(57)【要約】本発明は、二重相互作用的標識を有するＴＳＧプライマー（Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｐｒｉｍｅｒ）を利用したリアルタイム方式のターゲット核酸配列の検出に関する。本発明は、ＰＣＲ反応で使用されるプライマー内に二重相互作用的標識を導入することにより、ターゲット及びシグナルを全て増幅させて、複雑なオリゴヌクレオチドの使用無しに、ＰＣＲ反応によるリアルタイムターゲット検出を可能にする。本発明は、従来のリアルタイムＰＣＲ方法に係わる問題点及び短所から自由である。本発明は、標識プライマーだけを利用して、成功的にリアルタイムターゲット検出ができるようにする。また、本発明は、液相だけではなく、固相でもターゲット核酸配列の存在を示す強いシグナルを得ることができる。【選択図】図１ａ
2013514803.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターゲットシグナル発生プライマー（Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ、ＴＳＧプライマー）を利用してＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法であって、
（ａ）ターゲット核酸配列をＴＳＧプライマーとハイブリッド形成させる工程であって、前記ＴＳＧプライマーは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）レポーター分子及びクエンチャー分子を含み、前記ＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列とハイブリッド形成されない場合、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、前記ＴＳＧプライマーで３次元的に互いに隣接し、前記クエンチャー分子は、前記レポーター分子から出るシグナルをクエンチングして、前記ＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、前記ＴＳＧプライマーで３次元的に離隔され、前記クエンチャー分子は、前記レポーター分子から出るシグナルを脱消光して、これにより、前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生されて取得される工程と、
（ｂ）工程（ａ）の結果物をプライマー伸長条件下で鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって、前記ＴＳＧプライマーの３’−末端で３’−伸長反応が発生する工程と、
（ｃ）前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを検出する工程であって、これにより、前記シグナルは、ＤＮＡまたは核酸混合物内にターゲット核酸配列が存在することを示す工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼは、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有して、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性により前記ＴＳＧプライマーの３’−末端が伸長されて、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性により前記ＴＳＧプライマーの５’−末端が切断され、これにより前記レポーター分子または前記クエンチャー分子が前記ＴＳＧプライマーから放出されて、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法は、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを増幅させるために、前記工程（ａ）−（ｂ）または（ａ）−（ｃ）を少なくとも２回反復する工程と、その反復サイクルの間に変性過程とをさらに含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ｃ）におけるシグナル検出は、リアルタイム方式、エンド−ポイント（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ）方式または指定時間間隔（ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｔｉｍｅ  ｉｎｔｅｒｖａｌ）方式で行われる請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼは、５’→３’ヌクレアーゼ活性のない鋳型依存的核酸ポリメラーゼである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＴＳＧプライマーは、下記一般式Ｉの二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有する請求項１に記載の方法。
５’−Ｘｐ−Ｙｑ−Ｚｒ−３’  （Ｉ）
（式中、Ｘｐは、ターゲット核酸と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第１プライミング部位であり、Ｙｑは、少なくとも三つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚｒは、ターゲット核酸と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第２プライミング部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ、Ｙ及びＺは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであり、５’−第１プライミング部位のＴｍは、３’−第２プライミング部位のＴｍより高く、前記分割部位は、前記三つの領域のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、ターゲット核酸配列に対するアニーリングに関して、５’−第１プライミング部位を３’−第２プライミング部位から分割し、これにより、前記オリゴヌクレオチドの前記アニーリング特異性が、５’−第１プライミング部位及び３’−第２プライミング部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＳＧプライマーの全体アニーリング特異性を向上させる。）
【請求項７】
前記ＴＳＧプライマーの前記レポーター分子または前記クエンチャー分子は、５’−末端またはその５’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔された位置にある請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記ＴＳＧプライマーの前記レポーター分子または前記クエンチャー分子は、５’−末端に位置する請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＴＳＧプライマーは、その５’−末端に前記ターゲット核酸配列と非相補的な非ハイブリッド形成ヌクレオチド配列をさらに含み、前記非ハイブリッド形成ヌクレオチド配列は、ヘアピンループ構造を形成しない請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＴＳＧプライマーの前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子の一つは、非ハイブリッド形成ヌクレオチド配列に位置して、他の一つは、ハイブリッド形成ヌクレオチド配列に位置している請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記クエンチャー分子は、蛍光であり、工程（ｃ）で検出されるターゲット核酸配列の存在を示すシグナルは、前記蛍光クエンチャー分子から出るシグナルである請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼである請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＴＳＧプライマーは、その３’−末端部位に前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性に対して耐性を有するバックボーンを含む少なくとも１個のミスマッチヌクレオチドを有する請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法は、液相または固相で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法は、固相で行われて、前記ＴＳＧプライマーは、その５’−末端を介して固相基質の表面に固定化される請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み、前記ＴＳＧプライマーは、少なくとも２種のプライマーを含む請求項１または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む請求項１または１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ターゲット核酸配列は、前増幅された核酸配列である請求項１または１５に記載の方法。
【請求項１９】
ターゲットシグナル発生プライマー（Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ、ＴＳＧプライマー）を利用した増幅反応を通じてＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法であって、
（ａ）前記ターゲット核酸配列を増幅できる正方向プライマー及び逆方向プライマーとしての二つのプライマーを含む一対のプライマーと前記ターゲット核酸配列をハイブリッド形成させる工程であって、前記二つのプライマーのうち、少なくとも一つは、ＴＳＧプライマーであり、前記ＴＳＧプライマーは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）レポーター分子及びクエンチャー分子を含み、前記ＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列とハイブリッド形成されない場合、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、前記ＴＳＧプライマーで３次元的に互いに隣接し、前記クエンチャー分子は、前記レポーター分子から出るシグナルをクエンチングして、前記ＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、前記ＴＳＧプライマーで３次元的に離隔され、前記クエンチャー分子は、前記レポーター分子から出るシグナルを脱消光して、これにより、前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生されて取得される工程と、
（ｂ）工程（ａ）の結果物をプライマー伸長条件下で鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって前記二つのプライマーの３’−末端で３’−伸長反応が発生する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）の結果物を変性させる工程と、
（ｄ）前記工程（ａ）−（ｃ）を少なくとも２回反復し、前記ターゲット核酸配列及び前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルを全て増幅する工程と、
（ｅ）前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを検出する工程であって、前記シグナル検出は、工程（ｄ）の前記反復の各サイクルにおいて、工程（ｄ）の前記反復の終了時点で、または前記反復の間の指定時間間隔のそれぞれで行われて、このようなシグナルは、ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼは、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有して、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性により前記ＴＳＧプライマーの３’−末端が伸長されて、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性により前記ＴＳＧプライマーの５’−末端が切断され、これにより前記レポーター分子または前記クエンチャー分子が前記ＴＳＧプライマーから放出されて、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼは、５’→３’ヌクレアーゼ活性のない鋳型依存的核酸ポリメラーゼである請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記二つのプライマーのうち、少なくとも一つは、下記一般式Ｉの二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有する請求項１９に記載の方法。
５’−Ｘｐ−Ｙｑ−Ｚｒ−３’  （Ｉ）
（式中、Ｘｐは、ターゲット核酸と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第１プライミング部位であり、Ｙｑは、少なくとも三つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚｒは、ターゲット核酸と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第２プライミング部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ、Ｙ及びＺは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであり、５’−第１プライミング部位のＴｍは、３’−第２プライミング部位のＴｍより高く、前記分割部位は、前記三つの領域のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、ターゲット核酸配列に対するアニーリングに関して、前記５’−第１ハイブリダイゼーション部位を前記３’−第２ハイブリダイゼーション部位から分割し、これにより、前記オリゴヌクレオチドの前記アニーリング特異性が、前記５’−第１プライミング部位及び前記３’−第２プライミング部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＳＧプライマーの全体アニーリング特異性を向上させる。）
【請求項２３】
前記ＴＳＧプライマーの前記レポーター分子または前記クエンチャー分子は、５’−末端またはその５’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔された位置にある請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＴＳＧプライマーの前記レポーター分子または前記クエンチャー分子は、５’−末端に位置する請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＴＳＧプライマーは、その５’−末端に前記ターゲット核酸配列と非相補的な非ハイブリッド形成ヌクレオチド配列をさらに含み、前記非ハイブリッド形成ヌクレオチド配列は、ヘアピンループ構造を形成しない請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＴＳＧプライマーの前記レポーター分子または前記クエンチャー分子の一つは、非ハイブリッド形成ヌクレオチド配列に位置して、他の一つは、ハイブリッド形成ヌクレオチド配列に位置する請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記クエンチャー分子は、蛍光であり、工程（ｅ）で検出されるターゲット核酸配列の存在を示すシグナルは、前記蛍光クエンチャー分子から出るシグナルである請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼである請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＴＳＧプライマーは、その３’−末端部位に鋳型依存的核酸ポリメラーゼの３’→５’ヌクレアーゼ活性に対して耐性を有するバックボーンを含む少なくとも１個のミスマッチヌクレオチドを有する請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記方法は、液相または固相で行われる請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
前記方法は、固相で行われて、前記二つのプライマーのうち、少なくとも一つは、その５’−末端を介して固相基質の表面に固定化されて、前記固定化されたプライマーは、ＴＳＧプライマーである請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み、前記プライマー対は、少なくとも二つのプライマー対を含み、それぞれのプライマー対の少なくとも一つのプライマーは、ＴＳＧプライマーである請求項１９または３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む請求項１９または３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記ターゲット核酸配列は、前増幅された核酸配列である請求項１９または３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記プライマー対は、ｎｅｓｔｅｄ増幅用プライマー対である請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記増幅は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって行われる請求項１９または３１に記載の方法。
【請求項３７】
ターゲットシグナル発生プライマー（Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ、ＴＳＧプライマー）を利用してＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキットであって、
（ａ）ＴＳＧプライマーであって、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）レポーター分子及びクエンチャー分子を含み、前記ＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列とハイブリッド形成されない場合、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、前記ＴＳＧプライマーで３次元的に互いに隣接し、前記クエンチャー分子は、前記レポーター分子から出るシグナルをクエンチングして、前記ＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、前記ＴＳＧプライマーで３次元的に離隔され、前記クエンチャー分子は、前記レポーター分子から出るシグナルを脱消光して、これにより、前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生されて取得されるＴＳＧプライマーと、
（ｂ）鋳型依存的核酸ポリメラーゼであって、前記ＴＳＧプライマーと前記ターゲット核酸配列間のハイブリッド形成結果物に作用し、前記ＴＳＧプライマーの３’−末端に３’−伸長反応を発生させることができる鋳型依存的核酸ポリメラーゼと、
を含むことを特徴とするキット。
【請求項３８】
前記キットは、前記ターゲット核酸配列を増幅できる正方向プライマー及び逆方向プライマーとしての二つのプライマーを含む一対のプライマーを含み、前記二つのプライマーのうち、少なくとも一つは、前記ＴＳＧプライマーである請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼは、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有して、そのポリメラーゼ活性によりＴＳＧプライマーの３’−末端に３’−伸長反応及びその５’→３’ヌクレアーゼ活性によりＴＳＧプライマーの５’−末端に５’−切断反応の両方を発生させる請求項３７または３８に記載のキット。
【請求項４０】
前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼは、５’→３’ヌクレアーゼ活性のない鋳型依存的核酸ポリメラーゼである請求項３７または３８に記載のキット。
【請求項４１】
前記ＴＳＧプライマーまたは前記二つのプライマーの少なくとも一つは、下記一般式Ｉの二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有する請求項３７または３８に記載のキット。
５’−Ｘｐ−Ｙｑ−Ｚｒ−３’  （Ｉ）
（式中、Ｘｐは、ターゲット核酸と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第１プライミング部位であり、Ｙｑは、少なくとも三つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚｒは、ターゲット核酸と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第２プライミング部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ、Ｙ及びＺは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであり、５’−第１プライミング部位のＴｍは、３’−第２プライミング部位のＴｍより高く、前記分割部位は、前記三つの領域のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、ターゲット核酸配列に対するアニーリングに関して、５’−第１プライミング部位を３’−第２プライミング部位から分割し、これにより、前記オリゴヌクレオチドの前記アニーリング特異性が、前記５’−第１プライミング部位及び前記３’−第２プライミング部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＳＧプライマーの全体アニーリング特異性を向上させる。）
【請求項４２】
前記ＴＳＧプライマーの前記レポーター分子または前記クエンチャー分子は、５’−末端またはその５’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔された位置にある請求項３７から３９のいずれかに記載のキット。
【請求項４３】
前記ＴＳＧプライマーの前記レポーター分子または前記クエンチャー分子は、５’−末端に位置する請求項４２に記載のキット。
【請求項４４】
前記ＴＳＧプライマーは、その５’−末端に前記ターゲット核酸配列と非相補的な非ハイブリッド形成ヌクレオチド配列をさらに含み、前記非ハイブリッド形成ヌクレオチド配列は、ヘアピンループ構造を形成しない請求項３７または３８に記載のキット。
【請求項４５】
前記ＴＳＧプライマーの前記レポーター分子または前記クエンチャー分子の一つは、非ハイブリッド形成ヌクレオチド配列に位置して、他の一つは、ハイブリッド形成ヌクレオチド配列に位置する請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼである請求項３７または３８に記載のキット。
【請求項４７】
前記ＴＳＧプライマーは、その３’−末端部位に前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性に対して耐性を有するバックボーンを含む少なくとも１個のミスマッチヌクレオチドを有する請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
前記キットは、液相反応用または固相反応用である請求項３７または３８に記載のキット。
【請求項４９】
前記キットは、固相反応用であり、前記ＴＳＧプライマーは、５’−末端を介して固相基質の表面に固定化される請求項３７に記載のキット。
【請求項５０】
前記キットは、固相反応用であり、前記二つのプライマーの少なくとも一つは、５’−末端を介して固相基質の表面に固定化されて、前記固定化されたプライマーは、ＴＳＧプライマーである請求項３８に記載のキット。
【請求項５１】
前記ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み、前記ＴＳＧプライマーは、少なくとも２種のプライマーを含む請求項３７または４９に記載のキット。
【請求項５２】
前記ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み、前記プライマー対は、少なくとも二つのプライマー対を含み、それぞれのプライマー対の少なくとも一つのプライマーは、ＴＳＧプライマーである請求項３８または５０に記載のキット。
【請求項５３】
前記ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む請求項３７、３８、４９及び５０のいずれかに記載のキット。
【請求項５４】
前記ターゲット核酸配列は、前増幅された核酸配列である請求項３７、３８、４９及び５０のいずれかに記載のキット。
【請求項５５】
請求項３８または５０に記載のプライマー対は、ｎｅｓｔｅｄ増幅用プライマー対である請求項５４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＳＧプライマー（Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｐｒｉｍｅｒ）を利用したターゲット核酸配列の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
ターゲット核酸増幅過程は、ターゲット核酸を検出するための大部分の技術に広く関与している。核酸増幅は、分子生物学分野で利用される極めて重要（ｐｉｖｏｔａｌ）な過程であって、多様な増幅方法が提示された。例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈ．Ｉ．ら（特許文献１）は、プロモーター／プライマー配列をターゲット一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）にハイブリッド形成させた後、前記配列の多いＲＮＡコピーを転写する過程を含む核酸配列増幅方法を開示している。他の公知の核酸増幅方法は、転写に基づく増幅システムを含む（非特許文献１；及び特許文献２（Ｇｉｎｇｅｒａｓ  Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，））。
【０００３】
ポリメラーゼ連鎖反応（以下、‘ＰＣＲ’という）として公知された、最もよく利用される核酸増幅方法は、二本鎖ＤＮＡの変性、ＤＮＡ鋳型へのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング及びＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長の反復されたサイクル過程を含む（Ｍｕｌｌｉｓら、特許文献３〜５；非特許文献２）。
【０００４】
ＰＣＲ関連技術は、ターゲットＤＮＡ配列の増幅だけではなく、生物学と医学の研究分野で科学的応用又は方法に広く利用されており、例えば、ターゲット配列の検出、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、ディファレンシャルディスプレイ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｄｉｓｐｌａｙ）ＰＣＲ（ＤＤ−ＰＣＲ）、公知あるいは未知の遺伝子のＰＣＲを利用したクローニング、ｃＤＮＡ末端の高速増幅（ＲＡＣＥ）、任意的プライミングＰＣＲ（ＡＰ−ＰＣＲ）、マルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＰＣＲ、ＳＮＰゲノムタイピング、及びＰＣＲ関与ゲノム分析（非特許文献３）がある。
【０００５】
一方、現在まで提示された核酸増幅に基づいたターゲット核酸検出方法は、以下の通りである。
【０００６】
１．ポストＰＣＲ検出方法
典型的にポストＰＣＲ方法は、ターゲット核酸配列を分析するために、核酸増幅及び以後の増幅産物の検出を含む。従来のポストＰＣＲ検出方法によると、増幅産物を大きさの差によって離隔するか（一般に、ゲル電気泳動を利用して行う）、または増幅産物の固定化により離隔しなければならない。しかし、離隔過程は、持ち込み物による汚染及び低い処理性のような深刻な問題を引き起こす。
【０００７】
２．リアルタイム検出方法
ポストＰＣＲ方法の問題点を克服するために、リアルタイムで増幅された産物を検出するリアルタイムＰＣＲ方法が提示されて、汚染から自由になって、ターゲット核酸配列を定量的に分析することができるようになった。
【０００８】
２．１  標識プライマーベースの方法
２．１．１  サンライズプライマー方法
この方法は、５’末端にヘアピンループを形成し、蛍光団及びクエンチャーの一対を互いに隣接させ、減少された蛍光を示すサンライズプライマー（Ｓｕｎｒｉｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ）を利用する。このようなプライマーがＰＣＲ産物に取り込まれた場合、テイル部分が二本鎖になって、ヘアピンが解けて蛍光を増加させる（非特許文献４、及び特許文献６）。しかし、サンライズプライマー方法は、プライマーがターゲット核酸配列に相補的な配列及びその５’−末端にヘアピンループを形成できる配列を含むように複雑にデザインしなければならず、このような側面で便宜性が大きく劣る。また、プライマーにおいて、ヘアピンループの存在は、ターゲット核酸に対するハイブリッド形成効率を減少させる。
【０００９】
２．１．２  スコーピオンプライマー方法
この方法は、統合（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）シグナリングシステムを含むスコーピオンプライマーを利用する。前記プライマーは、鋳型結合領域及びテイルを有して、テイルは、リンカーとターゲット結合領域を含む。ターゲット結合領域は、プライマーの伸長産物で相補的な配列とハイブリッド形成される。その後、ターゲット特異ハイブリッド形成イベントは、シグナリングシステムとカップリングされて、ハイブリッド形成は、検出可能な変化を引き起こす。テイルドプライマーのリンカーは、プライマー鋳型のテイル領域のポリメラーゼ−媒介連鎖複写を妨害する（非特許文献５、特許文献７）。テイルドプライマーは、アンプリコン−依存的シグナルを発生させるためのリンカーと、プライマー伸長産物とハイブリッド形成されるターゲット結合領域をプライマーに含ませる必要があるため、サンライズプライマー方法と同様に、プライマーのデザイン及び合成に困難がある。また、プライマーにおいて、ヘアピンループの存在は、ターゲット核酸に対するハイブリッド形成効率を減少させる。
【００１０】
２．１．３  単一標識プライマー方法（Ｌｕｘ方法）
単一標識プライマー方法は、単一蛍光標識を含むプライマーを利用する方法であって、ターゲット配列とのハイブリッド形成によるプライマー上の蛍光特性の変化を観察し、ターゲット配列を検出する（特許文献８）。また、この方法は、効率的なシグナルの発生のためには、プライマーがヘアピンループ構造を備えなければならない。それだけではなく、標識の種類、蛍光標識周囲のプライマーの配列、プライマー上の蛍光標識の位置、周囲の他の成分など、多様な要素によりプライマー上の蛍光特性が変わる可能性があり、これは、プライマーデザインの最適化を難しくする。
【００１１】
２．１．４  ライオン方法（Ｌｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ；３’→５’ヌクレアーゼ活性を利用する）
この方法は、プライマーの３’−末端に少なくとも一つのヌクレオチドを人為的にミスマッチさせた標識プライマーを利用する。ハイブリッド形成がなされるに十分な条件下で標識プライマー及び試料がインキュベーションされて、次いで試料は、３’→５’校正活性を有する核酸ポリメラーゼに露出されて、これにより、標識または標識システムの一部が放出される（特許文献９）。
【００１２】
しかし、ミスマッチプライマーは、その３’末端にミスマッチヌクレオチドを含むように複雑にデザインしなければならない。しかも、３’末端が非ターゲット配列とミスマッチされる場合も、ミスマッチプライマーは、３’→５’校正活性を有する核酸ポリメラーゼにより、擬陽性シグナルを発生する可能性が高い。
【００１３】
２．２  標識プローブベースの方法
２．２．１  分子ビーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ）方法
分子ビーコンは、蛍光及びクエンチング染料を含むが、クエンチング染料が蛍光染料に隣接している場合にのみ、ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）が発生する。分子ビーコンは、溶液内で単一に存在する場合、ヘアピン構造を形成するようにデザインされており、これにより二つの染料が近接するようになる。
分子ビーコンがターゲットとハイブリッド形成される場合、蛍光及びクエンチャー染料は、離隔される。ＦＲＥＴは発生せず、蛍光染料は、照射（ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ）により光を放出する（非特許文献６及び７）。
【００１４】
しかし、分子ビーコン方法には幾つかの短所がある。
【００１５】
第一に、ヘアピン構造の二つの逆反復（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ）は、ターゲット核酸に相補的カウンターパートを有しなければならず、これは、ターゲットにおいても逆反復の存在を要求する。第二に、相補的核酸配列を有するヘアピン構造のループ部位のＴｍ及びステム部位のＴｍは、注意を払って均衡を合わせることが必要であり、これは、非特異的アンフォルディング（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）無しにターゲットが存在する時、ヘアピンプローブの特異的アンフォルディングが可能であるようにする分析温度を調節しなければならない。最後に、この方法は、ターゲット核酸配列を増幅するために、追加的にプライマーを必要とする。
【００１６】
２．２．２  ハイブリッド形成プローブ方法
この方法は、四つのオリゴヌクレオチドを利用する：二つのプライマー及び二つのプローブ。ハイブリッド形成プローブは単一標識を有して、一つは供与体蛍光団、他の一つは、受容体蛍光団を有する。二つのプローブの配列は、これらがヘッドツテイル方式（ｈｅａｄ  ｔｏ  ｔａｉｌ  ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）でターゲット配列にハイブリッド形成されるように選択されて、二つの染料を互いに近接するようにして、ＦＲＥＴが起こるようにする。プローブの一つにある受容体染料は、エネルギーを転移させて、他の一つは、異なる波長で蛍光を放出させる。蛍光の量は、ＰＣＲ過程の間に生成されるターゲットＤＮＡの量に正比例する（非特許文献６、８及び９）。
【００１７】
しかし、この方法は、マルチプレックス検出に適しておらず、ターゲット核酸配列を増幅するために、追加的にプライマーを必要とする。
【００１８】
２．２．３  ＴａｑＭａｎプローブ方法（５’→３’ヌクレアーゼ活性を利用する）
ＴａｑＭａｎプローブは、ＰＣＲ産物の内部にハイブリッド形成されるように製作される。ＰＣＲの間、即ち、ポリメラーゼがＴａｑＭａｎプローブの結合された鋳型を複製すると、ポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性は、プローブを切断させる。これは、蛍光とクエンチング染料を離隔して、ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）は、それ以上起こらない（非特許文献６及び８、並びに特許文献１０）。
【００１９】
しかし、この方法は、三つのオリゴヌクレオチド（一つの二重標識プローブ及び二つのプライマー）を利用するという側面で限界点を有する。この方法は、プローブのデザイン及び合成、そして反応条件の最適化を複雑にする。
【００２０】
２．２．４  セルフ−クエンチングプローブ方法（５’→３’ヌクレアーゼ活性を利用する）
セルフ−クエンチングプローブ方法は、ＰＣＲ産物の内部領域にハイブリッド形成される配列を有する二重標識プローブを利用する（特許文献１１）。
【００２１】
ＴａｑＭａｎプローブ方法と同様に、セルフ−クエンチングプローブ方法は、同時アッセイ（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ａｓｓａｙ）のために、三つのオリゴヌクレオチド（一つの二重−標識プローブ及び二つのプライマー）を利用する必要があり、これは、プローブデザイン及び反応条件の最適化を非常に複雑にする。
【００２２】
以上のように、今まで開発された従来のターゲット検出方法の大部分は、本質的な欠点を有して、これは、克服することが難しいと考えられる。
【００２３】
したがって、技術的、時間的及び費用的に効果的な、ターゲット核酸配列を検出する新規なアプローチが要求される。
【００２４】
本明細書全体にかけて多数の特許及び文献が参照されて、その引用が表示されている。引用された特許及び文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２５】
【特許文献１】国際公開第８９／０６７００号パンフレット
【特許文献２】国際公開第８８／１０３１５号パンフレット
【特許文献３】米国特許第４，６８３，１９５号明細書
【特許文献４】米国特許第４，６８３，２０２号明細書
【特許文献５】米国特許第４，８００，１５９号明細書
【特許文献６】米国特許第６，１１７，６３５号明細書
【特許文献７】米国特許第６，３２６，１４５号明細書
【特許文献８】米国特許第７，５３７，８８６号明細書
【特許文献９】米国特許第６，２４８，５２６号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，２１０，０１５号明細書
【特許文献１１】米国特許第５，７２３，５９１号明細書
【非特許文献】
【００２６】
【非特許文献１】Ｋｗｏｈ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６：１１７３−１１７７（１９８９）
【非特許文献２】Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０，１３５０−１３５４（１９８５）
【非特許文献３】ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍｏｌｌｅｒ，  ＰＣＲ．  ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ＮＹ（２０００）
【非特許文献４】Ｎａｚａｒｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２５  ｎｏ．１２：２５１６−２５２１（１９９７）
【非特許文献５】Ｗｈｉｔｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１７  ＡＵＧＵＳＴ：８０４−８０７（１９９９）
【非特許文献６】Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ，１２４：３８５−３９８（２００６）
【非特許文献７】Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１４  ＭＡＲＣＨ：３０３−３０８（１９９６）
【非特許文献８】Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ  １２４：３０３−３０８（２００６）
【非特許文献９】Ｂｅｒｎａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ，４６：１４７−１４８（２０００）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
本発明者らは、従来のターゲット核酸配列のリアルタイム検出技術の問題点を解決するために鋭意研究した。本発明者らは、ターゲット核酸配列に対するハイブリッド形成及び伸長反応に依存的にシグナルを発生させる新規なＴＳＧプライマー（Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｐｒｉｍｅｒ）を開発して、このＴＳＧプライマーを利用してターゲット核酸配列の検出のための多様なプロトコールを立案した。その結果、本発明者らは、本発明の新規なプロトコールまたは方法が、ターゲット核酸配列の検出、特に、リアルタイム検出において優れた作動性を示し、また、液相だけではなく固相でもより強くて迅速な方式でターゲット核酸配列を示すシグナルを発生させるということを確認した。
【００２８】
したがって、本発明の目的は、ＴＳＧプライマー（Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｐｒｉｍｅｒ）を利用して、ＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供することにある。
【００２９】
本発明の他の目的は、増幅反応において、ＴＳＧプライマー（Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｐｒｉｍｅｒ）を利用して、ＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供することにある。
【００３０】
本発明のまた他の目的は、ＴＳＧプライマー（Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｐｒｉｍｅｒ）を利用して、ＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキットを提供することにある。
【００３１】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
本発明の基本原理は、図１〜４に要約した。
【図１ａ】ＴＳＧプライマーを利用して、ターゲット核酸配列を検出するアッセイに係わる工程を模式的に示す。図１ａは、ターゲット核酸配列の検出のための標準的な構造を有するＴＳＧプライマーの利用を示す。
【図１ｂ】ＴＳＧプライマーを利用して、ターゲット核酸配列を検出するアッセイに係わる工程を模式的に示す。図１ｂは、ターゲット核酸配列の検出において、プライマーアニーリング特異性のために、二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有するＴＳＧプライマーの利用を示す。
【図２ａ】本発明のＴＳＧプライマー及び５’→３’ヌクレアーゼ活性のない鋳型依存的核酸ポリメラーゼを利用して、リアルタイム方式でターゲット核酸を検出するためのリアルタイムＰＣＲ増幅を模式的に示す。図２ａは、リアルタイムＰＣＲ増幅のために標準的な構造を有するＴＳＧプライマーの利用を示す
【図２ｂ】本発明のＴＳＧプライマー及び５’→３’ヌクレアーゼ活性のない鋳型依存的核酸ポリメラーゼを利用して、リアルタイム方式でターゲット核酸を検出するためのリアルタイムＰＣＲ増幅を模式的に示す。図２ｂは、リアルタイムＰＣＲ増幅において、プライマーアニーリング特異性のために、二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有するＴＳＧプライマーの利用を示す。
【図３ａ】本発明のＴＳＧプライマー及び５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼを利用して、リアルタイム方式でターゲット核酸を検出するためのリアルタイムＰＣＲ増幅を模式的に示す。図３ａは、リアルタイムＰＣＲ増幅のために標準的な構造を有するＴＳＧプライマーの利用を示す。
【図３ｂ】本発明のＴＳＧプライマー及び５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼを利用して、リアルタイム方式でターゲット核酸を検出するためのリアルタイムＰＣＲ増幅を模式的に示す。図３ｂは、リアルタイムＰＣＲ増幅において、プライマーアニーリング特異性のために、二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有するＴＳＧプライマーの利用を示す。
【図４ａ】固相基質に固定化させたＴＳＧプライマーを利用してターゲット核酸配列を検出するアッセイに係わる工程を模式的に示す。図４ａは、ターゲット核酸配列の検出のために標準的な構造を有するＴＳＧプライマーの利用を示す。
【図４ｂ】固相基質に固定化させたＴＳＧプライマーを利用してターゲット核酸配列を検出するアッセイに係わる工程を模式的に示す。図４ｂは、ターゲット核酸配列の検出において、プライマーアニーリング特異性のために、二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有するＴＳＧプライマーの利用を示す。
【図５】変性、ハイブリッド形成及びプライマー伸長の反復無しに、核酸合成反応を行う間、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のない鋳型依存的ＤＮＡポリメラーゼを利用することにより、ＴＳＧプライマーのハイブリッド形成及び伸長だけでＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを検出した結果を示す。１）  ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のないストッフェル切片である（５’→３’Ｅｘｏ−）。２）  鋳型は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ遺伝子に対する合成オリゴヌクレオチドである。３）  ＴＳＧプライマーは、同一な配列を有するが、括弧内の表示分、レポーター分子及びクエンチャー分子間の離隔された距離が異なる。４）  ＲＦＵ値は、４０分に測定した値である。５）  ΔＲＦＵは、鋳型がある場合のＲＦＵ値から、鋳型がない場合のＲＦＵ値を引いて計算した。
【図６】変性、ハイブリッド形成及びプライマー伸長の反復無しに、核酸合成反応を行う間、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のない鋳型依存的ＤＮＡポリメラーゼを利用することにより、ＴＳＧプライマーのハイブリッド形成及び伸長だけでＳ．ａｕｒｅｕｓを検出した結果を示す。１）  ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のないストッフェル切片である（５’→３’Ｅｘｏ−）。２）  鋳型は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ遺伝子に対する合成オリゴヌクレオチドである。３）  ＴＳＧプライマーは、同一な配列を有するが、括弧内の表示分、レポーター分子及びクエンチャー分子間の離隔された距離が異なる。４）  ＲＦＵ値は、４０分に測定した値である。５）  ΔＲＦＵは、鋳型がある場合のＲＦＵ値から、鋳型がない場合のＲＦＵ値を引いて計算した。
【図７】ＴＳＧプライマー及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のない鋳型依存的ＤＮＡポリメラーゼを利用して、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを検出するためのリアルタイムＰＣＲ増幅の結果を示す。１）  ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のないストッフェル切片である（５’→３’Ｅｘｏ−）。２）  鋳型は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのゲノムＤＮＡである。３）  ＴＳＧプライマーは、同一な配列を有するが、括弧内の表示分、レポーター分子及びクエンチャー分子間の離隔された距離が異なる。
【図８】ＴＳＧプライマー及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のない鋳型依存的ＤＮＡポリメラーゼを利用して、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを検出するためのリアルタイムＰＣＲ増幅の結果を示す。１）  ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のないストッフェル切片である（５’→３’Ｅｘｏ−）。２）  鋳型は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのゲノムＤＮＡである。３）  ＴＳＧプライマーは、同一な配列を有するが、括弧内の表示分、レポーター分子及びクエンチャー分子間の離隔された距離が異なる。
【図９】ＴＳＧプライマー及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のない鋳型依存的ＤＮＡポリメラーゼを利用して、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅを検出するためのリアルタイムＰＣＲ増幅の結果を示す。１）  ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のないストッフェル切片である（５’→３’Ｅｘｏ−）。２）  鋳型は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのゲノムＤＮＡである。３）  ＴＳＧプライマーは、同一な配列を有するが、括弧内の表示分、レポーター分子及びクエンチャー分子間の離隔された距離が異なる。
【図１０】ＴＳＧプライマー及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のない鋳型依存的ＤＮＡポリメラーゼを利用して、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓを検出するためのリアルタイムＰＣＲ増幅の結果を示す。１）  ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のないストッフェル切片である（５’→３’Ｅｘｏ−）。２）  鋳型は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのゲノムＤＮＡである。３）  ＴＳＧプライマーは、同一な配列を有するが、括弧内の表示分、レポーター分子及びクエンチャー分子間の離隔された距離が異なる。
【図１１】ＴＳＧプライマー及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のない鋳型依存的ＤＮＡポリメラーゼを利用して、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを検出するためのリアルタイムＰＣＲ増幅の結果を示す。１）  ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のないストッフェル切片である（５’→３’Ｅｘｏ−）。２）  ＴＳＧプライマーは、括弧内の表示のように、レポーター分子及びクエンチャー分子間が２１ヌクレオチド離隔された距離を有する。３）  鋳型は、表示したように、一連に希釈したＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのゲノムＤＮＡである。
【図１２】変性、ハイブリッド形成及びプライマー伸長を反復て核酸合成反応を行う間、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼまたは５’→３’ヌクレアーゼ活性のない鋳型依存的核酸ポリメラーゼを利用することによる、ＴＳＧプライマーから出るシグナルの発生及び蓄積の結果を示す。１）  ＴＳＧプライマーは、同一な配列を有するが、括弧内の表示分、レポーター分子及びクエンチャー分子間の離隔された距離が異なる。２）  ５’→３’Ｅｘｏ−は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のないストッフェル切片である。３）  ５’→３’Ｅｘｏ＋は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。４）  鋳型は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ遺伝子に対する合成オリゴヌクレオチドである。
【図１３】ＴＳＧプライマー及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的ＤＮＡポリメラーゼを利用して、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを検出するためのリアルタイムＰＣＲ増幅の結果を示す。１）  ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである（５’→３’Ｅｘｏ＋）。２）  鋳型は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのゲノムＤＮＡである。３）  ＴＳＧプライマーは、同一な配列を有するが、括弧内の表示分、レポーター分子及びクエンチャー分子間の離隔された距離が異なる。
【図１４】ＴＳＧプライマー及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的ＤＮＡポリメラーゼを利用して、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを検出するためのリアルタイムＰＣＲ増幅の結果を示す。１）  ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである（５’→３’Ｅｘｏ＋）。２）  鋳型は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのゲノムＤＮＡである。３）  ＴＳＧプライマーは、同一な配列を有するが、括弧内の表示分、レポーター分子及びクエンチャー分子間の離隔された距離が異なる。
【図１５】ＴＳＧプライマー及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的ＤＮＡポリメラーゼを利用して、  Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅを検出するためのリアルタイムＰＣＲ増幅の結果を示す。１）  ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである（５’→３’Ｅｘｏ＋）。２）  鋳型は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのゲノムＤＮＡである。３）  ＴＳＧプライマーは、同一な配列を有するが、括弧内の表示分、レポーター分子及びクエンチャー分子間の離隔された距離が異なる。
【図１６】ＴＳＧプライマー及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的ＤＮＡポリメラーゼを利用して、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓを検出するためのリアルタイムＰＣＲ増幅の結果を示す。１）  ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである（５’→３’Ｅｘｏ＋）。２）  鋳型は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのゲノムＤＮＡである。３）  ＴＳＧプライマーは、同一な配列を有するが、括弧内の表示分、レポーター分子及びクエンチャー分子間の離隔された距離が異なる。
【図１７】ＴＳＧプライマー及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的ＤＮＡポリメラーゼを利用して、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを検出するためのリアルタイムＰＣＲ増幅の結果を示す。１）  ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである（５’→３’Ｅｘｏ＋）。２）  ＴＳＧプライマーは、括弧内の表示のように、レポーター分子及びクエンチャー分子間が２１ヌクレオチド離隔された距離を有する。３）  鋳型は、表示したように、一連に希釈したＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのゲノムＤＮＡである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、二重標識システムを有するターゲットシグナル発生プライマー（Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ、ＴＳＧプライマー）及び鋳型依存的核酸ポリメラーゼを利用して、リアルタイム方式でターゲット核酸配列を検出する新規な方法に関する。
【００３４】
本発明によると、ＴＳＧプライマー（Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｐｒｉｍｅｒ）と命名されたシグナルがクエンチングされた状態の二重標識プライマーがターゲット核酸配列にハイブリッド形成されると、シグナル脱消光現象が発生されて、次いで前記二重標識プライマーが伸長され、ターゲット核酸配列に対する相補的な配列が合成され、最終的にターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを検出することができる。即ち、ＴＳＧプライマーでシグナル脱消光を引き起こす構造変化（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｎｇｅ）及び３’−伸長反応の両方が起こる。
【００３５】
本発明者らは、ヘアピンループ構造のように如何なる修飾された構造を有しないプライマーであるＴＳＧプライマーが、ハイブリッド形成及びプライマー伸長によってクエンチング状態から脱消光状態に転換されることにより、シグナルを発生させることができるということを最初に発見した。ＴＳＧプライマー及びこれを利用したリアルタイム方法は、本発明者らにより最初に提示された。
【００３６】
ＴＳＧプライマーの利点の一つは、ＴＳＧプライマー３’−末端における伸長が反応条件（例えば、反応温度）の変化によるシグナル強度の変化（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を抑制して、これは、ＴＳＧプライマー３’−末端の伸長は、反応温度変化によりシグナルがほとんど影響を受けないか、影響を受けないようにして、より信頼性があって安定的なシグナル結果が得られるようにするということである。特に、ＴＳＧプライマー３’−末端の伸長は、ＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列を増幅する。
【００３７】
増幅反応、特に、ＰＣＲベースのリアルタイム検出方法において、本発明のＴＳＧプライマーは、シグナル発生だけではなく、ターゲット増幅にも寄与し、ターゲット配列に対する同時的（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）アッセイを成功裏に達成する。
【００３８】
興味深いことに、ＴＳＧプライマーを利用した本発明の新規なリアルタイムＰＣＲ検出方法は、標準的なリアルタイムＰＣＲアプローチと明白に異なる方式で作用して、これは、従来技術の欠点を克服して、リアルタイム検出の効率性を向上させる。
【００３９】
ＴＳＧプライマーベースの方法と分子ビーコン及びＴａｑＭａｎプローブ方法のような従来プローブベースの方法の最も目立つ相違点は、標識プローブは、ターゲット配列を増幅せずにターゲットシグナルのみを発生させることができるが、ＴＳＧプライマーは、ターゲットシグナルを発生させるだけではなく、ターゲット配列も増幅させることができるということである。プローブベースの方法は、ターゲット増幅のために追加的なプライマーの使用を必要とするが、このような点は、本発明と明白に異なる事項である。標識プローブを利用する従来の方法は、増幅のために追加的なプライマーを必要とするため、プローブデザイン、プライマーデザイン、配列選択及び反応最適化に対する困難がある。その反面、ＴＳＧプライマー方法は、追加的なプローブを必要としないため、このような問題が最小化できる。
【００４０】
また、ＴＳＧプライマーは、伸長産物または増幅産物内に含まれるが（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、標識プローブは、如何なる産物にも含まれないため、ＴＳＧプライマー方法は、直接的に増幅産物を測定するが、標識プローブ方法から出るシグナルは、増幅産物を直接的に反映しない。
【００４１】
また、ターゲット配列と標識プローブのハイブリッド形成は、標識プローブ及び増幅産物の濃度によって変わり、これは、定量分析を難しくする。定量分析の正確性を向上させるために過剰量の標識プローブが利用できるとしても、それらは、高いバックグラウンド問題を引き起こす可能性が非常に高い。その反面、ＴＳＧプライマー方法は、標識プライマーを利用してターゲット増幅を直接的に測定することができて、これは、より高い精度でターゲット配列の定量分析を可能にする。
【００４２】
一方、サンライズ方法及びスコーピオン方法のような幾つかの従来のプライマーベースのリアルタイム検出方法は、ターゲット配列とのハイブリッド形成以前に、蛍光をクエンチングするためのヘアピン構造を形成していなければならない。
【００４３】
しかし、標識プライマーベースの方法におけるヘアピン構造の利用は、ハイブリッド形成効率だけではなく、増幅効率も減少させる。また、標識プライマーに適用されたヘアピン構造は、追加的な配列を必要として、したがって、プライマーは、ターゲット相補的な配列及びヘアピン形成配列を全部考慮してデザイン及び製作されなければならない。このような背景から、ヘアピン構造を有する標識プライマーをデザインすることは難しい。その反面、ＴＳＧプライマーは、ヘアピン構造の関与無しにターゲットシグナルを発生させて、ヘアピン構造に伴う欠点を克服することができる。
【００４４】
シグナル発生に対する基本的メカニズムの観点で、プライマーの単一標識を利用したＬｕｘ方法と、プライマーの二重相互作用的標識システムを利用する本発明とは、異なっている。プライマーの単一標識分子から出るシグナルは、標識の種類、標識周囲のプライマーの配列、プライマー上の標識の位置、周辺の他の要素など、多様な要素によって影響を受け、これは、Ｌｕｘ方法の欠点と見なされる。
【００４５】
上述したように、本発明のＴＳＧプライマーベースのリアルタイム検出方法は、従来のプライマー及びプローブベースの方法と差別化される一部技術的特徴（特に、シグナル発生の原理、オリゴヌクレオチドの構造及びオリゴヌクレオチドの機能）を有する。本発明の技術的特徴は、従来のリアルタイム方法の限界を克服するようにして、より効果的な方式でターゲット核酸配列が検出される。
【００４６】
驚いたことに、本発明者らは、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより、ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されたプライマーの５’−末端部位で５’−切断反応が起こり、前記５’−切断反応がターゲット配列の検出に絶妙に適用して、ターゲット配列に対するシグナルを発生させるということを見出した（ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００７０６４参照）。
【００４７】
５’−末端部位にレポーター分子及びクエンチャー分子を有するＴＳＧプライマーがターゲット配列（即ち、鋳型）にハイブリッド形成される場合、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼによりその５’−末端部位で５’−切断反応が起こり、その後、レポーター分子及びクエンチャー分子が互いに離隔されて、これは、ＴＳＧプライマーのシグナル脱消光を引き起こす。
【００４８】
５’−切断反応が発生するＴＳＧプライマーの比率は、鋳型依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性、反応条件及びレポーター分子及びクエンチャー分子間の距離によって変わる。
【００４９】
５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼ及び５’−末端部位にレポーター分子またはクエンチャー分子を有するＴＳＧプライマーを利用する場合、５’−切断反応が生じるということを考慮すると、本発明は、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを二つの異なる方式で提供することができる：（ｉ）ターゲット核酸配列とのハイブリッド形成による構造変化により引き起こされた、ＴＳＧプライマー上の相互作用的標識システムのシグナル脱消光（ｕｎｑｕｎｃｈｉｎｇ）を利用したシグナル発生；及び（ｉｉ）５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼを利用したＴＳＧプライマー５’−末端部位における５’−切断反応によるシグナル発生。
【００５０】
５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼを利用する本発明において、ＴＳＧプライマーの５’−末端部位（より好ましくは、５’−末端）がターゲット核酸配列に相補的な場合にのみ５’−切断反応が起こることが好ましい。
【００５１】
本発明によると、極めて向上された効率性及び信頼度でターゲット核酸配列をリアルタイムで検出することができる。本発明者らが知る限りでは、このような科学的結果及び技術的な戦略は、本発明者らによって最初に提示された。
【００５２】
本発明の一様態によると、本発明は、ターゲットシグナル発生プライマー（Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ、ＴＳＧプライマー）を利用してＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法であって、（ａ）ターゲット核酸配列をＴＳＧプライマーとハイブリッド形成させる工程であって、前記ＴＳＧプライマーは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）レポーター分子及びクエンチャー分子を含み、前記ＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列とハイブリッド形成されない場合、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、前記ＴＳＧプライマーで３次元的に互いに隣接し、前記クエンチャー分子は、前記レポーター分子から出るシグナルをクエンチングして、前記ＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、前記ＴＳＧプライマーで３次元的に離隔され、前記クエンチャー分子は、前記レポーター分子から出るシグナルを脱消光（ｕｎｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）して、これにより、前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生されて取得される工程と、
（ｂ）工程（ａ）の結果物をプライマー伸長条件下で鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって、前記ＴＳＧプライマーの３’−末端で３’−伸長反応が発生する工程と、
（ｃ）前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを検出する工程であって、これにより、前記シグナルは、ＤＮＡまたは核酸混合物内にターゲット核酸配列が存在することを示す工程と、を含む方法を提供する。
【００５３】
本発明者らは、従来のターゲット核酸配列のリアルタイム検出技術の問題点を解決するために鋭意研究した。本発明者らは、ターゲット核酸配列に対するハイブリッド形成及び伸長によってシグナルを発生できる新規なＴＳＧプライマー（Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｐｒｉｍｅｒ）を考案して、このＴＳＧプライマーを利用してターゲット核酸配列の検出のための多様なプロトコールを立案した。その結果、本発明者らは、本発明の新規なプロトコールまたは方法が、ターゲット核酸配列の検出、特に、リアルタイム検出において優れた作動性を示し、また、液相だけではなく固相でもより強くて迅速な方式でターゲット核酸配列を示すシグナルを発生させるということを確認した。
【００５４】
本発明によると、ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されるＴＳＧプライマーは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的標識システムを有する。前記ＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列とハイブリッド形成されない場合、前記レポーター分子及びクエンチャー分子は、前記ＴＳＧプライマーで３次元的に互いに隣接し、前記クエンチャー分子は、前記レポーター分子から出るシグナルをクエンチングして；反対に、前記ＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、前記ＴＳＧプライマーで３次元的に離隔され、前記クエンチャー分子は、前記レポーター分子から出るシグナルを脱消光（ｕｎｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）して、これにより、前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生されて取得される。このように、ＴＳＧプライマーは、二重機能を有する：（ｉ）ターゲット核酸配列に対するシグナル発生；及び（ｉｉ）ターゲット核酸配列に相補的な配列の合成。
【００５５】
したがって、本発明で利用されるプライマーは、‘ターゲットシグナル発生プライマー（Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ、ＴＳＧプライマー）’と命名されて、本発明の方法は、‘ＴＳＧプライマーターゲット検出アッセイ（ＴＳＧ  ｐｒｉｍｅｒ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）’と命名される。
【００５６】
本発明によると、まず、ターゲット核酸配列をＴＳＧプライマーとハイブリッド形成させる。
【００５７】
本明細書で使用される用語‘ターゲット核酸’、‘ターゲット核酸配列’または‘ターゲット配列’は、検出しようとする核酸配列を意味し、ハイブリッド形成、アニーリングまたは増幅条件下でプライマー及びプローブとアニーリングまたはハイブリッド形成される。
【００５８】
本明細書で使用される用語‘プライマー’は、オリゴヌクレオチドを意味するもので、核酸鎖（鋳型）に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件、即ち、ヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼのような重合剤の存在、そして適した温度とｐＨの条件で合成の開始点として作用できる。好ましくは、プライマーは、増幅において最大効率を有する一本鎖である。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。本発明で利用されるプライマーは、天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ｄＮＭＰ（即ち、ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰ及びｄＴＭＰ）、修飾ヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチドが含まれる。また、プライマーは、リボヌクレオチドも含むことができる。
【００５９】
プライマーは、重合剤の存在下で伸長産物の合成をプライミングさせることができるほど十分長くなければならない。プライマーの適した長さは、多数の要素、例えば、温度、応用分野及びプライマーのソース（ｓｏｕｒｃｅ）によって決定される。本明細書で使用された用語‘アニーリング’または‘プライミング’は、鋳型核酸にオリゴデオキシヌクレオチドまたは核酸が並置（ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ）されることを意味し、前記並置は、ポリメラーゼがヌクレオチドを重合させて、鋳型核酸またはその一部分に相補的な核酸分子を形成するようにする。
【００６０】
本明細書で使用された用語‘ハイブリッド形成、ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）’は、相補的な一本鎖核酸が二本鎖核酸を形成することを意味する。ハイブリッド形成は、二つの核酸鎖間の相補性が完全である場合（Ｐｅｒｆｅｃｔ  ｍａｔｃｈ）に起こるか、または一部ミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）塩基が存在しても起これる。ハイブリッド形成に必要な相補性の程度は、ハイブリッド形成条件によって変わり、特に温度によって調節され得る。
【００６１】
本明細書で使用された用語‘アニーリング’と‘ハイブリッド形成’には差がなく、本明細書で混用される。
【００６２】
本明細書で使用される用語‘ＴＳＧプライマー’は、セルフクエンチング、セルフ脱消光及び伸長ができるプライマーを意味する。特に、本発明で使用されるＴＳＧプライマーは、ターゲット配列に相補的な配列の合成及びターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを発生させることのできる二重標識プライマーを意味し、ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されない場合、相互作用的標識システムのクエンチングが誘導されて、ターゲット核酸配列にハイブリッド形成される場合は、相互作用的標識システムの脱消光が誘導されて、結局ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを発生させる。
【００６３】
本明細書で使用される用語‘正方向プライマー’は、３’→５’方向に配列されたターゲット核酸配列の一つの鎖に相補的なプライマー（５’→３’方向）を意味する。逆方向プライマーは、前記核酸配列の他の一つの鎖に相補的な配列を有する。
【００６４】
本明細書でＴＳＧプライマーのレポーター分子及びクエンチャー分子を言及しながら使用される用語‘３次元的に隣接（Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｌｙ  ａｄｊａｃｅｎｔ）’は、ヘアピンループのようなプライマーの如何なる分子内構造の助け無しに、レポーター分子及びクエンチャー分子が構造的に互いに近接していることを意味する。
【００６５】
ＴＳＧプライマーは、（ｉ）ターゲット核酸配列に対する相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）二重相互作用的標識システムを含む。本明細書で使用される用語‘相補的’は、所定のアニーリング条件または厳格条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下でプライマーがターゲット核酸配列に選択的にハイブリッド形成するほど十分相補的なことを意味し、用語‘実質的に相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）’及び‘完全に相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）’を包括する意味を有して、好ましくは、完全に相補的なことを意味する。
【００６６】
択一的に、ＴＳＧプライマーは、その５’−末端にターゲット核酸配列と非相補的な非ハイブリッド形成ヌクレオチド配列を追加的に有することができる。好ましくは、前記ＴＳＧプライマーの前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子の一つは、非ハイブリッド形成ヌクレオチド配列に位置して、他の一つは、ハイブリッド形成ヌクレオチド配列に位置する。ＴＳＧプライマーの非ハイブリッド形成ヌクレオチド配列は、好ましくは、ヘアピンループ構造を形成せず、ヘアピンループのような分子内構造の形成に関与しない。ＴＳＧプライマーの非ハイブリッド形成ヌクレオチド配列は、好ましくは、制限酵素部位を有しない。
【００６７】
好ましくは、ＴＳＧプライマーは、ヘアピンループ構造を形成しない。
【００６８】
本発明の好ましい具現例によると、二重標識システムは、ＴＳＧプライマーのターゲット相補的な配列に位置する。
【００６９】
本発明の好ましい具現例によると、ＴＳＧプライマーの５’−末端または５’−末端部位は、ターゲット核酸配列に完璧に相補的な配列を有する。
【００７０】
ＴＳＧプライマーは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的標識システムを有する。
【００７１】
前記相互作用的標識システムは、供与体分子及び受容体分子間にエネルギーが非放射能的（ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｉｖｅｌｙ）に伝達されるシグナル発生システムである。相互作用的標識システムの代表的例として、ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）標識システムは、蛍光レポーター分子（供与体分子）及びクエンチング分子（受容体分子）を含む。ＦＲＥＴでエネルギー供与体は、蛍光性であるが、エネルギー受容体は、蛍光性または非蛍光性である。
【００７２】
相互作用的標識システムの他の形態において、エネルギー供与体は、非蛍光性、例えば、発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）であり、エネルギー受容体は、蛍光性である。相互作用的標識システムのまた他の形態において、エネルギー供与体は、発光性、例えば、生物発光性、化学発光性または電気化学発光性であり、受容体は、蛍光性である。
【００７３】
より好ましくは、ターゲット核酸配列を示すシグナルは、相互作用的標識システムにより発生されて、最も好ましくは、ＦＲＥＴ標識システムである。
【００７４】
ＦＲＥＴ標識をＴＳＧプライマーに利用時、二つの標識（蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子）は、ＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列にハイブリッド形成されてストレッチ形態（Ｓｔｒｅｔｃｈ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を有する場合、互いに離隔されてシグナルの脱消光が発生される。ＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列にハイブリッド形成されず、ツイスト形態（Ｔｗｉｓｔ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）である場合は、二つの標識は、互いに隣接し、シグナルのクエンチングが発生される。
【００７５】
本明細書において、用語‘クエンチング（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）’及び‘脱消光（ｕｎｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）’は、総体的な概念として解釈される。例えば、‘脱消光’は、‘クエンチング’に比べ、クエンチングの効率または水準が低いと解釈できる。即ち、レポーター分子から出るシグナルのクエンチングは、前記シグナルの完全な消滅のみを意味するものではなく、クエンチング現象がない場合と比較し、相対的にシグナルが減少されることを包括する意味を有する。また、レポーター分子から出るシグナルの脱消光は、前記シグナルの完全な回復のみを意味するものではなく、クエンチング現象がある場合と比較し、相対的にシグナルが増加されることを包括する意味を有する。
【００７６】
上述のように、シグナルのクエンチング程度の差異によってターゲット核酸配列を示すシグナルを取得することができる。例えば、ターゲット核酸を検出するために、前記蛍光レポーター分子から出る相対的な蛍光強度を測定する場合、蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子が空間的に（または３次元的に）互いに隣接するようになるため、ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されないＴＳＧプライマーは、相対的に低い蛍光強度を示す（クエンチング状態）。ターゲット核酸配列にＴＳＧプライマーがハイブリッド形成される場合、蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子が空間的に互いに離隔されるため、相対的に高い蛍光強度を示す（脱消光状態）。
【００７７】
前記クエンチング−脱消光現象が生じ得るなら、レポーター分子及びクエンチャー分子は、ＴＳＧプライマーのどのような位置（ｓｉｔｅ）にも配置できる。
【００７８】
本発明の好ましい具現例によると、レポーター分子及びクエンチャー分子は、互いに４〜５０ヌクレオチド離隔された位置にある。
【００７９】
本発明の好ましい具現例によると、レポーター分子及びクエンチャー分子は、互いに最大５０ヌクレオチド離隔されて、より好ましくは、互いに最大４０ヌクレオチド、さらに好ましくは、互いに最大３０ヌクレオチド、最も好ましくは、互いに最大２５ヌクレオチド離隔される。
【００８０】
本発明の好ましい具現例によると、レポーター分子及びクエンチャー分子は、少なくとも４ヌクレオチド離隔されて、より好ましくは、少なくとも６ヌクレオチド、さらに好ましくは、少なくとも１０ヌクレオチド、最も好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチド離隔される。
【００８１】
本発明の好ましい具現例によると、ＴＳＧプライマーのレポーター分子または前記クエンチャー分子は、５’−末端またはその５’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔された位置にある。例えば、レポーター分子は、ＴＳＧプライマーの５’−末端またはその５’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔された位置にあり、クエンチャー分子は、レポーター分子から４〜５０ヌクレオチド離隔された位置にある。
【００８２】
本発明の好ましい具現例によると、ＴＳＧプライマーのレポーター分子は、５’−末端またはその５’−末端から１〜１０ヌクレオチド離隔された位置、より好ましくは、５’−末端に位置する。
【００８３】
本発明の好ましい具現例によると、ＴＳＧプライマーのクエンチャー分子は、５’−末端またはその５’−末端から１〜１０ヌクレオチド離隔された位置、より好ましくは、５’−末端に位置する。
【００８４】
本発明に利用できるレポーター分子及びクエンチャー分子は、当業界に公知されている如何なるものでも利用できる。その例は、下記の通りである：Ｃｙ２ＴＭ（５０６）、ＹＯＰＲＯＴＭ−１（５０９）、ＹＯＹＯＴＭ−１（５０９）、Ｃａｌｃｅｉｎ（５１７）、ＦＩＴＣ（５１８）、ＦｌｕｏｒＸＴＭ（５１９）、ＡｌｅｘａＴＭ（５２０）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １１０（５２０）、５−ＦＡＭ（５２２）、Ｏｒｅｇｏｎ  ＧｒｅｅｎＴＭ５００（５２２）、Ｏｒｅｇｏｎ  ２５  ＧｒｅｅｎＴＭ４８８（５２４）、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ（５２５）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ＧｒｅｅｎＴＭ（５２７）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １２３（５２９）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ＧｒｅｅｎＴＭ（５３１）、Ｃａｌｃｉｕｍ  ＧｒｅｅｎＴＭ（５３３）、ＴＯ−ＰＲＯＴＭ−１（５３３）、ＴＯＴＯ１（５３３）、ＪＯＥ（５４８）、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０（５５０）、Ｄｉｌ（５６５）、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０（５７０）、Ｃｙ３ＴＭ（５７０）、ＡｌｅｘａＴＭ５４６（５７０）、ＴＲＩＴＣ（５７２）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ＯｒａｎｇｅＴＭ（５７５）、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｒ＆Ｂ（５７５）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（５７５）、Ｃａｌｃｉｕｍ  ＯｒａｎｇｅＴＭ（５７６）、Ｐｙｒｏｎｉｎ  Ｙ（５８０）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ（５８０）、ＴＡＭＲＡ  （５８２）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ＲｅｄＴＭ（５９０）、Ｃｙ３．５ＴＭ（５９６）、ＲＯＸ（６０８）、Ｃａｌｃｉｕｍ  ＣｒｉｍｓｏｎＴＭ（６１５）、ＡｌｅｘａＴＭ５９４（６１５）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（６１５）、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ（６２８）、ＹＯ−ＰＲＯＴＭ−３（６３１）、ＹＯＹＯＴＭ−３（６３１）、Ｒｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４２）、Ｃ−Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４８）、ＴＯ−ＰＲＯＴＭ−３（６６０）、ＴＯＴＯ３（６６０）、ＤｉＤ  ＤｉｌＣ（５）（６６５）、Ｃｙ５ＴＭ（６７０）、Ｔｈｉａｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ（６７１）及びＣｙ５．５（６９４）。括弧の数字は、ナノメートル単位で表示した最大発光波長である。
【００８５】
適したレポーター−クエンチャー対は、下記のようなたくさんの文献に開示されている：Ｐｅｓｃｅら、ｅｄｉｔｏｒｓ，  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ  ＳＰＥＣＴＲＯＳＣＯＰＹ  （Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９７１）；  Ｗｈｉｔｅら、ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ：  Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ  （Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９７０）；  Ｂｅｒｌｍａｎ，  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ  ＳＰＥＣＴＲＡ  ＯＦ  ＡＲＯＭＡＴＩＣ  ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ，  ２ｎｄ  ＥＤＩＴＩＯＮ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９７１）；  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，  ＣＯＬＯＵＲ  ＡＮＤ  ＣＯＮＳＴＩＴＵＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９７６）；  Ｂｉｓｈｏｐ，  ｅｄｉｔｏｒ，  ＩＮＤＩＣＡＴＯＲＳ  （Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  １９７２）；  Ｈａｕｇｌａｎｄ，  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ  ＰＲＯＢＥＳ  ＡＮＤ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｅｕｇｅｎｅ，  １９９２）；  Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ，  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＰＨＯＳＰＨＯＲＥＳＣＥＮＣＥ  （Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９４９）；  Ｈａｕｇｌａｎｄ，  Ｒ．  Ｐ．，  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ  ＰＲＯＢＥＳ  ＡＮＤ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ，  Ｓｉｘｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｅｕｇｅｎｅ，  Ｏｒｅｇ．，  １９９６；  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏｓ．  ３，９９６，３４５及び４，３５１，７６０。
【００８６】
本発明において、広範囲波長または特定波長の蛍光をクエンチングできる非蛍光ブラッククエンチャー分子が利用できるということは、注目すべきことである。
【００８７】
ＴＨＤプライマーに適用されるＦＲＥＴ標識において、レポーターは、ＦＲＥＴの供与体を含み、クエンチャーは、ＦＲＥＴのその他のパートナー（受容体）を含む。例えば、フルオレセイン色素（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｙｅ）は、レポーター分子として利用されて、ロダミン色素（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ｄｙｅ）は、クエンチャー分子として利用される。
【００８８】
ターゲット核酸配列とのハイブリッド形成に続けて、ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されたＴＳＧプライマーを伸長させるために、プライマー伸長条件下で工程（ａ）の結果物を鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる。
【００８９】
表現‘プライマー伸長条件下で’は、鋳型依存的核酸ポリメラーゼによりＴＳＧプライマーの３’−末端で伸長反応が発生するに十分な条件を意味する。このような条件は、従来の核酸ポリメラーゼによるプライマー伸長のための条件に従うことができる。例えば、条件は、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．（２００１）で確認することができる。実施例から分かるように、条件には、適する時間の間、相対的に高温（例えば、５０℃〜７５℃）におけるターゲット核酸配列、ＴＳＧプライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）、ｄＮＴＰｓ及びＭｇＣｌ２のインキュベーションが含まれる。
【００９０】
ＴＳＧプライマーの伸長は、本発明で重要な工程である。ＴＳＧプライマーの伸長反応により伸長産物が生成される場合、伸長産物内に含まれたＴＳＧプライマー配列とターゲット核酸配列のより安定的なハイブリッド形成を引き起こす。また、ＴＳＧプライマーの伸長反応は、ＴＳＧプライマーの標識が伸長産物内に含まれるようにして、これにより、増幅産物の量に比例し、シグナルの強度が増加する。本発明で発生されるこのようなカップリング現象は、より正確なターゲット核酸配列の定量分析を可能にする。本発明によると、標識プローブとは異なって、ＴＳＧプライマー自体が非特異的に非ターゲット配列にハイブリッド形成される場合、高温（例えば、５０℃〜８５℃）のような厳格条件（Ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下でシグナル検出を行うことにより、如何なる擬陽性シグナルも生じないようにすることができる。また、ＴＳＧプライマーの伸長は、ターゲット核酸配列を増幅させて、ターゲット増幅とシグナル増幅を同時的に可能にする。
【００９１】
本発明によると、鋳型依存的核酸ポリメラーゼは、当業界に知られた如何なる核酸ポリメラーゼも含む。
【００９２】
本発明の重要な長所の一つは、ヌクレアーゼ活性無しに、鋳型依存的核酸ポリメラーゼを利用してターゲットシグナルを発生させるということである。
【００９３】
本発明の好ましい具現例によると、本発明で利用される鋳型依存的核酸ポリメラーゼは、ヌクレアーゼ活性がない。
【００９４】
本発明の好ましい具現例によると、本発明で利用される鋳型依存的核酸ポリメラーゼは、５’→３’ヌクレアーゼ活性がない。
【００９５】
本発明で利用される鋳型依存的核酸ポリメラーゼは、如何なる核酸ポリメラーゼも可能であり、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩの‘Ｋｌｅｎｏｗ’断片、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ及びバクテリオファージＴ７  ＤＮＡポリメラーゼを含む。好ましくは、ポリメラーゼは、多様なバクテリア種から得ることができる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。
【００９６】
本発明の好ましい具現例によると、本発明で利用される鋳型依存的核酸ポリメラーゼは、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有して、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性により前記ＴＳＧプライマーの３’−末端が伸長されて、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性により前記ＴＳＧプライマーの５’−末端が切断され、これによりレポーター分子またはクエンチャー分子が解離されて、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される。
【００９７】
好ましくは、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであり、これは、多様なバクテリア種から得ることができて、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｎｔｒａｎｉｋｉａｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｌａｃｔｅｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｎｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｉｌｖａｎｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｚ０５及びＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｐｓ  １７を含む。最も好ましくは、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【００９８】
興味深いことに、本発明者らは、ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されたＴＳＧプライマーを５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させることだけで、その３’−末端が伸長されるだけではなく、その５’−末端部位（例えば、５’−末端）が切断されるということを発見した。また、ＴＳＧプライマー５’−末端部位の切断反応は、本発明のシグナル発生に関与する。
【００９９】
要するに、本発明がＴＳＧプライマーの５’−切断反応と連関されて実施される場合、本発明は、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを二つの異なる方式で提供することができる：（ｉ）ターゲット核酸配列とのハイブリッド形成による構造変化により引き起こされた、ＴＳＧプライマー上の相互作用的標識システムのシグナル脱消光（ｕｎｑｕｎｃｈｉｎｇ）を利用したシグナル発生；及び（ｉｉ）５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼを利用したＴＳＧプライマー５’−末端部位における５’−切断反応によるシグナル発生。
【０１００】
本発明の好ましい具現例によると、ＴＳＧプライマーは、その５’−末端または５’−末端部位にターゲット核酸配列とマッチする配列を有する。
【０１０１】
本明細書において、ＴＳＧプライマーを言及しながら使用された用語‘５’−末端部位’は、ＴＳＧプライマーの５’−末端からある長さの連続的な配列を含む部位または領域を意味する。好ましくは、ＴＳＧプライマーの５’−末端部位は、その５’−末端及び５’−末端から離隔された１〜１０ヌクレオチドを含む配列を有する（より好ましくは、１〜７ヌクレオチド、さらに好ましくは、１〜５ヌクレオチド、よりさらに好ましくは、１〜３ヌクレオチド）。
【０１０２】
択一的に、本発明では、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼを利用することができる。
【０１０３】
本発明の好ましい具現例によると、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼを利用する場合、ＴＳＧプライマーは、その３’−末端部位または３’−末端に少なくとも一つのミスマッチヌクレオチド配列を含む。
【０１０４】
本発明の好ましい具現例によると、ＴＳＧプライマーがその３’−末端部位または３’−末端に少なくとも一つのミスマッチヌクレオチド配列を含む場合、ミスマッチヌクレオチド配列は標識を有しない。
【０１０５】
ミスマッチヌクレオチドの数は、１〜５、好ましくは、１〜４、より好ましくは１〜３、さらに好ましくは１〜２、最も好ましくは、１である。プライマーに少なくとも二つのミスマッチヌクレオチドがある場合、ミスマッチヌクレオチドは、連続的または不連続的に位置することができる。
【０１０６】
本発明の好ましい具現例によると、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼを利用する場合、ＴＳＧプライマーは、その３’−末端部位に鋳型依存的核酸ポリメラーゼの３’→５’ヌクレアーゼ活性に対して耐性を有するバックボーンを含む少なくとも一つのミスマッチヌクレオチドを有する。
【０１０７】
本発明の好ましい具現例によると、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼを利用する場合、ＴＳＧプライマーは、その３’−末端に、鋳型依存的核酸ポリメラーゼの３’→５’ヌクレアーゼ活性に対して耐性を有するバックボーンを含む単一マッチ決定ヌクレオチド（Ｓｉｎｇｌｅ  ｍａｔｃｈ−ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を有する。
【０１０８】
ＴＳＧプライマーの３’−末端の単一マッチ決定ヌクレオチドは、反対鎖に存在するマッチヌクレオチドにハイブリッド形成される場合にのみ、塩基対を形成する。しかし、反対鎖に存在するヌクレオチドが単一マッチ決定ヌクレオチドに相補的ではない場合、ＴＳＧプライマーの単一マッチ決定ヌクレオチドは、塩基対を形成できない。
【０１０９】
本発明において、ＴＳＧプライマーの３’−末端が塩基対を形成しなかった場合、ＴＳＧプライマーの３’−末端の単一マッチ決定ヌクレオチドは、３’→５’ヌクレアーゼ活性に対して耐性を有するバックボーンを含むため、切断反応が発生されず、これにより、伸長反応も発生されない。
【０１１０】
ＴＳＧプライマーの伸長は、伸長されたＴＳＧプライマーがない場合と比較し、ターゲット配列とのより高い安定的ハイブリッド形成を提供する。したがって、温度を調節することにより、伸長産物（即ち、ターゲット配列）の存在は、シグナル変化を分析して検出することができる。
【０１１１】
好ましくは、本発明は、ヌクレオチド変異の検出において非常に有用である。より好ましくは、本発明により検出されるヌクレオチド変異は、塩基置換であり、さらに好ましくは、ＳＮＰ（一塩基多型、ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）及び点突然変異である。
【０１１２】
本発明の好ましい具現例によると、ヌクレオチド変異は、ＴＳＧプライマーの３’−末端の単一マッチ決定ヌクレオチドの向かい側に位置させることができる。
【０１１３】
３’→５’ヌクレアーゼ活性に対して耐性を有するバックボーンは、当業界に知られた如何なるものも含む。例えば、前記ヌクレオチドは、多様なホスホロチオエート連結（ｌｉｎｋａｇｅ）、ホスホネート連結、ホスホロアミデート連結及び２’−カーボハイドレート修飾を含む。本発明の好ましい具現例によると、３’→５’ヌクレアーゼに対して耐性を有するバックボーンを含むヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結、アルキルホスホトリエステル連結、ハイドロゲンホスホネート連結、アルキルホスホロアミデート連結、アリールホスホロアミデート連結、ホスホロセレネート連結、２’−Ｏ−アミノプロピール修飾、２’−Ｏ−アルキル修飾、２’−Ｏ−アリール修飾、２’−Ｏ−ブチル修飾、α−アノマオリゴデオキシヌクレオチド及び１−（４’−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル）修飾である。
【０１１４】
本発明の好ましい具現例によると、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであり、これは、多様なバクテリア種から得ることができ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｂａｒｏｓｓｉ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ｏｃｃｕｌｔｕｍ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ及びＡｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｅｕｓのＤＮＡポリメラーゼを含む。最も好ましくは、３’→５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼは、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【０１１５】
本発明の好ましい具現例によると、本発明は、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを増幅させるために、前記工程（ａ）−（ｂ）または（ａ）−（ｃ）を少なくとも２回反復する工程と、その反復サイクルの間に変性過程とをさらに含む。サイクル反復回数は、特に制限されず、典型的に少なくとも２回、好ましくは、少なくとも５回、より好ましくは、少なくとも１０回である。変性は、工程（ａ）で形成された二本鎖二合体が一本鎖核酸の状態にする。変性に対する方法は、熱、アルカリ、ホルムアミド、ウレア及びグリコサール処理、酵素方法（例えば、ヘリカーゼ反応）、及び結合タンパク質を含むが、これらに限定されるものではない。例えば、変性は、８０℃乃至１０５℃範囲の温度に熱を加えて達成できる。このような処理を達成するための一般的な方法は、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．（２００１）により提供される。
【０１１６】
最終的に、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが検出される。シグナルの検出は、反復の各サイクルで（即ち、リアルタイム方式）、反復の終了時点で（即ち、エンド−ポイント方式）、または、反復の間、指定時間間隔のそれぞれで実施できる。好ましくは、シグナル検出は、反復の各サイクルで行って、これは、検出の正確性を向上させる。
【０１１７】
各標識に対するシグナルは、従来の方法により検出されるかまたは測定することができる。例えば、蛍光シグナルは、従来の方法、例えば、蛍光強度測定器を利用して検出するか測定することができる。
【０１１８】
本発明の長所は、シグナル検出工程でも明確に現れる。シグナル検出が高温（例えば、５０℃〜８５℃）のような高厳格条件（Ｈｉｇｈ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下で行われる場合、非−ターゲット核酸配列に非特異的にハイブリッド形成されて発生され得る擬陽性シグナルが完璧に除去できる。
【０１１９】
本発明の好ましい具現例によると、レポーター分子及びクエンチャー分子から構成された標識システムにおいて、レポーター分子のシグナルの変化を測定するか分析して、シグナル検出が実施される。
【０１２０】
本発明の好ましい具現例によると、クエンチャー分子が蛍光である場合、シグナル検出は、クエンチャー分子のシグナル変化、またはクエンチャー分子及びレポーター分子のシグナル変化を測定して、シグナル検出が実施される。
【０１２１】
本発明の好ましい具現例によると、クエンチャー分子は蛍光であり、検出されるターゲット核酸配列の存在を示すシグナルは、蛍光クエンチャー分子から出るシグナルである。
【０１２２】
本発明の目立つ特徴の一つは、液相及び固相の両方において成功的なシグナルが得られるということである。本発明の方法は、大きく二種の相、即ち、液相及び固相で実施することができる。
【０１２３】
Ｉ．液相におけるターゲット検出
１．ＴＳＧプライマー及び核酸ポリメラーゼを利用したターゲット検出
第一のプロトコールによると、ＴＳＧプライマー及び鋳型依存的核酸ポリメラーゼを利用して、ターゲット核酸配列を検出する（図１ａ及び１ｂ参照）。
【０１２４】
第一のプロトコールは、以下の工程を含む：
（ａ）ターゲット核酸配列をＴＳＧプライマーとハイブリッド形成させる工程であって、前記ＴＳＧプライマーは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）レポーター分子及びクエンチャー分子を含み、前記ＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列とハイブリッド形成されない場合、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、前記ＴＳＧプライマーで３次元的に互いに隣接し、前記クエンチャー分子は、前記レポーター分子から出るシグナルをクエンチングして、前記ＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、前記ＴＳＧプライマーで３次元的に離隔され、前記クエンチャー分子は、前記レポーター分子から出るシグナルを脱消光して、これにより、前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生されて取得される工程と、
（ｂ）工程（ａ）の結果物をプライマー伸長条件下で鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって、前記ＴＳＧプライマーの３’−末端で３’−伸長反応が発生する工程と、
（ｃ）前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを検出する工程であって、これにより、前記シグナルは、ＤＮＡまたは核酸混合物内にターゲット核酸配列が存在することを示す工程。
【０１２５】
本発明の好ましい具現例によると、工程（ｃ）におけるシグナル検出は、リアルタイム方式、エンド−ポイント方式または指定時間間隔方式で行われる。
【０１２６】
２．ＴＳＧプライマー及び５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを利用したターゲット検出
第二のプロトコールによると、ＴＳＧプライマー及び５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを利用してターゲット核酸配列を検出する。
【０１２７】
好ましくは、第二のプロトコールは、以下の工程を含む：
（ａ）ターゲット核酸配列をＴＳＧプライマーとハイブリッド形成させる工程であって、前記ＴＳＧプライマーは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）レポーター分子及びクエンチャー分子を含み、前記ＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列とハイブリッド形成されない場合、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、前記ＴＳＧプライマーで３次元的に互いに隣接し、前記クエンチャー分子は、前記レポーター分子から出るシグナルをクエンチングして、前記ＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、前記ＴＳＧプライマーで３次元的に離隔され、前記クエンチャー分子は、前記レポーター分子から出るシグナルを脱消光して、これにより、前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生されて取得される工程と、
（ｂ）工程（ａ）の結果物をプライマー伸長及び切断条件下で、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって、前記ＴＳＧプライマーの３’−末端で３’−伸長反応が発生し、前記ＴＳＧプライマーの５’−末端部位で５’−切断反応が発生し、これにより前記レポーター分子または前記クエンチャー分子が前記ＴＳＧプライマーから放出されて、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される工程と、
（ｃ）前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを検出する工程であって、これにより、前記シグナルは、ＤＮＡまたは核酸混合物内にターゲット核酸配列が存在することを示す工程。
【０１２８】
本発明の好ましい具現例によると、本発明は、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを増幅させるために、前記工程（ａ）−（ｂ）または（ａ）−（ｃ）を少なくとも２回反復する工程と、その反復サイクルの間に変性過程とをさらに含む。
【０１２９】
本発明の好ましい具現例によると、工程（ｃ）におけるシグナル検出は、リアルタイム方式、エンド−ポイント方式または指定時間間隔方式で行われる
【０１３０】
３．ＴＳＧプライマー、カウンターパートプライマー及び核酸ポリメラーゼを利用したターゲット検出
本発明の第三のプロトコールは、（ｉ）鋳型依存的核酸ポリメラーゼ及び（ｉｉ）ターゲット核酸配列を増幅できるＴＳＧプライマー及びそのカウンターパートプライマー（Ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ  ｐｒｉｍｅｒ）で構成された一対のプライマーを利用してターゲット核酸配列を検出して、このようなターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを増幅すると同時に、ターゲットも増幅させる（図２ａ及び２ｂ参照）。
【０１３１】
カウンターパートプライマーは、ＴＳＧプライマーであるか、ＴＳＧプライマーではない。
【０１３２】
好ましくは、この第三のプロトコールは、以下の工程を含み、ＴＳＧプライマーを利用した増幅反応を通じてＤＮＡまたは核酸混合物内でターゲット核酸配列を検出する：
（ａ）前記ターゲット核酸配列を増幅できる正方向プライマー及び逆方向プライマーとしての二つのプライマーを含む一対のプライマーと前記ターゲット核酸配列をハイブリッド形成させる工程であって、前記二つのプライマーのうち、少なくとも一つは、ＴＳＧプライマーであって、前記ＴＳＧプライマーは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）レポーター分子及びクエンチャー分子を含み、前記ＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列とハイブリッド形成されない場合、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、前記ＴＳＧプライマーで３次元的に互いに隣接し、前記クエンチャー分子は、前記レポーター分子から出るシグナルをクエンチングして、前記ＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、前記ＴＳＧプライマーで３次元的に離隔され、前記クエンチャー分子は、前記レポーター分子から出るシグナルを脱消光して、これにより、前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生されて取得される工程と
（ｂ）工程（ａ）の結果物をプライマー伸長条件下で鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって、前記二つのプライマーの３’−末端で３’−伸長反応が発生する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）の結果物を変性させる工程と、
（ｄ）前記工程（ａ）−（ｃ）を少なくとも２回反復し、前記ターゲット核酸配列及び前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルを全て増幅する工程と、
（ｅ）前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを検出する工程であって、前記シグナル検出は、工程（ｄ）の前記反復の各サイクルにおいて、工程（ｄ）の前記反復の終了時点で、または前記反復の間の指定時間間隔のそれぞれで行われて、このようなシグナルは、ターゲット核酸配列の存在を示す工程。
【０１３３】
４．ＴＳＧプライマー、カウンターパートプライマー及び５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを利用したターゲット検出
本発明の第四のプロトコールは、（ｉ）５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼ及び（ｉｉ）ターゲット核酸配列を増幅できるＴＳＧプライマー及びそのカウンタープライマーで構成された一対のプライマーを利用してターゲット核酸配列を検出し、このようなターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを増幅すると同時に、ターゲットも増幅させる（図３ａ及び３ｂ参照）。
【０１３４】
好ましくは、第四のプロトコールは、以下の工程を含む：
（ａ）前記ターゲット核酸配列を増幅できる正方向プライマー及び逆方向プライマーとしての二つのプライマーを含む一対のプライマーと前記ターゲット核酸配列をハイブリッド形成させる工程であって、前記二つのプライマーのうち、少なくとも一つは、ＴＳＧプライマーであって、前記ＴＳＧプライマーは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）レポーター分子及びクエンチャー分子を含み、前記ＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列とハイブリッド形成されない場合、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、前記ＴＳＧプライマーで３次元的に互いに隣接し、前記クエンチャー分子は、前記レポーター分子から出るシグナルをクエンチングして、前記ＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、前記ＴＳＧプライマーで３次元的に離隔され、前記クエンチャー分子は、前記レポーター分子から出るシグナルを脱消光して、これにより、前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生されて取得される工程と、
（ｂ）工程（ａ）の結果物をプライマー伸長及び切断条件下で、鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって、前記ＴＳＧプライマーの３’−末端で３’−伸長反応が発生し、前記ＴＳＧプライマーの５’−末端部位で５’−切断反応が発生し、これにより前記レポーター分子または前記クエンチャー分子が前記ＴＳＧプライマーから放出されて、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される工程と、
（ｃ）工程（ｂ）の結果物を変性させる工程と、
（ｄ）前記工程（ａ）−（ｃ）を少なくとも２回反復し、前記ターゲット核酸配列及び前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルを全て増幅する工程と、
（ｅ）前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを検出する工程であって、前記シグナル検出は、工程（ｄ）の前記反復の各サイクルにおいて、工程（ｄ）の前記反復の終了時点で、または前記反復の間の指定時間間隔のそれぞれで行われて、このようなシグナルは、ターゲット核酸配列の存在を示す工程。
【０１３５】
ＩＩ．固相におけるターゲット検出
本発明の格別な長所は、マイクロアレイのような固相においてもターゲット核酸配列を検出するに非常に効果的であるという点である。
【０１３６】
本発明の好ましい具現例によると、本発明は固相で行われて、ＴＳＧプライマーは、その５’−末端を介して固相基質の表面に固定化される。
【０１３７】
１．ＴＳＧプライマー及び核酸ポリメラーゼを利用したオン−チップ（Ｏｎ−Ｃｈｉｐ）ターゲット検出
この第一の固相プロトコールによると、ＴＳＧプライマー及び鋳型依存的ポリメラーゼを利用して、ターゲット核酸配列を固相で検出する（参照図４ａ及び４ｂ）。
【０１３８】
好ましくは、第一のプロトコールは、以下の工程を含む：
（ａ）前記ターゲット核酸配列を前記ＴＳＧプライマーとハイブリッド形成させる工程であって、前記ＴＳＧプライマーは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）レポーター分子及びクエンチャー分子を含み、前記ＴＳＧプライマーは、その５’−末端を介して固相基質の表面に固定化されて、前記ＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列とハイブリッド形成されない場合、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、前記ＴＳＧプライマーで３次元的に互いに隣接し、前記クエンチャー分子は、前記レポーター分子から出るシグナルをクエンチングして、前記ＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、前記ＴＳＧプライマーで３次元的に離隔され、前記クエンチャー分子は、前記レポーター分子から出るシグナルを脱消光して、これにより、前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生されて取得される工程と、
（ｂ）工程（ａ）の結果物をプライマー伸長条件下で鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって、前記ＴＳＧプライマーの３’−末端で３’−伸長反応が発生する工程と、
（ｃ）前記固相で前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを検出する工程であって、これにより、前記シグナルは、ＤＮＡまたは核酸混合物内にターゲット核酸配列が存在することを示す工程。
【０１３９】
２．ＴＳＧプライマー、カウンターパートプライマー及び核酸ポリメラーゼを利用したオン−チップ（Ｏｎ−Ｃｈｉｐ）ターゲット検出
本発明の第二の固相プロトコールは、（ｉ）鋳型依存的核酸ポリメラーゼ及び（ｉｉ）ターゲット核酸配列を増幅できるＴＳＧプライマー及びそのカウンターパートプライマー（Ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ  ｐｒｉｍｅｒ）で構成された一対のプライマーを利用してターゲット核酸配列を検出して、このようなターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを増幅すると同時に、ターゲットも増幅させる。
【０１４０】
即ち、第二の固相プロトコールは、オン−チップリアルタイムＰＣＲ技術を実現する。
【０１４１】
好ましくは、第二の固相プロトコールは、以下の工程を含む：
（ａ）前記ターゲット核酸配列を増幅できる正方向プライマー及び逆方向プライマーとしての二つのプライマーを含む一対のプライマーと前記ターゲット核酸配列をハイブリッド形成させる工程であって、前記二つのプライマーのうち、少なくとも一つは、ＴＳＧプライマーであって、前記ＴＳＧプライマーは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）レポーター分子及びクエンチャー分子を含み、前記二つのプライマーの少なくとも一つは、その５’−末端を介して固相基質の表面に固定化されて、前記固定化されたプライマーは、ＴＳＧプライマーであって、前記ＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列とハイブリッド形成されない場合、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、前記ＴＳＧプライマーで３次元的に互いに隣接し、前記クエンチャー分子は、前記レポーター分子から出るシグナルをクエンチングして、前記ＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、前記ＴＳＧプライマーで３次元的に離隔され、前記クエンチャー分子は、前記レポーター分子から出るシグナルを脱消光して、これにより、前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生されて取得される工程と
（ｂ）工程（ａ）の結果物をプライマー伸長条件下で鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって、前記二つのプライマーの３’−末端で３’−伸長反応が発生する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）の結果物を変性させる工程と、
（ｄ）前記工程（ａ）−（ｃ）を少なくとも２回反復し、前記ターゲット核酸配列及び前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルを全て増幅する工程と、
（ｅ）前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを検出する工程であって、前記シグナル検出は、工程（ｄ）の前記反復の各サイクルにおいて、工程（ｄ）の前記反復の終了時点で、または前記反復の間の指定時間間隔のそれぞれで行われて、このようなシグナルは、ターゲット核酸配列の存在を示す工程。
【０１４２】
本発明の好ましい具現例によると、前記ＴＳＧプライマーは、その５’−末端を介して固相基質の表面に固定化されて、他の一つのプライマーは、固定化されておらず、ＴＳＧプライマーではない。
【０１４３】
本発明の好ましい具現例によると、ＴＳＧプライマー及びカウンターパートプライマーは、下記一般式Ｉの二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有する：
５’−Ｘｐ−Ｙｑ−Ｚｒ−３’  （Ｉ）
（式中、Ｘｐは、ターゲット核酸と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第１プライミング部位（５’−ｆｉｒｓｔ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、Ｙｑは、少なくとも三つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、Ｚｒは、ターゲット核酸と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第２プライミング部位（３’−ｓｅｃｏｎｄ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｐｏｒｔｉｏｎ）であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ、Ｙ及びＺは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであり、５’−第１プライミング部位のＴｍは、３’−第２プライミング部位のＴｍより高く、前記分割部位は、前記三つの領域のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、ターゲット核酸配列に対するアニーリングに関して、５’−第１プライミング部位を３’−第２プライミング部位から分割し、これにより、前記オリゴヌクレオチドの前記アニーリング特異性が、前記５’−第１プライミング部位及び前記３’−第２プライミング部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＳＧプライマーの全体アニーリング特異性を向上させる。）
【０１４４】
ＤＰＯ構造は、ＤＳＯ（ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）のプライマー形態であって、本発明者らにより最初に提示された（ＷＯ２００６／０９５９８１；Ｃｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｕａｌ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＳＮＰ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ＣＹＰ２Ｃ１９  ｇｅｎｅ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ３５：６ｅ４０（２００７）参照）。
【０１４５】
ＤＰＯは、ハイブリッド形成またはアニーリングが分割領域により互いに離隔された５’−高Ｔｍ特異性部位（または５’−第１プライミング部位）及び３’−低Ｔｍ特異性部位（または３’−第２プライミング部位）により二重的に決定されるようにする新規な概念を具現したもので、非常に驚くべきハイブリッド形成特異性を示す（参照：ＷＯ２００６／０９５９８１；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｒｅｃｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ｕｓｉｎｇ  ｄｕａｌ−ｐｒｉｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｒｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４９：７６−８４（２００８）；Ｋｉｍ，  ｅｔ．  ａｌ．，Ｒａｐｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  １２  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｄｕａｌ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｓｔｅｍ−ｂａｓｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｖｉｒｏｍｅｔ．２００８．１１．００７（２００８）；Ｈｏｒｉｉ  ｅｔ．  ａｌ．，Ｕｓｅ  ｏｆ  ｄｕａｌ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｓｅｘｕａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ，Ｌｅｔｔｅｒｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｄｏｉ：１０．１１１／ｊ．１４７２−７６５Ｘ２００９．０２６１８ｘ（２００９）））。上述のように、ＤＰＯは、互いに異なるハイブリッド形成特性を有する二つのプライマー断片を究極的に有するようになる：初期の安定したハイブリッド形成に関与する５’−第１プライミング部位；及びターゲット特異性を決定する３’−第２プライミング部位。
【０１４６】
本発明の前記ＤＰＯ構造を有するプライマーを利用して増幅（特に、マルチプレックス増幅）する場合は、擬陽性及び擬陰性結果無しに成功裏にアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）を得ることができる。
【０１４７】
本発明の好ましい具現例によると、分割部位に位置するユニバーサル塩基は、デオキシイノシン、イノシン、７−デアザ−２’−デオキシイノシン、２−アザ−２’−デオキシイノシン、２’−ＯＭｅイノシン、２’−Ｆイノシン、デオキシ３−ニトロピロール、３−ニトロピロール、２’−ＯＭｅ３−ニトロピロール、２’−Ｆ３−ニトロピロール、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、デオキシ５−ニトロインドール、５−ニトロインドール、２’−ＯＭｅ５−ニトロインドール、２’−Ｆ５−ニトロインドール、デオキシ４−ニトロベンズイミダゾール、４−ニトロベンズイミダゾール、デオキシ４−アミノベンズイミダゾール、４−アミノベンズイミダゾール、デオキシネブラリン、２’−Ｆネブラリン、２’−Ｆ４−ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ−５−イントロインドール、ＰＮＡ−ネブラリン、ＰＮＡ−イノシン、ＰＮＡ−４−ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ−３−ニトロピロール、モルフォリノ−５−ニトロインドール、モルフォリノ−ネブラリン、モルフォリノ−イノシン、モルフォリノ−４−ニトロベンズイミダゾール、モルフォリノ−３−ニトロピロール、ホスホルアミデート−５−ニトロインドール、ホスホルアミデート−ネブラリン、ホスホルアミデート−イノシン、ホスホルアミデート−４−ニトロベンズイミダゾール、ホスホルアミデート−３−ニトロピロール、２’−Ｏ−メトキシエチルイノシン、２’−Ｏ−メトキシエチルネブラリン、２’−Ｏ−メトキシエチル５−ニトロインドール、２’−Ｏ−メトキシエチル４−ニトロ−ベンズイミダゾール、２’−Ｏ−メトキシエチル３−ニトロピロール、及び前記塩基の組み合せからなる群から選択される。より好ましくは、分割領域に位置するユニバーサル塩基は、デオキシイノシン、イノシン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロールまたは５−ニトロインドールであり、最も好ましくは、デオキシイノシンである。
【０１４８】
好ましくは、前記分割部位は、少なくとも３ユニバーサル塩基を有する連続したヌクレオチドを含み、より好ましくは、少なくとも４ユニバーサル塩基、最も好ましくは、少なくとも５ユニバーサル塩基である。
【０１４９】
好ましくは、ＤＰＯ構造の５’−第１プライミング部位の長さは、３’−第２プライミング部位より長い。前記５’−第１プライミング部位は、好ましくは、１５〜６０ヌクレオチドの長さを有して、より好ましくは、１５〜４０ヌクレオチド、さらに好ましくは、１５〜２５ヌクレオチドの長さを有する。３’−第２プライミング部位は、好ましくは、３〜１５ヌクレオチドの長さを有して、より好ましくは、５〜１５ヌクレオチド、最も好ましくは、６〜１３ヌクレオチドの長さを有する。前記分割部位は、好ましくは、３〜１０ヌクレオチド、より好ましくは、４〜８ヌクレオチド、最も好ましくは、５〜７ヌクレオチドの長さを有することが好ましい。本発明の好ましい具現例によると、前記５’−第１プライミング部位は、４０℃〜８０℃のＴｍを有して、より好ましくは、４５℃〜６５℃のＴｍを有する。３’−第２プライミング部位は、好ましくは、１０℃〜４０℃のＴｍを有する。前記分割部位は、好ましくは、３℃〜１５℃のＴｍを有する。
【０１５０】
本発明の好ましい具現例によると、前記３’−第１プライミング部位は、４０℃〜８０℃のＴｍを有して、より好ましくは、４５℃〜６５℃のＴｍを有する。前記５’−第２プライミング部位は、好ましくは、１０℃〜４０℃のＴｍを有する。前記分割部位は、好ましくは、３℃〜１５℃のＴｍを有する。
【０１５１】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の前記増幅に利用される二つのプライマーは、二つともＤＰＯ構造を有する。
【０１５２】
プライマーを利用してターゲット核酸配列を検出する従来技術は、使用されるプライマー及びプローブの内在的な限界のため、エラーシグナルを完璧に除去することができない。しかし、そのような意図的デザインのＤＰＯ構造を含むプライマーは、ごく向上された特異度でターゲット核酸配列にハイブリッド形成されて、エラーシグナル無しにターゲット核酸配列が検出されるようにする。
【０１５３】
本明細書において、プライマーを言及しながら使用される用語‘標準的な’は、ＤＰＯ構造を有しない全てのプライマーを意味する。それらは、本明細書において標準的なプライマーとして説明される。
【０１５４】
本発明の好ましい具現例によると、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子の一つは、５’−第１プライミング部位に位置して、他の一つは、前記５’−第１プライミング部位、前記３’−第２プライミング部位または前記分割部位に位置する。
【０１５５】
本発明は、検出及び／または増幅しようとするターゲット核酸配列に対して、ある特定配列または長さを必要としない。
【０１５６】
ｍＲＮＡを初期物質として利用する場合、アニーリング工程の実施以前に逆転写工程が必須的であり、これの詳細な内容は、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．（２００１）；及びＮｏｏｎａｎ，  Ｋ．  Ｆ．ら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０３６６  （１９８８）に開示されている。逆転写反応のためには、ランダムヘキサマーまたはｍＲＮＡにハイブリッド形成されるオリゴヌクレオチドｄＴプライマーが利用される。
【０１５７】
オリゴヌクレオチドｄＴプライマーは、ｄＴＭＰｓから構成されて、ｄＴプライマーがプライマーとしての役割ができる範囲内でこれのｄＴＭＰｓの一つまたはそれ以上は、他のｄＮＭＰで代替できる。逆転写は、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する逆転写酵素で実施できる。ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素を利用する場合、慎重に反応条件を選択することにより、別途のＲＮａｓｅ  Ｈ切断過程を省くことができる。
【０１５８】
特に、本発明で検出及び／または増幅可能なターゲット核酸配列は、あらゆる天然（Ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）の原核細胞核酸、真核細胞（例えば、原生動物と寄生動物、菌類、酵母、高等植物、下等動物、及び哺乳動物と人間を含む高等動物）核酸、ウイルス（例えば、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス、肝炎ウイルス、ポリオウイルスなど）核酸、またはウイロイド核酸を含む。
【０１５９】
少なくとも二つのターゲット核酸配列が同時に検出（マルチプレックス）されるという点で本発明の利点がさらに目立つ。
【０１６０】
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み（より好ましくは、少なくとも３種、さらに好ましくは、少なくとも５種）、ＴＳＧプライマーは、少なくとも２種のプライマーを含む（より好ましくは、少なくとも３種、さらに好ましくは、少なくとも５種）。本発明の好ましい具現例によると、ＴＳＧプライマーと一緒に対をなしてターゲット核酸配列を増幅できるカウンターパートプライマーは、少なくとも２種のプライマーを含む（より好ましくは、少なくとも３種、さらに好ましくは、少なくとも５種）。
【０１６１】
例えば、５種のＴＳＧプライマー（それぞれの異なる発光波長を有する蛍光レポーター分子が含まれている）、５種のカウンターパートプライマー及び核酸試料が含まれた反応容器を利用して本発明が実施される場合、５種の異なるターゲット核酸配列に該当する５種の異なる蛍光シグナルが発生し、リアルタイム方式で５種の異なるターゲット核酸配列が同時に検出される。この場合、使用されたクエンチャー分子は、全て互いに異なる特性を有するように選択することができる。択一的に、使用されたクエンチャー分子の全てまたは一部は、同じ特性を有するように選択することができる。
【０１６２】
また、本発明は、ヌクレオチド変異の検出において非常に有用である。本発明で使用される用語‘ヌクレオチド変異（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）’は、連続的ＤＮＡ断片または配列の類似したＤＮＡ断片において、特定位置に存在するＤＮＡ配列のヌクレオチド多様性を意味する。このような連続的ＤＮＡ断片は、一つの遺伝子または一つの染色体のある他の部位を含む。例えば、本発明で検出されるヌクレオチド変異は、ＳＮＰ（一塩基多型、Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、欠失、挿入、置換及び転座を含む。ヌクレオチド変異の例は、ヒトゲノムにある多様な変異（例えば、ＭＴＨＦＲ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）遺伝子の変異）、薬剤耐性病原体のヌクレオチド変異及び癌発生関連ヌクレオチドの変異を含む。
【０１６３】
本発明の好ましい具現例によると、本発明で利用されるターゲット核酸配列は、前増幅された（ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｅｄ）核酸配列である。前増幅された核酸配列の利用は、本発明のターゲット検出の敏感度と特異度を大きく増加させる。少量のターゲット核酸配列を適切な水準で前増幅し、次いで本発明によって検出すると、本発明のターゲット検出の敏感度及び特異度が向上される。興味深いことに、前増幅に利用されたプライマーの下流にある配列にハイブリッド形成されるＴＳＧプライマーを利用する場合、前記ＴＳＧプライマーは、ｎｅｓｔｅｄプライマー役割をして、本発明のターゲット検出の特異性を増加させる。
【０１６４】
本発明の好ましい具現例によると、増幅反応を利用してターゲット核酸配列を検出するために本発明に前増幅された核酸配列を利用する場合、本発明で利用されるプライマー対は、ｎｅｓｔｅｄ増幅のためのプライマー対である。
【０１６５】
本発明の他の様態によると、本発明は、
（ａ）ＴＳＧプライマーであって、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）レポーター分子及びクエンチャー分子を含み、前記ＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列とハイブリッド形成されない場合、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、前記ＴＳＧプライマーで３次元的に互いに隣接し、前記クエンチャー分子は、前記レポーター分子から出るシグナルをクエンチングして、前記ＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、前記ＴＳＧプライマーで３次元的に離隔され、前記クエンチャー分子は、前記レポーター分子から出るシグナルを脱消光して、これにより、前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生されて取得されるＴＳＧプライマーと、
（ｂ）鋳型依存的核酸ポリメラーゼであって、前記ＴＳＧプライマーと前記ターゲット核酸配列間のハイブリッド形成結果物に作用し、前記ＴＳＧプライマーの３’−末端に３’−伸長反応を発生させることができる鋳型依存的核酸ポリメラーゼと、を含み、ＴＳＧプライマー（Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ）を利用してＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキットを提供する。
【０１６６】
本発明のキットは、上述の本発明の検出方法を実施できるように構成されたものであるため、その中腹する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるために、その記載を省く。
【０１６７】
本発明のキットは、バッファー、ＤＮＡポリメラーゼ助因子及びデオキシリボヌクレオチド−５−トリホスフェートのようなターゲット増幅ＰＣＲ反応（例えば、ＰＣＲ反応）に必要な試薬を選択的に含むことができる。選択的に本発明のキットは、多様なポリヌクレオチド分子、逆転写酵素、多様なバッファー及び試薬、及びＤＮＡポリメラーゼ活性を抑制する抗体を含むことができる。
【０１６８】
また、キットは、陽性対照群及び陰性対照群反応を実施するに必要な試薬を含むことができる。ある一つの特定反応で使用される試薬の最適量は、本明細書の開示事項を習得した当業者により容易に決定できる。典型的に、本発明のキットは、上記言及された構成成分を含む別途の包装または区分で製作される。
【０１６９】
本発明の特徴と利点は、下記のように要約できる：
（ａ）本発明は、ターゲット核酸配列を検出するための新規なリアルタイムＰＣＲ方法に関するものである。ＴＳＧプライマーは、二重相互作用的標識システムから出るターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを発生させることができ、ＰＣＲ反応の間、その３’−伸長反応によりターゲット核酸配列を増幅させることができる。したがって、本発明は、リアルタイム方式でターゲット増幅と同時にターゲット核酸配列を検出する新規な方法を提供することができる。
（ｂ）ＴＳＧプライマーの伸長反応は、伸長産物内に二重標識ＴＳＧプライマーが含まれるようにして、これにより、増幅産物の量に比例し、シグナルの強度が発生する。本発明に適用されるこのようなカップリング現象は、より正確なターゲット核酸配列の定量分析を可能にする。
（ｃ）標識プローブとは異なって、ＴＳＧプライマー自体が如何なるプライマー伸長反応無しに非特異的に非ターゲット配列にハイブリッド形成される場合、高温のような厳格条件（Ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下でシグナル検出を行うことにより、擬陽性シグナルが生じないようにすることができる。
（ｄ）本発明のシグナル発生は、ヌクレアーゼ活性による切断反応無しに、ターゲット核酸配列とのハイブリッド形成によってのみ達成できる。この場合、本発明は、５’→３’ヌクレアーゼ活性または３’→５’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを必ずしも必要とせず、したがって、様々な応用のために多様な核酸ポリメラーゼを利用することができる。
（ｅ）５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを利用する場合、本発明は、ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されるＴＳＧプライマーの５’−切断反応からシグナルを得ることができ、これは、ターゲット検出効率を向上させる。
（ｆ）従来のリアルタイムＰＣＲ方法は、標識プローブまたはヘアピン構造のように複雑に修飾されたプライマー構造を必要とし、これは、プローブ及びプライマーのデザイン、合成または配列の選択を難しくした。しかし、本発明のＴＳＧプライマーは、追加的な標識プローブまたは複雑に修飾されたプライマー構造無しに、ターゲット増幅だけではなく、シグナル増幅にも利用でき、リアルタイムＰＣＲのためのプライマーのデザイン、合成及び配列の選択が非常に簡単且つ容易である。したがって、本発明は、従来リアルタイムＰＣＲ技術に比べ、より便利な方式で実施できる新規なリアルタイムＰＣＲ方法を提供する。
（ｇ）従来のプローブベースのリアルタイムＰＣＲ方法は、プライマーだけではなく、プローブに対するハイブリッド形成条件を最適化することが必要であるため、従来のプローブベースのリアルタイムＰＣＲ方法の最適化は非常に難しかった。ヘアピンループを形成するテイルを有するプライマーを利用する従来のリアルタイムＰＣＲ方法は、プライマーにおけるヘアピンループ形成及び修飾を考慮して反応条件を最適化する必要がある。しかし、本発明は、如何なる構造的修飾無しに、プライマーに対する最適化だけを考慮すればよいため、このような従来のリアルタイムＰＣＲ方法の最適化に係わる問題点及び短所から完璧に自由である。
（ｈ）従来のリアルタイムＰＣＲ方法は、プライマーまたはプローブのデザイン及び最適化が難しいため、マルチプレックスアッセイに適切ではない。それに対し、本発明は、リアルタイムＰＣＲにおいて、追加的なプローブまたは複雑に修飾されたプライマー構造無しに、標識されたプライマーだけを利用するため、マルチプレックス方式で卓越にリアルタイムターゲット検出が可能である。
（ｉ）従来のリアルタイムＰＣＲプローブに比較し、ＴＳＧプライマーは、進行過程の間伸長されて、伸長されたＴＳＧプライマーは、ターゲット核酸配列に対してより高い結合力を示す。従来のリアルタイムＰＣＲプライマーは、ヘアピン構造のように複雑に修飾された構造を必要とし、これは、ターゲット核酸配列との結合を妨害する。その反面、ＴＳＧプライマーは、そのような修飾を必要としないため、ＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列とのよりよい結合効率を有する。この特徴は、本発明の方法によるターゲット検出効率の向上に寄与する。
（ｊ）本発明の方法は、標準的なＰＣＲ反応に利用できるようにデザインされたプライマーを標識化して、この標識プライマーをＴＳＧプライマーとしてリアルタイムＰＣＲ反応に適用することにより、リアルタイムＰＣＲ反応を容易に実施することができる。要するに、従来のＰＣＲ反応でアンプリコンを生成させるプライマーを適した標識で容易に標識した後、本発明によってリアルタイムＰＣＲ反応によるターゲット核酸配列の検出に利用する。したがって、本発明の方法は、リアルタイムＰＣＲアッセイの開発において、時間及び費用面で効率的である。
（ｋ）上記論議のように、本発明で使用されるＤＰＯ構造を有するプライマーは、結合特異性の向上をもたらし、これにより、リアルタイムＰＣＲ反応において、プライマーの非ターゲット結合に係わる擬陽性シグナルが除去される。
【実施例】
【０１７０】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
【０１７１】
実施例１：ターゲット核酸配列の検出に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のないＤＮＡポリメラーゼを利用したＴＳＧプライマーの評価
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のない鋳型依存的核酸ポリメラーゼを利用する場合、ＴＳＧプライマーのターゲットハイブリッド形成及び伸長だけで、本発明のＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列を検出するに十分なシグナルを発生できるかどうかを評価した。
【０１７２】
この評価を実験するために、本発明者らは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ遺伝子またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ．  ａｕｒｅｕｓ遺伝子をターゲット鋳型として利用した。実験の便宜のために、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ遺伝子またはＳ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子に対する合成オリゴヌクレオチドを鋳型として利用した。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のないストッフェル断片（Ｓｔｏｆｆｅｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）をＤＮＡポリメラーゼとして利用した。レポーター分子及びクエンチャー分子間の離隔された程度の異なる二つのＴＳＧプライマーを各ターゲットに対してそれぞれ実験した。６−ＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を蛍光レポーター分子として利用して、ＴＳＧプライマーの５’−末端に位置させた。ＢＨＱ−１（Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  １）をクエンチャー分子として利用した。変性、ハイブリッド形成及びプライマー伸長の反復無しに核酸合成反応を行った。指定時間間隔（ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｔｉｍｅ  ｉｎｔｅｒｖａｌ）でシグナルを測定した。
【０１７３】
Ａ．  Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ遺伝子の検出のための核酸合成反応
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ遺伝子のターゲット核酸配列を鋳型として利用する場合、本実施例で利用された合成鋳型及びＴＳＧプライマーの配列は、下記の通りである：
ＳＰ＿Ｔ１０５  ５’−ＴＴＡＣＴＧＡＡＡＧＡＣＡＡＴＧＡＡＧＡＣＡＡＣＣＴＡＡＣＡＧＧＧＧＡＡＧＡＴＧＴＴＣＧＣＧＡＡＧＧＣＴＴＡＡＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＣＴＣＡＧＴＴＡＡＡＣＡＣＣＣＡＡＡＴＣＣＡＣＡＧＴＴＴＧＡＡＧＧＡＣＡＡＡＣＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）
ＳＰ＿ＴＳＧ（９）  ５’−［６−ＦＡＭ］ＴＣＣＴＴＣＡＡＡＣ［Ｔ（ＢＨＱ−１）］ＧＴＧＧＡＴＴＴＧＧＧＴＧＴ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
ＳＰ＿ＴＳＧ（２１）  ５’−［６−ＦＡＭ］ＴＣＣＴＴＣＡＡＡＣＴＧＴＧＧＡＴＴＴＧＧＧ［Ｔ（ＢＨＱ−１）］ＧＴ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）
（括弧内の数字９または２１は、レポーター分子及びクエンチャー分子間の離隔されたヌクレオチド数を意味する。）
【０１７４】
鋳型（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）２ｐｍｏｌｅ、１０×ストッフェルバッファー（Ｓｔｏｆｆｅｌ  ｂｕｆｆｅｒ）［１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）及び１００ｍＭ  ＫＣｌを含有した］２μＬ、ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ストッフェルフラグメント（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、ＵＳ）１ｕｎｉｔ、４種のｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）それぞれ２００μＭ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２及びＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２または３）５ｐｍｏｌｅを含有した２０μＬの最終容量で、ＴＳＧプライマーを利用した核酸合成反応を行った；前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に設置し；前記反応混合物を９５℃で２分間変性させて、５０℃で４０分間インキュベーションした。１分間隔で発生したシグナルを検出した。
【０１７５】
図５に示されたように、二つのＴＧＳプライマーのそれぞれは、鋳型のない場合（Ｎｏ．２及び４）より、鋳型のある場合（Ｎｏ．１及び３）がより高い蛍光強度を示した。したがって、ＴＳＧプライマーが核酸合成反応の間、ＴＳＧプライマーのハイブリッド形成及び伸長を通じて、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ遺伝子を検出するに十分なシグナルを提供するということが分かる。
【０１７６】
鋳型の有無において、クエンチャー分子から９ヌクレオチド離隔された位置にレポーター分子を有するＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）より、クエンチャー分子から２１ヌクレオチド離隔された位置にレポーター分子を有するＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）がさらに明らかなシグナル強度の差異（即ち、ＲＦＵ値の差異）を示したことは、注目すべきことである。
【０１７７】
Ｂ．  Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子の検出のための核酸合成反応
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子のターゲット核酸配列を鋳型として利用する場合、本実施例で利用された合成鋳型及びＴＳＧプライマーの配列は、下記の通りである：
ＳＡ＿Ｔ２００  ５’−ＧＣＣＡＡＴＡＡＡＡＣＴＡＧＧＡＧＧＡＡＡＴＴＴＡＡＡＴＧＴＴＡＧＡＡＴＴＴＧＡＡＣＡＡＧＧＡＴＴＴＡＡＴＣＡＴＴＴＡＧＣＧＡＣＴＴＴＡＡＡＧＧＴＣＡＴＴＧＧＴＧＴＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＡＡＣＡＡＣＧＣＣＧＴＡＡＡＣＣＧＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＣＡＣＧＧＡＡＴＧＡＡＴＡＡＴＧＴＴＧＡＡＴＴＴＡＴＣＧＣＴＡＴＣＡＡＣＡＣＡＧＡＣＧＧＴＣＡＡＧＣＴＴＴＡＡＡＣＴＴＡＴＣＴＡＡＡＧＣＴＧＡＡＴＣＴＡＡＡ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）
ＳＡ＿ＴＳＧ（６）  ５’−［６−ＦＡＭ］ＣＡＴＴＣＣＧ［Ｔ（ＢＨＱ−１）］ＧＧＴＣＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＴＴ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）
ＳＡ＿ＴＳＧ（２１）  ５’−［６−ＦＡＭ］ＣＡＴＴＣＣＧＴＧＧＴＣＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧ［Ｔ（ＢＨＱ−１）］Ｔ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）
（括弧内の数字６または２１は、レポーター分子及びクエンチャー分子間の離隔されたヌクレオチド数を意味する。）
【０１７８】
鋳型（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ０．２ｐｍｏｌｅ）及びＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５または６）を除いては、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ検出に利用された同一なプロトコールで核酸合成反応を行った。
【０１７９】
図６に示されたように、二つのＴＧＳプライマーのそれぞれは、鋳型のない場合（Ｎｏ．２及び４）より、鋳型のある場合（Ｎｏ．１及び３）がより高い蛍光強度を示した。したがって、ＴＳＧプライマーが核酸合成反応の間、ＴＳＧプライマーのハイブリッド形成及び伸長を通じて、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子を検出するに十分なシグナルを提供するということが分かる。
【０１８０】
鋳型の有無において、クエンチャー分子から６ヌクレオチド離隔された位置にレポーター分子を有するＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）より、クエンチャー分子から２１ヌクレオチド離隔された位置にレポーター分子を有するＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）がさらに明らかなシグナル強度の差異（即ち、ＲＦＵ値の差異）を示したことは、注目すべきことである。
【０１８１】
実施例２：ターゲット核酸の検出のためのリアルタイムＰＣＲ反応条件下で、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のないＤＮＡポリメラーゼを利用したＴＳＧプライマーの評価
リアルタイムＰＣＲ反応の間、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のない鋳型依存的核酸ポリメラーゼを利用する場合、本発明のＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列を検出するに十分なシグナルを発生できるかどうかを実験した。
【０１８２】
この評価を実験するために、ＴＳＧプライマーを含むプライマー対を利用し、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ遺伝子の検出のためのリアルタイムＰＣＲ反応をそれぞれ行った。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のないストッフェル断片（Ｓｔｏｆｆｅｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）をＤＮＡポリメラーゼとして利用した。レポーター分子及びクエンチャー分子間の離隔された程度の異なる二つのＴＳＧプライマーを各ターゲット遺伝子に対してそれぞれ実験した。
【０１８３】
Ａ．  Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ遺伝子の検出のためのリアルタイムＰＣＲ
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ遺伝子のターゲット核酸配列を鋳型として利用する場合、本実施例で利用された正方向プライマー及びＴＳＧプライマー（逆方向プライマー）の配列は、下記の通りである：
ＳＰ＿Ｆ１  ５’−ＧＧＴＴＴＣＣＧＴＡＣＡＧＣＣＴＴＧＡＩＩＩＩＩＧＴＴＡＴＣＡＡＴＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）
ＳＰ＿ＴＳＧ（９）  ５’−［６−ＦＡＭ］ＴＣＣＴＴＣＡＡＡＣ［Ｔ（ＢＨＱ−１）］ＧＴＧＧＡＴＴＴＧＧＧＴＧＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
ＳＰ＿ＴＳＧ（２１）  ５’−［６−ＦＡＭ］ＴＣＣＴＴＣＡＡＡＣＴＧＴＧＧＡＴＴＴＧＧＧ［Ｔ（ＢＨＱ−１）］ＧＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）
（Ｉは、デオキシイノシンを示し、括弧内の数字９または２１は、レポーター分子及びクエンチャー分子間の離隔されたヌクレオチド数を意味する。）
【０１８４】
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅゲノムＤＮＡ  １０ｎｇ、１０×ストッフェルバッファー（Ｓｔｏｆｆｅｌ  ｂｕｆｆｅｒ）［１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）及び１００ｍＭ  ＫＣｌを含有した］２μＬ、ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ストッフェルフラグメント（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）１ｕｎｉｔ、４種のｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）それぞれ２００μＭ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、正方向プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）５ｐｍｏｌｅ及び逆方向プライマーとしてＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２または３）５ｐｍｏｌｅを含有した２０μＬの最終容量で、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの検出のためのリアルタイムＰＣＲ反応を行った；前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に設置し；前記反応混合物を９５℃で２分間変性させて、９４℃で３０秒、５５℃で６０秒及び７２℃で１０秒過程を３０回行った。各サイクルのアニーリング工程（５５℃）で発生されたシグナルを検出した。
【０１８５】
図７に示されたように、ＴＳＧプライマー及び５’→３’ヌクレアーゼ活性のない鋳型依存的ＤＮＡポリメラーゼを利用したリアルタイムＰＣＲ反応において、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ鋳型がある場合は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する蛍光シグナルが観察されたが（Ｎｏ．１及び３）、その反面、ターゲット鋳型のない陰性対照群では、蛍光シグナルが現れなかった（Ｎｏ．２及び４）。
【０１８６】
クエンチャー分子から９ヌクレオチド離隔された位置にレポーター分子を有するＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）より、クエンチャー分子から２１ヌクレオチド離隔された位置にレポーター分子を有するＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）がさらに低いＣｔ値とさらに高いＲＦＵ値を示した。
【０１８７】
Ｂ．  Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子の検出のためのリアルタイムＰＣＲ
Ｓ．ａｕｒｅｕｓのターゲット核酸配列を鋳型として利用する場合、本実施例で利用された正方向プライマー及びＴＳＧプライマー（逆方向プライマー）の配列は、下記の通りである：
ＳＡ＿Ｆ１  ５’−ＴＧＴＴＡＧＡＡＴＴＴＧＡＡＣＡＡＧＧＡＴＴＴＡＡＩＩＩＩＩＴＡＧＣＧＡＣＴＴＴ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）
ＳＡ＿ＴＳＧ（６）  ５’−［６−ＦＡＭ］ＣＡＴＴＣＣＧ［Ｔ（ＢＨＱ−１）］ＧＧＴＣＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＴＴ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）
ＳＡ＿ＴＳＧ（２１）  ５’−［６−ＦＡＭ］ＣＡＴＴＣＣＧＴＧＧＴＣＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧ［Ｔ（ＢＨＱ−１）］Ｔ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）
（Ｉは、デオキシイノシンを示し、括弧内の数字６または２１は、レポーター分子及びクエンチャー分子間の離隔されたヌクレオチド数を意味する。）
【０１８８】
鋳型（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、正方向プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）及び逆方向プライマーであるＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５または６）を除いては、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ検出に利用された同一なプロトコールでリアルタイムＰＣＲ反応を行った。
【０１８９】
図８に示されたように、ＴＳＧプライマー及び５’→３’ヌクレアーゼ活性のない鋳型依存的ＤＮＡポリメラーゼを利用したリアルタイムＰＣＲ反応において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ鋳型がある場合は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する蛍光シグナルが観察されたが（Ｎｏ．１及び３）、その反面、ターゲット鋳型のない陰性対照群では、蛍光シグナルが現れなかった（Ｎｏ．２及び４）。
【０１９０】
クエンチャー分子から６ヌクレオチド離隔された位置にレポーター分子を有するＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）より、クエンチャー分子から２１ヌクレオチド離隔された位置にレポーター分子を有するＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）がさらに低いＣｔ値とさらに高いＲＦＵ値を示した。
【０１９１】
Ｃ．  Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子の検出のためのリアルタイムＰＣＲ
Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのターゲット核酸配列を鋳型として利用する場合、本実施例で利用された正方向プライマー及びＴＳＧプライマー（逆方向プライマー）の配列は、下記の通りである：
ＮＧ＿Ｆ１  ５’−ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＣＧＣＴＩＩＩＩＩＧＴＡＡＴＣＡＧＡＴ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）
ＮＧ＿ＴＳＧ（４）  ５’−［６−ＦＡＭ］ＣＴＣＡＴ［Ｔ（ＢＨＱ−１）］ＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧＣＡＴＡＴＴＴＡＡＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）
ＮＧ＿ＴＳＧ（２２）  ５’−［６−ＦＡＭ］ＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧＣＡＴＡＴＴ［Ｔ（ＢＨＱ−１）］ＡＡＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）
（Ｉは、デオキシイノシンを示し、括弧内の数字４または２２は、レポーター分子及びクエンチャー分子間の離隔されたヌクレオチド数を意味する。）
【０１９２】
鋳型（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、正方向プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）及び逆方向プライマーであるＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０または１１）を除いては、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ検出に利用された同一なプロトコールでリアルタイムＰＣＲ反応を行った。
【０１９３】
図９に示されたように、ＴＳＧプライマー及び５’→３’ヌクレアーゼ活性のない鋳型依存的ＤＮＡポリメラーゼを利用したリアルタイムＰＣＲ反応において、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ鋳型がある場合は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに対する蛍光シグナルが観察されたが（Ｎｏ．１及び３）、その反面、ターゲット鋳型のない陰性対照群では、蛍光シグナルが現れなかった（Ｎｏ．２及び４）。
【０１９４】
また、図９に示されたように、クエンチャー分子から４ヌクレオチド離隔された位置にレポーター分子を有するＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）より、クエンチャー分子から２２ヌクレオチド離隔された位置にレポーター分子を有するＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）がさらに低いＣｔ値とさらに高いＲＦＵ値を示した。
【０１９５】
Ｄ．  Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ遺伝子の検出のためのリアルタイムＰＣＲ
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのターゲット核酸配列を鋳型として利用する場合、本実施例で利用された逆方向プライマー及びＴＳＧプライマー（正方向プライマー）の配列は、下記の通りである：
ＮＭ＿Ｒ１  ５’−ＣＣＡＴＡＡＣＣＴＴＧＡＧＣＡＡＴＣＣＡＩＩＩＩＩＣＣＴＧＡＣＧＴＴＣ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）
ＮＭ＿ＴＳＧ（７）  ５’−［６−ＦＡＭ］ＣＴＴＡＴＣＧＣ［Ｔ（ＢＨＱ−１）］ＴＴＣＴＧＡＡＧＣＣＡＴＴＧ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）
ＮＭ＿ＴＳＧ（２０）  ５’−［６−ＦＡＭ］ＣＴＴＡＴＣＧＣＴＴＴＣＴＧＡＡＧＣＣＡＴ［Ｔ（ＢＨＱ−１）］Ｇ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）
（Ｉは、デオキシイノシンを示し、括弧内の数字７または２０は、レポーター分子及びクエンチャー分子間の離隔されたヌクレオチド数を意味する。）
【０１９６】
鋳型（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、逆方向プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）及び正方向プライマーであるＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３または１４）を除いては、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ検出に利用された同一なプロトコールでリアルタイムＰＣＲ反応を行った。
【０１９７】
図１０に示されたように、ＴＳＧプライマー及び５’→３’ヌクレアーゼ活性のない鋳型依存的ＤＮＡポリメラーゼを利用したリアルタイムＰＣＲ反応において、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ鋳型がある場合は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対する蛍光シグナルが観察されたが（Ｎｏ．１及び３）、その反面、ターゲット鋳型のない陰性対照群では、蛍光シグナルが現れなかった（Ｎｏ．２及び４）。
【０１９８】
また、図１０に示されたように、クエンチャー分子から７ヌクレオチド離隔された位置にレポーター分子を有するＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）より、クエンチャー分子から２０ヌクレオチド離隔された位置にレポーター分子を有するＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）がさらに低いＣｔ値とさらに高いＲＦＵ値を示した。
【０１９９】
実施例３：Ｓ．ａｕｒｅｕｓの検出のために、ＴＳＧプライマー及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のないＤＮＡポリメラーゼを利用したリアルタイムＰＣＲの敏感度
ＴＳＧプライマー及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のないＤＮＡポリメラーゼを利用したリアルタイムＰＣＲの敏感度は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子のターゲット核酸配列を検出することにより確認した。この実験のために、リアルタイムＰＣＲ反応に逆方向プライマーとしてＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）を利用した。１００ｐｇから１０ｆｇまで連続的に希釈させた（１０倍ずつ希釈）Ｓ．ａｕｒｅｕｓゲノムＤＮＡを鋳型として利用した。
【０２００】
本実施例で利用された正方向プライマー及びＴＳＧプライマー（逆方向プライマー）の配列は、下記の通りである：
ＳＡ＿Ｆ１  ５’−ＴＧＴＴＡＧＡＡＴＴＴＧＡＡＣＡＡＧＧＡＴＴＴＡＡＩＩＩＩＩＴＡＧＣＧＡＣＴＴＴ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）
ＳＡ＿ＴＳＧ（２１）  ５’−［６−ＦＡＭ］ＣＡＴＴＣＣＧＴＧＧＴＣＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧ［Ｔ（ＢＨＱ−１）］Ｔ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）
（Ｉは、デオキシイノシンを示し、括弧内の数字２１は、レポーター分子及びクエンチャー分子間の離隔されたヌクレオチド数を意味する。）
【０２０１】
連続的に希釈させたＳ．ａｕｒｅｕｓゲノムＤＮＡ（１００ｐｇから１０ｆｇまで；１０倍ずつ希釈）、１０×ストッフェルバッファー（Ｓｔｏｆｆｅｌ  ｂｕｆｆｅｒ）［１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）及び１００ｍＭ  ＫＣｌを含有した］２μＬ、ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ストッフェルフラグメント（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）１ｕｎｉｔ、４種のｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）それぞれ２００μＭ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、正方向プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）５ｐｍｏｌｅ及び逆方向プライマーとしてＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）５ｐｍｏｌｅを含有した２０μＬの最終容量でリアルタイムＰＣＲ反応を行った；前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に設置し；前記反応混合物を９５℃で２分間変性させて、９４℃で３０秒、５５℃で６０秒及び７２℃で１０秒過程を４０回行った。各サイクルのアニーリング工程（５５℃）で発生されたシグナルを検出した。
【０２０２】
図１１に示されたように、一連に希釈させたＳ．ａｕｒｅｕｓゲノムＤＮＡを利用してリアルタイムＰＣＲを行う場合、１００ｆｇまで希釈させた場合にもターゲット核酸配列が検出された（Ｎｏ．１〜４）。
【０２０３】
実施例４：５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼを利用したＴＳＧプライマー５’−末端部位の５’−切断反応によるシグナル発生
本発明者らは、鋳型依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性によりターゲット核酸配列にハイブリッド形成された標識プライマーの５’−末端部位で５’−切断反応が起こり、前記５’−切断反応がターゲット配列の検出に絶妙に適用され、ターゲット配列に対するシグナルを発生させるということを見出した（ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００７０６４参照）。
【０２０４】
したがって、本発明者らは、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼによりＴＳＧプライマーの５’−末端部位で５’−切断反応が起こり、これによりシグナルが発生されるかどうか実験した。
【０２０５】
この評価を実験するために、本発明者らは、実験便宜上、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅをターゲットとして、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ遺伝子に対する合成オリゴヌクレオチドを鋳型として利用した。レポーター分子及びクエンチャー分子間の離隔された程度の異なる二つのＴＳＧプライマーをそれぞれ実験した。６−ＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を蛍光レポーター分子として利用し、ＴＳＧプライマーの５’−末端に位置させた。ＢＨＱ−１（Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  １）をクエンチャー分子として利用した。変性、ハイブリッド形成及びプライマー伸長を反復して、核酸合成反応を行った。各反復のハイブリッド形成工程でシグナルを測定した。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のないストッフェル切片（Ｓｔｏｆｆｅｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡポリメラーゼとして利用した。
【０２０６】
本実施例で利用された合成鋳型及びＴＳＧプライマーの配列は、下記の通りである：
ＳＰ＿Ｔ１０５  ５’−ＴＴＡＣＴＧＡＡＡＧＡＣＡＡＴＧＡＡＧＡＣＡＡＣＣＴＡＡＣＡＧＧＧＧＡＡＧＡＴＧＴＴＣＧＣＧＡＡＧＧＣＴＴＡＡＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＣＴＣＡＧＴＴＡＡＡＣＡＣＣＣＡＡＡＴＣＣＡＣＡＧＴＴＴＧＡＡＧＧＡＣＡＡＡＣＣ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）
ＳＰ＿ＴＳＧ（９）  ５’−［６−ＦＡＭ］ＴＣＣＴＴＣＡＡＡＣ［Ｔ（ＢＨＱ−１）］ＧＴＧＧＡＴＴＴＧＧＧＴＧＴ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
ＳＰ＿ＴＳＧ（２１）  ５’−［６−ＦＡＭ］ＴＣＣＴＴＣＡＡＡＣＴＧＴＧＧＡＴＴＴＧＧＧ［Ｔ（ＢＨＱ−１）］ＧＴ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）
（括弧内の数字９または２１は、レポーター分子及びクエンチャー分子間の離隔されたヌクレオチド数を意味する。）
【０２０７】
Ａ．  ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のないＤＮＡポリメラーゼを利用して、変性、ハイブリッド形成及びプライマー伸長を反復した核酸合成反応
鋳型（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）２ｐｍｏｌｅ、１０×ストッフェルバッファー（Ｓｔｏｆｆｅｌ  ｂｕｆｆｅｒ）［１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）及び１００ｍＭ  ＫＣｌを含有した］２μＬ、ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ストッフェルフラグメント（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）１ｕｎｉｔ、４種のｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）それぞれ２００μＭ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２及びＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２または３）５ｐｍｏｌｅを含有した２０μＬの最終容量で核酸合成反応を行った；前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に設置し；前記反応混合物を９５℃で２分間変性させて、９４℃で３０秒及び５０℃で６０秒過程を４０回行った。各サイクルのアニーリング工程（５０℃）で発生されたシグナルを検出した。
【０２０８】
ノーマライゼーション（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）以後の結果を図１２に示したように、５’→３’ヌクレアーゼ活性のないストッフェル切片（Ｓｔｏｆｆｅｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）をＤＮＡポリメラーゼとして利用する場合、鋳型があってもシグナルの差異は現れなかった（Ｎｏ．１及び５）。
【０２０９】
このような結果は、ハイブリッド形成及びプライマー伸長だけで発生されたシグナルの強度が、反応サイクルの増加によって変化されず、これは、核酸反応の間、鋳型が増幅されなかったからであることを示す。
【０２１０】
したがって、核酸合成反応のサイクル反復において、ＴＳＧプライマーのハイブリッド形成及びプライマー伸長だけでは、ターゲット核酸配列があっても、検出可能なシグナルが蓄積されないことが分かる（Ｎｏ．１及び５）。
【０２１１】
Ｂ．  ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを利用して、変性、ハイブリッド形成及びプライマー伸長を反復した核酸合成反応
鋳型（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）２ｐｍｏｌｅ、２×ＤｉａＳｔａｒＴａｑ  ＰＣＲマスターミックス（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）［１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ＤｉａＳｔａｒＴａｑ  ＰＣＲバッファー、ＤｉａＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ２Ｕ及びｄＮＴＰミックスを含有した］１０μＬ及びＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２または３）５ｐｍｏｌｅを含有した２０μＬの最終容量で核酸合成反応を行った；前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に設置し；前記反応混合物を９５℃で１５分間変性させて、９４℃で３０秒及び５０℃で６０秒過程を４０回行った。各サイクルのアニーリング工程（５０℃）で発生されたシグナルを検出した。
【０２１２】
図１２に示されたように、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡポリメラーゼとして利用する場合、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対するシグナルの差異が観察された（Ｎｏ．３及び７）。
【０２１３】
このような結果は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼを利用してＴＳＧプライマーの５’−末端部位における５’−切断反応を発生させることができることを示す。したがって、サイクル毎にＴＳＧプライマーから放出された標識切片からシグナルが発生され、蓄積されて、ターゲット核酸配列の存在を示す観察可能なシグナルが結果として生じる（Ｎｏ．３及び７）。
【０２１４】
一方、クエンチャー分子から２１ヌクレオチド離隔された位置にレポーター分子を有するＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）より、クエンチャー分子から９ヌクレオチド離隔された位置にレポーター分子を有するＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）がさらに低いＣｔ値を示した。このような結果は、ＴＳＧプライマーのレポーター及びクエンチャー間の距離が短いほど、レポーター及びクエンチャー間の距離が長いものに比べ、クエンチングする程度において、５’−切断反応前後に大きい差を示すということを意味する。
【０２１５】
実施例５：ターゲット核酸の検出のためのリアルタイムＰＣＲ反応条件下で５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを利用したＴＳＧプライマーの実験
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼを利用して、リアルタイムＰＣＲ反応の間、本発明のＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列を検出するに十分なシグナルを発生できるかどうか評価した。
【０２１６】
この評価を実験するために、本発明者らは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼ及び反応条件を除いて、実施例２で利用されたものと同一な鋳型及びプライマーを利用した。
【０２１７】
Ａ．Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの検出のためのリアルタイムＰＣＲ
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅゲノムＤＮＡ  １０ｎｇ、２×ＤｉａＳｔａｒＴａｑ  ＰＣＲマスターミックス（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）［１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ＤｉａＳｔａｒＴａｑ  ＰＣＲバッファー、ＤｉａＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ２Ｕ及びｄＮＴＰミックスを含有した］１０μＬ、正方向プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）５ｐｍｏｌｅ及び逆方向プライマーとしてＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２または３）５ｐｍｏｌｅを含有した２０μＬの最終容量でリアルタイムＰＣＲを行った；前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に設置し；前記反応混合物を９５℃で１５分間変性させて、９４℃で３０秒及び５５℃で６０秒及び７２℃で１０秒過程を３０回行った。各サイクルのアニーリング工程（５５℃）で発生されたシグナルを検出した。
【０２１８】
図１３に示されたように、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ鋳型のある場合は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する蛍光シグナルが観察されたが（Ｎｏ．１及び３）、その反面、鋳型のない陰性対照群では、蛍光シグナルが現れなかった（Ｎｏ．２及び４）。
【０２１９】
また、クエンチャー分子から９ヌクレオチド離隔された位置にレポーター分子を有するＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）より、クエンチャー分子から２１ヌクレオチド離隔された位置にレポーター分子を有するＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）がさらに低いＣｔ値とさらに高いＲＦＵ値を示した。
【０２２０】
Ｂ．Ｓ．ａｕｒｅｕｓの検出のためのリアルタイムＰＣＲ
鋳型（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、正方向プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）及び逆方向プライマーとしてＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５または６）を除いては、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ検出に利用されたプロトコールでリアルタイムＰＣＲ反応を行った。
【０２２１】
図１４に示されたように、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ鋳型のある場合は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する蛍光シグナルが観察されたが（Ｎｏ．１及び３）、その反面、鋳型のない陰性対照群では、蛍光シグナルが現れなかった（Ｎｏ．２及び４）。また、クエンチャー分子から６ヌクレオチド離隔された位置にレポーター分子を有するＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）より、クエンチャー分子から２１ヌクレオチド離隔された位置にレポーター分子を有するＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）がさらに低いＣｔ値とさらに高いＲＦＵ値を示した。
【０２２２】
Ｃ．Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの検出のためのリアルタイムＰＣＲ
鋳型（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、正方向プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）及び逆方向プライマーであるＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０または１１）を除いては、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ検出に利用されたプロトコールでリアルタイムＰＣＲ反応を行った。
【０２２３】
図１５に示されたように、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ鋳型のある場合は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに対する蛍光シグナルが観察されたが（Ｎｏ．１及び３）、その反面、鋳型のない陰性対照群では、蛍光シグナルが現れなかった（Ｎｏ．２及び４）。また、クエンチャー分子から４ヌクレオチド離隔された位置にレポーター分子を有するＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）より、クエンチャー分子から２２ヌクレオチド離隔された位置にレポーター分子を有するＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）がさらに低いＣｔ値とさらに高いＲＦＵ値を示した。
【０２２４】
Ｄ．Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの検出のためのリアルタイムＰＣＲ
鋳型（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、逆方向プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）及び逆方向プライマーであるＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３または１４）を除いては、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ検出に利用されたプロトコールでリアルタイムＰＣＲ反応を行った。
【０２２５】
図１６に示されたように、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ鋳型のある場合は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対する蛍光シグナルが観察されたが（Ｎｏ．１及び３）、その反面、鋳型のない陰性対照群では、蛍光シグナルが現れなかった（Ｎｏ．２及び４）。また、クエンチャー分子から７ヌクレオチド離隔された位置にレポーター分子を有するＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）より、クエンチャー分子から２０ヌクレオチド離隔された位置にレポーター分子を有するＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）がさらに低いＣｔ値とさらに高いＲＦＵ値を示した。
【０２２６】
結論として、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的ＤＮＡポリメラーゼを利用する場合、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを二つの異なる方式で示すことができる：（ｉ）ターゲット核酸配列とのハイブリッド形成による構造変化により引き起こされた、ＴＳＧプライマー上の相互作用的標識システムのシグナル脱消光によるシグナル発生；及び（ｉｉ）５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼを利用したＴＳＧプライマー５’−末端部位における５’−切断反応によるシグナル発生。
【０２２７】
実施例６：Ｓ．ａｕｒｅｕｓの検出のために、ＴＳＧプライマー及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを利用したリアルタイムＰＣＲの敏感度
ＴＳＧプライマー及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを利用したリアルタイムＰＣＲの敏感度は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子のターゲット核酸配列を検出することにより確認した。この評価を実験するために、本発明者らは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼ及び反応条件を除いては、実施例３で利用されたものと同一な鋳型及びプライマーを利用した。
【０２２８】
連続的に希釈させたＳ．ａｕｒｅｕｓゲノムＤＮＡ（１００ｐｇから１０ｆｇまで；１０倍ずつ希釈）、１０×ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔマルチプレックスＰＣＲマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ）［１１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔマルチプレックスＰＣＲバッファー、ＨｏｔｓｔａｒｔＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰミックスを含有した］１０μＬ、正方向プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）５ｐｍｏｌｅ及び逆方向プライマーとしてＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）５ｐｍｏｌｅを含有した２０μＬの最終容量でリアルタイムＰＣＲ反応を行った；前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に設置し；前記反応混合物を９５℃で１５分間変性させて、９４℃で３０秒、５５℃で６０秒及び７２℃で１０秒過程を４０回行った。各サイクルのアニーリング工程（５５℃）で発生されたシグナルを検出した。
【０２２９】
図１７においても、図１１で述べたように、連続的に希釈させたＳ．ａｕｒｅｕｓゲノムＤＮＡを利用してリアルタイムＰＣＲを行う場合、１００ｆｇまで希釈させた場合にもターゲット核酸配列が検出された（Ｎｏ．１〜４）。
【０２３０】
実施例７：チップにおけるターゲット核酸配列の検出のためのＴＳＧプライマーの評価
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ遺伝子のターゲット核酸を鋳型として利用する場合、本実施例で利用された合成鋳型及びＴＳＧプライマーの配列は、下記の通りである：
ＳＰ＿Ｔ１０５  ５’−ＴＴＡＣＴＧＡＡＡＧＡＣＡＡＴＧＡＡＧＡＣＡＡＣＣＴＡＡＣＡＧＧＧＧＡＡＧＡＴＧＴＴＣＧＣＧＡＡＧＧＣＴＴＡＡＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＣＴＣＡＧＴＴＡＡＡＣＡＣＣＣＡＡＡＴＣＣＡＣＡＧＴＴＴＧＡＡＧＧＡＣＡＡＡＣＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）
ＳＰ＿ＴＳＧ（２１）＿Ｓ  ５’−［ＡｍｉｎｏＣ６］ＴＴＴＴＴ［Ｔ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｅ）］ＣＣＴＴＣＡＡＡＣＴＧＴＧＧＡＴＴＴＧＧＧ［Ｔ（ＢＨＱ−１）］ＧＴ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）
（括弧内の数字２１は、レポーター分子及びクエンチャー分子間の離隔されたヌクレオチド数を意味する。）
【０２３１】
Ａ．チップスライド上におけるＴＳＧプライマーの固定化
Ｇｅｎｏｒａｍａスポッティング溶液タイプＩでＴＳＧプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）が最終濃度５０μＭになるように溶解させた。溶解されたＴＳＧプライマーを常温、７０％相対湿度でガラススライド（Ｇｅｎｏｒａｍａ、Ｅｓｔｏｎｉａ）上にスポッティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）した。３７℃恒湿器で２時間スライドをインキュベーションした。その後、スライドを１％アンモニア溶液に１０分間放置して、常温で蒸留水で洗浄した。
【０２３２】
Ｂ．チップ上における核酸合成反応
鋳型（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）２ｐｍｏｌｅ、１０×ストッフェルバッファー（Ｓｔｏｆｆｅｌ  ｂｕｆｆｅｒ）［１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）及び１００ｍＭ  ＫＣｌを含有した］２μＬ、ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ストッフェルフラグメント（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）１ｕｎｉｔ、４種のｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）それぞれ２００μＭ及び５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有した２０μＬの最終容量で核酸合成反応を行った；前記反応混合物をスライドに移した。前記スライドをｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ器（ＧｅｎｅＡｍｐ  ｉｎ  ｓｉｔｕ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）に位置させた；変性のために、前記スライドを９５℃で２分間インキュベーションして、５０℃で４０分間インキュベーションした。核酸合成反応後、前記スライドを洗浄して（７０℃で）、マイクロアレイスキャナー（ＳｃａｎＡｒｒａｙ４０００、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を利用して、スライドのシグナルを検出してイメージを分析した。
【０２３３】
以上、本発明の望ましい具現例を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。
【図１ａ】
2013514803.tif 000003
【図１ｂ】
2013514803.tif 000004
【図２ａ】
2013514803.tif 000005
【図２ｂ】
2013514803.tif 000006
【図３ａ】
2013514803.tif 000007
【図３ｂ】
2013514803.tif 000008
【図４ａ】
2013514803.tif 000009
【図４ｂ】
2013514803.tif 000010
【図５】
2013514803.tif 000011
【図６】
2013514803.tif 000012
【図７】
2013514803.tif 000013
【図８】
2013514803.tif 000014
【図９】
2013514803.tif 000015
【図１０】
2013514803.tif 000016
【図１１】
2013514803.tif 000017
【図１２】
2013514803.tif 000018
【図１３】
2013514803.tif 000019
【図１４】
2013514803.tif 000020
【図１５】
2013514803.tif 000021
【図１６】
2013514803.tif 000022
【図１７】
2013514803.tif 000023
【配列表】
2013514803000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年8月15日(2012.8.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターゲットシグナル発生プライマー（Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ、ＴＳＧプライマー）を利用してＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法であって、
（ａ）ターゲット核酸配列をＴＳＧプライマーとハイブリッド形成させる工程であって、前記ＴＳＧプライマーは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）レポーター分子及びクエンチャー分子を含み、前記ＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列とハイブリッド形成されない場合、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、前記ＴＳＧプライマーで３次元的に互いに隣接し、前記クエンチャー分子は、前記レポーター分子から出るシグナルをクエンチングして、前記ＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、前記ＴＳＧプライマーで３次元的に離隔され、前記クエンチャー分子は、前記レポーター分子から出るシグナルを脱消光して、これにより、前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生されて取得される工程と、
（ｂ）工程（ａ）の結果物をプライマー伸長条件下で鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって、前記ＴＳＧプライマーの３’−末端で３’−伸長反応が発生する工程と、
（ｃ）前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを検出する工程であって、これにより、前記シグナルは、ＤＮＡまたは核酸混合物内にターゲット核酸配列が存在することを示す工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼは、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有して、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性により前記ＴＳＧプライマーの３’−末端が伸長されて、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性により前記ＴＳＧプライマーの５’−末端が切断され、これにより前記レポーター分子または前記クエンチャー分子が前記ＴＳＧプライマーから放出されて、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法は、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを増幅させるために、前記工程（ａ）−（ｂ）または（ａ）−（ｃ）を少なくとも２回反復する工程と、その反復サイクルの間に変性過程とをさらに含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＴＳＧプライマーの前記レポーター分子または前記クエンチャー分子は、５’−末端またはその５’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔された位置にある請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記クエンチャー分子は、蛍光であり、工程（ｃ）で検出されるターゲット核酸配列の存在を示すシグナルは、前記蛍光クエンチャー分子から出るシグナルである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼである請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＴＳＧプライマーは、その３’−末端部位に前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性に対して耐性を有するバックボーンを含む少なくとも１個のミスマッチヌクレオチドを有する請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記方法は、固相で行われて、前記ＴＳＧプライマーは、その５’−末端を介して固相基質の表面に固定化される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み、前記ＴＳＧプライマーは、少なくとも２種のプライマーを含む請求項１または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む請求項１または８に記載の方法。
【請求項１１】
ターゲットシグナル発生プライマー（Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ、ＴＳＧプライマー）を利用した増幅反応を通じてＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法であって、
（ａ）前記ターゲット核酸配列を増幅できる正方向プライマー及び逆方向プライマーとしての二つのプライマーを含む一対のプライマーと前記ターゲット核酸配列をハイブリッド形成させる工程であって、前記二つのプライマーのうち、少なくとも一つは、ＴＳＧプライマーであり、前記ＴＳＧプライマーは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）レポーター分子及びクエンチャー分子を含み、前記ＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列とハイブリッド形成されない場合、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、前記ＴＳＧプライマーで３次元的に互いに隣接し、前記クエンチャー分子は、前記レポーター分子から出るシグナルをクエンチングして、前記ＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、前記ＴＳＧプライマーで３次元的に離隔され、前記クエンチャー分子は、前記レポーター分子から出るシグナルを脱消光して、これにより、前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生されて取得される工程と、
（ｂ）工程（ａ）の結果物をプライマー伸長条件下で鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって前記二つのプライマーの３’−末端で３’−伸長反応が発生する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）の結果物を変性させる工程と、
（ｄ）前記工程（ａ）−（ｃ）を少なくとも２回反復し、前記ターゲット核酸配列及び前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルを全て増幅する工程と、
（ｅ）前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを検出する工程であって、前記シグナル検出は、工程（ｄ）の前記反復の各サイクルにおいて、工程（ｄ）の前記反復の終了時点で、または前記反復の間の指定時間間隔のそれぞれで行われて、このようなシグナルは、ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼは、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有して、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性により前記ＴＳＧプライマーの３’−末端が伸長されて、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性により前記ＴＳＧプライマーの５’−末端が切断され、これにより前記レポーター分子または前記クエンチャー分子が前記ＴＳＧプライマーから放出されて、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＴＳＧプライマーの前記レポーター分子または前記クエンチャー分子は、５’−末端またはその５’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔された位置にある請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記クエンチャー分子は、蛍光であり、工程（ｅ）で検出されるターゲット核酸配列の存在を示すシグナルは、前記蛍光クエンチャー分子から出るシグナルである請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼである請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法は、固相で行われて、前記二つのプライマーのうち、少なくとも一つは、その５’−末端を介して固相基質の表面に固定化されて、前記固定化されたプライマーは、ＴＳＧプライマーである請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
ターゲットシグナル発生プライマー（Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ、ＴＳＧプライマー）を利用してＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキットであって、
（ａ）ＴＳＧプライマーであって、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）レポーター分子及びクエンチャー分子を含み、前記ＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列とハイブリッド形成されない場合、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、前記ＴＳＧプライマーで３次元的に互いに隣接し、前記クエンチャー分子は、前記レポーター分子から出るシグナルをクエンチングして、前記ＴＳＧプライマーがターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子は、前記ＴＳＧプライマーで３次元的に離隔され、前記クエンチャー分子は、前記レポーター分子から出るシグナルを脱消光して、これにより、前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生されて取得されるＴＳＧプライマーと、
（ｂ）鋳型依存的核酸ポリメラーゼであって、前記ＴＳＧプライマーと前記ターゲット核酸配列間のハイブリッド形成結果物に作用し、前記ＴＳＧプライマーの３’−末端に３’−伸長反応を発生させることができる鋳型依存的核酸ポリメラーゼと、
を含むことを特徴とするキット。
【請求項１８】
前記キットは、前記ターゲット核酸配列を増幅できる正方向プライマー及び逆方向プライマーとしての二つのプライマーを含む一対のプライマーを含み、前記二つのプライマーのうち、少なくとも一つは、前記ＴＳＧプライマーである請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼは、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有して、そのポリメラーゼ活性によりＴＳＧプライマーの３’−末端に３’−伸長反応及びその５’→３’ヌクレアーゼ活性によりＴＳＧプライマーの５’−末端に５’−切断反応の両方を発生させる請求項１７または１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記ＴＳＧプライマーの前記レポーター分子または前記クエンチャー分子は、５’−末端またはその５’−末端から１〜５ヌクレオチド離隔された位置にある請求項１７から１９のいずれかに記載のキット。
【請求項２１】
前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼである請求項１７または１８に記載のキット。
【国際調査報告】
2013514803.tif 000024
2013514803.tif 000025
2013514803.tif 000026
2013514803.tif 000027
2013514803.tif 000028