(57)【要約】  本発明は、図２Ａに示されたアミノ酸配列を有するヒトＡｎｘ−Ａ１  タンパク質に対して高められた結合性を有する特異性結合性分子を提供する。本発明は、Ｔ細胞媒介性疾患の治療における特異性結合性分子の使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
図２Ａに示されたアミノ酸配列を有するヒトＡｎｘ−Ａ１  タンパク質に対して高められた結合性を有する特異性結合性分子。
【請求項２】
請求項１記載の特異性結合性分子であって、該特異性結合性分子の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）のＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ３、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む特異性結合性分子、またはそれぞれのＣＤＲｓと少なくとも７０％同一なアミノ酸配列。
【請求項３】
相補性決定領域（ＣＤＲｓ）のＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ３、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む請求項２記載の特異性結合性分子であって、
ＶＬＣＤＲ１はＫＡＳＥＮＶＶＴＹＶＳ、
ＶＬＣＤＲ２はＧＡＳＮＲＹＴ、
ＶＬＣＤＲ３はＧＱＧＹＳＹＰＹＴ、
ＶＨＣＤＲ１はＧＹＴＦＴＮＹＷＩＧ、
ＶＨＣＤＲ２はＤＩＹＰＧＧＤＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧ、
ＶＨＣＤＲ３はＷＧＬＧＹＹＦＤＹ、
または、それらと少なくとも７０％同一なアミノ酸配列である。
【請求項４】
該特異性結合性分子は、抗体またはそのフラグメントである、請求項１から３のいずれか１項記載の特異性結合性分子。
【請求項５】
該抗体がモノクローナル抗体である、請求項４記載の特異性結合性分子。
【請求項６】
モノクローナル抗体が人間化される、請求項５記載の特異性結合性分子。
【請求項７】
該フラグメントがＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖフラグメント、またはｓｃＦｖ分子である、請求項４記載の特異性結合性分子。
【請求項８】
図１１および／または図１３に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項１から５、または７のいずれか１項記載の特異性結合性分子。
【請求項９】
２０１０年６月３日にアクセションナンバー１００６０３０１として欧州細胞カルチャーコレクション（ＥＣＡＣＣ）に寄託されたハイブリドーマ細胞系によって製造される、請求項１から５のいずれか１項記載の特異性結合性分子。
【請求項１０】
図２Ａに示されたアミノ酸配列を有するヒトＡｎｘ−Ａ１  タンパク質に対して高められた結合性を有する特異性結合性分子を製造するハイブリドーマ細胞系。
【請求項１１】
２０１０年６月３日にアクセションナンバー１００６０３０１として欧州細胞カルチャーコレクション（ＥＣＡＣＣ）に寄託された、請求項１０記載のハイブリドーマ細胞系。
【請求項１２】
請求項１から９のいずれか１項記載の特異性結合性分子を含む製薬組成物。
【請求項１３】
さらに別の治療的活性薬を含む、請求項１２記載の製薬組成物。
【請求項１４】
薬剤における使用のための、請求項１から９のいずれか１項記載の特異性結合性分子。
【請求項１５】
Ｔ細胞媒介性疾患の治療における使用のための、請求項１から９のいずれか１項記載の特異性結合性分子。
【請求項１６】
前記Ｔ細胞媒介性疾患が移植対宿主病、移植拒否反応、アテローム性動脈硬化、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、乾癬、流産、および自己免疫疾患患から成る群から選択される、請求項１５記載の特異性結合性分子。
【請求項１７】
前記自己免疫疾患がリウマチ性関節炎（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、アジソン病、甲状腺機能亢進症、強皮症、多発性筋炎、糖尿病、自己免疫性ぶどう膜網膜炎、潰瘍性大腸炎、尋常性天疱瘡、炎症性腸疾患、自己免疫性甲状腺炎、ぶどう膜炎、ベーチェット病、およびシェーグレン症候群候群から成る群から選択される、請求項１６記載の特異性結合性分子。
【請求項１８】
前記自己免疫疾患がリウマチ性関節炎（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、および全身性エリテマトーデスである（ＳＬＥ）から成る群から選択される、請求項１７記載の特異性結合性分子。
【請求項１９】
前記自己免疫疾患は、リウマチ性関節炎（ＲＡ）または多発性硬化症（ＭＳ）である、請求項１８記載の特異性結合性分子。
【請求項２０】
前記Ｔ細胞媒介性疾患がアテローム性動脈硬化、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、および乾癬から成る群から選択される、請求項１６記載の特異性結合性分子。
【請求項２１】
請求項１から９のいずれか１項記載の特異性結合性分子の、Ｔ細胞媒介性疾患の治療における使用のための医薬の製造での使用。
【請求項２２】
請求項１から９のいずれか１項記載の特異性結合性分子を対象に投与することを含む、必要とされる対象における、Ｔ細胞媒介性疾患の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野  
本発明は特異性結合性分子、特にはアネキシン−Ａｌと結合する、抗体およびフラグメント、およびそのような特異性結合分子を生成するハイブリドーマ細胞ラインに関する。そのような特異性結合性分子はＴ細胞媒介性疾病の治療に有用である。
【０００２】
発明の背景
グルココルチコイド類（ＧＣｓ）は同時に先天性および適応的免疫反応の両方を妨げるその能力のため、さまざまな慢性の自己免疫疾患の療法にしばしば使用される。本発明者と他の研究グループによるここ約１０年間の研究は、先天性免疫応答へのＧＣｓの炎症効果のいくつかがアネキシン−１（Ａｎｎｅｘｉｎ−１：Ａｎｘ−Ａ１）と呼ばれるタンパク質によって仲介されることを示した。このタンパク質が好中性、マクロファージおよび内皮細胞を含む多くの細胞タイプのホメオスタティック・コントロールを生むと立証された。しかしながら、いつも無視される１つの態様は、適応的免疫反応におけるＡｎｘ−Ａ１の役割である。Ａｎｘ−Ａ１がグルココルチコイドの薬理効果の二次メッセンジャーの１つとして提案されていたことは驚くべきものである。
【０００３】
本発明者は、以前に、Ａｎｘ−Ａ１がＴ細胞レセプタ（ＴＣＲ）シグナリングの強度を調節することによってＴ細胞における恒常性の役割を果たすことを示した(D'Acquisto et al. , Blood 109: 1095-1102, 2007)。
【０００４】
さらに、本発明者は、Ａｎｘ−Ａ１の高水準がＴ細胞活性化の閾値を下げることを示し、Ｔｈ１  細胞への分化を支持し、Ａｎｘ−Ａ１の不完全なマウスがインペアードＴ細胞活性化を示し、Ｔｈ２細胞への増加した分化を示すことを示した(D'Acquisto et al. , Eur. J. Immunol. 37: 3131-3142, 2007)。
【０００５】
ＷＯ２００５／０２７９６５は、アポトーシス好中球が抗炎症の信号を樹枝状細胞に送達する機構の発見について記載し、このプロセスを妨げる抗体を同定する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の要約
本発明者は有害な細胞傷害効果なしでＴ細胞活性化を特異的に阻害する点で素晴らしい特性を持っているモノクローナル抗体を同定した。この抗体はＴ細胞仲介疾病、たとえば慢性関節リウマチまたは多発性硬化症の治療に有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従って、本発明は図２Ａに示されるアミノ酸配列を有するヒトＡｎｘ−Ａ１  タンパク質に対する向上した結合性を有する特異性結合性分子（specific binding molecule）を提供する。
【０００８】
定義
本明細書において使用される時、「特異性結合性分子」は、互いに結合特異性を持っている１組の分子のメンバーである。特異性結合性組のメンバーは、天然由来か、または完全または部分的に人工的に製造することができる。分子対の１つメンバーは、その表面に突出部またはくぼみであることができる領域を有する。これは分子組の他のメンバーの特定の空間的または極性部分と特異的に結合し、したがってそれと補足的であることができる。したがって、組のメンバーは互いに特異的に結合する能力を有している。特異的結合性組のタイプの例は、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモンレセプタ、受容体−配位子、酵素−基質である。一般に、本発明は抗原−抗体タイプの反応に関する。本発明の特異性結合性分子はＡｎｘ−Ａ１へ、他の分子類より大きな親和性で結合する、すなわち、特異的にＡｎｘ−Ａ１に結合する。Ａｎｘ−Ａ１に結合する特異性結合性分子は、アンチＡｎｘ−Ａ１抗体とアプタマー(aptamer)を含んでいる。本発明の特異性結合性分子は典型的には抗体である。本発明機能の抗−Ａｎｘ−Ａ１抗体は、投与された際にＴ細胞活性化を妨害し、その結果、典型的にはＴ細胞活性化の異常により引き起こされるＴ細胞媒介性疾病の治療に使用されることができる。
【０００９】
用語「抗体」は本明細書で用いられる場合には免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部位、すなわち、ある抗原と特異的に結合する抗原結合性部位を含む分子を意味し、天然由来か、または完全または部分的に人工的に製造することができる。この用語はまた、抗体結合ドメインであるかまたはそれと相同である結合領域を持っているすべてのポリペプチドまたはタンパク質を包含する。天然源からこれらを得るか、または一部または完全に人工的にそれらを製造できる。抗体は、典型的には２つの同じ重鎖と、重鎖よりも短い２つの同じ軽鎖を含むポリペプチドである。哺乳類には、２つのタイプの軽鎖である、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）と呼ばれる鎖がある。重鎖と軽鎖のそれぞれは可変領域と不変領域で構成される。重鎖可変領域はＶＨ領域と呼ばれ、軽鎖可変領域はＶＬ領域と呼ばれる。また、カッパ軽鎖に関しては、可変領域はＶＫ領域とも呼ばれる。重鎖と軽鎖のそれぞれの可変領域は３つの相補性決定領域（ＣＤＲｓ）、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。これらはそれぞれＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ３、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３と命名される。抗体の例としては、免疫グロブリンアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＡ）とそれらのアイソタイプサブクラス；Fab, F(ab')2, Fv, scFv, dAb, Fdのような、抗原結合領域を含むフラグメント；および二特異性抗体（diabody)があげられる。抗体は、ポリクローナル、またはモノクローナルであることができる。モノクロナール抗体は、本明細書において”ｍＡｂ”と呼ぶことがある。
【００１０】
発明の詳細な説明
アネキシンは、カルシウム−、およびりん脂質−結合細胞性蛋白質の群であり、また、リポコルチンとして知られている。アネキシンファミリーには、アネキシン  Ａｌ、アネキシン  Ａ２、およびアネキシン  Ａ５を含む１３のメンバーがある。また、アネキシン−Ａ１はアネキシン−１としても知られ、本明細書では「Ａｎｘ−Ａ１」とも呼ばれる。アネキシン−１（Ａｎｘ−Ａ１）は、３７ｋＤａの蛋白質であり、元々、グルココルチコイド類の作用のメディエータとして記述された。ここ数年間にわたって、証拠は、Ａｎｘ−Ａ１が順応性免疫系、特にＴ細胞におけるＴ細胞レセプタ（ＴＣＲ）シグナリングの強度を調節することにより恒常性の役割を果たすことを示している。Ａｎｘ−Ａ１は先天性免疫反応の細胞における炎症の内因のダウンレギュレータとして生体内で機能する。図１Ａは、Ａｎｘ−Ａ１の三次元構造を示しているリボン・ダイヤグラムである。
【００１１】
Ａｎｘ−Ａ１をコード化する８つのヒトヌクレオチド配列がある。もちろん、４つだけが翻訳されるので、ＡＮＸＡ１−００２、ＡＮＸＡ１−００３、ＡＮＸＡ１−００４およびＡＮＸＡ１−００６と指定されたＡｎｘ−Ａ１の４つのアイソフォームがある。これらの配列は、Ｅｎｓｅｍｂｌウェブサイト（www.ensembl.org）から利用可能であり、ＯＴＴＨＵＭＴ００００００５２６６４（ＡＮＸＡ１−００２）、ＯＴＴＨＵＭＴ００００００５２６６５（ＡＮＸＡ１−００３）、ＯＴＴＨＵＭＴ００００００５２６６６（ＡＮＸＡ１−００４）およびＯＴＴＨＵＭＴ００００００５２６６８（ＡＮＸＡ１−００６）と指定される。ヒトアネキシン−１（Ａｎｘ−Ａ１）の１つのアイソフォームの（ＡＮＸＡ１−００３）のアミノ酸とヌクレオチド配列は図２Ａに示される。ＡＮＸＡ１−００２、ＡＮＸＡ１−００４、およびＡＮＸＡ１−００６のアイソフォームのアミノ酸配列は図２Ｂ、２Ｃ、および２Ｄにそれぞれ示されている。図２から見られるように、アイソフォームＡＮＸＡ１−００２、ＡＮＸＡ１−００４、およびＡＮＸＡ１−００６はＡＮＸＡ１−００３のショートスプライス変形または少ない数のアミノ酸変化があるＡＮＸＡ１−００３の変形のどちらかである。
【００１２】
多くの研究が、Ａｃ．２−２６と名付けられたＡｎｘ−Ａ１のＮ末端基ペプチドが全蛋白質のバイオ活性代用薬として作用することを示した（例えば、 Lim et ol, Proc Natl Acad Sci USA 95, 14535-9, 1998を参照されたい）。
図１Ｂはアネキシン反復とこのバイオ活性配列の位置の略図である。ペプチドＡｃ．２−２６は図２に示されたＡｎｘ−Ａ１の全長アミノ酸配列のアミノ酸残基２−２６の配列を有するアセチル化ペプチドである。ペプチドＡｃ．２−２６の配列は、図１Ｃに示されていて、以下の通りである：
ＣＨ３ＣＯ−ＡＭＶＳＥＦＬＫＱＡＷＦＩＥＮＥＥＱＥＹＶＱＴＶＫ
【００１３】
Ａｎｘ−Ａ１とそのＮ末端基から誘導された生理活性ペプチドは、ホルミルペプチド受容体（ＦＰＲ）ファミリーのメンバーを通してそれらの生体学的効果を仲介する。Ａｎｘ−Ａ１はホルミルペプチド受容体  ライク−１（formyl peptide receptor like-1：ＦＰＲＬ−１）のファミリーの１つのメンバーの直接結合と活性化により、好中球の血管外遊出と先天性免疫への逆−調節性作用（counterregulatory actions）を生む。本発明者は以前に、ｈｒＡｎｘ−Ａ１の存在下でのＴ細胞の刺激が、ＦＰＲＬ−１の刺激を介してＴ細胞活性化を増加させることを見いだした(D’Acquisto et al., Blood 109: 1095-1102, 2007)。
【００１４】
本発明の特異性結合性分子はアネキシン−１（Ａｎｘ−Ａ１）に結合する。
特異性結合性分子が結合するＡｎｘ−Ａ１は、図２Ａに示されたポリペプチド配列を持っているヒトＡｎｘ−Ａ１である。
【００１５】
本発明の第１の態様では、図２Ａに示されたアミノ酸配列を有するヒトＡｎｘ−Ａ１  タンパク質に対して向上された、特異性結合性分子を提供する。
【００１６】
また本発明のこの態様は、本発明の第１の態様の特異性結合性分子の相補性決定領域（Complementarity Determining Regions:CDRs）のＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ３、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含む特異性結合性分子、またはそれぞれのＣＤＲｓと少なくとも７０％同じアミノ酸配列を含む特異性結合性分子を提供する。特異性結合性分子は典型的には抗体である。
【００１７】
１つの実施態様では、特異性結合性分子は相補性決定領域ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ３、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３を含み、それぞれは以下のアミノ酸配列を含む。
ＶＬＣＤＲ１はＫＡＳＥＮＶＶＴＹＶＳ。
ＶＬＣＤＲ２はＧＡＳＮＲＹＴ。
ＶＬＣＤＲ３はＧＱＧＹＳＹＰＹＴ。
ＶＨＣＤＲ１はＧＹＴＦＴＮＹＷＩＧ。
ＶＨＣＤＲ２はＤＩＹＰＧＧＤＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧ。
ＶＨＣＤＲ３はＷＧＬＧＹＹＦＤＹ。
または、少なくとも７０％が同じアミノ酸配列である。
【００１８】
ＣＤＲｓは、保存配列定義部（Kabat et al in "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Nat'l. Inst. Health, Bethesda, MD (1987)）と構造定義部（ChothiasとLesk J.Mol Biol.196:901-17(1987))の組み合わせにより指定される。これらの定義はカーター他でも記載される（Proc Nat’Acad Sci USA.89:4285-9 (1992)。
【００１９】
また、本発明は上記のペプチド配列の変異体も含む。本明細書において使用される時、「変異体」という用語は同様のアミノ酸配列を有し、および／または同じ機能を有するタンパク質をいう。例えば、「変異体」という用語は１以上のアミノ酸の付加、欠失、置換または同様のものを含むタンパク質またはポリペプチドを包含する。本発明の変異体の例は上で定義されたタンパク質、たとえば融合たんぱく質であり、ペプチドを含み、１種以上のアミノ酸類の他の１種以上のアミノ酸類での置換を有することができる。当業者は、様々なアミノ酸類が同様の特性を有することを意識している。１種以上のそのようなアミノ酸類物質は、その物質の希望の活性を取り除かずに、他の１種以上のそのようなアミノ酸類によってしばしば置換されることができる。
【００２０】
したがって、しばしば互いにアミノ酸類のグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンは互いに置換されることができる（脂肪族側鎖を有するアミノ酸類）。これらの可能な置換では、グリシンとアラニンが互いに置き換えをすることが好ましく（それらには比較的短い側鎖を有するので）、バリン、ロイシン、およびイソロイシンが互いに置き換えをすることが好ましい（疎水性であるより大きい脂肪族側鎖を有するので）。互いにしばしば置換されることができる他のアミノ酸類としては：フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；リシン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性の側鎖を有するアミノ酸）；アスパラギン酸およびグルタミン酸（酸性の側鎖を有するアミノ酸）；アスパラギンおよびグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；システインとメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）が挙げられる。
【００２１】
この種の置換はしばしば「保守的」または「準保守的な」アミノ酸置換と呼ばれる。したがって、本発明は上記のアミノ酸配列を有するＣＤＲｓを含み、ＣＤＲｓ中に１以上の保守的な置換基、たとえば上記のものと少なくとも７０％同じであるＣＦＲｓのアミノ酸配列を含む特異性結合性分子に及ぶ。例えば、それぞれのＣＤＲが上記のＣＤＲｓのアミノ酸配列と比較して、１、２、３、４または５の保守的置換基（ＣＤＲに依存する）を持つことができる。例えば、上記のＶＬＣＤＲ１のアミノ酸配列内に１、２または３の保守的置換基が存在することができ、上記のＶＬＣＤＲ２のアミノ酸配列内に１または２の保守的置換基が存在することができ、上記のＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列内に１または２の保守的置換基が存在することができ、上記のＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列内に１、２または３の保守的置換基が存在することができ、上記のＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列内に１、２、３、４または５の保守的置換基が存在することができ、上から出されたＶＬＣＤＲ２のアミノ酸配列、上記のＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列内に１、２または３の保守的置換基が存在することができ、そして、配列は上記のＣＤＲ配列と少なくとも７０％の同一性を保有するだろう。
【００２２】
３文字と１文字コードを使用して、以下の通りアミノ酸類について言及できる：グリシン（ＧまたはＧｌｙ）、アラニン（ＡまたはＡｌａ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、プロリン（ＰまたはＰｒｏ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、チロシン（ＹまたはＴｙｒ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）、リシン（ＫまたはＬｙｓ）、アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）、システイン（ＣまたはＣｙｓ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）、およびトレオニン（ＴまたはＴｈｒ）、残基がアスパラギン酸またはアスパラギンの場合、シンボルはＡｓｘまたはＢが使用できる。残基がグルタミン酸またはグルタミンの場合、シンボルはＧｌｘまたはＺが使用できる。文脈がそうでないことを示さない限り、アスパラギン酸の参照としてはアスパラギン酸塩を含み、およびグルタミン酸はグルタミン酸塩を含む。
【００２３】
アミノ酸欠失または挿入も、上記の融合たんぱく質のようなタンパク質のアミノ酸配列に対して起こることができる。したがって、たとえばポリペプチドの活性に実質的効果を持っていないか、または少なくともそのような活性を取り除かないアミノ酸類を欠失することができる。そのような欠失は利益がある。なぜなら、ポリペプチドの全長と分子量を、活性を保有しつつ、減少することができるからである。これは特定の目的のために必要であるポリペプチドの量の低減を可能にし、例えば、投与量レベルを減少できる。
【００２４】
また、上記の融合たんぱく質の配列に対するアミノ酸挿入も行うことができる。本発明の物質の特性を変更するためにこれを行うことができる（例えば、先に融合たんぱく質と関連して説明したような識別、精製または発現を補助するために）。
【００２５】
上に与えられた配列に対するアミノ酸変化は、例えば、部位特異的突然変異誘発または固体状態合成のような、任意の適当なテクニックを使用して行われることができる。
【００２６】
本発明の範囲内で、アミノ酸の置換または挿入を、天然由来または非天然由来のアミノ酸類を使用することで行うことができることが理解されるべきである。天然の、または合成のアミノ酸類が使用されるか否かに関わりなく、Ｌ−アミノ酸類だけが存在しているのが好ましい。
【００２７】
当技術分野で知られている「同一性」は、二個以上のポリペプチド配列または二以上のポリヌクレオチド配列の間の相関であり、配列を比較することによって決定する。また、当技術分野で同一性は、そのような配列のストリングの間の同一性により決定される、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の間の配列の関連性の度合いも意味する。２つのポリペプチド配列または２つのポリヌクレオチド配列の間の同一性を測定する多くの方法が存在しているが、同一性を決定するのに一般的に使われている方法は、コンピュータプログラムによるものである。２つの配列の間の同一性を決定する好ましいコンピュータプログラムとしては、ＧＣＧプログラムパッケージ(Devereux, et al., Nucleic Acids Research, 12, 387 (1984), BLASTP, BLASTN, and FASTA (Atschul et al., J. Molec. Biol. 215, 403 (1990))があげられるが、これに限定されない。
【００２８】
アミノ酸配列を比較するのにＣＬＵＳＴＡＬプログラムなどのプログラムを使用することもできる。適宜にいずれかの配列に空間を挿入することによって、このプログラムはアミノ酸配列を比較して、最適アラインメントを見いだす。最適なアラインメントのためにアミノ酸同一性または類似性について計算（アミノ酸タイプの同一性と保守性）することが可能である。ＢＬＡＳＴｘのようなプログラムは、類似配列の最も長い広がりを並べて、適合性の値を割り当てるだろう。その結果、それぞれが異なったスコアを有するいくつかの領域の類似が見いだされる領域について、比較することが可能である。同一性分析の両方のタイプが本発明で想定される。
【００２９】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセントは、最適の比較目的のために配列を並べ（例えば、最も良い配列のために第１の配列にギャップを導入することができる）、対応する位置でアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較することによって決定する。「最も良い並び」は、最も高いパーセントの同一性をもたらす２つの配列の並びである。パーセントの同一性は配列中の同じアミノ酸残基またはヌクレオチドの数で比較して決定する（すなわち、同一性％＝同じ位置／位置の総数×１００の値と等しい）。
【００３０】
２つの配列の間のパーセントの同一性の決定は、当業者に公知の数学的アルゴリズムを使用することで実行される。２つの配列を比較するための数学的アルゴリズムの例はカーリンとアルツチュルのアルゴリズム、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268、およびKarlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877で改良されたものである。Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410の、ＮＢＬＡＳＴとＸＢＬＡＳＴプログラムは、そのようなアルゴリズムを取り入れた。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索はＮＢＬＡＳＴプログラムで、スコア＝１００、語長＝１２で実行されて、本発明の核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得る。
ＢＬＡＳＴタンパク質検索はＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、語長＝３で実行されて、本発明のタンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得る。比較目的のためのギャップを有する配列を得るために、Gapped BLASTがAltschuｌらに記載されているようにして利用される（Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402）。別法として、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔが、分子間の距離関係を検出する繰り返された検索を実行するのに使用される（同上）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用するとき、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴとＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータ類が使用される。http://www.ncbi.nlm.nih.gov  を参照されたい。配列の比較に利用された数学的アルゴリズムの別の例はマイアーズとミラー（ＣＡＢＩＯＳ（１９８９））のアルゴリズムである。ＣＧＣ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）はそのようなアルゴリズムを取り入れている。当技術分野で知られている配列分析のための他のアルゴリズムとしては、トレリスとロボッティに記載されているＡＤＶＡＮＣＥとＡＤＡＭ（Torellis and Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10 :3-5）、およびＦＡＳＴＡ（Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-8）があげられる。ＦＡＳＴＡでは、ｋｔｕｐは、検索の感受性と速度を設定する制御オプションである。
【００３１】
典型的に、本発明の特異性結合性分子のＣＤＲｓのアミノ酸配列は、ＨＧＭＰ（Human Genome Mapping Project）によって提供されたＢＬＡＳＴコンピュータプログラム（Atschul他、J.MoL Biol.215,403-410(1990)）のデフォルトパラメータ類を使用して、アミノ酸値で、上記で説明したＣＤＲｓのアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性がある。より典型的には、ＣＤＲ配列は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または少なくとも９９％の、アミノ酸値で、上記で説明したＣＤＲｓのアミノ酸配列と同一性がある。典型的には、本発明の特異性結合性分子のＣＤＲ配列のそれぞれは、アミノ酸値で、上記で説明したＣＤＲｓのアミノ酸配列とこのレベルの同一性を有する。あるいはまた、本発明の特異性結合性分子のＣＤＲの任意の１、２、３  ４または５は、上記で説明したＣＤＲｓのアミノ酸配列とこのレベルの同一性を有する。
【００３２】
本発明の特異性結合性分子は典型的に抗体であり、より典型的にモノクローナル抗体である。１つの実施態様では、本発明のモノクローナル抗体はヒト化される。
【００３３】
本発明のモノクローナル抗体は、抗体のアミノ酸配列を変更することによって、ヒト化される。本発明の特異性結合性分子の免疫原性を減少させる方法は、例えば、部位特異的突然変異誘発または他の一般的に使用される分子生物学的手法により、適当な抗体フレームワーク足場または変化する表面残基リモデリングにＣＤＲを移植することを含む（Roguska他、Protein Eng9 895-904(1996))。
【００３４】
他の利用可能な方法としては、分子の中の潜在的Ｔ細胞エピトープの識別、および例えば部位特異的突然変異誘発（反−免疫(de-immunisation)）によるこれらの引き続く取り出しを含む。特異性結合性分子のヒューマニゼーションは、分子が治療薬として使用される時に望ましいことがある。ＣＤＲ領域または周囲のフレームワーク配列のヒューマニゼーションが所望により行われる。
【００３５】
オリジナルの抗体の特異性を保持したまま、他の抗体またはキメラ分子を製造するために、モノクローナルと他の抗体を採取して、ＤＮＡ組換え技術を使用することが可能である。そのようなテクニックは、抗体の免疫グロブリン可変領域、または相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を、異なった免疫グロブリンの不変部、または不変部フレームワーク領域にコード化するＤＮＡを挿入することを含むことができる。例えばＥＰ−Ａ−１８４１８７、ＧＢ２１８８６３８ＡまたはＥＰ−Ａ−２３９４００を参照されたい。
抗体を製造するハイブリドーマまたは他の細胞が、製造された抗体の結合特異性を変更するかまたはしない遺伝子変異または他の変化に供されることができる。
【００３６】
抗体は多くの方法で変成されることができる。「抗体」という用語は必要な特異性の結合領域を有するすべての特異結合メンバーまたは物質をカバーするものとして理解されるべきである。すなわち、この用語は天然物か、完全に又は一部合成物であるかに関わりなく、すべての免疫グロブリン結合領域を含む全てのポリペプチドをはじめとした、抗体のフラグメント、誘導体、機能的な同等物、および抗体の相同体、ヒト化された抗体をカバーする。免疫グロブリン結合ドメインを含むキメラ分子、または同等物、他のポリペプチドとの融合体も含まれる。キメラ抗体のクローニングと発現はＥＰ−Ａ−０１２０６９４およびＥＰ−Ａ−０１２５０２３に記載されている。ヒト化された抗体（humanised antibody）は非人間の、例えばネズミの抗体の可変部とヒト抗体の不変部を有する変成抗体であることができる。ヒト化された抗体を作るための方法は例えば、米国特許第５２２５５３９号に記載されている。
【００３７】
本発明の特異性結合性分子は抗体のフラグメントであることができる。全体の抗体のフラグメントが抗原を結合する機能を実行できることが示されている。結合フラグメントの例は（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインから成るＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ＶＨ、およびＣＨ１ドメインから成るＦｄフラグメント；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖフラグメント；（ｉｖ）ＶＨドメインから成るｄＡｂフラグメント（Ward, E.S. et al., Nature 341:544-546 (1989)）；（ｖ）分離ＣＤＲ領域；（ｖｉ）２つの結合したＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｖｉｉ）；  単一鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）であって、ＶＨドメインとＶＬドメインがペプチドリンカーによって結合され、２つのドメインが会合し抗原結合部位を形成することを許容するもの(Bird et al. , Science 242:423-426 (1988); Huston et al. , PNAS USA 85:5879-5883 (1988)); （ｖｉｉｉ）二重特異性（bispecific）単一鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）および（ｉｘ）遺伝子融合により構成された「ジアボディズ（diabodies）」、多価性または「マルチスペシフィックフラグメント（WO94/13804; P. Hollinger et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993))である。典型的には、フラグメントはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦｖフラグメントまたはｓｃＦｖ分子である。
【００３８】
ジアボディズはポリペプチドのマルチマー（multimer）である。それぞれのポリペプチドは、免疫グロブリン軽鎖の結合領域を含む第１のドメインと、免疫グロブリン重鎖の結合領域を含む第２のドメインとを含み、２つのドメインは例えば、ペプチドリンカーにより結合されるが、互いに会合して抗原結合部位を形成することはできない。抗原結合部位はマルティマー内の１つのポリペプチドの第１のドメインと、マルティマー内の他のポリペプチドの第２のドメインとの会合により形成される（ＷＯ９４／１３８０４）。
二重特異抗体が使用される場合、それらは従来の二重特異抗体であることができ、これらは種々の方法(Hollinger & Winter, Current Opinion Biotechnol. 4:446-449 (1993))で製造することができ、たとえば化学的に製造することができ、またはハイブリッドハイブリドーマから製造することができ、または上記の二重特異抗体フラグメントの任意のものであることができる。抗体全体ではなくむしろｓｃＦｖ二量体またはジアボディを使用することが望ましいかもしれない。デアボディとｓｃＦｖはＦｃ領域なしで構成され、可変ドメインだけを使用して、潜在的に抗イディオタイプ反応の効果を減少させる。他の形式の二重特異抗体はTraunecker et al. , EMBO Journal 10:3655-3659 (1991)で説明された単一鎖「Ｊａｎｕｓｉｎｓ」を含んでいる。
【００３９】
二重特異性の全体の抗体と対照的に、それらが容易に構成されて大腸菌内で発現されるので、二重特異性のジアボディズもまた有用である場合がある。適切な結合特異性のジアボディズ（および抗体フラグメントなどの他の多くのポリペプチド）は、ライブラリからファージディスプレイ（ＷＯ９４／１３８０４）を使用することで容易に選択される。
ジアボディズの１つのアームが一定に保たれるなら、例えば抗原Ｘに対する特異的な指向を有するなら、ライブラリはもう片方のアームが変化できるとしてライブラリを作ることができ、適切な特異性の抗体が選択される。
【００４０】
モノクローナル抗体  ＶＪ−４Ｂ６はハイブリドーマ細胞系ＶＪ−４Ｂ６−Ｅ５−Ｂ１０−Ｄ４によって分泌され、２０１０年６月３日に欧州細胞カルチャーコレクション（ＥＣＡＣＣ）、ヘルスプロテクションエージンシー、センター  フォー  エマージェンシー  プリペアードネス  アンド  レスポンス、ポートン  ダウン、サリスバリィ  ＳＰ４  ０ＪＧ、英国に、プタペスト条約に基づき寄託され、アクセション  Ｎｏ．１００６０３０１により指定された。
【００４１】
寄託は、クイーンメリーアンドウェストフィールドカレッジ、センター  フォア  バイオケミカル  ファーマコロジー、チャーターハウス  スクエア、ロンドン、ＥＣ１Ｍ  ６ＢＱのフルビオ  ダクイスト（Ｆｕｌｖｉｏ  Ｄ’Ａｃｑｕｉｓｔｏ）により行われた。寄託者は、出願人が出願中に寄託物について言及するのを認可され、欧州特許条約の規則  ３１（ｌ）（ｄ）により公衆にとって利用可能にされる寄託物に、予約不要の取り消せない同意を与えた。
【００４２】
ハイブリドーマ細胞系ＶＪ−４Ｂ６−Ｅ５−Ｂ１０−Ｄ４は特異的にアネキシン−Ａ１に結合するモノクローナル抗体ＶＪ−４Ｂ６を生成する。本発明のモノクローナル抗体ＶＪ−４Ｂ６はＩｇＧ２ｂアイソタイプのものである。
【００４３】
抗体ＶＪ−４Ｂ６は図２Ａに示されるアミノ酸配列を有する全長のヒトＡｎｘ−Ａ１  プロテインに対して増大された結合性を有する。
【００４４】
抗体ＶＪ−４Ｂ６の軽鎖可変領域のＤＮＡとアミノ酸配列は図１１に示される。図１２は、ＣＤＲｓでアノテートされたＶＪ−４Ｂ６（VJ-4B6 with the CDRs annotated）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。また、図１２はＶＪ−４Ｂ６の軽鎖不変部の最初のいくつかのアミノ酸も示す。
【００４５】
抗体ＶＪ−４Ｂ６の重鎖可変領域のＤＮＡとアミノ酸配列は図１３に示される。図１４は、ＣＤＲｓでアノテートされたＶＪ−４Ｂ６の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。また、図１４はＶＪ−４Ｂ６の重鎖不変部の最初のいくつかのアミノ酸も示す。
【００４６】
抗体ＶＪ−４Ｂ６のＣＤＲｓは以下の通りである：
ＶＬＣＤＲ１はＫＡＳＥＮＶＶＴＹＶＳ。
ＶＬＣＤＲ２はＧＡＳＮＲＹＴ。
ＶＬＣＤＲ３はＧＱＧＹＳＹＰＹＴ。
ＶＨＣＤＲ１はＧＹＴＦＴＮＹＷＩＧ。
ＶＨＣＤＲ２はＤＩＹＰＧＧＤＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧ。
ＶＨＣＤＲ３はＷＧＬＧＹＹＦＤＹ。
【００４７】
本発明は抗体ＶＪ−４Ｂ６のＣＤＲｓを有する特異性結合性分子に及び、抗体ＶＪ−４Ｂ６のＣＤＲｓの一つ以上と少なくとも７０％の同一性を有するＣＤＲｓを有する特異性結合性分子にも及ぶ。
【００４８】
また、本発明は抗体ＶＪ−４Ｂ６の軽鎖可変領域、重鎖可変領域または軽鎖可変領域と重鎖可変領域の両方を有する特異性結合性分子のいずれかに及ぶ。
【００４９】
本発明の具体的な実施態様では、図１１および／または図１３に示されているようなアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む本発明の第１の態様による特異性結合性分子を提供する。
【００５０】
また、本発明のこの実施態様は、図１１に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および／または図１３に示されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含むある特定の抗体フラグメントに及ぶ。例えば、この実施態様は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦｖフラグメントおよびｓｃＦｖ分子に及ぶ。
【００５１】
本発明は図１２および／または図１４に示されているアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む本発明の第１の態様による特異性結合性分子を包含する。
【００５２】
本発明の具体的な実施態様では、２０１０年６月３日にアクセッション番号１００６０３０１として欧州細胞カルチャーコレクション（ＥＣＡＣＣ）に寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生成される本発明の第１の態様による特異性結合性分子を提供する。
【００５３】
第２の態様では、本発明は図２Ａに示されてたアミノ酸配列を有するヒトＡｎｘ−Ａ１  プロテインに対して増大された特異性を有する結合性分子を生成するハイブリドーマ細胞系を提供する。
【００５４】
本発明の具体的な実施態様では、２０１０年６月３日にアクセッション番号１００６０３０１として欧州細胞カルチャーコレクション（ＥＣＡＣＣ）に寄託された本発明の第２の態様によるハイブリドーマ細胞系が提供される。
【００５５】
第３の態様では、本発明は本発明の特異性結合性分子を含む製薬組成物を提供する。
【００５６】
本発明のこの態様による組成物は使用のために任意の便利なルートにより配合されることができる。通常、本発明の製薬の組成物は本発明の特異性結合性分子に加えて、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、希釈剤、助剤、ビヒクル、バッファまたは安定剤を含む。かかる担体としては、限定するものではないが、生理食塩水、衝生理食塩水、デキストロース、リポソーム、水、グリセロール、ポリエチレングリコール、エタノール、及びそれらの組合せが挙げられる。患者に投薬する希望の方法に応じて、製薬の組成物は任意の適当な形にすることができる。
【００５７】
それは投与単位形状で提供することができ、一般に、密封容器内に包装して提供され、キットの一部として提供できる。必ずではないが、通常、そのようなキットは使用上の注意を含んでいるだろう。それは複数の前記の投与単位を含むことができる。
【００５８】
製薬組成物は投与のために任意の適切なルートで適合させる。例えば、経口（口腔剤または舌下剤を含む）、直腸、鼻、局所的（口腔剤、舌下剤または経皮剤を含む）、経膣または非経口的（皮下、筋肉内、静脈内または、皮内を含む）ルートにより投与されることができる。そのような組成物は製薬の技術分野で知られている任意の方法で調製されることができ、例えば、無菌状態の下でキャリアまたは賦形剤と有効成分を混合することによって調製されることができる。
【００５９】
経口投与のために適合させられた製薬組成物は、カプセル剤またはタブレット；粉剤または果粒；溶液、シロップまたは懸濁液（水溶性または非水性液体；または、可食性の泡またはホイップ；または乳濁液）などの個々の単位として存在することができる。
【００６０】
タブレットまたは硬ゼラチンカプセルのための適当な賦形剤としては、乳糖、とうもろこし澱粉、それらの誘導体、ステアリン酸またはそれの塩があげられる。
【００６１】
軟ゼラチンカプセルにおける使用のための適当な賦形剤としては、例えば植物油、ワックス、脂肪、半固体もしくは液体のポリオールなどがあげられる。
【００６２】
溶液およびシロップの製剤のために使用される賦形剤としては、例えば水、ポリオール、および糖類があげられる。懸濁液の製剤において、油（例えば、植物油）が水中油滴または油中水滴懸濁液を提供するために使用されることができる。
【００６３】
経皮投与のために適合された製薬の組成物は、長期間受容者の表皮に親密な接触のままで残っていることを意図する個々のパッチとして存在することができる。例えば、パッチから一般に、ファーマシューティカル・リサーチ３（６）：３１８（１９８６）に記載されているイオン泳動で有効成分を送達することができる。
【００６４】
局所投与のために適合された製薬の組成物は、軟膏剤、クリーム、懸濁液、ローション、粉末、溶液、ペースト、ゲル、スプレー、エアゾール剤または油として配合されることができる。望ましくは、眼または他の外部の組織、例えば、口のおよび皮膚の感染病に関しては、組成物は局所軟膏またはクリームとして適用される。軟膏剤として配合されると、有効成分はパラフィン系または水混和性軟膏基剤のどちらかと共に使われる。別法として、有効成分はクリームの中に、水中油クリーム基剤または油中水型基剤とともに配合される。眼への局所投与のために適合された製薬の組成物としては、適当なキャリア（特に水性溶媒）中に有効成分が溶解されるか、または懸濁された点眼剤があげられる。口への局所投与のために適合された製薬の組成物としては、トローチ、香錠、および口内洗剤があげられる。
【００６５】
直腸投与のために適合された製薬の組成物としては、坐剤または浣腸剤として存在することができる。
【００６６】
キャリアが固体である鼻への投与に適合された製薬の組成物は、例えば、粒度が２０〜５００ミクロンの範囲の粗い粉末を含み、鼻吸入法により投与される。すなわち、鼻の近くに保持された粉末の容器からの鼻腔を通る急速な吸入法により投与される。鼻噴霧または点鼻液として投与するための、キャリアが液体である適当な組成物は、有効成分の水溶性または油溶液を含んでいる。
【００６７】
吸入法での投与のために適合された製薬の組成物は、微粒子粉またはミストを含み、これらは加圧されたエアゾール剤、噴霧装置または注入器のような各種タイプの計量投与器具によって発生することができる。
【００６８】
膣内投与のために適合された製薬の組成物は、膣坐剤、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォームまたはスプレー配合物として提供されることができる。
【００６９】
非経口投与のために適合された製薬の組成物は、抗酸化剤、バッファ、静菌薬および溶質を含むことができる水溶性または非水性の無菌注射液であることができ、該溶質は配合物を投与が意図される患者の血液と実質的にアイソトニックにする。また懸濁剤と増粘剤を含むことができる水性および非水性の無菌懸濁液であることもできる。注射液に使用されることができる添加剤としては、水、アルコール類、ポリオール、グリセリン、および植物油があげられる。組成物は、単位服用量または複数適用量容器中に提供されて、例えば、密封されたアンプルおよびバイアル中に提供され、使用直前に無菌の液体キャリア、たとえば注射用蒸留水の添加だけを必要とする凍結乾燥された条件で貯蔵されることができる。注射液および懸濁液は、無菌粉剤、果粒、およびタブレットから即座に調製されることができる。
【００７０】
製薬の組成物は保存薬剤、可溶化薬剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、香料、塩類、（本発明の物質自分が、医薬的に許容され得る塩の形で提供できる）、バッファ、コーティング剤または酸化防止剤を含むことができる。
【００７１】
また、本発明の製薬の組成物は本発明の分子に加えて他の１種以上の治療的活性薬を含むことができる。
【００７２】
いくつかの実施態様では、活性薬物濃縮物の配合物は医薬的に許容され得る等張化剤、緩衝薬、および医薬的に許容され得る界面活性剤を含むことができる。
【００７３】
別法として、配合物は有効成分とリン酸水素ナトリウム一塩基酸、リン酸水素ナトリウム二塩基酸、塩化ナトリウム、ポリソルベート８０またはポリソルベート２０（撹はんにより誘発される集合の危険を最小とする表面活性剤）、水（ＵＳＰ／Ｐｈ．Ｅｕｒ）を含むことができ、任意に約６．０〜７．０、例えば約６．５にｐＨを調整することができる。
【００７４】
活性薬物濃縮物は凍結乾燥することも、凍結乾燥しないこともできる。
【００７５】
他の配合物は緩衝薬として酢酸ナトリウム三水和物、張度調整剤として塩化ナトリウム、ｐＨ調節剤として酢酸、および注射用の蒸留水を含むことができる。
【００７６】
本発明の組成物の用量は治療される疾病または障害、患者の年齢および状態に応じて広い範囲で変化し、医師が最終的に適切な使用用量を決定する。
【００７７】
この投与は適宜繰り返される。副作用が起こった場合には、通常の臨床実務にしたがって、投与量の量、そして／または頻度を減少することができる。
【００７８】
哺乳動物、特に人間への投与において、活性薬の日毎の投与量は、体重当たり、１マイクロｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ、典型的には約１０マイクロｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇまでであると予想される。医師はともあれ、患者の年齢、体重、性別および反応をはじめとする要因に応じて、個人に最も適した実際の投与量を決定するだろう。上記の用量は平均的な場合での例示である。もちろん、より高いかまたは低い用量が投与されることができ、これらも本発明の範囲内である。
【００７９】
本発明の特異性結合性分子は医薬として、例えば、Ｔ細胞媒介性疾患（T cell-mediated diseases）の治療に使用することができる。
【００８０】
したがって、４番目の態様では、本発明は医薬における使用のための本発明の特異性結合性分子を提供する。
【００８１】
５番目の態様では、本発明はＴ細胞媒介性疾患の治療における使用のための本発明の特異性結合性分子を提供する。したがって、本発明のこの態様は対象者、典型的にはそれを必要とする対象者における、本発明の特異性結合性分子を対象者に投与することを含むＴ細胞媒介性疾患の治療の治療法を含む。したがって、本発明はまた、Ｔ細胞媒介性疾患の治療のために使用される医薬の製造における本発明の特異性結合性分子の使用、またはＴ細胞媒介性疾患の治療のための医薬の製造における本発明の特異性結合性分子の使用を含む。治療方法は人間または動物の治療方法であることができ、本発明は人間そして／または獣医薬の両者に及ぶ。望ましくは、「治療的有効性量」（対象に利益を示すに十分な量）において対象に本発明の特異性結合性分子が投与される。本明細書において使用される時、「治療」は人間、または人間以外の動物、望ましくは哺乳動物に利益になる全ての領域を含む。治療は、既存の条件に関するか、または予防的であることができる（予防的な処置）。
【００８２】
本発明のこの態様では、本発明の特異性結合性分子は、Ｔ細胞によって媒介されるさまざまな疾病を治療するのに使用される。本明細書の文脈において、「Ｔ細胞媒介性疾患（T cell-mediated disease）」とは、Ｔ細胞が疾病または状態の病因または発展において役割を果たす全ての疾病または状態をいう。Ｔ細胞媒介性疾患は異所性Ｔ細胞活性化（aberrant T cell activation）で典型的に引き起こされる。従って、そのような疾病は、本明細書に示されるように、モノクローナル抗体ＶＪ−４Ｂ６によって効果を発するＡｎｘ−Ａ１の活性を妨げることによってＴ細胞の活性化を防ぐことによって、治療されることができる。典型的には、本発明で治療されたＴ細胞媒介性疾患は、Ｔｈ１細胞が役割を果たす疾病である。
【００８３】
Ｔ細胞媒介性疾患としては、移植対宿主病（graft- versus-host disease）、移植拒否反応、アテローム性動脈硬化、ＨＩＶ、そして／または、ＡＩＤＳ、乾癬、流産、およびいくつかの自己免疫疾患が挙げられるがこれらに限定されない。本発明に従って治療される自己免疫疾患としては、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、アジソン病、甲状腺機能亢進症、強皮症、多発性筋炎、糖尿病、特にいくつかの型の糖尿病（たとえば若年型糖尿病）、自己免疫性ぶどう膜網膜炎、潰瘍性大腸炎、尋常性天疱瘡、炎症性腸疾患、自己免疫性甲状腺炎、ぶどう膜炎、ベーチェット病、およびシェーグレン症候群があげられる。Ｔ細胞媒介性疾患は、典型的にはリウマチ性関節炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、アテローム性動脈硬化、ＨＩＶ、ＡＩＤＳまたは乾癬である。より典型的には、Ｔ細胞媒介性疾患は、リウマチ性関節炎または多発性硬化症である。
【００８４】
また、本明細書に定義されるＴ細胞媒介性疾患は、流産を含んでいる。本明細書に定義されるように、治療は予防（予防的な処置）であることができる。その結果、本発明の特異性結合性分子は、流産を予防するために使用できる。流産に非制御のＴｈ１反応が関係されることが知られており、Ｔｈ２の増加は妊娠に良好な反応を与える。
【００８５】
Ｔ細胞媒介性疾患は典型的にはリウマチ性関節炎（rheumatoid arthritis）である。リウマチ性関節炎（ＲＡ）では、Ｔ細胞が滑膜内の細胞を抗原提示細胞と認識して、相互作用するものと考えられている。いったん活性化されると、これらの細胞はサイトカインとエフェクタ分子を製造する。このシーケンシャルなサイトカインの拡大した生産は「サイトカインカスケード（cytokine cascade）」を構成し、マクロファージの活性化と起炎プロセスの誘発に帰結し、軟骨と骨の分解と融食作用に至る。時間がたつにつれて、骨浸食、軟骨の破壊、および関節の完全な破壊が起こる。
結局、多臓器システムが影響を受けることとなる。
【００８６】
別の実施態様では、Ｔ細胞媒介性疾患は多発性硬化症（ＭＳ）である。
【００８７】
別の実施態様では、Ｔ細胞媒介性疾患はアテローム性動脈硬化である。炎症は冠状動脈病と他のアテローム性動脈硬化の発現で重要な役割を果たす。免疫細胞は初期のアテローム性動脈硬化症を支配している。それらのエフェクタ分子は病巣の進行を加速し、炎症の活性化は急性冠状動脈症候群を顕在化させる。適応免疫はアテローム発生に非常に大きくかかわる。なぜならメタボリックの危険要因と相互作用して、動脈樹内の病巣を開始し、繁殖させ、活性化することが示されているからである。
【００８８】
別の実施態様では、Ｔ細胞媒介性疾患は全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である。
【００８９】
Ａｎｘ−Ａ１の、Ｔｈ１細胞を好ましく分化する能力に関連して、本発明はまた、例えば、細胞内病原に対する非制御の保護的な細胞（Ｔｈ１）反応を制限して、Ｔｈ１分化を抑圧しＴｈ２分化を促進することによって細胞外の感染病（Ｔｈ２反応）を治療するためにも使用される。
【００９０】
本発明の２番目の、そして引き続く態様のための好ましい特徴は第１の態様のそれに必要な変更がされる。
【００９１】
１つの実施態様では、本発明は図２Ａに示されたアミノ酸配列を有する、全長ヒトＡｎｘ−Ａ１  タンパク質に対して向上した特異性を有する結合性分子を提供する。
【００９２】
そのような特異性結合性分子の１つの例は、２０１０年６月３日にアクセション  Ｎｏ．１００６０３０１として欧州細胞カルチャーコレクション（ＥＣＡＣＣ）に寄託されたハイブリドーマ細胞系によって製造されたモノクローナル抗体ＶＪ−４Ｂ６である。
【００９３】
１つの実施態様では、本発明は以下のアミノ酸配列を持っているモノクローナル抗体ＶＪ−４Ｂ６のＣＤＲｓを持っている特異性結合性分子を提供する：
ＶＬＣＤＲ１はＫＡＳＥＮＶＶＴＹＶＳ。
ＶＬＣＤＲ２はＧＡＳＮＲＹＴ。
ＶＬＣＤＲ３はＧＱＧＹＳＹＰＹＴ。
ＶＨＣＤＲ１はＧＹＴＦＴＮＹＷＩＧ。
ＶＨＣＤＲ２はＤＩＹＰＧＧＤＹＴＮＹＮＥＫＦＫＧ。
ＶＨＣＤＲ３はＷＧＬＧＹＹＦＤＹである。
【００９４】
１つの実施態様では、本発明はモノクローナル抗体ＶＪ−４Ｂ６のＶＨおよび／またはＶＬ領域を有する特異性結合性分子を提供する。これらはそれぞれ図１１と１３に示される。
【００９５】
１つの実施態様では、本発明は２０１０年６月３日にアクセション  Ｎｏ．１００６０３０１として欧州細胞カルチャーコレクション（ＥＣＡＣＣ）に寄託されたハイブリドーマ細胞系VJ-4B6-E5-B10-D4を提供する。
【００９６】
モノクローナル抗体ＶＪ−４Ｂ６は図３Ａに記載された方法で製造された。簡潔にいえば、図２Ａに示された配列を持っている全長ヒトＡｎｘ−Ａ１をコード化するｃＤＮＡが、発現ベクター内にクローンされ細胞表層での発現が確認された。そして、金粒子に吸着されたベクタＤＮＡのいくつかの皮内投与をネズミに施した。マウス細胞は免疫ベクタを取り込み、ｃＤＮＡコード蛋白質を発現し、免疫反応を刺激した。マウスリンパ球はついでネズミのミエローマ細胞と融合し、ハイブリドーマを製造した。次に、特異性試験が行われ、ハイブリドーマがクローンされ、モノクローナル抗体が製造された。
【００９７】
モノクローナル抗体ＶＪ−４Ｂ６を製造するのに使用されるアプローチは、細胞表面に全分子を発現するＡｎｘ−Ａ１相補ＤＮＡトランスフェクト細胞を使用する。したがって、タンパク質は生体内で見つけられる四次天然構造と同じ型である。抗体作成のためのこのアプローチは、Ａｎｘ−Ａ１タンパク質によりネズミを免疫することによって生成するか、または非天然の全長のタンパク質であるＡｎｘ−Ａ１の他の商業的に利用可能な抗体の生産とは異なる。
【００９８】
本発明の抗体はリウマチ性関節炎や多発性硬化症などのＴ細胞媒介性疾患の治療で特に役に立つ。
【００９９】
本発明は、例示の目的のみで示される以下の実施例を参照し、さらに詳細に説明される。実施例では、多くの図が参照される。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１Ａ】図１Ａはアネキシン−１構造のリボン・ダイヤグラムであり、４つのアネキシンが繰り返され、Ｎ末端ドメインを示している。
【図１Ｂ】図１Ｂはアネキシン繰り返しと生活性配列のアネキシン−１ペプチドＡｃ．２−２６の位置を示す略図である。
【図１Ｃ】図１ＣはペプチドＡｃ．２−２６のアミノ酸配列を示している。これはＡｎｘ−Ａ１のアセチル化Ｎ末端基ペプチドフラグメントである。
【０１０１】
【図２Ａ】図２Ａは、ヒトアネキシン−１（Ａｎｘ−Ａ１）、アイソフォームＡＮＸＡ１−００３の（ｉ）アミノ酸配列と（ｉｉ）ヌクレオチド配列を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ヒトアネキシン−１（Ａｎｘ−Ａ１）、アイソフォームＡＮＸＡ１−００２のアミノ酸配列を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃはヒトアネキシン−１（Ａｎｘ−Ａ１）、アイソフォームＡＮＸＡ１−００４のアミノ酸配列を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ヒトアネキシン−１（Ａｎｘ−Ａ１）、アイソフォームＡＮＸＡ１−００６のアミノ酸配列を示す。
【０１０２】
【図３】図３はＶＪ−４Ｂ６の生成を示している。（Ａ）ＶＪ−４Ｂ６を分離して、製造するための戦略の略図。（Ｂ）ヒストグラムは、VJ-4B6の、アネキシン−１  ｃＤＮＡで安定してトランスフェクトさせたセルラインの染色（緑色の線；右側のピーク）、または無関係のコントロール  ｃＤＮＡ（赤色の線；左側のピーク）。
【０１０３】
【図４】図４はＶＪ−４Ｂ６の検証を示している。（Ａ）ＶＪ−４Ｂ６（５０ｎｇ／ミリリットル）と浸透されたヒト末梢血単核球（permeabilised human Peripheral Blood Mononuclear Cells：PBMC)または多形性単核細胞(Polymorph Mononuclear Cells:PMN)の染色。（Ｂ）ＶＪ−４Ｂ６（５０ｎｇ／ミリリットル）での、浸透されたネズミひ臓細胞または居住している腹腔マクロファージの染色。すべてのテストで、細胞は、４％のパラホルムアルデヒドによって固定されて、次に、ＦＡＣＳバッファ中の０．０２％のサポニンによって浸透された。細胞は、４℃で一晩ビオチニル化（biotinylated）ＶＪ−４Ｂ６でインキュベートされ、次に、１時間ストレプトアビジンＦＩＴＣ共役抗体（１：２００希釈）を使用して染色された。すべてのグラフでは、左側のピークはコントロールを表して、右側のピークはＶＪ−４Ｂ６を表す。示されたデータは、ただ一つの実験からのものであり、同様の結果の他の２つの実験を代表している。
【０１０４】
【図５】図５は、ＶＪ−４Ｂ６が抗ＣＤ３誘発の(anti-CD3-induced)Ｔ細胞増殖を抑制することを示している。ＡｎｘＡｌ＋／＋（Ａ）およびＡｎｘＡ１−／−（Ｂ）ネズミの脾臓とリンパ節からのＴ細胞は、ＶＪ−４Ｂ６の示した濃度の存在下で、プレート−結合された（plate-bound）抗ＣＤ３（１マイクロｇ／ｍｌ）で刺激された。１８〜２０時間の後、細胞は３Ｈ−チミジン（１  マイクロＣｉ）で１２時間、パルスされ、次いでセル−ハーベスタで処理され、３Ｈ−チミジンの取込みのレベルを測定した。示されたデータは、ただ一つの実験からのものであり、同様の結果の他の２つの実験を代表している。
【０１０５】
【図６】図６は、ＶＪ−４Ｂ６が抗ＣＤ３／ＣＤ２８誘発(anti-CD3/CD28-induced)Ｔ細胞増殖を抑制することを示している。ＡｎｘＡ１＋／＋（Ａ）およびＡｎｘＡ１−／−（Ｂ）のネズミの脾臓とリンパ節からのＴ細胞は、プレートに結合された抗ＣＤ３（１マイクロｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ２８（１マイクロｇ／ｍｌ）で、ＶＪ−４Ｂ６の示された濃度の存在下で刺激された。１８〜２０時間の後、細胞は３Ｈ−チミジン（１  マイクロＣｉ）で１２時間、パルスされ、次いでセル−ハーベスタで処理され、３Ｈ−チミジンの取込みのレベルを測定した。示されたデータは、ただ一つの実験からのものであり、同様の結果の他の２つの実験を代表している。
【０１０６】
【図７】図７は、ＶＪ−４Ｂ６が抗ＣＤ３誘発ＩＬ−２生産を抑制することを示している。ＡｎｘＡ１＋／＋（Ａ）およびＡｎｘＡ１−／−（Ｂ）のネズミの脾臓とリンパ節からのＴ細胞は、プレートに結合された抗ＣＤ３（１マイクロｇ／ｍｌ）で、ＶＪ−４Ｂ６の示された濃度の存在下で刺激された。２０〜２４時間後、細胞上澄が採取され、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−２のレベルが分析された。示されたデータは、ただ一つの実験からのものであり、同様の結果の他の２つの実験を代表している。
【０１０７】
【図８】図８は、ＶＪ−４Ｂ６が抗ＣＤ３／ＣＤ２８誘発ＩＬ−２生産を抑制することを示している。ＡｎｘＡ１＋／＋（Ａ）およびＡｎｘＡ１−／−（Ｂ）のネズミの脾臓とリンパ節からのＴ細胞は、プレートに結合された抗ＣＤ３（１マイクロｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ２８（１マイクロｇ／ｍｌ）で、ＶＪ−４Ｂ６の示された濃度の存在下で刺激された。２０〜２４時間後、細胞上澄が採取され、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−２のレベルが分析された。示されたデータは、ただ一つの実験からのものであり、同様の結果の他の２つの実験を代表している。
【０１０８】
【図９】図９は、ＶＪ−４Ｂ６が抗ＣＤ３誘発ＣＤ２５／ＣＤ６９アップレギュレーションを禁止することを示している。ＡｎｘＡ１＋／＋（Ａ）およびＡｎｘＡ１−／−（Ｂ）のネズミの脾臓とリンパ節からのＴ細胞は、プレートに結合された抗ＣＤ３（１マイクロｇ／ｍｌ）で、ＶＪ−４Ｂ６の示された濃度の存在下で刺激された。１８〜２０時間後に細胞が集められ、抗ＣＤ２５  ＦＩＴＣと抗ＣＤ６９  ＰＥで染色された。サンプルは、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒによって得られ、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアによって分析された。示されたデータは、ただ一つの実験からのものであり、同様の結果の他の２つの実験を代表している。
【０１０９】
【図１０】図１０は、ＶＪ−４Ｂ６が抗ＣＤ３／ＣＤ２８誘発ＣＤ２５／ＣＤ６９アップレギュレーションを禁止することを示している。ＡｎｘＡ１＋／＋（Ａ）およびＡｎｘＡ１−／−（Ｂ）のネズミの脾臓とリンパ節からのＴ細胞は、プレートに結合された抗ＣＤ３（１マイクロｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ２８（１マイクロｇ／ｍｌ）で、ＶＪ−４Ｂ６の示された濃度の存在下で刺激された。１８〜２０時間後に細胞が集められ、抗ＣＤ２５  ＦＩＴＣと抗ＣＤ６９  ＰＥで染色された。サンプルは、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒによって得られ、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアによって分析された。示されたデータは、ただ一つの実験からのものであり、同様の結果の他の２つの実験を代表している。
【０１１０】
【図１１】図１１は、ＶＪ−４Ｂ６の軽鎖可変領域のＤＮＡとアミノ酸配列を示す。
【０１１１】
【図１２】図１２は、ＣＤＲｓでアノテートされたＶＪ−４Ｂ６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、および不変部の開始部分をハイライトした。ナンバリングとＣＤＲｓはカバットによった。
【０１１２】
【図１３】図１３は、ＶＪ−４Ｂ６の重鎖可変領域のＤＮＡとアミノ酸配列を示す。
【０１１３】
【図１４】図１４は、ＣＤＲｓでアノテートされたＶＪ−４Ｂ６の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、および不変部の開始部分をハイライトした。ナンバリングとＣＤＲｓはカバットによった。カバットによって定義されるような超可変部領域ではないが、重鎖可変領域残基の２６〜２９は、Ｃｈｏｔｈｉａ（ＣｈｏｔｈｉａとＬｅｓｋ、１９８７）によって定義されたＣＤＲループの一部である。５２、５２ａ、８２、８２ａ、８２ｂ、８２ｃ、１００、および１００ａにおける挿入位置は５２ａ、８２ａｂｃ、１００ａとして示す。
【０１１４】
【図１５】図１５は、ＶＪ−４Ｂ６がＥＡＥの発現を抑制することを示している。Ｃ５７ＢＬ／６ネズミは、ＣＦＡ中のＭＯＧ３５−５５でイミュナイズ（immunized）されて、ＥＡＥのサインが２２日間毎日モニターされた。イミュナイゼーション（immunization）の６日後に、ネズミは、６日間毎に、ＩｇＧ（Ａ）の１００ｎｇ、または５（Ｂ）、５０（Ｃ）、１００ｎｇ（Ｄ）のＶＪ−４Ｂ６（ＰＢＳの１００マイクロリットル中）の腹腔内注射を受けた。結果は平均±ＳＥＭ（ｎ＝６／グループ）である。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１
【０１１５】
【図１６】図１６は、ＶＪ−４Ｂ６がＥＡＥの発現に関連している体重損失を抑えることを示している。Ｃ５７ＢＬ／６ネズミは、ＣＦＡ中のＭＯＧ３５−５５でイミュナイズされて、体重増／損失が２２日間毎日モニターされた。イミュナイゼーションの６日後に、ネズミは、６日間毎に、ＩｇＧ（Ａ）の１００ｎｇ、または５（Ｂ）、５０（Ｃ）、１００ｎｇ（Ｄ）のＶＪ−４Ｂ６（ＰＢＳの１００マイクロリットル中）の腹腔内注射を受けた。結果は平均±ＳＥＭ（ｎ＝６／グループ）である。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１
【０１１６】
【図１７】図１７は、ＶＪ−４Ｂ６がＣＩＡの発現を抑えることを示している。ＤＢＡ／１マウスはＣＦＡ中のウシタイプＩＩコラーゲンによってイミュナイズされた。一次イミュナイゼーションの２１日後に、マウスは完全なＣＦＡ中の２００のマイクロｇのタイプＩＩ型でブーストされ（皮下）、疾病の兆候が２０日間毎日モニターされた。ブーストされたネズミは６日間毎にＶＪ−４Ｂ６（ＰＢＳの１００マイクロリットル中）の１００ｎｇの腹腔内注射を受けた。結果は平均±ＳＥＭ（ｎ＝６／グループ）である。＊＊＊ｐ＜０．００１
【０１１７】
実施例１−  ＶＪ−４Ｂ６はＴ細胞含有アネキシン−１中でＴ細胞活性化を特異的に抑制する
材料と方法
ネズミ（図４Ｂ、５、６、７、８、９および１０で使用されたネズミ）B&K Universal（Grimston、イギリス）からＢａｌｂ／ｃマウスを得た。ΑnxΑ1−／−ネズミが発明者の研究室で産生され、B&K Universalで病原菌のない条件で飼育した。これらの研究で使用されるすべてのネズミは、生後６〜８週間であった。動物実験はイギリス内務省の規制（Guidance on the Operation of Animals, Scientific Procedures Act 1986）およびＥＵの規制に従って行われた。
【０１１８】
ネズミのＴ細胞抽出（図４Ｂ、５、６、７、８、９および１０で使用された細胞）
脾臓とリンパ節（わきの下、そけい部、および腸）を６〜８週間のネズミから取り出し、先に説明したシリンジプランジャーを使用し、５０μｍの細胞ストレナー（ＢＤ）で組織のゆるやかな離解を行った。次に、細胞懸濁液はフィコール上で層にされて、単核細胞を得、集められ、ＲＰＭＩ媒体（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄した。
【０１１９】
Ｔ細胞増殖アッセイ（図５と６におけるデータ）
精製されたリンパ節Ｔ細胞（１０５細胞／ミリリットル）は９６穴プレート中で、プレート結合された抗ＣＤ３（クローン１４５−２Ｃ１１；eBioscience）または抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８（クローン３７．５１；eBioscience）によってスティミュレートされた。１８−２０時間後に、培養物は１マイクロＣｉの［３Ｈ］−チミジン（Amersham Pharmacia Biotech）で１２時間パルスされ、加えられた放射活性が自動シンチレーションカウンタ（パッカード）で測定された。
【０１２０】
ＩＬ−２生産（図７と８におけるデータ）
精製されたリンパ節Ｔ細胞（１０５細胞／ミリリットル）は９６穴プレートで、プレート結合された抗ＣＤ３（クローン１４５−２Ｃ１１；eBioscience）または抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８（クローン３７．５１；eBioscience）によってスティミュレートされた。２０−２４時間後、培養上清が集められ、メーカーの指示にしたがってマウスＩＬ−２ＥＬＩＳＡキット（eBioscience）を使用してＩＬ−２含量が分析された。
【０１２１】
フローサイトメトリー解析（図９と１０）
細胞はＦＡＣＳバッファ（１％ＦＣＳと０．０２％のＮａＮ２含有ＰＢＳ）で再懸濁された。１００マイクロリットルのＦＡＣＳバッファ中、１×１０６／ミリリットルでリンパ球が染色され、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを備えたＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Becton Dickinson）上に得られた。使用された抗体は、抗ＣＤ２５  ＦＩＴＣ（クローンＰＣ６１、eBioscience）とＰＥ複合化抗ＣＤ６９（クローンＨ１．２Ｆ３）であった。
細胞は、非特異性結合を避けるために３０分間、４℃で、抗ＣＤ１６／３２含有ＦＡＣＳバッファ内で予備インキュベートされ、次いで４℃で３０分間、複合化された抗体の適切な濃度でラベルされた。ラベリングの後に、細胞は洗浄され、分析された。赤血球と死細胞を除くように前方および側方の散乱がセットされ、１サンプル当たり少なくとも２×１０４リンパ球が分析された。全ての実験において、染色された細胞はＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメータで得られ、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析された。
【０１２２】
フローサイトメトリー解析によるＶＪ−４Ｂ６の評価（図４）
ヒトＰＢＭＣおよびＰＭＮまたはネズミひ臓細胞と腹腔マクロファージが、最初に１０分間、４％のパラホルムアルデヒドを含むＦＡＣＳバッファ内で再懸濁され、その後、１５分間、４％のパラホルムアルデヒドと０．０２％のサポニンを含むＦＡＣＳバッファ内で懸濁された。細胞は１２時間４℃でビオチニル化（biotinylated）  ＶＪ−４Ｂ６の５０ｎｇ／ミリリットルでインキュベートされた。その後、細胞は１時間室温で、ストレプトアビジンＦＩＴＣ（１：２００希釈；eBioscience）でインキュベートされた。ラベリングの後に、細胞は、洗浄され分析された。赤血球と死細胞を除くように前方および側方の散乱がセットされ、１サンプル当たり少なくとも２×１０４リンパ球が分析された。全ての実験において、染色された細胞はＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメータで得られ、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析された。
【０１２３】
人間の末梢血白血球（図４Ａで使用された細胞）
血液ドナーはＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、およびＣ型肝炎ウイルスに陰性であることがテストされた、２０から３５歳の健康な男女であった。さらなる除外の基準は、最近４週間の感染、発熱、顕症アレルギー、異常な血球数、増加した肝臓酵素、または全ての種類の薬物摂取であった。新鮮な静脈血は健常ボランティアから集められ、すぐに３．２％のクエン酸ナトリウム（１：１０希釈）を含むチューブ内に移された。次に、細胞は、密度勾配法を使用して分離された：Ｆｉｃｏｌｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７１は、３ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１  １９１１（両者ともＳｉｇｍａから）の上で層にされ、個別の層を形成した。Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅｓの一番上に６ｍｌの血液（ＲＰＭＩ媒体で１：１に希釈する）を作成した。室温で３０分間、１５００ＲＰＭの遠心沈殿の後に、ＰＢＭＣｓおよびＰＭＮｓはそれらの適当な層から無菌毛細管ピペットを使用して吸引されて、ＲＰＭＩで３回洗浄した。
【０１２４】
統計分析
すべての統計分析がＰｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）を使用して行われた。すべての値は平均±ＳＥとして示される。統計分析は適切であることがスチューデントｔ検定または一方向ＡＮＯＶＡによって評価された。Ｐ＜０．０５の確率は有意であると考えられる。
【０１２５】
結果
新規な抗ＡｎｘＡ１  抗体は、図３Ａ（Ｇｅｎｏｖａｃ  ＧｍｂＨ、ドイツ）のスキームに示されたようにして遺伝子イミュナイゼーションで生成した。数匹のイミュナイズされたネズミからの血清がテストされ、３匹の細胞がＡｎｘＡｌ  ｃＤＮＡで感染させたＩｇＧ認識について陽性であるとの結果が得られた。これらのネズミからのひ細胞は、ハイブリドーマ細胞を発生させるようにミエローマ細胞と融合された。３つのハイブリドーマ細胞クローンの１つだけが首尾よくサブクローニングされ、エキスパンドされた。これらのハイブリドーマ細胞はＶＪ−４Ｂ６−Ｅ５−Ｂ１０−Ｄ４と呼ばれる。ハイブリドーマ細胞からの精製されたＩｇＧ２ｂ画分は、ＡｎｘＡｌ  ｃＤＮＡで感染された細胞を認識する（図３Ｂ、緑色の線；右側のピーク）が、無関係のｃＤＮＡで感染された細胞を認識しない（図３Ｂ、赤色の線；左側のピーク）。
【０１２６】
ＶＪ−４Ｂ６の特異性を明確にするために、異なったレベルのタンパク質を発現することが知られている浸透性のヒト、およびネズミの細胞におけるＡｎｘＡｌの発現をＦＡＣＳによって分析した。図４Ａに示されるように、ヒトＰＭＮはヒトＰＢＭＣに比較して、ＶＪ−４Ｂ６染色に対して非常に陽性であった（図４Ａ、右側のピーク、それぞれ左右のパネル）。これはＰＢＭＣと比べて、ＰＭＮが有意に多くのＡｎｘＡｌを発現するという従前の観察（Ｄ’Ａｃｑｕｉｓｔｏ他、未公開の結果）と一致している。同様に、ひ細胞と比べて、ＶＪ−４Ｂ６でのマウスマクロファージの染色は有意に多くのＡｎｘＡｌの発現を示した（図４Ｂ、右側のピーク、それぞれ左右のパネル）。これらの結果は、ＶＪ−４Ｂ６がヒトおよびネズミの両方のＡｎｘＡ１を認識することを示している。
【０１２７】
次に、Ｔ細胞活性化へのＶＪ−４Ｂ６の効果と特異性がテストされた。この目的のため、最初に、抗ＣＤ３誘発細胞増殖（３Ｈ−チミジン添加の手段により）へのＶＪ−４Ｂ６の効果が、ＡｎｘＡ１＋／＋またはＡｎｘＡｌ−／−ネズミからのＴ細胞を使用して測定された。図５は、抗ＣＤ３（それぞれ図５Ａと５Ｂ）での刺激により３Ｈ−チミジンの添加がＡｎｘＡ１＋／＋とＡｎｘＡ１−／−  Ｔ細胞の両方で、増加したことを示している。刺激された培養物へのＶＪ−４Ｂ６の添加は、ＡｎｘＡ１＋／＋Ｔ細胞では、３Ｈ−チミジン添加の濃度に依存する防止効果を示したが、ＡｎｘＡ１−／−ではそうではなかった。Ｔ細胞が抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８で刺激された状態で、同様の結果を得た（それぞれ図６Ａおよび６Ｂ）。
【０１２８】
これらの結果をさらに確認するために、Ｔ細胞活性化の他の古典的なマーカー、すなわちインターロイキン−２（ＩＬ−２）生産およびＣＤ２５／ＣＤ６９アップレギュレーションへのＶＪ−４Ｂ６の効果がテストされた。抗ＣＤ３だけ、または抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８によって刺激されたＴ細胞は、大量のＩＬ−２を生成した（それぞれ図７と８）。ＶＪ−４Ｂ６の添加は抑制に有意であり、ＡｎｘＡ１＋／＋では、濃度に依存するＩＬ−２生産を抑制したが、ＡｎｘＡ１−／−ではそうではなかった。ＣＤ２５／ＣＤ６９アップレギュレーションでも同様の結果を得た。抗ＣＤ３だけ、または抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８によって活性化されたＴ細胞は、ＣＤ２５／ＣＤ６９の両者にポジティブなＴ細胞の割合の著しい増加を引き起こした（それぞれ図９および図１０の左から２番目のパネル）。ＶＪ−４Ｂ６の存在下でのシュミレーションは、ＡｎｘＡ１＋／＋では濃度依存性のＣＤ２５／ＣＤ６９誘発（および発現）が顕著に禁止されたが、ＡｎｘＡ１−／−Ｔ細胞では起こらなかった。
【０１２９】
これらの結果は、抗ＣＤ３だけ、または抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８によって顕在化させられるシグナルリングにより、ＶＪ−４Ｂ６が、Ｔ細胞増殖、ＩＬ−２生産、およびＣＤ２５／ＣＤ６９アップレギュレーションを顕著に抑制することを示している。効果がＡｎｘＡｌ−／−Ｔ細胞では失われるので、ＶＪ−４Ｂ６によるＡｎｘＡ１の中和による効果は特異的である。これは活性Ｔ細胞が内因のＡｎｘＡｌを解離し、ついで適切なＴ細胞活性化が必要であるという発明者の前の観察と一致している(D’Acquisto et al., Blood 109: 1095-1102, 2007; D’Acquisto et al., Eur. J. Immunol. 37: 3131-3142, 2007)。
【０１３０】
要約すれば、これらのデータは、ＶＪ−４Ｂ６が濃度に依存する態様でＣＤ２５とＣＤ６９（Ｔ細胞活性化のマーカー）の抗ＣＤ３誘発のアップレギュレーション（upregulation）を禁止することを示している。同様の阻害作用はＩＬ−２生産と、Ｔ細胞増殖について観測された。最も重要には、この効果はアネキシン−１−欠乏  Ｔ細胞では観測されなかった。これは阻害が特異的であり、抗体が有害な細胞傷害効果を全く引き起こさないことを示している。
【０１３１】
実施例２−ＶＪ−４Ｂ６の配列
この実施例の目的は、ハイブリドーマ細胞から抗体の重鎖および軽鎖領域の遺伝子のクローンを作り、ＤＮＡ配列と相補性決定領域（ＣＤＲｓ）の位置と他の特徴を決定することであった。
【０１３２】
抗体可変領域のクローニングと配列
全ＲＮＡは、ハイブリドーマ細胞の１個のバイアルからＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙのミニキット（Ｃａｔ  Ｎｏ：７４１０４）を使用して調製された。ＲＮＡは、５０マイクロリットルの水中で溶離されて、１．２％のアガロースゲル上で検査した。
【０１３３】
ＶＨおよびＶＫ（可変カッパ軽鎖）相補ＤＮＡは、ＩｇＧとカッパ不変部プライマーを有する逆転写酵素を使用して調製された。第１のストランド相補ＤＮＡは、多数のシグナル配列プライマーを使用してＰＣＲにより増やされた。増やされたＤＮＡはゲルで精製され、ベクター  ｐＧｅｍＲ  Ｔ  Ｅａｓｙ（Ｐｒｏ  ｍｅｇａ）内でクローンを作られた。得られたＶＨおよびＶＫクローンは、予想されたサイズの挿入のためにスクリーニングされた。選択されたクローンのＤＮＡ配列は両方向で自動化ＤＮＡ塩基配列測定により決定した。配列における相補性決定領域（ＣＤＲｓ）の位置が、他の抗体配列に関して決定された（Ｋａｂａｔ他、１９９１）。
【０１３４】
結果
ＶＪ−４Ｂ６軽鎖
シングルＶＫ配列が同定された。ＶＪ−４Ｂ６  ＶＫのＤＮＡ配列および推定されたアミノ酸配列は図１１に示されている。ＣＤＲｓでアノテートされた推定蛋白質配列は図１２に示されている。２つの別々の増幅工程からの９つのクローン（７の非依存性）が同じＶ領域配列を与えた。ハイブリドーマ融合パートナーから起こる非生産的な異所性ＶＫ配列も多くのクローンに存在していて、配列の中の欠失を有する１つのクローンがあった。
【０１３５】
ＶＪ−４Ｂ６重鎖
シングルＶＨ配列が同定された。ＶＪ−４Ｂ６  ＶＨのＤＮＡ配列および推定されたアミノ酸配列は図１３に示されている。同じＶ領域配列は９つの非依存性のクローン(independent clones)で見られた。２つのクローンは単一塩基対変化を有し、１つのクローンは単一塩基対欠失と単一塩基対変化を有していた。また１つのクローンは２つの単一塩基対変化を有していた。１つのクローンでのみ、それぞれ５つの単一塩基対変化が起こった。残りの５つのクローンは、同一配列を有していた。ＣＤＲｓでアノテートされた推定蛋白質配列は図１４に示されている。
【０１３６】
参照
Chothia C and Lesk AM. Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J Mol Biol. 196: 901-17, 1987.
Kabat EA, Wu TT, Perry HM, Gottesman KS, Foeller C. Sequences of proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, 1991
【０１３７】
実施例３−生体内でのＶＪ−４Ｂ６の免疫抑制効果
生体内でのＶＪ−４Ｂ６の免疫抑制効果をテストするために、我々は自己免疫疾患の以下の２つの古典的モデルを選んだ：ＭＯＧ３３−５５誘起の実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ；多発性硬化症のモデルマウス）とコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ；リウマチ性関節炎のモデルマウス）。
【０１３８】
方法
実験的アレルギー性脳脊髄炎
０日目に、ＰＢＳ中のＭＯＧ３３−５５の３００マイクロｇと、加熱死菌化したM. tuberculosis H37Ra  ３００マイクログラムを含む等体積のＣＦＡからなる、エマルション３００マイクロリットルを皮下注射してイミュナイズした。エマルションは両方の脇腹に注射され、続いて０日目と２日目に、１００マイクロリットルの生理食塩水中のB. pertussis toxin (500ng/100 μl)を腹こう内注射した。ネズミはＥＡＥと体重損失の兆候のために毎日観測された。罹病度は６ポイントのスケールで評価された：
０＝疾病なし
１＝部分的に弛緩した尾
２＝完全に弛緩した尾
３＝立直り反射の損傷
４＝部分的な後あし麻痺症
５＝完全な後あし麻痺症
６＝瀕死または死亡
【０１３９】
コラーゲン誘発関節炎
６〜８の雄ＤＢＡ／１マウス（８−１２週齢）は尾の付け根に、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ；Hooke labs）中に乳化された２００マイクログラムのコラーゲンＩＩ型を皮内注射された。一次イミュナイゼーションの２１日後に、ネズミはＩＦＡ（Hooke labs）の２００マイクログラムのＩＩ型でブーストされた（皮下注射）。ネズミは、炎症性関節腫脹開始の兆候のために以下の２つの臨床的指標を使用してモニターされた：
【０１４０】
足膨張と臨床スコア
足膨張は血管内血量計で後ろ足の厚さを測定することによって評価された。メーカーによって推薦されるように、臨床の炎症性関節腫脹が評価された（http://hookelabs.com/protocols/ciaInductionDBAl/ciaInduction_DBA1.html）。１動物あたり最大１２のスコアで、それぞれの手足は等級付けされた。
【０１４１】
結果
Ｃ５７／ＢＬ６雄ネズミは、先に説明したようにして、ＭＯＧ３３−５５／ＣＦＡでイミュナイズされた(Paschalidis et al., J Neuroinflammation. 2009;6:33)。ネズミは、ＭＯＧ３３−５５／ＣＦＡでイミュナイズした後６日目から、６日毎に、ＶＪ−４Ｂ６（５、５０および１００ｎｇ／１００マイクロリットル）、ＩｇＧコントロール（１００ｎｇ／マイクロリットル）またはＰＢＳビヒクル（コントロール）の腹腔内注射を受けた。図１５に示されるように、５、５０および１００ｎｇのＶＪ−４Ｂ６で処理されたネズミは、ＩｇＧコントロールネズミと比べて疾病の兆候の顕著な用量依存的抑制を統計的に示した（それぞれ図１５Ｂ、Ｃ、およびＤ）。ＩｇＧコントロールネズミには効果がなかった（図１５Ａ）。それぞれの処理についての曲線下面積（ＡＵＣ）と阻害％対コントロール（２７．２９ＡＵＣ）の割合は以下の通りであった：ＩｇＧ１００ｎｇ、２４．１７  ＡＵＣ、１１．４％。ＶＪ−４Ｂ６  ５ｎｇ、１５．０４  ＡＵＣ、４４．８％。ＶＪ−４Ｂ６  ５０ｎｇ、５．８７  ＡＵＣ、７８．５％。ＶＪ−４Ｂ６  １００ｎｇ、７．０４  ＡＵＣ、７４．２％。
【０１４２】
ＥＡＥの動物モデルに関する研究は、疾病の急性相が体重損失と同時に起こることを示した。これはたぶん無食欲症および流体摂取の不足のためであろう。治療されたネズミの重量測定は臨床スコアの厳しさと相関し、ＶＪ−４Ｂ６による治療はコントロールと比較して用量依存的に、１８日目からの体重損失を抑えたことを示したが、ＩｇＧ処理されたネズミではそうではなかった（図１６）。
【０１４３】
免疫抑制剤としての生体内でのＶＪ−４Ｂ６の治療的有効性を確認するために、ＣＩＡモデルで効果をテストした。ＤＢＡ／１雄マウスは、先に説明したように、ＣＦＡ中のウシＩＩ型コラーゲンによりイミュナイズされた(D’Acquisto et al., Blood. 2007;109(3):1095-102)。コラーゲンによるブースト後０日目から開始して、６日毎に、ＶＪ−４Ｂ６（１００ｎｇ／１００マイクロリットル）またはＰＢＳビヒクル（コントロール）の腹腔内注射を受けた。ＥＡＥで得るデータと一致し、コントロールのマウス（ＡＵＣ  ８３．５０）と比較して、ＶＪ−４Ｂ６の投与は疾病の兆候の発達を顕著に抑えた（ＡＵＣ２６．７５；６７．９％）、図１７。
【０１４４】
アペンディックス３  
１４頁
特許出願手続のための微生物寄託の国際承認に関するプタペスト条約
寄託者の氏名および住所
フルビオ  ダクイスト
クイーンメリーアンドウェストフィールドカレッジ、センター  フォア  バイオケミカル  ファーマコロジー、チャーターハウス  スクエア、ロンドン、ＥＣ１Ｍ  ６ＢＱ、英国
１．  微生物の同定
寄託者により与えられた参照の同定
ＶＪ−４Ｂ６−Ｅ５−Ｂ１０−Ｄ４
国際寄託当局により与えられたアクセションナンバー
１００６０３０１
２．  科学的定義および／または提案された分類学上の指定
上記１で定義された微生物は科学的定義を伴う。
３．  領収および受理
この国際寄託当局は上記１で定義された微生物を、２０１０年６月３日に受理した（最初の寄託の日付）
４．  転換のための要求の受理
上記１で定義された微生物は２０１０年６月３日（最初の寄託の日付）に国際寄託当局により受理された。
５．  国際寄託当局
氏名    ＥＣＡＣＣ  特許スーパーバイザー
住所    ヘルス  プロテクション  エージェンシー  カルチャー  コレクションズ
ポートン  ダウン  サリスバリィ  ＳＰ４  ０ＪＧ  英国
国際寄託当局を代表する権原を有する者または代理人の署名
【０１４５】
寄託された微生物または他の生物学的物質の表示
Ａ．  寄託された微生物または他の生物学的物質に関する表示は１３頁、第３−１４行が参照される。
Ｂ．  寄託の表示
寄託施設の表示
欧州細胞カルチャーコレクション（ＥＣＡＣＣ）
寄託施設の住所
ヘルス  プロテクション  エージェンシー  
カルチャー  コレクションズ
センター  フォー  エマージェンシー  プリペアードネス  アンド  レスポンス、ポートン  ダウン、サリスバリィ  ＳＰ４  ０ＪＧ、英国
寄託日    ２０１０年  ６月３日
アクセションナンバー    １００６０３０１
Ｃ．  追加の表示
寄託は、クイーンメリーアンドウェストフィールドカレッジ、センター  フォア  バイオケミカル  ファーマコロジー、チャーターハウス  スクエア、ロンドン、ＥＣ１Ｍ  ６ＢＱ、英国の、フルビオ  ダクイストにより行われた。寄託者は、出願人が出願中に寄託物について言及するのを認可され、欧州特許条約（ＥＰＣ）の規則  ３１（ｌ）（ｄ）により公衆にとって利用可能にされる寄託物に、予約不要の取り消せない同意を与えた。認可および同意の宣言は、この国際出願と同時に提出されている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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