(57)【要約】  本発明は、グルコース、ガラクトース、アラビノースおよびキシロースを含む糖組成物から１種または複数の発酵産物を生産するのに適した細胞であって、１種または複数のキシロースイソメラーゼ遺伝子の２〜１５のコピーまたは１種または複数のキシロースレダクターゼおよびキシリトール１０デヒドロゲナーゼの２〜１５のコピー、ならびにａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ遺伝子の２〜１０のコピーを含み、これらの遺伝子が細胞ゲノムに組み込まれている細胞に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコース、ガラクトース、キシロース、アラビノースおよびマンノースを含む糖組成物から１つまたは複数の発酵産物を生産するのに適した細胞であって、１種または複数のキシロースイソメラーゼ遺伝子の２〜１５のコピーまたは１種または複数のキシロースレダクターゼおよびキシリトールデヒドロゲナーゼの２〜１５のコピー、ならびにａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ遺伝子の２〜１０のコピーを含み、これらの遺伝子が細胞ゲノムに組み込まれている細胞。
【請求項２】
前記細胞が、利用可能なグルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトースおよびマンノースを９０％以上発酵産物に変換することができる、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記細胞のＧＡＬ８０遺伝子が破壊されているかまたは欠失している、請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
前記細胞がサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、場合によっては、サッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）種に属する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５】
前記細胞がＰＰＰ遺伝子ＴＡＬ１、ＴＫＬ１、ＲＰＥ１およびＲＫＩ１の過剰発現を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６】
前記細胞がＸＫＳ１遺伝子を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７】
アルドースレダクターゼ遺伝子が欠失している、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８】
前記細胞にとって外来性の遺伝子はすべて、前記細胞のゲノムに組み込まれている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項９】
前記遺伝子が、
ａ）強力な構成的プロモーターの制御下にある、遺伝子ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤからなるクラスター
ｂ）場合によっては強力な構成的プロモーターの制御下にある、ＰＰＰ遺伝子ＴＡＬ１、ＴＫＬ１、ＲＰＥ１およびＲＫＩ１からなるクラスター；およびアルドースレダクターゼ遺伝子の欠失；
ｃ）強力な構成的プロモーターの制御下にある、ｘｙｌＡ遺伝子およびＸＫＳ１遺伝子からなるクラスター；
ｄ）強力な構成的プロモーターの制御下にある、ｘｙｌＡ遺伝子を含むコンストラクトであって、複数の遺伝子座上でゲノムに組み込まれる能力を有するコンストラクト；
ならびに混合糖細胞を生成するための混合糖コンストラクトの適応進化を宿主細胞に導入することによって前記細胞に導入される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１０】
前記細胞が阻害物質抵抗性細胞である、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
前記細胞が工業用細胞である、請求項９または１０に記載の細胞。
【請求項１２】
グルコース、ガラクトース、アラビノースおよびキシロースを含む糖組成物から１種または複数の発酵産物を生産するための方法であって、前記糖組成物が、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の混合糖細胞により発酵される方法。
【請求項１３】
前記糖組成物が、
ａ）前処理されたリグノセルロース系原料を産生するための、１種または複数のリグノセルロース系原料の前処理；
ｂ）前記糖組成物を産生するための、前処理されたリグノセルロース系原料の酵素的処理
によって、リグノセルロース系原料から産生される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記発酵が嫌気的に行われる、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記発酵産物が、エタノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、イタコン酸、マレイン酸、クエン酸、アジピン酸、リジン、メチオニン、トリプトファン、スレオニンおよびアスパラギン酸などのアミノ酸、１，３−プロパンジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム抗生物質およびセファロスポリン、ビタミン、医薬品、動物用飼料サプリメント、特殊化学品、化学供給原料、プラスチック、溶媒、バイオ燃料およびバイオガスを含む燃料または有機ポリマー、ならびにプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼまたはキシラナーゼなどの工業用酵素からなる群から選択される、請求項１２または１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、複数のＣ５糖および／またはＣ６糖を含む糖組成物（本明細書では、このような組成物を混合糖組成物とも称する）の発酵に適した細胞（本明細書では、混合糖細胞とも称する）に関する。混合糖組成物はリグノセルロース系原料に由来することができる。本発明はまた、混合糖細胞を使用して、混合糖組成物から発酵産物を生産する方法に関する。
【０００２】
［発明の背景］
化石燃料の代替物として生産されるエタノールの大部分は、現在、コーンスターチおよびサトウキビに由来するスクロースの発酵によるものである。再生可能な燃料を生産するための野心的な目標に到達するために、食物以外のバイオマスをエタノールなどの発酵産物に変換するための新技術の開発が進められている。サッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）がエタノール産業の選択した生物であるが、この生物は、バイオマス供給原料のヘミセルロース成分に含有される五炭糖を利用することができない。ヘミセルロースは、バイオマスの２０〜３０％を構成することがあり、キシロースおよびアラビノースが最も豊富なＣ５糖である。キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）の異種発現は、酵母細胞がキシロースを代謝し発酵できるようにするための選択肢の１つである。同様に、Ｓ．セレビシア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株における、細菌遺伝子ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤの発現は、アラビノースの利用および効率的なアルコール発酵をもたらす。ガラクトースは、Ｃ６糖であり、多くの場合経済的理由から無視することができない量（糖全体の約４％）で、リグノセルロース中に高頻度で存在する糖でもある。
【０００３】
Ｊ．ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００９）１５５，１３４０−１３５０は、グルコースがサッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の好む炭素源であること、および嫌気性条件下で、グルコース制限の発酵条件からガラクトース過剰条件に切り替えた際に、ガラクトースが消費されなかったことを開示している。
【０００４】
これまでに、グルコース、アラビノース、キシロースおよびガラクトースを、グルコースと同じ方法で発酵産物に変換する方法は開示されていない。
【０００５】
［発明の概要］
本発明の目的は、グルコース、キシロースおよびガラクトースおよびマンノース、すなわち４種の糖の混合物を発酵産物に変換できる細胞を提供することである。本発明の別の目的は、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトースおよびマンノース、すなわち５種の糖の混合物を発酵産物に変換できるような細胞を提供することである。本発明のさらなる目的は、安定であるような、上記に定義した細胞を提供することである。本発明のさらなる目的は、マーカーフリーであるような、上記に定義した株を提供することである。本発明のさらなる目的は、グルコース、キシロース、アラビノースおよびガラクトースが発酵産物に同時に変換される方法を提供することである。本発明によってこれらの目的の１つまたは複数が達成される。
【０００６】
本発明は、グルコース、ガラクトース、キシロース、アラビノースおよびマンノースを含む糖組成物から１種または複数の発酵産物を生産するのに適した細胞であって、１種または複数のキシロースイソメラーゼ遺伝子の２〜１５のコピーまたは１種または複数のキシロースレダクターゼおよびキシリトールデヒドロゲナーゼの２〜１５のコピー、ならびにａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ遺伝子の２〜１０のコピーを含み、これらの遺伝子が細胞ゲノムに組み込まれている細胞を提供する。
【０００７】
本発明はさらに、グルコース、アラビノースおよびキシロース、場合によってはガラクトースおよび／またはマンノースを含む糖から１種または複数の発酵産物を生産するための方法であって、
ａ）１種もしくは複数のキシロースイソメラーゼ遺伝子の２〜１５のコピーおよび／または１種もしくは複数のキシロースレダクターゼおよびキシリトールデヒドロゲナーゼの２〜１５のコピーを含み、これらの遺伝子がゲノムに組み込まれている混合糖細胞の存在下で糖組成物を発酵するステップと、
ｂ）発酵産物を回収するステップと
を含む方法を提供する。
【０００８】
一実施形態では、混合糖細胞はサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属である。一実施形態では、混合糖細胞はサッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）種である。一実施形態では、発酵産物はエタノールである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】プラスミドｐＰＷＴ００６の物理的地図を示す。
【図２】プラスミドｐＰＷＴ０１８の物理的地図を示す。
【図３】サザンブロットオートラジオグラムを示す。野生株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ（レーン１）およびＢＩＥ１０４Ａ２（レーン２）の染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの両方を用いて消化した。このブロットは特異的ＳＩＴ２プローブとハイブリダイズさせたものである。
【図４】プラスミドｐＰＷＴ０８０の物理的地図を示す。その配列は配列番号８で示される。
【図５】様々な培地における、ＢＥ１０４Ｐ１Ａ２の好気性条件下での増殖曲線を示す。ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１株は、ＹＮＢ  ２％ガラクトース上で前培養した。増殖曲線は、２％ガラクトースおよび１％アラビノース上で開始し、グラフ内の数字（１）で示される時点で、唯一の炭素源として２％アラビノースを含むＹＮＢに移したものである。ＯＤ６００が１を超えた後に、培養物を０．２の開始ＯＤ６００で新たな培地に移した。純粋アラビノース培地に３回移して得られた株をＢＩＥ１０４Ｐ１Ａ２ｃと名付けた。
【図６】唯一の炭素源として２％アラビノースを含むＹＮＢ上におけるＢＩＥ１０４Ｐ１Ａ２ｃの嫌気性条件下での増殖曲線を示す。ＯＤ６００が１を超えた後に、培養物を０．２の開始ＯＤ６００で新たな培地に移した。数回移した後に得られた株をＢＩＥ１０４Ｐ１Ａ２ｄ（＝ＢＩＥ２０１）と名付けた。
【図７】プラスミドｐＰＷＴ０４２の物理的地図を示す。その配列は配列番号１４で示される。
【図８】形質転換混合物の好気性条件下での増殖曲線を示す。ＢＩＥ２０１Ｘ９株をＸ１８−Ｔｙ１断片を用いて形質転換し、その形質転換混合物を使用して、２％キシロース添加Ｖｅｒｄｕｙｎ培地に接種した。ＯＤ６００が約３５に到達した後、培養物のアリコートを使用して、新たな培地が入った第２のフラスコに接種した。第２のフラスコからコロニーを単離して詳しく分析した。
【図９】２％グルコースまたは２％キシロースまたは２％アラビノースまたは２％ガラクトースのいずれかを添加したＶｅｒｄｕｙｎ培地上での単一コロニー単離物の増殖を示す。
【図１０】２％キシロースまたは２％アラビノースのいずれかを添加したＶｅｒｄｕｙｎ培地上での選択された単一コロニー単離物の増殖を示す。
【図１１】フェドバッチ実験における、合成培地上でのＢＩＥ１０４Ｐ１Ｙ９ｍｃ株とＢＩＥ２０１株との混合培養物による糖変換および産物形成を示す。ＣＯ２産生を定常的に測定した。増殖は、培養物の光学濃度を追跡することによりモニターした。前培養物は２％グルコース上で増殖させた。
【図１２】フェドバッチ実験における、合成培地上でのＢＩＥ２５２株による糖変換および産物形成を示す。ＣＯ２産生を定常的に測定した。増殖は、培養物の光学濃度を追跡することによりモニターした。前培養物は２％グルコース上で増殖させた。
【図１３】フェドバッチ実験において産生したＣＯ２の合計を示す。
【図１４】バッチ実験における、合成培地上でのＢＩＥ１０４Ｐ１Ｙ９ｍｃ株とＢＩＥ２０１株との混合培養物による糖変換および産物形成を示す。ＣＯ２産生を定常的に測定した。増殖は、培養物の光学濃度を追跡することによりモニターした。前培養物は２％グルコース上で増殖させた。
【図１５】バッチ実験における、合成培地上でのＢＩＥ２５２株の混合培養物による糖変換および産物形成を示す。ＣＯ２産生を定常的に測定した。増殖は、培養物の光学濃度を追跡することによりモニターした。前培養物は２％グルコース上で増殖させた。
【図１６】バッチ実験において産生したＣＯ２の合計を示す。
【図１７】１３．８％ｄ．ｍ．におけるコーンファイバー加水分解物に対するＢＩＥ２５２株の性能を示す。ＣＯ２産生速度、エタノール産生および糖変換を示す。
【図１８】１０％ｄ．ｍ．におけるコーンストーバー加水分解物に対するＢＩＥ２５２株の性能を示す。ＣＯ２産生速度、エタノール産生および糖変換を示す。
【図１９】１０％ｄ．ｍ．における麦わら加水分解物に対するＢＩＥ２５２株の性能を示す。ＣＯ２産生速度、エタノール産生および糖変換を示す。
【図２０】図２０ａは、ＢＩＥ２５２株の糖変換（速度）を示し、図２０ｂは、ＢＩＥ２５２株の単一コロニー単離物による、２％グルコースを含むＹＥＰ培地における１００世代を超える培養後の糖変換（速度）を示し、図２０ｃは、ＢＩＥ２５２株の単一コロニー単離物による、２％グルコースを含むＹＥＰ培地における１００世代を超える培養後の糖変換（速度）を示す。
【図２１】プラスミドｐＰＷＴ１４８の物理的地図を示す。
【図２２】プラスミドｐＰＷＴ１５２の物理的地図を示す。
【図２３】臭化エチジウムで染色したＣＨＥＦゲルを示す。染色体を、ＣＨＥＦ手法を使用して、それらのサイズに応じて分離した。分析した株は、ＢＩＥ１０４（非形質転換酵母細胞）、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ａ（アラビノースを消費できない一次形質転換体、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１の異名）、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃ株（アラビノース上で増殖できる、適応進化によりＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１から由来した株）、ＢＩＥ２０１株（嫌気性条件下、アラビノース上で増殖できる、適応進化によりＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃから由来した株）、およびＢＩＥ２５２（混合糖株）である。染色体のシフトが観察された（本文を参照のこと）。ＹＮＮ２９５株は、マーカー株（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）であり、染色体のサイズに対する参照として使用した。
【００１０】
［配列リストの簡単な説明］
配列番号１は、プラスミドｐＰＷＴ０１８の配列を示す。
配列番号２は、ｐＰＷＴ０１８の組込みをチェックするためのプライマーの配列を示す。
配列番号３は、（配列番号２と共に）ｐＰＷＴ０１８の組込みをチェックし、（配列番号４と共に）ｐＰＷＴ０１８のコピー数をチェックするためのプライマーの配列を示す。
配列番号４は、ｐＰＷＴ０１８のコピー数をチェックするためのプライマーの配列を示す。
配列番号５は、配列番号４と組み合わせてゲノム中のｐＰＷＴ０１８の存在をチェックするためのプライマーの配列を示す。
配列番号６は、ＳＩＴ２プローブを生成するための順方向プライマーの配列を示す。
配列番号７は、ＳＩＴ２プローブを生成するための逆方向プライマーの配列を示す。
配列番号８は、プラスミドｐＰＷＴ０８０の配列を示す。
配列番号９は、（配列番号１０と共に）、ＧＲＥ３遺伝子座の末端でのｐＰＷＴ０８０の正確な組込みをチェックし、（配列番号１１と共に）、プラスミドｐＰＷＴ０８０のコピー数をチェックするための順方向プライマーの配列を示す。
配列番号１０は、ＧＲＥ３遺伝子座の末端でのｐＰＷＴ０８０の正確な組込みをチェックするための逆方向プライマーの配列を示す。
配列番号１１は、プラスミドｐＰＷＴ０８０のコピー数をチェックするための逆方向プライマーの配列を示す。
配列番号１２は、ＲＫＩ１プローブを生成するための順方向プライマーの配列を示す。
配列番号１３は、ＲＫＩ１プローブを生成するための逆方向プライマーの配列を示す。
配列番号１４は、プラスミドｐＰＷＴ０４２の配列を示す。
配列番号１５は、ｐＰＷＴ０４２の組込みをチェックするためのプライマーの配列を示す。
配列番号１６は、ｐＰＷＴ０４２の組込みをチェックするためのプライマーの配列を示す。
配列番号１７は、ｐＰＷＴ０４２の組込みをチェックするためのプライマーの配列を示す。
配列番号１８は、ｐＰＷＴ０４２のマーカー消失をチェックするためのプライマーの配列を示す。
配列番号１９は、ｘｙｌＡカセットの増幅用プライマーの配列を示す。
配列番号２０は、ｘｙｌＡカセットの増幅用プライマーの配列を示す。
配列番号２１は、ｋａｎＭＸカセットの増幅用プライマーの配列を示す。
配列番号２２は、ｋａｎＭＸカセットの増幅用プライマーの配列を示す。
配列番号２３は、定量的ＰＣＲ用プライマーの配列を示す。
配列番号２４は、定量的ＰＣＲ用プライマーの配列を示す。
配列番号２５は、定量的ＰＣＲ用プライマーの配列を示す。
配列番号２６は、定量的ＰＣＲ用プライマーの配列を示す。
【００１１】
［発明の詳細な説明］
本明細書および添付の特許請求の範囲を通して、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、および「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの語尾変化語は、包含的であると解釈されるべきである。すなわち、これらの単語には、文脈の枠内で、具体的に列挙されない他のエレメントまたは整数も包含され得ることを示す意図がある。
【００１２】
本明細書において使用する冠詞「ａ」および「ａｎ」は、この冠詞の文法上の目的語が１または１を超える（すなわち１または少なくとも１である）ことを指す。例として、「エレメント（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は１つのエレメントまたは１つを超えるエレメントを意味することができる。
【００１３】
本明細書に記載された本発明の様々な実施形態は相互に組み合わせることができる。
【００１４】
［糖組成物］
本発明による糖組成物はグルコース、アラビノースおよびキシロースを含む。この基準を満足するいずれの糖組成物も、本発明において使用することができる。糖組成物における任意選択の糖はガラクトースおよびマンノースである。好ましい実施形態では、糖組成物は１種または複数のリグノセルロース系原料の加水分解物である。本明細書におけるリグノセルロースは、バイオマスのヘミセルロースおよびヘミセルロース部分を含む。リグノセルロースはまた、バイオマスのリグノセルロース系分画を含む。好適なリグノセルロース系原料は以下のリストに見出すことができる：果樹園プライミング、チャパラル、工場廃棄物、都市木材廃棄物、都市廃棄物、伐採廃棄物、森林間伐、短期輪作木質作物、産業廃棄物、麦わら、エンバクわら、稲わら、大麦わら、ライ麦わら、生茎、大豆もみ殻、米もみ殻、稲わら、トウモロコシグルテン飼料、エンバクもみ殻、サトウキビ、コーンストーバー、トウモロコシ茎、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ皮、スイッチグラス、ススキ、サトウモロコシ、キャノーラ茎、大豆茎、プレーリー草、ガマグラス（ｇａｍａｇｒａｓｓ）、スズメノテッポウ；サトウダイコンパルプ、柑橘果実パルプ、種もみ殻、セルロース系動物性廃棄物、芝生刈り取り、綿、海草、木、軟材、硬材、ポプラ、松、低木、草、小麦、麦わら、サトウキビバガス、トウモロコシ、トウモロコシ皮、トウモロコシホブ、トウモロコシ穀粒、穀粒由来繊維、穀物の湿式または乾式製粉由来の産物および副産物、都市ゴミ、廃紙、庭ゴミ、草木材料、農業残査、林業残査、都市固形ゴミ、廃紙、パルプ、製紙工場残査、枝、潅木、茎、トウモロコシ、トウモロコシ皮、エネルギー作物、森林、果実、花、穀物、草、草本作物、葉、樹皮、針葉、丸木、根、若木、低木、スイッチグラス、木、野菜、果実皮、蔓茎、サトウダイコンパルプ、小麦製粉、エンバクもみ殻、硬材または軟材、農業生産から生成した有機性廃棄物原料、林業木材廃棄物、またはこれらの２つ以上の組合せ。
【００１５】
リグノセルロース由来の好適な糖組成物の一部およびそれらの加水分解物の糖組成の概要を表１に示す。記載のリグノセルロースには、トウモロコシ穂軸、コーンファイバー、米もみ殻、メロンシェル、サトウダイコンパルプ、麦わら、サトウキビバガス、木材、草およびオリーブ圧搾物が含まれる。
【００１６】
【表１】
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【００１７】
表１から、これらのリグノセルロースでは、大量の糖が、グルコース、キシロース、アラビノースおよびガラクトースの形態で存在していることが明らかである。したがって、グルコース、キシロース、アラビノースおよびガラクトースの発酵産物への変換には、大きな経済的重要性がある。さらに、上述の糖よりも通常少量ではあるが、マンノースも一部のリグノセルロース原料に存在している。したがって、マンノースも混合糖細胞により変換されることは有利である。
【００１８】
［混合糖細胞］
混合糖細胞は、１種または複数のキシロースイソメラーゼ遺伝子の２〜１５のコピーまたは１種または複数のキシロースレダクターゼおよびキシリトールデヒドロゲナーゼの２〜１５のコピー、ならびにａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ遺伝子の２〜１０のコピーを含み、これらの遺伝子が細胞ゲノムに組み込まれている細胞である。
【００１９】
一実施形態では、混合糖細胞は、キシロースイソメラーゼの約８コピーまたは８コピーを含み、これらの遺伝子は混合糖細胞ゲノムに組み込まれている。別の実施形態では、混合糖細胞は、キシロースレダクターゼおよびキシリトールデヒドロゲナーゼの８コピーを含み、これらの遺伝子は混合糖細胞ゲノムに組み込まれている。
【００２０】
コピー数は任意の公知の方法により当業者により決定され得る。好適な方法を実施例に記載する。
【００２１】
混合糖細胞は、ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ遺伝子の２〜１０のコピーを含み、これらの遺伝子は細胞ゲノムに組み込まれている。ｔはグルコース、アラビノース、キシロースおよびガラクトースを発酵させることができる。
【００２２】
一実施形態では、混合糖細胞は、ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ遺伝子のそれぞれを２コピー、３コピー、４コピー、５コピー、６コピー、７コピー、８コピー、９コピーまたは１０コピー、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７または４〜６のコピー含み、これらの遺伝子は細胞ゲノムに組み込まれている。一実施形態では、混合糖細胞は、ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ遺伝子のそれぞれを約４コピーまたは４コピー含み、これらの遺伝子は細胞ゲノムに組み込まれている。
【００２３】
一実施形態では、混合糖細胞におけるキシロースイソメラーゼ遺伝子またはキシロースレダクターゼおよびキシリトールデヒドロゲナーゼのコピー数は８または９である。一実施形態では、混合糖細胞におけるａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ遺伝子のコピー数は３または４である。
【００２４】
一実施形態では、細胞は利用可能なグルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトースおよびマンノースを９０％以上発酵産物に変換することができる。一実施形態では、細胞は利用可能なすべてのグルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトースおよびマンノースについて、９１％以上、９２％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または１００％発酵産物に変換することができる。
【００２５】
一実施形態では、細胞のＧＡＬ８０遺伝子は破壊されているかまたは欠失している。
【００２６】
本発明の一実施形態では、混合糖細胞は１種または複数の追加の糖、好ましくはＣ５および／またはＣ６糖（例えばマンノース）を発酵させることができる。本発明の一実施形態では、混合糖細胞は、以下の１つまたは複数を含む：混合糖細胞がキシロースを発酵することを可能にするｘｙｌＡ遺伝子、ＸＹＬ１遺伝子およびＸＹＬ２遺伝子および／またはＸＫＳ１遺伝子；アルドースレダクターゼ（ＧＲＥ３）遺伝子の欠失；細胞のペントースリン酸経路を通るフラックスの増加を可能にするＰＰＰ遺伝子ＴＡＬ１、ＴＫＬ１、ＲＰＥ１およびＲＫＩ１の過剰発現。
【００２７】
一実施形態では、混合糖細胞は、工業用細胞、より好ましくは工業用酵母である。工業用細胞および工業用酵母細胞は以下のように定義することができる。工業的プロセスおける細胞（酵母）の生活環境は、研究室における生活環境とは顕著に異なる。工業用酵母細胞は、プロセスの間に変動し得る複数の環境条件下で良好に機能できなければならない。このような変動には、栄養源、ｐＨ、エタノール濃度、温度、酸素濃度等の変化が含まれ、これらは共に、サッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の細胞増殖およびエタノール産生に影響を及ぼす可能性がある。有害な工業条件下では、環境耐性のある株が増殖および産生を頑強に保つことができよう。工業用酵母株は、一般に、製パン工業、醸造工業、ワイン醸造およびエタノール産業など使用される用途で起こり得る、環境条件のこれらの変化に対してより頑強である。一実施形態では、工業用混合糖細胞は工業用宿主細胞をベースとして構築され、その構築は、本明細書の以下に記載のように行われる。工業用酵母（Ｓ．セレビシア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））の例は、Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｒｅｄ（登録商標）（Ｆｅｒｍｅｎｔｉｓ）、Ｆｅｒｍｉｏｌ（登録商標）（ＤＳＭ）およびＴｈｅｒｍｏｓａｃｃ（登録商標）（Ｌａｌｌｅｍａｎｄ）である。
【００２８】
一実施形態では、混合糖細胞は阻害物質耐性である。阻害物質耐性は、阻害化合物に対する抵抗性である。リグノセルロースにおける阻害化合物の存在およびレベルは、供給原料、前処理方法、加水分解プロセスの変動に応じて幅広く変動する可能性がある。阻害剤カテゴリの例は、カルボン酸、フランおよび／またはフェノール化合物である。カルボン酸の例は、乳酸、酢酸またはギ酸である。フランの例はフルフラールおよびヒドロキシ−メチルフルフラルである。フェノール化合物の例は、バンニリン（ｖａｎｎｉｌｉｎ）、シリンガ酸、フェルラ酸およびクマル酸である。カルボン酸に対する典型的な阻害物質量は、供給原料、前処理および加水分解条件に応じて、１リットル当たり数グラム〜１リットル当たり２０グラム以上である。フランに対しては、供給原料、前処理および加水分解条件に応じて、１リットル当たり数百ミリグラム〜１リットル当たり数グラムである。フェノールについては、供給原料、前処理および加水分解条件に応じて、１リットル当たり数十ミリグラム〜１リットル当たり１グラムである。
【００２９】
本発明による混合糖株は阻害物質耐性である。すなわち、それらの株は、一般的な前処理および加水分解条件で典型的に存在するレベルの一般的な阻害物質に耐えることができ、その結果、混合糖株には幅広い用途を見つけることができる。すなわち、様々な供給原料、様々な前処理方法および様々な加水分解条件に対して高い適用可能性がある。
【００３０】
一実施形態では、工業用混合糖細胞は、阻害物質耐性宿主細胞をベースとして構築され、その構築は、本明細書の以下に記載のように行われる。阻害物質耐性宿主細胞は、阻害物質耐性のＳ．セレビシア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＡＴＣＣ２６６０２が選択されたＫａｄａｒ  ｅｔ  ａｌ，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００７），Ｖｏｌ．１３６−１４０，８４７−８５８の例示にあるように、阻害物質含有原料上での増殖に対して細胞株をスクリーニングすることにより選択することができる。
【００３１】
一実施形態では、混合糖細胞はマーカーフリーである。本明細書で使用する用語「マーカー」は、マーカーを含有する宿主細胞の選択またはスクリーニングを可能にする形質または表現型をコードする遺伝子を指す。マーカーフリーは、マーカーが混合糖細胞に基本的にないことを意味する。マーカーフリーであることは、抗生物質マーカーが混合糖細胞の構築に使用され、その後除去される場合に特に有利である。マーカーの除去は、任意の好適な従来技術手法、例えば分子内組換えを使用して行うことができる。マーカー除去の好適な方法は実施例に例示する。
【００３２】
混合糖細胞は、植物バイオマス、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン、ラムノース、ガラクトース、フルクトース、マルトース、マルトデキストリン、リボース、リブロース、またはデンプン、デンプン誘導体、スクロース、ラクトースおよびグリセロールを、例えば発酵性糖に変換することができる。したがって、混合糖細胞は、セルラーゼ（エンドセルラーゼまたはエキゾセルラーゼ）、セルロースのグルコース単量体への変換およびヘミセルロースのキシロース単量体およびアラビノース単量体への変換に必要なヘミセルラーゼ（エンド−もしくはエキソ−キシラナーゼまたはアラビナーゼ）、ペクチンをグルクロン酸およびガラクツロン酸に変換することができるペクチナーゼ、またはデンプンをグルコース単量体に変換するアミラーゼなどの１種または複数の酵素を発現することができる。
【００３３】
混合糖細胞はさらに、エタノール、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸、イタコン酸、アミノ酸、１，３−プロパンジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム抗生物質またはセファロスポリンなどの所望の発酵産物へのピルベートの変換に必要な酵素活性を含むことができる。
【００３４】
一実施形態では、混合糖細胞は、アルコール発酵、好ましくは嫌気性アルコール発酵を天然に行うことができる細胞である。混合糖細胞には、エタノールに対する高い耐性、低いｐＨに対する高い耐性（すなわち、約５、約４、約３、または約２．５より低いｐＨで増殖可能）および有機物に対する高い耐性および／または高温に対する高い耐性があることが好ましい。
【００３５】
混合糖細胞の上記の特徴または活性のいずれも、細胞に天然に存在するものでも、または遺伝子改変により導入もしくは改変されたものでもよい。
【００３６】
［混合糖株の構築］
実施形態によれば、
ａ）強力な構成的プロモーターの制御下にある、遺伝子ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤからなるクラスター
ｂ）場合によっては強力な構成的プロモーターの制御下にある、ＰＰＰ遺伝子ＴＡＬ１、ＴＫＬ１、ＲＰＥ１およびＲＫＩ１からなるクラスター；およびアルドースレダクターゼ遺伝子の欠失；
ｃ）強力な構成的プロモーターの制御下にある、ｘｙｌＡ遺伝子およびＸＫＳ１遺伝子からなるクラスター；
ｄ）強力な構成的プロモーターの制御下にある、ｘｙｌＡ遺伝子を含むコンストラクトであって、複数の遺伝子座上でゲノムに組み込まれる能力を有するコンストラクト；
ならびに混合糖細胞を生成するための適応進化を宿主細胞に導入することによって混合糖細胞に遺伝子を導入することができる。上記の細胞は組換え発現手法を使用して構築することができる。
【００３７】
［組換え発現］
混合糖細胞は組換え細胞である。すなわち、混合糖細胞は、天然には当の細胞に存在しないヌクレオチド配列を含むか、またはそれを用いて形質転換されるか、またはそれを用いて遺伝子改変される。
【００３８】
細胞における酵素の組換え発現のための手法および混合糖細胞のさらなる遺伝子改変のための手法は、当業者には周知である。典型的には、そのような手法には、関連配列を含む核酸コンストラクトを用いる細胞の形質転換が含まれる。そのような方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ（２００１）”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、またはＦ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，”Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）などの標準ハンドブックから知ることができる。真菌宿主細胞の形質転換および遺伝子改変のための方法は、例えば、欧州特許第Ａ−０６３５５７４号明細書、国際公開第９８／４６７７２号パンフレット、国際公開第９９／６０１０２号パンフレット、国際公開第００／３７６７１号パンフレット、国際公開第９０／１４４２３号パンフレット、欧州特許第Ａ−０４８１００８号明細書、欧州特許第Ａ−０６３５５７４号明細書および米国特許第６，２６５，１８６号明細書から知ることができる。
【００３９】
典型的には、核酸コンストラクトは、プラスミド、例えば低コピープラスミドまたは高コピープラスミドとすることができる。本発明による細胞は、酵素をコードするヌクレオチド配列の単一コピーか、または例えばヌクレオチドコンストラクトの多コピーにより、もしくは酵素配列の多コピーを有するコンストラクトの使用により、その多コピーを含むことができる。
【００４０】
核酸コンストラクトはエピソームで維持することができ、したがって、常染色体複製配列などの自律複製用の配列を含む。好適なエピソーム性核酸コンストラクトは、例えば、酵母の２μもしくはｐＫＤ１プラスミド（Ｇｌｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：９６８−９７５），またはＡＭＡプラスミド（Ｆｉｅｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ．２９：４８２−４８９）をベースとすることができる。あるいは、各核酸コンストラクトは、細胞のゲノムに１つまたは複数のコピーを組み込むことができる。細胞ゲノムへの組込みは、非相同的な組換えによりランダムに起こり得るが、当技術分野で周知の相同組換えにより、核酸コンストラクトを細胞ゲノムに組み込むことが好ましい（例えば、国際公開第９０／１４４２３号パンフレット、欧州特許第Ａ−０４８１００８号明細書、欧州特許第Ａ−０６３５５７４号明細書および米国特許第６，２６５，１８６号明細書を参照のこと）。
【００４１】
大部分のエピソームまたは２μプラスミドは比較的不安定であり、各世代の後に約１０−２以上の細胞で失われる。選択増殖の条件下でも、細胞の６０％〜９５％のみがエピソーム性プラスミドを保持する。大部分のエピソーム性プラスミドのコピー数は、ｃｉｒ＋宿主の１細胞当たり２０〜１００の範囲にある。しかしながら、プラスミドは細胞間で均等に分配されず、集団における１細胞当たりのコピー数の変動は大きい。組込みプラスミドを用いて形質転換された株は、選択圧がない状態でも、極めて安定である。しかしながら、プラスミドの消失は、縦列反復ＤＮＡ間の相同組換えにより約１０−３〜１０−４の頻度で起こる可能性があり、ベクター配列のループアウトがもたらされる。したがって、安定な組込みの場合のベクター設計は、選択マーカー遺伝子が消失すると（これは、分子内相同組換えによっても起こる）、組込みコンストラクトのループアウトがもはや不可能になる設計であることが好ましい。遺伝子は、このように安定に組み込まれることが好ましい。本明細書では、安定な組込みは、組込みコンストラクトのループアウトがもはや不可能である、ゲノムへの組込みとして定義される。選択マーカーは存在しないことが好ましい。典型的には、酵素をコードする配列は、その酵素配列の転写および／または翻訳を実現できるかまたは補助できる、１つまたは複数の核酸配列に作動可能に連結されることになる。
【００４２】
用語「作動可能に結合される」は、記載の構成要素が意図どおりに機能することが可能になる関係に並置されることを指す。例えば、コード配列の転写に影響を及ぼす前記プロモーターまたはエンハンサーは、そのコード配列に作動可能に連結されている。
【００４３】
本明細書で使用する用語「プロモーター」は、１つまたは複数の遺伝子の転写を制御するように機能し、遺伝子の転写開始部位の転写方向に対して上流に位置し、かつＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのための結合部位、転写開始部位、および当業者に知られている他の任意のＤＮＡ配列の存在により構造上同定される、核酸断片を指す。「構成的」プロモーターとは、大部分の環境および発生の条件下で活性なプロモーターである。「誘導性」プロモーターとは、環境および発生の調節下で活性なプロモーターである。
【００４４】
本発明による酵素をコードするヌクレオチド配列の発現を達成するために使用することができるプロモーターは、発現される酵素をコードするヌクレオチド配列にとって天然ではない、すなわち、作動可能に連結されるヌクレオチド配列（コード配列）にとって異種のプロモーターである場合がある。しかしながら、このプロモーターは、宿主細胞にとっては同種、すなわち内在性とすることができる。
【００４５】
プロモーターは広範に入手可能であり、当業者には公知である。このようなプロモーターの好適な例としては、例えば、酵母または糸状菌由来のホスホフクルトキナーゼ（ＰＦＫ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ、ＴＤＨ３またはＧＡＰＤＨ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）のプロモーターなど解糖遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。酵母由来のこのようなプロモーターに関する詳細は、（国際公開第９３／０３１５９号パンフレット）に見つけることができる。他の有用なプロモーターは、リボソームタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター、ラクターゼ遺伝子のプロモーター（ＬＡＣ４）、アルコールデヒドロゲナーゼのプロモーター（ＡＤＨ１、ＡＤＨ４など）およびエノラーゼのプロモーター（ＥＮＯ）である。構成的および誘導性の両方を含む他のプロモーターならびにエンハンサーまたは上流の活性化配列が、当業者には公知であろう。本発明の宿主細胞で使用されるプロモーターは、所望により、その制御特性に影響を与えるように改変することができる。この関連で好適なプロモーターには、構成的および誘導性の両方の天然プロモーターならびに人工プロモーターが挙げられ、これらは当業者には周知である。真核宿主細胞の好適なプロモーターは、ＧＡＬ７、ＧＡＬ１０、またはＧＡＬ１、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＡＤＨ１、ＰＧＬ、ＰＨ０５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮ０１、ＴＰＩ１、およびＡＯＸ１とすることができる。他の好適なプロモーターとしては、ＰＤＣ１、ＧＰＤ１、ＰＧＫ１、ＴＥＦ１およびＴＤＨ３が挙げられる。
【００４６】
混合糖細胞では、酵素をコードするヌクレオチド酸配列の３’末端は、転写ターミネーター配列に作動可能に連結されていることが好ましい。ターミネーター配列は、選択した宿主細胞、例えば選択した酵母種において作動可能であることが好ましい。いずれにせよ、ターミネーターの選択は重要ではなく、例えば、任意の酵母遺伝子由来のものにすることができる。ただし、非酵母の真核遺伝子由来の場合には、ターミネーターは時として機能することがある。通常、酵素をコードするヌクレオチド配列はターミネーターを含む。このようなターミネーターは、宿主混合糖細胞におけるナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解を防止する変異と組み合わせることが好ましい（例えば、Ｓｈｉｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６１：１４６５−１４８２を参照のこと）。
【００４７】
転写終止配列はポリアデニル化シグナルを含むことがさらに好ましい。
【００４８】
場合によっては、選択可能マーカーが、本発明で使用するのに適した核酸コンストラクトに存在することがある。本明細書で使用する用語「マーカー」は、マーカーを含有する宿主細胞の選択またはスクリーニングを可能にする形質または表現型をコードする遺伝子を指す。マーカー遺伝子は抗生物質抵抗性遺伝子とすることができ、それによって、適切な抗生物質を使用して、形質転換されていない細胞の間から形質転換細胞を選択することができる。好適な抗生物質抵抗性マーカーの例としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、３’−０−ホスホトランスフェラーゼＩＩ（カナマイシン、ネオマイシンおよびＧ４１８抵抗性）が挙げられる。抗生物質抵抗性マーカーは、倍数体宿主細胞の形質転換にとって最も好都合となり得る。さらに、栄養要求性マーカー（ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２）または分裂酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）ＴＰＩ遺伝子（Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｐ  Ｒ，１９８５，Ｇｅｎｅ  ４０：１２５−１３０に記載）などの非抗生物質抵抗性マーカーも使用することができる。好ましい実施形態では、核酸コンストラクトを用いて形質転換された宿主細胞はマーカー遺伝子フリーである。マーカー遺伝子フリー組換え微生物宿主細胞を構築する方法は、欧州特許第Ａ−０６３５５７４号明細書に開示されており、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）のａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）遺伝子または酵母のＵＲＡ３およびＬＹＳ２遺伝子などの双方向マーカーの使用に基づいている。あるいは、緑色蛍光タンパク質、ｌａｃＬ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール、アセチルトランスフェラーゼ、β‐グルクロニダーゼなどのスクリーニング可能なマーカーを本発明の核酸コンストラクトに組み込んで、形質転換細胞のスクリーニングを可能にすることができる。
【００４９】
本発明で使用するのに適した核酸コンストラクトに存在し得る任意選択のさらなる要素として、これらに限定されないが、１つまたは複数のリーダー配列、エンハンサー、組込み因子、および／またはレポーター遺伝子、イントロン配列、セントロメア、テロマーおよび／またはマトリックス接着（ＭＡＲ）配列が挙げられる。本発明の核酸コンストラクトは、ＡＲＳ配列などの自律複製のための配列をさらに含むことができる。
【００５０】
したがって、組換えプロセスは、公知の組換え手法を用いて実行することができる。混合糖細胞における酵素の発現および過剰発現のための様々な手段が当業者には公知である。具体的には、宿主細胞における酵素をコードする遺伝子のコピー数を増加させることにより、例えば、宿主細胞のゲノム中に遺伝子のさらなるコピーを組み込むことにより、エピソーム性多コピー発現ベクターから遺伝子を発現させることにより、または多コピーの遺伝子を含むエピソーム性発現ベクターを導入することにより、酵素を過剰発現させることができる。
【００５１】
あるいは、本発明の宿主細胞における酵素の過剰発現は、過剰発現される酵素をコードする配列にとって天然ではないプロモーター、すなわち、作動可能に連結されるコード配列にとって異種のプロモーターの使用により達成することができる。プロモーターは、作動可能に連結されるコード配列にとって異種であることが好ましいが、プロモーターが、宿主細胞と同種、すなわち宿主細胞にとって内在性であることも好ましい。異種プロモーターは、コード配列にとって天然であるプロモーターよりも、高い定常状態レベルでコード配列を含む転写物を産生できる（すなわち、単位時間当たりより多くの転写物分子（すなわちｍＲＮＡ分子）を産生できる）ことが好ましい。この関連で好適なプロモーターには、構成的および誘導性の両方の天然プロモーターならびに人工プロモーターが含まれる。
【００５２】
一実施形態では、混合糖細胞はマーカーフリーであり、これは、栄養要求性マーカーまたは優性マーカー、具体的には抗生物質抵抗性マーカーが、ゲノム中または染色体外に存在しないことを意味する。
【００５３】
上述の酵素過剰発現に使用されるコード配列は、宿主細胞にとって同種であることが好ましい場合がある。しかしながら、宿主にとって異種のコード配列を使用してもよい。
【００５４】
酵素の過剰発現は、遺伝子改変細胞における酵素の産生を指す場合には、その酵素が、同一条件下で、改変されていない宿主細胞の場合と比較して、高レベルの特異的酵素活性で産生されることを意味する。通常、これは、酵素的に活性なタンパク質（またはマルチサブユニット酵素の場合にはタンパク質）が、同一条件下で、改変されていない宿主細胞の場合と比較して、より大量に、もっと正確にいえば、高い定常状態レベルで産生されることを意味する。同様に、これは通常、酵素的に活性なタンパク質をコードするｍＲＮＡが、同一条件下で、改変されていない宿主細胞の場合と比較して、より大量に、再度もっと正確にいえば、高い定常状態レベルで産生されることを意味する。宿主において、過剰発現される酵素は、過剰発現を引き起こす遺伝子改変を除いて遺伝学的に同一の株と比較して、少なくとも約１．１、約１．２、約１．５、約２、約５、約１０または約２０倍過剰発現されることが好ましい。過剰発現のこれらのレベルは、酵素活性の定常状態レベル、酵素タンパク質の定常状態レベル、および酵素をコードする転写物の定常状態レベルに適用することができることを理解されたい。
【００５５】
［適応］
適応は、集団がその生息地またはその複数の生息地に良好に適合（適応）するようになる進化プロセスである。このプロセスは数世代から多世代にわたって起こり、生物学の基礎的現象の１つである。
【００５６】
適応という用語はまた、生物生存にとって特に重要である特徴を指す場合もある。そのような適応は、繁殖に成功する良好な適合形態により、自然淘汰を介して、変動可能な集団内に生まれる。
【００５７】
環境条件の変化は、自然淘汰のアウトカムを変化させ、新しい条件下での生物の適合性を改善する、その後の適応に関する有益性の選択に影響を与える。極端な環境変化の場合には、有益な適応の出現および固定化が生存にとって必須となり得る。例えば、栄養源の利用可能性、温度、酸素の利用可能性など多くの異なる要因が、適応進化を促進する可能性がある。
【００５８】
［適合度］
適応度（ａｄａｐｔｅｄｎｅｓｓ）（生物が、所与の一連の生息地で生きることができ、繁殖することができる程度）および適合度（ｆｉｔｎｅｓｓ）の間には明確な関係がある。適合度は、自然淘汰率の評価および予測因子である。自然淘汰を適用すると、代替表現型が遺伝性ならば、代替表現型の相対頻度は時間の経過につれて変動することになる。
【００５９】
［遺伝子変化］
自然淘汰が集団の遺伝的変動に影響を与える場合、遺伝子変化が根底となるメカニズムである。この手段により、集団はその環境に遺伝学的に適応する。遺伝的変化は、目に見える構造変化をもたらすことも、または変化した生息地に適合するように生物の生理活性を調節することもある。
【００６０】
生息地がしばしば変わることが起こり得る。したがって、いつになっても適応プロセスが最終的に完了することは決してない。時間の経過につれて、環境が徐々に変化し、種がその環境に次第に良好に適合するようになることは起こり得る。一方、環境の変化が比較的急速に起こり、その後、種が次第に適合しなくなることも起こり得る。適応は遺伝的プロセスであり、このプロセスは、集団が生息地または環境を変えない場合も、ある程度まで常に進行する。
【００６１】
［適応進化］
混合糖細胞をその調製中に適応進化に付することができる。所望の糖を好ましくは唯一の炭素源として、さらに好ましくは嫌気性条件下で増殖することに対して、自然発生または誘導（例えば、放射線または化学物質による）のいずれかによる変異体を選択して、混合糖細胞を糖利用に適応させることができる。変異体の選択は、例えば、Ｋｕｙｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４，ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．４：６５５−６６４）に記載のような、培養物の連続継代を含む手法により、またはケモスタット培養における選択圧下での培養により実施することができる。例えば、好ましい宿主細胞では、変異体の選択により得られた改変を含む、上記の遺伝子改変の少なくとも１つが、キシロースを炭素源として、好ましくは唯一の炭素源として、また好ましくは嫌気性条件下で増殖する能力を宿主細胞に付与する。キシロースを変換するための遺伝子としてＸＩを使用する場合は、細胞は基本的にはキシリトールを産生しないことが好ましく、例えば、産生されるキシリトールは検出限界未満、または、例えばモル基準でいえば、消費される炭素の約５、約２、約１、約０．５、または約０．３％未満である。
【００６２】
また、適応進化は、例えば、Ｗｉｓｓｅｌｉｎｋ  Ｈ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｕｇ．２００７，ｐ．４８８１−４８９１に記載されている。
【００６３】
適応進化の一実施形態では、異なる培地中、例えば異なる組成物（グルコース、キシロースおよびアラビノース；キシロースおよびアラビノース）を含む３種の培地中で連続して増殖させる反復サイクルを用いる反復バッチ培養からなるレジメンを適用する。Ｗｉｓｓｅｌｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆｅｂ．２００９，ｐ．９０７−９１４を参照のこと。
【００６４】
［酵母形質転換および遺伝的安定性］
遺伝子工学（すなわち組換えＤＮＡを用いる酵母細胞の形質転換）は、１９７８年［Ｂｅｇｇｓ，１９７８；Ｈｉｎｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８］に初めて実行可能になった。酵母の組換えＤＮＡ技術は、それ以来それ自体で確立されてきた。多数の異なるベクターコンストラクトが利用可能である。一般に、シャトルベクターと呼ばれるこれらのプラスミドベクターは、複製起点および選択可能マーカー（多くの場合、βラクタマーゼ遺伝子、ａｍｐＲ）からなる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ベクターに由来する遺伝物質を含有し、そのため、これらのベクターは、酵母細胞に形質転換される前に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中で増殖させることが可能である。さらに、シャトルベクターは、酵母選択用の選択可能マーカーを含有する。マーカーは、特定のアミノ酸またはヌクレオチドを合成するための酵素をコードする遺伝子とすることができ、その結果、対応するゲノムの欠失（または変異）を保持する細胞が栄養要求性または無機栄養性に対して補完される。あるいは、これらのベクターは、ｇ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）、ヒグロマイシンＢまたはフレオマイシンのような特定の抗生物質に対する抵抗性を組換え酵母細胞（すなわちＤＮＡを取り込んで、マーカー遺伝子を発現する細胞）に提供する、異種の優性抵抗性マーカーを含有する。さらに、これらのベクターは、これらの部位に外来性ＤＮＡをクローニングすることを可能にする（組合せ）制限部位（多回クローニングサイトまたはＭＣＳ）の配列を含有することができる。ただし、別法が同様に存在する。
【００６５】
慣例的に、追加の遺伝エレメントの有無により、４タイプのシャトルベクターを識別することができる。
・  このプラスミドを制限酵素により開環し、直鎖ＤＮＡを酵母細胞の形質転換に使用する場合に、相同組換えにより、マーカーまたは別の遺伝子の遺伝子座で宿主ゲノムに組み込まれる組込みプラスミド（Ｙｉｐ）。このプラスミドは、一般に、ゲノムのこの特定部位に挿入された１コピーの外来性ＤＮＡの存在をもたらす。
・  酵母細胞における自律複製に必要な２μプラスミドＤＮＡ配列の一部を保持するエピソーム性プラスミド（ＹＥｐ）。多コピーの形質転換プラスミドが酵母細胞の中で増殖し、エピソームとして維持される。
・  形質転換プラスミドが数百倍に増殖することを可能にする酵母複製起点（ＡＲＳ、自律複製配列）を保持する自律複製プラスミド（ＹＲｐ）。
・  正常では安定な有糸分裂分離を保証し、通常、自己複製プラスミドのコピー数をちょうど１つに減少させるセントロメア配列（核染色体の１つに由来）をＡＲＳ配列に加えて保持するＣＥＮプラスミド（ＹＣｐ）。
【００６６】
これらのプラスミドは形質転換により酵母細胞に導入されている。酵母細胞の形質転換は、リチウム酢酸を用いる細胞の透過化（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ，１９８３）およびエレクトロポレーション法などいくつかの異なる手法により達成することができる。
【００６７】
組換え微生物の商業的用途では、プラスミドの不安定性が最も重要な課題である。不安定性は、プラスミドへの変化またはプラスミドの消失のために、形質転換細胞がその工学的特性を失う傾向である。この問題は、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（Ｐｌａｓｍｉｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．４，ｐｐ．４０１−４３５，１９９６）により詳細に議論されている。組込みプラスミドを用いて形質転換された株は、選択圧がない状態でも、極めて安定である（Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｆ．ｈｔｔｐ：／／ｄｂｂ．ｕｒｍｃ．ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ．ｅｄｕ／ｉａｂｓ／ｓｈｅｒｍａｎ  ｆ／ｙｅａｓｔ／９．ｈｔｍｌおよびその参考文献）。
【００６８】
異種ＤＮＡは、通常、染色体外プラスミド（ＹＥｐ、ＹＣｐおよびＹＲｐ）の形態で生物に導入される。特に、選択圧が連続的に加えられない場合には、新たな特性が保持されない可能性があることが、不運にも、細菌および酵母の両方において見出された。これは、組換え細胞が長期間増殖する場合に、ハイブリッドプラスミドの分離不安定性が起こるためである。これにより、集団の不均質化およびクローン的変異が起こり、最終的に、形質転換で導入された特性を細胞の大多数が失った細胞集団になる。栄養要求性マーカーを有するベクターが使用される場合、ベクターは最少培地中でのみ保持されるので、富栄養培地での培養は、多くの場合、ベクターの迅速な消失をもたらす。代替案、すなわち優性抗生物質抵抗性マーカーの使用は、生産プロセスと適合しないことが多い。抗生物質の使用は、登録の観点（極微量の抗生物質が最終産物の中にある可能性）から、または経済的理由（工業規模での抗生物質の使用コスト）から望ましくない場合がある。
【００６９】
ベクターの消失は、大規模な生産状況では問題になる。ＤＮＡ導入のための代替方法は、組込みプラスミド（Ｙｉｐ）の使用など酵母については存在する。ＤＮＡは組換えにより宿主ゲノムに組み込まれて、高い安定性が得られる（Ｃａｕｎｔ，Ｐ．Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９（１９８８）１７３−１９２）。我々は、宿主トランスポゾンを使用する組込み方法が良好な代替案であることを見出した。
【００７０】
［トランスポゾン］
本発明によれば、２〜１５のキシロースイソメラーゼ遺伝子またはキシロースレダクターゼ遺伝子およびキシリトールデヒドロゲナーゼが、混合糖細胞ゲノムに組み込まれる。一実施形態では、多コピーの最初の導入（すなわち適応進化前）は、遺伝子導入をもたらす当技術分野で公知の任意の方法で実行される。一実施形態では、これは、宿主細胞の反復配列（トランスポゾン）に相同な部分を有するベクターを使用して達成することができる。宿主細胞が酵母細胞である場合は、好適な反復配列は、デルタ配列として知られているＴｙエレメントの末端反復配列（ＬＴＲ）である。
【００７１】
ＴｙエレメントはＴｙ１およびＴｙ２と呼ばれる２つのかなり類似したサブファミリーに分類される。これらのエレメントは、長さが約６キロベース（ｋｂ）であり、約３３５塩基対の配列である末端反復配列（ＬＴＲ）により境界が形成されている（Ｂｏｅｋｅ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｈｅ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｏｎｔａｉｎｓ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  Ｎｏｎｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｐｉｅｓ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  Ｔｙ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｐｒ．１９８８，ｐ．１４３２−１４４２  Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．４）。完全に配列決定されたＳ．セレビシア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株であるＳ２８８ｃでは、最も豊富なトランスポゾンはＴｙ１（３１コピー）およびＴｙ２（１３コピー）である（Ｇａｂｒｉｅｌ  Ａ，Ｄａｐｐｒｉｃｈ  Ｊ，Ｋｕｎｋｅｌ  Ｍ，Ｇｒｅｓｈａｍ  Ｄ，Ｐｒａｔｔ  ＳＣ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｇｌｏｂａｌ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｌｏｃａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ  ２（１２）：ｅ２１２．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｇｅｎ．００２０２１２）。これらのトランスポゾンは、２つの重複する翻訳領域（ＯＲＦ）からなり、そのそれぞれはいくつかのタンパク質をコードする。このコード領域は前述したほとんど同一のＬＴＲにより挟まれている。Ｓ．セレビアイゼ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉａｉｓｅ）は、豊富でもなくかつ異なるものでもあるが、他のＴｙエレメントとして、Ｔｙ３、Ｔｙ４およびＴｙ５を含む。完全長Ｔｙエレメントの各ファミリーに対して、一桁多い単独ＬＴＲエレメントがゲノム全体に分散している。これらは、完全長エレメントが内部のタンパク質コード領域をループアウトしながら、ＬＴＲ−ＬＴＲ組換えをして生じたものと考えられる。
【００７２】
ゲノム全体にわたって多コピーを組み込むために、Ｔｙレトロトランスポゾンのレトロ転位機構が利用されてきた（Ｂｏｅｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。デルタ配列として知られているＴｙエレメントの末端反復配列（ＬＴＲ）は、Ｔｙ関連部位または単独部位のいずれかとして約１５０〜２００コピー存在しているので、相同組換えによる組込みのための好適な標的でもある（Ｂｏｅｋｅ，１９８９；Ｋｉｎｇｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｋｉｎｇｓｍａｎ，１９８８）。（Ｐａｒｅｋｈ  Ｒ．Ｎ．（１９９６）．Ａｎ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｔｕｎａｂｌｅ，Ｈｉｇｈ  Ｃｏｐｙ，Ｓｔａｂｌｅ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  Ｄｉｓｐｅｒｓｅｄ  Ｔｙ  ＤＥＬＴＡ  Ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１９９６，１２，１６−２１）。適応進化により、コピー数は変わる可能性がある。
【００７３】
［宿主細胞］
宿主細胞は有用な産物を産生するのに適した任意の宿主細胞とすることができる。宿主細胞は、細菌などの原核細胞または真核細胞等の任意の好適な細胞とすることができる。典型的には、細胞は、真核細胞、例えば酵母または糸状菌である。
【００７４】
酵母は、本明細書では、真核微生物として定義され、単細胞の形態で主に増殖するユーミコチナ（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門のすべての種を含む（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．，１９６２，Ｉｎ：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【００７５】
酵母は、単細胞葉状体の出芽によっても、または生物の分裂によっても増殖することができる。混合糖細胞として好ましい酵母は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クロエケラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、シュワンニオマイセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）またはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）に属することができる。酵母は嫌気性発酵ができる酵母、より好ましくは、嫌気性アルコール発酵ができる酵母であることが好ましい。
【００７６】
糸状菌は、本明細書では、ユーミコチナ（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門のすべての糸状形態を含む真核微生物として定義される。これらの菌類は、キチン、セルロース、および他の複合多糖で構成される栄養菌糸を特徴とする。本発明の細胞として使用するのに適した糸状菌は、形態学的、生理学的および遺伝学的に酵母と異なる。大部分の菌類が増殖に無菌条件を必要とせず、かつバクテリオファージ感染に対して非感受性であることから、糸状菌細胞の使用は有利となり得る。糸状菌による栄養増殖は、菌糸の伸長によるものであり、大部分の糸状菌の炭素異化反応は偏性好気性である。宿主細胞として好ましい糸状菌は、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ヒューミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、アクレモニウラ属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｒｒａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）またはペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）に属することができる。より好ましくは、糸状菌細胞は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、またはリゾプス・オリーゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）細胞とすることができる。
【００７７】
一実施形態では、宿主細胞は酵母とすることができる。
【００７８】
宿主は、工業用宿主、より好ましくは工業用酵母とすることが好ましい。工業用宿主細胞および工業用酵母細胞は以下のように定義することができる。工業的プロセスおける酵母細胞の生活環境は、研究室の生活環境とは顕著に異なる。工業用酵母細胞は、プロセスの間に変動し得る複数の環境条件下で良好に機能できなければならない。このような変動には、栄養源、ｐＨ、エタノール濃度、温度、酸素濃度等の変化が含まれ、これらは共に、サッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の細胞増殖およびエタノール産生に影響を及ぼす可能性がある。有害な工業条件下では、環境耐性のある株が増殖および産生を頑強に保つことができよう。工業用酵母株は、一般に、製パン工業、醸造工業、ワイン醸造およびエタノール産業など使用される用途で起こり得る、環境条件のこれらの変化に対してより頑強である。工業用酵母（Ｓ．セレビシア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））の例は、Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｒｅｄ（登録商標）（Ｆｅｒｍｅｎｔｉｓ）、Ｆｅｒｍｉｏｌ（登録商標）（ＤＳＭ）およびＴｈｅｒｍｏｓａｃｃ（登録商標）（Ｌａｌｌｅｍａｎｄ）である。
【００７９】
一実施形態では、宿主は阻害物質耐性である。阻害物質耐性宿主細胞は、阻害物質耐性のＳ．セレビシア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＡＴＣＣ２６６０２が選択されたＫａｄａｒ  ｅｔ  ａｌ，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００７），Ｖｏｌ．１３６−１４０，８４７−８５８の例示にあるように、阻害物質含有原料上での増殖に対して細胞株をスクリーニングすることにより選択することができる。
【００８０】
［ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ遺伝子］
混合糖細胞はアラビノースを使用することができる。したがって、混合糖細胞は、Ｌ−アラビノースをＬ−リブロースおよび／もしくはキシルロース５−リン酸に、かつ／または所望の発酵産物、例えば本明細書に記載の産物の１つに変換することができる。
【００８１】
Ｌ−アラビノースからエタノールを産生できる生物、例えばＳ．セレビシア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株は、好適な供給源から、ａｒａＡ（Ｌ−アラビノースイソメラーゼ）、ａｒａＢ（Ｌ−リブロキナーゼ）およびａｒａＤ（Ｌ−リブロース−５−Ｐ４−エピメラーゼ）遺伝子を導入して細胞を改変することにより、作製することができる。このような遺伝子は、混合糖細胞がアラビノースを使用できるように混合糖細胞に導入することができる。このような手法は、国際公開第２００３／０９５６２７号パンフレットに記載されている。ラクトバチルス・プランタナム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｎｕｍ）由来のａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ遺伝子は使用可能であり、国際公開第２００８／０４１８４０号パンフレットに開示されている。バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のａｒａＡ遺伝子および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来のａｒａＢおよびａｒａＤ遺伝子は使用可能であり、欧州特許第１４９９７０８号明細書に開示されている。別の実施形態では、国際公開第２００９０１１５９１号パンフレットに開示されているように、ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ遺伝子は、クラビバクター属（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）、アルトロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）および／またはグラメラ属（Ｇｒａｍｅｌｌａ）の少なくとも１つから、具体的には、クラビバクター・ミシガネンシス（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ）、アルトロバクター・オーレセンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｕｒｅｓｃｅｎｓ）および／またはグラメラ・フォルセティ（Ｇｒａｍｅｌｌａ  ｆｏｒｓｅｔｉｉ）の１つから由来するものでもよい。
【００８２】
［ＰＰＰ遺伝子］
混合糖細胞は、ペントースリン酸経路のフラックスを増加させる１つまたは複数の遺伝子改変を含むことができる。具体的には、遺伝子改変は、ペントースリン酸経路の非酸化的部分を通るフラックスの増加をもたらすことができる。ペントースリン酸経路の非酸化的部分におけるフラックスの増加を引き起こす遺伝子改変は、本明細書では、フラックスの増加を引き起こす遺伝子改変を除いて遺伝学的に同一の株におけるフラックスと比較して、フラックスを少なくとも約１．１、約１．２、約１．５、約２、約５、約１０または約２０倍増加させる改変を意味すると理解される。ペントースリン酸経路の非酸化的部分のフラックスは、唯一の炭素源としてのキシロース上で改変宿主を増殖させて、特異的キシロース消費速度を測定し、何らかのキシリトールが産生される場合には、特異的キシロース消費速度から特異的キシリトール生成速度を差し引くことにより、測定することができる。しかしながら、ペントースリン酸経路の非酸化的部分のフラックスは、キシロースを唯一の炭素源とした増殖速度、好ましくはキシロースを唯一の炭素源とした嫌気性増殖速度と比例する。キシロースを唯一の炭素源とした増殖速度（μｍａｘ）とペントースリン酸経路の非酸化的部分のフラックスとの間には比例関係がある。糖に関するバイオマスの収量は一定であるため、特異的キシロース消費速度（Ｑｓ）は、増殖速度（μ）を、糖に関するバイオマスの収量（Ｙｘｓ）で割ったものに等しい（嫌気性、増殖培地、ｐＨ、株の遺伝的背景等、所与の一連の条件下で；すなわち、Ｑｓ＝μ／Ｙｘｓ）。したがって、ペントースリン酸経路の非酸化的部分のフラックスの増加は、輸送がない限り（取り込みが律速である）、これらの条件下での最大増殖速度の増加から推定することができる。
【００８３】
ペントースリン酸経路のフラックスを増加させる１つまたは複数の遺伝子改変は、様々な方法で宿主細胞に導入することができる。これらは、例えば、キシルロースキナーゼおよび／もしくは非酸化的部分ペントースリン酸経路の酵素の１つまたは複数の高い定常状態活性レベル、ならびに／または非特異的アルドースレダクターゼ活性の低下した定常状態レベルを達成することを含む。定常状態活性レベルのこれらの変化は、変異体（自然発生、または化学物質もしくは放射線による誘導）の選択によって、および／または組換えＤＮＡ技術によって、例えば、酵素をコードする遺伝子またはこれらの遺伝子を調節する因子をそれぞれ過剰発現または不活化させることによって起こすことができる。
【００８４】
好ましい宿主細胞では、遺伝子改変は、（非酸化的部分）ペントースリン酸経路の少なくとも１つの酵素の過剰発現を含む。この酵素は、リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼをコードする酵素からなる群から選択されることが好ましい。（非酸化的部分）ペントースリン酸経路の酵素の様々な組み合わせを過剰発現させることができる。例えば、過剰発現される酵素は、少なくとも、リブロース−５−リン酸イソメラーゼおよびリブロース−５−リン酸エピメラーゼ酵素；または少なくとも、リブロース−５−リン酸イソメラーゼおよびトランスケトラーゼ酵素；または少なくとも、リブロース−５−リン酸イソメラーゼおよびトランスアルドラーゼ酵素；または少なくとも、リブロース−５−リン酸エピメラーゼおよびトランスケトラーゼ酵素；または少なくとも、リブロース−５−リン酸エピメラーゼおよびトランスアルドラーゼ酵素；または少なくとも、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ酵素；または少なくとも、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ酵素；または少なくとも、リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ酵素；または少なくとも、リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼおよびトランスアルドラーゼ酵素；または少なくとも、リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼおよびトランスケトラーゼ酵素とすることができる。本発明の一実施形態では、リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ酵素のそれぞれが、宿主細胞において過剰発現される。遺伝子改変として少なくともトランスケトラーゼとトランスアルドラーゼ酵素の両方の過剰発現を含む宿主細胞が、このような宿主細胞はすでにキシロース上で嫌気性増殖ができるため、より好ましい。実際、一部の条件下で、トランスケトラーゼとトランスアルドラーゼのみを過剰発現する宿主細胞はすでに、４種類の酵素すべて、すなわちリブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼを過剰発現する宿主細胞と同じ嫌気性増殖速度をキシロース上で有する。さらに、これらの酵素の１種類のみの過剰発現では代謝の不均衡が起こり得るため、イソメラーゼのみまたはエピメラーゼのみを過剰発現する宿主細胞よりも、リブロース−５−リン酸イソメラーゼとリブロース−５−リン酸エピメラーゼ酵素の両方を過剰発現する宿主細胞が好ましい。
【００８５】
「リブロース５−リン酸エピメラーゼ」酵素（ＥＣ５．１．３．１）は、本明細書では、Ｄ−リブロース５−リン酸へのＤ−キシルロース５−リン酸のエピマー化およびその逆のエピマー化を触媒する酵素として定義される。この酵素は、ホスホリブロースエピメラーゼ；エリトロース−４−リン酸イソメラーゼ；ホスホケトペントース３−エピメラーゼ；キシルロースリン酸３−エピメラーゼ；ホスホケトペントースエピメラーゼ；リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼ；Ｄ−リブロースリン酸３−エピメラーゼ；Ｄ−リブロース５−リン酸エピメラーゼ；Ｄ−リブロース−５−Ｐ  ３−エピメラーゼ；Ｄ−キシルロース−５−リン酸３−エピメラーゼ；ペントース−５−リン酸３−エピメラーゼ；またはＤ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼとしても知られる。リブロース−５−リン酸エピメラーゼは、そのアミノ酸配列によりさらに定義することができる。同様に、リブロース５−リン酸エピメラーゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列によって、またリブロース５−リン酸エピメラーゼをコードする参照ヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列によって定義することができる。リブロース−５−リン酸エピメラーゼをコードするヌクレオチド配列は、本明細書では、ＲＰＥ１と名付ける。
【００８６】
「リブロース５−リン酸イソメラーゼ」酵素（ＥＣ５．３．１．６）は、本明細書では、Ｄ−リブロース５−リン酸へのＤ−リボース５−リン酸の直接的異性化およびその逆の直接的異性化を触媒する酵素として定義される。この酵素は、ホスホペントスイソメラーゼ；ホスホリボイソメラーゼ；リボースリン酸イソメラーゼ；５−ホスホリボースイソメラーゼ；Ｄ−リボース５−リン酸イソメラーゼ；Ｄ−リボース−５−リン酸ケトール−イソメラーゼ；またはＤ−リボース−５−リン酸アルドース−ケトース−イソメラーゼとしても知られている。リブロース−５−リン酸イソメラーゼは、そのアミノ酸配列によりさらに定義することができる。同様に、リブロース５−リン酸イソメラーゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列によって、またリブロース５−リン酸イソメラーゼをコードする参照ヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列によって定義することができる。リブロース−５−リン酸イソメラーゼをコードするヌクレオチド配列は、本明細書では、ＲＫＩ１と名付ける。
【００８７】
「トランスケトラーゼ」酵素（ＥＣ２．２．１．１）は、本明細書では、以下の反応：Ｄ−リボース５−リン酸＋Ｄ−キシルロース５−リン酸  ＜−＞  セドヘプツロース７−リン酸＋Ｄ−グリセルアルデヒド３−リン酸およびその逆の反応を触媒する酵素として定義される。この酵素は、グリコールアルデヒドトランスフフェラーゼまたはセドヘプツロース−７−リン酸：Ｄ−グリセルアルデヒド３−リン酸グリコールアルデヒドトランスフフェラーゼとしても知られている。トランスケトラーゼは、そのアミノ酸によりさらに定義することができる。同様に、トランスケトラーゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列によって、またトランスケトラーゼをコードする参照ヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列によって定義することができる。トランスケトラーゼをコードするヌクレオチド配列は、本明細書では、ＴＫＬ１と名付ける。
【００８８】
「トランスアルドラーゼ」酵素（ＥＣ２．２．１．２）は、本明細書では、以下の反応：セドヘプツロース７−リン酸＋Ｄ−グリセルアルデヒド３−リン酸  ＜−＞  Ｄ−エリトロース４−リン酸＋Ｄ−フルクトース６−リン酸およびその逆の反応を触媒する酵素として定義される。この酵素は、ジヒドロキシアセトントランスフェラーゼ；ジヒドロキシアセトンシンターゼ；ホルムアルデヒドトランスケトラーゼ；またはセドヘプツロース−７−リン酸：Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸グリセロントランスフェラーゼとしても知られている。トランスアルドラーゼは、そのアミノ酸配列によりさらに定義することができる。同様に、トランスアルドラーゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列によって、またトランスアルドラーゼをコードする参照ヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列によって定義することができる。トランスケトラーゼをコードするヌクレオチド配列は、本明細書では、ＴＡＬ１と名付ける。
【００８９】
［キシロースイソメラーゼまたはキシロースレダクターゼの遺伝子］
本発明によれば、１種または複数のキシロースイソメラーゼ遺伝子および／または１種または複数のキシロースレダクターゼおよびキシリトールデヒドロゲナーゼの２〜１５コピーが宿主細胞のゲノムに導入される。これら２〜１５の遺伝エレメントの存在は、異性化または還元によりキシロースを変換する能力を細胞に付与する。
【００９０】
一実施形態では、１種または複数のキシロースイソメラーゼ遺伝子の２〜１５コピーが、宿主細胞のゲノムに導入される。
【００９１】
「キシロースイソメラーゼ」（ＥＣ５．３．１．５）は、本明細書では、Ｄ−キシルロースへのＤ−キシロースの直接的異性化および／またはその逆の直接的異性化を触媒する酵素として定義される。この酵素は、Ｄ−キシロースケトイソメラーゼとしても知られている。キシロースイソメラーゼは、本明細書では、Ｄ−グルコースとＤ−フルクトースとの間の変換を触媒することもできる（したがって、グルコースイソメラーゼと呼ぶこともできる）。キシロースイソメラーゼは、本明細書では、補因子として、マグネシウム、マンガンまたはコバルトなどの二価陽イオンを必要とすることがある。
【００９２】
したがって、このような混合糖細胞は、キシロースをキシルロースに異性化することができる。キシロースをキシルロースに異性化する能力は、定義されたキシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトを用いた宿主細胞の形質転換により宿主細胞に付与される。混合糖細胞はキシロースのキシルロースへの直接的異性化によりキシロースをキシルロースに異性化する。
【００９３】
キシロースイソメラーゼ活性の単位（Ｕ）は、本明細書では、Ｋｕｙｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３，ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．４：６９−７８）により記載の条件下で、１分間当たりキシルロース１ｎｍｏｌを産生する酵素量として定義することができる。
【００９４】
キシロースイソメラーゼ遺伝子は、例えば国際公開第２００６／００９４３４号パンフレットに開示のピロミセス（Ｐｙｒｏｍｙｃｅｓ）種など、様々な起源を有することができる。他の好適な起源は、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、具体的には、ＰＣＴ／欧州特許第２００９／５２６２３号明細書に記載のバクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）、具体的には、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ＰＣＴ／欧州特許第２００９／０５２６２５号明細書に記載のバチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）である。
【００９５】
別の実施形態では、１種または複数のキシロースレダクターゼおよびキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の２〜１５コピーが、宿主細胞のゲノムに導入される。この実施形態では、キシロースの変換は、キシロースレダクターゼおよびキシリトールデヒドロゲナーゼによりそれぞれ触媒される、キシリトール中間体を経由するキシロースのキシルロースへの２ステップ変換で行なわれる。この実施形態では、国際公開第２００４０８５６２７号パンフレットに開示されているように、キシロースレダクターゼ（ＸＲ）、キシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）およびキシロキナーゼ（ＸＫ）は過剰発現させることができ、場合によっては、ＮＡＤＰＨ産生酵素をコードする遺伝子の１つまたは複数およびＮＡＤＨ消費酵素をコードする遺伝子の１つまたは複数がアップレギュレートされる。
【００９６】
［ＸＫＳ１遺伝子］
混合糖細胞は、特異的キシルロースキナーゼ活性を増加させる１つまたは複数の遺伝子改変を含むことができる。この１つまたは複数の遺伝子改変により、例えばキシルロースキナーゼをコードするヌクレオチド配列の過剰発現によりキシルロースキナーゼの過剰発現が起こることが好ましい。キシルロースキナーゼをコードする遺伝子は、宿主細胞にとって内在性であっても、または宿主細胞にとって異種のキシルロースキナーゼであってもよい。宿主細胞においてキシルロースキナーゼの過剰発現に使用されるヌクレオチド配列は、キシルロースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
【００９７】
「キシルロースキナーゼ」酵素（ＥＣ２．７．１．１７）は、本明細書では、反応ＡＴＰ＋Ｄ−キシルロース＝ＡＤＰ＋Ｄ−キシルロース５−リン酸を触媒する酵素として定義される。この酵素は、リン酸化するキシルロキナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｎｇ  ｘｙｌｕｌｏｋｉｎａｓｅ）、Ｄ−キシルロキナーゼまたはＡＴＰ：Ｄ−キシルロース５−ホスホトランスフェラーゼとしても知られる。本発明のキシルロースキナーゼは、そのアミノ酸配列によりさらに定義することができる。同様に、キシルロースキナーゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列によって、またキシルロースキナーゼをコードする参照ヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列によって定義することができる。
【００９８】
混合糖細胞では、特異的キシルロースキナーゼ活性を増加させる１つまたは複数の遺伝子改変は、上記のペントースリン酸経路のフラックスを増加させる改変のいずれとも組み合わせることができる。しかし、これは必須ではない。
【００９９】
したがって、宿主細胞は、特異的キシルロースキナーゼ活性を増加させる１つまたは複数の遺伝子改変のみを含むことができる。本発明の宿主細胞におけるキシルロースキナーゼの過剰発現を達成および分析するための、当技術分野で利用可能な様々な手段は、ペントースリン酸経路の酵素について上記に記載したものと同じである。本発明の宿主細胞において、過剰発現されるキシルロースキナーゼは、過剰発現を引き起こす遺伝子改変を除いて遺伝学的に同一の株と比較して、少なくとも約１．１、約１．２、約１．５、約２、約５、約１０または約２０倍過剰発現されることが好ましい。過剰発現のこれらのレベルは、酵素活性の定常状態レベル、酵素タンパク質の定常状態レベル、および酵素をコードする転写物の定常状態レベルに適用することができることを理解されたい。
【０１００】
［アルドースレダクターゼ（ＧＲＥ３）遺伝子の欠失］
キシロースを変換するための遺伝子としてＸＩを使用する実施形態では、アルドースレダクターゼ活性を低下させることが有利となることがある。したがって、混合糖細胞は、宿主細胞において非特異的アルドースレダクターゼ活性を低下させる１つまたは複数の遺伝子改変を含むことができる。非特異的アルドースレダクターゼ活性は、非特異的アルドースレダクターゼをコードする遺伝子の発現を低下させるかまたはその遺伝子を不活化する１つまたは複数の遺伝子改変により宿主細胞において低下させることが好ましい。遺伝子改変により、宿主細胞において非特異的アルドースレダクターゼをコードする遺伝子の各内在性コピーの発現が低下または不活化することが好ましい（本明細書ではＧＲＥ３欠失と呼ばれる）。混合糖細胞は、二倍数性、多倍数性または異数性の結果として、非特異的アルドースレダクターゼをコードする遺伝子を多コピー含むことができ、かつ／または宿主細胞は、アミノ酸配列が異なり、それぞれが異なる遺伝子によりコードされる、アルドースレダクターゼ活性を有するいくつかの異なる（イソ）酵素を含むことができる。さらに、このような場合には、非特異的アルドースレダクターゼをコードする各遺伝子の発現は低下または不活化されることが好ましい。この遺伝子は、遺伝子の少なくとも一部の欠失によりまたは遺伝子の破壊により不活化されることが好ましく、この関連では、遺伝子という用語は、コード配列の上流または下流のいずれの非コード配列もまた含み、その（部分的）欠失または不活化により、宿主細胞において非特異的アルドースレダクターゼ活性の発現が低下する。
【０１０１】
宿主細胞において活性が低下するアルドースレダクターゼをコードするヌクレオチド配列は、アルドースレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
【０１０２】
したがって、宿主細胞において非特異的アルドースレダクターゼ活性を低下させる１つまたは複数の遺伝子改変のみを含む宿主細胞は、具体的に本発明に含まれる。
【０１０３】
「アルドースレダクターゼ」酵素（ＥＣ１．１．１．２１）は、本明細書では、キシロースまたはキシルロースをキシリトールに還元することができる酵素として定義される。本発明の関連では、アルドースレダクターゼは、本発明の宿主細胞にとって天然（内在性）であり、かつキシロースまたはキシルロースをキシリトールに還元することができる任意の非特異的アルドースレダクターゼとすることができる。非特異的アルドースレダクターゼは以下の反応：
アルドース＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋Ｈ＋  ＜−＞  アルジトール＋ＮＡＤ（Ｐ）＋
を触媒する。
【０１０４】
この酵素は広い特異性を有しており、アルドースレダクターゼ；ポリオールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）；アルジトール：ＮＡＤＰオキシドレダクターゼ；アルジトール：ＮＡＤＰ＋１−オキシドレダクターゼ；ＮＡＤＰＨアルドペントースレダクターゼ；またはＮＡＤＰＨアルドースレダクターゼとしても知られている。
【０１０５】
Ｓ．セレビシア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）にとって内在性であり、ＧＲＥ３遺伝子によりコードされる、そのような非特異的アルドースレダクターゼの具体例（Ｔｒａｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：５６６８−７４）。したがって、本発明のアルドースレダクターゼは、そのアミノ酸配列によりさらに定義することができる。同様に、アルドースレダクターゼは、この酵素をコードするヌクレオチド配列によって、またアルドースレダクターゼをコードする参照ヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列によって定義することができる。
【０１０６】
［配列同一性］
アミノ酸またはヌクレオチドの配列は、特定のレベルの類似性を示す場合に相同であると言われる。相同である２つの配列は、共通の進化的起源を示す。２つの相同配列が近縁であるか遠縁であるかは、「パーセント同一性」または「パーセント類似性」が、それぞれ高いか低いかにより示される。論争はあるが、「パーセント同一性」または「パーセント類似性」を示すために、「相同性レベル」または「パーセント相同性」を互換的に使用することが多い。
【０１０７】
用語「相同性」、「パーセント相同性」、「パーセント同一性」または「パーセント類似性」は、本明細書では、互換的に使用される。本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、最適な比較を目的として完全配列をアライメントすることをここで定義する。２つの配列間のアライメントを最適化するために、比較する２つの配列のいずれにもギャップを導入することができる。このようなアライメントを、比較する配列の全長にわたって実行することができる。あるいは、このアライメントを、より短い鎖長、例えば約２０、約５０、約１００以上の核酸／塩基またはアミノ酸にわたって実行することができる。同一性は、報告されたアライメント領域にわたる２つの配列間の同一マッチのパーセントである。
【０１０８】
２つの配列間の配列の比較およびパーセント同一性の決定は、数学アルゴリズムを使用して達成することができる。２つの配列をアライメントして２つの配列間の相同性を決定するために、数種類の異なるコンピュータプログラムが利用可能であるという事実は、当業者ならば承知しているであろう（Ｋｒｕｓｋａｌ，Ｊ．Ｂ．（１９８３）Ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｓｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  Ｉｎ  Ｄ．Ｓａｎｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｊ．Ｂ．Ｋｒｕｓｋａｌ，（ｅｄ．），Ｔｉｍｅ  ｗａｒｐｓ，ｓｔｒｉｎｇ  ｅｄｉｔｓ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｔｈｅ  ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，ｐｐ．１−４４  Ａｄｄｉｓｏｎ  Ｗｅｓｌｅｙ）。２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、２つの配列のアライメントのためにＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して決定することができる（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３）。このアルゴリズムはアミノ酸配列およびヌクレオチド配列をアライメントする。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−ＷｕｎｓｃｈアルゴリズムはコンピュータプログラムＮＥＥＤＬＥの中に実装されている。本発明の目的のために、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮＥＥＤＬＥプログラムを使用した（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．８．０またはそれ以降，ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ（２０００）Ｒｉｃｅ，Ｐ．Ｌｏｎｇｄｅｎ，Ｉ．ａｎｄ  Ｂｌｅａｓｂｙ，Ａ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６，（６）ｐｐ２７６−２７７，ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／）。タンパク質配列については、ＥＢＬＯＳＵＭ６２を置換マトリックスのために使用する。ヌクレオチド配列については、ＥＤＮＡＦＵＬＬを使用する。他のマトリックスを指定することができる。アミノ酸配列のアライメントに使用するオプションパラメーターは、１０のギャップ開始ペナルティおよび０．５のギャップ伸長ペナルティである。当業者は、これらのパラメーターが異なる場合はすべて、わずかに異なる結果が得られるが、異なるアルゴリズムを使用する場合は、２つの配列の全般的なパーセント同一性は顕著に変化しないことを認識するであろう。
【０１０９】
［グローバルな相同性の定義］
相同性または同一性は、いずれのギャップまたは伸長も含む全配列領域にわたる２つの全配列間の同一マッチのパーセントである。２つのアライメント配列間の相同性または同一性は以下のように計算される。すなわち、両配列において同一アミノ酸を示す、アライメント中の対応する位置の数を、ギャップを含むアライメントの全長で割る。本明細書で定義する同一性は、ＮＥＥＤＬＥから得ることができ、プログラムの出力中に「ＩＤＥＮＴＩＴＹ」と標識されている。
【０１１０】
［最長同一性の定義］
２つのアライメント配列間の相同性または同一性は以下のように計算される。すなわち、両配列において同一アミノ酸を示す、アライメント中の対応する位置の数を、アライメント中の全ギャップ数を差し引いた後のアライメントの全長で割る。本明細書で定義する同一性は、ＮＯＢＲＩＥＦオプションを使用してＮＥＥＤＬＥから得ることができ、プログラムの出力中に「最長同一性（ｌｏｎｇｅｓｔ−ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」と標識されている。本発明の目的のために、２つの配列（アミノ酸またはヌクレオチド）間の同一性（相同性）のレベルは、プログラムＮＥＥＤＬＥを使用して実行することができる場合、「最長同一性」の定義に従って計算される。
【０１１１】
本発明において使用するタンパク質配列は、配列データベースに対して検索を実施するために、例えば他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するために、「クエリー配列」としてさらに使用することができる。このような検索はＢＬＡＳＴプログラムを使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して公的に入手可能である。ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列に対して、ＢＬＡＳＴＮはヌクレオチド配列に対して使用される。ＢＬＡＳＴプログラムでは、以下のものをデフォルトとして使用する。
−ギャップ開始コスト：デフォルト＝ヌクレオチドに対して５／タンパク質に対して１１
−ギャップ伸長コスト：デフォルト＝ヌクレオチドに対して２／タンパク質に対して１
−ヌクレオチドミスマッチに対するペナルティ：デフォルト＝−３
−ヌクレオチドマッチに対する報酬：デフォルト＝１
−期待値：デフォルト＝１０
−ワードサイズ：デフォルト＝ヌクレオチドに対して１１／ｍｅｇａｂｌａｓｔに対して２８／タンパク質に対して３
【０１１２】
さらに、アミノ酸配列クエリーまたは核酸配列クエリーと検索された相同配列との間の局所同一性（相同性）度が、ＢＬＡＳＴプログラムにより決定される。しかしながら、特定の閾値を超えるマッチを与える配列セグメントのみが比較される。そのため、プログラムは、これらのマッチするセグメントに対してのみ同一性を計算する。したがって、このように計算された同一性は局所同一性と呼ばれる。
【０１１３】
［バイオ産物の生産］
ここ数年にわたって、作物糖からバイオエタノールを生産するために、様々な生物の導入が提案されてきた。しかしながら、実際には、主要なバイオエタノール生産プロセスではすべて、エタノール生産生物としてサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の酵母が使用され続けている。これは、工業的プロセスに対するサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種の多くの魅力的な特徴、すなわち酸、エタノールおよび浸透圧に対する高い耐性、嫌気性増殖能力、および当然のことながらその高いアルコール発酵能力によるものである。宿主細胞として好ましい酵母種としては、Ｓ．セレビシア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ブルデリ（Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ）、Ｓ．バーネッティ（Ｓ．ｂａｒｎｅｔｔｉ）、Ｓ．エキシグス（Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ）、Ｓ．ウバルム（Ｓ．ｕｖａｒｕｍ）、Ｓ．ディアスタティカス（Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）またはＫ．フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）が挙げられる。
【０１１４】
混合糖細胞はエタノール生産に適した細胞になり得る。しかしながら、混合糖細胞はエタノール以外の発酵産物の生産に適している可能性がある。
【０１１５】
そのような非エタノール性発酵産物としては、酵母または糸状菌などの真核微生物が生産可能な任意のバルクまたはファインケミカルが原理上挙げられる。
【０１１６】
非エタノール性発酵産物の生産に使用できる混合糖細胞は、アルコールデヒドロゲナーゼ活性の低下をもたらす遺伝子改変を含有する宿主細胞である。
【０１１７】
一実施形態では、混合糖細胞は、リグノセルロースに由来する糖をエタノールに変換するプロセスにおいて使用することができる。
【０１１８】
［リグノセルロース］
潜在的な再生可能供給原料と見なされ得るリグノセルロースは、一般に、多糖セルロース（グルカン）およびヘミセルロース（キシラン、ヘテロキシランおよびキシログルカン）を含む。さらに、ヘミセルロースの一部は、グルコマンナンとして、例えば木質由来供給原料中に存在することがある。単量体および多量体の両方を含む可溶性糖、例えばグルコース、セロビオース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、ラムノース、リボース、ガラクツロン酸、グルコロン酸（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）および他のヘキソースおよびペントースへのこれら多糖の酵素加水分解は、協奏的に作用する様々な酵素の作用の下で起こる。
【０１１９】
さらに、アラビナンなどのペクチンおよび他のペクチン質は、非木質植物組織由来の典型的細胞壁の乾燥質量のかなりの割合を構成している可能性がある（乾燥質量の約１／４から半分がペクチンである可能性がある）。
【０１２０】
［前処理］
酵素処理の前に、リグノセルロース系原料を前処理することができる。前処理は、酸、塩基、溶媒、熱、過酸化物、オゾン、機械的な破砕、研削、粉砕もしくは急速減圧、またはこれらの２つ以上の任意の組合せにリグノセルロース系原料をさらすことを含むことができる。この化学的前処理は、例えば１５０〜２２０℃の間で１〜３０分間などの熱前処理と組み合わせることが多い。
【０１２１】
［酵素加水分解］
前処理された原料は、一般に、本発明に従って発酵され得る糖を放出させるために、酵素加水分解に供される。これは、セルラーゼ、例えばセロビオヒドロラーゼ（類）、エンドグルカナーゼ（類）、β−グルコシダーゼ（類）、および場合によっては他の酵素と接触させるなどの従来の方法を用いて実行することができる。セルラーゼを用いる変換は、室温または高温で、十分量の糖（類）が放出される反応時間、実行することができる。酵素加水分解の結果は、糖組成物として本明細書で示したＣ５／Ｃ６糖を含む加水分解産物である。
【０１２２】
［発酵］
発酵プロセスは好気性または嫌気性の発酵プロセスとすることができる。嫌気性発酵プロセスは、本明細書では、無酸素状態で行われるかまたは実質的に酸素が消費されない、好ましくは、約５、約２．５または約１ｍｍｏｌ／ｌ／時未満、より好ましくは、０ｍｍｏｌ／ｌ／時が消費される（すなわち、酸素消費量は検出不可能である）、かつ有機分子が電子供与体と電子受容体の両方として機能する、発酵プロセスとして定義される。無酸素状態では、解糖およびバイオマス形成において産生されるＮＡＤＰＨは、酸化的リン酸化により酸化されることはない。この問題を解決するために、多くの微生物では、電子および水素受容体としてピルベートまたはその誘導体の１つが使用されてＮＡＤ＋が再生される。
【０１２３】
したがって、好ましい嫌気性発酵プロセスでは、ピルベートが電子（および水素受容体）として使用され、エタノール、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム抗生物質およびセファロスポリンなどの発酵産物に還元される。
【０１２４】
発酵プロセスは、細胞にとって最適な温度で行うことが好ましい。したがって、大部分の酵母または真菌の宿主細胞については、発酵プロセスは、約４２℃未満、好ましくは３８℃未満の温度で行われる。酵母または糸状菌の宿主細胞については、発酵プロセスは、約３５℃、約３３℃、約３０℃または約２８℃より低い温度で、かつ約２０℃、約２２℃または約２５℃より高い温度で行われることが好ましい。
【０１２５】
このプロセスでのキシロースおよび／またはグルコースについてのエタノール収率は、少なくとも約５０、約６０、約７０、約８０、約９０または約９８％であることが好ましい。エタノール収率は、本明細書では、理論最大収量のパーセントとして定義される。
【０１２６】
本発明は、さらに発酵産物を生産するプロセスに関する。
【０１２７】
本発明による発酵プロセスは、好気性および嫌気性の条件下で行うことができる。一実施形態では、このプロセスは微好気性または酸素制限の条件下で行なわれる。
【０１２８】
嫌気性発酵プロセスは、本明細書では、無酸素状態で行われるかまたは実質的に酸素が消費されない、好ましくは、約５、約２．５または約１ｍｍｏｌ／ｌ／時未満の消費である、かつ有機分子が電子供与体と電子受容体の両方として機能する、発酵プロセスとして定義される。
【０１２９】
酸素制限発酵プロセスは、酸素消費が気体から液体への酸素移動によって制限される発酵プロセスである。酸素制限の程度は、流入するガスフローの量および組成ならびに使用される発酵装置の実際の混合／物質移動特性によって決定される。酸素制限条件下のプロセスでは、酸素消費速度は、少なくとも約５．５、より好ましくは少なくとも約６、例えば少なくとも７ｍｍｏｌ／ｌ／時であることが好ましい。本発明の方法は、発酵産物の回収を含むことができる。
【０１３０】
好ましい方法では、細胞はキシロースとグルコースの両方を、好ましくは同時に発酵するが、この場合には、ジオーキシー増殖を防止するためのグルコース抑制に非感受性な細胞を使用することが好ましい。炭素源としてのキシロース（およびグルコース）の供給源に加えて、発酵培地は、細胞の増殖に必要な適切な成分をさらに含む。酵母などの微生物の増殖用発酵培地の組成は、当技術分野で周知である。
【０１３１】
発酵プロセスはバッチ、フェドバッチまたは連続方式で行うことができる。また、別々の加水分解および発酵（ＳＨＦ）のプロセス、または同時の糖化および発酵（ＳＳＦ）のプロセスを適用することができる。これらの発酵プロセス方式の組合せもまた、最適な生産性のために可能となり得る。これらのプロセスは、以下の本明細書において詳細に記載される。
【０１３２】
［ＳＳＦ方式］
同時の糖化および発酵（ＳＳＦ）の方式については、液化／加水分解または前糖化ステップための反応時間は、所望の収率、すなわちセルロースのグルコースへの変換収率を実現するための時間に依存する。そのような収率は、可能な限り高いことが好ましく、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上または９９．９％以上が好ましい。
【０１３３】
本発明によれば、ＳＨＦ方式における極めて高い糖濃度およびＳＳＦ方式における極めて高い産物濃度（例えばエタノール）が実現される。ＳＨＦ操作では、グルコース濃度は、２５ｇ／Ｌ以上、３０ｇ／Ｌ以上、３５ｇ／Ｌ以上、４０ｇ／Ｌ以上、４５ｇ／Ｌ以上、５０ｇ／Ｌ以上、５５ｇ／Ｌ以上、６０ｇ／Ｌ以上、６５ｇ／Ｌ以上、７０ｇ／Ｌ以上、７５ｇ／Ｌ以上、８０ｇ／Ｌ以上、８５ｇ／Ｌ以上、９０ｇ／Ｌ以上、９５ｇ／Ｌ以上、１００ｇ／Ｌ以上、１１０ｇ／Ｌ以上、１２０ｇ／Ｌ以上とするか、または、例えば、２５ｇ／Ｌ〜２５０ｇ／Ｌ、３０ｇｌ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌとすることができる。
【０１３４】
［ＳＳＦ方式における産物濃度］
ＳＳＦ操作では、産物濃度（ｇ／Ｌ）は産生されたグルコース量に依存するが、ＳＳＦでは糖が産物に変換されるので、これは明確ではなく、産物濃度は、理論最大収量を掛けることにより、ベースとなるグルコース濃度と関係づけることができる（グルコース１グラム当たりの産物グラムのＹｐｓ最大）。
【０１３５】
発酵産物の理論最大収量（グルコース１グラム当たりの産物グラムのＹｐｓ最大）は、生化学教科書から得ることができる。エタノールについては、酵母における正常な解糖発酵経路に従えば、１モルのグルコース（１８０グラム）から２モルのエタノール（＝２×４６＝９２グラムエタノール）が得られる。したがって、グルコースについてエタノールの理論最大収量は、９２／１８０＝０．５１１グラムのエタノール／１グラムのグルコースである。
【０１３６】
ブタノール（ＭＷ７４グラム／モル）またはイソブタノールについては、理論最大収量は１モルのグルコース当たり１モルのブタノールである。それ故、（イソ）ブタノールに対するＹｐｓ最大は、７４／１８０＝０．４１１グラムの（イソ）ブタノール／１グラムのグルコースである。
【０１３７】
乳酸については、ホモ乳酸発酵における発酵収量は、１モルのグルコース当たり２モルの乳酸（ＭＷ＝９０グラム／モル）である。この化学量論に従うと、Ｙｐｓ最大＝１グラムの乳酸／１グラムのグルコースである。
【０１３８】
他の発酵産物についても、同様の計算を行うことができる。
【０１３９】
［ＳＳＦ方式］
ＳＳＦ操作では、産物濃度は、２５ｇ＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ／Ｌ以上、３０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、３５ｇ＊Ｙｐｓ／Ｌ以上、４０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、４５＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、５０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、５５＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、６０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、６５＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、７０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、７５＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、８０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、８５＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、９０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、９５＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、１００＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、１１０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ以上、１２０ｇ／Ｌ＊Ｙｐｓ以上とするか、または、例えば２５＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ〜２５０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ、３０＊Ｙｐｓ  ｇｌ／Ｌ〜２００＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ、４０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ〜２００＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ、５０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ〜２００＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ、６０＊Ｙｐｓ  ｇ／ｌ〜２００＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ、７０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ〜２００＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ、８０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ〜２００＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ、９０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ、８０＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌ〜２００＊Ｙｐｓ  ｇ／Ｌとすることができる。
【０１４０】
したがって、本発明は、発酵産物を調製するための方法であって、
ａ．本明細書に記載の方法を使用して、リグノセルロースを分解するステップと、
ｂ．得られた原料を発酵させて、それによって発酵産物を調製するステップと
を含む方法を提供する。
【０１４１】
［発酵産物］
本発明の発酵産物は何らかの有用な産物になり得るものである。一実施形態では、それは、エタノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、イタコン酸、マレイン酸、クエン酸、アジピン酸、リジン、メチオニン、トリプトファン、スレオニンおよびアスパラギン酸などのアミノ酸、１，３−プロパンジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム抗生物質およびセファロスポリン、ビタミン、医薬品、動物用飼料サプリメント、特殊化学品、化学供給原料、プラスチック、溶媒、バイオ燃料およびバイオガスを含む燃料または有機ポリマー、ならびにプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼまたはキシラナーゼなどの工業用酵素からなる群から選択される産物である。例えば、発酵産物は、従来技術の細胞調製方法および発酵プロセスに従い、本発明による細胞により産生することができるが、これらの例は、本明細書では、限定するものと解釈されるべきでなく、ｎ−ブタノールは、国際公開第２００８１２１７０１号パンフレットまたは国際公開第２００８０８６１２４号パンフレットに記載の細胞により産生することができる；乳酸は、米国特許出願公開第２０１１０５３２３１号明細書または米国特許出願公開第２０１０１３７５５１明細書に記載のように；３−ヒドロキシ−プロピオン酸は、国際公開第２０１００１０２９１号パンフレットに記載のように；アクリル酸は、国際公開第２００９１５３０４７号パンフレットに記載のように、酢酸は、．．．に記載のように、コハク酸は、．．．に記載のように、グルコースを発酵させるフマラーゼ欠損変異体の細胞は細胞外フマル酸を蓄積した（＊＊＊さらに追加されることに留意されたい。
【０１４２】
［発酵産物の回収］
発酵産物の回収については、既存の技術が使用される。異なる発酵産物については、異なる回収プロセスが適切である。水性混合物からエタノールを回収する既存の方法は、一般に、分画および吸着の手法を使用する。例えば、ビール（ｂｅｅｒ）は依然として、水性混合物中にエタノールを含有する発酵産物を処理して、その後に分画（例えば、分別蒸留または他の同様な手法）に供される濃縮エタノール含有混合物を産生するために使用することができる。次に、最高濃度のエタノールを含有する分画を、吸着装置に通して、残留水をすべてではないにしても大部分エタノールから除去することができる。
【０１４３】
以下の実施例で本発明を説明する。
【０１４４】
［実施例］
別に指示がない限り、本明細書に記載の方法は、標準生化学手法である。好適な一般的方法論の教科書の例として、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９９５），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．が挙げられる。
【０１４５】
［培地組成］
増殖実験：サッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株を、以下の組成：０．６７％（ｗ／ｖ）の酵母窒素原基礎培地または合成培地（Ｖｅｒｄｕｙｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  ８：５０１−５１７，１９９２）および種々の濃度（特定の詳細に関しては実施例を参照のこと；濃度は容積に対する重量％（ｗ／ｖ））のグルコース、アラビノース、ガラクトースもしくはキシロースまたはこれらの基質の組合せを含有する培地上で増殖させる。寒天プレートを得るために、培地に２％（ｗ／ｖ）細菌用寒天を添加する。
【０１４６】
［エタノール産生］
１００ｍｌ振盪フラスコにおいて、２％グルコース添加Ｖｅｒｄｕｙｎ培地（Ｖｅｒｄｕｙｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  ８：５０１−５１７，１９９２）２５ｍｌに凍結保存培養物または寒天プレートからの単一コロニーを接種することにより前培養物を調製した。旋回シェーカー（２８０ｒｐｍ）で３０℃にて約２４時間インキュベートした後、この培養物を採取し、ＣＯ２放出の測定およびエタノール産生実験のために使用した。
【０１４７】
エタノール産生のための培養を、ＢＡＭ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍｏｎｉｔｏｒ，Ｈａｌｏｔｅｃ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）において、合成モデル培地（５％グルコース、５％キシロース、３．５％アラビノースおよび１％ガラクトースを含むＶｅｒｄｕｙｎ培地（Ｖｅｒｄｕｙｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  ８：５０１−５１７，１９９２））１００ｍｌ中で、３０℃にて実施した。滅菌前に、２Ｍ  ＮａＯＨ／Ｈ２Ｓ０４を用いて培地のｐＨを４．２に調整した。嫌気性培養用の合成培地には、エタノールに溶解した０．０１ｇｌ−１エルゴステロールおよび０．４２ｇｌ−１Ｔｗｅｅｎ８０を添加した（Ａｎｄｒｅａｓｅｎ  ａｎｄ  Ｓｔｉｅｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４１：２３−３６，１９５３；およびＡｎｄｒｅａｓｅｎ  ａｎｄ  Ｓｔｉｅｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４３：２７１−２８１，１９５４）。この培地に約２の開始ＯＤ６００で接種した。培養物をマグネティックスターラーにより撹拌した。培養物は通気されなかったので、発酵の間に急速に嫌気性条件が進展した。ＣＯ２産生を定常的にモニターした。糖変換および産物形成（エタノール、グリセロール）をＮＭＲにより分析した。ＬＫＢ  Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  Ｋ分光光度計を用いて６００ｎｍで培養物の光学濃度を追跡して増殖をモニターした。
【０１４８】
［Ｓ．セレビシア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の形質転換］
Ｇｉｅｔｚ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ（２００２；Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＬｉＡｃ／ＳＳ  ｃａｒｒｉｅｒ  ＤＮＡ  ＰＥＧ  ｍｅｔｈｏｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ３５０：８７−９６）に記載のように、Ｓ．セレビシア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の形質転換を行った。
【０１４９】
［コロニーＰＣＲ］
単一コロニー単離物をプラスチック性爪楊枝で採取し、ｍｉｌｌｉＱ水５０μｌの中に再懸濁した。この試料を９９℃で１０分間インキュベートした。供給業者が提供する説明書に従って、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を使用するＰＣＲ反応の鋳型として、インキュベートした試料の５μｌを使用した。
【０１５０】
ＰＣＲ反応条件：
ステップ１  ３’９８℃
ステップ２  １０”  ９８℃
ステップ３  １５”  ５８℃    ステップ２〜４を３０サイクル反復する
ステップ４  ３０”  ７２℃
ステップ５  ４’７２℃
ステップ６  ３０”  ２０℃
【０１５１】
［染色体ＤＮＡの単離］
２％グルコース含有ＹＥＰ培地にて回転シェーカーで酵母細胞を増殖させた（旋回シェーカーにて３０℃および２８０ｒｐｍで一晩）。これら培養物の１．５ｍｌを、エッペンドルフチューブに移し、最高速度で１分間遠心分離した。上清をデカントし、ペレットを、ＹＣＰＳ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  ｐＨ７．５中の０．１％ＳＢ３−１４（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）；１ｍＭ  ＥＤＴＡ）２００μｌおよびＲＮアーゼ（ウシ膵臓由来の２０ｍｇ／ｍｌ  ＲＮアーゼＡ、Ｓｉｇｍａ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）１μｌの中に再懸濁した。細胞懸濁液を６５℃で１０分間インキュベートした。この懸濁液をエッペンドルフ遠心分離機で７０００ｒｐｍにて１分間遠心分離した。上清をデカントした。ペレットを、ＣＬＳ（２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２％ＳＤＳ）２００μｌおよびＲＮアーゼＡ１μｌの中に注意深く溶解した。６５℃で１０分間インキュベートした後、懸濁液を氷冷した。ＰＰＳ（１０Ｍ酢酸アンモニウム）７０μｌを添加した後、溶液をボルテックスミキサー上で徹底的に混合した。遠心分離した後（エッペンドルフ遠心分離機で最高速度にて５分間）、上清を氷冷イソプロパノール２００μｌと混合した。ＤＮＡが即座に沈殿し、遠心分離（最高速度で５分間）によりペレットにした。このペレットを氷冷７０％エタノール４００μｌで洗浄した。室温でペレットを乾燥し、ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）５０μｌの中に溶解した。
【０１５２】
［エレクトロポレーションによる酵母細胞の形質転換］
２％グルコース含有ＹＥＰ培地２５ｍｌに単一酵母コロニーを接種することにより酵母細胞を培養した。フラスコを３０℃で一晩インキュベートした。
【０１５３】
６００ｎｍの光学濃度を測定し、光学濃度０．２を得るために必要な量を、２％グルコース含有ＹＥＰ培地１００ｍｌに移した。２〜３世代分に相当する光学濃度約１．２〜１．３に到達させるために、細胞を４〜５時間増殖させた。細胞を遠心分離により集め、ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣＩ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）２８ｍｌの中に再懸濁した。１Ｍ  ＬｉＡＣ溶液（濃ＨＡｃを用いてｐＨ７．５に調整）３ｍｌを添加した。細胞を、回転式インキュベータ（１５０ｒｐｍ、３０℃）の中で４５分間穏やかに振盪した。１Ｍ  ＤＴＴ（ジチオスレイトール）溶液５００μｌを添加した後、細胞をこれらの条件下で１５分間もう一度インキュベートした。滅菌氷冷ｍｉｌｌｉＱ水を用いて容積を１００ｍｌに合わせた。細胞を遠心分離により集めた。
【０１５４】
上清を捨て、ペレット化した細胞を滅菌氷冷ｍｉｌｌｉＱ水５０ｍｌで洗浄し、遠心分離により集めた。続く洗浄処理を、氷冷１Ｍソルビトール溶液３０ｍｌを用いて行った。遠心分離後、上清を捨て、細胞ペレットを氷冷１Ｍソルビトール溶液４ｍｌの中に再懸濁した。遠心分離後、上清を捨て、細胞ペレットを氷冷１Ｍソルビトール溶液３００μｌの中に再懸濁した。
【０１５５】
各形質転換のために、細胞懸濁液４０μｌを氷冷エッペンドルフチューブに移す。形質転換用ＤＮＡおよびサケ精子ＤＮＡ（担体ＤＮＡとして）５μｇを最大容積２０μｌで一緒に添加する。ＤＮＡはＴＥの中に溶解すべきである。内容物を穏やかに混合するためにエッペンドルフチューブを注意深くタッピングする。０．２ｃｍギャップを備えた、あらかじめ冷却した（氷上で）エレクトロポレーション用キュベットに内容物を移す。１．５ｋＶ、２００オームおよび２５μＦでパルス（例えばＢｉｏＲａｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｉｃｅを使用して）を印加する。パルス時間は約５ｍｓとすべきである。
【０１５６】
細胞を１Ｍソルビトール２００μｌに直ちに移す。ＹＥＰ  ２％グルコース４ｍｌを添加し、３０℃で１時間インキュベートする。遠心分離により細胞を集め、上清を捨て、１Ｍソルビトール４ｍｌの中にペレットを再懸濁する。遠心分離により細胞を集め、上清を捨て、１Ｍソルビトール３００μｌの中にペレットを再懸濁する。細胞を適度に希釈し、選択プレート上に塗布するかまたは選択培地の中で使用する。
【０１５７】
［実際の加水分解物への酵母適用試験］
希酸で前処理したコーンストーバーおよび麦わらの試料を、広範囲スペクトルの実験用セルラーゼ調製物を使用して６０℃で３日間（７２時間）酵素加水分解した。加水分解開始時のｐＨは５．０であった。加水分解開始時の乾燥物質含量は１０％ｗ／ｗであった。
【０１５８】
前処理コーンファイバー試料の加水分解条件は、加水分解温度が５０℃で、加水分解開始時の乾燥物質含量が１３．８％であることを除いて、基本的に同じであった。
【０１５９】
加水分解（７２時間）後に、試料を室温に冷却した。１０％ＮａＯＨを使用して、ｐＨを５．５に調節した。続いて、２００ｇ／ｌ（ＮＨ４）２Ｓ０４１ｍｌおよび１００ｇ／ｌ  ＫＨ２Ｐ０４１ｍｌを添加した。最終的に、加水分解物１ｋｇ当たりに、酵母１ｇの酵母乾燥物質含量に相当する酵母試料を添加した。時間の経過に伴うＣＯ２放出をＡＦＭ（Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒ；ＨａｌｏｔｅＣ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＢＶ，Ｖｅｅｎｅｎｄａａｌ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して追跡した。実験は少なくとも三つ組で３３℃にて７２時間実施した。三つ組の１つを一定間隔でサンプリングしてエタノール形成および残留糖濃度を分析する。これらのデータは、発酵収量を計算するために使用することができる。他の２つの実験ブロスはサンプリングしない。その代り、発酵の終了時に、Ｂｕｃｈｉ  Ｋ−３５５蒸留ユニットを使用して４５％蒸気で１５分間ブロスを蒸留する。産生されたアルコールは、Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ  ＤＭＡ  ５０００比重計（Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ  Ｂｅｎｅｌｕｘ  ＢＶＢＡ，Ｄｏｎｇｅｎ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して測定する。
【０１６０】
［定量的ＰＣＲ］
特にキシロースイソメラーゼ遺伝子の場合おいて、定量的ＰＣＲ反応を実施して、ゲノム中に存在する遺伝子のコピー数を決定した。この目的のために、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）製のＢｉｏ−Ｒａｄ  ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱシステムを使用した。ｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用した。供給者のマニュアルの推奨に従って、実験をセットアップした。キシロースイソメラーゼ遺伝子検出用のプライマーとして、配列番号２３および配列番号２４のプライマーを使用した。
【０１６１】
ＰＣＲ条件は以下の通りであった。
９５℃で３分間のインキュベーション
４０サイクル：９５℃で１０秒間
５８℃で４５秒間
７２℃で４５秒間
９５℃で１分間のインキュベーション
６５℃で１分間のインキュベーション
【０１６２】
融解曲線は、６５℃で１０秒間から蛍光測定を開始して決定する。９５℃に到達するまで、温度を１０秒ごとに０．５℃上昇させる。読み取りから、目的遺伝子のコピー数を計算および／または評価することができる。当業者が認識するように、この方法は、特定の閾値を上回るコピー数の正確な決定に関しては限界がある。
【０１６３】
［実施例１］
［ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１株の構築］
［１．１  アラビノース経路の遺伝子を含有する発現ベクターの構築］
図２に示すプラスミドｐＰＷＴ０１８は、以下のように構築した。ベクターｐＰＷＴ００６（図１、ＳＩＴ２遺伝子座（Ｇｏｔｔｌｉｎ−Ｎｉｎｆａ  ａｎｄ  Ｋａｂａｃｋ（１９８６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．６，ｎｏ．６，２１８５−２１９７）ならびに抗生物質Ｇ４１８上での形質転換体の選択およびアセトアミド上での増殖能力を可能にするマーカーからなる）を、制限酵素のＢｓｉＷＩおよびＭｌｕＩを用いて消化した。Ｇ４１８に対する抵抗性を付与するｋａｎＭＸマーカーはｐ４２７ＴＥＦ（Ｄｕａｌｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）から単離し、ａｍｄＳマーカーを含有する断片は、文献（Ｓｗｉｎｋｅｌｓ，Ｂ．Ｗ．，Ｎｏｏｒｄｅｒｍｅｅｒ，Ａ．Ｃ．Ｍ．ａｎｄ  Ｒｅｎｎｉｅｒｓ，Ａ．Ｃ．Ｈ．Ｍ（１９９５）Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｍｄＳ  ｃＤＮＡ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  ａｓ  ａ  ｄｏｍｉｎａｎｔ，ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｙｅａｓｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｙｅａｓｔ  Ｖｏｌｕｍｅ  １１，Ｉｓｓｕｅ  １９９５Ａ，ｐａｇｅ  Ｓ５７９；および米国特許第６０５１４３１号明細書）に記載されている。特許出願国際公開第２００８／０４１８４０号パンフレットに開示されている、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来のアラビノースイソメラーゼ（ａｒａＡ）、Ｌ−リブロキナーゼ（ａｒａＢ）およびＬ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼ（ａｒａＤ）をコードする遺伝子は、ＢａｓｅＣｌｅａｒ（Ｌｅｉｄｅｎ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）により合成した。Ｓ．セレビシア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の強力なプロモーター、すなわちａｒａＡ遺伝子の発現を制御するＴＤＨ３プロモーター、ａｒａＢ遺伝子を制御するＥＮＯ１プロモーター、およびａｒａＤ遺伝子を制御するＰＧｌ１プロモーターの制御下にある（またはそれに作動可能に連結された）上記３つのアラビノース遺伝子を包含する１つの大きな断片を合成した。この断片は特有の制限酵素であるＡｃｃ６５ＩおよびＭｌｕＩにより挟まれた。ＭｌｕＩおよびＢｓｉＷＩを用いて消化されたｐＰＷＴ００６の中にこの断片をクローニングして、プラスミドｐＰＷＴ０１８（図２）を得た。プラスミドｐＰＷＴ０１８の配列は配列番号１で示す。
【０１６４】
［１．２  酵母の形質転換］
ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ（ＭＡＴａ  ＵＲＡ３  ＨＩＳ３  ＬＥＵ２  ＴＲＰ１  ＭＡＬ２−８  ＳＵＣ２）を、供給業者の説明書に従い、ＳｆｉＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）であらかじめ直線化したプラスミドｐＰＷＴ０１８を用いて形質転換した。合成ＳｆｉＩ部位はＳＩＴ２遺伝子の５’−隣接部に設計した（図２を参照のこと）。Ｇ４１８（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を１ｍｌ当たり１００μｇ含有するＹＰＤ寒天（１リットル当たり：酵母抽出物１０ｇ、ペプトン２０ｇ／Ｌ、デキストロース２０ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ）上に形質転換混合物を播種した。２〜４日後に、コロニーがプレート上に出現したが、陰性対照（すなわち、形質転換実験においてＤＮＡを添加しない）では、ブランクのＹＰＤ／Ｇ４１８プレートが得られた。プラスミドｐＰＷＴ０１８の組込みはＳＩＴ２遺伝子座に向けられる。形質転換体はＰＣＲおよびサザンブロット法を使用して特徴づけた。
【０１６５】
プラスミドｐＰＷＴ０１８が１コピー正確に組み込まれたことを示すＰＣＲ反応を、配列番号２と配列番号３ならびに配列番号３と配列番号４で示されるプライマーを用いて実施した。配列番号２と配列番号３のプライマー対を用いて、ＳＩＴ２遺伝子座での正確な組込みをチェックした。プラスミドｐＰＷＴ０１８が多コピー組み込まれた場合は（ヘッドトゥーテール組込み）、配列番号３と配列番号４のプライマー対がＰＣＲ産物を与えることになる。後者のＰＣＲ産物がない場合は、ｐＰＷＴ０１８が１コピー組み込まれたことを示す。ＳＩＴ２遺伝子座にプラスミドｐＰＷＴ０１８が１コピー組み込まれた株を、ＢＩＥ１０４Ｒ２と名付けた。
【０１６６】
［１．３  マーカーレスキュー］
同じ選択マーカーを使用する他のコンストラクトを用いて酵母株を形質転換できるようにするためには、選択可能マーカーを除去する必要がある。プラスミドｐＰＷＴ０１８の設計は、染色体の中にｐＰＷＴ０１８が組み込まれる際に、相同配列が互い隣接するようにした。この設計により、選択可能マーカーがこれらの相同領域の自然の分子内組換えにより消失することが可能になる。
【０１６７】
栄養増殖に際して、低頻度であるが、分子内組換えが起こることになる。この組換えの頻度は、ゲノム中の相同性の長さおよび遺伝子座に依存する（未公表結果）。培養物の亜分画を新たな培地に逐次的に継代すると、分子内組換え体が時間の経過と共に蓄積することになる。
【０１６８】
この目的のために、ＢＩＥ１０４Ｒ２株を、単一コロニー単離物から開始して、ＹＰＤ培地（１リットル当たり：酵母抽出物１０ｇ、ペプトン２０ｇ／Ｌ、デキストロース２０ｇ／Ｌ）の中で培養した。一晩培養物２５μｌを使用して、新たなＹＰＤ培地に接種した。少なくとも５回のそのような連続継代の後に、培養物の光学濃度を測定して、１ｍｌ当たり約５０００個の濃度に細胞を希釈した。３０ｍＭ  ＫＰｉ（ｐＨ６．８）、０．１％（ＮＨ４）２Ｓ０４、４０ｍＭフルオロアセトアミド（Ａｍｅｒｓｈａｍ）および１．８％寒天（Ｄｉｆｃｏ）を含有する酵母カーボンベース培地（Ｄｉｆｃｏ）上に細胞懸濁液を１００μｌ播種した。ＢＩＥ１０４Ｒ２株の細胞と同一である、すなわち細胞内組換えがない細胞は、依然としてａｍｄＳ遺伝子を含有する。それらの細胞にとって、フルオロアセトアミドは有毒である。これらの細胞は、フルオロアセトアミドを含有する培地上で増殖することができず、コロニーを形成することはない。しかしながら、分子内組換えが起こった場合、選択可能マーカーを消失したＢＩＥ１０４Ｒ２変異体は、フルオロアセトアミドを増殖阻害化合物に変換することができないため、フルオロアセトアミド培地上で増殖できるようになる。それらの細胞はこの寒天培地上でコロニーを形成することになる。
【０１６９】
こうして得られたフルオロアセトアミド抵抗性コロニーを、配列番号２と配列番号３、ならびに配列番号４と配列番号５のプライマーを使用してＰＣＲ分析に供した。選択可能マーカーの組換えが意図したように起こった場合、配列番号２と配列番号３のプライマーによりバンドが得られることになる。結果として、強力な酵母プロモーターの制御下にあるａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ遺伝子を有するカセットが、宿主株ゲノムのＳＩＴ２遺伝子座の中に組み込まれている。その場合、プライマー４が組換えにより消失する領域でプライミングする以上、配列番号４と配列番号５のプライマーを使用するＰＣＲ反応からは、ＰＣＲ産物が得られるはずがない。後者のプライマーを用いてバンドが得られる場合は、ゲノム中に完全なプラスミドｐＰＷＴ０１８が存在することを示すため、組換えは起こっていない。
【０１７０】
配列番号２と配列番号３のプライマーによりＰＣＲ産物が得られない場合は、組換えは起こったが、完全なプラスミドｐＰＷＴ０１８のゲノム外への組換えである。選択可能マーカーだけでなく、アラビノース遺伝子も消失した。実際、野生酵母が回収されている。
【０１７１】
ｐＰＷＴ０１８の１コピー組込みと一致したＰＣＲ結果を示した単離物を、サザンブロット分析に供した。ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ株およびその正確な組換え体の染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化した（二重消化）。鋳型としてＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ株の染色体ＤＮＡを使用し、配列番号６と配列番号７のプライマーを用いて、ＳＩＴ２プローブを調製した。ハイブリダイゼーション実験の結果を図３に示す。
【０１７２】
野生株では、２．３５ｋｂのバンドが観察され、これは野生型遺伝子の予測サイズと一致する。プラスミドｐＰＷＴ０１８の組換えによる組込みおよび部分的な消失においては、１．０６ｋｂのバンドが予測された。実際、図３（レーン２）に示すように、このバンドが観察される。
【０１７３】
サザンブロット上のバンドが正確なパターン（図３から推定できるように）を示した株の１つは、ＢＩＥ１０４Ａ２と名付けられた株である。
【０１７４】
［１．４  非酸化的ペントースリン酸経路の４つの構成的に発現する遺伝子の導入］
ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ遺伝子を構成的に発現するサッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＩＥ１０４Ａ２を、プラスミドｐＰＷＴ０８０（図４）を用いて形質転換した。プラスミドｐＰＷＴ０８０の配列は配列番号８で示す。１コピー組込み形質転換体を選択した後の形質転換および選択のための手順は、セクション１．１、１．２および１．３に上記したものと同じである。手短に言えば、ＳｆｉＩ消化ｐＰＷＴ０８０を用いてＢＩＥ１０４Ａ２を形質転換した。Ｇ４１８（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を１ｍｌ当たり１００μｇ含有するＹＰＤ寒天（１リットル当たり：酵母抽出物１０ｇ、ペプトン２０ｇ／Ｌ、デキストロース２０ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ）上に形質転換混合物を播種した。
【０１７５】
２〜４日後に、コロニーがプレート上に出現したが、陰性対照（すなわち、形質転換実験においてＤＮＡを添加しない）では、ブランクのＹＰＤ／Ｇ４１８プレートが得られた。
【０１７６】
プラスミドｐＰＷＴ０８０の組込みはＧＲＥ３遺伝子座に向けられる。形質転換体はＰＣＲおよびサザンブロット法を使用して特徴づけた。ＧＲＥ３遺伝子座でのプラスミドｐＰＷＴ０８０の正確な組込みは、配列番号９と配列番号１０のプライマー対を使用するＰＣＲによりチェックし、配列番号９と配列番号１１のプライマー対を使用して、プラスミドｐＰＷＴ０８０の単一または多コピーの組込みを検出した。サザン解析については、配列番号１２と配列番号１３を使用して、Ｓ．セレビシア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＲＫＩ１遺伝子の一部を増幅するＰＣＲにより、プローブを調製した。天然ＲＫＩ１遺伝子の隣に、プラスミドｐＰＷＴ０８０の組込みに起因する余分なシグナルが得られた（データを示さず）。
【０１７７】
予測されるハイブリダイゼーションパターンと一致した、プラスミドｐＰＷＴ０８０の１コピーの正確な組込みを示す形質転換体をＢＩＥ１０４Ａ２Ｆ１と名付けた。プラスミドｐＰＷＴ０８０の組込みにより導入された選択マーカーを除去するために、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｆ１株を、コロニー単離物から開始してＹＰＤ培地の中で培養した。一晩培養物２５μｌを使用して、新たなＹＰＤ培地に接種した。５回の連続継代の後に、培養物の光学濃度を測定し、１ｍｌ当たり約５０００個の濃度に細胞を希釈した。３０ｍＭ  ＫＰｉ（ｐＨ６．８）、０．１％（ＮＨ４）２Ｓ０４、４０ｍＭフルオロアセトアミド（Ａｍｅｒｓｈａｍ）および１．８％寒天（Ｄｉｆｃｏ）を含有する酵母カーボンベース培地（Ｄｉｆｃｏ）上に細胞懸濁液を１００μｌ播種した。フルオロアセトアミド抵抗性コロニーは、配列番号９と配列番号１０のプライマーを使用するＰＣＲ分析に供した。正確なＰＣＲプロフィールの場合には、正確な組込みを確認するために、再びＲＫＩ１遺伝子のプローブを使用してサザンブロット分析を実施した。サザンブロット上のバンドが正確なパターンを示した株の１つは、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１と名付けた株である。
【０１７８】
［実施例２］
［ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃおよびＢＩＥ２０１をもたらす振盪フラスコ中の適応進化。］
［２．１  適応進化（好気的に）］
ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１株の単一コロニー単離物を使用して、２％ガラクトースを添加したＹＮＢ培地（Ｄｉｆｃｏ）に接種した。前培養物を、旋回シェーカーにて３０℃および２８０ｒｐｍで約２４時間インキュベートした。細胞を採取し、１％ガラクトースおよび１％アラビノースを含有するＹＮＢ培地の中に、０．２の開始ＯＤ６００で接種した（図５）。旋回シェーカーにて３０℃および２８０ｒｐｍで細胞を増殖させた。６００ｎｍの光学濃度を一定間隔でモニターした。
【０１７９】
光学濃度が５の値に到達したときに、培養物のアリコートを、同じ培地を含有する新たなＹＮＢ培地に移した。加えた細胞量は、培養物の開始ＯＤ６００が０．２になるようにした。ＯＤ６００が再び５に到達した後、培養物のアリコートを、唯一の炭素源として２％アラビノースを含有するＹＮＢ培地に移した（図５で（１）により示される事象）。
【０１８０】
２％アラビノースを唯一の炭素源として含むＹＮＢに移すと、約２週間後に増殖を観察することができた。６００ｎｍの光学濃度が少なくとも１の値に到達したときに、２％アラビノースを添加した新たなＹＮＢ培地を含む振盪フラスコに、０．２の開始ＯＤ６００で細胞を移した（図５、２８日目）。
【０１８１】
図５に示すように、逐次的継代を３回繰り返した。アラビノース上で迅速に増殖できる得られた株をＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃと名付けた。
【０１８２】
［２．２  適応進化（嫌気的に）］
好気性条件下におけるアラビノース上での増殖に適応した後に、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｃ株からの単一コロニーを、２％グルコース添加ＹＮＢ培地の中に接種した。前培養物を、旋回シェーカーにて３０℃および２８０ｒｐｍで約２４時間インキュベートした。細胞を採取し、２％アラビノース含有ＹＮＢ培地の中に、０．２の開始光学濃度ＯＤ６００で接種した。フラスコをウォーターロックで密閉して、酸素が培地およびヘッドスペースから完全に消失した後の嫌気性増殖条件を保証した。ＯＤ６００が３以上に到達した後に、培養物のアリコートを、開始ＯＤ６００値が毎回０．２になるように、２％アラビノースを含有する新たなＹＮＢ培地に移した（図６）。数回移した後に得られた株をＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１ｄ（＝ＢＩＥ２０１）と名付けた。
【０１８３】
［実施例３］
［ＢＩＥ２０１Ｘ９株の構築］
［３．１  ＢＩＥ２０１株の形質転換］
ＢＩＥ２０１株をプラスミドｐＰＷＴ０４２を用いて形質転換した。プラスミドｐＰＷＴ０４２の物理的地図を図７に示す。プラスミドｐＰＷＴ０４２（配列番号１４）は、バクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）に由来する、ＴＤＨ１プロモーター制御下のコドン対最適化ｘｙｌＡ遺伝子、およびＳ．セレビシア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来する、ＴＰＩ１プロモーター制御下のＸＫＳ１遺伝子を含有する４６３０ｂｐの挿入断片を含有する。ＢＩＥ２０１の形質転換の前に、供給業者が提供する説明書に従い、制限酵素Ｓｆｉｌを使用してｐＰＷＴ０４２を直線化した。Ｇ４１８（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を１ｍｌ当たり１００μｇ含有するＹＰＤ寒天（１リットル当たり：酵母抽出物１０ｇ、ペプトン２０ｇ／Ｌ、デキストロース２０ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ）上に形質転換混合物を播種した。
【０１８４】
２〜４日後に、コロニーがプレート上に出現したが、陰性対照（すなわち、形質転換実験においてＤＮＡを添加しない）では、ブランクのＹＰＤ／Ｇ４１８プレートが得られた。
【０１８５】
Ｓｆｉｌを用いてプラスミドｐＰＷＴ０４２を消化すると、その組込みはゲノム中のＳＩＴ４遺伝子座（Ｇｏｔｔｌｉｎ−Ｎｉｎｆａ  ａｎｄ  Ｋａｂａｃｋ（１９８６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．６，２１８５−２１９７）に向けられる。形質転換体はＰＣＲおよびサザンブロット法を使用して特徴づけた。プラスミドｐＰＷＴ０４２が１コピー正確に組み込まれたことを示す、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を使用するＰＣＲ反応を、配列番号１５と１６（ＳＩＴ４遺伝子座でのｐＰＷＴ０４２の正確な組込み）ならびに配列番号１６と１７（多コピー組込みの場合のみバンドが出現する）で示されるプライマーを用いて実施した。ゲノムに組み込まれたプラスミドｐＰＷＴ０４２を１コピー有する株は、ＢＩＥ２０１Ｙ９と名付けた。
【０１８６】
［３．２  マーカーレスキュー］
プラスミドｐＰＷＴ０４２の組込みにより導入された選択マーカーを除去するために、以下の手順を実施した。プラスミドｐＰＷＴ０４２の設計は、染色体の中にｐＰＷＴ０４２が組み込まれる際に、相同配列が互い隣接するようにした。この設計により、選択可能マーカーがこれらの相同領域の自然の分子内組換えにより消失することが可能になる。栄養増殖に際して、低頻度であるが、分子内組換えが起こることになる。この組換えの頻度は、ゲノム中の相同性の長さおよび遺伝子座に依存する（未公表結果）。培養物の亜分画を新たな培地に逐次的に継代すると、分子内組換え体が時間の経過と共に蓄積することになる。
【０１８７】
この目的のために、ＢＩＥ２０１Ｙ９株を、単一コロニー単離物から開始して、ＹＰＤ−２％グルコースの中で培養した。一晩培養物２５μｌを使用して、新たなＹＰＤ−２％グルコース培地に接種した。５回の連続継代の後に、培養物の光学濃度を測定し、１ｍｌ当たり約５０００個の濃度に細胞を希釈した。３０ｍＭ  ＫＰｉ（ｐＨ６．８）、０．１％（ＮＨ４）２Ｓ０４、４０ｍＭフルオロアセトアミド（Ａｍｅｒｓｈａｍ）および１．８％寒天（Ｄｉｆｃｏ）を含有する酵母カーボンベース培地（Ｄｉｆｃｏ）上に細胞懸濁液を１００μｌ播種した。ＢＩＥ２０１Ｙ９株の細胞と同一である、すなわち細胞内組換えがない細胞は、依然としてａｍｄＳ遺伝子を含有している。それらの細胞にとって、フルオロアセトアミドは有毒である。これらの細胞は、フルオロアセトアミドを含有する培地上で増殖することができず、コロニーを形成することはない。しかしながら、分子内組換えが起こった場合、選択可能マーカーを消失したＢＩＥ２０１Ｙ９変異体は、フルオロアセトアミドを増殖阻害化合物に変換することができないため、フルオロアセトアミド培地上で増殖できるようになる。それらの細胞はこの寒天培地上でコロニーを形成することになる。
【０１８８】
こうして得られたフルオロアセトアミド抵抗性コロニーを、配列番号１５と配列番号１６、ならびに配列番号１７と配列番号１８のプライマーを使用してＰＣＲ分析に供した。選択可能マーカーの組換えが意図したように起こった場合、配列番号１５と配列番号１６のプライマーによりバンドが得られることになる。結果として、ｘｙｌＡおよびＸＫＳ１遺伝子がＳＩＴ４遺伝子座に組み込まれている。その場合、プライマー１７が組換えにより消失する領域にプライミングする以上、配列番号１７と配列番号１８のプライマーを使用するＰＣＲ反応からは、ＰＣＲ産物が得られるはずがない。これらのプライマーを用いてバンドが得られる場合は、ゲノム中に完全なプラスミドｐＰＷＴ０４２が存在することを示すため、組換えは起こっていない。
【０１８９】
配列番号１５と配列番号１６のプライマーによりＰＣＲ産物が得られない場合は、組換えは起こったが、完全なプラスミドｐＰＷＴ０４２のゲノム外への組換えである。選択可能マーカーだけでなく、ｘｙｌＡ遺伝子およびＸＫＳ１遺伝子も消失した。実際、野生酵母が回収されている。
【０１９０】
予測されるＰＣＲ結果を示した単離物は、サザンブロット分析に供した（上記参照）。サザンブロット上のバンドが正確なパターンを示した株の１つは、ＢＩＥ２０１Ｘ９と名付けた株である。
【０１９１】
［実施例４］
［ＢＩＥ２５２株の構築および選択］
［４．１  ｘｙｌＡカセットの増幅］
ゲノムの中にｘｙｌＡ遺伝子の余剰コピーを導入するために、プラスミドｐＰＷＴ０４２を鋳型として、また配列番号１９と配列番号２０のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を使用してＰＣＲ反応を実施した。これらのプライマーを用いて、ＴＰＩ１プロモーター、コドン対最適化ｘｙｌＡ遺伝子およびＰＭＡ１ターミネーターを含むｘｙｌＡカセットを増幅する。プライマー設計は、ＰＣＲ断片の隣接部が酵母トランスポゾンＴｙ−１のデルタ配列のコンセンサス配列に相同になるようにする。これらの配列をＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から入手し、例えばＣｌｏｎｅ  Ｍａｎａｇｅｒ  ９  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＆  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｃａｒｙ，ＵＳＡ）のような、アライメントを可能にするソフトウェア・パッケージを使用して、アライメントすることができる。
【０１９２】
ｘｙｌＡカセットは、ゲノムへの組込みに対して選択することができる選択可能マーカーを含有しない。形質転換率を評価するために、ｋａｎＭＸ−マーカーを用いる第２の対照形質転換を行った。この目的のために、プラスミドｐ４２７ＴＥＦ（Ｄｕａｌｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）由来のｋａｎＭＸカセットを、配列番号２１と配列番号２２に対応するプライマーを使用するＰＣＲ反応で増幅した。
【０１９３】
［４．２  ＢＩＥ２０１Ｘ９の形質転換］
ＢＩＥ２０１Ｘ９を、ｘｙｌＡカセット（Ｘ１８−Ｔｙ１と命名）３０μｇまたはｋａｎＭＸカセット１０μｇのいずれかを含む断片を用い、（上記の）エレクトロポレーションプロトコールに従って形質転換した。Ｇ４１８（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を１ｍｌ当たり１００μｇ含有するＹＰＤ寒天（１リットル当たり：酵母抽出物１０ｇ、ペプトン２０ｇ／Ｌ、デキストロース２０ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ）上にｋａｎＭＸ形質転換混合物を播種した。２〜４日後に、コロニーがプレート上に出現したが、陰性対照（すなわち、形質転換実験においてＤＮＡを添加しない）では、ブランクのＹＰＤ／Ｇ４１８プレートが得られた。形質転換率は、ｋａｎＭＸカセット１μｇ当たり６００個を超えるコロニーであると思われた。
【０１９４】
Ｘ１８−Ｔｙ１形質転換混合物を使用して、２％キシロース添加Ｖｅｒｄｕｙｎ培地１００ｍｌを含有する振盪フラスコに接種した。対照として、形質転換の陰性対照（すなわち、形質転換実験においてＤＮＡを添加しない）を使用した。旋回シェーカーにて３０℃および２８０ｒｐｍで振盪フラスコをインキュベートした。６００ｎｍの光学濃度を定期的に測定することにより、増殖を追跡した。
【０１９５】
増殖曲線の結果を図８に示す。観察されるように、２０日目と２５日目の間で、Ｘ１８−Ｔｙ１振盪フラスコの光学濃度は劇的に増加したが、陰性対照の増殖は依然としてなかった。２５日目に、２％キシロースを添加した新たなＶｅｒｄｕｙｎ培地を含有するフラスコに、０．１５の開始光学濃度（６００ｎｍ）でＸ１８−Ｔｙ１培養物を接種した。再接種すると、培養物がキシロース上で直ちにかつ急速に増殖し始めたことが図８から明らかである。培養物が亜培養物の混合物からなる、したがって、Ｘ１８−Ｔｙ１カセットのコピー数およびキシロース上の増殖速度において差がある細胞からなると思われるため、細胞をｍｉｌｌｉＱ水の中に希釈し、単一コロニー単離物を得るためにＹＰＤ寒天プレート上に播種した。単一コロニー単離物を、異なる炭素源を利用する能力に関して試験した。
【０１９６】
［４．３  ＢＩＥ２５２株の選択］
他の重要な糖（グルコース、アラビノースおよびガラクトース）を利用する能力を失うことなく、キシロースを唯一の炭素源とする増殖が改善された株を選択するために、適応進化培養物の単一コロニー単離物１０個を、ＹＰＤ寒天上に再塗布した。続いて、２％グルコース添加ＹＰＤ培地上で前培養した。１０個の培養物を３０℃および２８０℃で一晩インキュベートした。各培養物のアリコートを使用して、２％グルコースまたは２％キシロースまたは２％アラビノースまたは２％ガラクトースのいずれかを添加した新たなＶｅｒｄｕｙｎ培地に、０．１５の開始光学濃度で接種した。対照として、ＢＩＥ２０１株、ＢＩＥ２０１Ｘ９株および混合集団（そこから１０個の単一コロニー単離物が回収された）が実験に含まれた。旋回シェーカーにて３０℃および２８０ｒｐｍで細胞を増殖させた。増殖は６００ｎｍの光学濃度測定に基づいて評価した。１９時間インキュベーション後の６００ｎｍにおける光学濃度の結果を図９に示す。
【０１９７】
図９の結果より、混合培養物および１０個の単一コロニー単離物はいずれも、キシロース上で高い最終光学濃度（６００ｎｍ）を示す。これらの株は、唯一の炭素源としてのアラビノース上で増殖したが、接種１９時間後の６００ｎｍにおける最終光学濃度は、親株、ＢＩＥ２０１株およびＢＩＥ２０１Ｘ９株と比較して低かった。増殖を数日間延長した後、他の単一コロニー単離培養物と比較して、コロニー３が最も高い光学濃度に到達したので（データを示さず）、コロニー３を選択した。試験したすべてのコロニーにおいて、キシロース上の増殖は変わらなかった。
【０１９８】
コロニー３の培養物を希釈し、ＹＰＤ寒天上に播種した。２％アラビノースまたは２％キシロースのいずれかを添加したＶｅｒｄｕｙｎ培地上で増殖する能力について、１１個の単一コロニー単離物を試験した。この目的のために、Ｖｅｒｄｕｙｎ  ２％グルコース上で前培養を行った。旋回シェーカーにて３０℃および２８０ｒｐｍで一晩細胞を増殖させた。アリコートを、２％アラビノースまたは２％キシロースのいずれかを添加したＶｅｒｄｕｙｎ培地に、０．１５の開始光学濃度で移した。コロニー３の培養物をこの試験の対照として含ませた。旋回シェーカーにて３０℃および２８０ｒｐｍで一晩細胞を増殖させた。増殖は６００ｎｍの光学濃度測定に基づいて評価した。４日間インキュベーション後の６００ｎｍにおける光学濃度の結果を図１０に示す。
【０１９９】
この結果から、キシロース上で、コロニー３．７が対照であるコロニー３の培養物と同様な光学濃度に到達したことがわかる。さらに、コロニー３．７が唯一の炭素源としてのアラビノース上で増殖する能力は、コロニー３の培養物と比較して大幅に改善していた。他の単一コロニー単離物も、キシロース上で増殖する能力を明らかに犠牲にして、アラビノース上での増殖が改善されたことを示す。単一コロニー単離物３．７の培養物をＢＩＥ２５２株と名付けた。ＢＩＥ２５２におけるＳＮＰおよび増幅は、欧州特許第１０１６０６４７．３号明細書からの優先権を主張する、２０１１年４月１９日に出願された同時係属中のＰＣＴ出願に記載のものと同じ手順に従って判定した。これらの試験から、ＢＩＥ２５２が以下のＳＮＰ：ＳＳＹ１遺伝子中のＧ１３６３Ｔ、ＹＪＲ１５４ｗ遺伝子中のＡ５１２Ｔ、ＣＥＰ３遺伝子中のＡ１１８６ＧおよびＧＡＬ８０遺伝子中のＡ４３６Ｃを有することがわかった。これらはＢＩＥ２０１と同じである。さらに、ＢＩＥ２０１に存在する染色体ＶＩＩ中の増幅は、ＢＩＥ２５２にも存在する。これを図２３に示す。
【０２００】
［実施例５］
［ＢＡＭにおける性能試験］
選択されたＢＩＥ２５２株の性能を試験するために、２％グルコース添加Ｖｅｒｄｕｙｎ培地の中にこの株を接種した。対照として、ＢＩＥ２０１株およびＢＩＥ１０４Ｐ１Ｙ９ｍｃ株を含めた。前者はグルコース、ガラクトースおよびアラビノースを発酵させることができる株（上記参照）であり、後者はグルコース、ガラクトースおよびキシロースを発酵させることができる株である。
【０２０１】
回転シェーカーにて３０℃および２８０ｒｐｍで一晩インキュベートした後、細胞を遠心分離により収集し、ＣＯ２産生のための培養を、ＢＡＭ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍｏｎｉｔｏｒ）において、５％グルコース、５％キシロース、３．５％アラビノースおよび１％ガラクトースを添加したＶｅｒｄｕｙｎ培地１００ｍｌの中で３３℃にて実施した。バッチ実験である一実験では、糖を添加したＶｅｒｄｕｙｎ培地１００ｍｌに細胞を加えた。フェドバッチ実験である第２の実験では、糖を添加したＶｅｒｄｕｙｎ培地１００ｍｌを、毎分３ｍｌの速度で細胞に加えた。ＣＯ２産生を一定間隔でモニターし、分析（６００ｎｍの光学濃度、エタノール、残留糖）のために試料を採取した。ＢＡＭ実験の直前に、ＢＩＥ２０１株およびＢＩＥ１０４Ｐ１Ｙ９ｍｃ株を光学濃度に基づいて１：１の比で混合した。
【０２０２】
ＢＡＭ実験の結果を、図１１、１２、１３、１４、１５および１６に示す。
【０２０３】
フェドバッチ方式における混合株（ＢＩＥ２０１およびＢＩＥ１０４Ｐ１Ｙ９ｍｃ）の性能から（図１１）、キシロースおよびアラビノースが時間の経過と共にある程度まで蓄積するにもかかわらず、流加の終了（約３３時間）前にすでに、消費速度が流加速度より速くなっていることがわかる。７２時間後には、アラビノースはすべて変換されたが、キシロースの消費は完全ではない。グルコースおよびガラクトースは常に検出レベルまたはその近辺にあり、これらの糖がペントースであるアラビノースおよびキシロースよりも好まれることが示される。
【０２０４】
ＢＡＭにおいてフェドバッチ方式で試験された場合（図１２を参照）、ＢＩＥ２５２株の性能は、混合株培養物と基本的に同じ特性を示す。しかしながら、キシロースおよびアラビノースはより高い濃度まで蓄積するが、その後のエタノールへの変換は、より高い速度で起こり、それにより、１２０時間後には同じエタノールタイターおよび同じＣＯ２産生の累積がもたらされる（図１３）。
【０２０５】
バッチ方式では、バッチ方式における混合株（ＢＩＥ２０１とＢＩＥ１０４Ｐ１Ｙ９ｍｃ）の性能により、発酵実験の開始後にグルコースが即座に消費されることがわかる（図１４）。続いて、ガラクトース、アラビノースおよびキシロースが共発酵される。約３０時間後、ガラクトースは消費された。約７２時間後、アラビノースも完全に消費された。両方とも、ＣＯ２およびエタノールの形成に顕著に寄与した。アラビノースの完全消費後に、キシロース消費、したがってエタノールおよびＣＯ２の産生が顕著に減速した。その点で、ＢＩＥ２５２株の性能は優れていた（図１５）。１０時間以内にグルコースが完全消費された直後に、ガラクトース、アラビノースおよびキシロースが、迅速かつ効率的に共発酵された。ガラクトース完全消費の後でも、ペントースであるアラビノースおよびキシロースは両方とも、完全に共発酵され、ＣＯ２産生およびエタノール形成に寄与した。ＢＩＥ２５２株の場合には、すべての糖の発酵が約７２時間後に完了した。図１６に示すように、これにより、混合株培養物（ＢＩＥ２０１とＢＩＥ１０４Ｐ１Ｙ９ｍｃ）と比較して、ＢＩＥ２５２株の高いＣＯ２産生の累積がもたらされた。
【０２０６】
［実施例６］
［実際の加水分解物における性能試験］
実際の加水分解物における性能試験は、２％グルコース添加ＹＥＰ培地を含有する振盪フラスコの中で一晩培養されたＢＩＥ２５２株を使用して実施した。遠心分離により細胞を収集し、１リットル当たり５０グラムの乾燥物質濃度で再懸濁した。
【０２０７】
試験した供給原料は、コーンファイバー、コーンストーバーおよび麦わらのバッチからなっていた。材料および方法のセクションに記載のように、加水分解および発酵を実施した。
【０２０８】
結果を、図１７（コーンファイバー）、１８（コーンストーバー）および１９（麦わら）に示す。比較的低量のガラクトースおよびアラビノースを含むが、主としてグルコースおよびキシロースからなる供給原料であるコーンストーバーおよび麦わらの場合には、すべての糖が７２時間でＣＯ２およびエタノールに変換された。コーンファイバー（図１７）の場合には、アラビノース、ガラクトースおよびキシロースが低量残留する。
【０２０９】
下記の表では、加水分解の終了時に放出されていた糖および発酵の終了時に産生されていたエタノール量に基づいて、発酵収量を計算した。
【０２１０】
【表２】
2013524796.tif 000004
【０２１１】
Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ  ＤＭＡ５０００比重計測定により決定される発酵終了時のエタノール産生量および使用した前処理供給原料の量に基づいて、加水分解および発酵の全体収量を二つ組で計算した。これらの数値を表３に示す。
【０２１２】
【表３】
2013524796.tif 000005
【０２１３】
［実施例７］
［ＢＩＥ２５２株の安定度試験］
［７．１  ＢＩＥ２５２株の安定性］
ＢＩＥ２５２株の安定性を試験するために、単一コロニー単離物を使用して、ＹＥＰ  ２％グルコース２５ｍｌに接種した。培養物の光学濃度を６００ｎｍで測定した。培養物を、回転シェーカーにて３０℃および２８０ｒｐｍで一晩インキュベートした。
【０２１４】
一晩インキュベートした後、光学濃度を測定した。インキュベーション前後のＯＤ６００値に基づいて、インキュベーションの間の世代数を計算した。一晩培養物２５μｌを使用して、新たな培地２５ｍｌを含有するフラスコに接種した。上記と同じ条件下で、培養物を再度インキュベートした。細胞が最初の単一コロニー単離物から少なくとも１００世代離れた培養物が得られるまで、この手順を繰り返した。アラビノースおよびキシロースの変換に必要となる、ＢＩＥ２５２株の導入遺伝子を維持するために、これらの条件下では選択圧が加えられないので、２％グルコース添加ＹＥＰ培地を選択した。
【０２１５】
少なくとも１００世代後に得られた細胞培養物を希釈し、ＹＰＤ寒天上に播種した。２個の単一コロニー単離物をＶｅｒｄｕｙｎ培地２％グルコースの中に接種した。対照として、親株ＢＩＥ２５２を一緒に採用した。培養物を、回転シェーカーにて３０℃および２８０ｒｐｍで一晩インキュベートした。一晩培養物のアリコートを使用して、１％グルコース、１％キシロース、０．７％アラビノース、０．３％ガラクトースおよび０．１％マンノースを添加したＶｅｒｄｕｙｎ培地２５ｍｌを含有するフラスコに、０．１５の開始光学濃度で接種した。一定間隔で、分析のために、すなわち６００ｎｍの光学濃度測定およびＮＭＲによる残留糖の測定のために試料を採取した。図２０ａ（安定度試験前のＢＩＥ２５２培養物）、２０ｂ（１００世代を超えるＢＩＥ２５２のコロニーからの培養物）および２０ｃ（１００世代を超えるＢＩＥ２５２の第２コロニーからの培養物）で示すように、これらの結果から３つの株培養物の挙動は、試験条件下で実質上同一であることがわかる。言いかえれば、この増殖培地における性能は変化しなかった。１００世代を超える培養の後に、この株は依然として同じ速度で５種の異なる糖を利用することができ、この株が遺伝学的に安定であることが示される。
【０２１６】
さらに、２％グルコース添加ＹＥＰ培地における１００世代培養前後のＢＩＥ２５２のコピー数を評価するために、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）実験を行った。Ｑ−ＰＣＲ分析は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）製のＢｉｏ−Ｒａｄ  ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱシステムを用いて実施した。ｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用した。供給者のマニュアルの推奨に従って、実験をセットアップした。
【０２１７】
ＢＩＥ２５２株の安定性は、キシロースイソメラーゼをコードするｘｙｌＡ遺伝子のコピー数を決定することにより評価した。参照単一コピー遺伝子として、ＡＣＴ１遺伝子を選んだ。
ｘｙｌＡ遺伝子およびＡＣＴ１遺伝子の検出用プライマーは以下のとおりである。
順方向プライマー  ｘｙｌＡ  配列番号２３
逆方向プライマー  ｘｙｌＡ  配列番号２４
順方向プライマー  ＡＣＴ１  配列番号２５
逆方向プライマー  ＡＣＴ１  配列番号２６
【０２１８】
結果は、ＢＩＥ２５２のコピー数は、ＡＣＴ１遺伝子に対して、ｘｙｌＡ遺伝子が約８コピーであることを示した。コピー数は、２％グルコース添加ＹＥＰ培地上での１００世代培養の前後で決定され、定量的ＰＣＲ分析の限界を考慮すると、基本的に同じであると思われた。
【０２１９】
２％グルコース添加ＹＥＰ培地における１００世代培養の前後で、いくつかのコロニーの染色体ＤＮＡを単離した。染色体ＤＮＡをＸｂａｌにより切断する。サザンブロット分析を、プライマー対配列番号２３と配列番号２４のＰＣＲ産物をプローブとして使用して実施する。得られたオートラジオグラムは、バンドのパターンに変化がないことを示しており、この株が非選択的条件下の１００世代増殖の後に、遺伝学的に安定であることが示される。
【０２２０】
［比較実験Ａ］
［７．２  ＹＥｐおよびＹＣｐのベクターを用いて形質転換したＢＩＥ２０１Ｘ９の安定性］
ＢＩＥ２０１Ｘ９株を、ベクターｐＰＷＴ１４８（ＹＣｐプラスミド）およびｐＰＷＴ１５２（ＹＥｐプラスミド）を用いて形質転換した。プラスミドｐＰＷＴ１４８の物理的地図を図２１に示す。プラスミドｐＰＷＴ１５２の物理的地図を図２２に示す。Ｇ４１８（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を１ｍｌ当たり１００μｇ含有するＹＰＤ寒天（１リットル当たり：酵母抽出物１０ｇ、ペプトン２０ｇ／Ｌ、デキストロース２０ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ）上に形質転換混合物を播種した。２〜４日後に、コロニーがプレート上に出現したが、陰性対照（すなわち、形質転換実験においてＤＮＡを添加しない）では、ブランクのＹＰＤ／Ｇ４１８プレートが得られた。
【０２２１】
各形質転換の３つのコロニーを、安定性試験のために混合物として使用した。この目的のために、混合コロニーを使用して、２％グルコースおよび１００μｇ  Ｇ４１８／ｍｌを添加したＹＥＰ培地に接種した。細胞を、回転シェーカーにて３０℃および２８０ｒｐｍで一晩インキュベートした。光学濃度を６００ｎｍで測定した。一晩培養物を使用して、２％グルコースを添加した新たなＹＥＰ培地および１００μｇ  Ｇ４１８／ｍｌを添加した同培地に、６００ｎｍで０．０２の開始光学濃度になるように接種した。文献（上記参照）の報告に基づくと、Ｇ４１８の存在下（すなわち、選択圧が加えられる）で培養された細胞は、その大多数が、細胞内部にプラスミドを保持することになると予測される。しかしながら、Ｇ４１８の非存在下では、細胞はそのプラスミドを急速に消失すると予測される。
【０２２２】
培養物を、回転シェーカーにて３０℃および２８０ｒｐｍで一晩インキュベートした。光学濃度を６００ｎｍで測定した。光学濃度測定に基づいて、培養物は、両方の培地（すなわち、Ｇ４１８存在および非存在）において８世代を経たと計算された。希釈をして、１００μｇ  Ｇ４１８／ｍｌ含有および非含有ＹＰＤプレート上に播種した。コロニーを視覚できかつカウントできるのに必要なように、プレートを３０℃で約２日間以上インキュベートした。
【０２２３】
さらに、一晩培養物２５μｌを使用して、２％グルコースを添加した新たなＹＥＰ培地２５ｍｌおよび１００μｇ  Ｇ４１８／ｍｌを添加した同培地２５ｍｌに接種した。培養物を、回転シェーカーにて３０℃および２８０ｒｐｍで一晩インキュベートした。光学濃度を６００ｎｍで測定した。光学濃度測定に基づいて、培養物は、両方の培地（すなわち、Ｇ４１８存在および非存在）において、さらに８世代を経たと計算された。希釈をして、１００μｇ  Ｇ４１８／ｍｌ含有および非含有ＹＰＤプレート上に播種した。コロニーを視覚できかつカウントできるのに必要なように、プレートを３０℃で約２日間以上インキュベートした。
【０２２４】
Ｇ４１８含有および非含有ＹＤＰ寒天上でカウントされたコロニーに基づいて、Ｇ４１８の存在下また非存在下での８世代および１６世代後の安定性を計算することができた。結果を表４に要約する。
【０２２５】
【表４】
2013524796.tif 000006
【０２２６】
この場合では、培地へのＧ４１８の添加による選択圧が培養期間中加えられていても、ＹＣｐプラスミドおよびＹＥｐプラスミド（すなわち、それぞれｐＰＷＴ１４８およびｐＰＷＴ１５２）は両方とも、形質転換酵母細胞の中で安定に維持されないことが表から理解することができる。しかしながら、プラスミド消失は選択圧がない状態ではるかに激しいことに留意しなければならない。
【０２２７】
この実験と実施例７とを併せると、キシロースイソメラーゼ遺伝子のゲノムへの染色体組込みが安定な酵母形質転換体を得るのに必要であるという洞察が得られる。
【０２２８】
［実施例８］
［ＧＡＬ８０の欠失はより良好なアラビノース変換をもたらす］
実施例４では、染色体ＶＩＩの一部も増幅している場合に、ＧＡＬ８０遺伝子に同定されたＳＮＰが、アラビノース上の増殖に対して正の相加効果を有するが示された。
【０２２９】
ＧＡＬ８０は、ガラクトースに応答して転写調節に関与する転写リプレッサーをコードする（Ｔｉｍｓｏｎ  ＤＪ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３６３（Ｐｔ  ３）：５１５−２０）。プロモーター中にＧＡＬ上流活性化部位（ＵＡＳ−ＧＡＬ）を含有する遺伝子の発現を、Ｇａｌ４ｐおよびＧａｌ３ｐと一緒に、Ｇａｌ８０ｐは協調的に調節する。これらの遺伝子にはＧＡＬ代謝遺伝子であるＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＧＡＬ２およびＧＡＬ７が含まれる（Ｌｏｈｒ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ９（９）：７７７−８７に総説がある）。ｇａｌ８０がない細胞は、非誘導培地においても、ＧＡＬ遺伝子を構成的に発現する（Ｔｏｒｃｈｉａ  ＴＥ，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ４（８）：１５２１−７）。
【０２３０】
ＧＡＬ８０遺伝子に同定されたＳＮＰは、Ｇａｌ８０ｐ、Ｇａｌ３ｐおよびＧａｌ４ｐの間の相互作用に影響を及ぼすという仮説がある。したがって、ガラクトースパーミアーゼをコードするＧＡＬ２を含むガラクトース代謝遺伝子の発現もまた、野生型ＧＡＬ８０対立遺伝子を有する酵母細胞と比較して、変化することになる。Ｇａｌ２ｐ（ガラクトースパーミアーゼ）はアラビノースのための主要な糖トランスポーターである（Ｋｏｕ  ｅｔ  ａｌ（１９７０）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１０３（３）：６７１−６７８；Ｂｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｌｅｓ（２００３）Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９（７）：４１４４−４１５０）。
【０２３１】
明らかに、ＧＡＬ８０遺伝子中のＳＮＰは、Ｌ−アラビノースを変換する能力に正の効果がある。アラビノース増殖表現型をさらに改善できるか否かを調査するために、ＧＡＬ８０遺伝子のコード配列全体を、ＰＣＲを媒介とした遺伝子置換戦略を使用して削除した。
【０２３２】
［８．１  ＧＡＬ８０遺伝子の破壊］
配列番号５８および５９（それぞれ順方向および逆方向プライマー）のプライマーを、プラスミドｐ４２７−ＴＥＦ（Ｄｕａｌｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）由来のｋａｎＭＸマーカーの増幅のために使用した。プライマーの隣接部は、ＧＡＬ８０遺伝子の５’−領域および３’−領域に相同である。相同組換えに際して、Ｗａｃｈ（Ｗａｃｈ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｙｅａｓｔ  １０，１７９３−１８０８）による記載と同様に、ＧＡＬ８０遺伝子のＯＲＦはｋａｎＭＸマーカーにより置換されることになる。得られた断片を、ＧＡＬ８０：：ｋａｎＭＸ断片と名付ける。
【０２３３】
ＢＩＥ２５２株の酵母形質転換は、Ｇｉｅｔｚ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ（２００２），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ３５０：８７−９６に記載のプロトコールに従い、精製されたＧＡＬ８０：：ｋａｎＭＸ断片を用いて行った。ＢＩＥ２５２株の構築は欧州特許第１０１６０６２２．６号明細書に記載されている。ＢＩＥ２５２株は、Ｓ．セレビシア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のキシロースおよびアラビノース発酵株であり、ＢＩＥ２０１の誘導株である。ＢＩＥ２５２株はまた、ＧＡＬ８０  ＳＮＰを含有している。
【０２３４】
選択のために１００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８含有ＹＥＰＤ寒天上に形質転換細胞を播種した。コロニーが肉眼で見えるまで、プレートを３０℃でインキュベートした。プラスミドｐ４２７−ＴＥＦを陽性対照として含めた。この場合は、多くのコロニーが得られた。ＭｉｌｌｉＱ（すなわち、ＤＮＡなし）を陰性対照として含めた。この場合は、コロニーは得られなかった。ＧＡＬ８０：：ｋａｎＭＸ断片では、多くのコロニーが得られた。正確な組込みを確認するために、２つの別個のコロニーをサザンブロット法により試験した（データを示さず）。ＧＡＬ８０遺伝子の正確な欠失を有するコロニーをＢＩＥ２５２ΔＧＡＬ８０と名付けた。
【０２３５】
［８．２  ＢＡＭにおける性能に対するＧＡＬ８０遺伝子置換の影響］
ＢＡＭ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍｏｎｉｔｏｒ；Ｈａｌｏｔｅｃ  ＢＶ，Ｖｅｅｎｅｎｄａａｌ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）実験を実施した。ＢＩＥ２５２株およびＢＩＥ２５２ΔＧＡＬ８０株（ＧＡＬ８０遺伝子のＯＲＦがｋａｎＭＸマーカーによって正確に置換された形質転換体）の単一コロニー単離物を使用して、２％グルコース添加Ｖｅｒｄｕｙｎ培地（Ｖｅｒｄｕｙｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  ８：５０１−５１７，１９９２）に接種した。前培養物を、３０℃および２８０ｒｐｍで約２４時間インキュベートした。細胞を採取し、合成モデル培地（５％グルコース、５％キシロース、３．５％アラビノース、１％ガラクトースおよび０．５％マンノースを添加したＶｅｒｄｕｙｎ培地、ｐＨ４．２）の中に、培地１ｋｇ当たり約１グラムの乾燥重量の細胞密度で接種した。ＣＯ２産生を定常的にモニターした。糖変換および産物形成をＮＭＲにより分析した。データは、指定時点での糖の残留量（１リットル当たりのグラム数における、グルコース、アラビノース、ガラクトース、マンノースおよびキシロース）および（副）産物（エタノール、グリセロールなど）の形成を表わす。増殖は、培養物の光学濃度（６００ｎｍ）を追跡することによりモニターした。実験は約７２時間行った。
【０２３６】
グラフを図２３（ＢＩＥ２５２）および２４（ＢＩＥ２５２ΔＧＡＬ８０）に示す。
【０２３７】
実験から、参照株ＢＩＥ２５２がグルコースおよびマンノースを迅速に変換したことが明確にわかる。グルコースの枯渇（約１０時間）後、キシロースおよびアラビノースの変換が始まった。ガラクトースの一部は、約１０時間の時点ですでに発酵されつつあり、これは、グルコースとガラクトースの（一部）同時利用を可能にする、この株のＧＡＬ８０  ＳＮＰによる可能性がある。実験の終了時である約７２時間、ほとんどすべての糖（約９９％）が変換された。糖１グラム当たりエタノール０．３７グラムのエタノール収量が得られた。
【０２３８】
ＢＩＥ２５２ΔＧＡＬ８０株は、ＢＩＥ２５２株よりも速い糖変換能力を示す。さらに、この株の場合には、マンノースおよびグルコースが発酵の第１の時間帯で変換される。しかしながら、ＢＩＥ２５２株とは対照的に、この形質転換体では、グルコース、ガラクトースおよびマンノースがアラビノースおよび特にキシロースと共に、一部同時消費される。一般に、糖消費が速いと、すべての利用可能な糖が一層完全に使用されるようになる。これはまた、時間経過に伴うＣＯ２放出からも明らかである。ＢＩＥ２５２の場合には、グルコースおよびマンノースから基本的に形成されるＣＯ２による第１のピークが観察される。１０ｍｌ／ｈｒを少し超えた最小点に到達した後（図２０）、第２のより平坦なピークが観察される。しかしながら、ＢＩＥ２５２ΔＧＡＬ８０の場合には（図２１）、第２のピークは、ＮＭＲによる糖分析から明らかなように、グルコース、キシロース、アラビノース、マンノースおよびガラクトースの同時使用が強まった結果、第１のピークの尾部として出現する。親株ＢＩＥ２５２では、異なる糖の使用はより逐次的である。したがって、ＢＩＥ２５２ΔＧＡＬ８０株の収量は実験の終了時（７２時間）により高く、糖１グラム当たりエタノール０．４０グラムである。
【０２３９】
結論として、ＢＩＥ２５２株における試験のように、ＧＡＬ８０遺伝子のＯＲＦの欠失はさらに性能の改善をもたらした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
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【図２０ｃ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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