(57)【要約】 2013501765.tif 000087  本発明は、チオール化合物中のチオール基を保護するための試薬としての、式（Ｉ）の部分を含む化合物の使用に関する（式中、Ｘ、Ｘ’及びＹは、本明細書中に記載したとおりである）。本発明の保護基方法論は、単純かつ選択的なチオール基の保護を可能にする。チオール基を切断してチオール官能基を再生することもまた、容易かつ制御可能である。本発明はさらに、ジスルフィド基の保護に関する類似の保護基方法論を提供する。【選択図】なし
2013501765.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
チオール化合物中のチオール基を保護するための試薬としての、式（Ｉ）の部分を含む化合物の使用：
【化１】
2013501765.tif 000081
式中、
Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＲ１の基を示し、Ｒ１は、水素、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル又はフェニルであり、
Ｙは求電子性脱離基である。
【請求項２】
式（Ｉ）の部分を含む化合物が、式（Ｉａ）の化合物である、請求項１に記載の使用：
【化２】
2013501765.tif 000082
式中、
Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＲ１の基を示し、Ｒ１は、水素、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル又はフェニルであり；
Ｙは求電子性脱離基であり；
Ｒ２は、水素原子又は基ＩＧを示し；
以下のいずれかであり：
Ｒ３及びＲ３’は、同じ又は異なって、それぞれ水素原子又は基ＩＧを示す；又は
Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３’）の基を形成し、Ｒ３３’は水素原子又は基ＩＧを示す；又は
Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３’）−Ｎ（Ｒ３３’）−の基を形成し、各Ｒ３３’は、同じ又は異なって、水素原子又は基ＩＧを示す；
各基ＩＧは、同じ又は異なって、非置換であるか又は１個以上のハロゲン原子で置換されている、Ｃ１−２０アルキル基、Ｃ２−２０アルケニル基又はＣ２−２０アルキニル基である部分を示し、式中、（ａ）０、１又は２個の炭素原子は、Ｃ６−１０アリーレン、５〜１０員のヘテロアリーレン、Ｃ３−７カルボシクリレン及び５〜１０員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されており、かつ（ｂ）０、１又は２個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−及び−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−基から選択される基によって置換されており、式中、
（ｉ）該アリーレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオール、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）及びニトロ基から選択される１個以上の置換基によって置換されており；
（ｉｉ）該カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基中の０、１又は２個の炭素原子は、−Ｃ（Ｏ）−基によって置換されている。
【請求項３】
Ｙが、ハロゲン原子又はトリフレート、トシレート、メシレート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル、Ｃ１−６アルキルチオール、５〜１０員のヘテロシクリルチオール、Ｃ６−１０アリールチオール、Ｃ３−７カルボシクリルチオール、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３、−ＯＣ（Ｏ）ＣＦ３、フェニルオキシ、−ＮＲｘＲｙＲｚ＋若しくは−ＰＲｘＲｙＲｚ＋基であり、式中、Ｒｘ、Ｒｙ及びＲｚは、同じ又は異なって、水素原子並びにＣ１−６アルキル及びフェニル基から選択される、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
Ｙが、ハロゲン原子又はＣ１−６アルキルチオール、５〜１０員のヘテロシクリルチオール、Ｃ６−１０アリールチオール若しくはＣ３−７カルボシクリルチオール基である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
Ｘ及びＸ’がそれぞれ酸素を示す、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
ＩＧが、非置換のＣ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基又はＣ２−６アルキニル基である部分を示し、式中、（ａ）０又は１個の炭素原子は、フェニレン、５〜６員のヘテロアリーレン、Ｃ５−６カルボシクリレン及び５〜６員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されており、該フェニレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにＣ１−４アルキル及びＣ１−４アルコキシ基から選択される１又は２個の置換基によって置換されており、かつ（ｂ）０、１又は２個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−及び−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−基から選択される基によって置換されている、
請求項２〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
ＩＧが、非置換のＣ１−６アルキル基である部分を示し、式中、（ａ）０又は１個の炭素原子は、非置換のフェニレン、５〜６員のヘテロアリーレン、Ｃ５−６カルボシクリレン及び５〜６員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されており、かつ（ｂ）０又は１個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−ＮＨ−及び−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−基から選択される基によって置換されている、
請求項６に記載の使用。
【請求項８】
ＩＧが、非置換のＣ１−６アルキル又はフェニル基を示す、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
Ｒ３、Ｒ３’及びＲ３３’がそれぞれ基ＩＧを示す、請求項２〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
式（Ｉａ）の化合物が式（Ｉｂ）の化合物
【化３】
2013501765.tif 000083
（式中、Ｘ、Ｘ’、Ｙ、Ｒ２及びＲ３３’は全て、請求項２〜９のいずれか１項に記載したとおりである）
である、請求項２〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
Ｘ及びＸ’がそれぞれ酸素原子を示し；
Ｒ３３’が水素原子又はＣ１−６アルキル基を示し；
Ｙがハロゲン原子を示し；
Ｒ２が水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す、
請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
チオール化合物が、システイン、又は少なくとも１個のシステイン残基を含むペプチド若しくはタンパク質である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
（ｉ）請求項１又は１２に記載のチオール化合物を、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の部分を含む化合物と反応させて、保護されたチオール基を有する化合物を産生する工程；及び
（ｉｉ）その後、該保護されたチオール基を脱保護する工程、
を含む、プロセス。
【請求項１４】
保護されたチオール基を脱保護する工程が、該保護されたチオール基を、コンジュゲート付加反応において求核剤として作用できる試薬と反応させることによってもたらされる、請求項１３に記載のプロセス。
【請求項１５】
試薬が、ホスフィン化合物又はチオールである、請求項１４に記載のプロセス。
【請求項１６】
試薬が、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、１，２−エタンジチオール、グルタチオン、２−メルカプトエタノール又はジチオスレイトールである、請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１７】
式（ＩＩ）の化合物：
【化４】
2013501765.tif 000084
式中、
Ｘ、Ｘ’、Ｒ２、Ｒ３及びＲ３’は全て、請求項２〜１１のいずれか１項に記載したとおりであり、Ｑは、カルボキシル基又は保護されたカルボキシル基であり、Ｑ’は、アミン基又は保護されたアミン基であり；
ただし、式（ＩＩ）の化合物は、１４Ｃ−Ｎ−エチルマレイミド−Ｓ−システインでも１４Ｃ−Ｎ−エチルマレイミド−Ｓ−Ｎ−アセチル−システインでもない。
【請求項１８】
Ｑがカルボキシル基であり、Ｑ’が保護されたアミン基である、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
ジスルフィド化合物中のジスルフィド基を保護するための試薬としての、式（ＩＩＩ）の部分を含む化合物の使用：
【化５】
2013501765.tif 000085
式中、
Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＲ１の基を示し、Ｒ１は、水素、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル又はフェニルであり；
Ｙ及びＹ’は、同じ又は異なって、それぞれ求電子性脱離基を示す。
【請求項２０】
式（ＩＩＩ）の部分を含む化合物が、式（ＩＩＩａ）の化合物である、請求項１９に記載の使用：
【化６】
2013501765.tif 000086
式中、
Ｘ、Ｘ’、Ｙ、Ｒ３及びＲ３’は全て、請求項２〜１１のいずれか１項に記載したとおりであり、Ｙ’はさらなる基Ｙであり、各基Ｙは同じ又は異なる。
【請求項２１】
（ｉ）ジスルフィド化合物中のジスルフィド基を、請求項１９又は２０に記載の式（ＩＩＩ）の部分を含む化合物と反応させて、保護されたジスルフィド基を有する化合物を産生する工程；及び
（ｉｉ）その後、該保護されたジスルフィド基を脱保護する工程、
を含む、プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（導入）
複雑な有機分子の合成はしばしば、複数の化学的に反応性の官能基を保有する試薬に対して化学変換を実施することを含む。かかるプロセスの重要な局面は、他の官能基に関与する望ましくない副反応を抑制しつつ、特定の官能基で所望の化学変換をもたらす必要性である。従って、化学的保護基の使用は、非常に多数の産業的及び治療的に有用な化合物を産生するのに必要な合成工程を実施する際に十分な特異性を達成することにおいて、重要な道具であることが多い。
【背景技術】
【０００２】
化学的保護の基本原理は、概念的には単純であり、その反応性が遮断される分子上の特定の官能基に化学的保護基を導入することによって、その分子上の別の官能基において反応が特異的にもたらされるのを可能にする。しかしながら、この単純な前提の根底には、多様な検討事項がある。これらには、分子の残りの部分に影響を与えない条件下でほぼ定量的な収率を達成するための特定の保護基の導入の必要性、副反応を誘導せずに又はその他の方法でそのプロセスの化学に影響を与えずに、後続の合成工程の間に保護基が完全にインタクトのままであるための要件、及びこれもまた分子上の別の場所に影響を与えない条件下で、必要なくなったときに保護基を除去しやすくする必要性、が挙げられる。さらに、多くの合成方法において、複数の保護基が同時に使用される。かかる方法では、１つの保護基を、任意の他の保護基に影響を与えない条件下で除去できることが、極めて重要であることが多い（いわゆる「直交」保護基ストラテジー）。この文脈において、非常に多数の保護基が知られており、当該分野で慣用的に使用されていることは、驚くべきことではない。
【０００３】
チオール官能基（−ＳＨ）は、高度に求核性であり、特に酸化プロセスを受けやすいことが周知である。従って、分子中のチオール基の保護は、合成手順の間に特に重要であり得る。例えば、タンパク新生アミノ酸システインの−ＣＨ２ＳＨ  α−置換は、ペプチド合成に関して独自の合成上の問題を提示する。なぜなら、チオール基はその保護されていない形態では、多くの慣用的な操作を妨害するからである。
【０００４】
チオール基を保護するための最も一般的なストラテジーはおそらく、直接的アルキル化（例えば、ｔ−ブチル、トリチル又はアセトアミドメチル基による）である。ジスルフィド形成（例えば、ｔ−ブチルチオール基による）及びアシル誘導体化（例えば、チオエステル、チオカーボネート及びチオカルバメートを形成する）もまた、分子の他の部分に化学変換をもたらしつつチオール基を遮蔽するために、しばしば使用される。
【０００５】
有機合成方法への組込みに適した新たな保護基がなおも必要とされている。新規チオール保護ストラテジーの開発を支持する特定の検討事項には、十分な特異性でチオールと反応する、必要に応じて容易に切断できる基を見出すこと、分子中の他の官能基（保護されているいないにかかわらず）に対し化学的に不活性な試薬を使用すること、が挙げられる。
【０００６】
本発明は、そのＣ＝Ｃ二重結合上に求電子性脱離基を保有する１，２−ジカルボニルエテン部分を有する試薬が、チオール化合物中のチオール基を保護するために使用できるという驚くべき知見に基づいている。このストラテジーの利点としては以下が挙げられる：
【０００７】
・試薬とチオール化合物との間の反応が、非常に迅速であり、実質的に化学量論的に実施できる。
・試薬が、複雑な有機分子中にしばしば存在する他の官能基（例えば、ヒドロキシル基、アミン基及びカルボキシル基）よりも、チオール官能基に対して選択性が高い。従って、チオール官能基の特異的保護が可能となる。
・化学的保護工程の間に形成されるチオエーテル結合が、容易に逆転可能であり、特に、当業者によって選択された時間で、制御された様式で切断できる。
・コンジュゲート付加反応において求核剤として作用できる試薬によって、チオエーテル結合が切断される。この特異的反応性プロフィールは、広範な合成ストラテジーにおいて利用され得る。例えば、本発明のチオール保護ストラテジーの使用は、保護された分子が、コンジュゲート付加反応求核剤と反応性の他の官能基をいずれも含まない場合、又はかかる試薬に対して化学的に不活性な１個以上のさらなる保護基が存在する場合に、特に有利であり得る。
【０００８】
本発明の方法論は、ジスルフィド化合物の保護にも、理想的に適している。なぜなら、第二の求電子性脱離基の組込みが、１，２−ジカルボニルエテン部分がそのＣ＝Ｃ二重結合の両方の炭素上に求電子性脱離基を保有し、その試薬をジスルフィド部分中に含まれる硫黄原子の両方と反応できるようにし、それによって、ジスルフィド官能基をマスクする複素環式構造を形成するからである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、チオール化合物中のチオール基を保護するための試薬としての、式（Ｉ）の部分を含む化合物の使用を提供する：
【００１０】
【化１】
2013501765.tif 000003
【００１１】
式中、
Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＲ１の基を示し、Ｒ１は、水素、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル又はフェニルであり、
Ｙは求電子性脱離基である。
【００１２】
本発明はまた、
（ｉ）チオール化合物を、本明細書中に記載される式（Ｉ）の部分を含む化合物と反応させて、保護されたチオール基を有する化合物を産生する工程；及び
（ｉｉ）その後、該保護されたチオール基を脱保護する工程、
を含むプロセスを提供する。
【００１３】
本発明はさらに、式（ＩＩ）の化合物を提供する：
【００１４】
【化２】
2013501765.tif 000004
【００１５】
式中、
Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＲ１の基を示し、Ｒ１は、水素、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル又はフェニルであり；
Ｙは求電子性脱離基であり；
Ｒ２は、水素原子又は基ＩＧを示し；
以下のいずれかであり：
Ｒ３及びＲ３’は、同じ又は異なって、それぞれ水素原子又は基ＩＧを示す；又は
Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３’）の基を形成し、Ｒ３３’は水素原子又は基ＩＧを示す；又は
Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３’）−Ｎ（Ｒ３３’）−の基を形成し、各Ｒ３３’は、同じ又は異なって、水素原子又は基ＩＧを示す；
各基ＩＧは、同じ又は異なって、非置換であるか又は１個以上のハロゲン原子で置換されている、Ｃ１−２０アルキル基、Ｃ２−２０アルケニル基又はＣ２−２０アルキニル基である部分を示し、式中、（ａ）０、１又は２個の炭素原子は、Ｃ６−１０アリーレン、５〜１０員のヘテロアリーレン、Ｃ３−７カルボシクリレン（carbocyclylene）及び５〜１０員のヘテロシクリレン（heterocyclylene）基から選択される基によって置換されており、かつ（ｂ）０、１又は２個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−及び−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−基から選択される基によって置換されており、式中、
（ｉ）該アリーレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオール、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）及びニトロ基から選択される１個以上の置換基によって置換されており；
（ｉｉ）該カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基中の０、１又は２個の炭素原子は、−Ｃ（Ｏ）−基によって置換されており；
Ｑは、カルボキシル基又は保護されたカルボキシル基であり；
Ｑ’は、アミン基又は保護されたアミン基であり；
ただし、式（ＩＩ）の化合物は、１４Ｃ−Ｎ−エチルマレイミド−Ｓ−システインでも１４Ｃ−Ｎ−エチルマレイミド−Ｓ−Ｎ−アセチル−システインでもない。
【００１６】
本発明はまた、ジスルフィド化合物中のジスルフィド基を保護するための試薬としての、式（ＩＩＩ）の部分を含む化合物の使用を提供する：
【００１７】
【化３】
2013501765.tif 000005
【００１８】
式中、
Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＲ１の基を示し、Ｒ１は、水素、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル又はフェニルであり；
Ｙ及びＹ’は、同じ又は異なって、それぞれ求電子性脱離基を示す。
【００１９】
なおさらに、本発明は、
（ｉ）ジスルフィド化合物中のジスルフィド基を、本発明の式（ＩＩＩ）の部分を含む化合物と反応させて、保護されたジスルフィド基を有する化合物を産生する工程；及び
（ｉｉ）その後、該保護されたジスルフィド基を脱保護する工程、
を含むプロセスを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、実施例５１に記載されるプロトコルの結果を示し、該実施例では、タンパク質／ビオチン−ＰＥＧ−ブロモマレイミド付加物及び未修飾のモデルタンパク質溶液（Ｉｎ）を、ニュートラアビジン被覆したアガロースビーズに添加し、遠心分離し、フロースルー（ＦＴ）収集し、ビーズをＰＢＳで洗浄し、両方の洗浄画分を収集し（Ｗ１及びＷ２）、タンパク質を、β−メルカプトエタノールを含むＰＢＳ中でインキュベートすることによりビーズから放出させ、サンプルを遠心分離し、切断されたタンパク質を含む溶離液（Ｅｌ）を収集した。
【図２】図２は、ＬＣ−ＭＳ（ｙ軸＝シグナル％；ｘ軸＝時間／ｍｉｎ）によって測定される、実施例６５に記載されるプロトコルに従った、ハロマレイミドからのソマトスタチン−マレイミド付加物の生成を示す。左上：ジクロロマレイミド（丸）、ジブロモマレイミド（四角）及びジヨードマレイミド（三角）からのソマトスタチン付加物の生成。右上：モノブロモマレイミド（丸）、Ｎ−メチルモノブロモマレイミド（四角）及びＮ−メチルジブロモマレイミド（三角）からのソマトスタチン付加物の生成。左下：Ｎ−フルオレセイン−ジブロモマレイミド（丸）、Ｎ−ビオチン−ジブロモマレイミド（四角）、Ｎ−ＰＥＧ  ５０００−ジブロモマレイミド（三角）、Ｎ−ＰＥＧ−５０００−ジチオフェノールマレイミド（菱形）及びＮ−ＰＥＧ  ３００−ジブロモマレイミド（卵型）からのソマトスタチン付加物の生成。
【図３】図３は、ＬＣ−ＭＳ（ｙ軸＝シグナル％；ｘ軸＝時間／ｍｉｎ）によって測定される、実施例６５に記載されるプロトコルに従った、ジチオマレイミドからのソマトスタチン−マレイミド付加物の生成を示す。左上：当量（丸）、５当量（四角）及び１０当量（三角）における、ジ−２−メルカプトエタノールマレイミドからのソマトスタチン付加物の生成。右上：１当量（丸）、５当量（四角）及び１０当量（三角）における、ジシステインマレイミドからのソマトスタチン付加物の生成。左下：１当量（丸）、５当量（四角）及び１０当量（三角）における、ジチオフェノールマレイミドからのソマトスタチン付加物の生成。右下：１当量（丸）、５当量（四角）及び１０当量（三角）における、ジ−２−メルカプトピリジンマレイミドからのソマトスタチン付加物の生成。
【図４】図４は、ＬＣ−ＭＳ（ｙ軸＝シグナル％；ｘ軸＝分（ｍｉｎ）、時間（ｈ）及び日（ｄ）で示される時間）によって測定される、実施例６５に記載されるプロトコルに従った、種々の還元剤によるマレイミド架橋ソマトスタチンの切断を示す。左上：ＤＴＴによる総修飾ソマトスタチン−マレイミド（白丸）及び副産物の総量（黒丸）。上中：２−メルカプトエタノールによる総修飾ソマトスタチン−マレイミド（白丸）及び副産物の総量（黒丸）。右上：ＧＳＨによる総修飾ソマトスタチン−マレイミド（白丸）及び副産物の総量（黒丸）。左下：ＴＣＥＰによる総修飾ソマトスタチン−マレイミド（白丸）及び副産物の総量（黒丸）。右下：１，２−エタンジチオールによる総修飾ソマトスタチン−マレイミド（白丸）及び副産物の総量（黒丸）。
【図５】図５は、ＬＣ−ＭＳ（ｙ軸＝シグナル％；ｘ軸＝時間／ｍｉｎ）によって測定される、実施例６５に記載されるプロトコルに従った、種々の量のＤＴＴ及び２−メルカプトエタノールによるマレイミド架橋ソマトスタチンの切断を示す。左：５０当量（白丸）、２０当量（白三角）及び１０当量（白四角）のＤＴＴによるソマトスタチンの再生。右：５０当量（白丸）、２０当量（白三角）及び１０当量（白四角）の２−メルカプトエタノールによるソマトスタチンの再生、並びに５０当量（黒丸）、２０当量（黒三角）及び１０当量（黒四角）での副産物の総量。
【図６】図６は、ＬＣ−ＭＳ（ｙ軸＝シグナル％；ｘ軸＝時間／ｍｉｎ）によって測定される、実施例６５に記載されるプロトコルに従った、架橋ソマトスタチンの触媒された切断を示す。図に示すのは、２−メルカプトエタノール（白丸）、２−メルカプトエタノールと共にＮａＩ（白四角）、及び２−メルカプトエタノールと共にベンゼンセレノール（白三角）による、ソマトスタチンの再生、並びに２−メルカプトエタノール（黒丸）、２−メルカプトエタノールと共にＮａＩ（黒四角）、及び２−メルカプトエタノールと共にベンゼンセレノール（黒三角）を使用したときの、総副産物である。
【図７】図７は、ＬＣ−ＭＳ（ｙ軸＝シグナル％；ｘ軸＝分（ｍｉｎ）、時間（ｈ）及び日（ｄ）で示される時間）によって測定される、実施例６５に記載されるプロトコルに従った、２−メルカプトエタノールによるＮ−官能化マレイミド架橋ソマトスタチンの切断を示す。左上：Ｎ−メチルマレイミドソマトスタチン付加物の切断により、ソマトスタチン（白丸）及び総副産物（黒丸）が生じる。上中：Ｎ−ビオチンマレイミドソマトスタチン付加物の切断により、ソマトスタチン（白丸）及び総副産物（黒丸）が生じる。右上：Ｎ−フルオレセインマレイミドソマトスタチン付加物の切断により、ソマトスタチン（白丸）及び総副産物（黒丸）が生じる。左下：Ｎ−ＰＥＧ  ５０００マレイミドソマトスタチン付加物の切断により、ソマトスタチン（白丸）及び総副産物（黒丸）が生じる。下中：Ｎ−ＰＥＧ  ３００マレイミドソマトスタチン付加物の切断により、ソマトスタチン（白丸）及び総副産物（黒丸）が生じる。
【図８】図８は、ＬＣ−ＭＳ（ｙ軸＝シグナル％；ｘ軸＝時間／ｈｏｕｒｓ）によって測定される、実施例６５に記載されるプロトコルに従った、モノブロモマレイミドとソマトスタチンとのジ付加生成物の切断を示す。左上：２−メルカプトエタノールを使用した、ソマトスタチン−マレイミド（白丸）、ソマトスタチン−ビス−マレイミド（黒丸）及び総副産物（三角）。右上：ＤＴＴを使用した、ソマトスタチン−マレイミド（白丸）、ソマトスタチン−ビス−マレイミド（黒丸）及び総副産物（三角）。左下：ＴＣＥＰを使用した、ソマトスタチン−マレイミド（白丸）、ソマトスタチン−ビス−マレイミド（黒丸）及び総副産物（三角）。
【図９】図９は、ＬＣ−ＭＳ（ｙ軸＝シグナル％；ｘ軸＝時間／ｍｉｎ）によって測定される、実施例６５に記載されるプロトコルに従った、種々の量のジチオマレイミドによるソマトスタチンの比較上のｉｎ  ｓｉｔｕ架橋を示す。本図は、３：５の比率のＴＣＥＰ開始剤及びチオフェノール（丸）、５：１０の比率のセレノール開始剤とチオフェノール（四角）、及び１０：２０の比率のセレノール開始剤と２−メルカプトエタノール（三角）、を使用した架橋ソマトスタチンの生成を示す。
【図１０】図１０は、ＬＣ−ＭＳ（ｙ軸＝シグナル％；ｘ軸＝時間／ｍｉｎ）によって測定される、実施例６５に記載されるプロトコルに従った、ソマトスタチンのｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＥＧ化を示す。本図は、５当量のＮ−ＰＥＧ５０００−ジチオフェノールマレイミド及び３当量のＴＣＥＰを使用した（丸）、並びに１０当量のＮ−ＰＥＧ５０００−ジチオフェノールマレイミド及び５当量のベンゼンセレノールを使用した（四角）、ＰＥＧ化ソマトスタチンの生成を示す。
【図１１】図１１は、実施例６５に記載されたパッチクランプアッセイで得られたホールセルパッチクランプ電流記録を示す。本図は、ＳＳＴＲ２を発現するＧＩＲＫ  １／２Ａ株化細胞から記録された、代表的な出力波形を示す。細胞を−６０ｍＶでクランプし、２０μＭのソマトスタチン又はその誘導体を２０秒間適用した。左上：ソマトスタチン（示された軸において、垂直線は１０００ｐＡを示し、水平線は２０ｍｓを示す）。右上：ジブロモマレイミド架橋ソマトスタチン（示された軸において、垂直線は１０００ｐＡを示し、水平線は２０ｍｓを示す）。左下：フルオレセインジブロモマレイミド架橋ソマトスタチン（示された軸において、垂直線は１０００ｐＡを示し、水平線は２０ｍｓを示す）。右下：ＰＥＧ化ジブロモマレイミド架橋ソマトスタチン（示された軸において、垂直線は１０００ｐＡを示し、水平線は２０ｍｓを示す）。
【図１２】図１２は、実施例６５に記載されたパッチクランプアッセイにおける、ソマトスタチン及びそのアナログにより活性化された電流の振幅を示す。ｘ軸は、電流の振幅をｐＡ／ｐＦで示す。上の２本のバーはフルオレセインジブロモマレイミド架橋ソマトスタチンに由来し（黒のバーは、百日咳毒素による２４時間にわたる細胞の前処理後であり；灰色のバーは前処理なしである）、次の２本のバーはＰＥＧ化ジブロモマレイミド架橋ソマトスタチンに由来し（黒のバーは、百日咳毒素による２４時間にわたる細胞の前処理後であり；灰色のバーは前処理なしである）、次の３本のバーはジブロモマレイミド架橋ソマトスタチンに由来し（白のバーは、ＧＩＲＫ阻害剤ＴｅｒｔｉａｐｉｎＱ（１００ｎＭ）との５分間のプレインキュベーション後であり；黒のバーは、百日咳毒素による２４時間にわたる細胞の前処理後であり；灰色のバーは前処理なしである）、下の２本のバーはソマトスタチンに由来する（黒のバーは、百日咳毒素による２４時間にわたる細胞の前処理後であり；灰色のバーは前処理なしである）。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本明細書中で使用する場合、用語「基」及び「部分」は相互交換可能に使用される。
【００２２】
本明細書中で使用する場合、「チオール化合物」は、少なくとも１個のチオール基−ＳＨを含む化合物である。
【００２３】
本明細書中で使用する場合、用語「求電子性脱離基」とは、その炭素原子における求核攻撃後に求核剤により置換され得る、飽和又は不飽和の炭素原子に結合した置換基を意味する。当業者は、特定の化合物上に位置付けるため及び特定の求核剤と反応するために適した求電子性脱離基を、慣用的に選択できる。
【００２４】
本明細書中で使用する場合、用語「求核剤」とは、電子対を提供することによって化学結合を形成することができる官能基又は化合物を意味する。
【００２５】
本明細書中で使用する場合、表現「チオール基を保護する」とは、チオール化合物上に保持されるチオール基（−ＳＨ）に保護基を導入することを意味する。保護基を使用する化学的保護の概念は、もちろん、有機合成の分野で十分理解されている。従って、当業者であれば、試薬又はプロセスの特定の使用が、「チオール基を保護する」ことを含むことを即座に認識するであろう。
【００２６】
本明細書中で使用する場合、用語「保護基」とは、化合物中の官能基に導入された、その官能基の化学的反応性を修飾する基を意味する。典型的には、保護基は、その官能基を、引き続く化学変換がその化合物にもたらされる場合に使用される反応条件に対して化学的に不活性にするといった方法で、官能基の化学的反応性を修飾する。従って、「チオール保護基」は、化合物中のチオール基に導入された保護基である。
【００２７】
当業者が即座に認識するように、保護基は、（保護されていない）官能基と保護基前駆体との間の反応によって、化合物中の官能基に導入される。保護されていないチオール官能基は、保護された化合物が形成される（即ち、化合物と保護基との間にチオール結合−Ｓ−が形成される）ときに典型的には離脱するプロトンを保有する。本発明において、保護基前駆体は、式（Ｉ）の部分を含む化合物である。チオール化合物上のチオール基が式（Ｉ）の部分を含む化合物と反応する場合、チオール基は、求電子性脱離基 Yを置換することによって、Ｃ＝Ｃ二重上の炭素原子の一方に結合する。従って、本発明の保護基は、式（Ｉ’）の部分を含む基である：
【００２８】
【化４】
2013501765.tif 000006
【００２９】
本明細書中で使用する場合、「保護された官能基」とは、保護基への結合によって化学的に保護された官能基を意味する。本発明によれば、「保護されたチオール基」は、式（Ｉ’）の部分を含む基に結合したチオール基である。「保護されたアミン基」は、アミン基（−ＮＨ２）を保護することによって得られ得る基である。「保護されたカルボキシル基」は、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を保護することによって得られ得る基である。
【００３０】
本明細書中で使用する場合、「脱保護する」とは、保護された官能基から保護基を除去することを意味する。従って、本発明では、保護されたチオール基を脱保護することは、保護されたチオール基から式（Ｉ’）の部分を含む基を除去することを含む。
【００３１】
本明細書中で使用する場合、２個以上の保護基に関して用語「直交（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）」とは、保護基の１つ１つが、それが結合した官能基から除去され得、他の保護基が化学的に不活性である反応条件が存在することを意味する。例えば、第一の保護基が塩基性条件下で除去できるが酸性条件下では除去できず、第二の保護基が酸性条件下で除去できるが塩基性条件下では除去できない場合、これら第一及び第二の保護基は、直交保護基を構成する。
【００３２】
本明細書中で使用する場合、用語「アルキル」には、直鎖及び分枝鎖の両方の飽和アルキル基が含まれる。好ましくは、アルキル基は、Ｃ１−２０アルキル基、より好ましくはＣ１−１５、なおより好ましくはＣ１−１２アルキル基、なおより好ましくはＣ１−６アルキル基であり、最も好ましくはＣ１−４アルキル基である。特に好ましいアルキル基には、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル及びヘキシルが挙げられる。用語「アルキレン」は、しかるべく解釈されるべきである。
【００３３】
本明細書中で使用する場合、用語「アルケニル」とは、分枝鎖でも非分枝鎖でもよい、１個以上の炭素−炭素二重結合を含む基をいう。好ましくは、アルケニル基は、Ｃ２−２０アルケニル基、より好ましくはＣ２−１５アルケニル基、なおより好ましくはＣ２−１２アルケニル基、又は好ましくはＣ２−６アルケニル基であり、最も好ましくはＣ２−４アルケニル基である。用語「アルケニレン」は、しかるべく解釈されるべきである。
【００３４】
本明細書中で使用する場合、用語「アルキニル」とは、分枝鎖でも非分枝鎖でもよい、１個以上の三重結合を含む炭素鎖をいう。好ましくは、アルキニル基は、Ｃ２−２０アルキニル基、より好ましくはＣ２−１５アルキニル基、なおより好ましくはＣ２−１２アルキニル基、又は好ましくはＣ２−６アルキニル基であり、最も好ましくはＣ２−４アルキニル基である。用語「アルキニレン」は、しかるべく解釈されるべきである。
【００３５】
特に指定しない場合、アルキル、アルケニル又はアルキニル基は、典型的には非置換である。しかしながら、かかる基が非置換又は置換であると示されている場合、１個以上の水素原子が、ハロゲン原子置換基で置換されていてもよい。好ましくは、置換されたアルキル、アルケニル又はアルキニル基は、１〜１０個の置換基、より好ましくは１〜５個の置換基、なおより好ましくは１、２又は３個の置換基、最も好ましくは１又は２個の置換基、例えば１個の置換基を有する。しかし好ましくは、アルキル、アルケニル又はアルキニル基は、非置換である。
【００３６】
アルキル、アルケニル若しくはアルキニル基である部分において、（ａ）０、１又は２個の炭素原子は、Ｃ６−１０アリーレン、５〜１０員のヘテロアリーレン、Ｃ３−７カルボシクリレン及び５〜１０員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されていてもよく、かつ（ｂ）０、１又は２個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−及び−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−基から選択される基によって置換されていてもよく、合計で０、１又は２個の該炭素原子及び−ＣＨ２−基が置換されていることが好ましく、合計で０又は１個がより好ましい。最も好ましくは、炭素原子又は−ＣＨ２−基のいずれも置換されていない。
【００３７】
−ＣＨ２−基を置換するための好ましい基は、−Ｏ−、−Ｓ−及び−Ｃ（Ｏ）−基である。炭素原子を置換するための好ましい基は、フェニレン、５〜６員のヘテロアリーレン、Ｃ５−６カルボシクリレン及び５〜６員のヘテロシクリレン基である。本明細書中で使用する場合、「０、１又は２個の炭素原子」への言及は、アルキル、アルケニル又はアルキニル鎖中の任意の末端又は非末端炭素原子（その炭素原子に結合した任意の水素原子を含む）を意味する。本明細書中で使用する場合、「０、１又は２個の−ＣＨ２−基」への言及は、アルキル、アルケニル又はアルキニル鎖中の末端炭素原子に対応しない基をいう。
【００３８】
本明細書中で使用する場合、Ｃ６−１０アリール基は、６〜１０個の炭素原子を有する、単環式又は多環式の６〜１０員の芳香族炭化水素環系である。フェニルが好ましい。用語「アリーレン」は、しかるべく解釈されるべきである。
【００３９】
本明細書中で使用する場合、５〜１０員のヘテロアリール基は、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される少なくとも１個のヘテロ原子、例えば、１、２、３又は４個のヘテロ原子を含む、単環式又は多環式の５〜１０員の芳香族環系（例えば、５〜６員環）である。環が４個のヘテロ原子を含む場合、これらは好ましくは全てが窒素原子である。用語「ヘテロアリーレン」は、しかるべく解釈されるべきである。
【００４０】
単環式ヘテロアリール基の例としては、チエニル、フリル、ピロリル、イミダゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル及びテトラゾリル基が挙げられる。
【００４１】
多環式ヘテロアリール基の例としては、ベンゾチエニル、ベンゾフリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾトリアゾリル、インドリル、イソインドリル及びインダゾリル基が挙げられる。好ましい多環式基としては、インドリル、イソインドリル、ベンズイミダゾリル、インダゾリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾチアゾリル及びベンゾイソチアゾリル基が挙げられ、より好ましくはベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル及びベンゾチアゾリルであり、最も好ましくはベンゾチアゾリルである。しかしながら、単環式ヘテロアリール基が好ましい。
【００４２】
好ましくは、ヘテロアリール基は、５〜６員のヘテロアリール基である。特に好ましいヘテロアリール基は、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル及びピラジニル基である。より好ましい基は、チエニル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピロリル及びトリアジニルでり、最も好ましくはピリジニルである。
【００４３】
本明細書中で使用する場合、５〜１０員のヘテロシクリル基は、１個以上の炭素原子、例えば１、２、３又は４個の炭素原子が、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）及びＳ（Ｏ）２から選択される部分で置換されている、非芳香族の、飽和又は不飽和の、単環式又は多環式のＣ５−１０炭素環式環系である。好ましくは、５〜１０員のヘテロシクリル基は５〜６員環である。用語「ヘテロシクリエン（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｙｅｎｅ）」は、しかるべく解釈されるべきである。
【００４４】
ヘテロシクリル基の例としては、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル（ｔｈｉｅｔａｎｙｌ）、ピロリジニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ジチオラニル（ｄｉｔｈｉｏｌａｎｙｌ）、ジオキソラニル、ピラゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ヘキサヒドロピリミジニル、メチレンジオキシフェニル、エチレンジオキシフェニル、チオモルホリニル、Ｓ−オキソ−チオモルホリニル、Ｓ，Ｓ−ジオキソ−チオモルホリニル、モルホリニル、１，３−ジオキソラニル、１，４−ジオキソラニル、トリオキソラニル（ｔｒｉｏｘｏｌａｎｙｌ）、トリチアニル（ｔｒｉｔｈｉａｎｙｌ）、イミダゾリニル、ピラニル、ピラゾリニル、チオキソラニル（ｔｈｉｏｘｏｌａｎｙｌ）、チオキソチアゾリジニル、１Ｈ−ピラゾール−５−（４Ｈ）−オニル、１，３，４−チアジアゾール−２（３Ｈ）−チオニル、オキソピロリジニル、オキソチアゾリジニル、オキソピラゾリジニル、スクシンイミド（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏ）及びマレイミド基及び部分が挙げられる。好ましいヘテロシクリル基は、ピロリジニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ジチオラニル、ジオキソラニル、ピラゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ヘキサヒドロピリミジニル、チオモルホリニル及びモルホリニル基及び部分である。より好ましいヘテロシクリル基は、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、チオモルホリニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピペリジニル、モルホリニル及びピロリジニル基である。
【００４５】
疑義を回避するため、ヘテロアリール基及びヘテロシクリル基の上記定義は、環中に存在し得る「Ｎ」部分をいうが、熟練の化学者に明らかなように、Ｎ原子は、単結合を介して隣接する環原子のそれぞれに結合した場合、プロトン化される（又は以下に規定する置換基を有する）であろう。
【００４６】
本明細書中で使用する場合、Ｃ３−７カルボシクリル基は、３〜７個の炭素原子を有する、非芳香族の、飽和又は不飽和の炭化水素環である。好ましくは、Ｃ３−７カルボシクリル基は、３〜７個の炭素原子、より好ましくは５〜６個の炭素原子を有する、飽和又はモノ不飽和の炭化水素環（即ち、シクロアルキル部分又はシクロアルケニル部分）である。例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル及びシクロヘキシル、並びにそれらのモノ不飽和バリアントが挙げられる。特に好ましい炭素環式基は、シクロペンチル及びシクロヘキシルである。用語「カルボシクリレン」は、しかるべく解釈されるべきである。
【００４７】
具体的には、カルボシクリレン又はヘテロシクレン基中の０、１又は２個の炭素原子は、−Ｃ（Ｏ）−基で置換され得る。本明細書中で使用する場合、置換される「炭素原子」は、それらが結合する水素原子を含むことが理解される。１又は２個の炭素原子が置換される場合、２個のかかる炭素原子が置換されることが好ましい。好ましいかかるカルボシクリル基としてはベンゾキノン基が挙げられ、好ましいかかるヘテロシクリル基としてはスクシンイミド及びマレイミド基が挙げられる。
【００４８】
特に指定しない場合、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル又はヘテロシクリル基は、典型的には非置換である。しかしながら、かかる基が非置換又は置換であると示されている場合、１個以上の水素原子が、ハロゲン原子又はＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオール、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）若しくはニトロ基で置換されていてもよい。好ましくは、置換されたアリール、ヘテロアリール、カルボシクリル又はヘテロシクリル基は、１〜４個の置換、より好ましくは１〜２個の置換基、最も好ましくは１個の置換基を有する。好ましくは、置換されたアリール、ヘテロアリール、カルボシクリル又はヘテロシクリル基は、２個以下のニトロ置換基を有する。好ましい置換基は、ハロゲン原子並びにＣ１−４アルキル及びＣ１−４アルコキシ基である。特に好ましい置換基はハロゲン原子である。しかし好ましくは、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル又はヘテロシクリル基は、非置換である。
【００４９】
本明細書中で使用する場合、ハロゲン原子は、典型的にはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ原子であり、好ましくはＢｒ又はＣｌ原子であり、より好ましくはＢｒ原子である。
【００５０】
本明細書中で使用する場合、Ｃ１−６アルコキシ基は、酸素原子に結合したＣ１−６アルキル（例えば、Ｃ１−４アルキル）基である。
【００５１】
本明細書中で使用する場合、Ｃ１−６アルキルチオール基は、硫黄原子に結合したＣ１−６アルキル（例えば、Ｃ１−４アルキル）基である。
【００５２】
本明細書中で使用する場合、５〜１０員のヘテロシクリルチオールは、硫黄原子に結合した５〜１０員の（例えば、５〜６員の）ヘテロシクリル基である。
【００５３】
本明細書中で使用する場合、Ｃ６−１０アリールチオールは、硫黄原子に結合したＣ６−１０アリール（例えば、フェニル）基である。
【００５４】
本明細書中で使用する場合、Ｃ３−７カルボシクリルチオールは、硫黄原子に結合したＣ３−７カルボシクリル（例えば、Ｃ５−６カルボシクリル）基である。
【００５５】
疑義を回避するため、トリフレート基はトリフルオロメタンスルホネート基であり、トシレート基はｐ−トルエンスルホネート基であり、メシレート基はメタンスルホネート基である。
【００５６】
好ましくは、Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＨの基を示す。より好ましくは、Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素又は硫黄を示す。好ましくは、Ｘ及びＸ’の少なくとも一方は酸素を示す。最も好ましくは、Ｘ及びＸ’は共に酸素である。
【００５７】
Ｙは、好ましくは、ハロゲン原子又はトリフレート、トシレート、メシレート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル、Ｃ１−６アルキルチオール、５〜１０員のヘテロシクリルチオール、Ｃ６−１０アリールチオール、Ｃ３−７カルボシクリルチオール、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３、−ＯＣ（Ｏ）ＣＦ３、フェニルオキシ、−ＮＲｘＲｙＲｚ＋若しくは−ＰＲｘＲｙＲｚ＋基である。より好ましくは、Ｙは、ハロゲン原子又はトリフレート、トシレート、メシレート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル、Ｃ１−６アルキルチオール、５〜１０員のヘテロシクリルチオール、Ｃ６−１０アリールチオール若しくはＣ３−７カルボシクリルチオールである。なおより好ましくは、Ｙは、ハロゲン原子又はＣ１−６アルキルチオール、５〜１０員のヘテロシクリルチオール、Ｃ６−１０アリールチオール若しくはＣ３−７カルボシクリルチオールである。最も好ましくは、Ｙは、ハロゲン原子、特に臭素原子である。
【００５８】
Ｒｘ、Ｒｙ及びＲｚはそれぞれ、好ましくは、水素原子及びＣ１−６アルキル基から選択される。より好ましくは、Ｒｘ、Ｒｙ及びＲｚはそれぞれ、好ましくは、水素原子並びにメチル及びエチル基から選択される。好ましくは、特定の−ＮＲｘＲｙＲｚ＋又は−ＰＲｘＲｙＲｚ＋基では、Ｒｘ、Ｒｙ及びＲｚは同じである。
【００５９】
式（Ｉ）の部分は、本発明に従ってチオール含有化合物を化学的に保護させる重要な反応性部分を示すことが明らかであろう。式（Ｉ）の部分（及び式（ＩＩ）の部分、別の箇所で詳細に記載される）において、記号
【００６０】
【化５】
2013501765.tif 000007
【００６１】
は、別の基への結合点を意味する。これらの結合点を介して結合した基の正体は、本発明には重要でないことが理解されよう。当業者であれば、特定の目的に合うように、これらの結合点を介して結合した基を、例えば、保護すべきチオール化合物又はジスルフィド化合物の具体的な正体に基づいて、選択することが可能であることが容易に理解できよう。
【００６２】
好ましくは、式（Ｉ）の部分を含む化合物は、式（Ｉａ）の化合物
【００６３】
【化６】
2013501765.tif 000008
【００６４】
であり、式中、
Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＲ１の基を示し、Ｒ１は、水素、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル又はフェニルであり；
Ｙは求電子性脱離基であり；
Ｒ２は、水素原子又は基ＩＧを示し；
以下のいずれかであり：
Ｒ３及びＲ３’は、同じ又は異なって、それぞれ水素原子又は基ＩＧを示す；又は
Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３’）の基を形成し、Ｒ３３’は水素原子又は基ＩＧを示す；又は
Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３’）−Ｎ（Ｒ３３’）−の基を形成し、各Ｒ３３’は、同じ又は異なって、水素原子又は基ＩＧを示す；
各基ＩＧは、同じ又は異なって、非置換であるか又は１個以上のハロゲン原子で置換されている、Ｃ１−２０アルキル基、Ｃ２−２０アルケニル基又はＣ２−２０アルキニル基である部分を示し、式中、（ａ）０、１又は２個の炭素原子は、Ｃ６−１０アリーレン、５〜１０員のヘテロアリーレン、Ｃ３−７カルボシクリレン及び５〜１０員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されており、かつ（ｂ）０、１又は２個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−及び−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−基から選択される基によって置換されており、式中、
（ｉ）該アリーレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオール、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）及びニトロ基から選択される１個以上の置換基によって置換されており；
（ｉｉ）該カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基中の０、１又は２個の炭素原子は、−Ｃ（Ｏ）−基によって置換されている。
【００６５】
好ましくは、Ｒ３及びＲ３’は、同じ又は異なって、それぞれ水素原子又は基ＩＧを示すか、或いはＲ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３’）の基を形成し、Ｒ３３’は水素原子又は基ＩＧを示す。
【００６６】
１つの好ましい実施形態において、Ｒ２が基ＩＧである場合、好ましくは、Ｒ２は、式（Ｉａ）の３位に直接結合した、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−及び−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−から選択される基を含む（即ち、Ｒ２は、３位に隣接する−ＣＨ２−基が、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−又は−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−基によって置換された部分である）。
【００６７】
Ｒ２は好ましくは、水素原子又はＣ１−６アルキル基である。最も好ましくは、Ｒ２は水素原子である。
【００６８】
Ｒ３及びＲ３’が同じ又は異なって、それぞれ水素原子又は基ＩＧを示す場合、好ましくは、Ｒ３及びＲ３’の少なくとも一方は基ＩＧである。好ましくは、Ｒ３及びＲ３’は共に基ＩＧを示す。
【００６９】
Ｒ３、Ｒ３’、又はＲ３及びＲ３’が基ＩＧを示す場合、その基ＩＧ又は各基ＩＧは好ましくは、式−Ｚ（Ｃ１−６アルキル）の基であり、式中、Ｚは、直接的結合又は基−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−若しくは−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）である。より好ましくは、この実施形態において、その基ＩＧ又は各基ＩＧは、式−Ｚ（Ｃ１−２アルキル）の基であり、式中、Ｚは、直接的結合又は基−Ｏ−、−ＮＨ−若しくは−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）である。最も好ましくは、この実施形態において、その基ＩＧ又は各基ＩＧは、式−Ｚ（Ｃ１−２アルキル）の基であり、式中、Ｚは、直接的結合又は基−Ｏ−若しくは−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）である。
【００７０】
好ましくは、Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３’）の基を形成する。
【００７１】
Ｒ３３’は好ましくは、水素原子又はＣ１−６アルキル基を示し、最も好ましくは、Ｒ３３’は、水素原子又はメチル若しくはエチル基（例えば、メチル又はエチル基）を示す。
【００７２】
ＩＧは好ましくは、非置換のＣ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基又はＣ２−６アルキニル基である部分を示し、式中、（ａ）０又は１個の炭素原子は、フェニレン、５〜６員のヘテロアリーレン、Ｃ５−６カルボシクリレン及び５〜６員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されており、該フェニレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにＣ１−４アルキル及びＣ１−４アルコキシ基から選択される１又は２個の置換基によって置換されており、かつ（ｂ）０、１又は２個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−及び−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−基から選択される基によって置換されている。
【００７３】
より好ましくは、ＩＧは、非置換のＣ１−６アルキル基である部分を示し、式中、（ａ）０又は１個の炭素原子は、非置換のフェニレン、５〜６員のヘテロアリーレン、Ｃ５−６カルボシクリレン及び５〜６員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されており、かつ（ｂ）０又は１個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−ＮＨ−及び−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−基から選択される基によって置換されている。
【００７４】
なおより好ましくは、ＩＧは、非置換のＣ１−６アルキル又はフェニル基を示す。
【００７５】
最も好ましくは、ＩＧは、非置換のＣ１−６アルキル基（例えば、メチル又はエチル基）を示す。
【００７６】
好ましくは、基ＩＧは、基−ＮＨ−が基−Ｃ（Ｏ）−又は−Ｃ（Ｓ）−に直接隣接して位置していない限り、いずれの基−ＮＨ−も含まない。より好ましくは、基ＩＧは、基−ＮＨ−が基−Ｃ（Ｏ）−に直接隣接して位置していない限り、いずれの基−ＮＨ−も含まない。
【００７７】
好ましくは、式（Ｉａ）の化合物は、式（Ｉｂ）の化合物：
【００７８】
【化７】
2013501765.tif 000009
【００７９】
であり、式中、Ｘ、Ｘ’、Ｙ、Ｒ２及びＲ３３’は全て、本明細書中に記載したとおりである。
【００８０】
式（Ｉｂ）の化合物において、特に好ましくは、
Ｘ及びＸ’はそれぞれ酸素原子を示し；
Ｒ３３’は水素原子又はＣ１−６アルキル基を示し；
Ｙはハロゲン原子を示し；
Ｒ２は水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す。
【００８１】
１実施形態において、本発明は、チオール化合物中のチオール基を保護するための試薬としての、上記式（Ｉ）の部分を含む化合物の使用に関する。典型的には、この使用は、式（Ｉ）の部分を含む化合物をチオール化合物と反応させることを含む。式（Ｉ）の部分を含む化合物をチオール化合物と反応させることで、チオール基が上記式（Ｉ’）の保護基で保護された化合物が産生される。
【００８２】
式（Ｉ）の部分を含む化合物は、標準的な文献に記載された手順及び当業者に周知の手順に従って、チオール化合物と反応させることができる。典型的な文献情報源は、「Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第４版（Ｗｉｌｅｙ）、Ｊ  Ｍａｒｃｈ、「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ」、第２版（Ｗｉｌｅｙ）、Ｒ．Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第２版（Ｐｅｒｇａｍｏｎ）、Ａ．Ｒ．Ｋａｔｒｉｔｚｋｙであり、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、「Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．」、「Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ」などに見出されるような総説記事、又は標準的な文献検索オンラインによって同定される又は「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ」若しくは「Ｂｅｉｌｓｔｅｉｎ」などの二次的情報源からの、一次文献情報源である。
【００８３】
好ましくは、この使用は、多工程合成手順の間の、チオール化合物中のチオール基を保護するための試薬としての、式（Ｉ）の部分を含む化合物の使用である。典型的には、多工程の合成手順は、保護されたチオール基ではない、チオール化合物が保有する官能基（例えば、チオール基ではない官能基）に化学変換をもたらすことを含む、少なくとも１つの合成工程を含む。好ましくは、この少なくとも１つの合成工程は、保護されたチオール基が化学的に不活性であるが、チオール基は化学的に反応性である条件下で実施される。典型的には、多工程の合成手順は、保護されたチオール基を脱保護する工程も含む。
【００８４】
さらなる実施形態において、本発明は、チオール化合物を、式（Ｉ）の部分を含む化合物と反応させて、保護されたチオール基を有する化合物を産生する工程；及び、その後、該保護されたチオール基を脱保護する工程、を含む、プロセスに関する。従って、このプロセスは、チオール基を選択的に保護し、次いでその後、必要なくなった保護基を除去するための手段を構成する。
【００８５】
典型的には、１つ以上の化学反応が、このプロセスの工程（ｉ）と（ｉｉ）との間に、チオール化合物にもたされる。当業者が認識するように、これらの工程の性質は、実施される全合成手順によって決定されよう。しかし典型的には、少なくとも１つの工程が、工程（ｉ）の後かつ工程（ｉｉ）の前に実施され、この工程は、保護されたチオール基ではない、チオール化合物が保有する官能基（例えば、チオール基ではない官能基）に化学変換をもたらすことを含む。好ましくは、この少なくとも１つの工程は、保護されたチオール基が化学的に不活性であるが、チオール基は化学的に反応性である条件下で実施される。
【００８６】
本発明のこのプロセスの１実施形態において、保護されたチオール基を有する化合物は、保護されたチオール基とは異なるさらなる保護された官能基を少なくとも１個、さらに含む。この実施形態において、好ましくは、この少なくとも１個のさらなる保護された官能基は、保護されたチオール基上の保護基に対して直交である保護基を含む。
【００８７】
保護されたチオール基を脱保護する工程は、電子不足型アルケンに結合したチオールを切断するための慣用的な方法を使用してもたらすことができる。従って、好ましくは、脱保護は、コンジュゲート付加反応において求核剤として作用できる試薬と共に生成物をインキュベートすることによってもたらされる。
【００８８】
コンジュゲート付加反応において求核剤として作用できることが周知の試薬の例としては、ホスフィン化合物、亜リン酸塩化合物、チオール、セレノール、アミン及びソフトカーボン求核化合物が挙げられる。ホスフィン化合物及び亜リン酸塩化合物は共に、３価のリン原子を含む。ホスフィンでは、このリン原子は水素又は炭素原子に結合されるが、亜リン酸塩では、このリン原子は酸素原子に結合される（炭素原子及び酸素原子自体は、それぞれの化合物中の他の基にさらに結合されることが理解される）。チオールは、チオール基−ＳＨを含む有機化合物である。セレノールは、−ＳｅＨ基を含む有機化合物である。アミンは、アミン官能基を含む化合物である。ソフトカーボン求核剤は、ソフトな求核炭素中心を含む化合物である。例示的なソフトカーボン求核剤は、米国特許第５，４１４，０７４号に開示されており、その内容は、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる。当業者であれば当然、慣用として、例えば、本明細書中に記載される試薬の例示的クラスのなかから適切な試薬を慣用的に選択することによって、コンジュゲート付加反応において求核剤として作用できる適切な試薬を選択することができるであろう。
【００８９】
脱保護をもたらすために本明細書中で好ましい試薬は、ホスフィン化合物及びチオールである。特に好ましいホスフィンは、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンであり、これは、「ＴＣＥＰ」として一般に知られ、化合物（例えばタンパク質）中のジスルフィド結合を還元するために、当該分野において一般に使用される。トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンはまた、その塩酸塩などの塩の形態でも供給され得る。特に好ましいチオールは１，２−エタンジチオール、グルタチオン、メルカプトエタノール及びジチオスレイトール（即ち、ＨＳＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＳＨ、ＤＴＴとして一般に知られる）である。例えば、試薬は、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、グルタチオン、２−メルカプトエタノール及びジチオスレイトールから選択され得る。
【００９０】
疑義を回避するために、本明細書中で使用する場合、用語「コンジュゲート付加反応において求核剤として作用できる試薬」とは、化合物中のα，β−不飽和部分、特に式（ＩＶ）の部分
【００９１】
【化８】
2013501765.tif 000010
【００９２】
と反応できる試薬を意味し、式中、Ｘは本明細書中に記載したとおりである。かかる試薬は、ある場合には「Ｍｉｃｈａｅｌ付加反応において求核剤として作用できる試薬」としても知られる。明らかに、これらの試薬は、求核炭素中心を介して反応する試薬（例えば、ソフトカーボン求核剤）に限定されず、求核非炭素中心を介して反応する試薬（例えば、本明細書中に記載される例示的試薬）も含む。
【００９３】
本発明において、チオール化合物は、チオール基−ＳＨを含む任意の化合物であり得る。しかし典型的には、チオール化合物は有機化合物である。当業者が理解するように、本発明の保護基は、保護基ストラテジーが一般に使用される任意の化合物（例えば、多工程合成手順における中間体）が保有するチオール基に適切に導入され得る。バイオテクノロジーの分野において特に興味が持たれるチオール含有化合物の例は、システイン、及び少なくとも１つのシステイン残基を含むペプチド又はタンパク質である。従って、本発明の使用及びプロセスの好ましい実施形態において、チオール化合物は、システイン、又は少なくとも１個のシステイン残基を含むペプチド若しくはタンパク質である。当業者が理解するように、この実施形態は、システイン又はシステイン残基に関与する慣用的な合成方法（例えば、ペプチド合成の方法、又はペプチド若しくはタンパク質が化学変換に供される方法（例えば、翻訳後修飾を模倣するため、又はプロテオミクス研究に着手すること若しくは治療的タンパク質を産生することを目的とした合成的修飾をもたらすため））を実施する場合に、特に有用である。
【００９４】
さらなる実施形態において、本発明は、式（ＩＩ）の化合物を提供する。この化合物は、化学的に保護されたシステイン分子を構成する。これは例えば、ペプチド及びタンパク質の合成方法において有用である。ペプチド及びタンパク質の合成方法は、当該分野で周知であり、従って、当業者であれば、ペプチド又はタンパク質を産生するための方法を実施するために本発明の方法論を適用することに、困難はないであろう。ペプチドを合成するために当該分野で慣用的に使用される種々の慣用的技術を議論した１つの一般的な参考教科書は、「Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｊｏｈｎ  Ｊｏｎｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９２）であり、その内容は、その全体が本明細書中で参照により組み込まれる。
【００９５】
第一の実施形態において、Ｑはカルボキシル基であり、Ｑ’はアミン基である。即ち、保護されたシステインは、そのカルボキシル官能基又はそのアミン官能基のいずれかを介して、反応し得る。この化合物は、二次的化合物と直接反応し得るか、或いは、例えばカルボキシル官能基又はアミン官能基上に目的の特定の保護基を配置するための、さらなる化学的保護工程がもたらされ得る。
【００９６】
それぞれ第二及び第三の実施形態において、Ｑは保護されたカルボキシル基であり、Ｑ’はアミン基であるか、或いはＱはカルボキシル基であり、Ｑ’は保護されたアミン基である。従って、第二の実施形態において、この分子は、そのアミン基のみを介して反応し得、一方、第三の実施形態において、この分子は、そのカルボキシル基のみを介して反応し得る。
【００９７】
第四の実施形態において、Ｑは保護されたカルボキシル基であり、Ｑ’は保護されたアミン基である。従って、この分子は、その３つの官能基のそれぞれにおいて保護される。これは、これらの保護された官能基のうち１つを脱保護することによって、反応のために準備できる。
【００９８】
特に好ましい実施形態において、Ｑはカルボキシル基であり、Ｑ’は保護されたアミン基である。当業者が理解するように、この分子は特に、固相ペプチド合成の慣用的な方法において使用するのに十分適しており、この方法は典型的には、Ｎ保護されたアミノ酸がそのカルボキシル末端で固相（第一サイクルにおいて）又は成長するペプチド鎖（その後のサイクルにおいて）のいずれかと反応する連続サイクルと、その後のＮ脱保護及びその後の新たなＮ保護されたアミノ酸とのさらなる反応とを含む。
【００９９】
ペプチド及びタンパク質の固相合成のための技術は、当該分野で周知である。広範な反応性基で活性化された多数の固相支持体が、例えばＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている。従って、当業者であれば、ペプチド又はタンパク質を産生するためのプロセスを実施するために本発明の方法論を適用することに、困難はないであろう。
【０１００】
保護されたカルボキシル基及び保護されたアミン基は、当該分野で周知であり、当業者によって慣用的に選択され得る。
【０１０１】
例示的な保護されたカルボキシル基としては、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」（Ｊｅｒｅｍｙ  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００３）及び「Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｊｏｈｎ  Ｊｏｎｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９２）に記載された保護されたカルボキシル基が挙げられ、これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる。特に好ましい保護されたカルボキシル基は−ＣＯＯＱであり、式中、Ｑは、Ｃ１−６アルキル、フェニル及びベンジル基から選択される。
【０１０２】
例示的な保護されたアミン基としては、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」（Ｊｅｒｅｍｙ  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００３）及び「Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｊｏｈｎ  Ｊｏｎｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９２）に記載された保護されたアミン基が挙げられ、これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる。特に好ましい保護されたアミン基は、トリチル（トリフェニルメチル）及び２−ニトロフェニルスルフェニル基並びに式−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＱ’の基であり、式中、Ｑ’は、Ｃ１−６アルキル、フェニル、ベンジル、２−（４−ビフェニル）−イソプロピル、９−フルオレニルメチルから選択される。特に好ましい保護されたアミン基は、式−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＱ’のものであり、式中、Ｑ’は、ｔ−ブチル又は９−フルオレニルメチルである（即ち、「ＢＯＣ保護されたアミン」又は「Ｆｍｏｃ保護されたアミン」）。
【０１０３】
好ましくは、式（ＩＩ）の化合物は、Ｃ−Ｎ−エチルマレイミド−Ｓ−システインでもＣ−Ｎ−エチルマレイミド−Ｓ−Ｎ−アセチル−システインでもない。
【０１０４】
さらなる態様において、本発明は、ジスルフィド化合物中のジスルフィド基を保護するための試薬としての、式（ＩＩＩ）の部分を含む式の化合物の使用に関する。
【０１０５】
ジスルフィド基は、式−Ｓ−Ｓ−の二価の基である。ジスルフィド中の内部Ｓ−Ｓ結合は、有機分子中の最も弱い結合である場合が多い。これは、還元的条件下で切断を受けて、２個の−ＳＨ部分を生じやすい。従って、ジスルフィド化合物が脂環式である場合、ジスルフィドの還元は、２個のチオール含有分子への、ジスルフィド化合物の切断をもたらす。ジスルフィド  ジスルフィドが複素環の一部である場合（例えば、これが、単一分子中に存在する２個のチオール基の縮合によって形成されたものである場合）、ジスルフィド結合の還元は開環をもたらす。両方の場合において、高度に求核性のチオール基が生成される。従って、明らかに、分子中のジスルフィド結合の切断は、有機合成手順に関して重要な結果を招く可能性があり得る。従って、ジスルフィド基が反応性であり得る反応条件を使用して化学変換が実施される場合、望ましくない副反応が生じるのを防ぐために、ジスルフィド基を化学的に保護することが望ましい場合がある。
【０１０６】
典型的には、ジスルフィド化合物中のジスルフィド基は、複素環の一部を形成する（即ち、これは、単一の分子中に存在する２個のチオール基の縮合によって形成されたものである）。
【０１０７】
２つの近接するシステイン残基中のチオール基のカップリングによるジスルフィド結合は、タンパク質中に一般的に見出され、それ自体、タンパク質のフォールディング及び安定性において重要な役割を果たす場合が多い。従って、好ましい実施形態において、ジスルフィド化合物は、ジスルフィド基を含むペプチド又はタンパク質である。
【０１０８】
式（ＩＩＩ）の化合物において、基Ｘ、Ｘ’及びＹは好ましくは、上記したのと同じ基である。基Ｙ’は、第二の求電子性脱離基である。好ましい基Ｙ’は、上記した好ましい基Ｙに対応する。式（ＩＩＩ）の化合物において、Ｙ及びＹ’は、同じでも異なってもよい。しかし好ましくは、Ｙ及びＹ’は同じである。
【０１０９】
好ましくは、式（ＩＩＩ）の部分を含む化合物は、式（ＩＩＩａ）の化合物：
【０１１０】
【化９】
2013501765.tif 000011
【０１１１】
であり、式中、Ｘ、Ｘ’、Ｙ、Ｒ３及びＲ３’は全て上記のとおりであり、Ｙ’はさらなる基Ｙであり、各基Ｙは同じ又は異なる。
【０１１２】
典型的には、この使用は、式（ＩＩＩ）の部分を含む化合物を、ジスルフィド化合物と反応させることを含む。式（ＩＩＩ）の部分を含む化合物をジスルフィド化合物と反応させることは、ジスルフィド化合物中のジスルフィド基のＳ−Ｓ結合を切断し、次いで、ジスルフィド基の２個の硫黄原子のうち一方が基Ｙを置換し、ジスルフィド基の２個の硫黄原子のもう一方が基Ｙ’を置換することを含む。
【０１１３】
式（ＩＩＩ）の部分を含む化合物は、標準的な文献に記載された、当業者に周知の手順に従って、ジスルフィド化合物と反応させることができる。典型的な文献情報源は、「Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第４版（Ｗｉｌｅｙ）、Ｊ  Ｍａｒｃｈ、「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ」、第２版（Ｗｉｌｅｙ）、Ｒ．Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第２版（Ｐｅｒｇａｍｏｎ）、Ａ．Ｒ．Ｋａｔｒｉｔｚｋｙであり、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、「Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．」、「Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ」などに見出されるような総説記事、又は標準的な文献検索オンラインによって同定される又は「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ」若しくは「Ｂｅｉｌｓｔｅｉｎ」などの二次的情報源からの、一次文献情報源である。好ましくは、反応は、ジスルフィド基を還元して２個の別個のチオール基−ＳＨを形成し、これらのチオール基を式（ＩＩＩ）の部分と反応させることによって、もたらされる。ジスルフィド基の還元は、慣用的な方法を使用して、例えば、ホスフィン、チオール又は水素化物剤などの還元剤との反応によって、実施できる。好ましい還元剤は、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、グルタチオン、メルカプトエタノール及びジチオスレイトールである。
【０１１４】
好ましくは、この使用は、多工程合成手順の間の、ジスルフィド化合物中のジスルフィド基を保護するための試薬としての、式（ＩＩＩ）の部分を含む化合物の使用である。典型的には、多工程の合成手順は、ジスルフィド基ではない、ジスルフィド化合物が保有する官能基に化学変換をもたらすことを含む、少なくとも１つの合成工程を含む。好ましくは、この少なくとも１つの合成工程は、保護されたジスルフィド基が化学的に不活性であるが、ジスルフィド基は化学的に反応性である条件下で実施される。典型的には、多工程の合成手順は、保護されたジスルフィド基を脱保護する（即ち、ジスルフィド結合を再形成する）工程も含む。
【０１１５】
さらなる実施形態において、本発明は、ジスルフィド化合物中のジスルフィド基を、式（ＩＩＩ）の部分を含む化合物と反応させて、保護されたジスルフィド基を有する化合物を産生する工程、及び、その後、該保護されたジスルフィド基を脱保護する工程、を含むプロセスに関する。従って、このプロセスは、ジスルフィド基を選択的に保護し、次いでその後、必要なくなった保護基を除去するための手段を構成する。
【０１１６】
典型的には、ジスルフィド化合物中のジスルフィド基を、式（ＩＩＩ）の部分を含む化合物と反応させる工程は、（ａ）ジスルフィド基を還元して、２個の別個のチオール基−ＳＨを形成する工程、及び（ｂ）これらのチオール基を式（ＩＩＩ）の部分と反応させる工程、を含む。ジスルフィド基の還元は、慣用的な方法を使用して、例えば、ホスフィン、チオール又は水素化物剤などの還元剤との反応によって、実施できる。好ましい還元剤は、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、グルタチオン、２−メルカプトエタノール及びジチオスレイトールである。別の好ましい還元剤は、１，２−エタンジチオールである。明らかに、ジスルフィド基は、第一の工程において還元され得、その後式（ＩＩＩ）の部分との別個の反応が行われる。或いは、ジスルフィド基の還元及び式（ＩＩＩ）の部分との反応は、単一の反応工程（即ち、還元剤及び式（ＩＩＩ）の部分の両方が同時に存在する）で実施され得る。
【０１１７】
典型的には、１つ以上の化学反応が、このプロセスの工程（ｉ）と（ｉｉ）との間にもたらされる。当業者が認識するように、これらの工程の性質は、実施される全合成手順によって決定されよう。しかし典型的には、少なくとも１つの工程が、工程（ｉ）の後かつ工程（ｉｉ）の前に実施され、この工程は、保護されたジスルフィド基ではない、該化合物が保有する官能基（例えば、ジスルフィド基ではない官能基）に化学変換をもたらすことを含む。好ましくは、この少なくとも１つの工程は、保護されたジスルフィド基が化学的に不活性であるが、ジスルフィド基は化学的に反応性である条件下で実施される。
【０１１８】
本発明のこのプロセスの１実施形態において、保護されたジスルフィド基を有する化合物は、保護されたジスルフィド基とは異なるさらなる保護された官能基を少なくとも１個、さらに含む。この実施形態において、好ましくは、この少なくとも１個のさらなる保護された官能基は、保護されたジスルフィド基上の保護基に対して直交である保護基を含む。
【０１１９】
保護されたジスルフィド基を脱保護する工程は、電子不足型アルケンに結合したチオールを切断するための慣用的な方法を使用してもたらすことができる。従って、好ましくは、脱保護は、コンジュゲート付加反応において求核剤として作用できる試薬と共に生成物をインキュベートすることによってもたらされる。従って、ジスルフィド脱保護をもたらすのに好ましい試薬は、チオール脱保護をもたらすための上記試薬に対応する。
【０１２０】
好ましくは、保護されたジスルフィド基を脱保護する工程は、炭素−炭素二重結合においてチオール結合を切断し、また、そうして形成された２個のチオール基を酸化してジスルフィド基を形成させることを含む。チオール基を酸化してジスルフィド基を形成するのに適切な試薬は、当該分野で周知である。例示的な酸化試薬としては、ヨウ素（Ｉ２）及び過酸化水素が挙げられ、ヨウ素が好ましい。
【実施例】
【０１２１】
以下の実施例は、本発明の根底をなす科学原理を説明する。広範な保護基による、広範なチオール化合物及びジスルフィド化合物の保護及び脱保護が実証されており、本発明の広い適用可能性を証明している。
【０１２２】
１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、１Ｈについては５００ＭＨｚ、１３Ｃについては１２５ＭＨｚの周波数で作動するＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ５００機器で、室温で記録した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、ＣＤＣｌ３（７．２６ｐｐｍ）シグナルを参照とした。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、ＣＤＣｌ３（７７．６７ｐｐｍ）シグナルを参照とした。
赤外線スペクトルは、センチメートルの逆数（ｃｍ−１）で与えられる周波数で、ＡＴＲモードで作動するＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  １００  ＦＴ−ＩＲスペクトロメータで実行した。
質量スペクトル及び高分解能質量データは、ＶＧ７０−ＳＥ質量分析計（ＥＩモード及びＣＩモード）で記録した。
融点（ｍ．ｐ．）はＧａｌｌｅｎｋａｍｐ加熱ブロックで取得したものであり、未補正である。
旋光度測定は、１０ｃｍのセル長さでＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ３４３旋光計を使用して実施した。
【０１２３】
略号
Ｂｏｃ                Ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基
Ｃｙｓ                システイン
Ｍａｌ                マレイミド
ＤＭＦ                ジメチルホルムアミド
ＴＣＥＰ              （トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）
ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ    液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化質量分析
【０１２４】
参考例１：ブロモマレイミド（化合物１）の調製
【０１２５】
【化１０】
2013501765.tif 000012
【０１２６】
クロロホルム（１５ｍＬ）中のマレイミド（２．００ｇ、０．０２ｍｏｌ）に、クロロホルム（１５ｍＬ）の臭素（１．１６ｍＬ、０．０２ｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を２時間還流し、１時間かけて室温まで冷却した。固体の黄色沈殿物を濾去し、冷クロロホルム（２ｘ５０ｍＬ）で洗浄して、粗製２，３−ジブロモスクシンイミド（４．０９ｇ、０．０１６ｍｏｌ）の白色結晶を得た。粗製スクシンイミドをテトラヒドロフラン（５０ｍＬ）中に溶解し、テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中のトリエチルアミン（２．４ｍＬ、０．０１７ｍｏｌ）を、０℃で５分間かけて添加した。反応混合物を室温まで温め、４８時間撹拌した。固体を濾去し、テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）で洗浄して、淡黄色（ｐａｌｅ  ｙｅｌｌｏｗ）粉末（２．１４ｇ、０．０１２ｍｏｌ）を５９％の収率で得た。
1H NMR (500MHz, CDCl3): δ = 7.67 (br s, 1H, NH), 6.89 (s, 1H, C=CH); 13C NMR (125MHz, CDCl3): δ = 173.8 (C=O), 170.5 (C=O), 136.9 (-(Br)C=C-), 135.4 (-C=CH-); IR (固体, cm-1): 3235 (s), 1709 (s); MS (CI+) m/z, (%): 178 (81M+, 32), 176 (79M+, 32), 125 (25), 86 (100); C4H3O2N79Brについて計算した質量: 175.93472. 実測値: 175.93493; m.p. 148 - 151℃.   
【０１２７】
参考例２：Ｎ−メチルブロモマレイミド（化合物２）の調製
【０１２８】
【化１１】
2013501765.tif 000013
【０１２９】
メタノール（２２．５ｍＬ）中のＮ−メチルマレイミド（０．５ｇ、４．５ｍｍｏｌ）に、臭素（０．５２ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を室温で２４時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、反応塊をテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中に溶解し、トリエチルアミン（０．８ｍＬ、５．８５ｍｍｏｌ）を添加し、次いで室温で２４時間撹拌した。この物質をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル、７：３）で精製して、青白い（ｐａｌｅ  ｗｈｉｔｅ）粉末（０．７６１ｇ、４．０ｍｍｏｌ）を８９％の収率で得た。
1H NMR (500MHz, CDCl3): δ = 6.90 (s, 1H, C=CH), 3.09 (s, 3H, N-CH3); 13C NMR (125MHz, CDCl3): δ = 168.6 (C=O), 165.4 (C=O), 131.9 (-C=CH-), 131.4 ((Br)C=C-), 24.7 (-N-CH3); IR (固体, cm-1): 3106 (s), 1708 (s); MS (CI) m/z, (%):192 (81M+, 99), 190(79M+, 100);  C5H5O2N79Brについて計算した質量: 189.95037. 実測値: 189.95052; m.p: 77-79℃.
【０１３０】
実施例１：Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｍａｌ）−ＯＭｅ（化合物４）の調製
【０１３１】
【化１２】
2013501765.tif 000014
【０１３２】
Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ（化合物３）（３６ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（１３ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）のメタノール（３ｍＬ）中撹拌溶液に、メタノール（３ｍＬ）中のブロモマレイミド（３０ｍｇ、０．１６９ｍｍｏｌ）を添加した。１分後、溶媒を真空中で除去した。この物質をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル、９：１から７：３の勾配溶出）で精製して、淡黄色粉末（５１ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）を１００％の収率で得た。
1H NMR (500MHz, CDCl3): δ =7.63 (s, 1H, NH), 6.27 (s, 1H, C=CH), 5.40 (d, 1H, J = 6.8, NH), 4.67 (ddd, 1H, J = 6.8, 5.4及び5.1, -HN-CH-C(O)-), 3.80 (s, 3H, O-CH3), 3.48 (dd, 1H, J = 13.8及び5.1, -S-CHH-), 3.62 (dd, 1H, J = 14.1及び5.4, -S-CHH-) 1.45 (s, 9H, 3 x CH3); 13C NMR (125MHz, CDCl3): δ = 170.2 (C=O), 168.9 (C=O), 167.6 (C=O), 155.2 (C=O), 155.9 (-C=CH-), 119.7 (-C=CH-), 81.1 ((CH3)CO-), 53.3 (O-CH3), 52.7 (CH), 34.0 (CH2), 28.3 (3 x CH3); IR (固体, cm-1) 3236 (w), 1715 (s); MS (CI+) m/z, (%): 331 (M+H, 5), 275 (20), 231 (100); [C13H18O6N2S]+Hについて計算した質量: 331.09638. 実測値: 331.09684; 20αD: -41.9o (c = 1.0, メタノール); m.p. 145-147℃.
【０１３３】
実施例２：Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｎ−Ｍｅ−Ｍａｌ）−ＯＭｅ（化合物５）の調製
【０１３４】
【化１３】
2013501765.tif 000015
【０１３５】
Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ（３２ｍｇ、０．１３６ｍｍｏｌ）のメタノール（４ｍＬ）中撹拌溶液に、酢酸ナトリウム（８２ｍｇ、０．４０８ｍｍｏｌ）を添加した。メタノール（４ｍＬ）中のＮ−メチルブロモマレイミド（２５．８ｍｇ、０．１３６ｍｍｏｌ）を１０分間かけてこれに添加した。この反応は淡黄色（ｌｉｇｈｔ  ｙｅｌｌｏｗ）に変化した。溶媒を真空中で除去し、残渣をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル、９：１から７：３の勾配溶出）で精製して、青白い粉末（３９．３ｍｇ、０．１１４ｍｍｏｌ）を８４％の収率で得た。
1H NMR (500MHz, CDCl3): δ = 6.26 (s, 1H, C=CH), 5.36 (d, 1H, J = 6.3, NH), 4.66 (m, 1H, -HN-CH-), 3.79 (s, 3H, O-CH3), 3.46 (dd, 1H, J = 5.2及び5.0, -S-CHH-), 3.35 (dd, 1H, J = 13.7及び5.1, -S-CHH-), 3.00 (s, 3H, -N-CH3), 1.44 (s, 9H, 3 x CH3); 13C NMR (125MHz, CDCl3): δ = 170.2 (C=O), 169.5 (C=O), 167.9 (C=O), 155.0 (C=O), 149.9(-C=CH-), 118.7 (-C=CH-), 80.9 ((CH3)3CO-), 53.1 (O-CH3), 52.7 (CH), 33.8 (CH2), 28.3 (3 x CH3), 24.1 (-N-CH3); IR (固体, cm-1) 3367.8, 2977.1, 1694.7; MS (ES+) m/z, (%): 367(46), 311 (M, 100); C14H20N2O6NaSについて計算した質量: 367.0940. 実測値: 367.0931; 20αD: -18.55o (c = 1.0, メタノール); m.p. 101-103℃.
【０１３６】
実施例３：プロピルアミンと比較した、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−Ｏｍｅに対するブロモマレイミド試薬の選択性の実証
Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ（３６ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）及びプロピルアミン（１０μＬ、０．１５３ｍｍｏｌ）のメタノール（３ｍＬ）中撹拌溶液に、メタノール（３ｍＬ）中のブロモマレイミド（３０ｍｇ、０．１６９ｍｍｏｌ）を添加した。１分後、溶媒を真空中で除去した。この物質をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル、９：１から７：３の勾配溶出）で精製して、淡黄色粉末（５１ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）を１００％で得た。データは、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｍａｌ）−ＯＭｅ  ４について上記で得たものと一致した。
【０１３７】
実施例４：Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅを再生するためのＮ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｍａｌ）−ＯＭｅの切断
【０１３８】
【化１４】
2013501765.tif 000016
【０１３９】
４（５０ｍｇ、０．１５１ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（２ｍＬ）中撹拌溶液に、２０ｍＬの水性緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０）を添加した。水性緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０）２０ｍＬ中のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（４３０ｍｇ  １．５１ｍｍｏｌ）を、この溶液に添加した。５分後、この水溶液を酢酸エチル（３ｘ２５ｍＬ）で抽出し、飽和塩化リチウム溶液（５ｘ２５ｍＬ）、水（２５ｍＬ）及びブライン（２５ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。溶媒を真空中で除去して、無色油状物（３４．５ｍｇ、０．１４８ｍｍｏｌ）を９８％の収率で得た。この油状物の１Ｈ ＮＭＲ及び１３Ｃ ＮＭＲは、これが市販のＮ−Ｂｏｃ−システイン  メチルエステル３であることを示した。
【０１４０】
実施例５：２，３−ジブロモマレイミドとソマトスタチンとの反応
ソマトスタチンは、分子内の２つのシステイン残基がジスルフィド結合で結合した形態で存在することが知られたペプチドホルモンである。
【０１４１】
１ｍｇの凍結乾燥ソマトスタチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、２ｍｌの５０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４−、ｐＨ６．２、４０％  ＭｅＣＮ、２．５％  ＤＭＦ中に再可溶化した。５００μｌを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ反応チューブに移し、同緩衝液中で希釈して最終濃度０．２５ｍｇ／ｍｌ（１５２．６μＭ）にした。２．０当量のＴＣＥＰ（５０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４−、ｐＨ６．２、４０％  ＭｅＣＮ中１００ｘストック溶液）を添加し、反応を周囲温度で１時間インキュベートした。ジスルフィド結合の還元後、１．４当量の２，３−ジブロモマレイミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、５０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４−、ｐＨ６．２、４０％  ＭｅＣＮ、２．５％  ＤＭＦ中１００ｘストック溶液）を添加し、溶液を穏やかに混合して、４℃でさらに１２時間インキュベートした。
【０１４２】
マレイミド架橋されたソマトスタチンが、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ（ＥＳ＋／ＥＳ−）によって検出された。コントロールには、未処理のペプチド、及び２，３−ジブロモマレイミド又はＴＣＥＰのみで処理したソマトスタチンを含めた。完全な還元は、ＴＣＥＰ処理したペプチドとマレイミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、５０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４−、ｐＨ６．２、４０％  ＭｅＣＮ、２．５％  ＤＭＦ中の１００ｘストック溶液）との反応によって検出された。
【０１４３】
実験データ：
未処理のソマトスタチン：[ES+]1638.04(m/z 1), 819.82 (m/z 2), 546.95 (m/z 3).
マレイミド架橋されたソマトスタチン：[ES+] 1734.14 Da (m/z 1), 867.40 Da (m/z 2), 578.73 (m/z 3).
【０１４４】
参考例３：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃの発現
【０１４５】
【化１５】
2013501765.tif 000017
【０１４６】
タンパク質ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃをモデルタンパク質として使用した。このモデルタンパク質は単一のシステイン残基を含む。
【０１４７】
ＬＣ−ＭＳは、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｑｕａｄ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＳＱＤ）に接続したＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ｕＰＬＣで実施した。カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ  ｕＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８  １．７μｍ  ２．１ｘ５０ｍｍ。波長：２５４ｎｍ。移動相：９５：５  水（０．１％ギ酸）：ＭｅＣＮ（０．１％ギ酸）、４分間にわたる勾配（５：９５  水（０．１％ギ酸）：ＭｅＣＮ（０．１％ギ酸）まで。流速：０．６ｍＬ／分。ＭＳモード：ＥＳ＋。スキャン範囲：ｍ／ｚ＝８５−２０００。スキャン時間：０．２５秒。データは連続体モードで得た。ＭＳのエレクトロスプレー供給源は、３．５ｋＶのキャピラリー電圧及び５０Ｖのコーン電圧で操作した。窒素を、総流量６００Ｌ／ｈで、ネブライザー及び脱溶媒和ガスとして使用した。総質量スペクトルを、ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェアにプレインストールされたＭａｘＥｎｔ  １アルゴリズムを使用して、イオンシリーズから再構築した。
【０１４８】
モデルタンパク質をＥ．ｃｏｌｉ中で過剰発現させ、６Ｈｉｓタグ化タンパク質を、標準的な技術によって、Ｎｉ−アフィニティクロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーの両方を使用して精製した。ＬＣ−ＭＳを用いた分析により、所望のタンパク質に対応する質量１４１６９の単一のタンパク質種が示された。
【０１４９】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｅｌｌｍａｎ試薬（５μＬ、Ｈ２Ｏ中２８２ｍＭ溶液）を０℃で添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、１０分間０℃で維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、単一の反応が生じて１４３６６の質量を有する単一の生成物が得られたことが示され、Ｃ１１１が官能化に利用可能であることが示された。
【０１５０】
実施例６：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃとブロモマレイミドとの反応
【０１５１】
【化１６】
2013501765.tif 000018
【０１５２】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望のタンパク質に対応する質量１４２６５の単一のタンパク質種が示された。
【０１５３】
この混合物を、０℃にてＥｌｌｍａｎ試薬（５μＬ、Ｈ２Ｏ中２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で１０分間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、Ｅｌｌｍａｎ試薬との明白な反応がなかったことが示され、これは、ブロモマレイミドの官能化がＣ１１１で生じたことを強調する。
【０１５４】
実施例７：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１ＣとＮ−メチルブロモマレイミドとの反応
【０１５５】
【化１７】
2013501765.tif 000019
【０１５６】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｎ−メチルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望のタンパク質に対応する質量１４２７８の単一のタンパク質種が示された。
【０１５７】
この混合物を、０℃にてＥｌｌｍａｎ試薬（５μＬ、Ｈ２Ｏ中２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、００℃で１０分間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、Ｅｌｌｍａｎ試薬との明白な反応がなかったことが示され、これは、Ｎ−メチルブロモマレイミドの官能化がＣ１１１で生じたことを強調する。
【０１５８】
実施例８：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ブロモマレイミド付加物のホスフィン媒介性の還元的切断
【０１５９】
【化１８】
2013501765.tif 000020
【０１６０】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２６５の単一のタンパク質種が示された。
【０１６１】
この混合物を、０℃にてＴＣＥＰ．ＨＣｌ（５μＬ、Ｈ２Ｏ中２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で３時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物が明らかに切断されて、ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ（質量＝１４１６８）を８５％の収率で生じたことが示された。残りの物質は、未反応のタンパク質／ブロモマレイミド付加物であった。
【０１６２】
実施例９：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物のホスフィン媒介性の還元的切断
【０１６３】
【化１９】
2013501765.tif 000021
【０１６４】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｎ−メチルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２７８の単一のタンパク質種が示された。
【０１６５】
この混合物を、０℃にてＴＣＥＰ．ＨＣｌ（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で３時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物が明らかに切断されて、ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ（質量＝１４１６８）を８５％の収率で生じたことが示された。残りの物質は、未反応のタンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物であった。
【０１６６】
実施例１０：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド付加物の合成
【０１６７】
【化２０】
2013501765.tif 000022
【０１６８】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０１６９】
実施例１１：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物の合成
【０１７０】
【化２１】
2013501765.tif 000023
【０１７１】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０１７２】
この混合物を、０℃にてグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物が、唯一の存在したタンパク質種（質量＝１４５７２）であることが示された。
【０１７３】
実施例１２：生理学的に適当なグルタチオン濃度（５ｍＭ）での、ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物のグルタチオン媒介性の切断
【０１７４】
【化２２】
2013501765.tif 000024
【０１７５】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０１７６】
この混合物を、０℃にてグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物が、存在する唯一のタンパク質種（質量＝１４５７２）であることが示された。
【０１７７】
この混合物を、０℃にてグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の１００ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃが、存在する唯一のタンパク質種（質量＝１４１７３）であることが示された。
【０１７８】
実施例１３：Ｎ−Ａｃ−Ｃｙｓ（Ｍａｌ）−ベンジルアミンの調製
【０１７９】
【化２３】
2013501765.tif 000025
【０１８０】
メタノール（４２ｍＬ）中のＮ−Ａｃ−Ｃｙｓ−ベンジルアミン（１．００ｇ、４．００ｍｍｏｌ）上記）に、メタノール（４２ｍＬ）中のブロモマレイミド（７７７ｍｇ、４．３７ｍｍｏｌ）を５分間かけて滴下した。１０分後、溶媒を真空中で除去し、残渣を、石油エーテル中１０％の酢酸エチルを使用するフラッシュクロマトグラフィーに供して、所望の化合物（４２９ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）をオフホワイトの固体として、ブロモマレイミドの６９％の回収率に基づき１００％の収率で得た。 δH (500 MHz, MeOD) 7.32-7.20 (m, 5H, 5 x Ar-H), 6.45 (s, 1H, H-12), 4.71 (t, 1H, J = 7.3, H-3), 4.38 (d, 2H, J = 2.7, H2-5), 3.40 (dd, 1H, J = 7.0及び13.6, HH-10), 3.25 (dd, 1H, J = 7.2及び13.6, HH-10), 1.99 (s, 3H, H3-1); δC (125 MHz, MeOD) 173.51 (C=O), 172.22 (C=O), 171.44 (C=O), 170.51 (C=O), 151.58 (C11), 139.48 (C6), 129.54 (2 x Ar-H), 128.51 (2 x Ar-H), 128.26 (C9), 121.01 (C12) 53.04 (C3), 44.25 (C5), 33.72 (C10), 22.42 (C1); IR (薄膜, cm-1) 3187 (w), 1717 (s), 1646 (s); MS (ES+) m/z (相対強度): 370 ([M+Na], 20), 337 (50), 325 (90), 309(100); [C16H17N3O4SN]+Naについて計算した正確な質量はm/z 370.0873を要求、実測値 370.0852 (ES+); UV (アセトニトリル) ε213= 19400, ε247 = 4800及びε337 = 2700 cm-1M-1d3; 白色固体は180℃で分解する。
【０１８１】
実施例１４：（Ｓ）−メチル  ２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−３−（１−（２−（５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１−スルホンアミド）エチル）−２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イルチオ）プロパノアートの調製
【０１８２】
【化２４】
2013501765.tif 000026
【０１８３】
ヒートガンを使用して撹拌溶液を短時間加熱することにより、ダンシル−ブロモマレイミド（１００ｍｇ）をメタノール（２００ｍｌ）中に溶解した。得られた淡黄色溶液に、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ（２２μｌ、０．１ｍｍｏｌ、０．５当量）及び酢酸ナトリウム（１４．５ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、０．５当量））を、３時間かけて添加した。反応をＴＬＣ（溶離液：４０％ＥｔＯＡｃ：６０％石油エーテル）でモニタリングした。添加が完了したところでメタノールを真空中で除去して、黄色油状物を得た。カラムクロマトグラフィーでの精製により、所望の生成物を得た（４８．２９ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、７９．７％）。 1H NMR (600MHz CDCl3): δH 8.54(d, J=8.56Hz, 1H, CH), 8.21(d, 1H, J=8.27Hz, CH), 8.13(d, 1H, J=8.57Hz, CH), 7.55(m, 2H, 2 x CH), 7.25(d, J=7.60Hz, 1H, CH), 5.92(s, 1H, CH), 4.44(m, 1H, HN-CH-CO), 3.77(s, 3H, OMe), 3.48(m, 2H, CH2), 3.44(m, 2H, CH2), 3.38(s, 6H, 2 xCH3), 3.13(t, J=5.79, 2H, S-CH2) 2.88(s, 9H, 3 x CH3). 13C NMR (600MHz CDCl3): 173.08, 170.52, 169.69, 168.96 (4x C=O), 157.73 (-C=CH), 153.16, 150.71, 136.48, 131.39, 131.25, 131.18, 130.74, 130.65, 129.31, 124.35, 120.61, 119.22, 81.12, 53.58, 52.95, 45.89, 41.53, 33.98, 28.66. IR: 3324.7 cm-1, 1775 cm-1. [M + H]+: 605.1756, 計算値; 605.1740.
【０１８４】
実施例１５：Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｍａｌ）−Ｇｌｙの調製
【０１８５】
【化２５】
2013501765.tif 000027
【０１８６】
メタノール（３ｍＬ）中のグルタチオン（４７ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）に、メタノール（３ｍＬ）中のブロモマレイミド（３０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を添加した。５分後、溶媒を真空中で除去して、所望の化合物（６２ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を粘度のある無色油状物として１００％の収率で得た。δH  (500 MHz, MeOD) 6.47 (s, 1H, H-12), 4.79 (dd, 1H, J = 5.7及び8.2, H-6), 4.06 (t, 1H, J = 6.5, H-2), 3.95 (s, 2H, H2-8), 3.49 (dd, 1H, J = 5.8及び13.9, HH-10), 3.29 (dd, 1H, J = 8.3及び13.6, HH-10), 2.61 (t, 2H, J = 7.1, H2-4), 2.29-2.15 (m, 2H, H2-3);  δC(125 MHz, MeOD) 174.68 (C=O), 172.81 (C=O), 172.39 (C=O), 171.89 (C=O), 171.62 (C=O), 170.59 (C=O), 151.75 (C11), 120.91 (C12), 53.79 (C6), 52.76 (C2), 42.01 (C8), 33.92 (C10) 32.42 (C4), 27.03 (C3); IR (油, cm-1) 3259 (m), 2928 (m), 1717 (s); MS (ES-) m/z (相対強度): 401 ([M-H], 100), 272 (30); [C14H18N4O8S]-Hについて計算した正確な質量はm/z 401.0767を要求、実測値 401.0773 (ES-); UV (アセトニトリル) ε204= 8100, ε253 = 5600及びε342 = 1900 cm-1M-1d3.
【０１８７】
実施例１６：Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（ＭｅＭａｌ）−Ｐｈｅ−ｉＰｒの調製の調製
【０１８８】
【化２６】
2013501765.tif 000028
【０１８９】
Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート（３４４ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ）を、（２Ｒ）−２−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−３−［（１−メチル−２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル）スルファニル］プロパン酸（３１３ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（１３９ｍｇ）のＤＭＦ（２ｍＬ）中撹拌溶液に添加し、反応を２１℃で３分間撹拌した。（２Ｓ）−１−オキソ−３−フェニル−１−（プロパン−２−イルアミノ）プロパン−２−アンモニウム  トリフルオロアセテート（２６２ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１．５ｍＬ）中溶液を反応混合物に添加し、その後、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２９４μＬ、１．６４ｍｍｏｌ）を添加し、反応を２１℃で４時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、残渣をＥｔＯＡｃ（６０ｍＬ）中に溶解し、１Ｍ  ＨＣｌ（ｘ３）、Ｈ２Ｏ（ｘ１）、飽和ＮａＨＣＯ３（ｘ３）、１０％ＬｉＣｌ（ｘ１）及び飽和ＮａＣｌ（ｘ１）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、溶媒を真空中で除去した。沈殿（ＣＨＣｌ３／石油エーテル  ４０〜６０）での精製により、所望の化合物を淡褐色固体として得た（３５９ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ、８４％収率）: 1H NMR (600 MHz, CD3CN, 25 °C) δ 7.32-7.28 (m, 2H), 7.25-7.21 (m, 3H), 7.11 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 6.46 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 4.46 (td, J = 7.6, 6.5 Hz, 1H), 4.31 (td, J = 7.3, 6.4 Hz), 3.88 (ダブレットのセプテット, J = 6.6, 6.3 Hz, 1H), 3.30 (dd, J = 13.7, 5.8 Hz, 1H), 3.16 (dd, J = 13.7, 7.4 Hz, 1H), 2.95 (dd, J = 13.8, 7.5 Hz, 1H), 2.93 (s, 3H), 1.43 (s, 9H), 1.07 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 1.02 (d, J = 6.6 Hz, 3H); 13C NMR (151 MHz, CD3CN, 25 °C) δ 169.39, 168.84, 168.77, 167.85, 155.17, 149.33, 136.77, 129.10, 127.98, 126.30, 118.57, 79.49, 54.10, 52.62, 40.91, 37.44, 32.43, 27.15, 22.95, 21.24, 21.17; IR (薄膜) 3301, 2973, 1770, 1701, 1674, 1641, 1525 cm-1; LRMS (EI) 518 (24%, [M]+・), 432 (23), 219 (33), 149 (21) 110 (27), 86 (37), 84 (100); C25H34N4O6S [M]+・について計算したHRMS (EI)  518.2194, 実測値518.2199.
【０１９０】
実施例１７：Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（ＭｅＭａｌ）−Ｐｈｅ−ｉＰｒの脱保護
【０１９１】
【化２７】
2013501765.tif 000029
【０１９２】
１５０ｍＭホスフェート緩衝液（ｐＨ８、２５ｍＬ）中のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（１３８ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（ＭｅＭａｌ）−Ｐｈｅ−ｉＰｒ（５０ｍｇ、９７μｍｏｌ）のＭｅＣＮ（２５ｍＬ）中撹拌溶液に添加し、反応を２１℃で１０分間撹拌した。Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−ｉＰｒの合成はＬＣＭＳ（ＥＳ−）４０８．７（１００％）で確認した。
【０１９３】
参考例４：Ｇｒｂ２−ＳＨ２  Ｌ１１１Ｃ変異体のクローニング及び発現
【０１９４】
【化２８】
2013501765.tif 000030
【０１９５】
Ｇｒｂ２−ＳＨ２  Ｌ１１１Ｃの配列（残基５３−１６３）：M G I E M K P H P W F F G K I P R A K A E E M L S K Q R H D G A F L I R E S E S A P G D F S L S V K F G N D V Q H F K V C R D G A G K Y F L W V V K F N S L N E L V D Y H R S T S V S R N Q Q I F L R D I E Q V P Q Q P T Y V Q A G S R S H H H H H H 終止。質量計算値＝１４１７１
【０１９６】
Ｇｒｂ２  ＳＨ２ドメインのためのＤＮＡ構築物は、１次アミノ酸配列５３−１６３を含んでおり、プラスミドＱＥ−６０（Ｑｉａｇｅｎ）にクローニングした。Ｇｒｂ２  ＳＨ２  Ｌ１１１Ｃ変異体は、変異残基をコードするオリゴヌクレオチドを使用した部位特異的変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｋｉｔ）によって構築した。両方の構築物を、Ｔ５プロモーターを使用してＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］、Ｑｉａｇｅｎ）中で発現させ、Ｃ末端に６−Ｈｉｓ  Ｔａｇを精製のために組み込んだ。培養物（１Ｌ）を、シングルコロニーからＴ．Ｂ．中で３７℃で増殖させ、０．９のＯ．Ｄ．λ６００に達した時点で１．０ｍＭ  ＩＰＴＧによって発現を誘導した。培養物に、ほぼ３時間にわたってタンパク質を発現させ、その後細胞をペレット化した。ペレットを、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含む０．１Ｍリン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．２中で溶解させた。溶解物を遠心分離し、上清をＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）にアプライした。Ｇｒｂ２−ＳＨ２  Ｌ１１１Ｃを、０．１Ｍリン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．２）によってＮｉ−ＮＴＡカラムから溶出させた。収集したＧｒｂ２  ＳＨ２  Ｌ１１１Ｃは、クマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥで可視化したとき、約９５％の純度であった。ドメインスワッピングによるＧｒｂ２  ＳＨ２ドメインの二量体化は、以前に観察されている。二量体及び単量体のＧｒｂ２−ＳＨ２を、０．１Ｍリン酸ナトリウム及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）で予め平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００カラム（３２０ｍＬ）で分離した。単量体Ｇｒｂ２−ＳＨ２の分子量（約１４ｋＤａ）及び二量体Ｇｒｂ２−ＳＨ２の分子量（約２８ｋＤａ）に対応する２つのピークが溶出した。Ｇｒｂ２−ＳＨ２  Ｌ１１１Ｃドメインのほぼ６０％が、カラムから単量体として溶出した。４℃で数ヶ月の過程にわたって相互変換が殆ど認められなかったことから、分離された単量体及び二量体は、驚くべきことに動力学的に安定であることが見出された。単量体を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−４遠心フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮し、タンパク質の最終濃度を、ＭｃＮｅｍａｒ及び共同研究者が得た吸光係数（１５，６００Ｍ−１）を用い、２８０ｎｍでの吸光度によって決定した。タンパク質を、１００ｍＬアリコート中２ｍｇ／ｍＬの濃度で凍結させ、これを実験の際に必要に応じて解凍した。単量体タンパク質の質量（質量１４１７０）はＥＳＩ−ＭＳを使用して得た。
【０１９７】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、０℃でＥｌｌｍａｎ試薬（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で１０分間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、単一の反応が起こって、１４３７０の質量を有する単一の生成物が生じたことが示され、これは、Ｃ１１１が官能化に利用可能であることを示す。
【０１９８】
実施例１８：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ブロモマレイミド付加物の調製
【０１９９】
【化２９】
2013501765.tif 000031
【０２００】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が定量的変換で形成されたことが示された（質量１４２６６）。
【０２０１】
混合物を、０℃でＥｌｌｍａｎ試薬（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で１０分間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、Ｅｌｌｍａｎ試薬との反応は明白には表れないことが示され、これは、ブロモマレイミド官能化がＣ１１１で生じたことを強調する。
【０２０２】
実施例１９：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物の調製
【０２０３】
【化３０】
2013501765.tif 000032
【０２０４】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｎ−メチルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した、ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が定量的変換で形成されたことが示された（質量１４２８０）。
【０２０５】
混合物を、０℃でＥｌｌｍａｎ試薬（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で１０分間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、Ｅｌｌｍａｎ試薬との反応は明白には表れないことが示され、これは、Ｎ−メチルブロモマレイミド官能化がＣ１１１で生じたことを強調している。
【０２０６】
実施例２０：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ブロモマレイミド付加物のホスフィン媒介性の還元的切断
【０２０７】
【化３１】
2013501765.tif 000033
【０２０８】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２６５の単一のタンパク質種が示された。
【０２０９】
混合物を、０℃でＴＣＥＰ．ＨＣｌ（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で３時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物が明らかに切断されて、所望の生成物（質量＝１４１６９）が８０％の変換で得られたことが示された。
【０２１０】
実施例２１：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ブロモマレイミド付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の還元的切断
【０２１１】
【化３２】
2013501765.tif 000034
【０２１２】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２６５の単一のタンパク質種が示された。
【０２１３】
混合物を、β−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理し、１秒間ボルテックスし、３７℃で４時間維持した。分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物が明らかに切断されて、所望の生成物（質量＝１４１７３）が定量的変換で得られたことが示された。
【０２１４】
実施例２２：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ブロモマレイミド付加物のグルタチオン媒介性の切断
【０２１５】
【化３３】
2013501765.tif 000035
【０２１６】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２６５の単一のタンパク質種が示された。
【０２１７】
混合物をグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理し、１秒間ボルテックスし、３７℃で４時間維持した。分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物が明らかに切断されて、所望の生成物（質量＝１４１７３）が定量的変換で得られたことが示された。
【０２１８】
実施例２３：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物のホスフィン媒介性の還元的切断
【０２１９】
【化３４】
2013501765.tif 000036
【０２２０】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｎ−メチルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２７８の単一のタンパク質種が示された。
【０２２１】
混合物を、０℃でＴＣＥＰ．ＨＣｌ（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で３時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物が明らかに切断されて、所望の生成物（質量＝１４１６８）が８５％の変換で得られたことが示された。
【０２２２】
実施例２４：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の還元的切断
【０２２３】
【化３５】
2013501765.tif 000037
【０２２４】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｎ−メチルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２８０の単一のタンパク質種が示された。
【０２２５】
混合物を、β−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理し、１秒間ボルテックスし、３７℃で４時間維持した。分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物が明らかに切断されて、所望の生成物（質量＝１４１７３）が定量的変換で得られたことが示された。
【０２２６】
実施例２５：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物のグルタチオン媒介性の切断
【０２２７】
【化３６】
2013501765.tif 000038
【０２２８】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｎ−メチルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２８０の単一のタンパク質種が示された。
【０２２９】
混合物を、グルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理し、１秒間ボルテックスし、３７℃で４時間維持した。分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物が明らかに切断されて、所望の生成物（質量＝１４１７３）が定量的変換で得られたことが示された。
【０２３０】
実施例２６：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ブロモマレイミド付加物のエタンジチオール媒介性の切断
【０２３１】
【化３７】
2013501765.tif 000039
【０２３２】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２６５の単一のタンパク質種が示された。
【０２３３】
混合物を、エタンジチオール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理し、１秒間ボルテックスし、３７℃で４時間維持した。分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物が明らかに切断されて、所望の生成物（質量＝１４１７３）が定量的変換で得られたことが示された。
【０２３４】
実施例２７：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ブロモマレイミド／２−メルカプトエタノール付加物の調製
【０２３５】
【化３８】
2013501765.tif 000040
【０２３６】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２６５の単一のタンパク質種が示された。
【０２３７】
混合物を、０℃で２−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で３時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ブロモマレイミド／２−メルカプトエタノール付加物（質量＝１４３４５）が５４％の収率で形成されたことが示された。残りの物質はＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃであった。
【０２３８】
実施例２８：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−メチルブロモマレイミド／２−メルカプトエタノール付加物の調製
【０２３９】
【化３９】
2013501765.tif 000041
【０２４０】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｎ−メチルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２７８の単一のタンパク質種が示された。
【０２４１】
混合物を、０℃で２−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で３時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４３５９）が９０％の収率で形成されたことが示された。残りの物質はＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃであった。
【０２４２】
実施例２９：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ブロモマレイミド／グルタチオン付加物の調製
【０２４３】
【化４０】
2013501765.tif 000042
【０２４４】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２６５の単一のタンパク質種が示された。
【０２４５】
混合物を、０℃でグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で３時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ブロモマレイミド／グルタチオン付加物（質量＝１４５７４）が４４％の変換で形成されたことが示された。残りの物質はＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃであった。
【０２４６】
実施例３０：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−メチルブロモマレイミド／グルタチオン付加物の調製
【０２４７】
【化４１】
2013501765.tif 000043
【０２４８】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｎ−メチルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２７８の単一のタンパク質種が示された。
【０２４９】
混合物を、０℃で２−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で３時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド／グルタチオン付加物（質量＝１４５８８）が９５％の変換で形成されたことが示された。残りの物質はＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃであった。
【０２５０】
実施例３１：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド付加物の調製
【０２５１】
【化４２】
2013501765.tif 000044
【０２５２】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４３４５）。
【０２５３】
実施例３２：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド付加物の２−メルカプトエタノール媒介性の還元的切断
【０２５４】
【化４３】
2013501765.tif 000045
【０２５５】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０２５６】
混合物を、０℃で２−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物が明らかに切断されて、所望の生成物（質量＝１４１７１）が定量的収率の収率で得られたことが示された。
【０２５７】
実施例３３：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド付加物のグルタチオン媒介性の還元的切断
【０２５８】
【化４４】
2013501765.tif 000046
【０２５９】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０２６０】
混合物を、０℃でグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物が明らかに切断されて、所望の生成物（質量＝１４１７０）が定量的収率で得られたことが示された。
【０２６１】
実施例３４：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物の調製
【０２６２】
【化４５】
2013501765.tif 000047
【０２６３】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０２６４】
混合物を、０℃でグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４５７３）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０２６５】
実施例３５：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド／β−１−チオグルコース付加物の調製
【０２６６】
【化４６】
2013501765.tif 000048
【０２６７】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０２６８】
混合物を、０℃でβ−１−チオグルコース、ナトリウム塩（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４４６１）がほぼ定量的収率で形成されたことが示された。
【０２６９】
実施例３６：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物のグルタチオン媒介性の切断
【０２７０】
【化４７】
2013501765.tif 000049
【０２７１】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０２７２】
混合物を、０℃でグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物が、唯一の存在するタンパク質種であることが示された（質量＝１４５７３）。
【０２７３】
混合物を、０℃でグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１７３）が、定量的収率で形成されたことが示された。
【０２７４】
実施例３７：生理学的に適切なグルタチオン濃度（５ｍＭ）での、ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物のグルタチオン媒介性の切断
【０２７５】
【化４８】
2013501765.tif 000050
【０２７６】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０２７７】
混合物を、０℃でグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物が存在する唯一のタンパク質種であることが示された（質量＝１４５７３）。
【０２７８】
混合物を、０℃でグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の１００ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１７３）が定量的収率で形成されたことが示された。
【０２７９】
実施例３８：生理学的に適切なグルタチオン濃度（１ｍＭ）での、ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物のグルタチオン媒介性の切断
【０２８０】
【化４９】
2013501765.tif 000051
【０２８１】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０２８２】
混合物を、０℃でグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物が存在する唯一のタンパク質種であることが示された（質量＝１４５７３）。
【０２８３】
タンパク質／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物の溶液を、緩衝液交換（Ｍｉｃｒｏ  Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎ  ６  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｃｏｌｕｍｎ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に供して、付加物（９５μＬ、［付加物］０．２ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を得た。これに、グルタチオン（５μＬ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４中２０ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで３７℃で４時間維持した。分析により、Ｇｒｂ２−ＳＨ２（Ｌ１１１Ｃ）（質量）１４１７０）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０２８４】
実施例３９：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０２８５】
【化５０】
2013501765.tif 000052
【０２８６】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０２８７】
混合物を、０℃でグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物が存在する唯一のタンパク質種であることが示された（質量＝１４５７３）。
【０２８８】
混合物を、０℃でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１７２）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０２８９】
実施例４０：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド／β−１−チオグルコース付加物のグルタチオン媒介性の切断
【０２９０】
【化５１】
2013501765.tif 000053
【０２９１】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０２９２】
混合物を、０℃でβ−１−チオグルコース（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド／β−１−チオグルコース付加物が存在する唯一のタンパク質種であることが示された（質量＝１４４６１）。
【０２９３】
混合物を、０℃でグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１７３）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０２９４】
実施例４１：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド／β−１−チオグルコース付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０２９５】
【化５２】
2013501765.tif 000054
【０２９６】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０２９７】
混合物を、０℃でβ−１−チオグルコース（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド／β−１−チオグルコース付加物が存在する唯一のタンパク質種であることが示された（質量＝１４４６１）。
【０２９８】
混合物を、０℃でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１７２）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０２９９】
実施例４２：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−フェニルブロモマレイミド付加物の調製
【０３００】
【化５３】
2013501765.tif 000055
【０３０１】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｎ−フェニルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４３５１）。
【０３０２】
実施例４３：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−フェニルジブロモマレイミド付加物の調製
【０３０３】
【化５４】
2013501765.tif 000056
【０３０４】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭ  ＭＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６）に、Ｎ−フェニルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４４３１）。
【０３０５】
実施例４４：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−フェニルジブロモマレイミド付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０３０６】
【化５５】
2013501765.tif 000057
【０３０７】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭ  ＭＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６）に、Ｎ−フェニルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／Ｎ−フェニルジブロモマレイミド付加物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４４３１）。
【０３０８】
混合物を、０℃でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１７９）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０３０９】
実施例４５：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−フェニルジブロモマレイミド／β−１−チオグルコース付加物の調製
【０３１０】
【化５６】
2013501765.tif 000058
【０３１１】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭ  ＭＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６）に、Ｎ−フェニルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／Ｎ−フェニルジブロモマレイミド付加物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４４３１）。
【０３１２】
混合物を、０℃でβ−１−チオグルコース（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／Ｎ−フェニルジブロモマレイミド／β−１−チオグルコース付加物が存在する唯一のタンパク質種であることが示された（質量＝１４５４７）。
【０３１３】
実施例４６：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−フェニルジブロモマレイミド／β−１−チオグルコース付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０３１４】
【化５７】
2013501765.tif 000059
【０３１５】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭ  ＭＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６）に、Ｎ−フェニルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／Ｎ−フェニルジブロモマレイミド付加物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４４３１）。
【０３１６】
混合物を、０℃でβ−１−チオグルコース（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／Ｎ−フェニルジブロモマレイミド／β−１−チオグルコース付加物が存在する唯一のタンパク質種であることが示された（質量＝１４５４７）。
【０３１７】
混合物を、０℃でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１７８）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０３１８】
実施例４７：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ビオチン−ＰＥＧ−ブロモマレイミド付加物の調製
【０３１９】
【化５８】
2013501765.tif 000060
【０３２０】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ビオチン−ＰＥＧ−ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４６３４）。
【０３２１】
実施例４８：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ビオチン−ＰＥＧ−ブロモマレイミド付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０３２２】
【化５９】
2013501765.tif 000061
【０３２３】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ビオチン−ＰＥＧ−ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ビオチン−ＰＥＧ−ブロモマレイミド付加物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４６３４）。
【０３２４】
混合物を、３７℃でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、３７℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１８０）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０３２５】
実施例４９：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ビオチン−ＰＥＧ−ジブロモマレイミド付加物の調製
【０３２６】
【化６０】
2013501765.tif 000062
【０３２７】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ビオチン−ＰＥＧ−ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で２時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が＞８０％の収率で形成されたことが示された（質量１４７０１）。
【０３２８】
実施例５０：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ビオチン−ＰＥＧ−ジブロモマレイミド付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０３２９】
【化６１】
2013501765.tif 000063
【０３３０】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ビオチン−ＰＥＧ−ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ビオチン−ＰＥＧ−ジブロモマレイミド付加物が＞８０％の変換で形成されたことが示された（質量１４７０１）。
【０３３１】
混合物を、０℃でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１７１）が＞８０％の変換で形成されたことが示された。
【０３３２】
実施例５１：ニュートラアビジン被覆したアガロースビーズ上へのＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ビオチン−ＰＥＧ−ブロモマレイミド付加物のプルダウン及び放出
【０３３３】
【化６２】
2013501765.tif 000064
【０３３４】
０℃のモデルタンパク質溶液（２００μＬ、［タンパク質］１．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ビオチン−ＰＥＧ−ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４６３４）。
【０３３５】
タンパク質／ビオチン−ＰＥＧ−ブロモマレイミド付加物（２００μＬ）及び非修飾モデルタンパク質（２００μＬ）を、濃縮器（Ｖｉｖａｓｐｉｎ、カットオフ１０ｋ）中でＰＢＳ緩衝液（３ｘ５００μＬ）で独立して洗浄し、タンパク質溶液（３００μＬ）（Ｉｎ）を得た。得られたタンパク質溶液のそれぞれについて、ニュートラアビジン被覆したアガロースビーズ（５０％水性スラリー７５０μＬ）を、ＰＢＳ（２ｘ５００μＬ）で洗浄した。次いで、タンパク質溶液（３００μＬ）をビーズに添加し、混合物を４℃で３０分間インキュベートした。混合物を遠心分離し、フロースルー（ＦＴ）を収集した。ビーズをＰＢＳ（２ｘ５００μＬ）で洗浄し、両方の洗浄画分を収集した（Ｗ１及びＷ２）。タンパク質を、β−メルカプトエタノール（２５ｍＭ）を含むＰＢＳ（３００μＬ）中で３７℃で２時間インキュベートすることにより、ビーズから放出させた。サンプルを遠心分離し、切断されたＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃを含む溶離液（Ｅｌ）を収集した。結果を図１に示す。
【０３３６】
回収されたタンパク質の量は、デンシトメトリーによるタンパク質希釈系列との比較により、４４％と決定された。しかしながら、不可逆的に物理吸着されたタンパク質（未修飾のタンパク質コントロールを使用して決定した）に対して補正すると、補正された回収率は７１％であった。
【０３３７】
実施例５２：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−フルオレセインブロモマレイミド付加物の調製
【０３３８】
【化６３】
2013501765.tif 000065
【０３３９】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に、Ｎ−フルオレセインブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が９０％の変換で形成されたことが示された（質量１４５９７）。
【０３４０】
実施例５３：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−フルオレセインブロモマレイミド付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０３４１】
【化６４】
2013501765.tif 000066
【０３４２】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に、Ｎ−フルオレセインブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／フルオレセインブロモマレイミド付加物が９０％の変換で形成されたことが示された（質量１４５９７）。
【０３４３】
混合物を、３７℃でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、３７℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１７１）が８７％の変換で形成されたことが示された。
【０３４４】
実施例５４：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−フルオレセインジブロモマレイミド付加物の調製
【０３４５】
【化６５】
2013501765.tif 000067
【０３４６】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｎ−フルオレセインジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が６１％の変換で形成されたことが示された（質量１４６７５）。
【０３４７】
実施例５５：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−フルオレセインジブロモマレイミド付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０３４８】
【化６６】
2013501765.tif 000068
【０３４９】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に、Ｎ−フルオレセインジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／フルオレセインジブロモマレイミド付加物が６１％の変換で形成されたことが示された（質量１４５９７）。
【０３５０】
混合物を、３７℃でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、３７℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１７１）が８５％の変換で形成されたことが示された。
【０３５１】
実施例５６：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ＢｒＤＤＰＤ付加物の調製
【０３５２】
【化６７】
2013501765.tif 000069
【０３５３】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ＢｒＤＤＰＤ（５μＬ、ＤＭＦ中の２８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで３７℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４３４８）。
【０３５４】
実施例５７：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ＢｒＤＤＰＤ付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０３５５】
【化６８】
2013501765.tif 000070
【０３５６】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ＢｒＤＤＰＤ（５μＬ、ＤＭＦ中の２８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで３７℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ＢｒＤＤＰＤ付加物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４３４８）。
【０３５７】
混合物を、４℃で４０時間透析し（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）、３７℃でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２Ｍ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、３７℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１８０）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０３５８】
実施例５８：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ＤｉＢｒＤＤＰＤ付加物の調製
【０３５９】
【化６９】
2013501765.tif 000071
【０３６０】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ＤｉＢｒＤＤＰＤ（５μＬ、ＤＭＦ中の２８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで３７℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４４２７）。
【０３６１】
実施例５９：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ＤｉＢｒＤＤＰＤ付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０３６２】
【化７０】
2013501765.tif 000072
【０３６３】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ＤｉＢｒＤＤＰＤ（５μＬ、ＤＭＦ中の２８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで３７℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ＤｉＢｒＤＤＰＤ付加物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４４２７）。
【０３６４】
混合物を、４℃で４０時間透析し（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）、次いで３７℃でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２Ｍ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、３７℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１８０）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０３６５】
実施例６０：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ＤｉＢｒＤＤＰＤ／β−１−チオグルコース付加物の調製
【０３６６】
【化７１】
2013501765.tif 000073
【０３６７】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ＤｉＢｒＤＤＰＤ（５μＬ、ＤＭＦ中の２８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで３７℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ＤｉＢｒＤＤＰＤ付加物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４４２７）。
【０３６８】
混合物を、４℃で４０時間透析し（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）、次いで０℃でβ−１−チオグルコース（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８．２ｍＭ）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、室温で１時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ＤｉＢｒＤＤＰＤ／β−１−チオグルコース付加物が存在する唯一のタンパク質種であることが示された（質量＝１４５４３）。
【０３６９】
実施例６１：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ＤｉＢｒＤＤＰＤ／β−１−チオグルコース付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０３７０】
【化７２】
2013501765.tif 000074
【０３７１】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ＤｉＢｒＤＤＰＤ（５μＬ、ＤＭＦ中の２８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで３７℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ＤｉＢｒＤＤＰＤ付加物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４４２７）。
【０３７２】
混合物を、４℃で４０時間透析し（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）、次いで０℃でβ−１−チオグルコース（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８．２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、室温で１時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ＤｉＢｒＤＤＰＤ／β−１−チオグルコース付加物が存在する唯一のタンパク質種であることが示された（質量＝１４５４３）。
【０３７３】
混合物を、室温でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２Ｍ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、室温で３０分間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１８０）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０３７４】
実施例６２：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ＢｒＤＤＰＤ／β−１−チオグルコース付加物の調製
【０３７５】
【化７３】
2013501765.tif 000075
【０３７６】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ＢｒＤＤＰＤ（５μＬ、ＤＭＦ中の２８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで３７℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ＢｒＤＤＰＤ付加物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４３４８）。
【０３７７】
混合物を、４℃で４０時間透析し（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）、次いで０℃でβ−１−チオグルコース（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８．２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、３７℃で１時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ＢｒＤＤＰＤ／β−１−チオグルコース付加物が１７％の変換で形成されたことが示された（質量＝１４５４３）。
【０３７８】
実施例６３：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｚ−２，３−ジブロモ−ブタ−２−エン二酸ジメチルエステル付加物の調製
【０３７９】
【化７４】
2013501765.tif 000076
【０３８０】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｚ−２，３−ジブロモ−ブタ−２−エン二酸ジメチルエステル（５μＬ、ＤＭＦ中の２８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで３７℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が形成されたことが示された（質量１４４４０）。
【０３８１】
実施例６４：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｚ−２，３−ジブロモ−ブタ−２−エン二酸ジメチルエステル付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０３８２】
【化７５】
2013501765.tif 000077
【０３８３】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｚ−２，３−ジブロモ−ブタ−２−エン二酸ジメチルエステル（５μＬ、ＤＭＦ中の２８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで３７℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４３７０）。
【０３８４】
混合物を、３７℃でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２Ｍ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、３７℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１８０）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０３８５】
実施例６５：ソマトスタチンの修飾及び再生
還元型ソマトスタチンの調製
【０３８６】
【化７６】
2013501765.tif 000078
【０３８７】
凍結乾燥したソマトスタチン（質量＝１６３８）を、緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５％ＤＭＦ）中に可溶化して、１５２．６μＭの濃度（０．２５ｍｇ／ｍｌ）とし、１．１当量のＴＣＥＰで、周囲温度で１時間還元した。還元の完了は、４当量のジブロモマレイミドをサンプルアリコートに添加し、ＬＣ−ＭＳで分析して確認した。
【０３８８】
ハロマレイミド及び誘導体によるソマトスタチンの架橋
還元型ソマトスタチンは記載したとおりに生成した。１．１当量のハロマレイミド又はジブロモマレイミド誘導体（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５〜１５．０％ＤＭＦ中１００ｘストック）を周囲温度で添加し、生成物の生成をＬＣ−ＭＳで１時間にわたりモニタリングした。結果を図２に示す。
【０３８９】
ジチオマレイミドによるソマトスタチンの架橋
還元型ソマトスタチンは記載したとおりに生成した。種々の量のジチオマレイミド（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５〜７．５％ＤＭＦ中１００ｘストック）を周囲温度で添加し、生成物の生成をＬＣ−ＭＳで１時間にわたりモニタリングした。結果を図３に示す。
【０３９０】
ブロモマレイミドによるソマトスタチンの修飾
【０３９１】
【化７７】
2013501765.tif 000079
【０３９２】
還元型ソマトスタチンは記載したとおりに生成した。２．１当量のブロモマレイミド（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、７．５％ＤＭＦ中１００ｘストック）を周囲温度で添加したところ、ジ−付加生成物への完全な変換がＬＣ−ＭＳによって１時間以内に観察された。
【０３９３】
種々の還元剤による架橋ソマトスタチンの切断
マレイミド架橋ソマトスタチンは、記載したように調製した。１００当量の種々の還元剤（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５％ＤＭＦ中１０００ｘストック）を添加し、未修飾ペプチド及び副産物（還元剤と遊離ペプチド−システインとの混合型ジスルフィド）の生成を、ＬＣ−ＭＳによって４℃で２日間モニタリングした。ソマトスタチンとＧＳＨとの混合型ジスルフィドは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳでのみ検出できた。結果を図４に示す。
【０３９４】
種々の量のＤＴＴ及び２−メルカプトエタノールによる、架橋ソマトスタチンの切断
マレイミド架橋ソマトスタチンは、記載したように調製した。種々の量のＤＴＴ又は２−メルカプトエタノール（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５％ＤＭＦ中１０００ｘストック）を添加し、未修飾ペプチド及び副産物（還元剤と遊離ペプチド−システインとの混合型ジスルフィド）の生成を、ＬＣ−ＭＳによって４℃で６時間モニタリングした。結果を図５に示す。
【０３９５】
架橋ソマトスタチンの触媒された切断
マレイミド架橋ソマトスタチンは、記載したように調製した。２０当量の２−メルカプトエタノール（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５％ＤＭＦ中１０００ｘストック）を添加し、その後、緩衝液又は５当量のヨウ化ナトリウム若しくはベンゼンセレノール（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、７．５％ＤＭＦ中１００ｘストック）のいずれかを添加し、未修飾ペプチド及び副産物（２−メルカプトエタノール又はベンゼンセレノールと遊離ペプチド−システインとの混合型ジスルフィド）の生成を、ＬＣ−ＭＳによって周囲温度で２０分間モニタリングした。結果を図６に示す。
【０３９６】
Ｎ−官能化マレイミド架橋ソマトスタチンの切断
ソマトスタチンを、記載したとおりに還元し、Ｎ−官能化マレイミド誘導体で架橋した。１００当量の２−メルカプトエタノール（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５％ＤＭＦ中１０００ｘストック）を添加し、未修飾ペプチド及び副産物（２−メルカプトエタノールと遊離ペプチド−システインとの混合型ジスルフィド）の生成をＬＣ−ＭＳにより４℃で２日間モニタリングした。結果を図７に示す。
【０３９７】
ソマトスタチンへのモノブロモマレイミドのジ−付加生成物の切断
還元型ソマトスタチンを、２．１当量のモノブロモマレイミドと反応させて、ジ−付加生成物を得た。次に、１００当量の２−メルカプトエタノール（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５％ＤＭＦ中１０００ｘストック）を添加し、モノ−付加生成物、未修飾ペプチド及び副産物（２−メルカプトエタノールと遊離ペプチド−システインとの混合型ジスルフィド）の生成を、ＬＣ−ＭＳにより周囲温度で２．５時間モニタリングした。結果を図８に示す。
【０３９８】
ソマトスタチンの比較上のｉｎ  ｓｉｔｕ架橋
ソマトスタチンに、種々の量のジチオマレイミド（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５−７．５％ＤＭＦ中１００ｘストック）を添加し、反応を周囲温度で１０分間インキュベートした。次に、種々の量のＴＣＥＰ又はベンゼンセレノール（１００ｘストック、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５〜７．５％ＤＭＦ中で新たに調製した）を添加し、架橋ソマトスタチンの生成を、ＬＣ−ＭＳにより周囲温度で１時間にわたりモニタリングした。結果を図９に示す。
【０３９９】
ソマトスタチンのｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＥＧ化
ソマトスタチンに、５当量のＮ−ＰＥＧ５０００−ジチオフェノールマレイミド又は１０当量のＮ−ＰＥＧ５０００−ジチオフェノールマレイミド（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５％ＤＭＦ中１００ｘストック）のいずれかを添加し、反応を周囲温度で１０分間インキュベートした。次に、３当量のＴＣＥＰそれぞれ５当量のベンゼンセレノール（１００ｘストック、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５−７．５％ＤＭＦ中に新たに調製）を添加し、ＰＥＧ化ソマトスタチンの生成を、ＬＣ−ＭＳによって周囲温度で２時間にわたってモニタリングした。結果を図１０に示す。
【０４００】
ＤｉＢｒＤＤＰＤによるソマトスタチンの修飾
【０４０１】
【化７８】
2013501765.tif 000080
【０４０２】
凍結乾燥ソマトスタチン（質量＝１６３８）を、緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５％ＤＭＦ）中に可溶化して、１５２．６μＭの濃度（０．２５ｍｇ／ｍＬ）にし、１．１当量のＴＣＥＰで２１℃で１時間還元した。還元の完了はＬＣＭＳによって確認した（質量＝１６４０）。ＤｉＢｒＤＤＰＤ（１００ｍｏｌ当量）を添加し、反応を２１℃で１０分間維持した。ソマトスタチン／ＤｉＢｒＤＤＰＤ付加物が定量的変換で形成したことが観察された（質量＝１８０３）。
【０４０３】
パッチクランプを使用した、架橋ソマトスタチンの生物活性保持の実証
得られたソマトスタチンアナログの活性に対して架橋修飾が有害な影響を有するか否かを試験するために、本発明者らは、ジブロモマレイミド架橋アナログ、ＰＥＧ化ジブロモマレイミド架橋アナログ及びフルオレセインジブロモマレイミド架橋アナログを、パッチクランプアッセイによって試験した。ＨＫＩＲ３．１／３．２チャネル及びヒトソマトスタチンレセプター２を発現するＨＥＫ２９３細胞をこれらの化合物で処理し、ホールセルパッチクランプ電流記録を採取した。３つ全てのアナログが、ソマトスタチン自体と匹敵する振幅で、ＧＩＲＫ電流の強い活性化を誘導した。コントロールとして細胞を百日咳毒素又はＧＩＲＫ阻害剤Ｔｅｒｔｉａｐｉｎ  Ｑで処理したとき、電流は大きく阻害された。このデータにより、架橋ソマトスタチンアナログが、ソマトスタチンレセプター２のアゴニズムに関して、ソマトスタチンの生物活性を保持していることが確認される。
【０４０４】
細胞培養
細胞培養方法及び安定細胞株の生成は、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５，９２１−９（２０００）に記載のとおりに実施した。Ｋｉｒ３．１チャネル及びＫｉｒ３．２Ａチャネルを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞（ヒト胚性腎細胞株）を、１０％胎仔ウシ血清及び７２７μｇのＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充した最小必須培地中で、加湿雰囲気（９５％Ｏ２、５％ＣＯ２）中３７℃で維持した。細胞を、落射蛍光を使用したトランスフェクト細胞の可視化のためのｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と共に、ＳＳＴＲ２  ＤＮＡ（Ｍｉｓｓｏｕｒｉ  Ｓ＆Ｔ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ）で一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションは、細胞培養培地（血清も抗生物質も含まない）９７μｌ当たり、５μｌのＦｕｇｅｎｅ  ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）並びに８００ｎｇのＳＳＴＲ２−ＤＮＡ及び４０ｎｇのＥＧＦＰ−ＤＮＡで実施した。
【０４０５】
パッチクランプ実験のためのソマトスタチン及びアナログの調製
架橋ソマトスタチンは上記のように調製した。ソマトスタチン及びそのアナログを、緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２）中で４℃で２４時間透析して、有機溶媒を除去した。透析後、濃度を決定し、ペプチドを４℃で保存した。最終濃度２０μＭのソマトスタチン及びアナログを使用した（希釈は、細胞外パッチクランプ緩衝液中で行った）。
【０４０６】
電気生理学
ホールセルパッチクランプ電流記録を、フィラメント化ホウケイ酸ガラスキャピラリー（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ、１．５ｍｍ  ＯＤｘ１．１７ｍｍ  ＩＤ）から引き出される３−４ＭΩの抵抗を有するファイアポリッシュピペットを使用して、Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ増幅器（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で実施した。データを取得し、Ｄｉｇｉｄａｔａ  １３２２Ａインターフェイス（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）及びｐＣＬＡＭＰソフトウェア（バージョン８．１、Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で分析した。速い灌流システムを使用して、ソマトスタチン及びアナログをアプライした（Ｒａｐｉｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｈａｎｇｅｒ、ＲＳＣ−１６０、Ｂｉｏ−Ｌｏｇｉｃ  Ｆｒａｎｃｅ）。細胞を−６０ｍＶでクランプした。細胞外溶液は以下であった（ｍＭ）：ＮａＣｌ  ８０、ＫＣｌ  ６０、ＣａＣｌ２  ２、ＭｇＣｌ２  １、ＨＥＰＥＳ  １０、ＮａＨ２ＰＯ４  ０．３３、グルコース  １０、ｐＨ７．４；一方、細胞内溶液は以下であった（ｍＭ）：グルコン酸Ｋ  １１０、ＫＣｌ  ２０、ＮａＣｌ  １０、ＭｇＣｌ２  １、ＭｇＡＴＰ  ２、ＥＧＴＡ  ２  ＧＴＰ  ０．３、ｐＨ７．４。アゴニストの適用後、電流は、遅延「ラグ」とその後のピーク振幅への迅速な上昇「ピークまでの時間」で活性化した。アゴニストの除去後、電流は、減衰してベースラインに戻った。各細胞について、薬物適用の圧力から生じたフローアーチファクト（ｆｌｏｗ  ａｒｔｉｆａｃｔ）が存在するか否かを評価した。これは、記録の開始時に、排水管の１つからの浴溶液を適用することによって行った。ＧＩＲＫ電流の阻害剤Ｔｅｒｔｉａｐｉｎ（Ａｌｏｍｏｎｅ）を、最終濃度１００ｎＭで使用した。細胞を、Ｇｉ／ｏタンパク質の阻害剤である百日咳毒素（Ｓｉｇｍａ、１００ｎｇ／ｍｌ）と共に一晩インキュベートした。薬物は濃ストック溶液として調製し、−２０℃で維持した。
【０４０７】
結果を図１１及び図１２に示す。
【図１】
2013501765.tif 000088
【図２】
2013501765.tif 000089
【図３】
2013501765.tif 000090
【図４】
2013501765.tif 000091
【図５】
2013501765.tif 000092
【図６】
2013501765.tif 000093
【図７】
2013501765.tif 000094
【図８】
2013501765.tif 000095
【図９】
2013501765.tif 000096
【図１０】
2013501765.tif 000097
【図１１】
2013501765.tif 000098
【図１２】
2013501765.tif 000099
【手続補正書】
【提出日】平成24年4月11日(2012.4.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）チオール化合物を、式（Ｉ）の部分を含む化合物
【化１】
2013501765.tif 000100
［式中、
Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＲ１の基を示し、Ｒ１は、水素、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル又はフェニルであり、Ｙは求電子性脱離基である］と反応させて、保護されたチオール基を有する化合物を産生する工程；及び
（ｉｉ）その後、該保護されたチオール基を脱保護する工程、
を含み、
少なくとも１つの工程が、工程（ｉ）の後かつ工程（ｉｉ）の前に実施され、該工程は、保護されたチオール基が化学的に不活性であるが、チオール基は化学的に反応性である条件下で、チオール化合物が保有する、保護されたチオール基ではない官能基に化学変換をもたらすことを含む、プロセス。
【請求項２】
式（Ｉ）の部分を含む化合物が、式（Ｉａ）の化合物である、請求項１に記載のプロセス：
【化２】
2013501765.tif 000101
式中、
Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＲ１の基を示し、Ｒ１は、水素、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル又はフェニルであり；
Ｙは求電子性脱離基であり；
Ｒ２は、水素原子又は基ＩＧを示し；
以下のいずれかであり：
Ｒ３及びＲ３’は、同じ又は異なって、それぞれ水素原子又は基ＩＧを示す；又は
Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３’）の基を形成し、Ｒ３３’は水素原子又は基ＩＧを示す；又は
Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３’）−Ｎ（Ｒ３３’）−の基を形成し、各Ｒ３３’は、同じ又は異なって、水素原子又は基ＩＧを示す；
各基ＩＧは、同じ又は異なって、非置換であるか又は１個以上のハロゲン原子で置換されている、Ｃ１−２０アルキル基、Ｃ２−２０アルケニル基又はＣ２−２０アルキニル基である部分を示し、式中、（ａ）０、１又は２個の炭素原子は、Ｃ６−１０アリーレン、５〜１０員のヘテロアリーレン、Ｃ３−７カルボシクリレン及び５〜１０員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されており、かつ（ｂ）０、１又は２個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−及び−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−基から選択される基によって置換されており、式中、
（ｉ）該アリーレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオール、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）及びニトロ基から選択される１個以上の置換基によって置換されており；
（ｉｉ）該カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基中の０、１又は２個の炭素原子は、−Ｃ（Ｏ）−基によって置換されている。
【請求項３】
Ｙが、ハロゲン原子又はトリフレート、トシレート、メシレート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル、Ｃ１−６アルキルチオール、５〜１０員のヘテロシクリルチオール、Ｃ６−１０アリールチオール、Ｃ３−７カルボシクリルチオール、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３、−ＯＣ（Ｏ）ＣＦ３、フェニルオキシ、−ＮＲｘＲｙＲｚ＋若しくは−ＰＲｘＲｙＲｚ＋基であり、式中、Ｒｘ、Ｒｙ及びＲｚは、同じ又は異なって、水素原子並びにＣ１−６アルキル及びフェニル基から選択される；又は
Ｙが、ハロゲン原子又はＣ１−６アルキルチオール、５〜１０員のヘテロシクリルチオール、Ｃ６−１０アリールチオール若しくはＣ３−７カルボシクリルチオール基である、
請求項１又は２に記載のプロセス。
【請求項４】
Ｘ及びＸ’がそれぞれ酸素を示す、請求項１〜３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項５】
ＩＧが、非置換のＣ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基又はＣ２−６アルキニル基である部分を示し、式中、（ａ）０又は１個の炭素原子は、フェニレン、５〜６員のヘテロアリーレン、Ｃ５−６カルボシクリレン及び５〜６員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されており、該フェニレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにＣ１−４アルキル及びＣ１−４アルコキシ基から選択される１又は２個の置換基によって置換されており、かつ（ｂ）０、１又は２個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−及び−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−基から選択される基によって置換されている；又は
ＩＧが、非置換のＣ１−６アルキル基である部分を示し、式中、（ａ）０又は１個の炭素原子は、非置換のフェニレン、５〜６員のヘテロアリーレン、Ｃ５−６カルボシクリレン及び５〜６員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されており、かつ（ｂ）０又は１個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−ＮＨ−及び−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−基から選択される基によって置換されている；又は
ＩＧが、非置換のＣ１−６アルキル又はフェニル基を示す、
請求項２〜４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項６】
Ｒ３、Ｒ３’及びＲ３３’がそれぞれ基ＩＧを示す、請求項２〜５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項７】
式（Ｉａ）の化合物が式（Ｉｂ）の化合物
【化３】
2013501765.tif 000102
（式中、Ｘ、Ｘ’、Ｙ、Ｒ２及びＲ３３’は全て、請求項２〜６のいずれか１項に記載したとおりである）
である、請求項２〜６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項８】
Ｘ及びＸ’がそれぞれ酸素原子を示し；
Ｒ３３’が水素原子又はＣ１−６アルキル基を示し；
Ｙがハロゲン原子を示し；
Ｒ２が水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す、
請求項７に記載のプロセス。
【請求項９】
チオール化合物が、システイン、又は少なくとも１個のシステイン残基を含むペプチド若しくはタンパク質である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１０】
保護されたチオール基を脱保護する工程が、該保護されたチオール基を、コンジュゲート付加反応において求核剤として作用できる試薬と反応させることによってもたらされ、試薬は、好ましくはホスフィン化合物又はチオールであり、より好ましくは、試薬は、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、１，２−エタンジチオール、グルタチオン、２−メルカプトエタノール又はジチオスレイトールである、
請求項１〜９のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のチオール化合物中のチオール基を保護するための試薬としての、請求項１〜８のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の部分を含む化合物の使用。
【請求項１２】
式（ＩＩ）の化合物：
【化４】
2013501765.tif 000103
式中、
Ｘ、Ｘ’、Ｒ２、Ｒ３及びＲ３’は全て、請求項２〜８のいずれか１項に記載したとおりであり、Ｑは、カルボキシル基又は保護されたカルボキシル基であり、Ｑ’は、アミン基又は保護されたアミン基であり；
ただし、式（ＩＩ）の化合物は、１４Ｃ−Ｎ−エチルマレイミド−Ｓ−システインでも１４Ｃ−Ｎ−エチルマレイミド−Ｓ−Ｎ−アセチル−システインでもなく；
好ましくは、Ｑがカルボキシル基であり、Ｑ’が保護されたアミン基である、
化合物。
【請求項１３】
（ｉ）ジスルフィド化合物中のジスルフィド基を、式（ＩＩＩ）の部分：
【化５】
2013501765.tif 000104
［式中、
Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＲ１の基を示し、Ｒ１は、水素、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル又はフェニルであり、Ｙ及びＹ’は、同じ又は異なって、それぞれ求電子性脱離基を示す］を含む化合物と反応させて、保護されたジスルフィド基を有する化合物を産生する工程；及び
（ｉｉ）その後、該保護されたジスルフィド基を脱保護する工程、
を含み、
少なくとも１つの工程が、工程（ｉ）の後かつ工程（ｉｉ）の前に実施され、該工程は、保護されたジスルフィド基が化学的に不活性であるが、ジスルフィド基は化学的に反応性である条件下で、ジスルフィド化合物が保有する、保護されたジスルフィド基ではない官能基に化学変換をもたらすことを含む、プロセス。
【請求項１４】
式（ＩＩＩ）の部分を含む化合物が、式（ＩＩＩａ）の化合物である、請求項１３に記載のプロセス：
【化６】
2013501765.tif 000105
式中、
Ｘ、Ｘ’、Ｙ、Ｒ３及びＲ３’は全て、請求項２〜８のいずれか１項に記載したとおりであり、Ｙ’はさらなる基Ｙであり、各基Ｙは同じ又は異なる。
【請求項１５】
ジスルフィド化合物中のジスルフィド基を保護するための試薬としての、請求項１３又は１４に記載の式（ＩＩＩ）の部分を含む化合物の使用。
【国際調査報告】
2013501765.tif 000106
2013501765.tif 000107
2013501765.tif 000108
2013501765.tif 000109
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