(57)【要約】本発明は、医学、特に内科学および/または心臓病学に関する。本発明は、試料を分類し、心血管疾患を患っているまたは患うリスクを有する患者を同定しかつ/または処置するための手段および方法であって、該患者の試料中に存在するmiRNAを測定することによる手段および方法を提供する。本発明はさらに、新しい心血管治療を同定するための手段および方法を提供する。
2013524809.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象が心血管疾患を患うリスクを有するかどうかを決定するための方法であって、該対象の試料を使って、hsa-miR-340*、miR-624*、miR-454*、miR-545:9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される少なくとも1つのmiRNAの発現の（相対的）レベルを決定すること、および該少なくとも1つのmiRNAの発現のレベルを参照値と比較することを含み、該比較の結果が、該個体が心血管疾患を患うリスクを有するかどうかを示す方法。
【請求項２】
少なくとも2つのmiRNAの発現の（相対的）レベルが決定され、該少なくとも2つのmiRNAの1つめがhsa-miR-340*またはhsa-miR-340*のホモログもしくはオルソログであり、かつ該少なくとも2つのmiRNAの2つめがmiR-624*、miR-454*、miR-545:9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択され、該方法が、該少なくとも2つのmiRNAの発現のレベルを参照値と比較することをさらに含み、該比較の結果が、該個体が心血管疾患を患うリスクを有するかどうかを示す、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
該第2のmiRNAがmiR-624*、miR-454*、hsa-miR-451、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
該第2のmiRNAがmiR-624*またはmiR-624*のホモログもしくはオルソログであり、該方法が、miR-454またはmiR-454のホモログもしくはオルソログの発現の（相対的）レベルを決定すること、ならびに該第1、第2およびさらなるmiRNAの発現のレベルを参照値と比較することをさらに含み、該比較の結果が、該個体が心血管疾患を患うリスクを有するかどうかを示す、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
全血試料が使用される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
該試料における該少なくとも1つのmiRNAの発現のレベルが、心血管疾患のリスクがない健常個体の試料における該少なくとも1つのmiRNAの発現のレベルと比較して、少なくとも1.50倍増加しているかどうかを決定することを含み、該miRNAが、hsa-miR-340*、miR-624*、miR-454*、miR-545:9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
該試料におけるhsa-miR-340*および/またはhsa-miR-340*のホモログおよび/またはオルソログの発現のレベルが、心血管疾患のリスクがない健常個体の試料におけるhsa-miR-340*および/またはhsa-miR-340*のホモログおよび/またはオルソログの発現のレベルと比較して、少なくとも1.50倍増加しているかどうかを決定すること、および該試料における該第2のmiRNAの発現のレベルが、心血管疾患のリスクがない健常個体の試料における該第2のmiRNAの発現のレベルと比較して、少なくとも1.50倍増加しているかどうかを決定することを含む、請求項2〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
該試料におけるhsa-miR-340*および/またはhsa-miR-340*のホモログおよび/またはオルソログの発現のレベルが、心血管疾患のリスクがない健常個体の試料におけるhsa-miR-340*および/またはhsa-miR-340*のホモログおよび/またはオルソログの発現のレベルと比較して、少なくとも1.50倍増加しているかどうかを決定すること、該試料におけるmiR-624*および/またはmiR-624*のホモログおよび/またはオルソログの発現のレベルが、心血管疾患のリスクがない健常個体の試料におけるmiR-624*および/またはmiR-624*のホモログおよび/またはオルソログの発現のレベルと比較して、少なくとも1.50倍増加しているかどうかを決定すること、ならびに該試料におけるmiR-454および/またはmiR-454のホモログおよび/またはオルソログの発現のレベルが、心血管疾患のリスクがない健常個体の試料におけるmiR-454および/またはmiR-454のホモログおよび/またはオルソログの発現のレベルと比較して、少なくとも1.50倍増加しているかどうかを決定することを含む、請求項4または5に記載の方法。
【請求項９】
該試料におけるhsa-miR-1280またはそのホモログもしくはオルソログの発現のレベルが、心血管疾患のリスクがない健常個体の試料におけるhsa-miR-1280またはそのホモログもしくはオルソログの発現のレベルと比較して、少なくとも1.50倍減少しているかどうかを決定することをさらに含む、請求項3〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
心血管疾患を処置し、低減し、遅延させかつ/または防止するための方法であって、該疾患を患っている対象または該疾患を患うリスクを有する対象の血小板および/または巨核球における、hsa-miR-340*、miR-624*、miR-454*、miR-545:9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される少なくとも1つのmiRNAのターゲットの量、発現および/または活性を増加させることを含む方法。
【請求項１１】
該少なくとも1つのmiRNAがhsa-miR-340*またはhsa-miR-340*のホモログもしくはオルソログであり、該方法が、該疾患を患っている対象または該疾患を患うリスクを有する対象の血小板および/または巨核球における、miR-624*、miR-454*、miR-545:9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択されるさらなるmiRNAのターゲットの量、発現および/または活性を増加させることをさらに含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
該さらなるmiRNAが、miR-624*、miR-454*、hsa-miR-451、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
該さらなるmiRNAがmiR-624*またはmiR-624*のホモログもしくはオルソログであり、該方法が、該疾患を患っている対象または該疾患を患うリスクを有する対象の血小板および/または巨核球における、miR-454のターゲットまたはmiR-454のホモログもしくはオルソログのターゲットの量、発現および/または活性を増加させることをさらに含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
miRNAの該ターゲットの量、発現および/または活性の該増加が、該血小板および/または該巨核球における該miRNAの発現または活性の阻害によって媒介される、請求項10〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
医薬として使用するための、hsa-miR-340*、miR-624*、miR-454*、miR-545:9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択されるmiRNAの阻害剤。
【請求項１６】
心血管疾患を処置し、低減し、遅延させかつ/または防止するための、hsa-miR-340*、miR-624*、miR-454*、miR-545:9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択されるmiRNAの阻害剤。
【請求項１７】
少なくとも1つの請求項15に記載の阻害剤と医薬上許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項１８】
少なくとも1つの、hsa-miR-340またはhsa-miR-340のホモログもしくはオルソログであるmiRNAの阻害剤を含む、請求項17に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
少なくとも1つの、miR-624*またはmiR-624*のホモログもしくはオルソログの阻害剤をさらに含む、請求項18に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
少なくとも1つの、miR-454*またはmiR-454*のホモログもしくはオルソログの阻害剤をさらに含む、請求項19に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
心血管疾患を処置し、低減し、遅延させかつ/または防止するのに使用するための、請求項17〜20のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
該心血管疾患が、アテローム性動脈硬化、冠状動脈疾患、一過性虚血発作、脳卒中、末梢血管疾患、急性冠症候群、安定狭心症、血管性認知症、および腎不全からなる群より選択される、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法、または請求項16に記載の阻害剤、または請求項21に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
hsa-miR-340*、miR-624*、miR-454*、miR-545:9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される少なくとも1つのmiRNAに特異的に結合する能力を有する少なくとも1つの分子と、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法における当該キットの使用に関する説明書とを含み、所望により1つ以上の対照および/または標準を含む、キット・オブ・パーツ。
【請求項２４】
hsa-miR-340*および/またはhsa-miR-340*のホモログおよび/またはオルソログに特異的に結合する能力を有する少なくとも1つの分子と、miR-624*および/またはmiR-624*のホモログおよび/またはオルソログに特異的に結合する能力を有する少なくとも1つの分子と、miR-454*および/またはmiR-454*のホモログおよび/またはオルソログに特異的に結合する能力を有する少なくとも1つの分子とを含む、請求項23に記載のキット・オブ・パーツ。
【請求項２５】
基盤上に固定化された分子を含む核酸分子のアレイであって、該分子の少なくとも一部が、hsa-miR-340*、miR-624*、miR-454*、miR-545:9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280、ならびにそのホモログおよびオルソログからなる群より選択される少なくとも4つのmiRNAに特異的に結合する能力を有するアレイ。
【請求項２６】
該分子の少なくとも一部が、hsa-miR-340*および/またはhsa-miR-340*のホモログおよび/またはオルソログに特異的に結合する能力を有し、該分子の少なくとも一部が、miR-624*および/またはmiR-624*のホモログおよび/またはオルソログに特異的に結合する能力を有し、かつ該分子の少なくとも一部が、miR-454*および/またはmiR-454*のホモログおよび/またはオルソログに特異的に結合する能力を有する、請求項25に記載のアレイ。
【請求項２７】
心血管疾患を処置し、低減し、遅延させかつ/または防止するのに有用な化合物を同定するための方法であって、心血管疾患を患っているまたは患うリスクを有する対象の第1試料中の血小板を、候補化合物と接触させること、該第1試料における該血小板による少なくとも1つのmiRNAの発現のレベルを、該候補化合物と接触させていない該対象の第2試料における血小板による少なくとも1つのmiRNAの発現と比較して決定することを含み、該miRNAがhsa-miR-340*、miR-624*、miR-454*、miR-545:9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択され、該第2試料における該少なくとも1つのmiRNAの発現と比較した該第1試料における該少なくとも1つのmiRNAの発現が、該化合物が心血管疾患を処置し、低減し、遅延させかつ/または防止するのに有用であるかどうかを示す方法。
【請求項２８】
対象における抗血小板治療の効果をモニタリングするための方法であって、対象の第1試料の少なくとも1つのmiRNAの発現のレベルを、該対象の第2試料の該少なくとも1つのmiRNAの発現のレベルと比較して決定することを含み、該少なくとも1つのmiRNAが、hsa-miR-340*、miR-624*、miR-454*、miR-545:9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択され、該第1試料の該少なくとも1つのmiRNAの発現のレベルと比較した該第2試料の該少なくとも1つのmiRNAの発現のレベルが、該抗血小板治療の効果を示し、該対象が、該第1試料と該第2試料の間に抗血小板治療を受けている方法。
【請求項２９】
該対象が心血管疾患を患っているか、または心血管疾患を患うリスクを有する、請求項26に記載の方法。
【請求項３０】
該少なくとも1つのmiRNAがhsa-miR-340*またはhsa-miR-340*のホモログもしくはオルソログであり、該方法が、miR-624*、miR-454*、miR-545:9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択されるさらなるmiRNAの発現のレベルを決定することをさらに含み、該第1試料の該さらなるmiRNAの発現と組み合わされた該hsa-miR-340*またはhsa-miR-340*のホモログもしくはオルソログの発現のレベルと比較した、該第2試料の該さらなるmiRNAの発現と組み合わされた該hsa-miR-340*またはhsa-miR-340*のホモログもしくはオルソログの発現のレベルが、該抗血小板治療の効果を示し、該対象が、該第1試料と該第2試料の間に抗血小板治療を受けている、請求項27〜29のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
該さらなるmiRNAが、miR-624*、miR-454*、hsa-miR-451、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
該さらなるmiRNAがmiR-624*またはmiR-624*のホモログもしくはオルソログであり、該方法が、miR-454またはmiR-454のホモログもしくはオルソログの発現のレベルを決定することをさらに含み、該第1試料の、miR-624*またはmiR-624*のホモログもしくはオルソログの発現と組み合わされ、且つmiR-454またはmiR-454のホモログもしくはオルソログの発現と組み合わされた、該hsa-miR-340*またはhsa-miR-340*のホモログもしくはオルソログの発現のレベルと比較した、該第2試料の、miR-624*またはmiR-624*のホモログもしくはオルソログの発現と組み合わされ、且つmiR-454またはmiR-454のホモログもしくはオルソログの発現と組み合わされた、該hsa-miR-340*またはhsa-miR-340*のホモログもしくはオルソログの発現のレベルが、該抗血小板治療の効果を示し、該対象が、該第1試料と該第2試料の間に抗血小板治療を受けている、請求項31に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医学、特に内科学および/または心臓病学に関する。
【背景技術】
【０００２】
心血管疾患は、専門用語としては、心血管系に影響を及ぼす任意の疾患を包含する。しかしこの用語は、通常、アテローム性動脈硬化に関係する疾患を指すために使用されている。
【０００３】
心血管疾患は、米国および大半の欧州諸国における死亡および身体障害の第一原因である。基礎をなす原因（アテローム性動脈硬化）は、通常、心臓障害が検出される時点までに著しく進んでいて、何十年にもわたって進行した後である。したがって、リスク要因を調整すること、例えば健康的な食餌、運動および喫煙の忌避などによって、アテローム性動脈硬化を防止することが、ますます重要視されるようになっている。
【０００４】
冠疾患（または冠動脈疾患（CAD））とは、冠循環が心筋と周囲組織に充分な循環を供給できないことをいう。CADは、数多くの遺伝的要因、環境要因、およびこれらの要因間の相互作用によって引き起こされると考えられている、複合疾患である。実際、CADについては、喫煙、高齢、男性、真性糖尿病、高い収縮期血圧、狭心症の個人歴、高脂肪食、感染因子、肥満、増加した血漿中総および低密度リポタンパク質（LDL）コレステロール、増加した血漿中トリグリセリド、および低下した血漿中高密度リポタンパク質（HDL）コレステロールを含む、数多くのリスク要因が同定されている。しかし、家族歴は、CADに関する最も有意な独立したリスク要因の一つであり、双生児研究でも、遺伝的要因はCADの発生の一因になることが示唆されている。高い死亡率、CADの遅発性、および家族内での表現型模写による複雑化も、この重要な疾患の遺伝学的解剖における大きな課題である。
【０００５】
CADの主因は、ゆっくりと進行するアテローム性プラーク形成と、虚血性合併症につながる急性血栓閉塞性イベントとで構成される。
【０００６】
CADはヒトの罹病および死亡の主要原因に相当することから、革新的な診断および治療戦略が必要とされている。現在のところ、対象が将来的にCADにかかるかどうかを正確に予測することは困難である。近頃は、これがリスク・カリキュレーターによって行われるが、これはそれほど正確ではない。そのうえ、当技術分野において知られているリスク・カリキュレーターは、対象がゆっくり発達するプラーク形成を有するかどうか、または急性閉塞性イベントのリスクを有するかどうかを予測することができない。ある人が冠動脈または末梢動脈の狭小化などといった心血管疾患を患っているかどうかを評価するために、いくつかの臨床検査を適用することはできる。例えば心電図、ストレス検査（運動負荷心電図）、心エコー法、血液検査（一定の脂肪、コレステロール、糖、およびタンパク質の異常レベルに関するもの）が診断目的に使用される。しかしこれらの検査はいずれも、個体が冠動脈疾患または末梢動脈疾患などの心血管疾患を患うリスクを、信頼性よく予測することはできない。それゆえに、心血管疾患のリスクをより高い信頼性で予測することができる新しいバイオマーカーが必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
心血管疾患を患うリスクを有する対象の試料を分類するための手段および方法、ならびに心血管疾患を患っているまたは患うリスクを有する対象を同定しかつ/または処置するための手段および方法を提供することが、本発明の目的である。心血管疾患治療に役立つ医薬を同定するための方法およびそのような治療をモニタリングするための方法を提供することが、本発明のさらにもう一つの目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、試料を分類し、心血管疾患を患っているまたは患うリスクを有する患者を同定しかつ/または処置するための手段および方法であって、該患者の試料中に存在するmiRNAを測定することによる手段および方法を提供する。本発明はさらに、新しい心血管治療を同定するための手段および方法を提供する。
【０００９】
本発明は、血小板中のmiRNAの変化した発現レベルが心血管疾患と相関することを、初めて示す。多くの人々が心血管疾患の遺伝的バイオマーカーを探索してきたが、それが血小板を使って行われたことは一度もなかった。例えば、循環miRNAは、AMIの診断に関して有用なバイオマーカーであることが示されている2-4。miR-1とmiR-208はどちらも、心筋傷害後に血漿において上昇すると報告されている。しかし、例えばmiR-1のレベルは退院したAMI患者では正常レベルに戻ったので、これらのmiRNAは、損傷した心細胞から血流中に放出されると思われる。心血管疾患の急性期における循環miRNAを調べたこれらの研究とは対照的に、本発明者らは、心血管疾患の安定期に血小板中に存在するmiRNAを調べた。この場合は、例えば損傷した心細胞から放出されたmiRNAは、もはや役割を果たさない。さらに、本発明者らが見いだしたmiRNAは以前の研究では見いだされていない。なぜなら、本発明以前には、心血管疾患に関係するmiRNAを探索する他の人々が、血小板精製試料（例えば多血小板血漿）におけるmiRNAレベルを探すことはなかったからである。その代わりに、例えば急性心血管疾患中の血漿試料におけるmiRNAレベルが決定された。しかし急性心血管疾患中は、全血試料または血漿試料において、いくつかのmiRNAがアップレギュレートおよび/またはダウンレギュレート（すなわち異常調節）される。これら異常調節されるmiRNAには、損傷した心臓細胞から放出されたmiRNAが含まれるが、例えば心臓損傷に作用する活性化白血球から放出されたmiRNAも含まれる。急性心血管疾患に通常付随する虚血性侵襲も、血液または血漿におけるいくつかのmiRNAの発現レベルに、顕著な影響を有する。本発明において心血管疾患に関する予測リスク要因であると同定されたmiRNAは、どの先行研究でも同定されなかった。なぜなら、これらのmiRNAは、多数の全miRNAを試験するために必要であった本発明者らが使用したスクリーニング方法（マイクロアレイ）で、CAD患者と健常対照との間に1.5〜2倍差の検出が可能になるほど高いレベルでは、心血管疾患の急性期における全血中に存在しないからである。
【００１０】
血小板が比較的純粋な試料、例えば多血小板血漿試料を使用することで、本発明者らは、血小板中に存在するmiRNAであり、かつ、急性心血管疾患のリスクを有するものの、まだ急性心血管疾患を患っていない対象において異常調節されるmiRNAを、同定することができた。これらのmiRNAは、心血管疾患を患うリスクを有する対象のバイオマーカーとして役立ち、それゆえに予測バイオマーカーとして使用することができる。
【００１１】
miRNAは、mRNAの翻訳を阻害することまたはmRNAの分解を促進することによってタンパク質合成を抑制する小さな核酸分子である。正常な発生および生理機能の重要な調節因子であることの他に、異常調節されたmiRNAの発現は、いくつかのヒト疾患と関連づけられている。したがってヒトmiRNAは、バイオマーカーとして極めて有用であるとみなされている。最近、無核の血小板におけるマイクロRNA経路の存在が発見された1。本発明は、血小板miRNAの発現プロファイルが、対象が心血管疾患を患っているかどうか、または心血管疾患を患うリスクを有するかどうかを決定するのに有用であるという洞察を、ここに提供する。本発明は、例えば、CADを有する患者の血小板では、健常対照の血小板と比べた場合に、特定のmiRNAが差異的に発現することを示す。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】24人の被検者（x軸上に試料識別）の発現プロファイルに関する教師あり階層的クラスタリング解析のヒートマップである。図の上部に被検者を対照（灰色）か症例（黒色）かに分類表示している。図示した214の差異的に発現するmiRNA（調整P＜0.05）の名称を表IIに同じ順序で列挙する。色コードグレースケールバーは、正規化されたmiRNA発現レベルを示す（濃い灰色は相対的に低い発現を示し、明るい灰色は相対的に高い発現を示す）。
【図２】CAD患者および対照被検者の血小板における7つの候補miRNAの発現プロファイル。各図の左側にある2本のバーは、miRNAアレイによって決定された、12人の健常対照と12人のCAD患者の平均miRNA発現を表す。同じデータセットでリアルタイムPCRによる検証を行った（右側にある2本のバー）。データを平均±SEMとして表し、*は健常対照と比べてp＜0.05を示す。
【図３】CAD患者および対照被検者の血小板における6つの候補miRNAの発現プロファイル。各図の左側にある2本のバーは、miRNAアレイコホート（対照12人および患者12人）の平均miRNA発現を表す。2つの独立したコホートでリアルタイムPCRによる検証を行った（右側にある4本のバー）。データを平均±SEMとして表し、*は健常対照と比べてp＜0.05を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
第1の実施形態において、本発明は、対象が心血管疾患を患うリスクを有するかどうかを決定するための方法であって、該対象の試料を使って、miR-545:9.1、miR-624*、およびmiR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される少なくとも1つのmiRNAの発現の（相対的）レベルを決定すること、および該少なくとも1つのmiRNAの発現のレベルを参照値と比較することを含み、該比較の結果が、該個体が心血管疾患を患っているかどうか、または心血管疾患を患うリスクを有するかどうかを示す方法を提供する。好ましくは、該方法はインビトロ法である。該参照値は、好ましくは、参照試料（好ましくは、心血管疾患を患っておらず、心血管疾患を患うリスクもない対象から得られるもの）を使って、該少なくとも1つのmiRNAの発現レベルを決定することによって得られる。好ましい一実施形態では、該miRNAが、hsa-miR-340*、miR-624*、miR-454、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される。より好ましい一実施形態では、該miRNAがhsa-miR-340*またはhsa-miR-340*のホモログもしくはオルソログである。もう一つのより好ましい実施形態では、該miRNAがmiR-624*またはmiR-624*のホモログもしくはオルソログである。
【００１４】
参照値と試験値の両方を同時に決定する必要はない。例えば、参照値を、好ましくは心血管疾患を患っておらず、心血管疾患を患うリスクもない対象から得た試料を使って、決定し、その参照値を、試験試料中の該少なくとも1つのmiRNAの相対的発現が、個体の心血管疾患を患うリスクを示すかどうかを決定するために、何度も繰り返し使用することが可能である。低い心血管疾患罹患リスクを示すことが明らかにされた発現のレベル、例えば健常個体からのいくつかの試料におけるmiRNAの平均レベルを、参照値として使用することが可能である。他方、心血管疾患を示すことまたは高い心血管疾患罹患リスクを示すことが明らかにされた発現のレベルを参照値として使用することも可能である。そのような参照値は、例えば、心血管疾患を患っている個体の試料を使って得られる。したがって、対象が心血管疾患を患うリスクを有するかどうかは、該対象の試料における上記miRNAのいずれかの発現のレベルを、健常個体の試料における発現のレベルまたは心血管疾患を患っている個体の試料における発現のレベルと比較することによって、決定することが可能である。健常個体のそれと同等な発現のレベルは、当該対象には心血管疾患のリスクがないことを示す。心血管疾患を患っている個体のそれと同等な発現のレベルは、当該対象が心血管疾患を患うリスクを有することを示す。同等とは、発現のレベルが、好ましくは1.8倍差未満、より好ましくは1.5倍差未満、より好ましくは1.3倍差未満、最も好ましくは1.2倍差未満であることを意味する。
【００１５】
本発明の方法では、miR-545:9.1、miR-624*、およびmiR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される少なくとも2つのmiRNAの発現レベルを決定することが好ましい。該少なくとも2つのmiRNAの少なくとも1つは、hsa-miR-340*またはmiR-624*であるか、hsa-miR-340*またはmiR-624*のホモログまたはオルソログであることが好ましい。より好ましくは、該少なくとも2つのmiRNAの該少なくとも1つは、hsa-miR-340*またはhsa-miR-340*のホモログもしくはオルソログである。好ましい一実施形態では、該少なくとも2つのmiRNAの1つめがhsa-miR-340またはhsa-miR-340のホモログもしくはオルソログであり、該少なくとも2つのmiRNAの2つめがmiR-454またはmiR-454のホモログもしくはオルソログである。より好ましくは、miR-545:9.1、miR-624*、およびmiR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される少なくとも3つ、より好ましくは少なくとも4つ、より好ましくは少なくとも5つ、より好ましくは少なくとも6つ、より好ましくは少なくとも7つ、最も好ましくは少なくとも8つのmiRNAの発現のレベルが、本発明の方法において決定される。対象の試料における上記miRNAのいくつかを決定することは、好ましくは、心血管疾患の罹患に関する対象のリスクの、より正確な評価につながる。
【００１６】
本発明は、例えば、hsa-miR-340*またはhsa-miR-340*のホモログもしくはオルソログの発現レベルを、少なくとも1つの他の本発明のmiRNAの発現レベル、好ましくはmiR-624*またはmiR-624*のホモログもしくはオルソログの発現レベルおよび/またはmiR-454*またはmiR-454*のホモログもしくはオルソログの発現レベルと組み合わせて決定すれば、心血管疾患の罹患に関する対象のリスクを、これらのmiRNAのうち1つだけの発現レベルを測定した場合よりも、正確に測定することができることを示す。miR-624*またはmiR-624*のホモログもしくはオルソログの発現レベルを、少なくとも1つの他の本発明のmiRNAの発現レベル、好ましくはhsa-miR-340*またはhsa-miR-340*のホモログもしくはオルソログの発現レベルおよび/またはmiR-454*またはmiR-454*のホモログもしくはオルソログの発現レベルと組み合わせて決定することについても、同じことが言える。
【００１７】
それゆえに、好ましい一実施形態では、少なくとも2つのmiRNAの発現の（相対的）レベルが決定され、該少なくとも2つのmiRNAの1つめはhsa-miR-340*またはhsa-miR-340*のホモログもしくはオルソログであり、該少なくとも2つのmiRNAの2つめは、miR-624*、miR-454*、miR-545:9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される、本発明の方法であって、該少なくとも2つのmiRNAの発現のレベルを参照値と比較することをさらに含み、該比較の結果が、該個体が心血管疾患を患うリスクを有するかどうかを示す方法が提供される。
【００１８】
より好ましい一実施形態では、該第2のmiRNAがmiR-624*、miR-454*、hsa-miR-451、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される、本発明の方法が提供される。より一層好ましい一実施形態では、該第2のmiRNAがmiR-454*またはmiR-454*のホモログもしくはオルソログである。
【００１９】
最も好ましい一実施形態では、該第2のmiRNAがmiR-624*またはmiR-624*のホモログもしくはオルソログである本発明の方法であって、miR-454またはmiR-454のホモログもしくはオルソログの発現の（相対的）レベルを決定することおよび該第1、第2およびさらなるmiRNAの発現のレベルを参照値と比較することをさらに含み、該比較の結果が、該個体が心血管疾患を患うリスクを有するかどうかを示す方法が提供される。
【００２０】
もう一つの好ましい実施形態では、少なくとも2つのmiRNAの発現の（相対的）レベルが決定される本発明の方法であって、該少なくとも2つのmiRNAの1つめがmiR-624*またはmiR-624*のホモログもしくはオルソログであり、該少なくとも2つのmiRNAの2つめがhsa-miR-340*、miR-454*、miR-545:9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択され、該少なくとも2つのmiRNAの発現のレベルを参照値と比較することをさらに含み、該比較の結果が、該個体が心血管疾患を患うリスクを有するかどうかを示す方法が提供される。
【００２１】
より好ましい一実施形態では、該第2のmiRNAがhsa-miR-340*、miR-454*、hsa-miR-451、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される、本発明の方法が提供される。
【００２２】
「健常対象」または「心血管疾患を患っておらず、心血管疾患を患うリスクもない対象」とは、正常集団と比較して増加したリスクを有さない対象を意味する。好ましくは、そのような対象は、過体重または高コレステロールを有さず、非喫煙者であり、非糖尿病者であり、心血管疾患の病歴または家族歴を有さない。
【００２３】
「心血管疾患を患っているまたは患うリスクを有する対象」とは、心血管疾患と既に診断されているかつ/または正常集団と比較して心血管疾患を患うリスクが増加している対象を意味する。
【００２４】
血小板中に存在する少なくとも1つのmiRNAの発現のレベルは、好ましくは、該血小板を含む試料を使って決定される。しかし、試料中の血小板がまだ無傷であること、および/またはmiRNAがまだ血小板内に存在することは、その発現のレベルを決定するためには必要でない。例えば、本発明のmiRNAのレベルを決定する前に血小板を溶解してもよく、そうすることが好ましい。次に、該試料において測定されたmiRNAの量を使って、該血小板中に存在する該miRNAの（相対的）レベルを算出する。絶対値を（例えばpg/1×106血小板などの単位で）決定する必要はなく、レベルは、好ましくは、多くのmiRNA定量研究において広く使用されている内在性参照RNAであるRNU6Bなどのハウスキーピング遺伝子との比較で決定されるので、「相対的」という語句を使用する。
【００２５】
本発明が、比較的血小板純度の高い試料、すなわち多血小板血漿試料を使って、健常個体の血小板における発現と比べて、心血管疾患のリスクを有する個体の血小板において差異的に発現するいくつかのmiRNAを同定したことが注目される。血小板において差異的に発現するいくつかのmiRNAを本発明がここに同定したので、もはや、本発明の方法において血小板濃縮試料を使用する必要はない。例えば、本発明の方法では、ある個体が心血管疾患を患うリスクを有するかどうかを決定するために、全血試料を使用することができる。
【００２６】
ただし、本発明の方法において使用するための試料の調製が、該血小板および/または該試料におけるmiRNAレベルの変化を誘発することは、避けることが好ましい。これは、例えば、血液試料を抗凝固剤なしで採取した場合に当てはまる。そのような血液試料の取扱は、血小板の活性化と、それに続く凝固を誘発する。凝固は、試料中のmiRNAレベルの改変につながるであろう。
【００２７】
miRNAのホモログは、本明細書においては、共通する祖先ゆえに類似しているmiRNAと定義される。DNA配列は、通常、類似していて、同一ではない。
【００２８】
miRNAのオルソログは、本明細書においては、種分化イベントによって分離された相同な核酸分子と定義される。オルソロガス遺伝子は、例えば、異なる種にあって、それらの種が共通の先祖から派生したために互いに類似している遺伝子である。もちろん、特定の種における心血管疾患の診断および/または処置には、該特定の種からのmiRNAオルソログを使用することが好ましい。したがってヒトでは、ヒト試料におけるmiRNAを決定する際に、好ましくは、ヒトmiRNAが決定される。
【００２９】
好ましい一実施形態では、ホモログおよび/またはオルソログが、本発明のmiRNAと、少なくとも50％の配列同一性を有する。より好ましい一実施形態では、配列同一性が、少なくとも60％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％である。
【００３０】
「％配列同一性」という用語は、本明細書においては、最大のパーセント配列同一性が得られるように、配列をアラインメントし、場合によってはギャップを必要に応じて導入した後に、関心対象の核酸配列におけるヌクレオチドと同一である核酸配列中のヌクレオチドのパーセンテージと定義される。アラインメントのための方法とコンピュータプログラムは、当技術分野ではよく知られている。
【００３１】
血小板におけるmiRNAの発現のレベルが決定されるので、血小板を含む試料、例えば血液試料または多血小板血漿試料を使用することが好ましい。それゆえに、好ましい一実施形態では、全血試料、好ましくは血小板が濃縮された血液試料を使用する、本発明の方法が提供される。全血試料とは、静脈血試料または動脈血試料、好ましくは開放系で（すなわち減圧を伴わずに）、好ましくは抗凝固剤を使って採血されたものを意味する。減圧は、血球にストレスを与えることが知られており、血小板の活性化と、それに続く試料中のmiRNAレベルの改変につながりうる。抗凝固剤の使用は、血液の凝固を防止しかつ/または減少させ、そうすることで、凝固が誘発する試料中のmiRNAレベルの変化を防止しかつ/または減少させる。より一層好ましい一実施形態では、該試料が多血小板血漿試料である本発明の方法が提供される。
【００３２】
多血小板血漿は、ベースライン（すなわち正常血漿中の血小板濃度）より高い血小板濃度を有する血漿と、ここに定義される。遠心分離によって多血小板血漿を調製するための方法は、当業者にはよく知られている。多血小板血漿が含有する白血球の濃度は、増加していても、増加していなくてもよい。ただし、本発明の方法では、白血球数が低い多血小板血漿試料を使用することが好ましい。好ましくは、該試料は、該試料中の血小板の量と比較して、5％未満、より好ましくは2.5％未満、より好ましくは1％未満、より一層好ましくは0.5％未満、最も好ましくは0.4%未満の白血球を含む。
【００３３】
本発明によれば、対照との対比でCAD患者において差異的に発現するmiRNAのうち、CAD患者では、hsa-miR-1280がダウンレギュレートされ、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-545:9.1、hsa-miR-451、hsa-miR-454*、およびhsa-miR-624*がアップレギュレートされる。試験結果の変動と個体間差があるので、ここでは、1.5倍のダウンレギュレーションまたはアップレギュレーションを、有意であるとみなし、ある人が心血管疾患を患うリスクを有するかどうかを予測すると定義する。
【００３４】
それゆえに、好ましい一実施形態では、該試料における該少なくとも1つのmiRNAの発現のレベルが、心血管疾患のリスクがない健常個体の試料における該少なくとも1つのmiRNAの発現のレベルと比較して、少なくとも1.50倍増加しているかどうかを決定することを含む本発明の方法であって、該少なくとも1つのmiRNAが、miR-545:9.1、miR-624*、およびmiR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択されるmiRNAを含む方法が提供される。より好ましい一実施形態では、該発現のレベルが、少なくとも1.55、好ましくは少なくとも1.60、より好ましくは少なくとも1.65、より好ましくは少なくとも1.75、最も好ましくは少なくとも1.85倍増加しているかどうかを決定する。
【００３５】
もう一つの好ましい実施形態では、該試料における該少なくとも1つのmiRNAの発現のレベルが、心血管疾患のリスクがない健常個体の試料における該少なくとも1つのmiRNAの発現のレベルと比較して、少なくとも1.50倍減少しているかどうかを決定することを含む本発明の方法であって、該miRNAがhsa-miR-1280またはそのホモログもしくはオルソログである方法が提供される。より好ましい一実施形態では、該発現のレベルが、少なくとも1.55、より好ましくは少なくとも1.60、より好ましくは少なくとも1.65、より好ましくは少なくとも1.75、最も好ましくは少なくとも1.85倍減少しているかどうかを決定する。
【００３６】
好ましい一実施形態では、該少なくとも1つのmiRNAが、miR-545:9.1、miR-624*、およびmiR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される、本発明の方法が提供される。より好ましい一実施形態では、該少なくとも1つのmiRNAが、miR-545:9.1、miR-624*、miR-454*、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される、本発明の方法が提供される。
【００３７】
好ましい一実施形態では、該試料におけるhsa-miR-340*および/またはhsa-miR-340*のホモログおよび/またはオルソログの発現のレベルが、心血管疾患のリスクがない健常個体の試料におけるhsa-miR-340*および/またはhsa-miR-340*のホモログおよび/またはオルソログの発現のレベルと比較して、少なくとも1.15倍、好ましくは少なくとも1.2、より好ましくは少なくとも1.25、より好ましくは少なくとも1.3、より好ましくは少なくとも1.4、より好ましくは少なくとも1.5、より好ましくは少なくとも1.60、より好ましくは少なくとも1.65、より好ましくは少なくとも1.75、最も好ましくは少なくとも1.85倍増加しているかどうかを決定すること、および該試料における第2のmiRNAの発現のレベルが、心血管疾患のリスクがない健常個体の試料における該第2のmiRNAの発現のレベルと比較して、少なくとも1.15倍、好ましくは少なくとも1.2、より好ましくは少なくとも1.25、より好ましくは少なくとも1.3、より好ましくは少なくとも1.4、より好ましくは少なくとも1.5、より好ましくは少なくとも1.60、より好ましくは少なくとも1.65、より好ましくは少なくとも1.75、最も好ましくは少なくとも1.85倍増加しているかどうかを決定することを含む本発明の方法であって、該第2のmiRNAが、miR-545:9.1、miR-624*、およびmiR-454*、hsa-miR-615-5p、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される方法が提供される。より好ましい一実施形態では、該第2のmiRNAが、miR-624*、およびmiR-454*、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される。より好ましい一実施形態では、該第2のmiRNAがmiR-454*またはmiR-454*のホモログもしくはオルソログである。
【００３８】
より好ましい一実施形態では、該試料におけるhsa-miR-340*および/またはhsa-miR-340*のホモログおよび/またはオルソログの発現のレベルが、心血管疾患のリスクがない健常個体の試料におけるhsa-miR-340*および/またはhsa-miR-340*のホモログおよび/またはオルソログの発現のレベルと比較して、少なくとも1.15倍、好ましくは少なくとも1.2、より好ましくは少なくとも1.25、より好ましくは少なくとも1.3、より好ましくは少なくとも1.4、より好ましくは少なくとも1.5、より好ましくは少なくとも1.60、より好ましくは少なくとも1.65、より好ましくは少なくとも1.75、最も好ましくは少なくとも1.85倍増加しているかどうかを決定すること、該試料におけるmiR-624*および/またはmiR-624*のホモログおよび/またはオルソログの発現のレベルが、心血管疾患のリスクがない健常個体の試料におけるmiR-624*および/またはmiR-624*のホモログおよび/またはオルソログの発現のレベルと比較して、少なくとも1.15倍、好ましくは少なくとも1.2、より好ましくは少なくとも1.25、より好ましくは少なくとも1.3、より好ましくは少なくとも1.4、より好ましくは少なくとも1.5、より好ましくは少なくとも1.60、より好ましくは少なくとも1.65、より好ましくは少なくとも1.75、最も好ましくは少なくとも1.85倍増加しているかどうかを決定すること、および該試料におけるmiR-454および/またはmiR-454のホモログおよび/またはオルソログの発現のレベルが、心血管疾患のリスクがない健常個体の試料におけるmiR-454および/またはmiR-454のホモログおよび/またはオルソログの発現のレベルと比較して、少なくとも1.15倍、好ましくは少なくとも1.2、より好ましくは少なくとも1.25、より好ましくは少なくとも1.3、より好ましくは少なくとも1.4、より好ましくは少なくとも1.5、より好ましくは少なくとも1.60、より好ましくは少なくとも1.65、より好ましくは少なくとも1.75、最も好ましくは少なくとも1.85倍増加しているかどうかを決定することを含む、本発明の方法が提供される。
【００３９】
もう一つの好ましい実施形態では、該試料におけるmiR-624*および/またはmiR-624*のホモログおよび/またはオルソログの発現のレベルが、心血管疾患のリスクがない健常個体の試料におけるmiR-624*および/またはmiR-624*のホモログおよび/またはオルソログの発現のレベルと比較して、少なくとも1.15倍、好ましくは少なくとも1.2、より好ましくは少なくとも1.25、より好ましくは少なくとも1.3、より好ましくは少なくとも1.4、より好ましくは少なくとも1.5、より好ましくは少なくとも1.60、より好ましくは少なくとも1.65、より好ましくは少なくとも1.75、最も好ましくは少なくとも1.85倍増加しているかどうかを決定すること、および該試料における第2のmiRNAの発現のレベルが、心血管疾患のリスクがない健常個体の試料における該第2のmiRNAの発現のレベルと比較して、少なくとも1.15倍、好ましくは少なくとも1.2、より好ましくは少なくとも1.25、より好ましくは少なくとも1.3、より好ましくは少なくとも1.4、より好ましくは少なくとも1.5、より好ましくは少なくとも1.60、より好ましくは少なくとも1.65、より好ましくは少なくとも1.75、最も好ましくは少なくとも1.85倍増加しているかどうかを決定することを含む本発明の方法であって、該第2のmiRNAが、miR-545:9.1、hsa-miR-340*、およびmiR-454*、hsa-miR-615-5p、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される方法が提供される。より好ましい一実施形態では、該第2のmiRNAが、hsa-miR-340*、およびmiR-454*、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される。
【００４０】
好ましい一実施形態において、本発明は、該試料におけるhsa-miR-1280またはそのホモログもしくはオルソログの発現のレベルが、心血管疾患のリスクがない健常個体の試料におけるhsa-miR-1280またはそのホモログもしくはオルソログの発現のレベルと比較して、少なくとも1.15倍、好ましくは少なくとも1.2、より好ましくは少なくとも1.25、より好ましくは少なくとも1.3、より好ましくは少なくとも1.4、より好ましくは少なくとも1.5、より好ましくは少なくとも1.60、より好ましくは少なくとも1.65、より好ましくは少なくとも1.75、最も好ましくは少なくとも1.85倍減少しているかどうかを決定することをさらに含む、本発明の方法も提供する。
【００４１】
miRNAは、ある人が心血管疾患を患うリスクを有するかどうかに関する単なる指標ではない。前述のように、miRNAは、mRNAの翻訳を阻害することによって、またはmRNAの分解を促進することによって、タンパク質合成を抑制することができる。したがってmiRNAは正常な発生および生理機能の強力な調節因子である。miRNAの増加した発現は、それらのターゲットの抑制されたタンパク質合成につながるであろう。hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-545:9.1、hsa-miR-451、hsa-miR-454*、および/またはhsa-miR-624*の増加した発現が、心血管疾患を患うリスクを有する対象において観察された。したがって、心血管疾患を処置し、低減し、かつ/または防止するには、そのような増加したmiRNAの作用を、例えばこれらのmiRNAのいずれかのターゲットの量、発現および/または活性を増加させることなどによって、打ち消すことが有用である。miRNAターゲットの量、発現および/または活性を増加させることは、例えば、該miRNAの量、活性および/または発現を阻害すること、またはターゲットそのものを与えることによって、行うことができる。
【００４２】
それゆえに、ある実施形態において、本発明は、心血管疾患を処置し、低減し、遅延させ、かつ/または防止するための方法であって、該疾患を患っている対象または該疾患を患うリスクを有する対象の血小板および/または巨核球における、miR-545:9.1、miR-624*、およびmiR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される少なくとも1つのmiRNAのターゲットの量、発現および/または活性を増加させることを含む方法を提供する。好ましくは、該少なくとも1つのmiRNAは、miR-545:9.1、miR-624*、およびmiR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される。より好ましくは、該少なくとも1つのmiRNAは、miR-545:9.1、miR-624*、miR-454*、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される。より好ましい一実施形態では、該少なくとも1つのmiRNAが、hsa-miR-340*もしくはmiR-624*、またはhsa-miR-340*もしくはmiR-624*のホモログもしくはオルソログである。より一層好ましい一実施形態では、該少なくとも1つのmiRNAが、hsa-miR-340*またはhsa-miR-340*のホモログもしくはオルソログである。
【００４３】
本発明は、該疾患を患っている対象または該疾患を患うリスクを有する対象の血小板および/または巨核球における、miR-545:9.1、miR-624*、およびmiR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される少なくとも2つ、より好ましくは少なくとも3つ、より好ましくは少なくとも4つ、またはそれ以上のmiRNAの1つ以上のターゲットの量、発現および/または活性を増加させることが、心血管疾患を処置し、低減し、遅延させかつ/または防止するのに有用であるという洞察を提供する。とりわけ、hsa-miR-340*、miR-624*、miR-454*、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログの群から選択される少なくとも2つのmiRNAの組合せは、心血管疾患を処置し、低減し、遅延させかつ/または防止するのに、とりわけ有用である。本発明によれば、hsa-miR-340*、miR-624*、およびmiR-454*、またはこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログの1つ以上のターゲットの量、発現および/または活性を増加させることは、心血管疾患を処置し、低減し、遅延させかつ/または防止するのに、最も有効である。
【００４４】
それゆえに、好ましい一実施形態では、該少なくとも1つのmiRNAがhsa-miR-340*またはhsa-miR-340*のホモログもしくはオルソログである、心血管疾患を処置し、低減し、遅延させかつ/または防止するための本発明の方法であって、該疾患を患っている対象または該疾患を患うリスクを有する対象の血小板および/または巨核球における、miR-624*、miR-454*、miR-545:9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択されるさらなるmiRNAのターゲットの量、発現および/または活性を増加させることをさらに含む方法が提供される。
【００４５】
より好ましい一実施形態では、該さらなるmiRNAが、miR-624*、miR-454*、hsa-miR-451、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される、心血管疾患を処置し、低減し、遅延させかつ/または防止するための本発明の方法が提供される。より一層好ましい一実施形態では、該さらなるmiRNAが、miR-454*またはmiR-454のホモログもしくはオルソログである。
【００４６】
最も好ましい一実施形態では、該さらなるmiRNAがmiR-624*またはmiR-624*のホモログもしくはオルソログである、心血管疾患を処置し、低減し、遅延させかつ/または防止するための本発明の方法であって、該疾患を患っている対象または該疾患を患うリスクを有する対象の血小板および/または巨核球における、miR-454のターゲットまたはmiR-454のホモログもしくはオルソログのターゲットの量、発現および/または活性を増加させることをさらに含む方法が提供される。
【００４７】
もう一つの好ましい実施形態では、該少なくとも1つのmiRNAがmiR-624*またはmiR-624*のホモログもしくはオルソログである、心血管疾患を処置し、低減し、遅延させかつ/または防止するための本発明の方法であって、該疾患を患っている対象または該疾患を患うリスクを有する対象の血小板および/または巨核球における、hsa-miR-340*、miR-454*、miR-545:9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択されるさらなるmiRNAのターゲットの量、発現および/または活性を増加させることをさらに含む方法が提供される。
【００４８】
より好ましい一実施形態では、該さらなるmiRNAが、hsa-miR-340*、miR-454*、hsa-miR-451、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される、心血管疾患を処置し、低減し、遅延させかつ/または防止するための本発明の方法が提供される。
【００４９】
好ましい一実施形態では、miRNAの該ターゲットの量、発現および/または活性の該増加が、該血小板および/または該巨核球における該miRNAの発現または活性の阻害によって媒介される、心血管疾患を処置し、低減し、遅延させかつ/または防止するための本発明の方法が提供される。
【００５０】
該疾患を患っている対象または該疾患を患うリスクを有する対象の血小板および/または巨核球における、miR-545:9.1、miR-624*、およびmiR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される少なくとも3つのmiRNAの1つのターゲットまたは複数のターゲットの量、発現および/または活性を増加させることを含む、心血管疾患を処置し、低減し、遅延させかつ/または防止するための方法も提供される。好ましくは、該少なくとも3つのmiRNAは、miR-624*、およびmiR-454*、hsa-miR-340*、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される。最も好ましくは、該少なくとも3つのmiRNAの1つめはmiR-624*またはmiR-624*のホモログもしくはオルソログであり、該少なくとも3つのmiRNAの2つめはmiR-454*またはmiR-454*のホモログもしくはオルソログであり、該少なくとも3つのmiRNAの3つめはhsa-miR-340*またはmiR-340*のホモログもしくはオルソログである。
【００５１】
好ましい一実施形態において、miRNAの該ターゲットの量、発現および/または活性の該増加は、該血小板および/または該巨核球における、miR-545:9.1、miR-624*、およびmiR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される少なくとも1つのmiRNAの発現または活性の阻害によって媒介される。好ましくは、該少なくとも1つのmiRNAは、miR-545:9.1、miR-624*、およびmiR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される。より好ましくは、該少なくとも1つのmiRNAは、miR-545:9.1、miR-624*、miR-454*、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される。
【００５２】
好ましくは、該miRNAの発現および/または活性の該阻害は、miRNAアンチセンス分子による。miRNAアンチセンス分子は、miRNAに対して高いパーセンテージの相補的配列同一性を有する核酸分子である。この高い相補的配列同一性は該miRNAへの特異的結合を可能にする。相補的とは、miRNAとmiRNAアンチセンス分子の間のプリンとピリミジンの特異的対形成を意味する。好ましくは、該miRNAアンチセンス分子とmiRNAとの該相補的配列同一性は、少なくとも50％である。より好ましい一実施形態では、配列同一性が、少なくとも60％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％である。
【００５３】
例えばCADを患っている対象において、hsa-miR-1280について観察されるような、miRNAの減少した発現は、miRNAターゲットの増加した発現につながるであろう。したがって、miRNAターゲットの量、発現および/または活性を減少させることによって、miRNAの減少した発現の効果を打ち消すことができる。これは、例えば、該miRNAの量、発現および/または活性を増加させることによって、行うことができる。
【００５４】
それゆえに、好ましい一実施形態では、心血管疾患を処置し、低減し、遅延させかつ/または防止するための本発明の方法であって、該疾患を患っている対象または該疾患を患うリスクを有する対象の血小板および/または巨核球における、hsa-miR-1280および/またはそのホモログおよび/またはオルソログのターゲットの量、発現および/または活性を減少させることをさらに含む方法が提供される。好ましくは、hsa-miR-1280、および/またはそのホモログおよび/またはオルソログの該ターゲットの量、発現および/または活性の該減少は、該血小板および/または該巨核球における、hsa-miR-1280、および/またはそのホモログおよび/またはオルソログおよび/またはアナログの量、発現および/または活性を増加させることによって媒介される。より好ましい一実施形態では、hsa-miR-1280、および/またはそのホモログおよび/またはオルソログの該ターゲットの量、発現および/または活性の該減少が、hsa-miR-1280および/またはホモログおよび/またはオルソログおよび/またはアナログを該対象に与えることによって媒介される。
【００５５】
それゆえに、もう一つの実施形態では、心血管疾患を処置し、低減し、遅延させかつ/または防止するための方法であって、該疾患を患っている対象または該疾患を患うリスクを有する対象の血小板および/または巨核球における、hsa-miR-1280および/またはそのホモログおよび/またはオルソログのターゲットの量、発現および/または活性を減少させることを含む方法が提供される。好ましくは、hsa-miR-1280、および/またはそのホモログおよび/またはオルソログの該ターゲットの量、発現および/または活性の該減少は、該血小板および/または該巨核球におけるhsa-miR-1280、および/またはそのホモログおよび/またはオルソログおよび/またはアナログの量、発現および/または活性を増加させることによって媒介される。より好ましい一実施形態では、hsa-miR-1280、および/またはそのホモログおよび/またはオルソログの該ターゲットの量、発現および/または活性の該減少は、該対象に、hsa-miR-1280および/またはホモログおよび/またはオルソログおよび/またはアナログを与えることによって媒介される。
【００５６】
好ましい一実施形態では、心血管疾患を処置し、低減し、遅延させかつ/または防止するための本発明の方法であって、miRNAの該ホモログ、オルソログ、および/またはアナログが該miRNAと少なくとも50％の配列同一性を有する方法が提供される。より好ましい一実施形態では、配列同一性が少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも95％である。
【００５７】
miRNAのアナログは、例えばヌクレアーゼ耐性を増加させるためおよび/またはターゲット配列に対するアンチセンスヌクレオチドのアフィニティを増加させるために修飾された、1つ以上の残基を含む人工的に修飾されたmiRNAと、ここに定義される。
【００５８】
好ましい一実施形態ではアナログが修飾された主鎖を含む。そのような主鎖の例として、モルホリノ主鎖、カルバメート主鎖、シロキサン主鎖、スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖、メチレンホルムアセチル主鎖、リボアセチル主鎖、アルケン含有主鎖、スルファメート、スルホネートおよびスルホンアミド主鎖、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖、およびアミド主鎖が挙げられる。
【００５９】
主鎖における残基間の結合がリン原子を含まないこと、例えば短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または1つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される結合などは、さらに好ましい。
【００６０】
ある好ましいアナログは、修飾ポリアミド主鎖を有するペプチド核酸(PNA)を含む。PNAベースの分子は、塩基対認識の観点から言えば、DNA分子の真の模倣物である。PNAの主鎖は、ペプチド結合によって連結されたN-(2-アミノエチル)-グリシン単位で構成されており、ここでは核酸塩基がメチレンカルボニル結合によって主鎖に連結されている。ある代替主鎖は1炭素延長されたピロリジンPNAモノマーを含む。PNA分子の主鎖は荷電したリン酸基を含有しないので、PNA-RNAハイブリッドは通常、RNA-RNAまたはRNA-DNAハイブリッドより、それぞれ安定である。
【００６１】
さらにもう一つの好ましい主鎖は、リボース糖またはデオキシリボース糖が6員モルホリノ環によって置き換えられているモルホリノアナログを含む。最も好ましいmiRNAアナログまたは等価物は、リボース糖またはデオキシリボース糖が6員モルホリノ環で置き換えられ、かつ隣接するモルホリノ環の間の陰イオン性ホスホジエステル結合が非イオン性ホスホロジアミデート結合で置き換えられているホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（PMO）を含む。
【００６２】
さらにもう一つの実施形態において、本発明のmiRNAアナログは、ホスホジエステル結合中の非橋かけ酸素の1つの置換を含む。この修飾は、塩基対合をわずかに不安定化するが、ヌクレアーゼ分解に対して著しい耐性を付与する。好ましいヌクレオチドアナログまたは等価物には、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、H-ホスホネート、メチルホスホネートおよび他のアルキルホスホネート、例えば3'-アルキレンホスホネート、5'-アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、例えば3'-アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェートまたはボラノホスフェートが含まれる。
【００６３】
さらにもう一つの本発明の好ましいmiRNAアナログは、-OH；-F；1つ以上のヘテロ原子が割り込んでいてもよい置換または無置換、線状または分岐、低級(C1-C10)アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アリル、またはアラルキル；O-、S-、またはN-アルキル；O-、S-、またはN-アルケニル；O-、S-またはN-アルキニル；O-、S-、またはN-アリル；O-アルキル-O-アルキル、-メトキシ、-アミノプロポキシ；メトキシエトキシ；-ジメチルアミノオキシエトキシ；および-ジメチルアミノエトキシエトキシなど、2'、3'および/または5'位が一置換または二置換されている1つ以上の糖部分を含む。糖部分は、ピラノースまたはその誘導体であるか、デオキシピラノースまたはその誘導体であることができ、好ましくはリボースまたはその誘導体であるか、デオキシリボースまたはその誘導体であることができる。好ましい誘導体化糖部分には、糖環の2'-炭素原子が3'または4'炭素原子に連結されて二環式糖部分を形成しているロックト核酸（LNA）が含まれる。好ましいLNAには、2'-O,4'-C-エチレン架橋核酸が含まれる。これらの置換はヌクレオチドアナログまたは等価物をRNaseHおよびヌクレアーゼ耐性にし、ターゲットRNAに対するアフィニティを増加させる。
【００６４】
もう一つの実施形態では、本発明のmiRNAアナログが、1つ以上の塩基修飾または塩基置換を含む。修飾塩基には、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ならびに当技術分野において知られているまたは今後知られることになる、ピリミジン塩基およびプリン塩基の他のアザ、デアザ、ヒドロキシ、ハロ、チオ、チオール、アルキル、アルケニル、アルキニル、チオアルキル誘導体などといった、合成塩基および天然塩基が含まれる。
【００６５】
アンチセンスオリゴヌクレオチド中の全ての位置が均一に修飾される必要がないことは、当業者には理解される。加えて、上述したアナログの2つ以上が、単一のmiRNAに組み込まれていてもよく、さらにはmiRNA内の単一の位置に組み込まれていてもよい。
【００６６】
したがって本発明は、心血管疾患を患っているまたは患うリスクを有する対象において過剰発現している、血小板中に存在するmiRNAの阻害剤が、例えば心血管疾患を処置し、低減し、遅延させかつ/または防止するのに有用であるという洞察を提供する。
【００６７】
それゆえに本発明は、さらに、医薬として使用するためのmiRNAの阻害剤であって、該miRNAが、miR-545:9.1、miR-624*、およびmiR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択されるものを提供する。もう一つの実施形態は、心血管疾患を処置し、低減し、遅延させかつ/または防止するためのmiRNAの阻害剤であって、該miRNAが、miR-545:9.1、miR-624*、およびmiR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択されるものを提供する。好ましい一実施形態では、該少なくとも1つのmiRNAが、miR-545:9.1、miR-624*、およびmiR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される。より好ましい一実施形態では、該少なくとも1つのmiRNAが、miR-545:9.1、miR-624*、miR-454*、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される。もう一つのより好ましい実施形態では、該miRNAが、hsa-miR-340*もしくはmiR-624*、またはhsa-miR-340*もしくはmiR-624*のホモログもしくはオルソログである。
【００６８】
hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-545:9.1、hsa-miR-451、hsa-miR-454*、hsa-miR-624*は、いずれも、心血管疾患を患っているまたは患うリスクを有する対象の血小板において過剰発現している。対照的に、hsa-miR-1280は、心血管疾患を患っているまたは患うリスクを有する対象の血小板では低い。したがって、心血管疾患を処置し、低減し、遅延させかつ/または防止するには、hsa-miR-1280の発現または活性を増加させなければならない。
【００６９】
それゆえに、本発明は、医薬として使用するための、miRNA hsa-miR-1280および/またはそのホモログ、オルソログおよび/またはアナログ、および/またはhsa-miR-1280の活性化因子も提供する。もう一つの実施形態において、本発明は、心血管疾患を処置し、低減し、遅延させかつ/または防止するための、miRNA hsa-miR-1280および/またはそのホモログ、オルソログおよび/またはアナログ、および/またはhsa-miR-1280の活性化因子を提供する。
【００７０】
少なくとも1つの本発明の阻害剤と医薬上許容される賦形剤とを含む医薬組成物も提供される。より好ましい一実施形態では、医薬組成物が、miRNAの阻害剤を少なくとも1つは含み、該miRNAがhsa-miR-340*またはそのホモログもしくはオルソログである。より好ましい一実施形態では、医薬組成物が、少なくとも1つのさらなるmiRNAの阻害剤を含み、該miRNAがmiR-624*もしくはmiR-454*またはmir-624*もしくはmiR-454*のホモログもしくはオルソログである。最も好ましい一実施形態では、医薬組成物が、少なくとも1つのmiR-624*の阻害剤、またはmir-624*のホモログもしくはオルソログの阻害剤、少なくとも1つのhsa-miR-340*の阻害剤、またはhsa-mir-340*のホモログもしくはオルソログの阻害剤、および少なくとも1つのmiR-454*の阻害剤、またはmiR-454*のホモログもしくはオルソログの阻害剤を含む。
【００７１】
もう一つのより好ましい実施形態では、医薬組成物が、miRNAの阻害剤を少なくとも1つは含み、該miRNAがmiR-624*またはそのホモログもしくはオルソログである。より好ましい一実施形態では、医薬組成物が、少なくとも1つのさらなるmiRNAの阻害剤を含み、該miRNAがhsa-miR-340*またはそのホモログもしくはオルソログである。
【００７２】
そのような本発明の医薬組成物は、心血管疾患を処置し、低減し、遅延させかつ/または防止するのに、とりわけ有用である。それゆえに本発明は、心血管疾患を処置し、低減し、遅延させかつ/または防止するのに使用するための、本発明の医薬組成物を提供する。
【００７３】
「心血管疾患」という用語は、心臓、動脈および静脈を冒す広範囲にわたるさまざまな疾患を包含する。本発明によれば、心血管疾患は、好ましくは、動脈の狭小化を伴うか、動脈の狭小化の結果である。この狭小化は、動脈を塞ぐほど重症である場合もあるが、必ずしもそうではない。動脈のタイプは、末梢動脈（例えば腕または脚の末梢動脈疾患、脳卒中、腎不全、または血管性認知症をもたらすもの）であってもよいし、冠状動脈（例えば一過性虚血発作、急性冠症候群、または安定狭心症をもたらすもの）であってもよい。
【００７４】
それゆえに、好ましい一実施形態では、本発明の方法、本発明の阻害剤、本発明の医薬組成物および/またはmiRNAであって、該心血管疾患が、アテローム性動脈硬化、冠状動脈疾患、一過性虚血発作、脳卒中、末梢血管疾患、急性冠症候群、安定狭心症、血管性認知症、および腎不全からなる群より選択されるものが提供される。
【００７５】
miR-545:9.1、miR-624*、およびmiR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、およびhsa-miR-1280からなる群より選択されるmiRNAの血小板発現は、対象が心血管疾患を患うリスクを有するかどうかを予測するという洞察が、本発明により、ここに得られたので、本発明は、血小板miRNA発現を決定するためのキットも提供する。
【００７６】
したがって、ある実施形態において本発明は、miR-545:9.1、miR-624*、およびmiR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280、ならびにそのホモログおよびオルソログからなる群より選択される少なくとも1つのmiRNAに特異的に結合する能力を有する少なくとも1つの分子と、本発明の方法における当該キットの使用に関する説明書とを含む、キット・オブ・パーツを提供する。該キットは、場合により、1つ以上の対照および/または1つ以上の標準を含有してもよい。好ましい一実施形態では、該少なくとも1つのmiRNAが、hsa-miR-340*もしくはmiR-624*、またはhsa-miR-340*もしくはmiR-624*のホモログ、オルソログもしくはアナログである。
【００７７】
好ましい一実施形態において、該キットは、miR-545:9.1、miR-624*、およびmiR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280、ならびにそのホモログおよびオルソログからなる群より選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的に結合する能力を有する少なくとも2つの分子を含む。より好ましい一実施形態において、該キットは、miR-545:9.1、miR-624*、およびmiR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280、ならびにそのホモログおよびオルソログからなる群より選択される3つのmiRNAに特異的に結合する能力を有する少なくとも3つの分子、より好ましくは前記の群から選択される4つのmiRNAに特異的に結合する能力を有する少なくとも4つの分子、より好ましくは前記の群から選択される5つのmiRNAに特異的に結合する能力を有する少なくとも5つの分子、より好ましくは前記の群から選択される6つのmiRNAに特異的に結合する能力を有する少なくとも6つの分子、最も好ましくは前記の群から選択される7つのmiRNAに特異的に結合する能力を有する少なくとも7つの分子を含む。前記少なくとも2つの分子が全体として本発明の2つのmiRNAに結合すること、および各分子が好ましくは1つのmiRNAだけに結合することは言うまでもない。同じことが、前記少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、および少なくとも7つの分子についても言える。
【００７８】
好ましい一実施形態では、少なくとも2つのmiRNAに特異的に結合する能力を有する少なくとも2つの分子を含む本発明のキット・オブ・パーツであって、該少なくとも2つの分子の1つめがhsa-miR-340*またはhsa-miR-340*のオルソログもしくはホモログであり、該少なくとも2つの分子の2つめが、miR-624*、miR-454*、またはmiR-624*もしくはmiR-454*のオルソログもしくはホモログであるものが提供される。
【００７９】
最も好ましい一実施形態では、hsa-miR-340*および/またはhsa-miR-340*のホモログおよび/またはオルソログに特異的に結合する能力を有する少なくとも1つの分子、miR-624*および/またはmiR-624*のホモログおよび/またはオルソログに特異的に結合する能力を有する少なくとも1つの分子、ならびにmiR-454*および/またはmiR-454*のホモログおよび/またはオルソログに特異的に結合する能力を有する少なくとも1つの分子を含む、本発明のキット・オブ・パーツが提供される。
【００８０】
もう一つの実施形態では、miR-545:9.1、miR-624*、miR-454*、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される少なくとも2つのmiRNAに特異的に結合する能力を有する少なくとも2つの分子を含むキット・オブ・パーツが提供される。より一層好ましい該キットは、miR-545:9.1、miR-624*、miR-454*、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される少なくとも3つのmiRNAに特異的に結合する能力を有する少なくとも3つの分子を含む。
【００８１】
さらにもう一つの実施形態では、miR-545:9.1、miR-624*、およびmiR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280、ならびにそのホモログおよびオルソログからなる群より選択される少なくとも4つのmiRNAに特異的に結合する能力を有する少なくとも4つの分子を含むキット・オブ・パーツが提供される。より好ましい一実施形態では、該キットが、miR-545:9.1、miR-624*、およびmiR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280、ならびにそのホモログおよびオルソログからなる群より選択される5つのmiRNAに特異的に結合する能力を有する少なくとも5つの分子、より好ましくは前記の群から選択される6つのmiRNAに特異的に結合する能力を有する少なくとも6つの分子、最も好ましくは前記の群から選択される7つのmiRNAに特異的に結合する能力を有する少なくとも7つの分子を含む。
【００８２】
したがって上述のキットは、ある個体が心血管疾患を患っているかどうか、または心血管疾患を患うリスクを有するかどうかを決定するのに有用である。それゆえに、ある実施形態では、ある個体が心血管疾患を患っているかどうか、または心血管疾患を患うリスクを有するかどうかを決定するのに使用するための、本発明のキットの使用が提供される。
【００８３】
本発明のmiRNAに特異的に結合するさまざまな分子を使用することができる。好ましくは、該少なくとも1つの分子は、核酸分子または人工核酸分子である。核酸分子は、単量体型ヌクレオチドの鎖で構成される。例えば安定性を改善するために、核酸分子は人工的に修飾される。人工的に修飾されたそのような核酸分子は、定義上、アナログである。アナログには、例えばペプチド核酸、ならびに少なくとも1つの修飾ヌクレオチドおよび/または非天然ヌクレオチド、例えばイノシンを含む核酸配列、LNA、モルホリノRNAおよび2'-O-メチルRNAが含まれる。
【００８４】
本発明のキットにおいて使用するための、本発明のmiRNAに特異的に結合する能力を有する核酸分子は、当業者によって容易に同定される。少なくとも1つの本発明のmiRNAに特異的に結合する能力を有する核酸分子は、好ましくは、該少なくとも1つのmiRNAと少なくとも85％の相補的配列同一性を有する少なくとも7ヌクレオチドの配列を含む。より好ましい一実施形態では、該核酸分子は、少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、または少なくとも24個のヌクレオチドを含み、該少なくとも1つのmiRNAと少なくとも85％の相補的配列同一性を有する。より好ましい一実施形態では、該相補的配列同一性が少なくとも90％、少なくとも95％、または100％である。前述のように、相補的とは、miRNAとmiRNAアンチセンス分子の間のプリンとピリミジンの特異的対形成を意味する。したがって相補的配列同一性とは、当該核酸分子と当該miRNAのアンチセンスの間の配列同一性のパーセンテージを意味する。
【００８５】
そのようなキットはアレイの形態で提供することができる。アレイは、高スループットスクリーニングにはとりわけ有用である。それゆえに、さらにもう一つの実施形態において、本発明は、基盤上に固定化された分子を含むアレイであって、該分子の少なくとも1つまたはいくつかが、miR-545:9.1、miR-624*、およびmiR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280、ならびにそのホモログおよびオルソログからなる群より選択される少なくとも4つのmiRNAに特異的に結合する能力を有するものを提供する。もう一つの実施形態において、本発明は、基盤上に固定化された分子を含むアレイであって、該分子の少なくとも1つまたはいくつかが、miR-545:9.1、miR-624*、およびmiR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-1280、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される少なくとも3つ、好ましくは少なくとも4つ、より好ましくは少なくとも5つ、より好ましくは少なくとも6つのmiRNAに特異的に結合する能力を有するものを提供する。
【００８６】
好ましい一実施形態では、該分子の少なくとも一部がhsa-miR-340*および/またはhsa-miR-340*のホモログおよび/またはオルソログに特異的に結合する能力を有し、該分子の少なくとも一部がmiR-624*および/またはmiR-624*のホモログおよび/またはオルソログに特異的に結合する能力を有し、かつ該分子の少なくとも一部がmiR-454*および/またはmiR-454*のホモログおよび/またはオルソログに特異的に結合する能力を有する、本発明のアレイが提供される。
【００８７】
もう一つの実施形態において、本発明は、基盤上に固定化された分子を含むアレイであって、該分子の少なくとも1つまたはいくつかが、hsa-miR-545:9.1、hsa-miR-454*、hsa-miR-624*、ならびにそのホモログおよびオルソログからなる群より選択される少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つのmiRNAに特異的に結合する能力を有するものを提供する。さらにもう一つの実施形態において、本発明は、基盤上に固定化された分子を含むアレイであって、該分子の少なくとも1つまたはいくつかが、hsa-miR-545:9.1、hsa-miR-454*、hsa-miR-624*、ならびにそのホモログおよびオルソログからなる群より選択される少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つのmiRNAに特異的に結合する能力を有するものを提供する。好ましい一実施形態において、該少なくとも2つのmiRNAの1つめは  である。例えば、該miRNAのうちのいくつかに結合する、好ましくは少なくとも4つに結合する能力を有する、1つの分子を合成することは可能である。これは例えば、少なくとも1つのmiRNAと少なくとも85％の相補的配列同一性を有する少なくとも7ヌクレオチドの配列を含み、少なくとも1つの他のmiRNAと少なくとも85％の相補的配列同一性を有する少なくとも7ヌクレオチドの配列をさらに含むというような核酸分子を合成することによって達成される。それぞれが少なくとも1つのmiRNAと少なくとも85％の相補的配列同一性を有する少なくとも7ヌクレオチドの配列を含む、いくつかの分子を合成することも可能である。好ましくは、異なる分子が、本発明の他のmiRNAと少なくとも85％の相補的配列同一性を有する。より好ましい一実施形態では、該核酸分子（1つまたは複数）が、少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、または少なくとも24個のヌクレオチドを含み、該少なくとも1つのmiRNAおよび/または該少なくとも1つの他のmiRNAと少なくとも85％の相補的配列同一性を有する。より好ましい一実施形態では、該相補的配列同一性が少なくとも90％、少なくとも95％、または100％である。
【００８８】
本発明のアレイは、好ましくは、それぞれが1つのmiRNAに選択的に結合する分子を含む。アレイには、好ましくは、本発明の方法における該アレイの使用に関する説明書が添えられる。前述のように、本発明の異なるmiRNAに特異的に結合するさまざまな分子を使用することができる。好ましくは、本発明のアレイでは核酸分子またはアナログが使用される。
【００８９】
もう一つの好ましい実施形態では、該アレイ上に存在する複数の分子が、miR-545:9.1、miR-624*、およびmiR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280、ならびにそのホモログおよびオルソログからなる群より選択される少なくとも5つ、より好ましくは少なくとも6つ、より好ましくは少なくとも7つのmiRNAに特異的に結合する能力を有する。もう一つの好ましい実施形態では、該アレイ上に存在する複数の分子が、miR-545:9.1、miR-624*、およびmiR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-1280、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される少なくとも4つ、より好ましくは少なくとも5つ、より好ましくは少なくとも6つのmiRNAに特異的に結合する能力を有する。
【００９０】
ある実施形態において、本発明は、好ましくは、ある個体が心血管疾患を患っているかどうか、または心血管疾患を患うリスクを有するかどうかを決定するための、本発明の方法における本発明のアレイの使用を提供する。
【００９１】
ある人が心血管疾患を患っているかどうかまたは心血管疾患を患うリスクを有するかどうかを決定するために、いくつかの他のリスク要因が、本発明より前に使用されていた。これらの要因には、血圧、血中コレステロールレベル、血中グルコースレベル、喫煙習慣、年齢、該対象における血清中C反応性タンパク質レベル、家族歴、BMI、および/または胴囲が含まれるが、これらに限るわけではない。これらのリスク要因は、本発明の方法に加えて、依然として有用である。
【００９２】
したがって本発明は、心血管疾患に関するリスクを決定するために、血圧、血中コレステロールレベル、血中グルコースレベル、喫煙習慣、年齢、該対象における血清中C反応性タンパク質レベル、家族歴、BMI、および/または胴囲を考慮することをさらに含む、本発明の方法を提供する。当業者は、これらのパラメータの参照値と、異常値に関連するリスクとを知っている。
【００９３】
miRNAレベルは、当技術分野において知られている任意の方法によって決定することができる。当業者は具体的な状況に最も適した方法を選択することができる。好ましい一実施形態では、miRNAのレベルが、定量リアルタイムPCRなどのPCR、マイクロアレイ、RNaseプロテクションアッセイ、免疫学的方法、インサイチュー・ハイブリダイゼーション、および/または配列決定を使って検出される、本発明の方法が提供される。これらの方法は、当技術分野ではよく知られており、例えばSambrookの「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」（第3版、2001、Cold Spring Harbor Laboratory Press）などの実験書に公表されている。
【００９４】
血小板中の本発明のmiRNAのレベルは、ある人が心血管疾患を患っているかどうか、または心血管疾患を患うリスクを有するかどうかを示すという洞察が、本発明により、ここに得られたので、本発明は、心血管疾患を処置し、低減し、遅延させかつ/または防止するのに有用な化合物を同定するための方法も提供する。本発明では、本発明のmiRNAの発現が、心血管疾患を患っているまたは患うリスクを有する対象では変化しているという洞察を利用して、候補化合物が該発現を正常化する能力を有するかどうかを決定する。この文脈において「正常化する」とは、心血管疾患を患っているまたは患うリスクを有する対象においてその発現が増加している場合には、候補化合物が該発現を減少させる能力を有することを意味する。逆に、ある化合物が、心血管疾患を患っているまたは患うリスクを有する対象において減少しているmiRNAの発現を増加させる能力を有するのであれば、その化合物はmiRNAの発現を正常化する能力を有する。
【００９５】
したがって本発明は、心血管疾患を処置し、低減し、遅延させかつ/または防止するのに有用な化合物を同定するための方法であって、心血管疾患を患っているまたは患うリスクを有する対象の第1試料の血小板を、候補化合物と接触させること、該第1試料の該血小板の少なくとも1つのmiRNAの発現のレベルを、該候補化合物と接触させていない該対象の第2試料の血小板の少なくとも1つのmiRNAの発現と比較して決定することを含み、該少なくとも1つのmiRNAはmiR-545:9.1、miR-624*、およびmiR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択され、該第2試料における該少なくとも1つのmiRNAの発現と比較した該第1試料における該少なくとも1つのmiRNAの発現が、該化合物が心血管疾患を処置し、低減し、遅延させかつ/または防止するのに有用であるかどうかを示す方法を提供する。好ましくは、該少なくとも1つのmiRNAは、miR-545:9.1、miR-624*、およびmiR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-1280、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される。より好ましくは、該少なくとも1つのmiRNAは、miR-545:9.1、miR-624*、miR-454*、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される。該少なくとも1つのmiRNAがhsa-miR-340*またはmiR-340*のホモログもしくはオルソログであることも好ましい。
【００９６】
好ましい一実施形態では、心血管疾患を処置し、低減し、遅延させかつ/または防止するのに有用な化合物を同定するための本発明の方法であって、心血管疾患を処置し、低減し、遅延させかつ/または防止するのに有用であると同定された化合物を選択しかつ/または単離することをさらに含む方法が提供される。
【００９７】
好ましい一実施形態では、心血管疾患を処置し、低減し、遅延させかつ/または防止するのに有用な化合物を同定するための本発明の方法であって、該少なくとも1つのmiRNAがhsa-miR-340*またはhsa-miR-340*のホモログもしくはオルソログであり、該方法が、miR-624*、miR-454*、miR-545:9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択されるさらなるmiRNAの発現のレベルを決定することをさらに含み、該第1試料の該さらなるmiRNAの発現と組み合わされた該hsa-miR-340*またはhsa-miR-340*のホモログもしくはオルソログの発現のレベルと比較した、該第2試料の該さらなるmiRNAの発現と組み合わされた該hsa-miR-340*またはhsa-miR-340*のホモログもしくはオルソログの発現のレベルが、該抗血小板治療の効果を示し、該対象が、該第1試料と該第2試料の間に抗血小板治療を受けている方法が提供される。
【００９８】
より好ましい一実施形態では、心血管疾患を処置し、低減し、遅延させかつ/または防止するのに有用な化合物を同定するための本発明の方法であって、該さらなるmiRNAが、miR-624*、miR-454*、hsa-miR-451、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される方法が提供される。より好ましい一実施形態では、該さらなるmiRNAがmiR-454*である。
【００９９】
最も好ましい一実施形態では、心血管疾患を処置し、低減し、遅延させかつ/または防止するのに有用な化合物を同定するための本発明の方法であって、該さらなるmiRNAがmiR-624*またはmiR-624*のホモログもしくはオルソログであり、該方法が、miR-454またはmiR-454のホモログもしくはオルソログの発現のレベルを決定することをさらに含み、該第1試料のmiR-624*またはmiR-624*のホモログもしくはオルソログの発現と組み合わされた、およびmiR-454またはmiR-454のホモログもしくはオルソログの発現と組み合わされた、該hsa-miR-340*またはhsa-miR-340*のホモログもしくはオルソログの発現のレベルと比較した、該第2試料のmiR-624*またはmiR-624*のホモログもしくはオルソログの発現と組み合わされた、およびmiR-454またはmiR-454のホモログもしくはオルソログの発現と組み合わされた、該hsa-miR-340*またはhsa-miR-340*のホモログもしくはオルソログの発現のレベルが、該抗血小板治療の効果を示し、該対象が、該第1試料と該第2試料の間に抗血小板治療を受けている方法が提供される。
【０１００】
もう一つの好ましい実施形態では、心血管疾患を処置し、低減し、遅延させかつ/または防止するのに有用な化合物を同定するための本発明の方法であって、該少なくとも1つのmiRNAがmiR-624*またはhsa-miR-624*のホモログもしくはオルソログであり、該方法が、hsa-miR-340*、miR-454*、miR-545:9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択されるさらなるmiRNAの発現のレベルを決定することをさらに含み、該第1試料の該さらなるmiRNAの発現と組み合わされた該miR-624*またはmiR-624*のホモログもしくはオルソログの発現のレベルと比較した、該第2試料の該さらなるmiRNAの発現と組み合わされた該miR-624*またはmiR-624*のホモログもしくはオルソログの発現のレベルが、該抗血小板治療の効果を示し、該対象が、該第1試料と該第2試料の間に抗血小板治療を受けている方法が提供される。
【０１０１】
より好ましい一実施形態では、心血管疾患を処置し、低減し、遅延させかつ/または防止するのに有用な化合物を同定するための本発明の方法であって、該さらなるmiRNAが、hsa-miR-340*、miR-454*、hsa-miR-451、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される方法が提供される。
【０１０２】
本発明の方法を使って抗血小板治療の効果をモニタリングすることも可能である。抗血小板治療では、血小板と相互作用する薬物を利用して、血小板が有害な凝血塊へと凝集するのを阻止する。抗血小板薬には、アスピリン、チクロピジン（Ticlid（登録商標））、クロピドグレル（Plavix（登録商標））、チロフィバン（Aggrastat（登録商標））、およびエプチフィバチド（Integrilin（登録商標））などがある。前述のように、心血管疾患を患うリスクを有する人々には、アスピリン治療にあまりよく応答しない人が、高い割合で存在する。本発明の方法では、そのような非応答者が同定され、他の医薬品に切り換えることができる。
【０１０３】
それゆえに、ある実施形態において、本発明は、対象における抗血小板治療の効果をモニタリングするための方法であって、対象の第1試料の少なくとも1つのmiRNAの発現のレベルを、該対象の第2試料の該少なくとも1つのmiRNAの発現のレベルと比較して決定することを含み、該少なくとも1つのmiRNAは、miR-545:9.1、miR-624*、およびmiR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択され、該第1試料の該少なくとも1つのmiRNAの発現のレベルと比較した該第2試料の該少なくとも1つのmiRNAの発現のレベルが、該抗血小板治療の効果を示し、該第1試料と該第2試料が採取される間に該対象が抗血小板治療を受けている方法を提供する。好ましくは、該少なくとも1つのmiRNAは、miR-545:9.1、miR-624*、およびmiR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-1280、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される。より好ましくは、該少なくとも1つのmiRNAが、miR-545:9.1、miR-624*、miR-454*、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される。好ましい一実施形態では、抗血小板治療の効果をモニタリングするための本発明の方法であって、該対象が心血管疾患を患っているか、または心血管疾患を患うリスクを有する方法が提供される。
【０１０４】
抗血小板治療に対する効果をモニタリングするための本発明の方法に使用される試料は、好ましくは、血小板を含む。しかし、試料中の血小板がまだ無傷であること、および/またはmiRNAがまだ血小板内に存在することは、その発現のレベルを決定するためには必要でない。例えば、本発明の方法では全血試料または血小板濃縮血漿試料を使用することができる。
【０１０５】
好ましい一実施形態では、対象における抗血小板治療の効果をモニタリングするための方法であって、該少なくとも1つのmiRNAがhsa-miR-340*またはhsa-miR-340*のホモログもしくはオルソログであり、該方法が、miR-624*、miR-454*、miR-545:9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択されるさらなるmiRNAの発現のレベルを決定することをさらに含み、該第1試料の該さらなるmiRNAの発現と組み合わされた該hsa-miR-340*またはhsa-miR-340*のホモログもしくはオルソログの発現のレベルと比較した、該第2試料の該さらなるmiRNAの発現と組み合わされた該hsa-miR-340*またはhsa-miR-340*のホモログもしくはオルソログの発現のレベルが、該抗血小板治療の効果を示し、該対象が、該第1試料と該第2試料の間に抗血小板治療を受けている方法が提供される。
【０１０６】
より好ましい一実施形態では、対象における抗血小板治療の効果をモニタリングするための方法であって、該さらなるmiRNAがmiR-624*、miR-454*、hsa-miR-451、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される方法が提供される。より好ましい一実施形態では、該さらなるmiRNAがmiR-454*またはそのホモログもしくはオルソログである。
【０１０７】
最も好ましい一実施形態では、対象における抗血小板治療の効果をモニタリングするための方法であって、該さらなるmiRNAがmiR-624*またはmiR-624*のホモログもしくはオルソログであり、該方法が、miR-454またはmiR-454のホモログもしくはオルソログの発現のレベルを決定することをさらに含み、該第1試料のmiR-624*またはmiR-624*のホモログもしくはオルソログの発現と組み合わされた、およびmiR-454またはmiR-454のホモログもしくはオルソログの発現と組み合わされた、該hsa-miR-340*またはhsa-miR-340*のホモログもしくはオルソログの発現のレベルと比較した、該第2試料のmiR-624*またはmiR-624*のホモログもしくはオルソログの発現と組み合わされた、およびmiR-454またはmiR-454のホモログもしくはオルソログの発現と組み合わされた、該hsa-miR-340*またはhsa-miR-340*のホモログもしくはオルソログの発現のレベルが、該抗血小板治療の効果を示し、該対象が、該第1試料と該第2試料の間に抗血小板治療を受けている方法が提供される。
【０１０８】
もう一つの好ましい実施形態では、対象における抗血小板治療の効果をモニタリングするための方法であって、該少なくとも1つのmiRNAがmiR-624*またはmiR-624*のホモログもしくはオルソログであり、該方法が、hsa-miR-340*、miR-454*、miR-545:9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択されるさらなるmiRNAの発現のレベルを決定することをさらに含み、該第1試料の該さらなるmiRNAの発現と組み合わされた該miR-624*またはmiR-624*のホモログもしくはオルソログの発現のレベルと比較した、該第2試料の該さらなるmiRNAの発現と組み合わされた該miR-624*またはmiR-624*のホモログもしくはオルソログの発現のレベルが、該抗血小板治療の効果を示し、該対象が、該第1試料と該第2試料の間に抗血小板治療を受けている方法が提供される。
【０１０９】
より好ましい一実施形態では、対象における抗血小板治療の効果をモニタリングするための方法であって、該さらなるmiRNAが、hsa-miR-340*、miR-454*、hsa-miR-451、ならびにこれらのmiRNAのいずれかのホモログおよびオルソログからなる群より選択される方法が提供される。
【０１１０】
以下に非限定的な実施例を挙げて本発明をさらに例証する。これらの実施例は決して本発明の範囲を限定しない。
【実施例】
【０１１１】
[図面の説明]
図１. 24人の被検者（x軸上に試料識別）の発現プロファイルに関する教師あり階層的クラスタリング解析のヒートマップである。図の上部に被検者を対照（灰色）か症例（黒色）かに分類表示している。図示した214の差異的に発現するmiRNA（調整P＜0.05）の名称を表IIに同じ順序で列挙する。色コードグレースケールバーは、正規化されたmiRNA発現レベルを示す（濃い灰色は相対的に低い発現を示し、明るい灰色は相対的に高い発現を示す）。
図２. CAD患者および対照被検者の血小板における7つの候補miRNAの発現プロファイル。各図の左側にある2本のバーは、miRNAアレイによって決定された、12人の健常対照と12人のCAD患者の平均miRNA発現を表す。同じデータセットでリアルタイムPCRによる検証を行った（右側にある2本のバー）。データを平均±SEMとして表し、*は健常対照と比べてp＜0.05を示す。
図３. CAD患者および対照被検者の血小板における6つの候補miRNAの発現プロファイル。各図の左側にある2本のバーは、miRNAアレイコホート（対照12人および患者12人）の平均miRNA発現を表す。2つの独立したコホートでリアルタイムPCRによる検証を行った（右側にある4本のバー）。データを平均±SEMとして表し、*は健常対照と比べてp＜0.05を示す。
【０１１２】
［実施例1］
計画および方法
研究対象集団
CADに関する遺伝的素因5を有する研究対象集団を作成するために、本発明者らは、若年でのCAD（早発性CAD）と早発性心血管疾患（CVD）の陽性家族歴とを有する白人男性患者12人の群を選択した。これらの患者はCADに関する持続的リスクを伴う「極端な」表現型を有する。それゆえにこの群はCADにおける血小板特異的miRNAの役割を調べるのに理想的である。患者は、早発性CADを専門とする、アムステルダムにあるAcademic Medical Centre（AMC）の、本発明者らの外来診療所から選択された。対照群は、広告によって募った12人の健常な白人男性ボランティアで構成された。この対照群はCVDの病歴も陽性家族歴も持たず、いかなる医薬品の使用も許されなかった。この研究はヘルシンキ宣言に適合し、研究プロトコールはアムステルダムにあるAMCの医療倫理委員会によって承認され、全ての被検者から書面によるインフォームド・コンセントを得た。
【０１１３】
定義
早発性CADは、51歳より前の心イベントと定義した。早発性CVDの陽性家族歴は、早発性CVD（男性＜51歳および女性＜56歳）を有する一親等家族が1人以上または二親等家族が2人以上と定義した。CADは、急性心筋梗塞（AMI）または安定狭心症（SAP）のどちらか一方と定義した。AMIは、症状または心電図上の変化によって臨床的に診断され、心壊死のマーカーの上昇した血漿中レベルによって確認された。SAPは症状によって臨床的に診断され、冠動脈造影によって示される著しい冠状動脈狭窄によって確認された。リスク要因は次のように定義した：高血圧、高血圧に対する既知の処置；真性糖尿病、真性糖尿病に対する既知の処置；肥満、ボディマス指数（BMI）＞30kg/m2；高コレステロール血症、高コレステロール血症に対する既知の処置。
【０１１４】
末梢血の収集と血小板の単離
非空腹時静脈血試料を、19ゲージ針を使って、肘前静脈から血行静止なしで採取した。血液を、5本のクエン酸三ナトリウムチューブ（それぞれ5mLで0.5mLの0.105Mクエン酸三ナトリウムを含有するもの。BD Vacutainer）に収集し、最初の1つを捨てた。採血後直ちに試料を遠心分離（180g、15分、室温、ブレーキなし）することで、多血小板血漿（PRP）を得た。ポリプロピレン製ピペットを使用し、白血球汚染を避けるためにPRPの少なくとも25％を残して、PRPをプラスチックチューブに注意深く移した。1部の酸性クエン酸デキストロース（ACD）バッファー（0.085Mクエン酸三ナトリウム、0.11Mグルコース、0.071Mクエン酸）を5部のPRPに加え、次に、そのPRPを遠心分離した（800g、20分、室温、ブレーキなし）。乏血小板血漿を捨て、血小板ペレットをタイロードバッファー（136.9mM NaCl、2.61mM KCl、11.9mM NaHCO3、5.55mMグルコース、2mM EDTA、pH6.5）に注意深く再懸濁した。その血小板懸濁液を遠心分離した（800g、20分、室温、ブレーキなし）。上清を捨て、血小板ペレットを50μlの滅菌リン酸緩衝食塩水（PBS）に再懸濁し、RNA単離前に−80℃で保存した。単離された血小板を蛍光活性化細胞選別（FACS）によって汚染について調べ、CD45−APC（BD Biosciences）、CD235a−FITC（DAKO）およびCD61−PE（BD Biosciences）に対するモノクローナル抗体を使用して、それぞれ白血球、赤血球および血小板を同定した。単離された血小板の純度は99.72％だった。
【０１１５】
RNA抽出とmiRNA発現プロファイリング
mirVana PARISキット（Ambion, Inc.）を使用し、製造者の液状試料用プロトコールに本質的に従って、血小板から全RNAを抽出した。試料を等体積の酸性フェノール・クロロホルムで2回抽出し、最後の洗浄ステップ後、溶出前に、カラムを3分間乾燥させるように、プロトコールを変更した。試料を50μlから12μlに濃縮し、そのうちの5μlをアレイに使用した。
【０１１６】
miRNA発現プロファイルは、Illumina Human v2 MicroRNA BeadArraysを製造者の推奨（Illumina, Inc.、カリフォルニア州サンディエゴ）に従って使用して、ServiceXS（オランダ・ライデン）において得られた。統計ソフトウェアパッケージR（バージョン2.9.0）でbeadarrayパッケージ（バージョン1.12.1）を使って、生データを前処理し、要約し、対数変換し、分位数正規化を行った。limmaパッケージ（バージョン2.18.3）を使用し、モデレーテッド（moderated）t検定を使って、差異的発現を評価した。Benjamini-Hochberg法を使用することによって多重検定に関して調整されたP値が0.05未満であるならば、miRNAは、有意に差異的に発現すると見なした。差異的に発現するmiRNA（調整p＜0.05）を、試料の階層的クラスタリング（ユークリッド距離、完全連結法）によって視覚化した。詳細な情報についてはオンラインの補足データを参照されたい。
【０１１７】
定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応による発現解析
マイクロアレイ解析を検証するために、患者と対照の間で差異的に発現されるmiRNAを、リアルタイムPCRのために選択した。RNA単離からの溶出液を8μlの固定液量で、逆転写反応におけるインプットとして使用した。miScript逆転写キット（Qiagen）を使ってインプットRNAを逆転写した。リアルタイムPCRは、High Resolution Melting Master（Roche）を使って、LightCycler480システムII（Roche）で行った。データはLinRegPCR定量PCRデータ解析ソフトウェア・バージョン11.3.3を使って解析した6。N0値の算出後に、データを内在性対照RNU6B（Applied Biosystems）に対して正規化した。詳細な情報についてはオンラインの補足データを参照されたい。
【０１１８】
結果
臨床的特徴
調査された被検者の臨床的特徴を表1に示す。糖尿病および肥満を有することがわかっている被検者は一人もいなかった。
【０１１９】
末梢血小板のmiRNAシグネチャー
マイクロアレイプロファイリングにより、血小板に検出された893の成熟ヒトmiRNAのうちの214は、CADを有する患者と健常対照との間で差異的に発現すると同定された（調整p＜0.05）。これら214のmiRNAを、miRNA発現プロファイルの類似性に基づいて被検者をクラスター化する教師あり階層的クラスタリング解析に使用した（図1）。このクラスタリング解析により、血小板由来miRNAのサブセットはCAD患者と健常対照とを区別できることが明らかになった。これらの214の差異的に発現するmiRNAのうち、9個のmiRNAは、対象と比べて患者では少なくとも1.5倍アップレギュレートされていた。さらにまた、4つのmiRNAは、対象と比べて患者では少なくとも1.5倍ダウンレギュレートされていた。本発明者らのデータのロバストネスを検証するために、本発明者らは、上述の外れ試料なしでも、本発明者らのデータを解析した。本発明者らが外れ値のどの組合せを省いたかにかかわりなく、6つのmiRNAは依然として有意にアップレギュレートされており、1つのmiRNAは依然として有意にダウンレギュレートされていた。アップレギュレートされるmiRNAはmiR-340*、miR-615-5p、miR-545:9.1、miR-451、miR-454*およびmiR-624*であり、ダウンレギュレートされるmiRNAはmiR-1280だった（図2参照）。
【０１２０】
リアルタイムPCRによるmiRNAアレイデータの検証
6つのアップレギュレートされるmiRNAと1つのダウンレギュレートされるmiRNAのアレイデータを、同じ集団において、リアルタイムPCRで検証した。2人の対照被検者は、RNU6B（本発明者らの内在性対照）の発現レベルが他の試料と比べて一貫して範囲外にあったので、この解析から除外した。6つのアップレギュレートされるmiRNAは全て、リアルタイムPCRでも、アップレギュレートされることが示されたが、PCRで統計的に有意なのは3つだけだった（miR-545:9.1、miR-624*およびmiR-454*；p＜0.05）。唯一のダウンレギュレートされるmiRNAは、確認することができなかった（図2参照）。他の3つのアップレギュレートされるmiRNAおよびmiR-1280を確認するために、現在、PCRの条件および試料サイズを最適化している。
【０１２１】
［実施例2］
計画および方法
研究対象集団
検証コホート
マイクロアレイデータの知見を確認するために、2つの独立した検証コホートにおいて、単離された血小板での、選ばれたmiRNAの発現レベルを、qRT-PCRによって測定した。
【０１２２】
検証コホートI
検証コホートIは、40人の早発性男性CAD被検者と40人の年齢適合男性対照とからなった。これらの対照も広告によって募った。参加者は、miRNAアレイ解析に使用した集団と同じ方法で、同一の組み入れ基準、除外基準および適合基準を使って選択した。データ収集は、CADの診断後、長年にわたって行われた。組み入れは2009年12月から2010年6月まで行われた。27人の対照被検者には、医薬品の使用前と使用後にmiRNA発現を評価することができるように、この研究に2回参加するように依頼した。これについては、彼らに、アセチルサリチル酸100mgを1日1回、シンバスタチン40mgを1日1回、8週間にわたって服用するように依頼した。
【０１２３】
検証コホートII
検証コホートIIは、早発性CADの有病率が高い4家族の構成員である、27人のアテローム性動脈硬化患者と、40人の健常家族構成員とからなった。これらの4家族は外来診療所において選別した。CADの徴候または愁訴がない家族構成員は、無症状のCADを評価するために冠動脈CTスキャンを受けた。症例は、CADの病歴を有することまたは冠動脈カルシウムスコア＞80パーセンタイルと定義した。対照は、CADの徴候も愁訴も伴わずかつ冠動脈カルシウムスコア＜80パーセンタイルであることと定義した。
【０１２４】
定義
早発性CADは、男性については51歳より前の、女性については56歳より前の、心イベントと定義した。早発性心血管疾患（CVD）の陽性家族歴は、早発性CVDを有する一親等家族が1人以上または二親等家族が2人以上と定義した。CADは、急性心筋梗塞（AMI）または安定狭心症のどちらか一方と定義した。AMIは、症状または心電図上の変化によって臨床的に診断され、心壊死のマーカーの上昇した血漿中レベルによって確認され、冠動脈造影によって示される冠状動脈閉塞、一枝病変によって確認された。安定狭心症は症状によって臨床的に診断され、冠動脈造影によって示される少なくとも2枝における著しい冠状動脈狭窄（＞70％）によって確認された。リスク要因は次のように定義した：高血圧：高血圧に対する処置、または半時間のDanimap測定で無処置収縮期血圧＞140mmHgもしくは拡張期血圧＞90mmHgが3回独立して測定されること；過体重：BMI＞25kg/m2；高コレステロール血症：総無処置コレステロールレベル＞8mmol/lまたはイベント前の高コレステロール血症に対する処置；喫煙：喫煙中；真性糖尿病：空腹時グルコース＞6.9mmol/lもしくは非空腹時＞11.1mmol/lが2回独立して測定されること、または真性糖尿病に対する既知の処置。
【０１２５】
上述のコホートはいずれもヘルシンキ宣言に適合している。研究プロトコールはアムステルダムにあるAMCの医療倫理委員会によって承認され、全ての被検者から書面によるインフォームド・コンセントを得た。
【０１２６】
末梢血の収集と血小板の単離
非空腹時静脈血試料を、19ゲージ針を使って、肘前静脈から血行静止なしで採取した。血液を、5本のクエン酸三ナトリウムチューブ（それぞれ5mlで0.5mlの0.105Mクエン酸三ナトリウムを含有するもの。BD Vacutainer）に収集した。最初の試料は解析には使用しなかった。採血後直ちに試料を遠心分離（180g、室温で15分、ブレーキなし）することで、多血小板血漿（PRP）を得た。ポリプロピレン製ピペットを使用し、白血球汚染を避けるために、PRPの上層をプラスチックチューブに注意深く移した。1部の酸性クエン酸デキストロース（ACD）バッファー（0.085Mクエン酸三ナトリウム、0.11Mグルコース、0.071Mクエン酸）を5部のPRPに加え、そのPRPを遠心分離した（800g、室温で20分、ブレーキなし）。乏血小板血漿を捨て、血小板ペレットをタイロードバッファー（136.9mM NaCl、2.61mM KCl、11.9mM NaHCO3、5.55mMグルコース、2mM EDTA、pH6.5）に注意深く再懸濁した。その血小板懸濁液を遠心分離した（800g、室温で20分、ブレーキなし）。上清を捨て、血小板ペレットを50μlの滅菌リン酸緩衝食塩水（PBS）に再懸濁し、RNA単離前に−80℃で保存した。単離された血小板を蛍光活性化細胞選別（FACS）によって調べ、CD45（BD Biosciences）、CD235a（DAKO）およびCD61（BD Biosciences）に対するモノクローナル抗体を使用して、白血球、赤血球および血小板を同定した。単離された血小板の純度はFACS分析で99.72％だった。
【０１２７】
RNAの単離
mirVana PARISキット（Ambion, Inc.）を使用し、製造者の液状試料用プロトコールに従って、血小板RNAを単離した。試料を等体積の酸性フェノール・クロロホルムで2回抽出し、最後の洗浄ステップ後、溶出前に、カラムを3分間乾燥させるように、プロトコールを変更した。試料を50μlから12μlに濃縮し、そのうちの5μlを後述のようにIlluminaアレイに使用した。
【０１２８】
定量リアルタイムPCRによる発現解析
マイクロアレイ解析を検証するために、患者と対照の間で差異的に発現されるmiRNAを、リアルタイムPCRのために選択した。RNA単離からの溶出液を8μlの固定液量で、逆転写反応におけるインプットとして使用した。miScript逆転写キット（Qiagen）またはTaqMan MicroRNA逆転写キット（Applied Biosystems）を使ってインプットRNAを逆転写した。miR340*、miR451、およびmiR624*のリアルタイムPCRは、High Resolution Melting Master（Roche）を使って行った。miR454*、miR545:9.1およびmiR615-5pのリアルタイムPCRは、TaqMan MicroRNAアッセイ（Applied Biosystem）およびLightCycler 480 Probe Master（Roche）を使って行った。どちらのリアルタイムPCRもLightCycler480システムII（Roche）で行った。MiR340*、miR451、およびmiR624*は、LinRegPCR定量PCRデータ解析ソフトウェア・バージョン12.3を使って解析した。MiR454*およびmiR545:9.1は、LinRegPCR定量PCRデータ解析ソフトウェア・バージョン12.5を使って解析した。今のところ、miRNA含有量を正規化し検証するための正規化プロトコールは確立されていない。この目的のために、N0値の算出後に、データを、血小板数と、全ての被検者で同じように発現したmiRNA233との両方に関して、正規化した。結果は、Statistical Package for the Social Sciences（SPSS）for Windows(登録商標)、バージョン11.10（SPSS、イリノイ州シカゴ）を使って、平均±SEMとして表す。正規分布ではなかったので、miRNAを対数変換した。全ての解析について、p値＜0.05が統計的有意差を表すとみなした。
【０１２９】
結果
候補miRNAの検証
検証コホートI
マイクロアレイ解析によって同定された7つの差異的に発現するmiRNAを、まず最初に、検証コホートIにおいて、リアルタイムPCRによって検証した。このコホートは、早発性CADを有する40人の選ばれた患者と、40人の健常適合対照とからなった。アレイ解析で観察された7つのmiRNAのうち2つのmiRNA、すなわちmiR340*およびmiR624*が、対照と比べて患者では有意にアップレギュレートされていた（図3）。
【０１３０】
検証コホートII
1回目の検証後に、本発明者らは、自らの結果を、本発明者らの早発性CAD外来診療所の患者の、より一般的な第2のコホートで検証した。このコホートは、27人の患者と40人の家族構成員とを含む、4家族からなった。アレイ解析において観察された7つのmiRNAのうち、2つのmiRNA、すなわちmiR340*およびmiR624*が、対照と比べて患者では有意にアップレギュレートされていた（図3）。
【０１３１】
医薬品使用と血小板miRNA発現
医薬品の使用が、2つの候補miRNA、すなわちmiR340*とmiR624*のmiRNA発現レベルに影響を有しうるかどうかを調べるために、方法の項で説明したように医薬品を使用した対照個体および医薬品を使用していない対照個体において、これらのmiRNAの発現を決定した。興味深いことに、医薬品は結果を変化させなかった。
【０１３２】
【表１】
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【０１３３】
［表2］図1に示した214の差異的に発現するmiRNAの名称（調整p＜0.05）
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【０１３４】
【表３】
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【０１３５】
参考文献
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2．Ji X, Takahashi R, Hiura Y, Hirokawa G, Fukushima Y, Iwai N. Plasma miR-208 as a biomarker of myocardial injury. Clin Chem 2009;55:1944-9.
3．Ai J, Zhang R, Li Y, Pu J, Lu Y, Jiao J, Li K, Yu B, Li Z, Wang R, Wang L, Li Q, Wang N, Shan H, Li Z, Yang B. Circulating microRNA-1 as a potential novel biomarker for acute myocardial infarction. Biochem Biophys Res Commun 2010;391:73-7. 
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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