(57)【要約】  本発明は、アンフィジノールを生成する菌株、望ましくは渦鞭毛藻類（Ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ）に属するアンフィディニウム・クレブシ（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｋｌｅｂｓｉｉ）、アンフィディニウム・カルテレ（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｃａｒｔｅｒａｅ）などの菌株を培養して得られた菌体の抽出物、または前記抽出物から得られた分画物を使用して細胞を培養することによって、マイコプラズマ汚染可能性を防止するための細胞培養方法；及びアンフィジノール誘導体を使用して、マイコプラズマで汚染された細胞を培養することによって、マイコプラズマで汚染された細胞からマイコプラズマ汚染を除去する方法を提供する。また、本発明は、単一細胞分離用の酵素溶液による処理及び細胞集塊の除去を含む、マイコプラズマで汚染された細胞からマイコプラズマ汚染を除去する方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンフィジノールを生成する菌株を培養して得られた菌体（ｂｉｏｍａｓｓ）の抽出物、または前記抽出物から得られた分画物を含む培地中で細胞を培養することを含む、マイコプラズマ汚染防止のための細胞培養方法。
【請求項２】
前記アンフィジノールを生成する菌株が、アンフィディニウム・クレブシ（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｋｌｅｂｓｉｉ）またはアンフィディニウム・カルテレ（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｃａｒｔｅｒａｅ）であることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養方法。
【請求項３】
前記抽出物が、（ａ）前記菌体を、Ｃ１〜Ｃ４アルコール及びアセトンで抽出する工程と、（ｂ）工程（ａ）で得られた抽出物を水及びエチルアセテートで抽出し、水層を分離する工程と、（ｃ）工程（ｂ）で得られた水層をｎ−ブタノールで抽出し、ｎ−ブタノール層を分離する工程とを含む抽出工程を遂行して得られることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養方法。
【請求項４】
前記分画物が、下記化学式１ないし８の化合物から選択されるアンフィジノール誘導体であることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養方法。
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【請求項５】
前記分画物が、化学式３の化合物であることを特徴とする請求項４に記載の細胞培養方法。
【請求項６】
前記培地が、サーファクチン１〜５０μＭ、シプロフロキサシン０．１〜１００μｇ／ｍｌ、またはリファンピシン０．１〜１００μｇ／ｍｌをさらに含むことを特徴とする請求項１ないし請求項５のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
【請求項７】
アンフィジノールを生成する菌株を培養して得られた菌体（ｂｉｏｍａｓｓ）の抽出物、または前記抽出物から得られた分画物を含む培地中で、マイコプラズマで汚染された細胞を培養することを含む、マイコプラズマで汚染された細胞からマイコプラズマ汚染を除去する方法。
【請求項８】
前記アンフィジノールを生成する菌株が、アンフィディニウム・クレブシ（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｋｌｅｂｓｉｉ）またはアンフィディニウム・カルテレ（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｃａｒｔｅｒａｅ）であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記抽出物が、（ａ）前記菌体を、Ｃ１〜Ｃ４アルコール及びアセトンで抽出する工程と、（ｂ）工程（ａ）で得られた抽出物を水及びエチルアセテートで抽出し、水層を分離する工程と、（ｃ）工程（ｂ）で得られた水層をｎ−ブタノールで抽出し、ｎ−ブタノール層を分離する工程とを含む抽出工程を遂行して得られることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記分画物が、下記化学式１ないし８の化合物から選択されるアンフィジノール誘導体であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
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【請求項１１】
前記分画物が、化学式３の化合物であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記培地が、サーファクチン１〜５０μＭ、シプロフロキサシン０．１〜１００μｇ／ｍｌ、またはリファンピシン０．１〜１００μｇ／ｍｌをさらに含むことを特徴とする請求項７ないし請求項１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
（ｉ）マイコプラズマで汚染された細胞を、単一細胞分離用の酵素溶液で処理して細胞懸濁液を得る工程と、（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞懸濁液から、細胞集塊（ｃｅｌｌ  ｃｌｕｍｐｓ）を除去する工程と、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた細胞懸濁液、または前記細胞懸濁液から回収した細胞を、マイコプラズマ阻害活性を有する物質を含有した培地中で培養する工程とを含む、マイコプラズマで汚染された細胞からマイコプラズマ汚染を除去する方法。
【請求項１４】
前記単一細胞分離用の酵素溶液が、トリプシン及びエチレンジアミン四酢酸を含有する溶液であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｉｉ）が、工程（ｉ）で得られた細胞懸濁液を、１０〜１００μｍのポアサイズを有するフィルターで濾過し、細胞集塊を除去することによって遂行されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記工程（ｉ）ないし工程（ｉｉｉ）を、２〜４回反復して遂行することを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記マイコプラズマ阻害活性を有する物質が、６−メチルプリンデオキシリボシド、６−メチルプリンリボシド、シプロフロキサシン、ドキシサイクリン、リファンピシン、クロラムフェニコール、プラスモシン、クリンダマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、テトラサイクリン、チアムリン、サーファクチン、アラメチシン、セクロピンＰ１、グロボマイシン、グラミシジンＳ、マガイニン２、メリチン、ポリミキシンＢ、チロシン、及びバリノマイシンからなる群から選択される１種以上の物質であることを特徴とする請求項１３ないし請求項１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記マイコプラズマ阻害活性を有する物質が、アンフィジノールを生成する菌株を培養して得られた菌体（ｂｉｏｍａｓｓ）の抽出物、または前記抽出物から得られた分画物であることを特徴とする請求項１３ないし請求項１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記アンフィジノールを生成する菌株が、アンフィディニウム・クレブシ（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｋｌｅｂｓｉｉ）またはアンフィディニウム・カルテレ（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｃａｒｔｅｒａｅ）であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記抽出物が、（ａ）前記菌体を、Ｃ１〜Ｃ４アルコール及びアセトンで抽出する工程と、（ｂ）工程（ａ）で得られた抽出物を水及びエチルアセテートで抽出し、水層を分離する工程と、（ｃ）工程（ｂ）で得られた水層をｎ−ブタノールで抽出し、ｎ−ブタノール層を分離する工程とを含む抽出工程を遂行して得られることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記分画物が、下記化学式１ないし８の化合物から選択されるアンフィジノール誘導体であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【化１７】
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【化１８】
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【化１９】
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【化２０】
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【化２１】
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【化２２】
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【化２３】
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【化２４】
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【請求項２２】
前記分画物が、化学式３の化合物であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンフィジノールを生成する菌株を培養して得られた菌体の抽出物、または前記抽出物から得られた分画物を使用して細胞を培養することによって、マイコプラズマ汚染可能性を防止するための細胞培養方法、及び前記抽出物または分画物を使用して、マイコプラズマで汚染された細胞を培養することによって、マイコプラズマで汚染された細胞からマイコプラズマ汚染を除去する方法に関する。また、本発明は、単一細胞分離用の酵素溶液による処理及び細胞集塊の除去を含む、マイコプラズマで汚染された細胞からマイコプラズマ汚染を除去する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイコプラズマ（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）は、モリクテス綱（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）に属する細胞壁を持たないバクテリアである。マイコプラズマは、大きさが約０．２〜０．８μｍであり、０．２μｍのフィルターを通過することができる。一般的にマイコプラズマ汚染は、細胞培養中に発生し、特に、マイコプラズマ・ヒオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・ファーメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、マイコプラズマ・オラーレ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｏｒａｌｅ）、マイコプラズマ・アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｇｉｎｉｎｉ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、アコレプラズマ・レイドロウイィ（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉ）などのマイコプラズマによる汚染が、細胞培養を頻繁に行う製薬会社、病院及び大学の研究室で発生している。一般的にマイコプラズマ汚染は、マイコプラズマに感染した生命体からの細胞株樹立の過程で発生し、血清の使用や実験室内での不注意によって細胞株間で汚染が広がり、ひいては実験室全体に広がる。
【０００３】
米国では、約１５％の細胞株が１種以上のマイコプラズマで汚染されていると報告されている。かような高い比率は、マイコプラズマが他の感染源（すなわち、細胞壁を有するバクテリアやカビ）の場合のような培地の混濁度上昇や、あるいはウイルスの場合のような細胞死滅といった可視的な変化がないためである。従って、実験者がその汚染を認知することができずに汚染を拡大させてしまう。また、マイコプラズマは、細胞壁がないため、細胞培養に主に使用するペニシリン及び他のベータ−ラクタム系抗生物質による影響を受けない。
【０００４】
細胞培養において、マイコプラズマ汚染は、可視的変化を伴わないが、多様な予期せぬ結果を引き起こす。代表的な現象のうち一つは、感染した細胞株の物質代謝を変化させ、異常なサイトカイン発現を誘導することである。従って、多くの実験や研究において、マイコプラズマ汚染に起因する異常な結果が生じることになる。またマイコプラズマは、細胞の形態を変化させ、またＤＮＡ合成あるいはＲＮＡ合成に必要な代謝物を消費して核酸代謝に影響を及ぼす。従って、細胞膜上の受容体や膜蛋白質の立体構造が変化し、細胞免疫あるいはシグナル伝達系が撹乱され、細胞増殖速度が変化することによって、細胞増殖試験や細胞毒性試験において予期せぬ結果が生じることになる。また、マイコプラズマは、感染した細胞の核酸代謝及び／または物質代謝を変化させるため、感染した細胞株を利用したウイルス産生も低下する。特に、単クローン抗体の産生時には、ハイブリドーマ細胞の融合率が低下するだけではなく、抗体産生も大きく低下し、実験の失敗につながる。かような現象は、生物学的製剤、例えば、ワクチンの生産に悪影響を及ぼすことになる。これは、マイコプラズマ汚染が経済的にも深刻な問題を引き起こすということを示している。
【０００５】
細胞培養に伴う深刻なマイコプラズマ汚染による前記のような問題にもかかわらず、マイコプラズマ汚染を満足すべきレベルで除去するための方法は、まだ開発されていない。典型的には、テトラサイクリン及びキノロン系抗生物質を使用したり、あるいはペプチド及びリポペプチドのような非抗生物質を使用してマイコプラズマ汚染を除去する。しかし、その場合でもマイコプラズマ汚染は完全には除去されず、また完全な除去のためにかような物質を高濃度で使用すると細胞毒性及び抗生物質耐性が発生しうる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、アンフィジノールを生成する菌株を培養して得られた菌体（ｂｉｏｍａｓｓ）の抽出物、または前記抽出物から得られた分画物を使用して細胞を培養することによって、マイコプラズマ汚染可能性を防止するための細胞培養方法を提供する。
本発明はまた、前記抽出物または分画物を使用して細胞を培養することによって、マイコプラズマで汚染された細胞からマイコプラズマ汚染を除去する方法を提供する。
本発明はまた、単一細胞分離用の酵素溶液による処理及び細胞集塊の除去を含む、マイコプラズマで汚染された細胞からマイコプラズマ汚染を除去する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一態様により、アンフィジノールを生成する菌株、望ましくはアンフィディニウム・クレブシ（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｋｌｅｂｓｉｉ）またはアンフィディニウム・カルテレ（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｃａｒｔｅｒａｅ）を培養して得られた菌体（ｂｉｏｍａｓｓ）の抽出物、または前記抽出物から得られた分画物を含む培地中で細胞を培養することを含む、マイコプラズマ汚染防止のための細胞培養方法が提供される。
また、本発明の他の態様により、アンフィジノールを生成する菌株、望ましくはアンフィディニウム・クレブシ（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｋｌｅｂｓｉｉ）またはアンフィディニウム・カルテレ（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｃａｒｔｅｒａｅ）を培養して得られた菌体（ｂｉｏｍａｓｓ）の抽出物、または前記抽出物から得られた分画物を含む培地中で、マイコプラズマで汚染された細胞を培養することを含む、マイコプラズマで汚染された細胞からマイコプラズマ汚染を除去する方法が提供される。
また、本発明の他の態様により、（ｉ）マイコプラズマで汚染された細胞を、単一細胞分離用の酵素溶液で処理して細胞懸濁液を得る工程と、（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞懸濁液から、細胞集塊（ｃｅｌｌ  ｃｌｕｍｐｓ）を除去する工程と、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた細胞懸濁液、または前記細胞懸濁液から回収した細胞を、マイコプラズマ阻害活性を有する物質を含有した培地中で培養する工程とを含む、マイコプラズマで汚染された細胞からマイコプラズマ汚染を除去する方法が提供される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によって、赤潮発生の原因藻類として知られているアンフィディニウム・クレブシ（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｋｌｅｂｓｉｉ）、アンフィディニウム・カルテレ（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｃａｒｔｅｒａｅ）などの菌株を培養して得られた菌体（ｂｉｏｍａｓｓ）の抽出物、または前記抽出物から得られた分画物が、選択的にマイコプラズマの死滅を誘導することが明らかになった。特に、前記抽出物または分画物は、細胞培養過程でマイコプラズマ汚染を防止することができ、またマイコプラズマで汚染された細胞からマイコプラズマ汚染を除去することによって、正常細胞を得ることができるということが明らかになった。従って、本発明による細胞培養方法によれば、マイコプラズマで汚染されることなく細胞培養を安定して行うことができる。また、本発明によるマイコプラズマ汚染を除去する方法は、マイコプラズマで汚染された細胞から正常細胞を得るのに有効に利用される。
【０００９】
また、本発明によって、マイコプラズマで汚染された細胞が細胞集塊（ｃｅｌｌ  ｃｌｕｍｐｓ）を含んでいる場合には、マイコプラズマ阻害活性を有する物質が前記細胞集塊に浸透することができないということが明らかになった。特に、継代培養時、単一細胞分離用の酵素溶液で処理して得られた細胞に少量でも細胞集塊が含まれていると、細胞集塊内部に存在するマイコプラズマ汚染を根本的に防止することができない。従って、本発明においては、細胞の培養時、単一細胞分離用の酵素溶液で処理した後、細胞集塊を除去する工程をさらに行うことによって、マイコプラズマ汚染を根本的に防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】マイコプラズマ診断キットによりマイコプラズマ汚染が確認されたＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅｐＧ２及びＲａｗ２６４．７細胞株の電気泳動写真である。図１において、マイコプラズマ・ファーメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）由来のＤＮＡ（ミネルバ、Ｃａｔ．Ｎｏ．５１−０１１７、ドイツ）を陽性対照として使用し、蒸留水を陰性対照として使用した。
【図２】マイコプラズマで汚染された細胞株において、アンフィジノール３（ＡＭ３）のマイコプラズマ汚染除去活性を測定した結果である。図２において、Ｍはサイズマーカーであり、マイコプラズマ・ファーメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）由来のＤＮＡ（ミネルバ、Ｃａｔ．Ｎｏ．５１−０１１７、ドイツ）を陽性対照として使用した。
【図３】マイコプラズマで汚染された細胞株を、サーファクチン、シプロフロキサシンまたはリファンピシン単独で、あるいはアンフィジノール３（ＡＭ３）と共に処理した場合のマイコプラズマ汚染除去活性を測定した結果である。
【図４】細胞培養時におけるマイコプラズマ汚染防止活性を評価した結果である。
【図５】細胞集塊の除去工程を含むまたは含まないマイコプラズマ汚染除去処理後、１、３、６及び１０回継代培養した細胞の電気泳動写真である。図５において、マイコプラズマ・ファーメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）由来のＤＮＡ（ミネルバ、Ｃａｔ．Ｎｏ．５１−０１１７、ドイツ）を陽性対照として使用し、蒸留水を陰性対照として使用した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書で、「アンフィジノールを生成する菌株」とは、アンフィジノール（ＡＭ）として知られているポリエンポリヒドロキシ（ｐｏｌｙｅｎｅ−ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙ）化合物を生産することができる菌株を意味する。現在までのところ、１５種のＡＭ（ＡＭ１ないしＡＭ１５）が知られているが、これらのＡＭに由来する多様な類似体（ａｎａｌｏｇｕｅｓ）もＡＭに含まれると理解される。また、渦鞭毛藻類（Ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ）に属するアンフィディニウム・クレブシ（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｋｌｅｂｓｉｉ）及びアンフィディニウム・カルテレ（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｃａｒｔｅｒａｅ）のみがアンフィジノールを生産する菌株として知られているが、その活性（すなわち、アンフィジノール生成能）を有するあらゆる組換え菌株及び変異株もアンフィジノールを生成する菌株として理解される。また、前記アンフィジノール類似体（ａｎａｌｏｇｕｅｓ）を生成する菌株、その組換え菌株及び変異株も前記アンフィジノールを生成する菌株として理解される。
【００１２】
本発明は、アンフィジノールを生成する菌株、望ましくはアンフィディニウム・クレブシ（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｋｌｅｂｓｉｉ）またはアンフィディニウム・カルテレ（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｃａｒｔｅｒａｅ）を培養して得られた菌体（ｂｉｏｍａｓｓ）の抽出物、または前記抽出物から得られた分画物を含む培地中で細胞を培養することを含む、マイコプラズマ汚染防止のための細胞培養方法を提供する。
【００１３】
渦鞭毛藻類（Ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ）に属する前記菌株アンフィディニウム・クレブシ（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｋｌｅｂｓｉｉ）及びアンフィディニウム・カルテレ（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｃａｒｔｅｒａｅ）は、赤潮発生の原因藻類として知られている。前記菌株の培養、菌体の抽出及び分画（ｆｒａｃｔｉｏｎｉｚｉｎｇ）は、公知の方法、例えば、Ｇｏｐａｌ  Ｋ．Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９７）５：１２４−１２８；Ｔｏｓｈｉｈｉｒｏ  Ｈｏｕｄａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５７（２００１）：５５５１−５５５５；またはＲｅｉｋｏ  Ｅｃｈｉｇｏｙａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈａｒｍｆｕｌ  ａｌｇａｅ  ４（２００５）：３８３−３８９に開示された方法によって遂行可能である。
【００１４】
例えば、前記菌株アンフィディニウム・クレブシ（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｋｌｅｂｓｉｉ）の培養は、明条件下、海水を含む培養器中で行われ、得られる菌体（ｂｉｏｍａｓｓ）は、グラスフィルターで濾過することによって回収可能である。
【００１５】
また、菌体の抽出は、得られた菌体をＣ１〜Ｃ４アルコール（望ましくはメタノール）及びアセトン、水及びエチルアセテート、ならびにｎ−ブタノールで順次抽出することによって、遂行可能である。具体的には、前記抽出物は、（ａ）前記菌体を、Ｃ１〜Ｃ４アルコール及びアセトンで抽出する工程と、（ｂ）工程（ａ）で得られた抽出物を水及びエチルアセテートで抽出し、水層を分離する工程と、（ｃ）工程（ｂ）で得られた水層をｎ−ブタノールで抽出し、ｎ−ブタノール層を分離する工程とを含む抽出工程を遂行して得られる。工程（ａ）において、前記抽出は、Ｃ１〜Ｃ４アルコール及びアセトンの混合溶媒を使用して遂行してもよい。また前記抽出は、前記菌体をＣ１〜Ｃ４アルコールで抽出して第１抽出物を得て、残っている菌体をアセトンで抽出して第２抽出物を得て、前記第１抽出物及び第２抽出物を混合することによって、遂行してもよい。前記Ｃ１〜Ｃ４アルコール及びアセトンの使用量は限定されず、例えば、菌体重量の１０ないし３００倍容量（ｍｌ／ｇ）の範囲であってもよい。工程（ｂ）において、水とエチルアセテートとの重量比は、１：２ないし１：５の範囲であってよく、その使用量は、工程（ａ）で得られた抽出物重量の１０ないし５０倍容量（ｍｌ／ｇ）の範囲であってもよい。工程（ｃ）において、ｎ−ブタノール抽出後分離されたｎ−ブタノール層を、減圧乾燥などの一般的な乾燥方法によって乾燥することによって、粉末状の抽出物を得ることができる。
【００１６】
また、前記分画（ｆｒａｃｔｉｏｎｉｚｉｎｇ）も、公知の方法、例えば、Ｇｏｐａｌ  Ｋ．Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９７）５：１２４−１２８；Ｔｏｓｈｉｈｉｒｏ  Ｈｏｕｄａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５７（２００１）：５５５１−５５５５；またはＲｅｉｋｏ  Ｅｃｈｉｇｏｙａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈａｒｍｆｕｌ  ａｌｇａｅ  ４（２００５）：３８３−３８９に開示された方法によって遂行可能である。例えば、前記ｎ−ブタノール抽出物について、５０％メタノールを使用したＨＷ−４０（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、Ｔｏｓｏｈ）カラムクロマトグラフィ、１００％メタノールを使用したセファデックスＬＨ−２０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ）カラムクロマトグラフィ、及び０〜５０％アセトニトリルを使用したＯＤＳ（ＹＭＣ、ＯＤＳ−ＡＱ）カラムクロマトグラフィを順次遂行し、次いで溶媒としてアセトニトリルを使用した逆相ＨＰＬＣを遂行する。前記分画により、アンフィジノール（ＡＭ）として知られている下記ポリエンポリヒドロキシ（ｐｏｌｙｅｎｅ−ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙ）化合物（ＡＭ１〜ＡＭ１５）を得ることができる。
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【００１７】
前記分画物において、アンフィジノール１（ＡＭ１）、アンフィジノール２（ＡＭ２）、アンフィジノール３（ＡＭ３）、アンフィジノール４（ＡＭ４）、アンフィジノール５（ＡＭ５）、アンフィジノール６（ＡＭ６）、アンフィジノール７（ＡＭ７）及びアンフィジノール９（ＡＭ９）の化合物、特にアンフィジノール３（ＡＭ３）が、選択的にマイコプラズマの死滅を誘導することによってすぐれた活性を示すことが本発明によって明らかになった。ＡＭ１、ＡＭ２、ＡＭ３、ＡＭ４、ＡＭ５、ＡＭ６、ＡＭ７及びＡＭ９の化学構造は、下記化学式１ないし８の通りである。
【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【化１４】
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【化１５】
2013512686.tif 000017
【００１８】
本発明によるマイコプラズマ汚染防止のための細胞培養方法において、使用可能である細胞は、マイコプラズマ汚染が起こりやすいことが知られているあらゆる細胞を含み、例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞株、ＨｅｐＧ２細胞株、Ｒａｗ２６４．７細胞株などを列挙することができるが、これらに限定されるものではない。使用可能である培地は、培養される細胞に適していると知られているあらゆる培地であってもよい。
【００１９】
前記マイコプラズマ汚染防止のための細胞培養方法において、培地中の前記抽出物または分画物の濃度は、０．１ｎＭないし１００μＭ、望ましくは１ｎＭないし１μＭ、さらに望ましくは５ｎＭないし１００ｎＭの範囲である。
【００２０】
また、前記培地は、前記抽出物または分画物に追加して、マイコプラズマ阻害活性を有すると知られている抗生物質あるいはリポペプチドを含んでもよい。例えば、シプロフロキサシン、ドキシサイクリン、リファンピシン、クロラムフェニコール、プラスモシン（Ｐｌａｓｍｏｃｉｎ）、クリンダマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、テトラサイクリン、チアムリンのような抗生物質；またはサーファクチン、アラメチシン、セクロピンＰ１、グロボマイシン、グラミシジンＳ、マガイニン２、メリチン、ポリミキシンＢ、チロシン、バリノマイシンのようなリポペプチドをさらに含んでもよい。本発明の一実施形態において、前記培地は、サーファクチン１ないし５０μＭ、シプロフロキサシン０．１ないし１００μｇ／ｍｌ、またはリファンピシン０．１ないし１００μｇ／ｍｌをさらに含んでもよい。
【００２１】
本発明はまた、前記抽出物または分画物を含む培地中で、マイコプラズマで汚染された細胞を培養することを含む、マイコプラズマで汚染された細胞からマイコプラズマ汚染を除去する方法を提供する。
【００２２】
マイコプラズマで汚染された細胞からマイコプラズマ汚染を除去する本発明の方法において、前記マイコプラズマで汚染された細胞は、マイコプラズマで汚染されたあらゆる種類の細胞を含み、例えば、マイコプラズマに感染したＮＩＨ３Ｔ３細胞株、ＨｅｐＧ２細胞株、Ｒａｗ２６４．７細胞株であるが、これらに限定されるものではない。前記マイコプラズマで汚染された細胞は、一般的な培養を通じて得られたマイコプラズマで汚染された細胞、継代培養に着手したあるいは継代培養中であるマイコプラズマで汚染された細胞、または継代培養を完了し、試験に使用する直前のマイコプラズマで汚染された細胞のいずれであってもよい。例えば、本発明による方法は、継代培養に着手したあるいは継代培養中であるマイコプラズマで汚染された細胞に適用可能である。マイコプラズマで汚染された細胞は、培地を除去し、例えばリン酸緩衝溶液で１回または２回洗浄して準備される。前記培地は、培養対象の汚染された細胞（すなわち、マイコプラズマに感染した細胞）に適していると知られている培地であれば制限なく使用することが可能である。
【００２３】
前記マイコプラズマ汚染を除去する方法において、培地中の前記抽出物または分画物の濃度は、０．１ｎＭないし１００μＭ、望ましくは１ｎＭないし１μＭ、さらに望ましくは５ｎＭないし１００ｎＭの範囲である。
【００２４】
また、前記培地は、前記抽出物または分画物に追加して、マイコプラズマ阻害活性を有すると知られている抗生物質あるいはリポペプチドを含んでもよい。例えば、シプロフロキサシン、ドキシサイクリン、リファンピシン、クロラムフェニコール、プラスモシン（Ｐｌａｓｍｏｃｉｎ）、クリンダマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、テトラサイクリン、チアムリンのような抗生物質；またはサーファクチン、アラメチシン、セクロピンＰ１、グロボマイシン、グラミシジンＳ、マガイニン２、メリチン、ポリミキシンＢ、チロシン、バリノマイシンのようなリポペプチドをさらに含んでもよい。本発明の一実施形態において、前記培地は、サーファクチン１ないし５０μＭ、シプロフロキサシン０．１ないし１００μｇ／ｍｌ、またはリファンピシン０．１ないし１００μｇ／ｍｌをさらに含んでもよい。
【００２５】
前記マイコプラズマで汚染された細胞の培養、すなわち、マイコプラズマで汚染された細胞の前記抽出物または分画物による処理は、例えば、一般的な細胞培養時間の間培養することによって行われ、必要な場合、前記抽出物または分画物を含有した培地中で前記細胞を継代培養することによって遂行可能である。このように培養された細胞では、もはやマイコプラズマが検出されず効果的に除去されているので、マイコプラズマ感染のない正常細胞を生産することが可能である。
【００２６】
本発明によって、マイコプラズマで汚染された細胞が細胞集塊（ｃｅｌｌ  ｃｌｕｍｐｓ）を含んでいる場合には、マイコプラズマ阻害活性を有する物質が前記細胞集塊に浸透することができないということが明らかになった。特に、継代培養時、単一細胞分離用の酵素溶液で処理して得られた細胞に少量でも細胞集塊が含まれていると、細胞集塊内部に存在するマイコプラズマ汚染を根本的に防止することができない。従って、本発明においては、細胞の培養時、単一細胞分離用の酵素溶液で処理した後、細胞集塊を除去する工程をさらに行うことによって、マイコプラズマ汚染を根本的に防止することができる。
【００２７】
すなわち、本発明の他の態様により、（ｉ）マイコプラズマで汚染された細胞を、単一細胞分離用の酵素溶液で処理して細胞懸濁液を得る工程と、（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞懸濁液から、細胞集塊（ｃｅｌｌ  ｃｌｕｍｐｓ）を除去する工程と、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた細胞懸濁液、または前記細胞懸濁液から回収した細胞を、マイコプラズマ阻害活性を有する物質を含有した培地中で培養する工程とを含む、マイコプラズマで汚染された細胞からマイコプラズマ汚染を除去する方法が提供される。
【００２８】
細胞集塊の除去工程を含む本発明による方法は、マイコプラズマで汚染された細胞を、単一細胞分離用の酵素溶液で処理して細胞懸濁液を得る工程［すなわち、工程（ｉ）］を含む。
【００２９】
前記マイコプラズマで汚染された細胞は、マイコプラズマで汚染されたあらゆる種類の細胞を含み、例えば、マイコプラズマに感染したＮＩＨ３Ｔ３細胞株、ＨｅｐＧ２細胞株、Ｒａｗ２６４．７細胞株であるが、これらに限定されるものではない。前記マイコプラズマで汚染された細胞は、一般的な培養を通じて得られたマイコプラズマで汚染された細胞、継代培養に着手したあるいは継代培養中であるマイコプラズマで汚染された細胞、または継代培養を完了し、試験に使用する直前のマイコプラズマで汚染された細胞のいずれであってもよい。例えば、本発明による方法は、継代培養に着手したあるいは継代培養中であるマイコプラズマで汚染された細胞に適用可能である。前記マイコプラズマで汚染された細胞は、培地を除去し、例えばリン酸緩衝溶液で１回または２回洗浄することによって、続いて行う酵素溶液処理のために準備される。
【００３０】
前記単一細胞分離用の酵素溶液は、培養プレート（例えば、培養皿、培養フラスコあるいは培養器）に固定されて増殖した細胞を、単一細胞（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ）の形態に解離するのに使われる酵素溶液であるならば、制限なく使用可能である。例えば、前記単一細胞分離用の酵素溶液は、トリプシン及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有する溶液（一般的に、「トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）」と呼ばれる）である。また、前記単一細胞分離用の酵素溶液は、細胞を培養プレートから剥離するのに使われる一般的な細胞分離溶液（ｃｅｌｌ  ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に使われるプロテアーゼ及びコラゲナーゼなどを含んでもよい。望ましくは、トリプシン及びＥＤＴＡを含有する溶液が使われ、トリプシンとＥＤＴＡとの重量比は、約２５：１であって、それぞれの濃度（例えば、リン酸緩衝液中の濃度）は、０．０２５％及び０．００１％であるが、これに限定されるものではない。また、Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ−００１−１００）のような市販の試薬も、前記トリプシン−ＥＤＴＡ溶液として使用可能である。トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を包含する、単一細胞分離用の酵素溶液は、細胞培養分野で一般的に使われる量で使用可能である。
【００３１】
前記酵素溶液処理は、細胞（例えば、リン酸緩衝溶液で洗浄して培地を除去した細胞）に単一細胞分離用の酵素溶液を加え、約３７℃で約１０分間インキュベーションし、ＤＭＥＭ培地などを加えて細胞懸濁液を得た後、前記細胞懸濁液を遠心分離して上澄液を除去することによって、遂行可能である。次いで、得られた細胞にＤＭＥＭ培地などの細胞培養用培地を加えることにより、細胞懸濁液が得られる。
【００３２】
細胞集塊の除去工程を含む本発明による方法は、工程（ｉ）で得られた細胞懸濁液から、細胞集塊（ｃｅｌｌ  ｃｌｕｍｐｓ）を除去する工程［すなわち、工程（ｉｉ）］を含む。
【００３３】
前記細胞集塊を除去する方法は、細胞集塊を除去することができる方法であるならば、制限なく使用可能である。例えば、適切なポア（ｐｏｒｅ）サイズを有するフィルターで濾過することによって、細胞集塊を除去することができる。本発明の一実施形態において、工程（ｉｉ）は、工程（ｉ）で得られた細胞懸濁液を、１０ないし１００μｍ、望ましくは３０ないし７０μｍ、さらに望ましくは約４０μｍのポアサイズを有するフィルターで濾過することによって、遂行可能である。
【００３４】
細胞集塊の除去工程を含む本発明による方法は、工程（ｉｉ）で得られた細胞懸濁液、または前記細胞懸濁液から回収した細胞を、マイコプラズマ阻害活性を有する物質を含有した培地で培養する工程［すなわち、工程（ｉｉｉ）］を含む。
【００３５】
工程（ｉｉ）で得られた細胞懸濁液は、培地を使用して培養に適した細胞濃度に調節可能である。また、工程（ｉｉ）で得られた細胞懸濁液からの細胞回収は、遠心分離法のような一般的な方法で行うことができる。また、工程（ｉｉｉ）の前記培地は、培養される細胞に適していると知られている培地であれば制限なく使用可能であり、必要によっては前記培地は、ＦＢＳなどのサイトカインが補充されていてもよい。
【００３６】
本発明による方法は、前記工程（ｉ）ないし工程（ｉｉｉ）を反復して行うことにより遂行され、例えば、前記工程（ｉ）ないし工程（ｉｉｉ）を２回ないし４回反復して行ってもよい。
【００３７】
前記マイコプラズマ阻害活性を有する物質は、マイコプラズマ阻害のために使われる公知の物質であってもよい。例えば、前記マイコプラズマ阻害活性を有する物質の例は、６−メチルプリンデオキシリボシド（６−ｍｅｔｈｙｌｐｕｒｉｎｅ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｉｄｅ）、６−メチルプリンリボシド（６−ｍｅｔｈｙｌｐｕｒｉｎｅ  ｒｉｂｏｓｉｄｅ）、シプロフロキサシン、ドキシサイクリン、リファンピシン、クロラムフェニコール、プラスモシン、クリンダマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、テトラサイクリン、チアムリン、サーファクチン、アラメチシン、セクロピンＰ１、グロボマイシン、グラミシジンＳ、マガイニン２、メリチン、ポリミキシンＢ、チロシン、バリノマイシンなどの抗生物質、ペプチドあるいはリポペプチドを含む。前記抗生物質またはリポペプチド（あるいはペプチド）の使用量は、公知の文献によって適切に決定される。また、市販のマイコプラズマ除去用試薬、例えば、ＬｏｏｋＯｕｔ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、ＢＭ−ｃｙｃｌｉｎ（Ｒｏｃｈｅ）などを使ってもよい。
【００３８】
望ましくは、前記マイコプラズマ阻害活性を有する物質は、アンフィジノールを生成する菌株を培養して得られた菌体（ｂｉｏｍａｓｓ）の抽出物、または前記抽出物から得られた分画物である。前記アンフィジノールを生成する菌株、菌体の抽出物及び分画物は、前述の通りである。
【００３９】
前述のように、前記分画物において、アンフィジノール１（ＡＭ１）、アンフィジノール２（ＡＭ２）、アンフィジノール３（ＡＭ３）、アンフィジノール４（ＡＭ４）、アンフィジノール５（ＡＭ５）、アンフィジノール６（ＡＭ６）、アンフィジノール７（ＡＭ７）及びアンフィジノール９（ＡＭ９）の化合物が望ましい。アンフィジノール３（ＡＭ３）がさらに望ましい。
【００４０】
培地中の前記抽出物または分画物の濃度は、０．１ｎＭないし１００μＭ、望ましくは１ｎＭないし１μＭ、さらに望ましくは５ｎＭないし１００ｎＭである。
【実施例】
【００４１】
以下、本発明について実施例により、さらに詳細に説明する。しかし、これら実施例は、説明のためだけに提供されるものであり、本発明はそれらによって限定されるものではない。
【００４２】
実施例１．アンフィジノール誘導体の分離
Ｇｏｐａｌ  Ｋ．Ｐａｕｌらの報告（Ｇｏｐａｌ  Ｋ．Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９７）５：１２４−１２８）に従って、アンフィディニウム・クレブシ（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｋｌｅｂｓｉｉ）からアンフィジノール誘導体を分離した。アンフィディニウム・クレブシ（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｋｌｅｂｓｉｉ）を、海水２リットルを含む５リットル培養器３台で、２４℃で照度１６ルクスの明条件下で４週間培養した後、グラスフィルターで濾過し、藻類バイオマス（ｂｉｏｍａｓｓ）を回収した。前記藻類バイオマス２５ｇを、メタノール１リットルで３回抽出した。その後、アセトン３００ｍｌを使用して、さらに３回抽出した。これらの抽出物を混合した後、蒸発器（ｒｏｔａｒｙ  ｖａｃｕｕｍ  ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ、Ｂｕｃｈｉ  Ｒ−２０５、Ｆｌａｗｉｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して揮発性溶液を留去した。水とエチルアセテート（１：４、ｖ／ｖ）との混合溶液４００ｍｌを、残存する不揮発性層に加えた後、水層を分離した。前記水層をｎ−ブタノールで抽出し、ｎ−ブタノール層を分離した。前記ｎ−ブタノール層の一部を減圧乾燥し、粉末（以下、「ブタノール抽出物」と称する）を得た。残りのｎ−ブタノール層は、下記の分画工程に供した。
【００４３】
前記残りのｎ−ブタノール層に対して、５０％メタノールを使用したＨＷ−４０（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、Ｔｏｓｏｈ）カラム、溶媒として１００％メタノールを使用したセファデックスＬＨ−２０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ）カラム、及び溶媒として０〜５０％アセトニトリルを使用したＯＤＳ（ＹＭＣ、ＯＤＳ−ＡＱ）カラムによるカラムクロマトグラフィを順次遂行した。最後に、溶媒として３３％アセトニトリルを使用した逆相ＨＰＬＣを遂行し、アンフィジノール誘導体（すなわち、ＡＭ１〜ＡＭ１５）を分離した。Ｌｅｏ  Ａ．Ｐａｑｕｅｔｔｅの方法（Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，２００５，７（１４），ｐｐ３１１１−３１１４）に従い、ＤＭＳＯ−ｄ６を溶媒として、５００ＭＨｚで１Ｈ−ＮＭＲ及び１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ測定を行い、得られたアンフィジノール誘導体を分析した。
【００４４】
実施例２．マイコプラズマに対するアンフィジノール誘導体の影響評価
実施例１で得られた抽出物及びアンフィジノール誘導体のマイコプラズマに対する影響を評価するために、マイコプラズマ・ヒオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、ＡＴＣＣ１７９８１）をＨａｙｆｌｉｃｋの方法（Ｈａｙｆｌｉｃｋ，１９６５，Ｔｅｘ．Ｒｅｐ．Ｂｉｏ．Ｍｅｄ．２３，２８５−３０３）に従って、ウシ胎児血清と酵母エキスとを補充したＰＰＬＯ培地（ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ−ｌｉｋｅ  ｏｒｇａｎｉｓｍ  ｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ、Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＵＳＡ）で培養した。具体的には、前記培地１００μｌを９６ウェルプレートの各ウェルに入れ、サンプル（すなわち、実施例１で得られた抽出物及びアンフィジノール誘導体）を各ウェルに加えた。各サンプルは、開始濃度を１ｍｇ／ｍｌとして２倍段階希釈系列を作製し、１２ウェルずつ準備した。マイコプラズマは、ウシ胎児血清と酵母エキスとを補充したＰＰＬＯ培地（ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ−ｌｉｋｅ  ｏｒｇａｎｉｓｍ  ｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ、Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＵＳＡ）で、３７℃で４８時間培養した。得られた培養液を、ＰＰＬＯ培地を使用して、１：１０の比率に希釈した。希釈した培養液１００μｌを、前記９６ウェルプレートの各ウェルに加え、各ウェルの総量を２００μｌにした。３７℃で２４時間培養した後、４０μｌの０．２ｍｇ／ｍｌ  ＩＮＴ（ｐ−ｉｏｄｏｎｉｔｒｏｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）を添加し、さらに４時間培養した。培養後、培地がピンク色に変化すれば、マイコプラズマの代謝が活発に起こっていることを意味する。サンプルによってマイコプラズマが抑制されれば、ピンク色への色調変化はあまり起こらない。従って、色調変化の起こらない最後の濃度を測定することによって、最小阻害濃度（ＭＩＣ）を得た。その結果は、次の表１の通りである。
【００４５】
【表１】
2013512686.tif 000018
−：  阻害活性なし
＋＋：  １０〜１００μｇ／ｍｌ
＋＋＋：  １〜２０μｇ／ｍｌ
＋＋＋＋：  ０．２５〜１０μｇ／ｍｌ
【００４６】
前記表１の結果から、アンフィジノール誘導体が、マイコプラズマに対する阻害活性を有するということが分かる。特に、ＡＭ３（化学式３の化合物）は、約０．２５μｇ／ｍｌの濃度で、マイコプラズマに対してすぐれた阻害活性を示した。
【００４７】
実施例３．マイコプラズマで汚染された細胞株からのマイコプラズマの除去
（１）マイコプラズマで汚染された細胞株の取得
ソウルのさまざまな大学の実験室で構築された多様な細胞株を入手した。入手した細胞株を、ＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１２８００−０５８）中で３日間培養した後、細胞を回収した。マイコプラズマ診断キット（Ｐｒｏｍｏｋｉｎｅ社・ドイツ、セルセーフ社・韓国）を利用し、添付されたプロトコルに従ってＰＣＲを遂行した。ＰＣＲ反応産物を１％アガロースゲルで電気泳動し、マイコプラズマ汚染を測定した。その結果、３種の細胞株、すなわち、ＮＩＨ３Ｔ、ＨｅｐＧ２、Ｒａｗ２６４．７細胞株のマイコプラズマ感染が確認された（図１参照）。
【００４８】
マイコプラズマ汚染が確認されたＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅｐＧ２、Ｒａｗ２６４．７細胞株を、Ｔ−７５培養フラスコ（ＮＵＮＣ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１５６３６７）にそれぞれ１×１０６個接種した。１０％以下の血清（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１００８２−１４７）を含むＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１２８００−０５８）を添加し、３日間培養した。
【００４９】
（２）マイコプラズマで汚染された細胞株からのマイコプラズマの除去
マイコプラズマ汚染が確認されたＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅｐＧ２、Ｒａｗ２６４．７細胞株を、Ｔ−２５培養フラスコ（ＮＵＮＣ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１５６３６７）にそれぞれ１×１０５個接種した。１０％以下の血清（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１００８２−１４７）を含むＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１２８００−０５８）を添加し、２０μｇ／ｍｌのアンフィジノール３（ＡＭ３）を添加した。３日間培養した後、得られた細胞をＴｒｙｓｉｎｅ−ＥＤＴＡで処理して細胞液を得た。このアンフィジノール３（ＡＭ３）で処理した細胞（１×１０５個）を接種した。１０％以下の血清（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１００８２−１４７）を含むＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１２８００−０５８）を添加し、２０μｇ／ｍｌのアンフィジノール３（ＡＭ３）を添加した。３日間培養した後、細胞を回収した。マイコプラズマ診断キット（Ｐｒｏｍｏｋｉｎｅ社・ドイツ、セルセーフ社・韓国）を利用し、添付されたプロトコルに従ってＰＣＲを遂行した。得られたＰＣＲ反応産物を１％アガロースゲルで電気泳動し、マイコプラズマ汚染を測定した。その結果を図２に示す。図２の結果から、アンフィジノール３（ＡＭ３）で処理したいずれの細胞株においても、マイコプラズマ汚染が完全に除去されていることが分かる。
【００５０】
（３）アンフィジノール３（ＡＭ３）と環状リポペプチド／抗生物質との同時処理
マイコプラズマで汚染された細胞株としてＨｅｐＧ２を使用し、アンフィジノール３（ＡＭ３）で処理する代わりに、アンフィジノール３（ＡＭ３）５μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌを、サーファクチン［１０μＭまたは２０μＭ］、シプロフロキサシン［１μｇ／ｍｌまたは５μｇ／ｍｌ］、あるいはリファンピシン［０．５μｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌ］と共に使用したことを除いては、前記（２）と同じ方法でマイコプラズマ汚染を測定した。その結果を図３に示す。図３の結果から、サーファクチン、シプロフロキサシンまたはリファンピシン単独で処理したときには、マイコプラズマ汚染が残存することが分かる。しかし、サーファクチン、シプロフロキサシンまたはリファンピシンを、アンフィジノール３（ＡＭ３）と共に使用した場合には、マイコプラズマ汚染が完全に除去された。
【００５１】
実施例４．細胞培養時のマイコプラズマ汚染に対する防止活性評価
マイコプラズマで汚染されていないＨｅｐＧ２細胞株を、１０％以下の血清（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１００８２−１４７）を含有するＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１２８００−０５８）に１×１０５個接種した。前記細胞株を、アンフィジノール３（ＡＭ３）２０μｇ／ｍｌ及びサーファクチン２０μＭで処理した後、マイコプラズマ・ヒオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、ＡＴＣＣ１７９８１）１×１０３ｃｆｕを接種した。前記細胞株を、培養器で、３７℃、５％ＣＯ２の条件で３日間培養した。１週間に２回継代培養し、週ごとに細胞を回収した。マイコプラズマ診断キット（Ｐｒｏｍｏｋｉｎｅ社・ドイツ、セルセーフ社・韓国）を利用し、添付されたプロトコルに従ってＰＣＲを遂行した。得られたＰＣＲ反応産物を１％アガロースゲルで電気泳動し、マイコプラズマ汚染を測定した。その結果を図４に示す。図４の結果から、マイコプラズマ汚染を人為的に誘導したにもかかわらず、得られた細胞は、マイコプラズマで汚染されることなく安定して培養されたことが分かる。
【００５２】
実施例５．細胞集塊の除去によるマイコプラズマ除去能の評価
（１）フィルター処理後の継代培養時のマイコプラズマ除去能評価
実施例３の（１）で、Ｔ−７５培養フラスコで培養されたマイコプラズマ感染が確認された細胞培養物（８０〜９０％コンフルエント）から培地を除去した。得られた細胞を、リン酸緩衝溶液１０ｍｌを使用して２回洗浄した。トリプシン−ＥＤＴＡ ２ｍｌを添加し、３７℃で１０分間インキュベーションして細胞を剥離した。次いで、ＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１２８００−０５８）を加えて１０ｍｌの細胞懸濁液を得て、これを１５ｍｌコニカルチューブに移した。コニカルチューブの細胞懸濁液を、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上澄液を除去した。前記コニカルチューブに、５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１２８００−０５８）１０ｍｌを加えて細胞懸濁液を得た。得られた細胞懸濁液を、５ｍｌずつ２つに分けた。第１群の細胞懸濁液は、４０μｍのポアサイズを有するフィルターを通過させ、第２群の細胞懸濁液は、フィルター処理を行わなかった。第１群及び第２群の細胞懸濁液を、５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１２８００−０５８）で希釈し、細胞の濃度をそれぞれ、約２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調節した。得られた第１群及び第２群の細胞懸濁液（それぞれ約２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞を含む）それぞれ４ｍｌを、１５ｍｌチューブに移した後、５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１２８００−０５８）を、５．５ｍｌずつ加え、それぞれＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ−ｉｎｉｔｉａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｃａｔ．ｎｏ．Ｍ４５６９）５００μｌで処理した。得られたそれぞれの混合液１０ｍｌをＴ−７５培養フラスコに移した後、ＣＯ２培養器で３日間培養した（第１継代処理）。
【００５３】
３日間Ｔ−７５培養フラスコで培養された培養物（８０〜９０％コンフルエント）から培地を除去した。得られた細胞を、リン酸緩衝溶液１０ｍｌを使用して２回洗浄した。トリプシン−ＥＤＴＡ ２ｍｌを添加し、３７℃で１０分間インキュベーションして細胞を剥離した。次いで、ＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１２８００−０５８）を加えて１０ｍｌの細胞懸濁液を得て、これを１５ｍｌコニカルチューブに移した。コニカルチューブの細胞懸濁液を、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上澄液を除去した。前記コニカルチューブに、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１２８００−０５８）１０ｍｌを加えて細胞懸濁液を得た。得られた細胞懸濁液を、５ｍｌずつ２つに分けた。前記と同様に、第１群の細胞懸濁液は、４０μｍのポアサイズを有するフィルターを通過させ、第２群の細胞懸濁液は、フィルター処理を行わなかった。第１群及び第２群の細胞懸濁液を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１２８００−０５８）で希釈し、細胞の濃度をそれぞれ約２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調節した。得られた第１群及び第２群の細胞懸濁液（それぞれ約２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞を含む）それぞれ４ｍｌを、１５ｍｌチューブに移した後、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１２８００−０５８）を５．５ｍｌずつ加え、それぞれＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ−Ｆｉｎａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｃａｔ．ｎｏ．Ｍ４４４４）５００μｌで処理した。得られたそれぞれの混合液１０ｍｌをＴ−７５培養フラスコに移した後、ＣＯ２培養器で３日間培養した（第２継代処理）。前記継代培養をさらに２回遂行し、合計して４回の継代培養を遂行した。
【００５４】
前記４回継代培養した細胞を、それぞれ再び１代から始めて３３代までさらに継代培養し、各継代培養は、一般的な細胞培養法、すなわち、フィルター処理なしのトリプシン−ＥＤＴＡ溶液処理、及びマイコプラズマ除去用試薬を含有しない培地中での培養を行うことによって遂行した。初めの４回の継代処理の後、追加で１、３、６、１０、１２、１５及び３３回継代培養したそれぞれの細胞について、マイコプラズマ汚染を測定した。マイコプラズマが除去されているか否かは、マイコプラズマ診断キット（Ｐｒｏｍｏｋｉｎｅ社・ドイツ、セルセーフ社・韓国）を利用し、添付されたプロトコルに従って測定した。得られたＰＣＲ反応産物は、１％アガロースゲルで電気泳動し、マイコプラズマ汚染を測定した。その結果を表２に示す。また図５は、前記追加で１、３、６及び１０回継代培養した、第１群及び第２群のＮＩＨ３Ｔ３細胞の電気泳動写真を示している。
【００５５】
【表２】
2013512686.tif 000019
＊−：汚染除去、＋：汚染
【００５６】
表２の結果から、フィルター処理を行った場合、いずれの細胞株においてもマイコプラズマ汚染が完全に除去されていることが分かる。しかし、表２及び図５の結果から、細胞集塊を除去する工程を遂行していない場合、３回継代培養した細胞から、マイコプラズマＤＮＡが出現していることが分かる。
【００５７】
（２）ポアサイズによるマイコプラズマ除去能の評価
４０μｍのポアサイズを有するフィルターの代わりに、１１、２０、３０、６０、８０、９０及び１００μｍのポアサイズを有するフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）ならびに５０及び７０μｍのポアサイズを有するフィルター（Ｆａｌｃｏｎ）を使用したことを除いては、前記（１）と同じ方法で継代培養を遂行した後、マイコプラズマ汚染を測定した。その結果を下記表３に示す。
【００５８】
【表３】
2013512686.tif 000020
＊−：汚染除去、＋：汚染
【００５９】
表３の結果から、１０ないし１００μｍのポアサイズを有するフィルターを使用した場合、マイコプラズマ汚染を完全に除去することができることが分かる。
【００６０】
（４）アンフィジノール誘導体を使用した場合のマイコプラズマ除去能の評価
マイコプラズマ除去用試薬として化学式３の化合物を２μｇ／ｍｌの濃度で使用し、１１、２０、３０、６０、８０、９０及び１００μｍのポアサイズを有するフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）ならびに４０、５０及び７０μｍのポアサイズを有するフィルター（Ｆａｌｃｏｎ）を使用したことを除いては、前記（１）と同じ方法で継代培養を遂行した後、マイコプラズマ汚染を測定した。その結果を下記表４に示す。
【００６１】
【表４】
2013512686.tif 000021
＊−：汚染除去、＋：汚染
【００６２】
表４の結果から、マイコプラズマ除去用試薬として化学式３の化合物を使用し、１０ないし１００μｍのポアサイズを有するフィルターを使用した場合、マイコプラズマ汚染を完全に除去することができることが分かる。
【図１】
2013512686.tif 000046
【図２】
2013512686.tif 000047
【図３】
2013512686.tif 000048
【図４】
2013512686.tif 000049
【図５】
2013512686.tif 000050
【手続補正書】
【提出日】平成24年8月9日(2012.8.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
実施例２．マイコプラズマに対するアンフィジノール誘導体の影響評価
実施例１で得られた抽出物及びアンフィジノール誘導体のマイコプラズマに対する影響を評価するために、マイコプラズマ・ヒオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、ＡＴＣＣ１７９８１）をＨａｙｆｌｉｃｋの方法（Ｈａｙｆｌｉｃｋ，１９６５，Ｔｅｘ．Ｒｅｐ．Ｂｉｏ．Ｍｅｄ．２３，２８５−３０３）に従って、ウシ胎児血清と酵母エキスとを補充したＰＰＬＯ培地（ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ−ｌｉｋｅ  ｏｒｇａｎｉｓｍ  ｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ、Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＵＳＡ）で培養した。具体的には、前記培地１００μｌを９６ウェルプレートの各ウェルに入れ、サンプル（すなわち、実施例１で得られた抽出物及びアンフィジノール誘導体）を各ウェルに加えた。各サンプルは、開始濃度を１ｍｇ／ｍｌとして２倍段階希釈系列を作製し、１２ウェルずつ準備した。マイコプラズマは、ウシ胎児血清と酵母エキスとを補充したＰＰＬＯ培地（ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ−ｌｉｋｅ  ｏｒｇａｎｉｓｍ  ｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ、Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＵＳＡ）で、３７℃で４８時間培養した。得られた培養液を、ＰＰＬＯ培地を使用して、１：１０の比率に希釈した。希釈した培養液１００μｌを、前記９６ウェルプレートの各ウェルに加え、各ウェルの総量を２００μｌにした。３７℃で２４時間培養した後、４０μｌの０．２ｍｇ／ｍｌ  ＩＮＴ（ｐ−ｉｏｄｏｎｉｔｒｏｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）を添加し、さらに４時間培養した。培養後、培地がピンク色に変化すれば、マイコプラズマの代謝が活発に起こっていることを意味する。サンプルによってマイコプラズマが抑制されれば、ピンク色への色調変化はあまり起こらない。従って、色調変化の起こらない最後の濃度を測定することによって、５０％抑制濃度（ＩＣ５０）を得た。その結果は、次の表１の通りである。
【国際調査報告】
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