(57)【要約】 2013501766.tif 000177  本発明は、固体基材及びそれに連結された式（Ｉ）の部分を含む生成物に関し、式中、Ｘ、Ｘ’及びＲは本明細書中に記載したとおりである。この生成物は、多数の適用（例えば、アフィニティクロマトグラフィー、ＥＬＩＳＡ、バイオテクノロジーアッセイ技術及び固相ペプチド合成）のために、標的分子（生化学的に興味深い分子など）を固体基材に固定化するために有用である。【選択図】なし
2013501766.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）固体基材及び（ｂ）それに連結された式（Ｉ）の部分を含む、生成物：
【化１】
2013501766.tif 000165
式中、
Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＱの基を示し、Ｑは、水素、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル又はフェニルであり；
以下のいずれかであり：
（ｉ）Ｒは、求電子性脱離基Ｙを示し、固体基材は、式（Ｉ）の１位、３位又は４位に連結されており、機能的部分が、式（Ｉ）の１位、３位又は４位に連結されている；又は
（ｉｉ）固体基材はチオール部分を有し、Ｒは、該チオール部分の硫黄原子への結合を示し、機能的部分が、式（Ｉ）の１位、３位又は４位に連結されている；又は
（ｉｉｉ）固体基材は、式（Ｉ）の１位、３位又は４位に連結されており、Ｒは、式−Ｓ−Ｆ１又は−Ｓ−Ｌ−Ｆ２の基を示し、式中Ｌはリンカー基を示し、−Ｓ−Ｆ１及び−Ｆ２は機能的部分を示す；
機能的部分は、検出可能部分、酵素活性部分、アフィニティタグ、ハプテン、免疫原性担体、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド又はリガンド候補、生物活性部分、リポソーム、ポリマー部分、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、細胞、炭水化物、ＤＮＡ及びＲＮＡから選択される。
【請求項２】
式（ＩＩ）を有する、請求項１に記載の生成物：
【化２】
2013501766.tif 000166
式中、
Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＱの基を示し、Ｑは、水素、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル又はフェニルであり；
Ｒ１は以下を示し：
（ｉ）求電子性脱離基Ｙ；又は
（ｉｉ）チオール部分を有し、該チオール部分の硫黄原子を介して式（ＩＩ）の２位に結合している、固体基材；又は
（ｉｉｉ）−Ｓ−Ｆ１若しくは−Ｓ−Ｌ−Ｆ２；
Ｒ２は、水素原子、Ｓｏｌ、−Ｌ−Ｓｏｌ、Ｆ３、Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｆ３）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍ又はＩＧを示し；
以下のいずれかであり：
Ｒ３及びＲ３’は、同じ又は異なって、それぞれ水素原子、Ｓｏｌ、−Ｌ−Ｓｏｌ、Ｆ３、Ｅ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｆ３）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍ又はＩＧを示す；又は
Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｏ−又は−Ｎ（Ｒ３３’）−の基を形成し、Ｒ３３’は、水素原子、Ｓｏｌ、−Ｌ−Ｓｏｌ、Ｆ３、Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｆ３）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍ又はＩＧを示す；又は
Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３’）−Ｎ（Ｒ３３’）−の基を形成し、各Ｒ３３’は、同じ又は異なって、水素原子、Ｓｏｌ、−Ｌ−Ｓｏｌ、Ｆ３、Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｆ３）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍ又はＩＧを示す；
Ｓｏｌは固体基材を示し；
−Ｓ−Ｆ１、Ｆ２及びＦ３のそれぞれは、同じ又は異なって、検出可能部分、酵素活性部分、アフィニティタグ、ハプテン、免疫原性担体、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド又はリガンド候補、生物活性部分、リポソーム、ポリマー部分、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、細胞、炭水化物、ＤＮＡ及びＲＮＡから選択される機能的部分を示し；
Ｅ及びＹのそれぞれは、同じ又は異なって、求電子性脱離基を示し；
各Ｎｕは、同じ又は異なって、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２及び−ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）から選択される求核剤を示し；
各Ｌは、同じ又は異なって、リンカー基を示し；
各Ｚは、同じ又は異なって、部分Ｌに結合した反応性基を示し；
各ｎは、同じ又は異なって、１、２又は３であり；
各ｍは、同じ又は異なって、０からｎまでの値を有する整数であり；
各ＩＧは、同じ又は異なって、非置換であるか又は１個以上のハロゲン原子置換基で置換されている、Ｃ１−２０アルキル基、Ｃ２−２０アルケニル基又はＣ２−２０アルキニル基である部分を示し、式中、（ａ）０、１又は２個の炭素原子は、Ｃ６−１０アリーレン、５〜１０員のヘテロアリーレン、Ｃ３−７カルボシクリレン及び５〜１０員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されており、かつ（ｂ）０、１又は２個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−及び−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−基から選択される基によって置換されており、式中、
（ｉ）該アリーレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオール、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）及びニトロ基から選択される１個以上の置換基によって置換されており；
（ｉｉ）該カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基中の０、１又は２個の炭素原子は、−Ｃ（Ｏ）−基によって置換されており；
ただし、該生成物は、１つの固体基材及び少なくとも１個の機能的部分を含む。
【請求項３】
Ｙが、ハロゲン原子又はトリフレート、トシレート、メシレート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル、Ｃ１−６アルキルチオール、５〜１０員のヘテロシクリルチオール、Ｃ６−１０アリールチオール、Ｃ３−７カルボシクリルチオール、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３、−ＯＣ（Ｏ）ＣＦ３、フェニルオキシ、−ＮＲｘＲｙＲｚ＋若しくは−ＰＲｘＲｙＲｚ＋基であり、式中、Ｒｘ、Ｒｙ及びＲｚは、同じ又は異なって、水素原子並びにＣ１−６アルキル及びフェニル基から選択される、請求項２に記載の生成物。
【請求項４】
Ｅが、ハロゲン原子又はＣ１−６アルコキシ、チオール、Ｃ１−６アルキルチオール、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）、トリフレート、トシレート、メシレート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル、イミダゾリル、フェニルオキシ若しくはニトロフェニルオキシ基である、請求項２又は３に記載の生成物。
【請求項５】
Ｌが、非置換であるか又は１個以上のハロゲン原子置換基で置換されている、Ｃ１−２０アルキレン基、Ｃ２−２０アルケニレン基又はＣ２−２０アルキニレン基である部分を示し、式中、（ａ）０、１又は２個の炭素原子は、Ｃ６−１０アリーレン、５〜１０員のヘテロアリーレン、Ｃ３−７カルボシクリレン及び５〜１０員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されており、かつ（ｂ）０、１又は２個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−及び−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−基から選択される基によって置換されており、式中、
（ｉ）該アリーレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオール、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）及びニトロ基から選択される１個以上の置換基によって置換されており；
（ｉｉ）該カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基中の０、１又は２個の炭素原子は、−Ｃ（Ｏ）−基によって置換されている、請求項２〜４のいずれか１項に記載の生成物。
【請求項６】
Ｌが、非置換のＣ１−６アルキレン基、Ｃ２−６アルケニレン基又はＣ２−６アルキニレン基である部分を示し、式中、（ａ）０又は１個の炭素原子は、フェニレン、５〜６員のヘテロアリーレン、Ｃ５−６カルボシクリレン及び５〜６員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されており、該フェニレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにＣ１−４アルキル及びＣ１−４アルコキシ基から選択される１又は２個の置換基によって置換されており、かつ（ｂ）０、１又は２個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−及び−Ｃ（Ｏ）−基から選択される基によって置換されている、請求項２〜５のいずれか１項に記載の生成物。
【請求項７】
Ｚが、
（ａ）式−ＬＧ、−Ｃ（Ｏ）−ＬＧ、−Ｃ（Ｓ）−ＬＧ又は−Ｃ（ＮＨ）−ＬＧの基（式中、ＬＧは求電子性脱離基である）；
（ｂ）−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）及び−Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ２基から選択される求核剤Ｎｕ’；
（ｃ）求核剤と開環求電子反応し得る環式部分Ｃｙｃ；
（ｄ）式−Ｓ（Ｏ２）（Ｈａｌ）の基（式中、Ｈａｌはハロゲン原子である）；
（ｅ）式−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ又は−Ｎ＝Ｃ＝Ｓの基；
（ｆ）式−Ｓ−Ｓ（ＩＧ’）の基（式中、ＩＧ’は、請求項２に記載の式ＩＧの基を示す）；
（ｇ）１個以上のハロゲン原子によって置換されたＣ６−１０アリール基である、基ＡＨ；
（ｈ）紫外線光への曝露によって活性化され得る光反応性基；
（ｉ）式−Ｃ（Ｏ）Ｈ又は−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−６アルキル）の基；
（ｊ）マレイミド基；
（ｋ）式−Ｃ（Ｏ）ＣＨＣＨ２の基；
（ｌ）式−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｎ２）Ｈ又は−ＰｈＮ２＋の基（式中、Ｐｈはフェニル基を示す）；又は
（ｍ）エポキシド基、
を示す、請求項２〜６のいずれか１項に記載の生成物。
【請求項８】
ＬＧが、ハロゲン原子並びに−Ｏ（ＩＧ’）、−ＳＨ、−Ｓ（ＩＧ’）、−ＮＨ２、−ＮＨ（ＩＧ’）、−Ｎ（ＩＧ’）（ＩＧ”）、−Ｎ３、トリフレート、トシレート、メシレート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル、イミダゾリル及びアジド基から選択され、ＩＧ’及びＩＧ”が、同じ又は異なって、それぞれ請求項２に記載の式ＩＧの基を示し；かつ／又は
Ｎｕ’が、−ＯＨ、−ＳＨ及び−ＮＨ２基から選択され；かつ／又は
Ｃｙｃが、基
【化３】
2013501766.tif 000167
及び
【化４】
2013501766.tif 000168
から選択され；かつ／又は
Ｈａｌが塩素原子であり；かつ／又は
ＡＨが、少なくとも１個のフッ素原子で置換されたフェニル基であり；かつ／又は
光反応性基が、
（ａ）少なくとも１個の式−Ｎ３の基によって置換されており、１個以上のハロゲン原子によって更に置換されていてもよい、Ｃ６−１０アリール基；
（ｂ）ベンゾフェノン基；
（ｃ）式−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｎ２）ＣＦ３の基；及び
（ｄ）式−ＰｈＣ（Ｎ２）ＣＦ３の基（式中、Ｐｈはフェニル基を示す）
から選択される、
請求項７に記載の生成物。
【請求項９】
Ｚが、
（ａ）式−ＬＧ、−Ｃ（Ｏ）−ＬＧ及び−Ｃ（Ｓ）−ＬＧの基（式中、ＬＧは、ハロゲン原子並びに−Ｏ（Ｃ１−６アルキル）、−ＳＨ、−Ｓ（Ｃ１−６アルキル）、トリフレート、トシレート、メシレート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル及びＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル基から選択される）；
（ｂ）式−ＯＨ、−ＳＨ及び−ＮＨ２の基；
（ｃ）式
【化５】
2013501766.tif 000169
又は
【化６】
2013501766.tif 000170
の基；及び
（ｄ）マレイミド基
から選択される、
請求項２〜８のいずれか１項に記載の生成物。
【請求項１０】
ＩＧが、非置換のＣ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基又はＣ２−６アルキニル基である部分を示し、式中、（ａ）０又は１個の炭素原子は、フェニレン、５〜６員のヘテロアリーレン、Ｃ５−６カルボシクリレン及び５〜６員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されており、該フェニレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにＣ１−４アルキル及びＣ１−４アルコキシ基から選択される１又は２個の置換基によって置換されており、かつ（ｂ）０、１又は２個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−及び−Ｃ（Ｏ）−基から選択される基によって置換されている、
請求項２〜９のいずれか１項に記載の生成物。
【請求項１１】
ｎが１である、請求項２〜１０のいずれか１項に記載の生成物。
【請求項１２】
式（ＩＩ）の生成物が式（ＩＩａ）の生成物
【化７】
2013501766.tif 000171
（式中、Ｘ、Ｘ’、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３３’は全て、請求項２〜１１のいずれか１項に記載したとおりである）
である、請求項２〜１１のいずれか１項に記載の生成物。
【請求項１３】
Ｘ及びＸ’がそれぞれ酸素を示し；
Ｒ１が以下を示し：
（ｉ）ハロゲン原子；又は
（ｉｉ）チオール部分を有し、該チオール部分の硫黄原子を介して式（ＩＩ）の２位に結合している、固体基材；又は
（ｉｉｉ）−Ｓ−Ｆ１；
Ｒ２は、水素若しくはハロゲン原子、固体基材、Ｆ３又はＣ１−６アルキル基を示し；
Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３’）の基を形成し、Ｒ３３’は、水素原子、固体基材、Ｆ３又はＣ１−６アルキル基を示し；
−Ｓ１−Ｆ１及びＦ３は、同じ又は異なって、検出可能部分、酵素活性部分、アフィニティタグ、ハプテン、免疫原性担体、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド又はリガンド候補、生物活性部分、リポソーム、ポリマー部分、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、細胞、炭水化物、ＤＮＡ及びＲＮＡから選択される機能的部分を示し；
ただし、該生成物は、１つの固体基材及び少なくとも１個の機能的部分を含む、請求項２〜１２のいずれか１項に記載の生成物。
【請求項１４】
１個の機能的部分−Ｓ−Ｆ１、Ｆ２又はＦ３を含む、請求項２〜１３のいずれか１項に記載の生成物。
【請求項１５】
前記機能的部分が機能的部分−Ｓ−Ｆ１である、請求項１４に記載の生成物。
【請求項１６】
Ｒ３及びＲ３’が一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３’）の基を形成し、Ｒ３３’が固体基材を示す、請求項２〜１６のいずれか１項に記載の生成物。
【請求項１７】
機能的部分に固体基材を連結するための試薬としての、式（ＩＩＩ）の部分を含む化合物の使用：
【化８】
2013501766.tif 000172
式中、
Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＱの基を示し、Ｑは、水素、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル又はフェニルであり；
Ｙは求電子性脱離基であり；
機能的部分は、検出可能部分、酵素活性部分、アフィニティタグ、ハプテン、免疫原性担体、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド又はリガンド候補、生物活性部分、リポソーム、ポリマー部分、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、細胞、炭水化物、ＤＮＡ又はＲＮＡである。
【請求項１８】
式（ＩＩＩ）の部分を含む化合物が、式（ＩＶ）の化合物である、請求項１８に記載の使用：
【化９】
2013501766.tif 000173
式中、
Ｒ２ａは、水素原子、Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ’）ｎ又はＩＧを示し；
以下のいずれかであり：
Ｒ３ａ及びＲ３ａ’は、同じ又は異なって、それぞれ水素原子、Ｅ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ’）ｎ又はＩＧを示す；又は
Ｒ３ａ及びＲ３ａ’は一緒になって、式−Ｏ−又は−Ｎ（Ｒ３３ａ’）の基を形成し、Ｒ３３ａ’は、水素原子、Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ’）ｎ又はＩＧを示す；又は
Ｒ３ａ及びＲ３ａ’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３ａ’）−Ｎ（Ｒ３３ａ’）−の基を形成し、各Ｒ３３ａ’は、同じ又は異なって、水素原子、Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ’）ｎ又はＩＧを示す；
Ｚ’は、Ｚ又は式−Ｓｉ（Ｏ（Ｃ１−６アルキル）（Ｇ１）（Ｇ２）の基を示し、Ｇ１及びＧ２は、同じ又は異なって、Ｈ、Ｃ１−６アルキル又はＯ（Ｃ１−６アルキル）を示し；
Ｘ、Ｘ’、Ｙ、Ｎｕ、Ｌ、Ｚ、ｎ、ＩＧ及びＥは全て、請求項２〜１３のいずれか１項に記載したとおりである。
【請求項１９】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の生成物を提供する工程であって、以下のいずれかである：
（ｉ）チオール部分を有する固体基材が、該チオール部分の硫黄原子を介して式（Ｉ）の２位に結合している；又は
（ｉｉ）基−Ｓ−Ｆ１又は−Ｓ−Ｌ−Ｆ２が、式（Ｉ）の２位に結合している、
工程；及び
式（Ｉ）の２位でチオール結合を切断する工程、
を含む、プロセス。
【請求項２０】
式（Ｖａ）又は（Ｖｂ）の生成物：
【化１０】
2013501766.tif 000174
式中、
Ｒ１は以下を示し：
（ｉ）チオール部分を有し、該チオール部分の硫黄原子を介して式（Ｖａ）又は（Ｖｂ）の２位に結合している、固体基材；又は
（ｉｉ）−Ｓ−Ｆ１若しくは−Ｓ−Ｌ−Ｆ２；
Ｘ、Ｘ’、−Ｓ−Ｆ１、Ｆ２、Ｒ２、Ｒ３及びＲ３’は、請求項２〜１３のいずれか１項に記載したとおりであり；
Ｒ４は、ハロゲン原子、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルコキシ、チオール、Ｃ１−６アルキルチオ若しくはＣ１−６アルキルカルボニルオキシ基、又は請求項２に記載の式Ｆ３の基であり；
基Ｒ２及びＲ４のうち少なくとも１個が式Ｆ３の基を含み、
ただし、該生成物は、１つの固体基材を含む。
【請求項２１】
アレイに整列された、請求項１〜１６及び２０のいずれか１項に記載の複数の生成物。
【請求項２２】
各生成物が、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド又はリガンド候補、ペプチド、タンパク質、細胞、ＤＮＡ及びＲＮＡから選択される機能的部分を含む、請求項２１に記載の複数の生成物。
【請求項２３】
（ａ）各生成物が異なる抗体又は抗体断片を含む；又は
（ｂ）各生成物が異なる抗原を含む；又は
（ｃ）各生成物が異なるリガンド又はリガンド候補を含む；又は
（ｄ）各生成物が異なるペプチドを含む；又は
（ｅ）各生成物が異なるタンパク質を含む；又は
（ｆ）各生成物が異なる細胞を含む；又は
（ｇ）各生成物が異なるＤＮＡを含む；又は
（ｈ）各生成物が異なるＲＮＡを含む、
請求項２２に記載の複数の生成物。
【請求項２４】
請求項２２又は２３に記載の複数の生成物を提供する工程；
該複数の生成物を、試験物質を含むサンプルとインキュベートする工程；及び
試験物質のいずれかが、複数の生成物のいずれかと結合しているか否かを検出する工程、
を含む、アッセイプロセス。
【請求項２５】
（ｉ）請求項１〜１５、１６及び２０のいずれか１項に記載の生成物を提供する工程であって、該生成物は、抗体又は抗原を含む、工程；
（ｉｉ）該生成物をサンプルとインキュベートする工程；
（ｉｉｉ）抗体又は抗原に結合していない任意の材料を除去する工程；及び
（ｉｖ）抗体又は抗原に結合した任意の物質を検出する工程、
を含む、検出プロセス。
【請求項２６】
サンプルから特定の物質を精製するためのプロセスであって、
（ｉ）請求項１〜１５、１６及び２０のいずれか１項に記載の生成物を提供する工程であって、該生成物は、該物質に選択的に結合できる機能的部分を含む、工程；
（ｉｉ）該生成物を該サンプルとインキュベートする工程；
（ｉｉｉ）機能的部分に結合していない任意の材料を除去する工程；及び
（ｉｖ）該生成物から該物質を分離する工程、
を含む、プロセス。
【請求項２７】
特定の物質がバイト物質Ｓｂであり、サンプルが、Ｓｂに結合できる１種以上のプレイ物質Ｓｐをさらに含んでいてもよい、請求項２６に記載のプロセス。
【請求項２８】
（ｉ）請求項１〜１６のいずれか１項に記載の生成物を提供する工程；
（ｉｉ）アミノ酸を該生成物に結合させる工程；及び
（ｉｉｉ）該アミノ酸に１個以上のさらなるアミノ酸を結合させて、固体基材に連結されたペプチド又はタンパク質部分を産生する工程；及び
（ｉｖ）該ペプチド又はタンパク質部分を該固体基材から切断する工程、
を含む、ペプチド又はタンパク質を産生するためのプロセス。
【請求項２９】
工程（ｉ）が、その硫黄原子を介して式（Ｉ）の２位に結合したシステイン残基を含む生成物を提供することを含む、請求項２８に記載のプロセス。
【請求項３０】
請求項１７又は１８に記載の使用であって、式（ＩＩＩ）の部分を含む化合物を使用して機能的部分に固体基材を連結することによって得られた生成物が、マレイミド環を含み、該使用が、該マレイミド環の開環をもたらすことをさらに含む、使用。
【請求項３１】
（ａ）機能的部分及び（ｂ）それに連結された固体基材を有する式（ＶＩ）の部分を含む生成物：
【化１１】
2013501766.tif 000175
式中、
Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＱの基を示し、Ｑは、水素、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル又はフェニルであり；
機能的部分は、検出可能部分、酵素活性部分、アフィニティタグ、ハプテン、免疫原性担体、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド、生物活性部分、リポソーム、ポリマー部分、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、細胞、炭水化物、ＤＮＡ及びＲＮＡから選択される。
【請求項３２】
式（ＶＩａ）を有する、請求項３１に記載の生成物：
【化１２】
2013501766.tif 000176
式中、
Ｘ、Ｘ’、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ３’はそれぞれ、請求項２〜１３のいずれか１項に記載されたとおりであり；
Ｒａｌｋ１、Ｒａｌｋ２、Ｒａｌｋ３及びＲａｌｋ４のそれぞれは、同じ又は異なって、請求項２〜１３のいずれか１項に記載された式Ｒ２の基であり；
各機能的部分は、同じ又は異なって、検出可能部分、酵素活性部分、アフィニティタグ、ハプテン、免疫原性担体、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド、生物活性部分、リポソーム、ポリマー部分、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、細胞、炭水化物、ＤＮＡ及びＲＮＡから選択され；
ただし、該生成物は、１つの固体基材及び少なくとも１個の機能的部分を含む。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（導入）
広範な種々の分子を固体基材に連結することが望ましい場合があることが周知である。例えば、表面上への生体分子（例えば、抗体、抗原及びタンパク質）の固定化は、多数の高感度かつ選択的な検出及び精製の技術（例えば、酵素結合免疫吸着検定法、プルダウンアッセイ及びアフィニティークロマトグラフィー法）の基礎を提供する。マイクロアレイ技術（基材上の別個の点に連結した複数の生体分子又は合成分子が、試験物質に対するその結合能力について同時にスクリーニングされる）は、バイオテクノロジー及び医薬品の分野における、革命的なスクリーニング技術である。一方、ノーベル賞受賞者Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄが先駆けて開発した固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）（ペプチド鎖が、固相に結合したままで段階的な様式で成長する）は、実験室スケールで合成ペプチドを産生するのに、群を抜いて最も簡便で高収率の方法である。
【０００２】
多くの基本的な固体基材材料が、かかる固定化方法を実施するために使用されてきた。これらには、ガラス、シリカ、マイカ、並びに天然ポリマー及び合成ポリマーの両方が挙げられる。固体基材はまた、具体的な適用のために適合させた種々の異なる形態で慣用的に使用され、例えば単一のチップ又はメンブランとして、ビーズ状にした材料として、又はカーボンナノチューブの特徴を示す中空の管状形態で存在する。
【０００３】
固体基材が特定の標的分子に連結されたコンジュゲートを設計する際の重要な検討事項には、基材と標的分子との間の結合の特徴、並びにこの結合が形成される容易さ及び特異性が挙げられる。
【０００４】
固体基材と目的分子との間で形成されるコンジュゲートの一体性を保つために、それらの成分は、（静電相互作用などのより弱い結合ではなく）共有結合で連結されることが望ましい場合が多い。明らかに、これを達成するためには、固体基材は、標的分子上の対応する官能基と反応できる官能基を少なくとも１個保有する必要がある。幸いにも、表面アクセス可能な官能基を提供するための固体基材材料の官能化は、周知技術である。従って、適切に官能化された固体基材は、慣用的に入手可能であり、市販されている。典型的には不活性のリンカー部分を介して固体基材材料に結合した官能基としては、標的分子上のアミン、カルボキシル、チオール、アルデヒド及び活性水素官能基に結合できる基が挙げられる。
【０００５】
反応性チオール基を介して標的分子に固体基材をカップリングすることは、チオール部分の独自の求核性の特徴と、これらの官能基が、固定化技術でしばしば標的化される生体分子中に豊富でないという事実とに起因して、特に目的とされ得る。これらの特徴は、チオール反応に基づく高度に選択的な固定化手順の可能性を開拓する。
【０００６】
従来、ヨードアセチル活性化固体基材が、タンパク質などのチオール含有分子を固定化するための試薬として使用されてきた。例えば、ヨードアセチル活性化アガロース又はアクリルアミドベースの樹脂が、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒから市販されている。しかしながら、ハロアセチル官能基の反応は、必ずしもチオール化合物に選択的とは限らないことが知られている。例えば、ハロアセチル基は、タンパク質内に存在する種々の官能基：ヒスチジンのイミダゾリル側鎖窒素、メチオニンのチオエステル、及びリジン残基の第一級ε−アミン基、及びＮ末端α−アミン、と反応できる。固体基材上のヨードアセチル基とチオール（例えば、タンパク質中のシステイン残基）との間の反応は、不可逆的でもある。これは、例えば、発現が困難なタンパク質（例えば、多くのＧＰＣＲ（Ｇタンパク質共役型レセプター））に関連する手順を実施する場合などに、その実用性に対する厳しい制限となり得る。明らかに、これは、固体基材と標的分子との間の結合の不安定性が重要である分野（例えば、固体基材が固相タンパク質合成に関連して使用されている場合）における、チオール固定化方法論の開発も不可能にしている
【０００７】
チオール含有生体分子を二次的分子（典型的には別の生体分子）に連結するための試薬として使用されてきた他の化合物には、１，２−ジカルボニルエテン誘導体及びチオスルホネートが挙げられる。１，２−ジカルボニルエテン誘導体（例えばマレイミド）は一般に、チオール及び特にシステイン部分との反応のための最も選択的な試薬であると認識されている。しかし不幸にも、この反応（チオールとヨードアセチル化合物との反応など）もまた、化学的に不可逆的である。
【０００８】
本発明は、１，２−ジカルボニルエテン架橋試薬のＣ＝Ｃ二重結合に求電子性脱離基を組み込むことが有利であるという、驚くべき知見に基づいている。その化学的修飾により、Ｃ＝Ｃ二重結合を保持したまま、チオール含有標的分子が架橋試薬を介して固体基材に容易に結合することが可能となる。同様に、これにより、Ｃ＝Ｃ二重結合を保持したまま、チオール含有固体基材が架橋試薬を介して標的分子に結合することが可能となる。これには以下の利点がある：
【０００９】
・クロスリンカーとチオールとの間の反応が、実質的に化学量論的な量のみのクロスリンカーを使用して、迅速かつ高収率で実施できることが多い。
・クロスリンカーとチオールとの間のチオエーテル結合が、容易に逆転可能であり、特に、当業者によって選択された時間で、制御された様式で切断できる。
・クロスリンカーにチオールを連結した後に得られる生成物中の二重結合の保持が、さらなる機能的化合物への連結のための反応部位を構成する。したがって、固体基材−標的分子コンジュゲートに余分な機能的に活性な分子を付加することが容易である。
【００１０】
新規架橋方法論は、標的分子の固体基材材料へのコンジュゲート化を含む公知の方法の全範囲にわたって容易に適用可能である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、（ａ）固体基材及び（ｂ）それに連結された式（Ｉ）の部分を含む、生成物を提供する：
【００１２】
【化１】
2013501766.tif 000003
【００１３】
式中、
Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＱの基を示し、Ｑは、水素、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル又はフェニルであり；
以下のいずれかであり：
（ｉ）Ｒは、求電子性脱離基Ｙを示し、固体基材は、式（Ｉ）の１位、３位又は４位に連結されており、機能的部分が、式（Ｉ）の１位、３位又は４位に連結されている；又は
（ｉｉ）固体基材はチオール部分を有し、Ｒは、該チオール部分の硫黄原子への結合を示し、機能的部分が、式（Ｉ）の１位、３位又は４位に連結されている；又は
（ｉｉｉ）固体基材は、式（Ｉ）の１位、３位又は４位に連結されており、Ｒは、式−Ｓ−Ｆ１又は−Ｓ−Ｌ−Ｆ２の基を示し、式中Ｌはリンカー基を示し、−Ｓ−Ｆ１及び−Ｆ２は機能的部分を示す；
機能的部分は、検出可能部分、酵素活性部分、アフィニティタグ、ハプテン、免疫原性担体、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド又はリガンド候補、生物活性部分、リポソーム、ポリマー部分、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、細胞、炭水化物、ＤＮＡ及びＲＮＡから選択される。
【００１４】
本発明はまた、機能的部分に固体基材を連結するための試薬としての、式（ＩＩＩ）の部分を含む化合物の使用も提供する：
【００１５】
【化２】
2013501766.tif 000004
【００１６】
式中、
Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＱの基を示し、Ｑは、水素、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル又はフェニルであり；
Ｙは求電子性脱離基であり；
機能的部分は、検出可能部分、酵素活性部分、アフィニティタグ、ハプテン、免疫原性担体、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド又はリガンド候補、生物活性部分、リポソーム、ポリマー部分、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、細胞、炭水化物、ＤＮＡ又はＲＮＡである。
【００１７】
本発明はさらに、
本発明の生成物を提供する工程であって、以下のいずれかである：
（ｉ）チオール部分を有する固体基材が、該チオール部分の硫黄原子を介して式（Ｉ）の２位に結合している；又は
（ｉｉ）基−Ｓ−Ｆ１又は−Ｓ−Ｌ−Ｆ２が、式（Ｉ）の２位に結合している、
工程；及び
式（Ｉ）の２位でチオール結合を切断する工程、
を含む、プロセスを提供する。
【００１８】
本発明は、式（Ｖａ）又は（Ｖｂ）の生成物もまた提供する：
【００１９】
【化３】
2013501766.tif 000005
【００２０】
式中、
Ｒ１は以下を示し：
（ｉ）チオール部分を有し、該チオール部分の硫黄原子を介して式（Ｖａ）又は（Ｖｂ）の２位に結合している、固体基材；又は
（ｉｉ）−Ｓ−Ｆ１若しくは−Ｓ−Ｌ−Ｆ２；
Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＱの基を示し、Ｑは、水素、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル又はフェニルであり；
Ｒ２は、水素原子、Ｓｏｌ、−Ｌ−Ｓｏｌ、Ｆ３、Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｆ３）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍ又はＩＧを示し；
以下のいずれかであり：
Ｒ３及びＲ３’は、同じ又は異なって、それぞれ水素原子、Ｓｏｌ、−Ｌ−Ｓｏｌ、Ｆ３、Ｅ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｆ３）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍ又はＩＧを示す；又は
Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｏ−又は−Ｎ（Ｒ３３’）−の基を形成し、Ｒ３３’は、水素原子、Ｓｏｌ、−Ｌ−Ｓｏｌ、Ｆ３、Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｆ３）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍ又はＩＧを示す；又は
Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３’）−Ｎ（Ｒ３３’）−の基を形成し、各Ｒ３３’は、同じ又は異なって、水素原子、Ｓｏｌ、−Ｌ−Ｓｏｌ、Ｆ３、Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｆ３）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍ又はＩＧを示す；
Ｒ４は、ハロゲン原子、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルコキシ、チオール、Ｃ１−６アルキルチオ若しくはＣ１−６アルキルカルボニルオキシ基、又は式Ｆ３の基であり；
Ｓｏｌは固体基材を示し；
−Ｓ−Ｆ１、Ｆ２及びＦ３のそれぞれは、同じ又は異なって、検出可能部分、酵素活性部分、アフィニティタグ、ハプテン、免疫原性担体、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド又はリガンド候補、生物活性部分、リポソーム、ポリマー部分、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、細胞、炭水化物、ＤＮＡ及びＲＮＡから選択される機能的部分を示し；
Ｅ及びＹのそれぞれは、同じ又は異なって、求電子性脱離基を示し；
各Ｎｕは、同じ又は異なって、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２及び−ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）から選択される求核剤を示し；
各Ｌは、同じ又は異なって、リンカー基を示し；
各Ｚは、同じ又は異なって、部分Ｌに結合した反応性基を示し；
各ｎは、同じ又は異なって、１、２又は３であり；
各ｍは、同じ又は異なって、０からｎまでの値を有する整数であり；
各ＩＧは、同じ又は異なって、非置換であるか又は１個以上のハロゲン原子置換基で置換されている、Ｃ１−２０アルキル基、Ｃ２−２０アルケニル基又はＣ２−２０アルキニル基である部分を示し、式中、（ａ）０、１又は２個の炭素原子は、Ｃ６−１０アリーレン、５〜１０員のヘテロアリーレン、Ｃ３−７カルボシクリレン（ｃａｒｂｏｃｙｃｌｙｌｅｎｅ）及び５〜１０員のヘテロシクリレン（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｙｌｅｎｅ）基から選択される基によって置換されており、かつ（ｂ）０、１又は２個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−及び−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−基から選択される基によって置換されており、式中、
（ｉ）該アリーレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオール、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）及びニトロ基から選択される１個以上の置換基によって置換されており；
（ｉｉ）該カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基中の０、１又は２個の炭素原子は、−Ｃ（Ｏ）−基によって置換されており；
基Ｒ２及びＲ４のうち少なくとも１個が式Ｆ３の基を含み、
ただし、該生成物は、１つの固体基材を含む。
【００２１】
本発明はさらに、アレイに整列された、本発明の複数の生成物を提供する。
【００２２】
なおさらに、本発明は、
本発明の複数の生成物を提供する工程（各生成物は、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド又はリガンド候補、ペプチド、タンパク質、細胞、ＤＮＡ及びＲＮＡから選択される機能的部分を含む）；
該複数の生成物を、試験物質を含むサンプルとインキュベートする工程；及び
試験物質のいずれかが、複数の生成物のいずれかと結合しているか否かを検出する工程、
を含むアッセイプロセスを提供する。
【００２３】
本発明は、
（ｉ）本発明の生成物を提供する工程であって、該生成物は、抗体又は抗原を含む、工程；
（ｉｉ）該生成物をサンプルとインキュベートする工程；
（ｉｉｉ）抗体又は抗原に結合していない任意の材料を除去する工程；及び
（ｉｖ）抗体又は抗原に結合した任意の物質を検出する工程、
を含む検出プロセスを提供する。
【００２４】
本発明は、サンプルから特定の物質を精製するためのプロセスもまた提供し、このプロセスは、
（ｉ）本発明の生成物を提供する工程であって、該生成物は、該物質に選択的に結合できる機能的部分を含む、工程；
（ｉｉ）該生成物を該サンプルとインキュベートする工程；
（ｉｉｉ）機能的部分に結合していない任意の材料を除去する工程；及び
（ｉｖ）該生成物から該物質を分離する工程、
を含む。
【００２５】
本発明はさらに、
（ｉ）本発明の生成物を提供する工程；
（ｉｉ）アミノ酸を該生成物に結合させる工程；及び
（ｉｉｉ）該アミノ酸に１個以上のさらなるアミノ酸を結合させて、固体基材に連結されたペプチド又はタンパク質部分を産生する工程；及び
（ｉｖ）該ペプチド又はタンパク質部分を該固体基材から切断する工程、
を含む、ペプチド又はタンパク質を産生するためのプロセスを提供する。
【００２６】
本発明は、（ａ）機能的部分及び（ｂ）それに連結された固体基材を有する式（ＶＩ）の部分を含む生成物もまた提供する：
【００２７】
【化４】
2013501766.tif 000006
【００２８】
式中、
Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＱの基を示し、Ｑは、水素、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル又はフェニルであり；
機能的部分は、検出可能部分、酵素活性部分、アフィニティタグ、ハプテン、免疫原性担体、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド、生物活性部分、リポソーム、ポリマー部分、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、細胞、炭水化物、ＤＮＡ及びＲＮＡから選択される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、実施例１に記載されるプロトコルの結果を示し、該実施例では、タンパク質／ビオチン−ＰＥＧ−ブロモマレイミド付加物及び未修飾のモデルタンパク質溶液（Ｉｎ）を、ニュートラアビジン被覆したアガロースビーズに添加し、遠心分離し、フロースルー（ＦＴ）収集し、ビーズをＰＢＳで洗浄し、両方の洗浄画分を収集し（Ｗ１及びＷ２）、タンパク質を、β−メルカプトエタノールを含むＰＢＳ中でインキュベートすることによりビーズから放出させ、サンプルを遠心分離し、切断されたタンパク質を含む溶離液（Ｅｌ）を収集した。
【図２】図２は、ＬＣ−ＭＳ（ｙ軸＝シグナル％；ｘ軸＝時間／ｍｉｎ）によって測定される、参考例１１６に記載されるプロトコルに従った、ハロマレイミドからのソマトスタチン−マレイミド付加物の生成を示す。左上：ジクロロマレイミド（丸）、ジブロモマレイミド（四角）及びジヨードマレイミド（三角）からのソマトスタチン付加物の生成。右上：モノブロモマレイミド（丸）、Ｎ−メチルモノブロモマレイミド（四角）及びＮ−メチルジブロモマレイミド（三角）からのソマトスタチン付加物の生成。左下：Ｎ−フルオレセイン−ジブロモマレイミド（丸）、Ｎ−ビオチン−ジブロモマレイミド（四角）、Ｎ−ＰＥＧ  ５０００−ジブロモマレイミド（三角）、Ｎ−ＰＥＧ−５０００−ジチオフェノールマレイミド（菱形）及びＮ−ＰＥＧ  ３００−ジブロモマレイミド（卵型）からのソマトスタチン付加物の生成。
【図３】図３は、ＬＣ−ＭＳ（ｙ軸＝シグナル％；ｘ軸＝時間／ｍｉｎ）によって測定される、参考例１１６に記載されるプロトコルに従った、ジチオマレイミドからのソマトスタチン−マレイミド付加物の生成を示す。左上：当量（丸）、５当量（四角）及び１０当量（三角）における、ジ−２−メルカプトエタノールマレイミドからのソマトスタチン付加物の生成。右上：１当量（丸）、５当量（四角）及び１０当量（三角）における、ジシステインマレイミドからのソマトスタチン付加物の生成。左下：１当量（丸）、５当量（四角）及び１０当量（三角）における、ジチオフェノールマレイミドからのソマトスタチン付加物の生成。右下：１当量（丸）、５当量（四角）及び１０当量（三角）における、ジ−２−メルカプトピリジンマレイミドからのソマトスタチン付加物の生成。
【図４】図４は、ＬＣ−ＭＳ（ｙ軸＝シグナル％；ｘ軸＝分（ｍｉｎ）、時間（ｈ）及び日（ｄ）で示される時間）によって測定される、参考例１１６に記載されるプロトコルに従った、種々の還元剤によるマレイミド架橋ソマトスタチンの切断を示す。左上：ＤＴＴによる総修飾ソマトスタチン−マレイミド（白丸）及び副産物の総量（黒丸）。上中：２−メルカプトエタノールによる総修飾ソマトスタチン−マレイミド（白丸）及び副産物の総量（黒丸）。右上：ＧＳＨによる総修飾ソマトスタチン−マレイミド（白丸）及び副産物の総量（黒丸）。左下：ＴＣＥＰによる総修飾ソマトスタチン−マレイミド（白丸）及び副産物の総量（黒丸）。右下：１，２−エタンジチオールによる総修飾ソマトスタチン−マレイミド（白丸）及び副産物の総量（黒丸）。
【図５】図５は、ＬＣ−ＭＳ（ｙ軸＝シグナル％；ｘ軸＝時間／ｍｉｎ）によって測定される、参考例１１６に記載されるプロトコルに従った、種々の量のＤＴＴ及び２−メルカプトエタノールによるマレイミド架橋ソマトスタチンの切断を示す。左：５０当量（白丸）、２０当量（白三角）及び１０当量（白四角）のＤＴＴによるソマトスタチンの再生。右：５０当量（白丸）、２０当量（白三角）及び１０当量（白四角）の２−メルカプトエタノールによるソマトスタチンの再生、並びに５０当量（黒丸）、２０当量（黒三角）及び１０当量（黒四角）での副産物の総量。
【図６】図６は、ＬＣ−ＭＳ（ｙ軸＝シグナル％；ｘ軸＝時間／ｍｉｎ）によって測定される、参考例１１６に記載されるプロトコルに従った、架橋ソマトスタチンの触媒された切断を示す。図に示すのは、２−メルカプトエタノール（白丸）、２−メルカプトエタノールと共にＮａＩ（白四角）、及び２−メルカプトエタノールと共にベンゼンセレノール（白三角）による、ソマトスタチンの再生、並びに２−メルカプトエタノール（黒丸）、２−メルカプトエタノールと共にＮａＩ（黒四角）、及び２−メルカプトエタノールと共にベンゼンセレノール（黒三角）を使用したときの、総副産物である。
【図７】図７は、ＬＣ−ＭＳ（ｙ軸＝シグナル％；ｘ軸＝分（ｍｉｎ）、時間（ｈ）及び日（ｄ）で示される時間）によって測定される、参考例１１６に記載されるプロトコルに従った、２−メルカプトエタノールによるＮ−官能化マレイミド架橋ソマトスタチンの切断を示す。左上：Ｎ−メチルマレイミドソマトスタチン付加物の切断により、ソマトスタチン（白丸）及び総副産物（黒丸）が生じる。上中：Ｎ−ビオチンマレイミドソマトスタチン付加物の切断により、ソマトスタチン（白丸）及び総副産物（黒丸）が生じる。右上：Ｎ−フルオレセインマレイミドソマトスタチン付加物の切断により、ソマトスタチン（白丸）及び総副産物（黒丸）が生じる。左下：Ｎ−ＰＥＧ  ５０００マレイミドソマトスタチン付加物の切断により、ソマトスタチン（白丸）及び総副産物（黒丸）が生じる。下中：Ｎ−ＰＥＧ  ３００マレイミドソマトスタチン付加物の切断により、ソマトスタチン（白丸）及び総副産物（黒丸）が生じる。
【図８】図８は、ＬＣ−ＭＳ（ｙ軸＝シグナル％；ｘ軸＝時間／ｈｏｕｒｓ）によって測定される、参考例１１６に記載されるプロトコルに従った、モノブロモマレイミドとソマトスタチンとのジ付加生成物の切断を示す。左上：２−メルカプトエタノールを使用した、ソマトスタチン−マレイミド（白丸）、ソマトスタチン−ビス−マレイミド（黒丸）及び総副産物（三角）。右上：ＤＴＴを使用した、ソマトスタチン−マレイミド（白丸）、ソマトスタチン−ビス−マレイミド（黒丸）及び総副産物（三角）。左下：ＴＣＥＰを使用した、ソマトスタチン−マレイミド（白丸）、ソマトスタチン−ビス−マレイミド（黒丸）及び総副産物（三角）。
【図９】図９は、ＬＣ−ＭＳ（ｙ軸＝シグナル％；ｘ軸＝時間／ｍｉｎ）によって測定される、参考例１１６に記載されるプロトコルに従った、種々の量のジチオマレイミドによるソマトスタチンの比較上のｉｎ  ｓｉｔｕ架橋を示す。本図は、３：５の比率のＴＣＥＰ開始剤及びチオフェノール（丸）、５：１０の比率のセレノール開始剤とチオフェノール（四角）、及び１０：２０の比率のセレノール開始剤と２−メルカプトエタノール（三角）、を使用した架橋ソマトスタチンの生成を示す。
【図１０】図１０は、ＬＣ−ＭＳ（ｙ軸＝シグナル％；ｘ軸＝時間／ｍｉｎ）によって測定される、参考例１１６に記載されるプロトコルに従った、ソマトスタチンのｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＥＧ化を示す。本図は、５当量のＮ−ＰＥＧ５０００−ジチオフェノールマレイミド及び３当量のＴＣＥＰを使用した（丸）、並びに１０当量のＮ−ＰＥＧ５０００−ジチオフェノールマレイミド及び５当量のベンゼンセレノールを使用した（四角）、ＰＥＧ化ソマトスタチンの生成を示す。
【図１１】図１１は、参考例１１６に記載されたパッチクランプアッセイで得られたホールセルパッチクランプ電流記録を示す。本図は、ＳＳＴＲ２を発現するＧＩＲＫ  １／２Ａ株化細胞から記録された、代表的な出力波形を示す。細胞を−６０ｍＶでクランプし、２０μＭのソマトスタチン又はその誘導体を２０秒間適用した。左上：ソマトスタチン（示された軸において、垂直線は１０００ｐＡを示し、水平線は２０ｍｓを示す）。右上：ジブロモマレイミド架橋ソマトスタチン（示された軸において、垂直線は１０００ｐＡを示し、水平線は２０ｍｓを示す）。左下：フルオレセインジブロモマレイミド架橋ソマトスタチン（示された軸において、垂直線は１０００ｐＡを示し、水平線は２０ｍｓを示す）。右下：ＰＥＧ化ジブロモマレイミド架橋ソマトスタチン（示された軸において、垂直線は１０００ｐＡを示し、水平線は２０ｍｓを示す）。
【図１２】図１２は、参考例１１６に記載されたパッチクランプアッセイにおける、ソマトスタチン及びそのアナログにより活性化された電流の振幅を示す。ｘ軸は、電流の振幅をｐＡ／ｐＦで示す。上の２本のバーはフルオレセインジブロモマレイミド架橋ソマトスタチンに由来し（黒のバーは、百日咳毒素による２４時間にわたる細胞の前処理後であり；灰色のバーは前処理なしである）、次の２本のバーはＰＥＧ化ジブロモマレイミド架橋ソマトスタチンに由来し（黒のバーは、百日咳毒素による２４時間にわたる細胞の前処理後であり；灰色のバーは前処理なしである）、次の３本のバーはジブロモマレイミド架橋ソマトスタチンに由来し（白のバーは、ＧＩＲＫ阻害剤ＴｅｒｔｉａｐｉｎＱ（１００ｎＭ）との５分間のプレインキュベーション後であり；黒のバーは、百日咳毒素による２４時間にわたる細胞の前処理後であり；灰色のバーは前処理なしである）、下の２本のバーはソマトスタチンに由来する（黒のバーは、百日咳毒素による２４時間にわたる細胞の前処理後であり；灰色のバーは前処理なしである）。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本明細書中で使用する場合、用語「固体基材」とは、標準的条件（約２０℃の温度及び約１００ｋＰａの圧力）下で固体であり、リンカーを任意選択で介して機能的部分と相互作用して、固体基材及び機能的部分の両方を含む生成物を形成できる、物体を意味する。本発明において使用される固体基材は、微視的寸法でも巨視的寸法でもよいが、典型的には、０．００１μｍ以上、好ましくは０．１ μｍ、最も好ましくは１μｍである少なくとも１つの寸法を有する。本発明の固体基材は、任意の形状を有することができ、これには、少なくとも１つの実質的に平らな表面を有する基材（例えば、「スライド」、「メンブラン」又は「チップ」状の基材）及び曲面を有する基材（例えば、ビーズ状の基材及びチューブ状の基材）が挙げられる。
【００３１】
当業者であれば、当該分野で慣用的に使用される固体基材の種々の材料、形状及びサイズに精通しているであろう。典型的には、本発明において使用される固体基材は、生体分子又は生物学的に興味深い他の分子を固定化するのに適切な固体基材であり、従って、かかる目的に適していることが当該分野で公知の任意の固体基材が挙げられる。かかる材料の供給業者には、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ及びＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈが挙げられる。
【００３２】
本発明の固体基材としては、ナノチューブ、金属基材、金属酸化物基材、ガラス基材、シリコン基材、シリカ基材、マイカ基材及びポリマー基材が挙げられる。好ましい金属基材としては、金、銀、銅、白金、鉄及び／又はニッケル基材が挙げられ、金基材が特に好ましい。
【００３３】
ポリマー基材には、天然ポリマー及び合成ポリマーが含まれる。明らかに、「ポリマー基材」は、複数のポリマー分子を含む基材である。好ましいポリマー基材としては、ポリスチレン基材、ポリプロピレン基材、ポリカーボネート基材、シクロ−オレフィンポリマー基材、架橋ポリエチレングリコール基材、多糖基材（例えば、アガロース基材）及びアクリルアミドベースの樹脂基材（例えば、ポリアクリルアミド基材及びポリアクリルアミン／アズラクトンコポリマー基材）が挙げられる。好ましい基材としては、金基材、ガラス基材、シリコン基材、シリカ基材及びポリマー基材、特に、本明細書中で特定したポリマー基材が挙げられる。特に好ましい基材は、ガラス基材、シリコン基材、シリカ基材、ポリスチレン基材、架橋ポリエチレングリコール基材、多糖基材（例えば、アガロース基材）及びアクリルアミドベースの樹脂基材である。別の好ましい実施形態では、固体基材は、ナノチューブ、特にカーボンナノチューブである。
【００３４】
本明細書中で使用する場合、用語「ナノチューブ」とは、チューブの幅がナノメートルオーダー（典型的には最大１０ナノメートル）である、チューブ状の構造を意味する。ナノチューブは、カーボンナノチューブ又は無機ナノチューブであり得る。カーボンナノチューブは、単層ナノチューブ（ＳＷＮＴ）又は多層ナノチューブ（ＭＷＮＴ）であり得る。無機ナノチューブは、シリコン、銅、ビスマス、金属酸化物（例えば、二酸化チタン、二酸化バナジウム及び二酸化マンガン）、硫化物（例えば、二硫化タングステン及び二硫化モリブデン）、窒化物（例えば、窒化ホウ素及び窒化ガリウム）及びセレン化物（例えば、セレン化タングステン及びセレン化モリブデン）などの、炭素以外の元素で製造されたナノチューブである。好ましくは、ナノチューブはカーボンナノチューブである。
【００３５】
本発明の１つの好ましい実施形態において、固体基材は、移植可能なデバイス（即ち、ヒト又は動物、好ましくはヒトの身体への移植に適したデバイス）である。好ましい移植可能なデバイスには、プロテーゼ、移植可能な薬物送達デバイス及びステントが挙げられ、ステントが特に好ましい。
【００３６】
本発明の生成物において、基材は、式（Ｉ）の部分に連結され、従って明らかに、固体基材は、そこに固定化された物質に対し強い（例えば共有）結合を形成できることが必要である。従って、固体基材は典型的に、反応性基を含む。特定の固体基材は、その表面の活性化を実施する必要性のない、適切な反応性基を含み得る（例えば、ポリマー基材内の個々のポリマー鎖の末端基が、反応性基を構成し得る）。或いは、反応性基は、固体基材の化学的活性化によって提供され得る。
【００３７】
固体基材に表面活性を付与する固体基材の化学的活性化は、当該分野で周知である。例えば、少なくとも１個のアルコキシシリコン結合を有するシラン化合物が、金属酸化物基材、ガラス基材、マイカ基材、シリコン基材及びシリカ基材を活性化するために一般に使用される。これらの化合物は、固体表面上の遊離のヒドロキシル基と反応して、強力なシリコン−酸素結合の形成を生じると考えられる。当然、シラン化合物は、それ自体が１個以上のさらなる機能的部分を保有し、目的の特定の標的分子と反応するように適合されたリンカー基を保有し得る。かかるリンカー基を保有するチオール化合物又はチオエーテル化合物は、強力な金−硫黄結合の形成によって金表面を活性化するために使用されることが多い。明らかに、ポリマー基材は、反応性基を有するように特に設計されてもよく（例えば、モノマーの賢明な選択によって）、或いは、重合完了後に活性化されてもよい。これらの技術は全て完全に慣用であり、標的分子上の事実上任意の一般的官能基（例えば、アミン、カルボキシル、チオール、アルデヒド及び活性水素官能基）と反応できる反応性基を有する活性化された固体基材が現在市販されている。
【００３８】
疑義を回避するため、用語「固体基材」には、本明細書中で使用する場合、元々反応性基を含む固体基材が含まれ、化学的に活性化された固体基材（即ち、上記表面活性化技術によって提供されるような反応性基を保有する固体基材）も含まれる。例えば、固体基材は、アフィニティタグ（又はパートナー）（例えば、ビオチン又は（ストレプト）アビジンタグ）を有する基材であり得る。
【００３９】
当業者が理解するように、そこに固定化された物質に共有結合する能力を固体基材に付与するのに、固体基材の化学的活性化が必要な場合、これは、固体基材を１，２−ジカルボニルエテン架橋試薬に結合させるための少なくとも２つのストラテジーの可能性を開く。第一のストラテジーにおいて、特定の反応性基を保有する化学的に活性化された固体基材（例えば、市販の化学的に活性化された基材）が提供され得、架橋試薬上の対応する反応性基と反応され得る。代替の可能性では、架橋試薬は、基材の事前の活性化なしに、固体基材に直接結合され得る。明らかに、これは、標的固体基材を活性化できる反応性基を保有するように架橋試薬を設計することによって達成され得る。例えば、固体基材がガラス基材である場合、架橋試薬はアルコキシシラン基を保有し得る。これらの状況において、固体基材の活性化及び架橋基の付加は、同時に起こる。
【００４０】
固体基材を式（Ｉ）の部分に連結するための別の有用な技術は、相補的なアフィニティタグパートナーを介したものであり、即ち、ここで、基材及び式（Ｉ）の部分のうち一方がアフィニティタグを含み、もう一方が関連するアフィニティパートナーを含む。ここで、「アフィニティタグ」及び「アフィニティパートナー」は本明細書中に記載するとおりである。このストラテジーは、固体基材を式（Ｉ）の部分に連結するための、代替的な、典型的には非共有結合性の手段を提供する。例えば、ビオチン／（ストレプト）アビジン対は、２つの種を結合させるための基礎として使用され得る：固体基材及び式（Ｉ）の部分のうち一方がビオチン基を含み、固体基材及び式（Ｉ）の部分のうちもう一方が（ストレプト）アビジン基を含む。
【００４１】
本明細書中で使用する場合、用語「機能的部分」とは、本発明の生成物の一部を形成する部分であって、検出可能部分、酵素活性部分、アフィニティタグ、ハプテン、免疫原性担体、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド又はリガンド候補、生物活性部分、リポソーム、ポリマー部分、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、細胞、炭水化物、ＤＮＡ及びＲＮＡのうちの１つであるものを意味する。
【００４２】
当業者が容易に理解するように、生成物内（例えば、固体基材及びそれに結合したリンカー基を含む生成物内）に含まれる機能的部分は、対応する「機能的化合物」をそれに結合させることによって得られ得る。機能的化合物が固体基材上の反応性基又は架橋試薬に結合する場合、新たな結合が二次的化合物に形成できるように、その機能的化合物中のいずれかの場所の結合が破壊される必要がある。かかるプロセスの例としては、それが固体基材又はクロスリンカーに結合した機能的部分になる場合には機能的化合物からの脱離基の喪失、機能的化合物が水素原子含有求核基（例えば、−ＯＨ又は−ＳＨ基）を介して反応する場合にはプロトンの喪失、又は機能的化合物中の二重結合の単結合への変換、が挙げられる。従って、当業者であれば、例えば「タンパク質」である機能的部分が、対応するタンパク質化合物と比較した内部結合の喪失（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ又は−ＮＨ２部分からのプロトンの喪失）を伴った、固体基材上の反応性基又はクロスリンカー試薬へのタンパク質化合物の結合によって形成される部分を意味することを理解するであろう。
【００４３】
機能的部分は典型的に、そのネイティブな形態（即ち、バイオコンジュゲートの一部でないとき）で別個の生物学的重要性を有する部分である。好ましくは、本発明で使用される任意の機能的部分は、少なくとも２００、より好ましくは少なくとも５００、最も好ましくは少なくとも１０００の相対分子量を有する。好ましくは、本明細書中に記載される機能的部分は生体分子である。
【００４４】
本明細書中で使用する場合、用語「検出可能部分」とは、試験サンプルにおいて検出可能なシグナルを生成し得る部分を意味する。明らかに、検出可能部分は、対応する「検出可能化合物」に由来する、本発明の生成物においてクロスリンカーを介して別の物質に連結された場合に検出可能なシグナルを生成する能力を保持した部分であると理解され得る。検出可能部分はまた、「タグ」、「プローブ」及び「標識」としても当該分野で一般に公知である。検出可能部分の例としては、発色性部分、蛍光性部分、放射性部分及び電気化学的に活性な部分が挙げられる。本発明では、好ましい検出可能部分は、発色性部分及び蛍光性部分である。蛍光性部分が最も好ましい。
【００４５】
発色性部分は着色する部分であり、本発明の生成物中に組み込まれたときに着色するか、或いは本発明の生成物中に組み込まれ、この生成物が次に二次的標的種と相互作用したとき（例えば、本発明の生成物がタンパク質を含む場合、これが次に別の標的分子と相互作用する）に着色するものである。
【００４６】
典型的には、用語「発色性部分」とは、少なくとも２つのエネルギー状態（比較的低いエネルギーの基底状態と、放射線スペクトルの特定の領域からの光エネルギーの吸収によって上昇し得る励起状態）で存在し得る、会合した（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）原子の基をいう。しばしば、会合した原子の基は、非局在化電子を含む。本発明での使用に適した発色性部分には、π系及び金属錯体を含むコンジュゲート化部分が挙げられる。例としては、ポルフィリン、ポリエン、ポリイン及びポリアリールが挙げられる。好ましい発色性部分は以下である：
【００４７】
【化５】
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【００４８】
蛍光性部分は、蛍光性の化学的部分であるフルオロフォアを含む部分である。本発明の生成物中に蛍光性部分として一般に組み込まれる蛍光性化合物の例には、以下が挙げられる：
【００４９】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素系；
シアニン及びメロシアニン；
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なＢＯＤＩＰＹ（ホウ素−ジピロメテン）色素系；
ＡＴＴＯ−ＴＥＣ  ＧｍｂＨが製造するＡＴＴＯ色素系；
フルオレセイン及びその誘導体；
ローダミン及びその誘導体；
ナフタレン誘導体（例えば、そのダンシル誘導体及びプロダン誘導体）；
ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾール及びベンゾオキサジアゾール誘導体；
クマリン及びその誘導体；
ピレン誘導体；並びに
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能な、オレゴングリーン、エオシン、テキサスレッド、カスケードブルー及びナイルレッド。
【００５０】
本発明での使用に好ましい蛍光性部分としては、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、スルホローダミン１０１酸塩化物（テキサスレッド）及びダンシルが挙げられる。フルオレセイン及びダンシルが特に好ましい。
【００５１】
放射性部分は、放射性核種を含む部分である。放射性核種の例としては、ヨウ素−１３１、ヨウ素−１２５、ビスマス−２１２、イットリウム−９０、イットリウム−８８、テクネチウム−９９ｍ、銅−６７、レニウム−１８８、レニウム−１８６、ガリウム−６６、ガリウム−６７、インジウム−１１１、インジウム−１１４ｍ、インジウム−１１４、ホウ素−１０、トリチウム（水素−３）、炭素−１１、炭素−１４、硫黄−３５及びフッ素−１８が挙げられる。
【００５２】
１実施形態において、放射性部分は、放射性核種単独からなり得る。別の実施形態において、放射性核種は、例えば、リンカー基（例えばチオール基含有リンカー）に直接共有結合することにより、又はキレート剤と配位錯体を形成することにより、より大きな放射性部分に組み込まれ得る。当該分野で公知の適切なキレート剤としては、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン−五酢酸無水物）、ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸）、ＴＥＴＡ（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラ−デカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸）、ＤＴＴＡ（Ｎ１−（ｐ−イソチオシアナトベンジル）−ジエチレン−トリアミン−Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３−四酢酸）及びＤＦＡ（Ｎ’−［５−［［５−［［５−アセチルヒドロキシアミノ）ペンチル］アミノ］−１，４−ジオキソブチル］ヒドロキシアミノ］ペンチル］−Ｎ−（５−アミノペンチル）−Ｎ−ヒドロキシブタンジアミド）が挙げられる。
【００５３】
電気化学的に活性な部分は、電流測定法又はボルタメトリ法などの電気化学的方法において、電気化学的シグナルを生成し得る基を含む部分である。典型的には、電気化学的に活性な部分は、少なくとも２つの別個の酸化還元状態で存在することができる。
【００５４】
慣用的に入手可能な非常に多数の検出可能化合物から、本発明に従う使用に適するであろう検出可能化合物を当業者が容易に選択できることは当然である。従って、本発明の方法論は、検出可能部分を含む生成物を産生するために使用され得、この生成物は次いで、かかる種の検出を含む任意の慣用の生化学的技術で使用され得る。例えば、１つのかかる技術では、検出可能部分は、ＦＲＥＴ分析法での使用に適したドナー発色団／アクセプター発色団対の一方のメンバーであり得る。
【００５５】
本明細書中で使用する場合、用語「酵素活性部分」とは、酵素、酵素基質又は酵素の補因子を意味する。好ましくは、酵素活性部分は酵素である。
【００５６】
本明細書中で使用する場合、用語「アフィニティタグ」とは、アフィニティタグとアフィニティパートナーの両方が単一のサンプル中に存在する場合に、第二の化学的部分である「アフィニティパートナー」と相互作用し得る化学的部分を意味する。典型的には、アフィニティタグは、アフィニティパートナーとの特異的結合相互作用を形成することができる。特異的結合相互作用は、サンプル中に存在するアフィニティパートナーと任意の他の化学物質との間で生じ得る任意の結合相互作用よりも強い結合相互作用である。特異的結合相互作用は、例えば、酵素とその基質との間で生じ得る。
【００５７】
アフィニティタグは、タンパク質などの生体分子の検出又は精製などの適用において有用であり得る。かかる適用において、固体基材及びアフィニティタグを含む生成物は、アフィニティタグとそのアフィニティパートナーとの間での特異的結合相互作用を利用することによって、生体分子及び対応するアフィニティパートナーを含むバイオコンジュゲートを検出又は精製するために使用され得る。
【００５８】
生化学で特に広く使用される１つのアフィニティタグ／アフィニティパートナー対は、ビオチン／（ストレプト）アビジン対である。アビジン及びストレプトアビジンは、ビオチン（５−［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル］ペンタン酸）由来のアフィニティタグに対し高い親和性及び特異性で結合するアフィニティパートナーとして使用され得るタンパク質である。当該分野で一般に使用される他のアフィニティタグ／アフィニティパートナー対としては、アミラーゼ／マルトース結合タンパク質、グルタチオン／グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ及び金属（例えば、ニッケル又はコバルト）／ポリ（Ｈｉｓ）が挙げられる。当業者であれば、各対のいずれかのメンバーが「アフィニティタグ」として機能し得、対のもう一方のメンバーが「アフィニティパートナー」として機能することを理解するであろう。従って、用語「アフィニティタグ」及び「アフィニティパートナー」は相互交換可能である。
【００５９】
当業者は、生化学、及び特にバイオコンジュゲート技術の背景におけるアフィニティタグ／アフィニティパートナー相互作用の慣用的な使用を認識しているであろう。従って当業者には、本発明に従う使用のためにアフィニティタグを選択するにあたり何らの困難もないであろう。従って、本発明の方法論は、アフィニティタグ／アフィニティパートナー相互作用を使用する慣用的な生化学的技術での使用に適応させた生成物を産生するために使用され得る。本発明の生成物において使用するのに特に好ましいアフィニティタグは、アビジン、ストレプトアビジン、アミラーゼ及びグルタチオンである。
【００６０】
本明細書中で使用する場合、用語、用語「ハプテン」とは、そのネイティブ形態ではｉｎ  ｖｉｖｏの免疫応答を刺激できないが、免疫原性担体分子に連結されるとｉｎ  ｖｉｖｏの免疫応答を刺激できる、エピトープを含む部分を意味する。典型的には、ハプテンは、比較的低い分子量（例えば１０００未満の分子量）の非タンパク質性部分である。エピトープは、免疫系によって認識され、免疫応答を刺激する、分子又は部分の一部である。
【００６１】
本明細書中で使用する場合、用語「免疫原性担体」とは、ｉｎ  ｖｉｖｏで投与されたときに免疫応答を促進できる、ハプテンにカップリングされ得る抗原を意味する。免疫原性担体の例としては、タンパク質、リポソーム、合成又は天然のポリマー部分（例えば、デキストラン、アガロース、ポリリジン及びポリグルタミン酸部分）、及び合成により設計された有機部分が挙げられる。一般に使用されるタンパク質免疫原性担体としては、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、アミノエチル化又はカチオン化されたウシ血清アルブミン、サイログロブリン、オボアルブミン及び種々のトキソイドタンパク質（例えば、破傷風トキソイド及びジフテリアトキソイド）が挙げられる。合成により設計された周知の有機分子担体には、多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）が挙げられる。
【００６２】
生化学の当業者が認識するように、ハプテン−免疫原性担体コンジュゲートは、例えば免疫学及びプロテオミクスにおいて広く使用される。当業者は、本発明の方法論が、ハプテン及び免疫原性担体を含むコンジュゲートを産生するために容易に適用でき、次いでこのコンジュゲートが固体基材に固定化されることを、認識するであろう。
【００６３】
本明細書中で使用する場合、用語「抗体又は抗体断片」とは、特異的抗原上のエピトープを介してその抗原に結合可能なタンパク質、又はかかるタンパク質の断片を意味する。抗体には、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が含まれる。モノクローナル抗体が好ましい。
【００６４】
本明細書中で使用する場合、用語「抗原」とは、ｉｎ  ｖｉｖｏで投与されたときに免疫応答を刺激でき、その免疫応答の間に産生される抗体に結合できる物質を意味する。
【００６５】
本明細書中で使用する場合、用語「リガンド」とは、生体分子の機能的特性を修飾するような方法で生体分子（例えばタンパク質）と相互作用できる部分を意味する。典型的には、リガンドは、標的タンパク質上の部位に結合する部分である。リガンドと生体分子との間の相互作用は、典型的には非共有結合である。例えば、相互作用は、イオン結合、水素結合又はファンデルワールス相互作用を介した相互作用であり得る。しかしながら、ある種のリガンドについては生体分子と共有結合を形成する可能性もある。しばしば、リガンドは、相互作用したときに生体分子の化学的コンフォメーションを変更することができる。
【００６６】
タンパク質と相互作用することができるリガンドの例としては、基質（例えば、酵素により触媒される化学反応に参加することにより、結合に際し酵素によって作用される）、阻害剤（結合に際しタンパク質活性を阻害する）、活性化因子（結合に際しタンパク質の活性を増加させる）及び神経伝達物質が挙げられる。
【００６７】
本明細書中で使用する場合、リガンド候補は、特定の生体分子に対するリガンドであると疑われる部分である。リガンド候補は、スクリーニング技術を実施するために、生化学において慣用的に使用される。典型的には、かかる技術では、複数のリガンド候補が提供され、次いで、それらが目的の生体分子（例えばタンパク質）と相互作用できるか否かを立証するためにアッセイされる。当業者が理解するように、特定のリガンド候補は、リガンドを構成する場合もあるし（生体分子と相互作用する場合）、リガンドを構成しない場合もある（生体分子と相互作用することが見出されない場合）。典型的には、特定の生体分子に対してアッセイされる複数のリガンド候補は、特定の共通の構造的特徴を共有するが、それらの構造の少なくとも１つの局面において互いに異なるように、意図的に選択される。
【００６８】
典型的には、リガンド候補は、低分子（例えば、１０００未満、又は５００未満の分子量を有する分子）である。好ましい実施形態において、複数のリガンド候補は、同時にスクリーニングできるように、アレイ（即ち、単一のアレイ構造）に整列された本発明の複数の生成物上に提示される。かかるアレイシステムは、「化合物マイクロアレイ（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）」又は「低分子アレイ（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ａｒｒａｙ）」として当該分野で一般に知られている。かかるシステムにおいて、複数のリガンド候補が、例えば、いわゆる「多様性指向型合成（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ−ｏｒｉｅｎｔｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」（ＤＯＳ）アプローチを使用して、選択され得る。アッセイ技術のこの分野における、固定化されたリガンド候補の適用の包括的な総説は、Ｕｔｔａｍｃｈａｎｄａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００５，９：４−１３）（その内容は、本明細書中でその全体が参照により組み込まれる）中に見出すことができる。
【００６９】
本明細書中で使用する場合、用語「生物活性部分」とは、ｉｎ  ｖｉｖｏで投与されたときに生化学的応答を誘導することができる部分を意味する。
【００７０】
生物活性部分は薬物であり得る。薬物には、細胞傷害剤（例えば、ドキソルビシン、メトトレキサート及びそれらの誘導体）、ｉｎ  ｖｉｖｏで代謝されて細胞傷害剤を生じ得る細胞毒前駆体、抗悪性腫瘍剤、降圧薬、心保護剤、抗不整脈薬、ＡＣＥ阻害剤、抗炎症薬、利尿薬、筋弛緩薬、局所麻酔薬、ホルモン、コレステロール降下薬、抗凝固薬、抗うつ薬、精神安定薬、神経遮断薬、鎮痛薬（例えば、麻薬性鎮痛薬又は解熱鎮痛薬）、抗ウイルス薬、抗菌薬、抗真菌薬、静菌薬（ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔ）、ＣＮＳ活性薬剤、抗痙攣薬、抗不安薬、制酸薬、麻薬、抗生物質、呼吸器薬剤（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）、抗ヒスタミン剤、免疫抑制剤、免疫活性化剤（ｉｍｍｕｎｏａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、栄養添加物、鎮咳薬、診断剤、催吐薬及び制吐薬、炭水化物、グリコサミノグリカン、糖タンパク質及び多糖、脂質、例えば、ホスファチジル−エタノールアミン、ホスファチジルセリン（ｐｈｏｓｐｈｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ）及びその誘導体、スフィンゴシン、ステロイド、ビタミン、抗生物質（ランチビオティク剤、静菌（ｂａｃｔｅｒｉｓｔａｔｉｃ）剤及び殺菌剤を含む）、抗真菌薬、駆虫剤、及び単細胞病原体を含む感染性因子に対する他の有効な薬剤、低分子エフェクター分子、例えば、ノルアドレナリン、αアドレナリンレセプターリガンド、ドパミンレセプターリガンド、ヒスタミンレセプターリガンド、ＧＡＢＡ／ベンゾジアゼピンレセプターリガンド、セロトニンレセプターリガンド、ロイコトリエン及びトリヨードサイロニン（ｔｒｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ）、並びにそれらの誘導体が含まれる。
【００７１】
本発明の好ましい実施形態において、生物活性部分は薬物である。この実施形態において、固体基材は典型的には、ステントなどの移植可能なデバイスである。
【００７２】
本明細書中で使用する場合、用語「リポソーム」とは、両親媒性の特性を有するリン脂質二重層からなる構造を意味する。本発明に従う使用に適したリポソームには、単層小胞及び多重層小胞が挙げられる。
【００７３】
本明細書中で使用する場合、用語「ポリマー部分」とは、対応する単一のポリマー分子から誘導される、単一のポリマー鎖（分枝又は非分枝）を意味する。ポリマー部分は、天然ポリマーでも合成ポリマーでもよい。しかし典型的には、ポリマー分子はポリヌクレオチドではない。当該分野で周知のように、ポリマー部分は、固体基材の表面特性を修飾するために使用され得る。例えば、固体基材がｉｎ  ｖｉｖｏで投与される場合（例えば、ステントのような移植可能なデバイスとして）、ポリマー部分は、生じる生物学的相互作用（例えば、生物学的安定性、血液適合性、及び異物に対して免疫系によって引き起こされる免疫応答）を修飾できる。
【００７４】
従って当業者であれば、固体基材及びポリマー部分を含む生成物を調製するために本発明の方法論が使用できることを認識するであろう。当業者であれば、当該分野で慣用的に使用されるポリマー部分に基づいて、本発明に従う使用に適したポリマー部分を容易に選択できるであろう。明らかに、ポリマー部分の性質は、本発明の生成物の意図した使用に依存するであろう。本発明に従う使用のための例示的なポリマー部分としては、多糖、ポリエーテル、ポリアミノ酸（例えばポリリジン）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ（メタ）アクリル酸及びその誘導体、ポリウレタン並びにポリホスファゼンが挙げられる。典型的には、かかるポリマーは、少なくとも１０個のモノマー単位を含む。従って、例えば、多糖は、少なくとも１０個の単糖単位を典型的に含む。
【００７５】
２つの特に好ましいポリマー分子は、デキストラン及びポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、並びにこれらの分子の誘導体（例えば、モノメトキシポリエチレングリコール、「ｍＰＥＧ」）である。好ましくは、ＰＥＧ又はその誘導体は、２０，０００未満の分子量を有する。好ましくは、デキストラン又はその誘導体は、１０，０００〜５００，０００の分子量を有する。
【００７６】
本明細書中で使用する場合、用語「アミノ酸」とは、アミン官能基及びカルボキシル官能基の両方を含む部分を意味する。しかしながら、好ましいアミノ酸はα−アミノ酸である。好ましくは、アミノ酸は、タンパク新生アミノ酸、即ち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、ピロリジン、セレノシステイン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンから選択されるアミノ酸である。しかしながら、アミノ酸は、非タンパク新生アミノ酸であってもよい。非タンパク新生アミノ酸の例としては、ランチオニン、２−アミノイソ酪酸、デヒドロアラニン、γ−アミノ酪酸、オルニチン、シトルリン、カナバリン及びミモシンが挙げられる。本発明に従う特に好ましいアミノ酸は、システインである。
【００７７】
本明細書中で使用する場合、用語「ペプチド」及び「タンパク質」とは、アミノ酸残基からなるポリマー部分を意味する。当業者が認識するように、用語「ペプチド」は典型的に、比較的短い長さのポリマーを示すために当該分野で使用され、用語「タンパク質」は典型的に、比較的長い長さのポリマーを示すために当該分野で使用される。本明細書中で使用する場合、ペプチドは最大５０アミノ酸残基を含み、対してタンパク質は５０アミノ酸より多くを含むことが慣用である。しかしながら、本出願で同定される機能的部分は、ペプチド又はタンパク質のいずれかを典型的に示し得るので、この区別は重要ではないことが理解されよう。
【００７８】
本明細書中で使用する場合、用語「ポリペプチド」は、「タンパク質」と相互交換可能に使用される。
【００７９】
本明細書中で使用する場合、ペプチド又はタンパク質は、任意の天然又は非天然のアミノ酸を含み得る。例えば、ペプチド又はタンパク質は、例えば天然のα−アミノ酸に対応する、α−アミノ酸残基のみを含んでいてもよい。或いは、ペプチド又はタンパク質はさらに、１以上の化学的修飾を含んでいてもよい。例えば、化学的修飾は、その翻訳後にタンパク質にｉｎ  ｖｉｖｏで生じる修飾である翻訳後修飾に対応し得、例えば、アシル化（例えば、アセチル化）、アルキル化（例えば、メチル化）、アミド化、ビオチン化、ホルミル化、グリコシル化、糖化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、酸化、硫酸化又はリン酸化である。当業者は当然、かかる翻訳後修飾されたペプチド又はタンパク質が、依然として本発明の意味の範囲内の「ペプチド」又は「タンパク質」を構成することを認識するであろう。例えば、糖タンパク質（１以上のオリゴ糖側鎖を有するタンパク質）がタンパク質の一種であることは当該分野で十分確立されている。
【００８０】
本明細書中で使用する場合、用語「細胞」は、生きた生物の単一の細胞を意味する。
【００８１】
本明細書中で使用する場合、用語「炭水化物」には、単糖類及びオリゴ糖類が含まれる。典型的には、オリゴ糖は、２〜９個の単糖単位を含む。従って、本明細書中で使用する場合、多糖は、炭水化物としてではなく「ポリマー部分」として分類される。しかしながら、本発明に従って使用される機能的部分は、「炭水化物」及び「多糖」のいずれかを典型的に構成するので、当業者はこの区別が重要ではないことを理解するであろう。
【００８２】
本明細書中で使用する場合、用語「ＤＮＡ」は、１以上のヌクレオチドから構成されるデオキシリボ核酸を意味する。ＤＮＡは、一本鎖でも二本鎖でもよい。好ましくは、ＤＮＡは１より多いヌクレオチドを含む。
【００８３】
本明細書中で使用する場合、用語「ＲＮＡ」は、１以上のヌクレオチドを含むリボ核酸を意味する。好ましくは、ＲＮＡは１より多いヌクレオチドを含む。
【００８４】
好ましい機能的部分は、検出可能部分、酵素活性部分（好ましくは酵素）、アフィニティタグ、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド又はリガンド候補、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、細胞、ＤＮＡ及びＲＮＡである。特に好ましい機能的部分は、酵素活性部分（好ましくは酵素）、アフィニティタグ、抗体又は抗体断片、抗原、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ及びＲＮＡである。
【００８５】
本明細書中で使用する場合、「コンジュゲート」とは、本明細書中に記載するような機能的部分及び少なくとも１つの固体基材及びさらなる機能的部分を含む分子を意味する。従って、本発明の生成物（固体基材を必ず含む）が機能的部分を含む場合、これはコンジュゲートを構成する。次いで、機能的部分及び固体基材は、本明細書中に記載されるように、クロスリンカー部分を介して互いに共有結合される。
【００８６】
本明細書中で使用する場合、用語「基」及び「部分」は相互交換可能に使用される。
【００８７】
本明細書中で使用する場合、用語「求電子性脱離基」とは、その炭素原子における求核攻撃後に求核剤により置換され得る、飽和又は不飽和の炭素原子に結合した置換基を意味する。当業者は、特定の化合物上に位置付けるため及び特定の求核剤と反応するために適した求電子性脱離基を、慣用的に選択できる。
【００８８】
本明細書中で使用する場合、用語「求核剤」とは、電子対を提供することによって化学結合を形成することができる官能基又は化合物を意味する。
【００８９】
本明細書中で使用する場合、用語「リンカー基」とは、ある化学的部分を別の化学的部分に連結することができる基を意味する。本発明に従って使用されるリンカー基の性質は、重要ではない。当業者であれば、リンカー基がコンジュゲート分子の構築に慣用的に使用されることを認識するであろう。典型的には、本発明で使用するためのリンカー基は有機基である。典型的には、かかるリンカー基は、５０〜１０００、好ましくは１００〜５００の分子量を有する。本発明に従う使用に適切なリンカー基の例は、当該分野の共通の一般的知識であり、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」（Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，１９９６）（その内容は本明細書中で参照によりその全体が組み込まれる）などの標準的な参考教科書に記載されている。
【００９０】
本明細書中で使用する場合、「反応性基」とは、第一の物質と第二の物質との間に共有結合が形成するように第二の物質上の官能基との化学反応に参加することができる、第一の物質上の官能基を意味する。反応性基には、脱離基、求核基及び本明細書中に記載される他の反応性基が挙げられる。
【００９１】
本明細書中で使用する場合、用語「アルキル」には、直鎖及び分枝鎖の両方の飽和アルキル基が含まれる。好ましくは、アルキル基は、Ｃ１−２０アルキル基、より好ましくはＣ１−１５、なおより好ましくはＣ１−１２アルキル基、なおより好ましくはＣ１−６アルキル基であり、最も好ましくはＣ１−４アルキル基である。特に好ましいアルキル基には、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル及びヘキシルが挙げられる。用語「アルキレン」は、しかるべく解釈されるべきである。
【００９２】
本明細書中で使用する場合、用語「アルケニル」とは、分枝鎖でも非分枝鎖でもよい、１個以上の炭素−炭素二重結合を含む基をいう。好ましくは、アルケニル基は、Ｃ２−２０アルケニル基、より好ましくはＣ２−１５アルケニル基、なおより好ましくはＣ２−１２アルケニル基、又は好ましくはＣ２−６アルケニル基であり、最も好ましくはＣ２−４アルケニル基である。用語「アルケニレン」は、しかるべく解釈されるべきである。
【００９３】
本明細書中で使用する場合、用語「アルキニル」とは、分枝鎖でも非分枝鎖でもよい、１個以上の三重結合を含む炭素鎖をいう。好ましくは、アルキニル基は、Ｃ２−２０アルキニル基、より好ましくはＣ２−１５アルキニル基、なおより好ましくはＣ２−１２アルキニル基、又は好ましくはＣ２−６アルキニル基であり、最も好ましくはＣ２−４アルキニル基である。用語「アルキニレン」は、しかるべく解釈されるべきである。
【００９４】
特に指定しない場合、アルキル、アルケニル又はアルキニル基は、典型的には非置換である。しかしながら、かかる基が非置換又は置換であると示されている場合、１個以上の水素原子が、ハロゲン原子置換基で置換されていてもよい。好ましくは、置換されたアルキル、アルケニル又はアルキニル基は、１〜１０個の置換基、より好ましくは１〜５個の置換基、なおより好ましくは１、２又は３個の置換基、最も好ましくは１又は２個の置換基、例えば１個の置換基を有する。しかし好ましくは、アルキル、アルケニル又はアルキニル基は、非置換である。
【００９５】
アルキル、アルケニル若しくはアルキニル基、又はアルキレン、アルケニレン若しくはアルキニレン基である部分において、（ａ）０、１又は２個の炭素原子は、Ｃ６−１０アリーレン、５〜１０員のヘテロアリーレン、Ｃ３−７カルボシクリレン及び５〜１０員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されていてもよく、かつ（ｂ）０、１又は２個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−及び−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−基から選択される基によって置換されていてもよく、合計で０、１又は２個の該炭素原子及び−ＣＨ２−基が置換されていることが好ましく、合計で０又は１個がより好ましい。最も好ましくは、炭素原子又は−ＣＨ２−基のいずれも置換されていない。
【００９６】
−ＣＨ２−基を置換するための好ましい基は、−Ｏ−、−Ｓ−及び−Ｃ（Ｏ）−基である。炭素原子を置換するための好ましい基は、フェニレン、５〜６員のヘテロアリーレン、Ｃ５−６カルボシクリレン及び５〜６員のヘテロシクリレン基である。本明細書中で使用する場合、「０、１又は２個の炭素原子」への言及は、アルキル、アルケニル又はアルキニル鎖中の任意の末端又は非末端炭素原子（その炭素原子に結合した任意の水素原子を含む）を意味する。本明細書中で使用する場合、「０、１又は２個の−ＣＨ２−基」への言及は、アルキル、アルケニル又はアルキニル鎖中の末端炭素原子に対応しない基をいう。
【００９７】
本明細書中で使用する場合、Ｃ６−１０アリール基は、６〜１０個の炭素原子を有する、単環式又は多環式の６〜１０員の芳香族炭化水素環系である。フェニルが好ましい。用語「アリーレン」は、しかるべく解釈されるべきである。
【００９８】
本明細書中で使用する場合、５〜１０員のヘテロアリール基は、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される少なくとも１個のヘテロ原子、例えば、１、２、３又は４個のヘテロ原子を含む、単環式又は多環式の５〜１０員の芳香族環系（例えば、５〜６員環）である。環が４個のヘテロ原子を含む場合、これらは好ましくは全てが窒素原子である。用語「ヘテロアリーレン」は、しかるべく解釈されるべきである。
【００９９】
単環式ヘテロアリール基の例としては、チエニル、フリル、ピロリル、イミダゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル及びテトラゾリル基が挙げられる。
【０１００】
多環式ヘテロアリール基の例としては、ベンゾチエニル、ベンゾフリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾトリアゾリル、インドリル、イソインドリル及びインダゾリル基が挙げられる。好ましい多環式基としては、インドリル、イソインドリル、ベンズイミダゾリル、インダゾリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾチアゾリル及びベンゾイソチアゾリル基が挙げられ、より好ましくはベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル及びベンゾチアゾリルであり、最も好ましくはベンゾチアゾリルである。しかしながら、単環式ヘテロアリール基が好ましい。
【０１０１】
好ましくは、ヘテロアリール基は、５〜６員のヘテロアリール基である。特に好ましいヘテロアリール基は、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル及びピラジニル基である。より好ましい基は、チエニル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピロリル及びトリアジニルでり、最も好ましくはピリジニルである。
【０１０２】
本明細書中で使用する場合、５〜１０員のヘテロシクリル基は、１個以上の炭素原子、例えば１、２、３又は４個の炭素原子が、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）及びＳ（Ｏ）２から選択される部分で置換されている、非芳香族の、飽和又は不飽和の、単環式又は多環式のＣ５−１０炭素環式環系である。好ましくは、５〜１０員のヘテロシクリル基は５〜６員環である。用語「ヘテロシクリエン（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｙｅｎｅ）」は、しかるべく解釈されるべきである。
【０１０３】
ヘテロシクリル基の例としては、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル（ｔｈｉｅｔａｎｙｌ）、ピロリジニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ジチオラニル（ｄｉｔｈｉｏｌａｎｙｌ）、ジオキソラニル、ピラゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ヘキサヒドロピリミジニル、メチレンジオキシフェニル、エチレンジオキシフェニル、チオモルホリニル、Ｓ−オキソ−チオモルホリニル、Ｓ，Ｓ−ジオキソ−チオモルホリニル、モルホリニル、１，３−ジオキソラニル、１，４−ジオキソラニル、トリオキソラニル（ｔｒｉｏｘｏｌａｎｙｌ）、トリチアニル（ｔｒｉｔｈｉａｎｙｌ）、イミダゾリニル、ピラニル、ピラゾリニル、チオキソラニル（ｔｈｉｏｘｏｌａｎｙｌ）、チオキソチアゾリジニル、１Ｈ−ピラゾール−５−（４Ｈ）−オニル、１，３，４−チアジアゾール−２（３Ｈ）−チオニル、オキソピロリジニル、オキソチアゾリジニル、オキソピラゾリジニル、スクシンイミド（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏ）及びマレイミド基及び部分が挙げられる。好ましいヘテロシクリル基は、ピロリジニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ジチオラニル、ジオキソラニル、ピラゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ヘキサヒドロピリミジニル、チオモルホリニル及びモルホリニル基及び部分である。より好ましいヘテロシクリル基は、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、チオモルホリニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピペリジニル、モルホリニル及びピロリジニル基である。
【０１０４】
疑義を回避するため、ヘテロアリール基及びヘテロシクリル基の上記定義は、環中に存在し得る「Ｎ」部分をいうが、熟練の化学者に明らかなように、Ｎ原子は、単結合を介して隣接する環原子のそれぞれに結合した場合、プロトン化される（又は以下に規定する置換基を有する）であろう。
【０１０５】
本明細書中で使用する場合、Ｃ３−７カルボシクリル基は、３〜７個の炭素原子を有する、非芳香族の、飽和又は不飽和の炭化水素環である。好ましくは、Ｃ３−７カルボシクリル基は、３〜７個の炭素原子、より好ましくは５〜６個の炭素原子を有する、飽和又はモノ不飽和の炭化水素環（即ち、シクロアルキル部分又はシクロアルケニル部分）である。例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル及びシクロヘキシル、並びにそれらのモノ不飽和バリアントが挙げられる。特に好ましい炭素環式基は、シクロペンチル及びシクロヘキシルである。用語「カルボシクリレン」は、しかるべく解釈されるべきである。
【０１０６】
具体的には、カルボシクリル又はヘテロシクリル基中の０、１又は２個の炭素原子は、−Ｃ（Ｏ）−基で置換され得る。本明細書中で使用する場合、置換される「炭素原子」は、それらが結合する水素原子を含むことが理解される。１又は２個の炭素原子が置換される場合、２個のかかる炭素原子が置換されることが好ましい。好ましいかかるカルボシクリル基としてはベンゾキノン基が挙げられ、好ましいかかるヘテロシクリル基としてはスクシンイミド及びマレイミド基が挙げられる。
【０１０７】
特に指定しない場合、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル又はヘテロシクリル基は、典型的には非置換である。しかしながら、かかる基が非置換又は置換であると示されている場合、１個以上の水素原子が、ハロゲン原子又はＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオール、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）若しくはニトロ基で置換されていてもよい。好ましくは、置換されたアリール、ヘテロアリール、カルボシクリル又はヘテロシクリル基は、１〜４個の置換、より好ましくは１〜２個の置換基、最も好ましくは１個の置換基を有する。好ましくは、置換されたアリール、ヘテロアリール、カルボシクリル又はヘテロシクリル基は、２個以下のニトロ置換基を有する。好ましい置換基は、ハロゲン原子並びにＣ１−４アルキル及びＣ１−４アルコキシ基である。特に好ましい置換基はハロゲン原子である。しかし好ましくは、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル又はヘテロシクリル基は、非置換である。
【０１０８】
本明細書中で使用する場合、ハロゲン原子は、典型的にはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ原子であり、好ましくはＢｒ又はＣｌ原子であり、より好ましくはＢｒ原子である。
【０１０９】
本明細書中で使用する場合、Ｃ１−６アルコキシ基は、酸素原子に結合したＣ１−６アルキル（例えば、Ｃ１−４アルキル）基である。
【０１１０】
本明細書中で使用する場合、Ｃ１−６アルキルチオール基は、硫黄原子に結合したＣ１−６アルキル（例えば、Ｃ１−４アルキル）基である。
【０１１１】
本明細書中で使用する場合、５〜１０員のヘテロシクリルチオールは、硫黄原子に結合した５〜１０員の（例えば、５〜６員の）ヘテロシクリル基である。
【０１１２】
本明細書中で使用する場合、Ｃ６−１０アリールチオールは、硫黄原子に結合したＣ６−１０アリール（例えば、フェニル）基である。
【０１１３】
本明細書中で使用する場合、Ｃ３−７カルボシクリルチオールは、硫黄原子に結合したＣ３−７カルボシクリル（例えば、Ｃ５−６カルボシクリル）基である。
【０１１４】
本発明の生成物は、少なくとも１個の機能的部分と共に、固体基材及び式（Ｉ）の部分を必ず含む。この式（Ｉ）の部分は、さらなる機能的部分に固体基材を連結できる架橋反応性部分を構成する。
【０１１５】
好ましくは、Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＨの基を示す。より好ましくは、Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素又は硫黄を示す。好ましくは、Ｘ及びＸ’の少なくとも一方は酸素を示す。最も好ましくは、Ｘ及びＸ’は共に酸素である。
【０１１６】
Ｙは、好ましくは、ハロゲン原子又はトリフレート、トシレート、メシレート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル、Ｃ１−６アルキルチオール、５〜１０員のヘテロシクリルチオール、Ｃ６−１０アリールチオール、Ｃ３−７カルボシクリルチオール、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３、−ＯＣ（Ｏ）ＣＦ３、フェニルオキシ、−ＮＲｘＲｙＲｚ＋若しくは−ＰＲｘＲｙＲｚ＋基である。より好ましくは、Ｙは、ハロゲン原子又はトリフレート、トシレート、メシレート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル、Ｃ１−６アルキルチオール、５〜１０員のヘテロシクリルチオール、Ｃ６−１０アリールチオール若しくはＣ３−７カルボシクリルチオールである。なおより好ましくは、Ｙは、ハロゲン原子又はＣ１−６アルキルチオール、５〜１０員のヘテロシクリルチオール、Ｃ６−１０アリールチオール若しくはＣ３−７カルボシクリルチオールである。最も好ましくは、Ｙは、ハロゲン原子、特に臭素原子である。
【０１１７】
Ｒｘ、Ｒｙ及びＲｚはそれぞれ、好ましくは、水素原子及びＣ１−６アルキル基から選択される。より好ましくは、Ｒｘ、Ｒｙ及びＲｚはそれぞれ、好ましくは、水素原子並びにメチル及びエチル基から選択される。好ましくは、特定の−ＮＲｘＲｙＲｚ＋又は−ＰＲｘＲｙＲｚ＋基では、Ｒｘ、Ｒｙ及びＲｚは同じである。
【０１１８】
第一の実施形態（ｉ）において、Ｒは、求電子性脱離基を示し、固体基材は、式（Ｉ）の１位、３位又は４位に連結されている。実施形態（ｉ）の生成物は、チオール基を有する機能的部分と反応でき、その結果、機能的部分は、該チオール基の硫黄原子を介して、即ち、求電子性脱離基Ｙを置換することによって、式（Ｉ）の２位に結合する。実施形態（ｉ）の生成物は、式（Ｉ）の１位、３位及び／又は４位に連結された、１個以上のさらなる機能的部分を既に有している（即ちこれは、固体基材を構成する）。
【０１１９】
第二の実施形態（ｉｉ）において、固体基材はチオール部分を有し、Ｒは、該チオール部分の硫黄原子への結合を示す。実施形態（ｉｉ）の生成物は、式（Ｉ）の１位、３位及び／又は４位に連結された、１個以上のさらなる機能的部分を含む（即ちこれは、固体基材及び１個以上の機能的分子の両方を含むコンジュゲートを構成する）。この生成物はまた、機能的部分と反応するように「準備された（ｐｒｉｍｅｄ）」固体基材試薬を構成する。当業者が理解するように、かかる反応は、式（Ｉ）の部分上に存在する任意の反応性官能基を介して生じ得、式（Ｉ）の２位と３位との間の炭素−炭素二重結合への付加が含まれる。
【０１２０】
第三の実施形態（ｉｉｉ）において、固体基材は、式（Ｉ）の１位、３位又は４位に連結されており、Ｒは、式−Ｓ−Ｆ１又は−Ｓ−Ｌ−Ｆ２の基を示し、式中Ｌはリンカー基を示し、−Ｓ−Ｆ１及び−Ｆ２は機能的部分を示す。従って、この実施形態においても、生成物はコンジュゲートを構成する。
【０１２１】
疑義を回避するため、部分−Ｓ−Ｆ１は、硫黄原子Ｓを介して第二の部分に結合した機能的部分を構成する。同様に、−Ｓ−Ｌ−は、硫黄原子に結合した本発明のリンカー基を示し、次いでこの硫黄原子が第二の部分に結合される。
【０１２２】
式（Ｉ）の部分は、本発明に従ってチオール含有機能的部分を固体基材にコンジュゲート化させる、又はチオール含有固体基材を機能的部分にコンジュゲート化させる、重要な反応性部分を示すことが明らかであろう。式（Ｉ）の部分（及び式（ＩＩＩ）の部分、別の箇所で詳細に記載される）において、記号
【０１２３】
【化６】
2013501766.tif 000008
【０１２４】
は、別の基への結合点を意味する。これらの結合点を介して結合した基の正体は、本発明には重要でないことが理解されよう。当業者であれば、特定の目的に合うように、これらの結合点を介して結合した基を、例えば、一緒に連結される機能的部分及び固体基材の具体的な正体に基づいて、選択することが可能であることが容易に理解できよう。当業者に周知のように、機能的部分及び特定の反応性基を有する固体基材と反応するように適応された官能基を保有し、かつリンカー基（典型的には、反応中に重要な役割を果たさない）によって間隔を空けられた架橋試薬が、慣用的に設計される。当業者であれば、式（Ｉ）の部分が、例えば、チオール基と反応するように設計された従来の部分（例えば、マレイミド基又はヨードアセチル基）を置換することによって、慣用のクロスリンカー試薬中に容易に組み込まれ得ることを、即座に理解するであろう。この様式での適応に適したクロスリンカー試薬の設計についての詳細な情報は、例えば、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」（Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，１９９６）（その内容は、その全体が本明細書中で参照により組み込まれる）中に見出すことができる。
【０１２５】
好ましくは、本発明の生成物は、式（ＩＩ）を有する：
【０１２６】
【化７】
2013501766.tif 000009
【０１２７】
式中、
Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＱの基を示し、Ｑは、水素、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル又はフェニルであり；
Ｒ１は以下を示し：
（ｉ）求電子性脱離基Ｙ；又は
（ｉｉ）チオール部分を有し、該チオール部分の硫黄原子を介して式（ＩＩ）の２位に結合している、固体基材；又は
（ｉｉｉ）−Ｓ−Ｆ１若しくは−Ｓ−Ｌ−Ｆ２；
Ｒ２は、水素原子、Ｓｏｌ、−Ｌ−Ｓｏｌ、Ｆ３、Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｆ３）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍ又はＩＧを示し；
以下のいずれかであり：
Ｒ３及びＲ３’は、同じ又は異なって、それぞれ水素原子、Ｓｏｌ、−Ｌ−Ｓｏｌ、Ｆ３、Ｅ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｆ３）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍ又はＩＧを示す；又は
Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｏ−又は−Ｎ（Ｒ３３’）−の基を形成し、Ｒ３３’は、水素原子、Ｓｏｌ、−Ｌ−Ｓｏｌ、Ｆ３、Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｆ３）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍ又はＩＧを示す；又は
Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３’）−Ｎ（Ｒ３３’）−の基を形成し、各Ｒ３３’は、同じ又は異なって、水素原子、Ｓｏｌ、−Ｌ−Ｓｏｌ、Ｆ３、Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｆ３）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍ又はＩＧを示す；
Ｓｏｌは固体基材を示し；
−Ｓ−Ｆ１、Ｆ２及びＦ３のそれぞれは、同じ又は異なって、検出可能部分、酵素活性部分、アフィニティタグ、ハプテン、免疫原性担体、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド又はリガンド候補、生物活性部分、リポソーム、ポリマー部分、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、細胞、炭水化物、ＤＮＡ及びＲＮＡから選択される機能的部分を示し；
Ｅ及びＹのそれぞれは、同じ又は異なって、求電子性脱離基を示し；
各Ｎｕは、同じ又は異なって、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２及び−ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）から選択される求核剤を示し；
各Ｌは、同じ又は異なって、リンカー基を示し；
各Ｚは、同じ又は異なって、部分Ｌに結合した反応性基を示し；
各ｎは、同じ又は異なって、１、２又は３であり；
各ｍは、同じ又は異なって、０からｎまでの値を有する整数であり；
各ＩＧは、同じ又は異なって、非置換であるか又は１個以上のハロゲン原子置換基で置換されている、Ｃ１−２０アルキル基、Ｃ２−２０アルケニル基又はＣ２−２０アルキニル基である部分を示し、式中、（ａ）０、１又は２個の炭素原子は、Ｃ６−１０アリーレン、５〜１０員のヘテロアリーレン、Ｃ３−７カルボシクリレン及び５〜１０員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されており、かつ（ｂ）０、１又は２個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−及び−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−基から選択される基によって置換されており、式中、
（ｉ）該アリーレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオール、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）及びニトロ基から選択される１個以上の置換基によって置換されており；
（ｉｉ）該カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基中の０、１又は２個の炭素原子は、−Ｃ（Ｏ）−基によって置換されており；
ただし、該生成物は、１つの固体基材及び少なくとも１個の機能的部分を含む。
【０１２８】
好ましくは、Ｒ１は、（ａ）求電子性脱離基Ｙ又は（ｂ）−Ｓ−Ｆ１若しくは−Ｓ−Ｌ−Ｆ２を示す。
【０１２９】
Ｒ２は好ましくは、水素原子、Ｓｏｌ、−Ｌ−Ｓｏｌ、Ｆ３、Ｙ、−Ｌ（Ｆ３）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍ又はＩＧである。より好ましくは、Ｒ２は、水素原子、Ｓｏｌ、Ｆ３、Ｙ、−Ｌ（Ｚ）ｎ又はＩＧであり、なおより好ましくは、水素若しくはハロゲン原子、Ｓｏｌ、Ｆ３又はＣ１−６アルキル基である。最も好ましくは、Ｒ２は、水素若しくはハロゲン原子又はＣ１−６アルキル基である。
【０１３０】
Ｒ３及びＲ３’が、同じ又は異なって、それぞれ水素原子、Ｓｏｌ、−Ｌ−Ｓｏｌ、Ｆ３、Ｅ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｆ３）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍ又はＩＧを示す場合、好ましくは、Ｒ３及びＲ３’は、同じ又は異なって、それぞれＳｏｌ、−Ｌ−Ｓｏｌ、Ｆ３、Ｅ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｆ３）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍ又はＩＧを示す。より好ましくは、この実施形態では、Ｒ３及びＲ３’のうち少なくとも１個が、Ｓｏｌ又は−Ｌ−Ｓｏｌを示し、最も好ましくはＳｏｌを示す。
【０１３１】
好ましくは、Ｒ３及びＲ３’は、同じ又は異なって、それぞれ水素原子、Ｓｏｌ、−Ｌ−Ｓｏｌ、Ｆ３、Ｅ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｆ３）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍ又はＩＧを示すか；又はＲ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３’）の基を形成し、Ｒ３３’は、水素原子、Ｓｏｌ、−Ｌ−Ｓｏｌ、Ｆ３、Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｆ３）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍ又はＩＧを示す。より好ましくは、Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３’）の基を形成する。
【０１３２】
Ｒ３３’は好ましくは、水素原子、Ｓｏｌ、−Ｌ−Ｓｏｌ、Ｆ３、−Ｌ（Ｆ３）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍ又はＩＧを示す。より好ましくは、Ｒ３３’は、水素原子、Ｓｏｌ、Ｆ３又はＩＧを示す。なおより好ましくは、Ｒ３３’は、水素原子、Ｓｏｌ、Ｆ３又はＣ１−６アルキル基を示す。最も好ましくは、Ｒ３３’はＳｏｌを示す。
【０１３３】
Ｅは好ましくは、ハロゲン原子、又はＣ１−６アルコキシ、チオール、Ｃ１−６アルキルチオール、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）、トリフレート、トシレート、メシレート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル、イミダゾリル、フェニルオキシ若しくはニトロフェニルオキシ基である。より好ましい式Ｅの基は、ハロゲン原子並びにトリフレート、トシレート及びメシレート基である。
【０１３４】
式（ＩＩ）中の好ましい基Ｘ、Ｘ’及びＹは、上述のとおりである。
【０１３５】
Ｎｕは好ましくは、式−ＯＨ又は−ＳＨの基である。別の実施形態において、Ｎｕは好ましくは、式−ＯＨ、−ＮＨ２又は−ＳＨの基であり、より好ましくは−ＮＨ２又は−ＳＨである。
【０１３６】
リンカー部分Ｌは、本発明の生成物中の２つの他の部分を一緒に連結する（即ち、これは少なくとも２価の部分である）。しかしながら、いくつかの実施形態において、特定のリンカー部分Ｌは、２個より多い他の部分を一緒に連結し得（例えば、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ３’又はＲ３３’が−Ｌ（Ｆ３）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍ（ｎは２又は３である）を示す場合）、この場合、３つ目の他の部分及び任意のさらなる他の部分のそれぞれが、対応する２価のリンカー部分Ｌ上の水素原子を置換することが理解されよう。
【０１３７】
Ｌは好ましくは、非置換であるか又は１個以上のハロゲン原子置換基で置換されている、Ｃ１−２０アルキレン基、Ｃ２−２０アルケニレン基又はＣ２−２０アルキニレン基である部分を示し、式中、（ａ）０、１、又は２個の炭素原子は、Ｃ６−１０アリーレン、５〜１０員のヘテロアリーレン、Ｃ３−７カルボシクリレン及び５〜１０員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されており、かつ（ｂ）０、１又は２個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−及び−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−基から選択される基によって置換されており、式中、
（ｉ）該アリーレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオール、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）及びニトロ基から選択される１個以上の置換基によって置換されており；
（ｉｉ）該カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基中の０、１又は２個の炭素原子は、−Ｃ（Ｏ）−基によって置換されている。
【０１３８】
より好ましくは、Ｌは、非置換のＣ１−６アルキレン基、Ｃ２−６アルケニレン基又はＣ２−６アルキニレン基である部分を示し、式中、（ａ）０又は１個の炭素原子は、フェニレン、５〜６員のヘテロアリーレン、Ｃ５−６カルボシクリレン及び５〜６員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されており、該フェニレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにＣ１−４アルキル及びＣ１−４アルコキシ基から選択される１又は２個の置換基によって置換されており、かつ（ｂ）０、１又は２個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−及び−Ｃ（Ｏ）−基から選択される基によって置換されている。
【０１３９】
最も好ましくは、Ｌは非置換のＣ１−４アルキレン基である部分であり、式中、０又は１個の炭素原子は、非置換のフェニレン基によって置換されている。
【０１４０】
Ｚは、式Ｌの基に結合した反応性基を示す。反応性基Ｚは、機能的部分をクロスリンカーに接続する（即ち、機能的部分を固体基材に連結する）ように選択される。当業者が理解するように、反応性基自体の性質は重要ではない。非常に広範な反応性基が、機能的部分をクロスリンカー試薬に接続するために、当該分野で現在慣用的に使用されている。かかる反応性基は、例えば、アミン化合物、チオール化合物、カルボキシル化合物、ヒドロキシル化合物、カルボニル化合物、又は反応性水素を含む化合物を、クロスリンカーに結合できるものであり得る。当業者であれば当然、任意のかかる反応性基が、本発明に従う使用に適切であることを即座に認識するであろう。従って、当業者は、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」（Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，１９９６）（その内容は、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）などの標準的教科書を参照して、共通の一般知識から、適切な反応性基を選択することができるであろう。
【０１４１】
Ｚは好ましくは以下である：
（ａ）式−ＬＧ、−Ｃ（Ｏ）−ＬＧ、−Ｃ（Ｓ）−ＬＧ又は−Ｃ（ＮＨ）−ＬＧの基（式中、ＬＧは求電子性脱離基である）；
（ｂ）−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）及び−Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ２基から選択される求核剤Ｎｕ’；
（ｃ）求核剤と開環求電子反応し得る環式部分Ｃｙｃ；
（ｄ）式−Ｓ（Ｏ２）（Ｈａｌ）の基（式中、Ｈａｌはハロゲン原子である）；
（ｅ）式−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ又は−Ｎ＝Ｃ＝Ｓの基；
（ｆ）式−Ｓ−Ｓ（ＩＧ’）の基（式中、ＩＧ’は、本明細書中に記載したとおりの式ＩＧの基を示す）；
（ｇ）１個以上のハロゲン原子によって置換されたＣ６−１０アリール基である、基ＡＨ；
（ｈ）紫外線光への曝露によって活性化され得る光反応性基；
（ｉ）式−Ｃ（Ｏ）Ｈ又は−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−６アルキル）の基；
（ｊ）マレイミド基；
（ｋ）式−Ｃ（Ｏ）ＣＨＣＨ２の基；
（ｌ）式−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｎ２）Ｈ又は−ＰｈＮ２＋の基（式中、Ｐｈはフェニル基を示す）；又は
（ｍ）エポキシド基。
【０１４２】
最も好ましくは、Ｚは以下から選択される：
（ａ）式−ＬＧ、−Ｃ（Ｏ）−ＬＧ及び−Ｃ（Ｓ）−ＬＧの基（式中、ＬＧは、ハロゲン原子並びに−Ｏ（Ｃ１−６アルキル）、−ＳＨ、−Ｓ（Ｃ１−６アルキル）、トリフレート、トシレート、メシレート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル及びＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル基から選択される）；
（ｂ）式−ＯＨ、−ＳＨ及び−ＮＨ２の基；
（ｃ）式
【０１４３】
【化８】
2013501766.tif 000010
【０１４４】
又は式
【０１４５】
【化９】
2013501766.tif 000011
【０１４６】
の基；及び
（ｄ）マレイミド基。
【０１４７】
ＬＧは好ましくは、ハロゲン原子並びに−Ｏ（ＩＧ’）、−ＳＨ、−Ｓ（ＩＧ’）、−ＮＨ２、ＮＨ（ＩＧ’）、−Ｎ（ＩＧ’）（ＩＧ’’）、−Ｎ３、トリフレート、トシレート、メシレート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル、イミダゾリル及びアジド基から選択され、式中、ＩＧ’及びＩＧ’’は、同じ又は異なって、それぞれ式ＩＧの基を示す。
【０１４８】
Ｎｕ’は好ましくは、−ＯＨ、−ＳＨ及び−ＮＨ２基から選択される。
【０１４９】
Ｃｙｃは好ましくは、基
【０１５０】
【化１０】
2013501766.tif 000012
【０１５１】
及び
【０１５２】
【化１１】
2013501766.tif 000013
【０１５３】
から選択される。
【０１５４】
Ｈａｌは好ましくは塩素原子である。
【０１５５】
ＡＨは好ましくは、少なくとも１個のフッ素原子で置換されたフェニル基である。
【０１５６】
光反応性基は、好ましくは以下から選択される：
（ａ）少なくとも１個の式−Ｎ３の基によって置換されており、１個以上のハロゲン原子によって更に置換されていてもよい、Ｃ６−１０アリール基；
（ｂ）ベンゾフェノン基；
（ｃ）式−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｎ２）ＣＦ３の基；及び
（ｄ）式−ＰｈＣ（Ｎ２）ＣＦ３の基（式中、Ｐｈはフェニル基を示す）。
【０１５７】
ｎは好ましくは１又は２であり、最も好ましくは１である。
【０１５８】
ＩＧは好ましくは、非置換のＣ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基又はＣ２−６アルキニル基である部分を示し、式中、（ａ）０又は１個の炭素原子は、フェニレン、５〜６員のヘテロアリーレン、Ｃ５−６カルボシクリレン及び５〜６員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されており、該フェニレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにＣ１−４アルキル及びＣ１−４アルコキシ基から選択される１又は２個の置換基によって置換されており、かつ（ｂ）０、１又は２個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−及び−Ｃ（Ｏ）−基から選択される基によって置換されている。
【０１５９】
より好ましくは、ＩＧは、非置換のＣ１−６アルキル基である部分を示し、式中、（ａ）０又は１個の炭素原子は、非置換のフェニレン、５〜６員のヘテロアリーレン、Ｃ５−６カルボシクリレン及び５〜６員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されている。
【０１６０】
最も好ましくは、ＩＧは、非置換のＣ１−６アルキル基を示す。
【０１６１】
好ましくは、式（ＩＩ）の生成物は、式（ＩＩａ）の生成物：
【０１６２】
【化１２】
2013501766.tif 000014
【０１６３】
であり、式中、Ｘ、Ｘ’、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３３’は全て、本明細書中に記載したとおりである。
【０１６４】
式（ＩＩ）の生成物において、特に好ましくは、
Ｘ及びＸ’はそれぞれ酸素を示し；
Ｒ１は以下を示し：
（ｉ）ハロゲン原子；又は
（ｉｉ）チオール部分を有し、該チオール部分の硫黄原子を介して式（ＩＩ）の２位に結合している、固体基材；又は
（ｉｉｉ）−Ｓ−Ｆ１；
Ｒ２は、水素若しくはハロゲン原子、固体基材、Ｆ３又はＣ１−６アルキル基を示し；
Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３’）の基を形成し、Ｒ３３’は、水素原子、固体基材、Ｆ３又はＣ１−６アルキル基を示し；
−Ｓ１−Ｆ１及びＦ３は、同じ又は異なって、検出可能部分、酵素活性部分、アフィニティタグ、ハプテン、免疫原性担体、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド又はリガンド候補、生物活性部分、リポソーム、ポリマー部分、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、細胞、炭水化物、ＤＮＡ及びＲＮＡから選択される機能的部分を示し；
ただし、該生成物は、１つの固体基材及び少なくとも１個の機能的部分を含む。
【０１６５】
好ましい実施形態において、式（ＩＩ）の生成物は、１個の機能的部分−Ｓ−Ｆ１、Ｆ２又はＦ３を含み、この機能的部分は好ましくは、機能的部分−Ｓ−Ｆ１である。
【０１６６】
特に好ましい実施形態において、式（ＩＩ）の生成物中、Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３’）の基を形成し、Ｒ３３’は固体基材を示す。
【０１６７】
好ましくは、固体基材又は少なくとも１個の機能的部分のいずれかが、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）の２位に結合する。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、本発明の生成物がマレイミド環を含むことが理解されるであろう。具体的には、これは、式（Ｉ）の部分において、１位及び４位の炭素原子が基−Ｎ（Ｒ３３’）−を介して一緒に連結される場合に起こる。この場合、本発明はさらに、本発明の生成物中のマレイミド環の開環をもたらす工程を含むプロセスを提供する。マレイミド環の開環は、当該分野で公知の加水分解反応によってもたらされ得る。マレイミドの開環をもたらすことは、機能的部分及び／又は固体基材をコンジュゲートに不可逆的に結合させることができるので、特定の適用で有利な場合がある。
【０１６９】
本発明の生成物は、式（ＩＩＩ）の部分を含む化合物である試薬を使用して、得ることができる：
【０１７０】
【化１３】
2013501766.tif 000015
【０１７１】
式中、
Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＱの基を示し、Ｑは、水素、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル又はフェニルであり；
Ｙは求電子性脱離基である。
【０１７２】
明らかに、本発明の生成物を産生するためのプロセスの正確な詳細は、所望の生成物の性質に依存する。
【０１７３】
式（ＩＩＩ）の部分が機能的部分を既に含んでいる場合、式（ＩＩＩ）の部分を含む試薬は、生成物を得るために固体基材と直接反応させることができる。従って、このプロセスは、固体基材を式（ＩＩＩ）の部分を含む化合物と反応させて、（ａ）固体基材及び（ｂ）それに連結された式（Ｉ）の部分を含む生成物を得る工程を含み、以下のいずれかである：
（ｉ）Ｒは、求電子性脱離基Ｙを示し、固体基材は、式（Ｉ）の１位、３位又は４位に連結されており、機能的部分が、式（Ｉ）の１位、３位又は４位に連結されている；又は
（ｉｉ）固体基材はチオール部分を有し、Ｒは、該チオール部分の硫黄原子への結合を示し、機能的部分が、式（Ｉ）の１位、３位又は４位に連結されている。
【０１７４】
所望の生成物が、式（Ｉ）の１位、３位又は４位に連結された固体基材を有する場合、その反応は、固体基材上の反応性基を、式（ＩＩＩ）の１位、３位又は４位に連結された反応性基と反応させることによって、実施される。固体基材は、化学的に活性化された固体基材（例えば、それ自体が反応性基を有するリンカー部分を有する固体基材）であり得る。次いで、その反応性基は、直接又はさらなるリンカー基（例えば、本明細書中に記載されるリンカー基）を介してのいずれかで、式（Ｉ）の１位、３位又は４位に結合され得る。例えば、活性化ガラス基材（例えば、それ自体が別の反応性基を有するアルコキシシラン保有リンカー化合物で処理されたガラス基材）が、固体基材として使用され得る。或いは、固体基材は、式（ＩＩＩ）の１位、３位又は４位に連結された適切な反応性基と直接反応できる表面基を含むだけでよい。例えば、ガラス基材は、アルコキシシラン保有反応性基が式（ＩＩＩ）の１位、３位又は４位に連結されると、式（ＩＩＩ）の部分を含む試薬と直接反応できる。なおさらなる代替法では、固体基材及び式（ＩＩＩ）の部分のそれぞれが、アフィニティタグ及びそのそれぞれのアフィニティパートナーのうち一方を保有し、この反応は、そのアフィニティパートナーへのアフィニティタグの結合を含む。
【０１７５】
所望の生成物が、チオール部分を有する固体基材を含み、該チオール部分の硫黄原子が式（Ｉ）の２位に結合している場合、実施される反応は、固体基材上のチオール基に式（ＩＩＩ）の２位を攻撃させ、従って求電子性脱離基Ｙを置換させることを含む。固体基材上のチオール部分は、特定の実施形態において、表面上に元々存在していてもよい（例えば、固体基材が、末端チオール基を有するポリマーを含むポリマー基材である場合）。或いは、チオール基は、固体基材を適切なクロスリンカー試薬で活性化することによって、容易に供給できる。例えば、ガラス基材は、アルコキシシラン末端（ガラス表面と反応する）及びチオール末端の両方を含むクロスリンカーを使用して、活性化できる。従って、具体的な例では、固体基材は、チオール含有リンカーに結合したガラス表面であるだろう。
【０１７６】
式（ＩＩＩ）の部分が機能的部分をまだ保有していない場合、これは、最初に固体基材と、二番目に機能的部分と、又は最初に機能的部分と、二番目に固体基材と、又は固体基材及び機能的部分の両方と同時に、反応させることができる。明らかに、固体基材、機能的部分及び試薬の具体的選択が、反応を実施する最適な方法を決定し得る。かかる検討事項は、当業者の技術範囲内である。
【０１７７】
１つの例示的な産生プロセスは、以下を含む：
ａ）固体基材を式（ＩＩＩ）の部分を含む化合物と反応させて、（ａ）固体基材及び（ｂ）それに連結した式（Ｉ）の部分を含む生成物を得る工程であって、以下のいずれかである：
（ｉ）Ｒは、求電子性脱離基Ｙを示し、固体基材は、式（Ｉ）の１位、３位又は４位に連結されている；又は
（ｉｉ）固体基材はチオール部分を有し、Ｒは、該チオール部分の硫黄原子への結合を示す、
工程；及び
ｂ）該生成物を機能的部分と反応させる工程。
【０１７８】
第二の例示的産生プロセスは、以下を含む：
ａ）機能的部分を式（ＩＩＩ）の部分を含む化合物と反応させる工程；及び
ｂ）工程ａ）で得られた化合物を固体基材と反応させて、本発明の生成物を得る工程。
【０１７９】
明らかに、上記第一及び第二の例示的産生プロセスの両方において、式（ＩＩＩ）の部分を含む化合物は、１位、３位又は４位に連結した少なくとも１個の反応性基を有さなければならない。これにより、固体基材及び機能的部分の両方が適応してコンジュゲート生成物になれることが確実になる。
【０１８０】
好ましくは、式（ＩＩＩ）の部分を含む化合物は、式（ＩＶ）の化合物：
【０１８１】
【化１４】
2013501766.tif 000016
【０１８２】
であり、式中、
Ｒ２ａは、水素原子、Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ’）ｎ又はＩＧを示し；
以下のいずれかであり：
Ｒ３ａ及びＲ３ａ’は、同じ又は異なって、それぞれ水素原子、Ｅ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ’）ｎ又はＩＧを示す；又は
Ｒ３ａ及びＲ３ａ’は一緒になって、式−Ｏ−又は−Ｎ（Ｒ３３ａ’）−の基を形成し、Ｒ３３ａ’は、水素原子、Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ’）ｎ又はＩＧを示す；又は
Ｒ３ａ及びＲ３ａ’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３ａ’）−Ｎ（Ｒ３３ａ’）−の基を形成し、各Ｒ３３ａ’は、同じ又は異なって、水素原子、Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ’）ｎ又はＩＧを示す；
Ｚ’は、Ｚ又は式−Ｓｉ（Ｏ（Ｃ１−６アルキル）（Ｇ１）（Ｇ２）の基を示し、Ｇ１及びＧ２は、同じ又は異なって、Ｈ、Ｃ１−６アルキル又はＯ（Ｃ１−６アルキル）を示し；
Ｘ、Ｘ’、Ｙ、Ｎｕ、Ｌ、Ｚ、ｎ、ＩＧ及びＥは全て、本明細書中に記載したとおりである。
【０１８３】
好ましくは、Ｒ３ａ及びＲ３ａ’は、同じ又は異なって、それぞれ水素原子、Ｅ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ’）ｎ又はＩＧを示すか；或いはＲ３ａ及びＲ３ａ’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３ａ’）−の基を形成し、Ｒ３３ａ’は水素原子、Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ’）ｎ又はＩＧを示す。
【０１８４】
式−Ｓｉ（Ｏ（Ｃ１−６アルキル）（Ｇ１）（Ｇ２）の基はアルコキシシラン基であり、ガラス基材、マイカ基材、シリカ基材及びシリコン基材などの基材を活性化するための優れた反応性基であることが知られている。従って、典型的には、式（ＩＶ）の化合物が、ガラス基材、マイカ基材、シリカ基材又はシリコン基材と反応する又はそれらに結合することが意図される場合、式−Ｓｉ（Ｏ（Ｃ１−６アルキル）（Ｇ１）（Ｇ２）の基が式（ＩＶ）の化合物に導入される。典型的には、１個以下のかかる基が、式（ＩＶ）の化合物上に存在する。好ましくは、式−Ｓｉ（Ｏ（Ｃ１−６アルキル）（Ｇ１）（Ｇ２）の基は、式−Ｓｉ（Ｏ（Ｃ１−４アルキル）（Ｇ１）（Ｇ２）の基であり、式中、Ｇ１及びＧ２は、同じ又は異なって、Ｃ１−４アルキル又はＯ（Ｃ１−４アルキル）を示し、より好ましくはＯ（Ｃ１−４アルキル）を示す。例示的な式−Ｓｉ（Ｏ（Ｃ１−６アルキル）（Ｇ１）（Ｇ２）の基は、−Ｓｉ（ＯＥｔ）３、−Ｓｉ（ＯＥｔ）２（ＯＭｅ）、−Ｓｉ（ＯＥｔ）（ＯＭｅ）２及び−Ｓｉ（ＯＭｅ）３であり、−Ｓｉ（ＯＥｔ）３及び−Ｓｉ（ＯＭｅ）３が特に好ましい。
【０１８５】
さらなる実施形態において、本発明は、機能的部分に固体基材を連結するための試薬としての、式（ＩＩＩ）の部分を含む化合物の使用に関する。この使用は、当業者が本発明の生成物を得るのを可能にする。この使用は、典型的には、式（ＩＩＩ）の部分を含む化合物を、（ａ）固体基材及び（ｂ）機能的部分と反応させて、機能的部分を含む本発明の生成物を得るプロセスを含む。例えば、この使用は、本発明の生成物を得るために本明細書中に記載される産生プロセスを実施することを含み得る。本発明の使用において、式（ＩＩＩ）の部分を含む化合物は、好ましくは式（ＩＶ）の化合物である。
【０１８６】
代替的実施形態において、この使用は、その代わりに、アルケン部分を含む機能的部分又は固体基材のいずれかが、式（ＩＩＩ）の部分の２位と３位との間の炭素−炭素二重結合との光触媒的［２＋２］環化付加に参加することによって、式（ＩＩＩ）の部分に結合される工程を含み得る。この手順は、式（ＩＩＩ）の部分由来の２−炭素原子及び３−炭素原子を含むシクロブタン環部分を生じ、環中、炭素−炭素二重結合は飽和されている。
【０１８７】
なおさらなる実施形態において、Ｒ３ａ及びＲ３ａ’が一緒になって式−Ｏ−の基を形成し、固体基材又は機能的部分が求核基（例えば、第一級又は第二級アミン基）を保有する場合、この求核基は、求核開環反応及び次いで求核閉環反応に参加することによって、式（ＩＶ）の部分に連結し得る。例えば、Ｘ及び／又はＸ’がＯであり、Ｒ３ａ及びＲ３ａ’が一緒になって式−Ｏ−の基を形成する場合、式（ＩＶ）の部分は環式酸無水物である。従って、アミン基などの求核基は、求核開環及び次いで求核閉環に参加し得、基−Ｏ−が求核基によって置換されるという全体的効果が生じることが理解できる。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、本発明の使用は、マレイミド環を含む生成物を産生することが理解されよう。この場合、本発明の使用は、マレイミド環の開環をもたらすことをさらに含み得る。マレイミド環の開環は、当該分野で公知の加水分解反応によってもたらされ得る。マレイミドの開環をもたらすことは、機能的部分及び／又は固体基材をコンジュゲートに不可逆的に結合させることができるので、特定の適用で有利な場合がある。
【０１８９】
当業者が理解するように、試薬（例えば、機能的部分を保有する化合物又はクロスリンカー試薬）が１個より多い反応性基を保有する場合、反応に関与することが意図されない反応性基の化学的保護をもたらすことが望ましい場合がある。例えば、基（例えば、ヒドロキシル、アミノ及びカルボキシ基）が最終生成物中に望まれる場合、これらの基を保護して、反応への望ましくない関与を回避することが必要な場合がある（例えば、Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．，「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９９を参照のこと）。従来の保護基が標準的な慣例と合わせて使用され得る。ある場合には、脱保護は、本明細書中に記載される産生プロセス及び使用において、中間又は最終の工程で使用され得る。
【０１９０】
本発明の生成物が、式（Ｉ）（又は式（ＩＩ））の２位に結合した固体基材又は機能的部分のいずれかを有する場合、その位置のチオール結合は、それぞれ固体基材又は機能的部分を放出するために、容易に切断できる。従って本発明は、このチオール結合を切断することを含むプロセスもまた提供する。
【０１９１】
切断は、不飽和炭素中心でチオール結合を切断するための慣用的な方法を使用して、特に、電子不足型アルケンに結合したチオールを切断するための慣用的な方法を使用して、もたらすことができる。従って、好ましくはこの切断は、Ｍｉｃｈａｅｌ反応において求核剤として作用できる試薬と共に生成物をインキュベートすることによってもたらされる。Ｍｉｃｈａｅｌ反応において求核剤として作用できることが周知の試薬の例としては、ホスフィン化合物、亜リン酸塩化合物、チオール、セレノール、アミン及びソフトカーボン求核化合物が挙げられる。ホスフィン化合物及び亜リン酸塩化合物は共に、３価のリン原子を含む。ホスフィンでは、このリン原子は水素又は炭素原子に結合されるが、亜リン酸塩では、このリン原子は酸素原子に結合される（炭素原子及び酸素原子自体は、それぞれの化合物中の他の基にさらに結合されることが理解される）。チオールは、チオール基−ＳＨを含む有機化合物である。セレノールは、−ＳｅＨ基を含む有機化合物である。アミンは、アミン官能基を含む化合物である。ソフトカーボン求核剤は、ソフトな求核炭素中心を含む化合物である。例示的なソフトカーボン求核剤は、米国特許第５，４１４，０７４号に開示されており、その内容は、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる。当業者であれば当然、慣用として、例えば、本明細書中に記載される試薬のクラスの例示的リストのなかから適切な試薬を慣用的に選択することによって、Ｍｉｃｈａｅｌ反応において求核剤として作用できる適切な試薬を選択することができるであろう。
【０１９２】
疑義を回避するために、本明細書中で使用する場合、用語「Ｍｉｃｈａｅｌ反応において求核剤として作用できる試薬」とは、化合物中のα，β−不飽和部分、特に式（ＩＶ）の部分
【０１９３】
【化１５】
2013501766.tif 000017
【０１９４】
と反応できる試薬を意味し、式中、Ｘは本明細書中に記載したとおりである。かかる試薬は、ある場合には「コンジュゲート付加反応において求核剤として作用できる試薬」としても知られる。明らかに、これらの試薬は、求核炭素中心を介して反応する試薬（例えば、ソフトカーボン求核剤）に限定されず、求核非炭素中心を介して反応する試薬（例えば、本明細書中に記載される例示的試薬）も含む。
【０１９５】
本明細書中で好ましい試薬は、ホスフィン化合物及びチオールである。特に好ましいホスフィンは、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンであり、これは、「ＴＣＥＰ」としても知られ、化合物（例えばタンパク質）中のジスルフィド結合を還元するために、当該分野において一般に使用される。トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンはまた、その塩酸塩などの塩の形態でも供給され得る。特に好ましいチオールはグルタチオンである。さらに好ましいチオールは、２−メルカプトエタノール及びジチオスレイトール（即ち、ＨＳＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＳＨ、ＤＴＴとして一般に知られる）である。試薬の好ましい群は、１，２−エタンジチオール、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、グルタチオン及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンである。
【０１９６】
典型的には、生成物が、チオール部分を含む固体基材がそのチオール部分の硫黄原子を介して式（Ｉ）の２位に結合した生成物である場合、チオール結合を切断する工程が固体基材を生じる。典型的には、生成物が、基−Ｓ−Ｆ１又は−Ｓ−Ｌ−Ｆ２が（Ｉ）の２位に結合した生成物である場合、チオール結合を切断する工程は、式ＨＳ−Ｆ１又はＨＳ−Ｌ−Ｆ２の機能的化合物を生じる。好ましい実施形態において、この生成物は、基−Ｓ−Ｆ１又は−Ｓ−Ｌ−Ｆ２が（Ｉ）の２位に結合した生成物である。
【０１９７】
さらなる実施形態において、本発明は、式（Ｖａ）又は（Ｖｂ）の生成物もまた提供する。固体基材及び少なくとも１個の機能的部分を含むので、これらの生成物は、コンジュゲート分子を構成することが理解されよう。さらに、これらの生成物は、２位と３位との間に炭素−炭素二重結合ではなく炭素−炭素単結合を含む。しかしながら、例えば従来のマレイミド試薬を使用して調製できる生成物とは異なり、式（Ｖａ）及び（Ｖｂ）の化合物は、２位及び３位に固体基材及び機能的部分の少なくともいずれかを含むか、又は２位及び３位に少なくとも２個の機能的部分を含む（当業者が認識するように、従来のマレイミド試薬は、単一のチオール含有の固体基材又は機能的部分と反応できるに過ぎず、２位と３位との間の二重結合に付加する）。
【０１９８】
式（Ｖａ）及び（Ｖｂ）の生成物は、簡単な方法を使用して調製できる。第一の方法では、式（Ｖａ）及び（Ｖｂ）の生成物は、式（Ｉ）の部分及び式（Ｉ）の２位に結合した固体基材又は機能的部分のいずれかを含むが３位に機能的部分を含まない、本発明の生成物から調製される。その場合、式（Ｖａ）及び（Ｖｂ）の生成物は、式（Ｉ）の２位と３位との間の炭素−炭素二重結合への、それぞれ機能的部分Ｆ３又は固体基材の求電子付加反応によって調製できる。第二の方法では、式（Ｖａ）及び（Ｖｂ）の生成物は、式（Ｉ）の部分及び式（Ｉ）の２位及び３位の両方に結合した固体基材又は機能的部分のいずれかを含む、本発明の生成物から調製される。その場合、式（Ｖａ）及び（Ｖｂ）の生成物は、二重結合を飽和するための求電子付加反応を実施することによって調製できる。この求電子付加反応は、さらなる機能的部分又は固体基材（例えば、チオールを含有するさらなる機能的部分又はチオール含有固体基材）の付加を含み得る。或いは、これは、不飽和の炭素−炭素中心において求電子付加反応を実施するために慣用的に使用される任意の他の試薬を含み得る。例えば、この試薬は、ハロゲン化水素、ジハロゲン、硫酸、水、アルコール、Ｈ２Ｓ、メルカプタン又はカルボン酸であり得る。
【０１９９】
特定の試薬に属する基が２位と３位との間の二重結合に付加する位置は、それぞれの試薬の正確な構造及び反応が実施される反応条件に依存することが理解されよう。例えば、付加の位置は通常、Ｍａｒｋｏｖｎｉｋｏｖ則に従って最も安定なカチオン性中間体が形成できるようなものになると予測され得る。当業者であれば、特定の位置が二重結合への特定の基の付加に望ましい場合に、反応条件の慣用的選択及びそれぞれの試薬上の種々の基の正体が、かかる位置選択性を達成可能であり得ることを理解するであろう。
【０２００】
当業者に明らかなように、本発明の方法論は、固体基材への機能的部分のコンジュゲート化を含む公知の生成物、プロセス及び方法に広く適用可能である。典型的には、このタイプの従来の生成物、プロセス及び方法は、固体基材及び機能的分子を一緒に連結する架橋分子上の従来公知のチオール反応性基（例えばマレイミド基又はヨードアセチル基）を、本発明の式（ＩＩＩ）の部分によって置換することによって、簡単に改変することができる。
【０２０１】
かかる慣用の生成物、プロセス及び方法の例としては、アレイ製品及び関連の多重アッセイ、ＥＬＩＳＡ法などの検出方法、プルダウンアッセイを含むアフィニティ精製技術、及び固相ペプチド若しくはオリゴヌクレオチド合成が挙げられる。
【０２０２】
従って本発明は、アレイに整列された、本発明の複数の生成物もまた提供する。本明細書中で使用する場合、「アレイに整列された複数の生成物」とは、典型的に、複数の領域（そのそれぞれが本発明の生成物として同定され得る）を有する単一の連続アレイを意味する。従って、典型的には複数の生成物のそれぞれが、単一のアレイ固体基材の一部を形成する固体基材を含む。しかしながら、複数の生成物のそれぞれは、式（Ｉ）の別個の部分を含む。
【０２０３】
好ましくは、本発明の複数の生成物において、各生成物は、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド又はリガンド候補、ペプチド、タンパク質、細胞、ＤＮＡ及びＲＮＡから選択される機能的部分を含む。
【０２０４】
より好ましくは、複数の生成物において、
（ａ）各生成物は異なる抗体又は抗体断片を含む；又は
（ｂ）各生成物は異なる抗原を含む；又は
（ｃ）各生成物は異なるリガンド又はリガンド候補を含む；又は
（ｄ）各生成物は異なるペプチドを含む；又は
（ｅ）各生成物は異なるタンパク質を含む；又は
（ｆ）各生成物は異なる細胞を含む；又は
（ｇ）各生成物は異なるＤＮＡを含む；又は
（ｈ）各生成物は異なるＲＮＡを含む。
【０２０５】
本発明のアレイシステムは、特定の機能的部分（及び特に、上記（ａ）〜（ｈ）に列挙されたものなどの特定の機能的部分）と相互作用するその能力について試験物質がアッセイされる方法に適用するのに有用であり得る。従って本発明は、試験物質を含むサンプルが本発明の複数の生成物であるアレイと共にインキュベートされるアッセイプロセスもまた提供する。次にこのプロセスは、試験物質のいずれかが、複数の生成物のいずれかと結合しているか否かを検出する工程を含む。一般的な検出ストラテジーは、例えばフルオロフォアで標的物質を標識することを使用する。他の検出ストラテジーとしては、熱量測定検出、化学発光検出及び表面プラズモン共鳴検出が挙げられる。
【０２０６】
このタイプのアッセイはしばしば、「多重アッセイ」として知られる。なぜなら、これらは、複数の別個のアッセイ（即ち、試験物質が本発明の単一の生成物と相互作用するか否かを検出するために実施されるアッセイ）を、単一の実験的試験へと組合わせるからである。かかるアッセイは、マイクロアッセイと一般に呼ばれることもあるが、アレイの物理的規模及び本発明のアッセイ技術に対しては何の制限もないことが強調される。例えば、単一のアレイ基材上の複数のタンパク質、ＤＮＡ又はＲＮＡの固定化を含む多数のアレイシステムが周知であり、市販されている。より小さい分子（例えば、基礎研究目的又は応用治療目的の両方のリガンド候補種）を含むアレイもまた、例えばＵｔｔａｍｃｈａｎｄａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００５，９：４−１３）（この内容は、本明細書中で参照によりその全体が組み込まれる）で概説されるように、当該分野で現在一般に知られている。当業者であれば、本発明の技術が、これら公知のシステムを改変するために慣用的に適用され得ることを即座に理解するであろう。
【０２０７】
本発明の技術を本明細書中に記載したようなアレイアッセイに適用することの重要な利点は、クロスリンカーに対して形成されたチオール結合が、本明細書中に記載される方法を使用して容易に切断できるということである。クロスリンカーへのチオール結合が固体基材に結合した硫黄原子からなる場合、この可逆性により、アッセイを実施した後に固体基材が完全に再生されるようになる。クロスリンカーへのチオール結合が機能的部分に結合した硫黄原子（例えば、タンパク質のシステイン残基中の硫黄原子）からなる場合、その可逆性により、機能的部分自体がアレイから容易に切断されるようになる。これは、例えば特定の検出方法論において、又はアッセイが完了した後に価値ある機能的部分を回収するために、有利であり得る。
【０２０８】
本発明はまた、抗体又は抗原を含む本発明の生成物を使用する、検出プロセスを提供する。この生成物はサンプルとインキュベートされ、抗体又は抗原に結合していない任意の材料が除去される。未結合の材料の除去は、例えば、当該分野で慣用的に使用される洗浄技術を使用して、実施できる。最後に、抗体又は抗原に結合したままの任意の物質が、例えば、発色性又は蛍光発生性の標識を使用して、検出される。
【０２０９】
本発明の好ましい実施形態において、検出プロセスはＥＬＩＳＡアッセイである。ＥＬＩＳＡアッセイの例は、間接的ＥＬＩＳＡ、サンドイッチ（又は「捕捉（ｃａｐｔｕｒｅ）」）ＥＬＩＳＡ、競合的ＥＬＩＳＡ及び逆（ｒｅｖｅｒｓｅ）ＥＬＩＳＡである。これらのアッセイプロセスは全て、慣用的なイムノアッセイプロセスであり、当業者に知られている。
【０２１０】
典型的には、ＥＬＩＳＡプロセスでは、検出工程は、酵素を含むコンジュゲート化合物及び抗体又は抗原に結合した物質に特異的に結合し得る抗体を添加することによって、また、酵素によって変換されると検出可能なシグナルを生成する（例えば、着色産物又は蛍光性産物を生じる）酵素基質を添加することによって、実施される。好ましい酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ及びグルコースオキシダーゼが挙げられる。
【０２１１】
本発明はまた、サンプルから特定の物質を精製するためのプロセスを提供する。このプロセスは、サンプルを、その物質に選択的に結合できる機能的部分を含む本発明の生成物と共にインキュベートする工程を含む。
【０２１２】
本明細書中で使用する場合、「物質に選択的に結合できる機能的部分」とは、他の物質に結合した任意の機能的部分を単離することを実質的に伴わずに、結合した機能的部分−物質実体がサンプルから単離されるのを可能にする、任意の他の物質（特に、関連する物質中に典型的に見出される任意の他の物質）への結合強度よりも十分に高い強度で、機能的部分がその物質に結合することを意味する。
【０２１３】
本発明での使用に適した機能的部分としては、特定の物質が対応するアフィニティパートナー又はアフィニティタグを含む場合にはアフィニティタグ又はアフィニティパートナーが、特定の物質が酵素基質である場合には酵素が、物質が対応する抗原である場合には抗体が、挙げられる。
【０２１４】
特定の物質を精製するためのプロセスは、機能的部分に結合していない任意の材料を除去する工程をさらに含む。未結合の材料の除去は、例えば、当該分野で慣用的に使用される洗浄技術を使用して、実施できる。最後に、物質は、慣用の溶出技術を使用して生成物から分離される。
【０２１５】
好ましい実施形態において、特定の物質は、バイト（ｂａｉｔ）物質Ｓｂを構成し、サンプルは、Ｓｂに結合できる１種以上のプレイ（ｐｒｅｙ）物質Ｓｐをさらに含んでいてもよい。当業者が理解するように、この特定の実施形態は、当該分野で「プルダウンアッセイ」として一般に知られるプロセスを構成する。プルダウンアッセイは、それら（プレイ）が結合する別の物質（バイト）を精製することによって、物質（プレイ）を間接的に精製するために慣用的に使用される。好ましくは、バイト物質はタンパク質であり、プレイ物質もタンパク質である。
【０２１６】
別の実施形態では、本発明は、ペプチド又はタンパク質を産生するためのプロセスに関する。このプロセスは、本発明の生成物にアミノ酸を結合させ、次いでそのアミノ酸に１個以上のさらなるアミノ酸を結合させて、固体基材に連結されたペプチド又はタンパク質部分を産生する工程を含む。最後に、ペプチド又はタンパク質部分は固体基材から切断される。
【０２１７】
固相合成の技術又はペプチド及びタンパク質は、当該分野で周知である。広範な反応性基で活性化された多数の固相支持体が、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈなどから市販されている。従って、当業者には、ペプチド又はタンパク質を産生するためのプロセスを実施するために本発明の方法論を適用するにあたり、何らの困難もないであろう。ペプチドを合成するために当該分野で現在使用されている種々の慣用技術を考察した１つの一般的な参考教科書は、「Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｊｏｈｎ  Ｊｏｎｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９２）（その内容は、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）である。
【０２１８】
特に好ましい実施形態において、このプロセスで使用される本発明の生成物は、（ａ）式（Ｉ）の２位に求電子性脱離基Ｙを有する生成物又は（ｂ）式（Ｉ）の２位にアミノ酸システインを有する生成物（このシステインは、硫黄原子を介して２位に結合している）である。生成物が２位に求電子性脱離基Ｙを有する場合、生成物に結合されるアミノ酸は、典型的には、求電子性脱離基Ｙを置換することによって２位に結合するシステイン原子である。次いで、１個以上のさらなるアミノ酸が、慣用の固相ペプチド合成反応方法論を使用して、固定化されたシステイン残基に結合される。
【０２１９】
当業者が即座に理解するように、この様式で固定化されたシステイン残基からペプチド又はタンパク質の鎖を成長させることに関連する顕著な利点は、最終的なペプチド又はタンパク質が、本明細書中に記載される切断プロセスを使用して、固体支持体から非常に容易に切断できるということである。
【０２２０】
本発明はさらに、（ａ）機能的部分及び（ｂ）それに連結された固体基材を有する式（ＶＩ）の部分を含む生成物を提供する：
【０２２１】
【化１６】
2013501766.tif 000018
【０２２２】
式中、
Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＱの基を示し、Ｑは、水素、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル又はフェニルであり；
機能的部分は、検出可能部分、酵素活性部分、アフィニティタグ、ハプテン、免疫原性担体、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド、生物活性部分、リポソーム、ポリマー部分、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、細胞、炭水化物、ＤＮＡ及びＲＮＡから選択される。
【０２２３】
この生成物は、典型的には１つの固体基材を含む。
【０２２４】
好ましくは、以下のいずれかである：
機能的部分はチオール部分を有し、そのチオール部分の硫黄原子を介して式（ＶＩ）の部分の２位に連結されており、固体基材は、式（ＶＩ）の部分の５位又は６位のいずれかに結合している；又は
固体基材はチオール部分を有し、そのチオール部分の硫黄原子を介して式（ＶＩ）の部分の２位に連結されており、機能的部分は、式（ＶＩ）の部分の５位又は６位のいずれかに結合している。
【０２２５】
好ましくは、固体基材が、式（ＶＩ）の部分の５位又は６位のいずれかに結合している。
【０２２６】
この生成物は、１個以上の機能的部分を含み得、その場合、各機能的部分は、検出可能部分、酵素活性部分、アフィニティタグ、ハプテン、免疫原性担体、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド、生物活性部分、リポソーム、ポリマー部分、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、細胞、炭水化物、ＤＮＡ及びＲＮＡから独立して選択される。
【０２２７】
この生成物を産生するための１つのプロセスは、以下を含む：
式（ＩＩＩ）の部分を含む化合物を、チオールを有する固体基材又は機能的部分と反応させて、式（ＩＩＩ）の部分中の求電子性脱離基Ｙがその固体基材又は機能的部分で置換された中間体生成物を得る工程（連結は、このチオール基を介したものである）；及び
この中間体生成物を、アルケン部分を含む機能的部分又は固体基材と反応させて、該アルケン部分と、中間体生成物の２位と３位との間の炭素−炭素二重結合との間の光触媒的［２＋２］環化付加反応をもたらす工程。
【０２２８】
好ましくは、（ａ）機能的部分及び（ｂ）それに連結された固体基材を有する式（ＶＩ）の部分を含む生成物は、式（ＶＩａ）を有する：
【０２２９】
【化１７】
2013501766.tif 000019
【０２３０】
Ｘ、Ｘ’、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ３’はそれぞれ、式（ＩＩ）の生成物に関連して記載されたとおりであり；
Ｒａｌｋ１、Ｒａｌｋ２、Ｒａｌｋ３及びＲａｌｋ４のそれぞれは、同じ又は異なって、式（ＩＩ）の生成物に関連して記載されたとおりの式Ｒ２の基であり；
各機能的部分は、同じ又は異なって、検出可能部分、酵素活性部分、アフィニティタグ、ハプテン、免疫原性担体、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド、生物活性部分、リポソーム、ポリマー部分、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、細胞、炭水化物、ＤＮＡ及びＲＮＡから選択され；
ただし、該生成物は、１つの固体基材及び少なくとも１個の機能的部分を含む。
【０２３１】
好ましくは、Ｒａｌｋ１、Ｒａｌｋ２、Ｒａｌｋ３及びＲａｌｋ４のうち１個は、Ｓｏｌ又は−Ｌ−Ｓｏｌを示し、好ましくはＲ１は、−Ｓ−Ｆ１又は−Ｓ−Ｌ−Ｆ２を示す。
【実施例】
【０２３２】
以下の実施例は、本発明の根底をなす科学原理を説明する。実施例の多くは、固体基材への機能的部分の連結を含まないため、参考例である。しかしながら、広範な機能的部分及び連結基について、タンパク質などの多数の大きい機能的部分を含む二次的部分への機能的部分の連結が実証されており、本発明の広い適用可能性を証明している。
【０２３３】
Ａ）予備的実施例
１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、１Ｈについては５００ＭＨｚ、１３Ｃについては１２５ＭＨｚの周波数で作動するＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ５００機器で、室温で記録した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、ＣＤＣｌ３（７．２６ｐｐｍ）シグナルを参照とした。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、ＣＤＣｌ３（７７．６７ｐｐｍ）シグナルを参照とした。
赤外線スペクトルは、センチメートルの逆数（ｃｍ−１）で与えられる周波数で、ＡＴＲモードで作動するＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  １００  ＦＴ−ＩＲスペクトロメータで実行した。
質量スペクトル及び高分解能質量データは、ＶＧ７０−ＳＥ質量分析計（ＥＩモード及びＣＩモード）で記録した。
融点（ｍ．ｐ．）はＧａｌｌｅｎｋａｍｐ加熱ブロックで取得したものであり、未補正である。
旋光度測定は、１０ｃｍのセル長さでＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ３４３旋光計を使用して実施した。
【０２３４】
略号
Ｂｏｃ                Ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基
Ｃｙｓ                システイン
Ｍａｌ                マレイミド
ＤＭＦ                ジメチルホルムアミド
ＴＣＥＰ              （トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）
ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ    液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化質量分析
【０２３５】
参考例１：ブロモマレイミド（化合物１）の調製
【０２３６】
【化１８】
2013501766.tif 000020
【０２３７】
クロロホルム（１５ｍＬ）中のマレイミド（２．００ｇ、０．０２ｍｏｌ）に、クロロホルム（１５ｍＬ）の臭素（１．１６ｍＬ、０．０２ｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を２時間還流し、１時間かけて室温まで冷却した。固体の黄色沈殿物を濾去し、冷クロロホルム（２ｘ５０ｍＬ）で洗浄して、粗製２，３−ジブロモスクシンイミド（４．０９ｇ、０．０１６ｍｏｌ）の白色結晶を得た。粗製スクシンイミドをテトラヒドロフラン（５０ｍＬ）中に溶解し、テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中のトリエチルアミン（２．４ｍＬ、０．０１７ｍｏｌ）を、０℃で５分間かけて添加した。反応混合物を室温まで温め、４８時間撹拌した。固体を濾去し、テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）で洗浄して、淡黄色（ｐａｌｅ  ｙｅｌｌｏｗ）粉末（２．１４ｇ、０．０１２ｍｏｌ）を５９％の収率で得た。
1H NMR (500MHz, CDCl3): δ = 7.67 (br s, 1H, NH), 6.89 (s, 1H, C=CH); 13C NMR (125MHz, CDCl3): δ = 173.8 (C=O), 170.5 (C=O), 136.9 (-(Br)C=C-), 135.4 (-C=CH-); IR (固体, cm-1): 3235 (s), 1709 (s); MS (CI+) m/z, (%): 178 (81M+, 32), 176 (79M+, 32), 125 (25), 86 (100); C4H3O2N79Brについて計算した質量: 175.93472. 実測値: 175.93493; m.p. 148 - 151℃.   
【０２３８】
参考例２：Ｎ−メチルブロモマレイミド（化合物２）の調製
【０２３９】
【化１９】
2013501766.tif 000021
【０２４０】
メタノール（２２．５ｍＬ）中のＮ−メチルマレイミド（０．５ｇ、４．５ｍｍｏｌ）に、臭素（０．５２ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を室温で２４時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、反応塊をテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中に溶解し、トリエチルアミン（０．８ｍＬ、５．８５ｍｍｏｌ）を添加し、次いで室温で２４時間撹拌した。この物質をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル、７：３）で精製して、青白い（ｐａｌｅ  ｗｈｉｔｅ）粉末（０．７６１ｇ、４．０ｍｍｏｌ）を８９％の収率で得た。
1H NMR (500MHz, CDCl3): δ = 6.90 (s, 1H, C=CH), 3.09 (s, 3H, N-CH3); 13C NMR (125MHz, CDCl3): δ = 168.6 (C=O), 165.4 (C=O), 131.9 (-C=CH-), 131.4 ((Br)C=C-), 24.7 (-N-CH3); IR (固体, cm-1): 3106 (s), 1708 (s); MS (CI) m/z, (%):192 (81M+, 99), 190(79M+, 100);  C5H5O2N79Brについて計算した質量: 189.95037. 実測値: 189.95052; m.p: 77-79℃   
【０２４１】
参考例３：Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｍａｌ）−ＯＭｅ（化合物４）の調製
【０２４２】
【化２０】
2013501766.tif 000022
【０２４３】
Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ（化合物３）（３６ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（１３ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）のメタノール（３ｍＬ）中撹拌溶液に、メタノール（３ｍＬ）中のブロモマレイミド（３０ｍｇ、０．１６９ｍｍｏｌ）を添加した。１分後、溶媒を真空中で除去した。この物質をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル、９：１から７：３の勾配溶出）で精製して、淡黄色粉末（５１ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）を１００％の収率で得た。
1H NMR (500MHz, CDCl3): δ =7.63 (s, 1H, NH), 6.27 (s, 1H, C=CH), 5.40 (d, 1H, J = 6.8, NH), 4.67 (ddd, 1H, J = 6.8, 5.4及び5.1, -HN-CH-C(O)-), 3.80 (s, 3H, O-CH3), 3.48 (dd, 1H, J = 13.8及び5.1, -S-CHH-), 3.62 (dd, 1H, J = 14.1及び5.4, -S-CHH-) 1.45 (s, 9H, 3 x CH3); 13C NMR (125MHz, CDCl3): δ = 170.2 (C=O), 168.9 (C=O), 167.6 (C=O), 155.2 (C=O), 155.9 (-C=CH-), 119.7 (-C=CH-), 81.1 ((CH3)CO-), 53.3 (O-CH3), 52.7 (CH), 34.0 (CH2), 28.3 (3 x CH3); IR (固体, cm-1) 3236 (w), 1715 (s); MS (CI+) m/z, (%): 331 (M+H, 5), 275 (20), 231 (100); [C13H18O6N2S]+Hについて計算した質量: 331.09638. 実測値: 331.09684; 20αD: -41.9o (c = 1.0, メタノール); m.p. 145-147℃.
【０２４４】
参考例４：Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｎ−Ｍｅ−Ｍａｌ）−ＯＭｅ（化合物５）の調製
【０２４５】
【化２１】
2013501766.tif 000023
【０２４６】
Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ（３２ｍｇ、０．１３６ｍｍｏｌ）のメタノール（４ｍＬ）中撹拌溶液に、酢酸ナトリウム（８２ｍｇ、０．４０８ｍｍｏｌ）を添加した。メタノール（４ｍＬ）中のＮ−メチルブロモマレイミド（２５．８ｍｇ、０．１３６ｍｍｏｌ）を１０分間かけてこれに添加した。この反応は淡黄色（ｌｉｇｈｔ  ｙｅｌｌｏｗ）に変化した。溶媒を真空中で除去し、残渣をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル、９：１から７：３の勾配溶出）で精製して、青白い粉末（３９．３ｍｇ、０．１１４ｍｍｏｌ）を８４％の収率で得た。
1H NMR (500MHz, CDCl3): δ = 6.26 (s, 1H, C=CH), 5.36 (d, 1H, J = 6.3, NH), 4.66 (m, 1H, -HN-CH-), 3.79 (s, 3H, O-CH3), 3.46 (dd, 1H, J = 5.2及び5.0, -S-CHH-), 3.35 (dd, 1H, J = 13.7及び5.1, -S-CHH-), 3.00 (s, 3H, -N-CH3), 1.44 (s, 9H, 3 x CH3); 13C NMR (125MHz, CDCl3): δ = 170.2 (C=O), 169.5 (C=O), 167.9 (C=O), 155.0 (C=O), 149.9(-C=CH-), 118.7 (-C=CH-), 80.9 ((CH3)3CO-), 53.1 (O-CH3), 52.7 (CH), 33.8 (CH2), 28.3 (3 x CH3), 24.1 (-N-CH3); IR (固体, cm-1) 3367.8, 2977.1, 1694.7; MS (ES+) m/z, (%): 367(46), 311 (M, 100); C14H20N2O6NaSについて計算した質量: 367.0940. 実測値: 367.0931; 20αD: -18.55o (c = 1.0, メタノール); m.p. 101-103℃.
【０２４７】
参考例５：Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｓｕｃｃ）−ＯＭｅ（化合物６）の調製
【０２４８】
【化２２】
2013501766.tif 000024
【０２４９】
Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ（３６ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）のメタノール（３ｍＬ）中撹拌溶液に、メタノール（３ｍＬ）のマレイミド（１７ｍｇ、０．１６９ｍｍｏｌ）を添加した。１分後、溶媒を真空中で除去した。この物質をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール、９９：１から７：３の勾配溶出）で精製して、無色油状物（５１ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）を１００％の収率で得た。これは、ジアステレオマーの１：１混合物であった。
1H NMR (500MHz, CDCl3): δ =9.00 (s, 1H, NH), 8.95 (s, 1H, NH), 5.59 (1H, d, J = 7.6, NH),  5.41 (d, 1H, J = 7.6, NH), 4.65 - 4.56 (m, 2H, 2 x -HN-HC-C(O)-) C=CHH), 3.93 (dd, 1H, J = 9.3及び3.9,CH), 3.86 (dd, 1H, J = 9.2及び4.2, CH), 3.76 (s, 3H, OCH3), 3.76 (s, 3H, OCH3), 3.51 (dd, 1H, J = 13.8及び4.6, -CHH-), 3.36 (dd, 1H, J = 14.1及び6.0, -CHH-), 3.19-3.11 (m, 3H, 3 x -CHH-), 2.96 (dd, 1H, J = 13.1及び7.1, - CHH-), 2.54-2.02 (m, 2H, -CHH-) 1.43 (s, 18H, 9 x CH3); 13C NMR (125MHz, CDCl3): δ = 177.2 (C=O), 177.1 (C=O), 175.1 (C=O), 175.0 (C=O), 172.0 (C=O), 171.5 (C=O), 155.5 (C=O), 155.3 (C=O), 80.6(2 x -OCCH3), 53.6 (CH), 52.91 (OCH3), 52.85 (OCH3), 50.8 (CH), 40.6 (CH), 40.0 (CH), 37.3 (CH2), 37.0 (CH2), 34.6 (CH2), 34.1 (CH2), 28.3 (6 x CH3); IR (油, cm-1) 3233 (w), 2980 (w), 1783 (w), 1709 (s); MS (CI+) m/z, (%): 333 (M+H, 15), 277 (50), 233 (100); C13H20O6N2Sについて計算した質量: 332.10420. 実測値: 332.10475;   
【０２５０】
参考例６：マレイミドがＮ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｍａｌ）−ＯＭｅのチオールを置換しないこと及びブロモマレイミドがＮ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｓｕｃｃ）−ＯＭｅのチオールを置換しないことの実証
【０２５１】
Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ（３６ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（１３ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）のメタノール（３ｍＬ）中撹拌溶液に、メタノール（３ｍＬ）中のブロモマレイミド（３０ｍｇ、０．１６９ｍｍｏｌ）を添加した。１０分後、マレイミド（１７ｍｇ、０．１６９ｍｍｏｌ）を添加した。溶媒を真空中で除去した。１Ｈ  ＮＭＲ分析は化合物４及び未反応のマレイミドのみを示した。
【０２５２】
Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ（３６ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（１３ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）のメタノール（３ｍＬ）中撹拌溶液に、メタノール（３ｍＬ）中のマレイミド（１７ｍｇ、０．１６９ｍｍｏｌ）を添加した。１０分後、ブロモマレイミド（３０ｍｇ、０．１６９ｍｍｏｌ）を添加した。溶媒を真空中で除去した。１Ｈ  ＮＭＲ分析は、化合物６及び未反応のブロモマレイミドのみを示した。
【０２５３】
参考例７：ブロモマレイミドとマレイミドとの間での、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−Ｏｍｅをめぐる競合反応
Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ（３６ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（１３ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）のメタノール（３ｍＬ）中撹拌溶液に、ブロモマレイミド（３０ｍｇ、０．１６９ｍｍｏｌ）及びマレイミド（１７ｍｇ、０．１６９ｍｇ）のメタノール（３ｍＬ）中混合物を添加した。１分後、溶媒を真空中で除去した。この物質をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル、９：１から７：３の勾配溶出）で精製して、７０％の収率で淡黄色粉末４（３６ｍｇ、０．１０８ｍｍｏｌ）を得、３０％の収率で無色油状物６（１５ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）を得た。
【０２５４】
参考例５により、一旦スクシンイミド又はマレイミド部分に結合すると、システイン部分はこれらの試薬の存在下で脱離できなくなることが実証された。従って、参考例６は、システイン試薬が、マレイミドとよりもブロモマレイミドとより迅速に反応することを実証している（即ち、反応速度論は、化合物４の形成に、より好都合である）。
【０２５５】
参考例８：プロピルアミンと比較した、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−Ｏｍｅに対するブロモマレイミド試薬の選択性の実証
Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ（３６ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）及びプロピルアミン（１０μＬ、０．１５３ｍｍｏｌ）のメタノール（３ｍＬ）中撹拌溶液に、メタノール（３ｍＬ）中のブロモマレイミド（３０ｍｇ、０．１６９ｍｍｏｌ）を添加した。１分後、溶媒を真空中で除去した。この物質をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル、９：１から７：３の勾配溶出）で精製して、淡黄色粉末（５１ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）を１００％で得た。データは、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｍａｌ）−ＯＭｅ  ４について上記で得たものと一致した。
【０２５６】
参考例９：Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅを再生するためのＮ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｍａｌ）−ＯＭｅの切断
【０２５７】
【化２３】
2013501766.tif 000025
【０２５８】
４（５０ｍｇ、０．１５１ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（２ｍＬ）中撹拌溶液に、２０ｍＬの水性緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０）を添加した。水性緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０）２０ｍＬ中のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（４３０ｍｇ  １．５１ｍｍｏｌ）を、この溶液に添加した。５分後、この水溶液を酢酸エチル（３ｘ２５ｍＬ）で抽出し、飽和塩化リチウム溶液（５ｘ２５ｍＬ）、水（２５ｍＬ）及びブライン（２５ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。溶媒を真空中で除去して、無色油状物（３４．５ｍｇ、０．１４８ｍｍｏｌ）を９８％の収率で得た。この油状物の１Ｈ ＮＭＲ及び１３Ｃ ＮＭＲは、これが市販のＮ−Ｂｏｃ−システイン  メチルエステル３であることを示した。
【０２５９】
参考例１０：２，３−ジブロモマレイミドとソマトスタチンとの反応
ソマトスタチンは、分子内の２つのシステイン残基がジスルフィド結合で結合した形態で存在することが知られたペプチドホルモンである。
【０２６０】
１ｍｇの凍結乾燥ソマトスタチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、２ｍｌの５０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４−、ｐＨ６．２、４０％  ＭｅＣＮ、２．５％  ＤＭＦ中に再可溶化した。５００μｌを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ反応チューブに移し、同緩衝液中で希釈して最終濃度０．２５ｍｇ／ｍｌ（１５２．６μＭ）にした。２．０当量のＴＣＥＰ（５０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４−、ｐＨ６．２、４０％  ＭｅＣＮ中１００ｘストック溶液）を添加し、反応を周囲温度で１時間インキュベートした。ジスルフィド結合の還元後、１．４当量の２，３−ジブロモマレイミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、５０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４−、ｐＨ６．２、４０％  ＭｅＣＮ、２．５％  ＤＭＦ中１００ｘストック溶液）を添加し、溶液を穏やかに混合して、４℃でさらに１２時間インキュベートした。
【０２６１】
マレイミド架橋されたソマトスタチンが、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ（ＥＳ＋／ＥＳ−）によって検出された。コントロールには、未処理のペプチド、及び２，３−ジブロモマレイミド又はＴＣＥＰのみで処理したソマトスタチンを含めた。完全な還元は、ＴＣＥＰ処理したペプチドとマレイミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、５０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４−、ｐＨ６．２、４０％  ＭｅＣＮ、２．５％  ＤＭＦ中の１００ｘストック溶液）との反応によって検出された。
【０２６２】
実験データ：
未処理のソマトスタチン：[ES+]1638.04(m/z 1), 819.82 (m/z 2), 546.95 (m/z 3).
マレイミド架橋されたソマトスタチン：[ES+] 1734.14 Da (m/z 1), 867.40 Da (m/z 2), 578.73 (m/z 3).
【０２６３】
参考例１１：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃの発現
【０２６４】
【化２４】
2013501766.tif 000026
【０２６５】
タンパク質ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃをモデルタンパク質として使用した。このモデルタンパク質は単一のシステイン残基を含む。
【０２６６】
ＬＣ−ＭＳは、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｑｕａｄ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＳＱＤ）に接続したＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ｕＰＬＣで実施した。カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ  ｕＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８  １．７μｍ  ２．１ｘ５０ｍｍ。波長：２５４ｎｍ。移動相：９５：５  水（０．１％ギ酸）：ＭｅＣＮ（０．１％ギ酸）、４分間にわたる勾配（５：９５  水（０．１％ギ酸）：ＭｅＣＮ（０．１％ギ酸）まで。流速：０．６ｍＬ／分。ＭＳモード：ＥＳ＋。スキャン範囲：ｍ／ｚ＝８５−２０００。スキャン時間：０．２５秒。データは連続体モードで得た。ＭＳのエレクトロスプレー供給源は、３．５ｋＶのキャピラリー電圧及び５０Ｖのコーン電圧で操作した。窒素を、総流量６００Ｌ／ｈで、ネブライザー及び脱溶媒和ガスとして使用した。総質量スペクトルを、ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェアにプレインストールされたＭａｘＥｎｔ  １アルゴリズムを使用して、イオンシリーズから再構築した。
【０２６７】
モデルタンパク質をＥ．ｃｏｌｉ中で過剰発現させ、６Ｈｉｓタグ化タンパク質を、標準的な技術によって、Ｎｉ−アフィニティクロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーの両方を使用して精製した。ＬＣ−ＭＳを用いた分析により、所望のタンパク質に対応する質量１４１６９の単一のタンパク質種が示された。
【０２６８】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｅｌｌｍａｎ試薬（５μＬ、Ｈ２Ｏ中２８２ｍＭ溶液）を０℃で添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、１０分間０℃で維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、単一の反応が生じて１４３６６の質量を有する単一の生成物が得られたことが示され、Ｃ１１１が官能化に利用可能であることが示された。
【０２６９】
参考例１２：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃとブロモマレイミドとの反応
【０２７０】
【化２５】
2013501766.tif 000027
【０２７１】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望のタンパク質に対応する質量１４２６５の単一のタンパク質種が示された。
【０２７２】
この混合物を、０℃にてＥｌｌｍａｎ試薬（５μＬ、Ｈ２Ｏ中２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で１０分間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、Ｅｌｌｍａｎ試薬との明白な反応がなかったことが示され、これは、ブロモマレイミドの官能化がＣ１１１で生じたことを強調する。
【０２７３】
参考例１３：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１ＣとＮ−メチルブロモマレイミドとの反応
【０２７４】
【化２６】
2013501766.tif 000028
【０２７５】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｎ−メチルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望のタンパク質に対応する質量１４２７８の単一のタンパク質種が示された。
【０２７６】
この混合物を、０℃にてＥｌｌｍａｎ試薬（５μＬ、Ｈ２Ｏ中２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、００℃で１０分間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、Ｅｌｌｍａｎ試薬との明白な反応がなかったことが示され、これは、Ｎ−メチルブロモマレイミドの官能化がＣ１１１で生じたことを強調する。
【０２７７】
参考例１４：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ブロモマレイミド付加物のホスフィン媒介性の還元的切断
【０２７８】
【化２７】
2013501766.tif 000029
【０２７９】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２６５の単一のタンパク質種が示された。
【０２８０】
この混合物を、０℃にてＴＣＥＰ．ＨＣｌ（５μＬ、Ｈ２Ｏ中２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で３時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物が明らかに切断されて、ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ（質量＝１４１６８）を８５％の収率で生じたことが示された。残りの物質は、未反応のタンパク質／ブロモマレイミド付加物であった。
【０２８１】
参考例１５：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物のホスフィン媒介性の還元的切断
【０２８２】
【化２８】
2013501766.tif 000030
【０２８３】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｎ−メチルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２７８の単一のタンパク質種が示された。
【０２８４】
この混合物を、０℃にてＴＣＥＰ．ＨＣｌ（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で３時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物が明らかに切断されて、ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ（質量＝１４１６８）を８５％の収率で生じたことが示された。残りの物質は、未反応のタンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物であった。
【０２８５】
参考例１６：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ブロモマレイミド／２−メルカプトエタノール付加物の合成
【０２８６】
【化２９】
2013501766.tif 000031
【０２８７】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２６５の単一のタンパク質種が示された。
【０２８８】
この混合物を、０℃にて２−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で３時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ブロモマレイミド／２−メルカプトエタノール付加物（質量＝１４３３９）が５５％の収率で形成されたことが示された。残りの物質はＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃであった。
【０２８９】
参考例１７：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−メチルブロモマレイミド／２−メルカプトエタノール付加物の合成
【０２９０】
【化３０】
2013501766.tif 000032
【０２９１】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｎ−メチルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２７８の単一のタンパク質種が示された。
【０２９２】
この混合物を、０℃にて２−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で３時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド／２−メルカプトエタノール付加物（質量＝１４３５６）が６１％の収率で形成されたことが示された。残りの物質は、ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃであった。
【０２９３】
参考例１８：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド付加物の合成
【０２９４】
【化３１】
2013501766.tif 000033
【０２９５】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０２９６】
参考例１９：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物の合成
【０２９７】
【化３２】
2013501766.tif 000034
【０２９８】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０２９９】
この混合物を、０℃にてグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物が、唯一の存在したタンパク質種（質量＝１４５７２）であることが示された。
【０３００】
参考例２０：生理学的に適当なグルタチオン濃度（５ｍＭ）での、ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物のグルタチオン媒介性の切断
【０３０１】
【化３３】
2013501766.tif 000035
【０３０２】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０３０３】
この混合物を、０℃にてグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物が、存在する唯一のタンパク質種（質量＝１４５７２）であることが示された。
【０３０４】
この混合物を、０℃にてグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の１００ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃが、存在する唯一のタンパク質種（質量＝１４１７３）であることが示された。
【０３０５】
Ｂ）さらなる実施例
一般的手順
１Ｈ  ＮＭＲ及び１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、１Ｈについては５００ＭＨｚ、１３Ｃについては１２５ＭＨｚの周波数で作動するＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ５００機器で、室温で記録した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、ＣＤＣｌ３（７．２６ｐｐｍ）シグナルを参照とした。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、ＣＤＣｌ３（７７．６７ｐｐｍ）シグナルを参照とした。赤外線スペクトルは、センチメートルの逆数（ｃｍ−１）で与えられる周波数で、ＡＴＲモードで作動するＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  １００  ＦＴ−ＩＲスペクトロメータで実行した。低分子に関する質量スペクトル及び高分解能質量データは、ＶＧ７０−ＳＥ質量分析計（ＥＩモード及びＣＩモード）で記録した。融点はＧａｌｌｅｎｋａｍｐ加熱ブロックで取得したものであり、未補正である。３，４−ジブロモマレイミド、凍結乾燥ソマトスタチン、ＰＥＧ５０００、ＴＣＥＰ及びベンゼンセレノールは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、さらなる精製なしに使用した。
【０３０６】
タンパク質及びペプチドの質量分析
タンパク質サンプルに対するＬＣ−ＭＳは、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｑｕａｄ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＳＱＤ）に接続したＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ｕＰＬＣを使用して実施した。カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ  ｕＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８  １．７μｍ  ２．１ｘ５０ｍｍ。波長：２５４ｎｍ。移動相：９５：５  水（０．１％ギ酸）：ＭｅＣＮ（０．１％ギ酸）、４分間にわたる勾配（５：９５  水（０．１％ギ酸）：ＭｅＣＮ（０．１％ギ酸）まで。流速：０．６ｍＬ／分。ＭＳモード：ＥＳ＋。スキャン範囲：ｍ／ｚ＝８５−２０００。スキャン時間：０．２５秒。データは連続体モードで得た。ＭＳのエレクトロスプレー供給源は、３．５ｋＶのキャピラリー電圧及び５０Ｖのコーン電圧で操作した。窒素を、総流量６００Ｌ／ｈで、ネブライザー及び脱溶媒和ガスとして使用した。総質量スペクトルを、ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェアにプレインストールされたＭａｘＥｎｔ  １アルゴリズムを使用して、イオンシリーズから再構築した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析は、ＭＡＬＤＩ  ｍｉｃｒｏ  ＭＸ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）で実施した。データは、３３７ｎｍのレーザー波長で、１２ｋＶのソース電圧及び５ｋＶのリフレクション電圧で、リフレクトロン陽イオンモードで得た。サンプルは以下に概説したように調製し、ペプチドを含むサンプルを、脱イオンＨ２Ｏ中で２４時間透析した。ペプチド及びその誘導体（０．１〜０．３ｍｇ／ｍｌ）を、トリフルオロ酢酸（１０ｍｇ／ｍｌ）を予めスポットした後に、２μｌシナピン酸（１０ｍｇ／ｍｌ）中でＭＡＬＤＩプレート上にスポットした。ＡＣＴＨ（１０ｎｇ／ｍｌ）を質量較正に使用した。
【０３０７】
参考例２１：ブロモマレイミドの調製
【０３０８】
【化３４】
2013501766.tif 000036
【０３０９】
クロロホルム（１５ｍＬ）中のマレイミド（２．００ｇ、０．０２ｍｏｌ）に、クロロホルム（１５ｍＬ）中の臭素（１．１６ｍＬ、０．０２ｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を２時間還流し、１時間かけて室温まで冷却した。固体の黄色沈殿物を濾去し、冷クロロホルム（２ｘ５０ｍＬ）で洗浄して、粗製２，３−ジブロモスクシンイミド（４．０９ｇ、０．０１６ｍｏｌ）のオフホワイトの結晶を得た。粗製スクシンイミドをテトラヒドロフラン（５０ｍＬ）中に溶解し、テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中のトリエチルアミン（２．４ｍＬ、０．０１７ｍｏｌ）を５分間かけて０℃で添加した。反応混合物を室温まで温め、４８時間撹拌した。固体を濾去し、テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）で洗浄した。フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテル中５％の酢酸エチル）で、所望の化合物（２．１４ｇ、０．０１２ｍｏｌ）が淡黄色粉末として５９％の収率で得られた。
δH (500 MHz, CDCl3) 7.67 (br s, 1H, NH), 6.89 (s, 1H, H-3); δC(125 MHz, CDCl3) 173.8 (C=O), 170.5 (C=O), 136.9 (C2), 135.4 (C3); IR (固体, cm-1) 3235 (s), 1709 (s); MS (CI+) m/z, (相対強度): 178 ([81M+H], 32), 176 ([79M+H], 32), 125 (25), 86 (100); [C4H2O2N79Br]+Hについて計算した質量: 175.9347 実測値 175.9349 (CI+); m.p. 148 - 151oC; UV (アセトニトリル) ε242= 13800及びε276 = 1700 cm-1M-1d3.
【０３１０】
参考例２２：Ｎ−メチルブロモマレイミドの調製
【０３１１】
【化３５】
2013501766.tif 000037
【０３１２】
メタノール（１０ｍＬ）中のＮ−メチルマレイミド（０．５ｇ、４．５ｍｍｏｌ）に、メタノール（５ｍＬ）中の臭素（２３２μＬ、４．５ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を室温で１２時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、テトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中に溶解した。テトラヒドロフラン（５ｍＬ）中のトリエチルアミン（８１５μＬ、５．９ｍｍｏｌ）を５分間かけて添加したところ、沈殿が形成された。反応混合物を２４時間撹拌した。固体を濾去し、テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）で洗浄した。フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテル中１０％の酢酸エチル）で、所望の化合物（５６３ｍｇ、２．９６ｍｍｏｌ）が淡黄色粉末として６６％の収率で得られた。 δH (500 MHz, CDCl3) 6.90 (s, 1H, H-3), 3.09 (s, 3H, H3-6); δC (125 MHz, CDCl3) 168.6 (C=O), 165.4 (C=O), 131.9 (C3), 131.4 (C2), 24.7 (C6); IR (固体, cm-1) 3106 (s), 1708 (s); MS (CI+) m/z, (相対強度):192 ([81M+H], 99), 190([79M+H], 100);  [C5H4O2N79Br]+Hについて計算した正確な質量は、189.9504を要する。実測値189.9505 (CI+); m.p: 77-79℃; UV (アセトニトリル) ε209 = 17100, ε238 = 13200, ε299 = 290 cm-1M-1d3.
【０３１３】
参考例２３：Ｎ−フェニルブロモマレイミドの調製
【０３１４】
【化３６】
2013501766.tif 000038
【０３１５】
クロロホルム（１５ｍＬ）中のＮ−フェニルマレイミド（２ｇ、１１．５０ｍｍｏｌ）に、クロロホルム（５ｍＬ）中の臭素（０．６５ｍＬ、１２．７０ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を１時間還流し、次いで室温まで冷却した。沈殿物を濾去し、クロロホルム（５０ｍＬ）で洗浄した。この固体（２．７０ｇ、８．１０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（５０ｍＬ）中に溶解し、トリエチルアミン（１．２ｍＬ、８．９ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中溶液を０℃でこれに滴下し、混合物を２時間撹拌した。混合物を室温まで温め、溶媒を真空中で除去した。残渣を酢酸エチル中に溶解し、Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）  ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させた（Ｎａ２ＳＯ４）。溶媒を真空中で除去して、所望の化合物（１．８０ｇ、７．１４ｍｍｏｌ）を淡黄色固体として６２％の収率で得た。データは文献：Ｓａｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２００３，３４６と一致した。
【０３１６】
参考例２４：Ｎ−フェニルジブロモマレイミドの調製
【０３１７】
【化３７】
2013501766.tif 000039
【０３１８】
アニリン（７２μＬ、０．７８８ｍｍｏｌ）を、ジブロモマレイン酸無水物（２００ｍｇ、０．７８８ｍｍｏｌ）のＡｃＯＨ（１０ｍＬ）溶液に添加した。混合物を室温で３時間撹拌し、１３０℃で９０分間撹拌した。冷却後、混合物を乾燥するまで濃縮し、微量のＡｃＯＨをトルエンとの共沸混合物によって除去した。黄褐色（ｔａｎ）の残渣を、シリカフラッシュクロマトグラフィー（５％ＥｔＯＡｃ／９５％石油エーテル）を使用して精製して、所望の化合物を淡黄色固体として得た（１６６ｍｇ、６０％）。δH (600 MHz, CDCl3) 7.48 (m, 2H, ArH), 7.41 (tt, 1H, J = 7.4及び1.1 Hz, ArH), 7.33 (m, 2H, ArH).; δC (150 MHz, CDCl3) 163.0, 131.0, 130.0, 129.5, 128.8, 126.2.
【０３１９】
参考例２５：３，４−ジヨード−ピロール−２，５−ジオンの調製
【０３２０】
【化３８】
2013501766.tif 000040
【０３２１】
酢酸（５０ｍｌ）中のジブロモマレイミド（５００．０ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）に、ヨウ化ナトリウム（８８６．５ｍｇ、５．９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１２０℃に加熱し、２時間還流した。反応を室温まで冷却し、Ｈ２Ｏ（５０ｍｌ）を添加し、４℃で１５時間維持した。黄色沈殿物を濾去し、風乾し、所望の化合物をオレンジ色の結晶性粉末として得た（４１５ｍｇ、６０％）。 1H NMR (500MHz, MeOD):シグナルなし; 13C NMR (125MHz, MeOD): δ = 169.3 (C), 119.5 (C); IR (固体, cm-1): 3244 (s), 2944 (m), 2833 (m); MS (EI) m/z, (%): 349 (M, 83), 179 (100); C4H12O2Nについて計算した質量: 348.80912. 実測値: 348.81026. m.p. 238-241℃ (文献値: 254-255℃). 
【０３２２】
参考例２６：３，４−ビス−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−ピロール−２，５−ジオンの調製
【０３２３】
【化３９】
2013501766.tif 000041
【０３２４】
緩衝液（１００ｍｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、５．０％ＤＭＦ）中の２−メルカプトエタノール（６８３．８μｌ、９．８ｍｍｏｌ）に、ＤＭＦ（２．５ｍｌ、最終濃度ＤＭＦ  ７．５％）中のジブロモマレイミド（１ｇ、３．９ｍｍｏｌ）を添加した。反応を室温で３０分間撹拌し、塩化リチウム（２０ｇ）を添加した。水性反応混合物を酢酸エチル（７ｘ１５０ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、溶媒を真空中で除去し、残留物質をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル、１：１から１：９の勾配溶出）で精製した。生成物を含む画分を収集し、溶媒を真空中で除去した。なお不純な生成物を、シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（メタノール：ジクロロメタン、０．５から１０．０％のメタノールの勾配溶出）で精製して、所望の化合物を黄色固体として得た（５１８ｍｇ、５３％）。λmax (50 mM リン酸ナトリウム, pH 6.2, 40 % MeCN, 2.5 % DMF)/ 318 nm (ε/ dm3 mol-1 cm-1 1855); 1H NMR (500MHz, MeOD): δ = 3.74 (t, 4H, J = 6.4, 2x HO-CH2), 3.41 (t, 4H, J = 6.3, 2x S-CH2) 13C NMR (125MHz, MeOD): δ = 168.5 (C), 137.2 (C), 62.3 (CH2), 34.4 (CH2); IR (固体, cm-1): 3344 (s), 2500 (m), 2078 (w); MS (EI) m/z, (%): 250 (M, 43), 232 (100), 161 (37); C8H11O4NS2について計算した質量: 250.02077. 実測値: 250.02126; m.p. 46-50℃.
【０３２５】
参考例２７：３，４−ビス−フェニルスルファニル−ピロール−２，５−ジオンの調製
【０３２６】
【化４０】
2013501766.tif 000042
【０３２７】
メタノール（６ｍｌ）中のジブロモマレイミド（８０．０ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）及び炭酸水素ナトリウム（１３０．２ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）に、メタノール（１ｍｌ）のベンゼンチオール（６６．６μｌ、０．７ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。反応を室温で１５分間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、残留物質をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル、９：１から７：３の勾配溶出）で精製して、所望の生成物を、鮮黄色の結晶として得た（７３ｍｇ、７５％）。λmax (50 mM リン酸ナトリウム, pH 6.2, 40 % MeCN, 2.5 % DMF)/ 412 nm (ε/ dm3 mol-1cm-1 2245); 1H NMR (500MHz, MeOD): δ = 7.27-7.22 (m, 6H, Ar-H), 7.16-7.14 (m, 4H, Ar-H); 13C NMR (125MHz, MeOD): δ = 169.3 (C), 137.6 (C), 135.4 (C), 132.4 (CH), 130.1 (CH), 129.1 (CH); IR (固体, cm-1): 3285 (m), 3059 (w), 2924 (w), 1774 (m), 1715 (s); MS (CI) m/z, (%): 314 (M+H, 100), 206 (13), 111 (12); C16H11O2NS2[+H]について計算した質量: 314.0231. 実測値: 314.0309; m.p. 102-104℃(文献値: 123-126℃).
【０３２８】
参考例２８：３，４−ビス−（ピリジン−２−イルスルファニル）−ピロール−２，５−ジオンの調製
【０３２９】
【化４１】
2013501766.tif 000043
【０３３０】
メタノール（１５ｍｌ）中のジブロモマレイミド（３００．０ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（４８０．０ｍｇ、５．９ｍｍｏｌ）に、メタノール（４ｍｌ）の１Ｈ−ピリジン−２−チオン（２７５．８ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。反応を室温で１５分間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、残留物質をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（メタノール：ジクロロメタン、０．５〜３．０％の勾配溶出）で精製して、所望の生成物を暗黄色粉末として得た（１９０ｍｇ、５１％）。λmax (50 mM リン酸ナトリウム, pH 6.2, 40 % MeCN, 2.5 % DMF)/ 395 nm (ε/ dm3 mol-1cm-1 3508); 1H NMR (500MHz, MeOD): δ = 8.37 (d, 2H, J = 3.8, 2x N-CH), 7.70 (t, 2H, J = 6.9, 2x C-CH-CH), 7.38 (d, 2H, J = 7.9, 2x C-CH), 7.26 (t, 2H, J = 6.5, 2x N-CH-CH); 13C NMR (125MHz, MeOD): δ = 168.5 (C), 154.7 (C), 150.9 (CH), 140.0 (C), 139.0 (CH), 126.8 (CH), 123.7 (CH); IR (固体, cm-1): 2926 (m), 2734 (w), 1771 (w), 1726 (s), 1619 (m); MS (CI) m/z, (%): 316 (M+H, 5), 152 (10), 126 (34), 112 (100); C14H9O2N3S2[+H]について計算した質量: 316.0214. 実測値: 316.0223.; m.p. 70-72℃.
【０３３１】
参考例２９：Ｎ−ＰＥＧ３００ジブロモマレイミドの調製
【０３３２】
【化４２】
2013501766.tif 000044
【０３３３】
反応は、完全に乾燥した条件下で実施した。ＴＨＦ（５ｍＬ）中のトリフェニルホスフィン（１９３．９ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）に、ジイソプロピルアゾジカルボキシレート（１４５．６μｌ、０．７ｍｍｏｌ）を−７８℃で滴下した。反応を５分間撹拌し、ＴＨＦ（４ｍＬ）中のＰＥＧ３００（２００．０ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を滴下した。反応を５分間撹拌し、ＴＨＦ（１ｍｌ）中のネオペンチルアルコール（４５．８ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を添加した。反応を５分間撹拌し、ＴＨＦ（２ｍｌ）中の３，４−ジブロモマレイミド（１８９．４ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）を添加した。反応を１０分間撹拌し、冷浴を取り除き、周囲温度で２０時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、残留物質をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（メタノール：ジクロロメタン、０．５〜５．０％メタノールの勾配溶出）で精製した。生成物を含む画分を収集し、溶媒を真空中で除去した。なお不純な生成物を、シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル、７：３から２：８の勾配溶出）で精製して、所望の化合物（１３７ｍｇ、４０％）を黄色油状物として９７．５％の純度で得た。 1H NMR (500MHz, CDCl3): δ = 3.76 (t, 2H, J = 5.6, N-CH2), 3.64-3.52 (m, 24H, 12x CH2-O), 3.49 (t, 2H, J = 4.4, N-CH2-CH2), 3.32 (s, 3H, O-CH3); 13C NMR (125MHz, CDCl3): δ = 163.8 (2x C), 129.5 (2x C), 72.0 (CH2), 70.7-70.5 (9x CH2), 70.1 (2x CH2), 67.5 (CH2), 59.1 (CH3), 39.0 (CH2); IR (固体, cm-1): 3496 (w), 2869 (m), 1786 (m), 1720 (s), 1594 (m); MS (CI) m/z, (%): 580 (81M+H, 12), 578 (81, 79 M+H, 23), 576 (79M+H, 12), 279 (100), 84 (61); C19H3179Br2O9N[+H]について計算した質量: 576.0444. 実測値: 576.0437.
【０３３４】
参考例３０：Ｎ−ＰＥＧ５０００ジブロモマレイミドの調製
【０３３５】
【化４３】
2013501766.tif 000045
【０３３６】
反応は、完全に乾燥した条件下で実施した。ＴＨＦ（８ｍＬ）及びＤＣＭ（３ｍＬ）の混合物中のトリフェニルホスフィン（１５４．６ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）に、ジイソプロピルアゾジカルボキシレート（１１６．０μｌ、０．６ｍｍｏｌ）を−７８℃で滴下した。反応を５分間撹拌し、ジクロロメタン（７ｍＬ）中のＰＥＧ５０００（２９５０．０ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を滴下した。反応を５分間撹拌し、ＴＨＦ（１ｍｌ）及びＤＣＭ（１ｍｌ）の混合物中のネオペンチルアルコール（２６．５ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を添加した。反応を５分間撹拌し、ＴＨＦ（２ｍｌ）中の３，４−ジブロモマレイミド（１５０．０ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を添加した。反応を５分間撹拌し、冷浴を取り除き、周囲温度で２０時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、残留物質をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（メタノール：ジクロロメタン、０．５〜５．０％メタノールの勾配溶出）で精製した。生成物を含む画分を収集し、溶媒を真空中で除去した。なお不純な生成物を、非常にゆっくりしたシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（メタノール：ジクロロメタン、０．５〜６．０％メタノールの勾配溶出）で精製して、所望の化合物を淡緑色の結晶性粉末として得た（４１７ｍｇ、１３％）。1H NMR (500MHz, CDCl3): δ = 3.58 (s, 4x n H, CH2); 13C NMR (125MHz, CDCl3): δ = 163.8 (C), 129.5 (C), 70.6 (CH2); IR (固体, cm-1): 3517 (w), 2872 (s), 1977 (w), 1727 (m), 1641 (w); m.p. 51-55℃.
【０３３７】
参考例３１：Ｎ−ＰＥＧ５０００ジチオフェノールマレイミドの調製
【０３３８】
【化４４】
2013501766.tif 000046
【０３３９】
反応は、完全に乾燥した条件下で実施した。ＴＨＦ（８ｍｌ）及びＤＣＭ（３ｍｌ）の混合物中のトリフェニルホスフィン（１６７．７ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）に、ジイソプロピルアゾジカルボキシレート（１２５．９μｌ、０．６ｍｍｏｌ）を−７８℃で滴下した。反応を５分間撹拌し、ＤＣＭ（７ｍｌ）中のＰＥＧ５０００（１６００．０ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を滴下した。反応を５分間撹拌し、ＴＨＦ（１ｍｌ）及びＤＣＭ（１ｍｌ）の混合物中のネオペンチルアルコール（５６．３ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を添加した。反応を５分間撹拌し、ＴＨＦ（３ｍｌ）中の３，４−ジチオフェノールマレイミド（２００．０ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を添加した。反応を５分間撹拌し、冷浴を取り除き、周囲温度で２０時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、残留物質をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（メタノール：ジクロロメタン、０．５〜１０．０％メタノールの勾配溶出）で精製した。生成物を含む画分を収集し、溶媒を真空中で除去した。なお不純な生成物を、ＴＬＣグレードのシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（メタノール：ジクロロメタン、０．０〜１０．０％メタノールの勾配溶出）で精製して、所望の化合物を鮮黄色の結晶性粉末として得た（１．２４ｇ、７３％）。1H NMR (500MHz, CDCl3): δ = 7.26 (dd, H, J = 7.7, J = 4.5, CH), 7.23 (dd, 2H, J = 8.4, J = 6.6, CH), 7.19 (dd, 2H, J = 8.4, J = 6.8, CH), 3.63 (s, 4x n H, CH2); 13C NMR (125MHz, CDCl3): δ = 166.7 (C), 135.7 (C), 131.9 (CH), 129.1 (C), 129.0 (CH), 128.4 (CH), 70.6 (CH2); IR (固体, cm-1): 3498 (w), 2881 (s), 1959 (w), 1711 (m); m.p. 57-59℃.
【０３４０】
参考例３２：２，３−ジブロモマレイン酸無水物の調製
【０３４１】
【化４５】
2013501766.tif 000047
【０３４２】
不活性雰囲気下で、無水マレイン酸（１．５０ｇ、１５．３ｍｍｏｌ、１当量）、三塩化アルミニウム（３００ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ、触媒）及び臭素（４．９５ｇ、３０．６ｍｍｏｌ、２当量）の溶液を、密封アンプル（注意−ブラストシールド）中で１６０℃で１６時間加熱した。２１℃まで冷却し、反応混合物をさらに２４時間撹拌し、注意深く開放した。ＥｔＯＡｃを添加し、固体を濾去し、さらなるＥｔＯＡｃで繰り返し洗浄した。最後に濾液を真空中で濃縮して、表題化合物を黄色固体として得、これをさらなる精製なしに使用した（３．０５ｇ、１１．９ｍｍｏｌ、７８％収率）。m.p 107-110℃; 13C NMR (150 MHz, CD3OD) δ 163.33 (s), 125.28 (s); IR (MeOH) 1769, 1706, 1590 cm-1; C4O3Br2 [M]+ について計算したHRMS (CI) 253.82087, 実測値253.82082.
【０３４３】
参考例３３：ｔｅｒｔ−ブチル  Ｎ−（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）カルバメートの調製
【０３４４】
【化４６】
2013501766.tif 000048
【０３４５】
ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジカーボネート（１．１０ｇ、５．００ｍｍｏｌ、１当量）のＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中溶液を、２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］エタンアミン（７．３２ｍＬ、５０．０ｍｍｏｌ、１０当量）のＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）中溶液に滴下した。得られた反応混合物を、２１℃で２４時間撹拌した。次いでＣＨ２Ｃｌ２を真空中で除去して、無色の残渣を得た。ＥｔＯＡｃ（１２５ｍＬ）の添加により、白色沈殿物の形成が起こり、これをＮａ２ＣＯ３の飽和溶液（３ｘ５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、真空中で濃縮した。カラムクロマトグラフィー（８：２  ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ）によるさらなる精製で、所望のモノ保護されたアミンが無色油状物として得られた（０．６９ｇ、２．８０ｍｍｏｌ、５６％収率）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 5.27 (bs, 1H, NH), 3.54-3.52 (m, 4H, OCH2), 3.47-3.42 (m, 4H, OCH2), 3.23-3.22 (m, 2H, NCH2), 2.80 (t, J = 5.0, 2H, NCH2), 2.05 (bs, 2H, NH), 1.35 (s, 9H, CH3); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 156.08 (s), 79.09 (s), 73.19 (t), 70.21 (t), 70.16 (t), 41.59 (t), 40.32 (t), 28.40 (q), * 1 t 欠落; IR (ニート) 3344, 2869, 1692 cm-1; C11H25N2O4[M + H]+について計算したHRMS (CI) 249.18143, 実測値249.18251. 
【０３４６】
参考例３４：ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ−（２−（２−（２−（５−（２−オキソ−１，３，３ａ，４，６，６ａ−ヘキサヒドロチエノ（３，４−ｄ）イミダゾール−６−イル）ペンタノイルアミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバメートの調製
【０３４７】
【化４７】
2013501766.tif 000049
【０３４８】
ビオチン（０．５９ｇ、２．４２ｍｍｏｌ、１．５当量）、ＨＢＴＵ（０．７９ｇ、２．１０ｍｍｏｌ、１．３当量）及びＤＩＥＡ（０．４５ｍＬ、２．６０ｍｍｏｌ、１．６当量）のＤＭＦ（１５ｍＬ）溶液を、２１℃で２０分間撹拌し、その後、ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ−（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）カルバメート（４００ｍｇ、１．６１ｍｍｏｌ、１当量）のＤＭＦ（１０ｍＬ）溶液に滴下した。反応混合物を２１℃で２時間撹拌し、その後、ＤＭＦを真空中で除去して黄色残渣を得た。粗製生成物をカラムクロマトグラフィー（勾配  ２〜１０％のＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）で精製して、所望の化合物を白色固体として得た（０．６１ｇ、１．２９ｍｍｏｌ、８０％収率）。m.p. 106-108℃; [α]D20.0 +23.0 (c 0.6, CH2Cl2); 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 4.55 (dd, J = 5.0, 7.5 Hz, 1H, NHC(O)NHCH), 4.36 (dd, J = 5.0, 7.5 Hz, 1H, NHC(O)NHCH), 3.62 (bs, 6H, OCH2), 3.59-3.55 (m, 2H, OCH2), 3.46 (m, 2H, NCH2), 3.31 (m, 2H, NCH2), 3.17 (dt, 3.0, 5.0 Hz, 1H, SCH), 2.92 (dd, J = 5.0, 13.0 Hz, 1H, SCHH), 2.79 (d, J = 13.0 Hz, 1H, SCHH), 2.27 (t, J = 7.0 Hz, 2H, NHC(O)CH2CH2CH2), 1.71 (m, 4H, NHC(O)CH2CH2CH2CH2), 1.47 (br, 11H, C(CH3)3 & NHC(O)CH2CH2CH2CH2); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 173.69 (s), 163.92 (s), 155.99 (s), 79.14 (s), 70.03 (t), 69.69 (br t), 61.58 (d), 60.06 (d), 55.19 (d), 40.16 (t), 39.96 (t), 38.91 (t), 35.44 (t), 28.09 (q), 27.80 (t), 27.67 (t), 25.23 (t), * 2 t 非存在; IR (ニート) 3307, 2933, 1691 cm-1; C21H38N4O6NaS [M+Na]+について計算したHRMS (ES) 497.2410, 実測値497.2423.
【０３４９】
参考例３５：２−（２−（２−（５−（２−オキソ−１，３，３ａ，４，６，６ａ−ヘキサヒドロチエノ（３，４−ｄ）イミダゾール−６−イル）ペンタノイルアミノ）エトキシ）エトキシ）エチルアンモニウム；２，２，２−トリフルオロアセテートの調製
【０３５０】
【化４８】
2013501766.tif 000050
【０３５１】
ｔｅｒｔ−ブチル  Ｎ−（２−（２−（２−（５−（２−オキソ−１，３，３ａ，４，６，６ａ−ヘキサヒドロチエノ（３，４−ｄ）イミダゾール−６−イル）ペンタノイルアミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバメート（０．６１ｇ、１．２９ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）及びＴＦＡ（５ｍＬ）中溶液を、２１℃で２４時間撹拌した。次いでトルエンを添加し（ｘ２）、溶媒を真空中で除去して、所望の化合物を油状物として得た（０．６３ｇ、１．２９ｍｍｏｌ、１００％収率）。[α]D20.0 +41.0 (c 0.49, MeOH); 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.53 (dd, J = 5.0, 7.5 Hz, 1H, NHC(O)NHCH), 4.33 (dd, J = 5.0, 7.5 Hz, 1H, NHC(O)NHCH), 3.71 (t, J = 5.0 Hz, 2H, OCH2CH2NH3), 3.65 (br, 4H, OCH2), 3.57 (t, J = 5.0 Hz, 2H, OCH2), 3.38 (t, J = 5.0 Hz, 2H, OCH2), 3.22 (dt, J = 5.0, 8.5 Hz, 1H, SCH), 3.13 (t, J = 5.0 Hz, 2H, C(O)NHCH2CH2O), 2.94 (dd, J = 5.0, 13.0 Hz, 1H, SCHH), 2.74 (d, J = 13.0 Hz, 1H, SCHH), 2.24 (t, J = 7.5 Hz, 2H, NHC(O)CH2CH2CH2), 1.76-1.43 (m, 6H, NHC(O)CH2CH2CH2CH2); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 174.98 (s), 164.76 (s), 69.92 (t), 69.83 (t), 69.22 (t), 66.46 (t), 62.08 (d), 60.36 (d), 55.59 (d), 39.65 (t), 39.24 (t), 38.77 (t), 35.29 (t), 28.29 (t), 28.06 (t), 25.44 (t); IR (MeOH) 3300, 2941, 1686 cm-1; C16H31N4O4S [M+H]+について計算したHRMS (ES) 375.2066, 実測値375.2060.
【０３５２】
参考例３６：Ｎ−（２−（２−（２−（３−ブロモ−２，５−ジオキソ−ピロール−１−イル）エトキシ）エトキシ）エチル）−５−（２−オキソ−１，３，３ａ，４，６，６ａ−ヘキサヒドロチエノ（３，４−ｄ）イミダゾール−６−イル）ペンタンアミドの調製
【０３５３】
【化４９】
2013501766.tif 000051
【０３５４】
モノブロモマレイン酸無水物（４５．０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ、１当量）を、２−（２−（２−（５−（２−オキソ−１，３，３ａ，４，６，６ａ−ヘキサヒドロチエノ（３，４−ｄ）イミダゾール−６−イル）ペンタノイルアミノ）エトキシ）エトキシ）エチルアンモニウム  ２，２，２−トリフルオロアセテート（１２４ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ、１当量）のＡｃＯＨ（１０ｍＬ）溶液に一度に添加し、反応混合物を１７０℃で３時間加熱した。２１℃まで冷却してトルエンを添加し、ＡｃＯＨを共沸により真空中で除去して（ｘ２）、粗製生成物を得た。カラムクロマトグラフィー（勾配  ２〜１０％のＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）により、所望の化合物を白色固体として得た（７０．０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ、５２％収率）。m.p. 95-98℃; [α]D20.0 +65.1 (c 0.15, MeOH); 1H NMR (600 MHz,  CD3OD) δ 7.17 (s, 1H, CHCBr), 4.51 (dd, J = 5.0, 8.0 Hz, 1H, NHC(O)NHCH), 4.33 (dd, J = 5.0, 8.0 Hz, 1H, NHC(O)NHCH), 3.77 (t, J = 5.5 Hz, 2H, OCH2), 3.68 (t, J = 5.5 Hz, 2H, OCH2), 3.63 (m, 2H, OCH2), 3.58 (m, 2H, OCH2), 3.53 (t, J = 5.5 Hz, 2H, NCH2), 3.37 (t, J = 5.5 Hz, 2H, NCH2), 3.24 (td, J = 5.0, 8.0 Hz, 1H, SCH), 2.95 (dd, J = 5.0, 12.5 Hz, 1H, SCHH), 2.73 (d, J = 12.5 Hz, 1H, SCHH), 2.26 (t, J = 7.0 Hz, 2H, NHC(O)CH2CH2CH2), 1.69 (m, 4H, CH2CH2CH2), 1.47 (クインテット, J = 7.0 Hz, 2H, CH2CH2CH2); 13C NMR (150 MHz, CD3OD) δ 176.12 (s), 170.13 (s), 166.97 (s), 166.08 (s), 133.63 (s), 132.05 (d), 71.22 (t), 71.11 (t), 70.61 (t), 68.69 (t), 63.35 (d), 61.61 (d), 57.03 (d), 41.09 (t), 40.31 (t), 39.09 (t), 36.75 (t), 29.78 (t), 29.50 (t), 26.87 (t); IR (MeOH) 3355, 2970, 1737 cm-1; C20H29N4O6 NaSBr [M+Na]+について計算したHRMS (ES)555.0889, 実測値555.0905.
【０３５５】
参考例３７：Ｎ−（２−（２−（２−（３，４−ジブロモ−２，５−ジオキソ−ピロール−１−イル）エトキシ）エトキシ）エチル）−５−（２−オキソ−１，３，３ａ，４，６，６ａ−ヘキサヒドロチエノ（３，４−ｄ）イミダゾール−６−イル）ペンタンアミドの調製
【０３５６】
【化５０】
2013501766.tif 000052
【０３５７】
ジブロモマレイン酸無水物（１０８ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ、１当量）を、２−（２−（２−（５−（２−オキソ−１，３，３ａ，４，６，６ａ−ヘキサヒドロチエノ（３，４−ｄ）イミダゾール−６−イル）ペンタノイルアミノ）エトキシ）エトキシ）エチルアンモニウム  ２，２，２−トリフルオロアセテート（２０５ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ、１当量）のＡｃＯＨ（１０ｍＬ）溶液に一度に添加し、反応混合物を１７０℃で２時間加熱した。２１℃まで冷却してトルエンを添加し、ＡｃＯＨを共沸により真空中で除去して（ｘ２）、粗製生成物を得た。カラムクロマトグラフィー（勾配  ２〜７％のＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）により、所望の化合物を白色固体として得た（１２３ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ、４８％収率）。m.p. 100-102℃; [α]D20.0 +71.0 (c 0.15, MeOH); 1H NMR (600 MHz,  CD3OD) δ 4.53 (dd, J = 5.0, 8.0 Hz, 1H, NHC(O)NHCH), 4.34 (dd, J = 5.0, 8.0 Hz, 1H, NHC(O)NHCH), 3.82 (t, J = 5.5 Hz, 2H, OCH2), 3.70 (t, J = 5.5 Hz, 2H, OCH2), 3.63 (m, 2H, OCH2), 3.59 (m, 2H, OCH2), 3.53 (t, J = 5.5 Hz, 2H, NCH2), 3.37 (t, J = 5.5 Hz, 2H, NCH2), 3.24 (dt, J = 5.0, 8.0 Hz, 1H, SCH), 2.96 (dd, J = 5.0, 13.0 Hz, 1H, SCHH), 2.73 (d, J = 13.0 Hz, 1H, SCHH), 2.26 (t, J = 7.5 Hz, 2H, NHC(O)CH2CH2CH2), 1.74 (m, 4H, CH2CH2CH2), 1.49 (クインテット, J = 7.5 Hz, 2H, CH2CH2CH2); 13C NMR (150 MHz, CD3OD) δ 174.83 (s), 164.71 (s), 164.06 (s), 129.00 (s), 69.80 (t), 69.72 (t), 69.24 (t), 67.19 (t), 61.97 (d), 60.22 (d), 55.64 (d), 39.67 (t), 39.03 (t), 38.56 (t), 35.42 (t), 28.39 (t), 28.11 (t), 25.47 (t); IR (MeOH) 2970, 1724, 1365, 1217 cm-1; C20H28N4O6NaSBr2[M+Na]+について計算したHRMS (ES) 631.9916, 実測値631.9937.
【０３５８】
参考例３８：Ｎ−フルオレセインブロモマレイミドの調製
【０３５９】
【化５１】
2013501766.tif 000053
【０３６０】
ジブロモマレイン酸無水物（３４６ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）を、フルオレセインアミン異性体１（６７８ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）の酢酸（６５ｍＬ）溶液に一度に添加し、反応混合物を密封管中で室温で１２時間撹拌した。次いで、反応混合物を１５０℃で３時間加熱した。室温まで冷却して固体を濾過し、乾燥させて（トルエン共沸混合物）、所望の化合物をオレンジ色の固体として得た（７２２ｍｇ、１．４３ｍｍｏｌ、７３％収率）。1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 7.99 (d, 1H, J = 1.7, 1H, H-11), 7.77 (dd, 1H, J = 1.9及び8.2, 1H, H-7), 7.73 (s, 1H, H-3), 7.43 (d, J = 8.2, 1H, H-8), 6.69 (m, 6H, 2 x H-16, 2 x H-17, 2 x H-18); 13C NMR (175 MHz, DMSO) δ 167.93 (C=O), 167.63 (C=O), 164.48 (C=O), 159.62 (2 x C18), 151.79 (2 x C20), 151.52 (C6), 133.68 (C7), 133.02 (Ar), 132.90 (C3),  131.23(C), 129.15 (2 x Ar-H), 126.73 (C), 124.82 (C11), 122.29 (C8), 112.77 (2 x Ar-H), 109.08 (2 x Ar), 102.30 (2 x Ar-H), 83.36 (C14); IR (固体, cm-1) 3064 (w), 1726 (s); MS (ES+) m/z, (相対強度): 508 ([81M], 95), 506([79M], 100); [C24H13O7N79Br] について計算した正確な質量は505.9875を要求、実測値 505.9833 (ES+).
【０３６１】
参考例３９：Ｎ−フルオレセインジブロモマレイミドの調製
【０３６２】
【化５２】
2013501766.tif 000054
【０３６３】
ジブロモマレイン酸無水物（７７．０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を、フルオレセインアミン異性体１（１０５ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）の酢酸（１０ｍＬ）溶液に一度に添加し、反応混合物を室温で６時間撹拌した。次いで固体を濾去し、酢酸エチルで洗浄し、酢酸（１０ｍＬ）中に再溶解した。次いで反応混合物を３時間加熱還流した。室温まで冷却してトルエン（１０ｍｌ）を添加し、溶媒を真空中で除去し、所望の化合物をオレンジ色の固体として得た（１４８ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ、８４％収率）。δ 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.07 (d, 1H, J = 1.5, H-11), 7.81 (dd, 1H, J = 1.5及び8.0, H-7), 7.34 (d, 1H, J = 8.5, H-8), 6.71-6.58 (m, 6H, 6 x Ar-H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 170.23 (C=O), 164.34 (2 x C=O), 161.63 (2 x C), 154.18 (2 x C), 152.93 (C), 134.59 (C), 134.19 (Ar-H), 131.01 (C), 130.35 (Ar-H), 129.25 (2 x C), 126.25 (2 x Ar-H), 123.63 (Ar-H), 113.84 (2 x Ar-H), 111.02 (2 x C), 103.55 (2 x Ar-H); IR (固体, cm-1) 3064 (w), 1732 (s); MS (ES+) m/z, (相対強度): 586 ([81+81M], 30), 584([79+81M], 100), 582([79+79M], 100); [C24H10O7N79Br2] について計算した正確な質量は581.8824を要求、実測値 581.8824 (ES+).
【０３６４】
参考例４０：Ｔｅｒｔ−ブチル  ２−アミノエチルカルバメートの調製
【０３６５】
【化５３】
2013501766.tif 000055
【０３６６】
ＤＣＭ（３０ｍＬ）中のジ−ｔｅｒｔブチルジカーボネート（３．２６ｇ、１５ｍｍｏｌ、１当量）を、オートインジェクターを使用して２時間かけて、アルゴン雰囲気下でエチレンジアミン（１０ｍｌ、１５０ｍｍｏｌ、１０当量）のＤＣＭ（３０ｍＬ）溶液に滴下した。ＴＬＣ分析（溶離液：９０％ＥｔＯＡｃ：１０％ＭｅＯＨ  Ｒｆ（８）＝０．２３）に基づけば、添加終了の３０分後に反応は完了した。ＤＣＭを、Ｂｕｅｃｈｉを使用して減圧下で除去した。得られた残渣をＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）中に取り、飽和Ｎａ２ＣＯ３（３ｘ２０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、真空中で濃縮して、所望の生成物を白色泡状物として得た（２．０８ｇ；１２．９８ｍｍｏｌ、８７％）。 mp (104-106℃), δH 1H NMR (300MHz CDCl3): 4.95 (ブロードシングレット, 1H, NH), 3.12(q, J=6.4Hz, 2H, CH2), 2.78(t, J=5.9Hz, 2H, CH2), 1.42(s, 9H, 3CH3). 13C NMR (CDCl3): 28.06, 41.51, 43.02, 78.82, 155.9 IR: 3354.9cm-1,  [M + H]+: 161.00
【０３６７】
参考例４１：ｔｅｒｔ−ブチル  ２−（５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１−スルホンアミド）エチルカルバメートの調製
【０３６８】
【化５４】
2013501766.tif 000056
【０３６９】
丸底フラスコを火炎乾燥させ、スターラーバー及びアミン（０．５７ｇ、３．６ｍｍｏｌ、１当量）の乾燥ＤＣＭ（１５０ｍＬ）溶液をアルゴン雰囲気下で投入した。乾燥ＤＣＭ（１５０ｍＬ）及びトリエチルアミン（１．３ｍｌ、９．２９ｍｍｏｌ、２．５当量）中のダンシルクロリド（１．０５ｇ、３．９２ｍｍｏｌ、１．１当量）を、隔壁を介して一度に添加した。反応をＴＬＣ（溶離液：３５％ＥｔＯＡｃ：６５％石油エーテル  Ｒｆ（９）＝０．２７，長波ＵＶ下での緑色蛍光）でモニタリングしたところ、反応は４時間後に完了した。カラムクロマトグラフィー（溶離液：３５％ＥｔＯＡｃ：６５％石油エーテル）での精製後、所望の化合物が粘着性の透明な緑色油状物として形成された（１．２４ｇ、３．１５ｍｍｏｌ、８８％）。
δH 1H NMR (CDCl3): 8.55(d, J=8.55Hz, 1H, CH),8.46(d, J=8.51Hz, 1H, CH), 8.33(d, J=8.67Hz, 1H, CH), 7.57(m, 2H, 2xCH), 7.26(d, J=7.08Hz, 1H, CH), 3.07(カルテット, J=6.58Hz, 2H, CH2), 2.89(m, 2H, CH2), 2.85(s, 6H, 2xCH3), 1.35(s, 9H, 3xCH3). 13C NMR (CDCl3): 158.01, 153.05, 136.5, 131.49, 131.09, 130.02, 129.54, 124.48, 120.59, 116.41, 80.41, 45.9, 43.81, 41.5, 28.5. MS: [M + H]+: 393.16.
【０３７０】
参考例４２：５−（３−アミノプロピルスルホニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルナフタレン−１−アミン  ２，２，２−トリフルオロアセテートの調製
【０３７１】
【化５５】
2013501766.tif 000057
【０３７２】
ＢＯＣ−カルバメート（１．２４ｇ、３．１５ｍｍｏｌ）を含むフラスコに、ＴＦＡ（４０ｍｌ）を一度に添加した。得られた灰色溶液を室温（約２５℃）で２時間撹拌した。完了に際し、溶液を真空中で濃縮し、トルエンと共沸混合した（５ｘ１０ｍｌ）。次いで、得られた粗製生成物を、カラムクロマトグラフィー（溶離液：ＥｔＯＡｃ  １：２  石油エーテル  Ｒｆ（１０）＝０．２０）で精製した。適切な画分を真空中で濃縮後、得られた黄色油状物にＤＣＭ（１００ｍｌ）を添加し、溶液を氷浴中に２時間配置したところ、この溶液は、長波ＵＶ下で蛍光性であった。所望の化合物（１．２５ｇ、３．１０ｍｍｏｌ、９７％）は、白色固体として溶液から析出し（ｃｒａｓｈｅｄ）、これを濾去して、重力下でジエチルエーテルで洗浄した。Mp (114-116℃); δH 1H NMR (500MHz MeOD): 8.64(d, J=8.3Hz, 1H, CH), 8.35(d, J=8.45Hz, 1H, CH), 8.32(d, J=8.65Hz, 1H, CH), 7.67(m, 2H, 2xCH), 7.34(d, J=7.3Hz, 1H, CH), 3.03(カルテット, 4H, 2 xCH2), 2.84(s, 6H, 2 x CH3). δc 13C NMR (500 MHz MeOD): 153.41, 135.78,  131.69, 131.32, 130.81, 130.56, 129.48, 124.29, 120.07, 116.635, 66.91, 45.79, 41.27, 40.78, 15.45. 19F NMR( 300 MHz CDCl3); -76.89;  IR: 3092cm-1, 2901.5cm-1 , MS: [M + H]+: 294
【０３７３】
参考例４３：（Ｅ）−２−ブロモ−４−（２−（５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１−スルホンアミド）エチルアミノ）−４−オキソブト−２−エン酸の調製
【０３７４】
【化５６】
2013501766.tif 000058
【０３７５】
オーブン乾燥した５００ｍｌの丸底フラスコにスターラーバーを投入した。アミン塩（１．０９ｇ、）を２５ｍｌ酢酸中に溶解し、フラスコに添加した。得られた淡黄色（ｌｉｇｈｔ  ｙｅｌｌｏｗ）の溶液に、ブロモマレイン酸無水物を添加し、反応をＴＬＣ（溶離液；１０％メタノール：９０％ＥｔＯＡｃ、Ｒｆ（１１）＝０．７）でモニタリングした。室温（２５℃）で１．５時間撹拌した後、酢酸を真空中で除去した。所望の化合物を、さらなる精製なしに使用した。1H NMR (500Mz CDCl3 (粗製)): δH 8.6(d, J=8.56Hz, 1H, CH), 8.35(d, 1H, J=8.27Hz, CH), 8.22(d, 1H, J=8.57Hz, CH), 7.64(m, 2H, 2 x CH), 7.30(d, J=7.60Hz, 1H, CH), 5.48(s, 1H, CH)/5.03(s, 1H, CH), 3.00(m, 4H, 2x CH2), 2.88(s, 9H, 2 x CH3)
【０３７６】
参考例４４：Ｎ−（２−（３−ブロモ−２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）−５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１−スルホンアミドの調製
【０３７７】
【化５７】
2013501766.tif 000059
【０３７８】
この酸を酢酸（２５ｍＬ）中に溶解し、オーブン乾燥した５００ｍｌの丸底フラスコに投入した。コンデンサーを取り付け、反応を２時間還流（１７０℃）下に置いた。次いで酢酸を、真空中で粗製混合物から除去し、得られた油状物をトルエンと共沸混合した（５ｘ１０ｍｌ）。得られた油状物をカラムクロマトグラフィー（溶離液：３０％酢酸エチル：７０％石油エーテル、上記溶離液系においてＲｆ（１２）＝０．２）で精製した。非常にゆっくりしたカラムが完了したところで、さらなる移動画分を収集し、溶媒を除去した。得られた褐色油状物を、氷浴中で１時間、ニート酢酸エチル（５０ｍｌ）中に静置した。所望の生成物（０．９６１ｇ、８０％）は、褐色固体として溶液から析出し（粉末様のテクスチャ）、これを重力下で濾過し、ジエチルエーテル（２０ｍｌ）で洗浄した。 mp (166-170℃); 1H NMR (600 MHz DMSO): δH 8.53(d, J=8.46Hz, 1H, CH), 8.21(d, 1H, J=8.40Hz, CH), 8.17(d, 1H, J=8.58Hz, CH), 7.56(m, 2H, 2 x CH), 7.18(d, J=7.50Hz, 1H, CH), 6.46 (s, 1H, マレイミドオレフィン C-H), 5.11(t, J=6.24,1H, NH), 3.56(m, 2H, CH2), 3.2(m, 2H, CH2), 3.91(s, 6H, 2 xCH3). δC 13C NMR (600 MHz DMSO): 168.62, 165.33, 151.38, 151.38,135.62, 132.33, 130.13, 129.60, 129.09, 128.85, 128.30, 127.96, 123.61, 118.99, 115.22, 45.11, 40.05, 39.37, 38.47.
【０３７９】
参考例４５：４−ブロモ−１，２−ジエチル−１，２−ジヒドロ−ピリダジン−３，６−ジオン（ＢｒＤＤＰＤ）の調製
【０３８０】
【化５８】
2013501766.tif 000060
【０３８１】
モノブロモマレイン酸無水物（１７７ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ’−ジエチルヒドラジン（８８ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）の氷ＡｃＯＨ（３ｍＬ）中混合物を、１３０℃で１６時間加熱した。溶媒を真空中で除去し、粗製残渣をカラムクロマトグラフィー（ニートＣＨ２Ｃｌ２〜５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）で精製して、４−ブロモ−１，２−ジエチル−１，２−ジヒドロ−ピリダジン−３，６−ジオンを黄色固体として得た（１５９ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ、６４％）: 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.31 (s, 1H), 4.14 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 4.07 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 1.26 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 1.22 (t, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 156.2 (s), 154.3 (s), 136.0 (d), 133.7 (s), 41.9 (t), 40.7 (t), 13.3 (q), 13.3 (q); IR (固体) 3058, 2979, 2938, 1631, 1595 cm-1; LRMS (CI) 249 (100, [M81Br+H]+), 247 (100, [M79Br+H]+); C8H12BrN2O2[M+H]+について計算したHRMS (CI) 249.0082, 実測値249.0086.
【０３８２】
参考例４６：４，５−ジブロモ−１，２−ジエチル−１，２−ジヒドロ−ピリダジン−３，６−ジオン（ＤｉＢｒＤＤＰＤ）の調製
【０３８３】
【化５９】
2013501766.tif 000061
【０３８４】
ジブロモマレイン酸無水物（２５６ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ’−ジエチルヒドラジン（８８ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）の氷ＡｃＯＨ（３ｍＬ）中の混合物を、１３０℃で１６時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、粗製残渣をカラムクロマトグラフィー（ニートＣＨ２Ｃｌ２〜５％  ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）で精製して、４，５−ジブロモ−１，２−ジエチル−１，２−ジヒドロ−ピリダジン−３，６−ジオンを黄色固体として得た（２０２ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ、６２％）: 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 4.17 (q, J = 7.0 Hz, 4H), 1.28 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 153.3 (s), 136.1 (s), 42.4 (t), 13.2 (q); IR (固体) 2979, 2937, 1630, 1574 cm-1; LRMS (EI) 328 (50, [M81Br81Br]+・), 326 (100, [M81Br79Br]+・), 324 (50, [M79Br79Br]+・); C8H10Br2N2O2 [M79Br79Br]+・について計算したHRMS (EI) 323.9104, 実測値 323.9097.
【０３８５】
参考例４７：Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｍａｌ）−ＯＭｅの調製
【０３８６】
【化６０】
2013501766.tif 000062
【０３８７】
Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ（３６ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（１３ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）のメタノール（３ｍＬ）中撹拌溶液に、メタノール（３ｍＬ）中のブロモマレイミド（３０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を添加した。１分後、溶媒を真空中で除去した。フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテル中５０％の酢酸エチルから酢酸エチルでの勾配溶出）により、淡黄色粉末Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｍａｌ）−ＯＭｅ（５１ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）が１００％で得られた。 δH (500 MHz, CDCl3) 7.63 (s, 1H, mal-NH), 6.27 (s, 1H, 9-H), 5.40 (d, 1H, J = 6.8, NH), 4.67 (ddd, 1H, J = 5.1, 5.4及び6.8, H-4), 3.80 (s, 3H, H3-6), 3.48 (dd, 1H, J = 5.1及び13.8, HH-7), 3.62 (dd, 1H, J = 5.4及び14.1, HH-7) 1.45 (s, 9H, 3 x H3-1-); δC (125 MHz, CDCl3) 170.2 (C=O), 168.9 (C=O), 167.6 (C=O), 155.2 (C=O), 155.9 (C8), 119.7 (C9), 81.1 (C2), 53.3 (C6), 52.7 (C4), 34.0 (C7), 28.3 (3 x C1); IR (固体, cm-1) 3236 (w), 1715 (s); MS (CI+) m/z, (相対強度): 331 ([M+H], 5), 275 (20), 231 (100); [C13H18O6N2S]+Hについて計算した質量は331.0964を要求、実測値 331.0968 (CI+); 20αD: -41.9o (c = 1.0, メタノール); m.p. 145-147℃; UV (アセトニトリル) ε245 = 14200及びε339= 8600 cm-1M-1d3.
【０３８８】
参考例４８：Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｎ’−Ｍｅ−Ｍａｌ）−ＯＭｅの調製
【０３８９】
【化６１】
2013501766.tif 000063
【０３９０】
Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ（３２ｍｇ、０．１３６ｍｍｏｌ）のメタノール（４ｍＬ）中撹拌溶液に、酢酸ナトリウム（８２ｍｇ、０．４０８ｍｍｏｌ）を添加した。これに、メタノール（４ｍＬ）中のＮ−メチルブロモマレイミド（２５．８ｍｇ、０．１３６ｍｍｏｌ）を、１０分間かけて添加した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテル中１０％の酢酸エチルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、所望の化合物（３９．３ｍｇ、０．１１４ｍｍｏｌ）を青白い粉末として８４％の収率で得た。δH (500MHz, CDCl3) 6.26 (s, 1H, H-9), 5.36 (d, 1H, J = 6.3, ‘Boc’ NH), 4.66 (m, 1H, H-4), 3.79 (s, 3H, H3-6), 3.46 (dd, 1H, J = 5.0及び5.2, HH-7), 3.35 (dd, 1H, J = 5.1及び13.7, HH-7), 3.00 (s, 3H, H3-13), 1.44 (s, 9H, 3 x H3-1); δC (125MHz, CDCl3) 170.2 (C=O), 169.5 (C=O), 167.9 (C=O), 155.0 (C=O), 149.9 (C8), 118.7 (C9), 80.9 (C2), 53.1 (C6), 52.7 (C4), 33.8 (C7), 28.3 (3 x C1), 24.1 (C13); IR (固体, cm-1) 3368 (m), 2977 (m), 1695 (s); MS (ES+) m/z, (相対強度): 311 (M+, 100); C14H20N2O6NaSについて計算した質量は367.0940を要求。実測値: 367.0931; 20αD: -18.55o (c = 1.0, メタノール); m.p. 101-103℃.
【０３９１】
実施例４９：２，３−ジ（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ）スクシンイミド（ジアステレオマーの混合物）の調製
【０３９２】
【化６２】
2013501766.tif 000064
【０３９３】
ブロモマレイミド（５０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）の水性緩衝液（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）：ＤＭＦ、９５：５（９．２５ｍＬ）中撹拌溶液に、ＤＭＦ（０．２５ｍＬ）中のＮ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ（６６０ｍｇ、２．８１ｍｍｏｌ）を添加した。５分後、水性反応混合物を酢酸エチル（３ｘ２５ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を飽和塩化リチウム水溶液（５ｘ２５ｍＬ）、水（２５ｍＬ）及びブライン（２５ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、溶媒を真空中で除去した。カラムクロマトグラフィー（石油エーテル中１０〜４０％の酢酸エチル）による精製により、２，３−ジ（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ）スクシンイミド（ジアステレオマーの混合物）を、黄色ワックス状油状物（１５０ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ、９４％収率）（２つの対称なジアステレオマーの分離不能な１：１混合物）として得た; δH (400 MHz, CDCl3) 8.62 (s, 1H, １つの対称なジアステレオマーからのマレイミド NH), 8.66 (s, 1H, １つの対称なジアステレオマーからのマレイミド NH), 5.62 (d, 2H, J = 8.4, １つの対称なジアステレオマーからの2  x ‘Boc’ NH), 5.51 (d, 2H, J = 8.0, １つの対称なジアステレオマーからの2  x ‘Boc’ NH), 4.72-4.58 (m, 両方のジアステレオマーからの4 x H-4), 3.80 (s, 6H, １つの対称なジアステレオマーからの2 x H3-6), 3.79 (s, 6H, １つの対称なジアステレオマーからの2 x H3-6), 3.68 (s, 2H, １つの対称なジアステレオマーからの2 x H-8), 3.64 (s, 2H, １つの対称なジアステレオマーからの 2 x H-8), 3.46 (dd, 2H, J = 4.8及び12.0 Hz, １つの対称なジアステレオマーからの2 x HH-7*), 3.37 (dd, 2H, J = 6.0及び14.4, １つの対称なジアステレオマーからの2 x HH-7†), 3.21 (dd, 2H, J = 4.8及び14.0 Hz, １つの対称なジアステレオマーからの2 x HH-7†), 3.11 (dd, 2H, J = 6.4及び14.0 Hz, １つの対称な ジアステレオマーからの2 x HH-7*), 1.463 (s, 18H, １つの対称なジアステレオマーからの6 x H3-1), 14.460 (s, 18H, １つの対称な ジアステレオマーからの6 x H3-1);
*-HMQCデータにより同じABシステムの一部として示されるシグナル
†-HMQCデータにより同じABシステムの一部として示されるシグナル
δC (125 MHz, CDCl3) 174.32 (2 x C=O), 171.25 (2 x C=O), 155.33 (2 x C=O), 80.61 (2 x C2), 80.58 (2 x C2), 53.51 (2 x C4), 53.18 (2 x C4), 52.91 (2 x C6), 52.90 (2 x C6), 48.45 (2 x C8), 47.89 (2 x C8), 34.66 (2 x C7), 34.59 (2 x C7), 28.37 (6 x C1), 28.36 (6 x C1)いくつかの炭素シグナルは、ジアステレオマーの重複に起因して欠落している; IR (薄膜、ニート) 3348, 2978, 1719 cm-1; MS (EI) m/z (相対強度): 566 ([M+H], 20), 564 ([M-H], 100); [C22H35N3O10S2]-Hについて計算した正確な質量は564.1669を要求、実測値 564.1686.
【０３９４】
参考例５０：Ｎ−Ａｃ−Ｃｙｓ（Ｍａｌ）−ベンジルアミンの調製
【０３９５】
【化６３】
2013501766.tif 000065
【０３９６】
メタノール（４２ｍＬ）中のＮ−Ａｃ−Ｃｙｓ−ベンジルアミン（１．００ｇ、４．００ｍｍｏｌ）上記）に、メタノール（４２ｍＬ）中のブロモマレイミド（７７７ｍｇ、４．３７ｍｍｏｌ）を５分間かけて滴下した。１０分後、溶媒を真空中で除去し、残渣を、石油エーテル中１０％の酢酸エチルを使用するフラッシュクロマトグラフィーに供して、所望の化合物（４２９ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）をオフホワイトの固体として、ブロモマレイミドの６９％の回収率に基づき１００％の収率で得た。 δH (500 MHz, MeOD) 7.32-7.20 (m, 5H, 5 x Ar-H), 6.45 (s, 1H, H-12), 4.71 (t, 1H, J = 7.3, H-3), 4.38 (d, 2H, J = 2.7, H2-5), 3.40 (dd, 1H, J = 7.0及び13.6, HH-10), 3.25 (dd, 1H, J = 7.2及び13.6, HH-10), 1.99 (s, 3H, H3-1); δC (125 MHz, MeOD) 173.51 (C=O), 172.22 (C=O), 171.44 (C=O), 170.51 (C=O), 151.58 (C11), 139.48 (C6), 129.54 (2 x Ar-H), 128.51 (2 x Ar-H), 128.26 (C9), 121.01 (C12) 53.04 (C3), 44.25 (C5), 33.72 (C10), 22.42 (C1); IR (薄膜, cm-1) 3187 (w), 1717 (s), 1646 (s); MS (ES+) m/z (相対強度): 370 ([M+Na], 20), 337 (50), 325 (90), 309(100); [C16H17N3O4SN]+Naについて計算した正確な質量はm/z 370.0873を要求、実測値 370.0852 (ES+); UV (アセトニトリル) ε213= 19400, ε247 = 4800及びε337 = 2700 cm-1M-1d3; 白色固体は180℃で分解する。
【０３９７】
参考例５１：Ｎ−メチルヘキシルスルファニルマレイミドの調製
【０３９８】
【化６４】
2013501766.tif 000066
【０３９９】
メタノール（１５ｍＬ）中のＮ−メチルブロモマレイミド（１００ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム三水和物（７０ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）に、メタノール（１００ｍＬ）中のヘキサンチオール（７４μＬ、０．５８ｍｍｏｌ）を、激しく撹拌しながら１時間かけて滴下した。５分後、溶媒を真空中で除去した。カラムクロマトグラフィー（石油エーテル中１０％の酢酸エチルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）での精製により、所望の化合物（９９ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を、鮮黄色の固体として、８３％の収率で得た。δH (600 MHz, CDCl3) 6.03 (s, 1H, H-2), 3.01 (s, 3H, H3-5), 2.89 (t, 2H, J = 7.6, 2H, H2-11), 1.76-1.71 (m, 2H, H2-10), 1.46-1.41 (m, 2H, H2-9), 1.33-1.27 (m, 4H, H2-7及びCH2-8), 0.89 (t, 3H, J = 6.5, H3-6); δC (125 MHz, CDCl3) 171.47 (C=O), 169.94 (C=O), 151.84 (C3), 117.27 (C2), 31.92 (C11), 31.31 (CH2), 28.64 (CH2), 27.75 (CH2), 24.10 (C5), 24.10 (C7), 14.09 (C6); IR (油, cm-1) 2727 (w), 1708 (s); MS (FAB+) m/z (相対強度): 250 ([M+Na], 40), 228 (35), 199 (30), 176 (100); [C11H17NO2S]+Naについて計算した正確な質量はm/z 250.0878を要求、実測値 250.0880 (FAB+)
【０４００】
参考例５２：２，３  ジヘキシルスルファニルスクシンイミド及びヘキシルスルファニルマレイミドの調製
【０４０１】
【化６５】
2013501766.tif 000067
【０４０２】
方法Ａ
メタノール（６０ｍＬ）中のブロモマレイミド（３００ｍｇ、１．６９ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（１３８ｍｇ、１．６９ｍｍｏｌ）に、ヘキサンチオール（３５６μＬ、２．５０ｍｍｏｌ）を添加した。５分後、溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル中１０％の酢酸エチル）による精製により、２，３  ジヘキサンチオスクシンイミド（１３ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を鮮黄色のペーストとして２％の収率で得、ヘキシルスルファニルマレイミド（アルケン３１０ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）をクリーム色の粉末として８６％の収率で得た。
【０４０３】
２，３  ジヘキシルスルファニルスクシンイミド
δH (500 MHz, CDCl3) 8.21 (s, 1H, NH), 3.49 (s, 2H, 2 x H-7), 2.89-2.83 (m, 2H, 2 x HH-6), 2.79-2.83 (m, 2H, 2 x HH-6), 1.71-1.57 (m, 4H, 2 x CH2), 1.44-1.37 (m, 4H, 2 x CH2), 1.34-1.26 (m, 8H, 4 x CH2), 0.89 (t, 6H, J = 6.8, 2 x H3-1); δC (125 MHz, CDCl3) 174.60 (2 x C=O), 48.23 (2 x C7), 32.34 (2 x CH2), 31.26 (2 x CH2), 28.99 (2 x CH2) 28.46 (2 x CH2), 22.56 (2 x CH2), 14.27 (2 x C1-); IR (固体, cm-1) 3198 (m), 2928 (m), 1703 (s); 質量イオンは見出されず。
【０４０４】
ヘキシルスルファニルマレイミド
δH (500 MHz, CDCl3) 7.35 (s, 1H, NH), 6.04 (s, 1H, H-8), 2.91 (t, 2H, H2-6), 1.78-1.72 (m, 2H, H2-5), 1.48-1.42 (m, 2H, CH2), 1.33-1.30 (m, 4H, 2 x CH2), 0.90 (t, 3H, J = 6.9, H3-1); δC (125 MHz, CDCl3) 169.06 (C=O), 167.69 (C=O), 152.74 (C7), 118.24 (C8), 32.06 (C6), 31.26 (CH2), 28.58 (CH2), 27.70 (CH2), 22.52 (CH2), 14.03 (C1); IR (固体, cm-1) 3200 (m), 2918 (m), 1703 (s); MS (ES-) m/z (相対強度): 212 ([M-H], 100); [C10H15NO2S]-Hについて計算した正確な質量はm/z 212.0745を要求、実測値 212.0753 (ES-); m.p. 99-101oC; UV (アセトニトリル) ε247 = 12000及びε347 = 9500 cm-1M-1d3.
【０４０５】
方法Ｂ
メタノール（１００ｍＬ）中のブロモマレイミド（３００ｍｇ、１．６９ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（１３８ｍｇ、１．６９ｍｍｏｌ）に、ヘキサンチオール（２３７μＬ、１．６９ｍｍｏｌ）を添加した。５分後、溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル中１０％の酢酸エチル）による精製により、ヘキシルスルファニルマレイミド（３６２ｍｇ、１．６９ｍｍｏｌ）をクリーム色の粉末として１００％の収率で得た。
【０４０６】
参考例５３：Ｎ−メチレンシクロヘキサンヘキシルスルファニルマレイミドの調製
【０４０７】
【化６６】
2013501766.tif 000068
【０４０８】
メタノール（５０ｍＬ）中のＮ−メチレンシクロヘキサンブロモマレイミド（５０ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）に、メタノール（５０ｍＬ）中のヘキサンチオール（５２μＬ、０．３７ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（５０ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）を、５分間かけて滴下した。１０分後、溶媒を真空中で除去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル）に供して、所望の化合物（２９ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）をオフホワイトの固体として８４％の収率で得た。δH (600 MHz, CDCl3) 6.01 (s, 1H, H-3), 6.27 (s, 1H, 9-H), 3.42 (d, 1H, J = 6.8, NH), 4.67 (ddd, 1H, J = 5.1, 5.4及び6.8, H-4), 3.80 (s, 3H, H3-6), 3.48 (dd, 1H, J = 5.1及び13.8, HH-7), 3.62 (dd, 1H, J = 5.4及び14.1, HH-7) 1.45 (s, 9H, 3 x H3-1); δC (125 MHz, CDCl3) 170.23 (C=O), 16844 (C=O), 151.49 (C2), 117.08 (C3), 44.36 (C16), 37.00 (C15), 31.91 (2 x CH2), 31.32 (2 x CH2), 30.73 (CH2), 28.66 (CH2), 27.78 (CH2), 26.33 (CH2), 25.73 (2 x CH2), 22.58 (CH2), 14.10 (C6); IR (固体, cm-1) 2927 (m), 1700 (s); MS (ES+) m/z, (相対強度): 310 ([M+H], 100), 180 (40); [C17H27O2NS]+Hについて計算した質量は310.1841 を要求、実測値 310.1828 (ES+).
【０４０９】
参考例５４：３−メルカプトプロピルチオマレイミド及び１，５−ジチオ−８−アザ−ビシクロ［５，３，０］デカン−７，９−ジオンの調製
【０４１０】
【化６７】
2013501766.tif 000069
【０４１１】
メタノール（６ｍＬ）中のブロモマレイミド（３０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（１４ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）に、１，３−プロパンジチオール（１７μｌ、０．１７ｍｍｏｌ）を添加した。５分後、溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル中１０％の酢酸エチル）による精製により、３−メルカプトプロピルチオマレイミド及び１，５−ジチオ，８−アザ−ビシクロ［５，３，０］デカン−７，９−ジオンを、２つの分離不能な異性体の混合物である淡黄色粉末として、３−メルカプトプロピルチオマレイミド（７ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を２１％の収率で、１，５−ジチオ，８−アザ−ビシクロ［５，３，０］デカン−７，９−ジオン（１２ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）を３４％の収率で得た。δH (500 MHz, MeOD) 6.28 (s, 1H, H-5), 4.41 (s, 3.2H, 2 x H-10), 3.15 (t, 2H, J = 7.3, H2-3), 2.82-2.77 (m, 3.2H, CH2), 2.35 (t, 3.2H, J = 13.1, CH2), 2.30-2.25 (m, 2H, CH2), 2.20-2.13 (m, 2H, CH2), 1.91-1.83 (m, 3.2H, CH2); δC (125 MHz, MeOD) 177.79 (2 x C11), 172.33 (C=O), 170.56 (C=O), 152.37 (C4), 120.30 (C5), 54.52 (2 x C10), 34.94 (2 x C9), 32.16 (CH2), 31.10 (CH2) 30.96 (CH2), 27.49 (CH2); IR (固体, cm-1) 3246 (m), 1703 (s); MS (ES-) m/z (相対強度): 202 ([M-H], 100); [C7H9NO2S2]-H について計算した正確な質量はm/z 201.9996を要求、実測値 201.9996 (ES-). 
【０４１２】
参考例５５：Ｎ−フェニルヘキシルスルファニルマレイミドの調製
【０４１３】
【化６８】
2013501766.tif 000070
【０４１４】
メタノール（６０ｍＬ）中のヘキサンチオール（１１１μＬ、０．７９ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム三水和物（１０８ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）に、メタノール（６０ｍＬ）中のＮ−フェニルモノブロモマレイミド（２００ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）を、激しく撹拌しながら１時間かけて滴下した。５分後、溶媒を真空中で除去した。カラムクロマトグラフィー（石油エーテル中１０％の酢酸エチルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）での精製により、所望の化合物（１０９ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）を淡黄色固体として４８％の収率で得た。 δH (600 MHz, CDCl3) 7.45 (dd, 2H, J = 7.1及び8.0, 2 x H-12), 7.36 (d, 2H, J = 6.0,  H-11), 7.35 (d, 2H, J = 8.1, 2 x H-13), 6.19 (s, 1H, H-2), 2.96 (t, 2H, J = 7.9, H2-10), 1.81-1.76 (m, 2H, H2-9), 1.50-1.45 (m, 2H, H2-8), 1.34-1.32 (m, 4H, H2-6及びH2-7), 0.91 (t, 3H, J = 6.9, H3-5); δC (125 MHz, CDCl3) 168.59 (C=O), 166.96 (C=O), 152.20 (C3), 131.53 (C14), 129.21 (2 x Ar-H), 127.93 (C11), 126.09 (2 x Ar-H), 117.24 (C2),  32.03 (C10), 31.33 (CH2), 28.68 (CH2), 27.78 (CH2), 22.59 (CH2), 14.11 (C5); IR (油, cm-1) 2931 (w), 1703 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 290 ([M+H], 100); [C16H20NO2S]+H について計算した正確な質量はm/z 290.1215を要求、実測値 290.1224 (CI+); 
【０４１５】
参考例５６：フェニルチオマレイミドの調製
【０４１６】
【化６９】
2013501766.tif 000071
【０４１７】
メタノール（３０ｍＬ）中のチオフェノール（５７μＬ、０．５６ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム三水和物（１３６ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）に、メタノール（３０ｍＬ）中のモノブロモマレイミド（１００ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）を、激しく撹拌しながら１時間かけて滴下した。５分後、溶媒を真空中で除去した。カラムクロマトグラフィー（石油エーテル中１０％の酢酸エチルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）での精製により、所望の化合物（２２ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を淡黄色固体として１９％の収率で得た。δH (600 MHz, CDCl3) 7.56 (dd, 2H, J = 1.6及び7.8, 2 x H-7), 7.50-7.48 (m, 3H, 3 x Ar), 5.63 (s, 1H, H-2); δC (125 MHz, CDCl3) 169.42 (C=O), 167.98 (C=O), 153.60 (C3), 134.45 (2 x Ar-H), 130.68 (C5), 130.42 (2 x Ar-H), 127.27 (C8), 119.91 (C2); IR (油, cm-1) 3265 (m), 1770 (m), 1701 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 206 ([M+H], 100), 111 (40); [C10H7NO2S]+Hについて計算した正確な質量はm/z 206.0276を要求、実測値 206.0273 (CI+); 
【０４１８】
参考例５７：１，４−ジチア−７−アザ−スピロ［４．４］ノナン−６，８−ジオンの調製
【０４１９】
【化７０】
2013501766.tif 000072
【０４２０】
メタノール（６ｍＬ）中のブロモマレイミド（３０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（１４ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）に、１，２−エタンジチオール（１７μｌ、０．１７ｍｍｏｌ）を添加した。５分後、溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル中１０％の酢酸エチル）による精製により、所望の化合物（１３ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）を淡黄色粉末として４１％の収率で得た。 δH (500 MHz, CDCl3) 8.39 (s, 1H, NH), 3.75-3.69 (m, 2H, HH-2及びHH-3), 3.60-3.53 (m, 2H, HH-2及びHH-3), 3.30 (s, 2H, H2-9); δC (125 MHz, CDCl3) 177.93 (C=O), 172.76 (C=O), 61.23 (C5), 43.12 (C9), 41.05 (C2及びC3); IR (固体, cm-1) 3290 (m), 1703 (m), 1629 (s); MS (ES-) m/z (相対強度): 188 ([M-H], 100); [C6H7NO2S2]-Hについて計算した正確な質量はm/z 187.9840を要求、実測値 187.9839 (ES-); m.p. 112-115℃.
【０４２１】
参考例５８：（Ｓ）−メチル  ２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−３−（１−（２−（５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１−スルホンアミド）エチル）−２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イルチオ）プロパノアートの調製
【０４２２】
【化７１】
2013501766.tif 000073
【０４２３】
ヒートガンを使用して撹拌溶液を短時間加熱することにより、ダンシル−ブロモマレイミド（１００ｍｇ）をメタノール（２００ｍｌ）中に溶解した。得られた淡黄色溶液に、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ（２２μｌ、０．１ｍｍｏｌ、０．５当量）及び酢酸ナトリウム（１４．５ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、０．５当量））を、３時間かけて添加した。反応をＴＬＣ（溶離液：４０％ＥｔＯＡｃ：６０％石油エーテル）でモニタリングした。添加が完了したところでメタノールを真空中で除去して、黄色油状物を得た。カラムクロマトグラフィーでの精製により、所望の生成物を得た（４８．２９ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、７９．７％）。 1H NMR (600MHz CDCl3): δH 8.54(d, J=8.56Hz, 1H, CH), 8.21(d, 1H, J=8.27Hz, CH), 8.13(d, 1H, J=8.57Hz, CH), 7.55(m, 2H, 2 x CH), 7.25(d, J=7.60Hz, 1H, CH), 5.92(s, 1H, CH), 4.44(m, 1H, HN-CH-CO), 3.77(s, 3H, OMe), 3.48(m, 2H, CH2), 3.44(m, 2H, CH2), 3.38(s, 6H, 2 xCH3), 3.13(t, J=5.79, 2H, S-CH2) 2.88(s, 9H, 3 x CH3). 13C NMR (600MHz CDCl3): 173.08, 170.52, 169.69, 168.96 (4x C=O), 157.73 (-C=CH), 153.16, 150.71, 136.48, 131.39, 131.25, 131.18, 130.74, 130.65, 129.31, 124.35, 120.61, 119.22, 81.12, 53.58, 52.95, 45.89, 41.53, 33.98, 28.66. IR: 3324.7 cm-1, 1775 cm-1. [M + H]+: 605.1756, 計算値; 605.1740
【０４２４】
参考例５９：（２Ｒ，２’Ｒ）−ジメチル  ３，３’−（１−（２−（５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１−スルホンアミド）エチル）−２，５−ジオキソピロリジン−３，４−ジイル）ビス（スルファンジイル）ビス（２−（ｔブトキシカルボニルアミノ）プロパノアート）の調製
【０４２５】
【化７２】
2013501766.tif 000074
【０４２６】
ダンシル／マレイミド／システイン付加物（１５ｍｇ、０．０２４７ｍｍｏｌ、１当量）をメタノール（１００ｍｌ）中に溶解した。得られた透明溶液に、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ（３．１μｌ、０．０２４７ｍｍｏｌ、１当量）を１時間かけて添加した。反応をＴＬＣ（溶離液：４０％ＥｔＯＡｃ：６０％石油エーテル）でモニタリングした。反応が完了したところで、メタノールを真空中で除去し、所望の生成物を得た（１２．５１ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、６０％）。 1H NMR (600MHz CDCl3): δH 8.44(d, J=8.56Hz, 1H, CH), 8.13(m, 2H, 2 x CH), 7.49(m, 2H, 2x CH), 7.17(m, 2H, 2 x CH), 4.49(bs,1H, HN-CH-CO), 3.77(s, 3H, OMe), 3.48(m, 2H, CH2), 3.44(m, 2H, CH2), 3.38(s, 6H, 2 xCH3), 3.13(t, J=5.79, 2H, S-CH2) 2.88(s, 9H, 3 x CH3).
【０４２７】
参考例６０：ジ−ダンシル−シスタミン−マレイミドの調製
【０４２８】
【化７３】
2013501766.tif 000075
【０４２９】
丸底フラスコに、ジ−ダンシルシスタミン（１００ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、ＴＣＥＰ（４６ｍｇ、１当量）及びＭｅＯＨ（１０ｍｌ）を投入した。反応混合物をアルゴン下周囲温度で３時間撹拌した。次いで、ＭｅＯＨ（５ｍｌ）中のジブロモマレイミド（３６ｍｇ、０．９当量）を反応混合物に添加した。３０分後、ＮａＯＡｃ（５６ｍｇ、４当量）を反応混合物に添加し、溶媒を真空中で留去した。残渣をＤＣＭ及びブラインでワークアップした。有機層を合わせ、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空中で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、０〜２０％のＥｔＯＡｃ−ＤＣＭ）による精製により、所望の化合物を黄色ゴムとして得た（４０ｍｇ、４０％）。 1HNMR (CDCl3, 600MHz), δ8.5 (2H, d J 8.5 Hz 芳香族H), δ8.2 (4H, m 芳香族H), δ7.53 (1H, s CONH), δ7.46 (4H, m, 芳香族H), δ7.1 (2H, d, J 7.4 Hz 芳香族H), δ5.65 (2H, t, J 6.27 SO2NH), δ3.3 (4H, t, J 6.0 SCH2), δ3.17 (4H, q, J 6.0 NHCH2), δ2.8 (12H, s NCH3); 13CNMR (CDCl3, 150MHz), δ165.9, 152.0, 136.5, 134.7, 130.7, 129.94, 129.85, 129.62, 129.57, 128.63, 123.3, 118.8, 115.4, 45.5, 43.6, 31.8; IR (cm-1) 3288 (br) 1720 (s) MS (Na+) m/z 相対強度: 736 (M, 100); [C32H35N5O6NaS4]について計算した正確な質量はm/z 736.1368を要求、実測値 736.1390 (Na+).
【０４３０】
参考例６１：ブロモ−ダンシル−シスタミン−マレイミドの調製
【０４３１】
【化７４】
2013501766.tif 000076
【０４３２】
丸底フラスコに、ジ−ダンシルシスタミン（４８ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）、ＴＣＥＰ（２３ｍｇ、１当量）及びＭｅＯＨ（１０ｍｌ）を投入した。反応混合物を、アルゴン下周囲温度で３時間撹拌した。ＭｅＯＨ（１０ｍｌ）中のジブロモマレイミド（４１ｍｇ、２当量）を反応混合物に添加した。１６時間後、反応混合物を真空中で濃縮した。残渣をＤＣＭ及びブラインでワークアップした。有機層を合わせ、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、０〜１５％のＥｔＯＡＣ−ＤＣＭ）で精製して、所望の化合物を得た（１７ｍｇ、２２％）。 1HNMR (CDCl3, 600MHz), δ8.5 (1H, d J 8.5 Hz 芳香族H), δ8.2 (2H, m 芳香族H), δ7.6 (1H, s CONH), δ7.53 (2H, m, 芳香族H), δ7.15 (1H, d, J 7.4 Hz 芳香族H), δ5.30 (1H, t, J 5.6 SO2NH), δ3.38 (2H, t, J 6.3 SCH2), δ3.26 (2H, q, J 6.3 NHCH2), δ2.88 (6H, s NCH3); 13CNMR (CDCl3, 150MHz), δ165.5, 162.9, 152.2, 142.5, 134.5, 130.95, 129.94, 129.92, 129.5, 128.7, 123.3, 119.0, 118.5, 115.4, 45.5, 43.7, 30.5; IR (cm-1) 3295 (br) 1726 (s) MS (ES+) m/z 相対強度: 485 (M, 100); [C18H19N3O4S2Br]について計算した正確な質量はm/z 484.0000を要求、実測値 783.9982.
【０４３３】
参考例６２：ダンシル−シスタミン−マレイミドの調製
【０４３４】
【化７５】
2013501766.tif 000077
【０４３５】
丸底フラスコに、ジ−ダンシルシスタミン（１００ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、ＴＣＥＰ（４６ｍｇ、１当量）及びＭｅＯＨ（１０ｍｌ）を投入した。反応混合物を、アルゴン下周囲温度で３時間撹拌した。ＭｅＯＨ（５ｍｌ）中のブロモマレイミド（５６ｍｇ、２当量）を反応混合物に添加した。１６時間後、反応混合物を真空中で濃縮した。残渣をＤＣＭ及びブラインでワークアップした。有機層を合わせ、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、０〜３０％のＥｔＯＡＣ−ＣＨＣｌ３）で精製して、所望の化合物（７３ｍｇ、５５％）を得た。 1HNMR (CDCl3, 600MHz), δ8.5 (1H, d J 8.5 Hz 芳香族H), δ8.2 (2H, m 芳香族H), δ8.1 (1H, s CONH), δ7.5 (2H, m, 芳香族H), δ7.15 (1H, d, J 7.5 Hz 芳香族H), δ6.0 (1H, s, CO2CH) δ5.89 (1H, t, J 6.4 SO2NH), δ3.20 (2H, q, J 6.7 NHCH2), δ3.99 (2H, t, J 6.9 SCH2), δ2.86 (6H, s NCH3); 13CNMR (CDCl3, 150MHz), δ169.6, 168.0, 152.0, 150.7, 134.4, 131.0, 129.9, 129.7, 129.5, 128.8, 123.4, 119.3, 118.7, 115.6, 45.5, 41.0, 31.8; IR (cm-1) 3277 (br) 1720 (s) MS (ES-) m/z 相対強度: 404 (M, 100); [C18H18N3O4S2] について計算した正確な質量はm/z 404.0739を要求、実測値 404.0733.
【０４３６】
参考例６３：Ｎ−プロピオン酸−メチル−エステル−ジ−ダンシル−シスタミン−マレイミドの調製
【０４３７】
【化７６】
2013501766.tif 000078
【０４３８】
丸底フラスコに、ジ−ダンシルシスタミン（１３２ｍｇ、０．２１４ｍｍｏｌ）、ＴＣＥＰ（６１ｍｇ、１当量）及びＭｅＯＨ（１０ｍｌ）を投入した。反応混合物を、アルゴン下周囲温度で３時間撹拌した。次いで、ＭｅＯＨ（５ｍｌ）中のジブロモマレイミド（７０ｍｇ、１当量）を反応混合物に添加した。３０分後、ＮａＯＡｃ（８８ｍｇ、５当量）を反応混合物に添加し、溶媒を真空中で留去した。残渣をＤＣＭ及びブラインでワークアップした。有機層を合わせ、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空中で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、０〜２０％のＥｔＯＡｃ−ＤＣＭ）による精製により、所望の化合物を黄色ゴムとして得た（３２ｍｇ、２０％）。1HNMR (CDCl3, 300MHz), δ8.5 (2H, d J 8.5 Hz 芳香族H), δ8.2 (4H, m 芳香族H), δ7.53 (1H, s CONH), δ7.45 (4H, m, 芳香族H), δ7.1 (2H, d, J 7.5 Hz 芳香族H), δ5.7 (2H, t, J 6.1 SO2NH), δ3.75 (2H, t, J 7.0 CONCH2), δ3.6(3H, s, OCH3), δ3.2 (4H, m, SCH2), δ3.18 (4H, m, NHCH2), δ2.9 (12H, s, NCH3), δ2.6 (2H, t, J 7.1 NHCH2) ; 13CNMR (CDCl3, 75MHz), δ171.3, 165.9, 135.8, 134.8, 130.5, 129.8, 129.5, 129.4, 128.4, 123.3, 119.0, 115.3, 51.9, 45.5, 43.5, 34.3, 32.6 31.9; IR (cm-1) 3295 (br) 2948 (br) 1702 (s) MS (ES-) m/z 相対強度: 798 (M, 100); [C36H40N5O8S4] について計算した正確な質量はm/z 798.1760を要求、実測値 798.1715.
【０４３９】
参考例６４：Ｎ−プロピオン酸−メチル−エステル−ブロモ−ダンシル−シスタミン−マレイミドの調製
【０４４０】
【化７７】
2013501766.tif 000079
【０４４１】
丸底フラスコに、ジ−ダンシルシスタミン（６６ｍｇ、０．１０７ｍｍｏｌ）、ＴＣＥＰ（３１ｍｇ、１当量）及びＭｅＯＨ（１０ｍｌ）を投入した。反応混合物を、アルゴン下周囲温度で３時間撹拌した。次いで、ＭｅＯＨ（５ｍｌ）中のジブロモマレイミド（７０ｍｇ、０．５当量）を反応混合物に添加した。１６時間後、ＮａＯＡｃ（８８ｍｇ、５当量）を反応混合物に添加し、溶媒を真空中で留去した。残渣をＤＣＭ及びブラインでワークアップした。有機層を合わせ、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空中で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、０〜２％のＭｅＯＨ−ＣＨＣｌ３）による精製により、所望の化合物を黄色ゴムとして得た（２０ｍｇ、１６％）。 1HNMR (CDCl3, 300MHz), δ8.5 (1H, m, 芳香族H), δ8.2 (2H, m 芳香族H), δ7.5 (2H, m, 芳香族H), δ7.2 (1H, d, J 7.5 Hz 芳香族H), δ5.2 (1H, t, J 6.1 SO2NH), δ3.8 (2H, t, J 7.0 CONCH2), δ3.7(3H, s, OCH3), δ3.4 (2H, m, SCH2), δ3.3 (2H, m, NHCH2), δ2.9 (6H, s, NCH3), δ2.6 (2H, t, J 7.1 NHCH2) ; 13CNMR (CDCl3, 75MHz), δ170.95, 165.5, 163.3, 141.6, 134.5, 130.8, 129.8, 129.5, 128.5, 123.2, 118.6, 115.3, 52.0, 45.4, 43.6, 34.8, 32.5 30.6; IR (cm-1) 3296 (br) 2948 (br) 1713 (s)
【０４４２】
参考例６５：Ｎ−ジエチレン−グリコール−モノメチル−エーテル−ジ−ダンシル−シスタミン−マレイミドの調製
【０４４３】
【化７８】
2013501766.tif 000080
【０４４４】
丸底フラスコに、ジ−ダンシルシスタミン（１５５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＣＥＰ（７２ｍｇ、１当量）及びＭｅＯＨ（１０ｍｌ）を投入した。反応混合物を、アルゴン下周囲温度で３時間撹拌した。次いで、ＭｅＯＨ（５ｍｌ）中のＰＥＧ−ジブロモマレイミド（１００ｍｇ、１当量）を反応混合物に添加した。１６時間後、ＮａＯＡｃ（１０２ｍｇ、５当量）を反応混合物に添加し、溶媒を真空中で留去した。残渣をＤＣＭ及びブラインでワークアップした。有機層を合わせ、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空中で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、０〜１０％のＴＨＦ−ＤＣＭ）による精製により、所望の化合物を黄色ゴムとして得た（１３ｍｇ、６％）。 1HNMR (MeOH, 300MHz), δ8.5 (2H, m, 芳香族H), δ8.3 (2H, m 芳香族H), δ8.13 (2H, m, 芳香族H), δ7.5 (4H, m, 芳香族H), δ7.2 (2H, m, 芳香族H), δ3.5 (12H, m, CONCH2, OCH2), δ3.3(3H, s, OCH3), δ3.1 (8H, m, SCH2, NHCH2), δ2.8 (12H, s, NCH3); 13CNMR (CDCl3, 150MHz), δ167.4, 153.2, 136.9, 136.2, 131.3, 131.2, 130.9, 130.2, 129.6, 124.3, 120.5, 116.4, 72.9, 71.4, 71.3, 71.1, 68.7, 59.1, 45.8, 44.5, 38.98, 36.97; IR (cm-1) 3323 (br) 2946 (br) 2946 (s) 1017 (s) MS (Na+) m/z 相対強度: 882 (M, 100); [C39H49N5O9NaS4] について計算した正確な質量はm/z 882.2311を要求、実測値 882.2294 (Na+).
【０４４５】
参考例６６：Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｍａｌ）−Ｇｌｙの調製
【０４４６】
【化７９】
2013501766.tif 000081
【０４４７】
メタノール（３ｍＬ）中のグルタチオン（４７ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）に、メタノール（３ｍＬ）中のブロモマレイミド（３０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を添加した。５分後、溶媒を真空中で除去して、所望の化合物（６２ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を粘度のある無色油状物として１００％の収率で得た。δH  (500 MHz, MeOD) 6.47 (s, 1H, H-12), 4.79 (dd, 1H, J = 5.7及び8.2, H-6), 4.06 (t, 1H, J = 6.5, H-2), 3.95 (s, 2H, H2-8), 3.49 (dd, 1H, J = 5.8及び13.9, HH-10), 3.29 (dd, 1H, J = 8.3及び13.6, HH-10), 2.61 (t, 2H, J = 7.1, H2-4), 2.29-2.15 (m, 2H, H2-3);  δC(125 MHz, MeOD) 174.68 (C=O), 172.81 (C=O), 172.39 (C=O), 171.89 (C=O), 171.62 (C=O), 170.59 (C=O), 151.75 (C11), 120.91 (C12), 53.79 (C6), 52.76 (C2), 42.01 (C8), 33.92 (C10) 32.42 (C4), 27.03 (C3); IR (油, cm-1) 3259 (m), 2928 (m), 1717 (s); MS (ES-) m/z (相対強度): 401 ([M-H], 100), 272 (30); [C14H18N4O8S]-Hについて計算した正確な質量はm/z 401.0767を要求、実測値 401.0773 (ES-); UV (アセトニトリル) ε204= 8100, ε253 = 5600及びε342 = 1900 cm-1M-1d3.
【０４４８】
参考例６７：Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（ＭｅＭａｌ）−Ｐｈｅ−ｉＰｒの調製の調製
【０４４９】
【化８０】
2013501766.tif 000082
【０４５０】
Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート（３４４ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ）を、（２Ｒ）−２−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−３−［（１−メチル−２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル）スルファニル］プロパン酸（３１３ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（１３９ｍｇ）のＤＭＦ（２ｍＬ）中撹拌溶液に添加し、反応を２１℃で３分間撹拌した。（２Ｓ）−１−オキソ−３−フェニル−１−（プロパン−２−イルアミノ）プロパン−２−アンモニウム  トリフルオロアセテート（２６２ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１．５ｍＬ）中溶液を反応混合物に添加し、その後、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２９４μＬ、１．６４ｍｍｏｌ）を添加し、反応を２１℃で４時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、残渣をＥｔＯＡｃ（６０ｍＬ）中に溶解し、１Ｍ  ＨＣｌ（ｘ３）、Ｈ２Ｏ（ｘ１）、飽和ＮａＨＣＯ３（ｘ３）、１０％ＬｉＣｌ（ｘ１）及び飽和ＮａＣｌ（ｘ１）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、溶媒を真空中で除去した。沈殿（ＣＨＣｌ３／石油エーテル  ４０〜６０）での精製により、所望の化合物を淡褐色固体として得た（３５９ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ、８４％収率）: 1H NMR (600 MHz, CD3CN, 25℃) δ 7.32-7.28 (m, 2H), 7.25-7.21 (m, 3H), 7.11 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 6.46 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 4.46 (td, J = 7.6, 6.5 Hz, 1H), 4.31 (td, J = 7.3, 6.4 Hz), 3.88 (ダブレットのセプテット, J = 6.6, 6.3 Hz, 1H), 3.30 (dd, J = 13.7, 5.8 Hz, 1H), 3.16 (dd, J = 13.7, 7.4 Hz, 1H), 2.95 (dd, J = 13.8, 7.5 Hz, 1H), 2.93 (s, 3H), 1.43 (s, 9H), 1.07 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 1.02 (d, J = 6.6 Hz, 3H); 13C NMR (151 MHz, CD3CN, 25℃) δ 169.39, 168.84, 168.77, 167.85, 155.17, 149.33, 136.77, 129.10, 127.98, 126.30, 118.57, 79.49, 54.10, 52.62, 40.91, 37.44, 32.43, 27.15, 22.95, 21.24, 21.17; IR (薄膜) 3301, 2973, 1770, 1701, 1674, 1641, 1525 cm-1; LRMS (EI) 518 (24%, [M]+・), 432 (23), 219 (33), 149 (21) 110 (27), 86 (37), 84 (100); C25H34N4O6S [M]+について計算したHRMS (EI)  518.2194, 実測値518.2199.
【０４５１】
参考例６８：Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（ＭｅＭａｌ）−Ｐｈｅ−ｉＰｒの脱保護
【０４５２】
【化８１】
2013501766.tif 000083
【０４５３】
１５０ｍＭホスフェート緩衝液（ｐＨ８、２５ｍＬ）中のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（１３８ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（ＭｅＭａｌ）−Ｐｈｅ−ｉＰｒ（５０ｍｇ、９７μｍｏｌ）のＭｅＣＮ（２５ｍＬ）中撹拌溶液に添加し、反応を２１℃で１０分間撹拌した。Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−ｉＰｒの合成はＬＣＭＳ（ＥＳ−）４０８．７（１００％）で確認した。
【０４５４】
参考例６９：Ｇｒｂ２−ＳＨ２  Ｌ１１１Ｃ変異体のクローニング及び発現
【０４５５】
【化８２】
2013501766.tif 000084
【０４５６】
Ｇｒｂ２−ＳＨ２  Ｌ１１１Ｃの配列（残基５３−１６３）：M G I E M K P H P W F F G K I P R A K A E E M L S K Q R H D G A F L I R E S E S A P G D F S L S V K F G N D V Q H F K V C R D G A G K Y F L W V V K F N S L N E L V D Y H R S T S V S R N Q Q I F L R D I E Q V P Q Q P T Y V Q A G S R S H H H H H H 終止。質量計算値＝１４１７１
【０４５７】
Ｇｒｂ２  ＳＨ２ドメインのためのＤＮＡ構築物は、１次アミノ酸配列５３−１６３を含んでおり、プラスミドＱＥ−６０（Ｑｉａｇｅｎ）にクローニングした。Ｇｒｂ２  ＳＨ２  Ｌ１１１Ｃ変異体は、変異残基をコードするオリゴヌクレオチドを使用した部位特異的変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｋｉｔ）によって構築した。両方の構築物を、Ｔ５プロモーターを使用してＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］、Ｑｉａｇｅｎ）中で発現させ、Ｃ末端に６−Ｈｉｓ  Ｔａｇを精製のために組み込んだ。培養物（１Ｌ）を、シングルコロニーからＴ．Ｂ．中で３７℃で増殖させ、０．９のＯ．Ｄ．λ６００に達した時点で１．０ｍＭ  ＩＰＴＧによって発現を誘導した。培養物に、ほぼ３時間にわたってタンパク質を発現させ、その後細胞をペレット化した。ペレットを、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含む０．１Ｍリン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．２中で溶解させた。溶解物を遠心分離し、上清をＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）にアプライした。Ｇｒｂ２−ＳＨ２  Ｌ１１１Ｃを、０．１Ｍリン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．２）によってＮｉ−ＮＴＡカラムから溶出させた。収集したＧｒｂ２  ＳＨ２  Ｌ１１１Ｃは、クマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥで可視化したとき、約９５％の純度であった。ドメインスワッピングによるＧｒｂ２  ＳＨ２ドメインの二量体化は、以前に観察されている。二量体及び単量体のＧｒｂ２−ＳＨ２を、０．１Ｍリン酸ナトリウム及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）で予め平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００カラム（３２０ｍＬ）で分離した。単量体Ｇｒｂ２−ＳＨ２の分子量（約１４ｋＤａ）及び二量体Ｇｒｂ２−ＳＨ２の分子量（約２８ｋＤａ）に対応する２つのピークが溶出した。Ｇｒｂ２−ＳＨ２  Ｌ１１１Ｃドメインのほぼ６０％が、カラムから単量体として溶出した。４℃で数ヶ月の過程にわたって相互変換が殆ど認められなかったことから、分離された単量体及び二量体は、驚くべきことに動力学的に安定であることが見出された。単量体を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−４遠心フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮し、タンパク質の最終濃度を、ＭｃＮｅｍａｒ及び共同研究者が得た吸光係数（１５，６００Ｍ−１）を用い、２８０ｎｍでの吸光度によって決定した。タンパク質を、１００ｍＬアリコート中２ｍｇ／ｍＬの濃度で凍結させ、これを実験の際に必要に応じて解凍した。単量体タンパク質の質量（質量１４１７０）はＥＳＩ−ＭＳを使用して得た。
【０４５８】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、０℃でＥｌｌｍａｎ試薬（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で１０分間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、単一の反応が起こって、１４３７０の質量を有する単一の生成物が生じたことが示され、これは、Ｃ１１１が官能化に利用可能であることを示す。
【０４５９】
参考例７０：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ブロモマレイミド付加物の調製
【０４６０】
【化８３】
2013501766.tif 000085
【０４６１】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が定量的変換で形成されたことが示された（質量１４２６６）。
【０４６２】
混合物を、０℃でＥｌｌｍａｎ試薬（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で１０分間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、Ｅｌｌｍａｎ試薬との反応は明白には表れないことが示され、これは、ブロモマレイミド官能化がＣ１１１で生じたことを強調する。
【０４６３】
参考例７１：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物の調製
【０４６４】
【化８４】
2013501766.tif 000086
【０４６５】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｎ−メチルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した、ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が定量的変換で形成されたことが示された（質量１４２８０）。
【０４６６】
混合物を、０℃でＥｌｌｍａｎ試薬（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で１０分間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、Ｅｌｌｍａｎ試薬との反応は明白には表れないことが示され、これは、Ｎ−メチルブロモマレイミド官能化がＣ１１１で生じたことを強調している。
【０４６７】
参考例７２：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ブロモマレイミド付加物のホスフィン媒介性の還元的切断
【０４６８】
【化８５】
2013501766.tif 000087
【０４６９】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２６５の単一のタンパク質種が示された。
【０４７０】
混合物を、０℃でＴＣＥＰ．ＨＣｌ（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で３時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物が明らかに切断されて、所望の生成物（質量＝１４１６９）が８０％の変換で得られたことが示された。
【０４７１】
参考例７３：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ブロモマレイミド付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の還元的切断
【０４７２】
【化８６】
2013501766.tif 000088
【０４７３】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２６５の単一のタンパク質種が示された。
【０４７４】
混合物を、β−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理し、１秒間ボルテックスし、３７℃で４時間維持した。分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物が明らかに切断されて、所望の生成物（質量＝１４１７３）が定量的変換で得られたことが示された。
【０４７５】
参考例７４：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ブロモマレイミド付加物のグルタチオン媒介性の切断
【０４７６】
【化８７】
2013501766.tif 000089
【０４７７】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２６５の単一のタンパク質種が示された。
【０４７８】
混合物をグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理し、１秒間ボルテックスし、３７℃で４時間維持した。分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物が明らかに切断されて、所望の生成物（質量＝１４１７３）が定量的変換で得られたことが示された。
【０４７９】
参考例７５：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物のホスフィン媒介性の還元的切断
【０４８０】
【化８８】
2013501766.tif 000090
【０４８１】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｎ−メチルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２７８の単一のタンパク質種が示された。
【０４８２】
混合物を、０℃でＴＣＥＰ．ＨＣｌ（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で３時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物が明らかに切断されて、所望の生成物（質量＝１４１６８）が８５％の変換で得られたことが示された。
【０４８３】
参考例７６：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の還元的切断
【０４８４】
【化８９】
2013501766.tif 000091
【０４８５】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｎ−メチルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２８０の単一のタンパク質種が示された。
【０４８６】
混合物を、β−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理し、１秒間ボルテックスし、３７℃で４時間維持した。分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物が明らかに切断されて、所望の生成物（質量＝１４１７３）が定量的変換で得られたことが示された。
【０４８７】
参考例７７：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物のグルタチオン媒介性の切断
【０４８８】
【化９０】
2013501766.tif 000092
【０４８９】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｎ−メチルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２８０の単一のタンパク質種が示された。
【０４９０】
混合物を、グルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理し、１秒間ボルテックスし、３７℃で４時間維持した。分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物が明らかに切断されて、所望の生成物（質量＝１４１７３）が定量的変換で得られたことが示された。
【０４９１】
参考例７８：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ブロモマレイミド付加物のエタンジチオール媒介性の切断
【０４９２】
【化９１】
2013501766.tif 000093
【０４９３】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２６５の単一のタンパク質種が示された。
【０４９４】
混合物を、エタンジチオール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理し、１秒間ボルテックスし、３７℃で４時間維持した。分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物が明らかに切断されて、所望の生成物（質量＝１４１７３）が定量的変換で得られたことが示された。
【０４９５】
参考例７９：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ブロモマレイミド／２−メルカプトエタノール付加物の調製
【０４９６】
【化９２】
2013501766.tif 000094
【０４９７】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２６５の単一のタンパク質種が示された。
【０４９８】
混合物を、０℃で２−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で３時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ブロモマレイミド／２−メルカプトエタノール付加物（質量＝１４３４５）が５４％の収率で形成されたことが示された。残りの物質はＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃであった。
【０４９９】
参考例８０：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−メチルブロモマレイミド／２−メルカプトエタノール付加物の調製
【０５００】
【化９３】
2013501766.tif 000095
【０５０１】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｎ−メチルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２７８の単一のタンパク質種が示された。
【０５０２】
混合物を、０℃で２−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で３時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４３５９）が９０％の収率で形成されたことが示された。残りの物質はＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃであった。
【０５０３】
参考例８１：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ブロモマレイミド／グルタチオン付加物の調製
【０５０４】
【化９４】
2013501766.tif 000096
【０５０５】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２６５の単一のタンパク質種が示された。
【０５０６】
混合物を、０℃でグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で３時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ブロモマレイミド／グルタチオン付加物（質量＝１４５７４）が４４％の変換で形成されたことが示された。残りの物質はＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃであった。
【０５０７】
参考例８２：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−メチルブロモマレイミド／グルタチオン付加物の調製
【０５０８】
【化９５】
2013501766.tif 000097
【０５０９】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｎ−メチルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２７８の単一のタンパク質種が示された。
【０５１０】
混合物を、０℃で２−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で３時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド／グルタチオン付加物（質量＝１４５８８）が９５％の変換で形成されたことが示された。残りの物質はＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃであった。
【０５１１】
参考例８３：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド付加物の調製
【０５１２】
【化９６】
2013501766.tif 000098
【０５１３】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４３４５）。
【０５１４】
参考例８４：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド付加物の２−メルカプトエタノール媒介性の還元的切断
【０５１５】
【化９７】
2013501766.tif 000099
【０５１６】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０５１７】
混合物を、０℃で２−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物が明らかに切断されて、所望の生成物（質量＝１４１７１）が定量的収率の収率で得られたことが示された。
【０５１８】
参考例８５：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド付加物のグルタチオン媒介性の還元的切断
【０５１９】
【化９８】
2013501766.tif 000100
【０５２０】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０５２１】
混合物を、０℃でグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物が明らかに切断されて、所望の生成物（質量＝１４１７０）が定量的収率で得られたことが示された。
【０５２２】
参考例８６：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物の調製
【０５２３】
【化９９】
2013501766.tif 000101
【０５２４】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０５２５】
混合物を、０℃でグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４５７３）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０５２６】
参考例８７：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド／β−１−チオグルコース付加物の調製
【０５２７】
【化１００】
2013501766.tif 000102
【０５２８】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０５２９】
混合物を、０℃でβ−１−チオグルコース、ナトリウム塩（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４４６１）がほぼ定量的収率で形成されたことが示された。
【０５３０】
参考例８８：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物のグルタチオン媒介性の切断
【０５３１】
【化１０１】
2013501766.tif 000103
【０５３２】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０５３３】
混合物を、０℃でグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物が、唯一の存在するタンパク質種であることが示された（質量＝１４５７３）。
【０５３４】
混合物を、０℃でグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１７３）が、定量的収率で形成されたことが示された。
【０５３５】
参考例８９：生理学的に適切なグルタチオン濃度（５ｍＭ）での、ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物のグルタチオン媒介性の切断
【０５３６】
【化１０２】
2013501766.tif 000104
【０５３７】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０５３８】
混合物を、０℃でグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物が存在する唯一のタンパク質種であることが示された（質量＝１４５７３）。
【０５３９】
混合物を、０℃でグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の１００ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１７３）が定量的収率で形成されたことが示された。
【０５４０】
参考例９０：生理学的に適切なグルタチオン濃度（１ｍＭ）での、ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物のグルタチオン媒介性の切断
【０５４１】
【化１０３】
2013501766.tif 000105
【０５４２】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０５４３】
混合物を、０℃でグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物が存在する唯一のタンパク質種であることが示された（質量＝１４５７３）。
【０５４４】
タンパク質／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物の溶液を、緩衝液交換（Ｍｉｃｒｏ  Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎ  ６  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｃｏｌｕｍｎ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に供して、付加物（９５μＬ、［付加物］０．２ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を得た。これに、グルタチオン（５μＬ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４中２０ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで３７℃で４時間維持した。分析により、Ｇｒｂ２−ＳＨ２（Ｌ１１１Ｃ）（質量）１４１７０）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０５４５】
参考例９１：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０５４６】
【化１０４】
2013501766.tif 000106
【０５４７】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０５４８】
混合物を、０℃でグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物が存在する唯一のタンパク質種であることが示された（質量＝１４５７３）。
【０５４９】
混合物を、０℃でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１７２）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０５５０】
参考例９２：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド／β−１−チオグルコース付加物のグルタチオン媒介性の切断
【０５５１】
【化１０５】
2013501766.tif 000107
【０５５２】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０５５３】
混合物を、０℃でβ−１−チオグルコース（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド／β−１−チオグルコース付加物が存在する唯一のタンパク質種であることが示された（質量＝１４４６１）。
【０５５４】
混合物を、０℃でグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１７３）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０５５５】
参考例９３：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド／β−１−チオグルコース付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０５５６】
【化１０６】
2013501766.tif 000108
【０５５７】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０５５８】
混合物を、０℃でβ−１−チオグルコース（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド／β−１−チオグルコース付加物が存在する唯一のタンパク質種であることが示された（質量＝１４４６１）。
【０５５９】
混合物を、０℃でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１７２）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０５６０】
参考例９４：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−フェニルブロモマレイミド付加物の調製
【０５６１】
【化１０７】
2013501766.tif 000109
【０５６２】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｎ−フェニルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４３５１）。
【０５６３】
参考例９５：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−フェニルジブロモマレイミド付加物の調製
【０５６４】
【化１０８】
2013501766.tif 000110
【０５６５】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭ  ＭＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６）に、Ｎ−フェニルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４４３１）。
【０５６６】
参考例９６：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−フェニルジブロモマレイミド付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０５６７】
【化１０９】
2013501766.tif 000111
【０５６８】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭ  ＭＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６）に、Ｎ−フェニルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／Ｎ−フェニルジブロモマレイミド付加物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４４３１）。
【０５６９】
混合物を、０℃でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１７９）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０５７０】
参考例９７：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−フェニルジブロモマレイミド／β−１−チオグルコース付加物の調製
【０５７１】
【化１１０】
2013501766.tif 000112
【０５７２】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭ  ＭＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６）に、Ｎ−フェニルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／Ｎ−フェニルジブロモマレイミド付加物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４４３１）。
【０５７３】
混合物を、０℃でβ−１−チオグルコース（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／Ｎ−フェニルジブロモマレイミド／β−１−チオグルコース付加物が存在する唯一のタンパク質種であることが示された（質量＝１４５４７）。
【０５７４】
参考例９８：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−フェニルジブロモマレイミド／β−１−チオグルコース付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０５７５】
【化１１１】
2013501766.tif 000113
【０５７６】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭ  ＭＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６）に、Ｎ−フェニルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／Ｎ−フェニルジブロモマレイミド付加物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４４３１）。
【０５７７】
混合物を、０℃でβ−１−チオグルコース（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／Ｎ−フェニルジブロモマレイミド／β−１−チオグルコース付加物が存在する唯一のタンパク質種であることが示された（質量＝１４５４７）。
【０５７８】
混合物を、０℃でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１７８）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０５７９】
参考例９９：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ビオチン−ＰＥＧ−ブロモマレイミド付加物の調製
【０５８０】
【化１１２】
2013501766.tif 000114
【０５８１】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ビオチン−ＰＥＧ−ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４６３４）。
【０５８２】
参考例１００：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ビオチン−ＰＥＧ−ブロモマレイミド付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０５８３】
【化１１３】
2013501766.tif 000115
【０５８４】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ビオチン−ＰＥＧ−ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ビオチン−ＰＥＧ−ブロモマレイミド付加物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４６３４）。
【０５８５】
混合物を、３７℃でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、３７℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１８０）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０５８６】
参考例１０１：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ビオチン−ＰＥＧ−ジブロモマレイミド付加物の調製
【０５８７】
【化１１４】
2013501766.tif 000116
【０５８８】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ビオチン−ＰＥＧ−ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で２時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が＞８０％の収率で形成されたことが示された（質量１４７０１）。
【０５８９】
参考例１０２：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ビオチン−ＰＥＧ−ジブロモマレイミド付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０５９０】
【化１１５】
2013501766.tif 000117
【０５９１】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ビオチン−ＰＥＧ−ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ビオチン−ＰＥＧ−ジブロモマレイミド付加物が＞８０％の変換で形成されたことが示された（質量１４７０１）。
【０５９２】
混合物を、０℃でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１７１）が＞８０％の変換で形成されたことが示された。
【０５９３】
実施例１：ニュートラアビジン被覆したアガロースビーズ上へのＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ビオチン−ＰＥＧ−ブロモマレイミド付加物のプルダウン及び放出
【０５９４】
【化１１６】
2013501766.tif 000118
【０５９５】
０℃のモデルタンパク質溶液（２００μＬ、［タンパク質］１．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ビオチン−ＰＥＧ−ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４６３４）。
【０５９６】
タンパク質／ビオチン−ＰＥＧ−ブロモマレイミド付加物（２００μＬ）及び非修飾モデルタンパク質（２００μＬ）を、濃縮器（Ｖｉｖａｓｐｉｎ、カットオフ１０ｋ）中でＰＢＳ緩衝液（３ｘ５００μＬ）で独立して洗浄し、タンパク質溶液（３００μＬ）（Ｉｎ）を得た。得られたタンパク質溶液のそれぞれについて、ニュートラアビジン被覆したアガロースビーズ（５０％水性スラリー７５０μＬ）を、ＰＢＳ（２ｘ５００μＬ）で洗浄した。次いで、タンパク質溶液（３００μＬ）をビーズに添加し、混合物を４℃で３０分間インキュベートした。混合物を遠心分離し、フロースルー（ＦＴ）を収集した。ビーズをＰＢＳ（２ｘ５００μＬ）で洗浄し、両方の洗浄画分を収集した（Ｗ１及びＷ２）。タンパク質を、β−メルカプトエタノール（２５ｍＭ）を含むＰＢＳ（３００μＬ）中で３７℃で２時間インキュベートすることにより、ビーズから放出させた。サンプルを遠心分離し、切断されたＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃを含む溶離液（Ｅｌ）を収集した。結果を図１に示す。
【０５９７】
回収されたタンパク質の量は、デンシトメトリーによるタンパク質希釈系列との比較により、４４％と決定された。しかしながら、不可逆的に物理吸着されたタンパク質（未修飾のタンパク質コントロールを使用して決定した）に対して補正すると、補正された回収率は７１％であった。
【０５９８】
参考例１０３：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−フルオレセインブロモマレイミド付加物の調製
【０５９９】
【化１１７】
2013501766.tif 000119
【０６００】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に、Ｎ−フルオレセインブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が９０％の変換で形成されたことが示された（質量１４５９７）。
【０６０１】
参考例１０４：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−フルオレセインブロモマレイミド付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０６０２】
【化１１８】
2013501766.tif 000120
【０６０３】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に、Ｎ−フルオレセインブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／フルオレセインブロモマレイミド付加物が９０％の変換で形成されたことが示された（質量１４５９７）。
【０６０４】
混合物を、３７℃でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、３７℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１７１）が８７％の変換で形成されたことが示された。
【０６０５】
参考例１０５：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−フルオレセインジブロモマレイミド付加物の調製
【０６０６】
【化１１９】
2013501766.tif 000121
【０６０７】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｎ−フルオレセインジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が６１％の変換で形成されたことが示された（質量１４６７５）。
【０６０８】
参考例１０６：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−フルオレセインジブロモマレイミド付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０６０９】
【化１２０】
2013501766.tif 000122
【０６１０】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に、Ｎ−フルオレセインジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／フルオレセインジブロモマレイミド付加物が６１％の変換で形成されたことが示された（質量１４５９７）。
【０６１１】
混合物を、３７℃でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、３７℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１７１）が８５％の変換で形成されたことが示された。
【０６１２】
参考例１０７：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ＢｒＤＤＰＤ付加物の調製
【０６１３】
【化１２１】
2013501766.tif 000123
【０６１４】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ＢｒＤＤＰＤ（５μＬ、ＤＭＦ中の２８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで３７℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４３４８）。
【０６１５】
参考例１０８：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ＢｒＤＤＰＤ付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０６１６】
【化１２２】
2013501766.tif 000124
【０６１７】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ＢｒＤＤＰＤ（５μＬ、ＤＭＦ中の２８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで３７℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ＢｒＤＤＰＤ付加物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４３４８）。
【０６１８】
混合物を、４℃で４０時間透析し（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）、３７℃でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２Ｍ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、３７℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１８０）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０６１９】
参考例１０９：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ＤｉＢｒＤＤＰＤ付加物の調製
【０６２０】
【化１２３】
2013501766.tif 000125
【０６２１】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ＤｉＢｒＤＤＰＤ（５μＬ、ＤＭＦ中の２８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで３７℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４４２７）。
【０６２２】
参考例１１０：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ＤｉＢｒＤＤＰＤ付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０６２３】
【化１２４】
2013501766.tif 000126
【０６２４】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ＤｉＢｒＤＤＰＤ（５μＬ、ＤＭＦ中の２８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで３７℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ＤｉＢｒＤＤＰＤ付加物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４４２７）。
【０６２５】
混合物を、４℃で４０時間透析し（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）、次いで３７℃でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２Ｍ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、３７℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１８０）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０６２６】
参考例１１１：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ＤｉＢｒＤＤＰＤ／β−１−チオグルコース付加物の調製
【０６２７】
【化１２５】
2013501766.tif 000127
【０６２８】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ＤｉＢｒＤＤＰＤ（５μＬ、ＤＭＦ中の２８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで３７℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ＤｉＢｒＤＤＰＤ付加物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４４２７）。
【０６２９】
混合物を、４℃で４０時間透析し（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）、次いで０℃でβ−１−チオグルコース（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８．２ｍＭ）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、室温で１時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ＤｉＢｒＤＤＰＤ／β−１−チオグルコース付加物が存在する唯一のタンパク質種であることが示された（質量＝１４５４３）。
【０６３０】
参考例１１２：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ＤｉＢｒＤＤＰＤ／β−１−チオグルコース付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０６３１】
【化１２６】
2013501766.tif 000128
【０６３２】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ＤｉＢｒＤＤＰＤ（５μＬ、ＤＭＦ中の２８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで３７℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ＤｉＢｒＤＤＰＤ付加物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４４２７）。
【０６３３】
混合物を、４℃で４０時間透析し（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）、次いで０℃でβ−１−チオグルコース（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８．２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、室温で１時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ＤｉＢｒＤＤＰＤ／β−１−チオグルコース付加物が存在する唯一のタンパク質種であることが示された（質量＝１４５４３）。
【０６３４】
混合物を、室温でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２Ｍ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、室温で３０分間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１８０）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０６３５】
参考例１１３：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ＢｒＤＤＰＤ／β−１−チオグルコース付加物の調製
【０６３６】
【化１２７】
2013501766.tif 000129
【０６３７】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ＢｒＤＤＰＤ（５μＬ、ＤＭＦ中の２８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで３７℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ＢｒＤＤＰＤ付加物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４３４８）。
【０６３８】
混合物を、４℃で４０時間透析し（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）、次いで０℃でβ−１−チオグルコース（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８．２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、３７℃で１時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ＢｒＤＤＰＤ／β−１−チオグルコース付加物が１７％の変換で形成されたことが示された（質量＝１４５４３）。
【０６３９】
参考例１１４：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｚ−２，３−ジブロモ−ブタ−２−エン二酸ジメチルエステル付加物の調製
【０６４０】
【化１２８】
2013501766.tif 000130
【０６４１】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｚ−２，３−ジブロモ−ブタ−２−エン二酸ジメチルエステル（５μＬ、ＤＭＦ中の２８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで３７℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が形成されたことが示された（質量１４４４０）。
【０６４２】
参考例１１５：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｚ−２，３−ジブロモ−ブタ−２−エン二酸ジメチルエステル付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０６４３】
【化１２９】
2013501766.tif 000131
【０６４４】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｚ−２，３−ジブロモ−ブタ−２−エン二酸ジメチルエステル（５μＬ、ＤＭＦ中の２８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで３７℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４３７０）。
【０６４５】
混合物を、３７℃でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２Ｍ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、３７℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１８０）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０６４６】
参考例１１６：ソマトスタチンの修飾及び再生
還元型ソマトスタチンの調製
【０６４７】
【化１３０】
2013501766.tif 000132
【０６４８】
凍結乾燥したソマトスタチン（質量＝１６３８）を、緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５％ＤＭＦ）中に可溶化して、１５２．６μＭの濃度（０．２５ｍｇ／ｍｌ）とし、１．１当量のＴＣＥＰで、周囲温度で１時間還元した。還元の完了は、４当量のジブロモマレイミドをサンプルアリコートに添加し、ＬＣ−ＭＳで分析して確認した。
【０６４９】
ハロマレイミド及び誘導体によるソマトスタチンの架橋
還元型ソマトスタチンは記載したとおりに生成した。１．１当量のハロマレイミド又はジブロモマレイミド誘導体（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５〜１５．０％ＤＭＦ中１００ｘストック）を周囲温度で添加し、生成物の生成をＬＣ−ＭＳで１時間にわたりモニタリングした。結果を図２に示す。
【０６５０】
ジチオマレイミドによるソマトスタチンの架橋
還元型ソマトスタチンは記載したとおりに生成した。種々の量のジチオマレイミド（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５〜７．５％ＤＭＦ中１００ｘストック）を周囲温度で添加し、生成物の生成をＬＣ−ＭＳで１時間にわたりモニタリングした。結果を図３に示す。
【０６５１】
ブロモマレイミドによるソマトスタチンの修飾
【０６５２】
【化１３１】
2013501766.tif 000133
【０６５３】
還元型ソマトスタチンは記載したとおりに生成した。２．１当量のブロモマレイミド（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、７．５％ＤＭＦ中１００ｘストック）を周囲温度で添加したところ、ジ−付加生成物への完全な変換がＬＣ−ＭＳによって１時間以内に観察された。
【０６５４】
ジブロモマレイン酸無水物によるソマトスタチンの修飾
【０６５５】
【化１３２】
2013501766.tif 000134
【０６５６】
還元型ソマトスタチンは記載したとおりに生成した。５当量のジブロモマレイン酸無水物（ＤＭＦ中）を添加し、生成物の生成をＬＣ−ＭＳでモニタリングした。１７．３％の架橋ソマトスタチンが９０分以内に生成した。
【０６５７】
種々の還元剤による架橋ソマトスタチンの切断
マレイミド架橋ソマトスタチンは、記載したように調製した。１００当量の種々の還元剤（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５％ＤＭＦ中１０００ｘストック）を添加し、未修飾ペプチド及び副産物（還元剤と遊離ペプチド−システインとの混合型ジスルフィド）の生成を、ＬＣ−ＭＳによって４℃で２日間モニタリングした。ソマトスタチンとＧＳＨとの混合型ジスルフィドは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳでのみ検出できた。結果を図４に示す。
【０６５８】
種々の量のＤＴＴ及び２−メルカプトエタノールによる、架橋ソマトスタチンの切断
マレイミド架橋ソマトスタチンは、記載したように調製した。種々の量のＤＴＴ又は２−メルカプトエタノール（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５％ＤＭＦ中１０００ｘストック）を添加し、未修飾ペプチド及び副産物（還元剤と遊離ペプチド−システインとの混合型ジスルフィド）の生成を、ＬＣ−ＭＳによって４℃で６時間モニタリングした。結果を図５に示す。
【０６５９】
架橋ソマトスタチンの触媒された切断
マレイミド架橋ソマトスタチンは、記載したように調製した。２０当量の２−メルカプトエタノール（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５％ＤＭＦ中１０００ｘストック）を添加し、その後、緩衝液又は５当量のヨウ化ナトリウム若しくはベンゼンセレノール（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、７．５％ＤＭＦ中１００ｘストック）のいずれかを添加し、未修飾ペプチド及び副産物（２−メルカプトエタノール又はベンゼンセレノールと遊離ペプチド−システインとの混合型ジスルフィド）の生成を、ＬＣ−ＭＳによって周囲温度で２０分間モニタリングした。結果を図６に示す。
【０６６０】
Ｎ−官能化マレイミド架橋ソマトスタチンの切断
ソマトスタチンを、記載したとおりに還元し、Ｎ−官能化マレイミド誘導体で架橋した。１００当量の２−メルカプトエタノール（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５％ＤＭＦ中１０００ｘストック）を添加し、未修飾ペプチド及び副産物（２−メルカプトエタノールと遊離ペプチド−システインとの混合型ジスルフィド）の生成をＬＣ−ＭＳにより４℃で２日間モニタリングした。結果を図７に示す。
【０６６１】
ソマトスタチンへのモノブロモマレイミドのジ−付加生成物の切断
還元型ソマトスタチンを、２．１当量のモノブロモマレイミドと反応させて、ジ−付加生成物を得た。次に、１００当量の２−メルカプトエタノール（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５％ＤＭＦ中１０００ｘストック）を添加し、モノ−付加生成物、未修飾ペプチド及び副産物（２−メルカプトエタノールと遊離ペプチド−システインとの混合型ジスルフィド）の生成を、ＬＣ−ＭＳにより周囲温度で２．５時間モニタリングした。結果を図８に示す。
【０６６２】
ソマトスタチンの比較上のｉｎ  ｓｉｔｕ架橋
ソマトスタチンに、種々の量のジチオマレイミド（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５−７．５％ＤＭＦ中１００ｘストック）を添加し、反応を周囲温度で１０分間インキュベートした。次に、種々の量のＴＣＥＰ又はベンゼンセレノール（１００ｘストック、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５〜７．５％ＤＭＦ中で新たに調製した）を添加し、架橋ソマトスタチンの生成を、ＬＣ−ＭＳにより周囲温度で１時間にわたりモニタリングした。結果を図９に示す。
【０６６３】
ソマトスタチンのｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＥＧ化
ソマトスタチンに、５当量のＮ−ＰＥＧ５０００−ジチオフェノールマレイミド又は１０当量のＮ−ＰＥＧ５０００−ジチオフェノールマレイミド（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５％ＤＭＦ中１００ｘストック）のいずれかを添加し、反応を周囲温度で１０分間インキュベートした。次に、３当量のＴＣＥＰそれぞれ５当量のベンゼンセレノール（１００ｘストック、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５−７．５％ＤＭＦ中に新たに調製）を添加し、ＰＥＧ化ソマトスタチンの生成を、ＬＣ−ＭＳによって周囲温度で２時間にわたってモニタリングした。結果を図１０に示す。
【０６６４】
ＤｉＢｒＤＤＰＤによるソマトスタチンの修飾
【０６６５】
【化１３３】
2013501766.tif 000135
【０６６６】
凍結乾燥ソマトスタチン（質量＝１６３８）を、緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５％ＤＭＦ）中に可溶化して、１５２．６μＭの濃度（０．２５ｍｇ／ｍＬ）にし、１．１当量のＴＣＥＰで２１℃で１時間還元した。還元の完了はＬＣＭＳによって確認した（質量＝１６４０）。ＤｉＢｒＤＤＰＤ（１００ｍｏｌ当量）を添加し、反応を２１℃で１０分間維持した。ソマトスタチン／ＤｉＢｒＤＤＰＤ付加物が定量的変換で形成したことが観察された（質量＝１８０３）。
【０６６７】
パッチクランプを使用した、架橋ソマトスタチンの生物活性保持の実証
得られたソマトスタチンアナログの活性に対して架橋修飾が有害な影響を有するか否かを試験するために、本発明者らは、ジブロモマレイミド架橋アナログ、ＰＥＧ化ジブロモマレイミド架橋アナログ及びフルオレセインジブロモマレイミド架橋アナログを、パッチクランプアッセイによって試験した。ＨＫＩＲ３．１／３．２チャネル及びヒトソマトスタチンレセプター２を発現するＨＥＫ２９３細胞をこれらの化合物で処理し、ホールセルパッチクランプ電流記録を採取した。３つ全てのアナログが、ソマトスタチン自体と匹敵する振幅で、ＧＩＲＫ電流の強い活性化を誘導した。コントロールとして細胞を百日咳毒素又はＧＩＲＫ阻害剤Ｔｅｒｔｉａｐｉｎ  Ｑで処理したとき、電流は大きく阻害された。このデータにより、架橋ソマトスタチンアナログが、ソマトスタチンレセプター２のアゴニズムに関して、ソマトスタチンの生物活性を保持していることが確認される。
【０６６８】
細胞培養
細胞培養方法及び安定細胞株の生成は、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５，９２１−９（２０００）に記載のとおりに実施した。Ｋｉｒ３．１チャネル及びＫｉｒ３．２Ａチャネルを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞（ヒト胚性腎細胞株）を、１０％胎仔ウシ血清及び７２７μｇのＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充した最小必須培地中で、加湿雰囲気（９５％Ｏ２、５％ＣＯ２）中３７℃で維持した。細胞を、落射蛍光を使用したトランスフェクト細胞の可視化のためのｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と共に、ＳＳＴＲ２  ＤＮＡ（Ｍｉｓｓｏｕｒｉ  Ｓ＆Ｔ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ）で一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションは、細胞培養培地（血清も抗生物質も含まない）９７μｌ当たり、５μｌのＦｕｇｅｎｅ  ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）並びに８００ｎｇのＳＳＴＲ２−ＤＮＡ及び４０ｎｇのＥＧＦＰ−ＤＮＡで実施した。
【０６６９】
パッチクランプ実験のためのソマトスタチン及びアナログの調製
架橋ソマトスタチンは上記のように調製した。ソマトスタチン及びそのアナログを、緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２）中で４℃で２４時間透析して、有機溶媒を除去した。透析後、濃度を決定し、ペプチドを４℃で保存した。最終濃度２０μＭのソマトスタチン及びアナログを使用した（希釈は、細胞外パッチクランプ緩衝液中で行った）。
【０６７０】
電気生理学
ホールセルパッチクランプ電流記録を、フィラメント化ホウケイ酸ガラスキャピラリー（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ、１．５ｍｍ  ＯＤｘ１．１７ｍｍ  ＩＤ）から引き出される３−４ＭΩの抵抗を有するファイアポリッシュピペットを使用して、Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ増幅器（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で実施した。データを取得し、Ｄｉｇｉｄａｔａ  １３２２Ａインターフェイス（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）及びｐＣＬＡＭＰソフトウェア（バージョン８．１、Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で分析した。速い灌流システムを使用して、ソマトスタチン及びアナログをアプライした（Ｒａｐｉｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｈａｎｇｅｒ、ＲＳＣ−１６０、Ｂｉｏ−Ｌｏｇｉｃ  Ｆｒａｎｃｅ）。細胞を−６０ｍＶでクランプした。細胞外溶液は以下であった（ｍＭ）：ＮａＣｌ  ８０、ＫＣｌ  ６０、ＣａＣｌ２  ２、ＭｇＣｌ２  １、ＨＥＰＥＳ  １０、ＮａＨ２ＰＯ４  ０．３３、グルコース  １０、ｐＨ７．４；一方、細胞内溶液は以下であった（ｍＭ）：グルコン酸Ｋ  １１０、ＫＣｌ  ２０、ＮａＣｌ  １０、ＭｇＣｌ２  １、ＭｇＡＴＰ  ２、ＥＧＴＡ  ２  ＧＴＰ  ０．３、ｐＨ７．４。アゴニストの適用後、電流は、遅延「ラグ」とその後のピーク振幅への迅速な上昇「ピークまでの時間」で活性化した。アゴニストの除去後、電流は、減衰してベースラインに戻った。各細胞について、薬物適用の圧力から生じたフローアーチファクト（ｆｌｏｗ  ａｒｔｉｆａｃｔ）が存在するか否かを評価した。これは、記録の開始時に、排水管の１つからの浴溶液を適用することによって行った。ＧＩＲＫ電流の阻害剤Ｔｅｒｔｉａｐｉｎ（Ａｌｏｍｏｎｅ）を、最終濃度１００ｎＭで使用した。細胞を、Ｇｉ／ｏタンパク質の阻害剤である百日咳毒素（Ｓｉｇｍａ、１００ｎｇ／ｍｌ）と共に一晩インキュベートした。薬物は濃ストック溶液として調製し、−２０℃で維持した。
【０６７１】
結果を図１１及び図１２に示す。
【０６７２】
参考例１１７：プロピルアミノマレイミドの調製
【０６７３】
【化１３４】
2013501766.tif 000136
【０６７４】
メタノール（１５ｍＬ）中のプロピルアミン（７５μＬ、１．０９ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（９２ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）に、メタノール（１５ｍＬ）中のブロモマレイミド（２００ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）を滴下した。１０分後、溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル中１０％の酢酸エチル）による精製により、所望の化合物（８２ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）を鮮黄色のワックス状固体として４９％の収率で得た。 δH (500 MHz, CDCl3) 7.36 (s, 1H, NH), 5.45 (s, 1H, NH), 4.80 (d, 1H, J = 1.3, H-5), 3.14 (dt, 2H, J = 6.2及び7.2, H2-3), 1.71-1.63 (m, 2H, H2-2), 0.99 (t, 3H, J = 7.4, H3-1); δC (125 MHz, CDCl3) 172.31 (C=O), 167.73 (C=O), 149.83 (C4), 85.29 (C5), 46.16 (C3), 21.91 (C2), 11.42 (C1); IR (固体, cm-1) 3190 (m), 2962 (m), 1693 (m), 1627 (s); MS (EI) m/z (相対強度): 154 (M+, 60), 125 (98), 84 (100); [C7H10N2O2]+ について計算した正確な質量はm/z 154.0737を要求、実測値 154.0734 (EI); UV (アセトニトリル) ε240= 7400及びε348 = 5700 cm-1M-1d3.
【０６７５】
参考例１１８：ブト−３−エニルアミノマレイミドの調製
【０６７６】
【化１３５】
2013501766.tif 000137
【０６７７】
メタノール（１５ｍＬ）中の３−ブテニルアミン塩酸塩（２００ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（１８４ｍｇ、２．２４ｍｍｏｌ）に、メタノール（１５ｍＬ）中のブロモマレイミド（２００ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）を滴下した。１０分後、溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル中１０％の酢酸エチル）による精製により、所望の化合物（１４２ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）を鮮黄色のワックス状固体として７６％の収率で得た。δH (500 MHz, CDCl3) 7.10 (s, 1H, NH), 5.77 (tdd, 1H, J = 6.9, 10.7及び17.4, H-2), 5.38 (s, 1H, NH), 5.18-5.15 (m, 2H, H2-1), 4.83 (d, 1H, J = 1.3, H-6), 3.24 (t, 2H, J = 6.7, H2-4), 2.40 (dtd, 2H, J = 1.2, 6.8及び6.9, H2-3); δC (125 MHz, CDCl3) 171.94 (C=O), 167.45 (C=O), 149.53 (C5), 133.89 (C2), 118.51 (C1), 85.80 (C6), 43.30 (C4), 32.68 (C3); IR (固体, cm-1) 3290 (m), 1703 (m), 1629 (s); MS (ES-) m/z (相対強度): 165 ([M-H], 100); [C8H10N2O2]-Hについて計算した正確な質量はm/z 165.0659を要求、実測値165.0664 (ES-); m.p. 68-76oC; UV (アセトニトリル) ε241 = 8300及びε348= 6100 cm-1M-1d3.
【０６７８】
参考例１１９：Ｎ−メチルプロピルアミノマレイミドの調製
【０６７９】
【化１３６】
2013501766.tif 000138
【０６８０】
メタノール（３０ｍＬ）中のプロピルアミン（５２μＬ、０．７８ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（６４ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）に、メタノール（３０ｍＬ）中のＮ−メチルモノブロモマレイミド（１５０ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）を滴下した。１０分後、溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル中１０％の酢酸エチル）による精製により、所望の化合物（４１ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）を鮮黄色のワックス状固体として３１％の収率で得た。 δH (500 MHz, CDCl3) 5.43 (s, 1H, NH), 4.80 (s, 1H, H-2), 3.16-3.13 (m, 2H, H2-9), 2.98 (s, 3H, H3-6), 1.71-1.64 (m, 2H, H2-8), 0.99 (t, J = 7.5, H3-7); δC (125 MHz, CDCl3) 172.71 (C=O), 167.66 (C=O), 149.51 (C3), 83.84 (C2), 46.01 (C9), 23.44 (C6), 21.87 (C8), 11.38 (C7); IR (薄膜, cm-1) 3317 (m), 2944 (w), 1698 (s), 1651 (s); MS (EI) m/z (相対強度): 168 (M+, 70), 139 (100), 111 (40); [C8H12N2O2]+について計算した正確な質量はm/z 168.0893を要求、実測値168.0887 (EI); UV (アセトニトリル) ε210 = 15900, ε240 = 2800, ε283 = 500及びε368 = 500 cm-1M-1d3.
【０６８１】
参考例１２０：２，９−アザトリシクロ［５，３，０，０１０−４］デカン−１，３−ジオンの調製
【０６８２】
【化１３７】
2013501766.tif 000139
【０６８３】
ブト−３−エニルアミノマレイミド（４２ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２５ｍＬ）中に溶解して、０．０１Ｍ溶液を提供した。得られた溶液を３０分間脱気し、撹拌しながら４分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（酢酸エチルから酢酸エチル中５％メタノールでの勾配溶出）により、所望の化合物（３９ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）をオフホワイトの固体として９３％の収率で得た。 δH (500 MHz, CDCl3) 3.50 (ddd, 1H, J = 2.6, 4.8及び11.8, HH-8), 3.18-3.12 (m, 2H, HH-8及びH-6), 2.98 (dd, 1H, J = 3.9及び10.7, H-4), 2.21 (ddd, 1H, J = 4.0, 8.6及び13.2, HH-5), 2.01 (ddd, 1H, 5.8, 10.5及び13.4, HH-5), 1.79 (m, 2H, H2-7); δC (125 MHz, CDCl3) 179.04 (C=O), 178.95 (C=O), 70.85 (C10), 48.43 (C8), 44.25 (C4), 43.82 (C6), 32.93 (C7) 24.96 (C5); IR (固体, cm-1) 3198 (m), 2944 (m), 1701 (s); MS (EI) m/z (相対強度): 166 (M+, 45), 125 (100); [C8H10N2O2]+ について計算した正確な質量はm/z 166.07387を要求、実測値166.07386 (EI); m.p. 110-113℃.
【０６８４】
参考例１２１：（４ＳＲ，６ＲＳ，７ＳＲ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−６−カルボニトリル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン及び（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−カルボニトリル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンの調製
【０６８５】
【化１３８】
2013501766.tif 000140
【０６８６】
ヘキシルスルファニルマレイミド（２５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（２２．５ｍＬ）及びアクリロニトリル（２．５ｍＬ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を提供した。得られた溶液を３０分間脱気し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（勾配溶出、石油エーテル中１０％の酢酸エチルから石油エーテル中５０％の酢酸エチル）により、（４ＳＲ，６ＲＳ，７ＳＲ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−６−カルボニトリル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（９ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）を粘度のある無色油状物として２９％の収率で得、（４ＲＳ，７ＲＳ，５ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−カルボニトリル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（１２ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）を粘度のある無色油状物として３９％の収率で得た。
【０６８７】
（４ＳＲ，６ＲＳ，７ＳＲ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−６−カルボニトリル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン  δH (500 MHz, CDCl3) 3.53 (dt, 1H, J = 1.4及び8.1, H-6), 3.16-3.10 (m, 2H, HH-5及びH-7), 2.89-2.80 (m, 2H, H2-13), 2.56-2.50 (m, 1H, HH-5), 1.67-1.55 (m, 4H, H2-12及びH2-11), 1.42-1.37 (m, 2H, H2-10), 1.33-1.27 (m, 2H, H2-9), 0.89 (t, 3H, J = 6.9, H3-8); δC (125 MHz, CDCl3) 174.49 (C=O), 172.91 (C=O), 116.82 (C4), 52.38 (C14), 44.16 (C6), 31.33 (C13), 30.87 (C7), 30.29 (CH2), 29.26 (CH2), 28.64 (CH2), 25.92 (CH2), 22.82 (C5), 14.11 (C8); IR (油, cm-1) 3223 (w), 2926 (w), 1778 (w), 1714 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 267 ([M+H], 40), 213 (70), 180 (100); [C13H18N2O2S]+H について計算した正確な質量はm/z 267.1167を要求、実測値267.1175 (CI+). 
【０６８８】
（４ＲＳ，７ＲＳ，５ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−カルボニトリル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン  δH (500 MHz, CDCl3) 3.66 (dd, 1H, J = 6.0及び9.5, H-5), 3.23 (dd, 1H, J = 5.2及び10.9, H-7), 3.01-2.82 (m, 3H, HH-6及びH2-13), 2.67 (ddd, 1H, J = 5.3, 9.6及び14.7, HH-6), 1.65-1.60 (m, 2H, H2-12), 1.42-1.36 (m, 2H, H2-11), 1.32-1.27 (m, 4H, H2-9及びH2-10), 0.88 (t, 3H, J = 6.8, H3-8); δC (125 MHz, CDCl3) 175.08 (C=O), 174.82 (C=O), 117.13 (C4), 51.24 (C14), 44.26 (C5), 31.36 (C13), 30.96 (C7), 29.82 (CH2), 29.19 (CH2), 28.62 (CH2), 25.72 (C6), 22.58 (CH2), 14.26 (C8); IR (油, cm-1) 3247 (w), 2927 (w), 1717 (s); MS (CI) m/z (相対強度): 267 ([M+H], 75), 214 (100), 180 (70); [C13H18N2O2S]+Hについて計算した正確な質量はm/z 267.1167を要求、実測値267.1158 (CI).
【０６８９】
参考例１１２：（５ＲＳ，９ＳＲ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−２−アザ−トリシロ（ｔｒｉｃｙｌｏ）［３．５．０．０５，９］ジ−１，３−オンの調製
【０６９０】
【化１３９】
2013501766.tif 000141
【０６９１】
ヘキシルスルファニルマレイミド（２５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（２２．５ｍＬ）及びシクロペンテン（３ｍＬ、３６ｍｍｏｌ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィー（勾配溶出、石油エーテル中１０％の酢酸エチルから石油エーテル中５０％の酢酸エチル）による精製により、所望の化合物（１２ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）を粘度のある無色油状物（２つの分離不能なジアステレオマーの１：１混合物）として７７％の収率で得た。ＣＯＳＹ分析は、特定のシグナル（下付の「ａ」及び「ｂ」で示す）が同じ化合物から生じるが、各ジアステレオマーの具体的な正体が未知であることを示している。シグナルの重複がＮＯｅ分析を妨げている。 δH (500 MHz, CDCl3) 3.15-3.07 (m, 2H, H-5a及びH-10a), 3.00 (t, 1H, J = 6.8, H-5b), 2.94 (td, 1H, J = 3.9及び6.6,  H-9b), 2.87-2.82 (m, 2H, H-9a及びHH-16a), 2.64-2.59 (m, 1H, HH-16b), 2.52-2.47 (m, 3H, H-10b, HH-16a及びHH-16b), 2.07 (dd, 2H, J = 6.3及び6.9, HH-15a及びHH-15b), 1.96-1.89 (m, 2H, HH-15a及びHH-15b) 1.88-1.82 (m, 4H, H2-7a及びH2-7b) 1.64-1.50 (m, 8H, H2-6a, H2-6b, H2-8a及びH2-8b), 1.38-1.25 (m, 12H, H2-12a, H2-12b, H2-13a, H2-13b, H2-14a及びH2-14b), 0.89-0.86 (m, 6H, H3-11a及びH3-11b); δC (125 MHz, CDCl3) 179.09 (C=O), 177.12 (C=O), 176.93 (C=O), 171.83 (C=O), 51.31 (C4), 51.33 (C4), 50.68 (C10), 45.32 (C10), 43.26 (C9), 41.70 (C5), 32.38 (CH2), 30.98 (CH2), 30.95 (CH2), 30.78 (CH2), 28.92 (CH2), 28.50 (CH2), 28.30 (CH2), 28.22 (CH2), 28.10 (CH2), 28.13 (CH2), 25.09 (CH2), 22.14 (CH2), 22.11 (CH2), 13.66 (2 x C11) いくつかの炭素 シグナルは、ジアステレオマーの重複に起因して欠落している; IR (油, cm-1) 3120 (w), 2927 (m), 1711 (s), 1627 (s); MS (ES-) m/z (相対強度): 280 ([M-H], 50), 212 (100); [C15H23NO2S]-H について計算した正確な質量はm/z 280.1371を要求、実測値280.1382 (ES-).
【０６９２】
参考例１２３：４−ヘキシルスルファニル−１−フェニル−１，７−ジヒドロ−２Ｈ−アゼピン−３，６−ジオン及び（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンの調製
【０６９３】
【化１４０】
2013501766.tif 000142
【０６９４】
ヘキシルスルファニルマレイミド（２５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２５ｍＬ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を提供した。得られた溶液を３０分間脱気し、スチレン（１３３μＬ、１．２ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、４−ヘキシルスルファニル−１−フェニル−１，７−ジヒドロ−２Ｈ−アゼピン−３，６−ジオン（１１ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）を粘度のある無色油状物として３０％の収率で得、（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（２６ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ）を粘度のある無色油状物として７０％の収率で得た。
【０６９５】
４−ヘキシルスルファニル−１−フェニル−１，７−ジヒドロ−２Ｈ−アゼピン−３，６−ジオン
δH (600 MHz, CDCl3) 7.34-7.24 (m, 5H, 5 x Ar-H), 6.15 (d, 1H, J = 1.5, H-5), 4.11 (t, 1H, J = 7.7, H-1), 3.01 (ddd, 1H, J = 1.5, 7.8及び15.8, HH-7), 2.96 (dd, 1H, J = 7.8及び15.6, HH-7), 2.36-2.26 (m, 2H, H2-13), 1.50-1.41 (m, 2H, H2-12), 1.35-1.33 (m, 6H, H2-9, H2-10及びH2-11), 0.85 (t, 3H, J = 7.0, H3-8); δC (150 MHz, CDCl3) 170.96 (C=O), 169.95 (C=O), 147.26 (C4), 141.10 (C14), 129.41 (C5), 128.89 (2 x Ar-H), 127.86 (C17), 127.71 (2 x Ar-H), 47.24 (C1), 32.47 (C13), 31.43 (CH2), 29.19 (CH2), 28.61 (CH2), 22.60 (CH2), 14.10 (C8); IR (油, cm-1) 3288 (w), 2928 (w), 1775 (w), 1717 (s); MS (FAB+) m/z (相対強度): 340 ([M+Na], 20), 329 (35), 207 (20), 176 (100); [C16H23NO2S]+Naについて計算した正確な質量はm/z 340.1347を要求、実測値340.1351 (FAB+).
【０６９６】
（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン
δH (600 MHz, CDCl3) 8.77 (s, 1H, NH), 7.39-7.31 (m, 5H, 5 x Ar-H), 4.05 (t, 1H, J = 8.8, H-5), 3.17 (dd, 1H, J = 3.4及び10.9, H-7), 3.04 (ddd, 1H, J = 8.4, 11.1及び12.7, HH-6), 2.63 (ddd, 1H, J = 3.6, 9.0及び12.8, HH-6), 2.43 (ddd, 1H, J = 6.7, 7.9及び11.3, HH-17), 2.13 (ddd, 1H, J = 6.6, 8.0及び11.3, HH-17), 1.30-1.08 (m, 8H, H2-13, H2-14及びH2-15及びH2-16), 0.83 (t, 3H, J = 7.3, H3-12); δC (150 MHz, CDCl3) 178.76 (C=O), 177.62 (C=O), 136.51 (C11), 128.77 (2 x Ar-H), 128.70 (2 x Ar-H), 128.03 (C8), 57.17 (C4), 45.70 (C5), 43.87 (C7), 31.26 (C17), 28.70 (CH2), 28.65 (CH2), 28.52 (CH2), 26.22 (C6), 22.46 (CH2), 14.10 (C12); IR (油, cm-1) 3218 (w), 2926 (w) 1771 (m), 1703 (s); MS (FAB+) m/z (相対強度): 340 ([M+Na], 20), 199 (25), 176 (100); [C16H23NO2S]+Na について計算した正確な質量はm/z 340.1347を要求、実測値 340.1357 (FAB+).
【０６９７】
参考例１２４：（４ＲＳ，７ＳＲ，５ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−カルボン酸メチルエステル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンの調製
【０６９８】
【化１４１】
2013501766.tif 000143
【０６９９】
ヘキシルスルファニルマレイミド（２５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２１．９ｍＬ）及びメチルアクリレート（３．１ｍＬ、３６ｍｍｏｌ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を提供した。得られた溶液を３０分間脱気し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテル中１０％の酢酸エチルから石油エーテル中５０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、所望の化合物（１７ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）を粘度のある無色油状物として４８％の収率で得た。 δH (600 MHz, CDCl3) 8.50 (s, 1H, NH), 3.81 (s, 3H, H3-8), 3.57 (dd, 1H, J = 5.8及び8.5, H-5), 3.18 (dd, 1H, J = 5.0及び10.7, H-7), 3.11 (ddd, 1H, J = 5.5, 11.0及び12.9, HH-6), 2.73 (dt, 1H, J = 7.5及び11.5, HH-15), 2.64 (dt, 1H, J = 7.5及び11.5, HH-15), 2.29 (ddd, 1H, J = 5.2, 8.5及び13.2, HH-6), 1.52-1.47 (m, 2H, H2-14), 1.35-1.30 (m, 2H, H2-13), 1.29-1.21 (m, 4H, H2-11及びH2-12), 0.87 (t, 3H, J = 6.7, H-3-10); δC (150 MHz, CDCl3) 176.65 (C=O), 171.13 (C=O), 170.48 (C=O), 52.59 (C8), 52.39 (C4), 44.56 (C7), 44.06 (C5), 31.41 (C15), 29.73 (CH2), 29.16 (CH2), 28.68 (CH2), 23.57 (C12), 22.57 (C11), 14.11 (C10); IR (油, cm-1) 3244 (w), 2928 (w) 1778 (w), 1714 (s); MS (FAB+) m/z (相対強度): 322 ([M+Na], 100), 300 (30), 214 (25); [C14H21NO4SN]+Na について計算した正確な質量はm/z 322.1089を要求、実測値 322.1082 (FAB+).
【０７００】
参考例１２５：（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−カルボン酸フェニルエステル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンの調製
【０７０１】
【化１４２】
2013501766.tif 000144
【０７０２】
ヘキシルスルファニルマレイミド（２５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２５ｍＬ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、フェニルアクリレート（１６０μＬ、１．２０ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、所望の化合物（２１ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）を粘度のある無色油状物として４８％の収率で得、ヘキシルスルファニルマレイミド二量体（１２ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）を４７％の収率で得た。 δH (600 MHz, CDCl3) 8.41 (s, 1H, NH), 7.41-7.39 (m, 2H, 2 x Ar-H), 7.27-7.25 (m, 1H, H-8), 7.20 (d, 1H, J = 7.8, 2 x Ar-H), 3.80 (dd, 1H, J = 5.1及び8.5, H-5), 3.29 (dd, 1H, J = 5.1及び10.7, H-7), 3.20 (ddd, 1H, J = 5.5, 10.9及び13.0, HH-6), 2.62 (dt, 1H, J = 7.5及び11.5, HH-18), 2.73 (dt, 1H, J = 7.5及び11.5, HH-18), 2.40 (ddd, 1H, J = 5.6, 8.8及び13.5, HH-6), 1.54-1.48 (m, 2H, H2-17), 1.33-1.16 (m, 6H, H2-14, H2-15及びH2-16), 0.84 (t, 3H, J = 6.9, H3-13); δC (150 MHz, CDCl3) 176.35 (C=O), 176.19 (C=O), 168.85 (C=O), 150.66 (C11), 129.64 (2 x Ar-H), 126.34 (C8), 121.54 (2 x Ar-H), 52.59 (C4), 44.78 (C7), 44.17 (C5), 31.36 (CH2), 29.94 (C18), 29.09 (CH2), 28.68 (CH2), 23.83(C6), 22.56 (CH2), 14.08 (C13); IR (油, cm-1) 3213 (w), 2927 (w) 1757 (m), 1715 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 362 ([M+H], 35), 268 (100), 149 (25); [C19H23NO4S]+H について計算した正確な質量はm/z 362.1426を要求、実測値362.1431 (CI+).
【０７０３】
参考例１２６：（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−（ｐ−アミノ）フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンの調製
【０７０４】
【化１４３】
2013501766.tif 000145
【０７０５】
ヘキシルスルファニルマレイミド（２５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２５ｍＬ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、４−ビニルアニリン（１３６μＬ、１．２ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、所望の化合物（７ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ）を粘度のある無色油状物として１７％の収率で得た。δH (600 MHz, CDCl3) 8.17 (s, 1H, NH), 7.10 (d, 2H, J = 8.5, 2 x Ar-H), 6.67 (d, 2H, J = 8.5, 2 x Ar-H), 3.94 (t, 1H, J = 9.0, H-5), 3.13 (dd, 1H, J = 3.7及び11.1, H-7), 2.98 (ddd, 1H, J = 8.8, 11.2及び12.9, HH-6), 2.58 (ddd, 1H, J = 3.5, 9.1及び12.8, HH-6), 2.42 (dt, 1H, J = 7.5及び11.5, HH-17), 2.17 (dt, 1H, J = 7.5及び11.5, HH-17), 1.34-1.29 (m, 2H, H2-16), 1.25-1.11 (m, 6H, H2-13, H2-14及びH2-15), 0.80 (t, 3H, J = 7.4, H3-12); δC (150 MHz, CDCl3) 178.64 (C=O), 177.48 (C=O), 146.28 (C8), 129.81 (2 x Ar-H), 126.20 (C11), 114.81 (2 x Ar-H), 57.97 (C4), 45.48 (C5), 43.79 (C7), 31.35 (CH2), 29.07 (CH2), 28.65 (C17), 26.41 (C6), 22.54 (CH2), 14.12 (C12); IR (油, cm-1) 3214 (w), 2928 (w) 1769 (m), 1715 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 333 ([M+H], 55), 119 (100); [C18H24N2O2S]+Hについて計算した正確な質量はm/z 333.1637を要求、実測値333.1642 (CI+).
【０７０６】
参考例１２７：４−ヘキシルスルファニル−１−（ｍ−ニトロ）フェニル−１，７−ジヒドロ−２Ｈ−アゼピン−３，６−ジオン、（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−（ｍ−ニトロ）フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン及び（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−（ｍ−ニトロ）フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンの調製
【０７０７】
【化１４４】
2013501766.tif 000146
【０７０８】
ヘキシルスルファニルマレイミド（２５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２５ｍＬ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、３−ニトロスチレン（１３６μＬ、１．２ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、４−ヘキシルスルファニル−１−（ｍ−ニトロ）フェニル−１，７−ジヒドロ−２Ｈ−アゼピン−３，６−ジオン（２３ｍｇ、０．０６３ｍｍｏｌ）を粘度のある無色油状物として５５％の収率で得、（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−（ｍ−ニトロ）フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（０．５ｍｇ，０．００１ｍｍｏｌ）を粘度のある無色油状物として１％の収率で得（４−ヘキシルスルファニル−１−（ｍ−ニトロ）フェニル−１，７−ジヒドロ−２Ｈ−アゼピン−３，６−ジオンと同時に）、（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−（ｍ−ニトロ）フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（１２ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を粘度のある無色油状物として２１％の収率で得た（二量体と同時に）。
【０７０９】
２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−１−（ｍ−ニトロ）フェニル−１，７−ジヒドロ−２Ｈ−アゼピン−３，６−ジオン
δH (600 MHz, CDCl3) 8.22 (s, 1H, H-16), 8.14 (d, 1H, J = 8.5, Ar-H), 7.68 (t, 1H, J = 7.6, Ar-H), 7.53 (t, 1H, J = 7.8, H-19), 7.20 (s, 1H, NH), 6.29 (s, 1H, H-5), 4.25 (t, 1H, J = 7.9, H-1), 3.03 (dd, 1H, J = 8.4及び15.4, HH-7), 2.98 (dd, 1H, J = 7.4及び15.2, HH-7), 2.37-2.26 (m, 2H, H2-13), 1.30-1.24 (m, 2H, H2-12), 1.21-1.08 (m, 6H, 3 x CH2), 0.81 (t, 3H, J = 7.1, H3-8); δC (150 MHz, CDCl3) 170.70 (C=O), 169.54 (C=O), 148.60 (C16), 146.35 (C4), 143.94 (C14), 133.83 (Ar-H), 129.96 (Ar-H), 129.86 (C5), 122.96 (Ar-H), 122.59 (Ar-H), 46.78 (C1), 32.52 (C7), 31.56 (CH2), 31.37 (C13), 29.03 (CH2), 28.52 (CH2), 22.57 (CH2), 14.11 (C8); IR (油, cm-1) 3282 (w), 2928 (m) 1775 (w), 1717 (s); 質量イオンは見出されず。
【０７１０】
（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−（ｍ−ニトロ）フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンのシグナルは太字である。
【０７１１】
【化１４５】
2013501766.tif 000147
【０７１２】
（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−（ｍ−ニトロ）フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン
δH (600 MHz, CDCl3) 8.59 (s, 1H, NH), 8.22-8.16 (m, 2H, 2 x Ar-H), 7.66 (d, 1H, J = 7.5, Ar-H), 7.56 (t, 1H, J = 8.0, H-11), 4.14 (t, 1H, J = 8.6, H-5), 3.23 (dd, 1H, J = 3.0及び11.6, H-7), 3.05 (ddd, 1H, J = 8.5, 11.1及び13.1, HH-6), 2.73 (ddd, 1H, J = 3.6, 9.0及び12.9, HH-6), 2.45 (ddd, 1H, J = 6.7, 8.1及び11.4, HH-19), 2.13 (ddd, 1H, J = 6.8, 8.0及び11.3, HH-19), 1.30-1.24 (m, 2H, H2-18), 1.21-1.08 (m, 6H, H2-15, H2-16及びH2-17), 0.81 (t, 3H, J = 7.1, H3-14); δC (150 MHz, CDCl3) 177.94 (C=O), 176.84 (C=O), 148.14 (C9), 138.76 (C13), 135.29 (Ar-H), 129.24 (Ar-H), 123.39 (Ar-H), 123.16 (Ar-H), 56.71 (C4), 45.09 (C5), 43.69 (C7), 31.26 (CH2), 28.88 (CH2), 28.84 (C19), 28.51 (C6), 26.33 (CH2), 22.57 (CH2), 14.06 (C14); IR (油, cm-1) 3214 (w), 2928 (w) 1773 (m), 1709 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 363 ([M+H], 10), 214 (15), 84 (100); [C18H22N2O4S]+Hについて計算した正確な質量はm/z 363.1379を要求、実測値363.1394 (CI+).
【０７１３】
参考例１２８：（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ）−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンの調製
【０７１４】
【化１４６】
2013501766.tif 000148
【０７１５】
Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｍａｌ）−ＯＭｅ（５０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（３０ｍＬ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、スチレン（１３６μＬ、１．２ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、所望の化合物（１６ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）を、粘度のある無色油状物として２４％の収率で、２つの主要なジアステレオマーの混合物として得た（小さいシグナルは、おそらくスチレンの付加に関して位置異性体の、２つの他のジアステレオマーを示唆する）。粗製物の再分析は、この反応が少なくとも８０％達成できたことを示唆する。δH (600 MHz, CDCl3) 8.08 (s, 2H, 2 x H-2), 7.40-7.31 (m, 10H, 10 x Ar-H), 5.0 (d, 1H, J = 8.2, H-15), 4.9 (d, 1H, J = 7.5, H-15), 4.26-4.23 (m, 1H, H-16), 4.18-4.12 (m, 1H, H-16), 4.06 (t, 2H, J = 8.5, 2 x H-5), 3.669 (s, 3H, H3-18), 3.674 (s, 3H, H3-18), 3.19 (ddd, 1H, J = 2.4及び11.0, H-7), 3.11 (dd, 1H, J = 3.2及び11.0, H-7) 3.04-2.93 (m, 3H, 2 x HH-6及びHH-19), 2.91 (dd, 1H, J = 6.6及び12.8, HH-19), 2.64-2.60 (m, 2H, 2 x HH-6), 2.51 (dd, 1H, J = 4.6及び12.8, HH-19), 2.43 (dd, 1H, J = 7.3及び13.0, HH-19), 1.45 (s, 9H, 3 x H3-12), 1.43 (s, 9H, 3 x H3-12); δC (150 MHz, CDCl3) 178.41 (C=O), 177.25 (C=O), 177.20 (C=O), 171.40 (C=O), 171.10 (C=O), 170.98 (C=O), 155.28 (C=O), 155.18 (C=O), 136.28 (C11), 136.25 (C11), 128.94 (2 x Ar-H), 128.93 (2 x Ar-H), 128.49 (2 x Ar-H), 128.46 (2 x Ar-H), 128.38 (C8), 128.33 (C8), 80.44 (2 x C13), 56.71 (C4), 56.48 (C4), 53.03 (C16), 52.87 (C16), 52.78 (C18), 52.75 (C18), 45.92 (C5), 45.82 (C5), 43.76 (C7), 43.61 (C7), 31.28 (C6), 31.09 (C6), 28.38 (6 x C12), 26.33 (C19), 26.21 (C19); IR (油, cm-1) 3215 (w), 2971 (w) 1738 (s), 1715 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 435 ([M+H], 10), 379 (30), 335 (100); [C21H27N2O6S]+Hについて計算した正確な質量はm/z 435.1590を要求、実測値 435.1576 (CI+).
【０７１６】
参考例１２９：１−（ｐ−メトキシ）フェニル−４−ヘキシルスルファニル−１，７−ジヒドロ−２Ｈ−アゼピン−３，６−ジオン、（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−（ｐ−メトキシ）フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン及び（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−（ｐ−メトキシ）フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンの調製
【０７１７】
【化１４７】
2013501766.tif 000149
【０７１８】
ヘキシルスルファニルマレイミド（２５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２５ｍＬ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、４−メトキシスチレン（１５４μＬ、１．２０ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、１−（ｐ−メトキシ）フェニル−４−ヘキシルスルファニル−１，７−ジヒドロ−２Ｈ−アゼピン−３，６−ジオン（１０ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）を無色油状物として２５％の収率で得、（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−（ｐ−メトキシ）フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（メジャー）及び（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−（ｐ−メトキシ）フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（マイナー）（２７ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）を、無色油状物として６７％の収率で、ジアステレオマー混合物（１０：１）として得た。
【０７１９】
４−ヘキシルスルファニル−１−（ｐ−メトキシ）フェニル−１，７−ジヒドロ−２Ｈ−アゼピン−３，６−ジオン δH (600 MHz, CDCl3) 7.21 (d, 2H, J = 8.5, 2 x Ar-H), 7.18 (s, 1H, NH), 6.84 (d, 2H, J = 9.0, 2 x Ar-H), 6.13 (s, 1H, H-5), 4.08 (t, 1H, J = 7.9, H-1), 3.80 (s, 3H, H3-18), 2.99 (dd, 1H, J = 7.2及び15.7, HH-7), 2.91 (dd, 1H, J = 8.7及び15.7, HH-7), 2.35-2.26 (m, 2H, H2-13), 1.51-1.43 (m, 2H, H2-12), 1.33-1.16 (m, 6H, H2-9 H2-10及びH2-11), 0.85 (t, 3H, J = 7.0, H3-8); δC (150 MHz, CDCl3) 171.03 (C=O), 170.05 (C=O), 159.06 (C17), 147.37 (C4), 132.92 (C14), 129.37 (C5), 128.79 (2 x Ar-H), 114.18  (2 x Ar-H), 55.38 (C18), 46.61 (C1), 32.59 (C7), 31.45 (C13), 31.38 (CH2), 29.22 (CH2), 28.64 (CH2), 22.61 (CH2), 14.14 (C8); IR (油, cm-1) 3275 (w), 2927 (m) 1774 (w), 1717 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 347 ([M+], 15), 237 (70), 230 (100), 202 (60); [C19H25NO3S]+について計算した正確な質量はm/z 347.1550を要求、実測値363.1553 (CI+).
【０７２０】
（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−（ｐ−メトキシ）フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（太字）及び（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−（ｐ−メトキシ）フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン
【０７２１】
【化１４８】
2013501766.tif 000150
【０７２２】
メジャーなジアステレオマー のシグナルのみが以下を示した：δC (150 MHz, CDCl3) 177.81 (C=O), 175.48 (C=O), 159.39 (C9), 129.94 (2 x Ar-H), 128.56 (C12), 113.65 (2 x Ar-H), 57.63 (C4), 55.38 (C8), 45.25 (C5), 43.78 (C7), 31.33 (CH2), 29.23 (CH2), 29.01 (CH2), 28.62 (CH2), 26.53 (C18), 22.52 (C6), 14.10 (C13); IR (油, cm-1) 3216 (w), 2928 (m) 1771 (m), 1707 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 348 ([M+H], 20), 135 (20), 134 (100); [C19H25NO3S]+H について計算した正確な質量はm/z 348.1633を要求、実測値363.1642 (CI+).
【０７２３】
参考例１３０：（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−（Ｎ−Ａｃ−Ｌ−Ｃｙｓ−ベンジルアミン）−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンの調製
【０７２４】
【化１４９】
2013501766.tif 000151
【０７２５】
Ｎ−Ａｃ−Ｃｙｓ（Ｍａｌ）−ベンジルアミン（２９ｍｇ、０．０８４ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５０ｍＬ）中に溶解して、０．００２Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、スチレン（１０μＬ、０．０８４ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテル中３０％の酢酸エチルから酢酸エチル中１０％のメタノールでの勾配溶出）により、所望の化合物（３３ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）を無色油状物として、［２＋２］反応のジアステレオマー混合物として８７％で得た。粗製物の再分析は、この反応がほぼ７０％達成できたことを示唆する。
【０７２６】
Ｎ−Ａｃ−Ｃｙｓ（Ｍａｌ）−ベンジルアミン（５８ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（８０ｍＬ）中に溶解して、０．００２Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、スチレン（１９１μＬ、１．７０ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテル中３０％の酢酸エチルから酢酸エチル中１０％のメタノールでの勾配溶出）により、所望の化合物（１４ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）を無色油状物として１９％の収率で得た。粗製物の再分析は、この反応が少なくとも７５％達成できたことを示唆する。
δH (600 MHz, CDCl3) 8.69 (s, 1H, H-2), 7.36-7.26 (m, 8H, 8 x Ar-H), 7.18 (d, 2H, J = 7.0, 2 x Ar-H), 6.65 (t, 1H, J = 5.6, H-17), 6.51 (d, 1H, J = 7.4, H-14), 4.33 (d, 2H, J = 6.0, H2-18), 4.30 (td, 1H, J = 1.2及び5.4, H-15), 4.05 (t, 1H, J = 8.9, H-5), 3.16 (dd, 1H, J = 3.1及び11.1, H-7),  3.04 (ddd, 1H, J = 8.9, 11.1及び12.8, HH-23), 2.94 (dd, 1H, J = 6.6及び13.3, HH-6), 2.59 (ddd, 1H, J = 3.4, 8.9及び12.5, HH-23), 2.31 (dd, 1H, J = 5.3及び13.6, HH-6), 1.98 (s, 3H, H3-12); δC (150 MHz, CDCl3) 179.07 (C=O), 176.97 (C=O), 171.10 (C=O), 169.67 (C=O), 137.67 (Ar), 136.16 (Ar), 129.02 (2 x Ar-H), 128.80 (2 x Ar-H), 128.55 (2 x Ar-H), 128.35 (Ar-H), 128.78 (2 x Ar-H), 127.66 (Ar-H), 57.44 (C4), 52.61 (C15), 46.09 (C5), 43.68 (C7), 43.66 (C18), 30.58 (C6), 26.15 (C23), 23.17 (C12); IR (油, cm-1) 3437 (w), 1726 (s); MS (FAB+) m/z (相対強度): 695 ([M+H], 10), 439 (10), 286 (100); [C32H34N6O8S2]+H について計算した正確な質量はm/z 695.1958を要求、実測値695.1964 (FAB+).
【０７２７】
参考例１３１：（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−２−メチル−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン及び（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−２−メチル−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンの調製
【０７２８】
【化１５０】
2013501766.tif 000152
【０７２９】
Ｎ−メチルヘキシルスルファニルマレイミド（２７ｍｇ、０．１１９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２５ｍＬ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、スチレン（１３６μＬ、１．１９ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−２−メチル−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（５ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）を無色油状物として１３％の収率で得、（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−２−メチル−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（２３ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）を無色油状物として５８％の収率で得た。
【０７３０】
（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−２−メチル−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン
δH (600 MHz, CDCl3) 7.32-7.30 (m, 3H, 3 x Ar-H), 7.13 (d, 2H, J = 7.9, 2 x H-10), 3.99 (dd, 1H, J = 7.8及び10.2, H-5), 3.20 (dd, 1H, J = 4.8及び10.3, H-7), 3.13-3.07 (m, 1H, HH-6), 2.93 (s, 3H, H3-18), 2.65 (td, 1H, J = 7.5及び11.4, HH-17), 2.58 (td, 1H, J = 7.5及び11.8, HH-17), 2.46 (ddd, 1H, J = 4.9, 7.7及び12.0, HH-6), 1.55-1.25 (m, 8H, H2-13, H2-14, H2-15及びH2-16), 0.87 (t, 3H, J = 7.0, H3-12); δC (150 MHz, CDCl3) 177.78 (C=O), 175.17 (C=O), 137.21 (C11), 128.71 (2 x Ar-H), 127.93 (C8), 127.24 (2 x Ar-H), 48.23 (C5), 42.71 (C7), 31.42 (CH2), 30.07 (C17), 29.33 (CH2), 28.69 (CH2), 25.71 (CH2), 25.25 (C18), 22.58 (CH2), 14.12 (C12); IR (油, cm-1) 2927 (w) 1715 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 332 ([M+H], 40), 228 (40), 86 (70), 84 (100); [C19H25NO2S]+Hについて計算した正確な質量はm/z 332.1684を要求、実測値 333.1697 (CI+).
【０７３１】
（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−２−メチル−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン
δH (600 MHz, CDCl3) 7.39-7.30 (m, 5H, 5 x Ar-H), 3.90 (t, 1H, J = 8.7, H-5) 3.13-3.11 (m, 4H, H3-18及びH-7), 3.00 (ddd, 1H, J = 8.5, 11.0及び12.8, HH-6), 2.53 (ddd, 1H, J = 3.7, 9.1及び12.8,  HH-6), 2.40 (ddd, 1H, J = 6.4, 8.1及び11.3, HH-17), 2.06 (ddd, 1H, J = 6.5, 8.3及び11.3, HH-17), 1.25-1.08 (m, 8H, H2-13, H2-14, H2-15及びH2-16), 0.82 (t, 3H, J = 7.4, H3-12); δC (150 MHz, CDCl3) 178.73 (C=O), 177.70 (C=O), 136.77 (C11), 128.89 (2 x Ar-H), 128.27 (2 x Ar-H), 127.99 (C8), 55.69 (C4), 45.62 (C5), 42.61 (C7), 31.29 (CH2), 28.94 (CH2), 28.68 (CH2), 28.55 (C17), 26.26 (C6), 25.70 (C18), 22.58 (CH2), 14.09 (C12); IR (油, cm-1) 2927 (w) 1703 (s),; MS (CI+) m/z (相対強度): 332 ([M+H], 100); [C19H25NO2S]+H について計算した正確な質量はm/z 332.1684を要求、実測値332.1680 (CI+).
【０７３２】
参考例１３２：（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−２−フェニル−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン、（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−２−フェニル−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン及び１−フェニル−３−フェニル−４−ヘキシルスルファニル−１，７−ジヒドロ−２Ｈ−アゼピン−３，６−ジオンの調製
【０７３３】
【化１５１】
2013501766.tif 000153
【０７３４】
Ｎ−フェニルヘキシルスルファニルマレイミド（３４ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２５ｍＬ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、スチレン（１３５μＬ、１．１８ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−２−フェニル−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン及び（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−２−フェニル−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（３７ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）を無色油状物として８０％の収率で、ジアステレオマー混合物（１１：２）として得、１−フェニル−３−フェニル−４−ヘキシルスルファニル−１，７−ジヒドロ−２Ｈ−アゼピン−３，６−ジオン（０．５ｍｇ、０．００１ｍｍｏｌ）を無色油状物として１％の収率で得た。（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−２−フェニル−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン及び（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−２−フェニル−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン
【０７３５】
（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−２−フェニル−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（太字）
【０７３６】
【化１５２】
2013501766.tif 000154
【０７３７】
１−フェニル−３−フェニル−４−ヘキシルスルファニル−１，７−ジヒドロ−２Ｈ−アゼピン−３，６−ジオン
δH (600 MHz, CDCl3) 7.54-7.27 (m, 10H, 10 x Ar-H), 6.32 (s, 1H, H-6), 4.19 (t, 1H, J = 88.0, H-1), 3.14-3.03 (m, 2H, H2-2), 2.39-2.29 (m, 2H, H2-13), 1.61-1.10 (m, 8H, 4 x CH2),  0.89-0.81 (m, 3H, H3-8); δC (150 MHz, CDCl3) 146.31 (C=O), 141.19 (C=O), 130.19 (Ar), 129.41 (Ar), 129.20 (Ar-H), 128.93 (2 x Ar-H), 128.49 (2 x Ar-H), 127.90 (Ar-H), 127.76 (2 x Ar-H), 126.03 (2 x Ar-H), 47.19 (C1), 32.70 (CH2), 31.43 (CH2), 29.83 (CH2), 29.20 (CH2), 28.63 (CH2), 22.61 (CH2), 14.13 (C8); IR (油, cm-1) 2926 (m) 1715 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 394 ([M+H], 40), 278 (100); [C24H27NO2S]+Hについて計算した正確な質量はm/z 394.1841を要求、実測値394.1829 (CI+).
【０７３８】
参考例１３３：（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−フェニルチオ−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン及び（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−４−フェニルチオ−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンの調製
【０７３９】
【化１５３】
2013501766.tif 000155
【０７４０】
フェニルチオマレイミド（１７ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２５ｍＬ）中に溶解して、０．００３Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、スチレン（１１１μＬ、０．８２ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−フェニルチオ−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（１．５ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ）を無色油状物として６％の収率で得、（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−４−フェニルチオ−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（１７．５ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）を無色油状物として６９％の収率で得た。
【０７４１】
（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−フェニルチオ−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン
δH (600 MHz, CDCl3) 8.05 (s, 1H, NH), 7.42-7.41 (m, 2H, 2 x Ar-H), 7.35-7.17 (m, 8H, 8 x Ar-H), 4.05 (t, 1H, J = 10.1, H-5), 3.29 (dd, 1H, J = 5.5及び13.0, H-7), 3.01 (dt, 1H, J = 10.3及び13.0, HH-6), 2.56 (ddd, 1H, J = 5.6, 10.1及び13.4, HH-6); δC (150 MHz, CDCl3) 176.69 (C=O), 174.10 (C=O), 136.56 (C11), 136.01 (2 x Ar-H), 130.13 (Ar-H), 129.66 (2 x Ar-H), 129.28 (C15), 128.72 (2 x Ar-H), 128.01 (Ar-H), 127.32 (2 x Ar-H), 60.59 (C4), 46.32 (C5), 43.70 (C7), 25.51 (C6); IR (油, cm-1) 3226 (w), 2925 (w) 1715 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 310 ([M+H], 10), 206 (30), 111 (100); [C18H15NO2S]+Hについて計算した正確な質量はm/z 310.0902を要求、実測値310.0901 (CI+).
【０７４２】
（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−４−フェニルチオ−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン
δH (600 MHz, CDCl3) 8.24 (s, 1H, NH), 7.43-7.30 (m, 6H, 8 x Ar-H), 7.27-7.24 (m, 2H, 2 x Ar-H), 4.13 (t, 1H, J = 9.0, H-5), 3.20-3.13 (m, 2H, HH-6及びH-7), 2.55 (ddd, 1H, J = 5.6, 8.3及び13.4, HH-6); δC (150 MHz, CDCl3) 177.99 (C=O), 177.17 (C=O), 135.80 (C11), 135.80 (2 x Ar-H), 129.64 (Ar-H), 129.54 (2 x Ar-H), 128.95 (C15), 128.51 (2 x Ar-H), 128.45 (2 x Ar-H), 128.22 (Ar-H), 60.72 (C4), 45.80 (C5), 43.39 (C7), 25.20 (C6); IR (油, cm-1) 3211 (w), 1772 (w) 1707 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 310 ([M+H], 50), 206 (100), 104 (40); [C18H15NO2S]+H について計算した正確な質量はm/z 310.0902を要求、実測値310.0905 (CI+).
【０７４３】
参考例１３４：（４ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプト−５−エン−１，３−ジオンの調製
【０７４４】
【化１５４】
2013501766.tif 000156
【０７４５】
ヘキシルスルファニルマレイミド（２５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２５ｍＬ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、フェニルアセチレン（１２８μＬ、１．１６ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌しながら３０分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、所望の化合物（４．５ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）を無色油状物として１８％の収率（回収されたＳＭに基づく）で得、同時にＳＭ（１．５ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ）を６％の収率で得た。 δH (600 MHz, CDCl3) 7.86 (s, 1H, NH), 7.68 (d, 2H, J = 7.86, 2 x Ar-H), 7.40-7.34 (m, 3H, 3 x Ar-H), 6.58 (s, 1H, H-5), 3.73 (s, 1H, H-7), 2.57 (dt, 1H, J = 2.3及び7.4, H2-13), 1.77-1.19 (m, 8H, 4 x CH2), 0.85 (t, 3H, J = 7.3, H3-8); δC (150 MHz, CDCl3) 173.46 (C=O), 173.28 (C=O), 149.72 (C17), 130.25 (C6), 130.02 (C14), 128.85 (2 x Ar-H), 126.32 (2 x Ar-H), 125.76 (C5), 53.78 (C7), 31.33 (CH2), 29.70 (CH2), 29.32 (CH2), 28.61 (CH2), 22.55 (CH2), 14.11 (C8); IR (油, cm-1) 3228 (w), 2925 (m), 1770 (w) 1709 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 316 ([M+H], 100), 214 (30); [C18H22NO2S]+Hについて計算した正確な質量はm/z 316.0371を要求、実測値316.1365 (CI+).
【０７４６】
参考例１３５：１−ブチル−４−ヘキシルスルファニル−１，７−ジヒドロ−２Ｈ−アゼピン−３，６−ジオン及び（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−ブチル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンの調製
【０７４７】
【化１５５】
2013501766.tif 000157
【０７４８】
ヘキシルスルファニルマレイミド（２５ｍｇ、０．１１６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２０．７ｍＬ）及びヘキサ−１−エン（４．３ｍＬ、１１．６ｍｍｏｌ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、１−ブチル−４−ヘキシルスルファニル−１，７−ジヒドロ−２Ｈ−アゼピン−３，６−ジオン（４ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）を無色油状物として１２％の収率で得（（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−ブチル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンと同時に）及び（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−ブチル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（１６ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）を無色油状物として４７％の収率で得た。
【０７４９】
１−ブチル−４−ヘキシルスルファニル−１，７−ジヒドロ−２Ｈ−アゼピン−３，６−ジオン
δH (600 MHz, CDCl3) 7.29 (s, 1H, NH), 6.43 (s, 1H, H-5), 2.91-2.76 (m, 3H, H-1及びH2-17), 2.70 (dd, 1H, J =1.4及び5.8, HH-7), 2.64 (dd, 1H, J = 1.4及び7.9, HH-7), 2.49 (t, 1H, J = 7.4, H2-13), 1.81-1.25 (m, 12H, 6 x CH2), 0.93-0.85 (m, 6H, H3-8及びH3-14); δC (150 MHz, CDCl3) 174.39 (C=O), 171.40 (C=O), 148.19 (C4), 129.28 (C5), 43.90 (C1), 34.97 (CH2), 31.53 (CH2), 30.60 (CH2), 29.70 (CH2), 29.07 (CH2), 28.76 (CH2), 28.51 (CH2), 22.66 (CH2), 22.65 (CH2), 14.16 (CH3), 14.13 (CH3); IR (油, cm-1) 3226 (w), 2927 (m) 1715 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 298 ([M+H], 80), 187 (100); [C16H27NO2S]+H について計算した正確な質量はm/z 298.1841を要求、実測値298.1841 (CI+).
【０７５０】
（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−ブチル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン
δH (600 MHz, CDCl3) 8.19 (s, 1H, NH), 3.09 (dd, 1H, J = 4.5及び10.2, H-7), 2.70-2.64 (m, 1H, H-5), 2.53-2.45 (m, 2H, H2-17), 2.37-2.28 (m, 2H, H2-6), 1.80-1.73 (m, 1H, HH-11), 1.59-1.50 (m, 2H, HH-11及びHH-10), 1.38-1.20 (m, 11H, HH-10及び5 x CH2), 0.90 (t, 3H, J = 7.1, CH3), 0.87 (t, 3H, J = 7.3, CH3); δC (150 MHz, CDCl3) 178.73 (C=O), 177.81 (C=O), 56.10 (C4), 44.29 (C7), 40.99 (C5), 31.42 (C17), 29.24 (CH2), 28.99 (CH2), 28.90 (CH2), 28.74 (CH2), 28.73 (CH2), 27.92 (CH2), 22.59 (CH2), 22.58 (CH2), 14.12 (CH3), 14.09 (CH3); IR (油, cm-1) 3209 (w), 2927 (m) 1774 (w), 1711 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 298 ([M+H], 100); [C16H27NO2S]+H について計算した正確な質量はm/z 298.1841を要求、実測値298.1845 (CI+).
【０７５１】
参考例１３６：（４ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−エチル−６−エチル−ビシクロ［３．２．０］ヘプト−５−エン−１，３−ジオンの調製
【０７５２】
【化１５６】
2013501766.tif 000158
【０７５３】
ヘキシルスルファニルマレイミド（２５ｍｇ、０．１１６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２１．１ｍＬ）及びヘキシ−３−イン（３．９ｍＬ、１１．６ｍｍｏｌ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、所望の化合物（１７ｍｇ、０．０５７ｍｍｏｌ）を無色油状物として４９％の収率で得た。 δH (600 MHz, CDCl3) 8.26 (s, 1H, NH), 3.88 (s, 1H, H-7), 2.99 (ddd, 1H, J = 7.5, 9.1及び12.8, HH-18), 2.87 (ddd, 1H, J =5.1, 8.7及び12.9, HH-18), 2.39-2.20 (m, 2H, HH-9及びHH-11), 1.95-1.75 (m, 2H, HH-9及びHH-11), 1.56-1.10 (m, 8H, 4 x CH2), 0.90-0.86 (m, 9H, H3-8, H3-10及びH3-12); δC(150 MHz, CDCl3) 172.66 (C=O), 171.34 (C=O), 148.84 (C=C), 142.53 (C=C), 70.45 (C4), 48.86 (C18), 48.09 (C7), 31.45 (CH2), 28.51 (CH2), 23.53 (CH2), 22.50 (CH2), 21.89 (CH2), 21.62 (CH2) 14.09 (C12), 12.03 (CH3), 11.84 (CH3); IR (油, cm-1) 2931 (m) 1717 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 312 ([M+OH], 100), 178 (100); [C16H25NO2S]+OH について計算した正確な質量はm/z 312.1633を要求、実測値312.1648 (CI+).
【０７５４】
参考例１３７：１−エチル−２−エチル−６−ヘキシルスルファニル−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−アゼピン−４，７−ジオンの調製
【０７５５】
【化１５７】
2013501766.tif 000159
【０７５６】
ヘキシルスルファニルマレイミド（２５ｍｇ、０．１１６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２１．１ｍＬ）及びｔｒａｎｓ−ヘキサ−３−エン（３．９ｍＬ、１１．６ｍｍｏｌ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、所望の化合物（２ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ）を無色油状物として６％の収率で得た。 δH (600 MHz, CDCl3) 7.32 (s, 1H, NH), 6.49 (s, 1H, H-6), 2.92 (ddd, 1H, J = 4.6, 6.3及び10.8, H-1), 2.83 (ddd, 1H, J =5.2, 9.4及び12.8, HH-13), 2.75 (dd, 1H, J = 5.9及び10.9, H-2), 2.62 (ddd, 1H, J = 6.7, 9.6及び12.7 HH-13), 2.07-2.00 (m, 1H, HH-17), 1.89-1.83 (m, 1H, HH-15), 1.79-1.40 (m, 6H, HH-15, HH-17及び2 x CH2), 1.33-1.30 (m, 4H, 2 x CH2), 1.10 (t, 3H, J = 7.5, H3-16), 0.92 (t, 3H, J = 7.4, CH3), 0.89 (t, 3H, J = 7.0, CH3); δC (150 MHz, CDCl3) 171.00 (C=O), 169.53 (C=O), 149.76 (C5), 129.27 (C6), 62.54 (C2), 51.16 (C13), 40.42 (C1), 31.48 (CH2), 28.65 (CH2), 23.65 (CH2), 23.32 (CH2), 22.52 (CH2), 17.23 (C17) 14.11 (CH3), 13.96 (CH3), 12.33 (CH3); IR (油, cm-1) 2962 (m) 1717 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 314 ([M+OH], 75), 180 (100); [C16H26NO2S]+OHについて計算した正確な質量はm/z 314.1790を要求、実測値314.1799 (CI+).
【０７５７】
参考例１３８：（４ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５，５−ジフェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンの調製
【０７５８】
【化１５８】
2013501766.tif 000160
【０７５９】
ヘキシルスルファニルマレイミド（２５ｍｇ、０．１１６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２１ｍＬ）及び１，１−ジフェニルエチレン（２０３μＬ、１．１６ｍｍｏｌ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、所望の化合物（３０ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）を無色油状物として６４％の収率で得た。 δH (600 MHz, CDCl3) 8.15 (s, 1H, NH), 7.42 (m, 2H, 2 x H-8), 7.36-7.21 (m, 8H, 8 x Ar-H), 3.54 (dd, 1H, J =10.3及び12.9, HH-6), 3.34 (dd, 1H, J = 5.7及び10.3, H-7), 3.18 (dd, 1H, J = 5.8及び12.9, HH-6), 2.43 (dt, 1H, J =7.3及び11.0, HH-17), 2.34 (dt, 1H, J = 7.4及び11.0, HH-17), 1.40-1.34 (m, 2H, H2-16), 1.26-1.20 (m, 4H,  H2-14及びH2-15), 1.18-1.13 (m, 2H, H2-13), 0.84 (t, 3H, J = 7.5, H3-12); δC (150 MHz, CDCl3) 177.16 (C=O), 175.87 (C=O), 142.09 (2 x Ar), 141.80 (2 x Ar), 128.17 (2 x Ar-H), 128.13 (2 x Ar-H), 128.10 (2 x Ar-H), 128.06 (2 x Ar-H), 127.44 (Ar-H), 127.32 (Ar-H), 63.03  (C5), 57.20 (C4), 44.38 (C7), 35.17 (C6), 31.35 (CH2), 30.07 (C17), 28.77 (CH2), 28.71 (CH2) 22.53 (CH2), 14.11 (C12); IR (油, cm-1) 2927 (m) 1772 (w), 1709 (s); MS (ES-) m/z (相対強度): 392 ([M], 10), 212 (100); [C24H26NO2S] について計算した正確な質量はm/z 392.1684を要求、実測値392.1674 (ES-) 
【０７６０】
参考例１３９：（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−２−メチレンシクロヘキサン−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン及び（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−２−メチレンシクロヘキサン−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンの調製
【０７６１】
【化１５９】
2013501766.tif 000161
【０７６２】
Ｎ−メチレンヘキシルスルファニルマレイミド（２５ｍｇ、０．１１６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２１ｍＬ）及び１，１−ジフェニルエチレン（２０３μＬ、１．１６ｍｍｏｌ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−２−メチレンシクロヘキサン−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン及び（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−２−メチレンシクロヘキサン−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（３０ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）を無色油状物として、ジアステレオマー混合物（１０：１）として６４％の収率で得た。
【０７６３】
（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−２−メチレンシクロヘキサン−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（太字）
【０７６４】
【化１６０】
2013501766.tif 000162
【０７６５】
参考例１４０：（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＳＲ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−７−ヘキシルスルファニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン及び（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＳＲ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−７−ヘキシルスルファニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンの調製
【０７６６】
【化１６１】
2013501766.tif 000163
【０７６７】
２，３  ジヘキシルスルファニルマレイミド（３８ｍｇ、０．１１５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２５ｍＬ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、スチレン（１３３μＬ、１．２ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌しながら２０分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＳＲ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−７−ヘキシルスルファニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（３ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ）を無色油状物として６％の収率で得、（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＳＲ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−７−ヘキシルスルファニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（３ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ）を無色油状物として６％の収率で得た。
【０７６８】
（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＳＲ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−７−ヘキシルスルファニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン
δH (600 MHz, CDCl3) 7.96 (s, 1H, NH), 7.33 (d, 2H, J = 7.0, 2 x Ar-H), 7.28 (t, 1H, J = 7.0, H-8), 7.21 (d, 2H, J = 7.5, 2 x Ar-H), 4.02 (t, 1H, J = 10.0, H-5), 2.98-2.92 (m, 2H, HH-6及び-S-CHH-), 2.87 (dd, 1H, J = 10.8及び13.6, HH-6), 2.83-2.72 (m, 2H, -S-CHH-及び-S-CHH-), 2.69 (dt, 1H, J = 7.4及び10.8, -S-CHH-) 1.68-1.57 (m, 4H, H2-16及びH2-22), 1.45-1.31 (m, 4H, H2-15及びH2-21), 1.31-1.25 (m, 8H, H2-13, H2-14, H2-19及びH2-20), 0.86 (t, 6H, J = 7.0, H3-12及びH3-18); δC (150 MHz, CDCl3) 176.91 (C=O), 172.96 (C=O), 136.09 (C11), 128.83 (2 x Ar-H), 128.13 (C8), 127.41 (2 x Ar-H), 62.86 (C4), 54.36 (C7), 46.49 (C5), 33.28 (C6), 31.51 (CH2), 31.47 (CH2), 30.65 (SCH2), 30.09 (SCH2), 29.22 (CH2), 28.96 (CH2), 28.80 (CH2), 28.74 (CH2), 22.63 (CH2), 22.60 (CH2), 14.17 (CH3), 14.15 (CH3); IR (油, cm-1) 3194 (w), 2928 (m) 1774 (w), 1722 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 432 ([M-H], 5), 332 (50), 316 (95), 207 (100); [C24H35NO2S2]-Hについて計算した正確な質量はm/z 432.2026を要求、実測値432.2029 (CI+).
【０７６９】
（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＳＲ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−７−ヘキシルスルファニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン
δH (600 MHz, CDCl3) 8.10 (s, 1H, NH), 7.41 (d, 2H, J = 6.9, 2 x Ar-H), 7.37 (t, 1H, J = 6.9, H-8), 7.33 (d, 2H, J = 6.9, 2 x Ar-H), 3.92 (t, 1H, J = 8.9, H-5), 2.95 (dd, 1H, J = 8.9及び12.9, HH-6), 2.86 (dt, 1H, J = 6.9及び14.2, -S-CHH-), 2.78-2.66 (m, 2H, HH-6及び-S-CHH-), 2.60 (ddd, 1H, J = 6.3, 8.3及び10.9, -S-CHH-) 2.00 (ddd, 1H, J = 5.6, 8.6及び10.7, -S-CHH-), 1.65-1.60 (m, 2H, HH-16及びHH-22), 1.43-1.06 (m, 14H, HH-16, HH-22, H2-13, H2-14, H2-15, H2-19, H2-20及びH2-21), 0.88 (t, 3H, J = 6.7, CH3), 0.82 (t, 3H, J = 7.1, CH3); δC (150 MHz, CDCl3) 176.59 (C=O), 176.44 (C=O), 136.03 (C11), 129.50 (2 x Ar-H), 128.83 (C8), 128.29 (2 x Ar-H), 62.32 (C4), 54.58 (C7), 45.33 (C5), 34.85 (C6), 31.48 (CH2), 31.33 (CH2), 30.51 (CH2), 29.21 (CH2), 29.06 (CH2), 28.90 (CH2), 28.76 (CH2), 28.53 (CH2), 22.62 (CH2), 22.50 (CH2), 14.16 (CH3), 14.11 (CH3); IR (油, cm-1) 3215 (w), 2926 (m) 1774 (w), 1715 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 432 ([M-H], 5), 329 (60), 207 (100), 161 (60); [C24H35NO2S2]-Hについて計算した正確な質量はm/z 432.2026 を要求、実測値 432.2034 (CI+).
【０７７０】
参考例１４１：（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＳＲ）２−アザ−４−（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ）−５−フェニル−７−（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ）−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンの調製
【０７７１】
【化１６２】
2013501766.tif 000164
【０７７２】
２，３−ジ−（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ）−マレイミド（７６ｍｇ、０．１３５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２９ｍＬ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、スチレン（１４８μＬ、１．３５ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌しながら３０分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテル中１０％の酢酸エチルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＳＲ）２−アザ−４−（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ）−５−フェニル−７−（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ）−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンと（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＳＲ）２−アザ−４−（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ）−５−フェニル−７−（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ）−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンとの混合物（２８ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）を、無色油状物として３６％の収率で得た。この混合物からのスペクトルは非常に複雑であったが、全てが同じ質量を有するので、ＭＳにより、化合物の正体が確認された。４ＲＳ，５ＲＳ，７ＳＲ）２−アザ−４−（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ）−５−フェニル−７−（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ）−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン及び（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＳＲ）２−アザ−４−（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ）−５−フェニル−７−（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ）−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンもまた、無色油状物（４６ｍｇ）として［５＋２］生成物と同時に単離された。１Ｈ  ＮＭＲ及びＭＳのデータは、このうち４０％（質量）が、所望のコンジュゲーション生成物（１８ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）（２０％の収率）であることを示唆する。 δH (600 MHz, CDCl3) 8.32 (d, 4.7H, J = 8.7, N-H), 8.05 (s, 1.2H, N-H), 7.79 (s, 1H, N-H), 7.40-7.20 (m, 60H, Ar-H), 5.65 (d, 1H, J = 7.2, H-N), 5.57 (d, 5.2H, J = 8.2, H-N), 5.45 (d, 4.9H, J = 7.3, H-N), 5.40 (d, 1.9H, J = 7.8, H-N), 4.92 (d, 2.5H, J = 7.3, H-14), 4.74 (d, 3.7H, J = 7.8, H-14), 4.62-4.54 (m, 8H, H-14), 4.16-4.11 (m, 2.7H), 4.09-4.06 (m, 3.9H), 3.97-3.9 (m, 7.8H), 3.80-3.75 (m, 50.5H, H3-12), 3.66 (s, 22.6H, H3-12) 3.47-3.04 (m, 41.4, H2-18), 2.99-2.94 (m, 9.5H, H2-18), 2.82-2.73 (m, 9.5H, H2-18), 1.46-1.42 (m, 240H, H3-17); δC (150 MHz, CDCl3) 175.94 (C=O), 175.84 (C=O), 175.82 (C=O), 171.10 (C=O), 171.04 (C=O), 170.95 (C=O), 155.28 (Ar), 129.63 (Ar-H), 129.50 (Ar-H), 128.96 (Ar-H), 128.88 (Ar-H), 128.80 (Ar-H), 128.75 (Ar-H), 128.59 (Ar-H), 128.53 (Ar-H), 128.41 (Ar-H), 80.51 (C16), 80.22 (C16), 52.97 (C12), 52.93 (C12), 52.71 (C14), 52.61 (C14), 45.25 (C5), 32.92 (C18), 32.86 (C18), 31.19 (C18), 31.08 (C18), 29.83 (C6), 28.42 (C17) いくつかの炭素 シグナルは、ジアステレオマーの重複に起因して欠落している; IR (油, cm-1) 2924 (m), 1712 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 666 ([M-H], 100); [C30H41N3O10S2]-Hについて計算した正確な質量はm/z 666.2155を要求、実測値 666.2188 (CI+).
【図１】
2013501766.tif 000178
【図２】
2013501766.tif 000179
【図３】
2013501766.tif 000180
【図４】
2013501766.tif 000181
【図５】
2013501766.tif 000182
【図６】
2013501766.tif 000183
【図７】
2013501766.tif 000184
【図８】
2013501766.tif 000185
【図９】
2013501766.tif 000186
【図１０】
2013501766.tif 000187
【図１１】
2013501766.tif 000188
【図１２】
2013501766.tif 000189
【手続補正書】
【提出日】平成24年4月11日(2012.4.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）固体基材及び（ｂ）それに連結された式（Ｉ）の部分を含む、生成物：
【化１】
2013501766.tif 000190
式中、
Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＱの基を示し、Ｑは、水素、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル又はフェニルであり；
以下のいずれかであり：
（ｉ）Ｒは、求電子性脱離基Ｙを示し、固体基材は、式（Ｉ）の１位、３位又は４位に連結されており、機能的部分が、式（Ｉ）の１位、３位又は４位に連結されている；又は
（ｉｉ）固体基材はチオール部分を有し、Ｒは、該チオール部分の硫黄原子への結合を示し、機能的部分が、式（Ｉ）の１位、３位又は４位に連結されている；又は
（ｉｉｉ）固体基材は、式（Ｉ）の１位、３位又は４位に連結されており、Ｒは、式−Ｓ−Ｆ１又は−Ｓ−Ｌ−Ｆ２の基を示し、式中Ｌはリンカー基を示し、−Ｓ−Ｆ１及び−Ｆ２は機能的部分を示す；
機能的部分は、検出可能部分、酵素活性部分、アフィニティタグ、ハプテン、免疫原性担体、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド又はリガンド候補、生物活性部分、リポソーム、ポリマー部分、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、細胞、炭水化物、ＤＮＡ及びＲＮＡから選択される。
【請求項２】
式（ＩＩ）を有する、請求項１に記載の生成物：
【化２】
2013501766.tif 000191
式中、
Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＱの基を示し、Ｑは、水素、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル又はフェニルであり；
Ｒ１は以下を示し：
（ｉ）求電子性脱離基Ｙ；又は
（ｉｉ）チオール部分を有し、該チオール部分の硫黄原子を介して式（ＩＩ）の２位に結合している、固体基材；又は
（ｉｉｉ）−Ｓ−Ｆ１若しくは−Ｓ−Ｌ−Ｆ２；
Ｒ２は、水素原子、Ｓｏｌ、−Ｌ−Ｓｏｌ、Ｆ３、Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｆ３）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍ又はＩＧを示し；
以下のいずれかであり：
Ｒ３及びＲ３’は、同じ又は異なって、それぞれ水素原子、Ｓｏｌ、−Ｌ−Ｓｏｌ、Ｆ３、Ｅ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｆ３）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍ又はＩＧを示す；又は
Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｏ−又は−Ｎ（Ｒ３３’）−の基を形成し、Ｒ３３’は、水素原子、Ｓｏｌ、−Ｌ−Ｓｏｌ、Ｆ３、Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｆ３）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍ又はＩＧを示す；又は
Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３’）−Ｎ（Ｒ３３’）−の基を形成し、各Ｒ３３’は、同じ又は異なって、水素原子、Ｓｏｌ、−Ｌ−Ｓｏｌ、Ｆ３、Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｆ３）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍ又はＩＧを示す；
Ｓｏｌは固体基材を示し；
−Ｓ−Ｆ１、Ｆ２及びＦ３のそれぞれは、同じ又は異なって、検出可能部分、酵素活性部分、アフィニティタグ、ハプテン、免疫原性担体、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド又はリガンド候補、生物活性部分、リポソーム、ポリマー部分、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、細胞、炭水化物、ＤＮＡ及びＲＮＡから選択される機能的部分を示し；
Ｅ及びＹのそれぞれは、同じ又は異なって、求電子性脱離基を示し；
各Ｎｕは、同じ又は異なって、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２及び−ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）から選択される求核剤を示し；
各Ｌは、同じ又は異なって、リンカー基を示し；
各Ｚは、同じ又は異なって、部分Ｌに結合した反応性基を示し；
各ｎは、同じ又は異なって、１、２又は３であり；
各ｍは、同じ又は異なって、０からｎまでの値を有する整数であり；
各ＩＧは、同じ又は異なって、非置換であるか又は１個以上のハロゲン原子置換基で置換されている、Ｃ１−２０アルキル基、Ｃ２−２０アルケニル基又はＣ２−２０アルキニル基である部分を示し、式中、（ａ）０、１又は２個の炭素原子は、Ｃ６−１０アリーレン、５〜１０員のヘテロアリーレン、Ｃ３−７カルボシクリレン及び５〜１０員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されており、かつ（ｂ）０、１又は２個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−及び−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−基から選択される基によって置換されており、式中、
（ｉ）該アリーレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオール、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）及びニトロ基から選択される１個以上の置換基によって置換されており；
（ｉｉ）該カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基中の０、１又は２個の炭素原子は、−Ｃ（Ｏ）−基によって置換されており；
ただし、該生成物は、１つの固体基材及び少なくとも１個の機能的部分を含む。
【請求項３】
（Ａ）：
Ｙが、ハロゲン原子又はトリフレート、トシレート、メシレート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル、Ｃ１−６アルキルチオール、５〜１０員のヘテロシクリルチオール、Ｃ６−１０アリールチオール、Ｃ３−７カルボシクリルチオール、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３、−ＯＣ（Ｏ）ＣＦ３、フェニルオキシ、−ＮＲｘＲｙＲｚ＋若しくは−ＰＲｘＲｙＲｚ＋基であり、式中、Ｒｘ、Ｒｙ及びＲｚは、同じ又は異なって、水素原子並びにＣ１−６アルキル及びフェニル基から選択される；及び／又は
（Ｂ）：
Ｅが、ハロゲン原子又はＣ１−６アルコキシ、チオール、Ｃ１−６アルキルチオール、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）、トリフレート、トシレート、メシレート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル、イミダゾリル、フェニルオキシ若しくはニトロフェニルオキシ基である；及び／又は
（Ｃ）：
Ｌが、非置換であるか又は１個以上のハロゲン原子置換基で置換されている、Ｃ１−２０アルキレン基、Ｃ２−２０アルケニレン基又はＣ２−２０アルキニレン基である部分を示し、式中、（ａ）０、１又は２個の炭素原子は、Ｃ６−１０アリーレン、５〜１０員のヘテロアリーレン、Ｃ３−７カルボシクリレン及び５〜１０員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されており、かつ（ｂ）０、１又は２個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−及び−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−基から選択される基によって置換されており、式中、
（ｉ）該アリーレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオール、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）及びニトロ基から選択される１個以上の置換基によって置換されており；
（ｉｉ）該カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基中の０、１又は２個の炭素原子は、−Ｃ（Ｏ）−基によって置換されている；及び／又は
（Ｄ）：
Ｚが、
（ａ）式−ＬＧ、−Ｃ（Ｏ）−ＬＧ、−Ｃ（Ｓ）−ＬＧ又は−Ｃ（ＮＨ）−ＬＧの基（式中、ＬＧは求電子性脱離基である）；
（ｂ）−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）及び−Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ２基から選択される求核剤Ｎｕ’；
（ｃ）求核剤と開環求電子反応し得る環式部分Ｃｙｃ；
（ｄ）式−Ｓ（Ｏ２）（Ｈａｌ）の基（式中、Ｈａｌはハロゲン原子である）；
（ｅ）式−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ又は−Ｎ＝Ｃ＝Ｓの基；
（ｆ）式−Ｓ−Ｓ（ＩＧ’）の基（式中、ＩＧ’は、請求項２に記載の式ＩＧの基を示す）；
（ｇ）１個以上のハロゲン原子によって置換されたＣ６−１０アリール基である、基ＡＨ；
（ｈ）紫外線光への曝露によって活性化され得る光反応性基；
（ｉ）式−Ｃ（Ｏ）Ｈ又は−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−６アルキル）の基；
（ｊ）マレイミド基；
（ｋ）式−Ｃ（Ｏ）ＣＨＣＨ２の基；
（ｌ）式−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｎ２）Ｈ又は−ＰｈＮ２＋の基（式中、Ｐｈはフェニル基を示す）；若しくは
（ｍ）エポキシド基、
を示す；及び／又は
（Ｅ）：
ＩＧが、非置換のＣ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基又はＣ２−６アルキニル基である部分を示し、式中、（ａ）０又は１個の炭素原子は、フェニレン、５〜６員のヘテロアリーレン、Ｃ５−６カルボシクリレン及び５〜６員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されており、該フェニレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにＣ１−４アルキル及びＣ１−４アルコキシ基から選択される１又は２個の置換基によって置換されており、かつ（ｂ）０、１又は２個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−及び−Ｃ（Ｏ）−基から選択される基によって置換されている；及び／又は
（Ｆ）：
ｎが１である、
請求項２に記載の生成物。
【請求項４】
式（ＩＩ）の生成物が式（ＩＩａ）の生成物
【化３】
2013501766.tif 000192
（式中、Ｘ、Ｘ’、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３３’は全て、請求項２又は３に記載したとおりである）
である、請求項２又は３に記載の生成物。
【請求項５】
Ｘ及びＸ’がそれぞれ酸素を示し；
Ｒ１が以下を示し：
（ｉ）ハロゲン原子；又は
（ｉｉ）チオール部分を有し、該チオール部分の硫黄原子を介して式（ＩＩ）の２位に結合している、固体基材；又は
（ｉｉｉ）−Ｓ−Ｆ１；
Ｒ２は、水素若しくはハロゲン原子、固体基材、Ｆ３又はＣ１−６アルキル基を示し；
Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３’）の基を形成し、Ｒ３３’は、水素原子、固体基材、Ｆ３又はＣ１−６アルキル基を示し；
−Ｓ１−Ｆ１及びＦ３は、同じ又は異なって、検出可能部分、酵素活性部分、アフィニティタグ、ハプテン、免疫原性担体、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド又はリガンド候補、生物活性部分、リポソーム、ポリマー部分、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、細胞、炭水化物、ＤＮＡ及びＲＮＡから選択される機能的部分を示し；
ただし、該生成物は、１つの固体基材及び少なくとも１個の機能的部分を含み、該生成物は、好ましくは、１個の機能的部分−Ｓ−Ｆ１、Ｆ２又はＦ３を含み、好ましくは、該機能的部分は機能的部分−Ｓ−Ｆ１である、
請求項２〜４のいずれか１項に記載の生成物。
【請求項６】
Ｒ３及びＲ３’が一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３’）の基を形成し、Ｒ３３’が固体基材を示す、請求項２〜５のいずれか１項に記載の生成物。
【請求項７】
機能的部分に固体基材を連結するための試薬としての、式（ＩＩＩ）の部分を含む化合物の使用：
【化４】
2013501766.tif 000193
式中、
Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＱの基を示し、Ｑは、水素、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル又はフェニルであり；
Ｙは求電子性脱離基であり；
機能的部分は、検出可能部分、酵素活性部分、アフィニティタグ、ハプテン、免疫原性担体、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド又はリガンド候補、生物活性部分、リポソーム、ポリマー部分、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、細胞、炭水化物、ＤＮＡ又はＲＮＡである。
【請求項８】
式（ＩＩＩ）の部分を含む化合物が、式（ＩＶ）の化合物である、請求項７に記載の使用：
【化５】
2013501766.tif 000194
式中、
Ｒ２ａは、水素原子、Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ’）ｎ又はＩＧを示し；
以下のいずれかであり：
Ｒ３ａ及びＲ３ａ’は、同じ又は異なって、それぞれ水素原子、Ｅ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ’）ｎ又はＩＧを示す；又は
Ｒ３ａ及びＲ３ａ’は一緒になって、式−Ｏ−又は−Ｎ（Ｒ３３ａ’）の基を形成し、Ｒ３３ａ’は、水素原子、Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ’）ｎ又はＩＧを示す；又は
Ｒ３ａ及びＲ３ａ’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３ａ’）−Ｎ（Ｒ３３ａ’）−の基を形成し、各Ｒ３３ａ’は、同じ又は異なって、水素原子、Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ’）ｎ又はＩＧを示す；
Ｚ’は、Ｚ又は式−Ｓｉ（Ｏ（Ｃ１−６アルキル）（Ｇ１）（Ｇ２）の基を示し、Ｇ１及びＧ２は、同じ又は異なって、Ｈ、Ｃ１−６アルキル又はＯ（Ｃ１−６アルキル）を示し；
Ｘ、Ｘ’、Ｙ、Ｎｕ、Ｌ、Ｚ、ｎ、ＩＧ及びＥは全て、請求項２〜５のいずれか１項に記載したとおりである。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の生成物を提供する工程であって、以下のいずれかである：
（ｉ）チオール部分を有する固体基材が、該チオール部分の硫黄原子を介して式（Ｉ）の２位に結合している；又は
（ｉｉ）基−Ｓ−Ｆ１又は−Ｓ−Ｌ−Ｆ２が、式（Ｉ）の２位に結合している、
工程；及び
式（Ｉ）の２位でチオール結合を切断する工程、
を含む、プロセス。
【請求項１０】
式（Ｖａ）又は（Ｖｂ）の生成物：
【化６】
2013501766.tif 000195
式中、
Ｒ１は以下を示し：
（ｉ）チオール部分を有し、該チオール部分の硫黄原子を介して式（Ｖａ）又は（Ｖｂ）の２位に結合している、固体基材；又は
（ｉｉ）−Ｓ−Ｆ１若しくは−Ｓ−Ｌ−Ｆ２；
Ｘ、Ｘ’、−Ｓ−Ｆ１、Ｆ２、Ｒ２、Ｒ３及びＲ３’は、請求項２〜５のいずれか１項に記載したとおりであり；
Ｒ４は、ハロゲン原子、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルコキシ、チオール、Ｃ１−６アルキルチオ若しくはＣ１−６アルキルカルボニルオキシ基、又は請求項２に記載の式Ｆ３の基であり；
基Ｒ２及びＲ４のうち少なくとも１個が式Ｆ３の基を含み、
ただし、該生成物は、１つの固体基材を含む。
【請求項１１】
アレイに整列された、請求項１〜６及び１０のいずれか１項に記載の複数の生成物であって、各生成物は、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド又はリガンド候補、ペプチド、タンパク質、細胞、ＤＮＡ及びＲＮＡから選択される機能的部分を含み、好ましくは、
（ａ）各生成物が異なる抗体又は抗体断片を含む；又は
（ｂ）各生成物が異なる抗原を含む；又は
（ｃ）各生成物が異なるリガンド又はリガンド候補を含む；又は
（ｄ）各生成物が異なるペプチドを含む；又は
（ｅ）各生成物が異なるタンパク質を含む；又は
（ｆ）各生成物が異なる細胞を含む；又は
（ｇ）各生成物が異なるＤＮＡを含む；又は
（ｈ）各生成物が異なるＲＮＡを含む。
【請求項１２】
（ｉ）請求項１〜６及び１０のいずれか１項に記載の生成物を提供する工程であって、該生成物は、抗体又は抗原を含む、工程；
（ｉｉ）該生成物をサンプルとインキュベートする工程；
（ｉｉｉ）抗体又は抗原に結合していない任意の材料を除去する工程；及び
（ｉｖ）抗体又は抗原に結合した任意の物質を検出する工程、
を含む、検出プロセス。
【請求項１３】
サンプルから特定の物質を精製するためのプロセスであって、
（ｉ）請求項１〜６及び１０のいずれか１項に記載の生成物を提供する工程であって、該生成物は、該物質に選択的に結合できる機能的部分を含む、工程；
（ｉｉ）該生成物を該サンプルとインキュベートする工程；
（ｉｉｉ）機能的部分に結合していない任意の材料を除去する工程；及び
（ｉｖ）該生成物から該物質を分離する工程、
を含む、プロセス。
【請求項１４】
（ｉ）請求項１〜６のいずれか１項に記載の生成物を提供する工程；
（ｉｉ）アミノ酸を該生成物に結合させる工程；及び
（ｉｉｉ）該アミノ酸に１個以上のさらなるアミノ酸を結合させて、固体基材に連結されたペプチド又はタンパク質部分を産生する工程；及び
（ｉｖ）該ペプチド又はタンパク質部分を該固体基材から切断する工程、
を含む、ペプチド又はタンパク質を産生するためのプロセス。
【請求項１５】
請求項７又は８に記載の使用であって、式（ＩＩＩ）の部分を含む化合物を使用して機能的部分に固体基材を連結することによって得られた生成物が、マレイミド環を含み、該使用が、該マレイミド環の開環をもたらすことをさらに含む、使用。
【国際調査報告】
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