を変性させる工程と、
（ｄ）前記工程（ａ）−（ｃ）を少なくとも２回繰り返して、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを増幅させる工程と、
（ｅ）前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルを検出する工程であって、前記検出は、前記工程（ｄ）の反復のサイクル毎に行われるか、工程（ｄ）の反復の終了時点で行われるか、あるいは前記反復の間、所定の時間間隔のそれぞれにおいて行われて、前記シグナルは、ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、
を含む、反復的エキソ核酸切断反応を利用してＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供する。
【００２２】
本発明者らは、ターゲット核酸配列に対するシグナルを効果的に増幅して、リアルタイム方式でターゲット核酸配列を検出できる新規なアプローチを開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、プローブ及びエキソヌクレアーゼ活性を利用すると、ターゲット増幅反応がなくてもシグナルを増幅させて、ターゲット核酸配列を非常に高い敏感度及び特異度で検出することができることを見出した。また、本発明者らは、本発明の新規なアプローチがターゲット検出用液相及び固相の反応に全て成功的に適用されることを見出した。
【００２３】
本発明によると、プローブ（蛍光レポーター及びクエンチャー分子で二重標識される）及びエキソ核酸切断活性を利用してエキソ核酸切断反応を反復的に行って、これにより、同時的な核酸増幅反応無しにターゲット核酸配列の存在を示す蛍光シグナルを増幅する。
【００２４】
したがって、従来リアルタイムＰＣＲ技術と明確に区別される本発明の最も大きい特徴は、ターゲットシグナル増幅のためのターゲット核酸配列の増幅を必要としないということである。本発明は、（ａ）蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子で二重標識されたプローブの利用、（ｂ）エキソ核酸切断活性を有する酵素により触媒されたエキソ核酸切断反応によるシグナル発生、及び（ｃ）エキソ核酸切断反応が伴われるハイブリダイゼーション及び変性の反復によるシグナル増幅によりターゲット核酸配列を成功的に検出することができる。
【００２５】
したがって、本発明は、‘反復的エキソ核酸切断反応（Ｃｙｃｌｉｃ  Ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ、ＣＥＲ）によるターゲットシグナル増幅（Ｔａｒｇｅｔ  ｓｉｇｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）’と命名される。
【００２６】
ＴａｑＭａｎＴＭプローブ方法、セルフクエンチングプローブ方法、分子的ビーコン方法、及びライオン方法（Ｌｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）のような二重−標識オリゴヌクレオチドを利用した従来のリアルタイムＰＣＲ技術は、シグナル増幅のためのターゲット配列の増幅反応を必然的に伴う。即ち、既存の方法は、増幅プライマーを利用してターゲット配列増幅することにより、ターゲット配列を示すさらに多いシグナルを発生させる。
【００２７】
これに対して、本発明は、ターゲット増幅反応無しに、エキソ核酸切断反応が介入されるプローブハイブリダイゼーション及び変性の反復を通じてシグナルを増幅する。
【００２８】
本発明者らは、ターゲット配列にハイブリッド形成される二重−標識プローブ上における５’→３’エキソ核酸切断反応及び／又は３’→５’エキソ核酸切断反応が、二重標識システムの標識を含んだ断片を生成させることができ、エキソ核酸切断反応下で二重−標識プローブ及びターゲット配列間のハイブリダイゼーション及び変性の反復で標識含有断片が蓄積（即ち、シグナル増幅）されて、ターゲットを検出するに十分なシグナル強度を提供する。
【００２９】
ターゲット増幅と関係なくターゲット配列を示すシグナルを増幅できる本発明は、ターゲット検出のために増幅プライマーを必要とせず、これは、本発明の最も重要な利点の一つである。特に、多数のターゲット配列を検出するマルチプレックス検出方法において、ターゲット検出用オリゴヌクレオチドだけではなく、ターゲット増幅用オリゴヌクレオチドを利用する従来のリアルタイムＰＣＲ方法は、擬陽性シグナル、オリゴヌクレオチド配列と反応条件の最適化の難しさ、そして費用問題のような克服すべき短所を有している。その反面、標識されたプローブだけでターゲット配列を検出できる本発明は、上述の問題を成功的に解決することができる。
【００３０】
また、本発明のＣＥＲ過程は、固相基質反応でもシグナル−最大化効果を有する。要約すると、固相基質上の固定化された標識プローブにターゲット配列がハイブリッド形成される場合、ハイブリダイゼーション程度は反応条件により決定される。ターゲット配列にハイブリッド形成されない標識プローブは、切断反応が発生しないため、シグナルが発生せず、これは、従来ハイブリダイゼーション−チップ技術において主要障害物である。本発明のＣＥＲ方法は、ターゲット配列及び標識プローブ間のハイブリダイゼーション及び変性の反復を含むため、固相基質上の標識プローブがターゲット配列にハイブリッド形成される機会がさらに多くなり、エキソ核酸切断活性により切断される機会もより多くなり、最終的にシグナルが最大に発生される。
【００３１】
また、シグナル発生が、プローブ切断反応ではなくハイブリダイゼーションにのみ依存する分子的ビーコン方法のような従来のハイブリダイゼーションに基づく方法に対して、シグナル増幅のみを利用する本発明は、利点がある。
【００３２】
ターゲット配列を検出するために、適した条件下でターゲット配列を示すシグナルを二重−標識プローブ及びエキソ核酸切断活性を利用して発生させて、同時的ターゲット増幅反応無しに増幅させることが本発明の進歩的な発明の概念であり、これは、本発明者によって最初に提示される。
【００３３】
本発明において、ターゲット核酸配列は、蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子で二重標識されたプローブとハイブリッド形成される。
【００３４】
本明細書で使用された用語‘ターゲット核酸’、‘ターゲット核酸配列’又は‘ターゲット配列’は、最終的に検出しようとする配列を意味し、ハイブリダイゼーション、アニーリング又は増幅条件下でプローブ又はプライマーとアニーリング又はハイブリッド形成される。
【００３５】
本明細書で使用された用語‘プローブ（ｐｒｏｂｅ）’は、ターゲット核酸配列に実質的に相補的な部位又は部位を含む一本鎖核酸分子を意味する。用語‘相補的’は、所定のアニーリング条件又は厳格条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下でプライマー又はプローブがターゲット核酸配列に選択的にハイブリダイズするほど十分相補的なことを意味し、用語‘実質的に相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）’及び‘完全に相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）’を包括する意味を有して、好ましくは、完全に相補的なことを意味する。好ましくは、プローブは、一本鎖デオキシリボヌクレオチド分子である。本発明のプローブは、天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ｄＮＭＰ（即ち、ｄＡＭＰ、ｄＧＭ、ｄＣＭＰ及びｄＴＭＰ）、修飾されたヌクレオチド又は非天然ヌクレオチドを含むことができる。また、プローブは、リボヌクレオチドも含むことができる。好ましくは、プローブの３’−末端は‘ブロック’されており、これはプローブの伸長を妨害する。ブロッキングは、最後のヌクレオチドの３’ヒドロキシル基にホスフェート基のような化学的部分を追加して達成できる。
【００３６】
本明細書で使用された用語‘ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）’は、相補的な一本鎖核酸が二本鎖核酸を形成することを意味する。ハイブリダイゼーションは、相補性が完全である（Ｐｅｒｆｅｃｔ  ｍａｔｃｈ）、又は一部ミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）塩基が存在する実質的にマッチする（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｍａｔｃｈ）、二つの核酸鎖間で起こる。ハイブリダイゼーションに必要な相補性の程度は、ハイブリダイゼーション条件によって変わり、特に温度によって調節され得る。
【００３７】
本明細書で使用された用語‘アニーリング’と‘ハイブリダイゼーション’は、差がなく、本明細書で混用される。
【００３８】
本発明のＣＥＲ方法は、追加的なプライマー（正方向プライマー及び／又は逆方向プライマー）を利用して行うことができる。本明細書で使用された用語‘正方向プライマー’は、３’→５’方向に配列されたターゲット核酸配列の一本鎖に相補的なプライマー（５’→３’方向）を意味する。本発明によると、プローブの上流に位置したプライマーは、‘正方向プライマー’又は‘上流プライマー’と命名される。逆方向プライマーは、前記核酸配列の他の一本鎖に相補的な配列を有する。
【００３９】
プローブ及び逆方向プライマーが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素と利用される場合、反復工程の間、核酸合成反応によりプローブとハイブリッド形成される鋳型が選択的に増加された。鋳型の増加は、ターゲット配列を検出するためのシグナルをより迅速に提供するようにする。一方、本発明は、ターゲット増幅と共にターゲット配列を検出するために、プローブだけではなく一対のプライマー（正方向プライマー及び逆方向プライマーを含む）を利用して行うことができる。
【００４０】
鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の存在下で、プローブ及び上流プライマーを利用してＣＥＲ方法を行う場合、上流プライマー又はその伸長産物に結合して活性化された５’→３’エキソヌクレアーゼ活性がプローブを切断し、ターゲット配列の存在を示すシグナルが発生する。
【００４１】
本発明のＣＥＲ過程は、下記のようなプロトコールによって実施できる：（Ｉ）５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用した液相及び固相反応；（ＩＩ）３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用した液相及び固相反応；（ＩＩＩ）５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素及び３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用した液相及び固相反応；及び（ＩＶ）５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素及び上流プライマーを利用した液相及び固相反応。
【００４２】
Ｉ．５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用したＣＥＲ過程
本発明によると、ターゲット核酸配列の存在を示す蛍光シグナルは、上流（正方向）プライマー無しに、二重−標識プローブ及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により増幅できる。
【００４３】
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素、特に、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼによりターゲット核酸配列にハイブリッド形成される二重−標識プローブの５’−末端部位がプライマー無しに切断されるということは、非常に興味深く、驚くべきことである。二重−標識プローブがターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合、それらの５’−末端部位は、プライマー伸長の発生無しに、鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断された。驚くことに、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により発生された蛍光シグナルは、鋳型−依存的核酸ポリメラーゼに接触した後、１分内に発生するということを本発明者らが見出し、この発見は、本発明のＣＥＲ方法の独特のシグナル発生過程に巧妙に適用される。
【００４４】
液相又は固相で５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用して行われるＣＥＲ過程は、前記述べた本発明者らの発見に基づき、ターゲット検出のために確立された。
【００４５】
ＴａｑＭａｎＴＭプローブ方法は、核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のあるプローブ切断反応によりリアルタイム方式でターゲット配列を検出する代表的な技術である。ＴａｑＭａｎＴＭプローブ方法によると、プローブ切断のための核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、核酸ポリメラーゼがプライマー（前記プローブの上流に位置）又はその伸長産物に結合される場合にのみ活性化された。したがって、プローブ切断のためには、上流プライマー又はその伸長産物がＴａｑＭａｎＴＭプローブ方法に決定的に必要であり、また上流プライマー又はその伸長産物と核酸ポリメラーゼの結合（又は相互作用）がプローブ切断に必要である（米国特許第５，２１０，０１５号）。米国特許第５，２１０，０１５号において、上流プライマーに結合した核酸ポリメラーゼによるプローブ切断反応は、重合反応−独立的切断と命名されて、上流プライマーの伸長産物に結合した核酸ポリメラーゼによるプローブ切断反応は、重合反応−独立的切断と命名される。しかし、米国特許第５，２１０，０１５号は、本発明の最も重要な関連事項である、プライマーとは独立であるプローブ切断反応を開示又は提示していない。
【００４６】
ＴａｑＭａｎＴＭプローブ方法と異なって、本発明では、ターゲット配列にハイブリッド形成されるプローブをプライマーに対して独立的方式で切断するための核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を二重−標識プローブと結合させて、ターゲット配列を示すシグナルを発生させる。
【００４７】
一方、ＴａｑＭａｎＴＭプローブ方法は、ターゲット配列を増幅することにより、ターゲット配列を示すシグナルを増幅する。その反面、プライマーを必要としない本発明は、ハイブリダイゼーション及び変性を繰り返すことにより、ターゲット配列を示すシグナルを増幅し、これは、ＴａｑＭａｎＴＭプローブ方法を含む従来のリアルタイムＰＣＲ技術に比べ、顕著に独特である。
【００４８】
本発明の技術的戦略は、核酸ポリメラーゼの独立的５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を、ターゲット配列を示すシグナル発生に利用して、同時的ターゲット増幅無しにもシグナルを増幅させることであって、本発明者によって最初に提示されて、これは、ＴａｑＭａｎＴＭプローブ方法を始めとした従来のリアルタイムＰＣＲ技術と明らかに相異なっている。
【００４９】
本明細書において、プローブを言及しながら使用された用語‘５’−末端部位’は、プローブの５’−末端からある長さの連続的な配列を含む部位又は領域を意味する。好ましくは、プローブの５’−末端部位は、その５’−末端から１〜１０ヌクレオチドを含む配列で構成される（より好ましくは、１〜５ヌクレオチド、より好ましくは、１〜３ヌクレオチド）。
【００５０】
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用する場合、プローブは、その５’−末端にマッチヌクレオチド配列を含むことが好ましい。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の大部分、特に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼは、単にターゲット核酸配列にハイブリッド形成されて、二重鎖を形成するプローブの５’−末端部位又は５’−末端を切断する。
【００５１】
本発明の好ましい具現例によると、ハイブリダイゼーション工程を２分間以上行わず、より好ましくは、１分３０秒間以上、さらに好ましくは、１分間以上である。本発明の好ましい具現例によると、ハイブリダイゼーション工程を少なくとも１０秒間以上行って、好ましくは、２０秒間、より好ましくは、３０秒間である。
【００５２】
ハイブリダイゼーション以前のプローブから発生するシグナルが、ハイブリダイゼーションに続く切断後のプローブから発生するシグナルと相異なっていれば、蛍光レポーター分子又はクエンチャー分子は、プローブ上のどんな位置（ｓｉｔｅ）にも位置可能である。
【００５３】
好ましくは、プローブ上のレポーター分子又はクエンチャー分子は、その５’−末端又はその５’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔された所に位置する。例えば、プローブ上のレポーター分子は、その５’−末端又はその５’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔された所に位置し、クエンチャー分子は、レポーター分子から４〜５０ヌクレオチド離隔された所に位置する。最も好ましくは、プローブ上のレポーター分子又はクエンチャー分子が５’−末端に位置するものである。
【００５４】
本発明の好ましい具現例によると、レポーター分子及びクエンチャー分子は、少なくとも４ヌクレオチド離隔され、より好ましくは、少なくとも６ヌクレオチド、さらに好ましくは、少なくとも１０ヌクレオチド、最も好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチド離隔される。
【００５５】
本発明の好ましい具現例によると、レポーター分子及びクエンチャー分子は、最大５０ヌクレオチド離隔され、より好ましくは最大３０ヌクレオチド、さらに好ましくは、最大２５ヌクレオチド、最も好ましくは、最大２０ヌクレオチド離隔される。
【００５６】
ターゲット核酸配列にプローブがハイブリッド形成される場合、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素がその５’−末端部位又はその５’−末端を切断して、その５’−末端部位又はその５’−末端に位置したレポーター分子又はクエンチング分子を解離させて、これによりレポーター分子の蛍光が脱消光（ｕｎｑｕｅｎｃｈｅｄ）されて、ターゲット核酸配列を示す蛍光シグナルが発生される。
【００５７】
固相反応において、前記プローブは、その３’−末端を通じて固相基質の表面上に固定化され、前記プローブは、前記酵素の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断される切断部位及び切断されない非切断部位を有して、前記非切断部位は、前記固相基質の表面に残存し、前記プローブ上の前記蛍光レポーター分子は、前記非切断部位に位置し、前記レポーター分子の前記蛍光をクエンチングできる前記クエンチャー分子は、前記切断部位に位置し、前記プローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合、前記プローブの前記切断部位は、前記酵素の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により前記プローブから解離されて、前記プローブの前記非切断部位上にある前記レポーター分子の前記蛍光が脱消光され、これにより、前記固相基質上で蛍光シグナルが検出されて前記ターゲット核酸配列の存在が決定される。
【００５８】
本発明の好ましい具現例によると、切断部位及び非切断部位は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対して耐性を有する修飾されたヌクレオチド又はバックボーンの使用のような５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する耐性付与方法により区分される。
【００５９】
固相反応において、クエンチャー分子は、プローブの切断部位にあり、好ましくは、プローブの５’−末端又はその５’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔された位置、より好ましくは、５’−末端に位置する。蛍光レポーター分子は、プローブの非切断部位にある。
【００６０】
本発明の好ましい具現例によると、レポーター分子及びクエンチャー分子は、少なくとも４ヌクレオチド離隔され、より好ましくは、少なくとも６ヌクレオチド、さらに好ましくは、少なくとも１０ヌクレオチド、最も好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチド離隔される。
【００６１】
固定化プローブが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によりその５’−末端から連続的に切断されるため、固定化プローブの残っている部位及びターゲット核酸配列間の結合が弱化され、これにより、固相基質上にある固定化プローブの非切断断片からターゲット核酸配列が解離される。ターゲット核酸配列の解離は、プローブの非切断部位上にあるレポーター分子が５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断されることを防止する。これと関連し、固定化プローブは、酵素の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性（好ましくは、鋳型−依存的核酸ポリメラーゼ）により切断される切断部位及び切断されない非切断部位の二つの部位を有するといえる。したがって、固相基質上でターゲット核酸配列の存在を示す蛍光シグナルが発生するためには、好ましくは、蛍光レポーター分子が非固定化プローブの非切断部位に位置し、レポーター分子の蛍光をクエンチングできるクエンチャー分子は、切断部位に位置する。
【００６２】
本発明の好ましい具現例によると、クエンチャー分子が蛍光である場合、検出しようとするターゲット核酸配列の存在を示すシグナルは、クエンチャー分子から出る蛍光シグナルである。上記の場合が特に固相反応に適用される場合、レポーター分子は、プローブの切断部位にあり、クエンチャー分子は、プローブの非切断部位にある。
【００６３】
好ましくは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素は、熱安定性エキソヌクレアーゼであり、より好ましくは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼであって（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ及びバクテリオファージＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ）、最も好ましくは、多様なバクテリア種から得る熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｎｔｒａｎｉｋｉａｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｌａｃｔｅｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｎｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｉｌｖａｎｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｚ０５及びＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｐｓ  １７のＤＮＡポリメラーゼを含む。最も好ましくは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【００６４】
好ましくは、本発明のＣＥＲ反応において、工程（ａ）は、追加的な逆方向プライマーを用いた、前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼによる前記追加的な逆方向プライマーの伸長反応により行われ、工程（ｂ）で前記プローブとハイブリッド形成されるターゲット核酸配列を生成させる。
【００６５】
固相反応のために、プローブは、固相基質表面に直接的又は間接的に固定化される。また、プローブは、共有又は非共有結合方式で固相基質表面上に固定化できる。固定化されたプローブが固相基質表面に固定化される場合は、適したリンカーが関与する。本発明で使用できるリンカーは、マイクロアレイでプローブを固定化するに利用される如何なるリンカーも含む。例えば、アミン基を有するアルキル又はアリール化合物、又はチオール基を有するアルキル又はアリール化合物がリンカーとしてプローブ固定化に利用できる。
【００６６】
本発明の好ましい具現例によると、本発明で利用される固相基質は、マイクロアレイである。本発明で反応環境を提供するマイクロアレイは、当業界に知られた如何なるマイクロアレイも含む。本発明の全ての過程、即ち、ターゲット配列とのアニーリング、伸長／切断反応及び蛍光の検出は、マイクロアレイ上でなされる。マイクロアレイで固定化プローブは、ハイブリダイズ可能なアレイ要素（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ  ａｒｒａｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ）として利用される。マイクロアレイを製作するための固相基質は、例えば、金属（例えば、金、金と銅の合金、アルミニウム）、金属オキシド、ガラス、セラミック、石英、シリコン、半導体、Ｓｉ／ＳｉＯ２ウェハー、ゲルマニウム、ガリウムアルセニド、カーボン、炭素ナノチューブ、ポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリルアミド）、セファロース、アガロース及びコロイドを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の複数の固定化プローブは、固相基質上の一つのアドレサブル（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）領域（ｒｅｇｉｏｎ）又は複数のアドレサブル領域に固定化されて、固相基質は、２〜１，０００，０００個のアドレサブル領域を含むことができる。フォトリソグラフィー、インクゼッティング、機械的マイクロスポッティング及びこれの類似方法のような従来製作技術により、特定応用のためのアレイを提供するために、固定化プローブが組み立てられる。
【００６７】
ＩＩ．３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用したＣＥＲ過程
本発明は、３’→５’エキソ核酸切断反応を有する酵素を利用して実施できる。ターゲット配列を検出するために、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を利用するリアルタイムＰＣＲ技術が知られており、例えば、米国特許第６，２４８，５２６号に開示されているライオン方法を含む。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を利用する既存の方法のように、従来リアルタイムＰＣＲ技術は、ターゲット配列を増幅してターゲット配列を示すシグナルを増幅する。
【００６８】
これと異なって、本発明は、ハイブリダイゼーション及び変性を繰り返してターゲット配列を示すシグナルを増幅する。本発明によると、ｄＮＴＰは、ターゲット検出のためのシグナル増幅において必須的ではない。
【００６９】
３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用する場合、プローブは、その３’−末端部位又は３’−末端に少なくとも１個のミスマッチヌクレオチドを含む。
【００７０】
本明細書でプローブを言及しながら使用された用語‘３’−末端部位’は、プローブの３’−末端からある長さの連続的な配列を含む部位又は領域を意味する。好ましくは、プローブの３’−末端部位は、その３’−末端から１〜１０ヌクレオチドを含む配列で構成される（より好ましくは、１〜５ヌクレオチド、さらに好ましくは、１〜３ヌクレオチド）。
【００７１】
本明細書で使用された用語‘ミスマッチヌクレオチド’は、非相補的なヌクレオチド又は校正（ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ）活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼによりミスマッチと認識されるヌクレオチドを意味する。
【００７２】
ミスマッチヌクレオチドは、プローブの多様な位置（ｓｉｔｅ）に存在しえる。好ましくは、ミスマッチヌクレオチドは、プローブの３’−末端部位に位置する。
【００７３】
本発明の好ましい具現例によると、ミスマッチヌクレオチドは、その３’−末端又はその３’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔された位置に存在し、より好ましくは、その３’−末端又はその３’−末端から１〜３ヌクレオチド、さらに好ましくは、その３’−末端又はその３’−末端から１ヌクレオチド、最も好ましくは、その３’−末端に存在する。
【００７４】
ミスマッチヌクレオチドの数は、１〜５、好ましくは、１〜４、より好ましくは１〜３、さらに好ましくは１〜２、最も好ましくは、１（単一ミスマッチヌクレオチド）である。プローブに少なくとも二つのミスマッチヌクレオチドがある場合、ミスマッチヌクレオチドは、連続的又は不連続的に位置することができる。
【００７５】
３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用する場合、蛍光レポーター分子又はクエンチャー分子は、プローブの３’−末端に位置することができる。
【００７６】
好ましくは、レポーター分子又はクエンチャー分子は、プローブのミスマッチヌクレオチド含み３’−末端部位に位置する。例えば、レポーター分子又はクエンチャー分子は、プローブの３’−末端部位上のミスマッチヌクレオチドの３’−隣接位置に位置することができる。択一的に、レポーター分子又はクエンチャー分子は、プローブの３’−末端部位上のミスマッチヌクレオチドに位置することができる。
【００７７】
より好ましくは、プローブ上のレポーター分子又はクエンチャー分子は、その３’−末端又はその３’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔されたミスマッチヌクレオチド上に位置する。最も好ましくは、プローブ上のレポーター分子又はクエンチャー分子は、３’−末端のミスマッチヌクレオチド上に位置する。
【００７８】
本発明の好ましい具現例によると、レポーター分子及びクエンチャー分子は、少なくとも４ヌクレオチド離隔されて、より好ましくは、少なくとも６ヌクレオチド、さらに好ましくは、少なくとも１０ヌクレオチド、最も好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチド離隔される。
【００７９】
本発明の好ましい具現例によると、レポーター分子及びクエンチャー分子は、最大５０ヌクレオチド離隔され、より好ましくは、最大３０ヌクレオチド、さらに好ましくは、最大２５ヌクレオチド、最も好ましくは、最大２０ヌクレオチド離隔される。
【００８０】
ターゲット核酸配列にプローブがハイブリッド形成される場合、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素がその３’−末端部位又はその３’−末端を切断し、その３’−末端部位又はその３’−末端に位置したレポーター分子又はクエンチング分子を解離させて、これによりレポーター分子の蛍光が脱消光（ｕｎｑｕｅｎｃｈｅｄ）され、ターゲット核酸配列を示す蛍光シグナルが発生される。
【００８１】
３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用した固相反応において、プローブは、その５’−末端を通じて固相基質の表面上に固定化され、前記プローブは、前記酵素の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性により切断される切断部位及び切断されない非切断部位を有し、前記非切断部位は、前記固相基質の表面に残存し、前記切断部位は、ミスマッチヌクレオチドを含み、前記プローブ上の前記蛍光レポーター分子は、前記非切断部位に位置し、前記レポーター分子の前記蛍光をクエンチングできる前記クエンチャー分子は、前記切断部位に位置し、前記プローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合、前記プローブの前記切断部位は、前記酵素の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性により前記プローブから解離されて、前記プローブの前記非切断部位上にある前記レポーター分子の前記蛍光が脱消光され、これにより、前記固相基質上で蛍光シグナルが検出されて前記ターゲット核酸配列の存在が決定される。
【００８２】
固相反応において、クエンチャー分子は、プローブの切断部位にあり、好ましくは、プローブの３’−末端又はその３’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔された位置、より好ましくは、３’−末端に位置する。蛍光レポーター分子は、プローブの非切断部位にある。
【００８３】
３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用して液相又は固相反応を行う場合、利用されるプローブは、下記一般式ＩＩのミスマッチ−保有二重特異性オリゴヌクレオチド構造を有することが好ましい。
５’−Ｘｐ−Ｙｑ−Ｚｒ−Ｄａ−３’  （ＩＩ）
（式中、Ｘｐは、ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第１ハイブリダイゼーション部位（５’−ｆｉｒｓｔ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、Ｙｑは、少なくとも三つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、Ｚｒは、ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第２ハイブリダイゼーション部位（３’−ｓｅｃｏｎｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、Ｄａは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による切断部位であり、前記切断部位は、前記ミスマッチヌクレオチドを含み、前記プローブは、蛍光レポーター分子及び前記レポーター分子の蛍光をクエンチングできるクエンチャー分子で二重標識されて、前記蛍光レポーター分子又は前記クエンチャー分子は、前記切断部位上に位置し、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ、Ｙ、Ｚ及びＤは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、５’−第１ハイブリダイゼーション部位のＴｍは、３’−第２ハイブリダイゼーション部位のＴｍより高く、前記分割部位は、前記Ｘｐ、Ｙｑ及びＺｒの三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記分割部位は、ターゲット核酸配列に対するハイブリッド形成に関して、前記５’−第１ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第２ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記プローブのハイブリダイゼーション特異性は、前記５’−第１ハイブリダイゼーション部位及び前記３’−第２ハイブリダイゼーション部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記プローブの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させる。）
【００８４】
ミスマッチ−保有ＤＳＯ（Ｄｕａｌ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）は、下記で述べられるＤＰＯに対する詳細説明を参照して説明できる。
【００８５】
好ましくは、５’−第１ハイブリダイゼーション部位は、３’−第２ハイブリダイゼーション部位より長い。５’−第１ハイブリダイゼーション部位は、１５〜６０ヌクレオチドの長さを有することが好ましく、より好ましくは、１５〜４０ヌクレオチド、さらに好ましくは、１５〜２５ヌクレオチドである。３’−第２ハイブリダイゼーション部位は、３〜１５ヌクレオチドの長さを有することが好ましく、より好ましくは、５〜１５ヌクレオチド、さらに好ましくは、６〜１３ヌクレオチドである。分割部位は、３〜１０ヌクレオチドの長さを有することが好ましく、より好ましくは、４〜８ヌクレオチド、最も好ましくは、５〜７ヌクレオチドである。
【００８６】
本発明の好ましい具現例によると、５’−第１ハイブリダイゼーション部位は、４０℃〜８０℃のＴｍを有して、好ましくは、４５℃〜６５℃のＴｍを有する。３’−第２ハイブリダイゼーション部位は、好ましくは、１０℃〜４０℃のＴｍを有する。分割部位は、好ましくは、３℃〜１５℃のＴｍを有する。
【００８７】
本発明の好ましい具現例によると、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素は、熱安定性エキソヌクレアーゼであり、より好ましくは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼである。
【００８８】
より好ましくは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼは、多様なバクテリア種から得られる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであり、これは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｂａｒｏｓｓｉ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｅｉ，  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ｏｃｃｕｌｔｕｍ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ、及びＡｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｅｕｓのＤＮＡポリメラーゼを含む。最も好ましくは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼは、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【００８９】
ＩＩＩ．５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素及び３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を両方とも利用したＣＥＲ過程
また、本発明は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素及び３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を両方とも利用して行うことができる。この方法のために、上述の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に適するプローブ及び３’→５’エキソヌクレアーゼ活性に適するプローブを同時に利用する。
【００９０】
本発明は、以下の工程を含む反復的エキソ核酸切断反応によるＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供する：
（ａ）（ｉ）前記ターゲット核酸配列の第１位置に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を含み、蛍光レポーター分子及び前記蛍光レポーター分子の蛍光をクエンチングできるクエンチャー分子が結合されている第１プローブ及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列の第２位置に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を含み、３’−末端部位に前記ターゲット核酸配列に対する人為的ミスマッチヌクレオチド配列を含み、蛍光レポーター分子及び前記蛍光レポーター分子の蛍光をクエンチングできるクエンチャー分子が結合されている第２プローブに前記ターゲット核酸配列をハイブリッド形成させる工程と、
（ｂ）５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素及び３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を第１プローブ及び第２プローブに接触させる工程であって、第１プローブは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されて、第２プローブは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されて、蛍光レポーター分子又はクエンチャー分子が第１プローブ及び第２プローブから解離され、レポーター分子の蛍光が脱消光されて、ターゲット核酸配列の存在を示す蛍光シグナルが発生する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）のプローブ−ターゲット核酸配列の二本鎖を変性させる工程と、
（ｄ）工程（ａ）−（ｃ）を少なくとも２回繰り返して、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを増幅させる工程と、
（ｅ）ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを検出する工程であって、検出は、工程（ｄ）の反復のサイクル毎に行われるか、工程（ｄ）の反復の終了時点で行われるか、あるいは反復の間、所定の時間間隔のそれぞれにおいて行われて、シグナルは、ターゲット核酸配列の存在を示す工程。
【００９１】
上記方法は、使用された二つのエキソ核酸切断酵素が互いに異なる方向性を有するため、‘ＴＯ−ＣＥＲ（Ｔｗｏ  Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｃｙｃｌｉｃ  Ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）’と命名される。
【００９２】
ＴＯ−ＣＥＲ反応において、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されるプローブ又は３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されるプローブは、それぞれ上記プロトコールＩ又はＩＩに記載のようにデザインされる。
【００９３】
また、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素に対するプローブは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断されないように、下記のようにデザインすることが好ましい：（ｉ）５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に抵抗性を有するブロッカーの利用、（ｉｉ）レポーター及びクエンチャー分子の近接した位置又は（ｉｉｉ）プローブの５’−末端部位の非−相補的な配列の利用。
【００９４】
好ましくは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断されないプローブは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に抵抗性を有するバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）を含むブロッカーを含むようにして製造される。５’→３’エキソヌクレアーゼに対する抵抗性を有するバックボーンは、当業界に公知されている如何なるものでも利用できる。例えば、それは、多様なホスホロチオエート連結（ｌｉｎｋａｇｅ）、ホスホネート連結、ホスホロアミデート連結及び２’−カーボヒドレート修飾を含む。本発明の好ましい具現例によると、５’→３’エキソヌクレアーゼに対して抵抗性を有するバックボーンを含むヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結、アルキルホスホトリエステル連結、アリールホスホトリエステル連結、アルキルホスホネート連結、アリールホスホネート連結、ハイドロゲンホスホネート連結、アルキルホスホロアミデート連結、アリールホスホロアミデート連結、ホスホロセレネート連結、２’−Ｏ−アミノプロピール修飾、２’−Ｏ−アルキル修飾、２’−Ｏ−アリール修飾、２’−Ｏ−ブチル修飾、α−アノマオリゴデオキシヌクレオチド及び１−（４’−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル）修飾である。プローブに存在するブロッカーヌクレオチドは、一つであるか、あるいは連続的に又は不連続的に存在する一つ以上のヌクレオチドである。
【００９５】
択一的に、プローブの３’−末端部位のレポーター分子及びクエンチャー分子を隣接するように位置させることにより、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によりプローブが切断されないようにする。プローブが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断される場合にも、近接した距離のレポーター分子及びクエンチャー分子は互いに分離されず、シグナルが発生しない。例えば、レポーター分子がプローブの３’−末端のミスマッチヌクレオチドと連結されて、クエンチャー分子は、３’−末端から３ヌクレオチド離隔されたヌクレオチドと連結される場合、プローブ上のミスマッチヌクレオチド及びクエンチャー−連結ヌクレオチドをスパニング（ｓｐａｎｎｉｎｇ）する配列は、特定ハイブリダイゼーション温度でターゲット配列に結合されず、その３’−隣接位置が５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断される。したがって、近接した距離のレポーター分子及びクエンチャー分子は互いに分離されず、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による誤ったシグナルを発生しない。
【００９６】
なお、また他のアプローチは、ミスマッチ−保有プローブの５’−末端部位上の非相補的な配列を利用することである。ミスマッチ−保有プローブがターゲット核酸配列にハイブリッド形成される場合、その５’−末端部位は、一本鎖を形成して、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断されない。
【００９７】
ＴＯ−ＣＥＲ反応の固相反応は、本明細書に述べられたＣＥＲ反応の詳細説明を参照して説明できる。
【００９８】
ＩＶ．５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ及び上流プライマーを利用したＣＥＲ過程
本発明のＣＥＲ反応は、プローブだけではなく、上流プライマーを利用して実施できる。
【００９９】
ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性、上流プライマー及びプローブを利用したＣＥＲ過程において、二つの異なるエキソヌクレアーゼ活性が利用される：（ｉ）上流プライマー又は上流プライマーの伸長産物との相互作用とは独立である５’→３’エキソヌクレアーゼ活性、及び（ｉｉ）上流プライマー又は上流プライマーの伸長産物との相互作用に依存的である５’→３’エキソヌクレアーゼ活性。
【０１００】
本発明者らは、二つの異なるエキソヌクレアーゼ活性を利用し、ＣＥＲ−ＵＰ（Ｃｙｃｌｉｃ  Ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｕｐｓｔｒｅａｍ  Ｐｒｉｍｅｒ）過程を新たに構築して、これは、ターゲット核酸配列を示すシグナルを二重的に発生し、ターゲット核酸配列をより効率的な方式で検出する。
【０１０１】
本発明によると、プローブの上流に位置したプライマーは、‘上流プライマー’又は‘正方向プライマー’と命名される。
【０１０２】
本発明の好ましい具現例によると、工程（ａ）は、ターゲット核酸配列上の第２位置に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する上流プライマーをさらに含み、プライマーの３’−末端は、プローブの５’−末端の上流に存在する。本発明の好ましい具現例によると、工程（ａ）は、ターゲット核酸配列にプローブ及びプライマーをハイブリッド形成させて行われて、これにより、ターゲット核酸配列及びプローブの第１二本鎖が形成されて、ターゲット核酸配列、プローブ及びプライマーの第２二本鎖が形成される。
【０１０３】
本発明の好ましい具現例によると、工程（ｂ）は、工程（ａ）の結果物を５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼに接触させることにより行われて、前記プローブがターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合、プローブは、（ｉ）プライマー又はプライマーの伸長産物との相互作用とは独立である鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断されて、蛍光レポーター分子又はクエンチャー分子は、プローブから解離されてレポーター分子の蛍光が脱消光され、第１蛍光シグナルが発生し、そして（ｉｉ）プライマー又はプライマーの伸長産物との相互作用に依存的である鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断されて、蛍光レポーター分子又はクエンチャー分子は、プローブから解離されてレポーター分子の蛍光が脱消光され、第２蛍光シグナルが発生し、これにより、同時的方式で蛍光シグナルが二重に発生される。
【０１０４】
本発明の好ましい具現例によると、工程（ｄ）は、工程（ａ）−（ｃ）を少なくとも２回繰り返して第１蛍光シグナル及び第２蛍光シグナルが増幅されるように行って、これにより、同時的に二重−シグナル増幅がなされる。
【０１０５】
好ましくは、反復的エキソ核酸切断反応によりＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するＣＥＲ−ＵＰ過程は、以下の工程を含む：
（ａ）ターゲット核酸配列をプローブ及び上流プライマーであるプライマーにハイブリッド形成させる工程であって、これにより、ターゲット核酸配列及びプローブの第１二本鎖が形成され、かつターゲット核酸配列、プローブ及びプライマーの第２二本鎖が形成され、前記プローブは、ターゲット核酸の第１位置に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列、蛍光レポーター分子及び蛍光レポーター分子の蛍光をクエンチングできるクエンチャー分子を含み、プライマーは、ターゲット核酸の第２位置に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を含み、プライマーの３’−末端は、プローブの５’−末端の上流に存在する工程と、
（ｂ）第１二本鎖及び第２二本鎖を５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼに接触させる工程であって、前記プローブがターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合、プローブは、（ｉ）前記プライマー又はプライマーの伸長産物との相互作用とは独立である鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断されて、蛍光レポーター分子又はクエンチャー分子は、プローブから解離されてレポーター分子の蛍光が脱消光され、第１蛍光シグナルが発生し、そして（ｉｉ）プライマー又はプライマーの伸長産物との相互作用に依存的である鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断され、蛍光レポーター分子又はクエンチャー分子は、プローブから解離されてレポーター分子の蛍光が脱消光され、第２蛍光シグナルが発生し、これにより、同時的方式で前記蛍光シグナルが二重に発生される工程と、
（ｃ）工程（ｂ）の第１二本鎖及び第２二本鎖を変性させる工程と、
（ｄ）工程（ａ）−（ｃ）を少なくとも２回繰り返して、ターゲット核酸配列の存在を示す第１蛍光シグナル及び第２蛍光シグナルを増幅させる工程（二重同時的シグナル増幅がなされる）と、
（ｅ）ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを検出する工程であって、前記検出は、前記工程（ｄ）の反復のサイクル毎に行われるか、工程（ｄ）の反復の終了時点で行われるか、あるいは反復の間、所定の時間間隔のそれぞれにおいて行われて、シグナルは、ターゲット核酸配列の存在を示す工程。
【０１０６】
用語‘プライマー又はプライマーの伸長産物との相互作用とは独立である５’→３’エキソヌクレアーゼ活性’（以下、独立的５’→３’エキソヌクレアーゼ活性という）は、（ｉ）上流プライマー又は上流プライマーの伸長産物がない場合、又は（ｉｉ）上流プライマー又は上流プライマーの伸長産物がプローブに結合された５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼと互いに相互作用するに十分近接していない条件下で、ターゲット配列とハイブリッド形成されたプローブに作用し、５’→３’エキソ核酸切断反応を触媒できるエキソ核酸切断活性を意味する。
【０１０７】
用語‘プライマー又はプライマーの伸長産物との相互作用に依存的である５’→３’エキソヌクレアーゼ活性’（以下、依存的５’→３’エキソヌクレアーゼ活性という）は、上流プライマー又は上流プライマーの伸長産物に結合された鋳型−依存的核酸ポリメラーゼがターゲット配列にハイブリッド形成されたプローブに作用する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を意味する。
【０１０８】
独立的５’→３’エキソヌクレアーゼ活性及び依存的５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の同時的利用は、本発明で最初に提示される。
【０１０９】
独立的５’→３’エキソヌクレアーゼ活性及び依存的５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、プローブが二つの異なるパターンで切断され、ターゲット核酸配列を示すシグナルが二重に発生される。
【０１１０】
本明細書で使用された用語‘二重シグナル増幅’は、ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されたプローブが、独立的５’→３’エキソヌクレアーゼ活性及び依存的５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、二つの異なる切断方式で切断され、ターゲット核酸配列を示すシグナルが二重に発生されて（第１蛍光シグナル及び第２蛍光シグナル）、工程（ａ）−（ｃ）の反復により増幅されることを意味する。
【０１１１】
本明細書で使用された用語‘二重同時的シグナル増幅’は、二重シグナル増幅が同時的に発生することを意味する。図７に示されたように、プローブは、独立的５’→３’エキソヌクレアーゼ活性及び依存的５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により同時的方式で切断されて、これにより、二重同時的シグナル増幅の発生がなされる。したがって、ＣＥＲ−ＵＰは、‘リアルタイム−ＤＳＳＡ（Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ−Ｄｕａｌ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｓｉｇｎａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）’と命名される。
【０１１２】
ＣＥＲ−ＵＰ過程は、本明細書で述べられたＣＥＲ過程の詳細説明を参照として説明できる。例えば、ＣＥＲ−ＵＰ過程に利用されるプローブ、ターゲット核酸配列及びハイブリダイゼーションは、上記述べられたＣＥＲ過程に対する詳細により説明できる。
【０１１３】
本明細書で使用された用語‘プライマー’は、オリゴヌクレオチドを意味するもので、核酸鎖（鋳型）に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件、即ち、ヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼのような重合剤の存在、そして適した温度とｐＨの条件で合成の開始点として作用できる。好ましくは、プライマーは、増幅において最大効率を有する一本鎖である。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。本発明で利用されるプライマーは、天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ｄＮＭＰ（即ち、ｄＡＭＰ，  ｄＧＭＰ，  ｄＣＭＰ及びｄＴＭＰ）、修飾ヌクレオチド又は非−天然ヌクレオチドが含まれる。また、プライマーは、リボヌクレオチドも含むことができる。
【０１１４】
プライマーは、重合剤の存在下で伸長産物の合成をプライミングさせることができるほど十分長くなければならない。プライマーの適した長さは、多数の要素、例えば、温度、応用分野及びプライマーの出所（ｓｏｕｒｃｅ）によって決定される。用語‘アニーリング’又は‘プライミング’は、鋳型核酸にオリゴデオキシヌクレオチド又は核酸が並置（ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ）されることを意味し、前記並置は、ポリメラーゼがヌクレオチドを重合させて、鋳型核酸又はその一部分に相補的な核酸分子を形成するようにする。
【０１１５】
上流プライマーは、ターゲット核酸配列上の第２位置に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を含む。本明細書で使用される用語‘相補的’は、所定のアニーリング条件又は厳格条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下でプライマー又はプローブがターゲット核酸配列に選択的にハイブリダイズするほど十分相補的なことを意味し、用語‘実質的に相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）’及び‘完全に相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）’を包括する意味を有して、好ましくは、完全に相補的なことを意味する。
【０１１６】
プローブは、ターゲット核酸配列上の第１位置に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を含む。前記プローブは、前記上流プライマーが有する配列を有しない。したがって、ターゲット核酸配列は、プローブだけではなく、上流プライマーにより照射できる。
【０１１７】
プローブ及び上流プライマーがターゲット核酸配列にハイブリッド形成される場合、上流プライマーの３’−末端は、プローブの５’−末端の上流に存在しなければならない。
【０１１８】
ハイブリダイゼーションにより、ターゲット核酸配列及びプローブの第１二本鎖が形成されて、ターゲット核酸配列、プローブ及びプライマーの第２二本鎖が形成される。上流プライマーのプライマー伸長条件下で第１二本鎖及び第２二本鎖のプローブは、鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断される。
【０１１９】
二つの異なるパターンによってプローブの切断が発生してシグナルが発生される：（ｉ）上流プライマー又は上流プライマーの伸長産物との相互作用とは独立である５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による切断反応から出る第１蛍光シグナル、及び（ｉｉ）上流プライマー又は上流プライマーの伸長産物との相互作用とは独立である５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による切断反応から出る第２蛍光シグナル。
【０１２０】
より詳細には、第１蛍光シグナルを引き起こす独立的５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による切断反応は、三つの異なる方式で発生する。
【０１２１】
第１の方式は、独立的５’→３’エキソヌクレアーゼ活性がプローブ及びターゲット核酸配列の第１二本鎖に作用してプローブを切断し、第１蛍光シグナルを発生させる方式である。
【０１２２】
第２の方式は、独立的５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が上流プライマーとの相互作用無しに第２二本鎖のプローブに作用してプローブを切断し、第１蛍光シグナルを発生させる方式である。
【０１２３】
第３の方式は、独立的５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が上流プライマーの伸長産物との相互作用無しに第２二本鎖のプローブに作用してプローブを切断し、  第１蛍光シグナルを発生させる方式である。
【０１２４】
要約すると、上流プライマー又は上流プライマーの伸長産物との相互作用とは独立である鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による切断反応は、（ｉ）ターゲット核酸配列及びプローブの第１二本鎖で発生し、（ｉｉ）ターゲット核酸配列、プローブ及び上流プライマーの第２二本鎖で発生し、上流プライマーは伸長されず、上流プライマーの３’−末端は、プローブの５’−末端から離隔されており、これは、プローブが上流プライマーとの相互作用に依存的である前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって切断されない程度に離隔されたものであり、又は（ｉｉｉ）ターゲット核酸配列、プローブ及び上流プライマーの第２二本鎖で発生し、上流プライマーは、鋳型−依存的核酸ポリメラーゼにより伸長されて、伸長された上流プライマーの３’−末端は、プローブの５’−末端から離隔されて、これは、プローブが上流プライマーの伸長産物との相互作用に依存的である前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって切断されない程度に離隔される。
【０１２５】
上流プライマー又は上流プライマーの伸長産物との相互作用とは独立である鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により第１蛍光シグナルが発生されることは、ターゲット配列の正確な検出において非常に重要である。例えば、従来リアルタイム技術において、エラーシグナルを除去するための方法は、いずれも上流プライマー又は伸長産物に依存的である５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に焦点を合わせている。しかし、本発明によると、エラーシグナルが第１蛍光シグナルから引き起こされる可能性があり、このようなエラーシグナルは、従来リアルタイム技術では考慮されなかった。このような点で、従来リアルタイム技術は、本質的なエラーデータを有する可能性が多い。したがって、第１蛍光シグナルの発生においてエラーシグナルの除去のためには、反応最適化が達成されなければならない。本発明によると、本発明の反応は、第１蛍光シグナルの発生を考慮して最適化することができる。
【０１２６】
第２蛍光シグナルを発生させる依存的５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による切断反応は、従来リアルタイムＰＣＲ過程の切断反応によって発生できる。
【０１２７】
本発明において、ターゲット核酸配列は、プローブ及び上流プライマーとハイブリッド形成され、上流プライマーは、プローブから離隔され、これは、上流プライマーがプローブと相互作用しない程度である場合、プローブは、上流プライマーの伸長産物との相互作用とは独立である５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断される。本発明の好ましい具現例によると、第２二本鎖のプローブの５’−末端は、上流プライマーの３’−末端から少なくとも２５ヌクレオチド離隔されている（より好ましくは、２５〜１００ヌクレオチド、さらに好ましくは、２５〜５０ヌクレオチド）。
【０１２８】
本発明の好ましい具現例によると、ＣＥＲ−ＵＰは、ＰＣＲ反応（ポリメラーゼ連鎖反応）によりターゲット核酸配列を増幅させるために、追加的に逆方向プライマーを利用して行われる。
【０１２９】
好ましくは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼは、熱安定性エキソヌクレアーゼであり、より好ましくは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ及びバクテリオファージＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ）であり、最も好ましくは、多様なバクテリア種から得られる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであって、これは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｎｔｒａｎｉｋｉａｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｌａｃｔｅｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｎｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｉｌｖａｎｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｚ０５及びＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｐｓ  １７を含む。最も好ましくは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【０１３０】
また、ＣＥＲ−ＵＰ過程は、プロトコールＩで詳述した５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用するＣＥＲ過程のように、固相反応だけではなく液相反応でも実施できる。ＣＥＲ−ＵＰ過程による液相反応及び固相反応は、その過程で上流プライマーを利用して、ポリメラーゼの二つの異なる５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を利用するという点を除いては、プロトコールＩで詳述した５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を利用するＣＥＲ過程に対する詳細説明で説明できる。
【０１３１】
ＣＥＲ−ＵＰを含む本発明のＣＥＲ反応では、プローブ上の標識は、相互作用的標識システムであり、より好ましくは、ＦＲＥＴ標識システムである。相互作用的標識システムは、供与体分子（レポーター分子）及び受容体分子（クエンチャー分子）間にエネルギーが非−放射能的（ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｉｖｅｌｙ）に伝達されるシグナル発生システムである。
【０１３２】
相互作用的標識システムの代表的例として、ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）標識システムは、蛍光レポーター分子（供与体分子）及びクエンチング分子（受容体分子）を含む。ＦＲＥＴでエネルギー供与体は、蛍光性であるが、エネルギー受容体は、蛍光性又は非−蛍光性である。
【０１３３】
相互作用的標識システムの他の形態において、エネルギー供与体は、非−蛍光性、例えば、発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）であり、エネルギー受容体は、蛍光性である。相互作用的標識システムのまた他の形態において、エネルギー供与体は、発光性、例えば、生物発光性、化学発光性又は電気化学発光性であり、受容体は、蛍光性である。
【０１３４】
より好ましくは、ターゲット核酸配列を示すシグナルは、相互作用的標識システムにより発生されて、最も好ましくは、ＦＲＥＴ標識システムである。
【０１３５】
ＣＥＲ−ＵＰを含む本発明のＣＥＲ反応では、プローブに利用されるレポーター分子及びクエンチャー分子は、当業界に公知されている如何なる分子も含むことができる。その例は、下記の通りである：  Ｃｙ２ＴＭ（５０６）、ＹＯ−ＰＲＯＴＭ−１  （５０９）、ＹＯＹＯＴＭ−１  （５０９）、Ｃａｌｃｅｉｎ  （５１７）、ＦＩＴＣ（５１８）、ＦｌｕｏｒＸＴＭ（５１９）、ＡｌｅｘａＴＭ（５２０）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １１０（５２０）、５−ＦＡＭ（５２２）、Ｏｒｅｇｏｎ  ＧｒｅｅｎＴＭ５００（５２２）、Ｏｒｅｇｏｎ  ＧｒｅｅｎＴＭ４８８（５２４）、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ（５２５）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ＧｒｅｅｎＴＭ（５２７）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １２３（５２９）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ＧｒｅｅｎＴＭ（５３１）、Ｃａｌｃｉｕｍ  ＧｒｅｅｎＴＭ（５３３）、ＴＯ−ＰＲＯＴＭ−１（５３３）、ＴＯＴＯ１（５３３）、ＪＯＥ（５４８）、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５  ３０／５５０（５５０）、Ｄｉｌ（５６５）、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０（５７０）、Ｃｙ３ＴＭ（５７０）、ＡｌｅｘａＴＭ５４６４（５７０）、ＴＲＩＴＣ  （５７２）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ＯｒａｎｇｅＴＭ（５７５）、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｒ＆Ｂ（５７５）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（５７５）、Ｃａｌｃｉｕｍ  ＯｒａｎｇｅＴＭ（５７６）、Ｐｙｒｏｎｉｎ  Ｙ（５８０）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ（５８０）、ＴＡＭＲＡ（５８２）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ＲｅｄＴＭ（５９０）、Ｃｙ３．５ＴＭ（５９６）、ＲＯＸ  １０（６０８）、Ｃａｌｃｉｕｍ  ＣｒｉｍｓｏｎＴＭ（６１５）、ＡｌｅｘａＴＭ５９４（６１５）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（６１５）、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ（６２８）、ＹＯ−ＰＲＯＴＭ−３（６３１）、ＹＯＹＯＴＭ−３（６３１）、Ｒ−ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４２）、Ｃ−Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４８）、ＴＯＰＲＯＴＭ−３（６６０）、ＴＯＴＯ３（６６０）、ＤｉＤ  ＤｉｌＣ（５）（６６５）、Ｃｙ５ＴＭ（６７０）、Ｔｈｉａｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ（６７１）及びＣｙ５．５（６９４）。括弧の数字は、ナノメートル単位で表示した最大発光波長である。
【０１３６】
適したレポーター−クエンチャー対は、下記のようなたくさんの文献に開示されている：Ｐｅｓｃｅら、ｅｄｉｔｏｒｓ，ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ  ＳＰＥＣＴＲＯＳＣＯＰＹ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７１）；  Ｗｈｉｔｅら、ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７０）；Ｂｅｒｌｍａｎ，  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ  ＳＰＥＣＴＲＡ  ＯＦ  ＡＲＯＭＡＴＩＣ  ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ，２ｎｄ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７１）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ＣＯＬＯＵＲ  ＡＮＤ  ＣＯＮＳＴＩＴＵＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７６）；Ｂｉｓｈｏｐ，  ｅｄｉｔｏｒ，ＩＮＤＩＣＡＴＯＲＳ  （Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９７２）；Ｈａｕｇｌａｎｄ，ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ  ＰＲＯＢＥＳ  ＡＮＤ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，１９９２）；Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ，ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＰＨＯＳＰＨＯＲＥＳＣＥＮＣＥ（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９４９）；Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ．，ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ  ＰＲＯＢＥＳ  ＡＮＤ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ，Ｓｉｘｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．，１９９６；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．３，９９６，３４５及び４，３５１，７６０。
【０１３７】
本発明において、広範囲波長又は特定波長の蛍光をクエンチングできる非−蛍光ブラッククエンチャー分子が利用できるということは、注目すべきことである。
【０１３８】
プローブに適用される標識システムにおいて、レポーターは、ＦＲＥＴの供与体を含み、クエンチャーは、ＦＲＥＴのその他のパートナー（受容体）を含む。例えば、フルオレセイン色素（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｙｅ）は、レポーター分子として利用されて、ロダミン色素（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ｄｙｅ）は、クエンチャー分子として利用される。
【０１３９】
ハイブリダイゼーション及びシグナル発生後、二本鎖の変性が行われる。変性に対する方法は、熱、アルカリ、ホルムアミド、ウレア及びグリコサール処理、酵素方法（例えば、ヘリカーゼ反応）、及び結合タンパク質を含むが、これらに限定されるものではない。例えば、８０℃乃至１０５℃範囲の温度に熱を加えて達成できる。このような処理を達成するための一般的な方法は、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）により提供される。
【０１４０】
工程（ａ）−（ｃ）を繰り返して、レポーター分子から出る蛍光シグナルを増幅させる。反復回数は特に制限されないが、一般に少なくとも２回、好ましくは、少なくとも５回、より好ましくは、少なくとも１０回である。
【０１４１】
最終的に、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが検出される。シグナル検出は、反復のサイクル毎に行われるか（即ち、リアルタイム方式）、反復の終了時点で行われるか（即ち、終了時点方式）、あるいは反復の間、所定の時間間隔のそれぞれにおいて行われる。好ましくは、シグナル検出は、反復のサイクル毎に行われて、検出の正確度を向上させることができる。
【０１４２】
シグナルは、各標識に対する従来方法により検出されるか、又は測定できる。例えば、蛍光シグナルは、従来方法、例えば、蛍光測定器（ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）により検出されるか測定できる。
【０１４３】
本発明は、検出及び／又は増幅しようとするターゲット核酸配列の如何なる特定配列又は長さも要求しない。
【０１４４】
ｍＲＮＡを初期物質として利用する場合、アニーリング工程の実施以前に逆転写工程が必須的であり、これの詳細な内容は、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）；及びＮｏｏｎａｎ，  Ｋ．Ｆ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０３６６（１９８８）に開示されている。逆転写反応のために、ランダムヘキサマー又はｍＲＮＡにハイブリッド形成されるオリゴヌクレオチドｄＴプライマーが利用される。
【０１４５】
オリゴヌクレオチドｄＴプライマーは、ｄＴＭＰｓから構成され、ｄＴプライマーがプライマーとしての役割ができる範囲内でこれのｄＴＭＰｓの一つ又はそれ以上は、他のｄＮＭＰで代替できる。逆転写は、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する逆転写酵素で実施できる。ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素を利用する場合、慎重に反応条件を選択することにより、ＲＮａｓｅ  Ｈ切断過程を省くことができる。
【０１４６】
特に、検出及び増幅できるターゲット核酸配列は、あらゆる天然（Ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）の原核細胞核酸、真核細胞（例えば、原生動物と寄生動物、菌類、酵母、高等植物、下等動物、及び哺乳動物と人間を含む高等動物）核酸、ウイルス（例えば、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス、肝炎ウイルス、ポリオウイルスなど）核酸、又はウイロイド核酸を含む。
【０１４７】
本発明の長所がよく発揮される場合は、少なくとも２個以上のターゲット核酸配列を同時に検出するマルチプレックス検出である。
【０１４８】
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、少なくとも２種（より好ましくは、少なくとも３種、最も好ましくは、少なくとも５種）の核酸配列を含み、プローブ（及び／又は上流プライマー）は、少なくとも２種（より好ましくは、少なくとも３種、最も好ましくは、少なくとも５種）のプローブを含む。
【０１４９】
例えば、本発明で５個のプローブ（異なる放出波長の蛍光レポーター分子をそれぞれ有する）を含む反応容器（ｖｅｓｓｅｌ）及び核酸試料を利用して行う場合、５個の異なるターゲット核酸に対応する５個の異なる蛍光シグナルを発生して、リアルタイムで５個の異なるターゲット核酸配列が同時的に検出されるようにする。このような場合、利用されるクエンチャー分子の全ては、互いに異なる性質を有するように選択できる。選択的に、利用されるクエンチャー分子の全て又は一部は、同じ性質を有するように選択できる。
【０１５０】
また、本発明は、ヌクレオチド変異の検出において非常に有用である。本明細書で使用された用語‘ヌクレオチド変異（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）’は、連続的ＤＮＡ断片又は配列が類似しているＤＮＡ断片において、特定位置に存在するＤＮＡ配列のヌクレオチド多様性を意味する。そのような連続的ＤＮＡ断片は、一つの遺伝子又は一つの染色体のある他の部位を含む。例えば、本発明の方法により検出できるヌクレオチド変異は、ＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、欠失、挿入、置換及びトランスロケーションを含む。ヌクレオチド変異の例は、ヒトゲノムにある多様な変異（例えば、ＭＴＨＦＲ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）遺伝子の変異）、薬剤耐性病原体のヌクレオチド変異及び癌発生−関連ヌクレオチドの変異を含む。
【０１５１】
本発明の好ましい具現例によると、本発明で利用されたターゲット核酸配列は、増幅プライマーを利用して獲得した前増幅された核酸配列である。前増幅された核酸配列の利用は、本発明のターゲット検出の敏感度と特異度を大きく増加させる。少量のターゲット核酸配列は、前増幅されて適合した量になった後、本発明の方法により検出されて、本発明のターゲット検出の敏感度及び特異度が向上される。
【０１５２】
本発明の好ましい具現例によると、ＣＥＲ−ＵＰのような本発明のＣＥＲ反応で追加的に利用される上流及び／又は逆方向プライマー及び／又はターゲット核酸配列の前増幅のための増幅プライマーは、下記一般式Ｉの二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有する：
５’−Ｘｐ−Ｙｑ−Ｚｒ−３’  （Ｉ）
（式中、Ｘｐは、ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第１プライミング部位であり、Ｙｑは、少なくとも三つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚｒは、ターゲット配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第２プライミング部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ、Ｙ及びＺは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、５’−第１プライミング部位のＴｍは、３’−第２プライミング部位のＴｍより高く、前記分割部位は、前記三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記分割部位は、ターゲット核酸配列に対するアニーリングに関して、５’−第１プライミング部位を３’−第２プライミング部位から分割し、これにより、前記オリゴヌクレオチドの前記アニーリング特異性が５’−第１プライミング部位及び３’−第２プライミング部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記プライマーの全体ハイブリダイゼーション特異性を向上させる。）
【０１５３】
ＤＳＯ（ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）のプライマー形態であるＤＰＯ構造は、本発明者らにより最初に提示された（ＷＯ２００６／０９５９８１；Ｃｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｕａｌ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＳＮＰ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ＣＹＰ２Ｃ１９  ｇｅｎｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５：６ｅ４０（２００７））。
【０１５４】
ＤＳＯは、ハイブリダイゼーション又はアニーリングが分割領域により互いに分離された５’−高Ｔｍ  特異性部位（又は５’−第１プライミング部位）及び３’−低Ｔｍ  特異性部位（又は３’−第２プライミング部位）により二重的に決定されるようにする新規な概念を具現したもので、非常に驚くべき特異性を示す（ＷＯ２００６／０９５９８１；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｒｅｃｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ｕｓｉｎｇ  ｄｕａｌ−ｐｒｉｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｒｓ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４９：７６−８４（２００８）；Ｋｉｍ，  ｅｔ．  ａｌ．，Ｒａｐｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  １２  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｄｕａｌ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｓｔｅｍ−ｂａｓｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｖｉｒｏｍｅｔ．２００８．１１．００７（２００８）；Ｈｏｒｉｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕｓｅ  ｏｆ  ｄｕａｌ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｓｅｘｕａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ，  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｄｏｉ：１０．１１１／ｊ．１４７２−７６５Ｘ２００９．０２６１８ｘ（２００９）））。上述のように、ＤＳＯは、互いに異なるアニーリング特性、すなわち、初期の安定したハイブリッド形成を招来する５’−第１プライミング部位；及びターゲット特異性を決定する３’−第２部位、を有する二つのプローブ断片を究極的に有するようになる。
【０１５５】
本発明のＤＰＯ構造を有するプライマーを利用した増幅（特に、マルチプレックス増幅）は、擬陽性及び擬陰性データのないアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）が獲得されるようにする。
【０１５６】
本発明の好ましい具現例によると、分割部位に位置するユニバーサル塩基は、デオキシイノシン、イノシン、７−デアザ−２’−デオキシイノシン、２−アザ−２’−デオキシイノシン、２’−ＯＭｅイノシン、２’−Ｆイノシン、デオキシ３−ニトロピロール、３−ニトロピロール、２’−ＯＭｅ３−ニトロピロール、２’−Ｆ３−ニトロピロール、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、デオキシ５−ニトロインドール、５−ニトロインドール、２’−ＯＭｅ５−ニトロインドール、２’−Ｆ５−ニトロインドール、デオキシ４−ニトロベンズイミダゾール、４−ニトロベンズイミダゾール、デオキシ４−アミノベンズイミダゾール、４−アミノベンズイミダゾール、デオキシネブラリン、２’−Ｆネブラリン、２’−Ｆ４−ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ−５−イントロインドール、ＰＮＡ−ネブラリン、ＰＮＡ−イノシン、ＰＮＡ−４−ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ−３−ニトロピロール、モルフォリノ−５−ニトロインドール、モルフォリノ−ネブラリン、モルフォリノ−イノシン、モルフォリノ−４−ニトロベンズイミダゾール、モルフォリノ−３−ニトロピロール、ホスホルアミデート−５−ニトロインドール、ホスホルアミデート−ネブラリン、ホスホルアミデート−イノシン、ホスホルアミデート−４−ニトロベンズイミダゾール、ホスホルアミデート−３−ニトロピロール、２’−Ｏ−メトキシエチルイノシン、２’−Ｏ−メトキシエチルネブラリン、２’−Ｏ−メトキシエチル５−ニトロインドール、２’−Ｏ−メトキシエチル４−ニトロ−ベンズイミダゾール、２’−Ｏ−メトキシエチル３−ニトロピロール、及び前記塩基の組み合せからなる群から選択される。より好ましくは、ユニバーサル塩基は、デオキシイノシン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール又は５−ニトロインドールであり、最も好ましくは、デオキシイノシンである。
【０１５７】
好ましくは、分割部位は、少なくとも３ユニバーサル塩基を有する連続したヌクレオチドを含み、より好ましくは、少なくとも４ユニバーサル塩基、最も好ましくは、少なくとも５ユニバーサル塩基を有する連続したヌクレオチドを含む。
【０１５８】
好ましくは、ＤＰＯ構造の５’−第１プライミング部位の長さは、３’−第２プライミング部位より長い。５’−第１プライミング部位は、好ましくは、１５〜６０ヌクレオチドの長さを有し、より好ましくは、１５〜４０ヌクレオチド、さらに好ましくは、１５〜２５ヌクレオチドの長さを有する。３’−第２プライミング部位は、好ましくは、３〜１５ヌクレオチドの長さを有し、より好ましくは、５〜１５ヌクレオチド、最も好ましくは、６〜１３ヌクレオチドの長さを有する。分割部位は、好ましくは、３〜１０ヌクレオチド、より好ましくは、４〜８ヌクレオチド、最も好ましくは、５〜７ヌクレオチドの長さを有することが好ましい。本発明の好ましい具現例によると、５’−第１プライミング部位は、４０℃〜８０℃のＴｍを有し、より好ましくは、４５℃〜６５℃のＴｍを有する。３’−第２プライミング部位は、好ましくは、１０℃〜４０℃のＴｍを有する。分割部位は、好ましくは、３℃〜１５℃のＴｍを有する。
【０１５９】
本発明の好ましい具現例によると、３’−第１プライミング部位は、４０℃〜８０℃のＴｍを有し、より好ましくは、４５℃〜６５℃のＴｍを有する。５’−第２プライミング部位は、１０℃〜４０℃のＴｍを有する。分割部位は、好ましくは、３℃〜１５℃のＴｍを有する。
【０１６０】
ターゲット核酸を検出するためにプライマーを利用する従来ＰＣＲ技術は、使用されるプライマーの内在的限界のため、エラーシグナルから十分に自由ではない。しかし、そのような意図的デザインのＤＰＯ構造を含むプライマーは、顕著に向上された特異度でターゲット核酸配列にハイブリッド形成されて、エラーシグナル無しにターゲット核酸配列が検出されるようにする。本明細書で使用された用語‘従来’は、プライマーの結合において、ＤＰＯ構造を含まない全てのプライマーを意味する。それらは、本明細書において従来プライマーとして説明される。
【０１６１】
本発明のまた他の様態によると、本発明は、反復的エキソ核酸切断反応によりＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するキットであって、（ａ）ターゲット核酸配列上の第１位置に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を含むプローブ、蛍光レポーター分子及びレポーター分子の蛍光をクエンチングできるクエンチャー分子と、（ｂ）プローブの切断のためのエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素と、を含むキットを提供する。
【０１６２】
本発明のキットは、前述の本発明の検出方法を実施して構成されるため、その重複する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるためにその記載を省く。
【０１６３】
本発明のキットは、バッファー、ＤＮＡポリメラーゼ助因子及びデオキシリボヌクレオチド−５−トリホスフェートのようなターゲット増幅ＰＣＲ反応（例えば、ＰＣＲ反応）に必要な試薬を選択的に含むことができる。追加的に、本発明のキットは、多様なポリヌクレオチド分子、逆転写酵素、多様なバッファー及び試薬、及びＤＮＡポリメラーゼ活性を抑制する抗体を含むことができる。
【０１６４】
また、キットは、陽性対照群及び陰性対照群反応を実施するに必須的な試薬を含むことができる。ある一つの特定反応で使用される試薬の最適量は、本明細書の開示事項を習得した当業者により容易に決定できる。典型的に、本発明のキットは、上記言及された構成成分を含む別途の包装又は区分で製作される。
【０１６５】
本発明の特徴と利点は、以下のように要約できる：
（ａ）本発明は、反復的エキソ核酸切断反応（ＣＥＲ）によりターゲット核酸配列を示すシグナルを増幅する新規なアプローチに関し、これは、（ｉ）酵素の５’→３’又は３’→５’エキソヌクレアーゼ活性（好ましくは、熱安定性鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’又は３’→５’エキソヌクレアーゼ活性）により二重標識プローブ切断によるシグナル発生及び（ｉｉ）二重標識プローブ及びターゲット核酸配列間のハイブリダイゼーション及び変性の反復によるシグナル増幅を含む。
（ｂ）ＣＥＲ方法において、シグナル増幅がターゲット配列の増幅に関係なく達成されるため、増幅プライマーをシグナル増幅に利用する必要がない。
（ｃ）本発明は、プライマー及びこれの伸長産物とは独立である鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を利用するため、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の活性化のための追加的なプライマーの助け無しにシグナルを増幅してターゲット配列を検出することができる。
（ｄ）本発明のＣＥＲ方法は、シグナル発生のためのプライマー又はターゲット増幅のためのプライマーの助け無しに単独でプローブを利用してターゲット配列が検出されるようにする。これと関連し、本発明は、オリゴヌクレオチドの配列決定、反応条件最適化の難しさ及び費用問題のようなマルチプルオリゴヌクレオチドの利用に係わる従来技術の短所から自由である。特に、前述の本発明の利点は、マルチプレックスターゲット検出においてより顕著である。
（ｅ）固相基質上に固定化されたプローブを利用するＣＥＲ方法において、反復的エキソ核酸切断反応のためのハイブリダイゼーション及び変性の反復は、固定化プローブの大部分を切断できるようにして、これにより、シグナル発生が最大化される。
（ｆ）本発明が５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性鋳型−依存的核酸ポリメラーゼ、上流プライマー及びプローブを利用して行われる場合、鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの二つの異なる５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を通じてターゲット配列を示すシグナルを発生することができる：（ｉ）上流プライマー又は上流プライマーの伸長産物との相互作用とは独立である５’→３’エキソヌクレアーゼ活性、及び（ｉｉ）上流プライマー又は上流プライマーの伸長産物との相互作用に依存的である５’→３’エキソヌクレアーゼ活性。
（ｇ）選択的に、本発明は、ターゲット配列の量の増加による検出効率性の向上のために、追加的な逆方向プライマーを利用して実施できる。また、本発明は、ターゲット増幅のために、一対のプライマー（正方向プライマー及び逆方向プライマー）を利用して実施できる。
（ｈ）本明細書に言及されたように、本明細書に利用されたＤＰＯ構造を有するプライマーは、リアルタイムＰＣＲ反応において、その結合特異度を向上させ、これにより、プライマーの非−ターゲット結合に連関された擬陽性シグナルを除去する。
【実施例】
【０１６６】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
【０１６７】
実施例１：５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを利用したターゲット核酸配列を検出するための反復的エキソ核酸切断反応の評価
本発明の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを利用した反復的エキソ核酸切断反応が、ターゲット核酸配列を検出するに十分なシグナルを発生させることができるかどうかについて評価した。
【０１６８】
この評価のために、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ遺伝子に対する合成オリゴヌクレオチドを鋳型として利用した。二重−標識プローブは、蛍光レポーター分子として、その５’−末端に６−ＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を有しており、クエンチャー分子として、その内部配列にＢＨＱ−１（Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  １）を有している。二重−標識プローブの３’−末端は、リン酸化修飾されており、そのような二重−標識プローブは伸長されない。反復的エキソ核酸切断反応は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを利用して行った。各サイクルのハイブリダイゼーション工程でシグナルを測定した。
【０１６９】
Ａ．Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子検出のための反復的エキソ核酸切断反応
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子のターゲット核酸配列を鋳型として利用する場合、本実施例で利用された合成鋳型及び二重−標識プローブの配列は、下記の通りである：
ＳＡ＿Ｔ７０  ５’−ＧＧＴＧＴＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＡＡＣＡＡＣＧＣＣＧＴＡＡＡＣＣＧＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＣＡＣＧＧＡＡＴＧＡＡＴＡＡＴＧＴＴＧＡＡＴＴＴＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）
２５  ＳＡ＿ＤＬＰ  ５’−［６−ＦＡＭ］ＣＡＴＴＣＣＧ［Ｔ（ＢＨＱ−１）］ＧＧＴＣＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＴＴ［Ｐｈｏｓ］−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
【０１７０】
合成鋳型（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）０．２ｐｍｏｌｅ、１０×ＤｉａＳｔａｒＴＭＴａｑ緩衝液２μＬ、ＤｉａＳｔａｒＴＭＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）２ｕｎｉｔ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び二重−標識プローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）  ５ｐｍｏｌｅを含有した２０μＬの最終容量で反復的エキソ核酸切断反応を行った；前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイム熱循環器（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に設置し；前記反応混合物を９５℃で２分間変性させた後、９５℃で２０秒間及び５５℃で６０秒間の過程を４０回繰り返した。各サイクルのハイブリダイゼーション工程（５５℃）で発生されたシグナルを検出した。
【０１７１】
図８に示されたように、鋳型が存在する場合（Ｎｏ．１）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子の検出のためのターゲットシグナル増幅が観察されたが、鋳型がないか（Ｎｏ．２）又は酵素がない場合（Ｎｏ．３）は観察されなかった。したがって、反復的エキソ核酸切断反応は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子を検出するに十分なシグナルを提供することができ、これは、二重−標識プローブの変性、ハイブリダイゼーション及びＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による切断過程の反復を通じて達成されることが分かる。
【０１７２】
Ｂ．  Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ遺伝子検出のための反復的エキソ核酸切断反応
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ遺伝子のターゲット核酸配列を鋳型として利用する場合、本実施例で利用された合成鋳型及び二重−標識プローブの配列は、下記の通りである：
ＳＰ＿Ｔ１０５  ５’−ＴＴＡＣＴＧＡＡＡＧＡＣＡＡＴＧＡＡＧＡＣＡＡＣＣＴＡＡＣＡＧＧＧＧＡＡＧＡＴＧＴＴＣＧＣＧＡＡＧＧＣＴＴＡＡＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＣＴＣＡＧＴＴＡＡＡＣＡＣＣＣＡＡＡＴＣＣＡＣＡＧＴＴＴＧＡＡＧＧＡＣＡＡＡＣＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）
ＳＰ＿ＤＬＰ  ５’−［６−ＦＡＭ］ＴＣＣＴＴＣＡＡＡＣＴＧＴＧＧＡＴＴ［Ｔ（ＢＨＱ−１）］ＧＧＧＴＧＴ［Ｐｈｏｓ］−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）
【０１７３】
鋳型（Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ２ｐｍｏｌｅ）及び二重−標識プローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）を除いては、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対して利用されたものと同一なプロトコールでエキソ核酸切断反応を行った。
【０１７４】
図９に示されたように、鋳型が存在する場合（Ｎｏ．１）、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ遺伝子の検出のためのターゲットシグナル増幅が観察されたが、鋳型がないか（Ｎｏ．２）又は酵素がない場合（Ｎｏ．３）は観察されなかった。したがって、反復的エキソ核酸切断反応は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ遺伝子を検出するに十分なシグナルを提供することができ、これは、二重−標識プローブの変性、ハイブリダイゼーション及びＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による切断過程の反復を通じて達成されることが分かる。
【０１７５】
実施例２：３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを利用したＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ  遺伝子を検出するための反復的エキソ核酸切断反応の評価
本発明者らは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＰｆｕポリメラーゼを利用した反復的エキソ核酸切断反応が、ターゲット核酸配列を検出するに十分なシグナルを増幅することができるかどうかについて実験した。
【０１７６】
この評価のために、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子に対する合成オリゴヌクレオチドを鋳型として利用した。ミスマッチ−保有二重−標識プローブは、その３’−末端にミスマッチヌクレオチドとしてデオキシイノシンを有する。プローブは、その５’−末端に蛍光レポーター分子として６−ＦＡＭで標識されて、その３’−末端にクエンチャー分子としてＢＨＱ−１（Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  １）で標識される。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを利用して反復的エキソ核酸切断反応を行った。各サイクルのハイブリダイゼーション工程でシグナルを測定した。
【０１７７】
本実施例で利用された合成鋳型及びミスマッチ−保有二重−標識プローブの配列は、下記の通りである：
ＮＧ−Ｔ７０  ５’−ＧＡＡＡＣＣＡＧＴＴＣＣＧＧＣＴＧＴＴＧＴＣＧＧＣＡＡＧＣＣＧＧＧＧＴＣＧＧＡＴＧＴＧＴＡＴＴＡＴＧＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＴＴＡＣＡＡＡＡＡＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）
ＮＧ＿ＤＬＰ  ５’−［ＢＨＱ−１］ＧＡＣＣＣＣＧＧＣＴＴＧＣＣＧＡＣＡＡＣＩ［６−ＦＡＭ］−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）
【０１７８】
合成鋳型（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）０．２ｐｍｏｌｅ、１０×ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭＩＩ反応緩衝液［２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有］２μＬ、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭＩＩフュージョンＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＵＳＡ）１ｕｎｉｔ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ２．４μＬ及びミスマッチ−保有二重−標識プローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）  ５ｐｍｏｌｅを含有した２０μＬの最終容量で反復的エキソ核酸切断反応を行った；前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイム熱循環器（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に設置し；前記反応混合物を９５℃で２分間変性させた後、９５℃で２０秒間及び５５℃で６０秒間の過程を４０回繰り返した。各サイクルのハイブリダイゼーション工程（５５℃）で発生されたシグナルを検出した。
【０１７９】
図１０に示されたように、鋳型が存在する場合（Ｎｏ．１）、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子の検出のためのターゲットシグナル増幅が観察されたが、鋳型がないか（Ｎｏ．２）又は酵素がない場合（Ｎｏ．３）は観察されなかった。したがって、反復的エキソ核酸切断反応は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子を検出するに十分なシグナルを提供することができ、これは、ミスマッチ−保有二重−標識プローブの変性、ハイブリダイゼーション及びＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性による切断過程の反復を通じて達成されることが分かる。
【０１８０】
実施例３：５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを利用してＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ遺伝子を検出するための反復的エキソ核酸切断反応の評価
本発明者らは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ遺伝子を検出するために、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを利用した反復的エキソ核酸切断反応を適用した。
【０１８１】
この適用のために、一対の増幅プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：７及び８）及び鋳型としてＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのゲノムＤＮＡを利用して増幅された産物を獲得した。
【０１８２】
本実施例で利用された二重−標識プローブ及びプライマーの配列は、下記の通りである：
ＳＰ＿Ｆ  ５’−ＧＧＴＴＴＣＣＧＴＡＣＡＧＣＣＴＴＧＡ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）
ＳＰ＿Ｒ  ５’−ＴＴＧＡＣＣＡＣＴＴＣＧＣＴＡＴＴＴＣＣ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）
ＳＰ＿ＤＬＰ  ５’−［６−ＦＡＭ］ＴＣＣＴＴＣＡＡＡＣＴＧＴＧＧＡＴＴ［Ｔ（ＢＨＱ−１）］ＧＧＧＴＧＴ［Ｐｈｏｓ］−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）
【０１８３】
Ａ．  Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ遺伝子の増幅
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅゲノムＤＮＡ  １０ｎｇ、１０×ＤｉａＳｔａｒＴＭＴａｑ緩衝液２μＬ、ＤｉａＳｔａｒＴＭＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）２ｕｎｉｔ、４種のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）それぞれ２００μＬ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、正方向プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）５ｐｍｏｌｅ及び逆方向プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）５ｐｍｏｌｅを含有した２０μＬの最終容量で増幅を行った；前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイム熱循環器（ＡＢＩ９７００、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）に設置し；前記反応混合物を９５℃で１５分間変性させた後（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）、９４℃で３０秒間、５５℃で６０秒間及び７２℃で６０秒間の過程を４０回繰り返した。増幅された産物をＰＣＲ精製キット（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）で精製した。精製工程の最終的な溶出量は、５０μＬである。
【０１８４】
Ｂ．  反復的エキソ核酸切断反応
精製されたＰＣＲ産物５μＬ、１０×ＤｉａＳｔａｒＴＭＴａｑ緩衝液２μＬ、ＤｉａＳｔａｒＴＭＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）２ｕｎｉｔ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び二重−標識プローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）５ｐｍｏｌｅを含有した２０μＬの最終容量で反復的エキソ核酸切断反応を行った；前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイム熱循環器（ＣＦＸ９６，  Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に設置し；前記反応混合物を９５℃で２分間変性させた後（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）、９５℃で２０秒間及び５５℃で６０秒間の過程を４０回繰り返した。各サイクルのハイブリダイゼーション工程（５５℃）で発生されたシグナルを検出した。
【０１８５】
図１１に示されたように、鋳型が存在する場合（Ｎｏ．１）、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ遺伝子の検出のためのターゲットシグナル増幅が観察されたが、鋳型がない場合（Ｎｏ．２）は観察されなかった。
【０１８６】
実施例４：Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ遺伝子の検出のために、反復的エキソ核酸切断反応を利用したリアルタイムＰＣＲ
本発明者らは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ遺伝子を検出するために、リアルタイムＰＣＲで５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを利用した反復的エキソ核酸切断反応を適用した。
【０１８７】
この適用のために、一対の増幅プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：７及び８）及び鋳型としてＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのゲノムＤＮＡを利用して増幅された産物を獲得した。
【０１８８】
この評価のために、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのゲノムＤＮＡ、プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：７及び８）及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを利用した。
【０１８９】
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅゲノムＤＮＡ  １０ｎｇ、１０×ＤｉａＳｔａｒＴＭＴａｑ緩衝液２μＬ、ＤｉａＳｔａｒＴＭＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）２ｕｎｉｔ、４種のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）それぞれ２００μＬ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、正方向プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）５ｐｍｏｌｅ、逆方向プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）５ｐｍｏｌｅ及び二重−標識プローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）５ｐｍｏｌｅを含有した２０μＬの最終容量でリアルタイムＰＣＲを行った；前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイム熱循環器（ＣＦＸ９６，  Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に設置し；前記反応混合物を９５℃で２分間変性させた後（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）、９５℃で２０秒間及び５５℃で６０秒間の過程を４０回繰り返した。各サイクルのハイブリダイゼーション工程（５５℃）で発生されたシグナルを検出した。
【０１９０】
図１２に示されたように、反復的エキソ核酸切断反応を含んだリアルタイムＰＣＲを行った時、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ鋳型が存在する場合（Ｎｏ．１）、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのターゲットシグナルは観察されたが、鋳型がない場合（Ｎｏ．２）は観察されなかった。
【０１９１】
実施例５：チップにおいてターゲット核酸配列を検出するための反復的エキソ核酸切断反応の評価
本発明者らは、反復的エキソ核酸切断反応が、固相でターゲット核酸配列を検出するに十分なシグナルを発生させることができるかどうかについて実験した。この適用のために、二重−標識プローブを固相基質の表面上に固定化した。
【０１９２】
Ａ．５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを利用したチップにおける反復的エキソ核酸切断反応
二重−標識プローブは、その３’−末端にアミノ基を有しており、前記アミノ基を通じて固相基質の表面上に固定化した。
【０１９３】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子のターゲット核酸配列及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを利用する場合、本実施例で利用された合成鋳型及び二重−標識プローブの配列は、下記の通りである：
ＳＡ＿Ｔ７０  ５’−ＧＧＴＧＴＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＡＡＣＡＡＣＧＣＣＧＴＡＡＡＣＣＧＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＣＡＣＧＧＡＡＴＧＡＡＴＡＡＴＧＴＴＧＡＡＴＴＴＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）
ＳＡ＿ＤＬＰ＿Ｓ  ５’−［ＢＨＱ−１］ＣＡＴＴＣＣＧＴＧＧＴＣＡＡＴＣＡＴ［Ｔ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）］ＣＧＧＴＴＴＴＴＴＴ［ＡｍｉｎｏＣ７］−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）
【０１９４】
二重−標識プローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）をＧｅｎｏｒａｍａスポッティングソルションタイプＩに５０μＭの最終濃度に溶解した。溶解された二重−標識プローブを７０％相対湿度の常温でガラススライド（Ｇｅｎｏｒａｍａ、Ｅｓｔｏｎｉａ）上にスポッティングした。スライドを３７℃恒温器で２時間インキュベーションした。その後、スライドを１％アンモニウム溶液に１０分間浸して、常温で蒸留水で洗浄した。
【０１９５】
鋳型（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）０．２ｐｍｏｌｅ、１０×ＤｉａＳｔａｒＴＭＴａｑ緩衝液２μＬ、ＤｉａＳｔａｒＴＭＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）２ｕｎｉｔ及び５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有した２０μｌの最終容量で反復的エキソ核酸切断反応を行った；反応混合物をスライドに移した。前記スライドをｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ機械（ＧｅｎｅＡｍｐ  ｉｎ  ｓｉｔｕ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）に設置し；前記スライドは、９５℃で２分間変性させた後（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）、９５℃で２０秒間及び５５℃で６０秒間過程を４０回繰り返した。反復的エキソ核酸切断反応後、スライドを洗浄してマイクロアレイスキャナー（ＳｃａｎＡｒｒａｙ４０００、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を利用して検出した後、イメージを分析した。
【０１９６】
Ｂ．３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを利用したチップにおける反復的エキソ核酸切断反応
ミスマッチ−保有二重−標識プローブは、その５’−末端にアミノ基を有しており、前記アミノ基を通じて固相基質の表面上に固定化した。ミスマッチ−保有二重−標識プローブは、ミスマッチヌクレオチドとしてデオキシイノシンを有する。
【０１９７】
Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子のターゲット核酸配列及び３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを利用する場合、本実施例で利用された合成鋳型及びミスマッチ−保有二重−標識プローブの配列は、下記の通りである：
ＮＧ＿Ｔ７０  ５’−ＧＡＡＡＣＣＡＧＴＴＣＣＧＧＣＴＧＴＴＧＴＣＧＧＣＡＡＧＣＣＧＧＧＧＴＣＧＧＡＴＧＴＧＴＡＴＴＡＴＧＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＴＴＡＣＡＡＡＡＡＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）
ＮＧ＿ＤＬＰ＿Ｓ  ５’−［ＡｍｉｎｏＣ６］ＴＴＴＴ［Ｔ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）］ＧＡＣＣＣＣＧＧＣＴＴＧＣＣＧＡＣＡＡＣＩ［ＢＨＱ−１］−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）
【０１９８】
ミスマッチ二重−標識プローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）をＧｅｎｏｒａｍａスポッティングソルションタイプＩに５０μＭの最終濃度に溶解した。溶解されたミスマッチ−保有二重−標識プローブを７０％相対湿度の常温でガラススライド（Ｇｅｎｏｒａｍａ、Ｅｓｔｏｎｉａ）上にスポッティングした。スライドを３７℃恒温器で２時間インキュベーションした。その後、スライドを１％アンモニウム溶液に１０分間浸して、常温で蒸留水で洗浄した。
【０１９９】
鋳型（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）０．２ｐｍｏｌｅ、１０×ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭＩＩ反応緩衝液２μＬ［２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有］、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭＩＩフュージョンＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＵＳＡ）  １ｕｎｉｔ及び２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ２．４μＬを含有した２０μＬの最終容量で反復的エキソ核酸切断反応を行った；反応混合物をスライドに移した。前記スライドをｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ機械（ＧｅｎｅＡｍｐ  ｉｎ  ｓｉｔｕ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）に設置し；前記スライドは、９５℃で２分間変性させた後（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）、９５℃で２０秒間及び５５℃で６０秒間過程を４０回繰り返した。反復的エキソ核酸切断反応後、スライドを洗浄してマイクロアレイスキャナー（ＳｃａｎＡｒｒａｙ４０００、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を利用して検出した後、イメージを分析した。
【０２００】
以上、本発明の望ましい具現例を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。
【図１ａ】
2013505718.tif 000003
【図１ｂ】
2013505718.tif 000004
【図２ａ】
2013505718.tif 000005
【図２ｂ】
2013505718.tif 000006
【図３ａ】
2013505718.tif 000007
【図３ｂ】
2013505718.tif 000008
【図４ａ】
2013505718.tif 000009
【図４ｂ】
2013505718.tif 000010
【図５】
2013505718.tif 000011
【図６】
2013505718.tif 000012
【図７】
2013505718.tif 000013
【図８】
2013505718.tif 000014
【図９】
2013505718.tif 000015
【図１０】
2013505718.tif 000016
【図１１】
2013505718.tif 000017
【図１２】
2013505718.tif 000018
【配列表】
2013505718000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年5月22日(2012.5.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ターゲット核酸配列をプローブにハイブリッド形成させる工程であって、前記プローブは、前記ターゲット核酸配列の第１位置（Ｆｉｒｓｔ  ｓｉｔｅ）に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列、蛍光レポーター分子及び前記レポーター分子の蛍光をクエンチングできるクエンチャー分子を含む工程と、
（ｂ）プローブの切断のために前記プローブを、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素と接触させる工程であって、前記蛍光レポーター分子又は前記クエンチャー分子は前記プローブから解離され、前記レポーター分子の蛍光が脱消光（ｕｎｑｕｅｎｃｈｅｄ）されて、前記ターゲット核酸配列の存在を示す蛍光シグナルが発生する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の前記プローブ−ターゲット核酸配列の二本鎖（ｄｕｐｌｅｘ）を変性させる工程と、
（ｄ）前記工程（ａ）−（ｃ）を少なくとも２回繰り返して、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを増幅させる工程と、
（ｅ）前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルを検出する工程であって、前記検出は、前記工程（ｄ）の反復のサイクル毎に行われるか、工程（ｄ）の反復の終了時点で行われるか、あるいは前記反復の間、所定の時間間隔のそれぞれにおいて行われて、前記シグナルは、ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、
を含むことを特徴とする、反復的エキソ核酸切断反応を利用してＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法。
【請求項２】
前記エキソヌクレアーゼ活性を有する前記酵素は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性酵素である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法は、固相で行われ、前記プローブは、その３’−末端を通じて固相基質の表面上に固定化され、前記プローブは、前記酵素の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断される切断部位及び切断されない非切断部位を有し、前記非切断部位は、前記固相基質の表面に残存し、前記プローブ上の前記蛍光レポーター分子は、前記非切断部位に位置し、前記レポーター分子の前記蛍光をクエンチングできる前記クエンチャー分子は、前記切断部位に位置し、前記プローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合、前記プローブの前記切断部位は、前記酵素の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により前記プローブから解離されて、前記プローブの前記非切断部位上にある前記レポーター分子の前記蛍光が脱消光され、これにより、前記固相基質上で蛍光シグナルを検出して前記ターゲット核酸配列の存在を決定する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記プローブは、その５’−末端にマッチヌクレオチドを含む請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼである請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（ａ）は、追加的な逆方向プライマーを用いた、前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼによる前記追加的な逆方向プライマーの伸長反応により行われ、工程（ｂ）で前記プローブとハイブリッド形成されるターゲット核酸配列を生成させる請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記工程（ａ）は、前記ターゲット核酸配列上の第２位置に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する上流プライマーをさらに含み、前記上流プライマーの３’−末端は、前記プローブの５’−末端の上流に存在する請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記工程（ａ）は、前記ターゲット核酸配列に前記プローブ及び前記上流プライマーをハイブリッド形成させて行われて、これにより、前記ターゲット核酸配列及び前記プローブによる第１二本鎖が形成され、かつ前記ターゲット核酸配列、前記プローブ及び前記上流プライマーによる第２二本鎖が形成される請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記工程（ｂ）は、工程（ａ）の結果物を５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼに接触させることにより行われ、前記プローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合、前記プローブは、（ｉ）前記上流プライマー又は上流プライマーの伸長産物との相互作用とは独立である前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断され、前記蛍光レポーター分子又は前記クエンチャー分子は、前記プローブから解離されて前記レポーター分子の蛍光が脱消光され、第１蛍光シグナルが発生し、そして（ｉｉ）前記上流プライマー又は上流プライマーの伸長産物との相互作用に依存的である前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断され、前記蛍光レポーター分子又は前記クエンチャー分子は、前記プローブから解離されて前記レポーター分子の蛍光が脱消光され、第２蛍光シグナルが発生し、これにより、同時的方式で前記蛍光シグナルが二重に発生される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記工程（ｄ）は、前記工程（ａ）−（ｃ）を少なくとも２回繰り返して前記第１蛍光シグナル及び前記第２蛍光シグナルが増幅されるように行われ、これにより、同時的に二重−シグナル増幅がなされる請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記上流プライマー又は前記上流プライマーの伸長産物との相互作用とは独立である前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、前記第１二本鎖に作用して前記プローブを切断し、これにより、前記第１蛍光シグナルが発生する請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記上流プライマー又は前記上流プライマーの伸長産物との相互作用とは独立である前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、前記第２二本鎖に作用し、前記上流プライマーとの相互作用無しに前記プローブを切断して、これにより、前記第１蛍光シグナルが発生する請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記上流プライマー又は前記上流プライマーの伸長産物との相互作用に依存的である前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、（ｉ）前記第２二本鎖の前記上流プライマー又は（ｉｉ）前記第２二本鎖の前記伸長産物と相互作して前記プローブを切断し、これにより、前記第２蛍光シグナルが発生する請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記上流プライマー又は前記上流プライマーの伸長産物との相互作用とは独立である前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による切断反応は、（ｉ）前記ターゲット核酸配列及び前記プローブによる前記第１二本鎖で発生し、（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列、前記プローブ及び前記上流プライマーによる前記第２二本鎖で発生し、前記上流プライマーは伸長されず、前記上流プライマーの３’−末端は、前記プローブの５’−末端から離隔されており、これは、前記プローブが前記上流プライマーとの相互作用に依存的である前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって切断されない程度に離隔されたもので、又は（ｉｉｉ）前記ターゲット核酸配列、前記プローブ及び前記上流プライマーによる前記第２二本鎖で発生し、前記上流プライマーは、前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼにより伸長されて、前記伸長された上流プライマーの３’−末端は、前記プローブの５’−末端から離隔されて、これは、前記プローブが前記上流プライマーの伸長産物との相互作用に依存的である前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって切断されない程度に離隔されたものである請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記エキソヌクレアーゼ活性を有する前記酵素は、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性酵素である請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法は、固相で行われ、前記プローブは、その５’−末端を通じて固相基質の表面上に固定化され、前記プローブは、前記酵素の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性により切断される切断部位及び切断されない非切断部位を有し、前記非切断部位は、前記固相基質の表面に残存し、前記切断部位は、前記ミスマッチヌクレオチドを含み、前記プローブ上の前記蛍光レポーター分子は、前記非切断部位に位置し、前記レポーター分子の前記蛍光をクエンチングできる前記クエンチャー分子は、前記切断部位に位置し、前記プローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合、前記プローブの前記切断部位は、酵素の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性により前記プローブから解離されて、前記プローブの前記非切断部位上にある前記レポーター分子の前記蛍光が脱消光され、これにより、前記固相基質上で蛍光シグナルを検出して前記ターゲット核酸配列の存在を決定する請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記プローブは、その３’−末端部位上に少なくとも１個の人為的ミスマッチヌクレオチドを含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み、かつ前記プローブは、少なくとも２種のプローブを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）前記ターゲット核酸上の第１位置に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列、蛍光レポーター分子及び前記レポーター分子の蛍光をクエンチングできるクエンチャー分子を含むプローブと、
（ｂ）前記プローブの切断のためのエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素と、
を含む、反復的エキソ核酸切断反応を利用したＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するキット。
【請求項２０】
前記エキソヌクレアーゼ活性を有する前記酵素は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性酵素である請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記プローブは、その５’−末端にマッチヌクレオチド配列を含む請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記エキソヌクレアーゼ活性を有する前記酵素は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼである請求項２０に記載のキット。
【請求項２３】
前記キットは、追加的な逆方向プライマーを含み、前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼによる前記追加的な逆方向プライマーの伸長反応により前記プローブとハイブリッド形成されるターゲット核酸配列を生成させる請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記キットは、前記ターゲット核酸配列上の第２位置に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する上流プライマーをさらに含み、前記上流プライマーの３’−末端は、前記プローブの５’−末端の上流に存在する請求項２２に記載のキット。
【請求項２５】
前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸ポリメラーゼは、（ｉ）ポリメラーゼ活性、（ｉｉ）前記上流プライマー又は前記上流プライマーの伸長産物との相互作用とは独立である５’→３’エキソヌクレアーゼ活性、及び（ｉｉｉ）前記上流プライマー又は前記上流プライマーの伸長産物との相互作用に依存的である５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を含む請求項２２に記載のキット。
【請求項２６】
前記プローブは、前記ターゲット核酸配列とハイブリッド形成され、前記プローブは、（ｉ）前記上流プライマー又は上流プライマーの伸長産物との相互作用とは独立である前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断され、前記蛍光レポーター分子又は前記クエンチャー分子は、前記プローブから解離されて前記レポーター分子の蛍光が脱消光され、第１蛍光シグナルが発生し、そして（ｉｉ）前記上流プライマー又は上流プライマーの伸長産物との相互作用に依存的である前記鋳型−依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断され、前記蛍光レポーター分子又は前記クエンチャー分子は、前記プローブから解離されて前記レポーター分子の蛍光が脱消光され、第２蛍光シグナルが発生し、これにより、同時的方式で前記蛍光シグナルが二重に発生される請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記エキソヌクレアーゼ活性を有する前記酵素は、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性酵素である請求項１９に記載のキット。
【請求項２８】
前記プローブは、その３’−末端部位上に少なくとも１個の人為的ミスマッチヌクレオチドを含む請求項２７に記載のキット。
【国際調査報告】
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