(57)【要約】本発明は、被験体の生物学的試料中のＡβ４０凝集体の測定値を得る工程を含み、該生物学的試料が脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含むものでない、評価対象の被験体においてアルツハイマー病を有する増大した確率の評価方法を提供する。一部の実施形態において、本発明は、初期病期のアルツハイマー病の増大した確率の評価方法に関する。本発明は、さらに、アルツハイマー病を有しない増大した確率の評価方法、アルツハイマー病の被験体の疾患進行のモニタリング方法、ならびにアルツハイマー病の被験体の疾患病期の指定方法、およびＭＣＩがアルツハイマー病に進行する増大した確率の評価方法を提供する。
2013512440.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
評価対象の被験体においてアルツハイマー病を有する増大した確率を評価するための方法であって、該方法は、該被験体の生物学的試料中のＡβ４０凝集体の測定値を得る工程を含み、該生物学的試料は、脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含まない、方法。
【請求項２】
評価対象の被験体においてＭＣＩがアルツハイマー病に進行する増大した確率を評価するための方法であって、該方法は、該被験体の生物学的試料中のＡβ４０凝集体の測定値を得る工程を含み、該生物学的試料は、脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含まない、方法。
【請求項３】
さらに、視覚的ディスプレイまたはプリンターを含む報告手段に前記Ａβ４０凝集体の測定値を報告する工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ａβ４０凝集体の測定値が前記生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
評価対象の前記被験体またはアルツハイマー病の前記被験体の前記生物学的試料が体液または体組織を含む、上述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記生物学的試料が、全血、血液分画物、血液成分、血漿、血小板、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、骨髄、尿、涙液、乳汁、リンパ液、器官組織、神経系の組織、非神経系の組織、筋肉組織、生検材料、剖検材料、脂肪生検材料、脂肪組織、細胞、糞便、胎盤、脾臓組織、リンパ組織、膵臓組織、気管支肺胞洗浄物（ＢＡＬ）、または滑液からなる群より選択されるメンバーを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記生物学的試料が、血漿、血清、ＣＳＦおよび尿からなる群より選択されるメンバーを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記Ａβ４０凝集体が循環している、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記生物学的試料が体組織を含み；
前記Ａβ４０凝集体の測定値または前記Ａβ４０凝集体レベルが、
該体組織のホモジネートを準備する工程；
該ホモジネートを凝集体特異的結合試薬と、該試薬が、Ａβ４０凝集体が存在する場合に該Ａβ４０凝集体に結合するのを可能にする条件下で接触させ、複合体を形成させる工程；および
該被験体生物学的試料中にＡβ４０凝集体があれば、該Ａβ４０凝集体を、該試薬に対する結合によって検出する工程であって、ここで、該試薬は、固体支持体に結合されており、該固体支持体に結合されている場合、単量体よりも凝集体に優先的に結合する、工程
を含む方法によって得られる、
請求項１〜４に記載の方法。
【請求項１０】
さらに、前記Ａβ４０凝集体レベルが対照レベル閾値よりも高い場合、前記被験体がアルツハイマー病またはアルツハイマー病に進行するＭＣＩを有する増大した確率を有すると決定する工程を含み、
該対照レベル閾値が、認知に関して正常な複数の対照被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを含むデータから計算され；
評価対象の該被験体と該対照被験体が同じ種であり；
該生物学的試料がすべてＣＳＦを含む、
請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記アルツハイマー病が初期病期である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
評価対象の被験体においてアルツハイマー病を有しない増大した確率を評価するための方法であって、該方法は、
該被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを得る工程；および
該被験体が臨床的認知障害を示さない場合、および該Ａβ４０凝集体レベルが対照レベル閾値と同じであるか、またはそれより低い場合、該被験体はアルツハイマー病を有しない増大した確率を有すると決定する工程
を含み；
該対照レベル閾値は、認知に関して正常な複数の対照被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを含むデータから計算され；
評価対象の該被験体と該対照被験体は同じ種であり；
該生物学的試料はすべてＣＳＦを含み、該生物学的試料はいずれも脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含まない、
方法。
【請求項１３】
評価対象の被験体においてアルツハイマー病を有しない増大した確率の評価を補助するための方法であって、該方法は、
該被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを測定する工程；および
該Ａβ４０凝集体レベルを異なる実体に連絡する工程
を含み；
該異なる実体により、該被験体が臨床的認知障害を示さない場合、および該Ａβ４０凝集体レベルが対照レベル閾値と同じであるか、またはそれより低い場合、該被験体はアルツハイマー病を有しない増大した確率を有すると決定され；
該対照レベル閾値は、認知に関して正常な複数の対照被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを含むデータから計算され；
評価対象の該被験体と該対照被験体は同じ種であり；
該生物学的試料はすべてＣＳＦを含み、該生物学的試料はいずれも脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含まない、
方法。
【請求項１４】
アルツハイマー病に対する処置を何も受けたことがないアルツハイマー病の被験体の疾患進行をモニタリングするための方法であって、該方法は、
アルツハイマー病と診断された後の時点で該被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを得る工程；および
（ａ）該被験体において初期病期のＡβ４０凝集体レベルが利用可能ならば、該Ａβ４０凝集体レベルが該初期病期のＡβ４０凝集体レベルよりも低い場合；あるいは（ｂ）該被験体において該初期病期レベルが利用可能でないならば、該Ａβ４０凝集体レベルが初期病期標準よりも低い場合、該被験体は、進んだ病期のアルツハイマー病に進行した増大した確率を有する；かまたは
（ａ）該被験体において該初期病期レベルが利用可能ならば、該Ａβ４０凝集体レベルが該初期病期レベルと同じである場合；あるいは（ｂ）該被験体において該初期病期レベルが利用可能でないならば、該Ａβ４０凝集体レベルが該初期病期標準と同じである場合、該被験体は、進んだ病期のアルツハイマー病に進行した低減した確率を有する
と決定する工程
を含み；
該初期病期レベルは、該被験体からアルツハイマー病の初期病期のときに採取された生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルであり；
該初期病期標準は、初期病期であることが既知のアルツハイマー病の１例以上の標準被験体から採取された１つ以上の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルであり；
該被験体と該標準被験体は同じ種であり；
該生物学的試料はすべてＣＳＦを含み、該生物学的試料はいずれも脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含まない、
方法。
【請求項１５】
アルツハイマー病に対する処置を何も受けたことがないアルツハイマー病の被験体の疾患進行のモニタリングを補助するための方法であって、該方法は、
アルツハイマー病と診断された後の時点で該被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを測定する工程；および
該Ａβ４０凝集体レベルを異なる実体に連絡する工程
を含み；
該異なる実体により、
（ａ）該被験体において初期病期のＡβ４０凝集体レベルが利用可能ならば、該Ａβ４０凝集体レベルが該初期病期のＡβ４０凝集体レベルよりも低い場合；あるいは（ｂ）該被験体において該初期病期レベルが利用可能でないならば、該Ａβ４０凝集体レベルが初期病期標準よりも低い場合、該被験体は、進んだ病期のアルツハイマー病に進行した増大した確率を有する；かまたは
（ａ）該被験体において該初期病期レベルが利用可能ならば、該Ａβ４０凝集体レベルが該初期病期レベルと同じである場合；あるいは（ｂ）該被験体において該初期病期レベルが利用可能でないならば、該Ａβ４０凝集体レベルが該初期病期標準と同じである場合、該被験体は、進んだ病期のアルツハイマー病に進行した低減した確率を有する
と決定され；
該初期病期レベルは、該被験体からアルツハイマー病の初期病期のときに採取された生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルであり；
該初期病期標準は、初期病期であることが既知のアルツハイマー病の１例以上の標準被験体から採取された１つ以上の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルであり；
該被験体と該標準被験体は同じ種であり；
該生物学的試料はすべてＣＳＦを含み、該生物学的試料はいずれも脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含まない、
方法。
【請求項１６】
アルツハイマー病に対するなんらかの処置前にアルツハイマー病の被験体の疾患病期を指定するための方法であって、該方法は、
該被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを得る工程；および
病期特異的標準が利用可能ならば、該Ａβ４０凝集体レベルが該病期特異的標準に近い場合、該被験体は該標準と同じ疾患病期を有する増大した確率を有すると決定する工程
を含み；
該病期特異的標準は、同じ既知病期のアルツハイマー病の１例以上の標準被験体から採取された１つ以上の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルであり；
該被験体と該標準被験体は同じ種であり；
該生物学的試料はすべてＣＳＦを含み、該生物学的試料はいずれも脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含まない、
方法。
【請求項１７】
アルツハイマー病に対するなんらかの処置前でのアルツハイマー病の被験体の疾患病期の指定を補助するための方法であって、該方法は、
該被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを測定する工程；および
該Ａβ４０凝集体レベルを異なる実体に連絡する工程
を含み；
該異なる実体により、病期特異的標準が利用可能ならば、該Ａβ４０凝集体レベルが該病期特異的標準に近い場合、該被験体は該標準と同じ疾患病期を有する増大した確率を有すると決定され；
該病期特異的標準は、同じ既知病期のアルツハイマー病の１例以上の標準被験体から採取された１つ以上の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルであり；
該被験体と該標準被験体は同じ種であり；
該生物学的試料はすべてＣＳＦを含み、該生物学的試料はいずれも脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含まない、
方法。
【請求項１８】
前記初期病期標準または前記病期特異的標準が、同じ既知病期のアルツハイマー病の複数の標準被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルの平均である、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つの初期病期標準と少なくとも１つの進んだ病期標準が前記Ａβ４０凝集体レベルとの比較に利用可能である、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２０】
さらに、評価対象の前記被験体のアルツハイマー病の第２の指標の測定値を得る工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
さらに、前記Ａβ４０凝集体の測定値と前記第２の指標の測定値を含むデータに基づいて被験体指数を計算する工程を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
さらに、前記被験体指数を対照指数閾値と比較する工程を含み、
該対照指数閾値は、認知に関して正常な複数の対照被験体の生物学的試料中のＡβ４０凝集体の測定値と該対照被験体の前記第２の指標の測定値を含むデータから計算され；
評価対象の前記被験体と該対照被験体は同じ種であり；
該生物学的試料はすべて同じ試料型である、
請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第２の指標が前記生物学的試料において測定される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記第２の指標がＡβ４２単量体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記第２の指標がＡβ４０単量体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記第２の指標がＡβ４２単量体であり；
前記被験体指数が、評価対象の前記被験体におけるＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比であり；
前記対照指数閾値が、前記対照被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルとＡβ４２単量体レベルを含むデータから計算される対照比閾値である、
請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記第２の指標がＡβ４０単量体であり；
前記被験体指数が、評価対象の前記被験体におけるＡβ４０単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比であり；
前記対照指数閾値が、前記対照被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルとＡβ４０単量体レベルを含むデータから計算される対照比閾値である、
請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
さらに、前記比が前記対照比閾値よりも高い場合、評価対象の前記被験体がアルツハイマー病を有する増大した確率を有すると決定する工程を含み、前記生物学的試料がＣＳＦを含む、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記アルツハイマー病が初期病期である、請求項２０〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
評価対象の被験体においてアルツハイマー病を有しない増大した確率を評価するための方法であって、該方法は、
該被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比を得る工程；および
該被験体が臨床的認知障害を示さない場合、および該比が対照比閾値と同じであるか、またはそれより低い場合、該被験体はアルツハイマー病を有しない増大した確率を有すると決定する工程
を含み；
該対照比閾値は、認知に関して正常な複数の対照被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルとＡβ４２単量体レベルを含むデータから計算され；
評価対象の該被験体と該対照被験体は同じ種であり；
該生物学的試料はすべてＣＳＦを含み、該生物学的試料はいずれも脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含まない、
方法。
【請求項３１】
評価対象の被験体においてアルツハイマー病を有しない増大した確率の評価を補助するための方法であって、該方法は、
該被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルとＡβ４２単量体レベルを測定する工程；および
該Ａβ４０凝集体レベルと該Ａβ４２単量体レベル、または該Ａβ４２単量体レベルに対する該Ａβ４０凝集体レベルの比のいずれかを、異なる実体に連絡する工程
を含み；
該異なる実体により、該被験体が臨床的認知障害を示さない場合、および該比が対照比閾値と同じであるか、またはそれより低い場合、該被験体はアルツハイマー病を有しない増大した確率を有すると決定され；
該対照比閾値は、認知に関して正常な複数の対照被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルとＡβ４２単量体レベルを含むデータから計算され；
評価対象の該被験体と該対照被験体は同じ種であり；
該生物学的試料はすべてＣＳＦを含み、該生物学的試料はいずれも脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含まない、
方法。
【請求項３２】
アルツハイマー病に対する処置を何も受けたことがないアルツハイマー病の被験体の疾患進行をモニタリングするための方法であって、該方法は、
アルツハイマー病と診断された後の時点で該被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比を得る工程；および
（ａ）該被験体においてＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの初期病期の比が利用可能ならば、該比が該初期病期の比よりも小さい場合；あるいは（ｂ）該被験体において該初期病期の比が利用可能でないならば、該比が初期病期の比の標準より小さい場合、該被験体は、進んだ病期のアルツハイマー病に進行した増大した確率を有する；かまたは
（ａ）該被験体において該初期病期の比が利用可能ならば、該比が該初期病期の比と同じである場合；あるいは（ｂ）該被験体において該初期病期の比が利用可能でないならば、該比が該初期病期の比の標準と同じである場合、該被験体は、進んだ病期のアルツハイマー病に進行した低減した確率を有する
と決定する工程
を含み；
該初期病期の比は、該被験体からアルツハイマー病の初期病期のときに採取された生物学的試料におけるＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比であり；
該初期病期の比の標準は、初期病期であることが既知のアルツハイマー病の１例以上の標準被験体から採取された１つ以上の生物学的試料におけるＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比であり；
該被験体と該標準被験体は同じ種であり；
該生物学的試料はすべてＣＳＦを含み、該生物学的試料はいずれも脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含まない、
方法。
【請求項３３】
アルツハイマー病に対する処置を何も受けたことがないアルツハイマー病の被験体の疾患進行のモニタリングを補助するための方法であって、該方法は、
アルツハイマー病と診断された後の時点で該被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルとＡβ４２単量体レベルを測定する工程；および
該Ａβ４０凝集体レベルと該Ａβ４２単量体レベル、または該Ａβ４２単量体レベルに対する該Ａβ４０凝集体レベルの比のいずれかを、異なる実体に連絡する工程
を含み；
該異なる実体により、
（ａ）該被験体においてＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの初期病期の比が利用可能ならば、該Ａβ４２単量体レベルに対する該Ａβ４０凝集体レベルの比が該初期病期の比よりも低い場合；あるいは（ｂ）該被験体において該初期病期の比が利用可能でないならば、該比が初期病期の比の標準より小さい場合、該被験体は、進んだ病期のアルツハイマー病に進行した増大した確率を有する；かまたは
（ａ）該被験体において該初期病期の比が利用可能ならば、該比が該初期病期の比と同じである場合；あるいは（ｂ）該被験体において該初期病期の比が利用可能でないならば、該比が該初期病期標準と同じである場合、該被験体は、進んだ病期のアルツハイマー病に進行した低減した確率を有する
と決定され；
該初期病期の比は、該被験体からアルツハイマー病の初期病期のときに採取された生物学的試料におけるＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比であり；
該初期病期の比の標準は、初期病期であることが既知のアルツハイマー病の１例以上の標準被験体から採取された１つ以上の生物学的試料におけるＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比であり；
該被験体と該標準被験体は同じ種であり；
該生物学的試料はすべてＣＳＦを含み、該生物学的試料はいずれも脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含まない、
方法。
【請求項３４】
アルツハイマー病に対するなんらかの処置前にアルツハイマー病の被験体の疾患病期を指定するための方法であって、該方法は、
該被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比を得る工程；および
病期特異的比の標準が利用可能ならば、該比が該比の標準に近い場合、該被験体は該病期特異的比の標準のものと同じ疾患病期を有する増大した確率を有すると決定する工程
を含み；
該比の標準は、同じ既知病期のアルツハイマー病の１例以上の標準被験体から採取された１つ以上の生物学的試料におけるＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比であり；
該被験体と該標準被験体は同じ種であり；
該生物学的試料はすべてＣＳＦを含み、該生物学的試料はいずれも脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含まない、
方法。
【請求項３５】
アルツハイマー病に対するなんらかの処置前でのアルツハイマー病の被験体の疾患病期の指定を補助するための方法であって、該方法は、
該被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルとＡβ４２単量体レベルを測定する工程；および
該Ａβ４０凝集体レベルと該Ａβ４２単量体レベル、または該Ａβ４２単量体レベルに対する該Ａβ４０凝集体レベルの比のいずれかを、異なる実体に連絡する工程
を含み；
該異なる実体により、病期特異的比の標準が利用可能ならば、該比が該比の標準に近い場合、該被験体は該病期特異的比の標準のものと同じ疾患病期を有する増大した確率を有すると決定され；
該比の標準は、同じ既知病期のアルツハイマー病の１例以上の標準被験体から採取された１つ以上の生物学的試料におけるＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比であり；
該被験体と該標準被験体は同じ種であり；
該生物学的試料はすべてＣＳＦを含み、該生物学的試料はいずれも脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含まない、
方法。
【請求項３６】
前記初期病期の比の標準または前記病期特異的比の標準が、同じ既知病期のアルツハイマー病の複数の標準被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比の平均である、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも１つの初期病期の比の標準と少なくとも１つの進んだ病期の比の標準が前記比との比較に利用可能である、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３８】
さらに、評価対象の前記被験体においてＭＣＩからアルツハイマー病への進行の第２の指標の測定値を得る工程を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項３９】
さらに、前記Ａβ４０凝集体の測定値と前記第２の指標の測定値を含むデータに基づいて被験体指数を計算する工程を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
さらに、前記被験体指数を対照指数閾値と比較する工程を含み、
該対照指数閾値は、認知に関して正常な複数の対照被験体の生物学的試料中のＡβ４０凝集体の測定値と該対照被験体の前記第２の指標の測定値を含むデータから計算され；
評価対象の前記被験体と該対照被験体は同じ種であり；
該生物学的試料はすべて同じ試料型である、
請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記第２の指標が前記生物学的試料において測定される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記第２の指標がＡβ４２単量体である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記第２の指標がＡβ４２単量体であり；
前記被験体指数が、評価対象の前記被験体におけるＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比であり；
前記対照指数閾値が、前記対照被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルとＡβ４２単量体レベルを含むデータから計算される対照比閾値である、
請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
さらに、前記比が前記対照比閾値よりも高い場合、評価対象の前記被験体がアルツハイマー病を有する増大した確率を有すると決定する工程を含み、前記生物学的試料がＣＳＦを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
評価対象の被験体においてＭＣＩがアルツハイマー病に進行する増大した確率を評価するための方法であって、該方法は、
該被験体の生物学的試料中のＡβ４０凝集体の測定値を得る工程、
該Ａβ４０凝集体レベルが対照レベル閾値よりも高い場合、該被験体はＭＣＩがアルツハイマー病に進行する増大した確率を有すると決定する工程
を含み、
該対照レベル閾値は、認知に関して正常な複数の対照被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを含むデータから計算され；
評価対象の該被験体と該対照被験体は同じ種であり；
該生物学的試料はすべてＣＳＦを含み、該生物学的試料はいずれも脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含まない、
方法。
【請求項４６】
評価対象の被験体においてＭＣＩがアルツハイマー病に進行する増大した確率の評価を補助するための方法であって、該方法は、
該被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを測定する工程；および
該Ａβ４０凝集体レベルを異なる実体に連絡する工程
を含み；
該異なる実体により、該Ａβ４０凝集体レベルが対照レベル閾値よりも高い場合、該被験体はＭＣＩがアルツハイマー病に進行する増大した確率を有すると決定され；
該対照レベル閾値は、認知に関して正常な複数の対照被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを含むデータから計算され；
評価対象の該被験体と該対照被験体は同じ種であり；
該生物学的試料はすべてＣＳＦを含み、該生物学的試料はいずれも脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含まない、
方法。
【請求項４７】
評価対象の被験体においてＭＣＩがアルツハイマー病に進行する増大した確率を評価するための方法であって、該方法は、
該被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比を得る工程；および
該比が対照比閾値より高い場合、該被験体はＭＣＩがアルツハイマー病に進行する増大した確率を有すると決定する工程
を含み；
該対照比閾値は、認知に関して正常な複数の対照被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルとＡβ４２単量体レベルを含むデータから計算され；
評価対象の該被験体と該対照被験体は同じ種であり；
該生物学的試料はすべてＣＳＦを含み、該生物学的試料はいずれも脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含まない、
方法。
【請求項４８】
評価対象の被験体においてＭＣＩがアルツハイマー病に進行する増大した確率の評価を補助するための方法であって、該方法は、
該被験体の生物学的試料におけるＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比を決定する工程；および
該Ａβ４０凝集体レベルと該Ａβ４２単量体レベル、または該Ａβ４２単量体レベルに対する該Ａβ４０凝集体レベルの比のいずれかを、異なる実体に連絡する工程
を含み；
該異なる実体により、該比が対照比閾値より高い場合、該被験体はＭＣＩがアルツハイマー病に進行する増大した確率を有すると決定され；
該対照比閾値は、認知に関して正常な複数の対照被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルとＡβ４２単量体レベルを含むデータから計算され；
評価対象の該被験体と該対照被験体は同じ種であり；
該生物学的試料はすべてＣＳＦを含み、該生物学的試料はいずれも脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含まない、
方法。
【請求項４９】
評価対象の前記被験体またはアルツハイマー病の前記被験体がヒトである、上述の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
評価対象の前記被験体またはアルツハイマー病の前記被験体が非ヒト動物である、上述の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
評価対象の前記被験体またはアルツハイマー病の前記被験体が生体である、上述の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
前記対照被験体または前記標準被験体が生体である、請求項１０〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記生物学的試料が、前記対照被験体または前記標準被験体の前記生物学的試料と同じ方法を用いて同じ様式で収集される、上述の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
前記Ａβ４０凝集体の測定値または前記Ａβ４０凝集体レベルが、
前記ＣＳＦを凝集体特異的結合試薬と、該試薬が、Ａβ４０凝集体が存在する場合に該Ａβ４０凝集体に結合するのを可能にする条件下で接触させ、複合体を形成させる工程；および
前記被験体のＣＳＦ中にＡβ４０凝集体があれば、該Ａβ４０凝集体を、該試薬に対する結合によって検出する工程
を含む方法によって得られ；
該試薬は、固体支持体に結合されており、該固体支持体に結合されている場合、単量体よりも凝集体に優先的に結合する、
請求項１０〜５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
前記検出する工程が、サブ工程：
前記試薬とＡβ４０凝集体によって形成された前記複合体を、Ａβ４０の未結合単量体が存在する場合に該Ａβ４０の未結合単量体から分離する工程；
任意選択で、Ａβ４０凝集体を該複合体から解離させる工程；および
Ａβ４０凝集体を検出する工程
を含む、請求項９または５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記検出する工程が、サブ工程：
前記試薬とＡβ４０凝集体によって形成された前記複合体を、Ａβ４０の未結合単量体が存在する場合に該Ａβ４０の未結合単量体から分離し、該Ａβ４０の未結合単量体を除去する工程；
該複合体内に存在している該Ａβ４０凝集体を変性させ、Ａβ４０単量体を形成させる工程；および
Ａβ４０単量体を検出する工程
を含む、請求項９または５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記Ａβ４０凝集体の測定値または前記Ａβ４０凝集体レベルが、シード多量体化を含む方法によって得られる、請求項１〜８または１０〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記試薬がペプトイドを含む、請求項９または５４に記載の方法。
【請求項５９】
前記試薬がペプチドを含む、請求項９または５４に記載の方法。
【請求項６０】
前記試薬がデンドロンを含む、請求項９または５４に記載の方法。
【請求項６１】
前記固体支持体が、ニトロセルロース、ポリスチレンラテックス、ポリフッ化ビニル、ジアゾ化ペーパー、ナイロン膜、活性化ビーズ、磁気応答性ビーズ、酸化チタン、酸化ケイ素、多糖ビーズ、多糖膜、アガロース、ガラス、ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール−ポリスチレンハイブリッド、細孔制御ガラス、ガラススライド、金ビーズ、およびセルロースからなる群より選択される、請求項９または５４に記載の方法。
【請求項６２】
前記試薬が検出可能に標識されている、請求項９または５４に記載の方法。
【請求項６３】
前記Ａβ４０凝集体が、前記複合体を、未結合単量体が存在する場合に該未結合単量体から分離した後に、検出試薬によって検出される、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項６４】
前記検出試薬が検出可能に標識されている、請求項６３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２００９年１１月３０日に出願された米国仮出願番号第６１／２６５，３４０号への優先権を主張し、上記米国仮出願は、その全容が参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
加齢と関連している痴呆の最も一般的な形態であるアルツハイマー病は、次の５０年間の間に、世界人口の高い割合が６５歳より上になるため、多発する恐れがある。アルツハイマー患者に対する医療は社会に対して相当な経済的負担を提示し、そしてそれは増大しつつあるが、既存の数少ない処置は該疾患の症状を緩和するものにすぎず；利用可能な予防的処置はない。さらに、現在使用されている診断方法は、疾患が進行した後にしか現れない該疾患の容易に観察可能な症状に依存性のものである。
【０００３】
アルツハイマー病は、脳内へのミスフォールドしたＡβおよびタウタンパク質の蓄積と関連している。被験体の生体内および被験体の生体から採取した試料中におけるこれらのミスフォールドタンパク質の凝集体の検出は困難であることが示されている。患者の生体において該凝集体の存在を確認するために現在使用されている手法は、粗野で侵襲的である。例えば、組織病理学的検査には、被験体に対するリスクを伴う生検が必要とされ得る。病変部および凝集した病原性タンパク質の沈着は、生検材料を採取する場所によっては見逃すことがあるため、組織病理学的検査は本質的にサンプリングエラーが生じ易い。したがって、被験体が死亡する前での、この状態に対する確定診断および軽減処置は、依然として実質的に未解決の課題である。
【０００４】
アミロイド−ベータタンパク質（Ａβ）凝集体、主に、Ａβ１−４０（Ａβ４０）と１−４２（Ａβ４２）の脳内への沈着は、アルツハイマー病（ＡＤ）と関連しており、該疾患に対する優れた標準マーカーとみなされている。しかしながら、ＡＤに対する唯一の確定的試験は、死後脳試料での原線維性Ａβ凝集体斑の免疫組織化学的染色である。現在、ＡＤに対するＦＤＡ承認済の死亡前診断試験はない。死亡前試験には、血漿試料またはＣＳＦ試料が使用され得る。一部の死亡前ＡＤ試験は、脳脊髄液（ＣＳＦ）に着目し、可溶性の単量体Ａβ４２の定量を試みるものである。しかしながら、このバイオマーカーはＡＤの間接的な測定値としての機能を果たすにすぎない。
【０００５】
最近の文献において、Ａβの小分子可溶性非原線維性オリゴマー種が、おそらく、アルツハイマー病の表現型に直接寄与している神経毒性因子であると示唆されている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。さらに、Ａβ４２に対して生成させた抗体、または蛍光標識Ａβ４２を用いたシード多量体化ストラテジーを使用し、アルツハイマー病の患者から採取された脳脊髄液（ＣＳＦ）中には、健常対照被験体から採取されたＣＳＦと比べて、上昇したレベルのＡβオリゴマー種が見い出されている（非特許文献５；非特許文献６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｈｏｓｈｉら，ＰＮＡＳ，２００３，１００，６３７０
【非特許文献２】Ｌａｍｂｅｒｔら，ＰＮＡＳ，１９９８，９５，６４４８
【非特許文献３】ＳａｋａｎｏおよびＺａｋｏ，ＦＥＢＢＳ  Ｊ．，２０１０，２７７（６），１３４８
【非特許文献４】Ｆｕｋｕｍｏｔｏら，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，２０１０，２４，２７１６
【非特許文献５】Ｇｅｏｒｇａｎｏｐｏｕｌｏｕら  ＰＮＡＳ，２００５，１０２，２２７３
【非特許文献６】Ｐｉｔｓｃｈｋｅら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９８，４（７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
アルツハイマー病に対するより迅速でより効率的な診断、およびアルツハイマー病に対する潜在的治療薬へのより迅速でより効率的な評価を可能にする、アルツハイマー病の早期検出のためのさらなるバイオマーカーの使用の必要性が存在している。また、軽度認知障害（Ｍｉｌｄ  Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ（ＭＣＩ））の臨床診断による他の痴呆と対照的な、アルツハイマー病の予後診断の必要性が存在している。患者のアルツハイマー病の病期の決定を可能とする方法へのさらなる必要性が存在しており、それにより、処置および医療が効率的な保健医療レジメンへと適切に調整され得る。また、アルツハイマー病の進行の評価が可能になると、該疾患に対する潜在的治療薬の試験および評価が大きく補助される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
好ましい実施形態の簡単な概要
本明細書に記載の発明は、Ａβ４０凝集体を単独で、またはＡβ４２単量体、Ａβ４０単量体もしくは他の指標との組合せのいずれかで、アルツハイマー病のバイオマーカーとして用いる方法を提供することにより、これらの必要性を満たすものである。
【０００９】
したがって、一態様は、被験体の生物学的試料中のＡβ４０凝集体の測定値を得る工程を含み、該生物学的試料が脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含むものでない、評価対象の被験体においてアルツハイマー病を有する増大した確率の評価方法を含む。この態様の一部の特定の実施形態では、該方法は、さらに、Ａβ４０凝集体の測定値を、視覚的ディスプレイまたはプリンターを含む報告手段に報告する工程を含む。他の実施形態において、Ａβ４０凝集体の測定値としては、生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルが挙げられる。他の実施形態では、該方法は、さらに、Ａβ４０凝集体レベルが対照レベル閾値よりも高い場合、被験体はアルツハイマー病を有する増大した確率を有すると決定する工程を含み、ここで、対照レベル閾値は、認知に関して正常な複数の対照被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを含むデータから計算され；評価対象の被験体と対照被験体は同じ種であり；生物学的試料はすべて同じ試料型のものである。上記の方法の一部の特定の実施形態において、アルツハイマー病は初期病期のものである。
【００１０】
別の態様は、被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを得る工程；ならびに被験体が臨床的認知障害を示さない場合、およびＡβ４０凝集体レベルが対照レベル閾値と同じであるか、またはそれより低い場合、被験体はアルツハイマー病を有しない増大した確率を有すると決定する工程を含み；ここで、対照レベル閾値は、認知に関して正常な複数の対照被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを含むデータから計算され；評価対象の被験体と対照被験体は同じ種であり；生物学的試料はすべて同じ試料型のものであり、生物学的試料はいずれも脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含むものでない、評価対象の被験体においてアルツハイマー病を有しない増大した確率の評価方法を含む。
【００１１】
関連する一態様は、被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを測定する工程；およびＡβ４０凝集体レベルを異なる実体に連絡する工程を含み；ここで、該異なる実体により、被験体が臨床的認知障害を示さない場合、およびＡβ４０凝集体レベルが対照レベル閾値と同じであるか、またはそれより低い場合、被験体はアルツハイマー病を有しない増大した確率を有すると決定され；対照レベル閾値は、認知に関して正常な複数の対照被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを含むデータから計算され；評価対象の被験体と対照被験体は同じ種であり；生物学的試料はすべて同じ試料型のものであり、生物学的試料はいずれも脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含むものでない、評価対象の被験体においてアルツハイマー病を有しない増大した確率の評価を補助するための方法を含む。
【００１２】
また別の態様は、アルツハイマー病と診断された後の時点で被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを得る工程；ならびに（ａ）被験体において初期病期のＡβ４０凝集体レベルが利用可能ならば、Ａβ４０凝集体レベルが該初期病期のＡβ４０凝集体レベルよりも低い場合；あるいは（ｂ）被験体において初期病期レベルが利用可能でないならば、Ａβ４０凝集体レベルが初期病期標準よりも低い場合、被験体は、進んだ病期のアルツハイマー病に進行した増大した確率を有し；または、（ａ）被験体において初期病期レベルが利用可能ならば、Ａβ４０凝集体レベルが該初期病期レベルと同じである場合；あるいは（ｂ）被験体において初期病期レベルが利用可能でないならば、Ａβ４０凝集体レベルが初期病期標準と同じである場合、被験体は、進んだ病期のアルツハイマー病に進行した低減した確率を有すると決定する工程を含み；ここで、初期病期レベルは、被験体からアルツハイマー病の初期病期のときに採取された生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルであり；初期病期標準は、初期病期であることが既知のアルツハイマー病の１例以上の標準被験体から採取された１つ以上の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルであり；被験体と標準被験体は同じ種であり；生物学的試料はすべて同じ試料型のものであり、生物学的試料はいずれも脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含むものでない、アルツハイマー病に対する処置を何も受けたことがないアルツハイマー病の被験体の疾患進行のモニタリング方法を含む。
【００１３】
関連する一態様は、アルツハイマー病と診断された後の時点で被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを測定する工程；およびＡβ４０凝集体レベルを異なる実体に連絡する工程を含み；ここで、該異なる実体により、（ａ）被験体において初期病期のＡβ４０凝集体レベルが利用可能ならば、Ａβ４０凝集体レベルが該初期病期のＡβ４０凝集体レベルよりも低い場合；あるいは（ｂ）被験体において初期病期レベルが利用可能でないならば、Ａβ４０凝集体レベルが初期病期標準よりも低い場合、被験体は、進んだ病期のアルツハイマー病に進行した増大した確率を有し；または（ａ）被験体において初期病期レベルが利用可能ならば、Ａβ４０凝集体レベルが該初期病期レベルと同じである場合；あるいは（ｂ）被験体において初期病期レベルが利用可能でないならば、Ａβ４０凝集体レベルが初期病期標準と同じである場合、被験体は、進んだ病期のアルツハイマー病に進行した低減した確率を有すると決定され；初期病期レベルは、被験体からアルツハイマー病の初期病期のときに採取された生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルであり；初期病期標準は、初期病期であることが既知のアルツハイマー病の１例以上の標準被験体から採取された１つ以上の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルであり；被験体と標準被験体は同じ種であり；生物学的試料はすべて同じ試料型のものであり、生物学的試料はいずれも脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含むものでない、アルツハイマー病に対する処置を何も受けたことがないアルツハイマー病の被験体の疾患進行のモニタリングを補助するための方法を含む。
【００１４】
さらにまた別の態様は、被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを得る工程；および病期特異的標準が利用可能ならば、Ａβ４０凝集体レベルが病期特異的標準に近い場合、被験体は病期特異的標準と同じ疾患病期を有する増大した確率を有すると決定する工程を含み；ここで、病期特異的標準は、同じ既知病期のアルツハイマー病の１例以上の標準被験体から採取された１つ以上の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルであり；被験体と標準被験体は同じ種であり；生物学的試料はすべて同じ試料型のものであり、生物学的試料はいずれも脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含むものでない、アルツハイマー病に対するなんらかの処置前にアルツハイマー病の被験体の疾患病期を指定するための方法を含む。
【００１５】
関連する一態様は、被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを測定する工程；およびＡβ４０凝集体レベルを異なる実体に連絡する工程を含み；ここで、該異なる実体により、病期特異的標準が利用可能ならば、Ａβ４０凝集体レベルが病期特異的標準に近い場合、被験体は病期特異的標準と同じ疾患病期を有する増大した確率を有すると決定され；病期特異的標準は、同じ既知病期のアルツハイマー病の１例以上の標準被験体から採取された１つ以上の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルであり；被験体と標準被験体は同じ種であり；生物学的試料はすべて同じ試料型のものであり、生物学的試料はいずれも脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含むものでない、アルツハイマー病に対するなんらかの処置前でのアルツハイマー病の被験体の疾患病期の指定を補助するための方法を含む。
【００１６】
疾患進行および疾患病期の指定に関する方法の一部の特定の実施形態において、初期病期標準または病期特異的標準は、同じ既知病期のアルツハイマー病の複数の標準被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルの平均である。一部の実施形態では、少なくとも１つの初期病期標準と少なくとも１つの進んだ病期標準が、Ａβ４０凝集体レベルとの比較に利用可能である。
【００１７】
別の態様は、上記のアルツハイマー病を有する増大した確率を評価する方法であって、さらに、評価対象の被験体のアルツハイマー病の第２の指標の測定値を得る工程を含む方法を含む。一部の特定の実施形態では、Ａβ４０凝集体の測定値と第２の指標の測定値を含むデータに基づいて被験体指数を計算するさらなる工程が存在する。該方法の一部の実施形態では、該方法は、被験体指数の計算後、さらに、被験体指数を対照指数閾値と比較する工程を含み、ここで、対照指数閾値は、認知に関して正常な複数の対照被験体の生物学的試料中のＡβ４０凝集体の測定値と対照被験体において第２の指標の測定値を含むデータから計算され；評価対象の被験体と対照被験体は同じ種であり；生物学的試料はすべて同じ試料型のものである。
【００１８】
一部の特定の実施形態では、第２の指標は生物学的試料において測定される。好ましい実施形態では、第２の指標がＡβ４２単量体またはＡβ４０単量体である。一部の特定の実施形態では、第２の指標がＡβ４２単量体であり；被験体指数は、評価対象の被験体においてＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比であり；対照指数閾値は、対照被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルとＡβ４２単量体レベルを含むデータから計算される対照比閾値である。他の実施形態では、第２の指標がＡβ４０単量体であり、被験体指数が、評価対象の被験体においてＡβ４０単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比であり；対照指数閾値が、対照被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルとＡβ４０単量体レベルを含むデータから計算される対照比閾値である。
【００１９】
第２の指標がＡβ４２単量体またはＡβ４０単量体である方法の一部の特定の実施形態では、該比が対照比閾値よりも高い場合、評価対象の被験体はアルツハイマー病を有する増大した確率を有すると決定するさらなる工程が存在する。
【００２０】
第２の指標の検出に関する方法の一部の特定の実施形態において、アルツハイマー病は初期病期のものである。
【００２１】
別の態様は、被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比を得る工程；ならびに、被験体が臨床的認知障害を示さない場合、および該比が対照比閾値と同じであるか、またはそれより低い場合、被験体はアルツハイマー病を有しない増大した確率を有すると決定する工程を含み；ここで、対照比閾値は、認知に関して正常な複数の対照被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルとＡβ４２単量体レベルを含むデータから計算され；評価対象の被験体と対照被験体は同じ種であり；生物学的試料はすべて同じ試料型のものであり、生物学的試料はいずれも脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含むものでない、評価対象の被験体においてアルツハイマー病を有しない増大した確率の評価方法を含む。
【００２２】
関連する一態様は、被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルとＡβ４２単量体レベルを測定する工程；およびＡβ４０凝集体レベルとＡβ４２単量体レベル、またはＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比のいずれかを異なる実体に連絡する工程を含み；ここで、該異なる実体により、被験体が臨床的認知障害を示さない場合、および該比が対照比閾値と同じであるか、またはそれより低い場合、被験体はアルツハイマー病を有しない増大した確率を有すると決定され；対照比閾値は、認知に関して正常な複数の対照被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルとＡβ４２単量体レベルを含むデータから計算され；評価対象の被験体と対照被験体は同じ種であり；生物学的試料はすべて同じ試料型のものであり、生物学的試料はいずれも脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含むものでない、評価対象の被験体においてアルツハイマー病を有しない増大した確率の評価を補助するための方法を含む。
【００２３】
また別の態様は、アルツハイマー病と診断された後の時点で被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比を得る工程；ならびに（ａ）被験体においてＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの初期病期の比が利用可能ならば、該比が該初期病期の比よりも小さい場合；あるいは（ｂ）被験体において初期病期の比が利用可能でないならば、該比が初期病期の比の標準より小さい場合、被験体は、進んだ病期のアルツハイマー病に進行した増大した確率を有し；または（ａ）被験体において初期病期の比が利用可能ならば、該比が該初期病期の比と同じである場合；あるいは（ｂ）被験体において初期病期の比が利用可能でないならば、該比が初期病期の比の標準と同じである場合、被験体は、進んだ病期のアルツハイマー病に進行した低減した確率を有すると決定する工程を含み；前記初期病期の比は、前記被験体からアルツハイマー病の初期病期のときに採取された生物学的試料におけるＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比であり；前記初期病期の比の標準は、初期病期であることが既知のアルツハイマー病の１例以上の標準被験体から採取された１つ以上の生物学的試料におけるＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比であり；被験体と標準被験体は同じ種であり；生物学的試料はすべて同じ試料型のものであり、生物学的試料はいずれも脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含むものでない、アルツハイマー病に対する処置を何も受けたことがないアルツハイマー病の被験体の疾患進行のモニタリング方法を含む。
【００２４】
関連する一態様は、アルツハイマー病と診断された後の時点で被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルとＡβ４２単量体レベルを測定する工程；およびＡβ４０凝集体レベルとＡβ４２単量体レベル、またはＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比のいずれかを異なる実体に連絡する工程を含み；ここで、該異なる実体により、（ａ）被験体においてＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの初期病期の比が利用可能ならば、Ａβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比が該初期病期の比よりも低い場合；あるいは（ｂ）被験体において初期病期の比が利用可能でないならば、該比が初期病期の比の標準より小さい場合、被験体は、進んだ病期のアルツハイマー病に進行した増大した確率を有し；または（ａ）被験体において初期病期の比が利用可能ならば、該比が該初期病期の比と同じである場合；あるいは（ｂ）被験体において初期病期の比が利用可能でないならば、該比が初期病期標準と同じである場合、被験体は、進んだ病期のアルツハイマー病に進行した低減した確率を有すると決定され；ここで、初期病期の比は、被験体から初期病期のアルツハイマー病のときに採取された生物学的試料におけるＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比であり；初期病期の比の標準は、初期病期であることが既知のアルツハイマー病の１例以上の標準被験体から採取された１つ以上の生物学的試料におけるＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比であり；被験体と標準被験体は同じ種であり；生物学的試料はすべて同じ試料型のものであり、生物学的試料はいずれも脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含むものでない、アルツハイマー病に対する処置を何も受けたことがないアルツハイマー病の被験体の疾患進行のモニタリングを補助するための方法を含む。
【００２５】
さらにまた別の態様は、被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比を得る工程；ならびに病期特異的比の標準が利用可能ならば、該比が該比の標準に近い場合、被験体は該病期特異的比の標準のものと同じ疾患病期を有する増大した確率を有すると決定する工程を含み；該比の標準は、同じ既知病期のアルツハイマー病の１例以上の標準被験体から採取された１つ以上の生物学的試料におけるＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比であり；被験体と標準被験体は同じ種であり；生物学的試料はすべて同じ試料型のものであり、生物学的試料はいずれも脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含むものでない、アルツハイマー病に対するなんらかの処置前にアルツハイマー病の被験体の疾患病期を指定するための方法を含む。
【００２６】
関連する一態様は、被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルとＡβ４２単量体レベルを測定する工程；およびＡβ４０凝集体レベルとＡβ４２単量体レベル、またはＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比のいずれかを異なる実体に連絡する工程を含み；ここで、該異なる実体により、病期特異的比の標準が利用可能ならば、該比が該比の標準に近い場合、被験体は該病期特異的比の標準のものと同じ疾患病期を有する増大した確率を有すると決定され；該比の標準は、同じ既知病期のアルツハイマー病の１例以上の標準被験体から採取された１つ以上の生物学的試料におけるＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比であり；被験体と標準被験体は同じ種であり；生物学的試料はすべて同じ試料型のものであり、生物学的試料はいずれも脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含むものでない、アルツハイマー病に対するなんらかの処置前でのアルツハイマー病の被験体の疾患病期の指定を補助するための方法を含む。
【００２７】
疾患進行または病期のバイオマーカーとして使用されるＡβ４０凝集体の比に関する方法の一部の特定の実施形態において、初期病期の比の標準または病期特異的比の標準は、同じ既知病期のアルツハイマー病の複数の標準被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比の平均である。一部の特定の実施形態では、少なくとも１つの初期病期の比の標準と少なくとも１つの進んだ病期の比の標準が、該比との比較に利用可能である。
【００２８】
また別の態様において、本明細書に記載の方法は、被験体の生物学的試料中のＡβ４０凝集体の測定値を得る工程を含み、該生物学的試料が脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含むものでない、ＭＣＩがアルツハイマー病に進行する増大した確率の評価方法を含む。この態様の一部の特定の実施形態では、該方法は、さらに、Ａβ４０凝集体の測定値を、視覚的ディスプレイまたはプリンターを含む報告手段に報告する工程を含む。他の実施形態において、Ａβ４０凝集体の測定値としては、生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルが挙げられる。他の実施形態では、該方法は、さらに、Ａβ４０凝集体レベルが対照レベル閾値よりも高い場合、被験体はＭＣＩがアルツハイマー病に進行する増大した確率を有すると決定する工程を含み、ここで、対照レベル閾値は、認知に関して正常な複数の対照被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを含むデータから計算され；評価対象の被験体と対照被験体は同じ種であり；生物学的試料はすべて同じ試料型のものである。上記の方法の一部の特定の実施形態において、アルツハイマー病は初期病期のものである。
【００２９】
別の態様は、上記のＭＣＩがアルツハイマー病に進行する増大した確率の評価方法であって、さらに、評価対象の被験体においてＭＣＩがアルツハイマー病に進行する第２の指標の測定値を得る工程を含む方法を含む。一部の特定の実施形態では、Ａβ４０凝集体の測定値と第２の指標の測定値を含むデータに基づいて被験体指数を計算するさらなる工程が存在する。該方法の一部の実施形態では、該方法は、被験体指数の計算後、さらに、被験体指数を対照指数閾値と比較する工程を含み、ここで、対照指数閾値は、認知に関して正常な複数の対照被験体の生物学的試料中のＡβ４０凝集体の測定値と対照被験体において第２の指標の測定値を含むデータから計算され；評価対象の被験体と対照被験体は同じ種であり；生物学的試料はすべて同じ試料型のものである。
【００３０】
一部の特定の実施形態では、第２の指標は生物学的試料において測定される。好ましい実施形態では、第２の指標がＡβ４２単量体である。一部の特定の実施形態では、第２の指標がＡβ４２単量体であり；被験体指数は、評価対象の被験体においてＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比であり；対照指数閾値は、対照被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルとＡβ４２単量体レベルを含むデータから計算される対照比閾値である。第２の指標がＡβ４２単量体である方法の一部の特定の実施形態では、該比が対照比閾値よりも高い場合、評価対象の被験体は、ＭＣＩがアルツハイマー病に進行する増大した確率を有すると決定するさらなる工程が存在する。第２の指標の検出に関する方法の一部の特定の実施形態において、アルツハイマー病は初期病期のものである。
【００３１】
別の態様は、被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体の測定値を得る工程、Ａβ４０凝集体レベルが対照レベル閾値よりも高い場合、被験体はＭＣＩがアルツハイマー病に進行する増大した確率を有すると決定する工程を含み、ここで、対照レベル閾値は、認知に関して正常な複数の対照被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを含むデータから計算され；評価対象の被験体と対照被験体は同じ種であり；前記生物学的試料はすべてＣＳＦを含むものであり、生物学的試料はいずれも脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含むものでない、評価対象の被験体においてＭＣＩがアルツハイマー病に進行する増大した確率の評価方法を含む。
【００３２】
関連する一態様は、被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを測定する工程；およびＡβ４０凝集体レベルを異なる実体に連絡する工程を含み；ここで、該異なる実体により、Ａβ４０凝集体レベルが対照レベル閾値よりも高い場合、被験体はＭＣＩがアルツハイマー病に進行する増大した確率を有すると決定され；対照レベル閾値は、認知に関して正常な複数の対照被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを含むデータから計算され；評価対象の被験体と対照被験体は同じ種であり；生物学的試料はすべてＣＳＦを含むものであり、生物学的試料はいずれも脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含むものでない、評価対象の被験体においてＭＣＩがアルツハイマー病に進行する増大した確率の評価を補助するための方法を含む。
【００３３】
また別の態様は、被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比を得る工程；ならびに、該比が対照比閾値よりも高い場合、被験体はＭＣＩがアルツハイマー病に進行する増大した確率を有すると決定する工程を含み；ここで、対照比閾値は、認知に関して正常な複数の対照被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルとＡβ４２単量体レベルを含むデータから計算され；評価対象の被験体と対照被験体は同じ種であり；生物学的試料はすべてＣＳＦを含むものであり、生物学的試料はいずれも脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含むものでない、評価対象の被験体においてＭＣＩがアルツハイマー病に進行する増大した確率の評価方法を含む。
【００３４】
関連する一態様は、被験体の生物学的試料におけるＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比を決定する工程；およびＡβ４０凝集体レベルとＡβ４２単量体レベル、またはＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比のいずれかを異なる実体に連絡する工程を含み；ここで、該異なる実体により、該比が対照比閾値よりも高い場合、被験体はＭＣＩがアルツハイマー病に進行する増大した確率を有すると決定され；対照比閾値は、認知に関して正常な複数の対照被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルとＡβ４２単量体レベルを含むデータから計算され；評価対象の被験体と対照被験体は同じ種であり；生物学的試料はすべてＣＳＦを含むものであり、生物学的試料はいずれも脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含むものでない、評価対象の被験体においてＭＣＩがアルツハイマー病に進行する増大した確率の評価を補助するための方法を含む。
【００３５】
上記の方法は、種々の異なる被験体を用いて実施され得る。上記のいずれかの方法の一部の特定の実施形態では、評価対象の被験体またはアルツハイマー病の被験体はヒトである。上記の方法の他の実施形態では、評価対象の被験体またはアルツハイマー病の被験体は非ヒト動物である。一部の特定の実施形態では、評価対象の被験体またはアルツハイマー病の被験体が生体であるか、あるいは対照被験体または標準被験体が生体である。
【００３６】
上記の方法は、種々の異なる生物学的試料において実施され得る。一部の特定の実施形態では、評価対象の被験体またはアルツハイマー病の被験体の生物学的試料は、体液または体組織を含むものである。具体的な実施形態において、生物学的試料は、全血、血液分画物、血液成分、血漿、血小板、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、骨髄、尿、涙液、乳汁、リンパ液、器官組織、神経系の組織、非神経系の組織、筋肉組織、生検材料、剖検材料、脂肪生検材料、脂肪組織、細胞、糞便、胎盤、脾臓組織、リンパ組織、膵臓組織、気管支肺胞洗浄物（ＢＡＬ）、または滑液を含むものであり得る。好ましい実施形態では、生物学的試料は血漿、血清、ＣＳＦまたは尿を含むものであり得る。
【００３７】
該試料が体液または組織を含むものである方法の実施形態では、Ａβ４０凝集体は好ましくは循環している。一部の特定の実施形態では、生物学的試料が、対照被験体または標準被験体の生物学的試料の場合と同じ様式で同じ方法を用いて収集される。
【００３８】
上記に記載のいずれかの方法の一部の特定の実施形態では、生物学的試料が体液を含むものであり；Ａβ４０凝集体の測定値またはＡβ４０凝集体レベルが、体液を凝集体特異的結合試薬と、該試薬がＡβ４０凝集体（存在する場合）に結合するのを可能にする条件下で接触させ、複合体を形成させる工程；および該被験体の生物学的試料中のＡβ４０凝集体（あれば）を、該試薬に対するその結合によって検出する工程を含む方法によって得られ；ここで、該試薬は、固体支持体に結合されており、該固体支持体に結合されている場合、単量体よりも凝集体に優先的に結合するものである。
【００３９】
他の実施形態では、生物学的試料が体組織を含むものであり；Ａβ４０凝集体の測定値またはＡβ４０凝集体レベルが、体組織のホモジネートを準備する工程；該ホモジネートを凝集体特異的結合試薬と、該試薬がＡβ４０凝集体（存在する場合）に結合するのを可能にする条件下で接触させ、複合体を形成させる工程；および該被験体の生物学的試料中のＡβ４０凝集体（あれば）を、該試薬に対するその結合によって検出する工程を含む方法によって得られ；ここで、該試薬は、固体支持体に結合されており、該固体支持体に結合されている場合、単量体よりも凝集体に優先的に結合するものである。
【００４０】
一部の特定の実施形態では、検出工程が、サブ工程である、試薬とＡβ４０凝集体によって形成された複合体を、Ａβ４０の未結合単量体（存在する場合）から分離する工程；任意選択で、Ａβ４０凝集体を複合体から解離させる工程；およびＡβ４０凝集体を検出する工程を含む。他の実施形態では、検出工程が、サブ工程である、試薬とＡβ４０凝集体によって形成された複合体をＡβ４０の未結合単量体（存在する場合）から分離し、Ａβ４０の未結合単量体を除去する工程；複合体内に存在しているＡβ４０凝集体を変性させ、Ａβ４０単量体を形成させる工程；およびＡβ４０単量体を検出する工程を含む。Ａβ４０凝集体は、該複合体を未結合単量体（存在する場合）から分離した後に、検出試薬によって検出され得る。検出試薬は検出可能に標識されていてもよい。
【００４１】
さらに他の実施形態では、Ａβ４０凝集体の測定値またはＡβ４０凝集体レベルは、シード多量体化を用いた方法によって得られる。凝集体特異的結合試薬を用いる方法の実施形態では、該試薬はペプチド、ペプトイドまたはデンドロンであり得；固体支持体はニトロセルロース、ポリスチレンラテックス、ポリフッ化ビニル、ジアゾ化ペーパー、ナイロン膜、活性化ビーズ、磁気応答性ビーズ、酸化チタン、酸化ケイ素、多糖ビーズ、多糖膜、アガロース、ガラス、ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール−ポリスチレンハイブリッド、細孔制御ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）、ガラススライド、金ビーズ、またはセルロースであり得；該試薬は検出可能に標識されていてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、Ａβ凝集体の検出に使用されるミスフォールドタンパク質アッセイ（Ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（ＭＰＡ））の工程を示す。
【図２】図２は、市販供給源Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＡＢＳ）由来の８例のＡＤと８例の対照ＣＳＦ試料で得られたＡβ４０凝集体の結果を示す。パネルＡ：対照群とＡＤ群との間でＡβ４０凝集体結果に統計学的有意差がみとめられる；パネルＢ：臨床認知ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）試験スコアに基づいて、ＡＤ群を疾患病期に従って分けた。ＡＮＯＶＡは、これらの試料が単一の集団に由来するものでないことを示す。群間の有意差を示す個々のｔ−検定を示す。すべてのグラフにおいてＹ軸は、ＭＰＡで検出された相対的光単位である。
【図３】図３は、市販供給源（ＡＢＳ）由来の３５例のＡＤと２３例の対照ＣＳＦ試料で得られたＡβ４０凝集体の結果を示す。パネルＡ：対照群とＡＤ群との間でＡβ４０凝集体結果に統計学的有意差がみとめられる；パネルＢ：ＡＤ試料は、供給元によって疾患病期に分けられた。ＡＮＯＶＡは、これらの試料が単一の集団に由来するものでないことを示す。群間の有意差を示す個々のｔ−検定を示す。すべてのグラフにおいてＹ軸は、ＭＰＡで検出された相対的光単位である。
【図４】図４は、大学病院の研究室から得た２６例のＡＤと１０例の適合対照ＣＳＦ試料で得られたＡβ４０凝集体の結果を示す。パネルＡ：対照群とＡＤ群との間でＡβ４０凝集体結果に統計学的有意差がみとめられる。Ｙ軸は、ＭＰＡで検出された相対的光単位である。パネルＢ：臨床認知ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）試験スコアに基づいて、ＡＤ群を疾患病期に従って分けた。ＡＮＯＶＡは、これらの試料が単一の集団に由来するものでないことを示す。群間の有意差を示す個々のｔ−検定を示す。
【図５−１】図５は、図４に示したものと同じ２６例のＡＤと１０例の適合対照ＣＳＦ試料で得られたＡβ４２単量体およびＡβ４０凝集体／Ａβ４２単量体比の結果を示す。パネルＡ：ＡＤ試料におけるＡβ４２単量体シグナルの統計学的に有意な減少が、捕捉前ＣＳＦにおいて測定されている。Ｙ軸は、捕捉前ＣＳＦ中のイムノアッセイによって測定されたＡβ４２単量体のｐｇ／ｍｌである。パネルＢ：ＡＤ試料におけるＡβ４０凝集体／Ａβ４２単量体比の統計学的に有意な増大が観察される。パネルＣ：臨床認知ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）試験スコアに基づいて、ＡＤ群を疾患病期に従って分けた。ＡＮＯＶＡは、これらの試料が単一の集団に由来するものでないことを示す。群間の有意差を示す個々のｔ−検定を示す。パネルＢおよびＣにおいて、Ｙ軸は、捕捉前ＣＳＦ中のイムノアッセイによって測定されたＡβ４２単量体のｐｇ／ｍｌに対するＭＰＡで検出されたＡβ４０シグナルの相対的光単位の比である。
【図５−２】図５は、図４に示したものと同じ２６例のＡＤと１０例の適合対照ＣＳＦ試料で得られたＡβ４２単量体およびＡβ４０凝集体／Ａβ４２単量体比の結果を示す。パネルＡ：ＡＤ試料におけるＡβ４２単量体シグナルの統計学的に有意な減少が、捕捉前ＣＳＦにおいて測定されている。Ｙ軸は、捕捉前ＣＳＦ中のイムノアッセイによって測定されたＡβ４２単量体のｐｇ／ｍｌである。パネルＢ：ＡＤ試料におけるＡβ４０凝集体／Ａβ４２単量体比の統計学的に有意な増大が観察される。パネルＣ：臨床認知ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）試験スコアに基づいて、ＡＤ群を疾患病期に従って分けた。ＡＮＯＶＡは、これらの試料が単一の集団に由来するものでないことを示す。群間の有意差を示す個々のｔ−検定を示す。パネルＢおよびＣにおいて、Ｙ軸は、捕捉前ＣＳＦ中のイムノアッセイによって測定されたＡβ４２単量体のｐｇ／ｍｌに対するＭＰＡで検出されたＡβ４０シグナルの相対的光単位の比である。
【図６】図６は、図４に示したものと同じ臨床試料の組（２６例のＡＤと１０例の適合対照ＣＳＦ試料）のＡＤ対対照のデータのＲＯＣ曲線を示す。
【図７】図７は、図４に示したものと同じ臨床試料の組（１３例の初期ＡＤと１０例の適合対照ＣＳＦ試料）の初期病期のＡＤ対対照のデータのＲＯＣ曲線を示す。
【図８】図８は、図４に示したものと同じ２６例のＡＤと１０例の適合対照ＣＳＦ試料で得られたＡβ４０単量体およびＡβ４０凝集体／Ａβ４０単量体比の結果を示す。パネルＡ：Ａβ４０単量体シグナルの統計学的に有意な減少は、捕捉前ＣＳＦにおいて測定したＡＤでは観察されなかった。パネルＡのグラフのＹ軸は、捕捉前ＣＳＦ中のイムノアッセイによって測定されたＡβ４０単量体のｐｇ／ｍｌである。パネルＢ：ＡＤ試料におけるＡβ４０凝集体レベル／Ａβ４０単量体レベル比の統計学的に有意な増大が観察される。Ｙ軸は、捕捉前ＣＳＦ中のイムノアッセイによって測定されたＡβ４０単量体のｐｇ／ｍｌに対するＭＰＡで検出されたＡβ４０シグナルの相対的光単位の比である。
【図９−１】図９は、同じ大学病院の研究室由来の大きな臨床試料の組（４７例のＡＤ、７１例のＭＣＩ、および２１例の対照）で得られたＡβ４０凝集体の結果を示す。パネルＡ：試料を、まず、ＣＳＦ収集時点の臨床診断に基づいて３つの異なる集団にグループ分けした。ＡＮＯＶＡでは、この３つの群間に統計学的な差はみとめられないが、対照群とＡＤ群とでＡβ４０凝集体結果に統計学的有意差がみとめられる。パネルＢ：ＭＣＩ試料を、さらに、ＣＳＦ試料収集後に行なった追跡臨床診断に基づいてサブ分類した。対照群とＡＤ群との間でＡβ４０凝集体結果に統計学的有意差がみとめられる。パネルＣ：ＭＣＩからＡＤの群において単一の高い値の外れ値を除いた後のサブ分類したＭＣＩ試料。ＡＮＯＶＡは、これらの試料が単一の集団に由来するものでないことを示す。群間の有意差を示す個々のｔ−検定を示す。すべてのグラフにおいてＹ軸は、ＭＰＡで検出された相対的光単位である。
【図９−２】図９は、同じ大学病院の研究室由来の大きな臨床試料の組（４７例のＡＤ、７１例のＭＣＩ、および２１例の対照）で得られたＡβ４０凝集体の結果を示す。パネルＡ：試料を、まず、ＣＳＦ収集時点の臨床診断に基づいて３つの異なる集団にグループ分けした。ＡＮＯＶＡでは、この３つの群間に統計学的な差はみとめられないが、対照群とＡＤ群とでＡβ４０凝集体結果に統計学的有意差がみとめられる。パネルＢ：ＭＣＩ試料を、さらに、ＣＳＦ試料収集後に行なった追跡臨床診断に基づいてサブ分類した。対照群とＡＤ群との間でＡβ４０凝集体結果に統計学的有意差がみとめられる。パネルＣ：ＭＣＩからＡＤの群において単一の高い値の外れ値を除いた後のサブ分類したＭＣＩ試料。ＡＮＯＶＡは、これらの試料が単一の集団に由来するものでないことを示す。群間の有意差を示す個々のｔ−検定を示す。すべてのグラフにおいてＹ軸は、ＭＰＡで検出された相対的光単位である。
【図１０−１】図１０は、図９に示したものと同じ４７例のＡＤ、７１例のＭＣＩ、および２１例の適合対照ＣＳＦ試料で得られたＡβ４２単量体およびＡβ４０凝集体／Ａβ４２単量体比の結果を示す。パネルＡ：ＭＣＩ試料とＡＤ試料の両方で、捕捉前ＣＳＦにおいて測定されたＡβ４２単量体シグナルに統計学的に有意な減少がみとめられる。パネルＢ：対照群とＭＣＩ群およびＡＤ群との間でＡβ４０凝集体／Ａβ４２単量体比の結果に統計学的有意差が認められる。パネルＣ：対照群と後にＡＤに進行したＭＣＩ群およびＡＤ群の両方との間で、Ａβ４２単量体の結果に統計学的有意差が認められる。パネルＤ：対照群と、後にＡＤに進行するＭＣＩ群およびＡＤ群との間でＡβ４０凝集体／Ａβ４２単量体の結果に統計学的有意差が認められる。すべてのパネルにおいて、ＡＮＯＶＡは、これらの試料が単一の集団に由来するものでないことを示す。群間の有意差を示す個々のｔ−検定を示す。パネルＡおよびＣのグラフのＹ軸は、捕捉前ＣＳＦ中のイムノアッセイによって測定されたＡβ４２単量体のｐｇ／ｍｌである。パネルＢおよびＤのＹ軸は、捕捉前ＣＳＦ中のイムノアッセイによって測定されたＡβ４２単量体のｐｇ／ｍｌに対するＭＰＡで検出されたＡβ４０シグナルの相対的光単位の比である。
【図１０−２】図１０は、図９に示したものと同じ４７例のＡＤ、７１例のＭＣＩ、および２１例の適合対照ＣＳＦ試料で得られたＡβ４２単量体およびＡβ４０凝集体／Ａβ４２単量体比の結果を示す。パネルＡ：ＭＣＩ試料とＡＤ試料の両方で、捕捉前ＣＳＦにおいて測定されたＡβ４２単量体シグナルに統計学的に有意な減少がみとめられる。パネルＢ：対照群とＭＣＩ群およびＡＤ群との間でＡβ４０凝集体／Ａβ４２単量体比の結果に統計学的有意差が認められる。パネルＣ：対照群と後にＡＤに進行したＭＣＩ群およびＡＤ群の両方との間で、Ａβ４２単量体の結果に統計学的有意差が認められる。パネルＤ：対照群と、後にＡＤに進行するＭＣＩ群およびＡＤ群との間でＡβ４０凝集体／Ａβ４２単量体の結果に統計学的有意差が認められる。すべてのパネルにおいて、ＡＮＯＶＡは、これらの試料が単一の集団に由来するものでないことを示す。群間の有意差を示す個々のｔ−検定を示す。パネルＡおよびＣのグラフのＹ軸は、捕捉前ＣＳＦ中のイムノアッセイによって測定されたＡβ４２単量体のｐｇ／ｍｌである。パネルＢおよびＤのＹ軸は、捕捉前ＣＳＦ中のイムノアッセイによって測定されたＡβ４２単量体のｐｇ／ｍｌに対するＭＰＡで検出されたＡβ４０シグナルの相対的光単位の比である。
【図１１】図１１は、図９に示したものと同じ大きな臨床試料の組（４７例のＡＤ、７１例のＭＣＩ、および２１例の対照）の対照対ＡＤのデータのＲＯＣ曲線を示す。
【図１２】図１２は、図９に示したものと同じ大きな臨床試料の組（４７例のＡＤ、７１例のＭＣＩ、および２１例の対照）の対照対ＡＤに進行するＭＣＩおよびＡＤのデータのＲＯＣ曲線を示す。
【図１３−１】図１３は、大学病院の研究室から得た別の異なるＣＳＦ試料の組で得られたＡβ４０凝集体とＡβ４２単量体の結果を示す。パネルＡ：対照群とＡＤ群との間でＡβ４０凝集体結果に統計学的有意差はみとめられない。Ｙ軸は、ＭＰＡで検出された相対的光単位である。パネルＢ：対照群とＡＤ群との間でＡβ４２単量体の結果に統計学的有意差はみとめられない。Ｙ軸は、捕捉前ＣＳＦ中のイムノアッセイによって測定されたＡβ４２単量体のｐｇ／ｍｌである。パネルＣ：対照群とＡＤ群との間でＡβ４０凝集体／Ａβ４２単量体の結果に統計学的有意差はみとめられない。Ｙ軸は、捕捉前ＣＳＦ中のイムノアッセイによって測定されたＡβ４２単量体のｐｇ／ｍｌに対するＭＰＡで検出されたＡβ４０シグナルの相対的光単位である。
【図１３−２】図１３は、大学病院の研究室から得た別の異なるＣＳＦ試料の組で得られたＡβ４０凝集体とＡβ４２単量体の結果を示す。パネルＡ：対照群とＡＤ群との間でＡβ４０凝集体結果に統計学的有意差はみとめられない。Ｙ軸は、ＭＰＡで検出された相対的光単位である。パネルＢ：対照群とＡＤ群との間でＡβ４２単量体の結果に統計学的有意差はみとめられない。Ｙ軸は、捕捉前ＣＳＦ中のイムノアッセイによって測定されたＡβ４２単量体のｐｇ／ｍｌである。パネルＣ：対照群とＡＤ群との間でＡβ４０凝集体／Ａβ４２単量体の結果に統計学的有意差はみとめられない。Ｙ軸は、捕捉前ＣＳＦ中のイムノアッセイによって測定されたＡβ４２単量体のｐｇ／ｍｌに対するＭＰＡで検出されたＡβ４０シグナルの相対的光単位である。
【図１４】図１４は、１６，０００ｇで１０分間または１３４，０００ｇで１時間遠心分離したアルツハイマー病ＣＳＦおよび正常ＣＳＦの上清およびペレット中の、ミスフォールドタンパク質アッセイによって検出されたＡβ４０凝集体の量を示す。説明：小チェック模様：Ａβ４０の総量；大チェック模様：１６，０００ｇの上清；水平線：１６，０００のペレット；垂直線：１３４，０００ｇの上清、斜線：１３４，０００ｇのペレット。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
詳細説明
本発明は、一部において、アルツハイマー病の確率の評価、アルツハイマー病の進行のモニタリング、アルツハイマー病の病期の指定、およびアルツハイマー病の早期診断、特に、ＭＣＩ患者がアルツハイマー病に進行する確率の評価に使用され得るバイオマーカーの発見に関する。特に、本発明は、Ａβ４０の凝集体を、単独で、またはＡβ４０もしくはＡβ４２の単量体との組合せで、アルツハイマー病の確率の評価、アルツハイマー病の進行のモニタリング、およびアルツハイマー病の病期の指定に使用することを伴う方法を含む。
【００４４】
本発明の実施には、特に記載のない限り、当該技術分野の技量の範囲内である化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の慣用的な方法が使用される。かかる手法は文献に充分に説明されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ならびにＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版，１９８９）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｂｉｒｄｉ，Ｋ．Ｓ．編，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第４版（Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９９，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｎ  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ，（Ｒｅａｍら編，１９９８，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）；ＰＣＲ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ），第２版（Ｎｅｗｔｏｎ  ＆  Ｇｒａｈａｍ編，１９９７，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）；ＰｅｔｅｒｓおよびＤａｌｒｙｍｐｌｅ，Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（第２版），Ｆｉｅｌｄｓら（編），Ｂ．Ｎ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照のこと。
【００４５】
本発明の試薬および方法は、特定の処方またはプロセスパラメータに限定されず、そのため、もちろんさまざまであり得ることは理解されよう。また、本明細書で用いる専門用語は、本発明の特定の実施形態を説明する目的のためのものにすぎず、限定を意図しないことも理解されよう。
【００４６】
Ｉ．定義
本発明の理解を容易にするため、本出願書類において用いている選択した用語を以下に論じる。
【００４７】
「バイオマーカー」は、本明細書で用いる場合、限定されないが、タンパク質、核酸、および代謝産物を包含するとともに、その多型、変異物、バリアント、修飾物、サブユニット、断片、タンパク質−リガンド複合体、および分解生成物、タンパク質−リガンド複合体、元素、関連代謝産物、ならびに生物学的状態と関連している他の分析物または試料由来測定値を包含する。また、バイオマーカーとしては、変異タンパク質または変異核酸も挙げられ得る。用語「分析物」は、本明細書で用いる場合、測定される任意の物質を意味するものであり得、電解質および元素（カルシウムなど）を包含し得る。
【００４８】
本明細書で用いる場合、「Ａβ４０単量体」は、凝集するときに露出されないＡβ４０上のエピトープに特異的な抗体によって検出される未変性の完全Ａβ４０タンパク質をいう。「Ａβ４２単量体」は、凝集するときに露出されないＡβ４２上のエピトープに特異的な抗体によって検出される未変性の完全Ａβ４２タンパク質をいう。
【００４９】
本明細書で用いる場合、用語「凝集体」は、非天然配座異性体間の非天然相互作用によって生じるタンパク質の１コピーより多くの該配座異性体を含む複合体をいう。凝集体は、多コピーの同じタンパク質、多コピーの１種類より多くのタンパク質、ならびにさらなる成分、例えば限定されないが、糖タンパク質、リポタンパク質、脂質、グリカン、核酸および塩を含むものであり得る。凝集体は、封入体、斑またはアグリソームなどの構造で存在するものであってもよい。凝集体は、原線維の形成に関する経路内のものであっても経路外のものであってもよい。凝集体の一例は、無定形（ａｍｏｒｐｈｏｕｓ）凝集体、オリゴマーおよび原線維である。無定形凝集体は、典型的には、不規則で不溶性である。「オリゴマー」は、本明細書で用いる場合、タンパク質の１コピーより多くの非天然配座異性体を含むものである。典型的には、これは、少なくとも２つの単量体を含むものであるが、１０００個以下の単量体、または一部の場合では１０６個以下の単量体を含むものである。オリゴマーとしては、小ミセル凝集体および前原線維（ｐｒｏｔｏｆｉｂｒｉｌ）が挙げられる。小ミセル凝集体は、典型的には、可溶性であり、規則正しく、球状の構造である。また、前原線維も、典型的には、可溶性であり、ベータ−シート構造を有する規則正しい凝集体である。前原線維は、典型的には、曲線を有する構造であり、少なくとも１０個、または一部の場合では少なくとも２０個の単量体を含むものである。原線維は、典型的には、不溶性であり、高度に規則正しい凝集体である。原線維は、典型的には、数百個から数千個の単量体を含むものである。原線維としては、例えば、アミロイドが挙げられ、これは、交差ベータシート構造を示し、コンゴレッドで染色し、偏光下で見た場合、青リンゴ色の複屈折によって確認され得る。単一の試料中に含まれている場合、無定形凝集体、オリゴマーおよび原線維などの凝集体は、遠心分離によって分離され得る。例えば、１４，０００×ｇで１０分間の遠心分離では、典型的には、非常に大きな凝集体（大きな原線維および無定形凝集体（１０〜１０００ＭＤａ）など）のみが除去され、１００，０００×ｇで１時間の遠心分離では、典型的には、１ＭＤａより大きな凝集体（小分子原線維および無定形凝集体など）が除去される。凝集体の大きさおよび可溶性は、分離に必要とされる沈降速度に影響を及ぼす。本発明の好ましい実施形態では、凝集体はＡβ４０を含むものである。
【００５０】
用語「凝集体特異的結合試薬」または「ＡＳＢ試薬」は、特定の電荷密度において固体支持体に結合させた場合、単量体と比べて凝集体に優先的に結合する任意の型の試薬（例えば限定されないが、ペプチド、ペプトイドおよびデンドロン）をいう。この結合は、親和性、アビディティまたは特異性の増大によるものであり得る。例えば、一部の特定の実施形態では、本明細書に記載の凝集体特異的結合試薬は、凝集体に優先的に結合するが、それでもなお単量体に、弱いが検出可能なレベルで結合する能力を有することがあり得る。典型的には、弱い結合またはバックグラウンド結合は、例えば適切な対照の使用によって、目的の凝集体との優先的な相互作用から容易に識別可能である。一般に、本発明の方法で使用される凝集体特異的結合試薬は、過剰の単量体の存在下で凝集体に結合する。好ましくは、ＡＳＢ試薬は、単量体に対する結合親和性／アビディティよりも少なくとも約２倍高い親和性／アビディティで凝集体に結合する。
【００５１】
凝集体特異的結合試薬が別のペプチドまたはタンパク質と「結合する」と言えるのは、試薬が別のペプチドまたはタンパク質に特異的に、非特異的に、または特異的結合と非特異的結合のいくらかの組合せで結合する場合である。試薬が凝集体に「優先的に結合する」と言えるのは、該試薬が、単量体よりも凝集体に対して、大きな親和性、アビディティおよび／または大きな特異性で結合する場合である。用語「優先的に結合する（“ｂｉｎｄ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ”，“ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｂｉｎｄ”）」、「選択的に結合する（“ｂｉｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ”，“ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｂｉｎｄ”）」、および「選択的に捕捉する」は、本明細書において互換的に用いている。
【００５２】
用語「アルツハイマー病（ＡＤ）タンパク質」または「ＡＤタンパク質」は、本明細書において互換的に用いており、凝集体（病原性タンパク質形態、病原性アイソフォーム、病原性アルツハイマー病タンパク質、およびアルツハイマー病配座異性体と種々に称する）と、非凝集体（単量体、通常の細胞形態、非病原性アイソフォーム、非病原性アルツハイマー病タンパク質と種々に称する）の両方、ならびに病原性コンホメーションまたは通常の細胞コンホメーションのいずれかを有しないものであり得るアルツハイマー病タンパク質の変性形態および種々の組換え形態をいう。例示的なアルツハイマー病タンパク質としては、Ａβおよびタウタンパク質が挙げられる。
【００５３】
用語「アミロイド−ベータ」、「アミロイド−β」、「Ａベータ」、「Ａβ」、「Ａβ４２」、「Ａβ４０」、「Ａβｘ−４２」、「Ａβｘ−４０」および「Ａβ４０／４２」は、本明細書で用いる場合、すべて、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の切断後、細胞外に見られる４３アミノ酸長までのもののファミリーであるアミロイド−βペプチドをいう。Ａβという用語は、任意の形態のアミロイド−βペプチドを一般的にいうために使用している。用語「Ａβ４０」は「Ａβｘ−４０」をいう。用語「Ａβ４２」は「Ａβｘ−４２」をいう。好ましくは、ｘは１〜１７である。より好ましくは、ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７である。用語「Ａβ１−４２」は、Ａβのアミノ酸１〜４２（ＡＰＰ配列（Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄら（１９９７）ＰＮＡＳ  ９４，１５５０−１５５５）のアミノ酸５９７〜６３８）に対応する断片をいう。用語「Ａβ１−４０」は、Ａβのアミノ酸１〜４０（ＡＰＰ配列のアミノ酸５９７〜６３６）に対応する断片をいう。Ａβ４０／４２という用語は、Ａβ４０アイソフォームとＡβ４２アイソフォームの両方をいうために使用している。
【００５４】
「指標」は、本明細書で用いる場合、単独でまたは他の指標との組合せのいずれかで、生物学的状態と関連している任意の因子をいう。指標としては、バイオマーカーならびに生物学的状態と関連している非生物学的試料由来因子、例えば、健康状態の非分析物生理学的マーカー、または生物学的試料では測定されない他の因子もしくはマーカー、例えば、本明細書において定義する「臨床パラメータ」が挙げられる。また、指標としては、数学的に得られる計算値である任意の指数、または任意の１つ以上の前述の測定値（例えば、一時的な傾向および差）の組合せも挙げられる。
【００５５】
「臨床パラメータ」は、本明細書で用いる場合、被験体の健康状態または他の特徴、例えば限定されないが、年齢、性別、家族の病歴、ＭＣＩ診断の既往、ＡｐｏＥ遺伝子型、教育レベル、および生活様式因子（高血圧、高コレステロール、および制御が不十分な糖尿病など）などのあらゆる非試料または非分析物バイオマーカーを包含する。また、アルツハイマー病の臨床パラメータとしては、当業者に知られた臨床試験結果、例えば、アルツハイマー病評価スケール認知（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｓｃａｌｅ−Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ（ＡＤＡＳ−Ｃｏｇ））、臨床的認知症尺度（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｅｍｅｎｔｉａ  Ｒａｔｉｎｇ（ＣＤＲ）、例えば、グローバルボックス合計ＣＤＲ）、メモリーボックス（Ｍｅｍｏｒｙ  Ｂｏｘ）スコア、およびミニメンタルステート検査（Ｍｉｎｉ−Ｍｅｎｔａｌ  Ｓｔａｔｅ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ（ＭＭＳＥ））も挙げられる。
【００５６】
「ＴＮ」は真の陰性であり、これは、疾患評価試験で、非疾患または正常対照が正しく分類されることを意味する。
【００５７】
「ＴＰ」は真の陽性であり、これは、疾患評価試験で、疾患被験体が正しく分類されることを意味する。
【００５８】
「ＦＮ」は偽陰性であり、これは、疾患評価試験で、疾患被験体が誤って非疾患または正常と分類されることを意味する。
【００５９】
「ＦＰ」は偽陽性であり、これは、疾患評価試験で、非疾患または正常対照が誤って疾患を有すると分類されることを意味する。
【００６０】
「精度」は、測定または計算された量（試験報告値）の、その実際の（または真の）値との適合性の度合をいう。臨床精度は、誤分類結果（偽陽性（ＦＰ）または偽陰性（ＦＮ））に対する真の結果（真の陽性（ＴＰ）または真の陰性（ＴＮ））の割合に関し、尺度の中でもとりわけ、感度、特異性、陽性予測値（ＰＰＶ）もしくは陰性予測値（ＮＰＶ）、または尤度、オッズ比と記載されることもあり得る。「試験精度」は、本明細書で用いる場合、（ＴＰ＋ＴＮ）／（ＴＰ＋ＴＮ＋ＦＰ＋ＦＮ）で計算されるものである。
【００６１】
「感度」は、ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ）によって計算されるもの、または疾患被験体の真の陽性分率である。
【００６２】
「特異性」は、ＴＮ／（ＴＮ＋ＦＰ）によって計算されるもの、または非疾患もしくは正常対照の真の陰性分率である。
【００６３】
「陰性予測値」または「ＮＰＶ」は、ＴＮ／（ＴＮ＋ＦＮ）によって計算されるもの、または全陰性試験結果の真の陰性分率である。また、これは、疾患の有病率および試験が意図される集団の試験前確率によって本質的に影響される。例えば、Ｏ’Ｍａｒｃａｉｇｈ  Ａ  Ｓ，Ｊａｃｏｂｓｏｎ  Ｒ  Ｍ，“Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｖａｌｕｅ  Ｏｆ  Ａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｔｅｓｔ，Ｈｏｗ  Ｔｏ  Ｐｒｅｖｅｎｔ  Ｍｉｓｌｅａｄｉｎｇ  Ｏｒ  Ｃｏｎｆｕｓｉｎｇ  Ｒｅｓｕｌｔｓ，”Ｃｌｉｎ．Ｐｅｄ．１９９３，３２（８）：４８５−４９１を参照のこと。これには、試験（例えば、臨床診断試験）の特異性、感度、ならびに陽性および陰性予測値が論じられている。多くの場合、連続的な診断試験測定値を使用するバイナリー疾患状態分類アプローチでは、感度と特異性は、Ｐｅｐｅら，“Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏｄｄｓ  Ｒａｔｉｏ  ｉｎ  Ｇａｕｇｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  ａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ，ｏｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｍａｒｋｅｒ，”Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  ２００４，１５９（９）：８８２−８９０による受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線によって要約され、曲線下面積（ＡＵＣ）またはｃ−統計量（単一の値だけで試験（もしくはアッセイ）のカットポイントの全範囲における試験、アッセイまたは方法の感度と特異性の表示を可能にする指標）によって要約される。例えば、Ｓｈｕｌｔｚ，“Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，”第１４章，Ｔｅｉｔｚ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＢｕｒｔｉｓおよびＡｓｈｗｏｏｄ（編），第４版  １９９６，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，第１９２〜１９９頁；ならびにＺｗｅｉｇら，“ＲＯＣ  Ｃｕｒｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａｎ  Ｅｘａｍｐｌｅ  Ｓｈｏｗｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  Ａｍｏｎｇ  Ｓｅｒｕｍ  Ｌｉｐｉｄ  Ａｎｄ  Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｃｏｒｏｎｏｒｙ  Ａｒｔｅｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ，”Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，３８（８）：１４２５−１４２８も参照のこと。尤度関数、オッズ比、情報理論、予測値、較正（例えば、適合度）、および再分類測定値を使用する代替的なアプローチは、Ｃｏｏｋ，“Ｕｓｅ  ａｎｄ  Ｍｉｓｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  Ｃｕｒｖｅ  ｉｎ  Ｒｉｓｋ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，”Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００７，１１５：９２８−９３５に従って要約される。試験によって規定される被験体コホートにおけるハザード比ならびに絶対および相対リスク比は、臨床精度および有用性のさらなる測定値である。この最後のものでは、多重法が多くの場合で使用され、Ｖａｓａｎ，“Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ，”Ｃｉｒｃｕｌａｔ���ｏｎ  ２００６，１１３：２３３５−２３６２のとおりに異常値または疾患値、例えば、基準範囲、判別範囲、およびリスク閾値が規定される。
【００６４】
「陽性予測値」または「ＰＰＶ」は、ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＰ）によって計算されるもの、または全陽性試験結果の真の陽性分率である。これは、疾患の有病率および試験が意図される集団の試験前確率によって本質的に影響される。
【００６５】
用語「式（ｆｏｒｍｕｌａ）」、「アルゴリズム」、および「モデル」は、任意の数学方程式、アルゴリズムプロセス、分析プロセスもしくはプログラムされたプロセス、または１回以上の継続的もしくは分類的入力を行ない、出力値（「指数」もしくは「指数値」と称される場合もある）を計算する統計学的手法に対して互換的に用いている。「式」の非限定的な例としては、和、比、および回帰演算子（係数または指数（ｅｘｐｏｎｅｎｔ）など）、バイオマーカー値の変換および正規化（例えば限定されないが、性別、年齢または人種などの臨床パラメータに基づいた正規化スキーム）、規則および指針、統計学的分類モデル、ならびに歴史的集団に対して作成（ｔｒａｉｎ）されたニューラルネットワークが挙げられる。バイオマーカーに特に有用なものは、被験体試料において検出されたバイオマーカーレベルと、被験体がアルツハイマー病を有する確率との関係を決定するための線形および非線形の方程式ならびに統計学的分類分析である。診断用パネルおよび組合せの構築に、特に重要であるのは、構造的および協同的（ｓｙｎａｃｔｉｃ）統計学的分類アルゴリズム、ならびにリスク指数構築方法であり、これは、パターン認識フィーチャーを使用し、例えば、とりわけ、相互相関、主成分分析（ＰＣＡ）、因子回転、ロジスティック回帰（ＬｏｇＲｅｇ）、線形判別分析（ＬＤＡ）、Ｅｉｇｅｎｇｅｎｅ線形判別分析（ＥＬＤＡ）、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、ランダムフォレスト（ＲＦ）、再帰分割木（ＲＰＡＲＴ）などの確立された手法、ならびに他の関連決定ツリー分類手法、Ｓｈｒｕｋｅｎ  Ｃｅｎｔｒｏｉｄｓ（ＳＣ）、ＳｔｅｐＡＩＣ、ｋ近傍法、ブースティング、決定木、ニューラルネットワーク、ベイジアンネットワーク、サポートベクターマシン、および隠れマルコフモデル、線形回帰または分類アルゴリズム、非線形回帰または分類アルゴリズム、分散分析（ＡＮＯＶＡ）、階層的分析またはクラスタリングアルゴリズム；決定ツリーを用いた階層的アルゴリズム；カーネル系マシンアルゴリズム（カーネル部分最小二乗アルゴリズム、カーネルマッチング追跡アルゴリズム、カーネルフィッシャーの判別分析アルゴリズム、またはカーネル主成分分析アルゴリズムなど）がある。これらを、さらなるバイオマーカーとモデルの改善との間のトレードオフを定量化するため、および過剰適合の最小化を補助するために、赤池情報量規準（ＡＩＣ）またはベイズ情報量規準（ＢＩＣ）などの情報量規準とカップリングさせてもよい。得られた予測モデルは、他の試験において確認され得るか、またはひとつだけ別に取り出す（ＬＯＯ）および１０分割交差確認（１０分割ＣＶ）などの手法を用いてもともと作成された試験において交差確認され得る。
【００６６】
本明細書で用いる場合、「〜と同じ」は、２つの測定値間に統計学的に有意な差がないことを意図することを意味する。
【００６７】
「統計学的に有意な」により、改変が、単に偶然起こる（これは「偽陽性」となり得る）と予測され得るものよりも大きいことを意図する。統計学的有意性は、当該技術分野において知られた任意の方法によって決定され得る。一般的に使用されている有意性の尺度としては、ｐ値が挙げられ、これは、所与のデータ点と少なくとも同じくらい極端な結果が得られる可能性を表し、該データ点が単なる偶然の結果であったと仮定している。結果は、多くの場合、０．０５以下のｐ値で高度に有意であるとみなされる。
【００６８】
本発明との関連における「被験体」は、好ましくは哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物が、アルツハイマー病の動物モデルに相当する被験体として好都合に使用されることがあり得る。被験体は雄性であっても雌性であってもよい。被験体は、以前にアルツハイマー病と診断されたことがある被験体であってもよく、アルツハイマー病を有すると確認された被験体であってもよい。好ましくは、被験体は、アルツハイマー病に対する治療的介入を受けたことがある被験体ではなく、該介入を受けている被験体でもない。あるいはまた、被験体は、以前にアルツハイマー病を有すると診断されたことがない被験体であってもよい。例えば、被験体は、アルツハイマー病に対する１つ以上のリスクファクターを示す被験体、またはアルツハイマー病のリスクファクターを示していない被験体、またはアルツハイマー病に対して無症候性の被験体であり得る。また、被験体は、アルツハイマー病に苦しんでいるか、またはアルツハイマー病を発症するリスクがある被験体であってもよい。
【００６９】
「ペプトイド」は、一般的に、少なくとも１つ、好ましくは２つ以上のアミノ酸置換体、好ましくはＮ置換グリシンを含むペプチド模倣物をいうために用いる。ペプトイドは、とりわけ、米国特許第５，８１１，３８７号に記載されている。本明細書で用いる場合、「ペプトイド試薬」は、アミノ末端領域と、カルボキシ末端領域と、該アミノ末端領域と該カルボキシ末端領域との間に少なくとも１つの「ペプトイド領域」とを有する分子である。アミノ末端領域は該試薬のアミノ末端側の領域をいい、ここには、典型的にはＮ置換グリシンは全く含まれていない。アミノ末端領域は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アシル、アミノ保護基、アミノ酸、ペプチドなどであり得る。カルボキシ末端領域は、ペプトイドのカルボキシ末端の端部の領域をいい、ここにはＮ置換グリシンは全く含まれていない。カルボキシ末端領域には、Ｈ、アルキル、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ保護基、アミノ酸、ペプチドなどが含まれ得る。
【００７０】
「デンドロン」は、本明細書で用いる場合、ペプチドとの構造的類似性がほとんどない分枝ポリマーである。
【００７１】
「シード（ｓｅｅｄｅｄ）多量体化」は、本明細書で用いる場合、進行性の沈着および可溶性Ａβ単量体の凝集体への変換をいう。単量体のシード多量体化は、低速核形成および高速成長速度論を特徴とする。
【００７２】
「レベル」は、本明細書で用いる場合、相対レベルをいう。
【００７３】
「体液」は、本明細書で用いる場合、循環液と非循環液を包含する。循環液の例としては、血液、ＣＳＦおよびリンパ液が挙げられる。非循環液の例としては、滑液が挙げられる。
【００７４】
「ＭＣＩ」は、本明細書で用いる場合、軽度認知障害をいう。ＭＣＩは、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ［Ｐｅｔｅｒｅｓｅｍｎ  ＲＣ（２００４）Ｍｉｌｄ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ａｓ  ａ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｅｎｔｉｔｙ．Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  ２５６，１８３−１９４］によって提唱されている認知障害の臨床診断であり、被験体の記憶愁訴、医師によって確認される客観的記憶障害、ＭＭＳＥスコアが≧２４である一般的認知機能の維持、日々の生活活動の障害は最小限であること、および痴呆のＤＳＭ−ＩＩＩＲ基準を満たしていないことを包含する。ＭＣＩと臨床診断される初期病期のＡＤの患者と、後にＡＤに進行するＭＣＩ患者サブセットは、おそらく類似した患者群であるが、医師によっては異なると分類される場合もある。
【００７５】
ＩＩ．本発明の方法
アルツハイマー病を有する増大した確率の評価方法
本明細書に記載の発明は、評価対象の被験体においてアルツハイマー病の増大した確率の評価方法を提供する。この方法は、被験体の脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含まない試料におけるＡβ４０凝集体レベルが、被験体がアルツハイマー病を有する確率と相関しているという発見に基づいている。アルツハイマー病の増大した確率の評価は、被験体が該疾患を有する確率もしくは見込みを決定すること、または被験体が該疾患を発症するか否かを予測することを含む。アルツハイマー病の増大した確率の評価は、さらに、例えば、該疾患を診断すること、または該疾患に対して予後診断を下すことを含む。
【００７６】
本明細書に記載の発明は、被験体の生物学的試料中のＡβ４０凝集体の測定値を得ることによる、評価対象の被験体においてアルツハイマー病の増大した確率の評価方法であって、該生物学的試料が脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含むものでない方法を提供する。
【００７７】
評価対象の被験体においてアルツハイマー病の増大した確率の評価方法は、Ａβ４０凝集体の測定値を、視覚的ディスプレイまたはプリンターを含む報告手段に報告する工程を含むものであり得る。Ａβ４０凝集体の測定値の報告は、手作業または自動で行なわれ得る。例えば、Ａβ４０凝集体の測定値は、報告手段に手作業で入力され得るか、またはＡβ４０凝集体の測定値は、後に報告手段への測定値の自動報告が可能な様式で得られ得る。好適な報告手段としては、例えば、慣用的なコンピュータプロセッサ、測定手段に直接リンクさせたコンピュータプロセッサ、または無線ネットワークなどによって測定手段にリモートリンクさせたコンピュータプロセッサが挙げられる。
【００７８】
一部の特定の実施形態では、Ａβ４０凝集体の測定値として、生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルが挙げられる。評価対象の被験体においてアルツハイマー病の増大した確率の評価方法は、Ａβ４０凝集体レベルが対照レベル閾値よりも高い場合、被験体はアルツハイマー病の増大した確率を有すると決定する工程を含むものであり得る。該閾値は、認知に関して正常な複数の対照被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを含むデータから計算される。評価対象の被験体と対照被験体は同じ種であり、生物学的試料はすべて同じ試料型のものである。
【００７９】
本発明の方法で使用される対照被験体は認知に関して正常である。被験体が認知に関して正常であるという決定は、当業者に知られた方法に従って行なわれ得る。本明細書において使用される対照被験体は、認知機能に対して一般的に使用される当業者に知られた臨床試験において、障害の徴候を示さない。かかる臨床試験の一例は、ＭＭＳＥ、ＣＤＲ、メモリーボックススコア、およびＡＤＡＳ−Ｃｏｇである。典型的には、対照被験体はまた、年齢および性別などの他の要素に基づいて選択される。例えば、可能な場合、評価対象の被験体と年齢および性別が適合している対照被験体が選択される。
【００８０】
閾値の計算
閾値は、データの意義のある数値サマリーを得るためのデータの操作に有用であることが当業者に知られた任意のモデルによって計算され得る。例えば、閾値は、認知に関して正常な複数の対照被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを平均化することにより単純に計算され得る。
【００８１】
一部の場合では、閾値は診断試験に使用される。かかる場合において、閾値は、好ましい診断成績パラメータ（精度、感度、特異性、陽性予測値および陰性予測値など）を組み込んだモデルから計算され得る。疾患の診断では、試験またはアッセイの閾値の値を変更すると、通常、感度と特異性が定性的に反比例の関係で変化する。したがって、提案された医学的試験、アッセイまたは被験体の状態の評価方法の精度と有用性の評価では、常に感度と特異性の両方を考慮すべきであり、感度と特異性は閾値の範囲において有意に変動することがあり得るため、感度と特異性が報告される閾値をどのようにするかに留意すべきである。対照レベル閾値の決定における使用に好ましい感度の値は、少なくとも６５％、望ましくは少なくとも７０％、より望ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％である。対照レベル閾値の決定における使用に好ましい特異性の値は、少なくとも６５％、望ましくは少なくとも７０％、より望ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％である。
【００８２】
あらゆる潜在的閾値の値を網羅したＡＵＣ（試験のＲＯＣ曲線下面積）などの統計量の使用は、本発明を使用するほとんどの分類的（ｃａｔｅｇｏｒｉｃａｌ）リスク尺度に好ましいが、継続的（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ）リスク尺度には、観察された結果または他の優れた標準に対する適合度および較正の統計量が好ましい。
【００８３】
アルツハイマー病の確率の評価のための診断精度の許容され得る度合は、ＡＵＣが少なくとも０．６０、望ましくは少なくとも０．６５、より望ましくは少なくとも０．７０、好ましくは少なくとも０．７５、より好ましくは少なくとも０．８０、最も好ましくは少なくとも０．８５であるものである。
【００８４】
アルツハイマー病の確率の評価のための診断精度の非常に高い度合は、ＡＵＣ（試験のＲＯＣ曲線下面積）が少なくとも０．８０、望ましくは少なくとも０．８５、より望ましくは少なくとも０．８７５、好ましくは少なくとも０．９０、より好ましくは少なくとも０．９２５、より好ましくは少なくとも０．９５、より好ましくは少なくとも０．９８、最も好ましくは少なくとも０．９９であるものである。
【００８５】
任意の評価または試験の予測値は、試験の感度と特異性、および試験対象の集団における状態の有病率の両方に依存する。この考えは、ベイズの定理に基づいて、スクリーニング対象の状態が被験体または集団に存在している尤度が大きいほど（試験前確率）、陽性試験の妥当性が大きく、結果が真の陽性である尤度が大きいことを示す。したがって、状態が存在している尤度が低い場合に任意の集団において任意の試験を使用することに伴う問題は、陽性結果がより限定的な値を有する（すなわち、陽性試験は偽陽性となる可能性が大きい）ということである。同様に、非常に高リスクの集団では、陰性試験結果は偽陰性となる可能性が高い。その結果、ＲＯＣおよびＡＵＣは、低疾患有病率の試験集団（年間の発生の割合（発生率）が１％未満であるか、または特定の対象期間における累積有病率が１０％未満である集団と定義する）では、試験の臨床有用性に関して誤解を引き起こすことがあり得る。
【００８６】
好ましい実施形態では、本発明は、１９より大きいＭＭＳＥスコアを特徴とするものであり得る初期病期のアルツハイマー病の増大した確率の評価方法に関する。
【００８７】
第２の指標の測定値
本明細書において提供する評価対象の被験体においてアルツハイマー病の増大した確率の評価方法は、さらに、評価対象の被験体のアルツハイマー病の第２の指標の測定値を得る工程を含んでいてもよい。第２の指標としては、例えば、アルツハイマー病の他のバイオマーカー、例えば、Ａβ４０またはＡβ４２単量体、Ａβ４２凝集体、タウ単量体および凝集体、アミロイド斑、およびアルツハイマー病に関連した遺伝子変異、ならびに試料由来でない指標、例えば、年齢、性別、ＡｐｏＥ遺伝子型、ＭＭＳＥスコア、ＣＤＲスコア、メモリーボックススコア、生活様式因子、例えば、高血圧、高コレステロール、および制御が不十分な糖尿病、および教育レベルが挙げられ得る。
【００８８】
アルツハイマー病の第２の指標の測定値を得た後、本明細書において提供する方法に、Ａβ４０凝集体の測定値と第２の指標の測定値を含むデータに基づいて被験体指数を計算する工程を含めてもよい。被験体指数は、アルツハイマー病の増大した確率に対するＡβ４０凝集体の測定値と第２の指標の測定値を含むデータの相対的寄与に相当する単一の数を提供するものである。被験体指数の計算方法は、各測定値とアルツハイマー病との関連性の強さおよび測定値間の任意の連関に応じて異なる。
【００８９】
生物学的状態または疾患に寄与している因子の重み付けに有用であることが当業者に知られた任意の式またはモデルが、被験体指数の計算に使用され得る。例えば、被験体指数の計算のための単純なモデルは、Ａβ４０凝集体の測定値と第２の指標の測定値との比の計算を伴うものであり得る。他の好ましい式としては、広いクラスの統計学的分類アルゴリズム、特に、判別分析の使用が挙げられる。判別分析の目的は、以前に特定されたフィーチャーの組からクラスのメンバーシップを予測することである。線形判別分析（ＬＤＡ）の場合、いくつかの基準による群の分離が最大になるフィーチャーの線形結合が特定される。フィーチャーは、ＬＤＡでは、異なる閾値を伴うｅｉｇｅｎｇｅｎｅ系アプローチ（ＥＬＤＡ）または多変量分散分析（ＭＡＮＯＶＡ）に基づいたステッピングアルゴリズムを用いて特定され得る。ホテリング・ローリー統計量に基づいた分離なしの確率が最小限となる順方向、逆方向、ステップワイズアルゴリズムを行なってもよい。
【００９０】
Ｅｉｇｅｎｇｅｎｅ系線形判別分析（ＥＬＤＡ）は、Ｓｈｅｎら（２００６）によって開発されたフィーチャー選択手法である。式により、変形固有分析を用いて多変量フレームワーク内においてフィーチャー（例えば、指標）が選択され、最も重要な固有ベクトルと関連しているフィーチャーが特定される。「重要な」は、ある閾値に関連して分類しようとしている試料間の差の最も大きい分散を説明する固有ベクトルと定義する。
【００９１】
サポートベクターマシン（ＳＶＭ）は、２つのクラスを分離するの超平面を見い出すことを試みる分類形式である。この超平面は、超平面から離れた厳密なマージン間隔であるデータ点であるサポートベクトルを含む。現状のデータ次元に分離超平面が存在しないという起こりそうな事象において、次元は、元の変数の非線形関数を採用することによりデータをより大きな次元に投入することによって大きく拡張される（ＶｅｎａｂｌｅｓおよびＲｉｐｌｅｙ，２００２）。必要とされないが、ＳＶＭのフィーチャーをフィルタリングすると、多くの場合、予測が改善される。フィーチャー（例えば、指標）はサポートベクターマシンに対して、最良の一変量フィーチャーが選択されるように非パラメータＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ（ＫＷ）検定を用いて特定され得る。ランダムフォレスト（ＲＦ，Ｂｒｅｉｍａｎ，２００１）または再帰分割（ＲＰＡＲＴ，Ｂｒｅｉｍａｎら，１９８４）もまた別々に、または組み合わせて、最も重要な指標の組合せを特定するために使用され得る。ＫＷおよびＲＦではともに、いくつかのフィーチャーがトータルから選択されることが必要とされる。ＲＰＡＲＴでは、利用可能な指標のサブセットを用いて単一の分類木が作成される。
【００９２】
本明細書に記載の評価対象の被験体においてアルツハイマー病を有する増大した確率の評価方法のさらなる工程は、被験体指数を対照指数閾値と比較することを含み得、ここで、対照指数閾値は、認知に関して正常な複数の対照被験体の生物学的試料中のＡβ４０凝集体の測定値と対照被験体において第２の指標の測定値を含むデータから計算される。評価対象の被験体と対照被験体は同じ種であり、生物学的試料はすべて同じ試料型のものである。
【００９３】
典型的には、対照指数閾値は、まず、認知に関して正常な各対照被験体での指数を、各対照被験体のＡβ４０凝集体の測定値と第２の指標の測定値に基づいて計算することにより計算される。対照被験体の指数は、被験体指数についての上記の方法と同じ方法によって計算され得る。認知に関して正常な各対照被験体の指数が計算されたら、対照指数閾値が、モデルから対照被験体の指数に基づいて計算される。例えば、対照指数閾値は、単純に対照被験体の指数を平均化することにより計算され得る。
【００９４】
一部の場合では、対照指数閾値は診断試験に使用される。かかる場合において、対照指数閾値は、好ましい診断成績パラメータ（精度、感度、特異性、陽性予測値および陰性予測値など）を組み込んだモデルから計算され得る。上記に論じたように、試験またはアッセイの閾値の値を変更すると、通常、感度と特異性が変化するが、定性的に反比例の関係である。したがって、提案された医学的試験、アッセイまたは被験体の状態の評価方法の精度と有用性の評価では、常に感度と特異性の両方を考慮すべきであり、感度と特異性は閾値の範囲において有意に変動することがあり得るため、感度と特異性が報告される閾値をどのようにするかに留意すべきである。対照指数閾値の指定における使用に好ましい感度の値は、少なくとも６５％、望ましくは少なくとも７０％、より望ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％である。対照指数閾値の指定における使用に好ましい特異性の値は、少なくとも６５％、望ましくは少なくとも７０％、より望ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％である。
【００９５】
一部の実施形態において、第２の指標は、Ａβ凝集体の測定値を得る試料と同じ生物学的試料において測定される。好ましい実施形態では、第２の指標はＡβ４０単量体またはＡβ４２単量体である。第２の指標がＡβ４０単量体またはＡβ４２単量体である特に好ましい実施形態では、被験体指数が、評価対象の被験体においてＡβ４０単量体またはＡβ４２単量体のレベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比であり、対照指数閾値が、対照被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルとＡβ４０単量体またはＡβ４２単量体のレベルを含むデータから計算される対照比閾値である。かかる実施形態において、対照指数閾値は、まず、複数の対照被験体においてＡβ４０単量体またはＡβ４２単量体のレベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比を計算し、続いて、モデルから複数の比に基づいて対照比閾値を計算することにより計算され得る。対照比閾値は、好ましい診断成績パラメータを組み込んだモデルを用いて計算され得る。この好ましい実施形態は、さらに、該被験体の比が対照比閾値より高い場合、評価対象の被験体はアルツハイマー病を有する増大した確率を有すると決定する工程を含んでいてもよい。第２の指標の測定値を得ることを伴う本明細書に記載の方法の実施形態では、本発明は、１９より大きいＭＭＳＥスコアを特徴とするものであり得る初期病期のアルツハイマー病の増大した確率の評価方法に関する。
【００９６】
アルツハイマー病を有しない確率の評価方法
別の態様によれば、本発明は、評価対象の被験体においてアルツハイマー病を有しない増大した確率の評価方法を提供する。該方法は、被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを得る工程、ならびに被験体が臨床的認知障害を示さない場合、およびＡβ４０凝集体レベルが対照レベル閾値と同じであるか、またはそれより低い場合、被験体はアルツハイマー病を有しない増大した確率を有すると決定する工程を含む。臨床的認知障害は、典型的には、当業者に知られた任意の臨床試験、例えば、アルツハイマー病評価スケール認知（ＡＤＡＳ−Ｃｏｇ）、臨床的認知症尺度（ＣＤＲ）、メモリーボックススコア、およびミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）によって評価される。臨床的認知障害は、当業者に知られたものなどの臨床試験の結果によって示され得る。対照レベル閾値は、認知に関して正常な複数の対照被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを含むデータから計算される。評価対象の被験体と対照被験体は同じ種であり、生物学的試料はすべて同じ試料型のものであり、脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含むものでない。
【００９７】
また別の態様によれば、本発明は、評価対象の被験体においてアルツハイマー病を有しない増大した確率の評価を補助するための方法を提供する。該方法は、被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを測定する工程、およびＡβ４０凝集体レベルを異なる実体に連絡する工程を含み、ここで、該異なる実体により、被験体が臨床的認知障害を示さない場合、およびＡβ４０凝集体レベルが対照レベル閾値と同じであるか、またはそれより低い場合、被験体はアルツハイマー病を有しない増大した確率を有すると決定される。対照レベル閾値は、認知に関して正常な複数の対照被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを含むデータから計算される。評価対象の被験体と対照被験体は同じ種であり、生物学的試料はすべて同じ試料型のものであり、脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含むものでない。
【００９８】
他の態様によれば、アルツハイマー病を有しない増大した確率の評価方法またはアルツハイマー病を有しない増大した確率の評価を補助するための方法は、被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比を得る工程または該比を測定する工程を含んでいてもよい。
【００９９】
疾患進行のモニタリング方法
本明細書に記載の発明は、アルツハイマー病の被験体の疾患進行のモニタリング方法を提供する。この方法は、アルツハイマー病の被験体においてＡβ４０凝集体レベルおよびＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比は、疾患が進行するにつれて減少するという、本実施例に記載したさらなる発見に基づいたものである。本明細書に記載の疾患進行のモニタリング方法によれば、アルツハイマー病の被験体は、アルツハイマー病に対する処置であることが現在知られているか、または将来、アルツハイマー病に対する処置であることが示されるかのいずれかである処置を全く受けたことがない被験体である。本発明のこの態様および他の態様によれば、アルツハイマー病に対する現在使用されている処置としては、例えば、コリンエステラーゼインヒビター（ドネペジル（Ａｒｉｃｅｐｔ）、リバスチグミン（Ｅｘｅｌｏｎ）およびガランタミン（Ｒａｚａｄｙｎｅ）など）、ＮＭＤＡグルタミン酸受容体遮断薬（メマンチン（Ｎａｍｅｎｄａ）など）、ならびにハーブ治療薬（フペルジンＡなど）が挙げられる。現在開発中の処置としては、免疫療法およびＡβワクチンが挙げられる。
【０１００】
本発明は、アルツハイマー病と診断された後の時点で被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを得る第１工程を含む、アルツハイマー病に対する処置を何も受けたことがないアルツハイマー病の被験体の疾患進行のモニタリング方法を提供する。次いで、該方法は、（ａ）被験体において初期病期Ａβ４０凝集体レベルが利用可能ならば、Ａβ４０凝集体レベルが該初期病期Ａβ４０凝集体レベルよりも低い場合、あるいは（ｂ）被験体において該初期病期Ａβ４０凝集体レベルが利用可能でないならば、Ａβ４０凝集体レベルが初期病期標準よりも低い場合、被験体は、進んだ病期のアルツハイマー病に進行した増大した確率を有すると決定する工程を含む。あるいはまた、該方法は、（ａ）被験体において該初期病期Ａβ４０凝集体レベルが利用可能ならば、Ａβ４０凝集体レベルが該初期病期Ａβ４０凝集体レベルと同じである場合、あるいは（ｂ）被験体において初期病期Ａβ４０凝集体レベルが利用可能でないならば、Ａβ４０凝集体レベルが初期病期標準と同じである場合、被験体は、進んだ病期のアルツハイマー病に進行した低減した確率を有すると決定する工程を含む。初期病期レベルは、初期病期のアルツハイマー病の被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベル、または初期病期であることが既知のアルツハイマー病の１例以上の標準被験体から採取された１つ以上の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルであり得る。該被験体と標準被験体は同じ種であり、生物学的試料はすべて同じ試料型のものであり、脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含むものでない。
【０１０１】
別の態様において、本発明は、アルツハイマー病に対する処置を何も受けたことがないアルツハイマー病の被験体の疾患進行のモニタリングを補助するための方法を提供する。該方法は、アルツハイマー病と診断された後の時点で被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを測定する工程、およびＡβ４０凝集体レベルを異なる実体に連絡する工程を含む。次いで、該異なる実体により、（ａ）被験体において初期病期Ａβ４０凝集体レベルが利用可能ならば、Ａβ４０凝集体レベルが該初期病期Ａβ４０凝集体レベルよりも低い場合、あるいは（ｂ）被験体において該初期病期Ａβ４０凝集体レベルが利用可能でないならば、Ａβ４０凝集体レベルが初期病期標準よりも低い場合、被験体は、進んだ病期のアルツハイマー病に進行した増大した確率を有すると決定される。あるいはまた、次いで、該異なる実体により、（ａ）被験体において該初期病期Ａβ４０凝集体レベルが利用可能ならば、Ａβ４０凝集体レベルが該初期病期Ａβ４０凝集体レベルと同じである場合、あるいは（ｂ）被験体において初期病期Ａβ４０凝集体レベルが利用可能でないならば、Ａβ４０凝集体レベルが初期病期標準と同じである場合、被験体は、進んだ病期のアルツハイマー病に進行した低減した確率を有すると決定される。初期病期レベルは、初期病期のアルツハイマー病の被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベル、または初期病期であることが既知のアルツハイマー病の１例以上の標準被験体から採取された１つ以上の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルであり得る。該被験体と標準被験体は同じ種であり、生物学的試料はすべて同じ試料型のものであり、脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含むものでない。
【０１０２】
他の態様によれば、アルツハイマー病の被験体の疾患進行のモニタリング方法またはアルツハイマー病の被験体の疾患進行のモニタリングを補助するための方法は、アルツハイマー病と診断された後の時点で被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比を得る工程または該比を測定する工程を含んでいてもよい。
【０１０３】
上記のセクションに記載の閾値の決定方法と同様、初期病期標準は、初期病期のアルツハイマー病の複数の標準被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを操作して該レベルの平均または他の意義のある数値サマリーを得るための当業者に知られた任意のモデルによって計算され得る。一部の特定の実施形態では、初期病期標準は、初期病期のアルツハイマー病の複数の標準被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルの平均である。
【０１０４】
初期病期のアルツハイマー病は、本明細書で用いる場合、１９より大きいＭＭＳＥスコアを特徴とするものである。
【０１０５】
疾患病期の指定方法
本明細書に記載の発明はまた、アルツハイマー病に対するなんらかの処置前にアルツハイマー病の被験体の疾患病期を指定するための方法を提供する。該方法は、被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを得る工程、および病期特異的標準が利用可能ならば、Ａβ４０凝集体レベルが該標準に近い場合、被験体は病期特異的標準と同じ疾患病期を有する増大した確率を有すると決定する工程を含む。典型的には、Ａβ４０凝集体レベルが該標準の９５％信頼区間内である場合、Ａβ４０凝集体レベルは該標準に「近い」とみなす。９５％信頼限界は、正常集団での平均±２（標準偏差）と定義する。該標準は、同じ既知病期のアルツハイマー病の１例以上の標準被験体から採取された１つ以上の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルである。該被験体と標準被験体は同じ種であり、生物学的試料はすべて同じ試料型のものであり、脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含むものでない。
【０１０６】
別の態様において、本発明は、アルツハイマー病に対するなんらかの処置前でのアルツハイマー病の被験体の疾患病期の指定を補助するための方法を提供する。該方法は、被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを測定する工程、およびＡβ４０凝集体レベルを異なる実体に連絡する工程を含む。次いで、該異なる実体により、標準が利用可能ならば、Ａβ４０凝集体レベルが該標準に近い場合、被験体は標準のものと同じ疾患病期を有する増大した確率を有すると決定される。該標準は、同じ既知病期のアルツハイマー病の１例以上の標準被験体から採取された１つ以上の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルである。該被験体と標準被験体は同じ種であり、生物学的試料はすべて同じ試料型のものであり、脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含むものでない。
【０１０７】
他の態様によれば、アルツハイマー病に対する処置前でのアルツハイマー病の被験体の疾患病期の指定方法、またはアルツハイマー病の処置前でのアルツハイマー病の被験体の疾患病期の指定を補助するための方法は、被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比を得る工程または該比を測定する工程を含んでいてもよい。
【０１０８】
本発明によれば、疾患病期は、当業者に知られたアルツハイマー病の任意の病期をいう。例えば、疾患病期としては、アルツハイマー病の初期病期およびアルツハイマー病の進んだ病期が挙げられる。初期病期のアルツハイマー病は、本明細書で用いる場合、１９より大きいＭＭＳＥスコアを特徴とするものであり、ＭＣＩが挙げられる。進んだ病期のアルツハイマー病は、本明細書で用いる場合、１９以下のＭＭＳＥスコアを特徴とするものであり、進行（ＭＭＳＥ＝１５〜１９）および後期病期（ＭＭＳＥ＜１５）のアルツハイマー病が挙げられる。標準被験体は、当業者に知られた方法に従ってアルツハイマー病の特定の病期を有すると分類された被験体であり得る。
【０１０９】
上記のセクションに記載の閾値の決定方法と同様、病期特異的標準は、既知病期のアルツハイマー病の複数の標準被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを操作して該レベルの平均または他の意義のある数値サマリーを得るための当業者に知られた任意のモデルによって計算され得る。一部の特定の実施形態では、該標準は、同じ既知病期のアルツハイマー病の複数の標準被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルの平均である。一部の特定の実施形態では、少なくとも１つの初期病期標準と少なくとも１つの進んだ病期標準が、Ａβ４０凝集体レベルとの比較に利用可能である。
【０１１０】
ＭＣＩがアルツハイマー病に進行する増大した確率の評価方法
また別の態様によれば、本発明は、評価対象の被験体においてＭＣＩがアルツハイマー病に進行する増大した確率の評価などの予後診断のための方法を提供する。該方法は、被験体の生物学的試料中のＡβ４０凝集体の測定値を得る工程、およびＡβ４０凝集体レベルが対照レベル閾値よりも高い場合、被験体はＭＣＩがアルツハイマー病に進行する増大した確率を有すると決定する工程を含む。対照レベル閾値は、認知に関して正常な複数の対照被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを含むデータから計算される。評価対象の被験体と対照被験体は同じ種であり；生物学的試料はすべて同じ試料型のもの、好ましくはＣＳＦ試料であり、該生物学的試料はいずれも脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含むものでない。
【０１１１】
関連する一態様において、本発明は、評価対象の被験体においてＭＣＩがアルツハイマー病に進行する増大した確率の評価を補助するための方法を提供する。該方法は、被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを測定する工程；およびＡβ４０凝集体レベルを異なる実体に連絡する工程を含み；ここで、該異なる実体により、Ａβ４０凝集体レベルが対照レベル閾値よりも高い場合、被験体はＭＣＩがアルツハイマー病に進行する増大した確率を有すると決定される。対照レベル閾値は、認知に関して正常な複数の対照被験体の生物学的試料におけるＡβ４０凝集体レベルを含むデータから計算される。評価対象の被験体と対照被験体は同じ種であり；前記生物学的試料はすべて同じ試料型のもの、好ましくはＣＳＦ試料であり、生物学的試料はいずれも脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含むものでない。
【０１１２】
他の態様によれば、ＭＣＩがアルツハイマー病に進行する増大した確率の評価方法は、被験体から採取された生物学的試料におけるＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比を得る工程または該比を測定する工程を含んでいてもよい。
【０１１３】
本明細書において提供する評価対象の被験体においてＭＣＩがアルツハイマー病に進行する増大した確率の評価方法は、さらに、評価対象の被験体においてＭＣＩがアルツハイマー病に進行する第２の指標の測定値を得る工程を含んでいてもよい。第２の指標としては、例えば、アルツハイマー病の他のバイオマーカー、例えば、Ａβ４０またはＡβ４２単量体、Ａβ４２凝集体、タウ単量体および凝集体、アミロイド斑、およびアルツハイマー病に関連した遺伝子変異、ならびに試料由来でない指標、例えば、年齢、性別、ＡｐｏＥ遺伝子型、ＭＭＳＥスコア、ＣＤＲスコア、メモリーボックススコア、生活様式因子、例えば、高血圧、高コレステロール、および制御が不十分な糖尿病、および教育レベルが挙げられ得る。
【０１１４】
ＭＣＩがアルツハイマー病に進行する第２の指標の測定値を得た後、本明細書において提供する方法に、Ａβ４０凝集体の測定値と第２の指標の測定値を含むデータに基づいて被験体指数を計算する工程を含めてもよく、被験体指数の計算方法は、「アルツハイマー病を有する増大した確率の評価方法」の「第２の指標の測定値」に関するセクションに記載のとおりである。
【０１１５】
評価対象の被験体においてＭＣＩがアルツハイマー病に進行する増大した確率を評価するための本明細書に記載の方法のさらなる工程は、被験体指数を対照指数閾値と比較することを含み得、ここで、対照指数閾値は、認知に関して正常な複数の対照被験体の生物学的試料中のＡβ４０凝集体の測定値と対照被験体において第２の指標の測定値を含むデータから計算される。対照指数は、「アルツハイマー病を有する増大した確率の評価方法」の「第２の指標の測定値」に関するセクションに記載のようにして計算され得る。
【０１１６】
被験体
本発明の好ましい実施形態では、被験体はヒトである。他の実施形態では、被験体は非ヒト動物である。好ましい非ヒト動物の例としてはマウスが挙げられる。
【０１１７】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、評価対象の被験体およびアルツハイマー病の被験体は生体であり得る。本発明のさらに好ましい実施形態において、対照被験体および標準被験体は生体であり得る。
【０１１８】
生物学的試料
本発明の方法で使用される生物学的試料は、脳組織、脳組織の分画物または脳ホモジネートを含むものでない。好ましい生物学的試料としては、体液または体組織が挙げられ得る。一部の特定の実施形態では、Ａβ４０凝集体は循環している。また、好ましい生物学的試料としては、全血、血液分画物、血液成分、血漿、血小板、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、骨髄、尿、涙液、乳汁、リンパ液、器官組織、神経系の組織、非神経系の組織、筋肉組織、生検材料、剖検材料、脂肪生検材料、脂肪組織、細胞、糞便、胎盤、脾臓組織、リンパ組織、膵臓組織、気管支肺胞洗浄物（ＢＡＬ）、または滑液が挙げられる。特に好ましい生物学的試料としては、血漿、血清、ＣＳＦおよび尿が挙げられる。他の実施形態では、生物学的試料としてはＣＳＦが挙げられる。
【０１１９】
ＩＩＩ．本発明の方法の実施
本発明の目的を達成するために必要とされる工程は、１つの実体または１つより多くの実体のいずれかによって実施され得る。実体は、例えば、人間、人間のグループ、施設、または企業であり得る。
【０１２０】
１つの実体
一部の特定の態様によれば、本発明の目的を達成するために必要とされる工程は１つの実体によって実施される。一部の特定の実施形態では、単一の実体によって、被験体の生物学的試料における指標のレベルが得られ、被験体が、アルツハイマー病を有する増大した確率または有しない増大した確率を有すると決定され得るか、進んだ病期のアルツハイマー病に進行した増大した確率または低減した確率を有すると決定され得るか、あるいは標準のものと同じ疾患病期を有する増大した確率を有すると決定され得る。この実体は、例えば、医者または臨床家であり得る。また、この実体は、病院または医者の診察室などの施設であってもよく、この場合、該方法の工程はすべて施設の従業員によって行なわれる。「得る」とは、本明細書で用いる場合、測定すること、受領すること、または他の様式で情報を直接もしくは間接的のいずれかで得ることが包含され得る。実体が比を得る本発明の態様において、比を得ることには、同じかもしくは異なる実体が計測工程を行なった後、測定値もしくはレベルから計算すること、該比を受領すること、または他の様式で該比を直接もしくは間接的のいずれかで得ることが包含され得る。
【０１２１】
また他の実施形態において、単一の実体により、被験体の生物学的試料における指標のレベルが測定され、該指標レベルが異なる実体に連絡され、次いで、該異なる実体により、被験体が、アルツハイマー病を有する増大した確率または有しない増大した確率を有すると決定され得るか、進んだ病期のアルツハイマー病に進行した増大した確率または低減した確率を有すると決定され得るか、あるいは標準のものと同じ疾患病期を有する増大した確率を有すると決定され得る。このような実施形態では、測定工程および連絡工程を行なう単一の実体は、例えば、診療所または検査技術者であり得る。
【０１２２】
１つより多くの実体
他の態様によれば、本発明の目的を達成するために必要とされる工程は、１つより多くの実体によって行なわれ得る。ある実体によって被験体の生物学的試料における指標のレベルが測定され得るが、異なる実体により、被験体が、アルツハイマー病を有する増大した確率または有しない増大した確率を有すると決定され得るか、進んだ病期のアルツハイマー病に進行した増大した確率または低減した確率を有すると決定され得るか、あるいは標準のものと同じ疾患病期を有する増大した確率を有すると決定され得る。例えば、診療所の検査技術者によって被験体の生物学的試料における指標のレベルが測定され得、病院の医者によって、被験体が、アルツハイマー病を有する増大した確率または有しない増大した確率を有すると決定され得るか、進んだ病期のアルツハイマー病に進行した増大した確率または低減した確率を有すると決定され得るか、あるいは標準のものと同じ疾患病期を有する増大した確率を有すると決定され得る。
【０１２３】
実体間の連絡
本発明の方法の実施における実体間の連絡は、当該技術分野で使用されている任意の手段によって行なわれ得る。典型的には、実体間で連絡される情報は報告書の形態である。一部の特定の実施形態では、第１の実体は、生物学的試料における指標のレベルを測定した第２の実体から該生物学的試料における指標のレベルを得ることがある。第１の実体は、第２の実体からの該レベルを直接得ても間接的に得てもよい。例えば、第１の実体は、該レベルの書面または電子方式での報告書を第２の実体または異なる実体から直接得ることがある。別の例では、第１の実体は該レベルの電子方式での報告書を、第２の実体が該レベルをアップロードしたネットワーク上で得ることがある。また別の例では、第１の実体は該レベルを、第２の実体によって行なわれた計測の報告書を作成した第３の実体から得ることがある。
【０１２４】
他の実施形態では、第１の実体により、生物学的試料における指標のレベルが測定され得、該レベルが第２の実体または異なる実体に連絡され得、次いで、第２の実体または該異なる実体により、被験体が、アルツハイマー病を有する増大した確率または有しない増大した確率を有すると決定され得るか、進んだ病期のアルツハイマー病に進行した増大した確率または低減した確率を有すると決定され得るか、あるいは標準のものと同じ疾患病期を有する増大した確率を有すると決定される。第１の実体は、該レベルを第２の実体に直接連絡しても間接的に連絡してもよい。例えば、第１の実体は、該レベルに関する報告書を作成し、該報告書を第２の実体に手渡しまたは電子方式で供与し得る。別の例では、第１の実体は該レベルをネットワークにアップロードし得、第２の実体は、ネットワークから該レベルを得ることができる。また別の例では、第１の実体は、該レベルを第３の実体に連絡し得、第３の実体が第２の実体による使用のために報告書を作成する。
【０１２５】
臨床試験
本発明の方法は、アルツハイマー病が関与する臨床試験に有用であり得る。典型的には、臨床試験における使用のために、本発明の目的を達成するために必要とされる工程は、１つより多くの実体によって実施される。例えば、異なる場所（異なる市内の診療所など）の多数の実体により、評価対象の被験体の生物学的試料における指標のレベルが測定され得、該レベルが異なる実体（臨床試験を監督している医者グループなど）に連絡され得、次いで、該異なる実体により、被験体が、アルツハイマー病を有する増大した確率または有しない増大した確率を有すると決定され得るか、進んだ病期のアルツハイマー病に進行した増大した確率または低減した確率を有すると決定され得るか、あるいは標準のものと同じ疾患病期を有する増大した確率を有すると決定される。一部の特定の実施形態では、該多数の実体により第３の実体が使用され得、第３の実体が該レベルの報告書を作成して異なる実体に連絡し、該異なる実体により、被験体が、アルツハイマー病を有する増大した確率または有しない増大した確率を有すると決定され得るか、進んだ病期のアルツハイマー病に進行した増大した確率または低減した確率を有すると決定され得るか、あるいは標準のものと同じ疾患病期を有する増大した確率を有すると決定される。本発明の方法を伴う臨床試験は、アルツハイマー病に対する新規薬物および処置の有効性の評価、またはアルツハイマー病およびその進行に対する種々の臨床パラメータ効果の評価に有用であり得る。
【０１２６】
ＩＶ．本発明の方法においてＡβ４０凝集体の測定値およびレベルを得る
本発明の方法は、評価対象の被験体の生物学的試料中のＡβ４０凝集体の測定値またはレベルを得る工程を含む。Ａβ４０凝集体の測定値またはレベルを得ることは、当業者に知られた任意の方法、例えば、ミスフォールドタンパク質アッセイ（ＭＰＡ）（Ｌａｕら，２００７，ＰＮＡＳ，１０４：１１５５１）、ＥＬＩＳＡ、シード多量体化、ナノ粒子系検出、ナノスケール光学的バイオセンサー法、フローサイトメトリーを伴うデュアルカラーＦＲＥＴ検出、およびデュアルカラー単一凝集体ＦＣＳ検出（Ｆｕｎｋｅら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００９，６：２８５−２８９）によって行なわれ得る。Ａβ４０凝集体の測定値またはレベルを得ることに有用な例示的な試薬としては、ｍＡｂ１５８（Ｅｎｇｌｕｎｄら  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ２００７，１０３：３３４−３４５）、ならびにＡβ凝集体に特異的に結合するＫａｙｅｄら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００３、３００：４８６−４８９およびＭｏｌ．Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，２００７，２：１８）に記載された抗体が挙げられる。また、当業者に知られた他の抗体も使用され得る。
【０１２７】
一部の特定の実施形態では、Ａβ４０凝集体レベルは、体液または体組織のホモジネートを凝集体特異的結合試薬と、Ａβ４０凝集体（存在する場合）への該試薬の結合が可能な条件下で接触させ、複合体を形成させる第１工程を含む方法によって得られる。凝集体特異的結合試薬は、ペプトイド、ペプチドまたはデンドロンなどの、特定の電荷密度において固体支持体に結合させた場合、単量体よりも凝集体に優先的に結合する任意の試薬であり得る。試薬が単量体よりも凝集体に対して大きな親和性、アビディティおよび／または大きな特異性で結合する場合、該試薬は凝集体に「優先的に結合する」という。凝集体特異的結合試薬としては、例えば、米国特許仮出願第６１／２５８，１８８号（引用により本明細書に組み込まれる）に記載されたものが挙げられ得る。このような凝集体特異的結合試薬は、標識、例えば限定されないが、タグ（例えば、ビオチン、Ｈｉｓ−タグ、オリゴヌクレオチド）、色素、フルオロフォア、および結合ペアのメンバーで検出可能に標識されたものであってもよい。
【０１２８】
凝集体特異的結合試薬は固体支持体に結合させる。使用される固体支持体としては、限定されないが、ニトロセルロース、ポリスチレンラテックスビーズ、酸化チタン、酸化ケイ素、多糖ビーズ、多糖膜、アガロース、ガラス、ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール−ポリスチレンハイブリッド、細孔制御ガラス、ガラススライド、金ビーズ、およびセルロースが挙げられる。Ａβ４０凝集体特異的結合試薬は固体支持体に、当業者に知られた任意の方法によって結合させ得る。
【０１２９】
また、Ａβ４０凝集体の測定値またはレベルを得る方法は、生物学的試料中のＡβ４０凝集体（あれば）を、凝集体特異的結合試薬に対するその結合によって検出する後続工程を含む。一部の特定の実施形態では、該方法の検出工程は、サブ工程である、該試薬とＡβ４０凝集体によって形成された複合体を、Ａβ４０の未結合単量体（存在する場合）から分離する工程、任意選択で、Ａβ４０凝集体を該複合体から解離させる工程、およびＡβ４０凝集体を検出する工程を含むものであり得る。他の実施形態では、該方法の検出工程は、サブ工程である、該試薬とＡβ４０凝集体によって形成された複合体をＡβ４０の未結合単量体（存在する場合）から分離し、Ａβ４０の未結合単量体を除去する工程、該複合体内に存在しているＡβ４０凝集体を変性させ、Ａβ４０単量体を形成させる工程、およびＡβ４０単量体を検出する工程を含むものであり得る。該試薬とＡβ４０凝集体によって形成された複合体の、Ａβ４０の未結合単量体からの分離および取り出しは、免疫沈降と洗浄によって、サイズ排除クロマトグラフィーによって、または任意の他の当業者に知られた方法によって行なわれ得る。「解離」は、該凝集体が該試薬とは別に検出され得るような、該試薬からのＡβ４０凝集体の物理的分離をいう。該複合体からのＡβ４０凝集体の解離および変性は、例えば、３．０〜６．０Ｍのグアニジニウム塩酸またはグアニジニウムイソチオシアネートを用いて行なわれ得る。また、Ａβ４０凝集体は、ｐＨの変更などの当業者に知られた任意の方法によっても解離および変性され得、Ａβ４０単量体が形成される。
【０１３０】
該複合体を未結合単量体（存在する場合）から分離した後、Ａβ４０凝集体は検出試薬によって検出され得る。検出試薬は、任意の試薬、典型的には、Ａβ４０凝集体および／またはＡβ４０単量体に特異的に結合する抗体であり得る。好適な検出試薬は米国特許仮出願第６１／２５８，１８８号に記載されている。好ましい検出試薬としては、１１Ａ５０−Ｂ１０（Ｃｏｖａｎｃｅ）（Ａβ４０のＣ末端に特異的な抗体）；４Ｇ８（Ａβアミノ酸１８〜２２に特異的）；２０．１（Ａβアミノ酸１〜１０に特異的）；および６Ｅ１０（Ａβアミノ酸３〜８に特異的）が挙げられる。一部の特定の実施形態では、検出試薬は、標識、例えば限定されないが、タグ（例えば、ビオチン、Ｈｉｓ−タグ、オリゴヌクレオチド）、色素、フルオロフォア、および結合ペアのメンバーによって検出可能に標識されている。
【０１３１】
以下の非限定的な実施例を例示のために示す。
【実施例】
【０１３２】
実施例１：Ａβ４０凝集体は、ミスフォールドタンパク質アッセイ（ＭＰＡ）を用いてアルツハイマー病患者のＣＳＦ試料中において検出される
この実施例は、循環Ａβ４０凝集体が生物学的試料中、特に、ＣＳＦの生物学的液体試料中において検出され得ることを初めて示す。より重要なことには、この実施例は、アルツハイマー病患者のＣＳＦ試料が、アルツハイマー病を有しておらず、認知に関して正常であると推定される人の対照試料よりも高いＡβ４０凝集体レベルを有することを示す。捕捉試薬ＰＳＲ１（磁気ビーズに結合させたペプトイド試薬ＸＩＩｂ）を用いたミスフォールドタンパク質アッセイ（ＭＰＡ）を使用し、Ａβ４０単量体と対抗するＡβ４０凝集体を選択的に検出した。
【０１３３】
ＰＳＲ１の構造を以下に示す。
【０１３４】
【化１】
2013512440.tif 000003
基本的なＭＰＡの模式図を図１に示す。簡単には、最初はアミロイド選択的ビーズベース捕捉工程であり、続いて、特定のアミロイドタンパク質種の溶出および特異的検出である。ここでは、各データ点に対して最低２００マイクロリットルの患者ＣＳＦが使用されている。
【０１３５】
この実施例では、８名のアルツハイマー病患者のＣＳＦ試料（またはＡＤ試料）と８名の正常対照個体のＣＳＦ試料をＡｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＡＢＳ）から得た。この８例のＡＤ試料を、臨床認知ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）試験スコアに基づいて疾患病期に分類した。以下の基準を、この実施例で試験した試料のグループ分けに使用した。
【０１３６】
【表１】
2013512440.tif 000004
２００μｌのこれらの各ＣＳＦ試料を、５０μｌの５×ＴＢＳＴＴ（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５；７５０ｍＭ  ＮａＣｌ；５％Ｔｗｅｅｎ−２０；５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）および３０μｌのＰＳＲ１（Ｄｙｎａｌ  Ｍ２７０−カルボン酸ビーズに３０ｍｇ／ｍＬで共有結合させたペプトイド試薬ＸＩＩｂ）とともに、５５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。
【０１３７】
アッセイの陰性対照は、２５０μｌ／アッセイの１×ＴＢＳＴＴバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１％Ｔｗｅｅｎ−２０；１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を用いて三連で行なった。陽性対照は、１２５μｌ／アッセイの、１００ｎｌの超音波処理済の５％ＡＤＢＨ（アルツハイマー病  脳ホモジネート）を含む２００μｌの正常ＣＳＦ（アルツハイマー病のない個体のＣＳＦ）と５０μｌの１×ＴＢＳＴＴを用いて行なった。
【０１３８】
洗浄バッファーが除去されている間、ビーズを固定化させるための磁気分離を使用し、ビーズをＴＢＳＴ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で８回洗浄した。１００μｌの１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４（Ｓｉｇｍａ製，製品番号Ｔ７７６３）を添加し、混合物を、７５０ｒｐｍで振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。ビーズを、再度、磁気分離を用いてＴＢＳＴで８回洗浄した。凝集体を、２０μｌの０．１Ｎ  ＮａＯＨを添加し、７５０ｒｐｍで振盪しながら８０℃で３０分間インキュベートすることにより、溶出させ変性させた。アッセイプレートを氷上に直ちに１分間置き、次いで、０．４％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する２０μｌの０．１２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４の添加によって中和した。混合物を、７５０ｒｐｍで振盪しながら室温で５分間インキュベートした。磁気分離をアッセイプレートに適用し、上清を、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）製のキット、ＭＳＤ（登録商標）９６−Ｗｅｌｌ  ＭＵＬＴＩ−ＳＰＯＴ（登録商標）Ｈｕｍａｎ／Ｒｏｄｅｎｔ［４Ｇ８］Ａｂｅｔａ  Ｔｒｉｐｌｅｘ  Ｕｌｔｒａ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ａｓｓａｙの構成要素であるＥＬＩＳＡプレートに移した。ＥＬＩＳＡは、Ａβ３８、Ａβ４０およびＡβ４０の多重検出を可能にするキットのプロトコルに従って行なった。このキットで得られたＡβ４０検出についてのイムノアッセイの結果を図２に示す。
【０１３９】
図２Ａは、アルツハイマー病患者のＣＳＦ試料が、疾患がなく認知に関して正常であると推定される対照試料よりも統計学的に有意に高いＡβ４０凝集体レベルを有することを示す。
【０１４０】
図２Ｂにおいて、ＡＤ試料群は疾患病期に従って分けている。ＡＮＯＶＡ検定は、ＡＤ試料と対照試料が単一の集団に由来するものでないことを示す。個々のｔ−検定は、初期病期のＡＤ試料群と対照群との間、ならびに進行サブ病期のＡＤ試料群と対照群との間の有意差を示す。この試験では試料数が少ないため、診断の感度と特異性は計算しなかった。
【０１４１】
実施例２：Ａβ４０凝集体レベルは、初期および進んだ病期のアルツハイマー病の患者のＣＳＦ試料において増大している
この実施例により、初期および進んだ病期のアルツハイマー病の患者のＣＳＦ試料では、上昇したレベルのＡβ４０凝集体が検出され得ることが確認され、初期病期の患者は、進んだ病期のアルツハイマー病の患者よりも高いＣＳＦ  Ａβ４０凝集体レベルを有することが示唆される。
【０１４２】
この実施例では、３５例のＡＤのＣＳＦ試料と２３例の対照試料をＡＢＳから得た。これらの試料を、ＡＢＳによって定義された初期病期ならびに進行および後期ＡＤサブ病期にグループ分けした。ＭＭＳＥスコアはこれらの試料に対して利用可能でなく、そのため、実施例１で記載のような分類の確認は可能でなかった。試料は、実施例１に記載のものと同じ方法を用いて試験した。
【０１４３】
図３Ａにより、アルツハイマー病患者のＣＳＦ試料は、疾患がなく認知に関して正常であると推定される対照試料よりも統計学的に有意に高いＡβ４０凝集体レベルを有することが確認される。
【０１４４】
図３Ｂにおいて、ＡＤ試料群は、ＡＢＳによって分類された病期およびサブ病期に従って分けている。ＡＮＯＶＡ検定は、ＡＤ試料と対照試料が単一の集団に由来するものでないことを示す。個々のｔ−検定は、ＡＢＳ初期病期のＡＤ試料群と対照群との間、ＡＢＳ進行サブ病期のＡＤ試料群と対照群との間、およびＡＢＳ後期サブ病期試料群と対照群との間の有意差を示す。
【０１４５】
ＡＤについて、平均対照群ＲＬＵ値＋２標準偏差の決定閾値で、８２．８６％の臨床感度および９５．６５％の臨床特異性が観察された。
【０１４６】
実施例３：別の供給源から得た臨床ＣＳＦ試料により、Ａβ４０凝集体レベルは、初期および進んだ病期のアルツハイマー病の患者において増大していること、ならびにＡβ４０凝集体はＡＤおよび初期病期のＡＤのバイオマーカーであることが確認される
この実施例は、初期および進んだ病期のアルツハイマー病の患者のＣＳＦ試料では、上昇したレベルのＡβ４０凝集体が検出され得ること、ならびにＡβ４０凝集体レベルはＡＤおよび初期病期のＡＤの有用なバイオマーカーであることを示す。
【０１４７】
この実施例では、２６例のＡＤと１０例の対照試料を、実施例１において論じた基準を用いて異なる疾患病期およびサブ病期にグループ分けし、実施例１に記載のものと同じ方法を用いて試験した。
【０１４８】
ＣＳＦ試料は大学病院の研究室から得た。ＡＤ群は、記憶障害の診療を受けている平均年齢７１．８±７．３歳の２６名の患者からなる群であった。ＡＤと診断された患者は、痴呆のＤＳＭ−ＩＩＩＲ基準［Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（１９８７）Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，改訂第３版．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ａｓｓｏｃａｉｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，ＵＳＡ］、およびＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡによって規定された推定ＡＤの基準［ＭｃＫａｎｎ  Ｇ，Ｄｒａｃｈｍａｎ  Ｄ，Ｆｏｌｓｙｅｉｎ  Ｍ，Ｋａｔｚｍａｎ  Ｒ，Ｐｒｉｃｘｅ  Ｄ，Ｓｔａｄｌａｎ  ＥＭ（１９８４）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮＩＮＣＤＳ−ＡＲＡＤＡ  Ｗｏｒｋ  Ｇｒｏｕｐ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ａｕｓｐｉｃｅｓ  ｏｆ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｔａｓｋ  Ｆｏｒｃｅ  ｏｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ３４，９３９−９４４］を満たしていなければならなかった。ＡＤ患者を、さらなる臨床評価を伴って経時的に追跡した。対照群（合計１０例，平均年齢６９．４±９．７歳）は、記憶愁訴または任意の他の認知症状の非存在、進行中の神経系または精神科系の疾患の徴候がないことに基づいて規定した。すべての患者および対照から、本試験に参加するインフォームドコンセントを得た。ＣＳＦは、ポリプロピレンチューブ内に収集し、遠心分離し、アリコートに分け、分析まで−８０℃で保存した。
【０１４９】
図４Ａでは、異なる臨床ＣＳＦ試料の組を使用しており、アルツハイマー病患者が、疾患がなく認知に関して正常であると推定される対照試料よりも高いＡβ４０凝集体レベルを有することが確認される。
【０１５０】
図４Ｂにおいて、ＡＤ試料群は、疾患病期およびサブ病期に従って分けている。ＡＮＯＶＡ検定は、ＡＤ試料と対照試料が単一の集団に由来するものでないことを示す。個々のｔ−検定は、初期病期のＡＤ試料群と対照群との間、進行サブ病期のＡＤ試料群と対照群との間、および後期サブ病期のＡＤ試料群と対照群との間の有意差を示す。
【０１５１】
アルツハイマー病についての最適な感度と特異性を調べるため、ＲＯＣ分析を実施した。ＲＯＣ分析の実施には、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．０を使用した。このプログラムにより、いくつかの異なる閾値／カットオフ値でのＲＯＣ曲線および関連するＡＵＣ、感度および特異性の値が得られる。次いで、最良の感度と特異性が示される最適な閾値／カットオフ値を、単に、最大の感度と特異性（すなわち、この２つのパラメータ間で最小の差）が示される閾値の値を選択することにより手作業で決定する。
【０１５２】
ＲＯＣ曲線を図６に示す。Ａβ４０凝集体についての診断成績パラメータを以下に示す。
【０１５３】
本明細書で用いる場合、パラメータは上記に定義したものである。試験精度は、（ＴＰ＋ＴＮ）／（ＴＰ＋ＴＮ＋ＦＰ＝ＦＮ）によって計算される。
【０１５４】
【表２】
2013512440.tif 000005
また、Ａβ４０凝集体は、初期病期のＡＤのみの有用なバイオマーカーであり得るか否かを評価するため、これらの試料に着目してさらなるＲＯＣ分析を行なった。ＲＯＣ曲線を図７に示す。診断成績パラメータを以下に示す。
【０１５５】
【表３】
2013512440.tif 000006
また、ＭＰＡアッセイを使用し、該試料をＡβ４２凝集体レベルについても試験した。いずれのＡＤ試料においても、Ａβ４２凝集体シグナルの統計学的に有意な増大は検出されなかった（データ示さず）。
【０１５６】
実施例４：Ａβ４２単量体に対するＡβ４０凝集体の比は、ＡＤと初期病期のＡＤの両方のバイオマーカーである
この実施例は、アルツハイマー病の患者のＣＳＦ試料におけるＡβ４２単量体レベルの有意な減少、およびＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比の有意な増大を示す。
【０１５７】
単独でまたはＡβ４０凝集体との組合せでのいずれかで有用であり得る他のバイオマーカーを特定するため、実施例３に記載の試料におけるＡβ４２単量体レベルを評価するための実験を行なった。
【０１５８】
ＣＳＦ試料は、実施例１に記載のＭＳＤ（登録商標）９６−Ｗｅｌｌ  ＭＵＬＴＩ−ＳＰＯＴ（登録商標）Ｈｕｍａｎ／Ｒｏｄｅｎｔ［４Ｇ８］Ａβ  Ｔｒｉｐｌｅｘ  Ｕｌｔｒａ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ａｓｓａｙキットのプロトコルに従ってアッセイバッファー中で１：３に希釈し、プロトコルに適用して処理した。このキットでは、Ａβ４２が凝集体形態のときは埋没していると考えられているＡβのＣ末端テイル領域に向けられるＡβ４２抗体が使用される。試料は、実施例１の場合のように変性させなかったため、この方法によって検出されるＡβ４２の大部分は単量体形態であると予測される。
【０１５９】
図５Ａは、ＡＤの患者のＣＳＦ試料におけるＡβ４２単量体レベルの統計学的に有意な減少を示す。
【０１６０】
Ａβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比を、各試料について計算した。図５Ｂは、ＡＤの患者での該比の統計学的に有意な増大を示す。
【０１６１】
ＲＯＣ分析は、Ａβ４２単量体レベルのみ、またはＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比を用いて行なった。先の実施例に示したＡβ４０凝集体データを含むＲＯＣ曲線を図６に示す。ＡＤについての診断成績パラメータを以下に示す。
【０１６２】
【表４】
2013512440.tif 000007
３つのすべての尺度で、非常に良好な感度、特異性および精度の値が得られたが、Ａβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比で、３つのうちで最良の値が得られた。
【０１６３】
また、この比は、初期病期のＡＤのみの有用なバイオマーカーであり得るか否かを評価するため、試料をまた、実施例１に記載の基準を用いた疾患病期に従って分けた（図５Ｃ）。Ｔ−検定は、初期病期のＡＤ試料群と対照群との間、進行サブ病期のＡＤ試料群と対照群との間、および後期サブ病期のＡＤ試料群と対照群との間の有意差を示す。先の実施例のＡβ４０凝集体データを含むＲＯＣ曲線を図７に示す。初期ＡＤについての診断成績パラメータを以下に示す。
【０１６４】
【表５】
2013512440.tif 000008
実施例５：Ａβ４０単量体に対するＡβ４０凝集体の比はアルツハイマー病患者のＣＳＦ試料において増大している
この実施例は、アルツハイマー病の患者のＣＳＦ試料におけるＡβ４０単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比の有意な増大、およびこの比がＡＤの有用なバイオマーカーであることを示す。
【０１６５】
単独でまたはＡβ４０凝集体との組合せでのいずれかで有用なさらなるバイオマーカーを特定するため、実施例３に記載の試料におけるＡβ４０単量体レベルを評価するための実験を行なった。
【０１６６】
ＣＳＦ試料は、実施例１に記載のＭＳＤ（登録商標）９６−Ｗｅｌｌ  ＭＵＬＴＩ−ＳＰＯＴ（登録商標）Ｈｕｍａｎ／Ｒｏｄｅｎｔ［４Ｇ８］Ａβ  Ｔｒｉｐｌｅｘ  Ｕｌｔｒａ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ａｓｓａｙキットのプロトコルによって、アッセイバッファー中で１：１１に希釈し、プロトコルに適用して処理した。このキットでは、Ａβ４０が凝集体形態のときは埋没していると考えられているＡβ４０のＣ末端テイル領域に向けられるＡβ４０抗体が使用される。試料は、実施例１の場合のように変性させなかったため、この方法によって検出されるＡβ４０の大部分は単量体形態であると予測される。
【０１６７】
アルツハイマー病患者のＣＳＦ試料において、Ａβ４０単量体レベルの有意な変化はみとめられない（図８Ａ）。しかしながら、図８Ｂに示されるように、Ａβ４０単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比の統計学的に有意な増大がみとめられる。
【０１６８】
ＲＯＣ分析は、Ａβ４０単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比を用いて行なった。ＲＯＣ曲線を図６に示す。診断成績パラメータは以下に記載のとおりである。
【０１６９】
【表６】
2013512440.tif 000009
Ａβ４０単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比は、良好な感度、特異性および精度の特徴を有する。
【０１７０】
実施例６：より多くの臨床ＣＳＦ試料収集により、Ａβ４０凝集体レベルは軽度認知障害の患者およびアルツハイマー病患者の両方において増大していること、ならびにＡβ４０凝集体はＡＤおよびＡＤに進行するＭＣＩ患者サブセットの両方のバイオマーカーであることが確認される
この実施例は、ＭＣＩ患者およびＡＤ患者の大きなＣＳＦ試料の組ではどちらでも、上昇したレベルのＡβ４０凝集体が検出され得ること、ならびにＡβ４０凝集体レベルは、ＡＤおよびＡＤの臨床診断に進行するＭＣＩ患者で構成された初期病期のＡＤの有用なバイオマーカーであることを示す。
【０１７１】
この大きなＣＳＦ試料の組は、大学病院の研究室から得た。ＣＳＦ収集時点でのＡＤ群は、記憶障害の診療を受けている平均年齢７５．７±６．６歳の４７名の患者からなる群であった。ＡＤと診断された患者は、痴呆のＤＳＭ−ＩＩＩＲ基準［Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（１９８７）Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，改訂第３版．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ａｓｓｏｃａｉｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，ＵＳＡ］、およびＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡによって規定された推定ＡＤの基準［ＭｃＫａｎｎ  Ｇ，Ｄｒａｃｈｍａｎ  Ｄ，Ｆｏｌｓｙｅｉｎ  Ｍ，Ｋａｔｚｍａｎ  Ｒ，Ｐｒｉｃｘｅ  Ｄ，Ｓｔａｄｌａｎ  ＥＭ（１９８４）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮＩＮＣＤＳ−ＡＲＡＤＡ  Ｗｏｒｋ  Ｇｒｏｕｐ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ａｕｓｐｉｃｅｓ  ｏｆ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｔａｓｋ  Ｆｏｒｃｅ  ｏｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ３４，９３９−９４４］を満たしていなければならなかった。ＡＤ患者を、反復臨床評価を伴って、経時的に追跡した（これにより臨床診断精度が増大する）。ＣＳＦ収集時点のＭＣＩ群は、平均年齢７２．９±７．７歳の７１名の患者からなる群であり、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ［Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ＲＣ（２００４）Ｍｉｌｄ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ａｓ  ａ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｅｎｔｉｔｙ．Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  ２５６，１８３−１９４］によって提唱され、被験体の記憶愁訴、医師によって確認される客観的記憶障害、ＭＭＳＥスコアが≧２４である一般的認知機能の維持、日々の生活活動の障害は最小限であること、および痴呆のＤＳＭ−ＩＩＩＲ基準を満たしていないことを含めたＭＣＩの基準を満たしていなければならなかった。対照群は、記憶愁訴または任意の他の認知症状が存在せず、進行中の神経系または精神科系の疾患の徴候がない平均年齢７６．６±６．５歳の健常高齢志願者からなる群であった。
【０１７２】
ＭＣＩ患者を、平均４．７年間、後のＡＤまたは他の型の痴呆への転換について臨床的に追跡した。後のＡＤ診断は、ＣＳＦ収集時点のＡＤ群で先に記載のものと同じＡＤの基準を満たしていなければならなかった。ＣＳＦは、ポリプロピレンチューブ内に収集し、遠心分離し、アリコートに分け、分析まで−８０℃で保存した。
【０１７３】
１００μｌのこれらの各ＣＳＦ試料を、２５μｌの５×ＴＢＳＴＴ（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．４；７５０ｍＭ  ＮａＣｌ；４．１５％Ｔｗｅｅｎ−２０；４．１５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）および３０μｌのＰＳＲ１（Ｄｙｎａｌ  Ｍ２７０−カルボン酸ビーズに３０ｍｇ／ｍＬで共有結合させたペプトイド試薬ＸＩＩｂ）とともに、５００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。
【０１７４】
アッセイの陰性対照は、１００μｌ／アッセイの正常ヒトＣＳＦおよび２５μｌの５×ＴＢＳＴＴバッファーを用いて三連で行なった。陽性対照は、１００μｌの陽性対照ＣＳＦ（アルツハイマー病と診断された個体のＣＳＦ）および２５μｌの１×ＴＢＳＴＴを用いて行なった。
【０１７５】
洗浄バッファーが除去されている間、ビーズを固定化させるための磁気分離を使用し、ビーズをＴＢＳＴ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で８回洗浄した。１００μｌの１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４（Ｓｉｇｍａ製，製品番号Ｔ７７６３）を添加し、混合物を、７５０ｒｐｍで振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。ビーズを、再度、磁気分離を用いてＴＢＳＴで８回洗浄した。凝集体を、２０μｌの０．１５Ｎ  ＮａＯＨを添加し、７５０ｒｐｍで振盪しながら室温で３０分間インキュベートすることにより、溶出させ変性させた。０．４％のＴｗｅｅｎ−２０を含む２０μｌの０．１８Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４の添加によってアッセイプレートを直ちに中和した。混合物を、７５０ｒｐｍで振盪しながら室温で５分間インキュベートした。磁気分離をアッセイプレートに適用し、上清を、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）製のキット、ＭＳＤ（登録商標）９６−Ｗｅｌｌ  ＭＵＬＴＩ−ＳＰＯＴ（登録商標）Ｈｕｍａｎ／Ｒｏｄｅｎｔ［４Ｇ８］Ａｂｅｔａ  Ｔｒｉｐｌｅｘ  Ｕｌｔｒａ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ａｓｓａｙの構成要素であるＥＬＩＳＡプレートに移した。ＥＬＩＳＡは、Ａβ３８、Ａβ４０およびＡβ４２の多重検出を可能にするキットのプロトコルに従って行なった。この実施例では、４７例のＡＤ、７１例のＭＣＩおよび２１例の対照試料は、臨床診断に基づいて３つの異なる集団にグループ分けした。次いで、ＭＣＩ試料を、ＣＳＦ試料収集後に行なった追跡臨床診断に基づいてさらにサブ分類した。
【０１７６】
図９Ａでは、大きな別のＣＳＦ試料の組を使用し、アルツハイマー病患者は、認知に関して正常な対照試料よりも高いレベルのＡβ４０凝集体を有することが確認される。図９Ｂにおいて、ＭＣＩ患者試料を、さらに、他の非ＡＤ型痴呆に後に進行する７名のＭＣＩ患者、３４名の安定なＭＣＩ患者、および臨床診断ＡＤへと進行する３０名のＭＣＩ患者に分けた。ＡＤでは、Ａｂ４０凝集体レベルの統計学的に有意な増大がみとめられる。図９Ｃにおいて、ＭＣＩからＡＤの群において高シグナル外れ値を除くと、対照群とＭＣＩからＡＤの群との間にさらなる統計学的有意性が示される。
【０１７７】
Ａβ４２単量体が単独でまたはＡβ４０凝集体との組合せでのいずれかで有用であり得ることを確認するため、該試料におけるＡβ４２単量体レベルを評価するための実験も行なった。ＣＳＦ試料は、実施例１に記載のＭＳＤ（登録商標）９６−Ｗｅｌｌ  ＭＵＬＴＩ−ＳＰＯＴ（登録商標）Ｈｕｍａｎ／Ｒｏｄｅｎｔ［４Ｇ８］Ａβ  Ｔｒｉｐｌｅｘ  Ｕｌｔｒａ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ａｓｓａｙキットのプロトコルに従ってアッセイバッファー中で１：３に希釈し、プロトコルに適用して処理した。このキットでは、Ａβ４２が凝集体形態のときは埋没していると考えられているＡβのＣ末端テイル領域に向けられるＡβ４２抗体が使用される。試料は、実施例１の場合のように変性させなかったため、この方法によって検出されるＡβ４２の大部分は単量体形態であると予測される。
【０１７８】
図１０Ａは、認知が正常な適合対照と比べて、ＭＣＩまたはＡＤいずれかの患者のＣＳＦ試料におけるＡβ４２単量体レベルの統計学的に有意な減少を示す。また、Ａβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比も各試料について計算した。図１０Ｂは、ＭＣＩまたはＡＤいずれかの患者での該比の統計学的に有意な増大を示す。同様のＡβ４２単量体レベル値およびＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比が、ＭＣＩサブセットでも、それぞれ、図１０Ｃおよび１０Ｄに示されている。図１０Ｄは、ＡＤ患者と後にＡＤに進行したＭＣＩ患者の両方での該比の統計学的に有意な増大を示す。
【０１７９】
アルツハイマー病についての最適な感度と特異性を決定するため、ＲＯＣ分析を実施した。ＲＯＣ分析の実施には、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用のＰｒｉｓｍバージョン５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用した。このプログラムにより、いくつかの異なる閾値／カットオフ値でのＲＯＣ曲線および関連するＡＵＣ、感度および特異性の値が得られる。次いで、最良の感度と特異性が示される最適な閾値／カットオフ値を、単に、最大の感度と特異性（すなわち、この２つのパラメータ間で最小の差）が示される閾値の値を選択することにより手作業で決定する。
【０１８０】
ＡＤの診断のＲＯＣ曲線を図１１に示す。Ａβ４０凝集体、Ａβ４２単量体、およびＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比についての診断成績パラメータを以下に示す。
【０１８１】
【表７】
2013512440.tif 000010
３つのすべての尺度で、非常に良好な感度、特異性および精度の値が得られたが、Ａβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比で、３つのうちで最良の値が得られた。
【０１８２】
ＡＤのバイオマーカーとしてのＡβ４０凝集体
Ａβ４０凝集体が、ＡＤに進行したＭＣＩ患者およびＡＤ患者の特異的検出によって規定されるＡＤの検出の有用なバイオマーカーでもあり得るか否かを評価するため、これらの試料に着目して、図９Ｂの全データ点のさらなるＲＯＣ分析を行なった。ＲＯＣ曲線を図１２に示す。示した閾値の値は、ＭＣＩからＡＤへの転換およびＡＤの両方のものである。診断成績パラメータを以下に示す。
【０１８３】
【表８】
2013512440.tif 000011
３つのすべての尺度で、非常に良好な感度、特異性および精度の値が得られたが、Ａβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比で、３つのうちで最良の値が得られた。
【０１８４】
また、ＭＰＡアッセイを使用し、該試料をＡβ４２凝集体レベルについても試験した。いずれのＡＤ試料でもＡβ４２凝集体シグナルの統計学的に有意な増大は検出されなかった（データ示さず）。
【０１８５】
ＡＤに進行するＭＣＩバイオマーカーとしてのＡβ４０凝集体
Ａβ４０凝集体が、後にＡＤに進行するＭＣＩ患者の有用なバイオマーカーでもあり得るか否かを評価するため、図１１および対応する上記の表に要約したＲＯＣ分析で得られたＡＤの検出のための３つの閾値の値を、後にＡＤまたは他の型の非ＡＤ痴呆に進行したＭＣＩ患者サブセットの試料に適用した。その後のＡＤへの進行を予測するためのＡβ４０凝集体、Ａβ４２単量体、およびＡβ４０凝集体／Ａβ４２単量体比についてのこれらの閾値の値の診断有用性を以下に要約する。
【０１８６】
【表９】
2013512440.tif 000012
３つのすべての尺度で、非常に良好な感度、特異性および精度の値が得られたが、Ａβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比で、３つのうちで最良の値が得られた。
【０１８７】
実施例７：別の臨床ＣＳＦ収集では、Ａβ４０凝集体レベルがアルツハイマー病患者において増大していることが確認されない
この実施例では、ＡＤ患者の別の独立したＣＳＦ試料の組で上昇したレベルのＡβ４０凝集体が検出され得ることも、Ａβ４０凝集体レベルがＡＤの有用なバイオマーカーであることも示されない。
【０１８８】
このＣＳＦ試料の組は、実施例６で評価したＣＳＦ試料と同じ大学病院の研究室から得た。患者は、実施例６で論じたものと同じ基準で診断し、同じ様式で収集した。
【０１８９】
２００μｌのこれらの各ＣＳＦ試料を、５０μｌの５×ＴＢＳＴＴ（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５；７５０ｍＭ  ＮａＣｌ；５％Ｔｗｅｅｎ−２０；５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）および３０μｌのＰＳＲ１（Ｄｙｎａｌ  Ｍ２７０−カルボン酸ビーズに３０ｍｇ／ｍＬで共有結合させたペプトイド試薬ＸＩＩｂ）とともに、５００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。
【０１９０】
アッセイの陰性対照は、２００μｌ／アッセイの正常ヒトＣＳＦおよび５０μｌの５×ＴＢＳＴＴバッファー（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５；７５０ｍＭ  ＮａＣｌ；５％Ｔｗｅｅｎ−２０；５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を用いて三連で行なった。陽性対照は、２００μｌの陽性対照ＣＳＦ（アルツハイマー病と診断された個体のＣＳＦ）および５０μｌの１×ＴＢＳＴＴを用いて行なった。
【０１９１】
洗浄バッファーが除去されている間、ビーズを固定化させるための磁気分離を使用し、ビーズをＴＢＳＴ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で８回洗浄した。１００μｌの１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４（Ｓｉｇｍａ製，製品番号Ｔ７７６３）を添加し、混合物を、７５０ｒｐｍで振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。ビーズを、再度、磁気分離を用いてＴＢＳＴで８回洗浄した。凝集体を、２０μｌの０．１Ｎ  ＮａＯＨを添加し、７５０ｒｐｍで振盪しながら８０℃で３０分間インキュベートすることにより、溶出させ変性させた。アッセイプレートを氷上に直ちに１分間置き、２００×ｇで１分間４℃にて遠心分離し、次いで、０．４％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する２０μｌの０．１２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４の添加によって中和した。混合物を、７５０ｒｐｍで振盪しながら室温で５分間インキュベートした。磁気分離をアッセイプレートに適用し、上清を、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）製のキット、ＭＳＤ（登録商標）９６−Ｗｅｌｌ  ＭＵＬＴＩ−ＳＰＯＴ（登録商標）Ｈｕｍａｎ／Ｒｏｄｅｎｔ［４Ｇ８］Ａｂｅｔａ  Ｔｒｉｐｌｅｘ  Ｕｌｔｒａ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ａｓｓａｙの構成要素であるＥＬＩＳＡプレートに移した。ＥＬＩＳＡは、Ａβ３８、Ａβ４０およびＡβ４２の多重検出を可能にするキットのプロトコルに従って行なった。
【０１９２】
この実施例では、１５例のＡＤと１５例の対照試料は、臨床診断に基づいて２つの異なる集団にグループ分けした。図１３Ａ、ＢおよびＣは、Ａβ４０凝集体レベル、Ａβ４２単量体レベル、またはＡβ４２単量体レベルに対するＡβ４０凝集体レベルの比のいずれにおいても、認知が正常な対照のＣＳＦ試料とＡＤ患者のＣＳＦ試料との間で統計学的に有意な変化は観察されなかったことを示す。本発明者らは、比較的小さな試料の組を使用したこの実施例において、検出されたＡβ４０凝集体レベルおよびＡβ４２単量体レベルが、先の実施例で検出されたレベルよりもずっと低いことを観察した。この小さな試料の組および低い検出レベルにより、なぜ、この実施例では、ＡＤのＣＳＦ試料において上昇したレベルのＡβ４０凝集体が検出され得ることを確認できないのかが説明され得る。
【０１９３】
実施例８：分画遠心分離法によるＡＤ  ＣＳＦからのＡβ４０凝集体のサイジング
この実施例では、ＰＳＲ１によってアルツハイマー病ＣＳＦから捕捉された凝集体の物理的性質を特性評価する。
【０１９４】
スパイクなしか、５ｎｇ／ｍＬのグロブロマーまたは２００ｎＬ／ｍＬのＡＤＢＨ（超音波処理あり、またはなし）でスパイクしたＡＤ  ＣＳＦまたはプールしていた正常ＣＳＦを、１６，０００×ｇで１０分間または１３４，０００×ｇで１時間、４Ｃにて遠心分離した。上清およびペレット画分を別々のチューブに採取し（ペレットは、元の試料と同じ容積のＣＳＦ中で再構成させた）、ミスフォールドタンパク質アッセイ（ＭＰＡ）に供した。
【０１９５】
ミスフォールドタンパク質アッセイ：１００ｕｌの試料を、２５ｕｌの５×ＴＢＳＴＴバッファー（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，７５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５％Ｔｗｅｅｎ２０，５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ｐＨ７．５）および３０ｕｌのＰＳＲ１ビーズとともに３７Ｃで１時間インキュベートした。ビーズをＴＢＳＴで６回洗浄した後、１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４との３０分間のインキュベーションおよびさらなるＴＢＳＴでの洗浄を行なった。Ａベータペプチドを０．１５Ｍ  ＮａＯＨで室温にて３０分間溶出させた後、０．１８Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４＋０．５％Ｔｗｅｅｎ２０での溶出液の中和およびＭｅｓｏｓｃａｌｅの三重Ａβイムノアッセイによる検出を、製造業者の使用説明書に従って行なった。
【０１９６】
公知の大きさの種々の凝集体の挙動を決定し、アルツハイマーＣＳＦ中にみられる凝集体の分子量参照を得た。凝集体の可溶性は、必ずしも分子量と線形関係を有するとは限らない（そして、凝集体のコンホメーションによって変動する）が、この試験では、凝集体の大きさのある程度の参照枠が示される。超音波処理していないアルツハイマー病脳ホモジネート（ＡＤＢＨ）由来のＡベータ原線維を１６，０００ｇおよび１３４，０００ｇの両方でペレット化した。この凝集体は、ＴＳＫ４０００カラムのボイドボリューム付近で溶出され、おそらく１ＭＤａより大きい。超音波処理したＡＤＢＨのある割合のＡベータ凝集体は、１６，０００ｇでは可溶性であったが、１３４，０００ｇではペレット化された。サイズ排除クロマトグラフィーにより、これらの凝集体は約０．５〜１ＭＤａであると推定された。グロブロマー（およそ５４ＫＤａであると推定される）は、１６，０００ｇと１３４，０００ｇの両方において可溶性であった。
【０１９７】
図１４は、１６，０００ｇまたは１３４，０００ｇで遠心分離したアルツハイマー病ＣＳＦおよび正常ＣＳＦの上清およびペレット中の、ミスフォールドタンパク質アッセイによって検出されたＡβ４０凝集体の量を示す。ＡＤ  ＣＳＦ中の内因性Ａβ４０凝集体は、１３４，０００ｇでの１時間の遠心分離後、溶液中のままであり、これは、該凝集体が、超音波処理したＡＤＢＨ試料中に見られる０．５〜１ＭＤａの「中間の大きさの」凝集体より小さいものであり得ることを示唆する。このようなデータは、ＡＤ  ＣＳＦ中に見られるオリゴマーが、組織（ＡＤＢＨ）内に沈着する凝集体と比較した場合、可溶性に関して異なる挙動を有することを示し、大きさがより小さいことを示唆する。
【図１】
2013512440.tif 000013
【図２】
2013512440.tif 000014
【図３】
2013512440.tif 000015
【図４】
2013512440.tif 000016
【図５−１】
2013512440.tif 000017
【図５−２】
2013512440.tif 000018
【図６】
2013512440.tif 000019
【図７】
2013512440.tif 000020
【図８】
2013512440.tif 000021
【図９−１】
2013512440.tif 000022
【図９−２】
2013512440.tif 000023
【図１０−１】
2013512440.tif 000024
【図１０−２】
2013512440.tif 000025
【図１１】
2013512440.tif 000026
【図１２】
2013512440.tif 000027
【図１３−１】
2013512440.tif 000028
【図１３−２】
2013512440.tif 000029
【図１４】
2013512440.tif 000030
【国際調査報告】
2013512440.tif 000031
2013512440.tif 000032
2013512440.tif 000033
2013512440.tif 000034
2013512440.tif 000035
2013512440.tif 000036