(57)【要約】本発明は、それについて役に立つTLRおよび方法のアンタゴニストとして新規免疫調節オリゴヌクレオチド(IRO)、およびその使用方法を提供する。これらIROは、TLRリガンド、またはTLRアゴニストに応じたTLR介在シグナル伝達を阻害または抑制するユニークな配列を有する。該方法は、癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性障害、感染症、皮膚病、アレルギー、喘息、または病原体に起因する疾患の予防および治療に用いることができよう。【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造：5-NpN3N2N1C*G1N1N2N3NzN4N5-3'を有するTLR7および/またはTLR9のアンタゴニスト
［式中、C*G*は、オリゴヌクレオチドモチーフであり、C*は5-Me-dCであり、G1は7-デアザ-dGである；
N1-N2は、それぞれ独立して2'-O-Meリボヌクレオチドである；
N3は、それぞれ独立してヌクレオチドである；
N1-N3は、それぞれ独立してヌクレオチドである；
NmおよびNmは、それぞれ独立してヌクレオチドである；
N4-N5は、それぞれ独立して2'-O-Me-リボヌクレオチドである；
pは5である；
zは3である。
ただし、該化合物は3つ未満の連続グアノシンを含む。］。
【請求項２】
構造：5'-CTATCTGUC*G1TTCTCTGU-3'、または5'-CTATCTGAC*G1TTCTCTGU-3'を有する請求項1に記載のアンタゴニスト。
【請求項３】
請求項1または2記載のアンタゴニストおよび医薬的に許容される担体を含有する医薬組成物。
【請求項４】
化合物番号1〜化合物番号67および化合物番号69〜化合物番号111から選ばれるTLR7および/またはTLR9のアンタゴニストである免疫調節オリゴヌクレオチド(IRO)化合物。
【請求項５】
請求項4記載のアンタゴニストおよび医薬的に許容される担体を含有する医薬組成物。
【請求項６】
請求項1、2、または4のいずれかに記載のアンタゴニストまたはその組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物のTLR7および/またはTLR9介在性免疫反応を阻害するための方法。
【請求項７】
投与経路が、非経口的、粘膜送達、経口、舌下、経皮、局所的、吸入、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃による、皮膚パッチ、または点眼薬、または口内洗浄液の形である請求項6に記載の方法。
【請求項８】
哺乳動物がヒトである請求項6に記載の方法。
【請求項９】
該アンタゴニストを、1またはそれ以上のワクチン、抗原、抗体、細胞毒性薬、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、TLRアゴニスト、TLRアンタゴニスト、ペプチド、タンパク質、遺伝子療法ベクター、DNAワクチン、アジュバント、キナーゼ阻害剤、または共刺激分子と組み合わせて投与する請求項6に記載の方法。
【請求項１０】
請求項1、2、または4に記載のアンタゴニスト、またはその組成物を投与することを含む、TLR7および/またはTLR9アゴニストの活性を抑制する方法。
【請求項１１】
該アンタゴニストをTLR7および/またはTLR9アゴニストの前またはそれと同時に投与することを含む請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
TLR7および/またはTLR9介在性自己免疫疾患を有する哺乳動物の治療的処置方法であって、該哺乳動物に、請求項1、2、または4に記載のアンタゴニスト、またはその組成物を投与することを含む、
該自己免疫疾患にTLR7および/またはTLR9が介在し、該自己免疫疾患が、乾癬、リウマチ性関節炎、全身性脱毛症、急性散在性脳脊髄炎、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、水疱性類天疱瘡、シャーガス病、慢性閉塞性肺疾患、小児脂肪便症、皮膚筋炎、子宮内膜症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン‐バレー症候群、橋本病、化膿性汗腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、限局性強皮症、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経ミオトニー、天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、統合失調症、シェーグレン症候群、側頭動脈炎、脈管炎、白斑症、外陰部痛、またはヴェグナー肉芽腫症から選ばれる、方法。
【請求項１３】
該アンタゴニストを、1またはそれ以上のワクチン、抗原、抗体、細胞毒性薬、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、TLRアゴニスト、TLRアンタゴニスト、ペプチド、タンパク質、遺伝子療法ベクター、DNAワクチン、アジュバント、キナーゼ阻害剤、または共刺激分子と組み合わせて投与する請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
投与経路が、非経口的、粘膜送達、経口、舌下、経皮、局所的、吸入、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃による、皮膚パッチ、または点眼薬もしくは口内洗浄液の形である請求項12に記載の方法。
【請求項１５】
哺乳動物がヒトである請求項12に記載の方法。
【請求項１６】
請求項1、2、または4のいずれかに記載のアンタゴニスト、またはその組成物を哺乳動物に投与することを含む、TLR7および/またはTLR9介在性自己免疫性疾患の予防方法であって、該自己免疫疾患が、乾癬、リウマチ性関節炎、全身性脱毛症、急性散在性脳脊髄炎、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、水疱性類天疱瘡、シャーガス病、慢性閉塞性肺疾患、小児脂肪便症、皮膚筋炎、子宮内膜症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン‐バレー症候群、橋本病、化膿性汗腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、限局性強皮症、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経ミオトニー、天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、統合失調症、シェーグレン症候群、側頭動脈炎、脈管炎、白斑症、外陰部痛、またはヴェグナー肉芽腫症から選ばれる方法。
【請求項１７】
該アンタゴニストを、1またはそれ以上のワクチン、抗原、抗体、細胞毒性薬、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、TLRアゴニスト、TLRアンタゴニスト、ペプチド、タンパク質、遺伝子療法ベクター、DNAワクチン、アジュバント、または共刺激分子と組み合わせて投与する請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
投与経路が、非経口的粘膜送達、経口、舌下、経皮、局所的、吸入、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃による、皮膚パッチ、または点眼薬もしくは口内洗浄液の形である請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
該哺乳動物がヒトである請求項16に記載の方法。
【請求項２０】
1またはそれ以上のワクチン、抗原、抗体、細胞毒性薬、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、TLRアゴニスト、TLRアンタゴニスト、ペプチド、タンパク質、遺伝子療法ベクター、DNAワクチン、アジュバント、または共刺激分子をさらに含む請求項3に記載の組成物。
【請求項２１】
1またはそれ以上のワクチン、抗原、抗体、細胞毒性薬、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、TLRアゴニスト、TLRアンタゴニスト、ペプチド、タンパク質、遺伝子療法ベクター、DNAワクチン、アジュバント、または共刺激分子をさらに含む請求項5に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、免疫学および免疫療法の分野、より具体的には免疫調節オリゴヌクレオチド(IRO)組成物、およびトール様受容体(Toll-like Receptor)介在性免疫反応を阻害および/または抑制するためのそれらの使用に関する。特に、本発明は、TLR7および/またはTLR9刺激を通して通常生成されるサイトカインをユニークに阻害するトール様受容体7(TLR7)および/またはTLR9のアンタゴニストに関する。
【背景技術】
【０００２】
トール様受容体(TLR)は、免疫系の多くの細胞に存在し、自然(innate)免疫反応に関与することが示されている(Hornung、V. ら、(2002) J.Immunol. 168:4531-4537)。脊椎動物(すなわち哺乳動物)において、このファミリーは、細菌、真菌、寄生生物およびウイルス由来の病原体関連分子パターンを認識することが知られているTLR1〜TLR10と呼ばれる10のタンパク質から成る(Poltorak, a.ら (1998) Science 282:2085-2088；Underhill, D.M.ら (1999) Nature 401:811-815；Hayashi, F. et. al (2001) Nature 410:1099-1103；Zhang, D.ら (2004) Science 303:1522-1526；Meier, A.ら (2003) Cell. Microbiol. 5:561-570；Campos, M.A.ら (2001) J. Immunol. 167：416-423；Hoebe, K.ら (2003) Nature 424：743-748；Lund, J. (2003) J. Exp. Med. 198:513-520；Heil, F.ら (2004) Science 303:1526-1529；Diebold, S.S.ら (2004) Science 303:1529-1531；Hornung, V.ら (2004) J. Immunol. 173:5935-5943)。TLRは、哺乳動物が外来分子を認識してそれに対する免疫反応を開始する重要な手段であり、自然免疫反応と獲得免疫反応を関連付ける手段も提供する(Akira, S.ら (2001) Nature Immunol. 2:675-680；Medzhitov, R. (2001) Nature Rev. Immunol. 1:135-145)。TLRは、自己免疫、感染症、および炎症を含む多くの疾患の病因に役割を果たすことも示されており(Cook, D.N.ら (2004) Nature Immunol. 5:975-979)、適切な薬剤を用いるTLR介在性活性化の制御は、疾患への治療介在手段を提供しうる。
【０００３】
あるTLRは細胞表面に位置して細胞外病原体を検出し、それに対する応答を開始し、他のTLRは細胞の内側に位置し、細胞内病原体を検知し、それに対する応答を開始する。表1に、TLRの表示、それらの細胞での位置、およびそれらに対する既知のアゴニストを示す(Diebold, S.S.ら (2004) Science 303:1529-1531；Liew, F.ら (2005) Nature 5:446-458；Hemmi Hら (2002) Nat Immunol 3:196-200；Jurk Mら, (2002) Nat Immunol 3:499；Lee Jら (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:6646-6651)；(Alexopoulou, L. (2001) Nature 413:732-738)。
表1
2013544816.tif 000002
【０００４】
細菌および合成DNA中に存在するある非メチル化CpGモチーフは免疫系を活性化し、抗腫瘍活性を誘導することが示されている(Tokunaga Tら, J. Natl. Cancer Inst. (1984) 72:955-962；Shimada Sら, Jpn. H cancer Res, 1986, 77, 808-816；Yamamoto Sら, Jpn. J. Cancer Res., 1986, 79, 866-73)。CpGジヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる他の研究では免疫反応を刺激することが示されている(Zhao Qら (1996) Biochem.Pharmacol. 26:173-182)。それに続く研究は、TLR9が細菌および合成DNA中に存在する非メチル化CpGモチーフを認識することを証明した(Hemmi, H.ら (2000) Nature 408:740-745)。CpG含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの他の修飾は、TLR9を介した免疫反応のモジュレーターとして作用するその能力に影響を及ぼすことができる(例えば、Zhaoら, Biochem. Pharmacol. (1996) 51:173-182；Zhaoら (1996) Biochem Pharmacol. 52:1537-1544；Zhaoら (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7:495-502；Zhao et al (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:3453-3458；Zhaoら (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:1051-1054；Yu, D.ら (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:2585-2588；Yu, D.ら (2001) Bioorg. Med. Chem. Lett. 11:2263-2267；およびKandimalla, E.ら (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813参照)。さらに、構造活性関係試験は、非メチル化CpGジヌクレオチドから生じるものとは異なる具体的な免疫反応プロファイルを誘導する合成モチーフおよび新規のDNAベースの化合物の同定を可能にした(Kandimalla, E.ら (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 102:6925-6930. Kandimalla, E.ら (2003) Proc. Nat. Acad. Sci. U S A 100:14303-14308；Cong, Y.ら (2003) Biochem Biophys Res. Commun.310:1133-1139；Kandimalla, E.ら (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 306:948-953；Kandimalla, E.ら (2003) Nucleic Acids Res. 31:2393-2400；Yu, D.ら (2003) Bioorg. Med. Chem.11:459-464；Bhagat, L.ら (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun.300:853-861；Yu, D.ら (2002) Nucleic Acids Res.30:4460-4469；Yu, D.ら (2002) J. Med. Chem.45:4540-4548；Yu, D.ら (2002) Biochem. Biophys. Res. Commun.297:83-90；Kandimalla. E.ら (2002) Bioconjug. Chem.13:966-974；Yu, D.ら (2002) Nucleic Acids Res. 30:1613-1619；Yu, D.ら (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:2803-2808；Yu, D.ら (2001) Bioorg. Med. Chem. Lett. 11:2263-2267；Kandimalla, E.ら (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813；Yu, D.ら (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:2585-2588；Putta, M.ら (2006) Nucleic Acids Res. 34:3231-3238)。
【０００５】
TLRの選択的局在およびそこから生じるシグナルは、免疫反応におけるその役割に対するある洞察を与える。免疫反応は、該反応に関与する細胞のサブセットに基づく自然反応および獲得反応の両方に関与する。例えば、古典的細胞介在性機能(例えば遅延型過敏症および細胞毒性Tリンパ球(CTL)の活性化)に関与するTヘルパー(Th)細胞はTh1細胞である。この反応は、抗原(例えばウイルス感染、細胞内病原体、および腫瘍細胞)に対する身体の自然反応であり、IFNγの分泌と付随するCTLの活性化をもたらす。
あるいはまた、B細胞活性化にヘルパー細胞として関与するTh細胞はTh2細胞である。Th2細胞は、細菌および寄生生物に反応して活性化されることが示されており、IL-4およびIL-5の分泌を通して身体の獲得免疫反応(例えばIgE生産および好酸球活性化)に介在しうる。。免疫反応の種類は、抗原暴露に反応して生成されるサイトカインよって影響を受け、Th1およびTh2細胞によって分泌されたサイトカインの違いは、これらの2つのサブセットの生物学的機能が異なる結果かもしれない。
【０００６】
TLRの活性化は免疫反応を開始することに関与するが、TLRによる免疫系の無制御な刺激は免疫不全対象のある種の疾患を悪化させるかもしれない。近年、いくつかのグループが、炎症性サイトカインの阻害剤としての合成オリゴデオキシオリゴヌクレオチド(ODN)の使用を示した(Lenert、P.ら(2003)DNA Cell Biol. 22(10):621-631)。
【０００７】
Lenertらは、ある種の合成ODNを用いて阻害性ODNを生成することができることを報告している(Lenert, P.ら (2003) DNA Cell Biol. 22(10):621-631)。これら阻害性ODNは、2つのトリプレット配列、近位「CCT」トリプレットおよび遠位「GGG」トリプレットを必要とする。これらのトリプレット含有阻害性ODNに加えて、いくつかのグループが、CpG含有ODNによってTLR-9介在性活性化を阻害することができる他の特異的DNA配列を報告した。これらの「阻害性」、「抑制性」モチーフは、ポリ「G」(例えば「GGGG」)または「GC」に富んでおり、メチル化される傾向があり、哺乳動物のDNAおよびある種のウイルス中に存在する(例えば、Chen、Y.ら、Gene Ther. 8:1024-1032(2001)；Stunz,L.L.、Eur.J.Immunol.32:1212-1222(2002)。Duramad、O.ら、J.Immunol、174:5193-5200(2005)およびJurk et. al(US2005/0239733)は、配列内にGGGGモチーフを含む阻害性DNAオリゴヌクレオチドのための構造について記載している。Patoleらは、GGGG含有ODNが全身性狼瘡を抑制することができることを証明している(Patole, P.ら(2005) J. Am. Soc. Nephrol. 16:3273-3280)。さらに Gursel, I.ら, J. Immunol., 171：1393-1400(2003)は、哺乳類テロメア中に高頻度で存在する反復TTAGGGエレメントがCpG誘導免疫活性化を下方制御することを記載している。Shirota, H.ら, J. Immunol., 173：5002-5007(2004)は、TTAGGGエレメントを含む合成オリゴヌクレオチドはこの活性によく似ており、ある種のTh1-依存性自己免疫疾患の予防/治療に有効であり得ることを証明する。
【０００８】
一方で、いくつかの研究は、ポリG含有ODNがTLRのアンタゴニストとして作用しているという見解を疑問視した。例えば、US6,426,334（Agrawalら）は、GGGGストリング含有CpGオリゴヌクレオチドの投与は強力な抗ウイルス活性と抗癌活性を有しており、これら化合物の投与は、血清IL-12濃度の増加を引き起こすだろうことを証明する。さらに、ポリG配列を含むCpGオリゴはTLR9活性化を通じて免疫反応を誘導し(Verthelyi Dら、J Immunol. 166, 2372, 2001；Gursel Mら、J Leukoc Biol, 71, 813, 2001, Krug Aら、Eur J Immunol, 31, 2154, 2001)、抗腫瘍活性および抗ウイルス活性を示す(Ballas GKら、J Immunol, 167, 4878, 2001；Verthelyi Dら、J Immunol, 170, 4717, 2003)ことが知られている。さらに、ポリGオリゴヌクレオチドはHIVおよびRel Aを阻害することが知られており(McShan WM,ら、J Biol Chem., 267(8):5712-21, 1992；Rando, RFら, J Biol Chem, 270(4):1754-60, 1995；Benimetskaya Lら, Nucleic Acids Res., 25(13):2648-56, 1997)、免疫刺激CpGモチーフおよび4連続Gヌクレオチドを含むODN (クラスA ODNとして知られている)は、インターフェロンγの生成および免疫反応におけるTh1シフトを誘導する。さらに、前臨床疾患モデルにおいて、クラスA ODNは、TLR介在性免疫反応を誘導することが示されている。
【０００９】
さらなる制限として、グアノシンストリングを含むオリゴヌクレオチドは、４重構造を形成し、アプタマーとして作用し、トロンビン活性を阻害することが示されている(Bock LCら, Nature, 355:564-6, 1992；Padmanabhan, Kら, J Biol Chem., 268(24):17651-4, 1993)を抑制する。したがって、単鎖構造または複数鎖構造がTLR9活性化を抑制するのに有効かどうかは不明である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
Kandimallaら(11/549,048)は、ポリG配列を必要としない新規クラスのTLRアンタゴニストについて記載している。Kandimallaらは、種々の疾患および障害の治療および予防にこれら新規組成物を適用することも記載している(11/549,048；11/743,876；12/140,334；12/140,338；12/244199)。しかしながら、ポリG配列を必要とせず、二次構造を形成する問題がないさらなるTLRアンタゴニストを開発することは依然として課題である。この課題は、TLR 7および/または9のユニークな阻害剤として作用することができる、新しいオリゴヌクレオチドベースの化合物および組成物のデザインを通して解決されるかもしれない。そのような新規カスタム化合物および組成物は、免疫刺激成分を用いる疾患および障害の治療および予防を含む多くの臨床関連適用に用途があるだろう。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、驚くべきことに、コア免疫刺激ジヌクレオチドの5'-側の核酸配列、コア免疫刺激ジヌクレオチド内の核酸、ヌクレオチド間結合、または2またはそれ以上のオリゴヌクレオチドを接続するリンカーのユニークな修飾により、通常TLR7および/またはTLR9刺激を介して生じるin vitroおよびin vivoサイトカインおよびケモカインプロフィールと明確に拮抗し、阻害し、抑制し、または予防するTLR7および/またはTLR9の新規アンタゴニストが生成されることをみいだした。
TLR7および/またはTLR9アゴニストに対するサイトカインおよびケモカイン反応と拮抗し、阻害し、抑制し、または予防するこの能力は、疾患特異的および患者特異的に種々の病状を予防および/または治療する能力をもたらす。
【００１２】
したがって、本発明は、TLR7および/またはTLR9の明確なアンタゴニストとして作用する免疫調節オリゴヌクレオチド(IRO)化合物、およびそのような化合物を用いてTLR7および/またはTLR9介在性免疫刺激と拮抗し、阻害し、抑制し、または予防する方法を提供する。これらIRO化合物は、免疫刺激モチーフを含み、免疫刺激モチーフの5'側の核酸配列および/または免疫刺激モチーフ中に1またはそれ以上の化学修飾がなかければ免疫刺激性であろう。TLR7および/またはTLR9活性と優先的に拮抗し、該活性を阻害し、抑制し、または予防するIRO化合物および組成物は構造：5-Nm-N3N2N1CGN1N2N3-Nm-3’を有する
［ここで、CGは、CpG、C*pG、C*pG*、またはCpG*から選ばれるオリゴヌクレオチドモチーフである。Cはシトシンである。C*はシトシン類似体または誘導体である。Gはグアニンである。G*はグアニン類似体または誘導体である。N1-N3は、それぞれ独立してヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体である。N1-N3は、それぞれ独立してヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体である。NmおよびNmは、それぞれ独立してヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、または非ヌクレオチドリンカーである。ただし、オリゴヌクレオチドモチーフのN1、N2、およびN3、および/またはC、および/またはGの少なくとも1が該オリゴヌクレオチドモチーフの活性と拮抗し、阻害し、抑制し、または予防するヌクレオチド誘導体であり、さらに、該化合物は、４未満の連続グアノシンヌクレオチド、好ましくは３未満の連続グアノシンを含む。該オリゴヌクレオチドモチーフの免疫刺激活性は該ヌクレオチド誘導体によって拮抗し、阻害し、抑制し、または予防される。mは0〜約30までの数である。］。
【００１３】
ある態様において、IRO化合物は少なくとも2のオリゴヌクレオチドを含みうる。ここで、少なくとも2つのオリゴヌクレオチドは、直接ヌクレオチド−ヌクレオチド結合により、該糖の3'位を介してまたは修飾糖もしくは修飾核酸塩基を介してその3'末端に、または非ヌクレオチドリンカーにより該糖の3'位を介してまたは修飾糖もしくは修飾核酸塩基を介してその3'末端に共有結合している。この態様の好ましい局面において、IRO化合物のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つは、構造：5'-Nm-N3N2N1CGN1N2N3-Nm-3’を有する［ここで、Nm、N1、N2、N3、C、G、N1、N2、N3、およびNmはIRO化合物の一般構造について前記したものと同意義である。］。この態様のより好ましい局面において、IRO化合物のオリゴヌクレオチドの少なくとも2つは、構造：5'-Nm-N3N2N1CGN1N2N3-Nm-3’を有する［ここで、Nm、N1、N2、N3、C、G、N1、N2、N3、およびNmはIRO化合物の一般構造について前記したものと同意義である。］。そのようなIRO化合物は、構造：5'-Nm-N3N2N1CGN1N2N3-Nm-3’-X-3'-Nm-N3N2N1GCN1N2N3-Nm-5’を有しうる［ここで、Xはヌクレオチド結合または非ヌクレオチドリンカーである。Nm、N1、N2、N3、C、G、N1、N2、N3、およびNmはIRO化合物の一般構造について前記したものと同意義である。］。
【００１４】
本発明のIRO化合物および組成物は、種々の細胞タイプおよび種々のin vitroおよびin vivo実験モデルにおけるTLR7および/またはTLR9介在性免疫反応を優先的に阻害し、各化合物または組成物は異なる免疫阻害プロフィールをもたらす。
【００１５】
本発明は、さらに、本発明のIRO化合物および医薬的に許容される担体を含有する医薬組成物を提供する。
【００１６】
本発明は、さらに、哺乳動物に医薬的有効量の本発明のIRO化合物または組成物を投与することを含む、脊椎動物（すなわち哺乳動物）におけるTLR介在性免疫反応を阻害する方法を提供する。ある好ましい態様において、TLR刺激の抑制または阻害には、本発明のIRO化合物を投与することが含まれる（ここで、TLRはTLR7およびTLR9から選ばれる）。
【００１７】
本発明は、さらに、本発明のIRO化合物を投与することを含む、TLRアゴニストの活性を抑制または阻害する方法を提供する（ここで、該IRO化合物は、TLRアゴニストと同時、またはその前または後に投与される）。好ましい態様において、TLRアゴニストはTLR7およびTLR9のアゴニストから選択される。
【００１８】
本発明は、さらに、哺乳動物に医薬的有効量の本発明のIRO化合物を投与することを含む、TLR7および/またはTLR9介在性疾患を有する脊椎動物（すなわち哺乳動物）を治療的に処置する方法を提供する。好ましい態様において、該疾患は、癌、自己免疫性疾患または障害、気道炎症、炎症性疾患または障害、感染症、マラリア、ライム病、眼感染症、結膜炎、皮膚病、乾癬、強皮症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、慢性疲労症候群、サルコイドーシス、移植拒絶反応、アレルギー、喘息、または病原体に起因する疾患である。好ましい自己免疫性疾患および障害には、制限されるものではないが、紅斑性狼瘡、多発性硬化症、I型糖尿病、過敏性大腸症候群、クローン病、リウマチ性関節炎、敗血症性ショック、全身性脱毛症、急性散在性脳脊髄炎、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、水疱性類天疱瘡、シャーガス病、慢性閉塞性肺疾患、小児脂肪便症、皮膚筋炎、子宮内膜症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン‐バレー症候群、橋本病、化膿性汗腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、限局性強皮症、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経ミオトニー、天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、統合失調症、シェーグレン症候群、側頭動脈炎(さらに「巨細胞性動脈炎」として知られている)、脈管炎、白斑症、外陰部痛およびヴェグナー肉芽腫症が含まれる。好ましい炎症性疾患および障害には、限定されるものではないが、気道炎症、喘息、自己免疫性疾患、慢性炎症、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、ベーチェット病、過敏症、炎症性腸疾患、再潅流障害、リウマチ性関節炎、移植拒絶反応、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、結膜炎および脈管炎が含まれる。
【００１９】
本発明は、さらに、癌、自己免疫性疾患または障害、気道炎症、炎症性疾患または障害、感染症、マラリア、ライム病、眼感染症、結膜炎、皮膚病、乾癬、強皮症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、慢性疲労症候群、サルコイドーシス、移植拒絶反応、アレルギー、喘息、または脊椎動物（すなわち哺乳動物）の病原体に起因する疾患を予防する方法であって、哺乳動物に医薬的有効量の本発明のIRO化合物を投与することを含む方法を提供する。好ましい自己免疫性疾患および障害には、制限されるものではないが、紅斑性狼瘡、多発性硬化症、I型糖尿病、過敏性大腸症候群、クローン病、リウマチ性関節炎、敗血症性ショック、全身性脱毛症、急性散在性脳脊髄炎、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、水疱性類天疱瘡、シャーガス病、慢性閉塞性肺疾患、小児脂肪便症、皮膚筋炎、子宮内膜症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン‐バレー症候群、橋本病、化膿性汗腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、限局性強皮症、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経ミオトニー、天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、統合失調症、シェーグレン症候群、側頭動脈炎(さらに「巨細胞性動脈炎」としても知られる)、脈管炎、白斑症、外陰部痛およびヴェグナー肉芽腫症が含まれる。好ましい炎症性疾患および障害には、限定されるものではないが、気道炎症、喘息、自己免疫性疾患、慢性炎症、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、ベーチェット病、過敏性、炎症性腸疾患、再潅流障害、リウマチ性関節炎、移植拒絶反応、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、結膜炎、および脈管炎が含まれる。
【００２０】
ある好ましい態様において、本発明によるIRO化合物は、1またはそれ以上のワクチン、抗原、抗体、細胞毒性薬、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、TLRアゴニスト、TLRアンタゴニスト、ペプチド、タンパク質、遺伝子療法ベクター、DNAワクチン、アジュバント、キナーゼ阻害剤、または共刺激分子、またはその組み合わせと組み合わせて投与される。ある好ましい態様において、投与経路は非経口的、粘膜送達、経口、舌下、経皮、局所的、吸入、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、胃内、膣内、遺伝子銃による、皮膚パッチ、または点眼薬もしくは口内洗浄液の形である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の免疫調節化合物の線形合成の合成スキームである。DMTr＝4,4'-ジメトキシトリチル；CE＝シアノエチル。
【図２】本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドのパラレル合成の合成スキームである。MTr＝4,4'-ジメトキシトリチル；CE＝シアノエチル。
【図３Ａ】実施例3に従って処理されたマウス脾細胞におけるTLR7/9アンタゴニストによってTLR7誘発サイトカイン/ケモカインを阻害するための本発明のTLR7/9アンタゴニストの能力を示す。
【図３Ｂ】実施例3に従って処理されたマウス脾細胞におけるTLR7/9アンタゴニストによってTLR7誘発サイトカイン/ケモカインを阻害するための本発明のTLR7/9アンタゴニストの能力を示す。
【図４Ａ】実施例3に従って処理されたマウス脾細胞におけるTLR7/9アンタゴニストによってTLR9誘発サイトカイン/ケモカインを阻害するための本発明のTLR7/9アンタゴニストの能力を示す。
【図４Ｂ】実施例3に従って処理されたマウス脾細胞におけるTLR7/9アンタゴニストによってTLR9誘発サイトカイン/ケモカインを阻害するための本発明のTLR7/9アンタゴニストの能力を示す。
【図５】実施例4に従って処理されたマウスにおけるin vivo TLR7誘発IL-12を阻害する、本発明のTLR7/9アンタゴニストの能力を示す。
【図６】実施例4に従って処理されたマウスにおけるin vivo TLR9誘発IL-12を阻害する、本発明のTLR7/9アンタゴニストの能力を示す。
【図７】実施例4に従って処理されたマウスにおける経時的なin vivo TLR7誘発IL-12を阻害する本発明のTLR7/9アンタゴニストの能力を示す。
【図８】実施例4に従って処理されたマウスにおける経時的なin vivo IL-12のTLR9誘発阻害を阻害する本発明のTLR7/9アンタゴニストの能力を示す。
【図９】実施例4に従って処理されたマウスにおけるマウス中のマウスTLR7＆9誘発サイトカインを選択的に阻害する本発明のTLR7/9アンタゴニストの能力を示す。
【図１０】本発明のTLR7/9アンタゴニストが実施例4に従って処理されたマウス中のin vivo TLR3またはTLR5活性を阻害しないことを示す。
【００２２】
本発明は、免疫療法適用のための免疫調節剤としての新規オリゴヌクレオチドベースの化合物の治療的使用に関する。本発明は、TLR7および/またはTLR9との相互作用を通して種々の免疫阻害プロファイルをもたらす新規なオリゴヌクレオチドベースの化合物を提供する。具体的には、本発明は、TLR介在性免疫反応を阻害および/または抑制するためのトール様受容体(TLR)のアンタゴニストとして免疫調節オリゴヌクレオチド(IRO)化合物を提供する。これらIROは、内因性および/または外因性のTLRリガンドまたはTLRアゴニストに反応してTLR７および/またはTLR9介在性シグナル伝達の阻害または抑制をもたらすオリゴヌクレオチド間リンカー、および/または化学修飾、および/またはヌクレオチド間結合を有する。本明細書で引用した参考文献は、当該分野の知識水準を反映し、本明細書の一部を構成する。引用した参考文献と本明細書の開示間の対立は後者に有利に解決される。
【００２３】
本発明は、さらに、免疫療法適用、例えば、限定されるものではないが、成人および小児の癌、自己免疫障害、喘息、呼吸器アレルギー、食物アレルギー、皮膚アレルギー、全身性紅斑性狼瘡(SLE)、関節炎、胸膜炎、慢性感染症、炎症性疾患、炎症性腸症候群、敗血症、および細菌、寄生虫、およびウイルス感染の治療、ならびに獣医的適用に用いることができる、TLRにに起因する免疫反応を抑制する方法を提供する。したがって、本発明は、免疫療法のための最適レベルの免疫調節効果を有するIRO化合物、およびそのような化合物の製造および使用方法を提供する。さらに、本発明のIRO化合物は、例えばワクチン、抗原、抗体、アレルゲン、化学療法剤(化学療法および標的治療の両方)および/または疾患の予防および治療のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドと組み合わせて有用である。
（定義）
【００２４】
用語「オリゴヌクレオチド」は、一般的には、複数の結合ヌクレオシド単位を含有するポリヌクレオシドを表す。そのようなオリゴヌクレオチドは、ゲノムまたはcDNAを含む、既存の核酸供給源から得ることができるが、好ましくは合成法により生成される。好ましい態様において、各ヌクレオシド単位は、限定されるものではないが、修飾ヌクレオシド塩基および/または修飾糖単位を含む、野生型のオリゴヌクレオチドと比較して種々の化学修飾および置換を含む。化学的修飾のは当業者に知られており、例えば、Uhlmann E et al. (1990) Chem. Rev. 90:543；「Protocols for Oligonucleotides and Analogs」 Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed, Humana Press, Totowa, USA 1993；およびHunziker, J. et al. (1995) Mod. Syn. Methods 7:331-417；およびCrooke, S. et al. (1996) Ann.Rev. Pharm. Tox. 36:107-129に記載されている。ヌクレオシド残基は多くの既知のヌクレオシド間結合のいずれか互いに結合することができる。そのようなヌクレオシド間連結には、限定されるものではないが、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホナート、アルキルホスホノチオアート、ホスホトリエステル、ホスホロアミダート、シロキサン、カーボネート、カルボアルコキシ、アセトアミダート、カーバメート、モルフォリノ、ボラノ、チオエーテル、架橋ホスホロアミダート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエート、およびスルホンヌクレオシド間結合が含まれる。用語「オリゴヌクレオチド」は、1またはそれ以上の立体特異的ヌクレオシド間結合(例えば(Rp)-または(Sp)-ホスホロチオエート、アルキルホスホナート、またはホスホトリエステル結合)を有するポリヌクレオシドも包含する。本明細書で用いている用語「オリゴヌクレオチド」および「ジヌクレオチド」は、あらゆるヌクレオシド間結合（該結合がリン酸基を含むか含まないかに関わらず）を有するジヌクレオシドおよびポリヌクレオシドを含むことを明確に意図する。ある好ましい態様において、これらのヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、またはホスホロジチオエート結合、またはその組み合わせでありうる。
【００２５】
用語「2'置換リボヌクレオシド」または「2'置換アラビノシド」は、一般的には、2'置換または2'-O-置換リボヌクレオシドを生成するためにペントース部分の2'位の水酸基が置換されたリボヌクレオシドまたはアラビノヌクレオシドを含む。ある態様において、そのような置換は、1〜6個の飽和または不飽和炭素原子を含む低級ヒドロカルビル基、ハロゲン原子、または6〜10個の炭素原子を有するアリール基により、そのようなヒドロカルビルまたはアリール基は、置換されていないか、または例えばハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルボアルコキシ、またはアミノ基で置換されていてもよい。2'-O-置換リボヌクレオシドまたは2'-O-置換アラビノシドの例には、限定されるものではないが、2'-アミノ、2'-フルオロ、2'-アリル、2'-O-アルキル、および2'-プロパルギルリボヌクレオシドまたはアラビノシド、2'-O-メチルリボヌクレオシド、または2'-O-メチルアラビノシド、および2'-O-メトキシエトキシリボヌクレオシド、または2'-O-メトキシエトキシアラビノシドが含まれる。
【００２６】
用語「3'」は、方向について用いる場合、一般的には、同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド中の別の領域または位置から3'側(下流)のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの領域または位置を表す。
【００２７】
用語「5'」は、方向について用いる場合、一般的には、同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド中の別の領域または位置から5'側(上流)のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの領域または位置を表す。
【００２８】
用語「約」は、一般的には、正確な数が重要ではないことを意味する。すなわち、オリゴヌクレオチド中のヌクレオシド残基の数は重要ではなく、ヌクレオシド残基が１または２個少ないかまたは１〜数個多いオリゴヌクレオチドは、上記態様のそれぞれの等価物と考えられる。
【００２９】
用語「アゴニスト」は、一般的には、細胞の受容体と結合し、反応を誘導する物質を表す。アゴニストは、しばしば自然物質(例えばリガンド)の作用とよく似ている。
【００３０】
用語「アンタゴニスト」は、一般的には、アゴニストまたはリガンドの効果を減ずるか、阻害するか、抑制する物質を表す。
【００３１】
用語「アジュバント」は、一般的には、免疫原(例えばワクチンまたは抗原)に加えると、該混合物に暴露するとレシピエント宿主の免疫原に対する免疫反応を増強するか強める物質を表す。
【００３２】
用語「気道炎症」は、一般的には、限定されるものではないが、喘息を含む。
【００３３】
用語「アレルゲン」は、一般的には、暴露すると対象にアレルギー反応を誘導する抗原または分子(通常、タンパク質)の抗原部分を表す。典型的には、該対象は、例えば、膨疹およびフレア試験、または当該分野で知られているあらゆる方法によって示されているアレルゲンに対してアレルギー性である。分子は、対象の小さなサブセットだけが該分子に暴露するとアレルギー性免疫反応を示す場合でも、アレルゲンであるという。
【００３４】
用語「アレルギー」は、一般的には、炎症によって特徴づけられた不適当な免疫反応を指し、限定されるものではないが、食物アレルギーおよび呼吸器系アレルギーを含む。
【００３５】
用語「抗原」は、一般的には、抗体またはT細胞抗原レセプターによって認識され選択的に結合し、免疫反応の誘導をもたらす物質を表す。抗原には、限定されるものではないが、ペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチドおよびその組み合わせが含まれうる。抗原は、天然または合成であってよく、一般的には、その抗原に特異的な免疫反応を誘発しうる。
【００３６】
用語「自己免疫疾患」および「自己免疫障害」は、一般的には、「自己」成分が免疫系の攻撃を受ける疾患または障害を意味する。
【００３７】
用語「TLR介在性疾患」または「TLR介在性障害」は、一般的には、1またはそれ以上のTLRの活性化が要因であるあらゆる病的状態を意味する。そのような状態には、限定されるものではないが、癌、自己免疫疾患または障害、気道炎症、炎症性疾患または障害、感染症、皮膚病、アレルギー、喘息、または病原体に起因する疾患が含まれる。
【００３８】
用語「生理学的に許容される」は、一般的には、本発明のIRO化合物または組成物の有効性と干渉しない、生物系、例えば、細胞、細胞培養、組織、または生物と適合する物質を表す。好ましくは、該生物系は生存生物、脊椎動物または哺乳動物である。
【００３９】
用語「担体」は、一般的には、あらゆる賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤、油、脂質、脂質含有小胞、ミクロスフェア、リポソームカプセル化、または医薬製剤で用いるための当該分野において知られた他の物質を包含する。担体、賦形剤、または希釈剤の特性が特定の適用のための投与経路に依存するであろうことは理解されるだろう。これらの材料を含む医薬的に許容される製剤の製造は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences,18版、A. Gennaro編, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990.に記載されている。
【００４０】
用語「併用投与」は、一般的には、免疫反応を調節するか、抑制するか、阻害するために、十分に近い時間で少なくとも2つの異なる物質を投与することを表す。併用投与は、同時投与、および少なくとも2つの異なる物質を一回量または分離した量で任意の順番で、数日までの時間を開けて投与することをいう。
【００４１】
用語「相補性（的）」は、一般的には、核酸とハイブリダイズする能力を有することを意味する。そのようなハイブリダイゼーションは、一般的には、好ましくはワトソンクリックまたはHoogsteen塩基対を形成する相補鎖間の水素結合の結果であるが、水素結合の他の方法および塩基のスタッキングもハイブリダイゼーションをもたらすことができる。
【００４２】
用語「有効量」または「十分量」は、一般的には、所望の生物学的効果、例えば有益な結果に影響を与えるのに十分な量を表す。すなわち、「有効量」または「十分量」は、それが投与されている文脈に依存するだろう。併用投与された抗原への免疫反応を調節する化合物または組成物を投与する文脈において、有効量の本発明IROまたは組成物および抗原は、抗原を単独で投与する時に得られる免疫反応に比べて目的とする調節、阻害、または抑制を達成するのに充分な量である。有効量は1またはそれ以上の投与で投与されてもよい。
【００４３】
用語「と組み合わせて（と併用して）」は、一般的には、患者の疾患または障害を治療する過程で、本発明のIRO化合物または組成物、および本発明のIRO化合物または組成物の免疫阻害作用を低下させない疾患または障害を治療するのに有用な薬剤を投与することを意味する。そのような併用療法は、本発明のIRO化合物または組成物、および/または独立して薬剤の２回以上の投与を含みうる。本発明のIRO化合物または組成物、および/または該薬剤の投与は、同じまたは異なる経路によってもよい。
【００４４】
用語「個体」または「対象」または「脊椎動物」は、一般的には、哺乳動物を表す。哺乳動物は、一般的には、限定されるものではないが、ヒト、ヒト以外の霊長類、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、肉牛、乳牛、ブタ、ヒツジおよびウサギを含む。
【００４５】
用語「キナーゼ阻害剤」は、一般的には、リン酸化依存性細胞シグナル伝達および/または細胞の成長経路と拮抗するかまたはそれを阻害する分子を表す。キナーゼ阻害剤は天然または合成であってよく、経口療法として投与する可能性がある低分子を含んでもよい。キナーゼ阻害剤は、標的キナーゼ分子の活性化を急速および特異的に阻害する能力を有する。プロテインキナーゼは、種々のシグナル伝達および成長経路を調節し、種々のタンパク質を含むので、魅力的な薬物標的である。それゆえ、キナーゼ阻害剤は、癌、心血管疾患、炎症性障害、糖尿病、黄斑変性症および神経学的障害を含む、キナーゼシグナル伝達が関与する疾患の治療に大きな可能性を有する。キナーゼ阻害剤の例には、ソラフェニブ(Nexavar（登録商標）)、Sutent（登録商標）、ダサチニブ、Dasatinib（登録商標）、Zactima（登録商標）、Tykerb（登録商標）およびSTI571が含まれる。
【００４６】
用語「ヌクレオシド」は、一般的には、糖(通常、リボースまたはデオキシリボース)、およびプリンまたはピリミジン塩基からなる化合物を表す。
【００４７】
用語「ヌクレオチド」は、一般的には、糖と結合したリン酸基を含有するヌクレオシドを表す。
【００４８】
本明細書でで用いている用語「ピリミジンヌクレオシド」は、ヌクレオシドの塩基部分がピリミジン塩基(例えばシトシン(C)またはチミン(T)またはウラシル(U))であるヌクレオシドを表す。同様に、用語「プリンヌクレオシド」は、ヌクレオシドの塩基部分がプリン塩基(例えばアデニン(A)またはグアニン(G))であることを特徴とするヌクレオシドを表す。
【００４９】
用語「類似体」または「誘導体」は、一般的には、あらゆるプリンおよび/またはピリミジンヌクレオチド、または修飾塩基および/または糖を有するヌクレオシドを表すために互換性に用いることができる。修飾塩基は、グアニン、シトシン、アデニン、チミン、またはウラシルでない塩基である。修飾糖は、リボースまたは2'デオキシリボースではない、オリゴヌクレオチドのバックボーンに用いることができるあらゆる糖である。
【００５０】
用語「阻害する」あるいは「抑制する」は、一般的には、反応を減少または抑制し、または反応の誘導および/または刺激から生じる反応の定性的な差を減少または抑制することをいう。
【００５１】
用語「非ヌクレオチドリンカー」は、一般的には、リン含有結合以外を介してオリゴヌクレオチドと結合する（または結合させられる）ことができるあらゆる結合または部分を表す。好ましくはそのようなリンカーは長さが約２Å（オングストローム）〜約２００Åである。
【００５２】
用語「ヌクレオチド結合」は、一般的には、リン含有結合を介して２つのヌクレオシドの3'および5'ヒドロキシル基を直接連結する直接3'-5'結合を表す。
【００５３】
用語「オリゴヌクレオチドモチーフ」は、CpG、C*pG、C*pG*、またはCpG*から選ばれるジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を意味する。用語CpG、C*pG、C*pG*およびCpG*は、免疫刺激性であるオリゴヌクレオチドモチーフを意味する（ここで、Cはシトシンである。C*はシトシン類似体または誘導体である。Gはグアニンである。G*はグアニン類似体または誘導体である。）。
【００５４】
「1またはそれ以上の修飾がなければ免疫刺激性であるオリゴヌクレオチドモチーフ」は、親オリゴヌクレオチドに基づくが１またはそれ以上の修飾を有する誘導体オリゴヌクレオチド中ではなく、親オリゴヌクレオチド中の免疫刺激性であるオリゴヌクレオチドモチーフを意味する。言いかえれば、「1またはそれ以上の修飾がなければ免疫刺激性であるオリゴヌクレオチドモチーフ」は、TLR9誘導部分自体の修飾によるか、またはオリゴヌクレオチドベースの化合物内の1またはそれ以上の化学的修飾によりTLR9介在性免疫反応の誘導が機能的にブロックまたは阻害されていることがなければTLR9アゴニスト活性を有するTLR9誘導部分を表す。TLR9誘導部分の活性を阻害する修飾には、限定されるものではないが、2'-O-Me-リボヌクレオシド、3'-O-Me-リボヌクレオシド、3-ニトロピロール、5-ニトロインドール、dU、β-L-デオキシリボヌクレオシド、α-デオキシリボヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、プロパンジオールリンカー、アミノリンカー、イソプロポキシル、グリセロールリンカー、2'-5'-DNA、2'-5'RNA、およびP-Me DNAが含まれる。
【００５５】
用語「治療」は、一般的には、症状の緩和、および/または疾患または障害の進行を遅らせおよび/または改善することを含む有益または望ましい結果を得ることを意図するアプローチを表す。
。
【００５６】
本発明のあるIROを表2に示す。この表中で、IRO化合物は、「o」で示したものを除きすべてホスホロチオエート(PS)結合を有している。示した場合を除き、ヌクレオチドはすべてデオキシリボヌクレオチドである。
表2
【００５７】
2013544816.tif 000003
2013544816.tif 000004
2013544816.tif 000005
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2013544816.tif 000008
【００５８】
G1＝7-デアザ-dG；G2＝AraG；C*＝5-Me-dC；C*＝2’-O-Me-5-Me-C；A^/G^/T^/G^＝2'-O-(2-メトキシエチル)-リボヌクレオチド；X＝グリセロールリンカー；(1,2,3-プロパントリオールリンカーとしても知られている)；X1＝1,2,4-ブタントリオールリンカー；Z＝1,3,5-ペンタントリオールリンカー；X4＝3-トリメチルアミノ-1,2-プロパンジオールリンカー；X5＝ビス-1,5-O-(3'-チミジル)-1,3,5-ペンタントリオールリンカー；X6＝ビス-1,5-O-[3'-(1,2-ジデオキシ-D-リボシル)]-1,3-5-ペンタントリオール）リンカー；X7＝3-(2-ヒドロキシエチル)-1,5-ペンタンジオールリンカー；G/U/A/C＝2'-O-Meリボヌクレオチド；o＝ホスホジエステル結合。
【００５９】
第1の局面において、本発明は免疫調節オリゴヌクレオチド(IRO)化合物を提供する。用語「IRO」は、TLR7および/またはTLR9のアンタゴニストである免疫調節オリゴヌクレオチドに基づく化合物であって、オリゴヌクレオチドモチーフの活性を機能的にブロックまたは阻害する１またはそれ以上の修飾がなければ免疫刺激性であるオリゴヌクレオチドモチーフおよび少なくとも1の修飾を含む化合物を表す（ただし、該化合物は4未満の連続グアノシンヌクレオチド、好ましくは3未満の連続グアノシンヌクレオチドを含む）。そのような修飾は、オリゴヌクレオチド5'末端中、オリゴヌクレオチドモチーフ隣接5'側配列中、および/または免疫刺激オリゴヌクレオチドモチーフ内にありうる。これら修飾は、TLR7および/またはTLR9介在性免疫刺激と拮抗し、該刺激を阻害し、抑制し、または妨げるIRO化合物をもたらす。そのような修飾は、免疫刺激オリゴヌクレオチドモチーフ隣接ヌクレオチド/ヌクレオシド、またはそのようなオリゴヌクレオチドモチーフ内の塩基、糖残基、および/またはリン酸バックボーンに対してでありうる。
【００６０】
IRO化合物の一般構造は、構造：5-Nm-N3N2N1CGN1N2N3-Nm-3’を有する
［ここで、CGは、CpG、C*pG、C*pG*、またはCpG*から選ばれるオリゴヌクレオチドモチーフである。Cはシトシンである。C*はシトシン類似体または誘導体である。Gはグアニンである。G*はグアニン類似体または誘導体である。N1-N3は、それぞれ独立してヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体である。N1-N3は、それぞれ独立してヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体である。NmおよびNmは、それぞれ独立してヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、または非ヌクレオチドリンカーである。ただし、オリゴヌクレオチドモチーフのN1、N2、およびN3、および/またはC、および/またはGの少なくとも1が該オリゴヌクレオチドモチーフの活性を機能的にブロックまたは阻害するヌクレオチド誘導体であり、さらに、該化合物は、４未満の連続グアノシンヌクレオチド、好ましくは３未満の連続グアノシンを含む。該オリゴヌクレオチドモチーフの免疫刺激活性は該ヌクレオチド誘導体によって拮抗し、阻害し、抑制し、または予防される。mは0〜約30までの数である。］。
【００６１】
好ましい態様において、N1は、オリゴヌクレオチドモチーフの活性を機能的にブロックするか阻害するヌクレオチド誘導体である。好ましい態様において、N1およびN2、またはN1およびN3、またはN2およびN3、またはN1、N2、およびN3は、オリゴヌクレオチドモチーフの活性を機能的にブロックするか阻害するヌクレオチド誘導体である。
【００６２】
好ましい態様において、IRO化合物はアンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
【００６３】
本発明のある態様において、IRO化合物は少なくとも2のオリゴヌクレオチド（例えば、２、３、４、５、または６オリゴヌクレオチド）を含みうる。ここで、少なくとも2のオリゴヌクレオチドは、直接ヌクレオチド−ヌクレオチド結合により、該糖の3'位を介してまたは修飾糖もしくは修飾核酸塩基を介してその3'末端と、または非ヌクレオチドリンカーにより該糖の3'位を介してまたは修飾糖もしくは修飾核酸塩基を介してその3'末端と共有結合している。この態様の好ましい局面において、IRO化合物のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つは、構造：5'-Nm-N3N2N1CGN1N2N3-Nm-3’を有する［ここで、Nm、N1、N2、N3、C、G、N1、N2、N3、およびNmはIRO化合物の一般構造について前記したものと同意義である。］。この態様のより好ましい局面において、IRO化合物のオリゴヌクレオチドの少なくとも2つは、構造：5'-Nm-N3N2N1CGN1N2N3-Nm-3’を有する［ここで、Nm、N1、N2、N3、C、G、N1、N2、N3、およびNmはIRO化合物の一般構造について前記したものと同意義である。］。そのようなIRO化合物は、構造：5'-Nm-N3N2N1CGN1N2N3-Nm-3’-X-3'-Nm-N3N2N1GCN1N2N3-Nm-5’を有しうる［ここで、Xはヌクレオチド結合または非ヌクレオチドリンカーである。Nm、N1、N2、N3、C、G、N1、N2、N3、およびNmはIRO化合物の一般構造について前記したものと同意義である。］。
【００６４】
本発明のある態様において、TLR7および/またはTLR9のアンタゴニストであるIRO化合物は構造：5-NpN3N2N1C*G*N1N2N3NzN4N5-3'
［ここで、C*G*は、C*が5-Me-dCであり、G*が7-デアザ-dGであるオリゴヌクレオチドモチーフである；
N1-N2は、それぞれ独立して2'-O-Meリボヌクレオチドである；
N3は、それぞれ独立してヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体である；
N1-N3は、それぞれ独立してヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体である；
NpおよびNzは、それぞれ独立してヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体である；
N4-N5は、それぞれ独立して2'-O-Meリボヌクレオチドである；
pは0〜約30の数である；
zは0〜約30の数である；
ただし、該化合物は3つ未満の連続グアノシンを含んでいる。］を有する。
ある態様において、pおよびzは、独立して1〜約20の数である。
ある態様において、pおよびzは、独立して2〜約15の数である。
ある態様において、pおよびzは、独立して3〜約10の数である。
【００６５】
本発明のある態様において、TLR7および/またはTLR9のアンタゴニストであるIRO化合物は構造：5-NpN3N2N1C*G*N1N2N3NzN4N5-3'
［ここで、C*G*は、C*が5-Me-dCであり、G*が7-デアザ-dGであるオリゴヌクレオチドモチーフである；
N1-N2は、それぞれ独立して2'-O-Meリボヌクレオチドである；
N3は、それぞれ独立してヌクレオチドである；
N1-N3は、それぞれ独立してヌクレオチドである；
NpおよびNzは、それぞれ独立してヌクレオチドである；
N4-N5は、それぞれ独立して2'-O-Meリボヌクレオチドである；
pは5であり、zは3である；
ただし、該化合物は3つ未満の連続グアノシンを含んでいる。］を有する。
【００６６】
好ましい態様において、構造：5'-Nm-N3N2N1CGN1N2N3-Nm-3’を有する2つのオリゴヌクレオチドは、直接ヌクレオチド−ヌクレオチド結合により糖の3'位を介してまたは修飾糖もしくは修飾核酸塩基を介してその3'末端に、または非ヌクレオチドリンカーにより糖の3'位を介してまたは修飾糖もしくは修飾核酸塩基を介してその3'末端に共有結合している。この態様の好ましい局面において、IRO化合物は構造：5'-Nm-N3N2N1CGN1N2N3-Nm-3’-X-3'-Nm-N3N2N1GCN1N2N3-Nm-5'［ここで、Xはヌクレオチド結合または非ヌクレオチドリンカーであり、Nm、N1、N2、N3、C、G、N1、N2、N3およびNmは、IRO化合物の一般構造に関する前記と同意義である。］を有する。好ましい態様において、2つのオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド結合によって直接共有結合している。より好ましい態様において、2つのオリゴヌクレオチドは、非ヌクレオチドリンカーによって共有結合している。
【００６７】
非限定的例として、2つのオリゴヌクレオチドを共有結合する非ヌクレオチドリンカーは、糖の3'-ヒドロキシルと結合しうる。そのような態様において、該リンカーは、ホスフェートベースの結合(例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホナート)、または非ホスフェートベースの結合により3'-ヒドロキシルと結合している官能基を含む。オリゴヌクレオチドの3'末端へのリンカーの結合可能部位を下記式I中に示す［式中、Bはヘテロ環式塩基を表わし、Pを指す矢印は、リン（亜リン酸）に対するあらゆる結合を示す。］
2013544816.tif 000009
式I
【００６８】
本発明のこの局面のある態様において、非ヌクレオチドリンカーは低分子、高分子、または生体分子（限定されるものではないが、ポリペプチド、抗体、脂質、抗原、アレルゲン、およびオリゴ糖を含む）である。ある他の態様において、該非ヌクレオチドリンカーは低分子である。本発明の目的において、低分子は、分子量が1,000da未満の有機部分である。ある態様において、該低分子の分子量は750Da未満である。
【００６９】
ある態様において、該低分子は、脂肪族または芳香族炭化水素であり、いずれも、所望により、該オリゴヌクレオチドを連結しまたはそれに付加した直鎖において、限定されるものではないが、ヒドロキシ、アミノ、チオール、チオエーテル、エーテル、アミド、チオアミド、エステル、ウレア、またはチオウレアを含む１またはそれ以上の官能基を含みうる。該小分子は環式または非環式でありうる。小分子リンカーの例には、限定されるものではないが、、アミノ酸、炭水化物、シクロデキストリン、アダマンタン、コレステロール、ハプテンおよび抗生物質が含まれる。しかしながら、非ヌクレオチドリンカーを説明する目的において、用語「小分子」は、ヌクレオシドを含むことを意図しない。
【００７０】
ある態様において、非ヌクレオチドリンカーはアルキルリンカー、またはアミノリンカーである。アルキルリンカーは、分岐または非分岐、環式または非環式、置換または非置換、飽和または不飽和、キラル、アキラル、またはラセミ混合物でありうる。該アルキルリンカーは炭素数約2〜約18でありうる。ある態様において、そのようなアルキルリンカーは炭素数約2〜約9でありうる。他の態様において、アルキルリンカーは炭素数３未満である。さらなる態様において、アルキルリンカーは、炭素数が少なくとも3、好ましくは炭素数4である。いくつかのアルキルリンカーは、限定されるものではないが、ヒドロキシ、アミノ、チオール、チオエーテル、エーテル、アミド、チオアミド、エステル、ウレアおよびチオエーテルを含む1またはそれ以上の官能基を含む。そのようなアルキルリンカーには、限定されるものではないが、1,2プロパンジオール、1,2,3プロパントリオール、1,3プロパンジオール、1,2,4ブタントリオール、1,3,5ペンタントリオール、3-トリメチルアミノ-1,2-プロパンジオール、ビス-1,5-O-[3'チミジル(-1,3,5-ペンタントリオール、ビス-1,5-O-[3'-(1,2-ジデオキシ-D-リボシル)]-1,3,5-ペンタントリオール、3-(2-ヒドロキシエチル)-1,5-ペンタンジオール、トリエチレングリコールヘキサエチレングリコール、ポリエチレングリコールリンカー(例えば[-O-CH2-CH2-]n(n＝1〜9))、メチルリンカー、エチルリンカー、プロピルリンカー、ブチルリンカー、またはヘキシルリンカーが含まれる。ある態様において、そのようなアルキルリンカーはペプチドまたはアミノ酸を含んでいてもよい。
【００７１】
ある態様において、非ヌクレオチドリンカーは、限定されるものではないが、表3中に記載のものを含みうる。
表3：代表的な非ヌクレオチドリンカー
2013544816.tif 000010
1,2,3-プロパンジオールリンカー(グリセロール)
2013544816.tif 000011
1,2,4-ブタントリオールリンカー
2013544816.tif 000012
1,3,5-ペンタントリオールリンカー
2013544816.tif 000013
3-トリメチルアミノ-1,2-プロパンジオールリンカー)
2013544816.tif 000014
ビス-1,5-O-(3'-チミジル)-1,3,5-ペンタントリオール(リンカー)
2013544816.tif 000015
ビス-1,5-O-[3'-(1,2-ジデオキシ-D-リボシル)]-1,3-5-ペンタントリオールリンカー
2013544816.tif 000016
3-(2-ヒドロキシエチル)-1,5-ペンタンジオール(リンカー)
【００７２】
ある態様中で、低分子リンカーは、グリセロール、または式：HO-(CH2)o-CH(OH)- (CH2)p-OH（ここで、oおよびpは、独立して1〜約6、1〜約4、または1〜約3の整数である。）グリセロール同族体である。他のある態様において、低分子リンカーは1,3-ジアミノ-2-ヒドロキシプロパンの誘導体である。あるそのような誘導体は、式：HO-(CH2)m-C(O)NH-CH2-CH(OH)-CH2-NHC(O)-(CH2)m-OH（ここで、mは、0〜約10、0〜約6まで、2〜約6、または2〜約4の整数である。）を有する。
【００７３】
本発明のある非ヌクレオチドリンカーは、2を超えるオリゴヌクレオチドの結合を可能にする。例えば、該低分子リンカーグリセロールは、オリゴヌクレオチドが共有結合しうる3つの水酸基を有する。したがって、本発明のあるIROは、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーと結合した2またはそれ以上のオリゴヌクレオチドを含む。そのようなIROは「分岐している」という。
【００７４】
IRO化合物は、例えば、静電気的相互作用、疎水性相互作用、π-スタッキング相互作用、水素結合、およびその組み合わせによって非共有結合した少なくとも2のオリゴヌクレオチドも含みうる。そのような非共有結合の非限定的例には、ワトソン‐クリック塩基対化、フーグスティーン塩基対化および塩基スタッキングが含まれる。
【００７５】
好ましい態様において、IRO化合物のオリゴヌクレオチドの1つはアンチセンスオリゴヌクレオチドではない。より好ましい態様において、IRO化合物のオリゴヌクレオチドのいずれもアンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
【００７６】
ある態様において、本発明の組成物および方法に用いる免疫調節オリゴヌクレオチド中のピリミジンヌクレオシドは以下の構造(II)を有する。
2013544816.tif 000017
（II）
［式中、Dは水素結合ドナーである；
D'は、水素、水素結合ドナー（供与体）、水素結合アクセプター（受容体）、親水基、疎水基、電子求引基および電子供与基からなる群から選ばれる；
Aは水素結合アクセプターまたは親水基である；
A'は、水素結合アクセプター、親水基、疎水基、電子求引基および電子供与基からなる群から選ばれる；
Xは炭素または窒素である；
S'はペントースまたはヘキソース糖環、または糖類似体である。］。
【００７７】
ある態様において、糖環は、リン酸塩部分、修飾リン酸塩部分、またはピリミジンヌクレオシドと別のヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を結合するのに適した他のリンカー部分で誘導体化される。
【００７８】
いくつかの態様において、水素結合ドナーには、限定されるものではないが、-NH-、-NH2、-SH、および-OHが含まれる。好ましい水素結合アクセプターには、限定されるものではないが、C＝O、C＝S、および芳香族ヘテロ環の環窒素原子(例えばシトシンのN3)が含まれる。
【００７９】
ある態様において、構造(II)はピリミジンヌクレオシド誘導体である。ピリミジンヌクレオシド誘導体の例には、限定されるものではないが、5-ヒドロキシシトシン、5-ヒドロキシメチルシトシン、N4-アルキルシトシン、またはN4-エチルシトシン、araC、5-OH-dC、N3-Me-dC、2'-O-Me-C、2'-O-Me-U、2'-O-Me-T、および4-チオウラシルが含まれる。化学修飾誘導体には、限定されるものではないが、チミンまたはウラシル類似体も含まれる。ある態様において、(II)中の糖部分S'は糖誘導体である。適切な糖誘導体には、限定されるものではないが、トレハロースまたはトレハロース誘導体、ヘキソースまたはヘキソース誘導体、アラビノースまたはアラビノース誘導体が含まれる。
【００８０】
ある態様において、本発明の組成物および方法に用いる免疫調節オリゴヌクレオチド中のプリンヌクレオシドは下記構造(III)を有する。
2013544816.tif 000018
（III）
［式中、Dは水素結合ドナーである；
D'は、水素、水素結合ドナーおよび親水基からなる群から選ばれる；
Aは水素結合アクセプターまたは親水基である；
Xは炭素または窒素である；
Lは、それぞれ独立して、C、O、NおよびSからなる群から選ばれる；
S'はペントースまたはヘキソース糖環、または糖類似体である。］。
【００８１】
ある態様において、糖環は、リン酸塩部分、修飾リン酸塩部分、またはピリミジンヌクレオシドと別のヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を結合するのに適した他のリンカー部分で誘導体化される。
【００８２】
ある態様において、水素結合ドナーには、限定されるものではないが、-NH-、-NH2、-SH、および-OHが含まれる。ある態様において、水素結合アクセプターには、限定されるものではないが、C＝O、C＝S、-NO2、および芳香族ヘテロ環の環窒素原子(例えばグアニンのN1)が含まれる。
【００８３】
ある態様において、構造(III)はプリンヌクレオシド誘導体である。プリンヌクレオシド誘導体の例には、限定されるものではないが、グアニン類似体、例えば7-デアザ-G、7-デアザ-dG、araG、6-チオ-G、イノシン、イソ-G、ロキソリビン、TOG(7-チオ-8-オキソ)-G、8-ブロモ-G、8-ヒドロキシ-G、5-アミノホルミシンB、オキソホルミシン、7-メチル-G、9-p-クロロフェニル-8-アザ-G、9-フェニル-G、9-ヘキシル-グアニン、7-デアザ-9-ベンジル-G、6-クロロ-7-デアザグアニン、6-メトキシ-7-デアザグアニン、8-アザ-7-デアザ-G(PPG)、2-(ジメチルアミノ)グアノシン、7-メチル-6-チオグアノシン、8-ベンジルオキシグアノシン、9-デアザグアノシン、1-(B-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチルプリン、1-(2'-デオキシ-b-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-O-メチル-G、およびN1-Me-dGが含まれる。化学修飾誘導体には、限定されるものではないが、アデニン類似体、例えば、9-ベンジル-8-ヒドロキシ-2-(2-メトキシエトキシ)アデニン、2-アミノ-N2-O-、メチルアデノシン、8-アザ-7-デアザ-A、7-デアザ-A、ビダラビン、2-アミノアデノシン、N1-メチルアデノシン、8-アザアデノシン、5-ヨードツベルシジン、および2'-O-Me-A。が含まれる。ある態様において、(III)中の糖部分S'は式IIで定義した糖誘導体である。
【００８４】
本発明のある態様において、免疫調節核酸は、少なくとも1のB-L-デオキシヌクレオシドまたは3'-デオキシヌクレオシドを含む核酸配列を含む。
【００８５】
本発明のある態様において、免疫調節オリゴヌクレオチドは、CpG、C*pG、C*pG*、およびCpG*から選ばれる少なくとも1つのジヌクレオチドを含む核酸配列を含む［ここで、Cはシトシンまたは2'-デオキシシチジンである。Gはグアノシンまたは2'-デオキシグアノシンである。C*は2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチルプリン、5-Me-dC、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジン、2'-O-置換リボヌクレオチド(限定されるものではないが、2'-O-Me-5-MeC、2'-O-(2-メトキシエチル)-リボヌクレオチド、または2'-O-Me-リボヌクレオチドを含む)、または他のピリミジンヌクレオシド類似体または誘導体である。G*は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'置換アラビノグアノシン、2'-O-置換アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシン、2'-O-置換リボヌクレオチド(限定されるものではないが、2'-O-(2-メトキシエチル)-リボヌクレオチドまたは2'-O-Me-リボヌクレオチドを含む)、または他のプリンヌクレオシド類似体または誘導体である。pは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選ばれるヌクレオシド間結合である。ここで、少なくとも1のジヌクレオチドの活性はフランキング配列によって制御される。］。
【００８６】
ある態様において、IRO化合物のオリゴヌクレオチドは、それぞれ、約6〜約35のヌクレオシド残基、好ましくは約9〜約30のヌクレオシド残基、より好ましくは約11〜約23のヌクレオシド残基を有する。ある態様において、オリゴヌクレオチドは約6〜約18のヌクレオチド残基を有する。
【００８７】
ある態様において、IRO化合物は、免疫反応の特異性または大きさを増強する1またはそれ以上のワクチン、抗原、抗体、細胞毒性薬、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、TLRアゴニスト、TLRアンタゴニスト、ペプチド、タンパク質、遺伝子療法ベクター、DNAワクチン、アジュバント、またはキナーゼ阻害剤、または共刺激分子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、タンパク質リガンド、トランス活性化因子、ペプチド、および修飾アミノ酸含有ペプチドと組み合わせることができる。
【００８８】
第2の局面において、本発明は、本発明のIRO化合物および生理学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００８９】
本発明のこの局面の態様において、該組成物は、さらに、免疫反応の特異性または大きさを増強する1またはそれ以上のワクチン、抗原、抗体、細胞毒性薬、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、TLRアゴニスト、TLRアンタゴニスト、ペプチド、タンパク質、遺伝子療法ベクター、DNAワクチン、アジュバント、またはキナーゼ阻害剤、または共刺激分子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、タンパク質リガンド、トランス活性化因子、ペプチド、および修飾アミノ酸含有ペプチドを含有することができる。
【００９０】
第3の局面において、本発明は、本発明のIRO化合物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における免疫反応のTLR介在性誘導を阻害または抑制する方法を提供するう。ある局面において、哺乳動物はヒトである。好ましい態様において、IRO化合物は免疫抑制を必要とする哺乳動物に投与される。
【００９１】
本発明のこの局面によれば、IRO化合物が、さらなるTLRリガンドまたはTLRアゴニストに対するTLRベースの免疫反応を抑制することができる。下記実施例でさらに説明するように、TLRアゴニストまたはTLRリガンド(例えば免疫刺激オリゴヌクレオチド)によるTLRベースの免疫反応の活性化は、IRO化合物の同時投与、前投与、または後投与により拮抗、阻害、抑制、または予防することができ、そのような拮抗、阻害、抑制、または予防は、投与後長時間(例えば数日間)維持されうる。本発明のこの有益な特性は、疾患または障害の予防および/または治療のために類のない長所を有する。例えば、病気の治療過程であるTLRアゴニストの適用は、IRO化合物が拮抗、抑制、阻害、または予防することができる望ましくない免疫刺激を引き起こすかもしれない。TLRアゴニストとの同時投与、前投与、および/または後投与によるIROの投与は、望ましくない副作用と拮抗、抑制、阻害、または予防しながら、TLRアゴニストの治療的利益をもたらし得る。さらに、本発明のIRO化合物の前投与はTLRアゴニスト、好ましくはTLR7および/またはTLR9アゴニストによる引き続く、または後のチャレンジに対する免疫反応(例えばアレルギー反応)と拮抗、抑制、阻害、または予防することもありうる。
【００９２】
本発明のこの局面の方法において、本発明のIRO化合物の投与は、限定されるものではないが、非経口的、粘膜送達、経口、舌下、経皮、局所的、吸入、胃内、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃による、皮膚パッチ、または点眼薬もしくは口内洗浄液の形を含むあらゆる適切な経路によることができる。IRO化合物の治療的組成物の投与は、その病気の症状または代用マーカーを減少させるのに有効な用量および期間で、既知の手順を用いて実施することができる。全身投与する場合は、該治療的組成物は、IRO化合物の血中濃度が約0.0001マイクロモル〜約100マイクロモルに達するのに充分な用量で投与するのが好ましい。より好ましくは、全身投与は、IRO化合物の血中濃度が約0.001マイクロモル〜約10マイクロモルに達するのに充分な用量で行われる。局所投与については、これよりはるかに低濃度で有効なことがあり、また、はるかに高い濃度が許容されうる。好ましくは、IRO化合物の総用量は、約0.001mg/患者/日〜約200mg/kg体重/日の範囲である。本発明のIRO化合物は、毎日、1日おき、2日おき、3日おき、4日おき、5日おき、6日おきに、または１週間に１回投与することが望ましいかもしれない。治療的有効量の本発明のIRO含有治療的組成物の１またはそれ以上を個体に単回投与として同時にまたは連続的に投与するのが望ましいかもしれない。
【００９３】
IRO化合物は、所望により、1またはそれ以上のアレルゲン、および/または抗原(自己または外来)、免疫原性タンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシニアン(KLH))、コレラ毒素Bサブユニット、または他の免疫原性担体タンパク質と結合させることができる。IROは、限定されるものではないが、TLRアゴニスト(例えばTLR2アゴニスト、TLR4アゴニストおよびTLR9アゴニスト)、フロインド不完全アジュバント、KLH、モノホスホリルリピッドA(MPL)、アラム、Merckアラムアジュバント(MAA)、サポニン（QS-21を含む）、イミクイモド（imiquimod）、またはその組み合わせを含む他の化合物(例えばアジュバント)と組み合わせて用いることもできる。
【００９４】
本発明のこの局面の方法は免疫系に関するモデル試験に有用である。該方法は、ヒトまたは動物の疾患の予防的または治療的処置にも有用である。例えば、該方法は、小児、成人、および獣医用ワクチン適用に有用である。
【００９５】
第4の局面において、本発明は、疾患または障害を有する患者を治療的に処置する方法であって、本発明のIRO化合物を該患者に投与することを含む方法を提供する。種々の態様において、治療すべき疾患または障害は、癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性障害、感染症、マラリア、ライム病、眼感染症、結膜炎、皮膚病、乾癬、強皮症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、慢性疲労症候群、サルコイドーシス、移植拒絶反応、アレルギー、喘息、または病原体に起因する疾患である。好ましい自己免疫障害には、限定されるものではないが、紅斑性狼瘡、多発性硬化症、I型糖尿病、過敏性大腸症候群、クローン病、リウマチ性関節炎、敗血症性ショック、全身性脱毛症、急性散在性脳脊髄炎、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、水疱性類天疱瘡、シャーガス病、慢性閉塞性肺疾患、小児脂肪便症、皮膚筋炎、子宮内膜症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン‐バレー症候群、橋本病、化膿性汗腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、限局性強皮症、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経ミオトニー、天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、統合失調症、シェーグレン症候群、側頭動脈炎(「巨細胞性動脈炎」)、脈管炎、白斑症、外陰部痛およびヴェグナー肉芽腫症が含まれる。好ましい炎症性障害には、限定されるものではないが、気道炎症、喘息、自己免疫性疾患、慢性炎症、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、ベーチェット病、過敏症、炎症性腸疾患、再潅流障害、リウマチ性関節炎、移植拒絶反応、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、結膜炎および脈管炎が含まれる。病原体には、細菌、寄生生物、真菌、ウイルス、ウイロイドおよびプリオンが含まれる。投与は、本発明の第3の局面で記載のごとく実施する。
【００９６】
第5の局面において、本発明は、本発明のIRO化合物を患者に投与することを含む、病気または障害を予防する方法を提供する。種々の態様において、予防すべき疾患または障害は、癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性障害、感染症、マラリア、ライム病、眼感染症、結膜炎、皮膚病、乾癬、強皮症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、慢性疲労症候群、サルコイドーシス、移植拒絶反応、アレルギー、喘息、または病原体に起因する疾患である。好ましい自己免疫障害には、限定されるものではないが、紅斑性狼瘡、多発性硬化症、I型糖尿病、過敏性大腸症候群、クローン病、リウマチ性関節炎、敗血症性ショック、全身性脱毛症、急性散在性脳脊髄炎、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、水疱性類天疱瘡、シャーガス病、慢性閉塞性肺疾患、小児脂肪便症、皮膚筋炎、子宮内膜症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン‐バレー症候群、橋本病、化膿性汗腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、限局性強皮症、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経ミオトニー、天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、統合失調症、シェーグレン症候群、側頭動脈炎(「巨細胞性動脈炎」)、脈管炎、白斑症、外陰部痛およびヴェグナー肉芽腫症
が含まれる。好ましい炎症性障害には、限定されるものではないが、気道炎症、喘息、自己免疫性疾患、慢性炎症、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、ベーチェット病、過敏症、炎症性腸疾患、再潅流障害、リウマチ性関節炎、移植拒絶反応、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、結膜炎および脈管炎が含まれる。病原体には、細菌、寄生生物、真菌、ウイルス、ウイロイドおよびプリオンが含まれる。投与は、本発明の第3の局面で記載のごとく実施する。
【００９７】
本発明の第3、第4、または第5の局面のあらゆる方法において、IRO化合物は、IRO化合物の免疫的アンタゴニスト、阻害、抑制、または予防効果または活性を無効にしない該疾患または障害の治療または予防に有用なあらゆる他の薬剤と組み合わせて投与することができる。本発明のあらゆる方法において、該疾患または障害の治療または予防に有用な薬剤には、限定されるものではないが、
免疫反応の特異性または大きさを増強する1またはそれ以上のワクチン、抗原、抗体、細胞毒性薬、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、TLRアゴニスト、TLRアンタゴニスト、ペプチド、タンパク質、遺伝子療法ベクター、DNAワクチン、アジュバント、またはキナーゼ阻害剤；または共刺激分子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、タンパク質リガンド、トランス活性化因子、ペプチドおよび修飾アミノ酸含有ペプチドが含まれる。例えば、癌治療において、IRO化合物は、1またはそれ以上の化学療法化合物、標的治療薬、および/またはモノクローナル抗体と組み合わせて投与することができると予期される。また、疾患の予防において、IRO化合物は1またはそれ以上のワクチンと組み合わせて投与することができると予期される。あるいはまた、該薬剤は、抗原またはアレルゲンをコードするDNAベクターを含むことができる。これらの態様において、本発明のIRO化合物は、アジュバントとして種々に作用し、直接免疫調節効果をもたらすことができる。
【００９８】
以下の実施例は、本発明のある典型的な態様をさらに示するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。例えば、代表的TLRリガンドを以下の実施例で示すが、本発明のIROがアンタゴニストとして作用するリガンドの範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００９９】
免疫調節部分を含むオリゴヌクレオチドの合成
本発明のIRO化合物はすべて標準手順により合成された(例えば米国特許公開公報No.20040097719を参照)。
【０１００】
オリゴヌクレオチドは、自動DNA合成装置(Expedite 8909；PerSeptive Biosystems、Framingham、Mass.)を用い、標準的線形合成またはパラレル合成手順に従って (例えば米国特許公開公報委No.20040097719の図5および6を参照) 1μMの規模で合成した。
【０１０１】
デオキシリボヌクレオシドホスホロアミダイトは(Aldrich-Sigma、St Louis、Mo)から得た。1',2'-ジデオキシリボースホスホロアミダイト、プロピル-1-ホスホロアミダイト、2-デオキシウリジンホスホロアミダイト、1,3-ビス-[5-(4,4'-ジメトキシトリチル)ペンチルアミジル]-2-プロパノールホスホロアミダイトおよびメチルホスホロアミダイトはGlen Research(Sterling、Va)から得た。β-L-2'-デオキシリボヌクレオシドホスホロアミダイト、α-2'-デオキシリボヌクレオシドホスホロアミダイト、モノ-DMT-グリセロールホスホロアミダイト、およびジ-DMT-グリセロールホスホロアミダイトはChemGenes(Willmington、Mass.)から得た。(4-アミノブチル)-1,3-プロパンジオールホスホロアミダイトはClontech(Palo Alto、Calif.)から得た。アラビノグアノシンは、Reliable Pharmaceutical(St. Louis, Mo.)から得た。アラビノグアノシンホスホロアミダイトは、Idera Pharmaceuticals, Inc.(Cambridge、Mass.)(Noronhaら(2000)Biochem、39:7050-7062)で合成された。
【０１０２】
ヌクレオシドホスホロアミダイトはすべて31Pおよび1HのNMRスペクトルによって特徴づけられた。修飾ヌクレオシドは、標準的カップリングサイクルを用いて、特定部位に組み込んだ。合成後、オリゴヌクレオチドは濃縮水酸化アンモニウムを用いて脱保護し、逆相HPLCによって精製し、次いで透析した。ナトリウム塩形の精製オリゴヌクレオチドは、使用前に凍結乾燥された。純度はCGEおよびMALDI-TOF MSによって試験した。
【実施例２】
【０１０３】
TLR7およびTLR9刺激の阻害
C57BL/6マウスの左の脇の下に、0時間に5mg/kgのIRO化合物を、24時間に0.25mg/kgのTLR9アゴニストまたは10mg/kgのTLR7アゴニストをs.c.注射した。血清サンプルを、TLR9またはTLR7アゴニスト注射の２時間後に得、IL-12濃度をELISAで測定した。IRO番号40については、TLR7およびTLR9アゴニストをIRO投与の72時間後に投与した。すべてのIROに関する結果を表4-11中に示す。これらの結果は、本発明のIRO化合物がTLR7および/またはTLR9活性をin vivoで阻害することができること、より一般的には、本発明のIRO化合物がTLR活性化を阻害することができることを示す。
【０１０４】
表4. マウスにおけるin vivoアンタゴニスト活性
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【０１０５】
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【０１０６】
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【０１０７】
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【０１０８】
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【０１０９】
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【０１１０】
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【０１１１】
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【０１１２】
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【実施例３】
【０１１３】
TLR7/TLR9 in vitroアンタゴニスト試験
C57BL/6マウスをこの試験に用いた。マウス脾細胞を、TLR7アゴニスト(200mg/ml)存在下、TLR9アゴニスト(1mg/ml)存在下、またはPBS存在下で、用量範囲0.3、1、5、10mg/ml(A)、または単回用量10mg/ml(B)のTLR7/TLR9アンタゴニストを24時間(37℃、5%CO2)培養した。上清を収集し、次いで、上清中でサイトカイン/ケモカイン反応をLuminex xMAPシステムを用いる多重分析により評価した。サンプルをデュプリケートで分析した(±SD)。結果を図3および4に示す。
【実施例４】
【０１１４】
TLR7/TLR9 in vivoアンタゴニスト試験
雌のC57BL/6マウス(2/群)の右脇腹に、0時に、1、5、または15mg/kgのアンタゴニスト化合物をs.c.注射した。次に、マウスの左脇腹に、24時に、TLR7アゴニスト(10mg/kg)、またはTLR9アゴニスト(0.25mg/kg)を注射した。アゴニスト投与2時間後に眼窩内出血により血液を収集した。次に、IL-12 ELISAにより血清サンプルを分析した。結果を図5および6に示す。
【０１１５】
さらに、雌のC57BL/6マウス(2/群)の右脇腹に、0時に、5mg/kgのアンタゴニスト化合物をs.c.注射した。次に、該マウスの左脇腹に、第1、2、4、9、および11日に、TLR7(10mg/kg)アゴニストを、または左歯面のうちの、第1、2、4、7、9、および11日にTLR9(0.25mg/kg)アゴニストを注射した。アゴニスト投与2時間後に眼窩内出血により血液を収集した。次に、IL-12 ELISAにより血清サンプルを分析した。結果を図7および8に示す。
【０１１６】
雌のC57BL/6マウス(2/群)の右脇腹に、0時に、5mg/kgのアンタゴニスト化合物をs.c.注射した。次に、該マウスの左脇腹に、24時に、TLR9アゴニスト(0.25mg/kg)またはTLR7アゴニスト(10mg/kg)を注射した。アゴニスト投与2時間後に眼窩内出血により血液を収集した。次に、血清サンプル中のサイトカイン/ケモカイン反応を、Luminex xMAPシステムを用いる多重分析により評価した。結果を図9に示す。
【０１１７】
最後に、雌のC57BL/6マウス(2/群)の右脇腹に、0時に、5mg/kgのアンタゴニスト化合物をs.c.注射した。次に、該マウスの左脇腹に、24時に、TLR3アゴニスト(10mg/kg) またはTLR5アゴニスト(0.25mg/kg)を注射した。アゴニスト投与2時間後に眼窩内出血により血液を収集した。次に、血清サンプル中のサイトカイン/ケモカイン反応を、Luminex xMAPシステムを用いる多重分析により評価した。結果を図10に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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