(57)【要約】  本発明は、遺伝子ＣＣＲ６及び／若しくはＢＬＲ１又はそのオーソロガス遺伝子若しくはパラロガス遺伝子内の少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析することを含む、哺乳動物の或る特定の免疫細胞を同定する方法、特にｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法、並びに或る特定の免疫細胞の検出並びに品質保証及び品質管理のためのタンパク質ＣＣＲ６及び／又はＢＬＲ１の遺伝子のＤＮＡメチル化分析の使用に関する。特に、本発明は、Ｔ細胞における遺伝子ＣＣＲ６内の少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析することに関する。さらに、本発明は、上記の方法を行うためのキット及びそれぞれの使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の免疫細胞、又はＴ細胞及び／若しくはＢ細胞、又は活性化Ｔ細胞を同定する方法であって、遺伝子ｃｃｒ６及び／若しくはｂｌｒ１又はそのオーソロガス遺伝子若しくはパラロガス遺伝子内の少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析することを含む、哺乳動物の免疫細胞、又はＴ細胞及び／若しくはＢ細胞、又は活性化Ｔ細胞を同定する方法。
【請求項２】
非活性化Ｔ細胞と比較した場合の脱メチル化が、安定に活性化されたＴ細胞、ＮＫ細胞、記憶Ｔ細胞、又はＣＤ４＋記憶Ｔ細胞若しくはＣＤ８＋記憶Ｔ細胞、記憶細胞傷害性Ｔ細胞、ナイーブＢ細胞及び記憶Ｂ細胞から選択される細胞の指標となる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
遺伝子ｃｃｒ６における脱メチル化が、ＣＣＲ６＋ＣＤ４＋Ｔ細胞若しくはＣＣＲ６＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、又は安定に活性化されたＣＣＲ６＋ＣＤ４＋Ｔ細胞若しくはＣＣＲ６＋ＣＤ８＋Ｔ細胞から選択される細胞の指標となり、前記方法が任意でＣＤ３＋細胞を単離する工程を更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子ＣＣＲ６及び／若しくはＢＬＲ１又はそのオーソロガス遺伝子若しくはパラロガス遺伝子内の少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態が、記憶Ｔ細胞、ナイーブＢ細胞及び／又は記憶Ｂ細胞におけるそれぞれのＣｐＧ位置と比較した場合の顆粒球、単球、ＮＫ細胞、ナイーブＴ細胞、ナイーブ細胞傷害性Ｔ細胞及び記憶細胞傷害性Ｔ細胞における遺伝子ＢＬＲ１又はそのオーソロガス遺伝子若しくはパラロガス遺伝子のメチル化の増大、並びにＮＫ細胞、記憶Ｔ細胞、記憶細胞傷害性Ｔ細胞、ナイーブＢ細胞及び／又は記憶Ｂ細胞におけるそれぞれのＣｐＧ位置と比較した場合の顆粒球、単球、ナイーブＴ細胞及びナイーブ細胞傷害性Ｔ細胞における遺伝子ＣＣＲ６又はそのオーソロガス遺伝子若しくはパラロガス遺伝子のメチル化の増大から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記メチル化状態の分析が、遺伝子ＣＣＲ６及び／若しくはＢＬＲ１又はそのオーソロガス遺伝子若しくはパラロガス遺伝子の転写開始領域、プロモーター領域、イントロン及び／若しくはエクソン／イントロン境界より上流の５’領域内、又は配列番号１３による遺伝子ＣＣＲ６のプロモーター領域又はそのオーソロガス領域若しくはパラロガス領域と重複する領域内の少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記メチル化状態の分析が、メチル化特異的酵素消化、バイサルファイトシークエンシング、ＭＳＰ、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ、又は増幅ＤＮＡの検出に基づく他の方法から選択される方法を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
サンプルのプールを、少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態について分析する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子ＣＣＲ６のメチル化状態の分析が、配列番号１及び配列番号２、配列番号３及び配列番号４、配列番号５及び配列番号６、配列番号７及び配列番号８、並びに配列番号１１及び配列番号１２、並びにそのオーソロガスプライマー対若しくはパラロガスプライマー対から選択されるプライマー対のうち少なくとも１つを用いた増幅を含むか、又は前記メチル化状態の分析が、配列番号５及び配列番号６、配列番号７及び配列番号８、配列番号１１及び配列番号１２、並びにそのオーソロガスプライマー対若しくはパラロガスプライマー対から選択されるプライマー対のうち少なくとも１つを用いた増幅を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記メチル化状態の分析が、配列番号１及び配列番号２のプライマー対によって増幅されるアンプリコンの７１位、９８位、１０６位、１３５位、１７８位、１９３位、２７７位、３１６位及び３３９位、配列番号３及び配列番号４のプライマー対によって増幅されるアンプリコンの２３位、３６位、３８位、５３位及び１１４位、配列番号５及び配列番号６のプライマー対によって増幅されるアンプリコンの２３位、１０９位、１６１位、１９３位、２１７位及び２４５位、配列番号７及び配列番号８のプライマー対によって増幅されるアンプリコンの６２位、１０１位、１２４位、２０２位、２４６位及び２５１位、配列番号１１及び配列番号１２のプライマー対によって増幅されるアンプリコンの７１位、９８位、１０６位、１３５位、１７８位、１９３位、２７７位及び３１６位、並びにそのオーソロガスＣｐＧ位置又はパラロガスＣｐＧ位置からなる群から選択される少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子ＢＬＲ１のメチル化状態の分析が、配列番号９及び配列番号１０、並びにそのオーソロガスプライマー対又はパラロガスプライマー対から選択されるプライマー対のうち少なくとも１つを用いた増幅を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記メチル化状態の分析が、配列番号９及び配列番号１０のプライマー対によって増幅されるアンプリコンの２３位、２５位、４６位、５１位、１０９位、１５７位、１７７位、１８３位、１９９位、２２９位、２４４位、２４７位、２８７位及び３６０位、並びにそのオーソロガスＣｐＧ位置又はパラロガスＣｐＧ位置からなる群から選択される少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳動物がマウス、ラット、サル又はヒトである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
哺乳動物の免疫状態を診断する方法であって、
ａ）免疫細胞を含有するサンプルを診断対象の前記哺乳動物から得る工程と、
ｂ）請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法により、前記免疫細胞における遺伝子ＣＣＲ６及び／若しくはＢＬＲ１又はそのオーソロガス遺伝子若しくはパラロガス遺伝子内の少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析する工程と、
ｃ）前記サンプル中に存在する免疫細胞の量を前記メチル化状態に基づいて特定する工程と、
ｄ）特定された前記量に基づいて前記哺乳動物の免疫状態について結論付ける工程と、
を含む、哺乳動物の免疫状態を診断する方法。
【請求項１４】
前記サンプルが血液サンプル、血中リンパ球のサンプル若しくはその画分、又はＣＤ３＋細胞の画分から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳動物が自己免疫疾患、同種移植レシピエントにおける有害作用、腫瘍性疾患、卵巣がん、慢性移植片対宿主病、アレルギー性喘息、多発性硬化症、炎症、炎症関節、関節リウマチ、乾癬性疾患、炎症性腸疾患、脳症、及びＸ連鎖免疫調整異常・多発性内分泌障害腸症候群（ＩＰＥＸ）から選択される疾患を患う患者である、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記免疫細胞がナイーブＴ細胞、記憶Ｔ細胞、及びＣＣＲ６＋ＣＤ４＋Ｔ細胞若しくはＣＣＲ６＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、又は安定に活性化されたＣＣＲ６＋ＣＤ４＋Ｔ細胞若しくはＣＣＲ６＋ＣＤ８＋Ｔ細胞から選択される活性化Ｔ細胞である、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｔ細胞における遺伝子ＣＣＲ６及び／又はＢＬＲ１の発現を調整する化学物質及び／又は生体物質に応じた前記Ｔ細胞の量を測定及び／又はモニタリングすることを更に含む、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
患者への移植に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した又は展開させた免疫細胞の適合性を決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法と、分析されるＣｐＧ位置が少なくとも８０％、又は９０％、又は９５％までメチル化されているか否かを検出することとを含む、患者への移植に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した又は展開させた免疫細胞の適合性を決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項１９】
免疫細胞におけるＣＣＲ６及び／又はＢＬＲ１の発現を調整する化学物質及び／又は生体物質を同定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、前記化学物質及び／又は生体物質の１つ又は複数を免疫細胞と接触させることと、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法を行うことと、前記化学物質及び／又は生体物質が、分析されるＣｐＧ位置のメチル化を調整するか否かを検出することとを含む、免疫細胞におけるＣＣＲ６及び／又はＢＬＲ１の発現を調整する化学物質及び／又は生体物質を同定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項２０】
前記物質が、分析されるＣｐＧ位置の少なくとも８０％、又は９０％、又は９５％までの脱メチル化をもたらす、請求項１９に記載の化学物質及び／又は生体物質を同定する方法。
【請求項２１】
配列番号１〜配列番号１２のいずれか１つによるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号１及び配列番号２、配列番号３及び配列番号４、配列番号５及び配列番号６、並びに配列番号７及び配列番号８、並びに配列番号９及び配列番号１０、並びに配列番号１１及び配列番号１２から選択されるプライマー対によって増幅されるアンプリコン、又は配列番号１３によるアンプリコン、又はオーソロガス若しくはパラロガスなオリゴマー若しくはアンプリコン。
【請求項２２】
活性化Ｔ細胞若しくはＢ細胞、又はナイーブＴ細胞若しくは記憶Ｔ細胞を、遺伝子ＣＣＲ６及び／又はＢＬＲ１内のＣｐＧ位置のメチル化状態の分析に基づいて同定するためのキットであって、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法を行うための材料を含む、活性化Ｔ細胞若しくはＢ細胞、又はナイーブＴ細胞若しくは記憶Ｔ細胞を、遺伝子ＣＣＲ６及び／又はＢＬＲ１内のＣｐＧ位置のメチル化状態の分析に基づいて同定するためのキット。
【請求項２３】
免疫細胞、又は安定した活性化Ｔ細胞若しくはＢ細胞を検出及び／又は同定するための請求項２１に記載のオリゴマー若しくはアンプリコン、又は請求項２２に記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子ＣＣＲ６及び／若しくはＢＬＲ１又はそのオーソロガス遺伝子若しくはパラロガス遺伝子内の少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析することを含む、哺乳動物の或る特定の免疫細胞を同定する方法、特にｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法、並びに或る特定の免疫細胞の検出並びに品質保証及び品質管理のためのタンパク質ＣＣＲ６及び／又はＢＬＲ１の遺伝子のＤＮＡメチル化分析の使用に関する。特に、本発明は、Ｔ細胞における遺伝子ＣＣＲ６内の少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析することに関する。さらに、本発明は、上記の方法を行うためのキット及びそれぞれの使用に関する。
【０００２】
本発明の目的上、本明細書中で引用される全ての参考文献及び配列表は、その全体が参照により援用される。
【背景技術】
【０００３】
初めにバーキットリンパ腫細胞において同定された、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体５（ＣＸＣＲ５）としても知られるバーキットリンパ腫受容体１（ＢＬＲ１）遺伝子は、リンパ球に特異的な発現パターンを有するＧタンパク質共役受容体のスーパーファミリーの最初のメンバーであった。ＢＬＲ１は、ケモカイン（ＩＬ−８、ＭＩＰ−１β）及び神経ペプチドの受容体と重要な関係を示す。成熟Ｂ細胞発生が著しく損なわれたＳＣＩＤマウスは、脾臓においてＢｌｒ１特異的ＲＮＡレベルの強い低下を示す。Ｂ細胞系統の異なる段階を示すマウスリンパ系腫瘍細胞株の分析から、Ｂ細胞リンパ腫におけるＢｌｒ１の発現は上昇するが、プレＢリンパ腫又は形質細胞腫においては上昇しないことが明らかとなる。マウスＢＬＲ１は、成熟Ｂリンパ球の再循環に対する調節的機能を有するサイトカイン／神経ペプチド受容体となる場合もある（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００４】
データベースエントリＡＢＫ４１９５３は、ＧＴＰ結合タンパク質（ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体５）であるヒトバーキットリンパ腫受容体１のアミノ酸配列を開示するものであり、データベースエントリＥＦ０６４７７０は、ＧＴＰ結合タンパク質（ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体５）であるヒトバーキットリンパ腫受容体１（ＢＬＲ１）遺伝子のヌクレオチド配列を開示するものである。
【０００５】
特許文献１及び特許文献２は、ケモカイン受容体であるバーキットリンパ腫受容体１（ＢＬＲ１）と、そのリガンドであるＢリンパ球走化性因子（ＢＬＣ）との相互作用を調整する作用物質を同定するため、及びＢＬＲ１ポリペプチドとＢＬＣポリペプチドとの相互作用を変調するための方法及び組成物を記載している。ＢＬＲ１：ＢＬＣ変調因子を同定する方法が、市販薬のスクリーニングに特に適用されるとして記載されている。
【０００６】
ケモカイン受容体発現の特異的なパターンは、免疫細胞が定常状態及び炎症状態の両方でそれらの標的組織へとホーミングする、全身の白血球の組織的な遊走を確実にする。ケモカイン受容体ＣＣＲ６は、ヒトの血液及び組織中の白血球、中でも樹状細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋エフェクター／記憶Ｔ細胞、ＣＤ２５ｈｉｇｈ調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ナイーブＢ細胞及び記憶Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞及びＮＫ細胞のサブセットで広範に発現される（非特許文献３）。記憶Ｔ細胞では、ＣＣＲ６は自己反応性ＩＬ−１０産生細胞集団（非特許文献４）並びに皮膚ホーミング細胞及び粘膜ホーミング細胞の大部分で発現される。幾つかの研究から、ＣＣＲ６が炎症性ＩＬ−１７産生ＣＤ４＋Ｔ細胞で一貫して発現されることが更に示されており（非特許文献５）、この細胞はマウス及びヒトにおける関節リウマチ、乾癬性疾患、炎症性腸疾患又は脳症等の多様な有害な炎症性疾患に関与する（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）。
【０００７】
特殊化した記憶サブセットへのＴ細胞の分化が、ホーミング受容体レパートリー及びケモカイン受容体レパートリーの獲得及び安定した発現も伴い、これらのサブセットの組織又は炎症に特異的な輸送を可能にすることが広く考えられている（非特許文献１３）。しかしながら、一部の研究では、ホーミング受容体の発現における相当な可塑性も報告されている。このことがＣＣＲ６の発現にも当てはまるか否かは知られていない。ＣＣＲ６発現は、ＴＧＦ−βと組み合わせた炎症誘発性サイトカインのカクテルによってＴＣＲ刺激性ナイーブＴ細胞で新たに誘導されることがある（非特許文献１４）。
【０００８】
安定した表現型及び機能を有する異なる系統へのＴ細胞の分化が、重要なエフェクター分子（非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７）又はＴｒｅｇにおけるＦｏｘｐ３等の系統特異的な転写因子（非特許文献１８、非特許文献１９、非特許文献２０）の後成的調節を伴うことの証拠が近年ますます提供されている。ごく小数の研究が、輸送に関与する分子がＴ細胞（非特許文献２１、非特許文献２２）又はがん細胞（非特許文献２３、非特許文献２４）において後成的調節を受けることの証拠を提供している。
【０００９】
非特許文献２５はＣＣＲ６の同定を記載している。データベースエントリＮＰ＿００４３５８は、ヒトケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体６のアミノ酸配列を開示するものである。
【００１０】
非特許文献２６は、ヒト結腸直腸がんにおけるＣＣＬ２０／ＣＣＲ６発現と結腸直腸肝転移の促進との間の関連性を提示している。これについては、結腸直腸組織に由来する３０個のヒトがんサンプル、結腸直腸肝転移巣に由来する３０個のヒトサンプル、及び隣接非腫瘍性肝組織が、定量リアルタイムＰＣＲ、ウエスタンブロット分析、組織化学、顕微解剖及び酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を用いてスクリーニングされた。全てのケモカイン受容体の過剰発現がＣＲＣにおいて見られ、結腸直腸肝転移巣では、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４及びＣＣＲ６だけが顕著に上方調節されていた。
【００１１】
特許文献３は、細胞ウイルス受容体に類似するＣＣＲ６及び上記受容体を使用する方法を記載している。
【００１２】
ＣＣＲ６及び／又はＢＬＲ１のメチル化と、或る特定のタイプの免疫細胞、特にＴ細胞との間の関係性は記載されていない。
【００１３】
個体のほとんどの細胞はＤＮＡコードの全く同じ相補体を含有するが、高等生物では様々な組織型において異なるパターンの遺伝子発現を行い、維持する必要がある。大抵の遺伝子調節は、現在の細胞の状態及び外部刺激の変化に応じた一時的なものである。一方で、持続的調節は、ＤＮＡの基本的な遺伝コードを変更しない遺伝性の調節パターンであるエピジェネティクスの主要な役割である。ＤＮＡメチル化は後成的調節の典型的な形態である。ＤＮＡメチル化は安定した細胞記憶として働き、様々な細胞型の長期にわたる同一性を維持するうえで重要な役割を果たす。
【００１４】
メチル化の主要な標的は、２ヌクレオチド配列シトシン−グアニン（「ＣｐＧ部位」）である。これに関して、シトシン（Ｃ）は単純な化学修飾を受け、５−メチル−シトシンとなる場合がある。ヒトゲノムにおいては、ＣＧ配列は、「ＣｐＧ島」と呼ばれる或る特定の比較的密なクラスターの場合を除き、予想されるよりもはるかに稀である。ＣｐＧ島はしばしば遺伝子プロモーターを伴い、ヒト遺伝子の半数以上がＣｐＧ島を有すると推定されている（非特許文献２７）。
【００１５】
ＤＮＡの異常メチル化は、しばしば健常細胞からがん性細胞への形質転換に伴って生じる。観察される影響にはゲノム規模の低メチル化、腫瘍抑制遺伝子のメチル化の増大及び多くのがん遺伝子の低メチル化がある（非特許文献２８、非特許文献２９、非特許文献３０によって概説される）。メチル化プロファイルは腫瘍特異的である（すなわち、特定の遺伝子又は更には個々のＣｐＧのメチル化パターンにおける変化は、特定の腫瘍型に特徴的である）ことが認識されており、現在では膀胱がん、乳がん、結腸がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、肺がん及び前立腺がんに対する診断マーカーの大規模なコレクションが存在する（非特許文献３０によって要約される）。
【００１６】
メチル化による後成的制御は、胚発生、Ｘ染色体不活性化、及び父性対立遺伝子又は母性対立遺伝子のいずれかのインプリンティング（単一対立遺伝子サイレンシング）を含む初期発生に必須である（非特許文献３１）。生殖細胞系では活性であるが、体細胞ではメチル化によってサイレンシングされる或る種の遺伝子も存在する（非特許文献３２、非特許文献３３）。
【００１７】
組織特異的なメチル化は成体の細胞型／段階の調節においても役割を果たし、メチル化と遺伝子発現との間の因果関係が確立されている場合もある。以下は、メチル化の変化が組織特異的な遺伝子発現の制御に強く関与する遺伝子のリストの一部である：乳酸脱水素酵素Ｃ（精巣）、オキシトシン受容体（血液及び肝臓）、チロシンアミノ転移酵素（肝臓）、ＧＦＡＰ（星状細胞）及びロイコシアリン（白血球）。他の場合では、メチル化は幾つかの他の主要な調節の副産物であり得るか、又は遺伝子を「オフ」状態に固定するために必要とされる（非特許文献３１）。本願（免疫細胞の同定（複数も可））については、因果（生物学的）関係は必要とされず、メチル化パターンと細胞型との間の強い相関関係が必要とされるだけである。
【００１８】
或る特定の遺伝子領域のこのような細胞型及び細胞状態に特異的な修飾のこれまで公表された例は、Ｔ細胞からヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１又はＴｈ２）への分化系列決定時に見られる。ナイーブ（未刺激）ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗原と遭遇すると活性化され、インターロイキンによる更なる刺激によって選択的細胞運命を受けることができる。２つのタイプのヘルパーＴ細胞は遺伝子発現の相互パターンを示す。Ｔｈ１はインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を産生し、ＩＬ−４をサイレンシングするが、Ｔｈ２はＩＬ−４を産生し、ＩＦＮ−γをサイレンシングする（非特許文献１５）。両方の選択的細胞運命について、これらの遺伝子の発現は、近位ＣｐＧ部位のメチル化と逆相関する。Ｔｈ２及びナイーブＴ細胞では、ＩＦＮ−γプロモーターがメチル化されるが、ＩＦＮ−γが発現されるＴｈ１細胞ではメチル化されない（非特許文献３４）。一方で、ＩＬ−４の全転写領域はＴｈ２誘導条件下で脱メチル化され、これはＩＬ−４の効率的な転写と強く相関する。Ｔｈ１細胞では、この大規模な脱メチル化は起こらないが、特定の非転写領域が次第に大幅にメチル化され、ＩＬ−４は発現されない（非特許文献３５）。さらに、非特許文献３６は、ナイーブＴ細胞においてＩＬ−２プロモーターが大幅にメチル化され、不活性となるが、ナイーブＴ細胞の活性化後には、ＩＬ−２遺伝子が６つの連続したＣｐＧで急速かつ特異的な脱メチル化を受けることを実証している。このメチル化パターンの変更は、細胞分化及びＩＬ−２産物の産生増加と同時に起こる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】国際公開第９９／２８４６８号
【特許文献２】米国特許第６，１１０，６９５号
【特許文献３】国際公開第０３／０１４１５３号
【非特許文献】
【００２０】
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【非特許文献２６】Rubie et al. (Rubie, C., Oliveira, V., Kempf,K., Wagner, M., Tilton, B., Rau, B., Kruse, B., Konig,J. and Schilling, M. Involvement of chemokine receptor CCR6 in colorectalcancer metastasis Tumour Biol. 27 (3), 166-174(2006))
【非特許文献２７】Antequera andBird, Proc Natl Acad Sci U S A. 90:11995-9, 1993
【非特許文献２８】Jones and Laird, Nature Genetics 21:163-167, 1999
【非特許文献２９】Esteller, Oncogene 21:5427-5440, 2002
【非特許文献３０】Laird, Nature Reviews/Cancer 3:253-266, 2003
【非特許文献３１】Erlich, J Cellular Chem 88:899-910, 2003
【非特許文献３２】Bird, Genes and Dev 16:6-21, 2002
【非特許文献３３】Li, Nature Reviews/Genetics 3:662-673, 2002
【非特許文献３４】Attwood et al., CMLS 59:241-257, 2002
【非特許文献３５】Lee et al., Immunity 16:649-660, 2002
【非特許文献３６】Bruniquel andSchwartz (Nat Immunol. 4:235-40, 2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明の目的の１つは、哺乳動物の及び／又は哺乳動物における或る特定の免疫細胞、好ましくはＴ細胞及び／又はＢ細胞を確実に同定するために、脊椎動物における細胞型及び細胞状態の指標として従来の方法論を補完するか、又はそれに取って代わることのできる優れたツールとして、特にその検出並びに品質保証及び品質管理のために、タンパク質ＣＣＲ６及び／又はＢＬＲ１の遺伝子の発現分析、特にＤＮＡメチル化分析に基づく発現分析の改良された方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
その第１の態様によると、本発明は、ＢＬＲ１及び／又はＣＣＲ６に陽性の哺乳動物の免疫細胞、好ましくはＮＫ細胞、記憶Ｔ細胞、記憶細胞傷害性Ｔ細胞、ナイーブＢ細胞又は記憶Ｂ細胞、最も好ましくは安定した活性化Ｔ細胞を同定する方法であって、上記哺乳動物における遺伝子ＣＣＲ６及び／若しくはＢＬＲ１又はそのオーソロガス遺伝子若しくはパラロガス遺伝子内の少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析することを含む、ＢＬＲ１及び／又はＣＣＲ６に陽性の哺乳動物の免疫細胞、好ましくはＮＫ細胞、記憶Ｔ細胞、記憶細胞傷害性Ｔ細胞、ナイーブＢ細胞又は記憶Ｂ細胞、最も好ましくは安定した活性化Ｔ細胞を同定する方法を提供することによって上記の目的を解決するものである。
【００２３】
驚くべきことに、ＣＣＲ６及び／又はＢＬＲ１の脱メチル化がＴリンパ球の安定した活性化の指標となることが見出された。当該技術分野で既知のように、Ｔ細胞又はＴリンパ球は細胞性免疫において中心的役割を果たし、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と呼ばれるそれらの細胞表面上の特有の受容体の存在によって、Ｂ細胞及びナチュラルキラー細胞等の他のリンパ球型と識別することができる。「活性化」という用語も当業者に既知であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化は、それぞれＡＰＣ（抗原提示細胞）上の主要組織適合性複合体ペプチド及びＢ７ファミリーメンバーによる、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体及びＣＤ２８の両方の連結によって起こる。細胞傷害性Ｔ細胞はウイルス感染細胞及び腫瘍細胞を破壊し、移植片拒絶反応にも関与する。これらの細胞はＣＤ８糖タンパク質をそれらの表面に発現するため、ＣＤ８＋Ｔ細胞としても知られる。細胞傷害性Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞の表面上に発現された分子とＡＰＣの表面上に発現された分子との間の幾つかの同時相互作用に依存する。
【００２４】
「一時的な」活性化とは対照的な「安定した」活性化は、近年本発明者らによってＴｒｅｇ特異的転写因子ＦＯＸＰ３について実証されたように（非特許文献１９）、免疫細胞がそれらの表現型、特にＣＣＲ６及び／又はＢＬＲ１の発現を長時間にわたって維持することを意味する。
【００２５】
本発明による方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで行うことができる。非活性化Ｔ細胞と比較した場合の脱メチル化が、安定に活性化されたＴ細胞、ＮＫ細胞、記憶Ｔ細胞、特にＣＤ４＋記憶Ｔ細胞若しくはＣＤ８＋記憶Ｔ細胞、記憶細胞傷害性Ｔ細胞、ナイーブＢ細胞及び記憶Ｂ細胞から選択される細胞の指標となる、本発明による方法が好ましい。
【００２６】
上記ＢＬＲ１及び／又はＣＣＲ６に陽性の免疫細胞、好ましくはＮＫ細胞、記憶Ｔ細胞、記憶細胞傷害性Ｔ細胞、ナイーブＢ細胞又は記憶Ｂ細胞が、安定したＢＬＲ１及び／又はＣＣＲ６に陽性の免疫細胞、好ましくは安定したＮＫ細胞、記憶Ｔ細胞、特にＣＤ４＋記憶Ｔ細胞又はＣＤ８＋記憶Ｔ細胞、記憶細胞傷害性Ｔ細胞、ナイーブＢ細胞及び記憶Ｂ細胞、並びにＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ４＋調節性Ｔ細胞である、本発明による方法が更に好ましい。ＢＬＲ１遺伝子座及び／又はＣＣＲ６遺伝子座の接近可能性の分析は、単なるＢＬＲ１及び／又はＣＣＲ６の発現以外にも、どの程度まで例えば記憶Ｔ細胞系統への変換が起こるかという更なる情報を提供する。
【００２７】
遺伝子ｃｃｒ６における脱メチル化が、ＣＣＲ６＋ＣＤ４＋Ｔ細胞若しくはＣＣＲ６＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、特に安定に活性化されたＣＣＲ６＋ＣＤ４＋Ｔ細胞若しくはＣＣＲ６＋ＣＤ８＋Ｔ細胞から選択される細胞の指標となり、上記方法が任意でＣＤ３＋細胞を単離する工程を更に含む、本発明による方法が更に好ましい。
【００２８】
ヒトＴ細胞上の安定したＣＣＲ６又はＢＬＲ１の発現が後成的機構によって制御されるか否かについては、これまでに研究されていない。概して、ＣＣＲ６の転写調節は十分に理解されていない。プロモーター活性を有する領域がマウスＣＣＲ６遺伝子において同定されており（Kucharzik T,
Hudson JT, 3rd, Waikel RL, Martin WD, Williams IR.
CCR6 expression distinguishes mouse myeloid and lymphoid dendritic cell subsets:
demonstration using a CCR6 EGFP knock-in mouse. Eur J
Immunol. 2002;32:104-112）、Ｔｈ１７細胞のマスター調節因子である転写因子ＲＯＲγｔの過剰発現が、ヒト及びマウスのＴ細胞上でのＣＣＲ６発現をもたらす（Hirota K,
Yoshitomi H, Hashimoto M, et al. Preferential recruitment of CCR6-expressing
Th17 cells to inflamed joints via CCL20 in rheumatoid arthritis and its animal
model. J Exp Med. 2007; 204:2803-2812、Manel N, Unutmaz
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growth factor-beta and induction of the nuclear receptor ROR-gamma-t. Nat Immunol. 2008;9:641-649）。本発明者らはしたがって、ＣＣＲ６遺伝子座のＤＮＡメチル化を含む後成的機構が、ヒトＴ細胞における安定したＣＣＲ６発現の調節に寄与するか否かを調査した。本発明者らは、一次Ｔ細胞において転写活性を有し、ヒトのＣＣＲ６−Ｔ細胞及びＣＣＲ６＋Ｔ細胞において差次的にメチル化される、ＣＣＲ６遺伝子内の非コード領域を同定することができた。これらの観察結果及びＤＮＡメチル化阻害剤５’−アザシチジンの誘導効果から、後成的機構がヒト免疫細胞、特にＣＣＲ６陽性記憶Ｔ細胞における安定したＣＣＲ６発現の調節、及び異なるホーミング特性のインプリンティングに関与することが示唆される。関節リウマチに関与することが報告されている細胞集団であるＩＬ１７陽性画分がＣＣＲ６陽性であることが示されたため、このマーカーは特に診断的価値がある（下記を参照されたい）。このマーカーの脱メチル化を測定する完全に定量的なメチル化アッセイを行う用途が好ましい。
【００２９】
好ましくは、上記メチル化状態の分析は、遺伝子ＣＣＲ６及び／若しくはＢＬＲ１又はそのオーソロガス遺伝子若しくはパラロガス遺伝子の転写開始領域、プロモーター領域、イントロン及び／若しくはエクソン／イントロン境界より上流の５’領域内、特に配列番号１３による遺伝子ＣＣＲ６のプロモーター領域又はそのオーソロガス領域若しくはパラロガス領域と重複する領域内の少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析することを含む。
【００３０】
本発明者らは、免疫細胞におけるＣＣＲ６及び／又はＢＬＲ１の発現の調節に機能的に関与する遺伝子ＣＣＲ６及び／又はＢＬＲ１内の特定の（particular）領域を同定した。この領域は、例えばバイサルファイトシークエンシング方法を用いて、ＢＬＲ１を発現する細胞、好ましくは記憶Ｔ細胞、ナイーブＢ細胞若しくは記憶Ｂ細胞、及び／又はＣＣＲ６を発現する細胞、好ましくはＮＫ細胞、記憶Ｔ細胞、記憶細胞傷害性Ｔ細胞、ナイーブＢ細胞若しくは記憶Ｂ細胞を、ＣＣＲ６及び／又はＢＬＲ１を発現しない細胞と比較した場合に、差次的メチル化状態を示す多くのＣｐＧモチーフを含有する。本発明者らは、ＣＣＲ６−細胞及びＢＬＲ１−細胞では遺伝子ＣＣＲ６及び／又はＢＬＲ１のＣｐＧモチーフがそれぞれ、ほぼ完全に（すなわち７０％超、好ましくは８０％超、好ましくは９０％超、最も好ましくは９５％超まで）メチル化されているが、同じモチーフが例えばＣＣＲ６＋Ｔ細胞では完全に脱メチル化されていることを実証することができた。
【００３１】
上述の領域内のＣｐＧモチーフの差次的メチル化は、ＣＣＲ６及び／又はＢＬＲ１の発現と強く相関する。このため、ＣＣＲ６遺伝子座及び／又はＢＬＲ１遺伝子座のメチル化状態の決定は、関節リウマチ、自己免疫疾患、移植片拒絶又はアレルギーの治療における臨床用途に必要とされる、選択的な免疫細胞の安定した集団を同定するのに有益なツールである。
【００３２】
ＣＣＲ６は、ｍＲＮＡ転写産物を用いて分析を行った場合及びタンパク質に対する抗体を用いて分析を行った場合の両方で、その遺伝子発現が活性化免疫細胞において観察されるため、上記細胞のマーカーとして記載されている。しかしながら、これらの同定手段は、単にその時点で（またそのため一時的に）活性化された細胞を認識するものである。このアッセイシステムは、安定に活性化されたＴ細胞と、刺激を受けたのみであり、これが誘発された後間もなく機能的表現型を失う（lose）Ｔ細胞とを識別することは可能ではない。第１の群は、ＣＣＲ６を永久的に発現するこれらのリンパ球を構成し、したがって活性化コンパートメントを構成する。安定したＣＣＲ６を発現する中期／長期の活性化リンパ球のみが脱メチル化されるため、リンパ球のメチル化パターンの分析によってのみ２つの種類／サブグループ間の識別が可能となる。したがって、実際には、メチル化分析によってのみ、ＣＣＲ６＋活性化リンパ球によって示される真の免疫応答及び機能を構成する安定したＣＣＲ６＋細胞が同定される。
【００３３】
活性化Ｔリンパ球の陽性同定については、この状況では全てのＢ細胞が永久的にＣＣＲ６＋であり、したがってバックグラウンド「ノイズ」を構成するため、ＣＤ３陽性細胞の事前単離（例えば、例えば細胞選別を用いた精製）が必要とされ得る。しかしながら、Ｔリンパ球コンパートメント内では、脱メチル化されたＣＣＲ６細胞のみを完全かつ安定に活性化されているとみなすことができる。細胞培養物中では永久的に活性化されたＣＣＲ６＋細胞を（ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳ及びｍＲＮＡを用いて）単離培養形態で同定することができるが、この測定では単一の時点でのＣＣＲ６陽性（及びＢＬＲ１＋）細胞、したがって安定に活性化された細胞及び一時的に活性化された細胞の両方が同定されるため、血液サンプル又はそのＴ細胞含有画分ではこれを達成することはできない。血液中での識別のためのマーカーは現在知られていない。驚くべきことに、一時的なＣＣＲ６／ＢＬＲ１タンパク質産生細胞がメチル化されたままである一方で、永久的に（安定した）ＣＣＲ６陽性／ＢＬＲ１陽性の対応物は脱メチル化されるため、本発明のメチル化マーカーは識別を達成することができる。
【００３４】
上記遺伝子ＣＣＲ６及び／若しくはＢＬＲ１又はそのオーソロガス遺伝子若しくはパラロガス遺伝子内の少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態が、記憶Ｔ細胞、ナイーブＢ細胞及び／又は記憶Ｂ細胞におけるそれぞれのＣｐＧ位置と比較した場合の顆粒球、単球、ＮＫ細胞、ナイーブＴ細胞、ナイーブ細胞傷害性Ｔ細胞及び記憶細胞傷害性Ｔ細胞における遺伝子ＢＬＲ１又はそのオーソロガス遺伝子若しくはパラロガス遺伝子のメチル化の増大、並びにＮＫ細胞、記憶Ｔ細胞、記憶細胞傷害性Ｔ細胞、ナイーブＢ細胞及び／又は記憶Ｂ細胞におけるそれぞれのＣｐＧ位置と比較した場合の顆粒球、単球、ナイーブＴ細胞及びナイーブ細胞傷害性Ｔ細胞における遺伝子ＣＣＲ６又はそのオーソロガス遺伝子若しくはパラロガス遺伝子のメチル化の増大から選択される、本発明による方法が好ましい。
【００３５】
本発明との関連で、「遺伝子」という用語は、ＣＣＲ６及びＢＬＲ１等の或る特定のタンパク質をコードし、上記遺伝子の調節に関与する他の遺伝要素を含有する染色体ＤＮＡの領域、例えば配列番号１３による遺伝子ＣＣＲ６のプロモーター領域又はそのオーソロガス領域若しくはパラロガス領域と重複する領域を意味するものとする。このため、遺伝子はイントロン、エンハンサー、プロモーター配列、及び遺伝子の５’非翻訳領域も含む。本発明の場合では、遺伝子は、本明細書中に示されるアクセッション番号で与えられる配列だけでなく、その上流及び下流の非翻訳領域も含む。
【００３６】
本発明について行われる一部の分析は、マウス系において行われた。しかし、ＢＬＲ１−細胞及びＢＬＲ１＋細胞並びに／又はＣＣＲ６−細胞及びＣＣＲ６＋細胞の間でＣｐＧモチーフの差次的メチル化を示す領域は、哺乳動物間、特にマウスとヒトとの間で高度に保存されている。加えて、実験から、ヒト系においてもマウスのＢＬＲ１＋細胞及び／又はＣＣＲ６−細胞と同じ及び／又は相同なＣｐＧモチーフが脱メチル化されることが示されている。本発明との関連で、この事実は「オーソロガス」遺伝子又は「パラロガス」遺伝子という用語によって説明される。「オーソログ」は共通祖先から進化した２つ以上の種における遺伝子であり、オーソロガス遺伝子とも呼ばれる。本発明との関連で、ヒト（Homo sapiens）ＣＣＲ６はしたがって、ハツカネズミ（Mus musculus）ＣＣＲ６遺伝子及び／又はタンパク質のオーソログである。「パラログ」はゲノム内の重複によって関連する遺伝子であり、パラロガス遺伝子とも呼ばれる。オーソログは進化の過程で同じ機能を保持するが、パラログは元の遺伝子と関連していても新たな機能を進化させている。「パラログ」という用語には、正常遺伝子に類似するが、機能的な最終産物を産生しないヌクレオチド配列である「偽遺伝子」が含まれる。偽遺伝子には２つの変形がある。第１の変形では最終産物がタンパク質である必要がある。第２の変形では最終産物はＲＮＡとなる。
【００３７】
本明細書中で与えられる情報に基づいて、当業者は容易にオーソロガス遺伝子又はパラロガス遺伝子を（例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷプログラム等の配列をアラインメントするためのコンピュータプログラムを用いて）比較し、（両方の）遺伝子において同じ領域内に及び／又は更には同じ等価位置に見ることができる領域及び／又はＣｐＧ位置を同定することが可能である。本発明によると、これらの領域及び／又はＣｐＧ位置はオーソロガス又はパラロガスとみなされる。通常、アラインメントは、分析される２つ（以上）のＤＮＡ断片間の配列同一性のレベルに基づく。配列同一性のレベルは、所与の断片の好ましくは約７５％、より好ましくは約８０％、最も好ましくは約９０％である。
【００３８】
ＣｐＧ位置のメチル化状態を分析するために、ＤＮＡメチル化を分析する任意の既知の方法を用いることができる。本発明による方法の好ましい実施の形態では、メチル化状態の分析は、メチル化特異的酵素消化、バイサルファイトシークエンシングから選択される方法、プロモーターメチル化、ＣｐＧ島メチル化、ＭＳＰ、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥから選択される分析、又は増幅ＤＮＡの検出に基づく他の方法を含む。これらの方法は当業者に十分に知られており、それぞれの文献中に見ることができる。さらに、（例えば５サンプル以上の）プールされたサンプルを用いることもでき、通常は、サンプルのプールを少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態について分析する。
【００３９】
本発明による方法の好ましい実施の形態では、上記遺伝子ＣＣＲ６のメチル化状態の分析は、配列番号１及び配列番号２（「アンプリコン８８８」）、配列番号３及び配列番号４（「アンプリコン１２０１」）、配列番号５及び配列番号６（「アンプリコン１２０２」）、配列番号７及び配列番号８（「アンプリコン１２０３」）、並びに配列番号１１及び配列番号１２（「ＤＭＲ」）、並びにそのオーソロガスプライマー対若しくはパラロガスプライマー対から選択されるプライマー対のうち少なくとも１つを用いた増幅を含み、好ましくは上記メチル化状態の分析が、配列番号５及び配列番号６、配列番号７及び配列番号８、配列番号１１及び配列番号１２、並びにそのオーソロガスプライマー対若しくはパラロガスプライマー対から選択されるプライマー対のうち少なくとも１つを用いた増幅を含む。
【００４０】
本発明による方法の別の好ましい実施の形態では、上記遺伝子ＢＬＲ１のメチル化状態の分析が、配列番号９及び配列番号１０（「アンプリコン１０３７」すなわち配列番号２９）、並びにそのオーソロガスプライマー対又はパラロガスプライマー対から選択されるプライマー対のうち少なくとも１つを用いた増幅を含む。
【００４１】
好ましくは、増幅はポリメラーゼ酵素、ＰＣＲ若しくは化学増幅反応、又は当業者に既知であり、例えばＭＳＰ、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ若しくはＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔとの関連で下記に記載されるような他の増幅方法を含む。本発明の別の態様では、配列番号１〜配列番号１２のいずれかによるオリゴマー、若しくは配列番号１及び配列番号２、配列番号３及び配列番号４、配列番号５及び配列番号６、並びに配列番号７及び配列番号８、並びに配列番号９及び配列番号１０、並びに配列番号１１及び配列番号１２から選択されるプライマー対によって増幅される（例えば配列番号１３による）アンプリコン、又はオーソロガス若しくはパラロガスなオリゴマー若しくはアンプリコンが、本発明の好ましい実施の形態を構成する。
【００４２】
当業者は、上記の情報及びマウス系から得られるデータに基づいて、上記のプライマーと好ましくは約７５％、より好ましくは約８０％、最も好ましくは約９０％の配列同一性を有するオーソロガスプライマー対又はパラロガスプライマー対を設計することができる。上記メチル化状態の分析が配列番号５及び配列番号６、配列番号７及び配列番号８、配列番号１１及び配列番号１２、並びにそのオーソロガスプライマー対又はパラロガスプライマー対から選択されるプライマー対のうち少なくとも１つを用いた増幅を含む、本発明による方法が特に好ましい。
【００４３】
上記メチル化状態の分析が、配列番号１及び配列番号２のプライマー対によって増幅されるアンプリコンのヌクレオチド位置７１、９８、１０６、１３５、１７８、１９３、２７７、３１６及び３３９、配列番号３及び配列番号４のプライマー対によって増幅されるアンプリコンの２３位、３６位、３８位、５３位及び１１４位、配列番号５及び配列番号６のプライマー対によって増幅されるアンプリコンの２３位、１０９位、１６１位、１９３位、２１７位及び２４５位、配列番号７及び配列番号８のプライマー対によって増幅されるアンプリコンの６２位、１０１位、１２４位、２０２位、２４６位及び２５１位、配列番号１１及び配列番号１２のプライマー対によって増幅されるアンプリコンの７１位、９８位、１０６位、１３５位、１７８位、１９３位、２７７位及び３１６位、並びにそのオーソロガスＣｐＧ位置又はパラロガスＣｐＧ位置からなる群から選択される少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析することを含む、本発明による方法が更に好ましい。
【００４４】
メチル化状態の分析が、配列番号９及び配列番号１０のプライマー対によって増幅されるアンプリコンの２３位、２５位、４６位、５１位、１０９位、１５７位、１７７位、１８３位、１９９位、２２９位、２４４位、２４７位、２８７位及び３６０位、並びにそのオーソロガスＣｐＧ位置又はパラロガスＣｐＧ位置からなる群から選択される少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析することを含む、本発明による方法が更に好ましい。これらの位置の大部分が活性化Ｔ細胞において脱メチル化されていることを実験で示すことができた。当業者はさらに、分析対象の部位、例えばアンプリコン８８８上に存在する全ての部位、及び／又はアンプリコン１０３７上に存在する全ての部位、又はＤＭＲ、又はそのオーソロガスＣｐＧ位置若しくはパラロガスＣｐＧ位置の量を最小限に抑えるために、ＣｐＧ位置の特定のサブセットを選択することが可能である。
【００４５】
本発明による方法は、遺伝子ＢＬＲ１及び／若しくはＣＣＲ６又はそのオーソログ若しくはパラログを有する任意の哺乳動物を用いて行うことができ、上記哺乳動物がマウス、ラット、サル又はヒトである本発明による方法が好ましい。
【００４６】
本発明の別の態様では、本発明は、哺乳動物の免疫状態を診断する方法であって、ａ）免疫細胞を含有するサンプルを診断対象の上記哺乳動物から得る工程と、ｂ）本発明による方法により、上記免疫細胞における遺伝子ＣＣＲ６及び／若しくはＢＬＲ１又はそのオーソロガス遺伝子若しくはパラロガス遺伝子内の少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析する工程と、ｃ）上記サンプル中に存在する免疫細胞の量及び／又はタイプを上記メチル化状態に基づいて特定する工程と、ｄ）特定された上記量及び／又はタイプに基づいて上記哺乳動物の免疫状態について結論付ける工程とを含む、哺乳動物の免疫状態を診断する方法を提供する。
【００４７】
本方法の一態様では、（種々のタイプの免疫細胞を含有する）サンプル中のＴ細胞の全集団を、ＣＣＲ６遺伝子及び／又はＢＬＲ１遺伝子におけるそれらのメチル化状態について分析する。部位の全メチル化頻度の結果に基づいて、例えば分析した集団内の記憶Ｔ細胞の比率及び／又は量を決定することができる。上記結果から、診断対象の哺乳動物の免疫状態及び／又はＴ細胞状態について結論付けることができる。方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで行うことができる。概して、好適なＴ細胞を含有する限り、全ての生体サンプルを使用することができる。上記サンプルが血液サンプル、血中リンパ球のサンプル又はその画分から選択される方法が好ましい。最も好ましくは、サンプルはＣＤ３によって、好ましくは細胞選別又は磁性ビーズ（ＭＡＣＳ）を用いて精製されたＴ細胞を含む。本方法を用いて、分析用のＢ細胞含有サンプルを生成することもできる。
【００４８】
本発明による方法は、遺伝子ｃｃｒ６及び／若しくはｂｌｒ１又はそのオーソログ若しくはパラログを有する任意の哺乳動物を用いて行うことができ、上記哺乳動物がマウス、ラット、サル又はヒトである本発明による方法が好ましい。上記哺乳動物が自己免疫疾患、自己免疫疾患における有害作用、同種移植レシピエントにおける有害作用、腫瘍性疾患、卵巣がん、慢性移植片対宿主病、アレルギー性喘息、多発性硬化症、炎症、炎症関節、関節リウマチ、乾癬性疾患、炎症性腸疾患、脳症、及びＸ連鎖免疫調整異常・多発性内分泌障害腸症候群（ＩＰＥＸ）から選択される疾患を患う患者である、方法が好ましい。好ましくは、上記疾患は関節リウマチである。これらの疾患及び免疫細胞とのそれらの関係は、それぞれの文献に記載されている。
【００４９】
ＢＬＲ１＋免疫細胞及び／又はＢＬＲ６＋免疫細胞、好ましくは活性化Ｔ細胞、ＮＫ細胞、記憶Ｔ細胞、記憶細胞傷害性Ｔ細胞、ナイーブＢ細胞又は記憶Ｂ細胞の量が、少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％までの分析対象のＣｐＧ位置の脱メチル化に相当する方法が更に好ましい。免疫細胞におけるＣＣＲ６及び／又はＢＬＲ１の発現を調整する化学物質及び／又は生体物質に応じた上記免疫細胞の量及び／又は比率を測定及び／又はモニタリングすることを更に含む方法がまた更に好ましい。すなわち、例えば疾患（例えば本明細書中に記載される）の治療、並びに免疫細胞に対する効果の点での上記治療の成功及び／又は進行によって生じる免疫細胞の量又は比率における変化は、本方法を用いて追跡することができる。本明細書中のマーカーに基づく免疫細胞のメチル化パターンの追跡調査は、上記化学物質及び／又は生体物質に対する応答による細胞における変化を指摘するものであり、場合によっては表現型変化の前であっても観察することができる。次いで、この情報を、基礎疾患又は関連疾患（例えば本明細書中で言及される）に対する治療法の調整に使用し、それにより副作用を回避及び／又は低減することを含む、改良されたより効果的な治療及び／又は予防を可能にすることができる。
【００５０】
本発明の更に別の態様では、本発明は、患者への移植に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した又は展開させた免疫細胞の適合性を決定する方法であって、本発明による方法と、分析されるＣｐＧ位置が少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％までメチル化されているか否かを検出することとを含む、患者への移植に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した又は展開させた免疫細胞の適合性を決定する方法を提供する。方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで行うことができる。例えば、ＣＣＲ６及び／又はＢＬＲ１の発現の変調、特に低下を示すと思われる免疫細胞は、通常は安定であるとはみなされず、更に使用されることはない。
【００５１】
本発明の更に別の態様では、本発明は、免疫細胞におけるＣＣＲ６及び／又はＢＬＲ１の発現を調整する化学物質及び／又は生体物質を同定する方法であって、上記化学物質及び／又は生体物質の１つ又は複数を免疫細胞と接触させることと、本明細書中に記載される本発明による方法を行うことと、上記化学物質及び／又は生体物質が、分析されるＣｐＧ位置のメチル化を調整するか否かを検出することとを含む、免疫細胞におけるＣＣＲ６及び／又はＢＬＲ１の発現を調整する化学物質及び／又は生体物質を同定する方法を提供する。方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで行うことができる。この態様では、本発明は、調節性Ｔ細胞に特異的な薬物療法及びそれぞれの医薬組成物の開発の出発点として用いることのできる、ＣＣＲ６及び／又はＢＬＲ１の発現を変調する化学物質及び／又は生体物質を同定することを目的とする、「スクリーニング方法」と呼ばれる場合もある方法を包含する。本方法は、ＣＣＲ６遺伝子及び／又はＢＬＲ１遺伝子が、ＮＫ細胞、記憶Ｔ細胞、記憶細胞傷害性Ｔ細胞、ナイーブＢ細胞又は記憶Ｂ細胞等の本明細書中に記載されるような免疫細胞の発生に中心的役割を果たすことが広く認められているという事実に基づく。したがって、ＣＣＲ６及び／又はＢＬＲ１の発現を変調する因子は、自己免疫疾患又は同種移植レシピエントを治療するための興味深いツールでもある。ＣＣＲ６及び／又はＢＬＲ１の発現を防止する因子であっても、ＢＬＲ１＋免疫細胞及び／又はＣＣＲ６＋免疫細胞、好ましくはＮＫ細胞、記憶Ｔ細胞、記憶細胞傷害性Ｔ細胞、ナイーブＢ細胞又は記憶Ｂ細胞が、強い抗腫瘍応答を防止することが示されている腫瘍患者の治療にとっては興味深い。ＣＣＲ６及び／又はＢＬＲ１の発現の安定した修飾をもたらすかかる因子は、本発明において記載される方法を用いて検出することができる。さらに、免疫細胞の分化を促進し、自己免疫障害及びアレルギー障害の緩和をもたらすことのできる因子を本発明の方法を用いて同定することができる。スクリーニング化合物として好適な化学物質及び／又は生体物質は当業者に既知であり、例えば小分子、ペプチド及びタンパク質、並びに抗体又はその断片が挙げられる。さらに、スクリーニングは商用の（commercial）化合物ライブラリーを、最も有利にはロボット等の好適な自動装置とともに用いて行うことができる。化学物質及び／又は生体物質を同定する方法の好ましい１つの実施の形態では、上記物質は、分析されるＣｐＧ位置の少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％までの脱メチル化をもたらす。
【００５２】
本発明による別の好ましい方法は、遺伝子ＣＣＲ６及び／又はＢＬＲ１の異常発現と関連する疾患を診断する方法であって、本明細書中に記載される本発明による方法と、分析されるＣｐＧ位置が少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％まで脱メチル化されているか否かを検出することとを含み、疾患が自己免疫疾患、同種移植レシピエントにおける有害作用、腫瘍性疾患、卵巣がん、慢性移植片対宿主病、アレルギー性喘息及びＩＰＥＸ症候群から選択される、遺伝子ＣＣＲ６及び／又はＢＬＲ１の異常発現と関連する疾患を診断する方法である。本方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで行うことができる。
【００５３】
本発明の別の好ましい態様は、免疫細胞、例えば活性化Ｔ細胞、好ましくはナイーブＴ細胞又は記憶Ｔ細胞を、遺伝子ＣＣＲ６及び／又はＢＬＲ１内のＣｐＧ位置のメチル化状態の分析に基づいて同定するためのキットであって、本発明による方法を行うための材料を含む、免疫細胞、例えば活性化Ｔ細胞、好ましくはナイーブＴ細胞又は記憶Ｔ細胞を、遺伝子ＣＣＲ６及び／又はＢＬＲ１内のＣｐＧ位置のメチル化状態の分析に基づいて同定するためのキットに関する。本発明による好ましい１つの実施の形態では、キットは、ａ）バイサルファイト試薬と、ｂ）上述したＣｐＧ位置のメチル化分析のための材料とを含む。当業者はさらに、分析対象の部位、例えばアンプリコン８８８上に存在する全ての部位、及び／又はアンプリコン１０３７上に存在する全ての部位、及び／又は配列番号１３によるアンプリコン（ＤＭＲ）上に存在する全ての部位、又はそのオーソロガスＣｐＧ位置若しくはパラロガスＣｐＧ位置の量を最小限に抑えるために、ＣｐＧ位置の特定のサブセットの材料を選択することが可能である。キットは診断キットであってもよい。
【００５４】
本発明によるキットは好ましくは、以下のものを含有してもよい：１．細胞サンプルを処理するための化学物質（バイサルファイト等）；２．手順プロトコル；３．特定の細胞型と関連するマーカーを検出する本発明によるオリゴヌクレオチドプローブ、アンプリコン、遮断剤又は伸長プライマー。オリゴヌクレオチドは、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）又は一塩基伸長法（ＳＢＥ）等の一般に利用可能な検出プラットフォーム上でシグナルを生成するように構成され得る。各々のシグナルは、サンプル中の特定の標的部位でのメチル化のレベルを示す。代案として、記載の核酸によるプローブをチップ上で使用するために作製することができる；４．結果を処理するための生物情報学ツール。これ、例えばソフトウェアは、生データからシグナルを正規化するか、読み出し値の解釈のための結果の行列を含有するか、又は例えば細胞型の割合若しくは有効性予測を計算する様々なアルゴリズムを実行するものであり得る。
【００５５】
本発明の更に別の好ましい態様は、免疫細胞、好ましくはナイーブＴ細胞又は記憶Ｔ細胞を検出及び／又は同定するための、上記に記載したものと同様の本発明によるオリゴマー若しくはアンプリコン又は本発明によるキットの使用に関する。
【００５６】
本発明の更に別の好ましい態様は、ＣＣＲ６及び／又はＢＬＲ１の発現に関連する疾患、自己免疫疾患、同種移植レシピエントにおける有害作用、腫瘍性疾患、卵巣がん、慢性移植片対宿主病、アレルギー性喘息、多発性硬化症、炎症、炎症関節、関節リウマチ、乾癬性疾患、炎症性腸疾患、脳症、及びＸ連鎖免疫調整異常・多発性内分泌障害腸症候群（ＩＰＥＸ）、好ましくは関節リウマチ、乾癬性疾患、炎症性腸疾患、最も好ましくは関節リウマチを治療する方法に関する。該方法は、ＣＣＲ６及び／又はＢＬＲ１の発現を用いて本発明によって特徴付けられる有効量の免疫細胞を、それを必要とする上記患者に投与することを含む。有効量の免疫細胞を投与する方法は文献に記載されており（例えば、Bharat A, Fields RC, Mohanakumar T.
Regulatory T cell-mediated transplantation tolerance. Immunol
Res. 2006; 33(3):195-212、June CH, Blazar
BR. Clinical application of expanded CD4(+)25(+) cells. Semin
Immunol. 2006 Jan 31、Khazaie K, von Boehmer
H. The impact of CD4(+)CD25(+) Treg on tumor specific
CD8(+) T cell cytotoxicity and cancer. Semin Cancer
Biol. 2006 Apr;16(2):124-136. Epub 2006 Jan 26、及びそれらにおいて引用される参考文献）、当業者は本発明との関連でこれらの方法を適用することが可能である。「治療」という用語は、上記ＣＣＲ６及び／又はＢＬＲ１の発現に関連した疾患の予防も含む。
【００５７】
ＣＣＲ６遺伝子座及び／又はＢＬＲ１遺伝子座内の領域のメチル化状態の分析は、細胞集団がＣＣＲ６遺伝子及び／又はＢＬＲ１遺伝子を安定に発現するか否かについての予測の改善を可能にする。したがって、本方法は、自己免疫疾患を患うか、又は同種移植を受けている患者への養子移入前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した又は展開させた免疫細胞の品質管理として用いることができる。ＣｐＧモチーフが或る程度まで脱メチル化されている場合に限り、これらの細胞がＣＣＲ６遺伝子及び／又はＢＬＲ１遺伝子を安定に発現し、しばらくした後でＣＣＲ６及び／又はＢＬＲ１の発現を失うことはないことが確信される。養子移入した細胞の調節性表現型の安定性に関するかかる「品質管理」は不可欠であり、ＣＣＲ６遺伝子座及び／又はＢＬＲ１遺伝子座の上述の領域（複数も可）のメチル化状態の分析によってのみ達成することができる。
【００５８】
本発明の１つの実施の形態では、本明細書中に記載されるように、ＣＣＲ６遺伝子座及び／又はＢＬＲ１遺伝子座のメチル化状態をバイサルファイトシークエンシングによって分析し、顆粒球、単球、ナイーブＴ細胞又はナイーブ細胞傷害性Ｔ細胞と、ＮＫ細胞、記憶Ｔ細胞、記憶細胞傷害性細胞、ナイーブＢ細胞又は記憶Ｂ細胞との著しい違いが明らかになった。ＣＣＲ６については、アンプリコン８８８及びアンプリコン１２０３（実施例を参照されたい）は通常の（conventional）顆粒球、単球、ナイーブＴ細胞又はナイーブ細胞傷害性Ｔ細胞内で高度のメチル化（ほぼ１００％）を示した（図８Ａ、図８Ｂ及び図９）。アンプリコン１２０４（配列番号２６；実施例を参照されたい）は、通常のナイーブＴ細胞及びナイーブ細胞傷害性Ｔ細胞内で高度のメチル化（ほぼ１００％）を示した。アンプリコン１２０１及びアンプリコン１２０２（実施例を参照されたい）においては、脱メチル化プロセスはナイーブＢ細胞及び記憶Ｂ細胞のみで起こり、脱メチル化が無作為事象ではなく、規定の領域に限定されることが示される。特に、ＣＣＲ６＋ＣＤ４＋記憶Ｔ細胞及びＣＤ８＋記憶Ｔ細胞内で高度の脱メチル化（ほぼ１００％）を示す領域がＣＣＲ６遺伝子座において同定された（配列番号１３を参照されたい）。
【００５９】
ＢＬＲ１遺伝子座と同様に、アンプリコン１０３７（実施例を参照されたい）は、通常の顆粒球、単球、ＮＫ細胞、ナイーブＴ細胞、記憶細胞傷害性Ｔ細胞又はナイーブ細胞傷害性Ｔ細胞内で高度のメチル化（ほぼ１００％）を示した（図８）。
【００６０】
免疫細胞上の異なるケモカイン受容体の差次的発現により、リンパ系組織及び非リンパ系組織への及びそれらの内部での様々な機能的サブセット及び分化段階のエフェクター細胞及び調節性細胞の組織的な時空的分布が確実になる。移行性の表現型、とりわけＴ細胞及びＢ細胞の一部は、分化時に見かけ上永久的にインプリンティングされ、身体の特定のコンパートメントへの記憶集団の選択的な送達（「ホーミング」）が可能となる。Ｔ細胞及びＢ細胞の子孫において安定したホーミング表現型がどのように獲得され、維持されるかについては十分に理解されていない。後成的機構、とりわけ本明細書中に記載されるようなＤＮＡ領域のメチル化／脱メチル化は転写調節に関与し、「遺伝性」メチル化シグネチャーのインプリンティングによる表現型変化の長期記憶をもたらすのに理想的に適している。本発明との関連では、本発明者らはこのため、差次的ＤＮＡメチル化が一次ヒトＴ細胞における安定したＣＣＲ６発現の獲得に関与し得るか否かを調査した。
【００６１】
本発明との関連では、驚くべきことに、白血球の亜集団間で差次的にメチル化されるＣＣＲ６遺伝子座内の領域（配列番号１３、ＤＭＲ）が、ＤＭＨ手法によって初めに同定され（非特許文献２０）、選別されたヒト血球サブセットのメチル化状態をバイサルファイト変換を用いて分析することによって検証された。観察されたメチル化パターンは、様々なリンパ球サブセットにおけるＣＣＲ６の発現に概ね一致し、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞、一部のＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞、成熟Ｂ細胞及びＣＤ４＋Ｔｒｅｇ等のＣＣＲ６発現細胞が、部分的に又は更には完全に脱メチル化されたＣＣＲ６領域を示したが、この遺伝子座はＣＣＲ６発現を欠く休止期のＣＤ１４＋単球及びＣＤ１５＋顆粒球では完全にメチル化された。
【００６２】
しかし、ＣＤ４＋記憶Ｔ細胞及びＣＤ８＋記憶Ｔ細胞では、ＣＣＲ６領域の脱メチル化は、表面上にＣＣＲ６タンパク質を発現するこれらのサブセットに限定され、ＣＣＲ６調節におけるこの遺伝要素及びそのメチル化状態に対する役割が示唆される。
【００６３】
本発明者らがＴｒｅｇ特異的転写因子ＦＯＸＰ３について近年実証することができたように（非特許文献１９）、ＤＮＡの脱メチル化は通常、安定した遺伝性の発現パターンのシグネチャーとして見られる。
【００６４】
他の多くの炎症性ケモカインの受容体と同様、ＣＣＲ６は循環記憶Ｔ細胞の大部分で発現されるが、ナイーブＴ細胞には見られず（Liao F, Rabin RL, Smith CS, Sharma G, Nutman
TB, Farber JM. CC-chemokine receptor 6 is expressed on diverse memory subsets
of T cells and determines responsiveness to macrophage inflammatory protein 3
alpha. J Immunol. 1999; 162:186-194.、Sato K, Kawasaki H, Nagayama H, et al.
Chemokine receptor expressions and responsiveness of cord blood T cells. J Immunol. 2001;166:1659-1666）、ＣＣＲ６発現がＴ細胞プライミング時に獲得されることが示唆される。ＣＣＲ６発現は、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＧＦ−β及びＴＮＦ−αを含有するサイトカインカクテルを用いてナイーブＣＣＲ６−ＣＤ４＋Ｔ細胞から新たに誘導することができる（非特許文献１４、Sato K, Kawasaki H, Nagayama H, et al.
Chemokine receptor expressions and responsiveness of cord blood T cells. J Immunol. 2001;166:1659-1666）。
【００６５】
ＣＣＲ６＋細胞の割合が誘導条件下での反復刺激によって増大するにもかかわらず、達成されるＣＣＲ６発現は、ｅｘ  ｖｉｖｏで選別されたＣＣＲ６＋記憶Ｔ細胞とは対照的に長期の培養時に安定であることが見出されず、ＣＣＲ６領域の脱メチル化と関連もしていなかったため、これらはＣＣＲ６＋記憶集団に特徴的であることが判明した。本発明者らがＩＬ−１７分泌ＣＣＲ６＋細胞及びＩＬ−１７非分泌ＣＣＲ６＋細胞におけるＣＣＲ６領域の脱メチル化について考えるところでは、記憶細胞におけるメチル化状態は機能的表現型から独立したものであり得る。まとめると、本発明によって提供されるデータから、ＣＤ４＋Ｔ細胞において安定したＣＣＲ６発現プロファイルをインプリンティングするには、特異的なこれまでに知られていないシグナルが必要とされることが示唆される。
【００６６】
最後に、ＤＮＡメチル化とＣＣＲ６の実際の発現との間の相関関係の欠如が、ＴＣＲ刺激後のＣＤ４＋記憶Ｔ細胞上のＣＣＲ６の下方調節について見出された。ＣＣＲ６発現の一時的な喪失は、メチル化パターンの変化を伴わなかった。ここでも、ＣＣＲ６がＴＣＲ刺激の除去及びＩＬ−２の添加の後に急速に再発現されたことから、発現の変化は安定していなかった。しかしながら、この場合、ＣＣＲ６下方調節がＣＣＲ６発現の転写調節ではなく（rather
than）受容体の変調によるものであることを排除することはできない。これらのデータから、ＣＣＲ６遺伝子座の重要な領域におけるＤＮＡメチル化が、記憶Ｔ細胞における永久的にＣＣＲ６を発現する表現型の獲得に関与することが示される。
【００６７】
ＣＣＲ６遺伝子座における調節性遺伝子要素のメチル化状態がＣＣＲ６発現の長期安定性を決定付けるという結果を、人工ＤＮＡ低メチル化を用いる実験によって更に裏付けた。Ｔ細胞刺激時のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤５’−アザシチジンの適用は、外因性ＣＣＲ６誘導サイトカインの非存在下であってもＣＣＲ６発現を増大させただけでなく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ展開時に安定したＣＣＲ６発現を示すＣＣＲ６＋細胞を生じ、これは以前にｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導されたＴｒｅｇにおけるＦｏｘｐ３発現についても観察された所見である（Polansky JK, Kretschmer K, Freyer J, et al.
DNA methylation controls Foxp3 gene expression. Eur J
Immunol. 2008; 38:1654-1663）。
【００６８】
本明細書で、本発明者らは、ＣＣＲ６を発現する記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞及び記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞、並びにＣＤ２５ｈｉｇｈＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇにおいて非メチル化ＣｐＧモチーフを示すヒトＣＣＲ６遺伝子座の非コード領域を同定し、特徴付けた。ＣＣＲ６＋記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞でのＣＣＲ６発現は、サイトカイン誘導増殖時に安定であり、ＴＣＲ刺激後に僅かに下方調節された。しかしながら、かかるＣＣＲ６下方調節は単に一時的なものであり、ＣＣＲ６遺伝子座内の調節性領域の再メチル化を伴わなかった。一方で、炎症性サイトカインの存在下でのＴＣＲ刺激によるナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＣＲ６発現のｉｎ  ｖｉｔｒｏ誘導は不安定なＣＣＲ６発現をもたらし、ＣＣＲ６遺伝子座のメチル化状態における変化を示さなかった。特に、ＤＮＡメチル化阻害剤５’−アザシチジンによる処理は、ＣＣＲ６発現の増大及び部分的な安定をもたらした。レポーター遺伝子プラスミドにクローニングすると、この差次的にメチル化される領域は、ｅｘ  ｖｉｖｏで単離したＣＣＲ６＋一次Ｔ細胞へのトランスフェクション後に構成的転写活性を示し、これがＣＣＲ６発現を調節するエンハンサー要素として働き得ることが実証された。
【００６９】
要するに、本発明者らは、後成的機構によって安定したＣＣＲ６発現を媒介する、ＣＣＲ６＋Ｔ細胞において構成的転写活性を示すヒトＣＣＲ６遺伝子の非コード領域を同定した。本発明は、後成的機構がケモカイン受容体の転写活性を調節するだけでなく、さらに永久的な発現パターンのインプリンティングにおいて重要な役割を果たし、それにより分化した記憶Ｔ細胞に組織分布的記憶を与え、それらの長期にわたる移行挙動を形作るものであり得るという実験的証拠を初めて提供する。
【００７０】
ここで、本発明を以下の実施例において添付の図面及び配列表を参照して更に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】ＣＣＲ６遺伝子内の好ましい非コード領域がヒトＰＢＭＣにおいて差次的メチル化を示すことを示す図である。Ａ）ヒトＣＣＲ６遺伝子座内のＣｐＧリッチ領域の局在化。Ｅｎｓｅｍｂｌデータベース（ＧＲＣｈ３７）から得られた推定ＣＣＲ６転写産物のエクソン構造を、予測プロモーター領域（Genomatix）、及びＣＣＲ６遺伝子座内の同定された差次的にメチル化される領域とともに表示した。ＣＣＲ６転写産物における灰色の（gray shaded）ボックスは非コードエクソン領域を表し、黒色のボックスはコード領域を含有する。Ｂ）ＣＣＲ６のＤＮＡメチル化パターンを、プールしたＰＢＭＣ（５人のドナー）から分析し、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋及びＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈに選別した。各々の列は１つの血球サブセットを表し、各々の行は単一のＣｐＧ部位を表す。ＤＮＡメチル化はバイサルファイトシークエンシングを用いて測定した。ＣｐＧメチル化レベルを、薄灰色（０％のメチル化）から濃灰色（１００％のメチル化）までのカラースケールに従って色分けした。
【図２】好ましいＣＣＲ６領域の脱メチル化が、ヒトのＣＤ４細胞及びＣＤ８細胞におけるＣＣＲ６発現と相関することを示す図である。Ａ）ＣＤ４＋ＣＤ２５−リンパ球及びＣＤ８＋ＣＤ２５−リンパ球に対するＣＣＲ６及びＣＤ４５ＲＡの代表的なＦＡＣＳ染色。Ｂ）ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞をＰＢＭＣから単離し、ＣＣＲ６−ナイーブ細胞並びにＣＣＲ６−記憶細胞及びＣＣＲ６＋記憶細胞に選別し、純度が９５％を超えるサブセットを得た。選別したサブセットのメチル化分析を、１人の代表的なドナーについて示す。下のグラフは、ＣＤ４＋Ｔ細胞については５人又は６人のドナー、ＣＤ８＋Ｔ細胞については３人のドナーのそれぞれに由来するＣｐＧ部位からのメチル化の平均を示す。
【図３】ＣＣＲ６＋Ｔ細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏ展開時にＣＣＲ６を安定に発現し、脱メチル化されたＣＣＲ６領域を維持することを示す図である。Ａ）ＣＦＳＥ標識ＣＣＲ６＋ＣＤ４＋記憶Ｔ細胞を、ＴＧＦ−βを添加した及び添加しない、組み換えヒトＩＬ−７及びＩＬ−１５（どちらも１０ｎｇ／ｍｌ）又は抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）を含有する培地中で６日間培養し、ＣＣＲ６発現について再分析した。４人のうち１人の代表的なドナーについて示す。Ｂ）ＣＣＲ６＋ＣＤ４＋記憶Ｔ細胞を、中性条件下で又はＴＧＦ−β（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加して、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）で刺激した。６日後、ＣＣＲ６発現を再分析した。灰色の曲線（curves）はアイソタイプ対照を示す。Ｃ）ＣＣＲ６領域のメチル化分析を、２人のドナーについてＢと同様に６日間培養したＣＣＲ６＋細胞について評価した。Ｄ）ＣＣＲ６＋細胞を中性条件下で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）で刺激し、６日目にＣＣＲ６−細胞及びＣＣＲ６＋細胞に選別し、ＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）を含有する培地中で更に３日間培養した。データは２人のドナーの代表的なものである。
【図４】ｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導されたＣＣＲ６が不安定であり、好ましいＣＣＲ６領域の脱メチル化をもたらさないことを示す図である。Ａ）ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、炎症誘発性サイトカイン及びＴＧＦ−βを添加せずに（白色のバー）又は添加して（黒色のバー）４日間刺激し、続いてＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）中で培養した。６日〜７日後、細胞をＣＣＲ６発現について分析した（ｎ＝２１、左のグラフ）。サイトカインカクテルを添加して（＋）及び添加せずに（−）培養したＣＤ４＋Ｔ細胞のメチル化プロファイルを右のグラフに示す（ｎ＝２）。Ｂ）Ａと同様にサイトカインカクテルで刺激した細胞をＣＣＲ６＋細胞及びＣＣＲ６−細胞に選別し（１人の代表的なドナーについて示す）、ＣＣＲ６領域のメチル化について分析した。Ｃ）Ｄに示すように刺激した後のＣＣＲ６領域のＣＣＲ６発現（上）及びメチル化分析（下）（１人の代表的なドナー）。Ｄ）ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＡと同様に培養し、左のパネルに示すように７日目、１０日目及び２４日目にＣＣＲ６発現について分析するか（ｎ＝４）、又は右のパネルに示すように、６日〜７日後に１回目の刺激と同じ条件下で再刺激し、ＣＣＲ６発現について分析した（ｎ＝１１）。
【図４−２】図４のつづき
【図５】ＤＮＡメチル化の阻害が部分的に安定したＣＣＲ６発現をもたらすことを示す図である。Ａ）ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、炎症誘発性サイトカイン及びＴＧＦ−βを添加せずに（ｎ＝１８、左のパネル）又は添加して（ｎ＝６、右のパネル）刺激した。４８時間後、Ａｚａを更に４８時間培地に添加した。ＣＣＲ６の発現を６日目に分析した。Ｂ）ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ａｚａを添加し、サイトカインを添加せずにＡと同様に刺激した。６日後、細胞をそれらのＣＣＲ６発現に応じて選別し、中性条件下、Ａｚａの非存在下で更に５日間再刺激し、続いてＣＣＲ６発現を再分析した。示したデータは、２回の独立して行った実験の代表的なものである。
【図６】好ましい差次的にメチル化されるＣＣＲ６領域が転写活性を有することを示す図である。全ＣＤ４＋Ｔ細胞に、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の前にＳＶ４０最小プロモーターを含有するｐＧＬ３−プロモータープラスミド、又はＣＣＲ６領域をＳＶ４０プロモーターの前にクローニングしたｐＧＬ３−ＣＣＲ６をトランスフェクトした。ヌクレオフェクション後に、細胞を、ＩＬ−２を含有する培地中で培養するか（白色のバー）、又はＰＭＡ及びイオノマイシンで４時間刺激した（灰色のバー）。ルシフェラーゼ相対発光量をウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して正規化した。ｐＧＬ３−プロモータープラスミドの値を１に設定し、ｘ倍の活性化を得た。バーは５人の異なるドナーに由来する細胞の平均ルシフェラーゼ活性を示し、ラインは単一値の分布域を示す。
【図７】第６染色体上のヒトＣＣＲ６脱メチル化領域（ＤＭＲ）を、予測される因子結合部位とともに示す図である。
【図８Ａ】種々の白血球細胞型（ＢＣＳＴ１８：顆粒球、ＢＣＳＴ１９：単球、ＢＣＳＴ２０：ＮＫ細胞、ＢＣＳＴ２１：ナイーブＴ細胞、ＢＣＳＴ２２：記憶Ｔ細胞、ＢＣＳＴ２３：ナイーブ細胞傷害性Ｔ細胞、ＢＣＳＴ２４：記憶細胞傷害性Ｔ細胞、ＢＣＳＴ２５：ナイーブＢ細胞、ＢＣＳＴ２６：記憶Ｂ細胞）におけるＣＣＲ６遺伝子及びＢＬＲ１遺伝子のプロモーター内の特定のＣｐＧ位置のメチル化を示す図である。アンプリコン内の特定の位置を、アンプリコンの後の番号によって示す、すなわちＡＭＰ８８８：７１はアンプリコン８８８の７１位である。Ａｍｐ８８８内のＣｐＧ１７８から始めてＣｐＧ７１に至るまで、厳密に細胞型に依存するメチル化を観察することができる。ナイーブＴ細胞は、それらのＣＤ４及びＣＤ８の発現状態にかかわらずメチル化の増大を示す。対照的に、ＣＣＲ６によって選別された記憶Ｔ細胞は、ＣＣＲ６を発現しない画分及びＣＣＲ６を発現する画分によって規定される、中程度から完全にメチル化された画分に分別され、同時に測定された遺伝子座で完全に脱メチル化される。ＢＬＲ１（アンプリコン１０３７）内の高度のメチル化を顆粒球、単球、ＮＫ細胞、ナイーブＴ細胞、ナイーブ細胞傷害性Ｔ細胞及び記憶細胞傷害性Ｔ細胞において見ることができる。
【図８Ｂ】種々のドナーの種々の白血球細胞型におけるＣＣＲ６遺伝子のプロモーター内の特定のＣｐＧ位置のメチル化を示す図である。メチル化状態がドナーに依存しないことを観察することができる。
【図９】ＣＣＲ６遺伝子の様々な異なる位置でのＣＣＲ６遺伝子座のメチル化分析を示す図である。この比較は、細胞傷害性Ｔ細胞及びヘルパーＴ細胞以外の様々な白血球細胞型を含む。データは、Ａｍｐ１２０１において脱メチル化は記憶Ｂ細胞及びナイーブＢ細胞のみで観察されるが、ＣＤ１５＋顆粒球、ＣＤ１４＋単球、ＣＤ５６＋Ｎｋ細胞及び全てのＴ細胞画分を含む他の全ての白血球画分は完全にメチル化されていることを示す。アンプリコン８８８においては、ＣＤ４Ｔ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞の両方の記憶画分に加えて、ＮＫ細胞及びＢ細胞が脱メチル化されている。
【図１０】ヒトゲノムの第６染色体上に表示した場合の図１及び図２に示される分析された様々なアンプリコンを示す図である。アンプリコンを示し、アンプリコン１つ当たりのＣｐＧの数を丸の中に示す。
【図１１】２人のドナーから分析し、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋及びＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−に選別した、ＣＣＲ６に対するＤＮＡメチル化パターン（アンプリコン８８８）の再現性を示す図である。各々の列は１つの血球サブセットを表し、各々の行は単一のＣｐＧ部位（左側に示すアンプリコンにおける位置）を表す。ＤＮＡメチル化はバイサルファイトシークエンシングを用いて測定した。ＣｐＧメチル化レベル（左のバー）は、薄灰色（０％のメチル化）から濃灰色（１００％のメチル化）までのカラースケールに従って色分けしている。
【図１２】種々の白血球細胞型（ＢＣＳＴ１８：顆粒球、ＢＣＳＴ１９：単球、ＢＣＳＴ２０：ＮＫ細胞、ＢＣＳＴ２１：ナイーブヘルパーＴ細胞、ＢＣＳＴ２２：記憶ヘルパーＴ細胞、ＢＣＳＴ２３：ナイーブ細胞傷害性Ｔ細胞、ＢＣＳＴ２４：記憶細胞傷害性Ｔ細胞、ＢＣＳＴ２５：ナイーブＢ細胞、ＢＣＳＴ２６：記憶Ｂ細胞、ＴＮＶＥ：ナイーブヘルパーＴ細胞、Ｔｒｅｇ：調節性Ｔ細胞）におけるＢＬＲ１遺伝子のプロモーター領域内の特定のＣｐＧ位置のメチル化レベルを示す図である。アンプリコン内の特定の位置を、アンプリコンの後の番号によって示す、すなわちＡＭＰ１０３７：２３はアンプリコン１０３７の２３位である。Ａｍｐ１０３７内のＣｐＧ２３から始めてＣｐＧ３６０まで、厳密に細胞型に依存するメチル化を観察することができる。ＢＬＲ１（アンプリコン１０３７）内の高度のメチル化を顆粒球、単球、ＮＫ細胞、ナイーブヘルパーＴ細胞、ナイーブ細胞傷害性Ｔ細胞及び記憶細胞傷害性Ｔ細胞において見ることができる。低度のメチル化を記憶ヘルパーＴ細胞、記憶Ｂ細胞及びナイーブＢ細胞、並びに調節性Ｔ細胞において見ることができる。
【００７２】
配列番号１〜配列番号１２及び配列番号１４〜配列番号２８は、実施例において使用されるプライマー及びプローブを示す。
【００７３】
配列番号１３は、本発明による遺伝子ｃｃｒ６のプロモーター領域と重複する領域を示す。
【００７４】
配列番号２９はアンプリコン１０３７の配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００７５】
以下の実施例は主に、遺伝子ＣＣＲ６の好ましい脱メチル化領域の分析との関連で行ったが、これらの実験をＣＣＲ６及びＢＬＲ１に関して本明細書中に記載される遺伝子の他の関連領域のメチル化分析に容易に適合させることができることは、当業者には理解される。
【００７６】
材料及び方法
細胞、抗体及びフローサイトメトリー
バフィーコート（DRK Blutspendedienst，Berlin，Germany）及び末梢血サンプルを、地方倫理委員会の承認に従ってインフォームドコンセント後に健常ドナーから得た。フィコールハイパック勾配（Sigma-Aldrich）を用いてＰＢＭＣを分離した。細胞表面抗原を、以下のモノクローナル抗体を用いて、単一パラメーター又は多重パラメーターの蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）分析によって分析した：ＰＥ−抗ＣＣＲ６（１１Ａ９）及びＡｌｅｘａ７００−抗ＣＤ４（ＲＰＡ−Ｔ４）（どちらもBD Biosciences製）。ＡＰＣ−抗ＣＤ２５（ＢＣ９６）はebioscienceから購入した。Beckman Coulter製のＰＥ−Ｃｙ５−抗ＣＤ８（Ｂ９．１１）、ＰＥ−Ｃｙ５−抗ＣＤ５６（Ｎ９０１）及びＦＩＴＣ−抗ＣＤ２５（Ｂ１．４９．９）。社内（DRFZ，Berlin）で生成された抗体：ＦＩＴＣ−抗ＣＤ４５ＲＡ（４Ｇ１１）、Ａｌｅｘａ４０５−抗ＣＤ４（ＴＴ１）及びＡｌｅｘａ４０５−抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）。一部の実験では、ＣＣＲ６発現をビオチン化ＣＣＲ６（１１Ａ９、BD Biosciences）を用いた間接免疫蛍光法によって検出し、続いてＡＰＣ結合ストレプトアビジン（SouthernBiotech）を用いて染色した。染色は非特異的な結合を遮断するために、０．５％ウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝生理食塩水中で行った。ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（BD Biosciences）をデータ取得に用い、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Treestar）を使用して分析を行った。
【００７７】
Ｔ細胞の単離及びＦＡＣＳ（商標）選別
抗ＣＤ４磁性ビーズ又は抗ＣＤ８磁性ビーズのそれぞれ及び自動ＭＡＣＳ分離システム（Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany）をメーカーの使用説明書に従って用いて、全ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞をＰＢＭＣから富化した。抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ２５、抗ＣＤ４５ＲＡ及び抗ＣＣＲ６を用いた続く染色の後、以下の細胞集団をＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）又はＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）細胞選別装置（BD Biosciences）で選別した：ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ４５ＲＡ＋）、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ）、ＣＣＲ６−ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＣＲ６−記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ４５ＲＡ−）、ＣＣＲ６＋記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＣＲ６−ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ８＋ＣＤ２５−ＣＤ４５ＲＡ＋）、ＣＣＲ６−記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ８＋ＣＤ２５−ＣＤ４５ＲＡ−）及びＣＣＲ８＋記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞。再分析の際に、選別した細胞は常に９８％を超える純度を示した。ｅｘ  ｖｉｖｏで単離した細胞を、メチル化分析又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養（下記を参照されたい）のいずれかに使用した。
【００７８】
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞及び記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴ細胞培養
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養アッセイについては、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、非必須刺激（non-essential stimulation）、β−メルカプトエタノール及び５％ヒト血清を含有するＲＰＭＩ  １６４０  Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（Invitrogen）（完全培地（ＣＭ））中で細胞を培養した。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の刺激については、１×１０５個の細胞を平底マイクロタイタープレート内で、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８でコーティングされた１×１０５個の磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Invitrogen）とともに、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２（R&D Systems）並びにＩＬ−４、ＩＬ−１２及びＩＦＮ−γに対する２μｇ／ｍｌの中和抗体を添加したＣＭ（中性条件、抗体はBD Biosciences製）中で４日間培養し、続いて１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Chiron）を含有するＣＭに移した。ナイーブＣＤ４＋細胞でのＣＣＲ６の誘導については、以下のサイトカインを培養の初めに添加した：１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（R&D）。一部の実験では、細胞の刺激を同じ条件下で最大３回繰り返した。メチル化阻害薬５’−アザシチジン（Ａｚａ、Sigma-Aldrich）によるナイーブＣＤ４＋細胞でのＣＣＲ６の誘導については、４８時間の培養後に５μＭのＡｚａを添加した。
【００７９】
記憶ＣＤ４＋ＣＣＲ６＋細胞及び記憶ＣＤ４＋ＣＣＲ６−細胞を、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）を用いて染色し、上記に記載されるような磁性ビーズ、又は１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５（R&D Systems）を含有するＣＭ中で培養した。４日後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを含有する培養物のみを、１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Chiron）を含有するＣＭに移した。培養の終了時に、細胞をフローサイトメトリーによって分析し、メチル化分析（下記を参照されたい）に使用した。
【００８０】
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
ヒトＣＣＲ６遺伝子座の差次的にメチル化される領域を、鋳型としてヒトｃＤＮＡ、及び以下のプライマーを用いたＰＣＲによって増幅した：（Ａ）５’−ＧＡＣＴＡＣＧＣＧＴＣＡＧＴＡＡＧＧＧＧＧＡＧＣＣＡＣＴＧ−３’（配列番号１１）、（Ｂ）５’−ＧＡＣＴＡＧＡＴＣＴＣＡＡＧＧＡＡＡＧＣＡＧＣＴＧＡＣＧＡ−３’（配列番号１２）。増幅された５０１ｂｐの要素を、ＭｌｕＩ及びＢｇｌＩＩによってｐＧＬ３プロモーターベクター（Promega）に、最小ＳＶ４０プロモーターの前にクローニングし、ｐＧＬ３−ＣＣＲ６を生成した。クローニングした領域のシークエンシングから、Ｅｎｓｅｍｂｌに保管されたヒトゲノムのＣＣＲ６領域配列との１００％の同一性が明らかになった。
【００８１】
ＭＡＣＳによって選別された全ＣＤ４＋Ｔ細胞を、２．５μｇのｐＧＬ３プロモーターベクター又はｐＧＬ３−ＣＣＲ６ベクターを用いてトランスフェクトした。合成ウミシイタケルシフェラーゼレポーターベクター（ｐＲＬ−ＴＫ、Promega）（１．５μｇ）を、トランスフェクション効率の内部対照として使用した。ヌクレオフェクション（Lonza）によるトランスフェクションの４時間後に、細胞をＩＬ−２を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養するか、又はＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ、Sigma）及びイオノマイシン（５００ｎｇ／ｍｌ、Sigma）で４時間刺激した。４８時間の培養後に細胞を採取し、デュアルルシフェラーゼアッセイシステム（Promega）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。データをウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して正規化した。
【００８２】
プライマー、ＤＮＡ調製、バイサルファイト変換、ＰＣＲ及びシークエンシング
プライマーをバイサルファイト特異的ＰＣＲ及びシークエンシング反応に使用した。ゲノムＤＮＡを、選別されたＴ細胞サブセットからＤＮｅａｓｙ組織キット（Qiagen）を用いて、培養動物細胞用のプロトコルに従って単離した。ゲノムＤＮＡのバイサルファイト処理を、これまでに記載されているように行った（Olek A, Oswald J,
Walter J. A modified and improved method for bisulphite
based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996;24:5064-5066.）。ＰＣＲを、１×ＰＣＲバッファー、１ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Qiagen）、２００μＭ  ｄＮＴＰ、各１２．５ｐｍｏｌのフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びに７ｎｇのバイサルファイト処理したゲノムＤＮＡを含有する２５μＬの最終容量で、９５℃で１５分間、並びに９５℃で１分間、５５℃で４５秒間及び７２℃で１分間の４０サイクル、及び７２℃で１０分間の最終伸長工程で行った。ＰＣＲ産物をＥｘ−ｏＳＡＰ−ＩＴ（USB Corp.）を用いて精製し、ＰＣＲプライマー及びＡＢＩ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１ケミストリ（Applied Biosystems）を適用してシークエンシングし、続いてＡＢＩ  ３１００遺伝子分析装置でキャピラリー電気泳動を行った。ＥＳＭＥを用いてＡＢ１ファイルを解釈した（Lewin J, Schmitt
AO, Adorjan P, Hildmann T, Piepenbrock C. Quantitative DNA methylation analysis based
on four-dye trace data from direct sequencing of PCR amplificates.
Bioinformatics. 2004; 20:3005-3012.）。
【００８３】
好ましいプライマー及びプローブの例は以下の通りである：
アンプリコン８８８の増幅プライマー（バイサルファイトシークエンシング用）：
フォワード：（８８８ｐ）ＧＴＴＡＧＴＧＧＧＧＴＴＧＡＧＴＡＧＧＡＴＡ（配列番号１）
リバース：（８８８ｏ）ＡＡＡＡＣＣＣＴＡＡＡＡＴＣＡＣＡＡＡＡＣＴＡ（配列番号２）
アンプリコン１２０１の増幅プライマー（バイサルファイトシークエンシング用）：
１２０１ｑ  ＴＴＧＧＴＡＡＴＧＴＴＴＧＴＴＴＧＧＡＡＡＧ（配列番号３）
１２０１ｒ  ＣＴＣＣＴＡＡＡＴＣＣＣＴＣＡＡＣＡＴＣＴＡ（配列番号４）
アンプリコン１２０２の増幅プライマー（バイサルファイトシークエンシング用）：
１２０２ｏ  ＡＡＡＣＴＣＡＣＡＡＣＴＴＣＣＴＴＣＡＣＴＣ（配列番号５）
１２０２ｐ  ＡＡＧＧＧＴＡＧＴＧＴＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＴＴ（配列番号６）
アンプリコン１２０３の増幅プライマー（バイサルファイトシークエンシング用）：
１２０３ｏ  ＣＡＣＣＴＡＡＴＣＴＴＣＡＴＡＴＡＡＣＡＣＡＡＡＡ（配列番号７）
１２０３ｐ  ＧＧＴＡＴＡＧＴＧＴＡＴＴＧＧＧＡＡＧＴＧＧ（配列番号８）
アンプリコン１２０４の増幅プライマー（バイサルファイトシークエンシング用）：
１２０４ｒ  ＴＣＴＣＴＴＴＴＴＣＴＴＡＴＣＡＣＴＴＴＡＣＣＡ（配列番号２７）
１２０４ｑ  ＴＧＴＴＴＴＴＡＧＧＡＡＡＧＧＡＡＧＴＴＴＧ（配列番号２８）
アンプリコン１０３７の増幅プライマー（配列番号２９；バイサルファイトシークエンシング用）：
１０３７ｏ  ＣＣＴＴＡＴＣＴＡＣＴＴＣＴＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴ（配列番号９）
１０３７ｐ  ＡＧＴＧＡＴＧＡＧＴＴＧＴＧＡＧＧＴＡＧＧＴ（配列番号１０）
ＤＭＲの増幅プライマー（バイサルファイトシークエンシング用）：
ＣｐＧ（メチル化）特異的ＰＣＲシステム
フォワードプライマー  ＧＡＧＡＴＧＡＴＡＡＧＧＧＧＴＧＣ（配列番号１４）
リバースプライマー  ＡＣＡＣＣＴＣＡＣＣＴＡＡＡＴＣＧ（配列番号１５）
プローブ  ＨＥＸ−ＴＴＴＡＧＧＣＧＴＧＡＧＧＡＣＧＴＧＧＡＧＴＴ−ＢＨＱ１（配列番号１６）
ＴｐＧ（脱メチル化）特異的ＰＣＲシステム
フォワードプライマー  ＧＡＧＡＴＧＡＴＡＡＧＧＧＧＴＧＴ（配列番号１７）
リバースプライマー  ＡＣＣＡＣＡＣＣＴＣＡＣＣＴＡＡＡＴＣＡ（配列番号１８）
プローブ  ＦＡＭ−ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＴＧＡＧＧＡＴＧＴＧＧＡＧＴＴＴＡＧＧＧ−ＢＨＱ１（配列番号１９）
【００８４】
ＣＣＲ６  ＤＭＲアッセイのゲノム標的領域は太字で示し、ＣｐＧには下線を引いている：
ＧＣＣＡＧＴＧＧＧＧＴＴＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＣＡＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＴＡＧＣＴＧＧＴＴＣＣＣＣＡＧＡＧＡＧＡＴＧＡＴＡＡＧＧＧＧＴＧＣＧＣＴＣＣＡＧＣＴＴＣＴＣＡＧＧＣＴＣＡＣＴＣＡＧＧＣＧＴＧＡＧＧＡＣＧＴＧＧＡＧＣＴＣＡＧＧＧＣＴＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＧＡＧＣＧＡＣＣＣＡＧＧＴＧＡＧＧＴＧＴＧＧＴＣＡＡＧＡＴＡＧＡＧＣＡＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＣＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＧＣＣＴＣＧＴＧＧＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＡＧＧＣＡＣＡＧＴＧＣＡＣＴＧＧＧＡＡＧＴＧＧＡＧＡＡＡＧＴＧＴＧＡＧＴＣＣＡＴＣＡＧＧＣＴＧＧＣＴＧＡＧＡＡＴＴＧＡＴＣＡＣＧＡＡＣＣＴＡＴＴＧＴＣＴＧＴＡＡＡＡＣＴＴＴＴＧＴＴＡＴＴＴＣＣＴＧＡＧＡＣＧＴＧＧＴＴＣＡＣＡＧＣＡＡＣＣＣＡＧＧＴＧＣＧＡＡＣＡＧＣＣＴＴＧＴＧＡＴＴＣＴＡＧＧＧＴＴＣＴ（配列番号１３）
【００８５】
コンピュータによる分析
推定転写因子結合部位の予測については、ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒツール（Genomatix）を用いた。
【００８６】
統計
データは平均±ＳＤとして表す。群間差を、指定のマンホイットニー検定又はウィルコクソン順位検定を用いて評価した。０．０５未満のＰ値は有意であるとみなした。
【００８７】
実施例１
ＣＣＲ６遺伝子座内の非コード領域は、ＣＣＲ６発現と相関して差次的メチル化を示す
本発明者らは以前に、差次的メチル化ハイブリダイゼーション（ＤＭＨ）技法を用いて通常のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ４＋Ｔｒｅｇとを比較することによって、ヒトＴｒｅｇにおける後成的に調節される遺伝子のスクリーニングを行った（非特許文献２０）。このＤＭＨスクリーニングでは、ＣＣＲ６が差次的にメチル化される遺伝子の一つであることが分かった。好ましい差次的にメチル化される領域は、報告された２つのＣＣＲ６転写産物の上流に位置し、推定ＣＣＲ６プロモーターと重複する（図１Ａ）。ＤＭＨのデータを確認するために、本発明者らは、ヒト末梢血から単離された通常のナイーブＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ４＋Ｔｒｅｇに由来するゲノムＤＮＡを用いてバイサルファイトシークエンシングを行った。ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ４＋Ｔｒｅｇは、大部分が脱メチル化されたＣＣＲ６領域を示したが（平均メチル化率２３．８％）、通常のナイーブＴ細胞はほぼ完全にメチル化されていた（平均メチル化率８１％）（図１Ｂ）。
【００８８】
Ｔｒｅｇ（Kleinewietfeld M, Puentes F, Borsellino G, Battistini L, Rotzschke O, Falk
K. CCR6 expression defines regulatory effector/memory-like cells within the
CD25+CD4+ T-cell subset. Blood. 2005;105:2877-2886.）に加えて、ＣＣＲ６の発現はＣＤ４＋記憶Ｔ細胞及びＣＤ８＋記憶Ｔ細胞の両方について報告されている。ＣＣＲ６遺伝子座の観察された脱メチル化が、ｅｘ  ｖｉｖｏでＣＣＲ６を発現する細胞の画分に限定されるか否かを理解するために、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞のサブセットを、ＣＣＲ６及びＣＤ４５ＲＡの発現に従って選別し（図２Ａ）、ＣＣＲ６遺伝子座のバイサルファイトシークエンシングによって分析した。ＣＣＲ６発現を欠くナイーブＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、及びＣＣＲ６−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４＋記憶Ｔ細胞の両方が強くメチル化されたが、ＣＣＲ６を発現するＣＤ４＋記憶Ｔ細胞は、分析したＣＣＲ６領域のほぼ完全な脱メチル化を示した（図２Ｂ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞は全体的に低いＤＮＡメチル化レベルを示したが、ＣＣＲ６＋ＣＤ８＋記憶Ｔ細胞は明らかにＣＣＲ６−ＣＤ８＋記憶Ｔ細胞と比較して低いメチル化ＣＣＲ６領域を示した（図２Ｂ）。これらのデータに一致して、休止期のＣＤ１４＋単球及びＣＤ１５＋顆粒球等のＣＣＲ６発現を欠く末梢血白血球サブセットは、ほぼ完全にメチル化されたＣＣＲ６領域を示したが（平均メチル化率８４％超）、ＣＣＲ６を発現するＣＤ５６＋ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞並びに成熟Ｂ細胞は、この部位で完全に脱メチル化されていた。まとめると、本発明者らのデータは、ＣＣＲ６発現がヒト白血球においてＣＣＲ６領域の脱メチル化と相関することを示している。
【００８９】
ＣＣＲ６＋Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ展開時にＣＣＲ６を安定に発現し、脱メチル化されたＣＣＲ６領域を維持する
ＣＤ４＋記憶Ｔ細胞上のＣＣＲ６発現及び分析したＣＣＲ６領域の対応するメチル化パターンの両方が、細胞分裂時に安定しているかを調べるために、選別されたＣＣＲ６＋ＣＤ２５−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４＋Ｔ細胞をＣＦＳＥで標識し、記憶細胞の恒常的代謝回転を媒介するサイトカインを用いて、又はＴＣＲによって誘発することによって刺激した。以前の報告（Geginat J, Sallusto F, Lanzavecchia A.
Cytokine-driven proliferation and differentiation of human naive, central
memory, and effector memory CD4(+) T cells. J Exp Med. 2001;194:1711-1719）と一致して、記憶Ｔ細胞がＩＬ−７及びＩＬ−１５等の恒常性サイトカインの存在下で増殖し、多数の細胞分裂の後であっても全ての増殖細胞が高レベルのＣＣＲ６発現を維持していた（図３Ａ）。ＴＣＲ刺激はＣＣＲ６発現の下方調節をもたらし（Sallusto F, Kremmer E, Palermo B, et al. Switch in chemokine receptor
expression upon TCR stimulation reveals novel homing potential for recently
activated T cells. Eur J Immunol.
1999;29:2037-2045）、これはＴＧＦ−βによって阻害され、ＩＬ−４によって促進された（図３Ａ及び図３Ｂ）。しかしながら、試験した全ての刺激条件下で、ＣＣＲ６領域のメチル化状態は変化しないままであり、同等の低レベルのメチル化を示した（図３Ｃ）。重要なことには、ＴＣＲ刺激の際にＣＣＲ６発現を失ったＣＣＲ６−／ｌｏｗ細胞が、ＴＣＲ刺激の非存在下での培養後にＣＣＲ６を急速に再発現したため、ＴＣＲによって誘導されるＣＣＲ６発現の下方調節は一時的でしかなかった（図３Ｄ）。このため、ＣＣＲ６領域の脱メチル化はＣＣＲ６発現の長期安定性に関連する。
【００９０】
ＣＣＲ６発現のｉｎ  ｖｉｔｒｏ誘導は不安定であり、ＣＣＲ６領域の脱メチル化をもたらさない
ＣＣＲ６発現は、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１）＋ＴＧＦ−βのカクテルの存在下での活性化によって、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の画分に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導することができる。本発明者らは、この新たなＣＣＲ６発現の誘導が、ＣＣＲ６領域の脱メチル化と関連しているか否かについて分析した。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、炎症性サイトカイン及びＴＧＦ−βの存在下で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）で刺激した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の６日目に、サイトカインの非存在下で刺激したＴ細胞と比較して有意に高いＴ細胞の画分がＣＣＲ６を発現した（図４Ａ）。しかしながら、両方の細胞集団がＣＣＲ６領域内でほぼ完全にメチル化され、未刺激ナイーブＴ細胞に対して違いを示さなかった（図１Ｂ及び図２Ｂ）。ＣＣＲ６−細胞及びＣＣＲ６＋細胞への選別後も、新たに誘導されたＣＣＲ６＋細胞においてＣＣＲ６領域の選択的な脱メチル化は観察することができなかった（図４Ｂ）。サイトカインカクテルの存在下での反復刺激はＣＣＲ６＋細胞の頻度を更に増大したが、ＣＣＲ６領域の脱メチル化は依然として検出可能ではなく（図４Ｃ及び図４Ｄ）、炎症性サイトカインのカクテルがＣＣＲ６発現の誘導には十分であるが、ＣＣＲ６遺伝子座の脱メチル化には十分でないことが示された。ｅｘ  ｖｉｖｏで単離したＣＤ４＋記憶Ｔ細胞とは対照的に、炎症性サイトカインの存在下でのＴＣＲ刺激によるナイーブＴ細胞におけるＣＣＲ６の新たな誘導は、一時的なＣＣＲ６発現しかもたらさず、ほぼ全ての細胞が誘導性サイトカインの非存在下での長期のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の際にＣＣＲ６発現を失った（図４Ｄ）。
【００９１】
ＤＮＡメチル化の阻害は培養ナイーブＴ細胞において部分的に安定したＣＣＲ６発現をもたらす
ＤＮＡメチル化状態は、５’−アザシチジン（Ａｚａ）等のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤の存在下でのＤＮＡ複製の誘導によって薬理学的に操作することができる。分析されるＣＣＲ６領域の脱メチル化が、ＣＣＲ６発現の安定化に関与するか否かを更に調べるために、本発明者らは、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＡｚａの存在下で抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）を用いて活性化した。驚くべきことに、Ａｚａ処理は、外因性サイトカインの非存在下であっても相当な割合の細胞においてＣＣＲ６発現を誘導し、これらのＡｚａ処理細胞においてＣＣＲ６領域の明らかな脱メチル化を検出することができた（図５Ａ）。興味深いことに、Ａｚａによって誘導されたＣＣＲ６＋細胞を選別し、Ａｚａの非存在下で中性条件下にて再刺激すると、ＣＣＲ６発現の顕著な安定性がこれらの細胞において観察され、ＣＣＲ６遺伝子座の脱メチル化がＴ細胞において安定したケモカイン受容体の発現を制御することが更に示された。
【００９２】
ＣＣＲ６遺伝子座の差次的にメチル化される要素は転写活性を有する
ＣＣＲ６遺伝子座の好ましい差次的にメチル化される領域は、２つの予測ＣＣＲ６転写産物の４４４／４４６塩基上流に位置する（図１Ａ）。ＣＣＲ６領域は、コンピュータにより予測されたプロモーター領域と部分的に重複する。転写開始部位のようなプロモーターに典型的な要素はＣＣＲ６領域においては検出されなかったが、転写調節因子ＰＰＡＲ、ＧＡＴＡ、ＡＨＲ、ＥＴＳ１又はＲＸＲ（それらの一部、例えばＥＴＳ１はメチル化依存的にそれらの標的配列に結合する）の推定結合部位が検出された（Maier H, Colbert J, Fitzsimmons D, Clark DR, Hagman
J. Activation of the early B-cell-specific mb-1 (Ig-alpha)
gene by Pax-5 is dependent on an unmethylated Ets
binding site. Mol Cell Biol. 2003;23:1946-1960, and
own unpublished observations）。
【００９３】
ＣＣＲ６発現の転写調節に対するＣＣＲ６領域の役割を分析するために、本発明者らはこの要素を、転写活性を有するエンハンサー要素の検出を可能にするＳＶ４０最小プロモーターを含有するルシフェラーゼレポーターベクターにクローニングした。末梢血から単離された全Ｄ４＋Ｔ細胞へのトランスフェクション後、ルシフェラーゼレポーター構築物を含有するＣＣＲ６領域の転写活性は、空の対照ベクターと比較して約２．４倍増大した（図６）。興味深いことに、ＰＭＡ＋イオノマイシンによるトランスフェクトしたＣＤ４＋Ｔ細胞の刺激が同等の結果をもたらしたため、ＣＣＲ６領域の転写活性は細胞の活性化状態に依存しなかった。これらの発見から、ＣＣＲ６遺伝子座の差次的にメチル化される領域が、ＴＣＲ媒介シグナルとは独立してエンハンサー活性を示すことが実証され、この要素が記憶Ｔ細胞における安定したＣＣＲ６発現の維持に機能的に関与することが示唆される。
【００９４】
実施例２
種々のＴ細胞種を２人の独立したドナーから精製し、ＦＡＣＳ選別した。細胞傷害性Ｔ細胞及びヘルパーＴ細胞の分別のためのマーカーとしてＣＤ４及びＣＤ８を用いて、細胞を分離した。次いで、ＣＤ４５ＲＡを用いてこれらの集団をナイーブ細胞集団及び記憶細胞集団に更に分離した。記憶集団をＣＣＲ６陽性集団及びＣＣＲ６陰性集団に更に分離した。結果を以下の表１にまとめる。
【００９５】
表１：本発明による遺伝子のメチル化パターン（図８を参照されたい）
【表１】
2013524828.tif 000002
【００９６】
図１１に示されるバイサルファイトシークエンシングデータを確認するために、アンプリコン８８８におけるＣＣＲ６のＣｐＧ位置７１、９８、１０６及び１３５を対象にするｑＰＣＲ分析にサンプルを更に供した。使用したメチル化特異的な（「ＣｐＧ」特異的）プライマー対を配列番号１４／配列番号１５に示し、対応するプローブを配列番号１６に示す。脱メチル化された配列（「ＴｐＧ」特異的）を検出するために、配列番号１７／配列番号１８に示すプライマー対を、配列番号１９のプローブとともに使用した。結果を表２にまとめる。図１１に示されるバイサルファイトシークエンシング結果を、ｑＰＣＲアッセイにおいて確認することができた。
【００９７】
表２：２人のドナーで分析し、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋及びＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−に選別したＣＣＲ６のＤＮＡメチル化パターン（アンプリコン８８８）を示す
【表２】
2013524828.tif 000003
2013524828.tif 000004
2013524828.tif 000005
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【図１】
2013524828.tif 000007
【図２】
2013524828.tif 000008
【図３】
2013524828.tif 000009
【図４】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2013524828.tif 000014
【図８Ａ】
2013524828.tif 000015
【図８Ｂ】
2013524828.tif 000016
【図９】
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【図１０】
2013524828.tif 000018
【図１１】
2013524828.tif 000019
【図１２】
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【配列表】
2013524828000001.app
【国際調査報告】
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