(57)【要約】  本発明は、ウイルス感染、特にヒト患者または他の動物宿主におけるＨＣＶを治療または防止するための化合物、組成物、および方法を対象とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2013542955.tif 000014
の化合物またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和であって、式中、
ＪおよびＪ１は、存在するまたは不在であることができ、存在するとき、独立して、低級アルキル（Ｃ１−Ｃ６）、アリール、アリールアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルオキシ、ケト、ヒドロキシ、アミノ、アリールアミノ、カルボキシアルキル、カルボキサミドアルキル、ハロ、シアノ、ホルミル、スルホニル、またはスルホンアミドから選択され、
Ｒは、アルキル（Ｃ１−Ｃ１０）、シクロアルキル（Ｃ３−Ｃ８）、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルである、  式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物であって、前記化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和は、個々の鏡像異性体、立体異性体、回転異性体、互変異性体、ラセミ体、またはそれらの混合物の形態であることができる、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ＨＣＶ感染を治療もしくは防止する、またはＨＣＶの生物学的活性を減少させるための方法であって、治療有効量または予防有効量の請求項１の化合物をその治療または予防を必要とする患者に投与することを含む、方法。
【請求項４】
前記化合物は、別の抗ＨＣＶ剤と組み合わせて投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
セリンプロテアーゼ活性を阻害するための方法であって、請求項１による化合物を上述した患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項６】
前記化合物は、患者に投与され、薬学的に好適な担体と一緒に薬学的に許容される組成物に製剤化される、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ＨＣＶ感染を治療もしくは防止する、またはＨＣＶの生物学的活性を減少させるための薬剤の調製における請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項８】
前記薬剤は、別の抗ＨＣＶ剤をさらに含む、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
セリンプロテアーゼ活性を阻害するための薬剤の調製における請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項１０】
前記薬剤は、薬学的に好適な担体をさらに含む、請求項７〜９のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＮＳ３プロテアーゼの阻害剤として有用な化合物、方法、および組成物、そのような化合物の合成、ならびにＨＣＶ感染を治療する、またはＨＣＶ感染の可能性もしくはその症状の重篤度を減少させるためのそのような化合物の使用を対象とする。
【０００２】
本願は、２０１０年１１月１日に出願された米国仮出願第６１／４０８，９８９号に対して優先権を主張する。
［背景技術］
世界中で１億８０００万人を超える人がＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）に感染している。毎年、３００〜４００万人が新たに感染していると推定され、その７０％は、慢性肝炎を発症する。ＨＣＶは、先進国において、全ての肝臓癌の例証の５０〜７６％、および全ての肝臓移植の３分の２を占める。標準的な療法（ペグ化インターフェロンα＋リバビリン）は、５０〜６０％の患者にのみ有効であり、しかしながら、標準的な療法（ペグ化インターフェロンα＋リバビリン）の有効性は、よく理解されておらず、標準的な療法（ペグ化インターフェロンα＋リバビリン）は、重大な副作用と関連する。したがって、ＨＣＶを治療および／または治癒するための新しい薬物を緊急に必要とする（１：Ｃｈｅｎ  ＫＸ，Ｎｊｏｒｏｇｅ  ＦＧ．Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ＨＣＶ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ．２００９  ８，８２１−３７、２：Ｇａｒｇ  Ｇ，Ｋａｒ  Ｐ．Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＨＣＶ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ｉｓｓｕｅｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｏｐｔｉｏｎｓ．Ｔｒｏｐ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２００９  ３０，１１−８、３：Ｐｅｒｅｉｒａ  ＡＡ，Ｊａｃｏｂｓｏｎ  ＩＭ．Ｎｅｗ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｆｏｒ  ＨＣＶ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ．２００９  ７，４０３−１１）。
【０００３】
ＨＣＶゲノムは、ヌクレオカプシドおよび脂質エンベロープに封入されたプラス鎖ＲＮＡを含み、約３０００のアミノ酸の大きなポリペプチドをコードする９．６ｋｂのリボヌクレオチドからなる（Ｄｙｍｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ２０００，１１，７９）。成熟後、このポリペプチドは、少なくとも１０のタンパク質に切り分けられる。ＮＳ３タンパク質のＮ末端ドメインに位置するＮＳ３セリンプロテアーゼは、後のポリタンパク質の下流の全ての切断事象を媒介する。その役割のため、ＮＳ３セリンプロテアーゼは、理想の薬物標的であり、以前の研究は、米国特許出願第ＵＳ２００５／００２０５０３号、第ＵＳ２００４／０２２９８１８号、および第ＵＳ２００４／００２２９７７６号に説明されるように、ヘキサペプチドならびにトリペプチドが様々な程度の阻害を示すことを示してきた。抗ＨＣＶ活性を示す大環状化合物は、国際特許出願第Ｗ０２００６１１１９０６１号、第Ｗ０２００７／０１５８５５号、および第Ｗ０２００７／０１６４４１号にも開示されている（全てＭｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）。
【０００４】
ＨＣＶ複製を選択的に阻害する新規抗ウイルス戦略の発見は、ＨＣＶの増殖に関する簡便な細胞培養モデルに欠くため長い間妨げられてきた。この障害は、最初に１９９９年のＨＣＶレプリコンシステムの確立（Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ，Ｒ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２００２，１，９１１-９１６およびＢａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ，Ｒ．，Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２００５，４３，２１０-２１６）により、そして２００５年の頑強なＨＣＶ細胞培養モデルの開発（Ｗａｋｉｔａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．  ２００５，１１，７９１−６、Ｚｈｏｎｇ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００５，１０２，９２９４−９、Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈ，Ｂ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２００５，３０９，６２３−６）により克服されてきた。
【０００５】
新しい抗ウイルスまたは化学療法剤、これらの薬剤を含む組成物、およびこれらの薬剤を使用する治療方法、特に薬物耐性または突然変異ウイルスを治療するための方法を提供することは有利であろう。本発明は、そのような薬剤、組成物、および方法を提供する。
［発明の概要］
本発明は、宿主におけるＨＣＶ感染を治療または防止するための化合物、方法、および組成物を提供する。化合物は以下の一般式を有し、
【０００６】
【化１】
2013542955.tif 000002
式中、Ｒ、Ｊ、およびＪ１は、以下に定義される通りである。
【０００７】
本方法は、ＨＣＶ感染による感染を治療または防止するために、本願に記載される少なくとも１つの化合物の治療有効量もしくは予防有効量を投与すること、またはＨＣＶ感染の生物学的活性を減少させるのに十分な量の化合物を投与することを伴う。薬学的組成物は、ＨＣＶに罹患する宿主を治療するための、薬学的に許容される担体または賦形剤と組み合わせた、本願に記載される化合物のうちの１つを含む。製剤は、少なくとも１つのさらなる治療薬をさらに含むことができる。加えて、本発明は、そのような化合物を調製するためのプロセスを含む。
【０００８】
Ｃ型肝炎レプリコンは、レプリコンの複製が生じるために、ウイルス性ヘリカーゼ、プロテアーゼ、およびポリメラーゼが機能性である必要がある。レプリコンの複製の阻害により証明されるように、レプリコンは、活性に関してスクリーンニングされる化合物がＨＣＶヘリカーゼ、プロテアーゼ、および／またはポリメラーゼが機能する能力を阻害するか否かを評価する高処理能力アッセイにおいて使用されることができる。
［詳細な説明］
本願に記載される化合物は、ＨＣＶに対して阻害活性を示す。したがって、本化合物は、宿主のウイルス感染を治療もしくは防止する、またはウイルスの生物学的活性を減少させるために使用されることができる。宿主は、哺乳類、特にＨＣＶに感染したヒトであることができる。本方法は、本願に記載される有効量の化合物のうちの１つ以上を投与することを伴う。
【０００９】
薬学的に許容される担体または賦形剤と組み合わせて本願に記載される１つ以上の化合物を含む薬学的製剤も開示する。一実施形態において、製剤は、本願に記載される少なくとも１つの化合物と、少なくとも１つのさらなる治療薬とを含む。
【００１０】
本発明は、以下の定義を参照することにより、より良く理解されるであろう。
［Ｉ．定義］
用語「独立して」とは、本願において、独立して適用される変数が用途に応じて独立して変動することを示すように使用される。よって、Ｒ”ＸＹＲ”等の化合物において、式中、Ｒ”は、「独立して炭素または窒素」であり、両方のＲ”が炭素であることができ、両方のＲ”が窒素であることができ、またはＲ”の１つが炭素であり、もう一方のＲ”が窒素であることができる。
【００１１】
本願で使用されるように、用語「鏡像異性体的に純粋」とは、化合物の少なくとも約９５％、好ましくは約９７％、９８％、９９％、または１００％の単一鏡像異性体を含む化合物組成物を指す。
【００１２】
本願で使用されるように、用語「実質的に〜を含まない」または「実質的に〜の不在下で」とは、化合物の少なくとも８５〜９０重量％、好ましくは９５％〜９８重量％、さらにより好ましくは９９％〜１００重量％の指定された鏡像異性体を含む化合物組成物を指す。好ましい実施形態において、本願に記載される化合物は、実質的に鏡像異性体を含まない。
【００１３】
同様に、用語「単離された」とは、少なくとも８５〜９０重量％、好ましくは９５％〜９８重量％、さらにより好ましくは９９％〜１００重量％の化合物を含む化合物組成物を指し、残りは他の化学種または鏡像異性体を含む。
【００１４】
本願で使用されるように、用語「アルキル」とは、特に特に規定がなければ、飽和直鎖、分枝鎖、もしくは環式、一級、二級、または三級炭化水素を指し、置換および非置換のアルキル基の両方を含む。アルキル基は、別段に反応に干渉しない、またはプロセスにおいて改善を提供する任意の部分と任意に置換されることができ、当業者に公知である、例えば、Ｇｒｅｅｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１（参照により本願に組み込まれる）に教示されるように、必要に応じて非保護または保護のいずれかのハロ、ハロアルキル、ヒドロキシル、カルボキシル、アシル、アリール、アシルオキシ、アミノ、アミド、カルボキシル誘導体、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノ、スルホン酸、チオール、イミン、スルホニル、スルファニル、スルフィニル、スルファモニル（ｓｕｌｆａｍｏｎｙｌ）、エステル、カルボン酸、アミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホリル、ホスフィン、チオエステル、チオエーテル、酸ハロゲン化物、無水物、オキシム、ヒドラジン、カルバメート、ホスホン酸、ホスホネートを含むがこれらに限定されない。具体的には、ＣＦ３およびＣＨ２ＣＦ３が含まれる。
【００１５】
本願において、用語Ｃ（アルキルの範囲）が使用されるときは常に、本用語は、独立して、具体的および個別に設定されるかのように、そのクラスの各メンバーを含む。用語「アルキル」はＣ１−２２アルキル部分を含み、用語「低級アルキル」はＣ１−６アルキル部分を含む。関連するアルキルラジカルは、接尾辞「−ａｎｅ」を接尾辞「−ｙｌ」で置換することにより命名されることを当業者は理解する。
【００１６】
用語「アルケニル」とは、１つ以上の二重結合を含有するため、直鎖もしくは分枝鎖の不飽和炭化水素ラジカルを指す。本願に開示されるアルケニル基は、任意に、反応プロセスに悪影響を与えない任意の部分で置換されることができ、アルキル部分上の置換基に関して記載されるものを含むが、これらに限定されない。アルケニル基の非限定的な例としては、エチレン、メチルエチレン、イソプロピリデン、１，２−エタン−ジイル、１，１−エタン−ジイル、１，３−プロパン−ジイル、１，２−プロパン−ジイル、１，３−ブタン−ジイル、および１，４−ブタン−ジイルを含む。
【００１７】
用語「アルキニル」とは、１つ以上の三重結合を含有するため、直鎖もしくは分枝鎖の不飽和非環式炭化水素ラジカルを指す。アルキニル基は、任意に、反応プロセスに悪影響を与えない任意の部分で置換されることができ、アルキル部分に関して上述されるものを含むが、これらに限定されない。好適なアルキニル基の非限定的な例としては、エチニル、プロピニル、ヒドロキシプロピニル、ブチン−１−イル、ブチン−２−イル、ペンチン−１−イル、ペンチン−２−イル、４−メトキシペンチン−２−イル、３−メチルブチン−１−イル、ヘキシン−１−イル、ヘキシン−２−イル、およびヘキシン−３−イル、３，３−ジメチルブチン−１−イルラジカルを含む。
【００１８】
用語「アルキルアミノ」または「アリールアミノ」とは、それぞれ、１つもしくは２つのアルキル置換基またはアリール置換基を有するアミノ基を指す。
本願で使用され、他に定義されない限り、用語「保護された」とは、さらなる反応を防止するために、または他の目的のために酸素、硫黄、窒素、またはリンの原子に加えられる基を指す。広範な様々の酸素保護基および窒素保護基が有機合成の当業者に公知であり、例えば上記のＧｒｅｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓに記載される。
【００１９】
用語「アリール」とは、単独で、または組み合わせで、１つ、２つ、または３つの環を含有する炭素環式芳香族系を意味し、そのような環は、ペンダント様式で一緒に結合されるか、または縮合されることができる。アリールの非限定的な例としては、フェニル、ビフェニル、もしくはナフチル、または芳香族環から水素を取り除いた後に残る他の芳香族基が挙げられる。用語アリールは、置換および非置換部分の両方を含む。アリール基は、任意に、化合物を調製するために本願に記載されるプロセスに悪影響を与えない任意の部分で置換されることができ、アルキル部分に関して上述されるものを含むがこれらに限定されない。置換されたアリールの非限定的な例としては、ヘテロアリールアミノ、Ｎ−アリール−Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ−ヘテロアリールアミノ−Ｎ−アルキルアミノ、ヘテロアラルコキシ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、アリールチオ、モノアリールアミドスルホニル、アリールスルホンアミド、ジアリールアミドスルホニル、モノアリールアミドスルホニル、アリールスルフィニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールチオ、ヘテロアリールスルフィニル、ヘテロアリールスルホニル、アロイル、ヘテロアロイル、アラルカノイル、ヘテロアラルカノイル、ヒドロキシアラルキル、ヒドキシ（ｈｙｄｏｘｙ）ヘテロアラルキル、ハロアルコキシアルキル、アリール、アラルキル、アリールオキシ、アラルコキシ、アリールオキシアルキル、飽和ヘテロシクリル、部分飽和ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールオキシアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、アリールアルケニル、およびヘテロアリールアルケニル、カルボアラルコキシを含む。
【００２０】
用語「アルカリル」または「アルキルアリール」とは、アリール置換基を有するアルキル基を指す。用語「アラルキル」または「アリールアルキル」とは、アルキル置換基を有するアリール基を指す。
【００２１】
本願で使用されるように、用語「ハロ」とは、クロロ、ブロモ、ヨード、およびフルオロを含む。
用語「アシル」とは、エステル基の非カルボニル部分が直鎖、分枝鎖、もしくは環式のアルキルまたは低級アルキル、アルコキシアルキル（メトキシメチルを含むがこれに限定されない）、アラルキル（ベンジルを含むがこれに限定されない）、アリールオキシアルキル（フェノキシメチル等）、アリール（任意にハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）で置換されるフェニルを含むがこれに限定されない）、アルキル（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、およびＣ４を含むがこれらに限定されない）、またはアルコキシ（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、およびＣ４を含むがこれらに限定されない）から選択されるカルボン酸エステル、スルホン酸エステル（アルキルもしくはアラルキルスルホニル（メタンスルホニルを含むがこれに限定されない）等）、モノ、ジ、もしくはトリリン酸エステル、トリチルもしくはモノメトキシトリチル、置換されたベンジル、トリアルキルシリル（例えばジメチル−ｔ−ブチルシリル）、またはジフェニルメチルシリルを指す。エステルにおけるアリール基は、最適にフェニル基を含む。用語「低級アシル」とは、非カルボニル部分が低級アルキルであるアシル基を指す。
【００２２】
用語「アルコキシ」および「アルコキシアルキル」とは、メトキシラジカル等のアルキル部分を有する直鎖または分枝鎖のオキシ含有ラジカルを包含する。用語「アルコキシアルキル」とは、アルキルラジカルに結合される、つまりモノアルコキシアルキルおよびジアルコキシアルキルラジカルを形成する１つ以上のアルコキシラジカルを有するアルキルラジカルも包含する。「アルコキシ」ラジカルは、「ハロアルコキシ」ラジカルを提供するために、フルオロ、クロロ、またはブロモ等の１つ以上のハロ原子でさらに置換されることができる。そのようなラジカルの例としては、フルオロメトキシ、クロロメトキシ、トリフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロエトキシ、フルオロエトキシ、テトラフルオロエトキシ、ペンタフルオロエトキシ、およびフルオロプロポキシを含む。
【００２３】
用語「アルキルアミノ」とは、それぞれ、アミノラジカルに結合される１つまたは２つのアルキルラジカルを含有する「モノアルキルアミノ」および「ジアルキルアミノ」を表す。用語アリールアミノとは、それぞれ、アミノラジカルに結合される１つまたは２つのアリールラジカルを含有する「モノアリールアミノ」および「ジアリールアミノ」を表す。用語「アラルキルアミノ」とは、アミノラジカルに結合されるアラルキルラジカルを包含する。用語アラルキルアミノは、それぞれ、アミノラジカルに結合される１つまたは２つのアラルキルラジカルを含有する「モノアラルキルアミノ」および「ジアラルキルアミノ」を表す。用語アラルキルアミノは、更にアミノラジカルに結合される１つのアラルキルラジカルおよび１つのアルキルラジカルを含有する「モノアラルキルモノアルキルアミノ」を表す。
【００２４】
本願で使用されるように、用語「ヘテロ原子」とは、酸素、硫黄、窒素、およびリンを指す。
本願で使用されるように、用語「ヘテロアリール」または「ヘテロ芳香族」とは、芳香族環に少なくとも１つの硫黄、酸素、窒素、もしくはリン含む、または芳香族系に２つ以上のヘテロ原子（Ｏ、Ｓ、Ｎ、Ｐ）の組み合わせを含む芳香族を指す。５員環および６員環の両方のヘテロアリールは、ベンゾフラン、ベンズチオフェン、ベンゾピロール等のベンゼン環に結合される５員環および６員環のヘテロアリールであるため、本願において想定される。
【００２５】
用語「複素環式」、「ヘテロシクリル」、およびシクロヘテロアルキルとは、酸素、硫黄、窒素、またはリン等の少なくとも１つのヘテロ原子が環に存在する、非芳香族環式基を指す。
【００２６】
ヘテロアリールおよび複素環式基の非限定的な例としては、フリル、フラニル、ピリジル、ピリミジル、チエニル、イソチアゾリル、イミダゾリル、テトラゾリル、ピラジニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、キノリル、イソキノリル、ベンゾチエニル、イソベンゾフリル、ピラゾリル、インドリル、イソインドリル、ベンズイミダゾリル、プリニル、カルバゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、イソオキサゾリル、ピロリル、キナゾリニル、シンノリニル、フタラジニル、キサンチニル、ヒポキサンチニル、チオフェン、フラン、ピロール、イソピロール、ピラゾール、イミダゾール、１，２，３−トリアゾール、１，２，４−トリアゾール、オキサゾール、イソキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、ピリミジンもしくはピリダジン、およびプテリジニル、アジリジン、チアゾール、イソチアゾール、１，２，３−オキサジアゾール、チアジン、ピリジン、ピラジン、ピペラジン、ピロリジン、オキサジラン、フェナジン、フェノチアジン、モルフォリニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピラジニル、キノキサリニル、キサンチニル、ヒポキサンチニル、プテリジニル、５−アザシチジン、５−アザウラシリル、トリアゾロピリジニル、イミダゾロピリジニル、ピロロピリミジニル、ピラゾロピリミジニル、アデニン、Ｎ６−アルキルプリン、Ｎ６−ベンジルプリン、Ｎ６−ハロプリン、Ｎ６−ビニルプリン、Ｎ６−アセチレンプリン、Ｎ６−アシルプリン、Ｎ６−ヒドロキシアルキルプリン、Ｎ６−チオアルキルプリン、チミン、シトシン、６−アザピリミジン、２−メルカプトピリミジン、ウラシル、Ｎ５−アルキルピリミジン、Ｎ５−ベンジルピリミジン、Ｎ５−ハロピリミジン、Ｎ５−ビニルピリミジン、Ｎ５−アセチレンピリミジン、Ｎ５−アシルピリミジン、Ｎ５−ヒドロキシアルキルプリン、およびＮ６−チオアルキルプリン、ならびにイソキサゾリルを含む。ヘテロ芳香族基は、アリールに関して上述されるように、任意に置換されることができる。複素環式基またはヘテロ芳香族基は、ハロゲン、ハロアルキル、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシル誘導体、アミド、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノから選択される１つ以上の置換基で任意に置換されることができる。ヘテロ芳香族は、所望により、部分的にまたは完全に水素化されることができる。非限定的な例として、ジヒドロピリジンは、ピリジンの代わりに使用されることができる。複素環式基またはヘテロアリール基上の含酸素官能基および含窒素官能基は、必要に応じて、または所望により保護されることができる。好適な保護基は、当業者に周知であり、トリメチルシリル、ジメチルヘキシルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、およびｔ−ブチルジフェニルシリル、トリチルもしくは置換されたトリチル、アルキル基、アセチルおよびプロピオニル等のアシル基、メタンスルホニル、ならびにｐ−トルエネルスルホニル（ｔｏｌｕｅｎｅｌｓｕｌｆｏｎｙｌ）を含む。複素環式基またはヘテロ芳香族基は、反応に悪影響を与えない任意の部分で置換されることができ、アリールに関して上述されるものを含むが、これらに限定されない。
【００２７】
本願で使用されるように、用語「宿主」とは、ウイルスが複製することができる単細胞生物または多細胞生物を指し、細胞系および動物、好ましくはヒトを含むが、これらに限定されない。代替的に、宿主は、ウイルスの複製または機能が本発明の化合物により変更されることができるウイルスゲノムの一部を保有することができる。用語宿主とは、具体的に、感染細胞、ウイルスゲノムの全てまたは一部を遺伝子導入された細胞、ならびに動物、特に霊長類（チンパンジーを含むがこれに限定されない）およびヒトを指す。本発明の大半の動物用途において、宿主はヒト患者である。しかしながら、ある適応症において、獣医学的用途が本発明により明らかに想定される（チンパンジーの治療に使用するため等）。
【００２８】
用語「ペプチド」とは、１つのアミノ酸のカルボキシル基により別のアミノ基に結合される２〜１００のアミノ酸を含有する様々な天然化合物または合成化合物を指す。
用語「薬学的に許容される塩またはプロドラッグ」とは、本願全体を通して、患者に投与されるとき、親化合物を提供する化合物の任意の薬学的に許容される形態を説明するために使用される。薬学的に許容される塩は、薬学的に許容される無機または有機の塩基および酸に由来するものを含む。好適な塩は、薬学分野に周知の多くの他の酸のうち、カリウムおよびナトリウム等のアルカリ金属、カルシウムおよびマグネシウム等のアルカリ土類金属に由来するものを含む。薬学的に許容されるプロドラッグとは、本発明の化合物を形成するために、宿主において代謝される、例えば加水分解または酸化される化合物を指す。プロドラッグの典型的な例としては、活性化合物の官能性部分上に生物学的に不安定な保護基を有する化合物を含む。プロドラッグは、活性化合物を生成するために、酸化、還元、アミノ化、脱アミノ化、ヒドロキシル化、脱ヒドロキシル化、加水分解、脱加水分解、アルキル化、脱アルキル化、アシル化、脱アシル化、リン酸化、または脱リン酸化されることができる化合物を含む。本発明の化合物のプロドラッグ形態は、抗ウイルス活性を有することができる、抗ウイルス活性のような活性を示す化合物を形成するために代謝されることができる、またはその両方である。
［ＩＩ．活性化合物］
本願に記載される化合物は、以下の一般式
【００２９】
【化２】
2013542955.tif 000003
またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを有し、式中、
ＪおよびＪ１は、存在しても不在であってもよく、存在するとき、独立して、低級アルキル（Ｃ１−Ｃ６）、アリール、アリールアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルオキシ、ケト、ヒドロキシ、アミノ、アリールアミノ、カルボキシアルキル、カルボキサミドアルキル、ハロ、シアノ、ホルミル、スルホニル、またはスルホンアミドから選択され、
Ｒは、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ３−８シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルである。
［ＩＩＩ．立体異性および多型性］
本願に記載される化合物は、不斉中心を有してもよく、ラセミ体、ラセミ混合物、個々のジアステレオマーまたは鏡像異性体として生じてもよく、全ての異性体の形態は本発明に含まれる。キラル中心を有する本発明の化合物は、光学活性形態およびラセミ形態で存在し、光学活性形態およびラセミ形態で単離されることができる。一部の化合物は、多型性を示すことができる。本発明は、本願に記載される有用な特性を有する本発明の化合物のラセミ、光学活性、多型、もしくは立体異性形態、またはそれらの混合物を包含する。光学活性形態は、例えば、再結晶法によるラセミ形態の分割により、光学活性開始材料からの合成により、キラル合成により、またはキラル固定相を使用する、もしくは酵素分割によるクロマトグラフィー分離により調製されることができる。
【００３０】
本化合物の光学活性形態は、当該技術分野に公知の任意の方法を使用して調製されることができ、これには、再結晶法によるラセミ形態の分割により、任意の活性開始材料からの合成により、キラル合成により、またはキラル固定相を使用するクロマトグラフィー分離が含まれるが、これらに限定されない。
【００３１】
光学活性材料を得るための方法の例としては、少なくとも以下を含む。
ｉ）結晶の物理的分離：個々の鏡像異性体の巨視的結晶が手動で分離される技法。この技法は、別個の鏡像異性体の結晶が存在する場合、即ち、材料が集合体であり、結晶が視覚的に異なる場合に使用されることができる。
ｉｉ）同時結晶化：個々の鏡像異性体がラセミ体の溶液から別個に結晶化される技法であり、後者が固体状態で集合体である場合にのみ可能である。
ｉｉｉ）酵素分割：ラセミ体の部分的または完全な分離が鏡像異性体の酵素との反応速度が異なることによる技法。
ｉｖ）酵素不斉合成：合成の少なくとも一工程が鏡像異性体的に純粋である、または所望の鏡像異性体の富化された合成前駆体を得るために、酵素反応を使用する合成法。
ｖ）化学不斉合成：所望の鏡像異性体が、生成物において非対称性（即ち不斉）を生成する条件下で、アキラル前駆体から合成される合成法で、この合成法はキラル触媒またはキラル補助物を使用して達成されることができる。
ｖｉ）ジアステレオマー分離：個々の鏡像異性体をジアステレオマーに変換する鏡像異性体的に純粋な試薬（キラル補助物）とラセミ化合物を反応させる技法。得られたジアステレオマーは、次いで、この時点でそのより異なる構造差および所望の鏡像異性体を得るために後に取り除かれるキラル補助物によって、クロマトグラフィーまたは結晶化により分離される。
ｖｉｉ）一次および二次不斉変換：ラセミ体からのジアステレオマーが、所望の鏡像異性体からのジアステレオマーの溶液において優勢となるように均衡化するか、または原理上最終的に全ての材料が所望の鏡像異性体から結晶質のジアステレオマーに変換されるように、所望の鏡像異性体からのジアステレオマーの優先的結晶化が均衡を乱す技法。次いで、所望の鏡像異性体はジアステレオマーから剥離される。
ｖｉｉｉ）速度論的分割：この技法は、速度論的条件下の鏡像異性体のキラル、非ラセミ試薬、または触媒との不均等な反応速度によるラセミ体の部分的または完全な分割（または部分的に分割された化合物のさらなる分割）の達成を指す。
ｉｘ）非ラセミ前駆体からのエナンチオ特異的合成：所望の鏡像異性体が非キラル開始材料から得られ、立体化学一体性が合成過程にわたって損なわれない、または最小に損なわれるのみである合成法。
ｘ）キラル液体クロマトグラフィー：ラセミ体の鏡像異性体が固定相と鏡像異性体の異なる相互作用により液体移動相で分離される（キラルＨＰＬＣを介することを含むがこれに限定されない）技法。固定相はキラル材料から作製されることができるか、または移動相は異なる相互作用を誘発するために追加のキラル材料を含有することができる。
ｘｉ）キラルガスクロマトグラフィー：ラセミ体が揮発され、鏡像異性体が固定された非ラセミ体キラル吸着剤相を含有するカラムとガス状移動相における鏡像異性体の異なる相互作用により分離される技法。
ｘｉｉ）キラル溶媒による抽出：鏡像異性体が１つの鏡像異性体を特定のキラル溶媒に優先的に溶解することにより分離される技法。
ｘｉｉｉ）キラル膜横断輸送：ラセミ体が薄膜障壁と接触して配置される技法。障壁は、典型的に、１つがラセミ体を含有する２つの混和流体を分離し、凝縮または圧力差等の駆動力により優先的な膜障壁横断輸送をもたらす。分離は、ラセミ体の１つの鏡像異性体のみが通過することができる膜の非ラセミ体キラル性質の結果として生じる。
【００３２】
疑似移動床クロマトグラフィーを含むがこれに限定されないキラルクロマトグラフィーが、一実施形態で使用される。広範な様々のキラル固定相が商業的に入手可能である。
［ＩＶ．化合物塩またはプロドラッグ製剤］
化合物が安定した非毒性酸または塩基塩を形成するのに十分に塩基性または酸性である場合、薬学的に許容される塩としての化合物の投与は、適切であり得る。薬学的に許容される塩の例は、酸と形成される有機酸添加塩であり、例えばトシレート、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、α−ケトグルタル酸塩、およびα−グリセロリン酸塩であり、生理学的に許容されるアニオンを形成する。好適な無機塩も形成されることができ、硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩、および炭酸塩が含まれるが、これらに限定されない。
【００３３】
薬学的に許容される塩を、当該技術分野において周知である標準的な手順を使用して、例えばアミン等の十分な塩基性化合物を好適な酸と反応させて、生理学的に許容されるアニオンを得ることにより得ることができる。カルボン酸のアルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウム、もしくはリチウム）塩またはアルカリ土類金属（例えば、カルシウム、マグネシウム）塩も調製することができる。
［Ｖ．治療方法］
ヒトを含むがこれに限定されない、ＨＣＶまたはその遺伝子断片に感染した宿主は、薬学的に許容される担体もしくは希釈剤の存在下で、有効量の活性化合物または活性化合物の薬学的に許容されるプロドラッグもしくは塩を患者に投与することにより治療されることができる。活性材料は、液体または固体形態で、任意の適切な経路により、例えば、経口的に、非経口的に、静脈内的に、皮内に、皮下に、または局所に投与されることができる。
［ＶＩ．組み合わせまたは代替療法］
一実施形態において、本発明の化合物を、少なくとも１つの他の抗ウイルス剤と一緒に用いることができる。
［表（その１）］
2013542955.tif 000004
［表（その２）］
2013542955.tif 000005
［表（その３）］
2013542955.tif 000006
［ＶＩＩ．薬学的組成物］
ヒトを含むがこれに限定されない、Ｃ型肝炎ウィルス（「ＨＣＶ」）に感染した宿主またはその遺伝子断片は、薬学的に許容される担体または希釈剤の存在下で、有効量の活性化合物またはその薬学的に許容されるプロドラッグもしくは塩を患者に投与することにより治療されることができる。活性材料は、液体または固体形態で、任意の適切な経路により、例えば、経口的に、非経口的に、静脈内的に、皮内に、皮下に、または局所に投与されることができる。
【００３４】
化合物の好ましい用量は、１日当り受給者の体重の約０．１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、より一般的には約１〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１〜約２０ｍｇ／ｋｇの範囲にある。薬学的に許容される塩およびプロドラッグの有効投与量の範囲を、送達される親化合物の重量に基づき計算することができる。塩またはプロドラッグが本質的に活性を示す場合、有効投与量は、塩もしくはプロドラッグの重量を使用して上述のように、または当業者に公知の他の手段により推定されることができる。
【００３５】
化合物は、１単位投与量形態当り７〜３，０００ｍｇ、好ましくは７０〜１４００ｍｇの活性成分を含有するものを含むがこれらに限定されない、任意の好適な投与量形態の単位で簡便に投与される。５０〜１，０００ｍｇの経口投与量が通常簡便である。
【００３６】
理想的には、活性成分は、約０．２〜７０μＭ、好ましくは約１．０〜１５μＭの活性化合物のピーク血漿濃度を達成するように投与されるべきである。これは、例えば、任意に生理食塩水中の活性成分の０．１〜５％溶液の静脈内注射により達成されるか、または活性成分のボーラスとして投与されることができる。
【００３７】
薬物組成物中の活性成分の濃度は、薬物の吸収、不活性化、および排出速度、ならびに当業者の公知の他の要因に依存するであろう。投与量の値は、緩和される状態の重篤度によっても変動するであろうということに留意する。任意の特定の対象に関して、個人の要求ならびに組成物を投与する、またはその投与を管理する者の専門的判断により、特定の投与量レジメンは経時的に調整されるべきであり、本願に記述される濃度範囲は、単に例示的であり、主張される組成物の範囲または実践を制限するものではないことをさらに理解されたい。活性成分は、一度に投与されることもでき、または異なる時間間隔で投与されるようにいくつかのより小さい用量に分けることができる。
【００３８】
活性化合物の好ましい投与形式は経口である。経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用担体を含むであろう。これらは、ゼラチンカプセルに封入されるか、または錠剤に圧縮されることができる。経口治療投与の目的において、活性化合物は、賦形剤と共に組み込まれ、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用されることができる。薬学的に適合性の結合剤および／またはアジュバント材料を、組成物の一部として含むことができる。
【００３９】
錠剤、ピル、カプセル、トローチ等は、以下の成分または類似する性質の化合物のいずれかを含有することができる：結合剤（微結晶セルロース、トラガントガム、またはゼラチン等）、賦形剤（デンプンまたはラクトース等）、崩壊剤（アルギン酸等）、プリモゲルまたはコーンスターチ、潤滑剤（ステアリン酸マグネシウムまたはステロテス等）、流動促進剤（コロイド状二酸化ケイ素等）、甘味剤（スクロースまたはサッカリン等）または風味剤（ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ風味）。投与量単位形態がカプセルである場合、上記の種類の材料に加え、脂肪油等の液体担体を含有することができる。加えて、単位投与量形態は、投与量単位の物理的形態を修飾する様々な他の材料、例えば砂糖のコーティング、シェラック、または他の腸溶剤を含有することができる。
【００４０】
化合物は、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウェハー、チューインガム等の構成要素として投与されることができる。シロップは、活性化合物（複数可）に加え、甘味剤としてスクロースまたは甘味料ならびにある防腐剤、染料、および着色剤ならびに風味料を含有することができる。
【００４１】
化合物またはその薬学的に許容されるプロドラッグもしくはその塩は、所望の作用を損なわない他の活性材料と、またはヌクレオシド化合物を含むがこれに限定されない抗生物質、抗真菌、抗炎症もしくは他の抗ウイルス等の所望の作用を補てんする材料と混合されることができる。非経口、皮内、皮下、または局所適用に使用される溶液または懸濁液は、以下の構成要素を含むことができる：減菌希釈剤（注射用の水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒等）、抗菌剤（ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等）、抗酸化剤（アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム等）、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸等）、緩衝液（酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩等）、および張度を調整するための薬剤（塩化ナトリウムまたはデキストロース等）。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または多用量バイアルに封入されることができる。
【００４２】
静脈内投与される場合、好ましい担体は、生理学的生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。
好ましい実施形態では、活性化合物は、移植片およびマイクロカプセル化された送達系を含むがこれらに限定されない制御放出製剤等の、身体からの迅速な排出に対して化合物を保護するであろう担体と共に調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸等の、生分解性の生体適合性のポリマーを使用することができる。例えば、胃酸による切断を保護するために、経腸的にコーティングされた化合物が使用されることができる。そのような製剤の調製方法は、当業者には明らかであろう。好適な材料を、商業的に得ることもできる。
【００４３】
リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を伴う、感染細胞を標的とするリポソームを含むがこれに限定されない）も、薬学的に許容される担体として好ましい。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号（参照により組み込まれる）に記載されるように、当業者に公知の方法により調製されることができる。例えば、リポソーム製剤は、適切な脂質（複数可）（ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイルホスファチジルコリン、およびコレステロール等）を、無機溶媒に溶解し、次に蒸発させ、乾燥した脂質の薄フィルムを容器の表面上に残すことにより調製されることができる。次いで、活性化合物の水溶液が容器に導入される。次いで、容器の側面から脂質材料を遊離させ、脂質凝集物を分散させるために、手動により容器を回転させ、それによってリポソーム懸濁液が形成される。
【００４４】
本発明の説明に使用される用語は、一般的に使用され、当業者に公知である。本願で使用されるように、以下の略記は示される意味を有する。
ａｑ  水性
ＣＤＩ  カルボニルジイミダゾール
ＤＭＦ  Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ  ジメチルスルホキシド
ＥＤＣ  １−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
ＥｔＯＡｃ  酢酸エチル
ｈ  時間/時間（複数）
ＨＯＢｔ  Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
Ｍ  モル濃度
ｍｉｎ  分
ｒｔまたはＲＴ  室温
ＴＢＡＴ  テトラブチルアンモニウムトリフェニルジフルオロケイ酸塩
ＴＢＴＵ  Ｏ−(ベンゾトリアゾール−１−イル)−Ｎ，Ｎ，Ｎ‘，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
ＴＨＦ  テトラヒドロフラン
［ＩＸ．活性化合物を調製するための一般手順］
本発明の化合物の調製方法は、以下の「具体的な実施例」のセクションに詳細に記載されるように、または当業者に公知の方法により調製されることができる。これらのスキームは、決して制限するものではなく、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく詳細の変形がなされることができることを当業者は理解するであろう。
［具体的な実施例］
本発明を代表する具体的な化合物は、以下の実施例および反応順序により調製され、反応順序を表す実施例およびダイアグラムは、本発明の理解に役立つように例示として提供され、後に続く特許請求の範囲に記述される本発明を制限するように決して解釈されるべきではない。本化合物は、後続の実施例において、本発明のさらなる化合物を生成するために中間体としても使用することができる。反応のいずれかで得られた収率を最適化するための試みは必ずしも行われなかった。当業者は、反応時間、温度、溶媒、および／または試薬における通常的変化を通してそのような収率をどのように増加させるか公知であろう。
【００４５】
試薬および溶媒は商業的供給者から得られ、さらに精製することなく使用された。塩化メチレンは、ＣａＣｌ２上で乾燥されて蒸留され、アルゴン下で分子篩４Å上で保管された。テトラヒドロフランは、使用前にアルゴン下でナトリウム／ベンゾフェノンケチル上で乾燥されて蒸留された。フラッシュクロマトグラフィー精製は、固定相としてマッハライ  ナーゲル（Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｌｇｅｌシリカゲル）（４０−６３μＭ）上で実施されるか、またはテレダイン  イスコ  コンビフラッシュ（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ  Ｉｓｃｏ  Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ）（登録商標）コンパニオン（Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ）（登録商標）装置上で充填レディセップ（ＲｅｄｉＳｅｐ）（登録商標）カラムを使用して行われた。分析高速液体クロマトグラフィー−質量分析（ＨＰＬＣ−ＭＳ）：
ＨＰＬＣ−ＭＳ条件Ａ１：ＨＰＬＳ−ＭＳは、ＢＤＳ  ハイパーシル（Ｈｙｐｅｒｓｉｌ）５０×２．１，３μｍを使用して、フォトダイオード  アレイ  ディテクター  ウォーターズ（Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ  Ａｒｒａｙ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｗａｔｅｒｓ）  ９９６およびウォーターズ  マイクロマス（Ｗａｔｅｒｓ  Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）  Ｑ−Ｔｏｆを装備するウォーターズ  アライアンス（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ）２７９０装置上で実施された。溶出条件は、線形勾配を含んだ：２０分で０％〜８０％のＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ（陽モードでは０．１％のＴＦＡを含有し、陰モードではＴＦＡを含まない）、流量０．２ｍＬ／分。
【００４６】
ＨＰＬＣ−ＭＳ条件Ａ２：ＨＰＬＳ−ＭＳは、ヌクレオジュル（Ｎｕｃｌｅｏｄｕｒ）  Ｃ１８  ピラミッド（Ｐｙｒａｍｉｄ）５０×２．１，３μｍを使用して、フォトダイオード  アレイ  ディテクター  ウォーターズ（Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ  Ａｒｒａｙ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｗａｔｅｒｓ）  ９９６およびウォーターズ  マイクロマス（Ｗａｔｅｒｓ  Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）  Ｑ−Ｔｏｆを装備するウォーターズ  アライアンス（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ）２７９０装置上で実施された。溶出条件は、線形勾配を含んだ：２０分で０％〜８０％のＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ（陽モードでは０．１％のＴＦＡを含有し、陰モードではＴＦＡを含まない）、流量０．３ｍＬ／分。
【００４７】
ＨＰＬＣ−ＭＳ条件Ｂ：ＨＰＬＳ−ＭＳは、アジレント  ゾルバックス（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ）  ＸＤＢ−Ｃ１８  ＲＰ  Ｃ１８  ４５×４．６，３．５μｍを使用して、質量分析のためにフォトダイオード  アレイ  ディテクター  アジレント（Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ  Ａｒｒａｙ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ａｇｉｌｅｎｔ）  Ｇ１３１５Ａ、ポリマーラブス（ｐｏｌｙｍｅｒｌａｂｓ）  ＥＬＳ２１００（ＤＥＤＬ）検出器およびアジレント  シンプル  クワッド（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｑｕａｄ）  ＥＳＩを装備するアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）  ＨＰ−１１００装置上で実施された。溶出条件は線形勾配を含んだ：４．５分で１０％〜１００％のＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ（０．０５％のＴＦＡを含有する）、流量１．５ｍＬ／分。
【００４８】
低分解能質量スペクトル（ＭＳ）は、陽（ＥＳ＋）または陰（ＥＳ−）モードで、大気圧イオン化条件（ＡＰＩ）で、アプライド  バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）  サイエックス（ＳＣＩＥＸ）３２００  キュートラップ（ＱＴＲＡＰ）から得られた。
【００４９】
高分解能質量分光（ＨＲＭＳ）は、パーキン  エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）装置から得られた。
ＮＭＲスペクトルは、重水素化した溶媒において、１Ｈに関しては２５０ＭＨｚで、そして１３Ｃ  ＮＭＲに関しては６３ＭＨｚでブルカー  アバンス（Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ）２５０上に記録され、溶媒残留ピークに対してｐｐｍで言及される（参考文献Ｇｏｔｔｌｉｅｂ  Ｈ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ１９９７（２）７５１２−７５１５を参照）。
［実施例１］
Ｐ２ヒドロキシプロリン誘導体の合成：
【００５０】
【化３】
2013542955.tif 000007
［実施例２］
１０の合成：
【００５１】
【化４】
2013542955.tif 000008
ＪおよびＪ１が存在する化合物１０の類似体は、例えば、開始材料：
【００５２】
【化５】
2013542955.tif 000009
の置換された形態を使用することにより調製され、式中、ＪおよびＪ１は、本願に定義される通りであるか、またはこれらの部分がスキームＩに記載されるカップリング化学法に干渉する場合、カップリング化学法が完了した後、または全体的な合成における後の工程で、所望のＪおよびＪ１部分に変換されることができる保護基である。
【００５３】
この式の化合物は公知であり、通常の日常的な実験を使用して調製されることができる。置換基のアリール環上への組み込みは、コア構造が調製される前、またはその後（即ち、置換基が主要なカップリング工程中に存在することができるか、または非置換された化合物（即ち、Ｊおよび／またはＪ１部分を含まない）が調製された後に添加されることができる）のいずれかに容易に実現されることができることを当業者は容易に理解するであろう。そのような置換基は、それ自体におよびそれ自体の有用な特性を提供することができるか、またはさらなる合成精錬の手段として機能することができる。１つの条件は、そのような置換が合成条件に耐えられるか、または合成がさもなければ完了した後に添加されるべきかのいずれかである。
【００５４】
例えば、アリール環は、特定のハロゲンにより変化する、様々な公知の手順を使用してハロゲン化されることができる。好適な試薬の例としては、濃縮されたＨＢｒ、塩化チオニル、ｐｙｒ−ＩＣｌ、フッ素、およびアンバーリスト−Ａ中の臭素／水を含む。アリール環のジアゾ化位置に置換基を有するいくつかの他の類似体は、ジアゾニウム塩中間体を介して、対応するアニリン化合物から合成されることができる。ジアゾニウム塩中間体は、公知の化学法を使用して、例えば、鉱酸の存在下でアニリン等の芳香族アミンを亜硝酸ナトリウムで処理することにより調製されることができる。
【００５５】
ジアゾニウム塩は、アニリンから形成されることができ、これは、同時にニトロベンゼンから調製されることができる（および類似性アミン置換されたヘテロアリール環は、ニトロ置換されたヘテロアリール環から調製されることができる）。ニトロ誘導体は、典型的には酸の存在下で亜硝酸塩との反応により、アミン化合物に還元されることができる。他の置換された類似体は、当業者に公知の一般技法を使用して、ジアゾニウム塩中間体から生成されることができ、ヒドロキシ、アルコキシ、フルオロ、クロロ、ヨード、シアノ、およびメルカプトが含まれるがこれらに限定されない。同様に、アルコキシ類似体は、ジアゾニウム塩をアルコールと反応させることにより作製されることができる。ジアゾニウム塩は、当業者に公知であるように、シアノまたはハロ化合物を合成するためにも使用されることができる。メルカプト置換体は、Ｈｏｆｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：９５３（１９９３）に記載される技法を使用して得られることができる。そのように生成されたメルカプタンは、同時に、水素化ナトリウムおよび適切な臭化アルキルとの反応により、アルキルチオ置換基に変換されることができる。後続の酸化は、次いでスルホンを提供するであろう。上述の化合物のアシルアミド類似体は、有機合成の当業者に公知の技法を使用して、対応するアミノ化合物を適切な酸無水物または酸塩化物と反応させることにより調製されることができる。
【００５６】
ヒドロキシ置換された類似体は、適切な酸、酸塩化物、または酸無水物との反応によって対応するアルカノイルオキシ置換された化合物を調製するために使用されることができる。同様に、ヒドロキシ化合物は、電子不足芳香族環での求核芳香族置換を介したアリールオキシおよびヘテロアリールオキシの両方の前駆体である。そのような化学法は、有機合成の当業者に周知である。エーテル誘導体は、アルキルハロゲン化物および好適な塩基とのアルキル化、または典型的にトリアキル−もしくはトリアリールホスフィンおよびアゾジカルボン酸ジエチルが使用される光延化学法を介して、ヒドロキシ化合物からも調製されることができる。光延条件に関しては、Ｈｕｇｈｅｓ，Ｏｒｇ．Ｒｅａｃｔ．（Ｎ．Ｙ．）４２：３３５（１９９２）およびＨｕｇｈｅｓ，Ｏｒｇ．Ｐｒｅｐ．Ｐｒｏｃｅｄ．Ｉｎｔ．２８：１２７（１９９６）を参照。
【００５７】
シアノ置換された類似体は、加水分解されて、対応するカルボキサミド置換された化合物を得ることができる。さらなる加水分解により、対応するカルボン酸置換された類似体が形成される。シアノ置換された類似体を水素化リチウムアルミニウムと還元させて、対応するアミノメチル類似物を生成する。アシル置換された類似体は、有機合成の当業者に公知の技法を使用して、適切なアルキルリチウムとの反応によって対応するカルボン酸置換された類似体から調製されることができる。
【００５８】
カルボン酸置換された類似体は、適切なアルコールおよび酸触媒との反応によって対応するエステルに変換されることができる。エステル基を伴う化合物は、水素化ホウ素ナトリウムまたは水素化リチウムアルミニウムで還元されて、対応するヒドロキシメチル置換された類似体を生成することができる。これらの類似体は同時に、従来の技法を使用して、水素化ナトリウムおよび適切なアルキルハロゲン化物との反応によって、エーテル部分を有する化合物に変換されることができる。代替的に、ヒドロキシメチル置換された類似体は、塩化トシルと反応させて、対応するトシルオキシメチル類似体を提供することができ、対応するトシルオキシメチル類似体は塩化チオニルおよび適切なアルキルアミンで遂次処理することにより対応するアルキルアミノアシル類似体に変換されることができる。これらのアミドのいくつかは、容易に求核アシル置換を受け、ケトンを生成することが知られている。 
【００５９】
ヒドロキシ置換された類似体は、Ｎ−アルキル−またはＮ−アリールイソシアネートとの反応により、Ｎ−アルキルまたはＮ−アリールカルバモイルオキシ置換された化合物を調製するために使用されることができる。アミノ置換された類似体は、有機合成の当業者に公知の技法を使用して、それぞれ、アルキルクロロホルメートエステルおよびＮ−アルキル−またはＮ−アリールイソシアネートとの反応により、アルコキシカルボキサミド置換された化合物および尿素誘導体を調製するために使用されることができる。
【００６０】
同様に、ベンジン環は、上述の反応を含む公知の化学法を使用して置換されることができる。例えば、ニトロベンゼン上の，ニトロ基は、亜硝酸ナトリウムと反応させて、ジアゾニウム塩を形成することができ、ジアゾニウム塩は上述のように操作されて、ベンゼン環上に様々な置換基を形成することができる。
【００６１】
したがって、上述の置換基は、開始ベンゼン環に加えられることができ、本願に記載される最終化合物に組み込まれることができる。
［実施例３］
ＨｅｐＧ２細胞におけるミトコンドリア毒性アッセイ：
ｉ）細胞成長および乳酸生成に対する化合物の作用：０μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、および１００μＭの薬物の存在下で細胞をインキュベートすることにより、ＨｅｐＧ２細胞の成長に対する作用を判定した。１０％のウシ胎児血清、１％のピルビン酸ナトリウム、および１％のペニシリン／ストレプトマイシンで補てんされた非必須アミノ酸を含む最小必須培地で、細胞（ウェル当り５×１０４）を１２ウェル細胞培養クラスター中で平板培養し、３７℃で４日間インキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、血球計数器を使用して、細胞数を判定した。Ｐａｎ−Ｚｈｏｕ  Ｘ−Ｒ，Ｃｕｉ  Ｌ，Ｚｈｏｕ  Ｘ−Ｊ，Ｓｏｍｍａｄｏｓｓｉ  Ｊ−Ｐ，Ｄａｒｌｅｙ−Ｕｓｍｅｒ  ＶＭ．“Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｓ  ｏｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ＨｅｐＧ２  ｃｅｌｌｓ”Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２０００；４４：４９６−５０３にも教示されている。乳酸生成に対する化合物の作用を測定するために、保存培養からのＨｅｐＧ２細胞を希釈し、ウェル当り２．５×１０４細胞で、１２ウェル培養プレートで平板培養した。様々な濃度（０μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、および１００μＭ）の試験化合物を加え、加湿した５％ＣＯ２雰囲気で４日間、培養物を３７℃でインキュベートした。４日目にそれぞれのウェルの細胞数を判定し、培養培地を回収した。培養培地を濾過し、比色分析乳酸アッセイ（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））を使用して、培地中の乳酸含量を判定した。乳酸の生成物は、ミトコンドリア機能の障害に関するマーカーと考えられることができるため、試験化合物の存在下の細胞成長で検出された乳酸生成のレベル上昇は、薬物誘発された細胞毒性作用を示す。
【００６２】
ｉｉ）ミトコンドリアＤＮＡ合成に対する化合物の作用：ミトコンドリアＤＮＡ含量を正確に定量化するためのリアルタイムＰＣＲアッセイが開発された（Ｓｔｕｙｖｅｒ  ＬＪ，Ｌｏｓｔｉａ  Ｓ，Ａｄａｍｓ  Ｍ，Ｍａｔｈｅｗ  ＪＳ，Ｐａｉ  ＢＳ，Ｇｒｉｅｒ  Ｊ，Ｔｈａｒｎｉｓｈ  ＰＭ，Ｃｈｏｉ  Ｙ，Ｃｈｏｎｇ  Ｙ，Ｃｈｏｏ  Ｈ，Ｃｈｕ  ＣＫ，Ｏｔｔｏ  ＭＪ，Ｓｃｈｉｎａｚｉ  ＲＦ．Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ２’，３’−ｄｉｄｅｏｘｙ−２’，３’−ｄｉｄｅｈｙｄｒｏｃｙｔｉｄｉｎｅ  ａｎａｌｏｇｓ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００２；４６：３８５４−６０を参照）。このアッセイは、ミトコンドリアＤＮＡ含量に対する試験化合物の作用を判定する本願に記載される全研究において使用された。このアッセイにおいて、低継代数のＨｅｐＧ２細胞を、コラーゲンコーティングされた９６ウェルプレートに５，０００細胞／ウェルで播種した。化合物を培地に加えて、０μＭ、０．１μＭ、１０μＭ、および１００μＭの最終濃度を得た。培養７日目に、商業的に入手可能なカラム（ＲＮｅａｓｙ９６キット；キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ））を使用して、細胞核酸を調製した。これらのキットはＲＮＡおよびＤＮＡを共精製し、よって、全核酸がカラムから溶出された。標的および参照増幅の両方に好適なプライマーおよびプローブを用いた多重Ｑ−ＰＣＲプロトコルを使用して、ミトコンドリアシトクロームｃ  オキシダーゼサブユニットＩＩ（ＣＯＸＩＩ）遺伝子およびβ−アクチンまたはｒＲＮＡ遺伝子を５μｌの溶出した核酸から増幅した。ＣＯＸＩＩにおいて、以下のセンス、プローブ、およびアンチセンスプライマーがそれぞれ使用された：５’−ＴＧＣＣＣＧＣＣＡＴＣＡＴＣＣＴＡ−３’、５’−テトラクロロ−６−カルボキシフルオレスセイン−ＴＣＣＴＣＡＴＣＧＣＣＣＴＣＣＣＡＴＣＣＣ−ＴＡＭＲＡ−３’、および５’−ＣＧＴＣＴＧＴＴＡＴＧＴＡＡＡＧＧＡＴＧＣＧＴ−３’。β−アクチン遺伝子（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受入番号Ｅ０１０９４）のエクソン３において、センス、プローブ、およびアンチセンスプライマーは、それぞれ、５’−ＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＴＴＣＡ−３’、５’−６−ＦＡＭＣＡＣＣＡＣＧＧＣＣＧＡＧＣＧＧＧＡＴＡＭＲＡ−３’、および５’−ＴＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴ−３’である。ｒＲＮＡ遺伝子のプライマーおよびプローブは、アプライド  バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から商業的に入手可能である。等しい増幅効率が全ての遺伝子に関して得られたため、ミトコンドリアＤＮＡ合成の阻害の可能性を調査するために、比較ＣＴ法が使用された。比較ＣＴ法は、標的（ＣＯＸＩＩ遺伝子）の量が内因性参照（β−アクチンまたはｒＲＮＡ遺伝子）の量に基準化され、標準物質（７日目に薬物を含まない対照）に対してである、算術的な式を使用する。このアプローチに関する算術的な式は、２−ΔΔＣＴにより与えられ、式中、ΔΔＣＴは、（平均標的試験サンプルに関するＣＴ−標的対照に関するＣＴ）−（平均参照試験に関するＣＴ−参���対照に関するＣＴ）である（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＭＲ，Ｋ  Ｗａｎｇ，ＪＢ  Ｓｍｉｔｈ，ＭＪ  Ｈｅｓｌｉｎ，ＲＢ  Ｄｉａｓｉｏ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０００；２７８：１７５−１８４を参照）。薬物の存在下での細胞成長のミトコンドリアＤＮＡ含量の減少は、ミトコンドリア毒性を示すであろう。
【００６３】
ｉｉ）電子顕微鏡形態的評価：ＮＲＴＩ誘発された毒性は、透過型電子顕微鏡検査を使用した超微細構造分析により観察されることができるミトコンドリアにおける形態的変化（例えば、クリステ、マトリックス溶解、および膨潤の消失、ならびに脂質滴形成）を生じることが示されてきた（Ｃｕｉ  Ｌ，Ｓｃｈｉｎａｚｉ  ＲＦ，Ｇｏｓｓｅｌｉｎ  Ｇ，Ｉｍｂａｃｈ  ＪＬ．Ｃｈｕ  ＣＫ，Ｒａｎｄｏ  ＲＦ，Ｒｅｖａｎｋａｒ  ＧＲ，Ｓｏｍｍａｄｏｓｓｉ  ＪＰ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃ  ａｎｄ  ｒａｃｅｍｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｓ  ｏｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＨｅｐＧ２  ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９６，５２，１５７７−１５８４、Ｌｅｗｉｓ  Ｗ，Ｌｅｖｉｎｅ  ＥＳ，Ｇｒｉｎｉｕｖｉｅｎｅ  Ｂ，Ｔａｎｋｅｒｓｌｅｙ  ＫＯ，Ｃｏｌａｃｉｎｏ  ＪＭ，Ｓｏｍｍａｄｏｓｓｉ  ＪＰ，Ｗａｔａｎａｂｅ  ＫＡ，Ｐｅｒｒｉｎｏ  ＦＷ．Ｆｉａｌｕｒｉｄｉｎｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｇａｍｍａ  ａｔ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ａｎａｌｏｇ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ｄｅｃｒｅａｓｅ  ｍｔＤＮＡ  ａｂｕｎｄａｎｃｅ，ａｎｄ  ｃａｕｓｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｅｐａｔｏｂｌａｓｔｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９６；９３：  ３５９２−７、Ｐａｎ−Ｚｈｏｕ  ＸＲ，Ｌ  Ｃｕｉ，ＸＪ  Ｚｈｏｕ，ＪＰ  Ｓｏｍｍａｄｏｓｓｉ，ＶＭ  Ｄａｒｌｅｙ−Ｕｓｍａｒ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｓ  ｏｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ＨｅｐＧ２  ｃｅｌｌｓ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２０００，４４，４９６−５０３を参照）。例えば、１０μＭのフィアルリジン（ＦＩＡＵ；１，２’−デオキシ−２’−フルオロ−１−Ｄ−アラビノフラノシル−５−ヨード−ウラシル）と共にインキュベートされたＨｅｐＧ２細胞の電子顕微鏡図は、ミトコンドリア機能不全と一致する形態的変化を伴う拡大したミトコンドリアの存在を示した。化合物がミトコンドリアにおける形態的な変化を促進したかを判定するために、０μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、および１００μＭの試験化合物の存在下で、ＨｅｐＧ２細胞（２．５×１０４細胞／ｍＬ）を組織培養皿（３５×１０ｍｍ）中に播種した。８日目に、細胞を固定し、脱水し、前述のＥｐｏｎａｓに埋め込んだ。薄片を調製し、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、次いで透過型電子顕微鏡検査を使用して検査した。
［実施例４］
骨髄細胞毒性に関するアッセイ
原発性ヒト骨髄単核細胞をカムブレックス  バイオサイエンス（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（ウォーカーズビレ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ），ＭＤ）から商業的に得た。ＣＦＵ−ＧＭアッセイは、５０単位／ｍＬのヒト組み換え顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子の存在下で二層軟寒天を使用して行われ、一方、ＢＦＵ−Ｅアッセイは、１単位／ｍＬのエリスロポエチンを含有するメチルセルロースマトリックスを使用した（Ｓｏｍｍａｄｏｓｓｉ  ＪＰ，Ｃａｒｌｉｓｌｅ  Ｒ．Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ３’−ａｚｉｄｏ−３’−ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ａｎｄ  ９−（１，３−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｐｒｏｐｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｇｕａｎｉｎｅ  ｆｏｒ  ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９８７；３１：  ４５２−４５４、Ｓｏｍｍａｄｏｓｓｉ，ＪＰ，Ｓｃｈｉｎａｚｉ，ＲＦ，Ｃｈｕ，ＣＫ，ａｎｄ  Ｘｉｅ，ＭＹ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ（−）ａｎｄ（＋）ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒ  ｏｆ  ２’，３’−ｄｉｄｅｏｘｙ−３’−ｔｈｉａｃｙｔｉｄｉｎｅ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９２；４４：１９２１−１９２５を参照）。それぞれの実験は、３人の異なるドナーからの細胞において、２つ組で実施された。ＡＺＴは、陽性対照として使用された。化合物の存在下で、細胞を５％のＣＯ２で１４〜１８日間、３７℃でインキュベートし、ＩＣ５０を判定するために倒立顕微鏡を使用して、５０の細胞を超えるコロニーが計数される。薬物濃度対ＢＦＵ−Ｅ生存率の対数の最小二乗線形回帰分析により、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を得た。統計分析は、独立非対合サンプルに関して、スチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）のｔ検定により実施された。
［実施例５］
細胞毒性アッセイ
前述のように、化合物の毒性は、ベロ（Ｖｅｒｏ）、ヒトＰＢＭ、ＣＥＭ（ヒトリンパ芽球様）、ＭＴ−２、およびＨｅｐＧ２細胞において評価された（Ｓｃｈｉｎａｚｉ  Ｒ．Ｆ．，Ｓｏｍｍａｄｏｓｓｉ  Ｊ．−Ｐ．，Ｓａａｌｍａｎｎ  Ｖ．，Ｃａｎｎｏｎ  Ｄ．Ｌ．，Ｘｉｅ  Ｍ．−Ｙ．，Ｈａｒｔ  Ｇ．Ｃ．，Ｓｍｉｔｈ  Ｇ．Ａ．＆Ｈａｈｎ  Ｅ．Ｆ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９９０，３４，１０６１−６７を参照）。シクロヘキシミドは、陽性の細胞毒性対照として含まれ、溶媒に曝露された未処理の細胞は、陰性対照として含まれた。前述の半有効法を使用して濃度応答曲線から細胞毒性ＩＣ５０を得た（Ｃｈｏｕ  Ｔ．−Ｃ．＆Ｔａｌａｌａｙ  Ｐ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇｕｌ．１９８４，２２，２７−５５、Ｂｅｌｅｎ’ｋｉｉ  Ｍ．Ｓ．＆Ｓｃｈｉｎａｚｉ  Ｒ．Ｆ．Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．１９９４，２５，１−１１を参照）。
１０のデータは、
ＰＢＭ＞１００μＭ（１００μＭで１７％阻害）
ＣＥＭ＞１００μＭ（１００μＭで１１％阻害）
ＶＥＲＯ＞１００（１００μＭで−０．８％阻害）である。
［実施例６］
ＨＣＶレプリコンアッセイ１
ＨＣＶレプリコンＲＮＡを含有するＨｕｈ  ７  クローン（Ｃｌｏｎｅ）  Ｂ細胞を５０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、播種直後、３つ組で、１０μＭで化合物を試験した。５日間のインキュベーション（３７℃、５％のＣＯ２）後、ジェントラ（Ｇｅｎｔｒａ）のベルサジーン（ｖｅｒｓａＧｅｎｅ）  ＲＮＡ精製キットを使用して、全細胞ＲＮＡを単離した。レプリコンＲＮＡおよび内部対照（タックマン（ＴａｑＭａｎ）  ｒＲＮＡ対照試薬、アプライド  バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を単一工程多重リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイで増幅した。試験化合物の閾値ＲＴ−ＰＣＲサイクルを、薬物を含まない対照（ΔＣｔ  ＨＣＶ）の閾値ＲＴ−ＰＣＲから減算することにより、化合物の抗ウイルスの有効性を計算した。３．３のΔＣｔは、レプリコンＲＮＡレベルにおいて、１ｌｏｇ減少に等しい（９０％少ない開始材料に等しい）。化合物の細胞毒性も、ΔＣｔ  ｒＲＮＡ値を使用して計算された。（２’−Ｍｅ−Ｃ）は対照として使用された。ＥＣ９０およびＩＣ５０値２を判定するために、ΔＣｔ：値を最初に開始材料３の分数に変換し、その後％阻害を計算するために使用した。
参照文献：
１．Ｓｔｕｙｖｅｒ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ｔｈａｔ  ｂｌｏｃｋｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｒ  ｂｏｖｉｎｅ  ｖｉｒａｌ  ｄｉａｒｒｈｅａ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００３，４７，２４４−２５４。
２．Ｒｅｅｄ  ＩＪ＆Ｍｕｅｎｃｈ  Ｈ，Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｒ  ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｆｉｆｔｙ  ｐｅｒｃｅｎｔ  ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｇ．  ２７：４９７，１９３８。
３．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ
結果を下の表１に示す。
【００６４】
【表１】
2013542955.tif 000010
［実施例７］
カニクイザルにおける生物学的利用能アッセイ
以下の手順は、化合物が生物利用可能であるか否かを判定するために使用されることができる。研究開始前の１週間以内に、カニクイザルは、血液採取を容易にするために慢性静脈カテーテルおよび皮下静脈アクセスポート（ＶＡＰ）を外科的に移植され、血液学および血清化学評価ならびに体重記録を含む身体検査を受けることができる。それぞれのサル（合計６匹）は、静脈内ボーラス（３匹のサル、ＩＶ）または経口胃管栄養法（３匹のサル、ＰＯ）のいずれかを介して、２〜２０ｍｇ／ｋｇの用量レベルで化合物を受けた。投与される製剤の量を重力測定法で判定するために、それぞれの投与シリンジを投与前に量る。指定された間隔（投与約１８〜０時間前、投与０〜４、４〜８、および８〜１２時間後）で、尿サンプルを皿受けにより採取し、処理する。慢性静脈カテーテルおよびＶＡＰを介して、または慢性静脈カテーテル手順が可能ではない場合、末梢血管から血液サンプルも回収する（投与前、投与０．２５、０．５、１、２、３、６、８、１２、および２４時間後）。最大濃度（Ｃｍａｘ）、最大濃度が達成されるときの時間（Ｔｍａｘ）、曲線下面積（ＡＵＣ）、用量濃度の半減期（ＴＶ，）、クリアランス（ＣＬ）、定常状態容量および分布（Ｖｓｓ）、ならびに生物学的利用能（Ｆ）に関して、血液および尿サンプルを分析する。
［実施例８］
選択されたヒトプロテアーゼに対するＨＣＶプロテアーゼ阻害剤の作用
ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤は、宿主プロテアーゼに関連する興味深い毒性に加えて、強い抗ウイルス能を示した。類似する毒性を解決するために、重要なヒトプロテアーゼのパネルの阻害に関して、新しいプロテアーゼ阻害剤が評価された。試験された酵素は、エラスターゼ（好中球）、プラスミン、トロンビン、およびカテプシンＳである。
【００６５】
ＥＬＡ２（エラスターゼ２）としても知られる好中球エラスターゼ（または白血球エラスターゼ）は、キモトリプシンと同じファミリーのセリンプロテアーゼであり、広範な基質特異性を有する。炎症中に好中球により分泌され、その主要な役割の１つは、宿主組織中の細菌を破壊することである（Ｂｅｌａａｏｕａｊ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２８９（５４８２）：１１８５−８）。
【００６６】
プラスミンは、プラスミノーゲン活性化因子による血漿中のプラスミノーゲンの変換に由来するセリンプロテアーゼである（Ｃｏｌｌｅｎ，Ｄ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，  ９３，８５７（１９９６）。この酵素（ＥＣ３．４．２１．７）は、多くの血漿タンパク質、最も顕著にはフィブリン塊を分解する。プラスミンは、炎症、新生組織形成、転移、創傷治癒、血管新生、胚形成、および排卵等のいくつかの病理学的および生理学的プロセスにも関与する（Ｖａｓｓａｌｌｉ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８８，１０６７（１９９１）。
【００６７】
トロンビンは、凝固カスケードにおいて多くの作用を有する、血流中の凝固タンパク質であり、凝塊カスケードの最後の酵素である。可溶性フィブリノーゲンを不溶性のフィブリンの鎖に変換するのはセリンプロテアーゼであり、また多くの他の凝固関連反応を触媒する。
【００６８】
ペプチダーゼＣ１ファミリーのメンバーであるカテプシンＳは、ＭＨＣクラスＩＩ分子上に存在するための抗原タンパク質のペプチドへの分解に関与し得るリソソームシステインプロテアーゼであり、したがって、免疫応答への鍵である。コードされるタンパク質は、広範なｐＨ範囲にわたってエラスターゼとして機能することができる。
材料：
■ビクター（Ｖｉｃｔｏｒ）３プレートリーダー（パーキン  エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ））
■透明の９６ウェルプレート（フェニックス  リサーチ（Ｐｈｅｎｉｘ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ））
■黒色の９６ウェルプレート（パーキン  エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ））
■ＲＮａｓｅおよびＤｎａｓｅ純水
方法：
エラスターゼ（ヒト好中球（カタログ＃１６−１４−０５１２００  アセンズ  リサーチアンドテクノロジー（Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），アセンズ（Ａｔｈｅｎｓ）  ＧＡ））：反応は、透明な９６ウェルプレートで、ウェル当り１００μＬのサンプル容量で行われた。２００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および５０％のグリセロールを含有する２Ｘアッセイ緩衝液を作製した。それぞれのサンプルにおいて、５０μＬの２Ｘアッセイ緩衝液を各ウェルに加えた。１ｍＭの最終濃度に基質（ＭｅＯＳｕｃ−ＡＡＰＶ−ｐＮＡ，発色基質、カタログ＃Ｐ−２１３、エンド  ライフ  サイエンシズ（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），プリマウス  ミーティング（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ），ＰＡ；ＤＭＳＯ中の５０ｍＭのストック）を加えた。水に４×濃度で薬物希釈液を加えた（２５μＬ）。最後に、混合液は、それぞれのサンプルにおいて１μＬのエラスターゼおよび２２μＬの水から作製され、２３μＬが各ウェルに加えられた。室温で３０分間、サンプルをインキュベートした。４０５ｎＭでの吸光度をビクター（Ｖｉｃｔｏｒ）３プレートリーダー上で読み取った。全てのサンプルは重複して試験された。結果は、阻害剤を含まない対照によって与えられる、ブランク調整された（エラスターゼなし）最大吸光度のパーセンテージとして示される。
【００６９】
プラスミンおよびトロンビン（Ｓｅｎｓｏｌｙｔｅ  ＲＨ１１０プラスミン活性アッセイキットおよびＳｅｎｓｏｌｙｔｅトロンビン活性アッセイキット（アナスペック（Ａｎａｓｐｅｃ）））：反応は、黒色の９６ウェルプレートで、ウェル当り１００μＬのサンプル容量で行われた。２Ｘアッセイ緩衝液が脱イオン水で１：１に希釈されるキット添付文書のプロトコルＡに従った。それぞれのアッセイには、陽性対照（希釈した酵素および試験化合物なし）、阻害剤対照（希釈した酵素およびプラスミン阻害剤、キットの構成要素Ｅまたはトロンビン阻害剤、Ｎ−α−ＮＡＰＡＰ合成阻害剤を含有する）、および基質対照（アッセイ緩衝液および基質）が含まれた。ビヒクルおよび自己蛍光対照も行われた。アッセイ緩衝液に１０×濃度で薬物希釈液を加えた（１０μＬ）。０．２５μｇ／ｍＬ（プラスミン）の濃度および１μｇ／ｍＬ（トロンビン）の濃度で、４０μＬ／ウェルで、基質対照を除く全てのウェルに酵素を加えた。最後に、基質を含有する５０μＬのアッセイ緩衝液を各ウェルに加えた。５０ｎＭ（プラスミン）または２０ｎＭ（トロンビン）の最終濃度に基質を加えた。サンプルを室温で３０分間インキュベートした。Ｅｘ／Ｅｍ＝４９０ｎｍ／５２０ｎｍで蛍光強度をビクター（Ｖｉｃｔｏｒ）３プレートリーダー上で読み取った。全てのサンプルは重複して試験された。結果は、陽性対照によって与えられる、基質対照調整された最大吸光度のパーセンテージとして示される。
【００７０】
カテプシンＳ（ＳｅｎｓｏｌｙｔｅカテプシンＳ活性アッセイキット（アナスペック（Ａｎａｓｐｅｃ）））：反応は、黒色の９６ウェルプレートで、ウェル当り１００μＬのサンプル容量で行われた。ＤＴＴをアッセイ緩衝液に加えて５μＭ濃度を得るキット添付文書のプロトコルＡに従った。それぞれのアッセイには、陽性対照（希釈した酵素および試験化合物なし）、阻害剤対照（希釈した酵素およびプラスミン阻害剤、構成成分Ｅまたはトロンビン阻害剤、Ｎ−ａ−ＮＡＰＡＰ合成阻害剤を含有する）、および基質対照（アッセイ緩衝液および基質）が含まれた。ビヒクルおよび自己蛍光対照も行われた。アッセイ緩衝液に１０×濃度で薬物希釈液を加えた（１０μＬ）。２．５μｇ／ｍＬの濃度で、４０μＬ／ウェルで、基質対照を除く全てのウェルにカテプシンＳを加えた。最後に、基質を含有する５０μＬのアッセイ緩衝液を各ウェルに加えた。基質を１６ｎＭの最終濃度に加えた。サンプルを室温で３０分間インキュベートした。Ｅｘ／Ｅｍ＝４９０ｎｍ／５２０ｎｍで蛍光強度をビクター（Ｖｉｃｔｏｒ）３プレートリーダー上で読み取った。全てのサンプルは重複して試験された。結果は、陽性対照によって与えられる、基質対照調整された最大吸光度のパーセンテージとして示される。
【００７１】
結果を下の表２に示す。
【００７２】
【表２】
2013542955.tif 000011
［実施例９］
化合物対Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３／４Ａ  ＷＴおよび突然変異プロテアーゼの活性
蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）ペプチド（アナスペック（ＡｎａＳｐｅｃ））を使用して、ＳｅｎｓｏＬｙｔｅ（登録商標）４９０ＨＣＶプロテアーゼアッセイキットを用いて、ＨＣＶ  ＮＳ３／４Ａプロテアーゼアッセイを行った。
【００７３】
結果を下の表３および４に示す。
【００７４】
【表３】
2013542955.tif 000012
【００７５】
【表４】
2013542955.tif 000013
前述の明細書は、図示の目的のため提供される実施例と共に本発明の原理を教示するが、本発明の実践は、以下の特許請求の範囲およびその等価物の範囲内に入る通常の変形、適合、および／または修正の全てを包含することを理解されるであろう。
【国際調査報告】
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2013542955.tif 000017