(57)【要約】  本発明は、少なくとも一つの分散形態のセルフアッセンブリータンパク質、及びセルフアッセンブリータンパク質のための少なくとも一つの特定の分散剤を水相中に含む安定な水性タンパク質分散系；前記安定な水性分散系を生産するためのプロセス；前記安定な水性分散系を用いたセルフアッセンブリータンパク質のエレクトロスピニングのためのプロセス；前記水性分散系から繊維シート体又は繊維を生産するためのプロセス；表面コーティングのための前記水性分散系の使用；エレクトロスピニングによって生産された材料の、医薬デバイス、衛生的な物品及び生地の製造における使用；並びに、本発明のエレクトロスピニングプロセスによって生産された繊維又は繊維シート体にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの分散形態のセルフアッセンブリータンパク質、及びセルフアッセンブリータンパク質のための少なくとも一つの分散剤を水相中に含む安定な水性タンパク質分散系であって、前記分散剤が両親媒性タンパク質から選択されるポリマー分散剤であるか、又は両親媒性ペプチド断片及び両親媒性有機オリゴマーから選択されるオリゴマー分散剤である、前記分散系。
【請求項２】
セルフアッセンブリータンパク質が、ミクロビーズを形成するか又は本質的に折り畳まれていないタンパク質、より具体的にはクモ絹タンパク質等の絹タンパク質若しくは昆虫タンパク質、又はこれらのタンパク質の少なくとも一つに由来し、かつ少なくとも約60%の配列同一性を有するセルフアッセンブリーアナログである、請求項１に記載の安定な水性分散系。
【請求項３】
セルフアッセンブリータンパク質が、
a）配列番号4のアミノ酸配列を含むR16タンパク質；
b）配列番号6のアミノ酸配列を含むS16タンパク質；
c）これらのタンパク質に由来し、かつ配列番号4又は配列番号6に対し少なくとも約60%の配列同一性を有する紡糸可能なアナログタンパク質
から選択される、請求項１又は２に記載の安定な水性分散系。
【請求項４】
両親媒性ペプチド断片が、前駆タンパク質の断片を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の安定な水性分散系。
【請求項５】
ポリマー分散剤がアルブミン、より具体的にはウシ血清アルブミン（BSA）又は無脂肪ウシ血清アルブミン（ffBSA）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の安定な水性分散系。
【請求項６】
前駆タンパク質がアルブミン、より具体的にはウシ血清アルブミン（BSA）又は無脂肪ウシ血清アルブミン（ffBSA）である、請求項４に記載の安定な水性分散系。
【請求項７】
両親媒性ペプチド断片が、請求項２又は３に記載のセルフアッセンブリータンパク質のペプチド断片である、請求項４に記載の安定な水性分散系。
【請求項８】
両親媒性有機オリゴマーが、エーテル構造単位を含み、かつ（疎水性側基を有する）少なくとも一つの疎水性エーテルオリゴマーブロック、及び（親水性側基を有する）少なくとも一つの親水性エーテルオリゴマーブロックを含むブロックコオリゴマーである、請求項１に記載の安定な水性分散系。
【請求項９】
少なくとも一つのセルフアッセンブリータンパク質を、安定な分散系の総重量を基準として重量で1%〜40%、好適には重量で5〜20%の割合で含み、任意に重量で0.01%〜50％、好適には重量で0.1%〜10%の少なくとも一つのさらなる製剤補助剤又は加工補助剤を共に含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の安定な水性分散系。
【請求項１０】
セルフアッセンブリータンパク質及び分散剤を、0.1:1〜1:0.001の相対重量割合で含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の安定な水性分散系。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の、少なくとも一つのセルフアッセンブリータンパク質の安定な水性分散系を生産するためのプロセスであって、可溶化剤（カオトロープ）を含む水性媒体にセルフアッセンブリータンパク質を溶解すること、及び生じた溶液を分散剤の存在下で透析又は限外濾過することにより、セルフアッセンブリータンパク質から可溶化剤（カオトロープ）を除去することを含む、前記プロセス。
【請求項１２】
セルフアッセンブリータンパク質及びポリマー分散剤の混合物がカオトロープを含む水性媒体に溶解され、カオトロープが、より具体的にはカオトロープを含まない透析媒体に対する透析によって、セルフアッセンブリータンパク質から除去され、安定な分散系を形成する、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１３】
セルフアッセンブリータンパク質がカオトロープを含む水性媒体に溶解され、カオトロープがセルフアッセンブリータンパク質から除去され、カオトロープの除去前又は除去中に両親媒性ペプチド断片又は合成の両親媒性オリゴマーを添加することにより安定な分散系を形成する、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１４】
カオトロープの除去が透析又は限外濾過又は沈降によりなされる、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１５】
カオトロープの除去が、少なくとも一つの両親媒性ペプチド断片又は少なくとも一つの合成両親媒性オリゴマーを含む透析媒体（透析バッファー）に対する透析によってなされる、請求項１３に記載のプロセス。
【請求項１６】
カオトロープを含む水性媒体が、緩衝された水性媒体と交換される、請求項１１〜１５のいずれか1項に記載のプロセス。
【請求項１７】
緩衝された媒体が約10〜12のpHを有する、請求項１６に記載のプロセス。
【請求項１８】
透析容量が、カオトロープ及びセルフアッセンブリータンパク質を含む透析される水性媒体の容量に対して、少なくとも100倍である、請求項１４〜１７のいずれか1項に記載のプロセス。
【請求項１９】
セルフアッセンブリータンパク質のエレクトロスピニングのためのプロセスであって、請求項１〜１０のいずれか1項に記載の、又は請求項１１〜１８のいずれか1項にしたがって得られた安定な水性分散系のエレクトロスピニングを含む、前記プロセス。
【請求項２０】
少なくとも一つのセルフアッセンブリータンパク質を含む繊維シート体又は繊維を生産するためのプロセスであって、請求項１〜１０のいずれか1項に記載の、又は請求項１１〜１８のいずれか1項にしたがって得られた水性分散系をエレクトロスピニングして、繊維シート体を形成することを含む、前記プロセス。
【請求項２１】
紡糸される分散系が、安定な分散系の総重量を基準として、重量で1%〜40%、好適には重量で5〜20%の割合でセルフアッセンブリータンパク質を含む、請求項１９又は２０のいずれかに記載のプロセス。
【請求項２２】
紡糸前に分散系が、
a）分散系に可溶な又は分散可能な、有機／合成バイオポリマー等の粘度調整剤；
b）キャリア形成性ポリマー；
c）薬理学、農業化学、皮膚化粧品又は毛髪化粧品活性成分；
から選択される少なくとも一つのさらなる添加剤と混合される、請求項１９〜２１のいずれか1項に記載のプロセス。
【請求項２３】
表面、より具体的には不織布、繊維及び発泡体をコーティング、より具体的にはスプレー又は浸漬コーティングするための、請求項１〜１０のいずれか1項に記載の安定な水性分散系の使用。
【請求項２４】
医療部門、より具体的には創傷接触材料、縫合糸、医療デバイス、インプラント、組織エンジニアリングにおける製品のための、請求項１９〜２２のいずれか1項にしたがって得られた材料の使用。
【請求項２５】
衛生用品及び生地の製造における、請求項１９〜２２のいずれか1項にしたがって得られた材料の使用。
【請求項２６】
請求項２０〜２２のいずれか1項に記載のプロセスによって得られた繊維又は繊維シート体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも一つの分散形態のセルフアッセンブリータンパク質及びセルフアッセンブリータンパク質のための少なくとも一つの特定の分散剤を水相中に含む安定な水性タンパク質分散系；前記安定な水性分散系を生産するためのプロセス；前記安定な水性分散系を用いたセルフアッセンブリータンパク質のエレクトロスピニング（electrospinning）のためのプロセス；前記水性分散系から繊維シート体又は繊維を生産するためのプロセス；表面コーティングのための前記水性分散系の使用；医療デバイス、衛生物品及び生地(textile)の製造における、エレクトロスピニングによって生産された材料の使用；並びに、本発明のエレクトロスピニングプロセスによって生産された繊維又は繊維シート体に関する。
【背景技術】
【０００２】
エレクトロスピニングプロセスは、ナノファイバー及びメソファイバーの生産に好適なプロセスである。例えばD.H. Reneker, H.D. Chunによって、Nanotechn. 7 (1996), p. 216 et seq（非特許文献1）に記載されているこのプロセスは、典型的に、電極として作用するエッジにおける高電場にポリマー溶融物又は溶液を暴露することを含む。これは例えば、ポリマー溶融物又は溶液を、電源の一つの極につないだカニューレから低圧力で電場内に押し出すことによってなされ得る。ポリマー溶融物又は溶液に生じる静電荷のために、物質の流れは対極の方向へ動き、対極へ向かう途中で凝固する。電極形状に依存して、このプロセスは繊維不織ウェブすなわち不織布、又は秩序だった繊維の集合体を提供する。
【０００３】
天然起源の材料、例えば、バイオポリマー又はそれに由来する合成ポリマーもまた、エレクトロスピニングによって加工可能である。
【０００４】
例として、Zarkoob及びRenekerによって記載されている(Polymer 45: 3973−3977, 2004) （非特許文献2）、ヘキサフルオロ−2−プロパノール溶液からの、クモのネフィラクラビペス（Nephila clavipes）のクモ絹たんぱく質の、エレクトロスピニングによるナノファイバーへの加工が挙げられる。ギ酸溶液からのボンビックスモリ（Bombyx mori）の絹の紡糸の試みは、Sukigara及びKoによって記載されており（Polymer 44: 5721−572, 2003）（非特許文献3）、彼達は繊維の形態に影響を与えるためにエレクトロスピニングのパラメーターを変更した。Jin及びKaplanは水をベースとする、絹又は絹／ポリエチレンオキシドのエレクトロスピニングを報告した(Biomacromolecules 3: 1233−1239, 2002)（非特許文献4）。
【０００５】
WO-A-03/060099（特許文献1）にはボンビックスモリ（Bombyx mori）絹タンパク質及びクモ絹タンパク質の紡糸のための（エレクトロスピニングを含む）様々な方法及び装置が記載されている。用いられたクモ絹タンパク質は遺伝子導入ヤギによって組み換え生産され、その乳から回収され、その後紡糸された。
【０００６】
それぞれR16及びS16として知られる昆虫タンパク質レシリン又はクモ絹タンパク質の反復単位で構成される合成バイオポリマーは、本発明の譲受人に譲渡されたWO2008/155304（特許文献2）に記載されている。ミクロビーズの形態であるポリマーは、例えばゲル様の産物に変換され得るか、又はタンパク質フィルムに加工され得る。
【０００７】
ポリマーのエレクトロスピニング、例えば任意に医薬又は農業化学活性成分と混合される合成バイオポリマー若しくは他の紡糸可能な有機ポリマー、又は相互に協調的なそれらのポリマー混合物は、本発明の譲受人に譲渡されたWO2010/015709（特許文献3）及びWO2010/015419（特許文献4）に記載されている。有機溶媒又は濃縮ギ酸中のポリマー溶液は、紡糸溶液として用いられる。
【０００８】
R16又はS16の水溶液が原理的に紡糸可能であることは、WO2010/015419に概略的に述べられている。しかしながら、かかる水溶液には、特に比較的高いタンパク質濃度において安定性を欠き、それにより溶液中の望ましくないゲル化又は沈殿が生じるという根本的な問題がある。
【０００９】
実際には、かかる紡糸可能な疎水性タンパク質の可溶性は、既知のカオトロピック試薬を用いる事によって大きく増加し得る。10Mのチオシアン酸グアニジン（GdmSCN）溶液において、実験的に観察された最も高い可溶性は、約38％である。しかしながら、GdmSCNが透析によって再び除去されると、タンパク質は沈殿する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第WO-A-03/060099号
【特許文献２】国際公開第WO2008/155304号
【特許文献３】国際公開第WO2010/015709号
【特許文献４】国際公開第WO2010/015419号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Nanotechn. 7 (1996), p. 216 et seq
【非特許文献２】Polymer 45: 3973-3977, 2004
【非特許文献３】Polymer 44: 5721 572, 2003
【非特許文献４】Biomacromolecules 3: 1233-1239, 2002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
疎水性が高いタンパク質、例えばR16タンパク質等の水への乏しい可溶性（最大で約1％）のために、本発明の目的は、前記タンパク質が紡糸されるために液相において比較的高濃度で安定化される、紡糸可能な系を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（透析中の）水溶液でのタンパク質の沈殿を防ぐという課題に対し、本発明によって提供される第一の解決策は、その構造中に疎水性部分も含む親水性タンパク質による疎水性タンパク質の安定化を含む。より具体的には、ウシ血清アルブミン（BSA、フラクションV）がこれらの要求を満たすことが実験的に示された。ウシ血清アルブミンは、血液中の脂肪酸及び脂質の輸送機能を果たす可溶性タンパク質である。BSAは607アミノ酸で構成され、約69.4kDaの分子量を有する。無脂肪BSA（ffBSA）はBSAの特定の形態であり、脂肪酸の除去によりさらなる疎水性部位が存在する。
【００１４】
前記課題に対し、本発明によって提供される第二の解決策は、好適なタンパク質断片（ペプチド）を用いた疎水性タンパク質の安定化を含む。本発明のタンパク質断片は疎水性配列ドメインと共に親水性配列ドメインを含む。より具体的には、二つのペプチドに基づく系が提供される：
a）    R16タンパク質のタンパク質断片を用いたネイティブなR16タンパク質の安定化
b）    BSAのタンパク質断片を用いたネイティブなR16タンパク質の安定化。
【００１５】
安定化用タンパク質断片を製造するための、タンパク質のそれぞれの加水分解性の分裂は、通常の方法によって、例えば80℃のNaOH溶液を用いてなされる。
【００１６】
前記課題に対し、本発明によって提供される第三の解決策は、それ自体は既知の化合物であり、例えばWO2010/057654に記載されている、好適な合成有機オリゴマーを用いた疎水性タンパク質の安定化を含む。WO2010/057654の内容は、参照により明白に明細書に組み込む。これらのオリゴマーもまた、疎水性ドメインと共に親水性ドメインを含み、高濃度の水溶液中において疎水性タンパク質を安定化する。
【００１７】
より具体的には、本発明者は、驚くべきことに、前記様々な解決手段の全てが、エレクトロスピニングによって分散系をさらに加工するために十分な時間、高濃度の疎水性タンパク質を安定に保つ安定化された水性タンパク質分散系を提供する事を見出した。疎水性ポリマーのエレクトロスピニングにおいて高濃度の有機溶媒又は有機酸を用いる必要性を除去し、ナノファイバー及び繊維シート体の全体的な生産プロセスを大いに単純化し、かつさらにそのコストを削減するのは、これが初めてである。結果として、本発明に従って実施されるプロセスは環境によりやさしく（なぜならこのプロセスは水溶液から紡糸する）、繊維の生産中より穏やかであり、かつタンパク質の安定性を改善する。さらに、該プロセスは、より少ない容量を用いるという有利な点も有しており、それゆえに取り扱いにも優れる。タンパク質溶液が濃縮されるので、繊維は高い処理量で、すなわち高い生産性で、水溶液から紡糸され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明に関するR16タンパク質加水分解物のマススペクトル（Maldi-ToF）を示す。
【図２】本発明に関するBSAタンパク質加水分解物のマススペクトル（Maldi-ToF）を示す。
【図３】BSAにより安定化され、かつ、粘度を高めるためにさらにポリエチレンオキシドポリマー（PEO）と混合された、R16タンパク質溶液のエレクトロスピニングによって得られた繊維の電子顕微鏡写真を示す。図３aは、成分ごとに42.5%、42.5%、及び15%の固形含量をそれぞれ有するR16タンパク質、BSA及びPEOの分散系の紡糸の結果を示す。図３bは、これら三つの成分の混合物の結果を示す、ただし固形含量はそれぞれ37%、37%、及び16%である。図３c及び図３dは、34.5％、34.5％、及び31％の固形含量をそれぞれ有するこれら三つの成分の混合物の、紡糸速度0.4ml/h(図３c)及び0.5ml/h(図３d)における紡糸の結果を示す。
【図４】R16タンパク質のペプチド断片を用いて安定化されたR16タンパク質の水性分散系のエレクトロスピニングによって得られた繊維の電子顕微鏡写真を示す。図４aは、成分ごとに61%、0.003%、及び39%の固形含量をそれぞれ有するR16タンパク質、R16断片、及びPEOの混合物の紡糸を示す。図４bは、それぞれ74%、0.004%、及び26%の固形含量における、これら三つの成分の紡糸の結果を示す。
【図５】BSAペプチド断片により安定化されたR16タンパク質溶液のエレクトロスピニングによって得られた繊維の電子顕微鏡写真を示す。図５a及び図５bは、異なる倍率での同じ繊維を示す。
【図６】本発明に関する化学式１の両親媒性オリゴマーにより安定化されたR16タンパク質溶液のエレクトロスピニングによって得られた繊維の電子顕微鏡写真を示す。
【図７】本発明に関するR16タンパク質による繊維芽細胞の細胞増殖に対するインビトロ活性を示す。様々な濃度のR16タンパク質断片における相対的細胞数の経時的変化が、（前記断片を含まない）コントロールと比較して、示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
１．一般的な用語の定義
「両親媒性」は親水性及び親油性の両方である物質の化学的特性を意味する。これは、該物質が親水性ドメイン及び疎水性ドメインの両方を有するという事実に基づく。
【００２０】
「カオトロピック」は、例えばバリウム塩、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン等のチオシアン酸塩、過塩素酸塩等の、水中の秩序だった水素結合を解く化学物質を示すのに用いられる。水素結合を破壊することにより、カオトロピック物質は水の構造を乱し、エントロピーの増大を引き起こす。アミノ酸の場合には、カオトロピック物質はそれにより疎水的な影響を変化させ、タンパク質を変性させる効果を有する。なぜならタンパク質折り畳みの推進力は疎水性アミノ酸の凝集だからである。
【００２１】
「分散系」は、ほとんどあるいは全く、互いに溶解しないか若しくは化学的に結合しない二以上の化学物質の不均一な混合物である。したがって、水性タンパク質分散系は水性媒体（分散媒）と固形タンパク質（分散相）の混合物であり、したがって「水性タンパク質懸濁液」と呼ぶこともできる。
【００２２】
「キャリア（担体）ポリマー」は、バイオポリマー及び／若しくはそれらの混合物、あるいは、一以上の合成ポリマーと一以上のバイオポリマーの混合物を意味するものと理解されたい。ここで、前記キャリアポリマーは、製剤化される活性／有益剤若しくは薬剤との非共有結合性の相互作用に関わるか、又は（分散又は結晶性の）粒子状活性成分を包囲若しくは吸着（担持）することができる。
【００２３】
活性又は有益剤は、農業化学、薬学、化粧品、又は食品及び飼料産業において用途を見出し得る、親水性、親油性、又は両親媒性の特性を有する合成若しくは天然の低分子量物質を意味し、さらに、本発明の繊維シート体に埋め込まれ得るか又は吸着され得る生物活性高分子、例えばペプチド（例えば、2〜10のアミノ酸残基を有するオリゴペプチド、及び10超、例えば11〜100のアミノ酸残基を有するポリペプチド）並びに酵素及び単鎖又は二本鎖の核酸分子（例えば2〜50の核酸残基を有するオリゴヌクレオチド及び50超の核酸残基を有するポリヌクレオチド）もまた意味すると理解されたい。
【００２４】
用語「繊維シート体」は、本発明において、個々のポリマー繊維だけでなく、複数のかかる繊維の秩序だった又はランダムな単一若しくは多数（層）の集合体、例えば繊維ウェブ又は不織布もまた含む。
【００２５】
特に示さない限り、ポリマーの分子量の記載は、Mn値又はMw値である。
【００２６】
２．特定の実施形態
より具体的には、本発明は以下の実施形態を提供する：
１．天然で、合成で、又は組み換えで生産された少なくとも一つの分散形態のセルフアッセンブリータンパク質、及びそのセルフアッセンブリータンパク質のための少なくとも一つの分散剤を水相中に含む安定な水性タンパク質分散系であって、前記分散剤が両親媒性タンパク質から選択されるポリマー分散剤であるか、又は両親媒性ペプチド断片及び／若しくは両親媒性有機オリゴマーから選択されるオリゴマー分散剤である、前記分散系。
【００２７】
２．セルフアッセンブリータンパク質が、ミクロビーズを形成するか又は本質的に折り畳まれていないタンパク質、より具体的にはクモ絹タンパク質等の絹タンパク質若しくは昆虫タンパク質（例えばレシリン）、又はこれらのタンパク質の少なくとも一つに由来し、かつ少なくとも（元のタンパク質に対して）約60%の配列同一性を有するセルフアッセンブリーアナログである、実施形態１に記載の安定な水性分散系。
【００２８】
３．セルフアッセンブリータンパク質が、
a）配列番号4のアミノ酸配列を含むR16タンパク質；
b）配列番号6のアミノ酸配列を含むS16タンパク質；
c）これらのタンパク質に由来し、かつ配列番号4又は配列番号6に対し少なくとも約60%、例えば約70、80、90、95、96、97、98、又は99%の配列同一性を有する紡糸可能なアナログタンパク質（例えばオリゴアルギニンブロック（1-20Arg）等のオリゴアミノ酸ブロックの挿入又は付加による）、
から選択される、実施形態１又は２に記載の安定な水性分散系。
【００２９】
４．両親媒性ペプチド断片が、前駆タンパク質の断片を含む、実施形態１〜３のいずれかに記載の安定な水性分散系。
【００３０】
５．ポリマー分散剤がアルブミン、より具体的にはウシ血清アルブミン（BSA）又は無脂肪ウシ血清アルブミン（ffBSA）である、実施形態１〜４のいずれかに記載の安定な水性分散系。
【００３１】
６．前駆タンパク質がアルブミン、より具体的にはウシ血清アルブミン（BSA）又は無脂肪ウシ血清アルブミン（ffBSA）である、実施形態４に記載の安定な水性分散系。
【００３２】
７．両親媒性ペプチド断片が、実施形態２又は３に記載のセルフアッセンブリータンパク質のペプチド断片である、実施形態４に記載の安定な水性分散系。
【００３３】
８．両親媒性有機オリゴマーが、エーテル構造単位を含み、かつ少なくとも一つの疎水性エーテルオリゴマーブロック（より具体的には少なくとも一つの疎水性側鎖を有する）、及び少なくとも一つの親水性エーテルオリゴマーブロック（より具体的には少なくとも一つの親水性側鎖を有する）を含むブロックコオリゴマーである、実施形態１に記載の安定な水性分散系。前記各ブロックは、より具体的には均一であり、すなわち本質的に同一のモノマー構造単位で構成される。
【００３４】
９．少なくとも一つのセルフアッセンブリータンパク質を、安定な分散系の総重量を基準として重量で1%〜40%の割合で、より具体的には重量で2%〜30%、3%〜25%、又は5%〜25%含み、任意に重量で0.01%〜50％、より具体的には重量で0.05%〜30%、0.08%〜20%、又は0.1%〜10%の少なくとも一つのさらなる製剤補助剤若しくは加工補助剤を共に含む、実施形態１〜８のいずれかに記載の安定な水性分散系。
【００３５】
１０．セルフアッセンブリータンパク質及び分散剤を、0.1:1〜1:0.001、又は0.2:1〜1:0.05、又は0.5:1〜1:0.2、又は0.7:1〜1:0.5の相対重量割合で含む、実施形態１〜９のいずれかに記載の安定な水性分散系。
【００３６】
１１．実施形態１〜１０のいずれかに記載の、少なくとも一つのセルフアッセンブリータンパク質の安定な水性分散系を生産するためのプロセスであって、可溶化剤（カオトロープ）を含む水性媒体にセルフアッセンブリータンパク質を溶解すること、及び生じた溶液を分散剤の存在下で透析又は限界濾過することにより、セルフアッセンブリータンパク質から可溶化剤（カオトロープ）を除去することを含む、前記プロセス。
【００３７】
１２．セルフアッセンブリータンパク質及びポリマー分散剤の混合物がカオトロープを含む水性媒体に溶解され、カオトロープが、より具体的にはカオトロープを含まない透析媒体に対する透析によって、セルフアッセンブリータンパク質から除去され、安定な分散系を形成する、実施形態１１に記載のプロセス。
【００３８】
１３．セルフアッセンブリータンパク質がカオトロープを含む水性媒体に溶解され、カオトロープがセルフアッセンブリータンパク質から除去され、カオトロープの除去前又は除去中に両親媒性ペプチド断片又は合成の両親媒性オリゴマーを添加することにより安定な分散系を形成する、実施形態１１に記載のプロセス。
【００３９】
１４．カオトロープの除去が透析、限外濾過、及び／又は沈降によりなされる、実施形態１１〜１３のいずれかに記載のプロセス。
【００４０】
１５．カオトロープの除去が、少なくとも一つの両親媒性ペプチド断片又は少なくとも一つの合成両親媒性オリゴマーを含む透析媒体（透析バッファー）に対する透析によってなされる、実施形態１３に記載のプロセス。
【００４１】
１６．カオトロープを含む水性媒体が、緩衝された水性媒体と交換される、実施形態１１〜１５のいずれか1形態に記載のプロセス。
【００４２】
１７．緩衝された媒体が約4〜12若しくは10〜12、又は約11.5のpHを有する、実施形態１６に記載のプロセス。
【００４３】
１８．透析容量が、カオトロープ及びセルフアッセンブリータンパク質を含む透析される水性媒体の容量に対して、少なくとも100倍、例えば200倍、300倍、500倍、若しくは1000倍、又はそれ以上多い、実施形態１４〜１７のいずれか1形態に記載のプロセス。
【００４４】
１９．セルフアッセンブリータンパク質のエレクトロスピニングのためのプロセスであって、実施形態１〜１０のいずれか1形態に記載の、又は実施形態１１〜１８のいずれか1形態にしたがって得られた安定な水性分散系のエレクトロスピニングを含む、前記プロセス。
【００４５】
２０．少なくとも一つのセルフアッセンブリータンパク質を含む繊維シート体又は繊維を生産するためのプロセスであって、実施形態１〜１０のいずれか1項に記載の、又は実施形態１１〜１８のいずれか1項にしたがって得られた水性分散系をエレクトロスピニングして繊維シート体を形成することを含む、前記プロセス。
【００４６】
２１．紡糸される分散系が、安定な分散系の総重量を基準として、重量で1%〜40%、より具体的には重量で2%〜30%、3%〜25%、又は5〜20%の割合でセルフアッセンブリータンパク質を含む、実施形態１９又は２０のいずれかに記載のプロセス。
【００４７】
２２．紡糸前に分散系が、
a）分散系に可溶な又は分散可能な、有機／合成バイオポリマー等の粘度調整剤；
b）キャリア形成性ポリマー；
c）薬理学、農業化学、皮膚化粧品又は毛髪化粧品活性成分；
d）薬剤、創傷治癒促進剤；
e）抗微生物剤、抗細菌剤、又は抗ウイルス剤；
から選択される少なくとも一つのさらなる添加剤と混合される、実施形態１９〜２１のいずれか1形態に記載のプロセス。
【００４８】
２３．表面、より具体的には不織布、繊維及び発泡体のコーティング、より具体的にはスプレー若しくは浸漬コーティング、又はシート形態のコーティングのための、実施形態１〜１０のいずれか1形態に記載の安定な水性分散系の使用。
【００４９】
２４．医療部門、より具体的には創傷接触材料、縫合糸、医療デバイス、インプラント、組織工学における製品のための、実施形態１９〜２２のいずれか1形態にしたがって得られた材料の使用。
【００５０】
２５．衛生物品及び繊維製品(textile)の製造における、実施形態１９〜２２のいずれか1形態にしたがって得られた材料の使用。
【００５１】
２６．実施形態２０〜２２のいずれか1形態に記載のプロセスによって得られた繊維又は繊維シート体。
【００５２】
３．本発明のさらなる具体例
i）セルフアッセンブリータンパク質
特に有用なセルフアッセンブリータンパク質は、特に絹タンパク質である。本発明の目的上絹タンパク質は、高度の反復アミノ酸配列を含み、動物中に液体形態で貯蔵され、その分泌物がせん断又は紡糸により繊維を生ずる絹タンパク質である（Craig, C. L. (1997) Evolution of arthropod silks. Annu. Rev. Entomol. 42: 231-67）。
【００５３】
特に好適なこの種類のタンパク質は、もともとクモから、特にクモの大瓶状腺（major ampullate gland）から単離されたクモの絹タンパク質、例えばニワオニグモ（Araneus diadematus）の大瓶状腺から単離されたADF3及びADF4である(Guerette et al., Science 272, 5258:112-5 (1996))。
【００５４】
同様に好適なタンパク質は、天然タンパク質であるか、又は天然の絹タンパク質に由来し、かつ遺伝子工学的方法を用いて原核生物若しくは真核生物の発現系において異種的に生産された合成タンパク質である。原核発現の生物の限定するものではない例として、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルスメガテリウム（Bacillus megaterium）、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）等が挙げられる。真核発現の生物の限定するものではない例として、酵母、例えばサッカロマイセスセレビシア（Saccharomyces cerevisiae）、ピキアパストリス（Pichia pastoris）等、糸状菌、例えばクロコウジカビ（Aspergillus niger）、コウジカビ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルスニデュランス（Aspergillus nidulans）、トリコデルマリーゼイ（Trichoderma reesei）、アクレモニウムクリソゲナム（Acremonium chrysogenum）等、哺乳類細胞、例えばHela細胞、COS細胞、CHO細胞等、昆虫細胞、例えばSf9細胞、MEL細胞等が挙げられる。
【００５５】
天然の絹タンパク質の反復単位に基づく合成タンパク質もまた好適である。合成の反復絹タンパク質配列に加え、合成タンパク質はさらに一以上の天然の非反復絹タンパク質配列を含み得る(Winkler and Kaplan, J. Biotechnol. 74: 85 93 (2000))。
【００５６】
合成クモ絹タンパク質のうち、天然のクモ絹タンパク質の反復単位に基づく合成クモ絹タンパク質を、紡糸プロセスによる活性剤の製剤化のために用いることもまた可能である。合成の反復クモ絹タンパク質配列に加え、合成タンパク質はさらに一以上の天然の非反復のクモ絹タンパク質配列を含み得る。
【００５７】
合成クモ絹タンパク質の中で、配列番号2のいわゆるC16タンパク質(Hummerich et al., Biochemistry, 43(42):13604-13612 (2004))、並びにこの配列の機能的等価物、機能的誘導体、及び塩（WO2007/082936も参照）が言及されるべきである。
【００５８】
さらに、レシリン等の昆虫の構造タンパク質の配列と結合された、天然の絹タンパク質の反復単位に基づく合成タンパク質も好適である(Elvin et al., 2005, Nature 437: 999-1002)。絹タンパク質及びレシリンから形成されたこれらの結合タンパク質の中で、R16及びS16タンパク質は、特に言及されるべきである。これらのタンパク質は配列番号４及び配列番号６で示されるポリペプチド配列を有する（WO2008/155304を参照）。
【００５９】
配列番号2、4、及び6で示されるポリペプチド配列に加え、特にこれら配列の機能的等価物、機能的誘導体、及び塩もまた好適である。
【００６０】
本明細書における「機能的等価物」は特に、前記アミノ酸配列の少なくとも一つの配列位置に、具体的に述べたもの以外のアミノ酸を一つ有するにもかかわらず、充填効果(packing effect)物質としての特性を有する変異体を意味する。したがって「機能的等価物」は、一以上のアミノ酸の付加、置換、欠失及び／又は反転によって得られる変異体を含み、かかる変更はそれにより本発明に従う特性プロフィール（property profile）を有する変異体が生じる限りいかなる配列位置でも起こり得る。機能的等価は、特に変異体と非修飾ポリペプチドとの間で反応パターンに質的一致がある場合にも存在する。
【００６１】
前記意味において、「機能的等価物」は前記ポリペプチドの「前駆物質」並びに、前記ポリペプチドの「機能的誘導体」及び「塩」も含む。
【００６２】
「前駆物質」は望ましい生物活性を有するか、又は有していないポリペプチドの天然又は合成の前駆物質である。
【００６３】
好適なアミノ酸置換の例は、以下の表から明らかである。
【表１】
2013544754.tif 000002
【００６４】
用語「塩」はカルボキシル基の塩だけでなく、本発明のタンパク質分子のアミノ基の酸付加塩もまた意味すると理解されたい。カルボキシル基の塩は通常の方法で得ることができ、無機塩、例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄及び亜鉛塩、並びに有機塩基、例えばトリエタノールアミン等のアミン、アルギニン、リジン、ピペリジン等の塩もまた含む。酸付加塩、例えば塩酸又は硫酸等の無機酸の塩、並びに例えば酢酸及びシュウ酸等の有機酸の塩もまた、本発明の範囲の一部を構成する。
【００６５】
本発明のポリペプチドの「機能的誘導体」もまた、機能的アミノ酸側鎖において、又はそれらのN−若しくはC−末端において、既知の技術により調製可能である。かかる誘導体は例えば、カルボン酸基の脂肪族エステル、アンモニア又は一級若しくは二級アミンとの反応により得られ得るカルボン酸基のアミド、アシル基との反応により調製される遊離アミノ基のN−アシル誘導体、又はアシル基との反応により調製される遊離ヒドロキシル基のO−アシル誘導体を含む。
【００６６】
本発明に従う「機能的等価物」には、本明細書で具体的に開示されるタンパク質／ポリペプチドの相同体もまた含まれる。これらは少なくとも、具体的に開示されたアミノ酸配列の一つに対して、少なくとも60%、例えば70%、80%又は85%、例えば90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有する。
【００６７】
二つの配列の「同一性」は、特に各場合の全長配列における残基の同一性、特に以下のパラメーターを設定したVector NTI Suite 7.1（Vector NTI Advance 10.3.0, In-vitrogen Corp.）（又はClustal法を用いたInformax (USA)のソフトウェア (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr;5(2):151-1)を用いた比較によって計算された同一性を意味する。
【表２】
2013544754.tif 000003
【００６８】
ii）分散剤
好適な水性分散系は、特にポリマー又はオリゴマー分散剤を用いて製造される。
【００６９】
（１）ポリマー分散剤は、より具体的にはグロブリン、特にアルブミン、より具体的にはウシ血清アルブミン（BSA）及びその無脂肪調製物（ffBSA）から選択され、かつ、それらは商業的に利用可能である。
【００７０】
アルブミンは約66000Daのモル質量を有し、584〜590のアミノ酸で構成される。そのシステインの割合が高いために、アルブミンは比較的高い硫黄含量を有する。アルブミンは水に可溶性であり、その水に対する結合能は約18ml/gである。その等電点はpH4.6である。アルブミンは両性電解質であり、すなわちアニオン及びカチオンの両方に可逆的に結合し得る。
【００７１】
（２）オリゴマー分散剤は、より具体的には前記天然及び合成絹タンパク質、並びにより具体的にはR16及びS16タンパク質の両親媒性ペプチド断片であり；並びに前記グロブリン、より具体的にはアルブミン、特にBSA又はffBSAの両親媒性ペプチド断片でもある。
【００７２】
この種の断片はもとのタンパク質の制御された分裂によって得られ得る。制御された分裂のために、例えば、好適な量のタンパク質を試験管に秤量し、0.2M NaOH溶液と混合し得る。試験管をしっかりと密封し、混合物を内部温度が約80℃になるまで水浴で加熱する。このようにして得た混合物を勢いよく攪拌する。しばらくした後、タンパク質はNaOH溶液に溶解し始める。タンパク質が溶解したらすぐに、サンプルを水浴から取り上げ、冷却し、分析する。この方法で得られ得るタンパク質加水分解物は、約500〜5000、例えば1000〜3000又は600〜4000の分子量を有するペプチド断片の混合物で構成され、これはマススペクトロメトリー（例えばMaldi-ToF）によって簡単に検証し得る。
【００７３】
（3）オリゴマー分散剤は、より具体的には、WO2010/057654に従って得られ得る、エーテル構造単位を含み、かつ（特に、少なくとも一つの疎水性側鎖を有する）少なくとも一つの疎水性エーテルオリゴマーブロック、及び（特に、少なくとも一つの親水性側鎖を有する）少なくとも一つの親水性エーテルオリゴマーブロックを含むブロックコオリゴマーである。より具体的には、前記ブロックはそれぞれ、均一な構成を有し、すなわち、本質的に同一のモノマー構造単位で構成される。
【００７４】
ブロックコオリゴマーの特定の群は、以下の一般式（A）で表され得る。
【化１】
2013544754.tif 000004
【００７５】
ここで、n及びmは同じであるか又は異なっており、それぞれ1〜20の整数値、より具体的には3〜10、例えば4、5、6、7、8、又は9であり、
ブロック（式中、blockで示す）1及び2は異なっており、ブロック1及び2のうち一つは親水性側鎖を有し、他方は疎水性側鎖を有し、
R1はH又は直鎖若しくは分岐C1-C6アルキル、アリール、又は直鎖若しくは分岐C1-C6アルキルアリールであり、ここでアリールは任意に置換され、かつより具体的には直鎖若しくは分岐C1-C4アルキル又は直鎖若しくは分岐C1-C4アルキルフェニルであり；
側鎖ラジカルR2及びR3は異なっており、疎水性ラジカル、より具体的には直鎖若しくは分岐C1-C6アルキル、アリール、又は直鎖若しくは分岐C1-C6アルキルアリールから選択され；又はH及び親水性ラジカル、例えば(CH2)p-COOH、-(CH2)p--COO-X+から選択され、ここでX+はH+又は金属カチオン、例えばアルカリ金属カチオン、より具体的にはNa+若しくはK+であり、かつpは1、2、又は3等の整数であり；
かつ、ブロック1及び2において、側鎖ラジカルR2及びR3はそれぞれ同じであるか、又はブロック1及び／又は2において側鎖ラジカルR2及び／又はR3はそれぞれ異なってよく、親水性又は疎水性ブロック中に少なくとも二つの異なる親水性又は疎水性サブブロックをそれぞれ形成し、ここで各サブブロックは少なくとも2〜5の同一の側鎖ラジカルを有し；並びに
R4はH又はC1-C6アルキル、より具体的にはHである。
【００７６】
C1-C6アルキルの例として、メチル、エチル、プロピル、1−メチルエチル、ブチル、1−メチルプロピル、2−メチルプロピル、1,1−ジメチルエチル、ペンチル、1−メチルブチル、2−メチルブチル、3-メチルブチル、2,2−ジメチルプロピル、1−エチルプロピル、ヘキシル、1,1−ジメチルプロピル、1,2−ジメチルプロピル、1−メチルペンチル、2−メチルペンチル、3-メチルペンチル、4−メチルペンチル、1,1−ジメチルブチル、1,2−ジメチルブチル、1,3−ジメチルブチル、2,2−ジメチルブチル、2,3−ジメチルブチル、3,3−ジメチルブチル、1−エチルブチル、2−エチルブチル、1,1,2−トリメチルプロピル、1,2,2−トリメチルプロピル、1−エチル−1−メチルプロピル及び1−エチル−2−メチルプロピルが挙げられる。
【００７７】
アリールは、より具体的にはナフチル又はフェニルである。
【００７８】
C1-C6アルキルアリールは、より具体的には、前記C1-C6アルキルラジカル、より具体的には非分岐C1-C6アルキルラジカルの、アリール（特にフェニル）置換アナログである。
【００７９】
アリール置換基はより具体的には前記定義に従うC1-C4アルキルラジカルである。
【００８０】
かかるオリゴマーの好適な例として、以下の化学式（１）〜（５）の化合物を挙げることができる。
【化２】
2013544754.tif 000005
【化３】
2013544754.tif 000006
【化４】
2013544754.tif 000007
【化５】
2013544754.tif 000008
【化６】
2013544754.tif 000009
【００８１】
iii）粘度増加剤
本発明に従う安定化された水性タンパク質分散系をエレクトロスピニングにおいてよりよく加工するには、この分散系に粘度増加剤を混合することが有利であり得る。
【００８２】
原理的には、水性媒体中の安定化されたタンパク質溶液／分散系は、前記目的に有用であると当業者に知られるあらゆる水溶性ポリマーと混合され得る。好適なポリマーは、より具体的には：ポリビニルアルコール、ポリビニルホルムアミド、ポリビニルアミン、ポリカルボン酸（ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸）、ポリアクリルアミド、ポリイタコン酸、ポリ（2−ヒドロキシエチルアクリレート）、ポリ（N−イソプロピルアクリルアミド）、ポリメタクリルアミド、ポリアルキレンオキシド、例えばポリエチレンオキシド；ポリ−N−ビニルピロリドン；ヒドロキシメチルセルロース；ヒドロキシエチルセルロース；ヒドロキシプロピルセルロース；カルボキシメチルセルロース；アルギン酸塩；コラーゲン；ゼラチン、ポリエチレンイミン、ポリスチレンスルホン酸；前記ポリマーの2以上の組み合わせ；前記ポリマーを構成するモノマー単位を一以上含むコポリマー、前記ポリマーを構成するモノマー単位を一以上含むグラフトコポリマーである。
【００８３】
本発明の特定の一実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリビニルホルムアミド、ポリビニルアミン、及びポリ−N−ビニルピロリドンから選択される。
【００８４】
本発明で用いられるポリマーのモル質量は、広い範囲、例えば500〜2000000又は1000〜1000000又は10000〜500000の間で変更され得る。
【００８５】
前記水溶性ポリマーは商業的に利用可能であり、及び／又は当業者に知られる方法によって得られ得る。
【００８６】
本発明のさらなる実施形態では、本発明のプロセスにおいて用いられるタンパク質溶液又は分散系は、前記定義に従う少なくとも一つの水溶性ポリマーを、溶液／分散系の全固形分を基準として、重量で0.01%〜40%、例えば重量で0.5%〜20%又は重量で2%〜15%含む。
【００８７】
溶液又は分散系に存在する水溶性ポリマーに対するタンパク質の重量比は、用いられるポリマーに依存する。例えば、タンパク質及び用いられる水溶性ポリマーは、約300:1〜約1:5、例えば約100:1〜約1:2、又は約20:1〜約1:1の重量比で用いられ得る。
【００８８】
iv）キャリア形成性ポリマー
好適な合成ポリマーとして、例えば、芳香族ビニル化合物のホモ及びコポリマー、アクリル酸アルキルのホモ及びコポリマー、メタクリル酸アルキルのホモ及びコポリマー、αオレフィンのホモ及びコポリマー、脂肪族ジエンのホモ及びコポリマー、ハロゲン化ビニルのホモ及びコポリマー、酢酸ビニルのホモ及びコポリマー、アクリロニトリルのホモ及びコポリマー、ウレタンのホモ及びコポリマー、ビニルアミドのホモ及びコポリマー、並びに前記ポリマーを構成するモノマー単位の二以上で構成されるコポリマーが挙げられる。
【００８９】
有用なキャリアポリマーとして、より具体的には以下のモノマーに基づくポリマーが挙げられる：
アクリルアミド、アジピン酸、メタクリル酸アリル、αメチルスチレン、ブタジエン、ブタンジオール、ジメタクリル酸ブタンジオール、ブタンジオールジビニルエーテル、ジメタクリル酸ブタンジオール、モノアクリル酸ブタンジオール、モノメタクリル酸ブタンジオール、ブタンジオールモノビニルエーテル、アクリル酸ブチル、メタクリル酸ブチル、シクロヘキシルビニルエーテル、ジエチレングリコールジビニルエーテル、ジエチレングリコールモノビニルエーテル、アクリル酸エチル、アクリル酸エチルジグリコール、エチレン、エチレングリコールブチルビニルエーテル、ジメタクリル酸エチレングリコール、エチレングリコールジビニルエーテル、アクリル酸エチルヘキシル、メタクリル酸エチルヘキシル、メタクリル酸エチル、エチルビニルエーテル、メタクリル酸グリシジル、ヘキサンジオールジビニルエーテル、ヘキサンジオールモノビニルエーテル、イソブテン、アクリル酸イソブチル、メタクリル酸イソブチル、イソプレン、イソプロピルアクリルアミド、アクリル酸メチル、メチレンビスアクリルアミド、メタクリル酸メチル、メチルビニルエーテル、n−ブチルビニルエーテル、N−メチル―N−ビニルアセタミド、N−ビニルカプロラクタム、N−ビニルイミダゾール、N−ビニルピペリドン、N−ビニルピロリドン、オクタデシルビニルエーテル、アクリル酸フェノキシエチル、ポリテトラヒドロフラン2ジビニルエーテル、プロピレン、スチレン、テレフタル酸、tert−ブチルアクリルアミド、アクリル酸tert−ブチル、メタクリル酸tert−ブチル、テトラエチレングリコールジビニルエーテル、アクリル酸トリエチレングリコールジメチル、トリエチレングリコールジビニルエーテル、トリエチレングリコールジビニルメチルエーテル、トリメタクリル酸トリメチロールプロパン、トリメチロールプロパントリビニルエーテル、ビニル2−エチルヘキシルエーテル、4−tert−ブチル安息香酸ビニル、酢酸ビニル、塩化ビニル、ビニルドデシルエーテル、塩化ビニリデン、ビニルイソブチルエーテル、ビニルイソプロピルエーテル、ビニルプロピルエーテル及びビニルtert−ブチルエーテル。
【００９０】
用語「合成ポリマー」はホモポリマー及びコポリマーの両方を含む。コポリマーとして、ランダムなものだけでなく、交互系、ブロックコポリマー、又はグラフトコポリマーもまた利用可能である。用語「コポリマー」は、二以上の異なるモノマーで構成されるポリマーを含み、ここで、少なくとも一つのモノマーのポリマー鎖中への組み込みは、例えばステレオブロックコポリマーの場合と同じように、様々な方法で実施され得る。
【００９１】
ホモ及びコポリマーの混合物を用いることもまた可能である。ホモ及びコポリマーは互いに混和性であってもなくても良い。
【００９２】
以下のポリマーが好適なものとして挙げられる：
ポリビニルエーテル、例えばポリベンジルオキシエチレン、ポリビニルアセタール、ポリビニルエステル、例えばポリ酢酸ビニル、ポリオキシテトラメチレン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリシロキサン、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、例えばポリN−イソプロピルアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリヒドロキシブチレート、ポリビニルアルコール、アセチル化ポリビニルアルコール、ポリビニルホルムアミド、ポリビニルアミン、ポリカルボン酸（ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸）、ポリアクリルアミド、ポリイタコン酸、ポリアクリル酸2−ヒドロキシエチル、ポリN−イソプロピルアクリルアミド、ポリスルホン酸（ポリ2−アクリルアミド−2−メチル−1−プロパンスルホン酸又はPAMPS）、ポリメタクリルアミド、ポリアルキレンオキシド、例えばポリエチレンオキシド；ポリ−N−ビニルピロリドン；マレイン酸、ポリエチレンイミン、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリレート、例えばポリアクリル酸フェノキシエチル、ポリアクリル酸メチル、ポリアクリル酸エチル、ポリアクリル酸ドデシル、ポリアクリル酸イソボルニル、ポリアクリル酸n-ブチル、ポリアクリル酸t-ブチル、ポリアクリル酸シクロヘキシル、ポリアクリル酸2−エチルヘキシル、ポリアクリル酸ヒドロキシプロピル、ポリメタクリレート、例えばポリメタクリル酸メチル、ポリメタクリル酸n-アミル、ポリメタクリル酸n−ブチル、ポリメタクリル酸エチル、ポリメタクリル酸ヒドロキシプロピル、ポリメタクリル酸シクロヘキシル、ポリメタクリル酸2−エチルヘキシル、ポリメタクリル酸ラウリル、ポリメタクリル酸t−ブチル、ポリメタクリル酸ベンジル、ポリメタクリル酸イソボルニル、ポリメタクリル酸グリシジル及びポリメタクリル酸ステアリル、ポリスチレン及びスチレンに基づくコポリマー、例えばマレイン酸無水物とのコポリマー、スチレン−ブタンジエンコポリマー、メタクリル酸メチル−スチレンコポリマー、N−ビニルピロリドンコポリマー、ポリカプロラクトン、ポリカプロラクタム、ポリN−ビニルカプロラクタム。
【００９３】
ポリN−ビニルピロリドン、ポリメタクリル酸メチル、アクリレート−スチレンコポリマー、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリアミド、及びポリエステルは、特に好適である。
【００９４】
さらに、合成の生分解性ポリマーを用いることが可能である。
【００９５】
「生分解性ポリマー」との記載は、DIN V 54900によって与えられる生分解性の定義を満たす全てのポリマー、より具体的にはコンポスタブルなポリエステルを含み得る。
【００９６】
生分解性の一般的な意味は、ポリマー、例えばポリエステルが適切かつ検証可能な間隔で分解するということである。分解は加水分解的に及び／又は酸化的に、かつ、微生物、例えば細菌、酵母、真菌、及び藻類の作用によって主になされ得る。生分解性は、例えばポリエステルをコンポストと混合してしばらく保管することによって定量化され得る。ASTM D 5338、ASTM D 6400、及びDIN V 54900に従って、CO2を含まない空気が、堆肥化中の成熟コンポスト、及び既定の温度プログラムに供した成熟コンポストに流される。ここで生分解性は、（サンプルの炭素含量から計算される）サンプルによって放出され得る最大のCO2量に対する、（サンプルを含まないコンポストによって放出されるCO2を差し引いた後の）サンプルによって放出される正味のCO2の比によって、生分解の百分率値として定義される。生分解性ポリエステルは典型的に、堆肥化のほんの数日後に、分解の明確な兆候、例えば真菌（カビ）の増殖、クラッキング（ひび割れ）、及びホーリング（穴の生成）を示す。生分解性ポリマーの例として、生分解性ポリエステル、例えばポリラクチド、ポリカプロラクトン、ポリアルキレンアジペートテレフタレート、ポリヒドロキシアルカノエート（ポリヒドロキシブチレート）及びポリラクチドグリコシドが挙げられる。特に好適なものとして、生分解性ポリアルキレンアジペートテレフタレート、好適にはポリブチレンアジペートテレフタレートが挙げられる。好適なポリアルキレンアジペートテレフタレートは例えばDE 4440858に記載されている（そして商業的に利用可能である。例えばBASFのEcoflex（登録商標））。
【００９７】
v）活性剤
本発明に従って製造された安定化されたタンパク質分散系は、活性若しくは有益剤を含む繊維、又は該繊維を含むシート体、例えばフィルム若しくは繊維不織ウェブを製造するのにもまた用いられ得る。
【００９８】
活性又は有益剤を含む該製剤の生産は、本発明の譲受人に譲渡されたWO2010/015419により具体的に記載されており、WO2010/015419を参照により本明細書に明白に組み込む。
【００９９】
潜在的に好適な種類の活性又は有益剤の詳細なリスト及びその代表例の限定するものではないリストもまた、WO2010/015419に記載されている。
【０１００】
疎水性物質と同様に親水性物質も原理的に製剤化され得る。製剤化可能な物質種の例として：タンパク質、ペプチド、核酸、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、プロテオグリカン、脂質、有機ポリマー、低分子量の合成又は天然の有機物若しくは無機物又は化学元素、例えば銀が挙げられる。
【０１０１】
該製剤は、より具体的には化粧品、ヒト医薬及び動物医薬だけでなく、作物保護の分野においても有用である。
【０１０２】
製剤化可能な物質種の、限定するものではない具体的な例として、以下のものが挙げられる：
化粧品又は医薬の分野において用いられる色素、脂肪酸、カロテノイド、レチノイド、ビタミン、プロビタミン、抗酸化剤、リポ酸、UV光遮蔽フィルター、過酸化物分解剤；並びにこれらの誘導体及び前駆物質；
治療又は診断目的のための医薬活性成分、例えば抗刺激物質、抗炎症剤、血管作動剤、感染阻害剤、麻酔剤、成長促進剤；並びにこれらの誘導体及び前駆物質；
創傷治癒促進剤；及び創傷の治癒に正の効果を有する活性剤；
抗微生物剤、抗細菌剤、又は抗ウイルス活性剤；
抗体、酵素、ペプチド、核酸、成長因子；
作物保護活性剤、例えば除草性、殺虫性及び／又は殺菌性効果を有する活性剤。
【０１０３】
本発明は、以下の限定するものではない詳細な実施形態を参照して、より具体的に記載される：
【実施例】
【０１０４】
実験：
一般的な方法：
１．エレクトロスピニング:
タンパク質溶液を、ノズルに基づくエレクトロスピニング系（Gimpel Ingenieur-Gesellschaft mbH www.gimpel.de）を用いて紡糸した。用いた高圧電源はEltexのジェネレーター、タイプはKNH34/N2A、0-30 kV、DC negであった。タンパク質溶液を、電源の極につないだカニューレから低圧で電場中に押し出した。電場の結果として生じるタンパク質溶液の静電荷のために、物質の流れは対極の方向へ動き、対極へ向かう途中で凝固し、細い繊維の形で沈着物になった。
【０１０５】
以下のパラメーター設定を用いた：
相対湿度：27％、
紡糸温度：23℃、
電圧：20kV、
電極間距離：15−20cm、
カニューレ直径：0.8又は0.9mm、
ポンプ速度：0.2〜0.5ml/h。
【０１０６】
記載した具体的な実施形態は、さらに回転に基づくエレクトロスピニング系に適用され得る。
【０１０７】
２．クロマトグラフィーマススペクトロメトリー
ペプチドのMALDI-ToFによる測定
マトリックス:α−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸（CCA）、シナピン酸（SA）
前記二つのマトリックスを、TAに溶解した飽和溶液（20mg/ml）として用いた。
【０１０８】
TA溶液の組成
【表３】
2013544754.tif 000010
【０１０９】
調製法には、「カバー法」だけでなく、「混合法」もまた使用した。「混合法」では、バッファーに溶解したサンプルを1:10の比でマトリックスと混合し、標的に規定量を加えた。「混合法」における希釈倍率は10倍であり、一方で「カバー法」では希釈は1:1で行われた。
【０１１０】
サンプルの高い塩含量は、固相抽出を用いて減少させた。C18コーティングを有するApplied Biosystemsのジップチップ（Zip-Tip）ピペットチップを用いた。ジップチップを、0.1%のトリフルオロ酢酸を含む純粋なアセトリトリル及び0.1%のTFAを含む1:1アセトニトリル／水で洗浄した。これに続いて0.1%TFAを含む水で二回平衡化した。サンプルを10μlの0.1%TFA溶液に溶解し、ジップチップで繰り返し吸ったり吐いたりピペッティングして、ペプチドを樹脂に結合させた。その後、チップを三回0.1%のTFA及び5%のメタノールを含む水溶液で洗浄した。サンプル成分を、1.8μlの（マトリックスを0.1%TFA、50%アセトニトリルに溶解した）マトリックス溶液でジップチップから溶出させ、直接MALDI-ToF-MS標的にピペットで採取した。
【０１１１】
３．細胞増殖試験
インビトロ試験は繊維芽細胞（HDFn, Invitrogen, No. C0045C）を用いて行った。
【０１１２】
試験を以下のステップで行った：
−６ウェルプレートの培地（10%FCS及び1%ペニシリン／ストレプトマイシンを含むDMEM低グルコース）中に、ウェルごとに15000個の細胞を播種、
−4時間後（細胞はこの時間、全て増殖した）、培地を、様々な濃度のタンパク質断片を加えた培地（調製については以下を参照されたい）1ml／ウェルに変更、
−インキュベーターにおいて37℃、5%CO2で24時間インキュベーションした後、アラマーブルー（Invitrogen order No. DAL1100；培地1mlにつき100μl；希釈比1:10に相当）を添加しさらに2時間インキュベーターでインキュベーション、
−ウェルごとに2×100μl（2回測定するため）の上清をF底の96ウェルプレートに移し、オプティマ蛍光リーダー（optima fluorescence reader）における544nmでの測定、
−様々な測定時間における測定、及びエクセルプログラムによる評価の繰り返し。
【０１１３】
増殖試験のためのタンパク質断片の調製：
300mgのR16タンパク質（又は他のタンパク質）を試験管に秤量し、9mlの0.2M NaOH溶液と混合する。試験管をしっかりと密封する。試験管内の混合物は内部温度が約80℃になるまで加熱する。ここで水浴の温度は少なくとも85℃であるべきである。混合物を勢いよく攪拌する。しばらくした後、タンパク質は溶解し、透明な溶液を形成する（色が変わる）。タンパク質が溶解したらすぐに、サンプルを水浴から取り上げ、冷却する。その後、サンプルは別のどんな熱処理にも付すべきではない。なぜなら、結果として断片がさらに分裂し得、ある状況では完全な分裂が起こり得るからである。
【０１１４】
冷却後、サンプルを蒸留水（5L）に対して透析する。透析を、分子量1000Daのカットオフを有する再生セルロースの透析膜（Carl-Roth, order number: 1967.1）により行う。透析の間、水を三回交換する。
【０１１５】
その後、サンプルをプラスチックペトリ皿に移し（前もって重量を決定する）、37℃で完全に乾燥させる。重量の決定後、サンプルを細胞試験に用い得る。
【０１１６】
参照例１：R16及びS16クモ絹タンパク質の生産
紡糸可能なR16及びS16溶液は、それぞれR16及びS16タンパク質ミクロビーズを用いて生産した。これらはWO 2008/155304に記載されるように調製され得る。
【０１１７】
参照例２：合成両親媒性オリゴマー分散剤の調製
（１）オリゴマーP（フェニルグリシジルエーテル）−ブロック−P（カルボキシメチルグリシジルエーテル）−（3,3）の調製
以下の化学式１：
【化７】
2013544754.tif 000011
【０１１８】
で表される、P（フェニルグリシジルエーテル）−ブロック−P（カルボキシメチルグリシジルエーテル）−（3,3）と名付けられた両親媒性オリゴマーは、その構造中に、三つの無極性フェニルエーテル基と、溶液のpHの変化に伴って荷電し得る三つの極性カルボキシル基を有する。
【０１１９】
合成は全て、慣習的なシュレンク技術（Schlenk technique）を用いて、酸素／空気の非存在下で行った。
【０１２０】
a）    エトキシエチルグリシジルエーテル（EEGE）モノマーの合成
【化８】
2013544754.tif 000012
【０１２１】
最初に、80g（1.08モル）のグリシドール及び400mLのエチルビニルエーテルと2gのパラ−トルエンスルホン酸（p-TsOH）を、温度が室温以上に上昇しないように氷浴中で混合した。次にバッチを3時間攪拌した。反応時間の終了後、溶液を三回重炭酸ナトリウムで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥物を濾過し、溶媒を真空中で除去した。残渣（約250mLのEEGE）を（油浴の温度を70℃より高くしないで）真空蒸留し、水素化カルシウム上で保管した。その後残渣を濃縮した。
【０１２２】
b）    最初のオリゴマー中間体の合成
【化９】
2013544754.tif 000013
【０１２３】
20.13ml（0.148モル）の3−フェニルプロパン−1−オール（イニシエーター）を、14.8ml（0.148モル）の10Mカリウムtert−ブトキシドを含む50mlのジグリム（diglyme）に溶解した。溶液を、tert−ブタノールを除くために、30分真空中で40℃に加熱した。その後、100ml（0.739モル）のあらかじめ精製した（CaH2により濃縮し、乾燥した）PGEをイニシエーター溶液に加え、120℃で一晩攪拌した。翌日、98ml（0.739モル）のEEGEを溶液に加え、混合物を攪拌しながら3時間120℃で加熱した。ジグリムを真空中で除去し、黄金色(golden brown)のハチミツ様の液体を得た。
【０１２４】
c）オリゴマー中間体の脱保護
【化１０】
2013544754.tif 000014
【０１２５】
黄金色のハチミツ様の液体をTHFに溶解し、93mlの濃縮HCl（37%）と混合し、1時間攪拌した。その後、溶液をNaHCO3で中和した。形成されたわずかに茶色がかった沈殿物を、濾過で除去した。一晩の間に、さらに沈殿物が生じた。沈殿物を、全ての固形物が溶液から除去されるまで、遠心分離により除去した。その後、THFを真空中で除去し、116.28g（0.11モル）の茶色がかった澄んだ油を得た。
【０１２６】
d）    オリゴマー中間体のアセチル化
【化１１】
2013544754.tif 000015
【０１２７】
茶色がかった油をDMFに溶解し、16.2ｇ（0.45モル）の（ペンタンで洗浄した）NaHと一晩攪拌した。そのプロセスで、溶液は暗褐色に変化する。その後、78.8g（0.45モル）のクロロ酢酸ナトリウム（NaTa）を加え、バッチを60℃で一晩攪拌した。DMFを真空中で除去し、残渣を蒸留水に溶解した。産物の淡褐色の沈殿を半濃縮HClにより沈ませ、分離し、その後NaOHに再溶解して、理論の52%の収率に相当する127g（0.127モル）の式１のP（フェニルグリシジルエーテル）−ブロック−P（カルボキシメチルグリシジルエーテル）−（3,3）を得た。
【０１２８】
NaOH溶液への溶解は、酸性官能基の代わりに、ナトリウム塩を与える。
【０１２９】
産物はナトリウム塩として溶液中で数ヶ月間安定である。溶液を使用の前に37℃で乾燥し、固形物として保管することもできる。
【０１３０】
（２）さらなるオリゴマーの調製
イニシエーター、モノマー成分のモル分率並びに／又は脱保護及びアセチル化の程度を変更して前記合成方法を繰り返すことで、例えば、以下の式2〜5で表される、さらなる両親媒性オリゴマーを調製し得る。
【化１２】
2013544754.tif 000016
【化１３】
2013544754.tif 000017
【化１４】
2013544754.tif 000018
【化１５】
2013544754.tif 000019
【０１３１】
実施例１：R16クモ絹タンパク質溶液のBSAによる安定化及び安定化産物の紡糸
１．１  安定化溶液の調製
無脂肪BSA（ffBSA）（Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe）及びR16タンパク質を秤量し、スナップトップバイアルに移し、チオシアン酸グアニジン溶液（6M）を用いて溶解する。140mgのR16タンパク質と140mgのffBSAの混合物は2mlの6Mチオシアン酸グアニジンに溶解され得る。様々なバッチにおいて用いられるR16及びffBSAの量を表1に示す。
【０１３２】
溶液を室温（約20〜25℃）で一晩（少なくとも12時間）攪拌する。次に生じたffBSA／R16溶液を10mM NaHCO3バッファー（pH約10.5）に対して透析する。透析は約12400の分子量カットオフを有する透析チューブ（Sigma-Aldrich, cat. No. D9777-100FT、セルロース膜）で行う。NaHCO3バッファーの容量は、少なくともサンプル容量の100倍である。透析の間、GdmSCNを可能な限り定量的に除去するために、バッファーを少なくとも1回交換する。
【０１３３】
透析中の各溶液の安定時間を決定し、以下の表2に記載した。「安定」は透析の間、特定の溶液でいかなるゲル化も観察されないことを意味する。
【０１３４】
１．２．  安定化溶液の紡糸
安定化溶液の紡糸可能性を試験するために、0.5mlのサンプルを様々な量のPEOポリマー（ポリオチレンエキシド、Mw＝900000；Sigma-Aldrich, cat. No. 189456-250g）と共に紡糸する。様々な量の（水に溶解した）PEOを加え、混合し、前記条件下で実験的エレクトロスピニング系で紡糸する。
【０１３５】
例えば、以下の溶液を紡糸する：
【表４】
2013544754.tif 000020
【０１３６】
1.3  結果
【表５】
2013544754.tif 000021
【０１３７】
最良の結果は、ffBSA／R16の1:1混合物により達成され得ると判断された。
【０１３８】
実施例２：R16クモ絹タンパク質の、R16タンパク質のペプチド断片を用いた安定化及び安定化産物の紡糸
２．１  R16タンパク質の調製：
R16タンパク質を秤量し、スナップトップバイアルに移し、チオシアン酸グアニジン溶液（6M）を用いて溶解する。
【０１３９】
２．２  R16ペプチド断片の調製
45mgのR16タンパク質を試験管に秤量し、2mlの0.2M NaOH溶液を加える。試験管をしっかりと密封し、混合物を内部温度が約80℃になるまで水浴で加熱する（水浴の温度は少なくとも85℃であるべきである）。生じる混合物を勢いよく攪拌する（約1000rpm）。しばらく（約10分）した後、タンパク質はNaOH溶液に溶解し始める。タンパク質が溶解したらすぐに、サンプルを水浴から取り上げ、冷却する。その後、サンプルはもはや、高熱処理に付すべきではない。なぜなら、結果として断片がさらに分裂し得、完全な分裂が起こり得るからである。非分裂R16タンパク質は溶液中で明瞭に可視的である。断片は易水溶性なので、分裂の間、溶解し始める。タンパク質をもはや見れなくなったらすぐに、完全な加水分解を避けるために分裂を終了させる。
【０１４０】
この方法で調製されるR16タンパク質加水分解物は、添付の図1で図示されるように約1000〜3000の分子量を有するペプチド断片の混合物で構成される。図1は典型的に生産されるR16タンパク質加水分解物のマススペクトラム（Maldi-ToF）を示す。
【０１４１】
２．３．  透析浴の調製
冷却後、加水分解物をシリンジにより透析浴（NaHCO3バッファー）（10mm、1.5 l）に移す。透析浴のpHは約10〜11に合わさなければならない（NaOH、固形物質）。様々なバッチのそれぞれで用いられるR16ペプチドの量を、以下の表3に記載する。
【０１４２】
２．４  透析の実施
次に、様々なR16タンパク質含量（表3参照）を有する（2.1にしたがって調製された）R16サンプルを、R16加水分解物を含むNaHCO3透析バッファー（pH約10.5）に対して透析する。このために、サンプルを透析チューブ（Sigma-Aldrich, cat. No. D9777-100FT、セルロース膜；分子量カットオフ限界は約12400）に移す。NaHCO3バッファーの容量は少なくともサンプル容量の100倍（例えば、1.5リットル）であるべきである。
【０１４３】
透析中の各溶液の安定時間を決定し、以下の表3に記載する。「安定」は、特定の溶液でいかなるゲル化も観察されないことを意味する。
【表６】
2013544754.tif 000022
【０１４４】
２．５  安定化溶液の紡糸
R16断片安定化溶液の紡糸可能性を試験するために、0.5mlのサンプルを様々な量のPEOポリマー（ポリオチレンエキシド、Mw＝900000；Sigma-Aldrich, cat. No. 189456-250g）と共に紡糸する。様々な量の（水に溶解した）PEOを加え、混合し、前記条件下で実験的エレクトロスピニング系で紡糸する。
【０１４５】
例えば、以下の溶液を紡糸する：
【表７】
2013544754.tif 000023
【０１４６】
実施例３：R16クモ絹タンパク質の、BSAペプチド断片を用いた安定化及び安定化産物の紡糸
３．１  R16タンパク質の調製：
R16タンパク質を秤量し、スナップトップバイアルに移し、チオシアン酸グアニジン溶液（6M）を用いて溶解した。
【０１４７】
３．２  BSAペプチド断片の調製
45mgのBSAタンパク質を試験管に秤量し、2mlの0.2M NaOH溶液を加える。試験管をしっかりと密封する。試験管内の混合物を室温で溶解させ、その後内部温度が約80℃になるまで加熱する。水浴の温度は少なくとも85℃であるべきである。混合物は勢いよく攪拌しなければならない（約1000rpm）。1分後、タンパク質はNaOH溶液中で分裂し始め、黄色がかった溶液を形成する。タンパク質が分裂したらすぐに、サンプルを水浴から取り上げ、冷却する。その後、サンプルはもはや、高熱処理に付すべきではない。なぜなら、結果として断片がさらに分裂し得、完全な分裂が起こり得るからである。
【０１４８】
この方法で調製されるBSAタンパク質加水分解物は、添付の図2で図示されるように約600〜4000の分子量を有するペプチド断片の混合物で構成される。図2は典型的な生産されたBSAタンパク質加水分解物のマススペクトラムを示す。
【０１４９】
３．３．透析浴の調製
冷却後、サンプルをシリンジにより透析浴（NaHCO3バッファー）（10mm、1.5 l）に移す。透析浴のpHは（NaOHによって）約10〜11に合わさなければならない。BSAペプチドの濃度は約0.003〜0.004%である。
【０１５０】
３．４  透析の実施
次に、様々なBSAタンパク質含量を有し、様々な量のBSA加水分解物を含む（表5参照）、（２．１に従って調製した）R16サンプルを透析する。透析を分子量カットオフ限界約12400を有する透析チューブ（Sigma-Aldrich、前記参照）で行う。NaHCO3バッファーの容量は少なくともサンプル容量の100倍（例えば、1.5 lの透析浴中に2mlのタンパク質溶液）であるべきである。
【０１５１】
透析中の各溶液の安定時間を決定し、表5に記載する。安定は、試験した溶液でいかなるゲル化も観察されないことを意味する。
【表８】
2013544754.tif 000024
【０１５２】
３．５  安定化溶液の紡糸
BSA断片安定化溶液の紡糸可能性を試験するために、2mlのサンプルを様々な量のPEOポリマー（ポリオチレンエキシド、Mw＝900000；Sigma-Aldrich, cat. No. 189456-250g）と紡糸する。様々な量のPEO（PEOは固体として添加する、表6を参照のこと）を加え、混合し、前記条件下で実験的エレクトロスピニング系で紡糸する。
【０１５３】
例えば、以下の溶液を紡糸する。
【表９】
2013544754.tif 000025
【０１５４】
実施例４：R16クモ絹タンパク質の、合成両親媒性オリゴマーを用いた安定化及び安定化産物の紡糸
用いる安定化剤は、参照例2（1）に従って調製したP（フェニルグリシジルエーテル）−ブロック−P（カルボキシメチルグリシジルエーテル）−（3,3）である。
【０１５５】
ナトリウム塩の形で溶液中で数か月間安定である、あらかじめNaOH溶液に溶解したオリゴマーは、溶液として又は（37℃で乾燥させた）固体として用いられ得る。
【０１５６】
４．１  R16タンパク質の調製：
R16を安定化するために、物質を特に固体として用いる。R16タンパク質を、6Mチオシアン酸グアニジン溶液に溶解する。オリゴマー固体を秤量し、R16溶液に直接溶解する。溶液を一晩ゆっくり攪拌する。この時間中に、オリゴマーはタンパク質に付加する。様々なバッチにおける適切な量的データを以下の表7に要約する。
【０１５７】
４．２  透析の実施：
翌日、チオシアン酸グアニジンを除去するために透析を行う。透析される溶液の容量は3mlである（磁気スターラーバーを含み、透析中攪拌される）。透析溶液の容量は1.5 l（10mM NaHCO3バッファー、NaOHでpH＝12に調整）である。透析を一晩（12時間）かけて行う。
【０１５８】
透析中の各溶液の安定時間を決定し、以下の表7に記載する。「安定」は、試験した溶液でいかなるゲル化も観察されないことを意味する。
【表１０】
2013544754.tif 000026
【０１５９】
４．３  安定化溶液の紡糸
オリゴマー安定化溶液の紡糸可能性を試験するために、0.5mlのサンプルをPEOポリマー（ポリエチレンオキシド、Mw＝900000；Sigma-Aldrich, cat. No. 189456-250g）と紡糸する。（固体として添加される）PEOを加え、混合し、前記条件下で実験的エレクトロスピニング系で紡糸する。
【０１６０】
例えば、以下の溶液を紡糸する：
【表１１】
2013544754.tif 000027
【０１６１】
実施例５：本発明の繊維シート体の創傷治癒促進剤の特性の評価
本発明に従って生産された繊維（実施例2に従って調製される；R16ペプチドによって安定化されたR16）の創傷治癒促進効果を、前記細胞増殖試験によって決定する。
【０１６２】
実験結果を添付の図7に要約する。細胞数が8日間にわたって増加することが観察される。R16タンパク質断片の添加はさらなる細胞数の増加をもたらす（最適濃度は0.06mg/ml）。
【０１６３】
本明細書で記載した刊行物、特にWO2010/057654の開示内容を、参照により明白に本明細書に組み込む。
【図１】
2013544754.tif 000028
【図２】
2013544754.tif 000029
【図３】
2013544754.tif 000030
【図４】
2013544754.tif 000031
【図５】
2013544754.tif 000032
【図６】
2013544754.tif 000033
【図７】
2013544754.tif 000034
【配列表】
2013544754000001.app
【国際調査報告】
2013544754.tif 000035
2013544754.tif 000036
2013544754.tif 000037
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