(57)【要約】  この発明は、α２インテグリンに結合するペプチド又はペプチド複合体、このペプチド又はペプチド複合体をコードする１つ又はそれより多い核酸、このペプチド又はペプチド複合体を作製する組み換え細胞、このペプチド又はペプチド複合体の作製方法、医薬として使用するためのこのペプチド又はペプチド複合体、あるいは核酸（複数を含む）を含んでなる医薬組成物、α２インテグリンを検出する方法及びスクリーニング方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド又はペプチド複合体、好ましくは、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、該ペプチド又はペプチド複合体、抗体又はフラグメントは、ヒトα２インテグリンのＩ−ドメインに特異的に結合し、該抗体又はフラグメントは、重鎖可変領域（ＶＨ）ドメイン及び軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインを含んでなり、該抗体又はフラグメントは、非ヒト霊長類α２インテグリンと交差反応するが、非霊長類α２インテグリンとは交差反応しない、上記ペプチド又はペプチド複合体、好ましくは、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項２】
ペプチド又はペプチド複合体、好ましくは、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、該ペプチド又はペプチド複合体、抗体又はフラグメントは、ヒトα２インテグリンのＩ−ドメインに特異的に結合し、該抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）ドメイン及び軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインを含んでなり、上記抗体又はフラグメントは、参照抗体のエピトープとの結合について参照抗体と競合し、該参照抗体は、アクセッション番号 ＤＳＭ２３９４４にてＤＳＭＺに寄託されているプラスミドによってコードされる軽鎖、及び（ｉ）アクセッション番号 ＤＳＭ２３９４６にてＤＳＭＺに寄託されているプラスミド、又は（ｉｉ）アクセッション番号 ＤＳＭ２３９４５にてＤＳＭＺに寄託されているプラスミドのいずれかによってコードされている重鎖を含んでなる、上記ペプチド又はペプチド複合体、好ましくは、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項３】
１つ又はそれより多い下記のコンポーネントａ）〜ｆ）：
ａ）ＬＣＤＲ１［ここで、ＬＤＲ１は、ＲＡＳＥＳＶＥＳＹＧＮＳＦＩＹ（配列番号６）又はその機能的に活性な変異体である］、
ｂ）ＬＣＤＲ２［ここで、ＬＤＲ２は、ＬＡＳＮＬＡＳ（配列番号７）又はその機能的に活性な変異体である］、
ｃ）ＬＣＤＲ３［ここで、ＬＤＲ３は、ＱＱＮＮＥＤＰＹＴ（配列番号８）又はその機能的に活性な変異体である］、
ｄ）ＨＣＤＲ１［ここで、ＨＤＲ１は、ＧＹＴＦＴＳＹＷＭＮ（配列番号３）又はその機能的に活性な変異体である］、
ｅ）ＨＣＤＲ２［ここで、ＨＤＲ２は、ＲＩＤＰＳＤＳＥＴＨＹＮＱＫＦＫ（配列番号４）又はその機能的に活性な変異体である］、及び
ｆ）ＨＣＤＲ３［ここで、ＨＤＲ３は、ＶＧＲＧＹＦＤＹ（配列番号５）又はその機能的に活性な変異体である］
を含んでなるペプチド又はペプチド複合体、好ましくは、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、
そして上記において、１つ又はそれより多いコンポーネントａ）〜ｆ）は、ペプチド又はペプチド複合体のα２インテグリンへの結合を可能にするように配置されている、上記ペプチド又はペプチド複合体、好ましくは、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド複合体であって、
（ｉ）ａ）〜ｃ）のコンポーネントは、軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）中に含まれ；
及び／又は
（ｉｉ）ｄ）〜ｆ）のコンポーネントは、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）中に含まれ；
及び／又は
（ｉｉｉ）ペプチド又はペプチド複合体は抗体であり；
及び／又は
（ｉｖ）ペプチド又はペプチド複合体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）2、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、多特異性抗体、デュアル特異性抗体、アイソタイプ抗体、デュアル可変ドメイン抗体及び二特異性抗体であり；
及び／又は
（ｖ）ペプチド又はペプチド複合体は、ヒトＩｇＭ定常ドメイン、ヒトＩｇＧｌ定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、ドメイン、ヒトＩｇＧ４定常ドメイン、ヒトＩｇＥ定常ドメイン、及びヒトＩｇＡ定常ドメインから成る群より選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含んでなり；
及び／又は
（ｖｉ）機能的に活性な変異体は、配列番号３〜８のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性から成る機能的に活性なフラグメントであり；
及び／又は
（ｖｉｉ）機能的に活性な変異体は、配列番号３〜８のいずれかのアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する機能的に活性な変異体であり、特に、機能的に活性な変異体は、１つ又はそれより多い保存的アミノ酸置換によって配列番号３〜８のいずれかのアミノ酸配列から誘導され；
及び／又は
（ｖｉｉｉ）
−配列番号１、又はその機能的に活性な変異体、及び／又は
−配列番号２、又はその機能的に活性な変異体、及び／又は
−配列番号９、又はその機能的に活性な変異体、及び／又は
−配列番号１０、又はその機能的に活性な変異体、及び／又は
−配列番号１１、又はその機能的に活性な変異体
のアミノ酸配列を含んでなり、
又は
（ｉｘ）
−配列番号１、又はその機能的に活性な変異体、及び
−配列番号２、又はその機能的に活性な変異体、及び
−場合により、５０個の付加アミノ酸残基、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜３０個、更により好ましくは、多くとも１〜２５個、なおより好ましくは、多くとも１〜１０個、最も好ましくは１個、２個、３個、４個、又は５個の付加アミノ酸残基
よりなるアミノ酸配列で構成され、
又は
（ｘ）
−配列番号９、又はその機能的に活性な変異体、及び
−配列番号１０、又はその機能的に活性な変異体、及び
−場合により、５０個の付加アミノ酸残基、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜３０個、更により好ましくは、多くとも１〜２５個、なおより好ましくは、多くとも１〜１０個、最も好ましくは１個、２個、３個、４個、又は５個の付加アミノ酸残基
よりなるアミノ酸配列で構成され、
又は
（ｘｉ）
−配列番号９、又はその機能的に活性な変異体、及び
−配列番号１１、又はその機能的に活性な変異体、及び
−場合により、５０個の付加アミノ酸残基、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜３０個、更により好ましくは、多くとも１〜２５個、なおより好ましくは、多くとも１〜１０個、最も好ましくは１個、２個、３個、４個、又は５個の付加アミノ酸残基
よりなるアミノ酸配列で構成される、上記ペプチド又はペプチド複合体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド複合体であって、
−ＬＤＲ１の機能的に活性な変異体は、１１位のアミノ酸での変異、特に、１１Ａｓｎ→Ｇｌｎを含んでなり；及び／又は
−ＨＤＲ２の機能的に活性な変異体は、６位のアミノ酸での変異、特に、６Ａｓｐ→Ｇｌｕを含んでなり；及び／又は
−配列番号１の機能的に活性な変異体は、特に、９Ａｌａ→Ｓｅｒ、１２Ａｌａ→Ｓｅｒ、１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ、１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ、２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ、３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ、４６Ｇｌｎ→Ｌｙｓ、４７Ａｌａ→Ｐｒｏ、８０Ａｓｐ→Ａｓｎ、８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、８７Ａｌａ→Ｔｈｒ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎから成る群より選択される、９位、１２位、１５位、２２位、３４位、４６位、４７位、８０位、８３位、８５位、８７位及び／又は８９位のアミノ酸での１つ又はそれより多い変異を含んでなり；及び／又は
−配列番号２の機能的に活性な変異体は、特に、５Ｈｉｓ→Ｖａｌ、７Ｐｒｏ→Ｓｅｒ、１１Ｌｅｕ→Ｖａｌ、１２Ｖａｌ→Ｌｙｓ、１７Ｐｒｏ→Ｓｅｒ、２０Ｌｅｕ→Ｖａｌ、３８Ｌｙｓ→Ａｒｇ、４０Ａｒｇ→Ａｌａ、４３Ａｒｇ→Ｇｌｎ、５５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、６１Ａｓｎ→Ａｌａ、６５Ｌｙｓ→Ｇｌｎ、６６Ａｓｐ→Ｇｌｙ、６７Ｌｙｓ→Ａｒｇ、７６Ｓｅｒ→Ｔｈｒ、８１Ｉｌｅ→Ｍｅｔ、８２Ｇｌｎ→Ｇｌｕ、８７Ｔｈｒ→Ａｒｇ、９１Ｓｅｒ→Ｔｈｒ、９３Ｖａｌ→Ｌｙｓ、１１２Ｔｈｒ→Ｌｅｕ、１１３Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び１１６Ｓｅｒ→Ｖａｌから成る群より選択される、５位、７位、１１位、１２位、１７位、２０位、３８位、４０位、４３位、５５位、６１位、６５位、６６位、６７位、７６位、８１位、８２位、８７位、９１位、９３位、１１２位、１１３位及び／又は１１６位のアミノ酸での１つ又はそれより多い変異を含んでなる、上記ペプチド又はペプチド複合体。
【請求項６】
前記抗体又はフラグメントが、ヒトα２−インテグリンのＩ−ドメインにｎＭレベルの結合親和性で特異的に結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド複合体。
【請求項７】
前記ペプチド又はペプチド複合体が、インビトロでヒトα２インテグリンのコラーゲンとの相互作用を阻害し、それによって、血小板と該コラーゲンの粘着による該血小板の活性を阻害する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド複合体。
【請求項８】
前記重鎖可変領域ドメインが、配列番号５の重鎖ＨＣＤＲ３を含んでなる、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド複合体。
【請求項９】
前記重鎖可変領域ドメインが、配列番号３（ＨＣＤＲ１）、配列番号４（ＨＣＤＲ２）、及び配列番号５（ＨＣＤＲ３）の重鎖ＣＤＲ、又はその機能的に活性な変異体を含んでなる、請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド複合体。
【請求項１０】
ＨＣＤＲ２の機能的に活性な変異体が、６位のアミノ酸でのＡｓｐ→Ｇｌｕの変異を含んでなる、請求項９に記載のペプチド又はペプチド複合体。
【請求項１１】
前記軽鎖可変領域ドメインが、配列番号８の軽鎖ＬＣＤＲ３を含んでなる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド複合体。
【請求項１２】
前記軽鎖可変領域ドメインが、配列番号６（ＬＣＤＲ１）、配列番号７（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号８（ＬＣＤＲ３）の軽鎖ＣＤＲ、又はその機能的に活性な変異体を含んでなる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド複合体。
【請求項１３】
ＬＣＤＲ１の機能的に活性な変異体が、１１位のアミノ酸でのＡｓｎ→Ｇｌｎの変異を含んでなる、請求項１２に記載のペプチド又はペプチド複合体。
【請求項１４】
前記重鎖可変領域（ＶＨ）ドメインが、配列番号２のＶＨ配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％の配列同一性を有している、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド複合体。
【請求項１５】
前記重鎖可変領域（ＶＨ）ドメインが、配列番号２の配列又はその機能的に活性な変異体を含んでなる、請求項１４に記載のペプチド又はペプチド複合体。
【請求項１６】
前記軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインが、配列番号１のＶＬ配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％の配列同一性を有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド複合体。
【請求項１７】
前記軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインが、配列番号１の配列又はその機能的に活性な変異体（functionally active thereof）を含んでなる、請求項１６に記載のペプチド又はペプチド複合体。
【請求項１８】
前記重鎖可変領域（ＶＨ）ドメインが、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１７、Ｈ２０、Ｈ３８、Ｈ４０、Ｈ４３、Ｈ５５、Ｈ６１、Ｈ６５、Ｈ６６、Ｈ６７、Ｈ７６、Ｈ８１、Ｈ８２、Ｈ８７、Ｈ９１、Ｈ９３、Ｈ１１２、Ｈ１１３及びＨ１１６から成る群より選択される位置における１つ又はそれより多いアミノ酸置換を含んでなる、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド複合体。
【請求項１９】
１つ又はそれより多いアミノ酸置換が、５Ｈｉｓ→Ｖａｌ、７Ｐｒｏ→Ｓｅｒ、１１Ｌｅｕ→Ｖａｌ、１２Ｖａｌ→Ｌｙｓ、１７Ｐｒｏ→Ｓｅｒ、２０Ｌｅｕ→Ｖａｌ、３８Ｌｙｓ→Ａｒｇ、４０Ａｒｇ→Ａｌａ、４３Ａｒｇ→Ｇｌｎ、５５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、６１Ａｓｎ→Ａｌａ、６５Ｌｙｓ→Ｇｌｎ、６６Ａｓｐ→Ｇｌｙ、６７Ｌｙｓ→Ａｒｇ、７６Ｓｅｒ→Ｔｈｒ、８１Ｉｌｅ→Ｍｅｔ、８２Ｇｌｎ→Ｇｌｕ、８７Ｔｈｒ→Ａｒｇ、９１Ｓｅｒ→Ｔｈｒ、９３Ｖａｌ→Ｌｙｓ、１１２Ｔｈｒ→Ｌｅｕ、１１３Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び１１６Ｓｅｒ→Ｖａｌから成る群より選択される、請求項１８に記載のペプチド又はペプチド複合体。
【請求項２０】
前記軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインが、Ｌ９、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ２２、Ｌ３４、Ｌ４６、Ｌ４７、Ｌ８０、Ｌ８３、Ｌ８５、Ｌ８７、及びＬ８９から成る群より選択される位置における１つ又はそれより多いアミノ酸置換を含んでなる、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド複合体。
【請求項２１】
１つ又はそれより多いアミノ酸置換が、９Ａｌａ→Ｓｅｒ、１２Ａｌａ→Ｓｅｒ、１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ、１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ、２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ、３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ、４６Ｇｌｎ→Ｌｙｓ、４７Ａｌａ→Ｐｒｏ、８０Ａｓｐ→Ａｓｎ、８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、８７Ａｌａ→Ｔｈｒ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎから成る群より選択される、請求項２０に記載のペプチド又はペプチド複合体。
【請求項２２】
前記重鎖可変領域（ＶＨ）ドメインが、配列番号３８（ＨＣ１）、配列番号３９（ＨＣ２）、配列番号４０（ＨＣ３）、配列番号４１（ＨＣ４）、配列番号４２（ＨＣ５）、配列番号４３（ＨＣ６）、及び配列番号４４（ＨＣ７）から成る群より選択されるＶＨ配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％の配列同一性を有する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド複合体。
【請求項２３】
前記重鎖可変領域（ＶＨ）ドメインが、配列番号３８（ＨＣ１）、配列番号３９（ＨＣ２）、配列番号４０（ＨＣ３）、配列番号４１（ＨＣ４）、配列番号４２（ＨＣ５）、配列番号４３（ＨＣ６）、及び配列番号４４（ＨＣ７）から成る群より選択されるＶＨ配列を含んでなる、請求項２２に記載のペプチド又はペプチド複合体。
【請求項２４】
前記軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインが、配列番号３３（ＬＣ１）、配列番号３４（ＬＣ２）、配列番号３５（ＬＣ３）、配列番号３６（ＬＣ４）、及び配列番号３７（ＬＣ５）から成る群より選択されるＶＬ配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％の配列同一性を有する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド複合体。
【請求項２５】
前記軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインが、配列番号３３（ＬＣ１）、配列番号３４（ＬＣ２）、配列番号３５（ＬＣ３）、配列番号３６（ＬＣ４）、及び配列番号３７（ＬＣ５）から成る群より選択されるＶＬ配列を含んでなる、請求項２４に記載のペプチド又はペプチド複合体。
【請求項２６】
前記抗体又は結合部分が、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド複合体。
【請求項２７】
抗原結合部分が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（ｓｃＦｖ）2から成る群より選択される、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド複合体。
【請求項２８】
多特異性抗体、デュアル特異性抗体、アイソタイプ抗体、デュアル可変ドメイン抗体及び二特異性抗体から成る群より選択される、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド複合体。
【請求項２９】
ヒトＩｇＭ定常ドメイン、ヒトＩｇＧｌ定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、ドメイン、ヒトＩｇＧ４定常ドメイン、ヒトＩｇＥ定常ドメイン、及びヒトＩｇＡ定常ドメインから成る群より選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含んでなる、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド複合体。
【請求項３０】
ヒトＩｇＧ４定常ドメインを含んでなる、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド複合体。
【請求項３１】
ペプチド又はペプチド複合体が、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントを含んでなる、又はそれから成る、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド複合体
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド複合体をコードする１つ又はそれより多い核酸。
【請求項３３】
α２インテグリン関連障害若しくは疾患の処置、予防又は診断において使用するための請求項１〜３１のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド複合体。
【請求項３４】
核酸（複数を含む）がベクター内に位置している、請求項３２に記載の核酸（複数を含む）。
【請求項３５】
請求項３２又は３４に記載の核酸の１つを異種発現する、細胞。
【請求項３６】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド複合体を生産する方法であって、請求項３５に記載の細胞を該ペプチド又はペプチド複合体の発現を可能にする条件のもとで培養する工程、所望により宿主細胞から該ペプチド又はペプチド複合体を回収する工程を含んでなる、上記方法。
【請求項３７】
医薬として使用するための、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の少なくとも１つのペプチド又はペプチド複合体、及び／又は請求項３２又は３４に記載の少なくとも１つの核酸を含んでなる、医薬組成物。
【請求項３８】
α２インテグリン関連疾患又は障害、好ましくは、血栓症、血管疾患、血管新生及び転移を含むがん、炎症、炎症性疾患、自己免疫疾患及び異常な又は増加した新脈管形成によって特徴付けられる疾患、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、移植に対する反応、視神経炎、脊髄外傷、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、レイノー症候群、実験的自己免疫性脳脊髄炎、シェーグレン症候群、強皮症、心血管疾患、乾癬、及び炎症反応を誘発する感染症から成る群より選択される疾患又は障害を処置し又は予防する際に使用するための請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
血管疾患及び／又は血栓症を処置し、又は予防する際、特に、急性冠動脈症候群、経皮的冠動脈インターベンション、虚血性脳卒中、頸動脈狭窄又は末梢動脈閉塞性疾患の処置において使用するための請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
α２インテグリンの変化に関連する疾患を診断する方法であって、
ａ）α２インテグリンを含むサンプルを請求項１〜３１のいずれか１項に記載の、ペプチド又はペプチド複合体と接触させる工程；及び
ｂ）α２インテグリンの、該ペプチド又はペプチド複合体への結合を検出する工程；及び
ｃ）工程ｂ）の結合を参照と比較する工程を含んでなり、
上記において、参照と比較したサンプル中のα２インテグリン結合の変化が疾患を示している、上記方法。
【請求項４１】
ａ）包装材料、
ｂ）請求項１〜３１若しくは３３のいずれか１項に記載のペプチド若しくはペプチド複合体、又はその製薬学的に許容される塩、又は請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の医薬組成物を含んでなり、
ｃ）該ペプチド又はペプチド複合体が疾患又は障害、特に、α２インテグリン関連疾患・障害の処置に有効であることを示している、ラベル又は該包装材料内に含まれるパッケージインサート、
を含んでなる物品。
【請求項４２】
α２インテグリン関連障害若しくは疾患の診断のための診断キットであって、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド複合体、及び適切な包装、及び場合により、α２インテグリンの検出する際に該ペプチド又はペプチド複合体を使用するための適切な使用説明書を含んでなる、上記キット。
【請求項４３】
α２インテグリン関連障害若しくは疾患の処置又は診断方法であって、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の１つ又はそれより多いペプチド又はペプチド複合体、及び／又は請求項３２又は３４に記載の１つ又はそれより多い核酸又は請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の医薬組成物の１つを使用する、上記α２インテグリン関連障害若しくは疾患の処置又は診断方法。
【請求項４４】
α２インテグリンの変化に関連する疾患の診断方法であって、
ａ）個体から取得したサンプルを請求項１〜３１のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド複合体と接触させる工程；及び
ｂ）α２インテグリンのペプチド又はペプチド複合体への結合を検出する工程；及び
ｃ）工程ｂ）の結合を、１つ又はそれより多い参照サンプル中のα２インテグリンのペプチド又はペプチド複合体への結合と比較する工程；を含んでなり、
上記において、１つ又はそれより多い参照サンプル中で検出される結合と比較して取得されたサンプル中の結合の変化が、疾患を示している、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、処置、予防又は診断に使用するためのα２インテグリンに結合するペプチド又はペプチド複合体（peptide complex）、このペプチド又はペプチド複合体をコードする１つ又はそれより多い核酸、このペプチド又はペプチド複合体を作製する組み換え細胞、このペプチド又はペプチド複合体の作製方法、医薬として使用するためのこのペプチド又はペプチド複合体、あるいは核酸（複数を含む）を含んでなる医薬組成物、α２インテグリンを検出する方法及びスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インテグリンは、隣接する細胞表面の接着分子及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）間の相互作用を媒介する膜貫通タンパク質である。インテグリンは、発生、及び癒傷、細胞分化及びアポトーシスの間の細胞移動を含むいくつかの生物過程において多様な役割を演じている。こうした活性はまた、腫瘍細胞の転移及び浸潤能を調節しうる。これらは、α及びβサブユニットから成るヘテロダイマーとして存在する。いくつかのα及びβサブユニットは、互いに特異性を示し、ＶＬＡ（最晩期抗原）メンバーと呼ばれうる。ヘテロダイマーはしばしば、優先的にいくつかの細胞接着分子、又はＥＣＭ（細胞外マトリックス）の構成成分に結合する。これらは触媒活性を持たないが、インテグリンは、焦点接着斑と呼ばれる複合体をシグナル伝達する多分子の一部でありうる。
【０００３】
リガンドに結合する際に、インテグリンは、アウトサイド・インシグナル伝達（outside-in signaling）と呼ばれる、細胞内シグナルをこうした細胞接着事象に応答して細胞活性を変化させる細胞骨格に細胞内シグナルを伝達する。こうしたシグナル伝達はまた、インサイド・アウトシグナル伝達（inside-out signaling）と呼ばれる、同じ細胞で発現される他のインテグリンサブタイプを活性化しうる。インサイド・アウトシグナル伝達は更に、細胞の細胞質内に発生する、α及びβサブユニット間のクラスプ（clasp）崩壊のような制御シグナルを介して生じ、次いで受容体の細胞外リガンド結合ドメインに伝達される。インテグリンは、発生、器官形態形成、生理機能及び病理、並びに正常組織ホメオスタシス、及び免疫及び血栓応答を制御する細胞接着事象において重要な役割を演じることができ、そしてこれに加えて、それらは細胞の環境センサーとしても働くことができる。
【０００４】
インテグリンヘテロダイマーの１つに、α２β１インテグリンがある。このα２β１インテグリンは、内皮及び上皮細胞、線維茅細胞、リンパ球、及び血小板を含めて、いくつかの異なる細胞種で発現される。α２β１のリガンド特異性は、細胞種によって変化する。これは血小板及び線維芽細胞ではコラーゲン受容体として働くことができるが、内皮及び上皮細胞では、コラーゲンとラミニン受容体の双方として働くことができる。
【０００５】
α２β１インテグリンは、αインテグリンのファミリーのα２インテグリンサブユニット、及びβインテグリンのファミリーに起源するβ１インテグリンサブユニットから構成される分子である。α２及びβ１インテグリンの配列は、当技術分野において知られており、例えば、非特許文献１及び２中に公表されている。参考例配列が図９に示されており、更なる配列を、例えば、ホモ・サピエンス（homo sapiens）α２及びβ１インテグリンに対する（以下を参照されたい）、ＮＣＢＩアクセッション番号、ＮＰ＿００２１９４、ＮＭ＿００２２０３、ＮＭ＿００２２１１、ＮＰ＿００２２０２（β１インテグリンアイソフォーム１Ａ）のもとで、米国国立バイオテクノロジーセンター（ＮＣＢＩ）データベースから検索することができる。
【０００６】
非ヒト起源（例えば、げっ歯類−マウス、ラットなど−類人猿又はその他）の配列と同様に、選択的スプライシング変異、アイソフォームは、当技術分野において知られており、それらが少なくとも１つのα２又はβ１インテグリンの知られている機能を示す限り、可能性のある代替的実施態様に相当する。
【０００７】
α２サブユニットは、しばしばＩ（すなわち、挿入）−ドメインと呼ばれている、アミノ末端近くに位置しているおよそ２００アミノ酸ドメインを含むインテグリンαサブユニットのサブセットのメンバーである。α2及びインテグリンサブユニット Ｉ−ドメインを含む、多くのＩ−ドメインは、更にカチオン結合部位、金属イオン依存性接着部位（ＭＩＤＡＳ）モチーフを含んでいる。α２インテグリンＩ−ドメインの構造キャラクタリゼーションが、例えば、非特許文献３中に公表されている。Ｉ−ドメインは、リガンド結合において重要な決定因子である。ヒトα２インテグリンＩ−ドメインのアミノ酸配列は、図９から入手することができる。これについてはα２インテグリン配列（配列番号２０）中でマークがつけられている。
【０００８】
このα２β１インテグリン（最晩期抗原２；ＶＬＡ−２）は、血小板、血管内皮細胞、上皮細胞、活性化単球／マクロファージ、線維芽細胞、白血球、リンパ球、活性化好中球、及びマスト細胞を含む種々の細胞種で発現される。α２β１の自然的リガンドは、コラーゲン及びラミニンを含み、その双方とも細胞外マトリックス内に見出される。α２β１インテグリンは、サイトカイン発現の増加及び増殖をもたらす、コラーゲン誘発血小板凝集、コラーゲン上の細胞移動、コラーゲン線維の細胞依存型再組織化、並びにコラーゲン依存性細胞応答、Ｔ細胞、マスト細胞及び好中球の機能の局面、遅延型過敏・接触過敏症（delayed type hypersensitivity contact hypersensitivity）及びコラーゲン誘発関節炎の局面、乳腺管形態形成、上皮の創傷治癒、並びにＶＥＧＦ誘導血管新生に関連するプロセスを含む、いくつかの生物学的及び病理学的プロセスに関与している。
【０００９】
血小板は通常、不活性な静止状態で血中を循環する。しかしながら、これらは損傷部位では広範囲なアゴニストに迅速に応答する状態になっている。刺激によって、それらは形態変化を受け、そして、フィブリノゲン及びヴォン・ヴィレブランド因子（ｖＷｆ）、他の血小板、及び血管壁の内皮ライニングなどの血漿タンパク質と非常に反応性に富むようになる。こうした相互作用はすべて、協力して、止血のフィブリン血小板血栓を迅速に形成することが容易になる（非特許文献４）。リガンドに結合すると、血小板受容体は、アウトサイド・インシグナル経路に伝達し、該経路は次に、血小板フィブリノゲン受容体、αＩＩｂβ３インテグリンのような、血小板凝集をもたらす二次受容体（secondary receptors）の活性化をもたらす、インサイド・アウトシグナル伝達のトリガーとなる。血小板のわずかの活性化でも、血小板血栓応答、血小板減少、及び出血性合併症を生じさせうる。
【００１０】
α２インテグリンは、血小板上で発現される唯一のコラーゲン結合インテグリンであり、そして血小板吸着においてコラーゲン及び止血にある種の役割を果たすのに関与している（非特許文献５；６；７）。それ故、アルファ２インテグリン機能を不活性化することが、血小板凝集に否定的に介入するために望ましいであろう。そうした１つの阻害が、例えば、インテグリンを不活性な状態に抑え込むアロステリックな阻害になるであろう。
【００１１】
インテグリン／リガンド相互作用によって、白血球の炎症組織への血管外遊出が容易になり（非特許文献８；９；１０）、そして炎症部位における炎症誘発性細胞の移動、動員及び活性化を含む、炎症性刺激に応答して組織中に循環することに起因する白血球の初期の血管外遊出の後の、下流の事象において役割を演じている（非特許文献１１）。
【００１２】
α２インテグリンをブロックすると、関節リウマチのマウスモデル及び炎症性腸疾患モデルにおいて遅延型過敏性反応及び有効性に対して影響を示すこと（非特許文献１２；１３）、そしてインビトロにおける内皮細胞増殖及び移動を減衰させること（非特許文献１４）が報告されており、α２インテグリンをブロックすることは、種々の癌で観察されるような、異常又は正常より高い血管新生を防止／阻害しうることを示唆している。更に、ラットの結腸直腸癌手術モデルにおいてα２インテグリンの阻害は、有効な抗転移剤であることが判明した（非特許文献１５）。結腸直腸がん細胞の分化系列決定（lineage commintment）はまた、悪性の表現型から移行しうる（非特許文献１６）。α２インテグリンは、膵臓癌における悪性表現型を媒介するとみられるので（非特許文献１７、この種の浸潤型癌における治療的アプローチのこの標的としての有効性が実証されている。更に、α２β１インテグリンは、前立腺癌の進行においてスフィンゴ糖脂質と相互作用し、この相互作用をブロックすれば、この種の癌のための治療的使用に有用であろうということが示唆されている（非特許文献１８）。多発性硬化症（ＭＳ）のマウスモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）において、この疾患の発病直後にＣＮＳの臨床的症状及び炎症が抑制されることを考慮すると、α２インテグリンは、抗−α２抗体を用いる処置として重要な役割を演じていると思われる（非特許文献１９）。抗−α２抗体の治療的に有益な作用のメカニズムは、α２β１インテグリンとＣ１ｑ補体タンパク質の相互作用を阻害することによるものである可能性が最も高い。この相互作用は、マスト細胞脱顆粒及びマスト細胞活性化における第一ステップであり、これはＭＳ、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎のような自己免疫及び炎症性疾患に関与している（非特許文献２０）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Takada and Hemler J. Cell Biol. 109(1):397-407, 1989
【非特許文献２】Argraves, W.S, J. Cell. Biol. Sep 105(3): 1183-90 (1987）
【非特許文献３】Dickeson et. al., J. Biol. Chemistry, 272, 7661-7668 (1997）
【非特許文献４】Cramer, 2002 in Hemostasis and Thrombosis, 4th edition
【非特許文献５】Santoro et al., Thromb. Haemost. 74:813-821 (1995)
【非特許文献６】Vanhoorelbeke et al., Curr Drug Targets Cardiovasc. Haematol. Disord. 3(2): 125-40 (2003)
【非特許文献７】Sarratt et al., Blood 106(4): 1268-1277 (2005）
【非特許文献８】Jackson et al., J. Med. Chem. 40:3359-3368 (1997);
【非特許文献９】Gadek et al., Science 295(5557):1086-9 (2002),
【非特許文献１０】Sircar et al., Bioorg. Med. Chem. 10:2051-2066 (2002）
【非特許文献１１】Eble J. A., Curr Pharm Des. 11(7):867-880 (2005）
【非特許文献１２】Kriegelstein et al., J. Clin. Invest. 110(12):1773-82 (2002)
【非特許文献１３】de Fougerolles et al., J. Clin. Invest. 105:721-720 (2000）
【非特許文献１４】Senger et al., Am. J. Pathol. 160(1):195-204 (2002）
【非特許文献１５】van der Bji et al, Hepatology 47(2): 532-543 (2008）
【非特許文献１６】Kirkland et al J Biol Chem 283(41): 27612-27619 (2008）
【非特許文献１７】Grzesiak and Bouvet, Br J Cancer 94: 1311-1319 (2006）
【非特許文献１８】van Slambrouck et al., Int J Onco 35: 693-699 (2009）
【非特許文献１９】Tsunoda et al Brain Pathol 17:45-55 (2007)
【非特許文献２０】McCall-Culbreath et al Blood 111(3562-3570) 2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、α２インテグリンは、関心を起こさせる医薬標的である。インテグリンは、特異的な阻害剤の開発にとって困難な標的であるので、多くの異なる可能性のある治療的適応症を考慮すると、α２インテグリン関連疾患の処置に使用できるα２インテグリンに結合する代替的阻害剤、特に現存しているα２インテグリン阻害剤と比較して若干異なった特性を示すアルファ２インテグリンの阻害剤のニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の概要
この発明は、処置、予防又は診断に使用するための、α２インテグリン抗体、抗原結合性フラグメント及び他の結合分子、この結合分子をコードする１つ又はそれより多い核酸、結合分子を作製する組み換え細胞、この結合分子を作製する方法、医薬として使用するためのこの結合分子又は核酸（複数を含む）を含んでなる医薬組成物、α２インテグリンを検出する方法及びスクリーニング方法に関する。
【００１６】
この目的を達成するために、α２インテグリンに対するモノクローナル抗体が作製され、そしてその特性の有無を試験した。これは、実施例中に記載されているような有利な特性を提供する。特に、この抗α２インテグリン抗体及びその一価のフラグメント又は誘導体は、結合定数、交差反応性、ドメインマッピング及びインビトロ機能性データを含む、一連の実験データによって特徴付けられた。
【００１７】
このモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が、α２インテグリンのＩ−ドメインに、ｎＭレベルの親和性で結合し、この結合は、同様にアルファ２インテグリンＩ−ドメインを標的とする、技術水準のコンパレーター抗体（comparator antibody）によって結合するエピトープとは異なるＩ−ドメイン内のエピトープで起こることが明らかであることが見出された。この発明による抗体（ＩｇＧ４ ｍＡｂ，Ｆａｂ）の操作された分子はすべて、ビアコアによる実験（Biacore experiments）において、同程度のオン及びオフ速度（on- and off-rates）を示す。それらは、関連する種に起源する血小板を用いて試験したところ、霊長類のα２β１インテグリンと交差反応性を示したのに対して、一方マウス、ラット、イヌ、モルモット、又はウサギのα２β１インテグリンに対しては、交差反応性は検出されなかった。
【００１８】
試験分子は、組み換えα２インテグリンのインビトロでのコラーゲンとの相互作用を低いｎＭレベルのＩＣ50値で阻害する。コラーゲンの阻害に加えて、抗α２β１インテグリンｍＡＢ又はＦａｂフラグメントは、単離したヒト血小板及びヒト多血小板血漿の双方において、静止状態で、コラーゲンへの血小板粘着を阻害することができる。それらはまた、コラーゲンをコートした表面上で流動状態下の血栓形成を阻害することができる。コラーゲン結合をブロックすることができ、従ってコラーゲンへの血小板粘着を防止することは、血栓形成における最も初期のステップの１つである。
【００１９】
最後に、ｍＡｂに使用された約３０人のドナーにおいて観察されたＧＰＩＩｂＩＩＩａの活性化又はＰ−セレクチンの表面発現の増加がなかったので、ｍＡｂ又はＦａｂは、血小板活性化を引き起こさなかった。従って、この発明は、一価の抗体、抗体フラグメント又は誘導体、並びに下記に列挙されているようなα２インテグリン関連疾患の処置のための研究、診断及び治療剤を製造するためのそれらの使用を提供する；特定の例としては、血栓症、他の血管疾患、癌及び血管新生の病理学的帰結、多発性硬化症などの自己炎症性疾患が挙げられる。
【００２０】
当業者に知られているように、抗体の結合特性は、可変ドメインによって媒介される。抗原に結合する場合には、重鎖に起源する可変ドメイン及び軽鎖に起源する共作用可変ドメインが通例、抗体に存在し、共作用を可能にするために配置される。この可変ドメインはまた、ＦＶ領域とも呼ばれる。より詳細には、軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）上にそれぞれ３つある可変ループが、抗原に結合する場合に関与している。こうしたループは、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれており、ＶＬの場合のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、そしてＶＨの場合のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がある。重鎖に起源する可変ドメインの種々の異なった配置、及び軽鎖に起源する共作用可変ドメインは、当技術分野において知られている。それ故、重鎖に起源する１つ又はそれより多い適切な可変ドメイン、及び軽鎖に起源する１つ又はそれより多い共作用可変ドメインを特定することが重要であった。シーケンスアライメントによって、重鎖及び軽鎖のＣＤＲは、上記に特定されたα２インテグリン抗体と同定された。
【００２１】
第一の局面では、この発明は、ペプチド又はペプチド複合体、好ましくは、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、前記ペプチド又はペプチド複合体、抗体又はフラグメントは、ヒトα２インテグリンのＩ−ドメインに特異的に結合し、前記抗体又はフラグメントは、重鎖可変領域（ＶＨ）ドメイン及び軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインを含んでなり、前記抗体又はフラグメントは、非ヒト霊長類（non-human primate）α２インテグリンと交差反応するが、非霊長類（non-primate）α２インテグリンとは交差反応しない、前記ペプチド又はペプチド複合体、好ましくは、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントに関する。
【００２２】
第二の局面では、この発明は、ペプチド又はペプチド複合体、好ましくは、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、前記ペプチド又はペプチド複合体、抗体又はフラグメントは、ヒトα２インテグリンのＩ−ドメインに特異的に結合し、前記抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）ドメイン及び軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインを含んでなり、前記抗体又はフラグメントは、参照抗体のエピトープとの結合について参照抗体と競合し、前記参照抗体は、アクセッション番号 ＤＳＭ２３９４４にてＤＳＭＺに寄託されているプラスミドによってコードされる軽鎖、及び（ｉ）アクセッション番号 ＤＳＭ２３９４６にてＤＳＭＺに寄託されているプラスミド、又は（ｉｉ）アクセッション番号 ＤＳＭ２３９４５にてＤＳＭＺに寄託されているプラスミドのいずれかによってコードされている重鎖を含んでなる、前記ペプチド又はペプチド複合体、好ましくは、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントに関する。
【００２３】
第三の局面では、この発明は、１つ又はそれより多い下記のコンポーネントａ）〜ｆ）：
ａ）ＬＣＤＲ１［ここで、ＬＤＲ１は、ＲＡＳＥＳＶＥＳＹＧＮＳＦＩＹ（配列番号６(SEQ ID NO:6)）又はその機能的に活性な変異体である］、
ｂ）ＬＣＤＲ２［ここで、ＬＤＲ２は、ＬＡＳＮＬＡＳ（配列番号７）又はその機能的に活性な変異体である］、
ｃ）ＬＣＤＲ３［ここで、ＬＤＲ３は、ＱＱＮＮＥＤＰＹＴ（配列番号８）又はその機能的に活性な変異体である］、
ｄ）ＨＣＤＲ１［ここで、ＨＤＲ１は、ＧＹＴＦＴＳＹＷＭＮ（配列番号３）又はその機能的に活性な変異体である］、
ｅ）ＨＣＤＲ２［ここで、ＨＤＲ２は、ＲＩＤＰＳＤＳＥＴＨＹＮＱＫＦＫ（配列番号４）又はその機能的に活性な変異体である］、及び
ｆ）ＨＣＤＲ３［ここで、ＨＤＲ３は、ＶＧＲＧＹＦＤＹ（配列番号５）又はその機能的に活性な変異体である］
を含んでなるペプチド又はペプチド複合体であって、
そして上記において、１つ又はそれより多いコンポーネントａ）〜ｆ）は、ペプチド又はペプチド複合体のα２インテグリンへの結合を可能にするように配置されている、前記ペプチド又はペプチド複合体に関する。
【００２４】
第四の局面では、この発明は、α２インテグリン関連障害若しくは疾患の処置、予防又は診断に使用するための上記ペプチド又はペプチド複合体に関する。
【００２５】
第五の局面では、この発明は、この発明のペプチド又はペプチド複合体をコードする１つ又はそれより多い核酸に関する。
【００２６】
第六の局面では、この発明は、この発明の核酸の１つを異種発現（heterologously expressing）する細胞に関する。
【００２７】
第七の局面では、この発明は、この発明による細胞を、このペプチド又はペプチド複合体の発現を可能にする条件下にて培養し、そして所望によりペプチド又はペプチド複合体を宿主細胞から回収することを含んでなる、この発明のペプチド又はペプチド複合体を作製する方法に関する。
【００２８】
第八の局面では、この発明は、医薬として使用するための、この発明の少なくとも１つのペプチド又はペプチド複合体、及び／又はこの発明の少なくとも１つの核酸を含んでなる医薬組成物に関する。
【００２９】
第九の局面では、この発明は、α２インテグリンの変化に関連する疾患を診断する方法であって、
その方法が、
ａ）α２インテグリンを含むサンプルを請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド複合体と接触させることと；及び
ｂ）α２インテグリンの、このペプチド又はペプチド複合体への結合を検出することと；及び
ｃ）工程ｂ）の結合を参照と比較することを含んでなり、
上記において、参照と比較してサンプル中のα２インテグリンの結合の変化が、疾患の存在を示す、前記方法に関する。
【００３０】
第十の局面では、この発明は、以下：
ａ）包装材料、
ｂ）請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド又はペプチド複合体又はその製薬学的に許容される塩、
ｃ）ラベル又はパッケージインサート
を含んでなる製品であって、
前記インサートは前記包装材料の中に含まれ、
前記ペプチド又はペプチド複合体が疾患又は障害、特にα２インテグリン関連疾患・障害の処置に有効であることを表示している、前記製品に関する。
【００３１】
第十一の局面では、この発明は、α２インテグリン関連障害若しくは疾患を診断するための診断キットであって、該キットが、この発明のペプチド又はペプチド複合体及び適切な包装、及び場合により、α２インテグリンを検出する際に前記ペプチド又はペプチド複合体を使用するための適切な使用説明書を含んでなる、前記キットに関する。
【００３２】
第十二の局面では、この発明は、この発明の１つ又はそれより多いペプチド又はペプチド複合体及び／又はこの発明の１つ又はそれより多い核酸又はこの発明の医薬組成物の１つを使用する、α２インテグリン関連障害若しくは疾患の処置又は診断方法に関する。
【００３３】
第十三の局面では、この発明は、α２インテグリンの変化に関連する疾患の診断方法であって、その方法が、
ａ）個体から取得したサンプルをこの発明のペプチド又はペプチド複合体と接触させることと；及び
ｂ）α２インテグリンのペプチド又はペプチド複合体への結合を検出することと；及び
ｃ）工程ｂ）の結合を、１つ又はそれより多い参照サンプル中のα２インテグリンのペプチド又はペプチド複合体への結合と比較することを含んでなり、
上記において、１つ又はそれより多い参照サンプル中で検出された結合と比較して取得したサンプル中の結合の変化が、疾患を表すことを特徴とする、前記方法に関する。
【００３４】
いくつかの実施態様では、この発明は、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体又はフラグメントは、ヒトα２インテグリンのＩ−ドメインと特異的に結合し、前記抗体又はフラグメントは、重鎖可変領域（ＶＨ）ドメイン及び軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインを含んでなり、前記抗体又はフラグメントは、非ヒト霊長類α２インテグリンと交差反応するが、非霊長類とはα２インテグリンとは交差反応しない、前記単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントに関する。
【００３５】
他の実施態様では、この発明は、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体は、ヒトα２インテグリンのＩ−ドメインと特異的に結合し、前記抗体又はフラグメントは、重鎖可変領域（ＶＨ）ドメイン及び軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインを含んでなり、前記抗体又はフラグメントは、参照抗体のエピトープとの結合について参照抗体と競合し、前記参照抗体は、アクセッション番号 ＤＳＭ２３９４４にてＤＳＭＺに寄託されているプラスミドによってコードされる軽鎖、及び（ｉ）アクセッション番号 ＤＳＭ２３９４６にてＤＳＭＺに寄託されているプラスミド、又は（ｉｉ）アクセッション番号 ＤＳＭ２３９４５にてＤＳＭＺに寄託されているプラスミドのいずれかによってコードされている重鎖を含んでなる、前記単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントに関する。
【００３６】
一実施態様では、前記抗体又はフラグメントは、ヒトα２インテグリンのＩ−ドメインにｎＭレベルの結合親和性で特異的に結合する。別の実施態様では、前記抗体又はフラグメントは、インビトロでヒトα２インテグリンのコラーゲンとの相互作用を阻害し、その結果、前記血小板と前記コラーゲンの粘着による血小板の活性化を阻害する。
【００３７】
一実施態様では、前記重鎖可変領域ドメインは、配列番号５の重鎖ＨＣＤＲ３を含んでなる。別の実施態様では、前記重鎖可変領域ドメインは、配列番号３（ＨＣＤＲ１）、配列番号４（ＨＣＤＲ２）、及び配列番号５（ＨＣＤＲ３）の重鎖ＣＤＲ、又はその機能的に活性な変異体を含んでなる。一実施態様では、ＨＣＤＲ２の機能的に活性な変異体（バリアント：vriant）は、６位のアミノ酸でのＡｓｐ→Ｇｌｕの変異を含んでなる。
【００３８】
一実施態様では、この軽鎖可変領域ドメインは、配列番号８の軽鎖ＬＣＤＲ３を含んでなる。別の実施態様では、この軽鎖可変領域ドメインは、配列番号６（ＬＣＤＲ１）、配列番号７（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号８（ＬＣＤＲ３）の軽鎖ＣＤＲ、又はその機能的に活性な変異体を含んでなる。一実施態様では、ＬＣＤＲ１の機能的に活性な変異体は、１１位のアミノ酸でのＡｓｎ→Ｇｌｎの変異を含んでなる。
【００３９】
一実施態様では、重鎖可変領域（ＶＨ）ドメインは、配列番号２のＶＨ配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％の配列同一性を有している。別の実施態様では、前記重鎖可変領域（ＶＨ）ドメインは、配列番号２の配列又はその機能的に活性な変異体（functionally active thereof）を含んでなる。
【００４０】
一実施態様では、軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインは、配列番号１のＶＬ配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％の配列同一性を有する。別の実施態様では、前記軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインは、配列番号１の配列又はその機能的に活性な変異体（functionally active thereof）を含んでなる。
【００４１】
一実施態様では、重鎖可変領域（ＶＨ）ドメインは、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１７、Ｈ２０、Ｈ３８、Ｈ４０、Ｈ４３、Ｈ５５、Ｈ６１、Ｈ６５、Ｈ６６、Ｈ６７、Ｈ７６、Ｈ８１、Ｈ８２、Ｈ８７、Ｈ９１、Ｈ９３、Ｈ１１２、Ｈ１１３及びＨ１１６から成る群より選択される位置における１つ又はそれより多いアミノ酸置換を含んでなる。一実施態様では、この１つ又はそれより多いアミノ酸置換は、５Ｈｉｓ→Ｖａｌ、７Ｐｒｏ→Ｓｅｒ、１１Ｌｅｕ→Ｖａｌ、１２Ｖａｌ→Ｌｙｓ、１７Ｐｒｏ→Ｓｅｒ、２０Ｌｅｕ→Ｖａｌ、３８Ｌｙｓ→Ａｒｇ、４０Ａｒｇ→Ａｌａ、４３Ａｒｇ→Ｇｌｎ、５５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、６１Ａｓｎ→Ａｌａ、６５Ｌｙｓ→Ｇｌｎ、６６Ａｓｐ→Ｇｌｙ、６７Ｌｙｓ→Ａｒｇ、７６Ｓｅｒ→Ｔｈｒ、８１Ｉｌｅ→Ｍｅｔ、８２Ｇｌｎ→Ｇｌｕ、８７Ｔｈｒ→Ａｒｇ、９１Ｓｅｒ→Ｔｈｒ、９３Ｖａｌ→Ｌｙｓ、１１２Ｔｈｒ→Ｌｅｕ、１１３Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び１１６Ｓｅｒ→Ｖａｌから成る群より選択される。
【００４２】
一実施態様では、軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインは、Ｌ９、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ２２、Ｌ３４、Ｌ４６、Ｌ４７、Ｌ８０、Ｌ８３、Ｌ８５、Ｌ８７、及びＬ８９から成る群より選択される位置における１つ又はそれより多いアミノ酸置換を含んでなる。一実施態様では、この１つ又はそれより多いアミノ酸置換は、９Ａｌａ→Ｓｅｒ、１２Ａｌａ→Ｓｅｒ、１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ、１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ、２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ、３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ、４６Ｇｌｎ→Ｌｙｓ、４７Ａｌａ→Ｐｒｏ、８０Ａｓｐ→Ａｓｎ、８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、８７Ａｌａ→Ｔｈｒ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎから成る群より選択される。
【００４３】
一実施態様では、重鎖可変領域（ＶＨ）ドメインは、配列番号３８（ＨＣ１）、配列番号３９（ＨＣ２）、配列番号４０（ＨＣ３）、配列番号４１（ＨＣ４）、配列番号４２（ＨＣ５）、配列番号４３（ＨＣ６）、及び配列番号４４（ＨＣ７）から成る群より選択されるＶＨ配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％の配列同一性を有する。別の実施態様では、重鎖可変領域（ＶＨ）ドメインは、配列番号３８（ＨＣ１）、配列番号３９（ＨＣ２）、配列番号４０（ＨＣ３）、配列番号４１（ＨＣ４）、配列番号４２（ＨＣ５）、配列番号４３（ＨＣ６）、及び配列番号４４（ＨＣ７）から成る群より選択されるＶＨ配列を含んでなる。
【００４４】
一実施態様では、軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインは、配列番号３３（ＬＣ１）、配列番号３４（ＬＣ２）、配列番号３５（ＬＣ３）、配列番号３６（ＬＣ４）、及び配列番号３７（ＬＣ５）から成る群より選択されるＶＬ配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％の配列同一性を有する。別の実施態様では、軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインは、配列番号３３（ＬＣ１）、配列番号３４（ＬＣ２）、配列番号３５（ＬＣ３）、配列番号３６（ＬＣ４）、及び配列番号３７（ＬＣ５）から成る群より選択されるＶＬ配列を含んでなる。
【００４５】
一実施態様では、抗体、又はその結合部分は、キメラ抗体又はヒト化抗体である。別の実施態様では、抗原結合部分は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ジスルフィドにより連結されたＦｖ、ｓｃＦｖ、及び（ｓｃＦｖ）2から成る群より選択される。別の実施態様では、抗体又は結合部分は、多（重）特異性抗体（multispecific antibody）、デュアル特異性抗体（dual specific antibody）、アイソタイプ抗体（isotype antibody）、デュアル可変ドメイン抗体（dual variable domain antibody）及び二（重）特異的抗体（bispecific antibody）から成る群より選択される。別の実施態様では、抗体又は結合部分は、ヒトＩｇＭ定常ドメイン、ヒトＩｇＧｌ定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、ドメイン、ヒトＩｇＧ４定常ドメイン、ヒトＩｇＥ定常ドメイン、及びヒトＩｇＡ定常ドメインから成る群より選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含んでなる。一実施態様では、抗体又は結合部分は、ヒトＩｇＧ４定常ドメインを含んでなる。
【００４６】
別の局面では、本発明は、本発明の抗体又は抗原結合部分のアミノ酸配列をコードする核酸を提供する。別の局面では、本発明は、この核酸を含んでなる組み換え発現ベクターを提供する。別の局面では、本発明は、組み換え発現ベクターを含んでなる宿主細胞を提供する。別の局面では、本発明は、抗体又は抗原結合性フラグメントを作製する方法であって、抗体が宿主細胞によって作製されるような条件下にて宿主細胞を培養することを含んでなる、前記方法を提供する。
【００４７】
別の局面では、本発明は、この抗体、又は抗原結合部分と、１つ又はそれより多い製薬学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物を提供する。別の局面では、本発明は、α２インテグリン関連障害若しくは疾患を処置し、予防し、又は診断する方法であって、その方法が、当該医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、前記方法を提供する。一実施態様では、このα２インテグリン関連疾患若しくは障害は、血栓症、血管疾患、血管新生及び転移を含む癌、炎症、炎症性疾患、自己免疫疾患及び異常な又は増加した新脈管形成によって特徴付けられる疾患、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、グラフティングに対する反応、視神経炎、脊髄外傷、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、レイノー症候群、実験的自己免疫性脳脊髄炎、シェーグレン症候群、強皮症、心血管疾患、乾癬、及び炎症反応を誘発する感染症から成る群より選択される。別の実施態様では、このα２インテグリン関連疾患若しくは障害は、急性冠動脈症候群、経皮的冠動脈インターベンション、虚血性脳卒中、頸動脈狭窄又は末梢動脈閉塞性疾患から成る群より選択される。
【００４８】
本発明の詳細な説明
定義
この発明を下記に詳細に述べる前に、この発明は、本明細書中に述べられている具体的な方法、プロトコル及び試薬に限定されることがない（こうしたものは変化しうるからである）ことが理解されるべきである。また、本明細書中で使用されている用語は、単に具体的な実施態様を述べることを目的にしているにすぎないものであり、そしてこの発明の範囲を制限することを意図しているものではなく、もっぱら添付した特許請求の範囲に限って制限されるであろうことが理解されるべきである。別途明記しない限り、本明細書中で使用されている技術的及び科学的用語はすべて、通例、この発明が属している技術分野における当業者によって理解されるのと同じ意味を有する。
【００４９】
好ましくは、本明細書中で使用されている用語は、“バイオテクノロジー用語のマルチリンガル辞典：（ＩＵＰＡＣ勧告）（A multilingual glossary of biotechnological terms):(IUPAC Recommendations））”，Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. 及び Koelbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland）中の記載と同様に定義される。
【００５０】
この明細書および下記の特許請求の範囲を通して、文脈上別の解釈をする必要のある場合を除き、語“含んでなる（comprise）”、並びに“含んでなる（comprises）”、“含んでなる（comprising）”などのその変形形態は、指定された１つの整数若しくはステップ（step）又は一群の整数若しくはステップを包含することを意味するが、それ以外の整数若しくはステップ又は一群の整数又はステップを除外することを意味しているものではないことは理解されるところである。
【００５１】
いくつかのドキュメント（例えば：特許、特許出願、科学出版物、製造業者の仕様書、使用説明書、ジェンバンクアクセッション番号シーケンスサブミッション（GenBank Accession Number sequence submissions）など）が、この明細書のテキストの全体を通して引用されている。先行発明を根拠にしてこうした開示よりも本発明のほうが前であるという権利がないということを本明細書中で承認したものであるといかなる場合でも解釈されてはならない。本明細書中で引用されているいくつかのドキュメントは、“参照によって組み込まれる（incorporated by reference）”ものとして特徴づけられている。こうした組み込まれた参照の定義又は教示と、この明細書中で説明されている定義又は教示の間で矛盾が存在した場合には、この明細書のテキストが優先される。
【００５２】
配列：本明細書中で言及している配列はすべて、全内容及び開示と共に、添付の配列表に開示されており、該配列表は本明細書の一部である。
【００５３】
用語“約（about）”は、数値と関連して使用される際には、表示されている数値と比較して５％小さい下限を有し、そして表示されている数値と比較して５％大きい上限を有する範囲内の数値を包含することを意図している。
【００５４】
本明細書中で使用される際には、用語“アルファ２インテグリン（alpha 2 integrin）”又は“ａ２インテグリン（a2 integrin）”とは、当技術分野において知られているアルファ２インテグリン、好ましくはヒトアルファ２インテグリン、特に、配列番号２１で示される核酸配列、及び配列番号２０のアミノ酸配列を有するヒトアルファ２インテグリン、又はその生物学的に活性なフラグメントを意味する。用語“Ｉ−ドメイン（I domain）”とは、アルファ２インテグリンの一部分を意味し、これは配列番号２０の中で下線が引かれており、そしてボールド体でタイプされている。
【００５５】
用語“特異的に結合する（specifically binds）”、“特異的結合（specific binding）”などは、このペプチド又はペプチド複合体、例えば、抗体又はその抗原結合フラグメントが、生理学的条件下にて比較的安定である、抗原との複合体を形成する。特異的結合は、多くとも（at least）約１×１０-6Ｍ以下（例えば、より小さいＫDはより強い結合を示す）の平衡解離定数によって特徴付けられうる。２つの分子が特異的に結合するかどうかを決定する方法は、当技術分野において周知であり、そして例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などを含む。しかしながら、アルファ２インテグリンに特異的に結合する単離された抗体は、他の種に起源するアルファ２インテグリン分子などの他の抗原と交差反応性を示しうる。例えば、ある種の実施態様では、本発明のアルファ２インテグリン−特異的抗体は、ヒト及び非ヒト霊長類双方のアルファ２インテグリンに非特異性抗原（例えば、非霊長類アルファ２インテグリン）に対するその親和性と比較して少なくとも２倍高い親和性で結合する。更に、アルファ２インテグリン及び１つ又はそれより多い更なる抗原に結合する多特異性抗体（例えば、二特異性）については、本明細書中で使用される際には、その場合でも、アルファ２インテグリンに“特異的に結合する（specifically bind）”抗体であると見なされる。
【００５６】
本明細書中で使用される際には、用語“ＫD”は、特定のペプチド／ペプチド複合体と標的分子、又は抗体と抗原の相互作用の平衡解離定数を意味することを意図している。平衡解離定数は通例、“ｍｏｌ／Ｌ”（“Ｍ”と短縮）の形で測定される。
【００５７】
用語“スローオフレート（slow off rate）”、“Ｋoff”又は“ｋｄ”では、表面プラズモン共鳴、例えば、BIACORE（商標）によって測定して、１×１０-3ｓ-1より小さい、好ましくは、１×１０-4ｓ-1より小さい速度定数でアルファ２インテグリンから解離するペプチド／ペプチド複合体又は抗体を意味する。
【００５８】
用語“高親和性（high affinity）”抗体とは、表面プラズモン共鳴、例えば、BIACORE（商標）又は溶液親和性ELISAで測定して、少なくとも１０-10Ｍ；好ましくは、１０-11Ｍ；更により好ましくは、１０-12Ｍのヒトアルファ２インテグリンに結合親和性を有するそうしたｍＡｂを意味する。
【００５９】
本明細書中で使用される用語“表面プラズモン共鳴（surface Plasmon resonance）”は、例えば、BIACORE（商標）システム（Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and
Piscataway, N.J.）を用いて、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度変化の検出により、リアルタイム生体特異的相互作用の解析を可能にする光学現象を意味する。
【００６０】
抗原決定基とも呼ばれている“エピトープ（epitope）”とは、免疫システムによって、具体的には、抗体、Ｂ細胞、又はＴ細胞によって認識される抗原の領域を意味する。本明細書中で使用される際には、“エピトープ”は、本明細書中に述べられている抗体又はその抗原結合性フラグメントに結合することができる抗原の一部分である。これに関連して、用語“結合（binding）”は、好ましくは、本明細書中に定義されている“特異的結合（specific binding）”に関する。エピトープは通例、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、又はスルホニル基などの分子の化学的活性表面系列から成り、特異的３次元構造特性、及び／又は特異的荷電特性を有しうる。コンフォメーションエピトープ及び非コンフォメーションエピトープは、変性溶媒の存在下において前者への結合は失われるが、後者への結合は失われないという点において区別されうる。
【００６１】
“パラトープ（paratope）”は、エピトープに特異的に結合する抗体の一部分である。
【００６２】
本明細書中で使用される際には、用語“抗体（antibody）”とは、ジスルフィド結合によって相互に連結した４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖から構成される免疫グロブリン分子を意味することを意図している。用語“抗体（antibody）”はまた、下記に述べられている、抗体、具体的には、本明細書中に述べられている抗体、例えば、原核生物において発現される抗体、非グリコシル化抗体並びに任意の抗原結合性抗体フラグメント及び誘導体のすべての組み換え形態を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（“ＨＣＶＲ”又は“ＶＨ”）及び重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインから構成される）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（“ＬＣＶＲ”又は“ＶＬ”）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。このＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域が組み入れられている、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に更に細分されうる。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫システムの種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的な補体システムの最初のコンポーネント（Ｃ１ｑ）を含む、免疫グロブリンの宿主組織又は因子への結合を媒介することができる。
【００６３】
この発明に関しては、用語「アルファ２抗体」、「ａ２抗体」、「α２抗体」、「アルファ２インテグリン抗体」、「ａ２インテグリン抗体」、「α２インテグリン抗体」は、同意語として使用され、そして、好ましくは、阻害性、すなわち、抗（アルファ２抗体、ａ２抗体、α２抗体、アルファ２インテグリン抗体、ａ２インテグリン抗体、α２インテグリン抗体）を意味している。
【００６４】
１つ又はそれより多いＣＤＲ残基の置換又は１つ又はそれより多いＣＤＲの脱落もまた可能である。１つ又は２つのＣＤＲが結合のために省くことができる抗体は、科学文献に記載されている。Padlan et al. (1995 FASEB J. 9:133-139)は、公表された結晶構造に基づいて、抗体とそれらの抗原間の接触領域を解析し、ＣＤＲ残基の約１／５〜１／３だけが実際に抗原と接触していると結論した。Padlanはまた、１つ又は２つのＣＤＲが、抗原と接触するアミノ酸を持たない多くの抗体を見出した（Vajdos et al. 2002 J Mol Biol 320:415-428も参照）。
【００６５】
抗原と接触していないＣＤＲ残基は、ChothiaＣＤＲ外にあるKabatＣＤＲの領域から、分子モデリングにより及び／又は経験的に、以前の研究（例えば、ＣＤＲＨ２中の残基Ｈ６０〜Ｈ６５は頻繁には必要とされない）に基づいて同定することができる。ＣＤＲ又はその残基が脱落している場合、それは通例、別のヒト抗体配列又はこのような配列のコンセンサス中で相当する位置を占有するアミノ酸で置換される。ＣＤＲ内の置換位置及び置換するアミノ酸はまた、経験的に選択することもできる。経験的置換は保存的置換であっても、それとも非保存的置換であってもよい。
【００６６】
本明細書中で使用される際には、用語、抗体の“抗原結合性フラグメント（antigen-binding fragment）”（又は単に“結合部分（binding portion）”）とは、アルファ２インテグリンに特異的に結合する能力を保持する１つ又はそれより多い抗体のフラグメントを意味する。抗体の抗原結合性機能は、全長抗体フラグメントによって行われうることが示されている。抗体の用語“抗原結合性フラグメント（antigen-binding fragment）”内に包含される結合性フラグメントの例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨドメインから成る一価のフラグメントであるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメントであるＦ（ａｂ’）2フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨドメインから成るＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アーム（single arm）のＶＬ及びＶＨドメインから成るＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインから成るｄＡｂフラグメント（Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、並びに（ｖｉｉ）場合により合成リンカーによって連結されていることもありうる２つ又はそれより多い単離されたＣＤＲの組み合わせが含まれる。更に、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは別個の遺伝子によりコードされているが、それらは組み換え方法を使用して、合成リンカーにより連結することができ、該合成リンカーによって、ＶＬ及びＶＨ領域がペアーとなって一価分子を形成する１つのタンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と呼ばれている；例えば、Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; 及び Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883参照）としてそれらが作製されることが可能となる。こうした単鎖抗体もまた、抗体の用語“抗原結合性フラグメント（antigen-binding fragment）”内に包含されていることが意図されている。更なる例は、（ｉ）免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドに融合された結合ドメインポリペプチド、（ｉｉ）ヒンジ領域に融合された免疫グロブリンの重鎖ＣＨ２定常領域、及び（ｉｉｉ）ＣＨ２定常領域に融合された免疫グロブリンの重鎖ＣＨ３定常領域を含んでなる結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である。結合ドメインポリペプチドは、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域でありうる。結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質は、更にＵＳ ２００３／０１１８５９２及びＵＳ ２００３／０１３３９３９中に開示されている。こうした抗体フラグメントは、当技術分野における当業者に知られている従来から行われている手法を用いて得られ、そしてフラグメントがインタクト抗体であるのと同様の方法で、有用性の有無がスクリーニングされる。“抗原結合性フラグメント（antigen-binding fragment）”の更なる例には、いわゆるマイクロ抗体があり、該マイクロ抗体は、１つのＣＤＲ（single ＣＤＲ）から誘導される。例えば、Heapらは、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０エンベロープグリコプロテインを対象とする抗体の重鎖ＣＤＲ３から誘導される１７アミノ酸残基マイクロ抗体を記載している（Heap CJ et al. (2005) J. Gen. Virol. 86:1791-1800）。他の例には、好ましくは、同属フレームワーク領域（cognate framework regionｓ）によって、互いに融合した２つ又はそれより多いＣＤＲ領域を���んでなる小分子擬似抗体が含まれる。同属ＶＨＦＲ２によって連結されたＶＨＣＤＲ１及びＶＬＣＤＲ３を含んでなる、こうした小分子擬似抗体は、によって記載されているQiu et al. (Qiu X-Q, et al. (2007) Nature biotechnology 25(8):921-929）。
【００６７】
従って、本明細書中で使用される際には、用語“抗体又はその抗原結合性フラグメント（antibody or antigen-binding fragment thereof）”とは、免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を意味する。
【００６８】
本発明において使用できる抗体及びその抗原結合性フラグメントは、鳥類及び哺乳類を含む任意の動物に起源しうる。好ましくは、抗体又はフラグメントは、ヒト、チンパンジー、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、モルモット、又はウサギ）、ニワトリ、七面鳥、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ウシ、ウマ、ロバ、ネコ、又はイヌ起源である。抗体は、ヒト又はマウス起源のものであることが特に好ましい。本発明の抗体はまた、１つの種、好ましくは、ヒト由来の抗体定常領域が、別の種、例えば、マウス由来である抗原結合部位と組み合わされるキメラ分子を含む。更に、本発明の抗体は、非ヒト種（例えば、マウスから）由来の抗体の抗原結合部位がヒト起源の定常及びフレームワーク領域と組み合わされるヒト化分子を含む。
【００６９】
本明細書中で例示されているように、本発明の抗体は、抗体を発現するハイブリドーマから直接得ることができ、あるいは宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、又はリンパ球細胞）中にクローニングし、そして組み換え技術によって発現させることができる。宿主細胞の更なる例には、大腸菌（E.coli）などの微生物、及び酵母などの真菌がある。あるいは、それらはトランスジェニック非ヒト動物又は植物で組み換え技術によって作製することができる。
【００７０】
用語“キメラ抗体（chimeric antibody）”とは、重鎖及び軽鎖のそれぞれのアミノ酸配列の一部が、特定の種に由来するか、又は特定のクラスに属する抗体の対応する配列と相同であるが、残りのセグメントの鎖は別の種又は部類における対応する配列と相同である、そうした抗体を意味する。通例、軽鎖及び重鎖双方の可変領域は、哺乳類の１種に由来する抗体の可変領域を模倣するが、定常部分は別のものに由来する抗体の配列と相同である。こうしたキメラ型の１つの明白な利点は、この可変領域が非ヒト宿主生物からの容易に利用可能なＢ細胞又はハイブリドーマを、例えば、ヒト細胞の調製物から誘導される定常領域と組み合わせて用い、現在知られている源から好都合にも誘導することができるということである。この可変可変領域は、調製が容易であるという利点を有しており、そしてその特異性はその源に影響を受けず、この定常領域がヒトであるということは、この抗体を注入されたときに、非ヒト源からの定常領域と比較してヒト対象からの免疫応答を引き出す可能性が高くない。しかしながら、定義ではこうした特定の例には限定されない。
【００７１】
用語“ヒト化（ヒト型化）抗体（humanized antibody）”は、非ヒト種からの免疫グロブリンから実質的に誘導される抗原結合部位を有する分子であって、この分子の残りの免疫グロブリン構造は、ヒト免疫グロブリン構造の及び／又は配列に基づいている分子を意味する。この抗原結合部位は、定常ドメインに融合した完全可変ドメインを含む場合もあり、あるいはその可変ドメイン内の適切なフレームワーク領域にグラフティングされた相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを含む場合もある。抗原結合部位は、野生型である場合もあり、または１つ又はそれより多いアミノ酸置換によって修飾されている、例えば、ヒト免疫グロブリンに更によりそっくり類似するように修飾されている場合もある。ヒト化抗体の一部の形態は、ＣＤＲ配列をすべて保存する（例えば、マウス抗体に起源する６つＣＤＲすべてを含むヒト化マウス抗体）。他の形態は、オリジナル抗体に対して変更されている１つ又はそれより多いＣＤＲを有する。
【００７２】
ヒト化抗体の場合の種々の方法は当業者に知られており、Almagro及びFranssonによってレビューされており、その内容は、全体として引用によって本明細書中に組み込まれる（Almagro JC and Fransson J (2008) Frontiers in Bioscience 13:1619-1633）。Almagro及びFranssonは、合理的なアプローチと経験的アプローチを区別している。合理的なアプローチは、操作設計抗体のわずかの変異体（variants）を作製し、そしてそれらの結合、又は他の関心のある特性を評価することによって特徴づけられる。設計された変異体が予測結果を生みださない場合には、新たな設計サイクル及び結合評価が開始される。合理的なアプローチには、ＣＤＲグラフティング、再表面化（Resurfacing）、超ヒト化（Superhumanization）、及びヒトストリング内容最適化（Human String Content Optimization）が含まれる。それにひきかえ、経験的アプローチは、ヒト化変異体の大規模ライブラリーの作成、及び豊富なテクノロジー又はハイスループットスクリーニングを用いる最も良いクローンの選択に基づいている。従って、経験的アプローチは、抗体変異体の広いスペース全体をサーチすることができる信頼できる選択及び／又はスクリーニングシステムに依存している。ファージディスプレイ及びリポソームディスプレイなどのインビトロディスプレイテクノロジーによって、こうした要件が実現され、当業者に周知である。経験的アプローチには、ＦＲライブラリー、セレクションガイド（Guided selection）、フレームワークシャフリング（Framework-shuffling）及びヒューマニアリング（Humaneering）が含まれる。
【００７３】
本明細書中で使用される際には、用語“ヒト抗体（human antibody）”は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むことを意図している。本発明のヒトｍＡｂは、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３において、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含むことができる（例えばインビトロでのランダム若しくは部位特異的突然変異誘発またはインビボでの体細胞変異によって誘導される変異体）。しかしながら、本明細書中で使用される際には、用語“ヒト抗体（human antibody）は、別の哺乳類種（例えば、マウス）の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列が、ヒトＦＲ配列にグラフティングされたｍＡｂを含むことは意図していない。本発明のヒト抗体は、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、又は例えば、Kucherlapati及びJakobovitsによる米国特許第５，９３９，５９８号中に記載されているような、内因性免疫グロブリンを発現しないが、１つ又はそれより多いヒト免疫グロブリンを産生するトランスジェニック動物から単離された抗体を含む。
【００７４】
本明細書中で使用される際には、用語“モノクローナル抗体（monoclonal antibody）”とは、単一の分子構成物の抗体分子の調製物を意味する。モノクローナル抗体は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示す。一実施態様では、このモノクローナル抗体は、非ヒト動物、例えば、マウスから得られる、不死化細胞と融合したＢ細胞を含むハイブリドーマによって作製される。
【００７５】
本明細書中で使用される際には、用語“組み換え抗体（recombinant antibody）”とは、組み換え手段によって調製され、発現され、作製され又は単離されるすべての抗体、例えば（ａ）免疫グロブリン遺伝子におけるトランスジェニック動物またはトランスクロモソーマル（transchromosomal）動物（例えばマウス）あるいはそれから調製されるハイブリドーマから単離される抗体、（ｂ）形質転換されることで抗体を発現する宿主細胞、例えばトランスフェクトーマ（transfectoma）から単離される抗体、（ｃ）組換えられたコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離される抗体、及び（ｄ）免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む他の任意の手段により調製、発現、作製または単離される抗体を含む。
【００７６】
本明細書中で使用される際には、用語 “トランスフェクトーマ（transfectoma）”は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、植物細胞、又は酵母細胞を含む真菌などの抗体を発現する組換え真核生物宿主細胞を含む。
【００７７】
本明細書中で使用される際には、“異種抗体（heterologous antibody）”は、こうした抗体を産生するトランスジェニック生物に関して定義される。この用語は、トランスジェニック生物から構成されない生物において見出されるものに相当するアミノ酸配列又はコード核酸配列を有し、一般にそのトランスジェニック生物以外の種に由来する抗体を意味する。
【００７８】
本明細書中で使用される際には、“ヘテロハイブリッド抗体（heterohybrid antibody）”は、異なる生物起源の軽鎖と重鎖を有する抗体を意味する。例えば、マウス軽鎖と結合したヒト重鎖を有する抗体はヘテロハイブリッド抗体である。
【００７９】
従って、この発明において使用するのに適切な“抗体及びその抗原結合性フラグメント（antibodies and antigen-binding fragments thereof）”には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一価抗体、二特異性抗体、ヘテロコンジュゲート（heteroconjugate）抗体、多特異性抗体、組み換え抗体、異種抗体、ヘテロハイブリッド抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体（特に、ＣＤＲグラフティング）、脱免疫化（deimmunized）抗体又はヒト抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’ フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって作製されるフラグメント、Ｆｄ、Ｆｖ、ジスルフィドにより連結されたＦｖｓ（ｄｓＦｖ）、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（diabodies）又はテトラボディ（tetrabodies）（Holliger P. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90(14), 6444-6448）、ナノボディ（nanobodies）（単一ドメイン抗体とも呼ばれている）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、及び上記のもののいずれかのエピトープ結合フラグメントが含まれるが、これらに限定されない。
【００８０】
本明細書中に述べられている抗体は、好ましくは単離されている。本明細書中で使用される際には、“単離された抗体（isolated antibody）”は、種々の抗原特異性を有する他のｍＡｂを実質的に含まない抗体を意味することを意図している（例えば、アルファ２インテグリンに特異的に結合する単離された抗体は、アルファインテグリン以外の抗原に特異的に結合するｍＡｂを実質的に含まない）。しかしながら、アルファ２インテグリンに特異的に結合する単離された抗体は、他の種に起源するアルファ２インテグリン分子のような他の抗原と交差反応を有する場合もありうる。
【００８１】
本明細書中で使用される際には、用語“アルファ２インテグリンの生物学的機能又は機能（biological function or function of alpha 2 integrin）”は、同意語として使用され、そして以下のようなアルファ２インテグリンのいずれかの機能を意味するが、それらに限定されない：ベータ１インテグリンとの結合及びベータ１インテグリンと複合体の形成、コラーゲン、ラミニンとの結合のような知られているリガンドのいずれかとの結合、コラーゲン誘導性血小板凝集、血栓応答の惹起、血小板減少、コラーゲン上の細胞移動（cell migration on collagen）、コラーゲン繊維の細胞依存性再組織化（cell-dependent reorganization of collagen fibers）、サイトカイン発現及び増殖の増加をもたらすコラーゲン依存性細胞応答（collagen-dependent cellular resonses resulting in increases in cytokine expression and proliferation）、Ｔ細胞のアルファ２インテグリン又はコラーゲン依存性側面、マスト細胞又は好中球機能、遅延型過敏症のアルファ２インテグリン又はコラーゲン依存性側面（collagen-dependent aspects of delayed type hypersensitivity）、接触過敏症のアルファ２インテグリン又はコラーゲン依存性側面（collagen-dependent aspects of contact hypersensitivity）、コラーゲン誘導性関節炎、乳腺腺管形態形成（mammary gland ductal morphogenesis）、表皮性創傷治癒、及びＶＥＧＦ誘導性血管新生に関連するプロセス。
【００８２】
本明細書中で使用される際には、“アルファ２インテグリンアンタゴニスト（alpha 2 integrin antagonist）”とは、アルファ２インテグリンの少なくとも１つの生物学的活
性、好ましくは、血液血小板、血管内皮細胞、上皮細胞、活性化単球／マクロファージ、線維芽細胞、白血球、リンパ球、活性化好中球及び／又はマスト細胞（特に化学量論量で使用される際）上に存在するアルファ２インテグリンの活性を阻害する化合物を意味する。この発明の好ましいアルファ２アンタゴニストは、中和抗体である。
【００８３】
本明細書中で使用される際には、“中和抗体（neutralizing antibody）”（又は“アルファ２インテグリン活性を中和する抗体（antibody that neutralizes alpha 2 integrin activity）”は、そのアルファ２インテグリンへの結合が、アルファ２インテグリンの少なくとも１つの生物学的活性の阻害をもたらす、好ましくは、アルファ２インテグリンの血小板を活性化する活性を阻害する、抗体を意味することを意図している。アルファ２インテグリンの生物学的活性のこの阻害は、当技術分野において知られているいくつかの標準的なインビトロ又はインビボアッセイのうちの１つ又は複数により、アルファ２インテグリン生物学的活性の１つ又はそれより多いインジケーターを測定することによって評価することができる。こうしたアッセイの例は、例えば、この発明の実施例に記載されている。
【００８４】
アルファ２インテグリンは、上記に列挙したような機能を有しているので、アルファ２インテグリンの活性は、血小板活性の増加に関連するようないくつかの疾患に作用を有する。従って、アルファ２インテグリンを標的とし、又は抗アルファ２インテグリン抗体を中和する阻害性ペプチド又はペプチド複合体、又はその抗原結合性フラグメントなどのアルファ２インテグリンアンタゴニストは、血小板活性などのアルファ２インテグリンの作用を減少させ、又は阻害するのに有用である。それ故、アルファ２インテグリンアンタゴニストは、血栓症、血管疾患、血管新生及び転移を含む癌、炎症、炎症性疾患、自己免疫疾患及び異常な又は増加した新脈管形成によって特徴付けられる疾患、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、移植に対する反応、視神経炎、脊髄外傷、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、レイノー症候群、実験的自己免疫性脳脊髄炎、シェーグレン症候群、強皮症、心血管疾患、乾癬、及び炎症反応を誘発する感染症を含む（これらには限定されない）、いくつかのそうした疾患を軽減し、改善し、抑制し、又は予防するために有用である。
【００８５】
特定の実施態様では、本明細書中で述べられている抗アルファ２インテグリン抗体又はその抗原結合性フラグメントは、サイトトキシン、化学療法剤、免疫抑制剤又は放射性同位体などの治療モイエティ（“イムノコンジュゲート（immunoconjugate）”）にコンジュゲートすることができる。
【００８６】
“保存的アミノ酸置換（conservative amino acid substitution）”とは、アミノ酸残基が類似の化学特性（例えば、電荷又は疎水性）を持つ側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されることである。一般的に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変化させない。２つ又はそれよりより多いアミノ酸配列が互いに保存的置換によって異なる場合には、類似性のパーセント又は程度は、置換の保存的性質を修正するために上方調整されうる。この調整手段は、当技術分野の当業者に周知である。例えば、Pearson (1994) Methods MoI. Biol. 24: 307- 331を参照されたい。類似の化学特性を有する側鎖を有するアミノ酸のグループの例には、以下が含まれる：
１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン；
２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリン及びトレオニン；
３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン；
４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン；
５）塩基性側鎖：リシン、アルギニン、及びヒスチジン；
６）酸性側鎖：アスパルギン酸（アスパルテート：aspartate）及びグルタミン酸（グルタメート：glutamate）、及び
７）硫黄含有側鎖：システイン及びメチオニン。
【００８７】
好ましい保存的アミノ酸置換基は以下である：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸（グルタメート：glutamate）−アスパルギン酸（アスパルテート：aspartate）、及びアスパラギン−グルタミン。あるいは保存的置換（conservative replacement）は、Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-45中に開示されているＰＡＭ２５０対数尤度行列において正の値を有する任意の変化である。“中等度に保存的（moderately conservative）”置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度行列において負でない値を有する任意の変化である。知られている遺伝コード、及び組み換え及び合成ＤＮＡ手法を考慮すると、熟練した科学者であれば、容易に保存的なアミノ酸変異体をコードするＤＮＡを構築することができる。
【００８８】
本明細書中で使用される際には、“非保存的置換（non-conservative substitutions）”又は“非保存的アミノ酸交換（non-conservative amino acid exchanges）”は、上記に示した７つの標準的アミノ酸グループ、１）〜７）の異なるグループ中に列挙されている別のアミノ酸によるアミノ酸の交換として定義される。
【００８９】
核酸又はそのフラグメントに言及する際に、用語“実質的同一性（substantial identity）”又は“実質的に同一な（substantially identical）”とは、適切なヌクレオチドの挿入又は欠失を別の核酸（又はその相補鎖）と最適にアライメントするときに、下記に議論されているように、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ又はＧＡＰなどの配列同一性の周知のアルゴリズムによって測定して、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９０％、そしてより好ましくは、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のヌクレオチド配列同一性があるということを示す。
【００９０】
ポリペプチドに適用される際には、用語“実質的類似性（substantial similarity）”又は“実質的に類似な（substantially similar）”とは、例えば、デフォルトギャップウェイト（default gap weights）を用いてプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによって最適にアライメントされるときに、２つのペプチド配列は、少なくとも９０％の配列同一性、更により好ましくは、少なくとも９５％、９８％又は９９％の配列同一性を分かち合う。好ましくは、同一ではない残基部分は、保存的アミノ酸置換によって異なる。
【００９１】
ポリペプチドの場合の配列類似性は通例、配列解析ソフトウェアを用いて測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む、種々の置換、欠失及び他の改変に割り当てられた類似性の基準を用いて類似配列をマッチングさせる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、密接に関連するポリペプチド、例えば、異なる生物種に起源するか、あるいは野生型タンパク質とそのミューテイン（mutein）の間の相同ポリペプチドの間の配列相同性又は配列同一性を決定するためにデフォルトパラメーターを用いて使用しうるＧＡＰ及びＢＥＳＴＦＩＴなどのプログラムを含む。例えば、GCG Version 6.1を参照。ポリペプチド配列はまた、ＦＡＳＴＡを用いてデフォルト又は推奨されるパラメーターと比較することができる；GCG Version 6.1．ＦＡＳＴＡのプログラム（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）によって、クエリー（query）及びサーチ配列（Pearson (2000）前掲）間のベストオーバーラップ（best overlap）領域のアライメント（alignment）及び配列同一性パーセントが可能となる。本発明の配列を異なる生物に起源する多くの数の配列を含むデータベースと比較する際に、別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメーターを用いるコンピュータープログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰ又はＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 410 及び (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 402参照。これら双方は引用によって本明細書中に組み込まれる。
【００９２】
配列同一性のパーセンテージがこの出願中で言及されているときには、こうしたパーセンテージは、別途具体的に指示されない限り、より長い配列の全長に関して算出される。より長い配列の全長に関するこうした算出は、核酸配列及びポリペプチド配列の双方に適用される。
【００９３】
本明細書中で使用される際には、疾患又は障害を（の）“処置する（treat）”、“処置すること（treating）”又は“処置（treatment）”とは、下記の１つ又は複数を達成することを意味する：（ａ）該障害の重症度及び／又は期間を減少させること、（ｂ）処置される該障害（複数を含む）に特徴的な症状の発症を制限又は予防すること、（ｃ）処置される該障害（複数を含む）に特徴的な症状の悪化を阻止すること、（ｄ）該障害（複数を含む）を過去に有していた患者における該障害（複数を含む）の再発を制限又は予防すること、及び（ｅ）過去に該障害（複数を含む）の症状を示した患者における症状の再発を制限又は予防すること。
【００９４】
本明細書中で使用される際には、疾患又は障害を（の）“予防する（prevent）”、“予防すること（preventing）”、“予防（prevention）”、又は“予防（prophylaxis）”とは、障害が対象で発症することを予防することを意味する。
【００９５】
本明細書中で使用される際には、表現“投与する（is for administration）”及び“投与する（is to be administered）”とは、“投与する準備ができている（is prepared
to be administered）”と同じ意味を有する。換言すれば、活性な化合物を“投与する（is for administration）”という記述は、前記の活性化合物を製剤化し、そして前記活性化合物が、その治療活性を発揮することができるような投与量に作り上げられるているというように理解されなければならない。
【００９６】
用語“治療的に有効な量（therapeutically effective amount）”又は“治療量（therapeutic amount）”は、研究者、獣医、医師、又は他の臨床家によって求められている、組織、システム、動物又はヒトの生物学的又は医学的応答を引き出す薬物又は医薬の量を意味することを意図している。用語“予防的に有効な量（prophylactically effective amount）”は、、研究者、獣医、医師、又は他の臨床家によって求められている、組織、システム、動物又はヒトにおいて予防しようとする生物学的又は医学的事象の発生のリスクを予防し、又は減少させる医薬の量を意味することを意図している。特に、患者が受ける投与量は、好ましくは、血栓症、血管疾患、血管新生及び転移を含む癌、炎症、炎症性疾患、自己免疫疾患及び異常な又は増加した新脈管形成によって特徴付けられる疾患、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、移植に対する反応、視神経炎、脊髄外傷、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、レイノー症候群、実験的自己免疫性脳脊髄炎、シェーグレン症候群、強皮症、心血管疾患、乾癬、及び炎症反応を誘発する感染症から成る群より選択される、α２インテグリン関連疾患又は障害の予防的又は治癒的治療（予防、改善又は治癒）を可能にするために、アルファ２インテグリン作用の阻害を示すのに十分なペプチド又はペプチド複合体の量を選択することができる。
【００９７】
本明細書中で使用される際には、“患者（patient）”とは、本明細書中に述べられている抗体及びその抗原結合性フラグメントでの処置から利益を得る任意の哺乳動物又は鳥を意味する。好ましくは、“患者（patient）”は、実験動物（例えば、マウス又はラット）、家畜動物（例えば、モルモット、ウサギ、ニワトリ、七面鳥、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ウシ、ウマ、ロバ、ネコ又はイヌを含む）、又はチンパンジー、及びヒトを含む霊長類から成る群から選択される。“患者（patient）”はヒトであることが特に好ましい。
【００９８】
“製薬学的に許容可能な（Pharmaceutically acceptable）”とは、連邦政府若しくは州政府の監督機関により承認されていること、あるいは米国薬局方（United States Pharmacopeia-33/National Formulary-28 Reissue, published by the United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville Md., publication date: April 2010）、又は動物における、より具体的にはヒトにおける使用のための他の一般的に認められた薬局方にリストされていることを意味する。
【００９９】
本発明の治療方法によって処置可能な具体的な対象集団には、アルファ２インテグリン活性化変異（機能獲得型変異（gain of function mutations），“ＧＯＦ”）の治療に適応される対象、好ましくは、血栓症、血管疾患、血管新生及び転移を含む癌、炎症、炎症性疾患、自己免疫疾患及び異常な又は増加した新脈管形成によって特徴付けられる疾患、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、移植に対する反応、視神経炎、脊髄外傷、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、レイノー症候群、実験的自己免疫性脳脊髄炎、シェーグレン症候群、強皮症、心血管疾患、乾癬、及び炎症反応を誘発する感染症から成る群より選択される、α２インテグリン関連疾患又は障害に罹患している対象が含まれる。
【０１００】
本発明の実施態様
次にこの発明を更に述べることになる。下記の部分では、本発明の種々の局面をより詳細に明らかにする。こうして明らかにしたそれぞれの局面は、明らかにそうではないという指示がない限り、任意の他の局面又は他の複数の局面と組み合わせることができる。具体的には、好ましい、あるいは有利であると指摘されたどんな特性も、明らかにそうではないという指示がない限り、好ましい、あるいは有利であると指摘された任意の他の特性又は他の複数の特性と組み合わせることができる。
【０１０１】
従って、この発明の第一の局面は、ペプチド又はペプチド複合体、好ましくは、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、前記ペプチド又はペプチド複合体、抗体又はフラグメントは、ヒトα２インテグリンのＩ−ドメインに特異的に結合し、前記抗体又はフラグメントは、重鎖可変領域（ＶＨ）ドメイン及び軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインを含んでなり、前記抗体又はフラグメントは、非ヒト霊長類α２インテグリンと交差反応するが、非霊長類α２インテグリンとは交差反応しない、前記ペプチド又はペプチド複合体、好ましくは、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントに関する。
【０１０２】
この発明の第二の局面は、ペプチド又はペプチド複合体、好ましくは、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、前記ペプチド又はペプチド複合体、抗体又はフラグメントは、ヒトα２インテグリンのＩ−ドメインに特異的に結合し、前記抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）ドメイン及び軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインを含んでなり、前記抗体又はフラグメントは、参照抗体のエピトープとの結合について参照抗体と競合し、前記参照抗体は、アクセッション番号 ＤＳＭ２３９４４にてＤＳＭＺに寄託されているプラスミドによってコードされる軽鎖、及び（ｉ）アクセッション番号 ＤＳＭ２３９４６にてＤＳＭＺに寄託されているプラスミド、又は（ｉｉ）アクセッション番号 ＤＳＭ２３９４５にてＤＳＭＺに寄託されているプラスミドのいずれかによってコードされている重鎖を含んでなる、前記ペプチド又はペプチド複合体、好ましくは、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントに関する。
【０１０３】
第三の局面では、この発明は、ペプチド又はペプチド複合体が、１つ又はそれより多い下記のコンポーネントａ）〜ｆ）：
ａ）ＬＣＤＲ１［ここで、ＬＣＤＲ１は、ＲＡＳＥＳＶＥＳＹＧＮＳＦＩＹ（配列番号６）又はその機能的に活性な変異体である］、
ｂ）ＬＣＤＲ２［ここで、ＬＣＤＲ２は、ＬＡＳＮＬＡＳ（配列番号７）又はその機能的に活性な変異体である］、
ｃ）ＬＣＤＲ３［ここで、ＬＣＤＲ３は、ＱＱＮＮＥＤＰＹＴ（配列番号８）又はその機能的に活性な変異体である］、
ｄ）ＨＣＤＲ１［ここで、ＨＣＤＲ１は、ＧＹＴＦＴＳＹＷＭＮ（配列番号３）又はその機能的に活性な変異体である］、
ｅ）ＨＣＤＲ２［ここで、ＨＣＤＲ２は、ＲＩＤＰＳＤＳＥＴＨＹＮＱＫＦＫ（配列番号４）又はその機能的に活性な変異体である］、及び
ｆ）ＨＣＤＲ３［ここで、ＨＣＤＲ３は、ＶＧＲＧＹＦＤＹ（配列番号５）又はその機能的に活性な変異体である］
を含んでなるペプチド又はペプチド複合体であって、
そして上記において、１つ又はそれより多いコンポーネントａ）〜ｆ）は、ペプチド又はペプチド複合体のα２インテグリン又はヘテロダイマーα２β１インテグリンへの結合を可能にするように配置されている、前記ペプチド又はペプチド複合体に関する。
【０１０４】
第四の局面では、この発明は、α２インテグリン関連障害若しくは疾患の処置、予防又は診断に使用するための上記ペプチド又はペプチド複合体に関する。
【０１０５】
配列番号６〜８の配列は、解析された抗体の軽鎖のＣＤＲであり、そして配列番号３〜５の配列は、解析された抗体の重鎖のＣＤＲである（これはシーケンス解析によって決定された）。この発明のもとでは、このペプチド又はペプチド複合体は、上記の軽鎖ＣＤＲのうちの１つ又はその機能的に活性な変異体及び／又は重鎖ＣＤＲのうちの１つ又はその機能的に活性な変異体を含んでなる。例としては、上記のＨＣＤＲのうちの１つ又は２つ又は３つ及び／又は上記のＬＣＤＲのうちの１つ又は２つ又は３つを、考えられる任意の組み合わせで含んでなるペプチド又はペプチド複合体が挙げられる。この発明の一実施態様は、３つのＬＣＤＲ及び３つのＨＣＤＲを含んでなるペプチド又はペプチド複合体であり、上記において、それらのうち少なくとも１つは、上記のａ）〜ｆ）のＣＤＲの１つである。
【０１０６】
この発明の文脈では、用語「ＬＣＤＲ」及び「ＬＤＲ」は、同意語として用いられる。同じことが、用語「ＨＣＤＲ」及び「ＨＤＲ」にも適用される。
【０１０７】
上記ＣＤＲが適切な方法で配置されている場合には、この配置により、α２インテグリンへの特異的な結合が可能となる。抗原の結合を可能にするＣＤＲの適切な配置は、当技術分野において知られている。種々の異なった抗体フォーマット又は結合パラメーターのフォーマットが開発されており、あるいはこれまで特定されてきた。こうした適切な配置、又は他の適切な配置は、このフォーマット又は配置がα２インテグリンとの特異的な結合を可能にする限り、いずれもこの発明のポリペプチド又はポリペプチド複合体の場合に使用することができる。
【０１０８】
上記の複数の配列番号によって定義されているＣＤＲ配列、又はその変異体は、１つの（ポリ）ペプチド鎖又はポリペプチド又はペプチド複合体中に配置することができる。それらが１つの（ポリ）ペプチド鎖中に配置される場合には、配列は、例えば、融合タンパク質のように、１つ又はそれより多いリンカー配列、好ましくは、ペプチドリンカーによって接続することができる。一実施態様によれば、当技術分野において知られているように、それらは自然的又は人工的な抗体スカフォールド又はフレームワークに組み込まれることができる。自然的抗体の場合には、ＣＤＲは、可変ドメイン内に保存的フレームワーク領域によって支えられている。このフレームワークは、下記でより詳細に述べられる、例えば、Ｆａｂ、１本鎖抗体などのように、人工抗体を得るために改変することができる。
【０１０９】
ＣＤＲが、ペプチド複合体中に配置されている場合には、２つ又はそれより多い（ポリ）ペプチドは、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、及び疎水性相互作用を含む、非共有結合によって互いに結合する。
【０１１０】
ペプチドは、直線鎖中に配置された２つ又はそれより多いα−アミノ酸で作製される有機化合物である。このアミノ酸は、隣接するアミノ酸残基のカルボキシル基とアミノ基の間でのペプチド結合によって互いに結合する。一般的に、遺伝子コードによって、２０種の標準アミノ酸が指定されている。合成の後又は間でも、タンパク質中の残基は、翻訳後修飾によって化学的に修飾することができ、それによって物理的及び化学的特性、折り畳み型構造、安定性、活性、そして最終的にはタンパク質の機能が変化する。この発明の種々の局面に応じてペプチドは、それらがα２インテグリンに結合することができる限り、修飾されていてもよいし、それとも修飾されていなくてもよい。
【０１１１】
当技術分野では、用語“ポリペプチド（polypeptide）”とは、ポリペプチド鎖を形成するように直線状態にペプチド結合によって互いに結合した、約２０、約２５、約３０又はそれよい多いアミノ酸を含んでなる分子を意味する。少なくとも２個のアミノ酸を含むこの種のより短い分子は一般的に、ペプチドと呼ばれている。用語“タンパク質（protein）”とは通例、１つ又はそれより多いポリペプチド鎖を含む分子を意味する。この発明の文脈では、用語「ペプチド（peptide）」、「ポリペプチド（polypeptide）」及び「タンパク質（protein）」は、同意語として使用される。
【０１１２】
この発明の文脈では、この発明の種々の局面に応じて、用語“ペプチド（peptide）”又は“ポリペプチド（polypeptide）”は、上記に定義されているペプチド又はポリペプチドを意味し、そして用語“ペプチド複合体（peptide complex）”とは、上記に定義されている１つ又はそれより多いペプチド及び／又はポリペプチド（例えば、本発明の抗体、抗原結合性フラグメント及び他の結合分子）を含む分子複合体を意味する。
【０１１３】
本明細書中に定義されているようなペプチド及びそのペプチド複合体は、α２インテグリン抗原を選択的に認識し、そしてα２インテグリン抗原に特異的に結合する。この発明の文脈では、用語“α２インテグリンとの特異的結合（specific binding to α2 integrin）”とは、本発明によってペプチド又はペプチド複合体が、α２インテグリンに、又はα２インテグリンＩ−ドメインに、又は任意の他のポリペプチドとの複合体（例えば、別のインテグリンサブユニットとのヘテロダイマー複合体、例えば、α２β１インテグリン複合体）中のα２インテグリンに特異的に結合することができることを意味する。好ましい実施態様では、この発明のペプチド又はペプチド複合体は、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントを含んでなるか、あるいは単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントから成るか、あるいは単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントである。
【０１１４】
本明細書中における用語“選択的（selective）”又は“特異的（specific）”の使用は、本発明によるペプチド又はペプチド複合体の結合特性を述べるために使用されるときには、開示されたペプチド又はペプチド複合体が、ペプチド／複合体がα２インテグリン特異的結合部分に更なる、異なる特異性を付与するように補完されている（例えば、分子が、２つの機能（そのうちの少なくとも１つは、α２インテグリンに特異的に結合することである）を結びつけ、又は生じさせるように設計されている二特異性（bispecific）若しくは二機能性分子の場合であるような）そうした特定の例の場合を除いて、α２インテグリン以外とは顕著な結合を示さない事実を意味する。特定の実施態様では、α２インテグリン特異的ペプチド又はその複合体は、ヒトα２インテグリンに多くとも１．２×１０-6（at least 1.2 × 10-6）のＫDで結合する。特定の実施態様では、α２インテグリン特異的ペプチド又はその複合体は、５×１／１０7以上（5×10-7 or more）、２×１／１０7以上（2×10-7 or more）、又は１×１／１０7以上（1×10-7 or more）のＫDでヒトα２インテグリンに結合する。更なる実施態様では、α２インテグリン特異的ペプチド又はその複合体は、ヒトα２インテグリンに１×１／１０8以上（１×10-8 or more）のＫDで結合する。他の実施態様では、α２インテグリン特異的ペプチド又はその複合体は、ヒトα２インテグリンに５×１／１０9（１×10-9 or more）以上又は１×１／１０9以上（１×10-9 or more）のＫDで結合する。更なる実施態様では、α２インテグリン特異的ペプチド又はその複合体は、ヒトα２インテグリンに２×１／１０10以上（2×10-10 or more）のＫDで結合する。特定の実施態様では、α２インテグリン特異的ペプチド又はその複合体は、上記のＫDでは他のタンパク質に結合しない。他の実施態様では、このα２インテグリン特異的ペプチド又はその複合体は、非特異的抗原に対するその親和性と比較して少なくとも２倍の親和性でα２インテグリン（例えば、ヒト及び／又は非ヒト霊長類α２インテグリン）に結合する。
【０１１５】
ＫDは、ｋd（特定の結合する分子−標的タンパク質相互作用の解離速度；ｋoffとも呼ばれる）のｋa（特定の結合する分子−標的タンパク質相互作用の結合速度；ｋonとも呼ばれる）に対する比率（すなわち、ｋd／ｋaは、モル濃度（Ｍ）として表現される）から得られる解離定数に関する。ＫD値は、当技術分野において十分確立した方法を用いて決定することができる。結合分子のＫDを決定する好ましい方法は、実施例１Ｄ中に記載されている。
【０１１６】
α２インテグリン特異的ペプチド又はその複合体は、用量依存的にα２インテグリン／リガンド相互作用を阻害することが判明されている（図２及び実施例参照）。従って、α２インテグリン特異的ペプチド又はその複合体は、コラーゲンのα２インテグリンへの結合を弱めるそれらの能力によって特徴付けることができる。α２インテグリン特異的ペプチド又はその複合体のいずれかによる阻害の程度は、対照と統計的に比較して定量的に測定することができ、あるいは当技術分野において利用可能な任意の代替方法によって定量的に測定することができる。特定の実施態様では、この阻害は、約１０％以上の阻害である。他の実施態様では、この阻害は、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、あるいは９５％以上である。
【０１１７】
このペプチド又はペプチド複合体はまた、上記配列の機能的に活性な変異体を含むことができる。本発明のペプチド又はペプチド複合体の機能的に活性な変異体は、α２インテグリンに結合する能力、そして場合によりα２インテグリンを阻害する能力を含めて、完全ペプチド（complete peptide）によって示されるものと同様な生物活性を有することによって特徴付けられる。この発明の文脈ではこの変異体は、変異体の活性（例えば、結合活性、場合によりＫDとして表現される）が、配列の変更のないペプチド／複合体の活性の１０％以上、２５％以上、５０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、あるいは９９％以上に達する場合に、機能的に活性である。α２インテグリンへの結合活性を決定する適切な方法は、実施例中に記載されている。機能的に活性な変異体は、限定された数のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入によって得ることができる。
【０１１８】
この発明の好ましい実施態様では、本発明のペプチド又はペプチド複合体は、１つ又はそれより多い以下の特性によって更に特徴付けられる：
（ｉ）ａ）〜ｃ）の１つ、２つ又は３つのコンポーネントが、軽鎖（ＶＬ）の可変ドメイン中に含まれ、
（ｉｉ）ｄ）〜ｆ）の１つ、２つ又は３つのコンポーネントが、重鎖（ＶＨ）の可変ドメイン中に含まれ、
（ｉｉｉ）ペプチド又はペプチド複合体は抗体であり、
（ｉｖ）ペプチド又はペプチド複合体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）2、二特異性抗体（bispecific antibody）、多特異性抗体（multispecific antibody）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ又はミニボディ、モノクローナル抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体であり、
（ｖ）ペプチド又はペプチド複合体は、ヒトＩｇＭ定常ドメイン、ヒトＩｇＧｌ定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、ドメイン、ヒトＩｇＧ４定常ドメイン、ヒトＩｇＥ定常ドメイン、及びヒトＩｇＡ定常ドメインから成る群より選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含んでなり、
（ｖｉ）機能的に活性な変異体は、配列番号３〜８のいずれかのアミノ酸配列の６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、あるいは９９％以上から成る、機能的に活性なフラグメントであり、
（ｖｉｉ）機能的に活性な変異体は、配列番号３〜８のいずれかのアミノ酸配列に対して、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、あるいは９９％以上の配列同一性を有する機能的に活性な変異体であり、特に、機能的に活性な変異体は、１つ又はそれより多い保存的アミノ酸置換によって配列番号３〜８のいずれかのアミノ酸配列から誘導され、
（ｖｉｉｉ）ペプチド又はペプチド複合体は、
−配列番号１、又はその機能的に活性な変異体、及び／又は
−配列番号２、又はその機能的に活性な変異体、及び／又は
−配列番号９、又はその機能的に活性な変異体、及び／又は
−配列番号１０、又はその機能的に活性な変異体、及び／又は
−配列番号１１、又はその機能的に活性な変異体、及び／又は、
のアミノ酸配列を含んでなり、
（ｉｘ）ペプチド又はペプチド複合体は、
−配列番号９、又はその機能的に活性な変異体、及び
−配列番号１０、又はその機能的に活性な変異体、及び
−場合により、５０個以下の付加アミノ酸残基（additional amino acid residue(s)）、１〜４０個、１〜３０個、１〜２５個、１〜１５個、１〜１０個、又は５個、４個、３個、２個、又は１個の付加アミノ酸残基
よりなるアミノ酸配列で構成され、
（ｘ）ペプチド又はペプチド複合体は、
−配列番号９、又はその機能的に活性な変異体、及び
−配列番号１１、又はその機能的に活性な変異体、及び
−場合により、５０個以下の付加アミノ酸残基、１〜４０個、１〜３０個、１〜２５個、１〜１５個、１〜１０個、又は５個、４個、３個、２個、又は１個の付加アミノ酸残基
よりなるアミノ酸配列で構成される。
【０１１９】
配列番号１及び２は、図５から得ることができる：それぞれ、配列番号１は、α２インテグリン抗体可変軽鎖のアミノ酸配列であり、配列番号２は、可変重鎖のアミノ酸配列である。
【０１２０】
配列番号９、１０及び１１は、図７から得ることができる：配列番号９は、ＩｇＧ４フォーマットとして作製された抗体のキメラ軽鎖のアミノ酸配列（ＣＤＲはアンダーラインされている）であり、配列番号１０は、ＩｇＧ４フォーマットとして作製された抗体のキメラ重鎖のアミノ酸配列（ＣＤＲはアンダーラインされている）であり、そして配列番号１１は、６ｘｈｉｓタグを加えたＦａｂフォーマット中のキメラ重鎖のアミノ酸配列である。定常領域は、ヒト配列バックボーン（実施例参照）に由来した。本発明はまた、ｈｉｓタグのない抗体コンストラクト又はフラグメント、ペプチド又はポリペプチド複合体のいずれかに関する。
【０１２１】
一実施態様によれば、ＨＣ及びＬＣの可変ドメインは、それぞれの定常領域に結合し、そしてキメラＨＣ又はＬＣコンストラクトを形成する。特定実施態様は、ＩＧＫＣタンパク質（例えば、配列番号９など）の定常領域と融合したキメラα２インテグリン抗体ＬＣ可変領域、ＩＧＨＧ４（例えば、配列番号１０など）の定常領域と融合したキメラα２インテグリン抗体ＨＣ可変領域、又はＩＧＨＧ１（例えば、配列番号１１など）の定常領域ＣＨ１ドメインと融合したキメラα２インテグリン抗体ＨＣ可変領域である。
【０１２２】
上記に詳述したように、コンポーネントａ）〜ｃ）（ＬＣ ＣＤＲ）及びｄ）〜ｆ）（ＨＣ ＣＤＲ）は、それぞれ、作製され、そして試験されたモノクローナル抗体の軽鎖（ＶＬ）の可変ドメイン、及び重鎖（ＶＨ）の可変ドメインをシーケンシングすることによって得られた。従って、これらは、同一のものに含まれうる。これは、任意の自然的に発生するＶＬ又はＶＨフレームワークであってもよいし、それとも人工的なＶＬ又はＶＨフレームワークであってもよい。この発明の一実施態様では、１つ又はそれより多いＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）は、優勢可変ドメイン（prevailing variable domain）、すなわち、ＶＬのフレームワーク中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、並びにＶＨのフレームワーク中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のフレームワーク中に配置される。このことは、上記に述べられているようないずれかの適切な方法によって（配列番号１及び２参照）特定されるようなＣＤＲを単独、一緒に、あるいはそれらを任意に組み合わせて、所定の近隣域（shown neighborhood）から除去し、そして別の（第二の）可変ドメインのフレームワークに移動させ、その結果第二の可変ドメインのＣＤＲを置き換えることができる。種々の可変ドメイン又は抗体配列が当技術分野において知られており、この目的のために使用することができる。例えば、その中に関心対象のＣＤＲを挿入する可変ドメインは、生殖細胞系（germ-line）又は再配置されたヒト可変ドメインから得ることができる。可変ドメインはまた、合成的に作製することができる。このＣＤＲ領域は、組み換えＤＮＡ技術を用いてそれぞれの可変ドメインに導入することができる。こうしたことを達成することができる１つの手段は、Marks et al., 1992, Bio/Technology 10:779-783中に記載されている。重鎖可変ドメインは、軽鎖可変ドメインとペアリングして、抗原結合部位を提示することができる。これに加えて、独立領域（例えば、可変重鎖ドメイン単独）は、抗原に結合するのに使用することができる。
【０１２３】
前のパラグラフ中で述べられているＣＤＲグラフティングによって作製された人工的に作製された軽鎖又は重鎖と、上記に述べられている重鎖又は軽鎖キメラの組み合わせもまた、それらがα２インテグリン結合特異性を示す限り、ありうることである。
【０１２４】
この発明のペプチド又はペプチド複合体は、グリコシル化することができる。タンパク質のグリコシル化及びその生理学的作用は、当技術分野において知られている。オリゴ糖コンポーネントは、物理学的安定性、プロテアーゼアタックに対する抵抗性（resistance
to protease attack）、免疫系との相互作用、薬物動態、及び特異的な生物活性を含む、治療的糖タンパク質の有効性に関連する特性に有意に（肯定的に、あるいは否定的に）影響を及ぼしうる。グリコシル化タンパク質の発現の場合には、哺乳類宿主細胞が、当技術分野において一般的に使用されている（Cumming et al., 1991, Glycobiology 1: 115-130; Jenkins et al., 1996, Nature Biotechn. 14: 975-981）。こうした例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＮＳＯ−及びＳＰ２／０−マウスミエローマ細胞が挙げられる。遺伝子導入動物に起源するグリコシル化タンパク質の作製もまた公表されている（Jenkins et al., 1996，上記参照）。更に、操作された組み換え宿主細胞の異種発現／過剰発現しているグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子も当技術分野において知られている（Bailey, 1991, Science 252: 1668-1675）。ＷＯ ９９５４３４２（Ａ１）では、改善された機能を有すると報告されている分岐型ＧＩｃＮＡｃを持つＮ結合型オリゴ糖（N-linked oligosaccharides）複合体を増加させる一連の糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ活性を発現する宿主細胞を用いて、グリコシル化タンパク質の生成方法が開示されている。
【０１２５】
この発明の一実施態様によれば、このペプチド又はペプチド複合体は、この発明によるペプチド又はペプチド複合体と同一でない１つ又はそれより多い分子（更なるモイエティ）に結合することができ、この複合体全体は“コンジュゲート（conjugate）”である。更なるモイエティの例は、例えば、ペプチド又はペプチド複合体、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド、又はＲＮＡ分子、（例えば、ＲＮＡｉ））、又は有機（小）分子、放射性モイエティのような１つ又はそれより多い更なる生体分子を含んでなる。こうした更なるモイエティは、それら自体、例えば、細胞傷害性、治療活性、免疫抑制活性などの機能を有しうるか、あるいはそれらは他の理由でコンジュゲート全体に有益でありうる（例えば、コンジュゲートの安定性の改善又は低下など）。この発明は、１つ又はそれより多い更なるモイエティにコンジュゲートされたペプチド又はペプチド複合体を含有する。このペプチド又はペプチド複合体が抗体、そのフラグメントの誘導体である場合には、このコンジュゲートは、イムノコンジュゲート（immunoconjugate）である。イムノコンジュゲートの例は、当技術分野において知られており（例えば、ＷＯ ０５／１０３０８１参照）、例えば、１つ又はそれより多い化学療法物質、プロドラッグ、サイトトキシン、放射性同位体又は放射性ヌクレオチド、免疫抑制モイエティ、治療的オリゴヌクレオチド、阻害剤的ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）がある。
【０１２６】
一実施態様によれば、このペプチド又はペプチド複合体は抗体である。自然的に発生する抗体は、免疫グロブリンとも呼ばれている、基本構造を共有する球状血漿タンパク質（約１５０ｋＤａ）である。それらはアミノ酸残基に付加された糖鎖を有しているので、それらは糖タンパク質である。それぞれの抗体の基本的な機能単位は、免疫グロブリン（Ｉｇ）モノマー（１つのＩｇ単位のみを含む）であり；分泌型抗体はまた、ＩｇＡの場合のように２つのＩｇ単位を持つダイマー、硬骨魚ＩｇＭのように４つのＩｇ単位を持つテトラマー、又は哺乳類のＩｇＭのように５つのＩｇ単位を持つペンタマーでありうる。この発明では、適切なフォーマットの例には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭと呼ばれる抗体アイソタイプを含む、自然的に発生する抗体のフォーマットが含まれる。
【０１２７】
Ｉｇモノマーは、４つのポリペプチド鎖；システイン残基間でのジスルフィド結合によって連結されている２つの同一の重鎖と２つの同一の軽鎖から成る“Ｙ”型分子である。それぞれの重鎖は、約４４０アミノ酸長であり；それぞれの軽鎖は、約２２０アミノ酸長である。重鎖及び軽鎖はそれぞれ、それらの折り畳み構造を安定化させる鎖間ジスルフィド結合を含む。それぞれの鎖は、Ｉｇドメインと呼ばれる構造ドメインから構成されている。こうしたドメインは、約７０〜１１０アミノ酸を含み、それらの大きさ及び機能に応じて異なったカテゴリーに分類される（例えば、可変部、すなわちＶ、及び定常部、すなわちＣ）。それらは、特徴的な免疫グロブリン折り畳み構造を有し、その中で２つのβシートは、保存されたシステインと他の荷電されたアミノ酸の間の相互作用によって合わさって、“サンドイッチ（sandwich）”型を形成している。
【０１２８】
α、δ、ε、γ、及びμで表示される５種類の哺乳類のＩｇ重鎖がある。存在している重鎖の種類によって、抗体のアイソタイプが決められる；こうした鎖は、それぞれ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ抗体に見出される。
【０１２９】
異なる重鎖は、大きさ及び組成の点で異なる；α及びγは、約４５０アミノ酸を含み、δは、約５００アミノ酸を含み、一方μ及びεは、約５５０アミノ酸を有する。それぞれの重鎖は、２つの領域、定常領域（ＣH）及び可変領域（ＶH）を有する。１つの種では、この定常領域は、同じアイソタイプの抗体においてはすべて、本質的に同一であるが、異なったアイソタイプの抗体においては異なる。重鎖γ、α及びδは、３つのタンデムＩｇドメインから構成されている定常領域、そしてフレキシビリティの付加のためのヒンジ領域を有する；重鎖μ及びεは、４つの免疫グロブリンドメインから構成される定常領域を有する。重鎖の可変領域は、異なるＢ細胞によって産生される抗体は異なるが、１つのＢ細胞、あるいはＢ細胞クローンによって産生される抗体はすべて同じである。それぞれの重鎖の可変領域は、約１１０アミノ酸長であり、そして１つのＩｇドメインから構成されている。
【０１３０】
哺乳類では、λ及びκと称される２種類の免疫グロブリンの軽鎖がある。軽鎖は、２つの連続するドメインを有する：１つは、定常ドメイン（ＣＬ）であり、そして１つは可変ドメイン（ＶＬ）である。軽鎖のおよその長さは、２１１〜２１７アミノ酸である。それぞれの抗体は、常に同一である２つの軽鎖を含んでいる；哺乳類の１つの抗体については、κ又はλである軽鎖の種類の１つだけが存在している。ι鎖のような軽鎖の他の種類は、軟骨魚類及び硬骨魚類のような下等脊椎動物において見出されている。
【０１３１】
自然的に発生する抗体に加えて、抗体フラグメントを含む人工的抗体フォーマットが開発されている。それらの一部について、下記に述べられている。しかしながら、上記のポリペプチド（複数を含む）を含んで成るか、あるいはそれから成り、そしてα２インテグリンとの特異的結合を可能にする他の抗体フォーマットはいずれもまた、この発明によって包含されている。
【０１３２】
すべての抗体の全体的な構造は非常に類似しているが、所与の抗体のユニークな特性は、上記に詳述されているように可変（Ｖ）領域によって決定される。より具体的には、それぞれ、軽鎖（ＶＬ）に３つの可変ループがあり、そして重鎖（ＶＨ）にも３つの可変ループがあり、この可変ループが、抗原に対して結合する働きをしており、すなわち、その抗原特異性の要因となっている。こうしたループは、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれている。ＶＨ及びＶＬドメインの双方に起源するＣＤＲが抗原結合部位に寄与しているので、最終的な抗原特異性を決定しているのは、重鎖及び軽鎖の組み合わせであって、どちらか単独ではない。
【０１３３】
従って、本明細書中で使用される際には、用語“抗体（antibody）”とは、自然的に発生する抗体に構造類似性を有し、α２インテグリンと特異的に結合することができるあらゆるポリペプチドを意味し、上記において、結合特異性は、配列番号３〜８のＣＤＲによって決定される。それゆえ、“抗体（antibody）”は、α２インテグリンとの特異的結合を有する、抗原結合性フラグメント（抗体構造から物理的に又は概念的に誘導されるフラグメント）、前記いずれかの誘導体、キメラ分子、別のポリペプチドと前記いずれかとの融合、あるいはα２インテグリンに選択的に結合し、そして場合によりα２インテグリンの機能を阻害するあらゆる代替的構造／組成を含む（これらには限定されない）、免疫グロブリン誘導構造（immunoglobulin-derived structure）を意味することを意図している。この抗体は、少なくとも１つの抗原結合性フラグメントを含んでなる任意のポリペプチドでありうる。抗原結合性フラグメントは、少なくとも、重鎖の可変ドメイン及び軽鎖の可変ドメインから成り、双方のドメインが一緒になって特異的抗原に結合することができるように配置されている。
【０１３４】
“完全長（Full length）”又は“完全（complete）”抗体とは、ジスルフィド結合によって相互に連結されている２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖を含んでなるタンパク質を意味し、これは以下を含んでなる：（１）重鎖に関しては、可変領域及び３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含んでなる重鎖定常領域；並びに（２）軽鎖に関しては、軽鎖可変領域と１つのドメイン、ＣＬを含んでなる軽鎖定常領域。用語“完全抗体（complete antibody）”に関しては、それぞれのドメインが、全ドメイン構造は変化させない変異、欠失、又は挿入などのようなその更なる改変を含みうるとしても、自然的に発生する抗体（すなわち、３つ又は４つの定常ドメインの重鎖、及び１つの定常ドメインの軽鎖、並びにそれぞれの可変ドメインを含んでなる）の通例の全ドメイン構造を有する、あらゆる抗体を意味している。
【０１３５】
“抗体フラグメント（antibody fragment）”はまた、上記に定義されているような少なくとも１つの抗原結合性フラグメントを含み、このフラグメントが誘導される完全抗体と本質的に同じ機能及び特異性を示す。パパインで限定タンパク分解（limited proteolytic digestion）すると、Ｉｇプロトタイプが３つのフラグメントに開裂される。２つの同一のアミノ末端フラグメント（それぞれは、１つの全Ｌ鎖と、およそ半分のＨ鎖を含む）は、抗原結合性フラグメント（Ｆａｂ）である。第三のフラグメント（それらは、大きさは似ているが、鎖間ジスルフィド結合を含む、双方の重鎖の半分でありカルボキシル末端を含む）は、結晶化が可能であるフラグメント（Ｆｃ）である。このＦｃは、炭水化物、補体結合及びＦｃＲ結合部位を含む。限定ペプシン分解すると、Ｆａｂ片とヒンジ領域の双方を含む１つのＦ（ａｂ’）2フラグメントが生じ、これには、Ｈ−Ｈ鎖間ジスルフィド結合が含まれる。Ｆ（ａｂ’）2は抗原結合に対して二価である。Ｆ（ａｂ’）2のジスルフィド結合は、Ｆａｂ’を得るために開裂されうる。更に、重鎖及び軽鎖の可変領域は融合して一緒になり１本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を形成することができる。
【０１３６】
初代（first generation）のフルサイズ抗体がいくつかの問題が提示されたときには、第二世代の抗体（second generation antibodies）の多くは、抗体のフラグメントだけを含んでいる。可変ドメイン（Ｆｖｓ）は、１つのＶＬ及び１つのＶＨから成るインタクトな（intact）抗原結合ドメインを含む最も小さいフラグメントである。結合ドメインだけを含むこうしたフラグメントは、酵素的アプローチ、又は関連する遺伝子フラグメント（例えば、バクテリア中及び真核細胞中の）の発現によって生成することができる。種々のアプローチを使用することができ、例えば、Ｆｖフラグメントだけ、又はＦｖと最初の定常ドメインを含む“Ｙ”の上腕の１つを含んでなる‘Ｆａｂ’フラグメントを使用することができる。こうしたフラグメントは通例、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）の生成をもたらす２つの鎖間のポリペプチド連結を導入することによって安定化される。あるいは、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｄｓＦｖ）フラグメントを使用することができる。フラグメント結合ドメインは、全長抗体を作製するために任意の定常ドメインと連結させるか、あるいは、他のタンパク質及びポリペプチドと融合することができる。
【０１３７】
組み換え抗体フラグメントは、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントである。一般的に、これはその抗原に対して高親和性を有し、種々の宿主中で発現することができる。こうした及び他の特性によって、ｓｃＦｖフラグメントは、医薬において適用可能になるのみならず、更に生物工学的適用を可能にする。上記に詳述した如く、ｓｃＦｖフラグメントでは、ＶＨ及びＶＬドメインは、親水性及びフレキシブルなペプチドリンカーで結合され、それによって発現及び折り畳み構造の有効性が改善される。通例、約１５アミノ酸のリンカーが使用され、それらのうち、（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3リンカーが最も頻繁に使用されている。ｓｃＦｖ分子は、使用されるリンカーに応じて、容易にタンパク質分解で分解されうる。遺伝子操作手法の発展と共に、こうした制限が実際には、機能及び安定性の改善にフォーカスした研究によって解消されうる。実例としては、ＶＨ−ＶＬダイマーが、鎖間ジスルフィド結合によって安定化される、ジスルフィドによって安定化された（又はジスルフィド連結）Ｆｖフラグメントの生成がある。システインは、ＶＬ及びＶＨドメイン間の接触面で導入され、その結果２つのドメインが一緒になるジスルフィド架橋を形成する。
【０１３８】
ｓｃＦｖｓの解離によって、モノマーｓｃＦｖｓがもたらされ、これはダイマー（ダイアボディ又は（ｓｃＦｖ）2）、トリマー（トリアボディ）、又はタンダブ（TandAbs）、及びフレキシボディ（Flexibodies）のようなより大きい複合体化することができる。
【０１３９】
２つの結合ドメインを有する抗体は、シンプルな（simple）ポリペプチド連結（ｓｃＦｖ）2を有する２つのｓｃＦｖの結合を通して、あるいは２つのモノマーの二量体化（ダイアボディ）を通して生成することができる。最もシンプルな設計は、２つの機能的抗原結合ドメインを有するダイアボディであり、これは、同じもの、類似のもの（二価のダイアボディ）でありうるか、あるいは異なる抗原に対する特異性（二特異性ダイアボディ）を有しうる。こうした二特異性抗体によって、例えば、新規なエフェクター機能（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）を標的細胞に動員することが可能になり、このことによってそれらが医学における応用に非常に有用になる。
【０１４０】
最近になって、重鎖の４つの可変ドメイン及び軽鎖の４つの可変ドメインを含む抗体フォーマットが開発されている。こうした例としては、四価の二特異性抗体が挙げられる（タンダブ及びフレキシボディ，Affimed Therapeutics AG, Heidelberg, Germany）。二特異性ダイアボディとは対照的に、二特異性タンダブは、たった１つのポリペプチドを含んで成るホモダイマーである。フレキシボディは、細胞表面上で互いにかなり離れている２つの分子を結合させるための高度のフレキシビリティを有する多価分子をもたらすことになるダイアボディマルチマーモチーフとｓｃＦｖの組み合わせである。２つより多い機能的抗原結合  ドメインが存在し、そしてそれらが異なる抗原に対する特異性を有する場合には、この抗体は、多特異性（multispecific）である。
【０１４１】
Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ分子又はドメイン抗体（Domantis）を含む（これらに限定されない）、いくつかの抗体分子は、ＶＨ及びＶＬドメインを並べる（line）ためにジスルフィド架橋を組み込むことによって安定化することができる。二特異性抗体は、従来から行なわれている技術を用いて生成することができ、その中で具体的な方法としては、化学的に、あるいはハイブリッドであるハイブリドーマから生成することが含まれ、他の技術としては、ＢｉＴＥTMテクノロジー（ペプチドリンカーを用いて異なる特異性の抗原結合領域を処理する分子）及び、ノブ−インツ−ホールエンジニアリング（knobs-into-holes engineering）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４２】
好ましくは、 この抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）2、二特異性抗体、多特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ又はミニボディでありうる。
【０１４３】
一実施態様では、この抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である。モノクローナル抗体は、それらは１個の親細胞の全てのクローンである１種類の免疫細胞によって産生されるので同一である単一特異性抗体である。キメラ抗体は、１種類の免疫グロブリンの少なくとも１つの領域が別の種類の免疫グロブリンの別の領域に融合している抗体であり、これは、その免疫原性を減少させるために遺伝子操作の手段によって行なわれる。例えば、マウスのＶL及びＶH領域を、ヒト免疫グロブリンの残存部分に融合させることができる。キメラ抗体の特定の種類は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体は、非ヒト抗体のＣＤＲをコードするＤＮＡをヒト抗体生成ＤＮＡと（又は反対に）融合させることによって生成される。次いでこの結果生じたＤＮＡコンストラクトは通例、ＣＤＲだけが非ヒトであるので、非ヒト親抗体（non-human parenteral antibody）、あるいはキメラ抗体と同様に免疫原性ではない抗体を発現させ、作製するために使用することができる。
【０１４４】
この発明の異なる局面の一実施態様によれば、ヒト又はヒト化抗体、あるいはそのフラグメントを使用することができる。従って、このペプチド又はペプチド複合体は、以下から成る群より選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含みうる：ヒトＩｇＭ定常ドメイン、ヒトＩｇＧｌ定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、ドメイン、ヒトＩｇＧ４定常ドメイン、ヒトＩｇＥ定常ドメイン、及びヒトＩｇＡ定常ドメイン。本発明の文脈では、この抗α２インテグリン抗体は、ＷＯ ２００９／０
３２６６１中に以前に記載されている方法を用いてヒト化されているが、当技術分野において知られている任意の適切なヒト化方法を使用することができる。
【０１４５】
上記に詳述したように、このＣＤＲはまた、特許請求の範囲で特定化されている任意のＣＤＲの機能的に活性な変異体でありうる。一実施態様では、この機能的に活性な変異体は、配列番号３〜８のいずれかの９０％以上のアミノ酸配列から成る機能的に活性なフラグメントである。あるいは、この機能的に活性な変異体は、配列番号３〜８のいずれかのアミノ酸配列に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％若しくは９５％以上の配列同一性を有する機能的に活性な変異体であり、特に、上記において、機能的に活性な変異体は、１つ又はそれより多い保存的アミノ酸置換（conservative amino acid substitution）によって、配列番号３〜８のいずれかのアミノ酸配列から誘導される（下記参照）。
【０１４６】
この発明の異なる局面の一実施態様では、このペプチド又はペプチド複合体 は、
−配列番号１、又はその機能的に活性な変異体、及び／又は
−配列番号２、又はその機能的に活性な変異体、及び／又は
−配列番号９、又はその機能的に活性な変異体、及び／又は
−配列番号１０、又はその機能的に活性な変異体、及び／又は
−配列番号１１、又はその機能的に活性な変異体
のアミノ酸配列を含んでなる。
【０１４７】
あるいは、このペプチド又はペプチド複合体は、
−配列番号９、又はその機能的に活性な変異体、及び
−配列番号１０、又はその機能的に活性な変異体、及び
−場合により、５０個の付加アミノ酸残基、又は１〜４０個、１〜３０個、１〜２５個、１〜１５個、１〜１０個、１個、又は２個、３個、４個、又は５個の付加アミノ酸残基
よりなるアミノ酸配列で構成される。
【０１４８】
あるいは、このペプチド又はペプチド複合体は、
−配列番号９、又はその機能的に活性な変異体、及び
−配列番号１１、又はその機能的に活性な変異体、及び
−場合により、５０個の付加アミノ酸残基、又は１〜４０個、１〜３０個、１〜２５個、１〜１５個、１〜１０個、１個、又は２個、３個、４個、又は５個の付加アミノ酸残基
よりなるアミノ酸配列で構成される。
【０１４９】
この機能的に活性な変異体は、配列番号１又は配列番号２又は配列番号９又は配列番号１０又は配列番号１１の配列のいずれかから、１つ又はそれより多い欠失によって誘導されることによって特徴付けられるフラグメントでありうる。この欠失（複数を含む）は、Ｃ末端であってもよいし、Ｎ末端であってもよいし、及び／又はその中間内部（internally）であってもよい。このフラグメントは、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個のような１０個以下の欠失によって、あるいは１個、２個、３個、４個又は５個のような５個以下の欠失によって、あるいは１個、２個又は３個のような３個以下の欠失によって、あるいは１個又は２個のような２個以下の欠失によって、あるいは１個の欠失によって得ることができる。本発明の機能的に活性なフラグメントは、α２インテグリン及び／又はα２β１インテグリンに結合することができること、及び場合によりα２及び／又はα２β１インテグリンを阻害することができることを含む、完全タンパク質によって示されるのと同様な生物活性を有することによって特徴付けられる。フラグメントの活性が、配列の変更のないアミノ酸配列の１０％以上、好ましくは２５％以上、より好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、又は最も好ましくは９９％以上の活性に達する場合には、この発明の文脈では抗原のフラグメントは機能的に活性である。α２β１インテグリンに対する結合活性を決定する適切な方法は、実施例、特に実施例１Ｄ中に述べられている。
【０１５０】
この変異体は、配列番号１又は配列番号２又は配列番号９又は配列番号１０又は配列番号１１の配列のいずれかから、欠失（複数を含む）、付加（複数を含む）及び／又は置換（複数を含む）を含む１つ又はそれより多いアミノ酸修飾によって誘導されることによって特徴付けられうる。この修飾（複数を含む）は、Ｃ末端であってもよいし、Ｎ末端であってもよいし、及び／又はその中間内部であってもよい。このフラグメントは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個のような１０個以下の欠失によって、あるいは１個、２個、３個、４個又は５個のような５個以下の欠失によって、あるいは１個、２個又は３個のような３個以下の欠失によって、あるいは１個又は２個のような２個以下の欠失によって、あるいは１個の欠失によって得ることができる。本発明の機能的に活性な変異体は、α２インテグリン及び／又はα２β１インテグリンに結合することができること、及び場合によりα２及び／又はα２β１インテグリンを阻害することができることを含む、完全タンパク質によって示されるのと同様な生物活性を有することによって特徴付けられる。この変異体の活性が、配列の変更のないアミノ酸配列の１０％以上、好ましくは２５％以上、より好ましくは５０％以上、更により好ましくは７０％以上、更により好ましくは８０％以上、とりわけ９０％以上、特に９５％以上、最も好ましくは９９％以上の活性に達する場合には、この発明の文脈ではこの変異体は機能的に活性である。
【０１５１】
（ｉｘ、ｘ又はｘｉ）の場合の付加アミノ酸は、Ｃ末端であってもよいし、Ｎ末端であってもよいし、及び／又はその中間内部に位置していてもよい。一実施態様によれば、５０個以下の付加、又は４０個以下、又は３０個以下、又は２０個以下の付加又は１０個以下の付加（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）、あるいは５個以下の付加（例えば、１個、２個、３個、４個又は５個）、あるいは３個以下の付加（例えば、１個、２個又は３個）、あるいは２個以下（例えば、１個または２個）、あるいはただ１個の付加がある。
【０１５２】
付加アミノ酸残基（複数を含む）は、任意のアミノ酸でありえ、該アミノ酸は、自然的に発生する、及びそうではない、Ｌ−及び／又はＤ−アミノ酸でありうる。好ましくは、このアミノ酸は、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンなどの任意の自然的に発生するアミノ酸である。
【０１５３】
このアミノ酸はまた、修飾されていてもよいし、それとも特殊なアミノ酸（unusual amino acid）であってもよい。こうしたものの例としては、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、２，４−ジアミノ酪酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン（N-ethylglycinem N-ethylasparagine）、ヒドロキシリシン、アロ−ヒドロキシリシン（allo-hydroxylysine）、３−ヒドロキシプロロイン（3-hydroxyproloine）、４−ヒドロキシプロロイン（4-hydroxyproloine）、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、６−Ｎ−メチルリシン、Ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン又はオルニチンがある。これに加えて、アミノ酸は、翻訳後修飾などの修飾を付されていてもよい。修飾の例としては、アセチル化、アミド化、ブロッキング（blocking）、ホルミル化、γ−カルボキシグルタミン酸ヒドロキシル化、グリコシル化、メチル化、
リン酸化、及び硫酸化が含まれる。１つより多い更なるアミノ酸残基又は非相同アミノ酸残基がペプチドに存在する場合、これらのアミノ酸残基は同じでもよく、それとも互いに異なってもよい。
【０１５４】
配列同一性のパーセンテージは、例えば、シーケンスアライメントによって決定することができる。比較のための配列のアライメントの方法は、当技術分野において周知である。種々のプログラム及びアライメントアルゴリズムについては、例えば、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981 又は Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci.US. A. 85: 2444, 1988中に記載されている。
【０１５５】
NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol.
215: 403-410, 1990）が、シーケンス解析プログラム、blastp、 blastn、 blastx、 tblastn及びtblastxと接続して使用するために、国立生物工学情報センター（the National Center for Biotechnology Information）（NCBI, Bethesda, MD）を含めて、及びインターネットによって、いくつかの供給源から利用可能である。配列番号１〜８の配列のいずれかの変異体は通例、ギャップblastpをデフォルトパラメーターに設定して、NCBI Blast 2.0を用いて特徴付けられる。少なくとも３０アミノ酸のアミノ酸配列の比較のために、Ｂｌａｓｔ２配列機能が、デフォルトBLOSUM62マトリックスをデフォルトパラメーターに設定して用いて使用される（ギャップの存在はコスト１１、及び残基ギャップ当たりはコスト１）。短いペプチド（約３０アミノ酸よりも少ない）をアライメントするときには、アライメントは、PAM30マトリックスをデフォルトパラメーターに設定して使用して（オープンギャップ９、エクステンションギャップ１ペナルティー）、Blast2配列機能を用いて行なわれる。１５アミノ酸以下のような短いウィンドウにわたる配列同一性を決定する方法は、国立生物工学情報センター（the National Center for Biotechnology Information） in Bethesda, Marylandにより維持されるウェブサイト中に記載されている。
【０１５６】
この発明の異なる局面の別の実施態様では、上記に定義されているような機能的に活性な変異体は、前記配列のいずれかの、配列番号１又は配列番号２又は配列番号９又は配列番号１０又は配列番号１１のいずれかのアミノ酸配列から１つ又はそれより多い保存的アミノ酸置換によって誘導される。
【０１５７】
保存的アミノ酸置換は、当技術分野における当業者であれば理解しているように、アミノ酸残基を類似又はより好ましい（意図している目的のため）機能及び／又は化学特性を付与するものに置き換える置換である。例えば、保存的アミノ酸置換はしばしば、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。こうしたファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。こうした修飾は、たとえそれらがそうした特性を改善しうるとしても、ポリペプチド（複合体）の結合又は機能的阻害特性を顕著に減少させるか、あるいは変化させるようには設計されない。置換される目的は、重大ではないが、分子の構造、分子の荷電又は疎水性、あるいは分子の大きさを維持し、又は強化することが可能なよりよいものに残基を置換すること（但し、これら決して限定されない）を含みうる。例えば、より少ない所望の残基を同じ極性又は荷電のものに単に置換することを所望することができる。こうした修飾は、当技術分野において知られている部位特異的変異導入（site-directed mutagenesis）及びＰＣＲを介した変異誘発（PCR-mediated mutagenesis）な
どの標準的な手法によって導入することができる。当技術分野における当業者が保存的アミノ酸置換を達成する１つの具体的手段は、アラニンスキャニング変異導入法（alanine scanning mutagenesis）である。次いで変化したポリペプチドを、当技術分野において利用可能な、又は実施例に述べられている機能的アッセイを用いて機能が維持されているか、あるいはよりよくなっているかどうかを試験する。この発明のより好ましい実施態様では、配列番号１又は配列番号２又は配列番号９又は配列番号１０又は配列番号２０のいずれかの配列における保存的置換の数は、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２又は１１のように２０以下、好ましくは、１０、９、８、７又は６のように１０以下、とりわけ、５、４、３のように５以下、特に２又は１である。
【０１５８】
この発明の異なる局面の更に別の実施態様では、このペプチド又はペプチド複合体は、下記の１つ又はそれより多い機能的に活性な変異体を含んでなる：
−上記において、ＬＤＲ１の機能的に活性な変異体は、１１位のアミノ酸での変異（mutation）、特に、１１Ａｓｎ→Ｇｌｎを含んでなり；
−上記において、ＨＤＲ２の機能的に活性な変異体は、６位のアミノ酸での変異、特に、６Ａｓｐ→Ｇｌｕを含んでなり；
−上記において、配列番号１の機能的に活性な変異体は、好ましくは、９Ａｌａ→Ｓｅｒ、１２Ａｌａ→Ｓｅｒ、１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ、１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ、２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ、３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ、４６Ｇｌｎ→Ｌｙｓ、４７Ａｌａ→Ｐｒｏ、８０Ａｓｐ→Ａｓｎ、８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、８７Ａｌａ→Ｔｈｒ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎから成る群より選択される、９位、１２位、１５位、２２位、３４位、４６位、４７位、８０位、８３位、８５位、８７位及び／又は８９位のアミノ酸での１つ又はそれより多い変異を含んでなり、
【０１５９】
又は上記において、配列番号１の機能的に活性な変異体は、下記の変異を含んでなり（ＬＣ１）；すなわち、９Ａｌａ→Ｓｅｒ、又は１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ、又は４６Ｇｌｎ→Ｌｙｓ、又は８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び４６Ｇｌｎ→Ｌｙｓ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び４６Ｇｌｎ→Ｌｙｓ、又は１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は４６Ｇｌｎ→Ｌｙｓ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び４６Ｇｌｎ→Ｌｙｓ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び４６Ｇｌｎ→Ｌｙｓ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び４６Ｇｌｎ→Ｌｙｓ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は表５のＬＣ１：９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び４６Ｇｌｎ→Ｌｙｓ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、
【０１６０】
又は上記において配列番号１の機能的に活性な変異体は、下記の変異を含んでなり（ＬＣ２）、すなわち、９Ａｌａ→Ｓｅｒ、又は１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ、又は３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ、又は４６Ｇｌｎ→Ｌｙｓ、又は８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び４６Ｇｌｎ→Ｌｙｓ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ、又は１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び４６Ｇｌｎ→Ｌｙｓ、又は１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ及び４６Ｇｌｎ→Ｌｙｓ、又は３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び４６Ｇｌｎ→Ｌｙｓ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ及び４６Ｇｌｎ→Ｌｙｓ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び４６Ｇｌｎ→Ｌｙｓ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ及び４６Ｇｌｎ→Ｌｙｓ、又は１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び４６Ｇｌｎ→Ｌｙｓ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ及び４６Ｇｌｎ→Ｌｙｓ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ及び４６Ｇｌｎ→Ｌｙｓ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び４６Ｇｌｎ→Ｌｙｓ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ及び４６Ｇｌｎ→Ｌｙｓ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ及び４６Ｇｌｎ→Ｌｙｓ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は表５のＬＣ２：９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ及び４６Ｇｌｎ→Ｌｙｓ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、
【０１６１】
又は上記において、配列番号１の機能的に活性な変異体は、下記の変異を含んでなり（ＬＣ３）；すなわち、９Ａｌａ→Ｓｅｒ、又は１２Ａｌａ→Ｓｅｒ、又は１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ、又は８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１２Ａｌａ→Ｓｅｒ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ、又は１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は表５に基づく（ＬＣ３）：９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、
【０１６２】
又は上記において、配列番号１の機能的に活性な変異体は、下記の変異を含んでなり（ＬＣ４）；すなわち、９Ａｌａ→Ｓｅｒ、又は１２Ａｌａ→Ｓｅｒ、又は１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ、又は３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ、又は８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１２Ａｌａ→Ｓｅｒ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ、又は１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ、又は１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ、又は１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ、又は１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ又は１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ又は表５に基づく（ＬＣ４）：９Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１２Ａｌａ→Ｓｅｒ及び１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ及び８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ及び８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、
【０１６３】
又は上記において、配列番号１の機能的に活性な変異体は、下記の変異を含んでなり（ＬＣ５）；すなわち、１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ、２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ、４７Ａｌａ→Ｐｒｏ、８０Ａｓｐ→Ａｓｎ、８７Ａｌａ→Ｔｈｒ、８９Ｔｈｒ→Ａｓｎ、又は１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ及び２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ、又は１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ及び４７Ａｌａ→Ｐｒｏ又は１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ及び８０Ａｓｐ→Ａｓｎ、又は１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ及び８７Ａｌａ→Ｔｈｒ、又は１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎ、又は２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ及び４７Ａｌａ→Ｐｒｏ、又は２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ及び８０Ａｓｐ→Ａｓｎ、又は２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ及び８７Ａｌａ→Ｔｈｒ、又は２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎ、又は４７Ａｌａ→Ｐｒｏ及び８０Ａｓｐ→Ａｓｎ、又は４７Ａｌａ→Ｐｒｏ及び８７Ａｌａ→Ｔｈｒ、又は４７Ａｌａ→Ｐｒｏ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎ、又は８０Ａｓｐ→Ａｓｎ及び８７Ａｌａ→Ｔｈｒ、又は８０Ａｓｐ→Ａｓｎ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎ、又は８７Ａｌａ→Ｔｈｒ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎ、又は１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ及び２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ及び４７Ａｌａ→Ｐｒｏ、又は１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ及び２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ及び８０Ａｓｐ→Ａｓｎ、又は１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ及び２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ及び８７Ａｌａ→Ｔｈｒ、又は１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ及び２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎ、又は１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ及び４７Ａｌａ→Ｐｒｏ及び８０Ａｓｐ→Ａｓｎ、又は１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ及び４７Ａｌａ→Ｐｒｏ及び８７Ａｌａ→Ｔｈｒ、又は１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ及び４７Ａｌａ→Ｐｒｏ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎ、又は１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ及び８０Ａｓｐ→Ａｓｎ及び８７Ａｌａ→Ｔｈｒ、又は１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ及び８０Ａｓｐ→Ａｓｎ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎ、又は１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ及び８７Ａｌａ→Ｔｈｒ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎ、又は２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ及び４７Ａｌａ→Ｐｒｏ及び８０Ａｓｐ→Ａｓｎ、又は２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ及び４７Ａｌａ→Ｐｒｏ及び８７Ａｌａ→Ｔｈｒ、又は２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ及び４７Ａｌａ→Ｐｒｏ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎ、又は２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ及び８０Ａｓｐ→Ａｓｎ及び８７Ａｌａ→Ｔｈｒ、又は２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ及び８０Ａｓｐ→Ａｓｎ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎ、又は２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ及び８７Ａｌａ→Ｔｈｒ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎ、又は４７Ａｌａ→Ｐｒｏ及び８０Ａｓｐ→Ａｓｎ及び８７Ａｌａ→Ｔｈｒ、又は４７Ａｌａ→Ｐｒｏ及び８０Ａｓｐ→Ａｓｎ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎ、又は４７Ａｌａ→Ｐｒｏ及び８７Ａｌａ→Ｔｈｒ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎ、又は８０Ａｓｐ→Ａｓｎ及び８７Ａｌａ→Ｔｈｒ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎ、又は１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ及び２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ及び４７Ａｌａ→Ｐｒｏ及び８０Ａｓｐ→Ａｓｎ、又は１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ及び２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ及び４７Ａｌａ→Ｐｒｏ及び８７Ａｌａ→Ｔｈｒ、又は１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ及び２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ及び４７Ａｌａ→Ｐｒｏ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎ、又は１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ及び２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ及び８０Ａｓｐ→Ａｓｎ及び８７Ａｌａ→Ｔｈｒ、又は１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ及び２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ及び８０Ａｓｐ→Ａｓｎ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎ、又は１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ及び２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ及び８７Ａｌａ→Ｔｈｒ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎ、又は１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ及び４７Ａｌａ→Ｐｒｏ及び８０Ａｓｐ→Ａｓｎ及び８７Ａｌａ→Ｔｈｒ、又は１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ及び４７Ａｌａ→Ｐｒｏ及び８０Ａｓｐ→Ａｓｎ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎ、又は１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ及び４７Ａｌａ→Ｐｒｏ及び８７Ａｌａ→Ｔｈｒ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎ、又は１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ及び８０Ａｓｐ→Ａｓｎ及び８７Ａｌａ→Ｔｈｒ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎ、又は２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ及び４７Ａｌａ→Ｐｒｏ及び８０Ａｓｐ→Ａｓｎ及び８７Ａｌａ→Ｔｈｒ、又は２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ及び４７Ａｌａ→Ｐｒｏ及び８０Ａｓｐ→Ａｓｎ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎ、又は２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ及び４７Ａｌａ→Ｐｒｏ及び８７Ａｌａ→Ｔｈｒ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎ、又は２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ及び８０Ａｓｐ→Ａｓｎ及び８７Ａｌａ→Ｔｈｒ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎ、又は４７Ａｌａ→Ｐｒｏ及び８０Ａｓｐ→Ａｓｎ及び８７Ａｌａ→Ｔｈｒ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎ、又は１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ及び２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ及び４７Ａｌａ→Ｐｒｏ及び８０Ａｓｐ→Ａｓｎ及び８７Ａｌａ→Ｔｈｒ、又は１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ及び２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ及び４７Ａｌａ→Ｐｒｏ及び８０Ａｓｐ→Ａｓｎ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎ、又は１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ及び２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ及び４７Ａｌａ→Ｐｒｏ及び８７Ａｌａ→Ｔｈｒ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎ、又は１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ及び２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ及び８０Ａｓｐ→Ａｓｎ及び８７Ａｌａ→Ｔｈｒ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎ、又は１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ及び４７Ａｌａ→Ｐｒｏ及び８０Ａｓｐ→Ａｓｎ及び８７Ａｌａ→Ｔｈｒ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎ、又は２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ及び４７Ａｌａ→Ｐｒｏ及び８０Ａｓｐ→Ａｓｎ及び８７Ａｌａ→Ｔｈｒ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎ、又は表５に基づいて（ＬＣ５）：１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ及び２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ及び４７Ａｌａ→Ｐｒｏ及び８０Ａｓｐ→Ａｓｎ及び８７Ａｌａ→Ｔｈｒ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎ、
及び／又は
【０１６４】
上記において、配列番号２の機能的に活性な変異体は、特に、５Ｈｉｓ→Ｖａｌ、７Ｐｒｏ→Ｓｅｒ、１１Ｌｅｕ→Ｖａｌ、１２Ｖａｌ→Ｌｙｓ、１７Ｐｒｏ→Ｓｅｒ、２０Ｌｅｕ→Ｖａｌ、３８Ｌｙｓ→Ａｒｇ、４０Ａｒｇ→Ａｌａ、４３Ａｒｇ→Ｇｌｎ、５５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、６１Ａｓｎ→Ａｌａ、６５Ｌｙｓ→Ｇｌｎ、６６Ａｓｐ→Ｇｌｙ、６７Ｌｙｓ→Ａｒｇ、７６Ｓｅｒ→Ｔｈｒ、８１Ｉｌｅ→Ｍｅｔ、８２Ｇｌｎ→Ｇｌｕ、８７Ｔｈｒ→Ａｒｇ、９１Ｓｅｒ→Ｔｈｒ、９３Ｖａｌ→Ｌｙｓ、１１２Ｔｈｒ→Ｌｅｕ、１１３Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び１１６Ｓｅｒ→Ｖａｌから成る群より選択される、５位、７位、１１位、１２位、１７位、２０位、３８位、４０位、４３位、５５位、６１位、６５位、６６位、６７位、７６位、８１位、８２位、８７位、９１位、９３位、１１２位、１１３位及び／又は１１６位のアミノ酸での１つ又はそれより多い変異を含んでなり、
【０１６５】
又は上記において、配列番号２の機能的に活性な変異体は、下記の変異を含んでなり（ＨＣ１）；すなわち、４３Ａｒｇ→Ｇｌｎ、又は６７Ｌｙｓ→Ａｒｇ、又は１１６Ｓｅｒ→Ｖａｌ、又は４３Ａｒｇ→Ｇｌｎ及び６７Ｌｙｓ→Ａｒｇ、又は４３Ａｒｇ→Ｇｌｎ及び１１６Ｓｅｒ→Ｖａｌ、又は６７Ｌｙｓ→Ａｒｇ及び１１６Ｓｅｒ→Ｖａｌ、又は表６に基づいて（ＨＣ１）：４３Ａｒｇ→Ｇｌｎ及び６７Ｌｙｓ→Ａｒｇ及び１１６Ｓｅｒ→Ｖａｌ、
【０１６６】
又は上記において、配列番号２の機能的に活性な変異体は、下記の変異を含んでなり（ＨＣ２）；４３Ａｒｇ→Ｇｌｎ、又は５５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は６７Ｌｙｓ→Ａｒｇ、又は１１６Ｓｅｒ→Ｖａｌ、又は４３Ａｒｇ→Ｇｌｎ及び５５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は４３Ａｒｇ→Ｇｌｎ及び６７Ｌｙｓ→Ａｒｇ、又は４３Ａｒｇ→Ｇｌｎ及び１１６Ｓｅｒ→Ｖａｌ、又は５５Ａｓｐ→Ｇｌｕ及び６７Ｌｙｓ→Ａｒｇ、又は５５Ａｓｐ→Ｇｌｕ及び１１６Ｓｅｒ→Ｖａｌ、又は６７Ｌｙｓ→Ａｒｇ及び１１６Ｓｅｒ→Ｖａｌ、又は４３Ａｒｇ→Ｇｌｎ及び５５Ａｓｐ→Ｇｌｕ及び６７Ｌｙｓ→Ａｒｇ、又は４３Ａｒｇ→Ｇｌｎ及び５５Ａｓｐ→Ｇｌｕ及び１１６Ｓｅｒ→Ｖａｌ、又は４３Ａｒｇ→Ｇｌｎ及び６７Ｌｙｓ→Ａｒｇ及び１１６Ｓｅｒ→Ｖａｌ、又は５５Ａｓｐ→Ｇｌｕ及び６７Ｌｙｓ→Ａｒｇ及び１１６Ｓｅｒ→Ｖａｌ、又は表６に基づいて（ＨＣ２）：４３Ａｒｇ→Ｇｌｎ及び５５Ａｓｐ→Ｇｌｕ及び６７Ｌｙｓ→Ａｒｇ及び１１６Ｓｅｒ→Ｖａｌ、
【０１６７】
又は上記において、配列番号２の機能的に活性な変異体は、下記の変異を含んでなり（ＨＣ３）；すなわち、１７Ｐｒｏ→Ｓｅｒ、又は１１６Ｓｅｒ→Ｖａｌ、又は表６に基づいて（ＨＣ３）：１７Ｐｒｏ→Ｓｅｒ及び１１６Ｓｅｒ→Ｖａｌ、
又は上記において、配列番号２の機能的に活性な変異体は、下記の変異を含んでなり（ＨＣ４）；すなわち、１７Ｐｒｏ→Ｓｅｒ、又は９３Ｖａｌ→Ｌｙｓ、又は１１６Ｓｅｒ→Ｖａｌ又は１７Ｐｒｏ→Ｓｅｒ及び９３Ｖａｌ→Ｌｙｓ、又は１７Ｐｒｏ→Ｓｅｒ及び１１６Ｓｅｒ→Ｖａｌ、又は９３Ｖａｌ→Ｌｙｓ及び１１６Ｓｅｒ→Ｖａｌ、又は表６に基づいて（ＨＣ４）：１７Ｐｒｏ→Ｓｅｒ及び９３Ｖａｌ→Ｌｙｓ及び１１６Ｓｅｒ→Ｖａｌ、
又は上記において、配列番号２の機能的に活性な変異体は、下記の変異を含んでなり（ＨＣ５）；すなわち、１７Ｐｒｏ→Ｓｅｒ、又は５５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は１１６Ｓｅｒ→Ｖａｌ又は１７Ｐｒｏ→Ｓｅｒ及び５５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は１７Ｐｒｏ→Ｓｅｒ及び１１６Ｓｅｒ→Ｖａｌ、又は５５Ａｓｐ→Ｇｌｕ及び１１６Ｓｅｒ→Ｖａｌ、又は表６に基づいて（ＨＣ５）：１７Ｐｒｏ→Ｓｅｒ及び５５Ａｓｐ→Ｇｌｕ及び１１６Ｓｅｒ→Ｖａｌ、
【０１６８】
又は上記において、配列番号２の機能的に活性な変異体は、下記の変異を含んでなり（ＨＣ６）；すなわち、１２Ｖａｌ→Ｌｙｓ、又は５５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は９３Ｖａｌ→Ｌｙｓ、又は１１６Ｓｅｒ→Ｖａｌ、又は１２Ｖａｌ→Ｌｙｓ及び５５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、又は１２Ｖａｌ→Ｌｙｓ及び９３Ｖａｌ→Ｌｙｓ、又は１２Ｖａｌ→Ｌｙｓ及び１１６Ｓｅｒ→Ｖａｌ、又は５５Ａｓｐ→Ｇｌｕ及び９３Ｖａｌ→Ｌｙｓ、又は５５Ａｓｐ→Ｇｌｕ及び１１６Ｓｅｒ→Ｖａｌ、又は９３Ｖａｌ→Ｌｙｓ及び１１６Ｓｅｒ→Ｖａｌ、又は１２Ｖａｌ→Ｌｙｓ及び５５Ａｓｐ→Ｇｌｕ及び９３Ｖａｌ→Ｌｙｓ、又は１２Ｖａｌ→Ｌｙｓ及び５５Ａｓｐ→Ｇｌｕ及び１１６Ｓｅｒ→Ｖａｌ、又は１２Ｖａｌ→Ｌｙｓ及び９３Ｖａｌ→Ｌｙｓ及び１１６Ｓｅｒ→Ｖａｌ、又は５５Ａｓｐ→Ｇｌｕ及び９３Ｖａｌ→Ｌｙｓ及び１１６Ｓｅｒ→Ｖａｌ、又は表６に基づいて（ＨＣ６）：１２Ｖａｌ→Ｌｙｓ及び５５Ａｓｐ→Ｇｌｕ及び９３Ｖａｌ→Ｌｙｓ及び１１６Ｓｅｒ→Ｖａｌ、
又は上記において、配列番号２の機能的に活性な変異体は、以下の変異のうち、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個又は全てを含んでなる（ＨＣ６）；５Ｈｉｓ→Ｖａｌ、７Ｐｒｏ→Ｓｅｒ、１１Ｌｅｕ→Ｖａｌ、１２Ｖａｌ→Ｌｙｓ、１７Ｐｒｏ→Ｓｅｒ、２０Ｌｅｕ→Ｖａｌ、３８Ｌｙｓ→Ａｒｇ、４０Ａｒｇ→Ａｌａ、４３Ａｒｇ→Ｇｌｎ、６１Ａｓｎ→Ａｌａ、６５Ｌｙｓ→Ｇｌｎ、６６Ａｓｐ→Ｇｌｙ、６７Ｌｙｓ→Ａｒｇ、７６Ｓｅｒ→Ｔｈｒ、８１Ｉｌｅ→Ｍｅｔ、８２Ｇｌｎ→Ｇｌｕ、８７Ｔｈｒ→Ａｒｇ、９１Ｓｅｒ→Ｔｈｒ、１１２Ｔｈｒ→Ｌｅｕ、１１３Ｌｅｕ→Ｖａｌ。
【０１６９】
こうした所定位置及び変異が、表４、５及び６に関連して実施例中に述べられている留意事項に基づいて導入された。たった１つだけの変異であってもよいし、それともこうした変異の組み合わせ（特に、表４、５及び６に述べられている組み合わせのいずれか）であってもよい。更に、このペプチド又はペプチド複合体は、上記に列挙される軽鎖変異体の１つ（one of the variant light chains）と、上記に列挙される重鎖変異体の１つ又は複数とが一緒に存在する、１つ又はそれより多い変異を含むことができ、例えば、以下の変異／機能的変異体の組み合わせの１つを含んでなるか、あるいはそれらから成る：ＬＣ１及びＨＣ１、ＬＣ１及びＨＣ２、ＬＣ１及びＨＣ３、ＬＣ１及びＨＣ４、ＬＣ１及びＨＣ５、ＬＣ１及びＨＣ６、ＬＣ１及びＨＣ７、ＬＣ２及びＨＣ１、ＬＣ２及びＨＣ２、ＬＣ２及びＨＣ３、ＬＣ２及びＨＣ４、ＬＣ２及びＨＣ５、ＬＣ２及びＨＣ６、ＬＣ２及びＨＣ７、ＬＣ３及びＨＣ１、ＬＣ３及びＨＣ２、ＬＣ３及びＨＣ３、ＬＣ３及びＨＣ４、ＬＣ３及びＨＣ５、ＬＣ３及びＨＣ６、ＬＣ３及びＨＣ７、ＬＣ４及びＨＣ１、ＬＣ４及びＨＣ２、ＬＣ４及びＨＣ３、ＬＣ４及びＨＣ４、ＬＣ４及びＨＣ５、ＬＣ４及びＨＣ６、ＬＣ４及びＨＣ７、ＬＣ５及びＨＣ１、ＬＣ５及びＨＣ２、ＬＣ５及びＨＣ３、ＬＣ５及びＨＣ４、ＬＣ５及びＨＣ５、ＬＣ５及びＨＣ６、ＬＣ５及びＨＣ７。
【０１７０】
これに加えて、例えば、本発明のペプチド又はペプチド複合体の検出又は精製のためにマーカーを加えることが望ましい場合もありうる。適切なマーカーには、タグ（例えば、６Ｈｉｓ（又はＨｅｘａＨｉｓ）タグ、７Ｈｉｓ、８Ｈｉｓ、ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ、（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）2Ｓｔｒｅｐタグ、ＨＡタグ、ｃ−ｍｙｃタグ又はグルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ）、蛍光マーカー（例えば、ＦＩＴＣ、フルオレセイン、ローダミン、Ｃｙ色素又はアレクサ（Alexa））、酵素標識（例えば、ペニシリナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼ）、放射性標識（例えば、3Ｈ、32Ｐ、35Ｓ、125Ｉ又は14Ｃ）が含まれるがこれらに限定されない。更に、このポリペプチド（複合体）は、支持体に加えてもよく、該支持体は、特にアレイ、ビーズ（例えば、ガラス又は磁気）、ファイバー、フィルムなどの固体の支持体である。当業者であれば、適切な更なるコンポーネントを選択することによって、この発明のポリペプチド又はポリペプチド複合体を含んでなる結合分子、及び更なるコンポーネントを意図する使用に適合させることができるであろう。
【０１７１】
この発明の別の実施態様によれば、このペプチド又はペプチド複合体は、１つ又はそれより多い以下の特性を示す：Ａ〜Ｅ（すなわち、Ａ、又はＢ、又はＣ、又はＤ、又はＥ、又はＡ及びＢ、又はＡ及びＣ、又はＡ及びＤ、又はＡ及びＥ、又はＢ及びＣ、又はＢ及びＤ、又はＢ及びＥ、又はＣ及びＤ、又はＣ及びＥ、又はＡ及びＢ及びＣ、又はＡ及びＢ及びＤ、又はＡ及びＢ及びＤ、又はＡ及びＢ及びＥ、又はＡ及びＣ及びＤ、又はＡ及びＣ及びＥ、又はＡ及びＤ及びＥ、又はＢ及びＣ及びＤ、又はＢ及びＣ及びＥ、又はＢ及びＤ及びＥ、又はＡ及びＢ及びＣ及びＤ、又はＡ及びＢ及びＣ及びＥ、又はＡ及びＣ及びＤ及びＥ、又はＢ及びＣ及びＤ及びＥ、又はＡ及びＢ及びＣ及びＥ：
Ａ）表１１に提示されているデータに基づく速度論的結合定数（kinetic binding constants）（表面プラズモン共鳴によって決定される、例えば、Biacoreによって）、
Ｂ）以下のような軽鎖の分子の質量（molecular mass）：２３．７３＋／−０．０５ｋＤａ又は２３．７３ｋＤａ（ＬＣ１）、又は２３．７４＋／−０．０５ｋＤａ又は２３．７ｋＤａ（ＬＣ２）、又は２３．７５＋／−０．０５ｋＤａ又は２３．８ｋＤａ（ＬＣ３）、又は２３．７７＋／−０．０５ｋＤａ又は２３．７７ｋＤａ（ＬＣ４）、又は２３．７９＋／−０．０５ｋＤａ又は２３．７９ｋＤａ（ＬＣ５）、５０．３１＋／−０．０５ｋＤＡ
及び／又は以下のような重鎖の分子の質量：５０．３１ｋＤａ（ＨＣ１）、又は５０．３３＋／−０．０５ｋＤＡ、又は５０．３３ｋＤａ（ＨＣ２）、又は５０．３０＋／−０．０５ｋＤａ又は５０．３０ｋＤａ（ＨＣ３）、又は５０．３３＋／−０．０５ｋＤａ又は５０．３３ｋＤａ（ＨＣ４）、又は５０．３２＋／−０．０５ｋＤａ又は５０．３２ｋＤａ（ＨＣ５）、又は５０．３５＋／−０．０５ｋＤａ又は５０．３５ｋＤａ（ＨＣ６）、又は５０．１９＋／−０．０５ｋＤａ又は５０．１９ｋＤａ（ＨＣ７）、Ｃ）静的状態下にて決定された、＜０．１、＜０．０９、＜０．０８、＜０．０７、＜０．０６、＜０．０５、＜０．０４、＜０．０３、＜０．０２又は＜０．０１のＩＣ50μｇ／ｍｌ値を有する洗浄したヒト血小板のコラーゲンへの結合の阻害、
Ｄ）静的状態下にて決定された、＜０．３、＜０．２、＜０．１、＜０．１５、＜０．１４又は＜０．１３のＩＣ50μｇ／ｍｌ値を有する多血小板血漿に由来するヒト血小板のコラーゲンへの結合の阻害、
Ｅ）＜１０、＜９、＜８、＜７、＜６、＜５、＜４、＜３、＜２．５、＜２、＜１．５、＜１又は＜０．５％のサイズ排除クロマトグラフィーによって決定される凝集パーセンテージ。
【０１７２】
第五の局面では、この発明は、この発明によるペプチド又はペプチド複合体をコードする１つ又はそれより多い核酸に関する。
【０１７３】
この発明の核酸分子は、ｍＲＮＡ又はｃＲＮＡなどのＲＮＡの形態であってもよいし、それとも、例えば、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ（例えば、クローニングによって得られるか、あるいは化学合成手法によるか、又はその組み合わせによって作製される）を含む、ＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡは、３本鎖であってもよいし、あるいは２本鎖であってもよいし、あるいは１本鎖であってもよい。１本鎖ＤＮＡは、センス鎖とも呼ばれるコード鎖であってもよいし、それともアンチセンス鎖とも呼ばれるノンコード鎖であってもよい。本明細書中で使用される際には、核酸分子とは、とりわけ、１本鎖及び２本鎖ＤＮＡ、１本鎖及び２本鎖ＲＮＡの混合であるＤＮＡ、及び１本鎖及び２本鎖領域の混合であるＲＮＡ、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子（これは、１本鎖、あるいはより普通には、２本鎖又は３本鎖、又は１本鎖及び２本鎖領域の混合でありうる）を意味する。これに加えて、本明細書中で使用される際には、核酸分子は、ＲＮＡ又はＤＮＡ、又はＲＮＡ及びＤＮＡの双方を含む３本鎖領域を意味する。
【０１７４】
これに加えて、この核酸は、１つ又はそれより多い修飾塩基を含みうる。こうした核酸はまた、例えば、生理学的環境においてこうした分子の安定性及び半減期を増加させるためのリボースリン酸バックボーンの修飾を含みうる。すなわち、安定性又は他の理由のために修飾されたバックボーンを有するＤＮＡ（複数を含む）又はＲＮＡ（複数を含む）は、その特性が本明細書中で意図されているような“核酸分子（nucleic acid molecule）”である。更に、稀な塩基（２つの例を挙げれば、イノシンのような稀な塩基、又はトリチル化塩基のような修飾された塩基）を含むＤＮＡ（複数を含む）又はＲＮＡ（複数を含む）が、この発明に関連する核酸分子である。当技術分野における当業者に知られている多くの有用な目的に役立つ極めて多種の修飾がＤＮＡ及びＲＮＡになされていることは理解されるところであろう。本明細書中で使用される際には、用語「核酸分子」は、こうした化学的、酵素的、又は代謝的に修飾された核酸分子の形態、並びに、とりわけ、単純型細胞及び複雑型細胞（simple and complex cells）を含む、ウイルス及び細胞のＤＮＡ及びＲＮＡ特性の化学的形態を包含する。例えば、核酸によってコードされるポリペプチドに作用しないヌクレオチド置換がなされることができ、従って、上記に定義されているような抗原又はフラグメント又はその機能的に活性な変異体をコードするあらゆる核酸分子がこの発明によって包含される。
【０１７５】
更に、フラグメント又はその機能的に活性な変異体を含む、本発明の１つ又はそれより多いポリペプチドをコードする核酸分子のいずれも、標準的なクローニング手法などの標準的手法を用いて、任意の所望の制御配列、リーダー配列、異種マーカー配列又は異種コード配列（heterologous coding sequence）に機能的に連結されて、融合タンパク質を作製することができる。
【０１７６】
本発明の核酸は通常、インビトロ、又は培養液中の細胞内で作り出すことができ、一般的には、核酸を作製するための、エンドヌクレアーゼ及び／又はエクソヌクレアーゼ及び／又はポリメラーゼ及び／又はリガーゼ及び／又はリコンビナーゼ又は当業者に知られている他の方法による核酸の操作手段による。
【０１７７】
この発明の異なる局面の別の実施態様では、核酸（複数を含む）は、ベクター内に配置される。ベクターは更に、それが宿主細胞中で複製されることを可能にする、複製開始点などの核酸配列、１つ又はそれより多い治療遺伝子、及び／又は選択可能なマーカー遺伝子、及び当技術分野で知られている、転写、翻訳及び／又はコードされたタンパク質の分泌を指示している制御因子のような他の遺伝因子を含むことができる。このベクターは、細胞を形質導入し、形質転換し、又は感染させるために使用することができ、その結果、その細胞に固有のもの以外の核酸及び／又はタンパク質を細胞に発現させることができる。このベクターは所望により、核酸を細胞内に入れることを達成させるのに役立つ、ウイルス粒子、リポソーム、被覆タンパク質（protein coating）などの材料を含む。標準的な分子生物学手法によるタンパク質発現のための適切な発現ベクターの数多い種類が、当技術分野において知られている。こうしたベクターは、昆虫、例えば、バキュロウイルス発現、又は酵母、真菌、バクテリア又はウイルス発現系を含む、従来から使用されているベクターの種類の中から選択される。それらの数多い種類が当技術分野において知られているが、他の適切な発現ベクターもまた、この目的のために使用することができる。こうした発現ベクターを得る方法は、周知である（例えば、Sambrook et al, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989）参照）。一実施態様では、このベクターは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターには、レトロウイルスベクター及びアデノウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。
【０１７８】
この方法によってトランスフェクションするための適切な宿主細胞又は細胞株は、細菌細胞を含む。例えば、大腸菌（E. coli）の種々の株が生物工学の分野において宿主細胞として周知である。バチルス・サブティリス（B. subtilis）、シュードモナス属（Pseudomonas）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、及び他の桿菌などの種々の株もまた、この方法に使用されうる。当技術分野における当業者に知られている酵母細胞の多くの株もまた、この発明のペプチドの発現のための宿主細胞として利用可能である。他の真菌細胞又はスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugipedera）（Ｓｆ９）細胞のような昆虫細胞もまた、発現系として使用されうる。あるいは、ヒト２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、サルＣＯＳ−１細胞株、又はＳｗｉｓｓマウス、ＢＡＬＢ／ｃマウス、若しくはＮＩＨマウスに由来するマウス３Ｔ３細胞などの哺乳動物細胞が使用されうる。更に他の適切な宿主細胞、並びにトランスフェクション、培養、増幅、スクリーニング、生成、及び精製のための方法が、当技術分野において知られている。
【０１７９】
この発明の異なる局面の一実施態様では、ハイブリドーマ細胞株、周知の従来から行なわれている手法によって作製される望ましいモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞株を使用することができる。この発明の関連では、このハイブリドーマ細胞は、α２インテグリン、特にα２β１インテグリンに特異的に結合する抗体を作製することができる。このハイブリドーマ細胞は、正常活性化された、抗体を産生するＢ細胞をミエローマ細胞と融合することによって作製することができる。具体的には、このハイブリドーマ細胞は、次のように作製することができる：Ｂ細胞を、関連の抗原で負荷された動物の脾臓から除去する。次いでこうしたＢ細胞を、培養液中で無限に増殖することができるミエローマ腫瘍細胞と融合する。この融合は、細胞膜をより透過性にすることによって行なわれる。この融合されたハイブリッド細胞（ハイブリドーマと呼ばれる）は、癌細胞であるので、急速に、かつ無限に増殖し、大量の所望の抗体を作製する。これを選抜し、次に限界希釈によってクローニングする。インターロイキン−６（例えば、ブライクローン（briclone））を含む補充培地が通例、この工程に必須である。選抜は、選択培地、具体的には、１倍濃度ＨＡＴ（1X concentration HAT）を含む培地中の新たに融合したプライマリーハイブリドーマ細胞をおよそ１０〜１４日間培養することによって行なわれる。ＨＡＴを使用した後、培地を含むＨＴを使用することが望ましいことがしばしばである。クローニングは、ポジティブプライマリーハイブリドーマ細胞の同定後に行なわれる。
【０１８０】
本発明のペプチド又はペプチド複合体は、適切な宿主細胞中、本発明の核酸を発現させることによって作製することができる。従って、別の局面では、この発明は、本発明によるペプチド又はペプチド複合体を作製する方法であって、本発明の核酸（複数を含む）を含む宿主細胞を、抗体の発現を可能にする条件下にて培養すること、及び所望により宿主細胞からペプチド又はペプチド複合体を回収することを含んでなる、前記方法に関する。
【０１８１】
この場合、宿主細胞を、例えば、従来から行なわれている、転写調節配列の制御下にて本発明の核酸を含む少なくとも１つの発現ベクターを用いるエレクトロポレーションなどの手段によって形質導入することができる。次いでこの形質導入又は形質転換した宿主細胞を、タンパク質の発現を可能にする条件下にて培養する。発現されたタンパク質を回収し、単離し、そして所望により、当技術分野における当業者に知られている適切な手段によって細胞から（又は細胞外に発現されている場合には、培養培地から）精製する。例えば、このタンパク質を細胞溶解後、可溶形態で分離するか、あるいは公知の手法（例えば、グアニジンクロリド中）を用いて抽出する。所望であれば、本発明のポリペプチド（複数を含む）を融合タンパク質として作製する。こうした融合タンパク質は、上記に述べられているものである。あるいは、例えば、選択された宿主細胞中でタンパク質の発現を高めるために、あるいは精製を改善するために、融合タンパク質を作製することが望ましい場合もありうる。この発明のポリペプチドを含んでなる分子は、更に種々の従来から行なわれている方法のいずれかを用いて精製することができ、こうした方法には、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣなどを使用する液体クロマトグラフィー（例えば、順相又は逆相）；アフィニティークロマトグラフィー（例えば、無機リガンド又はモノクローナル抗体を用いて）；サイズ排除クロマトグラフィー；固定化金属キレートクロマトグラフィー（immobilized metal chelate chromatography）；ゲル電気泳動などがある（但し、これらに限定されない）。当技術分野における当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく最も適切な分離及び精製手法を選択することができる。こうした精製によって、微生物の他のタンパク質物質及び非タンパク質物質を実質的に含まない形態で抗原が提供される。
【０１８２】
適切な宿主細胞は、例えば、多細胞生物に由来する真核細胞又は細胞株（上記に定義されているような、例えば、ＣＨＯ細胞又はＢＨＫ細胞）、酵母のような真核単細胞生物（例えば、分裂酵母（s.pombe）又は出芽酵母（s.cerevisiae））又は、大腸菌などの原核細胞である。非常に多くの適切な宿主細胞が、当技術分野において知られている。
【０１８３】
この発明の異なる局面の一実施態様は、ペプチド又はペプチド複合体が前記細胞／宿主細胞によって異種発現される、ペプチド又はペプチド複合体を作製する組み換え細胞に関する。ペプチド又はタンパク質（本明細書ではまた：ペプチド又はペプチド複合体）の異種発現は、この組み換え細胞が自然的にはこのペプチド又はタンパク質又はペプチド複合体を発現しない細胞から誘導されるということを意味し、そして該組み換え細胞は、改変されて（例えば、形質導入されるか、あるいは形質転換されている）おり、その結果そうしたものを発現する；例えば、抗体又はそのフラグメントのような前記ペプチド又はペプチド複合体の前記細胞によって発現を可能にする核酸（例えば、ペプチド又はペプチド複合体をコードするインサートを持っている人工的核酸コンストラクト（ベクター））を担持している。この組み換え細胞は、上記に定義されているような真核及び原核生物細胞を含めて、あらゆる細胞、細胞株又は宿主細胞から誘導されることができる。
【０１８４】
従って、この発明の第六の局面は、この発明の核酸の１つを異種発現する細胞に関する。
【０１８５】
第七の局面では、この発明は、この発明のペプチド又はペプチド複合体を作製する方法であって、前記ペプチド又はペプチド複合体の発現を可能にする条件下にて、この発明による細胞を培養すること、及び所望により宿主細胞から前記ペプチド又はペプチド複合体を回収することを含んでなる、前記方法に関する。
【０１８６】
この発明の第八の局面は、医薬として使用するために、少なくとも１つのペプチド又はペプチド複合体、又は本発明によるペプチド又はペプチド複合体を含むコンジュゲート、及び／又は本発明による少なくとも１つの核酸を含んでなる組成物に関する。
【０１８７】
この発明の（医薬）組成物は、更に製薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を包含することができる。この発明において有用な製薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤は、従来から使用されているものであり、緩衝剤、安定化剤、希釈剤、保存剤、及び可溶化剤を含むことができる。Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)において、本明細書中で開示されているポリペプチド／核酸の医薬送達に適切な組成物及び製剤が記載されている。この医薬組成物中の活性成分（ポリペプチド又は核酸）の含有量は、それが処置すること又は予防することに有用である限り限定されることはないが、好ましくは、全組成物に対して０．００００００１〜１０％（重量）を含む。
【０１８８】
一般的に、担体又は賦形剤の性質は、使用される具体的な投与方式に左右されるであろう。例えば、非経口製剤は通例、ビヒクルとしての水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水溶性デキストロース、グリセロールなどの薬学的に、及び生理学的に許容される液体を含めて、注入可能な液体を含む。固体組成物（例えば、粉末剤、ピル、錠剤、又はカプセル形態）の場合には、従来から使用されている非毒性固体担体は、例えば、医薬グレードのマンニトール、乳糖、スターチ、又はステアリン酸マグネシウムを含むことができる。生物学的に中性な担体に加えて、投与される医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤又は乳化剤、保存剤、及びｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウム又はソルビタンモノラウレートを含むことができる。
【０１８９】
一般的に、適切な量の薬学的に許容される塩が担体中で製剤を等張にするために用いられる。担体の例としては、生理食塩水、リンゲル溶液及びデキストロース溶液が含まれるが、それらに限定されない。好ましくは、許容される賦形剤、担体、又は安定化剤は、好ましくは、使用される投与量及び濃度において非毒性であり、以下のものが含まれる：クエン酸塩、リン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤；塩を形成する対イオン、例えば、ナトリウム及びカリウム；低分子量（＞１０のアミノ酸残基）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、又はゼラチン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；ヒスチジン、グルタミン、リシン、アスパラギン、アルギニン、又はグリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む炭水化物；単糖類；二糖類；他の糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；非イオン性界面活性剤、例えば、ツイーン、プルロニック又はポリエチレングリコール；メチオニン、アルコルビン酸及びトコフェロールを含む抗酸化剤；及び／又は保存剤、例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコール又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルパラベン又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール。
【０１９０】
この医薬組成物は、本発明の少なくとも１つのペプチド、ペプチド複合体又は核酸を包含する；しかしながら、これはまた、本発明の１つ又はそれより多い異なるペプチド及び／又はペプチド複合体及び／又は核酸を含むカクテル（すなわち、単純な混合物）を含むことができる。この発明のペプチド（複数を含む）又はペプチド複合体（複数を含む）はまた、製薬学的に許容される塩の形態で使用することができる。この発明のペプチドと塩を形成することができる適切な酸及び塩基は、当技術分野における当業者に周知であり、無機及び有機の酸及び塩基を含む。
【０１９１】
好ましくは、この医薬組成物は、α２インテグリン関連疾患若しくは障害を処置し、又は予防するために使用することができる。この発明の文脈では、α２インテグリン関連疾患若しくは障害とは、１つ又はそれより多いα２インテグリン機能又は活性に関与している、１つ又はそれより多いα２インテグリン機能又は活性によって引き起こされる、１つ又はそれより多いα２インテグリン機能又は活性が引き起こす一因となる、又は１つ又はそれより多いα２インテグリン機能又は活性によって侵されるいずれかの好ましからざる体の状態として理解されうる。こうした例としては、コラーゲン媒介性の細胞増殖の増大又は異常、又はサイトカインの分泌などのα２インテグリンが媒介する異常な細胞反応が関与するシグナル伝達経路又はプロセスが含まれ、その結果、例えば、血管新生、炎症性状態、又は創傷治癒障害に至る。具体的な例としては、以下が含まれるが、これらに限定されない：血栓症、血管疾患、血管新生及び転移を含む癌、膵臓癌、大腸癌、例えば、大腸癌から他の器官（例えば、肺及び肝臓）への転移性拡大、及びメラノーマ、炎症、炎症性疾患、自己免疫疾患及び異常な又は増加した新脈管形成によって特徴付けられる疾患、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、移植に対する反応、視神経炎、脊髄外傷、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、レイノー症候群、シェーグレン症候群、強皮症、心血管疾患、乾癬、アテローム性動脈硬化症、及び炎症反応を誘発する感染症。
【０１９２】
この発明の１つの実施態様では、この医薬組成物は、血管疾患及び／又は血栓症を処置する、又は予防するため、具体的には、例えば、急性冠動脈症候群、経皮的冠動脈インターベンション、虚血性脳卒中、頸動脈狭窄又は末梢動脈閉塞性疾患のようないくつかの臨床的適応疾患の処置に使用することができる。
【０１９３】
この発明の関連では、処置又は予防は、処置（すなわち、疾患状態又は障害を減少させるか、又は消失させるため、あるいは疾患状態又は障害がまだ露呈していない個体における、疾患状態又は障害の発現を防止するか、又は遅延させるため）が必要なあらゆる動物（非ヒト又はヒト、特にヒト、家畜又はペット動物などの哺乳類）に作用することができる。
【０１９４】
α２β１インテグリンは、血栓症の処置又は予防における注目に値する標的である。α２β１ノックアウトマウスを用いるインビボ試験によって、血栓の形成の減少、及び動脈血栓症モデルの閉塞までの時間の増加、並びに尻尾出血時間の延長が示された。α２インテグリン欠損及び多形型に関する臨床試験では、患者は、軽度から重度の出血障害及び血小板の正常に機能しないコラーゲン反応を示した。多形型は、α２β１の発現の増加をもたらし、その結果、＜６２の年齢の個体において致命的ではない心筋梗塞に対する非依存性危険因子、＜５０の年齢の患者において卒中発作の危険の増加、そしてＩＩ型糖尿病において糖尿病性網膜症の発症に対する危険の増加を引き起こした。更に、血小板及びα２インテグリンは、血管新生、腫瘍の進行／転移に関与している。従って、癌は更なる関心対象の治療分野である。α２インテグリンを阻害することによって、インビトロにおけるストローマ腫瘍浸潤に拮抗し、そして特に、インテグリン−ＥＣＭ／α２インテグリン媒介Ｉ型コラーゲン粘着（Integrin-ECM/α2 integrin-mediated type I collagen adhesion）は、インビトロにおける膵臓癌における悪性表現型の進展に関与していることが示されている。インビボでは、抗α２拮抗性ｍＡｂ（anti-α2 antagonistic mAbs）は、ラットモデルにおける手術によって誘発される肝臓転移の拡大を防止し、多能性ヒト結腸直腸癌細胞の分化を阻害し、そしてヒト扁平上皮癌異種移植片（human squamous cell carcinoma xenografts）の増殖及び血管新生を抑制する。
【０１９５】
結腸直腸癌の場合には、原発性結腸直腸癌の除去は、逆説的ではあるが、転移発症の危険性を増加させうるということが示されているが、その理由としては、事例証拠蓄積によって外科的損傷が腫瘍増殖を刺激しうることが示唆されている。手術の間の原発性腫瘍の操作によって、複雑な細胞変化の必要性を解消する腫瘍細胞離脱がもたらされる。加えて、手術損傷によって内皮下ＥＣＭの曝露が誘発され、その結果、通例発現されるインテグリンを介する結合を容易にし、腫瘍細胞接着が促進される。動物モデルでは、腫瘍細胞上のα２インテグリンをブロックすると、手術によって誘発された接着が完全に消失され、そして腹部手術の後、肝臓転移の進展した結果が完全に前の状態に回復した。
【０１９６】
膵臓癌の場合には、最新の治療はしばしば、それが生命をたった４ヶ月延長するだけなので、不十分である。特に、インテグリン−ＥＣＭ及びα２β１−インテグリン媒介Ｉ型コラーゲン粘着は、インビトロにおいて膵臓癌の悪性の表現型に関与している。ｍＡｂのようなα２β１インテグリン機能の阻害剤を用いる動物モデルにおける試験が、正式に認可され、そして膵臓癌の処置における治療的有効性の有無が評価されるべきである。
【０１９７】
こうした知見に基づいて、α２及び／又はａ２β１インテグリンを機能的にブロックすることによって、注目に値する治療機会（特に結腸直腸癌及び膵臓癌に対して）が提供されうる。
【０１９８】
この発明の第九の局面は、α２インテグリン発現の変化に関連する疾患を診断する方法であって、
その方法が、
ａ）α２インテグリンを含む対象からのサンプルを、本発明のペプチド又はペプチド複合体と接触させることと；
ｂ）α２インテグリンの、このペプチド又はペプチド複合体への結合を検出することと；及び
ｃ）工程ｂ）の結合を参照と比較することを含んでなり、
上記において、参照と比較してサンプル中のα２インテグリンの結合の変化が、疾患の存在を示す、前記方法に関する。この結合の変化は、工程ｂで参照サンプルと比較して検出し、例えば、シグナルの変化（すなわち、シグナルの増加又は減少）によって特定されうる。
【０１９９】
この発明のペプチド（複合体）はまた、診断アッセイのために使用することができる。上記に詳述したようにα２インテグリン及び／又はその変異体（mutations）の発現の変化は、特定の疾患に関連しうる。従って、このペプチド（複合体）は、α２インテグリンへの結合を決定するために使用することができる。コントロール又は参照と比較して結合（量的に又は質的に）が変化する場合には、このことによって疾患の存在を示すことができる。
【０２００】
従って、この発明の別の局面は、α２インテグリンの変化に関連する疾患を診断する方法であって、
その方法が、
ａ）個体の取得されたサンプルを、この発明のペプチド又はペプチド複合体と接触させることと；及び
ｂ）α２インテグリンの、このペプチド又はペプチド複合体への結合を検出することと；及び
ｃ）工程ｂ）の結合を、１つ又はそれより多い参照サンプルにおけるペプチド又はペプチド複合体へのα２インテグリンの結合と比較することを含んでなり、
上記において、１つ又はそれより多い参照サンプルにおいて検出される結合と比較して、取得されたサンプルにおける結合の変化が、疾患を示す、前記方法に関する。
【０２０１】
一般的に、対象から得られる試験サンプルは、α２インテグリンに特異的に結合する本発明のペプチド（複合体）と接触させることができる。所望により、このペプチド（複合体）は、この抗体を試験サンプルと接触させる前に、固体支持体に固定し、複合体の洗浄及びその後の単離を容易にすることができる。固体支持体の例には、例えば、マイクロタイタープレート、ガラス顕微鏡スライド、又はカバースリップ、スティック、ビーズ、又はマイクロビーズの形態の、ガラス又はプラスチックが含まれる。
【０２０２】
サンプルを抗体と共にインキュートした後、この混合物を洗浄し、そして形成されたペプチド（複合体）／α２インテグリン／複合体を検出することができる。このことは、洗浄した混合物を検出試薬と共にインキュベートすることによって達成することができる。この検出試薬は、検出可能な標識を使用することによってなされうる。種々の標識及び検出方法が当業者によって知られている。検出可能な標識に関しては、当技術分野において知られている任意の検出可能な標識を使用することができる。例えば、検出可能な標識は、放射性標識（例えば、3Ｈ、125Ｉ、35Ｓ、14Ｃ、32Ｐ、および33Ｐなど）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース ６−リン酸デヒドロゲナーゼなど）、化学発光標識（例えば、アクリジニウムエステル、アクリジニウムチオエステル、アクリジニウムスルホンアミド、フェナントリジニウムエステル、ルミナール、イソルミノールなど）、蛍光標識（例えば、フルオレセイン（例えば、５−フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、３’６−カルボキシフルオレセイン、５（６）−カルボキシフルオレセイン、６−ヘキサクロロフルオレセイン、６−テトラクロロフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネートなど））、ローダミン、フィコビリプロテイン、Ｒ−フィコエリスリン、量子ドット（例えば、硫化亜鉛でキャップされたセレン化カドミウム）、温度測定標識（thermometric label）、タグ（上記に定義されているような）又は免疫−ポリメラーゼ連鎖反応標識でありうる。
【０２０３】
アッセイを通して、インキュベーション及び／又は洗浄工程は、試薬のそれぞれの組み合わせの後に必要でありうる。インキュベーション工程は、約５秒から数時間、好ましくは、約５分から約２４時間に至るまで変化しうる。しかしながら、このインキュベーション時間は、アッセイフォーマット、バイオマーカー（抗原）、溶液量、濃度などによって左右されるであろう。通例、このアッセイは、周囲温度で行なわれるが、それらは１０℃〜４０℃のような温度範囲にわたって行なわれうる。
【０２０４】
便宜上、このペプチド（複合体）は、キットの形態で提供することができ、該キットは、診断アッセイを行なうことを含む、例えば、使用指示書を含む所定量の試薬のパッケージされた組み合わせである。このペプチド（複合体）が酵素で標識されている場合には、このキットは酵素が必要とする基質及びコファクター（例えば、検出可能な発色団、又はフルオロフォアを提供する基質前駆体）を含むであろう。他の添加剤としては、例えば、安定化剤、バッファー（例えば、ブロックバッファー（block buffer）又はライシスバッファー（lysis buffer））などをキットの中に含めることができる。このキットで提供される種々の試薬の相対量は、広範囲に変化することができ、例えば、アッセイの感度を実質的に最適化する試薬の溶液中の濃度が提供される。この試薬は、溶解すると適切な濃度を有する試薬溶液を提供することになる、例えば、賦形剤を含む、乾燥粉末、通例、凍結乾燥として提供されうる。
【０２０５】
参照は、健常対象からのサンプルであってもよいし、それとも健常対象集団で決定されてもよい：あるいは、これは公知の参照値でありうる。当技術分野における当業者であれば、２つの値が互いに有意に異なっているかどうかを評価する統計的手順（例えば、スチューデントのｔ検定又はカイ二乗検定）を知っている。更に、当業者であれば適切なコントロールを選択する方法を知っている。
【０２０６】
用語“対象からのサンプル（sample from a subject）”  及び“試験サンプル（test sample）”は、すべての生体液、所与の対象、特にヒトから分離された排出物及び組織に関連する。この発明の文脈では、こうしたサンプルには、血液、血清、血漿、乳頭吸引液、尿、精液（semen）、精液（seminal fluid）、精漿、前立腺液、排泄物、涙、唾液、汗、生検（biopsy）、腹水、脳脊髄液、母乳、リンパ液、気管支及び他の洗浄サンプル、又は組織抽出サンプルが含まれるが、これらに限定されない。この発明の関連では、通例、血液サンプルが使用のための好ましい試験サンプルである。
【０２０７】
第十の局面では、この発明は、以下：
ａ）包装材料（例えば、ペプチド又はペプチド複合体のための１つ又はそれより多い容器、及びラベル又はパケージインサート）
ｂ）この発明のペプチド又はペプチド複合体又はその製薬学的に許容される塩、
ｃ）ラベル（例えば、書面情報及び／又はバーコード及び／又は他のあらゆる種類の情報を含む）、又はパケージインサート（すなわち、チップ、リーフレット、ブックレットなどのあらゆる種類のデータキャリア）
を含んでなる製品であって、
前記パーケージ材料の中に含まれている前記インサートは、本明細書中で定義されているように、前記ペプチド又はペプチド複合体が疾患又は障害、特にα２インテグリン関連疾患・障害の処置に有効であることを表示している、前記製品に関する。
【０２０８】
第十一の局面では、この発明は、α２インテグリン関連障害若しくは疾患の診断のための診断キットであって、該キットが、この発明のペプチド又はペプチド複合体及び適切な包装、及び場合により、α２インテグリンの検出の際に前記ペプチド又はペプチド複合体を使用するための適切な使用説明書を含んでなる、前記診断キットに関する。
【０２０９】
この発明の第九の局面による診断キットは、第九の局面において定義されているようなコンポーネントを少なくとも含み、そして所望により、１つ又はそれより多い更なるコンポーネント（例えば、サンプル中のアルファ２インテグリンの検出を行なうのに必要、又は適切なバッファー及び他の試薬、又は所与の疾患のアルファ２インテグリン又は他のマーカーを検出する他の手段、又はネガティブ／ポジティブスタンダード、１つ又はそれより多い適切な容器内に適切に含まれているアルファ２インテグリン（ペプチド／ペプチド複合体）複合体を検出し、及び／又は視覚化し、及び／又は定量化するための１つ又はそれより多い二次抗体（適切に標識されている））を含んでなり、前記コンポーネントは、好ましくは、空間的にまとめられたユニットが一緒になり、そしてα２インテグリン関連障害若しくは疾患の診断において使用することが意図されている、製品である。
【０２１０】
第九の局面の一実施態様によれば、このキットは更に、この発明の第七又は第十一の局面及びその実施態様のいずれか１つによる方法のための使用指示書を含むデータキャリアを含んでなる。
【０２１１】
第十二の局面では、この発明は、この発明の１つ又はそれより多いペプチド又はペプチド複合体及び／又は１つ又はそれより多い核酸を使用する、α２インテグリン関連障害若しくは疾患の処置又は診断方法に関する。
【０２１２】
従って、この発明の局面は、α２インテグリンの変化に関連する疾患を診断する方法であって、
その方法が、
ａ）個体の取得されたサンプルを、この発明のペプチド又はペプチド複合体と接触させることと；及び
ｂ）α２インテグリンの、このペプチド又はペプチド複合体への結合を検出し、及び／又は定量化することと；及び
ｃ）工程ｂ）の結合を、１つ又はそれより多い参照サンプル中のα２インテグリンのペプチド又はペプチド複合体への結合と比較することを含んでなり、
上記において、１つ又はそれより多い参照サンプル中で検出される結合と比較して、取得されたサンプルにおける結合の変化が、疾患の存在を示す、前記方法に関する。この結合は、公知の方法を用いて親和性（例えば、ＫＤ、Ｋｏｆｆ、Ｋｏｎ比）の観点から、あるいは単に、例えば、参照サンプルのものと比較して、ペプチド／ペプチド複合体に対する標識抗体によってもたらされる、ペプチド／ペプチド−複合体−アルファ２インテグリン複合体のシグナル（強度）によって検出又は定量化されうる。
【０２１３】
特に、この発明の文脈における“参照個体（reference individual）”、“参照サンプル（reference sample）”又は“参照値（reference value）”の文脈における用語“参照（reference）”とは、ある種の（健常な）状態、疾患などについて特徴的、又は代表的である比較の対象又は標準物を意味する。すなわち、参照値は、ある種の状態（例えば、疾患状態又は健常状態）に典型的であるパラメーター（例えば、ある種のインジケーター／バイオマーカー分子の発現レベル）の標準的な値であり、参照個体は、比較のために選択され、そしてある種の健常状態又は疾患を有する個体であり、参照サンプルは、例えば、参照個体に起源するサンプル、あるいは疾患状態又は健常状態に典型的である、ある種のインジケーター又はバイオマーカーの特徴的なレベルを有する人工的なサンプルでありうる。
【０２１４】
本明細書中で使用される際には、用語“参照サンプル（reference sample）”とは、関心対象サンプルと実質的に同一の方法で解析され、その情報を関心対象サンプルの情報と比較するサンプルを意味する。その結果、参照サンプルによって、関心対象サンプルから得られた情報の評価を可能にする標準物が提供される。
【０２１５】
参照サンプルは、健常又は正常組織、器官又は個体から誘導することができ、その結果、組織、器官又は個体の健常状態の標準物が提供される。正常な参照サンプルの状態と関心対象サンプルの状態の間の違いによって、疾患の発症のリスク、あるいはその存在、あるいはそうした疾患又は障害の更なる進行を示すことが可能である。
【０２１６】
参照サンプルは、異常又は疾患組織、器官又は個体から誘導され、それによって組織、器官又は個体の疾患状態の標準物が提供されうる。異常な参照サンプルの状態と、関心対象サンプルの状態の間の違いによって、疾患の発症のリスクが低いこと、あるいは、そうした疾患又は障害が存在しないこと、又は改善されることを示すことができる。
【０２１７】
参照サンプルはまた、関心対象サンプル（先のより早い時点で取得された）と同じ組織、器官、又は個体から誘導されうる。先に取得された参照サンプルの状態と、関心対象サンプルの状態の間の違いによって、疾患の進行、すなわち、経時的に疾患が改善されているか、又は悪化しているかを示すことができる。参照サンプルの取得と、関心対象サンプルの取得の間に期間が経過した場合には、参照サンプルは、先のより早い時点又はその後のより遅い時点で取得した。こうした期間は、年（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００年）、月（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２月）、週（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８週）、日（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００日）、時間（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２時間）、分（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０分）、又は秒（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０秒）を表すことができる。
【０２１８】
疼痛の状態またはステージについて代表的な参照サンプルは、例えば、本明細書中で定義されているような、すなわち、アルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患と診断されうる障害又は疾患に罹患していることが知られているコントロール対象に起源されうる。このコントロール対象は、ヒトのような哺乳類、げっ歯動物類（例えば、ラット、ハムスター、又はマウス）又はサルであってもよいし、それとも鳥類のような哺乳類以外の他の動物であってもよい。
【０２１９】
好ましくは、サンプル又は値、及び参照サンプル又は値の双方とも、同じ種の対象（例えば、ヒト）、より好ましくは、同じ性（例えば、雌性又は雄性）及び／又は類似の年齢又は生活相（例えば、乳幼児、若年小児、年少者、成人、又は高齢者）の対象に起源する。
【０２２０】
この発明の異なった局面及び実施態様における参照又は参照サンプルは、好ましくは、健常な個体、罹患している個体、又は関心対象サンプルと同じ個体に起源する。参照（例えば、参照値）又は参照サンプルが関心対象サンプルと同じ個体から取得された場合には、この参照（例えば、参照値）又は参照サンプルは、好ましくは、先のより早い、又はその後のより遅い時点で、次いで関心対象サンプルが取得された。参照（例えば、参照値）又は参照サンプルの取得と、参照（例えば、参照値）又は関心対象サンプル又は値の取得の間に経過した期間は、年（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００年）、月（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２月）、週（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８週）、日（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００日）、時間（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２時間）、分（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０分）、又は秒（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０秒）を表す。これに代えて、あるいはこれに加えて、参照サンプルは、健常な個体を表しているアルファ２インテグリンのレベルを有するか、あるいはアルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患が存在するか、又は存在しないことを表しているアルファ２インテグリンのレベルを有するか、あるいはアルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患を発症するリスクが増大しているか又は減少しているかを表しているアルファ２インテグリンのレベルを有する参照サンプルである。
【０２２１】
参照又は参照サンプルが、健常な個体、あるいはアルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患を発症するリスクが低下している、又はアルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患が存在しないことを表しているアルファ２インテグリンのレベルを有している個体から誘導される実施態様では、参照サンプル又は値において、又は前記参照値又は参照サンプルと比較して関心対象のサンプル又は値において、アルファ２インテグリンのレベルの上昇は、その個体において、（ａ）アルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患が存在していること、及び／又は（ｂ）アルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患を発症するリスクが増大していること、及び／又は（ｃ）アルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患が進行していることを示す。参照が、罹患している個体、あるいはアルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患を発症するリスクが増大している、又はアルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患が存在していることを表している値を有している個体から誘導される実施態様では、アルファ２インテグリンの同程度のレベルは、その個体において、（ａ）アルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患が存在していること、及び／又は（ｂ）アルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患を発症するリスクが増大していること、及び／又は（ｃ）アルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患が進行していることを示す。
【０２２２】
参照（値）又は参照サンプルが、先の早い時点において関心対象の個体と同じ個体（から）である実施態様では、関心対象の個体／値／サンプルにおけるアルファ２インテグリンのレベルの上昇は、その個体において、（ａ）アルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患が存在していること、及び／又は（ｂ）アルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患を発症するリスクが増大していること、及び／又は（ｃ）アルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患が進行していることを示す。参照（値）又は参照サンプルが、先の早い時点において、関心対象の個体／サンプルと同じ個体（から）である実施態様では、関心対象のサンプルにおけるアルファ２インテグリンのレベルの低下は、（ａ）アルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患が変化していること、又はアルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患が改善されているか、又は存在していないこと、及び／又は（ｂ）アルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患を発症するリスクが減少していること、及び／又は（ｃ）アルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患の進行が低下していることを示す。
【０２２３】
参照（値）又は参照サンプルが、先の早い時点において関心対象サンプル／値と同じ個体（から）である実施態様では、関心対象サンプルにおけるアルファ２インテグリンの同程度のレベルは、その個体において、（ａ）アルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患を発症する同様なリスクがあること、及び／又は（ｂ）アルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患の進行が止まっていること、及び／又は（ｃ）アルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患が持続していることを示す。
【０２２４】
参照（値）又は参照サンプルが、健常な個体から、又はアルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患を発症するリスクが低下している個体から誘導され、あるいは健常な個体を表しているアルファ２インテグリンのレベル、又は疾患が存在していない状態、又はアルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患を発症するリスクが低下している状態を含む実施態様では、アルファ２インテグリンのレベル上昇は、その個体において、（ａ）アルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患が存在していること、及び／又は（ｂ）アルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患を発症するリスクが増大していること、及び／又は（ｃ）アルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患が進行していることを示す。
【０２２５】
参照（値）又は参照サンプルが、罹患している個体から、又はアルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患を発症するリスクが増大している個体から誘導され、あるいは罹患している個体、又は疾患が存在している状態、又はアルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患を発症するリスクが増大していることを表しているアルファ２インテグリンのレベル若しくは量を含む実施態様では、アルファ２インテグリンの同程度のレベルは、その個体において、（ａ）アルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患が存在していること、及び／又は（ｂ）アルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患を発症するリスクが増大していること、及び／又は（ｃ）アルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患が進行していることを示す。
【０２２６】
参照（値）又はサンプルが、関心対象サンプル（先の早い時点で取得された）と同じ個体から誘導される実施態様では、関心対象サンプルにおけるアルファ２インテグリンのレベルの上昇は、その個体において、（ａ）アルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患が存在していること、及び／又は（ｂ）アルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患を発症するリスクが増大していること、及び／又は（ｃ）アルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患が進行していることを示す。
【０２２７】
参照（値）又は参照サンプルが、関心対象サンプル（先の早い時点で取得された）と同じ個体から誘導される実施態様では、関心対象サンプルにおけるアルファ２インテグリンのレベルの減少は、その個体において、（ａ）アルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患が変化していること、又はアルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患が改善されているか、若しくは存在していないこと、及び／又は（ｂ）アルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患を発症するリスクが減少していること、及び／又は（ｃ）アルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患の進行が低下していることを示す。参照サンプルが関心対象サンプル（先の早い時点で取得された）と同じ個体から誘導される実施態様では、関心対象サンプルにおけるアルファ２インテグリンの同程度のレベルは、その個体において、（ａ）アルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患を発症するリスクが同程度であること、及び／又は（ｂ）アルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患の進行が止まっていること、及び／又は（ｃ）アルファ２インテグリン関連障害若しくは疾患が持続していることを示す。
【０２２８】
この発明の異なる局面の好ましい実施態様によれば、このペプチド又はペプチド複合体は、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントを含んでなるか、又はそれらから成る（それらである）。下記において、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原−結合性フラグメントに関する一部の好ましい実施態様が列挙されている：
１．単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体又はフラグメントは、ヒトα２インテグリンのＩ−ドメインに特異的に結合し、前記抗体又はフラグメントは、重鎖可変領域（ＶＨ）ドメイン及び軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインを含んでなり、前記抗体又はフラグメントは、非ヒト霊長類のα２インテグリンを交差反応するが、非霊長類のα２インテグリンとは交差反応しない、前記単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント。
２．単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体又はフラグメントは、ヒトα２インテグリンのＩ−ドメインに特異的に結合し、前記抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）ドメイン及び軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインを含んでなり、前記抗体又はフラグメントは、参照抗体のエピトープとの結合について参照抗体と競合し、前記参照抗体は、アクセッション番号 ＤＳＭ２３９４４にてＤＳＭＺに寄託されているプラスミドによってコードされる軽鎖、及び（ｉ）アクセッション番号 ＤＳＭ２３９４６にてＤＳＭＺに寄託されているプラスミド、又は（ｉｉ）アクセッション番号ＤＳＭ２３９４５にてＤＳＭＺに寄託されているプラスミドのいずれかによってコードされている重鎖を含んでなる、前記単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント。
３．前記実施態様１又は２に記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、前記抗体又はフラグメントは、ヒトα２インテグリンのＩ−ドメインにｎＭレベルの結合親和性で特異的に結合する、前記抗体、又はその抗原結合部分。
４．先行する実施態様のいずれか１つに記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、前記抗体又はフラグメントは、インビトロでヒトα２インテグリンのコラーゲンとの相互作用を阻害し、それによって、前記血小板と前記コラーゲンの粘着による血小板の活性を阻害する、前記抗体、又はその抗原結合部分。
５．先行する実施態様のいずれか１つに記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域ドメインは、配列番号５の重鎖ＨＣＤＲ３を含んでなる、前記抗体、又はその抗原結合部分。
６．先行する実施態様のいずれか１つに記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域ドメインは、配列番号３（ＨＣＤＲ１）、配列番号４（ＨＣＤＲ２）、及び配列番号５（ＨＣＤＲ３）の重鎖ＣＤＲ、又はその機能的に活性な変異体を含んでなる、前記抗体、又はその抗原結合部分。
７．実施態様６に記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、ＨＣＤＲ２の機能的に活性な変異体は、６位のアミノ酸でのＡｓｐ→Ｇｌｕの変異を含んでなる、前記抗体、又はその抗原結合部分。
【０２２９】
８．先行する実施態様のいずれか１つに記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、前記軽鎖可変領域ドメインは、配列番号８の軽鎖ＬＣＤＲ３を含んでなる、前記抗体、又はその抗原結合部分。
９．先行する実施態様のいずれか１つに記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、前記軽鎖可変領域ドメインは、配列番号６（ＬＣＤＲ１）、配列番号７（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号８（ＬＣＤＲ３）の軽鎖ＣＤＲ、又はその機能的に活性な変異体を含んでなる、前記抗体、又はその抗原結合部分。
１０．実施態様９に記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、ＬＣＤＲ１の機能的に活性な変異体は、１１位のアミノ酸でのＡｓｎ→Ｇｌｎの変異を含んでなる、前記抗体、又はその抗原結合部分。
１１．先行する実施態様のいずれか１つに記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域（ＶＨ）ドメインは、配列番号２のＶＨ配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％の配列同一性を有している、前記抗体、又はその抗原結合部分。
１２．実施態様１１に記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域（ＶＨ）ドメインは、配列番号２の配列又はその機能的に活性な変異体（functionally active thereof）を含んでなる、前記抗体、又はその抗原結合部分。
１３．先行する実施態様のいずれか１つに記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、前記軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインは、配列番号１のＶＬ配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％の配列同一性を有する、前記抗体、又はその抗原結合部分。
１４．実施態様１３に記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、前記軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインは、配列番号１の配列又はその機能的に活性な変異体（functionally active thereof）を含んでなる、前記抗体、又はその抗原結合部分。
１５．先行する実施態様のいずれか１つに記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域（ＶＨ）ドメインは、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１７、Ｈ２０、Ｈ３８、Ｈ４０、Ｈ４３、Ｈ５５、Ｈ６１、Ｈ６５、Ｈ６６、Ｈ６７、Ｈ７６、Ｈ８１、Ｈ８２、Ｈ８７、Ｈ９１、Ｈ９３、Ｈ１１２、Ｈ１１３及びＨ１１６から成る群より選択される位置における１つ又はそれより多いアミノ酸置換を含んでなる、前記抗体、又はその抗原結合部分。
１６．実施態様１５に記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、１つ又はそれより多いアミノ酸置換は、５Ｈｉｓ→Ｖａｌ、７Ｐｒｏ→Ｓｅｒ、１１Ｌｅｕ→Ｖａｌ、１２Ｖａｌ→Ｌｙｓ、１７Ｐｒｏ→Ｓｅｒ、２０Ｌｅｕ→Ｖａｌ、３８Ｌｙｓ→Ａｒｇ、４０Ａｒｇ→Ａｌａ、４３Ａｒｇ→Ｇｌｎ、５５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、６１Ａｓｎ→Ａｌａ、６５Ｌｙｓ→Ｇｌｎ、６６Ａｓｐ→Ｇｌｙ、６７Ｌｙｓ→Ａｒｇ、７６Ｓｅｒ→Ｔｈｒ、８１Ｉｌｅ→Ｍｅｔ、８２Ｇｌｎ→Ｇｌｕ、８７Ｔｈｒ→Ａｒｇ、９１Ｓｅｒ→Ｔｈｒ、９３Ｖａｌ→Ｌｙｓ、１１２Ｔｈｒ→Ｌｅｕ、１１３Ｌｅｕ→Ｖａｌ及び１１６Ｓｅｒ→Ｖａｌから成る群より選択される、前記抗体、又はその抗原結合部分。
【０２３０】
１７．先行する実施態様のいずれか１つに記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、前記軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインは、Ｌ９、Ｌ１２、Ｌ１５、Ｌ２２、Ｌ３４、Ｌ４６、Ｌ４７、Ｌ８０、Ｌ８３、Ｌ８５、Ｌ８７、及びＬ８９から成る群より選択される位置における１つ又はそれより多いアミノ酸置換を含んでなる、前記抗体、又はその抗原結合部分。
１８．実施態様１７に記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、１つ又はそれより多いアミノ酸置換は、９Ａｌａ→Ｓｅｒ、１２Ａｌａ→Ｓｅｒ、１５Ｌｅｕ→Ｖａｌ、１５Ｌｅｕ→Ｐｒｏ、２２Ｓｅｒ→Ｔｈｒ、３４Ａｓｎ→Ｇｌｎ、４６Ｇｌｎ→Ｌｙｓ、４７Ａｌａ→Ｐｒｏ、８０Ａｓｐ→Ａｓｎ、８３Ｇｌｕ→Ｇｌｎ、８５Ａｓｐ→Ｇｌｕ、８７Ａｌａ→Ｔｈｒ及び８９Ｔｈｒ→Ａｓｎから成る群より選択される、前記抗体、又はその抗原結合部分。
１９．先行する実施態様のいずれか１つに記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域（ＶＨ）ドメインは、配列番号３８（ＨＣ１）、配列番号３９（ＨＣ２）、配列番号４０（ＨＣ３）、配列番号４１（ＨＣ４）、配列番号４２（ＨＣ５）、配列番号４３（ＨＣ６）、及び配列番号４４（ＨＣ７）から成る群より選択されるＶＨ配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％の配列同一性を有する、前記抗体、又はその抗原結合部分。
２０．実施態様１９に記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域（ＶＨ）ドメインは、配列番号３８（ＨＣ１）、配列番号３９（ＨＣ２）、配列番号４０（ＨＣ３）、配列番号４１（ＨＣ４）、配列番号４２（ＨＣ５）、配列番号４３（ＨＣ６）、及び配列番号４４（ＨＣ７）から成る群より選択されるＶＨ配列を含んでなる、前記抗体、又はその抗原結合部分。
２１．先行する実施態様のいずれか１つに記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、前記軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインは、配列番号３３（ＬＣ１）、配列番号３４（ＬＣ２）、配列番号３５（ＬＣ３）、配列番号３６（ＬＣ４）、及び配列番号３７（ＬＣ５）から成る群より選択されるＶＬ配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％の配列同一性を有する、前記抗体、又はその抗原結合部分。
２２．実施態様２１に記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、前記軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインは、配列番号３３（ＬＣ１）、配列番号３４（ＬＣ２）、配列番号３５（ＬＣ３）、配列番号３６（ＬＣ４）、及び配列番号３７（ＬＣ５）から成る群より選択されるＶＬ配列を含んでなる、前記抗体、又はその抗原結合部分。
２３．先行する実施態様のいずれか１つに記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、前記抗体、又はその結合部分は、キメラ抗体又はヒト化抗体である、前記抗体、又はその抗原結合部分。
２４．先行する実施態様のいずれか１つに記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、抗原結合部分は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ジスルフィドにより連結されたＦｖ、ｓｃＦｖ、及び（ｓｃＦｖ）2から成る群より選択される、前記抗体、又はその抗原結合部分。
【０２３１】
２５．先行する実施態様のいずれか１つに記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、抗体又は結合部分は、多特異性抗体（multispecific antibody）、デュアル特異性抗体（dual specific antibody）、アイソタイプ抗体（isotype antibody）、デュアル可変ドメイン抗体（dual variable domain antibody）及び二特異性抗体（bispecific antibody）から成る群より選択される、前記抗体、又はその抗原結合部分。
２６．先行する実施態様のいずれか１つに記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、抗体又は結合部分は、ヒトＩｇＭ定常ドメイン、ヒトＩｇＧｌ定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、ドメイン、ヒトＩｇＧ４定常ドメイン、ヒトＩｇＥ定常ドメイン、及びヒトＩｇＡ定常ドメインから成る群より選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含んでなる、前記抗体、又はその抗原結合部分。
２７．先行する実施態様のいずれか１つに記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、抗体又は結合部分は、ヒトＩｇＧ４定常ドメインを含んでなる、前記抗体、又はその抗原結合部分。
２８．先行する実施態様のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合部分のアミノ酸配列をコードする単離された核酸。
２９．実施態様２８に記載の核酸を含んでなる組み換え発現ベクター。
３０．実施態様２９に記載の組み換え発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
３１．実施態様１〜２６のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合性フラグメントを作製する方法であって、抗体が宿主細胞によって作製されるような条件下にて実施態様３０に記載の宿主細胞を培養することを含んでなる、前記方法。
３２．実施態様１〜２７のいずれか１つに記載の抗体、又はその抗原結合部分と、１つ又はそれより多い製薬学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物。
３３．α２インテグリン関連障害若しくは疾患を処置し、予防し、又は診断する方法であって、その方法が、実施態様３２に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、前記方法。
３４．実施態様３３に記載の方法であって、α２インテグリン関連疾患若しくは障害は、血栓症、血管疾患、血管新生及び転移を含む癌、炎症、炎症性疾患、自己免疫疾患及び異常な又は増加した新脈管形成によって特徴付けられる疾患、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、移植に対する反応、視神経炎、脊髄外傷、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、レイノー症候群、実験的自己免疫性脳脊髄炎、シェーグレン症候群、強皮症、心血管疾患、乾癬、及び炎症反応を誘発する感染症から成る群より選択される、前記方法。
３５．実施態様３３に記載の方法であって、α２インテグリン関連疾患若しくは障害は、急性冠動脈症候群、経皮的冠動脈インターベンション、虚血性脳卒中、頸動脈狭窄又は末梢動脈閉塞性疾患から成る群より選択される、前記方法。
【０２３２】
３６．α２インテグリンの変化に関連する疾患を診断する方法であって、
その方法が、
ａ）α２インテグリンを含むサンプルを実施態様１〜２７のいずれか１つに記載の、抗体又は抗原結合性フラグメントと接触させることと；
ｂ）α２インテグリンの、この抗体又は抗原結合性フラグメントへの結合を検出することと；及び
ｃ）工程ｂ）の結合を参照と比較することを含んでなり、
上記において、参照と比較してサンプル中のα２インテグリンの結合の変化が、疾患の存在を示す、前記方法。
３７．ａ）包装材料、
ｂ）実施態様１〜２７のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合性フラグメント、
ｃ）ラベル又はパッケージインサート
を含んでなる製品であって、
このパーケージ材料内に含まれている前記インサートが、前記抗体又は抗原結合性フラグメントが、α２インテグリン関連疾患・障害の処置又は診断に有効であることを表示している、前記製品。
【０２３３】
本発明は、本明細書中で述べられている特定の方法、プロトコル、及び試薬に限定されることはなく、それはそれらが変化する場合がありうるからである。更に、本明細書中で使用されている用語定義は具体的な実施態様を説明する目的だけのためであり、この発明の範囲を限定する意図ではない。本明細書及び添付の特許請求の範囲中で使用されている際には、単数形“ａ”、“ａｎ”、及び“ｔｈｅ”は、この文脈で明瞭にそうではないと指示しない限り、複数の言及も含む。同様に、語“含んでなる（comprise）”、“含む（contain）及び“包含する（encompass）”は、排他的（exclusively）ではなく、包括的（inclusively）に解釈されなければならない。
【０２３４】
特段明記しない限り、本明細書中で使用されているすべての技術及び科学用語、並びにすべての頭字語は、本発明の技術分野における当業者によって通例理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中で述べられているものと類似、又は等価なあらゆる方法及び材料がこの発明の実施の中で使用されうるが、好ましい方法、及び材料は本明細書中に記載されている。
【０２３５】
本発明は更に、下記の実施例によって説明される。しかしながら、こうした実施例は、単に説明の目的だけのものであり、別途具体的に指示されない限り、本発明の範囲を限定する意図はない。
【図面の簡単な説明】
【０２３６】
【図１】Ａ及びＢは、HUVEC MesoScale Technologyによるハイブリドーマ上清から精製した抗α２インテグリンｍＡＢの結合を示す。
【図２】ハイブリドーマ上清から精製した抗α２インテグリンｍＡＢのHUVEC血管新生に対する作用を示す。抗α２インテグリンｍＡｂは、ＦＧＦ２によって誘発された血管新生を用量依存的に阻害することができた。
【図３】抗α２インテグリンｍＡｂ−Ｆａｂによる流動状態下でのコラーゲンへの血小板粘着阻害を示す。抗凝集ヒト血液を、ＤｉＯＣ６（３）色素及び抗α２インテグリンＦａｂの階段希釈液と共に、３７℃で１０分間インキュベートする。次いでこの血液を、コラーゲンコートキャピラリーを通してずり速度３０００ｓ−１で流動させる。被覆面積を表している例としての１０個の写真から、表面被覆率を算出する。こうした値は、抗α２インテグリンＦａｂの用量依存的作用として前記表面被覆率による阻害パーセンテージを示す。
【図４】マカカ（macaca：オナガザル科；カニクイザル）（図４ａ及び図４ｂ）及びヒト（図４ｃ及び図４ｄ）に由来するハイブリドーマ上清及び血液サンプルからのα２ｍＡｂを用いてＦＡＣＳ解析によって行なわれた種差間交差反応試験（interspecies cross reactivity studies）を示し、図４ａ及び図４ｃは、一次抗体を使用せずに二次抗体を使用してネガティブコントロールのみを表す。
【図５】図５ａ）は、ハイブリドーマによって作製された抗α２インテグリンモノクローナルマウス抗体の可変軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１）及びコード配列（配列番号１２）を示す。図５ｂ）は、抗α２インテグリンモノクローナルマウス抗体の可変重鎖のアミノ酸配列（配列番号２）及びコード配列（配列番号１３）を示す。アミノ酸配列において、ＣＤＲは、ボールド体でマークがつけられ、下線が引かれている。
【図６】抗α２インテグリンモノクローナルマウス抗体の異なったＣＤＲのアミノ酸配列を示し、図６ａは重鎖ＣＤＲを示し、そして図６ｂは軽鎖ＣＤＲを示し、ＨＣＤＲ１は配列番号３であり、ＨＣＤＲ２は配列番号４であり、ＨＣＤＲ３は配列番号５であり、ＬＣＤＲ１は配列番号６であり、ＬＣＤＲ２は配列番号７であり、ＬＣＤＲ３は配列番号８である。
【図７−１】実施例中で詳述されているように、上記のマウス可変軽鎖領域（配列番号１）又は可変重鎖領域（配列番号２）を、ヒト定常領域（の一部）と連結させることによって作製されたキメラコンストラクトの配列を示す。図７ａは、キメラ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号９）及びコード配列（配列番号１４）を示し、図７ｂは、キメラ重鎖のアミノ酸配列（配列番号１０）及びコード配列（配列番号１５）を示し、図７ｃは、キメラ重鎖Ｆａｂフラグメントのアミノ酸配列（配列番号１１）及びコード配列（配列番号１６）を示す。アミノ酸配列において、ＣＤＲは下線が引かれており、α２可変ドメインに相当する配列は、ボールド体でタイプされており、そしてＨｉｓタグはイタリック体で書かれている。
【図７−２】図７−１の続きである。
【図８】キメラコンストラクトの作製のために使用される種々のヒト定常領域のアミノ酸配列を示す。配列番号１７は、ヒトＩＧＫＣタンパク質、配列番号９による軽鎖キメラの作製に使用される軽鎖定常領域［スイスプロットアクセッション番号（Swiss-Prot accession number）Ｑ５０２Ｗ４］のアミノ酸配列であり、配列番号１８は、ヒト変異ＩＧＨＧ４、配列番号１０（変異したアミノ酸はボールド体でタイプされている）による重鎖キメラの構築に使用される重鎖定常領域［スイスプロットアクセッション番号Ｐ０１８６１．１］のアミノ酸配列であり、配列番号１９は、ヒトＩＧＨＧ１タンパク質、配列番号１１による重鎖Ｆａｂフラグメントキメラの作製に使用されるスイスプロットアクセッション番号Ｑ５６９Ｆ４による重鎖定常領域のアミノ酸配列である。
【図９−１】ヒトα２及びβ１インテグリンのアミノ酸配列及びコード配列を示し、配列番号２０は、ＮＰ＿００２１９４．２によるα２インテグリン前駆体タンパク質のアミノ酸配列である。実験に使用され、大腸菌において組み換え発現されたＩ−ドメインについては、下線が引かれ、かつボールド体でタイピングされている。配列番号２１は、ＮＣＢＩアクセッション番号（NCBI accession number）：ＮＭ＿００２２０３．３によるα２インテグリンのコード配列であり、配列番号２２は、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００２２０２．２によるβ１インテグリンアイソフォーム１Ａ前駆体タンパク質のアミノ酸配列であり、そして配列番号２３は、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿００２２１１．３によるβ１インテグリンアイソフォーム１Ａのコード配列である。
【図９−２】図９−１の続きである。
【図９−３】図９−２の続きである。
【図９−４】図９−３の続きである。
【図９−５】図９−４の続きである。
【図９−６】図９−５の続きである。
【図９−７】図９−６の続きである。
【図１０−１】ＭＳによって検証された、マウスハイブリドーマに起源するオリジナルマウス抗α２インテグリン抗体のアミノ酸配列及びコード配列を示し：配列番号４５（図１０ａ）は、抗α２インテグリンｍＡＢのＬＣをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列であり、配列番号４６（図１０ｂ）は、抗α２インテグリンｍＡＢのＨＣをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列であり、配列番号４７（図１０ｃ）は、ハイブリドーマから分泌された抗α２インテグリンｍＡＢのＬＣのアミノ酸配列であり、配列番号４８（図１０ｄ）は、ハイブリドーマから分泌された抗α２インテグリンｍＡＢのＬＣのアミノ酸配列である。配列番号５３（図１０ｅ）は、コンパレーター（comparator）ｍＡｂ ＴＭＣ２２０６のＬＣのアミノ酸配列であり、配列番号５４（図１０ｆ）は、コンパレーターｍＡｂ ＴＭＣ２２０６のＨＣのアミノ酸配列である。
【図１０−２】図１０−１の続きである。
【図１１】ビアコア（Biacore）によって決定された種々のアルファ２インテグリン抗体の解離定数を示す。結果は、ｍＡｂ ＴＭＣ２２０６の場合に対して、多くの場合において、より望ましいか、又は多くとも（at least）等しい解離定数を示す。
【図１２】Biacoreを用いて測定された、非ヒト化Ｆａｂによってプレバインディングされた（前結合：pre-bound）インテグリンα2Ｉ−ドメインへのコンパレーターｍＡｂ ＴＭＣ２２０６の結合（（ｓ）秒単位の時間（ｘ軸）対（ＲＵ）レスポンス単位でのレスポンスの差（ｙ軸））を示す。図１２から得られることができるように、ＴＭＣ２２０６は、非ヒト化ＦａｂによってプレバイディングされたインテグリンＩ−ドメインに結合する。
【図１３】コンパレーターｍＡｂ ＴＭＣ２２０６によってプレバインディングされたインテグリンα2Ｉ−ドメインへの非ヒト化Ｆａｂの、結合（（ｓ）秒単位の時間（ｘ軸）対（ＲＵ）レスポンス単位でのレスポンスの差（ｙ軸））を示す。図１３から得ることができるように、非ヒト化Ｆａｂは、コンパレーターｍＡｂ ＴＭＣ２２０６によってプレバイディングされたインテグリンα2Ｉ−ドメインに結合する。
【図１４】洗浄血小板を用いて静止状態下におけるコラーゲンへの血小板粘着の阻害を示す。バッチ６６０は、ＬＣ１／ＨＣ１に相当し、バッチ６６１は、ＬＣ２／ＨＣ２に相当し、バッチ６６２は、ＬＣ３／ＨＣ３に相当し、バッチ６６３は、ＬＣ３／ＨＣ４に相当し、バッチ６６４は、ＬＣ４／ＨＣ５に相当し、バッチ６６５は、ＬＣ４／ＨＣ６に相当し、バッチ６６６は、ＬＣ５／ＨＣ７に相当し、そしてバッチ６６７は、コンパレーターである。この結果はまた、表１２から誘導することができる。バッチ番号６６０、６６２、及び６６３は、ｍＡｂ ＴＭＣ２２０６に対して、少なくとも等しいか、あるいは更によくコラーゲンへの血小板粘着を阻害する。
【０２３７】
実施例
実施例１：機能的な抗α２インテグリンｍＡｂ及びＦａｂの作製及び選択
Ａ−α２インテグリンｍＡＢクローン細胞からのシーケンス単離
ハイブリドーマからのα２インテグリンｍＡｂの作製及び精製
α２インテグリンｍＡＢ細胞バンクの２×１０6細胞を含む１つのクライオバイアルを３７℃で急速解凍した。こうした細胞を、オービタルシェーカープラットフォームによって１１０ｒｐｍで回転させながら、大気中５％ＣＯ2の加湿雰囲気下にて３７℃のインキュベーター中で、１０％ＦＢＳ、１Ｘ ＩＴＳ（Gibco 41 400-045）、１Ｘ ピルビン酸ナトリウム（Gibco 11 360-039）、１５０μｇ／ｍＬのオキサロ酢酸、２ｍＭのグルタミン（Gibco 25030-024）及び１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco 15070-063）を補充した、ダルベッコ変法イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium（Gibco 31053-028））から成る新鮮な５ｍＬの培地を含むＴ−２５ｃｍ2フラスコに移した。
【０２３８】
ハイブリドーマから精製されたｍＡｂのアイソタイピングは、セロテック（Serotec）
（Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Test Kit; ref. MMT1）からの標準的な市販のアイソタイピングキットの使用によって行なわれ、ｍＣｋ、ｍＩｇＧ２ａアイソタイプが明らかにされた。
【０２３９】
細胞は、細胞増幅のために２〜３日ごとにサブ培養された。作製の場合には、細胞を、６つのＴ５００フラスコ（２００ｍＬ）中に、１０％ＦＢＳ、１Ｘ ＩＴＳ、１Ｘ ピルビン酸ナトリウム、１５０μｇ／ｍＬ オキサロ酢酸、２ｍＭ グルタミン及び１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン／ストレプトマイシンを補充した、イスコフ改変ダルベッコ培地（Iscove's Modified Dulbecco's medium）（Sigma I3390）中、１．８×１０5Ｃ／ｍＬにおいて１０日間播種した。
【０２４０】
精製の場合には、抗α２インテグリンｍＡｂをプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー（Hitrap Protein G, GE Healthcare）によって上清から直接取得し、そして０．１Ｍ 酢酸によって溶出させた。Superdex 200（GE Healthcare）及び限外ろ過を用いるＳＥＣによってタンパク質をポリッシング（polishing）した後、このタンパク質を指示された実験に用いた。
【０２４１】
α２インテグリンｍＡｂの重鎖及び軽鎖配列の決定
モノクローナル抗体の可変ドメインをコードするｃＤＮＡは次のように得られた：ｍＲＮＡを、キアゲン社（Qiagen）からのオリゴテックスキット（Oligotex kit）を用いてハイブリドーマ細胞から抽出した。相当するｃＤＮＡを、Gene Racerキット（Invitrogen）、転写酵素（transcriptase SuperScript III）（５５℃で）（Invitrogen）及び表１に述べられているプライマー（RACEMOG2a又はCKFOR）を使用するRACE法によるＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。このｃＤＮＡフラグメントは、５５℃でポリメラーゼ Phusion（Finnzymes）を用いてＰＣＲによって増幅し、プライマーはまた、表１に記載されている。
【０２４２】
【表１】
2013544489.tif 000002
【０２４３】
重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域をコードする増幅されたフラグメントを、大腸菌中で増幅された、InvitrogenからのpCR4-Topoプラスミド中にクローニングした。次いでクローン化されたｃＤＮＡを双方の鎖（strand）上でシーケンシングした。
【０２４４】
タンパク質配列は、こうした配列をコードするプラスミドから翻訳し、重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の質量を算出した（表２）。得られた値は、対応するハイブリドーマの培養液から精製されたｍＡｂの作製物から得られたマススペクトル分析データと完全に一致した（表２参照）。ＨＣ及びＬＣの核酸及びアミノ酸配列は、下記の配列表中で報告されている：配列番号４６及び４８は、ハイブリドーマ上清から精製されたα２インテグリンｍＡｂのＨＣに相当し、配列番号４５及び４７は、ハイブリドーマ上清から精製されたα２インテグリンｍＡｂのＬＣに相当する。
【０２４５】
【表２】
2013544489.tif 000003
【０２４６】
Ｂ−抗α２インテグリンｍＡｂのＣＤＲの配列の決定
ＣＤＲ領域の配列は、ＫＡＢＡＴ命名法を用いてタンパク質配列から推定された。
【０２４７】
ＨＣの場合には、ＣＤＲ１は、配列番号３に相当し、ＣＤＲ２は、配列番号４に相当し、ＣＤＲ３は、配列番号５に相当する。
【０２４８】
ＬＣの場合には、ＣＤＲ１は、配列番号６に相当し、ＣＤＲ２は、配列番号７に相当し、ＣＤＲ３は、配列番号８に相当する。
【０２４９】
Ｃ−キメラ抗α２インテグリンｍＡｂ発現プラスミドの作製
抗α２インテグリンｍＡｂの可変重鎖及び軽鎖は、AccuPrimePfx SuperMix（Invitrogen; Cat. No.: 12344-040）、及び、それぞれ、抗α２インテグリンｍＡｂ重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡ（ｃＤＮＡ作製については、上記参照）を用いて、ＰＣＲによって作製された。２５μｌ ＰＣＲ反応では、５サイクルが、プライマー α２ｍＡＢ−ＶＨ ＦＯＲ及びＲＥＶ（重鎖）、又はプライマー α２ｍＡＢ−ＶＬ ＦＯＲ及びＲＥＶ（軽鎖）プライマー（９５℃，１５秒；６２℃、３０秒；６８℃，１分）を用いて行なわれた。リーダー配列を導入するには、０．５μｌのそれぞれの第１ＰＣＲサンプルが、第１ＰＣＲに関する場合と同じＰＣＲ条件を用いて、リーダー ＦＯＲ１−５４及びα２ｍＡＢ−ＶＬ（又は−ＶＨ）ＲＥＶプライマーを持つ第２ＰＣＲのためのテンプレートとして使用された。最後に、最初の反応の場合と同じＰＣＲ条件を用いて、０．５μｌの第２ＰＣＲを、リーダー ＦＯＲ１−２３及びα２インテグリンｍＡＢ−ＶＬ（又は−ＶＨ）ＲＥＶプライマーを持つ第３ＰＣＲ（２５サイクルを行なう）のためのテンプレートとして使用した。第３ＰＣＲのＰＣＲ産物を、ＰＣＲ精製キット（Qiagen,Cat.No.28104）を用い、そのキットプロトコルの記載の通り精製した。ＰＣＲ産物を、販売者のマニュアル中の記載の通り、Invitrogen TOPO TAクローニングキット（Cat #450001）を用いて、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ中にクローニングし、そしてこのクローニングキットに含まれているＭ１３フォワードプライマー及びＭ１３リバースプライマーを用いてシーケンシングした。
【０２５０】
マウスα２抗体可変軽鎖及び重鎖の配列は、可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列に言及している配列番号１、及び可変軽鎖ドメインのコード配列に言及している配列番号１２、並びに可変重鎖ドメインのアミノ酸配列に言及している配列番号２、及び可変重鎖ドメインのコード配列に言及している配列番号１３を有している図５から得ることができる。
【０２５１】
この可変軽鎖ドメイン（配列番号１による）を、ＶＬを配列番号９及び配列番号１４によるα２抗体 ＶＬ−ＩＧＫＣ軽鎖キメラを生じさせるNheI/BsiWI及びIGKC BsiWI/HindIIIで消化させることによって、定常軽鎖（IGKC, Swiss-Prot：Q502W4）と融合させた。この融合によって、エピソーム発現ベクターｐＸＬ（Durocher et al. (2002), Nucl. Acid
s Res. 30(2））、Ｅ９のNheI/HindIII部位に結合し、キメラα２抗体軽鎖の哺乳類発現プラスミド“pFF0033_pXLc-AscII-IGKC”（アクセッション番号ＤＳＭ ２３９４４のもとでＤＳＭＺに寄託されている）が作製された。
【０２５２】
この可変重鎖ドメイン（配列番号２による）は、配列番号１０／１５によるα２インテグリンＶＨ−ＩＧＨＧ４定常重鎖キメラを生じさせる、ヒト定常重鎖（IGHG4, Swiss-Prot P01861, S108P, L115E）の変異した変異体（バリアント）（mutated variant）と融合し、あるいはＦａｂを作製するために、配列番号１１／１６によるα２インテグリンＶＨ−ＩＧＨＧ１定常重鎖Ｆａｂキメラを生じさせる、ヒト定常ＩＧＨＧ１（Swiss-Prot: Q569F4）からの６ｘＨｉｓタグＣＨ１ドメインと融合した。この目的を達成させるために、このＶＨを、NheI/ApaLIで消化し、そしてそれぞれ、ApaI/HindIIIで消化したＩＧＨＧ４又はＨｉｓタグＣＨ１ドメインと融合させた。この融合によって、エピソーム発現ベクターｐＸＬのNheI/HindIII部位に結合し、キメラα２抗体重鎖−ＩｇＧ４の哺乳類発現プラスミド“pFF0036_pXLc-AscII-IGHG4”（アクセッション番号ＤＳＭ ２３９４６のもとでＤＳＭＺに寄託されている）が、あるいは、キメラα２抗体重鎖−Ｆａｂの哺乳類発現プラスミド“pFF0035_pXLc-AscII-CH1-Hi”（アクセッション番号ＤＳＭ ２３９４５のもとでＤＳＭＺに寄託されている）が、それぞれ、作製された。
【０２５３】
種々のプラスミドが、以下のアクセッション番号のもとでDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweigに寄託されている：ＤＳＭ ２３９４５（キメラ抗α２抗体重鎖Ｆａｂフラグメントの真核細胞発現のためのプラスミド）、ＤＳＭ ２３９４６（キメラ抗α２抗体ＩｇＧ４重鎖の発現のためのプラスミド）及びＤＳＭ ２３９４４（キメラ抗α２抗体ＩＧＫＣ軽鎖の発現のためのプラスミド)。
【０２５４】
【表３】
2013544489.tif 000004
【０２５５】
実施例２：抗α２インテグリンｍＡｂ及びＦａｂの特性
Ａ−組み換え抗α２インテグリンｍＡＢ及びＦａｂフラグメントの作製
キメラ抗α２インテグリンＩｇＧ４及び抗α２インテグリンＦａｂ分子の発現
抗体の重鎖及び軽鎖をコードする発現プラスミドを、大腸菌ＤＨ５ａ中で増殖した。トランスフェクションのために使用されるプラスミドは、Qiagen EndoFree Plasmid Megaキットを用いて大腸菌から調製した。
【０２５６】
フリースタイル培地（Freestyle Medium）（Invitrogen）中で増殖するＨＥＫ ２９３−ＦＳ細胞を、Fugene（Roche）トランスフェクション試薬を用いて指示されているＬＣ及びＨＣプラスミドでトランスフェクトした。７日後、この細胞を、遠心分離により除去し、上清を０．２２μｍフィルター上に通して粒子を除去した。
【０２５７】
キメラ抗α２インテグリン−ＩｇＧ４及び抗α２インテグリン−Ｆａｂ分子の精製
ＩｇＧ４タンパク質を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー(HiTrap Protein A HP Columns, GE Life Sciences)によって精製した。１００ｍＭ酢酸バッファー、１００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ３．５を用いて、カラムから溶出後、モノクローナル抗体を、HiPrep 26/10脱塩カラムを用いて脱塩し、１ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳ中に混和し、０．２２μｍろ過した。
【０２５８】
Ｆａｂタンパク質を、HiTrap IMAC HPカラム（GE Life Sciences）上でＩＭＡＣによって精製した。直線勾配グラジエント（溶出バッファー：２０ｍＭ リン酸ナトリウム，０．５Ｍ ＮａＣｌ，５０〜５００ｍＭ イミダゾール，ｐＨ７．４）を用いてカラムから溶出した後、タンパク質を含む画分をプールし、そしてHiPrep 26/10脱塩カラムを用いて脱塩し、１ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳ中に混和し、０．２２μｍろ過した。
【０２５９】
タンパク質濃度を２８０ｎｍで吸光度を測定することにより決定した。各バッチを、Protein 200 Plus LabChipキットを用い、アジレント２１００バイオアナライザー（Agilent 2100 bioanalyzer）によって還元条件及び非還元条件下にて分析し、それぞれのサブユニット及びモノマーの純度及び分子量を決定した。
【０２６０】
Ｂ−抗α２インテグリンｍＡｂ又はＦａｂの結合特性
精製された抗体及び相当するＦａｂフラグメントの詳細な速度論的キャラクタリゼーションのために、Biacore 3000（GE Healthcare）による表面プラズモン共鳴テクノロジー（Surface plasmon resonance technology）を用いた。リガンドとしての抗インテグリン抗体又はＦａｂフラグメント、及びアナライトとしてのインテグリンα２β１ Ｉ−ドメインを用いて、直接結合アッセイが使用された。通例、抗体又はＦａｂフラグメント（６００ＲＵ）を、アミン反応カップリングによって研究グレードのＣＭ５チップ上に固定化し、その結果、それぞれ、抗体及びＦａｂフラグメントに結合したＩ−ドメインの場合、８０及び１４０ＲＵの最大結合レスポンス（Ｒｍａｘ）になった。結合速度を、４ｍＭ ＭｇＣｌ2（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％ 界面活性剤Ｐ２０）を用いて補充したＨＢＳ−Ｐバッファー中、３０μｌ／分の流速で、０．４〜２８ｎＭ Ｉ−ドメインの濃度範囲にわたって測定した。チップ表面を、１０ｍＭ グリシンｐＨ２．２を用いて再生した。速度論的パラメーターを、参照として固定化された抗インテグリン抗体又はＦａｂフラグメントを含まないフローセル（flow cell）を用いて、BIAevaluation program package（バージョン ４．１）で解析し、算出した。質量移動（mass transfer）を有する１：１結合モデルが、抗体又はＦａｂフラグメントの０．４〜２８ｎＭのアナライト濃度に相当する曲線データのグローバルフィッティングに適用された。
【０２６１】
【表４】
2013544489.tif 000005
【０２６２】
ブロッキングｍＡｂ及びＦａｂは、ヒトα２β１−ドメインに対してナノモル範囲での親和性を示した（表３）。
【０２６３】
更に、抗ａ２インテグリンｍＡｂの結合特性を評価するために、HUVEC細胞（promocell
C12200, lot 6062203）を用いる細胞ベースアッセイが行なわれた。細胞を、ＰＢＳ（１０，０００細胞／ウェル）中で高結合型プレート（Meso Scale Discovery (MSD), L15XB-3）上にコートし、そして室温で２時間インキュベートした。次いでこのプレートを空にし、ＰＢＳで２回洗浄し、そしてブロッキング溶液（MSD, R93BA-4）で９０分間ブロッキングした。上記に述べられているように再びプレートを空にし、そして洗浄した後、抗α２−ｍＡｂの階段希釈液を加え、そして室温で１時間細胞と共にインキュベートした。上記のような洗浄工程の更なる１回の後、界面活性剤（Meso scale Discovery, R92TD-2）を加えないReadバッファーＴを加えた。電気化学発光を適切なデバイス（Meso scale Discovery, Sector imager）で読み取った。スキャチャードプロット解析（Scatchard plot analysis）を試験ｍＡｂのＫＤを決定するために使用した（図１参照）。
【０２６４】
Ｃ−抗α２インテグリンｍＡｂの交差反応特性
抗α２インテグリンｍＡｂを、血液サンプル又はヒト血小板を用いて、ＦＡＣＳ実験によって、マカカ（macaca：オナガザル科；カニクイザル）及びヒトからの血小板と特異的に相互作用する能力があるかどうかを評価した。ｍＡｂをヒト血液、マカカ血液又はヒト血小板のサンプルと共に、そしてヤギ−抗マウス−ＩＧｇフィコエリトリン（ＰＥ）結合二次ｍＡｂ（Beckman Coulter #731856）と共にインキュベートした。このサンプルを溶解液（Lysing Solution）（BD #349202）で処理し、そして血小板を遠沈させ、再懸濁し、ＦＡＣＳで解析した。
【０２６５】
マウス、ラット、イヌ、モルモット、ブタ又はウサギのα２β１インテグリンに対して、こうした種からの全血を用いて試験したところ、なんら反応性は検出されなかった（データは示されていない）一方で、この抗α２インテグリンｍＡｂは、ヒト全血サンプル（＞９８％ポジティブ、図４ｄ）との反応性の場合のように、カニクイザル（macaca fascicularis）の血液サンプルとの類似の反応性（９７．３％ポジティブ、図４ｂ）を示した。すなわち、ＦＡＣＳ解析によると、マウス、ラット、イヌ、モルモット、ブタ又はウサギのα２β１インテグリンに対して、こうした種からの全血を用いて試験したところ、なんら交差反応性は検出されなかった一方で、カニクイザル血液からの血小板による霊長類α２β１インテグリンの場合には、抗体の種間交差反応性があるように見える。
【０２６６】
実施例３−抗α２ＩｇＧ及びＦａｂのＦｖドメインのヒト化及び操作設計
ヒト化
抗α２インテグリンｍＡＢ抗体のＶＬ及びＶＨ配列の３Ｄ相同モデル（3D homology models）を、ＭＯＥ２００８における抗体モデラーアプリケーション（antibody modeller application）を用いて構築した。いくつかのＰＤＢテンプレートが、ＬＣ及びＨＣフレームワーク並びにＣＤＲループを構築するために特定された。すべてのテンプレート（templates）は、Ｈ３ループに対するベストなテンプレート（５６％同一性）以外は、ＶＬ及びＶＨ抗α２インテグリンｍＡＢ配列に対して８３％を超える同一性を有した。この結果生じたＬＣ及びＨＣモデルは、その後、ＭＯＥにおいて実施された標準的な手順を用いてエネルギーが最小化された。その後、マウスＶＬ／ＶＨの最小化３Ｄ相同モデルの分子動力学（ＭＤ）算定がタンパク質バックボーンに関する、５００Ｋ温度、一般化ボルン暗溶媒（Generalized Born implicit solvent）中、１．１ナノ秒間という拘束された状態で行なわれた。１０の多様なコンフォメーションが、最後の１ｎｓの間に１００ｐｓ毎のこの最初のＭＤ処理から抽出された。次いでこうした１０の多様なコンフォメーションは、それぞれ、タンパク質バックボーンに関する、３００Ｋ温度、一般化ボルン暗溶媒中、２．３ナノ秒間という拘束がない状態で、ＭＤに提出された。次いで、それぞれの１０ＭＤ処理の場合には、ＭＤ軌道からの最後の２，０００のスナップショット（ピコ秒毎に１つ）が算出するために使用され、それぞれの抗α２インテグリンｍＡＢアミノ酸の場合には、その標準偏差（ｒｍｓｄ）を参照モノイドポジション（medoid position）と比較した。所与のアミノ酸の１０の別々のＭＤ処理における平均ｒｍｓｄを、すべての抗α２インテグリンｍＡＢマウスアミノ酸の全平均ｒｍｓｄと比較することによって、ＭＤの間に理解されたように、アミノ酸がＴ細胞受容体と相互作用する可能性があり、免疫応答の活性化の原因であると考えられるのに十分フレキシブルであるかどうかが決定される。６４個のアミノ酸は、最終的には、抗α２インテグリンｍＡＢ抗体においてフレキシブルであると認定され、そのうち３４個は、ＣＤＲ内に位置していないか、あるいはそれらのすぐ近くに位置していない（５Å）。“バーニア（Vernier）”領域に位置しているアミノ酸はまた、考慮されない（J. Mol. Biol. 1992, 224, 487-499）。
【０２６７】
次いで、最も多い３４個のフレキシブル抗α２インテグリンｍＡＢアミノ酸（ＣＤＲ＋５Å領域を除いて）の作動を、２０ｎｓ（１０×２ｎｓ）の間、４９のヒト生殖細胞系相同モデル（human germlines homology models）の相当するフレキシブルなアミノ酸の作動と比較し、それぞれの場合に１０×２ｎｓ ＭＤシミュレーションを行なった。この４９のヒト生殖細胞系モデルを、７つの最も一般的なヒト生殖細胞系軽鎖（ｖｋ１、ｖｋ２、ｖｋ３、ｖｋ４、ｖｌａｍｂｄａ１、ｖｌａｍｂｄａ２、ｖｌａｍｂｄａ３）及び、７つの最も一般的なヒト生殖細胞系重鎖（ｖｈ１ａ、ｖｈ１ｂ、ｖｈ２、ｖｈ３、ｖｈ４、ｖｈ５、ｖｈ６）と体系的に組み合わせて構築した。このｖｋ１−ｖｈ１ｂヒト生殖細胞系抗体は、抗α２インテグリンｍＡＢのフレキシブルアミノ酸と比較してそのフレキシブルアミノ酸の６２％４Ｄ類似性を示した；それ故、ｖｋ１−ｖｈ１ｂ生殖細胞系抗体を、フレキシブルアミノ酸に焦点をあてて抗α２インテグリンｍＡＢ抗体をヒト化するために使用した。抗α２インテグリンｍＡＢとｖｋ１−ｖｈ１ｂアミノ酸の間の対アミノ酸結合（pairwise amino acid association）の場合には、２つの配列は、２つの相当する相同モデルα炭素の最適な３Ｄ重ね合わせ（3D superposition）に基づいてアライメントされた。
【０２６８】
安定化
ＣＤＲを除いて、それらのそれぞれの正準な配列に対して低頻度に発生する軽鎖及び重鎖のアミノ酸は、本来、最も高頻度に見出されるアミノ酸に変異されることが提示されている（△△Gth> 0.5 kcal/mol; [E. Monsellier, H. Bedouelle. Improving the stability of an antibody variable fragment by a combination of knowledge-based approaches： validation and mechanisms. J. Mol. Biol. 2006, 362,580-593］）。ＬＣ及びＨＣの場合のコンセンサス変異の最初のリストは、最も近縁なヒト生殖細胞系（すなわち、ｖｋ１−ｖｈ１ｂ）中に見出されるアミノ酸、すなわち、ＬＣ中の４つの可能性のある変異及びＨＣ中の３つの可能性のある変異に限定されている。こうした変異は、ＣＤＲ中、そのすぐ近く（＋５オングストローム）、あるいは“バーニア（Vernier）”領域には位置していない（J. Mol. Biol. 1992, 224, 487-499）。抗アルファ２インテグリン抗体を安定化する可能性のあるこうしたコンセンサス変異を検討する他のクライテリアが考慮される。こうしたクライテリアは、変異の表面での疎水性親水性指標（hydropathy）、あるいは分子力学ベースの予測される安定化の有利な変化である。
【０２６９】
グラフティングによるヒト化
ヒト化は、最も近縁なヒト生殖細胞系を、それぞれ、抗α２インテグリンｍＡＢ軽鎖及び重鎖に特定化することによって開始される。これは、体系的に列挙されるすべてのヒト生殖細胞系に対してＢＬＡＳＴサーチを行なうことによってなされる（カッパ鎖及びラムダ鎖のＶ及びＪドメイン；重鎖のＶ、Ｄ及びＪドメインの全ての可能な組み合わせ）。このＢＬＡＳＴサーチは、インハウス・イントラネットアプリケーションを用いて行なわれた。
【０２７０】
下記の最も近縁なヒト生殖細胞系は、抗α２インテグリン軽鎖及び重鎖に対して、それぞれ、７７％及び６８％の同一性を有するものと確認された：
【表５】
2013544489.tif 000006
【０２７１】
ＩＧＬＫＶ７９＿ＩＧＬＫＪ２は、配列番号４９に相当する。ＩＧＨＶ１１＿ＩＧＨＤ３３＿ＩＧＨＪ８は、配列番号５０に相当する。
【０２７２】
このヒト化変異は、ＣＤＲ（カバットナンバリング（Kabat numbering））及びバーニア領域残基を除いて、２つのアライメントされた配列を対比較することによって得られる。
【０２７３】
好ましからざる配列モチーフの変異
下記の配列モチーフが考えられる：Ａｓｐ−Ｐｒｏ（酸に不安定な結合）、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（グリコシル化、Ｘ＝任意のアミノ酸（Ｐｒｏは除く））、Ａｓｐ−Ｇｌｙ／Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（フレキシブル領域におけるスクシンイミド／ｉｓｏ−ａｓｐ形成）、Ａｓｎ−Ｇｌｙ／Ｈｉｓ／Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｃｙｓ（アミド分解サイトの露出）、Ｍｅｔ（露出領域の酸化）。この結果生じるヒト化配列は、ＩＥＤＢデータベースに対する配列類似性が破壊され（http://www.immuneepitope.org/home.do; version June 2009）、どの配列もいずれかの公知のＢ又はＴ細胞エピトープを含まないことが保証されている。
【表６】
2013544489.tif 000007
【０２７４】
操作設計された配列
軽鎖についての５つのバージョン（軽鎖変異体、ＬＣ１、ＬＣ２、ＬＣ３、ＬＣ４、ＬＣ５）及び重鎖についての７つのバージョンが設計された（重鎖変異体、ＨＣ１、ＨＣ２、ＨＣ３、ＨＣ４、ＨＣ５、Ｈ６、Ｈ７）。ＬＣ１バージョンは、抗α２インテグリンｍＡＢ軽鎖の非ＣＤＲの最もフレキシブルなアミノ酸と、ＶＫ１ヒト生殖細胞系軽鎖の間の直接比較から誘導される４つの変異を示す。ＬＣ２バージョンは、ＣＤＲ領域（Ｎ３４Ｑ）中のアミド分解サイトの可能性を除去するための１つの付加変異を含む。ＬＣ３バージョンは、抗α２インテグリンｍＡＢ軽鎖を最適に安定化させると予測されるヒト化及び安定化変異を含む。ＬＣ４バージョンは、アミド分解サイト（Ｎ３４Ｑ）の可能性を除去するための１つの付加変異を含む。ＬＣ５バージョンは、グラフティング方法から誘導される６つの変異を示す。
【０２７５】
ＨＣ１バージョンは、抗α２インテグリンｍＡＢ重鎖の非ＣＤＲの最もフレキシブルなアミノ酸と、ＶＨ１ｂヒト生殖細胞系の間の直接比較から誘導される３つの変異を示す。ＨＣ２バージョンは、ＣＤＲ領域（Ｄ５５Ｅ）中の問題あるスクシンイミドＩｓｏ−Ａｓｐ形成サイトを除去するための別の付加変異を含む。ＨＣ３バージョンは、抗α２インテグリンｍＡＢ重鎖を最適に安定化させると予測されるヒト化及び安定化変異を含む。ＨＣ４バージョンは、可能性のある凝集問題に対応するための付加変異を含む。ＨＣ５バージョンは、ＨＣ３変異及びＣＤＲ領域（Ｄ５５Ｅ）中の問題あるスクシンイミドＩｓｏ−Ａｓｐ形成サイトの可能性を除去するための付加変異を含む。ＨＣ６バージョンは、可能性のあるアグリゲーション問題に対応するための付加変異を含む。ＨＣ７バージョンは、グラフティング方法から誘導される２０の変異を示す。
【０２７６】
全部で、７つの組み合わせが作製された：
・ＬＣ１／ＨＣ１（ヒト化のみに対応する変異（（mutations addressing humanization only））
・ＬＣ２／ＨＣ２（ヒト化及びＬＣ／ＨＣの可能性のある問題あるサイト［ＮＳ及びＤＳ］に対応する変異）
・ＬＣ３／ＨＣ３（ヒト化及び安定化に対応する変異）
・ＬＣ３／ＨＣ４（ヒト化及び安定化及び抗凝集（anti-aggregation）に対応する変異）・ＬＣ４／ＨＣ５（ヒト化及び安定化及びＬＣの可能性のある問題あるサイト［ＮＳ］及びＨＣの可能性のある問題あるサイト［ＤＳ］に対応する変異）
・ＬＣ４／ＨＣ６（ヒト化、安定化、抗凝集及びＬＣの可能性のある問題あるサイト［ＮＳ］及びＨＣの可能性のある問題あるサイト［ＤＳ］に対応する変異）
・ＬＣ５／ＨＣ７（グラフティングによるヒト化に対応する変異）。
【０２７７】
【表７】
2013544489.tif 000008
【０２７８】
【表８】
2013544489.tif 000009
【０２７９】
【表９】
2013544489.tif 000010
【０２８０】
ヒト化可変配列を遺伝子合成によって作製し、そして実施例１Ｃ中で述べられているような相当する重鎖及び軽鎖発現ベクター中にクローニングした。
【０２８１】
操作設計軽鎖配列
５つのバージョンの軽鎖変異体をクローニングした（ＬＣ１、ＬＣ２、ＬＣ３、ＬＣ４、ＬＣ５）。可変鎖の操作設計によって導入された変異は、ハイライトされているか、あるいは下線が引かれている。
【表１０】
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【０２８２】
下記は、ＶＫ１＿Ｖｈ１ｂヒト生殖細胞系と対比したＬＣ抗α２β１インテグリンのアライメントである：
【化１】
2013544489.tif 000012
【０２８３】
操作設計重鎖配列
７つのバージョンの重鎖変異体をクローニングした（ＨＣ１、ＨＣ２、ＨＣ３、ＨＣ４、ＨＣ５、ＨＣ６、ＨＣ７）。可変鎖の操作設計によって導入された変異は、ハイライトされている。
【表１１】
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【０２８４】
【表１２】
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【０２８５】
下記は、ＨＣ Ｖｋ１＿Ｖｈ１ｂヒト生殖細胞系と対比したＨＣ抗α２１インテグリンｍＡｂのアライメントである。
【化２】
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【０２８６】
それぞれの抗インテグリンα2ｍＡｂ変異体の可変重鎖及び軽鎖（５つの異なる軽鎖：ＶＬ１−ＶＬ５及び７つの異なる重鎖ＶＨ１−ＶＨ７）を遺伝子合成によって作製した［ＡｐａＬＩを有する５’ＵＴＲ−配列（５’−ＧＴＧＣＡＣＡＧＣ−３’）及びＡｐａＩ（重鎖）又はＢｓｉＷＩ（軽鎖）を有する３’ＵＴＲ（５’−ＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣ−３’）を含む］。この可変重鎖ドメインを抗インテグリンα2ＶＨ−ＩＧＨＧ４定常重鎖ｍＡｂを生じるヒト定常重鎖（ＩＧＨＧ４，Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ０１８６１，Ｓ１０８Ｐ，Ｌ１１５Ｅ）の変異された変異体（mutated variant）を含む改変ｐＸＬ発現ベクターのＡｐａＬＩ／ＡｐａＩサイトに結合させた。
【０２８７】
この可変軽鎖ドメインを、抗インテグリンα2ＶＬ−ＩＧＫＣ定常軽鎖ｍＡｂを生じるヒト定常軽鎖（ＩＧＫＣ，Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｑ５０２Ｗ４）を含む改変ｐＸＬ発現ベクターのＡｐａＬＩ／ＢｓｉＷＩサイトに結合させた。遺伝子合成、クローニング及びＤＮＡ作製の完全なプロセスは市販の製造供給元（Geneart AG）によって理解された。
【０２８８】
比較のために、当技術分野において知られているヒト化ｈＩｇＧ４抗アルファ２インテグリン抗体（ＴＭＣ２２０６）が使用された（“コンパレーター（comparator）”）。このコンパレーターの軽鎖アミノ酸配列及び重鎖アミノ酸配列は、本明細書中、図１０ｅの配列番号５３及び配列番号５４として記載されている。
【０２８９】
【表１３】
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【０２９０】
こうした配列を検証するために、このｍＡｂを、マススペクトロメトリーを用いて解析した。インタクト質量測定のために、サンプルを２０分間トラップし、１５％溶出剤Ａ（Ｈ2Ｏ／０．０５％ＴＦＡ）〜５０％溶出剤Ｂ（アセトニトリル／０．０５％ＴＦＡ）の範囲のグラジエントで溶出する前に、２％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を用いるモノリストラップカラム（monolithic trap column）によって２０μｌ／分で脱塩した。
【０２９１】
このサンプルを、３７℃の温度で、モノリスカラム（ＰＳ−ＤＶＢ；１００μｍＩ．Ｄ．×５ｃｍ）によってナノフロー（nanoflow）（３００ｎｌ／分）で操作して分離した。このサンプルの投入は、外径３６５μｍ、内径７５μｍ、先端径１５μｍを有するエレクトロスプレー針を用い、それにシーズガスを加え新しいオブジェクト（new objective）から行なわれた。取得後、スペクトルを、相当する時間範囲にわたってまとめ、そしてApplied Biosystems/MDS SciexからのBioAnalystと共に供給されるタンパク質の再構成ツールを用いてデコンヴォルーションした。
【０２９２】
タンパク質配列を、プラスミドコード配列から翻訳し、そしてＨＣ及びＬＣの質量を算出した（表８）。
【０２９３】
【表１４】
2013544489.tif 000017
【０２９４】
観察された値は、算出された質量と非常によく一致し、そしてクローン化コンストラクトを検証した。
【０２９５】
実施例４−インビトロの生化学的及び細胞ベースアッセイにおけるα２インテグリンｍＡＢの評価
固相アッセイのために、インテグリン（α2−Ｉ−ドメイン：α2−Ｉ−ドメイン ＧＳＴ ａａ １４０−３３９（ＴＢＳ／５ｍＭ Ｍｎ2+中），５０μｌ／ウェル；）を、９６ウェルプレート（Corning Costar, 3690）上で、室温で終夜固定化した。次いで２５μｌ／ウェルのブロッキング溶液（５％ ＢＳＡ（クルード）（Ａ７９０６），１×ＴＢＳ）を加え、そして廃棄した。２００μｌ／ウェルのブロッキング溶液を加え、３時間室温で放置した。洗浄工程（２００μｌ／ウェル 結合バッファー（１×ＴＢＳ及び０．１％ ＢＳＡ（Ａ７６３８）及び２ｍＭ Ｍｎ2+；ＴＢＳ：１５０ｍＭ ＮａＣｌ，２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（Fluka 93371） ｐＨ７．４）で３回）の後、サンプルを、室温で３時間（静止）、下記の５０μｌと共にインキュベートした：
ａ）ビオチン化コラーゲンのみ−コントロール（１０μｌ 結合バッファー及び４０μｌビオチン化コラーゲン）
ｂ）１０μｌ／ウェル化合物（compound）、４０μｌ／ウェル ビオチン化コラーゲン
ｃ）ブランク：５０μｌ／ウェル 結合バッファー。
【０２９６】
洗浄工程（２００μｌ／ウェル 結合バッファーで３回）の後、サンプルを、５０μｌ／ウェル ExtrAvidin Peroxidase（ペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｐeroxidase conjugate），Ｓｉｇｍａ Ｅ２８８６；１：５００（結合バッファー中））と共に室温で３０分間インキュベートし、そして再び２００μｌ／ウェル 結合バッファーで４回洗浄した。５０μｌ／ウェル ペルオキシダーゼ基質（ＡＢＴＳ溶液；２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、Sigma A-1888；２７５μｌ（１１ｍｇ ＡＢＴＳ（０．５ｍｌ ｄＨ2Ｏ中に溶解）；及び５．５ｍｌ ０．１Ｍ酢酸ナトリウム（Sigma S-3272）／０．０５Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4（Riedel de Haen 04270） ｐＨ５．０；及び５５μｌ Ｈ2Ｏ2 Ｓｉｇｍａ Ｈ−１００９（１０μｌ（＝３０％）及び１０４５μｌ ｄＨ2Ｏ）を１０〜３０分間にわたって室温で加え、静止（緑色の着色が得られるまで）させ、そして５０μｌ／ウェル ２％ＳＤＳを加えた後、吸光度を４０５ｎｍ（SpectraMax 190）で読み取った。ブランクサブトラクション（blank subtraction）処理の後、１００−（（平均値 化合物*１００）／平均値 コラーゲンポジティブコントロール）として阻害％を算出した。
【０２９７】
【表１５】
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【０２９８】
要約すれば、α２インテグリンｍＡＢは、α１β１／コラーゲン相互作用（固相アッセイ）、α５β１／フィブロネクチン相互作用（固相アッセイ）、ａＩＩｂｂ３（ＧＰＩＩｂＩＩＩａ）活性化（ＦＡＣＳアッセイ）、Ｐ−セレクチンのヒト血小板（hu plt）上での発現（ＦＡＣＳアッセイ）、全血液だけでの、又はＡＤＰ、ＴＲＡＰ、コラーゲンで刺激後のヒト血小板凝集、ヒトＰＢＬからのＬＤＨ放出、ＴＮＦα放出又はＩＬ１β放出（単独又はＬＰＳを組み合わせて）に対する作用を示さなかった。
【０２９９】
ヒト臍帯静脈内皮細胞管腔長形成（Huvec tubule length formation）
血管新生におけるインテグリン抗ａ２ｍａｂの活性を評価するために、ＨＵＶＥＣ細胞を用いるインビトロアッセイを行なった。マトリゲル（Matrigel）（BD Biosciences, #3
54230）を、Ｉ型コラーゲン（BD Biosciences #35429）（matrigel 1/3.25, PBS 5× 1/5，コラーゲンＩ １ｍｇ／ｍｌ，ｑｓｐ水）と混和し、３７℃、５％ＣＯ2で１時間インキュベートした。粘着したＨＵＶＥＣ細胞を、Acutase溶液を用いて培養フラスコから注意深く引き離し、遠心分離し、そして培養液培地（ＥＢＭ，ＦＣＳ ２％，ＥＧＦブレットキット（EGF bullet kit））中、１．２×１０5細胞／ｍｌで再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液を、抗ａ２ｍａｂ及びＦＧＦ２（Peptrotech，１０ｎｇ／ｍｌ）の階段希釈液の存在下又は非存在下でマトリックスを含むウェルに加え、そして３７℃、５％ＣＯ2で１８時間インキュベートした。管腔形成の検出のために、クレシルバイオレット溶液を加え、そして３７℃で３０分間インキュベートした。管腔形成は、ウェル当たりの管腔長の合計を測定することによって決定された。算出は、Image Proand software（MediaCybernetics）を用いて、ネガティブコントロール（ＦＧＦ２を含まない）及びポジティブコントロール（ＦＧＦ２を含むが、抗ａ２ｍａｂを含まない）と対比して行なわれ、１つの条件で６回（6 replicats per condition）測定した。一致する結果が図２に示されている。抗アルファ２インテグリンｍＡＢでは、ＦＧＦ２によって誘発される血管新生を用量依存的に阻害することが可能であった。
【０３００】
実施例５−血流下及び静止状態下での抗α２インテグリンｍＡＢ−Ｆａｂによるコラーゲンへの血小板粘着の阻害
タンパク質−タンパク質相互作用検討のために、組み換えによって発現されたインテグリンα２β１インテグリン、又はインテグリン α２β１インテグリンのＩ−ドメインを、ＴＢＳバッファー中、４℃で終夜、９６ウェルプレート（Corning Costar 3690）にコートした。過剰のタンパク質を洗い流した後、このプレートをＢＳＡ溶液（５％ Sigma A7906）でブロッキングし、そして再び洗浄した。α２インテグリンＭａｂの階段希釈液を、プレート及びビオチン化コラーゲン（ラット尾，Sigma C8897）に加えた。これは４％ＨＳＡの存在下又は非存在下で行なわれた。室温で２時間インキュベーションした後、このプレートを再び洗浄した。Extravidin Peroxidase溶液（Sigma E2886）を加え、そしてこのプレートを暗室で２０分間インキュベートした。測定は、４０５ｎＭでElisa reader（SpectraMax190 Molecular Devices）で行なわれた。阻害％及びＩＣ５０が知られている標準品と対比して算出された。
【０３０１】
コラーゲンへの血小板結合検討のために、プレート（Isoplate, Perkin Elmer, F1450 571）をＴＢＳ中、室温で１時間、コラーゲン（Sigma C8897）でコートした。ウェルを繰り返しＴＢＳで洗浄し、その後抗α２インテグリンＭＡｂの階段希釈液を加えた。ヒルジン、ＰＧＥ１及びＲｅｏＰｒｏで抗凝固され、そしてカルセインＡＭ（CalceinAM）（C-3099 Molecular Probes）で標識された、新たに調製したヒト多血小板血漿、又は単離されたヒト血小板を加え、そして光から保護して室温で９０分間インキュベートした。洗浄後、プレートを４９２ｎＭ ＥＸ、５３５ｎＭ ＥＭでＭ５リーダー（M5 reader）（Molecular Devices）で測定した。阻害％及びＩＣ５０を知られている標準品と対比して算出した。
【０３０２】
ずり応力下（under shear）での実験で、抗α２インテグリンｍＡＢについて、流動状態下で、コラーゲンへの血小板粘着を阻害する能力があるかどうかを解析した。ガラスキャピラリーを４℃で終夜、コラーゲンでコートした。洗浄し、ブロッキング（ＢＳＡを用いて）した後、それらをフローデバイス（flow device）中に取り付けた。ボランティアからの新たに取り出した抗凝固ヒト血液を、ＤｉＯＣ６（３）で標識し、そして、抗α２インテグリンｍＡＢの階段希釈液と共に３７℃で１０分間インキュベートした。このサンプルを、キャピラリーに通してずり速度３０００ｓ−１の擬似動脈フローで流動させた。キャピラリーをリンスした後、流動血液に接しているキャピラリーの表面を表している１０個の写真をとった。イメージングソフトウェアを用いて、表面被覆率を決定し、そして阻害％及びＩＣ５０を知られている標準品と対比して算出した。
【０３０３】
血小板（thrombocyte）粘着アッセイのために、血小板を次のように濃縮した：ヒルジン（２０μｇ／ｍｌ；レフルダン（Refludan）（Pharmion））及び血液を、１５０ｇで２０分間遠心分離し、抗凝固ヒト血液を作成した。多血小板血漿（ＰＲＰ）を回収し、そして再び遠心分離し、上記のように回収した。少血小板血漿を１９４９ｇで１０分間（２回）の遠心分離によって残存する血液から得た。ＰＰＰを希釈細胞（２ｍＭ Ｍｇ）に加え、細胞の濃度を２×１０5／μｌに調整した。細胞を０．５時間放置し、そして５×１０4／μｌに希釈した。その後、細胞を３μｇ／ｍｌ ＲｅｏＰｒｏ（２．５μｇ／ｍｌ；Centocor B.V., Leiden, NL）（１０分，室温）と接触させ、６ｍＭ ＭｎＣｌ2×４Ｈ2Ｏ（５ｍＭ）を加えた（インキュベーション（１０分間））。
【０３０４】
プレートは次のように調製した：プレート（Perkin Elmer, IsoPlate, 1450-571）を１００μｌ／ウェル Ｉ型コラーゲン １０μｇ／ｍｌ（酢酸中、０．０１Ｍでのラット尾 C8897 Sigma Stock ２００μｇ／ｍｌからのＩ型）で、室温で１時間インキュベートした。次いでそれらを２００μｌ／ウェル ＴＢＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４，１２０ｍＭ ＮａＣｌ，２、７ｍＭ ＫＣｌ，０．０５ｍＭ ＣａＣｌ2，２ｍＭ ＭｇＣｌ2×６Ｈ2Ｏ，０．１％ ＢＳＡ）を用いて３回洗浄した。その後、１０μｌ／ウェル 化合物及びＲｅｏＰｒｏ処理及びＭｎ処理血小板（５×１０4 細胞／μｌ，５０μｌ／ウェル）を加えた。細胞を１．５時間（暗室）インキュベートし、そして２００μｌ／ウェル ＴＢＳで３回洗浄した。２．５μＭ カルセインＡＭ（５０μｌ／ウェル，Ｃ−３０９９，Molecular Probes，ＭＷ ９９４．８７，３０分，室温）を加え、引き続いて洗浄工程を行なった。読みとり工程を細胞の不存在下で、SpectraMax M5：Fluoreszenz 励起（ＥＸ） ４９２ 放出（ＥＭ） ５３５ カットオフ（Ｃｕｔｏｆｆ）：５３０（Automatic）を用いて行なった。ブランクサブトラクション処理の後、１００−（（平均値 化合物*１００）／平均値 コントロール）として阻害％を算出した。
【０３０５】
図３から得ることができる通り、抗α２インテグリンｍＡＢは、用量依存的にずり応力下にて血小板粘着を、ナノモル単位のＩＣ５０で阻害した。
【０３０６】
実施例６−サイズ排除クロマトグラフィーによって決定された抗α2インテグリンｍＡｂの凝集挙動
すべてのヒト化変異体及びコンパレーター（comparator）の凝集パーセンテージ（aggregation percentage）がどうかについて試験した。TSKgel SWXLガードカラム（TosohBioscience）と共に、TSKgel G3000SWXLカラム（７．８ｍｍ ＩＤ×３０．０ｃｍ Ｌ，TosohBioscience）を用いて、サイズ排除クロマトグラフィーをAEKTA explorer 10（GE Healthcare）によって行なった。３０μｌのサンプル（０．４〜１ｍｇ／ｍｌ）を注入し、そしてクロマトグラフィーをランニングバッファーとして１００ｍＭ Ｎａ2ＳＯ4、１００ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、０．０５％ ＮａＮ3 ｐＨ ６．７を用い、１ｍｌ／分、そして２８０ｎｍの検出波長で行なった。このカラムをゲルろ過分子量マーカー（gel filtration molecular weight markers (Sigma Aldrich））を用いてキャリブレートした。データ評価を、ユニコーンソフトウェア ｖ５．１１（Unicorn software v5.11）（GE Healthcare）を用いて行なった。
【０３０７】
【表１６】
2013544489.tif 000019
【０３０８】
表１０から得ることができる通り、アルファ２インテグリンｍＡｂのすべての試験変異体は、低いパーセンテージの凝集を有する。コンパレーターの凝集挙動を比較すると、すべての試験したアルファ２インテグリン抗体は、コンパレーターと比較してより低い凝集パーセンテージ値を示した。
【０３０９】
実施例７−ビアコア（Biacore）によって測定された抗α2インテグリンｍＡｂの速度論的結合データ
Biacore 3000（GE Healthcare）による表面プラズモン共鳴テクノロジーが精製ヒト化抗体の詳細な速度論的キャラクタリゼーションのために使用された。抗ヒトＦｃ特異性抗体（MAB1302, Millipore）によってキャプチャーされた抗インテグリン抗体を用いて、キャプチャーアッセイ（capture assay）が使用され、そしてインテグリンα2Ｉ−ドメインがアナライトとして使用された。通例、１２０ＲＵの抗インテグリン抗体が、固定化抗ヒトＦｃ特異的抗体によってキャプチャーされ（研究グレードＣＭ５）、その結果、この抗体に結合したＩ−ドメインの３０ＲＵのＲｍａｘがもたらされた。４ｍＭ ＭｇＣｌ2（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．００５％ 界面活性剤Ｐ２０）を補充したＨＢＳ−Ｐバッファー中、０．８〜２５ｎＭ Ｉ−ドメインの濃度範囲にわたり、３０μｌ／分の流速で結合カイネティクス（Binding kinetics）が測定された。チップ表面を１０ｍＭ グリシン ｐＨ ２．５で再生した。参照として固定化抗ヒトＦｃ特異的抗体を含むフローセル（flow cell）を用いて、速度論的パラメーターを解析し、そしてＢＩＡ評価プログラムパッケージ（BIAevaluation program package）（バージョン４．１）で算出した。質量移動を有する１：１結合モデルが、抗体又はの０．８〜２５ｎＭのアナライト濃度に相当する曲線データのグローバルフィッティングに適用された。
【０３１０】
表１１）３つの変異体は、非ヒト化ｍＡｂとしてBiacoreで類似のＫDを有した：
−組み合わせ ＬＣ１／ＨＣ１（ヒト化のみに対応する変異）
−組み合わせ ＬＣ３／ＨＣ３（ヒト化及び安定化に対応する変異）
−組み合わせ ＬＣ３／ＨＣ４（ヒト化及び安定化及び抗凝集に対応する変異）。
グラフティングによる変異体変異（variant mutation）は、非ヒト化ｍＡｂに近接していた。
【０３１１】
実施例８−抗アルファ２インテグリン抗体のエピトープ決定
非ヒト化抗アルファ２ｍＡｂ、コンパレーターｍＡｂのエピトープを検証するために、エピトープキャラクタリゼーションが表面プラズモン共鳴テクノロジーを用いてBiacore 3000（GE Healthcare）によって行なわれた。非ヒト化抗アルファ２ｍＡｂに相当するＦａｂフラグメントをアミン反応性カップリングによって５００ＲＵでＣＭ５チップ上に固定した。このインテグリンＩ−ドメインを１０μｌ／分でＦａｂフラグメントによってキャプチャーし、そして短時間の解離期間の後、抗体 ＴＭＣ２２０６を、３０μｌ／分でα2Ｉ−ドメインに結合させた。再生を１０ｍＭ グリシンバッファー ｐＨ ２．０を用いて行なった。第二の実験では、コンパレーターｍＡｂ ＴＭＣ２２０６を、抗ヒトＦｃ特異的抗体（MAB1302 Millipore）の表面上にキャプチャーした。次いでこのインテグリンＩ−ドメイン、引き続いて非ヒト化Ｆａｂを結合させた。この結果は、図１３及び図１４から得ることができる。この結果によると、コンパレーター抗体 ＴＭＣ２２０６が非ヒト化Ｆａｂによってプレバインディング（prebound）されたインテグリンＩ−ドメインに結合することが明瞭に示された。
【０３１２】
従って、非ヒト化Ｆａｂは、コンパレーターｍＡｂ ＴＭＣ２２０６によってプレバインディングされたインテグリンＩ−ドメインに結合する。非ヒト化Ｆａｂ及びコンパレーターｍＡｂのインテグリンα2Ｉ−ドメインへの同時結合（simultaneous binding）は、Ｆａｂ及びコンパレーターｍＡｂ双方のエピトープが同一ではないことを示す。このことは、この発明の抗アルファ２抗体及びコンパレーター抗体がアルファ２インテグリンの中の異なったエピトープに結合することを意味する。
【０３１３】
実施例９−コラーゲンコートプレート及び洗浄血小板又は多血小板血漿を用いる静止状態下での血小板結合アッセイ
α２β１インテグリンは血液血小板で発現され、それらのコラーゲンへの粘着において重要な役割を演じているので、こうした細胞を用いる血小板結合試験のためのインビトロアッセイシステムが使用された。血小板結合試験のために、プレート（Isoplate, Perkin
Elmer, F1450 571）をＴＢＳ中、室温で１時間、コラーゲン（Sigma C8897）でコートした。ウェルをＴＢＳで繰り返し洗浄し、その後、抗α２インテグリンｍＡｂの階段希釈液を加えた。ヒルジン、ＰＧＥ１及びＲｅｏＰｒｏで抗凝固され、そしてカルセインＡＭ（CalceinAM）（C-3099 Molecular Probes）で標識された、新たに調製したヒト多血小板血漿、又は新たに単離されたヒト血小板を加え、そして光から保護して室温で９０分間インキュベートした。洗浄後、プレートを４９２ｎＭ 励起、５３５ｎＭ 放出でＭ５リーダー（M5 reader）（Molecular Devices）で測定した。阻害％及びＩＣ５０を、アルファ２インテグリン又は非ヒト化アルファ２ｍＡＢの小分子阻害剤を用いて作成された滴定曲線と対比して算出した。結果は表１２から得ることができる。
【０３１４】
【表１７】
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【０３１５】
表１２で示されている結果から得られることができる通り、洗浄血小板を用いる静止状態下のもとで異なる抗アルファ２抗体変異体によって示される血小板阻害は、コンパレーター抗体のそれに匹敵し、一部の変異体（ＬＣ３／ＨＣ３又はＬＣ３／ＨＣ４）の場合には、一層顕著に、あるいは幾分強い（ＬＣ１／ＨＣ１）。
【０３１６】
【表１８】
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【０３１７】
表１３に示されている結果から得られることができる通り、多血小板血漿を用いて静止状態下で、異なる抗アルファ２抗体変異体、変異体ＬＣ１／ＨＣ１、変異体ＬＣ３／ＨＣ３、変異体ＬＣ３／ＨＣ４及び変異体ＬＣ５／ＨＣ７によって示される血小板阻害は、コンパレーター抗体のそれに匹敵する。
【０３１８】
静止状態での血小板結合アッセイから結論づけられうる通り、抗α2インテグリン抗体のヒト化形態は、濃度依存的に血液血漿の存在下、又は非存在下で新たに単離されたヒト血小板の粘着を遮断する。４つの変異体は、非ヒト化ｍＡｂと、生物アッセイにおいて同様な阻害活性を示す：
−組み合わせ ＬＣ１／ＨＣ１（ヒト化のみに対応する変異）
−組み合わせ ＬＣ３／ＨＣ３（ヒト化及び安定化に対応する変異）
−組み合わせ ＬＣ３／ＨＣ４（ヒト化及び安定化及び抗凝集に対応する変異）
−組み合わせ ＬＣ５／ＨＣ７（グラフティングによるヒト化に対応する変異）
【０３１９】
問題あるサイト（ＮＳ；ＤＳ）に対応する、そして上記の血小板結合実験においてより低い血小板阻害を示す３つの変異体（ＬＣ２／ＨＣ２、ＬＣ４／ＨＣ５及びＬＣ４／ＨＣ６）は、実施例７（表１１参照）の上記のBiacoreによる実験における非ヒト化抗アルファ２インテグリン抗体と比較してより弱いα２Ｉ−ドメイン結合活性を示す変異体と全く同様であった。すなわち、血小板結合アッセイの結果は、Biacoreによる評価からの親和性データと完全に一致している。
【０３２０】
実施例１０−異なる抗アルファ２抗体変異体の熱安定性
熱安定性に関する結果は、表１４にまとめられている。この抗体は、コンパレーターと同等な、等しい又は良好な熱安定性を示す。熱安定性測定は、ＰＣＲサーモサイクラー（PCR thermocycler）（Ｍｙ−ＩＱ−１０〜９０℃の温度範囲（１℃／分）で２回）を用いて行なわれた。ＰＢＳバッファー中に希釈された抗体の２マイクログラムが４０Ｘサイプロオレンジ（40XSYPRO Orange）（Invitrogen）に補充された。
【０３２１】
【表１９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図９−６】
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【図９−７】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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