(57)【要約】  本発明は、癌を有するヒトを治療する方法であって、前記ヒト由来の少なくとも一つの第１のサンプルにおいてＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における少なくとも一つの突然変異または前記ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子によりコードされている少なくとも一つの変異型タンパク質を検出すること、および前記少なくとも一つのサンプルが少なくとも一つの変異型ＰＩ３Ｋタンパク質またはＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における突然変異を有する場合には、前記ヒトに有効量の２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩を医薬組成物として投与することを含んでなる方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を有するヒトを治療する方法であって、
前記ヒト由来の少なくとも一つの第１のサンプルから、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における少なくとも一つの突然変異または前記ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子によりコードされている少なくとも一つの変異型タンパク質を検出すること、ならびに
前記少なくとも一つのサンプルが、少なくとも一つの変異型ＰＩ３Ｋタンパク質またはＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における突然変異を有する場合には、前記ヒトに、有効量の２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩を医薬組成物として投与すること
を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における突然変異が体細胞突然変異である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における突然変異が、３１４０Ａ＞Ｇ、１６３３Ｇ＞Ａ、１６２４Ｇ＞Ａ、３１４０Ａ＞Ｔ、１６３４Ａ＞Ｃ、１６３４Ａ＞Ｇ、１６３６Ｃ＞Ａ、および３３３Ｇ＞Ｃから選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子によりコードされているタンパク質における少なくとも一つの突然変異が、Ｈ１０４７Ｌ、Ｈ１０４７Ｒ、Ｑ５４６Ｋ、Ｅ５４５Ａ、Ｍ１０４３Ｉ、Ｅ５４５Ｄ、Ｅ５４５Ｋ、Ｐ５３９Ｒ、Ｋ１１１Ｎ、Ｐ４４９Ｔ、およびＥ５４２Ｋから選択されるものである、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも一つの突然変異が、Ｈ１０４７Ｒ、Ｑ５４６Ｋ、Ｅ５４５Ａ、Ｍ１０４３Ｉ、Ｅ５４５Ｄ、Ｐ５３９Ｒ、およびＫ１１１Ｎから選択されるものである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記癌が、乳癌、結腸癌、腎細胞癌、肺癌、肝臓癌、膀胱癌、黒色腫、およびリンパ腫から選択されるものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも一つの第１のサンプルが、腫瘍サンプルまたは腫瘍細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ヒトが、３コピー以上のＨＥＲ２遺伝子を有する腫瘍を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ヒトが、５コピー以上のＨＥＲ２遺伝子を有する腫瘍を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヒトが、Ｈｅｒ２および／もしくはそのフラグメント、ならびに／またはＨｅｒ２をコードする遺伝子からのタンパク質を過剰発現する腫瘍を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプルがＫＲＡＳ遺伝子における突然変異を有さない、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヒト由来の少なくとも一つの第２のサンプルから、Ｒａｓタンパク質の突然変異の状態を決定することをさらに含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のサンプルと、第２のサンプルとが同じである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１のサンプルと、第２のサンプルとがどちらも腫瘍サンプルである、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１のサンプルと、第２のサンプルとが血液に由来する、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１のサンプルと、第２のサンプルとが異なる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｒａｓタンパク質がＫＲＡＳである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｒａｓタンパク質における突然変異が、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｒ  Ｅ７６Ｇ、Ｅ７６Ｋ、Ｅ７６Ｑ、およびＡ１４６Ｔから選択されるものである、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｒａｓタンパク質における突然変異が、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、およびＧ１３Ａから選択されるものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
癌を有する患者を治療する方法であって、
前記患者由来の少なくとも一つの腫瘍細胞におけるＨｅｒ２遺伝子の数および／または前記腫瘍細胞により発現されるＨｅｒ２／ｎｅｕ受容体の量を検出すること、ならびに
前記腫瘍細胞が３コピー以上のＨｅｒ２遺伝子を有する場合には、および／または前記腫瘍細胞が非腫瘍細胞よりも多い量のＨｅｒ２遺伝子産物を発現する場合には、治療上有効な量の２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩を医薬組成物として投与すること
を含んでなる、方法。
【請求項２１】
前記腫瘍細胞が、乳癌、膀胱癌、膵臓癌、肺癌、結腸癌、黒色腫、およびリンパ腫から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
癌を有するヒトを治療する方法であって、
（１）前記ヒト由来の少なくとも一つの腫瘍細胞に対し、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における少なくとも一つの突然変異に関して遺伝子型決定を行うこと、および
（２）ＰＩＫ３ＣＡにおける少なくとも一つの突然変異が検出される場合には、少なくとも１用量の２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩を医薬組成物として投与すること
を含んでなる、方法。
【請求項２３】
癌を有するヒトを治療する方法であって、
（１）それを必要とするヒトに抗新生物薬を投与すること、
（２）前記ヒト由来の少なくとも一つの腫瘍細胞に対し、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における少なくとも一つの突然変異に関して遺伝子型決定を行うこと、および
（２）ＰＩＫ３ＣＡにおける少なくとも一つの突然変異が検出される場合には、少なくとも１用量の２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩を医薬組成物として投与すること
を含んでなる、方法。
【請求項２４】
ＰＩＫ３ＣＡにおける少なくとも一つの突然変異の検出と、医薬組成物としての２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩に対する、癌に罹患している前記ヒトの高い反応の可能性とを相関させることをさらに含んでなる、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
（１）前記ヒト由来の少なくとも一つの腫瘍細胞に対し、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における少なくとも一つの突然変異に関して、およびＨｅｒ２遺伝子のコピー数に関して遺伝子型決定を行うこと、ならびに
（２）ＰＩＫ３ＣＡにおける少なくとも一つの突然変異が検出され、かつ少なくとも３コピーのＨｅｒ２遺伝子が検出された場合には、少なくとも１用量の２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩を医薬組成物として投与すること
を含んでなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
（１）前記ヒト由来の少なくとも一つの腫瘍細胞に対し、ＫＲａｓタンパク質における少なくとも一つの突然変異に関して遺伝子型決定を行うこと、
（２）前記Ｒａｓタンパク質における突然変異が検出されない場合には、少なくとも１用量の２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩を医薬組成物として投与すること
を含んでなる、請求項２２または２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＫＲａｓタンパク質の少なくとも一つの突然変異が、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、およびＧ１３Ａから選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも１用量の第２の抗新生物薬を投与することをさらに含んでなる、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
癌を有するヒトを治療する方法であって、
（１）それを必要とするヒトに１用量の抗新生物薬を投与すること、
（２）前記ヒト由来の少なくとも一つの腫瘍細胞に対し、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における少なくとも一つの突然変異に関して遺伝子型決定を行うこと、および
（３）ＰＩＫ３ＣＡにおける少なくとも一つの突然変異が検出された場合には、少なくとも１用量の２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩を医薬組成物として投与すること
を含んでなる、方法。
【請求項３０】
前記ヒトが腫瘍細胞において少なくとも一つの変異型ＰＩ３Ｋタンパク質における少なくとも一つの突然変異、またはＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における突然変異および／または少なくとも３コピー以上のＨｅｒ２遺伝子を有する場合には、ヒトの治療に対する高い反応の可能性と、少なくとも一つの、少なくとも１用量の２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミドまたは薬学的に許容可能な塩とを相関させる工程をさらに含んでなる、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
技術分野
本発明は、薬物の投与および癌患者を治療する方法に関する。
【０００２】
背景技術
拡大しつつある癌治療の標的療法の開発および使用は、鍵となる発癌経路、および標的とされるこれらの経路の摂動が臨床反応とどのように対応するかについての理解の高まりを表している。標的療法に対する有効性を予測することの難しさは、経路の調節解除（例えば、活性化突然変異、増幅）の原因機構について全体的な知識が限られているためであると思われる。前臨床の癌治療に対するトランスレーショナル・リサーチは、どの腫瘍の種類および遺伝子型が治療から利益を得る可能性が最も高いかを決定することに焦点を当てている。選択された患者集団を標的とすることは、療法の可能性を最大とする助けとなり得る。腫瘍モデルの前臨床細胞反応プロファイリングは、新規な癌療法の基礎となった。in vitro腫瘍モデルのコホートを用いた予測臨床有効性への努力が成功をもたらした（例えば、ＥＧＦＲ阻害剤は、ＥＧＦＲ変異を保有する腫瘍に選択的に有用である）。従って、多様な腫瘍由来細胞株の拡張パネルは、「希望者全員」の有効性治験を再現し、それにより、どの組織構造および特定の腫瘍遺伝子型が治療から利益を得る可能性が最も高いかを同定することができる。現在、多くの特異的分子量マーカーが、臨床状況下で、利益を得る可能性が最も高い患者を同定するために使用されている。例えば、in vitroにおいて、イマチニブは活性化されたＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子融合を有する細胞を選択的に死滅させるが(Carroll et al., 1997)、ラパチニブはＨｅｒ２過剰発現細胞の増殖を優先的に阻害する(Rusnak et al., 2007)。両方とも商業的成果を収め、これらの遺伝子異常を保有する腫瘍を有する患者に利益を与えた。
【０００３】
ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路は、ヒト癌において活性化されることが最も多い経路である。腫瘍形成および腫瘍進行におけるこの経路の機能および重要性は十分に立証されている(SamuelsおよびEricson. Curr. Opp in Oncology, 2006. 18: 77-82)。ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達は、細胞の生存、増殖および代謝の中枢的なモジュレーターであると思われる。これには、ＰＩ３Ｋタンパク質ファミリーのメンバーであり細胞増殖および翻訳の直接的なレギュレーターであるラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）の活性化が含まれる。従って、腫瘍におけるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達の調節解除は、無制限な生殖能およびアポトーシスの回避を含めた悪性腫瘍の数多くの顕著な特徴を示す細胞表現型に寄与する(HanahanおよびWeinberg, Cell. 2000. 100:57-70)。
【０００４】
この経路の活性化は受容体チロシンキナーゼの活性化により、またはＰＴＥＮ腫瘍サプレッサーの無活動により間接的に起こる場合が多い。また、ＰＩ３Ｋの直接的活性化は、ＰＩ３Ｋαのｐ１１０α触媒サブユニットをコードする遺伝子ＰＩＫ３ＣＡの活性化突然変異の結果であり得る。ＰＩＫ３ＣＡでは３つの「多発点」突然変異が同定されており、２つはらせんドメインＥ５４２ＫおよびＥ５４５Ｋに位置し、一つはキナーゼドメインＨ１０４７Ｒに位置する。ＰＩＫ３ＣＡに見られるこれらおよびその他の突然変異は、ＰＩ３Ｋαの脂質キナーゼ活性を活性化し、シグナル伝達経路の活性化を誘導し、および培養細胞の形質転換を促進することが示されている。Ｈｅｒ２（ＥＲＢＢ２としても知られる）は、細胞膜表面結合受容体チロシンキナーゼであり、上皮細胞増殖因子受容体ファミリーのメンバーである。機能的には、Ｈｅｒ２は細胞増殖および分化を調節するシグナル伝達経路の成分である。癌原遺伝子Ｈｅｒ２は乳癌の約１５〜２０％で活性化され、他の発現経路の中でもＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達の上流アクチベーターであることも知られている。
【０００５】
２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミド（以下、化合物Ｂ）、またはその薬学的に許容可能な塩は、その薬学的に許容可能な塩とともに、特に癌の治療においてＰＩ３Ｋ活性の阻害剤として有用であることが、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６３８１９号（国際出願日２００８年５月１６日）、国際公開第ＷＯ２００８／１４４４６３号（国際公開日２００８年１１月２７日）に開示され、特許請求されている（化合物Ｂは、実施例３４５の化合物である）。これらの公報の開示内容は、引用することにより、本明細書の開示の一部とされる。化合物Ｂは、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６３８１９号に記載の通りに製造することができる。
【０００６】
化合物Ｂは、新規な癌治療としてヒトで試験されている。化合物Ｂに反応する可能性のより高い遺伝子型を同定することが望ましい。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、癌を有するヒトを治療する方法であって、前記ヒト由来の少なくとも一つの第１のサンプルから、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における少なくとも一つの突然変異または前記ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子によりコードされている少なくとも一つの変異型タンパク質を検出すること、ならびに前記少なくとも一つのサンプルが少なくとも一つの変異型ＰＩ３Ｋタンパク質またはＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における突然変異を有する場合には、前記ヒトに有効量の２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩を医薬組成物として投与することを含んでなる方法を提供する。
【発明の具体的説明】
【０００８】
本発明はまた、癌を有するヒトを治療する方法であって、前記ヒト由来の少なくとも一つの第１のサンプルから、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における少なくとも一つの突然変異または前記ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子によりコードされている少なくとも一つの変異型タンパク質を検出すること、および前記少なくとも一つのサンプルが少なくとも一つの変異型ＰＩ３Ｋタンパク質またはＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における突然変異を有する場合には、前記ヒトに有効量の２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩を医薬組成物として投与することを含んでなる方法を提供する。
【０００９】
本発明はまた、前記ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における突然変異が体細胞突然変異である、上記方法に関する。
【００１０】
本発明はまた、前記ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における突然変異が、３１４０Ａ＞Ｇ、１６３３Ｇ＞Ａ、１６２４Ｇ＞Ａ、３１４０Ａ＞Ｔ、１６３４Ａ＞Ｃ、１６３４Ａ＞Ｇ、１６３６Ｃ＞Ａ、および３３３Ｇ＞Ｃから選択される、上記方法のいずれか一つの関する。
【００１１】
本発明はまた、前記ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子によりコードされているタンパク質における少なくとも一つの突然変異がＨ１０４７Ｌ、Ｈ１０４７Ｒ、Ｑ５４６Ｋ、Ｅ５４５Ａ、Ｍ１０４３Ｉ、Ｅ５４５Ｄ、Ｅ５４５Ｋ、Ｐ５３９Ｒ、Ｋ１１１Ｎ、Ｐ４４９Ｔ、およびＥ５４２Ｋから選択される、上記方法のいずれか一つに関する。
【００１２】
一実施形態では、前記少なくとも一つの突然変異は、Ｈ１０４７Ｒ、Ｑ５４６Ｋ、Ｅ５４５Ａ、Ｍ１０４３Ｉ、Ｅ５４５Ｄ、Ｐ５３９Ｒ、およびＫ１１１Ｎから選択される。
【００１３】
一実施形態では、前記癌は乳癌、結腸癌、腎細胞癌(reno cell carcinoma)、肺癌、肝臓癌、膀胱癌、黒色腫癌、およびリンパ腫から選択される。
【００１４】
一実施形態では、前記少なくとも一つの第１のサンプルは、腫瘍サンプルまたは腫瘍細胞である。
【００１５】
一実施形態では、前記ヒトは、３コピー以上のＨＥＲ２遺伝子を有する腫瘍を有する。
【００１６】
一実施形態では、前記ヒトは、５コピー以上のＨＥＲ２遺伝子を有する腫瘍を有する。
【００１７】
一実施形態では、前記ヒトは、Ｈｅｒ２および／またはそのフラグメントおよび／またはＨｅｒ２をコードする遺伝子由来のタンパク質を過剰発現する腫瘍を有する。
【００１８】
一実施形態では、前記サンプルは、ＫＲＡＳ遺伝子における突然変異を有さない。
【００１９】
一実施形態では、前記方法は、前記ヒト由来の少なくとも一つの第２のサンプルから、Ｒａｓタンパク質の突然変異の状態を決定することをさらに含んでなる。
【００２０】
一実施形態では、前記第１のサンプルと第２のサンプルは同じである。
【００２１】
一実施形態では、前記第１のサンプルと第２のサンプルはどちらも腫瘍サンプルである。
【００２２】
一実施形態では、前記第１のサンプルと第２のサンプルは血液由来である。
【００２３】
一実施形態では、前記第１のサンプルと第２のサンプルは異なる。
【００２４】
一実施形態では、前記Ｒａｓタンパク質はＫＲＡＳである。
【００２５】
一実施形態では、前記Ｒａｓタンパク質における突然変異は、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｒ  Ｅ７６Ｇ、Ｅ７６Ｋ、Ｅ７６Ｑ、およびＡ１４６Ｔから選択される。
【００２６】
一実施形態では、前記Ｒａｓタンパク質における突然変異は、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、およびＧ１３Ａから選択される。
【００２７】
本発明はまた、癌を有する患者を有する方法であって、前記患者少なくとも一つの腫瘍細胞におけるＨｅｒ２遺伝子の数および／または前記腫瘍細胞のより発現されるＨｅｒ２／ｎｅｕ受容体の量を検出すること、および前記腫瘍細胞が３コピー以上のＨｅｒ２遺伝子を有する場合には、かつ／または前記腫瘍細胞が非腫瘍細胞よりも多い量のＨｅｒ２遺伝子産物を発現する場合には、治療上有効な量の２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩を医薬組成物として投与することを含んでなる方法に関する。
【００２８】
一実施形態では、前記腫瘍細胞は、乳癌、膀胱癌、膵臓癌、肺癌、結腸癌、黒色腫およびリンパ腫から選択される。
【００２９】
本発明はまた、癌を有するヒトを治療する方法であって、（１）前記ヒト由来の少なくとも一つの腫瘍細胞に対し、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における少なくとも一つの突然変異に関して遺伝子型決定を行うこと、および（２）ＰＩＫ３ＣＡにおける少なくとも一つの突然変異が検出される場合には、少なくとも１用量の２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩を医薬組成物として投与することを含んでなる方法に関する。
【００３０】
本発明はまた、癌を有するヒトを治療する方法であって、（１）それを必要とするヒトに抗新生物薬を投与すること、（２）前記ヒト由来の少なくとも一つの腫瘍細胞に対し、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における少なくとも一つの突然変異に関して遺伝子型決定を行うこと、および（２）ＰＩＫ３ＣＡにおける少なくとも一つの突然変異が検出される場合には、少なくとも１用量の２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩を医薬組成物として投与することを含んでなる方法に関する。
【００３１】
一実施形態では、前記方法は、ＰＩＫ３ＣＡにおける少なくとも一つの突然変異の検出と、医薬組成物としての２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩に対する、癌に罹患している前記ヒトの高い反応の可能性とを相関させることをさらに含んでなる。
【００３２】
本発明はまた、（１）前記ヒト由来の少なくとも一つの腫瘍細胞に対し、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における少なくとも一つの突然変異に関して、およびＨｅｒ２遺伝子のコピー数に関して遺伝子型決定を行うこと、ならびに（２）ＰＩＫ３ＣＡにおける少なくとも一つの突然変異が検出され、かつ、少なくとも３コピーのＨｅｒ２遺伝子が検出される場合には、少なくとも１用量の２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩を医薬組成物として投与することを含んでなる方法に関する。
【００３３】
本発明はまた、（１）前記ヒト由来の少なくとも一つの腫瘍細胞に対し、ＫＲａｓタンパク質における少なくとも一つの突然変異に関して遺伝子型決定を行うこと、（２）前記Ｒａｓタンパク質における突然変異が検出さない場合には、少なくとも１用量の２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩を医薬組成物として投与することをさらに含んでなる、上記方法のいずれか一つに関する。
【００３４】
一実施形態では、前記ＫＲａｓタンパク質の少なくとも一つの突然変異は、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、およびＧ１３Ａから選択される。
【００３５】
本発明はまた、少なくとも１用量の第２の抗新生物薬を投与することをさらに含んでなる、上記方法のいずれか一つに関する。
【００３６】
本発明はまた、癌を有するヒトを治療する方法であって、（１）それを必要とするヒトに１用量の抗新生物薬を投与すること、（２）前記ヒト由来の少なくとも一つの腫瘍細胞に対し、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における少なくとも一つの突然変異に関して遺伝子型決定を行うこと、および（３）ＰＩＫ３ＣＡにおける少なくとも一つの突然変異が検出される場合には、少なくとも１用量の２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩を医薬組成物として投与することを含んでなる方法に関する。
【００３７】
本発明はまた、前記ヒトが腫瘍細胞において少なくとも一つの変異型ＰＩ３Ｋタンパク質における少なくとも一つの突然変異、またはＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における突然変異および／または少なくとも３コピー以上のＨｅｒ２遺伝子を有する場合には、ヒトの治療に対する高い反応の可能性と、少なくとも一つの、少なくとも１用量の２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミドまたは薬学的に許容可能な塩とを相関させる工程をさらに含んでなる、上記方法のいずれか一つに関する。
【００３８】
定義
当技術分野で理解されるように用語「野生型」は、遺伝子改変のない、または所与の遺伝子座に関して二倍性（２ｎ）状態の、天然集団に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列を意味する。患者が３コピー以上の遺伝子を有する場合の二倍体からの逸脱は「増幅」とみなされる。これもまた当技術分野で理解されるように、「変異体」は、それぞれ野生型ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに見られる対応するアミノ酸または核酸と比較して、アミノ酸または核酸に少なくとも一つの改変を有するポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列を含む。変異体という用語には、最も高頻度に見られる（野生型）核酸鎖に比べて、核酸鎖の配列に塩基対の違いが一つだけ存在する一塩基多型（ＳＮＰ）が含まれる。本明細書において「遺伝子改変」または「遺伝的に改変される」とは、限定されるものではないが、ＤＮＡ配列の１以上の塩基に対する抑制、置換、増幅、欠失、および／または挿入を意味する。また、本明細書において、「遺伝的に改変される」とは、それぞれ核酸またはアミノ酸の少なくとも一つの欠失、置換または抑制を有するポリペプチドまたはポリペプチドをコードする遺伝子を意味し得る。
【００３９】
遺伝子変異体および／またはＳＮＰは、既知の方法によって同定することができる。例えば、野生型またはＳＮＰは、ＤＮＡ増幅とシーケンシング技術、ＤＮＡおよびＲＮＡ検出技術（限定されるものではないが、それぞれノーザンおよびサザンブロットを含む）、および／または種々のバイオチップおよびアレイ技術によって同定することができる。ＷＴ型および変異型ポリペプチドは、限定されるものではないが、ＥＬＩＳＡなどの免疫診断技術、ウエスタンブロットまたは免疫組織化学を含む種々の技術によって検出することができる。腫瘍細胞におけるＤＮＡ増幅は、ＰＣＲに基づく方法などの定量的ＤＮＡ検出技術によって同定することができる。さらに、マイクロアレイに基づく方法を用いてＤＮＡ増幅を評価することもできる。これらには、マイクロアレイに基づく比較ゲノムハイブリダイゼーション(Greshock, J., et al. 2004. Genome Res 14: 179-87)およびＤＮＡ「ＳＮＰチップ」(Bignell, G. R., et al. 2004 Genome Res 14: 287-95)が含まれる。
【００４０】
本明細書において、対立遺伝子または多型を検出する工程は、限定されるものではないが、血清学的方法および遺伝学的方法が含まれる。検出された対立遺伝子または多型は、個々の表現型を左右する上で機能的に関連づけられるものかもしれないし、または機能的多型／対立遺伝子と連鎖不平衡にある対立遺伝子または多型であるかもしれない。多型／対立遺伝子は被験体のゲノムＤＮＡにおいて証明されるが、当業者には自明であるように、ＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはこの領域から転写または翻訳されたタンパク質配列からも検出可能である。
【００４１】
遺伝学で周知のように、同じ遺伝子の異なる供給源から得られたヌクレオチドおよび関連のアミノ酸配列は、ナンバリングスキームも正確な配列も異なる場合がある。このような違いはナンバリング法、遺伝子内の固有の配列変動、および／またはシーケンシングエラーによるものであり得る。従って、本明細書で特定の多型部位を番号で示す場合、当業者ならば、それらを記載するのに異なるナンバリング法／命名法が用いられていても、その遺伝子内の配列および位置に相当する多型部位を含むことを理解するであろう。
【００４２】
本明細書において被験体（またはＤＮＡもしくは他の生体サンプル）を、ある遺伝子の多型対立遺伝子、または少なくとも一つのポリペプチドもしくは少なくとも一つのポリペプチドをコードする遺伝子における突然変異に関して「遺伝子型決定」するとは、その遺伝子または遺伝子発現産物（例えば、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはタンパク質）のどの変異型、対立遺伝子型または多型が被験体（またはサンプル）に存在するか、または存在しないかを検出すること意味する。このような遺伝子から発現された関連するＲＮＡまたはタンパク質も、突然変異体または多型バリエーションの検出に使用可能である。当技術分野で周知のように、ある個体は、ある特定の対立遺伝子に関して異型接合性であるか同型接合性であり得る。３以上の対立遺伝子型が存在する場合もあり、従って、４通り以上の遺伝子型が存在し得る。本明細書において、対立遺伝子は、他の対立遺伝子変異体の可能性が排除された場合に「検出」することができ、例えば、特定の核酸の位置がアデニン（Ａ）でもチミン（Ｔ）でもまたはシトシン（Ｃ）でもないと分かった場合に、その位置にはグアニン（Ｇ）が存在すると結論付けることができる（すなわち、被験体においてＧが「検出」または「診断」される）。配列バリエーションは、直接（例えば、シーケンシングによる）、または間接的に（例えば、制限断片長多型分析、または既知配列のプローブのハイブリダイゼーション検出、または参照鎖コンフォメーション多型による）、または他の既知の方法を用いて検出することができる。
【００４３】
本明細書において、ある集団の「遺伝学的サブセット」は、特定の遺伝子型、または少なくとも一つの体細胞突然変異を有する腫瘍を有する集団のメンバーからなる。二対立遺伝子多型の場合、集団は、可能性として、次の３つのサブセット：対立遺伝子１に関して同型接合（１，１）、異型接合（１，２）、および対立遺伝子２に関して同型接合（２，２）に分類することができる。被験体の「集団」は、例えば、化合物Ｂで処置されている個体または癌を有する個体などの種々の判定基準を用いて定義することができる。いくつかの場合では、集団の遺伝学的サブセットは、別の遺伝学的サブセットに比べて治療に対する高い反応の可能性を持ち得る。例えば、ＨＥＲ２遺伝子の増幅を有する癌患者の遺伝学的サブセットは、その増幅を持たないサブセットよりも化合物Ｂによる治療に対して高い反応割合を持ち得るかもしれない。別の例では、特定の遺伝子型を有する患者は、特定の表現型応答の高いリスクまたは低いリスクを示し得るかもしれない。
【００４４】
本明細書において、遺伝子型決定に基づいて特定の表現型応答に「素因がある」または「高いリスクがある」被験体は、標的多型遺伝子座（または複数の遺伝子座）において異なる遺伝子型を有する個体よりもその表現型を示す可能性が高い。表現型応答が複数の対立遺伝子多型、または２以上の遺伝子の遺伝子型決定に基づく場合、相対的リスクはその複数の遺伝子型の中で異なるものであり得る。
【００４５】
本明細書において治療に対する「反応」およびその派生語は、限定されるものではないが、患者が投薬を受けた後の患者の臨床病態の改善を含む。反応は、患者の病態が治療の開始時よりも悪化しないことも意味し得る。反応は疾患または障害のある特定の顕在化の測定によって定義され得る。癌に関して、反応は、限定されるものではないが、患者の腫瘍および／または腫瘍細胞のサイズの縮小または数の減少を意味し得る。反応は、患者の前腫瘍細胞の数の減少または減弱などの他のエンドポイントによって定義することもできる。
【００４６】
本明細書において「遺伝子検査」（遺伝子スクリーニングとも呼ばれる）は、被験体の遺伝子型を決定するための被験体由来の生体サンプルの検査を意味し、被験体の遺伝子型が、特定の表現型を生じるかもしくはそれに対する感受性を高める（または対立遺伝子との連鎖不平衡にありその表現型を生じるかもしくはそれに対する感受性を高める）対立遺伝子を含んでなるか否かを決定するために使用可能である。
【００４７】
１以上の突然変異の検査のための生体サンプルは、タンパク質、ヌクレオチド、細胞ブレブまたは成分、血清、細胞、血液、血液成分（循環腫瘍ＤＮＡなど）、尿および唾液の群から選択され得る。突然変異に関する検査は、当技術分野で公知の、かつ／または本明細書に記載のいくつかの技術によって行うことができる。
【００４８】
遺伝子もしくはＰＣＲ産物、またはその断片もしくは一部を含む任意の核酸の配列は、当技術分野で公知の任意の方法（例えば、化学的シーケンシングまたは酵素的シーケンシング）によって配列決定することができる。ＤＮＡの「化学的シーケンシング」は、Maxam and Gilbert (1977) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560) に記載方法などを表し、この方法では、個々の塩基特異的反応を用いてＤＮＡがランダムに切断される。ＤＮＡの「酵素的シーケンシング」は、Sanger (Sanger, et al., (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463)に記載の方法などをもちい得る。
【００４９】
従来の分子生物学、微生物学、およびシーケンシング技術を含む組換えＤＮＡ技術は、当業者に周知である。このような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (本明細書では「Sambrook, et al., 1989」); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D. N. Glover編 1985);オリゴヌクレオチド合成(M. J. Gait ed. 1984);核酸ハイブリダイゼーション(B. D. Hames & S. J. Higgins編(1985));転写および翻訳(B. D. Hames & S. J. Higgins編(1984));動物細胞培養(R. I. Freshney編(1986));固定化細胞および酵素(IRL Press, (1986)); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984) ; F. M. Ausubel, et al. (編), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)参照。
【００５０】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）親和性アッセイは、従来のハイブリダイゼーションアッセイの派生型である(Nielsen et al., Science 254:1497-1500 (1991); Egholm et al., J. Am. Chem. Soc. 114:1895-1897 (1992); James et al., Protein Science 3:1347-1350 (1994))。ＰＮＡは、ワトソン−クリックの塩基対形成の法則に従う構造的ＤＮＡミミックであり、標準的ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイで使用される。ＰＮＡ／ＤＮＡのミスマッチはＤＮＡ／ＤＮＡのミスマッチよりも不安定であり、相補的ＰＮＡ／ＤＮＡ鎖は相補的ＤＮＡ／ＤＮＡ鎖よりも強い結合する形成するので、ＰＮＡはハイブリダイゼーションアッセイにおいてより高い特異性を示す。
【００５１】
ＤＮＡマイクロアレイは、遺伝子バリエーション、多型および細胞遺伝学的変化（例えば、ＤＮＡ増幅および欠失）を検出するために開発された(Taton et al., Science 289:1757-60, 2000; Lockhart et al., Nature 405:827-836 (2000); Gerhold et al., Trends in Biochemical Sciences 24:168-73 (1999); Wallace, R. W., Molecular Medicine Today 3:384-89 (1997); Blanchard and Hood, Nature Biotechnology 149:1649 (1996); (Greshock, J., et al. 2004. Genome Res 14: 179-87; Bignell, G. R., et al. 2004 Genome Res 14: 287-95))。ＤＮＡマイクロアレイは、ガラスまたはナイロン基板上に高速ロボットによって形成され、既知の属性を有するＤＮＡ断片（「プローブ」）を含む。マイクロアレイは、既知のＤＮＡ断片とおよび未知のＤＮＡ断片（「標的」）を照合するために使用される。
【００５２】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は互換的に用いられ、本明細書においては、一般用語として天然タンパク質、断片、ペプチド、またはポリペプチド配列の類似体を指して用いられる。従って、天然タンパク質、断片、および類似体はポリペプチド類の種類である。
【００５３】
ポリペプチド配列の突然変異に関して「Ｘ＃Ｙ」という表記は当技術分野で認知されており、ここで、「＃」は、突然変異の位置をそのポリペプチドのアミノ酸番号で示し、「Ｘ」は、野生型アミノ酸配列においてその位置に見られるアミノ酸を示し、「Ｙ」は、その位置における変異アミノ酸を示す。例えば、Ｋ−ｒａｓポリペプチドに関して「Ｇ１２Ｓ」の表記は、野生型Ｋ−ｒａｓ配列のアミノ酸番号１２にはグリシンが存在し、そのグリシンが変異型Ｋ−ｒａｓ配列ではセリンに置換されていることを示す。
【００５４】
ポリペプチドまたはポリペプチドをコードする遺伝子における用語「少なくとも一つの突然変異」およびその派生語は、対立遺伝子変異体、スプライス変異体、誘導変異体、置換変異体、欠失変異体、および／または挿入変異体、融合ポリペプチド、相同分子種、および／または種間同族体のうち１以上を有するポリペプチドまたはポリペプチドをコードする遺伝子を意味する。例として、ＰＩＫ３ＣＡの少なくとも一つの突然変異は、細胞内で産生される少なくとも一つのＰＩＫ３ＣＡタンパク質について、ポリペプチドまたはそのポリペプチドをコードする遺伝子全配列のうち一部がその細胞には存在しないか、または発現されないＰＩＫ３ＣＡを含む。例えば、ＰＩＫ３ＣＡタンパク質は、末端切断型で細胞により産生されてもよく、その末端切断型の配列は、その末端切断部の配列について野生型であってよい。欠失は、遺伝子または遺伝子によりコードされているタンパク質の全部または一部が存在しないことを意味し得る。さらに、細胞内で発現される、または細胞によりコードされるタンパク質のうちあるものは突然変異型であり得、同じ細胞内で産生される同じタンパク質の他のコピーは野生型であり得る。
【００５５】
本明細書において「遺伝子の異常」は、欠失、置換、付加、転座、被験体の細胞の通常の天然核酸含量に比べての増幅などを意味する。用語「突然変異体ＰＩＫ３ＣＡ」および「ＰＩＫ３ＣＡ突然変異体」は、少なくとも一つの突然変異を有するＰＩＫ３タンパク質を意味する。特定の実施形態では、突然変異には、限定されるものではないが、アミノ酸Ｈ１４０７、Ｅ５４５、Ｐ５３９、Ｐ４４９およびＥ５４２における突然変異が含まれ、限定されるものではないが、Ｈ１４０７Ｌ、Ｈ１４０７Ｒ、Ｅ５４５Ｋ、Ｐ５３９Ｒ、Ｐ４４９Ｔ、およびＥ５４２Ｋが挙げられる。特定の例示的変異型ＰＩＫ３ＣＡポリペプチドとしては、限定されるものではないが、対立遺伝子変異体、スプライス変異体、誘導変異体、置換変異体、欠失変異体、および／または挿入変異体、融合ポリペプチド、相同分子種、および種間同族体が挙げられる。特定の実施形態では、変異型ＰＩＫ３ＣＡポリペプチドは、Ｃ末端またはＮ末端に、限定されるものではないが、リーダー配列残基、ターゲティング残基、アミノ末端メチオニン残基、リシン残基、タグ残基および／または融合タンパク質残基などの付加的残基を含む。
【００５６】
本明細書において用語「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのいずれか、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの改変型である、少なくとも１０塩基長のヌクレオチドの高分子形態を意味する。この用語には、一本鎖型および二本鎖型のＤＮＡが含まれる。
【００５７】
本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド」は、天然型および非天然型オリゴヌクレオチド結合によって相互連結された天然型および改変型ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、一般に２００塩基長以下を含んでなるポリヌクレオチドサブセットである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、１０〜６０塩基長であり、最も好ましくは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０〜４０塩基長を含む。オリゴヌクレオチドは、通常一本鎖であるが（例えば、プローブの場合）、オリゴヌクレオチドは二本鎖であってもよい（例えば、遺伝子変異体の構築に用いる場合）。オリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかであり得る。
【００５８】
オリゴヌクレオチドプローブ、またはプローブは、一般に約８ヌクレオチド長〜数百ヌクレオチド長の範囲の大きさの核酸分子である。このような分子は一般に、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で核酸配列とハイブリダイズすることにより、サンプルにおいてそのような標的核酸配列を同定するために使用される。ハイブリダイゼーション条件は、上記に詳細に記載されている。
【００５９】
ＰＣＲプライマーは核酸配列でもあるが、ＰＣＲプライマーは一般に、ポリメラーゼ連鎖反応に使用されるかなり短いオリゴヌクレオチドである。ＰＣＲプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブは、当業者ならば、標的配列からの配列情報を用いて、容易に開発および作製することができる（例えば、Sambrook et al., 前掲またはGlick et al., 前掲参照）。
【００６０】
用語「増幅」およびその派生語は、染色体相補物に１以上の余分な遺伝子コピーが存在することを意味する。本明細書において、ＨＥＲ２遺伝子は、細胞内に３コピー以上の遺伝子が存在すれば、おそらく増幅されている。同様に、増幅はまた、細胞内に３、４、５、６またはそれを超える遺伝子コピーも含む。ＨＥＲ２遺伝子の増幅は乳癌で頻繁であることが見出されており、胃癌などの他の腫瘍タイプでも生じていることが示されている。Semba et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:6497-6501 (1985); Yokota et al., Oncogene, 2:283-287 (1988); Zhou et al., Cancer Res., 47:6123-6125 (1987); King et al., Science, 229:974-976 (1985); Kraus et al., EMBO J., 6:605-610 (1987); van de Vijver et al., Mol. Cell. Biol., 7:2019-2023 (1987); Yamamoto et al., Nature, 319:230-234 (1986)。
【００６１】
用語「ＨＥＲ２が増幅された」および「増幅されたＨＥＲ２」とは、１７ｑ２１−ｑ２２にマッピングされる、通常（２コピー）を超えるＨＥＲ２遺伝子座を有する状態を意味する。ＨＥＲ２の増幅はまた、隣接する遺伝子（例えば、ＧＲＢ７）も含み得る。また、増幅は様々な規模であってよく、３コピーを有する細胞ならびに２０コピーを超える細胞などがある。
【００６２】
本明細書において、「過剰発現される」および「過剰発現」ならびにその派生語は、所与の細胞がある特定のタンパク質を正常細胞に比べて多数産生することを意味する。例えば、いくつかの腫瘍細胞は、正常乳房組織由来の細胞に比べて細胞表面でＨｅｒ２またはＥｒｂ２を過剰発現することが知られている。遺伝子導入実験では、ＨＥＲ２の過剰発現がＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を形質転換し、また、毒性マクロファージサイトカイン腫瘍壊死因子に対する耐性の増強をもたらすことが示されている。Hudziak et al., "Amplified Expression of the HER2/ERBB2 Oncogene Induces Resistance to Tumor Necrosis Factor Alpha in NIH 3T3 Cells", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5102-5106 (1988)。特定の細胞におけるポリペプチドの発現レベルは、限定されるものではないが、細胞ゲノム内の種々の調節エレメントおよび／または非コード配列の突然変異、欠失、および／または置換によって達成され得る。
【００６３】
本明細書において、「治療」は、その障害に関連する１以上の症状が有益に変更される任意の様式を意味する。従って、この用語は、その障害の症状もしくは副作用の治癒もしくは改善、またはその障害の進行の減速を含む。
【００６４】
本明細書において、用語「癌」、「新生物」、および「腫瘍」は互換的に用いられ、単数形または複数形のいずれかで、宿主生物に対して病的となる悪性化を受けた細胞を意味する。原発性癌細胞（すなわち、悪性化部位の近傍から得られた細胞）は、十分確立された技術、特に、組織学的検査によって非癌性細胞から容易に識別することができる。本明細書において、癌細胞の定義には、原発性癌細胞を含むだけでなく、癌細胞祖先に由来するいずれの細胞も含む。これには、転移癌細胞、ならびに癌細胞に由来するin vitro培養物および細胞株が含まれる。通常固形腫瘍として顕在化する癌のタイプに関していう場合、「臨床的に検出可能な」腫瘍は、例えば、ＣＡＴスキャン、ＭＲ画像、Ｘ線、超音波もしくは触診などの手段により、腫瘍塊に基づいて検出可能なもの、および／または患者から取得可能なサンプルにおける１以上の癌特異的抗原の発現によって検出可能なものである。腫瘍は、造血系腫瘍、例えば、血液細胞などの腫瘍であり得る。このような腫瘍に基づく臨床病態の具体例としては、慢性骨髄球性白血病または急性骨髄球性白血病などの白血病；多発性骨髄腫などの骨髄腫；リンパ腫などを含む。
【００６５】
いくつかの実施形態では、生体サンプルは、腫瘍細胞を含む細胞、血液、血液成分、尿、および唾液からなる群から選択される。
【００６６】
いくつかの実施形態では、生体サンプルは、腫瘍細胞、細胞、血液、血液成分、尿、および唾液からなる群から選択される。
【００６７】
化合物Ｂ、ならびにその薬学的に許容可能な塩および溶媒和物はそのままの化学物質として投与することもできるが、有効成分を医薬組成物として提供することもできる。よって、本発明の実施形態は、治療上有効な量の化合物Ｂと１以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む医薬組成物をさらに提供する。担体、希釈剤、または賦形剤は、処方物の他の成分と適合し、かつ、そのレシピエントに害がないという点で許容されるものでなければならない。本発明の別の態様によれば、化合物Ｂを１以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤と混合することを含む、医薬処方物の製造方法も提供される。
【００６８】
医薬処方物は、単位用量当たりに所定量の有効成分を含有する単位投与形で提供してもよい。このような単位は、治療される病態、投与経路、ならびに患者の年齢、体重および状態に応じて例えば、０．５ｍｇ〜１ｇ、好ましくは１ｍｇ〜８００ｍｇの化合物Ｂの化合物を含有し得る。好ましい単位投与処方物は、有効成分の１日用量もしくは部分用量（本明細書の上記に挙げた通り）、またはその適当な分数を含有するものである。さらに、このような医薬処方物は、製薬分野で周知の任意の方法によって製造することができる。
【００６９】
医薬処方物は、例えば、経口（頬側または舌下を含む）、直腸、鼻腔、局所（頬側、舌下または経皮を含む）、膣または非経口（皮下、筋肉内、静脈内または皮内を含む）経路によるなどの任意の適当な経路による投与に適合させることができる。このような処方物は、例えば、有効成分を担体または賦形剤と会合させることによるなどの、製薬分野で公知の任意の方法によって製造することができる。
【００７０】
経口投与に適合した医薬処方物は、カプセル剤もしくは錠剤；散剤もしくは顆粒剤；水性もしくは非水性液中の溶液もしくは懸濁液；可食泡沫もしくはホイップ；または水中油型液体エマルションもしくは油中水型液体エマルションなどの個別単位として製造することができる。
【００７１】
例えば、錠剤またはカプセル剤の形態の経口投与のためには、有効薬物成分を経口用で無毒の薬学的に許容可能な不活性担体、例えば、エタノール、グリセロール、水などと合わせることができる。散剤は、前記化合物を好適な微細なサイズに粉砕し、同様に粉砕した医薬担体、例えば、デンプンまたはマンニトールなどの可食炭水化物と混合することによって製造される。着香剤、保存剤、分散剤および着色剤も存在してよい。
【００７２】
カプセル剤は、上記のような粉末混合物を調製し、形成済みのゼラチン剤皮に充填することによって製造される。充填操作前の粉末混合物にコロイドシリカ、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムまたは固体ポリエチレングリコールなどの流動促進剤および滑沢剤を加えることができる。カプセル剤が服用された際に薬剤の利用率を高めるために、崩壊剤または可溶化剤、例えば、寒天、炭酸カルシウムまたは炭酸ナトリウムを加えることもできる。
【００７３】
さらに、この混合物中に、所望のまたは必要な、好適な結合剤、滑沢剤、崩壊剤、および着色剤を配合することもできる。好適な結合剤としては、デンプン、ゼラチン、天然糖（グルコースまたはβ−ラクトースなど）、トウモロコシ甘味剤、天然および合成ガム（アラビアガム、トラガカントガムまたはアルギン酸ナトリウムなど）、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックスなどが挙げられる。これらの投与形に使用される滑沢剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウ、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。崩壊剤としては、限定されるものではないが、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムなどが挙げられる。錠剤は、例えば、粉末混合物を調製し、造粒またはスラッグ化を行い、滑沢剤および崩壊剤を加え、打錠することによって処方される。粉末混合物は、化合物、好適には粉砕したものを上記のような希釈剤または塩基と、また場合により、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、もしくはポリビニルピロリドンなどの結合剤、パラフィンなどの遅延剤溶液、第四級塩などの吸収促進剤、および／またはベントナイト、カオリンもしくは二リン酸カルシウムなどの吸収剤と混合することによって調製される。粉末混合物は、シロップ、デンプンペースト、アラビアゴム粘液(acadia mucilage)、またはセルロースもしくはポリマー材料の溶液などの結合剤で湿らせ、篩に通すことにより造粒することができる。造粒の別法として、粉末混合物を打錠機に通すことができ、得られたものを粉砕して顆粒とする。顆粒は、ステアリン酸、ステアリン酸塩、タルクまたは鉱油を加えることにより滑沢化して、打錠型に粘着するのを防ぐことができる。次に滑沢化した混合物を打錠する。また、本発明の化合物は、流動性の不活性担体と混合して、造粒またはスラッグ化工程を経ずに直接打錠することもできる。セラックのシーリングコート、糖またはポリマー材料のコーティング、およびワックスのつや出しコーティングからなる透明または不透明な保護コーティングを提供することができる。異なる単位剤形を識別するためにこれらのコーティングに染料を加えることもできる。
【００７４】
溶液、シロップ、およびエリキシルなどの経口用の液体は、ある一定の量に所定の化合物を含有するような単位投与形で調製することができる。シロップは、化合物を適宜着香した水溶液に溶解することにより調製することができ、エリキシルは無毒のアルコール性ビヒクルを使用することにより調製される。懸濁液は、化合物を無毒のビヒクルに分散させることにより製剤することができる。エトキシル化イソステアリルアルコールおよびポリオキシエチレンソルビトールエーテルなどの可溶化剤および乳化剤、保存剤、ペパーミント油などの香味剤、または天然甘味剤またはサッカリンまたは他の人工甘味剤などを加えることもできる。
【００７５】
適当であれば、経口投与のための単位投与処方物はマイクロカプセル化することができる。また、処方物は、例えば、粒子材料をポリマーまたはワックスなどでコーティングするか、またはそれらに包埋することにより放出を延長または持続するように調製することもできる。
【００７６】
また、単位投与形は、小単ラメラ小胞、大単ラメラ小胞、および多重ラメラ小胞などのリポソーム送達系の形態であってもよい。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミン、またはホスファチジルコリンなどの種々のリン脂質から形成することができる。
【００７７】
特に上述した成分に加え、これらの処方物は、対象とする処方物のタイプを考慮して当技術分野で慣例の他の薬剤を含んでよいと理解すべきであり、例えば、経口投与に好適なものは着香剤を含んでよい。
【００７８】
化合物Ｂまたはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物の治療上有効な量は、例えば、動物の齢および体重、治療を必要とする正確な病態、その重篤度、処方物の性質、および投与経路を含むいくつかの因子によって異なり、最終的には、担当の医師または獣医の裁量下にある。しかしながら、本明細書に記載されているものなどの癌病態の治療のための化合物Ｂまたはその塩もしくは溶媒和物の有効量は、一般に、１日当たり０．１〜１００ｍｇ／ｋｇレシピエント（哺乳動物）体重の範囲、より通常には、１日当たり１〜１２ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。従って、７０ｋｇの成体哺乳動物では、１日当たりの実際の量は通常、７０〜８４０ｍｇとなり、この量は１日当たり単回用量で与えてもよいし、またはより通常には、総１日用量が同じになるように、１日当たり何回かの部分用量（例えば、２回、３回、４回、５回または６回）で与えてもよい。その塩または溶媒和物の有効量は、化合物Ｂ自体の有効量の割合として求めればよい。上記に挙げた他の病態の治療にも同様の量が適当であると考えられる。
【００７９】
本発明のこれらの態様に従って投与または処方される化合物の量は、例えば患者の年齢および体重、治療を必要とする正確な病態、病態の重篤度、処方物の性質、および投与経路を含むいくつかの因子によって異なる。最終的には、この量は担当医の裁量下にある。
【００８０】
Response Evaluation Criteria In Solid Tumors (RECIST)は、癌患者が治療中に改善する（「反応」）、同じ状態に留まる（「安定化」）、または悪化する（「進行」）場合を定義する、公開されている規則のセットである。判定基準は、欧州癌研究治療機関(European Organosation for Research and Treatment of Cancer (EORTC)、米国国立癌研究所(National Cancer Institute of the United States)およびカナダ国立癌研究所(Cancer Institute of Canada)臨床試験グループを含む国際共同研究により、２０００年２月に公開された。現在、癌治療を固形腫瘍における客観的反応に関して評価する大多数の臨床試験がＲＥＣＩＳＴを使用している。
【００８１】
ＲＥＣＩＳＴ  １．０判定基準
測定可能および測定不能疾患の定義
測定可能疾患：少なくとも一つの測定可能な病巣が存在すること。
【００８２】
測定可能病巣：少なくとも１寸法が正確に測定でき、最大径（ＬＤ）が、
・従来技術（医学的写真［皮膚または口腔病巣］、触診、単純Ｘ線、ＣＴ、またはＭＲＩ）で≧２０ｍｍ
または
・スパイラスＣＴスキャンで≧１０ｍｍ
である病巣。
【００８３】
測定不能病巣：骨病巣、軟膜疾患、腹水、胸腔または心膜滲出液、皮膚／肺リンパ管炎、確定できず、続いて撮像技術も行わない腹部腫瘤、嚢胞性病巣、または間接的エビデンスだけによって（例えば、検査値によって）記録される疾患を含め、測定可能である（従来技術で最大径＜２０ｍｍ、またはスパイラスＣＴスキャンで＜１０ｍｍ）とみなすには小さすぎる病巣を含む他の総ての病巣。
【００８４】
測定方法
従来のＣＴおよびＭＲＩ：最小サイズの病巣が画像再構成間隔の２倍でなければならない。画像が最低１０ｍｍ間隔で連続的に再構成される場合、ベースライン病巣の最小サイズは２０ｍｍであり得る。ＭＲＩは好ましく、使用する場合、次の検査で同じ画像列を使用することにより、同じ解剖面において病巣を測定しなければならない。可能な限り、同じスキャナを使用すべきである。
【００８５】
スパイラルＣＴ：画像が最低５ｍｍ間隔で連続的に再構成される場合、ベースライン病巣の最小サイズは１０ｍｍであり得る。この仕様は、胸部、腹部、および骨盤の腫瘍に適用する。
【００８６】
胸部Ｘ線：胸部Ｘ線の病巣は、それらが明確に確定され、含気性肺により取り囲まれている場合には、測定可能な病巣として許容される。しかしながら、ＭＲＩが好ましい。
【００８７】
臨床検査：臨床的に検出された病巣は、表在性（例えば、皮膚結節および触知可能なリンパ節）である場合に限り、ＲＥＣＩＳＴ判定基準により測定可能とみなされる。皮膚病巣の場合、視野中に、病巣の大きさを評価するための定規および患者検査番号を含め、カラー写真による表示が必要である。
【００８８】
標的および非標的病巣のベースライン表示
総ての関連臓器を代表する各臓器につき最大５病巣、合計１０病巣の、総ての測定可能な病巣を標的病巣と特定し、ベースラインにおける記録および測定を行うべきである。
【００８９】
標的病巣は、それらの大きさ（ＬＤを有する）およびそれらの正確な反復測定（臨床的にまたは撮像技術による）に対する適性に基づき選択するべきである。
【００９０】
総ての標的病巣のＬＤの合計を計算し、ベースライン合計ＬＤとして記録する。ベースライン合計ＬＤは、客観的腫瘍反応を特徴付ける参照値として用いる。
【００９１】
他の総ての病巣（または疾患部位）を非標的標的病巣とみなすべきであり、これもベースラインにおいて記録すべきである。これらの病巣の測定は必要ではないが、追跡調査中有、それぞれの有無は記載しなければならない。
【００９２】
指標病巣の表示は、評価日、病変部の記載、寸法、および病巣を追跡するため使用した診断検査のタイプを含むべきである。
【００９３】
測定値は総て、定規またはカリパスを用い、メートル法を採用して記録すべきである。
【００９４】
反応判定基準
疾患の評価は、治療開始後６週間毎に行うべきである。しかしながら、部分反応または完全反応を受けている被験体は、少なくとも２８日後に疾患評価を確定しなければならない。評価は２８日後付近に行わなければならないが（計画が許せば）、２８日より早くてはいけない。
【００９５】
標的病巣に対する反応の評価に関する定義は次の通りである。
【００９６】
標的病巣の評価
完全反応（ＣＲ）−総ての標的病巣の消失。
【００９７】
部分反応（ＰＲ）−ベースライン合計ＬＤを参照値として、標的病巣のＬＤの合計における少なくとも３０％の低下。
【００９８】
安定疾患（ＳＤ）−治療の開始以来、最小の合計ＬＤを参照値として、ＰＲに分類されるほど十分な退縮がなく、進行性疾患（ＰＤ）に分類されるほど十分な増大もない。治療の開始以来記録された最小の合計ＬＤを参照値として病巣、または１以上の新たな病巣の出現。
【００９９】
非標的病巣の評価
非標的病巣の客観的腫瘍反応を判定するために使用される判定基準の定義は次の通りである。
【０１００】
完全反応−総ての非標的病巣の消失。
【０１０１】
不完全反応／安定疾患−１以上の非標的病巣の持続。
【０１０２】
進行性疾患−１以上の新たな病巣の出現および／または既存の非標的病巣の明白な進行。
【０１０３】
ＲＥＣＩＳＴに基づく反応の総合反応の評価
総合反応とは、治療の開始から疾患進行／再発が示されるまでに記録された最良の反応である。一般に、被験体の最良の反応の割り当ては、測定と確定判定基準の両方の遂行によって左右される。
【０１０４】
下表は、新たな病巣の出現を伴うまたは伴わない標的病巣および非標的病巣における腫瘍反応の総ての組合せに関する最良総合反応の評価を表している。
【０１０５】
【表１】
2013545756.tif 000002
注：その時点で、疾患進行の客観的エビデンスは無いが、健康状態の全体的な悪化を示し、治療の中止が必要な被験体は、「症候性悪化」を有するとして分類しなければならない。治療の中止後であっても客観的進行を記録するようにあらゆる努力をしなければならない。
【０１０６】
場合によっては、残存病変と正常組織の識別が困難なこともある。完全反応の評価がこの判定に左右される場合には、残存病巣を検査（穿刺吸引／生検）して完全反応の状態を確認することが奨励される。
【０１０７】
確定判定基準
ＰＲまたはＣＲの状態を割り当てるには、確認疾患評価は、最初にその反応判定基準に適合してから２８日以降に行わなければならない。
【０１０８】
ＳＤの状態を割り当てるには、追跡測定値が、試験登録後、最低１２週間おいて、少なくとも一度でＳＤ判定基準に適合していなければならない。
【実施例】
【０１０９】
実験
化合物Ｂの製造
２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミド
【化１】
2013545756.tif 000003
ａ）６−ブロモ−４−（４−ピリダジニル）キノリン
６−ブロモ−４−ヨードキノリン（１７．４３ｇ、５２．２ｍｍｏｌ）、４−（トリブチルスタンニル）ピリダジン（１９．２７ｇ、５２．２ｍｍｏｌ）、およびＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）−ＣＨ２Ｃｌ２（２．１３２ｇ、２．６１ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（２００ｍＬ）に溶かし、１０５℃に加熱した。３時間後、パラジウム触媒を追加し、６時間加熱した。濃縮し、塩化メチレン／メタノールに溶かした。２％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃからの５％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃを用いてカラムクロマトグラフィー（ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ）により精製し、粗標題化合物を得た。ＥｔＯＡｃで摩砕し、６−ブロモ−４−（４−ピリダジニル）キノリン（５．８ｇ、２０．２７ｍｍｏｌ、収率３８．８％）を得た。MS(ES)+ m/e 285.9, 287.9 [M+H]+
【０１１０】
ｂ）２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミド
無水１，４−ジオキサン（１２０ｍｌ）中、６−ブロモ−４−（４−ピリダジニル）キノリン（４．８ｇ、１６．７８ｍｍｏｌ）、ビス（ピナコラト）二ホウ素（４．６９ｇ、１８．４５ｍｍｏｌ）、ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）−ＣＨ２Ｃｌ２（５３０ｍｇ、０．６４９ｍｍｏｌ）および酢酸カリウム（３．２９ｇ、３３．６ｍｍｏｌ）のスラリーを１００℃で３時間加熱した。出発臭化物が完全に消失したことをＬＣＭＳにより確認した。次に、この反応物をＮ−［５−ブロモ−２−（メチルオキシ）−３−ピリジニル］−２，４−ジフルオロベンゼンスルホンアミド（６．６８ｇ、１７．６１ｍｍｏｌ）および追加のＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）−ＣＨ２Ｃｌ２（５５０ｍｇ、０．６７３ｍｍｏｌ）で処理した後、１１０℃で１６時間加熱した。反応物を室温まで放冷し、濾過し、濃縮した。残渣をクロマトグラフィー（Ａｎａｌｏｇｉｘ；５％ＭｅＯＨ／５％ＣＨ２Ｃｌ２／９０％ＥｔＯＡＣ）により精製し、６．５ｇ（７６％）の目的生成物を得た。MS(ES)+ m/e 505.9 [M+H]+
【０１１１】
中間体：
Ｎ−［５−ブロモ−２−（メチルオキシ）−３−ピリジニル］−２，４−ジフルオロベンゼンスルホンアミドの製造
【化２】
2013545756.tif 000004
ａ）５−ブロモ−２−（メチルオキシ）−３−ニトロピリジン
メタノール（２００ｍＬ）中、５−ブロモ−２−クロロ−３−ニトロピリジン（５０ｇ、２１１ｍｍｏｌ）の冷却（０℃）溶液に、１０分かけて２０％ナトリウムメトキシド（５０ｍＬ、２１１ｍｍｏｌ）溶液を滴下した。この反応物（すぐに不均質となった）を周囲温度まで温め、１６時間撹拌した。反応物を濾過し、沈殿を水（２００ｍＬ）で希釈し、１時間撹拌した。固体を濾過し、水（３×１００ｍＬ）で洗浄し、真空乾燥器（４０℃）で乾燥させ、５−ブロモ−２−（メチルオキシ）−３−ニトロピリジン（３６ｇ、１５４ｍｍｏｌ、収率７３．４％）を淡黄色粉末として得た。元の濾液を真空濃縮し、水（１５０ｍＬ）で希釈した。飽和塩化アンモニウム（２５ｍＬ）を加え、この混合物を１時間撹拌した。固体を濾過し、水で洗浄し、真空乾燥器（４０℃）で乾燥させ、第２生成物５−ブロモ−２−（メチルオキシ）−３−ニトロピリジン（９ｇ、３８．６ｍｍｏｌ、収率１８．３４％）を得た。総収率＝９０％  MS(ES)+ m/e 232.8, 234.7 [M+H]+
ｂ）５−ブロモ−２−（メチルオキシ）−３−ピリジンアミン
酢酸エチル（１Ｌ）中、５−ブロモ−２−（メチルオキシ）−３−ニトロピリジン（４５ｇ、１９３ｍｍｏｌ）の溶液に塩化スズ（ＩＩ）二水和物（１７４ｇ、７７２ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を還流下で４時間加熱した。ＬＣ／ＭＳは出発材料が一部残留していることを示したので、２０ｍｏｌ％の塩化スズ（ＩＩ）二水和物を加え、還流下で加熱を続けた。２時間後、反応物を周囲温度まで放冷し、真空濃縮した。残渣を２Ｎ水酸化ナトリウムで処理し、この混合物を１時間撹拌した。次に、この混合物を塩化メチレン（１Ｌ）とともにセライトで濾過し、塩化メチレン（５００ｍＬ）で洗浄した。層を分離し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮して５−ブロモ−２−（メチルオキシ）−３−ピリジンアミン（２３ｇ、１１３ｍｍｏｌ、収率５８．７％）を得た。この生成物をそのまま次の反応に用いた。MS(ES)+ m/e 201.9, 203.9 [M+H]+
【０１１２】
ｃ）Ｎ−［５−ブロモ−２−（メチルオキシ）−３−ピリジニル］−２，４−ジフルオロベンゼンスルホンアミド
ピリジン（２００ｍＬ）中、５−ブロモ−２−（メチルオキシ）−３−ピリジンアミン（２０．３ｇ、１００ｍｍｏｌ）の冷却（０℃）溶液に塩化２，４−ジフルオロベンゼンスルホニル（２１．３ｇ、１００ｍｍｏｌ）を１５分かけてゆっくり加えた（反応物は不均質となった）。氷浴を外し、反応物を周囲温度で１６時間撹拌し、その時点で反応物を水（５００ｍＬ）で希釈し、固体を濾別し、多量の水で洗浄した。沈殿を真空乾燥器にて５０℃で乾燥させ、Ｎ−［５−ブロモ−２−（メチルオキシ）−３−ピリジニル］−２，４−ジフルオロベンゼンスルホンアミド（１２ｇ、３１．６ｍｍｏｌ、収率３１．７％）を得た。MS(ES)+ m/e 379.0, 380.9 [M+H]+
【０１１３】
生物学的データ：
遺伝子型決定
Ｑｉａｇｅｎ  ＱｉＡｍｐ  ＤＮＡ血液キットを用い、血液からＤＮＡを抽出した。遺伝子型決定は、下記の技術：グラクソスミスクライン(Taylor JD, Briley D, Nguyen Q, Long K, Iannone MA, Li MS, Ye F, Afshari A, Lai E, Wagner M, Chen J, Weiner MP (2001) Flow cytometric platform for high-throughput single nucleotide polymorphism analysis. Biotechniques 30(3): 661-6, 668-9)により改変された一塩基鎖伸長アッセイ(single base chain extension assay)であるＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｈｕｍａｎ  １Ｍ  ＤＮＡ分析ビーズチッププラットフォーム(Steemers FJ, Chang W, Lee G, Barker DL, Shen R et al. (2006) Whole-genome genotyping with the single-base extension assay. Nat Methods 3: 31-33)を用いて行った。
【０１１４】
統計分析
有効性ＰＧｘ分析は、各多型に関して、エンドポイントとしてのインベスティゲーター・レビュー(Investigator Review)に基づくＰＦＳおよび反応率（ＲＥＣＩＳＴ）を用いて行った。Ｃｏｘ回帰を用いて各ＳＮＰとＰＦＳの遺伝的連関を調べた。遺伝子型による生存率のカプラン・マイヤープロットを作成した。下記の共変量、年齢、性別、人種、Ｍｏｔｚｅｒリスクスコア、ＥＣＯＧパフォーマンス・ステータス、および過去の腎臓切除の状態のそれぞれをＣｏｘモデリングにより、ＰＦＳとの連関について個々に調べた。ｐ＜０．０５でＰＦＳと有意に連関があった総ての共変量を遺伝子型に関するＣｏｘモデルに含めた。
【０１１５】
ＲＥＣＩＳＴ反応は、部分反応者および完全反応者（ＰＲ＋ＣＲ）、安定疾患（ＳＤ）、および進行性疾患（ＰＤ）の３つのカテゴリーに分類した。反応状態が「未知」または「評価不能」である患者は本分析から除外した。反応と遺伝子型とで構成した３×３テーブルについてフィッシャーの正確確率検定を用い、連関の有意性を評価した。
【０１１６】
この予備的分析では、多重比較に対する補正は行わなかった。望ましくは独立したデータセットでの確認を要する名義的有意水準（ｐ＜０．０５）を満たす多型を報告した。
【０１１７】
実施例１
ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）シグナル伝達経路は、広域のヒト癌において活性化されている。癌細胞の成長および生存におけるＰＩ３Ｋの生物学的役割ならびにヒト癌における活性化突然変異の頻度は十分に報告されている。この経路の活性化は、間接的には受容体チロシンキナーゼの体細胞異常によって、または直接的にはＰＩＫ３ＣＡなどのＰＩ３Ｋ遺伝子における突然変異によって起こる場合が多い。かなりの割合の腫瘍がこの経路の阻害から利益を得ていると考えられる。
【０１１８】
化合物Ｂは、２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミドとも呼ばれ、野生型ホスホイノシチド３−キナーゼα（ＰＩ３Ｋα）およびヒト癌において見られるｐ１１０αの一般的な活性化突然変異体の新規な経口投与用阻害剤である。化合物Ｂは、タンパク質キナーゼの大規模パネルで評価した際、ＰＩ３Ｋファミリー酵素に良好な選択性を示す。この化合物は最近、第Ｉ相臨床試験に入ったところである。
【０１１９】
in vitro腫瘍モデルのコホートを用いて、臨床有効性を予測する試みが成果を上げたことから、腫瘍由来細胞株の拡張パネルは、「全候補」の有効性治験を再現することができ、それにより、どの組織構造および特定の腫瘍遺伝子型が治療から利益を得る可能性が最も高いかを特定することができる。この目的で、化合物Ｂを２つのヒト乳癌細胞株パネルで試験した。
【０１２０】
試験１．乳癌細胞株パネルＡ
方法
細胞株増殖アッセイ
この試験には計１５の乳癌細胞株を用いた。これらの細胞は、５％または１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）および１ｍＭピルビン酸ナトリウムを添加したＲＰＭＩ−１６４０、または供給者[American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA; Developmental Therapeutics Program, National Cancer Institute, Bethesda, MD, USA; German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ), Braunschweig, Germany; European Collection of Cell Cultures (ECACC), Porton Down, UK]によって推奨されている培養培地で培養した。各株の細胞を３８４ウェルマイクロタイタープレートに２種類の細胞密度で播種した。低密度範囲は３００〜１８００細胞／ウェルであり、高密度範囲は６００〜３６００細胞／ウェルであった。播種密度はその阻害剤の非存在下での細胞株の増殖率により決定され、細胞株間で異なった。高播種密度は低播種密度の二倍であった。各細胞密度は３反復で播種した。各細胞株、各密度で合計３０ウェルを漸増濃度の化合物Ｂで処理した。さらに、各密度で２４ウェルのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）処理対照を設けた。播種後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。次に、化合物Ｂを１０種の濃度で各細胞株に加えた。まず、化合物Ｂの投与溶液をＤＭＳＯにて、マスターストック濃度１０ｍＭで調製した。次に、この保存溶液の１：３連続希釈液を作成し、一定範囲の検量線用保存濃縮液：１０．００ｍＭ、３．１６４ｍＭ、１．００１ｍＭ、３１６．９μＭ、１００．３μＭ、３１．７４μＭ、１０．０４μＭ、３．１７８μＭ、１．００６μＭおよび３１８．３ｎＭとした。これらの化合物Ｂの検量線用保存濃縮液を、Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸリキッドハンドラーを用い、播種済みの癌細胞株に分注し、最終処理濃度を保存濃縮液の０．１％とした。化合物Ｂを含まない同容量のＤＭＳＯを、各播種密度の２４の対照ウェルに０．１％濃度で分注した。また、ＤＭＳＯ対照の添加直後に、各細胞株につき
各播種密度で同様に細胞を播種した０時点プレートも準備した。７２時間インキュベーション後、プレートの各ウェルに、細胞培養培地と同容量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を加えた。内容物が混合されて細胞溶解と安定化が誘導された後、細胞の発光をＳｐａｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５ｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて記録した。
【０１２１】
化合物Ｂ処理細胞の発光を、化合物Ｂの総ての濃度、各細胞密度、３反復の全ウェルについて、２４のＤＭＳＯ処理対照ウェルの平均値と比較した。マイクロソフトエクセルでＸＬｆｉｔモデル２０５にて強度パーセント値を用い、低播種密度および高播種密度のｇＩＣ５０を計算した（４パラメーターロジスティックフィット）。具体的には、増加枠の中点（ｇＩＣ５０）は、化合物添加時（Ｔ＝０）における細胞数とＤＭＳＯで処理した対照細胞の増殖の間の半分のところに位置する。ｇＩＣ５０値は、癌細胞の増殖阻害を測る尺度となる。各細胞株、各播種密度の曲線について、両データの質と曲線の当てはめの妥当性を手作業で調べた。最初のデータが不十分であった場合には、その曲線およびその後のｇＩＣ５０を以降の分析から除外した。細胞株の播種物は、当てはめた曲線のｒ２値が＜０．７５であった場合に、不十分な質であるとみなした。最後に、データの質が許容されるものであれば、Ｙｍｉｎ値（０時点での細胞密度に対する最大増殖阻害と定義）を、データが妥当な質であった場合の細胞傷害性の尺度として計算した。
【０１２２】
１５総ての細胞株について、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ５００Ｋチップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｉｎｃ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用い、ＨＥＲ２遺伝子のＤＮＡコピー数データを採取した。まず、各株から、ＧｅｎＥｌｕｔｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡミニプレップキット（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いてＤＮＡを抽出した。２つのアリコート（各２５０ｎｇ）を制限酵素ＮｓｐまたはＳｔｙ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）で消化した。次に、消化したＤＮＡをアダプターと連結し、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＣＲにより増幅し、およそ２５０〜２０００ｂｐの産物を得た。各酵素消化物について、１００μＬの４アリコートでＰＣＲを行い、プールし、精製し、定量し、４０μｇ／４５μＬに補正し、ＤＮアーゼＩで切断し、およそ２５〜２００ｂｐのサイズとした。次に、これらの癌細胞株の切断産物を標識し、変性させ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ５００Ｋチップにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションが完了したところで、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｓｔａｔｉｏｎｓを用いて各アッセイを洗浄および染色した。画像データはＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｉｓｉｓ、Ｉｎｃ、Ｄｕｒｈａｍ  ＮＣ）を用いて採取した。１０種の非腫瘍形成性リンパ芽球性細胞株のパネルから同様にして採取したデータを用い、ＤＮＡコピー数を算出した。
【０１２３】
ＨＥＲ２遺伝子のＤＮＡコピー数は、下記の手順を用いて算出した。
【０１２４】
１．総ての「ＳＮＰチップ」画像（「ＣＥＬファイル」）を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅソフトウエアを用いて抽出し、読み取り、ｄＣｈｉｐソフトウエアパッケージ(Lin et al. 2004)を用いて補正した。総ての癌細胞株について、ＳＮＰ強度スコアをリンパ芽球性参照パネルの個々の中央値強度スコアで割ることにより、ＳＮＰ式の「コピー数比率」（ｌｏｇ２スケール）を算出した。総てのサンプルについて中央値コピー数が２倍性であると仮定して、データを補正した。
【０１２５】
２．最後に、サーキュラー・バイナリー・セグメンテーション(circular binary segmentation)（ＣＢＳ）によってコピー数の推論を行ってノイズ（例えば、標的内のマスクされていない複合配列からのノイズ）を減らし、少なくとも２つの基礎ＳＮＰに基づいてゲノム全領域のコンセンサススコアを得た(Olshen et al. 2004)。
【０１２６】
３．このプラットフォームと核型データの事前の比較(Greshock, J., et al. 2007. Cancer Res 67:10173-80)に基づくＬｏｇ２比カットオフを用いて、ＨＥＲ２を、３〜５コピー（０．２５〜０．６５）、＞５コピー（＞０．６５）のコピー数増、一染色体性(monsomies)（−０．２５〜−０．７５）または同型接合性の欠如（＜−０．７５）を有するとして分類した。
【０１２７】
細胞株突然変異データ
ＰＩＫ３ＣＡおよびＫＲＡＳ遺伝子の状態に関する突然変異データを収集した。データ源はthe Catolog of Somatic Mutations in Cancer database (COSMIC) (Bamford S. et al. Br. J. Cancer. 2004. 91:355-58)の一部として公開されている癌細胞株突然変異スクリーニングデータである。増殖アッセイで用いた細胞株の属性がＣＯＳＭＩＣデータベースにおける属性と一致することを確認するため、感受性スクリーニングにおける細胞株とＣＯＳＭＩＣにおける細胞株とで遺伝子型比較を行った。具体的には、これには、以下のことが含まれる。
【０１２８】
１．Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ５００Ｋ「ＳＮＰチップ」（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）およびＲＬＭＭアルゴリズム(Rabbee & Speed, Bioinformatics, 2006. 22: 7-12)を用い、各細胞株について遺伝子型を予測すること。
【０１２９】
２．各細胞株の遺伝子型が、ＣＯＳＭＩＣにおいて突然変異プロフィールを有する各細胞株について予め予測されたものと一致するかどうか確認すること。
【０１３０】
遺伝子型の一致に基づき、各細胞株の突然変異の状態を割り付けること。
【０１３１】
結果
化合物Ｂを１５種のヒト乳房細胞株のパネルで試験した。細胞傷害性曲線を作成し、２種類の細胞密度を用い、総ての細胞についてｇＩＣ５０を求めた（表１）。化合物ＢのｇＩＣ５０は、この１５細胞パネルで、０．１〜２２７．０ｎＭの範囲であった。全体の中央値ｇＩＣ５０は３．２ｎＭであった。腫瘍細胞株の３／１５（２０％）がｇＩＣ５０＞２０ｎＭを示し、７／１５（４７％）がｇＩＣ５０＜３ｎＭを示した。
【０１３２】
各個の細胞株の応答性の程度はｇＩＣ５０の算出に基づいて評価し、この場合、値が低いほど、化合物Ｂによる処理に対する細胞の応答性が高い。
【０１３３】
ＫＲＡＳおよびＰＩＫ３ＣＡの突然変異データは、化合物Ｂに対する応答性に関してスクリーニングした１５細胞株の総てに利用可能であった。合計４０％（６／１５）の細胞株がＰＩＫ３ＣＡの突然変異を有し、７％（１／１５）がＫＲＡＳの突然変異を有していた。両遺伝子に対して突然変異を有する細胞株は無かった。合計２０％（３／１５）がＨＥＲ２遺伝子に５コピー以上のコピー数増加を有していた。これらのデータを表２に示す。
【０１３４】
ＤＮＡ配列：
ヒトＰＩＫ３ＣＡの野生型遺伝子配列は当技術分野で公知であり、http://www.ncbi.nlm.nih.gov（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿０１２１１３．１）を含む種々のデータベースから入手することができる。また、Volinia, et al. Genomics 24(3):472-7 (1994)も参照。
【０１３５】
ＫＲａｓ：遺伝子配列もまた、http://www.ncbi.nlm.nih.gov（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００７５２４．１）から入手することができる。
【０１３６】
Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、およびＨ−Ｒａｓの野生型タンパク質配列は当技術分野で公知であり、ＳｗｉｓＰｒｏｔデータベースＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（それぞれＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｎｏ．  Ｐ０１１１６（Ｋ−ｒａｓ）；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｎｏ．  Ｐ０１１１１（Ｎ−ｒａｓ）、およびＰ０１１１２（Ｈ−Ｒａｓ））を含む種々のデータベースから入手することができる。また、Shimizu, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 80(1983), pp. 2112-2116; Bos, Mutation research, Reviews in Genetic Toxicology 195 (30:255-271 (1988);およびFasano, et al., Mol. Cell. Biol., 4 (1984), pp. 1695-1705も参照。
【０１３７】
【表２】
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【０１３８】
【表３】
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【０１３９】
【表４】
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【０１４０】
試験２．乳房細胞株パネルＢ
化合物Ｂ処理の関数としての増殖阻害を、別のアッセイにおいて、正常上皮組織および癌細胞の両方から構成される５１の乳房細胞株のパネルで分析した。
【０１４１】
薬物の調製：
薬物は３３ｍＭ（特に断りのない限り）保存液としてＤＭＳＯに溶かし、３回以内の実験を行うのに十分な溶液を含有するアリコートとして−２０℃で保存した（凍結／解凍サイクルを制限するため）。
【０１４２】
薬物プレートの調製：
希釈薬物プレート：
保存濃縮液から、ＤＭＳＯを用いて８種の連続希釈液（１：５）を作製した。従って、合計９用量（保存液と８種の連続希釈液）を用量応答曲線に利用可能であった。
【０１４３】
検量線用薬物プレート：
この希釈薬物プレートから、総ての用量にわたって、ＰＢＳまたは細胞株を用いたスクリーニングに使用される細胞培養培地のいずれかを用いて別の希釈液を作製した。
【０１４４】
一般に、処理の際は１００μｌの細胞培養に約５μｌを加え、各用量を３ウェルで反復した。
注：処理ウェルでの最終ＤＭＳＯ濃度は０．３％以下である。
【０１４５】
また、ビヒクル対照として０．３％ＤＭＳＯで処理した３ウェルおよび（場合により）ＰＢＳまたは培地（ＤＭＳＯまたは化合物の添加なし）のいずれかで処理した細胞培養物３ウェルも設けた。
【０１４６】
スクリーニングプロトコール：
−１日：９６ウェルプレートに１００μｌ容量で細胞を播種。
【０１４７】
注：播種する細胞数は、３日間の薬物処理後の増殖アッセイ時に対照ウェルがなお対数増殖期にあるように（密集前）調整。
【０１４８】
０日目：処理のためにプレートに薬物を添加。
【０１４９】
０時点プレートを、薬物を添加した時点でベースラインの読み取りを確保できるように、増殖アッセイの手順を施した。
【０１５０】
３日目：若干の改変を加え、増殖アッセイ（例えば、ＰｒｏｍｅｇａによるＣｅｌｌ−Ｔｉｔｒｅ  Ｇｌｏアッセイ）の手順を施す。
【０１５１】
１倍ＣＴＧ試薬（製造者により提示されているようにＰＢＳで２倍希釈することによる）を調製する。
【０１５２】
プレート（９６ウェル）から培地を除去し、１ウェル当たり５０μｌの１倍ＣＴＧを加える。
【０１５３】
このプレートを室温で１０分間回転させ、ＢＩＯ−ＴＥＫ  ＦＬｘ８００で読み取る。
【０１５４】
データの算出：
ＬＢＮＬは、NCI/NIH DTP Human Tumor Cell Line Screen Process(http://dtp.nci.nih.gov/branches/btb/ivclsp.html)により設定されたプロトコールに従い、以下にまとめる。
【０１５５】
増殖阻害パーセンテージは次のように算出する。
【０１５６】
濃度がＴｉ＞／＝Ｔｚである場合、［（Ｔｉ−Ｔｚ）／（Ｃ−Ｔｚ）］×１００
濃度がＴｉ＜Ｔｚである場合、［（Ｔｉ−Ｔｚ）／Ｔｚ］×１００
Ｃ：対照増殖（ビヒクル対照増殖）
Ｔｚ：０時点での読み取り値
Ｔｉ：９種の濃度水準の薬物の存在下での試験増殖
ｇＩＣ５０：５０％増殖阻害は下式から算出する。
【０１５７】
［（Ｔｉ−Ｔｚ）／（Ｃ−Ｔｚ）］×１００＝５０
（薬物インキュベーションの際の対照細胞の正味増殖に５０％の低下をもたらす薬物濃度）。
【０１５８】
ＴＧＩ：全増殖阻害は下式から算出する。
【０１５９】
Ｔｉ＝Ｔｚ
全増殖阻害をもたらす薬物濃度（「０時点」のベースラインまで減少）。
【０１６０】
ＬＣ５０：細胞増殖の５０％正味低下は下式から算出する。
【０１６１】
［（Ｔｉ−Ｔｚ）／Ｔｚ］×１００＝−５０
最初（０時点）の細胞数に比べて薬物処理終了時の細胞数に５０％の減少をもたらす薬物の濃度（処理後の細胞の正味減少を示す）。
【０１６２】
活性のレベルが達成されれば、これらの３つの各パラメーターについて値を算出するが、効果が達成されないかまたは上回れば、そのパラメーターの値は、供試最大または最小濃度よりも高いまたは低いとして表現される。
【０１６３】
細胞株セットのサブセットはそれらの分子サブタイプに関して特徴付けられたものである。これらの細胞株を分類するためのこの手順は、Neve, R. M. et al. 2006. Cancer Cell 10: 515-27に記載されている。分類は遺伝子発現データに基づいて行った。
【０１６４】
化合物Ｂを５１のヒト乳房細胞株のパネルで試験した。細胞傷害性曲線を作成し、総ての細胞について２種類の細胞密度を用いてｇＩＣ５０を求めた（表１）。１５細胞パネルに対しての化合物ＢのｇＩＣ５０は１．１〜３９８．１ｎＭの範囲であった。全体のｇＩＣ５０中央値は１０．４ｎＭであり、平均値は２８．９ｎＭであった。１６／５１（３１％）の腫瘍細胞株だけがｇＩＣ５０＞３０ｎＭを示し、７／５１（１４％）はｇＩＣ５０＜３ｎＭを示した。
各個の細胞株の応答性の程度はｇＩＣ５０の算出に基づいて評価し、この場合、値が低いほど、化合物Ｂによる処理に対する細胞の応答性が高い。
【０１６５】
ＰＩＫ３ＣＡの突然変異データは、化合物Ｂに対する応答性に関してスクリーニングされた３３の細胞株に利用可能であった。合計２７％（９／３３）の細胞株がＰＩＫ３ＣＡの突然変異を有していた。合計４９細胞株をＨＥＲ２の状態に関してスクリーニングした。これらのうち１３／４９（２７％）が、ＨＥＲ２が増幅されているとみなされた。これらのデータを表３に示す。
【０１６６】
【表５】
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【０１６７】
本発明の好ましい実施形態が上記に説明されているが、本発明は本明細書に開示されているその通りの教示に限定されるものではなく、下記の特許請求の範囲内に入る総ての改変に対する権利が保持されると理解するべきである。
【国際調査報告】
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