(57)【要約】凝血の部位に対して治療剤を局在化させる（例えば、血小板に対して標的化されること、または凝血の部位で活性化され得ることによる）キメラの凝固因子であって、クリアランス速度が低下されるか、製造可能性が改善されるか、血栓形成性が低下されるか、活性が向上されるか、またはこれらの特徴の２つ以上を有している、キメラの凝固因子、同様にキメラの凝固因子を作製するための方法、およびこれらの凝固因子を用いて止血を改善するための方法も記載される。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラの凝固因子であって、ｉ）ＦＶＩＩ、ＦＩＸおよびＦＸからなる群より選択される凝固因子と、ｉｉ）血小板に結合する標的部分と、ｉｉｉ）前記凝固因子と前記標的部分との間のスペーサー部分と、を含む、キメラの凝固因子。
【請求項２】
請求項１に記載のキメラの凝固因子であって、式Ａ  Ｂ  Ｃによって示される構造を含み、ここでＡは凝固因子であり；ここでＢはスペーサー部分であり；かつここでＣは、血小板に結合する、少なくとも１つの標的部分である、キメラの凝固因子。
【請求項３】
請求項２に記載のキメラの凝固因子であって：Ａ  Ｂ  Ｃ；Ｃ  Ｂ  Ａからなる群より選択される式によって提示されるアミノ末端からカルボキシ末端の構造を含む、キメラの凝固因子。
【請求項４】
前記キメラの凝固因子が、少なくとも１つの標的部分を欠いている適切なコントロールと比較した場合、血小板の存在下でトロンビンの生成の増大を示す、請求項１に記載のキメラの凝固因子。
【請求項５】
さらに、足場部分および必要に応じて第二のスペーサー部分を含む、請求項１に記載のキメラの凝固因子。
【請求項６】
請求項５に記載のキメラの凝固因子であって、さらにＤおよびＥを含み、ここでＤがスペーサー部分であり；かつＥが足場部分であり、かつここで前記キメラの凝固因子が：Ａ  Ｂ  Ｃ  Ｄ  Ｅ；Ａ  Ｄ  Ｅ  Ｂ  Ｃ；Ｅ  Ｄ  Ａ  Ｂ  Ｃ；Ｃ  Ｂ  Ａ  Ｄ  Ｅ；Ｅ  Ｄ  Ｃ  Ｂ  Ａ；およびＣ  Ｂ  Ｅ  Ｄ  Ａ、からなる群より選択される式によって提示されるアミノ末端からカルボキシ末端の構造を含む、キメラの凝固因子。
【請求項７】
Ｅが、第一のＦｃ部分Ｆ１および第二のＦｃ部分Ｆ２を含んでいる二量体Ｆｃ領域である、請求項６に記載のキメラの凝固因子。
【請求項８】
請求項７に記載のキメラの凝固因子であって、前記凝固因子が、２つのＦｃ部分の間に差し込まれた切断性ｓｃＦｃ（ｃｓｃＦｃ）リンカーを含むポリペプチドとして発現され、ここでｃｓｃＦｃリンカーが、ｃｓｃＦｃポリペプチドリンカーの切断を生じる少なくとも１つの酵素的切断部位に隣接する、キメラの凝固因子。
【請求項９】
前記ｃｓｃＦｃリンカーが、ｃｓｃＦｃリンカーの切断を生じる少なくとも１つの酵素的切断部位に隣接する、請求項８に記載のキメラの凝固因子。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの酵素的切断部位が、細胞内プロセシング部位である、請求項９に記載のキメラの凝固因子。
【請求項１１】
前記ポリペプチドリンカーが、同じ酵素によってまたは異なる酵素によって認識される、２つの酵素的切断部位に隣接される、請求項９に記載のキメラの凝固因子。
【請求項１２】
前記ポリペプチドリンカーが、約１０アミノ酸〜約５０アミノ酸の長さを有する、請求項９に記載のキメラの凝固因子。
【請求項１３】
前記ポリペプチドリンカーが、約２０アミノ酸〜約３０アミノ酸の長さを有する、請求項９に記載のキメラの凝固因子。
【請求項１４】
前記ポリペプチドリンカーが、ｇｌｙ／ｓｅｒペプチドを含む、請求項９に記載のキメラの凝固因子。
【請求項１５】
前記ｇｌｙ／ｓｅｒペプチドが、式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、またはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎのペプチドであり、ここでｎが、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群より選択される、正の整数である請求項１４に記載のキメラの凝固因子。
【請求項１６】
前記（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカーが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４およびＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４からなる群より選択される、請求項１５に記載のキメラの凝固因子。
【請求項１７】
前記凝固因子が、２つのポリペプチド鎖を含む、請求項８に記載のキメラの凝固因子。
【請求項１８】
請求項７に記載のキメラの凝固因子であって、ここで前記キメラの凝固因子が、スペーサー部分を介してＦ１に連結されたＡおよびＦ２に連結されたＣと；スペーサー部分を介してＦ１に連結されたＡおよびスペーサー部分を介してＦ２に連結されたＣと；Ｆ１に連結されたＡおよびスペーサー部分を介してＦ２に連結されるＣと；スペーサー部分を介してＦ１に連結されるＡおよびスペーサー部分を介してＦ２に連結されるＣと、からなる群より選択される構造を有する、キメラの凝固因子。
【請求項１９】
請求項１８に記載のキメラの凝固因子であって、２つのポリペプチドを含み、ここで前記第一のポリペプチドが、部分Ａ  ＢＦ１；Ａ  ＢＦ１；Ａ  ＢＦ１、Ａ  ＢＦ１  Ｄ  Ｃを含み、および前記第二のポリペプチドが部分ＣＦ２；Ｃ  ＤＦ２；：Ｆ２  Ｄ  Ｃ、Ｆ２  Ｄ  Ｃを含み、ここで前記２つのポリペプチド鎖が、Ｆｃ領域を形成する、キメラの凝固因子。
【請求項２０】
前記標的部分が、Ｆｃ領域のポリペプチド鎖の少なくとも１つに融合される、請求項７に記載のキメラの凝固因子。
【請求項２１】
前記標的部分が、Ｆ１およびＦ２のうちの少なくとも１つに直接融合される、請求項７に記載のキメラの凝固因子。
【請求項２２】
前記標的部分が、スペーサー部分を介してＦ１およびＦ２のうちの少なくとも１つに融合される、請求項７に記載のキメラの凝固因子。
【請求項２３】
前記標的部分が、切断リンカーを介してＦ１およびＦ２のうちの少なくとも１つに融合される、請求項７に記載のキメラの凝固因子。
【請求項２４】
前記標的部分が：抗体分子、抗体分子の抗原結合フラグメント、ｓｃＦｖ分子、レセプターのレセプター結合部分、ペプチド、からなる群より選択される、請求項１に記載のキメラの凝固因子。
【請求項２５】
前記標的部分が、休止血小板に結合する、請求項１、２、５または７に記載のキメラの凝固因子。
【請求項２６】
前記標的部分が、活性化血小板に選択的に結合する、請求項１、２、５または７に記載のキメラの凝固因子。
【請求項２７】
前記標的部分が：ＧＰＩｂａ、ＧＰＶＩ、およびＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの不活性型からなる群より選択される標的に対して選択的に結合する、請求項２５に記載のキメラの凝固因子。
【請求項２８】
前記標的部分が：ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの活性型、Ｐセレクチン、ＧＭＰ−３３、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ＣＤ４０Ｌ、およびＬＯＸ−１からなる群より選択される標的に対して選択的に結合する、請求項２６に記載のキメラの凝固因子。
【請求項２９】
前記標的部分が、ＧＰＩｂ複合体に結合する、請求項２５に記載のキメラの凝固因子。
【請求項３０】
前記標的部分が：ＰＳ４、ＯＳ１、およびＯＳ２からなる群より選択されるペプチドである、請求項２５に記載のキメラの凝固因子。
【請求項３１】
前記標的部分が：ＳＣＥ５、ＭＢ９、およびＡＰ３からなる群より選択される抗体由来の抗体可変領域を含む、請求項２５に記載のキメラの凝固因子。
【請求項３２】
前記凝固因子が、第ＶＩＩ因子である、請求項１、２、５または７に記載のキメラの凝固因子。
【請求項３３】
前記凝固因子が、第ＶＩＩ因子の高い比活性の改変体である、請求項１、２、５または７に記載のキメラの凝固因子。
【請求項３４】
前記凝固因子が、第ＩＸ因子である、請求項１、２、５または７に記載のキメラの凝固因子。
【請求項３５】
前記凝固因子が、第ＩＸ因子の高い比活性の改変体である、請求項１、２、５または７に記載のキメラの凝固因子。
【請求項３６】
前記凝固因子が、第Ｘ因子である、請求項１、２、５または７に記載のキメラの凝固因子。
【請求項３７】
前記凝固因子が、第Ｘ因子の高い比活性の改変体である、請求項１、３、４、または５に記載のキメラの凝固因子。
【請求項３８】
前記凝固因子が、ある細胞によって活性型で分泌される、請求項８に記載のキメラの凝固因子。
【請求項３９】
前記凝固因子が、インビボで活性化される、請求項１に記載のキメラの凝固因子。
【請求項４０】
前記キメラの凝固因子が、前記凝固因子中に天然には存在しない異種の酵素的切断部位を含む、請求項３９に記載のキメラの凝固因子。
【請求項４１】
前記酵素的切断部位が、前記凝固因子の重鎖部分のアミノ末端に対して遺伝子的に融合されている、請求項４０に記載のキメラの凝固因子。
【請求項４２】
前記足場部分が、前記キメラの凝固因子の流体力学半径を増大するタンパク質分子である、請求項５に記載のキメラの凝固因子。
【請求項４３】
前記足場部分が、もし存在する場合、アルブミンおよびＸＴＥＮ（登録商標）からなる群より選択される、請求項４２に記載のキメラの凝固因子。
【請求項４４】
ＦＶＩＩを含んでいるポリペプチドであって、前記ＦＶＩＩが、凝固カスケードのある成分によって活性化され得る異種の酵素的切断部位を含む、ポリペプチド。
【請求項４５】
前記ポリペプチドが、足場部分、および必要に応じてスペーサー部分を含む、請求項４４に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
前記足場部分が、第一のＦｃ部分Ｆ１と第二のＦｃ部分Ｆ２とを含む二量体Ｆｃ領域である、請求項４５に記載のキメラの凝固因子。
【請求項４７】
前記凝固因子が、２つのポリペプチド鎖を含む、請求項４４に記載のキメラの凝固因子。
【請求項４８】
請求項４４に記載のキメラの凝固因子であって、ここで前記キメラの凝固因子は、スペーサー部分を介して第一のＦｃ部分に連結された凝固因子と；スペーサー部分を介して第二のＦｃ部分に連結された凝固因子と；Ｆ１に直接連結される凝固因子と；Ｆ２に直接連結される凝固因子と、からなる群より選択される構造を有する、凝固因子。
【請求項４９】
さらに標的部分Ｃを含む、請求項４７に記載のキメラの凝固因子。
【請求項５０】
前記キメラの凝固因子が、ｃｓｃＦｃリンカーを含んでいる単一のポリペプチド鎖として合成される、請求項４７に記載のキメラの凝固因子。
【請求項５１】
前記ｃｓｃＦｃリンカーが、前記リンカーの切断を生じる少なくとも１つの酵素的切断部位に隣接する、請求項４９に記載のキメラの凝固因子。
【請求項５２】
前記少なくとも１つの酵素的切断部位が細胞内プロセシング部位である、請求項５０に記載のキメラの凝固因子。
【請求項５３】
前記ｃｓｃＦｃリンカーが、同じ酵素によって、または異なる酵素によって認識される２つの酵素的切断部位に隣接される、請求項５０に記載のキメラの凝固因子。
【請求項５４】
前記ｃｓｃＦｃリンカーが、約１０〜約５０アミノ酸の長さを有する、請求項４９に記載のキメラの凝固因子。
【請求項５５】
前記ｃｓｃＦｃリンカーが、約２０〜約３０アミノ酸の長さを有する請求項４９に記載のキメラの凝固因子。
【請求項５６】
前記ｃｓｃＦｃリンカーが、ｇｌｙ／ｓｅｒペプチドを含む、請求項４９に記載のキメラの凝固因子。
【請求項５７】
前記ｇｌｙ／ｓｅｒペプチドが、式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎまたはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎのペプチドであり、ここでｎが１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群より選択される正の整数である、請求項５６に記載のキメラの凝固因子。
【請求項５８】
前記（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカーが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４およびＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４からなる群より選択される、請求項５６に記載のキメラの凝固因子。
【請求項５９】
前記凝固因子が、第ＶＩＩ因子の高い比活性の改変体である、請求項４５に記載のキメラの凝固因子。
【請求項６０】
前記凝固因子の天然には存在しない異種の酵素的切断部位が、血栓形成の部位で切断される、請求項４４に記載のキメラの凝固因子。
【請求項６１】
前記切断部位が；第ＸＩａ因子切断部位、第Ｘａ因子切断部位、およびトロンビン切断部位からなる群より選択される、請求項４４に記載のキメラ凝固因子。
【請求項６２】
酵素的切断部位が、前記凝固因子の重鎖部分のアミノ末端に対して遺伝子的に融合されている、請求項５９に記載のキメラの凝固因子。
【請求項６３】
前記標的部分が休止血小板に結合する、請求項４８に記載のキメラの凝固因子。
【請求項６４】
前記標的部分が、活性化された血小板に対して選択的に結合する、請求項４８に記載のキメラの凝固因子。
【請求項６５】
前記標的部分が：ＧＰＩｂａ、ＧＰＶＩ、およびＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの不活性型、からなる群より選択される標的に対して選択的に結合する、請求項６３に記載のキメラの凝固因子。
【請求項６６】
前記標的部分が：ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの活性型、Ｐセレクチン、ＧＭＰ−３３、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ＣＤ４０Ｌ、およびＬＯＸ−１、からなる群より選択される標的に対して選択的に結合する、請求項６４に記載のキメラの凝固因子。
【請求項６７】
前記足場部分が、前記キメラの凝固因子の流体力学半径を増大するタンパク質分子である、請求項６４に記載のキメラの凝固因子。
【請求項６８】
前記足場部分が、もし存在する場合、アルブミンおよびＸＴＥＮ（登録商標）からなる群より選択される、請求項６７に記載のキメラの凝固因子。
【請求項６９】
請求項４４のキメラの凝固因子であって：Ａ  Ｂ  Ｃ；Ｃ  Ｂ  Ａ；Ａ  Ｂ  Ｃ  Ｄ  Ｅ；Ａ  Ｄ  Ｅ  Ｂ  Ｃ、Ｅ  Ｄ  Ａ  Ｂ  Ｃ、Ｃ  Ｂ  Ａ  Ｄ  Ｅ、Ｅ  Ｄ  Ｃ  Ｂ  Ａ、Ｃ  Ｂ  Ｅ  Ｄ  Ａ、からなる群より選択されるアミノ末端からカルボキシ末端の部分の直線配列を含み、ここでＡは活性化可能な凝固因子、Ｂは存在しないか、またはリンカーであり、Ｃは標的部分であり、Ｄは存在しないか、またはリンカーであり、およびＥは足場部分である、キメラの凝固因子。
【請求項７０】
請求項４４に記載のキメラの凝固因子であって、ここで前記凝固因子が、凝固因子の軽鎖および重鎖を含み、かつ前記軽鎖および重鎖の各々が、別々のポリペプチド鎖として発現される、キメラの凝固因子。
【請求項７１】
請求項１、２、５、７、４４、４５、４５および５８のいずれか１項に記載のキメラの凝固因子をコードする核酸分子。
【請求項７２】
前記核酸分子が、ベクター中に存在する、請求項７１に記載の核酸分子。
【請求項７３】
前記ベクターがさらに、前記酵素的切断部位のうちの少なくとも１つを切断する酵素をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項７２に記載のベクター。
【請求項７４】
請求項７２に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項７５】
前記宿主細胞が、細胞内プロセシングし得る酵素を発現する、請求項７２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項７６】
前記酵素が、細胞に対して内因性である、請求項７５に記載の宿主細胞。
【請求項７７】
前記酵素が、細胞に対して異種である、請求項７５に記載の宿主細胞。
【請求項７８】
キメラの凝固因子を産生するための方法であって、請求項７６または７７に記載の宿主細胞を培養中で培養することと、この培地からキメラの凝固因子を回収することとを包含する、方法。
【請求項７９】
２つのポリペプチド鎖を含む、プロセシングされたヘテロ二量体ポリペプチドであって、前記プロセシングされた、ヘテロ二量体ポリペプチドは、細胞培養培地中で培養される細胞中で請求項７８に記載のベクターを発現すること、および前記培養培地から、成熟したヘテロ二量体ポリペプチドを単離することによって作製される、ヘテロ二量体ポリペプチド。
【請求項８０】
請求項１、２、５、７、４４、４５、４８および５８のいずれかに記載のキメラ凝固因子と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項８１】
請求項７１に記載の核酸分子と薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項８２】
請求項８０または８１に記載の組成物を投与することを包含する、被験体における止血を改善するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１０年７月９日出願の米国特許仮出願第６１／３６３，１８３号；２０１０年７月９日出願米国特許仮出願第６１／３６３，１８６号；２０１１年２月１１日出願米国特許仮出願第６１／４４２，０２９号；２０１１年２月１１日出願の米国特許仮出願第６１／４４２，１５０号；２０１１年２月１１日出願の米国特許仮出願第６１／４４２，０５５号；２０１１年３月２５日出願米国特許仮出願第６１／４６７，８８０号；および２０１１年５月３１日出願米国特許仮出願第６１／４９１，７６２号の恩典を請求する。上記で引用した仮特許出願の全内容は、参照によって本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
外因性の凝固経路の開始は、組織因子（血管壁に対する損傷の結果として露出される）と第ＶＩＩａ因子との間の複合体の形成によって媒介される。次いでこの複合体は、第ＩＸ因子および第Ｘ因子をその活性型に変換する。第Ｘａ因子は、限られた量のプロトロンビンをトロンビンに対して組織因子保有細胞上で変換する。この得られたトロンビンは次に、組織因子保有細胞から離れて拡散し得、血小板、ならびに第Ｖ因子および第ＶＩＩＩ因子を活性化し、第Ｖａ因子および第ＶＩＩＩａ因子を作製する。凝血の拡大相の間、第Ｘａ因子は、第ＩＸａ因子によって（第ＶＩＩＩａ因子との複合体で）、活性化された血小板の表面上で生成される。第Ｘａ因子は、第Ｖａ因子と複合して、プロトロンビンをトロンビンに活性化し、これがトロンビンのバーストを生じる。このカスケードは、トロンビンによるフィブリノーゲンのフィブリンへの変換で頂点に達し、これがフィブリン塊の形成を生じる。第ＶＩＩ因子および組織因子は、血液凝固の開始において重要な役割を果たす。
【０００３】
第ＶＩＩ因子は、単鎖のチモーゲンとして血中に循環する血漿の糖タンパク質である。このチモーゲンは、触媒として不活性である。単鎖の第ＶＩＩ因子は、インビトロで種々の因子によって２本の鎖の第ＶＩＩａ因子に変換され得るが、第Ｘａ因子は、第ＶＩＩ因子の重要な生理学的な活性化因子である。チモーゲン第ＶＩＩ因子の活性化された二本鎖の分子への変換は、アミノ酸位置１５２のアルギニン残基およびアミノ酸位置１５３のＩｌｅ残基を連結するペプチド結合の切断によって生じる。組織因子、リン脂質およびカルシウムイオンの存在下では、二本鎖の第ＶＩＩａ因子は、第Ｘ因子または第ＩＸ因子を活性化する。第ＶＩＩａ因子は、ＴＦ保有細胞、典型的には損傷された内皮細胞の表面で作用すること、および開始量のトロンビンを生成する（これが次に、血小板を拡散させてそれらを活性化し、それらをトロンビン生成の増殖段階にプライムする）ことによって凝固カスケードの生理学的な開始因子であると考えられる。治療上は、組み換えの第ＶＩＩａ因子は、活性化された血小板の表面上で第Ｖ因子を活性化することによって作用し、凝固の増殖段階の間にトロンビンのバーストを生成するのにＦＩＸａまたはＦＶＩＩＩａの必要性を迂回する。ＦＶＩＩａは血小板について比較的低い親和性を有するので、組み換えＦＶＩＩａは、生理学的レベルを超えて投与される。このプロセスは、組織因子依存性であると考えられる。
【０００４】
ヒト第ＩＸ因子は、単鎖の糖タンパク質（分子量５７，０００）として循環する。これは、血漿中にチモーゲンとして存在し、セリンプロテアーゼ、第ＩＸａβ因子（さらに一般的には、ＦＩＸａと呼ばれる）に、第ＸＩａ因子（活性化された血漿トロンボプラスチン前駆体）によってカルシウムイオンの存在下で変換される。活性化反応では、２つの内部ペプチド結合を、第ＩＸ因子で加水分解する。これらの切断は、特定のアルギニル−アラニンペプチド結合および特定のアルギニル−バリンペプチド結合で生じる。これによって、前駆分子の内部領域からの活性化ペプチド（分子量はほぼ１１，０００に等しい）の遊離、および第ＩＸａβ因子（分子量はほぼ４６，０００に等しい）の生成が生じる。第ＩＸａβ因子は、軽鎖（分子量はほぼ１８，０００に等しい）および重鎖（分子量はほぼ２８，０００に等しい）から構成され、これらの鎖は、ジスルフィド結合によって一緒に保持される。  
【０００５】
第Ｘ因子はまた、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇの３つのペプチドによって接続される軽鎖および重鎖を含む単鎖のポリペプチドとして合成される。次いで、この単鎖の分子は、２つ（またはそれ以上）の内部ペプチド結合の切断によって軽鎖および重鎖に変換される。血漿では、これらの２つの鎖は、ジスルフィド結合によって一緒に連結されて第Ｘ因子を形成する。活性化された第Ｘ因子、第Ｘａ因子は最終の共通の経路に関与し、それによってプロトロンビンはトロンビンに変換され、これが次にフィブリノーゲンをフィブリンに変換する。
【０００６】
凝固因子は、しばらくの間、止血を改善するために患者に投与されていた。組み換えＤＮＡ技術の出現によって、凝固障害を有する患者の処置を有意に改善され、安全かつ着実なタンパク質治療の開発を可能になった。例えば、組み換え活性化された第ＶＩＩ因子は、血友病ＡまたはＢ、凝固因子第ＸＩ因子またはＶＩＩ因子の欠損、血小板機能の欠損、血小板減少症、またはフォン・ヴィレブランド病を有する患者で生じるような、大出血の処置のために広く用いられてきた。組み換えの第ＩＸ因子が、同様に治療上有用である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このような組み換え分子は有効であるが、治療剤を凝固の部位に局在化するか、薬物動態特性の改善を有するか、クリアランス速度の低下を有するか、改善された製造可能性を有するか、血栓形成性が低下しているか、活性が増強されているか、またはこれらの特徴のうちの２つ以上を有する改善版が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、活性が増強されたキメラの凝固因子に関する。本発明は、とりわけ、キメラの凝固因子を作製するための方法を特徴づけるが、このキメラの凝固因子は、これらの方法を用いて作製され、かつ止血を改善するための方法は、これらの凝固因子を用いる。本発明のキメラの凝固因子は、増強された薬物動態特性を保有するか、クリアランス速度を低下するか、製造可能性が改善されているか、血栓形成性が低下しているか、活性が増強されているか、またはこれらの特徴のうちの２つ以上を有する。一実施形態では、本発明の改善された凝固因子は活性が増大しており、ここでは、例えば、血小板に対して凝固因子を標的すること、または血栓形成の部位で活性化される、活性化可能な形態（天然には存在しない活性化可能な形態）で被験体に存在することを必要とする。
【０００９】
一態様では、本発明は、ＦＶＩＩ、ＦＩＸおよびＦＸからなる群より選択される凝固因子と、血小板に結合する標的部分と、必要に応じて、この凝固因子と標的部分との間のスペーサー部分とを含むキメラの凝固因子に関する。
【００１０】
一実施形態では、この凝固因子は、式Ａ  Ｂ  Ｃによって示される構造を含み、ここでＡは凝固因子であり；ここでＢはスペーサー部分であり；かつここでＣは、血小板に結合する、少なくとも１つの標的部分である。
【００１１】
一実施形態では、上記の凝固因子は：Ａ  Ｂ  Ｃ；Ｃ  Ｂ  Ａからなる群より選択される式によって提示されるアミノ末端からカルボキシ末端の構造を含む。
【００１２】
一実施形態では、上記の凝固因子は、少なくとも１つの標的部分を欠いている適切なコントロールと比較した場合、血小板の存在下でトロンビンの生成の増大を示す。
【００１３】
一実施形態では、上記の凝固因子は、足場部分および必要に応じて第二のスペーサー部分を含む。
【００１４】
一実施形態では、上記の凝固因子はさらに、ＤおよびＥを含み、ここでＤがスペーサー部分であり；かつＥが足場部分であり、かつここでこのキメラの凝固因子は：Ａ  Ｂ  Ｃ  Ｄ  Ｅ；Ａ  Ｄ  Ｅ  Ｂ  Ｃ；Ｅ  Ｄ  Ａ  Ｂ  Ｃ；Ｃ  Ｂ  Ａ  Ｄ  Ｅ；Ｅ  Ｄ  Ｃ  Ｂ  Ａ；およびＣ  Ｂ  Ｅ  Ｄ  Ａ、からなる群より選択される式によって提示されるアミノ末端からカルボキシ末端の構造を含む。
【００１５】
一実施形態では、Ｅは、第一のＦｃ部分Ｆ１および第二のＦｃ部分Ｆ２を含んでいる二量体Ｆｃ領域である。
【００１６】
一実施形態では、上記の凝固因子は、２つのＦｃ部分の間に差し込まれた切断性ｓｃＦｃ（ｃｓｃＦｃ）リンカーを含むポリペプチドとして発現され、ここでこのｃｓｃＦｃリンカーは、ｃｓｃＦｃポリペプチドリンカーの切断を生じる少なくとも１つの酵素的切断部位に隣接する。
【００１７】
一実施形態では、上記ｃｓｃＦｃリンカーは、ｃｓｃＦｃリンカーの切断を生じる少なくとも１つの酵素的切断部位に隣接する。
【００１８】
一実施形態では、上記少なくとも１つの酵素的切断部位は、細胞内プロセシング部位である、請求項９に記載のキメラの凝固因子。
【００１９】
一実施形態では、上記ポリペプチドリンカーは、同じ酵素によってまたは異なる酵素によって認識される、２つの酵素的切断部位に隣接される。
【００２０】
一実施形態では、上記ポリペプチドリンカーは、約１０アミノ酸〜約５０アミノ酸の長さを有する。
【００２１】
一実施形態では、上記ポリペプチドリンカーは、約２０アミノ酸〜約３０アミノ酸の長さを有する。
【００２２】
一実施形態では、上記ポリペプチドリンカーは、ｇｌｙ／ｓｅｒペプチドを含む。
【００２３】
一実施形態では、上記ｇｌｙ／ｓｅｒペプチドは、式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、またはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎのペプチドであり、ここでｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群より選択される正の整数である。一実施形態では、この（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４およびＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４からなる群より選択される。
【００２４】
一実施形態では、上記凝固因子は、２つのポリペプチド鎖を含む。
【００２５】
一実施形態では、上記キメラの凝固因子は：スペーサー部分を介してＦ１に連結されたＡおよびＦ２に連結されたＣと；スペーサー部分を介してＦ１に連結されたＡおよびスペーサー部分を介してＦ２に連結されたＣと；Ｆ１に連結されたＡおよびスペーサー部分を介してＦ２に連結されるＣと；スペーサー部分を介してＦ１に連結されるＡおよびスペーサー部分を介してＦ２に連結されるＣと、からなる群より選択される構造を有する。
【００２６】
一実施形態では、キメラの凝固因子は、２つのポリペプチドを含み、ここで第一のポリペプチドは、部分Ａ  Ｂ  Ｆ１；Ａ  Ｂ  Ｆ１；Ａ  Ｂ  Ｆ１；またはＡ  Ｂ  Ｆ１  Ｄ  Ｃを含み、および上記第二のポリペプチドが部分Ｃ  Ｆ２；Ｃ  Ｄ  Ｆ２；Ｆ２  Ｄ  Ｃ；またはＦ２  Ｄ  Ｃを含み、ここでこの２つのポリペプチド鎖が、Ｆｃ領域を形成する。
【００２７】
一実施形態では、上記標的部分は、Ｆｃ領域のポリペプチド鎖の少なくとも１つに融合される。一実施形態では、この標的部分は、Ｆ１およびＦ２のうちの少なくとも１つに対して直接融合される。一実施形態では、この標的部分は、スペーサー部分を介してＦ１およびＦ２のうちの少なくとも１つに融合される。一実施形態では、この標的部分は、切断リンカーを介してＦ１およびＦ２のうちの少なくとも１つに融合される。一実施形態では、この標的部分は、切断可能なリンカーを介してＦ１およびＦ２の少なくとも１つに融合される。一実施形態では、この標的部分は：抗体分子、抗体分子の抗原結合フラグメント、ｓｃＦｖ分子、レセプターのレセプター結合部分、ペプチド、からなる群より選択される。一実施形態では、この標的部分は、休止血小板に対して選択的に結合する。一実施形態では、この標的部分は、活性化血小板に対して選択的に結合する。一実施形態では、この標的部分は：ＧＰＩｂａ、ＧＰＶＩ、およびＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの不活性型からなる群より選択される標的に対して選択的に結合する。一実施形態では、この標的部分は：ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの活性型、Ｐセレクチン、ＧＭＰ−３３、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ＣＤ４０Ｌ、およびＬＯＸ−１からなる群より選択される標的に対して選択的に結合する。一実施形態では、この標的部分は、ＧＰＩｂ複合体に結合する。一実施形態では、この標的部分は：ＰＳ４、ＯＳ１、およびＯＳ２からなる群より選択されるペプチドである。一実施形態では、この標的部分は：ＳＣＥ５、ＭＢ９、およびＡＰ３からなる群より選択される抗体由来の抗体可変領域を含む。
【００２８】
一実施形態では、上記凝固因子は、第ＶＩＩ因子である。
【００２９】
一実施形態では、上記凝固因子は、第ＶＩＩ因子の高い比活性の改変体である。一実施形態では、この凝固因子は、第ＩＸ因子である。一実施形態では、この凝固因子は、第ＩＸ因子の高い比活性の改変体である。一実施形態では、この凝固因子は、第Ｘ因子である。一実施形態では、凝固因子は、第Ｘ因子の高い比活性の改変体である。
【００３０】
一実施形態では、上記凝固因子は、ある細胞によって活性型で分泌される。一実施形態では、この凝固因子は、インビボで活性化される。
【００３１】
一実施形態では、上記キメラの凝固因子は、上記凝固因子中の天然には存在しない異種の酵素的切断部位を含む。
【００３２】
一実施形態では、上記酵素的切断部位は、上記凝固因子の重鎖部分のアミノ末端に対して遺伝子的に融合されている。
【００３３】
一実施形態では、上記凝固因子は、足場部分を含み、この足場部分は、上記キメラの凝固因子の流体力学半径を増大するタンパク質分子である。一実施形態では、この足場部分は、もし存在する場合、アルブミンおよびＸＴＥＮ（登録商標）からなる群より選択される。
【００３４】
別の態様では、本発明は、ＦＶＩＩを含んでいるポリペプチドであって、このＦＶＩＩが、凝固カスケードのある成分によって活性化され得る異種の酵素的切断部位を含む、ポリペプチドに関与する。
【００３５】
一実施形態では、上記ポリペプチドは、足場部分、および必要に応じてスペーサー部分を含む。
【００３６】
一実施形態では、上記足場部分は、第一のＦｃ部分、Ｆ１と第二のＦｃ部分、Ｆ２とを含む二量体Ｆｃ領域である。
【００３７】
一実施形態では、上記凝固因子は、２つのポリペプチド鎖を含む。
【００３８】
一実施形態では、上記キメラの凝固因子は：スペーサー部分を介して第一のＦｃ部分に連結された凝固因子と；スペーサー部分を介して第二のＦｃ部分に連結された凝固因子と；Ｆ１に直接連結される凝固因子と；Ｆ２に直接連結される凝固因子と、からなる群より選択される構造を有する。
【００３９】
一実施形態では、上記キメラ凝固因子はさらに標的部分を含む。
【００４０】
一実施形態では、上記キメラの凝固因子は、ｃｓｃＦｃリンカーを含む単一のポリペプチド鎖として合成される。一実施形態では、このｃｓｃＦｃリンカーは、このリンカーの切断を生じる少なくとも１つの酵素的切断部位に連結される（例えば、直接連結されるかまたは隣接する）。
【００４１】
一実施形態では、上記少なくとも１つの酵素的切断部位は、細胞内プロセシング部位である。一実施形態では、上記ｃｓｃＦｃリンカーは、同じ酵素によって、または異なる酵素によって認識される２つの酵素的切断部位に隣接される。一実施形態では、このｃｓｃＦｃリンカーは、約１０〜約５０アミノ酸の長さを有する。一実施形態では、このｃｓｃＦｃリンカーは、約２０〜約３０アミノ酸の長さを有する。
【００４２】
一実施形態では、上記ｃｓｃＦｃリンカーは、ｇｌｙ／ｓｅｒペプチドを含む。
【００４３】
一実施形態では、上記ｇｌｙ／ｓｅｒペプチドは、式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎまたはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎのペプチドであり、ここでｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群より選択される正の整数である。一実施形態では、この（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４およびＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４からなる群より選択される。
【００４４】
一実施形態では、上記凝固因子は、第ＶＩＩ因子の高い比活性の改変体である。一実施形態では、この凝固因子に存在する異種の酵素的切断部位は、血栓形成の部位で切断される。一実施形態では、この切断部位は；第ＸＩａ因子切断部位、第Ｘａ因子切断部位、およびトロンビン切断部位からなる群より選択される。一実施形態では、この酵素的切断部位は、凝固因子の重鎖部分のアミノ末端に対して遺伝子的に融合されている。
【００４５】
一実施形態では、上記標的部分は休止血小板に結合する。一実施形態では、この標的部分は、活性化された血小板に対して選択的に結合する。
【００４６】
一実施形態では、上記標的部分は：ＧＰＩｂａ、ＧＰＶＩ、およびＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの不活性型、からなる群より選択される標的に対して選択的に結合する。一実施形態では、この標的部分は：ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの活性型、Ｐセレクチン、ＧＭＰ−３３、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ＣＤ４０Ｌ、およびＬＯＸ−１、からなる群より選択される標的に対して選択的に結合する。
【００４７】
一実施形態では、上記足場部分は、上記キメラの凝固因子の流体力学半径を増大するタンパク質分子である。一実施形態では、上記足場部分は、もし存在する場合、アルブミンおよびＸＴＥＮ（登録商標）からなる群より選択される。
【００４８】
一態様では、本発明は：Ａ  Ｂ  Ｃ；Ｃ  Ｂ  Ａ；Ａ  Ｂ  Ｃ  Ｄ  Ｅ；Ａ  Ｄ  Ｅ  Ｂ  Ｃ、Ｅ  Ｄ  Ａ  Ｂ  Ｃ、Ｃ  Ｂ  Ａ  Ｄ  Ｅ、Ｅ  Ｄ  Ｃ  Ｂ  Ａ、Ｃ  Ｂ  Ｅ  Ｄ  Ａ、からなる群より選択されるアミノ末端からカルボキシ末端の部分の直線配列に関し、ここでＡは活性化可能な凝固因子、Ｂは存在しないか、またはリンカーであり、Ｃは標的部分であり、Ｄは存在しないか、またはリンカーであり、およびＥは足場部分である。
【００４９】
一実施形態では、上記凝固因子は、凝固因子の軽鎖および重鎖を含み、かつ上記軽鎖および重鎖の各々が、別々のポリペプチド鎖として発現される。
【００５０】
一実施形態では、本発明は、本発明のキメラの凝固因子をコードする核酸分子に関与する。一実施形態では、この核酸分子は、ベクター中に存在する。一実施形態では、このベクターはさらに、上記酵素的切断部位のうちの少なくとも１つを切断する酵素をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００５１】
一実施形態では、本発明は、本発明の発現ベクターを含む、宿主細胞に関する。一実施形態では、この宿主細胞は、細胞内プロセシングし得る酵素を発現する。一実施形態では、この酵素は、宿主に対して内因性である。一実施形態では、この酵素は、細胞に対して異種である。
【００５２】
別の実施形態では、本発明は、キメラの凝固因子を産生するための方法であって、上記宿主細胞を培養中で培養することと、この培地からキメラの凝固因子を回収することとを包含する、方法に関する。
【００５３】
別の実施形態では、本発明は、２つのポリペプチド鎖を含む、プロセシングされたヘテロ二量体ポリペプチドであって、上記プロセシングされた、ヘテロ二量体ポリペプチドが、細胞培養培地中で培養される細胞中で上記ベクターを発現すること、およびこの培養培地から、成熟したヘテロ二量体ポリペプチドを単離することによって作製される、ヘテロ二量体ポリペプチドに関する。
【００５４】
一実施形態では、本発明は、キメラ凝固因子と、薬学的に許容される担体とを含む組成物に関する。
【００５５】
別の実施形態では、本発明は、本発明の核酸分子と薬学的に許容される担体とを含む組成物に関する。
【００５６】
別の実施形態では、本発明は、本発明の組成物を投与することを包含する、被験体における止血を改善するための方法に関与する。
【００５７】
一態様では、本発明は、凝固因子の軽鎖部分および重鎖部分、ならびに少なくとも１つの標的部分を含むキメラ凝固因子であって、ここでこの標的部分（ｉ）は、血小板に対して特異的に結合し、（ｉｉ）この凝固因子の軽鎖と重鎖との間に差し込まれず、かつここでこのキメラの凝固因子は、少なくとも１つの標的部分を欠く適切なコントロールに比較して、血小板の存在下でトロンビンの生成の増大を示すキメラの凝固因子に関する。
【００５８】
別の態様では、本発明は、キメラの凝固因子であって、部分Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅを直鎖状配列で含む凝固因子に関し、ここでＡは凝固因子、活性化可能な凝固因子、または活性化された凝固因子であり；Ｂは存在しないか、またはリンカーであり；Ｃは標的部分であり；Ｄは存在しないか、またはリンカーであり；かつＥは存在しないかまたは足場部分である。
【００５９】
さらに別の態様では、本発明は、キメラの凝固因子であって：ＡＢＣ；ＡＢＣＤＥ；ＡＤＥＢＣ、ＥＤＡＢＣ、ＣＢＡＤＥ、ＥＤＣＢＡ、ＣＢＥＤＡからなる群より選択されるアミノ末端からカルボキシ末端の部分の直鎖状配列を含み、ここでＡが凝固因子、活性化可能な凝固因子、または活性化された凝固因子であり、Ｂは存在しないか、またはリンカーであり、Ｃは標的部分であり、Ｄは存在しないか、またはリンカーであり、かつＥは足場部分である、キメラ凝固因子に関する。
【００６０】
さらに別の態様では、本発明は、キメラの凝固因子であって：ＡＢＦ１：Ｆ２；ＡＢＦ１：ＣＤＦ２；ＡＢＦ１：Ｆ２ＤＣ、ＡＢＦ１ＤＣ：Ｆ２ＤＣからなる群より選択されるアミノ末端からカルボキシ末端の部分の直鎖状配列を含み、ここでＡは凝固因子、活性化可能な凝固因子または活性化された凝固因子であり、Ｂは存在しないか、またはリンカーであり、Ｃは標的部分であり、Ｄは存在しないか、またはリンカーであり、かつＦ１およびＦ２は各々、Ｆｃ部分であり、かつ：２つのポリペプチド鎖のＦ１およびＦ２鎖によって媒介される二量体化を示す、キメラの凝固因子に関する。
【００６１】
さらに別の態様では、本発明は、凝固因子の軽鎖部分および重鎖部分、ならびに少なくとも１つの標的部分を含むキメラ凝固因子であって、ここでこの標的部分は、血小板に特異的に結合し、ここでキメラの凝固因子は、２つのポリペプチド鎖を含むジスルフィド連結したＦｃ領域を含む、キメラの凝固因子に関する。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、標的ドメインを含む例示的なキメラの凝固因子を図示する。これらの例示的な構築物は、Ｆｃ領域を含む。
【図２】図２は、標的ドメインを含む例示的なキメラの凝固因子構築物を図示する。これらの例示的な構築物は、切断性の単鎖（ｃｌｅａｖａｂｌｅ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ）Ｆｃ（ｃｓｃＦｃ）を含み、ここではこのｓｃＦｃリンカーは、細胞（ｓｃＦｃリンカーが発現されて２つの鎖Ｆｃ領域が形成される）によってプロセシングされる。
【図３】図３は、標的ドメインを含む例示的なキメラの凝固因子構築物を図示しているが、ここではこの凝固因子部分は、Ｇｌａドメインを欠く。これらの例示的な構築物は、Ｆｃ領域を含む。
【図４】図４は、標的ドメインを含んでいる例示的なキメラの凝固因子構築物であって、ここで凝固因子部分がＧｌａドメインを欠いている、キメラの凝固因子構築物を例示している。これらの例示的な構築物は、切断性の単鎖のＦｃ（ｃｓｃＦｃ）を含み、ここでこのｓｃＦｃリンカーは、細胞（ｓｃＦｃリンカーが発現されて２つの鎖Ｆｃ領域が形成される）によってプロセシングされる。
【図５】図５は、活性化される（例えば、インビトロでの活性化後、または凝固因子の軽鎖および重鎖の別の発現によって）か、または活性化可能である（すなわち、凝血の部位でインビボにおいて切断可能である部分を含む）、例示的なキメラの凝固因子構築物を例示している（パネルＤおよびＥを参照のこと）。これらの例示的な構築物は、Ｆｃ領域を含む。構築物Ａ、Ｂ、およびＣは、早期の実験では発現されなかった。
【図６】図６は、活性化される（例えば、インビトロでの活性化後、または凝固因子の軽鎖および重鎖の別の発現によって）か、または活性化可能である（すなわち、凝血の部位でインビボにおいて切断可能である部分を含む）、例示的なキメラの凝固因子構築物を例示している。これらの例示的な構築物は、切断可能な単鎖Ｆｃ（ｃｓｃＦｃ）を含み、ここでは、ｓｃＦｃリンカーは、細胞（ｓｃＦｃリンカーが発現されて２つの鎖Ｆｃ領域が形成される）によってプロセシングされる。
【図７】図７は、標的ドメインを含む例示的なキメラの凝固因子構築物を図示する。
【図８】図８は、標的ドメインを含んでいる例示的なキメラの凝固因子構築物であって、ここでこの凝固因子部分がＧｌａドメインを欠く、キメラの凝固因子構築物を例示する。
【図９】図９は、活性化される（例えば、インビトロでの活性化後、または凝固因子の軽鎖および重鎖の別の発現によって）か、または活性化可能である（すなわち、凝血の部位でインビボにおいて切断可能である部分を含む）、例示的なキメラの凝固因子構築物を図示している。
【図１０】図１０は、ＦＶＩＩ−０１１の精製および活性化のためのＳＤＳ  ＰＡＧＥを示す。
【図１１】図１１は、活性なＦＶＩＩ−０５３の精製のためのＳＤＳ  ＰＡＧＥを示す。
【図１２Ａ】図１２は、ＦＶＩＩ−０１１およびＦＶＩＩ−１０２の概略図を示しており、そしてＦＡＣＳによって決定される、活性化された血小板に対するＦＶＩＩＩ−０１１およびＦＶＩＩ−０２７の結合を示す。
【図１２Ｂ】図１２は、ＦＶＩＩ−０１１およびＦＶＩＩ−１０２の概略図を示しており、そしてＦＡＣＳによって決定される、活性化された血小板に対するＦＶＩＩＩ−０１１およびＦＶＩＩ−０２７の結合を示す。
【図１３Ａ】図１３は、活性化された血小板の存在下におけるＦＶＩＩ−０２７、ＦＶＩＩ−０１１およびＮｏｖｏｓｅｖｅｎの活性を測定するためのトロンビン生成アッセイを示す。
【図１３Ｂ】図１３は、活性化された血小板の存在下におけるＦＶＩＩ−０２７、ＦＶＩＩ−０１１およびＮｏｖｏｓｅｖｅｎの活性を測定するためのトロンビン生成アッセイを示す。
【図１３Ｃ】図１３は、活性化された血小板の存在下におけるＦＶＩＩ−０２７、ＦＶＩＩ−０１１およびＮｏｖｏｓｅｖｅｎの活性を測定するためのトロンビン生成アッセイを示す。
【図１３Ｄ】図１３は、活性化された血小板の存在下におけるＦＶＩＩ−０２７、ＦＶＩＩ−０１１およびＮｏｖｏｓｅｖｅｎの活性を測定するためのトロンビン生成アッセイを示す。
【図１４Ａ】図１４によって、ＰＡＣ−１が、血小板に対する結合の増大、およびＦＶＩＩ−０２７に関連するトロンビン生成の速度の増大を削減することが示される。
【図１４Ｂ】図１４によって、ＰＡＣ−１が、血小板に対する結合の増大、およびＦＶＩＩ−０２７に関連するトロンビン生成の速度の増大を削減することが示される。
【図１５】図１５は、活性化された血小板の存在下におけるＦＶＩＩ−０３７およびＮｏｖｏｓｅｖｅｎの活性を測定するためのトロンビン生成アッセイで用いられる構築物を示す。
【図１６Ａ】図１６は、活性化された血小板の存在下におけるＦＶＩＩ−０３７およびＮｏｖｏｓｅｖｅｎの活性を測定するためのトロンビン生成アッセイを示す。
【図１６Ｂ】図１６は、活性化された血小板の存在下におけるＦＶＩＩ−０３７およびＮｏｖｏｓｅｖｅｎの活性を測定するためのトロンビン生成アッセイを示す。
【図１６Ｃ】図１６は、活性化された血小板の存在下におけるＦＶＩＩ−０３７およびＮｏｖｏｓｅｖｅｎの活性を測定するためのトロンビン生成アッセイを示す。
【図１７】図１７は、図１８に示される活性化された血小板の存在下におけるＦＶＩＩ−０４４、ＦＶＩＩ−０４５、ＦＶＩＩ−０４６、ＦＶＩＩ−０１１およびＮｏｖｏｓｅｖｅｎの活性を測定するためのトロンビン生成アッセイで用いられる構築物を示す。
【図１８Ａ】図１８は、活性化された血小板の存在下におけるＦＶＩＩ−０４４、ＦＶＩＩ−０４５、ＦＶＩＩ−０４６、ＦＶＩＩ−０１１およびＮｏｖｏｓｅｖｅｎの活性を測定するためのトロンビン生成アッセイを示す。
【図１８Ｂ】図１８は、活性化された血小板の存在下におけるＦＶＩＩ−０４４、ＦＶＩＩ−０４５、ＦＶＩＩ−０４６、ＦＶＩＩ−０１１およびＮｏｖｏｓｅｖｅｎの活性を測定するためのトロンビン生成アッセイを示す。
【図１８Ｃ】図１８は、活性化された血小板の存在下におけるＦＶＩＩ−０４４、ＦＶＩＩ−０４５、ＦＶＩＩ−０４６、ＦＶＩＩ−０１１およびＮｏｖｏｓｅｖｅｎの活性を測定するためのトロンビン生成アッセイを示す。
【図１８Ｄ】図１８は、活性化された血小板の存在下におけるＦＶＩＩ−０４４、ＦＶＩＩ−０４５、ＦＶＩＩ−０４６、ＦＶＩＩ−０１１およびＮｏｖｏｓｅｖｅｎの活性を測定するためのトロンビン生成アッセイを示す。
【図１９】図１９は、図２０に示される活性化された血小板の存在下におけるＦＶＩＩ−０４７、ＦＶＩＩ−０４８、ＦＶＩＩ−０４９、ＦＶＩＩ−０１１およびＮｏｖｏｓｅｖｅｎの活性を測定するためのトロンビン生成アッセイで用いられる構築物を示す。
【図２０Ａ】図２０は、活性化された血小板の存在下におけるＦＶＩＩ−０４7、ＦＶＩＩ−０４８、ＦＶＩＩ−０４９、ＦＶＩＩ−０１１およびＮｏｖｏｓｅｖｅｎの活性を測定するためのトロンビン生成アッセイを示す。
【図２０Ｂ】図２０は、活性化された血小板の存在下におけるＦＶＩＩ−０４7、ＦＶＩＩ−０４８、ＦＶＩＩ−０４９、ＦＶＩＩ−０１１およびＮｏｖｏｓｅｖｅｎの活性を測定するためのトロンビン生成アッセイを示す。
【図２０Ｃ】図２０は、活性化された血小板の存在下におけるＦＶＩＩ−０４7、ＦＶＩＩ−０４８、ＦＶＩＩ−０４９、ＦＶＩＩ−０１１およびＮｏｖｏｓｅｖｅｎの活性を測定するためのトロンビン生成アッセイを示す。
【図２０Ｄ】図２０は、活性化された血小板の存在下におけるＦＶＩＩ−０４7、ＦＶＩＩ−０４８、ＦＶＩＩ−０４９、ＦＶＩＩ−０１１およびＮｏｖｏｓｅｖｅｎの活性を測定するためのトロンビン生成アッセイを示す。
【図２１】図２１は、図２２に示される活性化された血小板の存在下におけるＦＶＩＩ−０５３およびＦＶＩＩ−０１１の活性を測定するためのトロンビン生成アッセイで用いられる構築物を示す。
【図２２Ａ】図２２は、活性化された血小板の存在下におけるＦＶＩＩ−０５３およびＦＶＩＩ−０１１の活性を測定するためのトロンビン生成アッセイを示す。
【図２２Ｂ】図２２は、活性化された血小板の存在下におけるＦＶＩＩ−０５３およびＦＶＩＩ−０１１の活性を測定するためのトロンビン生成アッセイを示す。
【図２２Ｃ】図２２は、活性化された血小板の存在下におけるＦＶＩＩ−０５３およびＦＶＩＩ−０１１の活性を測定するためのトロンビン生成アッセイを示す。
【図２２Ｄ】図２２は、活性化された血小板の存在下におけるＦＶＩＩ−０５３およびＦＶＩＩ−０１１の活性を測定するためのトロンビン生成アッセイを示す。
【図２３Ａ】図２３は、ＰＡＣ−１がＦＶＩＩ−０５３に関連するトロンビン生成の速度の増大を削減することを示す。
【図２３Ｂ】図２３は、ＰＡＣ−１がＦＶＩＩ−０５３に関連するトロンビン生成の速度の増大を削減することを示す。
【図２４】図２４は、図２５に示される、ＨＥＫ２９３細胞の一時的なトランスフェクションおよびプロテインＡプルダウン後の、ＦＶＩＩＦｃ種のウエスタンブロット分析で用いられる構築物を示す。
【図２５】図２５は、ＨＥＫ２９３細胞の一時的なトランスフェクションおよびプロテインＡプルダウン後の、ＦＶＩＩＦｃ種のウエスタンブロット分析を示す。
【図２６】図２６は、ｐＳＹＮ−ＰＣ５−００３の有無におけるｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０２４の一時的なトランスフェクション後のプロテインＡ免疫沈降のウエスタンブロットを示す。レーン１、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０２４、非還元；レーン２、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０２４、非還元；レーン３、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０２４、還元；レーン４、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０２４、還元。
【図２７】図２７は、ＨＥＫ２９３細胞の一時的なトランスフェクションおよびプロテインＡプルダウン後の、ＦＶＩＩＦｃ種のウエスタンブロット分析（Ｆｃウエスタン）を示す。
【図２８】図２８は、ＦＸＩａによるＦＶＩＩ−０３９およびＦＶＩＩ−０４０処置を示す。
【図２９】図２９によって、ＧＰＩＩｂＩＩＩａの活性型に標的されるＦＶＩＩａＦｃ改変体がトロンビン生成の速度増大を示すことが示される。
【図３０】図３０は、血友病Ａヒト血液におけるＦＶＩＩ−０８８および野性型組み換えＦＶＩＩａＦｃの活性を測定するための回転血栓弾性測定（Ｒｏｔａｔｉｏｎ  Ｔｈｒｏｍｂｏｅｌａｓｔｏｍｅｔｒｙ）（ＲＯＴＥＭ）アッセイを示す。凝固時間、血栓形成時間およびαアングルパラメーターを示す。
【図３１】図３１は、例示的な切断部位およびこのような切断部位の例示的な位置を活性化可能な凝固因子構築物において示す。この図では、ＦＶＩＩを例として用いる。
【図３２】図３２は、図３１に図示される構築物の切断を示す。
【図３３】図３３は、追加の活性化可能な構築物およびウエスタンブロットを示しており、それらの切断を図示する。
【図３４】図３４は、ＦＶＩＩ−０６２およびＦＶＩＩ−０９０構築物を用いるトロンビン生成アッセイの結果を示す。ＦＶＩＩ−０６２は、トロンビン切断部位を欠く負のコントロールであり、そのため構築物は活性化できない。ＦＶＩＩ−０９０は、ＡＬＲＰＲ切断部位を含み、そのためトロンビンによって活性化可能である。
【図３５】図３５は、高い比活性のＦＶＩＩ改変体の切断を図示する。ＦＶＩＩ重鎖−Ｆｃおよび軽鎖Ｆｃは、１バンド中で崩壊する。なぜならこの重鎖は、トリプシン１７０ループの挿入後にグリコシル化部位を欠き、小さくなるからである。
【図３６】図３６は、ＦＶＩＩ−０９０およびＦＶＩＩ−１００を用いるトロンビン生成アッセイの結果を図示する。
【図３７】図３７は、ＦＶＩＩ−０９０およびＦＶＩＩ−１１５を用いるトロンビン生成アッセイの結果を図示する。
【図３８】図３８は、トロンビンで活性化された活性化可能なＦＶＩＩＦＣのアミド分解活性を図示する。活性化可能な改変体のアミド分解活性は、トロンビン活性化後に測定され得、そしてＦＶＩＩ−０９０と比較して高い比活性の改変体についてのアミド分解活性の増大がある。これらのアッセイでは、トロンビンによる活性化可能な分子の活性化後、ヒルジンを添加して、発色性基質のトロンビン切断を阻害する。この方式では、トロンビンは、ＦＶＩＩａ活性を検出する能力を妨げない。
【図３９】図３９は、ＦＶＩＩａによって切断されない基質Ｓ２７６５を用いる、ＦＶＩＩａによるＦＸの活性化を測定するアッセイの結果を図示する。このアッセイでは、１０ｕＭのＦＸをＦＶＩＩａＦｃとともに１５分間３７℃でインキュベートした。この反応を、ＥＤＴＡでクエンチして、基質を添加した。図３９は、ＦＶＩＩａＦｃによるＦＸ活性化が検出され得るということを示すコントロールの実験の結果を示す。
【図４０】図４０は、「活性化可能なＦＶＩＩＦｃ」によるＦＸａ生成活性を示す。図４０に示される実験によって、高い比活性の改変体に関するＦＸ活性化活性の増大があることが示される。この実験では、ＦＶＩＩＦｃ（１００ｎＭ）を、トロンビン（１００ｎＭ）で活性化した。ヒルジンを添加して、トロンビンを阻害した。ＦＸ（１０ｕＭ）を添加し、続いてＥＤＴＡを添加して、反応を阻害した。ＦＸの活性を、ＦＸａ基質を検出することによって測定した。
【図４１】図４１は、ＦＶＩＩ−１１８、ＦＶＩＩ−１１９、およびＦＶＩＩ−１２７で用いた活性化可能なモノマー構築物を含む、例示的な活性化可能な構築物の形式を図示する。
【図４２】図４２は、ヘテロ二量体（ＦＶＩＩ−０９０）に比較した、活性化可能な構築物、特に単量体の（ＦＶＩＩ−１１８およびＦＶＩＩ−１１９）のトロンビン切断の有効性を図示する。
【図４３】図４３は、高い比活性の改変体（ＦＶＩＩ−１２７）に対して野性型の活性化可能なＦＶＩＩＦｃ（ＦＶＩＩ−１１８）を比較するためのトロンビン生成アッセイの結果を図示する。
【図４４Ａ】図４４Ａは、いくつかの標的化構築物を図示する。この場合、ＧＰＩＩｂＩＩＩａの活性な高次構造に結合するＳＣＥ５ｓｃＦｖは、この構築物中の種々の部位に含まれる。
【図４４Ｂ】図４４Ｂは、これらの構築物を用いる、血小板豊富なＦＶＩＩＩ欠乏血漿におけるトロンビン生成アッセイの結果を図示する。Ｎ７は、Ｎｏｖｏｓｅｖｅｎのコントロールである。
【図４４Ｃ】図４４Ｃは、血小板に対する組み換えＦＶＩＩａＦｃ改変体の結合を、ＦＡＣによって図示する。
【図４５Ａ】図４５Ａは、ＡＰ３（休止血小板および活性化された血小板に存在するＧＰＩＩｂＩＩＩａに対するｓｃＦｖ）を含むいくつかの標的されたＦＶＩＩａを図示する。
【図４５Ｂ】図４５Ｂは、血小板豊富なＦＶＩＩＩ欠損の血漿におけるトロンビン生成アッセイの結果を示す。
【図４５Ｃ】図４５Ｃは、血小板に対するｒＦＶＩＩａＦｃ改変体の結合の結果をＦＡＣＳによって示す。
【図４６Ａ】図４６Ａは、いくつかの標的化ＦＶＩＩａ構築物であって、ＧＰＩｂ−αを、その分子、特にＰＳ４、ＯＳ１、およびＯＳ２ペプチドに結合するペプチドを用いて標的する構築物を示す。
【図４６Ｂ】図４６Ｂは、図４６Ａで示されるＣ末端ペプチド構築物を用いて、血小板豊富なＦＶＩＩＩ欠損の血漿におけるトロンビン生成アッセイの結果を示す。
【図４７Ａ】図４７Ａは、図４６Ａに示されるＮ末端ペプチド構築物を用いる、血小板豊富なＦＶＩＩＩ欠損の血漿における、トロンビン生成アッセイの結果を示す。
【図４７Ｂ】図４７Ｂは、ＦＶＩＩ−０４５およびＦＶＩＩ−０４８の直接比較を示す。
【図４８】図４８は、ＦＡＣＳによって決定される、血小板に対するＦＶＩＩ−０４５およびＦＶＩＩ−０４８ならびに野性型ＦＶＩＩａＦｃの結合を示す。この図はまた、Ｂｅｒｎａｒｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００８，４７：４６７４−４６８２に報告されるような標的ペプチドの親和性を示す。
【図４９Ａ】図４９Ａは、例示的な標的化されるＦＶＩＩＩ構築物を示す。
【図４９Ｂ】図４９Ｂは、ＦＶＩＩＩ欠損の血小板豊富な血漿におけるトロンビン生成アッセイの結果を示す。この実験では、アッセイは、組織因子（上のパネル）で活性化されるか、または血小板活性化（下のパネル）によって活性化された。
【図５０】図５０は、ｇｌａドメインを含む標的化ＦＶＩＩ構築物（ＦＶＩＩ−０１１）、およびｇｌａドメインを欠いている標的化ＦＶＩＩ構築物（ＦＶＩＩ−０２８）の半減期を測定する実験の結果を示す。
【図５１Ａ】図５１Ａは、標的部分を含むいくつかのＦＩＸ構築物、この場合は、ＳＣＥ５ｓｃＦｖを示す。
【図５１Ｂ】図５１Ｂは、図５１Ａの構築物を用いる、血小板豊富なＦＩＸ欠損の血漿における、トロンビン生成アッセイの結果を示す。
【図５１Ｃ】図５１Ｃでは、ＦＩＸ−０６８およびＦＩＸ−０８８の両方とも、トロンビン生成によって測定される場合、ＦＩＸ−０４２よりも少なくとも４倍高い活性を有することが図示される。
【図５２Ａ】図５２Ａは、ＦＩＸ−０９０およびＢｅｎｅｆｉｘを比較するトロンビン生成アッセイの結果を示す。
【図５２Ｂ】図５２Ｂでは、ＦＩＸ−０９０の活性がＢｅｎｅｆｉｘの活性のほぼ４倍であることが示される。
【図５３Ａ】図５３Ａは、休止血小板および活性化された血小板に存在する、ＧＰＩｂに結合するペプチドを含んでいる標的化ＦＩＸを示す。
【図５３Ｂ】図５３Ｂは、血小板豊富なＦＩＸ欠損の血漿における、トロンビン生成アッセイの結果を示す。
【図５３Ｃ】図５３Ｃでは、ＦＩＸ−０８９が、トロンビン生成によって測定した場合、ＦＩＸ−０４２よりもほぼ４倍強いが、比活性は低いことが示される。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
発明の詳細な説明
本発明は、キメラの凝固因子に関する。本発明は、凝固因子の有効性、薬物動態特性、および／または製造可能性を増強する新規な方法の開発に少なくとも一部は基づく。一実施形態では、本発明の改善された凝固因子は、活性が増大しており、ここでは、例えば、血小板に対して凝固因子を標的すること、または血栓形成の部位で活性化される、活性化可能な形態（天然には存在しない活性化可能な形態）で被験体に存在することを必要とする。これは、例えば、凝固因子を標的することによって、またはそれらを活性化可能な形態で作製することによって達成され得る。
【００６４】
一実施形態では、本発明の凝固因子は、凝血の部位に標的される。凝固因子を休止血小板または活性化された血小板に標的する標的部分を組み込むことによって、凝固因子の活性は、増強され得る。例えば、第ＶＩＩ因子の場合、活性化因子Ｘ（ＦＸａ）を生成するために内皮細胞表面で組織因子（ＴＦ）によって活性化される可能性が高い内因性のＦＶＩＩとは異なり、外因性のＦＶＩＩａは、ＴＦとは独立した方式でＦＸａ／ＦＩＸａを生成する可能性が高い（他の凝固因子が局在化される活性化血小板の表面で最も有効である）。しかし、生理学的には、ＦＶＩＩａは、内皮細胞のようなＴＦ保有性の細胞の表面で作用して、血小板に低い親和性を有する。治療的な組み換えＦＶＩＩａは、活性化された血小板の表面上で第Ｘ因子を第Ｘａ因子に変換することによって作用するという仮説がなされた。低い血小板親和性を克服して、出血を処置するのに有効であるには、組み換えＦＶＩＩａは、生理学的なレベルを上回って投与される。従って、ＦＶＩＩａの場合、血小板表面に対する標的化は、この分子の有効性を有意に増大し得る。他の凝固因子（例えば、ＦＩＸ、ＦＶＩＩＩ、ＦＸ）は、血小板に対して高い親和性を有するが、血小板標的化部位を組み込むことによって、これらは活性の増強を示し過ぎる場合がある。さらに、ＦＶＩＩａはヒトでは比較的半減期が短い（約２．３時間）。この半減期の短さのせいで、出血を制御するために組み換えＦＶＩＩａは複数回投与する必要をもたらす可能性がある。従って、血小板に対して凝固因子、詳細にはＦＶＩＩａを標的することは有効性を改善する。
【００６５】
標的部分は、キメラの凝固因子の多数の位置に配置され得る。標的化されたキメラの凝固因子の例示的な構造は、例えば、図１−４、７、８、１７、１９、２１、４４、４６、４９、５１、および５３に示される。
【００６６】
別の実施形態では、本発明のキメラの凝固因子は、凝血の部位で活性化可能な形態で作製される。バイパス療法における使用のためには、外因性の凝固因子は、活性化型で与えられる場合のみ有効である。しかし、このような活性化された凝固因子は、内因性の経路（例えば、アンチトロンビンＩＩＩ、ＴＦＰＩ）によって急速に不活性化されて、活性型のクリアランスおよび短い有効半減期がもたらされる。より高用量を考慮すれば、この問題は解決されない。なぜなら、これは、血栓形成効果を生じ得るからである。従って、一実施形態では、本発明は、「活性化可能な」キメラの凝固因子構築物であって、凝固因子に正常は存在しない異種の酵素的切断部位を含む、キメラの凝固因子構築物に関する。これらの分子は、増強されたチモーゲンとして循環し、投与の際に不活性化がないことで半減期が長いが、酵素による切断によって凝固部位で容易に活性化され得る。一実施形態では、このような異種の酵素的切断部位は、凝固ケスケードの間に産生される酵素についての切断部位である。例えば、一実施形態では、活性化可能な構築物の異種切断部位は、第ＸＩａ因子、第Ｘａ因子、またはトロンビン切断部位を含む。例示的なＦＸＩａ切断部位としては、例えば、以下が挙げられる：ＴＱＳＦＮＤＦＴＲおよびＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲ。例示的なトロンビン切断部位としては、例えば、以下が挙げられる：ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ、ＴＴＫＩＫＰＲ、およびＡＬＲＰＲ。一実施形態では、異種の切断部位は、上記凝固因子の軽鎖と重鎖との間に差し込まれる。別の実施形態では、異種の切断部位は、この凝固因子の２つの鎖の間に差し込まれない。一実施形態では、この異種切断部位は、この凝固因子の重鎖に対してアミノ末端である。
【００６７】
この異種切断部位は、切断性のリンカー中に存在し、キメラの凝固因子において多数の位置に位置し得る。活性化可能なキメラの凝固因子の例示的な構造は、例えば、図５、６、９、２９、２７、３１、および４１に示される。例示的なこのような構築物は、血栓形成の存在下で活性化されて、下にさらに詳細に記載される。
【００６８】
一実施形態では、本発明のキメラの凝固因子は、例えば、分子の流体力学半径を増大するための足場を備える。例えば、本発明のキメラの凝固因子は、融合タンパク質であってもよい。例示的な足場としては、例えば、ＦｃＲｎ結合部分（例えば、完全Ｆｃ領域またはＦｃＲｎに結合するその部分）、単鎖のＦｃ領域（ＳｃＦｃ領域，例えば、米国特許出願公開第２００８／０２６０７３８号、ＷＯ２００８／０１２５４３、またはＷＯ２００８／１４３９５４５に記載される）、切断可能ｓｃＦｃ領域（本明細書に記載されるようなｃｓｃＦｃ領域を含む）、複雑性の少ないタンパク質またはその一部、例えば、ＸＴｅｎポリペプチド（登録商標）、またはアルブミンが挙げられる。
【００６９】
一実施形態では、  本発明のキメラの凝固因子は、Ｆｃ領域またはそのＦｃＲｎ結合部分を足場部分として使用する。一実施形態では、キメラの凝固因子が融合されるＦｃ部分は、天然に存在する（または野性型（ＷＴ）の）Ｆｃ部分である。別の実施形態では、Ｆｃ部分は、配列中に１つ以上の変動を含む。
【００７０】
別の実施形態では、Ｆｃ部分は、ｓｃＦｃ部分（例えば、非切断性のまたはｃｓｃＦｃリンカーを含む）である。ｃｓｃＦｃリンカーを含む構築物では、プロセシングされていない分子は、切断性の単鎖のＦｃ領域を含み、ここでは成分のＦｃ部分は単一のポリペプチド鎖中に遺伝子的に融合されて、機能的な単鎖の二量体Ｆｃ領域を形成する。ｃｓｃＦｃリンカーは、ポリペプチドの二量体Ｆｃ領域を縦列で含むＦｃ部分を連結してもよいし、または１つのＦｃ部分をこの構築物の非−Ｆｃ部分、例えば、凝固因子もしくは標的部分に連結してもよく、これが次に第二のＦｃ部分に連結される。このｃｓｃＦｃリンカーは、ｓｃＦｃ領域を含み、少なくとも１つの酵素的切断部位、例えば、細胞内酵素プロセシング部位に隣接するＦｃ部分の間に差し込まれる。一実施形態では、ｓｃＦｃリンカーは、核酸分子によってコードされるタンパク質が細胞中でプロセシングされるとき、リンカー（例えば、そのリンカーの全てまたは実質的に全て）の切除を生じる２つの酵素的切断部位に隣接される。別の実施形態では、このｓｃＦｃリンカーは、ポリペプチドが細胞によって分泌された後に、インビトロでこのリンカーの切除を可能にする少なくとも１つの酵素的切断部位に隣接するか、またはこの構築物が被験体に投与された後に、インビボでリンカーの切断を可能にする少なくとも１つの酵素的切断部位を備える。従って、一実施形態では、このようなポリペプチドは、プロセシングされていない形態で１つの連続ヌクレオチド配列の一部として単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中にコードされるｓｃＦｃ領域（単数または複数）を備えるが、ｃｓｃＦｃリンカーは酵素的に切断され（例えば、投与の前、または投与後インビボで）、単一アミノ酸鎖に融合されていないＦｃ領域を含むヘテロ二量体分子であるポリペプチドを生じ、すなわち、この得られたプロセシングされた構築物は、２つのポリペプチド鎖を含むＦｃ領域を有する。このような実施形態では、全てのまたは実質的に全てのリンカーが切除されるが、いくつかの実施形態では、切断部位の一部、例えば、ＲＲＲＲ切断部位という４つのアルギニンが残る場合がある。
【００７１】
一実施形態では、ｓｃＦｃリンカーは、切断のための２つのプロセシング部位に隣接する。この２つのプロセシング部位は、同じであってもまたは異なってもよい。一実施形態では、少なくとも１つのプロセシング部位は、アルギニンｋｅｘ２／フリン酵素によって認識されるような塩基性アミノ酸残基のクラスターである。このような酵素は、アルギニン残基のすぐＣ末端側で切断する。別の実施形態では、少なくとも１つの切断部位は、インビボで切断され得る部位、例えば、トロンビンによって認識される切断部位である。
【００７２】
一実施形態では、本発明のキメラの凝固因子は、ｃｓＦｃリンカーを含むｓｃＦｃ分子の状況では、活性型で製造される。例えば、第ＶＩＩ因子は一般には、チモーゲンとして組み換え的に産生され、投与のための活性型を産生するには製造の間に活性が必要である。一実施形態では、本発明のキメラの凝固因子は、製造可能性を改善するためにこれが活性型で発現される細胞から分泌される。下にさらに詳細に示すとおり、このような凝固因子は、分子中に単鎖のＦｃ領域を組み込むことによって産生され得る。単鎖Ｆｃ領域は、単一のポリペプチド鎖中に存在するＦｃ部分の二量体化によって形成される。一実施形態では、このような構築物は、少なくとも１つの細胞内プロセシング部位に隣接するｓｃＦｃの２つのＦｃ部分を連結するｓｃＦｃポリペプチドリンカーを備える。このような構築物の切断は、分泌経路において後期まで、例えば、タンパク質がトランスゴルジ装置中で活性プロセシング酵素と共存するときまで、遅れる。
【００７３】
一実施形態では、本発明のポリペプチドをコードする構築物を発現する細胞は、２つのポリペプチド鎖を含む二量体分子を生じる１つ以上のプロセシング部位でｓｃＦｃリンカーを切断する酵素を内因性に発現する。別の実施形態では、本発明のポリペプチドをコードする構築物を発現する細胞は、１つ以上のプロセシング部位でｓｃＦｃリンカーを切断する酵素を外因性に発現する。
【００７４】
一実施形態では、本発明のキメラの凝固因子は、最適の構築物を創出するためにこれらの特徴のうちの２つ以上を組み合わせてもよい、例えば、休止血小板に対して活性化可能な融合タンパク質構築物を標的すること（その結果、効果的におよび活性な凝固の部位でより高い局所濃度で活性化される）。例示的なこのような組み合わせの構築物は、両方ともが標的されるキメラの凝固因子を備え、かつプロセシングの増強のためのｓｃＦｃリンカーを備える。別の実施形態では、本発明の構築物は、標的化されて、活性化可能である。
【００７５】
例示的な本発明の構築物は、添付の図面および配列表に図示される。一実施形態では、本発明は、図に示される構造を有するポリペプチドに関する。別の実施形態では、本発明は、添付の配列表に示される配列を有するポリペプチドまたはこのようなポリペプチドをコードする核酸分子に関する。一実施形態では、本発明は、添付の配列表に示される配列を有するポリペプチドの成熟型に関する。これらの構築物およびそれらをコードする核酸分子は、被験体において止血を改善するために用いられ得ることが理解される。
【００７６】
本明細書および特許請求の範囲の明確に理解するために、以下の定義を下に示す。
【００７７】
１．定義
本明細書において用いる場合、「タンパク質」または「ポリペプチド」という用語は、２つ以上の天然のアミノ酸または天然でないアミノ酸のポリマーを指す。
【００７８】
「アミノ酸」という用語には、アラニン（ＡｌａまたはＡ）；アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）；アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）；アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）；システイン（ＣｙｓまたはＣ）；グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）；グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）；グリシン（ＧｌｙまたはＧ）；ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）；イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）；ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）；リジン（ＬｙｓまたはＫ）；メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）；フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）；プロリン（ＰｒｏまたはＰ）；セリン（ＳｅｒまたはＳ）；トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）；トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）；チロシン（ＴｙｒまたはＹ）；およびバリン（ＶａｌまたはＶ）を包含する。非伝統的なアミノ酸も、本発明の範囲内であり、ノルロイシン、オミチン、ノルバリン、ホモセリン、およびＥｌｌｍａｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１−３３６（１９９１）に記載されるものなどの他のアミノ酸残基アナログを包含する。そのような非天然のアミノ酸残基を生成するために、Ｎｏｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１８２（１９８９）および上述のＥｌｌｍａｎらの手順を用いてもよい。簡潔に述べると、これらの手順は、天然に存在しないアミノ酸残基を用いてサプレッサーｔＲＮＡを化学的に活性化し、その後、ＲＮＡのインビトロの転写および翻訳を行うことを包含する。非伝統的なアミノ酸の導入は、当該分野で公知のペプチド化学を用いて達成することもできる。本明細書において用いられる「極性のアミノ酸」という用語は、正味ゼロ電荷を有するが、それらの側鎖（例えば、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｃ）の異なる部分にゼロでない部分電荷を有するアミノ酸を包含する。これらのアミノ酸は、疎水性相互作用および静電相互作用に関与する場合がある。本明細書において用いられる「荷電アミノ酸」という用語は、それらの側鎖（例えば、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｅ、Ｄ）に非ゼロ正味荷電を有することができるアミノ酸を包含する。これらのアミノ酸は、疎水性相互作用および静電相互作用に関与する場合がある。
【００７９】
「アミノ酸置換」とは、第２の異なる「置換」アミノ酸残基による、所定のアミノ酸配列（出発ポリペプチドのアミノ酸配列）における少なくとも１つの既存のアミノ酸残基の置換を指す。「アミノ酸挿入」とは、所定のアミノ酸配列への少なくとも１つの付加的アミノ酸の組み込みを指す。挿入は、通常、１つまたは２つのアミノ酸残基の挿入からなるが、この大きな「ペプチド挿入」は、例えば、約３〜約５または最大約１０、１５、もしくは２０のアミノ酸残基までにおよぶ挿入さえ行うことができる。挿入された残基（単数または複数）は、上記において開示されるように、天然、または非天然であり得る。「アミノ酸欠失」は、所定のアミノ酸配列からの少なくとも１つのアミノ酸残基の除去を指す。
【００８０】
ポリペプチドは、単量体（モノマー）または多量体（マルチマー）のいずれであってもよい。例えば、一実施形態では、本発明のタンパク質は、二量体である。本発明の二量体ポリペプチドは２つのポリペプチド鎖を含んでもよく、または１つのポリペプチド鎖からなってもよい（例えば、ｓｃＦｃ分子の場合）。一実施形態では、本発明の二量体はホモ二量体であり、２つの同一のモノマーサブユニットまたはポリペプチド（例えば、２つの同一のＦｃ部分または２つの同一の生物学的に活性な部分）を含んでいる。別の実施形態では、本発明の二量体は、ヘテロ二量体であり、２つの同一でないモノマーのサブユニットまたはポリペプチドを含んでいる（例えば、２つの異なる凝固因子またはその部分または１つの凝固因子のみを含んでいる）。例えば、参照によって本明細書に援用される、米国特許第７４０４９５６号を参照のこと。
【００８１】
本明細書において用いる場合、「ポリペプチドリンカー」という用語は、ポリペプチド鎖の直鎖状アミノ酸配列における２つのドメインを接続するペプチドまたはポリペプチド配列（例えば、合成ペプチドまたはポリペプチド配列）を指す。一実施形態では、本発明のポリペプチドは、構築物を作製する２つのＦｃ部分を直接または間接的に接続するポリペプチドリンカーをコードする核酸分子によってコードされる。これらのリンカーは、本明細書においては、「ｓｃＦｃリンカー」と呼ばれ、このｓｃＦｃリンカーは、Ｆｃ部分を含んでいるポリペプチドの２つのＦｃ部分の間に差し込まれる。ｓｃＦｃリンカーが２つのＦｃ部分を連続して直鎖状のポリペプチド配列中で接続する場合、これは「直接」連結である。対照的に、ｓｃＦｃリンカーが、第一のＦｃ部分を結合部分に連結し得、これが次に第二のＦｃ部分に連結されて、これによって間接的な連結が形成される。これらのｓｃＦｃリンカーによって、単鎖の遺伝子構築物の形成が可能になる。一実施形態では、このポリペプチドはまた、酵素的切断部位を備え、これが切断可能なｓｃＦｃリンカー（ｃｓｃＦｃリンカー）を生じ、一実施形態では、実質的に切除される（例えば、細胞によるプロセシングの間）。従って、得られたプロセシングされたポリペプチドは、二量体分子であり、これは、少なくとも２つのアミノ酸鎖を含み、かつ外来のリンカーのアミノ酸配列を実質的に欠く。いくつかの実施形態では、全てまたは実質的に全てのリンカーが切除されるが、いくつかの実施形態では、切断部位の一部、例えば、ＲＲＲＲ切断部位の４つのアルギニンが残る場合がある。
【００８２】
別の実施形態では、本明細書においては「スペーサー」と呼ばれる別の種類のポリペプチドリンカーを用いて、異なる部分、例えば、凝固因子または標的部分をポリペプチド上のＦｃ部分に接続してもよい。この種のリンカーは、ポリペプチド分子に対して可塑性を提供し得る。スペーサーは一般的には切断されない；しかし特定の実施形態では、このような切断は所望され得る。スペーサーの例示的な部分は、添付の図面に示される。スペーサーは、凝固因子、標的化部分、および／または足場の間に、例えば、これらの部分のＮ末端またはＣ末端に位置してもよい。一実施形態では、これらのリンカーは、プロセシングの間に除去されない。
【００８３】
本発明のキメラの凝固因子に存在し得る第三種のリンカーは、本明細書では、異種の切断部位を含む「切断性（切断可能）リンカー」と呼ばれ、これは異種の切断部位（例えば、第ＸＩａ因子、Ｘａ、またはトロンビン切断部位）を含み、追加のスペーサーリンカーを、切断部位のＮ末端もしくはＣ末端のいずれかまたは両側の上に含んでもよい。このような部位の例示的な位置は、添付の図面に示され、そして、例えば、標的化部分に隣接する位置を含む。別の実施形態では、このようなリンカーは、凝固因子またはその一部に隣接さしてもよい。例えば、一実施形態では、切断性のリンカーは、凝固因子の重鎖のＮ末端に融合されて、この凝固因子の活性化可能な形態を作製し得る。このような場合、この切断性のリンカーは、その切断部位のＮ末端で追加のスペーサーリンカーを含んでもよいが、その凝固因子の重鎖のアミノ末端に対する切断部位のＣ末端での直接融合を必要とする。
【００８４】
本明細書において用いる場合、「ｇｌｙ−ｓｅｒポリペプチドリンカー」という用語は、グリシンおよびセリン残基からなるペプチドを指す。例示的なｇｌｙ／ｓｅｒポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号４）を含む。別の例示的なｇｌｙ／ｓｅｒポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列Ｓ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含む。
【００８５】
一実施形態では、ｎ＝１である。他の実施形態では、ｎ＝２である。別の実施形態では、ｎ＝３、すなわち、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３である。別の実施形態では、ｎ＝４、すなわち、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号６）である。別の実施形態では、ｎ＝５である。さらに別の実施形態では、ｎ＝６である。別の実施形態では、ｎ＝７である。さらに別の実施形態では、ｎ＝８である。別の実施形態では、ｎ＝９である。さらに別の実施形態では、ｎ＝１０である。別の例示的なｇｌｙ／ｓｅｒポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号２６）を含む。一実施形態では、ｎ＝１である。一実施形態では、ｎ＝２である。好ましい実施形態では、ｎ＝３である。別の実施形態では、ｎ＝４である。別の実施形態では、ｎ＝５である。さらに別の実施形態では、ｎ＝６である。
【００８６】
指名されたポリペプチドまたはタンパク質「由来の」ポリペプチドまたはアミノ酸の配列とは、ポリペプチドの起源を指す。好ましくは、ポリペプチドまたはアミノ酸配列（特定の配列に由来する）は、その配列またはその一部に対して本質的に同一であるアミノ酸配列を有する（ここでこの一部は、少なくとも１０〜２０アミノ酸、好ましくは少なくとも２０〜３０アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも３０〜５０アミノ酸からなる）か、そうでなければ、その配列の起源を有すると当業者に確認できる。
【００８７】
別のペプチド由来のポリペプチドは、出発ポリペプチドに対して１つ以上の変異、例えば、別のアミノ酸残基で置換された１つ以上のアミノ酸残基、または１つ以上のアミノ酸残基の挿入もしくは欠失を有する１つ以上のアミノ酸残基を有する場合がある。好ましくは、このポリペプチドは、天然には存在しないアミノ酸配列を含む。このような改変体は、必然的に出発抗体と１００％未満の配列同一性または類似性を有する。好ましい実施形態では、この改変体は、出発ポリペプチドのアミノ酸配列と約７５％〜１００％未満、より好ましくは、約８０％〜１００％未満、さらに好ましくは約８５％〜１００％未満、さらに好ましくは約９０％〜１００％未満（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）、そして最も好ましくは約９５％〜１００％未満のアミノ酸配列同一性または類似性のアミノ酸配列を、例えば、改変体分子の長さにわたって有する。一実施形態では、出発ポリペプチド配列とそれに由来する配列との間に１つのアミノ酸相違がある。この配列に関する同一性または類似性は、本明細書において、配列を整列させ、もし必要であれば、最大パーセント配列同一性を達成するために配列をアラインメントしてギャップを導入した後、出発アミノ酸残基と同一である（すなわち、同じ残基の）候補配列におけるアミノ酸残基の割合として定義される。
【００８８】
本発明の好ましいポリペプチドは、ヒトタンパク質配列由来のアミノ酸配列（例えば、少なくとも１つの凝固因子またはＦｃ部分またはドメイン）を含む。しかし、ポリペプチドは、別の哺乳動物種由来の１つ以上のアミノ酸を含んでもよい。例えば、凝固因子、Ｆｃドメイン、または標的部分は、非ヒト種由来であって、本発明のポリペプチドに含まれてもよい。あるいは、１つ以上のアミノ酸が、非ヒト種由来のポリペプチドに存在してもよい。本発明の好ましいポリペプチドは、免疫原性ではない。
【００８９】
本発明のポリペプチドは、それらが天然に存在するかまたは天然のポリペプチド（それが由来する）とは、天然のポリペプチドの所望の活性を保持したままで、アミノ酸配列において変化するように変更され得ることがまた当業者によって理解される。例えば、「非必須」アミノ酸残基で保存的置換または変化をもたらすヌクレオチドまたはアミノ酸置換が作製されてもよい。免疫グロブリン由来のポリペプチド（例えば、Ｆｃドメイン、部分、または抗原結合部位）の非天然の改変体をコードする単離された核酸分子は、免疫グロブリンのヌクレオチド配列への１つ以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失（その結果１つ以上のアミノ酸の置換、付加または欠失がこのコードされたタンパク質に導入される）によって創出され得る。変異は、標準的な技術、例えば、部位指向性突然変異誘発、およびＰＣＲ媒介性の突然変異誘発によって導入され得る。
【００９０】
本発明のポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸残基で、例えば、必須または非必須アミノ酸残基で、保存的アミノ酸置換を含んでもよい。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される置換である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該分野で定義されており、これには塩基性の側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性の側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。従って、ポリペプチド中の非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換されてもよい。別の実施形態では、アミノ酸のストリングを、構造的に同様のストリング（順序および／または側鎖ファミリーメンバーの組成が異なる）で置換してもよい。あるいは、別の実施形態では、変異体は、飽和突然変異誘発などによってコード配列の全てまたは一部にそって無作為に導入されてもよいし、得られた変異体は、本発明のポリペプチドに導入されてもよいし、それらが所望の標的に結合する能力についてスクリーニングされてもよい。
【００９１】
ポリペプチドの状況では、「直鎖状配列」または「配列」とは、アミノからカルボキシル末端方向における、ポリペプチド中のアミノ酸の順序であり、ここでは配列中でお互いと隣接する残基は、このポリペプチドの一次構造中で連続する。
【００９２】
本明細書において用いる場合、「連結される」、「融合される」、または「融合」という用語は、ペプチド結合（例えば、遺伝子融合）、化学的結合または他の手段を介した連結を指す。例えば、分子または部分が連結され得る１つの方法は、ペプチド結合を介して分子または部分を連結するポリペプチドリンカーを使用する。「遺伝子的に融合される」、「遺伝子的に連結される」または「遺伝子的融合」は、交換可能に用いられ、２つ以上のタンパク質、ポリペプチド、またはそれらのフラグメントの、それらの個々のペプチド骨格を介した、これらのタンパク質、ポリペプチドまたはフラグメントをコードする単一のポリヌクレオチド分子の遺伝子発現を通じた、同一線上の、共有結合、または結合を指す。このような遺伝子的融合は、単一の連続の遺伝子的配列の発現を生じる。好ましい遺伝子的融合は、インフレームであり、すなわち、２つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が融合されて、連続するより長いＯＲＦが、もとのＯＲＦの正確なオープンリーディングフレームを維持する方式で形成される。従って、得られた組み換え融合タンパク質は、もとのＯＲＦによってコードされるポリペプチドに対応する２つ以上のタンパク質セグメントを含む単一のポリペプチドである（このセグメントは、正常には、自然にはそのように連結されない）。この場合、この単一のポリペプチドは、プロセシングの間に切断されて、２つのポリペプチド鎖を含む二量体分子が生じる。
【００９３】
本明細書において用いる場合、「Ｆｃ領域」という用語は、天然の免疫グロブリンのＦｃ領域に対応するポリペプチドの一部（すなわち、その２つの重鎖のそれぞれのＦｃドメインの二量体会合によって形成されるような）として定義される。天然のＦｃ領域は、ホモ二量体であり、２つのポリペプチド鎖を含む。対照的に「遺伝子的に融合されるＦｃ領域」または「単鎖Ｆｃ領域」（ｓｃＦｃ領域）という用語は、本明細書において用いる場合、単一ポリペプチド鎖内で遺伝子的に連結される（すなわち、単一の連続の遺伝子配列でコードされる）Ｆｃドメインからなる合成の二量体Ｆｃ領域を指す。
【００９４】
本明細書において用いる場合、「Ｆｃドメイン」という用語は、パパイン切断部位のすぐ上流のヒンジ領域で始まり（すなわち、重鎖定常領域の第一の残基を１１４として、ＩｇＧの残基２１６）、抗体のＣ末端で終わる、単一の免疫グロブリン重鎖の一部を指す。従って、完全Ｆｃドメインは、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む。
【００９５】
本明細書において用いる場合、「Ｆｃドメイン部分」または「Ｆｃ部分」という用語は、Ｆｃドメインのアミノ酸配列を含むか、またはＦｃドメイン由来である。特定の実施形態では、Ｆｃ部分は、以下の少なくとも１つを含む：ヒンジ（例えば、上、中および／または下のヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、または改変体、一部、またはそのフラグメント。他の実施形態では、Ｆｃ部分は、完全Ｆｃドメイン（すなわち、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン）を含む。一実施形態では、Ｆｃ部分は、ＣＨ３ドメイン（またはその一部）に融合されたヒンジドメイン（またはその一部）を含む。別の実施形態では、Ｆｃ部分は、ＣＨ３ドメイン（またはその一部）に融合されたＣＨ２ドメイン（またはその一部）を含む。別の実施形態では、Ｆｃ部分は、ＣＨ３ドメインまたはその一部からなる。別の実施形態では、Ｆｃ部分は、ヒンジドメイン（またはその一部）およびＣＨ３ドメイン（またはその一部）からなる。別の実施形態では、Ｆｃ部分は、ＣＨ２ドメイン（またはその一部）およびＣＨ３ドメインからなる。別の実施形態では、Ｆｃ部分は、ヒンジドメイン（またはその一部）およびＣＨ２ドメイン（またはその一部）からなる。一実施形態では、Ｆｃ部分は、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部（例えば、ＣＨ２ドメインの全てまたは一部）を欠く。
【００９６】
本明細書において用いる場合、「半減期」という用語は、インビボにおける特定のポリペプチドの生物学的半減期を指す。半減期は、被験体に投与された量の半分がその動物の循環および／または他の組織から除去されるのに必要な時間で示され得る。所定のポリペプチドのクリアランス曲線が、時間の関数として構築される場合、その曲線は通常は、急性のα相とより長いβ相との二相性である。このα相は典型的には、血管内腔と血管外腔との間の投与されたＦｃポリペプチドの平衡に相当し、そして部分的にはポリペプチドのサイズによって決定される。このβ相は典型的には、血管内腔のポリペプチドの代謝に相当する。従って、好ましい実施形態では、本明細書において用いられる半減期という用語は、β相のポリペプチドの半減期を指す。ヒトにおけるヒト抗体の代表的なβ相半減期は２１日である。
【００９７】
本明細書において用いる場合、「部分」という用語は、キメラポリペプチドの区画部分または構成要素を指す。
【００９８】
本明細書において用いる場合、「標的化部分」という用語は、所望部位または細胞に対して本発明のポリペプチドを局在するかまたは指向する、分子、そのフラグメントまたはポリペプチドの成分を指す。一実施形態では、本発明の構築物は、例えば、所望の部位に対して分子を局在化することによって、ポリペプチドの活性を増強する「標的化部分」を含む。このような部分は、例えば、抗体またはその改変体（例えば、およびｓｃＦｖ）またはペプチドであってもよい。別の実施形態では、このような標的部分は、ポリペプチド、リガンドのレセプター結合部分、またはレセプターのリガンド結合部分（本発明のポリペプチドに連結されて、例えば、細胞または組織の上で、所望の標的に結合する）であってもよい。この標的部分は、構築物に対して遺伝子的に融合されてもよく、構築物に対して結合体化されてもよく、またはスペーサーを介して構築物に連結されてもよい。例えば、標的化部分は、標的部分と、構築物のＦｃ部分との間の結合の形成によって本発明の構築物に結合されてもよく、ここでこの標的化部分は、第一の官能基を含み、そしてＦｃ部分は、第二の官能基を含み、ここでこの第一および第二の官能基は、お互いと反応して、化学結合を形成し得る（例えば、米国特許第７３８１４０８号を参照のこと）。一実施形態では、標的部分は、血小板に結合する。例示的な標的化部分は、下にさらに詳細に記載される。
【００９９】
一実施形態では、本発明の構築物における使用のための標的部分は、抗体改変体を含む。「抗体改変体」または「改変された抗体」という用語は、天然には存在せず、アミノ酸配列またはアミノ酸側鎖化学（本明細書に記載されるような、天然に由来する抗体のものとは少なくとも１つのアミノ酸またはアミノ酸改変で異なる）を有する抗体を包含する。本明細書において用いる場合、「抗体改変体」という用語は、それが天然には存在しないように変更されている抗体の合成型、例えば、少なくとも２つの重鎖部分を含むが、２つの完全な重鎖は含まない抗体（例えば、ドメイン欠失抗体またはミニボディ）；２つ以上の異なる抗原または単抗原上の異なるエピトープに結合するように変更された多特異性型の抗体（例えば、二重特異性、三重特異性など）；ｓｃＦｖ分子に接合する重鎖分子；一本鎖抗体；ジアボディ；トリアボディ；ならびに変化したエフェクター機能を有する抗体などを包含する。
【０１００】
本明細書において用いる場合「ｓｃＦｖ分子」という用語は、１つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、またはその一部、および１つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、またはその一部からなる結合分子を含み、ここで、各々の可変ドメイン（またはその一部）は、同じまたは異なる抗体に由来する。ｓｃＦｖ分子は、好ましくは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に差し込まれるｓｃＦｖリンカーを含む。ＳｃＦｖ分子は、当該分野で周知であり、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号、Ｈｏら、１９８９．Ｇｅｎｅ  ７７：５１、Ｂｉｒｄら、１９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３、Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏら、１９９１．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０１１７、Ｍｉｌｅｎｉｃら、１９９１．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５１：６３６３、Ｔａｋｋｉｎｅｎら、１９９１．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４：８３７において記載される。
【０１０１】
本明細書において用いられる「ｓｃＦｖリンカー」とは、ｓｃＦｖのＶＬとＶＨドメインとの間に差し込まれる部分を指す。ｓｃＦｖリンカーは、好ましくは、抗原結合の高次構造においてｓｃＦｖ分子を維持する。一実施形態においては、ｓｃＦｖリンカーは、ｓｃＦｖリンカーペプチドを含むか、またはそれからなる。特定の実施形態においては、ｓｃＦｖリンカーペプチドは、ｇｌｙ−ｓｅｒポリペプチドリンカーを含むか、またはそれからなる。他の実施形態においては、ｓｃＦｖリンカーは、ジスルフィド結合を含む。
【０１０２】
「グリコシル化」という用語は、ポリペプチドに対する１つ以上の炭水化物の共有結合を指す。代表的には、グリコシル化は、細胞の細胞内環境またはそれからの抽出物内で生じ得る翻訳後事象である。グリコシル化という用語は、例えば、Ｎ−連結グリコシル化（ここでは１つ以上の糖がアスパラギン残基に連結される）および／またはＯ−連結グリコシル化（ここでは１つ以上の糖がヒドロキシル基を有するアミノ酸残基（例えば、セリンまたはトレオニン）に連結される）を包含する。一実施形態では、本発明の分子はグリコシル化される。別の実施形態では、本発明の分子は、非グリコシル化されている（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）。さらに別の実施形態では、本発明の分子は、野性型Ｆｃ領域におけるグリコシル化と比較してグリコシル化が低下している。
【０１０３】
本明細書において用いられる「ジスルフィド結合」という用語は、２つの硫黄原子の間に形成される共有結合を包含する。アミノ酸システインは、ジスルフィド結合を形成し得るか、第２のチオール基と架橋し得るチオール基を含む。大半の天然に存在するＩｇＧ分子では、ＣＨ１およびＣＬ領域は、天然ジスルフィド結合によって結合され、２つの重鎖は、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムを用いて２３９および２４２（ＥＵナンバリングシステムでは位置２２６または２２９）に対応する位置で２つの天然ジスルフィド結合によって結合される。
【０１０４】
「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、所望のポリヌクレオチドを細胞に導入して発現するためのビヒクルとして、本発明に従って用いられるベクターを意味する。当業者に公知のように、そのようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス、およびレトロウイルスからなる群から容易に選択することができる。一般的に、本発明に適合するベクターは、選択マーカー、所望の遺伝子のクローニングを容易にする適切な制限部位、ならびに真核または原核細胞に進入および／または複製する能力を含む。
【０１０５】
本発明のキメラの凝固因子を産生するために、多数の発現ベクター系を使用してもよい。例えば、ベクターの１つのクラスは、ウシ乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクチニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶまたはＭＯＭＬＶ）、またはＳＶ４０ウイルスなどの動物ウイルスに由来するＤＮＡエレメントを利用する。さらに、染色体内にＤＮＡを組み込まれた細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することによって選択され得る。このマーカーは、栄養要求性宿主への原栄養性、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）、または銅などの重金属に対する耐性を提供し得る。選択性のマーカー遺伝子は、発現されるべきＤＮＡ配列に直接結合されてもよいし、または同時形質転換によって同じ細胞に導入されてもよい。一実施形態においては、誘導性発現系を使用してもよい。付加的エレメントも、ｍＲＮＡの最適な合成に必要となる場合がある。これらのエレメントは、シグナル配列、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、および終止シグナルを含んでもよい。一実施形態においては、分泌シグナル、例えば、幾つかのよく特徴付けられた細菌性リーダーペプチド（例えば、ｐｅｌＢ、ｐｈｏＡ、またはｏｍｐＡ）のいずれか１つが、ポリペプチドの最適な分泌を得るために、本発明のポリペプチドのＮ末端とインフレームで融合されてもよい（Ｌｅｉら、（１９８８），Ｎａｔｕｒｅ，３３１：５４３、Ｂｅｔｔｅｒら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１０４１、Ｍｕｌｌｉｎａｘら、（１９９０）．ＰＮＡＳ，８７：８０９５）。
【０１０６】
「宿主細胞」という用語は、組み換えＤＮＡ技術を用いて構築され、少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターによって形質転換された細胞を指す。組み換え宿主からのタンパク質の単離のためのプロセスの説明において、「細胞」および「細胞培養」という用語は、他に明確に特定されない限り、同義的に使用され、タンパク質源を意味する。言い換えれば、「細胞」からのタンパク質の回収は、スピンダウンした全細胞、または培地および懸濁された細胞の両方を含有する細胞培養からのいずれかを意味し得る。タンパク質発現のために用いられる宿主細胞株は、最も好ましくは、哺乳動物由来のものであり；当業者は、その中で発現される所望の遺伝子産物に対して最も適切な特定の宿主細胞株を優先的に判定する能力を有すると考えられる。例示的な宿主細胞株しては、限定するものではないが、ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０Ｔ抗原を有するＣＶＩの誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＰｅｒＣ６細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、および２９３（ヒト腎臓）が挙げられる。宿主細胞株は、通常、商業サービスであるＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、または既刊の文献から入手可能である。本発明のポリペプチドは、細菌もしくは酵母などの非哺乳動物細胞、または植物細胞においても発現することができる。この点において、細菌のような様々な単細胞性非哺乳動物微生物；すなわち、培養または発酵において増殖できる微生物も形質転換することができることが理解される。形質転換を起こしやすい細菌としては、腸内細菌科のメンバー、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）またはサルモネラ属の株；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのようなバシラス科；肺炎球菌；連鎖球菌、およびインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）が挙げられる。細菌において発現される場合、ポリペプチドは、通常、封入体の一部となることがさらに認識される。ポリペプチドは、単離、精製され、その後に、機能分子に組み立てられなければならない。
【０１０７】
原核生物に加えて、真核微生物を用いてもよい。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、すなわち一般的なパン酵母は、真核微生物の間で最も一般的に用いられるが、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを含む、多数の他の株が、一般に入手可能である。サッカロミセス属における発現のために、例えば、プラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、（１９７９），Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９、Ｋｉｎｇｓｍａｎら、（１９７９），Ｇｅｎｅ，７：１４１、Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら、（１９８０），Ｇｅｎｅ，１０：１５７）が、一般的に用いられる。このプラスミドは、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ，（１９７７），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２）などの、トリプトファンにおいて成長する能力を欠いている酵母の変異株に対する選択マーカーを提供するＴＲＰ１遺伝子を既に含んでいる。そのため、酵母宿主細胞ゲノムの特性としてのｔｒｐｌ損傷の存在は、トリプトファンの非存在下における増殖による形質転換を検出するための効果的な環境を提供する。
【０１０８】
本明細書において用いる場合、「内因性（の）」という用語は、細胞中に天然に存在する分子（例えば、核酸および／またはタンパク質分子）を指す。対照的に、「外因性（の）」または「異種（の）」という用語は、所定の状況、例えば細胞中、またはポリペプチド中で通常には見出されない、このような分子を指す。例えば、外因性または異種の分子は、例えば、トランスフェクションもしくは他の形態の遺伝子操作によって、細胞内に導入されて、細胞の操作後にのみ存在してもよいし、または異種アミノ酸配列は、それが天然には見いだされないタンパク質中に存在ししてもよい。
【０１０９】
本明細書において用いる場合、「切断部位」または「酵素的切断部位」という用語は、酵素によって認識される部位を指す。特定の酵素的切断部位は、細胞内プロセシング部位を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、凝固カスケードの間に活性化される酵素によって切断される酵素的切断部位を有し、その結果このような部位の切断が血栓形成の部位で生じる。例示的なこのような部位としては、例えば、トロンビン、第ＸＩａ因子または第Ｘａ因子によって認識される部位が挙げられる。例示的なＦＸＩａ切断部位としては、例えば、ＴＱＳＦＮＤＦＴＲおよびＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲが挙げられる。例示的なトロンビン切断部位としては、例えば、ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ、ＴＴＫＩＫＰＲ、ＬＶＰＲＧ  配列番号３５）およびＡＬＲＰＲが挙げられる。他の酵素的切断部位は当該分野で公知である。
【０１１０】
本明細書において用いる場合、「プロセシング部位」または「細胞内プロセシング部位」という用語は、ポリペプチドの翻訳後に機能する酵素のための標的であるポリペプチド中のある種の酵素的切断部位を指す。一実施形態では、このような酵素は、ゴルジのルーメンからトランスゴルジ区画への輸送の間に機能する。細胞内プロセシング酵素は、細胞からのタンパク質の分泌の前にポリペプチドを切断する。このようなプロセシング部位の例としては、例えば、エンドペプチダーゼのＰＡＣＥ／フリン（ここでＰＡＣＥは、対の塩基性アミノ酸切断酵素（Ｐａｉｒｅｄ  ｂａｓｉｃ  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  Ｃｌｅａｖｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ）についての頭文字である）ファミリーによって標的される部位が挙げられる。これらの酵素は、ゴルジ膜に局在し、配列モチーフＡｒｇ−［任意の残基］−（ＬｙｓまたはＡｒｇ）−Ａｒｇのカルボキシ末端側でタンパク質を切断する。本明細書において用いる場合、酵素の「フリン」ファミリーとしては、例えば、フリン、ＰＣ２、ＰＣ１／Ｐｃ３、ＰＣ４、ＰＡＣＥ４、ＰＣ５／ＰＣ６、およびＬＰＣ／ＰＣ７／ＰＣ８／ＳＰＣ７が挙げられる。他のプロセシング部位は当該分野で公知である。
【０１１１】
２つ以上のプロセシング部位または切断部位を備える構築物では、このような部位は同じであっても異なってもよいことが理解される。
【０１１２】
インビトロの産生によって、本発明の所望の変更されたポリペプチドを大規模化して大量に生成することが可能になる。組織培養条件下での哺乳動物細胞培養のための技術は、当該分野で公知であり、かつ同種の懸濁培養物を、例えば、エアリフトリアクター中に、もしくは連続スターラーリアクター中に、または固定されるかもしくは取り込まれた細胞培養物を、例えば、中空ファイバー、マイクロカプセル中に、アガロースマイクロビーズもしくはセラミックカートリッジ上に包含する。必要および／または所望の場合、ポリペプチドの溶液は、慣習的なクロマトグラフィー方法、例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ＤＥＡＥ−セルロース上でのクロマトグラフィー、またはアフィニティークロマトグラフィーによって精製されてもよい。
【０１１３】
本明細書において用いる場合、「ポリペプチドの投与から利益を得る被験体」という句は、例えば、止血を改善するための、本発明のポリペプチドの投与から利益を得る、哺乳動物被験体のような被験体を包含する。
【０１１４】
「キメラのタンパク質」または「融合タンパク質」とは本明細書において用いる場合、第二の供給源由来の第二のアミノ酸配列に対して、共有結合的にまたは非共有結合的に結合された、第一の共有原由来の第一のアミノ酸配列から構成される任意のタンパク質であって、ここでこの第一および第二の供給源は同じではないタンパク質を指す。同じではない第一の供給源および第二の供給源は、２つの異なる生物学的実体、または同じ生物学的実体由来の２つの異なるタンパク質、または生物学的実体および非生物学的実体を包含し得る。キメラのタンパク質は、例えば、少なくとも２つの異なる生物学的供給源由来のタンパク質を含んでもよい。生物学的供給源としては、任意の非合成的に産生された核酸またはアミノ酸配列（例えば、上記のいずれかの、本明細書にさらに記載されるような、ゲノムまたはｃＤＮＡの配列、プラスミドまたはウイルスベクター、天然のビリオンまたは変異体もしくはアナログ）を挙げることができる。合成の供給源としては、化学的に産生され、生物学的な系によるのではない（例えば、アミノ酸配列の固相合成）、タンパク質または核酸の配列を挙げることができる。キメラのタンパク質としてはまた、少なくとも２つの異なる合成の供給源由来のタンパク質、または少なくとも１つの生物学的供給源および少なくとも１つの合成の供給源由来のタンパク質を挙げることもできる。キメラのタンパク質はまた、任意の供給源由来、または任意の供給源由来の低分子の有機もしくは無機の分子由来の、核酸に対して共有結合されるかまたは非共有結合された、第一の供給源由来の第一のアミノ酸配列を含んでもよい。このキメラのタンパク質は、第一と第二のアミノ酸配列の間、または第一のアミノ酸配列と核酸との間、または第一のアミノ酸配列と低分子の有機または無機の分子との間にリンカー分子を含んでもよい。
【０１１５】
本明細書において用いる場合、「凝固因子」という用語は、天然に存在するかまたは組み換え産生され、被験体における出血エピソードの期間を防止するかまたは減少する、分子またはそのアナログを指す。言い換えれば、これは、凝固促進活性を有する分子である、すなわち、フィブリノーゲンの不溶性フィブリンのメッシュ（血液を凝固または凝血させる）への変換を担うことを意味する。
【０１１６】
凝固活性とは、本明細書において用いる場合、フィブリン塊の形成において頂点に達するか、および／または出血もしくは放血のエピソードの重篤度、期間もしくは頻度を低減する生化学的反応のカスケードに関与する能力を意味する。
【０１１７】
止血とは、本明細書において用いる場合、放血もしくは出血の停止もしくは緩徐化；または血管もしくは体部を通じた血流の停止もしくは緩徐化を意味する。
【０１１８】
止血障害とは、本明細書において用いる場合、フィブリン塊を形成する能力の障害または不全に起因して、自発性または外傷の結果として、出血傾向によって特徴づけられる遺伝子的に受け継がれるかまたは後天性の状態を意味する。このような障害の例としては、血友病が挙げられる。３つの主な形態とは、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子欠損）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子欠損または「クリスマス病」）および血友病Ｃ（第ＸＩ因子欠損、中度の出血傾向）であり、フォン・ヴィレブランド病、第Ｘｉ因子欠損（ＰＴＡ欠損）、第ＸＩＩ因子欠損、フィブリノーゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子または第ＸＩＩＩ因子における欠損または構造的な異常、ベルナールスリエ（Ｂｅｒｎａｒｄ−Ｓｏｕｌｉｅｒ）症候群は、ＧＰＩｂの血管または欠損である。ＧＰＩｂ（ｖＷＦのレセプター）は、欠損性であって、一次的な血栓形成（一次止血）の欠失および出血傾向の増大）、ならびにグランツマン−ネーゲリ血小板無力症（グランツマン血小板無力症）をもたらし得る。肝不全（急性型または慢性型）では、肝臓による凝固因子の産生が不十分であり；これは出血のリスクを増大し得る。
【０１１９】
本発明のキメラの分子は、予防的に用いられてもよい。本明細書において用いる場合、「予防的処置」という用語は、出血エピソードの前の分子の投与を指す。一実施形態では、一般的な止血剤の必要な被験体とは、手術を受けているか、または手術を受けるところである。本発明のキメラのタンパク質は、予防剤として術前に投与されてもまたは術後に投与されてもよい。本発明のキメラのタンパク質は、急性の出血エピソードを管理するために術中または術後に投与され得る。手術としては、限定するものではないが、肝移植、肝切除、または幹細胞移植を挙げることができる。
【０１２０】
オンデマンドの処置としては、出血エピソード、関節血症、筋出血、口腔出血（ｂｌｅｅｄ）、出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、筋肉への出血、口腔出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、外傷、頭部の外傷（頭部外傷）、胃腸出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後隙出血、後腹膜腔出血、または腸腰筋鞘の出血のための処置が挙げられる。この被験体は、外科的な予防、周術期管理、または手術の処置の必要の必要がある場合がある。このような手術としては、例えば、小手術、大手術、抜歯、扁桃摘出術、鼠径ヘルニア切除術、骨膜切除術、人工膝関節置換術、開頭術、骨接合術、外傷手術、頭蓋内手術、腹腔内手術、胸腔内手術または関節置換術が挙げられる。
【０１２１】
本明細書において用いる場合「急性出血」という用語は、背景にある原因にかかわらず出血エピソードを指す。例えば、被験体は、外傷、尿毒症、遺伝性出血障害（例えば、第ＶＩＩ因子欠損）血小板障害、または凝固因子に対する抗体の発達に起因する耐性を有し得る。
【０１２２】
本明細書に用いられる処置する、処置、処置することとは、例えば、ある疾患または状態の重篤度の軽減；ある疾患経過の期間の減少；ある疾患または状態に関連する１つ以上の症状の寛解；ある疾患または状態を有する被験体に対する有益な効果の提供（この疾患または状態を治癒する必要がない）、ある疾患または状態に関連する１つ以上の症状の予防を指す。
【０１２３】
ＩＩ．凝固因子
詳細には、本発明は、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、および第Ｘ因子の改善バージョンに関する。これらの因子は全てが、軽鎖のアミノ末端が各々、追加部分の組み込みを受け入れられないという点で構造的に関連している。同様に、これらの３つの凝固因子の重鎖のアミノ末端部分は、切断可能な部分（すなわち、切断部分を介して連結される部分または切断部位からなる部分）以外は、追加部分の組み込みを受け入れられない。本発明のキメラの凝固因子構築物は、これらの共有される特性に基づいて命名され、第ＶＩＩ因子は、本発明の例示的な実施形態を例示するために示されることが多いが、本発明の構築物は、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、または第Ｘ因子を用いて作製され得ることが理解される。例えば、当業者は、本発明の構築物のＦＶＩＩ部分が、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸまたはＦＸ部分で置換されて、これらの凝固因子のうちの１つの増強バージョンを作製できることを理解する。
【０１２４】
本発明の例示的なキメラの凝固因子構築物は、添付の図面に示される。この図は一般に、凝固因子を単鎖として（そのチモーゲン型で）図示するが、この凝固因子はまた、本発明の構築物中でその活性型、例えば、二本鎖のジスルフィド結合型として存在してもよいことが理解される。
【０１２５】
一実施形態では、本発明のキメラの凝固因子は、細胞によって活性型で発現される。別の実施形態では、キメラの凝固因子は不活性型で発現され、引き続き、インビトロで適切な条件下で活性化され、その結果この凝固因子の活性型が、この構築物中に存在する。別の実施形態では、本発明のキメラの凝固因子は、凝固因子を不活性型で含み、そしてこの凝固因子は、投与後にインビボで活性化される。
【０１２６】
一実施形態では、ｓｃＦｃ足場は、活性型の分子を産生するために用いられ得る。特定の凝固因子は、組み換え的にチモーゲンとして産生され、従って、製造の間に活性化を要する。活性型の第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、および第Ｘ因子は、重鎖および軽鎖がジスルフィド結合によってのみ連結されている二量体分子から構成される。
【０１２７】
一実施形態では、キメラの凝固因子は、止血を改善するために被験体への投与前に活性化される。凝固因子を活性化するための方法は当該分野で公知である。例えば、一実施形態では、本発明のキメラの凝固因子は、約５ｍＭの濃度でＣａＣｌ２を含有する培地と接触させられる。
【０１２８】
別の実施形態では、本発明のキメラの凝固因子は、それを発現する細胞によって活性型で分泌される。一実施形態では、活性なキメラの凝固因子は、凝固因子の重鎖および軽鎖を別々のポリペプチドとして発現することによって作製される。
【０１２９】
別の実施形態では、凝固因子の重鎖のＮ末端は、分泌経路で後期まで（すなわち、トランスゴルジネットワークにおける活性なプロセシング酵素とタンパク質が共局在化するまで）、合成の間の凝固因子の活性化を遅らせる細胞内プロセシング部位を含むように改変されて、より大きい生産性をもたらす。例示的なこのような細胞内プロセシング部位としては、フリンによって認識される部位が挙げられる。このファミリーの酵素のための例示的な切断部位としては、モチーフＡｒｇ−Ｘａａ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ａｒｇを含むアミノ酸配列が挙げられる。
【０１３０】
好ましい実施形態では、本発明の活性な構築物は、例えば、ｓｃＦｃリンカー（例えば、ｃｓｃｆｃリンカー）を用いて、Ｆｃ融合タンパク質の状況で作製される。
【０１３１】
例示的な構築物は、添付の図面に示される。
【０１３２】
一実施形態では、本発明は、プロセシングされた（例えば、成熟）ポリペプチドであって、ｓｃＦｃポリペプチドリンカーに隣接する少なくとも１つの切断部位が切断され、その結果、その分子がもはや単一のポリペプチド鎖ではなく、その結果、このポリペプチドが、少なくとも２つのポリペプチド鎖から構成される（酵素的切断部位（単数または複数）Ｐ１および／またはＰ２での切断に起因する）、ポリペプチドに関する．
【０１３３】
一実施形態では、このようなプロセシングされたポリペプチドは、ポリペプチドリンカーの切断後に遊離のアミノ末端を有する第二のＦｃ部分（すなわち、ポリペプチドリンカーの切断の前にアミノ末端からカルボキシ末端をカウントしたとき、第二のＦｃ部分）に連結された凝固因子またはその一部を含む。
【０１３４】
一実施形態では、第二のＦｃ部分のＮ末端に結合された凝固因子は、触媒的に活性であり、例えば、酵素活性を有する。別の実施形態では、第二のＦｃ部分のＮ末端に結合された凝固因子は、細胞によってチモーゲンとして分泌されて、この凝固因子が完全に活性化されるためのさらなる酵素的プロセシングを必要とする。
【０１３５】
一実施形態では、本発明は、プロセシングの間、さらなる活性化の必要のない、細胞から活性型または活性化型で分泌される凝固因子に関する。例えば、第ＶＩＩ因子は一般に、組み換え的にチモーゲンとして産生され、投与のための活性型を産生するために製造の間の活性化を必要とする。一実施形態では、本発明のポリペプチドは、製造可能性を改善するためにそれが活性型で発現される細胞から分泌される。下にさらに詳細に示すとおり、このような凝固因子は、ｃｓｃＦｃリンカーを含んでいるｓｃＦｃ分子の状況では凝固因子の軽鎖およびこの凝固の重鎖を別々に発現することによって産生され得る。このような構築物の活性化は、トランスゴルジ装置において活性なプロセシング酵素とタンパク質が共存するとき例えば、プロセシングの間の分泌経路で後期まで遅らせられる。
【０１３６】
一実施形態では、本発明の凝固因子は、第ＶＩＩ因子の成熟型またはその改変体である。第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ、Ｆ７；第７因子、凝血第ＶＩＩ因子、血清第ＶＩＩ因子、血清プロトロンビン変換加速因子、ＳＰＣＡ、プロコンバーチンおよびエプタコグアルファとも呼ばれる）は、凝血カスケードの一部であるセリンプロテアーゼである。ＦＶＩＩは、Ｇｌａドメイン、２つのＥＧＦドメイン（ＥＧＦ−１およびＥＧＦ−２）、およびセリンプロテアーゼドメイン（またはペプチダーゼＳ１ドメイン）（例えば、キモトリプシンとのような、セリンプロテアーゼのペプチダーゼＳ１ファミリーの全てのメンバーの間で高度に保存されている）を含む。ＦＶＩＩは、単鎖チモーゲン、活性化されたチモーゲン様の二本鎖のポリペプチドおよび完全に活性化された二本鎖型として存在する。本明細書において用いる場合、「チモーゲン様」タンパク質またはポリペプチドとは、タンパク質分解性切断によって活性化されたが、依然として、チモーゲンに関連する特性、例えば、低い活性もしくは不活性、またはタンパク質のチモーゲン型の高次構造を模倣する高次構造などを呈するタンパク質を指す。例えば、組織因子に結合されない場合、ＦＶＩＩのこの二本鎖の活性化型は、チモーゲン様タンパク質である；これは、非切断のＦＶＩＩチモーゲンと類似の高次構造を保持し、従って、極めて低い活性を呈する。組織因子に対する結合の際、ＦＶＩＩのこの二本鎖の活性化型は、高次構造の変化を受け、凝固因子としてその完全活性を獲得する。
【０１３７】
例示的なＦＶＩＩ改変体としては、比活性が増大した改変体、例えば、その酵素活性（ＫｃａｔまたはＫｍ）を増大することによってＦＶＩＩの活性を増大する変異体が挙げられる。このような改変体は、当該分野で記載されており、これには、例えば、Ｐｅｒｓｓｏｎら、２００１．ＰＮＡＳ  ９８：１３５８３；Ｐｅｔｒｏｖａｎ  ａｎｄ  Ｒｕｆ．２００１．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６６１６；Ｐｅｒｓｓｏｎら、２００１  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２９１９５；Ｓｏｅｊｉｍａら、２００１．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１７２２９；Ｓｏｅｊｉｍａら、２００２．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４７：４９０２７に記載されるような分子の変異体型が挙げられる。一実施形態では、ＦＶＩＩの改変体は、変異体を含み、例示的な変異としては、Ｖ１５８Ｄ−Ｅ２９６Ｖ−Ｍ２９８Ｑが挙げられる。別の実施形態では、ＦＶＩＩの改変体型としては、ＦＶＩＩ成熟配列からのアミノ酸６０８−６１９（ＬＱＱＳＲＫＶＧＤＳＰＮ，１７０−ループに対応する）のトリプシンの１７０ループ由来のアミノ酸ＥＡＳＹＰＧＫでの置換が挙げられる。ＦＩＸの高い比活性の改変体も当該分野で公知である。例えば、Ｓｉｍｉｏｎｉら、（２００９  Ｎ．Ｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３６１：１６７１）は、Ｒ３３８Ｌ変異体を記載する。Ｃｈａｎｇら、（１９８８  ＪＢＣ  ２７３：１２０８９）およびＰｉｅｒｒｉら、（２００９  ヒトＧｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０：４７９）は、Ｒ３３８Ａ変異体を記載する。他の変異体は、当該分野で公知であり、そして例えば、ＺｏｇｇおよびＢｒａｎｄｓｔｅｔｔｅｒ．２００９  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １７：１６６９；Ｓｉｃｈｌｅｒら．２００３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：４１２１；ならびにＳｔｕｒｚｅｂｅｃｈｅｒら、１９９７．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４１２：２９５に記載されるものが挙げられる。これらの引用文献の内容は、参照によって本明細書に援用される。
【０１３８】
チモーゲン様形態からの高次構造変化の際に生じる完全活性は、その補因子に対する結合の際に組織因子を生じる。また、組織因子の非存在下における高次構造変化を生じる変異も導入され得る。従って、ＦＶＩＩａという言及には、その二本鎖型、チモーゲン様型、および完全活性化された二本鎖型を包含する。
【０１３９】
一実施形態では、本発明の凝固因子は、第ＶＩＩＩ因子またはその改変体の成熟型である。ＦＶＩＩＩは、血液凝固の内因性経路において、カルシウムイオンの存在下で、負に荷電されたリン脂質表面上に存在する反応である、第ＩＸａ因子による第Ｘ因子の活性化を加速する補因子として機能する。ＦＶＩＩＩは、ドメイン構造Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２を有する２３５１のアミノ酸単鎖ポリペプチドとして合成される。Ｗｅｈａｒ，Ｇ．Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：３３７−３４２（１９８４）およびＴｏｏｌｅ，Ｊ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：３４２−３４７（１９８４）。ＦＶＩＩＩのドメイン構造は、相同な凝固因子、第Ｖ因子（ＦＶ）のドメイン構造と同一である。Ｋａｎｅ，Ｗ．Ｈ．ら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８３：６８００−６８０４（１９８６）およびＪｅｎｎｙ，Ｒ．Ｊ．ら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８４：４８４６−４８５０（１９８７）。ＴｈｅＦＶＩＩＩ  Ａ−ドメインは、３３０アミノ酸であり、かつお互いと、ならびにＦＶのＡドメインおよび血漿銅結合タンパク質セルロプラスミンに対して４０％のアミノ酸同一性を有する。Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｎ．ら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８１：３９０−３９４（１９８４）。各々のＣ−ドメインは、１５０アミノ酸であり、かつＦＶのＣドメインに対して、ならびに複合糖質および負に荷電されたリン脂質に結合するタンパク質に対して４０％の同一性を呈する。Ｓｔｕｂｂｓ，Ｊ．Ｄ．ら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８７：８４１７−８４２１（１９９０）。ＦＶＩＩＩ  Ｂ−ドメインは、単一のエキソンによってコードされて、ＦＶ  Ｂ−ドメインを含んでいる任意の公知のタンパク質に対してわずかな相同性を示す。Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒ，Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：３２６−３３０（１９８４）ａｎｄ  Ｃｒｉｐｅ，Ｌ．Ｄ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：３７７７−３７８５（１９９２）。
【０１４０】
ＦＶＩＩＩは、Ａ１ドメインとＡ３ドメインとの間の非共有結合の二価金属イオン結合を通じて会合される重鎖（ドメインＡ１−Ａ２−Ｂ）および軽鎖（ドメインＡ３−Ｃ１−Ｃ２）のヘテロ二量体として血漿中に分泌される。血漿中では、ＦＶＩＩＩは、フォン・ヴィレブランド因子に対する結合によって安定化される。さらに詳細には、ＦＶＩＩＩ軽鎖は、フォン・ヴィレブランド因子のアミノ末端における一次結合部位に対して非共有結合的相互作用によって結合される。トロンビンによるタンパク質分解性活性の際、ＦＶＩＩＩは、２つの重鎖フラグメント（Ａ１、５０ｋＤａフラグメント、およびＡ２、４３ｋＤａフラグメント）および軽鎖（Ａ３−Ｃ１−Ｃ２、７３ｋＤａ鎖）のヘテロ二量体へ活性化される。従って、ＦＶＩＩＩの活性型（ＦＶＩＩＩａ）は、トロンビン切断されたＡ３−Ｃ１−Ｃ２軽鎖に対する二価金属イオン連結を通じて会合されたＡ１サブユニット、およびイオン会合を通じてＡ１ドメインと会合された遊離Ａ２サブユニットからなる。Ｅａｔｏｎ，Ｄ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：５０５（１９８６）；Ｌｏｌｌａｒ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１２４８１（１９９１）；およびＦａｙ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：８９５７（１９９１）。このＦＶＩＩＩａヘテロ二量体は、不安定であり、かつ生理学的条件下でＡ２サブユニットの解離を通じて急速な不活性化を受ける。
【０１４１】
一実施形態では、凝固因子は、第ＶＩＩＩ因子のＢドメイン欠失バージョンを含む。第ＶＩＩＩ因子の「Ｂ−ドメイン」とは、本明細書において用いる場合、内部のアミノ酸配列同一性およびタンパク質分解性切断の部位によって規定される当該分野で公知のＢドメインと同じである（例えば、全長ヒト第ＶＩＩＩ因子の残基Ｓｅｒ７４１−Ａｒｇ１６４８）。他のヒト第ＶＩＩＩ因子ドメインは、以下のアミノ酸残基によって定義される：Ａ１、残基Ａｌａ１−Ａｒｇ３７２；Ａ２、残基Ｓｅｒ３７３−Ａｒｇ７４０；Ａ３、残基Ｓｅｒ１６９０−Ａｓｎ２０１９；Ｃ１、残基Ｌｙｓ２０２０−Ａｓｎ２１７２；Ｃ２、残基Ｓｅｒ２１７３−Ｔｙｒ２３３２。Ａ３−Ｃ１−Ｃ２配列は、残基Ｓｅｒ１６９０−Ｔｙｒ２３３２を含む。残りの配列、残基Ｇｌｕ１６４９−Ａｒｇ１６８９は、通常は、ａ３酸性領域と呼ばれる。全ドメイン（ブタ、マウスおよびイヌの第ＶＩＩＩ因子についてのＢドメインを含む）に関する境界の位置もまた当該分野で公知である。一実施形態では、第ＶＩＩＩ因子のＢドメインは欠失される（「Ｂ−ドメイン−欠失第ＶＩＩＩ因子」または「ＢＤＤＦＶＩＩＩ」）。ＢＤＤＦＶＩＩＩの例は、当該分野で公知のＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）（Ｓ７４３／Ｑ１６３８融合を有する組み換えＢＤＤＦＶＩＩＩ）である。
【０１４２】
「Ｂ−ドメイン−欠失第ＶＩＩＩ因子」は、その各々がその全体として参照によって本明細書に援用される、米国特許第６，３１６，２２６号、同第６，３４６，５１３号、同第７，０４１，６３５号、同第５，７８９，２０３号、同第６，０６０，４４７号、同第５，５９５，８８６号、同第６，２２８，６２０号、同第５，９７２，８８５号、同第６，０４８，７２０号、同第５，５４３，５０２号、同第５，６１０，２７８号、同第５，１７１，８４４号、同第５，１１２，９５０号、同第４，８６８，１１２号、および同第６，４５８，５６３号に開示される全欠失または部分欠失を有する場合がある。いくつかの実施形態では、本発明のＢ−ドメイン欠失の第ＶＩＩＩ因子配列は、米国特許第６，３１６，２２６号（また米国特許第６，３４６，５１３号にも）の第４欄、第４行〜第５欄の２８行および実施例１〜５に開示される欠失のいずれか１つを含む。別の実施形態では、Ｂ−ドメイン欠失の第ＶＩＩＩ因子は、Ｓ７４３／Ｑ１６３８  Ｂドメイン欠失の第ＶＩＩＩ因子（ＳＱバージョンの第ＶＩＩＩ因子）（例えば、アミノ酸７４４〜アミノ酸１６３７の欠失の第ＶＩＩＩ因子、例えば、配列番号６、すなわち配列番号２のアミノ酸１−７４３およびアミノ酸１６３８−２３３２を有する第ＶＩＩＩ因子）である。いくつかの実施形態では、本発明のＢ−ドメイン欠失の第ＶＩＩＩ因子は、米国特許第５，７８９，２０３号（また米国特許第６，０６０，４４７号、米国特許第５，５９５，８８６号、および米国特許第６，２２８，６２０号も）の第２欄２６〜５１行および実施例５〜８に開示される欠失を有する。いくつかの実施形態では、Ｂ−ドメイン欠失の第ＶＩＩＩ因子は、米国特許第５，９７２，８８５の第１欄の２５行〜第２欄の４０行；米国特許第６，０４８，７２０号の第６欄，行１−２２および実施例１；米国特許第５，５４３，５０２号の第２欄、行１７−４６；米国特許第５，１７１，８４４号の第４欄、行２２〜第５欄、行３６；米国特許第５，１１２，９５０号の第２欄、行５５〜６８、図２、および実施例１；米国特許第４，８６８，１１２号の第２欄、行２〜第１９欄、行２１および表２；米国特許第７，０４１，６３５号の第２欄、行１〜第３欄、行１９、第３欄、行４０〜第４欄、行６７、第７欄、行４３〜第８欄、行２６、および第１１欄、行５〜第１３欄、行３９；または米国特許第６，４５８，５６３号の第４欄、行２５〜５３に記載の欠失を有する。いくつかの実施形態では、Ｂ−ドメイン欠失の第ＶＩＩＩ因子は、ほとんどのＢドメインが欠失しているが、その全体が参照によって本明細書に援用される、ＷＯ９１／０９１２２に開示されるように、２つのポリペプチド鎖中への一次翻訳産物のインビボでのタンパク質分解性プロセシングに必須であるＢドメインのアミノ末端配列を依然として含む。いくつかの実施形態では、Ｂ−ドメイン欠失の第ＶＩＩＩ因子は、アミノ酸７４７−１６３８の欠失、すなわち、事実上Ｂドメインの完全アミノ酸欠失で構築されている。Ｈｏｅｂｅｎ  Ｒ．Ｃ．，ら．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（１３）：７３１８−７３２３（１９９０）は、その全体が参照によって本明細書に援用される。Ａ  Ｂ−ドメイン欠失の第ＶＩＩＩ因子はまた、第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸７７１〜１６６６またはアミノ酸８６８〜１５６２の欠失を含んでもよい。Ｍｅｕｌｉｅｎ  Ｐ．，ら．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．２（４）：３０１−６（１９８８）は、その全体が参照によって本明細書に援用される。本発明の一部である追加のＢドメイン欠失としては以下が挙げられる：アミノ酸９８２〜１５６２または７６０〜１６３９の欠失（Ｔｏｏｌｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８６）８３，５９３９−５９４２））、７９７〜１５６２の欠失（Ｅａｔｏｎ，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８６）２５：８３４３−８３４７）），７４１〜１６４６の欠失（Ｋａｕｆｍａｎ（国際公開ＷＯ８７／０４１８７））、７４７−１５６０の欠失（Ｓａｒｖｅｒ，ら、ＤＮＡ（１９８７）６：５５３−５６４））、７４１〜１６４８の欠失（Ｐａｓｅｋ（ＰＣＴ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．８８／００８３１））、または８１６〜１５９８もしくは７４１〜１６４８の欠失（Ｌａｇｎｅｒ（Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．（１９８８）Ｎｏ  ８２：１６−２５，欧州特許第２９５５９７号））（その各々は、その全体が参照によって本明細書に援用される）。前述の欠失の各々は、任意の第ＶＩＩＩ因子配列で作製され得る。一実施形態では、本発明は、ＦＶＩＩＩの標的化バージョンであって、ここで標的化は（ｉ）血小板に特異的に結合し、（ｉｉ）凝固因子の軽鎖と重鎖との間に差し込まれず、かつここでこのキメラの凝固因子は、少なくとも１つの標的化部分を欠いている適切なコントロールに比較して血小板の存在下でトロンビンの生成の増大を示す、標的化バージョンに関する。
【０１４３】
一実施形態では、本発明の凝固因子は、第ＩＸ因子の成熟型またはその改変体である。第ＩＸ因子は、４１５個のアミノ酸の単鎖血漿チモーゲンとして循環する（Ａ．Ｖｙｓｏｔｃｈｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，８４３６（１９９３））。ＦＩＸのチモーゲンは、ＦＸＩａによって、または組織因子／ＦＶＩＩａ複合体によって活性化される。アルギニン−アラニン１４５−１４６とアルギニン−バリン１８０−１８１との間の特定の切断によって、システイン１３２とシステイン２８９との間の単一のジスルフィド結合によって連結される軽鎖および重鎖が生じる（Ｓ．Ｂａｊａｊら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２，４０４７（１９８３））。ＦＩＸの構造的な組織化は、ビタミンＫ依存性の血液凝固タンパク質ＦＶＩＩ、ＦＸおよびプロテインＣのものと同様である（Ｂ．ＦｕｒｉｅおよびＢ．Ｆｕｒｉｅ，前出）。アミノ末端のほぼ４５アミノ酸は、γ−カルボキシグルタミン酸、またはｇｌａ、ドメインを含む。この後ろに、２つの上皮細胞増殖因子相同性ドメイン（ＥＧＦ）、活性化ペプチドおよび触媒性「重鎖」（セリンプロテアーゼファミリーのメンバーである）（Ａ．Ｖｙｓｏｔｃｈｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，８４３６（１９９３）；Ｓ．Ｓｐｉｔｚｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２６５，２１９（１９９０）；Ｈ．Ｂｒａｎｄｓｔｅｔｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２，９７９６（１９９５））が続く。
【０１４４】
一実施形態では、本発明の凝固因子は、第Ｘ因子の成熟型である。第Ｘ因子は、５８．５ｋＤａという分子量のビラミンＫ依存性糖タンパク質であり、肝細胞から血漿中にチモーゲンとして分泌される。最初に、第Ｘ因子は、全部で４８８個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを有するプレプロペプチドとして産生される。このシグナルペプチドは、小胞体中への移入の間にシグナルペプチドによって切断され、このプロペプチド配列は、成熟Ｎ末端鎖のＮ末端で最初の１１のグルタミン酸残基でγカルボキシル化が生じた後に切断される。さらなるプロセシング工程は、Ａｒｇ１８２とＳｅｒ１８３との間での切断によって生じる。このプロセシング工程はまた、３つのペプチドＡｒｇ１８０−Ｌｙｓ１８１−Ａｒｇ１８２の欠失を同時に生じる。得られた分泌された第Ｘ因子チモーゲンは、Ｃｙｓ１７２とＣｙｓ３４２との間のジスルフィド架橋を介して共有結合される１３９アミノ酸のＮ末端軽鎖（Ｍ，１６，２００）および３０６アミノ酸のＣ末端重鎖（Ｍ，４２，０００）からなる。さらなる翻訳後プロセシング工程は、Ａｓｐ１０３のβヒドロキシル化、ならびにＮ−型グリコシル化およびＯ−型グリコシル化を包含する。
【０１４５】
これらの凝固因子の野性型（ＷＴ）バージョンまたはその生物学的に活性な部分に加えて、本発明はまた、活性を有するその前駆体の短縮型、対立遺伝子改変体および種改変体、スプライス改変体によってコードされる改変体、およびこの凝固因子の成熟型に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含んでおり、血栓形成を促進する能力を保持している他の改変体も使用する。例えば、ＴＦ結合、第Ｘ因子結合、リン脂質結合および／またはＦＶＩＩの凝固活性のようなＦＶＩＩの少なくとも１つの活性を保持する、改変されたＦＶＩＩポリペプチドおよびその改変体が使用されてもよい。活性を保持することによって、この活性は、保持される活性のレベルが検出可能な効果を生じるのに十分である限り、野性型凝固因子に比較して、減少されるかまたは増大されるなど、変更されてもよい。本発明の構築物で用いられ得る凝固因子の例示的な配列は、添付の配列表に見出される。
【０１４６】
例示的な改変されたポリペプチドとしては、限定するものではないが、組織特異的なアイソフォームおよびその対立遺伝子改変体、核酸の翻訳によって調製される合成の分子、組み換え方法を通じる、より短いポリペプチドの連結を含む合成のような、化学合成によって生成されるタンパク質、ヒトおよび非ヒト組織および細胞から単離されるタンパク質、キメラのポリペプチドおよびその修飾型が挙げられる。本発明の凝固因子はまた、十分な長さのＷＴ分子のフラグメントもしくは一部からなってもよいし、または全長の成熟ポリペプチドの少なくとも１つの活性を保持する（必要に応じて活性化の際）ための適切な領域を含んでもよい。例示的な凝固因子改変体は、当該分野で公知である。
【０１４７】
本明細書において用いる場合、「Ｇｌａドメイン」という用語は、プロトロンビン、凝固因子ＶＩＩ、ＩＸおよびＸ、タンパク質Ｃ、Ｓ、およびＺのような、ビタミンＫ依存性タンパク質に存在する保存された膜結合モチーフを指す。これらのタンパク質は、これらのタンパク質のＮ末端Ｇｌａドメイン中でクラスター化されるアミノ酸である、ｇ−カルボキシグルタミン酸の翻訳後合成のためにビタミンＫを必要とする。このドメインに存在する全てのグルタミン酸残基は、潜在的なカルボキシル化部位であり、従ってそれらの多くはカルボキシル化によって改変される。カルシウムイオンの存在下では、Ｇｌａドメインは、ホスファチジルセリンを含むリン脂質膜と相互作用する。Ｇｌａドメインはまた、組織因子（ＴＦ）であるＦＶＩＩａ補因子に対する結合においてある役割を果たす。ＴＦと複合体化され、ＦＶＩＩａのＧｌａドメインは、７つのＣａ２＋イオンをロードされ、細胞表面上のリン脂質との相互作用のために細胞膜の方向に３つの疎水性側鎖を突出させＴＦのＣ末端ドメインとの有意な接触を有する。
【０１４８】
第ＶＩＩ因子のＧｌａドメインは、負に荷電されたリン脂質表面に対する凝固因子の結合で重要な役割を果たす、一般的でないアミノ酸（カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）を含む。
【０１４９】
ＧＬＡドメインは、カルシウムイオンの高親和性の結合を担う。これは、成熟型のタンパク質のＮ末端の先端で開始して、保存された芳香族残基で終わる。保存されたＧｌａ−ｘ（３）−Ｇｌａ−ｘ−Ｃｙｓモチーフは、カルボキシラーゼによる基質認識のために重要であるとみなされるドメインの中央で見出される。
【０１５０】
表面プラズモン共鳴分析と組み合わせたストップトフロー蛍光動態測定を用いて、Ｇｌａドメインは、事象の順序に重要であり、それによってＦＶＩＩａのプロテアーゼドメインがｓＴＦと接触を開始することが見出された（ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌおよびＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．２００５．３３７：１２７６）。さらに、凝固因子のクリアランスは、例えば、肝臓細胞およびクリアランスレセプター上で、例えば、ＥＰＣＲ上で。Ｇｌａ相互作用を通じて有意に媒介され得る。
【０１５１】
一実施形態では、標的化凝固因子は、Ｇｌａドメインを欠くように改変される。Ｇｌａドメインは、肝細胞、ＥＰＣＲのようなクリアランスレセプターなどに対する結合のような、複数の経路を介して凝固因子のクリアランスの媒介を担う。従って、Ｇｌａドメインを排除することは、凝固因子の半減期に有益な効果を有する。Ｇｌａドメインはまた、凝固の部位に対して凝固因子を局在化することによって活性に一般的に必要であるが、血小板標的化ドメイン部分を含むことによって、Ｇｌａ欠失の凝固因子を血小板に標的する。一実施形態では、本発明の凝固因子は、標的部分を含み、かつＧｌａドメインを欠く。例えば、第ＶＩＩ因子の場合には、Ｇｌａドメインは、軽鎖のアミノ末端に存在し、かつアミノ酸１−３５からなる。例示的な凝固因子のＧｌａドメインは、添付の配列表に示される。このドメインは、標準的な分子生物学的技術を用いて除去されて、標的化ドメインで置き換えられ、そして改変された軽鎖が本発明の構築物に組み込まれてもよい。一実施形態では、切断部位は、この分子の活性化を容易にするためにＧｌａドメインを欠いている構築物中に導入されてもよい。例えば、一実施形態では、このような切断部位は、凝固因子が活性化されたときに切断されるアミノ酸の間に導入されてもよい（例えば、第ＶＩＩ因子の場合はアミノ酸１５２〜１５３の間）。Ｇｌａドメインを欠いている例示的な凝固因子は、添付の図面に示される。
【０１５２】
一実施形態では、分子の活性化を容易にするためにＧｌａドメインを欠いている構築物中に切断部位が導入されてもよい。例えば、一実施形態では、このような切断部位は、凝固因子が活性化されたときに切断されるアミノ酸の間に導入されてもよい（例えば、第ＶＩＩ因子の場合はアミノ酸１５２〜１５３の間）。Ｇｌａドメインを欠いている例示的な凝固因子は、添付の図面に示される。
【０１５３】
例示的な凝固因子は、哺乳動物、例えば、ヒト由来のものである。例示的な凝固因子の配列は、添付の配列表中に、例えば、単独で、またはキメラの凝固因子構築物と関連して示される。
【０１５４】
ＩＩＩ．標的部分
一実施形態では、本発明の凝固因子は、血小板上で発現される標的分子に結合する、「標的化部分」を用いて凝固の部位に対して凝固因子を局在化することによって、その有効性を増強するように血小板に標的される。好ましくは、この標的化分子は、血小板以外の細胞または組織上では発現されず、すなわち、この標的化部分は特異的に血小板に結合する。
【０１５５】
一実施形態では、休止血小板上で見出されるレセプター／高次構造が標的される。標的されることによって、凝固のための部位は、有効性の増強のためにプライムされ得る。このような分子を標的することはまた、凝固因子の半減期を延長するか、および／またはクリアランスを妨げ得る。このような標的の例としては、ＧｐＩｂ／Ｖ／ＩＸ複合体のＧｐＩｂ、ならびにＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのＧｐＶＩおよび不活性型が挙げられる。
【０１５６】
一実施形態では、活性化された血小板上でのみ見出されるレセプター／高次構造は、活性な凝固の部位に対して凝固因子を標的化するために標的化される。このような標的の例としては、例えば、ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａの活性型およびＣＤ６２Ｐが挙げられる。
【０１５７】
一実施形態では、本発明のポリペプチドは、血小板に親和性を有しており、血小板に結合する「標的化部分」を含む。例えば、一実施形態では、標的部分は、ＧＰＩｂ複合体、例えば、ＧＰＩｂ−αに結合する。このような標的化部分の例としては、活性な血小板および不活性な血小板の両方に結合するペプチドＰＳ４、ＯＳ１、およびＯＳ２が挙げられる（Ｂｅｎａｒｄら、２００８  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４７：４６７４）；別の実施形態では、標的部分は、ＧＰＩＩｂＩＩＩａの活性な高次構造に結合する。このような標的化部分の例としては、ＳＣＥ５およびＭＢ９可変領域（活性な血小板のみに結合する）が挙げられる（Ｓｃｈｗａｒｚら、２００４  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ａｒｔｉｃｌｅ  １０．１０９６／ｆｊ．０４−１５１３ｆｊｅ；Ｓｃｈｗａｒｚら、２００６  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．９９：２５−３３；米国特許出願公開第２００７０２１８０６７号）。別の実施形態では、標的部分は、ＧＰＩＩｂＩＩＩａの活性な／不活性な高次構造の両方に結合する。このような標的部分の例は、ＡＰ３抗体の可変領域である（Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、２００３．Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、およびＶａｓｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０１：９３７；ＷＯ２０１０１１５８６６）。他の標的および標的化部分は当該分野で公知である。凝固活性が増強された第ＩＸ因子の別バージョン（３つ組の変異体Ｖ８６Ａ／Ｅ２７７Ａ／Ｒ３３８Ａ）は、Ｌｉｎら、２０１０．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓおよびＨａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ８：１７７３）によって記載されている。これらの引用文献の内容は、本引用文献によって本明細書に援用される。
【０１５８】
本発明のキメラの凝固因子は、１つ以上の標的部分を含んでもよい。例示的な立体配置は添付の図面に示される。さらに、２つ以上の標的化部分はお互いに対して（例えば、スペーサーを介して）連続して連結されて、直列の配列が本発明の構築物に対して作動可能に連結されてもよい。２つ以上の標的化部分が本発明のキメラの凝固因子に存在する場合、この部分は、同じであっても異なってもよい。
【０１５９】
一実施形態では、標的部分は、凝固の部位で標的部分を除去するために切断され得る切断可能なリンカーによって、本発明のキメラの凝固因子に融合される。別の実施形態では、標的部分は、切断可能なリンカーを介して結合されず、従って、凝固の部位では切断されない。
【０１６０】
一実施形態では、標的部分は、第ＶＩＩＩ因子のＮ末端またはＣ末端に配置される。別の実施形態では、標的部分は、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸのＣ末端、またはＦＶＩＩａ、ＦＩＸａもしくはＦＸａのいずれかまたは両方の鎖のＣ末端上に配置される。Ｆｃ領域またはその一部が使用される実施形態では、標的部分は、第二のＦｃ鎖のＮ末端もしくはＣ末端、またはＦｃ鎖のいずれかもしくは両方のＣ末端に配置されてもよい。
【０１６１】
一実施形態では、標的部分は、ある構築物に対して直接遺伝子的に融合されないが、この構築物に対してスペーサーまたは化学結合を介して連結される。例えば、標的化部分は、ある構築物の標的部分とＦｃ部分との間の結合の形成によって本発明の構築物に結合され得、ここでこの標的化部分は、第一の官能基を含み、かつこのＦｃ部分は、第二の官能基を含み、ここでこの第一のおよび第二の官能基は、お互いと反応して化学結合を形成し得る（例えば、米国特許第７３８１４０８号を参照のこと）。
【０１６２】
一実施形態では、本発明のポリペプチドは、抗原結合部位（例えば、抗体の抗原結合部位、抗体改変体、または抗体フラグメント）、ポリペプチド、リガンドのレセプター結合部分、またはレセプターのリガンド結合部分（血小板、例えば、休止血小板または活性化された血小板に対して特異的に結合する）のうちの少なくとも１つを含む。例示的な標的化部分としては、標的されるべき分子に結合するｓｃＦｖ分子またはペプチドが挙げられる。標的化部分の例は、本発明の実施例および図面に見出される。標的部分として有用な他の分子は、本明細書における教示に基づいて当業者によって容易に選択され得る。
【０１６３】
Ａ．血小板に結合する抗原結合部位
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、抗体の少なくとも１つの抗原結合部分（例えば、結合部位）を含む。一実施形態では、抗原結合部分は、ポリペプチドを血小板に対して標的する。
【０１６４】
他の実施形態では、本発明のポリペプチドは、抗原結合部分を含んでもよい。「抗原結合部分」という用語は、抗原に結合するか、または抗原結合（すなわち、特異的な結合）についてインタクトな抗体と（すなわち、それらが由来するインタクトな抗体と）競合する、免疫グロブリン、抗体または抗体改変体のポリペプチドフラグメントを指す。例えば、この抗原結合部分は、上記の任意の抗体または抗体改変体に由来し得る。抗原結合部分は、当該分野で周知の組み換え方法または生化学的方法によって産生され得る。例示的な抗原結合部分としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、および（Ｆａｂ’）２、ならびにｓｃＦｖ分子が挙げられる。
【０１６５】
他の実施形態では、本発明のキメラの凝固因子は、単鎖の結合分子由来の結合部分を含んでもよい（例えば、単鎖の可変領域またはｓｃＦｖ）。単鎖抗体の産生について記載された技術（米国特許第４，６９４，７７８号；Ｂｉｒｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４４２（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５５４（１９８９））は、単鎖の結合分子を産生するように適合され得る。単鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖および軽鎖フラグメントを連結することによって形成され、結果として単鎖抗体が生じる。Ｅ．ｃｏｌｉにおける機能的なＦｖフラグメントのアセンブリのための技術もまた用いられてもよい（Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
【０１６６】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、単鎖の可変領域配列（ｓｃＦｖ）を含むか、またはそれらからなる、１つ以上の結合部位または領域を含む。単鎖可変領域配列は、１つ以上の抗原結合部位を有する単独のポリペプチド、例えば、ＶＨドメインに対して可塑性リンカーによって連結されるＶＬドメインを含む。このＶＬおよび／またはＶＨドメインは、上記の任意の抗体または抗体改変体由来であってもよい。ＳｃＦｖ分子は、ＶＨ−リンカー−ＶＬ方向で構築されても、またはＶＬ−リンカー−ＶＨ方向で構築されてもよい。抗原結合部位を作製するＶＬおよびＶＨドメインを連結する可塑性リンカーは好ましくは、約１０〜約５０アミノ酸の残基を含む。一実施形態では、ポリペプチドリンカーは、ｇｌｙ−ｓｅｒポリペプチドリンカーである。例示的なｇｌｙ／ｓｅｒポリペプチドリンカーは、式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎであって、ここでｎが正の整数（例えば、１、２、３、４、５、または６）である、リンカーである。他のポリペプチドリンカーは当該分野で公知である。単鎖の可変領域配列を有する抗体（例えば、単鎖のＦｖ抗体）およびこのような単鎖抗体を作製する方法は当該分野で周知である（例えば、Ｈｏら、１９８９．Ｇｅｎｅ  ７７：５１；Ｂｉｒｄら、１９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３；Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏら、１９９１．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０１１７；Ｍｉｌｅｎｉｃら、１９９１．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５１：６３６３；Ｔａｋｋｉｎｅｎら、１９９１．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４：８３７）。
【０１６７】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドで使用されるｓｃＦｖ分子は、安定化されたｓｃＦｖ分子である。一実施形態では、この安定化されたｃＦｖ分子は、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に差し込まれたｓｃＦｖリンカーを含んでもよく、ここでＶＨおよびＶＬドメインは、ＶＨドメインのアミノ酸とＶＬドメインのアミノ酸との間のジスルフィド結合によって連結される。他の実施形態では、安定化されたｓｃＦｖ分子は、最適化された長さまたは組成を有するｓｃＦｖリンカーを含み得る。さらに他の実施形態では、この安定化されたｓｃＦｖ分子は、少なくとも１つの安定化アミノ酸置換（単数または複数）を有するＶＨドメインまたはＶＬドメインを含んでもよい。さらに別の実施形態では、安定化されたｓｃＦｖ分子は、上記の安定化特徴のうち少なくとも２つを有してもよい。
【０１６８】
安定化されたｓｃＦｖ分子は、改善されたタンパク質安定性を有するか、または改善されたタンパク質安定性をこの分子が作動可能に連結されるポリペプチドに対して付与する。本発明の好ましいｓｃＦｖリンカーは、従来のポリペプチドに比較して、本発明のポリペプチドの熱安定性を少なくとも約２℃または３℃まで改善する。比較は、例えば、本発明のｓｃＦｖ分子の間で行ってもよい。特定の好ましい実施形態では、この安定化されたｓｃＦｖ分子は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ｓｃＦｖリンカーおよびジスルフィド結合（ＶＨアミノ酸４４およびＶＬアミノ酸１００を連結する）を含む。他の例示的な安定化されたｓｃＦｖ分子（本発明のポリペプチド中で使用され得る）は、その各々が全体として参照によって本明細書に援用される、２００６年１２月８日出願の米国特許仮出願第６０／８７３，９９６号、または２００７年３月１９日出願の米国特許出願第１１／７２５，９７０号に記載される。
【０１６９】
本発明のポリペプチドは、当該分野で認識されるプロトコールを用いて、抗体に由来する可変領域またはその一部（例えば、ＶＬおよび／またはＶＨドメイン）を含んでもよい。例えば、可変ドメインは、非ヒト哺乳動物、例えば、マウス、モルモット、霊長類、ウサギまたはラットにおいて、この哺乳動物を抗原またはそのフラグメントで免疫することによって、産生された抗体由来であってもよい。全ての目的のために参照によって援用される、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ（前出）を参照のこと。免疫グロブリンは、関連の抗原（例えば、精製された腫瘍関連抗原または細胞またはこのような抗原を含む細胞抽出物）およびアジュバントの複数回の皮下注射または腹腔内注射によって生成され得る。免疫は典型的には、活性化された脾臓細胞またはリンパ球由来の抗原反応性抗体の産生を含む免疫応答を惹起する。
【０１７０】
可変領域は、免疫された哺乳動物の血清から採取されるポリクローナル抗体由来であってもよいが、所望の可変領域が由来するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の同種の調製物を提供するために、脾臓、リンパ節、または末梢血から個々のリンパ球を単離することが望ましい場合が多い。ウサギまたはモルモットが、通常、ポリクローナル抗体を作製するために用いられる。マウスが、通常、モノクローナル抗体を作製するために用いられる。モノクローナル抗体は、抗原フラグメントをマウスに注入し、「ハイブリドーマ」を調製し、抗原に特異的に結合する抗体に対してハイブリドーマをスクリーニングすることによって、フラグメントに対して調製することができる。この周知のプロセス（Ｋｏｈｌｅｒら、（１９７５）、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５）では、抗原を注入されたマウス由来の比較的短命か、または臨死のリンパ球は、不死の腫瘍細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）と融合されるため、したがって、不死であり、かつＢ細胞によって遺伝的にコードされる抗体を産生することが可能なハイブリッド細胞または「ハイブリドーマ」を産生する。得られたハイブリッドは、単一抗体の形成のための特定の遺伝子を含む各々の個々の株による選択、希釈、および再増殖によって、単一の遺伝株に分離される。それらは、所望の抗原に対して同種であり、それらの純粋な遺伝的血統に関して「モノクローナル」と称される抗体を産生する。
【０１７１】
このようにして調製されるハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つ以上の物質を含有する適切な培地において播種され、増殖する。当業者は、ハイブリドーマの形成、選択、および成長のための試薬、細胞株、および培地が、多数の供給源より市販され、標準的プロトコールが、十分に確立していることを認識している。概して、ハイブリドーマ細胞が成長している培養培地は、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のようなインビトロアッセイによって測定される。所望の特異性、親和性および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が特定された後、クローンは、限界希釈手順によってサブクローニングされ、標準方法によって成長されてもよい（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓおよびＰｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、またはタンパク質Ｌアフィニティークロマトグラフィー）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、または透析等の従来の精製手順によって、培養培地、腹水、または血清から分離することができることはさらに認識されている。
【０１７２】
必要に応じて、抗体は、抗原の他の非重複フラグメントに結合することなく、特定の活性状態の血小板に対する結合について、または抗原の特定の領域または所望のフラグメントに対する結合についてスクリーニングされてもよい。後者のスクリーニングは、抗原の欠失変異体の集合への抗体の結合を判定すること、およびどの欠失変異体が抗体に結合するかを判定することによって達成することができる。結合は、例えば、ウエスタンブロット法またはＥＬＩＳＡによって評価することができる。抗体への特定の結合を示す最小のフラグメントが、抗体のエピトープを定義する。あるいは、エピトープ特異性は、試験抗体および参照抗体が抗原への結合に関して競合する競合アッセイによって判定され得る。試験抗体および参照抗体が競合するならば、それらは、同じエピトープまたは十分近接するエピトープに結合し、その結果１つの抗体の結合が他の抗体の結合に干渉する。
【０１７３】
所望のモノクローナル抗体またはその結合部位をコードするＤＮＡは、定常領域ドメイン配列の単離のための上述の任意の従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖または軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）、容易に単離および配列決定され得る。単離され、サブクローニングされたハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として作用する。より詳しくは、単離されたＤＮＡ（本明細書において記載されるように合成することができる）は、本発明のポリペプチドへの組み込みのための所望の可変領域配列をクローニングするために用いられ得る。
【０１７４】
他の実施形態においては、結合部位は、完全ヒト抗体に由来する。ヒトまたは実質的なヒト抗体は、内因性免疫グロブリン産生が不可能なトランスジェニック動物（例えば、マウス）において生成され得る（例えば、それぞれの内容は、参照によって、本明細書に援用される米国特許第６，０７５，１８１号、同第５，９３９，５９８号、同第５，５９１，６６９号、および同第５，５８９，３６９号を参照のこと）。例えば、キメラおよび生殖系列変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域のホモ接合体欠失は、内因性抗体産生の完全阻害を生じることが記載されている。そのような生殖細胞系列変異体マウスへのヒト免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原チャレンジの際にヒト抗体の産生を生じる。ＳＣＩＤマウスを用いるヒト抗体を生成するための別の好ましい手段は、米国特許第５，８１１，５２４号において開示され、この内容は、参照によって、本明細書に援用される。これらのヒト抗体に関連する遺伝物質はまた、本明細書において記載されるように単離され、操作されてもよいことが認識される。
【０１７５】
他の態様においては、本発明のポリペプチドは、抗体の改変型に由来する抗原結合部位、またはその一部を含んでもよい。例示的なそのような型としては、例えば、ミニボディ、ジアボディ、トリアボディ、ナノボディ、カメリド、Ｄａｂ、四価抗体、イントラジアボディ（例えば、Ｊｅｎｄｒｅｙｋｏら、２００３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：４７８１３）、融合タンパク質（例えば、抗体サイトカイン融合タンパク質、Ｆｃレセプターの少なくとも一部と融合されるタンパク質）、および二重特異性抗体が挙げられる。他の改変抗体は、例えば、米国特許第４，７４５，０５５号、欧州特許第２５６，６５４号、Ｆａｕｌｋｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９８：２８６（１９８２）、欧州特許第１２０，６９４号、欧州特許第１２５，０２３号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１２３：７９３（１９７９）、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：２１９７（１９８０）、Ｒａｓｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４１：２０７３（１９８１）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２３９（１９８４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：６８５１（１９８４）、欧州特許第２５５，６９４号、欧州特許第２６６，６６３号、およびＷＯ８８／０３５５９号において記載される。再分類された免疫グロブリン鎖も、公知である。例えば、米国特許第４，４４４，８７８号；ＷＯ８８／０３５６５号；ならびに欧州特許第６８，７６３号、および本明細書において記載される参考文献を参照のこと。
【０１７６】
別の実施形態においては、本発明のキメラの凝固因子は、ジアボディである抗原結合部位もしくは領域、またはそれに由来する抗原結合部位を含む。ジアボディは、二量体の四価分子であり、それぞれ、ｓｃＦｖ分子と同様のポリペプチドを有するが、同じポリペプチド鎖上のＶＬおよびＶＨドメインが、相互作用することができないように、通常、可変ドメインの両方に接続する短い（例えば、１０未満、好ましくは１〜５）アミノ酸残基リンカーを有する。その代わりに、１つのポリペプチド鎖のＶＬおよびＶＨドメインは、第２のポリペプチド鎖上のＶＨおよびＶＬドメイン（それぞれ）と相互作用する（例えば、国際公開第ＷＯ０２／０２７８１号を参照）。一実施形態においては、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つの遺伝子的に融合されたＦｃ領域（すなわち、ｓｃＦｃ領域）のＮ末端および／またはＣ末端に対して作動可能に連結されるジアボディを含む。
【０１７７】
特定の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、単一ドメイン結合分子（例えば、単一ドメイン抗体）を標的部分として含む。例示的な単一ドメイン分子は、軽鎖可変ドメインを有さない、抗体の単離された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、すなわち、重鎖可変ドメイン、および重鎖可変ドメインを有さない、抗体の単離された軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、すなわち、軽鎖可変ドメインを含む。本発明の結合分子において使用される例示的な単一ドメイン抗体としては、例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ，ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８（１９９３）、およびＤｕｍｏｕｌｉｎ，ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１：５００−５１５（２００２）に記載される、例えば、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄ）重鎖可変ドメイン（約１１８〜１３６のアミノ酸残基）が挙げられる。他の例示的な単一ドメイン抗体としては、Ｄａｂｓ（登録商標）（Ｄｏｍａｎｔｉｓ  Ｌｔｄ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）としても周知の単一のＶＨまたはＶＬドメインが挙げられる。さらに他の単一ドメイン抗体としては、サメ抗体（例えば、サメＩｇ−ＮＡＲ）が挙げられる。サメＩｇ−ＮＡＲは、１つの可変ドメイン（Ｖ−ＮＡＲ）および５つのＣ様定常ドメイン（Ｃ−ＮＡＲ）のホモ二量体を含み、ここで多様性は、長さが５〜２３残基と異なる伸長ＣＤＲ３領域に集中される。ラクダ科（例えば、ラマ）においては、ＶＨＨと称される重鎖可変領域は、全抗原−結合ドメインを形成する。カメリドＶＨＨ可変領域と従来の抗体（ＶＨ）に由来する領域との間の主な相違としては、（ａ）ＶＨＨにおける対応する領域と比較して、ＶＨの軽鎖接触表面におけるよりも疎水性のアミノ酸、（ｂ）ＶＨＨにおけるより長いＣＤＲ３、および（ｃ）ＶＨＨにおけるＣＤＲ１とＣＤＲ３との間のジスルフィド結合の頻繁な出現、が挙げられる。単一ドメイン結合分子を作製するための方法は、米国特許第６，００５，０７９号および同第６，７６５，０８７号において記載され、その両方の内容とも、参照によって本明細書に援用される。ＶＨＨドメインを含む例示的な単一ドメイン抗体としては、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）（Ａｂｌｙｎｘ  ＮＶ、Ｇｈｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）が挙げられる。
【０１７８】
本発明の結合分子での使用のための、結合部位が由来し得る、例示的な抗体は、当該分野で公知である。このような標的化部分の例としては、活性な血小板のみを結合するＳＣＥ５およびＭＢ９可変領域が挙げられる（Ｓｃｈｗａｒｚら、２００４  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ａｒｔｉｃｌｅ  １０．１０９６／ｆｊ．０４−１５１３ｆｊｅ；Ｓｃｈｗａｒｚら、２００６  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．９９：２５−３３；米国特許出願公開第２００７０２１８０６７号）。別の実施形態では、標的部分は、ＧＰＩＩｂＩＩＩａの活性な／不活性な高次構造の両方に結合する。このような標的部分の例は、ＡＰ３抗体の可変領域である（Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、２００３．Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、およびＶａｓｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０１：９３７；ＷＯ２０１０１１５８６６）。
【０１７９】
Ｂ．非免疫グロブリン血小板結合分子
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、非免疫グロブリン結合分子に由来する１つ以上の血小板結合部位を含む。本明細書において用いる場合、「非免疫グロブリン結合分子」という用語は、免疫グロブリン以外のポリペプチドに由来するが、血小板標的に対して所望の結合特異性を付与するために操作され得る（例えば、変異誘発され得る）部分（例えば、骨格またはフレームワーク）を、結合部位が含む結合分子である。抗体分子に由来しない結合部位を含む結合分子の他の例としては、レセプター結合部位およびリガンド結合部位（血小板に結合する）が挙げられる。
【０１８０】
非免疫グロブリン結合分子は、人工的に多様化された結合部位を有する結合分子のライブラリーからの標的結合改変体の選択または単離によって特定され得る。多様化されたライブラリーは、完全に無作為のアプローチ（例えば、エラープローン（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、エキソンシャッフリング、または指向性進化）を用いて生成されてもよいし、または当該分野において承認されている設計ストラテジーによって補助されてもよい。例えば、結合部位は、その同族標的分子と相互作用する場合に、通常、関与するアミノ酸部分は、結合部位をコードする核酸内における対応する位置での縮重コドン、トリヌクレオチド、無作為ペプチド、またはループ全体の挿入によって無作為化され得る（例えば、米国特許出願公開第２００４０１３２０２８号を参照のこと）。アミノ酸位置の場所は、標的分子を有する複合体における結合部位の結晶構造の検討によって特定され得る。無作為化の候補位置としては、ループ、平面、らせん、および結合部位の結合腔が挙げられる。特定の実施形態においては、多様化の候補である可能性が高い結合部位内のアミノ酸は、当該分野で公知の技術を用いて特定できる。無作為化後、次に多様化されたライブラリーを選択またはスクリーニング手順に供して、当該分野で公知の方法を用いて、所望の結合特徴を有する結合分子、例えば、特定の結合血小板を得る。選択は、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、またはリボソームディスプレイのような当該分野において承認されている方法によって達成することができる。一実施形態においては、血小板に結合することが当該分野で公知の分子を、本発明の構築物で使用してもよい。例えば、当該分野で記載されるＧＰＩｂａに結合するペプチド（例えば、ＰＳ４、０Ｓ１、または０Ｓ２）を用いてもよい（Ｂｅｎａｒｄら、２００８．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４７：４６７４−４６８２）。
【０１８１】
ＩＶ．活性化可能凝固因子
バイパス療法のために与えられる凝固因子は、活性型で与えられるときは有効である。なぜなら外因性の凝固因子は、十分な動態で有効であるように活性化されない場合が多いからである。しかし、それらはまた、内因性の経路によって（例えば、アンチトロンビンＩＩＩまたはＴＦＰＩによって）急速に不活性化され、活性型のクリアランスおよび短い有効半減期がもたらされる。一実施形態では、本発明のキメラの凝固因子は、「活性化可能」である。このような活性化可能な構築物は、より長い半減期を有する増強されたチモーゲンとして循環するが、必要に応じて凝固部位で容易に切断され得る。
【０１８２】
一実施形態では、本発明の活性化可能な構築物は、切断性のリンカーを含み、このリンカーは、例えば、第ＸＩａ因子、第Ｘａ因子、またはトロンビン切断部位（それぞれ、第ＸＩａ因子、Ｘａ、またはトロンビンによって切断される）を含み、凝固の部位で活性型の凝固因子の形成をもたらす。例示的な第ＦＸＩａ因子切断部位は、例えば、ＴＱＳＦＮＤＦＴＲおよびＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲを含む。例示的なトロンビン切断部位は、例えば、ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ、ＴＴＫＩＫＰＲ、およびＡＬＲＰＲを含むかまたはそれからなる配列（例えば、ＡＬＲＰＲＶＶＧＧＡ））を含む。
【０１８３】
一実施形態では、切断性のリンカーは、スペーサー部分によって１つ以上の側（上流、下流または両側）に隣接され得る。
【０１８４】
一実施形態では、切断性のリンカーは、凝固因子の軽鎖と重鎖との間に差し込まれる。別の実施形態では、切断性のリンカーは、凝固因子の軽鎖と重鎖との間に差し込まれない。一実施形態では、切断性のリンカーは、重鎖のアミノ末端に配置される。
【０１８５】
例示的な活性化可能な構築物は、添付の図面および以下の実施例に示される。
【０１８６】
Ｖ．足場部分
本発明のいくつかの実施形態は、例えば、タンパク質部分、ｃｓｃＦｃ領域、Ｆｃ部分、アルブミン、ＸＴＥＮなどから選択され得る、足場部分を含む。
【０１８７】
Ａ．タンパク質部分
一実施形態では、足場はタンパク質部分である。このような部分は、完全タンパク質もしくはその一部、または合成分子を含んでもよい。好ましいタンパク質部分は、構築物に組み込まれる場合、本発明のキメラの凝固因子の半減期を改善する十分な分子サイズのものである。例えば、一実施形態では、人工のタンパク質、ＸＴＥＮが、足場として構築物中に含まれてもよい（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒら、２００９．２７：１１８６）。別の実施形態では、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）は、本発明の構築物中に含まれてもよい。例えば、当該分野で公知のように、血清アルブミン（例えば、ＨＳＡ）をタンパク質足場として用いてもよい。特定の種々のドメインおよびＨＳＡのサブドメインでは、血清アルブミン足場ベースのタンパク質ライブラリーの生成のための変異または無作為化に十分受け入れられる構造を有する。本発明で用いられ得る、アルブミン、例えば、そのフラグメントの例は、公知である。例えば、米国特許第７，５９２，０１０；米国特許第６，６８６，１７９；およびＳｃｈｕｌｔｅ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓ．１２４  Ｓｕｐｐｌ．２：Ｓ６−Ｓ８（２００９）（その各々が、その全体が参照によって本明細書に援用される）。
【０１８８】
Ｂ．ｓｃＦｃ領域
一実施形態では、本発明は、ｃｓｃＦｃを含んでいる、一実施形態における単一ポリペプチド鎖内に少なくとも１つの遺伝子的に融合されたＦｃ領域またはその一部を含むポリペプチド（すなわち、単鎖のＦｃ（ｓｃＦｃ）領域を含むポリペプチド）を提供する。
【０１８９】
一実施形態では、キメラの凝固因子は、ＦＶＩＩ、ＦＩＸおよびＦＸからなる群より選択される凝固因子、および血小板に結合する標的部分、および必要に応じて凝固因子と標的部分との間のスペーサー部分を含む。別の実施形態では、ポリペプチドはＦＶＩＩを含み、このＦＶＩＩは、凝固カスケードの成分によって活性化可能な異種の酵素的切断部位を含む。
【０１９０】
一実施形態では、本発明は、プロセシングされていないポリペプチドであって、ここで同じ直鎖状ポリペプチド鎖内の少なくとも２つのＦｃ部分またはドメイン（例えば、２、３、４、５、６、またはそれ以上のＦｃ部分またはドメイン）が、Ｆｃポリペプチドリンカーによって連結される１つの機能的なｓｃＦｃ領域を形成するように折り畳まれ得る（例えば、分子内にまたは分子間に折り畳まれ得る）ポリペプチドを提供する。例えば、１つの好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、そのｓｃＦｃ領域を介して、少なくとも１つのＦｃレセプター（例えば、ＦｃＲｎ、ＦｃγＲレセプター（例えば、ＦｃγＲＩＩＩ）、または補体タンパク質（例えば、Ｃ１ｑ））に対して結合して、半減期を改善するか、または免疫エフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、食作用、または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣＣ））を誘発するか、および／または製造可能性を改善し得る。
【０１９１】
別のデザインの種々のポリペプチドが、本発明の範囲内である。例えば、一実施形態では、ポリペプチドは以下の部分を含む：
Ａ−Ｆ１−Ｐ１−Ｌ−Ｐ２−Ｂ−Ｆ２（Ｉ）
【０１９２】
アミノ末端からカルボキシル末端の直鎖状配列では、Ａは存在する場合、凝固因子またはその一部であり、Ｆ１は第一のＦｃ部分またはドメインであり、Ｐ１は酵素的切断部位であり、ＬはＳｃＦｃリンカーであり、Ｐ２は酵素的切断部位Ｂであり、存在するならば、凝固因子またはその一部であり、Ｆ２は第二のＦｃ部分またはドメインであり、かつ「−」は、ペプチド結合である。式（Ｉ）は、少なくともＡまたはＢであり、必要に応じてその両方である。ＡおよびＢは、両方が存在する場合、凝固因子の対応する重鎖および軽鎖であり得る。式（Ｉ）は、少なくともＰ１またはＰ２、および必要に応じて両方を含む。Ｐ１およびＰ２は、両方が存在する場合、同じであっても異なってもよい。式（Ｉ）は、少なくともＦ１およびＦ２を含む。Ｆ１およびＦ２は、両方とも存在する場合、同じであっても異なってもよい。
【０１９３】
式Ｉによる例示的なポリペプチドとしては以下が挙げられる：Ａ−Ｆ１−Ｐ１−Ｌ−Ｐ２−Ｆ２；Ｆ１−Ｐ１−Ｌ−Ｐ２−Ｂ−Ｆ２；Ａ−Ｆ１−Ｐ１−Ｌ−Ｆ２；Ｆ１−Ｐ１−Ｌ−Ｂ−Ｆ２；Ａ−Ｆ１−Ｌ−Ｐ２−Ｆ２；およびＦ１−Ｌ−Ｐ２−Ｂ−Ｆ２。
【０１９４】
一実施形態では、Ｆ１およびＦ２は各々が、ＣＨ２およびＣＨ３部分を含む。  
【０１９５】
一実施形態では、ｃｓｃＦｃリンカー（Ｌ）の切断および実質的な切除後、本発明のポリペプチドは、２つのポリペプチド鎖であって、第一のポリペプチド鎖が第一のＦｃ部分に連結されたＡを含み、第二のポリペプチド鎖が第二のＦｃ部分に連結されたＢを含み、ここでＦ１およびＦ２が二量体化してＦｃ領域を形成する、ポリペプチド鎖を含む。一実施形態では、ＡおよびＢは必要に応じて存在し、かつ凝固因子またはその一部である。
【０１９６】
一実施形態では、Ａは、凝固因子の軽鎖であり、かつＢは凝固因子の重鎖である。一実施形態では、Ｂは凝固因子の軽鎖であり、かつＡは凝固因子の重鎖である。一実施形態では、ＡおよびＢがポリペプチド中で会合する場合、次にこのポリペプチドは、機能的な凝固因子、例えば、ＦＶＩＩ、ＦＩＸまたはＦＸを形成する。一実施形態では、このようなポリペプチドは、細胞からの分泌の際に酵素的に活性である。
【０１９７】
ｉ）Ｆｃ部分またはドメイン
本発明のポリペプチドを産生するためのＦ１およびＦ２として有用なＦｃ部分は、多数の異なる供給源から得ることができる。好ましい実施形態においては、このポリペプチドのＦｃ部分は、ヒト免疫グロブリンに由来する。しかしながら、Ｆｃ部分は、例えば、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）または非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、マカク）種を含む、別の哺乳動物種の免疫グロブリン由来であってもよい。さらに、ポリペプチドＦｃドメインまたはその一部は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥを含む、任意の免疫グロブリンクラス、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む、任意の免疫グロブリンイソタイプに由来してもよい。好ましい実施形態においては、ヒトイソタイプＩｇＧ１が用いられる。
【０１９８】
様々なＦｃ部分遺伝子配列（例えば、ヒト定常領域遺伝子配列）は、公的にアクセス可能な寄託の形態で入手可能である。特定のエフェクター機能を有するか（または特定のエフェクター機能を欠いている）、または免疫原性を低下させる特定の修飾を有するＦｃ部分配列を含む定常領域ドメインを選択してもよい。抗体および抗体コード遺伝子の多くの配列は公開されており、適切なＦｃ部分配列（例えば、ヒンジ、ＣＨ２、および／またはＣＨ３配列、またはそれらの一部）は、当該分野において承認されている技術を用いてこれらの配列から導くことができる。前述の方法のいずれかを用いて得られた遺伝物質は、次いで、本発明のポリペプチドを得るために変化または合成されてもよい。本発明の範囲は、定常領域ＤＮＡ配列の対立遺伝子、改変体、および変異体を包含することがさらに認識される。
【０１９９】
Ｆｃ部分配列は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、および対象のドメインを増幅するよう選択されるプライマーを用いてクローニングされてもよい。抗体からＦｃ部分配列をクローニングするためには、ｍＲＮＡは、ハイブリドーマ、脾臓、またはリンパ細胞から単離され、ＤＮＡへ逆転写され、抗体遺伝子がＰＣＲによって増幅されてもよい。ＰＣＲ増幅方法は、米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８００，１５９号；同第４，９６５，１８８号、および例えば、「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ＭｅｔｈｏｄｓおよびＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ｉｎｎｉｓら、編集，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ｈｏら、１９８９．Ｇｅｎｅ  ７７：５１、Ｈｏｒｔｏｎら、１９９３．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２７０）において詳述される。ＰＣＲは、コンセンサス定常領域プライマー、または公表された重鎖または軽鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列に基づくさらに特異的なプライマーによって開始され得る。上記のように、ＰＣＲを用いて、抗体軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離してもよい。この場合、ライブラリーは、コンセンサスプライマー、またはマウス定常領域プローブ等のより大きい同種プローブによってスクリーニングされてもよい。抗体遺伝子の増幅に適切な多数のプライマーセットが、当該分野で周知である（例えば、精製抗体のＮ末端配列に基づく５’プライマー（ＢｅｎｈａｒおよびＰａｓｔａｎ．１９９４．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：１５０９）、ｃＤＮＡ端部の迅速増幅（Ｒｕｂｅｒｔｉ，Ｆ．ら、１９９４．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７３：３３）、抗体リーダー配列（Ｌａｒｒｉｃｋら、１９８９  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６０：１２５０）。抗体配列のクローニングは、１９９５年１月２５日出願のＮｅｗｍａｎらの米国特許第５，６５８，５７０号においてさらに記載され、この内容は、参照によって、本明細書に援用される。
【０２００】
本発明のポリペプチドは、２つ以上のＦｃ部分（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはそれ以上のＦｃ部分）を含んでもよい。これらの２つ以上のＦｃ部分は、Ｆｃ領域を形成し得る。一実施形態においては、Ｆｃ部分は、異なる型のものであってもよい。一実施形態においては、このポリペプチドに存在する少なくとも１つのＦｃ部分は、ヒンジドメイン、またはその一部を含む。別の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つのＣＨ２ドメイン、またはその一部を含む少なくとも１つのＦｃ部分を含む。別の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つのＣＨ３ドメイン、またはその一部を含む少なくとも１つのＦｃ部分を含む。別の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つのＣＨ４ドメイン、またはその一部を含む少なくとも１つのＦｃ部分を含む。別の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つのヒンジドメイン、またはその一部、および少なくとも１つのＣＨ２ドメイン、またはその一部（例えば、ヒンジ−ＣＨ２の方向における）を含む少なくとも１つのＦｃ部分を含む。別の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つのＣＨ２ドメイン、またはその一部、および少なくとも１つのＣＨ３ドメイン、またはその一部（例えば、ＣＨ２−ＣＨ３の方向における）を含む少なくとも１つのＦｃ部分を含む。別の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、例えば、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、ヒンジ−ＣＨ３−ＣＨ２、またはＣＨ２−ＣＨ３−ヒンジの方向において、少なくとも１つのヒンジドメイン、またはその一部、少なくとも１つのＣＨ２ドメイン、またはその一部、および少なくとも１つのＣＨ３ドメイン、またはその一部を含む少なくとも１つのＦｃ部分を含む。
【０２０１】
特定の実施形態においては、このポリペプチドは、１つ以上の免疫グロブリン重鎖に由来する少なくとも１つの完全Ｆｃ領域を含む（例えば、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含む、Ｆｃ部分であるが、これらは同じ抗体に由来する必要はない）。他の実施形態においては、このポリペプチドは、１つ以上の免疫グロブリン重鎖に由来する少なくとも２つの完全Ｆｃ領域を含む。好ましい実施形態においては、完全Ｆｃ部分は、ヒトＩｇＧ免疫グロブリン重鎖（例えば、ヒトＩｇＧ１）に由来する。
【０２０２】
別の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、完全ＣＨ３ドメイン（ＥＵナンバリングによる抗体Ｆｃ領域のアミノ酸約３４１〜４３８）を含む少なくとも１つのＦｃ部分を含む。別の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、完全ＣＨ２ドメイン（ＥＵナンバリングによる抗体Ｆｃ領域のアミノ酸約２３１〜３４０）を含む少なくとも１つのＦｃ部分を含む。別の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、少なくともＣＨ３ドメイン、および少なくとも１つのヒンジ領域（ＥＵナンバリングによる抗体Ｆｃ領域のアミノ酸約２１６〜２３０）、およびＣＨ２ドメインを含む少なくとも１つのＦｃ部分を含む。一実施形態においては、本発明のポリペプチドは、ヒンジおよびＣＨ３ドメインを含む少なくとも１つのＦｃ部分を含む。別の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含む少なくとも１つのＦｃ部分を含む。好ましい実施形態においては、Ｆｃ部分は、ヒトＩｇＧ免疫グロブリン重鎖（例えば、ヒトＩｇＧ１）に由来する。一実施形態では、Ｆｃ部分は、ＥＵナンバー２２１〜４４７に相当するアミノ酸を含むか、またはそれからなる。
【０２０３】
別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＦｃＲｎ結合パートナーを含む少なくとも１つのＦｃ部分を含む。ＦｃＲｎ結合パートナーは、ＦｃＲｎ結合パートナーのＦｃＲｎレセプターによる必然的な能動的輸送を伴いＦｃＲｎレセプターによって特異的に結合され得る、分子またはその一部である。特異的に結合したとは、生理学的条件下で比較的安定な複合体を形成する２つの分子を指す。特異的な結合は、通常は中〜高度の能力で低い親和性を有する非特異的な結合とは識別される、高い親和性および低〜中度の能力によって特徴づけられる。通常は、結合は、親和性定数ＫＡが１０６Ｍ−１より高く、またはさらに好ましくは１０８Ｍ−１より高い場合に特異的とみなされる。必要に応じて、非特異的な結合は、結合条件を変化することによって特異的な結合に実質的に影響することなく減少され得る。分子の濃度、溶液のイオン強度、温度、結合させる時間、ブロッキング剤（例えば、血清アルブミン、ミルクカゼイン）の濃度などのような適切な結合条件は、慣用的な技術を用いて当業者に最適化され得る。
【０２０４】
ＦｃＲｎレセプターは、ヒトを含むいくつかの哺乳動物種から単離された。ヒトＦｃＲｎ、サルＦｃＲｎ  ラットＦｃＲｎ、およびマウスＦｃＲｎの配列は公知である（Ｓｔｏｒｙら、１９９４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２３７７）。ＦｃＲｎレセプターは、ＩｇＧ（ただしＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥのような他の免疫グロブリンクラスではない）に、比較的低いｐＨで結合し、ＩｇＧを管腔中で漿膜の方向に経細胞的に能動輸送し、次いで、間質液中で見られる比較的高いｐＨでＩｇＧを遊離する。これは、成体の上皮組織（米国特許第６，４８５，７２６号、同第６，０３０，６１３号、同第６，０８６，８７５；ＷＯ０３／０７７８３４；米国特許出願公開第２００３−０２３５５３６号（Ａ１））例としては、肺および腸管上皮（Ｉｓｒａｅｌら、１９９７，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９２：６９）腎近位尿細管上皮（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、２００２，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８２：Ｆ３５８）ならびに鼻上皮、膣表面、および胆道系表面で発現される。
【０２０５】
本発明のＦｃＲｎ結合パートナーは、ＦｃＲｎレセプターによって特異的に結合され得る分子、例としては、ＩｇＧ全体、ＩｇＧのＦｃフラグメント、およびＦｃＲｎレセプターの完全結合領域を含む他のフラグメントを包含する。ＦｃＲｎレセプターに結合するＩｇＧのＦｃ部分の領域は、Ｘ線結晶学に基づいて記載されている（Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒら、１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３７９）。ＦｃＲｎとのＦｃの主な接触領域は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの接合部に近い。Ｆｃ−ＦｃＲｎ接触は全て、単一のＩｇ重鎖内である。ＦｃＲｎ結合パートナーとしては、ＩｇＧ全体、ＩｇＧのＦｃフラグメントおよびＦｃＲｎの完全結合領域を含むＩｇＧの他のフラグメントが挙げられる。主な接触部位としては、ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２４８、２５０〜２５７、２７２、２８５、２８８、２９０〜２９１、３０８〜３１１、および３１４、ならびにＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８５〜３８７、４２８、および４３３〜４３６が挙げられる。免疫グロブリンもしくは免疫グロブリンフラグメント、または領域のアミノ酸ナンバリングに対する言及は全て、Ｋａｂａｔら、１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．に基づく。
【０２０６】
ＩｇＧのＦｃ領域は、十分認識された手順、例えば、部位指向性突然変異誘発などによって改変され得、ＦｃＲｎに結合される改変されたＩｇＧまたはＦｃフラグメントもしくはその一部を生成する可能性が高い。このような改変としては、ＦｃＲｎ接触部位とは離れた改変、およびＦｃＲｎに対する結合を予防または増強さえする接触部位内の改変が挙げられる。例えば、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（Ｆｃγ１）における以下の単一アミノ酸残基が、ＦｃＲｎについてＦｃ結合親和性の有意な損失なしに置換され得る：Ｐ２３８Ａ、Ｓ２３９Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｋ２４８Ａ、Ｄ２４９Ａ、Ｍ２５２Ａ、Ｔ２５６Ａ、Ｅ２５８Ａ、Ｔ２６０Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ａ、Ｈ２６８Ａ、Ｅ２６９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｅ２７２Ａ、Ｌ２７４Ａ、Ｎ２７６Ａ、Ｙ２７８Ａ、Ｄ２８０Ａ、Ｖ２８２Ａ、Ｅ２８３Ａ、Ｈ２８５Ａ、Ｎ２８６Ａ、Ｔ２８９Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｒ２９２Ａ、Ｅ２９３Ａ、Ｅ２９４Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｙ２９６Ｆ、Ｎ２９７Ａ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｆ、Ｒ３０１Ａ、Ｖ３０３Ａ、Ｖ３０５Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｌ３０９Ａ、Ｑ３１１Ａ、Ｄ３１２Ａ、Ｎ３１５Ａ、Ｋ３１７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｓ３２４Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ａ３３０Ｑ、Ｐ３３１Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｔ３３５Ａ、Ｓ３３７Ａ、Ｋ３３８Ａ、Ｋ３４０Ａ、Ｑ３４２Ａ、Ｒ３４４Ａ、Ｅ３４５Ａ、Ｑ３４７Ａ、Ｒ３５５Ａ、Ｅ３５６Ａ、Ｍ３５８Ａ、Ｔ３５９Ａ、Ｋ３６０Ａ、Ｎ３６１Ａ、Ｑ３６２Ａ、Ｙ３７３Ａ、Ｓ３７５Ａ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｑ、Ｅ３８０Ａ、Ｅ３８２Ａ、Ｓ３８３Ａ、Ｎ３８４Ａ、Ｑ３８６Ａ、Ｅ３８８Ａ、Ｎ３８９Ａ、Ｎ３９０Ａ、Ｙ３９１Ｆ、Ｋ３９２Ａ、Ｌ３９８Ａ、Ｓ４００Ａ、Ｄ４０１Ａ、Ｄ４１３Ａ、Ｋ４１４Ａ、Ｒ４１６Ａ、Ｑ４１８Ａ、Ｑ４１９Ａ、Ｎ４２１Ａ、Ｖ４２２Ａ、Ｓ４２４Ａ、Ｅ４３０Ａ、Ｎ４３４Ａ、Ｔ４３７Ａ、Ｑ４３８Ａ、Ｋ４３９Ａ、Ｓ４４０Ａ、Ｓ４４４Ａ、およびＫ４４７Ａ、ここで、例えば、Ｐ２３８Ａは、２３８位置でアラニンによって置換される野性型プロリンである。一例として、１つの特定の実施形態では、Ｎ２９７Ａ変異体を組み込み、高度に保存されたＮ−グリコシル化部位を除去する。アラニンに加えて、他のアミノ酸を、上記の特定の位置で野性型アミノ酸に関して置換してもよい。変異を単独でＦｃに導入して、天然のＦｃとは別個の１００を超えるＦｃＲｎ結合パートナーを生じ得る。さらに、これらの個々の変異体のうち２つ、３つまたはそれ以上の組み合わせを一緒に導入して、１００を超えるＦｃＲｎ結合パートナーを生じてもよい。さらに、本発明の構築物のＦｃＲｎ結合パートナーの１つを変異してもよく、他のＦｃＲｎ結合パートナーは全く変異されなくてもよく、または両方とも変異されてもよく、ただし異なる変異はない。Ｎ２９７Ａを含む、本明細書に記載の任意の変異体が、生理学的に活性な分子（例えば、ＥＰＯ，ＩＦＮ、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、Ｔ２０）にかかわらず、Ｆｃを改変するために用いられてもよい。
【０２０７】
特定の上記の変異体は、ＦｃＲｎ結合パートナーに対して新規な機能を付与し得る。例えば、一実施形態は、Ｎ２９７Ａを組み込み、高度に保存されたＮ−グリコシル化部位を除去する。この変異の効果は、免疫原性を低下して、それによって、ＦｃＲｎ結合パートナーの循環半減期を増強すること、ならびにＦｃＲｎについての親和性を損なうことなく、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、およびＦｃγＲＩＩＩＡに対して結合できないＦｃＲｎ結合パートナーをもたらすことである（Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅら、１９９５，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６０：８４７；Ｆｒｉｅｎｄら、１９９９，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６８：１６３２；Ｓｈｉｅｌｄｓら、１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１）。ＦｃＲｎに対する上記の変異から生じる新規な機能のさらなる例としては、いくつかの場合には、野性型のものを上回って増大され得る。この増大された親和性は、「結合」速度定数の増大、「解離」速度定数の低下、または「結合」速度定数の増大および「解離」速度定数の低下の両方を反映し得る。ＦｃＲｎに対する親和性の増大を付与すると思われる変異としては、Ｔ２５６Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、およびＮ４３４Ａが挙げられる（Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１）。
【０２０８】
さらに、少なくとも３つのヒトＦｃγレセプターは、下部のヒンジ領域内のＩｇＧ上の結合部位、一般にはアミノ酸２３４〜２３７を認識すると思われる。従って、新規な機能および潜在的な免疫原性の減少の別の例は、例えば、ＩｇＧ２「ＰＶＡ」（１つのアミノ酸欠失を有する）由来の対応する配列に対してヒトＩｇＧ１「ＥＬＬＧ」のアミノ酸２３３〜２３６を置き換えることによって、この領域の変異から生じ得る。種々のエフェクター機能を媒介するＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩは、このような変異が導入されたとき、ＩｇＧ１に結合しないことが示された。ＷａｒｄおよびＧｈｅｔｉｅ  １９９５，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２：７７およびＡｒｍｏｕｒら、１９９９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：２６１３。
【０２０９】
一実施形態では、ＦｃＲｎ結合パートナーは、配列ＰＫＮＳＳＭＩＳＮＴＰ（配列番号１２）および必要に応じてさらにＨＱＳＬＧＴＱ（配列番号１３）、ＨＱＮＬＳＤＧＫ（配列番号１４）、ＨＱＮＩＳＤＧＫ（配列番号２４）、またはＶＩＳＳＨＬＧＱ（配列番号２５）（米国特許第５，７３９，２７７号）から選択される配列を含むポリペプチドである。
【０２１０】
２つのＦｃＲｎレセプターは、単一のＦｃ分子に結合し得る。結晶学的データによって、各々のＦｃＲｎ分子がＦｃホモ二量体の単一のポリペプチドに結合することが示唆される。一実施形態では、ＦｃＲｎ結合パートナー、例えば、ＩｇＧのＦｃフラグメントを、生物学的に活性な分子に連結することは、生物学的に活性な分子を経口的に、口腔内に、舌下に、直腸に、膣に、経鼻的に投与されるエアロゾルとして、または肺経路を介して、または眼の経路を介して送達するという意味をもたらす。別の実施形態では、キメラのタンパク質は、侵襲的に、例えば、皮下に、静脈内に投与され得る。
【０２１１】
本発明のポリペプチドのＦｃ部分を作製するための定常領域ドメインまたはその一部は、異なる免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、本発明のポリペプチドは、ＩｇＧ１分子由来のＣＨ２ドメインまたはその一部、およびＩｇＧ３分子由来のＣＨ３領域またはその一部を含んでもよい。別の例では、ポリペプチドは、部分的には、ＩｇＧ１分子由来、および部分的にはＩｇＧ３分子由来のヒンジドメインを含んでいるＦｃ部分を含んでもよい。本明細書に示されるとおり、当業者には、Ｆｃ部分が天然に存在する抗体分子からアミノ酸配列を変化させるように変更されてもよいことが理解される。
【０２１２】
別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、１つ以上の短縮Ｆｃ部分を含んでいるｓｃＦｃ領域を、この部分がＦｃ領域に対してＦｃレセプター（ＦｃＲ）結合特性を付与するのに十分であるにもかかわらず、含む。例えば、ＦｃＲｎに結合するＦｃドメインの一部（すなわち、ＦｃＲｎ結合部分）は、ＩｇＧ１のおよそアミノ酸２８２〜４３８（ＥＵナンバリング）を含み、ここで主な接触部位は、ＣＨ２ドメインのアミノ酸２４８、２５０〜２５７、２７２、２８５、２８８、２９０〜２９１、３０８〜３１１、および３１４、ならびにＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８５〜３８７、４２８、および４３３〜４３６である。従って、本発明のポリペプチドのＦｃ部分は、ＦｃＲｎ結合部分を含んでもよいし、またはそれからなってもよい。ＦｃＲｎ結合部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含んでいる任意のアイソタイプの重鎖に由来し得る。一実施形態では、ヒトアイソタイプＩｇＧ１の抗体由来のＦｃＲｎ結合部分を用いる。別の実施形態では、ヒトアイソタイプＩｇＧ４の抗体由来のＦｃＲｎ結合部分を用いる。
【０２１３】
一実施形態では、本発明のポリペプチドは、完全Ｆｃ領域の１つ以上の定常領域ドメインを欠き、すなわち、それらのドメインは部分的にまたは完全に欠失されている。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、完全ＣＨ２ドメインを欠く（ΔＣＨ２構築物）。当業者は、このような構築物が、抗体の異化速度に対するＣＨ２ドメインの調節特性に起因して好ましい場合があることを理解する。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＩｇＧ１ヒト定常領域ドメインをコードするベクター（例えば、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ由来）由来のＣＨ２ドメイン欠失Ｆｃ領域を含む（例えば、ＷＯ０２／０６０９５５Ａ２およびＷＯ０２／０９６９４８Ａ２を参照のこと）。この例示的なベクターは、ＣＨ２ドメインを欠失するように操作されて、ドメイン欠失のＩｇＧ１定常領域を発現する合成ベクターを提供する。これらの例示的な構築物は好ましくは、結合ＣＨ３ドメインを直接それぞれのＦｃドメインのヒンジ領域に融合するように操作される。
【０２１４】
他の構築物では、２つ以上の構成要素Ｆｃ部分の間にスペーサー部分を提供することが所望され得る。例えば、スペーサー部分は、ヒンジ領域とＣＨ２ドメインとの間、および／またはＣＨ２とＣＨ３ドメインとの間に配置されてもよい。例えば、適合する構築物が、発現されてもよく、ここではＣＨ２ドメインが欠失されており、残りのＣＨ３ドメイン（合成または非合成の）が５〜２０アミノ酸のスペーサー部分を有するヒンジ領域に連結される。このようなスペーサー部分は、例えば、定常ドメイン領域の調節性エレメントが遊離のままであり、かつアクセス可能であること、またはヒンジ領域が可塑性のままであることを保証するために追加され得る。好ましくは、本発明と適合する任意のリンカーペプチドは、比較的非免疫原性であり、かつｓｃＦｃ領域の適切な折り畳みを妨げることはない。
【０２１５】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、二量体のＦｃ領域であって、同じかまたは実質的に同じ配列組成のＦｃ部分を含んでいるＦｃ領域を含んでもよい（本明細書においては、「ホモ二量体Ｆｃ領域」と呼ばれる）。他の実施形態では、本発明のポリペプチドは、二量体Ｆｃ領域であって、配列組成が異なっている少なくとも２つのＦｃ部分を含むＦｃ領域を含んでもよい（すなわち、本明細書においては「ヘテロ二量体Ｆｃ領域」と呼ばれる）。１つの例示的な実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、第一のＦｃ部分にアミノ酸置換を含む（例えば、ＥＵの位置２９７でのアスパラギンのアミノ酸置換）が、第二のＦｃ部分には含まない。  
【０２１６】
特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、半グリコシル化される。例えば、ヘテロマーのｓｃＦｃ領域は、第一の、グリコシル化された、Ｆｃ部分（例えば、グリコシル化されたＣＨ２領域）および第二の、非グリコシル化された、Ｆｃ部分（例えば、非グリコシル化されたＣＨ２領域）を含んでもよく、ここでリンカーは、グリコシル化された部分と非グリコシル化されたＦｃ部分との間に差し込まれる。他の実施形態では、Ｆｃ領域は、完全にグリコシル化され、すなわち、全てのＦｃ部分がグリコシル化されている。なおさらなる実施形態では、Ｆｃ領域は、非グリコシル化されてもよく、すなわち、グリコシル化されているＦｃ部分はない。
【０２１７】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドで使用されるＦｃ部分は、例えば、アミノ酸変異体（例えば、付加、欠失、または置換）によって変更される。例えば、一実施形態では、Ｆｃ部分は、そのＦｃ部分が由来する野性型Ｆｃと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。例えば、ここで、このＦｃ部分は、ヒトＩｇＧ１抗体由来であり、改変体は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域の対応する位置での野性型アミノ酸に比較して少なくとも１つのアミノ酸変異（例えば、置換）を含む。
【０２１８】
Ｆｃ改変体のアミノ酸置換（単数または複数）は、その残基が抗体中のＦｃ領域で与えられる位置の数（ＥＵナンバリング習慣を用いて示されるような）に対応するとされるＦｃ部分内の位置に位置してもよい。当業者は、Ｆｃ部分における位置にどのＥＵ番号が対応するかを決定するために容易にアラインメントを作製し得る。
【０２１９】
一実施形態では、Ｆｃ改変体は、ヒンジドメインまたはその一部に位置するアミノ酸位置で置換を含む。別の実施形態では、Ｆｃ改変体は、ＣＨ２ドメインまたはその一部に位置するアミノ酸位置で置換を含む。別の実施形態では、Ｆｃ改変体は、ＣＨ３ドメインまたはその一部に位置するアミノ酸位置で置換を含む。別の実施形態では、Ｆｃ改変体は、ＣＨ４ドメインまたはその一部に位置するアミノ酸位置で置換を含む。
【０２２０】
特定の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、２つ以上のアミノ酸置換を含むＦｃ改変体を含む。本発明のポリペプチドは、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはそれ以上のアミノ酸置換を含んでもよい。好ましくは、アミノ酸置換は、少なくとも１アミノ酸部分、またはそれ以上、例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはそれ以上というアミノ酸位置、またはそれ以上の間隔で互いに空間的に位置する。より好ましくは、操作されたアミノ酸は、少なくとも５、１０、１５、２０、または２５のアミノ酸位置、またはそれ以上の間隔で互いに離れて空間的に位置する。
【０２２１】
特定の実施形態においては、Ｆｃ改変体は、このような野生型Ｆｃドメインを含むＦｃ領域によって付与された少なくとも１つのエフェクター機能の変化（例えば、Ｆｃレセプター（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、もしくはＦｃγＲＩＩＩ）、または補体タンパク質（例えば、Ｃ１ｑ）に結合するか、または抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、食作用、もしくは補体依存性細胞毒性（ＣＤＣＣ）を誘引するＦｃ領域の能力の改善または低下）を付与する。他の実施形態では、Ｆｃ改変体は、遺伝子操作されたシステイン残基を提供する。
【０２２２】
本発明のポリペプチドは、エフェクター機能および／またはＦｃＲもしくはＦｃＲｎ結合における変化（例えば、増強または減少）を付与することが公知である当該分野で認識されるＦｃ改変体を使用し得る。詳細には、本発明の結合分子は、例えば、国際公開ＷＯ８８／０７０８９Ａ１、ＷＯ９６／１４３３９Ａ１、ＷＯ９８／０５７８７Ａ１、ＷＯ９８／２３２８９Ａ１、ＷＯ９９／５１６４２Ａ１、ＷＯ９９／５８５７２Ａ１、ＷＯ００／０９５６０Ａ２、ＷＯ００／３２７６７Ａ１、ＷＯ００／４２０７２Ａ２、ＷＯ０２／４４２１５Ａ２、ＷＯ０２／０６０９１９Ａ２、ＷＯ０３／０７４５６９Ａ２、ＷＯ０４／０１６７５０Ａ２、ＷＯ０４／０２９２０７Ａ２、ＷＯ０４／０３５７５２Ａ２、ＷＯ０４／０６３３５１Ａ２、ＷＯ０４／０７４４５５Ａ２、ＷＯ０４／０９９２４９Ａ２、ＷＯ０５／０４０２１７Ａ２、ＷＯ０４／０４４８５９、ＷＯ０５／０７０９６３Ａ１、ＷＯ０５／０７７９８１Ａ２、ＷＯ０５／０９２９２５Ａ２、ＷＯ０５／１２３７８０Ａ２、ＷＯ０６／０１９４４７Ａ１、ＷＯ０６／０４７３５０Ａ２、およびＷＯ０６／０８５９６７Ａ２；米国特許出願公開第２００７／０２３１３２９号、米国特許出願公開第２００７／０２３１３２９号、米国特許出願公開第２００７／０２３７７６５号、米国特許出願公開第２００７／０２３７７６６号、米国特許出願公開第２００７／０２３７７６７号、米国特許出願公開第２００７／０２４３１８８号、米国特許出願公開第２００７０２４８６０３号、米国特許出願公開第２００７０２８６８５９号、米国特許出願公開第２００８００５７０５６号；または米国特許第５，６４８，２６０号；同第５，７３９，２７７号；同第５，８３４，２５０号；同第５，８６９，０４６号；同第６，０９６，８７１号；同第６，１２１，０２２号；同第６，１９４，５５１号；同第６，２４２，１９５号；同第６，２７７，３７５号；同第６，５２８，６２４号；同第６，５３８，１２４号；同第６，７３７，０５６号；同第６，８２１，５０５号；同第６，９９８，２５３号；同第７，０８３，７８４号；および同第７，３１７，０９１（各々は、本明細書において参照によって援用される）に開示されるアミノ酸位置のうちの１つ以上で変化（例えば、置換）を含んでもよい。一実施形態では、特定の変化（例えば、当該分野で開示される１つ以上のアミノ酸の特定の置換）が、開示されるアミノ酸位置のうちの１つ以上で作製され得る。別の実施形態では、開示されるアミノ酸位置のうちの１つ以上のでの異なる変化（例えば、当該分野で開示される１つ以上のアミノ酸位置の異なる置換）がなされてもよい。
【０２２３】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、抗体の抗原−非依存性エフェクター機能、詳細には抗体の循環半減期を変化するＦｃ部分に対するアミノ酸置換を含む。
【０２２４】
このようなポリペプチドは、これらの置換を欠くポリペプチドと比較した場合、ＦｃＲｎへの結合の増加または低下のいずれかを示し、従って、それぞれ、血清中の半減期が延長または短縮している。ＦｃＲｎに対して親和性が改善されているＦｃ改変体は、より長い血清半減期を有することが見込まれ、そのような分子は、例えば、慢性疾患または障害を治療するために、投与されたポリペプチドの長い半減期が望ましい場合の哺乳動物を治療するための方法において有用な用途を有する（例えば、米国特許第７，３４８，００４号、同第７，４０４，９５６号および同第７，８６２，８２０号を参照のこと）。対照的に、ＦｃＲｎ結合親和性が低下したＦｃ改変体は、より短い半減期を有すると期待され、そのような分子も、例えば、インビボ画像診断、あるいは出発ポリペプチドが、長期に渡って循環に存在する場合に毒性副作用を有する状況など、短い循環時間が有利であり得る哺乳動物への投与において有用である。また、低下したＦｃＲｎ結合親和性を有するＦｃ改変体はまた、胎盤を通過する可能性もより低くなるため、妊婦における疾患または障害の治療においても有用である。さらに、低下したＦｃＲｎ結合親和性が望ましい可能性がある他の用途としては、脳、腎臓および／または肝臓での局所化が望ましい場合の用途が挙げられる。１つの例示的な実施形態においては、本発明のポリペプチドは、血管系から腎臓糸球体の上皮を横切る運搬の低下を示す。別の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、脳から血液脳関門（ＢＢＢ）を横切る脈管性間隙への運搬の低下を示す。一実施形態においては、変化したＦｃＲｎ結合を有するポリペプチドは、Ｆｃ部分の「ＦｃＲｎ結合ループ」内に１つ以上のアミノ酸置換を有する少なくとも１つのＦｃ部分（例えば、１つまたは２つのＦｃ部分）を含む。ＦｃＲｎ結合ループは、野生型の完全長Ｆｃ部分のアミノ酸残基２８０〜２９９（ＥＵナンバリングによる）から構成される。他の実施形態においては、変化したＦｃＲｎ結合親和性を有する本発明のポリペプチドは、１５ÅのＦｃＲｎ「接触ゾーン」内に１つ以上のアミノ酸置換を有する少なくとも１つのＦｃ部分（例えば、１つまたは２つのＦｃ部分）を含む。本明細書において用いられる場合、１５ÅのＦｃＲｎ「接触ゾーン」という用語は、以下の野生型完全長Ｆｃ部分の位置にある残基を含む：２４３〜２６１、２７５〜２８０、２８２〜２９３、３０２〜３１９、３３６〜３４８、３６７、３６９、３７２〜３８９、３９１、３９３、４０８、４２４、４２５〜４４０（ＥＵナンバリング）。好ましい実施形態においては、変化したＦｃＲｎ結合親和性を有する本発明のポリペプチドは、以下のＥＵ位置のいずれか１つに対応するアミノ酸位置に１つ以上のアミノ酸置換を有する少なくとも１つのＦｃ部分（例えば、１つまたは２つのＦｃ部分）を含む：２５６、２７７〜２８１、２８３〜２８８、３０３〜３０９、３１３、３３８、３４２、３７６、３８１、３８４、３８５、３８７、４３４（例えば、Ｎ４３４ＡまたはＮ４３４Ｋ）、および４３８。ＦｃＲｎ結合活性を変化させた例示的なアミノ酸置換は、国際公開ＷＯ０５／０４７３２７号に開示され、この内容は、参照によって、本明細書に援用される。
【０２２５】
本発明のポリペプチドはまた、ポリペプチドのグリコシル化を変更する当該分野で認識されるアミノ酸置換を含み得る。例えば、結合ポリペプチドのｓｃＦｃ領域は、グリコシル化の低下をもたらす変異を有するＦｃ部分を含んでもよいし（例えば、Ｎ−連結またはＯ−連結のグリコシル化）、または野性型Ｆｃ部分の変更された糖型（例えば、低フコースまたはフコースなしのグリカン）を含んでもよい。
【０２２６】
他の実施形態では、本発明のポリペプチドは、溶媒露出表面に位置する、遺伝子操作されたシステイン残基またはそのアナログを有する少なくとも１つのＦｃ部分を含む。好ましくは、遺伝子操作されたシステイン残基またはそのアナログは、ｓｃＦｃ領域によって付与されるエフェクター機能を妨害しない。さらに好ましくは、この変更は、ｓｃＦｃ領域がＦｃレセプター（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、またはＦｃγＲＩＩＩ）または補体タンパク質（例えば、Ｃ１ｑ）に結合する能力、または免疫エフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、食作用、または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣＣ））を誘発する能力を妨害しない。
【０２２７】
一実施形態では、本発明のプロセシングされていないポリペプチドは、遺伝子的に融合されたＦｃ領域（すなわち、ｓｃＦｃ領域）であって、本明細書に記載されるＦｃ部分から独立して選択されるその構成要素Ｆｃ部分の２つ以上を有する領域を含み得る。一実施形態では、二量体Ｆｃ領域のＦｃ部分は同じである。別の実施形態では、Ｆｃ部分の少なくとも２つは異なる。例えば、本発明のポリペプチドのＦｃ部分は、同じ数のアミノ酸残基を含むか、またはそれらは、１つ以上のアミノ酸残基ずつ長さが異なり得る（例えば、約５アミノ酸残基（例えば、１、２、３、４、または５アミノ酸残基）、約１０残基、約１５残基、約２０残基、約３０残基、約４０残基、または約５０残基ずつ）。さらに他の実施形態では、本発明のポリペプチドのＦｃ部分は、１つ以上のアミノ酸位置で配列が異なってもよい。例えば、少なくとも２つのＦｃ部分が、およそ５アミノ酸位置（例えば、１、２、３、４、または５アミノ酸位置）、約１０位置、約１５位置、約２０位置、約３０位置、約４０位置、または約５０位置）で異なり得る。
【０２２８】
ＶＩ．ポリペプチドリンカー
本明細書において用いる場合、「ポリペプチドリンカー」という用語は、ポリペプチド鎖の直鎖状アミノ酸配列における２つのドメインを接続するペプチドまたはポリペプチド配列（例えば、合成のペプチドまたはポリペプチド配列）を指す。本発明のポリペプチドは、構築物を作製する２つのＦｃ部分を直接または間接的に接続するポリペプチドリンカーをコードする核酸分子によってコードされる。これらのリンカーは、本明細書においては「ｓｃＦｃリンカー」と呼ばれる。ｓｃＦｃリンカーが２つのＦｃ部分を連続して直鎖状ポリペプチド配列で接続する場合、これは、「直接」連結である。対照的に、ｓｃＦｃリンカーは、結合部分に対して第一のＦｃ部分を連結し得、これが次に、第二のＦｃ部分に連結され、それによって間接的な連結が形成される。これらのｓｃＦｃリンカー（Ｌ）は、単鎖の遺伝子的構築物の形成を生じる。しかし、一実施形態では、ｓｃＦｃポリペプチドはまた、酵素的切断部位を含み、これによってｓｃＦｃリンカーは切断性（ｃｓｃＦｃリンカー）になり、一実施形態では、実質的には切除される（例えば、細胞によるプロセシングの間）。従って、プロセシングされた分子は、二量体分子であって、少なくとも２つのアミノ酸鎖を含み、かつ実質的に外因性のリンカーアミノ酸配列を欠いている二量体分子である。いくつかの実施形態では、全てのまたは実質的に全てのリンカーが切り出されるが、いくつかの実施形態では、切断部位の一部、例えば、ＲＲＲＲ切断部位の４つのアルギニンが残る場合がある。
【０２２９】
別の実施形態では、本明細書においては「スペーサー」と呼ばれる別の種類のポリペプチドリンカーを用いて、異なる部分、例えば、凝固因子または標的部分をＦｃ部分に接続してもよい。この種のポリペプチドリンカーは、ポリペプチド分子に対して可塑性を提供し得る。スペーサーは一般的には切断されないが、このような切断は所望され得る。スペーサーの例示的な位置は、添付の図面に示される。スペーサーは、凝固因子、標的化部分、および／または足場の間に、例えば、これらの部分のＮ末端またはＣ末端に位置してもよい。一実施形態では、これらのリンカーは、プロセシングの間に除去されない。
【０２３０】
本発明のキメラの凝固因子に存在し得る第三種のリンカーは、切断部位（例えば、第ＸＩａ因子、Ｘａ、またはトロンビン切断部位）を含み、かつ追加のスペーサーリンカーを、切断部位のＮ末端もしくはＣ末端のいずれかまたは両側の上に含み得る切断性（切断可能）リンカーである。これらの切断性リンカーは、凝固因子に組み込まれた場合、異種切断部位を有するキメラ分子を生じる。このような部位の例示的な位置は、添付の図面に示されており、これには、例えば、標的部位に対する隣接が挙げられる。別の実施形態では、このようなリンカーは、凝固因子またはその一部に隣接してもよい。例えば、一実施形態では、切断性のリンカーは、凝固因子の重鎖のＮ末端に融合されて、この凝固因子の活性化可能な形態を作製し得る。このような場合、この切断性のリンカーは、その切断部位のＮ末端で追加のスペーサーリンカーを含んでもよいが、その凝固因子の重鎖のアミノ末端に対する切断部位のＣ末端での直接融合を必要とする。
【０２３１】
一実施形態では、本発明のプロセシングされていないポリペプチドは、単一のポリペプチド鎖に含まれるＦｃ領域を形成するようにｃｓｃＦｃリンカーを介して連結される２つ以上のＦｃドメインまたは部分を含む。ｃｓｃＦｃリンカーは、少なくとも１つの酵素的切断部位、例えば、細胞内酵素によるプロセシングのための部位に隣接する。少なくとも１つの酵素的切断部位でのポリペプチドの切断は、少なくとも２つのポリペプチド鎖を含むポリペプチドを生じる。一実施形態では、ｃｓｃＦｃリンカーは、Ｆ１またはＦ２を、例えば、凝固因子に、必要に応じて切断部位を介して連結する。
【０２３２】
上記で示されるとおり、他のポリペプチドリンカーは必要に応じて、例えば、凝固因子または標的部分をＦｃ部分に接続するために、本発明の構築物中で用いられ得る。ある種のポリペプチドリンカーは、本明細書においてはスペーサーと呼ばれる。本発明と関連して用いられ得るスペーサーのいくつかの例示的な位置としては、例えば、添付の図面に示され、下にさらに詳細に記載されるアミノ酸などのＧｌｙＳｅｒアミノ酸を含むポリペプチドが挙げられる。一実施形態では、スペーサーは、各々が独立して、凝固因子、足場部分、例えば、Ｆｃ、切断部位、および標的部分から選択される１つ以上の部位に隣接してもよい。
【０２３３】
一実施形態では、ポリペプチドリンカーは合成であり、すなわち、天然には存在しない。一実施形態では、ポリペプチドリンカーとしては、ペプチド（またはポリペプチド）（これは天然に存在しても、または天然には存在しなくてもよい）が挙げられ、これはアミノ酸の第一の直鎖状配列を、これが天然には連結されていないし、または事実上遺伝子的に融合されてもいない、アミノ酸の第二の直鎖状配列に連結するかまたは遺伝子的に融合する、アミノ酸配列を含む。例えば、一実施形態ではこのポリペプチドリンカーは、天然に存在するポリペプチドの改変型である（例えば、付加、置換または欠失などの変異を含んでいる）、天然には存在しないポリペプチドを含んでもよい。別の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、天然には存在しないアミノ酸を含んでもよい。別の実施形態では、このポリペプチドリンカーは、天然には生じない直鎖状配列に存在する天然に存在するアミノ酸を含んでもよい。さらに別の実施形態では、このポリペプチドリンカーは、天然に存在するポリペプチド配列を含んでもよい。
【０２３４】
例えば、特定の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、同一のＦｃ部分を融合し、それによってホモマーのｓｃＦｃ領域を形成するために用いられ得る。他の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、異なるＦｃ部分（例えば、野性型Ｆｃ部分およびＦｃ部分改変体）を融合し、それによってヘテロマーのｓｃＦｃ領域を形成するために用いられ得る。
【０２３５】
別の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーを含むか、またはそれらからなる。一実施形態では、ｓｃＦｃまたはｃｓｃＦｃリンカーは、免疫グロブリンヒンジの少なくとも一部およびｇｌｙ−ｓｅｒリンカーを含む。本明細書において用いる場合、「ｇｌｙ−ｓｅｒリンカー」という用語は、グリシンおよびセリン残基からなるペプチドを指す。例示的なｇｌｙ／ｓｅｒリンカーは、式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号４）のアミノ酸配列を含み、ここでｎは正の整数である（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）。好ましいｇｌｙ／ｓｅｒリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号２９）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号６）、または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６（配列番号５）である。別の例示的なｇｌｙ−ｓｅｒリンカーは、ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ（配列番号３０）である。特定の実施形態では、このようなｇｌｙ−ｓｅｒリンカーは、ポリペプチドリンカーの２つの他の配列（例えば、本明細書に記載される任意のポリペプチドリンカー配列）の間に挿入され得る。他の実施形態では、ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーは、ポリペプチドリンカーの別の配列（例えば、本明細書に記載される任意のポリペプチドリンカー配列）の一方または両端に結合される。さらに他の実施形態では、２つ以上のｇｌｙ−ｓｅｒリンカーが、ポリペプチドリンカーに連続して差し込まれる。一実施形態では、本発明のポリペプチドリンカーは、上部ヒンジ領域の少なくとも一部（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４分子由来）、中央ヒンジ領域の少なくとも一部（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４分子）および一連のｇｌｙ／ｓｅｒアミノ酸残基（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ）（配列番号４）のようなｇｌｙ／ｓｅｒリンカー）を含む。
【０２３６】
本発明のポリペプチドリンカーは、少なくとも１アミノ酸長であり、かつ変化する長さのアミノ酸であってもよい。一実施形態では、本発明のポリペプチドリンカーは、約１〜約５０アミノ酸長である。この文脈で用いる場合、「約」という用語は、＋／−２つのアミノ酸残基を示す。リンカー長は、正の整数でなければならないので、約１〜約５０アミノ酸長という長さは、１−３〜４８−５２アミノ酸長という長さを意味する。別の実施形態では、本発明のポリペプチドリンカーは、約１０−２０アミノ酸長である。別の実施形態では、本発明のポリペプチドリンカーは、約１５〜約５０アミノ酸長である。別の実施形態では、本発明のポリペプチドリンカーは、約２０〜約４５アミノ酸長である。別の実施形態では、本発明のポリペプチドリンカーは、約１５〜約３５または約２０〜約３０アミノ酸長である。別の実施形態では、本発明のポリペプチドリンカーは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、または６０アミノ酸長である。一実施形態では、本発明のペプチドリンカーは、２０または３０アミノ酸長である。
【０２３７】
ポリペプチドリンカーは、当該分野で公知の技術を用いてポリペプチド配列に導入され得る。改変は、ＤＮＡ配列分析によって確認され得る。プラスミドＤＮＡを用いて、産生されるポリペプチドの安定な産生のために宿主細胞を形質転換してもよい。
【０２３８】
ＶＩＩＩ．酵素的切断部位
一実施形態では、１つ以上の酵素的切断部位（単数または複数）が、本発明のプロセシングされていないポリペプチドのｃｓｃＦｃリンカー（Ｌ）に連結され、例えば、横にあるか、または隣接される。このような切断部位は、ｃｓｃＦｃリンカーの上流もしくは下流、またはその両方であってもよい。例えば、本発明のポリペプチドをコードする構築物の一実施形態では、切断部位は、ｃｓｃＦｃリンカー（Ｌ）の一端または両端に対して（例えば、直接または間接的に）連結される。
【０２３９】
例えば，一実施形態では、本発明の核酸分子は、以下の式によって示されるポリペプチドを規定する：
Ａ−Ｆ１−Ｐ１−Ｌ−Ｐ２−Ｂ−Ｆ２（Ｉ）
【０２４０】
アミノ末端からカルボキシル末端の直鎖状配列では、Ａは存在する場合、凝固因子またはその一部であり、Ｆ１は第一のＦｃ部分またはドメインであり、Ｐ１は酵素的切断部位であり、ＬはｃｓｃＦｃリンカーであり、Ｐ２は酵素的切断部位Ｂであり、存在するならば、凝固因子またはその一部であり、Ｆ２は第二のＦｃ部分またはドメインであり、かつ「−」は、ペプチド結合である。式（Ｉ）は、少なくともＡまたはＢ、必要に応じてその両方を含む。ＡおよびＢは、両方が存在する場合、凝固因子の対応する重鎖および軽鎖であり得る。式（Ｉ）は、少なくともＰ１またはＰ２、および必要に応じて両方を含む。Ｐ１およびＰ２は、両方が存在する場合、同じであっても異なってもよい。式（Ｉ）は、少なくともＦ１およびＦ２を含む。Ｆ１およびＦ２は、両方とも存在する場合、同じであっても異なってもよい。
【０２４１】
別の実施形態では、第ＸＩａ因子または第Ｘａ因子の切断部位は、本発明の構築物中に、例えば、切断性のリンカーに組み込まれてもよい。例示的なＦＸＩａ切断部位は、例えば、ＴＱＳＦＮＤＦＴＲおよびＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲを含む。例示的なトロンビン切断部位は、例えば、ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ、ＴＴＫＩＫＰＲ、ＬＶＰＲＧ配列番号３５）およびＡＬＲＰＲＶＶＧＧＡを含む。他の有用な切断部位が当該分野で公知である。
【０２４２】
一実施形態では、このリンカーのいくつかの部分は、少なくとも１つの酵素的切断部位で切断後に残る場合がある。外因性のアミノ酸配列の存在を最小化するために、２つの切断部位が、本発明のポリペプチド中に含まれてもよい。いくつかの実施形態では、全てのまたは実質的に全てのリンカーが切除されるが、いくつかの実施形態では、切断部位の一部、例えば、ＲＲＲＲ切断部位の４つのアルギニンが残る場合がある。
【０２４３】
ポリペプチドの調製
本発明のキメラの凝固因子を組み換え的に産生するには種々の方法が利用可能である。一実施形態では、本発明は、本発明のキメラのタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸構築物に関する。コードの縮重性のおかげで、種々の核酸配列は、ポリペプチドのアミノ酸配列をコードすることが理解される。所望のポリヌクレオチドは、新規の固相ＤＮＡ合成によって、または初期に調製したポリヌクレオチドのＰＣＲ突然変異誘発によって産生され得る。
【０２４４】
オリゴヌクレオチド媒介性の突然変異誘発は、アミノ酸置換をコードするコドンを（例えば、Ｆｃ改変体部分へ）導入するための置換、インフレーム挿入または変更（例えば、変更されたコドン）を調製するための１方法である。例えば、出発ポリペプチドＤＮＡは所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドを一本鎖のＤＮＡテンプレートにハイブリダイズすることによって変更される。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、オリゴヌクレオチドプライマーに組み込むテンプレートの全体的な第二の相補的な鎖を合成する。一実施形態では、遺伝子操作、例えば、プライマーベースのＰＣＲ突然変異誘発が、本明細書に記載されるように、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを産生するために、変更を組み込むために十分である。
【０２４５】
組み換え産生のために、キメラのタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を適切な発現ビヒクル、すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳のために必須のエレメントを含むベクター、またはＲＮＡウイルスベクターの場合は、複製および翻訳のために必須のエレメントを含むベクター中に挿入する。
【０２４６】
キメラのタンパク質をコードする核酸を、適切なリーディングフレーム中でベクターに挿入する。次いで、この発現ベクターを、ポリペプチドを発現する適切な標的細胞中にトランスフェクトする。当該分野で公知のトランスフェクション技術としては、限定するものではないが、リン酸カルシウム沈殿（Ｗｉｇｌｅｒら、１９７８，Ｃｅｌｌ  １４：７２５）およびエレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎら、１９８２，ＥＭＢＯ，Ｊ．１：８４１）が挙げられる。種々の宿主発現ベクター系を利用して、真核生物細胞中で、本明細書に記載のキメラのタンパク質を発現してもよい。一実施形態では、真核生物細胞は、動物細胞であり、これには哺乳動物細胞（例えば、２９３細胞、ＰｅｒＣ６、ＣＨＯ、ＢＨＫ、Ｃｏｓ、ＨｅＬａ細胞）が挙げられる。キメラのタンパク質が、真核生物細胞で発現される場合、キメラのタンパク質をコードするＤＮＡはまた、キメラのタンパク質が分泌されることを可能にするシグナル配列をコードしてもよい。当業者は、タンパク質は翻訳されるが、シグナル配列は細胞によって切断されて成熟キメラタンパク質が形成されることを理解する。種々のシグナル配列、例えば、天然の第ＶＩＩ因子シグナル配列、天然の第ＩＸ因子シグナル配列およびマウスＩｇＫ軽鎖シグナル配列が当該分野で公知である。あるいは、シグナル配列がキメラのタンパク質に含まれない場合、細胞を溶解することによって回収され得る。
【０２４７】
本発明のキメラのタンパク質は、げっ歯類、ヤギ、ヒツジ、ブタまたはウシのようなトランスジェニック動物で合成されてもよい。「トランスジェニック動物」という用語は、それらのゲノム中へ外来の遺伝子を組み込んでいる非ヒト動物を指す。この遺伝子は、生殖細胞系列の組織に存在するので、この遺伝子は親から子孫に受け継がれる。外因性の遺伝子は、単一細胞の胚に導入される（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４４３８）。免疫グロブリン分子を産生するトランスジェニックを含む、トランスジェニック動物を産生する方法は当該分野で公知である（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：６３７６；ＭｃＫｎｉｇｈｔら、１９８３，Ｃｅｌｌ  ３４：３３５；Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８３，Ｎａｔｕｒｅ  ３０６：３３２；Ｒｉｔｃｈｉｅら、１９８４，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：５１７；Ｂａｌｄａｓｓａｒｒｅら、２００３，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ５９：８３１  ；Ｒｏｂｌら、２００３，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ５９：１０７；Ｍａｌａｓｓａｇｎｅら、２００３，Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １０（３）：２６７）。
【０２４８】
発現ベクターは、組み換え的に産生されたタンパク質の容易な精製または特定を可能にするタグをコードしてもよい。例としては、限定するものではないが、ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、１９８３，ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１）が挙げられ、ここでは本明細書に記載されるキメラのタンパク質をコードする配列を、ハイブリッドタンパク質が産生されるように、ｌａｃ  ｚコード領域とともにインフレームでベクター中に連結してもよい；ｐＧＥＸベクターを用いて、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグを有するタンパク質を発現してもよい。これらのタンパク質は通常、可溶性であり、かつグルタチオン−アガロースビーズに対する吸着によって、続いて、遊離のグルタチオンの存在下での溶出によって細胞から容易に生成され得る。このベクターは、精製後のタグの容易な除去のための切断部位を含む（例えば、ＰｒｅＣｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｅａｐａｃｋ，Ｎ．Ｊ．））。
【０２４９】
本発明の目的のために、多数の発現ベクター系を使用してもよい。これらの発現ベクターは典型的には、宿主生物体中で、エピソームとして、または染色体ＤＮＡの一体部分として、複製可能である。発現ベクターは、発現制御配列を含んでもよく、この配列には限定するものではないが、プロモーター（例えば、天然に会合するかまたは異種のプロモーター）、エンハンサー、シグナル配列、スプライスシグナル、エンハンサーエレメント、および転写末端配列を含む。好ましくは、発現制御配列は、真核生物宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトし得るベクター中の真核生物プロモーター系である。発現ベクターはまた、ウシ乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクチニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶまたはＭＯＭＬＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、またはＳＶ４０ウイルスのような動物ウイルス由来のＤＮＡエレメントを利用し得る。他には、内部リボソーム結合部位を有するポリシストロン性の系の使用を包含する。
【０２５０】
通常は、発現ベクターは、選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性またはネオマイシン耐性）を含んで、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にする（例えば、Ｉｔａｋｕｒａら、米国特許第４，７０４，３６２号を参照のこと）。ＤＮＡをそれらの染色体に組み込んでいる細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することによって選択され得る。このマーカーは、栄養要求性宿主への原栄養性、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）、または銅などの重金属に対する耐性を提供し得る。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるべきＤＮＡ配列に直接結合されてもよいし、または同時形質転換によって同じ細胞に導入されてもよい。
【０２５１】
好ましい発現ベクターは、ＮＥＯＳＰＬＡである（米国特許第６，１５９，７３０号）。このベクターは、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー、マウスβグロビン主要プロモーター、ＳＶ４０複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエキソン１およびエキソン２、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子およびリーダー配列を含む。このベクターは、可変および定常領域遺伝子の組み込み、細胞中のトランスフェクション、その後のＧ４１８含有培地中での選択およびメトトレキサート増幅の際に極めて高レベルの抗体発現を生じることが見出された。ベクター系はまた、米国特許第５，７３６，１３７号および同第５，６５８，５７０号（その各々がその全体が本明細書において参照によって援用される）に教示される。この系は、高い発現レベル、例えば、＞３０ｐｇ／細胞／日を提供する。他の例示的なベクター系は、例えば、米国特許第６，４１３，７７７号に開示される。
【０２５２】
他の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ポリシストロン性の構築物を用いて発現され得る。これらの発現系では、本発明の複数の遺伝子産物、例えば、多量体結合タンパク質の複数のポリペプチドが、単一のポリシストロン性構築物から産生され得る。これらの系は有利には、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を用いて、本発明の比較的高レベルのポリペプチドを真核生物宿主細胞に提供する。適合性のＩＲＥＳ配列は、本明細書にこれも援用される米国特許第６，１９３，９８０号に開示される。当業者は、このような発現系を用いて、本出願に開示されるポリペプチドの全範囲を効率的に生成し得ることを理解する。
【０２５３】
さらに一般的には、ポリペプチドをコードするベクターまたはＤＮＡ配列を一旦調製すれば、この発現ベクターを適切な宿主細胞中に導入してもよい。すなわち、宿主細胞を形質転換してもよい。宿主細胞へのプラスミドの導入は、当業者に周知の種々の技術によって達成され得る。これらとしては限定するものではないが、トランスフェクション（電気泳動およびエレクトロポレーションを含む）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープＤＮＡによる細胞融合、マイクロインジェクションおよびインタクトなウイルスでの感染が挙げられる。Ｒｉｄｇｗａｙ，Ａ．Ａ．Ｇ．「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」第２４．２章，４７０−４７２頁  Ｖｅｃｔｏｒｓ，ＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＤｅｎｈａｒｄｔ，編集．（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．１９８８）を参照のこと。最も好ましくは、宿主細胞へのプラスミド導入は、エレクトロポレーションを介する。この形質転換された細胞は、軽鎖および重鎖の産生に対して適切な条件下で増殖され、重鎖および／または軽鎖のタンパク質合成についてアッセイされる。例示的なアッセイ技術としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または蛍光活性化された細胞分取分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学などが挙げられる。
【０２５４】
本明細書において用いる場合、「形質転換」という用語は、遺伝子型を変化し、結果としてレシピエント細胞の変化を生じる、レシピエントの宿主細胞へのＤＮＡの導入を指して広義に用いられるものである。
【０２５５】
これらの同じ表現によれば、「宿主細胞」とは、組み換えＤＮＡ技術を用いて構築され、少なくとも１つの異種遺伝子をコードしているベクターで形質転換された細胞を指す。組み換え宿主からのポリペプチドの単離のためのプロセスの説明では、「細胞」および「細胞培養物」という用語は、交換可能に用いられて、明らかに他を特定するのでない限り、ポリペプチドの供給源を指す。言い換えれば、「細胞」からのポリペプチドの回収とは、スピンダウンした細胞全体から、または培地および懸濁細胞の両方を含む細胞培養物からのいずれを意味してもよい。
【０２５６】
タンパク質発現のために用いられる宿主細胞は、哺乳動物由来の細胞が最も好ましい；当業者は、所望の遺伝子産物をその中で発現させるのに最適の特定の宿主細胞株を優先的に決定する能力を承知している。例示的な宿主細胞株としては、限定するものではないが、ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０のＴ抗原を有するＣＶＩの誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３．ｔｉｍｅｓ．６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、ＰｅｒＣ６、および２９３（ヒト腎臓）が挙げられる。宿主細胞株は通常は、商業的供給源、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから、または公表文献から入手可能である。
【０２５７】
一実施形態では、宿主細胞は、成熟ポリペプチドを形成するためのプロセシングの間にｓｃＦｃリンカー（例えば、このようなリンカーが存在する場合、細胞内プロセシング部位（単数または複数）を含む）を切断するために必要な酵素（単数または複数）を内因性に発現する。このプロセシングの間、ｓｃＦｃリンカーは、外因性のアミノ酸の存在を減少するために実質的に除去され得る。本発明の別の実施形態では、宿主細胞を形質転換して、細胞に対して外因性である１つ以上の酵素を発現し、その結果ｓｃＦｃリンカーのプロセシングが生じるかまたは改善される。
【０２５８】
一実施形態では、細胞によって内因性にまたは外因性に発現され得る酵素は、酵素のフリンファミリーのメンバーである。ヒトフリン（すなわち、ＰＡＣＥ）の完全ｃＤＮＡおよびアミノ酸配列は、１９９０．Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｏｕｗｅｌａｎｄ  Ａ  Ｍら、（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：６６４；Ｅｒｒａｔｕｍ  ｉｎ：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：１３３２（１９９０）に公表されている。
【０２５９】
Ｂａｒｒらに発行された米国特許第５，４６０，９５０号は、組み換えＰＡＣＥおよびＰＡＣＥと異種タンパク質の基質前駆体ポリペプチドとの同時発現（活性な成熟異種タンパク質の発現を改善する）を記載する。
【０２６０】
ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｅｎら、に発行された米国特許第５，９３５，８１５号は同様に、組み換えヒトフリン（すなわち、ＰＡＣＥ）およびフリンと異種タンパク質の基質前駆体ポリペプチドとの同時発現（活性な成熟異種タンパク質の発現を改善する）を記載する。この特許で開示される、潜在的な基質前駆体としては、第ＩＸ因子の前駆体が挙げられる。ＰＡＣＥに加えて、哺乳動物フリン／サブチリシン／Ｋｅｘ２ｐ様プロタンパク質転換酵素（ＰＣ）ファミリーの他のメンバーは、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＣ５／６（本明細書において以降では単にＰＣ５と呼ぶ）、ＰＡＣＥ４、およびＬＰＣ／ＰＣ７／ＰＣ８／ＳＰＣ７を包含すると報告されている。これらの種々のメンバーは、特定の保存された全体的な構造特徴を共有するが、それらは、組織分布、細胞内の局在、切断特性、および好ましい基質が異なる。概説については、Ｎａｋａｙａｍａ  Ｋ（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３２７：６２５−３５を参照のこと。ＰＡＣＥと同様に、これらのプロタンパク質転換酵素は一般には、アミノ末端から開始して、シグナルペプチド、プロペプチド（自己触媒的に切断され得る）、サブチリシン様触媒ドメイン（Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、およびＡｓｎ／Ａｓｐ残基によって特徴付けられる）、およびＨｏｍｏＢドメイン（これも本質的に触媒活性に必須であり、かつＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列によって特徴づけられる）を含む。ＰＡＣＥ、ＰＡＣＥ４、およびＰＣ５はまた、Ｃｙｓリッチなドメイン（機能は未知である）を含む。さらに、ＰＣ５は、膜貫通ドメインの有無のアイソフォームを有し；これらの異なるアイソフォームは、それぞれＰＣ５ＢおよびＰＣ５Ａとして公知である。ＰＡＣＥの触媒性ドメインのアミノ酸配列とこのプロタンパク質転換酵素のファミリーの他のメンバーの触媒性ドメインのアミノ酸配列との間の比較によって以下の同一性程度が明らかになる：ＰＣ４について７０パーセント；ＰＡＣＥ４およびＰＣ５について６５パーセント；ＰＣ１／ＰＣ３について６１パーセント；ＰＣ２について５４パーセント；およびＬＰＣ／ＰＣ７／ＰＣ８／ＳＰＣ７について５１パーセント。Ｎａｋａｙａｍａ  Ｋ（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３２７：６２５−３５。
【０２６１】
ＰＡＣＥおよびＰＡＣＥ４は、部分的に重複するが別個の基質を有することが報告された。具体的には、ＰＡＣＥ４は、ＰＡＣＥとは著しく対照的に、ＦＩＸの前駆体ポリペプチドを処理できないことが報告された。Ｗａｓｌｅｙ  Ｌ  Ｃら、（１９９３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６８：８４５８〜６５；Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａ  Ａら、（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３２：１１５８６−９０。
【０２６２】
Ｓｅｉｄａｈらに発行された米国特許第５，８４０，５２９号は、ヒトＰＣ７のヌクレオチドおよびアミノ酸配列、ならびに他のＰＣファミリーメンバーと比較してＰＣ７がＨＩＶ  ｇｐ１６０をｇｐ１２０およびｇｐ４１に切断する顕著な能力を開示する。
【０２６３】
げっ歯類ＰＣ５のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、最初、Ｌｕｓｓｏｎ  Ｊら、（１９９３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：６６９１−５によってＰＣ５として、およびＮａｋａｇａｗａ  Ｔら、（１９９３）Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１１３：１３２−５によってＰＣ６として記載された。Ｄａｙらに発行された米国特許第６，３８０，１７１号は、膜貫通ドメインのないアイソフォームであるヒトＰＣ５Ａのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を開示する。これらの酵素の配列およびそのクローニング方法は当該分野で公知である。
【０２６４】
本発明のポリペプチドをコードする遺伝子はまた、細菌または酵母または植物の細胞などの非哺乳動物細胞中で発現され得る。この関連では、細菌のような種々の単細胞の非哺乳動物微生物がまた形質転換され得ることも理解される；すなわち、それらは、培養物またはファファーメンテーション中で増殖可能である。形質転換し易い細菌としては、腸内細菌科のメンバー、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）またはサルモネラ属の株；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのようなバシラス科；肺炎球菌；連鎖球菌、およびインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）が挙げられる。細菌において発現される場合、ポリペプチドは、通常、封入体の一部となることがさらに認識される。このポリペプチドは、単離、精製され、その後に、機能分子に組み立てられなければならない。
【０２６５】
原核生物に加えて、真核生物微生物もまた用いられてもよい。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、または一般的なパン酵母は真核生物微生物の中でも最も一般的に用いられるが、多数の他の株が共通して利用可能である。
サッカロミセス属での発現のためには、プラスミドＹＲｐ７が、例えば、（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ，７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら、Ｇｅｎｅ，１０：１５７（１９８０））共通して用いられる。このプラスミドは既に、トリプトファン中で増殖する能力を欠いている酵母の変異体株の選択マーカーを提供するＴＲＰ１遺伝子、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７））を含む。次いで、酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてｔｒｐ１損傷の存在によって、トリプトファンの非存在下での増殖によって形質転換を検出するための有効な環境が得られる。
Ｐｉｃｈｉａのような他の酵母宿主もまた使用されてもよい。酵母発現ベクターは、発現制御配列（例えば、プロモーター）、複製起点、終止配列などを必要に応じて有する。典型的なプロモーターとしては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼおよび他の糖分解酵素が挙げられる。誘導性の酵母プロモーターとしては、とりわけ、アルコール脱水素酵素、イソチトクロムＣ、ならびにメタノール、マルトースおよびガラクトース利用を担う酵素が挙げられる。
【０２６６】
あるいは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、トランスジェニック動物のゲノムへの導入およびトランスジェニック動物の乳中へのその後の発現のために導入遺伝子に組み込まれ得る（例えば、Ｄｅｂｏｅｒら、米国特許第５，７４１，９５７号、Ｒｏｓｅｎ，米国特許第５，３０４，４８９号、およびＭｅａｄｅら、米国特許第５，８４９，９９２号を参照のこと）。適切な導入遺伝子としては、カゼイン、またはβラクトグロブリンのような乳腺特異的遺伝子由来のプロモーターおよびエンハンサーと作動可能に連結しているポリペプチドのコード配列が挙げられる。
【０２６７】
インビトロの産生によって、大量の所望のポリペプチドを得るための大規模化が可能になる。組織培養条件下での哺乳動物細胞培養のための技術は、当該分野で公知であり、かつ同種の懸濁培養物を、例えば、エアリフトリアクター中に、もしくは連続スターラーリアクター中に、または固定されるかもしくは取り込まれた細胞培養物を、例えば、中空ファイバー、マイクロカプセル中に、アガロースマイクロビーズもしくはセラミックカートリッジ上に包含する。必要および／または所望の場合、ポリペプチドの溶液は、慣習的なクロマトグラフィー方法、例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロースまたは（イムノ−）アフィニティークロマトグラフィー上でのクロマトグラフィーによって、例えば、合成のヒンジ領域ポリペプチドの優先的な生合成後、または本明細書に記載されるＨＩＣクロマトグラフィーの前にもしくは後に精製されてもよい。アフィニティータグ配列（例えば、Ｈｉｓ（６）タグ）は必要に応じて、下流の精製を容易にするためにポリペプチド配列に結合されてもまたはその中に含まれてもよい。
【０２６８】
一実施形態では、本発明の宿主細胞は、ｓｃＦｃリンカー足場を含むポリペプチドをコードする遺伝子構築物、およびｃｓｃＦｃリンカーをプロセシングし得る１つ以上の酵素を含む。この構築物および酵素（単数または複数）は、単一のベクターまたは２つのベクターを用いて発現され得る。
【０２６９】
一実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子に関与する。一実施形態では、この核酸分子は、ＦＶＩＩ、ＦＩＸおよびＦＸからなる群より選択されるキメラの凝固因子をコードし、この凝固因子は、血小板に結合する標的部分と、必要に応じて凝固因子と標的部分との間のスペーサー部分とを含む。別の実施形態では、本発明は、ＦＶＩＩを含む、ポリペプチドをコードする核酸分子に関与し、このＦＶＩＩは、凝固カスケードの成分によって活性化可能な異種の酵素的切断部位を含む。
【０２７０】
一旦発現されれば、このキメラの凝固因子は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ精製、ゲル電気泳動などを含む、当該分野の標準的手順に従って精製されてもよく（一般にハイブリダイズ、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，（１９８２）を参照のこと）、本発明の実施例で用いられる方法を特に参照のこと。薬学的用途に対しては、少なくとも約９０〜９５％という均質性の実質上純粋なタンパク質が好ましく、そして９８〜９９％またはそれ以上の均質性が、最も好ましい。
【０２７１】
ＩＸ．本発明のポリペプチドを投与する方法
別の実施形態では、本発明は、本発明の増強された凝固因子の治療上有効な量を投与することを包含する、止血障害を有する被験体を処置する方法に関する。
【０２７２】
被験体に対する投与のための組成物は、本発明のキメラの凝固因子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子（遺伝子治療の適用のため）およびポリペプチド分子を含む。
【０２７３】
一実施形態では、本発明の増強された凝固因子組成物は、止血を促進する少なくとも１つの他の薬剤と組み合わせて投与される。止血を促進するこのような他の剤は、凝固活性を示す治療剤である。例であって、限定するものではないが、止血剤としては、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロトロンビンもしくはフィブリノーゲン、または任意の前述の活性化型を挙げることができる。止血剤の凝固因子はまた、抗線維素溶解薬、例えば、ε−アミノ−カプロン酸、トラネキサム酸を含んでもよい。
【０２７４】
本発明の一実施形態では、組成物（例えば、ポリペプチドまたはそのポリペプチドをコードする核酸分子）とは、被験体に投与された場合、凝固因子が活性型で存在する組成物である。このような活性分子は細胞によって活性型で発現されてもよいし、または被験体に対する投与の前にインビトロで活性化されてもよい。別の実施形態では、この組成物は、凝固因子が活性化可能な形態で存在し、かつ凝固因子が被験体への投与後に凝固の部位においてインビボで活性化される、組成物である。
【０２７５】
本発明のキメラの凝固因子は、静脈内に、皮下に、筋肉内にまたは、任意の粘膜表面を介して、例えば、経口的に、舌下に、口腔内に、舌下に、経鼻的に、直腸内に、膣内にまたは肺経路を介して投与され得る。キメラのタンパク質は、キメラのタンパク質の所望の部位への緩徐な放出を可能にするバイオポリマー固体支持体内に移植されるか、またはそれに連結され得る。
【０２７６】
経口投与のために、薬学的組成物は、従来の手段によって調製される錠剤またはカプセルの形態をとってもよい。この組成物はまた、液体、例えば、シロップまたは懸濁液として調製されてもよい。この液体は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用油脂）、乳化剤（レシチンまたはアカシア）、非水性ビヒクル（例えば、アーモンドオイル、油性エステル類、エチルアルコールまたは分画植物油）、および防腐剤（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾアートまたはソルビン酸）を含んでもよい。この調製物はまた、香味剤、着色剤および甘味剤を含んでもよい。あるいは、この組成物は、水または別の適切なビヒクルでの構成のための乾燥製品として調製されてもよい。
【０２７７】
口腔内および舌下投与のためには、この組成物は、従来のプロトコールによる錠剤、トローチ剤、または急速溶解フィルムの形態をとってもよい。
【０２７８】
吸入による投与のために、本発明による使用のための化合物は、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾル噴霧の形態で（例えば、ＰＢＳ中で）、適切な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素または他の適切なガスとともに都合よく送達される。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、一定量を送達するためのバルブを設けることによって決定され得る。例えば、インヘイラーまたは吸入器での使用のためのゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、ラクトースまたはデンプンのような化合物および適切な粉末基剤の粉末混合物を含んで処方され得る。
【０２７９】
一実施形態では、本発明のポリペプチドの投与経路は、非経口である。非経口という用語は本明細書において用いる場合、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸または膣の投与を包含する。静脈内型の非経口投与が好ましい。これらの投与形態の全てが明確に本発明の範囲内であるとみなされるが、投与の形態は、注射用の溶液、特に静脈内または動脈内の注射または点滴である。通常、注射用の適切な薬学的組成物は、緩衝液（例えば、酢酸塩、リン酸塩またはクエン酸塩の緩衝液）、サーファクタント（例えば、ポリソルベート）、必要に応じて安定化剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含んでもよい。しかし、本明細書の教示と適合する他の方法では、このポリペプチドは、有害な細胞集団の部位に直接送達されて、それによって、治療剤に対する疾患の組織の暴露を増大し得る。
【０２８０】
非経口投与のための調製物としては、無菌の水溶液または非水性溶液、懸濁液およびエマルジョンが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えば、オリーブ油、および注射用有機エステル、例えば、オレイン酸エチルである。水性の担体としては、水、アルコール溶液／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液、例としては、生理食塩水および緩衝化媒体が挙げられる。本発明では、薬学的に許容される担体としては、限定するものではないが、０．０１〜０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝液、または０．８％の生理食塩水が挙げられる。他の共通の非経口ビヒクルとしては、リン酸ナトリウム溶液、リンガーのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、液体および栄養補充因子、電解質補充因子、例えば、リンゲルデキストロースに基づくもの、などが挙げられる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスなどのような防腐剤および他の添加物もまた存在してもよい。
【０２８１】
さらに詳細には、注射用途に適した薬学的組成物としては、滅菌注射用溶液または懸濁液の即時的な調製のための、滅菌水溶液（ここでは水溶性）または分散剤および無菌粉末が挙げられる。このような場合、この組成物は、滅菌しなければならず、かつ容易にシリンジから出る程度まで液体でなければならない。これは製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、好ましくは、細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保存される。この担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、など）およびその安定な混合物を含んでいる、溶媒または分散媒体であってもよい。この適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散の場合には必要な粒子サイズの維持によって、およびサーファクタントの使用によって維持され得る。
【０２８２】
微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを組成物中に含ませるのが望ましい。注射可能組成物の長期にわたる吸収は、組成物中に吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含有させることによってもたらされ得る。
【０２８３】
任意の場合に、滅菌注射溶液は、本明細書に挙げた成分の１つ以上の組み合わせと共に適切な溶媒中に必要な量の活性化合物（例えば、ポリペプチドをそれ自体で、または他の活性剤と組み合わせて）組み込み、必要に応じて、その後に濾過殺菌することによって調製してもよい。一般には、分散は、活性化合物を滅菌ビヒクル中（塩基性分散媒体および上記で列挙されたものから必要な他の成分を含む）に組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製用のための滅菌粉末の場合には、好適な調製方法は真空乾燥および凍結乾燥法であり、これは活性成分に加え、その事前に滅菌濾過された溶液中に任意の付加的な所望成分の粉末を生じる。注射用の調製物は、処理され、アンプル、バッグ、ボトル、シリンジまたはバイアルのような容器中に充填され、当該分野で公知の方法による無菌状態のもとで密閉される。さらにこの調製物は、充填されて、キットの形態で販売されてもよい。このような製品は好ましくは、関連の組成物が凝固障害に罹患しているか、またはその素因がある被験体を処置するために有用であることを示している、ラベルまたは添付文書を有する。
【０２８４】
薬学的組成物はまた、例えば、ココアバターまたは他のグリセリド類などの従来の坐剤の基剤を含む、坐剤または停留浣腸として直腸投与用に処方されてもよい。
【０２８５】
状態の処置のための、本発明の組成物の有効量は、多くの異なる要因、例としては投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトか動物か、他の併用薬、および処置が予防的か治療的かに依存して変化する。通常は、患者は、ヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物も処置され得る。処置投薬量は、安全性および有効性を最適化するために当業者に公知の慣用的方法を用いて滴定されてもよい。
【０２８６】
一実施形態では、生物学的に活性な部分（例えば、ＦＩＸを含む）の用量は、約２５〜１００ＩＵ／ｋｇ、例えば、０．４１７ｍｇ／ｋｇ〜１．６７ｍｇ／ｋｇにおよんでもよい。別の実施形態では、生物学的に活性な部分（例えば、ＦＶＩＩＩを含む）の用量は、約２５〜６５ＩＵ／ｋｇ、例えば、０．００３１２５ｍｇ／ｋｇ〜０．００８１２５ｍｇ／ｋｇにおよんでもよい。別の実施形態では、生物学的に活性な部分の用量（例えば、ＦＶＩＩを含んでいる）は、約９０〜２７０ｕｇ／ｋｇまたは０．０９０〜０．２７０ｍｇ／ｋｇにおよんでもよい。
【０２８７】
投薬量は、１０００ｕｇ／ｋｇ〜０．１ｎｇ／ｋｇ体重におよんでもよい。一実施形態では、投薬範囲は、１ｕｇ／ｋｇ〜１００ｕｇ／ｋｇである。このタンパク質は、連続して投与されても、または特定の時間間隔で投与されてもよい。インビトロアッセイを使用して、最適の投与量範囲および／または投与スケジュールを決定してもよい。凝固因子活性を測定するインビトロアッセイは、当該分野で公知、例えば、ＳＴＡ−ＣＬＯＴ  ＶＩＩａ−ｒＴＦ凝固アッセイである。さらに、有効用量は、動物モデル、例えば、血友病イヌ（Ｍｏｕｎｔら、２００２，Ｂｌｏｏｄ  ９９（８）：２６７０）から得られる用量応答曲線から外挿され得る。
【０２８８】
上記の範囲の用量の中間もまた、本発明の範囲内であるものとする。被験体は、その用量を毎日、一日おきに、毎週、または経験的な分析によって決定される任意の他のスケジュールによって投与されてもよい。例示的な処置は、例えば、少なくとも６か月という長期間にわたって複数用量の投与を必要とする。いくつかの方法では、２つ以上のポリペプチドを同時に投与してもよく、その場合、投与される各々のポリペプチドの投薬量は、示した範囲内におさまる。
【０２８９】
本発明のポリペプチドは、複数回投与されてもよい。単回投薬の間の間隔は、毎日であっても、毎週であっても、毎月であってもまたは毎年であってもよい。間隔はまた、患者の改変されたポリペプチドまたは抗原の血液レベルを測定することによって示されるとおり不規則であってもよい。あるいは、ポリペプチドは、必要な投与頻度が少なくてもよい、徐放性処方物として投与されてもよい。投薬量および頻度は、患者におけるこのポリペプチドの半減期に応じて変化する。
【０２９０】
投与の用量および頻度は、処置が予防的であるかまたは治療的であるかに応じて変化し得る。予防的な適用では、本発明のポリペプチドまたはそのカクテルを含んでいる組成物を、まだ疾患状態ではない患者に投与して、患者の耐性を向上するか、または疾患の影響を最小限にする。このような量は、「予防上有効な用量」であると定義される。比較的低用量を、長期間にわたって比較的低頻度の間隔で投与する。数例の患者は、死ぬまで処置を受け続ける。
【０２９１】
本発明のポリペプチドは必要に応じて、処置（例えば、予防的または治療的）の必要な障害または状態を処置するのに有効な他の剤と組み合わせて投与されてもよい。
【０２９２】
本明細書において用いる場合、補助療法と組み合わせるかまたは併用した本発明のポリペプチドの投与は、治療および開示されたポリペプチドの連続的、同時、同延、同時発生、併用または同時期の投与または適用を意味する。当業者は、併用療法の投与計画の種々の成分の投与または適用が、処置の全体的な有効性を増強するために調節され得ることを理解する。当業者（例えば、医師）は、選択された補助療法および本明細書の教示に基づいて過度の実験しに、有効な併用療法の投与計画を容易に判別できる。
【０２９３】
本発明のポリペプチドが、薬剤（例えば、併用療法の投与計画を提供するため）と組み合わせて、または併用して用いられ得ることがさらに理解される。本発明のポリペプチドが組み合され得る例示的な剤としては、処置されている特定の障害について現在の標準的な治療に相当する剤が挙げられる。このような剤は、事実上、化学的であっても、生物学的であってもよい。「生物学的」または「生物製剤」という用語は、治療剤としても使用を意図する、生きている生物体および／またはそれらの産物から作製された任意の薬学的に活性な剤を指す。
【０２９４】
本発明のポリペプチドと組み合わせて用いられるべき剤の量は、被験体によって変化してもよいし、または当該分野で公知であるものに応じて投与されてもよい。例えば、Ｂｒｕｃｅ  Ａ  Ｃｈａｂｎｅｒら、Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ，ｉｎ  Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  １２３３−１２８７（（Ｊｏｅｌ  Ｇ．Ｈａｒｄｍａｎ  ら、第９版．１９９６）を参照のこと。別の実施形態では、標準的な治療と一致するこのような剤の量が投与される。
【０２９５】
前に考察したとおり、本発明のポリペプチドは、凝固障害のインビボ処置のために薬学的に有効な量で投与されてもよい。この点において、本発明のポリペプチドは、活性剤の投与を容易にし、安定性を促進するように処方され得ることが理解される。好ましくは、本発明による薬学的組成物は、生理食塩水、非毒性の緩衝液、防腐剤などのような薬学的に許容される、非毒性の、無菌の担体を含む。当然ながら、本発明の薬学的組成物は、このポリペプチドの薬学的に有効な量を提供するために、単一用量で投与されても、または複数用量で投与されてもよい。
【０２９６】
一実施形態では、本発明のキメラの凝固因子は、核酸分子として投与され得る。核酸分子は、当該分野で公知の技術を用いて投与され得、この技術としては、ベクター、プラスミド、リポソーム、ＤＮＡ注入、エレクトロポレーション、遺伝子銃、静脈内注射または肝動脈注入が挙げられる。遺伝子治療の実施形態における使用のためのベクターは当該分野で公知である。
【０２９７】
本開示の範囲と一致して、本発明のキメラの凝固因子は、治療効果または予防効果を生じるのに十分な量で処置の前述の方法に従って、ヒトまたは他の動物に投与され得る。
【０２９８】
本発明のキメラのタンパク質は、当業者に理解されるとおり、ある疾患または状態を有する被験体を処置する方法を含むがこれには限定されない、多くの用途を有する。この疾患または状態としては、限定するものではないが、止血の障害が挙げられる。
【０２９９】
一実施形態では、本発明は、本発明の少なくとも１つのキメラの凝固因子の治療上有効な量を投与することを包含する、止血障害を有する被験体の処置方法に関する。
【０３００】
本発明のキメラの凝固因子は、フィブリン塊の形成を促進することによって、止血障害を処置または予防する。本発明のキメラの凝固因子は、凝血カスケードの任意のメンバーを活性化し得る。凝固因子は、外因経路、内因経路、またはその両方に関与し得る。
【０３０１】
本発明のキメラの凝固因子は、止血障害、例えば、キメラの凝固因子に存在する特定の凝固因子で処置可能であることが公知の障害を処置するために用いられ得る。本発明のキメラのタンパク質の投与によって処置され得る止血障害としては、限定するものではないが、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォン・ヴィレブラント病、第ＸＩ因子欠損（ＰＴＡ欠損）、第ＸＩＩ因子欠損、同様にフィブリノーゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子、または第ＸＩＩＩ因子の欠損または構造異常が挙げられる。
【０３０２】
一実施形態では、止血障害は、遺伝性の障害である。一実施形態では、被験体は、血友病Ａを有し、キメラのタンパク質は、第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩＩａ因子を含む。別の実施形態では、被験体は、血友病Ａを有し、キメラの凝固因子は、第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子を含む。別の実施形態では、被験体は、血友病Ｂを有し、キメラの凝固因子は、第ＩＸ因子または第ＩＸａ因子を含む。別の実施形態では、被験体は、血友病Ｂを有し、キメラのタンパク質は第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子を含む。別の実施形態では、被験体は、第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩＩａ因子に対する阻害性抗体を有し、キメラの凝固因子は、第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子を含む。さらに別の実施形態では、被験体は、第ＩＸ因子または第ＩＸａ因子に対する阻害性抗体を有し、キメラのタンパク質は、第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子を含む。
【０３０３】
本発明のキメラの凝固因子は、止血障害を有する被験体を予防的に処置するために用いられ得る。本発明のキメラの凝固因子は、止血障害を有する被験体において急性の出血エピソードを処置するために用いられ得る。
【０３０４】
一実施形態では、止血障害は、凝固因子、例えば、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子の欠損の結果である。別の実施形態では、止血障害は、不完全な凝固因子の結果であり得る。
【０３０５】
別の実施形態では、止血障害は、後天性の障害であり得る。後天性の障害は、背景にある二次疾患または状態から生じ得る。無関係の状態は、例えば、限定するものではないが、癌、自己免疫疾患、または妊娠であってもよい。後天性の障害は、高齢から、または背景にある二次障害を処置するための薬物療法（例えば、癌化学療法）から生じ得る。
【０３０６】
本発明はまた、止血障害、または止血障害を生じる二次的な疾患もしくは障害を有さない被験体を処置する方法に関する。従って、本発明は、本発明の少なくとも１つのキメラ凝固因子の治療上有効な量を投与することを包含する、一般的な止血剤の必要な被験体を処置する方法に関する。例えば、一実施形態では、一般的な止血剤の必要な被験体は、手術を受けているか、または手術に臨んでいる。本発明のキメラの凝固因子は、術前または術後に予防剤として投与されてもよい。本発明のキメラの凝固因子は、急性の出血エピソードを管理するために術中または術後に投与され得る。手術としては、限定するものではないが、肝移植、肝切除または幹細胞移植を挙げることができる。
【０３０７】
別の実施形態では、本発明のキメラの凝固因子を用いて、止血障害を受けていない急性の出血エピソードを有する被験体を処置してもよい。急性の出血エピソードは、重度の外傷、例えば、手術、自動車事故、創傷、銃による裂創、または制御されない出血を生じる任意の他の外傷性事象から生じ得る。
【０３０８】
本発明はさらに、以下の実施例で例示されるが、これは限定と解釈されるべきではない。本出願全体にわたって引用される全ての引用文献、特許および公開特許出願の内容は、参照によって本明細書に援用される。
【実施例】
【０３０９】
本実施例を通じて、別段言及しない限り、以下の材料および方法を用いた。
【０３１０】
一般的な材料および方法
一般には、本発明の実施は、別段示さない限り、化学、生物物理学、分子生物学、組み換えＤＮＡ技術、免疫学（特に、例えば、抗体技術）の従来の技術、および電気泳動の標準的な技術を使用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、５１０，Ｐａｕｌ，Ｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ＡｐｐｒｏａｃｈＳｅｒｉｅｓ，１６９）、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，編集，Ｉｒｌ  Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗら、ＣＳ．Ｈ．Ｌ．Ｐｒｅｓｓ，Ｐｕｂ．（１９９９）；ならびにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，編集Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９２）を参照のこと。
（実施例１）
【０３１１】
第二のＦｃ鎖のアミノ末端でＦＶＩＩ−ＦｃおよびＭＢ９−Ｆｃを含んでいるヘテロ二量体構築物。
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０２７のクローニング
ＦＶＩＩ−０２７構築物は、細胞中の製造の間にプロセシングされるとき、切断のためのｃｓｃＦｃを含む。この構築物は、標的部分、ｓｃＦｖ部分（ＧＰＩＩｂＩＩＩａに結合する）、ＭＢ９を含む。
【０３１２】
プラスミド（ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０２７）を、ＦＶＩＩ−ＦｃおよびＭＢ９−Ｆｃヘテロ二量体発現のために生成し、ここでＭＢ９は、活性化された血小板上のレセプターＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに結合することが以前に示されたｓｃＦｖである。ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０２７由来のタンパク質は、細胞中で単一のポリペプチドとして発現され、ここでＦＶＩＩ−ＦｃサブユニットのＣ末端は、（ＧＧＧＧＳ）６ｘポリペプチドリンカーによってＭＢ９−ＦｃサブユニットのＮ末端に連結される。さらに、ＲＲＲＲＳおよびＲＫＲＲＫＲ配列を、各々の配列での最後のＡｒｇ後のプロタンパク質転換酵素による細胞内切断のために、それぞれ、ポリペプチドリンカーの５’末端および３’末端に挿入した。引き続き、細胞は、２つの鎖ＦＶＩＩ−Ｆｃ／ＭＢ９−Ｆｃヘテロ二量体を発現し、ここでＦＶＩＩ−Ｆｃ鎖は、ＲＲＲＲＳ配列をＣ末端で有するが、このリンカーの残りおよびＲＫＲＲＫＲ配列は、そうでなければ除去された。
【０３１３】
第一の工程として、一連の中間体プラスミドを以下のプライマーを用いて生成した：
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ−ＢｐｓＥＩ−Ｆｃ−Ｆ
ＡＧＴＣＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣＴＣＣＧＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＣＧＧＡＣＣ
ＢａｍＨＩ−リンカー−Ｆｃ−Ｒ
ＣＡＴＣＧＧＡＴＣＣＣＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＡＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＣＣＴＧＡＴＣＣＡＣＣＣＣＣＡＣＣＴＧＡＴＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧＧ
ＢｃｌＩ−Ｆｃ−Ｆ
ＣＡＧＴＣＴＴＧＡＴＣＡＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣ
ｓｃＦｃ−ＥｃｏＲＩ−Ｒ
ＡＣＴＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧ
ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｋｏｚａｋ−ＦＶＩＩ−Ｆ：
ＣＧＡＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＣＴＣＣＣＡＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧ
ＦＶＩＩ−ＨＣ−ＢｓｐＥＩ−Ｒ：
ＡＧＧＡＧＴＴＣＣＧＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＣＧＧＴＧＧＧＣＡＴＧＴＧＴＧＡＧＴＴＴＴＧＴＣＧＧＡＴＣＣＣＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＡＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＣＣＴＧＡＴＣＣＡＣＣＣＣＣＡＣＣＴＧＡＴＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＡＣＣＣＡＣＣＴＣＣＧＣＣＧＧＡＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＧＡＡＡＴＧＧＧＧＣＴＣＧＣＡＧＧＡＧＧ
５０ｕｌのＰＣＲ反応を、以下のサイクルを用いて、２５ｐｍｏｌのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ−ＢｐＥＩ−Ｆｃ−ＦおよびＢａｍＨＩ−リンカー−Ｆｃ−ＲおよびテンプレートｐＳＹＮ−Ｆｃ−００１で行った：９５℃２分間；３０サイクルの（９５℃３０秒間、５４℃３０秒間、７２℃１分間）。予想される大きさのバンド（約７００ｂｐ）を、Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．）を用いてゲル精製して、ｐＢＵＤＣＥ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）のＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ制限部位にクローニングして中間体ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−００７を生成した。プライマーＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ−ＢｐＥＩ−Ｆｃ−ＦおよびＢａｍＨＩ−リンカー−Ｆｃ−Ｒは、アミノ酸２２１（ＥＵナンバリング）で開始するＦｃ領域を増幅して、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩ制限酵素部位を、Ｆｃ領域部位のすぐ上流に付加し、同様に、（ＧＧＧＧＳ）４ｘリンカーをコードするＤＮＡフラグメント、続いてＢａｍＨＩ部位をＦｃコード領域のすぐ下流に付加した。次に、５０ｕｌの反応を、２５ｐｍｏｌのＢｃｌＩ−Ｆｃ−ＦおよびｓｃＦｃ−ＥｃｏＲＩ−Ｒ、およびテンプレートｐＳＹＮ−Ｆｃ−０１１を用い、上記と同じサイクルを用いて行った。予想される大きさのバンド（約７００ｂｐ）を上記のようにゲル精製して、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−００７のＢｃｌＩ／ＥｃｏＲＩ制限部位にクローニングして中間体プラスミドｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−００８を生成した。プライマー対ＢｃｌＩ−Ｆｃ−ＦおよびｓｃＦｃ−ＥｃｏＲＩ−Ｒは、Ｆｃ領域を増幅したが、一方で、ＢｃｌＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を、それぞれＦｃコード領域のすぐ上流および下流に付加した。最後の中間体プラスミドを生成するために、５０ｕｌのＰＣＲ反応を、２５ｐｍｏｌのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｋｏｚａｋ−ＦＶＩＩ−ＦおよびＦＶＩＩ−ＨＣ−ＢｓｐＥＩ−ＲおよびテンプレートｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−００１を用い、以下のサイクルを用いて行った：９５℃２分間；３０サイクルの（９５℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃９０秒間）。このプライマー対は、ＦＶＩＩコード領域を増幅するが一方で、（ＧＧＧＧＳ）６ｘポリペプチドリンカーをコードする分子の３’末端でＤＮＡフラグメントを、続いてアミノ酸２２１（ＥＵナンバリング）をコードするＦｃ領域のフラグメントを付加した。プライマーＨｉｎｄＩＩＩ−Ｋｏｚａｋ−ＦＶＩＩ−Ｆは、この分子の５’末端でＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を、続いて、ＦＶＩＩコード領域のすぐ上流でＫｏｚａｋ配列を生成する。このＦＶＩＩ−ＨＣ−ＢｓｐＥＩ−Ｒプライマーは、ポリペプチドリンカーをコードするＤＮＡおよびＦｃ部分を導入する。予想される大きさのバンド（約１５００ｂｐ）を上記のようにゲル精製して、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−００８のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓｐＥＩ部位にクローニングしてｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０１１を生成した。
【０３１４】
次に、２つのＤＮＡフラグメントを合成した：Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ−ＦＶＩＩ−０２７−１およびＧｅｎｓｃｒｉｐｔ−ＦＶＩＩ−０２６−２。Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ−ＦＶＩＩ−０２７−１は、Ｆｃ領域の一部をコードするＤＮＡフラグメント（ヌクレオチド１３０６で開始する（ＥＵナンバリング））、続いて配列ＲＲＲＲＳ−（ＧＧＧＧＳ）６ｘ−ＲＫＲＲＫＲ、続いてＭＢ９  ｓｃＦｖの一部（残基１−１４２）からなる。ＥｃｏＲＩ部位を、遺伝子コードの縮重性を用いてＭＢ９のコード配列に導入して、適切なアミノ酸配列を保存して、Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ−ＦＶＩＩ−０２７−１の最後の６塩基を重複させる。さらに、５’の最初の塩基は、Ｆｃ領域中に見出されるＳｐａＩ部位を含む。Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ−ＦＶＩＩ−０２６−２は、ＭＢ９（残基１４３−２７３）の一部をコードするＤＮＡフラグメント、続いて（ＧＧＧＧＳ）６ｘポリペプチドリンカー、続いてＦｃ領域およびＥｃｏＲＩ部位からなる。ＥｃｏＲＩ部位を、遺伝子コードの縮重性を用いてＭＢ９のコード配列に導入して、適切なアミノ酸配列を保存して、Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ−ＦＶＩＩ−０２６−２の最後の６塩基を重複させる。
【０３１５】
Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ−ＦＶＩＩ−０２７−１を、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０１１のＳａｐＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローニングして、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０３６を生成した。次に、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ−ＦＶＩＩ−０２６−２を、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０３６のＥｃｏＲＩ部位にクローニングして、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０２７を生成した。最後のクローニング部位の正確な方向は、制限酵素分析およびＤＮＡ配列決定によって確認した。
（実施例２）
【０３１６】
第二のＦｃ鎖のカルボキシ末端でＦＶＩＩ−ＦｃおよびＭＢ９−Ｆｃを含んでいるヘテロ二量体構築物、ＭＢ９。
ＦＶＩＩ−０３７のクローニング
ＦＶＩＩ−０３７構築物は、プロセシングの間に切断されないｓｃＦｃ足場を用いて作製される。この構築物では、標的部分、やはりＭＢ９  ｓｃＦｖ（ＧＰＩＩｂＩＩＩａに結合する）は、第二のＦｃ部分のＣ末端に結合される。
【０３１７】
ＤＮＡフラグメントＧｅｎｓｃｒｉｐｔ−ＦＶＩＩ−０３７の合成は、外注した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）。このフラグメントは、Ｆｃ領域の一部（残基４３４〜４４７、ＥＵナンバリング）続いて（ＧＧＧＧＳ）４ｘポリペプチドリンカーおよびＭＢ９  ｓｃＦｖを含む。Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ−ＦＶＩＩ−０３７のＳａｐＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０１１（Ｐ０８３０と呼ぶ）のＳａｐＩ／ＥｃｏＲＩにサブクローニングして、中間構築物を生成した。ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０１１由来のＳａｐＩフラグメントを、この中間構築物のＳａｐＩ部位にサブクローニングして、ｐＳＹＮＦＶＩＩ−０３７を生成した。
（実施例３）
【０３１８】
第二のＦｃ鎖のカルボキシ末端でＦＶＩＩ−ＦｃおよびＧＰＩｂに対するペプチドを含んでいるヘテロ二量体構築物
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０４１中間体構築物のクローニング。
この構築物を作製するために、ＦＶＩＩ−０４１構築物を最初は、ある中間体として作製した。ＤＮＡ分子Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ−ＦＶＩＩ−０４１の合成は、外注した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）。このフラグメントを、ＳａｐＩで消化して、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０１１のＳａｐＩ部位にクローニングして、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０４１を生成した。このプロセスによって、第二のＦｃ中にＳａｌＩ部位（残基４１２−４１３  ＥＵナンバリング，ＧＴＧ  ＧＡＣ〜ＧＴＣ  ＧＡＣ）を導入する。
【０３１９】
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０４４−、−０４５および−０４６のクローニング。
ＦＶＩＩ−０４１構築物を、出発材料として用いて、ＧＰＩｂに結合するペプチドである標的部分を含むいくつかの構築物を生成した。ＰＳ４ペプチドは−０４４構築物中で、ＯＳ１ペプチドは、−０４５構築物中で、ＯＳ２ペプチドは、−０４６構築物中で用いる。これらの構築物中では、ｓｃＦｃ足場を用いて、そのペプチドを、リンカーを介して第二のＦｃ部分のＣ末端に結合する。
【０３２０】
Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ−ＦＶＩＩ−０４４、−０４５および−０４６の合成は、外注した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）。これらのＤＮＡフラグメントを、ＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩで切断して、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０４１のＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩ部位中にサブクローニングして、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０４４、−０４５および−０４６を生成した。
（実施例４）
【０３２１】
第二のＦｃ鎖のアミノ末端でＦＶＩＩ−ＦｃおよびＧＰＩｂに対するペプチドを含んでいるヘテロ二量体構築物
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０４３中間体のクローニング
この構築物を作製するために、ＦＶＩＩ−０４３構築物を、最初に中間体として作製した。ＤＮＡフラグメントＧｅｎｓｃｒｉｐｔ−ＦＶＩＩ−０４３の合成は、外注した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）。このフラグメントは、Ｆｃ領域の一部をコードするＤＮＡ分子（残基２３２〜４４７、ＥＵナンバリング）続いて（ＧＧＧＧＳ）４ｘポリペプチドリンカーおよび別のＦｃ領域の一部（残基２２１〜２３８、ＥＵナンバリング）を含む。このＤＮＡフラグメントは、ＢｓｐＥＩおよびＲｓｒＩＩで消化して、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０４２のＢｓｐＥＩ／ＲｓｒＩＩ部位中にサブクローニングして、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０５０を生成した。このプロセスは、固有のＳａｌＩ部位（残基４１２−４１３（ＥＵナンバリング）、ＧＴＧ  ＧＡＣ〜ＧＴＣ  ＧＡＣ）を第一のＦｃ中に導入する。ｐＳＹＮＦＶＩＩ−０５０のＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０１１のＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位中にサブクローニングして、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０４３を生成した。
【０３２２】
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０４７、−０４８および−０４９のクローニング。
ＦＶＩＩ−０４３構築物を、出発材料として用いて、ＧＰＩｂに結合するペプチドである標的化部分を含むいくつかの構築物を生成した。ＰＳ４ペプチドを、−０４７構築物中で、ＯＳ１ペプチドを−０４８構築物中で、およびＯＳ２ペプチドを−０４９構築物中で用いる。これらの構築物では、ｓｃＦｃ足場を用いて、ペプチドを、ｓｃＦｃリンカーと第二のＦｃ部分のＮ末端に連結されるリンカーとの間に差し込む。
【０３２３】
ＤＮＡ分子Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ−ＦＶＩＩ−０４７、−０４８および−０４９の合成は、外注した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）。Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ−ＦＶＩＩ−０４７、−０４８および−０４９由来のＳａｌ／ＲｓｒＩＩフラグメントを、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０４３のＳａｌＩ／ＲｓｒＩＩ部位にサブクローニングして、それぞれ、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０４７、−０４８および０４９を生成した。
（実施例５）
【０３２４】
Ｇｌａ欠失のＦＶＩＩ−Ｆｃおよび標的化分子を含んでいるヘテロ二量体構築物
ＦＶＩＩ−０２８中間体のクローニング
この構築物を作製するために、ＦＶＩＩ−０２８構築物を第一の中間体として作製した。ＤＮＡフラグメントＧｅｎｓｃｒｉｐｔ−ＦＶＩＩ−０２８の合成は、外注した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）。このフラグメントは、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩで切断して、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０１１中にサブクローニングして、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０２８を生成した。
【０３２５】
ＦＶＩＩ−０５３のクローニング
ＦＶＩＩ−０２８構築物を、出発材料として用いて、標的部分を含む構築物を生成し、Ｇｌａドメインを欠く凝固因子を使用する。この構築物について、アミノ酸１−３５を、ＦＶＩＩから除去して、ＲＫＲＲＫＲ挿入を、残基Ｒ１５２（ＷＴＦＶＩＩナンバリング）の後ろに添加して、細胞内活性化を容易にした。ＭＢ９  ｓｃＦｖは、標的部分として役立った。
【０３２６】
ＤＮＡ分子Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ−ＦＶＩＩ−０２５は、外注し、この分子由来のＸｂａＩ／ＢｓｉＷＩフラグメントを、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０２８のＸｂａＩ／ＢｓｉＷＩ部位にサブクローニングして、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０５３を生成した。
（実施例６）
【０３２７】
２つの別々のポリペプチドとして第ＶＩＩ因子重鎖および軽鎖を含んでいるヘテロ二量体構築物
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０２４中間体構築物のクローニング
ＦＶＩＩ−０２４構築物は、第ＦＶＩＩの重鎖および軽鎖が単鎖分子で連続しない構築物である。この構築物は、ｃｓｃＦｃリンカーが、トランス−ゴルジ網目状構造におけるプロテアーゼによって切断されるように、ｃｓｃＦｃを使用する。この切断によって、リンカーの除去、およびＦＶＩＩの活性化が生じ、これは活性化されたＦＶＩＩＦｃの発現を生じる。
【０３２８】
ＦＶＩＩのコード配列は、以下のプライマーを用いて、ヒト肝臓ｍＲＮＡライブラリー（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ）からポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写によって得た：
ＦＶＩＩ−Ｆ１
ＧＧＧＡＡＴＧＴＣＡＡＣＡＧＧＣＡＧＧＧ
ＦＶＩＩ−Ｒ１
ＣＴＴＧＧＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＣ
【０３２９】
５０μｌの反応を、製造業者の標準的なプロトコールに従って、ＭＪサーモサイクラー中でＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）を備えるＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲを用いて各々の１０ｐｍｏｌのプライマーで行った。用いたサイクルは、逆転写について５０℃で３０分間、続いて９４℃で２分間の変性および３０サイクルの（９４℃３０秒間、５３℃３０秒間、７２℃９０秒間）続いて、１０分間、７２℃であった。予想される大きさのバンド（約１４００ｂｐ）を、Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．）を用いてゲル精製して、ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）を用いてｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯ中にクローニングして、中間体プラスミドｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−００１を生成した。二本の鎖のＦＶＩＩ−ＦｃおよびＦｃヘテロ二量体の発現のためのプラスミドを構築するために、ＦＶＩＩコード配列を、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｋｏｚａｋ−ＦＶＩＩ−Ｆ
ＣＧＡＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＣＴＣＣＣＡＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧ
ＢｓｐｅＩ−Ｆｃ−ＦＶＩＩ−Ｒ
ＣＧＡＣＴＣＣＧＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＣＧＧＴＧＧＧＣＡＴＧＴＧＴＧＡＧＴＴＴＴＧＴＣＧＧＧＡＡＡＴＧＧＧＧＣＴＣＧＣＡＧＧ
【０３３０】
フォワードプライマーＨｉｎｄＩＩＩ−Ｋｏｚａｋ−ＦＶＩＩ−Ｆは、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位、続いてＫｏｚａｋ配列を、ＦＶＩＩコード領域のすぐ上流に付加する。リバースプライマーＢｓｐｅＩ−Ｆｃ−ＦＶＩＩ−Ｒは、アミノ酸２２１〜２２３（ＥＵナンバリング）を含んでいるＩｇＧ１の定常領域（Ｆｃ領域）のフラグメントを付加する。このプロセスはまた、遺伝子コードの縮重性を用いてアミノ酸２３１〜２３３にＢｓｐＥＩ制限部位を組み込み、正確なアミノ酸配列（ＥＵナンバリング）を保存する。５０ｕｌの反応を、１５ｐｍｏｌの各々のプライマーおよびテンプレートｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−００１を用い、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅシステムを製造業者のプロトコールに従って、ＭＪサーモサイクラー中で用いて、以下のサイクルを用いて行った：９５℃２分間；３０サイクルの（９５℃１５秒間、４９℃３０秒間、６８℃９０秒間）；６８℃１０分間。プラスミドｐＳＹＮ−ＦＩＸ−０２７（ｐＢＵＤＦＩＸＦｃ／Ｆｃ）を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｐＥＩで消化して、ベクターについて予想される大きさのバンド（約５８００ｂｐ）を、ＦＩＸ挿入物（予想される大きさのバンド約１４８０ｂｐ）から離れて、Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．）を用いて精製した。次にＰＣＲ増幅したＦＶＩＩ配列を、ＦＩＸ挿入物を除去した後、ｐＳＹＮ−ＦＩＸ−０２７由来のベクターのＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位中にサブクローニングした。これによって、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−００２（ｐＢＵＤＦＶＩＩＦｃ／Ｆｃ）を生成した。次に、Ａ（ＧＧＧＧＳ）６ｘポリペプチドリンカーをＦＶＩＩとｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−００２中のＦｃ領域コード配列との間に以下のプライマーを用いて付加した：
ＦＶＩＩ−リンカー−Ｆ：
ＣＡＴＣＣＣＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＧＴＣＣ
ＦＶＩＩ−Ｌｉｎｋｅｒ−Ｒ：
ＧＧＧＣＡＴＧＴＧＴＧＡＧＴＴＴＴＧＴＣＴＧＡＴＣＣＣＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＡＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＣＣＴＧＡＴＣＣＡＣＣＣＣＣＡＣＣＴＧＡＴＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＡＣＣＣＡＣＣＴＣＣＧＣＣＧＧＡＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＧＡＡＡＴＧＧＧＧＣＴＣＧＣＡＧＧＡＧＧ
Ｆｃ−リンカー−Ｆ：
ＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣ
Ｆｃ−リンカー−Ｒ：
ＧＣＡＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧ
【０３３１】
２つの１２μｌのＰＣＲ反応を、１２ｐｍｏｌのＦＶＩＩ−リンカー−ＦおよびＦＶＩＩ−リンカー−Ｒ（反応１）またはＦｃ−リンカー−ＦおよびＦｃ−リンカー−Ｒ（反応２）のいずれかを用いて、Ｅｘｐａｎｄ  ＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）を用いて、製造業者の標準的なプロトコールによってＭＪサーモサイクラー中で行った。第一のおよび第二の反応を、１μｇのｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−００２をテンプレートとして用い、以下のサイクルを用いて行った：９４℃、２分間；１４サイクルの（９４℃、３０秒間、５５℃、３０秒間、７２℃、２分間）；７２℃、１０分間。予想される大きさのバンド（反応１については５３２ｂｐおよび反応２については６７０ｂｐ）を、Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．）を用いてゲル精製し、次いでＰＣＲ反応中で、２５ｐｍｏｌのＦＶＩＩ−リンカー−ＦおよびＦｃ−リンカー−Ｒと前のとおり組み合わせて、ただし増幅は３０サイクルとした。予想される大きさのバンド（１２００ｂｐ）を、Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．）で精製して、制限酵素ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。予想される大きさのバンド（９２０ｂｐ）は、前のとおりゲル精製して、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−００２のＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＩ部位にクローニングして、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−００３（ｐＢＵＤＦＶＩＩＦｃ／６ｘ（ＧＧＧＧＳ）／Ｆｃ）を生成した。
【０３３２】
二本鎖のヘテロ二量体を発現するためのｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０２４のクローニング
プラスミド（ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０２４）を、二本鎖のヘテロ二量体（ここで、１つの鎖は、ＦＶＩＩ軽鎖（残基１−１５２）続いて（ＧＧＧＧＳ）６ｘリンカー続いてＦｃ領域からなり、一方他方の鎖は、ＦＶＩＩ重鎖（残基１５３〜４０６）続いて（ＧＧＧＧＳ）６ｘリンカー続いてＦｃ領域を含む）の発現のために生成した。このプラスミドを、ヘテロ二量体を、単一のポリペプチド（ここでＦＶＩＩ重鎖−リンカー−Ｆｃ鎖のＣ末端は、重鎖−リンカー−Ｆｃ鎖のＮ末端に接続される）として発現するように、以下のポリペプチド配列によって設計する：ＲＲＲＲＳ−（ＧＧＧＧＳ）６ｘ−ＲＫＲＲＫＲ、ここでＲＲＲＲＳおよびＲＫＲＲＫＲ配列は、プロタンパク質転換酵素的切断部位である）。各々の切断部位での最後のＡｒｇの後のプロタンパク質転換酵素による細胞内切断は、ポリペプチドリンカーの除去を生じ得る。結果として、細胞は、２つの鎖のヘテロ二量体（ここでＦＶＩＩ軽鎖−リンカー−Ｆｃ鎖は、Ｃ末端でＲＲＲＲＳ配列を有するが、このリンカーの残りおよびＲＫＲＲＫＲ配列は、そうでなければ除去された）を発現する。ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０２４およびいくつかの中間体プラスミドの構築には、以下のプライマーの使用を必要とした：
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ−ＢｐＥＩ−Ｆｃ−Ｆ
ＡＧＴＣＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣＴＣＣＧＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＣＧＧＡＣＣ
ＢａｍＨＩ−リンカー（ＰＡＣＥ１）−Ｆｃ−Ｒ
ＣＡＴＣＧＧＡＴＣＣＣＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＡＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＣＣＴＧＡＴＣＣＡＣＣＣＣＣＡＣＣＴＧＡＴＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＧＣＣＧＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧＧ
ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｋｏｚａｋ−ＦＶＩＩ−Ｆ
ＣＧＡＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＣＴＣＣＣＡＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧ
ＢｓｐＥＩ−Ｆｃ−リンカー−ＦＶＩＩＬＣ−Ｒ
ＧＡＧＴＴＣＣＧＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＣＧＧＴＧＧＧＣＡＴＧＴＧＴＧＡＧＴＴＴＴＧＴＣＴＧＡＴＣＣＣＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＡＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＣＣＴＧＡＴＣＣＡＣＣＣＣＣＡＣＣＴＧＡＴＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＡＣＣＣＡＣＣＴＣＣＧＣＣＧＧＡＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＧＧＣＣＴＴＧＧＧＧＴＴＴＧＣＴＧＧ
ＢａｍＨＩ−２ｘｌｉｎｋ−ｐａｃｅ−ＨＣ−Ｆ
ＣＡＧＴＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＧＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＴＧＣＣ
Ｆｃ−ＥｃｏＲＩ−Ｒ
ＡＴＧＴＣＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧＧ
【０３３３】
第一の中間体プラスミドを生成するために、ＰＣＲ反応は、２５ｐｍｏｌのプライマーＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ−ＢｐＥＩ−Ｆｃ−ＦおよびＢａｍＨＩ−リンカー（ＰＡＣＥ１）−Ｆｃ−ＲおよびテンプレートｐＳＹＮ−Ｆｃ−００１を用いて、Ｅｘｐａｎｄ  ＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）を用い、製造業者の標準的なプロトコールによってＭＪサーモサイクラー中で行った。以下のサイクルを用いた：９５℃２分間；３０サイクルの（９５℃３０秒間、５８℃３０秒間、および７２℃１分間）；７２℃１０分間。正確な大きさのバンド（約７３０ｂｐ）を上記のようにゲル精製して、ｐＢＵＤＣＥ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングして、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０１４を生成した。プライマーＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ−ＢｐＥＩ−Ｆｃ−ＦおよびＢａｍＨＩ−リンカー（ＰＡＣＥ１）−Ｆｃ−Ｒを用いるＰＣＲ増幅によって、Ｆｃ領域の一部（アミノＡ  Ｘ−Ｙ）続いてＲＲＲＲＳ配列および（ＧＧＧＧＳ）２ｘポリペプチドリンカーをコードするＤＮＡフラグメントを生成した。プライマーＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ−ＢｐＥＩ−Ｆｃ−Ｆは、この分子の５’末端でＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩ制限部位を導入し、一方で、プライマーＢａｍＨＩ−リンカー（ＰＡＣＥ１）−Ｆｃ−Ｒは、ＢａｍＨＩを、ＧＧＧＧＳリンカーの最後の２つの残基をコードするコドンと重複する３’末端に導入する（コドンＧＧＡ  ＴＣＣを有する残基ＧＳ）。次に、別のＰＣＲ反応を、上記のとおり、プライマーＨｉｎｄＩＩＩ−Ｋｏｚａｋ−ＦＶＩＩ−ＦおよびＢｓｐＥＩ−Ｆｃ−リンカー−ＦＶＩＩＬＣ−ＲおよびテンプレートｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−００２を用い、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０１４のクローニングについて記載される同じ条件を用い、ただしアニーリング温度は５７℃で行った。予想される大きさのバンド（約７００ｂｐ）は、ゲル精製して、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０１４のＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｐＥＩ部位中にクローニングして、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０２３を生成した。プライマーＨｉｎｄＩＩＩ−Ｋｏｚａｋ−ＦＶＩＩ−ＦおよびＢｓｐＥＩ−Ｆｃ−リンカー−ＦＶＩＩＬＣ−Ｒは、ＦＶＩＩ軽鎖、続いて（ＧＧＧＧＳ）６ｘポリペプチドリンカーおよびＦｃ領域の一部を最大アミノ酸２３２（ＥＵナンバリング）までをコードするＤＮＡフラグメントを増幅した。プライマーＨｉｎｄＩＩＩ−Ｋｏｚａｋ−ＦＶＩＩ−Ｆは、この分子の５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を続いてＫｏｚａｋ配列を導入し、一方で、プライマーＢｓｐＥＩ−Ｆｃ−リンカー−ＦＶＩＩＬＣ−Ｒは、この分子の３’末端にＢｓｐｅＩ部位を付加する。
【０３３４】
最終工程では、ＰＣＲ反応は、上記のように、プライマーＢａｍＨＩ−２ｘリンク（ｌｉｎｋ）−ペース（ｐａｃｅ）−ＨＣ−ＦおよびＦｃ−ＥｃｏＲＩ−ＲおよびテンプレートｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−００３を用い、以下のサイクルを用いて行った：９５℃２分間；３０サイクルの（９５℃３０秒間、５５℃３０秒間、および７２℃２分間）；７２℃７分間。このＰＣＲ反応によって、（ＧＧＧＧＳ）２ｘポリペプチドリンカー続いてＲＫＲＲＫＲ配列続いてＦＶＩＩ重鎖をコードするＤＮＡ分子を生成した。プライマーＢａｍＨＩ−２ｘリンク（ｌｉｎｋ）−ペース（ｐａｃｅ）−ＨＣ−ＦおよびＦｃ−ＥｃｏＲＩ−Ｒは、それぞれ、分子の５’末端および３’末端にＢａｍＨＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位を導入する。予想される大きさのバンド（約１６００ｂｐ）を、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０２３のＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローニングして、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０２４を生成した。
【０３３５】
中間体ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０７３のクローニング
サイレント変異体を、ＦＶＩＩ−０２４の第一のＦｃ部分に、ＰＣＲベースの部位指向性突然変異誘発方法によって導入して、位置４１２および４１３（ＥＵナンバリング）のアミノ酸をコードするＤＮＡ領域でＳａｌＩ部位を生成した。これによって、中間体構築物ＦＶＩＩ−０７３を生成した。
【０３３６】
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０５７のクローニング
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０５７のＳａｌＩ〜ＢｓｉＷＩ部位由来のヌクレオチドを含むＤＮＡ配列の合成は、外注した。このＤＮＡを、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０７３のＳａｌＩ／ＢｓｉＷＩ部位にサブクローニングして、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０５７を生成した。
【０３３７】
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０５８、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０５９、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０６０、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０６１およびｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０６２のクローニング
これらの構築物を、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０５７（ＳａｌＩ〜ＢｓｉＷＩのＤＮＡ合成は外注して、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０７３の中にサブクローニングした）について記載のとおりクローニングした。
【０３３８】
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０６６のクローニング
ＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０６６のＳａｌＩ〜ＲｓｒＩＩ部位由来のヌクレオチドを含むＤＮＡ配列の合成は、外注した。このＤＮＡを、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０４３のＳａｌＩ／ＲｓｒＩＩ部位にサブクローニングして、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０６６を生成した。
【０３３９】
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０６７のクローニング
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０６７のＳａｌＩ〜ＥｃｏＲＩ部位由来のヌクレオチドを含むＤＮＡ配列の合成は、外注した。このＤＮＡを、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０４１のＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングして、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０６７を生成した。
【０３４０】
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０９０のクローニング
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０９０のＢａｍＨＩ〜ＢｓｉＷＩ部位由来のヌクレオチドを含むＤＮＡ配列の合成は、外注した。このＤＮＡを、３ウェイライゲーションによってｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０６１（ここでは、外注したＤＮＡを、ＢａｍＨＩ／ＢｓｉＷＩおよびｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０６１を用い、ＢａｍＨＩ／ＢｓｉＷＩ／ＮｏｔＩを用いて切断した）中にサブクローニングして、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０９０を生成した。
【０３４１】
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−１００のクローニング
ＦＶＩＩの１７０ループの一部（ＦＶＩＩ成熟配列のアミノ酸３１１〜３２２）を、トリプシンの１７０ループ（アミノ酸ＥＡＳＹＰＧＫ）で置き換えた。この変異を、標準的な重複ＰＣＲ方法によって、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０９０をテンプレートとして、および骨格構造を用いて、導入してｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−１００を生成した。
【０３４２】
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−１１５のクローニング
３ポイントの変異（Ｖ１５８Ｄ、Ｅ２９６ＶおよびＭ２９８Ｑ；成熟ＦＶＩＩ配列ナンバリング）を、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０９０のＦＶＩＩコード領域中に、ＰＣＲベースの部位指向性突然変異誘発によって導入して、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−１１５を生成した。
【０３４３】
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−１１８のクローニング
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−１１８のＸｂａＩ〜ＢｓｉＷＩ部位由来のヌクレオチドを含むＤＮＡ配列の合成は、外注した。このＤＮＡを、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０１１のＸｂａＩ／ＢｓｉＷＩ部位にサブクローニングして、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−１１８を生成した。
【０３４４】
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−１１９のクローニング
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−１１９のＸｂａＩ〜ＢｓｉＷＩ部位由来のヌクレオチドを含むＤＮＡ配列の合成は、外注した。このＤＮＡを、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０１１のＸｂａＩ／ＢｓｉＷＩ部位中にサブクローニングして、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−１１９を生成した。
【０３４５】
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−１２７のクローニング
トリプシンの１７０ループを含むＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲによって、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−１００をテンプレートとして用いて生成した。このＰＣＲ反応によって、それぞれ５’および３’でＢｓｉＷＩおよびＢｓｐＥＩ制限部位を生成した。このＤＮＡフラグメントを、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−１１８のＢｓｉＷＩ／ＢｓｐＥＩ部位中にサブクローニングして、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−１２７を生成した。
【０３４６】
ｐＳＹＮ−ＦＩＸ−０４２のクローニング
ｐＳＹＮ−ＦＩＸ−０３０（米国特許第７５６６５６５に記載）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓｐＥＩフラグメントを、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０１１のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓｐＥＩ部位にサブクローニングして、ｐＳＹＮ−ＦＩＸ−０４２を生成した。
【０３４７】
ｐＳＹＮ−ＦＩＸ−０６８のクローニング
ｐＳＹＮ−ＦＩＸ−０３０（米国特許第７５６６５６５号に詳細に記載されるプラスミド）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓｐＥＩフラグメントを、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０６６のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓｐＥＩ部位中にサブクローニングして、ｐＳＹＮ−ＦＩＸ−０６８を生成する。
【０３４８】
ｐＳＹＮ−ＦＩＸ−０８８のクローニング
ｐＳＹＮ−ＦＩＸ−０６７由来のＢｓｐＥＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐＳＹＮ−ＦＩＸ−０５３のＢｓｐＥＩ−ＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングして、ｐＳＹＮ−ＦＩＸ−０８８を生成する。  
【０３４９】
ｐＳＹＮ−ＦＩＸ−０８９のクローニング
ｐＳＹＮ−ＦＩＸ−０４８由来のＢｓｐＥＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐＳＹＮ−ＦＩＸ−０５３のＢｓｐＥＩ−ＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングして、ｐＳＹＮ−ＦＩＸ−０８９を生成する。
【０３５０】
ｐＳＹＮ−ＦＩＸ−０９０のクローニング
タンパク質のＸｂａＩ部位〜Ｃ末端に由来するＦＩＸコード領域、続いて６ｘ（ＧＧＧＧＧＳ）リンカー、ＳＣＥ５コード配列およびＥｃｏＲＩ部位を含むＤＮＡフラグメントは、合成について外注し、ｐＳＹＮ−ＦＩＸ−０５３のＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ部位中にサブクローニングして、ｐＳＹＮ−ＦＩＸ−０９０を生成した。ＳＣＥ５配列は以下に示す：
ＡＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＭＦＳＲＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＰＥＷＶＳＧＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＡＴＹＴＳＲＳＤＶＰＤＱＴＳＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＳＡＳＡＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶＳＥＬＴＱＤＰＡＶＳＶＡＬＧＱＴＶＲＩＴＣＱＧＤＳＬＲＮＦＹＡＳＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＴＬＶＩＹＧＬＳＫＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＡＳＳＳＧＮＴＡＳＬＴＩＴＧＡＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＬＬＹＹＧＧＧＱＱＧＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＲＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＡＡ
【０３５１】
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０９４のクローニング
６ｘ（ＧＧＧＧＳ）リンカーをコードする配列、続いてＳＣＥ５コード配列を含んでいるＤＮＡフラグメントを、合成（外注）して、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０１１改変体（ＦＶＩＩコード領域のＣ末端でＥｃｏＲＶ部位を生成するように事前に改変された）のＥｃｏＲＶ／ＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。
【０３５２】
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０８８のクローニング
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０８８のＳａｌＩ〜ＲｓｒＩＩ部位由来のヌクレオチドを含むＤＮＡ配列の合成は、外注した。このＤＮＡを、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０６６のＳａｌＩ／ＲｓｒＩＩ部位にサブクローニングして、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０８８を生成した。
【０３５３】
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−１２５のクローニング
ＤＮＡフラグメントは、ＡＰ３領域およびリンカーの一部を含んでいる、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０８８からＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ反応によって、それぞれ、５’および３’でＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位を生成した。このＤＮＡフラグメントを、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０１１のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ部位中にサブクローニングしてｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−１２５を生成した。
【０３５４】
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−０４１のクローニング
ヒト組み換えＢ−ドメイン欠失ＦＶＩＩＩのコード配列を、ＦＶＩＩＩ特異的なプライマーを用いてヒト肝臓ポリＡ  ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって得た。このＦＶＩＩＩ配列は、ＦＶＩＩＩの天然のシグナル配列を含む。Ｂ−ドメイン欠失は、セリン７４３（Ｓ７４３；２２８７ｂｐ）の後で開始して、グルタミン１６３８（Ｑ１６３８；４９６９ｂｐ）の前で終わり、２６８２ｂｐという総欠失である（ＳＱバージョン）。
【０３５５】
ヒト組み換えＦｃのコード配列は、Ｆｃ特異的なプライマーを用いてヒト白血球ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＲＴ−ＰＣＲによって得た。プライマーは、Ｂ−ドメイン欠失のＦＶＩＩＩ配列が、介在するリンカーなしでＦｃ配列のＮ末端に直接融合されるように、設計した。ＦＶＩＩＩＦｃのＤＮＡ配列を、哺乳動物の二重発現ベクターｐＢＵＤＣＥ４．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の中に、ＣＭＶプロモーターの制御下でクローニングした。
【０３５６】
マウスＩｇｋシグナル配列を含んでいる第二の同一のＦｃ配列は、ＲＴ−ＰＣＲによって得て、発現ベクターｐＢＵＤＣＥ４．１中で、第二のプロモーターＥＦ１αの下流にクローニングした。この最終の構築物を、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−０１３と命名した。
【０３５７】
第二のプラスミドを、ＰＣＲおよび標準的な分子生物学的技術を用いて同様の構築物から創出し、ｒＦＶＩＩＩＢＤＤ−Ｆｃ−Ｆｃ（ｒＦＶＩＩＩＢＤＤＦｃコード配列を、第二のＦｃ配列に対して（ＧＧＧＧＳ）４リンカーとともに融合した）を発現して、ｒＦＶＩＩＩＢＤＤ−Ｆｃモノマー−二量体ハイブリッドのみの産生を、一過性トランスフェクションで可能にした。この構築物は、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−０４１と命名した。
【０３５８】
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−０４９のクローニング
中間体ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−０４８は、ｐＢＵＤ−ＣＥ４．１由来のＮｈｅＩ／ＸｈｏＩフラグメントをｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−０１３中にクローニングすることによって生成した。ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−０４９のＲｓｒＩＩ〜ＸｂａＩ部位由来の領域を含むＤＮＡフラグメントの合成を、外注した。このフラグメントを、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−０４８のＲｓｒＩＩ／ＸｂａＩ部位中にサブクローニングして、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−０４９を生成した。
【０３５９】
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−１０８のクローニング
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０６６由来のＳａｌＩ／ＲｓｒＩＩフラグメントを、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−０４９中にサブクローニングして、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−１０８を生成したことが示された。
（実施例７）
【０３６０】
活性化された構築物の発現での追加の試み
いくつかの他の構築物を、活性化されたＦＶＩＩを発現するという目標で作製した。しかし、これらの構築物は、活性化された分子を首尾よく発現することはなかった。ウエスタンブロットによって、ＦＶＩＩ重鎖は、異種のシグナルペプチドを重鎖のＮ末端に融合するという一般的方法を用いると遊離のＮ末端では発現できなかった。
【０３６１】
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０１０のクローニング
ＦＶＩＩ−０１０構築物とは、第ＶＩＩ因子の重鎖がｓｃＦｃ足場の状況で発現され、軽鎖が別々に発現された構築物である。
【０３６２】
プライマー対ＦＶＩＩ−ＨＣ−Ｈｉｎｄ３−ＩｇｇＫｓｓ−Ｆ／ＦＶＩＩ−ＨＣ−ＢｓｐＥＩ−Ｒを用い、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−００１（上記を参照のこと）を用いてＰＣＲ増幅する。ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−００８（上記を参照のこと）のＢｓｐＥＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位におけるクローンで、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−００９を生成する。
【０３６３】
ＰＣＲでは、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−００３（Ｐ０８３０を参照のこと）由来のＦＶＩＩ軽鎖をプライマーＦＶＩＩ−ＬＣ−ＮｏｔＩ−Ｆ／ＦＶＩＩ−ＬＣ−ＸｈｏＩ−Ｒを用いて増幅して、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−００９中にクローニングし、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０１０を生成する。
【０３６４】
プライマー
ＦＶＩＩ−ＨＣ−ＢｓｐＥＩ−Ｒ
ＡＧＧＡＧＴＴＣＣＧＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＣＧＧＴＧＧＧＣＡＴＧＴＧＴＧＡＧＴＴＴＴＧＴＣＧＧＡＴＣＣＣＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＡＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＣＣＴＧＡＴＣＣＡＣＣＣＣＣＡＣＣＴＧＡＴＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＡＣＣＣＡＣＣＴＣＣＧＣＣＧＧＡＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＧＡＡＡＴＧＧＧＧＣＴＣＧＣＡＧＧＡＧＧ
ＦＶＩＩ−ＨＣ−Ｈｉｎｄ３−ＩｇｇＫｓｓ−ｆ
ＡＣＴＧＡＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴＧＧＧＴＡＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＣＡＧＧＴＴＣＣＡＣＴＧＧＴＡＴＴＧＴＧＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＴＧＣ
ＦＶＩＩ−ＬＣ−ＮｏｔＩ−Ｆ
ＡＣＴＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＣＴＣＣＣＡＧＧ
ＦＶＩＩ−ＬＣ−ＸｈｏＩ−Ｒ
ＡＣＴＧＡＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＣＧＧＣＣＴＴＧＧＧＧＴＴＴＧＣＴＧＧ
【０３６５】
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０１３のクローニング
ＦＶＩＩ−０１３構築物とは、軽鎖がｓｃＦｃ足場の状況で発現され、重鎖が別々に発現された構築物である。
【０３６６】
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−００１（Ｐ０８３０を参照のこと）由来のプライマー対ＦＶＩＩ−ＬＣ−リンカー−ＢａｍＨＩ−Ｒ／ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｋｏｚａｋ−ＦＶＩＩ−Ｆａｎｄを用いてＰＣＲ増幅して、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０１１のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングして、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０１２を生成する。プライマー対ＦＶＩＩ−ＨＣ−ＮｏｔＩ−Ｆ／ＦＶＩＩ−ＨＣ−ＸｈｏＩ−Ｒを用いてｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−００９由来のＦＶＩＩ−ＨＣをＰＣＲ増幅して、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０１２中にサブクローニングしてｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０１３を生成する。
【０３６７】
プライマー
ＦＶＩＩ−ＬＣ−６ｘリンカー−ＢａｍＨＩ−ＲＡＣＴＧＡＣＧＧＡＴＣＣＣＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＡＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＣＣＴＧＡＴＣＣＡＣＣＣＣＣＡＣＣＴＧＡＴＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＡＣＣＣＡＣＣＴＣＣＧＣＣＧＧＡＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＧＧＣＣＴＴＧＧＧＧＴＴＴＧＣＴＧＧＣ
ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｋｏｚａｋ−ＦＶＩＩ−Ｆ
ＣＧＡＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＣＴＣＣＣＡＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧ
ＦＶＩＩ−ＨＣ−ＮｏｔＩ−Ｆ
ＡＣＴＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣ
ＦＶＩＩ−ＨＣ−ＸｈｏＩ−Ｒ
ＡＣＴＧＡＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＧＧＡＡＡＴＧＧＧＧＣＴＣＧＣＡＧＧＡＧ
【０３６８】
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０１８のクローニング
ＦＶＩＩ−０１８構築物のために、ＦＶＩＩの重鎖をＦｃ融合タンパク質として発現して、ＦＶＩＩの軽鎖を、別々のＦｃ融合タンパク質として別々に発現した。
【０３６９】
プライマーＦＶＩＩ−ＨＣ−Ｈｉｎｄ３−ＩｇｇＫｓｓ−Ｆ／ｓｃＦｃ−ＥｃｏＲＩ−Ｒを用いて、ＨＣＦＶＩＩ−リンカー−Ｆｃを、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０１０をテンプレートとして用いてＰＣＲ増幅した。ｐＢＵＤＣＥ４のＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位中にサブクローニングする。これによってｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０１７を作製する。次に、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０１３から、プライマーｓＦＶＩＩ−ＬＣ−ＮｏｔＩ−Ｆ／ＦＣ−ＸＨＯＩ−Ｒを用いてＰＣＲ増幅して、ＦＶＩＩ−０１７のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ部位中にサブクローニングする。これによってＰＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０１８を作製する。
【０３７０】
プライマー
ｓｃＦｃ−ＥｃｏＲＩ−Ｒ
ＡＣＴＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧ
Ｆｃ−ＸｈｏＩ−Ｒ
ＡＧＣＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧ
（実施例８）
【０３７１】
活性化可能な構築物の発現の試み
ＦＶＩＩ−０３９、−０４０のクローニング
ＤＦＴＲ第ＸＩａ因子切断部位の場合は、適切な切断部位を用いて、第ＶＩＩ因子が凝固の部位で、インビボで活性化され得るいくつかの構築物を、構築物を生成する試みで作製した。
【０３７２】
０３９構築物は、ｓｃＦｃ足場の状況で作製した。この構築物は、ＦＶＩＩ軽鎖、ＦＸＩａ切断部位、およびＩ１５３Ｖ変異体を有するｒＦＶＩＩ重鎖を、第一のＦｃ部分のＮ末端に結合された直鎖状配列に含んだ。
０４０構築物はまた、ｓｃＦｃ足場の状況でも作製した。この構築物は、Ｒ１５２欠失を有するＦＶＩＩ軽鎖、ＸＩａ切断部位、およびＩ１５３Ｖ変異体を有するＦＶＩＩ重鎖を、第一のＦｃ部分のＮ末端に連結された直鎖状配列中に含んだ。ＤＦＴＲ切断配列は、ＦＩＸに見出される天然のＦＸＩａ配列である。ＦＩＸでは、ＤＦＴＲ配列にはバリンが続き、そのためＩ１５２Ｖ変異体を、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０３９、−０４０に導入してＦＸＩａ切断有効性を増大した。
【０３７３】
ＤＮＡ分子Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ−ＦＶＩＩ−０３９および−０４０の合成は、外注した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）。Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ−ＦＶＩＩ−０３９および−０４０由来のＸｂａＩ／ＢｓｉＷＩフラグメントを、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０１１のＸｂａＩ／ＢｓｉＷＩ部位にサブクローニングして、それぞれｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０３９および−０４０を生成した。
（実施例９）
【０３７４】
構築物の一過性トランスフェクション
構築物の発現のために、ＨＥＫ−２９３−Ｆ細胞を、ビタミンＫ３（ＦＶＩＩおよびＦＩＸトランスフェクションのみのため）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補充したＦｒｅｅｓｔｙｌｅ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の懸濁物中で２μｇ／リットル（増殖培地）まで、懸濁細胞として３７℃／１０％ＣＯ２で増殖させた。細胞は、３日ごとに４日まで、５×１０５細胞／ｍｌの細胞密度で播種することによって継代培養した。
【０３７５】
トランスフェクションの２４時間前、細胞を、ＬＯＮＧ（商標）Ｒ３ＩＧＦ−１（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補充した増殖培地中で、２０μｇ／リットル（トランスフェクション培地）に７×１０５細胞／ｍｌで播種した。トランスフェクションの日、トランスフェクション溶液を、トランスフェクトされるべき細胞培養物の総容積の５％に等しい溶液で作製した。トランスフェクション溶液中で、ＤＮＡを、トランスフェクション培地中のＰＥＩ（６０ｍｇ／Ｌ）の新鮮に作製された溶液に添加した（最終濃度２０ｍｇ／Ｌ）。この溶液を、３０秒間旋回させて、室温で５分間インキュベートした後に細胞培養物に直接添加した。４時間後、ビタミンＫ３、ＬＯＮＧ（商標）Ｒ３ＩＧＦ−１および２００ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＯｐｔｉＣＨＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の細胞培養容積に等しい容積を、細胞に添加した。その細胞培養物を、上記で示されたように増殖させて、毎日の培地のサンプルを採取して、タンパク質発現を評価した。回収の日に、細胞をスピンダウンして、培地をタンパク質生成、またはプロテインＡプルダウン／ウエスタンブロットによるタンパク質分析のために調製物中に濾過した。
（実施例１０）
【０３７６】
ＦＶＩＩＦｃ分子（ＦＶＩＩ−０２８およびＦＶＩＩ−０５３を除く）およびＦＩＸＦｃ分子のタンパク質精製
ＦＶＩＩＦｃ分子は、以下のカラム：１）シュード−アフィニティー溶出による陰イオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ｑセファロース４ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）続いて、最も活性な種を選択的に溶出する種々のレベルのＣａＣｌ２での溶出）、続いて２）ｓｈＦｃＲｎ（可溶性ヒトＦｃＲｎ）アフィニティー（セファロース４ＦＦビーズとのＮＨＳ−カップリングｓｈＦｃＲｎ）クロマトグラフィー、を用いて馴化培地から精製して、Ｆｃ−含有タンパク質を低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．２）で結合し、中性のｐＨ（例えば、ｐＨ８．０）を溶出する。いくつかの場合には、ＮａＣｌ溶出による陰イオン交換クロマトグラフィーを利用している追加の工程を含んだ。これらの精製工程は、当業者に公知の標準的な方法を利用して、ＳＥＣ分析およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって９５％を超える純度の精製タンパク質を生成した。ＦＩＸＦｃタンパク質は、米国特許第７，５６６，５６５号に以前に記載されるとおりに精製した。
（実施例１１）
【０３７７】
ＦＶＩＩ−０２８およびＦＶＩＩ−０５３のタンパク質精製
ＦＶＩＩ−０２８および−０５３を、以下のカラムを用いて馴化培地から精製した：１）疎水性相互作用クロマトグラフィー（例えば、ＰｈｅｎｙｌＦＦ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））、続いて２）塩溶液を用いる陰イオン／陽イオン交換クロマトグラフィー。これらの精製工程は、当業者に公知の標準的な方法を利用して、ＳＥＣ分析およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって９５％を超える純度の精製タンパク質を生成した。
（実施例１２）
【０３７８】
ＦＩＸ−０９０のタンパク質精製
ＦＩＸ−０９０を、２−工程のクロマトグラフィープロセス、最初は、抗ＧＬＡドメイン抗体によるイムノアフィニティークロマトグラフィー、つづいて上記のＦＩＸＦｃタンパク質と同様のシュードアフィニティー溶出を用いる陰イオン交換クロマトグラフィーを通じて精製した。これらの精製工程は、当業者に公知の標準的な方法を利用して、ＳＥＣ分析およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって９５％を超える純度の精製タンパク質を生成した。
（実施例１３）
【０３７９】
ＦＶＩＩＩＦｃタンパク質の精製
ＦＶＩＩＩＦｃタンパク質を、ＦＶＩＩＩ特異的アフィニティー精製工程（ＭｃＣｕｅ２００９）続いて陰イオン交換と標準ＮａＣｌ溶出との組み合わせおよび／またはｓｈＦｃＲｎ（可溶性ヒトＦｃＲｎ）アフィニティー（セファロース４ＦＦビーズとのＮＨＳカップリングｓｈＦｃＲｎ）クロマトグラフィーを含む、２または３つのカラム精製プロセスを用いて、浄化されかつ化学的に定義された回収培地から精製して、Ｆｃ−含有タンパク質を低ｐＨ（例えば、ｐＨ６．２）で結合して、中性のｐＨ（例えば、ｐＨ８．０）で溶出する。これらの精製工程は、当業者に公知の標準的な方法を利用して、ＳＥＣ分析およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって９５％を超える純度の精製タンパク質を生成した。
（実施例１４）
【０３８０】
ＦＶＩＩ構築物の活性化
ＦＶＩＩＦｃを含んでいるＦｃＲｎカラムから溶出した画分を、プールして、総タンパク質を、４ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。ＣａＣｌ２濃度を、５ｍＭまで上げて、そのサンプルを、４℃で２４〜４８時間、少なくとも８０％のＦＶＩＩＦｃが活性化されるまでインキュベートした。活性化の程度は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって評価した（図１０）。
（実施例１５）
【０３８１】
ＦＶＩＩａ活性アッセイ、可溶性組織因子方法
ＦＶＩＩａＦｃ改変体の不活性を、可溶性組織因子方法によって決定した。脂質化された全長組織因子とは異なり、可溶性組織因子（組織因子の細胞外部分）は、ＦＶＩＩをＦＶＩＩａに活性化できないが、これは、ＦＶＩＩａによる第Ｘ因子の第Ｘａ因子への変換の活性化因子として機能する。ＦＶＩＩａＦｃ改変体の比活性を決定するために、Ａ  ＳＴＡＣＬＯＴ（登録商標）ＦＶＩＩ−ｒＴＦキット（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ，Ａｓｎｉｅｒｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を、以下の製造業者の推奨に従って用いた。表１は、データをまとめており、全ての改変体について匹敵する比活性を示す。
【０３８２】
【表１】
2013534427.tif 000002
（実施例１８）
【０３８３】
ＦＶＩＩａＦｃおよび血小板の結合を研究するためのＦＡＣアッセイ
本実施例では、以下の試薬および方法を用いた：
試薬
ＡＤＰ：Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ番号Ａ２７５４，ストック１ｍＭ、作業濃度１０ｕＭ
ＳＦＬＬＲＮペプチド：社内合成、ストック濃度５ｍｇ／ｍｌ（６．７ｍＭ）、作業濃度５０ｕｇ／ｍｌ（６７ｕＭ）
ＦＶＩＩ抗体−ＦＩＴＣ−標識：Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ＳＡＦＶＩＩ−ＡＰＦＴＣ
血小板緩衝液：１５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１３８ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＣａＣｌ２、５．５ｍＭのデキストロースおよびｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、ｐＨ７．４
【０３８４】
方法
●血小板をカウントする
●２０ｕｌの約２〜４×１０８細胞／ｍｌのゲル精製血小板を１ｍｌの血小板緩衝液に添加する。
●各々のサンプルについて１００ｕｌのアリコートを作製する
●必要に応じてアゴニストおよびＦＶＩＩＦｃを（所望の濃度まで）添加して、３７℃で１５分間インキュベートする
●等容積のＨＢＳ／５ｍＭのＣａＣｌ２／１．５％ホルムアミドを添加して、２０分間、ＲＴでインキュベートする
●３０００ｇで１５分間スピンする
●ＨＢＳ／５ｍＭのＣａＣｌ２／１ｍｇ／１ｍｌのＢＳＡ中で洗浄し、再度スピンして、１００ｕｌの血小板緩衝液中に再懸濁した。
●２．５ｕｌのＦＶＩＩ抗体−ＦＩＴＣ標識を添加し、３０分間室温でインキュベートする。
●ＦＡＣで分析する
（実施例１７）
【０３８５】
トロンビン生成アッセイ
本実施例では、以下の試薬および方法を用いた：
【０３８６】
試薬
ＦＶ：ＨＴＩ，カタログ番号ＨＣＶ−０１００，ロット番号Ｚ０４１３、５．１ｍｇ／ｍｌ
プロトロンビン：ＨＴＩ，カタログ番号ＨＣＰ−００１０，ロット番号Ｚ０１２８，４．８ｍｇ／ｍｌ
ＦＸ：ＨＴＩ，カタログ番号  ＨＣＸ−００５０，ロット番号Ｘ０４０１，５．４ｍｇ／ｍｌ
ＡＴＩＩＩ：ＨＴＩ，カタログ番号  ＨＣＡＴＩＩＩ−０１２０，ロット番号Ｙ０４０１，８．２ｍｇ／ｍｌ
ＴＦＰＩ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ，カタログ番号  ４９００ＰＣ，ロット番号０８１０３１，１００ｕｇ／ｍｌ
リーダー：Ｆｌｕｏｒｓｋａｎ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ
トロンビン標準物質：トロンビンスコープ（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ），カタログ番号ＴＳ２０．００
フルカ（Ｆｌｕｃａ）：トロンビンスコープ（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ），カタログ番号  ＴＳ５０．００
血小板緩衝液：１５ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１３８ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２，５．５ｍＭのデキストロース，１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを補充（使用前に）
ＡＤＰ：Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ番号  Ａ２７５４，ストック１ｍＭ，作業濃度１０ｕＭ
ＳＦＬＬＲＮペプチド：社内合成、ストック濃度５ｍｇ／ｍｌ（６．７ｍＭ）、作業濃度５０ｕｇ／ｍｌ（６７ｕＭ）
【０３８７】
【表２】
2013534427.tif 000003
【０３８８】
方法
−製造業者の推奨に従ってソフトウェアを設定する。
【０３８９】
−水およびＦｌｕｃａ緩衝液を事前に温める。
【０３９０】
−凝固因子ミックス（混合物）を作製する。ＦＶ、ＦＩＩ、ＦＸ，ＡＴＩＩＩおよびＴＦＰＩのストック濃縮物を希釈して、作業溶液を作製する。５ｕｌ／ウェルが必要であり、そのため３０ウェルのアッセイのために、単一のバルク溶液中に全ての凝固因子溶液の１８０μｌの各々のミックスを調製する。
【０３９１】
−ＦＶＩＩａＦｃ希釈物を予備調製する。１２００ｎＭの溶液（１２ｕｌを８８ｕｌの緩衝液中に）を１００ｕｌ中に作製して、４倍（２５ｕｌを７５ｕｌの緩衝液に）に希釈して、２００ｎＭおよび６２．５ｎＭの溶液を得る。
【０３９２】
−標準物質溶液を作製する（１ｍｌの温水を標準物質バイアルに）
【０３９３】
−２０ｕｌの緩衝液または標準物質をウェルに添加する
【０３９４】
−２５ｕｌの凝固因子ミックスをウェルに添加する（または２５ｕｌの緩衝液を標準物質ウェルに）
【０３９５】
−２０ｕｌのＦＶＩＩａＦｃウェルに添加する（または緩衝液を標準物質ウェルに）
【０３９６】
−３５ｕｌの血小板を添加する（事前にＡＤＰおよびＳＦＬＬＲＮを添加する）。血小板を標準物質ウェルに添加する。
【０３９７】
−装置にプレートを置き、Ｆｌｕｃａ緩衝液を調製し、プレートを装置に置いた５分後、反応を開始する（２０ｕｌＦｌｕｃａ／ウェルを添加する）。
（実施例１８）
【０３９８】
一過性トランスフェクションから生成されるタンパク質の分析
一過性トランスフェクションからのタンパク質の分析のために、ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩ−０１０、０１１、−０１３、−０１８、−００３、−０１９  −０２０および−０２４のトランスフェクション由来の馴化培地を、プロテインＡ免疫沈降に供した。要するに、細胞培養上清を、ほぼ５０ｕｌのプロテインＡ−セファロース５０％スラリーと混合して、４℃で１時間振盪しながらインキュベートし、次いで遠心分離してプロテインＡビーズをペレットにした。ビーズを、１ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁することによって２回洗浄し、スピンして、吸引する。そのビーズを、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で、減圧条件または非還元条件下で再懸濁して、１００℃で５分間加熱し、スピンダウンして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にロードして、標準的なプロトコールに従って泳動した。ゲルを、ニトロセルロース膜に移して、ウエスタンブロットを行い、Ｆｃ領域またはＦＶＩＩ軽鎖を検出した。Ｆｃ検出のために、用いた抗体は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特定の）−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体（Ｐｉｅｒｃｅ  ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ抗体，カタログ番号３１４１３）であった。ＦＶＩＩ軽鎖検出のために、抗軽鎖モノクローナル抗体を用いた（Ｇｒｅｅｎ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ，ｃｌｏｎｅ  ６ＭＡ−２１９）。この抗体を、５％の脱脂粉乳を含むＰＢＳＴ（ＰＢＳに加えて０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）中で、１：１５，０００（Ｆｃ検出のため）または１：２００（軽鎖検出のため）に希釈し、膜とともに室温で１時間インキュベートした。次いで、膜をＰＢＳＴ中で３回１０分間洗浄し、シグナルをＦｃ検出のための化学発光法によって検出した。ＦＶＩＩ軽鎖検出のためには、膜をさらに、ＰＢＳＴ中で１：５０００希釈した、ＨＲＰ−標識ヤギ抗−マウス抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，＃  １０１０−０５）を含有する溶液中で１時間インキュベートした。この膜をまた、ＰＢＳＴ中で３回１０分間洗浄して、シグナルを、化学発光法によって検出した。化学発光検出は、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  カタログ番号ＲＰＮ２１３２）を用いて、製造業者のプロトコールに従って行った。シグナルは、Ｓｔｏｒｍ  ８４０  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で可視化した。
【０３９９】
ＦＶＩＩ−０２４リンカー中のプロタンパク質転換酵素的切断部位のプロセシングに対するＰＣ５の効果を、図２６に示すように試験した。非還元条件下では、切断部位プロセシングに対するＰＣ５の効果は、検出できない。なぜなら、ＦＶＩＩ軽鎖−ＦｃおよびＦＶＩＩ重鎖−Ｆｃサブユニットは、Ｆｃ領域中で２つのジスルフィド結合を介して連結されたままであるからである（レーン２および３）。還元条件下で、本発明者らは、ＰＣ５と同時トランスフェクトされてない細胞から生成されたＦＶＩＩ−０２４の部分的プロセシング（レーン４）、ただし細胞がＰＣ５で同時トランスフェクトされた場合は、完全プロセシング（レーン５）を観察した。このリンカーの完全プロセシングによって、活性化されたＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）の分泌が生じる。なぜなら、重鎖の遊離のＮ末端が必要であり、タンパク質を活性化するのに十分であるからである。
（実施例１９）
【０４００】
ＦＸＩａによるＦＶＩＩ−０３９およびＦＶＩＩ−０４０の切断
ＦＸＩａによる活性化ＦＶＩＩ−０３９およびＦＶＩＩ−０４０（これらのタンパク質におけるＦＶＩＩ軽鎖のすぐ上流に挿入されたＦＸＩａ切断部位の結果として）をインビトロで特徴づけた。５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．４中に１５ｎＭのＦＸＩａを含有する、ＦＶＩＩ−０３９、ＦＶＩＩ−０４０またはＦＶＩＩ−０１１（不活性化された）の１．５μＭ溶液を、５分または２０分間インキュベートして、ＦＶＩＩＦｃの切断を、還元条件下でＳＤＳ  ＰＡＧＥによって、続いてＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙ染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって決定した。ＦＸＩａは、図２８に示されるように、ＦＶＩＩ−０３９、ＦＶＩＩ−０４０および不活性化されたＦＶＩＩ−０１１を切断できなかった。
（実施例２０）
【０４０１】
別の活性化可能なＦＶＩＩＦｃ構築物
ＦＸＩａがＦＶＩＩ−０３９およびＦＶＩＩ−０４０を切断できないことは、立体障害によって切断部位に対してプロテアーゼが接近できないことで生じた場合がある。ＦＸＩａまたはトロンビン切断部位の接近性を改善するためには、この部位は、重鎖に軽鎖が先行しない構造では重鎖の上流に位置する（軽鎖−リンカー−Ｆｃ−ｓｃＦｃリンカー−ＦＸＩａ／トロンビン切断部位−重鎖−リンカー−Ｆｃ）。いくつかの実施形態では、重鎖は、Ｉ１５２Ｖ変異体を含む、一旦、最高の切断部位が決定されれば、ｃｓｃＦｃが導入され、その結果細胞は、以下の構造を有するヘテロ二量体タンパク質を分泌する：軽鎖−リンカー−Ｆｃ（第二の鎖に結合されるジスルフィドである）：ＦＸＩａ／トロンビン切断部位−重鎖−リンカーＦｃ。
【０４０２】
図２８に示される構築物で観察される活性化のレベルを改善するために、図３１で図示される活性化可能な改変体の第二の生成（図６Ｅに示されるものと構造が同様）を用いて、切断部位の接近可能性を増大した。この例では、ＦＸＩａおよびトロンビン切断部位をこれらの構築物のために用いた（図３１を参照のこと）。構築物は、前に記載のように一過性にトランスフェクトされた。ＦＶＩＩＦｃは、プロテインＡを用いて培地から捕獲した。ビーズに結合したＦＶＩＩＦｃを、緩衝液中に入れ、ＦＸＩａまたはトロンビンを添加して、インキュベートした。ＦＶＩＩＦｃを、ビーズからＳＤＳ  ＰＡＧＥローディング緩衝液を用いて１００℃で５分間溶出した。そのゲルを、ロードして、ウエスタンブロットを行い、前に記載のようにＦｃを検出し、その結果を図３２に示す。図３２に示されるとおり、トロンビンおよび第ＸＩａ因子切断部位の両方とも、切断されて、適切な酵素の存在下でＦＶＩＩ重鎖および軽鎖分子を生じ得る。最高の切断が、構築物ＦＶＩＩ−０６０およびＦＶＩＩ−０６１について観察されたが、トロンビンの存在下で、負のコントロール（ＦＶＩＩ−０６２）については、切断は観察されなかった。
（実施例２１）
【０４０３】
第ＶＩＩ因子活性化可能な構築物
図３３に示される構築物は、（ＦＶＩＩ−０９０、ＦＶＩＩ−０８９およびＦＶＩＩ−０６２）であって、以前に記載のとおり、クローニングされ、発現され、精製された（これらのタンパク質は、活性化の必要がない）。クローニングのエラーに起因して「ＶＶＧＧＡ」配列を、ＦＶＩＩ−０６０およびＦＶＩＩ−０６１のＡＬＲＰＲトロンビン切断配列の後ろに挿入したが、一方でこの挿入は、活性に影響すると予想されるが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥベースのアッセイにおいてトロンビンによる切断の評価に影響するとは予測されない。この配列を、ＦＶＩＩ−０８９およびＦＶＩＩ−０９０中で除去した。１２５ｎＭのＦＶＩＩ−０９０、ＦＶＩＩ−０８９、ＦＶＩＩ−０６２、または血漿由来ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩ）に、漸増濃度のトロンビンを添加して、１０分間３７℃でインキュベートした。この混合物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動して、トロンビンによる切断を決定した（図３３）。ＦＶＩＩ軽鎖−ＦｃおよびＦＶＩＩ重鎖−Ｆｃの生成は、トロンビンとのインキュベーション後にＦＶＩＩ−０８９およびＦＶＩＩ−０９０について観察された。血漿由来ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ−０６２陰性コントロールのトロンビンによる切断がなかったという事実によって特異性が示される。ＦＶＩＩ−０８９およびＦＶＩＩ−０９０について切断有効性の有意な相違は観察されなかった。
【０４０４】
トロンビン生成アッセイを用いて、活性化可能な改変体ＦＶＩＩ−０９０の活性を測定した。ＦＶＩＩＩ欠損の血小板豊富な血漿におけるトロンビン生成アッセイは、前に記載のとおり行い、ただし凝固因子および血小板は、ＦＶＩＩＩ欠損の血小板豊富な血漿で置き換えている。図３４に示される結果は、トロンビン生成が、５０ｎＭのＦＶＩＩＦｃで活性化されたアッセイからである。図３４に示すとおり、トロンビンは、５０ｎＭのＦＶＩＩａＦｃによって生成する。２００ｎＭＦＶＩＩ−０９０（陰性コントロールＦＶＩＩ−０６２ではない）を５０ｎＭのＦＶＩＩＦｃに添加することによって、トロンビン生成の有意な増大が生じ、このことは、ＦＶＩ−０９０が、ＦＶＩＩＦｃによって生成されるトロンビンによって活性化されることを示唆する。なんらＦＶＩＩＦｃ活性化のないＦＶＩＩ−０９０は、活性化の存在しないＦＶＩＩ−０６２に対してトロンビン生成の増大を示す。これは、組織因子または接触経路活性化の残留レベルによって生成される少量のトロンビンからのＦＶＩＩ−０９０の活性化によって生じ得る。
（実施例２２）
【０４０５】
高い比活性の第ＶＩＩ因子活性化可能構築物
高い比活性のバージョンの第ＶＩＩ因子、ＦＶＩＩ−１００を作製するために、ＦＶＩＩ−０９０由来のＦＶＩＩ成熟配列のアミノ酸３１１〜３２２（ＬＱＱＳＲＫＶＧＤＳＰＮ，１７０−ループに相当する）を、トリプシンの１７０−ループ由来のアミノ酸ＥＡＳＹＰＧＫで置き換えた。この置換は、高い比活性を付与することが示された。
【０４０６】
さらなる高い比活性のバージョンの第ＶＩＩ因子、ＦＶＩＩ−１１５を構築した。このバージョンでは、１７０ループは野性型であるが、ＦＶＩＩの重鎖には３つのポイントミューテーション、Ｖ１５８Ｄ、Ｅ２９６ＶおよびＭ２９８Ｑがある。ＦＶＩＩ−１００およびＦＶＩＩ−１１５を、図４１に図示する。
【０４０７】
可溶性組織因子アッセイでは、ＦＶＩＩ−０１１（野性型ＦＶＩＩａＦｃ）の比活性は、１０，０００ＩＵ／ｍｇである。ＦＶＩＩ−０９０は、０．３２ＩＵ／ｍｇという比活性を、ＦＶＩＩ−１００は、０．２５ＩＵ／ｍｇという比活性、およびＦＶＩＩ−１１５は、１４ＩＵ／ｍｇという比活性を有する。従って、各々の活性化可能な形態（適切な酵素による活性化の前）は、このアッセイでは本質的に不活性である。
【０４０８】
活性化されたＦＶＩＩの状況では、このような高い比活性の改変体は、より有効であるという可能性を有するが、またアンチトロンビンのようなタンパク質による阻害をさらに受けやすい可能性もある。この阻害は、ＦＶＩＩａが活性であることに依存し；従って、活性化可能な高い比活性の改変体（不活性タンパク質として投与される）は、アンチトロンビン阻害に対してより耐性でなければならないが、損傷部位で一旦活性化されれば、高い比活性を有する可能性がある。
【０４０９】
トロンビンによる、精製されたＦＶＩＩ−０９０およびＦＶＩＩ−１００および１１５（高い比活性の改変体）の切断は、前に記載のとおり試験した。結果を図３５に示す。ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析では、３つのタンパク質が、トロンビンによって、匹敵する効率で切断されたことが示された。ＦＶＩＩ−１００について、ＦＶＩＩ重鎖−Ｆｃおよび軽鎖Ｆｃは、１バンド中で崩壊する。なぜなら、グリコシル化部位は、トリプシン１７０ループの挿入後に重鎖から除去され、ＦＶＩＩ  ＨＣ−Ｆｃバンドの質量を減らし、従ってこれは、ゲル上でより高速に移動し、ＦＶＩＩ  ＬＣ−Ｆｃバンドと共遊走するからである。トロンビン生成アッセイを用いて、活性化可能な改変体ＦＶＩＩ−０９０および高い比活性の改変体ＦＶＩＩ−１００の活性を測定した。前に本明細書で記載したとおり、トロンビン生成は、ヒト血小板、第Ｘ因子、第Ｖ因子、プロトロンビン、アンチトロンビンおよび組織因子経路インヒビターを用いて、再構成した系で試験した。活性は、５ｎＭトロンビン活性化の有無で測定した。
【０４１０】
図３６に示すとおり、ＦＶＩＩ−０９０の活性は、トロンビンの存在下で増強され、このことは、トロンビンによるＦＶＩＩ−０９０の活性化を示唆する。しかし、活性は、トロンビン活性化で高い比活性の改変体ＦＶＩＩ−１００の状況で有意に増大される。トロンビンの非存在下におけるｒＦＶＩＩ−１００について長い開始時間の高い活性によって、組織因子の残留レベル、トロンビンまたは接触経路活性化は、トロンビンを外因性に付加することなくＦＶＩＩ−１００を活性化するのに十分なトロンビンを生成し得る。図３７は、他の高い比活性の改変体、ＦＶＩＩ−１１５に関して同様の結果が得られたことを示す。
（実施例２３）
【０４１１】
種々のアッセイを用いる活性化可能な改変体の活性の確認
本実施例では、色素生産性アッセイを用いて、ＦＶＩＩ活性を測定した。用いたアッセイの１つは、ＦＶＩＩａによって色素生産性基質の切断を測定することによってＦＶＩＩａＦｃのアミド分解活性を測定する。これらのうち別のアッセイは、ＦＶＩＩａがＦＸを活性化する能力を測定することによってＦＸ活性化の活性を測定するが、これは活性化されるＦＸ（ＦＸａ）によって切断される色素生産性基質のレベルを測定することによって決定される。
【０４１２】
アミド分解アッセイにおいて、色素生産性基質Ｃｈｒｏｍｏｚｙｍｅ  ｔ−ＰＡを用いた。ＦＶＩＩａは、この基質を用量依存性の方式で切断する。この基質はまた、トロンビンによって切断されるが、このトロンビンによる切断は、ヒルジンによって阻害され得る（データ示さず）。
【０４１３】
図３８に示されるとおり、活性化可能な改変体のアミド分解活性は、トロンビン活性化後に測定し得、ＦＶＩＩ−０９０に比較して高い比活性の改変体について大きいアミド分解活性がある。これらのアッセイでは、トロンビンによる活性化可能な分子の活性化後、ヒルジンを添加して、色素生産性基質のトロンビン切断を阻害する。この方式では、トロンビンは、ＦＶＩＩａ活性を検出する能力を妨害しない。
【０４１４】
ＦＶＩＩａによるＦＸの活性化はまた、高い比活性のＦＶＩＩ活性化可能な改変体でも増強される。ＦＶＩＩａによるＦＸの活性を測定するために、基質Ｓ２７６５を用いた。この色素生産性基質はまた、ＦＸによっても認識される。このアッセイでは、１０ｕＭのＦＸを、ＦＶＩＩａＦｃとともに１５分間インキュベートして、反応をＥＤＴＡでクエンチした。図３９は、ＦＶＩＩａＦｃによるＦＸ活性化が検出され得ることを示すコントロール実験の結果を示す。
【０４１５】
図４０に示される実験によって、高い比活性の活性化可能な改変体ＦＶＩＩ−１００についてのＦＸ活性化活性の増大があることが示される。この実験では、ＦＶＩＩＦｃ（１００ｎＭ）をトロンビン（１００ｎＭ）で２０分間、３７℃で活性化した。ヒルジンを添加してトロンビンを阻害した。ＦＸ（１０ｕＭ）を添加して、１５分間３７℃でインキュベートし、続いてＥＤＴＡによって反応を阻害した。Ｓ２７６５基質を添加して、ＦＸａ  生成を、基質切断をモニタリングすることによって検出した。
（実施例２４）
【０４１６】
単量体Ｆｃ分子はまた、活性化可能な形態で合成され得る。
３つの単量体の構築物を、図４１に示されるように作製した。ＦＶＩＩ−１１８では、ＡＬＲＰＲ切断部位を、軽鎖と重鎖との間に挿入した。ＦＶＩＩ−１１９では、配列ＧＧＧＧＳ−ＡＬＲＰＲを、軽鎖と重鎖との間に挿入した。ＦＶＩＩ−１２７については、構築物を、ＦＶＩＩ−１１８のように、ただし、ＦＶＩＩ−１００で用いられる同じ高い比活性の変異体を用いて作製した。これらの構築物の不活性化精製型の比活性を、可溶性の組織因子アッセイで試験して、ＦＶＩＩ−０１１（１０，０００ＩＵ／ｍｇという活性を有した野性型ＦＶＩＩａＦｃ）と比較した。ＦＶＩＩ−１１８は、４．５ＩＵ／ｍｇという活性を有し、ＦＶＩＩ−１２７は、１．８ＩＵ／ｍｇという活性を有し、これによって、これらの分子が、それらの活性化可能な形態で本質的に活性がなかったことが示された。
【０４１７】
ＦＶＩＩ−１１８、ＦＶＩＩ−１１９およびＦＶＩＩ−０９０のトロンビン切断反応、続いてＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を、以前に記載のとおり行った。図４２で示されるように、活性化可能な構築物中の切断部位は、モノマーおよびヘテロ二量体Ｆｃ分子の両方の状況で切断可能であり得る。この図では、トロンビン濃度が増大している不活性化されたＦＶＩＩＦｃバンドの強度の低下は、ＦＶＩＩ−１１８、ＦＶＩＩ−１１９、およびＦＶＩＩ−０９０構築物について同様である。
【０４１８】
別の活性化可能な単量体の構築物、ＦＶＩＩ−１２７を作製して、試験した。ＦＶＩＩ−１２７は、ＦＶＩＩ−１１８の骨格を有し、ただし、高い比活性を付与するためにＦＶＩＩ−１００において用いたのと同じ１７０ループ置換を有する。図４３に示すとおり、ＦＶＩＩ−１２７の活性は、高い比活性のアミノ酸置換を欠いているＦＶＩＩ−１１８と比較して有意に増大される。トロンビンの非存在下におけるＦＶＩＩ−１２７について長い開始時間の高い活性によって、組織因子の残留レベル、トロンビンまたは接触経路活性化は、トロンビンを外因性に付加することなくＦＶＩＩ−１２７を活性化するのに十分なトロンビンを生成し得ることが示唆される。ＦＶＩＩ−１２７活性は、トロンビンによって加速される。
（実施例２５）
【０４１９】
活性型のＧＰＩＩｂＩＩＩａに対して標的されたＦＶＩＩａＦｃ改変体  
本実施例では、図４４Ａに図示される構築物を、以前に記載のとおり、クローニングして、一過性に発現して、精製して、活性化した。ＦＶＩＩ−０６６を、ＰＣ５を用いて同時トランスフェクトして、タンパク質配列が記載されたｃｓｃＦｃリンカーを完全にプロセシングして、第一のＦｃ部分を血小板標的部分に接続した。これらの構築物は、標的部分ＳＣＥ５（ＧＰＩＩｂＩＩＩａの活性な高次構造に対するｓｃＦｖ）を使用した。ＳＣＥ５は、マウスおよびヒトのレセプターと交差反応することが示された。ＳＣＥ５標的部分を、ＦＶＩＩＦｃの第二のＦｃ部分のＮ末端（ＦＶＩＩ−０６６）またはＣ末端（ＦＶＩＩ−０６７）で置き換えた。さらに、ＳＣＥ５を、ＦＶＩＩａ（ＦＶＩＩ−０９４）のＣ末端で置き換えた。ＦＶＩＩａＦｃ（ＦＶＩＩ−０１１）およびＮｏｖｏｓｅｖｅｎを、コントロールとして用いた。図４４Ｂに示されるとおり、これらのタンパク質を、以前に記載のとおりＦＶＩＩＩ欠損のヒト血漿においてトロンビン生成アッセイによって試験した。これらの実験によって、コントロールに対してＳＣＥ５標的部分を含んでいる全てのタンパク質についてトロンビン生成の速度の増大が明らかになった。最高速度のトロンビン生成が、ＦＶＩＩ−０６６で、続いてＦＶＩＩ−０９４およびＦＶＩＩ−０６７で観察され、このことでＳＣＥ５標的部分の配置は、タンパク質の活性に対して有意な影響を有し得ることが示唆された。活性化されたヒト血小板に対するこれらのタンパク質の結合は、前に記載のとおりＦＡＣＳアッセイで測定した（図４４Ｃ）。ＳＣＥ５標的部分を含んでいる全てのＦＶＩＩａタンパク質は、ＦＶＩＩａＦｃコントロールに対する血小板の結合の増大を示した。これによって、ＦＶＩＩａに対するＳＣＥ５標的部分の結合は、血小板からその親和性を増大し得ることが示される。ＳＣＥ５標的部分は、マウスＧＰＩＩｂＩＩＩａレセプターとの相互作用を示したので、ＦＶＩＩ−０６６を、トロンビン生成アッセイで、マウスＦＶＩＩＩ欠損の血小板豊富な血漿を用いて、ならびに再構成システムでは、ヒトの精製された成分および血小板を、以前に記載のとおり用いて試験した。（図２９）。本発明者らは、両方のシステムにおいてコントロールに対してＦＶＩＩ−０６６についてトロンビン生成の速度の増大を観察した。
（実施例２６）
【０４２０】
活性型のＧＰＩＩｂＩＩＩａに対して標的化された追加のＦＶＩＩａＦｃ改変体
本実施例では、図１２Ａに図示される構築物ＦＶＩＩ−０２７をクローニングし、発現し（ＰＣ５を用いて同時トランスフェクションして、タンパク質配列が記載されたｃｓｃＦｃリンカーを完全にプロスセシングして、第一のＦｃ部分を血小板標的部分に接続する）、精製して、活性化した（以前に記載のとおり）。この構築物は、標的部分ＭＢ９（ＧＰＩＩｂＩＩＩａの活性な高次構造に結合することが示されたｓｃＦｖ）を使用する。ＦＡＣＳアッセイは、以前に記載のとおり行って、活性化された血小板に対する結合を評価し、ＦＶＩＩ−０２７が、ＦＶＩＩ−０１１コントロールよりも高い親和性を有する活性化された血小板に対して結合することが示された（図１２Ｂ）。トロンビン生成アッセイを、再構成された精製されたヒトタンパク質および血小板を用いて、以前に記載のとおり行った（図１３Ａ、１３Ｂおよび１３Ｃ）。ＦＶＩＩ−０２７は、コントロールに対してトロンビン生成の速度の増大を示した。図１３Ｄでは、トロンビン生成アッセイに基づいて、ＦＶＩＩ−０２７は、ＦＶＩＩ−０１１またはＮｏｖｏｓｅｖｅｎよりも４倍大きい活性を有することが図示される。図１４では、ＦＶＩＩ−０２７の血小板結合およびトロンビン生成活性の増強が、ＰＡＣ１（ＧＰＩＩｂＩＩＩａの活性化型に対する結合についてＭＢ９と競合する抗体）によって廃されることを図示しており、このことは、この効果がＭＢ９と活性化型のＧＰＩＩｂＩＩＩａとの相互作用によって媒介されることを示している。ＭＢ９標的部分はまた、図１５に図示されるＦＶＩＩ−０３７を生成するためにＦＶＩＩＦｃの第二のＦｃ部分のＣ末端に配置された。血小板を用いるＦＶＩＩＩ欠損の再構成された系でのトロンビン生成アッセイによって、Ｎｏｖｏｓｅｖｅｎコントロールに対してＦＶＩＩ−０３７についてトロンビン生成の速度増大が明らかになった（図１６）。
（実施例２７）
【０４２１】
活性化された血小板および不活性化された血小板の両方に対して標的化された第ＶＩＩ因子構築物
本実施例では、図４５Ａに図示される構築物を、以前に記載のとおり、クローニングし、発現し、精製して、活性化した。ＦＶＩＩ−０８８を、ＰＣ５と同時トランスフェクトして、タンパク質配列が記載されたｃｓｃＦｃリンカーを完全にプロセシングして、第一のＦｃ部分を血小板標的部分に接続した。ＦＶＩＩ−０８８およびＦＶＩＩ−１２５は、ＡＰ３標的部分（ヒトＧＰＩＩｂＩＩＩａに活性なおよび不活性な高次構造の両方に結合するｓｃＦｖ）を使用した。図４５Ｂの結果によって、ＦＶＩＩＩ欠損の血小板豊富な血漿におけるトロンビン生成アッセイが示され、そしてＦＶＩＩ−０８８およびＦＶＩＩ−１２５の両方とも、コントロールに対してトロンビン生成の速度増大を示し、このことは、ＧＰＩＩｂＩＩＩａの活性なおよび不活性な高次構造に対するＦＶＩＩａＦｃまたはＦＶＩＩａの標的が、活性の増大を生じることを示している。活性化されたヒト血小板に対するＦＶＩＩ−０８８およびＦＶＩＩａＦｃの結合を、ＦＡＣＳ（図４５Ｃ）によって試験した。これらのデータによって、ＦＶＩＩ−０８８が血小板に対して、ＦＶＩＩＦｃ（ＦＶＩＩ−０１１）よりも高い親和性で結合することが明らかになり、これによって、ＡＰ３標的部分が、血小板についてＦＶＩＩａＦｃの親和性を増大し得ることが示される。
【０４２２】
Ｒｏｔａｔｉｏｎ  Ｔｈｒｏｍｂｏｅｌａｓｔｏｍｅｔｒｙ（ＲＯＴＥＭ（登録商標）、Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ  ＧｍｂＨ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）は、血小板−標的化ＦＶＩＩａ構築物を評価するための別の方法である。なぜなら、これによって全血中での（血小板の存在下での）いくつかの凝固パラメーターの特徴付けが可能になるからである。ＦＶＩＩ−０８８および野性型組み換えＦＶＩＩａＦｃ（ｒＦＶＩＩａＦｃ）が強固でかつ安定な凝固を形成する能力を、ＲＯＴＥＭによって、塩化カルシウムを活性化因子（ＮＡＴＥＭ）として用いて、製造業者の推奨に従って評価した。ヒトドナー由来の血小板Ａ血液を、ＦＶＩＩＦｃを用いて１００、３０または１０ｎＭという最終濃度までスパイクした。ＮＡＴＥＭ反応は、ＣａＣｌ２の添加によって開始した。凝固パラメーター、例としては、凝固時間（凝血開始時間に関する）、血栓形成時間（凝血速度に関する）およびアルファ角（凝血速度に関する）を、図３０に示すとおり評価した。ＦＶＩＩ−０８８は、ＦＶＩＩ−０８８の凝固反応速度の増強と一致して、凝固時間および血栓形成時間の有意な低下、ならびに野性型ｒＦＶＩＩＦｃに対するアルファ角の増大を示した。これらのデータによって、ＦＶＩＩ−０８８は、トロンビン生成アッセイと一致して野性型ＦＶＩＩＦｃに対して活性の増強があることが示される。
（実施例２８）
【０４２３】
血小板に対してＦＶＩＩａを標的するためのペプチドの使用
図４６Ａに図示される構築物を、以前に記載のとおり、クローニングし、発現し、精製して、活性化した。これらのタンパク質を、血小板レセプターＧＰＩｂ−α（活性化されたおよび不活性化された血小板で見出される）に結合するペプチド、特異的にはＰＳ４、ＯＳ１、およびＯＳ２を血小板標的化部分として用いて作製した。これらの分子の作製おいて、ペプチドを、この構築物の第二のＦｃ部分のＮ末端またはＣ末端のいずれかに結合した。ＦＶＩＩ−０４４構築物は、この構築物の第二のＦｃ部分のＣ末端に結合されたＰＳ４ペプチドを使用し；ＦＶＩＩ−０４５は、この構築物の第二のＦｃ部分のＣ末端に結合されたＯＳ１ペプチドを使用し；そしてＦＶＩＩ−０４６構築物は、この構築物の第二のＦｃ部分のＣ末端に結合されたＯＳ２分子を使用した。対照的に、ＦＶＩＩ−０４７構築物は、この構築物の第二のＦｃ部分のＮ末端に結合されたＰＳ４ペプチドを使用し；ＦＶＩＩ−０４８分子は、この構築物の第二のＦｃ部分のＮ末端に結合されたＯＳ１ペプチドを使用し；そしてＦＶＩＩ−０４９分子は、この構築物の第二のＦｃ部分のＮ末端に結合されたＯＳ２ペプチドを使用した。トロンビン生成アッセイは、以前に記載のとおりＦＶＩＩＩ欠損の血小板豊富な血漿を用いて行った。図４６Ｂに示すとおり、このアッセイを、限界濃度のＦＶＩＩａで行った場合、ＦＶＩＩ−０４４、ＦＶＩＩ−０４５、およびＦＶＩＩ−０４６のＣ−末端融合構築物の各々が、Ｎｏｖｏｓｅｖｅｎコントロールに比較して増強されたトロンビン生成を示した。同様の結果を、Ｎ末端融合構築物について図４７Ａに示す。図４７Ｂでは、ＦＶＩＩ−０４５構築物が、このアッセイにおいてＦＶＩＩ−０４８構築物よりもわずかに優れている場合があること、ただし、やはりＮ末端およびＣ末端融合の両方ともＮｏｖｏｓｅｖｅｎコントロールよりも優れていることが示される。さらに、各々のペプチドについて公開されたＧＰＩｂ−α親和性（図４８）とＦＶＩＩＦｃに対して組み換え的に融合された場合そのペプチドと関連する活性の増大との間に相関がある。図４８は、ＦＡＣＳで決定した、活性化血小板に対するＦＶＩＩ−０４９、ＦＶＩＩ−０４８および野性型ＦＶＩＩＦｃ（ＦＶＩＩ−０１１コントロール）の結合、ならびにＢｅｒｎａｒｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００８．４７：４６７４−４６８２に報告される標的ポリペプチドについての親和性を示す。ＦＡＣＳデータによって、ＦＶＩＩ−０１１コントロールに対する血小板についてのＦＶＩＩ−０４５およびＦＶＩＩ−０４８の活性の増大が明らかになった。
（実施例２９）
【０４２４】
活性型のＧＰＩＩｂＩＩＩａに対して標的されるＡｎＦＶＩＩＩＦｃ改変体
図４９Ａに図示される構築物は、以前に記載のとおり作製された。ＦＶＩＩＩ−０４１は、野性型ＦＶＩＩＩＦｃであるが、ＦＶＩＩＩ−１０８は、第二のＦｃ部分のＮ末端でＳＣＥ５血小板標的化部分を有する。発現のために、ＦＶＩＩＩ−１０８を、ＰＣ５を用いて同時トランスフェクトして、タンパク質配列が記載されたｃｓｃＦｃリンカーを完全にプロセシングして、第一のＦｃ部分を血小板標的部分に接続する。これらのタンパク質を、以前に記載のとおりＦＶＩＩＩ欠損の血小板豊富な血漿を用いてトロンビン生成アッセイで試験し、ただし、さらに、トロンビン生成アッセイはまた、組織因子でも活性化した。図４９Ｂに示すとおり、ＦＶＩＩＩＦｃの標的化バージョンを用いて有意な改善は示されなかった。本明細書に記載されるトロンビン生成アッセイは、血小板の表面上でのトロンビン生成を測定し、従って活性の正確な指標であることが注目に値する。
（実施例３０）
【０４２５】
Ｇｌａドメインを欠く血小板に対して標的されたＦＶＩＩのバージョンの作製および試験
本実施例では、図２１に図示されるバージョンのＦＶＩＩａＦｃを生成した。このタンパク質は、Ｎ末端でＭＢ９  ｓｃＦｖおよびＧｌａドメイン除去する欠失を有する。ＦＶＩＩ−０５３は、細胞内活性化のために軽鎖と重鎖との間に挿入されたＲＫＲＲＫＲ配列を含む。ＦＶＩＩ−０５３を、一過性に発現して（タンパク質の活性化を生じるＲＫＲＲＫＲ配列のプロセシングのためにＰＣ５で同時トランスフェクトした）、以前に記載のとおり精製した。精製した成分および血小板を用いるトロンビン生成アッセイによって、ＦＶＩＩ−０５３がいくつかの活性を有する（図２２）（この活性がＦＶＩＩ−０１１コントロールに対して損なわれるにもかかわらず（図２２Ｄ））ことが明らかになる。図２３のデータは、ＧＰＩＩｂＩＩＩａ結合についてＭＢ９と競合するＰＡＣ１抗体がいかに、ＦＶＩＩ−０５３と関連するトロンビン生成活性を阻害するかを示しており、これによって血小板標的化は、活性に重要であることが示唆される。ＦＶＩＩ−０５３と同一（ただしＲＫＲＲＫＲ挿入物を欠いている）別の構築物を生成し（ＦＶＩＩ−０２８）不活性化されたＦＶＩＩ−０１１と一緒に不活性化するのにおいてＰｋ研究で試験した。図５０に示されるとおり、標的化されたＧｌａ−なしのＦＶＩＩ−０２８分子の終末半減期は、ＦＶＩＩ−０１１コントロールの半減期（７．１時間）よりもほぼ３倍長く（２０．３時間）、このことは、Ｇｌａドメインを除去すれば、ＦＶＩＩＦｃの終末半減期が増大することを示唆している。
（実施例３１）
【０４２６】
血小板標的したＦＩＸ分子
本実施例では、図５１Ａに図示されるＦＩＸ構築物を作製して、試験した。ＦＩＸ−０６８を、ＰＣ５で同時トランスフェクトして、タンパク質配列が記載されるｃｓｃＦｃリンカーを完全にプロセシングし、第一のＦｃ部分を標的部分に接続した。ＦＩＸ−０６８は、第二のＦｃ部分のＮ末端にＳＣＥ５血小板標的部分を有するが、ＦＩＸ−０８８は、第二のＦｃ部分のＣ末端にＳＣＥ５を有する。ＦＩＸ−０９０は、ＦｃドメインなしのＦＩＸ構築物であり、ＦＩＸタンパク質のＣ末端に結合されたＳＣＥ５部分を有する。ＦＩＸ−０４２は、標的部分のない単鎖のＦｃとしてのＦＩＸＦｃであり、コントロールとして作製された。ＢｅｎｅＦＩＸ（Ｐｆｉｚｅｒ）もまた、コントロールとしても用いられた。トロンビン生成アッセイで誤った結果を生じるＢｅｎｅＦＩＸサンプル由来の微量の活性化されたＦＩＸ（ＦＩＸａ）を除去するため、ＢｅｎｅＦＩＸサンプルを、不可逆的な活性部位インヒビターであるグルタミル−グリシル−アルギニル−クロロメチルケトン（Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理した。ＢｅｎｅＦＩＸを、過剰量のインヒビターとともに室温で１８０分間インキュベートした。次いでそのサンプルを透析して、未結合のインヒビターを除去した。この処理したＢｅｎｅＦＩＸは以降、ＢｅｎｅＦＩＸと呼ぶ。作製された分子の比活性は、ＦＩＸ−０４２、６ＩＵ／ｎｍｏｌ；ＦＩＸ０６８、５．１ＩＵ／ｎｍｏｌ；ＦＩＸ−０８８、３．５ＩＵ／ｎｍｏｌ；ＦＩＸ−０９０、１３．８ＩＵ／ｎｍｏｌ、およびＢｅｎｅＦＩＸ、１２ＩＵ／ｎｍｏｌであった。これらの構築物（ＦＩＸ−０６８、ＦＩＸ−０８８およびＦＩＸ−０４２）を、図５１Ｂに示されるように、血小板豊富なＦＩＸ欠損の血漿において、トロンビン生成アッセイで試験した場合、各々の標的された分子は、ＦＩＸ−０４２コントロールよりも高い活性を有した。図５１Ｃは、ＦＩＸ−０６８およびＦＩＸ−０８８の両方とも、トロンビン生成で測定した場合、ＦＩＸ−０４２よりも少なくとも４倍大きい活性を有することを図示する。ＦＩＸ−０４２の１つ以上の活性は、ＦＩＸ−０６８およびＦＩＸ−０８８よりも高いので、トロンビン生成アッセイで観察される活性の増大は、過小評価され得、従って、血小板標的による活性の増大は、４倍より大きい場合がある。
【０４２７】
図５２Ａに示されるとおり、ＦＩＸ−０９０（Ｆｃを欠く）も、ＢｅｎｅＦＩＸに対して活性の増大を示し、このことは、Ｆｃの非存在下で血小板に対してＦＩＸを標的化することはまた活性も増大することを示唆している。図５２Ｂは、ＦＩＸ−０９０の活性がＢｅｎｅＦＩＸの少なくとも４倍であることを示す。ＦＩＸ−０９０およびＢｅｎｅＦＩＸの両方とも同様の比活性を有するので、トロンビン生成アッセイでの活性の４倍の増大は、血小板標的化効果によって生じたに違いない。
（実施例３２）
【０４２８】
血小板に対してＦＩＸを標的化するためのペプチドの使用
本実施例では、図５３Ａに図示されるＦＩＸ−０８９構築物を、以前に記載のとおり、クローニングして、一過性に発現して、精製した。この分子は、この構築物の第二のＦｃ部分のＮ末端に結合された、ＧＰＩｂ−αレセプターに結合するＯＳ１ペプチドを含む。ＦＩＸ−０８９構築物の比活性は、コントロールのＦＩＸ−０４２分子のコントロールについての６ＩＵ／ｎｍｏｌに比べて、２．４ＩＵ／ｎｍｏｌであった。
【０４２９】
図５３Ｂに示されるとおり、ＦＩＸ−０８９分子は、ＦＩＸ−血小板豊富な血漿を用いるトロンビン生成アッセイにおいてＦＩＸ−０４２コントロールよりも活性であり；これは、ＦＩＸの限界濃度では特に明白である。図５３Ｃによって、ＦＩＸ−０８９が、トロンビン生成で測定した場合、ＦＩＸ−０４２よりもほぼ４倍強いが、一方で有する不活性は低いことが示される。これによってさらに、ＧＰＩｂに対する標的化は、ＦＩＸＦｃの活性を増大することが示唆される。
【０４３０】
ドラフトの配列表
ＦＶＩＩ−０２７アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Ｆｃ領域にＦＶＩＩまたはＭＢ９を接続するリンカー領域は、下線を付しており、そしてプロタンパク質転換酵素プロセシング部位を有するリンカーは、太字で示している
【０４３１】
【化１】
2013534427.tif 000004
ＦＶＩＩ−０２７のＤＮＡ配列
【０４３２】
【化２】
2013534427.tif 000005
Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ−ＦＶＩＩ−０２７−１  ＤＮＡ配列
【０４３３】
【化３】
2013534427.tif 000006
Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ−ＦＶＩＩ−０２６−２  ＤＮＡ配列
【０４３４】
【化４】
2013534427.tif 000007
ＦＶＩＩ−０３７アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Ｆｃ領域にＦＶＩＩまたはＭＢ９を接続するリンカー領域は、下線を付しており、そして両方のＦｃｓ部位を接続するリンカーは、太字で示している
【０４３５】
【化５】
2013534427.tif 000008
ＦＩＸ−０３７  ＤＮＡ配列
【０４３６】
【化６】
2013534427.tif 000009
ＦＶＩＩ−０５３アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、Ｆｃ領域に対してＦＶＩＩを接続するリンカー領域は、下線を付しており、両方のＦｃｓ部位を接続するリンカーは、太字で示している、そしてＭＢ９は、イタリック体にしている。
【０４３７】
【化７】
2013534427.tif 000010
ＦＶＩＩ−０５３  ＤＮＡ配列
【０４３８】
【化８】
2013534427.tif 000011
ＦＶＩＩ−０４４アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Ｆｃ領域に対してＦＶＩＩまたはＰＳ４を接続するリンカー領域は、下線を付しており、両方のＦｃｓ部位を接続するリンカーは、太字で示しており、そしてＰＳ４ペプチドは、イタリック体にしている。
【０４３９】
【化９】
2013534427.tif 000012
ＦＶＩＩ−０４４  ＤＮＡ配列
【０４４０】
【化１０】
2013534427.tif 000013
ＦＶＩＩ−０４５アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Ｆｃ領域に対してＦＶＩＩまたはＯＳ１を接続するリンカー領域は、下線を付しており、両方のＦｃｓ部位を接続するリンカーは、太字で示しており、そしてＯＳ１ペプチドは、イタリック体にしている。
【０４４１】
【化１１】
2013534427.tif 000014
ＦＶＩＩ−０４５  ＤＮＡ配列
【０４４２】
【化１２】
2013534427.tif 000015
ＦＶＩＩ−０４６アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Ｆｃ領域に対してＦＶＩＩまたはＯＳ２を接続するリンカー領域は、下線を付しており、両方のＦｃｓ部位を接続するリンカーは、太字で示しており、そしてＯＳ２ペプチドは、イタリック体にしている。
【０４４３】
【化１３】
2013534427.tif 000016
ＦＶＩＩ−０４６のＤＮＡ配列
【０４４４】
【化１４】
2013534427.tif 000017
ＦＶＩＩ−０４７アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Ｆｃ領域に対してＦＶＩＩまたはＰＳ４を接続するリンカー領域は下線を付しており、そしてＰＳ４ペプチドは、イタリック体にしている。  
【０４４５】
【化１５】
2013534427.tif 000018
ＦＶＩＩ−０４７のＤＮＡ配列
【０４４６】
【化１６】
2013534427.tif 000019
ＦＶＩＩ−０４８アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Ｆｃ領域に対してＦＶＩＩまたはＯＳ１を接続するリンカー領域は下線を付しており、そしてＯＳ１ペプチドは、イタリック体にしている。
【０４４７】
【化１７】
2013534427.tif 000020
ＦＶＩＩ−０４８のＤＮＡ配列
【０４４８】
【化１８】
2013534427.tif 000021
ＦＶＩＩ−０４９アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Ｆｃ領域に対してＦＶＩＩまたはＯＳ２を接続するリンカー領域は下線を付しており、そしてＯＳ２ペプチドは、イタリック体にしている。
【０４４９】
【化１９】
2013534427.tif 000022
ＦＶＩＩ−０４９のＤＮＡ配列
【０４５０】
【化２０】
2013534427.tif 000023
ＦＶＩＩ−０１１アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Ｇｌａドメインは、イタリック体にしており、Ｆｃ領域に対してＦＶＩＩを接続するリンカー領域は、下線を付しており、そして両方のＦｃｓ部位を接続するリンカーは、太字で示している。
【０４５１】
【化２１】
2013534427.tif 000024
ＦＶＩＩ−０１１  ＤＮＡ配列
【０４５２】
【化２２】
2013534427.tif 000025
Ｂドメイン欠失のＦＶＩＩＩアミノ酸配列：シグナルペプチドは下線であり；ＨＣ配列とＬＣ配列との間の１４アミノ酸リンカー（残りのＢドメインを含んでいる）は、二重の下線であり、太字で示されるＳ７４３／Ｑ１６３８融合部位を備える。
【０４５３】
【化２３】
2013534427.tif 000026
全長ＦＶＩＩＩアミノ酸配列：シグナルペプチドは下線
【０４５４】
【化２４】
2013534427.tif 000027
ＦＩＸアミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは二重の下線である。
【０４５５】
【化２５】
2013534427.tif 000028
ＦＩＸ  ＤＮＡ配列
【０４５６】
【化２６】
2013534427.tif 000029
ＦＸアミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは二重の下線である。
【０４５７】
【化２７】
2013534427.tif 000030
ＦＸ  ＤＮＡ配列
【０４５８】
【化２８】
2013534427.tif 000031
ＦＶＩＩ−０６６のＤＮＡ配列
【化２９】
2013534427.tif 000032
ＦＶＩＩ−０６６アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Ｆｃ領域に対してＦＶＩＩまたはＳＣＥ５を接続するリンカー領域は、下線を付しており、そしてプロタンパク質転換酵素プロセシング部位を有するリンカーは、太字で示している
【０４５９】
【化３０】
2013534427.tif 000033
ＦＶＩＩ−０５７のＤＮＡ配列
【０４６０】
【化３１】
2013534427.tif 000034
ＦＶＩＩ−０５７アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Ｆｃ領域に対してＦＶＩＩ軽鎖または重鎖を接続するリンカー領域は、下線を付しており、Ｆｃおよび第ＸＩａ因子切断部位を接続するリンカー領域は、太字で示しており、そして第ＸＩａ因子切断部位は、破線の下線で示す。
【０４６１】
【化３２】
2013534427.tif 000035
ＦＶＩＩ−０５８のＤＮＡ配列
【０４６２】
【化３３】
2013534427.tif 000036
ＦＶＩＩ−０５８アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Ｆｃ領域に対してＦＶＩＩ軽鎖または重鎖を接続するリンカー領域は、下線を付しており、Ｆｃおよびトロンビン切断部位を接続するリンカー領域は、太字で示しており、そしてトロンビン切断部位は、破線の下線で示す
【０４６３】
【化３４】
2013534427.tif 000037
ＦＶＩＩ−０５９のＤＮＡ配列
【０４６４】
【化３５】
2013534427.tif 000038
ＦＶＩＩ−０５９アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Ｆｃ領域に対してＦＶＩＩ軽鎖または重鎖を接続するリンカー領域は、下線を付しており、Ｆｃおよびトロンビン切断部位を接続するリンカー領域は、太字で示しており、そしてトロンビン切断部位は、破線の下線で示す
【０４６５】
【化３６】
2013534427.tif 000039
ＦＶＩＩ−０６０のＤＮＡ配列のＤＮＡ配列
【０４６６】
【化３７】
2013534427.tif 000040
ＦＶＩＩ−０６０アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Ｆｃ領域に対してＦＶＩＩ軽鎖または重鎖を接続するリンカー領域は、下線を付しており、Ｆｃおよびトロンビン切断部位を接続するリンカー領域は、太字で示しており、そしてトロンビン切断部位は、破線の下線で示す。
【０４６７】
【化３８】
2013534427.tif 000041
ＦＶＩＩ−０６１のＤＮＡ配列
【０４６８】
【化３９】
2013534427.tif 000042
ＦＶＩＩ−０６１アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Ｆｃ領域に対してＦＶＩＩ軽鎖または重鎖を接続するリンカー領域は、下線を付しており、Ｆｃおよびトロンビン切断部位を接続するリンカー領域は、太字で示しており、そしてトロンビン切断部位は、破線の下線で示す
【０４６９】
【化４０】
2013534427.tif 000043
ＦＶＩＩ−０６２のＤＮＡ配列
【０４７０】
【化４１】
2013534427.tif 000044
ＦＶＩＩ−０６２アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Ｆｃ領域に対してＦＶＩＩａ軽鎖または重鎖を接続するリンカー領域は、下線を付しており、そしてＦｃおよびＦＶＩＩａ重鎖を接続するリンカー領域は、太字で示す
【０４７１】
【化４２】
2013534427.tif 000045
ＦＶＩＩ−０９０のＤＮＡ配列
【化４３】
2013534427.tif 000046
ＦＶＩＩ−０９０アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Ｆｃ領域に対してＦＶＩＩ軽鎖または重鎖を接続するリンカー領域は、下線を付しており、Ｆｃおよびトロンビン切断部位を接続するリンカー領域は、太字で示しており、そしてトロンビン切断部位は、破線の下線で示す
【０４７２】
【化４４】
2013534427.tif 000047
ＦＶＩＩ−１００のＤＮＡ配列
【０４７３】
【化４５】
2013534427.tif 000048
ＦＶＩＩ−１００アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Ｆｃ領域に対してＦＶＩＩ軽鎖または重鎖を接続するリンカー領域は、下線を付しており、Ｆｃおよびトロンビン切断部位を接続するリンカー領域は、太字で示している，トロンビン切断部位は、破線の下線で示す、そしてトリプシン１７０ループ領域は、波線の下線を付す。
【０４７４】
【化４６】
2013534427.tif 000049
ＦＶＩＩ−１１５のＤＮＡ配列  
【０４７５】
【化４７】
2013534427.tif 000050
ＦＶＩＩ−１１５アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Ｆｃ領域に対してＦＶＩＩ軽鎖または重鎖を接続するリンカー領域は、下線を付しており、Ｆｃおよびトロンビン切断部位を接続するリンカー領域は、太字で示しており、トロンビン切断部位は、破線の下線で示す、そしてＦＶＩＩａにおける３つの点変異（Ｖ１５８Ｄ、Ｅ２９６ＶおよびＭ２９８Ｑ）は太字でかつ下線を付している。
【０４７６】
【化４８】
2013534427.tif 000051
ＦＶＩＩ−１１８のＤＮＡ配列
【０４７７】
【化４９】
2013534427.tif 000052
ＦＶＩＩ−１１８アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、トロンビン切断部位は、破線の下線で示し、Ｆｃ領域に対してＦＶＩＩ重鎖を接続するリンカー領域は下線を付しており、そしてＦｃ領域を接続するリンカー領域は、太字で示している
【０４７８】
【化５０】
2013534427.tif 000053
ＦＶＩＩ−１１９のＤＮＡ配列
【０４７９】
【化５１】
2013534427.tif 000054
ＦＶＩＩ−１１９アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、ＧＧＧＳリンカーを有するトロンビン切断部位は下線で示し、Ｆｃ領域に対してＦＶＩＩ重鎖を接続するリンカー領域は下線を付しており、そしてＦｃ領域を接続するリンカー領域は、太字で示している。
【０４８０】
【化５２】
2013534427.tif 000055
ＦＶＩＩ−１２７のＤＮＡ配列
【０４８１】
【化５３】
2013534427.tif 000056
ＦＶＩＩ−１２７アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、トロンビン切断部位は、破線の下線で示し、トリプシン１７０ループ領域は、波線の下線を付す、Ｆｃ領域に対してＦＶＩＩ重鎖を接続するリンカー領域は下線を付しており、そしてＦｃ領域を接続するリンカー領域は、太字で示している
【０４８２】
【化５４】
2013534427.tif 000057
ＦＶＩＩ−１２５のＤＮＡ配列
【０４８３】
【化５５】
2013534427.tif 000058
ＦＶＩＩ−１２５アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、そしてＡＰ３に対してＦＶＩＩを接続するリンカー領域は太字であり、そしてＡＰ３  ｓｃＦｖは、イタリック体にしている。
【０４８４】
【化５６】
2013534427.tif 000059
ＦＶＩＩ−０６７のＤＮＡ配列
【０４８５】
【化５７】
2013534427.tif 000060
ＦＶＩＩ−０６７アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Ｆｃ領域に対してＦＶＩＩａを接続するリンカー領域は、下線を付しており、両方のＦｃ領域を接続するリンカーは破線の下線を付しており、そしてＦｃ領域をＳＣＥ５に対して接続するリンカーは太字である。
【０４８６】
【化５８】
2013534427.tif 000061
ＦＶＩＩ−０９４のＤＮＡ配列
【０４８７】
【化５９】
2013534427.tif 000062
ＦＶＩＩ−０９４アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、そしてＦＶＩＩをＳＣＥ５に接続するリンカー領域は下線を付している。
【０４８８】
【化６０】
2013534427.tif 000063
ＦＶＩＩ−０２８のＤＮＡ配列
【０４８９】
【化６１】
2013534427.tif 000064
ＦＶＩＩ−０２８アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、Ｆｃ領域に対してＦＶＩＩを接続するリンカー領域は、下線を付しており、両方のＦｃｓ部位を接続するリンカーは、太字で示しており、そしてＭＢ９は、イタリック体にしている。
【０４９０】
【化６２】
2013534427.tif 000065
ＤＮＡ配列ＦＶＩＩ−０３９のＤＮＡ配列
【０４９１】
【化６３】
2013534427.tif 000066
ＦＶＩＩ−０３９アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、ＦＸＩａ切断部位は、破線の下線で示す，Ｆｃ領域に対してＦＶＩＩ重鎖を接続するリンカー領域は下線を付しており、そしてＦｃ領域を接続するリンカー領域は、太字で示している。
【０４９２】
【化６４】
2013534427.tif 000067
ＦＶＩＩ−０４０のＤＮＡ配列
【０４９３】
【化６５】
2013534427.tif 000068
ＦＶＩＩ−０４０アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、ＦＸＩａ切断部位は、破線の下線で示し、Ｆｃ領域に対してＦＶＩＩ重鎖を接続するリンカー領域は下線を付しており、そしてＦｃ領域を接続するリンカー領域は、太字で示している。
【０４９４】
【化６６】
2013534427.tif 000069
ＦＩＸ−０４２のＤＮＡ配列
【０４９５】
【化６７】
2013534427.tif 000070
ＦＩＸ−０４２アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、そしてＦｃ領域を接続するリンカー領域は下線を付している。
【０４９６】
【化６８】
2013534427.tif 000071
ＦＩＸ−０６８のＤＮＡ配列
【０４９７】
【化６９】
2013534427.tif 000072
ＦＩＸ−０６８アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Ｆｃ領域に対してＳＣＥ５を接続するリンカー領域は、下線を付しており、そしてプロタンパク質転換酵素プロセシング部位を有するリンカーは、太字で示している。
【０４９８】
【化７０】
2013534427.tif 000073
ＦＩＸ−０８８のＤＮＡ配列
【０４９９】
【化７１】
2013534427.tif 000074
ＦＩＸ−０８８アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、両方のＦｃ領域を接続するリンカーは下線を付しており、そしてＦｃ領域をＳＣＥ５に対して接続するリンカーは太字である。
【０５００】
【化７２】
2013534427.tif 000075
ＦＩＸ−０８９のＤＮＡ配列
【０５０１】
【化７３】
2013534427.tif 000076
ＦＩＸ−０８９アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Ｆｃ領域に対してＯＳ１を接続するリンカー領域は下線を付しており、そしてＯＳ１ペプチドは、イタリック体にしている。
【０５０２】
【化７４】
2013534427.tif 000077
ＦＩＸ−０９０のＤＮＡ配列
【０５０３】
【化７５】
2013534427.tif 000078
ＦＩＸ−９０アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、そしてＦＩＸをＳＣＥ５に接続するリンカー領域は下線を付している。
【０５０４】
【化７６】
2013534427.tif 000079
ＦＶＩＩ−０８８のＤＮＡ配列
【０５０５】
【化７７】
2013534427.tif 000080
ＦＶＩＩ−０８８アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Ｆｃ領域に対してＦＶＩＩまたはＡＰ３を接続するリンカー領域は、下線を付しており、ＡＰ３  ｓｃＦｖはイタリック体であり、そしてプロタンパク質転換酵素プロセシング部位を有するリンカーは、太字で示している。
【０５０６】
【化７８】
2013534427.tif 000081
ＦＶＩＩＩ−０４１のＤＮＡ配列
【０５０７】
【化７９−１】
2013534427.tif 000082
【化７９−２】
2013534427.tif 000083
【化７９−３】
2013534427.tif 000084
ＦＶＩＩＩ−０４１アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、そしてＦｃ領域を接続するリンカー領域は下線を付している。
【０５０８】
【化８０】
2013534427.tif 000085
ＦＶＩＩＩ−１０８のＤＮＡ配列
【０５０９】
【化８１−１】
2013534427.tif 000086
【化８１−２】
2013534427.tif 000087
ＦＶＩＩＩ−１０８アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、Ｆｃ領域に対してＳＣＥ５を接続するリンカー領域は、下線を付しており、そしてプロタンパク質転換酵素プロセシング部位を有するリンカーは、太字で示している。
【０５１０】
【化８２】
2013534427.tif 000088
ｐＳＹＮ−ＦＶＩＩＩ−０４９のＤＮＡ配列
【０５１１】
【化８３−１】
2013534427.tif 000089
【化８３−２】
2013534427.tif 000090
【化８３−３】
2013534427.tif 000091
ＦＶＩＩＩ−０４９アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、そしてプロタンパク質転換酵素プロセシング部位を有するリンカーは、太字で示している。
【化８４】
2013534427.tif 000092
【図１】
2013534427.tif 000093
【図２】
2013534427.tif 000094
【図３】
2013534427.tif 000095
【図４】
2013534427.tif 000096
【図５】
2013534427.tif 000097
【図６】
2013534427.tif 000098
【図７】
2013534427.tif 000099
【図８】
2013534427.tif 000100
【図９】
2013534427.tif 000101
【図１２Ａ】
2013534427.tif 000102
【図１２Ｂ】
2013534427.tif 000103
【図１３Ａ】
2013534427.tif 000104
【図１３Ｂ】
2013534427.tif 000105
【図１３Ｃ】
2013534427.tif 000106
【図１３Ｄ】
2013534427.tif 000107
【図１４Ａ】
2013534427.tif 000108
【図１４Ｂ】
2013534427.tif 000109
【図１５】
2013534427.tif 000110
【図１６Ａ】
2013534427.tif 000111
【図１６Ｂ】
2013534427.tif 000112
【図１６Ｃ】
2013534427.tif 000113
【図１７】
2013534427.tif 000114
【図１８Ａ】
2013534427.tif 000115
【図１８Ｂ】
2013534427.tif 000116
【図１８Ｃ】
2013534427.tif 000117
【図１８Ｄ】
2013534427.tif 000118
【図１９】
2013534427.tif 000119
【図２０Ａ】
2013534427.tif 000120
【図２０Ｂ】
2013534427.tif 000121
【図２０Ｃ】
2013534427.tif 000122
【図２０Ｄ】
2013534427.tif 000123
【図２１】
2013534427.tif 000124
【図２２Ａ】
2013534427.tif 000125
【図２２Ｂ】
2013534427.tif 000126
【図２２Ｃ】
2013534427.tif 000127
【図２２Ｄ】
2013534427.tif 000128
【図２３Ａ】
2013534427.tif 000129
【図２３Ｂ】
2013534427.tif 000130
【図２４】
2013534427.tif 000131
【図２９】
2013534427.tif 000132
【図３０】
2013534427.tif 000133
【図３１】
2013534427.tif 000134
【図３４】
2013534427.tif 000135
【図３６】
2013534427.tif 000136
【図３７】
2013534427.tif 000137
【図３８】
2013534427.tif 000138
【図３９】
2013534427.tif 000139
【図４０】
2013534427.tif 000140
【図４１】
2013534427.tif 000141
【図４３】
2013534427.tif 000142
【図４４Ａ】
2013534427.tif 000143
【図４４Ｂ】
2013534427.tif 000144
【図４４Ｃ】
2013534427.tif 000145
【図４５Ａ】
2013534427.tif 000146
【図４５Ｂ】
2013534427.tif 000147
【図４５Ｃ】
2013534427.tif 000148
【図４６Ａ】
2013534427.tif 000149
【図４６Ｂ】
2013534427.tif 000150
【図４７Ａ】
2013534427.tif 000151
【図４７Ｂ】
2013534427.tif 000152
【図４８】
2013534427.tif 000153
【図４９Ａ】
2013534427.tif 000154
【図４９Ｂ】
2013534427.tif 000155
【図５０】
2013534427.tif 000156
【図５１Ａ】
2013534427.tif 000157
【図５１Ｂ】
2013534427.tif 000158
【図５１Ｃ】
2013534427.tif 000159
【図５２Ａ】
2013534427.tif 000160
【図５２Ｂ】
2013534427.tif 000161
【図５３Ａ】
2013534427.tif 000162
【図５３Ｂ】
2013534427.tif 000163
【図５３Ｃ】
2013534427.tif 000164
【図１０】
2013534427.tif 000165
【図１１】
2013534427.tif 000166
【図２５】
2013534427.tif 000167
【図２６】
2013534427.tif 000168
【図２７】
2013534427.tif 000169
【図２８】
2013534427.tif 000170
【図３２】
2013534427.tif 000171
【図３３】
2013534427.tif 000172
【図３５】
2013534427.tif 000173
【図４２】
2013534427.tif 000174
【配列表】
2013534427000001.app
【国際調査報告】
2013534427.tif 000175
2013534427.tif 000176
2013534427.tif 000177