(57)【要約】  本発明は、ドロロキシフェンとクロピドグレルとの一定用量の組み合わせを含む医薬組成物及びその使用に関する。
2013512885.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
正常な成人の組織構造の減少と関連のある疾患の治療又は予防を目的とする医薬の製造のための、ドロロキシフェンとクロピドグレルとの混合物、又は医薬的に許容されるそれらの塩を含む組成物の、使用。
【請求項２】
正常な成人の組織構造の減少と関連のある疾患の治療又は予防を目的とする医薬としての使用のための、ドロロキシフェンとクロピドグレルとの混合物、又は医薬的に許容されるそれらの塩を含む、医薬組成物。
【請求項３】
本質的に均一であるドロロキシフェンとクロピドグレルとの混合物、又は医薬的に許容されるそれらの塩。
【請求項４】
ドロロキシフェンがクエン酸ドロロキシフェンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の混合物又は組成物、及びそれらの使用。
【請求項５】
クロピドグレルがクロピドグレル重硫酸塩である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の混合物又は組成物、及びそれらの使用。
【請求項６】
２つの成分のモル比が10:1〜1:10である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の混合物又は組成物、及びそれらの使用。
【請求項７】
ドロロキシフェンがクエン酸ドロロキシフェンである、請求項６に記載の混合物又は組成物、及びそれらの使用。
【請求項８】
炎症性疾患の治療を目的とする医薬の調製のための、式(VI)
【化１】
2013512885.tif 000011
の化合物又は医薬的に許容されるその塩の、使用。
【請求項９】
炎症性疾患の治療を目的とする医薬の調製のための、式(VI’) 
【化２】
2013512885.tif 000012
の化合物又は医薬的に許容されるその塩の、使用。
【請求項１０】
有効成分として、式(VI)
【化３】
2013512885.tif 000013
の化合物又は医薬的に許容されるその塩、及び少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤及び/又は担体を含む医薬的に許容される、組成物。
【請求項１１】
有効成分として、式(VI’) 
【化４】
2013512885.tif 000014
の化合物又は医薬的に許容されるその塩、及び少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤及び/又は担体を含む医薬的に許容される、組成物。
【請求項１２】
一般式(VI): 
【化５】
2013512885.tif 000015
の化合物。
【請求項１３】
一般式(VI’):
【化６】
2013512885.tif 000016
の化合物。
【請求項１４】
正常な成人の組織構造の減少と関連のある疾患の治療又は予防のための、ドロロキシフェンとクロピドグレルとの混合物、又は医薬的に許容されるそれらの塩を含む、組成物。
【請求項１５】
炎症性疾患の治療のための、式(VI) 又は(VI’) の化合物、
【化７】
2013512885.tif 000017
又は医薬的に許容されるそれの塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドロロキシフェンとクロピドグレルの一定用量の組み合わせを含む組成物及び医薬の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
中年及び高齢者の多くの蔓延疾患は、胎生期及び出産早期の発育中に構築された健康な組織構造の段階的減少を含む。例えば、冠動脈疾患において、コレステロール、平滑筋細胞、カルシウム、細胞外基質及び免疫系細胞を含有する動脈硬化プラークの段階的な発達によって血管壁の同心円の三層構造は破壊される。自己免疫性疾患において、自己抗原へ向けられた抗体の作用は、組織構造の慢性の破壊を媒介する。同様に、アルツハイマー病等の神経変性疾患は、不溶性細胞外基質タンパク質の凝集の沈殿及び活性化免疫細胞局所的動員の結果である。
【０００３】
10年以上前、広範な成体組織の健康な構造の維持は活発なプロセスであり、増殖因子ベータ型（TGF-β）スーパーファミリーの形質転換においてサイトカインはこの活発な維持の中で重要なメディエーターである、と我々は提唱した（例えば、Biochem Soc Trans. 1995 May;23(2):403-6; Biol Rev Camb Philos Soc. 1995 Nov;70(4):571-96を参照されたい）。この提唱は、保護サイトカイン仮説（Protective Cytokine Hypothesis）と呼ばれ、当初は議論の余地があったが、その後多様な実験データにより支持された（例えば、Arterioscler Thromb Vase Biol. 2004 Mar;24(3):399-404及びその中の参考文献を参照されたい）。例えば、マウスを部分的にＴＧＦ−ベータ欠損させた場合（tgfbｌ遺伝子のヘテロ接合欠損によるか、又は中和抗体もしくは可溶性受容体の投与による）、アテローム性動脈硬化に対する感受性が顕著に増加した（J Cell Sci. 2000 Jul;113(13):2355-61 ; Arterioscler Thromb Vase Biol. 2002 Jun l;22(6):975-82; Circ Res. 2001 Nov 9;89(10):930-4; Blood. 2003 Dec l;102(12):4052-8）。同様に、遺伝的改変動物におけるＴＧＦ−ベータレベルの減少によっても、癌（例えば、Nat Med. 1998 Jul;4(7):802-7）及び自己免疫疾患（J Autoimmun. 2000 Feb;14(l):23-42）の素因の増加が示された。
【０００４】
ＴＧＦ−ベータレベルの減少によって、例えば、アテローム性動脈硬化、自己免疫疾患及び神経変性疾患等の、成体組織構造の緩やかな減少に関連する疾患に個体が罹患する場合、結果としてＴＧＦ−ベータレベルを上昇させる薬剤が保護剤になるにちがいない（例えば、Nat Med. 1996 Apr;2(4):381-5; Curr Alzheimer Res. 2005 Apr;2(2): 183-6を参照されたい）。
【０００５】
残念ながら、過剰なＴＧＦ−ベータレベルは、レベルの減少と同様に障害となり得る。サイトカインのＴＧＦ−ベータファミリーのメンバーは、既知の細胞外基質形成の最も強力な誘導因子の一つである。その結果、ＴＧＦ−ベータのレベルが高くなり過ぎると、組織構造が基質タンパク質、例えばコラーゲン又はフィブロネクチンの過増殖産物を介して破壊され、組織を構成する細胞間の配列関係を最終的に破壊する（例えば、血管壁構造上の過剰TGF-ベータの効果に関するProc Natl Acad Sci USA. 1993 Nov 15;90(22): 10759-63を参照されたい）。
【０００６】
このため、成体組織構造の減少に関連する疾患の予防のために最適な発明は、最適範囲でＴＧＦ−ベータのレベルを維持できる、１又は２以上の薬剤の投与であろうことはすぐに明らかとなった。
【０００７】
多くのタンパク質と同様に、ＴＧＦ−ベータは良好でない薬物動態を示す（投与後数分以内に血液から除去される）ので、ＴＧＦ−ベータタンパク質の直接投与は斯かる基準を満たさない可能性があり（J Clin Invest. 1991 Jan;87(l):39-44）、継続投与は、タンパク質の組織濃度が所望の最適レベル範囲外となる、最高値と最低値を防止することが必要となるであろうことは確かである。
【０００８】
一方で、ＴＧＦ−ベータの細胞産生の刺激は、（通常の環境下で）この繊維形成サイトカインの過剰活性が増大することを阻止する天然制御系を活用する。
【０００９】
ＴＧＦ−ベータは、既知の生物活性がない潜在型前駆体として産生される。この前駆体は、成熟サイトカインとＬＡＰ（又は潜在型関連ペプチド（Latency-Associated Peptide））との間のタンパク質分解性切断を経験した各単量体であるＴＧＦ−ベータ遺伝子産物の、ジスルフィド結合二量体からなる。ただし、二量体ＬＡＰは成熟サイトカインに非共有的に結合し、この複合体は通常のＴＧＦ−ベータ受容体に結合できない。細胞外環境に放出されると（共有的又は非共有的相互作用を介して、様々な異なるＴＧＦ−ベータ結合タンパク質と結びつく可能性があり）、潜在型前駆体が活性化ステップに置かれる。少なくともインビトロ（in vitro）において、（例えば加熱、極端なｐＨ、カオトロピック剤、プロテアーゼ及び特定のタンパク質：タンパク質相互作用、例えばインテグリンとの相互作用）を含む広範な条件は、ＬＡＰ内での立体構造変化をもたらし、非共有複合体を個々に解体する。斯かるプロセスは図１で説明される。
【００１０】
この活性化プロセスは強固に制御され、多数の重要な機能を提供する。（１）それは、ＴＧＦ−ベータを、ある細胞型から産生させ、遠位の細胞外基質中に局在化させ、その後活性化し近傍細胞に影響を及ぼす。（２）遺伝子転写、翻訳及び排出のみ制御されれば可能となる、ＴＧＦ−ベータ活性のレベルの動的な制御を、様々な因子にさせる。（３）フィードバック制御により、危険なほど高レベルのＴＧＦ−ベータ活性の増強を阻止する。
【００１１】
このような正のフィードバックループの１つは、プロテアーゼ阻害剤プラスミノーゲン活性化因子阻害因子−１（ＰＡＩ−１）によって媒介される。ＰＡＩ−１レベルは、従来のＴＧＦ−ベータ細胞表面受容体を経由するＴＧＦ−ベータ活性により、ほとんどの細胞において転写レベルで著しく調節される（J Biol Chem. 1991 Jan 15;266(2):1092-100）。その結果、ＴＧＦ−ベータレベルが上昇し、ＰＡＩ−１産生レベルも同様に上昇する。ＰＡＩ−１はＴＧＦ−ベータの活性化阻害剤として作用することが周知であるが（Cell Biol. 1990 Aug;l l l(2):757-6)）、阻害が媒介される正確な分子機構は幾分議論の余地が残されている。ＰＡＩ−１は、潜在型ＴＧＦ−ベータ前駆体の最初の産生の際に、ＬＡＰと成熟サイトカインとの間の細胞内切断に関与するプロテアーゼの作用を阻害するか、あるいはＬＡＰを切断し活性サイトカインを放出する酵素を阻害している可能性がある（プロテアーゼの可能性が最も高い）（これらの争点の考察に関するBioessays. 2006 Jun;28(6):629-41を参照されたい）。
【００１２】
ＰＡＩ−１産生はＴＧＦ−ベータ活性により刺激され、且つそれ自身ＴＧＦ−ベータ活性を阻害するため、これは特定組織においてＴＧＦ−ベータ活性のレベルが高くなり過ぎることを阻止する強力なフィードバックループを形成する。しかしながら、ＴＧＦ−ベータは他のプロテアーゼ阻害剤（例えば、組織メタロプロテアーゼ阻害物質; TIMP）の産生を刺激するので、多数の類似のフィードバックループが存在し、それらは共に潜在型前駆体の過剰産生に対する十分な保護を提供する可能性がある。
【００１３】
残念ながら、活性ＴＧＦ−ベータタンパク質の直接投与（薬理学的投与による投与、又はサイトカインの自発的活性バージョンをコードする組み換えＴＧＦ−ベータ遺伝子を用いる遺伝子操作による投与）は、これらの制御プロセスを回避してＴＧＦ−ベータ活性のレベルを過剰に上昇させる。このような研究において、通常、組織繊維症は、組織構造の急速な破壊を伴って広がることが観察される。
【００１４】
一方で、潜在ＴＧＦ−ベータ前駆体の産生を刺激する薬剤の投与は、任意の組織においてＴＧＦ−ベータ活性を上昇させることができ、そのレベルは準最適であり、過剰な活性の危険性及び繊維形成の発生がない。このため、我々はＴＧＦ−ベータ産生刺激因子が、例えば、循環器系疾患、自己免疫疾患、及び神経変性疾患等のこれらに限定されない成体組織構造の減少に関連する疾患の治療用治療剤の、有用な新規のクラスであると推定した（例えば、2006年8月1日に発行された米国特許第7,084.171号、2002年6月25日に発行された米国特許第6,410,587号を参照されたい）。
【００１５】
ＴＧＦ−ベータ産生刺激因子の前記クラスは、例えばタモキシフェン（ＴＭＸ）等のトリフェニルエチレン（ＴＰＥ）誘導体である。当初ＴＰＥは、エストロゲン受容体調整因子として開発されたので、クラスとしてＴＰＥは多様な薬理活性を有する。２つのエストロゲン受容体タンパク質（ＥＲ びＥＲ ）への結合に加え、種々のＴＰＥが、ＡＴＰ結合カセットトランスポータータンパク質（Biochem Biophys Res Commun. 1997 Jun 27;235(3):669-74）、酵素ステロール 、８イソメラーゼ（J Clin Oncol. 1995 Dec;13(12):2900-5）及びＰ−糖タンパク質トランスポーター（Biopharm Drug Dispos. 2004 Oct;25(7):283-9）の阻害剤として、並びに抗酸化剤（Biochem Soc Symp. 1995;61 :209-19）として作用することが報告されている。さらに、多数のＴＰＥ、特に具体的にはタモキシフェンは、多種多様の細胞型において、インビトロ（in vitro）（Am J Clin Oncol. 1991;14 Suppl 2:S15-20; Biochem J. 1993 Aug 15;294(l):109-12）及びインビボ（in vivo）において（J Steroid Biochem MoI Biol. 1993 Dec;47(l-6):137-42; Nat Med. 1995 Oct; 1(10): 1067-73）、ＴＧＦ−ベータの産生を刺激することが報告されている。
【００１６】
斯かる活性は、ＴＧＦ−ベータ産生刺激因子としての活性であり、これにより、例えば循環器系疾患（例えば冠動脈疾患及び再狭窄）、並びに自己免疫疾患及び神経変性障害等の、正常成体組織構造の減少に関連する疾患の予防のための、例えばタモキシフェン等のＴＰＥの使用を我々が特許請求することに繋がった（例えば、米国特許第7,084,171号及び関連特許）。
【００１７】
過去10年の間、ＴＰＥ、特にタモキシフェンを、正常成体組織構造の減少に関連する斯かる疾患、特に、冠動脈疾患に続発する心筋梗塞による死を予防するために使用できるという、多様な臨床データが集められ、我々の特許査定となった請求項を支持するものである（例えば、本明細書に各々参照により組み込まれる、米国特許第5,472,985号、米国特許第5,595,722号、米国特許第5,599,844号、米国特許第5,770,609号、米国特許第5,773,479号、米国特許第5,847,007号、米国特許第5,945,456号、米国特許第6,117,911号、米国特許第6,166,090号、米国特許第6,197,789号、米国特許第6,251,920号、米国特許第6,262,079号、米国特許第6,395,494号、米国特許第6,410,587号、米国特許第7,084,171号等）。例えば、Braithwaiteとその共同研究者等は、乳癌を予防するためにタモキシフェンで治療を受けた27,000人以上の女性の心血管の転帰のメタ分析を示し、慢性的なタモキシフェン使用者においては心筋梗塞が死因となる相対危険度が0.67であることがわかった（J Gen Intern Med. 2003 Nov;18(11):937-47）。これは、危険度に言い換えると33％の低下であり、より危険度の高い群、例えば男性において再現する場合、英国の１年だけでも心筋梗塞による死亡が少なくとも10,000人少なくなる可能性が有り、これは米国の５倍の数である。同様に、Clarkeとその共同研究者等は、タモキシフェン治療が、アテローム疾患の重荷の代替マーカーである内皮機能を改善したことを実証した（Circulation. 2001 Mar 20;103(11): 1497-502）。これらの結果はわれわれの最近のレビューに要約されている（本明細書に参照により組み込まれるGrainger & Schofield, Circulation (2005) 112:3018-24）。
【００１８】
残念ながら、正常成体組織構造の減少に関連する少なくとも１つの疾患における有効性についてのこのような肯定的な実証にもかかわらず、タモキシフェンはＥＲ陽性乳癌の治療及び予防（エストロゲン受容体調整因子としての、その代替的な薬理的機能に顕著に依存する適用）以外の使用には未だ広範には採用されていない。
【００１９】
これら分野が熱心に研究されていない明白な理由は、タモキシフェンの使用に伴う煩わしい副作用である。タモキシフェンが、タモキシフェン及びＴＰＥクラスの他のメンバーについて報告される過剰な薬理学的及び分子的相互作用による様々な効果（有益なものもあれば、有害なものもある）を有するのは当然のことである。今日、使用している低分子医薬剤は、その目的の標的に対して真に特異的でなく、副作用は他の極めて有効な医薬の適用をしばしば制限する。
【００２０】
薬物の設計及び開発の際に、副作用の影響を制限するために採用できる一般的手法が多数ある。ある手法は、原剤の目的とする薬効を保持するが、より特異的で分子相互作用及び薬理的影響の多様性が低い、完全に新規な組成物をデザイン又は同定するものである。しかしながら、この手法はいくつかの重大な欠点がある。第一に、斯かる組成物を同定する成功率の高い一般的な方法が存在せず、また、副作用を有する原剤ですら、同定することが困難で、時間及びコストがかかる可能性がある。第二に、一部又は全ての副作用が、標的の有益な効果に寄与する同一分子の相互作用の、直接又は間接的な結果であり得る。これらの例においては、副作用から独立して有益な効果特性のみを保持することはほとんど不可能であろう。
【００２１】
以前から他でうまく使用されている第二の手法は、単一組成物中に２つ以上の有効成分を組み合わせるものであり、斯かる組み合わせは、単独で投与される成分、又は同じ個体であるが別の時間に投与される同じ２つの成分よりも優れた特性を有する。
【００２２】
２つの異なる概念が、組み合わせアプローチの成功の基礎となる。第一のシナリオにおいては、同じ影響を及ぼすが異なる分子作用機構を有する２つの薬物が組み合わされ、斯かる２つの成分が標的因子に相乗的影響を示すようになる。相乗的に作用する２つの成分の使用によって同一の有益な効果を達成するため、各成分を顕著に低い用量で投与することが可能になる。副作用が相乗的増強も示さないならば（副作用が標的の効果とは異なる分子相互作用に依存するならば、増強を示さないであろう）、そのような組成物は厄介な副作用が減少した状態で同一の有益な効果を与える可能性がある。確かに、たとえ２つの薬剤が（相乗的とは反対の）相加的効果のみを示しても、（この場合、２つの別々の処置としてよりも、単一の組成物としてそれらを投与するその利益は、顕著ではないであろうが）組み合わせ組成物はなお有益な効果と同じ度合いで副作用の低下を示すであろう。単一の調製物中に、２つの有効成分を組み合わせるこのような組成物の例は多数存在する。例えば、Plachetka 等 (1999年2月16日付の米国特許第5,872,145号)は、鎮痛剤、特にＮＳＡＩＤと５−ＨＴ受容体アゴニストとの組み合わせを、片頭痛の治療のために発明した。両有効成分は、各薬剤が最少有効用量としてそれぞれ通常考えられる用量未満で投与され、斯かる組み合わせは同時に、最少有効用量以上の用量では不要な副作用を伴う単一の薬剤をより高用量で投与することによって通常付随する有効性レベルを達成した。
【００２３】
第二のシナリオは、組み合わせが同時に有効且つ安全であるように、組成物中の第二の有効成分が第一の有効成分の副作用に対抗することを目的とする。斯かる組成物はあまり一般的ではないが、特許権に係る実施例では、特定の応用において大いに成功している。例えば、エストロゲンのみでのホルモン補充治療の使用は不所望の子宮肥大をもたらすが、エストロゲンとプロゲストゲンとの組み合わせは、子宮無処置の女性が安全に使用できる組み合わせ錠剤をもたらす。一方、子宮を摘出した女性における使用の場合は、競合しないエストロゲンが同等に有効である（この場合、副作用自体は現れない）。この例によれば、副作用が非常に強く、且つ（子宮内膜癌の場合）生命を脅かし得るものですらあり、単一の組み合わせ組成物は、１つの有効成分のみを患者が服用し、他の有効成分を服用しない可能性を排除するので、２つの有効成分を単一の組成物中で組み合わせることは、臨床上相当有益であることは明らかである。
【００２４】
例えばタモキシフェン等のＴＰＥは、ＴＧＦ−ベータ産生刺激因子として良好な活性を有するが、より広い応用を制限する多数の副作用が確認されている。最も重要なことには、最も一般的に使用される用量（20 mg/日）でのタモキシフェンの慢性使用が、割合によっては致命的となり得る血栓塞栓症の、わずかではあるが有意な増加をもたらすことである。タモキシフェン慢性使用者におけるこの凝血原の増加傾向はまた、タモキシフェン使用者における致命的な脳血管発作（脳卒中）の増加の原因となる可能性があり（J Gen Intern Med. 2003 Nov;18(11):937-47）、その約90％は(元来出血性であるのとは対照的に)虚血性である。これらの凝血原性副作用は、患者が治療開始前に既に凝血原の傾向を示す可能性もあるため、ＴＰＥが冠動脈疾患の予防又は治療用に想定される循環器系環境において格別の懸念となっている。さらに、冠動脈疾患の危険度が増大した患者はまた、虚血性脳卒中の危険度が上昇する可能性がある。特に、女性に蔓延する疾患、例えば自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ）の治療のためにＴＰＥを使用する場合、他の副作用、例えば子宮内膜癌の危険度の増大も懸念される。例えば顔面紅潮及びＴＰＥのホルモン活性のその他の事象等のより軽度の副作用も存在する。これらの副作用は、患者の生活の質に重大な影響を及ぼし、重症又は生命を脅かすような症状（例えば正常な成体組織構造の減少に関連する疾患、例えば循環器系疾患、自己免疫疾患及び神経変性）の治療のためのこれらの薬剤の使用を排除する必要はないが、より重症な疾患の治療のためであっても、同様にこのような薬物療法の有効性を脅かす、患者コンプライアンスの問題を引き起こす。
【００２５】
我々は、（循環器系疾患、自己免疫疾患、及び神経変性状態）を含む、正常な成人の組織構造の減少と関連のある疾患の予防又は治療のための、ＴＧＦ−ベータ産生刺激因子として有用な一連の組成物を以前に開示した。斯かる組成物は、以前に報告されたＴＧＦ−ベータ産生刺激因子のこれらの広範な徴候における適用を制限する副作用を低減又は回避する(国際公開第2008/099144号; 英国特許第2446641号)。これらの組成物は、少なくとも２つの有効成分 (及び任意の賦形剤又は担体)を含み、少なくとも１つの有効成分がTGF-ベータ産生刺激因子であり、他の有効成分が第一の有効成分の投与と関連のある副作用を減少することができる組成物である。
【００２６】
我々の最初の開示(国際公開第2008/099144号; 英国特許第2446641号) は、選択されたTGF-ベータ産生刺激因子及び斯かる選択されたTGF-ベータ産生刺激因子を投与することによる副作用を軽減することを目的とする第二の (さらなる) 有効成分の両方において変更可能な多くの可能性のある組み合わせを記載する。多数の異なる実施例は、特許請求する組成物の利点を説明するために供した。しかしながら、明細書及び請求項は、開示される多く成分の中の最も有用な組み合わせの選択についてガイダンスをあまり提供していなかった。
【００２７】
我々の元の開示において記載される構造(I)、又はより好ましくは (II)を有するタモキシフェンに関するTPEは、斯かる先行発明の使用の好適なTGF-ベータ産生刺激因子であることは明らかである。しかしながら、より狭い一般式(II)でさえ非常に多くの化合物質が含まれ、(存在する場合)いずれの化学物質が一般的なクラスより優れた特性を有するかを発見するために、それら全てを試験することは非現実的である。
【００２８】
【化１】
2013512885.tif 000003
（式中、
R1は、１、２又は３つのＶにより任意に置換される（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、又はアリールであり、
R2は、１、２又は３つのＶにより任意に置換されるフェニルである、又はR2は、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、ハロ（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ6）シクロアルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルシクロ（Ｃ3〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ5〜Ｃ6）シクロアルケニル、又は（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ5〜Ｃ6）シクロアルケニルであり、
R3は、２位においてＲjで任意に置換され、さらに１、２又は３つのＶにより任意に置換される水素又はフェニルであり、
R4は、水素、ニトロ、ハロ、アリール、ヘテロアリール、アリール（Ｃ1〜Ｃ3）アルキル、ヘテロアリール（Ｃ1〜Ｃ3）アルキル、ハロ（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、シアノ（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ4）アルコキシカルボニル（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ6）シクロアルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルシクロ（Ｃ3〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ5〜Ｃ6）シクロアルケニル、又は（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ5〜Ｃ6）シクロアルケニルであり、ここでいずれかのアリール又はヘテロアリールは、１、２又は３つのＶにより任意に置換されてもよく、又は
R5及びRjは共に、−ＣＨ2−ＣＨ2−、−Ｓ−、−Ｏ−（ＮＨ）−、Ｎ［（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル］−、−ＯＣＨ2−、Ｏ−Ｃ［（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル］2−又は−ＣＨ＝ＣＨ−であり、
-------は、単結合又は-C(B)(D)-であり、ここでB及びDは、各々独立して水素、(C1-C6)アルキル又はハロゲンであり、
Vは、OPO3H2、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルコキシ、メルカプト、(C1-C4)アルキルチオ、ハロ、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチル、ニトロ、N(Rn)(Ro)、シアノ、トリフルオロメトキシ、ペンタフルオロエトキシ、ベンゾイル、ヒドロキシ、アルキル、ベンジル、-OSO2(CH2)0-4CH3、U(CH2)1-4COORp、-(CH2)0-4COORp、-U(CH2)2-4ORp、-(CH2)0-4ORp、-U(CH2)1-4C(=O)Rk、-(CH2)0-4C(=O)Rk、-U(CH2)1-4Rk、-(CH2)0-4Rk、又は-U(CH2)2-4OC(=O)Rpであり、ここでUは、O、N(Rm)、又はSであり、
Zは、-(CH2)1-3-、O、-OCH2-、-CH2O-、-C(=O)O-、N(Rq)-、C=O、又は共有結合であり、
Rkは、１又は２個の（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルで任意に置換されるアミノ、又は１又は２個のさらなるN(Rz)、Ｓ又は非過酸化物Ｏを任意に含むＮ−複素環であり、ここでRzは、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、フェニル又はベンジルであり、
Rn及びRoは、独立して水素、(C1-C6アルキル)、フェニル、ベンジル、又は(C1-C6)アルカノイルであるか、又はRn及びRoは、それらが結合する窒素と共に、3、4、5又は6員の複素環であり、
Rpは、H又は(C1-C6)アルキルであり、且つ
Rm及びRqは、独立して水素、(C1-C6)アルキル、フェニル、ベンジル又は(C1-C6)アルカノイルである）
の化合物、又は1-(4-[2-(ジエチルアミノ)エトキシ]フェニル)-2-(4-メトキシフェニル)-1-フェニルエタン-1-オール(MER25)である斯かる化合物、或いはそれらの医薬的に許容される塩。
【００２９】
一般式(I)の好適な化合物は、式(II):
【化２】
2013512885.tif 000004
（式中、
Zは、C=O又は共有結合であり、
Yは、H又はO(C1-C4アルキル)であり、
R10及びR11は、それぞれ (C1-C4)アルキルであるか、又はそれらが結合するNと共に飽和複素環基を形成し、
R12は、エチル又はクロロエチルであり、
R13は、H、又はR12と共に-CH2-CH2-又は-S-であり、
R14及びR15は、H、I、O(C1-C4)アルキルから独立して選択される）
のトリフェニルエチレン構造を有する化合物、又は医薬的に許容されるその塩であった。
【００３０】
アスピリン、アスピリナート又は式(III)のチオフェン等の抗血小板剤は、先行発明の組成物中の好適な第二の薬剤であることは明らかである。しかしながら、これらの一般式には非常に多くの化合物質が含まれ、(存在する場合)いずれの化学物質が一般的なクラスより優れた特性を有するかを発見するためにそれら全てを試験することは非現実的であろう。
【００３１】
【化３】
2013512885.tif 000005
（式中、
R5は、水素、ハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、CF3、-NRcRd、-C(=O)ORe、-OC(=O)ORe、-C(=N)ORe、(C1-C6)アルキル又は(C1-C6)アルコキシであり、
R6は、水素又は-XRaであり、
R7は、-C(=O)YRbであり、
R8は、(=O)nであるか、又はR8は、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルカノイル又は(C1-C6)アルカノイルオキシであるとともに、チオフェン硫黄と共にスルホニウム塩を形成し、ここで結合した対イオンは医薬的に許容される陰イオンであり、
R9は、水素、-C(=O)ORh又は-C(=O)SRhであり、
n=0、1又は2であり、
Xは、酸素又は硫黄であり、
Yは、酸素又は硫黄であり、
Raは、(C1-C6)アルカノイルであり、
Rbは、水素又は(C1-C3) アルキルであり、
Rc及びRdは、各々独立して水素、(C1-C4)アルキル、フェニル、C(=O)OH、C(=O)O(C1-C4)アルキル、CH2C(=O)OH、CH2C(=O)O(C1-C4)アルキル、又は(C1-C4)アルコキシである、又はRc及びRdは、それらが結合する窒素と共に、3、4、5又は6員の複素環であり、且つ
Re-Riは、独立して水素又は(C1-C6)アルキルであるとともに、
R6及びR7が、それらが結合する環の隣接位置上、又は斯かる環の2-及び5-位上に存在し、さらにR6が水素である場合、R7はそれが結合する環の2-又は5位上に存在し、R4は(C1-C4)アルカノイルオキシである）
の化合物又は医薬的に許容されるその塩。
【００３２】
２つの異なるクラスから自由に選択される２つの薬剤の組み合わせである組成物が特許請求される場合、これが網羅する組成物の数は各成分のクラスのメンバーの数の積であることは明らかである。従って、以前に開示した発明によれば、たった100個の薬剤が第一のクラスのメンバーであり、且つたった100個の異なる薬剤が第二のクラスのメンバーである場合、10,000個の異なる組み合わせが形成され得る。国際公開第2008/099144号及び英国特許第2446641号に関しては、100個よりさらに多くの薬剤がTGF-ベータ産生刺激因子のクラスのメンバーとして開示されることは明らかである。さらに、100個よりさらに多くの薬剤は、(アスピリナート（aspinate）及び式(III) の化合物を含む) 抗血小板剤のクラスのメンバーである。結果としてそれらの中で、10,000個よりさらに多くのこれらのクラスの組み合わせが開示され、特許請求される。
【００３３】
一般的に開示される組み合わせのこの非常に多くのクラスから、(それらの組み合わせのいずれかの開示される優れた特性に基づくよりも、主にこれらに関して得られるデータの量に基づく) より少数の好適な組成物を開示した。
【００３４】
特に、先行発明の好適な組成物は、次のリストから選択される組成物であった。
−タモキシフェン及びアスピリン、ドロロキシフェン及びアスピリン又はトレミフェン及びアスピリン、
−タモキシフェン及びクロピドグレル、ドロロキシフェンとクロピドグレル又はトレミフェン及びクロピドグレル、
−タモキシフェン及びアスピリン及びクロピドグレル、
−タモキシフェン及びアトルバスタチン又はタモキシフェン及びシンバスタチン、
−タモキシフェンアスピリナート、ドロロキシフェンアスピリナート又はトレミフェンアスピリナート、
−タモキシフェンアスピリナート及びクロピドグレル又はタモキシフェンアスピリナート及びアトルバスタチン、
−タモキシフェン及びナプロキセン又はタモキシフェンアスピリナート及びナプロキセン、
−タモキシフェン及びガランタミン又はタモキシフェンアスピリナート及びガランタミン、
及び (特定の塩が既に特定されている場合を除いて)任意の医薬的に許容されるそれらの塩。
【００３５】
これらの１８個の組み合わせ中の１２個は、好適なTGF-ベータ産生刺激因子としてタモキシフェンを含有する。さらに、先行の開示は、タモキシフェン及びクロピドグレルの組み合わせが、先行発明の最も好適な実施形態であることを示す。さらに、提供される全ての例は、タモキシフェンをTGF-ベータ産生刺激因子として選択する。
【００３６】
Dicker 等 (米国特許出願第2004/0180812号)は、癌等の増殖性疾患の治療のためのトリフェニルエチレン及び抗血小板剤の双方の使用もまた開示する。Dicker等は発明の有効な薬剤のリストに含まれる好適な薬剤の中から選択する場合、含有物にタモキシフェン及びクロピドグレルを選択するかもしれないが、彼らはトリフェニルエチレンと抗血小板剤とを組み合わせた組成物は開示しない(代わりに、抗血小板剤での前治療が抗増殖性トリフェニルエチレンの局所性腫瘍への接近を改善する治療計画を提案し、彼らは、それが最も有効であると期待している)。
【００３７】
よって、本発明に先行して以前に開示された薬剤の非常に多数の組み合わせ以外のいずれかが、提示のデータに基づく他の組み合わせよりも特に優れ得ることはこれまで当然想定されていない。我々の以前の研究及び全く異なる課題を解決しようとするDicker等双方から得られる教示から、トリフェニルエチレンとして選択されたタモキシフェンと他の薬剤との組み合わせが好ましく、特に、最も好ましい組み合わせはタモキシフェンとクロピドグレルであることが強く示される。
【発明の概要】
【００３８】
本明細書において、我々は驚いたことに、TGF-ベータ産生刺激因子と抗血小板剤とのある特定の組み合わせが、我々が以前開示した一般的な組み合わせのクラスより顕著に且つ予想外に優れることを示す。特に、TPEドロロキシフェンと抗血小板剤クロピドグレルとの組み合わせは、先行の教示に従って、最も好ましい組み合わせであろうと推定されていたかもしれない、タモキシフェンとクロピドグレルとの組み合わせより顕著に優れる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、TGF-ベータの制御及び活性化に関与する経路を示す。図は、TGF-ベータ1に関する特定のデータに基づくが、非常に類似した経路がTGF-ベータ2及びTGF-ベータ3に関して機能する。本明細書で記載されるTGF-ベータ産生刺激因子は、標識される「活性化」の１又は２以上の工程に利用可能な局在性潜在型TGF-ベータの量を増加するために、これらの工程のいずれか (又は図示されない他の工程)に作用し得る。
【図２】図２は、使用したタモキシフェンの構造類似体の様々な濃度の存在下での、ラット大動脈平滑筋細胞の培養物の増殖のTGF-ベータ1依存的抑制に関する用量反応曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
定義
用語「約」とは、考えられる値の周囲の区間を意味する。本明細書で使用される場合、「約X」とは、XマイナスXの10%〜XプラスXの10%、好ましくはXマイナスXの5%〜XプラスXの5%の区間を意味する。
【００４１】
本明細書における数的範囲の使用は、発明の範囲に、範囲内の個々の整数値全て及び所定の範囲の最も広範な範囲内の上下限値の数値全ての組み合わせを含むことを明確に意図する。
【００４２】
本明細書で使用される用語「含む」とは、本発明の組成物を含む、所定の薬剤の一定用量の組み合わせを意味し、製造工程の一部として成分は共に混合され、本質的に均質の混合物を形成する。疑いの回避のために記載するが、例え同時であっても、本発明の組成物を含む２つの薬剤の同時投与は、本明細書で記載される「混合物」を構成しない。しかしながら、上述の通り、混合物(例えば、化合物VI)を含む成分の化学的な組み合わせは予測され、且つ斯かる定義に従って混合物を構成する。
【００４３】
本明細書で使用される用語「TGF-ベータ産生刺激因子」とは、サイトカイン、TGF-ベータの細胞産生を増加する薬剤を記載するために使用される。薬剤がTGF-ベータ産生刺激因子であるかを説明するための方法は、当業者に周知である(例えば、本明細書において参照により組み込まれる、米国特許第6,410,587号を参照されたい)。薬剤がTGF-ベータ産生刺激因子であるか(及びそれがどの程度であるか) を決定するための適切な試験は実施例１において供されるが、他の同等の試験もまた他に記載されるとおり使用することができる。
【００４４】
本明細書で使用される用語「TGF-ベータ」とは、(他に明確に記載しない、又は使用される文脈から明らかでない限り)特に哺乳類TGF-ベータ1アイソフォームを意味するために使用される。
【００４５】
本明細書で使用される用語「ドロロキシフェン」とは、式IVに示される化合物(E)-1-(4’-(2-ジメチルアミノエトキシ)フェニル)-1-(3-ヒドロキシフェニル)-2-フェニルブテ-1-エンを意味するために使用され、任意の水和状態で遊離塩基及び斯かる化合物の任意の塩形態を含む。
【００４６】
本明細書で使用される用語「クロピドグレル」とは、式Vの化合物メチル2-(2-クロロフェニル)-2-(6,7-ジヒドロチエノ[3,2-c]ピリジン-5(4H)-イル)酢酸を意味するために使用され、任意の水和状態で遊離塩基及び化合物の任意の塩形態を含み、(S) 配置に立体中心を有する。
【００４７】
用語「CLP*」は、クロピドグレルの活性代謝物として通常容認される、化合物(Z、1S) 3'-カルボキシメチレン-4'-メルカプト-ピペリジン-1-イル-(2''-クロロフェニル)酢酸を意味するために使用される。これらの鏡像異性体のどちらがインビボ（in vivo）での代謝クロピドグレルの生物活性に関与するか分かっていないので、分子の (4位の)立体中心は、(R)又は(S)配置とすることができる(Pereillo et al. (2002) Drug Met. Disposition 30:1288-95を参照されたい)。
【００４８】
他に定義しない限り、明細書中で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明の技術の当業者によって通常理解される同一の意味を有する。同様に、明細書中で言及する全ての論文、特許出願、全ての特許及び全ての他の引用文献は、(法的に許可される場合)参照により組み込まれる。
【００４９】
より詳細には、本発明は、２つの有効成分を含む組成物及び治療剤の使用を供する。斯かる２つの有効成分に関して、第一の薬剤は、遊離塩基又は医薬的に許容される塩形態としてのドロロキシフェン (IV)であり、第二の薬剤は、遊離塩基又は医薬的に許容される塩形態としてのクロピドグレル (V)である。
【化４】
2013512885.tif 000006
【００５０】
重要なことに、本発明の組成物は、混合物として患者に投与されなければならない。２つの有効成分の別々の投与を超える本発明の組成物の主たる利点は、安全性である。例えば、ドロロキシフェン等のトリフェニルエチレンの副作用は、特定環境において、深刻、さらには致命的となり得る。つまり、２つの薬剤を別々に投与し、患者が (偶発的に又は故意に) 有効成分の１つを投与し続けるが、他の有効成分を投与しないことが生じ得る、不必要なリスクが存在する。このような状況では、患者は相当の悪影響を受ける可能性がある。トリフェニルエチレンは、血栓塞栓症(さらにその後の脳卒中) のリスクを増加するが、抗血小板剤はこのリスクを軽減する。
【００５１】
言い換えれば、２つの成分が一緒であることの望ましい効果が、別々に投与される時のいずれかの薬剤の効果と異なる場合、単一医薬 (錠剤、カプセル、ゲル又は他の剤形)としてのこれらの２つの医薬の供給は、斯かる２つの医薬の別々の投与を超える相当の利点を供する。原則的には、同時にではあるが別々の医薬 (例えば、錠剤、カプセル又はゲル)として化合物を投与することによって同一の効果が達成され得るが、単独投与されるいずれか一方の化合物と同様の異なる (且つあまり望ましくない)効果を生じるリスクは、２つの化合物が単一医薬として投与される場合より高い。２つの医薬の組み合わせと単独投与のいずれか１つの化合物との間の効果の特徴における違いが (例えば、潜在的に致命的な副作用の場合で) 顕著なら、このようなリスクの増加は容認できないものとなる。
【００５２】
さらに、本明細書で示されるように、２つの薬剤の摂取のタイミングが同時でない場合、２つの薬剤間の代謝相互作用はおそらく、クロピドグレルの活性代謝物の予測不可能なレベルを生じるであろう。この原則上、患者が斯かる結合医薬の２つの成分を別々の時間に摂取する可能性が増加するにつれ、予想外の (且つ潜在的に有害な)結果がますます生じ得る。同一剤形中の２成分の存在は、同時投与を確実にし、これにより、有効成分 (及びその代謝産物)のより予測可能な曝露特性を得ることとなり、より予測可能且つ望ましい治療成績を生じる。
【００５３】
本発明はまた、クロピドグレル (V) 又は医薬的に許容されるその塩と共に、ドロロキシフェン (IV)又は医薬的に許容されるその塩、さらに少なくとも１つ医薬的に許容される賦形剤及び/又は担体を含む、混合物として２つの有効成分を含む医薬組成物を供する。本明細書の目的のために、用語「混合物」とは、(例えば、両成分がそれらの十分な医薬活性を有することが可能である、エステル、又はアミド又は任意の同様の共有化学結合としての)２つの薬剤の化学結合を任意に含むことができる。例えば、クロピドグレルのメチルエステルの、ドロロキシフェンのヒドロキシル基とのエステル転移反応によって形成されるエステルである単一分子(VI)は、本発明ドロロキシフェンとクロピドグレルの「混合物」を表し、つまり特許請求するものである。
【化５】
2013512885.tif 000007
【００５４】
化合物(VI)が１つ以上の光学活性形態で存在し得ることは明らかであろう。結果として、本開示は、分離のいずれかの鏡像異性体、及び等しい割合の両方の鏡像異性体のラセミ混合物を含む鏡像異性体の混合物に関する。化合物(VI)はまた、当業者に周知の広範囲の対イオンとの塩形態で容易に調製することができ、このような塩形態は本開示に包含される。
【００５５】
しかしながら、クロピドグレルは、ある立体化学的配置においてのみ抗血小板活性を有することが周知であるので、エステル結合の切断に続いて代謝産物として得られる(VI)の光学異性体は、クロピドグレルにおける原子の斯かる空間配置を有する化合物が好適である。この好適な(VI)の光学異性体は、(VI’)として説明する。疑義の回避のため、この好適な異性体は図示するように、二重結合周囲にトランス (又は(E)-) 配置を有する。
【化６】
2013512885.tif 000008
【００５６】
医薬的に許容される塩とは、特に、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、二リン酸塩及び硝酸塩等の無機酸、又は例えば、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、メタンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、パルモ酸塩（palmoate）、及びステアリン酸塩等の有機酸の付加塩を意味する。また、本発明の範囲内で使用される場合、斯かる塩は、例えば、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウム等の塩基から形成される。医薬的に許容される塩の他の例に関して、「Salt selection for basic drugs」, Int. J. Pharm. (1986), 33, 201-217を参照されたい。好ましくは、ドロロキシフェン成分は、クエン酸塩として存在してよい。好ましくは、クロピドグレル成分は、重硫酸塩 (又は硫酸水素塩)として存在してよい。
【００５７】
典型的には、組成物は、1mg〜200mg、より典型的には、10mg〜100mgの範囲の量のドロロキシフェンを含むことができる。典型的には、組成物は、10mg〜500mg、より典型的には、50mg〜200mgの量のクロピドグレルを含むことができる。典型的には、クロピドグレルのドロロキシフェンに対する割合は、10:1〜1:10、より典型的には、10:1〜1:1の範囲とすることができる。本発明の好適な組成物は、(重硫酸塩として)クロピドグレルの用量50〜150mgと共に、(クエン酸塩として)ドロロキシフェンの用量20〜80mgを含む。
【００５８】
本発明の好適な組成物は、75mgのクロピドグレルとの組み合わせの20mgのクエン酸ドロロキシフェンから成る。斯かる組成物は、(適した医薬担体又は医薬との)錠剤形態である。好ましくはこのような組成物の錠剤は、患者に毎日単回投与することができる。
【００５９】
医薬組成物は、例えば、粉末、顆粒、錠剤、ゼラチンカプセル、リポソーム又は坐薬等の固体形態とすることができる。適した固体担体は、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリジン及びワックス等とすることができる。他の適した医薬的に許容される医薬及び/又は担体は、当業者に周知であろう。
【００６０】
本発明の医薬組成物はまた、例えば、溶液、乳濁液、懸濁液又はシロップ剤等の液体形態で存在してよい。適した液体担体は、例えば、水、有機溶媒例えば、グリセロール又はグリコール、及び水中のそれらの様々な割合の混合物等とすることができる。
【００６１】
本発明は、定義の化合物、組成物及びその使用を含み、斯かる化合物は、水和又は溶媒和形態である。
【００６２】
本発明によれば、本発明の組成物、又は医薬的に許容されるその塩又は医薬組成物又は有効成分としてそれらを含有する医薬によって予防又は治療されることを目的とする疾患とは、特に以下を含む。
−自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、クローン病、グレーブス病、重症筋無力症、エリテマトーデス、強皮症、シェーグレン症候群、自己免疫性１型糖尿病、
−血管障害、例えば脳卒中、冠動脈疾患、心筋梗塞、不安定狭心症、アテローム性動脈硬化又は脈管炎、例えば、ベーチェット症候群、巨細胞動脈炎、リウマチ性多発性筋痛、ヴェーゲナー肉芽腫症、脈管性チャーグストラウス症候群、ヘノッホシェーンライン紫斑病、及び川崎病、
−喘息、アレルギー性鼻炎又は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、
−骨粗鬆症（低骨塩密度）、
−腫瘍増殖、
−例えば腎臓移植患者における、移植臓器拒絶及び／又は遅延移植又は臓器機能、
−乾癬、
−アレルギー、
−アルツハイマー病、及び神経変性による他の特発性認知症、
−パーキンソン病、
−ハンチントン病、
−外傷性脳損傷（例えば、交通事故による頭部損傷）、及びこのような急性外傷性損傷による慢性後遺症（例えば、記憶障害）。
【００６３】
法的に許容される場合、本発明はまた、本明細書中で請求する組成物又は医薬の治療上有効量の患者への投与による正常な成人の組織構造の減少を含む疾患の症状の治療、寛解又は予防方法を供する。
【００６４】
本発明の医薬の投与は、局所的、経口、非経口経路、筋肉内注射等によって行うことができる。
【００６５】
好ましくは、本発明の組成物の投与により寛解、治療又は予防される疾患は、次のリストから選択される。
−循環器疾患、例えばアテローム性動脈硬化、及びアテローム性動脈硬化の臨床的後遺症、例えば心筋梗塞、狭心症、不安定狭心症、脳卒中、一過性脳虚血性発作及び抹消閉塞性動脈疾患、
−自己免疫疾患、例えばリウマチ様関節炎及び多発性硬化症、
−神経変性疾患、例えばアルツハイマー病及びパーキンソン病、
−腫瘍の成長。
【００６６】
本発明の組成物は、当業者に周知の方法を使用して容易に製造される。特に、個々の有効な医薬成分は、当業者に周知の方法によって合成することができ、どちらも市販の単離化合物である。２つの有効成分が化合されている場合を除いて、本発明の組成物を含む２つの有効な医薬成分は、好ましくは細かな分離粉末として混合され、均質の混合物が得られ、続いて当業者に周知の技術を使用して適した医薬担体及び/又は医薬に添加される。任意の担体及び医薬との混合物は、続いて、例えば、錠剤、カプセル、液体懸濁液又は坐薬として、当技術分野で確立された方法を使用してヒトへの投与に適当な形態に調製される。
【００６７】
本発明の組成物が、例えば、エステル(VI)として化合された２つ又は３つ以上の有効な医薬成分を含む場合、斯かる組み合わせは、当業者に周知の方法を使用して調製される。例えば、エステル (VI)を調製するために、(塩化チオニル又は他の方法を使用して)3'-カルボキシメチレン-4'-メルカプト-ピペリジン-1-イル)-(2''-クロロフェニル)酢酸を酸塩化物又は(HATU又は他のカップリング剤を使用して)活性エステルに変換し、続いてドロロキシフェン及び4-ジメチルアミノピリジンで処理し、標準的な方法に従ってエステルを形成する。あるいは、3'-カルボキシメチレン-4'-メルカプト-ピペリジン-1-イル)-(2''-クロロフェニル)酢酸及びドロロキシフェンの等モルの混合物を標準的な方法に従って、ジメチルアミノピリジン及びカルボジイミドカップリング剤で処理することができる。エステル転移反応の他の方法は当業者に周知であり、同様にエステル(VI)を調製するために使用することができる。
【００６８】
次の実施例は、上記手順を説明するために提示するものであり、本発明の範囲を限定するものと決して見なされるべきではない。
【実施例】
【００６９】
実施例1 : ドロロキシフェンは、タモキシフェンを含む他のトリフェニルエチレンに匹敵するTGF-ベータ産生刺激因子である。
広範囲のトリフェニルエチレンが、TGF-ベータ産生刺激因子であると示されており、その結果、一般的なクラスはこの目的のために特許請求される(例えば、米国特許第6,262,079号及び米国特許第6,410,587号を参照されたい)。しかしながら、TGF-ベータ産生刺激因子としての様々なトリフェニルエチレンの効力及び能力の比較の開示は存在しない。さらに、異なるトリフェニルエチレンがTGF-ベータのアイソフォームに異なる効果を有することは、当業者に周知である。例えばタモキシフェンは、TGF-ベータ1を刺激し、それより程度が低いがTGF-ベータ3もまた刺激するが、ラロキシフェンは主にTGF-ベータ3を刺激し、TGF-ベータ1にほとんど又は全く効果を有しない。これらのアイソフォームに対する効果におけるこの違いから、冠動脈心疾患の予防に対するラロキシフェンの効果が、タモキシフェンよりそれほど強力でないことが想定される(Grainger & Schofield (2005) Circulation 112:3018-24)。
【００７０】
ドロロキシフェンを他のトリフェニルエチレンと比較するために、我々はTGF-ベータ1活性に関して機能アッセイを利用した。他のアプローチは、様々な理由であまり適しない。産生されるTGF-ベータは、細胞又は細胞外基質と結合した状態であり、このため培養細胞由来の条件培地における(例えば、ELISAによる)アッセイに利用できないので、トリフェニルエチレンに応答した培養細胞によるTGF-ベータタンパク質産生を直接測定することが不可能である。例えば、定量的PCRによるメッセンジャーRNAのレベルの測定は、試験薬剤がTGF-ベータ産生刺激因子である可能性は示す。しかしながら、転写後のプロセスがTGF-ベータ活性の制御において重要な役割を果たし、mRNAレベルの測定では試験薬剤のこれらのプロセス(例えば、翻訳効率、糖鎖付加、シグナルペプチドの除去、成熟、有効性及び活性化) への効果は検出できないので、明確な証拠が示されず、また効力又は能力の比較が不可能である。一方、例えば、TGF-ベータによって強く抑制される平滑筋細胞培養の増殖速度の測定等の機能アッセイは、これらのプロセス全てへの試験薬剤の総効果の尺度を供する。このようなアッセイの特異性は、TGF-ベータ(又は必要に応じてTGF-ベータ1)に対する有効な、特異性の高い中和抗体の存在又は不存在下における、平滑筋細胞の増殖速度の比較によって達成される。この方法は、様々な化合物のTGF-ベータ産生刺激因子活性の説明のために先行技術において広範囲に使用されている(例えば、Kirschenlohr et al. (1995) Cardiovasc. Res. 29:848-55又は米国特許第6,410,587号を参照されたい)。
【００７１】
方法
ウィスターラットの大動脈血管平滑筋細胞は、タモキシフェンに応答してTGF-ベータ産生を増加し (例えば、インビトロ（in vitro）における証拠に関するGrainger et al (1993) Biochem. J. 294(1):109-12、及びインビボ（in vivo）での証拠に関するGrainger et al (1998) J. Cell Sci. 111(19):2977-88を参照されたい)、中和抗TGF-ベータ1抗体での可逆的な方法に応答して増殖が遅延することがこれまで示されているので、この機能アッセイのための標的細胞型として斯かる細胞を選択した。以前記載されるとおりに正確に、単離ラット大動脈の酵素分散によって細胞を調製した(Grainger et al (1993) Biochem. J. 294(1):109-12及びその中の参考文献)。DMEM + 10%胎仔ウシ血清 (FCS)中で細胞を培養し(37℃; 5% CO2)、そして4日ごとに0.02% トリプシン/EDTA (Gibco)を使用して1:2希釈で継代した。実験を６〜２０継代で行った。
【００７２】
本実験に関して、細胞を12ウェルの培養プレート中で継代し、24時間成長させた。この時 (「0時」とする)、試験薬物を10%エタノール溶媒中で細胞に添加し、培地中の溶媒の濃度は0.1%を超えなかった。続いて細胞を72時間インキュベートした。全処理条件を３通り確立した。３通りの細胞を0時にカウントした (以下を参照)。他のウェル全てを72時間後にカウントした。
【００７３】
各ウェル中の細胞の数を次の通り測定した。血清を含まないDMEMでウェルを3回洗浄し、吸引し、続いて100μlのトリプシン/EDTA溶液(Gibco) で37℃で2分間インキュベートした。細胞単層の完全な除去を顕微鏡で確認した。斯かる懸濁液の一部における細胞密度を、改良のノイバウェル血球計算器を使用してカウントすることによって測定し、試料採取に先立ち、穏やかなピペッティングによって懸濁液を確実に均一にした。細胞密度を、１μlの細胞数と懸濁液の総体積(100μl)を掛けることによって、ウェルに存在する細胞の絶対数に換算した。各条件に関して、実験の終わりにおける細胞の平均数を、細胞数の平均値によって３通りのウェルそれぞれにおいて算出した。
【００７４】
各条件下の細胞培養の増殖の程度を、72時におけるその条件下の細胞の平均数から、0時において測定した細胞の平均数を減算することによって測定した。各条件下のTGF-ベータ1の活性の量を、抗体の不存在下で達成された成長の抑制から、中和抗TGF-ベータ1抗体(AB-101-NA; R&D Systems) の存在下で達成された成長の抑制を減算することによって測定した。
【００７５】
別の対照実験において、使用した中和抗体の量 (10μh/ml)が、100ng/mlの組換え活性TGF-ベータ1 (R&D Systems) の効果を十分に抑制することが示された。対照の抗体 (非免疫ニワトリIgY; Sigma) は、TGF-ベータ1の存在又は不存在下で細胞成長に効果を有しないことが示された。
【００７６】
この方法は、TGF-ベータ産生刺激因子の効果を測定する他の記載と同様である(例えば、Kirschenlohr et al. (1995) Cardiovasc. Res. 29:848-55; Grainger et al (1993) Biochem. J. 294(1):109-12; Grainger et al (1993) Cardiovasc. Res. 27(12):2238-47; 米国特許第6,410,587号)。
【００７７】
結果
タモキシフェンは、用量依存的方法において、TGF-ベータ活性を増大し、約7μMで最大半量の効果を有し(図2; 表1)、これは以前の発表データと一致した(Grainger et al (1993) Biochem. J. 294(1):109-12)。見かけのED50は、おそらく実験で使用したウシ胎仔血清のバッチに依存して変化する可能性が有り、また血清のバッチに依存してタモキシフェンは10μM〜66μMの濃度範囲で細胞毒性を生じる。一方、同時にタモキシフェンの異なる類似体の効果を同一実験で比較することが可能であり、これらの類似体間の効果の違いは、例えば、使用した血清の特定のバッチにおける差異等の実験の詳細な条件に起因しない (つまり、それは試験した全ての類似体に関して同一である)。クエン酸タモキシフェン及びタモキシフェン遊離塩基に関して得られた値において違いはなかった。
【００７８】
【表１】
2013512885.tif 000009
【００７９】
表 1 : モキシフェンの様々な構造類似体のTGF-ベータ産生刺激因子の活性に関するED50。
図2に示す用量反応曲線からED50を測定した。TGF-ベータ1への中和抗体の存在によって可逆的であった培養下でのTGF-ベータ産生刺激因子の活性度をラット大動脈平滑筋細胞の増殖抑制として算出した (上述の方法を参照されたい)。
【００８０】
タモキシフェンの様々な構造類似体の効果を、図2及び表1に示す。実質的に活性の低かったラロキシフェンを除いて、タモキシフェンの他の類似体で達成可能な効力又は最大効果において本質的に違いはなかった。ラロキシフェンは(本明細書で測定された)TGF-ベータ1に関する産生刺激因子として測定可能な活性を有しないが、TGF-ベータ3の産生を刺激することに留意されたい。
【００８１】
結論
これらの実験は、ドロロキシフェンがTGF-ベータ産生刺激因子として、タモキシフェン、及び一部の他の通常試験されるタモキシフェンの構造類似体に匹敵する活性を有することを示す。
【００８２】
実施例2 : インビボ（in vivo）でのクロピドグレルの代謝へのトリフェニルエチレンの同時投与の効果
P2Y12拮抗剤のチオフェンクラスの他のメンバーのように、クロピドグレルは、抗血小板活性を直接示さない。代わりに、斯かる分子は、シトクロムP450アイソザイム、主に2C9及び2C19の作用を介してインビボ（in vivo）で活性化される (Ayalasomayajula et al. (2007) J Clin Pharmacol. 47(5):613-9; Dansette et al (2009) Chem Res Toxicol. 22(2):369-73.)。酸化に続いて、チオフェン環は開環し、血小板P2Y12受容体に共有結合で反応し、不活化し、脱感作に繋がる。この機構を介したクロピドグレル活性化は、特にシトクロムP450活性のレベルに感受性があるが、これは競合エステル加水分解が斯かる分子を不活化するからである。結果として、活性代謝物の算出がある程度ゆっくりである場合、エステル加水分解に起因して活性はさらに急速に低下する。
【００８３】
結果として、例えば、遺伝子多型及び他の生体異物の同時投与等のシトクロムP450活性に影響する要因は、クロピドグレル代謝、そしてその後の生物学的効率に顕著に影響する。例えば、2C19の特定の「低代謝群（low metabolizer）」多型は同定されており(Mega et al (2009) New Engl. J. Med. 360: 354-362; Simon et al. (2009) New Engl. J. Med. 360: 363-375; Collet et al (2009). Lancet 373:309)、より通常の野生型対立遺伝子を有するそれぞれにおいて、確認されたものの３分の１のみ活性代謝物のピークレベルをもたらす。対照的に、例えば、グレープフルーツジュース等のシトクロムP450アイソザイム誘発因子の同時投与は、クロピドグレルの活性代謝物の２倍のピーク濃度となり得る。
【００８４】
一部のアイソザイムを抑制するが同時に他を誘発する、多くの薬剤がシトクロムP450系の複合効果を有するので、シトクロムP450アイソザイム調節剤の投与のクロピドグレルの主要活性代謝物の薬物動態への全体的な影響を予測することは不可能でないにしろ困難である。さらに、２つのこれらの薬物がこのように相互作用し、続いて影響が時間と共に変化しうる場合、繰り返し投与後に、最初の投与におけるシトクロムP450活性の直接的な抑制は経時的に優位となり得るので、同一又は異なるシトクロムP450アイソザイムの誘発は、関連するP450活性の全体的な上昇となり得る。
【００８５】
タモキシフェンを含むトリフェニルエチレンは、シトクロムP450アイソザイム(主に3A4) の基質と共に抑制剤として周知であり、他のアイソザイムの範囲の肝臓発現を誘発することが知られる (概要に関するDesta et al (2004) J Pharmacol Exp Ther. 310(3):1062-75を参照されたい)。結果として、おそらく相互作用が存在し、トリフェニルエチレンの同時投与は予測不可能にクロピドグレルの活性代謝物の薬物動態に影響しうる。その結果、その生物学的及び治療的特性の望まない調整を生じる。このような相互作用のリスクは十分高く、規制機関、例えば、EuropeのEMEA及びUSAのFDAによって認可されたPlavix（登録商標）(Bristol Myers Sqibbから購入したクロピドグレル重硫酸塩錠剤) の表示は、このような相互作用を警告する。この表示アドバイスを支持する理論上のリスクを除いて、これらの２つの薬剤間の相互作用は、実際は本質的に広範囲に研究されておらず、予測が困難である。
【００８６】
構造上異なるトリフェニルエチレン及びクロピドグレルの代謝間の相互作用の本質はまた、特定のシトクロムP450アイソザイムの特定分子の抑制及び誘発特性に依存し、適切であるが複雑且つ予測不可能な態様で変化するであろう。それは、実験的調査によってのみ測定することができる。
【００８７】
方法
成熟オスSprague-Dawleyラットに、0.1mg/kg〜10mg/kgの異なる用量で様々なトリフェニルエチレン(適切な用量範囲で、このような化合物はヒトにおいて使用できるであろう)、又はビヒクル単独を、10mg/kg クロピドグレルと同時に、経口経管栄養によってどちらも投与する。血液試料を内在の頸静脈カテーテルを介して、投与0.5、1、2、4、8及び24時間後に採取し、当業者に周知の従来の方法によって血清を調製する。
【００８８】
クロピドグレルの活性代謝物であるCLP*のレベルを続いて、チオールアルキル化薬ヨードアセトアミドを含有するチューブに血液試料を回収しLC-MSによって各血液試料中で測定する。ヨードアセトアミドは、CLP*と反応し、当業者に周知の標準的な方法を使用したLC-MSによって検出可能な安定した生成物を生じる。CLP*のアセトアミド付加物の標準試料を使用して、試料中のCLP*-アセトアミドのレベルを定量化する。斯かるアッセイに由来する結果は、通常CLP*のレベルを評価するために使用される抗血小板活性に関する生物検定と相関し(例えば、Pereillo et al (2002) Drug Met. Disposition 30:1288-95を参照されたい)、よって、ヨードアセトアミドによるCLP*の検出は、反応条件下で定量的に完了へと進む又はCLP*濃度に関してゼロ次であると考えられる。CLP*-アセトアミド付加物の濃度は、よって、CLP*の濃度と比例すると考えることができる。CLP*-アセトアミドの薬物動態を続いて、WinNonLinで実行される標準薬物動態モデルを使用して異なる条件下で比較する。
【００８９】
結果
ビヒクル対照と比較して、タモキシフェンの同時投与は、用量依存的方法において、10mg/kg のタモキシフェンでCLP*-アセトアミドのCmax 濃度を最大88%減少した。このようなクロピドグレル代謝の大きな抑制は、クロピドグレルの生物学的及び治療的効果に明らかに顕著且つ望まない影響を有するであろう。これは、理論上の考察に基づくPlavix（登録商標）の表示に記載される警告について、明らかな実験的証拠を供する。
【００９０】
タモキシフェンの他の類似体はまた、クロピドグレル代謝を顕著に抑制したが (表2)、いずれもタモキシフェン自体と同様の大きな効果は有しなかった。試験した５つの類似体の中で、ドロロキシフェンのみがクロピドグレル代謝に効果を有しなかった。
【００９１】
【表２】
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【００９２】
表 2 : クロピドグレルの代謝への、タモキシフェンの様々な構造類似体の効果。
クロピドグレルの活性代謝物のためのマーカーであるCLP*-アセトアミドのCmaxを示す (3種の動物の平均値)。ビヒクル対照と比較したパーセント抑制を算出し、スチューデント独立t検定の適用によってトリフェニルエチレンの併用効果の統計的有意性を測定した (同等の分散を想定した、両側)。0.05未満のP値を、クロピドグレル代謝へのトリフェニルエチレンの有意な効果を示すものとした。
【００９３】
結果
これらの実験は最終的に、大抵のトリフェニルエチレンが、異なる程度にクロピドグレルの代謝に影響することを示す。驚いたことに、ドロロキシフェンは、クロピドグレルの薬物動態に効果を有さず、よって、クロピドグレルと組み合わせた使用に関して、試験したいずれの他のタモキシフェン類似体より予想外に優れる。実際、(TGF-ベータ1の産生を刺激しないので、TGF-ベータ1産生刺激因子として使用することができない) ラロキシフェンを除いて(実施例1を参照されたい)、ドロロキシフェン以外の試験したトリフェニルエチレン化合物はいずれも、クロピドグレルと組み合わせて投与する場合、全く有効でないであろう。よって、ドロロキシフェンは、本明細書中で試験した他の全てのトリフェニルエチレン化合物より定量的にだけでなく、定性的にも優れる。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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