(57)【要約】  本明細書は、改変クロストリジウム毒素、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインを含む組成物、該改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子、及び、該改変クロストリジウム毒素の二本鎖形態を含む組成物を開示する。
2013514091.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）クロストリジウム毒素中毒プロセスの酵素的標的改変工程を実行することが可能な、クロストリジウム毒素酵素ドメイン；
ｂ）クロストリジウム毒素中毒プロセスのトランスロケーション工程を実行することが可能な、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン；及び、
ｃ）切断可能な結合のＰ１部位を含むプロテアーゼ切断部位のＰ部分と結合ドメインとを含み、プロテアーゼ切断部位のＰ部分のＰ１部位が結合ドメインのアミノ末端に隣接し、それにより組込型プロテアーゼ切断部位を作る、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメイン
を含む一本鎖改変クロストリジウム毒素であって、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインの切断により、一本鎖改変クロストリジウム毒素が二本鎖形態に変換され、同源レセプタ−に結合可能なアミノ末端を有する結合ドメインが生成される、前記一本鎖改変クロストリジウム毒素。
【請求項２】
改変クロストリジウム毒素が、１）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン、及び組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメイン、２）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメイン、及びクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン、３）組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメイン、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン、及びクロストリジウム毒素酵素ドメイン、４）組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、及びクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン、又は、５）クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメイン、及びクロストリジウム毒素酵素ドメインの順番である直鎖アミノ−カルボキシル方向単一ポリペプチドを含む、請求項１に記載の改変クロストリジウム毒素。
【請求項３】
クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインが、ＢｏＮＴ／Ａトランスロケーションドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂトランスロケーションドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１トランスロケーションドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄトランスロケーションドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅトランスロケーションドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆトランスロケーションドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇトランスロケーションドメイン、ＴｅＮＴトランスロケーションドメイン、ＢａＮＴトランスロケーションドメイン、又は、ＢｕＮＴトランスロケーションドメインである、請求項１に記載の改変クロストリジウム毒素。
【請求項４】
クロストリジウム毒素酵素ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン、ＴｅＮＴ酵素ドメイン、ＢａＮＴ酵素ドメイン、又は、ＢｕＮＴ酵素ドメインである、請求項１に記載の改変クロストリジウム毒素。
【請求項５】
組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインが、配列番号４から配列番号１１８のいずれか一つである、請求項１に記載の改変クロストリジウム毒素。
【請求項６】
切断可能な結合のＰ１部位を含むプロテアーゼ切断部位のＰ部分が、配列番号１２１、配列番号１２７、又は配列番号１３０である、請求項１に記載の改変クロストリジウム毒素。
【請求項７】
結合ドメインがオピオイドペプチドである、請求項１に記載の改変クロストリジウム毒素。
【請求項８】
オピオイドペプチドが、エンケファリン、ＢＡＭ２２ペプチド、エンドモルフィン、エンドルフィン、ダイノルフィン、ノシセプチン、又はリモルフィンである、請求項７に記載の改変クロストリジウム毒素。
【請求項９】
結合ドメインがＰＡＲリガンドである、請求項１に記載の改変クロストリジウム毒素。
【請求項１０】
ＰＡＲリガンドが、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４である、請求項９に記載の改変クロストリジウム毒素。
【請求項１１】
請求項１に記載の一本鎖改変クロストリジウム毒素から得る二本鎖と、薬学的に許容される担体、薬学的に許容される成分、又は薬学的に許容される担体及び薬学的に許容される成分の両方とを含む、医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１に記載の改変クロストリジウム毒素をコードする、ポリヌクレオチド分子。
【請求項１３】
ポリヌクレオチド分子がさらに発現ベクターを含む、請求項１２に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項１４】
以下の工程を含む、改変クロストリジウム毒素を生産する方法：
ａ）請求項１３のポリヌクレオチド分子を細胞に導入する工程；及び
ｂ）ポリヌクレオチド分子を発現させる工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００９年１２月１６日に提出した米国仮特許出願第６１／２８６，９５４号の権利を享受するものであり、該仮出願は、本参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。
【背景技術】
【０００２】
クロストリジウム毒素、例えば、ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴｓ）、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ及びＢｏＮＴ／Ｇ、及び破傷風神経毒（ＴｅＮＴ）などの神経伝達阻害能は、様々な治療用途及び化粧品用途に利用されている（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｊ．  Ｌｉｐｈａｍ，  ＣＯＳＭＥＴＩＣ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＢＯＴＵＬＩＮＵＭ  ＴＯＸＩＮ（Ｓｌａｃｋ，  Ｉｎｃ．，  ２００４）参照）。医薬組成物として市販されているクロストリジウム毒素には、ＢｏＮＴ／Ａ製剤（例えば、ＢＯＴＯＸ（登録商標）（Ａｌｌｅｒｇａｎ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ア−バイン）、ＤＹＳＰＯＲＴ（登録商標）／ＲＥＬＯＸＩＮ（登録商標）（Ｂｅａｕｆｏｕｒ  Ｉｐｓｅｎ、英国、ポ−トンダウン）、ＮＥＵＲＯＮＯＸ（登録商標）（Ｍｅｄｙ−Ｔｏｘ，Ｉｎｃ．、韓国、梧倉面）、ＢＴＸ−Ａ（蘭州生物製品研究所、中国）、及びＸＥＯＭＩＮ（登録商標）（Ｍｅｒｚ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＧｍｂＨ．、ドイツ、フランクフルト）など）；並びにＢｏＮＴ／Ｂ製剤（例えば、ＭＹＯＢＬＯＣ（登録商標）／ＮＥＵＲＯＢＬＯＣ（登録商標）（Ｅｌａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、カリフォルニア州サンフランシスコ）など）が含まれる。例として、ＢＯＴＯＸ（登録商標）は、現在、１つ以上の国で以下の適応症に対して承認されている：アカラシア、成人型痙性、裂肛、背部痛、眼瞼痙攣、歯ぎしり、頸部ジストニア、本態性振戦、眉間の皺又は運動過多性の顔の皺、頭痛、片側顔面痙攣、膀胱機能亢進、発汗過多、若年性脳性麻痺、多発性硬化症、ミオクロ−ヌス性障害、鼻唇の皺、痙攣性発声障害、斜視および第７神経障害。
【０００３】
クロストリジウム毒素治療は、神経伝達物質をシナプス間隙に分泌する際に利用される開口分泌プロセスを妨げることにより、神経伝達物質の放出を阻害する。医薬産業では、クロストリジウム毒素治療の利用を、現在の骨格筋弛緩薬用途から拡大し、種々の慢性疼痛、神経性炎症、泌尿生殖器疾患などの感覚神経関連疾患、並びに膵炎などの非神経関連疾患の治療に利用することが強く期待されている。クロストリジウム毒素を用いた治療を拡大するために現在開発が行われている１つの方法として、クロストリジウム毒素を改変し、非クロストリジウム毒素標的細胞への改変された細胞標的能を改変毒素に付与するものがある。この再標的化能は、クロストリジウム毒素の天然の標的ドメインを、非クロストリジウム毒素標的細胞内に存在する非クロストリジウム毒素レセプタ−への選択的な結合活性を有する標的ドメインに置き換えることで得られる。このような標的ドメインの改変は、非クロストリジウム毒素標的細胞上に存在する非クロストリジウム毒素レセプタ−（標的レセプタ−）に選択的に結合可能な改変毒素をもたらす（再標的化）。非クロストリジウム毒素標的細胞への標的活性を有する再標的化クロストリジウム毒素は、非クロストリジウム毒素標的細胞上のレセプタ−に結合し、細胞質に移動し、そして、非クロストリジウム毒素標的細胞のＳＮＡＲＥ複合体に対してタンパク質分解作用を発揮することができる。
【０００４】
非クロストリジウム毒素標的細胞への標的活性を有する再標的化クロストリジウム毒素の非限定的な例は、例えば、以下に記載されている；Ｋｅｉｔｈ  Ａ．  Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  Ａｂｌｅ  Ｔｏ  Ｍｏｄｉｆｙ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｓｅｎｓｏｒｙ  Ａｆｆｅｒｅｎｔ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ、米国特許第５，９８９，５４５号（１９９９年１１月２３日）；Ｃｌｉｆｆｏｒｄ  Ｃ．  Ｓｈｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｔｏｘｉｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ、米国特許第６，４６１，６１７号（２００２年１０月８日）；Ｃｏｎｒａｄ  Ｐ．  Ｑｕｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｕｃｕｓ  Ｈｙｐｅｒｓｅｃｒｅｔｉｏｎ、米国特許第６，６３２，４４０（２００３年１０月１４日）；Ｌａｎｃｅ  Ｅ．  Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｏｆ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ、米国特許第６，８４３，９９８号（２００５年１月１８日）；Ｓｔｅｐｈａｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ，  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｐａｉｎ、米国特許公開第２００２／００３７８３３号（２００２年３月２８日）；Ｋｅｉｔｈ  Ａ．  Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｎｏｎ−ｎｅｕｒａｌ  Ｃｅｌｌｓ、米国特許公開第２００３／０１８０２８９号（２００３年９月２５日）；Ｊ．  Ｏｌｉｖｅｒ  Ｄｏｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ、国際公開第２００１／０１４５７０号（２００１年３月１日）；Ｋｅｉｔｈ  Ａ．  Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ、国際特許公開第２００５／０２３３０９号（２００５年３月１７日）；及び、Ｌａｎｃｅ  Ｅ．  Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ、米国特許出願第１１／３７６，６９６号（２００６年３月１５日）。クロストリジウム毒素に関連する治療効果を再標的化する能力により、クロストリジウム毒素治療を利用することができる薬剤の用途が大幅に拡大されている。非限定例として、感覚ニュ−ロンに再標的化した改変クロストリジウム毒素は、例えば、痛覚過敏及びアロディニア、神経因性疼痛、及び炎症性疼痛などの種々の慢性疼痛の治療に有用である（例えば、前掲のＦｏｓｔｅｒ（１９９９）；前掲のＤｏｎｏｖａｎ（２００２）；及び、Ｓｔｅｐｈａｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ，  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  Ｐａｉｎ  ｗｉｔｈ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  ａｎｄ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ、米国特許第７，０２２，３２９号（２００６年４月４日）参照）。別の非限定例として、膵臓細胞に再標的化した改変クロストリジウム毒素は、���炎の治療に有用である（例えば、前掲のＳｔｅｗａｒｄ（２００５）参照）。
【０００５】
再標的化クロストリジウム毒素の開発で明らかになった驚くべき発見の一つに、標的部分の配置、又は提示に関するものがある。以下に詳しく説明するように、天然のクロストリジウム毒素は、酵素ドメイン（アミノ領域位置）、トランスロケーションドメイン（中間領域位置）、及び結合ドメイン（カルボキシル領域位置）の順番になっている直鎖アミノ−カルボキシル方向単一ポリペプチド配列順からなる３つの主要なドメインで構成されている（図２）。この天然の配列は、細胞表面のレセプタ−に結合するために必要なドメインがクロストリジウム毒素のカルボキシル領域位置に存在しているため、標的部分のカルボキシル提示と呼ぶことができる。しかし、３つの主要なドメインの直鎖アミノ−カルボキシル方向単一ポリペプチド配列順を変え、標的部分をクロストリジウム毒素のアミノ領域位置に配置させたり（アミノ提示と呼ぶ）、同様に中間領域位置に配置させたり（中心提示と呼ぶ）することで、クロストリジウム毒素が改変できることが示されている（図２）。このクロストリジウム毒素ドメイン及び標的部分の位置の再配置は成功しているが、適切なレセプタ−との結合にフリ−なアミノ末端を必要とする標的部分のクラスに関しては、依然として問題が残っている。
【０００６】
適切なレセプタ−との結合にフリ−なアミノ末端を必要とする標的部分に関連する問題は、クロストリジウム毒素が、天然又は改変されたものに関わらず、完全な活性を示すためには二本鎖形態に処理されなければならないという事実から生じている。天然のクロストリジウム毒素は、それぞれ約１５０ｋＤａの一本鎖ポリペプチドに翻訳され、その後、天然のプロテアーゼによって、ジスルフィドループ内でタンパク質分解による切断によって切断される（図１）。この切断は、ジスルフィド架橋を形成する２つのシステイン残基の間に生じる不連続な二本鎖ループ領域内で起こる。この翻訳後プロセシングにより、酵素ドメインを含む約５０ｋＤａの軽鎖（ＬＣ）と、トランスロケーションドメイン及び細胞結合ドメインを含む約１００ｋＤａの重鎖（ＨＣ）とを含む二本鎖分子が生じ、ＬＣとＨＣは、１つのジスルフィド結合及び非共有相互作用によって結合している（図１）。組み換えによって作製されたクロストリジウム毒素では、通常、天然の二本鎖ループプロテアーゼ切断部位を、外来のプロテアーゼ切断部位に置き換えている。例えば、Ｄｏｌｌｙ，  Ｊ．Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ、米国特許第７，４１９，６７６号（２００８年９月２日）を参照（参照により本明細書に取り込まれる）（図２）。再標的化クロストリジウム毒素では、標的部分の大きさで全体の分子量が異なるが、活性化プロセス及びその外来プロテアーゼ切断部位への依存は、組み換えによって作製されたクロストリジウム毒素と本質的に同じである。例えば、Ｓｔｅｗａｒｄ，  Ｌ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ、米国特許出願第１２／１９２，９００号（２００８年８月１５日）；Ｓｔｅｗａｒｄ，  Ｌ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｆｏｒ  Ｎｏｎ−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｃｅｌｌｓ、米国特許出願第１１／７７６，０７５（２００７年７月１１日）；Ｓｔｅｗａｒｄ，  Ｌ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｆｏｒ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｃｅｌｌｓ、米国特許出願第１１／７７６，０５２号（２００７年７月１１日）を参照（それぞれ参照により本明細書に取り込まれる）。一般的に、外来プロテアーゼを用いて一本鎖ポリペプチドを二本鎖形態に変換する活性化プロセスは、標的部分をアミノ提示、中心提示、又はカルボキシル提示の配置で有する再標的化クロストリジウム毒素の処理に用いることができる。これは、標的部分のほとんどでは、当該部分のアミノ末端がレセプタ−結合に関与しないためである。このため、多様なプロテアーゼ切断部位を、クロストリジウム毒素又は再標的化クロストリジウム毒素の活性化二本鎖形態の作成��用いることができる。しかし、レセプタ−との結合にフリ−なアミノ末端を必要とする標的部分の場合、アミノ末端が適切なレセプタ−結合に不可欠であるため、この一般論に当てはまらない例外となる。このため、そのプロテアーゼ切断部位のカルボキシル末端に切断可能な結合がないプロテアーゼ切断部位は、切断部位の残遺物を標的部分のアミノ末端に残してしまうため、使用することができない。そのような再標的化毒素は、二本鎖形態に処理されるとしても、切断部位の残遺物がレセプタ−結合機能に不可欠な標的部分のアミノ末端のアミノ酸を覆い隠すことで、標的部分が同源のレセプタ−に結合する能力を持たず、不活性となる。
【０００７】
例えば、再標的化クロストリジウム毒素は、アミノ−カルボキシル方向直鎖配列順で、酵素ドメイン、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位、結合ドメイン、及びトランスロケーションドメインを含む（中心提示配列）。ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位は、コンセンサス配列Ｐ５−Ｐ４−Ｌ−Ｆ−Ｑ↓−Ｇ−Ｐ−Ｐ３’−Ｐ４’−Ｐ５’（配列番号１）を含み、ここで、Ｐ５はＤ又はＥが選好され；Ｐ４はＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ又はＴであり；そして、Ｐ３’、Ｐ４’、及びＰ５’はいずれのアミノ酸でもよい。Ｑ−Ｇ切断可能結合の切断が起きると、切断部位のＧＰ残遺物が、結合ドメインに含まれている標的部分のアミノ末端になる。通常、この残遺物は、標的部分の同源レセプタ−への結合を阻害しない。一つの例外が、適切なレセプタ−結合にフリ−なアミノ末端を必要とする標的部分である。この場合、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位のＧＰ残遺物が、適切な結合に不可欠な標的部分のフリ−なアミノ末端を覆い隠し、それにより改変クロストリジウム毒素がレセプタ−に結合できなくなり、細胞内部に入り込むことができなくなるため、不活性化される。
【０００８】
現在、第Ｘａ因子とエンテロキナーゼの２つのプロテアーゼのみが、適切なレセプタ−結合にフリ−なアミノ末端を必要とする標的部分を有する再標的化クロストリジウム毒素の活性化に有用であることがわかっている。第Ｘａ因子の切断部位Ｐ５−Ｉ（Ｅ／Ｄ）ＧＲ↓−Ｐ１’−Ｐ２’−Ｐ３’−Ｐ４’−Ｐ５’（配列番号２）（ここで、Ｐ５、Ｐ１’、Ｐ２’、Ｐ３’、Ｐ４’及びＰ５’はいずれのアミノ酸でもよい）は、Ｐ１アルギニンのカルボキシル側で切断される、部位特異的なプロテアーゼ切断部位である。同様に、エンテロキナーゼの切断部位ＤＤＤＤＫ↓−Ｐ１’−Ｐ２’−Ｐ３’−Ｐ４’−Ｐ５’（配列番号３）（ここで、Ｐ１’、Ｐ２’、Ｐ３’、Ｐ４’及びＰ５’はいずれのアミノ酸でもよい）は、Ｐ１リジンのカルボキシル側で切断される、部位特異的なプロテアーゼ切断部位である。いずれの部位でのタンパク質分解でも、切断部位残遺物が残らないため、完全なアミノ末端を有する標的部位が得られる。例えば、トリプシン、ケモトリプシン、ペプシン、Ｖ８プロテアーゼ、サ−モライシン、ＣＮＢｒ、Ａｒｇ−Ｃ、Ｇｌｕ−Ｃ、Ｌｙｓ−Ｃ、及びＴｙｒ−Ｃなどの他のプロテアーゼは、それらの切断部位のカルボキシル末端で切断しうるが、部位自体は非特異的である。このため、これらのプロテアーゼは、再標的化毒素の他の領域を切断し、毒素を不活性化するため、用いることができない。しかし、第Ｘａ因子及びエンテロキナーゼに関しても、いくつかの問題がある。第Ｘａ因子に関しては、このプロテアーゼは、血液由来の供給源からの精製産物としてのみ入手可能である；現在、組み換えによって作製された第Ｘａ因子は市販されていない。このため、第Ｘａ因子は、血液由来の試薬に対する衛生上の懸念と、そのような製品を使用することによる高コストから、医薬品の製造には適していない。
【０００９】
同様に、エンテロキナーゼにも、医薬品の製造が困難かつ高コストになるいくつかの短所がある。第１に、エンテロキナーゼは、現状の医薬品の製造及び品質管理に関する参照（ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ（ｃＧＭＰ））の認可がなく、それを得るためには時間と費用がかかる。第２に、エンテロキナーゼは、４つのジスルフィド結合を含む２６．３ｋＤａの大きな分子であり、組み換えによる作製が困難なことで有名である。このため、よりコスト効率の良い、細菌を用いた発現システムは、ジスルフィド結合を作ることができないため、利用が難しい。しかし、真核細胞を用いた発現システムの利用にもいくつかの欠点がある。その１つとして、組み換えにより作製したエンテロキナーゼの大多数は封入体中に隔離され、十分な量を精製することが難しい。別の欠点として、用いる真核細胞によっては、ＧＭＰの認可を満たすために、製造プロセスにおいて更なる精製工程が必要になる場合がある。さらに別の欠点として、第Ｘａ因子とエンテロキナーゼはともに、特に高濃度で用いた場合、意図した標的部位以外の位置で基質を切断する。このように、これらの問題によって、第Ｘａ因子又はエンテロキナーゼのいずれかを、フリ−なアミノ末端を有する標的部分を含む二本鎖再標的化クロストリジウム毒素の商業生産に用いることは、高コスト、非効率、かつ困難なプロセスであり、そのような再標的化クロストリジウム毒素を生物医薬品として製造するための全体のコストが増加し、大きな障害となっている。
【発明の概要】
【００１０】
本明細書は、二本鎖形態への処理が第Ｘａ因子又はエンテロキナーゼのいずれにも依存しない、フリ−なアミノ末端を有する標的部分を含む改変クロストリジウム毒素を開示する。これは、切断後にレセプタ−結合に不可欠な適切なアミノ末端が生成されるように、新規のプロテアーゼ切断部位を標的部分に組み込むことで達成される。
【００１１】
本発明の態様では、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインを含む改変クロストリジウム毒素を提供する。適切なレセプタ−結合にフリ−なアミノ末端を必要とする結合ドメインを含むクロストリジウム毒素は、すべて、プロテアーゼ切断部位結合ドメインを組み込むことで改変することが可能であると考えられる。そのようなクロストリジウム毒素は、例えば、以下に記載されている：Ｓｔｅｗａｒｄ，  Ｌ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ、米国特許出願第１２／２１０，７７０号（２００８年９月１５日）；Ｓｔｅｗａｒｄ，  Ｌ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ、米国特許出願第１２／１９２，９００号（２００８年８月１５日）；Ｓｔｅｗａｒｄ，  Ｌ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｆｏｒ  Ｎｏｎ−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｃｅｌｌｓ、米国特許出願第１１／７７６，０７５号（２００７年７月１１日）；Ｓｔｅｗａｒｄ，  Ｌ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｆｏｒ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｃｅｌｌｓ、米国特許出願第１１／７７６，０５２号（２００７年７月１１日）；Ｆｏｓｔｅｒ，  Ｋ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、米国特許出願第１１／７９２，２１０号（２００７年５月３１日）；Ｆｏｓｔｅｒ，  Ｋ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｏｎ−Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ、米国特許出願第１１／７９１，９７９号（２００７年５月３１日）；Ｓｔｅｗａｒｄ，  Ｌ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ、米国特許公開第２００８／００３２９３１号（２００８年２月７日）；Ｆｏｓｔｅｒ，  Ｋ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｏｎ−Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ、米国特許公開第２００８／０１８７９６０号（２００８年８月７日）；Ｓｔｅｗａｒｄ，  Ｌ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ、米国特許公開第２００８／０２１３８３０号（２００８年９月４日）；Ｓｔｅｗａｒｄ，  Ｌ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ  Ｗｉｔｈ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｆｏｒ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｃｅｌｌｓ、米国特許公開第２００８／０２４１８８１号（２００８年１０月２日）；及び、Ｄｏｌｌｙ，  Ｊ．Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ、米国特許第７，４１９，６７６号（２００８年９月２��）（それぞれ、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。
【００１２】
本発明の別の態様では、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインを含む改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子は、さらに発現ベクターを含むことができる。
【００１３】
本発明の別の態様では、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素の二本鎖形態を含む組成物を提供する。本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素の二本鎖形態を含む組成物は、医薬組成物でありうる。そのような医薬組成物は、本明細書に開示する改変クロストリジウム毒素に加えて、医薬担体、医薬成分、又はそれらの両方を含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、天然のクロストリジウム毒素のドメイン編成を示す。一本鎖形態は、酵素ドメイン、トランスロケーションドメイン、ＨＣ結合ドメインを含むアミノからカルボキシル方向の直鎖編成を示している。トランスロケーションドメインと酵素ドメインの間に位置する二本鎖ループ領域は、二重ＳＳブラケットによって示されている。この領域は、天然のプロテアーゼ（例えば内因性クロストリジウム毒素プロテアーゼ、又は環境中で生じる天然のプロテアーゼなど）によってタンパク質分解による切断が起きると、一本鎖形態の毒素を二本鎖形態に変換する、内因性二本鎖ループプロテアーゼ切断部位を含む。
【図２】図２は、結合ドメインのカルボキシル提示、結合ドメインの中心提示、及び結合ドメインのアミノ提示で配置したクロストリジウム毒素のドメイン編成を示す。トランスロケーションドメインと酵素ドメインの間に位置する二本鎖ループ領域は、二重ＳＳブラケットによって示されている。この領域は、同源のプロテアーゼによって切断されると一本鎖形態の毒素を二本鎖形態に変換する、外来プロテアーゼ切断部位を含む。
【図３】図３は、中枢及び末梢ニュ−ロンにおける神経伝達物質の放出及びクロストリジウム毒素中毒の現在の典型の模式図を示す。図３Ａは、中枢及び末梢ニュ−ロンの神経伝達物質放出機構の模式図を示す。放出プロセスは、２つの工程を含むものとして説明することができる：１）神経伝達物質分子を含む小胞の小胞結合ＳＮＡＲＥタンパク質が、細胞膜に位置する膜結合ＳＮＡＲＥタンパク質と結合する、小胞のドッキング；及び、２）小胞が細胞膜と融合し、神経伝達物質分子がエキソサイト−シスにより分泌される、神経伝達物質放出。図３Ｂは、中枢及び末梢ニュ−ロンにおける破傷風及びボツリヌス毒素活性についての中毒機構の模式図を示す。この中毒プロセスは、４つの工程を含むものとして説明することができる：１）クロストリジウム毒素がクロストリジウムレセプタ−系に結合して中毒プロセスを開始する、レセプタ−結合；２）毒素結合の後、毒素／レセプタ−系複合体を含む小胞がエンドサイト−シスにより細胞内に取り込まれる、複合体の内部移行；３）小胞内のｐＨの変化、クロストリジウム毒素重鎖のＨＮドメインを含むチャネルポアの形成、クロストリジウム毒素軽鎖の重鎖からの分離、及び活性軽鎖の放出などを含む、複数の事象が起きていると考えられている、軽鎖のトランスロケーション；及び、４）クロストリジウム毒素の活性軽鎖が、その標的ＳＮＡＲＥ基質（例えば、ＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰ又はシンタキシンなど）をタンパク質分解により切断し、それにより小胞のドッキング及び神経伝達物質の放出を妨げる、酵素による標的改変。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ（クロストリジウム・ボツリナム）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ（クロストリジウム・テタニ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂａｒａｔｉｉ（クロストリジウム・バラティ）、及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ（クロストリジウム・ブチリカム）により生産されるクロストリジウム毒素は、ヒトおよびその他の哺乳類の治療および美容処置に最も広く用いられている。クロストリジウム・ボツリナムの株は、抗原性の異なる７種類のボツリヌス毒素（ＢｏＮＴｓ）を生産し、それらには、ヒト（ＢｏＮＴ／Ａ、／Ｂ、／Ｅ、及び／Ｆ）又は動物（ＢｏＮＴ／Ｃ１及び／Ｄ）におけるボツリヌス中毒の大発生の調査によって同定されたもの、又は土壌から単離されたもの（ＢｏＮＴ／Ｇ）がある。ＢｏＮＴｓは、互いにおよそ３５％のアミノ酸同一性を有し、機能ドメインの編成および全体構造は同じである。当業者においては、それぞれのタイプのクロストリジウム毒素には、アミノ酸配列、及び、さらにこれらのタンパク質をコードする核酸に何らかの違いがあるサブタイプが存在しうることが認識されている。例えば、現在、ＢｏＮＴ／Ａには、ＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ａ３、及びＢｏＮＴ／Ａ４の４つのサブタイプが存在し、特定のサブタイプは別のＢｏＮＴ／Ａサブタイプと比較しておよそ８９％のアミノ酸同一性を有する。７種類のＢｏＮＴセロタイプは、すべて類似した構造と薬理学的性質を有するが、それぞれ異質な細菌学的特徴も示す。一方、破傷風毒素（ＴｅＮＴ）は、クロストリジウム・テタニの一様の群によって生産される。他の２つのクロストリジウム種であるクロストリジウム・バラティ及びクロストリジウム・ブチリカムは、ＢａＮＴ及びＢｕＮＴの毒素を生産し、これらはそれぞれＢｏＮＴ／Ｆ及びＢｏＮＴ／Ｅに似ている。
【００１６】
それぞれの成熟二本鎖分子は、３つの機能的に異なるドメインを含む：１）ＬＣ内に位置し、神経伝達物質放出器のコアコンポーネントを特異的に標的とする亜鉛依存性エンドペプチダーゼ活性を有するメタロプロテアーゼ領域を含む、酵素ドメイン；２）ＨＣのアミノ末端側半分（ＨＮ）に含まれ、細胞内小胞から標的細胞の細胞質へのＬＣの放出を促進する、トランスロケーションドメイン；及び、３）ＨＣのカルボキシル末端側半分（ＨＣ）に存在し、標的細胞表面にあるレセプタ−複合体への毒素の結合活性及び結合特異性を決定する、結合ドメイン。ＨＣドメインは、大きさがおよそ同じである２つの異なる構造的特徴を含み、これらは機能を示し、ＨＣＮサブドメイン、ＨＣＣサブドメインと呼ばれる。表１に、典型的なクロストリジウム毒素に見られる各ドメインのおよその境界領域を示す。
【００１７】
【表１】
2013514091.tif 000003
【００１８】
毒性には、これら３つの機能ドメインの結合活性、トランスロケーション活性、及び酵素活性のすべてが必要である。このプロセスのすべての詳細については、まだ正確には知られていないが、クロストリジウム毒素がニュ−ロンに入り込み、神経伝達物質の放出を阻害する全体的な細胞中毒機構は、セロタイプやサブタイプに関係なく同様である。以下の記載は限定するものではないが、中毒機構は少なくとも次の４つの工程を含むものとして説明することができる：１）レセプタ−結合、２）複合体の内部移行、３）軽鎖のトランスロケーション、及び、４）酵素による標的改変（図３）。このプロセスは、クロストリジウム毒素のＨＣドメインが、標的細胞の細胞膜表面にある毒素特異的レセプタ−系に結合することで開始される。レセプタ−複合体の結合特異性は、部分的には、それぞれのクロストリジウム毒素レセプタ−複合体を異なるように構成すると思われるガングリオシドとタンパク質レセプタ−の特異的組合せによって達成されると考えられている。結合が起きると、毒素／レセプタ−複合体はエンドサイト−シスにより取り込まれ、取り込まれた小胞は特定の細胞内経路へと選別される。トランスロケーションの工程は、小胞区画の酸性化が引き金になっていると考えられている。このプロセスは、毒素の疎水性を高め、二本鎖形態の形成を促進する、２つの重要なｐＨ依存的構造転換を引き起こすとみられる。活性化が起きると、毒素の軽鎖エンドペプチダーゼが細胞内小胞から細胞質基質へと放出され、神経伝達物質放出器の３つの既知のコアコンポーネントの１つを特異的に標的にすると考えられている。これらのコアタンパク質は、小胞結合膜タンパク質（ＶＡＭＰ）／シナプトブレビン、２５ｋＤａのシナプトソーム関連タンパク質（ＳＮＡＰ−２５）、及びシンタキシンであり、これらはシナプス小胞ドッキング及び神経終末での融合に必要とされ、可溶性Ｎ−エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体（ＳＮＡＲＥ）ファミリ−のメンバ−を構成している。ＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｅは、ＳＮＡＰ−２５をカルボキシル末端領域内で切断し、それぞれ９又は２６個のアミノ酸セグメントを放出し、また、ＢｏＮＴ／Ｃ１もＳＮＡＰ−２５をカルボキシル末端付近で切断する。ボツリナムのセロタイプＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ、及び破傷風毒素は、ＶＡＭＰの保存された中央部分に対して作用し、ＶＡＭＰのアミノ末端部分を細胞質基質に放出する。ＢｏＮＴ／Ｃ１は、シンタキシンを細胞質膜表面付近の１つの部位で切断する。シナプスＳＮＡＲＥの選択的タンパク質分解は、インビボで、クロストリジウム毒素によって引き起こされる神経伝達物質放出の遮断の原因となっている。クロストリジウム毒素のＳＮＡＲＥタンパク質標的は、様々な非ニュ−ロン型におけるエキソサイト−シスによく見られる；これらの細胞では、ニュ−ロンに見られるように、軽鎖ペプチダーゼ活性がエキソサイト−シスを阻害する（例えば、Ｙａｎｎ  Ｈｕｍｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｏｗ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ａｎｄ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ  Ｂｌｏｃｋ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ８２（５）  Ｂｉｏｃｈｉｍｉ���．  ４２７−４４６  （２０００）；Ｋａｔｈｒｙｎ  Ｔｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ａｎｄ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｔｉｌｉｔｙ，  ２７（１１）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  ５５２−５５８．  （２００２）；Ｇｉｏｖａｎｎａ  Ｌａｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎｅｙ  ｏｆ  Ｔｅｔａｎｕｓ  ａｎｄ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｎｓ，  １１（９）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４３１−４３７，  （２００３）を参照）。
【００１９】
本発明のある態様では、改変クロストリジウム毒素は、一部において、一本鎖改変クロストリジウム毒素及び二本鎖改変クロストリジウム毒素を含む。上述のように、クロストリジウム毒素は、天然か非天然かに関わらず、まず一本鎖ポリペプチドとして合成される。この一本鎖形態は、続いて、プロテアーゼによりジスルフィド結合を形成する２つのシステイン残基に間に作られた不連続な二本鎖ループ領域内にあるプロテアーゼ切断部位で切断される。この翻訳後プロセシングにより、軽鎖（ＬＣ）と重鎖とを含む二本鎖分子が生じる。本明細書において、「二本鎖ループ領域」とは、ＬＣドメインとＨＣドメインの間に位置するジスルフィド結合によって形成される、天然又は非天然のクロストリジウム毒素のループ領域を意味する。本明細書において、「一本鎖改変クロストリジウム毒素」とは、本明細書に開示されるいずれかの改変クロストリジウム毒素であって、一本鎖形態にあるもの、すなわち、二本鎖ループ領域内にあるプロテアーゼ切断部位で、同源のプロテアーゼによる切断が行われていないものを意味する。本明細書において、「二本鎖改変クロストリジウム毒素」とは、本明細書に開示されるいずれかの改変クロストリジウム毒素であって、二本鎖形態にあるもの、すなわち、二本鎖ループ領域内にあるプロテアーゼ切断部位で、同源プロテアーゼによる切断が行われているものを意味する。
【００２０】
本発明のある態様では、改変クロストリジウム毒素は、一部において、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインを含む。本明細書において、「組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメイン」とは、切断可能な結合のＰ１部位を含むプロテアーゼ切断部位のＰ部分と結合ドメインとを含むアミノ酸配列であって、プロテアーゼ切断部位のＰ部分にある切断可能な結合のＰ１部位は、結合ドメインのアミノ末端に隣接しており、それにより、結合ドメインの最初のアミノ酸が切断可能な結合のＰ１’部位となる組込型プロテアーゼ切断部位を形成している、アミノ酸配列を意味する。以下にさらに詳細に説明するように、プロテアーゼ切断部位のＰ部分とは、プロテアーゼ切断部位の標準的なコンセンサス配列（＞Ｐ６−Ｐ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’−Ｐ３’−Ｐ４’−Ｐ５’−＞Ｐ６’；ここでＰ１−Ｐ１’は切断可能な結合を表す）のＰ部分（＞Ｐ６−Ｐ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１）からとったアミノ酸配列を意味する。このように、結合ドメインのアミノ末端のアミノ酸は、切断可能な結合の形成に役割を果たすとともに、結合ドメインが同源レセプタ−に適切に結合するために不可欠な結合ドメインの第１残基として機能する。表２に、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインの非限定的な例を示す。当技術分野では、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインを改変クロストリジウム毒素のアミノ末端に配置する場合（アミノ提示）、改変クロストリジウム毒素の発現を最大化するために、開始メチオニンを付加すべきであることが知られている。また、配列番号１２７に記載する切断可能な結合のＰ１部位を含むプロテアーゼ切断部位のＰ部分、又は配列番号１３０に記載する切断可能な結合のＰ１部位を含むプロテアーゼ切断部位のＰ部分は、表２に記載するプロテアーゼ組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインに存在する配列番号１２１に記載する切断可能な結合のＰ１部位を含むプロテアーゼ切断部位のＰ部分と、置き換えることができる。
【００２１】
【表２−１】
2013514091.tif 000004
【表２−２】
2013514091.tif 000005
【表２−３】
2013514091.tif 000006
【表２−４】
2013514091.tif 000007
【表２−５】
2013514091.tif 000008
【表２−６】
2013514091.tif 000009
【００２２】
切断可能な結合のＰ１部位を含むプロテアーゼ切断部位のＰ部分は、いかなるものでも、結合ドメインとともに、本発明に開示する組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインの一部として組込型プロテアーゼ切断部位を形成するために用いることができると考えられるが、ただし、得られる組込型プロテアーゼ切断部位がプロテアーゼによって選択的に認識され、また、タンパク質分解による切断が起きると、得られる結合ドメインのアミノ末端がその同源レセプタ−に選択的に結合できることが条件とされる。本明細書において、「プロテアーゼによって選択的に認識される」とは、プロテアーゼが、完全なプロテアーゼ切断部位、すなわち、標準的なコンセンサス配列、又はＰ１部分を含むプロテアーゼ切断部位のＰ部分を取り除いていないプロテアーゼ切断部位を認識するのと同等又は実質的に同等なレベルで、組込型プロテアーゼ切断部位を認識する能力を意味する。本実施形態のある態様では、組込型プロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識が例えば以下の場合に、プロテアーゼは組込型プロテアーゼ切断部位を選択的に認識する：完全なプロテアーゼ切断部位の認識レベルの少なくとも１０％、完全なプロテアーゼ切断部位の認識レベルの少なくとも２０％、完全なプロテアーゼ切断部位の認識レベルの少なくとも３０％、完全なプロテアーゼ切断部位の認識レベルの少なくとも４０％、完全なプロテアーゼ切断部位の認識レベルの少なくとも５０％、完全なプロテアーゼ切断部位の認識レベルの少なくとも６０％、完全なプロテアーゼ切断部位の認識レベルの少なくとも７０％、完全なプロテアーゼ切断部位の認識レベルの少なくとも８０％、完全なプロテアーゼ切断部位の認識レベルの少なくとも９０％、完全なプロテアーゼ切断部位の認識レベルの少なくとも９５％、又は、完全なプロテアーゼ切断部位の認識レベルの１００％。
【００２３】
本実施形態の別の態様では、組込型プロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ認識が例えば以下の場合に、プロテアーゼは組込型プロテアーゼ切断部位を選択的に認識する：完全なプロテアーゼ切断部位の認識レベルの１０％〜１００％、完全なプロテアーゼ切断部位の認識レベルの１０％〜９０％、完全なプロテアーゼ切断部位の認識レベルの１０％〜８０％、完全なプロテアーゼ切断部位の認識レベルの１０％〜７０％、完全なプロテアーゼ切断部位の認識レベルの２０％〜１００％、完全なプロテアーゼ切断部位の認識レベルの２０％〜９０％、完全なプロテアーゼ切断部位の認識レベルの２０％〜８０％、完全なプロテアーゼ切断部位の認識レベルの２０％〜７０％、完全なプロテアーゼ切断部位の認識レベルの３０％〜１００％、完全なプロテアーゼ切断部位の認識レベルの３０％〜９０％、完全なプロテアーゼ切断部位の認識レベルの３０％〜８０％、完全なプロテアーゼ切断部位の認識レベルの３０％〜７０％、完全なプロテアーゼ切断部位の認識レベルの４０％〜１００％、完全なプロテアーゼ切断部位の認識レベルの４０％〜９０％、完全なプロテアーゼ切断部位の認識レベルの４０％〜８０％、完全なプロテアーゼ切断部位の認識レベルの４０％〜７０％、完全なプロテアーゼ切断部位の認識レベルの５０％〜１００％、完全なプロテアーゼ切断部位の認識レベルの５０％〜９０％、完全なプロテアーゼ切断部位の認識レベルの５０％〜８０％、又は、完全なプロテアーゼ切断部位の認識レベルの５０％〜７０％。
【００２４】
別の態様では、プロテアーゼは、完全なプロテアーゼ切断部位、すなわち、標準的なコンセンサス配列、又はＰ１’部分を含むプロテアーゼ切断部位のＰ’部分を取り除いていないプロテアーゼ切断部位と同等又は実質的に同等なレベルの結合親和性で、組込型プロテアーゼ切断部位を認識することができる。本実施形態のある態様では、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインに対するプロテアーゼの結合親和性が例えば以下の場合に、プロテアーゼは組込型プロテアーゼ切断部位を選択的に認識する：完全なプロテアーゼ切断部位に対する結合親和性の少なくとも１０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する結合親和性の少なくとも２０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する結合親和性の少なくとも３０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する結合親和性の少なくとも４０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する結合親和性の少なくとも５０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する結合親和性の少なくとも６０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する結合親和性の少なくとも７０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する結合親和性の少なくとも８０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する結合親和性の少なくとも９０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する結合親和性の少なくとも９５％、又は、完全なプロテアーゼ切断部位に対する結合親和性の１００％。
【００２５】
本実施形態の別の態様では、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインに対するプロテアーゼの結合親和性が例えば以下の場合に、プロテアーゼは組込型プロテアーゼ切断部位を選択的に認識する：完全なプロテアーゼ切断部位に対する結合親和性の１０％〜１００％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する結合親和性の１０％〜９０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する結合親和性の１０％〜８０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する結合親和性の１０％〜７０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する結合親和性の２０％〜１００％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する結合親和性の２０％〜９０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する結合親和性の２０％〜８０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する結合親和性の２０％〜７０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する結合親和性の３０％〜１００％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する結合親和性の３０％〜９０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する結合親和性の３０％〜８０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する結合親和性の３０％〜７０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する結合親和性の４０％〜１００％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する結合親和性の４０％〜９０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する結合親和性の４０％〜８０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する結合親和性の４０％〜７０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する結合親和性の５０％〜１００％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する結合親和性の５０％〜９０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する結合親和性の５０％〜８０％、又は、完全なプロテアーゼ切断部位に対する結合親和性の５０％〜７０％。
【００２６】
別の態様において、プロテアーゼは、完全なプロテアーゼ切断部位、すなわち、標準的なコンセンサス配列またはＰ１’部分を含むプロテアーゼ切断部位のＰ’部分が除去されていないプロテアーゼ切断部位と同程度または実質的に同程度のレベルの切断効率で、組込型プロテアーゼ切断部位を認識することができる。本実施形態の態様において、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインに対するプロテアーゼの切断効率が例えば以下の場合に、プロテアーゼは組込型プロテアーゼ切断部位を選択的に認識する：完全なプロテアーゼ切断部位に対する切断効率の少なくとも１０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する切断効率の少なくとも２０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する切断効率の少なくとも３０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する切断効率の少なくとも４０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する切断効率の少なくとも５０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する切断効率の少なくとも６０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する切断効率の少なくとも７０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する切断効率の少なくとも８０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する切断効率の少なくとも９０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する切断効率の少なくとも９５％、または完全なプロテアーゼ切断部位に対するして切断効率の１００％。
【００２７】
この実施形態の別の態様では、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインに対するプロテアーゼの切断効率が、例えば以下の場合に、プロテアーゼは組込型プロテアーゼ切断部位を選択的に認識する：完全なプロテアーゼ切断部位に対する切断効率の１０％〜１００％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する切断効率の１０％〜９０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する切断効率の１０％〜８０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する切断効率の１０％〜７０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する切断効率の２０％〜１００％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する切断効率の２０％〜９０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する切断効率の２０％〜８０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する切断効率の２０％〜７０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する切断効率の３０％〜１００％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する切断効率の３０％〜９０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する切断効率の３０％〜８０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する切断効率の３０％〜７０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する切断効率の４０％〜１００％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する切断効率の４０％〜９０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する切断効率の４０％〜８０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する切断効率の４０％〜７０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する切断効率の５０％〜１００％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する切断効率の５０％〜９０％、完全なプロテアーゼ切断部位に対する切断効率の５０％〜８０％、または完全なプロテアーゼ切断部位に対する切断効率の５０％〜７０％。
【００２８】
本発明のある態様において、改変クロストリジウム毒素は、一部には、切断可能な結合のＰ１部位を包含するプロテアーゼ切断部位のＰ部分を含む。プロテアーゼ切断部位の標準的なコンセンサス配列は、＞Ｐ６−Ｐ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’−Ｐ３’−Ｐ４’−Ｐ５’−＞Ｐ６’で表示することができ、ここで、Ｐ１−Ｐ１’は切断可能な結合を表す。本明細書中で使用される用語「切断可能な結合のＰ１部位を包含するプロテアーゼ切断部位のＰ部分」とは、切断可能な結合のＰ１部位を含む標準的なコンセンサス配列のＰ部分（＞Ｐ６−Ｐ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１）から取り出されたアミノ酸配列、例えば、アミノ酸配列Ｐ１、Ｐ２−Ｐ１、Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１、Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１またはＰ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１等をいう。本明細書中で使用される用語「切断可能な結合Ｐ１’部位を包含するプロテアーゼ切断部位のＰ’部分」とは切断可能な結合Ｐ１’部位を含む標準的なコンセンサス配列のＰ’部分（Ｐ１’−Ｐ２’−Ｐ３’−Ｐ４’−Ｐ５’−＞Ｐ６’）から取り出されたアミノ酸配列、例えば、アミノ酸配列Ｐ１’、Ｐ１’−Ｐ２’、Ｐ１’−Ｐ２’−Ｐ３’、Ｐ１’−Ｐ２’−Ｐ３’−Ｐ４’、またはＰ１’−Ｐ２’−Ｐ３’−Ｐ４’−Ｐ５’等をいう。
【００２９】
部位特異的プロテアーゼに関して、このＰ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’−Ｐ３’−Ｐ４’−Ｐ５’切断部位配列に存在するアミノ酸の大部分は高度に保存されている。従って、例えば、ヒトライノウイルス３ＣはＰ５−Ｐ４−Ｌ−Ｆ−Ｑ−Ｇ−Ｐ−Ｐ３’−Ｐ４’−Ｐ５’（配列番号：１）のコンセンサス配列、好ましくはＤまたはＥをＰ５位に、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、ＳまたはＴをＰ４位に；ＬをＰ３位に、ＦをＰ２位に、ＱをＰ１位に、ＧをＰ１’部位に、ＰをＰ２’位に有する。この高度な配列保存は切断の特異性または選択性に必要とされるので、このコンセンサス配列を変更すると、通常、その同源プロテアーゼによって切断できない部位をもたらす。例えば、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位（Ｇ−Ｐ−Ｐ３’−Ｐ４’−Ｐ５’，配列番号：１１９）から切断可能な結合のカルボキシル末端側の５残基を除去してＰ５−Ｐ４−Ｌ−Ｆ−Ｑ（配列番号：１２０）のみを含む切断部位を作製すると、該部位はこのプロテアーゼによって切断できない。本発明の１つの重要な態様は、あるプロテアーゼ切断部位は、切断可能な結合Ｐ１’部位を包含するプロテアーゼ切断部位のＰ’部分を除去することにより改変されることが可能であり、それでもなお、同源のプロテアーゼによって特異的にまたは選択的に認識されることが可能であるという知見である。
【００３０】
したがって、一実施形態において、プロテアーゼ切断部位のＰ部分は切断可能な結合のＰ１部位である。この実施形態の態様において、切断可能な結合のＰ１部位を包含するプロテアーゼ切断のＰ部分は、例えば、Ｐ２−Ｐ１配列、Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１配列、Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１配列、Ｐ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１配列またはＰ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１配列を包含するアミノ酸断片およびこの配列を超えてアミノ方向に伸長する配列、すなわち、＞Ｐ６である。他の実施形態では、除去される、切断可能な結合のＰ１’部位を包含するプロテアーゼ切断部位のＰ’部分はＰ１’部位である。この実施形態の態様において、除去された切断可能な結合のＰ１’部位を包含するプロテアーゼ切断部位のＰ’部分は、例えば、Ｐ１’−Ｐ２’配列、Ｐ１’−Ｐ２’−Ｐ３’配列、Ｐ１’−Ｐ２’−Ｐ３’−Ｐ４’配列、Ｐ１’−Ｐ２’−Ｐ３’−Ｐ４’−Ｐ５’配列、またはＰ１’−Ｐ２’−Ｐ３’−Ｐ４’−Ｐ５’配列を包含するアミノ酸断片およびこの配列を超えてカルボキシル方向に伸長する、すなわち、＞Ｐ６’である。
【００３１】
この実施形態のある態様では、切断可能な結合のＰ１部位を包含するプロテアーゼ切断部位のＰ部分はコンセンサス配列Ｅ−Ｐ５−Ｐ４−Ｙ−Ｐ２−Ｑ＊（配列番号：１２１）を含み、ここでＰ２、Ｐ４、およびＰ５は任意のアミノ酸であり得る。本実施形態の別の態様では、組込型プロテアーゼ切断部位は配列番号：１２２、配列番号：１２３、  配列番号：１２４、配列番号：１２５、または配列番号：１２６（表３）である。この実施形態の更なる別の態様では、切断可能な結合のＰ１部位を包含するプロテアーゼ切断部位のＰ部分はコンセンサス配列Ｐ５−Ｖ−Ｒ−Ｆ−Ｑ＊（配列番号：１２７）を含み、ここでＰ５は任意のアミノ酸であり得る。本実施形態の別の態様では、組込型プロテアーゼ切断部位は、配列番号：１２８または配列番号：１２９（表３）である。この実施形態の別の態様では、切断可能な結合のＰ１部位を包含するプロテアーゼ切断部位のＰ部分は、コンセンサス配列Ｐ５−Ｄ−Ｐ３−Ｐ２−Ｄ＊（配列番号：１３０）を含み、ここでＰ５は任意のアミノ酸であり得る；Ｐ３は任意のアミノ酸であり得るが、好ましくはＥであり；Ｐ２は任意のアミノ酸であり得る。本実施形態の別の態様では、組込型プロテアーゼ切断部位は配列番号：１３１，配列番号１３２または配列番号：１３３（表３）である。
【００３２】
【表３】
2013514091.tif 000010
アステリスク（＊）は指示されたプロテアーゼによって切断されるペプチド結合である。
【００３３】
本発明のある態様において、改変クロストリジウム毒素は、一部には、結合ドメインを含む。本明細書中で使用される用語「結合ドメイン」は「標的部分」と同義であり、生理的条件下で標的細胞の特徴である細胞表面マ−カ−に優先的に結合するアミノ酸配列領域をいう。本細胞表面マ−カ−は、ポリペプチド、多糖、脂質、糖蛋白、リポ蛋白を含んでも良く、またはこれらの構造的特徴を複数有してもよい。本明細書中で使用される用語「優先的に結合」とは、本結合ドメインの細胞表面マ−カ−への結合能力が任意の他の細胞表面マ−カ−への結合能力に比べて少なくとも１桁異なることをいう。この実施形態の態様において解離定数（Ｋｄ）が、例えば、任意の他の細胞表面マ−カ−に対する結合ドメインの結合定数より少なくとも１桁小さい、任意の他の細胞表面マ−カ−に対する結合ドメインの結合定数より少なくとも２桁小さい、任意の他の細胞表面マ−カ−に対する結合ドメインの結合定数より少なくとも３桁小さい、任意の他の細胞表面マ−カ−に対する結合ドメインの結合定数より少なくとも４桁小さい、または任意の他の細胞表面マ−カ−に対する結合ドメインの結合定数より少なくとも５桁小さい時、結合ドメインは細胞表面マ−カ−に優先的に結合する。この実施形態の別の態様では、解離定数（Ｋｄ）が、例えば、最大１ｘ１０−５Ｍ−１、最大１ｘ１０−６Ｍ−１、最大１ｘ１０−７Ｍ−１、最大１ｘ１０−８Ｍ−１、最大１ｘ１０−９Ｍ−１、最大１ｘ１０−１０Ｍ−１、１ｘ１０−１１Ｍ−１、または最大１ｘ１０−１０Ｍ−１２である時、結合ドメインは優先的に細胞表面マ−カ−に結合する。
【００３４】
この実施形態の更に別の態様では、結合定数（Ｋａ）が、例えば、任意の他の細胞表面マ−カ−に対する結合ドメインの結合定数（Ｋａ）に対して少なくとも一桁大きい、任意の他の細胞表面マ−カ−に対する結合ドメインの結合定数（Ｋａ）に対して少なくとも２桁大きい、任意の他の細胞表面マ−カ−に対する結合ドメインの結合定数（Ｋａ）に対して少なくとも３桁大きい、任意の他の細胞表面マ−カ−に対する結合ドメインの結合定数（Ｋａ）に対して少なくとも４桁大きい、または任意の他の細胞表面マ−カ−に対する結合ドメインの結合定数（Ｋａ）に対して少なくとも５桁大きい時、結合ドメインは優先的に細胞表面マ−カ−に結合する。この実施形態の更なる態様において、結合定数が、例えば、少なくとも１ｘ１０−５Ｍ−１、少なくとも１ｘ１０−６Ｍ−１、少なくとも１ｘ１０−７Ｍ−１、少なくとも１ｘ１０−８Ｍ−１、少なくとも１ｘ１０−９Ｍ−１、または少なくとも１ｘ１０−１０Ｍ−１である時、結合ドメインは優先的に細胞表面マ−カ−に結合する。
【００３５】
任意の結合ドメインが、本発明で開示される組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインの一部として使用し得ることが考えられる。本発明で開示される組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインの一部として使用し得る結合ドメインがレセプタ−結合にフリ−なアミノ末端を要求する例が、例えば、前掲のＳｔｅｗａｒｄ，  米国特許出願番号１２／２１０，７７０，  （２００８）、前掲のＳｔｅｗａｒｄ，  米国特許出願番号１２／１９２，９００，  （２００８）、前掲のＳｔｅｗａｒｄ，  米国特許出願番号１１／７７６，０７５，  （２００７）、  前掲のＳｔｅｗａｒｄ，  米国特許出願番号１１／７７６，０５２，  （２００７）、前掲のＦｏｓｔｅｒ，  米国特許出願番号１１／７９２，２１０，  （２００７）、前掲のＦｏｓｔｅｒ，  米国特許出願番号１１／７９１，９７９，  （２００７）、前掲のＳｔｅｗａｒｄ，  米国特許出願番号２００８／００３２９３１，  （２００８）、前掲のＦｏｓｔｅｒ，  米国特許出願番号２００８／０１８７９６０，  （２００８）、前掲のＳｔｅｗａｒｄ，  米国特許出願番号２００８／０２１３８３０，（２００８）、前掲のＳｔｅｗａｒｄ，  米国特許出願番号２００８／０２４１８８１，  （２００８）、および、Ｄｏｌｌｙ，  米国特許出願番号７，４１９，６７６，  （２００８）に記載されており、その内容は、引用をもって、その全体が本明細書に組み込まれる。かかる結合ドメインの非限定的な例として、エンケファリン、エンドモルフィン、エンドルフィン、ダイノルフィン、ノシセプチン、リモルフィン、等のオピオイド類、またはかかるオピオイド類の機能的誘導体、およびプロテアーゼ活性化レセプタ−（ＰＡＲ）リガンド類が包含される。
【００３６】
この実施形態の態様において、結合ドメインとして有用なエンケファリンは、ロイシンエンケファリン、メチオニンエンケファリン、メチオニンエンケファリンＭＲＧＬ、メチオニンエンケファリンＭＲＦ、またはかかるエンケファリン類の機能的誘導体である。この実施形態の別の態様において、結合ドメインとして有用なＢＡＭ２２は、ＢＡＭ２２ペプチド（１−１２）、ＢＡＭ２２ペプチド（６−２２）、ＢＡＭ２２ペプチド（８−２２）、ＢＡＭ２２ペプチド（１−２２）、またはかかるＢＡＭ２２類の機能的誘導体である。この実施形態の態様において、結合ドメインとして有用なエンドモルフィンは、エンドモルフィン−１、エンドモルフィン−２、またはかかるエンドモルフィン類の機能的誘導体である。この実施形態の更に別の態様において、結合ドメインとして有用なエンドルフィンは、エンドルフィン−α、ネオエンドルフィン−α、エンドルフィン−β、ネオエンドルフィン−β、エンドルフィン−γ、またはかかるエンドルフィン類の機能的誘導体である。この実施形態の更に別の態様において、結合ドメインとして有用なダイノルフィンは、ダイノルフィンＡ、ダイノルフィンＢ（ロイモルフィン）、リモルフィン、またはかかるダイノルフィン類の機能的誘導体である。この実施形態の更なる態様において、結合ドメインとして有用なノシセプチンは、ノシセプチンＲＫ、ノシセプチン、神経ペプチド１、神経ペプチド２、神経ペプチド３、またはかかるノシセプチン類の機能的誘導体である。この実施形態の更なる態様において、結合ドメインとして有用なＰＡＲリガンドは、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、ＰＡＲ４、またはかかるＰＡＲリガンド類の機能的誘導体である。
【００３７】
この実施形態の別の態様において、結合ドメインは配列番号：１５４から配列番号：１８６のいずれか１つである。この実施形態の更に別の態様において、結合ドメインは、例えば、配列番号：１５４から配列番号：１８６のいずれか１つと少なくとも７０％のアミノ酸相同性、配列番号：１５４から配列番号：１８６のいずれか１つと少なくとも７５％のアミノ酸相同性、配列番号：１５４から配列番号：１８６のいずれか１つと少なくとも８０％のアミノ酸相同性、配列番号：１５４から配列番号：１８６のいずれか１つと少なくとも８５％のアミノ酸相同性、配列番号：１５４  から配列番号：１８６のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸相同性、または配列番号：１５４から配列番号：１８６のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸相同性を有する。この実施形態の更に別の態様において、結合ドメインは、例えば、配列番号：１５４  から配列番号：１８６のいずれか１つと最大７０％のアミノ酸相同性、配列番号：１５４から配列番号：１８６のいずれか１つと最大７５％のアミノ酸相同性、配列番号：１５４  から配列番号：１８６のいずれか１つと最大８０％のアミノ酸相同性、配列番号：１５４から配列番号：１８６のいずれか１つと最大８５％のアミノ酸相同性、配列番号：１５４から配列番号：１８６のいずれか１つと最大９０％のアミノ酸相同性、または配列番号：１５４  から配列番号：１８６のいずれか１つと最大９５％のアミノ酸相同性を有する。
【００３８】
この実施形態の別の態様において、結合ドメインは、例えば、配列番号：１５４  から配列番号：１８６のいずれか１つに対して少なくとも１つ、２つ、または３つの非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施形態の別の態様において、結合ドメインは、例えば、配列番号：１５４  から配列番号１８６のいずれか１つに対して最大１つ、２つ、または３つの非連続的なアミノ酸置換を有する。この実施形態の更に別の態様において、結合ドメインは、例えば、配列番号：１５４  から配列番号：１８６のいずれか１つに対して少なくとも１つ、２つ、または３つの非連続的なアミノ酸欠損を有する。この実施形態の更に別の態様において、結合ドメインは、例えば、配列番号：１５４から配列番号：１８６のいずれか１つに対して最大１つ、２つ、または３つの非連続的なアミノ酸欠損を有する。この実施形態の更に別の態様において、結合ドメインは、例えば、配列番号：１５４から配列番号：１８６のいずれか１つに対して少なくとも１つ、２つ、または３つの非連続的なアミノ酸付加を有する。この実施形態の更に別の態様において、結合ドメインは、例えば、配列番号：１５４  から配列番号：１８６のいずれか１つに対して最大１つ、２つ、または３つの非連続的なアミノ酸付加を有する。
【００３９】
この実施形態の別の態様において、結合ドメインは、例えば、配列番号：１５４  から配列番号：１８６のいずれか１つに対して少なくとも１つ、２つ、または３つの連続的なアミノ酸置換を有する。この実施形態の別の態様において、結合ドメインは、例えば、配列番号：１５４  から配列番号：１８６のいずれか１つに対して最大１つ、２つ、または３つの連続的なアミノ酸付加を有する。この実施形態の更に別の態様において、結合ドメインは、例えば、配列番号：１５４  から配列番号：１８６のいずれか１つに対して少なくとも１つ、２つ、または３つの連続的なアミノ酸欠損を有する。この実施形態の更に別の態様において、結合ドメインは、例えば、配列番号：１５４から配列番号：１８６のいずれか１つに対して最大１つ、２つ、または３つの連続的なアミノ酸欠損を有する。この実施形態の更に別の態様において、結合ドメインは、例えば、配列番号：１５４から配列番号：１８６のいずれか１つに対して少なくとも１つ、２つ、または３つの連続的なアミノ酸付加を有する。この実施形態の更に別の態様において、結合ドメインは、例えば、配列番号：１５４から配列番号：１８６のいずれか１つに対して最大１つ、２つ、または３つの連続的なアミノ酸付加を有する。
【００４０】
本発明のある態様において、改変クロストリジウム毒素は、一部には、クロストリジウム毒素酵素ドメインを含む。本明細書中で使用される用語「クロストリジウム毒素酵素ドメイン」とは、クロストリジウム毒素中毒プロセスにおける酵素的な標的改変工程を実行することのできる任意のクロストリジウム毒素ポリペプチドを意味する。したがって、クロストリジウム毒素酵素ドメインは、例えば、ＳＮＡＰ−２５基質、ＶＡＭＰ基質、シンタキシン基質のようなＳＮＡＲＥ蛋白質等のクロストリジウム毒素基質を特異的に標的とし、酵素的に切断する。クロストリジウム毒素酵素ドメインの非限定的な例として、例えば、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン、ＴｅＮＴ酵素ドメイン、ＢａＮＴ酵素ドメイン、およびＢｕＮＴ酵素ドメインが包含される。クロストリジウム毒素酵素ドメインの他の非限定的な例として、例えば、配列番号：１３４のアミノ酸  １−４４８、配列番号：１３５のアミノ酸１−４４１、配列番号：１３６のアミノ酸１−４４９、配列番号：１３７のアミノ酸１−４４５、配列番号：１３８のアミノ酸１−４２２、配列番号：１３９のアミノ酸１−４３９、  配列番号」１４０のアミノ酸１−４４６、  配列番号：１４１のアミノ酸１−４５７、配列番号：１４２のアミノ酸１−４３１、  および配列番号：１４３のアミノ酸１−４２２が包含される。
【００４１】
クロストリジウム毒素酵素ドメインには、限定するものではないが、例えば、クロストリジウム毒素酵素ドメインのアイソフォームおよびクロストリジウム毒素酵素ドメインサブタイプ等の天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体；例えば、保存的クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体、非保存的なクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体、クロストリジウム毒素酵素ドメインキメラ体、これらの活性なクロストリジウム毒素酵素ドメイン断片、またはこれらの任意の組み合わせ等の非天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体が包含される。
【００４２】
本明細書中で使用される用語「クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体」とは、天然または非天然を問わず、開示された参照配列（表１）の相当する領域からの少なくとも１つのアミノ酸の変更を有するクロストリジウム毒素酵素ドメインを意味し、かつ、上記参照配列の相当する領域に対する同一性のパ−セントで記載し得る。明示的に示さない限り、開示された実施形態の実施に有用なクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体とは、クロストリジウム毒素中毒プロセスの酵素的な標的改変工程を実行する変異体である。非限定的な例として、配列番号：１３４のアミノ酸１−４４８を含むＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン変異体は、例えば、配列番号：１３４のアミノ酸領域１−４４８と比較してアミノ酸の置換、欠損、または付加等の少なくとも１つのアミノ酸の違いを有するであろう；配列番号：１３５のアミノ酸１−４４１を含むＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン変異体は、配列番号：１３５のアミノ酸領域１−４４１と比較して、例えば、アミノ酸の置換、欠損、または付加等の少なくとも１つのアミノ酸の違いを有するであろう；配列番号：１３６のアミノ酸１−４４９を含むＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン変異体は、配列番号：１３６のアミノ酸領域１−４４９と比較して、例えば、アミノ酸の置換、欠損、または付加等の少なくとも１つのアミノ酸違いを有するであろう；配列番号：１３７のアミノ酸１−４４５を含むＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン変異体は、配列番号：１３７のアミノ酸領域１−４４５と比較して、例えば、アミノ酸の置換、欠損、または付加等の少なくとも１つのアミノ酸違いを有するであろう；配列番号：１３８のアミノ酸１−４２２を含むＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン変異体は、配列番号：１３８のアミノ酸領域１−４２２と比較して、例えば、アミノ酸の置換、欠損、または付加等の少なくとも１つのアミノ酸の違いを有するであろう；配列番号：１３９のアミノ酸１−４３９を含むＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン変異体は、配列番号：１３９のアミノ酸領域１−４３９と比較して、例えば、アミノ酸の置換、欠損、または付加等の少なくとも１つのアミノ酸の違いを有するであろう；配列番号：１４０のアミノ酸１−４４６を含むＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン変異体は、配列番号：１４０のアミノ酸領域１−４４６と比較して、例えば、アミノ酸の置換、欠損、または付加等の少なくとも１つのアミノ酸の違いを有するであろう；配列番号：１４１のアミノ酸１−４５７を含むＴｅＮＴ酵素ドメイン変異体は、配列番号：１４１のアミノ酸領域１−４５７と比較して、例えば、アミノ酸の置換、欠損、または付加等の少なくとも１つのアミノ酸違いを有するであろう；配列番号：１４２のアミノ酸１−４３１を含むＢａＮＴ酵素ドメイン変異体は、配列番号：１４２のアミノ酸領域１−４３１と比較して、例えば、アミノ酸の置換、欠損、または付加等の少なくとも１つのアミノ酸違いを有するであろう；および配列番号：１４３のアミノ酸１−４２２を含むＢｕＮＴ酵素ドメイン変異体は、配列番号：１４３のアミノ酸領域１−４２２と比較して、例えば、アミノ酸の置換、欠損、または付加等の少なくとも１つのアミノ酸違いを有するであろう。
【００４３】
本明細書中で使用される用語「天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体」とは、選択的スプライシングを受けた転写産物から生産されるクロストリジウム毒素酵素ドメインアイソフォーム、自然突然変異により生産されるクロストリジウム毒素酵素ドメインアイソフォームおよびクロストリジウム毒素酵素ドメインサブタイプを限定されずに包含し、天然の過程により生産される任意のクロストリジウム毒素酵素ドメインを意味する。天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体は、この変異体が基づいている参照クロストリジウム毒素酵素ドメインと実質的に同様に機能することができ、かつ本発明の任意の態様においても参照クロストリジウム毒素酵素ドメインを代替し得る。天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の非限定的な例として、例えば、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメインアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメインアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメインアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメインアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメインアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメインアイソフォーム、およびＴｅＮＴ酵素ドメインアイソフォーム等のクロストリジウム毒素酵素ドメインアイソフォームがある。天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の他の非限定的な例として、例えば、サブタイプＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ａ３、ＢｏＮＴ／Ａ４、およびＢｏＮＴ／Ａ５からの酵素ドメイン；サブタイプＢｏＮＴ／Ｂ１、ＢｏＮＴ／Ｂ２、ＢｏＮＴ／Ｂ二価、ＢｏＮＴ／Ｂ非タンパク分解性からの酵素ドメイン；サブタイプＢｏＮＴ／Ｃ１−１およびＢｏＮＴ／Ｃ１−２からの酵素ドメイン；サブタイプＢｏＮＴ／Ｅ１、ＢｏＮＴ／Ｅ２、ＢｏＮＴ／Ｅ３からの酵素ドメイン；およびサブタイプＢｏＮＴ／Ｆ１、ＢｏＮＴ／Ｆ２、ＢｏＮＴ／Ｆ３、およびＢｏＮＴ／Ｆ４からの酵素ドメイン等のクロストリジウム毒素酵素ドメインサブタイプがある。
【００４４】
本明細書中で使用される用語「非天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体」とは、ランダム変異導入法または合理的設計を用いて遺伝子操作により生産されるクロストリジウム毒素酵素ドメインおよび化学合成により生産されるクロストリジウム毒素酵素ドメインを限定されずに包含するヒトの操作により生産される任意のクロストリジウム毒素酵素ドメインを意味する。非天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の非限定的な例として、例えば、保存的なクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体、非保存的なクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体、クロストリジウム毒素酵素ドメインキメラ変異体、および活性なクロストリジウム毒素酵素ドメイン断片が包含される。非天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の他の非限定的な例として、例えば、非天然のＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン変異体、非天然のＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン変異体、非天然のＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン変異体、非天然のＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン変異体、非天然のＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン変異体、非天然のＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン変異体、非天然のＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン変異体、非天然のＴｅＮＴ酵素ドメイン変異体、非天然のＢａＮＴ酵素ドメイン変異体、および非天然のＢｕＮＴ酵素ドメイン変異体が包含される。
【００４５】
本明細書中で使用される用語「保存的なクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体」とは、他のアミノ酸で置換されたアミノ酸を少なくとも１つ有する、または参照クロストリジウム毒素酵素ドメイン配列（表１）由来のオリジナルなアミノ酸と少なくとも１つの同じ性質を有するアミノ酸類似体を少なくとも１つ有するクロストリジウム毒素酵素ドメインを意味する。性質の例として、同様のサイズ、トポグラフィ、荷電、疎水性、親水性、脂溶性、共有結合能、水素結合能、物理化学的性質等、またはそれらの任意な組み合わせが限定されずに包含される。保存的なクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体は、この変異体が基づいている機能様式に関して、参照クロストリジウム毒素酵素ドメインと実質的に同じように機能でき、本発明の任意の態様において参照クロストリジウム毒素酵素を代替し得る。保存的なクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の非限定的な例として、例えば、保存的なＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン変異体、保存的なＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン変異体、保存的なＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン変異体、保存的なＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン変異体、保存的なＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン変異体、保存的なＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン変異体、保存的なＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン変異体、および保存的なＴｅＮＴ酵素ドメイン変異体、保存的なＢａＮＴ酵素ドメイン変異体、および保存的なＢｕＮＴ酵素ドメイン変異体が包含される。
【００４６】
本明細書中で使用される用語「非保存的なクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体」とは、１）非保存的なクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の基礎となる参照クロストリジウム毒素酵素ドメインから、少なくとも１つのアミノ酸が欠損している；２）非保存的なクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の基礎となる参照クロストリジウム毒素酵素ドメインに、少なくとも１つのアミノ酸が付加している；または３）少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている、または参照クロストリジウム毒素酵素ドメイン配列（表１）由来のオリジナルなアミノ酸と同様な任意の性質を共有しないアミノ酸類似体で置換されている、クロストリジウム毒素酵素ドメインを意味する。非保存的なクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体は、該非保存的なクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の基礎となる参照クロストリジウム毒素酵素ドメインと実質的に同様に機能し、本発明の任意の態様において参照クロストリジウム毒素酵素ドメインの代わりに用いることができる。非保存的なクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の非限定的な例として、例えば、非保存的なＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン変異体、非保存的なＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン変異体、非保存的なＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン変異体、非保存的なＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン変異体、非保存的なＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン変異体、非保存的なＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン変異体、非保存的なＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン変異体、および非保存的なＴｅＮＴ酵素ドメイン変異体、非保存的なＢａＮＴ酵素ドメイン変異体、および非保存的なＢｕＮＴ酵素ドメイン変異体が包含される。
【００４７】
本明細書中で使用される用語「クロストリジウム毒素酵素ドメインキメラ体」とは、少なくともクロストリジウム毒素酵素ドメインの一部、および表１に示す参照クロストリジウム毒素酵素ドメインと少なくとも１つの性質が異なる毒素酵素ドメインを構成する少なくとも１つの他のポリペプチドの少なくとも一部を含むポリペプチドを意味する。ただし、このクロストリジウム毒素酵素ドメインキメラ体は、神経伝達物質放出装置のコアコンポーネントを特異的に標的とすることが未だ可能であり、したがってクロストリジウム毒素がタンパク分解的に基質を切断する全体的な細胞機構の実行に関与する。かかるクロストリジウム毒素酵素ドメインキメラ体は、例えば、Ｌａｎｃｅ  Ｅ．  Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｅｕｃｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  Ｍｏｔｉｆ  ａｎｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ，  米国特許公報２００３／００２７７５２  （Ｆｅｂ．  ６，  ２００３）；  Ｌａｎｃｅ  Ｅ．  Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ，  米国特許公報２００３／０２１９４６２  （Ｎｏｖ．  ２７，  ２００３）；  ａｎｄ  Ｌａｎｃｅ  Ｅ．  Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ，  米国特許公報２００４／０２２０３８６  （Ｎｏｖ．  ４，  ２００４）に記載されており、その内容は、引用をもって、その全体が本明細書に組み込まれる。クロストリジウム毒素酵素ドメインキメラ体の非限定的な例として、例えば、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインキメラ体、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメインキメラ体、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメインキメラ体、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメインキメラ体、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメインキメラ体、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメインキメラ体、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメインキメラ体、およびＴｅＮＴ酵素ドメインキメラ体、ＢａＮＴ／Ａ酵素ドメインキメラ体、およびＢｕＮＴ酵素ドメインキメラ体が包含される。  
【００４８】
本明細書中で使用される用語「活性なクロストリジウム毒素酵素ドメイン断片」とは、本発明の態様において使用可能な酵素ドメインを含む種々のクロストリジウム毒素断片のいずれかを意味する。ただし、これらの酵素ドメイン断片は、神経伝達物質放出装置のコアコンポーネントを特異的に標的とすることが可能であり、したがってクロストリジウム毒素がタンパク分解的に基質を切断する全体的な細胞機構の実行に関与する。該クロストリジウム毒素酵素ドメインは、長さが約４２０から４６０アミノ酸であり、酵素ドメインを含む（表１）。酵素ドメインの酵素活性にはクロストリジウム毒素酵素ドメインの全長は不要であることが研究により明らかにされている。非限定的な例では、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインの最初の８アミノ酸（配列番号：１３４の残基１−８）は酵素活性には不要である。他の非限定的な例では、ＴｅＮＴ酵素ドメインの最初の８アミノ酸（配列番号：１４１の残基１−８）は酵素活性には不要である。同様に、酵素ドメインのカルボキシル末端は活性には不要である。非限定的な例では、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインの最後の３２アミノ酸（配列番号：１３４の残基４１７−４４８）は活性には不要である。他の非限定的な例では、ＴｅＮＴ酵素ドメインの最後の３１アミノ酸（配列番号：１４１の残基４２７−４５７）は活性には不要である。したがって、この実施形態の態様では、例えば、少なくとも３５０アミノ酸、少なくとも３７５アミノ酸、少なくとも４００アミノ酸、少なくとも４２５アミノ酸、および少なくとも４５０アミノ酸の長さを有する酵素ドメインを含むクロストリジウム毒素酵素ドメインが包含され得る。この実施形態の別の態様では、例えば、最大３５０アミノ酸、最大３７５アミノ酸、最大４００アミノ酸、最大４２５アミノ酸、および最大４５０アミノ酸の長さを有する酵素ドメインを含むクロストリジウム毒素酵素ドメインが包含され得る。
【００４９】
上記の如く、１つの実施形態において、クロストリジウム毒素酵素ドメインは天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体を含む。この実施形態のある態様では、天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体は、例えば、ＢｏＮＴ／Ａアイソフォームからの酵素ドメイン、またはＢｏＮＴ／Ａサブタイプからの酵素ドメイン等の天然のＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン変異体；例えば、ＢｏＮＴ／Ｂアイソフォームからの酵素ドメイン、またはＢｏＮＴ／Ｂサブタイプからの酵素ドメイン等の天然のＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン変異体；ＢｏＮＴ／Ｃ１アイソフォームからの酵素ドメイン、またはＢｏＮＴ／Ｃ１サブタイプからの酵素ドメイン等の天然のＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン変異体；例えば、ＢｏＮＴ／Ｄアイソフォームからの酵素ドメイン、またはＢｏＮＴ／Ｄサブタイプからの酵素ドメイン等の天然のＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン変異体；例えば、ＢｏＮＴ／Ｅアイソフォームからの酵素ドメイン、またはＢｏＮＴ／Ｅサブタイプからの酵素ドメイン等の天然のＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン変異体；例えば、ＢｏＮＴ／Ｆアイソフォームからの酵素ドメイン、またはＢｏＮＴ／Ｆサブタイプからの酵素ドメイン等の天然のＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン変異体；例えば、ＢｏＮＴ／Ｇアイソフォームからの酵素ドメイン、またはＢｏＮＴ／Ｇサブタイプからの酵素ドメイン等の天然のＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン変異体；例えば、ＴｅＮＴアイソフォームからの酵素ドメイン、またはＴｅＮＴサブタイプからの酵素ドメイン等の天然のＴｅＮＴ酵素ドメイン変異体；例えば、ＢａＮＴアイソフォームからの酵素ドメイン、またはＢａＮＴサブタイプからの酵素ドメイン等の天然のＢａＮＴ酵素ドメイン変異体；または例えば、ＢｕＮＴアイソフォームからの酵素ドメイン、またはＢｕＮＴサブタイプからの酵素ドメイン等の天然のＢｕＮＴ酵素ドメイン変異体である。
【００５０】
この実施形態の態様において、天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体は、該天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の基礎となる参照クロストリジウム毒素酵素ドメインに対し、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドである。この実施形態の別の態様において、天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体は、該天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の基礎となる参照クロストリジウム毒素酵素ドメインに対し、例えば、最大７０％、最大７５％、最大も８０％、最大８５％、最大９０％、または最大９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドである。
【００５１】
この実施形態の態様において、クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体は、例えば、該天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の基礎となる参照クロストリジウム毒素酵素ドメインに対し、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、または１００個の非連続的なアミノ酸置換；該天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の基礎となる参照クロストリジウム毒素酵素ドメインに対し、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、または１００個の非連続的なアミノ酸置換；該天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の基礎となる参照クロストリジウム毒素酵素ドメインに対し、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、または１００個の非連続的なアミノ酸欠損；該天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の基礎となる参照クロストリジウム毒素酵素ドメインに対し、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、または１００個の非連続的なアミノ酸欠損；該天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の基礎となる参照クロストリジウム毒素酵素ドメインに対し、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、または１００個の非連続的なアミノ酸付加；または該天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の基礎となる参照クロストリジウム毒素酵素ドメインに対し、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、または１００個の非連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドである。
【００５２】
この実施形態の更に別の態様では、天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体は、例えば、該天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の基礎となる参照クロストリジウム毒素酵素ドメインに対し、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、または１００個の連続的なアミノ酸置換；該天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の基礎となる参照クロストリジウム毒素酵素ドメインに対し、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、または１００個の連続的なアミノ酸置換；該天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の基礎となる参照クロストリジウム毒素酵素ドメインに対し、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、または１００個の連続的なアミノ酸欠損；該天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の基礎となる参照クロストリジウム毒素酵素ドメインに対し、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、または１００個の連続的なアミノ酸欠損；該天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の基礎となる参照クロストリジウム毒素酵素ドメインに対し、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、または１００個の連続的なアミノ酸付加；または該天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の基礎となる参照クロストリジウム毒素酵素ドメインに対し、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、または１００個の連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドである。
【００５３】
他の実施形態では、クロストリジウム毒素酵素ドメインは、非天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体を含む。この実施形態のある態様では、非天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体は、例えば、保存的なＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン変異体、非保存的なＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン変異体、ＢｏＮＴ／Ａキメラ酵素ドメイン、または活性なＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン断片等の非天然のＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン変異体；例えば、保存的なＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン変異体、非保存的なＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン変異体、ＢｏＮＴ／Ｂキメラ酵素ドメイン、または活性なＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン断片等の非天然のＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン変異体；例えば、保存的なＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン変異体、非保存的なＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン変異体、ＢｏＮＴ／Ｃ１キメラ酵素ドメイン、または活性なＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン断片等の非天然のＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン変異体；例えば、保存的なＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン変異体、非保存的なＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン変異体、ＢｏＮＴ／Ｄキメラ酵素ドメイン、または活性なＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン断片等の非天然のＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン変異体；例えば、保存的なＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン変異体、非保存的なＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン変異体、ＢｏＮＴ／Ｅキメラ酵素ドメイン、または活性なＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン断片等の非天然のＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン変異体；例えば、保存的なＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン変異体、非保存的なＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン変異体、ＢｏＮＴ／Ｆキメラ酵素ドメイン、または活性なＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン断片等の非天然のＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン変異体；例えば、保存的なＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン変異体、非保存的なＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン変異体、ＢｏＮＴ／Ｇキメラ酵素ドメイン、または活性なＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン断片等の非天然のＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン変異体；例えば、保存的なＴｅＮＴ酵素ドメイン変異体、非保存的なＴｅＮＴ酵素ドメイン変異体、ＴｅＮＴキメラ酵素ドメイン、または活性なＴｅＮＴ酵素ドメイン断片等の非天然のＴｅＮＴ酵素ドメイン変異体；例えば、保存的なＢａＮＴ酵素ドメイン変異体、非保存的なＢａＮＴ酵素ドメイン変異体、ＢａＮＴキメラ酵素ドメイン、または活性なＢａＮＴ酵素ドメイン断片等の非天然のＢａＮＴ酵素ドメイン変異体；または、例えば、保存的なＢｕＮＴ酵素ドメイン変異体、非保存的なＢｕＮＴ酵素ドメイン変異体、ＢｕＮＴキメラ酵素ドメイン、または活性なＢｕＮＴ酵素ドメイン断片等の非天然のＢｕＮＴ酵素ドメイン変異体である。
【００５４】
この実施形態の態様において、非天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体は、該非天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の基礎となる参照クロストリジウム毒素酵素ドメインに対し、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドである。この実施形態の別の態様では、非天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体は、該非天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の基礎となる参照クロストリジウム毒素酵素ドメインに対し、例えば、最大７０％、最大７５％、最大８０％、最大８５％、最大９０％、または最大９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドである。
【００５５】
この実施形態の別の態様では、非天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体は、例えば、該非天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の基礎となる参照クロストリジウム毒素酵素ドメインに対し、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、または１００個の非連続的なアミノ酸置換；該非天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の基礎となる参照クロストリジウム毒素酵素ドメインに対し、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、または１００個の非連続的なアミノ酸置換；該非天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の基礎となる参照クロストリジウム毒素酵素ドメインに対し、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、または１００個の非連続的なアミノ酸欠損；該非天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の基礎となる参照クロストリジウム毒素酵素ドメインに対し、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、または１００個の非連続的なアミノ酸欠損；該非天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の基礎となる参照クロストリジウム毒素酵素ドメインに対し、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、または１００個の非連続的なアミノ酸付加；該非天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の基礎となる参照クロストリジウム毒素酵素ドメインに対し、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、または１００個の非連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドである。
【００５６】
この実施形態の更に別の態様において、非天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体は、例えば、該非天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の基礎となる参照クロストリジウム毒素酵素ドメインに対し、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、または１００個の連続的なアミノ酸置換；該非天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の基礎となる参照クロストリジウム毒素酵素ドメインに対し、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、または１００個の連続的なアミノ酸置換；該非天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の基礎となる参照クロストリジウム毒素酵素ドメインに対し、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、または１００個の連続的なアミノ酸欠損；該非天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の基礎となる参照クロストリジウム毒素酵素ドメインに対し、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、または１００個の連続的なアミノ酸欠損；該非天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の基礎となる参照クロストリジウム毒素酵素ドメインに対し、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、または１００個の連続的なアミノ酸付加；または該非天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の基礎となる参照クロストリジウム毒素酵素ドメインに対し、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、または１００個の連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドである。
【００５７】
他の実施形態において、クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体のポリペプチド鎖における１つの特定の位置にある疎水性アミノ酸は、他の疎水性アミノ酸で置換し得る。疎水性アミノ酸の例として、例えば、Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、ＶおよびＷが包含される。この実施形態の別の態様において、クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体のポリペプチド鎖における１つの特定の位置にある脂肪族アミノ酸は、他の脂肪族アミノ酸で置換し得る。脂肪族アミノ酸の例として、例えば、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｐ、およびＶが包含される。この実施形態の更に別の態様において、クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体のポリペプチド鎖における１つの特定の位置にある芳香族アミノ酸は、他の芳香族アミノ酸で置換し得る。芳香族アミノ酸の例として、例えば、Ｆ、Ｈ、Ｗ、およびＹが包含される。この実施形態の更に別の態様において、クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体のポリペプチド鎖における１つの特定の位置にあるスタッキングなアミノ酸は、他のスタッキングなアミノ酸で置換し得る。スタッキングなアミノ酸の例として、例えば、Ｆ、Ｈ、Ｗ、およびＹが包含される。この実施形態の更に別の態様において、クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体のポリペプチド鎖における１つの特定の位置にある極性アミノ酸は、他の極性アミノ酸で置換し得る。極性アミノ酸の例として、例えば、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、およびＲが包含される。この実施形態の更なる態様において、クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体のポリペプチド鎖における１つの特定の位置にある極性が低いまたは親和性のないアミノ酸は、極性の低いまたは親和性のない他のアミノ酸で置換し得る。極性の低いまたは親和性のないアミノ酸の例として、例えば、Ａ、Ｈ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、およびＹが包含される。この実施形態の更なる別の態様において、クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体のポリペプチド鎖における１つの特定の位置にある陽性荷電アミノ酸は、他の陽性荷電アミノ酸で置換し得る。陽性荷電アミノ酸の例として、例えば、Ｋ、Ｒ、およびＨが包含される。この実施形態の更に別の態様において、クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体のポリペプチド鎖における１つの特定の位置にある陰性荷電アミノ酸は、他の陰性荷電アミノ酸と置換し得る。陰性荷電アミノ酸の例として、ＤおよびＥが包含される。この実施形態の更に別の態様において、クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体のポリペプチド鎖における１つの特定の位置にある小さなアミノ酸は、他の小さなアミノ酸で置換し得る。小さなアミノ酸の例として、例えば、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、およびＴが包含される。この実施形態の更に別の態様において、クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体のポリペプチド鎖における１つの特定の位置にあるＣベータ分岐アミノ酸は他のＣベータアミノ酸で置換し得る。Ｃベータ分岐アミノ酸の例として、例えば、Ｉ、ＴおよびＶが包含される。
【００５８】
本発明の別の態様において、改変クロストリジウム毒素は、一部、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインを含む。本明細書中で使用される用語「クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン」とは、クロストリジウム毒素軽鎖のトランスロケーションを介在するクロストリジウム毒素中毒プロセスのトランスロケーション工程を実行することのできる任意のクロストリジウム毒素ポリペプチドを意味する。「トランスロケーション」とは、小胞膜を通過してポリペプチドが輸送されることを促進する能力を意味し、それによってポリペプチドの一部またはすべてを細胞質に暴露させる。種々のボツリヌス神経毒のトランスロケーションには、エンドソーム内のｐＨ低下による重鎖のアロステリックな構造変化が関与すると考えられている。この構造変化には重鎖のＮ末の半分が関与し、このＮ末の半分の介在によって、小胞膜の孔が形成されると思われている；この変化はタンパク分解性の軽鎖がエンドソーム小胞内から細胞質へ移動することを可能にする。例えば、Ｌａｃｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ５：８９８−９０２  （Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９９８）を参照のこと。こうして、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインは、クロストリジウム毒素軽鎖が細胞内小胞膜を通過して、細胞質へ移動することを促進する。クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインの非限定的な例として、例えば、ＢｏＮＴ／Ａトランスロケーションドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂトランスロケーションドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１トランスロケーションドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄトランスロケーションドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅトランスロケーションドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆトランスロケーションドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇトランスロケーションドメイン、ＴｅＮＴトランスロケーションドメイン、ＢａＮＴトランスロケーションドメイン、およびＢｕＮＴトランスロケーションドメインが包含される。クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインの非限定的な他の例として、例えば、配列番号：１３４のアミノ酸４４９−８７３、配列番号：１３５のアミノ酸４４２−８６０、配列番号１３６のアミノ酸４５０−８６８、配列番号：１３７のアミノ酸４４６−８６４、配列番号１３８のアミノ酸４２３−８４７、配列番号：１３９のアミノ酸４４０−８６６、配列番号：１４０のアミノ酸４４７−８６５、配列番号：１４１のアミノ酸４５８−８８１、配列番号：１４２のアミノ酸４３２−８５７、および配列番号：１４３のアミノ酸４２３−８４７が包含される。
【００５９】
クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインは、例えば、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインアイソフォームおよびクロストリジウム毒素トランスロケーションドメインサブタイプ等の天然クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体；例えば、保存的なクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体、非保存的クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインキメラ体、それらのクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン断片、またはそれらの組み合わせ等の非天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体を限定されずに包含する。
【００６０】
本明細書中で使用される用語「クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体」とは、天然または非天然を問わず、開示された参照配列（表１）の相当する領域から少なくとも１つのアミノ酸の変更を有するクロストリジウム毒素トランスロケーションドメインを意味し、かつ開示された上記参照配列の相当する領域に対するパ−セント同一性で記載され得る。明示的に示さない限り、開示された実施形態を実施するのに有用なクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体は、クロストリジウム毒素軽鎖のトランスロケーションを介在する上記毒素による中毒プロセスのトランスロケーション工程を実行する変異体である。非限定的な例として、配列番号：１３４のアミノ酸４４９−８７３を含むＢｏＮＴ／Ａトランスロケーションドメイン変異体は、例えば、配列番号：１３４のアミノ酸領域４４９−８７３と比較してアミノ酸の置換、欠損または付加等の少なくとも１つのアミノ酸の違いを有するであろう；配列番号：１３５のアミノ酸４４２−８６０を含むＢｏＮＴ／Ｂトランスロケーションドメイン変異体は、例えば、配列番号：１３５のアミノ酸領域４４２−８６０と比較してアミノ酸の置換、欠損または付加等の少なくとも１つのアミノ酸の違いを有するであろう；配列番号：１３６のアミノ酸４５０−８６８を含むＢｏＮＴ／Ｃ１トランスロケーションドメイン変異体は、例えば、配列番号：１３６のアミノ酸領域４５０−８６８と比較してアミノ酸の置換、欠損または付加等の少なくとも１つのアミノ酸の違いを有するであろう；配列番号：１３７のアミノ酸４４６−８６４を含むＢｏＮＴ／Ｄトランスロケーションドメイン変異体は、例えば、配列番号：１３７のアミノ酸領域４４６−８６４と比較してアミノ酸の置換、欠損または付加等の少なくとも１つのアミノ酸の違いを有するであろう；配列番号：１３８のアミノ酸４２３−８４７を含むＢｏＮＴ／Ｅトランスロケーションドメイン変異体は、例えば、配列番号：１３８のアミノ酸領域４２３−８４７と比較してアミノ酸の置換、欠損または付加等の少なくとも１つのアミノ酸の違いを有するであろう；配列番号：１３９のアミノ酸４４０−８６６を含むＢｏＮＴ／Ｆトランスロケーションドメイン変異体は、例えば、配列番号：１３９のアミノ酸領域４４０−８６６と比較してアミノ酸の置換、欠損または付加等の少なくとも１つのアミノ酸の違いを有するであろう；配列番号：１４０のアミノ酸４４７−８６５を含むＢｏＮＴ／Ｇトランスロケーションドメイン変異体は、例えば、配列番号：１４０のアミノ酸領域４４７−８６５と比較してアミノ酸の置換、欠損または付加等の少なくとも１つのアミノ酸の違いを有するであろう；配列番号：１４１のアミノ酸４５８−８８１を含むＴｅＮＴトランスロケーションドメイン変異体は、例えば、配列番号：１４１のアミノ酸領域４５８−８８１と比較してアミノ酸の置換、欠損または付加等の少なくとも１つのアミノ酸の違いを有するであろう；配列番号：１４２のアミノ酸４３２−８５７を含むＢａＮＴトランスロケーションドメイン変異体は、例えば、配列番号：１４２のアミノ酸領域４３２−８５７と比較してアミノ酸の置換、欠損または付加等の少なくとも１つのアミノ酸の違いを有するであろう；および配列番号：１４３のアミノ酸４２３−８４７を含むＢｕＮＴトランスロケーションドメイン変異体は、例えば、配列番号：１４３のアミノ酸領域４２３−８４７と比較してアミノ酸の置換、欠損または付加等の少なくとも１つのアミノ酸の違いを有するであろう。
【００６１】
本明細書中で使用される用語「天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体」とは、選択的スプライシングを受けた転写産物から生産されるクロストリジウム毒素トランスロケーションドメインアイソフォーム、自然突然変異により生産されるクロストリジウム毒素トランスロケーションドメインアイソフォーム、およびクロストリジウム毒素トランスロケーションドメインサブタイプを限定されずに包含する天然過程により生産される任意のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメインを意味する。天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体は、該天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体の基礎となる参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインと実質的に同様に機能することができ、本発明の任意の態様において、参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインの代わりに使用することができる。天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体の非限定的な例として、例えば、ＢｏＮＴ／Ａトランスロケーションドメインアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｂトランスロケーションドメインアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｃ１トランスロケーションドメインアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｄトランスロケーションドメインアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｅトランスロケーションドメインアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｆトランスロケーションドメインアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｇトランスロケーションドメインアイソフォーム、ＴｅＮＴトランスロケーションドメインアイソフォーム、ＢａＮＴトランスロケーションドメインアイソフォーム、およびＢｕＮＴトランスロケーションドメインアイソフォーム等のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメインアイソフォームがある。天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体の他の非限定的な例として、例えば、サブタイプＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ａ３、ＢｏＮＴ／Ａ４、およびＢｏＮＴ／Ａ５からのトランスロケーションドメイン；サブタイプＢｏＮＴ／Ｂ１，ＢｏＮＴ／Ｂ２，ＢｏＮＴ／Ｂ二価およびＢｏＮＴ／Ｂ非タンパク分解性からのトランスロケーションドメイン；サブタイプＢｏＮＴ／Ｃ１−１およびＢｏＮＴ／Ｃ１−２からのトランスロケーションドメイン；サブタイプＢｏＮＴ／Ｅ１、ＢｏＮＴ／Ｅ２およびＢｏＮＴ／Ｅ３からのトランスロケーションドメイン；およびサブタイプＢｏＮＴ／Ｆ１、ＢｏＮＴ／Ｆ２、ＢｏＮＴ／Ｆ３およびＢｏＮＴ／Ｆ４からのトランスロケーションドメイン等のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメインサブタイプがある。
【００６２】
本明細書中で使用される用語「非天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体」とは、ランダム変異導入法または合理的設計を用いて遺伝子操作により生産されるクロストリジウム毒素トランスロケーションドメインおよび化学合成により生産されるクロストリジウム毒素トランスロケーションドメインを限定されずに包含する、ヒトの操作により生産される任意のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメインを意味する。非天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体の非限定的な例として、例えば、保存的なクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体、非保存的なクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインキメラ変異体、および活性なクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン断片が包含される。非天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体の非限定的な例として、例えば、非天然のＢｏＮＴ／Ａトランスロケーションドメイン変異体、非天然のＢｏＮＴ／Ｂトランスロケーションドメイン変異体、非天然のＢｏＮＴ／Ｃ１トランスロケーションドメイン変異体、非天然のＢｏＮＴ／Ｄトランスロケーションドメイン変異体、非天然のＢｏＮＴ／Ｅトランスロケーションドメイン変異体、非天然のＢｏＮＴ／Ｆトランスロケーションドメイン変異体、非天然のＢｏＮＴ／Ｇトランスロケーションドメイン変異体、非天然のＴｅＮＴトランスロケーションドメイン変異体、非天然のＢａＮＴトランスロケーションドメイン変異体、および非天然のＢｕＮＴトランスロケーションドメイン変異体が包含される。
【００６３】
本明細書中で使用される用語「保存的なクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体」とは、他のアミノ酸、または参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン配列（表１）からのオリジナルなアミノ酸と同じ性質を少なくとも１つ有するアミノ酸類似体で置換されたアミノ酸を少なくとも１つ有するクロストリジウム毒素トランスロケーションドメインを意味する。性質の例として、同様のサイズ、トポグラフィ、荷電、疎水性、親水性、脂溶性、共有結合能、水素結合能、物理化学的性質等、またはそれらの任意な組み合わせが限定されずに包含される。保存的なクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体は、該保存的なクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体の基礎となる参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインと実質的に同様に機能でき、本発明の任意の態様において、参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインの代わりに使用することができる。保存的なクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体の非限定的な例として、例えば、保存的なＢｏＮＴ／Ａトランスロケーションドメイン変異体、保存的なＢｏＮＴ／Ｂトランスロケーションドメイン変異体、保存的なＢｏＮＴ／Ｃ１トランスロケーションドメイン変異体、保存的なＢｏＮＴ／Ｄトランスロケーションドメイン変異体、保存的なＢｏＮＴ／Ｅトランスロケーションドメイン変異体、保存的なＢｏＮＴ／Ｆトランスロケーションドメイン変異体、保存的なＢｏＮＴ／Ｇトランスロケーションドメイン変異体、保存的なＴｅＮＴトランスロケーションドメイン変異体、保存的なＢａＮＴトランスロケーションドメイン変異体、および保存的なＢｕＮＴトランスロケーションドメイン変異体が包含される。
【００６４】
本明細書中で使用される用語「非保存的なクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体」とは、１）該非保存的なクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体の基礎となる参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインから、少なくとも１つのアミノ酸が欠損している；２）該非保存的なクロストリジウム毒素トランスロケーションドメインの基礎となる参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインに、少なくとも１つのアミノ酸が付加している；または３）少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸または参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン配列（表１）からのオリジナルなアミノ酸と類似の性質を共有しないアミノ酸類似体で置換されている、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインを意味する。非保存的なクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体は、該非保存的なクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体の基礎となる参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインと実質的に同様に機能することができ、本発明の任意の態様において参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインの代わりに使用できる。非保存的なクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体の非限定的な例として、例えば、非保存的なＢｏＮＴ／Ａトランスロケーションドメイン変異体、非保存的なＢｏＮＴ／Ｂトランスロケーションドメイン変異体、非保存的なＢｏＮＴ／Ｃ１トランスロケーションドメイン変異体、非保存的なＢｏＮＴ／Ｄトランスロケーションドメイン変異体、非保存的なＢｏＮＴ／Ｅトランスロケーションドメイン変異体、非保存的なＢｏＮＴ／Ｆトランスロケーションドメイン変異体、非保存的なＢｏＮＴ／Ｇトランスロケーションドメイン変異体、および非保存的なＴｅＮＴトランスロケーションドメイン変異体、非保存的なＢａＮＴトランスロケーションドメイン変異体、および非保存的なＢｕＮＴトランスロケーションドメイン変異体が包含される。
【００６５】
本明細書中で使用される用語「クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインキメラ体」とは、クロストリジウム毒素酵素ドメインの少なくとも一部、および表１の参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインとは少なくとも１つの性質が異なる毒素トランスロケーションドメインを構成する少なくとも１本の他のポリペプチドの少なくとも一部を含むポリペプチドを意味する。ただし、このクロストリジウム毒素トランスロケーションドメインキメラ体は、神経伝達物質放出装置のコアコンポーネントを特異的に標的とすることが未だ可能であり、したがってクロストリジウム毒素がタンパク分解的に基質を切断する全体的な細胞機構の実行に関与する。クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインキメラ体の非限定的な例として、例えば、ＢｏＮＴ／Ａトランスロケーションドメインキメラ体、ＢｏＮＴ／Ｂトランスロケーションドメインキメラ体、ＢｏＮＴ／Ｃ１トランスロケーションドメインキメラ体、ＢｏＮＴ／Ｄトランスロケーションドメインキメラ体、ＢｏＮＴ／Ｆトランスロケーションドメインキメラ体、ＢｏＮＴ／Ｇトランスロケーションドメインキメラ体、ＴｅＮＴトランスロケーションドメインキメラ体、ＢａＮＴトランスロケーションドメインキメラ体、およびＢｕＮＴトランスロケーションドメインキメラ体が包含される。
【００６６】
本明細書中で使用される用語「活性なクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン断片」とは、本発明の態様において有用であり得るトランスロケーションドメインを含む種々のクロストリジウム毒素断片のいずれかを意味する。ただし、これらの活性断片はＬＣが標的細胞内の小胞から細胞質中に放出することを促進することができ、したがって細胞機構の実行に関与し、よってクロストリジウム毒素がタンパク分解的に基質を切断する。クロストリジウム毒素重鎖からのトランスロケーションドメインは、約４１０から４３０アミノ酸の長さで、１つのトランスロケーションドメインを含む（表１）。クロストリジウム毒素重鎖からのトランスロケーションドメインの全長はトランスロケーションドメインのトランスロケーション活性には不要であることが研究により示されている。したがって、この実施形態の態様は、例えば少なくとも３５０アミノ酸、少なくとも３７５アミノ酸、少なくとも４００アミノ酸、および少なくとも４２５アミノ酸の長さを有するトランスロケーションドメインを含むクロストリジウム毒素トランスロケーションドメインを包含し得る。この実施形態の別の態様は、例えば、最大３５０アミノ酸、最大３７５アミノ酸、最大４００アミノ酸および最大４２５アミノ酸の長さのトランスロケーションドメインを含むクロストリジウム毒素トランスロケーションドメインを包含し得る。
【００６７】
このように、実施形態において、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインは天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体を含む。本実施形態の態様では、天然のクロストリジウム毒素変異体は、例えば、ＢｏＮＴ／Ａアイソフォーム由来のトランスロケーションドメイン若しくはＢｏＮＴ／Ａサブタイプ由来のトランスロケーションドメインのような天然のＢｏＮＴ／Ａトランスロケーションドメイン変異体であり、例えば、ＢｏＮＴ／Ｂアイソフォーム由来のトランスロケーションドメイン若しくはＢｏＮＴ／Ｂサブタイプ由来のトランスロケーションドメインのような天然のＢｏＮＴ／Ｂトランスロケーションドメイン変異体であり、例えば、ＢｏＮＴ／Ｃ１アイソフォーム由来のトランスロケーションドメイン若しくはＢｏＮＴ／Ｃ１サブタイプ由来のトランスロケーションドメインのような天然のＢｏＮＴ／Ｃ１のトランスロケーションドメイン変異体であり、例えば、ＢｏＮＴ／Ｄアイソフォーム由来のトランスロケーションドメイン若しくはＢｏＮＴ／Ｄサブタイプ由来のトランスロケーションドメインのような天然のＢｏＮＴ／Ｄのトランスロケーションドメイン変異体であり、例えば、ＢｏＮＴ／Ｅアイソフォーム由来のトランスロケーションドメイン若しくはＢｏＮＴ／Ｅサブタイプ由来のトランスロケーションドメインのような天然のＢｏＮＴ／Ｅのトランスロケーションドメイン変異体であり、例えば、ＢｏＮＴ／Ｆアイソフォーム由来のトランスロケーションドメイン若しくはＢｏＮＴ／Ｆサブタイプ由来のトランスロケーションドメインのような天然のＢｏＮＴ／Ｆのトランスロケーションドメイン変異体であり、例えば、ＢｏＮＴ／Ｇアイソフォーム由来のトランスロケーションドメイン若しくはＢｏＮＴ／Ｇサブタイプ由来のトランスロケーションドメインのような天然のＢｏＮＴ／Ｇのトランスロケーションドメイン変異体であり、例えば、ＴｅＮＴアイソフォーム由来のトランスロケーションドメイン若しくはＴｅＮＴサブタイプ由来のトランスロケーションドメインのような天然のＴｅＮＴのトランスロケーションドメイン変異体であり、例えば、ＢａＮＴアイソフォーム由来のトランスロケーションドメイン若しくはＢａＮＴサブタイプ由来のトランスロケーションドメインのような天然のＢａＮＴのトランスロケーションドメイン変異体であり、又は、例えば、ＢｕＮＴアイソフォーム由来のトランスロケーションドメイン若しくはＢｕＮＴサブタイプ由来のトランスロケーションドメインのような天然のＢｕＮＴのトランスロケーションドメイン変異体である。
【００６８】
本実施形態の態様において、天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体は、天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインに対して、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、若しくは、少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドである。本実施形態のさらに別の態様において、天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体は、天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインに対して、例えば、多くとも７０％、多くとも７５％、多くとも８０％、多くとも８５％、多くとも９０％、若しくは、多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドである。
【００６９】
本実施形態の別の態様において、天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体は、例えば、天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインに対して多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、若しくは、１００個の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチド、天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインに対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、若しくは、１００個の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチド、天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインに対して多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、若しくは、１００個の非連続的なアミノ酸欠質を有するポリペプチド、天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインに対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、若しくは、１００個の非連続的なアミノ酸欠質を有するポリペプチド、天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインに対して多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、若しくは、１００個の非連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチド、又は、天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインに対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、若しくは、１００個の非連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドである。
【００７０】
本実施形態のさらに別の態様において、天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体は、例えば、天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインに対して多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、若しくは、１００個の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチド、天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインに対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、若しくは、１００個の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチド、天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインに対して多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、若しくは、１００個の連続的なアミノ酸欠質を有するポリペプチド、天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインに対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、若しくは、１００個の連続的なアミノ酸欠質を有するポリペプチド、天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインに対して多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、若しくは、１００個の連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチド、又は、天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインに対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、若しくは、１００個の連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドである。
【００７１】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインは非天然クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体を含む。本実施形態の態様において、非天然クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体は、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ａトランスロケーションドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ａトランスロケーションドメイン変異体、ＢｏＮＴ／Ａキメラトランスロケーションドメイン、若しくは、活性型ＢｏＮＴ／Ａトランスロケーションドメイン断片のような非天然ＢｏＮＴ／Ａトランスロケーションドメイン変異体、又は、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｂトランスロケーションドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｂトランスロケーションドメイン変異体、ＢｏＮＴ／Ｂキメラトランスロケーションドメイン、若しくは、活性型ＢｏＮＴ／Ｂトランスロケーションドメイン断片のような非天然ＢｏＮＴ／Ｂトランスロケーションドメイン変異体、又は、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１トランスロケーションドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１トランスロケーションドメイン変異体、ＢｏＮＴ／Ｃ１キメラトランスロケーションドメイン、若しくは、活性型ＢｏＮＴ／Ｃ１トランスロケーションドメイン断片のような非天然ＢｏＮＴ／Ｃ１トランスロケーションドメイン変異体、又は、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｄトランスロケーションドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｄトランスロケーションドメイン変異体、ＢｏＮＴ／Ｄキメラトランスロケーションドメイン、若しくは、活性型ＢｏＮＴ／Ｄトランスロケーションドメイン断片のような非天然ＢｏＮＴ／Ｄトランスロケーションドメイン変異体、又は、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｅトランスロケーションドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｅトランスロケーションドメイン変異体、ＢｏＮＴ／Ｅキメラトランスロケーションドメイン、若しくは、活性型ＢｏＮＴ／Ｅトランスロケーションドメイン断片のような非天然ＢｏＮＴ／Ｅトランスロケーションドメイン変異体、又は、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｆトランスロケーションドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｆトランスロケーションドメイン変異体、ＢｏＮＴ／Ｆキメラトランスロケーションドメイン、若しくは、活性型ＢｏＮＴ／Ｆトランスロケーションドメイン断片のような非天然ＢｏＮＴ／Ｆトランスロケーションドメイン変異体、又は、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｇトランスロケーションドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｇトランスロケーションドメイン変異体、ＢｏＮＴ／Ｇキメラトランスロケーションドメイン、若しくは、活性型ＢｏＮＴ／Ｇトランスロケーションドメイン断片のような非天然ＢｏＮＴ／Ｇトランスロケーションドメイン変異体、又は、例えば、保存的ＴｅＮＴトランスロケーションドメイン変異体、非保存的ＴｅＮＴトランスロケーションドメイン変異体、ＴｅＮＴキメラトランスロケーションドメイン、若しくは、活性型ＴｅＮＴトランスロケーションドメイン断片のような非天然ＴｅＮＴトランスロケーションドメイン変異体、又は、例えば、保存的ＢａＮＴトランスロケーションドメイン変異体、非保存的ＢａＮＴトランスロケーションドメイン変異体、ＢａＮＴキメラトランスロケーションドメイン、若しくは、活性型ＢａＮＴトランスロケーションドメイン断片のような非天然ＢａＮＴトランスロケーションドメイン変異体、又は、例えば、保存的ＢｕＮＴトランスロケーションドメイン変異体、非保存的ＢｕＮＴトランスロケーションドメイン変異体、ＢｕＮＴキメラトランスロケーションドメイン、若しくは、活性型ＢｕＮＴトランスロケーションドメイン断片のような非天然ＢｕＮＴトランスロケーションドメイン変異体である。
【００７２】
本実施形態の態様において、非天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体は、天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインに対して、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、若しくは、少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドである。本実施形態のさらに別の態様において、非天然のクロステリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体は、天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインに対して、例えば、多くとも７０％、多くとも７５％、多くとも８０％、多くとも８５％、多くとも９０％、若しくは、多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドである。
【００７３】
本実施形態の別の態様において、非天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体は、例えば、非天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインに対して多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、若しくは、１００個の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチド、非天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインに対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、若しくは、１００個の非連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチド、非天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインに対して多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、若しくは、１００個の非連続的なアミノ酸欠質を有するポリペプチド、非天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインに対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、若しくは、１００個の非連続的なアミノ酸欠質を有するポリペプチド、非天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインに対して多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、若しくは、１００個の非連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチド、又は、非天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインに対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、若しくは、１００個の非連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドである。
【００７４】
本実施形態のさらに別の態様において、非天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体は、例えば、非天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインに対して多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、若しくは、１００個の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチド、非天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインに対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、若しくは、１００個の連続的なアミノ酸置換を有するポリペプチド、非天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインに対して多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、若しくは、１００個の連続的なアミノ酸欠質を有するポリペプチド、非天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインに対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、若しくは、１００個の連続的なアミノ酸欠質を有するポリペプチド、非天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインに対して多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、若しくは、１００個の連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチド、又は、非天然のクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインに対して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、若しくは、１００個の連続的なアミノ酸付加を有するポリペプチドである。
【００７５】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体のポリペプチド鎖のある位置の疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換することができる。疎水性アミノ酸の例として、例えば、システイン、フェニルアラニン、イソロイシン、メチオニン、バリン、そして、トリプトファンが挙げられる。本実施形態の別の態様において、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体のポリペプチド鎖のある位置の脂肪族アミノ酸を別の脂肪族アミノ酸に置換することができる。脂肪族アミノ酸の例として、例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、そして、バリンが挙げられる。本実施形態のさらに別の態様において、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体のポリペプチド鎖のある位置の芳香族アミノ酸を別の芳香族アミノ酸に置換することができる。芳香族アミノ酸の例として、例えば、フェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファン、そして、チロシンが挙げられる。本実施形態のさらに別の態様において、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体のポリペプチド鎖のある位置のスタッキングアミノ酸を別のスタッキングアミノ酸に置換することができる。スタッキングアミノ酸の例として、例えば、フェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファン、そして、チロシンが挙げられる。本実施形態のさらに別の態様において、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体のポリペプチド鎖のある位置の極性アミノ酸を別の極性アミノ酸に置換することができる。極性アミノ酸の例として、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アスパラギン、グルタミン、そして、アルギニンが挙げられる。本実施形態のさらに別の態様において、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体のポリペプチド鎖のある位置のより極性の低いアミノ酸、若しくは、中性アミノ酸を別のより極性の低いアミノ酸、若しくは、中性アミノ酸で置換することができる。より極性の低いアミノ酸、若しくは、中性アミノ酸の例として、例えば、アラニン、ヒスチジン、グリシン、プロリン、セリン、トレオニン、そして、チロシンが挙げられる。本実施形態のさらに別の態様において、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体のポリペプチド鎖のある位置の正に荷電したアミノ酸を別の正に荷電したアミノ酸に置換することができる。正に荷電したアミノ酸の例として、例えば、リシン、アルギニン、そして、ヒスチジンが挙げられる。本実施形態のさらに別の態様において、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体のポリペプチド鎖のある位置の負に荷電したアミノ酸を別の負に荷電したアミノ酸に置換することができる。負に荷電したアミノ酸の例として、例えば、アスパラギン酸とグルタミン酸が挙げられる。本実施形態の別の態様において、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体のポリペプチド鎖のある位置の小アミノ酸を別の小アミノ酸で置換することができる。小アミノ酸の例として、例えば、アラニン、アスパラギン酸、グリシン、アスパラギン、プロリン、セリン、そして、トレオニンが挙げられる。本実施形態のさらに別の態様において、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体のポリペプチド鎖のある位置のべ−タ位炭素分枝アミノ酸を別のベ−タ位炭素分枝アミノ酸で置換することができる。べ−タ位炭素分枝アミノ酸の例として、例えば、イソロイシン、トレオニン、そして、バリンが挙げられる。
【００７６】
天然クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体、非天然クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体、天然クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体、非天然クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン変異体、そして、結合ドメインのパ−セント同一性を決定するために、これらに限定されないが、グロ−バルアラインメント法、ロ−カルアラインメント法、及び、例えばセグメントアプロ−チ法のようなハイブリッドアラインメント法を含む様々な配列比較法のうちどんな方法も使用されることができる。パ−セント同一性を決定するプロトコルは当業者の範囲内できまりきった方法である。
【００７７】
グロ−バルアラインメント法は配列をその分子の最初から最後まで整列させ、個々の残基対のスコアを合計し、そして、ギャップペナルティを課すことにより最適のアラインメントを決定する。非限定的な方法として、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ（例えば、Ｊｕｌｉｅ  Ｄ．  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ：  Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，  Ｐｏｓｉｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｃｈｏｉｃｅ，  ２２（２２）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４６７３−４６８０  （１９９４）を参照のこと）、及び、反復改善法（例えば、Ｏｓａｍｕ  Ｇｏｔｏｈ，  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ａｃｃｕｒａｃｙ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ  ｂｙ  Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  ａｓ  Ａｓｓｅｓｓｅｄ  ｂｙ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ，  ２６４（４）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ８２３−８３８  （１９９６）を参照のこと）が挙げられる。
【００７８】
ロ−カルアラインメント法は入力された全ての配列に共有される１つ以上の保存されたモチ−フを同定することにより配列を整列させる。非限定的な方法として、例えば、マッチボックス法（例えば、Ｅｒｉｃ  Ｄｅｐｉｅｒｅｕｘ  ａｎｄ  Ｅｒｎｅｓｔ  Ｆｅｙｔｍａｎｓ，  Ｍａｔｃｈ−Ｂｏｘ：  Ａ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｌｙ  Ｎｅｗ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｅｖｅｒａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，  ８（５）  ＣＡＢＩＯＳ  ５０１−５０９  （１９９２）を参照のこと）、及び、Ｇｉｂｂｓサンプリング法（例えば、Ｃ．Ｅ．  Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｓｕｂｔｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｉｇｎａｌｓ：  Ａ  Ｇｉｂｂｓ  Ｓａｍｐｌｉｎｇ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ，  ２６２（５１３１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０８−２１４  （１９９３）を参照のこと）、及び、Ａｌｉｇｎ−Ｍ法（例えば、Ｉｖｏ  Ｖａｎ  Ｗａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｌｉｇｎ−Ｍ  −  Ａ  Ｎｅｗ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，  ２０（９）  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １４２８−１４３５  （２００４）を参照のこと）が挙げられる。
【００７９】
ハイブリッドアラインメント法はグロ−バルアラインメント法とロ−カルアラインメント法の両方の機能的な局面を組み合わせる。非限定的な方法として、例えば、セグメント間比較法（例えば、Ｂｕｒｋｈａｒｄ  Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｂａｓｅｄ  Ｏｎ  Ｓｅｇｍｅｎｔ−Ｔｏ−Ｓｅｇｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，  ９３（２２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １２０９８−１２１０３  （１９９６）を参照のこと）、及び、Ｔ−Ｃｏｆｆｅｅ法（例えば、Ｃｅｄｒｉｃ  Ｎｏｔｒｅｄａｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔ−Ｃｏｆｆｅｅ：  Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ，  ３０２（１）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２０５−２１７  （２０００）を参照のこと）、及び、ＭＵＳＣＬＥ法（例えば、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｃ．  Ｅｄｇａｒ，  ＭＵＳＣＬＥ：  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｗｉｔｈ  Ｈｉｇｈ  Ｓｃｏｒｅ  Ａｃｃｕｒａｃｙ  ａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ，  ３２（５）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １７９２−１７９７  （２００４）を参照のこと）、及び、ＤＩＡＬＩＧＮ−Ｔ法（例えば、Ａｍａｒｅｎｄｒａｎ  Ｒ  Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＤＩＡＬＩＧＮ−Ｔ：  Ａｎ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  Ｓｅｇｍｅｎｔ−Ｂａｓｅｄ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ，  ６（１）  ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ６６  （２００５）を参照のこと）が挙げられる。
【００８０】
本明細書において開示される改変クロストリジウム毒素は柔軟なスペーサーを含む可動部をさらに含有することもできると理解される。柔軟なスペーサーを含む可動部はポリペプチド領域の長さを調整し、ポリペプチドの特徴、特質、若しくは、性状を最適化するために使用されうる。非限定的な例を挙げると、１つ以上の柔軟なスペーサーを直列に含むポリペプチド領域はプロテアーゼ切断部位をよりよく露出するように用いられることが可能であり、それによってプロテアーゼによるその部位の切断を容易にする。別の非限定的な例を挙げると、１つ以上の柔軟なスペーサーを直列に含むポリペプチド領域は組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインをよりよく呈示するように用いられることが可能であり、それによってその結合ドメインのそのレセプタ−への結合を容易にする。
【００８１】
ペプチドを含む柔軟なスペースは少なくとも１アミノ酸長であり、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、セリン、若しくは、ヒスチジンのような小さい側鎖Ｒ基を有する非荷電アミノ酸を含む。従って、一実施形態において、柔軟なスペーサーは、例えば、少なくとも１アミノ酸の、少なくとも２アミノ酸の、少なくとも３アミノ酸の、少なくとも４アミノ酸の、少なくとも５アミノ酸の、少なくとも６アミノ酸の、少なくとも７アミノ酸の、少なくとも８アミノ酸の、少なくとも９アミノ酸の、若しくは、少なくとも１０アミノ酸の長さを有することができる。別の実施形態において、柔軟なスペーサーは、例えば、多くとも１アミノ酸の、多くとも２アミノ酸の、多くとも３アミノ酸の、多くとも４アミノ酸の、多くとも５アミノ酸の、多くとも６アミノ酸の、多くとも７アミノ酸の、多くとも８アミノ酸の、多くとも９アミノ酸の、若しくは、多くとも１０アミノ酸の長さを有することができる。さらに別の実施形態において、柔軟なスペーサーは、例えば、１から３アミノ酸の間、２から４アミノ酸の間、３から５アミノ酸の間、４から６アミノ酸の間、若しくは、５から７アミノ酸の間でありうる。柔軟なスペーサーの非限定的な例として、例えば、ＧＧＧ、ＧＧＧＧ（配列番号：１４４）、及び、ＧＧＧＧＳ（配列番号：１４５）のようなＧースペーサー、又は、ＡＡＡ、ＡＡＡＡ（配列番号：１４６）、及び、ＡＡＡＡＶ（配列番号：１４７）のようなＡースペーサーが挙げられる。
【００８２】
従って、一実施形態では、本明細書において開示される改変クロストリジウム毒素は柔軟なスペーサーを含む可動部をさらに含むことができる。別の実施形態において、本明細書において開示される改変クロストリジウム毒素は複数の直列に並んだ柔軟なスペーサーを含む可動部をさらに含有することができる。本実施形態の態様において、可動部は直列に、例えば、少なくとも１つのＧースペーサー、少なくとも２つのＧースペーサー、少なくとも３つのＧースペーサー、少なくとも４つのＧースペーサー、若しくは、少なくとも５つのＧースペーサーを含むことができる。本実施形態の別の態様においては、可動部は直列に、例えば、多くとも１つのＧースペーサー、多くとも２つのＧースペーサー、多くとも３つのＧースペーサー、多くとも４つのＧースペーサー、若しくは、多くとも５つのＧースペーサーを含むことができる。本実施形態のさらに別の態様においては、可動部は直列に、例えば、少なくとも１つのＡースペーサー、少なくとも２つのＡースペーサー、少なくとも３つのＡースペーサー、少なくとも４つのＡースペーサー、若しくは、少なくとも５つのＡースペーサーを含むことができる。本実施形態のさらに別の態様においては、可動部は直列に、例えば、多くとも１つのＡースペーサー、多くとも２つのＡースペーサー、多くとも３つのＡースペーサー、多くとも４つのＡースペーサー、若しくは、多くとも５つのＡースペーサーを含むことができる。本実施形態の別の態様において、改変クロストリジウム毒素は１コピ−以上の同じ柔軟なスペーサー、１コピ−以上の異なる柔軟なスペーサー領域、若しくは、それらのどんな組み合わせも含む可動部を含有することができる。
【００８３】
本実施形態の別の態様において、柔軟なスペーサーを含む改変クロストリジウム毒素は、例えば、改変ＢｏＮＴ／Ａ、改変ＢｏＮＴ／Ｂ、改変ＢｏＮＴ／Ｃ１、改変ＢｏＮＴ／Ｄ、改変ＢｏＮＴ／Ｅ、改変ＢｏＮＴ／Ｆ、改変ＢｏＮＴ／Ｇ、改変ＴｅＮＴ、改変ＢａＮＴ、改変ＢｕＮＴであることができる。
【００８４】
改変クロストリジウム毒素が中毒プロセスを遂行することができるという条件で、本明細書で開示される改変クロストリジウム毒素はすべての位置に柔軟なスペーサーを含むことができると考えられる。本実施形態の態様において、柔軟なスペーサーは、例えば、酵素ドメインとトランスロケーションドメインの間、酵素ドメインと組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインの間、酵素ドメインと外来性プロテアーゼ切断部位の間に位置する。本実施形態の別の態様において、Ｇースペーサーは、例えば、酵素ドメインとトランスロケーションドメインの間、酵素ドメインと組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインの間、酵素ドメインと外来性プロテアーゼ切断部位の間に位置する。本実施形態の別の態様において、Ａースペーサーは、例えば、酵素ドメインとトランスロケーションドメインの間、酵素ドメインと組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインの間、酵素ドメインと外来性プロテアーゼ切断部位の間に位置する。
【００８５】
本実施形態の別の態様において、柔軟なスペーサーは、例えば、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインとトランスロケーションドメインの間、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインと酵素ドメインの間、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインと外来性プロテアーゼ切断部位の間に位置する。本実施形態の別の態様において、Ｇースペーサーは、例えば、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインとトランスロケーションドメインの間、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインと酵素ドメインの間、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインと外来性プロテアーゼ切断部位の間に位置する。本実施形態の別の態様において、Ａースペーサーは、例えば、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインとトランスロケーションドメインの間、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインと酵素ドメインの間、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインと外来性プロテアーゼ切断部位の間に位置する。
【００８６】
本実施形態のさらに別の態様において、柔軟なスペーサーは、例えば、トランスロケーションドメインと酵素ドメインの間、トランスロケーションドメインと組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインの間、トランスロケーションドメインと外来性プロテアーゼ切断部位の間に位置する。本実施形態の別の態様において、Ｇースペーサーは、例えば、トランスロケーションドメインと酵素ドメインの間、トランスロケーションドメインと組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインの間、トランスロケーションドメインと外来性プロテアーゼ切断部位の間に位置する。本実施形態の別の態様において、Ａースペーサーは、例えば、トランスロケーションドメインと酵素ドメインの間、トランスロケーションドメインと組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインの間、トランスロケーションドメインと外来性プロテアーゼ切断部位の間に位置する。
【００８７】
本明細書で開示される改変クロストリジウム毒素は、該改変クロストリジウム毒素は中毒プロセスを遂行することができるかぎり、すべての位置に組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインを含むことができると考えられる。非限定的な例として、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインを改変クロストリジウム毒素のアミノ末端に位置する例、及び、改変クロストリジウム毒素のクロストリジウム毒素酵素ドメインとトランスロケーションドメインの間に組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインを位置する例が挙げられる。別の非限定的な例として、改変クロストリジウム毒素のクロストリジウム毒素酵素ドメインとクロストリジウム毒素トランスロケーションドメインの間に組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインを位置する例が挙げられる。天然のクロストリジウム毒素の酵素ドメインは本来の開始メチオニンを含む。従って、酵素ドメインがアミノ末端部位にないドメイン構成において、開始メチオニンを含むアミノ酸配列はアミノ末端ドメインの前に配置されるべきである。同様に、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインがアミノ末端部位にある場合、開始メチオニンとプロテアーゼ切断部位を含むアミノ酸配列は、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインがフリ−なアミノ末端を必要とする場合に機能しうるように繋がることができる。例えば、Ｓｈｅｎｇｗｅｎ  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ，  米国特許出願１１／５７２，５１２号  （Ｊａｎ．  ２３，  ２００７）を参照のこと。この文献の内容全体を参照として明細書に組み入れる。さらに、機能しうるように繋がっているポリペプチドを開始メチオニンを含む別のポリペプチドのアミノ末端に付加すると本来の開始メチオニン残基が削除されうることは、本技術分野で公知である。
【００８８】
従って、ある実施形態において、本明細書で開示される改変クロストリジウム毒素は、アミノ末端からカルボキシ末端へ、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメイン、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン、及び、クロストリジウム毒素酵素ドメインの線形順序でこれらのドメインを含む一本鎖ポリペプチドを含むことができる。別の実施形態において、本明細書で開示される改変クロストリジウム毒素は、アミノ末端からカルボキシ末端へ、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、及び、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインの線形順序でこれらのドメインを含む単一ポリペプチドを含むことができる。さらに別の実施形態において、本明細書で開示される改変クロストリジウム毒素は、アミノ末端からカルボキシ末端へ、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメイン、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインの線形順序でこれらのドメインを含む単一ポリペプチドを含むことができる。さらに別の実施形態において、本明細書で開示される改変クロストリジウム毒素は、アミノ末端からカルボキシ末端へ、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメインの線形順序でこれらのドメインを含む一本鎖ポリペプチドを含むことができる。
【００８９】
本発明の態様は、一部において、ポリヌクレオチド分子を提供するものである。本明細書で使用されるように、「ポリヌクレオチド分子」という用語は「核酸分子」と同意であり、例えば、リボヌクレオチドやデオキシリボヌクレオチドのような、任意の長さのヌクレオチドの重合体を意味する。本明細書で開示される全ての改変クロストリジウム毒素はポリヌクレオチド分子にコードされうることが考えられる。これらに限定されないが、天然のＤＮＡ分子、及び、非天然のＤＮＡ分子、及び、天然のＲＮＡ分子、及び、非天然のＲＮＡ分子を含む、本明細書で開示される改変クロストリジウム毒素をコードしうる全てのポリヌクレオチド分子が有効でありうることも考えられる。天然のＤＮＡ分子、及び、非天然のＤＮＡ分子の非限定的な例として、一本鎖ＤＮＡ分子、二本鎖ＤＮＡ分子、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、並びに、例えば、プラスミドコンストラクト、ファージミドコンストラクト、バクテリオファージコンストラクト、レトロウイルスコンストラクト、及び、人工染色体コンストラクトのようなベクターコンストラクトが挙げられる。天然のＲＮＡ分子、及び、非天然のＲＮＡ分子の非限定的な例として、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ｍＲＮＡが挙げられる。
【００９０】
本明細書で公開する改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子の作成に必要でありうる、しっかり確立された分子生物学の技術には、これらに限定されないが、当業者の範囲内できまりきった方法であるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、制限酵素反応、アガロースゲル電気泳動、核酸ライゲーション、細菌の形質転換、核酸抽出、核酸シークエンシング、及び、遺伝的組換えに基づく技術を含む方法が含まれる。改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子の作成に必要である特定のプロトコルの非限定的な例は、例えば、前掲のＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，  （２００１）、および、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  （Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ２００４）に記述されている。さらに、改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子の作成に有用なさまざまな市販品が広く利用可能である。これらのプロトコルは当業者の範囲内できまりきった方法である。
【００９１】
従って、一実施形態において、ポリヌクレオチド分子が本明細書で開示される改変クロストリジウム毒素をコードする。本実施形態の態様において、ポリヌクレオチド分子が、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメイン、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン、及び、クロストリジウム毒素酵素ドメインを含む改変クロストリジウム毒素をコードする。本実施形態の別の態様において、ポリヌクレオチド分子が、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、及び、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインを含む改変クロストリジウム毒素をコードする。本実施形態のさらに別の態様において、ポリヌクレオチド分子が、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメイン、及び、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインを含む改変クロストリジウム毒素をコードする。本実施形態のさらに別の態様において、ポリヌクレオチド分子が、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメイン、及び、クロストリジウム毒素酵素ドメインを含む改変クロストリジウム毒素をコードする。
【００９２】
本発明の別の態様は、部分的に、本明細書で開示される改変クロストリジウム毒素を生産する方法であって、細胞内で改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を発現させる工程を含む方法を提供するものである。本発明の別の態様は、本明細書で開示される改変クロストリジウム毒素を生産する方法で、本明細書で開示される改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を含む発現コンストラクトを細胞に導入し、細胞内で発現コンストラクトを発現させる工程を含む方法を提供するものである。
【００９３】
本明細書で開示される方法は、部分的に、改変クロストリジウム毒素を含む。本明細書で開示される全ての改変クロストリジウム毒素は本明細書で開示される方法を用いて生産されうることが考えられる。本明細書で開示される改変クロストリジウム毒素をコードする全てのポリヌクレオチド分子は、本明細書で開示される方法を用いて、本明細書で開示される改変クロストリジウム毒素を生産するのに有効でありうることも考えられる。
【００９４】
本明細書で開示される方法は、部分的に、発現コンストラクトを含む。発現コンストラクトは、細胞内で、若しくは、無細胞抽出液でポリヌクレオチド分子を発現させるのに有効な発現ベクターに作動可能に連結された本明細書で開示されるポリヌクレオチド分子を含む。これらに限定されないが、ウイルス発現ベクター、原核生物発現ベクター、並びに、例えば、酵母発現ベクター、昆虫発現ベクター、及び、哺乳類発現ベクターのような真核生物発現ベクター、並びに、無細胞抽出液発現ベクターを含む多種多様の発現ベクターが改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチドを発現させるのに使用されうる。これらの方法の態様を実践するのに有効な発現ベクターは改変クロストリジウム毒素を恒常的、組織特異的、細胞特異的、若しくは、誘導性のプロモーター配列、エンハンサー配列、又は、その両方の制御下で発現するベクターを含みうることが、さらに、理解されている。発現ベクターの非限定的な例は、そのような発現ベクターから発現コンストラクトを作成し使用するのにしっかりと確立された試薬、及び、条件とともに、これらに限定されないが、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ、ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ、  ＱＩＡＧＥＮ，  Ｉｎｃ．，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ、及び、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡを含む供給業者より容易に入手可能である。適切な発現ベクターの選択と、作成、及び、使用は当業者の範囲内できまりきった方法である。
【００９５】
従って、本実施形態の態様は、これらに限定されないが、改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたウイルス発現ベクター、改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された原核生物発現ベクター、改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された酵母発現ベクター、改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された昆虫発現ベクター、及び、改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された哺乳類発現ベクターを含む。本実施形態の別の態様は、これらに限定されないが、本明細書で開示される改変クロストリジウム毒素を、改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された無細胞抽出液発現ベクターを含む無細胞抽出液を用いて発現させるのに適した発現コンストラクトを含む。
【００９６】
本明細書で開示される方法は、部分的に、細胞を含む。全ての細胞が使用されうると考えられる。従って、本実施形態の態様は、これらに限定されないが、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｒｕｌｌｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、及び、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍに由来する細菌のような好気性、微好気性、好二酸化炭素性、通性、嫌気性、グラム陰性、及び、グラム陽性の細菌細胞の株などを含めて様々な原核細胞、並びに、これらに限定されないが、例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、及び、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａに由来するような酵母株、例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、及び、Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａに由来するような昆虫細胞と昆虫培養細胞株、及び、例えば、マウス、ラット、ハムスタ−、ブタ、ウシ、ウマ、霊長類、及び、ヒトに由来するような哺乳類細胞と哺乳類培養細胞株を含む様々な真核細胞を含む。細胞株はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、及び、Ｔｈｅ  Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓより入手可能である。適切な細胞株を選択し、作成し、使用する特定のプロトコルの非限定的な例は、例えば、ＩＮＳＥＣＴ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  （Ｍａｔｔｈｅｕｓ  Ｆ．  Ａ．  Ｇｏｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  １９９３）、ＩＮＳＥＣＴ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥＳ：  ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＥＤ  ＡＳＰＥＣＴＳ  （Ｊ．  Ｍ．  Ｖｌａｋ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．，  Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  １９９６）、Ｍａｕｒｅｅｎ  Ａ．  Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ＆  Ｉａｎ  Ｆ．  Ｒａｅ，  ＧＥＮＥＲＡＬ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ  ＯＦ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ  （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９７）、ＣＥＬＬ  ＡＮＤ  ＴＩＳＳＵＥ  ＣＵＬＴＵＲＥ：  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＰＲＯＣＥＤＵＲＥＳ  （Ａｌａｎ  Ｄｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ  ｅｄｓ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  １９９８）、Ｒ．  Ｉａｎ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  ＣＵＬＴＵＲＥ  ＯＦ  ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬＳ：  Ａ  ＭＡ��ＵＡＬ  ＯＦ  ＢＡＳＩＣ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥ  （Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  ４ｔｈ  ｅｄ．  ２０００）、ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ：  Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ  （Ｊｏｈｎ  Ｒ．  Ｗ．  Ｍａｓｔｅｒｓ  ｅｄ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ３ｒｄ  ｅｄ．  ２０００）、前掲のＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，  （２００１）、  ＢＡＳＩＣ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ：  Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ  （Ｊｏｈｎ  Ｍ．  Ｄａｖｉｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ，  ２ｎｄ  ｅｄ．  ２００２）、及び、前掲のＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  （２００４）に記述されている。これらのプロトコルは当業者の範囲内ではきまりきった方法である。
【００９７】
本明細書において開示される方法は、部分的に、ポリヌクレオチド分子を細胞に導入することを含む。細胞に導入されたポリヌクレオチド分子は一時的に、若しくは、安定的にその細胞によって維持されうる。安定的に維持されるポリヌクレオチド分子は染色体外に存在し、自律的に複製しうる、又は、細胞の染色体に組み込まれ、非自律的に複製しうる。本明細書で開示されるポリヌクレオチド分子を細胞に導入するための全ての方法が使用されうることが考えられる。細胞に核酸分子を導入するのに有効な方法は、これらに限定されないが、例えば、塩化カルシウム介在法、リン酸カルシウム介在法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストラン介在法、脂質介在法、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）介在法、ポリリシン介在法、及び、ポリブレン介在法のような化学的形質移入法、若しくは、形質転換法、例えば、パ−ティクル・ガン法、マイクロインジェクション法、プロトプラスト融合法、及び、電気穿孔法のような物理的形質移入法、若しくは、形質転換法、並びに、例えば、レトロウイルス介在形質移入法のようなウイルス介在形質移入法を含む。例えば、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎｔｏ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，  ｐｐ．  １６．１−１６．６２  （Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  ｅｄｓ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｖｏｌ．  ３，  ３ｒｄ  ｅｄ．  ２００１）を参照のこと。当業者は、発現コンストラクトを細胞に導入する特定の方法の選択は、細胞が発現コンストラクトを一時的に保持するかどうか、若しくは、細胞が発現コンストラクトを安定的に保持するかどうかで、部分的に、左右されるであろうことを理解している。当業者の範囲内でこれらのプロトコルはきまりきった方法である。
【００９８】
本実施形態の態様において、化学的方法は、トランスフェクションと呼ばれるが、改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を細胞に導入するために使用される。形質移入の化学的方法では、化学試薬は核酸と複合体を形成し、細胞へのその取り込みを容易にする。そのような化学試薬は、これらに限定されないが、リン酸カルシウム介在性（例えば、Ｍａｒｔｉｎ  Ｊｏｒｄａｎ  ＆  Ｆｌｏｒｉａｎ  Ｗｏｒｍ，  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｈｅｒｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，  ３３（２）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３６−１４３  （２００４）を参照のこと）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストラン介在性、脂質介在性、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）介在性のような陽イオン性ポリマ−介在性、及び、ポリリシン介在性、及び、ポリブレン介在性（例えば、Ｃｈｕｎ  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ，  ３３（２）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４４−１５０  （２００４）を参照のこと）を含む。そのような化学的デリバリーシステムは標準的な方法により調製されることができ、そして、市販されている。例えば、ＣｅｌｌＰｈｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，  Ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｎｄ  ＤＥＡＥ  Ｄｅｘｔｒａｎ，  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｉｎｃ．，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥTM  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）、ＥｘＧｅｎ  ５００  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｈａｎｏｖｅｒ，  ＭＤ）、及び、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ  ａｎｄ  Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ  （Ｑｉａｇｅｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）を参照のこと。
【００９９】
本実施形態の別の態様において、物理的方法は改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を細胞に導入するために使用される。物理的技法は、これらに限定されないが、電気穿孔法、パ−ティクル・ガン法、及び、マイクロインジェクション法を含む。パーティクル・ガン法、及び、マイクロインジェクション法は細胞に核酸分子を導入するために細胞壁に穴をあける。例えば、Ｊｅｉｋｅ  Ｅ．  Ｂｉｅｗｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｓｍｉｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，  ７１（１）  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６７−７５  （１９９７）、及び、Ｊｏｈｎ  Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ＆  Ｓａｒａｈ  Ｃ．  Ｒ．  Ｌｕｍｍｉｓ，  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｄｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ：  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｇｕｎ  ｔｏ  ｄｅｌｉｖｅｒ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ｄｙｅｓ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，  ３３（２）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２１−１２５  （２００４）を参照のこと。電気穿孔法は、電気透過処理法とも呼ばれるが、短時間の高電圧の電気パルスを用い、膜に一時的な穴を創り、その穴を通して核酸分子が入り込む。電気穿孔法はあらゆる細胞種の安定的な形質移入、及び、一時的な形質移入に効果的に使用されうる。例えば、Ｍ．  Ｇｏｌｚｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ，  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ３３（２）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２６−１３５  （２００４）、及び、Ｏｌｉｖｅｒ  Ｇｒｅｓｃｈｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｗ  ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌｓ，  ３３（２）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １５１−１６３  （２００４）を参照のこと。
【０１００】
本実施形態の別の態様において、ウイルス介在法は、形質導入と呼ばれるが、改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を細胞中に導入するために使用される。一時的な形質導入のウイルス介在法において、ウイルス粒子が感染し、宿主細胞中で複製するプロセスが、該メカニズムを用いて核酸分子を細胞に導入するために、操作されてきた。ウイルス介在法は、これらに限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ピコルナウイルス、アルファウイルス、及び、バキュロウイルスを含む多種多様なウイルスから開発されてきた。例えば、Ａｒｍｉｎ  Ｂｌｅｓｃｈ，  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ａｎｄ  ＭＬＶ  ｂａｓｅｄ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ，  ３３（２）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １６４−１７２  （２００４）  、Ｍａｕｒｉｚｉｏ  Ｆｅｄｅｒｉｃｏ，  Ｆｒｏｍ  ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｅｓ  ｔｏ  ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ，  ２２９  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３−１５  （２００３）  、Ｅ．  Ｍ．  Ｐｏｅｓｃｈｌａ，  Ｎｏｎ−ｐｒｉｍａｔｅ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ，  ５（５）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ５２９−５４０  （２００３）  、Ｋａｒｉｍ  Ｂｅｎｉｈｏｕｄ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，  １０（５）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ４４０−４４７  （１９９９）  、Ｈ．  Ｂｕｅｌｅｒ，  Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ，  ３８０（６）  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ６１３−６２２  （１９９９）  、Ｃｈｏｏｉ  Ｍ．  Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ，  ２１（１２）  ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ８９５−９１３  （２００２）；  Ｅｄｗａｒｄ  Ａ．  Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｕｓｉｎｇ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ，  ２１（１２）  ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ９１５−９３６  （２００２）；  Ｐａｏｌａ  Ｇｒａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＨＳＶ  ａｍｐｌｉｃｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ，  ３３（２）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７９−１８６  （２００４）、Ｉｌｙａ  Ｆｒｏｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ：  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ９３（２１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．  １１３７１−１１３７７  （１９９６）  、Ｍａｒｋｕｓ  Ｕ．  Ｅｈｒｅｎｇｒｕｂｅｒ，  Ａｌｐｈａｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ５９（１）  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  Ｂｕｌｌ．  １３−２２  （２００２）；  Ｔｈｏｍａｓ  Ａ．  Ｋｏｓｔ  ＆  Ｊ．  Ｐａｔｒｉｃｋ  Ｃｏｎｄｒｅａｙ，  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ��ｓ  ａｓ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｇｅｎｅ−ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ，  ２０（４）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １７３−１８０  （２００２）  、及び、Ａ．  Ｈｕｓｅｒ  ＆  Ｃ．  Ｈｏｆｍａｎｎ，  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ：  ｎｏｖｅｌ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｇｅｎｅ−ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｈｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ３（１）  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５３−６３  （２００３）を参照のこと。
【０１０１】
アデノウイルスは約３６ｋｂの比較的大きいポリヌクレオチド分子を扱い、高力価で生じ、多種多様の分裂細胞、及び、非分裂細胞の両方に効率よく感染することができるので、アデノウイルスは、無エンベロープの二本鎖ＤＮＡウイルスであるのだが、しばしば、哺乳類細胞の形質導入に選択される。例えば、Ｗｉｍ  Ｔ．  Ｊ．  Ｍ．  Ｃ．  Ｈｅｒｍｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｎｄ  ｇｌｉａ：  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＣＮＳ  ａｎｄ  ＰＮＳ，  ７１（１）  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８５−９８  （１９９７）  、及び、Ｈｉｒｏｙｕｋｉ  Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ，  ５２（３）  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．  １６５−１７６  （２００１）を参照のこと。核酸分子が細胞内でエピソームにより保有されるので、アデノウイルスベースのシステムを用いた形質導入はタンパク質の長期の発現には耐えない。アデノウイルスベクターシステムとそのようなベクターの使用法についての特定のプロトコルは、例えば、ＶＩＲＡＰＯＷＥＲTM  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）  及び  ＶＩＲＡＰＯＷＥＲTM  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ  ２５−０５４３  ｖｅｒｓｉｏｎ  Ａ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ．，  （Ｊｕｌ．  １５，  ２００２）  、並びに、ＡＤＥＡＳＹTM  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｉｎｃ．，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）  及び  ＡＤＥＡＳＹTM  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ  ０６４００４ｆ，  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｉｎｃで公開されている。
【０１０２】
核酸分子デリバリーは、例えば、オンコレトロウイルス、及び、レンチウイルスのような一本鎖ＲＮＡウイルスを使用することもできる。レトロウイルス介在形質導入は、しばしば、１００％に近い形質導入効率をもたらし、感染多重度（ＭＯＩ）を変化させることによりプロウイルスのコピー数を容易に制御することができる。例えば、Ｔｉｚｉａｎａ  Ｔｏｎｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ−  ａｎｄ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ−ｂａｓｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，  ２８５  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １４１−１４８  （２００４）、Ａｒｍｉｎ  Ｂｌｅｓｃｈ，  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ａｎｄ  ＭＬＶ  ｂａｓｅｄ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ，  ３３（２）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １６４−１７２  （２００４）、Ｆｅｌｉｘ  Ｒｅｃｉｌｌａｓ−Ｔａｒｇａ，  Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ，  ２６７  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４１７−４３３  （２００４）、及び、Ｒｏｌａｎｄ  Ｗｏｌｋｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，  ２４６  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３９１−４１１  （２００４）を参照のこと。レトロウイルス粒子はタンパク質のカプシドに詰め込まれたＲＮＡゲノムから成り、それが脂質のエンベロープに囲まれている。レトロウイルスはそのＲＮＡを逆転写酵素とともに細胞質に注入することにより宿主細胞に感染する。ＲＮＡテンプレートは、それから、線状の二本鎖ｃＤＮＡに逆転写され、宿主細胞のゲノムにインテグレートすることにより自身を複製する。ウイルス粒子は水平的に（ビリオンを介して細胞から細胞へ）広がるばかりでなく、垂直的に（プロウイルスを介して親細胞から娘細胞へ）広がる。対象の核酸分子が宿主細胞の染色体に安定的に組み込まれ、それによって、タンパク質の長期にわたる発現を可能にするので、この複製戦略は長期にわたる持続的な発現を可能にする。例えば、様々な組織に注入されたレンチウイルスが１年以上の間、持続的なタンパク質発現を引き起こすことが、動物を用いた研究により示されてきた。例えば、Ｌｕｉｇｉ  Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｄｉｖｉｄｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ，  ２７２（５２５９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３−２６７  （１９９６）を参照のこと。例えば、モロニ−マウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）のようなオンコレトロウイルス由来のシステムは広く使用され、多様な非分裂細胞に感染する。レンチウイルスも分裂細胞と非分裂細胞を含む多様な細胞種に感染し、高度に特異的な細胞へのターゲッティングを許容する複雑なエンベロープタンパク質をもつことができる。
【０１０３】
レトロウイルスベクターとそのようなベクターの使用法についての特定のプロトコルは、例えば、Ｍａｎｆｒｅｄ  Ｇｏｓｓｅｎ  ＆  Ｈｅｒｍａｎｎ  Ｂｕｊａｒｄ，  Ｔｉｇｈｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ，  米国特許５，４６４，７５８号  （Ｎｏｖ．  ７，  １９９５）、Ｈｅｒｍａｎｎ  Ｂｕｊａｒｄ  ＆  Ｍａｎｆｒｅｄ  Ｇｏｓｓｅｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  米国特許５，８１４，６１８号  （Ｓｅｐ．  ２９，  １９９８）、Ｄａｖｉｄ  Ｓ．  Ｈｏｇｎｅｓｓ，  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｉｎｓｅｃｔ  ｓｔｅｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｓ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓａｍｅ，  米国特許５，５１４，５７８号  （Ｍａｙ  ７，  １９９６）、Ｄａｖｉｄ  Ｓ．  Ｈｏｇｎｅｓｓ，  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｉｎｓｅｃｔ  ｅｃｄｙｓｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，  米国特許６，２４５，５３１号  （Ｊｕｎ．  １２，  ２００１）  、Ｅｌｉｓａｂｅｔｔａ  Ｖｅｇｅｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｈａｖｉｎｇ  Ｃ．  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎｓ，  米国特許５，３６４，７９１号  （Ｎｏｖ．  １５，  １９９４）  、Ｅｌｉｓａｂｅｔｔａ  Ｖｅｇｅｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｕｔａｔｅｄ  ｓｔｅｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｗｉｔｃｈ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ，  米国特許５，８７４，５３４号  （Ｆｅｂ．  ２３，  １９９９）  、及び、Ｅｌｉｓａｂｅｔｔａ  Ｖｅｇｅｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｕｔａｔｅｄ  ｓｔｅｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｗｉｔｃｈ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ，  米国特許５，９３５，９３４号  （Ａｕｇ．  １０，  １９９９）で公開されている。そのようなウイルスデリバリーシステムは標準的な方法により調製されることができ、そして、市販されている。例えば、ＢＤＴＭ  Ｔｅｔ−Ｏｆｆ  ａｎｄ  Ｔｅｔ−Ｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）  及び  ＢＤＴＭ  Ｔｅｔ−Ｏｆｆ  ａｎｄ  Ｔｅｔ−Ｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌ，  ＰＴ３００１−１，  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，  （Ｍａｒ．  １４，  ２００３）  、ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈＴＭ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）  及び  ＧＥＮＥＳＷＩＴＣＨＴＭ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ａ  Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ−Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｄ，  ２５−０���１３，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ．，  （Ｎｏｖ．  ４，  ２００２）  、ＶＩＲＡＰＯＷＥＲＴＭ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）  及び  ＶＩＲＡＰＯＷＥＲＴＭ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ  ２５−０５０１  ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｅ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ．，  （Ｄｅｃ．  ８，  ２００３）  、並びに、ＣＯＭＰＬＥＴＥ  ＣＯＮＴＲＯＬ（登録商標）  Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）  及び  ＣＯＭＰＬＥＴＥ  ＣＯＮＴＲＯＬ（登録商標）  Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ，  ０６４００５ｅを参照のこと。
【０１０４】
本明細書で開示される方法は、部分的に、ポリヌクレオチド分子から改変クロストリジウム毒素を発現させることを含む。これらに限定されないが、細胞ベースのシステム、及び、無細胞発現システムを含む様々な発現システムのどんなものもポリヌクレオチド分子から改変クロストリジウム毒素を発現させるために使用されうると考えられる。細胞ベースのシステムは、これらに限定されないが、ウイルス発現システム、原核細胞発現システム、酵母細胞発現システム、バキュロウィウルス発現システム、昆虫細胞発現システム、哺乳類細胞発現システムを含む。無細胞システムは、これらに限定されないが、小麦は伊賀抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、及び、大腸菌抽出液を含み、一般的に本明細書で開示される方法に同等である。発現システムを用いるポリヌクレオチド分子の発現は、これらに限定されないが、誘導発現、非誘導発現、恒常的発現、ウイルス介在発現、安定的に組み込まれた発現、及び、一時的な発現を含む多様な特徴のどんなものをも含むことができる。特徴がはっきりしたベクター、試薬、条件、及び、細胞を含む発現システムは、これらに限定されないが、Ａｍｂｉｏｎ，  Ｉｎｃ．  Ａｕｓｔｉｎ，  ＴＸ；  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ、ＱＩＡＧＥＮ，  Ｉｎｃ．，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ、及び、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡを含む供給業者より容易に入手可能である。適切な異種性の発現システムの選択と使用についての非限定的な例は、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｓ．  Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｂ．  Ｄａｖｉｄ  Ｈａｍｅｓ  ｅｄｓ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９９）、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｍ．  Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ＆  Ｊａｍｅｓ  Ｐ．  Ｈｏｅｆｆｌｅｒ，  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．  Ｕｓｉｎｇ  Ｎａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｒｔ  ｏｆ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９９）、及び、Ｍｅｅｎａ  Ｒａｉ  ＆  Ｈａｒｉｓｈ  Ｐａｄｈ，  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  ８０（９）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１２１−１１２８，  （２００１）に記述されている。これらのプロトコルは当業者の範囲内できまりきった方法である。
【０１０５】
様々な細胞ベースの発現方法が本明細書で開示されるポリヌクレオチドにコードされる改変クロストリジウム毒素を発現させるのに有効である。これらに限定されないが、ウイルス発現システム、原核細胞発現システム、酵母細胞発現システム、バキュロウィウルス発現システム、昆虫細胞発現システム、哺乳類細胞発現システムが例として挙げられる。ウイルス発現システムは、これらに限定されないが、ｔｈｅ  ＶＩＲＡＰＯＷＥＲＴＭ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）  、ｔｈｅ  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）  、ｔｈｅ  ＡＤＥＡＳＹＴＭ  ＸＬ  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）  、及び、ｔｈｅ  ＶＩＲＡＰＯＲＴ（登録商標）  Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）を含む。原核細胞発現システムの非限定的な例として、ｔｈｅ  ＣＨＡＭＰＩＯＮＴＭ  ｐＥＴ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）、ｔｈｅ  ＴＲＩＥＸＴＭ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）  、ｔｈｅ  ＱＩＡＥＸＰＲＥＳＳ（登録商標）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＱＩＡＧＥＮ，  Ｉｎｃ．）  、及び、ｔｈｅ  ＡＦＦＩＮＩＴＹ（登録商標）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）が挙げられる。酵母発現システムは、これらに限定されないが、ｔｈｅ  ＥＡＳＹＳＥＬＥＣＴＴＭ  Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）、ｔｈｅ  ＹＥＳ−ＥＣＨＯＴＭ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔｓ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ  ）、及び、ｔｈｅ  ＳＰＥＣＴＲＡＴＭ  Ｓ．  ｐｏｍｂｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を含む。バキュロウィウルス発現システムの非限定的な例として、ｔｈｅ  ＢａｃｕｌｏＤｉｒｅｃｔＴＭ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ），  ｔｈｅ  ＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ（登録商標）  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）、及び、ｔｈｅ  ＢＤ  ＢＡＣＵＬＯＧＯＬＤＴＭ  （ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）が挙げられる。昆虫細胞発現システムは、これらに限定されないが、ｔｈｅ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＤＥＳ（登録商標））  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）、ＩＮＳＥＣＴＳＥＬＥＣＴＴＭ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）、及び、ＩＮＳＥＣＴＤＩＲＥＣＴＴＭ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を含む。哺乳類細胞発現システムの非限定的な例として、ｔｈｅ  Ｔ−ＲＥＸＴＭ  （Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）、ｔｈｅ  ＦＬＰ−ＩＮＴＭ  Ｔ−ＲＥＸＴＭ  Ｓｙｓｔｅｍ    （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ），  ｔｈｅ  ｐｃＤＮＡＴＭ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）、ｔｈｅ  ｐＳｅｃＴａｇ２  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）、ｔｈｅ  ＥＸＣＨＡＮＧＥＲ（登録商標）  Ｓｙｓｔｅｍ，  ＩＮＴＥＲＰＬＡＹＴＭ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＴＡＰ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）、ＣＯＭＰＬＥＴＥ  ＣＯＮＴＲＯＬ（登録商標）  Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）、及び、ＬＡＣＳＷＩＴＣＨ（登録商標）  ＩＩ  Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）が挙げられる。
【０１０６】
本明細書で開示されるポリヌクレオチド分子にコードされる改変クロストリジウム毒素を発現させる別の方法は原核細胞抽出液、及び、真核細胞抽出液のような様々な無細胞発現システムを使用する。原核細胞抽出液の非限定的な例として、ｔｈｅ  ＲＴＳ  １００  Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＨＹ  Ｋｉｔ  （Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）、ｔｈｅ  ＡｃｔｉｖｅＰｒｏ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ａｍｂｉｏｎ，  Ｉｎｃ．，  Ａｕｓｔｉｎ，  ＴＸ）、ｔｈｅ  ＥｃｏＰｒｏＴＭ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）、及び、ｔｈｅ  ＥＸＰＲＥＳＳＷＡＹＴＭ  Ｐｌｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）が挙げられる。真核細胞抽出液は、これらに限定されないが、ｔｈｅ  ＲＴＳ  １００  Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  ＣＥＣＦ  Ｋｉｔ  （Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）、ｔｈｅ  ＴＮＴ（登録商標）  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）、ｔｈｅ  Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  ＩＶＴＴＭ  Ｋｉｔ  （Ａｍｂｉｏｎ，  Ｉｎｃ．，  Ａｕｓｔｉｎ，  ＴＸ）、ｔｈｅ  Ｒｅｔｉｃ  Ｌｙｓａｔｅ  ＩＶＴＴＭ  Ｋｉｔ  （Ａｍｂｉｏｎ，  Ｉｎｃ．，  Ａｕｓｔｉｎ，  ＴＸ）、ｔｈｅ  ＰＲＯＴＥＩＮｓｃｒｉｐｔ（登録商標）  ＩＩ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ａｍｂｉｏｎ，  Ｉｎｃ．，  Ａｕｓｔｉｎ，  ＴＸ）、及び、ｔｈｅ  ＴＮＴ（登録商標）  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を含む。
【０１０７】
本明細書で開示される改変クロストリジウム毒素は細胞により一本鎖の形状で産生される。最大の活性に達するために、この一本鎖の形状はその二本鎖の形状に変換されなければならない。この変換プロセスは、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメイン内に位置するプロテアーゼ切断部位をタンパク質分解により切断することにより達せられる。この変換プロセスは標準的なインビトロタンパク質分解性切断アッセイを用いて実行されうるか、又は、本出願に伴う特許出願Ｇｈａｎｓｈａｎｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅｉｒ  Ｄｉ−ｃｈａｉｎ  Ｆｏｒｍ，  Ａｔｔｏｒｎｅｙ  Ｄｏｃｋｅｔ  Ｎｏ．  １８４６９  ＰＲＯＶ  （ＢＯＴ）に記述されているように細胞ベースのタンパク質分解性切断システムで実行されうる。この文献の内容全体を参照として明細書に組み入れる。
【０１０８】
本発明の態様は、部分的に、本明細書で開示される改変クロストリジウム毒素を含む組成物を提供するものである。本発明で有用な組成物は一般に医薬的に許容される本明細書で開示される改変クロストリジウム毒素を含む組成物として投与される。本明細書で使用されているように、「医薬的に許容される」という用語は、個体に投与されたときに有害な、アレルギ−性の、又は、その他の不都合な、又は、望まれない反応を引き起こさないどんな分子実態をも意味する。本明細書で使用されているように、「医薬的に許容される組成物」という用語は「医薬的組成物」と同義であり、例えば、本明細書で開示されるどんな改変クロストリジウム毒素でも、そのような治療上効果のある濃度の活性成分を意味する。改変クロストリジウム毒素を含む医薬的組成物は医学上の、及び、獣医学上の適用に有効である。医薬組成物は患者に単独で投与されてもよく、又は、その他の補足的な活性成分、作用薬、薬剤、若しくは、ホルモンと組み合わせて投与されてもよい。その医薬的組成物は、これらに限定されないが、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠化、研和、乳剤化、カプセル化、封入、及び、凍結乾燥を含む様々な工程のどんなものをも用いて製造されうる。その医薬組成物は、これらに限定されないが、無菌液、懸濁液、乳剤、凍結乾燥物、錠剤、丸薬、小丸薬、カプセル、粉剤、シロップ剤、エリキシル剤、又は、投薬に適したその他のどんな剤形をも含む様々な形状のどんなものをもとることができる。
【０１０９】
改変クロストリジウム毒素を含む医薬組成物は、医薬組成物への活性成分の加工を容易にする薬剤的に許容される担体を含むことも可能であることも考えられる。本明細書で使用されているように、「薬理学的に許容される担体」という用語は「薬理学的担体」と同義であり、投与されたときに長期にわたる、又は、永続的な有害な効果が実質的に無いどんな担体をも意味し、「薬理学的に許容される賦形剤、安定化剤、希釈剤、添加物、佐剤、及び、医薬品添加物」のような術語を包含する。そのような担体は、一般に、活性化合物と混合され、又は、活性化合物を希釈、若しくは、封入することを許容され、そして、そのような担体は固体、半固体、若しくは、液体の薬品でありうる。活性成分は可溶性でありうる、又は、望ましい担体、若しくは、希釈剤に懸濁された懸濁液として送達されうると理解される。これらに限定されないが、例えば、水、生理食塩水、グリシン溶液、ヒアルロン酸溶液などの水性媒体、例えば、マンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカン、セルロース、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウムなどの固体の担体、溶媒、分散媒、塗料、抗細菌剤および抗カビ剤、等張薬品および吸収作用遅延薬品、又は、その他のいずれかの非活性成分を含む様々な薬剤的に許容される担体のどんなものも使用されうる。薬理学的に許容される担体の選択は投薬の方法に左右されうる。どんな薬理学的に許容される担体も活性成分と不適合である場合を除いて、医薬的に許容される組成物においてその使用が考慮される。そのような薬剤的担体の具体的な使用の非限定的な例をＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （Ｈｏｗａｒｄ  Ｃ．  Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  ７ｔｈ  ｅｄ．  １９９９）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  （Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄ．，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  ２０ｔｈ  ｅｄ．  ２０００）  、Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  （Ｊｏｅｌ  Ｇ．  Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，  １０ｔｈ  ｅｄ．  ２００１）  、及び、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  （Ｒａｙｍｏｎｄ  Ｃ．  Ｒｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，    ＡＰｈＡ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ２００３）に見つけることができる。これらのプロトコルはきまりきった方法であり、どんな修正も当業者の範囲内である。
【０１１０】
本明細書で開示される医薬組成物は、これらに限定されないが、緩衝液、保存剤、等張化剤、塩、抗酸化剤、モル浸透圧調整剤、生理物質、薬理的物質、充填剤、乳化剤、湿潤剤、甘味剤、若しくは、着香剤などを含むその他の薬剤的に許容される成分（若しくは、薬剤的成分）を含むこともできると、さらに、考えられる。結果生じる製剤が医薬的に許容できるという条件で、本明細書で開示される医薬組成物を調製するために様々な緩衝液とｐＨを調整するための手段が使用されうる。そのような緩衝液は、これらに限定されないが、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水、及び、ホウ酸緩衝液を含む。必要に応じ、酸と塩基が組成物のｐＨを調製するのに使用されうると理解される。薬剤的に許容される抗酸化剤は、これらに限定されないが、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アセチルシステイン、ブチルヒドロキシアニソール、及び、ブチルヒドロキシトルエンを含む。有効な保存剤は、これらに限定されないが、塩化ベンズアルコニウム、クロロブタノール、チメロサール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、例えば、ＰＵＲＩＴＥ（登録商標）のようなオキシクロロ組成物、並びに、例えば、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）又はジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）ビスアミド、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）カルシウム、および、ＣａＮａＤＴＰＡビスアミドのようなキレ−ト化剤を含む。医薬組成物に有用な等張化剤は、これらに限定されないが、塩化ナトリウム、塩化カリウム、マンニトール又はグリシン、及び、その他の薬剤的に許容される等張化剤を含む。その医薬組成物は塩として提供されうる。そして、それは、これらに限定されないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸を含む様々な酸によって形成されうる。塩は対応する遊離塩基形よりも水性の、又は、その他のプロトン性溶媒に溶けやすい傾向にある。薬理学の分野で公知のこれらの、又は、その他の物質は本発明で有用な医薬的組成物に含まれることができると理解される。
【０１１１】
従って、実施形態において、ある組成物は本明細書で開示される改変クロストリジウム毒素を含む。本実施形態の態様において、医薬組成物は本明細書で開示される改変クロストリジウム毒素と薬理学的担体を含む。本実施形態の別の態様において、医薬組成物は本明細書で開示される改変クロストリジウム毒素と薬理学的成分を含む。本実施形態のさらに別の態様において、医薬組成物は本明細書で開示される改変クロストリジウム毒素、薬理学的担体、及び、薬理学的成分を含む。本実施形態の別の態様において、医薬組成物は本明細書で開示される改変クロストリジウム毒素と少なくとも１種の薬理学的担体、少なくとも１種の薬理学的成分、若しくは、少なくとも１種の薬理学的担体および少なくとも１種の薬理学的成分を含む。
【０１１２】
本発明の態様は以下のように記述されうる。
１．（ａ）クロストリジウム毒素中毒プロセスの酵素的標的改変工程を実行することができるクロストリジウム毒素酵素ドメイン、（ｂ）クロストリジウム毒素中毒プロセスのトランスロケーション工程を実行することができるクロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン、および（ｃ）切断可能な結合のＰ１部位を含むプロテアーゼ切断部位のＰ部分と結合ドメインとを含む組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインであって、プロテアーゼ切断部位のＰ部分のＰ１部位が結合ドメインのアミノ末端に隣接し、それにより組込型プロテアーゼ切断部位を創出するもの、を含む一本鎖改変クロストリジウム毒素であって、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインの切断が一本鎖改変クロストリジウム毒素を二本鎖形状に変換し、同源のレセプタ−に結合することができるアミノ末端を有する結合ドメインを作り出すもの。
２．アミノ末端からカルボキシ末端へ
（１）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメイン、
（２）クロストリジウム毒素酵素ドメイン、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメイン、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン、
（３）組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメイン、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、
（４）組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン、又は、
（５）クロストリジウム毒素トランスロケーションドメイン、組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、
の線形順序でこれらのドメインを含む単一ポリペプチドを含む１記載の改変クロストリジウム毒素。
３．クロストリジウム毒素トランスロケーションドメインがＢｏＮＴ／Ａトランスロケーションドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂトランスロケーションドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１トランスロケーションドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄトランスロケーションドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅトランスロケーションドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆトランスロケーションドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇトランスロケーションドメイン、ＴｅＮＴトランスロケーションドメイン、ＢａＮＴトランスロケーションドメイン、又は、ＢｕＮＴトランスロケーションドメインである１記載の改変クロストリジウム毒素。
４．クロストリジウム毒素酵素ドメインがＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン、ＴｅＮＴ酵素ドメイン、ＢａＮＴ酵素ドメイン、又は、ＢｕＮＴ酵素ドメインである１記載の改変クロストリジウム毒素。
５．組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインが配列番号：４から配列番号：１１８までのいずれかである１記載の改変クロストリジウム毒素。
６．切断可能な結合のＰ１部位を含むプロテアーゼ切断部位のＰ部分が配列番号：１２１、配列番号：１２７、又は、配列番号：１３０である請求項１記載の改変クロストリジウム毒素。
７．結合ドメインがオピオイドペプチドである１記載の改変クロストリジウム毒素。
８．オピオイドペプチドがエンケファリン、ＢＡＭ２２ペプチド、エンドモルフィン、エンドルフィン、ダイノルフィン、ノシセプチン、又は、リモルフィンである７記載の改変クロストリジウム毒素。
９．オピオイドペプチドが配列番号：１５４から配列番号：１８６である７記載の改変クロストリジウム毒素。
１０．結合ドメインがＰＡＲリガンドである１記載の改変クロストリジウム毒素。
１１．ＰＡＲリガンドがＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又は、ＰＡＲ４である９記載の改変クロストリジウム毒素。
１２．請求項１記載の一本鎖改変クロストリジウム毒素の二本鎖形状、及び、医薬的に許容される担体、医薬的に許容される成分、若しくは、医薬的に許容される担体と医薬的に許容される成分の両方を含む医薬組成物。
１３．請求項１記載の改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子。
１４．ポリヌクレオチド分子がさらに発現ベクターを含む１２記載のポリヌクレオチド分子。
１５．（ａ）請求項１３記載のポリヌクレオチド分子を細胞に導入し、（ｂ）そのポリヌクレオチド分子を発現させる工程を含む改変クロストリジウム毒素を生産する方法。
【実施例】
【０１１３】
実施例１
組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインを有する改変クロストリジウム毒素の作成
次の例は本明細書で開示される組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインを有するいかなる改変クロストリジウム毒素をも作成するのに有効な方法を示す。
【０１１４】
活性化の後、アミノ末端フリーのターゲティング部分を有する改変クロストリジウム毒素を作成するために、ノシセプチンターゲティング部分を含む再標的化毒素を、本明細書で開示されるように、既存のエンテロキナーゼ切断部位とノシセプチンターゲティング部分を組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメイン（ＩＰＣＳ−ＢＤ）で置き換えるように修飾した。エンテロキナーゼ切断部位とノシセプチンターゲティング部分を含む再標的化毒素の例は、例えば、前掲のＳｔｅｗａｒｄ，米国特許出願１２／１９２，９００号，（２００８）、前掲のＦｏｓｔｅｒ，米国特許出願１１／７９２，２１０号，（２００７）、前掲のＦｏｓｔｅｒ，米国特許出願１１／７９１，９７９号，（２００７）、前掲のＤｏｌｌｙ，  米国特許第７，４１９，６７６号，（２００８）で公開されており、各文献の内容全体を参照として明細書に組み入れる。例えば、配列番号：１４８に記載のポリヌクレオチド分子を含む７．８９−ｋｂの発現コンストラクトがＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化され、エンテロキナーゼ切断部位とノシセプチンターゲティング部分をコードする２６０ｂｐのポリヌクレオチド分子を切除し、結果、生じた７．６３ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片がゲル精製法を用いて精製された。組込型プロテアーゼ切断部位と配列番号：１５２に記載のノシセプチンをコードする３２３ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片（配列番号：１４９）が精製された７．６３ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片にＴ４  ＤＮＡライゲースを用いてサブクローンされた。ライゲーション・ミックスはエレクトロコンピテント大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）に電気穿孔法を用いてトランスフォームされ、細胞は５０μｇ／ｍＬの濃度でカナマイシンを含む１．５％  Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ寒天プレート（ｐＨ７．０）上に蒔かれ、３７℃の恒温器に一晩の成長のために放置された。発現コンストラクトを含む細菌はカナマイシン耐性コロニーとして同定された。候補コンストラクトはアルカリ溶解プラスミドミニプレパレーション法を用いて単離され、挿入断片の有無と方向を決定するため制限酵素消化マッピングにより、及び、ＤＮＡシークエンシングにより解析された。このクローニング計画は、配列番号：１５１記載のＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−Ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｎをコードする配列番号：１５０記載のポリヌクレオチド分子を含むｐＥＴ２９発現コンストラクトをもたらした。
【０１１５】
別法では、配列番号：１５２記載のＩＰＣＳ−Ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｎを含むＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−Ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｎ（配列番号：１５１）に基づくポリヌクレオチド分子は標準的な方法を用いて合成されることもできる（ＢｌｕｅＨｅｒｏｎ（登録商標）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｂｏｔｈｅｌｌ，  ＷＡ）。２０から５０ｂｐ長のオリゴヌクレオチドは標準的なホスホラミダイト合成を用いて合成される。これらのオリゴヌクレオチドは二本鎖ＤＮＡになるようハイブリダイズされ、全長のポリヌクレオチド分子を組み立てるためにライゲートされるであろう。これらのポリヌクレオチド分子は標準的な分子生物学の方法を用いてｐＵＣＢＨＢ１ベクターのＳｍａＩ部位にクローンされｐＵＣＢＨＢ１／ＢｏＮＴ／Ａ−ＡＰ４Ａ−Ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｎを生ずるであろう。合成されたポリヌクレオチド分子は、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＴＭ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３．１  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）とＡＢＩ  ３１００  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を用いたシークエンシングにより確認される。必要に応じて、ＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−Ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｎ（配列番号：１５１）に基づく発現最適化ポリヌクレオチド分子が、大腸菌株での発現を改善するために合成されうる。ＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−Ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｎをコードするポリヌクレオチド分子は、（１）大腸菌株の固有のポリヌクレオチド分子に典型的に存在する同義コドンを含むよう、（２）大腸菌株に見られる固有のポリヌクレオチド分子の平均的Ｇ＋Ｃ含量により近く匹敵するＧ＋Ｃ含量を含むよう、（３）ポリヌクレオチド分子内に見られるポリモノヌクレオチド領域を減らすよう、及び／又は、（４）ポリヌクレオチド分子内に見られる内部制御部位、若しくは、内部構造部位を除去するように修飾されうる。例えば、Ｌａｎｃｅ  Ｅ．  Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔｙｐｅ  Ａ，  米国特許公開公報２００８／００５７５７５号  （Ｍａｒ．  ６，  ２００８）、および、Ｌａｎｃｅ  Ｅ．  Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔｙｐｅ  Ｅ，  米国特許公開公報２００８／０１３８８９３号  （Ｊｕｎ．  １２，  ２００８）を参照のこと。一旦、配列の最適化が完了すると、２０から５０ｂｐ長のオリゴヌクレオチドは標準的なホスホラミダイト合成を用いて合成される。これらのオリゴヌクレオチドは二本鎖ＤＮＡになるようハイブリダイズされ、全長のポリヌクレオチド分子を組み立てるためにライゲートされる。このポリヌクレオチド分子は標準的な分子生物学の方法を用いてｐＵＣＢＨＢ１ベクターのＳｍａＩ部位にクローンされｐＵＣＢＨＢ１／ＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−Ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｎを生ずる。合成されたポリヌクレオチド分子はＤＮＡシークエンシングにより確認される。必要に応じて、例えば、酵母株、昆虫培養細胞株、若しくは、哺乳類培養細胞株のようなそのほかの生物への発現最適化が行われうる。例えば、前掲のＳｔｅｗａｒｄ，  米国特許公開公報２００８／００５７５７５号，  （２００８）、及び、前掲のＳｔｅｗａｒｄ，  米国特許公開公報２００８／０１３８８９３号，  （２００８）を参照のこと。
【０１１６】
例えば、配列番号：４から配列番号：７に基づくＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−Ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎｓ、配列番号：８から配列番号：２７に基づくＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−ＢＡＭ−２２ｓ、配列番号：２８から配列番号：２９に基づくＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−Ｅｎｄｏｍｏｒｐｈｉｎｓ、配列番号：３０から配列番号：３５に基づくＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−Ｅｎｄｏｒｐｈｉｎｓ、配列番号：３６から配列番号：６８に基づくＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−Ｄｙｎｏｒｐｈｉｎｓ、配列番号：６９から配列番号：７４に基づくＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−Ｒｉｍｏｒｐｈｉｎｓ、配列番号：７５から配列番号：８４に基づくＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−Ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｎｓ、配列番号：８５から配列番号：８７に基づくＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ、又は、配列番号：８８から配列番号：１１８に基づくＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−ＰＡＲｓのようなその他のＩＰＣＳ−ＢＤｓを含むＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−ＢＤｓをコードするポリヌクレオチド分子を含むｐＵＣＢＨＢ１クローニングコンストラクトを作成するために同様のクローニング計画が使用されるであろう。同様に、例えば、ＢｏＮＴ／Ｂ−ＩＰＣＳ−ＢＤ、ＢｏＮＴ／Ｃ１−ＩＰＣＳ−ＢＤ、ＢｏＮＴ／Ｄ−ＩＰＣＳ−ＢＤ、ＢｏＮＴ／Ｅ−ＩＰＣＳ−ＢＤ、ＢｏＮＴ／Ｆ−ＩＰＣＳ−ＢＤ、ＢｏＮＴ／Ｇ−ＩＰＣＳ−ＢＤ、ＴｅＮＴ−ＩＰＣＳ−ＢＤ、ＢａＮＴ／Ｂ−ＩＰＣＳ−ＢＤ、又は、ＢｕＮＴ／Ｂ−ＩＰＣＳ−ＢＤのようなその他のクロストリジウム毒素−ＩＰＣＳ−ＢＤｓをコードするポリヌクレオチド分子を含むｐＵＣＢＨＢ１クローニングコンストラクトを作成するのに、同様のクローニング計画が使用されうる。
【０１１７】
ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−Ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｎを作成するために、ｐＵＣＢＨＢ１／ＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−Ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｎコンストラクトは、（１）ＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−Ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｎのオープンリーディングフレームをコードするポリヌクレオチド分子を切り出し、（２）このポリヌクレオチド分子がｐＥＴ２９ベクター（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）に作動可能に連結されることを可能にする制限酵素で消化された。この挿入断片は、ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−Ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｎを生じるよう、適切な制限酵素で消化されたｐＥＴ２９ベクターにＴ４ＤＮＡライゲース法を用いてサブクローンされた。ライゲーション・ミックスはエレクトロコンピテント大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）に電気穿孔法を用いてトランスフォームされ、細胞は５０μｇ／ｍＬの濃度でカナマイシンを含む１．５％  Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ寒天プレート（ｐＨ７．０）上に蒔かれ、３７℃の恒温器に一晩の成長のために放置された。発現コンストラクトを含む最近はカナマイシン耐性コロニーとして同定された。候補コンストラクトはアルカリ溶解プラスミドミニプレパレーション法を用いて単離され、挿入断片の有無と方向を決定するため制限酵素消化マッピングにより解析された。このクローニング計画は、ＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−Ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｎをコードするポリヌクレオチド分子を含むｐＥＴ２９発現コンストラクトをもたらした。
【０１１８】
例えば、配列番号：４から配列番号：７に基づくＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−Ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎｓ、配列番号：８から配列番号：２７に基づくＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−ＢＡＭ−２２ｓ、配列番号：２８から配列番号：２９に基づくＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−Ｅｎｄｏｍｏｒｐｈｉｎｓ、配列番号：３０から配列番号：３５に基づくＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−Ｅｎｄｏｒｐｈｉｎｓ、配列番号：３６から配列番号：６８に基づくＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−Ｄｙｎｏｒｐｈｉｎｓ、配列番号：６９から配列番号：７４に基づくＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−Ｒｉｍｏｒｐｈｉｎｓ、配列番号：７５から配列番号：８４に基づくＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−Ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｎｓ、配列番号：８５から配列番号：８７に基づくＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ、又は、配列番号：８８から配列番号：１１８に基づくＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−ＰＡＲｓのようなその他のＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−ＢＤｓをコードするポリヌクレオチド分子を含むｐＥＴ２９発現コンストラクトを作成するために同様のクローニング計画が使用されるであろう。同様に、例えば、ＢｏＮＴ／Ｂ−ＩＰＣＳ−ＢＤ、ＢｏＮＴ／Ｃ１−ＩＰＣＳ−ＢＤ、ＢｏＮＴ／Ｄ−ＩＰＣＳ−ＢＤ、ＢｏＮＴ／Ｅ−ＩＰＣＳ−ＢＤ、ＢｏＮＴ／Ｆ−ＩＰＣＳ−ＢＤ、ＢｏＮＴ／Ｇ−ＩＰＣＳ−ＢＤ、ＴｅＮＴ−ＩＰＣＳ−ＢＤ、ＢａＮＴ／Ｂ−ＩＰＣＳ−ＢＤ、又は、ＢｕＮＴ／Ｂ−ＩＰＣＳ−ＢＤのようなその他のクロストリジウム毒素−ＩＰＣＳ−ＢＤｓをコードするポリヌクレオチド分子を含むｐＥＴ２９発現コンストラクトを作成するのに、同様のクローニング計画が使用されうる。
【０１１９】
実施例２
組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインを有する改変クロストリジウム毒素の発現
次の例は本明細書で開示されるいかなる改変クロストリジウム毒素をも細菌細胞内で発現させるのに有効な方法を示す。
【０１２０】
本明細書で開示される改変クロストリジウム毒素を発現させるために、例えば、実施例１で記述されたような発現コンストラクトがエレクトロコンピテントＡＣＥＬＬＡ（登録商標）  Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）に電気穿孔法を用いてトランスフォームされた。細胞は、それから、５０  μｇ／ｍＬの濃度でカナマイシンを含む１．５％  Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ寒天プレート（ｐＨ７．０）上に蒔かれ、３７℃の恒温器に一晩の成長のために放置された。発現コンストラクトを含む形質転換された大腸菌のカナマイシン耐性コロニーが５０  μｇ／ｍＬの濃度でカナマイシンを含む３．０  ｍＬのＰＡ−０．５Ｇ培地を含むバッフル付きフラスコに接種するのに使用され、それは、それから、回転速度２５０ｒｐｍで振盪する３７℃の恒温器に一晩の成長のために設置された。結果、生じたオーバーナイト・スターター培養液は５０  μｇ／ｍＬの濃度でカナマイシンを含む２５０  ｍＬのＺＹＰ−５０５２自己誘導培地を接種するのに用いられた。これらの培養物は回転速度２５０  ｒｐｍで振盪する３７℃の恒温器内で凡そ３．５時間、培養され、それから、回転速度２５０  ｒｐｍで振盪する２２℃の恒温器内で、さらに１６から１８時間、培養された。細胞は遠心分離（４，０００  ｒｐｍ、４℃、２０から３０分）により回収され、直ちに使用されるか、又は、必要時まで−８０℃で保存された。
【０１２１】
実施例３
組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインを有する改変クロストリジウム毒素の精製
次の例は本明細書で開示されるいかなる改変クロストリジウム毒素をも精製し、定量するのに有効な方法を示す。
【０１２２】
本明細書で開示される改変クロストリジウム毒素を含む細胞ペレットを溶解するために、例えば、実施例２で記述されたような細胞ペレットは、ＢＵＧＢＵＳＴＥＲ（登録商標）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  （ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）、１ｘ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  Ｓｅｔ  ＩＩＩ  （ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）、２５  ｕｎｉｔ／ｍＬ  Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  （ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）、及び、１，０００  ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  ｒＬｙｓｏｚｙｍｅ  （ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を含む溶解緩衝液に再懸濁された。細胞懸濁液はプラットフォームロッカー上で２０分間、室温で保温され、界面活性剤を沈殿させるために１５分間、氷上で保温され、それから、不溶性の細胞破片を除去するために４℃で３０分間、３０，５００  ｒｃｆの遠心力で遠心分離された。澄んだ上清は新しいチューブに移され、ＩＭＡＣ精製に直ちに使用されるか、又は、必要時まで４℃で乾燥して保存された。
【０１２３】
固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を用いて本明細書で開示される改変クロストリジウム毒素を精製するために、浄化した上清は、ＩＭＡＣ洗浄緩衝液（２５ｍＭＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭイミダゾール、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール）で平衡化された２．５から５．０ｍＬのＴＡＬＯＮＴＭ  ＳｕｐｅｒＦｌｏｗ  Ｃｏ２＋  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅｓｉｎ  （ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）と混合された。澄んだ上清とレジンの混合物はプラットフォームロッカー上で６０分間、４℃で保温された。澄んだ上清とレジンの混合物は、それから、使い捨てのポリプロピレン製カラム支持体（Ｔｈｏｍａｓ  Ｉｎｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏ．，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ）に移され、真空マニフォールドに取り付けられた。カラムは５カラム容量のＩＭＡＣ洗浄緩衝液で２回、洗浄された。改変クロストリジウム毒素は２カラム容量のＩＭＡＣ溶出緩衝液（２５ｍＭ  Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ塩化ナトリウム、５００ｍＭイミダゾール、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール）で溶出され、凡そ１ｍＬずつの画分に採取された。各溶出画分に含まれる改変クロストリジウム毒素の量はブラッドフォード・ダイ・アッセイ法により決定した。この方法では、各１．０ｍＬの画分うちの１０μＬのアリコットを脱イオン化された蒸留水で１対４に希釈された２００μＬのＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）と混合し、発色シグナルの強度が分光光度計を用いて測定された。最も強いシグナルを有する画分が溶出ピークとみなされ、それらは一つに混合され、その後の手順のために溶液を調整するための透析にかけられた。ＩＭＡＣで精製された改変クロストリジウム毒素の緩衝液交換は４℃で、２５ｋＤ分画分子量（ＭＷＣＯ）膜（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を装着したＦＡＳＴＤＩＡＬＹＺＥＲ（登録商標）  （Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）で透析することで成し遂げられた。タンパク質サンプルは、その後のイオン交換クロマトグラフィー精製で使用されるように、適切な脱塩緩衝液（Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ）（５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０））へ交換される。ＦＡＳＴＤＩＡＬＹＺＥＲ（登録商標）は、絶えず撹拌されている１Ｌの脱塩緩衝液の中に設置され、一晩、４℃で保温された。
【０１２４】
ＦＰＬＣイオン交換クロマトグラフィーを用いた本明細書で開示される改変クロストリジウム毒素の精製のために、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）に透析した改変クロストリジウム毒素のサンプルは、ＢｉｏＬｏｇｉｃ  ＤｕｏＦｌｏｗ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）を用いて０．５ｍＬ／分の流速で、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）で平衡化した１ｍＬ容のＵＮＯ−Ｑ１ＴＭ  陰イオン交換カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）にアプライされた。結合したタンパク質は、４℃、１．０ｍＬ／分の流速で、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１Ｍ塩化ナトリウムを含む溶出緩衝液を用いた塩化ナトリウム段階勾配法により次のように溶出された。１．０ｍＬ／分の流速で３ｍＬの７％溶出緩衝液、１．０ｍＬ／分の流速で６ｍＬの１２％溶出緩衝液、そして、１．０ｍＬ／分の流速で１０ｍＬの１２％から１００％までの溶出緩衝液。カラムからの物質の溶出はＱｕａｄＴｅｃ  ＵＶ−Ｖｉｓ  ｄｅｔｅｃｔｏｒを用い、２１４ｎｍ、２６０ｎｍ、及び、２８０ｎｍで検出され、２８０ｎｍで０．０１任意単位（ＡＵ）以上の吸光を行う全てのピークが１．０ｍＬずつの画分で採取された。タンパク質濃度を決定するために標準的なＴｙｐｈｏｏｎ  Ｇｅｌ  Ｑｕａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）が使用された。ピーク画分はプールされ、５％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−４００が加えられ、アリコットは液体窒素で凍結され、そして、−８０℃で保存された。
【０１２５】
本明細書で開示される改変クロストリジウム毒素の発現は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析された。上述した方法を用いて精製された改変クロストリジウム毒素のサンプルは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む、及び、含まない２ｘ  ＬＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）に加えられ、変性条件のもと、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）  Ｎｏｖｅｘ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ｐｒｅｃａｓｔ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌｓ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を用いたＭＯＰＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。ゲルはＳＹＰＲＯ（登録商標）  Ｒｕｂｙ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）で染色され、分離されたポリペプチドはＦｌｕｏｒ−Ｓ  ＭＡＸ  ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）を用いて画像化された。改変クロストリジウム毒素の収量を定量するために、様々な量の精製された改変クロストリジウム毒素サンプルがジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含まない２ｘ  ＬＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）に加えられ、非変性条件のもと、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）  Ｎｏｖｅｘ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ｐｒｅｃａｓｔ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌｓ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を用いたＭＯＰＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。ゲルはＳＹＰＲＯ（登録商標）  Ｒｕｂｙ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）で染色され、分離されたポリペプチドはＦｌｕｏｒ−Ｓ  ＭＡＸ  ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）を用いて画像化された。画像化の次に、参照曲線がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の標準物質に対して描かれ、毒素の量がこの曲線から内挿を行った。改変クロストリジウム毒素のサイズはＭａｇｉｃＭａｒｋＴＭ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）に対する比較により決定した。
【０１２６】
本明細書で開示される改変クロストリジウム毒素の発現は、ウェスタンブロット解析法によっても解析された。上述の方法を用いて精製されたタンパク質サンプルはジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む、及び、含まない２ｘ  ＬＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）に加えられ、変性的で還元的な条件のもと、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）  Ｎｏｖｅｘ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ｐｒｅｃａｓｔ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌｓ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を用いたＭＯＰＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。分離されたポリペプチドは、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ（登録商標）  ＳＤ  ｓｅｍｉ−ｄｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｃｅｌｌ  ａｐｐａｒａｔｕｓ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）を用いるウェスタンブロッティングによりゲルからフッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）に転写された。ＰＶＤＦ膜は、２５ｍＭトリス緩衝生理食塩水（２５ｍＭ２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール塩酸（トリス塩酸）（ｐＨ７．４）、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．７ｍＭ塩化カリウム）、０．１％ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、２％ウシ血清アルブミン、５％脱脂粉乳を含む溶液中で２時間、室温で保温することによりブロックされた。ブロックされた膜は、４℃で一晩、適切な一次抗体をプローブとして含むトリス緩衝生理食塩水ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（２５ｍＭトリス緩衝生理食塩水、０．１％ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレ−ト）中で保温された。一次抗体で探索されたブロットは１５分ずつ３回、トリス緩衝生理食塩水ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）で洗浄された。洗浄された膜は、室温で２時間、二次抗体としてホースラディッシュ・ペルオキシダーゼに結合した適切なイムノグロブリンＧ抗体を含むトリス緩衝生理食塩水ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）中で保温された。二次抗体で探索されたブロットは１５分ずつ３回、トリス緩衝生理食塩水ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）で洗浄された。標識された改変クロストリジウム毒素のシグナル検出はＥＣＬ  ＰｌｕｓＴＭ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）を用いて可視化され、改変クロストリジウム毒素の発現レベルの定量のためにＴｙｐｈｏｏｎ  ９４１０  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｍｏｄｅ  Ｉｍａｇｅｒ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）で画像化された。
【０１２７】
実施例４
組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインを有する改変クロストリジウム毒素の活性化
次の例は、本明細書で開示される組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインを有するいかなる改変クロストリジウム毒素をも、その毒素の一本鎖形状を二本鎖形状に変換することにより、活性化するのに有効な方法を示す。
【０１２８】
本明細書で開示される改変クロストリジウム毒素を活性化するために、例えば、実施例３で記述されたような精製された改変クロストリジウム毒素の１．０μｇを含む５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）溶液に２．５から１０ユニットのＡｃＴＥＶプロテアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を加えることにより、反応混合物が用意された。この反応混合物は２３から３０℃で６０から１８０分間、保温された。一本鎖形状からその二本鎖形状への変換を解析するために、反応混合物の微量のアリコットは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）有り、及び、無しで、変性条件のもと、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）  Ｎｏｖｅｘ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ｐｒｅｃａｓｔ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌｓ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を用いたＭＯＰＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。ゲルはＳＹＰＲＯ（登録商標）  Ｒｕｂｙ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）で染色され、分離されたポリペプチドは、一本鎖形状と二本鎖形状の改変クロストリジウム毒素を定量するため、Ｆｌｕｏｒ−Ｓ  ＭＡＸ  ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）を用いて画像化された。改変クロストリジウム毒素形状のサイズと量はＭａｇｉｃＭａｒｋＴＭ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）に対する比較により決定した。
【０１２９】
結果は、改変クロストリジウム毒素の組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメイン内のＴＥＶニッキングの次に、改変毒素の二本鎖形状に相当する、それぞれ凡そ５０ｋＤａの二本のバンドが還元的な条件で検出されたことを示す。さらに、同じサンプルが非還元的な条件で泳動されるとき、凡そ５０ｋＤａの二つのバンドは消え、凡そ１００ｋＤａの新しい一本のバンドが観察された。まとめると、これらの観察結果は、還元的な条件で見られる凡そ５０ｋＤａの二本のバンドはクロストリジウム毒素酵素ドメイン、及び、ターゲティング部分をそのアミノ末端に付着されたクロストリジウム毒素トランスロケーションドメインに相当することを示している。
【０１３０】
実施例５
活性化された組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメインを有する改変クロストリジウム毒素の精製
次の例は、ＴＥＶを用いた活性化の後、本明細書で開示される改変クロストリジウム毒素の二本鎖形状を精製し、定量するのに有効な方法を示す。
【０１３１】
本明細書で開示される活性化された改変クロストリジウム毒素を精製するために、例えば、実施例４で記述されたようなタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼで処理されたクロストリジウム毒素を含む反応混合物は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼを取り除き、そして、二本鎖の改変クロストリジウム毒素を回収するために、陰イオン交換クロマトグラフィーにかけられた。反応混合物は、１．０ｍＬ／ｍｉｎの流速で、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）で平衡化した１．０ｍＬ容のＵＮＯ−Ｑ１ＴＭ  陰イオン交換カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）にロ−ドされた。結合したタンパク質は５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）と１Ｍ塩化ナトリウムを含む溶出緩衝液を用いた塩化ナトリウムグラディエント法により次のように溶出された。１．０ｍＬ／分の流速で３ｍＬの７％溶出緩衝液、１．０ｍＬ／分の流速で６ｍＬの１２％溶出緩衝液、そして、１．０ｍＬ／分の流速で１０ｍＬの１２％から１００％までの溶出緩衝液。カラムからの物質の溶出はＱｕａｄＴｅｃ  ＵＶ−Ｖｉｓ検出器を用い、２１４ｎｍ、２６０ｎｍ、及び、２８０ｎｍで検出され、１８０ｎｍで０．０１任意単位（ＡＵ）以上の吸光を行う全てのピークが１．０ｍＬずつの画分で採取された。選択された画分はジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む、及び、含まない２ｘ  ＬＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）に加えられ、変性条件のもと、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）  Ｎｏｖｅｘ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ｐｒｅｃａｓｔ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌｓ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を用いたＭＯＰＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。ゲルはＳＹＰＲＯ（登録商標）  Ｒｕｂｙ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）で染色され、分離されたポリペプチドは、精製された活性化改変クロストリジウム毒素を定量するために、Ｆｌｕｏｒ−Ｓ  ＭＡＸ  ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）を用いて画像化された。ピーク画分はプールされ、５％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−４００が加えられ、精製されたサンプルは液体窒素で凍結され、そして、−８０℃で保存された。
【０１３２】
実施例６
組込型タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位−ガラニン結合ドメインを含む改変クロストリジウム毒素の作成
次の例は、本明細書で開示される組込型タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位ガラニン結合ドメインを含む二本鎖ループを含有する改変クロストリジウム毒素の二本鎖形状を作成するのに有効な方法を示す。
【０１３３】
組込型タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位ガラニン結合ドメインを含む二本鎖ループを含有する改変クロストリジウム毒素の二本鎖形状を作成するために、ノシセプチンターゲティング部分を含む再標的化毒素は既存のエンテロキナーゼ切断部位とノシセプチンターゲティング部分を組込型プロテアーゼ切断部位−ガラニン結合ドメインで置換して修飾された。エンテロキナーゼ切断部位とノシセプチンターゲティング部分を含む再標的化毒素の例は、例えば、前掲のＳｔｅｗａｒｄ，  米国特許出願第１２／１９２，９００号，（２００８）、前掲のＦｏｓｔｅｒ，  米国特許出願第１１／７９２，２１０号，（２００７）、前掲のＦｏｓｔｅｒ，  米国特許出願第１１／７９１，９７９号，（２００７）、前掲のＤｏｌｌｙ，  米国特許第７，４１９，６７６号，（２００８）において公開されており、各文献の内容全体を参照として明細書に組み入れる。例えば、配列番号：１４８に記載のポリヌクレオチド分子を含む７．８９−ｋｂの発現コンストラクトがＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化され、エンテロキナーゼ切断部位とノシセプチンターゲティング部分をコードする２６０ｂｐのポリヌクレオチド分子を切除し、結果、生じた７．６３ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片がゲル精製法を用いて精製された。組込型プロテアーゼ切断部位−配列番号：１８８に記載のガラニンをコードする３１１ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片（配列番号：１８７）が精製された７．６３ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片にＴ４  ＤＮＡライゲースを用いてサブクローンされた。ライゲーション・ミックスはエレクトロコンピテント大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）に電気穿孔法を用いてトランスフォームされ、細胞は５０  μｇ／ｍＬの濃度でカナマイシンを含む１．５％  Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ寒天プレート（ｐＨ７．０）上に蒔かれ、３７℃の恒温器に一晩の成長のために放置された。発現コンストラクトを含む細菌はカナマイシン耐性コロニーとして同定された。候補コンストラクトはアルカリ溶解プラスミドミニプレパレーション法を用いて単離され、挿入断片の有無と方向を決定するため制限酵素消化マッピングにより、及び、ＤＮＡシークエンシングにより解析された。このクローニング計画は、配列番号：１９０記載のＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−Ｇａｌａｎｉｎをコードする配列番号：１８９記載のポリヌクレオチド分子を含むｐＥＴ２９発現コンストラクトをもたらした。
【０１３４】
別法では、配列番号：１８８記載のＩＰＣＳ−Ｇａｌａｎｉｎを含むＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−Ｇａｌａｎｉｎ（配列番号：１９０）に基づくポリヌクレオチド分子は標準的な方法を用いて合成されることもできる（ＢｌｕｅＨｅｒｏｎ（登録商標）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｂｏｔｈｅｌｌ，  ＷＡ）。２０から５０ｂｐ長のオリゴヌクレオチドは標準的なホスホラミダイト合成を用いて合成される。これらのオリゴヌクレオチドは二本鎖ＤＮＡになるようハイブリダイズされ、全長のポリヌクレオチド分子を組み立てるためにライゲートされるであろう。これらのポリヌクレオチド分子は標準的な分子生物学の方法を用いてｐＵＣＢＨＢ１ベクターのＳｍａＩ部位にクローンされｐＵＣＢＨＢ１／ＢｏＮＴ／Ａ−ＡＰ４Ａ−Ｇａｌａｎｉｎを生ずるであろう。合成されたポリヌクレオチド分子は、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＴＭ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３．１  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）とＡＢＩ  ３１００  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を用いたシークエンシングにより確認される。必要に応じて、ＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−Ｇａｌａｎｉｎ（配列番号：１９０）に基づく発現最適化ポリヌクレオチド分子が、大腸菌株での発現を改善するために合成されうる。ＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−Ｇａｌａｎｉｎをコードするポリヌクレオチド分子は、（１）大腸菌株の固有のポリヌクレオチド分子に典型的に存在する同義コドンを含むよう、（２）大腸菌株に見られる固有のポリヌクレオチド分子の平均的Ｇ＋Ｃ含量により近く匹敵するＧ＋Ｃ含量を含むよう、（３）ポリヌクレオチド分子内に見られるポリモノヌクレオチド領域を減らすよう、及び／又は、（４）ポリヌクレオチド分子内に見られる内部制御部位、若しくは、内部構造部位を除去するように修飾されうる。例えば、Ｌａｎｃｅ  Ｅ．  Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔｙｐｅ  Ａ，米国特許公開公報２００８／００５７５７５号  （Ｍａｒ．  ６，  ２００８）、および、Ｌａｎｃｅ  Ｅ．  Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔｙｐｅ  Ｅ，米国特許公開公報２００８／０１３８８９３号  （Ｊｕｎ．  １２，  ２００８）を参照のこと。一旦、配列の最適化が完了すると、２０から５０ｂｐ長のオリゴヌクレオチドは標準的なホスホラミダイト合成を用いて合成される。これらのオリゴヌクレオチドは二本鎖ＤＮＡになるようハイブリダイズされ、全長のポリヌクレオチド分子を組み立てるためにライゲートされる。このポリヌクレオチド分子は標準的な分子生物学の方法を用いてｐＵＣＢＨＢ１ベクターのＳｍａＩ部位にクローンされｐＵＣＢＨＢ１／ＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−Ｇａｌａｎｉｎを生ずる。合成されたポリヌクレオチド分子はＤＮＡシークエンシングにより確認される。必要に応じて、例えば、酵母株、昆虫培養細胞株、若しくは、哺乳類培養細胞株のような異なる生物への発現最適化が行われうる。例えば���前掲のＳｔｅｗａｒｄ，  米国特許公開公報２００８／００５７５７５号，  （２００８）、及び、前掲のＳｔｅｗａｒｄ，  米国特許公開公報２００８／０１３８８９３号，  （２００８）を参照のこと。
【０１３５】
ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−Ｇａｌａｎｉｎを構築するために、ｐＵＣＢＨＢ１／ＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−Ｇａｌａｎｉｎコンストラクトは、（１）ＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−Ｇａｌａｎｉｎのオープンリーディングフレームをコードするポリヌクレオチド分子を切り出し、（２）このポリヌクレオチド分子がｐＥＴ２９ベクター（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）に作動可能に連結されることを可能にする制限酵素で消化された。この挿入断片は、ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−Ｇａｌａｎｉｎを生じるよう、適切な制限酵素で消化されたｐＥＴ２９ベクターにＴ４ＤＮＡライゲース法を用いてサブクローンされた。ライゲーション・ミックスはエレクトロコンピテント大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）に電気穿孔法を用いてトランスフォームされ、細胞は５０  μｇ／ｍＬの濃度でカナマイシンを含む１．５％  Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ寒天プレート（ｐＨ７．０）上に蒔かれ、３７℃の恒温器に一晩の成長のために放置された。発現コンストラクトを含む最近はカナマイシン耐性コロニーとして同定された。候補コンストラクトはアルカリ溶解プラスミドミニプレパレーション法を用いて単離され、挿入断片の有無と方向を決定するため制限酵素消化マッピングにより解析された。このクローニング計画は、ＢｏＮＴ／Ａ−ＩＰＣＳ−Ｇａｌａｎｉｎをコードするポリヌクレオチド分子を含むｐＥＴ２９発現コンストラクトをもたらした。
【０１３６】
実施例７
組込型タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位−ガラニン結合ドメインを含む改変クロストリジウム毒素の発現
次の例は組込型タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位−ガラニン結合ドメインを含む改変クロストリジウム毒素を細菌細胞内で発現させるのに有効な方法を示す。
【０１３７】
開示される組込型タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位−ガラニン結合ドメインを含む改変クロストリジウム毒素を発現させるために、例えば、実施例６で記述されたような発現コンストラクトがエレクトロコンピテントＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）Ａｃｅｌｌａ（登録商標）細胞（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）に電気穿孔法を用いてトランスフォームされた。細胞は、それから、５０μｇ／ｍＬの濃度でカナマイシンを含む１．５％Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ寒天プレート（ｐＨ７．０）上に蒔かれ、３７℃の恒温器に一晩の成長のために放置された。発現コンストラクトを含む形質転換された大腸菌のカナマイシン耐性コロニーが５０μｇ／ｍＬの濃度でカナマイシンを含む３．０ｍＬのＰＡ−０．５Ｇ培地を含むバッフル付きフラスコに接種するのに使用され、それは、それから、回転速度２５０ｒｐｍで振盪する３７℃の恒温器に一晩の成長のために設置された。結果、生じたオーバーナイト・スターター培養液は５０μｇ／ｍＬの濃度でカナマイシンを含む２５０ｍＬのＺＹＰ−５０５２自己誘導培地を接種するのに用いられた。これらの培養物は回転速度２５０ｒｐｍで振盪する３７℃の恒温器内で凡そ３．５時間、培養され、それから、回転速度２５０ｒｐｍで振盪する２２℃の恒温器内で、さらに１６から１８時間、培養された。細胞は遠心分離（４，０００ｒｐｍ、４℃、２０から３０分）により回収され、直ちに使用されるか、又は、必要時まで−８０℃で保存された。
【０１３８】
実施例８
組込型タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位−ガラニン結合ドメインを含む改変クロストリジウム毒素の精製
次の例は組込型タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位−ガラニン結合ドメインを含む改変クロストリジウム毒素を精製し、定量するのに有効な方法を示す。
【０１３９】
組込型タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位−ガラニン結合ドメインを含む改変クロストリジウム毒素を含む細胞ペレットを溶解するために、例えば、実施例７で記述されたような細胞ペレットは、ＢＵＧＢＵＳＴＥＲ（登録商標）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  （ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）、１ｘ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  Ｓｅｔ  ＩＩＩ  （ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）、２５  ｕｎｉｔ／ｍＬ  Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  （ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）、及び、１，０００  ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  ｒＬｙｓｏｚｙｍｅ  （ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を含む溶解緩衝液に再懸濁された。細胞懸濁液はプラットフォームロッカー上で２０分間、室温で保温され、界面活性剤を沈殿させるために１５分間、氷上で保温され、それから、不溶性の細胞破片を除去するために４℃で３０分間、３０，５００ｒｃｆの遠心力で遠心分離された。澄んだ上清は新しいチューブに移され、ＩＭＡＣ精製に直ちに使用されるか、又は、必要時まで４℃で乾燥して保存された。
【０１４０】
固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を用いて組込型タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位−ガラニン結合ドメインを含む改変クロストリジウム毒素を精製するために、浄化した上清は、ＩＭＡＣ洗浄緩衝液（２５ｍＭ  Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）  （ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭイミダゾール、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール）で平衡化された２．５から５．０ｍＬのＴＡＬＯＮＴＭ  ＳｕｐｅｒＦｌｏｗ  Ｃｏ２＋  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅｓｉｎ  （ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）と混合された。浄化した上清とレジンの混合物はプラットフォームロッカ−上で６０分間、４℃で保温された。浄化した上清とレジンの混合物は、それから、使い捨てのポリプロピレン製カラム支持体（Ｔｈｏｍａｓ  Ｉｎｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏ．，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ）に移され、真空マニフォールドに取り付けられた。カラムは５カラム容量のＩＭＡＣ洗浄緩衝液で２回、洗浄された。改変クロストリジウム毒素は２カラム容量のＩＭＡＣ溶出緩衝液（２５ｍＭ  Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ塩化ナトリウム、５００ｍＭイミダゾール、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール）で溶出され、凡そ１ｍＬずつの画分に採取された。各溶出画分に含まれる改変クロストリジウム毒素の量はブラッドフォード・ダイ・アッセイ法により決定した。この方法では、各１．０ｍＬの画分うちの１０μＬのアリコットを脱イオン化された蒸留水で１対４に希釈された２００μＬのＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）と混合し、発色シグナルの強度が分光光度計を用いて測定された。最も強いシグナルを有する画分が溶出ピークとみなされ、それらは一つに混合され、その後の手順のために溶液を調整するための透析にかけられた。ＩＭＡＣで精製された改変クロストリジウム毒素の緩衝液交換は４℃で、２５ｋＤ分画分子量（ＭＷＣＯ）膜（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を装着したＦＡＳＴＤＩＡＬＹＺＥＲ（登録商標）  （Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）で透析することで成し遂げられた。タンパク質サンプルは、その後の活性化工程で使用されるように、適切な脱塩緩衝液（Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ）（５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０））へ交換される。ＦＡＳＴＤＩＡＬＹＺＥＲ（登録商標）は、絶えず撹拌されている１Ｌの脱塩緩衝液の中に設置され、一晩、４℃で保温された。
【０１４１】
組込型タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位−ガラニン結合ドメインを含む改変クロストリジウム毒素の発現はポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析された。上述した方法を用いて精製された改変クロストリジウム毒素のサンプルは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む、及び、含まない２ｘ  ＬＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）に加えられ、変性条件のもと、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）  Ｎｏｖｅｘ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ｐｒｅｃａｓｔ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌｓ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を用いたＭＯＰＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。ゲルはＳＹＰＲＯ（登録商標）  Ｒｕｂｙ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）で染色され、分離されたポリペプチドはＦｌｕｏｒ−Ｓ  ＭＡＸ  ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）を用いて画像化された。改変クロストリジウム毒素の収量を定量するために、様々な量の精製された改変クロストリジウム毒素サンプルがジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含まない２ｘ  ＬＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）に加えられ、非変性条件のもと、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）  Ｎｏｖｅｘ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ｐｒｅｃａｓｔ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌｓ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を用いたＭＯＰＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。ゲルはＳＹＰＲＯ（登録商標）  Ｒｕｂｙ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）で染色され、分離されたポリペプチドはＦｌｕｏｒ−Ｓ  ＭＡＸ  ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）を用いて画像化された。画像化の次に、参照曲線がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の標準物質に対して描かれ、毒素の量がこの曲線から内挿を行った。改変クロストリジウム毒素のサイズはＭａｇｉｃＭａｒｋＴＭ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）に対する比較により決定した。
【０１４２】
実施例９
組込型タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位−ガラニン結合ドメインを含む改変クロストリジウム毒素の活性化
次の例は、組込型プロテアーゼ切断部位−ガラニン結合ドメインを有する改変クロストリジウム毒素を、そのタンパク質の一本鎖形状を二本鎖形状に変換することにより、活性化するのに有効な方法を示す。
【０１４３】
組込型プロテアーゼ切断部位−ガラニン結合ドメインを有する改変クロストリジウム毒素を活性化するために、例えば、実施例８で記述されたような精製された改変クロストリジウム毒素の１．０μｇを含む５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）溶液に２．５から１０ユニットのＡｃＴＥＶプロテアーゼ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を加えることにより、反応混合物が用意された。この反応混合物は２３から３０℃で６０から１８０分間、保温された。一本鎖形状からその二本鎖形状への変換を解析するために、反応混合物の微量のアリコットは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）有り、及び、無しで、変性条件のもと、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）  Ｎｏｖｅｘ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ｐｒｅｃａｓｔ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌｓ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を用いたＭＯＰＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。ゲルはＳＹＰＲＯ（登録商標）  Ｒｕｂｙ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）で染色され、そして、一本鎖形状と二本鎖形状の改変クロストリジウム毒素を定量するため、Ｆｌｕｏｒ−Ｓ  ＭＡＸ  ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）を用いて画像化された分離されたポリペプチド。改変クロストリジウム毒素のサイズはＭａｇｉｃＭａｒｋＴＭ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）に対する比較により決定した。
【０１４４】
結果は、改変クロストリジウム毒素の組込型プロテアーゼ切断部位結合ドメイン内のタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）ニッキングの次に、改変毒素の二本鎖形状に相当する、それぞれ凡そ５０ｋＤａの二本のバンドが還元的な条件で検出されたことを示す。さらに、同じサンプルが非還元的な条件で泳動されるとき、凡そ５０ｋＤａの二つのバンドは消え、凡そ１００ｋＤａの新しい一本のバンドが観察された。まとめると、これらの観察結果は、還元的な条件で見られる凡そ５０ｋＤａの二本のバンドはクロストリジウム毒素酵素ドメイン、及び、ターゲティング部分をそのアミノ末端に付着されたクロストリジウム毒素トランスロケーションドメインに相当することを示している。
【０１４５】
実施例１０
組込型タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位−ガラニン結合ドメインを含む活性化された改変クロストリジウム毒素の精製
次の例は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）を用いた活性化の後、組込型プロテアーゼ切断部位−ガラニン結合ドメインを有する改変クロストリジウム毒素の二本鎖形状を精製し、定量するのに有効な方法を示す。
【０１４６】
組込型プロテアーゼ切断部位−ガラニン結合ドメインを有する活性化された改変クロストリジウム毒素を精製するために、例えば、実施例９で記述されたようなタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼで処理されたクロストリジウム毒素を含む反応混合物は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼを取り除き、そして、二本鎖の改変クロストリジウム毒素を回収するために、陰イオン交換クロマトグラフィーにかけられた。反応混合物は、１．０ｍＬ／分の流速で、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）で平衡化した１．０ｍＬ容のＵＮＯ−Ｑ１ＴＭ  陰イオン交換カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）にロードされた。結合したタンパク質は５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）と１Ｍ塩化ナトリウムを含む溶出緩衝液を用いた塩化ナトリウム勾配法により次のように溶出された。１．０ｍＬ／分の流速で３ｍＬの７％溶出緩衝液、１．０ｍＬ／分の流速で６ｍＬの１２％溶出緩衝液、そして、１．０ｍＬ／分の流速で１０ｍＬの１２％から１００％までの溶出緩衝液。カラムからの物質の溶出はＱｕａｄＴｅｃ  ＵＶ−Ｖｉｓ  検出器を用い、２１４ｎｍ、２６０ｎｍ、及び、２８０ｎｍで検出され、１８０ｎｍで０．０１任意単位（ＡＵ）以上の吸光を行う全てのピークが１．０ｍＬずつの画分で採取された。選択された画分はジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む、及び、含まない２ｘ  ＬＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）に加えられ、変性条件のもと、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）  Ｎｏｖｅｘ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ｐｒｅｃａｓｔ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌｓ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を用いたＭＯＰＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。ゲルはＳＹＰＲＯ（登録商標）  Ｒｕｂｙ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）で染色され、分離されたポリペプチドは、精製された活性化改変クロストリジウム毒素を定量するために、Ｆｌｕｏｒ−Ｓ  ＭＡＸ  ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）を用いて画像化された。ピーク画分はプールされ、５％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−４００が加えられ、精製されたサンプルは液体窒素で凍結され、そして、−８０℃で保存された。
【０１４７】
本発明の態様が公開された実施形態を参照して記述されてきたが、当業者は、公開された具体的な実施例はこれらの態様を単に説明するものであり、決して本発明を限定的にするものではないことを容易に認識するであろう。多様な修正が、本発明の真意から離れることなくなされうる。
【０１４８】
本発明の態様が公開された実施形態を参照して記述されてきたが、当業者は、公開された具体的な実施例はこれらの態様を単に説明するものであり、決して本発明を限定的にするものではないことを容易に認識するであろう。多様な修正が、本発明の真意から離れることなくなされうる。
【図１】
2013514091.tif 000011
【図２−１】
2013514091.tif 000012
【図２−２】
2013514091.tif 000013
【図３Ａ】
2013514091.tif 000014
【図３Ｂ】
2013514091.tif 000015
【配列表】
2013514091000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年8月15日(2012.8.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2013514091000001.app
【国際調査報告】
2013514091.tif 000016
2013514091.tif 000017
2013514091.tif 000018