(57)【要約】緑膿菌のＲ型ピオシン等の天然バクテリオシンの改変された形態、ならびにＧＲＡＳ生物においてそれらを産生するための方法が開示されている。このバクテリオシンは、細菌表面上等の同族結合パートナーまたは受容体に対しての結合特異性および親和性をつかさどる領域中のそれらの尾部繊維の端部が改変される。毒性因子または適応性因子を含む、細菌表面上の受容体と結合させる等の改変バクテリオシンの使用方法も記載されている。【選択図】図１
2013545460.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的細菌を検出するための方法であって、
標的細菌を含有する疑いがある細菌の大混合集団の試料を、Ｐ２ファージの基板結合領域（ＢＰＡＲ）をコードするポリヌクレオチドおよび標的細菌に結合する受容体結合ドメインをコードする異種ポリヌクレオチドを含む遺伝子操作された尾部繊維遺伝子と、前記標的細菌が感受性を有する抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子とを含む組換えＰ４バクテリオファージゲノムを含む組換えＰ４バクテリオファージと、接触させることと、
前記試料および遺伝子操作されたＰ４バクテリオファージを培養することと、
前記抗生物質の存在下で、前記標的細菌の増殖の検出により前記試料中の前記標的細菌の存在を検出することと、を含む、方法。
【請求項２】
遺伝子操作された尾部繊維遺伝子を含む組換えＰ４バクテリオファージゲノムを含む核酸分子であって、前記遺伝子操作された尾部繊維遺伝子が、Ｐ２ファージの基板結合領域（ＢＰＡＲ）をコードするポリヌクレオチドおよび受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）をコードする異種ポリヌクレオチドを含む、核酸分子。
【請求項３】
前記ＢＰＡＲが、Ｐ２バクテリオファージ遺伝子Ｈ産物のアミノ末端部を含む、請求項１に記載の方法、または請求項２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記ＢＰＡＲが、前記Ｐ２バクテリオファージ遺伝子Ｈ産物のアミノ酸１〜１５７または１〜１５８を含む、請求項１に記載の方法、または請求項２に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記異種ポリヌクレオチドが、Ｌ−４１３ｃ、ＰＳ１７、ＢＰＰ−１、ＣＴＸ、ＶＨＭＬ、ＣＵＳ３、エプシロン１５、ＨＫ６２０、ｓｆ６、ＳＴ６４Ｔ、またはｐｈｉＶ１０ファージに由来する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法または核酸分子。
【請求項６】
前記異種ポリヌクレオチドが、前記ＲＢＤのＣ末端をコードする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法または核酸分子。
【請求項７】
前記Ｃ末端が、約３４７〜７５５アミノ酸長である、請求項６に記載の方法または核酸分子。
【請求項８】
前記標的細菌が、大腸菌、シゲラ属、サルモネラ属、エルシニア属、ボルデテラ属、またはシュードモナス属の株である、請求項１、３、４、５、６、または７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記大腸菌株が、志賀毒素産生性大腸菌である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細菌の大混合集団が、少なくとも１００万個の細菌からなる、請求項１、３、４、５、６、７、８、または９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記検出された標的細菌が、前記細菌の大混合集団中１，０００，０００個につき１個未満である、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１０年１１月８日に出願され、現在係属中の米国特許出願第１２／９４１，７１７号からの優先権の利益を主張し、その全内容が、完全に記載されているのと同程度、参照により組み込まれる。
【０００２】
本開示は、緑膿菌のＲ型ピオシン等の天然の高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシンの改変された形態に関する。このバクテリオシンは、細菌表面上のもの等の同族結合パートナーまたは受容体に対する結合特異性および親和性をつかさどる領域中のそれらの尾部繊維の端部が改変される。毒性因子または適応性因子を含む、細菌表面上の受容体と結合させるため等の改変バクテリオシンの使用方法も記載されている。本開示はまた、球状タンパク質を含むように尾部繊維が改変されたＲ型ピオシンにも関し、これらのタンパク質が、多糖等の細胞表面構造体と結合し、それらを分解することができる。規制当局により一般に安全と認められている（「ＧＲＡＳ」）細菌細胞によるＲ型ピオシンの産生のための非天然系が、そのようなＧＲＡＳ細菌により産生されるＲ型ピオシンと同様に記載されている。
【背景技術】
【０００３】
現在世界的に、細菌性疾患よりもウイルス性病原体による脅威に対してはるかに大きな注目が集まっている。しかしながら、遍在する抗生物質に耐性の細菌は、病院および他の医療施設における患者のケアおよび費用抑制に打撃を与え続けている。同時に、慢性疾患に対する薬物およびライフスタイルの改善を支持する抗生物質の開発からの撤退が見られる。ここ２０年間で、２つの新しい種類の抗生物質（オキサゾリジノンおよびリポペプチド）のみが、米国市場に導入された（Ｗｅｎｚｅｌ，２００４）。
【０００４】
米国内だけで、病院での細菌感染のケースが毎年２００万件を超えている。これらのうち、約９０，０００人の人々が死亡する。最も警戒すべき統計は、これらの原因となる細菌の７０％超が、少なくとも１種類の抗菌剤に耐性を有するということである（Ｂａｄ  Ｂｕｇｓ，Ｎｏ  Ｄｒｕｇｓ，２００４）。この数値は、警戒すべき割合で増加を続けている。これらの抗生物質耐性の院内感染が米国経済に及ぼす年間の費用は５０億ドルを超えている。このような驚異的な地球規模の状況という現実により、抗菌剤の開発および使用に対する新しい取り組みが余儀なくなるであろう（Ｔａｌｂｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。ヒトおよび動物の医療において抗生物質の大規模な使用（および乱用）が広く行われたが、かつては「特効薬」であった多くの抗生物質が今や臨床的な効果がないという程度まで、抗生物質に耐性を示す細菌性病原体の出現もまた広く見られている（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｈｒｅａｔｓ  ｔｏ  Ｈｅａｌｔｈ，２００３）。
【０００５】
１つの例として、緑膿菌は、植物および動物に対する遍在する病原体であるが、複数の抗菌剤に対する耐性の発生率の急速な上昇を呈している（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｈｒｅａｔｓ  ｔｏ  Ｈｅａｌｔｈ，２００３、Ｂａｄ  Ｂｕｇｓ，Ｎｏ  Ｄｒｕｇｓ，２００４）。緑膿菌は、好気性、運動性、グラム陰性の桿菌である。緑膿菌は、通常土壌、水、及び植物中に生息する。これは、健康な人間に疾患を発症させることはほとんどないが、全院内感染の約１０％を占める日和見病原体である（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｒｅｐｏｒｔ−Ｄａｔａ  Ｓｕｍｍａｒｙ  ｆｒｏｍ  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９８６−Ａｐｒｉｌ  １９９６）。緑膿菌は、嚢胞性線維症（ＣＦ）の患者を冒す最も一般的な病原体であって、その検体培養の６１％が陽性を示し（Ｇｏｖａｎ，Ｊ．Ｒ．Ｗ．ａｎｄ  Ｖ．Ｄｅｒｅｔｉｃ，１９９６，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，６０（３）：５３０−５７４）、また集中治療ユニットに見られる２種類の最も一般的な病原体の１つでもある（Ｊａｒｖｉｓ，Ｗ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ，１９９２，Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，２９（ａ  ｓｕｐｐ．）：１９−２４）。
【０００６】
ある緑膿菌の感染による死亡率は、５０％にまで達し得る。現在、緑膿菌の感染は、抗生物質、特には、薬物の組み合わせを用いることにより、依然として効果的に制御することができている。しかしながら、一般的な抗生物質のいくつかに対する耐性が見られており、それは、特に、集中治療ユニットにおいて問題である（Ａｒｃｈｉｂａｌｄ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓ．，２４（２）：２１１−２１５、Ｆｉｓｈ，Ｄ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ，１９９５，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ，１５（３）：２７９−２９１）。さらに、緑膿菌は、複数の抗生物質耐性遺伝子を有するプラスミドを取り込む機序をすでに示しており（Ｊａｋｏｂｙ，Ｇ．Ａ．（１９８６），Ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｖｏｌ．Ｘ，Ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，ｐｐ．２６５−２９４，Ｊ．Ｒ．Ｓｏｋａｃｈ（ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）、現時点でシュードモナス菌の感染に対する認定されたワクチンは存在しない。
【０００７】
他の多くの細菌種と同様に、緑膿菌の株の変異性は、非常に顕著である。変異性は、多くの異なる機序で発生することが示されており、これらの機序としては、プロファージの細菌ゲノムへの組み込み（Ｚｉｅｒｄｔ，Ｃ．Ｈ．ａｎｄ  Ｐ．Ｊ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，１９６４，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８７：１００３−１０１０）、バクテリオファージからのサイトトキシン遺伝子の付加（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ，１９９４，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２２：２３９−２４４）、およびトランスポゾン経由（Ｓｉｎｃｌａｉｒ，Ｍ．Ｉ．ａｎｄ  Ｂ．Ｗ．Ｈｏｌｌｏｗａｙ，１９８２，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５１：５６９−５７９）が挙げられるが、これらに限定されない。このような形での多様性により、新たな病原性の機序が緑膿菌へ組み込まれてきた。ＣＦでよく見られるムコイド表現型への転換等、これらおよびその他の遷移は、警戒を続ける必要があることを明らかに示している。
【０００８】
これらの問題点が、薬物耐性の菌株の適切な同定および毒性の根絶を目的とした診断ツールおよび治療方法の必要性を指し示している。
【０００９】
多くの細菌は、殺菌性の物質であるバクテリオシンを産生する。バクテリオシンは、ポリペプチドからなり、分子量が変化する。バクテリオシンは、それらの抗菌特性のために使用されてきたが、中には、多くの臨床的に使用される抗生物質よりも殺菌性の範囲がより制限されたものがある。例えば、感受性のある、または感受性の高い生物の受容体部位に結合することで、同一の、または極めて関連性の高い種の構成部分を認識し、そのため、それに作用するようなバクテリオシンがいくつか報告されている。
【００１０】
広い分類として、バクテリオシンは、３種類に分類される。第１の種類は、熱安定性がある小分子である。この第１の種類の例としては、コリシンＶ（コリシンが大腸菌群に特異的である）が挙げられる。第２の種類は、緑膿菌により産生されるＳ型ピオシンで、分子量がより大きなタンパク質分子である。第３の種類は、遺伝学的にも形態学的にもバクテリオファージの尾部と類似しているバクテリオシンが含まれる。最後の種類の例としては、緑膿菌のＦ型およびＲ型ピオシン、ならびにエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）のエンテロコリチシン（ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃｉｎ）が挙げられる。これらのピオシンは、祖先バクテリオファージ（ａｎｃｅｓｔｒａｌ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）由来のものであると報告されている。Ｆ型ピオシンは、ラムダファージファミリーとの構造的類似性を有し、後の２つのＲ型ピオシンは、Ｐ２ファージファミリーと関連している。
【００１１】
Ｒ型ピオシンは、ミオウイルス（ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーのバクテリオファージの非柔軟性で収縮性の尾部と類似しており、シュードモナス菌ゲノムの単一の遺伝子クラスター内でコードされる（Ｓｈｉｎｏｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ，１９８３）。図１を参照のこと。標的細菌に特異的に結合した後、これらのピオシンは、細菌細胞中にポアを形成し、その細胞質膜の完全性に損傷を与え、膜脱分極を起こす。また、Ｆ型ピオシンもバクテリオファージの尾部と類似しているが、柔軟性があり非収縮性の棒状構造を有する。ピオシンは、大部分の緑膿菌株により産生され、１種類を超えるピオシンを合成する菌株もある。
【００１２】
Ｒ型ピオシンは、いくつかの緑膿菌株によって産生される複雑で高分子量のバクテリオシンであり、ある種の他の緑膿菌株に対する殺菌作用を有する（概説については、Ｍｉｃｈｅｌ−Ｂｒｉａｎｄ  ａｎｄ  Ｂａｙｓｓｅ，２００２を参照）。現在まで、５種類のＲ型ピオシンが同定されており、それらの標的範囲に基づいて（下記参照）、Ｒ１からＲ５と称する。菌株ＰＡＯ１は、Ｒ２ピオシンを産生し、これは、１６個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなる遺伝子クラスター内でコードされ、そのうちの１２個は、バクテリオファージＰ２、ＰＳ１７、ΦＣＴＸ、および他のＰ２様ファージのＯＲＦへの有意な配列相同性を示す（Ｎａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。ピオシンの産生は、ＤＮＡ損傷によって誘発され（Ｍａｔｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９３）、クラスターの正の転写調節因子であるＰｒｔＮの抑制因子であるＰｒｔＲを分解するＲｅｃＡによって制御される。ピオシン遺伝子の誘発は、細菌細胞１個当たり約２００個のピオシン粒子の合成をもたらし、続いて、バクテリオファージ溶解と類似の機序により細胞が溶解する。ピオシンは、まずその尾部繊維でリポ多糖（ＬＰＳ）に結合し、それに続く鞘部の収縮、ならびに細菌の外膜、細胞壁、および細胞質膜を通してのコアの貫通により、迅速かつ特異的に、標的細胞を死滅させる。この貫通により、細胞質膜の完全性が損なわれ、膜電位の脱分極が起こる（Ｕｒａｔａｎｉ  ａｎｄ  Ｈｏｓｈｉｎｏ，１９８４）。多くの観点から、ピオシンは、適合された尾部器官のみからなる、すなわち、カプシドもＤＮＡも含まない、耐プロテアーゼ性および耐酸性であり、非伝染性の抗菌性粒子を産生するためにホストが適合させた欠陥プロファージとみなすことができる。ピオシン遺伝子の複製には、それが包埋された細菌ゲノムの複製が必要である。
【００１３】
５つの異なるピオシン受容体特異性は、互いに直線的な関係を持ち、２つの分岐を有する（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ，１９７０、Ｍｅａｄｏｗ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，１９７８、Ｋａｇｅｙａｍａ，１９７５）。Ｒ５ピオシンが最も広い範囲を有し、他の４つの特異性を含む。他の４つのＲ型の受容体は、Ｒ５から分岐する２つの分岐、または特異性のファミリーを形成する。１つ目の分岐は、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ２に対する受容体を含み、この順で、Ｒ３ピオシンに特異性を示す受容体が、細胞表面から最も遠位にある。２つ目の分岐は、Ｒ１受容体を含み、これは、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４に対する受容体とは無関係の特異性決定因子を有すると思われる。Ｒ１〜Ｒ４ピオシンのいずれかに感受性を有する全ての緑膿菌株が、Ｒ５にも感受性を有するが、Ｒ５ピオシンのみに感受性を有する菌株もあることから、この２つの分岐は、Ｒ５に対する受容体に付属していると考えられる。緑膿菌株には、天然に存在する５つのＲ型ピオシン全てに対する耐性を有するものもある。
【００１４】
緑膿菌のピオシンは、主に、緑膿菌の菌株を特異的に死滅させるが、ヘモフィルス、ナイセリア、およびカンピロバクター種のある種類の菌株を死滅させることも示されている（Ｆｉｌｉａｔｒａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ，２００１、Ｍｏｒｓｅ  ｅｔ  ａｌ，１９７６、Ｍｏｒｓｅ  ｅｔ  ａｌ，１９８０、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，１９８１，１９８２）。
【００１５】
Ｒ型ピオシンの特異性は、遺伝子：ｐｒｆ１５によってコードされる尾部繊維によって付与される。ＰＲＦ１５タンパク質は、ミオウイルスファミリーのファージの、特にＰ２様ファージの尾部繊維と極めて密接に関係している（Ｎａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。これらの尾部繊維は、図１に示されるように、基板構造上に対称的に配置されたホモ三量体であり、１粒子当たり６個の複製を有する。尾部繊維のＮ末端領域が基板に結合し、Ｃ末端部分の、恐らくは先端近辺が細菌受容体に結合し、それによって死滅の特異性が付与される。ｐｒｆ１６遺伝子（Ｒ型ピオシンの場合）によってコードされる同族シャペロンのＰＲＦ１６タンパク質は、ｐｒｆ１５のすぐ下流に位置し、尾部繊維の適切な折り畳み、および／またはピオシン構造上での尾部繊維のアセンブリに必要である。Ｒ型ピオシン粒子は、ある種の緑膿菌バクテリオファージの尾部と、免疫化学的および遺伝学的に類似していると説明されている（Ｋａｇｅｙａｍａ  １９７５、Ｋａｇｅｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．１９７９、Ｓｈｉｎｏｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．１９８９、およびＳｈｉｎｏｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．１９８３ｂ）。Ｒ型ピオシンならびにＰＳ−１７およびΦＣＴＸ等のシュードモナス菌バクテリオファージは、共通の祖先溶原バクテリオファージを通した関連しており、そこから、頭部タンパク質および複製機能をコードする遺伝子が欠損し、残ったファージ遺伝子が、防御的なＲ型ピオシンの成分としての機能に適していることが提案されている（Ｓｈｉｎｏｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．１９８９）。
【００１６】
類似の高分子量Ｒ型バクテリオシンは、エルシニアエンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）（Ｓｔｒａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、リステリアモノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（Ｚｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ，１９９５）、スタフィロコッカスアウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  ＆  Ｐａｔｔｅｅ，１９８１）、およびエルビニアアミロボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｍｙｌｏｖｏｒａ）（Ｊａｂｒａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）を含む他の細菌について説明されている。バクテリオシンの分類および命名法は、特に、その由来、化学、および作用に関する証拠が増加していくことにより、時間とともに変わってきている。通常、バクテリオシンの命名は、その産生種に基づいている。例えば、大腸菌はコリシンと称するバクテリオシンを産生し、緑膿菌はピオシンを産生し、リステリアモノサイトゲネスはモノシンを産生し、エルシニアエンテロコリチカはエンテロコリチシンを産生する。歴史上、分類は、約２０種類のコリシンの識別から始まり、これらはＡ‐Ｖと分類された。ほとんどの場合、それぞれのバクテリオシンは、同一または分類学的に関連する生物の種に対して特異的に作用すると思われる。ピオシンを産生する菌株は、通常、それ自身のピオシンに対する耐性を有する。バクテリオシンの濃縮に関する一般的なアッセイは、米国特許第４，１４２，９３９号に記載されている。
【００１７】
大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７等のある種の病原性の大腸菌株は、食品媒介病原体である。大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７に汚染された肉、生野菜、乳製品、ジュース等からの病気の発生は、かなりの罹患率および死亡率をもたらした。薬剤および方法は、これらの病原性細菌で汚染され得る食品を有効かつ安全に殺菌または消毒することが必要とされる。
【００１８】
上記の文献の引用は、前述の事項のいずれについてもそれが関連する先行技術であると承認することを意図するものではない。日付の表記およびこれらの文献の内容に関する説明はすべて、出願者が入手可能な情報に基づいており、日付およびこれらの文献の内容の正確性に関していかなる承認をも構成するものではない。
【発明の概要】
【００１９】
本開示は、バクテリオファージ尾部と類似しているが、それとは異なる、バクテリオシンの種類の遺伝子操作された形態に関する。これらのバクテリオシンには、Ｒ型ピオシン、尾状の（ｔａｉｌ−ｌｉｋｅ）バクテリオシン、Ｒ型バクテリオシン、またはバクテリオファージの尾部構造と関連するその他の高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシンが挙げられる。参照を簡便にするために、「ｈｍｗバクテリオシン」という用語は、本開示のバクテリオシンを指すために本明細書で使用され、これには、Ｒ型バクテリオシン、Ｒ型ピオシン、モノシン、エンテロコリチシン、メニンゴシン、およびスタフィロコッカスアウレウスの受容能因子が挙げられるが、これらに限定されない（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐａｔｔｅｅ，１９８１）。
【００２０】
天然のｈｍｗバクテリオシンは、通常、熱不安定性であり、トリプシン耐性であり、ＳＯＳシステムを活性化させる薬剤によって誘発され得る。例えば、それらは、シュードモナス種、リゾビウムルピン（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｕｐｉｎ）、リステリアモノサイトゲネス、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、エルシニア種、エルビニア種、およびフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種といった多くの腸内細菌においても識別されている。
【００２１】
遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンは、多くの異なるポリペプチドサブユニットの複数の複製からなり、尾部繊維タンパク質で形成された１つ以上、通常６つの尾部繊維を有する。それぞれの尾部繊維は、受容体に結合または相互作用し、結合対を形成する受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む。ＲＢＤは、細菌結合特性を含む尾部繊維の一部であり、そのため結合対の第１の構成部分となる。本明細書に開示されるＲＢＤは、改変された尾部繊維を形成する尾部繊維中のタンパク質の改変部を含む。他のポリペプチドサブユニットを有する改変された尾部繊維は、遺伝子操作された（または、改変された）ｈｍｗバクテリオシンを形成する。ＲＢＤが結合する受容体は、結合対の第２の構成部分であり、これは、改変された尾部繊維を含まないバクテリオシンに対する受容体と同じであっても異なっていてもよい。本開示のいくつかの実施形態では、結合対の第２の構成部分は、病原性細菌の毒性因子または適応性因子である。他の実施形態では、第２の構成部分は、細胞膜等の細菌細胞の最外層の成分、または、グラム陽性細菌の場合は、細胞壁成分である。
【００２２】
改変された尾部繊維を欠いているｈｍｗバクテリオシンと比較して、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンは、受容体との相互作用において、その数、方法、および結合強度が異なったものとなり得る。したがって、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンは、改変のないバクテリオシンと比較して、異なるまたはさらなる結合特性（例えば、結合特異性、親和性、および／または結合力（ａｖｉｄｉｔｙ））を有し得る。遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンは、天然分子ではないが、天然分子を改変した形であってよい。あるいは、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンは、別の非天然のバクテリオシンを改変した形であってよい。ほとんどの実施形態では、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンは、バクテリオシンによって結合される受容体を発現する細菌細胞にとって、依然として致命的な薬剤である。
【００２３】
第１の態様では、本開示は、改変されたＲＢＤを有する尾部繊維タンパク質を含むｈｍｗバクテリオシンを含む。ｈｍｗバクテリオシンの限定されない例としては、Ｒ型ピオシンが挙げられる。いくつかの実施形態では、改変されたＲＢＤは、天然のバクテリオシンと比較して、このドメインのアミノ酸配列の変化を含む。アミノ酸配列の変化の限定されない例としては、１個以上のアミノ酸の置換、挿入（付加）、または欠失が挙げられる。当然、１つ以上の置換、挿入（付加）、または欠失の組み合わせも使用することができる。
【００２４】
他の実施形態では、尾部繊維は、単一の三量体尾部繊維を形成する３つの尾部繊維タンパク質モノマーのうちの１つ以上に、異種配列、または非バクテリオシン配列を含む。そして、ネイティブの（ｎａｔｉｖｅ）、もしくは天然のバクテリオシンの尾部繊維が、ホモ三量体でＲＢＤを形成し得るのに対し、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンの尾部繊維は、１つもしくは２つのタンパク質モノマーが他と異なるヘテロ三量体、または、３つのタンパク質モノマー全てが全く同様に非ネイティブ（非天然）であるホモ三量体のいずれかである。１つ以上のタンパク質モノマー中に異種（または、非ネイティブ）配列が存在することにより、三量体は、改変されたＲＢＤを有する尾部繊維を形成することができる。
【００２５】
異種配列は、したがって、アセンブルされた三量体において少なくとも尾部繊維のＲＢＤが変性されるように、そのモノマーの一部に存在する。変性されたＲＢＤでは、尾部繊維の結合性質および特性が変化し、それによって、その尾部繊維を含むｈｍｗバクテリオシンの結合活性が変化する。いくつかの実施形態では、異種ＲＢＤは、別のバクテリオシン、またはバクテリオファージもしくはプロファージからの尾部タンパク質に由来する。多くの場合、異種ＲＢＤは、バクテリオシンの尾部繊維タンパク質、バクテリオファージ尾部繊維タンパク質、または推定尾部繊維タンパク質のＣ末端部の少なくとも一部を含むポリペプチドであり、その配列は、細菌のゲノム内に見られる生存、もしくは欠損溶原性バクテリオファージの遺伝子に由来する。
【００２６】
異種ＲＢＤは、タンパク質が球状、好ましくは多糖特異的である尾部タンパク質または尾部スパイク状タンパク質をコードするバクテリオファージに由来され得る。尾部スパイクは、尾部の構成要素であり、バクテリオファージＰ２２およびエプシロン１５に見られるもの等の構造において、通常、ホモ三量体である。それらは、尾部繊維タンパク質と同様に機能し、遺伝子操作され得る。したがって、本開示の目的のために、尾部スパイクまたはその一部がＲＢＤと考えられる。これらのタンパク質が、細胞表面の多糖構造体と結合し、分解することができる。酵素の基質と結合する尾部スパイクタンパク質構造の同じモチーフは、酵素基質が標的細菌の表面上で受容体としての機能も果たし得るため、ＲＢＤ機能を提供することができる。例えば、ｐｈｉＶ１０は、ポドウイルス科に属するバクテリオファージであり、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７菌株を感染させることができる（Ｗａｄｄｅｌｌ  ＆  Ｐｏｐｐｅ  ２０００、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＣ＿００７８０４）。ｐｈｉＶ１０尾部スパイク（配列番号６０）は、病原体の大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の表面上でＯ１５７抗原を特異的に認識し、それに結合し、分解する。配列番号６１、６２、６３、６４、および６５等であるが、これらに限定されない、ポリマー結合および分解活性があるその他の球状タンパク質は、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンにおいてＲＢＤ構造体としての機能を果たすことができる。
【００２７】
配列番号６１の大腸菌ＲＳ２１８のＫ１菌株のＣＵＳ３プロファージの尾部スパイクは、大腸菌のＫ１菌株のカプセルを認識し、分解するファージＫ１ＥおよびＫ１Ｆの尾部タンパク質のものと非常に類似しているエンドシアリダーゼである。ＣＵＳ３の尾部スパイクは、Ｐ２２の尾部スパイクタンパク質と類似している頭部結合ドメインおよびその他のファージのエンドシアリダーゼと関連しているＣ末端を有する。この尾部スパイクまたはその一部のＲ２の尾部繊維基板結合領域（ＢＰＡＲ）への融合により、大腸菌のＫ１菌株を死滅させることができるピオシンを作製する。
【００２８】
配列番号６２のバクテリオファージＨＫ６２０の尾部スパイクは、Ｐ２２様ファージのＨＫ６２０の尾部スパイクである。それは、大腸菌ＨのＯ抗原に対して特異的である。この尾部スパイクまたはその一部のＲ２の尾部繊維ＢＰＡＲへの融合により、大腸菌のＨ菌株を死滅させることができるピオシンを作製する。
【００２９】
配列番号６３のファージＳｆ６の尾部スパイクもまた、Ｐ２２様であり、フレクスナー赤痢菌のＯ抗原を認識し、分解する。この尾部スパイクまたはその一部のＲ２の尾部繊維ＢＰＡＲへの融合により、フレクスナー赤痢菌株を死滅させることができるピオシンを作製する。
【００３０】
配列番号６４のファージＳＴ６４Ｔの尾部スパイクは、Ｐ２２様であり、サルモネラチフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＤＴ６４のＯ抗原を認識する。この尾部スパイクまたはその一部のＲ２の尾部繊維ＢＰＡＲへの融合により、ＤＴ６４等のサルモネラチフィムリウム菌株を死滅させることができるピオシンを作製する。
【００３１】
配列番号６５のファージエプシロン１５の尾部スパイクは、ｐｈｉＶ１０の尾部スパイクと類似しており、属Ｅ１のサルモネラエンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）に対して特異的である。この尾部スパイクまたはその一部のＲ２の尾部繊維ＢＰＡＲへの融合により、属Ｅ１のサルモネラエンテリカ菌株を死滅させることができるピオシンを作製する。
【００３２】
尾部スパイクタンパク質およびその一部分は、特異的シャペロンにより円滑化されることなく、適切に折り畳んでよい。したがって、Ｒ型ピオシン尾部繊維と、ＲＢＤとして異種尾部スパイクタンパク質との間の融合の生成は、通常、Ｒ型ピオシン尾部繊維と、別のＲ型ピオシン、またはＰ２、Ｌ−４１３ｃ、ＡＢ１７、もしくはＰＳ１７等のミオウイルスからの異種尾部繊維タンパク質との間の融合を必要とするように、ＲＢＤ特異的シャペロンを必要としない場合がある。
【００３３】
異種ＲＢＤは、ｈｍｗバクテリオシンのＢＰＡＲを含むポリペプチドまたはミオウイルスファージ尾部繊維タンパク質に融合される。ＢＰＡＲを含むポリペプチドは、ｈｍｗバクテリオシン尾部繊維のＮ末端部の全てまたは一部を含んでもよく、このＮ末端部は、まさにＣ末端以外であれば尾部繊維のどの部分からなることができる。
【００３４】
他の実施形態では、異種ＲＢＤは、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）バクテリオファージの主要トロピズム決定因子（ＭＴＤ）に由来する。限定されない例としては、任意に、バクテリオファージの尾部繊維のＲＢＤの全てまたは一部を有する、改変された、または多様化された（ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ）トロピズム決定因子を含む異種ＲＢＤが挙げられる。いくつかの実施形態では、バクテリオファージの尾部繊維は、ビブリオハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ）ミオウイルス様（ＶＨＭＬ）バクテリオファージもしくはその多様化された誘導体の尾部繊維、または多様性を生じさせるレトロエレメント（Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｒｅｔｒｏｅｌｅｍｅｎｔ）（ＤＧＲ）構造体を含む別のプロファージもしくはバクテリオファージの尾部繊維である。
【００３５】
本開示は、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンの一部分をさらに含み、その一部分は、細菌細胞表面上で受容体と結合し、次いで、細胞膜の貫通を促進するバクテリオシンの活性は維持される。したがって、その一部分は、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンの結合（認識）および膜貫通活性が維持されるものであればいかなるものであってもよい。いくつかの実施形態では、その一部分は、切断された１つ以上のバクテリオシンポリペプチドを含む。
【００３６】
関連態様では、本開示は、本開示のｈｍｗバクテリオシンの一部であり得る改変された尾部繊維を含む。三量体の尾部繊維は、改変されたＲＢＤまたは異種ＲＢＤを有する１つ以上の尾部繊維タンパク質を含んでよい。いくつかの実施形態では、改変された単量体の尾部繊維タンパク質は、Ｒ型バクテリオシンに由来し、一方、他の実施形態では、この尾部繊維タンパク質は、バクテリオファージ尾部繊維またはバクテリオファージ尾部スパイクタンパク質に由来する。
【００３７】
本開示はまた、改変された尾部繊維タンパク質をコードするネイティブの、単離された、もしくは組換え核酸配列、ならびにそのコード配列を含むベクターおよび／または（宿主）細胞も含む。このベクターおよび／または宿主細胞を用いて、尾部繊維を形成し、本開示の遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンに組み込まれるネイティブの、単離された、もしくは改変された尾部繊維タンパク質を産生するためのコード配列を発現させてもよい。改変された尾部繊維タンパク質をコードする配列はまた、改変された尾部繊維タンパク質の存在下で、ｈｍｗバクテリオシンを産生する、または産生することができる細菌細胞に導入してもよい。
【００３８】
場合によっては、製造用細菌は、食品添加物または食品成分等のために、米国連邦食品、医薬品、化粧品法（Ｕ．Ｓ．Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｆｏｏｄ，Ｄｒｕｇ，ａｎｄ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ａｃｔ）により、「一般に安全と認められている」または「ＧＲＡＳ」として指定されているものである。典型的には、食品に意図的に添加される任意の物質は、その物質が、通常、その意図された使用の条件下で安全であることが十分に示されるとき、専門家によって認識されない限り、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって精査および認可されることが条件となっている食品添加物である。ＧＲＡＳ物質は、事前承認なしで利用することができる。
【００３９】
改変された尾部繊維タンパク質の発現は、細胞による改変されたｈｍｗバクテリオシンの産生をもたらす。天然のバクテリオシン尾部繊維タンパク質配列またはそのようなタンパク質をコードする核酸が、不活性化または除去される場合、改変されたｈｍｗバクテリオシンのみが産生される。天然のバクテリオシン尾部繊維タンパク質配列またはそのようなタンパク質をコードする核酸が、維持される場合、改変されたｈｍｗバクテリオシンは、天然のバクテリオシン尾部繊維と共に産生され、生成された改変されたピオシンは、改変されたピオシンと天然のピオシンとの混合物となり得る。加えて、そのような産生宿主細菌から生成されたピオシンは、二価（多価）のピオシン、即ち、それぞれがその特異的な結合特性を有する２種類の尾部繊維の混合物を有する単一のピオシン粒子を含み得る。そのような多価のピオシンは、同じピオシン粒子または分子内に複数の、即ち、２つ以上の結合および死滅の特異性を有する。トランスフェクトされた細菌は増殖して、改変されたｈｍｗバクテリオシンによって、または天然のバクテリオシンと改変されたｈｍｗバクテリオシンとの混合物からのｈｍｗバクテリオシンのうちの１つによって結合された受容体を発現する他の細菌の増殖を予防または阻害するｈｍｗバクテリオシンを産生することができる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、この受容体は、改変されたｈｍｗバクテリオシンへの曝露が、毒性または病原性菌株の増殖を予防または阻害するように、毒性または病原性菌株の毒性因子または適応性因子である。遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンによって標的とされる毒性因子の限定されない例としては、米国特許第６，３５５，４１１号および公開特許出願第ＷＯ９９／２７１２９号（Ａｕｓｕｂｅｌら）に開示されている配列によってコードされるものが挙げられる。
【００４１】
この曝露は、任意に、ｈｍｗバクテリオシンを発現するトランスフェクトされた細菌との接触、または共培養によって行う。本開示は、動物または植物対象上またはその内部において、トランスフェクトされた細菌のインビボでの増殖を可能にすることを含む。トランスフェクトされた細菌のインビボでの適用は、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンによって標的とされる表面受容体を発現する細菌に対して保護状態を提供する。この保護状態は、免疫状態と類似しており、トランスフェクトされた細菌は、本質的には、動物または植物の免疫または他の防衛システムを増強または補助する。
【００４２】
他の実施形態では、改変された単量体の尾部繊維タンパク質のＲＢＤをコードする核酸配列は、そのコード配列の識別、物理的単離、および／または選択を可能にする遺伝子システムの一部である。限定されない例としては、この遺伝子システムは、その識別、単離、および／または選択を可能にするファージ、溶原性ファージ、形質導入粒子、コスミド、またはファージゲノムの中のコード配列を含んでよい。いくつかの実施形態では、この配列は、繊維遺伝子の一部分と融合され、発現されて、改変された尾部繊維三量体を産生し、これにより、改変されたｈｍｗバクテリオシンは、ＲＢＤをコードする配列が識別または単離された溶原性ファージを内部に持つ宿主生物の表面に結合し、それを死滅させる。改変された尾部繊維三量体中の表現型の検出により、この配列を選択および／またはスクリーニングし、識別し、単離することができる。いくつかの実施形態では、この表現型は、所望の、恐らくは希少である、受容体結合特性であり得る。
【００４３】
本開示は、それぞれが改変された尾部繊維タンパク質をコードする複数のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ配列を含む、ファージ、形質導入粒子、コスミド、またはファージゲノムのライブラリーを含む。ＲＢＤの結合表現型とコード遺伝子型とのこの組み合わせにより、それらをコードする配列が、ライブラリー内に表されるように、複数の改変されたＲＢＤの発現を可能にする。いくつかの実施形態では、ライブラリーの構成要素はそれぞれ、ホモ三量体の尾部繊維が発現して、ライブラリーの構成要素のそれぞれの結合表現型を決定するためのスクリーニングまたは選択のために使用可能であるように、１つの改変された尾部繊維タンパク質をコードする配列を含む。他の実施形態では、本明細書に開示されるヘテロ三量体の尾部繊維が発現して、それらの結合表現型のためのスクリーニングまたは選択することができるように、ライブラリーの構成要素には、改変された尾部繊維タンパク質をコードする１つを超える配列を有するものを含む。したがって、ライブラリーの構成要素の結合表現型は、それぞれのコード配列に連結される。所望の、または有利なＲＢＤをコードする遺伝子型がそのように識別されると、それを用いて、改変されたｈｍｗバクテリオシンのための尾部繊維を作製することができる。尾部繊維の同族シャペロン機能、例えば、ＶＨＭＬのＲＢＤを自然に多様化するＶＨＭＬの同族シャペロン機能を実施することにより、ＶＨＭＬに由来する多様化されたＲＢＤを含む尾部繊維の適切な折り畳みを確保することができる。
【００４４】
本明細書に開示されるベクター、宿主細胞、ファージ、形質導入粒子、コスミド、ファージゲノム、およびライブラリーは、核酸分子をコードする尾部繊維タンパク質を含む組成物と見なされてもよい。
【００４５】
本開示の組成物はまた、ＲＢＤタンパク質のＢＰＡＲタンパク質への融合から得られる融合タンパク質も含む。例えば、ｐｈｉＶ１０の尾部スパイクの全てまたは一部は、Ｒ型ピオシンの尾部繊維ＰＲＦ１５のＢＰＡＲと融合される。場合によっては、これらの融合タンパク質は、他のタンパク質、またはファージ、または細胞の構成要素において提供され得る。あるいは、それらは単離されても、分離されてもよい。融合タンパク質は、ライブラリーの一部であり、スクリーニングまたは選択に使用可能であり得る、および／または投与のための担体または賦形剤と関連し得る。それらは、組換え方法によって調製され得るか、または化学的に合成され得る。
【００４６】
本開示のさらなる組成物は、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンまたはその抗細菌部分を含む。この組成物は、ｈｍｗバクテリオシンのために抗細菌性であり、担体または賦形剤を含んでよい。当然、この担体または賦形剤は、ｈｍｗバクテリオシンのようなマルチサブユニット複合体タンパク質と組み合わせて使用するのに適しているものである。いくつかの実施形態では、この担体または賦形剤は、組成物を臨床的または農業に使用することができるように、薬学的に許容される。他の実施形態では、この担体または賦形剤は、ヒトまたは非ヒト動物等に、局所、肺、胃腸、または全身の投与に適している。さらなる実施形態では、この担体または賦形剤は、限定されない例として、植物または植物からの生鮮食品等の、表面への、または非動物の生物への投与に適している。
【００４７】
本明細書に開示される組成物は、１つを超える融合タンパク質もしくは遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンを含んでも、１つ以上のさらなる薬剤を含んでもよく、これには、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンと共に使用することが望ましい天然のｈｍｗバクテリオシンが挙げられるが、これに限定されない。さらなる薬剤の限定されない例としては、酵素、抗生物質、抗真菌剤、殺菌剤、鎮痛剤、および抗炎症剤が挙げられる。
【００４８】
さらなる態様では、本開示は、本明細書に記載されるｈｍｗバクテリオシンに関連する産物の使用方法を提供する。本開示の実施形態は、細菌細胞の増殖を阻害する方法、または細菌細胞死を誘発する方法を含む。そのような方法は、感受性の高い細菌細胞（複数を含む）を、有効量の遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンと、または融合タンパク質等のその抗細菌部分と接触させることを含む。あるいは、ｈｍｗバクテリオシンまたはその抗細菌部分を含む組成物を使用してもよい。場合によっては、有効量は、平均して、細菌細胞１個当たりｈｍｗバクテリオシンわずか１個と同等の量とすることができる。また、より高い量を使用してもよい。
【００４９】
他の実施形態では、細菌の細胞質膜の完全性に損傷を与える方法が提供される。その損傷により、膜電位の喪失、および／またはいくつかの細胞内容物の喪失をもたらす場合がある。そのような方法は、細胞膜を、融合タンパク質と、または遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンと、またはその抗細菌部分と接触させることを含む。多くの場合、細胞膜は、毒性または病原性細菌の細胞膜である。
【００５０】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、対象内部で、融合タンパク質、または遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシン、またはその抗細菌部分のインビボでの適用（または投与）を含み得る。あるいは、本方法は、インビトロまたはエクスビボで接触することを含んでもよい。
【００５１】
なおさらなる態様では、本開示は、毒性のある先祖細菌から無毒性細菌を形成する方法を提供する。本方法は、毒性細菌を、その毒性細菌の毒性因子または適応性因子と結合させる遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンと、またはその抗細菌部分と接触させることを含む。この接触工程は、ｈｍｗバクテリオシンまたはその抗細菌部分の使用された量によって、細菌の全てが死滅するわけではない条件下で、または細胞増殖において完全に阻害されるわけではない条件下で行われ得る。この接触工程は、標的とされる細菌が、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンまたはその抗細菌部分を生存させることができ、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンまたはその抗細菌部分に対して感受性のない（そのため、耐性のある）無毒性突然変異体または改変された細菌子孫になった場合にのみ増殖することができる選択的な負荷をかける。いくつかの実施形態では、この耐性は、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンまたはその抗細菌部分に対する毒性因子もしくは適応性因子または受容体の発現の欠損によるものであり、それによって、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンによる攻撃が回避される。別の実施形態では、この耐性は、毒性因子または適応性因子が、改変されたピオシンのＲＢＤに対する効果的な受容体として作用せず、変化した形態ではその毒性または適応性機能を失うように変化することによる場合もある。生存している子孫による耐性の獲得、およびその結果としての、元は毒性のあった細菌の毒性または適応性の変化は、インビボまたはインビトロで測定し、その失われた病原性を実証することができる。
【００５２】
関連態様では、本開示は、毒性細菌の毒性因子または適応性因子に結合し、それらの因子によってその殺菌効果を媒介する遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンまたはその抗細菌部分との接触によって無毒性細菌の集団を維持する方法を提供する。ｈｍｗバクテリオシンの存在は、毒性細菌の増殖（または発生、または増殖）を妨げ、そのため、無毒性としてその集団を維持する。いくつかの実施形態では、この接触工程は、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンまたはその抗細菌部分を発現する本明細書に記載される細菌細胞の使用により行われ得る。
【００５３】
さらなる態様では、試料中の標的細菌を検出するための方法が提供される。本方法は、標的細菌を含有する疑いがある細菌の大混合集団の試料を、Ｐ２ファージの基板結合領域（ＢＰＡＲ）をコードするポリヌクレオチドおよび標的細菌に結合する受容体結合ドメインをコードする異種ポリヌクレオチドを含む遺伝子操作された尾部繊維遺伝子と、標的細菌が感受性を有する抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子とを含む組換えＰ４バクテリオファージゲノムを有する組換えＰ４バクテリオファージと、接触させることと、試料および遺伝子操作されたＰ４バクテリオファージを培養することと、抗生物質の存在下で、標的細菌の増殖の検出によって、試料中の標的細菌の存在を検出することと、を含む。いくつかの実施形態では、ＢＰＡＲは、Ｐ２バクテリオファージ遺伝子Ｈ産物のアミノ末端部を含む。ある実施形態では、ＢＰＡＲは、Ｐ２バクテリオファージ遺伝子Ｈ産物のアミノ酸１〜１５７または１〜１５８を含む。さらなる実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、Ｌ−４１３ｃ、ＰＳ１７、ＢＰＰ−１、ＣＴＸ、ＶＨＭＬ、ＣＵＳ３、エプシロン１５、ＨＫ６２０、ｓｆ６、ＳＴ６４Ｔ、またはｐｈｉＶ１０ファージに由来する。組換えＰ４バクテリオファージのいくつかの実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、ＲＢＤのＣ末端をコードする。特定の実施形態では、Ｃ末端は、約３４７〜７５５アミノ酸長である。一態様では、異種ポリヌクレオチドは、配列番号６０からのアミノ酸２０４〜８７５、２１１〜８７５、または２１７〜８７５をコードする。いくつかの実施形態では、標的細菌は、エシェリキア属、シゲラ属、サルモネラ属、エルシニア属、ボルデテラ属、スタフィロコッカス属、クロストリジウム属、アシネトバクター属、シュードモナス属、およびストレプトコッカス属からなる群から選択される属に由来する。好ましい実施形態では、標的細菌は、大腸菌、シゲラ属、サルモネラ属、エルシニア属、ボルデテラ属、またはシュードモナス属の菌株である。特定の実施形態では、標的細菌は、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、大腸菌Ｋ１株、大腸菌Ｈ株、シゲラフレクスナー、サルモネラチフィムリウム、属Ｅ１のサルモネラエンテリカ、エルシニアペスティス、ペルタクチンを発現するボルデテラブロンキセプティカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ペルタクチンを発現する大腸菌、および緑膿菌からなる群から選択される。特定の実施形態では、標的細菌は、大腸菌株である。ある実施形態では、大腸菌株は、志賀毒素産生性大腸菌である。一態様では、大腸菌株は、Ｏ１５７：Ｈ７である。ある実施形態では、標的細菌は、細菌の大混合集団中に存在し、混合集団は、少なくとも１００万個の細菌を有する。特定の実施形態では、検出された標的細菌は、細菌の大混合集団中１，０００，０００個につき１個未満である。
【００５４】
別の態様では、遺伝子操作された尾部繊維遺伝子を有する組換えＰ４バクテリオファージゲノムを含む核酸分子が提供され、遺伝子操作された尾部繊維遺伝子は、Ｐ２ファージの基板結合領域（ＢＰＡＲ）をコードするポリヌクレオチドおよび受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）をコードする異種ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、組換えバクテリオファージは、抗生物質の耐性遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＢＰＡＲは、Ｐ２バクテリオファージ遺伝子Ｈ産物のアミノ末端部を含む。ある実施形態では、ＢＰＡＲは、Ｐ２バクテリオファージ遺伝子Ｈ産物のアミノ酸１〜１５８を含む。さらなる実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、Ｌ−４１３ｃ、ＰＳ１７、ＢＰＰ−１、ＣＴＸ、ＶＨＭＬ、ＣＵＳ３、エプシロン１５、ＨＫ６２０、ｓｆ６、ＳＴ６４Ｔ、またはｐｈｉＶ１０ファージに由来する。組換えＰ４バクテリオファージのいくつかの実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、ＲＢＤのＣ末端をコードする。特定の実施形態では、Ｃ末端は、約３４７〜７５５アミノ酸長である。一態様では、異種ポリヌクレオチドは、配列番号６０からのアミノ酸２０４〜８７５、２１１〜８７５、または２１７〜８７５をコードする。
【００５５】
本開示の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の添付される図面および説明に記載されている。本開示の他の特性、目的、および利点は、図面および詳細な説明、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】パネルＡにおいて６つの尾部繊維のうちの４つを示すＲ型ピオシン粒子の電子顕微鏡写真、およびパネルＢにおいてＲ型ピオシン粒子の主要成分の概略図を提供する。
【図２】野生型ピオシン（Ｒ２）、尾部繊維欠失菌株に産生されたピオシン粒子（ΡΑ０１Δｐｒｆ１５）、およびＲ２−Ｐ２尾部繊維融合により相補されたピオシンの段階希釈（５×）スポットアッセイを提供する。標的細菌は、緑膿菌１３ｓおよび大腸菌Ｃ１ａである。野生型Ｒ２ピオシン粒子は、シュードモナス菌を死滅させることができるが、大腸菌を死滅させることはできない。尾部繊維欠失菌株は、活性ピオシン粒子を産生しないが、Ｒ２−Ｐ２尾部繊維融合でトランスに相補されると、大腸菌Ｃ１ａを死滅させることができる。
【図３】Ｒ２ピオシン構造のＲ２−Ｐ２尾部繊維融合による相補である。Ａに示されるように、Ｐ２尾部繊維遺伝子のＣ末端（ＲＢＤ）部分が、Ｒ２尾部繊維のＮ末端（ＢＰＡＲ）部分と融合した。  図３Ｂは、野生型Ｒ２ピオシンの概略図を示す（左）。Ｒ２ピオシンは、Ｒ２（ＢＰＡＲ）−Ｐ２（ＲＢＤ）融合構築物で相補して、キメラ尾部繊維がその構造に組み込まれた粒子（右）を作製する。Ｒ２−Ｐ２粒子は、死滅範囲が変化し、特定の大腸菌株を標的とするようになる。
【図４】複数のＲ２−Ｐ２融合およびそれらの殺菌作用を提供する。Ｒ２のＮ末端、１から１６４位のアミノ酸（基板結合領域「ＢＰＡＲ」）を、種々のＰ２のＣ末端部分（ＲＢＤ）と融合した。数字は、それぞれのタンパク質のアミノ酸の位置番号を表している。それぞれの構築された尾部繊維を含む（大腸菌Ｃに対して）改変されたピオシンの殺菌作用は、存在（＋）または不在（−）として表す。
【図５】Ｐ２尾部繊維のＣ末端１５８から６６９位の部分（ＲＢＤ）と融合したＲ２尾部繊維のＮ末端の種々の部分（ＢＰＡＲ）を示す。数字は、それぞれのタンパク質のアミノ酸の位置番号を表している。それぞれの構築された尾部繊維を含む（大腸菌Ｃに対して）改変されたピオシンの殺菌作用は、存在（＋）または不在（−）として表す。
【図６】複数のＲ２−Ｐ２融合およびそれらの殺菌作用を示す。Ｒ２のＮ末端１から２４０位のアミノ酸（ＢＰＡＲ）を、種々のＰ２のＣ末端部分（ＲＢＤ）と融合した。数字は、それぞれのタンパク質のアミノ酸の位置番号を表している。それぞれの構築された尾部繊維を含む（大腸菌Ｃに対して）改変されたピオシンの殺菌作用は、存在（＋）または不在（−）として表す。
【図７】Ｐ２尾部繊維のＣ末端３２２から６６９位の部分（ＲＢＤ）と融合したＲ２尾部繊維のＮ末端の種々の部分（ＢＰＡＲ）を提供する。数字は、それぞれのタンパク質のアミノ酸の位置番号を表している。それぞれの構築された尾部繊維を含む（大腸菌Ｃに対して）改変されたピオシンの殺菌作用は、存在（＋）または不在（−）として表す。
【図８】種々のＲ型ピオシンの尾部繊維、尾部繊維融合、およびシャペロンによる、ΡΑ０１Δｐｒｆ１５  Ｒ２ピオシン構造のトランスでの相補を示す。Ｒ１からＲ５によって相補されたピオシンの活性は、全てのピオシン型に対して感受性を有する指示菌株である緑膿菌１３ｓへのスポッティングによって評価された。Ｒ２−Ｐ２で相補されたピオシンは、指示菌として大腸菌Ｃを用いた活性についての試験を行い、Ｒ２−Ｌ−４１３ｃで相補されたピオシンは、エルシニアペスティス菌株ＫＩＭ上で試験を行った。  Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４のＰＲＦ１５尾部繊維は、ＰＡ０１Δｐｒｆ１５  Ｒ２ピオシンの内因性ＰＲＦ１６によって相補することが可能であった。Ｒ２と比較してＣ末端が異なるＲ１およびＲ５のＰＲＦ１５尾部繊維は、最大活性を得るためには、それら自身の同族ＰＲＦ１６（それ自身がＲ２の対応物とは異なっている）が必要であった。ファージＰ２およびＬ−４１３ｃ尾部繊維のＣ末端（ＲＢＤ）をそれぞれ含むＲ２−Ｐ２およびＲ２−Ｌ−４１３ｃ融合体は両方とも、ファージの遺伝子Ｇによってコードされるそれらの同族尾部繊維アセンブリシャペロンが必要である。
【図９】ピオシン尾部繊維およびシャペロンの発現ベクターｐＵＣＰ３０Ｔを示す。遺伝子ｐｒｆ１５およびｐｒｆ１６は、両方の種とともに、複製開始点（ｏｒｉ  ｐＲＯ１６００、ｒｅｐ、およびｏｒｉＴ）を有するシュードモナス／大腸菌シャトルベクター（Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ）を用いて発現する。クローン部位は、表示された制限酵素開裂部位によって示される。プラスミドは、ゲンタマイシン耐性（Ｇｍ  Ｒ）を付与し、培養培地にゲンタマイシンを添加することで維持される。両遺伝子の転写は、ｌａｃＩQによって負に制御されるｔａｃプロモーターにより誘発される。緑膿菌株ＰＡＯ１Δｐｒｆ１５に形質転換されるとき、例えばｐｒｆ１５およびｐｒｆ１６等のプラスミドに組み込まれた遺伝子は、ＰＡＯ１Δｐｒｆ１５宿主産生細菌中に残っているこれらのピオシン遺伝子のマイトマイシンＣ産生による誘発と同時に、ＩＰＴＧにより誘発された後、トランスに発現する。
【図１０】エルシニアペスティスに特異的なピオシン尾部繊維の構築物を提供する。Ｒ２−Ｐ２を構築するために使用された戦略と同様に、Ｌ−４１３ｃ尾部繊維遺伝子の一部分をコードするＣ末端（ＲＢＤ）を、Ｒ２尾部繊維のＮ末端部分（ＢＰＡＲ）と融合した。トランスに発現して、Ｒ２尾部繊維欠失菌株ΡΑ０１Δｐｒｆ１５を相補するとき、エルシニアペスティスを効果的に死滅させることができるが、シュードモナスを死滅させることができないキメラＲ２−Ｌ−４１３ｃ尾部繊維を含む改変されたピオシン粒子が産生される。
【図１１】図１１Ａは、Ｒ２ピオシン尾部繊維の基板結合領域（ＢＰＡＲ）へのバクテリオファージＰ２およびｐｈｉＶ１０尾部繊維の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）のそれぞれの尾部繊維融合を示す。  図１１Ｂは、Ｒ２−Ｐ２尾部繊維融合またはＲ２−Ｖ１０尾部繊維融合のいずれかをそれらの構造に組み込むピオシンの殺菌作用を提供する。ＰＡＯ１Δｐｒｆ１５において、トランスに尾部繊維融合を発現することによってピオシンが産生され、一方、ピオシン遺伝子が同時に誘発された。ピオシン活性は、大腸菌ＥＤＬ９３３およびＴＥＡ０２６の菌叢上においてスポット方法によって評価された。ＥＤＬ９３３は、Ｏ１５７抗原を産生する野生型菌株である。ＴＥＡ０２６は、Ｏ抗原産生が不完全であるＥＤＬ９３３の突然変異である（Ｈｏ  ａｎｄ  Ｗａｌｄｏｒ，２００７）。ＥＤＬ９３３は、Ｒ２−Ｖ１０に対して感受性があるが、Ｒ２−Ｐ２に対しては感受性がない。ＴＥＡ０２６は、ピオシンＲ２−Ｐ２に対して感受性があるが、Ｒ２−Ｖ１０に対しては感受性がない。これは、Ｏ１５７抗原が、Ｖ１０  ＲＢＤの受容体であり、Ｐ２  ＲＢＤがリポ多糖類を認識することを示す。
【図１２】ゲンタマイシン耐性の遺伝子（ａａｃＣ１）、およびＰ４サテライトファージの非必須領域に挿入され、左方向の早期プロモーターＰLEによって制御されるＰ２  Ｈ−Ｖ１０等の融合尾部繊維を含むＰ４プラスミド、ｐＤＧ２１８の略図である。他の示された遺伝子および機能は、Ｐ４ｓｉｄ1由来である（Ｓｈｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７）。
【図１３Ａ】頁１３Ａ〜１３Ｎに提供される配列番号１〜７１のアミノ酸配列または核酸配列を提供する。
【図１３Ｂ】頁１３Ａ〜１３Ｎに提供される配列番号１〜７１のアミノ酸配列または核酸配列を提供する。
【図１３Ｃ】頁１３Ａ〜１３Ｎに提供される配列番号１〜７１のアミノ酸配列または核酸配列を提供する。
【図１３Ｄ】頁１３Ａ〜１３Ｎに提供される配列番号１〜７１のアミノ酸配列または核酸配列を提供する。
【図１３Ｅ】頁１３Ａ〜１３Ｎに提供される配列番号１〜７１のアミノ酸配列または核酸配列を提供する。
【図１３Ｆ】頁１３Ａ〜１３Ｎに提供される配列番号１〜７１のアミノ酸配列または核酸配列を提供する。
【図１３Ｇ】頁１３Ａ〜１３Ｎに提供される配列番号１〜７１のアミノ酸配列または核酸配列を提供する。
【図１３Ｈ】頁１３Ａ〜１３Ｎに提供される配列番号１〜７１のアミノ酸配列または核酸配列を提供する。
【図１３Ｉ】頁１３Ａ〜１３Ｎに提供される配列番号１〜７１のアミノ酸配列または核酸配列を提供する。
【図１３Ｊ】頁１３Ａ〜１３Ｎに提供される配列番号１〜７１のアミノ酸配列または核酸配列を提供する。
【図１３Ｋ】頁１３Ａ〜１３Ｎに提供される配列番号１〜７１のアミノ酸配列または核酸配列を提供する。
【図１３Ｌ】頁１３Ａ〜１３Ｎに提供される配列番号１〜７１のアミノ酸配列または核酸配列を提供する。
【図１３Ｍ】頁１３Ａ〜１３Ｎに提供される配列番号１〜７１のアミノ酸配列または核酸配列を提供する。
【図１３Ｎ】頁１３Ａ〜１３Ｎに提供される配列番号１〜７１のアミノ酸配列または核酸配列を提供する。
【図１４】ゲンタマイシン耐性遺伝子（ａｃｃ１）およびＰ２尾部繊維遺伝子Ｐ２−Ｈを含むために、Ｐ４がゲノム改変された組換えＰ４／Ｐ２ゲノム構築物の概略図を提供する。その他は、遺伝子が野生型Ｐ４ファージのものであることを示した。
【図１５】大腸菌Ｃ１ａと大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の混合物を、示される割合で、図１４中の構築物を含む組換えＰ４／Ｐ２バクテリオファージと接触させる場合のゲンタマイシンを含む寒天プレート上での大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＥＤＬ９３３）の増殖写真を提供する。
【図１６】組換えＰ４バクテリオファージ粒子の混合物を、示される割合で、大腸菌Ｃ１ａまたは大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のいずれかと接触させる場合のゲンタマイシンを含む寒天プレート上での大腸菌Ｃ１ａまたは大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＥＤＬ９３３）の増殖写真を提供する。
【００５７】
定義
本明細書で使用されるｈｍｗバクテリオシンは、Ｒ型ピオシン、尾状のバクテリオシン、Ｒ型バクテリオシン、およびＲ型ピオシン、モノシン、エンテロコリチシン、メニンゴシン、または他の高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシンを含む。ｈｍｗバクテリオシンは、改変された形態のＲ型ピオシン、エンテロコリチシン、モノシン、およびメニンゴシンを含む（Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ“Ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ．”  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９１（５）：１６９６−９，１９６６を参照）。改変されたまたは遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンは、緑膿菌のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、またはＲ５ピオシンから選択される改変されたＲ型ピオシンであり得る。改変されたまたは遺伝子操作されたバクテリオシンは、ｐｈｉＶ１０等のバクテリオファージの尾部スパイクを含んでよい。
【００５８】
本開示のバクテリオシンは、熱不安定性、軽い耐酸性、トリプシン耐性、約６５，０００×ｇで遠心分離で沈殿可能、および電子顕微鏡で分割可能であり得る（Ｊａｂｒａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：５７０４−５７１０，２００２、Ｄａｗ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｎ  ２７：４６７−４７９，１９９６、Ｂｒａｄｌｅｙ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｒｅｖｓ．３１：２３０−３１４，１９６７、およびＫａｇｅｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ９：４７１−４７６，１９６２を参照）。多くの場合、本明細書に開示される遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンは、いずれの組み合わせにおいて、これらの特性のうちの１つ以上を有する。本明細書に開示されるバクテリオシンおよび遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンに共通のさらなる特性は、これらは核酸を含まず、したがって、多くのバクテリオファージでは可能であるような、標的細菌を死滅させた後、またはその間に、それ自身の複製ができないという、複製欠損であるということである。
【００５９】
本明細書に開示されるＲ型ピオシンおよび他のｈｍｗバクテリオシンは、複数のタンパク質、またはポリペプチドのサブユニットを含む複雑な分子であり、ミオウイルスファミリーのバクテリオファージの尾部構造と類似している。天然のＲ型ピオシンでは、サブユニット構造は、緑膿菌のゲノム等の細菌ゲノムによってコードされ、ピオシンを形成して、他の細菌に対する自然防御として働く（Ｋａｇｅｙａｍａ，１９７５）。感受性を有する標的細菌は、単一のＲ型ピオシン分子によって死滅させることができる（Ｋａｇｅｙａｍａ，１９６４、Ｓｈｉｎｏｍｉｙａ  ＆  Ｓｈｉｇａ，１９７９、Ｍｏｒｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０、Ｓｔｒａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【００６０】
「標的細菌（ｔａｒｇｅｔ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）」または「標的細菌（ｔａｒｇｅｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ）」は、本開示の遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンによって結合され、および／またはその増殖、生存、もしくは複製がそれによって阻害される細菌を指す。「増殖の阻害」、またはその変形した形の用語は、細菌細胞の分割速度の低下もしくは停止、または細菌細胞の分裂の停止、または細菌の死を指す。
【００６１】
本明細書で使用される「核酸」は、通常、一本鎖または二本鎖の形態の、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマー（純粋または混合）を指す。この用語は、ヌクレオチド類似体、または改変された骨格残基もしくは連結を含む核酸を包含することができ、これらは、合成、天然、もしくは非天然のものであり、参照核酸と類似の結合、構造、もしくは機能特性を有し、ならびに、参照ヌクレオチドと類似の方法で代謝される。そのような類似体の限定されない例としては、ホスホロチオエート、ホスホラミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２‐０‐メチルリボヌクレオチド、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。核酸という用語は、状況によっては、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと交換可能に用いられる場合もある。
【００６２】
特定の核酸配列はまた、その保守的に改変された変異体（縮退コドン置換等）および相補配列、ならびに明示された配列も包含する。特に、縮退コドン置換は、１つ以上の選択された（または全ての）コドンの第３（「ウォッブル（ｗｏｂｂｌｅ）」）の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換される配列を作り出すことによって達成され得る。したがって、本明細書に開示されるタンパク質配列をコードする核酸配列はまた、本明細書に開示されるように、その改変された変異体も包含する。
【００６３】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、通常、本明細書で交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。アミノ酸は、公知の３文字記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号で本明細書に表すことができる。
【００６４】
毒性因子は、生物の病原性に寄与するが、その一般的な生存能力には寄与しない分子である。毒性因子を失うことにより、生物の病原性は下がるが、生存能力が必ずしも下がるとは限らない。毒性因子は、例えば、遺伝子発現の制御、接着性もしくは移動性の付与、抗生物質の排出、またはバイオフィルムを含む防御皮膜の形成等の多くの機能のいずれか１つを有することができる。
【００６５】
適応性因子は、生物の一般的な生存能力、増殖速度、またはその環境下での競合性に寄与する分子である。適応性因子を失うことにより、生物は生存能力または競合性が低下し、この欠陥により、間接的に病原性が低下する。適応性因子はまた、例えば、栄養素、イオン、または水の摂取、細胞膜もしくは細胞壁の構成成分または保護剤の形成、核酸の複製、修復、または突然変異、環境的なもしくは競合的な攻撃からの防御またはそれに対する攻撃等の、多くの機能のいずれか１つを有することもできる。
【００６６】
いくつかの毒性因子および適応性因子は、細菌の表面に存在し、それによって、本明細書に開示されるｈｍｗバクテリオシンに接触可能となる。いくつかの表面の毒性因子または適応性因子に結合することにより、ｈｍｗバクテリオシンは、細胞膜に孔を開け、細胞質膜の完全性に損傷を与え、および／または細胞の膜電位を消失させることにより、死滅を媒介することができる。ｈｍｗバクテリオシンの結合および死滅を恐らくは補助していると思われるこれらの表面の接触可能な分子は、外膜のタンパク質、多糖類、およびリポ多糖類である。したがって、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンの標的として考えられるのは、外膜のタンパク質、多糖類、およびリポ多糖類である毒性因子および適応性因子である。遺伝子操作されたピオシンの標的である毒性因子のいくつかの限定されない例としては、膜内開裂プロテアーゼ（ｉＣＬＩＰ）であるメタロプロテアーゼ、ＩＬおよびＩＩＬガラクトース結合およびフコース結合レクチン、接着性マトリックス分子を認識する微生物表面成分（ＭＳＣＲＡＭＭ）タンパク質、およびＡＣＥ等のアドヘシンが挙げられる。
【００６７】
特定の毒性因子の標的化への最終的な成功は、その細菌表面上でのトポグラフィー、その表面での密度、恐らくは外膜内でのその２次元的な移動性、および病原体の臨床分離株または野外分離株でのその広がりに依存する。例えば、ＯｐｒＭは、例えば、ＭｅｘＡＢ系等の複数の排出ポンプに関与するポリン様外膜タンパク質であり、多くのグラム陰性細菌で広く見られる（Ｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｃｏｃｋ，２０００）。ＯｐｒＭと同様に、ＴｏｌＣは、グラム陰性病原体の多くの排出ポンプに必要なアクセサリータンパク質である（Ｋｏｒｏｎａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｐｉｄｄｏｃｋ，２００６）。加えて、セクレチンのＹｃｒＣファミリーのいくつかの構成要素は、緑膿菌およびエルシニアペスティス等の多くのグラム陰性病原体がその哺乳類ホストを中毒化するために依存する３型分泌系（「Ｔ３ＳＳ」）による病原性エフェクタータンパク質の転座に必要である、外膜タンパク質である（Ｇａｌａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｍｅｒ．  １９９９、Ｋｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７、Ｃｏｒｎｅｌｉｓ，２００６）。加えて、ＹｓｃＷファミリーの構成要素はまた、外膜にアンカリングしてセクレチンを膜内へ挿入する補助となる、リポタンパク質である（Ｂｕｒｇｈｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【００６８】
毒性および適応性因子のさらなる限定されない例としては、大腸菌アクアポリンＺ水チャネル等のアクアポリン（Ｃａｌａｍｉｔａ，２０００を参照）；ＲｅｔＳ（Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、およびＺｏｌｆａｇｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５を参照）；７ＴＭＲ−ＤＩＳＭファミリーの構成要素（Ａｎａｎｔｈａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３を参照）；ＯｐｒＭ（Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０００および配列番号１１を参照）；ＯｐｒＪ（配列番号１２）、ＯｐｒＮ（配列番号１３）、ＡｐｒＦ（配列番号１４）、ＯｐｍＭ（配列番号１５）、ＯｐｍＡ（配列番号１６）、ＯｐｍＤ（配列番号１７）、ＯｐｍＥ（配列番号１８）、ＯｐｍＱ（配列番号３５）、ＯｐｍＢ（配列番号３６）、ＯｐｍＪ（配列番号３７）、ＯｐｍＧ（配列番号３８）、ＯｐｍＩ（配列番号３９）、ＯｐｍＨ（配列番号４０）、ＯｐｍＫ（配列番号４１）、ＯｐｍＮ（配列番号４２）、ＯｐｍＦ（配列番号４３）、またはＯｐｍＬ（配列番号４４）等の細菌タンパク質；ポリンのＯｐｒＤファミリー（Ｔａｍｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００６を参照）；ＡＣＥまたはエンテロコッカスフェカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）ＯＧ１ＲＦがコードするＡＣＥ遺伝子（Ｓｒｅｅｄｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００およびＲｉｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９を参照）；ガラクトース結合およびフコース結合レクチン、ＰＡ−ＩＬおよびＰＡ−ＩＩＬ（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２を参照）；Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４により説明される植物および動物の毒性遺伝子；細胞外ピロリン酸部分（Ｂｏｎｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００４を参照）；メタロプロテアーゼ（Ｒｕｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９を参照）；ならびにトランスポゾンがコードする表面分子（Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３を参照）が挙げられる。
【００６９】
開示された遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンが標的とする毒性因子の他の限定されない例としては、米国特許第６，３５５，４１１号および国際公開第ＷＯ９９／２７１２９号に開示されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によってコードされた毒性因子が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるバクテリオシンが標的とする因子は、米国特許からの以下のＯＲＦによってコードされる因子である。
【表１】
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【００７０】
本開示を実施する形態の詳細な説明
一般事項
Ｈｍｗバクテリオシンは、急速に細菌を死滅させる能力を有する。インビボでの研究に関するいくつかの初期の報告は、それらがマウスでのこの用途で有効であり得ることを示している（Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９７４、Ｍｅｒｒｉｋｉｎ  ａｎｄ  Ｔｅｒｒｙ，１９７２）。本発明は、好ましくは腹腔内または静脈内のいずれかで投与するとき、野生型Ｒ２ピオシンが、抗生物質耐性の緑膿菌が引き起こす急性腹膜炎にかかったマウスを治療することができること、および、Ｒ２ピオシンが、１回の投与量中に１０9個のピオシンまたは全タンパク質量で１μｇ未満のような非常に少ない投与量で作用することができる（データは示さず）ということを提供する。
【００７１】
しかしながら、抗菌剤として臨床的に有用なｈｍｗバクテリオシンに関しては、殺菌範囲の狭さという問題には対処しなけばならない。このことは、正常細菌叢に影響を及ぼすことなく、そのため、最小限の巻き添え被害も与えない特定の種または菌株を特異的に標的とすることができるという点で有益であると見なすことができるが、公知のバクテリオシンに感受性を有する種／菌株の種類は限られている。例えば、Ｒ型ピオシンは、いくつかの緑膿菌株によって産生されることが現在知られており、狭い範囲の他のシュードモナス菌株および数種類のグラム陰性種に対して活性を有する。他の種からのＲ型バクテリオシンが報告されている（エルビニア、Ｊａｂｒａｎｅ  ２００２を参照、エルシニアエンテロコリチカ、Ｓｔｒａｕｃｈ等を参照）が、その存在は限られていると思われる。一方、ミオウイルスファージは、非常に広く分布して一般的であり、グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌の種類の両方で見られる。
【００７２】
本開示は、それがｈｍｗバクテリオシンの範囲を変化させることができることを示す。ピオシンおよびその関連するファージの両方において、主たる範囲の決定因子は、尾部繊維に存在し、細菌表面に特異的に結合し、そのＣ末端部分（ＲＢＤ）とＬＰＳまたは他の細胞表面構造の構成成分との相互作用を起こす。ＬＰＳは、異なる種と細菌株との間で大きく異なる場合があり、バクテリオファージの尾部繊維自体が、特に細胞表面と相互作用するこのＣ末端領域において、大きく異なっている（Ｔｅｔａｒｔ，Ｄｅｓｐｌａｔｓ）。この多様性は、ホストの表面を変化させるためのファージの持続する適応に明らかに反映する。同じホストに感染する異なるファージ型（大腸菌ファージＰ２、Ｍｕ、およびＰ１）が、尾部繊維のＣ末端部分で配列相同性を有することが確認されており（Ｈａｇｇａｒｄ−Ｌｊｕｎｇｑｕｉｓｔ  Ｅ，Ｈａｉｌｉｎｇ  Ｃ，Ｃａｌｅｎｄａｒ  Ｒ．）、これらの遺伝子領域における水平移動が、ホストの特異性に関与している可能性が高いことを示している。例えば、Ｒ２ピオシンは、大腸菌ファージＰ２とも非常に密接に関連しているファージのシュードモナスファージｐｈｉＣＴＸと、非常に高いレベルでの配列相同性を有している。Ｒ２ピオシンとＰ２の尾部繊維配列を比較すると、Ｃ末端（ＲＢＤ）よりもＮ末端（ＢＰＡＲ）の方が高い配列相同性が見られ、Ｃ末端がホストの特異性に関与していることが示唆されている。
【００７３】
本明細書に開示されるように、尾部繊維遺伝子のＣ末端部分を遺伝子操作することによって、ピオシンまたは他のｈｍｗバクテリオシンの標的範囲を変化させることが可能である。注目すべきことは、この範囲の変化が、種および属のバリアを越えて起こすことができることであり、天然のＲ型ピオシンおよび他の天然のｈｍｗバクテリオシンを本明細書に開示されるように改変して、より広い範囲を有する抗菌剤を開発することができることを示している。
【００７４】
改変されたｈｍｗバクテリオシン
本開示は、結合特異性および／または親和性が変化した遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンを提供する。いくつかの実施形態では、本開示のｈｍｗバクテリオシンは、病原性細菌の毒性因子または適応性因子として作用する表面の露出した分子と特異的に結合する。「特異的に（または選択的に）結合する」という用語は、多くの場合、タンパク質および他の生物学的物質の異種集団において、結合リガンドの存在を決定付ける結合反応を指す。結果として、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンは特異的に結合すると、一般的には、病原性細菌を死滅させることができる。さらに、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンに対する耐性を得るために、標的とされる病原性細菌は、ｈｍｗバクテリオシンの認識部位または結合部位を欠失することが必要となる。言い換えると、改変されたｈｍｗバクテリオシンが、その受容体として毒性因子または適応性因子を特異的かつ独占的に使用する場合、その細菌は、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンによる死滅から逃れるためには、その毒性または適応性を損なうか、または完全に欠失せざるを得なくなる。
【００７５】
本開示の改変されたｈｍｗバクテリオシンは、バクテリオファージ尾部と類似しているが、未改変、天然、もしくはネイティブのバクテリオシンと比較して変化した結合能力、または受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を有する。ＲＢＤは、本明細書に記載される組換えＤＮＡ技術を用いることでアミノ酸配列を変化させることができる。通常、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して使用される「組換え」という用語は、その細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが異種核酸もしくはタンパク質の導入、またはネイティブ核酸もしくはタンパク質の変化によって改変されることを示すか、またはその細胞がそのように改変された細胞に由来するものであることを示す。したがって、組換え細胞は、ネイティブ（非組換え）の形態の細胞内では見られない遺伝子を発現するか、または、ネイティブ遺伝子が異常発現であるか、過小発現であるか、または全く発現しない。
【００７６】
多くの実施形態では、ＲＢＤは、改変して、別のバクテリオシンまたはバクテリオファージからの尾部繊維または尾部スパイクのＲＢＤとすることができる。本明細書に開示される限定されない例の一つとして、Ｒ２ピオシンのＲＢＤは、（異なる宿主に感染する）ファージの尾部繊維タンパク質のＣ末端部分（ＲＢＤ）をＲ２尾部繊維タンパク質のＮ末端部分（ＢＰＡＲ）と融合させることによって改変される。Ｐ２尾部繊維のＣ末端をＲ２のＰＲＦ１５と融合させ、Ｐ２同族シャペロンを共発現することによって、Ｒ２の標的細菌の範囲を変化させて、大腸菌Ｃを死滅させた。図２を参照。
【００７７】
さらなる実施形態では、ｈｍｗバクテリオシンは、別の方法で遺伝子操作される。本開示は、細菌（病原性細菌等）の表面分子を認識するか、または標的とするように設計されるか、または選択されるｈｍｗバクテリオシンを含む。その表面分子は、ｈｍｗバクテリオシンによって認識または結合される細菌上の受容体と見なすことができる。
【００７８】
本開示は、ｈｍｗバクテリオシンの尾部繊維が受容体と結合するか、または相互作用して結合対を形成する特性に基づいている。この結合または相互作用は、結合対の第１の要素である尾部繊維のＲＢＤにより、この対の第２の要素である受容体を用いて発生する。多くの実施形態では、この受容体は、細菌細胞の表面分子またはその一部分である。他の実施形態では、この受容体は、病原性細菌の毒性因子または適応性因子の特性を有する分子である。
【００７９】
本明細書に開示される改変されたまたは遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンは、基板結合領域（ＢＰＡＲ）および改変されたまたは異種のＲＢＤの両方を持つ尾部繊維を含む。本明細書に記載されるように、この尾部繊維は、３つの尾部繊維タンパク質サブユニットからなる三量体構造であり、これらのそれぞれはまた、尾部繊維のＢＰＡＲに対応し、それを形成する第１のドメインと、尾部繊維の改変されたまたは異種のＲＢＤに対応し、それを形成する第２のドメインとを含む。
【００８０】
一般に、「異種」は、タンパク質または核酸配列の一部分に関して使用されるとき、その配列が、自然状態では互いに同じ関係では通常は見られない２つ以上のサブ配列を含むことを示す。例えば、異種タンパク質は、そのタンパク質が、自然状態では互いに同じ関係では見られない２つ以上のサブ配列を含むことを示す。「異種の」はまた、そのアミノ酸配列もしくは核酸配列が、通常は他の配列と共には見られないか、または通常は選択されたプラスミド、ベクター、もしくはホスト内には含まれない、ということも意味する。すなわち、これから利用されようとしているシステムにとってネイティブなものではないということである。例えば、タンパク質で、これらのタンパク質の野生型源ではない生物によって産生されたタンパク質である。
【００８１】
したがって、多くの実施形態では、本開示は、タンパク質のＢＰＡＲと、改変されたまたは異種のＲＢＤとを含むｈｍｗバクテリオシンの尾部繊維タンパク質を含む。ＢＰＡＲは、通常、尾部繊維タンパク質のＮ末端領域にあり、一方、ＲＢＤは、通常、Ｃ末端領域にある。改変されたまたは異種のＲＢＤ以外は、尾部繊維タンパク質は、いかなる天然のｈｍｗバクテリオシンのものであってもよく、ピオシン、モノシン、エンテロコリチシン、またはメニンゴシンが限定されない例として挙げられる。いくつかの実施形態では、配列番号１、３、５、７、９によって表されるＲ１−ピオシン、Ｒ２−ピオシン、Ｒ３−ピオシン、Ｒ４−ピオシン、およびＲ５−ピオシンの尾部繊維タンパク質はそれぞれ、本明細書に記載されるように使用され得る。さらなる実施形態では、この尾部繊維タンパク質は、配列番号４５のΦＣＴＸファージのもの、配列番号１９のファージＰＳ１７のもの、または配列番号２１および２２のＶＨＭＬバクテリオファージのものであってよい。
【００８２】
本開示の実施形態としては、図３に示されるように、ｈｍｗバクテリオシンの尾部繊維タンパク質ＢＰＡＲと、バクテリオファージの尾部繊維タンパク質からのＲＢＤとの組み合わせを含む。場合によっては、組み合わせは、バクテリオシンの尾部繊維タンパク質の１位から約１６４位または２４０位までのＮ末端アミノ酸を含んでよい。このポリペプチド断片は、ＲＢＤを含むそのＣ末端部分を含むバクテリオファージの尾部繊維タンパク質の領域と融合してよい。その領域は、１位から約１５０位、約１７０位、約１９０位、約２９０位、約３００位、または約３２０位までのＮ末端領域が欠失したポリペプチド断片であってよい。
【００８３】
限定されない例として、Ｒ２ピオシンおよびＰ２ファージの尾部繊維タンパク質を用いて、ＢＰＡＲを含有する断片は、１位から１６４位または２４０位までのＮ末端アミノ酸を含んでよい。図４〜７を参照。ＲＢＤを含む断片は、Ｐ２または関連ファージ尾部繊維タンパク質の約３４７〜約７５５アミノ酸の長さであるＣ末端を挙げることができる。融合は、組換えＤＮＡ技術により、ｐｒｆ１５等のＲ２尾部繊維タンパク質をコードする核酸配列、およびその尾部繊維タンパク質をコードするＰ２ファージの遺伝子Ｈを用いて容易に調製することができる。ＲＢＤが、別のｈｍｗバクテリオシンまたはミオウイルスの尾部繊維に由来するとき、ＲＢＤの同族シャペロンは、改変された尾部繊維のアセンブリを機能性ピオシン構造に確保するために、融合尾部繊維遺伝子と共発現する必要がある。図８を参照。
【００８４】
別の限定されない例は、Ｒ２ピオシンおよびｐｈｉＶ１０ファージの使用である。ＢＰＡＲを含む断片は、ＰＲＦ１５タンパク質の１位から１６１位または１６４位までのＮ末端アミノ酸を含んでよい。ＲＢＤを含有する断片は、Ｖ１０尾部スパイクタンパク質の２０４位、２１１位、または２１７位から８７５位までのＣ末端アミノ酸を含んでよい。図１１Ａ、および配列番号６７、６８、６９を参照。
【００８５】
他の実施形態では、改変されたＲＢＤは、天然のＲＢＤと比べて、または尾部繊維タンパク質中に存在するＢＰＡＲと比べて、ＲＢＤのアミノ酸配列の変化を含む。アミノ酸配列の変化の限定されない例としては、１つ以上のアミノ酸の置換、挿入（または付加）、あるいは欠失が挙げられる。
【００８６】
ＲＢＤアミノ酸残基の置換を含む実施形態では、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２２％、約２４％、約２６％、約２８％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、もしくは約５０％またはそれ以上の尾部繊維タンパク質中のＣ末端が置換される。いくつかの実施形態では、置換は、Ｃ末端から約２４５、約２６０、約２７５、もしくは約２９０またはそれ以上の残基内に存在する。
【００８７】
置換の位置は、その領域内の１つ以上のいずれかの組み合わせであってもよい。例示的な位置としては、配列番号１、３、５、７、または９における４４８、４４９、４５２、４５３、４５４、４５５、４５９、４６０、４６２、４６３、４６４、４６９、４７２、４７３、４７４、４７５、４７８、４８０、４８４、４８５、４８６、４９１、４９４、４９６、４９７、４９８、４９９、５０５、５０６、５０７、５０８、５１０、５１２、５１４、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２３、５２７、５２８、５３０、５３１、５３３、５３５、５３７、５３８、５４１、５４３、５４６、５４８、５６１、６０３、６０４、６０５、６０６、６１０、６１８、６２１、６２４、６２６、６２７、６２８、６２９、６３１、６３２、６３３、６３８、６４１、６４２、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５７、６５９、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、６８０、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、および６９１位、ならびにこれらのいずれかの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、置換は、本明細書に記載されるように、保存的である。他の実施形態では、置換は、非保存的置換である。
【００８８】
さらなる実施形態では、尾部繊維タンパク質のＣ末端での同じ領域内でのアミノ酸残基の挿入および欠失が行われ得る。
【００８９】
ＲＢＤの他の源としては、Ｔ−４および他のＴ−偶数または偽Ｔ−偶数ファージ、ファージＴ−３およびＴ−７、ファージのＴ−７スーパーグループ、ファージＭｕ、ファージＰ２２、ファージＬ−４１３ｃ、ポドファージ、ラムダファージ、および偶数多糖類結合または特異的タンパク質結合酵素もしくはリガンドが挙げられるが、これらに限定されず、これらの結合特性は、ｐｈｉＶ１０の尾部スパイクタンパク質がそうであるように、ＲＢＤ機能に役立てることができる。
【００９０】
多様化によるＲＢＤ
さらなる実施形態では、尾部繊維タンパク質は、２００６年６月８日に公開された米国特許出願公開第２００６−０１２１４５０号（その全体が記載されているかのごとく、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、多様性を生じさせるレトロエレメント（ＤＧＲ）を配置することによって構造を多様化させる生物由来のＲＢＤによる置換、またはその挿入を含む。ボルデテラバクテリオファージＢＰＰ−１の主要トロピズム決定因子（ＭＴＤ）は、そのような構造の１つである。ＭＴＤの配列は、本明細書に開示される配列番号２４によって表される。他の実施形態では、置換は、ＭＴＤ配列の一部分で行われ、例えば、配列番号２４の４９から３８１までの残基、１７１から３８１までの残基、または３０６から３８１までの残基等の領域であるが、これらに限定されない。配列番号３の６９１位より後ろの部分等の尾部繊維タンパク質の末端へのＭＴＤ配列、またはそのいずれかの断片（上記で挙げたもの等）の挿入は、本明細書に開示される実施形態内である。ＭＴＤ配列、またはそのいずれかの断片（上記で挙げたもの等）の置換は、尾部繊維タンパク質の任意の非ＢＰＡＲ領域に対しても行うことができる。限定されない例としては、配列番号１、３、５、７、または９の領域で、約６４３、６２５、５６２、４４８、４２８、２３１、および１６３位から始まりその配列のＣ末端までが挙げられる（これらの置換の実例は、図４〜７を参照）。
【００９１】
本明細書に記載されるように、尾部繊維中のトロピズム決定因子配列は、多様化して、複数の改変されたまたは異種のＲＢＤを産生することができる。トロピズム決定因子をコードする核酸配列は、鋳型領域（ＴＲ）に、シスまたはトランスで、操作によって連結させることができる可変領域（ＶＲ）を含み、それによってＴＲはＶＲの部位特異的な突然変異生成を誘導する鋳型配列となる。ＶＲ領域とＴＲ領域との間の操作による連結には、逆転写酵素（ＲＴ）活性をコードする配列との操作による連結も含み、これはＶＲに対してトランスに存在することができる。トロピズム決定因子のＶＲの可変部位は、概して、相同的な鋳型領域であるＴＲのアデニン残基に対応しており、それ自身は不変であり、ＶＲ内の配列の変化に不可欠である。最初の分子が、ＶＲと同一のＴＲを含む場合があるが、ＴＲ内に存在するアデニン残基が、ＶＲ配列内の対応する位置に突然変異生成、または多様化をもたらす。したがって、ＴＲ配列がＶＲ内の配列の完全にそのままな繰り返し配列である場合、ＶＲ領域の多様化により、ＴＲ配列を変えることなく、ＴＲ内にも見られるＶＲ内に１つ以上のアデニン残基が別のヌクレオチド、すなわち、シトシン、チミン、またはグアニンへと変異するという結果になる。このシステムを用いて、本明細書に記載される改変された尾部繊維タンパク質のＶＲ領域を、ひいてはＲＢＤを、変化させることができる。
【００９２】
多様化により、尾部繊維タンパク質は、得られるＲＢＤが、配列番号２４で表されるボルデテラバクテリオファージＢＰＰ−１の主要トロピズム決定因子（ＭＴＤ）に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性を有するように変化させることができる。本明細書に記載されるように、尾部繊維タンパク質とトロピズム決定因子の組み合わせは、尾部繊維タンパク質配列へのトロピズム決定因子配列もしくはその一部分の置換、または挿入であってもよい。したがって、得られた尾部繊維タンパク質は、上記で挙げたように、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性を有する結合ドメインによる置換または挿入を含むものであると見なすことができる。
【００９３】
多様化および配列の変化のために、尾部繊維およびトロピズム決定因子をコードする核酸分子の組み合わせを使用してもよい。したがって、尾部繊維タンパク質の全てまたは一部、およびトロピズム決定因子の全てまたは一部をコードする配列の核酸の組み合わせは、開示される実施形態内である。他の実施形態は、本明細書に開示される改変されたまたは異種のＲＢＤを有する任意の尾部繊維タンパク質をコードする核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、コードされた改変されたまたは異種のＲＢＤは、天然のＲＢＤと比べて、または上記のような尾部繊維タンパク質中に存在するＢＰＡＲと比べて、ＲＢＤのアミノ酸配列の変化を含む。
【００９４】
さらなる実施形態では、核酸分子をコードする尾部繊維タンパク質を、多様化に利用可能とし、本明細書に開示される改変された尾部繊維タンパク質を形成することができる。好適なプロモーターの制御下で、核酸分子は、ａｔｄ−ＴＲ−ｂｒｔ領域に対して５’に操作によって配置される。このＴＲ配列は、ＴＲ’と称し、下記で論じられるようにＶＲ配列に基づいて作製され得る。得られる核酸構築物は、ａｔｄの上流の転写終結構造の欠失を有し得る。
【００９５】
上記のように尾部繊維タンパク質のＣ末端部をコードする核酸分子の領域は、ＶＲとなるように選択され、変化する際にＶＲによってコードされる配列内でのアミノ酸の変化を誘導する位置にアデニン残基を含むＴＲ’配列に操作によって連結させる。そのようなアデニン残基は、ＶＲ内で１番目または２番目のコドンとなるように意図的に設計され得る。ＴＲ’配列は、最初は選択されたＶＲと同一であってよいが、部位特異的突然変異誘発または新たな核酸合成により、コードされた尾部繊維タンパク質内での突然変異生成および多様化を誘導するための対応する位置でのみアデニン残基を含むＴＲ’配列を作製することができる。
【００９６】
ｈｍｗバクテリオシンの作製および使用
本明細書に記載される核酸分子を用いて、当業者に公知のいかなる手段によって、改変されたまたは遺伝子操作されたタンパク質を含む尾部繊維タンパク質を発現させ、作製することができる。いくつかの実施形態では、この発現は、コードされた尾部繊維タンパク質の発現を誘導することができる異種プロモーターに操作によって連結させる核酸分子を含むベクターの使用によるものである。このプロモーターは、尾部繊維タンパク質を発現させる、または発現させないように、誘導因子またはコリプレッサーとして機能する外因性分子によって制御することができる。
【００９７】
多くの実施形態では、発現は、種々のバクテリオファージについて報告されている尾部繊維の「シャペロン」をコードする配列等のアクセサリー遺伝子の発現と共に発生させることができる。ｈｍｗバクテリオシンまたはミオウイルスの尾部繊維に由来する際のＲＢＤ部分に対する同族シャペロンの存在は、図８に示されるように、必ずしもバクテリオシンの一部となることなく、本開示のｈｍｗバクテリオシンのアセンブリを促進する。シャペロンの１つの限定されない例は、Ｒ２  ｐｒｆ１６（配列番号４）によってコードされ、それは、ｐｒｆ１５（配列番号３）によってコードされるＲ２ピオシンの尾部繊維タンパク質に対応するものである（またはそれに対して同族シャペロンである）。他の例としては、Ｐ２（配列番号２６）内の遺伝子Ｇ、Ｌ−４１３ｃ（配列番号２９）上の遺伝子Ｇ、配列番号２０のＰＳ１７尾部繊維に対する同族シャペロン、ＶＨＭＬバクテリオファージ内のＯｒｆ３８（配列番号２３）が挙げられ、これらのそれぞれは、これらのミオウイルスファージのそれぞれにおいて、それぞれの尾部繊維遺伝子に対して同族シャペロンである。これらの遺伝子は、Ｔ４の尾部繊維（配列番号３１）の三量体への適切な折り畳みをつかさどることで知られているファージＴ４のｇｐ３８（配列番号３２）と相同である（Ｂｕｒｄａ，Ｑｕ，Ｈａｓｈｅｍｏｌｈｏｓｓｅｎｉ）。
【００９８】
図８に示されるように、非同族シャペロンが、所定の尾部繊維タンパク質の正確な折り畳み、および／またはｈｍｗバクテリオシンへのアセンブリには不十分であり得るため、同族シャペロンの使用は有利である。限定されない例として、Ｒ２のｐｒｆ１６遺伝子産物は、尾部繊維のＰ２のＲＢＤ部に融合されたＲ２のＢＰＡＲに損傷を与える改変された尾部繊維の折り畳みを相補するには不十分であることが観察されている。理論に束縛されることなく、本開示の理解を向上させるために提供するものであるが、シャペロンは、その同族尾部繊維タンパク質のＣ末端部分に特異的に作用することができ、尾部繊維およびそれらのシャペロンが共進化した（ｃｏ−ｅｖｏｌｖｅｄ）ものであると考えられる。しかしながら、Ｑｕらは、その同族シャペロンであるｇｐ３８に対する必要性を抑制するＴ４のｇｐ３７尾部繊維の突然変異を単離した。この突然変異は、ｇｐ３７内にコイルドコイルモチーフの複製を有し、それ自体が折り畳みに関与し得る。したがって、さらに、尾部繊維タンパク質は、同族シャペロンを共発現する必要なく、適切に折り畳まれるように、そのような変化を含むように設計され得ると考えられる。
【００９９】
したがって、本開示の実施形態は、本明細書に記載されるように、改変されたまたは遺伝子操作された尾部繊維タンパク質をコードし、シャペロンと任意に共発現する核酸分子でトランスフェクトされた細菌細胞を含む。核酸分子の発現、任意にアクセサリー（シャペロン）タンパク質と共に発現して、本開示の改変されたまたは遺伝子操作された尾部繊維の産生をもたらす。本開示はまた、１つを超える核酸分子を用いて、混合したホモ三量体の尾部繊維またはヘテロ三量体の尾部繊維をもたらす１つを超える改変されたまたは遺伝子操作された尾部繊維タンパク質の発現も含む。さらに、尾部繊維タンパク質およびシャペロンをコードする配列は、プラスミドまたは他のベクター等の単一の核酸分子内に含まれていてもよく、または別々の分子であってもよい。単一の核酸分子が使用されるとき、その配列は、任意に、同じ調節配列の制御下にあってもよい。あるいは、このコード配列は、別々の調節制御下にあってもよい。
【０１００】
いくつかの実施形態では、細菌細胞はまた、さらなるサブユニットを発現して、改変されたまたは遺伝子操作された尾部繊維を含むｈｍｗバクテリオシンを形成することもできる。実施形態のあるグループでは、細菌細胞の内因性尾部繊維タンパク質をコードする配列が不活化されるか、または欠失されている。任意に、尾部繊維タンパク質および／またはシャペロンをコードする配列を含むものとは別である、プラスミドまたは他のベクター等の核酸分子上の配列によって、他のサブユニットは、コードされてもよい。したがって、尾部繊維タンパク質および／またはシャペロンは、他のサブユニットに対して、トランスに１つ以上の核酸分子が提供されてもよい。
【０１０１】
核酸、ベクター、および細菌細胞は、本明細書に開示される改変されたまたは遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンを産生する方法に使用してもよい。そのような方法は、尾部繊維およびｈｍｗバクテリオシンの発現および産生をもたらす条件下で、上記の核酸分子を含む細菌細胞を培養することを含み得る。本開示のいくつかの実施形態では、この条件は、動物内でのインビボである。
【０１０２】
実施形態のあるグループでは、ｈｍｗバクテリオシンの作製方法は、宿主細菌内で改変されたまたは遺伝子操作された尾部繊維タンパク質を含むバクテリオシンサブユニットを発現することと、その細菌培養からのｈｍｗバクテリオシンを回収することと、を含む。この宿主細菌は、バクテリオシンの産生のために必要な他のサブユニットをコードし、発現させる相補的な宿主産生細菌である。「宿主細菌（ｈｏｓｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ）または（ｈｏｓｔ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）」という用語は、本明細書に開示されるｈｍｗバクテリオシンを産生するために使用される細菌を指す。宿主細菌はまた、「宿主産生細菌（ｈｏｓｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）」、「宿主産生細菌（ｈｏｓｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ）」、「産生細菌（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）」、または「産生細菌（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ）」と称される場合がある。「細菌培地からのｈｍｗバクテリオシンの回収」は、一般に、宿主細菌培地からバクテリオシンの除去を含む。
【０１０３】
実施形態の選択的なグループでは、本明細書に記載される改変された尾部繊維を有するｈｍｗバクテリオシンの作製方法が提供される。この方法は、本明細書に開示されるいかなる手段によって、改変された尾部繊維タンパク質をコードする核酸分子を作製することと、ｈｍｗバクテリオシンが産生される条件下で、細胞内で核酸分子を発現させることと、を含んでよい。
【０１０４】
本開示の実施形態は、本明細書に記載される尾部繊維タンパク質を含むｈｍｗバクテリオシンを含む。実施形態のあるグループでは、このバクテリオシンは、配列番号１、３、５、７、９によって表されるアミノ酸配列の一部に含まれる尾部繊維タンパク質を含む。他の実施形態では、このバクテリオシンは、異種改変されたＲＢＤを有する尾部繊維を含む、改変されたまたは遺伝子操作されたピオシン、モノシン、エンテロコリチシン、またはメニンゴシンである。多くの実施形態では、異種改変されたＲＢＤは、細菌毒性因子または適応性因子と結合する。
【０１０５】
さらなる実施形態では、多価の尾部繊維を有する遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンが開示される。ボルデテラブロンキセプティカバクテリオファージＢＰＰ−１のＭＴＤは、Ｘ線結晶解析により、その四面体の底で３つのややフラットな受容体結合部位を形成する１２個の不連続な可変アミノ酸残基を３セット有する高度に絡み合ったピラミッド形のホモ三量体であり、収束進化したＣ型レクチン（「ＣＴＬ」）ドメイン内に位置することが見出されている。１．５オングストロームの解像度での５つのＭＴＤ変異体の構造の比較は、可変残基の主鎖の形状が、構造的に不変であり、ＣＴＬおよび三量体のアセンブリにおける挿入は共に、可変残基の組み合わせの提示のための静的足場（ｓｔａｔｉｃ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）の形成に関与し、それによって、タンパク質の誤った折り畳みの発生が最小限に抑えられることを示す（ＭｃＭａｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。したがって、変異トロピズム決定因子繊維の構造が、相互作用を起こさない、溶媒曝露の１２個のアミノ酸残基であることを除いては同一であるため、３つの適切に折り畳まれた混合モノマーを含む単一の尾部繊維を作り出すことができる。
【０１０６】
その受容体、ボルデテラ毒性因子パータクチンと結合した主要なＭＴＤ−Ｐ１変異体の構造はまた、結晶解析により解明され、特徴付けられている。ＭＴＤのモノマーの１つがパータクチンの１つの構造的ドメインに結合し、同じＭＴＤの第２の同一のモノマーが同じ（単量体）パータクチン分子の異なる非対称の構造ドメインと結合し、第３のＭＴＤモノマーは、結合しない状態で残される。
【０１０７】
上述の変異体ＭＴＤ構造およびＭＴＤとその標的であるパータクチンとの結合相互作用は、多価の尾部繊維の設計および選択に適用させることができる。例えば、ＭＴＤモノマーが、２つの異なる構造ドメインに対して親和性を示すことができるが、さらに、多量体の形態では、機能的なファージとの結合および感染に影響を及ぼすのに十分な結合力（ａｖｉｄｉｔｙ）を有することは明らかである。さらに、ファージとの結合および感染のために適切な結合力を提供するために、繊維の全てのモノマーが受容体に結合する必要があるわけではない。これらのデータおよび結論を、少なくともＴ４バクテリオファージ、さらには、ミオウイルスファミリーのメンバーに関しては、尾鞘部の収縮およびコアの細菌細胞膜の貫通を誘発するために、わずか３つの（ホモ三量体）尾部繊維が受容体と結合する必要があるという知見と合わせて、多価のｈｍｗバクテリオシンを作り出すいくつかの手段を示す。
【０１０８】
そのような遺伝子操作された多価のｈｍｗバクテリオシンは、宿主の範囲がより広く、同じ細菌生物上でさえも１つを超える毒性因子または適応性因子と結合することができ、それによって、標的細菌が、全ての標的とする関連受容体の発現の変異的な欠損によって耐性を確立することがより困難となる。Ｒ型バクテリオシンは、遺伝子操作され、３つの同一の尾部繊維からなる２つの独立したセットを有することができる。あるセットの繊維は、同じ３つの同一ではないモノマーからなり、別のセットの繊維は、３つの異なる同一ではないモノマーからなる。それぞれのモノマーは、ちょうどトロピズム決定因子がそうであるように、２つの異なるエピトープ（例えば、２つの異なる受容体）に対する結合親和性を有することができる。それによって、１２個の異なる標的受容体分子（２つの「エピトープ」／モノマー×３つのモノマー／尾部繊維×２セットの異なる尾部繊維／Ｒ型バクテリオシン＝１２個の標的受容体）のうちのいずれか１つ以上を発現する任意の細菌は、遺伝子操作された多価のｈｍｗバクテリオシンと結合し、膜の貫通を誘発する。そのような遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンは、異常に広い宿主の範囲を有し、さらに、１つを超える標的受容体を発現する細菌が遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンに対して耐性を有するようになる可能性は極めて低い。
【０１０９】
他の態様では、本開示のｈｍｗバクテリオシンの使用方法が提供される。いくつかの実施形態では、細菌の細胞膜の完全性に損傷を与える方法が開示される。本方法は、本明細書に開示されるように、標的細菌を、融合ペプチドまたはｈｍｗバクテリオシンまたはその一部分と接触させることを含んでもよい。あるいは、この接触は、本明細書に開示される組成物を含むｈｍｗバクテリオシンとの接触であり得る。
【０１１０】
実施形態のあるグループでは、この接触は、対象内でのインビボで行われる。したがって、対象内の細菌の膜の完全性に損傷を与える方法が開示される。本方法は、本明細書に記載されるように、融合ペプチドまたはｈｍｗバクテリオシンまたはその一部分を対象に投与することを含んでもよい。実施形態の別のグループでは、この接触は、エクスビボまたはインビトロで行われる。
【０１１１】
本方法は、独立した治療法として、または細胞集団の治療等、付属的な治療法として用いることができる。これらの方法と組み合わせて、細菌に基づく状態を治療するために有用であろう数多くの抗菌剤（抗生物質および化学治療薬を含む）が公知である。
【０１１２】
なおさらなる実施形態では、毒性のある先祖細菌から無毒性または非適合性の子孫を形成する方法が提供される。本方法は、毒性のある細菌を、本明細書に開示される当該毒性のある先祖細菌の毒性因子または適応性因子と結合するｈｍｗバクテリオシンと接触させることを含んでもよい。次いで、本方法は、毒性因子または適応性因子をもはや発現しない無毒性の細菌の子孫の選択を可能にすることにより継続し得る。
【０１１３】
代替の実施形態では、無毒性の細菌の集団を維持する方法が提供される。本方法は、集団を毒性細菌の毒性因子または適応性因子と結合するｈｍｗバクテリオシンと接触させることを含んでもよい。次いで、本方法は、毒性細菌の増殖を継続し、予防する。理論によって束縛されることなく、本開示の理解を向上させるために提供するものであるが、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンに対する細菌の耐性の出現は、病原性細菌の毒性または適応性の欠損に付随するものとなる。
【０１１４】
本開示の方法はまた、細菌の増殖が望ましくないまたは有害であると考えられる環境に適用することもできる。限定されない例としては、医療機関および手術室設備を含む環境、ならびに、生の肉類または魚類を取り扱うまたは廃棄する場所を含む食品または食品調製の表面または区域の殺菌が挙げられる。また、本方法は、熱に弱い物体、医療装置、および移植臓器を含む移植組織片の殺菌に用いることもできる。
【０１１５】
特に、食品または食品生産物は、大腸菌のある菌株等の病原性または望ましくない細菌によって影響を受ける。しかしながら、場合によっては、細菌のある種または群のみが病原性があるため、特定のバクテリオシンを、これらの群または種を標的とするように設計することができる。例えば、Ｏ１５７：Ｈ７等の大腸菌株を死滅または軽減させるが、影響を受けない他の天然の有害ではない大腸菌を残すように選択してもよい。したがって、細菌の選択的または全体の衛生化または殺菌が、１つ以上のバクテリオシンの使用によって可能である。
【０１１６】
別の実施形態では、診断のスクリーニングまたは選択方法が提供される。疑わしいまたは公知の細菌の試料は、１つ以上の遺伝子操作されたバクテリオシンに対してスクリーニングされて、細菌に対して潜在的な治療効果を同定することができる。
【０１１７】
さらに、遺伝子操作されたバクテリオシンを用いて、病原性細菌の存在を選択的または一般に検出することができる。場合によっては、バクテリオシンは、標的細菌の存在下のような検出可能なマーカーで標識化され、この標識は検出されるか、または同定され得る。
【０１１８】
標的細菌
本開示の遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンは、改変されて、限定されない例として、院内細菌または化膿菌等の病原性細菌を含む、種々の細菌種および菌株上の受容体を標的とすることができる。本明細書に記載される選択された細菌の毒性因子を標的とするのに加えて、元々バクテリオファージに対する感受性の高い細菌は、本開示の遺伝子操作されたピオシン等のｈｍｗバクテリオシンによって阻害され得る細菌の限定されないグループの例の１つである。これらの細菌には、天然のピオシンに対して感受性のある、ならびに感受性のないグラム陰性細菌が含まれる。さらなる限定されない例としては、グループとしてのグラム陰性細菌、グラム陽性細菌が挙げられる。他のグラム陽性細菌を標的とするグラム陽性細菌内のｈｍｗバクテリオシン様の要素に関する報告がある（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＆  Ｐａｔｔｅｅ，１９８１、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  ＆  Ｐａｔｔｅｅ，１９８１、Ｚｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。いくつかの実施形態では、標的細菌が、同定または診断される。そのような細菌の限定されない例としては、エシェリキア属、スタフィロコッカス属、クロストリジウム属、アシネトバクター属、シュードモナス属、またはストレプトコッカス属の細菌が挙げられる。
【０１１９】
毒性因子を標的とする限定されない例として、本開示は、ファージ尾部繊維タンパク質のＲＢＤの使用を含み、例えば、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７に感染するが、Ｏ１５７抗原を欠損したそれに由来する変異体株ＴＥＡ０２６に感染しないポドウイルス科のファージｐｈｉＶ１０に由来する尾部スパイクタンパク質のＲＢＤ等である（Ｈｏ  ａｎｄ  Ｗａｌｄｏｒ，２００７）。このファージの結合は、病原性の大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７生物による腸の植民地化に関与する毒性因子Ｏ１５７抗原の存在が必要である（Ｈｏ  ａｎｄ  Ｗａｌｄｏｒ，２００７）。したがって、本開示のｈｍｗバクテリオシンは、改変されたｈｍｗバクテリオシンが大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の毒性因子Ｏ１５７抗原を標的とするように、上記のファージｐｈｉＶ１０の尾部スパイクタンパク質（配列番号６０）からの球状のＲＢＤを含む改変された尾部繊維タンパク質を含んでもよい。球状の尾部スパイクタンパク質が、そのようなものなしで明らかに折り畳む場合には、同族シャペロンを有さず、ひいては、シャペロンは、Ｒ２のＰｒｆ１５のＢＰＡＲを有するその融合のアセンブリには必要とされない。
【０１２０】
「感染」とは、対象内、または組織内、または非細菌の細胞内での細菌の増殖を指し、この細菌は、実際にもしくは潜在的に、対象内、または組織内、または非細菌の細胞内において疾患または症状を引き起こし得るものである。感染の治療は、物体または物質の予防的な処置を含むことができる。限定されない例には、提供された臓器、組織、および細胞；レスピレーターもしくは透析装置のような医療機器；または、手術中もしくは手術後の傷等の創傷が挙げられる。他の使用としては、さらなる増殖時に問題となり得る標的細菌の除去が挙げられる。さらなる実施形態では、ｈｍｗバクテリオシンを用いて、細菌感染または汚染を有する食品、植物、または植物の収穫した部分を処理するか、または病院または商業的環境等の標的細菌の環境発生を処理する。
【０１２１】
本開示は、細菌を標的とするために、本明細書に開示されるｈｍｗバクテリオシンの投与またはそれとの接触による、以下のような組織および対象のそのような感染の治療法を提供する。感染としては、角膜の一般的な感染（「角膜炎」および角膜潰瘍）が挙げられ、少なくともその３分の２は、緑膿菌によって引き起こされる。これらの病原体の約３０％が、複数の抗生物質に耐性を有すると報告されている（Ｍａｈ−Ｓａｄｏｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。角膜の細菌感染は、比較的稀であると考えられるが、感染をした目の視力の低下、または失明さえも可能性があるため、医師による緊急の手当てを要する重篤な状態である。治療可能であり、抗生物質耐性の緑膿菌によって引き起こされるその他の一般的な感染としては、例えば、「外耳炎」等の耳への感染（Ｒｏｌａｎｄ  ＆  Ｓｔｒｏｍａｎ，２００２）、重度の火傷および創傷に続発する感染（Ｈｏｌｄｅｒ，１９９３）、ならびに嚢胞性線維症が挙げられる。嚢胞性線維症は、緑膿菌およびその近縁種であるバークホルデリアセバシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）によって引き起こされる慢性で抗生物質耐性の感染によって着実に悪化するもので（Ｇｏｖａｎ  ＆  Ｄｅｒｅｔｉｃ，１９９６）、嚢胞性線維症でのこれらの病原体は、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンを用いることで処理することができる。ピオシン等のバクテリオシンは、凍結乾燥に対する耐性があるため（Ｈｉｇｅｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９６９）、本開示は、上部および／または下部気道への送達が成功する確率を高めるために、凍結乾燥した投与用バクテリオシン製剤を含む。
【０１２２】
本明細書に記載される、対象の治療は、通常、「治療を必要とする対象」の治療である。治療の必要性の判定または診断は、臨床医等の当業者が、当該技術分野で認知される手段を用いて行うことができる。いくつかの実施形態では、対象とは、生命を脅かす可能性のある細菌感染、またはその生物の健康状態の悪化、もしくは寿命の短縮をもたらす細菌感染を有する動物または植物である。
【０１２３】
さらなる実施形態では、バイオフィルム内の細菌を死滅させる、またはその増殖を阻害する方法が提供される。そのような方法は、バイオフィルムを、そのバイオフィルム内の細菌を標的とする本明細書に開示されるｈｍｗバクテリオシンと接触させることを含んでもよい。
【０１２４】
本明細書に記載されるように、抗菌ｈｍｗバクテリオシンを用いて、特定の細菌の増殖、生存、または複製を阻害する。この細菌は、病原性の菌株、もしくは環境に有害な菌株であってよく、または、予防的な方法で処理してもよい。病原性微生物は、一般に疾患を引き起こすが、特定の状況下でのみそうである場合もある。
【０１２５】
細菌はまた、院内（病院由来の）感染、環境の細菌、および化膿性の（膿を形成する）細菌であってもよい。本開示の方法および組成物を用いて、典型的な病院環境に棲息する細菌を含む院内細菌、またはヒトの皮膚もしくは鼻上あるいはヒトの胃腸管内に存在する細菌、または傷に感染して膿を形成する細菌の増殖を阻害することができる。院内感染は、入院中に発症する感染、または病院内で行われる処置に関連する感染である。これらの処置に関連する感染は、患者が病院から退院した後に発症する場合が多い。最も一般的な院内細菌感染は、尿路感染、手術部位の感染、肺炎、クロストリジウムディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連の下痢、および偽膜大腸炎、ならびに細菌が血液から増殖する場合のある重度の全身感染である。
【０１２６】
本開示の方法および組成物を用いて、グラム陰性またはグラム陽性細菌の増殖を阻害することができる。グラム陽性細菌の限定されない例としては、スタフィロコッカス（化膿性）、エンテロコッカス（日和見性）、ストレプトコッカス、エンテロコッカス、バシラス、ミクロコッカス、マイコバクテリウム、コリネバクテリウム、およびクロストリジウムが挙げられる。グラム陰性細菌の限定されない例としては、シュードモナス（化膿性）、大腸菌（日和見性）、サルモネラ（日和見性）、カンピロバクター（日和見性）、プロテウス（化膿性）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）（日和見性）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）（化膿性）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）（化膿性）、グラム陰性非発酵桿菌（アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）等）、およびシゲラが挙げられる。化膿性球菌は、球状の細菌であり、動物の様々な化膿性（膿を生成する）感染を引き起こす。これには、グラム陽性球菌であるスタフィロコッカスアウレウス、ストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、およびストレプトコッカスニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ならびにグラム陰性球菌であるナイセリアゴノレー（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、およびナイセリアメニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）が含まれる。
【０１２７】
さらなる実施形態では、本開示の開示された方法および組成物を用いて、特に抗生物質耐性の細菌の増殖を阻害する。限定されない例としては、多剤耐性（ＭＤＲ）となった数多くの細菌性病原体が挙げられる。
【０１２８】
ピオシンの遺伝子操作
ピオシンは、Ｆｒａｎｃｏｉｓ  Ｊａｃｏｂによって発見され、初めて高分子量バクテリオシンであると記載された（Ｊａｃｏｂ，１９５４）。その他の複数のグラム陰性細菌（Ｃｏｅｔｚｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９６８）内で、ならびに共にグラム陽性生物であるリステリアモノサイトゲネス（Ｚｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）およびスタフィロコッカスアウレウス（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐａｔｔｅｅ，１９８１）内で、同様のバクテリオシン様の存在が記載されている。ピオシンは、形態的には収縮した（ミオウイルス）バクテリオファージの尾部に類似しているが、単なる欠損ファージではなく、重要な違いが存在する。例えば、ピオシンとファージの尾部との間には、物理的および化学的な安定性の違いが存在する（Ｋａｇｅｙａｍａ  ＆  Ｅｇａｍｉ，１９６２、Ｎａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。ピオシンの宿主範囲は比較的狭く、通常は同じ種の菌株に限定されるが、例外も存在する（Ｍｏｒｓｅ  ｅｔ  ａｌ，１９７６、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２）。一方、ミオウイルスバクテリオファージは、広い宿主範囲を示すことができ、その宿主範囲は、Ｒ型ピオシンのそれと同様に、その尾部繊維の先端の結合特異性によって決定される（Ｔｅｔａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【０１２９】
数多くのファージ尾部繊維に関しては、ファージの宿主範囲、もしくは「トロピズム」が異なる突然変異体または変異体において、遺伝子の遠位部（３’末端）の３分の１が異なっている（Ａｃｋｅｒｍａｎｎ，２００３）。限定されない例として、主要トロピズム決定因子（ＭＴＤ）であるボルデテラバクテリオファージＢＰＰ−１の受容体結合タンパク質は、配列が大きく異なる（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｄｏｕｌａｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。トロピズム決定因子の変化は、ファージにコードされたレトロエレメント（多様性を生じさせるレトロエレメント、またはＤＧＲ）に依存しており、このレトロエレメントは、種々のファージおよび細菌のゲノムでの配列変異の発生に関係付けられているＤＧＲのファミリーに属する。ボルデテラＤＧＲは、１０13を超えるＭＴＤの異なる配列変異を産生することができ、１０14〜１０16の可能な抗体の配列に匹敵する。トロピズム決定因子の変異体は、ＤＧＲがコードする逆転写酵素（ｂＲＴ）および安定な鋳型領域（ＴＲ）が関与する、特有のアデニン特異的突然変異生成プロセスによって産生される。ＭＴＤの変異性は、そのＣ末端可変領域（ＶＲ）全体に分散している１２個のアデニンでコードされたアミノ酸に集中している（Ｄｏｕｌａｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。数多くのボルデテラＭＴＤ変異体の３次元結晶構造が解明され、以下に示すように、構造の先端部が結合特異性を決定し、それによってファージの主要トロピズム（宿主範囲）を決定していることが確認されている（ＭｃＭａｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。したがって、以下でさらに記載されるように、トロピズム決定因子およびその関連するＤＧＲシステムを本開示の実践において使用してもよい。
【０１３０】
多くのシュードモナス種は、Ｒ型ピオシンのための遺伝子を有する（Ｔａｋｅｙａ  ｅｔ  ａｌ．，１９６９、Ｋａｇｅｙａｍａ，１９７５）。Ｒ型ピオシンの遺伝子座は、約１０個の構造遺伝子、ならびに調節遺伝子およびシャペロン遺伝子を含む約１６の相補群からなる（Ｓｈｉｎｏｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．１９８３ａ、Ｓｈｉｎｏｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３ｂ）。形態的にも遺伝子的にも、Ｒ型ピオシンは、ミオウイルスバクテリオファージの尾部に類似しているが、頭部構造を持たず、したがって、核酸を含有しない（Ｋａｇｅｙａｍａ，１９６４、Ｉｓｈｉｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９６５、Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２）。それらは、Ｐ２関連の祖先種のファージ尾部構造から進化したものと考えられるが、単なる欠損ファージではなく、防御的な殺菌剤としての役割のためにさらに適応したものである（Ｎａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ，２０００）。しかしながら、バクテリオファージと同様に、ピオシンは、標的細菌上の特定の分子「受容体」と結合し、「コア」または針状の構造によってその膜を貫通する（Ｕｒａｔａｎｉ  ＆  Ｈｏｓｈｉｎｏ，１９８４）。その膜のコア貫通の直接の結果として、細菌がその細胞膜の完全性の損傷と膜電位の喪失によって死滅し、それは単一のピオシンの攻撃によって発生可能な殺菌現象である（Ｉｉｊｉｍａ，１９７８、Ｕｒａｔａｎｉ  ＆  Ｈｏｓｈｉｎｏ，１９８４、Ｓｔｒａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【０１３１】
典型的なＲ型ピオシンのＲＢＤ、またはＲピオシン結合の受容体結合決定因子は、細菌表面分子と結合する。Ｒ２ピオシン単離物の場合、ＲＢＤは、その尾部繊維のカルボキシ末端部分に存在する。尾部繊維は、ｐｒｆ１５遺伝子産物のホモ三量体である（Ｎａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。ｐｒｆ１５遺伝子内のＲＢＤの改変、および改変されたｐｒｆ１５遺伝子のＲ型ピオシンを産生するシステムへの組換えにより、改変された結合特異性を有する遺伝子操作されたピオシンの産生を可能にする。
【０１３２】
ボルデテラバクテリオファージの主要トロピズム決定因子（ＭＴＤ）は、結合ドメインとしていくつかの特有の有用な特性を有している。ボルデテラバクテリオファージのＭＴＤの機能的な形態は、ボルデテラの毒性因子タンパク質であるパータクチンと結合するホモ三量体である。したがって、ＭＴＤ遺伝子は、ｐｒｆ１５遺伝子の遠位末端と融合して、そのＭＴＤの特性を利用することができる。したがって、本明細書に記載されるように、本開示の一態様は、緑膿菌のＲ型ピオシン尾部繊維タンパク質（ＰＲＦ１５）とボルデテラファージＢＰＰ−１の主要トロピズム決定因子（ＭＴＤ）との間の融合タンパク質の構築を含む。ＰＲＦ１５−ＭＴＤ融合物を用いて、緑膿菌ＶＡ０１Δｐｒｆ１５をトランスで相補し、パータクチンを発現するボルデテラブロンキセプティカ、またはパータクチンを発現する大腸菌と結合させてこれを死滅させることができる。
【０１３３】
さらに、遺伝子型が尾部繊維の結合表現型と結合されるように、Ｐ２またはＰ４バクテリオファージを、ｐｒｆ１５−ＭＴＤまたはその他の尾部繊維融合遺伝子を内部に有するサロゲートとして用いることができる。これにより、所望のＲＢＤをコードする尾部繊維遺伝子の効率的な形質導入、選択、および単離が可能になる。
【０１３４】
投与様式
本開示の遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンは、いかなる好適な手段によっても投与することができる。限定されない例としては、対象への、局所または局在化した投与、ならびに肺への投与（吸入）、カテーテルもしくは点滴チューブによる胃腸管への投与、または全身投与が挙げられる。全身投与の代表的で限定されない例としては、腹腔内投与および静脈内投与が挙げられる。腹腔内投与および静脈内投与されたピオシンの防御効果は、投与したピオシンに対してインビトロで感受性を示す緑膿菌株の致死量を全身感染させたマウスで実証された（Ｍｅｒｒｉｋｉｎ  ＆  Ｔｅｒｒｙ，１９７２、Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９７４）。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるｈｍｗバクテリオシンと標的細菌集団とを接触させると、そのバクテリオシンが存在しないものと比較して、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、もしくは少なくとも１０，０００倍、またはそれを超える倍率での個体数の減少が見られる。他の実施形態では、その接触により、そのバクテリオシンが存在しないものと比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍、またはそれを超える倍率での細菌の可検出性の減少という結果を得ることができる。
【０１３５】
本開示の遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンは、ｈｍｗバクテリオシンに感受性を有する細菌による感染もしくは汚染に罹患している、罹患していると診断された、または罹患している疑いのあるいかなる対象にも投与することができる。そのような対象の限定されない例としては、動物の種（哺乳類、爬虫類、両生類、鳥類、魚類）、ならびに昆虫、植物、および真菌が挙げられる。哺乳類種の代表的な限定されない例としては、ヒト；非ヒト霊長類；ウシ、ブタ、ヤギ、およびヒツジ等の農業関連の種；マウスおよびラット等のげっ歯類；イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、およびウマ等のペット、ディスプレイ、またはショーのための哺乳類；ならびにイヌおよびウマ等の作業用の哺乳類が挙げられる。鳥類の代表的な限定されない例としては、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ならびにオウムおよびインコ等のペットまたはショーのためのトリが挙げられる。本開示の遺伝子操作されたバクテリオシンで治療される動物の対象は、四足動物、二足動物、水生動物、脊椎動物、または昆虫を含む無脊椎動物であってもよい。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、治療される対象は、ヒトの子供、または成熟期に達していないその他の若い動物である。したがって、本開示は、本開示のｈｍｗバクテリオシンに感受性を有する細菌またはその他の微生物による感染を含む小児科状態の治療を含む。
【０１３７】
本開示はまた、ヒト対象または非ヒト動物の微生物叢中に存在する細菌の望ましくない増殖の結果生じるもの等の日和見感染の治療または予防も提供する。日和見感染は、対象の免疫抑制状態の結果、または泌尿生殖器（ＧＵ）もしくは胃腸（ＧＩ）管の共生細菌叢を変化させる抗生物質治療の結果である場合がある。したがって、本開示はまた、免疫抑制対象、および他の医薬品を投与された対象の治療または予防も提供する。抗細菌活性を有するｈｍｗバクテリオシンは、限定されない例として、抗生物質もしくは抗真菌剤等の別の抗細菌剤または抗微生物剤と組み合わせて用いることができる。「抗微生物剤」とは、単細胞生物の増殖を阻害する、もしくはこれを死滅させるために用いることができる薬剤または化合物である。抗微生物剤としては、抗生物質、化学療法剤、抗体（補体あり、もしくはなしで）、およびＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、脂質、もしくは細胞膜の合成または機能の化学阻害剤が挙げられる。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、ｈｍｗバクテリオシンまたは融合タンパク質は、「薬学的に許容される」賦形剤または担体と共に配合される。そのような成分は、過度な有害な副作用なしにヒト、動物、および／または植物に用いるのに適するものである。有害な副作用の限定されない例としては、毒性、刺激、および／またはアレルギー性反応が挙げられる。賦形剤または担体は、通常、妥当なベネフィット／リスク比に見合ったものである。多くの実施形態では、担体または賦形剤は、局所投与または全身投与に適している。限定されない薬学的に好適な担体としては、無菌の水性または非水性溶液、懸濁液、および乳剤が挙げられる。例としては、リン酸緩衝食塩水、水、油／水型乳剤等の乳剤、および様々な種類の湿潤剤等、標準的な薬学的賦形剤が挙げられるが、これらに限定されない。非水溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイル等の植物油、およびオレイン酸エチル等の注射用有機エステルである。水性担体としては、水、アルコール性／水性溶液、乳剤、または懸濁液が挙げられ、これには食塩水および緩衝媒体が含まれる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、液体および栄養補充液、電解質補充液（リンガーデキストロースを主体としたもの等）等が挙げられる。
【０１３９】
本明細書に開示されるさらなる製剤および薬学的組成物は、細菌宿主に特異的な単離されたｈｍｗバクテリオシン；同じ細菌宿主を標的とする２、３、５、１０、もしくは２０、またはそれを超す種類のバクテリオシンの混合物；および、異なる細菌宿主、または同じ細菌宿主の異なる菌株を標的とする２、３、５、１０、もしくは２０、またはそれを超す種類のバクテリオシンの混合物を含む。
【０１４０】
任意に、本開示のｈｍｗバクテリオシンを含む組成物はまた、当該技術分野で公知の手段を用いて凍結乾燥してもよい。当該技術分野で公知のように、その後、再構成および使用を実行することができる。
【０１４１】
また、マイクロカプセル化されたｈｍｗバクテリオシンを含む製剤も提供される。いくつかの実施形態では、これらにより、徐放動態特性を提供することができるか、または経口摂取により胃から小腸もしくは大腸への到達が可能となる。一般的に、薬学的組成物は、例えば、顆粒剤、錠剤、ピル剤、坐薬、カプセル剤（例えば経口送達に適合）、マイクロビーズ、マイクロスフェア、リポソーム、懸濁液、軟膏、ペースト、およびローション等の様々な形態で調製することができる。経口および局所での使用に適する薬学的グレードの有機もしくは無機担体および／または希釈剤を用いて、治療上有効な化合物を含む組成物を作ることができる。安定剤、湿潤剤および乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、または適切なｐＨ値を確保するための緩衝剤を含むことができる。
【０１４２】
ｈｍｗバクテリオシンは、通常、「安全で効果的な」量または濃度で使用され、上述のような過度で有害な副作用なしに、所望の治療応答をもたらすのに十分な量を指す。ｈｍｗバクテリオシンはまた、「治療上効果的な」量または濃度で使用することもでき、それは、所望の治療応答を得る効果のある量を指し、例えば、細菌細胞の分裂速度を遅延させる、または細菌細胞の分裂を停止させる、または細菌を死滅させるもしくは細菌の個体数の増加速度を低下させる効果のある量であるが、これらに限定されない。安全で効果的な量または治療上効果的な量は、様々な要因で変わるが、熟練した医師により、過度な実験をすることなく容易に決定することができる。要因の限定されない例としては、治療を行う特定の状態、対象の身体状態、治療を受ける対象の種類、治療の期間、併用する治療（もしあれば）の性質、および使用する具体的な製剤が挙げられる。
【０１４３】
さらに、そして、遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンに対する細菌の耐性が発生する可能性を予想して、バクテリオシンが標的細菌の毒性因子または適応性因子を標的とする場合、生物の毒性または適応性の損傷が伴う場合がある。細菌がｈｍｗバクテリオシンに対して耐性となる主たる、しかし限定されない機序は、バクテリオシンに対する受容体の欠損であるため、本明細書に開示されるように毒性因子または適応性因子を標的とすることは、従来の抗生物質およびバクテリオファージを超える多くの利点を提供する。従来の抗生物質およびバクテリオファージに対する耐性は、受容体または抗菌剤の標的分子の欠損以外の、多くの異なる機序が原因であり得る。限定されない例として、本開示のｈｍｗバクテリオシンは、バクテリオシンを細胞環境から除去する細菌の排出ポンプに影響されることがなく、細菌の核酸不活性化機序にも影響されないであろう。
【０１４４】
本発明に関する主題事項を一般的に説明したが、以下の実施例を参照することで、同じ内容がより容易に理解され、その例は、特に特定されない限り、説明のために提供するのであって、本開示を制限することを意図したものではない。
【実施例】
【０１４５】
以下の例は、説明のために提供されるが、特許請求された主題事項を制限するものではない。
【０１４６】
実施例１：融合タンパク質を含む改変されたｈｍｗバクテリオシン
ａ）相補システム
本明細書に記載される改変されたｈｍｗバクテリオシンの作製を促進するために、尾部繊維をトランスに相補するためのシステムの構築を確立した。代表的なモデルとしてＲ２ピオシンを用いて、緑膿菌ＰＡＯ１ゲノム中のＲ２のｐｒｆ１５コード配列の欠失を作り出して、改変されたｐｒｆ１５遺伝子産物等の相補尾部繊維タンパク質がトランスに発現されるプラットフォームを作製した。
【０１４７】
一般に、Ｈｏａｎｇらの方法により欠失させて、緑膿菌株ＰＡＯ１Δｐｒｆ１５を作製した。Ｒ２シャペロンに対する配列番号４のｐｒｆ１６コード領域は、Ｒ２のｐｒｆ１５遺伝子の末端を８ヌクレオチドによって重複し、リボソーム結合部位は、配列番号３のｐｒｆ１５コード領域内にある。必ずしもピオシン構造に組み込まれないＰＲＦ１６タンパク質は、三量体尾部繊維のアセンブリのため、ひいては最大の殺菌作用のために必要であると報告されている（図８およびＮａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。したがって、ｐｒｆ１６のための転写開始部位およびそのリボソーム結合部位の両方は、シャペロンが「尾部のない」欠損ピオシンをコードする改変されたピオシン構築物の誘発時に産生されるように、無変性のまま維持された。
【０１４８】
簡潔に述べると、ｐｒｆ１５のコドン１１〜３０１のインフレームでの欠失を、以下のように、ＰＡＯ１中で作製した。所望の欠失の上流にある１．１ｋｂのＫｐｎＩ−ＡｇｅＩ断片を、プライマーＡＶ０８５（５’−ＧＣＴＴＣＡＡＴＧＴＧＣＡＧＣＧＴＴＴＧＣ）（配列番号４６）およびＡＶ０８８（５’−ＧＣＣＡＣＡＣＣＧＧＴＡＧＣＧＧＡＡＡＧＧＣＣＡＣＣＧＴＡＴＴＴＣＧＧＡＧＴＡＴ）（配列番号４７）を用いて、ＰＡ０１ゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅し、２．２ｋｂのＡｇｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、プライマーＡＶ０８７（５’−ＡＴＡＣＴＣＣＧＡＡＡＴＡＣＧＧＴＧＧＣＣＴＴＴＣＣＧＣＴＡＣＣＧＧＴＧＴＧＧＣ）（配列番号４８）およびＡＶ０８６（５’−ＴＣＣＴＴＧＡＡＴＴＣＣＧＣＴＴＧＣＴＧＣＣＧＡＡＧＴＴＣＴＴ）（配列番号４９）を用いて増幅した。得られた制限断片を、ｐＥＸ１８Ｇｍ（Ｈｏａｎｇら）のＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローン化して、ｐＥＸＧｍ−Δｐｒｆ１５を作製した。完成した構築物を、エレクトロポレーション（Ｃｈｕａｎｃｈｕｅｎら）によって、株ＰＡＯ１に形質転換した。要素は、１００μｇ／ｍＬのゲンタマイシンで選択され、分離固体は、５μｇ／ｍＬの蔗糖を含み、ＮａＣｌおよびゲンタマイシンがない培地中で選択された。欠失の候補は、ＰＣＲ分析、ピオシン誘発、およびＰＣＲ増幅断片の配列決定によって確認した。
【０１４９】
株ΡΑＯ１Δ／ｐｒｆ１５は、その親株ＰＡＯ１と同様に増殖し、ピオシンをコードする遺伝子は、ＳＯＳ応答を通して誘発可能に維持されており、これが細胞の溶解をもたらす。ピオシン遺伝子産物のいくつかの産生はあったと思われるが、安定した「尾部のない」ピオシン粒子は、ΡΑＯ１Δｐｒｆ１５から産生されなかったと思われる。
【０１５０】
Ｒ２ピオシンのｐｒｆ１５は、まず、コード配列を広い宿主範囲のシュードモナス／大腸菌シャトルベクターｐＵＣＰ３０Ｔにクローン化することによってトランスに発現させた。図９を参照。いくつかの最初の構築物では、転写は、構造的にまたはプロモーターからのｌａｃＩ制御下で行われた。しかし、他の構築物では、転写は、発現がＳＯＳ応答を通して調節されるように、内因性ｐｒｆ１５プロモーターで調節されるように改変された。これにより、改変されたｐｒｆ１５遺伝子の発現を、ＰＡＯ１Δｐｒｆ１５ゲノム内に存在する他のピオシン遺伝子の発現と同調して誘発することを可能にした。
【０１５１】
簡単に述べると、広い宿主範囲のベクターｐＵＣＰ３０Ｔ（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｈ．Ｐら）は、特有のＢｓｐＨＩ部位を充填することで改変し、ｐＵＣＰ３０ＴΔＢｓｐを形成した。ｔａｃプロモーターを、ＭＴＤ発現ベクター（Ｊｅｆｆｅｒｙ  Ｆ．Ｍｉｌｌｅｒ，ＵＣＬＡより寄贈）から、プライマーＡＶ１１０（５’−ＴＴＴＡＴＴＡＧＣＧＧＡＡＧＡＧＣＣＧＡＣＴＧＣＡＣＧＧＴＧＣＡＣＣＡＡＴＧ）（配列番号５０）およびＡＶ１１４（５’−ＣＣＣＴＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＴＡＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧ）（配列番号５１）を用いてＰＣＲによって増幅し、ｐＵＣＰ３０ＴΔＢｓｐにクローン化して、ｐＵＣＰ−ｔａｃを作製した。
【０１５２】
Ｒ２のＰＲＦ１５コード領域を、プライマーＡＶ１１８（５’−ＣＴＴＣＣＴＴＴＣＡＴＧＡＣＧＡＣＣＡＡＴＡＣＴＣＣＧＡＡ）（配列番号５２）およびＡＶ１１６（５’−ＡＣＣＡＣＧＡＡＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧＴＣＣＡＡＡＴＧＣＣＴＣ）（配列番号５３）を用いて増幅し、一方、Ｒ２のｐｒｆ１５およびｐｒｆ１６を、プライマーＡＶ１１８およびＡＶ０８６（５’−ＴＣＣＴＴＧＡＡＴＴＣＣＧＣＴＴＧＣＴＧＣＣＧＡＡＧＴＴＣＴＴ）（配列番号４９）を用いてサブクローンから増幅した。ｐｒｆ１５およびｐｒｆ１５／１６の増幅した断片を、ＢｓｐＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化されたｐＵＣＰｔａｃにクローン化して、ｐＵＣＰ−ｔａｃ−ｐｒｆ１５およびＰＵＣＰ−ｔａｃ−ｐｒｆ１５／１６を得た。
【０１５３】
内因性ｐｒｆ１５プロモーターを用いた発現については、ｐｒｆ１５およびｐｒｆ１６を、ｐｒｆ１５の上流の１０８８ｂｐ配列と共に、プライマーＡＶ１０７（５’−ＣＡＣＣＡＴＣＴＡＧＡＣＡＡＴＡＣＧＡＧＡＧＣＧＡＣＡＡＧＴＣ）（配列番号５４）およびＡＶ０９１（５’−ＴＣＣＴＣＡＡＧＣＴＴＡＣＧＴＴＧＧＴＴＡＣＣＧＴＡＡＣＧＣＣＧＴＧ）（配列番号５５）を用いてサブクローンから増幅し、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐＵＣＰ３０Ｔにクローン化して、ｐＵＣＰ−Ｒ２ｐ−ｐｒｆ１５／１６を作製した。
【０１５４】
浮遊増殖する対数期にあり（ｉｎ  ｌｏｇ  ｐｈａｓｅ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｇｒｏｗｔｈ）発現プラスミドを含む細菌を、３μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣで処理して、ピオシンの産生を誘発した。安定なピオシンが、誘発時、野生型ＰＡＯ１のものと同様の収量で産生された。ピオシンは、ＰＡＯ１から産生されたＲ２ピオシンと同じ殺菌範囲および活性レベルを有していた。したがって、安定なピオシン複合体の産生には、他のピオシンをコードする遺伝子の発現に加えて、尾部繊維タンパク質の発現が必要であり、トランスでの尾部繊維遺伝子の発現で十分であった。
【０１５５】
ｐｒｆ１５がｔａｃプロモーターから構造的に発現されたとき、細胞増殖は、ｌａｃＩまたは内因性プロモーターにより調節されたときよりも著しく低下した。細胞内でのＰＲＦ１５のみの産生は有害であると思われるが、両方のプロモーターから生成されたピオシンの収量は同等である。
【０１５６】
プラスミド構築物を作製して、そこからＲ２のｐｒｆ１６がＲ２のｐｒｆ１５と共に共発現させて、トランスに発現されたＰＲＦ１５の折り畳みのためのｐｒｆ１６の適切な一時的発現を確保した。
【０１５７】
ｂ）組換えｈｍｗバクテリオシン  本明細書に記載されるように、その範囲に基づいて、Ｒ１〜５と称される５つの異なるＲ型ピオシンが確認されている。尾部繊維タンパク質をコードする遺伝子配列は、Ｒ１（配列番号１）およびＲ２（配列番号３）に対するもののみ知られているため、それぞれ配列番号６、８、および１０の産生株中に存在するそれらの同族シャペロンをコードする配列と共に、ＰＣＲを用いて、Ｒ３（配列番号５）、Ｒ４（配列番号７）、およびＲ５（配列番号９）のピオシンの尾部繊維遺伝子を単離し、配列決定した。また、ピオシンＲ１およびＲ２のシャペロン遺伝子もクローン化し、それぞれ配列番号２および４を配列決定した。尾部繊維が範囲を決定するという仮説を確認するために、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のピオシンの尾部繊維タンパク質をコードする配列を得て、それらがＲ２ピオシン構造に組み込まれるように、ΡΑＯ１Δｐｒｆ１５中でトランスに発現させた。次いで、得られた組換え株のそれぞれは、ピオシンを産生するように誘発し、図２および８に示されるように、それぞれの範囲を、スポットアッセイによって測定した。
【０１５８】
ｃ）ピオシン：Ｒ２−Ｐ２における機能性尾部繊維としての融合タンパク質
Ｒ２尾部繊維ｐｒｆ１５遺伝子とバクテリオファージＰ２の遺伝子Ｈ配列との融合物を作製し、発現させ、これを用いて、本開示のさらなる改変されたｈｍｗバクテリオシンを産生させた。多くの大腸菌株に感染するバクテリオファージＰ２は、Ｒ２のｐｒｆ１５（配列番号３）、特に、Ｎ末端コード部分との高い配列類似性を有する尾部繊維をコードする遺伝子Ｈ（配列番号２５）を有する。標的特異性を与える推定領域（ＲＢＤ）であるＰ２の尾部繊維タンパク質のＣ末端の５５１のアミノ酸残基をコードする遺伝子Ｈの一部分を、Ｒ２のＰＲＦ１５のＮ末端基板結合（ＢＰＡＲ）部分である１６４のアミノ酸をコードするｐｒｆ１５の一部分と融合させて、改変された尾部繊維タンパク質（配列番号２７）をコードした。
【０１５９】
バクテリオファージＰ２はまた、遺伝子Ｇ（配列番号２６）によってコードされた推定尾部繊維シャペロンもコードし、これは、Ｒ２ピオシンのｐｒｆ１６（配列番号４）によってコードされたシャペロン、および多くの他のミオウイルスファージのシャペロンによってコードされたシャペロンと類似している。遺伝子Ｇにコードされるシャペロンが、融合におけるＰ２尾部繊維タンパク質のＣ末端部分の折り畳みにとって重要である可能性が高いため、構築物を作製して、Ｐ２遺伝子Ｇを共発現させた。
【０１６０】
１から１６４位のアミノ酸をコードするＲ２のｐｒｆ１５の一部分を、プライマーＡＶ１１８およびＡＶ１２７（５’−ＴＴＣＴＴＴＡＡＧＣＴＴＴＴＣＣＴＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＴＧ）（配列番号５６）を用いてサブクローンから増幅し、ＢｓｐＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを消化させた。１５８から６６９位のアミノ酸をコードするＰ２遺伝子Ｈの一部分を、プライマーＡＶ１２４（５’−ＣＣＴＣＣＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＧＣＧＧＣＡＴＴＴＣＣＧ）（配列番号５７）およびＡＶ１２６（５’−ＴＣＣＴＴＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＣＣＴＧＣＧＣＡＡＣＧＴ）（配列番号５８）を用いてＰ２ファージストック（Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｃａｌｅｎｄａｒ）から増幅した。Ｐ２遺伝子Ｈ１５８から６６９位に遺伝子Ｇを加えたものを、プライマーＡＶ１２４およびＡＶ１２５（５’−ＣＣＴＣＣＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＧＣＧＧＣＡＴＴＴＣＣＧ）（配列番号５９）を用いて増幅した。Ｐ２からのＰＣＲ産物のそれぞれは、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化させた。ｐＵＣＰ−ｔａｃ−Ｒ２−Ｐ２Ｈは、１から１６４位のアミノ酸断片をコードするｐｒｆ１５断片を、１５８から６６９位のアミノ酸断片をコードするＰ２遺伝子Ｈ断片と共に、ＢｓｐＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化されたｐＵＣＰ−ｔａｃにクローン化することによって作製された。ｐＵＣＰ−ｔａｃ−Ｒ２−Ｐ２ＨＧは、１から１６４位のアミノ酸断片をコードするｐｒｆ１５断片を、１５８から６６９位のアミノ酸断片をコードするＰ２遺伝子Ｈ断片に遺伝子Ｇを加えたものと共に、ＢｓｐＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化されたｐＵＣＰ−ｔａｃにクローン化することによって作製された。
【０１６１】
簡単に述べると、ＰＡ０１Δｐｒｆ１５は、ｐｒｆ１５−Ｐ２遺伝子Ｈの融合構築物で形質転換され、ピオシン産物は、マイトマイシンＣによって誘発された。ピオシン粒子を精製し、スポット試験および細菌生存アッセイによって活性について試験した（図２を参照）。Ｒ２−Ｐ２融合尾部繊維を含む精製されたピオシン粒子は、大腸菌Ｃ１ａに対する殺菌作用を有したが、緑膿菌株１３ｓを死滅させることはできなかった。さらに、Ｐ２遺伝子Ｇの発現が、活性ピオシンを産生するために必要であった。このことは、図８に示されるように、シャペロンが、尾部繊維のＣ末端部分の適切な折り畳みには必要であるという仮説を支持する。
【０１６２】
大腸菌Ｃ１ａを死滅させる機能性ピオシンを形成するための一連の異なるＲ２−Ｐ２尾部繊維タンパク質融合の能力を、一連の異なるＲ２−Ｐ２融合によって調べた。これらの融合の代表的な例を、大腸菌Ｃ１ａに対する得られた殺菌作用を示すと共に、図４〜７に示す。
【０１６３】
ｄ）ピオシン：Ｒ２−Ｌ−４１３ｃにおける機能性尾部繊維としてのさらなる融合タンパク質
さらなる改変されたｈｍｗバクテリオシンが、エルシニアペスティスを標的とするように産生された。Ｌ−４１３ｃは、ほとんどのエルシニアペスティス株に感染するエルシニオファージである（Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｃａｌｅｎｄａｒ，ｐｅｒｓｏｎａｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）。ほとんどのＬ−４１３ｃゲノムは、Ｐ２と極めて類似性が高いが、重要な例外として配列番号２８の尾部繊維遺伝子Ｈがあり、これはＰ２のものとは大きく異なっている。理論に束縛されることなく、本開示の理解を向上させるために提供するものであるが、尾部繊維遺伝子Ｈの違い、ひいては、コードされたタンパク質の違いが、その異なる宿主範囲に最も起こり得る主な原因となる特徴である。
【０１６４】
しかしながら、Ｌ−４１３ｃ遺伝子Η（配列番号２８）のＮ末端は、Ｐ２の対応物（配列番号２５）との配列相同性をかなり共有しており、これは、その基板結合の機能によるものと思われる。図１０（配列番号３０）に示されるように、融合尾部繊維を、Ｌ‐４１３ｃ尾部繊維のＣ末端部（１５８位から９１３位）と融合したＲ２のＰＲＦ１５からのＮ末端の１から１６４位のアミノ酸を用いて作製して、改変された尾部繊維を作製するために、融合体を構築した。この融合を、上述のように、Ｌ‐４１３ｃ尾部繊維同族シャペロン、遺伝子Ｇ（配列番号２９）、と共にΡΑＯ１Δｐｒｆ１５中で発現させた。誘発後、産生されたピオシン粒子は、エルシニアペスティスＫＩＭ、ならびに大腸菌Ｃを死滅させ、ひいては、エルシニオファージＬ−４１３ｃの宿主範囲と同様の死滅範囲を有した。この改変されたピオシンは、いずれのシュードモナス株も死滅させなかった。
【０１６５】
ｅ）ピオシン：Ｒ２−ＶＨＭＬにおける尾部繊維としてのさらなる融合タンパク質
緑膿菌Ｒ２ピオシンの尾部繊維ＢＰＡＲ（ｐｒｆ１５によってコードされた）とビブリオハーベイミオウイルス様（ＶＨＭＬ）バクテリオファージの２つの尾部繊維遺伝子（配列番号２１および２２）のうちの１つとの間で作製された新規の融合尾部繊維を用いて、さらなる改変されたｈｍｗピオシン粒子が作製された。尾部繊維（Ｏａｋｅｙ  ａｎｄ  Ｏｗｅｎｓ，２０００、Ｏａｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｄｏｕｌａｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．２００４）の分散可能な部分をＲ２ピオシンの尾部繊維に融合した。ｏｒｆ３５遺伝子［配列番号２２］およびその推定される同族シャペロンのものであるｏｒｆ３８［配列番号２３］を、ＢｒｉｓｂａｎｅのＡｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｅｎｔｅｒに提供されたＤｒ．ＯａｋｅｙのＶＨＭＬファージから得られた新しいＤＮＡ配列データに基づいて合成した。一連の融合体は、Ｒ２のｐｒｆ１５とｏｒｆ３５遺伝子の間で生成され、この融合体は、ＰＡ０１Δｐｒｆ１５中のｏｒｆ３８と共に共発現させた。例えば、ＢＰＡＲ  Ｒ２の１〜１６４とＶＨＭＬ  Ｏｒｆ３５の２６〜４１０との融合は、精製され得る堅牢なＲ型ピオシン粒子を形成し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分析されたとき、期待された大きさの融合尾部繊維を含むＲ型ピオシンタンパク質を示した。
【０１６６】
我々の研究所において得られたデータは、１つだけ例外として、キメラＲ型ピオシン尾部繊維構造のみが、精製され得るＲ型ピオシン粒子を形成し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにおいて適切なタンパク質を示し、期待された標的細菌上で殺菌作用を示すものであったことを示している。その１つの例外が、この１つのキメラＲ２のｐｒｆ１５−ＶＨＭＬ  ｏｒｆ３５融合である。このキメラＲ型ピオシンの作製は、試験したビブリオ種のいずれに対しても殺菌性がなかったが、溶原性ＶＨＭＬバクテリオファージがＤＮＡシークエンシングのために単離されたビブリオハーベイ株は、クラスタシィアンおよびカキへの病原性のため、米国に輸出することができない。「オーファン（ｏｒｐｈａｎ）」キメラＲ２のｐｒｆ１５−ＶＨＭＬ  ｏｒｆ３５ピオシンを生成し、得られた、ＶＨＭＬ由来のＲＢＤを有する改変されたｈｍｗバクテリオシンは、天然のＶＨＭＬのＤＧＲによる多様化に供することができるという結論を出す。
【０１６７】
ｆ）ピオシン：Ｒ２−Ｖ１０における機能性尾部繊維としてのさらなる融合タンパク質
バクテリオファージｐｈｉＶ１０は、ポドウイルス科に属し、最も一般的な大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７株に感染することができる（Ｗａｄｄｅｌｌ  ａｎｄ  Ｐｏｐｐｅ，２０００、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＣ＿００７８０４）。ファージｐｈｉＶ１０は、ファージＰ２またはＲ型ピオシンの尾部繊維状のものをコードしないが、その代わり、バクテリオファージＰ２２およびエプシロン１５のものと同様の尾部スパイク状のタンパク質をコードする。これらの尾部スパイクは、一般的に、多糖類に特異的であり、それらが結合する表面多糖類構造を分解する球形タンパク質である。ｐｈｉＶ１０の尾部スパイクは、病原体の大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の表面上でＯ１５７抗原を特異的に認識し、それに結合し、分解する可能性が高い。
【０１６８】
Ｒ２ピオシン尾部繊維のａａ１〜１６１および１〜１６４等のＮ末端のＢＰＡＲコード部分に個別にそれらを遺伝的に融合させることによって、ｐｈｉＶ１０の尾部スパイクタンパク質（配列番号６０）のａａ２０４〜８７５、２１１〜８７５、および２１７〜８７５等のＲＢＤの種々のＣ末端部分として配置した。これらの組換え融合遺伝子（Ｒ２のＰｒｆ１５  １〜１６４：Ｖ１０尾部スパイク２０４〜８７５［配列番号６７］、Ｒ２のＰｒｆ１５  １〜１６４：Ｖ１０尾部スパイク２１７〜８７５［配列番号６８］、およびＲ２のＰｒｆ１５  １〜１６１：Ｖ１０尾部スパイク２１１〜８７５［配列番号６９］）のうちの３つを適切なシュードモナス菌株（ＰＡＯ１Δｐｒｆ１５）中で個別に発現させたとき、産生され、放出されたピオシン粒子を、それらの構造機能性のあるＲ２−Ｖ１０尾部融合に組み込んだ。これらのキメラピオシン粒子は、我々の研究所において８つ全ての大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７株に対して殺菌作用を有したが、不完全なＯ１５７抗原を有するＥＤＬ９３３の突然変異体を含むいずれの他の大腸菌株も死滅しなかった。さらに、大腸菌ＥＤＬ９３３から抽出したＬＰＳのＳＤＳ  ＰＡＧＥによって証明されるように、キメラＲ２−Ｖ１０ピオシンは、Ｏ１５７抗原を消化した。したがって、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の公知の毒性因子であるＯ１５７抗原を特異的に認識し、消化し、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７株を特異的に死滅させる、組換えＲ型ピオシンを作製した。
【０１６９】
Ｒ２−Ｖ１０ピオシンにより処理された大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７から現れ得るＲ２−Ｖ１０ピオシン耐性突然変異体がそれらのＯ１５７の毒性因子を遊離するかどうかを判定するために、事前の化学的突然変異誘発する、または誘発しない、Ｒ２−Ｖ１０ピオシン耐性ＥＤＬ９３３の大腸菌然変異体を選択した。７つの独立した突然変異体のＬＰＳ構造は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分析され、それらが変化したＯ抗原構造を有するかどうかを判定した。７つのそれぞれは、異なる定質的または大いに定量的に変化したＯ１５７抗原を有し、Ｒ２−Ｖ１０への耐性が大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７病原体から毒性因子のＯ１５７の損失をもたらすことを示した。
【０１７０】
一連のタンパク質構造分析プログラムを利用するＱｕｉｃｋｆｉｒｅソフトウェア（Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｌｏｎｄｏｎ）を用いてｐｈｉＶ１０尾部スパイクタンパク質をモデリングする際、Ｃ末端の４２２個のアミノ酸［配列番号６０］におけるガラクツロナナーゼ［配列番号６６］との構造的相同性が予測されたことを見出した。これは、ピオシンＰｒｆ１５［配列番号６７、６８、６９等］のＮ末端部に融合されるとき、Ｏ１５７抗原と結合することによって組換えＲ型ピオシンが、α−Ｄ−Ｇａｌ２Ｎａｃを含んだ大腸菌Ｏ１５７を死滅させることができるが、そのＯ抗原中のα−Ｄ−Ｇａｌ２Ｎａｃを欠いていることが知られているＴＥＡ０２６突然変異体または上述のその他の７種類のＥＤＬ９３３突然変異体を死滅させない、Ｖ１０尾部スパイク部の能力を説明した。Ｑｕｉｃｋｆｉｒｅはまた、ｐｈｉＶ１０尾部スパイクが、サルモネラＯ抗原と結合し、それを分解することが知られているファージ尾部タンパク質であるファージＰ２２尾部スパイク［配列番号７０］のエンドラムノシダーゼに対して構造的相同性を有することも示した。したがって、Ｒ型ピオシンの尾部繊維のＮ末端のＢＰＡＲに対してそのような触媒機能を有するタンパク質の融合は、その表面上で酵素の基質を発現する細菌を標的とし、死滅させる酵素の基質結合特性を利用する能力を組換えＲ型ピオシンに与えた。
【０１７１】
したがって、Ｒ型ピオシンは、天然にはＲ型ピオシンと似ていない尾部構造を有するファージからの尾部タンパク質を用いて異なる特異性を有するように遺伝子操作され、それ故に、非天然Ｒ型ピオシンを作製する。
【０１７２】
ｇ）ピオシン：Ｒ２−ＰＳ１７における機能性尾部繊維としてのさらなる融合タンパク質
緑膿菌ファージＰＳ１７は、Ｆeｌｉｘ  ｄ’Ｈeｒｅｌｌｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｔｉe  Ｌａｖａｌ，Ｃａｎａｄａから入手した。ＰＳ１７のプラークは、緑膿菌株ＰＭＬ１４の感染によって産生された。ファージＰＳ１７に対して溶原性のＰＭＬ１４細胞は、未使用のトリプシン大豆寒天プレート上にプラークからの細胞をストリーキングすることによって単離された。溶原性は、Ｇｅｎｂａｎｋ配列ＢＰＳＦＩＦＩＩから設計されたプライマーＡＶ１６８およびＡＶ１６７を用いたコロニーＰＣＲ増幅によって確認された。溶原性細胞の一晩培養物は、２００ｍＬのトリプシン大豆培養液中で１：１００に希釈され、６００ｎｍでの光学密度が約０．２になるまで、３７℃で振とうした（２２５ｒｐｍ）。最終濃度がμｇ／ｍＬとなるようにマイトマイシンＣを添加し、培養物をさらに５時間振とうし、このとき、溶解は明らかであった。デオキシリボヌクレアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１単位／４０ｍＬ）を添加し、溶解液を３７℃で３０分間インキュベートして、粘度を低下させた。次いで、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＪＡ−２５．５０ローターにより、１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することによって細片を除去した。溶解液を、株ＰＭＬ１４上で滴定し、約８×１０9ｐｆｕ／ｍＬであると判定した。ファージＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  Ｌａｍｂｄａミニプレップキットを用い、製造業者の指示書に従って、キットから３つのカラムを用いて、４０ｍＬの透明溶解液から単離された。ＤＮＡは、合計４０μＬ中で再懸濁された。
プライマー配列（５’から３’まで列挙）：
【表２】
2013545460.tif 000004
【０１７３】
Ｓｈｉｎｏｍｉｙａ  ａｎｄ  Ｉｎａ（１９８９）の制限マップに基づいて、約４．２ｋｂのＢｇｌＩＩ断片をクローン化し、配列決定した。ＰＳ１７ファージＤＮＡの１μＬの試料は、ＢｇｌＩＩで消化させ、次いで、アガロースゲル中で電気泳動させた。適切な断片がゲルから切除され、精製され、ＢａｍＨＩで消化させたｐＵＣ１９ベクターＤＮＡと共に連結された。コンピテント大腸菌細胞は、連結された産物と共に形質転換され、形質転換細胞が、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有するＬＢ寒天プレート上に選択された。プラスミドミニプレップを作製し、ＤＮＡ配列分析のために使用した。２つのオーバーラップオープンリーディングフレーム（配列番号７１）は、様々な尾部繊維遺伝子およびシャペロンに対して有意な相同性を有することが見出された。プラスミドｐＵＣ１９−ＰＳ−Ｂ３では、推定されるシャペロンオープンリーディングフレームの終止コドンとベクターポリリンカー由来のＳａｃｌ制限酵素認識部位との間に約５３ｂｐがあった。
【０１７４】
ｐＵＣＰ３０Ｔは、ＢｓｐＨＩで消化され、ｄＮＴＰの存在下で、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片による処理によりその末端部はその先が丸くなり、ベクターは再連結して、ＢｓｐＨＩ部位を欠いたｐＳＷ１０７を形成した。
【０１７５】
ｌａｃＩq遺伝子およびｒｒｎＢＴ２終了配列は、第１の段階で鋳型としてｐＭＡＬ−ｃ２Ｅ等のｌａｃＩqを含有する好適なプラスミドベクターならびにプライマーＡＶ１４０およびＡＶ０２７を用い、第２の段階でプライマーＡＶ１４１およびＡＶ２７を用いて、２段階ＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ産物は、ＳａｐＩで消化させ、ＳａｐＩで消化させたｐＳＷ１０７と共に連結して、プラスミドｐＤＧ１９を形成した。
【０１７６】
ｔａｃプロモーターは、鋳型として好適なプラスミドベクターｐＧＥＸ−２ＴならびにプライマーＡＶ１６９およびＡＶ１１４を用いて、ＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ産物は、ＳａｐＩおよびＥｃｏＲＩで消化させ、ＳａｐＩおよびＥｃｏＲＩで消化させたｐＤＧ１９と共に連結して、プラスミドｐＤＧ３５を形成した。
【０１７７】
推定される尾部繊維およびシャペロンオープンリーディングフレームは、プライマーＡＶ２３８およびＡＶ０４７を用いてプラスミドｐＵＣ１９−ＰＳ−Ｂ３からＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ産物は、ＢｓｐＨＩおよびＳａｃＩで消化させ、ＢｓｐＨＩおよびＳａｃＩで消化させたｐＤＧ３５と共に連結して、ｐＤＧ６５を形成した。
【０１７８】
Ｒ２  ｐｒｆ１５およびｐｒｆ１６を含むＤＮＡ断片は、プライマーＰＲＦ１３−ＦおよびＡＶ０８６を用いてＰＡＯ１ゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ産物は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの「Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」を用いてクローン化した。得られたクローンは、ｐＴＯＰＯ−Ｒ２と表された。
【０１７９】
コドン１−２２３を表すＲ２  ｐｒｆ１５オープンリーディングフレームの断片は、鋳型としてｐＴＯＰＯ−Ｒ２ならびにプライマーＡＶ１１８およびＡＶ２８７を用いて、ＰＣＲによって増幅させた。コドン２２０からコドン７７９後の終止コドンに加えて推定されるシャペロンオープンリーディングフレームまでのＣ末端部を表すＰＳ１７の推定される尾部繊維オープンリーディングフレーム断片は、鋳型としてｐＵＣ１９−ＰＳ−Ｂ３ならびにプライマーＡＶ２８６およびＡＶ２９３を用いて、ＰＣＲによって増幅させた。得られたＰＣＲ産物は、２０ｂｐのオーバーラップ配列を含んだ。２つの断片は、プライマーＡＶ１１８およびＡＶ２９３を用いて、オーバーラップＰＣＲによりアセンブリされた。得られた断片は、ＢｓｐＨＩおよびＳａｃＩで消化させ、ＢｓｐＨＩおよびＳａｃＩで消化させたｐＤＧ３５と共に連結して、プラスミドｐＳＷ１２２を形成した。
【０１８０】
ＰＳ１７プラークは、通常、感受性細胞の菌叢上に不透明な「牛の目」の外観を有する。ＰＳ１７ファージは、株ＰＭＬ１４上に平面培養し、透明な外観を有するいくつかの稀なプラークが選択された。透明なプラークのファージは、透明な外観を有する単離されたプラークを再度平面培養し、選択することによって精製された。ＰＳ１７−ｃ５と表される単離物がさらなる使用のために選択された。
【０１８１】
緑膿菌株ＰＡ０１は、実施例１においてＰＡＯ１Δｐｒｆ１５を作製するために説明される方法と同様の方法によって、ＰＡＯ１−ｍΔｐｒｆ１５を作製するために、そのｐｒｆ１５コード配列（配列番号３）のヌクレオチド１０−２０６７を削除した。トリプシン大豆培養液中で５０ｍＬのＰＡＯ１−ｍΔｐｒｆ１５の培養液を、６００ｎｍでの光学密度が約０．２になるまで、３７℃で振とうした。ＰＳ１７−ｃ５の１つのプラークをプレートから液体培養物に移した。３７℃でさらに３時間振とうした後、６００ｎｍでの光学密度を低下し、溶解は明らかであった。次いで、培養物を一晩（１６時間）振とうした状態にした。一晩インキュベーションした後、培養物は、再度不透明になった。培養液の試料を、トリプシン大豆寒天プレート上にインキュベートし、一晩インキュベートした。コロニーは、プライマーＡＶ１６８およびＡＶ１６７を用いて、コロニーＰＣＲによってＰＳ１７の溶原性について確認され、陰性を示した。ＰＡＯ１−ｍΔｐｒｆ１５−ｃ５Rと表されるクローン単離物が、Ｒ２−ＰＳ１７の改変されたピオシンの宿主産生細菌としてさらなる使用のために選択された。Ｃｈｏｉ  ａｎｄ  Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ（２００５）によって説明された方法と同様の方法によってエレクトロコンピテントな細胞が作製され、ｐＤＧ６５およびｐＳＷ１２２で形質転換された。形質転換細胞が選択され、１００μｇ／ｍＬのゲンタマイシンで維持された。
【０１８２】
Ｒ２−ＰＳ１７ピオシンの発現のために、１００μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを添加したトリプシン大豆培養液中のＰＡＯ１−ｍΔｐｒｆ１５−ｃ５Rの一晩培養物を、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含有するＧ培地（Ｓｈｉｎｏｍｉｙａ，１９７２）に１：１００で希釈した。この培養物を、６００ｎｍでの光学密度が約０．２になるまで、振とうしながら（２２５ｒｐｍ）、３７℃でインキュベートした。次いで、最終濃度が３μｇ／ｍＬとなるようにマイトマイシンＣを添加し、培養物を３７℃で３〜４時間振とうした。任意に、デオキシリボヌクレアーゼを、４０ｍＬ当たり１単位で添加し、溶解物を３７℃で１５〜３０分間インキュベートして、粘度を低下させた。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＪＡ−２５．５０ローターにより、１２，０００ｒｐｍで、４℃で３０分間遠心分離することによって細片を除去した。上清を未使用の遠心分離管に移し、ピオシンを２２，０００ｒｐｍ（約５８，５００×ｇ）で、４℃で１時間沈殿させた。ペレットは、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ中の３％の原体積で再懸濁し、４℃で保存した。
【０１８３】
組換え「Ｒ２−ＰＳ１７」ピオシン調製物の殺菌作用は、ＰＭＬ１４等のＰＳ１７に感受性のある緑膿菌株においてスポット希釈によって示された。
【０１８４】
ｈ）ピオシン：Ｒ２−ＭＴＤにおける機能性尾部繊維としてのさらなる融合タンパク質
ボルデテラバクテリオファージＢＰＰ−１の主要トロピズム決定因子（ＭＴＤ）は、Ｃ型レクチン（ＣＴＬ）ドメインを有し、これは、多くの異なる生物学的状況における、多くの様々な種類の分子に対する結合決定因子として作用する（Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ，１９９９、ＭｃＭａｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ＢＰＰ−１では、ＭＴＤは、ファージの尾部末端に位置するホモ三量体球状ドメインとして組み込まれており、そこで、ボルデテラブロンキセプティカおよびボルデテラパータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の外部表面上で発現する毒性因子、表面タンパク質パーテクチンと結合することができる（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。これに関して、ＭＴＤは、ファージが媒介するホーミング突然変異生成（ｈｏｍｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）の標的でもあり、それによって、バクテリオファージが、その変化し続ける宿主に感染するための新規の結合決定因子を獲得する結果となり得る。
【０１８５】
ＭＴＤドメインおよびそのいくつかの多様化変異体に関する最近の構造研究により、三量体の繊維の先端が、１０兆個を超える変異体結合リガンドを含むことができる固定された足場をいかにして形成するかが示された（ＭｃＭａｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００５）。ＭＴＤドメインをピオシン尾部繊維タンパク質上へ融合し、その後、Ｍｉｌｌｅｒらによって説明されたＤＧＲシステムを用いてＭＴＤドメインを多様化することにより（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｄｏｕｌａｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、変異体の非常に大きなライブラリーが作製され、そこから、変化した結合特異性を有するピオシン尾部をコードする遺伝子が選択され、入手される。
【０１８６】
実施例２：融合タンパク質のアッセイ
ａ）ピオシンの精製およびアッセイ
ＰＡＯ１または適切な誘導体を、プラスミドを維持するために必要な場合は、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを添加したＧ培地中、２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で増殖させた。培養物のＯＤ６００が約０．２５０に達したとき、最終濃度が３μｇ／ｍＬとなるようにマイトマイシンＣを添加した。培養物を、溶解が発生するまでさらに２．５時間インキュベートした。ＤＮａｓｅ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の５単位（１単位／μＬ）を、２００ｍＬの培養物に添加し、培養物をさらに３０分間インキュベートした。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＪＬＡ−１６．２５０ローターにより、１２，０００ｒｐｍで１時間遠心分離することによって細片を除去した。上清を氷上で攪拌しながら、そこへ、最終添加体積が溶解物の上清１００ｍＬに対して６５ｍＬとなるまで飽和硫酸アンモニウムを１ｍＬ／分の速度でゆっくり添加した。これを４℃で一晩保存した。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＪＡ−２５．５０ローターにより、１２，０００ｒｐｍで、４℃で１時間遠心分離することによって硫酸アンモニウムの沈殿物を回収し、ペレットを１０ｍＬのＴＮ５０バッファー（１０ｍＭ  ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中へ再懸濁した。再懸濁溶液中のピオシン粒子は、次いで、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＪＡ−２５．５０ローターにより、２２，０００ｒｐｍ（５８，５００×ｇ）で、４℃で１時間沈殿させ、３〜５ｍＬのＴＮ５０バッファー中へ再懸濁した。ピオシン調製物は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析により、＞９０％の純度であると判断した。
【０１８７】
ピオシンの定量アッセイは、Ｋａｇａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９６４によって記載された方法を若干修正した方法により、生存細菌を計数することにより行われた。ピオシン試料を、標的細菌（約１×１０9ＣＦＵ／ｍＬ）で、３７℃で４０分間インキュベートした。次いで、試料を希釈し、平面培養して、生存細菌を計数した。ピオシン粒子の数と生存細菌の画分とは、ポアソン分布、ｍ＝−ｌｎＳ、の関係にあり、ｍ＝致死事象の平均回数／細胞であり、Ｓは生存細菌の画分である。活性ピオシン粒子の合計数／ｍＬ＝ｍ×細胞／ｍＬである。株１３ｓは、これらのアッセイで使用された緑膿菌であり、多くの抗生物質に耐性を有するが、５つのＲ型ピオシン全てに感受性を有する臨床的単離株である。標的である大腸菌は、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｃａｌｅｎｄａｒ氏によりご提供いただいたＣ１ａであった。
【０１８８】
また、半定量アッセイも、スポット法で行い、ピオシン試料をＴＮ５０バッファー中で段階希釈して、標的細菌の菌叢上にスポッティングした。３７℃で一晩インキュベートした後、ピオシン活性は、菌叢上の死滅によるクリア領域によって観察することができた。図２は、このアッセイ形式による代表的な結果を示す。
【０１８９】
実施例３：遺伝子操作された尾部繊維のスクリーニングのための組換えバクテリオファージ
Ｐ４バクテリオファージを、遺伝子型を尾部繊維の結合表現型と連結させるように、尾部繊維融合遺伝子を内部に有するサロゲートとして使用した。これにより、所望の尾部繊維遺伝子の効率的な選択、形質導入、および単離が可能となる。
【０１９０】
バクテリオファージＰ２は、他の腸内の種に感染することができる溶原性大腸菌ファージであり、緑膿菌中で複製することができるが、これに感染することはできない（Ｂｅｒｔａｎｉ  ＆  Ｓｉｘ，１９８８、Ｋａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。Ｒ型ピオシンは、遺伝子的にも構造的にもＰ２と近い関係にあり、遺伝子ＨによってコードされるＰ２尾部繊維タンパク質は、基板結合が生じるＰＲＦ１５のＮ末端部分と相同性を示す（Ｈａｇｇａｒｄ−Ｌｊｕｎｇｑｕｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２、Ｎａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。Ｐ２またはＰ４バクテリオファージを、プラスミドにコードされた尾部繊維がＰ２ファージにコードされた繊維の代わりにファージ粒子に組み込まれたサロゲートファージとして用いることにより、ピオシンでの意図する機能的な関連性と極めて類似する関連性において融合繊維の提示および選択が可能となる。
【０１９１】
尾部繊維遺伝子型は、ファージディスプレイ技術と同様に、遺伝子選択のために、形質導入ファージ粒子内で結合表現型と物理的に連結させた。アンバー変異をその繊維タンパク質遺伝子Ｈ（アンバー抑制遺伝子＋大腸菌で作製された）に有するＰ２ファージは、通常はバクテリオファージゲノムＤＮＡのパッケージングに対するシグナルとして作用するｃｏｓパッケージング部位（ｃｏｓ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｓｉｔｅ）を有するＰ４系プラスミドを内部に有する大腸菌に感染する場合（Ｚｉｅｒｍａｎｎ  ＆  Ｃａｌｅｎｄａｒ，１９９１、Ｋａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）、新たに合成されたＰ２／Ｐ４ファージ粒子の頭部にｃｏｓを含むＰ４プラスミドをパッケージすることになる。図１２のＰ４系プラスミドは、尾部融合遺伝子をコードし、発現する。Ｐ２に感染した大腸菌内でＰ４プラスミドから発現された融合尾部繊維は、欠損（アンバーが切断された）遺伝子Ｈ産物（Ｐ２尾部繊維タンパク質）の代わりにＰ２／Ｐ４粒子中へ組み込まれた。Ｐ２ホリンおよびリゾチームの発現によって感染細胞の溶解により、放出されたＰ２／Ｐ４系形質導入粒子は、Ｐ２ゲノムではなく尾部融合遺伝子をコードするｃｏｓ含有Ｐ４プラスミドを持ち、アンバーが切断されたＰ２尾部繊維ではなく組換え融合尾部繊維を有した。
【０１９２】
具体的には、プラスミドｐＳＷ１６６は、バクテリオファージＰ４ｓｉｄ1（Ｓｈｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．１９７７）の塩基２２６から２５９４に対応する領域を、プロモーターからなる７６３ｂｐ断片ならびにＰＣＲ増幅（プロモーターに隣接するＭｆｅＩおよびＫｐｎＩならびに終止コドンに隣接するＥｃｏＲＩ）によって導入された制限酵素認識部位によって側面に配置されたプラスミドｐＵＣＰ３０Ｔ（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，２００１、ＮＣＢＩ受入番号Ｕ３３７５２）からのａａｃＣ１（ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ３−１）のコード領域と置き換えることによって構築され、Ｐ４と同じ方向において遺伝子にクローン化された。
【０１９３】
プラスミドｐＤＧ２１１は、ＰLEプロモーターがａａｃＣ１と同じ極性にあり、ＮｈｅＩ部位およびＮｃｏＩ部位がＫｐｎＩ部位とＰLEプロモーターとの間に作製されるように、ＭｆｅＩ部位とＫｐｎＩ部位の間に、ＰＣＲ増幅によって得られ、塩基８５８５から８８３５（相補鎖）に対応するＰ４のＰLEプロモーター（Ｄｅｈo  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）からなる２７４ｂｐ断片を挿入することによって構築された。
【０１９４】
Ｐ２遺伝子Ｈの尾部繊維遺伝子の１から１５７位のアミノ酸およびｐｈｉＶ１０尾部スパイク遺伝子の２１８から８７５位のアミノ酸をコードするＰＣＲ増幅によって得られるＤＮＡ断片は、ｐＤＧ２１１のＮｃｏＩ部位とＫｐｎＩ部位との間に挿入され、図１２のｐＤＧ２１８を作製した。
【０１９５】
１ｍＬのプラスミドｐＤＧ２１８を内部に有する大腸菌Ｃ１ａの培地を、ＯＤ６００が１．０になるように増殖し、１ｍＭのＣａＣｌ2を添加し、約２の感染の多重度でＰ２ａｍＨ７２ｖｉｒ２０（Ｓｕｎｓｈｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９７１）に感染させた。１０分間の事前吸着させた後、細胞を２２５ｒｐｍで、３７℃で５０分間振とうした。微小遠心管中で１分間遠心分離によって、細菌および細片を除去し、溶解上清液を保存した。
【０１９６】
それぞれの大腸菌ＴＥＡ０２６および大腸菌ＥＤＬ９３３（Ｈｏ  ａｎｄ  Ｗａｌｄｏｒ，２００７）標的細胞の培地（２００μＬ）は、２．５ｍＭのＣａＣｌ2および２．５ｍＭのＭｇＣｌ2を添加した。溶解物（前のステップ）からの上清（５０μＬ）を添加し、１０分間事前吸着した。次いで、細胞を７００μＬの培養液で希釈し、２２５ｒｐｍで、３７℃で１時間振とうした。それぞれの細胞懸濁液のアリコート（１０μＬ）を、１５μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含有するＬＢ寒天プレート上に平面培養した。次いで、プレートを３７℃で一晩インキュベートした。およそ１０００のコロニーをＥＤＬ９３３プレート上に増殖させたが、ＴＥＡ０２６プレート上には増殖させなかった。
【０１９７】
ｐＤＧ２１８（図１４）等の場合、Ｐ２−Ｖ１０の融合遺伝子ではなく、完全な融合されないＰ２遺伝子Ｈの尾部繊維遺伝子を含むように構築された対照のＰ４系の陰性対照プラスミドｐＤＧ２１２は、Ｐ２ａｍＨ７２ｖｉｒ２０に感染させた後、大腸菌Ｃ１ａから同様にパッケージ化された。１０μＬの対照溶解物を、ゲンタマイシン含有プレート上で大腸菌Ｃ１ａとインキュベートしたとき、１０，０００を超えるコロニーが増殖したが、同じ対照溶解物がゲンタマイシン含有プレート上でＥＤＬ９３３とインキュベートしたとき、何も生じなかった。したがって、Ｏ１５７に特異的な結合特性を内部に有さないＰ４粒子によるトランスフェクションからのＥＤＬ９３３のゲンタマイシン耐性コロニーを生じるための偽陽性頻度は、１０-4未満である。Ｐ２アンバーＨと共に重感染した場合、Ｏ１５７株に感染することができるが、Ｃ１ａには感染することができないＰ４粒子が産生される。ＰＳ１７システムとは異なって、ｐｈｉＶ１０およびその尾部スパイクがＰ２とは遺伝的にも構造的にも完全に無関係であることに留意するのは重要である。これは、広い範囲の異なるファージ型がこのシステムによって利用することができ、用途の幅をさらに広げることを示す。
【０１９８】
細胞と結合し、バクテリオファージの侵入機序を誘発する能力のある形質導入ファージ粒子は、標的化に成功した細菌にゲンタマイシン耐性を付与し、そこからゲンタマイシン選択の下での細菌の複製の後、選択された繊維融合遺伝子がプラスミドから単離される。ＰＣＲによって単離された機能性Ｖ１０系ＲＢＤ遺伝子が、Ｒ２のｐｒｆ１５のＢＰＡＲ（ａａ１〜１６４）に融合され、ＰＡ０１Δｐｒｆ１５中でトランスに発現され、組換えピオシンが単離され、大腸菌ＴＥＡ０２６および大腸菌ＥＤＬ９３３における殺菌作用についてアッセイされた。Ｐ２／Ｐ４粒子について記載されるように、Ｒ２ピオシンＰＲＦ１５からＢＰＡＲに融合されたとき、Ｖ１０尾部スパイクタンパク質からのＲＢＤは、ＥＤＬ９３３に対して殺菌性があったが、Ｏ１５７抗原を欠いている突然変異体ＴＥＡ０２６に対しては殺菌性がなかったように、得られた改変されたピオシンに対して特異性を与えた。改変された尾部繊維ＲＢＤの機能の再設計および最適化を行うために、Ｐ４プラスミド上の尾部繊維遺伝子を容易にさらに操作して、多くの融合接合部を作り出し、ＲＢＤの多様化を行う。
【０１９９】
関連Ｐ４ビリオン粒子は、ａａ１〜１５８をコードするＰ２遺伝子ＨのＢＰＡＲ部分を、ａａ１６４〜７７９のＲＢＤをコードするシュードモナスファージＰＳ１７の尾部繊維遺伝子に融合させることによって生成された組換え尾部繊維を有するように作られた。遺伝子Ｈ−ＰＳ１７の尾部繊維融合遺伝子は、ｐＤＧ２１８と同様に、Ｐ４系プラスミドのｐＤＧ２２４から後者の同族シャペロンと共に共発現させた。一旦ｐＤＧ２２４を内部に保持する大腸菌Ｃ１ａに感染したＰ２ａｍＨ７２ｖｉｒ２０の溶解物から回収されると、Ｐ４粒子は、緑膿菌株ＰＭＬ１４へのゲンタマイシン耐性の形質転換が伝達されたが、緑膿菌株ＰＡ１４には伝達されなかった。ＰＳ１７ファージもまた、前者の緑膿菌株ＰＭＬ１４には感染するが、後者の緑膿菌株ＰＡ１４には感染しない。したがって、Ｐ４系サロゲートシステムは、細菌の属を越えてさえも、組換え遺伝子型を組換え尾部繊維結合表現型と組み合わせるための選択方法が提供されている。
【０２００】
このアプローチはまた、従来のファージ提示システムを用いるとき、三量体のタンパク質のＣ末端提示により課せられる多くの問題を克服する（Ｈｅｌｄ  ＆  Ｓｉｄｈｕ，２００４）。バクテリオファージＰ２は、遺伝学的にも形態学的にもピオシンの尾部繊維と類似している尾部繊維を有する（Ｎａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。尾部繊維は、それらのＮ末端によってＰ２およびピオシンの基板に付着し、Ｐ２およびＲ２ピオシン尾部繊維のＮ末端の有意な配列相同性がある（Ｎａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ，２０００、Ｈａｇｇａｒｄ−Ｌｊｕｎｇｑｕｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。さらに、Ｐ２関連ファージであるＰＳ１７の尾部繊維遺伝子は、Ｒ２ピオシン尾部繊維遺伝子であるｐｒｆ１５を相補することができる（Ｓｈｉｎｏｍｉｙａ，１９８４、Ｓｈｉｎｏｍｉｙａ  ＆  Ｉｎａ，１９８９）。
【０２０１】
あるいは、ビブリオハーベイ（ＢＰＰ−１のように、これも機能性ＤＧＲも含有する）のＶＨＭＬファージの尾部繊維遺伝子ｏｒｆ３５の部分を、Ｐ２遺伝子ＨのＮ末端ドメインへ融合させる。次いで、この組換え構築体は、ｏｒｆ３５  ＲＢＤに組み込まれたＶＨＭＬ  ＶＲのＤＧＲ駆動型の多様化を行った後、上記のように、特定の対象のＲＢＤのＰ４に基づいた選択を可能にする。
【０２０２】
実施例４：所望の尾部繊維遺伝子を回収する方法
遺伝子操作された尾部繊維遺伝子を持つＰ２またはＰ４バクテリオファージは、ピオシン尾部繊維遺伝子型を結合表現型と組み合わせるサロゲートとして作用する。そのようなサロゲートバクテリオファージの内部に保持される尾部繊維遺伝子の多様化された、または突然変異を起こされたライブラリーから特定の結合表現型を選択またはスクリーニングすることにより、所望の結合特異性をコードする尾部繊維遺伝子を単離することができる。選択は、まず、望ましくないバインダーを除去し、次いで、残ったサロゲートの中から意図する標的分子と結合するものを単離するか、またはその逆を行うことによってサロゲートバクテリオファージもしくは形質導入粒子を固相標的分子上へ吸着させるという単回または複数回の濃縮サイクルを行うことによって実施することができる。あるいは、選択は、いずれかの結合ステップを単独で適用することによって行うこともできる。最終的には、所望の結合表現型を示すサロゲートを、制限酵素断片のクローン化、または尾部繊維遺伝子の多様化された末梢部分の特定のＤＮＡ配列と結合するオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ反応により、ＤＮＡ抽出、および保持されている尾部繊維遺伝子の単離に付すことができる。
【０２０３】
サロゲートファージまたは形質導入Ｐ４粒子が標的を発現する細菌上でプラークを形成しない場合であっても、感染または形質導入された細菌は、内部に保持するプラスミドまたはプラスミドと共にＰ４プラスミドコードされたゲンタマイシン耐性等の抗生物質耐性を獲得し、したがって、選択的な増殖およびそれに続く抽出を行うことで、多コピープラスミドおよびその所望の尾部繊維遺伝子を単離することができる。
【０２０４】
これらの技術により、所望の特定の結合表現型を示すサロゲートバクテリオファージまたは形質導入粒子の同定および単離が可能となり、そこから所望の特定の非天然のｈｍｗバクテリオシン尾部繊維遺伝子が抽出および単離される。さらに、サロゲートの哺乳類分子、細胞、または組織への結合により、治療用ｈｍｗバクテリオシンに組み込まれた場合、有害な事象を起こす恐れのある尾部繊維をコードするいかなる遺伝子もライブラリーから奪うように配置することができる。
【０２０５】
挿入突然変異体である緑膿菌株の利用可能なライブラリーがあり、この変異体は、極めて病原性の高い親ＰＡ１４緑膿菌とは、それぞれの重複しない同系突然変異体から１つ欠損する形で一連の特定の毒性因子の発現が欠損していることだけが異なっている（ａｕｓｕｂｅｌｌａｂ．ｍｇｈ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐａｌ４／ｈｏｍｅ．ｃｇｉのホームページを参照）。これらの同系の突然変異体株は、他の一般的な表面分子ではなく、標的毒性因子に対するサロゲートバクテリオファージの特異性を確保するためのツールを提供する。例えば、サロゲートＰ４バクテリオファージの集団を、特定の標的毒性因子を欠損した緑膿菌の突然変異体の高密度培養物と共にインキュベートすることで、同系突然変異株および毒性の親株の両方に存在する表面分子と結合するサロゲートバクテリオファージまたは形質導入粒子を吸着させて集団から除去することができる。除去処理された集団は、所望の毒性因子と結合するサロゲートの濃縮が行われる。特定の毒性因子または適応性因子を発現する細菌と結合し、これに感染するサロゲートバクテリオファージを単離した後は、それぞれを、標的因子を欠損している同系突然変異株に感染することができないものについて直接スクリーングすることができる。選択されたプラスミドは、サロゲート形質導入粒子に再パッケージし、吸着‐除去および感染のプロセスを通してさらなる濃縮、および最終的には毒性因子または適応性因子を標的とするための所望の尾部繊維をコードするｐＵＣ系プラスミドの精製を行うことで、何度でも再利用可能である。
【０２０６】
組換えＰ４ゲノムにおいてコードされた組換えまたは天然の尾部繊維遺伝子は、当業者によく知られているいくつかの方法のいずれか１つによって、特に特異性を付与するＲＢＤドメインの部分において、突然変異生成を施すことができる。突然変異したＰ４ゲノムプラスミドは、低多重度で大腸菌Ｃに形質転換され、続いて、ゲンタマイシン耐性の形質転換細胞が、ファージＰ２アンバーＨ（Ｐ２ａｍＨ７２ｖｉｒ２０）によって感染する。上記のように、Ｐ４ビリオン粒子のライブラリーは、パッケージ化され、産生され、突然変異体ＲＢＤ部分を有する尾部繊維を有し、この遺伝子は、パッケージ化された組換えＰ４ゲノム内で特異的にコードされる。これらの突然変異体のいくつかは、標的細菌上で所与の標的受容体に対して特異的な結合能力をコードする。所望の、実に希少である、結合能力を有する突然変異体ＲＢＤを内部に有するＰ４ゲノムは、ビリオンライブラリーで標的細菌の菌株を感染させ、ゲンタマイシン耐性の細菌コロニーを単離することによって選択することができる。耐性細菌は、標的細菌の菌株に対して特異性を得る突然変異体ＲＢＤをコードするＰ４ゲノムを内部に有する。
【０２０７】
所望の希少な結合表現型を選択し、それによって、望ましくないＰ４粒子の大集団から遺伝子型を選択することの例は、ｐＤＧ２１２（Ｐ２尾部繊維）を内部に有する大腸菌Ｃ１ａおよびｐＤＧ２１８（Ｐ２−Ｖ１０の組換え尾部繊維）を内部に有する大腸菌Ｃ１ａからの異なる割合のＰ４粒子の溶解物を混合することによって示された。この混合物が、Ｐ２−Ｖ１０尾部繊維を有する０％、１％、９９％、または１００％のＰ４粒子を含む、またはＰ２尾部繊維を有するその逆の数のＰ４粒子を含むとき、コロニーを形質転換した適切な数のＥＤＬ９３３または大腸菌Ｃ１ａを、ゲンタマイシンを含有する寒天プレート上に増殖させた。つまり、ｐＤＧ２１８を内部に有する大腸菌から回収されたＰ４粒子が、唯一、トランスフェクトし、ＥＤＬ９３３細菌へのゲンタマイシン耐性を伝達することができ、一方、ｐＤＧ２１２を内部に有する大腸菌から回収されたものが、唯一、トランスフェクトし、大腸菌Ｃ１ａ細菌へのゲンタマイシン耐性を伝達することができた。ｐＤＧ２１２を内部に有する大腸菌からのＰ４を用いた形質転換を試みた後、大腸菌ＥＤＬ９３３のゲンタマイシン耐性コロニーの形成である偽陽性増殖の頻度は、１０-5未満であった。また、ｐＤＧ２１８を内部に有する大腸菌からのＰ４を用いた形質転換を試みた後、大腸菌Ｃ１ａのゲンタマイシン耐性コロニーの形成であるその逆も観察され、１０-5未満であった。
【０２０８】
所望の結合表現型を有するＤＮＡをコードする突然変異体ＲＢＤは、ＲＢＤまでの遺伝子Ｈの配列５’およびＲＢＤまでの配列３’内であるが、ＲＢＤコード領域のすぐ外側のプライマーを用いて、ＰＣＲ法によって単離することができる。選択されたＲＢＤのＤＮＡ配列は、ａａ１〜１６４をコードするその部分等のＲ型ピオシンｐｒｆ１５遺伝子のＢＰＡＲ部分と融合され、ＰＡ０１Δｐｒｆ１５等の細菌または以下に記載されるような産生株中のトランスで発現させ、新規で所望の結合特異性および殺菌特異性を有する組換えＲ型ピオシンを作製する。
【０２０９】
実施例５：遺伝子操作されたｈｍｗバクテリオシンを産生するための方法
改変された尾部繊維遺伝子は、プラスミドが媒介する対立遺伝子交換反応を用いて、（ｉ）内在するｐｒｔＲ、ｐｒｔＮ、ｐｒｆ１５、およびホリン（ｐｒｆ９またはＰＡ０６１４）遺伝子が欠失もしくは無能力化されたＲピオシン遺伝子クラスター（エンドリシン遺伝子を含む）も、例えば細菌人工染色体（ＢＡＣ）上で、内部にも保持する産生細菌中での発現のために、調節されたプロモーターの下、プラスミド中へ組換えられるか、または（ｉｉ）ＢＡＣベクターそのものを含むピオシンクラスター中へ組換えられる。
【０２１０】
ａ）大腸菌におけるＲ型ピオシンの発現
Ｒ２ピオシン遺伝子クラスターは、ＰＣＲ産物由来の５つの異なるクローン化した断片を用いて、４つの異なる変異体においてクローン化された。
【０２１１】
断片１は、ＰＡ０１ゲノムＤＮＡからプライマーＡＶ４６１およびＰＲＦ１３Ｒを用いて、ＰＣＲによって増幅され、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化させた。得られた断片は、Ｇｅｎｂａｎｋ配列ＡＢ０３０８２５の塩基４２６７〜７８５６を表した。プライマーＡＶ４６１は、ＥｃｏＲＩ部位を加えた。この断片は、遺伝子ｐｒｔ−Ｒおよびｐｒｔ−Ｎを欠いた。
【０２１２】
断片２は、ＰＡ０１ゲノムＤＮＡからプライマーＡＶ５２９およびＰＲＦ１３Ｒを用いて、ＰＣＲによって増幅され、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化させた。得られた断片は、Ｇｅｎｂａｎｋ配列ＡＢ０３０８２５の塩基２９７５〜７８５６を表した。プライマーＡＶ５２９は、ＥｃｏＲＩ部位を加えた。この断片は、遺伝子ｐｒｔ−Ｒおよびｐｒｔ−Ｎを含んだ。
【０２１３】
断片３は、ＰＡ０１ゲノムＤＮＡからプライマーＡＶ３３３およびＡＶ３３４を用いて増幅され、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩで消化させた。得られた断片は、Ｇｅｎｂａｎｋ配列ＡＢ０３０８２５の塩基７８５６〜１４２８０を表した。この断片は、完全長ｐｒｆ１５遺伝子を含む。
【０２１４】
断片４は、ΡΑ０１−ｒΔｐｒｆ１５ゲノムＤＮＡからプライマーＡＶ３３３およびＡＶ３３４を用いて増幅され、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩで消化させた。得られた断片は、Ｇｅｎｂａｎｋ配列ＡＢ０３０８２５の塩基７８５６〜９１５５および１００２８〜１４２８０を表した。この断片は、８７３ｂｐの内部欠損を有するｐｒｆ１５遺伝子を含んだ。
【０２１５】
断片５は、ＰＡ０１ゲノムＤＮＡからプライマーＡＶ４０７およびＡＶ４０４を用いて増幅され、ＮｈｅＩおよびＰａｃＩで消化させた。得られた断片は、Ｇｅｎｂａｎｋ配列ＡＢ０３０８２５の塩基１４，２８０〜１９，８６０を表した。プライマーＡＶ４０４は、ＰａｃＩ部位を加えた。
【０２１６】
複製起点およびβ−ラクタマーゼ遺伝子を含むｐＢＲ３２２（Ｇｅｎｂａｎｋ配列ＳＹＮＰＢＲ３２２のヌクレオチド２３３４〜４３５３を含む）の断片は、プライマーＡＶ３３７およびＡＶ３３８を用いて増幅された。得られた断片は、ＮｏｔＩで消化させ、複数のクローニング部位は、キナーゼ化およびアニール化したオリゴＡＶ３３９およびＡＶ３４０を用いてＮｏｔＩで消化させたベクターを連結させることによって作製された。得られたプラスミドは、ｐＤＧ１２１と表された。
ＰＣＲプライマー配列：
【表３】
2013545460.tif 000005
【０２１７】
プラスミドｐＤＧ１７３は、断片１、３、および５を含み、ｐＤＧ１２１のＥｃｏＲＩ部位とＰａｃＩ部位の間にそれぞれ挿入した。
【０２１８】
プラスミドｐＤＧ１７４は、断片２、３、および５を含み、ｐＤＧ１２１のＥｃｏＲＩ部位とＰａｃＩ部位の間にそれぞれ挿入した。
【０２１９】
プラスミドｐＤＧ１７５は、断片１、４、および５を含み、ｐＤＧ１２１のＥｃｏＲＩ部位とＰａｃＩ部位の間にそれぞれ挿入した。
【０２２０】
プラスミドｐＤＧ１７６は、断片２、３、および５を含み、ｐＤＧ１２１のＥｃｏＲＩ部位とＰａｃＩ部位の間にそれぞれ挿入した。
【０２２１】
大腸菌株ＢＬ２１（非λＤＥ３溶原菌、Ｎｏｖａｇｅｎカタログ番号６９４４９−３）の化学的にコンピテントな細胞は、プラスミドｐＤＧ１７３、ｐＤＧ１７４、ｐＤＧ１７５、またはｐＤＧ１７６で形質転換された。プラスミドの保持が選択され、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンで維持された。
【０２２２】
ピオシンの発現のために、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを添加したＬＢ培養液中の株ＢＬ２１の一晩培養物を、２５μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むＧ培地（Ｓｈｉｎｏｍｉｙａ，１９７２）に１：１００で希釈した。この培養物を、６００ｎｍでの光学密度が約０．２になるまで、振とうしながら（２２５ｒｐｍ）、３７℃でインキュベートした。次いで、３３．３ｎｇ／ｍＬが最終濃度となるようにマイトマイシンＣを添加し、培養物を３７℃で一晩（１５〜２２時間）振とうした。培養物はなお、不透明であった。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＪＡ−２５．５０ローター中で１２，０００ｒｐｍ（約１７，４００×ｇ）で、４℃で３０分間遠心分離することによって、細胞および細片を除去した。上清を未使用の遠心分離管に移し、ピオシンを２２，０００ｒｐｍ（約５８，５００×ｇ）で、４℃で１時間沈殿させた。ペレットは、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ中の３％の原体積で再懸濁し、４℃で保存した。それぞれの調製物の殺菌作用は、緑膿菌の株１３ｓ上でアッセイされた。１０μＬのそれぞれの試料は、分子量標準とともに４〜２０％のポリアクリルアミドトリスグリシンＳＤＳゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で電気泳動させた。ｐＤＧ１７３およびｐＤＧ１７４を含む大腸菌形質転換細胞からの調製物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において、強力な殺菌作用および明らかなＲ型ピオシンタンパク質サブユニットを示した。ｐＤＧ１７５およびｐＤＧ１７６を含む大腸菌形質転換細胞からの調製物は、全て予測したように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において、殺菌作用を示さず、実質的なＲ型ピオシンタンパク質サブユニットも示さなかった。
【０２２３】
ｂ）蛍光菌におけるＲ型ピオシンの発現
キナーゼ化およびアニール化したオリゴＡＶ５３０およびＡＶ５３１は、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化させた広い宿主範囲のプラスミドベクターｐＵＣＰ３０Ｔ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＸＸＵ３３７５２）に連結させた。得られたプラスミドは、ｐＤＧ１７１と表された。
【０２２４】
プライマー配列：
【表４】
2013545460.tif 000006
【０２２５】
約１５．６ｋｂのｐＤＧ１７３からのＥｃｏＲＩ−ＰａｃＩ断片は、ＥｃｏＲＩおよびＰａｃＩで消化させたＤＧ１７１に連結されて、ｐＤＧ１９３を形成した。
【０２２６】
約１６．９ｋｂのｐＤＧ１７４からのＥｃｏＲＩ−ＰａｃＩ断片は、ＥｃｏＲＩおよびＰａｃＩで消化させたｐＤＧ１７１に連結されて、ｐＤＧ１９４を形成した。
【０２２７】
約１４．７ｋｂのｐＤＧ１７５からのＥｃｏＲＩ−ＰａｃＩ断片は、ＥｃｏＲＩおよびＰａｃＩで消化させたｐＤＧ１７１に連結されて、ｐＤＧ１９５を形成した。
【０２２８】
約１６．０ｋｂのｐＤＧ１７６からのＥｃｏＲＩ−ＰａｃＩ断片は、ＥｃｏＲＩおよびＰａｃＩで消化させたｐＤＧ１７１に連結されて、ｐＤＧ１９６を形成した。
【０２２９】
Ｃｈｏｉ  ａｎｄ  Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ（２００５）によって記載された方法と同様の方法によってエレクトロコンピテントな蛍光菌（ＡＴＣＣカタログ１３５２５）が作製され、ｐＤＧ１９３、ｐＤＧ１９４、ｐＤＧ１９５、またはｐＤＧ１９６で形質転換された。形質転換細胞が選択され、１００μｇ／ｍＬのゲンタマイシンで維持された。
【０２３０】
ピオシンの発現のために、１００μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを添加したトリプシン大豆培養液中の一晩培養物を、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含有するＧ培地（Ｓｈｉｎｏｍｉｙａ，１９７２）に１：１００で希釈した。この培養物を、６００ｎｍでの光学密度が約０．２になるまで、振とうしながら（２２５ｒｐｍ）、３７℃でインキュベートした。次いで、最終濃度が３μｇ／ｍＬとなるようにマイトマイシンＣを添加し、培養物を３７℃で３〜４時間振とうした。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＪＡ−２５．５０ローター中で１２，０００ｒｐｍ（約１７，４００×ｇ）で、４℃で３０分間遠心分離することによって、細片を除去した。上清を未使用の遠心分離管に移し、ピオシンを２２，０００ｒｐｍ（約５８，５００×ｇ）で、４℃で１時間沈殿させた。ペレットは、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５の３％の原体積で再懸濁し、４℃で保存した。それぞれの調製物の殺菌作用は、緑膿菌の株１３ｓ上でアッセイされた。１０μＬのそれぞれの試料は、分子量標準とともに４〜２０％のポリアクリルアミドトリスグリシンＳＤＳゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で電気泳動させた。ｐＤＧ１９３およびｐＤＧ１９４を含む大腸菌形質転換細胞からの調製物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において、強力な殺菌作用および明らかなＲ型ピオシンタンパク質サブユニットを示した。ｐＤＧ１９５およびｐＤＧ１９６を含む大腸菌形質転換細胞からの調製物は、全て予測したように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において、殺菌作用を示さず、実質的なＲ型ピオシンタンパク質サブユニットも示さなかった。
【０２３１】
ｌａｃまたはｔａｃ等の遺伝子操作された調節可能なプロモーターを通してのｐｒｔＮの直接の誘発等、ピオシン遺伝子および遺伝子操作された尾部繊維遺伝子の誘発により、宿主細胞は、栄養素が枯渇して増殖が止まるまでピオシンを合成する（Ｙｏｕｎｇ，Ｒｙ，２００６）。産生細菌は、ホリン遺伝子の不活化によって細胞の溶解に必要である細菌細胞壁への細胞質エンドリシンのアクセスが妨げられるため、クロロホルムの非存在下では溶解しない。使い終わった細胞は、遠心分離または濾過で回収し、その後、細胞質を満たした溶解性ピオシンの回収を所望するまで、凍結する。解凍によって内部細胞膜が破裂し、エンドリシンが放出されて細菌が溶解し、それによって、改変されたピオシンの回収物が放出される。必要であれば、少量のクロロホルムを細菌ペーストが解凍される水性溶媒に添加することによって、細菌膜の破壊を加速もしくは完了させることができる。
【０２３２】
実施例６：組換えＰ４／Ｐ２バクテリオファージを用いた細菌の菌株の標的化
大腸菌Ｃ１ａおよび大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７等の細菌の大混合集団を、その集団の１つだけの菌株を標的とするために、図１４に示される構築物を含む上記のように遺伝子操作されたＰ４ファージ粒子と接触させたとき、標的細菌のコロニーは、ゲンタマイシンの存在下で、接触させた集団を増殖させることによって単離された。この実験では、既知数の大腸菌Ｃ−１ａおよびＥＤＬ９３３（Ｏ１５７：Ｈ７）が、図１５に提供される表（Ａ〜Ｇ行）中に示されるように、異なる割合で混合された。それぞれの混合した集団は、Ｏ１５７抗原を標的とするために、図１４に示されるように、遺伝子操作されたＰ４粒子と２０分間接触させた。次いで、それぞれの混合した培地は、１５μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含有する寒天プレート上に広げた。プレートは、３７℃で一晩インキュベートされ、翌朝撮影された（プレートの画像は、図１５に示される）。計数され得るそれぞれのプレート上のコロニー数は、それぞれの画像下に示される。プレートＥ、Ｆ、およびＧから５つのコロニーがそれぞれ、ＰＣＲ分析による志賀毒素（Ｓｔｘ）遺伝子１に対して試験された。プレートＧ上のもの以外の試験された全てのコロニーが、ＥＤＬ９３３であると確認された。プレートＧ上の３つのコロニーは、ＰＣＲ分析によってＳｔｘ遺伝子を持たないことからも明らかなように、Ｐ４ファージ溶解物−調製物を汚染したＰ４プラスミドを含有する大腸菌Ｃ−１ａであった。図１５に示されるように、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７細菌中１００万個につき１個未満の細菌が、少なくとも５００万個の非Ｏ１５７大腸菌株の集団から単離され得る。
【０２３３】
逆に言えば、異なる細菌株を標的とし、感染するように遺伝子操作されたＰ４ファージの混合集団を考えると、新規のシステムは、標的細菌に対して特異的な遺伝子操作された尾部繊維を含む希少なＰ４ファージを単離するように配置され得ることを示した。この実験では、上記および図１２に記載される方法によって作り出され、Ｐ２遺伝子Ｈ（Ｈ）またはｐｈｉＶ１０尾部スパイク遺伝子と融合されたＰ２遺伝子Ｈ（Ｈ−Ｖ１０）を含む既知数の遺伝子操作されたＰ４ファージ粒子は、異なる割合で混合された（図１６の画像の左に示される）。混合したＰ４ファージ集団は、大腸菌Ｃ−１ａまたはＥＤＬ９３３（Ｏ１５７：Ｈ７）のいずれかの培地と１０分間接触させ、これらの培地を１５μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含むプレート上でインキュベートした。プレートは、３７℃で一晩インキュベートされ、翌朝撮影された（図１６に提供された画像）。
【０２３４】
「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、または「によって特徴付けられる（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ）」と相互交換可能に使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、包括的または制限のない言語であり、さらなる、列挙されない要素、または方法のステップを除外しない。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という語句は、特許請求の範囲内で特定されないいかなる要素、ステップ、または構成要素を除外する。「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という語句は、特定の材料またはステップと、特許請求された本発明の基本的および新規の特徴付けに実質的に影響しないものに対して特許請求の範囲を制限する。本開示は、これらの語句のそれぞれの範囲に相当する本発明の組成物および方法の実施形態を企図する。したがって、列挙される要素またはステップを含む組成物または方法は、組成物または方法が本質的にこれらの要素またはステップからなる、またはそれらからなる特定の実施形態を企図する。
【０２３５】
特許、特許出願、および刊行物を含む本明細書で引用した全ての参考文献は、過去に特に組み入れられたものであっても、そうでないものであっても、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。本明細書で使用される「ａ」、「ａｎ」、および「ａｎｙ」という用語はそれぞれ、単数形および複数形の両方を含むことを意図している。
【０２３６】
これまで、本発明を十分に説明してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、および過剰な実験をすることなく、広い範囲の同等のパラメーター、濃度、および条件で同じことを実施可能であることは当業者によって理解されよう。
【０２３７】
本発明は、その具体的な実施形態と関連させて説明してきたが、さらなる変更が可能であることは理解されるであろう。本出願は、一般的に本発明の原理に従い、本発明が関連する当該技術分野内での既知のまたは慣用の実践の範囲内であり、そして上述の本質的な特徴に適用され得るような、本開示からの逸脱を含む、本発明のいかなる変形、使用、または適用を網羅することを意図している。
【０２３８】
本発明は、上記の実施例に関して記載されているが、修正および変更は、本発明の精神および範囲内で包含されることを理解されよう。したがって、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ制限される。
【０２３９】
参考文献
【表５】
2013545460.tif 000007
【表６】
2013545460.tif 000008
【表７】
2013545460.tif 000009
【表８】
2013545460.tif 000010
【表９】
2013545460.tif 000011
【表１０】
2013545460.tif 000012
【表１１】
2013545460.tif 000013
【表１２】
2013545460.tif 000014
【図１】
2013545460.tif 000015
【図２】
2013545460.tif 000016
【図３】
2013545460.tif 000017
【図４】
2013545460.tif 000018
【図５】
2013545460.tif 000019
【図６】
2013545460.tif 000020
【図７】
2013545460.tif 000021
【図８】
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【図９】
2013545460.tif 000023
【図１０】
2013545460.tif 000024
【図１１】
2013545460.tif 000025
【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
2013545460.tif 000028
【図１３Ｃ】
2013545460.tif 000029
【図１３Ｄ】
2013545460.tif 000030
【図１３Ｅ】
2013545460.tif 000031
【図１３Ｆ】
2013545460.tif 000032
【図１３Ｇ】
2013545460.tif 000033
【図１３Ｈ】
2013545460.tif 000034
【図１３Ｉ】
2013545460.tif 000035
【図１３Ｊ】
2013545460.tif 000036
【図１３Ｋ】
2013545460.tif 000037
【図１３Ｌ】
2013545460.tif 000038
【図１３Ｍ】
2013545460.tif 000039
【図１３Ｎ】
2013545460.tif 000040
【図１４】
2013545460.tif 000041
【図１５】
2013545460.tif 000042
【図１６】
2013545460.tif 000043
【配列表】
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【国際調査報告】
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2013545460.tif 000045
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