(57)【要約】  好ましくは三遺伝子分類子の発現レベルを用いて前立腺癌の再発可能性を判定するための方法、デバイス及びキットが開示される。これらの方法、デバイス及びキットは、現在使用されている多くのノモグラムとは独立して使用することができ、あるいは、このようなノモグラムの性能を全体的に改善するために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺癌が再発するリスクが高いと分類される被検者と前立腺癌が再発するリスクが低いと分類される被検者とを識別するための分類子であって、該分類子が、
少なくとも２つの診断マーカーの各発現レベルであって、各発現レベルが２つ又は３つ以上の対照マーカーの平均値と比較して測定される、発現レベルと、
被検者を、前記前立腺癌が再発するリスクが高いと分類される被検者と前記前立腺癌が再発するリスクが低いと分類される被検者のいずれかに分類するための、前記少なくとも２つの診断マーカーの発現レベルと組み合わされる、Ｋａｔｔａｎノモグラムに基づく予測確率と、を含む、分類子。
【請求項２】
前記Ｋａｔｔａｎノモグラムが、手術前（及び、受ける場合にはホルモン療法前）のＰＳＡ値、前立腺摘出の時点でのＰＳＡ、手術時の第１  Ｇｌｅａｓｏｎ、手術時の第２  Ｇｌｅａｓｏｎ、前立腺摘出Ｇｌｅａｓｏｎ合計、前立腺摘出の年、病気をしていない月数、サージカルマージンが陽性であったかどうか、精嚢内に癌が見られたかどうか、嚢外拡張が存在したかどうか、リンパ節内に癌が見られたかどうか（もしあれば、除去されたかどうか）、放射線療法前のＰＳＡ、放射線投与量（適用可能である場合）、サージカルマージンが陽性であるか又は陰性であったか（適用可能である場合）、精嚢転移が存在したかどうか（適用可能である場合）、リンパ節転移が存在したかどうか（適用可能である場合）、嚢外転移が存在したかどうか（適用可能である場合）、ネオアジュバントホルモンを処方したかどうか、ネオアジュバント放射線を処方したかどうかからなる群の２つ又は３つ以上の構成要素に基づく複合的判定である、請求項１に記載の分類子。
【請求項３】
前記Ｋａｔｔａｎノモグラムが、処置前のＰＳＡレベル、組み合わせたＧｌｅａｓｏｎグレード、試料のＧｌｅａｓｏｎ合計、臨床病期、サージカルマージン状態、コアにおける前立腺被膜浸潤の最大の癌の長さ、生検コアにおける癌の合計長さ、陽性レベルのコアの割合、前立腺外進展、前立腺外進展のレベル、アポトーシス指数、１つ又は２つ以上のコアにおける癌の割合、１つ又は２つ以上のコアにおける悪性度の高い癌の割合、腫瘍の合計体積、癌の位置する領域、精嚢浸潤の存在、精嚢浸潤のタイプ、ｐ５３、Ｋｉ−６７、ｐ２７、ＤＮＡ倍数性状態、リンパ節の状態及びリンパ管浸潤からなる群の２つ又は３つ以上の構成要素に基づく複合的な判定である、請求項１に記載の分類子。
【請求項４】
診断マーカーＭＹＨ１１、ＳＳＢＰ１及びＤＰＴを含む、請求項１に記載の分類子。
【請求項５】
ＭＹＨ１１、ＳＳＢＰ１及びＤＰＴに加えて、表２から選択されるＨｉｓｔｏｎｅ  １  Ｈ３ｄ以外の診断マーカーを含む、請求項２に記載の分類子。
【請求項６】
前記対照マーカーがＴＵＢＡ、ＡＬＡＳ１及びＡＣＴＧ１である、請求項１に記載の分類子。
【請求項７】
前立腺癌の再発の予測方法であって、
標準と比較してＤＰＴの発現レベルを判定することと、
表２に記載のもののうち少なくとも１つの追加のマーカーの発現レベルを判定することと、
前記ＤＰＴの発現レベル及び前記表２に記載のもののうちＨｉｓｔｏｎｅ  １  Ｈ３ｄ以外の少なくとも１つの追加のマーカーの発現レベルを、前立腺癌の再発率に対応するスコアに変換することと、を含む、方法。
【請求項８】
前記変換工程の代わりとして、前記ＤＰＴの発現レベル及び前記表２に記載のもののうちＨｉｓｔｏｎｅ  １  Ｈ３ｄ以外の少なくとも１つの追加のマーカーの発現レベルを、前立腺癌の再発の少なくとも１つの追加の指標と組み合わせて、複合スコアを判定する工程を更に含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
少なくともＤＰＴの発現レベルを検出するためのキットであって、前記キットが、試薬と、ＤＰＴを特異的に認識する第一プローブと表２から選択されるＨｉｓｔｏｎｅ  １  Ｈ３ｄ以外の第二マーカーを特異的に認識する第二プローブとを含む第一プローブセットと、を含む、キット。
【請求項１０】
前記ＤＰＴの発現レベル及び前記表２からのＨｉｓｔｏｎｅ  １  Ｈ３ｄ以外の少なくとも１つの追加のマーカーの発現レベルを前立腺癌の再発可能性の指標に変換するためのデバイスを更に含む、請求項９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
前立腺癌に対する根治的前立腺摘除又は他の積極的処置を行うのに先立って、その手法で治癒可能かどうかをできるだけ精確に知ることは有用である。典型的には、医師は、具体的な予測を行うことを断るか、又は全体平均を提供するか、又は主観的な評価を提供するか、又はモデルに基づいて定義された（高若しくは低リスク群などの）リスク群に患者を分類するかによって、予後情報に対する患者の要求に応えることになり得る。ほとんどの場合、最も精確な評価を提供することこそが最適な応答である。癌の病期が手術又は処置後の再発率と相関することから、実現し得る最良の評価を提供するためには、前立腺癌患者において最終的な病理病期又は結果を予測するための多くの努力が払われてきた。この目的のために、多くのノモグラム、アルゴリズム及びマーカーが採用されており、Ｋａｔｔａｎノモグラムが最も成功している。好ましくは、コンコーダンス・インデックス（concordance index）を使用して、考慮されているモデル／ノモグラム／アルゴリズム及びこれらの類するものから具体的な治療戦略を選択する。Ｋａｔｔａｎノモグラムは、米国特許第５９９３３８８号及び同第６４０９６６４号に記載されており、これらはどちらも参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
根治的前立腺摘除は、限局性前立腺癌の処置を目的とした積極的治療法である。残念ながら、根治的前立腺摘除で処置された多くの人は、処置後に、これらの病気の進行を経験することになる。血清ＰＳＡ値の上昇は癌の再発を意味するものであり、癌は、ＰＳＡ値の上昇開始に伴い、手術の数カ月後又は数年後に多くの人において再発する。ＰＳＡが検出可能なレベルになる前に、最終的に再発を経験しそうな人を早期に同定することは、生活の質を保持しながら追加の処置を検討するのに有用である。更に、再発の可能性の精確な推定もまた、対照群のための候補又は対象とする治験処置のための候補を同定するための臨床試験において有用である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
新しく診断される限局性前立腺癌の分類において精確さを増加させることは、この下位群の患者のために処置をより良好にあつらえる場合に必要とされる。他の癌での場合のように、多数の分子マーカー並びに表現型及び予後の遺伝子サインが前立腺癌について近年開発されている。これらは、明瞭な侵襲的前立腺癌の部類、及び多数の潜在的な遺伝子マーカー候補の存在につながるいくつかの重要な洞察を提供した。少数の遺伝子マーカーに関して発現値が組み込まれる臨床的に実施可能な試験は有用であり、ＰＳＡ再発のリスクを評価するために、単独で又はＫａｔｔａｎ手術後ノモグラムなどの他のツールと併用してのいずれかで設置することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一態様では、遺伝子発現に基づくアッセイを使用して、前立腺癌の再発の予後を提供する。この遺伝子発現に基づくアッセイは、好ましくは少数の遺伝子に基づく。３つの遺伝子を用いるプロファイルが好ましい。好ましい実施形態では、３つの遺伝子ＭＹＨ１１、ＳＳＢＰ１及びＤＰＴの発現レベルは、前立腺癌再発の可能性についての予後情報を提供する。別の実施形態では、Ｆｉｌａｍｉｎ  Ｃ、γ、ＲＡＳ  ｌｉｋｅ  ｆａｍｉｌｙ  １２及びＦｉｌａｍｉｎ  Ａなどの遺伝子の発現レベルを使用してもよい。他の可能なマーカーの組み合わせとしては、（ｉ）Ｇｒｏｗｔｈ  Ａｒｒｅｓｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  １、Ｓｍｏｏｔｈｅｌｉｎ、Ｌｅｉｏｍｏｄｉｎ  １及びＨｉｓｔｏｎｅ  １  Ｈ３ｄ、並びに、（ｉｉ）Ｓｏｒｂｉｎ  ａｎｄ  ＳＨ３  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  １、ＰＤＺ  ａｎｄ  ＬＩＭ  ｄｏｍａｉｎ  ７、ＬＩＭ  ａｎｄ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ａｎｔｉｇｅｎ  ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ２が挙げられる。発現レベルに基づくマーカーの追加の有用な組み合わせは、表２から容易に選択され得る。
【０００５】
別の態様では、遺伝子発現レベルに基づくアッセイは、前立腺癌予後に関する複数の臨床的な指標に基づくノモグラムなどの臨床ツールと併用される。
【０００６】
好ましい実施形態では、３つの遺伝子及び３つの対照遺伝子の発現に関する測定値を求める。好ましくは、この遺伝子発現測定値は、３つの対照遺伝子の平均と比較して測定される。これらの遺伝子発現測定値は、Ｋａｔｔａｎノモグラムから予測される確率と共に、統計モデルに組み込まれて、再発率又は再発のリスクを反映するスコアを生じる。この情報はまた、根治的前立腺摘除後のＰＳＡレベルの上昇を判定するのに使用することもできる。この再発率は、患者が治療選択肢の中から個人的に治療選択を行う助けとなり得る。
【０００７】
前立腺癌が再発するリスクの高いカテゴリーに含まれる被検者と前立腺癌が再発するリスクの低いカテゴリーに含まれる被検者とを識別するための分類子が、より具体的に開示される。好ましい分類子は、表２に記載のもののうち少なくとも２つの診断マーカーの発現レベルを測定することを含む分類手順を含み、測定された各発現レベルは２つ又は３つ以上の対照マーカーの発現レベルの平均と比較される。これらの少なくとも２つの診断マーカーの発現レベルは、次に、Ｋａｔｔａｎノモグラムに基づく予測的確率と組み合わされて、分類子を生じ、これもまたノモグラムの形態であり得る。本明細書では、Ｋａｔｔａｎノモグラムは、複合的判定であり、例えば、米国特許第６，４０９，６６４号及び同第５，９９３，３８８号に記載されている。
【０００８】
Ｋａｔｔａｎノモグラムは、典型的には、手術前（及び、受ける場合にはホルモン療法前）のＰＳＡ値、前立腺摘出の時点でのＰＳＡ、手術時の第１  Ｇｌｅａｓｏｎ、手術時の第２  Ｇｌｅａｓｏｎ、前立腺摘出Ｇｌｅａｓｏｎ合計、前立腺摘出の年、病気をしていない月数、サージカルマージンが陽性であったかどうか、精嚢内に癌が見られたかどうか、嚢外拡張が存在したかどうか、リンパ節内に癌が見られたかどうか（もしあれば、除去されたかどうか）、放射線療法前のＰＳＡ、放射線投与量（適用可能である場合）、サージカルマージンが陽性であるか又は陰性であったか（適用可能である場合）、精嚢転移が存在したかどうか（適用可能である場合）、リンパ節転移が存在したかどうか（適用可能である場合）、嚢外転移が存在したかどうか（適用可能である場合）、ネオアジュバントホルモンを処方したかどうか、ネオアジュバント放射線を処方したかどうかからなる群の２つ又は３つ以上の構成要素に基づく。
【０００９】
Ｋａｔｔａｎノモグラムもまた、処置前のＰＳＡレベル、組み合わせたＧｌｅａｓｏｎグレード、試料のＧｌｅａｓｏｎ合計、臨床病期、サージカルマージン状態、癌のコアにおける前立腺被膜浸潤の最大の癌の長さ、生検コアにおける癌の合計長さ、陽性レベルのコアの割合、前立腺外進展、前立腺外進展のレベル、アポトーシス指数、１つ又は２つ以上のコアにおける癌の割合、１つ又は２つ以上のコアにおける悪性度の高い癌の割合、腫瘍の合計体積、癌の位置する領域、精嚢浸潤の存在、精嚢浸潤のタイプ、ｐ５３、Ｋｉ−６７、ｐ２７、ＤＮＡ倍数性状態、リンパ節の状態及びリンパ管浸潤からなる群の２つ又は３つ以上の構成要素に基づく複合的な判定であり得る。
【００１０】
前立腺癌が再発するリスクの高いカテゴリーに含まれる被検者と前立腺癌が再発するリスクの低いカテゴリーに含まれる被検者とを識別するための好ましい分類子は、診断マーカーＭＹＨ１１、ＳＳＢＰ１及びＤＰＴの発現レベルを測定することを必要とする。
【００１１】
好ましい対照マーカーは、ＴＵＢＡ、ＡＬＡＳ１及びＡＣＴＧ１である。別の好ましい対照マーカーは、ＲＴ−ＰＣＲにより検出されるような比較的安定した発現レベルを目的として選択される。
【００１２】
前立腺癌が再発するリスクの高いカテゴリーに含まれる被検者と前立腺癌が再発するリスクの低いカテゴリーに含まれる被検者とを識別するための別の好ましい分類子は、ＭＹＨ１１、ＳＳＢＰ１及びＤＰＴに加えて、表２に記載のもののうち少なくとも１つの診断マーカーの発現レベルを測定することを必要とする。
【００１３】
別の好ましい実施形態では、２つ又は３つ以上の診断マーカーが、表２に提示されているマーカーの組から選択される。診断マーカーのより具体的な組が挙げられる。
【００１４】
前立腺癌の再発の予測方法も開示される。この方法は、（ｉ）標準と比較してＤＰＴの発現レベルを判定する工程と、（ｉｉ）表２に記載のもののうち少なくとも１つの追加のマーカーの発現レベルを判定する工程と、（ｉｉｉ）ＤＰＴの発現レベル及び表２に記載のもののうち少なくとも１つの追加のマーカーの発現レベルを前立腺癌の再発率に対応するスコアに変換する工程と、を含む。この方法は、ＤＰＴの発現レベル及び表２に記載のもののうち少なくとも１つの追加のマーカーの発現レベルを変換する工程の代わりに、ＤＰＴの発現レベル及び表２に記載のもののうち少なくとも１つの追加のマーカーの発現レベルを前立腺癌の少なくとも１つの追加の指標と組み合わせて複合スコアを判定する工程を有してもよい。このような複合スコアは、前立腺癌の再発可能性を反映する。
【００１５】
好ましくは、ＤＰＴの発現レベル及び表２に記載のもののうち少なくとも１つの追加のマーカーの発現レベルは、前立腺摘出（prostectomy）、ホルモン療法、単一種薬剤化学療法、二種薬剤化学療法、及び、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤による処置からなる群から選択される少なくとも１つの処置に先立って、判定される。
【００１６】
本開示はまた、少なくともＤＰＴの発現レベルを検出するためのキットも限定することなく範囲内に収め、このキットは、試薬と、ＤＰＴを特異的に認識する第一プローブと表２から選択される第二マーカーを特異的に認識する第二プローブとを含む第一プローブセットと、を含む。このキットは、ＤＰＴの発現レベル及び表２からの少なくとも１つの追加のマーカーの発現レベルを前立腺癌の再発可能性の指標に変換するためのデバイスを含んでもよい。このデバイスは、ノモグラムの形態であってもよい。より具体的には、好ましいキットは、機械的デバイス、グラフ表示、及び、前立腺癌の再発可能性の指標の表示を提供すべくユーザーインターフェースを実行するためのソフトウェア命令、からなる群の１つ又は２つ以上の構成要素として組み込まれる。本発明の更なる態様では、前立腺腫瘍からの３つの遺伝子と３つの対照遺伝子の測定を行うための試薬を含有するキットが、提供される。遺伝子測定値を３つの対照遺伝子の平均に対して正規化するのを可能にするための（場合によりコンピューターコードとしての）指示が、提供される。これらの測定は、ノモグラムから得られる予測的確率と共に、再発率を生じる統計モデルに組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】１５７人の患者についての独立した一連のテストから得られた結果に基づくｃ−インデックスを用いた、本明細書に開示されている分類子とノモグラムの比較。分類子についてのｃ−インデックスは、ノモグラムについてのｃ−インデックスよりも明らかに高かった（０．７７対０．６７）。
【図１Ｂ】テスト事例での５年間の予測推定値と実際の再発率との間の対応関係。分類子は、理想の予測子と比較するとテスト事例についての予測スペクトル全体にわたって良好な較正を示しており、一方、５年間のノモグラムはより悪性の場合に検出の精確性が劣ることを示した。
【図２Ａ】予測された低リスク群と高リスク群についてのＰＳＡ再発に対する時間的な差異を表すために、ＰＳＡ無再発率についてのカプラン・マイヤー分析（ＨＲ  ６．８５、９５％  ＣＩ＝３．７７〜１２．４３、Ｐ＜０．００１，）。５年目に、２群間のＰＳＡ再発の絶対差は、５８％であった（７５％対１７％）。
【図２Ｂ】図２Ａで使用され、Ｇｌｅａｓｏｎスコアが６又は７である患者に適用される分類子。
【図２Ｃ】図２Ａで使用され、病理学的病期ｐＴ２又はｐＴ３ａを呈する患者に適用される分類子。
【図２Ｄ】図２Ａで使用され、手術前ＰＳＡ濃度≦１０ｎｇ／ｍＬ又は１０＜ＰＳＡ≦２０ｎｇ／ｍＬである分類子。
【図２Ｅ】図２Ａで使用され、陽性又は陰性のサージカルマージンを有する患者に適用される分類子を示す。
【図３】これらをテスト事例に適用したときの各モデルの最高精確性に基づいたカットオフ値の適用を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
ノモグラムは、前立腺癌再発を予測するために広く使用されている。最も広く使用されているノモグラムは、米国特許第６，４０９，６６４号及び同第５，９９３，３８８号に記載のＫａｔｔａｎノモグラムであり、これらの各々はその全体が本明細書に組み込まれるものとする。自分の前立腺癌について外科処置を受けていない人に関しては、これらのノモグラムは、以下の情報を組み込んでいる：最近のＰＳＡ（前立腺特異抗原）値、第１及び第２  Ｇｌｅａｓｏｎグレード、臨床病期についての医師の評価（１９９２若しくは１９９７のＵＩＣＣシステムを用いて）、放射線治療に推奨される線量（適用可能である場合）、生検中に見られる陽性コアの数、生検中に見られる陰性コアの数、ネオアジュバントホルモンを処方したかどうか、及びネオアジュバント放射線を処方したかどうか。外科処置を受けた人に関しては、因子としては、手術前（及び、受ける場合にはホルモン療法前）のＰＳＡ値、前立腺摘出の時点でのＰＳＡ、手術時の第１  Ｇｌｅａｓｏｎ、手術時の第２  Ｇｌｅａｓｏｎ、前立腺摘出Ｇｌｅａｓｏｎ合計、前立腺摘出の年、病気をしていない月数、サージカルマージンが陽性であったかどうか、精嚢内に癌が見られたかどうか、嚢外拡張が存在したかどうか、リンパ節内に癌が見られたかどうか（もしあれば、除去されたかどうか）、放射線療法前のＰＳＡ、放射線投与量（適用可能である場合）、サージカルマージンが陽性であるか又は陰性であったか（適用可能である場合）、精嚢転移が存在したかどうか（適用可能である場合）、リンパ節転移が存在したかどうか（適用可能である場合）、嚢外転移が存在したかどうか（適用可能である場合）、ネオアジュバントホルモンを処方したかどうか、ネオアジュバント放射線を処方したかどうかが挙げられる。この情報はスプレッドシートにおいて組み合わされ、例えば、単純な統計処置により、予後を判定するために使用される解析がなされる。
【００１９】
本発明の方法及びキットは、最も好ましくは、これらのノモグラム及びこれらが提供する情報と共に使用される。本発明の方法及びキットはまた、一群の遺伝子の検出を伴う。好ましくは、この群の遺伝子のうちの１つの発現レベルは、対照マーカーのうちの少なくとも１つと比較して測定される。より好ましくは、３つの遺伝子及び３つの対照の発現レベルが測定される。最も好ましい遺伝子は、ＭＹＨ１１、ＳＳＢＰ１及びＤＰＴである。好ましい対照は、ＡＬＡＳ１、ＴＵＢＡ及びＡＣＴＧ１である。遺伝子ＭＹＨ１１又はＤＰＴが高発現であるほど、実施例において記載されるように、このような過剰発現が見られない場合と比べ前立腺癌再発が生じないままである可能性がより強いことを示す。ＳＳＢＰ１の発現レベルが高いほど、再発可能性がより強いことを示す。発現レベルが測定される遺伝子に対応する核酸配列、並びに、このような発現レベルを測定するために使用される配列は、本明細書ではマーカーと呼ばれる。対象の他の配列としては、ＡＬＡＳ１、ＴＵＢＡ及びＡＣＴＧ１などのアッセイ対照として有用である遺伝子が挙げられる。マーカーは、遺伝子発現を検出するのに使用される方法のいずれかで検出され、好ましくはこれらは、ＰＣＲ、その変形及び代替方法などの増幅に基づく方法である。最も好ましくは、ＲＴＰＣＲが使用される。
【００２０】
特定のマーカーに対して特異的な核酸プローブ及びレポーターは、好ましくは、腫瘍組織においてマーカー遺伝子の発現を検出するために使用される。前立腺組織、尿、尿道洗浄液、血液及び血清などの血液成分、射精精液、並びに、前立腺タンパク質が期待される他のサンプルなどの他の生物学的流体又は組織を使用することができる。検出可能な量の関連ポリヌクレオチドを含有する任意の試料を使用することができる。
【００２１】
１つの開示される方法は、マーカーを含有する標的細胞を、核酸に結合する試薬に接触させることを含む。標的細胞成分は、ＲＮＡなどの核酸である。試薬は、好ましくは、標的配列を増幅して検出するようなプローブ及びプライマーを含む。例えば、試薬は、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ試薬又はＳｃｏｒｐｉｏｎレポーターと呼ばれるもの、並びに、米国特許第６，３２６，１４５号及び同第６，２７０，９６７号（Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ  ｅｔ．ａｌ．）（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする）に記載のものなどの、これら自身のレポーター部分と組み合わせた又は結合させた複製開始配列（priming sequences）を含むことができる。これらは同じではないが、用語「プライマー」と「複製開始配列」は、本明細書では、核酸配列の増幅を開始させる分子又は分子の一部を指すために使用されるものとする。
【００２２】
好ましいプライマーは、プライマー伸長産物の合成を開始することができるものであり、これは、多型遺伝子座鎖に対して実質的に相補的である。プライマー及び／又はプローブは、自動化方法などの任意の好適な方法を用いて、調製され得る。合成を行うことができる環境条件としては、ヌクレオシド三リン酸、及び重合のための試薬、例えば、ＤＮＡポリメラーゼが存在すること、並びに好適な温度及びｐＨが挙げられる。プライマー又は複製開始配列の複製開始部分は、好ましくは、増幅の効率性を最大化させるために好ましくは一本鎖であるが、二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、プライマーは、伸長産物を調製するために使用される前に、その鎖を単離するように最初に処理される。プライマーは、重合誘導剤の存在下において伸長産物の合成を開始するにあたり十分に長くなくてはならない。
【００２３】
好ましいプライマーは、最も好ましくは８個以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドからなる。プライマーの正確な長さは、温度、バッファー及びヌクレオチド組成などの要因によって異なる。オリゴヌクレオチドプライマーは、最も好ましくは約１２〜２０個のヌクレオチドを含むが、これらは、ヌクレオチドをより多く又はより少なく含んでもよい。
【００２４】
核酸の相補的な鎖が分離される場合、核酸がもともと二本鎖であったか、又は一本鎖であったかにかかわらず、分離された鎖は、更なる核酸鎖の合成のためにテンプレートとして使用できる状態である。この合成は、プライマーとテンプレートとのハイブリダイゼーションを生じさせる条件下で行われる。一般に、合成は、緩衝水溶液中で、好ましくはｐＨ  ７〜９、最も好ましくは約８で生じる。モル過剰（ゲノム核酸では、通常約１０８：１（プライマー：テンプレート））の２つのオリゴヌクレオチドプライマーが、好ましくは、分離されたテンプレート鎖を含有するバッファーに加えられる。本発明のプロセスが診察用途に使用される場合、相補的な鎖の量は既知でないことがあり、そのため、相補的な鎖の量に対するプライマーの量は、常に確実に決定することはできない。しかしながら、実際問題として、増幅される配列が、複雑な長鎖の核酸鎖の混合物中に含まれる場合には、加えられるプライマーの量は相補的な鎖（テンプレート）の量に対し一般的にモル過剰となる。モル濃度が大過剰であることは、プロセスの効率性を改善するために好ましい。
【００２５】
重合剤は、プライマー伸長産物の合成を達成するように機能する任意の化合物又は系、好ましくは酵素であり得る。この目的のための好適な酵素は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、他の利用可能なＤＮＡポリメラーゼ、ポリメラーゼ変異体、逆転写酵素、及び熱安定性酵素（例えば、ＤＮＡを変性させるために十分高い温度に供した後に、プライマー伸長を生じる酵素）を含む他の酵素が挙げられる。好ましい剤は、Ｔａｑポリメラーゼである。好適な酵素は、各遺伝子座の核酸鎖に対して相補的であるプライマー伸長産物を形成するように、好適な方法でヌクレオチドの化合を促進する。一般的に合成は、各プライマーの３’末端で開始し、合成が終了するまでテンプレート鎖に沿って５’方向に進み、異なる長さの分子を生成する。しかしながら、上記の同じプロセスを使用して、５’末端で合成を開始し、３’末端に進む重合剤も存在し得る。
【００２６】
本発明の別の態様では、発現比が使用される。得られた増幅済みマーカーの量と増幅済み参照マーカー又は増幅済み参照マーカーの量との間の比を確立することにより、発現比を使用することができる。比の確立は、定量的リアルタイムＰＣＲを使用して行うことができる。比は、前立腺癌再発の可能性を判定するために、統計モデルに代入することができる。
【００２７】
本発明のキットは、様々な構成要素を備えるように構成することができ、好ましくはその結果、これらはすべて、少なくとも１つのプライマー、又はプローブ、又は検出分子（例えば、Ｓｃｏｒｐｉｏｎレポーター）を含有する。一実施形態では、キットは、マーカー部分を増幅及び検出する試薬を含む。任意により、キットは、サンプルから核酸を抽出するための、サンプル調製試薬及び／又は物品（例えば、チューブ）を含む。
【００２８】
好ましいキットでは、対応するＰＣＲプライマーセットなどのＲＴＰＣＲに必要な試薬、Ｔａｑポリメラーゼなどの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、及び加水分解プローブ又は分子ビーコンなどの好適な検出試薬、が含まれる。任意による好ましいキットでは、検出試薬は、スコーピオンレポーター又は試薬である。二本鎖ＤＮＡに特化した単一ダイプライマー又は蛍光染料、例えば、エチジウムブロマイドもまた使用され得る。キット内の追加の材料としては、好適な反応チューブ又はバイアル瓶、バリア組成物、典型的にはワックスビーズ（任意によりマグネシウムを含む）、必要なバッファー及びｄＮＴＰなどの試薬、対照核酸及び／又は任意の追加的なバッファー、化合物、補助因子、イオン構成成分、タンパク質及び酵素、ポリマー、並びにこれらに類するものが挙げられる。任意により、キットは、核酸抽出試薬及び材料を含む。
【００２９】
本発明の好ましいキットでは、プロテアーゼサンプルを用い患者のアッセイを行うための指示が提供される。Ｃｏｘ比例ハザード分析又は他の統計的比較子からの予測を提供するためのコンピューター指示をコード化された物品が提供されることが最も好ましい。これらの指示は、汎用コンピューターなどのコンピューターにロードされ、その結果、遺伝子解析値及び場合によりＫａｔｔａｎパラメーターがプログラムに入力されると、コンピューターは再発可能性をアウトプットとして提供する（高対低、又は、数的指標）。
【００３０】
本発明の好ましいキットでは、ノモグラムの機械的実行もまた提供され得る。このような実行は、ノモグラムにより使用される個々の可変要素について考慮できるように、紙ベースの要素又は可動性の機械パーツを使用してもよい。
【実施例】
【００３１】
（実施例１）：
目的：限局性前立腺癌を有する患者の最適マネジメントのために、再発リスクの精確な見積りが必要とされる。ノモグラムと新規分子予測子とを、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）再発の新しい予後モデルに組み合わせた。
【００３２】
この研究は、限局性前立腺癌を有する患者においてＰＳＡ再発と相関する遺伝子を同定するためにデザインされたが、臓器特異的疾患を有する患者のマネジメントのための現行の通常の臨床実施において容易に適用できる精確な予測的分類子の開発を目的としている。ここで、ＰＳＡ再発のリスクを評価するための、ＲＴＰＣＲにより測定可能な３つの新規遺伝子マーカーの発現値と、前立腺癌の臨床マネジメントにおいて広く使用されているツールであるＫａｔｔａｎ手術後ノモグラム（１１）と、を組み込む臨床的に実施可能な試験の開発を報告する。最後に、この新しい分類子が、この低リスク患者集団における生化学的再発を予測するためのＫａｔｔａｎノモグラムと比較して精確さが改善されていることを示す。
【００３３】
材料及び方法：ＰＳＡ再発に関連する遺伝子を同定するために、ホルマリン固定パラフィン包理（ＦＦＰＥ）局所前立腺癌組織から得た遺伝子プロファイルを解析した。同定されたマーカーのプロファイルを逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴＰＣＲ）により再現させた。これらの遺伝子のうちの３つから得たＲＴＰＣＲプロファイルをＫａｔｔａｎ手術後ノモグラムから得たアウトプットと共に使用して、ＰＳＡ再発の予測モデルを作成した。
【００３４】
結果：可変要素選択後、３つの遺伝子の発現値と手術後ノモグラムを組み合わせたＰＳＡ再発モデルを構築した。３遺伝子にノモグラムを加えたモデルでは、５年間のＰＳＡ再発に関し、検証セットにおいて、ノモグラムではコンコーダンス・インデックス（ｃ−インデックス）が０．６７であったのに比較して、ｃ−インデックスは０．７７であると予測した。このモデルは、ノモグラムでは同定されなかった、再発について高リスクにあった患者の下位集団を同定した。
【００３５】
結論：この新しい遺伝子に基づく分類子は、５年間のノモグラムと比較した場合に、臓器特異的前立腺癌に罹患している患者のＰＳＡ再発リスクを評価するのに優れた予測力を有する。この分類子は、処置決定及び補助臨床療法のために、患者をより精確に高リスク群と低リスク群に層別化し得る。
【００３６】
材料及び方法
患者及び腫瘍サンプル
Ｓｔ．Ｖｉｎｃｅｎｔ’ｓ  Ｃａｍｐｕｓ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＳＶＣＰＣＧ）データベース（Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  Ａｐｐｒｏｖａｌ  Ｈ００／０８８）から患者情報を入手した。１９９０年１月から２００１年１２月まで、Ｓｔ  Ｖｉｎｃｅｎｔ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｓｙｄｎｅｙ）にて９６０人の患者に対して、手術前治療を行わずに、前立腺癌を根治的前立腺摘除（ＲＰ）で処置した。現行の調査で臨床的に局所的な疾患と評価されている３１６人の継続患者の下位集団は、病理学的病期がｐＴ２Ａ〜ｐＴ３Ａの範囲であった９６０人の患者であり、中途打ち切り患者についての最短経過観察は５年であり、ＲＰは１次処置であり、組織塊は、遺伝子発現プロファイリング実験における使用のためにＲＰ試料から評価することができた。ＰＳＡ再発の日付は、ＲＰ後に血清中ＰＳＡが初めて２ｎｇ／ｍＬ以上に増加した日付として定義された。これらの患者を、ランダムに訓練事例とテスト事例に分けた。テスト事例は、検証目的のためにのみ使用した。可変要素が連続的であったか、ｔｉｍｅ−ｔｏ−ｅｖｅｎｔ型であったか又はカテゴリーであったかに依存して、ｔ検定、ｌｏｇ−ｒａｎｋ又はカイ二乗検定のいずれかにより、訓練事例とテスト事例の間の臨床可変要素の分布における差異を評価した。すべての統計解析は両側検定であり、有意性はｐ＜０．０５として定義された。
【００３７】
遺伝子発現プロファイリング
ＦＦＰＥ組織ブロックの各々から得た６μｍの切片を病理学レビュー（ＪＧＫ）にかけ、マクロダイセクションを行って、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＲＮＡ  Ｐａｒａｆｆｉｎキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ））を用いる総ＲＮＡ抽出のに＞３０％の悪性上皮が使用されたことを確認した。
【００３８】
１２００遺伝子をカスタムデザインしたＤＮＡ介在アニーリング、選別、ライゲーション及び伸長マイクロアレイ（ＤＡＳＬ）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））を用いて、訓練シリーズのすべての総ＲＮＡ試料について遺伝子発現プロファイリング実験を行った（２２）。遺伝子発現プロファイルとＤＡＳＬアレイのデザインのどちらもＧＥＯデータベースでアクセスすることができる（アクセス係属中）。３つの対照遺伝子ＡＬＡＳ１、ＴＵＢＡ及びＡＣＴＧ１は、前立腺癌における先行研究（１２、２３）に基づいてマイクロアレイ及びＲＴＰＣＲ解析のために選択された。
【００３９】
生存モードを用いるマイクロアレイの有意性解析（ＳＡＭ）を使用して、アレイ上の各プローブについての予後有意性を測定した（２４〜２６）。これらのプローブを、検定統計値の絶対値によりランク付けした。データ並べ替えにより、偽陽性率（False discovery rates）を計算した。
【００４０】
ＲＴＰＣＲアッセイは、増加しているプローブ及び減少しているプローブの両方について偽陽性率が最も低く報告されたすべての遺伝子を含む、上位にランク付けされた予後マーカー候補（ｎ＝３０）に関してデザインされた。訓練サンプルの、アレイとＲＴＰＣＲデータの間のピアソン相関が低い（＜０．４）遺伝子は、更なる解析から除外された。
【００４１】
予後モデルの構築
Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅオンライン計算機（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｓｋｃｃ．ｏｒｇ／ｍｓｋｃｃ／ｈｔｍｌ／１００８８．ｃｆｍ）を用い、手術後履歴モデルを使用して、５年間のノモグラム再発スコアを各患者個人について計算した。多変量モデルのために可変要素を選択するために、ＲＴＰＣＲからの候補遺伝子のデルタＣＴ値、並びに、ノモグラムから予測された確率は、訓練サンプルを用いてＬ１正規化経路アルゴリズムにより処理された（２５）。Ｃｏｘモデルに過剰適合する可能性に異なる制限を設定するために、経路アルゴリズムを用いて訓練シリーズを交差検定することにより、最小誤差を有するサインが選択された。展開のための最終的な予測モデルは、Ｃｏｘ比例ハザードモデルを使用して、これらの選択された可変要素を訓練事例に適合させることにより、構築された。
【００４２】
モデルの高リスク及び低リスク層別化のためのカットオフ、並びに、ノモグラムのためのカットオフはどちらも、偽陽性及び偽陰性についてのコストが等しいという仮定の下で選択された。この仮定の下、最高の訓練事例精確性を得るカットオフ（相関的に分類された患者の合計数により画定される）を選択した。
【００４３】
予後モデルの検証
テスト事例において実際に再発しないままであるかについて予測的予後モデルの精確性を評価するために、Ｃｏｘ比例ハザード回帰により推定された５年間無再発率の予測と、５年の時点での実際に無再発率のカプラン・マイヤー推定から、検量線を作成した（２４、２７）。カプラン・マイヤー曲線により、並びに、訓練事例から予め選択されたカットオフに基づいてテスト事例患者を低リスク群と高リスク群に層別化することによるハザード比により、テスト事例の最終的な予後モデルの性能を評価した。すべての統計解析は、Ｒ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．５．０（ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）で行った。
【００４４】
結果
患者の特徴
３１６の前立腺摘徐ＦＦＰＥ組織から総ＲＮＡを単離し、ＲＮＡ分解が生じた２０のサンプルを除外した。訓練事例及びテスト事例に含まれる患者の臨床的及び病理学的特徴は、表１に要約される。メジアン経過観察は７２ヵ月であり、根治的前立腺摘除から生化学的再発までのメジアン時間は、再発した人の間では３４ヵ月であった。２９６人の患者のうち９８人は再発を呈し、このうちの７４人の患者は手術から５年以内に再発を呈した。訓練シリーズは１３８人の患者から構成され、残りの１５８人はテスト事例に回した。これら２セットの患者の間には臨床病理学的特徴に統計的な有意差はなかった（表１）。
【００４５】
遺伝子発現及び単変量解析
１３８人の患者の訓練事例からのＲＮＡサンプルをＤＡＳＬアレイにより解析した。ＳＡＭアルゴリズムの並べ替えは、ＤＡＳＬアレイにおける２０の遺伝子については偽陽性率が０％であることを明らかにした。ＳＡＭ解析からのスコア値によりランク付けされた上位３０の遺伝子は、偽陽性率が６．８％であった。これらの３０の遺伝子を次に、同じ訓練事例を使用して、ＲＴＰＣＲ解析により評価した。選択した３０の遺伝子のうち、６つはＤＡＳＬとＲＴＰＣＲの間の相関関係が０．４未満であったことから、更なる解析からは除外した。無再発率における各遺伝子の影響をＣｏｘ回帰により測定した。このハザード比は、それぞれ正規化ＣＴが１増加することに対するＰＳＡ再発の相対的リスクを定量化した。ハザード比とＰ値は、訓練事例及びテスト事例（表２）の両方について記録される。２４のマーカーのうちの２３（マーカーＨＩＳＴ１Ｈ３Ｄ以外）は、テスト事例において再発に有意な関連を有し続けた。同じ解析において、手術後５年間のノモグラムもまた訓練事例及びテスト事例の両方におけるＰＳＡ再発の重要な予測子であった（それぞれＰ値は０．００１及び０．００５）。
【００４６】
（実施例２）：
多変量予後分類子を構築するために、実施例１のＲＴＰＣＲ訓練事例において可変要素を更に選択した。Ｌ１正規化アルゴリズムにより４つの可変要素を選択した：３つの遺伝子（ＤＰＴ、ＳＳＢＰ１及びＭＹＨ１１）及び５年間のノモグラム。これらの４つの可変要素を次に、Ｃｏｘ回帰分析を用いて、訓練事例においてモデル化した。
【００４７】
分類子検証及び生存分析
１５７人の患者の独立したテスト事例で予後モデルをテストした際に、分類子のｃ−インデックスは、ノモグラムのｃ−インデックスよりも明らかに高かった（０．７７対０．６７）（図１Ａ）。臓器特異的疾患に限定されない、同じ病院からの９６０人の患者から構成される継続前立腺癌患者コホートで試験した際、ノモグラム性能は、公開された研究と一致した（ｃ−インデックスは０．７２）（図１Ａ）。次に、検量線を使用して、テスト事例についての５年間の予測評価が実際の再発率にどれだけ近かったかを測定した。分類子は、理想の予測子と比較するとテスト事例についての予測スペクトル全体にわたって良好な較正を示しており、一方、５年間のノモグラムはより悪性の場合に検出の精確性が劣ることを示した（図１Ｂ）。
【００４８】
訓練事例からのカットオフを使用して、テスト事例の患者を高リスク群又は低リスク群のいずれかに入れた。訓練サンプルにおいて最高の精確性を生じた訓練事例からのカットオフに基づいて、患者を低リスク群及び高リスク群に層別化することにより、テスト事例サンプルのためにカプラン・マイヤー曲線を生成した。５年間疾患を発症せずに生存すると予測された訓練事例、並びに、０．３、０．５、０．７及び０．９の予測確率におけるカットに基づく５年経過時点でのカプラン・マイヤー推定、から検量線を形成した。ＰＳＡ無再発率についてのカプラン・マイヤー分析は、予測された低リスク群と高リスク群についてのＰＳＡ再発に対する時間において高度に有意な差を示した（ＨＲ  ６．８５、９５％  ＣＩ＝３．７７〜１２．４３、Ｐ＜０．００１、図２Ａ）。５年目に、２群間のＰＳＡ再発の絶対差は、５８％であった（７５％対１７％）。加えて、この分類子はまた、以下の患者下位集団においてＰＳＡ再発について強力な予後因子を表した：Ｇｌｅａｓｏｎスコア６又は７（図２Ｂ）、病理学的病期ｐＴ２又はｐＴ３ａ（図２Ｃ）、手術前ＰＳＡ濃度≦１０ｎｇ／ｍＬ又は１０＜ＰＳＡ≦２０ｎｇ／ｍＬ（図２Ｄ）、並びに、陽性又は陰性サージカルマージン（図２Ｅ）。
【００４９】
訓練事例及びテスト事例に含まれる患者の臨床的又は病理学的特徴は、表１に要約される。メジアン経過観察は、７２ヵ月であった。根治的前立腺摘除から生化学的再発までの平均及びメジアン時間は、それぞれ、４０及び３４ヵ月であった。２９６人の患者のうち９８人（３３％）が再発を呈し、そのうちの７４人（２５％）の患者が手術の５年以内に再発を呈した。
【００５０】
改善された予後モデルの適用
患者マネジメントにおけるこのモデルの潜在的影響を評価するために、テストコホートにおける手術後５年間のノモグラムに対して、分類子を用いた予後層別化の精確性を比較した。各モデルの最高精確性に基づいてカットオフを用い、次にこれらをテスト事例に適用した（図３）。１５７人のテスト事例患者のうち、ノモグラムにより低リスクと予測された１３６人は、再発率が２３．５％（３２／１３６）であった。対照的に、分類子をこの群に適用した場合には再発が「高リスク」であると同定された１４人のうち、１２人の患者は再発が証明された（８６％）。分類子が「低リスク」状態とした１２２人の患者のうち、２０人の患者（１６．４％）がＰＳＡを再発した。逆に、ノモグラムにより「高リスク」と予測されたが分類子により「低リスク」と予測された１１人の患者のうち、再発が証明されたものはいなかった。それゆえに、この分類子は、このシリーズの前立腺癌患者についての手術後ノモグラムにより提供される予後情報に更なる予後情報を与えた。
【００５１】
（実施例３）：
候補マーカー及び３つの対照遺伝子に対してＲＴＰＣＲアッセイをデザインした。マーカーに関し複数のＰＣＲプライマー及びプローブをデザインした。３つの対照遺伝子の平均に対してＣＴ値を正規化した。
【００５２】
各正規化した遺伝子をＤＡＳＬシグナル値に対してプロットした。総ＲＮＡを１５回逆転写し、遺伝子特異的プライマーで予め増幅した。次に、予め増幅したｃＤＮＡをＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００配列検出システム（ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）を用い定量化した。
【００５３】
ＤＰＴ−１２３２  ３０９６：
順方向プライマーＧＧＧＴＴＧＧＡＡＧＧＡＴＴＴＣＣＴＧＡＡ（配列番号１）
逆方向プライマーＣＣＣＴＧＣＡＣＴＣＡＴＴＴＴＣＣＴＴＡＣＴＧ（配列番号２）
プローブ５’Ｆａｍ−３’ＭＧＢ標識されたプローブＴＡＧＡＡＧＡＣＡＡＡＣＧＴＴＡＧＣＡＴＡＣ（配列番号３）
【００５４】
ＭＹＨ１１−５８９３  ４６０：
順方向プライマーＧＣＡＣＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＧＡＧ（配列番号４）
逆方向プライマーＴＣＧＴＴＴＣＣＴＣＧＣＣＴＧＧＴＧ（配列番号５）
プローブ５’Ｆａｍ−３’ＭＧＢ標識されたプローブＡＧＧＡＡＡＣＴＴＣＧＣＡＧＴＧＡＴ（配列番号６）
【００５５】
ＳＳＢＰ１−２９１  ２９９０：
順方向プライマーＡＧＴＴＴＡＣＣＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＴＧＴＣＡＧ（配列番号７）
逆方向プライマー５’Ｆａｍ−３’ＭＧＢ  ＴＴＧＡＴＡＴＧＣＣＡＣＧＴＣＴＣＴＧＡＧＧ（配列番号８）
標識されたプローブＡＴＧＧＣＡＣＡＧＡＡＴＡＴＣＡＧ（配列番号９）
【００５６】
（実施例４）：
追加のパネルも同定されたが、これは好ましいパネルと比較して準最適であり、それ自体も有用である。代替的パネルの各々は、単独型パネルとして又はＫａｔｔａｎノモグラムと組み合わせて使用することができ、その性能は代替的パネルの各々により改善される。矢印は、モデルに対応するｃ−インデックスを示す。
【００５７】
Ａｌｔ１：
ＦＬＮＣ＋ＲＡＳＬ１２＋ＭＹＬＫ＋ＦＬＮＡ＋ＮＯＭ＿Ｈ５→０．７１
ＦＬＮＣ＋ＲＡＳＬ１２＋ＭＹＬＫ＋ＦＬＮＡ→０．６７
【００５８】
Ａｌｔ２：
ＧＡＳ１＋ＳＭＴＮ＋ＬＭＯＤ１＋ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｄ＋ＮＯＭ＿Ｈ５→０．７４
ＧＡＳ１＋ＳＭＴＮ＋ＬＭＯＤ１＋ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｄ→０．７１
【００５９】
Ａｌｔ３：
ＳＯＲＢＳ１＋ＰＤＬＩＭ７＋ＬＩＭＳ２＋ＭＴ１Ｘ＋ＮＯＭ＿Ｈ５→０．７３
ＳＯＲＢＳ１＋ＰＤＬＩＭ７＋ＬＩＭＳ２＋ＭＴ１Ｘ→０．６９
【００６０】
（実施例５）：
残りのマーカーに関するプローブ及びプライマー対も同定された。これらは表３に示される。
【００６１】
（実施例６）：
ＭＹＨ１１、ＤＰＴ及びＳＳＢＰ１並びにＡＬＡＳ、ＡＣＴＧ及びＴＵＢＡのためのプライマー及びプローブの代替の組も開発された。この結果は、実施例３のプライマー及びプローブの組と比較して、少なくとも一致しており、あるいは、優れていた。これらの代替的プライマー及びプローブは以下のものである：
ＤＰＴ５５８Ｆ  ＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＡＧＧＧＡＴＣＧＣ（配列番号１０）
ＤＰＴ６４０Ｒ  ＣＣＣＡＧＡＴＴＴＧＧＴＡＴＧＴＧＧＣＡ（配列番号１１）
ＤＰＴ５８８Ｐ＿ＦＡＭ  ＣＡＴＡＡＴＧＴＧＣＣＧＧＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡ（配列番号１２）
ＭＹＨ  ５８９５  Ｆ  ＧＣＡＣＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＧＡ（配列番号１３）
ＭＹＨ  ５９６４Ｒ  ＴＡＧＡＡＧＧＡＡＣＧＡＡＡＧＡＧＧＴＣＴＣ（配列番号１４）
ＭＹＨ  ５９２５  Ｐ＿Ｏｒａｎｇｅ  ＣＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＴＴＣＧＣＡＧＴＧＡＴ（配列番号１５）
ＳＳＢＰ１；２８１Ｆ  ＧＧＧＡＴＡＧＴＧＡＡＧＴＴＴＡＣＣＡＡＣ（配列番号１６）
ＳＳＢＰ１；３５９Ｒ  ＴＴＧＡＴＡＴＧＣＣＡＣＧＴＣＴＣＴＧＡ（配列番号１７）
ＳＳＢＰ１；３１２Ｐ（ＯＲＡＮＧＥ）ＣＡＧＴＣＡＡＡＡＧＡＣＡＡＣＡＴＧＧＣＡＣＡＧ（配列番号１８）
ＴＵＢＡ  ５８６  Ｆ  ＴＴＣＧＣＡＡＧＣＴＧＧＣＴＧＡ（配列番号１９）
ＴＵＢＡ  ６６６  Ｒ  ＣＡＴＧＡＧＣＡＧＧＧＡＧＧＴＧＡＡ（配列番号２０）
ＴＵＢＡ  ６３９  Ｐ＿Ｃｙ５（Ｑｕａｓａｒ）ＡＧＣＴＴＴＧＧＴＧＧＧＧＧＡＡＣＴＧＧＴＴＣＴ（配列番号２１）
ＡＬＡＳ９１８Ｆ  ＣＡＡＧＴＧＴＣＡＧＴＣＴＧＧＴＧＣＡ（配列番号２２）
ＡＬＡＳ９８４Ｒ  ＧＴＴＧＴＴＴＣＡＡＡＧＴＧＴＣＣＡＴＡＡＣ（配列番号２３）
ＡＬＡＳ９４８Ｐ＿ＦＡＭ  ＣＴＡＧＧＡＡＴＧＡＧＴＣＧＣＣＡＣＣＣＡＣ（配列番号２４）
ＡＣＴＧ  ８６２  Ｆ  ＡＧＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣＴＧＧＧＴＡＴ（配列番号２５）
ＡＣＴＧ  ９０３  Ｒ  ＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＡＡＧＧＴＧＧＴ（配列番号２６）
ＡＣＴＧ  ８８２  Ｐ＿Ｃｙ５（Ｑｕａｓａｒ）ＧＡＡＴＣＴＴＧＣＧＧＣＡＴＣＣＡＣＧＡ（配列番号２７）
【００６２】
考察：
開示された分類子のうち、複雑性のレベルが比較的低いものも、診断認可プラットフォーム（diagnostic-approved platform）でＦＦＰＥ組織内での小さな組の遺伝子の発現を測定する能力の点で重要である。これらの重要な利点は、臨床的診断の設定にこの予測ツールがうまく実装可能であるかどうかに影響する、一部の重要な要因に対応する。ＦＦＰＥ組織から誘導する必要のあるＲＮＡが非常に低濃度であることも、手術前経直腸的生検を含む通常の病理試料に対するその潜在的長期適用性を促進する。
【００６３】
前立腺癌関連遺伝子の発現に関する、この系統だった評価は、潜在的に広範な臨床的有用性を有する限局性前立腺癌再発の、遺伝子に基づく分類子を開発するという目的で、ＰＳＡ再発に相関するものである。カスタムＤＡＳＬアレイ、ＦＦＰＥ組織から誘導されるＲＮＡの高スループットな遺伝子発現プロファイリングを可能にするマイクロアレイプラットフォームを用いて、新規遺伝子予測子を同定した（２２）。この研究の鍵となる構成要素は、公開されているデータセット（１２、１３）、社内遺伝子発現データ（非公開）及び前立腺癌進行において先行して示唆れているマーカー（１４、１６、１７）の再分析により同定された遺伝子マーカーに基づくカスタムＤＡＳＬマイクロアレイ遺伝子セットのデザインであった。これは、本研究において最も重要であったこれらの３０の遺伝子に対してある程度独立した検証を可能にした。遺伝子発現アレイ分析においてＰＳＡ再発に関連する２４の遺伝子マーカーを、確立されたノモグラムと組み合わせた場合にＰＳＡ再発の新たな分類子を生じる好ましい３遺伝子サイン（ＤＰＴ、ＭＹＨ１１及びＳＳＢＰ１）を生じるＲＴＰＣＲにより更に検証された。この分類子は、続いて、患者の独立した群において検証された。ＤＰＴ及びＭＹＨ１１は新しい前立腺癌の予後マーカーであり、一方、ＳＳＢＰ１は先行して急性前立腺癌に関連している（１７）。
【００６４】
前立腺癌再発について広範に使用されるノモグラムと組み合わせたこの新しい分類子の価値の評価は、新しい分類子が、手術後ノモグラム単独（９）よりもはるかに信頼性の高い精確性でもって再発が低リスクである患者及び再発が高リスクである患者の両方を同定したことを示した。本明細書に提示した分類子はまた、従来の臨床病理学的パラメーターに基づいて臨床的に関連する下位集団内の患者を高リスク再発群及び低リスク再発群に層別化することができる。注目すべきことに、Ｇｌｅａｓｏｎ  ６及び７の癌患者を層別化する能力は、現行のアプローチよりも予測精確性において大幅な進歩を呈する。前立腺癌の重要なエンドポイントとしてＰＳＡの再発を使用することは、ほんの一部の患者が臨床的に重要な疾患の再発及び進行を経験することから、議論されてきた。これらの関係は、このコホートのＰｒＣａからの転移及び死亡についてのデータが十分に集まるにつれて、より明確に定義されるであろう。しかしながら、前立腺摘出後のＰＳＡ増加を検出することが、ほとんどの医師及び患者が更なる処置選択肢を考える際に重要な判断点になることは明瞭である（５）。この文脈で、５年間のノモグラムを使用してこの分類子の潜在的影響を評価することは、５年以内に生じる手術後の生化学的再発の大半について正当である。
【００６５】
他の公開されているサイン、及び分子表現型の遺伝子マーカー、及び前立腺癌における予後に対して考慮した際に、デザインツールとしてのこの新しい分類子の影響は重要である（１２〜２０）。米国で前立腺癌に関して新しく診断された症例のうちの８０％超が、臨床的に局所進行性の疾患を有する前立腺癌患者であることから、この研究は、特にこれらの患者における再発リスクの予測を補助するために開発されている点で独特である。公開されたサイン及び遺伝子マーカーは、病理学的病期のスペクトルを表す患者のコホートから同定されている一方、この研究において訓練コホート及びテストコホートはいずれも臓器特異的前立腺癌に制限された。先行レポートと比較して、このコホートのうち臨床的に局所進行性の疾患の患者において５年間のノモグラムの性能が比較的低いことから、予測ツールの開発において使用される患者群と、見込まれる標的群との間に一致をもつ重要性は強化される。更なる分析では、これは、この研究の臓器特異的症例のみを評価する制限におそらく起因する。臓器特異的疾患に限定されなかった、同じ病院の前立腺癌患者コホートを、本発明に基づき継続的にテストした場合、ノモグラム性能は先行研究（９、１１）と一致した。
【００６６】
分類子の複雑性が比較的低レベルであることも重要である。ＦＦＰＥ組織内の小さな組の遺伝子の発現を測定する能力及び保存標本における診断テストのために認可されるプラットフォームの使用と共に、これは、この予測ツールをうまく実装して臨床的診断を設定し得るかの見込みに影響を及ぼす、いくつかの鍵となる要因に対処することから重要な利点である。ＦＦＰＥ組織から誘導する必要のあるＲＮＡが低濃度であることも、手術前経直腸的生検を含む通常の病理標本に対するその潜在的長期適用性を促進する。手術前の設定に対しこの分類子の適用性がより広いものであることを確認するために、生検において遺伝子を選択的に複製するなどの両方の手術生検及び手術前生検外的コホートを、更に検証することが現在必要とされている。
【００６７】
局所前立腺癌について精確な予測分類子を実行することは、初期前立腺癌の患者マネジメントのために重要な意味を有する。局所的疾患及び高リスクの特徴を有する患者は、ホルモン、放射線及び全身処置を含む補助治療から利益を得る傾向があり、この利益は処置治験において評価すべきである（７、２８、２９）。このような作用因子を採用する初期フェーズの臨床試験はホルモン不応性の設定で実施されているが、最終的には補助治療として局所前立腺癌において治験することもできる（３０）。均一な患者群を確保するために高リスク患者の精確な同定を行うことは、これらの研究にとって固有のものである（８）。逆に、再発が低リスクである患者の同定を改善すると、ＰＳＡスクリーニングを通して低悪性度の癌を多数同定する結果として、治療により死亡に至る患者の数が減少する。
【００６８】
最後に、局所前立腺癌の予後モデルの改善が進むと、低悪性度の疾患の治療を控えるか又は再発が高リスクである人に補助化学療法を提供するかのいずれかの処置決定の改善を促進する可能性がある。
【００６９】
本開示における参考文献のすべては、これによって、関連教示のすべてについて参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【００７０】
参考文献：
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１９．Ｈｅｎｓｈａｌｌ  Ｓ，Ｈｏｒｖａｔｈ  Ｌ，Ｑｕｉｎｎ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ：Ｚｉｎｃ−ａｌｐｈａ２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｒａｄｉｃａｌ  ｐｒｏｓｔａｔｅｃｔｏｍｙ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ２００６；９８：１４２０。
２０．Ｍｕｃｃｉ  Ｌ，Ｐａｗｉｔａｎ  Ｙ，Ｄｅｍｉｃｈｅｌｉｓ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ：Ｔｅｓｔｉｎｇ  ａ  ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｅａｔｈ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｓｗｅｄｉｓｈ  Ｗａｔｃｈｆｕｌ  Ｗａｉｔｉｎｇ  Ｃｏｈｏｒｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｐｒｅｖ  ２００８；１７：１６８２。
２１．Ｑｕｉｎｎ  ＤＩ，Ｈｅｎｓｈａｌｌ  ＳＭ  ａｎｄ  Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ  ＲＬ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｏｕｔｃｏｍｅ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００５；４１：８５８。
２２．Ｂｉｂｉｋｏｖａ  Ｍ，Ｔａｌａｎｔｏｖ  Ｄ，Ｃｈｕｄｉｎ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｎ  ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｆｉｘｅｄ，ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂｅａｄ  ａｒｒａｙｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００４；１６５：１７９９。
２３．Ｏｈｌ  Ｆ，Ｊｕｎｇ  Ｍ，Ｘｕ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ：Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｉｓｓｕｅ：ｗｈｉｃｈ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｇｅｎｅ  ｓｈｏｕｌｄ  ｂｅ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｆｏｒ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ？Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ２００５；８３：１０１４。
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２５．Ｐａｒｋ  ＭＹ  ａｎｄ  Ｈａｓｔｉｅ  Ｔ：Ｌ１  ｒｅｇｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｐａｔｈ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  ｌｉｎｅａｒ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｊ  Ｒ  Ｓｔａｔ  Ｓｏｃ：Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）２００７；６９：６５９。
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３０．Ｍａｚｈａｒ  Ｄ  ａｎｄ  Ｗａｘｍａｎ  Ｊ：Ｅａｒｌｙ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  Ｕｒｏｌ  ２００８；５：４８６。
【００７１】
【表１−１】
2013524783.tif 000002
【表１−２】
2013524783.tif 000003
＊  Ｐ値は、カイ二乗検定により算出した。
†  Ｐ値は、ｔ検定により算出し、連続変数として特徴を評価した。
‡  Ｐ値は、ｌｏｇ−ｒａｎｋ検定により算出した。
【表２】
2013524783.tif 000004
＊  Ｃｏｘ回帰ｐ値
†  ハザード比は、正規化ＣＴ値において各々１の増加毎である。
【表３−１】
2013524783.tif 000005
【表３−２】
2013524783.tif 000006
【表３−３】
2013524783.tif 000007
【表３−４】
2013524783.tif 000008
【００７２】
〔実施の態様〕
（１）  前立腺癌が再発するリスクが高いと分類される被検者と前立腺癌が再発するリスクが低いと分類される被検者とを識別するための分類子であって、該分類子が、
少なくとも２つの診断マーカーの各発現レベルであって、各発現レベルが２つ又は３つ以上の対照マーカーの平均値と比較して測定される、発現レベルと、
被検者を、前記前立腺癌が再発するリスクが高いと分類される被検者と前記前立腺癌が再発するリスクが低いと分類される被検者のいずれかに分類するための、前記少なくとも２つの診断マーカーの発現レベルと組み合わされる、Ｋａｔｔａｎノモグラムに基づく予測確率と、を含む、分類子。
（２）  前記Ｋａｔｔａｎノモグラムが、手術前（及び、受ける場合にはホルモン療法前）のＰＳＡ値、前立腺摘出の時点でのＰＳＡ、手術時の第１  Ｇｌｅａｓｏｎ、手術時の第２  Ｇｌｅａｓｏｎ、前立腺摘出Ｇｌｅａｓｏｎ合計、前立腺摘出の年、病気をしていない月数、サージカルマージンが陽性であったかどうか、精嚢内に癌が見られたかどうか、嚢外拡張が存在したかどうか、リンパ節内に癌が見られたかどうか（もしあれば、除去されたかどうか）、放射線療法前のＰＳＡ、放射線投与量（適用可能である場合）、サージカルマージンが陽性であるか又は陰性であったか（適用可能である場合）、精嚢転移が存在したかどうか（適用可能である場合）、リンパ節転移が存在したかどうか（適用可能である場合）、嚢外転移が存在したかどうか（適用可能である場合）、ネオアジュバントホルモンを処方したかどうか、ネオアジュバント放射線を処方したかどうかからなる群の２つ又は３つ以上の構成要素に基づく複合的判定である、実施態様１に記載の分類子。
（３）  前記Ｋａｔｔａｎノモグラムが、処置前のＰＳＡレベル、組み合わせたＧｌｅａｓｏｎグレード、試料のＧｌｅａｓｏｎ合計、臨床病期、サージカルマージン状態、コアにおける前立腺被膜浸潤の最大の癌の長さ（prostatic capsular invasion maximum cancer length）、生検コアにおける癌の合計長さ、陽性レベルのコアの割合、前立腺外進展、前立腺外進展のレベル、アポトーシス指数、１つ又は２つ以上のコアにおける癌の割合、１つ又は２つ以上のコアにおける悪性度の高い癌の割合、腫瘍の合計体積、癌の位置する領域、精嚢浸潤の存在、精嚢浸潤のタイプ、ｐ５３、Ｋｉ−６７、ｐ２７、ＤＮＡ倍数性状態、リンパ節の状態及びリンパ管浸潤からなる群の２つ又は３つ以上の構成要素に基づく複合的な判定である、実施態様１に記載の分類子。
（４）  診断マーカーＭＹＨ１１、ＳＳＢＰ１及びＤＰＴを含む、実施態様１に記載の分類子。
（５）  ＭＹＨ１１、ＳＳＢＰ１及びＤＰＴに加えて、表２から選択されるＨｉｓｔｏｎｅ  １  Ｈ３ｄ以外の診断マーカーを含む、実施態様２に記載の分類子。
（６）  前記対照マーカーがＴＵＢＡ、ＡＬＡＳ１及びＡＣＴＧ１である、実施態様１に記載の分類子。
（７）  前記診断マーカーが、表２に提示されているＨｉｓｔｏｎｅ  １  Ｈ３ｄ以外のマーカーの組から選択される、実施態様１に記載の分類子。
（８）  前記対照マーカーが、ＲＴ−ＰＣＲにより検出されるような比較的安定した発現レベルのために選択される、実施態様１に記載の分類子。
（９）  前立腺癌の再発の予測方法であって、
標準と比較してＤＰＴの発現レベルを判定することと、
表２に記載のもののうち少なくとも１つの追加のマーカーの発現レベルを判定することと、
前記ＤＰＴの発現レベル及び前記表２に記載のもののうちＨｉｓｔｏｎｅ  １  Ｈ３ｄ以外の少なくとも１つの追加のマーカーの発現レベルを、前立腺癌の再発率に対応するスコアに変換することと、を含む、方法。
（１０）  前記変換工程の代わりとして、前記ＤＰＴの発現レベル及び前記表２に記載のもののうちＨｉｓｔｏｎｅ  １  Ｈ３ｄ以外の少なくとも１つの追加のマーカーの発現レベルを、前立腺癌の再発の少なくとも１つの追加の指標と組み合わせて、複合スコアを判定する工程を更に含む、実施態様９に記載の方法。
【００７３】
（１１）  前記複合スコアが、前立腺癌の再発可能性を反映する、実施態様１０に記載の方法。
（１２）  前記ＤＰＴの発現レベル及び前記表２に記載のもののうちＨｉｓｔｏｎｅ  １  Ｈ３ｄ以外の少なくとも１つの追加のマーカーの発現レベルが、前立腺摘出（prostectomy）、ホルモン療法、単一種薬剤化学療法、二種薬剤化学療法、及び、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤による処置からなる群から選択される少なくとも１つの処置に先立って、判定される、実施態様９に記載の方法。
（１３）  少なくともＤＰＴの発現レベルを検出するためのキットであって、前記キットが、試薬と、ＤＰＴを特異的に認識する第一プローブと表２から選択されるＨｉｓｔｏｎｅ  １  Ｈ３ｄ以外の第二マーカーを特異的に認識する第二プローブとを含む第一プローブセットと、を含む、キット。
（１４）  前記ＤＰＴの発現レベル及び前記表２からのＨｉｓｔｏｎｅ  １  Ｈ３ｄ以外の少なくとも１つの追加のマーカーの発現レベルを前立腺癌の再発可能性の指標に変換するためのデバイスを更に含む、実施態様１３に記載のキット。
（１５）  前記デバイスがノモグラムである、実施態様１３に記載のキット。
（１６）  前記ノモグラムが、機械的デバイス、グラフ表示、及び、前立腺癌の再発可能性の指標の表示を提供すべくユーザーインターフェースを実行するためのソフトウェア命令、からなる群の１つ又は２つ以上の構成要素として組み込まれる、実施態様１５に記載のキット。
【図１Ａ】
2013524783.tif 000009
【図１Ｂ】
2013524783.tif 000010
【図２Ａ】
2013524783.tif 000011
【図２Ｂ】
2013524783.tif 000012
【図２Ｃ】
2013524783.tif 000013
【図２Ｄ】
2013524783.tif 000014
【図２Ｅ】
2013524783.tif 000015
【図３】
2013524783.tif 000016
【配列表】
2013524783000001.app
【国際調査報告】
2013524783.tif 000017
2013524783.tif 000018