(57)【要約】  針のアレイと、１種または複数の流体薬剤と、少なくとも１種のハイドロゲルとを含む投与デバイスが記載されている。デバイスは、複数の流体薬剤をそれぞれの軸に沿って組織内に同時にデリバリーすることができる。ハイドロゲルの使用は、流体薬剤の制約されたデリバリーをもたらす。薬剤の制約されたデリバリーは、薬物インプラントを組織内に置くことによっても達成される。その後、組織に対する薬剤の効果を評価することができる。その上、本発明は、治療剤をｉｎ  ｖｉｖｏでデリバリーし、レポーター組織を候補薬物評価に用いて抵抗性を検出し特徴付けることによる、筋肉疾患の治療を対象とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）平行軸に沿って組織内に複数の流体薬剤をデリバリーするために配置された針のアレイと、
（ｂ）組織にデリバリーされるとハイドロゲルを欠く同一流体薬剤よりも低い程度で組織全体に分散するよう処方された１種または複数の流体薬剤、およびハイドロゲルと、
を含む投与デバイス。
【請求項２】
針のアレイに関連したアクチュエータをさらに含み、流体薬剤が、アクチュエータによって分注される、請求項１に記載の投与デバイス。
【請求項３】
アクチュエータが、プランジャを含む、請求項１に記載の投与デバイス。
【請求項４】
アクチュエータが、ポンプを含む、請求項１に記載の投与デバイス。
【請求項５】
針のアレイが、約１〜約１，０００本の針を含む、請求項１に記載の投与デバイス。
【請求項６】
針のアレイが、約２〜約１，０００本の針を含む、請求項１に記載の投与デバイス。
【請求項７】
針のアレイが、約５〜約１，０００本の針を含む、請求項１に記載の投与デバイス。
【請求項８】
流体薬剤が、少なくとも１種の指標粒子を含む、請求項１に記載の投与デバイス。
【請求項９】
指標粒子が、金属粒子、蛍光色素、量子ドット、量子バーコード、Ｘ線造影剤、磁気共鳴画像法造影剤、陽性対照および陰性対照からなる群から選択される、請求項８に記載の投与デバイス。
【請求項１０】
指標粒子が色素を含む、請求項８に記載の投与デバイス。
【請求項１１】
色素が蛍光である、請求項１０に記載の投与デバイス。
【請求項１２】
組織が動物に由来する、請求項１に記載の投与デバイス。
【請求項１３】
組織がヒトに由来する、請求項１に記載の投与デバイス。
【請求項１４】
流体薬剤が、抗がん剤、抗炎症剤、抗感染剤、再生剤、弛緩剤、アポトーシス阻害剤、アポトーシス誘導剤、抗凝血剤、外皮用剤、増殖刺激剤、血管拡張剤、血管収縮剤、鎮痛剤、抗アレルギー剤またはこれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の投与デバイス。
【請求項１５】
流体薬剤が、抗がん剤を含む、請求項１に記載の投与デバイス。
【請求項１６】
組織が、がん性である、炎症を起こしている、感染している、萎縮している、麻痺している、発作を起こしているまたは凝固している、あるいはそうであると疑われる、請求項１に記載の投与デバイス。
【請求項１７】
組織ががん性である、あるいはそうであると疑われる、請求項１に記載の投与デバイス。
【請求項１８】
組織が腫瘍である、請求項１に記載の投与デバイス。
【請求項１９】
腫瘍が、良性腫瘍および悪性腫瘍から選択される、請求項１に記載の投与デバイス。
【請求項２０】
前記ハイドロゲルが、２つの異なる分子量範囲を有する少なくとも１種のポリマーの二成分混合物を含む、請求項１に記載の投与デバイス。
【請求項２１】
前記ハイドロゲルが、乾燥状態で少なくとも２０ｇｆ／ｃｍ2の引張強さを有する、請求項１に記載の投与デバイス。
【請求項２２】
前記ハイドロゲルが、乾燥状態で２０〜１２０ｇｆ／ｃｍ2の引張強さを有する、請求項１に記載の投与デバイス。
【請求項２３】
前記ハイドロゲルが、水和状態で少なくとも５ｇｆ／ｃｍ2の引張強さを有する、請求項１に記載の投与デバイス。
【請求項２４】
前記ハイドロゲルが、水和状態で５〜１５ｇｆ／ｃｍ2の引張強さを有する、請求項１に記載の投与デバイス。
【請求項２５】
前記ハイドロゲルが、コラーゲンを含む、請求項１に記載の投与デバイス。
【請求項２６】
前記ハイドロゲルが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項１に記載の投与デバイス。
【請求項２７】
前記ＰＥＧが、少なくとも５００の分子量を有する、請求項２６に記載の投与デバイス。
【請求項２８】
前記ＰＥＧが、４，０００〜８，０００の分子量を有する、請求項２７に記載の投与デバイス。
【請求項２９】
前記ＰＥＧが、８，０００〜４５，０００の分子量を有する、請求項２７に記載の投与デバイス。
【請求項３０】
前記ハイドロゲルが、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）を含む、請求項１に記載の投与デバイス。
【請求項３１】
前記ハイドロゲルが、ポリカプロラクトンを含む、請求項１に記載の投与デバイス。
【請求項３２】
前記少なくとも１種のポリマーが、ＰＥＧを含む、請求項２０に記載の投与デバイス。
【請求項３３】
２つの異なる分子範囲が、５００〜２，０００および４，０００〜８，０００を含む、請求項２０に記載の投与デバイス。
【請求項３４】
２つの異なる分子範囲が、２，０００〜４，０００および８，０００〜２０，０００を含む、請求項２０に記載の投与デバイス。
【請求項３５】
２つの異なる分子範囲が、２，０００〜８，０００および１０，０００〜４５，０００を含む、請求項２０に記載の投与デバイス。
【請求項３６】
２つの異なる分子範囲が、４，０００〜８，０００および１０，０００〜４５，０００を含む、請求項２０に記載の投与デバイス。
【請求項３７】
流体薬剤およびハイドロゲルが、平行軸に沿って組織内にデリバリーされる、請求項１に記載の投与デバイス。
【請求項３８】
流体薬剤の拡散速度が、ハイドロゲルの孔径によって制御される、請求項１に記載の投与デバイス。
【請求項３９】
孔径が、約５０ｎｍ〜５００μｍの間の範囲である、請求項３８に記載の投与デバイス。
【請求項４０】
それぞれが前記針の各１本と流体連絡した１個または複数のリザーバをさらに含む、請求項１に記載の投与デバイス。
【請求項４１】
それぞれが前記針の各１本と流体連絡した２個以上のリザーバをさらに含む、請求項１に記載の投与デバイス。
【請求項４２】
それぞれが前記針の各１本と流体連絡した５個以上のリザーバをさらに含む、請求項１に記載の投与デバイス。
【請求項４３】
前記リザーバのいずれも、他のいかなるリザーバ内の薬剤とも同一の流体薬剤を含まない、請求項４１または４２に記載の投与デバイス。
【請求項４４】
前記リザーバのうち少なくとも２個が、同一流体薬剤を含む、請求項４１または４２に記載の投与デバイス。
【請求項４５】
異なるリザーバにおける同一流体薬剤の濃度が異なっている、請求項４４に記載の投与デバイス。
【請求項４６】
前記リザーバのうち少なくとも１個が、少なくとも２種の流体薬剤を含む、請求項４０〜４２に記載の投与デバイス。
【請求項４７】
（ａ）針を含む投与デバイスによって、ハイドロゲルを含む少なくとも１種の医薬組成物を組織内に置くステップと、
（ｂ）医薬組成物を組織内に分注するステップであって、医薬組成物が１種または複数の候補薬剤を含み、医薬組成物がハイドロゲルを欠く同一医薬組成物よりも低い程度で組織全体に分散するステップと、
を含む、動物の組織内に候補薬剤をデリバリーする方法。
【請求項４８】
（ａ）針を含む投与デバイスに、１種または複数の候補薬剤を含む１種または複数の薬物インプラントを充填するステップと、
（ｂ）前記投与デバイスを用いて、前記１種または複数の薬物インプラントを組織内に挿入するステップと、
を含む、動物の組織内に候補薬剤をデリバリーする方法。
【請求項４９】
投与デバイスが、２本以上の針を含む、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５０】
投与デバイスが、５本以上の針を含む、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５１】
投与デバイスが、アクチュエータを含む、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５２】
アクチュエータが、プランジャを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
アクチュエータが、ポンプを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
投与デバイスが、それぞれが前記針の各１本と連絡した２個以上のリザーバを含む、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５５】
投与デバイスが、それぞれが前記針の各１本と連絡した５個以上のリザーバを含む、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５６】
投与デバイスが、それぞれが前記針の各１本と連絡した１０個以上のリザーバを含む、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５７】
前記リザーバのいずれも、他のいかなるリザーバ内の薬剤とも同一の候補薬剤を含まない、請求項５４〜５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記リザーバのうち少なくとも２個が、同一候補薬剤を含む、請求項５４〜５６に記載の方法。
【請求項５９】
異なるリザーバにおける同一流体薬剤の濃度が異なっている、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記リザーバのうち少なくとも１個が、２種以上の候補薬剤を含む、請求項５４〜５６に記載の方法。
【請求項６１】
２種以上の候補薬剤を含む、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項６２】
５種以上の候補薬剤を含む、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項６３】
候補薬剤が、デリバリー軸に対して同軸の略円柱状領域に分注される、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項６４】
前記候補薬剤が、平行軸に沿って組織内に分注される、請求項６１または６２に記載の方法。
【請求項６５】
候補薬剤が、全身的に検出可能濃度で、あるいはそれを下回る濃度でデリバリーされる、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項６６】
候補薬剤が、少なくとも１種の指標粒子を含む、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項６７】
指標粒子が、金属粒子、蛍光色素、量子ドット、量子バーコード、Ｘ線造影剤、磁気共鳴画像法造影剤、陽性対照および陰性対照からなる群から選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
指標粒子が蛍光色素である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
組織内の蛍光色素を画像処理して、これにより候補薬剤の支出（ディスバースメント）をモニタリングするステップをさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
動物がヒトである、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項７１】
動物が、マウス、ラットまたはイヌである、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項７２】
前記１種または複数の候補薬剤が、抗がん剤、抗炎症剤、抗感染剤、再生剤、弛緩剤、アポトーシス阻害剤、アポトーシス誘導剤、抗凝血剤、外皮用剤、増殖刺激剤、血管拡張剤、血管収縮剤、遺伝子モジュレート剤、鎮痛剤、抗アレルギー剤、ＲＮＡｉ分子またはこれらの組み合わせを含む、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項７３】
前記１種または複数の候補薬剤が、抗がん剤を含む、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項７４】
組織ががん性である、あるいはそうであると疑われる、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項７５】
組織が腫瘍である、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項７６】
腫瘍が、良性腫瘍および悪性腫瘍から選択される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
ハイドロゲルが、コラーゲンを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項７８】
ハイドロゲルが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項７９】
ハイドロゲルが、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項８０】
ハイドロゲルが、ポリカプロラクトンを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項８１】
前記医薬組成物が、色素をさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項８２】
色素が、生物機能の活性化および非活性化の検出を可能にする、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
生物機能が、経路、酵素の活性、遺伝子の発現、薬物感受性、薬物抵抗性、遺伝子の転写、遺伝子に関連したＲＮＡ分子の翻訳またはペプチド合成である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
生物機能が、がん、変性疾患、炎症、代謝、アポトーシスまたは免疫応答に関連する、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
生物機能が、がんに関連する、請求項８２に記載の方法。
【請求項８６】
生物機能がアポトーシス経路であり、前記色素がアポトーシスを報告する、請求項８２に記載の方法。
【請求項８７】
前記検出が、蛍光の測定により行われる、請求項８２に記載の方法。
【請求項８８】
色素を画像処理して、これにより生物機能の活性化または非活性化を検出するステップをさらに含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８９】
画像処理の結果に基づき治療剤の潜在的な治療価値を予測するステップをさらに含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
生物機能の活性化または非活性化を定量化するステップをさらに含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
前記１種または複数の薬物インプラントのそれぞれが、組織内における薬物の徐放または持続放出を可能にする不活性生分解性結合剤を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項９２】
薬物インプラントが、固形の少なくとも１種の候補薬剤を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項９３】
候補薬剤が、１分間〜６週間の期間にわたり放出される、請求項４８に記載の方法。
【請求項９４】
１種または複数の薬物インプラントのそれぞれが、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１ｍｍ未満の直径を有する、請求項４８に記載の方法。
【請求項９５】
針のそれぞれが、前記薬物インプラントの１種または複数を収容するよう構成されている、請求項４８に記載の方法。
【請求項９６】
針のそれぞれが、前記薬物インプラントの２種以上を収容するよう構成されている、請求項４８に記載の方法。
【請求項９７】
針のそれぞれが、前記薬物インプラントの５種以上を収容するよう構成されている、請求項４８に記載の方法。
【請求項９８】
２種以上の薬物インプラントを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項９９】
５種以上の薬物インプラントを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項１００】
組織における前記１種または複数の候補薬剤の効果を評価するステップをさらに含む、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項１０１】
評価が、前記１種または複数の候補薬剤を導入した後に、組織の少なくとも一部分を切除するステップを含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
評価が、前記１種または複数の候補薬剤を導入した後に、組織の少なくとも一前切除部分を解析するステップを含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
前記切除または前切除ステップが、前記１種または複数の候補薬剤の導入後１日〜６週間の間に行われる、請求項１０１または１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
評価が、組織の画像処理を含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０５】
前記画像処理が、放射線画像法、磁気共鳴画像法、ポジトロン放出断層撮影法および生物フォトンイメージングを含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記画像処理が、前記１種または複数の候補薬剤の導入前、導入中または導入後に行われる、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０７】
前記評価が、変化した生理状態の検出を含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０８】
（ｉ）前記評価に基づき前記薬剤のうち少なくとも１種を選択するステップ、（ｉｉ）前記評価に基づき前記薬剤のうち少なくとも１種を除外するステップおよび（ｉｉｉ）前記評価に基づき前記薬剤のうち少なくとも２種に優先順位をつけるステップのうち一ステップをさらに含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０９】
ａ．経路のモジュレーションにより検出可能シグナルを生成するレポーター細胞を作製するステップと、
ｂ．前記レポーター細胞からレポーター組織を構築するステップと、
ｃ．針アレイデバイスを用いて前記候補薬剤を前記レポーター組織内の領域へとデリバリーすることにより、前記レポーター組織内の前記レポーター細胞における前記候補薬剤の効果を判定して、前記レポーター細胞内の前記検出可能シグナルを検出するステップと、
を含む、レポーター組織を用いて複数の候補薬剤を評価する方法。
【請求項１１０】
前記針アレイデバイスが、約２〜約１００本の針を含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記針アレイデバイスが、５〜約１０００本の針を含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１２】
前記レポーター細胞が、がん細胞である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１３】
前記レポーター組織が、異種移植された腫瘍を含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１４】
前記モジュレーションが、活性化を含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１５】
前記モジュレーションが、阻害を含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１６】
前記候補薬剤が、遺伝子治療剤、化学療法剤、小分子、抗体、タンパク質、低分子干渉ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、検出可能標識、治療タンパク質、治療細胞、サイトカイン、抗体−薬物コンジュゲート、抗体、ポリペプチド、ペプチドミメティックおよびマイクロＲＮＡからなる群から選択される薬剤を含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１７】
前記候補薬剤が、抗がん剤を含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１８】
前記候補薬剤のそれぞれが、ハイドロゲル内に存在する、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１９】
前記レポーター細胞が、ルシフェラーゼに基づく活性を示すジーントラップを含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１２０】
前記レポーター細胞が、内在性プロモーターに関連したレポーター遺伝子を含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１２１】
レポーターが、ルシフェラーゼおよびＧＦＰに基づくレポーターを含み、経路が、ＡＫＴ経路を含み、内在性プロモーターが、ホスファターゼ・テンシンホモログ遺伝子を含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１２２】
前記検出可能シグナルが、蛍光を含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１２３】
前記蛍光が、ＧＦＰ、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ｐｈｉＹＦＰ、ｃｏｐＧＦＰ、ＣＧＦＰ、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＹＰｅｔ、ＡｃＧＦＰ１、ＡｍＣｙａｎ、ＡｓＲｅｄ２、ｄｓＲｅｄ、ｄｓＲｅｄ２、ｄｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＥＢＦＰ、ＨｃＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ  Ｃｙａｎ、ｍＯｒａｎｇｅ、ＤｓＲｅｄ−モノマー、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍおよびｍＲａｓｐｂｅｒｒｙからなる群から選択される蛍光タンパク質により生成される、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記蛍光タンパク質が、ＧＦＰである、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
前記検出可能シグナルが、酵素の反応から得られる検出可能な生成物を含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１２６】
前記酵素が、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼおよびラクタマーゼからなる群から選択される、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記酵素がルシフェラーゼである、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２８】
判定が、デリバリー後に前記レポーター組織を画像処理して、前記検出可能シグナルを観察するステップを含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１２９】
画像処理する前にレポーター組織を切除するステップをさらに含む、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
画像処理する前に切除されたレポーター組織の切片を作製するステップをさらに含む、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
ステップ（ａ）のレポーター細胞株から、前記シグナル伝達経路のモジュレーションにより第二の検出可能シグナルを生成するレポーター細胞株を作製するステップをさらに含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１３２】
第一の検出可能シグナルが、シグナル伝達経路の活性化を示し、第二の検出可能シグナルが、シグナル伝達経路の阻害を示す、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
第一の検出可能シグナルが、シグナル伝達経路の阻害を示し、第二の検出可能シグナルが、シグナル伝達経路の活性化を示す、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３４】
前記候補薬剤に応答して前記第二の検出可能シグナルを以前に生成したが、現在は前記候補薬剤に応答して前記第一の検出可能シグナルを生成している細胞を単離するステップをさらに含む、請求項１３２または１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
前記候補薬剤に応答して前記検出可能シグナルを以前に生成したが、前記検出可能シグナルをもはや生成していない細胞を単離するステップをさらに含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１３６】
単離された細胞の少なくとも１種の核酸の配列を決定して、前記候補薬剤に応答した変化の遺伝的基盤を決定するステップをさらに含む、請求項１３４または１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
前記配列決定が、ハイスループットシーケンシングを含む、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
前記核酸が、ゲノムＤＮＡを含む、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３９】
前記核酸が、メッセンジャーＲＮＡを含む、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１４０】
ａ．経路のモジュレーションにより検出可能シグナルを生成するレポーター組織に、複数のがん治療を投与するステップと、
ｂ．前記複数のがん治療のうち１種または複数に応答して前記検出可能シグナルを示す前記レポーター組織内の細胞集団を単離するステップと、
ｃ．細胞集団から得られた少なくとも１種の核酸の配列を決定して、これにより、選択されたがん治療に対する抵抗性を決定するステップと、
を含む、がん治療に対する抵抗性を決定するための方法。
【請求項１４１】
ａ．経路のモジュレーションにより検出可能シグナルを生成するレポーター組織に、複数のがん治療を投与するステップと、
ｂ．前記複数のがん治療のうち１種または複数に応答して前記検出可能シグナルを示す前記レポーター組織内の細胞集団を単離するステップと、
ｃ．遺伝子のコピー数を判定して、これにより、選択されたがん治療に対する抵抗性を決定するステップと、
を含む、がん治療に対する抵抗性を決定するための方法。
【請求項１４２】
複数のがん治療の前記投与が、針アレイによる注入を含む、請求項１４０または１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
前記モジュレーションが、活性化を含む、請求項１４０または１４１に記載の方法。
【請求項１４４】
前記モジュレーションが、阻害を含む、請求項１４０または１４１に記載の方法。
【請求項１４５】
前記単離が、細胞選別を含む、請求項１４０または１４１に記載の方法。
【請求項１４６】
前記配列決定が、ハイスループットシーケンシングを含む、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４７】
前記核酸が、ゲノムＤＮＡを含む、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４８】
前記核酸が、メッセンジャーＲＮＡを含む、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４９】
対象の筋肉疾患または障害の治療のための療法の局所的デリバリー方法であって、複数の針を含む針アレイデバイスを用いて、前記対象の組織に治療剤をｉｎ  ｖｉｖｏで同時に投与するステップを含む方法。
【請求項１５０】
選択された遺伝子を対象の筋肉組織にｉｎ  ｖｉｖｏでデリバリーする方法であって、（ａ）前記選択された遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ転写および翻訳を導くことのできる制御エレメントに作動可能に連結した前記選択された遺伝子を含むウイルスベクターを含むウイルスを用意するステップと、
（ｂ）複数の針を含む針アレイデバイスを用いて、前記ウイルスを前記筋肉組織にｉｎ  ｖｉｖｏで導入するステップと、
を含む方法。
【請求項１５１】
療法が、遺伝子置換療法、マイクロＲＮＡ療法、ＲＮＡｉ療法、抗体療法およびアプタマー療法を含む、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５２】
療法が遺伝子置換療法である、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５３】
筋肉疾患または障害が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、エメリ・ドレフュス型筋ジストロフィー、筋萎縮症、Ｘ連鎖型球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、カヘキシー、栄養障害、結核、ハンセン病、糖尿病、腎疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、がん、末期腎不全、熱傷、糖尿病、うっ血性心不全、サルコペニア、肺気腫、骨軟化症または心筋症からなる群から選択される、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５４】
筋肉疾患または障害が、筋肉の消耗疾患である、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５５】
筋肉疾患または障害が、デュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５６】
筋肉疾患または障害が、サルコペニアである、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５７】
針が、筋肉内注射によるデリバリーのために構成されている、請求項１４９または１５０に記載の方法。
【請求項１５８】
遺伝子または遺伝子置換治療剤が、１本の肢の大きな筋線維の１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％超へとデリバリーされる、請求項１５２または１５０に記載の方法。
【請求項１５９】
組織が、脳、肝臓、肺、腎臓、前立腺、卵巣、脾臓、リンパ、甲状腺、膵臓、心臓、筋肉、腸、喉頭、食道または胃組織である、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１６０】
組織が筋肉組織である、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１６１】
筋肉組織が、骨格筋、平滑筋または心筋である、請求項１５０または１６０に記載の方法。
【請求項１６２】
対象が、非ヒト霊長類、マウス、イヌ、ラット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ヤギ、スナネズミ、ハムスター、モルモットまたはヒトである、請求項１４９または１５０に記載の方法。
【請求項１６３】
対象がイヌである、請求項１４９または１５０に記載の方法。
【請求項１６４】
対象がヒトである、請求項１４９または１５０に記載の方法。
【請求項１６５】
遺伝子が、ジストロフィンを含む、請求項１５０または１５２に記載の方法。
【請求項１６６】
遺伝子が、タンパク質をコードするジストロフィン・ミニ遺伝子またはジストロフィン・ミニ遺伝子の相補体を含み、タンパク質が、
（ａ）ジストロフィンタンパク質のＮ末端ドメインまたはジストロフィンタンパク質の修飾されたＮ末端ドメイン、
（ｂ）ジストロフィンタンパク質の５ロッド反復ドメイン、
（ｃ）ジストロフィン遺伝子のＨＩドメインおよびジストロフィンタンパク質のＨ４ドメインならびに
（ｄ）ジストロフィンタンパク質のシステインリッチドメイン
を含み、前記ヌクレオチド配列が、５，０００ヌクレオチド未満を有する、請求項１５０または１５２に記載の方法。
【請求項１６７】
遺伝子が、ミオスタチン阻害物質をコードする、請求項１５０または１５２に記載の方法。
【請求項１６８】
ミオスタチン阻害物質が、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、他のフォリスタチン様タンパク質、ＦＬＲＧまたはＧＡＳＰ−１である、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１６９】
遺伝子が、１種または複数の制御エレメントに作動可能に連結した、請求項１５０または１５２に記載の方法。
【請求項１７０】
前記１種または複数の制御エレメントのそれぞれが、ＡＡＶ逆位末端反復配列、レトロウイルス長末端反復配列、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ＣＭＶエンハンサー、β−アクチンプロモーター、α−アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、筋特異的クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーターおよびＭＣＫエンハンサーからなる群から選択される、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７１】
少なくとも１種の制御エレメントが、ＭＣＫプロモーターである、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７２】
遺伝子置換治療剤が、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、バキュロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、レトロウイルスまたはレンチウイルスを含む、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１７３】
遺伝子置換治療剤が、ＡＡＶを含む、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７４】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスを含む、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１７５】
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスを含む、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１７６】
前記ウイルスベクターが、組換えアデノ随伴ウイルスを含む、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１７７】
ＡＡＶが、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０およびＡＡＶ−１１からなる群から選択される、請求項１５０または１７３に記載の方法。
【請求項１７８】
ＡＡＶがＡＡＶ−６である、請求項１７７に記載の方法。
【請求項１７９】
遺伝子置換治療剤が、幹細胞を含む、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１８０】
幹細胞が、胚性幹細胞、成体幹細胞または人工多能性幹細胞である、請求項１７９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の規定の下で、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１０年１１月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／４１６，６８６号；２０１０年１１月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／４１７，１５７号；２０１１年３月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／４５４，１１５号；２０１１年５月６日に出願された米国仮特許出願第６１／４８３，４３７号；２０１１年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／４７５，８５８号；および２０１１年４月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／４７５，５９４号に基づく優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
開示されている実施形態は、全般的には、生体組織への治療剤の導入と、それに続く評価のためのデバイスおよび方法に関し、特に、ｉｎ  ｖｉｖｏでの組織への複数の薬剤の同時導入に関する。
【背景技術】
【０００３】
多数のがん関連の薬剤に対し、任意の特定の時点における前臨床および臨床試験ならびに評価がなされているが、その多くは、次のステップに進むことができない。実際のところ、がん関連治療の９０％超が、第Ｉ相または第ＩＩ相臨床試験評価で落とされると推定される。第ＩＩＩ相試験における失敗率は、ほぼ５０％であり、発見から第ＩＩＩ相試験までにかかる新薬開発の費用は、８億ドル〜１７億ドルの間であり、８〜１０年間を要する可能性がある。
【０００４】
その上、多くの対象は、有効性が示された標準薬であっても応答しない。現時点では十分に理解できないまたは容易に評価されない原因により、一部の個々の対象は、標準薬物療法に応答しない。腫瘍学の分野における重大な一課題は、候補薬物に対し細胞自律的な抵抗性を有する個々の対象に対する薬剤選択を除外して、付随する利益のない不必要な副作用のリスクを低下させることである。関連する問題は、腫瘍部位における所望の濃度を達成するために、多くの腫瘍学的薬物候補に対し過剰な全身濃度が必要とされることであり、この課題は、多くの血管新生過少（ｕｎｄｅｒ−ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ）腫瘍における薬物浸透不良により悪化する（Ｔｕｎｇｇａｌら、１９９９  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５：１５８３）。
【０００５】
さらに、活性化過剰の発がん性シグナル伝達経路は、がんの発生、進行および維持を行わせる。一部の事例において、がん細胞は、活性化過剰シグナルの薬理的阻害が腫瘍の細胞死をもたらすように、該活性化過剰シグナル依存性となり得る。この依存性は、がん細胞に、シグナル伝達の配線を変えさせ（ｒｅｗｉｒｅ）、薬物抵抗性を付与する突然変異を発達させ、最終的に、標的阻害物質の存在下で盛んに成長するよう促す。その結果、標的薬剤は、限定的な臨床有効性を示すようになる。本技術分野において、腫瘍可塑性に対抗する有効な戦略のため、単一の発がん性タンパク質ではなく全経路を標的化する必要がある。さらに、全経路解析において同定された複数の標的の検証には、複数の候補治療剤を並行してスクリーニングする能力が必要とされる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルは、組織または腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏ状況におけるシグナル伝達を再現（ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅ）できないため、相対的に迅速かつ安価なｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング方法は、臨床試験における候補薬物の高い失敗率をもたらしてきた。したがって、がんにおいて活性化されるシグナル伝達経路の様々な構成要素に対する様々な候補薬剤の有効性を効率的に判定する、ｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングモデルの必要がある。
【０００６】
最も高頻度かつ重篤な形態の筋ジストロフィーである、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）もまた、効率的な薬物スクリーニングおよびデリバリーによる恩恵を受けることができる。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、筋線維の細胞骨格を細胞外マトリクス、ジストロフィン結合糖タンパク質複合体（ＤＡＧ）に連結する多タンパク質複合体の構成要素である、ジストロフィンの欠如に起因する。ジストロフィンを欠くと、複合体は機能的に損なわれ、これにより、横紋筋、心筋および平滑筋の筋線維の変性ならびに脂肪および結合組織による筋肉の漸進的な置換が生じる。ＤＭＤの臨床経過は、重篤かつ進行性である。罹患者は、筋肉酵素の高血清レベルに基づき出生時に診断することができ、罹患者は、５歳までに筋力低下を呈し、続いて独立歩行できなくなり、最終的に１０代後半または２０代前半に呼吸不全または心筋症で死亡する。本技術分野において、筋ジストロフィーやサルコペニア等、筋肉疾患および障害を治療する必要がある。さらに、一部のそれ以外では有望な薬剤の全身投与、例えば血管内投与は非効率的であり、望まない全身性副作用をもたらす。したがって、局所的デリバリーの治療方法が有利である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本技術分野において、候補薬剤を検査およびデリバリーするためならびに個々の対象にとって有益となる可能性が増加した薬剤を同定するための改善されたデバイスおよび方法の必要性が明らかにある。本発明は、これらのおよび同様の必要性に取り組み、他の関連する利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様は、（ａ）平行軸に沿って組織内に複数の流体薬剤をデリバリーするために配置された針のアレイと、（ｂ）組織にデリバリーされるとハイドロゲルを欠く同一流体薬剤よりも低い程度で組織全体に分散するよう処方された１種または複数の流体薬剤、およびハイドロゲルとを含む投与デバイスを提供することである。特定のさらに別の実施形態において、投与デバイスは、針のアレイに関連したアクチュエータを含み、流体薬剤は、アクチュエータによって分注される。アクチュエータは、プランジャまたはポンプを含むことができる。
【０００９】
投与デバイスは、１、２、３、４、５、６、７、８、８、１０、１５、２０、３０、５０、１００本以上の針を含むことができる。特定の実施形態において、針のアレイは、約１〜約１，０００本の針を含む。特定の他の実施形態において、針のアレイは、約２〜約１，０００本の針を含む。特定の他の実施形態において、針のアレイは、約５〜約１，０００本の針を含む。
【００１０】
一部の実施形態において、流体薬剤は、少なくとも１種の指標粒子を含むことができる。一部のさらに別の実施形態において、指標粒子は、金属粒子、蛍光色素、量子ドット、量子バーコード、Ｘ線造影剤、磁気共鳴画像法造影剤、陽性対照および陰性対照からなる群から選択される。一部のさらにまた別の実施形態において、指標粒子は、色素を含む。色素は蛍光となり得る。一部の他の実施形態において、流体薬剤は、抗がん剤、抗炎症剤、抗感染剤、再生剤、弛緩剤、アポトーシス阻害剤、アポトーシス誘導剤、抗凝血剤、外皮用剤、増殖刺激剤、血管拡張剤、血管収縮剤、鎮痛剤、抗アレルギー剤またはこれらの組み合わせを含む。一部のさらに別の実施形態において、流体薬剤は、抗がん剤を含む。
【００１１】
特定の実施形態において、組織は、動物に由来する。特定の他の実施形態において、組織は、ヒトに由来する。一部の実施形態において、組織は、がん性である、炎症を起こしている、感染している、萎縮している、麻痺している、発作を起こしているまたは凝固している、あるいはそうであると疑われる。さらに別の一実施形態において、組織はがん性である、あるいはそうであると疑われる。さらにまた別の一実施形態において、組織は腫瘍である。
【００１２】
特定の実施形態は、流体薬剤のデリバリーを制御するためのハイドロゲルの使用を企図する。一部の実施形態において、前記ハイドロゲルは、コラーゲンを含む。一部の実施形態において、前記ハイドロゲルは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。ＰＥＧは、少なくとも５００の分子量を有し得る。さらに別の一実施形態において、ＰＥＧは、４，０００〜８，０００の分子量を有する。さらにまた別の一実施形態において、ＰＥＧは、８，０００〜４５，０００の分子量を有する。一部の実施形態において、前記ハイドロゲルは、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）を含む。特定の別の一実施形態において、前記ハイドロゲルは、ポリカプロラクトンを含む。ハイドロゲルは、２つの異なる分子量範囲を有する少なくとも１種のポリマーの二成分混合物を含むことができる。一部の実施形態において、ハイドロゲルはＰＥＧである。さらに別の一実施形態において、２つの異なる分子範囲は、５００〜２，０００および４，０００〜８，０００を含む。さらにまた別の一実施形態において、２つの異なる分子範囲は、４，０００〜８，０００および１０，０００〜４５，０００を含む。さらになお別の一実施形態において、２つの異なる分子範囲は、２，０００〜４，０００および８，０００〜２０，０００を含む。ハイドロゲルは、乾燥状態で少なくとも２０ｇｆ／ｃｍ2の引張強さを有し得る。さらに別の一実施形態において、ハイドロゲルは、乾燥状態で２０〜１２０ｇｆ／ｃｍ2の引張強さを有する。一部の実施形態において、ハイドロゲルは、水和状態で少なくとも５ｇｆ／ｃｍ2の引張強さを有し得る。さらに別の一実施形態において、ハイドロゲルは、水和状態で５〜１５ｇｆ／ｃｍ2の引張強さを有する。
【００１３】
一部の実施形態において、流体薬剤およびハイドロゲルは、平行軸に沿って組織内にデリバリーされる。流体薬剤の拡散速度は、ハイドロゲルの孔径によって制御され得る。一部の実施形態において、孔径は、約５０ｎｍ〜５００μｍの間の範囲である。
【００１４】
一部の実施形態において、投与デバイスは、それぞれが前記針の各１本と流体連絡した１個または複数のリザーバをさらに含む。投与デバイスは、それぞれが前記針の各１本と流体連絡した２個以上、５個以上または１０個以上のリザーバを有し得る。各リザーバは、同一または異なる流体薬剤を含むことができる。一実施形態において、前記リザーバのいずれも、他のいかなるリザーバ内の薬剤とも同一の流体薬剤を含まない。別の一実施形態において、前記リザーバのうち少なくとも２個は、同一流体薬剤を含む。さらに別の一実施形態において、異なるリザーバにおける同一流体薬剤の濃度は異なっている。さらになお別の一実施形態において、前記リザーバのうち少なくとも１個は、少なくとも２種の流体薬剤を含む。
【００１５】
針は、多孔性の針となり得る。一部の実施形態において、前記１本または複数の針のうち少なくとも１本は、その全長にわたって複数のポートを含む。さらに別の一実施形態において、複数のポートの分布密度は、針の先端から個々のポートまでの距離に反比例する。さらにまた別の一実施形態において、複数のポートそれぞれのサイズは、針の先端から個々のポートまでの距離に反比例する。一方、針は、流体薬剤に対し透過性でなくてもよい。針は、多孔性材料で作製されていなくても、その全長にわたって孔を持たなくてもよい。一部の実施形態において、投与デバイスは、１本または複数の多孔性チューブをさらに含むことができる。多孔性チューブは、流体薬剤およびハイドロゲルを含むことができる。多孔性チューブの孔径は、流体薬剤の拡散速度を制御することができる。
【００１６】
本発明の別の一態様は、（ａ）針を含む投与デバイスによって、ハイドロゲルを含む少なくとも１種の医薬組成物を組織内に置くステップと、（ｂ）医薬組成物を組織内に分注するステップであって、医薬組成物が１種または複数の候補薬剤を含み、医薬組成物がハイドロゲルを欠く同一医薬組成物よりも低い程度で組織全体に分散するステップとを含む、動物の組織内に候補薬剤をデリバリーする方法を提供することである。本発明のさらに別の一態様は、（ａ）針を含む投与デバイスに、１種または複数の候補薬剤を含む１種または複数の薬物インプラントを充填するステップと、（ｂ）前記投与デバイスを用いて、前記１種または複数の薬物インプラントを組織内に挿入するステップとを含む、動物の組織内に候補薬剤をデリバリーする方法を提供することである。投与デバイスは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００本以上の針を含むことができる。特定のさらに別の実施形態において、投与デバイスは、アクチュエータを含む。アクチュエータは、プランジャまたはポンプとなり得る。投与デバイスは、少なくとも１個のリザーバを含むことができる。一部の実施形態において、投与デバイスは、それぞれが前記針の各１本と連絡した２個以上のリザーバを含む。他の実施形態において、投与デバイスは、それぞれが前記針の各１本と連絡した５個以上のリザーバを含む。さらに他の実施形態において、投与デバイスは、それぞれが前記針の各１本と連絡した１０個以上のリザーバを含む。各リザーバ内の候補薬剤は、同一であっても、異なっていてもよい。一部の実施形態において、前記リザーバのいずれも、他のいかなるリザーバ内の薬剤とも同一の候補薬剤を含まない。一部の他の実施形態において、前記リザーバのうち少なくとも２個は、同一候補薬剤を含む。さらに別の一実施形態において、異なるリザーバにおける同一流体薬剤の濃度は異なっている。さらに他の一部の実施形態において、前記リザーバのうち少なくとも１個は、２種以上の候補薬剤を含む。組織内に挿入された候補薬剤の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、５０、１００個以上となり得る。一部の実施形態において、候補薬剤は、デリバリー軸に対して同軸の略円柱状領域に分注される。一部の他の実施形態において、候補薬剤は、平行軸に沿って組織内に分注される。一部の他の実施形態において、候補薬剤は、全身的（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙ）検出可能濃度で、あるいはそれを下回る濃度でデリバリーされる。動物は、ヒト、マウス、ラットまたはイヌとなり得る。
【００１７】
特定の実施形態は、指標粒子の使用を企図する。一部の実施形態において、候補薬剤は、少なくとも１種の指標粒子を含む。一部のさらに別の実施形態において、指標粒子は、金属粒子、蛍光色素、量子ドット、量子バーコード、Ｘ線造影剤、磁気共鳴画像法造影剤、陽性対照および陰性対照からなる群から選択される。さらにまた別の一実施形態において、指標粒子は蛍光色素である。さらにまた別の一実施形態において、組織内の蛍光色素を画像処理して、これにより候補薬剤の支出をモニタリングすることができる。様々な実施形態において、候補薬剤は、抗がん剤、抗炎症剤、抗感染剤、再生剤、弛緩剤、アポトーシス阻害剤、アポトーシス誘導剤、抗凝血剤、外皮用剤、増殖刺激剤、血管拡張剤、血管収縮剤、鎮痛剤、抗アレルギー剤、遺伝子モジュレート剤、ＲＮＡｉ分子またはこれらの組み合わせを含むことができる。さらに別の一実施形態において、候補薬剤は、抗がん剤を含む。組織は、ヒトまたはマウスに由来し得る。一部の実施形態において、組織はがん性である、あるいはそうであると疑われる。さらに別の一実施形態において、組織は腫瘍である。さらにまた別の一実施形態において、腫瘍は、良性腫瘍および悪性腫瘍から選択される。
【００１８】
特定の実施形態は、候補薬剤のデリバリーを制御するためのハイドロゲルの使用を企図する。一部の実施形態において、前記ハイドロゲルは、コラーゲンを含む。一部の実施形態において、前記ハイドロゲルは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。ＰＥＧは、少なくとも５００の分子量を有し得る。さらに別の一実施形態において、ＰＥＧは、４，０００〜８，０００の分子量を有する。さらにまた別の一実施形態において、ＰＥＧは、８，０００〜４５，０００の分子量を有する。一部の実施形態において、前記ハイドロゲルは、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）を含む。一部の別の実施形態において、前記ハイドロゲルは、ポリカプロラクトンを含む。一部の実施形態において、１種または複数の候補薬剤およびハイドロゲルは、多孔性チューブに充填され、続いて組織内に挿入される。一部の実施形態において、針は、多孔性の針を含む。他の実施形態において、針は、医薬組成物および候補薬剤に対し透過性ではない。ハイドロゲルは、２つの異なる分子量範囲を有する少なくとも１種のポリマーの二成分混合物を含むことができる。一部の実施形態において、ハイドロゲルはＰＥＧである。さらに別の一実施形態において、２つの異なる分子範囲は、５００〜２，０００および４，０００〜８，０００を含む。さらにまた別の一実施形態において、２つの異なる分子範囲は、２，０００〜４，０００および８，０００〜２０，０００を含む。さらになお別の一実施形態において、２つの異なる分子範囲は、４，０００〜８，０００および１０，０００〜４５，０００を含む。ハイドロゲルは、乾燥状態で少なくとも２０ｇｆ／ｃｍ2の引張強さを有し得る。さらに別の一実施形態において、ハイドロゲルは、乾燥状態で２０〜１２０ｇｆ／ｃｍ2の引張強さを有する。一部の実施形態において、ハイドロゲルは、水和状態で少なくとも５ｇｆ／ｃｍ2の引張強さを有し得る。さらに別の一実施形態において、ハイドロゲルは、水和状態で５〜１５ｇｆ／ｃｍ2の引張強さを有する。
【００１９】
一部の実施形態において、流体薬剤およびハイドロゲルは、平行軸に沿って組織内にデリバリーされる。流体薬剤の拡散速度は、ハイドロゲルの孔径によって制御され得る。一部の実施形態において、孔径は、約５０ｎｍ〜５００μｍの間の範囲である。
【００２０】
特定のさらに別の実施形態は、生物機能の活性化および非活性化の検出のための色素の使用を企図する。一実施形態において、医薬組成物は、色素を含む。色素は、生物機能の活性化および非活性化の検出を可能にする。生物機能は、経路、酵素の活性、遺伝子の発現、薬物感受性、薬物抵抗性、遺伝子の転写、遺伝子に関連したＲＮＡ分子の翻訳またはペプチド合成である。一部の実施形態において、生物機能は、がん、変性疾患、炎症、代謝、アポトーシスまたは免疫応答に関連する。さらに別の一実施形態において、生物機能は、がんに関連する。さらにまた別の一実施形態において、生物機能はアポトーシス経路であり、前記色素はアポトーシスを報告する。検出は、蛍光の測定により行うことができる。一部の実施形態において、色素を画像処理して、これにより生物機能の活性化または非活性化の検出を行うことができる。さらに別の一実施形態において、治療剤の潜在的な治療価値は、画像処理の結果に基づいて予測することができる。別の一実施形態において、生物機能の活性化または非活性化は、画像処理に基づいて定量化することができる。
【００２１】
一部の実施形態において、薬物インプラントは、組織内における薬物の徐放または持続放出を可能にする不活性生分解性結合剤を含む。薬物インプラントは、固形の少なくとも１種の候補薬剤を含む。一部の実施形態において、候補薬剤は、１分間〜６週間の期間にわたり放出される。１種または複数の薬物インプラントのそれぞれは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１ｍｍ未満の直径を有し得る。針のそれぞれは、前記薬物インプラントの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０種以上を収容するよう構成されてよい。２、３、４、５、６、７、８、９、１０種以上等、複数の薬物インプラントが組織内に挿入され得る。
【００２２】
特定の実施形態は、組織に対する前記１種または複数の候補薬剤の効果の評価を企図する。特定の実施形態は、（ｉ）前記評価に基づき前記薬剤のうち少なくとも１種を選択するステップ、（ｉｉ）前記評価に基づき前記薬剤のうち少なくとも１種を除外するステップおよび（ｉｉｉ）前記評価に基づき前記薬剤のうち少なくとも２種に優先順位をつけるステップのうち一ステップをさらに含む。一部の実施形態において、組織に対する１種または複数の流体薬剤の効果は、１種または複数の候補薬剤が組織に前デリバリー（ｐｒｅ−ｄｅｌｉｖｅｒ）された方法において評価することができる。一部の実施形態において、評価は、前記１種または複数の候補薬剤を導入した後に、組織の少なくとも一前切除部分を解析するステップを含む。特定の他の実施形態において、評価は、前記１種または複数の候補薬剤を導入した後に、組織の少なくとも一前切除部分を解析するステップを含む。特定のさらに別の実施形態において、切除または前切除ステップは、前記１種または複数の候補薬剤の導入後１日〜６週間の間に行うことができる。一部の実施形態において、評価は、組織の画像処理を含む。画像処理は、放射線画像法、磁気共鳴画像法、ポジトロン放出断層撮影法および生物フォトンイメージングを含む。特定の実施形態において、画像処理は、前記１種または複数の候補薬剤の導入前、導入中または導入後に行われる。特定の実施形態において、評価は、変化した生理状態の検出を含む。
【００２３】
本発明は、その一態様において、ａ）経路のモジュレーションにより検出可能シグナルを生成するレポーター細胞株を作製するステップと、ｂ）前記レポーター細胞株からレポーター組織を構築するステップと、ｃ）針アレイを用いて前記複数の候補薬剤を前記レポーター組織にデリバリーすることにより、前記レポーター組織に対する複数の候補薬剤の有効性を判定して、前記検出可能シグナルを検出するステップとを含む、レポーター組織を用いて候補薬剤をスクリーニングするための方法を提供する。一部の実施形態において、レポーター組織は、異種移植された腫瘍を含む。モジュレーションは、活性化を含んでも、阻害を含んでもよい。一部の実施形態において、複数の候補薬剤のそれぞれは、遺伝子治療剤、化学療法剤、小分子、抗体、タンパク質、低分子干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、検出可能標識、治療タンパク質、治療細胞、サイトカイン、抗体−薬物コンジュゲート、抗体、ポリペプチドおよびペプチドミメティックからなる群から選択される薬剤を含む。一部のさらに別の実施形態において、候補薬剤は、抗がん剤を含む。複数の候補薬剤のそれぞれは、ハイドロゲル内に存在し得る。レポーター細胞株は、ルシフェラーゼに基づく活性を示すジーントラップを含むことができる。その上、レポーター細胞株は、内在性プロモーターに関連したレポーター遺伝子を含むことができる。検出可能シグナルは、蛍光を含むことができる。一部の実施形態において、蛍光は、ＧＦＰ、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ｐｈｉＹＦＰ、ｃｏｐＧＦＰ、ＣＧＦＰ、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＹＰｅｔ、ＡｃＧＦＰ１、ＡｍＣｙａｎ、ＡｓＲｅｄ２、ｄｓＲｅｄ、ｄｓＲｅｄ２、ｄｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＥＢＦＰ、ＨｃＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ  Ｃｙａｎ、ｍＯｒａｎｇｅ、ＤｓＲｅｄ−モノマー、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍおよびｍＲａｓｐｂｅｒｒｙからなる群から選択される蛍光タンパク質により生成される。さらに別の一実施形態において、前記蛍光タンパク質は、ＧＦＰである。その上、検出可能シグナルは、酵素の反応から得られる検出可能な生成物を含むことができる。一部の他の実施形態において、酵素は、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼおよびラクタマーゼからなる群から選択される。さらに別の一実施形態において、酵素はルシフェラーゼである。一部の実施形態において、判定は、注入後に前記レポーター組織を画像処理して、前記検出可能シグナルを観察するステップを含む。一部の実施形態において、方法は、画像処理する前にレポーター組織を切除し、必要に応じて切片を作製するステップをさらに含む。一部の他の実施形態において、方法は、画像処理する前にレポーター組織を前切除し、必要に応じて切片を作製するステップをさらに含む。
【００２４】
本発明は、別の一態様において、ａ）シグナル伝達経路のモジュレーションにより検出可能シグナルを生成するレポーター細胞株に由来する固形組織を得るステップと、ｂ）前記固形組織に複数の治療剤をデリバリーするステップと、ｃ）前記検出可能シグナルを検出して、前記治療剤の１種または複数に対する応答を決定するステップとを含む、固形組織内における薬剤に対する応答を決定する方法を提供する。一部の実施形態において、方法は、ステップ（ａ）のレポーター細胞株から、前記シグナル伝達経路のモジュレーションにより第二の検出可能シグナルを生成するレポーター細胞株を作製するステップをさらに含む。第一の検出可能シグナルは、シグナル伝達経路の活性化を示すことができ、第二の検出可能シグナルは、シグナル伝達経路の阻害を示すことができる。一部の実施形態において、方法は、前記１種または複数の治療剤に応答して前記第二の検出可能シグナルを以前に生成したが、現在は前記１種または複数の治療剤に応答して前記第一の検出可能シグナルを生成している細胞を単離するステップをさらに含む。一部の実施形態において、方法は、前記１種または複数の治療剤に応答して前記検出可能シグナルを以前に生成したが、前記検出可能シグナルをもはや生成していない細胞を単離するステップをさらに含む。一部の実施形態において、方法は、前記単離された細胞から得られた少なくとも１種の核酸の配列を決定して、前記治療剤の１種または複数に応答した変化の遺伝的基盤を決定するステップをさらに含む。少なくとも１種の核酸は、ゲノムＤＮＡであってもメッセンジャーＲＮＡであってもよい。モジュレーションは、活性化または阻害を含むことができる。得るステップは、腫瘍または異種移植された腫瘍を含み得る固形組織の遺伝子操作を含むことができる。検出可能シグナルは、発色団、フルオロフォア、蛍光タンパク質、リン光色素、タンデム（ｔａｎｄｅｍ）色素、粒子、ハプテン、放射性同位元素およびルシフェラーゼ等の酵素の化学発光基質からなる群から選択される分子を含むことができる。
【００２５】
本発明は、また別の一態様において、ａ）経路のモジュレーションにより検出可能シグナルを生成するレポーター細胞株に由来するレポーター組織に薬物をデリバリーするステップと、ｂ）前記薬物に応答して前記検出可能シグナルを示す前記レポーター組織内の細胞集団を単離するステップと、ｃ）前記細胞集団の少なくとも１種の核酸の配列を決定して、薬物応答の遺伝的基盤を決定するステップとを含む、薬物に対するｉｎ  ｖｉｖｏ応答の遺伝的基盤を決定するための方法を提供する。配列決定は、ハイスループットシーケンシングを含むことができる。方法は、全ゲノム増幅のステップまたは薬物に応答して検出可能シグナルを示さなかった細胞集団から得られたゲノムＤＮＡのサブトラクティブハイブリダイゼーションのステップをさらに含むことができる。
【００２６】
本発明は、また別の一態様において、ａ）経路のモジュレーションにより検出可能シグナルを生成するレポーター組織に、複数のがん治療を投与するステップと、ｂ）前記複数のがん治療のうち１種または複数に応答して前記検出可能シグナルを示す前記レポーター組織内の細胞集団を単離するステップと、ｃ）細胞集団から得られた少なくとも１種の核酸の配列を決定して、これにより、選択されたがん治療に対する抵抗性を決定するステップとを含む、がん治療に対する抵抗性を決定するための方法を提供する。投与は、針アレイによる注入を含むことができる。モジュレーションは、活性化または阻害を含むことができる。単離は、細胞選別を含むことができる。配列決定は、ハイスループットシーケンシングを含むことができる。
【００２７】
本発明は、さらに別の一態様において、ａ）活性シグナル伝達経路を含む細胞株を得るステップと、ｂ）ジーントラップベクターを用いて前記細胞株のゲノム内の複数の位置にレポーターをランダムに組み込むステップと、ｃ）前記シグナル伝達経路の阻害剤に応答してレポーターを発現する細胞集団を単離するステップと、ｄ）選択された細胞からレポーター細胞株を作製するステップとを含む、レポーター細胞株を作製する方法を提供する。方法は、ステップｃの後に、前記シグナル伝達経路の第二の阻害剤に応答してレポーターを追加的に発現する細胞を単離するための選択の第二ラウンドを行うステップをさらに含むことができる。方法は、ステップｂの後に、レポーターを構成的に発現する細胞を除去するステップをさらに含むことができる。一部の実施形態において、細胞株は、がん細胞株である。一部の実施形態において、シグナル伝達経路は、Ａｋｔ経路、ＰＩ３Ｋ経路、ＭＥＫ経路、ｍＴＯＲ経路、ＥＧＦ経路またはＲａｓ経路からなる群から選択される。一部の実施形態において、阻害剤は、ゲフィチニブ、ＭＫ−２２０６およびＰＤ３２５９０１からなる群から選択される。レポーターは、ルシフェラーゼに基づくレポーターとなり得る。
【００２８】
本発明は、別の一態様において、ａ）経路のモジュレーションにより検出可能シグナルを生成するレポーター組織に複数のがん治療を投与するステップと、ｂ）前記複数のがん治療のうち１種または複数に応答して前記検出可能シグナルを示す前記レポーター組織内の細胞集団を単離するステップと、ｃ）遺伝子のコピー数を判定して、これにより、選択されたがん治療に対する抵抗性を決定するステップとを含む、がん治療に対する抵抗性を決定するための方法を提供する。
【００２９】
別の一態様において、本開示は、筋肉疾患の治療に関与する。一実施形態において、対象の筋肉疾患または障害の治療のための療法の局所的デリバリー方法であって、複数の針を含む針アレイデバイスを用いて、前記対象の組織に治療剤をｉｎ  ｖｉｖｏで同時に投与するステップを含む方法が提供される。療法は、遺伝子置換療法、マイクロＲＮＡ療法、ＲＮＡｉ療法、抗体療法およびアプタマー療法を含むことができる。筋肉疾患または障害は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、エメリ・ドレフュス型筋ジストロフィー、筋萎縮症、Ｘ連鎖型球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、カヘキシー、栄養障害、結核、ハンセン病、糖尿病、腎疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、がん、末期腎不全、熱傷、糖尿病、うっ血性心不全、サルコペニア、肺気腫、骨軟化症または心筋症からなる群から選択され得る。針は、多孔性の針または薬剤に対し不透過性の針を含むことができる。一部の実施形態において、針は、筋肉内注射によるデリバリーのために構成される。一部の実施形態において、遺伝子または遺伝子置換治療剤は、１本の肢の大きな筋線維の１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％超へとデリバリーされる。組織は、脳、肝臓、肺、腎臓、前立腺、卵巣、脾臓、リンパ、甲状腺、膵臓、心臓、筋肉、腸、喉頭、食道または胃組織となり得る。さらに別の一実施形態において、筋肉は、骨格筋、平滑筋または心筋である。一部の実施形態において、遺伝子置換治療剤は、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、バキュロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、レトロウイルスまたはレンチウイルスを含む。
【００３０】
別の一態様において、選択された遺伝子を対象の筋肉組織にｉｎ  ｖｉｖｏでデリバリーする方法であって、（ａ）前記選択された遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ転写および翻訳を導くことのできる制御エレメントに作動可能に連結した前記選択された遺伝子を含むウイルスベクターを含むウイルスを用意するステップと、（ｂ）複数の針を含む針アレイデバイスを用いて、前記ウイルスを前記筋肉組織にｉｎ  ｖｉｖｏで導入するステップとを含む方法が提供される。一部の実施形態において、対象は、非ヒト霊長類、マウス、イヌ、ラット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ヤギ、スナネズミ、ハムスター、モルモットまたはヒトとなり得る。特定の実施形態において、遺伝子は、ジストロフィンを含むことができる。特定のさらに別の実施形態において、遺伝子は、タンパク質をコードするジストロフィン・ミニ遺伝子またはジストロフィン・ミニ遺伝子の相補体を含むことができ、タンパク質は、（ａ）ジストロフィンタンパク質のＮ末端ドメインまたはジストロフィンタンパク質の修飾されたＮ末端ドメイン、（ｂ）ジストロフィンタンパク質の５ロッド反復ドメイン、（ｃ）ジストロフィン遺伝子のＨＩドメインおよびジストロフィンタンパク質のＨ４ドメインならびに（ｄ）ジストロフィンタンパク質のシステインリッチドメインを含み、前記ヌクレオチド配列は、５，０００ヌクレオチド未満を有する。一部の実施形態において、ミオスタチン阻害物質をコードする。一部のさらに別の実施形態において、ミオスタチン阻害物質は、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、他のフォリスタチン様タンパク質、ＦＬＲＧまたはＧＡＳＰ−１である。一部の実施形態において、遺伝子は、１種または複数の制御エレメントに作動可能に連結している。一部のさらに別の実施形態において、前記１種または複数の制御エレメントのそれぞれは、ＡＡＶ逆位末端反復配列、レトロウイルス長末端反復配列、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ＣＭＶエンハンサー、β−アクチンプロモーター、α−アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、筋特異的クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーターおよびＭＣＫエンハンサーからなる群から選択される。一部の実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０およびＡＡＶ−１１からなる群から選択される。さらに別の一実施形態において、ＡＡＶはＡＡＶ−６である。一部の実施形態において、遺伝子置換治療剤は、幹細胞を含む。さらに別の一実施形態において、幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞または人工多能性幹細胞である。一部の実施形態において、針は、少なくとも１本の多孔性の針を含む。一部の実施形態において、針は、少なくとも２本の多孔性の針を含むことができる。
参照による組み込み
【００３１】
本明細書において言及されているあらゆる刊行物、特許および特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許または特許出願それぞれが、特におよび個々に、参照により本明細書に組み込まれることが示されていたのと同じ程度まで、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３２】
本発明の新規特質は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特質および有利点のより良い理解は、本発明の本質が利用されている例示的実施形態を記載する続く詳細な記載およびそれに付随する図を参照することによって得られる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】動物において腫瘍に候補薬剤を投与する方法を例示する図である。
【図２】種々の実施形態による治療剤を生物組織に注射するための針アレイアセンブリの模式図である。
【図３】一実施形態によるデリバリーアセンブリの図表である。
【図４】一実施形態による針アレイの図である。
【図５】別の実施形態によるデリバリーアセンブリのエレメントを示す図である。
【図６】本発明の本質を例示する腫瘍の一部分を示す図である。
【図７】一実施形態によるデータ処理システムの図である。
【図８】多孔質針によってドキソルビシンを投与されたリンパ腫瘍の薄片を例示する図である。
【図９】複数の腫瘍深度で死滅させた空間的に限定された細胞の顕微鏡観察を例示する図である。
【図１０】腫瘍への蛍光色素の４種の異なる量での空間的に限定された注射の蛍光顕微鏡観察を例示する図である。
【図１１】ヒト髄芽細胞腫試料におけるヘッジホッグ経路拮抗作用へのｅｘ  ｖｉｖｏ応答を例示するグラフである。
【図１２】空間的に限定された注射に続く腫瘍死滅を例示する図である。
【図１３】ビヒクルまたはＳｈｈアンタゴニストを注射されたマウスの生存を例示するグラフである。
【図１４】ドキソルビシンおよび対照を注射されたマウス腫瘍の蛍光画像を例示する図である。
【図１５】腫瘍における空間的に限定されたレンチウイルス発現を例示する図である。
【図１６】腫瘍へのＫＩＦ１１  ｓｈＲＮＡ注射を例示する図である。
【図１７】腫瘍へのｓｈＲＮＡ注射への応答における細胞死を例示する図である。
【図１８】候補治療剤の有効性を評価するためにレポーター細胞株を用いる方法の計画を例示する図である。
【図１９】治療への抵抗性の遺伝的根拠を決定するためにレポーター細胞株を用いる方法の計画を例示する図である。
【図２０】レポーター細胞株を生成するための選択戦略を例示する図である。
【図２１】本開示の多孔質針アレイを示す図である。
【図２２】色素、薬剤およびレンチウイルスの局所的デリバリーを示す図である。
【図２３】多孔質針アレイを用いて化合物をスクリーニングするためのプーリング戦略を示す図である。
【図２４】ＧＳＫ３阻害物質の多孔質針介在注射が腫瘍においてｂ−カテニン駆動ルシフェラーゼ活性を誘導することを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
総括
本発明は、固形組織への流体薬剤の空間的に制約されたデリバリーのためのデバイスおよび方法を提供する。本開示は、孔径等のパラメータを変動させることによりデリバリーを制御する、ハイドロゲルの孔を通した拡散により流体薬剤をデリバリーするための針アレイと併せたハイドロゲルの使用を特色とする。デリバリーの局在化および速度等、デリバリーパラメータの制御は、治療および診断適用において多くの利点をもたらす。
【００３５】
一部の好ましい実施形態において、それぞれ別個の流体薬剤を含有する複数の組成物の組織内への平行軸に沿った制御された挿入を行うことができる、プランジャまたはポンプ等、アクチュエータモジュールに連結された正確に配置されたデリバリー針のアレイの使用により、ハイドロゲルおよび１種または複数の流体薬剤を含む組成物は、平行軸に沿って固形組織内に挿入される。一部の事例において、ハイドロゲルマトリクスにおける孔を通した拡散による受動デリバリーは、挿入後に起こる。
【００３６】
一部の実施形態において、投与デバイスは、それぞれが前記針の各１本と流体連絡した１個または複数のリザーバをさらに含む。投与デバイスは、それぞれが前記針の各１本と流体連絡した２個以上、５個以上または１０個以上のリザーバを有し得る。各リザーバは、同一または異なる流体薬剤を含むことができる。一実施形態において、前記リザーバのいずれも、他のいかなるリザーバ内の薬剤とも同一の流体薬剤を含まない。別の一実施形態において、前記リザーバのうち少なくとも２個は、同一流体薬剤を含む。さらに別の一実施形態において、異なるリザーバにおける同一流体薬剤の濃度は異なっている。さらになお別の一実施形態において、前記リザーバのうち少なくとも１個は、少なくとも２種の流体薬剤を含む。
【００３７】
一部の好ましい実施形態において、１種または複数のハイドロゲル組成物は、針等、デリバリーデバイスの使用により、生物の標的組織に挿入される。一部の事例において、１、２、３、４、５、６、１０、２０、５０、１００または１，０００本を超える針は、針が組織内の複数の平行領域に複数の組成物をデリバリーするように配列される。挿入されると、２種以上のハイドロゲルは、針のサイズ、形状および構成によって決定される平行な円柱として組織に存在することができる。一部の好ましい事例において、このようなチューブからの固体デリバリーは、孔径および拡散速度により組織内の円柱へと制約される。一部の好ましい実施形態において、デリバリーは、多孔性の針の孔を通して行われる。１本または複数の多孔性の針は、平行デリバリーのためのアレイとして構成され得る。一部の他の好ましい実施形態において、ハイドロゲルありまたはなしの流体薬剤は、多孔性チューブに充填され、続いて組織内に挿入される。流体薬剤のデリバリーは、多孔性チューブの孔径により制御される。
【００３８】
空間的制限は、組織における複数の候補治療剤の平行スクリーニングを可能にし、組織における軸を通じた候補治療剤それぞれの導入により、組織の不均質を制御する。特定の実施形態において、組織の選択された領域は、対象における固形組織の一部分であり、特定のさらに別の実施形態において、対象は、前臨床モデルまたはヒト対象の１種である。特定の他の実施形態において、方法は、導入後の組織の少なくとも一部分を切除するステップを含む。特定の他の実施形態において、方法は、導入後の組織の少なくとも一部分を前切除するステップを含む。特定のさらに別の実施形態は、切除前の組織の画像処理、切除と同時発生的な組織の画像処理および切除後の組織の画像処理のうち少なくとも１つを含む。特定の他の実施形態において、切除は、１種または複数の流体薬剤の導入後の選択された期間である、ある時点における組織の少なくとも一部分の切除を含む。選択された期間は、約２〜９６時間の間の範囲となり得る。特定の実施形態において、選択された期間は、１週間を超える期間である。切除後、複数の候補薬剤の空間的に制約されたデリバリーは、薬剤の相対有効性のｅｘ  ｖｉｖｏ解析を可能とし得る。
【００３９】
本明細書に開示されている一部の実施形態は、液相の薬剤の固形組織への制約されたデリバリーのための方法に関する。このような選択的デリバリーは、所望の固形組織における治療上有効濃度を達成するための治療または候補薬剤の過剰な全身濃度の必要をなくし、これにより、無関係の組織に対する臨床上有害な毒性を回避し、望ましくない副作用も回避する。流体薬剤を全身的検出可能濃度で、あるいはそれを下回る濃度でデリバリーして、望ましい効果を達成することができる。
【００４０】
一部の実施形態において、本方法は、複数の候補治療剤が腫瘍の平行軸に沿ってデリバリーされる、がん薬剤の検査およびデリバリーを対象とする。このような方法は、候補腫瘍薬の効率的な前臨床および臨床試験を可能にし、個々の対象に有益となる可能性が高い治療の同定を容易にする。本開示は、がん治療の評価において有用な方法を提供し、罹患細胞が抵抗性となり得る候補薬物のスクリーニングプログラムまたは治療レジメンからの早期排除を可能にする。
【００４１】
一部の実施形態において、腫瘍における１種または複数の候補薬剤の効果は、１種または複数の流体薬剤が腫瘍に前デリバリーされた方法において評価することができる。一部の実施形態において、評価は、前記１種または複数の候補薬剤を導入した後の組織の少なくとも一前切除部分の解析を含む。特定の他の実施形態において、評価は、前記１種または複数の候補薬剤を導入した後に腫瘍の少なくとも一部分を前切除するステップを含む。特定のさらに別の実施形態において、切除または前切除ステップは、前記１種または複数の候補薬剤の導入後１日〜６週間の間に行うことができる。一部の実施形態において、評価は、腫瘍の画像処理を含む。画像処理は、放射線画像法、磁気共鳴画像法、ポジトロン放出断層撮影法および生物フォトンイメージングを含む。特定の実施形態において、画像処理は、前記１種または複数の候補薬剤の導入前、導入中または導入後に行われる。特定の実施形態において、評価は、変化した生理状態の検出を含む。さらに、本開示は、生きた生物における固形組織の微小環境を的確に再現しないｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に優る利点をもたらす、候補薬剤のｉｎ  ｖｉｖｏでのスクリーニングを提供する。
【００４２】
本開示は、生体腫瘍において薬物の多重化学療法薬有効性試験を行う方法に関する。
【００４３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルは、無処置のがんの動物モデルまたは患者において増殖した腫瘍と同じ仕方で薬物に応答しないため、本開示の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養モデルのスクリーニングに優る利点を有する。したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルに基づいた、臨床に進むためまたは患者におけるがんの治療介入のための薬物の開発を探求する決断には問題がある。対照的に、本開示は、生体ヒト腫瘍との関係で、あるいはがんの動物モデルとの関係で、複数の潜在的な抗がん剤を同時に検査するための方法を提供する。
【００４４】
一部の実施形態において、抗がん剤または被験薬剤を含む個々に調製された薬物インプラントは、薬物スティックの腫瘍内への平行挿入を可能にする導入針の整列した頭部を用いて固形組織内に分布される。注入デバイスは、導入針を通して腫瘍内に薬物インプラントを挿入させることができる。薬物インプラントは、固体ロッドまたはスティックを含むことができ、好ましくは、固形の薬剤を含むことができる。一部の事例において、薬物インプラントは、組織内における薬物の徐放または持続放出を可能にする不活性生分解性結合剤を含む。
【００４５】
一部の実施形態において、薬物インプラントは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１ｍｍ未満の直径を有する。針アレイ頭部は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、２００、３００、４００種または１，０００種を超える薬物インプラントを収容するよう構成され得る。複数の薬物インプラントを束ねて、針を用いた注入に適した直径を有する薬物インプラントの束を形成することができる。
【００４６】
一部の実施形態において、注入デバイスは、針を通して固形組織内に１種または複数の薬物インプラントを押し込むよう構成されたプランジャを含む。一部の実施形態において、固形組織は腫瘍を含む。
【００４７】
腫瘍への挿入後、薬剤は、１分間〜６週間の期間にわたり１種または複数の薬物インプラントから放出されて、腫瘍の別々の部分を、空間的に限局された様式で各薬物に個々に曝露させることができる。
【００４８】
薬物は、本開示の方法により平行軸に沿って腫瘍の深部またはｚ軸へと挿入されるため、薬物スティックの挿入路の横方向に（それに対し垂直または直交して）腫瘍の切片を作製することにより、各挿入薬物近位の領域における腫瘍応答の解析を可能にし、これにより生体腫瘍との関係における薬物有効性の多重解析を可能にする。
【００４９】
本開示の一部の実施形態において、１種または複数の薬物インプラントは、針等、運搬デバイスの使用により組織内に挿入される。一部の好ましい実施形態において、複数の薬物インプラントは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７３２１２号明細書に記載されている針アレイ等、針アレイの使用により組織の平行軸に沿って挿入される。
【００５０】
一部の事例において、複数の針は、プランジャの押圧により組織内に薬物インプラントが駆出または薬物インプラントが注入されるように、複数のリザーバ内の複数の薬物インプラントまたは薬物インプラントの束に連結した複数のアクチュエータに取り付けられる。特定のさらに別の実施形態において、複数のプランジャのプランジャは、同時に押圧され得るように、それぞれの第二の末端において動作可能なように一体に連結される。
【００５１】
インプラントは、組織に部分的にまたは完全に埋め込むことができる。インプラントの組織内への配置は、針によりインプラントを組織内に挿入することにより容易となり得る。インプラントは、針に関連したプランジャを押圧することにより、組織内にさらに置くことができる。
【００５２】
組織内にインプラントが置かれると、インプラントは、組織内に溶解し拡散することができる。拡散速度は、インプラントの体積に影響され得る、あるいは組織内のインプラントの溶解速度を低下させるよう作用する不活性結合剤の存在に影響され得る。薬剤は、約１分間〜約１ヶ月、約１時間〜約６週間、約１２時間〜約７２時間、約２４時間〜約４８時間、約１週間〜２週間、約２週間〜３週間または約３週間〜４週間の期間にわたり組織内に拡散することができる。
【００５３】
本開示は、シグナル伝達経路の特異的なモジュレーションに応答して検出可能シグナルを放射するレポーター細胞を含むｉｎ  ｖｉｖｏ組織モデルを作製する方法を提供する。いくつかの方法、例えば、ジーントラップ技術または内在性プロモーターに関連したレポーター遺伝子の使用は、組織モデルを構築するためのレポーター細胞の作製に用いることができる。どちらの戦略も、レポーター遺伝子の内在性ゲノム部位への組み込みにより天然の細胞経路に関して報告するという点において有利である。内在性プロモーターに関連したレポーター遺伝子の使用は、公知のプロモーターまたは転写因子応答エレメントの制御下において対象のレポーター配列（ルシフェラーゼ、ＧＦＰ等）を発現するベクターの導入によりなされ得る。例えば、フォークヘッド応答エレメント（インスリン応答エレメントとしても知られている）は、ＡＫＴ経路の活性化状態の追跡に用いられてきた。重要なことに、ＡＫＴの阻害は、このプロモーターの制御下における遺伝子の転写を活性化する。ホスファターゼ・テンシンホモログ遺伝子（ＰＴＥＮ）の不活性化突然変異を有する細胞型においてレポーター細胞を作製し、これにより高ＡＫＴ経路状態および低バックグラウンドのルシフェラーゼシグナルを生じることができる。このアプローチは、対象がん経路毎に別個の経路特異的ベクターの同定および構築を必要とするが、異所的発現プロモーターの使用は、上述のジーントラップアプローチに代わる低リスクの実行可能な代替法を表す。
【００５４】
本方法の一部の実施形態において、レポーターは、レポーターが発がん性経路の阻害により活性化されるように、発がん性経路内の細胞株における遺伝子に組み込まれる。ゲノム部位内に組み込まれたレポーターを含む細胞は、レポーター細胞株と称する。レポーター組織は、レポーター細胞を含む固形組織を意味する。レポーター組織は、例えば、レポーター細胞株由来の細胞をマウス等の動物に導入し、細胞を固形腫瘍に発達させることにより、レポーター細胞株から作製することができる。レポーター細胞株に由来するレポーター組織（例えば、腫瘍）の細胞は、発がん性経路阻害により検出可能シグナルを生成することができ、がん治療の候補方法のスクリーニングに有用なｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏプラットフォームを提供する。
【００５５】
一部の実施形態において、レポーター組織は、候補治療剤の多重解析のために針アレイと併せて用いられる。針アレイは、例えば、複数の治療剤のデリバリーに用いることができる、あるいは複数のがん治療の投与に用いることができる。針アレイを用いたデリバリーのためのデバイスおよび方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７３２１２号明細書に記載されている。針アレイは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０本を超える、１００本を超える、あるいは１，０００本を超える針を含有し得る。これらの針は、共通の薬剤をデリバリーするよう構成することができる、あるいは１本または複数の針は、異なる薬剤をデリバリーするよう構成することができる。針は、プランジャまたはポンプ等、共通のアクチュエータに連結されて、これによりアクチュエータの活性化による全針からの同時注入を可能にし得る。一部の実施形態において、針は、その個々の内容物を平行軸に沿って組織内にデリバリーするよう構成される。このデリバリーは、空間的に制約された様式で行うことができ、複数の針による複数の薬剤のデリバリーは、針毎に組織内の円柱へと制限される。一部の実施形態において、空間的に制約されたデリバリーは、１本または複数の多孔性チューブの使用により達成され、候補薬剤は、チューブの孔を通した拡散により組織にデリバリーされる。一部の実施形態において、多孔性チューブは、ポリスルホン等、多孔性ポリマーを含む。一部の実施形態において、候補薬剤は、ハイドロゲル等、ポリマーマトリクスを含み、候補薬剤の拡散の速度および程度は、ポリマーマトリクスの存在により低下する。本開示のレポーター組織内の細胞は、検出可能シグナルを放射して、所定の薬剤による発がん性経路の阻害を示すことにより、候補薬剤のデリバリーに応答することができる。複数の薬剤の空間的に制約されたデリバリーは、異なる薬剤の効果の識別を可能にし得る。さらに、組織内の円柱に沿った薬剤のデリバリーは、組織の異なる領域における不均一な細胞挙動を制御することができる。
【００５６】
図１８は、細胞プール１からの選択によりレポーター細胞株２が作製される、本開示の方法の略図を提示する。細胞は、公知の経路モジュレーター（例えば、発がん性シグナル伝達経路を阻害する薬物）に応答したレポーターの活性化に基づき選択することができる。レポーター細胞株２を用いて、レポーター細胞株に由来する腫瘍４を有する異種移植されたマウス３を作製することができる。異種移植された腫瘍４は、がん治療において有用な候補治療剤のスクリーニングのためのプラットフォームとして働く。一部の実施形態において、針アレイ５は、異種移植腫瘍内への平行軸に沿った複数の候補治療剤のデリバリーに用いることができる。針アレイを用いたデリバリーは、デリバリー領域６が互いに異なるように、空間的に制限され得る。腫瘍を切除し、切除された腫瘍７の切片を必要に応じて作製してから画像処理して、様々な候補治療剤の相対有効性を評価することができる。
【００５７】
一部の実施形態において、レポーター組織は、治療方法に対する抵抗性の基盤の決定において用いられる。公知の発がん性経路特異的な応答エレメント制御下の遺伝子にレポーターを導入し、これにより、活性経路状態を示す検出可能シグナルを生成する細胞株を作製することができる。次に、ジーントラップ技法を用いて、経路阻害により検出可能シグナルを生成する細胞を選択することができる。レポーター細胞株は、経路活性化対阻害に関して別個のシグナル（例えば、異なる波長を放出する）を生成することができる。このような系から得られる細胞は、マウス等の動物モデルに異種移植して、発がん性経路が活性化および阻害された状態をディファレンシャルに報告するレポーターレポーター組織を作製することができる。一部の実施形態において、発がん性経路が活性化（「オン（ｏｎ）」）および阻害（「オフ（ｏｆｆ）」）された状態をディファレンシャルに報告するレポーター組織は、候補治療剤のスクリーニングに用いても、また、抵抗性の発達が、治療剤の継続投与中における経路「オフ」状態から経路「オン」状態へのシグナルの切り換えにより示される、以前に成功した治療剤に対する抵抗性の発達を示すように用いてもよい。治療に対する抵抗性を発達する細胞を単離して、抵抗性の遺伝的基盤を決定するようさらに特徴付けることができる。
【００５８】
図１９は、レポーター細胞株を用いてがん治療の方法に対する抵抗性の基盤を決定することができる、本開示の方法の模式図を図示する。一部の実施形態において、レポーター細胞株２は、細胞プール１から作製され、この細胞株を用いて、レポーター細胞株２に由来する異種移植された腫瘍４を有するマウス３を作製することができる。一部の実施形態において、レポーター細胞株は、発がん性経路の阻害によりレポーターシグナルを生成する。レポーター細胞株は、２種の識別可能なシグナル（例えば、２種の識別可能な波長の蛍光）を生成して、経路の活性化対阻害状態を示すことができる。一部の実施形態において、レポーター細胞株は、発がん性経路の活性化によりレポーターシグナルを生成する。針アレイ５をレポーター組織４と併せて用いて、経路活性化または阻害をもたらす化合物を決定することができる。針アレイは、組織の平行領域における複数の薬剤のデリバリーに有用であり、組織内の軸に沿ったデリバリーによる組織の不均質の制御を可能にする。レポーター細胞株に由来するレポーター組織の細胞が、薬剤に対する応答を示すことが判明すれば、レポーター組織または同様にレポーター細胞株に由来する他のレポーター組織を用いて、薬剤に対する応答を止めた１個または複数の細胞８を同定することができる。このような細胞を単離してクローン増幅９することができ、このような細胞のゲノム配列プロファイル１０を得ることにより、薬剤に対する抵抗性の遺伝的基盤を決定することができる。
【００５９】
一部の実施形態において、治療剤に対する応答の遺伝的基盤は、治療剤の投与により検出可能シグナルを示す細胞から得られたゲノムＤＮＡの配列を決定することにより決定される。ゲノムＤＮＡの配列決定は、ハイスループットシーケンシングを含み得る。ハイスループットシーケンシングの方法は、本技術分野において公知のものであり、本明細書においてさらに詳細に記載されている。一部の実施形態において、全ゲノム増幅は、配列決定前にゲノムＤＮＡにおいて行われる。
【００６０】
一部の実施形態において、レポーター細胞は、様々な流体薬剤に対する組織の応答の決定において有用なレポーター組織の作製に用いられる。レポーター組織は、複数のレポーター細胞を含む。複数の流体薬剤は、針アレイを用いてレポーター組織にデリバリーすることができる。レポーター組織は、疾患または障害の特色を示しても、あるいは正常であってもよい。応答は、シグナル伝達経路の活性化、シグナル伝達経路の阻害または別の変化した生理状態の形を取り得る。一部の実施形態において、方法は、薬物の副作用の決定に有用である。変化した生理状態は、対象または生物ソースから得られた生物試料における変化した（例えば、適切な対照と比べて統計的に有意な様式で測定可能に変化した）構造または機能の検出を可能にする領域または生物試料等、固形組織における（および一部の実施形態において、固形腫瘍における）状況、過程、経路、動的構造、状態または他の活性に直接的に関与するいずれかの検出可能パラメータとなり得る。したがって、本発明の方法は、変化した生理状態の指標が例えば細胞または生化学的活性となり得るこのような相関に部分的に関係する。細胞または生化学的活性のさらに非限定的な例として、細胞生存率、細胞増殖、アポトーシス、抗増殖シグナルに対する細胞抵抗性、細胞運動性、結合組織分解酵素の細胞発現もしくは同化作用、血管新生の細胞補充または本明細書に提示されている他の判断基準が挙げられる。
【００６１】
変化した生理状態は、固形組織機能に直接的または間接的に関与する任意の構造または活性が、対照または標準と比べて統計的に有意な様式で変化した、任意の状態または機能をさらに意味することができ、固形組織構成成分と導入された薬剤との間の直接的もしくは間接的相互作用を起源とする、あるいは代謝産物、異化産物、基質、前駆体、補助因子等、このような相互作用の結果生成され得る中間体の間の相互作用の結果生じる構造的または機能的変化を起源とすることができる。さらに、変化した生理状態として、対象または生物ソースの一部または全部の細胞または組織における、一部の実施形態においては固形組織の一部または全部の細胞における、一部の実施形態においては固形組織における固形腫瘍等、腫瘍の一部または全部の細胞における、変化したシグナル伝達、呼吸、代謝的、遺伝的、生合成または他の生化学的もしくは生物物理学的活性が挙げられるがこれらに限定されない。非限定的な例として、酵素的機序によるものであれ非酵素的機序によるものであれ、細胞内におけるアポトーシス経路の誘導ならびに異型の化学的および生化学的に架橋された化学種の生成等、変化した生物学的シグナル伝達、細胞生存率、細胞増殖、アポトーシス、抗増殖シグナルに対する細胞抵抗性、細胞運動性、結合組織分解酵素の細胞発現もしくは同化作用、血管新生の細胞補充または他の判断基準は全て、変化した生理状態を示すものとして考慮することができる。
【００６２】
本開示は、疾患治療のための針アレイデバイスを用いた局所的デリバリー方法に関与する。例示的なデバイスは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７３２１２号明細書に記載されている。
【００６３】
ヒトにおけるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、ジストロフィン遺伝子における突然変異によるジストロフィンの欠如に起因する致死性、Ｘ連鎖性の劣性筋肉疾患である。ＤＭＤは、骨格筋および心筋の両方に影響を及ぼし、運動能力の急速な減退を生じ、最終的に完全麻痺および死をもたらす進行性筋肉消耗によって特徴付けられる。
【００６４】
本開示は、組織機能、例えば筋肉機能を促進する遺伝子または遺伝子産物を意味する用語である、遺伝子置換治療剤に関与する。遺伝子置換治療剤は、組織機能の損失を生じる遺伝的障害を有する対象における機能を回復することにより、組織機能を促進することができる、あるいは健常な対象における組織機能を増強することができる。一部の実施形態において、組織機能のエフェクターは、老化のプロセスにより失われた組織機能を増強する。
【００６５】
本開示の一部の実施形態は、対象の罹患組織内の隣接領域への遺伝子置換療法の同時投与を含む、筋肉疾患または障害を治療する方法を提供する。
【００６６】
他の実施形態において、本開示は、対象への遺伝子置換療法の局所的デリバリー方法であって、ａ）遺伝子置換治療剤を含む治療剤を用意するステップと、ｂ）複数の針を含む針アレイデバイスを用いて、前記治療剤を前記対象の組織に局所的にデリバリーするステップとを含む方法を提供する。
【００６７】
本開示は、選択された遺伝子を筋肉組織にｉｎ  ｖｉｖｏでデリバリーする方法であって、（ａ）前記選択された遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ転写および翻訳を導くことのできる制御エレメントに作動可能に連結した前記選択された遺伝子を含むＡＡＶベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンを用意するステップと、（ｂ）複数の針を含む針アレイデバイスを用いて、前記組換えＡＡＶビリオンを前記筋肉組織にｉｎ  ｖｉｖｏで導入するステップとを含む方法も提供する。
【００６８】
一部の実施形態において、針は、筋肉内注射によるデリバリーのために構成されている。
【００６９】
一部の実施形態において、肢における機能的筋群全体の筋肉内への治療用ＡＡＶベクターの大規模デリバリーは、多孔性針デリバリーデバイスを用いて対象、例えばｃｘｍｄイヌにおいて達成される。筋ジストロフィーの動物におけるジストロフィンタンパク質の発現は、本開示のＡＡＶ６ウイルスを用いて達成することができる。遺伝子置換治療剤デリバリーにより、医師または高度専門看護師は、１本の肢または胴体の片側の大きな筋線維全体の１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％超に、ジストロフィンの遺伝子を有するＡＡＶ６を導入することができる。それぞれが異なる身体領域に取り組む医者の小規模チームは、１回の鎮静期間内における完全な遺伝子治療のデリバリーを可能にする。
【００７０】
標的組織
一部の実施形態において、本開示は、固形組織において候補治療剤をスクリーニングするためのシステムを例証する。固形組織は、医術分野において周知のものであり、実質的に多細胞、細胞間、組織および／または臓器構築の産物である、任意の粘着性で空間的に別個で非流体である画定された解剖学的区画を包含することができ、その例として、関連結合組織を含み得る、あるいはそれにより構造的統合性が得られ、薄膜（例えば、髄膜、心膜、胸膜、粘膜、基底膜、網、臓器被包（ｏｒｇａｎ−ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ）膜など）により他の身体部分から区別され得る三次元的に画定された区画等が挙げられる。非限定的な例示的な固形組織として、脳、肝臓、肺、腎臓、前立腺、卵巣、脾臓、リンパ節（扁桃腺等）、甲状腺、膵臓、心臓、骨格筋、腸、喉頭、食道および胃を挙げることができる。上述および他の固形組織の解剖学的位置、形態学的特性、組織学的特性評価ならびに侵襲的および／または非侵襲的アクセスは全て、関連分野の当業者にとって周知のものである。一部の実施形態において、組織は正常である。一部の実施形態において、組織は、がん性である、炎症を起こしている、感染している、萎縮している、麻痺している、発作をおこしているまたは凝固している、あるいはそうであると疑われる。一部の実施形態において、組織は、がん性である、あるいはそうであると疑われる。一部の実施形態において、組織はがん性である。
【００７１】
好ましい一実施形態において、本方法はがんを対象とし、標的組織は、良性であっても悪性であってもよい腫瘍を含み、前立腺がん細胞、乳がん細胞、結腸がん細胞、肺がん細胞、脳がん細胞および卵巣がん細胞からなる群から選択される少なくとも１種のがん細胞を含む。特定の実施形態において、腫瘍は、腺腫、腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、小細胞癌、未分化大細胞癌、軟骨肉腫および線維肉腫から選択されるがんを含む。米国国立がん研究所（Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（米国メリーランド州ベテスダ）によって公表された基準、またはＤｅＶｉｔａ，Ｈｅｌｌｍａｎ，ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ’ｓ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２００８、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ／Ｏｖｉｄ、ニューヨーク）；Ｐｉｚｚｏ  ａｎｄ  Ｐｏｐｌａｃｋ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ２５  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（第４版、２００１、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ／Ｏｖｉｄ、ニューヨーク）；およびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｋｉｎｚｌｅｒ、Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ（第２版、２００２、ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ、ニューヨーク）に記載されている基準等、技術上認められた（Ａｒｔ−ａｃｃｅｐｔｅｄ）臨床診断基準が、上述および他のがん型に対し確立されている。特定のがんの分類および特性評価の他の非限定的な例は、例えば、Ｉｇｎａｔｉａｄｉｓら、（２００８  ＰａｔｈｏｂｉｏＬ  ７５：１０４）；Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．５：９）；およびＡｕｍａｎら、（２００８  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ．４０：３０３）に記載されている。特定の実施形態において、組織の選択された領域は、対象における腫瘍の部分であり、特定のさらに別の実施形態において、対象は、前臨床モデルおよびヒト患者の一種である。
【００７２】
特定の好ましい実施形態は、米国国立がん研究所（米国メリーランド州ベテスダ）の基準またはＤｅＶｉｔａ，  Ｈｅｌｌｍａｎ，ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ’ｓ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２００８、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ／Ｏｖｉｄ、ニューヨーク）；Ｐｉｚｚｏ  ａｎｄ  Ｐｏｐｌａｃｋ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（第４版、２００１、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ／Ｏｖｉｄ、ニューヨーク）；およびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｋｉｎｚｌｅｒ、Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ（第２版、２００２、ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ、ニューヨーク）に記載されている基準等、技術上認められた臨床診断基準に従って、がんであるまたはがんを発症もしくは得るリスクがあるとして診断された患者等、ヒト対象である対象または生物ソースを企図し、特定の実施形態は、このような判断基準によりがんである、がんを発症するまたはがんを得るリスクがないことが知られているヒト対象を企図する。
【００７３】
特定の他の実施形態は、非ヒト対象または生物ソース、例えば、本技術分野において固形腫瘍および／または他のがんの前臨床モデル等の前臨床モデルとして知られ得るような非ヒト対象を包含する、マカク、チンパンジー、ゴリラ、サバンナモンキー、オランウータン、ヒヒ等、非ヒト霊長類または他の非ヒト霊長類を企図する。特定の他の実施形態は、哺乳動物である非ヒト対象、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ヤギ、スナネズミ、ハムスター、モルモットまたは他の哺乳動物を企図する。このような哺乳動物の多くは、本技術分野において、固形腫瘍および／または他のがん等、特定の疾患または障害の前臨床モデルとして知られた対象となり得る（例えば、Ｔａｌｍａｄｇｅら、２００７  Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７０：７９３；Ｋｅｒｂｅｌ、２００３  Ｃａｎｃ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．２（４  Ｓｕｐｐｌ  １）：Ｓ１３４；Ｍａｎら、２００７  Ｃａｎｃ．Ｍｅｔ．Ｒｅｖ．２６：７３７；Ｃｅｓｐｅｄｅｓら、２００６  Ｃｌｉｎ．ＴｒａｎｓＬ  Ｏｎｃｏｌ．８：３１８）。実施形態の範囲は、過度に限定されることを目的としないが、対象または生物ソースが、非哺乳動物の脊椎動物、例えば、別の高等脊椎動物またはトリ、両生類もしくは爬虫類生物種または別の対象もしくは生物ソースであってよい他の実施形態も企図するようなものである。トランスジェニック動物は、該動物の細胞のうち１個または複数が、非内在性（即ち、異種）の核酸であり、その細胞の部分において染色体外エレメントとして存在する、あるいはその生殖系列ＤＮＡ内（即ち、その細胞の大部分または全部のゲノム配列内）に安定的に組み込まれた核酸を包含する非ヒト動物である。本発明の特定の実施形態において、トランスジェニック動物の組織は標的化され得る。一部の実施形態において、固形組織は、ある生物の１個または複数の細胞（例えば、培養されたヒトがん細胞）を非ヒトモデル生物に導入することにより作製された異種移植片である。
【００７４】
本発明の方法は、種々の固形組織への治療剤の投与に適しており、したがって、該方法は、医学的および獣医学的用途を有する。一部の実施形態において、動物は、ペット、コンパニオンアニマル、見張り（ｇｕａｒｄｉａｎ）動物、使役（ｗｏｒｋｉｎｇ）動物、繁殖動物、介助動物、競走動物、家畜、群の動物または実験動物である。
【００７５】
一部の実施形態において、対象は、前臨床動物モデルである。一部の好ましい実施形態において、対象は、マウスモデルまたはラットモデルのうち一方である。前臨床モデルは、異種移植または異種移植術のレシピエントである動物モデルとなることができ、異種移植または異種移植術は、ある種から別の種への生細胞、組織または臓器の移植術を意味するよう互換的に用いられる用語である。一部の好ましい事例において、前臨床モデルは、腫瘍へと発達する１個または複数のがん細胞のレシピエントである。レシピエント前臨床モデルは、ＳＣＩＤマウスまたはヌードマウス等、免疫無防備状態の動物となり得る。胸腺欠損ヌードマウスは、胸腺を増悪化または欠損させ、Ｔ細胞数の大幅な低下により免疫系を阻害する遺伝的突然変異を有する系統に由来する実験用マウスである。前臨床モデルにおける免疫無防備状態は、遺伝的異常の結果となり得る、あるいは免疫系機能を抑制するための薬物治療の結果となり得る。免疫抑制薬または免疫抑制剤は、免疫系の活性を阻害または防止する薬物である。免疫抑制薬の非限定的な例として、グルココルチコイド；細胞分裂阻害薬；アルキル化剤；メトトレキサート等の葉酸アナログならびにアザチオプリンおよびメルカプトプリン等のプリンアナログを包含する抗代謝剤；アザチオプリンおよびメルカプトプリン；ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシンおよびミトラマイシンを包含する細胞傷害性抗生物質；免疫系の要素を標的化するポリクローナルおよびモノクローナル抗体；ならびにシクロスポリン、タクロリムス、ボクロスポリンおよび他のカルシニューリン阻害剤ならびにシロリムスを包含するイムノフィリンに作用する薬物；インターフェロン、オピオイド、ＴＮＦ結合タンパク質、ミコフェノール酸およびフィンゴリモドが挙げられる。
【００７６】
一部の実施形態において、固形組織は軟部組織である。軟部組織の非限定的な例として、筋肉、脂肪、皮膚、腱、靱帯、血液および神経組織が挙げられる。生物試料は、対象または生物ソースから血液試料、生検標本、組織外植片、臓器培養物、体液またはその他の組織もしくは細胞調製物を得ることにより用意することができる。
【００７７】
対象または生物ソースは、ヒトもしくは非ヒト動物、トランスジェニックまたはクローニングもしくは組織工学による（幹細胞の使用による等）生物、初代細胞培養物または培養適応した細胞株となり得る。培養適応した細胞株として、染色体に組み込まれたもしくはエピソーム組換え核酸配列を含有し得る遺伝子操作された細胞株、不死化したもしくは不死化可能な細胞株、体細胞雑種細胞株、分化したまたは分化可能な細胞株、形質転換した細胞株等が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の一部の実施形態において、対象または生物ソースは、悪性状態である、あるいはそのリスクがあると疑われ得、本発明の一部の実施形態において、対象または生物ソースは、このような疾患のリスクがないまたは存在しないことが知られていてよい。
【００７８】
流体薬剤
特定の実施形態において、流体薬剤は、（ａ）遺伝子治療剤、（ｂ）化学療法剤、（ｃ）小分子、（ｄ）抗体、（ｅ）タンパク質、（ｆ）低分子干渉ＲＮＡおよびそのコードポリヌクレオチドのうち一方、（ｇ）アンチセンスＲＮＡおよびそのコードポリヌクレオチドのうち一方、（ｈ）リボザイムおよびそのコードポリヌクレオチドのうち一方、（ｉ）検出可能標識、（ｊ）治療タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドミメティックのうち１種ならびに（ｋ）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）から選択される薬剤を含む。特定のさらに別の実施形態において、検出可能標識は、放射標識、放射線不透過性標識、蛍光標識、比色標識、色素、酵素標識、ＧＣＭＳタグ、アビジンおよびビオチンから選択される。特定の実施形態において、薬剤は、（ｉ）少なくとも１種の作動可能に連結したプロモーターを含む遺伝子治療剤、（ｉｉ）少なくとも１種の作動可能に連結したプロモーターを含む低分子干渉ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）少なくとも１種の作動可能に連結したプロモーターを含むアンチセンスＲＮＡをコードするポリヌクレオチドおよび（ｉｖ）少なくとも１種の作動可能に連結したプロモーターを含むリボザイムをコードするポリヌクレオチドから選択される。特定のさらに別の実施形態において、作動可能に連結したプロモーターは、構成的プロモーターおよび調節可能なプロモーターから選択される。さらにまた別の特定の実施形態において、調節可能なプロモーターは、誘導性プロモーター、密接に調節されたプロモーターおよび組織特異的なプロモーターから選択される。
【００７９】
候補薬剤または候補化合物は、標的組織にデリバリーされ得る水溶液、混合物またはコロイドにおける任意の流体または分子を意味する。針からデリバリーされる薬剤を意味するよう用いる場合、用語、流体は、液体、気体、コロイド、懸濁された固体等、このような針を通して流れることができる任意の物質として解釈するよう広義に解釈されたい。
【００８０】
候補腫瘍学的薬剤の選択は、関連分野の当業者であれば理解、決定することができる（例えば、Ｂｅｒｋｏｗら編、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ、第１６版、Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏ．、ニュージャージー州ローウェイ、１９９２；Ｇｏｏｄｍａｎら編、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第１０版、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、ニューヨーク州エルムスフォード（２００１）；Ｄｅ  Ｖｉｔａ，Ｈｅｌｌｍａｎ，ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ’ｓ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２００８、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ／Ｏｖｉｄ、ニューヨーク）；Ｐｉｚｚｏ  ａｎｄ  Ｐｏｐｌａｃｋ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（第４版、２００１、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ／Ｏｖｉｄ、ニューヨーク）；Ａｖｅｒｙ’ｓ  Ｄｒｕｇ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第３版、ＡＤＩＳ  Ｐｒｅｓｓ，ＬＴＤ．、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ、メリーランド州ボルチモア（１９８７）、Ｅｂａｄｉ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、Ｌｉｔｔｌｅ、Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、ボストン、（１９８５）；Ｏｓｏｌｃｉ  ａｌ編、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、ペンシルベニア州イーストン（１９９０）；Ｋａｔｚｕｎｇ、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ、コネチカット州ノーウォーク（１９９２）を参照されたい）。候補薬剤は、試験的治療のリストを開示するリソース、例えば、進行中および計画された臨床試験のデータベースをその「ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ」ウェブサイトに維持する国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）（メリーランド州ベセスダ）から選択され得る。
【００８１】
固形腫瘍を治療するための治療剤等、治療剤へと開発するための候補薬剤のスクリーニング方法および評点方法において用いるための候補薬剤は、化合物、組成物または分子の「ライブラリー」またはコレクションとして提供することができる。このような分子は、通常、本技術分野において「小分子」として知られ、１０5ダルトン未満、１０4ダルトン未満または１０3ダルトン未満の分子量を有する化合物を包含する。
【００８２】
例えば、被験化合物のライブラリーの複数のメンバーは、候補薬剤のぞれぞれを各対象における領域内の軸に沿った複数の位置に分布させることにより、公知の腫瘍型の腫瘍を有する１つまたは複数の対象それぞれにおける公知の腫瘍型の固形腫瘍の領域に候補薬剤として導入することができ、選択された期間（例えば、時間の範囲、最短期間または特定の期間）の後、候補薬剤が導入された固形腫瘍の領域は、画像処理または各対象から除去され、例えば、効果を生じない（陰性対照）または容易に検出可能な効果を生じる（陽性対照）本明細書に提示されている対照薬剤で処置された領域における位置と比べて変化した生理状態が、本明細書に提示されている通り存在するか決定することにより、領域内のそれぞれの位置における各薬剤の効果（あるとすれば）を検出して各領域を比較することができる。
【００８３】
候補薬剤は、複数の反応容器において行われた複数の所定の化学反応によって調製された合成薬剤を包含し得るコンビナトリアルライブラリーのメンバーとしてさらに提供することができる。例えば、様々な出発化合物は、所定の構成成分が反応条件の複数の順列および／または組み合わせを追跡可能に行うのを可能にする固相合成、記録されたランダム混合手法および記録された反応分割技法のうち１種または複数を用いて調製することができる。得られた産物は、ペプチド（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０８６９４号明細書、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０４６６６号明細書を参照）または本明細書に提示されている小分子を包含し得る他の組成物（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０８５４２号明細書、欧州特許第０７７４４６４号明細書、米国特許第５，７９８，０３５号明細書、米国特許第５，７８９，１７２号明細書、米国特許第５，７５１，６２９号明細書を参照）の合成コンビナトリアルライブラリー等、スクリーニングされた後に反復的な選択および合成手順がなされ得るライブラリーを含む。当業者であれば、本開示において、多様な種別のこのようなライブラリーが、確立された手順に従って調製され、変化したミトコンドリア機能の指標におけるその影響が検査され得ることを認められよう。
【００８４】
他の候補薬剤は、タンパク質（治療タンパク質等）、ペプチド、ペプチドミメティック、ポリペプチドおよび遺伝子治療剤（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボザイムおよびアンチセンスＲＮＡのコード配列等、治療遺伝子または治療産物をコードするポリヌクレオチドを含有するプラスミド、ウイルスベクター、人工染色体その他）とすることができ、特定のさらに別の実施形態において、遺伝子治療剤は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター（例えば、ＩＰＴＧ誘導性）、密接に調節されたプロモーター（例えば、その同族誘導物質または抑制解除物質の非存在下では検出可能な転写をほとんど生じないまたは全く生じないプロモーター）もしくは組織特異的なプロモーター等の調節可能なプロモーター等、作動可能に連結したプロモーターを含み得る。上述および関連する薬剤を調製、検査および使用するための手法は、本技術分野において公知のものである。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００７  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ）；Ｒｏｓｅｎｚｗｅｉｇ  ａｎｄ  Ｎａｂｅｌ（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（とりわけ、その第１３章、「Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、２００８  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ）；Ａｂｅｌｌ、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｍｉｍｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ、１９９７  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ＮＹ．を参照されたい。
【００８５】
他の候補薬剤は、天然起源の、免疫学的に誘発された、キメラ、ヒト化、組換えならびに他の遺伝子操作された抗原特異的な免疫グロブリンおよび人工的に作製された抗原結合断片、ならびに単鎖抗体、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、Ｆａｂ断片、抗体−薬物コンジュゲート、二特異性抗体等のそれらの派生体等、抗体となり得る。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００７  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（１９９９  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー）を参照されたい。
【００８６】
治療用途のための薬学的に許容される担体は、製薬技術分野において周知のものであり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９８５）に記載されている。例えば、生理ｐＨの無菌生理食塩水およびリン酸緩衝食塩水を用いることができる。保存料、安定剤、色素および他の補助的薬剤を医薬組成物に供給することができる。例えば、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルを保存料として添加することができる。Ｉｄ．  ａｔ  １４４９。その上、抗酸化剤および懸濁剤を用いてよい。Ｉｄ．。「薬学的に許容される塩」とは、薬用化合物と、有機もしくは無機酸（酸付加塩）または有機もしくは無機塩基（塩基付加塩）の組み合わせに由来する薬用化合物の塩を意味する。本明細書における使用に企図される薬物を包含する薬剤は、遊離塩基または塩形態のいずれかで用いることができ、どちらの形態であっても、本発明の特定の実施形態の範囲内に収まると考慮される。
【００８７】
１種または複数の薬剤を含有する医薬組成物は、組成物を対象に投与することのできるいかなる形態であってもよい。一部の実施形態において、組成物は液状となり、投与経路は、本明細書に記載されている固形組織への投与を含むであろう。本明細書における用語、非経口は、経皮または皮下注射および筋肉内、髄内および胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｍａｌ）技法を包含する。
【００８８】
医薬組成物は、その中に含有されている有効成分が、ヒト対象等、対象への該組成物の投与により生物に利用可能となるように処方される。対象に投与される組成物は、１回もしくは複数用量または投薬量単位の形態を取ることができ、例えば、測定前（ｐｒｅ−ｍｅａｓｕｒｅｄ）の流体容量は、単一投薬量単位を含むことができ、液状の１種または複数の組成物（例えば、薬物）の容器は、複数の投薬量単位を保持することができる。薬物の用量は、薬物の所望の濃度範囲、例えば、固形組織におけるデリバリー針のごく近傍における薬物の所望の濃度範囲の達成または維持に十分な様式および時間で投与される、治療上有効量の特定の薬物の全部または部分を包含し、用量を含む薬物の絶対量は、医学的および製薬ならびに関連する技術水準に照らして熟練の医者が精通している、薬物、対象、固形組織および他の判断基準に応じて変動する。特定の実施形態において、少なくとも２用量の薬物を投与することができ、特定の他の実施形態において、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の用量を投与することができる。
【００８９】
溶液または懸濁液の形態であれ他の同様の形態であれ、本明細書における液体医薬組成物は、次の、アジュバント：注射用の水、生理食塩水溶液、生理的食塩水、リンゲル溶液、生理食塩水溶液（例えば、正常生理食塩水または等張性、低張性もしくは高張性塩化ナトリウム）等、無菌希釈剤、溶媒または懸濁培地として働く合成モノもしくはジグリセリド（ｄｉｇｙｌｃｅｒｉｄｅｓ）等の固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等、抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム等、抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸等、キレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩等、緩衝剤および塩化ナトリウムまたはデキストロース等、浸透圧調整のための薬剤のうち１種または複数を包含し得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量のバイアル内に封入され得る。一部の実施形態において、生理的食塩水はアジュバントである。注射用医薬組成物は無菌となり得る。アルミニウム塩、油中水型エマルジョン、生分解性油媒体、水中油型エマルジョン、生分解性マイクロカプセル、ハイドロゲルおよびリポソーム等が挙げられるがこれらに限定されないデリバリー媒体等、他の成分を調製物に包含することも望ましい。
【００９０】
当業者にとって公知の任意の適切な担体は、本発明の医薬組成物において用いることができるが、担体の種類は、投与様式および従来の徐放的薬物放出が望ましいかにも応じて変動するであろう。薬物の補充的注射等、非経口投与のため、担体は、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックスまたは緩衝剤を含むことができる。本発明の医薬組成物の担体として生分解性マイクロスフェア（例えば、ポリ乳酸ガラクチド（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ  ｇａｌａｃｔｉｄｅ））を用いてもよい。適切な生分解性マイクロスフェアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号および第５，０７５，１０９号明細書に開示されている。一部の実施形態において、マイクロスフェアは、およそ２５ミクロンよりも大きいが、一方、他の実施形態は、そのように限定的ではなく、他の寸法を企図する。
【００９１】
医薬組成物は、緩衝剤等の希釈剤、アスコルビン酸等の抗酸化剤、低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、グルコース、ショ糖またはデキストリン等の炭水化物、ＥＤＴＡ等のキレート剤、グルタチオンならびに他の安定剤および賦形剤を含有してもよい。非特異的な血清アルブミンと共に混合された中性緩衝食塩水または生理食塩水は、例示的な適切な希釈剤である。一部の実施形態において、薬剤（例えば、治療薬物または候補薬物）は、希釈剤として適切な賦形剤溶液（例えば、ショ糖）を用いる凍結乾燥物として処方される。
【００９２】
特定の実施形態は、固形腫瘍等、固形組織における平行軸に沿った複数の空間的に画定された位置への複数の薬物、候補薬物、造影剤、位置マーカー、有効性の指標および適切な対照組成物の直接デリバリーと、続く、所望の時間間隔後の、処理組織の切除および治療の効果に関する組織の評価または解析を企図する。有効性の指標は、例えば、検出可能な指標化合物、ナノ粒子、ナノ構造または他の組成物とすることができ、他の組成物は、生体色素（例えば、トリパンブルー）、比色ｐＨ指標、多くの細胞生理パラメータ（例えば、ｐＨ、細胞内Ｃａ2+または他の生理関連のイオン濃度、ミトコンドリア膜電位、細胞膜電位等、Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（第１０版）２００５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州カールズバッドを参照）に応じて別個の蛍光を示し得る蛍光化合物、酵素基質、特異的なオリゴヌクレオチドプローブ、レポーター遺伝子等、細胞の生理状態を示す検出可能シグナルを生じるレポーター分子を含む。対照組成物は、例えば、偽注射、生理食塩水、ＤＭＳＯまたは他のビヒクルもしくは緩衝剤対照、不活性エナンチオマー、スクランブルされたペプチドもしくはヌクレオチド等、生理状態に統計的に有意な変化を生じないことが以前に立証された陰性対照；およびＦＤＡに認可された治療化合物等、生理状態に統計的に有意な変化を生じることが以前に立証された陽性対照となり得る。
【００９３】
一部の実施形態において、流体薬剤は、色素をさらに含む。医薬組成物を固形組織に投与した後に色素を画像処理して、同一医薬組成物に存在する治療剤の分布および活性を観察することができる。一部の実施形態において、色素は蛍光色素である。一部の実施形態において、色素は放射性色素である。
【００９４】
一部の実施形態において、流体薬剤は、位置マーカーを含む。位置マーカーは、公知のものであり、非限定的な例として、蛍光量子ドット、墨汁、金属またはプラスチックビーズ、色素、染色、腫瘍ペイント（Ｖｅｉｓｅｈら、２００７  Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．６７：６８８２）または他の位置マーカーが挙げられ、所望の位置に導入することができる。マーカーは、可視、光学的、比色、色素、酵素、ＧＣＭＳタグ、アビジン、ビオチン、放射性物質（放射性標識および放射線不透過性等）、蛍光または他の検出可能シグナルとなり得る、それに続いて位置確認できる任意の検出可能シグナル源を包含し得る。
【００９５】
したがって、検出可能マーカーは、独特かつ容易に同定可能なガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣＭＳ）タグ分子を含む。多数のこのようなＧＣＭＳタグ分子は、本技術分野で公知のものであり、検出可能識別子成分として単独または組み合わせた使用のために選択することができる。説明のためであって限定を目的としないが、１、２種以上のこのようなＧＣＭＳタグの様々な異なる組み合わせは、本明細書に記載されているデバイスの個々のリザーバに、各リザーバの内容物が独特のＧＣＭＳ「署名」に基づいて同定されるのを可能にする仕方で添加することができ、これにより、それに続いて注入領域から回収される任意の試料から、同定目的のためその元々の針へと遡ることができる。ＧＣＭＳタグの例として、α，α，α−トリフルオロトルエン、α−メチルスチレン、ｏ−アニシジン、多くの別個のコカインアナログのいずれかまたは規定の条件下で容易に同定可能なＧＣＭＳ署名を有する他のＧＣＭＳタグ化合物、例えば、Ｓｕｐｅｌｃｏ（登録商標）２００５ガスクロマトグラフィーカタログに記載されており、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈから入手できるＳｕｐｅｌｃｏ（登録商標）製品等、ＳＰＥＸ  ＣｅｒｔｉＰｒｅｐ  Ｉｎｃ．（ニュージャージー州メタチェン）またはＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）から入手できる製品が挙げられる。
【００９６】
多孔性チューブ
一部の実施形態において、本方法は、１本または複数の多孔性チューブの使用による組織への流体薬剤の投与を提供する。流体薬剤は、多孔性チューブの孔を通して拡散することにより組織に接触する。本願のデバイスおよび方法において用いられる多孔性チューブは、中空となり得る、あるいは多孔性材料を均一に含むことができる。多孔性チューブは、内容物の含有、貯蔵、投与、デリバリーおよび輸送に適している。内容物は、１種または複数の治療剤を含む医薬組成物となり得る。単一の中空および／または多孔性チューブ内の治療剤は、同一であっても、異なる種類の治療剤の混合物であってもよい。複数の中空および／または多孔性チューブ内において、各チューブは、別のチューブと同じ治療剤または別のチューブとは異なる治療剤を含有することができる。一部の実施形態において、あらゆる中空および／または多孔性チューブは、複数のチューブの他のいかなるチューブに含有されている治療剤とも異なる治療剤を含有する。
【００９７】
中空および／または多孔性チューブは、チューブを保持し、薬物デリバリーを容易にするフレームと接続することができる。中空および／または多孔性チューブは、フレームから脱離させることができる。フレームに接続された中空および／または多孔性チューブの数および空間的配向性は、対象の薬物デリバリーの必要に基づき変動し得る。
【００９８】
中空および／または多孔性チューブは、チューブ材料で作製されている。チューブ材料は、流体薬剤の含有、貯蔵、投与、デリバリーおよび輸送に適している。内容物は、１種または複数の治療剤を含む医薬組成物となり得る。一部の実施形態において、チューブ材料は、酸に対し基本的に不活性である。一部の実施形態において、チューブ材料は、塩基に対し基本的に不活性である。一部の実施形態において、チューブ材料は、酸および塩基に対し基本的に不活性である。一部の実施形態において、チューブ材料は、水に不溶性である。一部の実施形態において、チューブ材料は、有機溶媒に不溶性である。一部の実施形態において、チューブ材料は、有機溶媒に基本的に不溶性である。一部の実施形態において、チューブ材料は、非ハロゲン化有機溶媒に不溶性である。一部の実施形態において、チューブ材料は、非ハロゲン化有機溶媒に基本的に不溶性である。
【００９９】
チューブ材料は、生体適合性である。チューブ材料は、基本的に生理的に不活性であり、生理的事象を誘発しない。チューブ材料は、固形組織内における炎症、免疫応答、感染または任意の他の種類の拒絶を引き起こさない。一部の実施形態において、チューブ材料は生分解性である。一部の実施形態において、チューブ材料は、固形組織内で経時的に分解する。チューブ材料は熱安定性であり、チューブは、対象における使用前にオートクレーブ内で滅菌することができる。
【０１００】
チューブ材料は、チューブへの成形に適しているが、固形組織内に置いた際のチューブ形状の保持にも適している。チューブ材料は、清浄な仕方での破損、切断、スライス、脱離または分離に適しており、固形組織内に置いた後に破損、切断、スライス、脱離または分離することができる。一部の実施形態において、チューブ材料は切断しやすい。
【０１０１】
一部の実施形態において、チューブ材料はポリマーである。一部の実施形態において、チューブ材料はコポリマーである。一部の実施形態において、チューブ材料は、架橋したポリマーまたはコポリマーである。チューブ材料の非限定的な例として、ポリスルホン、ポリアミン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリカルバメート、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエーテル、ポリオレフィン、多環芳香族材料が挙げられる。一部の実施形態において、チューブ材料はポリスルホンである。
【０１０２】
ポリマーからの中空チューブの調製は、様々な経路により達成することができる。これらは、湿式、乾式または融解成形プロセスと称される。融解成形は、ポリマーのその融点を上回る加熱と、中空チューブを成形するよう設計されたオリフィス（通常、ダイと称される）を通したその押し出しに関与する。融解物は、押し出されると、ポリマーを微細なチューブに凝固させるクエンチにより冷却される。乾式成形プロセスにおいて、ポリマーの溶液は、所望のオリフィスを通して押し出され、加熱したカラムに供給され、溶媒を蒸発させ、続いてチューブを成形する。湿式膜成形プロセスにおいて、ポリマーの溶液は、オリフィスを通して押し出され、ポリマーを非溶媒中でクエンチして、ポリマーをチューブに凝固させる。上述の成形プロセスのうち、湿式膜成形は、中空多孔性チューブの容易な作製を可能にする。用いられる特定の成形プロセスは、用いられるポリマーおよび所望の中空チューブの種類に依存するであろう。
【０１０３】
一部の実施形態において、チューブ材料は、複数の孔を含む。チューブの内容物は、チューブから固形組織へと孔を介して拡散することができる。多孔性チューブから固形組織への拡散の速度は、孔径に影響され得る、例えば、より大きな孔は、より速い拡散速度を生じる。一部の実施形態において、チューブ材料は透過性である。一部の実施形態において、多孔性チューブは透過性である。
【０１０４】
有効薬剤は、より低い化学ポテンシャルの方向、即ち、デバイスの外表面に向かって拡散する。デバイスの外表面において、平衡は再確立される。有効薬剤の定常状態フラックスは、フィックの拡散の法則に従って確立されるであろう。拡散による材料を通した薬物の通過速度は、一般に、その中の薬物の溶解性および多孔性壁の厚さに依存する。多孔性チューブ材料の選択は、デリバリーされる特定の流体薬剤による。
【０１０５】
多孔性材料の作製において、孔のサイズは、ポリマーの溶媒強度に影響される。溶媒強度の急速な減少は、多くの場合、連続的ポリマー相内の小さい液滴の分散を捕捉する傾向がある。溶媒強度の緩やかな減少は、ポリマーマトリクス内の核形成部位を可能にし、より大きな孔を形成させる。このような場合において、溶媒強度の低下は、膜構造が固まるのに十分なほど急速となる必要がある。
【０１０６】
多孔性ポリマーの作製において多孔性ネットワークの空隙率および体積を変化させる別の仕方は、ポリマー溶液の濃度を変化させることである。濃度がより低ければ、より大きな孔およびより大きな孔体積を促進する傾向がある。しかし、溶媒中のポリマー濃度の可能な高さ（通常４５％ｗ／ｗ以下）には限度がある。さもなければ、ポリマーは、連続的溶媒相における分散相となり、これにより、多孔性ネットワークを排除するであろう。多孔性の管状膜を達成する別の方法は、冷却によりポリマー溶液の急速な相反転を生じることである。
【０１０７】
好ましい実施形態において、平均孔径は、約５０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ、９００ｎｍ、１μｍ、２μｍ、３μｍ、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、５０μｍ、１００μｍまたは５００μｍである。単一チューブの孔は全て、ほぼ同じ孔径となり得る。一部の実施形態において、単一チューブの孔はそれぞれ、該チューブの他のあらゆる孔の孔径とは無関係な孔径を有する。複数の多孔性チューブ内において、全孔は、ほぼ同じ孔径を有し得る、あるいは各孔は、該複数の多孔性チューブの他のあらゆる孔のサイズとは無関係なサイズを有し得る。
【０１０８】
単一の多孔性チューブ内において、孔径は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、７５０％または１，０００％も変動し得る。単一の多孔性チューブ内において、孔径は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約９０％、約１００％、約１２５％、約１５０％、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％、約７５０％または約１，０００％も変動し得る。
【０１０９】
孔径は、拡散速度に影響を及ぼすことができ、孔径は、拡散速度に影響を及ぼすようモジュレートされ得る。拡散速度に影響を与える目的のために、所定の平均孔径を有する多孔性チューブを作製することができる。医薬組成物、治療剤および多孔性チューブ材料の物理的および化学的特性に部分的に影響されて、治療剤の異なる医薬組成物は、変動速度で多孔性チューブから拡散し得る。変動的な平均孔径を有する多孔性チューブを作製し、特異的な医薬組成物または治療剤の所望の拡散速度をもたらす孔径を見出すよう実験的に用いることができる。
【０１１０】
複数のチューブにおいて、全チューブは、ほぼ同じチューブ長を有し得る、あるいは各チューブは、該複数のチューブの他のあらゆるチューブのチューブ長とは無関係なチューブ長を有し得る。チューブは、直径を有する。複数のチューブにおいて、全チューブは、ほぼ同じ直径を有し得る、あるいは各チューブは、該複数のチューブの他のあらゆるチューブの直径とは無関係な直径を有し得る。チューブは、壁厚を有する。複数のチューブにおいて、全チューブは、ほぼ同じ壁厚を有し得る、あるいは各チューブは、該複数のチューブの他のあらゆるチューブの壁厚とは無関係な壁厚を有し得る。
【０１１１】
多孔性チューブは、上端および下端を有する。一部の実施形態において、チューブ全体が、医薬組成物または治療剤等、流体薬剤を含有する。一部の実施形態において、下端は、医薬組成物または治療剤等、流体薬剤を含有し、上端は、医薬組成物または治療剤等、流体薬剤を含有しない。
【０１１２】
チューブの下端は、固形組織への内容物の投与の補助に適したデバイスに取り付けることができる。チューブの下端は、例えば、針、ポート、カテーテル、静脈内ラインまたは固形組織への医薬組成物のデリバリーに適した他の装置に接続することができる。一部の実施形態において、装置（例えば、針）は、固形組織の浸透に適している。
【０１１３】
チューブの上端は、固形組織への内容物の投与の補助に適したデバイスに取り付けることができる。チューブの上端は、例えば、プランジャ、ポンプ、ピストンまたは固形組織への医薬組成物のデリバリーに十分な圧力を与えるのに適した他の装置、あるいは本明細書に記載されている任意のこのようなデバイスに接続することができる。
【０１１４】
チューブは、流体薬剤を充填する、詰めるまたは装填することができる。チューブは、使用直前に充填することができる、あるいは充填、貯蔵および発送することができる。流体薬剤を充填した後、多孔性チューブのいずれかの末端または両末端を密封してよい。一部の事例において、例えば、延長された期間、流体薬剤中にチューブを浸漬することにより流体薬剤を充填する前に、多孔性チューブの一または両末端を密封してよい。
【０１１５】
チューブの細い直径および形状は、毛細管作用による簡便な充填を可能にする。チューブまたは複数のチューブを流体医薬組成物中に浸し、医薬組成物をチューブ内に吸い込ませることができる。閉鎖環境において、医薬組成物に陽圧を加えると、チューブ内により多量の医薬組成物が充填される。したがって、チューブ内の医薬製剤の量は、容易かつ確実に制御することができる。
【０１１６】
チューブの空隙率は、流体医薬組成物の溶液槽内にチューブを浸漬することによる簡便な充填を可能にする。医薬組成物は、例えば、チューブ材料の孔を通してあるいは透過性によりチューブ内に拡散し得る。チューブ内に拡散する医薬組成物の量は、例えば、外圧、孔径、透過性、チューブ長、溶液槽深度、溶液槽量、溶液槽に置かれた時間の量およびチューブ材料に影響され得る。
【０１１７】
中空および／または多孔性チューブ内に充填された医薬組成物は、１種または複数の治療剤を含む。本発明と適合性の治療剤の非限定的な例は、本明細書の他の部分で詳述されており、抗がん剤、抗炎症剤、抗感染剤、再生剤、弛緩剤、アポトーシス阻害剤、アポトーシス誘導剤、抗凝血剤、外皮用剤、増殖刺激剤、血管拡張剤、血管収縮剤、鎮痛剤、抗アレルギー剤および本明細書に記載されているいずれかの治療剤が挙げられる。一部の実施形態において、治療剤は抗がん剤である。
【０１１８】
ハイドロゲル
ハイドロゲルは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１０年７月２９日に公開された、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ｖｉａ  Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」と題するＬｕｏ、Ｌｅｅらによる米国特許出願公開第２０１００１８９７９４号明細書に記載されている。
【０１１９】
一部の実施形態において、ハイドロゲルを含む組成物は、組織にデリバリーされる。ハイドロゲルは、固形組織全体への医薬製剤の拡散または分散の速度を遅らせるのに有効である。一部の実施形態において、ハイドロゲルを含有する医薬組成物は、ハイドロゲルを欠く類似の医薬組成物よりも低い程度で固形組織全体に分散する。一部の実施形態において、ハイドロゲルを含有する医薬組成物は、ハイドロゲルを欠く類似の医薬組成物よりも遅く固形組織全体に分散する。ハイドロゲルは、１種のポリマーであっても、２種以上のポリマーの混合物であってもよい。一部の実施形態において、ハイドロゲルは有する。一部の実施形態において、ハイドロゲルは、２つの異なる分子量範囲を有する少なくとも１種のポリマーの二成分混合物を含む。一部の実施形態において、ハイドロゲルはＰＥＧである。さらに別の一実施形態において、２つの異なる分子範囲は、５００〜２，０００および４，０００〜８，０００を含む。さらにまた別の一実施形態において、２つの異なる分子範囲は、２，０００〜４，０００および８，０００〜２０，０００を含む。さらにまた別の一実施形態において、２つの異なる分子範囲は、４，０００〜８，０００および１０，０００〜４５，０００を含む。二成分系の分子量および比率を調整することにより、流体薬剤の拡散速度を制御することができる。
【０１２０】
ハイドロゲルの特性評価のための別の特性は引張強さである。ハイドロゲルは、乾燥状態で少なくとも２０ｇｆ／ｃｍ2の引張強さを有し得る。さらに別の一実施形態において、ハイドロゲルは、乾燥状態で２０〜１２０ｇｆ／ｃｍ2の引張強さを有する。一部の実施形態において、ハイドロゲルは、水和状態で少なくとも５ｇｆ／ｃｍ2の引張強さを有し得る。さらに別の一実施形態において、ハイドロゲルは、水和状態で５〜１５ｇｆ／ｃｍ2の引張強さを有する。
【０１２１】
ハイドロゲルは、医薬組成物の約１％〜約９９％の量で存在し得る。一部の実施形態において、ハイドロゲルは、医薬組成物の0.1%、約0.2%、約0.3%、約0.4%、約0.5%、約0.6%、約0.7%、約0.8%、約0.9%、約1%、約1.1%、約1.2%、約1.3%、約1.4%、約1.5%、約1.6%、約1.7%、約1.8%、約1.9%、約2%、約2.1%、約2.2%、約2.3%、約2.4%、約2.5%、約2.6%、約2.7%、約2.8%、約2.9%、約3%、約3.1%、約3.2%、約3.3%、約3.4%、約3.5%、約3.6%、約3.7%、約3.8%、約3.9%、約4%、約4.1%、約4.2%、約4.3%、約4.4%、約4.5%、約4.6%、約4.7%、約4.8%、約4.9%、約5%、約5.5%、約6%、約6.5%、約7%、約7.5%、約8%、約8.5%、約9%、約9.5%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約17%、約18%、約19%、約20%、約21%、約22%、約23%、約24%、約25%、約26%、約27%、約28%、約29%、約30%、約31%、約32%、約33%、約34%、約35%、約36%、約37%、約38%、約39%、約40%、約41%、約42%、約43%、約44%、約45%、約46%、約47%、約48%、約49%、約50%、約51%、約52%、約53%、約54%、約55%、約56%、約57%、約58%、約59%、約60%、約61%、約62%、約63%、約64%、約65%、約66%、約67%、約68%、約69%、約70%、約71%、約72%、約73%、約74%、約75%、約76%、約77%、約78%、約79%、約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、または約99%の量で存在する。
【０１２２】
ハイドロゲルは、多孔性となり得る。生体利用に適した例示的な多孔性ハイドロゲルは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第４，０１４，３３５号明細書に記載されている。このような材料として、架橋したポリビニルアルコール、ポリオレフィンもしくはポリビニルクロリド（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ｃｈｍｏｒｉｄｅ）または架橋したゼラチン；再生、不溶性、非浸食性（ｎｏｎ−ｅｒｏｄｉｂｌｅ）セルロース、アシル化セルロース、エステル化セルロース、酢酸プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、酢酸ジエチルアミノ酢酸セルロース；ポリウレタン、ポリカーボネートならびにポリカチオンおよびポリアニオン修飾した不溶性コラーゲンの共沈殿により生成された微小孔性ポリマーが挙げられる。
【０１２３】
一部の実施形態において、ハイドロゲルは、コラーゲンを含む。コラーゲン供給源の非限定的な例として、ＥＨＳ（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ）マウス肉腫基底膜、ウシアキレス腱、ウシ鼻中隔、ウシ気管軟骨、仔ウシ皮膚、ニワトリ胸骨軟骨、ヒト肺、ヒト胎盤、カンガルー尾部、マウス胸骨およびラット尾部腱が挙げられる。一部の事例において、コラーゲンは、ハイドロゲルの０．１％、０．２％、０．５％、０．７％、１％、１．２％、１．４％、１．６％、１．８％、２％または５％超を含むことができる。一部の事例において、組換えコラーゲンが用いられてよい。数種のコラーゲン供給源が、米国特許出願公開第２００７０２５４０４１号明細書に記載されている。水に不溶性のコラーゲン材料を用いてよく、これは、天然の組織供給源（例えば、レシピエントのヒトまたは他の患者に対し異種間、同種異系間または自源性（ａｕｔｏｇｅｎｉｃ））に由来しても、組換えにより調製してもよい。コラーゲンは、そのアミノ酸配列、炭水化物含量およびジスルフィド架橋の有無に応じていくつかの異なる型に細分類することができる。Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲンは、コラーゲンの最も一般的なサブタイプの２型である。Ｉ型コラーゲンは、皮膚、腱および骨に存在し、一方、ＩＩＩ型コラーゲンは、主に皮膚において見出される。本発明の組成物において用いられるコラーゲンは、皮膚、骨、腱または軟骨から得て、本技術分野および産業分野において周知の方法により精製することができる。あるいは、コラーゲンは、商業的供給源から購入することもできる。本発明における使用には、Ｉ型ウシコラーゲンが好ましい。
【０１２４】
コラーゲンは、アテロペプチドコラーゲンおよび／またはテロペプチドコラーゲンとなり得る。さらにまた、非線維性および線維性コラーゲンのいずれか一方または両方を用いてよい。非線維性コラーゲンは、可溶化されており、その天然の線維型に再構成されていないコラーゲンである。
【０１２５】
適切なコラーゲン製品は、例えば、牛皮からｓｅｍｅｄ  Ｆとして知られる線維性コラーゲンを製造するＫｅｎｓｅｙ  Ｎａｓｈ  Corporation（ペンシルベニア州エクストン）等から市販されている。牛皮に由来するコラーゲン材料は、Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｈｏｌｄｉｎｇ  Corporation（ニュージャージー州プレインズボロ）によっても製造されている。天然由来または組換えヒトコラーゲン材料も、本発明における使用に適している。例証として、組換えヒトコラーゲン製品は、Ｆｉｂｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サンフランシスコ）から入手できる。本発明の組成物に組み込まれた固体の粒子状コラーゲンは、例えば、インタクトなまたは再構成された繊維、あるいはランダムに成形された粒子の形態である。
【０１２６】
コラーゲンは、室温で水に溶解して水溶液を形成することができるが、３７度で重合を行ってゲルを形成する。米国特許第４，１６４，５５９号明細書において、Ｍｉｙａｔａは、コラーゲンの化学、分子構造および生化学的特性が、十分に確立されたことについて記す（Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、３巻、２３１〜２５３頁、１９７４年）。コラーゲンは、角膜、皮膚等、結合組織の主要タンパク質であり、ペプシン等、タンパク質分解酵素（コラゲナーゼ以外の）で処理することにより可溶化および精製することができる。可溶化されたコラーゲンは、テロペプチドが少なく、比較的安価であり、抗原性がなく、医用材料として有用である。酵素で可溶化された天然のコラーゲンは、酸性ｐＨにおいて可溶性であるが、生理的ｐＨにおいて３７度で重合してゲルを形成する。
【０１２７】
他の実施形態において、本技術分野において公知の様々な製剤において、ハイドロゲルは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。ＰＥＧハイドロゲルに存在し得るポリマーの非限定的な例として、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）およびポリカプロラクトン（ＰＣＬ）が挙げられる。これらのコポリマーの一部の例として、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＬＡ、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＡおよびｍＰＥＧ−ｂ＋ＰＣＬ（１２００）−ｂ−ＰＥＧ（６０００）−ｂ−ＰＣＬ（１２００）コポリマーが挙げられる。ＰＥＧは、少なくとも５００の分子量を有し得る。さらに別の一実施形態において、ＰＥＧは、４，０００〜８，０００の分子量を有する。さらにまた別の一実施形態において、ＰＥＧは、８，０００〜４５，０００の分子量を有する。ＰＬＧＡは、その生分解性および生体適合性のために、多くの食品医薬局（ＦＤＡ）に認可された治療デバイスにおいて用いられるコポリマーである。ＰＬＧＡは、２種の異なるモノマー、グリコール酸および乳酸の環状ダイマー（１，４−ジオキサン−２，５−ジオン）のランダム開環共重合により合成される。重合に用いたラクチド対グリコリドの比率に依存して、異なる型のＰＬＧＡを得ることができる。これは通常、用いたモノマーの比率に関して同定される（例えば、ＰＬＧＡ７５：２５は、その組成が７５％乳酸および２５％グリコール酸であるコポリマーを同定する）。あらゆるＰＬＧＡは、結晶性ではなくアモルファスであり、４０〜６０度の範囲のガラス転移温度を示す。薬物デリバリーまたは生体材料適用に関するＰＬＧＡの使用に関連して、極最小の全身性毒性がある。ＰＬＡは、トウモロコシデンプン、タピオカ産物またはサトウキビ等、再生可能な資源に由来する生分解性、熱可塑性の脂肪族ポリエステルである。ＰＣＬは、６０℃前後の低い融点および約−６０℃のガラス転移温度を有する生分解性ポリエステルである。ＰＣＬは、オクタン酸スズ等、触媒を用いたｅ−カプロラクトンの開環重合により調製される。ＰＣＬは、人体において用いられ、埋め込まれると緩慢に分解される、ＦＤＡに認可された材料である。
【０１２８】
薬物インプラント
一部の実施形態において、本開示は、薬物インプラントを用いて生体腫瘍において多重化学療法薬有効性試験を行う方法に関する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルは、無処置のがんの動物モデルまたは患者において増殖した腫瘍と同じ仕方で薬物に応答しないため、本開示の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養モデルのスクリーニングに優る利点を有する。したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルに基づいた、臨床に進むためまたは患者におけるがんの治療介入のための薬物の開発を探求する決断には問題がある。対照的に、本開示は、生体ヒト腫瘍との関係で、あるいはがんの動物モデルとの関係で、複数の潜在的な抗がん剤を同時に検査するための方法を提供する。
【０１２９】
一部の実施形態において、抗がん剤または被験薬剤を含む個々に調製された薬物インプラントは、薬物スティックの腫瘍内への平行挿入を可能にする導入針の整列した頭部を用いて固形組織内に分布される。注入デバイスは、導入針を通して腫瘍内に薬物インプラントを挿入させることができる。薬物インプラントは、固体ロッドまたはスティックを含むことができ、好ましくは、固形の薬剤を含むことができる。一部の事例において、薬物インプラントは、組織内における薬物の徐放または持続放出を可能にする不活性生分解性結合剤を含む。
【０１３０】
一部の実施形態において、薬物インプラントは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１ｍｍ未満の直径を有する。針アレイ頭部は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、２００、３００、４００種、または１，０００種を超える薬物インプラントを収容するよう構成することができる。複数の薬物インプラントを束ねて、針を用いた注入に適した直径を有する薬物インプラントの束を形成することができる。
【０１３１】
一部の実施形態において、注入デバイスは、針を通して固形組織に１種または複数の薬物インプラントを押し込むよう構成されたプランジャを含む。一部の実施形態において、固形組織は腫瘍を含む。
【０１３２】
腫瘍への挿入後、薬剤は、１分間〜６週間の期間にわたり１種または複数の薬物インプラントから放出されて、腫瘍の別々の部分を、空間的に限局された様式で個々に各薬物に曝露させることができる。
【０１３３】
薬物は、本開示の方法により平行軸に沿って腫瘍の深部またはｚ軸へと挿入されるため、薬物スティックの挿入路の横方向に（それに垂直または直交して）腫瘍の切片を作製することにより、各挿入薬物近位の範囲における腫瘍応答の解析を可能にし、これにより生体腫瘍との関係における薬物有効性の多重解析を可能にすることができる。あるいは、薬物は、身体の面に平行に挿入してもよい。
【０１３４】
本開示の一部の実施形態において、１種または複数の薬物インプラントは、針等、運搬デバイスの使用により組織内に挿入される。一部の好ましい実施形態において、複数の薬物インプラントは、本開示の針アレイの使用により組織の平行軸に沿って挿入される。
【０１３５】
一部の事例において、複数の針は、プランジャの押圧により組織内に薬物インプラントが駆出または薬物インプラントが注入されるように、複数のリザーバ内の複数の薬物インプラントまたは薬物インプラントの束に連結した複数のアクチュエータに取り付けられる。特定のさらに別の実施形態において、複数のプランジャのプランジャは、同時に押圧され得るよう、それぞれの第二の末端において動作可能に一体に連結される。
【０１３６】
インプラントは、組織内に部分的にまたは完全に埋め込むことができる。組織へのインプラントの配置は、針によりインプラントを組織内に挿入することにより容易となり得る。インプラントは、針に関連したプランジャを押圧することにより、組織内にさらに置くことができる。
【０１３７】
インプラントが組織内に置かれると、インプラントは、組織内に溶解し拡散することができる。拡散速度は、インプラントの体積に影響され得る、あるいは組織内におけるインプラントの溶解速度を低下させるよう作用する不活性結合剤の存在に影響され得る。薬剤は、約１分間〜約１ヶ月、約１時間〜約６週間、約１２時間〜約７２時間、約２４時間〜約４８時間、約１週間〜２週間、約２週間〜３週間または約３週間〜４週間の期間にわたり組織内に拡散することができる。
【０１３８】
デリバリーデバイスおよび方法
図１は、針および薬物インプラントの使用による組織への候補薬剤のデリバリーを図示する。針３は、組織内に挿入され、プランジャ１が押圧されて、薬物インプラント２を組織内に注入する。組織に挿入された後、候補薬剤４は、拡散等により組織にデリバリーされる。
【０１３９】
一部の実施形態において、１本または複数の多孔性チューブが、針等、運搬デバイスの使用により組織内に挿入される。一部の好ましい実施形態において、複数の多孔性チューブは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７３２１２号明細書に記載されている針アレイ等、針アレイの使用により組織の平行軸に沿って挿入される。
【０１４０】
一部の事例において、複数の針は、プランジャの押圧により多孔性チューブが駆出または多孔性チューブが組織内に注入されるように、複数のリザーバ内の複数の多孔性チューブまたは多孔性チューブの束に連結した複数のアクチュエータに取り付けられる。特定のさらに別の実施形態において、複数のプランジャのプランジャは、同時に押圧され得るように、それぞれの第二の末端において動作可能に一体に連結される。特定のさらにまた別の実施形態は、選択的に変化する速度で複数のプランジャの全てを押圧するよう構成されたプランジャドライバを含む。他の実施形態において、複数のアクチュエータのそれぞれは、第一および第二の末端を有する複数の流体伝送路の１本を含み、複数の流体伝送路それぞれの第一の末端は、複数のリザーバの各１個と連結されている。他の実施形態において、デバイスは、流体圧力源を含み、複数のアクチュエータのそれぞれは、流体圧力源と複数のリザーバの各１個との間に流体継手を含む。さらに別の実施形態において、流体圧力源は、圧縮機、真空アキュムレータ、蠕動ポンプ、親シリンダ、マイクロ流体ポンプおよびバルブのうち少なくとも１種を含む。
【０１４１】
別の一実施形態において、複数の針のそれぞれは、その全長にわたって分布する複数のポートを含む。多孔性チューブ内の流体薬剤は、これらのポートを介して固形組織と拡散的連絡するようになり、針挿入期間における組織への流体薬剤のデリバリーを可能にすることができる。この適用は、受動デリバリーの期間の制御に有用となり得る。一部の事例において、多孔性チューブの一末端は、開口していてよく、この末端への加圧が多孔性チューブからの流体薬剤のデリバリー速度を決定するように構成されている。
【０１４２】
ポートは、針に沿って様々に構成され得る。特定の実施形態において、複数のポートそれぞれのサイズは、針の先端から個々のポートまでの距離に反比例する。特定の他の実施形態において、複数のポートの分布密度は、針の先端から個々のポートまでの距離に反比例する。特定の他の実施形態において、複数のポートは、針の全長にわたってらせん状パターンで分布している。特定の他の実施形態において、複数のポートは、一対のポートがそれぞれ針の反対側に存在し、針の全長にわたって各ポート対が、隣接するポート対に対し９０度回転するよう配置されている。
【０１４３】
チューブは、組織内に部分的にまたは完全に埋め込むことができる。チューブは、中空であっても、あるいは多孔性材料を均一に含んでもよい。組織へのチューブの配置は、針によりチューブを組織内に挿入することにより容易にすることができる。チューブは、針に関連したプランジャを押圧することにより組織内にさらに置くことができる。
【０１４４】
チューブを組織内に置いた後、チューブを破損、切断、スライス、脱離または分離して、チューブの上端をチューブの下端から除去することができる。下端は組織内に置いておき、一方、上端は組織から除去する。一部の実施形態において、チューブの下端は治療剤を含有し、チューブの上端は治療剤を含有しない。一部の実施形態において、チューブの下端および上端はどちらも治療剤を含有する。
【０１４５】
チューブが組織内に置かれると、チューブの内容物（例えば、医薬組成物または治療剤）は、チューブから組織へと拡散することができる。拡散速度は、チューブの空隙率に影響され得る。内容物は、約１分間〜約１ヶ月、約１時間〜約１週間、約１２時間〜約７２時間または約２４時間〜約４８時間の期間にわたって、チューブ材料を通して組織内に拡散することができる。
【０１４６】
図２を参照すると、複数の針１１２と、多孔性チューブを含有する複数のリザーバ１１４と、本例においてはプランジャ１１６等である複数のデリバリーアクチュエータと、コントローラ１０２とを包含する、針アレイアセンブリ１００が示されている。複数の針１１２のそれぞれは、複数の針の他の針と相対的な位置に固定され、プランジャも同様に、適所に固定されて同時に作動できるよう動作可能に連結される。複数の針１１２のそれぞれは、複数のリザーバ１１４の各１個と流体連絡し、複数のプランジャのそれぞれは、複数のリザーバ１１４の各１個に配置された第一の末端を包含する。コントローラ１０２は、複数のプランジャ１１６それぞれの第二の末端に動作可能に連結される。コントローラは、運動のスピード、距離および方向に関してリザーバ内のプランジャの作動を制御するよう構成される。
【０１４７】
リザーバ１１４内の多孔性チューブのそれぞれは、異なる薬剤を装填することができる、あるいは多孔性チューブの一部または全部は、共通の薬剤を装填することができる。第二の方向における複数のプランジャ１１６の運動は、個々のリザーバ１１４に陽圧または過圧を生じ、個々の針１１２を介してリザーバの内容物を排出させる。
【０１４８】
本構成において、相対的に少量の複数の治療剤は、評価および解析のため、固形組織１０６の領域に直接的に同時に挿入することができる。挿入後、多孔性チューブ内の流体薬剤は、受動性拡散により周囲の組織に放出される。一部の実施形態において、組織にデリバリーされる治療剤の量は、一針当たり１μＬ未満である。組織１０６の評価およびそこにデリバリーされた異なる治療剤の有効性は、例えば、それに続く臨床試験の潜在的な治療剤のスクリーニングのために、あるいは組織１０６における治療剤の相対有効性に基づき対象特異的な治療決定を下すために用いることができる。
【０１４９】
様々な実施形態において、いかなる数の針を用いてもよい。例えば、僅か１、２または３本の針を用いてよく、一部の実施形態においては、千本を超える針を用いてもよい。
【０１５０】
図３は、別の一実施形態に係るデリバリーアセンブリ１５０の線図である。デリバリーアセンブリ１５０は、針アレイ１５２と、インサータセンブリ１９０と、アクチュエータアセンブリ１５６と、ドライバアセンブリ１５８と、制御アセンブリ２４０と、フレーム１６２とを包含する。フレーム１６２は、アセンブリ１５０の他の要素が連結する実質的に硬固な構造を提供する。
【０１５１】
針アレイ１５２は、複数の針シリンダ１６６と、針ブロック１６８とを含む。示されている実施形態において、針ブロック１６８は、フレーム１６２と統合されている。複数の針シリンダ１６６のそれぞれは、第一の末端１７０において、針ブロック１６８において延在する個々の針開口部１７４において連結されており、図示されている実施形態においては、０．１５ｍｍの呼び直径を有するルーメン１７６であって、針シリンダ１６６の実質的に全長に延在するルーメン１７６を含む。各針シリンダ１６６は、第一の末端１７０に向かう領域においてリザーバ１７８を、第二の末端に向かう領域において針１２０を、針シリンダ１６６の第二の末端に先端１２４を包含する。示されている実施形態において、先端１２４は先細に尖る。
【０１５２】
各デリバリー針１２０は、その全長にわたって分布する複数のポート１２２により画定される。複数の針シリンダ１６６それぞれの長さおよび各針１２０の長さは、実施形態に応じて変動する。一実施形態において、各針シリンダ１６６は、１５ｃｍよりも長いが、他の実施形態において、針シリンダのそれぞれは、それぞれ１０ｃｍよりも長い、５ｃｍ〜１０ｃｍの間および好ましくは２ｃｍを超える。同様に、様々な実施形態において、それに沿ってポート１２２が離間している各針シリンダ１６６の部分によって画定された、複数のデリバリー針１２０のそれぞれは、０．１ｃｍよりも長く、２ｃｍよりも長く、４ｃｍよりも長く、８ｃｍよりも長い。
【０１５３】
インサータセンブリ１９０は、針ブロック１６８における針シリンダ１６６の配置に対応する構成で、図３に示す通り複数の針シリンダ１６６のそれぞれが複数のインサータ針１４０の各１本の内に配置され得るように、そこに延在する個々のインサータ開口部１９０においてインサータブロック１９２と連結した複数のインサータ針１４０を含む。インサータセンブリ１９０は、針シリンダ１６６それぞれの先端１２４のみが複数のインサータ針１４０の各１本から延びる第一の位置と、針シリンダ１６６それぞれの第二の末端が個々のインサータ針１４０から延びる第二の位置との間で、針シリンダ１６６の長さにわたって軸方向にスライドすることができ、第二の位置は、個々のデリバリー針１２０のポート１２２の全てをクリアにするのに十分な距離である。
【０１５４】
一実施形態において、インサータブロック１９２と針ブロック１６８との間に配置されるように構成されたスペーサであって、インサータブロックおよび針ブロックが両者共にスペーサと係合すると、インサータブロックが第一の位置で維持されるようなサイズのスペーサが設置される。スペーサを取り除くと、インサータブロック１９２と針ブロック１６８の互いに対する運動が可能となり、針ブロックに対し第二の位置におけるインサータブロックの配置を可能にする。
【０１５５】
アクチュエータアセンブリ１５６は、針シリンダ１６６およびインサータ針１４０の配置と対応する構成で、複数のプランジャ２００それぞれの第二の末端２０８が、示されている複数の針シリンダ１６６の各１本のリザーバ１７８内に配置されるように、それぞれの第一の末端２０４においてプランジャブロック２０６と連結した複数のプランジャ２００を含む。Ｏリング２１０は、複数のプランジャ２００のそれぞれの第二の末端２０８に設置されて、個々のルーメン１７６の壁と密閉的に係合する。アクチュエータアセンブリ１５６は、アクチュエータブロック２１４に連結したアクチュエータ２１２も含み、そのアクチュエータブロック２１４は、プランジャブロック２０６に堅固に連結する。示されている実施形態において、アクチュエータ２１２は、本技術分野において周知の通りのシンブル２２２、バレル２２４およびスピンドル２２８を有するマイクロメータデバイス２２０を含む。バレル２２４は、フレーム１６２と堅固に連結しているが、スピンドル２２８は、フレーム１６２に対しアクチュエータブロックの並進運動を制御できるよう、アクチュエータブロック２１４と回転自在に連結する。マイクロメータデバイスは、０．０１ｍｍ増分で較正され、スピンドルは、シンブル２２２の一回転につき０．５ｍｍ移動し、最大ストロークは１５ｍｍである。したがって、シンブルの完全回転１回は、各針シリンダ１６６のルーメン１７８内で複数のプランジャそれぞれを０．５ｍｍ動かし、一周毎に約０．０００１ｃｍ3の容量または０．１ｎＬを移す。したがって、最大ストロークを１５ｍｍとすると、複数の針１２０それぞれの最大分注能力は、約３ｎＬである。
【０１５６】
ドライバアセンブリ１５８は、本技術分野において周知の通りのステッピングモータ２３０を含み、ステッピングモータ２３０は、モータケーシング２３２と、モータ２３０のロータと連結したモータシャフト２３４と、本技術分野において周知の通りの他の要素とを含む。モータケーシング２３２は、フレーム１６２と堅固に連結しており、モータシャフト２３４は、例えばスプライン継手等を介してそこに回転可能に係止しつつ、マイクロメータデバイスのシンブル２２２とスライド自在に連結する。したがって、モータシャフト２３４からの回転力は、シンブル２２２に伝わるが、シンブルの軸方向の運動は、モータシャフトにより制限されない。このような継手は、機械技術分野において周知のものである。図示されている実施形態のステッピングモータ２３０は、各回転を１２５ステップに分割するように構成されている。よって、モータ２３０の各増分的回転ステップは、シンブルを約３°回転させ、リザーバ１７８毎に約０．８ｐＬの容量を移動させる。
【０１５７】
コントローラアセンブリ１６０は、コントローラ２４０と、コントローラからステッピングモータ２３０へと延在する制御ケーブル２４２を包含する。
【０１５８】
モータシャフト２３４の方向、スピードおよび回転度を制御するためのシグナルは、このようなモータが属す分野における周知の仕方でコントローラ２４０からステッピングモータ２３０へと制御ケーブル２４２を介して伝わる。一実施形態において、コントローラはプログラム可能である。利用者は、回転スピードを選択することによりデリバリー針１２０からのデリバリースピードを、また、一部の事例においては、ロータの部分および完全回転の数を選択することによりデリバリーされる多孔性チューブの容量を制御するよう、コントローラをプログラムすることができる。別の一実施形態において、コントローラは、利用者がモータ２３０の回転の速度および方向をリアルタイムで制御するよう、手動で操作される。第三の実施形態において、ドライバおよびコントローラアセンブリは省略され、アクチュエータアセンブリ２１２のシンブル２２２を手動で回転させることにより、利用者がデリバリーを制御する。
【０１５９】
リザーバ１７８の装填は、多数の仕方で達成することができる。例えば、針シリンダ１６６の配置に対応する配置の複数のカップまたは区画を包含する装填容器を用意することができる。利用者は先ず、カップそれぞれの中の多孔性チューブ材料内に、選択された流体性薬剤または薬剤の組み合わせを置く。図３のデリバリーアセンブリ１５０は、図面に示す通り針シリンダを下に向け、アクチュエータ２１２のスピンドル２２８を完全に延長させて配置される。針１２０が個々のカップの内容物に完全に浸漬するまでフレーム１６２を下げる。次に、モータ２３０を逆方向に回転するよう制御して、スピンドル２２８を内部に引き込み、プランジャ２００を上に引き上げる。続いてこれにより、リザーバ１７８内に外界に対して陰圧が生じ、針ポート１２２を介して針シリンダ１６６内部に内容物を引き込む。リザーバが十分に装填されると、ロータの回転が停止し、針アレイ１５２が装填容器から引き抜かれる。
【０１６０】
装填物をデリバリーするため、一実施形態において、針アレイ１５２の針シリンダ１６６のそれぞれは、インサータセンブリ１９０のインサータ針１４０の各１本において、針１２０の先端１７８がインサータ針１４０から突出するように配置される。次に、針１２０の先端が対象の皮膚に貫入するよう、デリバリーアセンブリ１９０は、対象の標的組織領域と軸方向配列で配置され、軸方向に並進する。デリバリーアセンブリ１９０の軸方向の並進は、針シリンダ１６６の先端１２４が、標的組織領域の選択された距離内に貫入するまで持続する。次に、フレーム１６２およびそこに連結された要素は軸方向に動き続けるが、針１２０が標的組織領域内に延在するよう、インサータセンブリ１９０は適所に保持される。
【０１６１】
針１２０が正確に配置されると、デリバリーアセンブリ１９０の運動は停止され、フレーム１６２は対象に相対的な位置に保持される。次に、ステッピングモータ２３０を制御して前方向にシンブル２２２を回転させて、スピンドル２２８を延長させ、プランジャ２００を針シリンダ１６６内に送り、個々のリザーバ１７８内に過圧を生じ、これによりデリバリー針１２０のポート１２２を介してリザーバから標的組織領域へと内容物を排出させる。
【０１６２】
デリバリーは、数秒間で行うことができる、あるいは相対的に低い過圧下で数分間または数時間にわたり延長させて、周囲の組織内へのリザーバ内容物の完全吸収を促進することができる。図５を参照しつつ説明されている実施形態において、ステッピングモータ２３０は、プランジャ２００を１秒未満で全１５ｍｍ押圧するのに十分なほど速く、あるいは１回転に何時間もかけられるほど十分に遅くロータを回転させるよう制御することができる。
【０１６３】
次に図４を参照すると、別の一実施形態に係るデリバリーアセンブリ２７０の要素が示されている。針ブロック２７２は、そこを通って延在する、近接して離間したアレイに配置された大型の複数の針開口部２７４を包含する。針シリンダ１６６は、様々な種別の長さおよび数、サイズならびにポート間隔で別々に設置される。
【０１６４】
使用の際、利用者は、特定の手順に用いられる針の数を選択し、特定の針シリンダ１６６を選択し、特定の手順に選択される配置で、それぞれを針ブロックの複数の開口部２７４の各１個に置く。利用者は、例えば１〜５本等、少数の針のみを必要とし得る、あるいは数百または数千本の針を必要とし得る。さらに、針シリンダ１６６は、変動的な長さおよび構成のものとなり得る。針は、多孔性チューブ内に流体薬剤を前充填することができる。利用者は、対象の身体における標的組織領域のサイズ、形状および位置、標的組織領域における流体の所望の分布密度、標的組織の透過性等の要因に少なくとも部分的に応じて、針ブロック２７２における針シリンダ１６６の配置ならびにその個々の長さおよび構成を選択する。
【０１６５】
以前の実施形態のデリバリーアクチュエータは、プランジャとして説明されてきた。しかし、リザーバから針へとデリバリーされる治療剤の量を制御するために、いかなる適切なアクチュエータを用いてもよい。例えば、圧縮空気または圧縮液体等による流体圧力を用いて、多孔性チューブおよび針を介して生体組織の領域にデリバリーされる治療剤の量を制御することができる。
【０１６６】
続いて、図５を参照すると、別の一実施形態に係るデリバリーアセンブリ３００が示されている。デリバリーアセンブリ３００は、個々のリザーバ１７８および針１２０を含む複数の針シリンダ３０２を包含する。流体継手３１２は、針シリンダ３０２を多岐管３０４と流体連絡させる。流体圧力源３０６および流体真空源３０８はそれぞれ、バルブ３１０の操作により多岐管３０４と流体連絡させることができる。
【０１６７】
図５の実施形態において、針シリンダ３０２は、互いに固定されていないが、例えば標的組織領域に個別に据え付けることができる。デリバリー針１２０を選択された流体、例えば治療剤またはそれぞれの治療剤に置き、流体真空源を多岐管と流体連絡させてリザーバ内に陰圧を引いて、針の中に薬剤を引き込むことにより、リザーバを装填することができる。次に、利用者は、針１２０を標的組織領域に配置する。針を全て適所に配置したら、多岐管３０４を加圧し、針シリンダ１６６それぞれのリザーバから、個々のデリバリー針のポート１２２を介して流体を排出させる。図５は、単純な流体回路を示すが、実際には、このような回路が、バルブ、圧力レギュレータ、蠕動ポンプ、マイクロ流体ポンプ、真空アキュムレータ、圧縮機、コントローラ（これら全て本技術分野において周知であり、所定の適用の選択および構成は当業者の技能範囲内にある）等のいずれかを包含し得ることを理解されたい。
【０１６８】
候補薬剤のスクリーニング
本発明の薬物デリバリーデバイスは、１種または複数の治療剤を詰めた１種または複数の多孔性組成物を対象の組織に置くことにより、治療または候補治療剤を対象に投与する方法に有用である。複数の候補治療剤の空間的に制約されたデリバリーは、腫瘍等、固形組織に対する効果に関する薬剤の平行評価を可能にする。
【０１６９】
多孔性組成物内における流体薬剤は、治療剤に対する応答のモニタリングにおいて有用な色素を含有することができる。色素は、位置マーカーとなり得る、あるいは例えば蛍光により、画像処理後に生物機能の活性化または不活性化を報告するよう選ぶことができる。このプロセスにより、実験者は、対象生理系における治療剤の影響の直接的な判定を行うことができるようになる。
【０１７０】
治療または候補治療剤の効果の検出は、細胞または組織の生物機能の変化を判定することにより行うことができる。一部の実施形態において、生物機能は、経路、酵素の活性、遺伝子の発現、遺伝子の転写、遺伝子に関連したＲＮＡ分子の翻訳またはペプチド合成である。一部の実施形態において、生物機能は、がん、変性疾患、炎症、代謝、アポトーシスまたは免疫応答に関連する。一部の実施形態において、生物機能は、がんに関連する。一部の実施形態において、経路はがん経路である。一部の実施形態において、酵素は、がんに関連する。一部の実施形態において、遺伝子は、がんに関連する。一部の実施形態において、経路はアポトーシス経路であり、色素はアポトーシスを報告する。
【０１７１】
一部の実施形態において、遺伝子は、ABL1、ABL2、ACSL3、AF15Q14、AF1Q、AF3p21、AF5q31、AKAP9、AKT1、AKT2、ALK、ALO17、APC、ARHGEF12、ARHH、ARNT、ASPSCR1、ASXL1、ATF1、ATIC、ATM、BCL10、BCL11A、BCL11B、BCL2、BCL3、BCL5、BCL6、BCL7A、BCL9、BCR、BHD、BIRC3、BLM、BMPR1A、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRD3、BRD4、BRIP1、BTG1、BUB1B、C12orf9、C15orf21、CANT1、CARD11、CARS、CBFA2T1、CBFA2T3、CBFB、CBL、CBLB、CBLC、CCND1、CCND2、CCND3、CD74、CD79A、CD79B、CDH1、CDH11、CDK4、CDK6、CDKN2A-p14ARF、CDKN2A-p16(INK4a)、CDKN2C、CDX2、CEBPA、CEP1、CHCHD7、CHEK2、CHIC2、CHN1、CIC、CLTC、CLTCL1、CMKOR1、COL1A1、COPEB、COX6C、CREB1、CREB3L2、CREBBP、CRLF2、CRTC3、CTNNB1、CYLD、D10S170、DDB2、DDIT3、DDX10、DDX5、DDX6、DEK、DICER1、DUX4、EGFR、EIF4A2、ELF4、ELK4、ELKS、ELL、ELN、EML4、EP300、EPS15、ERBB2、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、ERG、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EVI1、EWSR1、EXT1、EXT2、EZH2、FACL6、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FBXW7、FCGR2B、FEV、FGFR1、FGFR1OP、FGFR2、FGFR3、FH、FIP1L1、FLI1、FLT3、FNBP1、FOXL2、FOXO1A、FOXO3A、FOXP1、FSTL3、FUS、FVT1、GAS7、GATA1、GATA2、GATA3、GMPS、GNAQ、GNAS、GOLGA5、GOPC、GPC3、GPHN、GRAF、HCMOGT-1、HEAB、HEI10、HERPUD1、HIP1、HIST1H4I、HLF、HLXB9、HMGA1、HMGA2、HNRNPA2B1、HOOK3、HOXA11、HOXA13、HOXA9、HOXC11、HOXC13、HOXD11、HOXD13、HRAS、HRPT2、HSPCA、HSPCB、IDH1、IDH2、IGH@、IGK@、IGL@、IKZF1、IL2、IL21R、IL6ST、IRF4、IRTA1、ITK、JAK1、JAK2、JAK3、JAZF1、JUN、KDM5A、KDM5C、KDM6A、KDR、KIAA1549、KIT、KLK2、KRAS、KTN1、LAF4、LASP1、LCK、LCP1、LCX、LHFP、LIFR、LMO1、LMO2、LPP、LYL1、MADH4、MAF、MAFB、MALT1、MAML2、MAP2K4、MDM2、MDM4、MDS1、MDS2、MECT1、MEN1、MET、MHC2TA、MITF、MKL1、MLF1、MLH1、MLL、MLLT1、MLLT10、MLLT2、MLLT3、MLLT4、MLLT6、MLLT7、MN1、MPL、MSF、MSH2、MSH6、MSI2、MSN、MTCP1、MUC1、MUTYH、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、MYH11、MYH9、MYST4、NACA、NBS1、NCOA1、NCOA2、NCOA4、NF1、NF2、NFIB、NFKB2、NIN、NONO、NOTCH1、NOTCH2、NPM1、NR4A3、NRAS、NSD1、NTRK1、NTRK3、NUMA1、NUP214、NUP98、NUT、OLIG2、OMD、P2RY8、PAFAH1B2、PALB2、PAX3、PAX5、PAX7、PAX8、PBX1、PCM1、PCSK7、PDE4DIP、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PER1、PHOX2B、PICALM、PIK3CA、PIK3R1、PIM1、PLAG1、PML、PMS1、PMS2、PMX1、PNUTL1、POU2AF1、POU5F1、PPARG、PRCC、PRDM16、PRF1、PRKAR1A、PRO1073、PSIP2、PTCH、PTEN、PTPN11、RAB5EP、RAD51L1、RAF1、RANBP17、RAP1GDS1、RARA、RB1、RBM15、RECQL4、REL、RET、ROS1、RPL22、RPN1、RUNX1、RUNXBP2、SBDS、SDH5、SDHB、SDHC、SDHD、SEPT6、SET、SETD2、SFPQ、SFRS3、SH3GL1、SIL、SLC45A3、SMARCA4、SMARCB1、SMO、SOCS1、SRGAP3、SS18、SS18L1、SSH3BP1、SSX1、SSX2、SSX4、STK11、STL、SUFU、SUZ12、SYK、TAF15、TAL1、TAL2、TCEA1、TCF1、TCF12、TCF3、TCL1A、TCL6、TET2、TFE3、TFEB、TFG、TFPT、TFRC、THRAP3、TIF1、TLX1、TLX3 TMPRSS2、TNFAIP3、TNFRSF17、TNFRSF6、TOP1、TP53、TPM3、TPM4、TPR、TRA@、TRB@、TRD@、TRIM27、TRIM33、TRIP11、TSC1、TSC2、TSHR、TTL、USP6、VHL、WAS、WHSC1、WHSC1L1、WRN、WT1、WTX、XPA、XPC、ZNF145、ZNF198、ZNF278、ZNF331、ZNF384、ZNF521、ZNF9、mTOR、MEK、PI3K、HIF、IGF1R、GLS1、またはZNFN1A1である。一部の実施形態において、経路は、上述の遺伝子のいずれかに関連する。一部の実施形態において、ペプチド合成のペプチドは、上述の遺伝子のいずれかの遺伝子産物である。
【０１７２】
一部の実施形態において、標的組織は、疾患の特色を示さず、色素は、１種または複数の化合物に対する個々の組織の応答の判定に用いることができる。一部の事例において、１種または複数の化合物は、組織内に変化した生理状態を生じるために投与することができる。変化した生理状態は、対象または生物ソースから得られた生物試料における変化した（例えば、適切な対照と比べて統計的に有意な仕方で測定可能に変化した）構造または機能の検出を可能にする領域または生物試料等、固形組織（および一部の実施形態において、固形腫瘍）における状況、プロセス、経路、動的構造、状態または他の活性に直接的に関係するいずれかの検出可能パラメータとなり得る。したがって、本発明の方法は、このような相関に部分的に関係し、変化した生理状態の指標は、例えば細胞または生化学的活性、さらに非限定的な例として、細胞生存率、細胞増殖、アポトーシス、抗増殖シグナルに対する細胞抵抗性、細胞運動性、結合組織分解酵素の細胞発現もしくは同化作用、血管新生の細胞補充または本明細書に提示されている他の判断基準等となり得る。
【０１７３】
変化した生理状態は、固形組織機能に直接的または間接的に関与する任意の構造または活性が、対照または標準と比べて統計的に有意な仕方で変化した、任意の状態または機能をさらに意味することができ、固形組織構成成分と導入された薬剤との間の直接または間接相互作用を起源とする、あるいは代謝産物、異化産物、基質、前駆体、補助因子等、このような相互作用の結果生成され得る中間体の間の相互作用の結果生じる構造的または機能的変化を起源とすることができる。さらに、変化した生理状態として、対象または生物ソースの一部または全部の細胞または組織における、一部の実施形態においては固形組織の一部または全部の細胞における、一部の実施形態においては固形組織における固形腫瘍等、腫瘍の一部または全部の細胞における、変化したシグナル伝達、呼吸、代謝、遺伝的、生合成または他の生化学的もしくは生物物理学的活性を挙げることができる。非限定的な例として、酵素的機序によるものであれ非酵素的機序によるものであれ、細胞内のアポトーシス経路の誘導ならびに異型の化学的および生化学的に架橋された化学種の生成等、変化した生物学的シグナル伝達、細胞生存率、細胞増殖、アポトーシス、抗増殖シグナルに対する細胞抵抗性、細胞運動性、結合組織分解酵素の細胞発現もしくは同化作用、血管新生の細胞補充または他の判断基準は全て、変化した生理状態を示すものとして考慮することができる。
【０１７４】
一実施形態において、複数の治療剤がデリバリーされた固形組織は、それに続いて、対象から切除して評価することができる。例えば、標的組織ががん性腫瘍である場合、そこに注入された複数の薬剤は、このような腫瘍におけるその有効性または効果が調査中である数種の薬剤を包含することができる。様々な薬剤をｉｎ  ｖｉｖｏで注入し、続いて選択された期間待機して、その後腫瘍を除去することにより、腫瘍ｉｎ  ｓｉｔｕにおける薬剤の効果を調査することができる。この操作は、腫瘍微小環境を保存し、この方法を現在のｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ療法評価方法から区別する。各薬剤は、時間と共に例えば、周囲の組織の密度、薬剤の粘性および組成、個々の薬剤による組織の水和性等の要因に応じて、多かれ少なかれそのデリバリー軸から外部に浸透する。通常、薬剤が拡散する組織の部分は、個々のデリバリー軸に対し同軸の略円柱状領域である。
【０１７５】
様々な実施形態において、組織の領域は、切除する前にある期間放置される。例えば一般に、デリバリー後４８〜７２時間の期間は、腫瘍が検出可能な応答を示すのに十分であると考えられる。他の事例において、待機期間は、数時間、数日間または数週間となり得る。一部の実施形態において、組織領域は、公知の方法を用いて画像処理され、針の挿入前の組織の標的領域を正確に位置づけることができる。領域は、組織の領域に複数の薬剤をデリバリーする前と後に反復的に画像処理することができる。
【０１７６】
一部の実施形態において、関連技術分野の当業者にとって公知の、多数の公知の組織学的、組織化学的、免疫組織学的、病理組織学的、顕微鏡的（形態計測解析および／または三次元再構築等）、細胞学的、生化学的、薬理的、分子生物学的、免疫化学的、画像処理または他の分析的技法のいずれかによる解析のため、切除された組織は、平行軸に対して実質的に垂直（例えば、垂直または垂直から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５度以上も逸脱して）である平行面に沿って、複数の連続した組織学的切片に切断することができる。例えば、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｂａｎｃｒｏｆｔ  ａｎｄ  Ｇａｍｂｌｅ、Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（第６版）２００７  Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、英国オックスフォード；Ｋｉｅｍａｎ、Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、２００１  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー；およびＭ．Ａ．Ｈａｙａｔ（編）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ−第１および２巻、２００７年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹを参照されたい。画像処理は、分注用針が固形組織内に挿入される前、その間、その後に行うことができる。
【０１７７】
他の実施形態において、組織の部分が切除された後、複数の薬剤は、針アレイの複数の針の各１本を介して組織の該部分にデリバリーされる。
【０１７８】
次に、図６を参照すると、注入手順と、それに続く摘出の後の腫瘍３２０の部分が示されている。腫瘍３２０の切片を作製して、デリバリー軸に対し実質的に垂直となる面に沿って複数のスライス３２２を作製した。円柱状デリバリー領域３２４は、各薬剤の浸透領域を画定し、切片３２２の面に垂直に延在する。
【０１７９】
領域３２４の多くは、利用者に容易に検出可能とはならない可能性があるため、一般に少なくとも２個の容易に検出可能な位置マーカー３２４ａ、３２４ｂが、それぞれ広く隔たった位置において注入される薬剤となる。次に、利用者は、デリバリー軸それぞれの位置がマークされたテンプレートを重ね合わせ、テンプレートに示されているマーカーの位置を、所定の切片３２２の検出可能な位置マーカー３２４ａ、３２４ｂと合わせ、これにより、その他のデリバリー領域３２４を位置づけることができる。位置マーカー３２４ａ、３２４ｂは、利用者により検出可能ないずれかの組成物となることができる。様々な例示的な位置マーカーは、本開示の他の部分に詳細に記載されている。一実施形態において、位置マーカーは、注入手順後の延長された期間検出可能となるよう、また、テンプレートの位置決定のための的確なガイドを提供するよう、周囲の組織への浸透および拡散に抵抗し、例えば３２４ａに示す通り、細い円柱状に濃縮を維持するよう選択される。
【０１８０】
位置マーカーに加えて、対照薬剤も、注入される薬剤の内の１種となり得る。例えば、陰性対照は、他の薬剤においてはビヒクルとして用いられる物質を含むことができ、陽性対照は、他のデリバリー軸において個々にデリバリーされる薬剤の大部分または全部の化合物を含むことができる。
【０１８１】
腫瘍３２０の切片を作製した後、利用者は、より詳細に後述する通り、腫瘍３２０の様々な切片３２２のデリバリー領域３２４において選択されたアッセイを行う。本明細書に開示されているデバイスおよび方法の利益の一つは、腫瘍における所定の薬剤の有効性の評価に加えて、様々なデリバリー領域３２４における薬剤の有効性を評価および比較することができることである。さらに、腫瘍の様々な部分における所定の薬剤の効果は、垂直および水平の両方で評価することができる。例えば切片３２２ａにおけるデリバリー領域３２４ｃにおける薬剤の効果を、切片３２２ｂおよび３２２ｃにおける同一領域３２４ｃにおけるその効果と比較することにより、垂直に生じ得る異なる組織組成における該薬剤の効果を区別することができる。同様に、同一薬剤を、アレイとして数本のデリバリー軸、例えば、３２４ｃおよび３２４ｄにデリバリーして、次に、所定の切片３２２のこれらの位置における相対効果を比較して、水平的区別を達成することができる。本技術分野において周知の通り、生体組織は、相対的に短い距離であっても滅多に均一ではない。所定の薬剤は、ある組織構造における腫瘍の効果が実質的にない一方、他の組織構造においては非常に有効となり得る。上に記す通り、このようなディファレンシャルな効果を検出し評価することができる。
【０１８２】
評価され得る別の有用な一態様は、薬剤が組織内で相互作用する領域における複数の薬剤の効果である。デリバリー領域３２４ｅおよび３２４ｆは、他の領域よりも互いに近接して離間し、個々のデリバリー領域が重複する領域３２４ｅｆにおいて、個々の薬剤の相互作用が生じる。
【０１８３】
本発明において企図される特定の実施形態において、候補薬剤の有効性は、Ｈａｎａｈａｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ（２０００  Ｃｅｌｌ  １００：５７）およびそこに引用されている参考文献に総説されているパラメータ等、がん細胞に特徴的な多数の生物学的パラメータのいずれかを判定することによる等、本明細書に提示されている変化した生理状態を検出することにより同定することができる。その文中には、がん細胞により示され、（ｉ）アポトーシスから逃れる能力、（ｉｉ）増殖シグナルにおける自給自足（ｓｅｌｆ−ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）の獲得、（ｉｉｉ）増殖阻害シグナルに対する非感受性、（ｉｖ）組織浸潤性および転移性表現型の獲得、（ｖ）無制限の複製能および（ｖｉ）持続的な血管新生のうち１種または複数を決定するための、本技術分野で公知の種々の技法のいずれかにより検出可能な１つまたは複数の形質における候補薬剤の効果を決定するための手法が開示されている。当業者であれば、特定の切除された腫瘍系に適応され得るこれらの生理状態変化の存在を検出するための複数のアプローチに精通している。例えば、Ｂｏｎｉｆｉｃａｎｏら（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００７  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌら（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００７  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ；Ｃｏｌｉｇａｎら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００７  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、２００７  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹを参照されたい。アッセイされて変化した生理状態を同定することができるパラメータの非限定的な例として、例えば、免疫組織化学のｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション（例えば、Ｓｈｉｂａｔａら、２００２  Ｊ．Ａｎａｔ．２００：３０９）、細胞内リン酸化タンパク質局在（例えば、Ｇａｖｅｔら、１９９８  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１１：３３３３）等による、細胞生存率、細胞分裂、アポトーシス、壊死、細胞表面マーカー発現、細胞活性化状態、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）成分またはＥＣＭ分解酵素の細胞同化作用、形態計測解析、細胞プロセスの拡張または退縮、細胞骨格再編成、変化した遺伝子発現のアッセイが挙げられる。
【０１８４】
本明細書に記載されている通り、変化した生理状態の少なくとも１種の指標のレベルの決定を用いて、臨床試験参加の適格性に関して対象集団を層別化してもよい。上述および関連する実施形態は、現在の事例よりも初期段階の発症における候補治療化合物の評価に関連する利点を有利に提供するものとして企図されている。例えば、第ＩＩ相試験の前にバイオマーカーパラメータ（対象排除の基盤となり得る）を確立することは現在の標準臨床試験実施ではないが、一方、本明細書に記載されている実施形態は、例えば、第ＩＩ相において確立されたバイオマーカー判断基準なしでも有用な結果を生じることができる。したがって、本発明において開示されている特定の実施形態の実施により、固形腫瘍の腫瘍学的薬物開発プログラムにおいて、特定の候補薬剤に対する非応答者の結果に基づき、応答がないあるいは利益が期待できない対象を臨床試験から時間効率的かつ費用効果的に排除させる様式等により、以前の事例よりも早く候補薬剤の特性に関する関連情報を得ることができることが想定される。
【０１８５】
例えば、本明細書に記載されている通りに決定される、変化した生理状態の少なくとも１種の指標のレベルに従った対象集団の層別化は、がん対象において用いられる任意の候補治療剤の有効性と相関させるためおよび／または対象を応答者、非応答者または可能性のある応答者として分類するために有用なマーカーを提供することができる。
【０１８６】
一部の実施形態において、本方法は、潜在的な新規療法を同定および機能的に特徴付けるための前臨床動物モデルにおける等、薬物スクリーニングおよび創薬において有用である。例えば、複数のｓｉＲＮＡを腫瘍内投与して、所望の標的遺伝子の発現をノックダウンするそれらの相対能力を比較することができる。他の同様の実施形態は、臨床状況における用途を見出すことができ、例えば、特定の腫瘍における効果がない公知の治療剤を検討から「除外」または排除して、これにより無効な治療レジメンの投与に関連し得る時間損失および望ましくない副作用を回避することにより、対象の治療管理を有利に進めることができる。
【０１８７】
一部の実施形態は、固形組織が、薬剤デリバリーを行うことができるおよび／または試料回収できる腫瘍、固形腫瘍を含む実施形態を包含する。当業者であれば、本明細書における開示から、本明細書に記載されている特定の実施形態の実施過程において、選択された腫瘍領域が、本発明において説明されているデバイスの針が挿入され、導入される部位、あるいは他の仕方で腫瘍と接触する部位を含み得ることが認められよう。領域は、針挿入、導入または接触ステップの前、その間またはその後に行うことができる画像処理に基づく、あるいは対象から固形組織を切除する前、その間またはその後に行われる画像処理に基づく、あるいは解剖学的位置、外科手技の過程におけるアクセス容易性、血管新生の程度または他の判断基準等が挙げられるがこれらに限定されない他の判断基準に基づく等、いかなる数の根拠に基づき選択してもよい。
【０１８８】
レポーター細胞株の生成
本開示は、レポーター細胞株を生成する方法であって、細胞がシグナル経路のモジュレーションを示す検出可能なシグナルを発光する方法を提供する。いくつかの実施形態では、レポーター細胞株はがん細胞株および、発がん経路のモジュレーションを表す組み込まれたレポーターを含む。いくつかの実施形態では、レポーター細胞株は、ルシフェラーゼに基づく活性を示すジーントラップを用いて生成される。レポーターは発がん経路の阻害を報告できる。いくつかの実施形態では、本開示は、シグナル経路のモジュレーションに応答して検出可能なシグナルを提供するためのレポーター細胞株およびレポーター組織の使用を含む。選択プロセスは、ジーントラップに由来するルシフェラーゼに基づく活性状態レポーターを作製するために使用されうる。得られたレポーター細胞は、特定の発がん経路の阻害に応答して強い陽性シグナル（例えば電磁放射線の発光）を生成する。がん経路の活性化状態が転写性産生量として反映されることは、通常細胞と比較してがん遺伝子活性化腫瘍において遺伝子の特定のセットが上方制御および下方制御されることから十分に確立された知見である。本明細書に記載のジーントラップは、本来のプロモーター、エンハンサー、インスレーターおよびマイクロＲＮＡが発現を調節する内在性遺伝子中にレポーターを導入することにより本来の腫瘍生物学を反映する。適切な薬物選択戦略と組み合わせるとジーントラップベクターは、対象の各阻害経路に対して最も応答性の内在性遺伝子への組み込みに続いてトラップされたレポーターを発現する腫瘍細胞の迅速な単離を可能にする。したがって一つのベクターは、対象の任意の活性化発がん経路を保有する任意の腫瘍細胞型に適用可能である。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、検出可能なシグナルは、蛍光タンパク質を含み、その非限定的例は
GFP、BFP、CFP、YFP、EGFP、EYFP、Venus、Citrine、phiYFP、copGFP CGFP、ECFP、Cerulean、CyPet、T-Sapphire、Emerald、YPet、AcGFP1、AmCyan、AsRed2、dsRed、dsRed2、dsRed-Express、EBFP、HcRed、ZsGreen、ZsYellow、J-Red、TurboGFP、Kusabira Orange、Midoriishi Cyan、mOrange、DsRed-モノマー、mStrawberry、mRFP1、tdTomato、mCherry、mPlum、およびmRaspberry。
を含む。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、検出可能なシグナルは、酵素反応の検出可能な生成物を含む。反応生成物が当技術分野において周知の方法によって検出可能である酵素の非限定的例は、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼおよびラクタマーゼを含む。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、レポーター細胞株は、がん細胞株を含む。がん細胞株の非限定的例は、前立腺がん、乳がん、結腸がん、肺がん、脳がんおよび卵巣がん由来の細胞株を含む。特定の実施形態では、がん細胞株は、腺腫、腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、小細胞癌、大細胞未分化癌、軟骨肉腫および線維肉腫から選択されるがんに由来する。ＥＧＦレポーター（例えばＨＣＣ８２７肺癌）、ＲＡＳ（例えばＡ５４９肺癌、ＨＣＴ−１１６結腸癌）またはＰＩ３Ｋ（ＨＣＴ−１１６結腸癌、ＭＣＦ７乳癌、Ｔ４７Ｄ乳癌）のいずれかの活性化変異または腫瘍抑制因子ＰＴＥＮ（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌、ＥＶＳＡ−Ｔ乳癌）の非活性化変異を保有することが周知の乳房、肺および結腸腫瘍株は用いられうる。
【０１９２】
本方法において用いられうる一般に用いられる細胞株の非包括的一覧は、
293-T、3T3細胞、721、9L、A2780、A2780ADR、A2780cis、A172、A20、A253、A431、A-549、ALC、B16、B35、BCP-1細胞、BEAS-2B、bEnd.3、BHK-21、BR293、BxPC3、C3H-10T1/2、C6/36、Cal-27、CHO、COR-L23、COR-L23/CPR、COR-L23/5010、COR-L23/R23、COS-7、COV-434、CML T1、CMT、CT26、D17、DH82、DU145、DuCaP、EL4、EM2、EM3、EMT6/AR1、EMT6/AR10.0、FM3、H1299、H69、HB54、HB55、HCA2、HEK-293、HeLa、Hepa1c1c7、HL-60、HMEC、HT-29、Jurkat、JY細胞、K562細胞、Ku812、KCL22、KG1、KYO1、LNCap、Ma-Mel 1-48、MC-38、MCF-7、MCF-10A、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-435、MDCK II、MDCK II、MOR/0.2R、MONO-MAC 6、MTD-1A、MyEnd、NCI-H69/CPR、NCI-H69/LX10、NCI-H69/LX20、NCI-H69/LX4、NIH-3T3、NALM-1、NW-145、OPCN/OPCT細胞株、Peer、PNT-1A/PNT 2、RenCa、RIN-5F、RMA/RMAS、Saos-2細胞、Sf-9、SkBr3、T2、T-47D、T84、THP1細胞株、U373、U87、U937、VCaP、Vero細胞、WM39、WT-49、X63、YAC-1、YAR。
を含む。
【０１９３】
レポーターは、レポーター細胞株を作製するために細胞株に導入されうる。レポーターは、活性化において検出可能なシグナルを生成する生物学的エレメントを意味する。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞株は、最適化されたジーントラップベクターを形質導入され、がん経路特異的レポーター細胞を得るための選択プロセスに供される。例えばレポーター細胞株は、ＥＧＦ、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴまたはＲＡＳ経路阻害を検出できる。いくつかの実施形態は、スプライス受容体ならびにレポーターおよび選択可能マーカー（例えばＮｅｏ）をコードするスプライスドナー配列隣接遺伝子を含むアプロモーターレス（ａｐｒｏｍｏｔｅｒｌｅｓｓ）トラッピングカセットに関連する。遺伝子に組み込まれた場合、レポーターの発現は内在性プロモーター、エンハンサーおよびインスレーターによって調節される。したがってレポーター活性は、内在性遺伝子の発現を正確に示す。
【０１９４】
レポーターは、直接検出可能である（例えば蛍光タンパク質）または間接的に検出可能である（例えば酵素）シグナルを生成できる。検出は、これだけに限らないが放射線計測、目視観測、分光光度計での測定、蛍光励起に続く視覚化を含む。多数の検出可能な成分が当業者に周知であり、これだけに限らないが粒子、フルオロフォア、ハプテン、酵素およびそれらの比色、蛍光発生、化学発光基質ならびにＲＩＣＨＡＲＤ  Ｐ．ＨＡＵＧＬＡＮＤ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ  ＰＲＯＢＥＳ  ＡＮＤ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ  １０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、ＣＤ−ＲＯＭ、Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００５）に記載されている他の標識を含む。
【０１９５】
レポーター分子は、発色団、フルオロフォア、蛍光タンパク質、リン光色素、タンデム色素、粒子、ハプテン、酵素および放射性同位元素を非限定的に含む。蛍光タンパク質の非限定的例は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびフィコビリタンパク質ならびにそれらの誘導体を含む。化学発光を産生する酵素およびそれらの適切な基質も本明細書に記載のレポーター分子において用いられうる。そのような酵素は、これだけに限らないがルシフェラーゼおよびエクオリン（例えばホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）ルシフェラーゼ）の天然形態および組換え形態を含む。追加的に、安定なジオキセタン、ルミノール、イソルミノールおよびアクリジンエステルを含有するものなどのホスファターゼ、グリコシダーゼおよびオキシダーゼのための化学発光産生基質も本明細書に記載のレポーター分子において用いられうる。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、ガウシアルシフェラーゼが用いられる。ガウシアルシフェラーゼは、ヒト化、膜アンカー化および細胞外に提示されるように操作されうる。ルシフェラーゼの使用は、セレンテラジンなどのルシフェラーゼ基質の存在下で生きた動物におけるレポーター活性のリアルタイム可視化を可能にする。
【０１９７】
レポーターの細胞表面発現は検出を促進し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択のためにも有用である。経路阻害によって上方制御される遺伝子内で生じるトラッピング事象は、ルシフェラーゼ陽性細胞（フローアシスト細胞選別（ｆｌｏｗ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ）などの方法を用いてそれらの蛍光に基づき単離されうる）をもたらす。
【０１９８】
本開示は、レポーター細胞株を生成するための選択に基づく方法を提供する。いくつかの実施形態では、選択は、周知の経路阻害物質の亜致死性濃度を用いて実施される。ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）、ＭＫ−２２０６およびＰＤ３２５９０１は、ＥＧＦ、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴおよびＲａｓ経路阻害物質応答性レポーターを選択するためにそれぞれ用いられうる。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、選択プロセスにおいて用いられる薬剤の（対象の発がん経路の阻害に無関係な）オフターゲット活性に応答するジーントラップは、対象の発がん経路の（最初の選択ステップにおいて用いられる阻害物質と構造的に無関係な）第二阻害物質を用いる対抗スクリーニング（ｃｏｕｎｔｅｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）ステップによって除外される。第二阻害物質への応答においてレポーターの誘導可能な発現を保持している細胞は、クローニングされ、さらなる解析のために増殖されることができる。いくつかの実施形態では、トラップされた遺伝子の同定は、当技術分野において周知のＰＣＲに基づく方法によって達成される。
【０２００】
いくつかの実施形態では、ジーントラップは、レポーター構築物の導入後に細胞が動物モデルに異種移植される選択戦略を用いてｉｎ  ｖｉｖｏで生成される。異種移植後、がん細胞は動物モデル内で腫瘍を形成でき、この腫瘍が経路阻害への細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ応答を検査するための基礎として役立ちうる。ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍コンテクストにおいて１つまたは複数の周知の経路阻害物質に応答するこれらの細胞は、次いで（例えばＦＡＣＳによって）単離され、レポーター細胞株としての使用のために開発されうる。
【０２０１】
レポーター細胞株は、「オン」および「オフ」の両方の経路状態を示すように生成されうる。いくつかの実施形態では、第一レポーター細胞株がシグナル経路のモジュレーションに応答して検出可能なシグナルを産生するように生成され、第二レポーター細胞株が第一レポーター細胞株から産生される（第二レポーター細胞株は前記シグナル経路のモジュレーションにおいて第二の検出可能なシグナルを生成する）。いくつかの実施形態では、第一の検出可能なシグナルは、シグナル経路の活性化を示し、第二の検出可能なシグナルはシグナル経路の阻害を示す。
【０２０２】
組織モデル
いくつかの実施形態では本開示は、レポーター組織において候補治療剤をスクリーニングするための系を例示する。レポーター組織は、レポーター細胞株を用いて動物モデル内で生成されうる。いくつかの実施形態では、動物モデルは、マウスモデルまたはラットモデルの内の１つである。動物モデルは、異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）または異種移植（ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）（用語は生存細胞、組織または臓器の１つの種から別への移植を意味して互換的に用いられる）のレシピエントであってよい。いくつかの実施形態では、レポーター組織は、１つまたは複数のレポーター細胞の免疫低下動物（ＳＣＩＤマウスまたはヌードマウスなど）への異種移植から生成した腫瘍である。胸腺欠損ヌードマウスは、劣化した胸腺または胸腺欠損を生じ、Ｔ細胞の数が大きく低下していることにより阻害された免疫系をもたらす遺伝的変異を有する株由来の実験用マウスである。前臨床モデルにおける免疫低下状態は、遺伝的異常の結果である場合があり、または免疫系機能を抑制する薬物治療の結果である場合もある。
【０２０３】
モデルにおける腫瘍細胞移植は、原発性および転移性の腫瘍局在性を刺激するために種々の部位（皮下、腹腔内、乳房脂肪パッド、肝内、肺内、頭蓋内および心臓内）に実施されうる。腫瘍スフェロイドの移植も実施されうる。異種移植された腫瘍は、前記哺乳動物への腫瘍の移植によって得られ、前記腫瘍は新鮮な外科的検体、腫瘍細胞株、固形腫瘍由来の細胞、がん性細胞のスフェロイドおよび宿主動物における腫瘍継代から得られた腫瘍小片からなる群から選択される。
【０２０４】
免疫抑制薬物または免疫抑制剤は、免疫系の活性を阻害するまたは抑制する薬物である。免疫抑制薬物の非限定的例は、グルココルチコイド；細胞分裂阻害剤；アルキル化剤；メトトレキサートなどの葉酸類似物ならびにアザチオプリンおよびメルカプトプリンなどのプリン類似物を含む代謝拮抗薬；アザチオプリンおよびメルカプトプリン；ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシンおよびミトラマイシンを含む細胞傷害性抗生物質；免疫系のエレメントを標的化するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体；ならびにシクロスポリン、タクロリムス、ボクロスポリンおよび他のカルシニューリン阻害物質ならびにシロリムスを含むイムノフィリンに作用する薬物；インターフェロン、オピオイド、ＴＮＦ結合タンパク質、ミコフェノレートならびにフィンゴリモドを含む。
【０２０５】
レポーター組織は、疾患または障害の特質を示すまたは示さない固形組織を含みうる。レポーター組織は、組織スキャフォールドにおいて操作された人工的組織であってよい。
【０２０６】
レポーター組織は、任意の固形組織を含みうる。固形組織は医学分野において十分に周知であり、関連する結合組織由来の構造的統合性を含みうるまたは由来することができ、薄膜（例えば髄膜、心膜、胸膜、粘膜、基底膜、網、臓器包膜（ｏｒｇａｎ−ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）など）によって身体の他の領域から分離されうる三次元的に区別された区画などの、実質的に多細胞性、細胞間、組織および／または臓器構造の生成物である任意の凝集性で空間的に分離された非流体性で限定的な解剖学的区画を含みうる。非限定的例示的な固形組織は、脳、肝臓、肺、腎臓、前立腺、卵巣、脾臓、リンパ節（扁桃を含む）、甲状腺、膵臓、心臓、骨格筋、腸、喉頭、食道および胃を含む。解剖学的位置、形態学的特性、組織学的特徴ならびにこれらのおよび他の固形組織への侵襲的および／または非侵襲的アクセスは関連する技術分野の当業者に十分周知である。いくつかの実施形態では、組織は、がん性である、炎症を起こしている、感染している、萎縮している、麻痺している、発作を起こしているもしくは凝固しているまたはそうであると疑われる。いくつかの実施形態では、組織は、がん性であるまたはそうであると疑われる。いくつかの実施形態では、組織はがん性である。
【０２０７】
特定の実施形態は、Ｕ．Ｓ．  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）のものまたはＤｅＶｉｔａ、Ｈｅｌｌｍａｎ、ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ’ｓ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２００８、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ／Ｏｖｉｄ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；ＰｉｚｚｏおよびＰｏｐｌａｃｋ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、２００１、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ／Ｏｖｉｄ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；ならびにＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｋｉｎｚｌｅｒ、Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ（Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、２００２、ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載の通り；などの当技術分野において認められた臨床診断基準に従ってがんを有する、またはがんを発症するもしくはがんにかかる危険があると診断された患者などのヒト対象である組織の生物学的供給源を考察する；特定の実施形態はそのような基準によりがんを有する、またはがんを発症するもしくはがんにかかる危険がないことが周知であるヒト対象を考察する。
【０２０８】
生物試料は血液試料、生検検体、組織移植片、臓器培養物、生体液または対象もしくは生物学的供給源由来の任意の他の組織もしくは細胞調製物を得ることによって提供されうる。
【０２０９】
特定の他の実施形態は、組織移植のための非ヒトレシピエント（例えば固形腫瘍および／または他のがんについての前臨床モデルを含む、当技術分野において前臨床モデルとして周知である場合がある非ヒト対象を含んでマカク、チンパンジー、ゴリラ、ベルベット、オランウータン、ヒヒまたは他の非ヒト霊長類などの非ヒト霊長類）を考察する。特定の他の実施形態は、哺乳動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ヤギ、スナネズミ、ハムスター、モルモットまたは他の哺乳動物）である非ヒト対象を考察し；多数のそのような哺乳動物は、固形腫瘍および／または他のがんを含む特定の疾患または障害のための前臨床モデルとして当技術分野において周知である対象でありうる（例えばＴａｌｍａｄｇｅら、２００７  Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７０：７９３；Ｋｅｒｂｅｌ、２００３  Ｃａｎｃ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．２（４  Ｓｕｐｐｌ  １）：Ｓ１３４；Ｍａｎら、２００７  Ｃａｎｃ．Ｍｅｔ．Ｒｅｖ．２６：７３７；Ｃｅｓｐｅｄｅｓら、２００６  Ｃｌｉｎ．ＴｒａｎｓＬ  Ｏｎｃｏｌ．８：３１８）。しかし、対象または生物学的供給源が非哺乳動物脊椎動物（例えば別の高等脊椎動物もしくは鳥類、両生類もしくは爬虫類種）または他の対象もしくは生物学的供給源でありうる他の実施形態も考察されるように、実施形態の範囲がそのように限定されることは意図されない。動物の細胞の１つまたは複数が、非内在性（例えば異種性）であって細胞の一部分に染色体外エレメントとして存在するもしくはその生殖系ＤＮＡに（すなわちそのほとんどまたは全ての細胞のゲノム配列に）安定に組み込まれている核酸を含む遺伝子導入動物は非ヒト動物である。本発明の特定の実施形態では、遺伝子導入動物は標的化されうる。
【０２１０】
薬剤のスクリーニング
いくつかの実施形態では、レポーター組織は、がんのｉｎ  ｖｉｖｏモデル由来の様々な候補薬剤についての有効性データを得るための針アレイデバイスと併せて用いられる。この戦略はｉｎ  ｖｉｖｏ検査のためにマウスを遺伝的に操作する必要性を回避する。腫瘍の不均質を説明するために、腫瘍の複数の領域を試料採取することを確実にするために針の経路は組織深く貫通する。この手法は、局所的偽陽性または偽陰性結果を抑制する。組織は候補薬剤デリバリーに続いて採取されてよく、場合により標的会合を確認し、腫瘍増殖およびアポトーシスを標準的組織学および免疫組織化学を用いて判定することを可能にするように薄片に切り取られうる。多孔質針アレイと高フィディリティー高感度のがん遺伝子経路レポーター由来のジーントラップとの順調な結合はｉｎ  ｖｉｖｏ検証プラットフォームを提供する。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、針アレイ薬物デリバリーデバイスは、レポーター組織モデルへ１つまたは複数の候補治療剤を平行して投与することにおいて有用である。レポーター組織モデルは、レポーター細胞株に由来する異種移植された腫瘍であってよい。針アレイデバイスから腫瘍への複数の候補治療剤の空間的に制限されたデリバリーは、組織内での薬剤の拡散を低減するハイドロゲル中での薬剤のデリバリーによって達成されうる。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、本開示は、ａ）経路のモジュレーションにおいて検出可能なシグナルを生成するレポーター細胞株を作製するステップ；ｂ）前記レポーター細胞株からレポーター組織を構築するステップ；およびｃ）前記レポーター組織での複数の候補治療剤の有効性を、前記複数の候補治療薬剤を前記レポーター組織に針アレイを用いてデリバリーすることおよび前記検出可能なシグナルを検出することによって判定するステップを含むレポーター組織を用いて候補薬剤をスクリーニングするための方法を提供する。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、本開示は、ａ）経路のモジュレーションにおいて検出可能なシグナルを生成するレポーター細胞株を作製するステップ；ｂ）前記レポーター細胞株からレポーター組織を構築するステップ；ｃ）薬物を前記レポーター組織にデリバリーするステップ；ｄ）前記薬物への応答において前記検出可能なシグナルを示す前記レポーター組織内の細胞集団を単離するステップ；およびｅ）薬物応答の遺伝的基礎を決定するために細胞の前記集団のゲノムＤＮＡを配列決定するステップを含む薬物へのｉｎ  ｖｉｖｏ応答の遺伝的基礎を決定するための方法を提供する。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、異種移植された腫瘍は、多孔質針アレイデバイスによる注射に適合する大きさに達するまでレポーター細胞株から増殖される。異種移植された腫瘍は、約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．５、１．６、１．７または２．０ｃｍ3まで増殖されうる。次いで腫瘍は針アレイを用いて幾何的に限定された位置に注射されうる。腫瘍は注射後の選択された期間後（１、２、３、４、５、１０、１５、２４、３６もしくは４８時間より長くまたは１週間より長くてもよい）に切除、固定および切片化されうる。
【０２１５】
治療剤または候補治療剤の効果の検出は、レポーター細胞株およびそのような細胞株由来の組織モデルによって産生される１つまたは複数の検出可能なシグナルを判定することによって実施されうる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の検出可能なシグナルは生物経路のモジュレーションを示す。いくつかの実施形態では、モジュレーションは活性化を含む。いくつかの実施形態では、モジュレーションは阻害を含む。いくつかの実施形態では、生物経路は、がん関連経路または発がん経路である。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、検出可能なシグナルは、ABL1、ABL2、ACSL3、AF15Q14、AF1Q、AF3p21、AF5q31、AKAP9、AKT1、AKT2、ALK、ALO17、APC、ARHGEF12、ARHH、ARNT、ASPSCR1、ASXL1、ATF1、ATIC、ATM、BCL10、BCL11A、BCL11B、BCL2、BCL3、BCL5、BCL6、BCL7A、BCL9、BCR、BHD、BIRC3、BLM、BMPR1A、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRD3、BRD4、BRIP1、BTG1、BUB1B、C12orf9、C15orf21、CANT1、CARD11、CARS、CBFA2T1、CBFA2T3、CBFB、CBL、CBLB、CBLC、CCND1、CCND2、CCND3、CD74、CD79A、CD79B、CDH1、CDH11、CDK4、CDK6、CDKN2A-p14ARF、CDKN2A-p16(INK4a)、CDKN2C、CDX2、CEBPA、CEP1、CHCHD7、CHEK2、CHIC2、CHN1、CIC、CLTC、CLTCL1、CMKOR1、COL1A1、COPEB、COX6C、CREB1、CREB3L2、CREBBP、CRLF2、CRTC3、CTNNB1、CYLD、D10S170、DDB2、DDIT3、DDX10、DDX5、DDX6、DEK、DICER1、DUX4、EGFR、EIF4A2、ELF4、ELK4、ELKS、ELL、ELN、EML4、EP300、EPS15、ERBB2、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、ERG、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EVI1、EWSR1、EXT1、EXT2、EZH2、FACL6、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FBXW7、FCGR2B、FEV、FGFR1、FGFR1OP、FGFR2、FGFR3、FH、FIP1L1、FLI1、FLT3、FNBP1、FOXL2、FOXO1A、FOXO3A、FOXP1、FSTL3、FUS、FVT1、GAS7、GATA1、GATA2、GATA3、GMPS、GNAQ、GNAS、GOLGA5、GOPC、GPC3、GPHN、GRAF、HCMOGT-1、HEAB、HEI10、HERPUD1、HIP1、HIST1H4I、HLF、HLXB9、HMGA1、HMGA2、HNRNPA2B1、HOOK3、HOXA11、HOXA13、HOXA9、HOXC11、HOXC13、HOXD11、HOXD13、HRAS、HRPT2、HSPCA、HSPCB、IDH1、IDH2、IGH@、IGK@、IGL@、IKZF1、IL2、IL21R、IL6ST、IRF4、IRTA1、ITK、JAK1、JAK2、JAK3、JAZF1、JUN、KDM5A、KDM5C、KDM6A、KDR、KIAA1549、KIT、KLK2、KRAS、KTN1、LAF4、LASP1、LCK、LCP1、LCX、LHFP、LIFR、LMO1、LMO2、LPP、LYL1、MADH4、MAF、MAFB、MALT1、MAML2、MAP2K4、MDM2、MDM4、MDS1、MDS2、MECT1、MEN1、MET、MHC2TA、MITF、MKL1、MLF1、MLH1、MLL、MLLT1、MLLT10、MLLT2、MLLT3、MLLT4、MLLT6、MLLT7、MN1、MPL、MSF、MSH2、MSH6、MSI2、MSN、MTCP1、MUC1、MUTYH、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、MYH11、MYH9、MYST4、NACA、NBS1、NCOA1、NCOA2、NCOA4、NF1、NF2、NFIB、NFKB2、NIN、NONO、NOTCH1、NOTCH2、NPM1、NR4A3、NRAS、NSD1、NTRK1、NTRK3、NUMA1、NUP214、NUP98、NUT、OLIG2、OMD、P2RY8、PAFAH1B2、PALB2、PAX3、PAX5、PAX7、PAX8、PBX1、PCM1、PCSK7、PDE4DIP、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PER1、PHOX2B、PICALM、PIK3CA、PIK3R1、PIM1、PLAG1、PML、PMS1、PMS2、PMX1、PNUTL1、POU2AF1、POU5F1、PPARG、PRCC、PRDM16、PRF1、PRKAR1A、PRO1073、PSIP2、PTCH、PTEN、PTPN11、RAB5EP、RAD51L1、RAF1、RANBP17、RAP1GDS1、RARA、RB1、RBM15、RECQL4、REL、RET、ROS1、RPL22、RPN1、RUNX1、RUNXBP2、SBDS、SDH5、SDHB、SDHC、SDHD、SEPT6、SET、SETD2、SFPQ、SFRS3、SH3GL1、SIL、SLC45A3、SMARCA4、SMARCB1、SMO、SOCS1、SRGAP3、SS18、SS18L1、SSH3BP1、SSX1、SSX2、SSX4、STK11、STL、SUFU、SUZ12、SYK、TAF15、TAL1、TAL2、TCEA1、TCF1、TCF12、TCF3、TCL1A、TCL6、TET2、TFE3、TFEB、TFG、TFPT、TFRC、THRAP3、TIF1、TLX1、TLX3 TMPRSS2、TNFAIP3、TNFRSF17、TNFRSF6、TOP1、TP53、TPM3、TPM4、TPR、TRA@、TRB@、TRD@、TRIM27、TRIM33、TRIP11、TSC1、TSC2、TSHR、TTL、USP6、VHL、WAS、WHSC1、WHSC1L1、WRN、WT1、WTX、XPA、XPC、ZNF145、ZNF198、ZNF278、ZNF331、ZNF384、ZNF521、ZNF9、mTOR、MEK、PI3K、HIF、IGF1R、GLS1、またはZNFN1A1からなる群から選択される遺伝子であってよい遺伝子の活性化または阻害を報告する。いくつかの実施形態では、経路は、前述の遺伝子のいずれかに関連する。いくつかの実施形態では、検出可能なシグナルは、ポリペプチドまたはタンパク質などの遺伝子の生成物について報告する。
【０２１７】
実施形態により組織モデルは、がん治療における治療剤の有効性を評価するために用いられる。いくつかの実施形態では、複数の治療剤がデリバリーされている固形組織は、次に対象から切り出され、評価される。例えば標的組織ががん性腫瘍である場合、その中に注射される複数の薬剤はそのような腫瘍へのその有効性または効果が調査中であるいくつかの薬剤を含む場合もある。種々の薬剤をｉｎ  ｖｉｖｏに注射し、次いで腫瘍を除去する前に選択された期間待機することによって、本来の位置にある腫瘍への薬剤の効果がレポーター組織内のレポーター細胞によって発光されたシグナルを判定することによって調査されうる。本開示は、本来の腫瘍微小環境内でスクリーニングする方法を提供し、それは現在のｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ治療剤評価方法とは区別される。経時的に各薬剤は、例えば周囲の組織の密度、薬剤の粘性および組成、各薬剤による組織の水和性などの要因に応じてより多い程度または少ない程度そのデリバリー軸から外向きに浸透する。典型的には薬剤が広がる組織の部分は、各デリバリー軸に対して同軸の略円柱状領域である。
【０２１８】
種々の実施形態により組織領域は、切除される前に一定期間静置される。例えばデリバリー後４８〜７２時間の一定期間が検出可能な応答を示すために腫瘍について一般的に十分であると考えられる。待機時間は数時間、数日または数週間である場合がある。いくつかの実施形態により組織領域は、針の挿入の前に組織の標的領域を正確に位置づける周知の方法を用いて画像化される。組織の領域への複数の薬剤のデリバリー前およびデリバリー後に領域は繰り返し画像化されうる。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、切り出された組織は、任意の多数の周知の組織学的、組織化学的、免疫組織学的、病理組織学的、顕微鏡的（形態計測的解析および／または三次元的再構成を含む）、細胞学的、生化学的、薬理学的、分子生物学的、免疫化学的な画像処理または他の解析技術（関連する技術分野の当業者に周知である技術）による解析のために、平行軸に実質的に垂直である平行平面（例えば垂直または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５度程度もしくはより大きな度数で垂直から偏向している）に沿って複数の系列組織学的切片に切られる。例えばそれぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＢａｎｃｒｏｆｔおよびＧａｍｂｌｅ、Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（６th  Ｅｄ．）２００７  Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ；Ｋｉｅｍａｎ、Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、２００１  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；ならびにＭ．Ａ．Ｈａｙａｔ（Ｅｄ．）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ−Ｖｏｌｓ．１および２、２００７  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。画像処理は分注針が固形組織に挿入される前、挿入中または挿入された後に実施されうる。いくつかの実施形態では、画像処理は、経路のモジュレーションへの応答においてレポーター細胞株によって生成される検出可能なシグナルの検出を含む。
【０２２０】
本明細書に記載の通り、変化した生理的状態の少なくとも１つの指標のレベルの決定は、臨床試験に参加するための適格性に関して対象集団を層別化するためにも用いられうる。これらのおよび関連する実施形態は、現行よりも開発のより早い段階での候補治療用化合物の評価に関連する有利点を有効に提供することから考察される。例えば第ＩＩ相研究の前にバイオマーカーパラメータ（対象の排除についての根拠となりうる）を確立することは現在の標準的臨床試験の実践ではないが、本明細書に記載する実施形態は、例えば第Ｉ相または第ＩＩ相で、バイオマーカー判定基準の確立がない場合でも有用な結果を提供できる。したがって今回開示される特定の実施形態の実践を通じて候補薬剤の特性に関連する情報が、固形腫瘍腫瘍学薬物開発プログラムにおいて以前の場合よりも早期に得られる場合があることが、具体的な候補薬剤についての非応答結果に基づいて応答または利益が期待できない対象の臨床試験からの排除を時間効率よくおよび費用効率よく可能にできるやり方を含んで予測される。
【０２２１】
例えば本明細書に記載の通り決定された変化した生理的状態の少なくとも１つの指標のレベルによる対象集団の層別化は、がん対象において用いられる任意の候補治療薬剤の有効性に関連し、および／または対象を応答者、非応答者もしくは応答者である可能性がある者に分類するための有用なマーカーを提供できる。
【０２２２】
いくつか実施形態では、方法は、潜在的な新規治療剤を同定および機能的に特徴付けるための前臨床動物モデルにおいてなどの薬物スクリーニングおよび創薬において有用である。例えば複数のｓｉＲＮＡが腫瘍内に投与されることができ、望まれる標的遺伝子の発現をノックダウンするそれらの相対的能力は比較されうる。他の類似する実施形態は、臨床コンテクストにおける使用（例えば具体的な腫瘍において効果を有さない周知の治療剤を考察から「除外」または排除するための）を見出すことができ、したがって時間のロスおよび無効な治療計画を投与することに関連する場合がある望ましくない副作用を回避することにより対象の治療的管理を有利に進行させる。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、浸透または溶け込みは、薬剤が灌流（任意の血管による進入および分散）することなく導入された針のすぐ近くの固形組織における薬剤保持の領域を意味し、細胞外空間もしくは細胞外マトリクスにおけるまたは細胞膜もしくは細胞内での会合における薬剤の保持を含みうる。浸透は、針の挿入もしくは流体注射のそれ自体から生じる組織の顕微鏡的に検出可能な機械的破壊を意味する物理化学的作用、または薬剤によって生じる非生物学的機械的破壊もしくは化学的組織破壊（例えば細胞膜への損傷または細胞−細胞結合の統合崩壊）とは区別されうる。薬理学的効果は、薬剤の作用の分子機構の結果として検出可能である細胞または組織の生理的状態の統計的に有意な変化（例えば細胞骨格再構築、細胞性プロセスの伸長もしくは中止または多数の周知の細胞骨格的、生化学的、分子生物学的もしくは他の読み値のいずれかを用いて検出されうる生物学的シグナル伝達の証拠）を含む。系列切片の比較は、組織学的に検出される効果の性質を区別できるようにする。
【０２２４】
候補治療剤のプーリングおよびデコンボリューションについての戦略は、図６に示される。いくつかの実施形態では、初期スクリーニングは、空間的に限定された腫瘍部分に注射された試薬のプールされたセットを用いて実施される。陽性リポーターシグナルを生じたプールは、デコンボリューションされ、個々の構成要素は、経路阻害の原因となる薬剤を同定するために再スクリーニングされる。
【０２２５】
経路モジュレーションの決定
いくつかの実施形態では、固形組織内の標的領域が、薬剤の効果を評価するために周知の技術を用いて画像化されうることが考察される。画像処理は、例えば放射線画像法、磁気共鳴画像法、ポジトロン放出断層撮影、生物フォトンイメージングなどを含む任意の好適なプロセスまたは方法によってであってよい。いくつかの実施形態では、標的領域は、デリバリープロセスの前、デリバリープロセス中およびデリバリープロセス後に繰り返し画像化されうる。いくつかの実施形態では、画像処理は、対象由来（レポーター細胞株由来）組織モデルの切除の前、切除中および／または切除後に行う。
【０２２６】
画像処理において、レポーターシグナルのレベルは、当業者に周知の方法によって定量されうる。レポーティングシグナルの観察および／または定量は、治療剤の使用および有効性に関する情報に基づく研究および医療上の判断を行うために用いられうる。そのような観察により行われる場合がある判断の非限定的例は、流体容量品質管理、位置的追跡および薬物体内分布を含む。そのような実験は、ヒトにおける潜在的治療剤の活性に関して情報に基づいた予測を行うために用いられるうるレポーティングシグナルを提供するために下等哺乳動物（例えばマウス）において実施されうる。この種の動物研究は、天然環境の代わりに管理された環境下の細胞において薬物有効性研究を実施することによって生じる固有の不確実性および不正確性を回避するために用いられうる。
【０２２７】
蛍光シグナルの定量は、当技術分野において周知の任意の方法によって達成されうる。蛍光シグナルは、生物経路の上方制御または下方制御を決定するために標準または対照と比較されうる。そのような観察は、薬物候補の治療価値に関する予測を行うために用いられうる。
【０２２８】
治療抵抗性の決定
いくつかの実施形態では、本開示は、固形組織内での薬剤への応答を決定する方法であって、ａ）シグナル伝達経路のモジュレーションにおいて検出可能なシグナルを生成するレポーター細胞株を作製するステップ；ｂ）前記レポーター細胞株に由来する固形組織を得るステップ；ｃ）前記固形組織に複数の治療剤をデリバリーするステップ；およびｄ）前記治療剤の１つまたは複数への応答を決定するために前記検出可能なシグナルを検出するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、前記１つまたは複数の治療剤への応答において前記検出可能なシグナルを以前生成したが、もはや前記検出可能なシグナルを生成しない細胞を単離するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、レポーター細胞株は、シグナル伝達経路の２つの異なる状態（例えば「オン」または「オフ」）を示す２つの検出可能なシグナルを生成し、方法は前記１つまたは複数の治療剤への応答において第二の検出可能なシグナルを以前生成したが、現在は前記１つまたは複数の治療剤への応答において第一の検出可能なシグナルを生成する細胞を単離するステップをさらに含む。単離された細胞は、１つまたは複数の治療剤への応答における変化の遺伝的根拠を決定するためにゲノムＤＮＡ配列決定に供されうる。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、本開示は、がん治療への抵抗性を決定するための方法であって、ａ）経路のモジュレーションにおいて検出可能なシグナルを生成するレポーター細胞株を作製するステップ；ｂ）前記レポーター細胞株からレポーター組織を構築するステップ；ｃ）前記レポーター組織に複数のがん治療を投与するステップ；ｄ）複数のがん治療の内の選択された１つへの応答において前記検出可能なシグナルを示す前記レポーター組織内の細胞の集団を単離するステップ；ｅ）前記単離された細胞の集団から第二のレポーター組織を構築するステップ；ｆ）第二レポーター組織に前記選択されたがん治療を投与するステップ；ｇ）選択されたがん治療への応答において前記検出可能なシグナルを示さなくなった細胞の第二集団を単離するステップ；およびｈ）細胞の第二集団由来のゲノムＤＮＡを配列決定するステップを含み、選択されたがん治療への抵抗性を決定するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、経路のモジュレーションにおいて検出可能なシグナルを生成するレポーター細胞株を作製するステップ；前記レポーター細胞株からレポーター組織を構築するステップ；前記レポーター組織に複数の治療剤をデリバリーするステップ；および前記検出可能なシグナルを示す前記レポーター組織内の細胞の集団を単離するステップを含むがん治療への抵抗性を決定するための方法に関する。このモジュレーションは活性化または阻害を含みうる。単離は細胞選別を含みうる。方法は、前記検出可能なシグナルを示す細胞の前記集団についての全ゲノム配列決定を実施するステップ、および前記治療剤の１つまたは複数への抵抗性の遺伝的根拠を決定するステップをさらに含みうる。
【０２３０】
細胞集団は、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）などの当技術分野において周知の細胞選別技術を用いて単離されうる。細胞は、選別機を用いて（例えばＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ  Ｃａｌｉｆ．から入手可能な選別機を用いて；米国特許第５，６２７，０３７号；第５，０３０，００２号；および第５，１３７，８０９号も参照されたい）ＦＡＣＳによって選別されうる。細胞が選別機を通過する際に、レーザー光が蛍光化合物を励起させ、一方通過する細胞を検出機が計数し、蛍光を検出することによって細胞に蛍光化合物が付着しているかどうかを決定する。各細胞に結合した標識の量は、試料を特徴付けるために定量および解析されうる。選別機は、細胞の方向を変えることもでき、結合タンパク質が結合している細胞を結合タンパク質が結合していない細胞から分離できる。分離された細胞は培養および／または特徴付けられうる。
【０２３１】
配列決定
配列決定の前に、ポリヌクレオチドは増幅によって増やされてもよい。同様にゲノムは全ゲノム増幅によって増やされてもよい。本明細書のＤＮＡ領域を増幅するために用いられうるＰＣＲ技術の例は、これだけに限らないが定量的ＰＣＲ、定量的蛍光ＰＣＲ（ＱＦ−ＰＣＲ）、多重蛍光ＰＣＲ（ＭＦ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、単一細胞ＰＣＲ、制限酵素断片長多型ＰＣＲ（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ／ＲＴ−ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ホットスタートＰＣＲ（ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ  ＰＣＲ）、ネステッドＰＣＲ、インサイツポロノニーＰＣＲ（ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｐｏｌｏｎｏｎｙ  ＰＣＲ）、インサイツローリングサークル増幅（ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＲＣＡ）、架橋ＰＣＲ、ピコタイターＰＣＲ（ｐｉｃｏｔｉｔｅｒ  ＰＣＲ）およびエマルジョンＰＣＲを含む。他の好適な増幅方法は、これだけに限らないがリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅、自家持続配列複製法、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅、コンセンサス配列プライムドポリメラーゼ連鎖反応（ＣＰ−ＰＣＲ）、任意プライムドポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰ−ＰＣＲ）、縮重オリゴヌクレオチドプライムドＰＣＲ（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｐｒｉｍｅｄ  ＰＣＲ）（ＤＯＰ−ＰＣＲ）および核酸に基づく配列増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＢＳＡ）を含む。具体的な多型遺伝子座を増幅するために用いられうる他の増幅方法は、米国特許第５，２４２，７９４号、第５，４９４，８１０号、第４，９８８，６１７号および第６，５８２，９３８号において記載のものを含む。本発明のいくつかの実施形態はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の用語で記載されるが、いくつかの実施形態では、増幅方法は、例えば自家持続配列反応、リガーゼ連鎖反応、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅法（ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ポリメラーゼ連鎖反応およびリガーゼ連鎖反応、Ｑ−ベータファージ増幅法、鎖置換増幅法またはスプライス重複伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ｓｐｌｉｃｅ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）であってよい。
【０２３２】
配列決定の前に対象のＤＮＡ試料は、サブトラクティブハイブリダイゼーションによって増やされてもよい。サブトラクティブハイブリダイゼーションの方法は、当技術分野において周知であり、米国特許第５，９３５，７８８号および第５，５９９，６７２号に記載されている。一般にサブトラクティブハイブリダイゼーションの方法においては、第一ＤＮＡプール由来のＤＮＡまたはｃＤＮＡ鎖が第二ＤＮＡプールから作製されたＤＮＡまたはｍＲＮＡにハイブリダイズされ、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドまたはＤＮＡ二本鎖が酵素的手段またはクロマトグラフィーの手段によって除去される。残ったサブトラクティドＤＮＡが次いで配列決定などのさらなる解析において用いられうる。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、配列決定誤差率が１つまたは複数の対照ポリヌクレオチドの配列決定結果に基づき評価される。いくつかの実施形態では、単回の読み取りから少なくとも７５ｂｐを産生する大量に平行して配列決定するプラットフォームである配列決定プラットフォームが用いられる。いくつかの実施形態では、大量に平行して配列決定するプラットフォームは、単回の読み取りから少なくとも１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００または２０００ｂｐより多くを産生する。
【０２３４】
本発明において有用である方法論は、無作為に断片化されたゲノムＤＮＡの平面（光学的に透明な表面）への付着および（それぞれが１平方ｃｍあたり約１，０００コピーの鋳型を含有している数百万クラスターを有する高密度配列決定フローセルを作成するための）固相増幅を用いる数百万断片の大量に平行した配列決定に基づいている。これらの鋳型は４色ＤＮＡ合成による配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）技術を用いて配列決定される。Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆ．によって提供される製品を参照されたい。Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎらへの米国特許出願公開第２００３／００２２２０７号、２００３年１月３０日出願、発明の名称「Ａｒｒａｙｅｄ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ」も参照されたい。そのような方法を用いて２つの固有のアダプターは、ＰＣＲを用いて次に増幅される各ＤＮＡ断片にライゲーションされる。
【０２３５】
ブリッジ増幅のプロセスにおいて、フローセル表面は、試料調製段階でライゲーションされるアダプターの配列に対応する１本鎖オリゴヌクレオチドでコートされる。１本鎖のアダプターにライゲーションされた断片は、ポリメラーゼに基づく伸長のための試薬に暴露されたフローセルの表面に結合される。ライゲーションした断片の遊離／遠位末端が表面上の相補的オリゴヌクレオチドに「架橋」するとプライミングが生じる。変性と伸長の繰り返しは、フローセル表面全域にわたる数百万の固有の箇所での単一分子の局在化した増幅をもたらす。次いで数百万の固有のクラスターを含有するフローセルは、伸長および画像処理の自動化サイクルのための配列決定デバイスに置かれる。配列決定の最初のサイクルは、単一の蛍光ヌクレオチドの最初の取り込みに続くフローセル全体の高解像度画像処理からなる。これらの画像は最初の塩基について集められたデータを表す。バックグラウンドを超える全てのシグナルは、クラスターの物理的位置を同定し、蛍光発光は４種の塩基の内のどれがその位置に取り込まれたかを同定する。このサイクルが繰り返され、１回に１塩基、作成される画像の系列それぞれが特定のクラスターでの単一塩基伸長を表している。塩基決定は、経時的な発光色を同定するアルゴリズムによって得る。
【０２３６】
対末端配列決定では、標準的単一読み取りＤＮＡライブラリー調製への簡易な修飾が、１つの対末端読み取りにおいて各クラスターのフォワード鋳型鎖およびリバース鋳型鎖両方での読み取りを促進する。いくつかの実施形態では、大量に平行して配列決定するプラットフォームは、１つの対末端読み取りから少なくとも１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、２０００、３０００、５０００または１０，０００ｂｐより多くを産生する。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、相補鎖が合成される際に単一のＤＮＡ鋳型における配列情報を画像化するために用いられる。ヌクレオチドは逐次的に挿入される；逐次的取り込みを識別するためには時間分解能だけが必要である。それぞれの順調な取り込み事象後に、蛍光シグナルが測定され、次いで光脱色によって無効化される。この方法それ自体が大量平行化に役立つ。この技術は、バックグラウンド蛍光を低下させる全内部反射照明（ｔｏｔａｌ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ  ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）を備えた従来の顕微鏡による単一分子蛍光の観察を可能にする。石英スライドの表面は、遊離ヌクレオチドの非特異的結合を抑制する一方でＤＮＡ鋳型を特異的に固着させるために化学的に処理され、溶液を交換するためにプラスチックフローセルが表面に付けられる。ＤＮＡ鋳型オリゴヌクレオチドを蛍光標識したプライマーにハイブリダイズされ、１分子を解像するために十分低い表面密度でストレプトアビジンおよびビオチンによって表面に結合される。プライムされた鋳型は、それらの蛍光タグを通じて検出され、それらの位置はその後の参照のために記録され、タグは光脱色される。次いで標識ヌクレオチド三リン酸およびＤＮＡポリメラーゼ酵素は、フローセルの中および外で洗浄され、ＤＮＡ鋳型の既知の位置は蛍光の出現に関してモニターされる。技術は、望まれないノイズを排除するためにエバネッセント光顕微鏡と単一対蛍光共鳴エネルギー移動（ｓｉｎｇｌｅ−ｐａｉｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）（ｓｐＦＲＥＴ）との組み合わせを用いる。ドナーフルオロフォアは、フォルスター半径内のアクセプターだけを励起させ、それにより近視野で非常に高い解像度を効果的に作り出す。このフルオロフォア対のフォルスター半径が５ｎｍであることから、この方法の空間的解像度は、回折限界を５０倍上回り、従来の近視野顕微鏡を一桁上回る。
【０２３８】
本試料由来のゲノムＤＮＡの同一性を同定する別の方法は、直接線形解析（ｄｉｒｅｃｔ  ｌｉｎｅａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＤＬＡ）と称され、Ｃｈａｎ  ら、「ＤＮＡ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔａｇｓ」Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４：１１３７〜１１４６（２００４）に記載されている。本方法では、単一のフルオロフォア感度が可能である多色検出系に連結された微小流体デバイスが伸長流（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎａｌ  ｆｌｏｗ）中でＤＮＡ分子を伸ばすために用いられる。二本鎖ＤＮＡ分子は配列特異的モチーフ部位で蛍光ｂｉｓＰＮＡ（ペプチド核酸）タグに繋がれる。次いでＤＮＡ分子は、微小流体デバイスで伸ばされ、共焦点蛍光検出器を通る流路に入る。ＤＬＡは、個々のＤＮＡ分子中の複数の特異的配列モチーフの空間的位置を提供でき、１分間あたり数千個の各分子が解析されうる。
【０２３９】
ハイスループット配列決定は、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）および超深度配列決定（ｕｌｔｒａ  ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を含みうる。
【０２４０】
合成による配列は、核酸タグ上の配列決定エレメントに相補的な配列決定プライマーを用いて開始されうる。方法は、ポリメラーゼ反応での相補的核酸配列の伸長鎖への標識ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似物の取り込み直後（実質的にリアルタイム）または取り込み時（リアルタイム）に各ヌクレオチドのアイデンティティーを検出することを含む。標識ヌクレオチドの順調な取り込み後に、シグナルは測定され、次いで当技術分野において周知の方法によって無効化される。合成による配列法の例は、米国特許出願公開第２００３／００４４７８１号、第２００６／００２４７１１号、第２００６／００２４６７８号および第２００５／０１００９３２号に記載されている。合成による配列決定のためのヌクレオチドまたはヌクレオチド類似物を標識するために用いられうる標識の例は、これだけに限らないが発色団、蛍光成分、酵素、抗原、重金属、磁気プローブ、色素、リン光基、放射性材料、化学発光成分、散乱または蛍光ナノ粒子、ラマンシグナル生成成分および電子化学的検出成分を含む。合成による配列決定は、１時間あたり少なくとも１，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００、３０，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００または少なくとも５００，０００読み取りを実施できる。そのような読み取りは１読み取りあたり少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２０または少なくとも１５０塩基を有しうる。
【０２４１】
別の配列決定方法は、増幅された領域をＬＳＴ中の配列エレメントに相補的プライマーにハイブリダイズすることを含む。このハイブリダイゼーション複合体は、ポリメラーゼ、ＡＴＰスルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼおよび基質ルシフェリンおよびアデノシン５’ホスホ硫酸とインキュベートされる。次に塩基Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ（Ｕ）に対応するデオキシヌクレオチド三リン酸が逐次的に添加される。各塩基取り込みにはピロリン酸の放出が付随し、スルフリラーゼによってＡＴＰに転換され、オキシルシフェリンの合成および可視光の放出を駆動する。ピロリン酸放出が取り込まれた塩基の数と等モルであることから、放出される光は、いずれの１ステップにおいて添加されるヌクレオチドの数に比例する。プロセスは配列全体が決定されるまで繰り返される。さらに別の配列決定方法は、４個の位置の内の１個へのアンカープライマーのハイブリダイゼーションを含むライゲーション計画（変性ライゲーション）による４色配列決定を含む。次に蛍光色素で標識された変性九量体集団へのアンカープライマーの酵素的ライゲーション反応が実施される。任意のサイクルにおいて、用いられる九量体集団は、その位置の内の１つのアイデンティティーが九量体に付着したフルオロフォアのアイデンティティーと関連している構造である。照会される位置での相補性をリガーゼが識別する範囲で、蛍光シグナルは塩基のアイデンティティーの推定を可能にする。ライゲーションおよび４色画像処理を実施後に、アンカープライマー：九量体複合体は、取り除かれ、新たなサイクルが始まる。ライゲーション実施後に配列情報を画像化する方法は、当技術分野において周知である。
【０２４２】
米国特許出願第０９／５７２，５３０号は、核酸分子を配列決定するために用いられるゼロ−モード導波路（ｚｅｒｏ−ｍｏｄｅ  ｗａｖｅｇｕｉｄｅ）を記載している。この方法は、標的核酸に相補的な活性部位にヌクレオチド類似物を添加するために好適な位置に互いに方向付けられた核酸重合化酵素と標的核酸分子との複合体を提供することを含む。ヌクレオチド類似物の各種類が標的核酸中の異なるヌクレオチドに相補的であり、添加されたヌクレオチド類似物が次のヌクレオチド類似物の付加に備えたままである活性部位の近くに複数の種類のヌクレオチド類似物が提供される。重合化ステップの結果として活性部位に添加されたヌクレオチド類似物は、同定される。複数のヌクレオチド類似物を提供するステップ、重合化ステップおよび同定ステップは繰り返され、標的核酸の配列が決定される。ゼロ−モード導波管は、標的核酸に付加されたヌクレオチド類似物を同定するステップを実行するために用いられる。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、ハイスループット配列決定は、Ｍａｒｇｕｉｌｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ４３７（７０５７）：３７６〜８０（２００５）において記載されるものなどの超深度配列決定（ｕｌｔｒａ−ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）の使用を含む。簡潔には、増幅産物は、希釈され、（各ビーズが増幅された材料の単一分子を捕捉する）ビーズと混合される。次いで各ビーズ上のＤＮＡ分子は、ビーズに全て結合したままである配列の数百万のコピーを生成するために増幅される。そのような増幅は、ＰＣＲによってもたらされうる。各ビーズは（場合により位置決めされうる）ピコリットルサイズのウエルであってよい別々のウエルに入れられうる。いくつかの実施形態では、各ビーズは、油中ＰＣＲ反応混合物乳剤の液滴中に捕捉され、各液滴中でＰＣＲ増幅が生じる。ビーズ上での増幅は、それに結合した元の増幅産物の少なくとも百万、少なくとも５百万、または少なくとも一千万コピーを保持する各ビーズをもたらす。最終的に、ビーズは、単回４時間の実行において４００，０００を超える読み取り（１読み取りあたり〜１００）をもたらす合成による高度平行配列決定装置（ｈｉｇｈｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｍａｃｈｉｎｅ）内に置かれる。用いられうる超深度配列決定の他の方法は、Ｈｏｎｇ，Ｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２（４）：４３５〜９（２００４）；Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｂ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６（４）：３７３〜８２（２００５）；Ｓｈｅｎｄｕｒｅ，Ｐ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９（５７４１）：１７２８〜３２（２００５）に記載されている。
【０２４４】
遺伝子置換治療剤
本開示の実施形態では、遺伝子置換治療剤は１つまたは複数の幹細胞またはアデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、バキュロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、レトロウイルスおよびレンチウイルスなどのベクターを含みうる。ｒＡＡＶは、１つまたは複数の遺伝子置換治療剤をコードするポリヌクレオチドに隣接した１つまたは複数のＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含むｒＡＡＶゲノムを含みうる。
【０２４５】
用語ベクターは、遺伝子配列を細胞に移行できるプラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、リポソーム、ＤＮＡ−ウイルスコンジュゲート、ＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ウイルス、細菌などの任意の作用物を意味する。したがって用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクルならびにウイルス性および非ウイルス性ベクターを含む。ベクターは、標的化分子をベクターに結合させることによって特定の細胞に標的化されてよい。標的化分子は、対象の細胞型または組織型に特異的である任意の作用物であって、例えばリガンド、抗体、糖、受容体または他の結合分子を含む。本発明は、等価の機能を果たすその他の形態のベクターを含むことも意図される。
【０２４６】
本発明のｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐＤＮＡを欠いている。ｒＡＡＶゲノム中のＡＡＶ  ＤＮＡは、組換えウイルスが由来する場合がある、これだけに限らないがＡＡＶ血清型ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０およびＡＡＶ−１１を含む任意のＡＡＶ血清型由来であってよい。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ  ＤＮＡはＡＡＶ血清型ＡＡＶ−６由来である。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当技術分野において周知である。例えばＡＡＶ−１の全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７で提供されており；ＡＡＶ−２の全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１４０１で提供されており；ＡＡＶ−３の全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿１８２９で提供されており；ＡＡＶ−４の全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８２９で提供されており；ＡＡＶ−５ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ＿０８５７１６で提供されており；ＡＡＶ−６の全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８６２で提供されており；ＡＡＶ−７およびＡＡＶ−８ゲノムの少なくとも一部分はＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９でそれぞれ提供されている。ＡＡＶベクターは、ヒトＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、トリＡＡＶ、オビアンＡＡＶなどを含むアデノ随伴ウイルス血清型由来のベクターおよび１つ以上のＡＡＶ血清型由来のベクター（ハイブリッドＡＡＶベクター）を意味する。例えばハイブリッドＡＡＶベクターは、ＡＡＶ−１およびＡＡＶ−２の両方に由来するＤＮＡ配列を含有してよい。
【０２４７】
組換えＡＡＶベクタープラスミドは、プラスミドを含む組換えＡＡＶベクターの１つの種類を意味する。一般にＡＡＶベクターと同様に、５’および３’ＩＴＬは選択された異種性ヌクレオチド配列に隣接する。ＡＡＶベクターは、ポリアデニル化部位などの転写配列および選択可能マーカーまたはレポーター遺伝子、エンハンサー配列ならびに転写の誘導を可能にする他の制御エレメントも含みうる。そのような制御エレメントは、下により十分に記載される。付加的にＡＡＶベクターは、ウイルス粒子作製の目的で１つまたは複数の細胞株に安定的に導入されうる。そのような細胞株は通常ＡＡＶパッケージ細胞株と称される。
【０２４８】
本明細書で用いる用語組換えＡＡＶ、組換えＡＡＶ粒子または組換えＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ  ＩＴＲによって順に５’および３’で隣接されている異種性ヌクレオチド配列をキャプシド形成した（すなわちタンパク質外被で囲っている）ＡＡＶタンパク質殻からなる感染性の、複製欠損ウイルスとして定義される。これに関連して１本鎖ＡＡＶ核酸分子（一般的に定義される用語としてのセンス／コード鎖またはアンチセンス／アンチコード鎖のいずれか）は、ＡＡＶビリオン中にパッケージされることができ；センス鎖およびアンチセンス鎖は両方とも同等に感染性である。組換えＡＡＶ  ＤＮＡが全長ウイルスゲノム（約５，０００ヌクレオチド）と同等またはその５０％より小さい場合、それも２本鎖ヘアピン様ＤＮＡとしてＡＡＶビリオン中にパッケージされうる。そのようなビリオンも完全に感染性である。
【０２４９】
組換えＡＡＶを構築するための多数の技術が当技術分野において周知である。例えば米国特許第５，１７３，４１４号、Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ８，３９８８〜３９９６［１９８８］；Ｃａｒｔｅｒ  Ｂ  Ｊ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３、５３３〜５３９［１９９２］；Ｍｕｚｙｃｚｋａ  Ｎ、上に引用；およびＺｈｏｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９、１８６７〜１８７５［１９９４］；Ｘｉａｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２、２２２４〜３２［１９９８］を参照されたい。
【０２５０】
ベクターは、制御エレメントまたは調節エレメントを含むことができ、用語は、レシピエント細胞内におけるコード配列の複製、転写および翻訳を集団的に提供するプロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上方制御ドメイン、複製開始点、配列内リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサーなどを集団的に意味する。選択されたコード配列が適切な宿主細胞内で複製、転写および翻訳されうる限り、これらの制御配列の全てが常に存在する必要はない。制御エレメントは、シス作用性であってよく、またはトランス作用性因子に応答性であってもよい。調節の性質に応じて、プロモーターは構成的であってよくまたは調節されてもよい。プロモーターの例は、ＳＰ６、Ｔ４、Ｔ７、ＳＶ４０初期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）ステロイド誘導性プロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、ミオシンプロモーター、α−アクチンプロモーターなどである。代替として、上のプロモーターの改変バージョンおよび合成筋肉プロモーター（Ｌｉら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７、２４１〜２４５［１９９９］）も含まれうる。最後にプロモーターは、内在性ＡＡＶプロモーターまたはＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）であってもよい。
【０２５１】
パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子作製のために必要な全ての構成要素を安定に発現する細胞株を作るためのものである。例えばＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠いているｒＡＡＶゲノムを含むプラスミド（または複数のプラスミド）、ｒＡＡＶゲノムから分離されたＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能マーカーは、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（ＧＣ  ｔａｉｌｉｎｇ）（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ、７９：２０７７〜２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎｅｔａｌ．、１９８３、Ｇｅｎｅ、２３：６５〜７３）などの手順によってまたは直接、平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ  ＆  Ｃａｒｔｅｒ、１９８４、Ｊ．ＢｉｏＩ．Ｃｈｅｒｎ．、２５９：４６６１〜４６６６）によって細菌性プラスミドに導入される。次いでパッケージング細胞株にアデノウイルスなどのヘルパーウイルスを感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模作製に適していることである。好適な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノムならびに／またはｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するためにプラスミドよりもアデノウイルスまたはバキュロウイルスを用いる。
【０２５２】
ｒＡＡＶ作製の一般的原理は、例えばＣａｒｔｅｒ、１９９２、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５３３〜５３９；およびＭｕｚｙｃｚｋａ、１９９２、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：９７〜１２９）において概説されている。種々の手法はＲａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６４６６（１９８４）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６２：１９６３（１９８８）；およびＬｅｂｋｏｗｓｋｉら、１９８８  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、７：３４９（１９８８）．Ｓａｍｕｌｓｋｉら、（１９８９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３：３８２２〜３８２８）；米国特許第５，１７３，４１４号；ＷＯ９５／１３３６５および対応する米国特許第５，６５８，７７６号；ＷＯ９５／１３３９２；ＷＯ９６／１７９４７；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、（１９８９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３：３８２２〜３８２８）；米国特許第５，１７３，４１４号；ＷＯ９５／１３３６５および対応する米国特許第５，６５８，７７６号；ＷＯ９５／１３３９２；ＷＯ９６／１７９４７；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００；ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）；ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）；ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）；ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）；ＷＯ９９／１１７６４；Ｐｅｒｒｉｎら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：６０９〜６１５；Ｃｌａｒｋら、（１９９６）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：１１２４〜１１３２；米国特許第５，７８６，２１１号；米国特許第５，８７１，９８２号；および米国特許第６，２５８，５９５号に記載されている。
【０２５３】
本発明の目的のためのｒＡＡＶビリオン作製のために好適な宿主細胞は、異種性ＤＮＡ分子のレシピエントとして使用されうる、または使用されている微生物、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞を含む。用語は、形質移入された最初の細胞の子孫を含む。したがって本明細書で用いられる宿主細胞は、外来性ＤＮＡ配列を形質移入されている細胞を一般に意味する。安定なヒト細胞株２９３（例えばｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ受託番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３を通じて容易に入手できる）由来の細胞は、本発明の実施において好ましい。具体的にはヒト細胞株２９３は、アデノウイルス５型ＤＮＡ断片で形質転換され（Ｇｒａｈａｍら、（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９）、アデノウイルス性Ｅ１ａおよびＥ１ｂ遺伝子を発現する（Ａｉｅｌｌｏら、（１９７９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ９４：４６０）ヒト胎児由来腎臓細胞株である。２９３細胞株は容易に形質移入され、ｒＡＡＶビリオンを作製するための特に好都合なプラットフォームを提供する。
【０２５４】
ＡＡＶ  ｒｅｐコード領域は、複製タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコードするＡＡＶゲノムの当技術分野において認められた領域を意味する。これらのＲｅｐ発現生成物は、ＡＡＶのＤＮＡ複製開始点の認識、結合およびニッキング、ＤＮＡヘリカーゼ活性ならびにＡＡＶ（または他の異種性）プロモーター由来の転写のモジュレーションを含む多数の機能を有することが示されている。Ｒｅｐ発現生成物は、ＡＡＶゲノムを複製するために集合的に必要である。ＡＡＶ  ｒｅｐコード領域の記載について例えばＭｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７〜１２９；およびＫｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３〜８０１を参照されたい。ＡＡＶ  ｒｅｐコード領域の好適な相同体は、ＡＡＶ−２  ＤＮＡ複製を介在することも周知であるヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）ｒｅｐ遺伝子を含む（Ｔｈｏｍｓｏｎら、（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０４：３０４〜３１１）。
【０２５５】
ＡＡＶ  ｃａｐコード領域によって意味されるのは、キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３またはこれらの機能性相同体をコードするＡＡＶゲノムの当技術分野において認められた領域である。これらのＣａｐ発現生成物は、ウイルスゲノムをパッケージングするために集合的に必要とされるパッケージング機能を供給する。ＡＡＶ  ｃａｐコード領域の記載について、例えばＭｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．ａｎｄ  Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（上記）を参照されたい。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶ発現ベクターの形質移入の前、または形質移入と同時のいずれかで宿主細胞にＡＡＶヘルパー構築物を形質移入することによって宿主細胞に導入される。したがってＡＡＶヘルパー構築物は、増殖性のＡＡＶ感染のために必要である失われたＡＡＶ機能を補完するためのＡＡＶ  ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子の少なくとも一過的な発現を提供するために用いられる。ＡＡＶヘルパー構築物は、ＡＡＶ  ＩＴＲを欠いており、それら自身を複製およびパッケージングできない。これらの構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルスまたはビリオンの形態であってよい。ＲｅｐおよびＣａｐの発現生成物の両方をコードする一般に用いられるプラスミドｐＡＡＶ／Ａｄおよびｐ１Ｍ２９＋４５などの多数のＡＶＶヘルパー構築物は記載されている。例えばＳａｍｕｌｓｋｉら、（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２〜３８２８；およびＭｃＣａｒｔｙら、（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２９３６〜２９４５を参照されたい。ＲｅｐおよびＣａｐの発現生成物をコードする多数の他のベクターは記載されている。例えば米国特許第５，１３９，９４１号を参照されたい。ＡＡＶ発現ベクターおよびＡＡＶヘルパー構築物の両方は、１つまたは複数の任意選択での選択可能マーカーを含有するように構築されうる。好適マーカーは、細胞が適切な選択培地で増殖される際に、選択可能マーカーを含有する核酸構築物で形質移入されたこれらの細胞に抗生物質耐性または感受性を付与する、色をつける、または細胞の抗原特徴を変化させる遺伝子を含む。本発明の実施において有用ないくつかの選択可能マーカー遺伝子は、Ｇ４１８（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．から入手可能）への耐性を付与することにより哺乳動物細胞における選択を可能にするハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（アミノグリコシドホスホトランフェラーゼ（ＡＰＨ）をコードする）を含む。他の適切なマーカーは当業者に周知である。
【０２５６】
上に記載のＡＡＶ発現ベクターを含有する宿主細胞は、ｒＡＡＶビリオンを作製するためにＡＡＶ  ＩＴＲに隣接するヌクレオチド配列を複製およびキャプシド形成するためのＡＡＶヘルパー機能を提供できるようにされていなければならない。ＡＡＶヘルパー機能は、一般にＡＡＶ遺伝子生成物（次に産生的ＡＡＶ複製のためにトランスで機能する）を提供するために発現されうるＡＡＶ由来コード配列である。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶ発現ベクターから失われている必要なＡＡＶ機能を補完するために本明細書において用いられる。したがってＡＡＶヘルパー機能は、１つもしくは両方の主なＡＡＶ  ＯＲＦ、すなわちｒｅｐおよびｃａｐコード領域またはこれらの機能性相同体を含む。
【０２５７】
宿主細胞（またはパッケージング細胞）は、ｒＡＡＶビリオンを作製するためにＡＡＶ由来機能または付属する機能を提供できないようにされていなければならない。そのような方法は、当技術分野において周知であり、米国特許第５，８５８，３５１号に開示されている。
【０２５８】
本発明の方法において投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば具体的なｒＡＶＶ、投与方法、治療目的、個体および標的化される細胞型（複数可）に応じて変化し、当技術分野における標準的方法によって決定されうる。ｒＡＶＶの力価は、１ｍｌあたりＤＮａｓｅ抵抗性粒子（ＤＮａｓｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）（ＤＲＰ）約１ｘ１０６個、約１ｘ１０７個、約１ｘ１０８個、約１ｘ１０９個、約１ｘ１０１０個約１ｘ１０１１個、約１ｘ１０１２個、約１ｘ１０１３個から約１ｘ１０１４個またはそれ以上の範囲であってよい。投与量はウイルスゲノムの単位（ｖｇ）でも表される場合がある。
【０２５９】
ｒＡＡＶは、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配によるなどの当技術分野における標準的方法によって精製されうる。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製するための方法は当技術分野において周知であり、例えばＣｌａｒｋら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１０（６）：１０３１〜１０３９（１９９９）；Ｓｃｈｅｎｐｐ  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、６９４２７〜４４３（２００２）；米国特許第６，５６６，１１８号およびＷＯ  ９８／０９６５７において開示の方法を含む。
【０２６０】
別の実施形態では、開示は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物のデリバリーを考察する。これらの組成物は筋肉を増強するためおよび／または筋肉機能を改善するために用いられうる。いくつかの実施形態では、開示の組成物は、対象のミオスタチン阻害物質をコードするｒＡＡＶを含む。他の実施形態では、本発明の組成物は、対象の様々なミオスタチン阻害物質をコードする２つ以上のｒＡＡＶを含みうる。さらなる実施形態では、組成物は、１つまたは複数のジストロフィンタンパク質をコードするｒＡＡＶを含む。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、遺伝子置換治療剤は、１つまたは複数の幹細胞を含む。幹細胞は、複数の細胞型に分化できる多能性または多分化能細胞である。幹細胞は、少なくとも１つの他の細胞型に分化転換できる細胞も含む。前駆体細胞または前駆細胞は、より成熟した細胞に分化できる特定の分化経路における任意の細胞であってよい。分化した細胞は通常の生理的条件下ではより成熟した細胞に分化できない細胞である。同様に用語前駆体細胞集団は、より成熟した細胞に発達できる細胞の群を意味する。前駆体細胞集団は、全能性である細胞、多能性である細胞および限定された幹細胞系列である細胞（すなわち全ての造血幹細胞系列には発達できないまたは例えば赤血球系列の細胞だけに発達できる細胞）を含みうる。幹細胞は、多能性幹細胞または全能性幹細胞であってよい。本明細書において用いられる用語全能性細胞は、細胞の全ての系列に発達できる細胞を意味する。同様に用語細胞の全能性集団は、細胞の全ての系列に発達できる細胞の組成物を意味する。同様に本明細書において用いられる用語多能性細胞は、種々の（全てではない）系列に発達でき、少なくとも全ての造血性細胞系列（例えばリンパ系、赤血球系および血小板系細胞系列）に発達できる細胞を意味する。例えば多能性細胞は、内皮細胞以外の全ての細胞系列に発達する能力を有することによって全能性細胞とは異なってよい。細胞の多能性集団は、細胞の全ての系列には発達できないが、少なくとも全ての造血幹細胞系列には発達できる細胞の組成物を意味する。同様に全能性細胞または細胞の組成物は、多能性細胞または細胞の組成物よりも発達していない。本明細書において用いられる用語発達、分化および成熟の全ては、少なくとも２つの異なる細胞系列へ分化する潜在能力を有する状態から特化された細胞になる細胞の進行を意味する。そのような用語は、本出願の目的のために互換的に用いられうる。
【０２６２】
幹細胞は、いくつかの型：胚盤胞において認められる胚性幹細胞（ＥＳＣｓ）、後胚期組織において認められる成体幹細胞および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）（成体型から胚性型状態に脱分化されている）に典型的には分類される。成体幹細胞は胎性組織および成体組織から抽出され、大部分についてはそれらが分化できる細胞型は限定されている。それらはＥＳＣと比較して限定された分化能力を有しているが、成体幹細胞は安定に機能し、いくつかの組織型にわたって分化することが示されている。Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒら、（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４（２）：１４３〜１４７およびＨｕａｒｄら、２００４）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（５）：４１９〜２３。
【０２６３】
幹細胞または前駆体細胞は、これだけに限らないが例えば末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）、骨髄から単離された幹細胞（骨髄細胞；ＢＭＣｓ）；脂肪組織から単離された幹細胞；間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）、臍帯血から単離された幹細胞、月経液、心臓由来細胞、胚性幹細胞、ＣＤ３０＋細胞、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３４’’細胞、ＣＤ９＋細胞、ＣＤ２９＋細胞、ＣＤ４４＋細胞、ＣＤ４５＋細胞、ＣＤ４９＋細胞、ＣＤ５４＋細胞、ＣＤ５６＋細胞、ＣＤ５９＋細胞、ＣＤ７１＋細胞、ＣＤ９０＋細胞、例えばＣＤ９０．１＋またはＣＤ９０．２＋細胞、ＣＤ１０５＋細胞、ＣＤ１３３＋細胞、ＣＤ１３５＋（ｆｌｔ−３＋）細胞、ＣＤ１４０ａ＋細胞、ＣＤＣＰ１＋細胞、ＣＤ１４６＋（ｍ’’ｃ−１８＋）細胞、ＡＢＣＧ２＋細胞、ＣＤ１４４＋細胞、胎性肝臓キナーゼ１＋細胞、Ｓｔｒｏ−１＋細胞、ＣＤ１１７＋（ｃ−ｋｉｔ＋）細胞、ネスチン＋細胞、ＰＳＡ−ＮＣＡｍ＋細胞、ＣＤ３０＋細胞、ｐ７５ニューロトフィン＋細胞、ＣＤ１０６＋細胞、ＣＤ１２０ａ＋細胞、ＣＤ１２４＋細胞、ＣＤ１６６＋細胞、幹細胞因子＋（ＳＣＦ＋）細胞、Ｓｃａ−１＋細胞、ＳＨ２＋細胞、ＳＨ３＋細胞、ＨＬＡ、例えばＨＬＡ−ＡＢＣ細胞、骨形態形成タンパク質タンパク質＋（ＢＭＰ）細胞、例えばＢＭＰ２＋およびＢＭＰ４＋細胞、Ｇａｐ４３＋細胞、グリア線維酸性タンパク質‘１’（ＧＦＡＰ＋）細胞、ミエリン塩基性タンパク質＋（ＭＢＰ＋）細胞、０４＋細胞、Ｏ１＋細胞、シナプトフィジン＋細胞、アルカリホスファターゼ＋細胞、ｃｒｉｐｔｏ＋（ＴＤＧＦ−１＋）細胞、ポドカリキシン＋細胞、硫酸化プロテオグリカン＋細胞、例えばシリル化ケラチン硫酸プロテオグリカン＋細胞、ステージ特異的胎児抗原＋（例えば、ＳＳＥＡ−１、−３および−４）細胞、ＴＲＡ−１−６０＋細胞、ＴＲＡ−１−８１＋細胞、オステオカルシン＋細胞、マトリクスｇｌａタンパク質＋細胞、オステオポンチン‘１’細胞、Ｔｈｙｌ＋細胞、コラーゲンＩＩ型＋細胞、コラーゲンＩＶ型＋細胞、脂肪酸輸送体＋細胞およびベータ−インテグリン＋細胞を含む。
【０２６４】
本発明は、組換えＡＡＶビリオンを用いて選択された遺伝子の筋肉細胞または組織への順調な移行を提供する。方法は、組換えＡＡＶビリオンの筋肉組織への直接的、ｉｎ  ｖｉｖｏ注射（例えば筋肉内注射による）および治療対象へ続いて導入されうる筋肉細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ形質導入を可能にする。分化した筋肉細胞および組織は、それらが容易に利用でき、非分裂性であることから遺伝子治療のための望ましい標的を提供する。しかし本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質導入されることができ、続いて対象に導入されうる筋原細胞などの未分化筋肉細胞での使用も見出す。筋肉内注射は、針アレイデバイスを用いて達成されうる。
【０２６５】
遺伝子置換
本開示の実施形態では、遺伝子置換治療剤は、置換遺伝子を提供するために役立ち、それにより根底にある原因が対象における対応する遺伝子中の欠損であるおよび／または遺伝子の置換が対象に有益である疾患または障害を治療する。１つまたは複数の遺伝子が本発明の方法を用いて置換されうる。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、置換遺伝子は、生物機能性のマイクロ−ジストロフィンをコードする。マイクロ−ジストロフィンをコードする遺伝子は、５ｋｂより小さい場合がある。重要なことに、マイクロ−ジストロフィンはジストロフィー病態および症状から筋肉を保護できる。
【０２６７】
マイクロ−ジストロフィンをコードする遺伝子は、ジストロフィン・ミニ遺伝子と称される場合があり、用語はセントラルロッドドメイン（ｃｅｎｔｒａｌ  ｒｏｄ  ｄｏｍａｉｎ）中の広範囲の欠失に加えてヒトジストロフィンＤＮＡのＣ末端ドメイン中の広範囲の欠失によって作製されたジストロフィン構築物を包含する。付加的にジストロフィン・ミニ遺伝子は、元のタンパク質翻訳開始コドンＡＴＧ周辺のＤＮＡ配列が修飾された修飾Ｎ末端ドメインを含有してもよい。修飾配列は、ミニジストロフィンタンパク質合成を増強する。代替的にジストロフィン・ミニ遺伝子は、ドメインのいくつかがユートロフィンまたはスペクトリン遺伝子由来の相同ドメインで置換されているハイブリッド遺伝子であってもよい（Ｔｉｎｓｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ３６０、５９１〜５９３［１９９２］；Ｋｏｅｎｉｇら、Ｃｅｌｌ５３、２１９〜２１６［１９８８］）。具体的にはユートロフィンは構造および機能の両方においてジストロフィンに高度に相同性であり、それによりそれらの主なドメインは互換的である（Ｔｉｎｓｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ．３８４、３４９〜３５３［１９９６］；Ｄｅｃｏｎｉｎｃｋら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．３、１２１６〜２１［１９９７］；Ｒａｆａｅｌら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．１９、７９〜８２［１９９８］；）。例えばジストロフィンのＮ末端および／またはＣ末端ドメインは、ジストロフィン・ミニ遺伝子中においてユートロフィン対応物で置換されてもよい。同様にセントラルロッドドメインは、ユートロフィンまたはスペクトリン遺伝子由来のロッド反復ドメインからなってよい。ジストロフィン・ミニ遺伝子は、ＡＡＶウイルス性ベクターの５ｋｂパッケージング限界より小さい。さらに、本発明に記載のジストロフィン・ミニ遺伝子と同様のやり方でユートロフィンのミニ遺伝子を構築することも妥当である。いくらかのＤＭＤ患者は、ジストロフィンタンパク質を完全に欠いていることから、ジストロフィン・ミニ遺伝子生成物は新抗原となりうる。ジストロフィンドメインのユートロフィンのそれでの置換は、免疫応答を低下させうる。
【０２６８】
ジストロフィン・ミニ遺伝子は、ジストロフィン遺伝子のＮ末端配列、ジストロフィン遺伝子のＣ末端システインリッチ（ＣＲ）ドメイン、ジストロフィン遺伝子の少なくともヒンジＨＩおよびＨ４ならびに少なくとも４個のロッド反復ドメインを含みうる。ロッド反復ドメインは、ジストロフィン、ユートロフィンまたはスペクトリン遺伝子のロッド反復ドメインから、好ましくはジストロフィン遺伝子の２４ロッド反復ドメインから、最も好ましくはジストロフィン遺伝子のロッド反復ドメインＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ２２、Ｒ２３およびＲ２４からなる群から選ばれうる。ジストロフィン・ミニ遺伝子のＮ末端は、遺伝子生成物の機能に影響を与えずに発現効率を改善するために修飾されてよい。例えばジストロフィン遺伝子の翻訳開始ＡＴＧコドン周辺の元の配列は、タンパク質合成の効率を増加させるためにコザック配列で置換されうる。本発明の一実施形態では、コード配列の３ヌクレオチド上流は、「ＡＡＡ」から「ＣＣＡ」に変更されることができ、コード配列の４番目のヌクレオチドは「Ｃ」から「Ｇ」に変更されうる。付加的にＮ末端の一部分または全体は、ユートロフィン遺伝子の対応物によって置換されうる。同様にジストロフィン・ミニ遺伝子のＣＲドメインもユートロフィン遺伝子の対応物によって置換されうる。
【０２６９】
いくつかの実施形態では、置換遺伝子は、ミオスタチン阻害物質の追加的な１つもしくは複数のコピーまたはミオスタチン阻害物質の増強バージョンをコードする。ミオスタチン阻害物質は、天然のミオスタチン阻害物質の野生型または変異体バージョンを含むことができ、その非限定的例はミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、ＦＬＲＧおよびＧＡＳＰ−１を含む。
【０２７０】
本開示のミオスタチン阻害物質は、ペプチドまたはポリペプチドであってよい。タンパク質は、ミオスタチンに結合することによって［ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３８７（６６２８）：８３〜９０（１９９７）］、またはミオスタチン受容体アクチビンＩＩｂに結合することによって［ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、２２（３）：２６０〜２６４（１９９９）］ミオスタチンを阻害しうる。ミオスタチンに結合することによってミオスタチンを阻害するタンパク質の例は、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン［Ｓｈｉｍａｓａｋｉら、米国特許第５，０４１，５３８号］、他のフォリスタチン様タンパク質（米国特許第５，９４２，４２０号；第６，４１０，２３２号；第６，５３７，９６６号；および第６，９５３，６６２号）、ＦＬＲＧ（［Ｈｉｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７（４３）：４０７３５〜４０７４１（２００２）］およびＧＡＳＰ−１（［Ｈｉｌｌら、Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、１７：１１４４〜１１５４（２００３）］である。本発明によるミオスタチン阻害物質であるタンパク質は、タンパク質断片であってよく、またはキメラ（すなわち融合）タンパク質であってよい。
【０２７１】
本開示の他の好適な置換遺伝子は、例えばサルコグリカン欠損での置換のためのサルコグリカンおよび筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）患者のＩＧＦ−１または変異体ＳＯＤＩ干渉戦略での治療を含む。
【０２７２】
置換遺伝子の発現は、これだけに限らないがＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）、レトロウイルス長末端反復配列（ＬＴＲ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーターおよび／またはエンハンサー、ＣＭＶエンハンサーおよびニワトリβ−アクチンプロモーター、α−アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、筋特異的クレアチニンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーターおよび／またはエンハンサーなどを含む多数の調節エレメントによって制御されうる。代替的に上のプロモーターの改変バージョンおよび合成筋肉プロモーターも用いられうる。
【０２７３】
開示の制御エレメントは、プロモーター領域、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製開始点、配列内リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサーなどを含み、レシピエント細胞内でのコード配列の複製、転写および翻訳を集合的に提供する。選択されたコード配列が適切な宿主細胞内で複製、転写および翻訳されうる限り、これらの制御エレメントの全てが常に存在する必要はない。
【０２７４】
用語プロモーター領域は、ＤＮＡ調節配列を含むヌクレオチド領域を意味するその通常の意味で本明細書において用いられ、調節配列はＲＮＡポリメラーゼに結合でき、下流（３’−方向）コード配列の転写を開始できる遺伝子由来である。
【０２７５】
作動可能に連結は、エレメントの配置であって、記載された構成成分がそれらの通常の機能を実施するように構成されていることを意味する。したがってコード配列に作動可能に連結された制御エレメントは、コード配列の発現に影響を与えることができる。制御エレメントは、コード配列の発現を管理するように機能する限りそれと近接である必要はない。したがって、例えば介在性で非翻訳だが転写される配列がプロモーター配列とコード配列との間に存在する場合があり、それでもプロモーター配列はコード配列に作動可能に連結されていると考えられうる。
【０２７６】
筋特異的および誘導性のプロモーター、エンハンサーなどの制御エレメントは、本開示の方法において用いられうる。そのような制御エレメントは、これだけに限らないが、ｍｙｏＤ遺伝子ファミリー由来などのアクチンおよびミオシン遺伝子ファミリー由来のもの（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７６１〜７６６）；筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ−２（Ｃｓｅｒｊｅｓｉ  ａｎｄ  Ｏｌｓｏｎ（１９９１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１：４８５４〜４８６２）；ヒト骨格アクチン遺伝子由来制御エレメント（Ｍｕｓｃａｔら、（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：４０８９〜４０９９）および心臓アクチン遺伝子；筋クレアチンキナーゼ配列エレメント（Ｊｏｈｎｓｏｎら、（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：３３９３〜３３９９）およびマウスクレアチンキナーゼエンハンサー（ｍＣＫ）エレメント；骨格高速収縮トロポニンＣ遺伝子、低速収縮心筋トロポニンＣ遺伝子および低速収縮トロポニンＩ遺伝子由来の制御エレメント；低酸素誘導核因子（Ｓｅｍｅｎｚａら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：５６８０〜５６８４；Ｓｅｍｅｎｚａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２３７５７〜２３７６３）；グルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）などのステロイド誘導性エレメントおよびプロモーター（Ｍａｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５６０３〜５６０７）；ＲＵ４８６誘導のための融合コンセンサスエレメント；ならびにテトラサイクリン調節遺伝子発現を提供するエレメント（Ｄｈａｗａｎら、（１９９５）Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２１：２３３〜２４０；Ｓｈｏｃｋｅｔｔら、（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６５２２〜６５２６を含む。
【０２７７】
いくつかの実施形態では、筋肉機能の１つまたは複数のエフェクターをコードするポリヌクレオチドは、遺伝子カセットを形成するように、標的細胞において機能的である転写制御ＤＮＡ（例えばプロモーターＤＮＡ）およびポリアデニル化シグナル配列ＤＮＡに作動可能に連結している。遺伝子カセットは、哺乳動物細胞において発現される際にＲＮＡ転写物のプロセシングを促進するためのイントロン配列も含んでよい。代替的にｒＡＡＶゲノム中のポリヌクレオチドは筋肉機能ＲＮＡのエフェクターであるか、または筋肉機能のエフェクターのＲＮＡをコードする場合もある。ＲＮＡは、筋肉機能の負の調節因子（例えばミオスタチンまたはその受容体アクチビンＩＩｂ）の発現を阻害することによって筋肉機能に影響を及ぼすアンチセンスＲＮＡＳ、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）またはアプタマーであってよい。発現を阻害する他の機序は、これだけに限らないが、翻訳開始部位に方向付けられたアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡに結合し、ＤＮＡ巻き戻しおよび転写を妨げるＲＮＡを含む。さらに別の例として、Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．）、Ｄａｒｍａｃｏｎ  Ｉｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、Ｃｏｌｏ．）、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＬＬＣ（Ｈｅｒｎｄｏｎ、Ｖａ．）などの商業的提供者は、カスタムｓｉＲＮＡ分子を生成する。付加的にＳＩＬＥＮＣＥＲＴＭ  ｓｉＲＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．）ｏｐｓｉＲＮＡ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）などの商業的キットは、カスタムｓｉＲＮＡ分子を作製するために利用可能である。
【０２７８】
疾患および障害
本開示の方法は、筋肉の消耗疾患などの筋肉疾患または障害の治療において有用である。用語筋肉の消耗疾患は、低下した筋肉機能を生じる状態を広く意味する。
【０２７９】
筋肉の消耗疾患は、一般に３つのカテゴリー：（１）筋ジストロフィー；（２）炎症性ミオパチー；および（３）筋萎縮症に分けられる。本開示の方法での治療に関する筋ジストロフィーは、例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィーおよび肢帯型筋ジストロフィーを含む。筋ジストロフィーは、遺伝性、進行性であり、各型は筋力低下の特徴的、選択的様式を生じる。他の筋ジストロフィーは、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィーおよびエメリ・ドレフュス型筋ジストロフィーを含む。
【０２８０】
デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよびベッカー型筋ジストロフィーは、これらのジストロフィーが筋力低下および能力障害の類似した様式を共有していることならびに同様に遺伝性であることにおいて類似している。典型的には、デュシェンヌ型またはベッカー型筋ジストロフィーについて治療を必要とする対象は、歩行困難を有し、最終的には車椅子依存者となる。一般にデュシェンヌ型筋ジストロフィーとベッカー型筋ジストロフィーとの間を区別する任意的手段は、罹患した対象が１６歳でまだ歩行できるかどうかに依存する。デュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する対象は、一般に十代までに車椅子生活になる。より詳細には、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹患した対象の筋生検は、ベッカー型筋ジストロフィーを罹患した対象と比較してより無能性の変化を示す。
【０２８１】
デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよびベッカー型筋ジストロフィーは、筋線維がジストロフィンを作ることができるように方向付ける同一の遺伝子の欠損または変異による。ジストロフィン遺伝子は、細胞外マトリクスを筋線維細胞骨格に連結する際に機能する大きな４２７ｋＤタンパク質をコードしている。ジストロフィンのアミノ末端は、骨格筋の収縮性装置と接触している繊維状アクチンに結合し、一方カルボキシル末端近くのシステインリッチドメインは、ジストロフィン糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）を構成する他の膜タンパク質と関連する線維膜に局在するジストログリカンタンパク質に結合している。ジストロフィン発現の欠損は、ＤＧＣメンバーの付随する減少をもたらす。現在、ジストロフィンの減少および結果として生じるＤＧＣ複合体の減少は、収縮性活動の反復サイクル後に損傷を受ける骨格筋膜の統合性を損なうと考えられている。膜損傷は、さらにクレアチンキナーゼ放出を生じ、カルシウム流入を刺激し、免疫Ｔ細胞、マクロファージおよびマスト細胞の動員を誘導し、結果的に筋線維壊死になる。これらの細胞の再生能力は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者において消耗され、それにより筋肉の消耗プロセスを悪化させる線維症および脂肪沈着が蓄積する。
【０２８２】
肢帯型筋ジストロフィーは、さらに２つのカテゴリー、常染色体優性遺伝性（ＬＧＭＤ  １）および常染色体劣性遺伝性（ＬＧＭＤ  ２）症候群に分類されうる少なくとも１０個の異なる遺伝性障害を含む。大部分の肢帯型筋ジストロフィーの症状は、典型的には小児期から青年期に始まる骨盤筋力低下で始まる。後に、次の２０〜３０年間にわたる運動性の顕著な減少または車椅子依存への進行を伴う肩の筋力低下の発症がある。
【０２８３】
大部分の常染色体優性遺伝性型肢帯型筋ジストロフィーを生じる欠損遺伝子は、いまだ発見されていないが、疾患は種々の染色体における変異と関連している。例えばＬＧＭＤ１Ａ型ジストロフィーは、５番染色体に関連している。追加的にＬＧＭＤ１Ｂ型ジストロフィーは、第１染色体に関連している。常染色体優性遺伝性型肢帯型筋ジストロフィーに関連している他の染色体は、３番および７番染色体を含む。いくつかの常染色体劣性遺伝性型肢帯型筋ジストロフィーは、ジストロフィン関連糖タンパク質（すなわちサルコグリカン）における変異のためである。
【０２８４】
別の実施形態は、本開示の方法を炎症性ミオパチーを治療するために用いることを包含する。炎症性ミオパチーは、横紋骨格筋の疾患または異常な状態である。ほとんどの炎症性ミオパチーの原因は不明である。典型的には炎症性ミオパチーは、身体自身の免疫系が筋細胞を攻撃する自己免疫反応から生じると考えられている。治療に関する炎症性ミオパチーの例は、多発性筋炎および皮膚筋炎を含みうる。
【０２８５】
多発性筋炎の症状は、筋炎および筋圧痛を含む。症状の発症は急性である場合があるが、状態は通常ゆっくり進行し、未処置のままにすると対象の歩行能力を損なう場合がある。
【０２８６】
皮膚筋炎についての治療を必要とする対象は、多発性筋炎と類似の症状を有するが、追加的に特徴的な皮膚発疹の徴候を示す。詳細には青紫色または赤黒い発疹が対象の顔面、眼瞼ならびに爪、指関節、肘、膝、胸および背中の周辺に現れる。典型的には皮膚筋炎は、４０代後半から６０代前半の成人対象にまたは５歳から１５歳の間の年齢の小児に生じる。
【０２８７】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、筋萎縮症を治療するために利用されうる。筋萎縮症は、がん性カヘキシー、ＡＩＤＳカヘキシーまたは心臓カヘキシーなどの障害または状態の結果である場合がある。一般にカヘキシーは、がん、ＡＩＤＳおよび慢性心不全などの多数の疾患の副次的影響として生じる場合がある脂肪組織および骨格筋量の両方の大量減少（体重の３０％まで）に関連する。脂肪組織および骨格筋量の減少は、食欲不振、早期満腹、疲労、全身性筋力低下、筋肉機能の低下および進行性の筋肉の消耗をもたらす場合がある。
【０２８８】
対象における筋肉の消耗疾患は、対象が筋ジストロフィー；筋萎縮症；Ｘ連鎖型球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、カヘキシー；栄養障害、結核、ハンセン病、糖尿病、腎疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＤ）、がん、末期腎不全、熱傷、糖尿病、うっ血性心不全、サルコペニア、肺気腫、骨軟化症または心筋症を有する対象の結果である場合がある。
【０２８９】
別の実施形態では、筋肉の消耗疾患は、エンテロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、帯状疱疹、ＨＩＶ、トリパノソーマ、インフルエンザ、コクサッキー、リケッチア、旋毛虫、住血吸虫またはマイコバクテリアの感染による。
【０２９０】
サルコペニアは、高齢の慢性疾病患者を苦しめる消耗性疾患であり、筋肉量および機能の減少によって特徴付けられ、例えば本発明の方法によって治療されうる。付加的に他の環境および状態が関連し、筋肉の消耗障害を引き起こす場合がある。例えば研究は、慢性腰痛の重症例に傍脊柱筋群消耗があることを示している。
【０２９１】
本開示の方法での治療が考察される疾患および障害のさらなる非限定的例は、筋肉が有害に冒されている神経変性疾患／障害（例えば筋萎縮性側索硬化症多発性硬化症および脊髄性筋萎縮症）、サルコペニア、カヘキシー、肥満、ＩＩ型糖尿病、ポンペ病およびリソソーム蓄積障害を含む。
【０２９２】
遺伝子治療のための標的組織
いくつかの実施形態では、開示は、遺伝子置換治療剤を筋肉組織（用語筋肉と互換的に用いられる）または筋肉細胞（用語は、筋肉由来の細胞または細胞群を意味し、これだけに限らないが骨格筋；平滑筋（例えば消化管、膀胱および血管由来）；および心筋由来の細胞および組織を含む）に導入する方法を例示する。用語筋肉細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ両方の筋肉細胞を捉える。したがって例えば単離された心筋細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで対象にある筋肉組織中に存在する場合の筋肉細胞と同様に本発明の目的のための筋肉細胞を構成する。同様に包含されるのは、筋管、筋芽細胞（分裂するおよび分化したの両方）、心筋細胞および心筋芽細胞などの筋細胞などの、分化したおよび未分化の筋肉細胞のいずれにも由来する筋肉細胞および筋肉組織である。
【０２９３】
一般に組織は医学分野において十分に周知であり、関連する結合組織由来の構造的統合性を含むまたは由来することができ、薄膜（例えば髄膜、心膜、胸膜、粘膜、基底膜、網、臓器包膜（ｏｒｇａｎ−ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）など）によって身体の他の領域から分離されうる三次元的に区別されたコンパートメントなどの、実質的に多細胞性、細胞間、組織および／または臓器構造の生成物である任意の凝集性で空間的に分離した非流体性で区別された解剖学的コンパートメントを含みうる。非限定的例示的な組織は、脳、肝臓、肺、腎臓、前立腺、卵巣、脾臓、リンパ節（扁桃を含む）、甲状腺、膵臓、心臓、骨格筋、腸、喉頭、食道および胃を含みうる。解剖学的位置、形態学的特性、組織学的特徴ならびにこれらのおよび他の固形組織への侵襲的および／または非侵襲的アクセスは関連する技術分野の当業者に十分周知である。いくつかの実施形態では、組織は正常である。いくつかの実施形態では、組織は、がん性である、炎症を起こしている、感染している、萎縮している、麻痺している、発作を起こしているまたは凝固しているまたはそうであると疑われる。いくつかの実施形態では、組織は、筋肉疾患または障害を罹患しているまたは罹患していると疑われる。いくつかの実施形態では、組織は筋肉疾患または障害を罹患している。
【０２９４】
遺伝子治療のための対象
特定の実施形態では、対象は、前臨床モデルおよびヒト対象の内の１つである。対象は、非限定的にヒトならびにチンパンジーおよび他の類人猿およびサル種などの非ヒト霊長類；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマなどの家畜；イヌおよびネコなどの飼育哺乳動物；マウス、ラットおよびモルモットなどのげっ歯類を含む実験動物などを含む哺乳網の任意のメンバーを意味する哺乳動物であってよい。用語は具体的な年齢および性別を意味しない。したがって成体対象および新生対象ならびに胎仔を、オスまたはメスにかかわらず網羅することを意図する。
【０２９５】
いくつかの実施形態では、対象は、野生型イヌまたはｃｘｍｄイヌなどのイヌ前臨床モデルである。イヌの骨格筋へのＡＡＶベクターの有効な浸透およびデリバリーは、個々の筋肉内ＡＡＶ注射後のＷＴおよびｃｘｍｄイヌの両方における長期間の導入遺伝子発現を可能にすることにおいて有効な免疫抑制処方計画を用いて達成される。
【０２９６】
いくつかの実施形態では、対象は、前臨床動物モデルである。いくつかの実施形態では、対象は、マウスモデルまたはラットモデルの内の１つである。前臨床モデルは、異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）または異種移植（ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）のレシピエントである動物モデルであってよく、用語は、１つの種から別の種への生きている細胞、組織または臓器の移植を意味して互換的に用いられる。いくつかの好ましい場合では、前臨床モデルは、腫瘍に発達する１つまたは複数のがん細胞のレシピエントである。レシピエント前臨床モデルは、ＳＣＩＤマウスまたはヌードマウスなどの免疫低下動物であってよい。胸腺欠損ヌードマウスは、変質した胸腺または胸腺欠損を生じてＴ細胞数の大幅な低下のために阻害された免疫系をもたらす遺伝的変異を有する株由来の実験用マウスである。前臨床モデルにおける免疫低下状態は、遺伝的異常の結果であってよく、または免疫系機能を抑制する薬物治療の結果であってよい。免疫抑制薬物または免疫抑制剤は、免疫系の活性を阻害するまたは抑制する薬物である。免疫抑制薬物の非限定的例は、グルココルチコイド；細胞分裂阻害剤；アルキル化剤；メトトレキサートなどの葉酸類似物ならびにアザチオプリンおよびメルカプトプリンなどのプリン類似物を含む代謝拮抗薬；アザチオプリンおよびメルカプトプリン；ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシンおよびミトラマイシンを含む細胞傷害性抗生物質；免疫系のエレメントを標的化するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体；ならびにシクロスポリン、タクロリムス、ボクロスポリンおよび他のカルシニューリン阻害物質ならびにシロリムスを含むイムノフィリンに作用する薬物；インターフェロン、オピオイド、ＴＮＦ結合タンパク質、ミコフェノレートならびにフィンゴリモドを含む。
【０２９７】
特定の他の実施形態は、非ヒト対象または生物学的供給源（例えば、固形腫瘍および／または他のがんについての前臨床モデルを含む、当業者に前臨床モデルとして周知である場合がある非ヒト対象を含む例えばマカク、チンパンジー、ゴリラ、ベルベット、オランウータン、ヒヒまたは他の非ヒト霊長類などの非ヒト霊長類）を考察する。特定の他の実施形態は、例えばマウス、イヌ、ラット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ヤギ、スナネズミ、ハムスター、モルモットまたは他の哺乳動物などの哺乳動物である非ヒト対象を考察し；そのような哺乳動物の多くは、固形腫瘍および／または他のがんを含む特定の疾患または障害のための前臨床モデルとして当業者に周知である対象でありうる（例えばＴａｌｍａｄｇｅら、２００７  Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７０：７９３；Ｋｅｒｂｅｌ、２００３  Ｃａｎｃ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．２（４  Ｓｕｐｐｌ  １）：Ｓ１３４；Ｍａｎら、２００７  Ｃａｎｃ．Ｍｅｔ．Ｒｅｖ．２６：７３７；Ｃｅｓｐｅｄｅｓら、２００６  Ｃｌｉｎ．ＴｒａｎｓＬ  Ｏｎｃｏｌ．８：３１８）。しかし、対象または生物学的供給源が非哺乳動物脊椎動物（例えば別の高等脊椎動物もしくは鳥類、両生類もしくは爬虫類種）または他の対象もしくは生物学的供給源でありうる他の実施形態も考察されるように、本実施形態の範囲がそのように限定されることは意図されない。非内在性（例えば異種性）であって細胞の一部分に染色体外エレメントとして存在するもしくはその生殖系ＤＮＡに（すなわちそのほとんどまたは全ての細胞のゲノム配列に）安定に組み込まれている核酸を動物の細胞の１つまたは複数が含む遺伝子導入動物は非ヒト動物である。本発明の特定の実施形態では、遺伝子導入動物の組織は標的でありうる。いくつかの実施形態では、固形組織は、１つの生物の１つまたは複数の細胞（例えば培養されたヒトがん細胞または原発性ヒトがん細胞）を非ヒトモデル生物に導入することによって作製された異種移植片である。
【０２９８】
本発明の方法は、種々の組織に遺伝子置換治療剤を投与するために好適である；方法は医学的および獣医学的使用を有する。いくつかの実施形態では、動物は、ペット、コンパニオンアニマル、監視動物（ｇｕａｒｄｉａｎ  ａｎｉｍａｌ）、使役動物、繁殖動物、介助動物、競争用動物、家畜、飼われている動物（ｈｅｒｄｅｄ  ａｎｉｍａｌ）または実験動物である。
【０２９９】
対象または生物学的供給源は、ヒトまたは非ヒト動物、遺伝子導入されたまたはクローニングされたまたは組織操作された（幹細胞の使用を通じるものを含む）生物、初代細胞培養または、これだけに限らないが染色体に組み込まれたもしくはエピソームの組換え核酸配列を含有できる遺伝的に操作された細胞株を含む培養適応細胞株、不死化されたまたは不死化可能な細胞株、体細胞ハイブリッド細胞株、分化したまたは分化可能な細胞株、形質転換された細胞株などであってよい。本発明のいくつかの実施形態では、対象または生物学的供給源は、悪性状態または筋肉疾患もしくは障害を有することが疑われる、または有する危険がある場合があり、本発明のいくつかの実施形態では、対象または生物学的供給源は、そのような疾患の危険性または存在がないことが周知であってよい。
【０３００】
処方
流体薬剤または遺伝子置換治療剤は、薬学的に許容される担体を含むことができ、その例は製薬分野において周知であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄｉｔ．１９８５）に記載されている。例えば、生理的ｐＨの滅菌生理食塩水およびリン酸緩衝生理食塩水は用いられうる。保存剤、安定化剤、色素および他の補助的薬剤は医薬組成物中で提供されうる。例えば安息香酸ナトリウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のソルビン酸およびエステルは、保存剤として添加されうる。付加的に抗酸化剤および懸濁剤も用いられうる。薬学的に許容される塩は、そのような化合物と有機酸もしくは無機酸（酸付加塩）または有機塩基もしくは無機塩基（塩基付加塩）との組み合わせから誘導される薬物化合物の塩を意味する。本明細書において使用について考察される薬物を含む薬剤は、遊離塩基または塩形態のいずれにおいても、両形態が本発明の特定の実施形態の範囲内にあると考えられて用いられうる。
【０３０１】
薬剤は、対象に投与されることができる任意の形態にあってよい。いくつかの実施形態により薬剤は、液体形態であってよく、投与経路は本明細書に記載の組織への投与を含む。本明細書において用いる用語非経口は、これだけに限らないが経皮または皮下注射および筋肉内、髄内および胸骨内技術を含む。
【０３０２】
本明細書において用いる液体医薬組成物は、溶液、懸濁液または他の形態であるかにかかわらず、１つまたは複数の次のアジュバント：注射のための水、生理食塩水、生理的食塩水、リンゲル溶液、生理食塩水（例えば通常の生理食塩水または等張性、低浸透圧性もしくは高浸透圧性塩化ナトリウム）などの滅菌希釈剤、溶媒または懸濁媒体として役立ちうる合成モノまたはジグリセリドなどの固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アルコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸、クエン酸またはリン酸などの緩衝剤および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの浸透圧の調整のための薬剤を含みうる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量バイアルに封入されうる。いくつかの実施形態では、生理的食塩水はアジュバントである。注射可能な医薬組成物は滅菌されうる。これだけに限らないがアルミニウム塩、油中水乳剤、生分解性油ビヒクル、水中油乳剤、生分解性マイクロカプセル、ハイドロゲルおよびリポソームを含むデリバリービヒクルなどの他の構成要素を調製物中に含むことが望ましい場合もある。
【０３０３】
当業者に周知の任意の好適な担体は本発明の医薬組成物中で用いられうるが、担体の種類は投与の様式および従来の徐放性薬物放出が望ましいかどうかに応じて変わる。薬物の追加的注射などの非経口投与のために担体は、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックスまたは緩衝剤を含みうる。生分解性微粒子（例えばポリ乳酸ガラクチド）は、本発明の医薬組成物のためのカーダー（ｃａｒｄｅｒ）として用いられうる。好適な生分解性微粒子は、例えば米国特許第４，８９７，２６８号および第５，０７５，１０９号において開示されている。いくつかの実施形態では、微粒子はおよそ２５ミクロンより大きいが、他の実施形態はそのように限定されず、他の大きさも考察する。
【０３０４】
医薬組成物は、緩衝剤などの希釈剤、アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、グルコース、スクロースまたはデキストリンを含む炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、グルタチオンおよび他の安定化剤ならびに賦形剤も含有しうる。中性緩衝生理食塩水または非特異的血清アルブミンと混合した生理食塩水は例示的な適切な希釈剤である。いくつかの実施形態では、薬剤（例えば治療剤または候補薬物）は、希釈剤として適切な賦形剤溶液（例えばスクロース）を用いて凍結乾燥物として処方される。
【０３０５】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ハイドロゲルをさらに含む。ハイドロゲルは、固形組織全体への医薬用製剤の拡散または分散の速度を遅くするために有効である。いくつかの実施形態では、ハイドロゲルを含有する医薬組成物は、ハイドロゲルを欠く類似の医薬組成物よりも低い程度で固形組織全体に分散する。いくつかの実施形態では、ハイドロゲルを含有する医薬組成物は、ハイドロゲルを含まない類似の医薬組成物よりもより遅く固形組織全体に分散する。
【０３０６】
ハイドロゲルは、医薬組成物の約0.1%、約0.2%、約0.3%、約0.4%、約0.5%、約0.6%、約0.7%、約0.8%、約0.9%、約1%、約1.1%、約1.2%、約1.3%、約1.4%、約1.5%、約1.6%、約1.7%、約1.8%、約1.9%、約2%、約2.1%、約2.2%、約2.3%、約2.4%、約2.5%、約2.6%、約2.7%、約2.8%、約2.9%、約3%、約3.1%、約3.2%、約3.3%、約3.4%、約3.5%、約3.6%、約3.7%、約3.8%、約3.9%、約4%、約4.1%、約4.2%、約4.3%、約4.4%、約4.5%、約4.6%、約4.7%、約4.8%、約4.9%、約5%、約5.5%、約6%、約6.5%、約7%、約7.5%、約8%、約8.5%、約9%、約9.5%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約17%、約18%、約19%、約20%、約21%、約22%、約23%、約24%、約25%、約26%、約27%、約28%、約29%、約30%、約31%、約32%、約33%、約34%、約35%、約36%、約37%、約38%、約39%、約40%、約41%、約42%、約43%、約44%、約45%、約46%、約47%、約48%、約49%、約50%、約51%、約52%、約53%、約54%、約55%、約56%、約57%、約58%、約59%、約60%、約61%、約62%、約63%、約64%、約65%、約66%、約67%、約68%、約69%、約70%、約71%、約72%、約73%、約74%、約75%、約76%、約77%、約78%、約79%、約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、または約99%の量で存在できる。
【０３０７】
生物学的使用のために好適な例示的多孔質材料は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，０１４，３３５号に記載されている。これらの材料はこれだけに限らないが、架橋ポリビニルアルコール、ポリオレフィンもしくはポリビニルクロリドまたは架橋ゼラチン；再生不溶性非浸食性セルロース、アシル化セルロース、エステル化セルロース、セルロースアセテートプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、セルロースアセテートジエチルアミノアセテート；ポリウレタン、ポリカーボネートおよびポリカチオンとポリアニオンの修飾不溶性コラーゲンの共沈殿によって形成された微小孔性ポリマーを含む。
【０３０８】
いくつかの実施形態では、ハイドロゲルはコラーゲンを含む。コラーゲンの供給源の非限定的例は、エンゲルブレス−ホルム−スワーンマウス肉腫基底膜、ウシアキレス腱、ウシ鼻中隔、ウシ気管軟骨、仔牛皮膚、ニワトリ胸骨軟骨、ヒト肺、ヒト胎盤、カンガルー尾部、マウス胸骨およびラット尾腱を含む。コラーゲンは、０．１％、０．２％、０．５％、０．７％、１％、１．２％、１．４％、１．６％、１．８％、２％または５％より多いハイドロゲルを含みうる。組換えコラーゲンは用いられうる。コラーゲンのいくつかの供給源は米国特許出願第ＵＳ２００７０２５４０４１号に記載されている。水に不溶性であるコラーゲン材料は用いられることができ、天然組織供給源（例えばレシピエントヒトまたは他の患者に関して異種間、同種間もしくは自源性）に由来でき、または組換え的に調製されうる。コラーゲンは、それらのアミノ酸配列、炭水化物含有量およびジスルフィド架橋結合の存在または不在に応じていくつかの異なる型に亜分類されうる。Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲンは、コラーゲンの２つの最も一般的な亜型である。Ｉ型コラーゲンは、皮膚、腱および骨に存在し、一方ＩＩＩ型コラーゲンは主に皮膚に認められる。本発明の組成物中に用いられるコラーゲンは、皮膚、骨、腱または軟骨から得ることができ、当技術分野および産業において周知の方法によって精製されうる。代替的にコラーゲンは、商業的供給源から購入されうる。Ｉ型ウシコラーゲンは本発明における使用のために好ましい。
【０３０９】
コラーゲンは、アテロペプチドコラーゲンおよび／またはテロペプチドコラーゲンであってよい。さらに非線維性および線維性コラーゲンのいずれかまたは両方は用いられうる。非線維性コラーゲンは、可溶化されており、天然の線維性形態に再構成されていないコラーゲンである。
【０３１０】
好適なコラーゲン生成物は、例えば、ｓｅｍｅｄ  Ｆとして周知の線維性コラーゲンをウシ皮膚から製造しているＫｅｎｓｅｙ  Ｎａｓｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｅｘｔｏｎ、Ｐａ．）からを含んで商業的に入手可能である。ウシ皮膚由来のコラーゲン材料は、Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｈｏｌｄｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ、Ｎ．Ｊ．）によっても製造されている。天然由来のまたは組換えヒトコラーゲン材料も本発明における使用のために好適である。例示的に組換えヒトコラーゲン生成物はＦｉｂｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．）から入手可能である。本発明の組成物に組み入れられる固形粒子状コラーゲンは、例えば未処理のもしくは再構成された線維状の形態または不規則な形状の粒子であってよい。
【０３１１】
コラーゲンは、室温で水に溶解されて水性溶液を形成することができるが、３７度で重合を受けてゲルを形成する。Ｍｉｙａｔａは米国特許第４，１６４，５５９号においてコラーゲンの化学的、分子構造的および生化学的特性が十分に確立されていることを記載している（Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｖｏｌ．３、ｐ．２３１〜２５３、１９７４）。コラーゲンは、角膜、皮膚などの結合組織の主なタンパク質であり、ペプシンなどのタンパク質分解酵素（コラゲナーゼ以外）での処理によって可溶化および精製されうる。可溶化コラーゲンは、テロペプチドに乏しく、比較的安価であり、非抗原性であり、生化学材料として有用である。酵素可溶化天然コラーゲンは、酸性ｐＨにおいて可溶性であるが、生理的ｐＨおよび３７度で重合してゲルを形成する。
【０３１２】
他の実施形態では、ハイドロゲルは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を当技術分野において周知の種々の処方で含む。ＰＥＧハイドロゲル中に存在できるポリマーの非限定的例は、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）およびポリカプロラクトン（ＰＣＬ）を含む。これらのコポリマーのいくつかの例はＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＬＡ、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＡおよびｍＰＥＧ−ｂ＋ＰＣＬ（１２００）−ｂ−ＰＥＧ（６０００）−ｂ−ＰＣＬ（１２００）コポリマーを含む。ＰＬＧＡは、その生分解性および生体適合性のために、多くの食品医薬品局（ＦＤＡ）に認可された治療デバイスにおいて用いられるコポリマーである。ＰＬＧＡは、２つの異なるモノマーのランダム開環共重合の手段によって合成される、グリコール酸と乳酸の環状二量体（１，４−ジオキサン−２，５−ジオン）。重合のために用いられたラクチドのグリコリドに対する比に応じて、ＰＬＧＡの様々な形態を得ることができ：これらは用いられたモノマーの割合に対して通常同定される（例えばＰＬＧＡ  ７５：２５はその組成が７５％乳酸および２５％グリコール酸であるコポリマーを同定する）。全てのＰＬＧＡは結晶性よりも無定形であり、４０〜６０度の範囲にガラス転移温度を示す。薬物デリバリーまたは生体材料適用のためのＰＬＧＡの使用に関連して極めてわずかな全身性毒性がある。ＰＬＡは、コーンスターチ、タピオカ産物またはサトウキビなどの再生可能資源由来の生分解性、熱可塑性、脂肪性のポリエステルである。ＰＣＬは、６０℃付近の低融点および約−６０℃のガラス転移温度を有する生分解性ポリエステルである。ＰＣＬは、オクタン酸スズなどの触媒を用いるｅ−カプロラクトンの開環重合によって調製される。ＰＣＬは、ヒト身体に用いられ、移植においてゆっくり分解されるＦＤＡに認可された材料である。
【０３１３】
用量および投与
本発明の中空および／または多孔質チューブを含む薬物デリバリーデバイスは、１つまたは複数の治療剤を詰めた１本または複数本の多孔質チューブを対象の組織に置くことによって対象に治療剤または候補治療剤を投与する方法のために有用である。チューブは組織中に部分的にまたは完全に埋め込まれていてよい。チューブの組織中への留置（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）は、針によって組織へチューブを挿入することによって促進されうる。チューブは、針に伴うプランジャを押し下げることによってさらに組織に置かれうる。
【０３１４】
チューブが組織に置かれた後にチューブは、チューブの下端からチューブの上端を除去するために割られる、切断される、薄く切られる、分離されるまたは分割されることができる。下端は組織に置かれたままだが、上端は組織から除去される。いくつかの実施形態では、チューブの下端は治療剤を含有し、チューブの上端は治療剤を含有しない。いくつかの実施形態では、チューブの下端および上端の両方が治療剤を含有する。
【０３１５】
ひとたびチューブが組織に置かれると、チューブの内容物（例えば医薬組成物または治療剤）はチューブから組織に拡散できる。プロセスを図１に例示する。拡散の速度はチューブの多孔度に影響される場合がある。内容物は、チューブ材料を通じて組織中に約１分間から約１カ月；約１時間から約１週間；約１２時間から約７２時間；または約２４時間から約４８時間の期間にわたって拡散できる。
【０３１６】
チューブの内容物が色素を含有する場合、色素は治療剤の支出（ｄｉｓｂｕｒｓｅｍｅｎｔ）または活性をモニターするために組織中で画像化されうる。色素は、画像処理において例えば蛍光によって、生物機能の活性化または非活性化を報告するために選ばれうる。このプロセスは、実験者が対象の生理的系への治療剤の影響を直接判定することを可能にする。
【０３１７】
一般にｒＡＡＶビリオンは、当技術分野において周知のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ遺伝子導入技術のいずれかを用いて筋肉細胞に導入されうる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで遺伝子導入する場合、望まれるレシピエント筋肉細胞は、対象から取り出され、ｒＡＡＶビリオンで遺伝子導入され、対象に再導入される。代替的に同系のまたは異種の筋肉細胞は、これらの細胞が対象において不適切な免疫応答を生じさせない場合に用いられうる。
【０３１８】
対象への遺伝子導入細胞のデリバリーおよび導入のために好適な方法は記載されている。例えば細胞は、組換えＡＡＶビリオンと筋肉細胞とを、例えば適切な培地において組み合わせることによってならびに対象のＤＮＡを保持しているこれらの細胞をサザンブロットおよび／もしくはＰＣＲなどの従来技術を用いて、または選択可能マーカーを用いてスクリーニングすることによって導入されうる。次いで遺伝子導入された細胞は、医薬組成物中に処方されることができ、組成物は、筋肉内、静脈内、皮下および腹腔内注射による、または例えば針アレイデバイスを用いる平滑筋および心筋への注射によるなどの種々の技術によって対象に導入される。
【０３１９】
ｉｎ  ｖｉｖｏデリバリーのためにｒＡＡＶビリオンは、医薬組成物中に処方されることができ、一般に、例えば骨格筋または心筋への直接の筋肉内注射によって非経口投与される。医薬組成物は、治療有効量（すなわち問題の疾患状態の症状を低下または回復させるために十分な量または望まれる利益を付与するために十分な量）の対象のタンパク質を作製するために十分な遺伝子材料を含む。医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤も含有する。そのような賦形剤は、組成物を受けた個体に有害な抗体の産生をそれ自体が誘導せず、過度の毒性を伴うことなく投与されうる任意の医薬品を含む。薬学的に許容される賦形剤は、これだけに限らないが水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールなどの液体を含む。
【０３２０】
適切な用量は、とりわけ治療される哺乳動物、治療される対象の年齢および全身状態、治療される状態の重症度、問題の具体的な治療用タンパク質、投与の様式に依存する。適切な有効量は、当業者によって容易に決定されうる。したがって治療有効量は、臨床試験を通じて決定されうる比較的広い範囲にある。例えばｉｎ  ｖｉｖｏ注射用（すなわち骨格筋または心筋への直接注射）のために、治療有効用量はｒＡＡＶビリオンの約１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４または１０１５の桁にある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ遺伝子導入のために筋肉細胞にデリバリーされるｒＡＡＶビリオンの有効用量は、ｒＡＡＶビリオンの１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２または１０１３の桁にある。医薬組成物中の遺伝子導入細胞の量は、筋肉細胞約１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０または１０１０個からである。遺伝子導入細胞が血管平滑筋に導入される場合、低い用量が適切である場合がある。他の有効用量は、用量反応曲線を確立する日常的試験を通じて当業者によって容易に確立されうる。
【０３２１】
投薬治療は、単回投与計画または複数回投与計画であってよい。さらに対象は、適切な回数の投与を投与されうる。当業者は適切な投与回数を容易に決定できる。
【０３２２】
遺伝子治療のための方法
動物モデル、麻酔および免疫抑制：野生型研究用イヌは、本開示の対象となりうる。針アレイは、局所麻酔と（例えばリドカインと）または全身麻酔共に用いられうる。全身麻酔は、ブトルファノール、ジアゼパム／ケタミン、プロポフォールおよびイソフルランを含むことができ、動物は当技術分野において周知の方法によってモニターされうる。イヌはシクロスポリン（ＣＳＰ）で免疫抑制されることができ、カルシニューリン阻害物質をベクター注射の２日前から与えられ、６週間目まで１日２回７．５ｍｇ／ｋｇ経口で続けられ、ミコフェノル酸モフェチル（ＭＭＦ）、代謝拮抗剤を１日２回、５ｍｇ／ｋｇ  ｓ．ｑ．の用量で０日目から実験終了まで投与された。
【０３２３】
針製造：針先端から０．５ｍｍから始まる５ｍｍの多孔質領域を有する３０ｍｍ長の針は本開示の実施形態において用いうる。針は、外形０．４６ｍｍおよび内径０．２５ｍｍを有する外科用ステンレススチールチューブでできていてよく、孔は直径０．１５ｍｍであり０．２５ｍｍ離れていてよい。孔は放電加工機（ＥＤＭ）によって作られてよい。ステンレススチールチューブは、先端を密封するために回転溶接されることができ、先端は、中心から０．０６ｍｍを超えて異ならない先端で最大フランジ角度４８度を有する鉛筆先端に研磨されうる。特注の多孔質針は、標準的操作手順で大きさ、長さ、先端形状、孔径および孔分布に関して顕微鏡下目視検査によって内部品質管理（ＱＣ）されうる。
【０３２４】
アレイヘッド設計および製造：イヌ筋肉への注射のための針アレイヘッドは、マウスモデル腫瘍学研究のために用いられる針、チューブおよびポンプと適合性に作製されうる。設計は、気泡形成および流体の乱れを最少化するために回路中の接続数を最小化でき、流体経路沿いの内径の急激な変化を最小化できる。アレイヘッドのハブは、医療用ポリスルホンポリマーから作られることができ、取り扱いを容易にするために高さ１〜１．５ｃｍでおよそ３×９ｃｍの卵型である。針は、ハブを貫く軸方向の穴に一致し、設置されることができ、次いで医療用接着剤を用いて固定されうる。最終ＱＣ、梱包および滅菌は、全てのアレイヘッドについて実施されうる。
【０３２５】
シリンジポンプ：Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ＰＨＤ  Ｕｌｔｒａ  ｓｙｒｉｎｇｅ  ｐｕｍｐなどのポンプは、約１０００ｐｓｉ未満の背圧、約０．０００１μｌ／時間から２２１ｍｌ／時間の流速範囲において正確な容量をデリバリーするために用いられうる。５００μｌシリンジは、約１．５ｎｌ／分から約１．６ｍｌ／分の間でデリバリーするために用いられうる。約０．２５ｍｍの直径および肉厚約１．６ｍｍを有する塩化ポリビニル（ＰＶＣ）チューブは、望まれる速度で流体をデリバリーするために好適である。チューブ材料は、溶媒耐性ならびにＦＤＡ認可およびヒト臨床使用への好適性に関して選択されうる。
【０３２６】
注入濃度、容量および速度：開示の針は、ハンクス緩衝塩類溶液の容量２５、５０、７５、１００、１５０、２００または２５０μｌ中のベクターゲノム５×１０１１を約１、２、３、４、５、６もしくは１０分間かけてまたは約３０秒間未満でデリバリーできる。各筋肉は、単一の多孔質針注射を受ける場合がある。非吸収性縫合糸はマーカーとして注射部位に取り付けられうる。
【０３２７】
筋生検および組織解析：筋生検は、例えば第ＩＸ因子発現を判定するために種々の時点で得られうる。筋肉組織はＯ．Ｃ．Ｔ．媒体（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）に包埋されることができ、連続的クリオスタット切片はヘマトキシリンおよびエオシン−フェロキシン（ｐｈｌｏｘｉｎｅ）（Ｈ＆Ｅ）染色を用いて組織学的評価のため；イヌ第ＩＸ因子発現の検出（ウサギ抗イヌ第ＩＸ因子（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）が一次抗体として用いられうる）のために作製されうる。緩衝液注射部位から採取された筋生検は、陰性対照として役立ちうる。ｃＦＩＸを発現している筋線維は、面積１ｃｍ２内で計数されることができ、ｃＦＩＸ陽性筋線維の百分率は算出され、様々なデリバリー計画間で比較されうる。
【０３２８】
データ取得および解析
いくつかの実施形態では、固形組織中の標的領域が、薬剤の効果を評価するために周知の技術を用いて画像化されうることが考察される。画像処理は、例えば放射線画像法、磁気共鳴画像法、ポジトロン放出断層撮影法、生物フォトンイメージングなどを含む任意の好適なプロセスまたは方法によってであってよい。いくつかの実施形態では、標的領域は、デリバリープロセスの前、デリバリープロセス中およびデリバリープロセス後に繰り返し画像化されうる。
【０３２９】
画像処理において、レポーティングシグナルのレベルは、当業者に周知の方法によって定量されうる。レポーティングシグナルの観察および／または定量は、治療剤の使用および有効性に関する情報に基づく研究および医療上の判断を行うために用いられうる。そのような観察により行われる場合がある判断の非限定的例は、流体容量品質管理、位置的追跡および薬物体内分布を含む。そのような実験は、ヒトにおける潜在的治療剤の活性に関して情報に基づく予測を行うために用いられうるレポーティングシグナルを提供するために下等哺乳動物（例えばマウス）において実施されうる。この種の動物研究は、天然環境の代わりに管理された環境下の細胞において薬物有効性研究を実施することによって生じる固有の不確実性および不正確性を回避するために用いられうる。
【０３３０】
蛍光シグナルの定量は、当技術分野において周知の任意の方法によって達成されうる。蛍光シグナルは、生物経路の上方制御または下方制御を決定するために標準または対照と比較されうる。そのような観察は、薬物候補の治療価値に関する予測を行うために用いられうる。
【０３３１】
図７の実施形態によりデータ処理システム３５０は、操作を実行するためまたは指示するために用いられ、プロセッサ３５４およびメモリ３５６を含む。プロセッサ３５４はメモリ３５６とアドレス／データバス３６０によって連絡し、針アレイアセンブリ３６２および対象スキャンデバイス３６４とも連絡する。対象スキャンデバイス３６４は、実施形態により、対象にｉｎ  ｖｉｖｏで針アレイアセンブリ３６２の針を設置することを補助するためおよび、放射画像処理または核医療アッセイなどの画像処理技術を用いる標的組織領域の非侵襲的解析のために用いられる。プロセッサ３５４は、商業的に入手可能でありうるまたは特注マイクロプロセッサ、マイクロコントローラ、シグナルプロセッサなどであってよい。メモリ３５６は、任意のメモリデバイスならびに／または機能性回路およびモジュールを実装するために用いられるソフトウエアおよびデータを含有する記憶媒体を含みうる。
【０３３２】
メモリ３５６は、例えばオペレーティングシステム３６６、アプリケーションプログラム３６８；入力／出力デバイスドライバ３７０；およびデータ３７２などのデータ処理システムにおいて用いられるソフトウエアおよびデータのいくつかの分類のいずれを含んでもよい。アプリケーションプログラム３６８はいくつかの実施形態による回路およびモジュールの種々の特質を実装するプログラムの例示であり、データ３７２は、アプリケーションプログラム３６８、オペレーティングシステム３６６、入力／出力デバイスドライバ３７０およびメモリ３５６に属する場合がある他のソフトウエアプログラムによって用いられる静的および動的データを表す。
【０３３３】
種々の実施形態によりデータ処理システム３５０は、アレイコントローラ３７６、スキャナコントローラ３７８などを含むいくつかのモジュールを含みうる。モジュールは単一のモジュールとしてまたは、そうでなければ本明細書に記載の操作を実行するために構成される追加的モジュールとして構成されうる。例えばアレイコントローラ３７６は、アクチュエータ１１６を制御し、結果として針１１２によるリザーバ１１４からの治療剤の放出を制御することによって図２の針アレイアセンブリ１００を制御するために構成されうる。スキャナコントローラ３７８は、対象スキャンデバイス３６４を制御するために構成されうる。
【０３３４】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の薬剤の導入に続く生理的状態の変化の固形組織における検出は、固形組織への薬剤（複数可）の浸透の程度を検出すること、組織中における薬剤（複数可）の吸収の程度を検出すること、組織での薬剤（複数可）の物理化学的効果を検出することおよび／または組織での薬剤（複数可）の薬理学的効果を検出することを含む。蛍光アッセイを含む、固形組織への薬物の浸透または溶け込みのアッセイは、当技術分野において周知であり、記載されており（例えばＫｅｒｒら、１９８７  Ｃａｎｃ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９：１およびこれに引用される参考文献；Ｎｅｄｅｒｍａｎら、１９８１  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  １７：２９０；Ｄｕｒａｎｄ、１９８１  Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４１：３４９５；Ｄｕｒａｎｄ、１９８９  ＪＮＣＩ  ８１：１４６；Ｔｕｎｇｇａｌら、１９９９  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５：１５８３）、例えば切り出しおよび切片化の前に対象の薬剤と共に固形組織に共投与された検出可能な標識の組織学的系列切片における検出を通じて本開示によりさらに構成されうる。
【０３３５】
そのような実施形態では、浸透または溶け込みは、薬剤が灌流（任意の血管による進入および分散）を排して導入された針のすぐ近くの固形組織における薬剤保持の領域に関連し、細胞外空間もしくは細胞外マトリクスにおけるまたは細胞膜もしくは細胞内との会合における薬剤の保持を含みうる。浸透は、針の挿入もしくは流体注射のそれ自体から生じる顕微鏡的に検出可能な組織の機械的破壊を意味する物理化学的作用、または薬剤によって生じる非生物学的機械的なもしくは化学的な組織破壊（例えば細胞膜への損傷または細胞−細胞結合の統合崩壊）とは区別されうる。薬理学的効果は、薬剤の作用の分子機構の結果として検出可能である細胞または組織の生理的状態の統計的に有意な変化（例えば細胞骨格再構築、細胞性プロセシングの伸長もしくは中止または多数の周知の細胞骨格的、生化学的、分子生物学的もしくは他の読み値のいずれかを用いて検出されうる生物学的シグナル伝達の証拠）を含む。系列切片の比較は、組織学的に検出される効果の性質を区別できるようにする。
【０３３６】
本開示のいくつかの好ましい実施形態では、多孔質針アレイは、ハイドロゲルおよび複数の候補治療剤を含む複数の組成物を組織中に平行軸に沿って置くために用いられる。いくつかの場合では、組成物は、例えば位置、浸透、シグナル経路の状態または細胞へのデリバリーを示すために有用でありうる色素をさらに含む。いくつかの好ましい実施形態では、組織は腫瘍である。腫瘍は複数の組成物のデリバリーに続いて切り出され、切片化されてよく、個々の切片は、例えば複数の候補治療剤の相対的効能を決定するために明視野顕微鏡または蛍光顕微鏡を用いて画像化されうる。
【実施例】
【０３３７】
［実施例１］
複数の腫瘍深度での色素の空間的に限定されたデリバリー
ドキソルビシンを本方法の多孔質チューブを用いてリンパ腫腫瘍にデリバリーした。次いで腫瘍を切り出し、切片化した。図８は、蛍光顕微鏡および明視野顕微鏡を用いて画像化した腫瘍の薄片を示す。これらの画像は、ドキソルビシン蛍光が明視野画像において識別可能な死細胞の領域と重複することを示す。ドキソルビシン蛍光および死細胞の領域は、腫瘍薄片内のゾーンに局在しており、空間的に制限されたドキソルビシンデリバリーを反映している。図９は、異なる深さ由来の３種の腫瘍横断面薄片を示し、図８に示した局所的なデリバリーが種々の腫瘍深度に及んでいることを実証している。細胞死は、示す３種の腫瘍深度にわたって局在的領域において観察された。
【０３３８】
空間的に限定されたデリバリーを針アレイを用いる蛍光色素の４種の異なる容量での注射によって検査した。色素を腫瘍内に４つの平行軸に沿って注射した。図１０は、これらの注射の蛍光顕微鏡観察および得られた空間的に限定された蛍光色素の分布（上パネル）を例示する。注射はＡ）１０μＬ；Ｂ）７．５μＬ；Ｃ）５μＬ；およびＤ）２．５μＬであった。下パネルのグラフは、各注射について、異なる腫瘍深度由来の１５切片にわたって平均化した分布の相対的面積示す。
【０３３９】
図１４は、化合物の空間的に限定されたデリバリーおよび腫瘍の領域で生じた局在化した効果をモニターするための本方法による種々の指標色素の使用を示す。マウス腫瘍に１．ドキソルビシン；および２．対照を注射した。パネルＡは、色素の６４０ｎｍでの励起および８００ｎｍでの発光を例示する。パネルＢは、ドキソルビシンの５００ｎｍでの励起および６００ｎｍでの発光後に観察したドキソルビシンシグナル（３．）を例示する。パネルＣは、色素の６４０ｎｍでの励起および７２０ｎｍでの発光後に観察したアポトーシスシグナル（４．）を例示する。結果は、アポトーシスがドキソルビシンを受けた領域と重なるが、対照とは重ならないことを示し、空間的に限定された薬物デリバリーおよび腫瘍細胞死滅を実証している。
【０３４０】
［実施例２］
ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ解析の比較
ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）アンタゴニストをｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで検査し、結果を比較した。図１１は、ヒト髄芽腫試料でのヘッジホッグ経路拮抗作用へのｉｎ  ｖｉｔｒｏ応答を例示する。髄芽腫細胞は３名の患者から採取し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した。３名の患者、ＭＢ１〜ＭＢ３、由来の試料をＳｈｈアンタゴニストの効果について検査し、それはこの研究における陽性対照と比較して反応を示さなかった。バーＡ）は、１μＭ  ＳＨＨアンタゴニストの注射を；バーＢ）は５μＭ  ＳＨＨアンタゴニストの注射を；およびバーＣ）は陽性対照の注射を示す。
【０３４１】
図１１に示すｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験の結果とは対照的に、図１２はｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍へのＳｈｈアンタゴニスト注射の応答を例示する。本発明の方法を用いて空間的に限定された様式でＳｈｈアンタゴニストを腫瘍中に注射し、蛍光顕微鏡によって視覚化した。図１２は、Ａ）カスパーゼ３；およびＢ）Ｇｌｉ１についての局在化した陽性シグナルの明視野顕微鏡観察を示し、両方の場合において空間的に制限された腫瘍死滅を例示している。
【０３４２】
図１２に示すｉｎ  ｖｉｖｏ実験の結果は、Ｓｈｈアンタゴニストががんのマウスモデルにおいて陽性の効果を有することを予測した。本実験で用いた頭蓋内髄芽種モデル（条件付パッチ１ヌル）マウスは、早発型および１００％の表現率を有して髄芽種を発症する。したがってマウスに２０ｍｇ／ｋｇでＡ）ビヒクルに加えてＩＰＩ−９２６（ｎ＝１２）；またはＢ）ビヒクルのみ（ｎ＝１１）を毎日注射した。マウスを生存について５０日間モニターし、結果を図１３に示す。実験は、対照マウスと比較してＩＰＩ−９２６薬物を与えられたマウスが顕著に増加した生存を有したことを示した。この実験の結果は、図１２のｉｎ  ｖｉｖｏ実験によって予測されたが、図１１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験によって予測されなかった通りＳｈｈ拮抗作用がｉｎ  ｖｉｖｏでがん進行に影響を与えたことを実証する。
【０３４３】
［実施例３］
核酸の空間的に限定されたデリバリー
本方法を用いて核酸分子の空間的に制限されたデリバリーを検査した。ＨＴ２９結腸腫瘍異種移植片をプロモーター駆動ＧＦＰ発現を有するレンチウイルスと共に注射した。図１５は、ＧＦＰ発現レンチウイルスの空間的に限定された注射に続く全腫瘍薄片の蛍光顕微鏡観察を例示する。パネルＡは、ＧＦＰ発現が注射領域に局在していたことを示す。パネルＢは、ウイルス注入ゾーンの拡大図を示す。
【０３４４】
次いで方法を空間的に限定されたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に適用した。レンチウイルス内の小さなヘアピンＲＮＡｉ（ｓｈＲＮＡ）構築物をマウス腫瘍に局所的にデリバリーした。ｓｈＲＮＡは、腫瘍細胞有糸分裂のための必須遺伝子、ＫＩＦ１１に対して方向付けられた。ノックダウン能力を有さない対照構築物も用いた。追加的な対照としてＧＦＰウイルス単独を注射した。これら３種の構築物を腫瘍内の３つの異なる位置に注射し、局在効果を観察した。３種全ての事例において、アポトーシスレポーター近赤外タグ付きアネキシン５（Ｖｉｓｅｎ）を構築物と共に共注射した。注射に続いて腫瘍を切り出し、切片化し、アポトーシスレポーターを観察するために蛍光顕微鏡によって視覚化した。
【０３４５】
図１６は、この解析の結果を示し、１．アポトーシスレポーターを有するＫＩＦ１１  ｓｈＲＮＡ；２．アポトーシスレポーターを有する対照ウイルス；および３．アポトーシスレポーターを有するＧＦＰウイルスを示している。スキャンは、４種の腫瘍深度で得た：５００ミクロン；１，０００ミクロン；１，５００ミクロン；および２．０００ミクロン。ＫＩＦ１１  ｓｈＲＮＡを受けた領域だけがアポトーシスについて陽性の読み値を示し、ＫＩＦ１１のノックダウンに関連する腫瘍細胞死滅を示しており、ＫＩＦ１１  ｓｈＲＮＡ構築物を受けた領域に空間的に限定されていた。
【０３４６】
空間的に限定された腫瘍細胞死滅を図１７にも示す。マウス腫瘍に１．ＫＩＦ１１  ｓｈＲＮＡ；２．対照；３．ＫＩＦ１１  ｓｈＲＮＡおよびアポトーシス色素（近赤外タグ付きアネキシン５）；４．対照；ならびに５．対照およびアポトーシスシ色素を注射した。腫瘍を切り出し、切片化し、蛍光顕微鏡によって視覚化した。結果は、空間的に制限されたＫＩＦ１１  ｓｈＲＮＡのデリバリーがアポトーシス色素を用いて観察可能なシグナルをもたらすが、対照はもたらさないことを示す。アポトーシス色素を含まずにＫＩＦ１１または対照構築物を投与した場合は、バックグラウンドシグナルは観察されなかった。
【０３４７】
［実施例４］
腫瘍モデル／多孔質針アレイ適合性判定
全ての潜在的細胞株は、異種移植腫瘍として胸腺欠損ヌードマウスにおいて増殖されることができ、針アレイデバイスによる注射との適合性について判定されうる。ＥＧＦ受容体（例えばＨＣＣ８２７肺癌）、ＲＡＳ（例えばＡ５４９肺癌、ＨＣＴ−１１６結腸癌）もしくはＰＩ３Ｋ（ＨＣＴ−１１６結腸癌、ＭＣＦ７乳癌、Ｔ４７Ｄ乳癌）の活性化変異または腫瘍抑制因子ＰＴＥＮ（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌、ＥＶＳＡ−Ｔ乳癌）の非活性化変異のいずれかを有することが周知である乳房、肺および結腸腫瘍系は用いることができる。用いることができる細胞株は、Ａ２０５８メラノーマ（ｂｒａｆ、ｐｔｅｎ）、ＬｎＣＡＰ前立腺癌（ｋｒａｓ、ｐｔｅｎ）、Ｈ２１２２肺癌（ｋｒａｓ、ｓｔｋ１１）およびＭＣＦ７乳癌（ｐｉｋ３ｃａ、ｃｄｋｎ２ａ）を含む。腫瘍細胞が由来する組織環境を最適にするために、腫瘍モデルは可能である場合は同所的に移植されうる。
【０３４８】
増殖速度、大きさ、形状、対称性、固形性および到達性などの腫瘍特徴は、針アレイヘッドを通じて腫瘍下部へ薬剤がデリバリーされうる容易さに全て影響を与える。今日まで、ほとんどの異種移植腫瘍（＞８０％）は注射と適合性であることが見出されている。しかしいくつかの腫瘍は、アレイでの注射を妨げる特徴（例えば大きな腫瘍内嚢腫）を持つ。本発明者らのプラットフォームのコンテクストにおいて最終的には使用できないレポーター系を生成するために使う時間および資源の潜在的な浪費を回避するために、多孔質針アレイデバイスによる注射に適合性の大きさに達するまで（約１．０〜１．５ｍｍ3）各腫瘍型は異種移植腫瘍として増殖されうる。次いで腫瘍は近赤外追跡用色素と共に５箇所の幾何的に決めた位置に注射されうる。２４時間後、腫瘍は切除され、ホルマリン固定され、ビブラトームを用いて切片化されうる。次いで厚さ２００ミクロン切片は、注射された追跡用色素の体内分布を判定するためにＩＶＩＳ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）において解析されうる。腫瘍正着率が５０％を上回り、色素の空間的に限定された分布（注射カラムに対して垂直な＜４００細胞層）が５箇所全ての注射位置で明確に観察される場合、腫瘍系は本発明者らのプラットフォームと適合性であるとみなされ、がん経路特異的レポーターモデルを生成するために用いられうる。
【０３４９】
［実施例５］
レポーター細胞株の生成
腫瘍細胞株は、最適化されたジーントラップで遺伝子導入されることができ、強いがん経路特異的レポーター細胞を得るためにカスタマイズした選択プロトコールに供される。用いられたベクターは、ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）ルシフェラーゼ（レポーター）およびＮｅｏ（選択可能マーカー）をコードする遺伝子に隣接するスプライス受容体およびスプライスドナー配列からなるプロモーターレストラッピングカセットを含有する。遺伝子に組み込まれた場合、ガウシアルシフェラーゼレポーターの発現は内在性プロモーター、エンハンサーおよびインシュレーターによって調節される。したがってレポーター活性は、内在性遺伝子の発現を正確に示す。ガウシアルシフェラーゼは、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍プラットフォームとして理想的に適している。それは、非常に明るく（１００〜１０００×＞ホタルルシフェラーゼ）ＡＰＴ非依存性である。ヒト化、膜固着および細胞外に提示されるガウシアルシフェラーゼは、操作されている（Ｘａｃｔａｇｅｎ、ＬＬＣ）。操作されたルシフェラーゼは、高い発光活性を保持し、その上グローアプリケーション（ｇｌｏｗ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）のために安定化されている。膜固着ガウシアルシフェラーゼは、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像処理、ルシフェラーゼ基質セレンテラジンの導入で生きた動物における経路阻害事象のリアルタイム視覚化を可能にすることにおいて、天然で分泌されるガウシアルシフェラーゼより優れていることが示されている。ルシフェラーゼのこの形態の細胞表面発現もｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択戦略を促進する。経路阻害によって高度に上方制御される遺伝子内で生じるトラッピング事象は、フローアシストフロー選別（ＦＡＣＳ）などの方法によって単離されうるルシフェラーゼ陽性細胞をもたらしうる。
【０３５０】
選択に基づくレポーター細胞株の生成のための戦略を図２０に例示する。ジーントラップベクターは、ＡＫＴ活性細胞の大きな集団にパッケージされたレンチウイルス粒子として導入されうる。細胞は、ルシフェラーゼに基づく選択に供されうる。初回は、ルシフェラーゼを恒常的に発現しているトラップを除外する。次に細胞はＡＫＴ阻害物質に暴露され、２回目の選択に供される。この回は、阻害物質への応答においてルシフェラーゼを発現している細胞を選択でき、機能的遺伝子中にトラップを持たない細胞を除外できる。構造的に無関係のＡＫＴ阻害物質での選択の最終回は、経路特異的であるトラップを選択し、ＡＫＴ経路に無関係な分子特異的活性に応答するトラップを除外する。
【０３５１】
ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）、ＭＫ−２２０６およびＰＤ３２５９０１の亜致死性濃度をＥＧＦ、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴおよびＲａｓ経路阻害物質応答性レポーターを選択するためにそれぞれ用いることができる。対象のトラップへの潜在的増殖阻害作用を最小化するために、薬物のポストセレクションから細胞を除くことができる。選択戦略は、誘導可能なジーントラップが、対象の発がん経路の阻害には無関係な、選択プロセスにおいて用いられる薬剤のオフターゲット活性に応答することも考慮する。第二の構造的に無関係な経路阻害物質での陽性誘導可能レポーター細胞の最初にプールされた集団のカウンタースクリーニングは、これらのオフターゲットジーントラップを除去できる。第２阻害物質への応答においてルシフェラーゼの誘導可能な発現を保持する細胞は、さらなる解析のためにクローニングおよび増やされることができる。
【０３５２】
［実施例６］
レポーター組織のスクリーニングならびにｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏ解析の比較
同所性異種移植は、経路阻害への応答における強いシグナル強度に基づき選択されたレポーター株を用いてＮｕ／Ｎｕ（ヌード）胸腺欠損マウスにおいて確立されうる。腫瘍は、それらが直径およそ１．５〜２ｃｍになるまで増殖を許容されてよい。陽性対照経路阻害物質（例えばＡＫＴ、ＭＥＫまたはＥＧＦＲ阻害物質）は、多孔質針アレイデバイスの５本の針の内の１本に充填されうる。追加的な陽性対照として、ＡＫＴ、ＭＥＫおよびＥＧＦＲの効率的なサイレンシングに関して検証されたＲＮＡｉ剤（主にレンチウルスｓｈＲＮＡベクター）も用いられうる。経路不活性試薬が陰性対照として充填されてよい。検査化合物は、残りの針に充填されうる。多孔質針アレイを用いる色素の空間的に制限された注射を図２１に示す。化学的化合物およびレンチウイルスベクターの両方は、図２２に示す通り多孔質針アレイデバイスを用いて腫瘍の空間的に限定された一部分に順調にデリバリーされている。
【０３５３】
系は、試料が多孔質針から押し出されるまで充填される。針ヘッドは麻酔したマウスの腫瘍に注射されてよく、薬物に近赤外追跡用色素を加えたもの７マイクロリットルは針跡に沿った逆流を抑制するために５分間を超えるやり方で注射されうる。腫瘍注射の１時間後、マウスにセレンテラジン（７．７ｍｇ／ｋｇ）を注射でき、腫瘍はＩＶＩＳを用いて直ちにおよび次の６時間について１時間ごとに、誘導されたルシフェラーゼ発現から生じる発光に関して調査されうる。発光は光子／分としてＬｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて定量されうる。６時間の終わりに、腫瘍は切除され、ｉｎ  ｖｉｖｏとｅｘ  ｖｉｖｏでの読み値の間でのシグナル強度における差異（存在する場合は）を判定するためにＩＶＩＳを用いて再解析される。実験は複数の異種移植マウスにおいて実施されうる。
【０３５４】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され、記載されているが、そのような実施形態が例示の方法によってのみ提供されることは当業者に明らかである。多数の変形、変化および置換は本発明から逸脱することなく当業者に見出される。本明細書に記載の本発明の実施形態への種々の別法が本発明の実施において用いられうることは理解されるべきである。続く特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲の範囲内の方法および構造物ならびにそれらの等価物はそれにより網羅されることが意図される。
【０３５５】
［実施例７］
ＧＳＫ３阻害物質の多孔質針介在注射が腫瘍においてｂ−カテニン駆動ルシフェラーゼ活性を誘導する
この実施例では、本発明者らは、ＷＮＴ経路活性化への応答においてルシフェラーゼを発現する十分に特徴付けられたｂ−カテニンレポーターを用いた（図２４）。このレポーターを持つ腫瘍細胞をヌードマウスの促腹部で異種移植腫瘍として増殖させた。ＷＮＴ刺激がない場合またはｂ−カテニン（ＧＳＫ３ｂなど）の陰性調節因子を阻害する薬物への暴露では、これらの腫瘍におけるｂ−カテニンの活性化状態は非常に低い。したがって本発明者らは、２つの異なるＧＳＫ３阻害物質を注射した腫瘍中でのｂ−カテニンレポーターの局所的活性化を本発明者らが検出できるかどうかを検査するためにこのモデルを用いた。７本の多孔質針アレイを用いて２種のＧＳＫ３阻害物質を同時に５種類の経路不活性検査薬剤の注射と比較した。注射に続いて動物は、ルシフェリンの腹腔内注射の前に２４時間それらのケージに戻された。Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳでの生きた動物の画像処理は、ＧＳＫ３阻害物質の正確な位置に対応するルシフェラーゼ活性の２箇所の異なる領域を明らかにした（図２４）。他の５箇所の注射部位ではバックグラウンドを超えるシグナルは観察されなかった。ルシフェリンに暴露した腫瘍の厚い切片も、ＧＳＫ３阻害物質によって誘導されたルシフェラーゼ活性の空間的に限定された領域を実証した。ルシフェラーゼシグナルの目立たない非重複範囲を達成する能力は、本発明者らのｉｎ  ｖｉｖｏ多重比較解析をがんの動物モデルにおける網羅的選別的中の追跡のために数百試料に大規模化する可能性と調和する。本発明者らは、同様の結果がジーントラップ由来の経路レポーターで達成されることを確信している。
【０３５６】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され、記載されているが、そのような実施形態が例示の方法によってのみ提供されることは当業者に明らかである。多数の変形、変化および置換は本発明から逸脱することなく当業者に見出される。本明細書に記載の本発明の実施形態への種々の別法が本発明の実施において用いられうることは理解されるべきである。続く特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲の範囲内の方法および構造物ならびにそれらの等価物はそれにより網羅されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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