(57)【要約】本発明は、標的の存在を示すシグナルを生成および増幅するために、核酸から構成される酵素および/またはタンパク質酵素を使用するための組成物および方法に関する。より具体的には、本発明は、部分的また完全な酵素基質としての機能を果たす核酸構造を含む組成物、および標的の検出を容易にするためにこれらの構造を使用するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第1の酵素増幅因子基質(Enzyme Amplifier Substrate)オリゴヌクレオチド(EAS1)および第2の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS2)を含む組成物であって、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1およびEAS2が、第1のドライバー断片オリゴヌクレオチド(DF)と組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識および切断配列を含む第1の完全酵素シグナル増幅因子(CESA)複合体を形成し、かつ第1のDFの一部がEAS1の一部と相補的である、組成物。
【請求項２】
EAS1、EAS2、および第1のヌクレアーゼを含む組成物であって、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1およびEAS2が、第1のDFと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成し、第1のDFの一部がEAS1の一部と相補的である、組成物。
【請求項３】
多成分核酸酵素(MNAザイム(MNAzyme))、MNAザイム基質、EAS1、EAS2、および第1のヌクレアーゼを含む組成物であって：
MNAザイムが、MNAザイム組織化助長因子(assembly facilitator)の存在下で自己組織化してMNAザイムを形成する少なくとも第1のパートザイム(partzyme)および第2のパートザイムを含み、少なくとも第1および第2のパートザイムのそれぞれが基質アーム部分、触媒コア部分、およびセンサーアーム部分を含み、かつ第1および第2のパートザイムをそれらそれぞれの触媒コア部分が会合するように近接して維持して、MNAザイムの触媒コアを形成するように、センサーアームがMNAザイム組織化助長因子と相互作用し、かつ触媒コアがMNAザイム基質を修飾して第1のDFを形成することができ；
かつ、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部が第1のDFの一部と相補的であり、かつ第1のDFがEAS1およびEAS2と組織化して、少なくとも第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESA複合体を形成することができる、
組成物。
【請求項４】
MNAザイム基質が、第1の鎖および第2の鎖を含むオリゴヌクレオチド複合体の第1の鎖であり、第1の鎖が内部ループ部分を含み、かつ内部ループ部分内の塩基が第2の鎖の塩基とハイブリダイズせず、かつMNAザイムが内部ループ部分を切断することができる、請求項3記載の組成物。
【請求項５】
第2の鎖が第1のDFを含む、請求項4記載の組成物。
【請求項６】
第1の鎖と第2の鎖とがヘアピンループ部分によって一方の末端で連結されている、請求項4または請求項5記載の組成物。
【請求項７】
MNAザイム基質がヘアピンオリゴヌクレオチドのヘアピンループ部分であり、かつMNAザイムがヘアピンループ部分を切断することができ、かつ第1のドライバー断片がヘアピンオリゴヌクレオチド内の二本鎖基部の一方の鎖中に位置する、請求項3記載の組成物。
【請求項８】
組織化助長因子が、同定される標的である、請求項3〜7のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９】
第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド(Synthetic Initiator Oligonucleotide, SIO)、EAS1、EAS2、第1のヌクレアーゼ、および第2のヌクレアーゼを含む組成物であって：
SIOが標的とハイブリダイズして二重鎖基質を形成することができ、第1のヌクレアーゼが二重鎖基質を切断して第1のDFを生成することができ；かつ
EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部が第1のDFの一部と相補的であり、かつEAS1およびEAS2が、第1のDFと組織化した場合にのみ、第2のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成する、
組成物。
【請求項１０】
第1のヌクレアーゼが、SIOが標的とハイブリダイズした場合にのみ、SIOを切断して第1のDFを生成することができる、請求項9記載の組成物。
【請求項１１】
第1ヌクレアーゼが、標的がSIOとハイブリダイズした場合にのみ、標的を切断して第1のDFを生成することができる、請求項9記載の組成物。
【請求項１２】
第1のヌクレアーゼが制限酵素ではない、請求項11記載の組成物。
【請求項１３】
第1のヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼである、請求項9〜12のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１４】
第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼが同じヌクレアーゼである、請求項9〜13のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１５】
第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼが異なるヌクレアーゼである、請求項9〜13のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１６】
第1のヌクレアーゼが、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、請求項1〜8のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１７】
第2のヌクレアーゼが、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、請求項9〜15のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１８】
前記ニックが、ヌクレアーゼ認識部位内に、ヌクレアーゼ切断部位に、またはヌクレアーゼ認識部位と切断部位の間に位置する、請求項16または請求項17記載の組成物。
【請求項１９】
前記ヌクレアーゼが、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspR Iからなる群より選択される、請求項16〜18のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２０】
第1のDFのEAS1への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識配列を完成する、請求項1〜19のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２１】
第1のDFのEAS1への結合が、部分的ヌクレアーゼ切断配列を完成する、請求項1〜19のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２２】
第1のDFが前記配列に少なくとも1つの塩基を寄与する、請求項20または請求項21記載の組成物。
【請求項２３】
第1のDFが前記配列に少なくとも2つの塩基を寄与する、請求項20〜22のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２４】
第1のDFが前記配列に少なくとも3つの塩基を寄与する、請求項20〜23のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２５】
前記塩基が、EAS1とEAS2との結合によって形成される部分的ヌクレアーゼ認識部位のすぐ3'側にある、請求項22〜24のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２６】
前記塩基が、EAS1とEAS2との結合によって形成される部分的ヌクレアーゼ認識部位のすぐ5'側にある、請求項22〜24のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２７】
第1のDFがヌクレアーゼ認識配列またはヌクレアーゼ切断配列に塩基を寄与しない、請求項1〜19のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２８】
EAS1およびEAS2が、EAS1およびEAS2の相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、ならびにEAS1の一方の末端とEAS2の一方の末端を連結するヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である、請求項1〜27のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２９】
前記ヘアピンループ部分がオリゴヌクレオチドリンカーまたは非オリゴヌクレオチドリンカーである、請求項28記載の組成物。
【請求項３０】
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドが、EAS1またはEAS2のいずれかから伸長した一本鎖5'または3'オーバーハング部分を含む、請求項28または請求項29記載の組成物。
【請求項３１】
EAS1またはEAS2の一部が第2のDFを含み、かつ第2のDFが、ヌクレアーゼによる第1のCESA複合体の修飾時に放出され得る、請求項1〜30のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３２】
ヘアピンループ部分の一部が第2のDFを含み、かつ第2のDFが、ヌクレアーゼによる第1のCESA複合体の修飾時に放出され得る、請求項28〜30のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３３】
第1のDFと第2のDFが同一ではない、請求項31または請求項32記載の組成物。
【請求項３４】
第1のDFと第2のDFが同一である、請求項31または請求項32記載の組成物。
【請求項３５】
第2のDFが第1のDFの断片であるか、または第1のDFが第2のDFの断片である、請求項31または請求項32記載の組成物。
【請求項３６】
第2のDF、EAS1、およびEAS2が組織化して、第1のCESA複合体を形成することができる、請求項34または請求項35記載の組成物。
【請求項３７】
第3の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS3)および第4の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS4)をさらに含み、EAS3の一部がEAS4の一部と相補的であり、かつEAS3の一部が第2のDFの一部と相補的であり、EAS3およびEAS4が、第2のDFと組織化した場合にのみ、付加的なヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第2のCESA複合体を形成する、請求項31〜33のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３８】
EAS3またはEAS4が第3のDFを含む、請求項37記載の組成物。
【請求項３９】
第3のDFが第1のDFと同一である、請求項38記載の組成物。
【請求項４０】
第3のDFが第1のDFと同一ではない、請求項38記載の組成物。
【請求項４１】
付加的なヌクレアーゼが組成物中の別のヌクレアーゼと同一である、請求項37〜40のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４２】
付加的なヌクレアーゼが組成物中の別のヌクレアーゼと同一ではなく、かつ組成物が該付加的なヌクレアーゼを含む、請求項37〜40のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４３】
付加的なヌクレアーゼが、第2のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、請求項37〜42のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４４】
前記ヌクレアーゼが、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspR Iからなる群より選択される、請求項37〜43のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４５】
第2のDFのEAS3への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識配列および/またはヌクレアーゼ切断配列を完成する、請求項37〜44のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４６】
第2のDFが、ヌクレアーゼ認識配列またはヌクレアーゼ切断配列に塩基を寄与しない、請求項37〜44のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４７】
EAS3およびEAS4が、EAS3およびEAS4の相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、ならびにEAS3の一方の末端とEAS4の一方の末端とを連結するヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である、請求項37〜46のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４８】
前記ヘアピンループ部分がオリゴヌクレオチドリンカーまたは非オリゴヌクレオチドリンカーである、請求項47記載の組成物。
【請求項４９】
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドが、EAS3またはEAS4のいずれかから伸長した一本鎖5'または3'オーバーハング部分を含む、請求項47または請求項48記載の組成物。
【請求項５０】
骨格オリゴヌクレオチド、EAS1、EAS2、EAS3、およびEAS4を含む第1の複合体を含む組成物であって、該骨格オリゴヌクレオチドが：
(i) EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、EAS2の一部は第1のDFの一部と相補的であり、かつEAS1またはEAS2の一部は第2のDFを含み、かつEAS1およびEAS2は、第1のDFと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成する、EAS1を含む第1の部分；
(ii) EAS3の一部はEAS4の一部と相補的であり、EAS3の一部は第2のDFの一部と相補的であり、かつEAS3またはEAS4の一部は第1のDFを含み、かつEAS3およびEAS4は、第2のDFと組織化した場合にのみ、第2のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第2のCESA複合体を形成する、EAS3を含む第2の部分；ならびに
(iii) 第1の部分と第2の部分を接続する第3の部分
を含む、組成物。
【請求項５１】
骨格オリゴヌクレオチド、第5の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS5)、第6の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS6)、第7の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS7)、および第8の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS8)を含む第2の複合体をさらに含み、該骨格オリゴヌクレオチドが：
(i) EAS5の一部はEAS6の一部と相補的であり、EAS5の一部は第2のDFの一部と相補的であり、かつEAS5またはEAS6の一部は第1のDFを含み、かつEAS5およびEAS6は、第2のDFと組織化した場合にのみ、第3のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第3のCESA複合体を形成する、EAS5を含む第1の部分；ならびに
(ii) EAS7の一部はEAS8の一部と相補的であり、EAS8の一部は第1のDFの一部と相補的であり、かつEAS7またはEAS8の一部は第2のDFを含み、かつEAS7およびEAS8は、第1のDFと組織化した場合にのみ、第4のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第4のCESA複合体を形成する、EAS7を含む第2の部分；ならびに
(iii) 第1の部分と第2の部分を接続する第3の部分であって、第1の複合体の骨格の第3の部分と相補的である、第3の部分
を含む、請求項50記載の組成物。
【請求項５２】
EAS1がEAS7と同一であり、EAS2がEAS8と同一であり、EAS3がEAS5と同一であり、かつ/またはEAS4がEAS6と同一である、請求項51記載の組成物。
【請求項５３】
第1のヌクレアーゼが第3のヌクレアーゼと同一であり、かつ/または第2のヌクレアーゼが第4のヌクレアーゼと同一であり、かつ/または第1、第2、第3、および第4のヌクレアーゼが同一である、請求項51または請求項52記載の組成物。
【請求項５４】
第1の複合体と第2の複合体が、それらそれぞれの相補的な第3の部分を介してハイブリダイズして、第1の二重複合体を形成する、請求項51〜53のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５５】
第1の二重複合体が第2の二重複合体に連結している、請求項54記載の組成物。
【請求項５６】
第1の二重複合体のEAS1〜EAS8のうちのいずれか1つまたは複数と第2の二重複合体のEAS1〜EAS8のうちのいずれか1つまたは複数の連結により、第1の二重複合体が第2の二重複合体に連結している、請求項55記載の組成物。
【請求項５７】
第1の二重複合体のEAS2および/またはEAS8と第2の二重複合体のEAS2および/またはEAS8の連結により、第1の二重複合体が第2の二重複合体に連結している、請求項55または請求項56記載の組成物。
【請求項５８】
連結が、化学的ハイブリダイゼーション、抗体、オリゴヌクレオチドリンカー、非オリゴヌクレオチドリンカー、共有結合、およびペプチドリンカーのうちのいずれか1つまたは複数を用いて達成される、請求項56または請求項57記載の組成物。
【請求項５９】
連結が、酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドのうちのいずれか1つまたは複数のビオチン化、およびアビジンを用いた複数のビオチン化酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドの複合体化により達成される、請求項56または請求項57記載の組成物。
【請求項６０】
第1および/または第2のヌクレアーゼが、第2のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、請求項50〜59のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６１】
第1および/または第2のヌクレアーゼが、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspR Iからなる群より選択される、請求項50〜60のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６２】
第1のDFのEAS2もしくはEAS8への結合、および/または第2のDFのEAS3もしくはEAS5への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識配列および/または部分的ヌクレアーゼ切断配列を完成する、請求項51〜61のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６３】
第1のDFのEAS2もしくはEAS8への結合、および/または第2のDFのEAS3もしくはEAS5への結合が、ヌクレアーゼ認識配列またはヌクレアーゼ切断配列に塩基を寄与しない、請求項51〜61のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６４】
EAS1およびEAS2；EAS3およびEAS4；EAS5およびEAS6；ならびにEAS7およびEAS8より選択される一対の酵素増幅因子基質が、該対の各メンバーの相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、および基部の一方の末端に連結しているヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である、請求項51〜63のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６５】
前記ヘアピンループ部分がオリゴヌクレオチドリンカーまたは非オリゴヌクレオチドリンカーである、請求項64記載の組成物。
【請求項６６】
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドが一本鎖5'または3'オーバーハング部分を含む、請求項64または請求項65記載の組成物。
【請求項６７】
以下のものを含むSIOを含む組成物：
(i) 標的鎖と相補的な第1の部分および該標的鎖と相補的でない第2の部分であって、第1の部分と第2の部分はホスホロチオエートによって分離されており、かつ第2の部分は第1のDFを含む、第1の部分および第2の部分；ならびに
(ii) EAS1およびEAS2であって、
EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、EAS1とEAS2のハイブリダイゼーションは、両末端に3'オーバーハングを有する二重鎖構造を提供し、
EAS1の一部は第1のDFの一部と相補的であり、かつ
EAS1およびEAS2は、第1のDFと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼによって消化され得る陥凹3'末端を含む第1のCESA複合体を形成することができる、EAS1およびEAS2。
【請求項６８】
SIOが、2つの相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、一本鎖ヘアピンループ、および3'オーバーハングを含むヘアピンオリゴヌクレオチドである、請求項67記載の組成物。
【請求項６９】
ヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼである、請求項67または請求項68記載の組成物。
【請求項７０】
エキソヌクレアーゼが、一本鎖オリゴヌクレオチド、5個もしくはそれ以上の塩基の3'オーバーハングを含む二本鎖オリゴヌクレオチド、またはホスホロチオエートヌクレオチド間連結を消化することができない、請求項69記載の組成物。
【請求項７１】
任意の第1のDFが、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼを用いて生成される、請求項1〜70のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７２】
エキソヌクレアーゼが、ヌクレアーゼBAL-31、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼIII、T7エキソヌクレアーゼ、T7エキソヌクレアーゼI、およびエキソヌクレアーゼTからなるより選択される、請求項71記載の組成物。
【請求項７３】
エキソヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼIIIである、請求項71または請求項72記載の組成物。
【請求項７４】
エンドヌクレアーゼが、T7エンドヌクレアーゼI、RNase H、フラップヌクレアーゼ、またはマングビーン(Mung Bean)ヌクレアーゼである、請求項71記載の組成物。
【請求項７５】
任意のEASが1つまたは複数の検出可能な標識を含む、請求項1〜74のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７６】
任意のEASがフルオロフォア部分および/またはクエンチャー部分を含む、請求項1〜75のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７７】
任意のパートザイム、組織化助長因子、MNAザイム基質、DF、EAS1、EAS2、EAS3、EAS4、EAS5、EAS6、EAS7、EAS8、またはSIOが、ホスホロチオエート、4-アセチルシチジン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウリジン、2'-O-メチルシチジン、5-カルボキシメチルアミノメチルチオウリジン、ジヒドロウリジン、2'-O-メチルプソイドウリジン、β D-ガラクトシルケオシン、2'-O-メチルグアノシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデノシン、1-メチルアデノシン、1-メチルプソイドウリジン、1-メチルグアノシン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアノシン、2-メチルアデノシン、2-メチルグアノシン、3-メチルシチジン、5-メチルシチジン、N6-メチルアデノシン、7-メチルグアノシン、5-メチルアミノメチルウリジン、5-メトキシアミノメチル-2-チオウリジン、β D-マンノシルメチルウリジン、5-メトキシカルボニルメチルウリジン、5-メトキシウリジン、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデノシン、N-((9-β-リボフラノシル-2-メチルチオプリン-6-イル)カルバモイル)スレオニン、N-((9-β-リボフラノシルプリン-6-イル)N-メチル-カルバモイル)スレオニン、ウリジン-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウリジン-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、プソイドウリジン、ケオシン、2-チオシチジン、5-メチル-2-チオウリジン、2-チオウリジン、4-チオウリジン、5-メチルウリジン、N-((9-β-D-リボフラノシルプリン-6-イル)カルバモイル)スレオニン、2'-O-メチル-5-メチルウリジン、2'-O-メチルウリジン、ワイブトシン、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン、β D-アラビノシルウリジン、およびβ D-アラビノシルチミジンからなる群より選択される、少なくとも1つのヌクレオチド置換または付加を含む、請求項1〜76のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７８】
MNAザイムパートザイム、MNAザイム基質、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも1つが、アプタマーまたはその一部をさらに含む、請求項3〜8のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７９】
アプタマーまたはその一部が、核酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、それらの誘導体、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも1つを含む、請求項78記載の組成物。
【請求項８０】
任意のMNAザイムパートザイム、MNAザイム基質、EAS1、EAS2、EAS3、EAS4、EAS5、EAS6、EAS7、EAS8、SIO、DF、またはヌクレアーゼが、固体支持体に付着している、請求項1〜79のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８１】
第1のDFが標的の存在下でのみ産生される、請求項1、2、または50のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８２】
第1のDFが標的とは異なる、請求項3、9、または50のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８３】
組成物が標的を検出するためのものであり、かつ第1のDFが該標的とは異なる、請求項1または請求項2記載の組成物。
【請求項８４】
任意のEASが、別のEASとハイブリダイズして、複数のDFとハイブリダイズし得る部分的酵素シグナル増幅因子(PESA)複合体を形成することができる、請求項1〜83のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８５】
標的分子の異なる部分に特異的な第1および第2のMNAザイムを含む、請求項3〜8のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８６】
標的分子の異なる部分に特異的なMNAザイムが、該標的の存在下で組織化した場合に、同じ基質を認識し切断する、請求項85記載の組成物。
【請求項８７】
異なる標的に対して特異性を有する少なくとも2つの異なるMNAザイムを含む、請求項3〜8のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８８】
異なる標的に対して相補性を有する少なくとも2つの異なるSIOを含む、請求項9または請求項67記載の組成物。
【請求項８９】
異なる第1のDFと組織化される少なくとも2つの異なる第1のCESA複合体を含む、請求項1〜3、9、50、または67のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９０】
以下の段階を含む、標的を検出するための方法：
(a) 2つまたはそれ以上のパートザイムおよび少なくとも1つの多成分核酸(MNAザイム)基質を提供する段階であって、該パートザイムは標的の存在下で自己組織化して、少なくとも1つのMNAザイムを形成する、段階；
(b) MNAザイムの自己組織化および触媒活性を可能にする条件下で、標的を含むと推定される試料にパートザイムを接触させる段階であって、MNAザイムの触媒活性により、前記少なくとも1つのMNAザイム基質から第1のドライバー断片オリゴヌクレオチド(DF)が産生される、段階；
(c) 第1の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS1)および第2の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS2)を提供する段階であって、EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部は第1のDFの一部と相補的である、段階；
(d) 以下を可能にする条件下で、EAS1およびEAS2を第1のDFに接触させる段階：
(1) 第1の完全酵素シグナル増幅因子(CESA)複合体を形成するための、第1のDFとEAS1およびEAS2との組織化、ならびに
(2) 第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位の形成；
(e) 第1のヌクレアーゼを提供する段階；ならびに
(f) ヌクレアーゼと認識部位との相互作用および切断部位での切断を可能にする条件下で、第1のヌクレアーゼを第1のCESA複合体と接触させる段階であって、第1のヌクレアーゼによる切断は、標的の存在を示す検出可能な影響をもたらす、段階。
【請求項９１】
第1のヌクレアーゼが、第1のヌクレアーゼの認識部位および/または切断部位を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、請求項90記載の方法。
【請求項９２】
第1のDFが、MNAザイム基質の切断によって産生される、請求項90または請求項91記載の方法。
【請求項９３】
第1のDFが、2つまたはそれ以上のMNAザイム基質の核酸連結によって産生される、請求項90または請求項91記載の方法。
【請求項９４】
MNAザイム基質が、第1の鎖および第2の鎖を含むオリゴヌクレオチド複合体の第1の鎖であり、第1の鎖が内部ループ部分を含み、かつ内部ループ部分内の塩基が第2の鎖の塩基とハイブリダイズせず、かつMNAザイムが内部ループ部分を切断することができる、請求項90〜92のいずれか一項記載の方法。
【請求項９５】
第2の鎖が第1のDFを含む、請求項94記載の方法。
【請求項９６】
第1の鎖と第2の鎖がヘアピンループ部分によって一方の末端で連結されている、請求項94または請求項95記載の方法。
【請求項９７】
MNAザイム基質がヘアピンオリゴヌクレオチドのヘアピンループ部分であり、前記MNAザイムがヘアピンループ部分を切断することができ、かつ第1のドライバー断片が該ヘアピンオリゴヌクレオチド内の二本鎖基部の一方の鎖中に位置する、請求項90〜92のいずれか一項記載の方法。
【請求項９８】
以下の段階を含む、標的を検出する方法：
(a) 少なくとも第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド(SIO)を提供する段階；
(b) SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、ひいては第1のヌクレアーゼの二重鎖基質を作出する条件下で、標的を含むと推定される試料とSIOを接触させる段階；
(c) SIOと標的のハイブリダイゼーションによって形成された二重鎖基質を切断し得る第1のヌクレアーゼを提供する段階であって、第1のヌクレアーゼによる二重鎖基質の切断により第1のDFが生成される、段階；
(d) EAS1およびEAS2を提供する段階であって、EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部は第1のDFの一部と相補的である、段階；
(e) 以下を可能にする条件下で、EAS1およびEAS2を第1のDFと接触させる段階：
(1) 第1のCESAを形成するための、第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化、ならびに
(2) 第2のヌクレアーゼの認識部位および切断部位の形成；
(f) 第2のヌクレアーゼを提供する段階；ならびに
(g) 第2のヌクレアーゼと認識部位との相互作用および切断部位での切断を可能にする条件下で、第2のヌクレアーゼを第1のCESAと接触させる段階であって、第2のヌクレアーゼによる切断は、標的の存在を示す検出可能な影響をもたらす、段階。
【請求項９９】
第1のヌクレアーゼが、SIOが標的とハイブリダイズした場合にのみ、SIOを切断して第1のDFを生成する、請求項98記載の方法。
【請求項１００】
第1のヌクレアーゼが、標的がSIOとハイブリダイズした場合にのみ、標的を切断して第1のDFを生成する、請求項98記載の方法。
【請求項１０１】
第1のヌクレアーゼが制限酵素ではない、請求項100記載の方法。
【請求項１０２】
第1のヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼである、請求項98〜101のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０３】
第1のCESA複合体の切断によりさらなるDFの放出が可能になり、かつさらなるDFがさらなる酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドと組織化してさらなるCESA複合体を形成し、かつ少なくとも1つのヌクレアーゼを用いてさらなるCESA複合体が切断されて、さらなる検出可能な影響がもたらされ、かつさらなるDFが放出され、それによって検出可能な影響のさらなる増加が促進される、請求項90〜102のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０４】
以下の段階を含む、カスケードを用いて標的を検出する方法であって：
(a) 第1のDFを産生する段階であって、第1のDFは標的の存在下でのみ産生される、段階；
(b) 以下のものを提供する段階：
(i) EAS1およびEAS2であって、
EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、
EAS1の一部は第1のDFの一部と相補的であり、かつ
EAS1またはEAS2の一部は第2のDFを含む、EAS1およびEAS2、
ならびに、
(ii) 第3の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS3)および第4の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS4)であって、
EAS3の一部はEAS4の一部と相補的であり、
EAS3の一部は第2のDFの一部と相補的である、EAS3およびEAS4；
(c) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化を可能にして、第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESA複合体を形成させる条件下における、EAS1およびEAS2と(a)の第1のDF；
(ii) 第1のヌクレアーゼと第1のCESA複合体の認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第1のヌクレアーゼによる切断部位での切断により第2のDFが放出される、第1のCESA複合体と第1のヌクレアーゼ；
(d) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第2のDFとEAS3およびEAS4の組織化を可能にして、第2のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第2のCESA複合体を形成させる条件下における、EAS3およびEAS4と第2のDF；
(ii) 第2のヌクレアーゼと第2のCESA複合体の認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第2のヌクレアーゼは該切断部位で第2のCESA複合体を切断する、第2のCESA複合体と第2のヌクレアーゼ；
ここで、第1のCESA複合体および/または第2のCESA複合体の切断は、検出可能な影響をもたらす、方法。
【請求項１０５】
第1のCESA複合体および第2のCESA複合体の切断がそれぞれ、検出可能な影響をもたらす、請求項104記載の方法。
【請求項１０６】
第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼが同じヌクレアーゼである、請求項104および請求項105記載の方法。
【請求項１０７】
第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼが異なるヌクレアーゼである、請求項104および請求項105記載の方法。
【請求項１０８】
EAS3またはEAS4の一部が付加的なDFを含み、かつ第2のヌクレアーゼによる第2のCESA複合体の切断部位での切断により、該付加的なDFが放出される、請求項104〜107のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０９】
前記付加的なDFの一部が第5の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS5)の第1の部分と相補的であり、EAS5の第2の部分が第6の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS6)の一部と相補的であり、かつEAS5およびEAS6が該付加的なDFと組織化して第3のCESA複合体を形成する、請求項108記載の方法。
【請求項１１０】
(i) 付加的なDFの一部が第1のDFと同一であるか；
(ii) 付加的なDFが第1のDFと同一であるか；または
(iii) 付加的なDFが第1のDFの断片であり；
該付加的なDFがEAS1およびEAS2と組織化して、第1のCESA複合体を形成することができる、請求項108記載の方法。
【請求項１１１】
以下の段階を含む、カスケードを用いて複数の異なる標的を検出する方法であって：
(a) 少なくとも第1のDFおよび第2のDFを産生する段階であって、第1のDFは第1の標的の存在下でのみ産生され、第2のDFは第2の標的の存在下でのみ産生される、段階；
(b) 以下のものを提供する段階：
(i) EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、
EAS1の一部は第1のDFの一部と相補的である、EAS1およびEAS2、ならびに
(ii) EAS3の一部はEAS4の一部と相補的であり、
EAS3の一部は第2のDFの一部と相補的である、EAS3およびEAS4；
(c) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化を可能にして、第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESA複合体を形成させる条件下における、EAS1およびEAS2と(a)の第1のDF；
(ii) 第1のヌクレアーゼと第1のCESA複合体の認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第1のヌクレアーゼは該切断部位で第1のCESA複合体を切断して、第1の検出可能な影響をもたらす、第1のCESA複合体と第1のヌクレアーゼ；
(d) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第2のDFとEAS3およびEAS4の組織化を可能にして、第2のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第2のCESA複合体を形成させる条件下における、EAS3およびEAS4と第2のDF；
(ii) 第2のヌクレアーゼと第2のCESA複合体の認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第2のヌクレアーゼは該切断部位で第2のCESA複合体を切断して、第2の検出可能な影響をもたらす、第2のCESA複合体と第2のヌクレアーゼ；
ここで、第1の検出可能な影響は第2の検出可能な影響とは異なる。
【請求項１１２】
第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼが同じヌクレアーゼである、請求項111記載の方法。
【請求項１１３】
第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼが異なるヌクレアーゼである、請求項111および請求項112記載の方法。
【請求項１１４】
(i) EAS1またはEAS2の一部が付加的なDFを含み、かつ第1のヌクレアーゼによる第1のCESA複合体の切断部位での切断により、該付加的なDFが放出される；かつ
(ii) 該付加的なDFが少なくとも2つの付加的なEASオリゴヌクレオチドと組織化して付加的なCESA複合体を形成し、ヌクレアーゼによる該付加的なCESA複合体の切断により、第1の検出可能な影響が増加する、
請求項111〜113のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１５】
(i) EAS3またはEAS4の一部が付加的なDFを含み、かつ第2のヌクレアーゼによる第2のCESA複合体の切断部位での切断により、該付加的なDFが放出される；かつ
(ii) 該付加的なDFが少なくとも2つの付加的なEASオリゴヌクレオチドと組織化して付加的なCESA複合体を形成し、ヌクレアーゼによる該付加的なCESA複合体の切断により、第2の検出可能な影響が増加する、
請求項111〜114のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１６】
以下の段階を含む、カスケードを用いて標的を検出する方法であって：
(a) 第1のドライバー断片を産生する段階であって、第1のドライバー断片は該標的の存在下でのみ提供される、段階；
(b) 以下のものを提供する段階：
(i) EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、
EAS1の一部は第1のDFの一部と相補的であり、
EAS1またはEAS2の一部は第2のDFを含み、かつ
EAS1またはEAS2は支持体に連接されている、EAS1およびEAS2、
(ii) EAS3の一部はEAS4の一部と相補的であり、
EAS3の一部は第2のDFの一部と相補的であり、
EAS3またはEAS4の一部は第3のDFを含み、かつ
EAS3またはEAS4は支持体に連接されている、EAS3およびEAS4；
(c) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化を可能にして、第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESAを形成させる条件下における、EAS1およびEAS2と(a)の第1のDF；
(ii) 第1のヌクレアーゼと第1のCESAの認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第1のものによる該切断部位での切断により第2のDFが放出される、第1のCESAと第1のヌクレアーゼ；
(d) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第2のDFとEAS3およびEAS4の組織化を可能にして、第2のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第2のCESAを形成させる条件下における、EAS3およびEAS4と第2のDF；
(ii) 第2のヌクレアーゼと第2のCESAの認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第2のヌクレアーゼによる該切断部位での切断により、EAS1およびEAS2と組織化して第1のCESAを形成し得る第3のDFが放出される、第2のCESAと第2のヌクレアーゼ；
ここで、第1のCESA複合体および/または第2のCESA複合体の切断は、検出可能な影響をもたらす、方法。
【請求項１１７】
(a)の第1のDFが、
SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、イニシエーターヌクレアーゼ(initiator nuclease)による修飾に適した二重鎖構造を形成させる条件下で、標的を含むと推定される試料とSIOを接触させること、および
二重鎖構造を前記イニシエーターヌクレアーゼと接触させること
によって産生され、
前記イニシエーターヌクレアーゼによる二重鎖構造中の対形成または非対形成領域の修飾により、第1のDFが放出される、
請求項104〜116のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１８】
(a)の第2のDFが、
SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、イニシエーターヌクレアーゼによる修飾に適した二重鎖構造を形成させる条件下で、標的を含むと推定される試料とSIOを接触させること、および
二重鎖構造を前記イニシエーターヌクレアーゼと接触させること
によって産生され、
前記イニシエーターヌクレアーゼによる二重鎖構造中の対形成または非対形成領域の修飾により、第2のDFが放出される、
請求項111〜115のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１９】
前記イニシエーターヌクレアーゼが、SIOが標的とハイブリダイズした場合にのみ、SIOを切断して前記DFを生成する、請求項117または請求項118記載の方法。
【請求項１２０】
前記イニシエーターヌクレアーゼが、標的がSIOとハイブリダイズした場合にのみ、標的を切断して前記DFを生成する、請求項117または請求項118記載の方法。
【請求項１２１】
前記イニシエーターヌクレアーゼが制限酵素ではない、請求項120記載の方法。
【請求項１２２】
前記イニシエーターヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼである、請求項117〜121のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２３】
SIOが支持体に付着している、請求項117〜122のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２４】
(a)の第1のDFが、2つまたはそれ以上のパートザイムおよび少なくとも1つのMNAザイム基質を提供すること、および標的を含むと推定される試料とパートザイムを、該標的の存在下でMNAザイムの自己組織化および触媒活性を可能にする条件下で接触させることによって産生され、該触媒活性により該基質が修飾され、それによって第1のDFが提供される、請求項104〜116のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２５】
(a)の第2のDFが、2つまたはそれ以上のパートザイムおよび少なくとも1つのMNAザイム基質を提供すること、および標的を含むと推定される試料とパートザイムを、該標的の存在下でMNAザイムの自己組織化および触媒活性を可能にする条件下で接触させることによって産生され、該触媒活性により該基質が修飾され、それによって第2のDFが提供される、請求項111〜115のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２６】
MNAザイム基質が、第1の鎖および第2の鎖を含むオリゴヌクレオチド複合体の第1の鎖であり、第1の鎖が内部ループ部分を含み、かつ内部ループ部分内の塩基が第2の鎖の塩基とハイブリダイズせず、かつMNAザイムが内部ループ部分を切断することができる、請求項124または請求項125記載の方法。
【請求項１２７】
第2の鎖が前記DFを含む、請求項126記載の方法。
【請求項１２８】
第1の鎖と第2の鎖がヘアピンループ部分によって一方の末端で連結されている、請求項126または請求項127記載の方法。
【請求項１２９】
前記ヘアピンループ部分がオリゴヌクレオチドリンカーまたは非オリゴヌクレオチドリンカーである、請求項128記載の方法。
【請求項１３０】
前記MNAザイム基質がヘアピンオリゴヌクレオチドのヘアピンループ部分であり、MNAザイムがヘアピンループ部分を切断することができ、かつ前記ドライバー断片がヘアピンオリゴヌクレオチド内の二本鎖基部の一方の鎖中に位置する、請求項124または請求項125記載の方法。
【請求項１３１】
EAS3およびEAS4が、EAS3およびEAS4の相補的部分の間で形成される二本鎖部分、ならびにEAS3の一方の末端とEAS4の一方の末端とを連結するヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチド複合体の成分である、請求項104〜130のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３２】
EAS1およびEAS2が、EAS1およびEAS2の相補的部分の間で形成される二本鎖部分、ならびにEAS1の一方の末端とEAS2の一方の末端とを連結するヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチド複合体の成分である、請求項90〜130のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３３】
前記ヘアピンループ部分がオリゴヌクレオチドリンカーまたは非オリゴヌクレオチドリンカーである、請求項131または請求項132記載の方法。
【請求項１３４】
前記ヘアピンオリゴヌクレオチド複合体が、1つのEASオリゴヌクレオチドから伸長した5'または3'オーバーハング一本鎖部分をさらに含む、請求項131〜133のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３５】
前記ヘアピンループ部分が、検出可能な部分および/またはクエンチャー部分を含む、請求項131〜134のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３６】
EAS3および/またはEAS4が検出可能な部分および/またはクエンチャー部分を含み、かつ該検出可能な部分とクエンチャー部分とが、第2のヌクレアーゼによる第2のCESAの切断時に分離して、検出可能な影響を提供する、請求項104〜130のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３７】
EAS3が検出可能な部分およびクエンチャー部分を含み、EAS4がさらなるクエンチャー部分を含み、かつ該検出可能な部分とさらなるクエンチャー部分とが、第2のヌクレアーゼによる第2のCESAの切断時に分離して、検出可能な影響を提供する、請求項136記載の方法。
【請求項１３８】
EAS1および/またはEAS2が検出可能な部分および/またはクエンチャー部分を含み、かつ該検出可能な部分とクエンチャー部分とが、第1のヌクレアーゼによる第1のCESAの切断時に分離して、検出可能な影響を提供する、請求項90〜130のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３９】
EAS1が検出可能な部分およびクエンチャー部分を含み、EAS2がさらなるクエンチャー部分を含み、かつ該検出可能な部分とさらなるクエンチャー部分とが、第1のヌクレアーゼによる第1のCESAの切断時に分離して、検出可能な影響を提供する、請求項138記載の方法。
【請求項１４０】
検出可能な部分がフルオロフォアである、請求項135〜139のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４１】
第1のヌクレアーゼが、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、請求項90〜97のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４２】
第2のヌクレアーゼが、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、請求項98〜103のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４３】
第1のヌクレアーゼが、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができ、かつ/または第2のヌクレアーゼが、第2のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、請求項104〜137のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４４】
前記ニックが、ヌクレアーゼ認識部位内に、ヌクレアーゼ切断部位に、またはヌクレアーゼ認識部位と切断部位の間に位置する、請求項141〜143のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４５】
前記ヌクレアーゼが、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspR Iからなる群より選択される、請求項141〜144のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４６】
第1のDFのEAS1への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識部位および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位を完成する、請求項90〜145のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４７】
第2のDFのEAS2への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識部位および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位を完成する、請求項104〜137のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４８】
前記DFが、部分的ヌクレアーゼ認識配列および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位に少なくとも1つの塩基を寄与する、請求項146または請求項147記載の方法。
【請求項１４９】
前記DFが、部分的ヌクレアーゼ認識部位および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位に少なくとも2つの塩基を寄与する、請求項146〜148のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５０】
前記DFが、部分的ヌクレアーゼ認識部位および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位に少なくとも3つの塩基を寄与する、請求項146〜149のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５１】
前記塩基が、酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドの結合によって形成される部分的ヌクレアーゼ認識部位のすぐ3'側にある、請求項148〜150のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５２】
前記塩基が、酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドの結合によって形成される部分的ヌクレアーゼ認識部位のすぐ5'側にある、請求項148〜150のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５３】
第1のDFが、ヌクレアーゼ認識部位またはヌクレアーゼ切断部位に塩基を寄与しない、請求項90〜145のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５４】
第2のDFが、ヌクレアーゼ認識部位またはヌクレアーゼ切断部位に塩基を寄与しない、請求項104〜137のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５５】
以下の段階を含む、カスケードを用いて標的を検出する方法であって：
(a) 第1のドライバー断片を産生する段階であって、第1のドライバー断片は標的の存在下でのみ産生される、段階；
(b) 以下のものを含む第1の骨格オリゴヌクレオチドを含む第1の複合体を提供する段階：
(i) EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、
EAS2の一部は第1のドライバー断片の一部と相補的であり、かつ
EAS1またはEAS2の一部は第2のドライバー断片を含む、EAS1を含む第1の部分、
(ii) EAS3の一部はEAS4と相補的であり、
EAS3の一部は第2のドライバー断片の一部と相補的であり、かつ
EAS3またはEAS4の一部は第1のドライバー断片を含む、EAS3を含む第2の部分、および
(iii) 第1の部分と第2の部分を接続する第3の部分；
ならびに、
(c) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化を可能にして、第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESAを形成させる条件下における、EAS1およびEAS2と(a)の第1のDF；
(ii) 第1のヌクレアーゼと第1のCESAの認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第1のヌクレアーゼによる該切断部位での切断により第2のDFが放出される、第1のCESAと第1のヌクレアーゼ；
(d) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第2のDFとEAS3およびEAS4の組織化を可能にして、第2のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第2のCESAを形成させる条件下における、EAS3およびEAS4と第2のDF；
(ii) 第2のヌクレアーゼと第2のCESAの認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第2のヌクレアーゼによる該切断部位での切断により、EAS1およびEAS2と組織化して第1のCESAを形成し得る第1のDFが放出される、第2のCESAと第2のヌクレアーゼ；
ここで、第1のCESA複合体および/または第2のCESA複合体の切断は、検出可能な影響をもたらす、方法。
【請求項１５６】
第1のCESA複合体の切断および第2のCESA複合体の切断がそれぞれ、検出可能な影響をもたらす、請求項155記載の方法。
【請求項１５７】
以下の段階をさらに含む、方法であって：
(a) 以下のものを含む骨格オリゴヌクレオチドを含む第2の複合体を提供する段階：
(i) 第5の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS5)を含む第1の部分であって、
EAS5の一部は第6の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS6)の一部と相補的であり、かつ
EAS5の一部は第2のドライバー断片の一部と相補的であり、かつ
EAS5またはEAS6の一部は第1のドライバー断片を含む、第1の部分、および
(ii) 第7の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS7)を含む第2の部分であって、
EAS7の一部は第8の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS8)の一部と相補的であり、
EAS8の一部は第1のドライバー断片の一部と相補的であり、
EAS7またはEAS8の一部は第2のドライバー断片を含む、第2の部分、および
(iii) 第1の部分と第2の部分を接続する第3の部分であって、第1の複合体の骨格の第3の部分と相補的である、第3の部分；
ならびに、
(b) 第1の複合体の第3の部分と第2の複合体の第3の部分とのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、第1の複合体と第2の複合体を接触させ、それによって第1の二重複合体を形成させる段階；
(c) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第2のDFとEAS5およびEAS6の組織化を可能にして、第3のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第3のCESAを形成させる条件下における、EAS5およびEAS6と(a)の第2のDF；
(ii) 第3のヌクレアーゼと第3のCESAの認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第3のヌクレアーゼによる該切断部位での切断により、EAS1およびEAS2と組織化して第1のCESAを形成し得、かつEAS7およびEAS8と組織化して第4のCESAを形成し得る第1のDFが放出される、第3のCESAと第3のヌクレアーゼ；ならびに
(d) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第1のDFとEAS7およびEAS8の組織化を可能にして、第4のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第4のCESAを形成させる条件下における、EAS7およびEAS8と第1のDF；
(ii) 第4のヌクレアーゼと第4のCESAの認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第4のヌクレアーゼによる該切断部位での切断により、EAS3およびEAS4と組織化して第2のCESAを形成し得、かつEAS5およびEAS6と組織化して第3のCESAを形成し得る第2のDFが放出される、第4のCESAと第4のヌクレアーゼ；
ここで、第3のCESA複合体および/または第4のCESA複合体の切断は、検出可能な影響をもたらす、請求項155または請求項156記載の方法。
【請求項１５８】
第3のCESA複合体の切断および第4のCESA複合体の切断がそれぞれ、検出可能な影響をもたらす、請求項157記載の方法。
【請求項１５９】
EAS1がEAS7と同一であり、EAS2がEAS8と同一であり、EAS3がEAS5と同一であり、かつ/またはEAS4がEAS6と同一である、請求項157または請求項158記載の方法。
【請求項１６０】
第1の二重複合体が第2の二重複合体に連結している、請求項157〜159のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６１】
第1の二重複合体のEAS1〜EAS8のうちのいずれか1つまたは複数と第2の二重複合体のEAS1〜EAS8のうちのいずれか1つまたは複数との連結により、第1の二重複合体が第2の二重複合体に連結している、請求項160記載の方法。
【請求項１６２】
第1の二重複合体のEAS2および/またはEAS8と第2の二重複合体のEAS2および/またはEAS8の連結により、第1の二重複合体が第2の二重複合体に連結している、請求項160または請求項161記載の方法。
【請求項１６３】
連結が、化学的ハイブリダイゼーション、抗体、オリゴヌクレオチドリンカー、非オリゴヌクレオチドリンカー、およびペプチドリンカーのうちのいずれか1つまたは複数を用いて達成される、請求項161または請求項162記載の方法。
【請求項１６４】
連結が、酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドのうちのいずれか1つまたは複数のビオチン化、およびアビジンを用いた複数のビオチン化酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドの複合体化により達成される、請求項161または請求項162記載の方法。
【請求項１６５】
(a)の第1のDFが、
SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、イニシエーターヌクレアーゼによる修飾に適した二重鎖構造を形成させる条件下で、標的を含むと推定される試料とSIOを接触させること、および
二重鎖構造を前記イニシエーターヌクレアーゼと接触させること
によって産生され、
前記イニシエーターヌクレアーゼによる二重鎖構造中の対形成または非対形成領域の修飾により、第2のDFが放出される、
請求項155〜請求項164のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６６】
前記イニシエーターヌクレアーゼが、SIOが標的とハイブリダイズした場合にのみ、SIOを切断して前記DFを生成する、請求項165記載の方法。
【請求項１６７】
前記イニシエーターヌクレアーゼが、標的がSIOとハイブリダイズした場合にのみ、標的を切断して前記DFを生成する、請求項165記載の方法。
【請求項１６８】
前記イニシエーターヌクレアーゼが制限酵素ではない、請求項167記載の方法。
【請求項１６９】
(a)の第1のDFが、2つまたはそれ以上のパートザイムおよび少なくとも1つのMNAザイム基質を提供すること、および標的を含むと推定される試料とパートザイムを、該標的の存在下でMNAザイムの自己組織化および触媒活性を可能にする条件下で接触させることによって産生され、該触媒活性により該基質が修飾され、それによって第1のDFが提供される、請求項155〜164のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７０】
EAS1、EAS2、EAS3、EAS4、EAS5、EAS6、EAS7、およびEAS8のうちのいずれか1つまたは複数が、検出可能な部分およびクエンチャー部分を含み、該検出可能な部分およびクエンチャー部分が、第1、第2、第3、および/または第4のCESAの切断時に分離して、検出可能な影響を提供する、請求項157〜169のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７１】
(i) EAS1が検出可能な部分を含み、かつEAS2がクエンチャー部分を含む、もしくはその逆である；および/または
(ii) EAS3が検出可能な部分を含み、かつEAS4がクエンチャー部分を含む、もしくはその逆である；および/または
(iii) EAS5が検出可能な部分を含み、かつEAS6がクエンチャー部分を含む、もしくはその逆である；
(iv) EAS7が検出可能な部分を含み、かつEAS8がクエンチャー部分を含む、もしくはその逆である；
ここで、検出可能な部分とクエンチャー部分は、第1、第2、第3、および/または第4のCESAの切断時に分離して、検出可能な影響を提供する、
請求項157〜169のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７２】
任意の前記ヌクレアーゼが、第1、第2、または第3のヌクレアーゼの認識配列を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、請求項155〜171のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７３】
前記ヌクレアーゼが、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspRIからなる群より選択される、請求項172記載の方法。
【請求項１７４】
任意の前記DFの酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドへの結合が、部分的ヌクレアーゼ認識部位および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位を完成する、請求項155〜171のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７５】
EAS1およびEAS2；EAS3およびEAS4；EAS5およびEAS6；ならびにEAS7およびEAS8より選択される一対の酵素増幅因子基質が、該対の各メンバーの相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、および基部の一方の末端に連結しているヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である、請求項157〜168のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７６】
任意の第1のDFが、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼより選択されるヌクレアーゼを用いて生成される、請求項90〜175のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７７】
エキソヌクレアーゼが、ヌクレアーゼBAL-31、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼIII、T7エキソヌクレアーゼ、T7エキソヌクレアーゼI、およびエキソヌクレアーゼTからなる群より選択される、請求項176記載の方法。
【請求項１７８】
エンドヌクレアーゼが、T7エンドヌクレアーゼI、RNase H、フラップヌクレアーゼ、またはマングビーンヌクレアーゼである、請求項176記載の方法。
【請求項１７９】
以下の段階を含む、カスケードを用いて標的を検出する方法であって：
(a) 以下のものを提供する段階：
(i) 標的鎖と相補的な第1の部分および該標的鎖と相補的でない第2の部分であって、第1の部分と第2の部分はホスホロチオエートによって分離されており、かつ第2の部分は第1のDFを含む、第1の部分および第2の部分；ならびに
(ii) EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1とEAS2のハイブリダイゼーションは、両末端に3'オーバーハングを有する二重鎖構造を提供し、かつEAS1の一部は第1のDFの一部と相補的である、EAS1およびEAS2；
(iii) 第1のエキソヌクレアーゼ；ならびに
(b) 以下のものを接触させる段階：
(i) SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、ひいては第1のエキソヌクレアーゼの二重鎖基質を作出する条件下における、第1のエキソヌクレアーゼによる二重鎖構造の修飾により、二重鎖基質から第1のDFが放出される、標的を含むと推定される試料とSIO；
(ii) 第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化を可能にして、第2のエキソヌクレアーゼの基質を含む第1のCESA複合体を形成させる条件下における、EAS1およびEAS2と(b)の第1のDF；
(iii) 第2のエキソヌクレアーゼと第1のCESA複合体との相互作用を可能にする条件下における、第2のエキソヌクレアーゼによる第1のCESA複合体の修飾により、第1のCESA複合体から、付加的なEAS1およびEAS2と組織化して付加的な第1のCESA複合体を形成し得る第1のDFが放出される、第1のCESAと第2のエキソヌクレアーゼ；
ここで、二重鎖構造の該修飾および/または第1のCESA複合体の該修飾は、検出可能な影響を提供する、方法。
【請求項１８０】
二重鎖構造の前記修飾および第1のCESA複合体の前記修飾が、検出可能な影響を提供する、請求項179記載の方法。
【請求項１８１】
SIOが、2つの相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、一本鎖ヘアピンループ、および3'オーバーハングを含むヘアピンオリゴヌクレオチドである、請求項179または請求項180記載の方法。
【請求項１８２】
第1および/または第2のエキソヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼIIIである、請求項179〜181のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８３】
SIOおよび/またはEAS1が検出可能な部分およびクエンチャー部分を含み、かつ該検出可能な部分とクエンチャー部分が、前記エキソヌクレアーゼによる修飾時に分離して、検出可能な影響を提供し得る、請求項179〜182のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８４】
前記検出可能な部分がフルオロフォアである、請求項183記載の方法。
【請求項１８５】
前記検出可能な影響が、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分光法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射測定、測光法、シンチグラフィー、電子的方法、UV、可視光もしくは赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせによって検出される、請求項90〜184のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８６】
検出可能な影響が測定され、かつ該測定の大きさおよび/または検出可能な影響の蓄積率が標的の量を示す、請求項90〜185のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８７】
標的が、核酸、タンパク質、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオン、核酸、またはそれらの任意の誘導体、部分、もしくは組み合わせからなる群より選択される、請求項90〜186のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８８】
核酸が、DNA、メチル化DNA、アルキル化DNA、RNA、メチル化RNA、マイクロRNA、siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、プレおよびプリマイクロRNA、他の非コードRNA、リボソームRNA、それらの誘導体、それらの単位複製配列、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項187記載の方法。
【請求項１８９】
核酸の供給源が、合成、哺乳動物、ヒト、動物、植物、真菌、細菌、ウイルス、古細菌、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項187または請求項188記載の方法。
【請求項１９０】
核酸が増幅される、請求項187〜189のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９１】
第1のDFが標的とは異なる、請求項98、104、111、116、または155のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９２】
任意のEASが別のEASとハイブリダイズして、複数のDFとハイブリダイズし得る部分的酵素シグナル増幅因子(PESA)複合体を形成することができる、請求項90〜191のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９３】
標的分子の異なる部分に特異的な第1および第2のMNAザイムを用いる段階を含む、請求項90〜97、124、125、または169のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９４】
標的分子の異なる部分に特異的なMNAザイムが、該標的の存在下で組織化した場合に、同じ基質を認識し切断する、請求項193記載の方法。
【請求項１９５】
異なる標的に対して特異性を有する少なくとも2つの異なるMNAザイムを用いる段階を含む、請求項90〜97、124、125、または169のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９６】
異なる標的に対して相補性を有する少なくとも2つの異なるSIOを用いる段階を含む、請求項98、117、118、および165のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９７】
異なる第1のDFと組織化される少なくとも2つの異なる第1のCESA複合体を用いる段階を含む、請求項90、98、104、11、116、または155のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９８】
ヌクレアーゼ；ならびに
EAS1とEAS2の一部は相補的であり、かつEAS1およびEAS2は、ドライバー断片オリゴヌクレオチドと組織化した場合にのみ、該ヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む複合体を形成する、EAS1およびEAS2
を含む、シグナルを増幅するためのキット。
【請求項１９９】
ヌクレアーゼ；
EAS1とEAS2の一部が相補的である、EAS1およびEAS2；
標的に対応するMNAザイムを組織化するように設計された複数のパートザイム；ならびに
MNAザイム基質であって、ただし、該基質の一部はEAS1の一部と相補的である、MNAザイム基質
を含む、標的を検出するためのキットであって、
ここで、EAS1およびEAS2は、ドライバー断片オリゴヌクレオチドと組織化した場合にのみ、該ヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む複合体を形成する、キット。
【請求項２００】
ヌクレアーゼ；
EAS1とEAS2の一部が相補的である、EAS1およびEAS2；
標的とハイブリダイズしてヌクレアーゼ基質を形成するように設計された複数のSIO
を含む、標的を検出するためのキットであって、
ここで、ヌクレアーゼ基質の一部はEAS1の一部と相補的であり、
EAS1およびEAS2は、ドライバー断片オリゴヌクレオチド(DF)と組織化した場合にのみ、該ヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む複合体を形成する、キット。
【請求項２０１】
第1の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS1)および第2の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS2)を含むキットであって、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1およびEAS2が、第1のドライバー断片オリゴヌクレオチド(DF)と組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識および切断配列を含む第1の完全酵素シグナル増幅因子(CESA)複合体を形成し、かつ第1のDFの一部がEAS1の一部と相補的である、キット。
【請求項２０２】
EAS1、EAS2、および第1のヌクレアーゼを含むキットであって、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1およびEAS2が、第1のDFと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成し、第1のDFの一部がEAS1の一部と相補的である、キット。
【請求項２０３】
多成分核酸酵素(MNAザイム)、MNAザイム基質、EAS1、EAS2、および第1のヌクレアーゼを含むキットであって：
MNAザイムが、MNAザイム組織化助長因子の存在下で自己組織化してMNAザイムを形成する少なくとも第1のパートザイムおよび第2のパートザイムを含み、少なくとも第1および第2のパートザイムのそれぞれが基質アーム部分、触媒コア部分、およびセンサーアーム部分を含み、かつ第1および第2のパートザイムをそれらそれぞれの触媒コア部分が会合するように近接して維持して、MNAザイムの触媒コアを形成するように、センサーアームがMNAザイム組織化助長因子と相互作用し、かつ触媒コアがMNAザイム基質を修飾して第1のDFを形成することができ；
ならびに、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部が第1のDFの一部と相補的であり、かつ第1のDFがEAS1およびEAS2と組織化して、少なくとも第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESA複合体を形成することができる、
キット。
【請求項２０４】
前記MNAザイム基質が、第1の鎖および第2の鎖を含むオリゴヌクレオチド複合体の第1の鎖であり、第1の鎖が内部ループ部分を含み、かつ内部ループ部分内の塩基が第2の鎖の塩基とハイブリダイズせず、かつMNAザイムが内部ループ部分を切断することができる、請求項203記載のキット。
【請求項２０５】
第2の鎖が第1のDFを含む、請求項204記載のキット。
【請求項２０６】
第1の鎖と第2の鎖がヘアピンループ部分によって一方の末端で連結されている、請求項204または請求項205記載のキット。
【請求項２０７】
前記MNAザイム基質がヘアピンオリゴヌクレオチドのヘアピンループ部分であり、MNAザイムがヘアピンループ部分を切断することができ、かつ第1のドライバー断片がヘアピンオリゴヌクレオチド内の二本鎖基部の一方の鎖中に位置する、請求項203記載のキット。
【請求項２０８】
組織化助長因子が、同定される標的である、請求項203〜207のいずれか一項記載のキット。
【請求項２０９】
第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド(SIO)、EAS1、EAS2、第1のヌクレアーゼ、および第2のヌクレアーゼを含むキットであって：
SIOが標的とハイブリダイズして二重鎖基質を形成することができ、第1のヌクレアーゼが二重鎖基質を切断して第1のDFを生成することができ；かつ
EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部が第1のDFの一部と相補的であり、かつEAS1およびEAS2が、第1のDFと組織化した場合にのみ、第2のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成する、
キット。
【請求項２１０】
第1のヌクレアーゼが、SIOが標的とハイブリダイズした場合にのみ、SIOを切断して第1のDFを生成することができる、請求項209記載のキット。
【請求項２１１】
第1のヌクレアーゼが、標的がSIOとハイブリダイズした場合にのみ、標的を切断して第1のDFを生成することができる、請求項209記載のキット。
【請求項２１２】
第1のヌクレアーゼが制限酵素ではない、請求項211記載のキット。
【請求項２１３】
第1のヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼである、請求項209〜212のいずれか一項記載のキット。
【請求項２１４】
第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼが同じヌクレアーゼである、請求項209〜213のいずれか一項記載のキット。
【請求項２１５】
第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼが異なるヌクレアーゼである、請求項209〜213のいずれか一項記載のキット。
【請求項２１６】
第1のヌクレアーゼが、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、請求項201〜209のいずれか一項記載のキット。
【請求項２１７】
第2のヌクレアーゼが、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、請求項209〜215のいずれか一項記載のキット。
【請求項２１８】
前記ニックが、ヌクレアーゼ認識部位内に、ヌクレアーゼ切断部位に、またはヌクレアーゼ認識部位と切断部位の間に位置する、請求項216または請求項217記載のキット。
【請求項２１９】
前記ヌクレアーゼが、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspR Iからなる群より選択される、請求項216〜218のいずれか一項記載のキット。
【請求項２２０】
EAS1およびEAS2が、EAS1およびEAS2の相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、ならびにEAS1の一方の末端とEAS2の一方の末端を連結するヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である、請求項198〜219のいずれか一項記載のキット。
【請求項２２１】
ヘアピンオリゴヌクレオチドが、EAS1またはEAS2のいずれかから伸長した一本鎖5'または3'オーバーハング部分を含む、請求項220記載のキット。
【請求項２２２】
EAS1またはEAS2の一部が第2のDFを含み、かつ第2のDFが、ヌクレアーゼによる第1のCESA複合体の修飾時に放出され得る、請求項198〜221のいずれか一項記載のキット。
【請求項２２３】
ヘアピンループ部分の一部が第2のDFを含み、かつ第2のDFが、ヌクレアーゼによる第1のCESA複合体の修飾時に放出され得る、請求項220〜221のいずれか記載のキット。
【請求項２２４】
第1のDFと第2のDFが同一ではない、請求項222または請求項223記載のキット。
【請求項２２５】
第1のDFと第2のDFが同一である、請求項222または請求項223記載のキット。
【請求項２２６】
第2のDFが第1のDFの断片であるか、または第1のDFが第2のDFの断片である、請求項222または請求項223記載のキット。
【請求項２２７】
第2のDF、EAS1、およびEAS2が組織化して、第1のCESA複合体を形成することができる、請求項225または請求項226記載のキット。
【請求項２２８】
第3の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS3)および第4の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS4)をさらに含む、キットであって、EAS3の一部がEAS4の一部と相補的であり、かつEAS3の一部が第2のDFの一部と相補的であり、かつEAS3およびEAS4が、第2のDFと組織化した場合にのみ、付加的なヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第2のCESA複合体を形成する、請求項222〜224のいずれか一項記載のキット。
【請求項２２９】
EAS3またはEAS4が第3のDFを含む、請求項228記載のキット。
【請求項２３０】
第3のDFが第1のDFと同一である、請求項229記載のキット。
【請求項２３１】
第3のDFが第1のDFと同一ではない、請求項229記載のキット。
【請求項２３２】
付加的なヌクレアーゼがキット中の別のヌクレアーゼと同一である、請求項228〜231のいずれか一項記載のキット。
【請求項２３３】
付加的なヌクレアーゼがキット中の別のヌクレアーゼと同一ではなく、かつキットが該付加的なヌクレアーゼを含む、請求項228〜231のいずれか一項記載のキット。
【請求項２３４】
付加的なヌクレアーゼが、第2のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、請求項228〜233のいずれか一項記載のキット。
【請求項２３５】
前記ヌクレアーゼが、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspR Iからなる群より選択される、請求項228〜234のいずれか一項記載のキット。
【請求項２３６】
EAS3およびEAS4が、EAS3およびEAS4の相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、ならびにEAS3の一方の末端とEAS4の一方の末端を連結するヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である、請求項228〜235のいずれか一項記載のキット。
【請求項２３７】
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドが、EAS3またはEAS4のいずれかから伸長した一本鎖5'または3'オーバーハング部分を含む、請求項236記載のキット。
【請求項２３８】
骨格オリゴヌクレオチド、EAS1、EAS2、EAS3、およびEAS4を含む第1の複合体を含むキットであって、該骨格オリゴヌクレオチドが：
(i) EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、EAS2の一部は第1のDFの一部と相補的であり、かつEAS1またはEAS2の一部は第2のDFを含み、かつEAS1およびEAS2は、第1のDFと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成する、EAS1を含む第1の部分；
(ii) EAS3の一部はEAS4の一部と相補的であり、EAS3の一部は第2のDFの一部と相補的であり、かつEAS3またはEAS4の一部は第1のDFを含み、かつEAS3およびEAS4は、第2のDFと組織化した場合にのみ、第2のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第2のCESA複合体を形成する、EAS3を含む第2の部分；ならびに
(iii) 第1の部分と第2の部分を接続する第3の部分
を含む、キット。
【請求項２３９】
骨格オリゴヌクレオチド、第5の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS5)、第6の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS6)、第7の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS7)、および第8の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS8)を含む第2の複合体をさらに含む、キットであって、該骨格オリゴヌクレオチドが：
(i) EAS5の一部はEAS6の一部と相補的であり、EAS5の一部は第2のDFの一部と相補的であり、かつEAS5またはEAS6の一部は第1のDFを含み、かつEAS5およびEAS6は、第2のDFと組織化した場合にのみ、第3のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第3のCESA複合体を形成する、EAS5を含む第1の部分；ならびに
(ii) EAS7の一部はEAS8の一部と相補的であり、EAS8の一部は第1のDFの一部と相補的であり、かつEAS7またはEAS8の一部は第2のDFを含み、かつEAS7およびEAS8は、第1のDFと組織化した場合にのみ、第4のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第4のCESA複合体を形成する、EAS7を含む第2の部分；ならびに
(iii) 第1の部分と第2の部分を接続する第3の部分であって、第1の複合体の骨格の第3の部分と相補的である、第3の部分
を含む、請求項238記載のキット。
【請求項２４０】
EAS1がEAS7と同一であり、EAS2がEAS8と同一であり、EAS3がEAS5と同一であり、かつ/またはEAS4がEAS6と同一である、請求項239記載のキット。
【請求項２４１】
第1のヌクレアーゼが第3のヌクレアーゼと同一であり、かつ/または第2のヌクレアーゼが第4のヌクレアーゼと同一であり、かつ/または第1、第2、第3、および第4のヌクレアーゼが同一である、請求項239または請求項240記載のキット。
【請求項２４２】
第1の複合体と第2の複合体が、それらそれぞれの相補的な第3の部分を介してハイブリダイズして、第1の二重複合体を形成する、請求項239〜241のいずれか一項記載のキット。
【請求項２４３】
第1の二重複合体が第2の二重複合体に連結している、請求項242記載のキット。
【請求項２４４】
第1の二重複合体のEAS1〜EAS8のうちのいずれか1つまたは複数と第2の二重複合体のEAS1〜EAS8のうちのいずれか1つまたは複数の連結により、第1の二重複合体が第2の二重複合体に連結している、請求項243記載のキット。
【請求項２４５】
第1の二重複合体のEAS2および/またはEAS8と第2の二重複合体のEAS2および/またはEAS8との連結により、第1の二重複合体が第2の二重複合体に連結している、請求項243または請求項244記載のキット。
【請求項２４６】
連結が、化学的ハイブリダイゼーション、抗体、オリゴヌクレオチドリンカー、非オリゴヌクレオチドリンカー、およびペプチドリンカーのうちのいずれか1つまたは複数を用いて達成される、請求項244または請求項245記載のキット。
【請求項２４７】
連結が、酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドのうちのいずれか1つまたは複数のビオチン化、およびアビジンを用いた複数のビオチン化酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドの複合体化により達成される、請求項244または請求項245記載のキット。
【請求項２４８】
第1および/または第2のヌクレアーゼが、第2のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、請求項239〜247のいずれか一項記載のキット。
【請求項２４９】
第1および/または第2のヌクレアーゼが、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspR Iからなる群より選択される、請求項239〜248のいずれか一項記載のキット。
【請求項２５０】
EAS1およびEAS2；EAS3およびEAS4；EAS5およびEAS6；ならびにEAS7およびEAS8より選択される一対の酵素増幅因子基質が、該対の各メンバーの相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、および基部の一方の末端に連結しているヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である、請求項239〜249のいずれか一項記載のキット。
【請求項２５１】
以下のものを含むSIOを含むキット：
(i) 標的鎖と相補的な第1の部分および該標的鎖と相補的でない第2の部分であって、第1の部分と第2の部分はホスホロチオエートによって分離されており、かつ第2の部分は第1のDFを含む、第1の部分および第2の部分；ならびに
(ii) EAS1およびEAS2であって、
EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、EAS1とEAS2のハイブリダイゼーションは、両末端に3'オーバーハングを有する二重鎖構造を提供し、
EAS1の一部は第1のDFの一部と相補的であり、かつ
EAS1およびEAS2は、第1のDFと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼによって消化され得る陥凹3'末端を含む第1のCESA複合体を形成することができる、EAS1およびEAS2。
【請求項２５２】
SIOが、2つの相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、一本鎖ヘアピンループ、および3'オーバーハングを含むヘアピンオリゴヌクレオチドである、請求項251記載のキット。
【請求項２５３】
前記ヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼである、請求項251または252記載のキット。
【請求項２５４】
任意のEASが1つまたは複数の検出可能な標識を含む、請求項198〜253のいずれか一項記載のキット。
【請求項２５５】
任意のEASがフルオロフォア部分およびクエンチャー部分を含む、請求項198〜254のいずれか一項記載のキット。
【請求項２５６】
任意のMNAザイムパートザイム、MNAザイム基質、EAS1、EAS2、EAS3、EAS4、EAS5、EAS6、EAS7、EAS8、SIO、DF、またはヌクレアーゼが、固体支持体に付着している、請求項198〜255のいずれか一項記載のキット。
【請求項２５７】
第1のDFが標的とは異なる、請求項199、200、208、または209のいずれか一項記載のキット。
【請求項２５８】
標的分子の異なる部分に特異的な第1および第2のMNAザイムを含む、請求項199または請求項203記載のキット。
【請求項２５９】
標的分子の異なる部分に特異的なMNAザイムが、該標的の存在下で組織化した場合に、同じ基質を認識し切断する、請求項258記載のキット。
【請求項２６０】
異なる標的に対して特異性を有する少なくとも2つの異なるMNAザイムを含む、請求項199または請求項203記載のキット。
【請求項２６１】
異なる標的に対して相補性を有する少なくとも2つの異なるSIOを含む、請求項200、209、または251のいずれか一項記載のキット。
【請求項２６２】
請求項1〜89のいずれか一項記載の組成物を含むキット。
【請求項２６３】
キットを使用するための説明書をさらに含む、請求項198〜262のいずれか一項記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照による組み入れ
本出願は、2010年11月19日に出願されたオーストラリア仮特許出願第2010905152号の優先権を主張し、その全内容は相互参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
技術分野
本発明は、標的の存在を示すシグナルを生成および増幅するために、核酸から構成される酵素および/またはタンパク質酵素を使用するための組成物および方法に関する。より具体的には、本発明は、部分的また完全な酵素基質としての機能を果たす核酸構造を含む組成物、および標的の検出を容易にするためにこれらの構造を使用するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヌクレアーゼ
ヌクレアーゼとは、核酸のヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合を切断する酵素である。デオキシリボヌクレアーゼはDNAに作用し、リボヌクレアーゼはRNAに作用するが、いくつかのヌクレアーゼは基質としてDNAおよびRNAの両方を利用する。
【０００４】
ヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼにさらに分類され得るが、いくつかの酵素は複数の機能を有し、エンドヌクレアーゼ活性およびエキソヌクレアーゼ活性の両方を示し得る。エンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する。対照的に、エキソヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖の末端でホスホジエステル結合を切断する。エキソヌクレアーゼは、DNA鎖またはRNA鎖の5'末端もしくは3'末端のいずれかから、または両末端からヌクレオチドを除去し得る。フラップエンドヌクレアーゼは、二本鎖オリゴヌクレオチドの分岐末端を認識し、最初の重複塩基後で一本鎖5'アームを除去して2つのオリゴヌクレオチド間に3'ヒドロキシルニックを残す構造特異的5'エンドヌクレアーゼである。
【０００５】
ヌクレアーゼは、分子生物学のためのツールとして広く用いられている。タンパク質エンドヌクレアーゼの例には、制限エンドヌクレアーゼ、マングビーン(Mung Bean)ヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼIV(大腸菌(E. coli))、RNase A、RNase I(大腸菌)、RNase III(大腸菌)、またはRNase H(大腸菌)が含まれる。タンパク質エキソヌクレアーゼの例には、エキソヌクレアーゼI(大腸菌)、エキソヌクレアーゼIII(大腸菌)、エキソヌクレアーゼVII、およびT7エキソヌクレアーゼが含まれる。DNAザイム、リボザイム、およびMNAザイム(MNAzyme)を含む触媒核酸もまたエンドヌクレアーゼとして機能し、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断し得る。
【０００６】
制限酵素
制限酵素(RE)または制限エンドヌクレアーゼとは、核酸の特異的な制限酵素認識(RER)部位または配列(RERS)を認識し、RERSにおいて、またはRERSから離れて核酸を切断する触媒タンパク質である。制限酵素は、分子生物学において最も広く用いられているツールの1つであり、それらは典型的に細菌または古細菌から精製される。例えば、EcoRIは大腸菌(Escherichia coli)から精製され、Hind IIIはインフルエンザ菌(Haemophilus influenza)から精製される。何千もの制限酵素が精製され特徴づけられており、250種を超える様々な制限酵素認識配列が同定されている。
【０００７】
制限酵素切断によって生じる末端の種類には、5'オーバーハングもしくは3'オーバーハングが存在する末端、または切断が平滑であり得る末端(オーバーハングなし)が含まれる。大部分の制限酵素は、二本鎖二重鎖の両鎖を切断する。ニッキング酵素は二本鎖DNA基質を必要とするが、一方の鎖のみが切断される。この種の酵素の例はNt.AlwIであり、これは配列GGATCNNNN/Nを認識し、フォワードスラッシュ(/)によって示される位置でこの鎖を切断する。大多数は基質として二本鎖DNAを必要とするが、一本鎖DNAを認識し切断する少数の制限酵素も報告されている。
【０００８】
触媒核酸酵素
触媒核酸酵素とは、核酸基質を修飾し得る核酸から構成される酵素(非タンパク質酵素)である。例えば、触媒核酸酵素は、DNA分子(DNAザイムまたはデオキシリボザイムまたはDNA酵素としても知られる)またはRNA分子(当技術分野でリボザイムとして知られる)、または複数のDNAもしくはRNA分子から構成される多成分核酸酵素(当技術分野でMNAザイムとして知られる)であってよい。触媒核酸エンドヌクレアーゼは、異なる核酸基質配列を特異的に認識し、切断する。DNAザイムおよびリボザイムは、RNA基質、DNA基質、および/またはキメラDNA/RNA基質を切断し得ることが示されている。触媒核酸酵素は、基質配列が最低限の配列要件を満たす場合にのみ、核酸基質(標的)を切断し得る。標的基質は、触媒核酸の基質認識ドメイン(結合アーム)と相補的でなければならず、基質は切断部位において特異的配列を含まなくてはならない。切断部位におけるそのような配列要件の例には、DNAザイム切断(10-23モデル)のためのプリン：ピリミジン配列の要件、およびハンマーヘッドリボザイムのための配列ウリジン：X、ただしXはA、C、またはUと等しくてよいが、Gとは等しくない、の要件が含まれる。10-23 DNAザイムは、特定のRNAホスホジエステル結合において核酸基質を切断し得るDNAザイムである。このDNAザイムは、2つの基質認識ドメイン(結合アーム)が隣接したデオキシヌクレオチド15個の触媒ドメインを有する。DNAザイムおよびリボザイムの場合、認識される標的基質配列は、切断される分子と同じ分子である。
【０００９】
MNAザイムとは、組織化助長因子(assembly facilitator)の存在下で組織化し、そうして初めて触媒活性を有する多成分核酸酵素である。これらの酵素は、1つまたは複数の組織化助長因子の存在下で自己組織化し、基質を触媒修飾する活性MNAザイムを形成する複数の部分酵素、すなわちパートザイム(partzyme)から構成される。基質と組織化助長因子(標的)は、別個の核酸分子である。パートザイムは、(i) 組織化助長因子(標的核酸など)に結合するセンサーアーム；(ii) 基質と結合する基質アーム、および(iii) 組織化すると組み合わさって完全な触媒コアを提供する部分的触媒コア配列を有する。MNAザイムは、例えば異なる標的核酸配列を含む幅広い組織化助長因子を認識するように設計することができる。組織化助長因子の存在に応答して、MNAザイムはそれらの基質を修飾する。この基質修飾をシグナル生成と結びつけることができ、よってMNAザイムは酵素的に増幅された出力シグナルを生成し得る。組織化助長因子は、生体試料または環境試料中に存在する標的核酸であってよい。このような場合、MNAザイム活性による基質の修飾の検出は、標的の存在を示す。核酸基質を切断し得るいくつかのMNAザイムが報告されており、核酸基質を連結し得るさらなるMNAザイムもまた当技術分野で公知である。
【００１０】
標的検出またはシグナル増幅のために制限酵素を使用する方法
標的核酸の検出のために制限酵素(RE)を使用する方法は、当技術分野で公知である。制限酵素は、DNA中の一塩基多型(SNP)を特異的に認識することによって、遺伝子対立遺伝子を識別し得る。しかしながら、これは、SNPが、ある対立遺伝子内に存在する天然RERSを変化させる場合にのみ達成され得る。この方法では、配列決定を必要とせずに、制限酵素を用いてDNA試料の遺伝子型を同定することができる。REでゲノムDNAを消化した後、得られたDNA断片をゲル電気泳動によって分離し、解析することができる。稀な例では、天然RERS内に後天性の突然変異が偶然に存在する場合に、それらの突然変異が検出され得る。
【００１１】
異なる戦略を用いて、標的検出のためにREを利用する、いくつかの他の方法が公表されている。制限増幅アッセイとして知られる1つの方法は、検出される標的と相補的であり、かつ特異的RER部位を含む標的の領域にまたがる標識オリゴヌクレオチドプローブを使用する(米国特許第5,102,784号(特許文献1))。標識プローブと標的とのハイブリダイゼーション後、得られた二重鎖がREで切断され、切断されたプローブの検出によって標的の存在が示される。続いて、別の無傷のプローブが、第2の相補的オリゴヌクレオチドおよび切断された標的断片に結合し得る。この第2のオリゴヌクレオチドは、切断された標的断片にすぐ近接して結合し、RE部位の再構成をもたらして、別のプローブの切断を可能にする。このアプローチの不利点には、(i) 関心対象の領域内に特異的RERSを含む標的を有するという要件、および(ii) 任意の時点で切断可能な二重鎖の最大数が、存在する標的分子の元の数に等しいために、感度が限定されることが含まれる。関心対象の領域内に特異的RERSを含むという標的の要件によって、このアッセイの適応性が顕著に限定される。任意の時点でアッセイ中に存在するシグナル生成複合体の量は、存在する標的分子の数に限定され、これはシグナル強度、および十分なシグナル強度を得るために必要とされる実行時間に悪影響を及ぼすため、上記の第2の不利点もまた特に重要である。REを使用する標的検出アッセイの別の例は、ニッキングエンドヌクレアーゼシグナル増幅(NESA)と称される。制限増幅アッセイと同様に、この方法は、検出される標的と相補的であり、かつこの場合にはニッキングREのための特異的なRER部位を含む標的の領域にまたがる標識オリゴヌクレオチドプローブを使用する(Kiesling et al, NAR; 35; 18; e117, 2007(非特許文献1))。標識プローブと標的とのハイブリダイゼーション後、得られた二重鎖の一方の鎖がニッキングREで切断され、この切断によりプローブの解離が生じるが、標的は無傷のままである。プローブの切断は、特定の標的の存在を示すシグナルを生成する。次に、標的はさらなるプローブとハイブリダイズして、シグナルの増加をもたらし得る。この場合も同様に、このアプローチの不利点は、(i) 関心対象の領域内に特異的な天然RERS(この場合、具体的には、標的に隣接した数少ないニッキングRERSのうちの1つのRERS)を含む標的を有するという要件、および(ii) 任意の時点で切断可能な二重鎖の最大数が標的分子の元の数に等しいために、このアプローチの感度が限定されることである。
【００１２】
カスケード酵素シグナル増幅因子(Zou et al, Angew. Chem. Int Ed; 49 p1-5; 2010(非特許文献2))と称される別のプロトコールは、複数の段階、すなわち；(i) 2つのプローブが標的に結合して重複を生じ、これがフラップエンドヌクレアーゼによって切断される；(ii) 切断されたフラップ断片が、同様にループに結合している別のオリゴヌクレオチドに隣接した位置で分子ビーコンのループに結合し、次にT4リガーゼがこれら2つのオリゴヌクレオチドを結合(連結)し、これによりビーコンが開き、ニッキングREのためのRERSが作出される；次いで最後に(iii) ニッキングREがビーコンを切断し、連結された断片を放出して、これが別のビーコンに結合する段階を必要とする。この方法は、ニッキングRERSが標的中に天然に存在する特異的必要性を克服するが、本方法により、2つの断片が連結されて新たなRER部位を作出しなければならないことが教示される。さらに、本方法は厄介であり、エンドヌクレアーゼ、連結、および切断活性のそれぞれに特異的な3つの逐次的緩衝液を必要とする。
【００１３】
これらの方法はいずれも、特定の標的が都合のよい天然RERSを有するかどうかにかかわらず、最初の標的認識事象後に標的のシグナルを独立して増幅する様式で、標的の検出によって生じるシグナルを増幅するための簡便なプロトコールを提供するものではない。
【００１４】
他の標的およびシグナル増幅技術
標的検出の感度を高めるために、標的増幅またはシグナル増幅のための戦略が使用されている。標的増幅を使用する方法の例には、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)、鎖置換増幅(SDA)、ループ媒介性等温増幅(LAMP)、ローリングサークル増幅(RCA)、転写物媒介性増幅(TMA)；自律的配列複製(3SR)、または核酸配列に基づく増幅(NASBA)が含まれる。
【００１５】
触媒核酸を用いるシグナル増幅カスケードのいくつかの例は、当技術分野で公知である。連結カスケードは、オリゴヌクレオチドを含む2つのRNAを連結する第1のリボザイム(A)を用いて、第2のリボザイム(B)を形成する。次に、リボザイム(B)は、オリゴヌクレオチドを含む他の2つのRNAを連結して、新たな第1のリボザイム(A)を形成し、このようにしてカスケード反応を誘発する。他のシグナル増幅カスケードは、環状化DNAザイム/基質分子を用いる。DNAザイム(A)は環状である場合には不活性であるが、環状DNAザイム(A)を切断する第2のDNAザイム(B)による線状化によって活性化された状態になる。次に、活性のある線状DNAザイム(A)は環状DNAザイム(B)分子を切断して、それらを線状化し、活性化する。互いに切断/線状化し得る2つのDNAザイムが、触媒核酸活性のカスケードをもたらす。
【００１６】
例えば、DNAザイムの使用と、アプタマーの多用途性および/または伝統的なタンパク質酵素の触媒力を併用することを含む、他のアプローチが利用可能である。この方法はタンパク質酵素の放出をもたらし、今度はその酵素が検出可能な分子の形成を触媒し、それによってシグナルが生じ、増幅され得る。このアプローチにより高感度検出が可能になるが、各アッセイのために高度にカスタマイズされた分子を必要とするため、費用がかかる。代替的な方法には、例えば、反応を媒介する標識プローブに付着させた二次レポーター分子(例えば、アルカリホスファターゼ)を使用することによってシグナルを増幅する分枝DNAアッセイ(bDNA)が含まれる。チラミドシグナル増幅(TSA)法は、西洋ワサビペルオキシダーゼを用いてチラミドをその活性型に変換し、これがタンパク質中のチロシン残基に結合する。インベーダーアッセイはヌクレアーゼ切断を可能にして、時間と共に標的分子当たり1000を超える切断事象をもたらす。しかしながら、公知のシグナル増幅法には限界および欠陥がある。例えば、bDNAアッセイは、標的増幅法ほど高感度ではない。感度以外にも、公知のシグナル増幅アッセイは、実行時間の長期化、過度に複雑なプロトコール、および/またはコストの増加を含む他の不利点と関連づけられている。
【００１７】
したがって、シグナル増幅を組み入れた、核酸配列および他の標的を検出および定量するための新たな改良法の必要性が続いている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】米国特許第5,102,784号
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Kiesling et al, NAR; 35; 18; e117, 2007
【非特許文献２】Zou et al, Angew. Chem. Int Ed; 49 p1-5; 2010
【発明の概要】
【００２０】
第1の局面において、本発明は、第1の酵素増幅因子基質(Enzyme Amplifier Substrate)オリゴヌクレオチド(EAS1)および第2の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS2)を含む組成物であって、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、EAS1およびEAS2が、第1のドライバー断片オリゴヌクレオチド(DF)と組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識および切断配列を含む第1の完全酵素シグナル増幅因子(CESA)複合体を形成し、第1のDFの一部がEAS1の一部と相補的である、組成物を提供する。
【００２１】
第2の局面において、本発明は、EAS1、EAS2、および第1のヌクレアーゼを含む組成物であって、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、EAS1およびEAS2が、第1のDFと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成し、第1のDFの一部がEAS1の一部と相補的である、組成物を提供する。
【００２２】
第3の局面において、本発明は、多成分核酸酵素(MNAザイム)、MNAザイム基質、EAS1、EAS2、および第1のヌクレアーゼを含む組成物であって：
MNAザイムが、MNAザイム組織化助長因子の存在下で自己組織化してMNAザイムを形成する少なくとも第1のパートザイムおよび第2のパートザイムを含み、少なくとも第1および第2のパートザイムのそれぞれが基質アーム部分、触媒コア部分、およびセンサーアーム部分を含み、第1および第2のパートザイムをそれらそれぞれの触媒コア部分の会合のために近接して維持して、MNAザイムの触媒コアを形成するように、センサーアームがMNAザイム組織化助長因子と相互作用し、触媒コアがMNAザイム基質を修飾して第1のDFを形成することができ；
ならびに、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部が第1のDFの一部と相補的であり、第1のDFがEAS1およびEAS2と組織化して、少なくとも第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESA複合体を形成することができる、
組成物を提供する。
【００２３】
第3の局面の1つの態様において、MNAザイム基質は、第1の鎖および第2の鎖を含むオリゴヌクレオチド複合体の第1の鎖であり、第1の鎖は内部ループ部分を含み、内部ループ部分内の塩基は第2の鎖の塩基とハイブリダイズせず、MNAザイムは内部ループ部分を切断することができる。
【００２４】
第3の局面の1つの態様において、第2の鎖は第1のDFを含む。
【００２５】
第3の局面の1つの態様において、第1の鎖と第2の鎖はヘアピンループ部分によって一方の末端で連結されている。
【００２６】
第3の局面の1つの態様において、MNAザイム基質はヘアピンオリゴヌクレオチドのヘアピンループ部分であり、MNAザイムはヘアピンループ部分を切断することができ、第1のドライバー断片はヘアピンオリゴヌクレオチド内の二本鎖基部の一方の鎖中に位置する。
【００２７】
第3の局面の1つの態様において、組織化助長因子は、同定される標的である。
【００２８】
第4の局面において、本発明は、第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド(Synthetic Initiator Oligonucleotide, SIO)、EAS1、EAS2、第1のヌクレアーゼ、および第2のヌクレアーゼを含む組成物であって：
SIOが標的とハイブリダイズして二重鎖基質を形成することができ、第1のヌクレアーゼが二重鎖基質を切断して第1のDFを生成することができ；ならびに
EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部が第1のDFの一部と相補的であり、EAS1およびEAS2が、第1のDFと組織化した場合にのみ、第2のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成する、
組成物を提供する。
【００２９】
第5の局面において、本発明は、第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド(SIO)、EAS1、EAS2、および第1のヌクレアーゼ、および第2のヌクレアーゼを含む組成物であって：
SIOが標的とハイブリダイズして二重鎖構造を形成することができ、第1のヌクレアーゼが、SIOが標的とハイブリダイズした場合にのみ、SIOを切断して第1のDFを生成することができ；ならびに
EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部が第1のDFの一部と相補的であり、EAS1およびEAS2が、第1のDFと組織化した場合にのみ、第2のヌクレアーゼの認識および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成する、
組成物を提供する。
【００３０】
第6の局面において、本発明は、第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド(SIO)、EAS1、EAS2、第1のヌクレアーゼ、および第2のヌクレアーゼを含む組成物であって、
SIOが標的とハイブリダイズして二重鎖構造を形成することができ、第1のヌクレアーゼが、標的がSIOとハイブリダイズした場合にのみ、標的を切断して第1のDFを生成することができ；
EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部が第1のDFの一部と相補的であり、EAS1およびEAS2が、第1のDFと組織化した場合にのみ、第2のヌクレアーゼの認識および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成し；
ならびに、第1のヌクレアーゼが制限エンドヌクレアーゼではない、
組成物を提供する。
【００３１】
第4〜第6の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼは、SIOが標的とハイブリダイズした場合にのみ、SIOを切断して第1のDFを生成することができる。
【００３２】
第4〜第6の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼは、標的がSIOとハイブリダイズした場合にのみ、標的を切断して第1のDFを生成することができる。
【００３３】
第4〜第6の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼは制限酵素ではない。
【００３４】
第4〜第6の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼである。
【００３５】
第4〜第6の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼは同じヌクレアーゼである。
【００３６】
第4〜第6の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼは異なるヌクレアーゼである。
【００３７】
第4〜第6の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼは、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる。
【００３８】
第4〜第6の局面の1つの態様において、第2のヌクレアーゼは、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる。
【００３９】
第4〜第6の局面の1つの態様において、ニックは、ヌクレアーゼ認識部位内に、ヌクレアーゼ切断部位に、またはヌクレアーゼ認識部位と切断部位の間に位置する。
【００４０】
第4〜第6の局面の1つの態様において、ヌクレアーゼは、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspR Iからなる群より選択される。
【００４１】
第4〜第6の局面の1つの態様において、第1のDFのEAS1への結合は、部分的ヌクレアーゼ認識配列を完成する。
【００４２】
第1〜第6の局面の1つの態様において、第1のDFのEAS1への結合は、部分的ヌクレアーゼ切断配列を完成する。
【００４３】
第1〜第6の局面の1つの態様において、第1のDFは前記配列に少なくとも1つの塩基を寄与する。
【００４４】
第1〜第6の局面の1つの態様において、第1のDFは前記配列に少なくとも2つの塩基を寄与する。
【００４５】
第1〜第6の局面の1つの態様において、第1のDFは前記配列に少なくとも3つの塩基を寄与する。
【００４６】
第1〜第6の局面の1つの態様において、前記塩基は、EAS1とEAS2の結合によって形成される部分的ヌクレアーゼ認識部位のすぐ3'側にある。
【００４７】
第1〜第6の局面の1つの態様において、前記塩基は、EAS1とEAS2の結合によって形成される部分的ヌクレアーゼ認識部位のすぐ5'側にある。
【００４８】
第1〜第6の局面の1つの態様において、第1のDFはヌクレアーゼ認識配列またはヌクレアーゼ切断配列に塩基を寄与しない。
【００４９】
第1〜第6の局面の1つの態様において、EAS1およびEAS2は、EAS1およびEAS2の相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、ならびにEAS1の一方の末端とEAS2の一方の末端を連結するヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である。
【００５０】
第1〜第6の局面の1つの態様において、ヘアピンループ部分はオリゴヌクレオチドリンカーまたは非オリゴヌクレオチドリンカーである。
【００５１】
第1〜第6の局面の1つの態様において、ヘアピンオリゴヌクレオチドは、EAS1またはEAS2のいずれかから伸長した一本鎖5'または3'オーバーハング部分を含む。
【００５２】
第1〜第6の局面の1つの態様において、EAS1またはEAS2の一部は第2のDFを含み、第2のDFは、ヌクレアーゼによる第1のCESA複合体の修飾時に放出され得る。
【００５３】
第1〜第6の局面の1つの態様において、ヘアピンループ部分の一部は第2のDFを含み、第2のDFは、ヌクレアーゼによる第1のCESA複合体の修飾時に放出され得る。
【００５４】
第1〜第6の局面の1つの態様において、第1のDFと第2のDFは同一ではない。
【００５５】
第1〜第6の局面の1つの態様において、第1のDFと第2のDFは同一である。
【００５６】
第1〜第6の局面の1つの態様において、第2のDFは第1のDFの断片であるか、または第1のDFは第2のDFの断片である。
【００５７】
第1〜第6の局面の1つの態様において、第2のDF、EAS1、およびEAS2は組織化して、第1のCESA複合体を形成することができる。
【００５８】
第1〜第6の局面の1つの態様において、組成物は、第3の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS3)および第4の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS4)をさらに含み、EAS3の一部はEAS4の一部と相補的であり、かつEAS3の一部は第2のDFの一部と相補的であり、EAS3およびEAS4は、第2のDFと組織化した場合にのみ、付加的なヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第2のCESA複合体を形成する。
【００５９】
第1〜第6の局面の1つの態様において、EAS3またはEAS4は第3のDFを含む。
【００６０】
第1〜第6の局面の1つの態様において、第3のDFは第1のDFと同一である。
【００６１】
第1〜第6の局面の1つの態様において、第3のDFは第1のDFと同一ではない。
【００６２】
第1〜第6の局面の1つの態様において、付加的なヌクレアーゼは前記組成物中の別のヌクレアーゼと同一である。
【００６３】
第1〜第6の局面の1つの態様において、付加的なヌクレアーゼは前記組成物中の別のヌクレアーゼと同一ではなく、該組成物は該付加的なヌクレアーゼを含む。
【００６４】
第1〜第6の局面の1つの態様において、付加的なヌクレアーゼは、第2のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる。
【００６５】
第1〜第6の局面の1つの態様において、ヌクレアーゼは、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspR Iからなる群より選択される。
【００６６】
第1〜第6の局面の1つの態様において、第2のDFのEAS3への結合は、部分的ヌクレアーゼ認識配列および/またはヌクレアーゼ切断配列を完成する。
【００６７】
第1〜第6の局面の1つの態様において、第2のDFは、ヌクレアーゼ認識配列またはヌクレアーゼ切断配列に塩基を寄与しない。
【００６８】
第1〜第6の局面の1つの態様において、EAS3およびEAS4は、EAS3およびEAS4の相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、ならびにEAS3の一方の末端とEAS4の一方の末端を連結するヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である。
【００６９】
第1〜第6の局面の1つの態様において、ヘアピンループ部分はオリゴヌクレオチドリンカーまたは非オリゴヌクレオチドリンカーである。
【００７０】
第1〜第6の局面の1つの態様において、ヘアピンオリゴヌクレオチドは、EAS3またはEAS4のいずれかから伸長した一本鎖5'または3'オーバーハング部分を含む。
【００７１】
第7の局面において、本発明は、骨格オリゴヌクレオチド、EAS1、EAS2、EAS3、およびEAS4を含む第1の複合体を含む組成物であって、該骨格オリゴヌクレオチドが：
(i) EAS1を含む第1の部分、ただし、EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、EAS2の一部は第1のDFの一部と相補的であり、EAS1またはEAS2の一部は第2のDFを含み、EAS1およびEAS2は、第1のDFと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成する；
(ii) EAS3を含む第2の部分、ただし、EAS3の一部はEAS4の一部と相補的であり、EAS3の一部は第2のDFの一部と相補的であり、EAS3またはEAS4の一部は第1のDFを含み、EAS3およびEAS4は、第2のDFと組織化した場合にのみ、第2のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第2のCESA複合体を形成する；ならびに
(iii) 第1の部分と第2の部分を接続する第3の部分
を含む、組成物を提供する。
【００７２】
第7の局面の1つの態様において、組成物は、骨格オリゴヌクレオチド、第5の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS5)、第6の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS6)、第7の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS7)、および第8の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS8)を含む第2の複合体をさらに含み、該骨格オリゴヌクレオチドは：
(i) EAS5を含む第1の部分、ただし、EAS5の一部はEAS6の一部と相補的であり、EAS5の一部は第2のDFの一部と相補的であり、EAS5またはEAS6の一部は第1のDFを含み、EAS5およびEAS6は、第2のDFと組織化した場合にのみ、第3のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第3のCESA複合体を形成する；ならびに
(ii) EAS7を含む第2の部分、ただし、EAS7の一部はEAS8の一部と相補的であり、EAS8の一部は第1のDFの一部と相補的であり、EAS7またはEAS8の一部は第2のDFを含み、EAS7およびEAS8は、第1のDFと組織化した場合にのみ、第4のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第4のCESA複合体を形成する；ならびに
(iii) 第1の部分と第2の部分を接続する第3の部分、ただし、第3の部分は第1の複合体の骨格の第3の部分と相補的である
を含む。
【００７３】
第7の局面の1つの態様において、EAS1はEAS7と同一であり、EAS2はEAS8と同一であり、EAS3はEAS5と同一であり、および/またはEAS4はEAS6と同一である。
【００７４】
第7の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼは第3のヌクレアーゼと同一であり、ならびに/または第2のヌクレアーゼは第4のヌクレアーゼと同一であり、ならびに/または第1、第2、第3、および第4のヌクレアーゼは同一である。
【００７５】
第7の局面の1つの態様において、第1の複合体と第2の複合体は、それらそれぞれの相補的な第3の部分を介してハイブリダイズして、第1の二重複合体を形成する。
【００７６】
第7の局面の1つの態様において、第1の二重複合体は第2の二重複合体に連結している。
【００７７】
第7の局面の1つの態様において、第1の二重複合体のEAS1〜EAS8のうちのいずれか1つまたは複数と第2の二重複合体のEAS1〜EAS8のうちのいずれか1つまたは複数の連結により、第1の二重複合体は第2の二重複合体に連結している。
【００７８】
第7の局面の1つの態様において、第1の二重複合体のEAS2および/またはEAS8と第2の二重複合体のEAS2および/またはEAS8の連結により、第1の二重複合体は第2の二重複合体に連結している。
【００７９】
第7の局面の1つの態様において、連結は、化学的ハイブリダイゼーション、抗体、オリゴヌクレオチドリンカー、非オリゴヌクレオチドリンカー、共有結合、およびペプチドリンカーのうちのいずれか1つまたは複数を用いて達成される。
【００８０】
第7の局面の1つの態様において、連結は、酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドのうちのいずれか1つまたは複数のビオチン化、およびアビジンを用いた複数のビオチン化酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドの複合体化により達成される。
【００８１】
第7の局面の1つの態様において、第1および/または第2のヌクレアーゼは、第2のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる。
【００８２】
第7の局面の1つの態様において、第1および/または第2のヌクレアーゼは、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspR Iからなる群より選択される。
【００８３】
第7の局面の1つの態様において、第1のDFのEAS2もしくはEAS8への結合、および/または第2のDFのEAS3もしくはEAS5への結合は、部分的ヌクレアーゼ認識配列および/または部分的ヌクレアーゼ切断配列を完成する。
【００８４】
第7の局面の1つの態様において、第1のDFのEAS2もしくはEAS8への結合、および/または第2のDFのEAS3もしくはEAS5への結合は、ヌクレアーゼ認識配列またはヌクレアーゼ切断配列に塩基を寄与しない。
【００８５】
第7の局面の1つの態様において、EAS1およびEAS2；EAS3およびEAS4；EAS5およびEAS6；ならびにEAS7およびEAS8より選択される一対の酵素増幅因子基質は、該対の各メンバーの相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、および基部の一方の末端に連結しているヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である。
【００８６】
第7の局面の1つの態様において、ヘアピンループ部分はオリゴヌクレオチドリンカーまたは非オリゴヌクレオチドリンカーである。
【００８７】
第7の局面の1つの態様において、ヘアピンオリゴヌクレオチドは一本鎖5'または3'オーバーハング部分を含む。
【００８８】
第8の局面において、本発明は、以下のものを含むSIOを含む組成物を提供する：
(i) 標的鎖と相補的な第1の部分および該標的鎖と相補的でない第2の部分、ただし、第1の部分と第2の部分はホスホロチオエートによって分離されており、第2の部分は第1のDFを含む；ならびに
(ii) EAS1およびEAS2、ただし
EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、EAS1とEAS2のハイブリダイゼーションは、両末端に3'オーバーハングを有する二重鎖構造を提供し、
EAS1の一部は第1のDFの一部と相補的であり、かつ
EAS1およびEAS2は、第1のDFと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼによって消化され得る陥凹3'末端を含む第1のCESA複合体を形成することができる。
【００８９】
第8の局面の1つの態様において、SIOは、2つの相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、一本鎖ヘアピンループ、および3'オーバーハングを含むヘアピンオリゴヌクレオチドである。
【００９０】
第8の局面の1つの態様において、ヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼである。
【００９１】
第8の局面の1つの態様において、エキソヌクレアーゼは、一本鎖オリゴヌクレオチド、5個もしくはそれ以上の塩基の3'オーバーハングを含む二本鎖オリゴヌクレオチド、またはホスホロチオエートヌクレオチド間連結を消化することができない。
【００９２】
第1〜第8の局面の1つの態様において、任意の第1のDFは、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼを用いて生成される。
【００９３】
第1〜第8の局面の1つの態様において、エキソヌクレアーゼは、ヌクレアーゼBAL-31、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼIII、T7エキソヌクレアーゼ、T7エキソヌクレアーゼI、およびエキソヌクレアーゼTからなるより選択される。
【００９４】
第1〜第8の局面の1つの態様において、エキソヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼIIIである。
【００９５】
第1〜第8の局面の1つの態様において、エンドヌクレアーゼは、T7エンドヌクレアーゼI、RNase H、フラップヌクレアーゼ、またはマングビーンヌクレアーゼである。
【００９６】
第1〜第8の局面の1つの態様において、任意のEASは1つまたは複数の検出可能な標識を含む。
【００９７】
第1〜第8の局面の1つの態様において、任意のEASはフルオロフォア部分および/またはクエンチャー部分を含む。
【００９８】
第1〜第8の局面の1つの態様において、任意のパートザイム、組織化助長因子、MNAザイム基質、DF、EAS1、EAS2、EAS3、EAS4、EAS5、EAS6、EAS7、EAS8、またはSIOは、ホスホロチオエート、4-アセチルシチジン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウリジン、2'-O-メチルシチジン、5-カルボキシメチルアミノメチルチオウリジン、ジヒドロウリジン、2'-O-メチルプソイドウリジン、β D-ガラクトシルケオシン、2'-O-メチルグアノシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデノシン、1-メチルアデノシン、1-メチルプソイドウリジン、1-メチルグアノシン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアノシン、2-メチルアデノシン、2-メチルグアノシン、3-メチルシチジン、5-メチルシチジン、N6-メチルアデノシン、7-メチルグアノシン、5-メチルアミノメチルウリジン、5-メトキシアミノメチル-2-チオウリジン、β D-マンノシルメチルウリジン、5-メトキシカルボニルメチルウリジン、5-メトキシウリジン、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデノシン、N-((9-β-リボフラノシル-2-メチルチオプリン-6-イル)カルバモイル)スレオニン、N-((9-β-リボフラノシルプリン-6-イル)N-メチル-カルバモイル)スレオニン、ウリジン-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウリジン-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、プソイドウリジン、ケオシン、2-チオシチジン、5-メチル-2-チオウリジン、2-チオウリジン、4-チオウリジン、5-メチルウリジン、N-((9-β-D-リボフラノシルプリン-6-イル)カルバモイル)スレオニン、2'-O-メチル-5-メチルウリジン、2'-O-メチルウリジン、ワイブトシン、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン、β D-アラビノシルウリジン、およびβ D-アラビノシルチミジンからなる群より選択される、少なくとも1つのヌクレオチド置換または付加を含む。
【００９９】
第3の局面の1つの態様において、MNAザイムパートザイム、MNAザイム基質、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも1つは、アプタマーまたはその一部をさらに含む。
【０１００】
第3の局面の1つの態様において、アプタマーまたはその一部は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、それらの誘導体、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも1つを含む。
【０１０１】
第1〜第8の局面の1つの態様において、任意のMNAザイムパートザイム、MNAザイム基質、EAS1、EAS2、EAS3、EAS4、EAS5、EAS6、EAS7、EAS8、SIO、DF、またはヌクレアーゼは、固体支持体に付着している。
【０１０２】
第1、第2、および第7の局面の1つの態様において、第1のDFは標的の存在下でのみ産生される。
【０１０３】
第3の局面および第4〜第7の局面の1つの態様において、第1のDFは標的とは異なる。
【０１０４】
第1および第2の局面の1つの態様において、組成物は標的を検出するためのものであり、第1のDFは該標的とは異なる。
【０１０５】
第3の局面の1つの態様において、任意のEASは、別のEASとハイブリダイズして、複数のDFとハイブリダイズし得る部分的酵素シグナル増幅因子(PESA)複合体を形成することができる。
【０１０６】
第3の局面の1つの態様において、組成物は、標的分子の異なる部分に特異的な第1および第2のMNAザイムを含む。
【０１０７】
第3の局面の1つの態様において、標的分子の異なる部分に特異的なMNAザイムは、該標的の存在下で組織化した場合に、同じ基質を認識し切断する。
【０１０８】
第3の局面の1つの態様において、組成物は、異なる標的に対して特異性を有する少なくとも2つの異なるMNAザイムを含む。
【０１０９】
第4〜第6および第8の局面の1つの態様において、組成物は、異なる標的に対して相補性を有する少なくとも2つの異なるSIOを含む。
【０１１０】
第4〜第6および第8の局面の1つの態様において、組成物は、異なる第1のDFと組織化される少なくとも2つの異なる第1のCESA複合体を含む。
【０１１１】
第9の局面において、本発明は、以下の段階を含む、標的を検出するための方法を提供する：
(a) 2つまたはそれ以上のパートザイムおよび少なくとも1つの多成分核酸(MNAザイム)基質を提供する段階であって、パートザイムは標的の存在下で自己組織化して、少なくとも1つのMNAザイムを形成する、段階；
(b) MNAザイムの自己組織化および触媒活性を可能にする条件下で、標的を含むと推定される試料とパートザイムを接触させる段階であって、MNAザイムの触媒活性により、少なくとも1つのMNAザイム基質から第1のドライバー断片オリゴヌクレオチド(DF)が生成される、段階；
(c) 第1の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS1)および第2の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS2)を提供する段階であって、EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部は第1のDFの一部と相補的である、段階；
(d) 以下を可能にする条件下で、EAS1およびEAS2を第1のDFと接触させる段階：
(1) 第1の完全酵素シグナル増幅因子(CESA)複合体を形成するための、第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化、ならびに
(2) 第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位の形成；
(e) 第1のヌクレアーゼを提供する段階；ならびに
(f) ヌクレアーゼと認識部位との相互作用および切断部位での切断を可能にする条件下で、第1のヌクレアーゼを第1のCESA複合体と接触させる段階であって、第1のヌクレアーゼによる切断は、標的の存在を示す検出可能な影響をもたらす、段階。
【０１１２】
第9の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼは、第1のヌクレアーゼの認識部位および/または切断部位を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる。
【０１１３】
第9の局面の1つの態様において、第1のDFは、MNAザイム基質の切断によって産生される。
【０１１４】
第9の局面の1つの態様において、第1のDFは、2つまたはそれ以上のMNAザイム基質の核酸連結によって産生される。
【０１１５】
第9の局面の1つの態様において、MNAザイム基質は、第1の鎖および第2の鎖を含むオリゴヌクレオチド複合体の第1の鎖であり、第1の鎖は内部ループ部分を含み、内部ループ部分内の塩基は第2の鎖の塩基とハイブリダイズせず、MNAザイムは内部ループ部分を切断することができる。
【０１１６】
第9の局面の1つの態様において、第2の鎖は第1のDFを含む。
【０１１７】
第9の局面の1つの態様において、第1の鎖と第2の鎖はヘアピンループ部分によって一方の末端で連結されている。
【０１１８】
第9の局面の1つの態様において、MNAザイム基質はヘアピンオリゴヌクレオチドのヘアピンループ部分であり、MNAザイムはヘアピンループ部分を切断することができ、第1のドライバー断片はヘアピンオリゴヌクレオチド内の二本鎖基部の一方の鎖中に位置する。
【０１１９】
第10の局面において、本発明は、以下の段階を含む、標的を検出する方法を提供する：
(a) 少なくとも第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド(SIO)を提供する段階；
(b) SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、ひいては第1のヌクレアーゼの二重鎖基質を作出する条件下で、標的を含むと推定される試料とSIOを接触させる段階；
(c) SIOと標的のハイブリダイゼーションによって形成された二重鎖基質を切断し得る第1のヌクレアーゼを提供する段階であって、第1のヌクレアーゼによる二重鎖基質の切断により第1のDFが生成される、段階；
(d) EAS1およびEAS2を提供する段階であって、EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部は第1のDFの一部と相補的である、段階；
(e) 以下を可能にする条件下で、EAS1およびEAS2を第1のDFと接触させる段階：
(1) 第1のCESAを形成するための、第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化、ならびに
(2) 第2のヌクレアーゼの認識部位および切断部位の形成；
(f) 第2のヌクレアーゼを提供する段階；ならびに
(g) 第2のヌクレアーゼと認識部位との相互作用および切断部位での切断を可能にする条件下で、第2のヌクレアーゼを第1のCESAと接触させる段階であって、第2のヌクレアーゼによる切断は、標的の存在を示す検出可能な影響をもたらす、段階。
【０１２０】
第11の局面において、本発明は、以下の段階を含む、標的を検出する方法を提供する：
(a) 少なくとも第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド(SIO)を提供する段階；
(b) SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、ひいては第1のヌクレアーゼのための二重鎖構造を作出する条件下で、標的を含むと推定される試料とSIOを接触させる段階；
(c) SIOが標的とハイブリダイズした場合にのみSIOを切断し得る第1のヌクレアーゼと二重鎖構造を接触させる段階であって、第1のヌクレアーゼはSIOを切断して第1のDFを生成する、段階；
(d) EAS1およびEAS2を提供する段階であって、EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部は第1のDFの一部と相補的である、段階；
(e) 以下を可能にする条件下で、EAS1およびEAS2を第1のDFと接触させる段階：
(1) 第1のCESAを形成するための、第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化、ならびに
(2) 第2のヌクレアーゼの認識部位および切断部位の形成；
(f) 第2のヌクレアーゼを提供する段階；ならびに
(g) 第2のヌクレアーゼと認識部位との相互作用および切断部位での切断を可能にする条件下で、第2のヌクレアーゼを第1のCESAと接触させる段階であって、第2のヌクレアーゼによる切断は、標的の存在を示す検出可能な影響をもたらす、段階。
【０１２１】
第12の局面において、本発明は、以下の段階を含む、標的を検出する方法を提供する：
(a) 少なくとも第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド(SIO)を提供する段階；
(b) SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、ひいては第1のヌクレアーゼのための二重鎖構造を作出する条件下で、標的を含むと推定される試料とSIOを接触させる段階；
(c) 標的がSIOとハイブリダイズした場合にのみ標的を切断し得る第1のヌクレアーゼと二重鎖構造を接触させる段階であって、第1のヌクレアーゼは標的を切断して第1のDFを生成する、段階；
(d) EAS1およびEAS2を提供する段階であって、EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部は第1のDFの一部と相補的である、段階；
(e) 以下を可能にする条件下で、EAS1およびEAS2を第1のDFと接触させる段階：
(1) 第1のCESAを形成するための、第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化、ならびに
(2) 第2のヌクレアーゼの認識部位および切断部位の形成；
(f) 第2のヌクレアーゼを提供する段階；ならびに
(g) 第2のヌクレアーゼと認識部位との相互作用および切断部位での切断を可能にする条件下で、第2のヌクレアーゼを第1のCESAと接触させる段階であって、第2のヌクレアーゼによる切断は、標的の存在を示す検出可能な影響をもたらす、段階。
【０１２２】
第10〜第12の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼは、SIOが標的とハイブリダイズした場合にのみ、SIOを切断して第1のDFを生成する。
【０１２３】
第10〜第12の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼは、標的がSIOとハイブリダイズした場合にのみ、標的を切断して第1のDFを生成する。
【０１２４】
第10〜第12の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼは制限酵素ではない。
【０１２５】
第10〜第12の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼである。
【０１２６】
第10〜第12の局面の1つの態様において、第1のCESA複合体の切断によりさらなるDFの放出が可能になり、さらなるDFはさらなる酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドと組織化してさらなるCESA複合体を形成し、少なくとも1つのヌクレアーゼを用いてさらなるCESA複合体が切断されて、さらなる検出可能な影響がもたらされ、かつさらなるDFが放出され、それによって検出可能な影響のさらなる増加が促進される。
【０１２７】
第13の局面において、本発明は、以下の段階を含む、カスケードを用いて標的を検出する方法を提供する：
(a) 第1のDFを生成する段階であって、第1のDFは標的の存在下でのみ生成される、段階；
(b) 以下のものを提供する段階：
(i) EAS1およびEAS2、ただし：
EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり：
EAS1の一部は第1のDFの一部と相補的であり；かつ
EAS1またはEAS2の一部は第2のDFを含む；
ならびに、
(ii) 第3の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS3)および第4の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS4)、ただし：
EAS3の一部はEAS4の一部と相補的であり；
EAS3の一部は第2のDFの一部と相補的である；
(c) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化を可能にして、第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESA複合体を形成させる条件下における、EAS1およびEAS2と(a)の第1のDF；
(ii) 第1のヌクレアーゼと第1のCESA複合体の認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第1のCESA複合体と第1のヌクレアーゼ、ただし、第1のヌクレアーゼによる切断部位での切断により第2のDFが放出される；
(d) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第2のDFとEAS3およびEAS4の組織化を可能にして、第2のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第2のCESA複合体を形成させる条件下における、EAS3およびEAS4と第2のDF；
(ii) 第2のヌクレアーゼと第2のCESA複合体の認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第2のCESA複合体と第2のヌクレアーゼ、ただし、第2のヌクレアーゼは該切断部位で第2のCESA複合体を切断する；
ただし、第1のCESA複合体および/または第2のCESA複合体の切断は、検出可能な影響をもたらす。
【０１２８】
第13の局面の1つの態様において、第1のCESA複合体および第2のCESA複合体の切断はそれぞれ、検出可能な影響をもたらす。
【０１２９】
第13の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼは同じヌクレアーゼである。
【０１３０】
第13の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼは異なるヌクレアーゼである。
【０１３１】
第13の局面の1つの態様において、EAS3またはEAS4の一部は付加的なDFを含み、第2のヌクレアーゼによる第2のCESA複合体の切断部位での切断により、該付加的なDFが放出される。
【０１３２】
第13の局面の1つの態様において、付加的なDFの一部は第5の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS5)の第1の部分と相補的であり、EAS5の第2の部分は第6の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS6)の一部と相補的であり、かつEAS5およびEAS6は該付加的なDFと組織化して、第3のCESA複合体を形成する。
【０１３３】
第13の局面の1つの態様において：
(i) 付加的なDFの一部は第1のDFと同一であるか；
(ii) 付加的なDFは第1のDFと同一であるか；または
(iii) 付加的なDFは第1のDFの断片であり；
該付加的なDFはEAS1およびEAS2と組織化して、第1のCESA複合体を形成することができる。
【０１３４】
第14の局面において、本発明は、以下の段階を含む、カスケードを用いて複数の異なる標的を検出する方法を提供する：
(a) 少なくとも第1のDFおよび第2のDFを産生する段階であって、第1のDFは第1の標的の存在下でのみ生成され、第2のDFは第2の標的の存在下でのみ産生される、段階；
(b) 以下のものを提供する段階：
(i) EAS1およびEAS2、ただし：
EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり：
EAS1の一部は第1のDFの一部と相補的である；ならびに、
(ii) EAS3およびEAS4、ただし：
EAS3の一部はEAS4の一部と相補的であり：
EAS3の一部は第2のDFの一部と相補的である；
(c) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化を可能にして、第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESA複合体を形成させる条件下における、EAS1およびEAS2と(a)の第1のDF；
(ii) 第1のヌクレアーゼと第1のCESA複合体の認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第1のCESA複合体と第1のヌクレアーゼ、ただし、第1のヌクレアーゼは該切断部位で第1のCESA複合体を切断して、第1の検出可能な影響をもたらす；
(d) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第2のDFとEAS3およびEAS4の組織化を可能にして、第2のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第2のCESA複合体を形成させる条件下における、EAS3およびEAS4と第2のDF；
(ii) 第2のヌクレアーゼと第2のCESA複合体の認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第2のCESA複合体と第2のヌクレアーゼ、ただし、第2のヌクレアーゼは該切断部位で第2のCESA複合体を切断して、第2の検出可能な影響をもたらす；
ただし、第1の検出可能な影響は第2の検出可能な影響とは異なる。
【０１３５】
第14の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼは同じヌクレアーゼである。
【０１３６】
第14の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼは異なるヌクレアーゼである。
【０１３７】
第14の局面の1つの態様において：
(i) EAS1またはEAS2の一部は付加的なDFを含み、第1のヌクレアーゼによる第1のCESA複合体の切断部位での切断により、該付加的なDFが放出される；および
(ii) 該付加的なDFは少なくとも2つの付加的なEASオリゴヌクレオチドと組織化して付加的なCESA複合体を形成し、ヌクレアーゼによる該付加的なCESA複合体の切断により、第1の検出可能な影響が増加する。
【０１３８】
第14の局面の1つの態様において：
(i) EAS3またはEAS4の一部は付加的なDFを含み、第2のヌクレアーゼによる第2のCESA複合体の切断部位での切断により、該付加的なDFが放出される；および
(ii) 該付加的なDFは少なくとも2つの付加的なEASオリゴヌクレオチドと組織化して付加的なCESA複合体を形成し、ヌクレアーゼによる該付加的なCESA複合体の切断により、第2の検出可能な影響が増加する。
【０１３９】
第15の局面において、本発明は、以下の段階を含む、カスケードを用いて標的を検出する方法を提供する：
(a) 第1のドライバー断片を生成する段階であって、第1のドライバー断片は標的の存在下でのみ提供される、段階；
(b) 以下のものを提供する段階：
(i) EAS1およびEAS2、ただし：
EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり；
EAS1の一部は第1のDFの一部と相補的であり； 
EAS1またはEAS2の一部は第2のDFを含み；かつ
EAS1またはEAS2は支持体に連接されている；
(ii) EAS3およびEAS4、ただし：
EAS3の一部はEAS4の一部と相補的であり：
EAS3の一部は第2のDFの一部と相補的であり；
EAS3またはEAS4の一部は第3のDFを含み；かつ
EAS3またはEAS4は支持体に連接されている；
(c) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化を可能にして、第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESAを形成させる条件下における、EAS1およびEAS2と(a)の第1のDF；
(ii) 第1のヌクレアーゼと第1のCESAの認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第1のCESAと第1のヌクレアーゼ、ただし、第1のものによる該切断部位での切断により第2のDFが放出される；
(d) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第2のDFとEAS3およびEAS4の組織化を可能にして、第2のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第2のCESAを形成させる条件下における、EAS3およびEAS4と第2のDF；
(ii) 第2のヌクレアーゼと第2のCESAの認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第2のCESAと第2のヌクレアーゼ、ただし、第2のヌクレアーゼによる該切断部位での切断により、EAS1およびEAS2と組織化して第1のCESAを形成し得る第3のDFが放出される；
ただし、第1のCESA複合体および/または第2のCESA複合体の切断は、検出可能な影響をもたらす。
【０１４０】
第13〜第15の局面の1つの態様において、(a)の第1のDFは、
SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、イニシエーターヌクレアーゼによる修飾に適した二重鎖構造を形成させる条件下で、標的を含むと推定される試料とSIOを接触させること、および
二重鎖構造をイニシエーターヌクレアーゼと接触させること
によって産生され、
イニシエーターヌクレアーゼによる二重鎖構造中の対形成または非対形成領域の修飾により、第1のDFが放出される。
【０１４１】
第14の局面の1つの態様において、(a)の第2のDFは、
SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、イニシエーターヌクレアーゼによる修飾に適した二重鎖構造を形成させる条件下で、標的を含むと推定される試料とSIOを接触させること、および
二重鎖構造をイニシエーターヌクレアーゼと接触させること
によって産生され、
イニシエーターヌクレアーゼによる二重鎖構造中の対形成または非対形成領域の修飾により、第2のDFが放出される。
【０１４２】
第13〜第15の局面の1つの態様において、イニシエーターヌクレアーゼは、SIOが標的とハイブリダイズした場合にのみ、SIOを切断して前記DFを生成する。
【０１４３】
第13〜第15の局面の1つの態様において、イニシエーターヌクレアーゼは、標的がSIOとハイブリダイズした場合にのみ、標的を切断して前記DFを生成する。
【０１４４】
第13〜第15の局面の1つの態様において、イニシエーターヌクレアーゼは制限酵素ではない。
【０１４５】
第13〜第15の局面の1つの態様において、イニシエーターヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼである。
【０１４６】
第13〜第15の局面の1つの態様において、SIOは支持体に付着している。
【０１４７】
第13〜第15の局面の1つの態様において、(a)の第1のDFは、2つまたはそれ以上のパートザイムおよび少なくとも1つのMNAザイム基質を提供すること、および標的を含むと推定される試料とパートザイムを、該標的の存在下でMNAザイムの自己組織化および触媒活性を可能にする条件下で接触させることによって産生され、該触媒活性により該基質が修飾され、それによって第1のDFを提供する。
【０１４８】
第14の局面の1つの態様において、(a)の第2のDFは、2つまたはそれ以上のパートザイムおよび少なくとも1つのMNAザイム基質を提供すること、および標的を含むと推定される試料とパートザイムを、該標的の存在下でMNAザイムの自己組織化および触媒活性を可能にする条件下で接触させることによって産生され、該触媒活性により該基質が修飾され、それによって第2のDFを提供する。
【０１４９】
第13〜第15の局面の1つの態様において、MNAザイム基質は、第1の鎖および第2の鎖を含むオリゴヌクレオチド複合体の第1の鎖であり、第1の鎖は内部ループ部分を含み、内部ループ部分内の塩基は第2の鎖の塩基とハイブリダイズせず、MNAザイムは内部ループ部分を切断することができる。
【０１５０】
第13〜第15の局面の1つの態様において、第2の鎖は前記DFを含む。
【０１５１】
第13〜第15の局面の1つの態様において、第1の鎖と第2の鎖はヘアピンループ部分によって一方の末端で連結されている。
【０１５２】
第13〜第15の局面の1つの態様において、ヘアピンループ部分はオリゴヌクレオチドリンカーまたは非オリゴヌクレオチドリンカーである。
【０１５３】
第13〜第15の局面の1つの態様において、MNAザイム基質はヘアピンオリゴヌクレオチドのヘアピンループ部分であり、MNAザイムはヘアピンループ部分を切断することができ、前記ドライバー断片はヘアピンオリゴヌクレオチド内の二本鎖基部の一方の鎖中に位置する。
【０１５４】
第13〜第15の局面の1つの態様において、EAS3およびEAS4は、EAS3およびEAS4の相補的部分の間で形成される二本鎖部分、ならびにEAS3の一方の末端とEAS4の一方の末端を連結するヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチド複合体の成分である。
【０１５５】
第9〜第15の局面の1つの態様において、EAS1およびEAS2は、EAS1およびEAS2の相補的部分の間で形成される二本鎖部分、ならびにEAS1の一方の末端とEAS2の一方の末端を連結するヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチド複合体の成分である。
【０１５６】
第9〜第15の局面の1つの態様において、ヘアピンループ部分はオリゴヌクレオチドリンカーまたは非オリゴヌクレオチドリンカーである。
【０１５７】
第9〜第15の局面の1つの態様において、ヘアピンオリゴヌクレオチド複合体は、1つのEASオリゴヌクレオチドから伸長した5'または3'オーバーハング一本鎖部分をさらに含む。
【０１５８】
第9〜第15の局面の1つの態様において、ヘアピンループ部分は、検出可能な部分および/またはクエンチャー部分を含む。
【０１５９】
第9〜第15の局面の1つの態様において、EAS3および/またはEAS4は検出可能な部分および/またはクエンチャー部分を含み、検出可能な部分とクエンチャー部分は、第2のヌクレアーゼによる第2のCESAの切断時に分離して、検出可能な影響を提供する。
【０１６０】
第9〜第15の局面の1つの態様において、EAS3は検出可能な部分およびクエンチャー部分を含み、EAS4はさらなるクエンチャー部分を含み、検出可能な部分とさらなるクエンチャー部分は、第2のヌクレアーゼによる第2のCESAの切断時に分離して、検出可能な影響を提供する。
【０１６１】
第9〜第15の局面の1つの態様において、EAS1および/またはEAS2は検出可能な部分および/またはクエンチャー部分を含み、検出可能な部分とクエンチャー部分は、第1のヌクレアーゼによる第1のCESAの切断時に分離して、検出可能な影響を提供する。
【０１６２】
第9〜第15の局面の1つの態様において、EAS1は検出可能な部分およびクエンチャー部分を含み、EAS2はさらなるクエンチャー部分を含み、検出可能な部分とさらなるクエンチャー部分は、第1のヌクレアーゼによる第1のCESAの切断時に分離して、検出可能な影響を提供する。
【０１６３】
第9〜第15の局面の1つの態様において、検出可能な部分はフルオロフォアである。
【０１６４】
第9の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼは、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる。
【０１６５】
第10〜第12の局面の1つの態様において、第2のヌクレアーゼは、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる。
【０１６６】
第13〜第15の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼは、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができ、および/または第2のヌクレアーゼは、第2のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる。
【０１６７】
第9〜第15の局面の1つの態様において、ニックは、ヌクレアーゼ認識部位内に、ヌクレアーゼ切断部位に、またはヌクレアーゼ認識部位と切断部位の間に位置する。
【０１６８】
第9〜第15の局面の1つの態様において、ヌクレアーゼは、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspR Iからなる群より選択される。
【０１６９】
第9〜第15の局面の1つの態様において、第1のDFのEAS1への結合は、部分的ヌクレアーゼ認識部位および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位を完成する。
【０１７０】
第9〜第15の局面の1つの態様において、第2のDFのEAS2への結合は、部分的ヌクレアーゼ認識部位および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位を完成する。
【０１７１】
第9〜第15の局面の1つの態様において、前記DFは、部分的ヌクレアーゼ認識配列および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位に少なくとも1つの塩基を寄与する。
【０１７２】
第9〜第15の局面の1つの態様において、前記DFは、部分的ヌクレアーゼ認識部位および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位に少なくとも2つの塩基を寄与する。
【０１７３】
150. 前記DFが、部分的ヌクレアーゼ認識部位および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位に少なくとも3つの塩基を寄与する、請求項146〜149のいずれか一項記載の方法。
【０１７４】
第9〜第15の局面の1つの態様において、前記塩基は、酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドの結合によって形成される部分的ヌクレアーゼ認識部位のすぐ3'側にある。
【０１７５】
第9〜第15の局面の1つの態様において、前記塩基は、酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドの結合によって形成される部分的ヌクレアーゼ認識部位のすぐ5'側にある。
【０１７６】
第9〜第15の局面の1つの態様において、第1のDFは、ヌクレアーゼ認識部位またはヌクレアーゼ切断部位に塩基を寄与しない。
【０１７７】
第13〜第15の局面の1つの態様において、第2のDFは、ヌクレアーゼ認識部位またはヌクレアーゼ切断部位に塩基を寄与しない。
【０１７８】
第16の局面において、本発明は、以下の段階を含む、カスケードを用いて標的を検出する方法を提供する：
(a) 第1のドライバー断片を産生する段階であって、第1のドライバー断片は標的の存在下でのみ産生される、段階；
(b) 以下のものを含む第1の骨格オリゴヌクレオチドを含む第1の複合体を提供する段階：
(i) EAS1を含む第1の部分、ただし
EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり；
EAS2の一部は第1のドライバー断片の一部と相補的であり；かつ
EAS1またはEAS2の一部は第2のドライバー断片を含む；
(ii) EAS3を含む第2の部分、ただし
EAS3の一部はEAS4と相補的であり；
EAS3の一部は第2のドライバー断片の一部と相補的であり；かつ
EAS3またはEAS4の一部は第1のドライバー断片を含む；および
(iii) 第1の部分と第2の部分を接続する第3の部分；
ならびに、
(c) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化を可能にして、第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESAを形成させる条件下における、EAS1およびEAS2と(a)の第1のDF；
(ii) 第1のヌクレアーゼと第1のCESAの認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第1のCESAと第1のヌクレアーゼ、ただし、第1のヌクレアーゼによる該切断部位での切断により第2のDFが放出される；
(d) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第2のDFとEAS3およびEAS4の組織化を可能にして、第2のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第2のCESAを形成させる条件下における、EAS3およびEAS4と第2のDF；
(ii) 第2のヌクレアーゼと第2のCESAの認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第2のCESAと第2のヌクレアーゼ、ただし、第2のヌクレアーゼによる該切断部位での切断により、EAS1およびEAS2と組織化して第1のCESAを形成し得る第1のDFが放出される；
ただし、第1のCESA複合体および/または第2のCESA複合体の切断は、検出可能な影響をもたらす。
【０１７９】
第16の局面の1つの態様において、第1のCESA複合体の切断および第2のCESA複合体の切断はそれぞれ、検出可能な影響をもたらす。
【０１８０】
第16の局面の1つの態様において、方法は以下の段階をさらに含む：
(a) 以下のものを含む骨格オリゴヌクレオチドを含む第2の複合体を提供する段階：
(i) 第5の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS5)を含む第1の部分、ただし
EAS5の一部は第6の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS6)の一部と相補的であり；かつ
EAS5の一部は第2のドライバー断片の一部と相補的であり；かつ
EAS5またはEAS6の一部は第1のドライバー断片を含む；および
(ii) 第7の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS7)を含む第2の部分、ただし
EAS7の一部は第8の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS8)の一部と相補的であり；
EAS8の一部は第1のドライバー断片の一部と相補的であり；
EAS7またはEAS8の一部は第2のドライバー断片を含む；および
(iii) 第1の部分と第2の部分を接続する第3の部分、ただし、第3の部分は第1の複合体の骨格の第3の部分と相補的である；ならびに、
(b) 第1の複合体の第3の部分と第2の複合体の第3の部分のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、第1の複合体と第2の複合体を接触させ、それによって第1の二重複合体を形成させる段階；
(c) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第2のDFとEAS5およびEAS6の組織化を可能にして、第3のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第3のCESAを形成させる条件下における、EAS5およびEAS6と(a)の第2のDF；
(ii) 第3のヌクレアーゼと第3のCESAの認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第3のCESAと第3のヌクレアーゼ、ただし、第3のヌクレアーゼによる該切断部位での切断により、EAS1およびEAS2と組織化して第1のCESAを形成し得る、ならびにEAS7およびEAS8と組織化して第4のCESAを形成し得る第1のDFが放出される；ならびに
(d) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第1のDFとEAS7およびEAS8の組織化を可能にして、第4のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第4のCESAを形成させる条件下における、EAS7およびEAS8と第1のDF；
(ii) 第4のヌクレアーゼと第4のCESAの認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第4のCESAと第4のヌクレアーゼ、ただし、第4のヌクレアーゼによる該切断部位での切断により、EAS3およびEAS4と組織化して第2のCESAを形成し得る、ならびにEAS5およびEAS6と組織化して第3のCESAを形成し得る第2のDFが放出される；
ただし、第3のCESA複合体および/または第4のCESA複合体の切断は、検出可能な影響をもたらす。
【０１８１】
第16の局面の1つの態様において、第3のCESA複合体の切断および第4のCESA複合体の切断はそれぞれ、検出可能な影響をもたらす。
【０１８２】
第16の局面の1つの態様において、EAS1はEAS7と同一であり、EAS2はEAS8と同一であり、EAS3はEAS5と同一であり、および/またはEAS4はEAS6と同一である。
【０１８３】
第16の局面の1つの態様において、第1の二重複合体は第2の二重複合体に連結している。
【０１８４】
第16の局面の1つの態様において、第1の二重複合体のEAS1〜EAS8のうちのいずれか1つまたは複数と第2の二重複合体のEAS1〜EAS8のうちのいずれか1つまたは複数の連結により、第1の二重複合体は第2の二重複合体に結合している。
【０１８５】
第16の局面の1つの態様において、第1の二重複合体のEAS2および/またはEAS8と第2の二重複合体のEAS2および/またはEAS8の連結により、第1の二重複合体は第2の二重複合体に結合している。
【０１８６】
第16の局面の1つの態様において、連結は、化学的ハイブリダイゼーション、抗体、オリゴヌクレオチドリンカー、非オリゴヌクレオチドリンカー、およびペプチドリンカーのうちのいずれか1つまたは複数を用いて達成される。
【０１８７】
第16の局面の1つの態様において、連結は、酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドのうちのいずれか1つまたは複数のビオチン化、およびアビジンを用いた複数のビオチン化酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドの複合体化により達成される。
【０１８８】
第16の局面の1つの態様において、(a)の第1のDFは、
SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、イニシエーターヌクレアーゼによる修飾に適した二重鎖構造を形成させる条件下で、標的を含むと推定される試料とSIOを接触させること、および
二重鎖構造をイニシエーターヌクレアーゼと接触させること
によって産生され、
イニシエーターヌクレアーゼによる二重鎖構造中の対形成または非対形成領域の修飾により、第2のDFが放出される。
【０１８９】
第16の局面の1つの態様において、イニシエーターヌクレアーゼは、SIOが標的とハイブリダイズした場合にのみ、SIOを切断して前記DFを生成する。
【０１９０】
第16の局面の1つの態様において、イニシエーターヌクレアーゼは、標的がSIOとハイブリダイズした場合にのみ、標的を切断して前記DFを生成する。
【０１９１】
第16の局面の1つの態様において、イニシエーターヌクレアーゼは制限酵素ではない。
【０１９２】
第16の局面の1つの態様において、(a)の第1のDFは、2つまたはそれ以上のパートザイムおよび少なくとも1つのMNAザイム基質を提供すること、および標的を含むと推定される試料とパートザイムを、該標的の存在下でMNAザイムの自己組織化および触媒活性を可能にする条件下で接触させることによって生成され、該触媒活性により該基質が修飾され、それによって第1のDFが提供される。
【０１９３】
第16の局面の1つの態様において、EAS1、EAS2、EAS3、EAS4、EAS5、EAS6、EAS7、およびEAS8のうちのいずれか1つまたは複数は、検出可能な部分およびクエンチャー部分を含み、検出可能な部分とクエンチャー部分は、第1、第2、第3、および/または第4のCESAの切断時に分離して、検出可能な影響を提供する。
【０１９４】
第16の局面の1つの態様において：
(i) EAS1は検出可能な部分を含み、かつEAS2はクエンチャー部分を含む、もしくはその逆である；および/または
(ii) EAS3は検出可能な部分を含み、かつEAS4はクエンチャー部分を含む、もしくはその逆である；および/または
(iii) EAS5は検出可能な部分を含み、かつEAS6はクエンチャー部分を含む、もしくはその逆である；
(iv) EAS7は検出可能な部分を含み、かつEAS8はクエンチャー部分を含む、もしくはその逆である；
ただし、検出可能な部分とクエンチャー部分は、第1、第2、第3、および/または第4のCESAの切断時に分離して、検出可能な影響を提供する。
【０１９５】
第16の局面の1つの態様において、ヌクレアーゼは、第1、第2、または第3のヌクレアーゼの認識配列を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる。
【０１９６】
第16の局面の1つの態様において、ヌクレアーゼは、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspRIからなる群より選択される。
【０１９７】
第16の局面の1つの態様において、任意の前記DFの酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドへの結合は、部分的ヌクレアーゼ認識部位および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位を完成する。
【０１９８】
第9〜16の局面の1つの態様において、EAS1およびEAS2；EAS3およびEAS4；EAS5およびEAS6；ならびにEAS7およびEAS8より選択される一対の酵素増幅因子基質は、該対の各メンバーの相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、および基部の一方の末端に連結しているヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である。
【０１９９】
第9〜第16の局面の1つの態様において、任意の第1のDFは、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼより選択されるヌクレアーゼを用いて生成される。
【０２００】
第9〜第16の局面の1つの態様において、エキソヌクレアーゼは、ヌクレアーゼBAL-31、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼIII、T7エキソヌクレアーゼ、T7エキソヌクレアーゼI、およびエキソヌクレアーゼTからなるより選択される。
【０２０１】
第9〜第16の局面の1つの態様において、エンドヌクレアーゼは、T7エンドヌクレアーゼI、RNase H、フラップヌクレアーゼ、またはマングビーンヌクレアーゼである。
【０２０２】
第17の局面において、本発明は、以下の段階を含む、カスケードを用いて標的を検出する方法を提供する：
(a) 以下のものを提供する段階：
(i) 標的鎖と相補的な第1の部分および該標的鎖と相補的でない第2の部分、ただし、第1の部分と第2の部分はホスホロチオエートによって分離されており、第2の部分は第1のDFを含む；ならびに
(ii) EAS1およびEAS2、ただし、EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、EAS1とEAS2のハイブリダイゼーションは、両末端に3'オーバーハングを有する二重鎖構造を提供し、かつEAS1の一部は第1のDFの一部と相補的である；
(iii) 第1のエキソヌクレアーゼ；ならびに
(b) 以下のものを接触させる段階：
(i) SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、ひいては第1のエキソヌクレアーゼの二重鎖基質を作出する条件下における、標的を含むと推定される試料とSIO、ただし、第1のエキソヌクレアーゼによる二重鎖構造の修飾により、二重鎖基質から第1のDFが放出される；
(ii) 第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化を可能にして、第2のエキソヌクレアーゼの基質を含む第1のCESA複合体を形成させる条件下における、EAS1およびEAS2と(b)の第1のDF；
(iii) 第2のエキソヌクレアーゼと第1のCESA複合体との相互作用を可能にする条件下における、第1のCESAと第2のエキソヌクレアーゼ、ただし、第2のエキソヌクレアーゼによる第1のCESA複合体の修飾により、第1のCESA複合体から、付加的なEAS1およびEAS2と組織化して付加的な第1のCESA複合体を形成し得る第1のDFが放出される；
ただし、二重鎖構造の該修飾および/または第1のCESA複合体の該修飾は、検出可能な影響を提供する。
【０２０３】
第17の局面の1つの態様において、二重鎖構造の前記修飾および第1のCESA複合体の前記修飾は、検出可能な影響をもたらす。
【０２０４】
第17の局面の1つの態様において、SIOは、2つの相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、一本鎖ヘアピンループ、および3'オーバーハングを含むヘアピンオリゴヌクレオチドである。
【０２０５】
第17の局面の1つの態様において、第1および/または第2のエキソヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼIIIである。
【０２０６】
第17の局面の1つの態様において、SIOおよび/またはEAS1は検出可能な部分およびクエンチャー部分を含み、検出可能な部分とクエンチャー部分は、エキソヌクレアーゼによる修飾時に分離して、検出可能な影響を提供し得る。
【０２０７】
第17の局面の1つの態様において、検出可能な部分はフルオロフォアである。
【０２０８】
第9〜第17の局面の1つの態様において、検出可能な影響は、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分光法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射測定、測光法、シンチグラフィー、電子的方法、UV、可視光、もしくは赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせによって検出される。
【０２０９】
第9〜第17の局面の1つの態様において、検出可能な影響が測定され、該測定の大きさおよび/または検出可能な影響の蓄積率は、標的の量を示す。
【０２１０】
第9〜第17の局面の1つの態様において、標的は、核酸、タンパク質、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオン、核酸、またはそれらの任意の誘導体、部分、もしくは組み合わせからなる群より選択される。
【０２１１】
第9〜第17の局面の1つの態様において、核酸は、DNA、メチル化DNA、アルキル化DNA、RNA、メチル化RNA、マイクロRNA、siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、プレおよびプリマイクロRNA、他の非コードRNA、リボソームRNA、それらの誘導体、それらの単位複製配列、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
【０２１２】
第9〜第17の局面の1つの態様において、核酸の供給源は、合成、哺乳動物、ヒト、動物、植物、真菌、細菌、ウイルス、古細菌、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
【０２１３】
第9〜第17の局面の1つの態様において、核酸は増幅される。
【０２１４】
第10〜第16の局面の1つの態様において、第1のDFは標的とは異なる。
【０２１５】
第9〜第17の局面の1つの態様において、任意のEASは別のEASとハイブリダイズして、複数のDFとハイブリダイズし得る部分的酵素シグナル増幅因子(PESA)複合体を形成することができる。
【０２１６】
第9および第13〜第16の局面の1つの態様において、方法は、標的分子の異なる部分に特異的な第1および第2のMNAザイムを用いる段階を含む。
【０２１７】
第9および第13〜第16の局面の1つの態様において、標的分子の異なる部分に特異的なMNAザイムは、該標的の存在下で組織化した場合に、同じ基質を認識し切断する。
【０２１８】
第9および第13〜第16の局面の1つの態様において、方法は、異なる標的に対して特異性を有する少なくとも2つの異なるMNAザイムを用いる段階を含む。
【０２１９】
第10〜第16の局面の1つの態様において、方法は、異なる標的に対して相補性を有する少なくとも2つの異なるSIOを用いる段階を含む。
【０２２０】
第9〜第16の局面の1つの態様において、方法は、異なる第1のDFと組織化される少なくとも2つの異なる第1のCESA複合体を用いる段階を含む。
【０２２１】
第18の局面において、本発明は、以下のものを含む、シグナルを増幅するためのキットを提供する：
ヌクレアーゼ；ならびに
EAS1およびEAS2、ただし、EAS1とEAS2の一部は相補的であり、EAS1およびEAS2は、ドライバー断片オリゴヌクレオチドと組織化した場合にのみ、該ヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む複合体を形成する。
【０２２２】
第19の局面において、本発明は、以下のものを含む、標的を検出するためのキットを提供する：
ヌクレアーゼ；
EAS1およびEAS2、ただし、EAS1とEAS2の一部は相補的である；
標的に対応するMNAザイムを組織化するように設計された複数のパートザイム；ならびに
MNAザイム基質、ただし、該基質の一部はEAS1の一部と相補的である；
ただし、EAS1およびEAS2は、ドライバー断片オリゴヌクレオチドと組織化した場合にのみ、該ヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む複合体を形成する。
【０２２３】
第20の局面において、本発明は、以下のものを含む、標的を検出するためのキットを提供する：
ヌクレアーゼ；
EAS1およびEAS2、ただし、EAS1とEAS2の一部は相補的である；
標的とハイブリダイズしてヌクレアーゼ基質を形成するように設計された複数のSIO；
ただし、ヌクレアーゼ基質の一部はEAS1の一部と相補的であり、
EAS1およびEAS2は、ドライバー断片オリゴヌクレオチド(DF)と組織化した場合にのみ、該ヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む複合体を形成する。
【０２２４】
第21の局面において、本発明は、第1の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS1)および第2の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS2)を含むキットであって、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、EAS1およびEAS2が、第1のドライバー断片オリゴヌクレオチド(DF)と組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識および切断配列を含む第1の完全酵素シグナル増幅因子(CESA)複合体を形成し、第1のDFの一部がEAS1の一部と相補的である、キットを提供する。
【０２２５】
第22の局面において、本発明は、EAS1、EAS2、および第1のヌクレアーゼを含むキットであって、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、EAS1およびEAS2が、第1のDFと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成し、第1のDFの一部がEAS1の一部と相補的である、キットを提供する。
【０２２６】
第23の局面において、本発明は、多成分核酸酵素(MNAザイム)、MNAザイム基質、EAS1、EAS2、および第1のヌクレアーゼを含むキットであって：
MNAザイムが、MNAザイム組織化助長因子の存在下で自己組織化してMNAザイムを形成する少なくとも第1のパートザイムおよび第2のパートザイムを含み、少なくとも第1および第2のパートザイムのそれぞれが基質アーム部分、触媒コア部分、およびセンサーアーム部分を含み、第1および第2のパートザイムをそれらそれぞれの触媒コア部分の会合のために近接して維持して、MNAザイムの触媒コアを形成するように、センサーアームがMNAザイム組織化助長因子と相互作用し、触媒コアがMNAザイム基質を修飾して第1のDFを形成することができ；
ならびに、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部が第1のDFの一部と相補的であり、第1のDFがEAS1およびEAS2と組織化して、少なくとも第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESA複合体を形成することができる、
キットを提供する。
【０２２７】
第23の局面の1つの態様において、MNAザイム基質は、第1の鎖および第2の鎖を含むオリゴヌクレオチド複合体の第1の鎖であり、第1の鎖は内部ループ部分を含み、内部ループ部分内の塩基は第2の鎖の塩基とハイブリダイズせず、MNAザイムは内部ループ部分を切断することができる。
【０２２８】
第23の局面の1つの態様において、第2の鎖は第1のDFを含む。
【０２２９】
第23の局面の1つの態様において、第1の鎖と第2の鎖はヘアピンループ部分によって一方の末端で連結されている。
【０２３０】
第23の局面の1つの態様において、MNAザイム基質はヘアピンオリゴヌクレオチドのヘアピンループ部分であり、MNAザイムはヘアピンループ部分を切断することができ、第1のドライバー断片はヘアピンオリゴヌクレオチド内の二本鎖基部の一方の鎖中に位置する。
【０２３１】
第23の局面の1つの態様において、組織化助長因子は、同定される標的である。
【０２３２】
第24の局面において、本発明は、第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド(SIO)、EAS1、EAS2、第1のヌクレアーゼ、および第2のヌクレアーゼを含むキットであって：
SIOが標的とハイブリダイズして二重鎖基質を形成することができ、第1のヌクレアーゼが二重鎖基質を切断して第1のDFを生成することができ；ならびに
EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部が第1のDFの一部と相補的であり、EAS1およびEAS2が、第1のDFと組織化した場合にのみ、第2のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成する、
キットを提供する。
【０２３３】
第25の局面において、本発明は、第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド(SIO)、EAS1、EAS2、および第1のヌクレアーゼ、および第2のヌクレアーゼを含むキットであって：
SIOが標的とハイブリダイズして二重鎖構造を形成することができ、第1のヌクレアーゼが、SIOが標的とハイブリダイズした場合にのみ、SIOを切断して第1のDFを生成することができ；ならびに
EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部が第1のDFの一部と相補的であり、EAS1およびEAS2が、第1のDFと組織化した場合にのみ、第2のヌクレアーゼの認識および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成する、
キットを提供する。
【０２３４】
第26の局面において、本発明は、第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド(SIO)、EAS1、EAS2、第1のヌクレアーゼ、および第2のヌクレアーゼを含むキットであって：
SIOが標的とハイブリダイズして二重鎖構造を形成することができ、第1のヌクレアーゼが、標的がSIOとハイブリダイズした場合にのみ、標的を切断して第1のDFを生成することができ；
EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部が第1のDFの一部と相補的であり、EAS1およびEAS2が、第1のDFと組織化した場合にのみ、第2のヌクレアーゼの認識および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成し；
ならびに、第1のヌクレアーゼが制限エンドヌクレアーゼではない、
キットを提供する。
【０２３５】
第24〜第26の局面の1つの態様において、ヌクレアーゼは、SIOが標的とハイブリダイズした場合にのみ、SIOを切断して第1のDFを生成することができる。
【０２３６】
第24〜第26の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼは、標的がSIOとハイブリダイズした場合にのみ、標的を切断して第1のDFを生成することができる。
【０２３７】
第24〜第26の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼは制限酵素ではない。
【０２３８】
第24〜第26の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼである。
【０２３９】
第24〜第26の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼは同じヌクレアーゼである。
【０２４０】
第24〜第26の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼは異なるヌクレアーゼである。
【０２４１】
第21〜第26の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼは、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる。
【０２４２】
第24〜第26の局面の1つの態様において、第2のヌクレアーゼは、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる。
【０２４３】
第21〜第26の局面の1つの態様において、ニックは、ヌクレアーゼ認識部位内に、ヌクレアーゼ切断部位に、またはヌクレアーゼ認識部位と切断部位の間に位置する。
【０２４４】
第21〜第26の局面の1つの態様において、ヌクレアーゼは、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspR Iからなる群より選択される。
【０２４５】
第18〜第26の局面の1つの態様において、EAS1およびEAS2は、EAS1およびEAS2の相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、ならびにEAS1の一方の末端とEAS2の一方の末端を連結するヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である。
【０２４６】
第18〜第26の局面の1つの態様において、ヘアピンオリゴヌクレオチドは、EAS1またはEAS2のいずれかから伸長した一本鎖5'または3'オーバーハング部分を含む。
【０２４７】
第18〜第26の局面の1つの態様において、EAS1またはEAS2の一部は第2のDFを含み、第2のDFは、ヌクレアーゼによる第1のCESA複合体の修飾時に放出され得る。
【０２４８】
第18〜第26の局面の1つの態様において、ヘアピンループ部分の一部は第2のDFを含み、第2のDFは、ヌクレアーゼによる第1のCESA複合体の修飾時に放出され得る。
【０２４９】
第18〜第26の局面の1つの態様において、第1のDFと第2のDFは同一ではない。
【０２５０】
第18〜第26の局面の1つの態様において、第1のDFと第2のDFは同一である。
【０２５１】
第18〜第26の局面の1つの態様において、第2のDFは第1のDFの断片であるか、または第1のDFは第2のDFの断片である。
【０２５２】
第18〜第26の局面の1つの態様において、第2のDF、EAS1、およびEAS2は組織化して、第1のCESA複合体を形成することができる。
【０２５３】
第18〜第26の局面の1つの態様において、キットは、第3の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS3)および第4の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS4)をさらに含み、EAS3の一部はEAS4の一部と相補的であり、かつEAS3の一部は第2のDFの一部と相補的であり、EAS3およびEAS4は、第2のDFと組織化した場合にのみ、付加的なヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第2のCESA複合体を形成する。
【０２５４】
第18〜第26の局面の1つの態様において、EAS3またはEAS4は第3のDFを含む。
【０２５５】
第18〜第26の局面の1つの態様において、第3のDFは第1のDFと同一である。
【０２５６】
第18〜第26の局面の1つの態様において、第3のDFは第1のDFと同一ではない。
【０２５７】
第18〜第26の局面の1つの態様において、付加的なヌクレアーゼは前記キット中の別のヌクレアーゼと同一である。
【０２５８】
第18〜第26の局面の1つの態様において、付加的なヌクレアーゼは前記キット中の別のヌクレアーゼと同一ではなく、該キットは該付加的なヌクレアーゼを含む。
【０２５９】
第18〜第26の局面の1つの態様において、付加的なヌクレアーゼは、第2のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる。
【０２６０】
第18〜第26の局面の1つの態様において、ヌクレアーゼは、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspR Iからなる群より選択される。
【０２６１】
第18〜第26の局面の1つの態様において、EAS3およびEAS4は、EAS3およびEAS4の相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、ならびにEAS3の一方の末端とEAS4の一方の末端を連結するヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である。
【０２６２】
第18〜第26の局面の1つの態様において、ヘアピンオリゴヌクレオチドは、EAS3またはEAS4のいずれかから伸長した一本鎖5'または3'オーバーハング部分を含む。
【０２６３】
第27の局面において、本発明は、骨格オリゴヌクレオチド、EAS1、EAS2、EAS3、およびEAS4を含む第1の複合体を含むキットであって、該骨格オリゴヌクレオチドが：
(i) EAS1を含む第1の部分、ただし、EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、EAS2の一部は第1のDFの一部と相補的であり、EAS1またはEAS2の一部は第2のDFを含み、EAS1およびEAS2は、第1のDFと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成する；
(ii) EAS3を含む第2の部分、ただし、EAS3の一部はEAS4の一部と相補的であり、EAS3の一部は第2のDFの一部と相補的であり、EAS3またはEAS4の一部は第1のDFを含み、EAS3およびEAS4は、第2のDFと組織化した場合にのみ、第2のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第2のCESA複合体を形成する；ならびに
(iii) 第1の部分と第2の部分を接続する第3の部分
を含む、キットを提供する。
【０２６４】
第27の局面の1つの態様において、キットは、骨格オリゴヌクレオチド、第5の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS5)、第6の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS6)、第7の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS7)、および第8の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS8)を含む第2の複合体をさらに含み、該骨格オリゴヌクレオチドは以下を含む：
(i) EAS5を含む第1の部分、ただし、EAS5の一部はEAS6の一部と相補的であり、EAS5の一部は第2のDFの一部と相補的であり、EAS5またはEAS6の一部は第1のDFを含み、EAS5およびEAS6は、第2のDFと組織化した場合にのみ、第3のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第3のCESA複合体を形成する；ならびに
(ii) EAS7を含む第2の部分、ただし、EAS7の一部はEAS8の一部と相補的であり、EAS8の一部は第1のDFの一部と相補的であり、EAS7またはEAS8の一部は第2のDFを含み、EAS7およびEAS8は、第1のDFと組織化した場合にのみ、第4のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第4のCESA複合体を形成する；ならびに
(iii) 第1の部分と第2の部分を接続する第3の部分、ただし、第3の部分は第1の複合体の骨格の第3の部分と相補的である。
【０２６５】
第27の局面の1つの態様において、EAS1はEAS7と同一であり、EAS2はEAS8と同一であり、EAS3はEAS5と同一であり、および/またはEAS4はEAS6と同一である。
【０２６６】
第27の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼは第3のヌクレアーゼと同一であり、ならびに/または第2のヌクレアーゼは第4のヌクレアーゼと同一であり、ならびに/または第1、第2、第3、および第4のヌクレアーゼは同一である。
【０２６７】
第27の局面の1つの態様において、第1の複合体と第2の複合体は、それらそれぞれの相補的な第3の部分を介してハイブリダイズして、第1の二重複合体を形成する。
【０２６８】
第27の局面の1つの態様において、第1の二重複合体は第2の二重複合体に連結している。
【０２６９】
第27の局面の1つの態様において、第1の二重複合体のEAS1〜EAS8のうちのいずれか1つまたは複数と第2の二重複合体のEAS1〜EAS8のうちのいずれか1つまたは複数の連結により、第1の二重複合体は第2の二重複合体に連結している。
【０２７０】
第27の局面の1つの態様において、第1の二重複合体のEAS2および/またはEAS8と第2の二重複合体のEAS2および/またはEAS8の連結により、第1の二重複合体は第2の二重複合体に連結している。
【０２７１】
第27の局面の1つの態様において、連結は、化学的ハイブリダイゼーション、抗体、オリゴヌクレオチドリンカー、非オリゴヌクレオチドリンカー、およびペプチドリンカーのうちのいずれか1つまたは複数を用いて達成される。
【０２７２】
第27の局面の1つの態様において、連結は、酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドのうちのいずれか1つまたは複数のビオチン化、およびアビジンを用いた複数のビオチン化酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドの複合体化により達成される。
【０２７３】
第27の局面の1つの態様において、第1および/または第2のヌクレアーゼは、第2のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる。
【０２７４】
第27の局面の1つの態様において、第1および/または第2のヌクレアーゼは、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspR Iからなる群より選択される。
【０２７５】
第27の局面の1つの態様において、EAS1およびEAS2；EAS3およびEAS4；EAS5およびEAS6；ならびにEAS7およびEAS8より選択される一対の酵素増幅因子基質は、該対の各メンバーの相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、および基部の一方の末端に連結しているヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である。
【０２７６】
第28の局面において、本発明は、以下のものを含むSIOを含むキットを提供する：
(i) 標的鎖と相補的な第1の部分および該標的鎖と相補的でない第2の部分、ただし、第1の部分と第2の部分はホスホロチオエートによって分離されており、第2の部分は第1のDFを含む；ならびに
(ii) EAS1およびEAS2、ただし
EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、EAS1とEAS2のハイブリダイゼーションは、両末端に3'オーバーハングを有する二重鎖構造を提供し、
EAS1の一部は第1のDFの一部と相補的であり、かつ
EAS1およびEAS2は、第1のDFと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼによって消化され得る陥凹3'末端を含む第1のCESA複合体を形成することができる。
【０２７７】
第28の局面の1つの態様において、SIOは、2つの相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、一本鎖ヘアピンループ、および3'オーバーハングを含むヘアピンオリゴヌクレオチドである。
【０２７８】
第28の局面の1つの態様において、ヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼである。
【０２７９】
第18〜第28の局面の1つの態様において、任意のEASは1つまたは複数の検出可能な標識を含む。
【０２８０】
第18〜第28の局面の1つの態様において、任意のEASはフルオロフォア部分およびクエンチャー部分を含む。
【０２８１】
第18〜第28の局面の1つの態様において、任意のMNAザイムパートザイム、MNAザイム基質、EAS1、EAS2、EAS3、EAS4、EAS5、EAS6、EAS7、EAS8、SIO、DF、またはヌクレアーゼは、固体支持体に付着している。
【０２８２】
第19、第20、および第23〜第26の局面の1つの態様において、任意の第1のDFは標的とは異なる。
【０２８３】
第19および第23の局面の1つの態様において、キットは、標的分子の異なる部分に特異的な第1および第2のMNAザイムを含む。
【０２８４】
第19および第23の局面の1つの態様において、標的分子の異なる部分に特異的なMNAザイムは、該標的の存在下で組織化した場合に、同じ基質を認識し切断する。
【０２８５】
第19および第23の局面の1つの態様において、キットは、異なる標的に対して特異性を有する少なくとも2つの異なるMNAザイムを含む。
【０２８６】
第20、第24〜第26、および第28の局面の1つの態様において、キットは、異なる標的に対して相補性を有する少なくとも2つの異なるSIOを含む。
【０２８７】
第29の局面において、本発明は第1〜第8の局面のいずれか1つの組成物を含むキットを提供する。
【０２８８】
第19〜第29の局面の1つの態様において、キットは、該キットを使用するための説明書をさらに含む。
【０２８９】
別の局面において、少なくとも第1の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS1)および少なくとも第2の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS2)を含む組成物であって、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、EAS1およびEAS2が、ドライバー断片オリゴヌクレオチド(DF)と組織化した場合にのみ、ヌクレアーゼの認識および切断配列を含む完全酵素シグナル増幅因子複合体(CESA)を形成し、DFの一部がEAS1の一部と相補的である、組成物が提供される。
【０２９０】
別の局面において、少なくとも第1の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS1)および少なくとも第2の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS2)および少なくとも第1のヌクレアーゼを含む組成物であって、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、EAS1およびEAS2が、ドライバー断片オリゴヌクレオチド(DF)と組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識および切断配列を含む完全酵素シグナル増幅因子複合体(CESA)を形成し、DFの一部がEAS1の一部と相補的である、組成物が提供される。ヌクレアーゼは制限酵素であってよい。
【０２９１】
別の局面において、少なくとも第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド(SIO)、少なくとも第1の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS1)、少なくとも第2の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS2)、少なくとも第1のヌクレアーゼ、および少なくとも第2のヌクレアーゼを含む組成物であって；
SIOが標的とハイブリダイズして二重鎖基質を形成することができ、第1のヌクレアーゼが二重鎖基質を切断してドライバー断片(DF)を生成することができ；ならびに
EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部がDFの一部と相補的であり、EAS1およびEAS2が、DFと組織化した場合にのみ、第2のヌクレアーゼの認識および切断配列を含む完全酵素シグナル増幅因子複合体(CESA)を形成する、
組成物が提供される。
【０２９２】
第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼは同じヌクレアーゼであってよく、あるいは第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼは異なるヌクレアーゼであってもよい。
【０２９３】
別の局面において、少なくとも1つのMNAザイム、少なくとも1つのMNAザイム基質、および少なくとも第1の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS1)、および少なくとも第2の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS2)、および少なくとも第1のヌクレアーゼを含む組成物であって：
MNAザイムが、MNAザイム組織化助長因子の存在下で自己組織化してMNAザイムを形成する少なくとも第1のパートザイムおよび第2のパートザイムを含み、少なくとも第1および第2のパートザイムのそれぞれが基質アーム部分、触媒コア部分、およびセンサーアーム部分を含み、第1および第2のパートザイムをそれらそれぞれの触媒コア部分の会合のために近接して維持して、MNAザイムの触媒コアを形成するように、センサーアームがMNAザイム組織化助長因子と相互作用し、触媒コアがMNAザイム基質を修飾してドライバー断片(DF)を形成することができ；
ならびに、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部がDFの一部と相補的であり、DFがEAS1およびEAS2と組織化して、少なくとも第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む完全酵素シグナル増幅因子複合体(CESA)を形成することができる、
組成物が提供される。
【０２９４】
組織化助長因子は、同定される標的であってよい。第1および/または第2のヌクレアーゼは、制限酵素、エンドヌクレアーゼ、またはエキソヌクレアーゼからなる群より選択され得る。エンドヌクレアーゼは、T7エンドヌクレアーゼIまたはマングビーンヌクレアーゼであってよい。エキソヌクレアーゼは、ヌクレアーゼBAL-31、エキソヌクレアーゼ1、エキソヌクレアーゼIII、T7エキソヌクレアーゼ、T7エキソヌクレアーゼI、またはエキソヌクレアーゼTであってよい。1つの態様において、エキソヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼIIIである。
【０２９５】
別の局面において、以下の段階を含む、標的を検出する方法が提供される：
(a) 少なくとも第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド(SIO)を提供する段階；
(b) SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、ひいては第1のヌクレアーゼの二重鎖基質を作出する条件下で、標的を含むと推定される試料とSIOを接触させる段階；
(c) SIOと標的のハイブリダイゼーションによって形成された二重鎖基質を切断し得る第1のヌクレアーゼを提供する段階であって、第1のヌクレアーゼによる二重鎖基質の切断によりドライバー断片(DF)が生成される、段階；
(d) 第1の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS1)および第2の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS2)を提供する段階であって、EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部はDFの一部と相補的である、段階；
(e) 以下を可能にする条件下で、EAS1およびEAS2をドライバー断片と接触させる段階：
(1) CESAを形成するための、DFとEAS1およびEAS2の組織化、ならびに
(2) 第2のヌクレアーゼの認識および切断部位の形成；
(f) 第2のヌクレアーゼを提供する段階；ならびに
(g) 第2のヌクレアーゼと認識部位との相互作用および切断部位での切断を可能にする条件下で、第2のヌクレアーゼをCESAと接触させる段階であって、第2のヌクレアーゼによる切断は、標的の存在を示す検出可能な影響をもたらす、段階。
【０２９６】
別の局面において、以下の段階を含む、標的を検出するための方法が提供される：
(a) 2つまたはそれ以上のパートザイムおよび少なくとも1つのMNAザイム基質を提供する段階であって、パートザイムは標的の存在下で自己組織化して、少なくとも1つのMNAザイムを形成する、段階；
(b) MNAザイムの自己組織化および触媒活性を可能にする条件下で、標的を含むと推定される試料とパートザイムを接触させる段階であって、MNAザイムの触媒活性により、少なくとも1つのMNAザイム基質からドライバー断片(DF)が産生される、段階；
(c) 第1の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS1)および第2の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS2)を提供する段階であって、EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部はDFの一部と相補的である、段階；
(d) 以下を可能にする条件下で、EAS1およびEAS2をドライバー断片と接触させる段階：
(1) CESAを形成するための、DFとEAS1およびEAS2の組織化、ならびに
(2) ヌクレアーゼの認識および切断部位の形成
(e) ヌクレアーゼを提供する段階；
(f) ヌクレアーゼと認識部位との相互作用および切断部位での切断を可能にする条件下で、ヌクレアーゼをCESAと接触させる段階であって、ヌクレアーゼによる切断は、標的の存在を示す検出可能な影響をもたらす、段階。
【０２９７】
第5および第6の局面の方法におけるヌクレアーゼは、制限酵素、エンドヌクレアーゼ、またはエキソヌクレアーゼの群より選択され得る。エンドヌクレアーゼは、T7エンドヌクレアーゼIまたはマングビーンヌクレアーゼであってよい。エキソヌクレアーゼは、ヌクレアーゼBAL-31、エキソヌクレアーゼ1、エキソヌクレアーゼIII、T7エキソヌクレアーゼ、T7エキソヌクレアーゼI、またはエキソヌクレアーゼTであってよい。1つの態様において、エキソヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼIIIである。
【０２９８】
ドライバー断片は、MNAザイム基質の切断、または2つもしくはそれ以上のMNAザイム基質の核酸連結によって産生され得る。
【０２９９】
EAS1は検出可能な部分およびクエンチャー部分を含んでよく、ヌクレアーゼによるEAS1の切断時に、検出可能な部分によって提供される検出可能な影響は増加または減少する。別の態様において、EAS1は検出可能な部分を含んでよく、かつEAS2はクエンチャー部分を含んでよい。あるいは、EAS2は検出可能な部分を含んでよく、かつEAS1はクエンチャー部分を含んでよい。ヌクレアーゼによる切断時に、検出可能な部分によって提供される検出可能な影響は増加または減少し得る。
【０３００】
CESAの切断によりさらなるドライバー断片の放出が可能になり、ドライバー断片はさらなるEAS1およびEAS2と組織化してさらなるCESAを形成してよく、少なくとも1つのさらなるヌクレアーゼはさらなるCESAを切断して、さらなる検出可能な影響をもたらし、かつさらなるドライバー断片を放出させ、それによって検出可能な影響のさらなる増加が促進される。
【０３０１】
検出可能な影響は、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分光法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射測定、測光法、シンチグラフィー、電子的方法、UV、可視光、もしくは赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせによって検出され得る。
【０３０２】
検出可能な影響を測定することができ、測定の大きさは標的の量を示し得る。
【０３０３】
標的は、核酸、タンパク質、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオン、核酸、またはそれらの任意の誘導体、部分、もしくは組み合わせの群より選択され得る。
【０３０４】
核酸は、DNA、メチル化DNA、アルキル化DNA、RNA、メチル化RNA、マイクロRNA、siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、プレおよびプリマイクロRNA、他の非コードRNA、リボソームRNA、それらの誘導体、それらの単位複製配列、またはそれらの任意の組み合わせの群より選択され得る。
【０３０５】
核酸の供給源は、合成、哺乳動物、ヒト、動物、植物、真菌、細菌、ウイルス、古細菌、およびそれらの任意の組み合わせの群より選択され得る。
【０３０６】
核酸を増幅することができる。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)、鎖置換増幅(SDA)、ループ媒介性等温増幅(LAMP)、ローリングサークル増幅(RCA)、転写物媒介性増幅(TMA)、自律的配列複製(3SR)、核酸配列に基づく増幅(NASBA)、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法(RT-PCR)のうちの1つまたは複数を含み得る。
【０３０７】
パートザイム、組織化助長因子、MNAザイム基質、ドライバー断片、EAS1、EAS2、またはSIOのうちの少なくとも1つは、ホスホロチオエート、4-アセチルシチジン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウリジン、2'-O-メチルシチジン、5-カルボキシメチルアミノメチルチオウリジン、ジヒドロウリジン、2'-O-メチルプソイドウリジン、β D-ガラクトシルケオシン、2'-O-メチルグアノシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデノシン、1-メチルアデノシン、1-メチルプソイドウリジン、1-メチルグアノシン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアノシン、2-メチルアデノシン、2-メチルグアノシン、3-メチルシチジン、5-メチルシチジン、N6-メチルアデノシン、7-メチルグアノシン、5-メチルアミノメチルウリジン、5-メトキシアミノメチル-2-チオウリジン、β D-マンノシルメチルウリジン、5-メトキシカルボニルメチルウリジン、5-メトキシウリジン、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデノシン、N-((9-β-リボフラノシル-2-メチルチオプリン-6-イル)カルバモイル)スレオニン、N-((9-β-リボフラノシルプリン-6-イル)N-メチル-カルバモイル)スレオニン、ウリジン-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウリジン-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、プソイドウリジン、ケオシン、2-チオシチジン、5-メチル-2-チオウリジン、2-チオウリジン、4-チオウリジン、5-メチルウリジン、N-((9-β-D-リボフラノシルプリン-6-イル)カルバモイル)スレオニン、2'-O-メチル-5-メチルウリジン、2'-O-メチルウリジン、ワイブトシン、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン、β D-アラビノシルウリジン、およびβ D-アラビノシルチミジンからなる群より選択される、少なくとも1つのヌクレオチド置換または付加を含む。
【０３０８】
いくつかの態様において、CESAの標的化切断によるシグナルの生成を妨げる部位における、オリゴヌクレオチド断片の特異的なエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ消化を妨げるために、ヌクレオチド類似体を含めることができる。好ましい態様において、ホスホロチオエート連結を用いて、T7エキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼIII、および/またはエキソヌクレアーゼIなどのヌクレアーゼの切断を阻害することができる。
【０３０９】
MNAザイムパートザイム、MNAザイム基質、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも1つは、少なくとも1つのアプタマーまたはその一部をさらに含み得る。アプタマーまたはその一部は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質、またはそれらの誘導体もしくは組み合わせのうちの少なくとも1つを含み得る。
【０３１０】
アプタマーまたはその一部は、核酸、タンパク質、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオン、またはそれらの任意の誘導体、部分、もしくは組み合わせの群より選択される標的と結合し得る。
【０３１１】
MNAザイムパートザイム、MNAザイム基質、EAS1、EAS2、SIO、または少なくとも1つのヌクレアーゼのうちの少なくとも1つは、固体支持体に付着していてよい。
【０３１２】
別の局面において、以下のものを含む、シグナルを増幅するためのキットが提供される：
ヌクレアーゼ；ならびに
EAS1およびEAS2、ただし、EAS1とEAS2の一部は相補的であり、EAS1およびEAS2は、ドライバー断片オリゴヌクレオチドと組織化した場合にのみ、該ヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む完全酵素シグナル増幅因子複合体(CESA)を形成する。
【０３１３】
別の局面において、以下のものを含む、標的を検出するためのキットが提供される：
ヌクレアーゼ；
EAS1およびEAS2、ただし、EAS1とEAS2の一部は相補的である；
標的に対応するMNAザイムを組織化するように設計された複数のパートザイム；ならびに
MNAザイム基質、ただし、該基質の一部はEAS1の一部と相補的である；
ただし、EAS1およびEAS2は、ドライバー断片オリゴヌクレオチドと組織化した場合にのみ、該ヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む完全酵素シグナル増幅因子複合体(CESA)を形成する。
【０３１４】
別の局面において、以下のものを含む、標的を検出するためのキットが提供される：
ヌクレアーゼ；
EAS1およびEAS2、ただし、EAS1とEAS2の一部は相補的である；
標的とハイブリダイズしてヌクレアーゼ基質を形成するように設計された複数のSIO；
ただし、ヌクレアーゼ基質の一部はEAS1の一部と相補的であり；かつ
EAS1およびEAS2は、ドライバー断片オリゴヌクレオチドと組織化した場合にのみ、該ヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む完全酵素シグナル増幅因子複合体(CESA)を形成する。
【０３１５】
本発明のこれらおよび他の局面を、図面および実施例を参照して、以下により詳細に記載するが、図面および実施例は本発明のいくつかの局面を説明するものであり、本発明の全体を包含しているわけではなく、それらは添付の特許請求の範囲の意義および範囲の中で変化形および変更が可能であることを当業者は明白に理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０３１６】
添付の図面に関して、本発明の好ましい態様を、ほんの一例としてここで記載する。
【図１】図1は、種々の切断可能および切断不可能な二重鎖オリゴヌクレオチド構造体の例示的な図解を提供している。各オリゴヌクレオチド断片の5'末端を丸によって示す。構造体A（i）は、ヌクレアーゼによる切断を受けやすいマルチオリゴヌクレオチド複合体である完全酵素シグナル増幅因子（CESA）複合体の例を図解している。このCESAは、3種のオリゴヌクレオチド、すなわち酵素増幅因子基質オリゴ1（EAS1）、酵素増幅因子基質オリゴ2（EAS2）、およびドライバー断片（DF）から構成される。A（i）に図解されているCESAにおいて、DFの5'末端はEAS2の3'末端と接している。DFの3'末端がEAS2の5'末端と接している第2のCESAは、A（ii）に図解されている。  構造体B（i）は、切断を受けやすい二重鎖構造体の形成を妨害する付加的配列の存在により、RE等のヌクレアーゼによる切断に抵抗性のマルチオリゴヌクレオチド複合体である酵素阻害性複合体（EIC）の例を図解している。このEICは、3種のオリゴヌクレオチド、すなわちEAS1、EAS2、および阻害性断片（InF）から構成される。InFは、DFの配列に加えて、EAS2との接合を妨害しかつEIC複合体をヌクレアーゼ消化に対して抵抗性にする付加的配列を含有している。EIC B（i）において、InFの5'末端はEAS2の3'末端を妨害する。InFの3'末端がEAS2の5'末端を妨害する第2のEICは、B（ii）に図解されている。  構造体C（i）は、切断を受けやすい二重鎖構造体を形成するのに必要とされる配列の欠如により、RE等のヌクレアーゼによる切断に抵抗性があるマルチオリゴヌクレオチド複合体である部分的酵素シグナル増幅因子（PESA）複合体の例を図解している。この図解において、PESAは、2種のオリゴヌクレオチド、すなわちEAS1およびEAS2から構成される。このPESAは、ヌクレアーゼによる認識および／または切断に充分な二重鎖配列を含有していない。PESA C（i）において、EAS1の5'末端に不充分な二重鎖配列が存在する。EAS1の3'末端に不充分な二重鎖配列が存在する第2のPESAは、C（ii）に図解されている。
【図２】図2は、制限エンドヌクレアーゼ（RE）によって切断されるように設計された、種々の十分に組織化した完全酵素シグナル増幅因子（CESA）複合体の例示的なスキーマを示している。これらの略図において、上段の黒い実線はCESAの酵素増幅因子基質オリゴ断片1（EAS1）を表し、下段の黒い実線はCESAの酵素増幅因子基質オリゴ断片2（EAS2）を表す。ドライバー断片（白い中央部を有する黒い線によって表されるDF）は、RE（陰影線のボックスとして表される）の認識配列を完成させるのに必要とされ得、かつ／またはREによる切断に必要とされるRE認識部位に隣接した付加的配列を提供し得る。切断部位は、黒い実線の垂直矢印によって表される。  REによる切断は、5'突出、3'突出のいずれかをもたらし得、またはそれは平滑末端を生成し得る。REは、EAS1、EAS2、およびDFを含む二本鎖の組織化したCESAのうちの一方または両方の鎖を切断し得る。EAS2とDFとが接する位置は、連続した（断裂していない）二本鎖の二重鎖をREが通常切断する位置であってよく、またはそれは、REによる認識および切断に必要とされる配列を有する他の位置であってよい。EAS2に接するDFの末端は、より長いオリゴ、例えば前の工程における阻害性断片（InF）の切断によって生成され得る。InFは、例えばヌクレアーゼによって切断可能な合成イニシエーターオリゴ（SIO）、またはMNAザイムによって切断可能なMNAザイム基質を含んでよい。タンパク質酵素またはMNAザイムによるそのようなより長いオリゴの切断は、5'および3'断片をもたらし得、それらの一方または両方は、CESAの完成のためのDFとして働き得る。そのような場合、EAS2に接するDFの末端は、切断されたオリゴの3'断片の5'末端、または切断されたオリゴの5'断片の3'末端でなければならない。  パネル（a）：REの認識配列を完成させるためにDFが必要とされ、かつRE切断が3'突出をもたらす、DFを有する組織化したCESA。この例において、EAS2と接するDFの末端は、3'切断断片の5'末端である。  パネル（b）：REの認識配列を完成させるためにDFが必要とされ、かつRE切断が5'突出をもたらす、DFを有する組織化したCESA。この例において、EAS2と接するDFの末端は、3'切断断片の5'末端である。  パネル（c）：REの認識配列を完成させるためにDFが必要とされ、かつRE切断が平滑末端をもたらす、DFを有する組織化したCESA。この例において、EAS2と接するDFの末端は、3'切断断片の5'末端である。  パネル（d）：REの認識配列を完成させるためにDFが必要とされ、かつREが一方の鎖のみを、この図解においてはEAS1を切断する、DFを有する組織化したCESA。この例において、EAS2と接するDFの末端は、3'切断断片の5'末端である。  パネル（e）：DFは、REの認識配列を完成させるために必要とされず、むしろREによる切断のために必要とされるRE認識部位に隣接する配列を提供する、DFを有する組織化したCESA。この例において、EAS2と接するDFの末端は、3'切断断片の5'末端である。  パネル（f）：REの認識配列を完成させるためにDFが必要とされ、かつRE切断が5'突出をもたらす、DFを有する組織化したCESA。この例において、EAS2と接するDFの末端は、5'切断断片の3'末端である。  パネル（g）：DFが、REによる切断のために必要とされる完全なRE認識配列の一方の鎖を提供することによってREの認識配列を完成させる、DFを有する組織化したCESA。この例において、EAS2と接するDFの末端は、3'切断断片の5'末端である。  パネル（h）：DFが、REによる切断のために必要とされる完全なRE認識配列の一方の鎖を提供することによってREの認識配列を完成させる、DFを有する組織化したCESA。この例において、EAS2と接するDFの末端は、5'切断断片の3'末端である。
【図３】図3は、実施例1の種々の切断可能および切断不可能な二重鎖オリゴヌクレオチド構造体の例示的な図解である。各オリゴヌクレオチド断片の5'末端を丸によって示す。完全または部分的な制限酵素認識部位を点線のボックスとして示し、制限酵素切断部位を実線の垂直矢印として示す。パネルAは、酵素による切断を受けやすいマルチオリゴヌクレオチド複合体である完全酵素シグナル増幅因子（CESA）複合体の例を図解している。この図および実施例1において、酵素は、その認識部位から離れて切断する制限酵素（RE）Mnl Iである。このCESAは、3種のオリゴヌクレオチド、すなわちフルオロフォアおよびクエンチャーで標識されている酵素増幅因子基質オリゴ1（上段の黒い実線によって表されるEAS1）、クエンチャーで標識された酵素増幅因子基質オリゴ2（下段の黒い実線によって表されるEAS2）、ならびにドライバー断片（白い中央部を有する黒い線によって表されるDF）から構成される。このCESAにおいて、DFの5'末端はEAS2の3'末端と接している。このCESAの切断は、REによるEAS1およびEAS2オリゴヌクレオチドの切断により蛍光の増大をもたらすが、しかしながら、DFは切断されず、そのため、別の部分的酵素シグナル増幅因子（PESA）複合体に結合することができる。このような、CESAの切断を用いてシグナルを増幅する反応を「EzyAmp」反応と称する。  パネルBは、REによる切断に抵抗性があるマルチオリゴヌクレオチド複合体である酵素阻害性複合体（EIC）の例を図解している。このEICは、3種のオリゴヌクレオチド、すなわちEAS1、EAS2、および阻害性断片（InF）から構成される。InFは、DFの配列全体（RERを完成させるために必要とされる塩基を含む）を含むが、REによる切断に必要とされる構造体の形成を妨害する付加的配列も含む。このEICにおいて、InFの5'末端は、EAS2の3'末端に接し、かつEAS2の3'末端における結合を妨害する。InFは、標的の存在下においてのみ切断されてDFを産生し得るオリゴ配列を含んでよい。例えば、InFは、標的特異的な様式でヌクレアーゼによって切断可能なSIO、またはMNAザイムによって切断可能なMNAザイム基質を含んでよい。  パネルCは、ヌクレアーゼ、例えばRE Mnl Iによる切断に抵抗性があるマルチオリゴヌクレオチド複合体である部分的酵素シグナル増幅因子複合体（PESA）の例を図解している。このPESAは、2種のオリゴヌクレオチド、すなわちEAS1およびEAS2から構成される。このPESAは、REによって必要とされる二本鎖の認識配列を含有していない。  パネルDは、EAS1のみを含有しており、ゆえにREによる切断を受けにくい対照の例を図解している。RE認識部位および切断部位を形成するためには、EAS1に相補的な配列が必要とされるため、切断は起こり得ない。
【図４】図4は、EzyAmp反応の一例を図解している。第1の酵素増幅因子基質オリゴ（EAS1）および第2の酵素増幅因子基質（EAS2）オリゴを含むPESA複合体を含有している反応において、ドライバー断片（DF）（標的依存的な酵素修飾によって生成される、または反応混合物に直接添加される）が存在する。DFは、PESA複合体と組織化して、ヌクレアーゼ認識部位および切断部位を含有しているCESAを生成するものであって、この図解において、ヌクレアーゼは制限酵素である。EAS1、EAS2、およびDFのそれぞれにおける丸は、各オリゴの5'末端を示す。制限酵素認識部位を点線のボックスとして示し、制限酵素切断部位を実線の垂直矢印によって示す。この図解において、第1のEAS1はフルオロフォア（F）で標識されており、第2のEAS2はクエンチャー（Q）で標識されている。後に成分の解離が続く、組織化したCESAの切断は、蛍光シグナルの生成および無傷DFの放出をもたらす。DFは、次いで遊離して別のPESAと結びつき、オリゴのさらなる酵素的切断およびそれに続く蛍光につながる別のCESAを形成する。ゆえに、プロセスは継続し、かつさらなるCESAのヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）を介した切断によって蛍光シグナルが産生されるシグナル増幅をもたらす。
【図５】図5は、REによるCESAの切断によってシグナル増幅が仲介される、MNAザイムによって開始されるEzyAmp反応の例示的なスキーマである。Aのボックスは、その基質（白い中央部を有する黒い線）に結合している組織化したMNAザイム（灰色の実線）を図解しており、Bのボックスは、2つの部分的酵素シグナル増幅因子（PESA）複合体（黒い実線）を図解するものであって、そのそれぞれは、この図解においてフルオロフォア（F）およびクエンチャー（Q）で標識された酵素増幅因子基質オリゴ1（EAS1）、ならびにこの図解においてクエンチャー（Q）で標識された酵素増幅因子基質オリゴ2（EAS2）をなす。Cのボックスは、EAS1、EAS2、およびここではドライバー断片（DF）として機能する、切断されたMNAザイム基質の一方の断片によって形成される、完全酵素シグナル増幅因子（CESA）複合体を図解している。EAS1、EAS2、MNAザイムパートザイム、MNAザイム基質、およびDFのそれぞれにおける丸は、各オリゴヌクレオチドの5'末端を示す。制限酵素認識部位を点線のボックスとして示し、制限酵素切断部位を実線の垂直矢印として示す。反応における種々の工程に、1〜6の番号が付されている。以下の工程を用いたこの反応によって、標的DNAまたはRNAの検出が可能となる。工程1において、標的は、パートザイムと組織化して、MNAザイム基質を切断するMNAザイムを形成する。工程2において、切断されたMNAザイム基質の一方の断片は、PESAと結合し、そこでそれはDFとして機能しかつCESAの形成をもたらす。工程3において、十分に組織化したCESAはREによって切断される。工程4において、切断されたCESA断片は解離し、フルオロフォアとクエンチャーの分離につながり、ゆえに標的核酸の存在の指標である蛍光の増大を産生する。このスキームにおいて、DF自体は実際にはREによって切断されないため、それは遊離して別のPESAと結びつき（工程5）、REによって切断され得る新たなCESAを形成し（工程6）、ゆえに蛍光シグナルのさらなる増幅につながる。
【図６】図6は、REによる、本例ではMnl IによるCESAの切断によってシグナル増幅が仲介される、MNAザイムによって開始されるEzyAmp反応によって生成される蛍光シグナルの図解である。本例において、開始（MNAザイムによる）およびシグナル増幅（REによる）の2つの工程は、各工程に伴う蛍光の変化を観察することによって同時に観測された。標的組織化助長因子（AF-PD1）の存在下におけるMNAザイムレポーター基質（Sub1(8:9)-FB）のMNAザイム切断の標的依存的な開始工程を、クエンチャーからのFAMの分離後（両方とも、MNAザイムレポーター基質上に存在する）のFAMの増大によって観測した。EAS1、EAS2、およびDFから形成されるCESA複合体内にEAS1を組み入れた場合、シグナルを増幅するEzyAmp工程を、JOEとクエンチャーとの間にあるこのEAS1オリゴの切断後のJOE蛍光の増大によって観測した。標的（AF-PD1）を含有している反応または標的を欠いている反応（対照）のすべての成分は、1つの反応チャンバー内に存在しており、FAMおよびJOEの両方の蛍光は同時に観測された。FAMチャンネルにおいて、標的組織化助長因子AF-PD1の存在下におけるSub1(8:9)-FBのMNAザイムを介した切断は（（i）標的AF-PD1）、経時的なFAM蛍光の増大およびDFの産生をもたらした。AF-PD1を欠いている反応において（（ii）標的なしの対照）、経時的なFAM蛍光の増大はなかった。JOEチャンネルにおいて、標的AF-PD1の存在下におけるSub1-FBのMNAザイム切断によって生成されるDFの存在下におけるRE活性は（（iii）標的AF-PD1）、CESAの切断および経時的なJOE蛍光の増大を引き起こした。対照的に、AF-PD1を欠いている反応は（（iv）標的なしの対照）、経時的なJOE蛍光の増大を示さなかった。
【図７】図7は、複数種のCESA複合体を含有しているEzyAmpシステムの例示的なスキーマである。EAS1、EAS2、およびDFのそれぞれにおける丸は、各オリゴの5'末端を示す。制限酵素認識部位を点線のボックスとして示し、制限酵素切断部位を実線の垂直矢印として示す。この図解において、CESA A*は、DF-aと組み合わせたPESA Aから形成される。CESA B*は、DF-bと組み合わせたPESA Bから形成される。DF-aは、分析物の存在がより大きなオリゴヌクレオチド断片の切断、例えばSIOの標的依存的ヌクレアーゼ切断またはMNAザイム基質の標的依存的MNAザイム切断をもたらす条件下で、標的分析物の存在下において形成される。DF-aは、PESA Aと組み合わさって、REによって切断されるCESA A*を形成し、DF-aへの改変なしでDF-bを産生し、かつシグナルが生成され得る。次いで、DF-aは、新たなCESA A*を形成し、かつDF-b分子のシグナルおよび数の両方を増幅し得る。加えて、DF-bは、PESA Bと組み合わさって、REによって切断され得るCESA B*を形成し、DF-bを改変することなくさらなるシグナルを産生し得る。したがって、DF-bは、さらなるCESA B*を形成し、かつシグナルをさらに増幅することができる。
【図８】図8は、大腸菌（E.coli）由来のエキソヌクレアーゼIの3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を用いた、ドライバー断片（DF）を生成するためのメカニズムを図解している。この酵素は、DNA二重鎖から3'一本鎖突出を除去する。灰色の縞模様の線は標的DNAを表し、黒い実線は、ドライバー断片の生成を助長するために混合物に添加された合成イニシエーターオリゴ（SIO）を表す。閉じた丸はオリゴの5'末端を表す。灰色の実線は、DFのハイブリダイゼーションによってCESAに変換されるPESAを表す。開いた丸は、この位置でのエキソヌクレアーゼIによる複合体の切断を阻止するために組み入れられた、3'突出上のホスホロチオエートを表す。左のパネルにおいて、ドライバー断片は標的に由来する。右のパネルにおいて、DFは合成イニシエーターオリゴに由来する。右のパネルのスキームにおいて、標的は再利用されて、より多くのDFを生成することができる。
【図９】図9は、マングビーンヌクレアーゼのエキソヌクレアーゼ活性を用いた、ドライバー断片を生成するためのメカニズムを図解している。このエンドヌクレアーゼは、3'または5'方向のいずれかから、DNA二重鎖から一本鎖突出を分解し、平滑末端を残す。縞模様の灰色の線は標的DNAを表し、黒い実線は、DFの生成を助長するために混合物に添加された合成イニシエーターオリゴ（SIO）を表す。閉じた丸はオリゴの5'末端を表す。灰色の実線は、DFのハイブリダイゼーションによってCESAに変換されるPESAを表す。左のパネルにおいて、ドライバー断片は標的に由来する。右のパネルにおいて、DFは合成イニシエーターオリゴに由来する。左（L）または右（R）のパネルの両方に描かれている方法は、2つの工程（1および2）で実施されて、マングビーンヌクレアーゼによるPESAまたはCESAの消化を阻止し得る。これは、物理的分離または他の手段によって達成され得る。
【図１０】図10は、エキソヌクレアーゼIIIのエキソヌクレアーゼ活性を用いた、ドライバー断片を生成するためのメカニズムを図解している。この酵素は、DNA二重鎖の3'末端からヌクレオチドを除去する。該酵素は、平滑のまたは陥凹した3'末端上で活性を有するが、一本鎖DNA上では活性を有さず、ゆえに3'突出末端を切断しない。該酵素は、二重鎖DNAにおけるニックからの加水分解を始動して、一本鎖のギャップを産生することもできる。オリゴ上のホスホロチオエートヌクレオチド（空洞の丸によって示される）の存在によって、このエキソヌクレアーゼ活性はブロックされる。縞模様の灰色の線は標的DNAを表し、黒い実線は、DFの生成を助長するために混合物に添加された合成イニシエーターオリゴを表す。閉じた丸はオリゴの5'末端を表す。灰色の実線は、DFのハイブリダイゼーションによってCESAに変換されるPESAを表す。DFの3'フラップにおけるホスホロチオエートによって、この断片がCESAを完成させた場合に生成されるニックでの切断が阻止される。DFはSIOに由来し、無傷の標的は再利用されて、より多くのDFを生成することができる。
【図１１】図11は、T7エキソヌクレアーゼのエキソヌクレアーゼ活性を用いた、ドライバー断片を生成するためのメカニズムを図解している。この酵素は、リン酸化された5'ヌクレオチド上でより高い活性を有して、DNA二重鎖またはDNA/RNA二重鎖の5'末端からヌクレオチドを除去する。5'ホスフェートのない5'末端上での活性は、リン酸化基質の存在下において大幅に低下する。縞模様の灰色の線は標的RNAを表し、黒い実線は、DFの生成を助長するために混合物に添加された合成イニシエーターオリゴを表す。Pは5'末端におけるリン酸化されたヌクレオチドを表す。灰色の実線は、DFのハイブリダイゼーションによってCESAに変換されるPESAを表す。DFは合成イニシエーターオリゴ（SIO）に由来し、RNA標的は再利用されて、より多くのDFを生成することができる。PESAは、DNAから構成されるが、T7エキソヌクレアーゼによる分解を阻止するために、二重鎖の5'末端（点線のボックス）にいくつかのRNAを有してもよい。
【図１２】図12は、Mnl I等のREによるCESAの切断によってシグナル増幅が仲介される、MNAザイムによって開始されるEzyAmp反応によって生成される蛍光シグナルの図解である。本例において、開始およびシグナル増幅の2つの工程は、各工程に伴う蛍光の変化を観察することによって同時に観測された。標的組織化助長因子（AF-PD1）の存在下におけるMNAザイムレポーター基質（Sub1-TRB2：TXRおよびクエンチャーで標識されている）のMNAザイム切断の標的依存的な開始工程を、クエンチャーからのTXRの分離後のTXRの増大によって観測した。EAS1、EAS2、およびDFから形成されるCESA複合体内にEAS1を組み入れた場合、シグナルを増幅するEzyAmp工程を、JOEとクエンチャーとの間にあるこのEAS1オリゴの切断後のJOE蛍光の増大によって観測した。標的（AF-PD1）を含有している反応または標的を欠いている反応（対照）のすべての成分は、1つの反応チャンバー内に存在しており、TXRおよびJOEの両方の蛍光は同時に観測された。TXRチャンネルにおいて、標的組織化助長因子AF-PD1の存在下におけるSub1-TRB2のMNAザイム切断は（（i）標的AF-PD1）、経時的なTXR蛍光の増大およびDFの産生をもたらした。AF-PD1を欠いている反応において（（ii）標的なしの対照）、経時的なTXR蛍光の増大はなかった。JOEチャンネルにおいて、標的AF-PD1の存在下におけるMNAザイム切断によって生成されるDFの存在下におけるRE活性は（（iii）標的AF-PD1）、CESAの切断および経時的なJOE蛍光の増大を引き起こした。対照的に、AF-PD1を欠いている反応は（（iv）標的なしの対照）、経時的なJOE蛍光の増大を示さなかった。
【図１３】図13は、任意の標的のセットに対する等温のユニバーサルな多重化シグナル増幅のためのストラテジーを図解している。オリゴヌクレオチドのそれぞれにおける丸は、各オリゴの5'末端を表す。制限酵素認識部位を点線のボックスとして示す。複数種の標的の多重解析のためのストラテジーは、複数種のユニバーサル基質を切断する複数種のMNAザイムを用いて、複数種のユニバーサルPESAと組織化し得る複数種のユニバーサルドライバー断片を生成して、複数種のユニバーサルCESAを形成する。3種の標的、標的1、標的2、および標的3の検出のためのストラテジーを図解している。標的1は、ユニバーサルMNAザイム基質1を切断し得るMNAザイムの組織化を引き起こし得る。ユニバーサルMNAザイム基質1の切断は、PESA1と組織化し得るユニバーサルドライバー断片1の生成をもたらして、CESA1を形成し得る。CESA1を固有のフルオロフォア1で標識することができ、ヌクレアーゼで切断されると、標的1の存在を示す固有の波長における蛍光をもたらす。同様に、標的2は、ユニバーサルMNAザイム基質2を切断し得るMNAザイムの組織化を引き起こし得る。ユニバーサルMNAザイム基質2の切断は、PESA2と組織化し得るユニバーサルドライバー断片2の生成をもたらして、CESA2を形成し得る。CESA2を固有のフルオロフォア2で標識することができ、ヌクレアーゼで切断されると、標的2の存在を示す固有の波長における蛍光をもたらし得る。標的3は、ユニバーサルMNAザイム基質3を切断し得るMNAザイムの組織化を引き起こし得る。ユニバーサルMNAザイム基質3の切断は、PESA3と組織化し得るユニバーサルドライバー断片3の生成をもたらして、CESA3を形成し得る。CESA3を固有のフルオロフォア3で標識することができ、ヌクレアーゼで切断されると、標的3の存在を導く固有の波長における蛍光をもたらし得る。CESA1および2および3が切断されると、フルオロフォア1および2および3に伴う蛍光を、1つの反応で同時に観測することができる。  そのようなユニバーサル多重化システムにおいて、新たな標的を多重化反応内に容易に代入することができる。例えば、ユニバーサルMNAザイム基質1／PESA1／CESA1／フルオロフォア1のシステムは、新たな標的に特異的なセンサーアームを有し、しかしながらMNAザイム基質1への結合に適した基質アームを保持し続ける、新たなMNAザイムの合成を必要とするのみである。MNAザイム基質1の切断は常に同じドライバー断片1を産生するため、新たな標的は、以前のとおりCESA1の組織化およびそれに続く切断をもたらす。
【図１４】図14は、種々の二重鎖構造体の解析の結果を示す。パネルA、B、およびCに図解されている二重鎖構造体はすべて、フルオロフォア（F）およびクエンチャー（Q）で標識された上段の黒い実線のオリゴ（EAS1）、ならびにクエンチャーで標識された下段の黒い実線（EAS2）を含む。EAS1およびEAS2は一緒にPESAを含む。加えて、パネルAは、ドライバー断片（DF）を表す下段の縞模様のオリゴを有し、パネルBは、阻害性断片（InF）を表す下段の縞模様のオリゴを有する。  パネルAにおいて、反応におけるEAS1、EAS2、およびDF1の存在は、観察された経時的なFAM蛍光の増大によって示されるように（図14A）、RE Mnl Iに対する切断可能なCESA二重鎖基質の形成をもたらした。この観察結果は、REによる認識および切断に必要とされる領域内の2本の鎖のうちの少なくとも一方に断裂またはニックを含有している二本鎖複合体を認識および切断し得る制限酵素の能力と一致する。対照的に、反応はDF1断片を欠いているがInFを含むパネルBにおいて、形成した二重鎖は切断されず、ゆえに経時的な蛍光の増大は観察されなかった（図14B）。これは、InFがDF1の配列全体を含むという事実にもかかわらず起こった。DF中にも存在するその特異的配列に付加的である、InF中に存在する配列は、切断可能な二重鎖基質の形成を阻害した。実際、付加的配列は、酵素阻害性複合体（EIC）と称される切断不可能な複合体の形成をもたらした。  反応はEAS1およびEAS2のみを含有しており、DF1およびInFの両方を欠いているパネルCにおいて、蛍光の増大は観察されず、これら2種のオリゴ（EAS1およびEAS2）だけでは、REによる二重鎖の認識および切断に不充分であることを示した（図14C）。オリゴEAS1およびEAS2はハイブリダイズして部分的酵素シグナル増幅因子（PESA）複合体を形成するが、しかしながら、切断不可能なPESAを切断可能なCESAに変換するためには、付加的オリゴ、すなわちDFが必要とされる。
【図１５】図15は、いくつかの変形型はRE Mnl Iに対する切断可能なCESA二重鎖基質をもたらす、DFがPESA候補に結合し得る種々の構造体を図解している。これらの構造体を、実施例5の反応1〜8において試験した。本実施例において、DFの存在下（（i）とラベルされた線）または非存在下（（ii）とラベルされた線）における、フルオロフォアとクエンチャー部分の分離に伴う蛍光の変化を観察することによって、Mnl I切断を観測した。1〜8の番号が付されている各パネルは、PESA候補の構造（黒い実線）およびDF候補の位置（縞模様の線）を示している。丸はオリゴヌクレオチドの5'末端を示す。RERSを点線のボックスとして示す。反応7におけるNがDFとRERSとの間に存在するデオキシリボヌクレオチドを指すという点を除いて、「N」は、RERSを完成させるために必要とされる、DFに存在するデオキシリボヌクレオチド（すなわち、PESAからなくなっている、RERS由来のヌクレオチド）に等しい。反応4において、「n」はリボヌクレオチドを示す。実線の垂直矢印はMnl Iに対する切断部位を示し、「^」は隣接したヌクレオチド間にホスホジエステル結合がないことを示す。PESAおよびDF構造体候補の図式の下は、実施例5において記載されるように、これらのオリゴヌクレオチドとMnl Iとのインキュベーションの間の経時的な蛍光レベルのプロットである。二つ組の反応の平均を示す。  パネル1（実施例5の反応1）において、DFを、部分的Mnl I認識部位5'GAGG3'の直前の3'配列として設計した（GAGG^）。DFの非存在下（ii）における蛍光の増大と比較して、DFの存在下（i）ではより速い速度の蛍光の増大が観察された。この反応におけるPESAは、RER配列全体を含有していたが、RERSの側面に位置する追加配列の付加（DFによって提供される）によって、より速い切断がもたらされた。  パネル2（実施例5の反応2）において、DFを、3'末端からの1個のヌクレオチドによって5'GAGG3'という部分的Mnl I認識配列を完成させるように設計した（GAG^G）。DFの存在下において、経時的な蛍光の増大が観察された（i）。対照的に、DFが存在しない場合、経時的な蛍光の増大は観察されなかった（ii）。この結果は、DFが3'末端からの1個のヌクレオチド（G）によって5'GAGG3'という部分的Mnl I認識配列を完成させた場合に、切断可能なCESAが形成され得ることを示している。  パネル3（実施例5の反応3）において、DFを、3'末端からの2個のヌクレオチドによって5'GAGG3'という部分的Mnl I認識配列を完成させるように設計した（GA^GG）。DFの存在下において、経時的な蛍光の増大が観察された（i）。対照的に、DFが存在しない場合、経時的な蛍光の増大は観察されなかった（ii）。この結果は、DFが3'末端からの2個のヌクレオチド（GG）によって5'GAGG3'という部分的Mnl I認識配列を完成させた場合に、切断可能なCESAが形成され得ることを示している。  パネル4（実施例5の反応4）において、DFを、2番目の塩基がリボヌクレオチドである、3'末端からの2個のヌクレオチドによって5'GAGG3'という部分的Mnl I認識配列を完成させるように設計した（GA^gG）。DFの存在下において、経時的な蛍光の増大が観察された（i）。対照的に、DFが存在しない場合、経時的な蛍光の増大は観察されなかった（ii）。この結果は、DFが3'末端からの2個のヌクレオチド（GG）によって5'GAGG3'という部分的Mnl I認識配列を完成させた場合に��たとえ2番目のヌクレオチドがリボヌクレオチド（Gg）である場合でさえ、切断可能なCESAが形成され得ることを示している。  パネル5（実施例5の反応5）において、DFを、3'末端からの3個のヌクレオチドによって5'GAGG3'という部分的Mnl I認識配列を完成させるように設計した（G^AGG）。DFの存在下において、経時的な蛍光の増大が観察された（i）。対照的に、DFが存在しない場合、経時的な蛍光の増大は観察されなかった（ii）。この結果は、DFが3'末端からの3個のヌクレオチド（GGA）によって5'GAGG3'という部分的Mnl I認識配列を完成させた場合に、切断可能なCESAが形成され得ることを示している。  パネル6（実施例5の反応6）において、DFを、5'GAGG3'というMnl I認識配列から直接上流にある5'配列として結合するように設計した（^GAGG）。DFの存在下（i）または非存在下（ii）において、経時的な蛍光の増大は観察されなかった。この結果は、DFが5'GAGG3'というMnl I認識配列から直接上流にある5'末端で結合した場合に、切断可能なCESAは形成されないことを示している。  パネル7（実施例5の反応7）において、DFを、5'GAGG3'というMnl I認識配列から2ヌクレオチド上流にある5'配列として結合するように設計した（^NNGAGG）。DFの存在下において、経時的な蛍光の増大が観察された（i）。対照的に、DFが存在しない場合、経時的な蛍光の増大は観察されなかった（ii）。この結果は、DFがMnl I RERSから2ヌクレオチド上流で結合し、RE切断部位を完成させた場合に、切断可能なCESAが形成され得ることを示している。  パネル8（実施例5の反応8）において、DFを、5'末端からの2個のヌクレオチドによって5'CCTC3'という部分的Mnl I認識配列を完成させるように設計した（CC^TC）。DFの存在下において、経時的な蛍光の増大が観察された（i）。対照的に、DFが存在しない場合、経時的な蛍光の増大は観察されなかった（ii）。この結果は、DFが5'末端からの2個のヌクレオチド（CC）によって5'CCTC3'という部分的Mnl I認識配列を完成させた場合に、切断可能なCESAが形成され得ることを示している。
【図１６】図16は、実施例6において記載されるREのStyD 4I（パネルI）、Rsa I（パネルII）、Msp I（パネルIII）、およびBssK I（パネルIV）による、例示される種々の構造体に対する切断のパターンを図解している。反応は、以下のとおり列挙される構造体を含有していた：反応A：CESA、反応B：PESA＋InF、反応C：PESA、反応D：標識したEAS1オリゴ、反応E（陽性対照）および反応F（陰性対照）：連続した二本鎖のRE基質。反応A〜EはREを含有していたが、一方で、陰性対照の反応FはREを含有していなかった。二つ組の反応の平均を示す。  これらの酵素、および本実験において解析された他のすべての酵素（データ示さず）は、陽性対照（反応E）に対して、経時的な蛍光の増大を呈した。これらの観察結果は、十分なRERSを含有している連続した二本鎖複合体を認識および切断し得るREの能力と一致する。すべての陰性対照の反応（反応F）は、経時的な蛍光の増大を呈しなかった。  パネルIは、表13の列Iに記載されるRE StyD4 Iに対して得られたデータを示している。このREに対する反応A〜Dにおいて、経時的な蛍光の増大は観察されなかった。このことは、このREが、試験された条件下で、該REによる認識および切断に必要とされる領域内の2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含有している二本鎖複合体を切断することができないことの指標である。さらに、反応が部分的に形成されたRERSのみを含有している場合、このREは切断することができなかった。  パネルIIは、表13の列IIに記載されるRE Rsa Iに対して得られたデータを示している。他の2つのREのPme IおよびHpy 8Iも、Rsa Iに対して報告されるものと同様のパターンを示した。反応Aにおいて、EAS1、EAS2、およびDFの存在は、観察された経時的な蛍光の増大によって示されるように、切断可能なCESAの形成をもたらした。これらの観察結果は、これらのREが、試験された反応条件下で、RERS内にニックを含有している二本鎖複合体を認識かつ切断することができることの指標である。対照的に、DFを欠いているがInFを含む反応Bにおいて、経時的な蛍光の増大は観察されず、形成した二本鎖複合体が切断されなかったことを示した。この反応条件下では、EICが形成された。これらのREに対する反応CおよびDに対して、経時的な蛍光の増大は観察されず、このREは、不完全なRERSを含有している構造体を切断することができないことを示した。  パネルIIIは、表13の列IIIに記載されるRE Msp Iに対して得られたデータを示している。RE Ear Iも、Msp Iに対して報告されるものと同様のパターンの結果を示した。反応Aおよび反応Bに対して、経時的な蛍光の増大が観察された。反応Aにおいて、EAS1、EAS2、およびDFの存在は、経時的な蛍光の増大によって示されるように、切断可能なCESAの形成をもたらした。これらの観察結果は、該REが、RERS内にニックを含有している二本鎖複合体を認識かつ切断することができることの指標である。しかしながら、該REは、DFを欠いているがInFを含む反応Bにおいても、蛍光の増大を呈した。これらの観察結果は、該反応条件下で、InFはEICを形成しないことを示している。これらのREに対する反応CおよびDに対して、蛍光の増大は観察されず、このREは、不完全なRERSを含有している構造体を切断することができないことを示した。  図16のパネルIVは、表13の列IVに記載されるRE BssK Iに対して得ら��たデータを示している。RE Alw Iも、BssK Iに対して報告されるものと同様のパターンの結果を示した。反応A〜Dにおいて、経時的な蛍光の増大が観察された。これらの反応において、複合体は十分なまたは部分的なRERSを含有していた。このことは、これらのREが、試験された反応条件下で、十分なRERSおよび部分的なRERSの両方を認識かつ切断することができることの指標である。
【図１７】図17のパネルAは、EzyAmpフィードバックカスケード反応のためのストラテジーを図解している。本実施例では、2種のPESA（PESA AおよびPESA B）が存在している。PESA A（黒）はESA1A（上段の鎖）およびEAS2A（下段の鎖）を含み、PESA B（灰色）はEAS1B（上段の鎖）およびEA2B（下段の鎖）を含む。両方のPESAは、REに対する、本実施例ではMnl Iに対する部分的な認識部位を含有している。PESA A（上段の構造体、左側）がDF-a（白い線、灰色の境界線）とハイブリダイズした場合、Mnl Iに対する完全な認識部位（黒い点線のボックス）を含有している切断可能なCESA A複合体（中段の構造体、左側）が形成される。CESA Aの切断（下段の断片、左側）は、フルオロフォア、例えばJOE（J）とクエンチャー（Q）の分離による蛍光の増大をもたらす。加えて、CESA Aの切断は、複数の切断断片の放出をもたらし、そのうちの1つは新たなDF-b（縞模様の線）として機能し得る。PESA B（上段の構造体、右側）がDF-bとハイブリダイズした場合、Mnl Iに対する完全な認識部位（灰色の点線のボックス）を含有しているCESA B（中段の構造体、右側）が形成される。CESA Bの切断は、フルオロフォア、例えばFAM（F）とクエンチャー（Q）の分離による蛍光の増大をもたらす（下段の断片、右側）。加えて、CESA Bの切断は、複数の切断断片の放出をもたらし、そのうちの1つは新たなDF-aとして機能し得る。各CESA Aの切断は、新たなCESA Bの形成をもたらし得る新たなDFを生成し、かつ各CESA Bの切断は、新たなCESA Aの形成をもたらし得る新たなDFを生成し、ゆえにフィードバックカスケードを生成する。各工程における新たなDFの生成に加えて、混合物中にすでに存在しているDFは、再利用されてさらなるCESAを形成することができる。このストラテジーを用いて、DF-aまたはDF-bのいずれかの標的依存的な生成に応答してシグナルを増幅することができる。  パネルBおよびCは、パネルAにおいて記載されるカスケードの例からの蛍光の結果を示している。示されたデータは、二つ組の平均を表す。パネルB（反応A）は、PESA AおよびBにDF-aを添加した際の、JOEおよびFAMチャンネルの両方における蛍光の増大を示している。JOEチャンネルにおける増大するシグナル（「（ii）JOE：CESA A＋DF-a」とラベルされた線）は、DF-aがPESA AにハイブリダイズしてCESA Aを形成することの指標である。CESA AはMnl Iによって切断され、2箇所のクエンチャー部分からのJOEフルオロフォアの分離につながる、EAS1AおよびEAS2Aのオリゴヌクレオチド断片の解離をもたらした。FAMチャンネルにおける増大するシグナル（「（i）FAM：CESA B＋DF-a」とラベルされた線）は、EASA2の切断断片の1つであるDF-bが、切断されたCESA Aから解離し、かつPESA Bにハイブリダイズして、CESA Bを産生したことを示している。Mnl IによるCESA Bの切断は、クエンチャー部分からのFAMフルオロフォアの分離につながる、EAS1BおよびEAS2Bのオリゴヌクレオチド断片の解離をもたらした。EAS2Bの切断断片の1つは、PESA Aにハイブリダイズしてより多くのCESA Aを産生する新たなDF-a分子である。これによって、PESA A、PESA B、CESA A、およびCESA B間のフィードバックカスケードが完成された。FAMチャンネルにおける蛍光の増大の遅延は、この反応が、CESA Aの切断からのDF-bの産生に頼っていることを示している。DF-aを欠いている反応において（「（II）DF-aなしの対照」とラ���ルされた線）、JOEまたはFAM蛍光の増大はなかった。  パネルB（反応B）は、PESA AおよびPESA Bの両方を含有している反応にDF-bを添加した際の、FAMおよびJOEチャンネルの両方における蛍光の増大を示している。FAMチャンネルにおける増大するシグナル（「（v）FAM：CESA B＋DF-b」とラベルされた線）は、DF-bがPESA BにハイブリダイズしてCESA Bを形成することの指標である。CESA BはMnl Iによって切断され、FAMフルオロフォアとクエンチャー部分の分離につながる、EAS1BおよびEAS2Bのオリゴヌクレオチド断片の解離をもたらした。JOEチャンネルにおける増大するシグナル（「（vi）JOE：CESA A＋DF-b」とラベルされた線）は、EAS2Bの切断断片の1つであるDF-aが、切断されたCESA Bから解離し、かつPESA Aにハイブリダイズして、CESA Aを産生したことを示している。Mnl IによるCESA Aの切断は、JOEフルオロフォアと2箇所のクエンチャー部分の分離につながる、EAS1AおよびEAS2Aのオリゴヌクレオチド断片の解離をもたらした。EAS2Aの切断断片の1つは、PESA Bにハイブリダイズしてより多くのCESA Bを産生する新たなDF-b分子である。これによって、PESA A、PESA B、CESA A、およびCESA B間のフィードバックカスケードが完成された。JOEチャンネルにおける蛍光の増大の遅延は、この反応が、CESA Bの切断からのDF-aの産生に頼っていることを示している。DF-bを欠いている反応において（「（IV）DF-bなしの対照」とラベルされた線）、JOEまたはFAM蛍光の増大はなかった。  本実験において、2種のCESA複合体間のカスケード反応を実証するために、PESA AおよびPESA Bは異なるフルオロフォアのFAMおよびJOEで標識された。他の形式において、PESA AおよびPESA Bの両方を同じフルオロフォアで標識することができ、そのため、CESA AおよびCESA Bの切断からのシグナルは相加的である。
【図１８】図18のパネルAは、ヘアピンPESAを形成するESAオリゴヌクレオチドを採用した、EzyAmpフィードバックカスケード反応のためのストラテジーを図解している。このカスケード反応には、2種の二重標識した（フルオロフォア−クエンチャー）PESAヘアピンオリゴヌクレオチドが存在している。両方とも、REについての、本例ではMnl Iについての部分的部位を含有している。PESA A（上段の構造体、左側）がDF-a（白い線）とハイブリダイズした場合、Mnl Iの完全な認識部位（点線のボックス）をここでは含有しているCESA A（中段の構造体、左側）が形成される。CESA Aの切断（下段の断片、左側）は、PESA A上のフルオロフォア（F）とクエンチャー（Q）部分の分離による蛍光の増大をもたらす。加えて、CESA Aの切断は、複数の切断断片の放出をもたらし、そのうちの1つは新たなDF-b（縞模様の線）として機能し得る。PESA B（上段の構造体、右側）がDF-bとハイブリダイズした場合、Mnl Iの完全な認識部位（点線のボックス）をここでは含有しているCESA B（中段の構造体、右側）が形成される。CESA Bの切断は、PESA B上のフルオロフォアとクエンチャー部分の分離による蛍光の増大をもたらす（下段の断片、右側）。加えて、CESA Bの切断は、複数の切断断片の放出をもたらし、そのうちの1つは新たなDF-aとして機能し得る。各CESA A複合体の切断は、新たなCESA Bの形成をもたらし得る新たなDF-bを生成し、かつ各CESA B複合体の切断は、新たなCESA Aの形成をもたらし得る新たなDF-aを生成し、ゆえにフィードバックカスケードを生成する。各工程における新たなDFの生成に加えて、混合物中にすでに存在しているDFは、再利用されてさらなるCESAを形成することができる。このストラテジーを用いて、DF-aまたはDF-bのいずれかの標的依存的な生成に応答してシグナルを増幅することができる。  パネルBは、パネルAにおけるストラテジーを用いた実施例7において得られた結果を示している。本実験において、CESA AはPESA AおよびDF-aから構成され、CESA BはPESA BおよびDF-bから構成された。PESA Aは、DF-bとして機能し得る領域をその中に含有しており、かつPESA Bは、DF-aとして機能し得る領域をその中に含有していた。各反応において、すべての成分は1つの反応チャンバー内に存在していた。RE活性を、二重標識したPESAの切断に伴う蛍光の変化によって観測した。蛍光を、二つ組の反応の正規化した平均として示す。  パネルBにおける結果は、DF-aおよびヘアピンPESA Aの存在が、経時的な蛍光の増大によって示されるように、切断可能なCESA Aの形成をもたらしたことを実証している（反応 （i））。対照的に、いかなるDFも存在していない下でPESA Aを含有している反応（反応（ii））は、経時的な蛍光の変化を示さず、PESA Aだけでは切断可能なオリゴヌクレオチドでないことを示した。反応（iii）において、ヘアピンPESA BとのDF-bの存在は、経時的な蛍光の増大によって示されるように、切断可能なCESA Bの形成をもたらした。対照的に、いかなるDFも存在していない下でPESA Bを含有している反応（iv）では、経時的な蛍光の変化は観察されず、PESA Bだけでは切断可能なオリゴヌクレオチドでないことを示した。反応（v）において、PESA AおよびPESA Bの両方と一緒のDF-aの存在は、反応（i）と比較して、経時的な蛍光の増大のほぼ倍増をもたらした。これはCESA A切断からのDF-bの放出の指標であり、次いでそれは、今度は切断されかつより多くのDF-aを放出する、切断可能なCESA Bを形成した。この反応は、DF-aの存在によって開始されるシグナル増幅フィードバックカスケードを表す。反応（vi）において、PESA AおよびPESA Bの両方とのDF-bの存在は、反応（iii）と比較して、経時的な蛍光の増大のほぼ倍増をもたらした。これはCESA B切断からのDF-aの放出の指標であり、次いでそれは、今度はより多くのDF-bを放出する、切断可能なCESA Aを形成した。この反応は、DF-bの存在によって開始されるシグナル増幅フィードバックカスケードを表す。反応（vii）は、DFが存在せずにPESA AおよびPESA Bを含有している陰性対照反応である。この反応は経時的な蛍光の増大を示さず、DFの非存在下においてPESA AとPESA Bとの間に切断可能なCESA構造体は形成されないことを示した。反応（viii）は、等濃度でDF-a、DF-b、PESA A、およびPESA Bを含有しており、そのため、存在するすべてのPESAがCESAを形成し得かつ切断され得、ゆえにシステムにおいて獲得され得る最大の蛍光を表示する、陽性対照反応である。反応（viii）、（vi）、および（v）において、70分の時点での最終蛍光レベルは同程度であり、反応（v）および（vi）におけるフィードバックカスケードが完成に到達していることを示した。
【図１９】図19のパネルAは、開始DF配列がMNAザイム基質配列の一部でない、EzyAmpカスケードシステムの例示的なスキーマを図解している。このシステムの成分を、パネルAの左側の表中に図解する。これらの構造体に関して、黒丸は各オリゴヌクレオチドの5'末端を示し、RE認識部位は点線のボックスとして示され、制限酵素切断部位は実線の矢頭として示され、フルオロフォアおよびクエンチャー部分の存在は、それぞれFおよびQによって示されている。構造体（i）は、標的の存在下で結びついてMNAザイムを形成する、標的特異的パートザイムを図解している。複合体（ii）は、DF-aを部分的に含むオリゴヌクレオチド（（v）にある）と、DFオリゴヌクレオチドに相補的である配列が側面に位置する基質配列を含有している基質ブロッカーオリゴヌクレオチドと呼ばれる第2のオリゴとからなる、基質ブロッカー−DF-a複合体を図解している。これらのオリゴは、ハイブリダイゼーションによって固定されて、MNAザイムに対する基質である外側にループを作った領域（基質ループは円形の領域によって示されており、灰色の十字（X）はMNAザイムによる切断の部位を示す）を含有している、二本鎖オリゴ複合体を形成する。複合体（ii）は、MNAザイムによる基質ループの切断が、DF-aに結合している切断された断片の解離をもたらし、ゆえにより長い二本鎖オリゴ複合体の一本鎖伸長としてDF-aを放出するように設計されている。構造体（iii）は、CESA Aを形成するためにDF-a配列を必要とする、第1のPESA（PESA A）を図解している。このPESA Aは、REによるCESA Aの切断後に放出されるように設計されているDF-b（オリゴvi）をなす領域を、その配列内に含有している。構造体（iv）は、CESA Bを形成するためにDF-bを必要とする、第2のPESA（PESA B）を図解している。このPESA Bは、REによるCESA Bの切断後に放出されるように設計されているDF-aとして機能し得る領域を、その配列内に含有している。構造体（v）は、PESA AからCESA Aを形成するのに必要とされるDF-aを示している。構造体（vi）は、PESA BからCESA Bを形成するのに必要とされるDF-bを示している。  パネルAの右側にあるスキームは、この設計のアッセイにおける工程を図解している。工程1において、パートザイムは標的上に組織化し、構造体（ii）の基質ループを切断するように設計されたMNAザイムを形成する。工程2において、MNAザイムによる切断は、DF-aに相補的な配列の解離をもたらし、ゆえにDF-aがPESA AにハイブリダイズしてCESA Aを形成する（工程3に描かれる）ことが可能となる。工程4において、CESA Aの切断によってDF-bが放出される。この工程は、CESA Aの切断によってフルオロフォアとクエンチャー部分が分離された場合、付随した蛍光の増大も生成し得る。工程4において、放出されたDF-bは、PESA Bと結びついて、REによって次いで切断可能であるCESA Bを形成し得る。CESA Bの切断は、DF-aの放出をもたらし、かつ切断によってフルオロフォアとクエンチャー部分が分離された場合、付随した蛍光の増大も生成し得る。工程5および6において、システムは、CESA AおよびCESA Bが連続的に形成されかつ切断されてより多くのDF-aおよびDF-bを放出し、より多くのCESA AおよびCESA Bの形成をもたらす、フィードバックカスケードを形成する。より複雑な反応では、固有のMNAザイム（固有の標的を示す）によって放出され���ように設計された固有のDFをそれぞれが含有している、複数種の基質−ブロッカー−DF複合体が存在してよい。  パネルBは、パネルAにおいて記載されるものと類似したスキーマを用いて、MNAザイムによって開始されるEzyAmp反応を実証している実施例9において記載されるデータを示している。EzyAmp反応における成分には、基質−ブロッカーオリゴヌクレオチド；DF-aオリゴヌクレオチド（基質−ブロッカー−DF-a複合体を一緒に形成する）；標的にハイブリダイズし得、かつループ型基質を切断し得るMNAザイムを形成し得るパートザイム；PESA A；およびPESA Bが含まれた。PESA AはEAS1AおよびEAS2Aから構成されており、ESA2AはDF-bとして機能し得る配列を含む。PESA BはEAS1BおよびEAS2Bから構成されており、ESA2BはDF-aとして機能し得る配列を含む。反応のすべての成分は1つの反応チャンバー内に存在しており、かつ標的を含有している（標的）または標的を欠いている（標的なしの対照）のいずれかであった。FAMとクエンチャー部分の分離につながるEAS1AおよびEAS1Bの切断後のFAM蛍光の増大によって、シグナル増幅を観測した。標的の存在下におけるループ型基質のMNAザイム切断は、二本鎖の基質ブロッカー−DF-bオリゴヌクレオチド複合体の部分的な解離をもたらした。解離した複合体のDF-a部分は、PESA Aとハイブリダイズし、Mnl Iによって次いで切断されるCESA Aの形成をもたらした。これは、今度は、CESA Bの形成を可能にするDF-bを放出して、Mnl IによるCESA Bの切断をもたらし、ゆえにより多くのDF-aを放出して、CESA AとCESA Bとの間のフィードバックカスケードを完成させた。  対照的に、標的を欠いている反応（標的なしの対照）は、経時的な蛍光の指数関数的な増大を示さなかった（80分後に、低レベルの蛍光のドリフトのみが観察された）。このことは、ループ型基質のMNAザイム切断を開始してDF-aを放出し、今度は、それに続くEzyAmpカスケード反応を開始するために、標的が必要とされることを示している。
【図２０】図20は、固形担体に連接されている複数種のCESA複合体を含有しているEzyAmpシステムの例示的なスキーマを図解している。このシステムの成分は、以下のように図解されている：黒丸は各オリゴヌクレオチドの5'末端を示し、RERSは点線のボックスとして示され、切断部位は実線の矢印として示されている。ステーション1は、標的依存的な様式で切断された場合に（工程1−例えばMNAザイムを用いてMNAザイム基質を切断する）、第1のDF（縞模様の線）の放出をもたらす、連接したオリゴヌクレオチド（MNAザイム基質またはSIO）を図解している。このDFは、次いでステーション2における連接したPESA Aに移動しかつハイブリダイズして、CESA Aを形成し得る（工程2）。REによるCESA Aの切断（工程3）は、ステーション3におけるPESA Bに移動し得る第2のDF（黒い実線）を放出する。第2のDFがPESA Bとハイブリダイズした場合、CESA Bが形成される（工程4）。REによるCESA Bの切断は、第1のDF（縞模様の線）として機能し得る配列の放出をもたらす。この第1のDFは、次いでステーション2に移動し（工程5）、かつ、切断されてより多くの第2のDFを放出し得るより多くのCESA Aを形成し得る。このように、カスケード反応は開始され得、CESA AおよびCESA Bの連続的な形成および切断を可能にする（工程3、4、および5）。PESAがフルオロフォア（F）およびクエンチャー（Q）部分で標識されている場合、これらの部分の間にあるEASの切断によって蛍光シグナルが生成され得る。このシグナルは、ステーション2もしくは3における固体表面上で保持され得（この図において図解されるように）、または例えばフルオロフォアおよびクエンチャー部分の配置が反転している場合には、溶液中に放出され得る。
【図２１】図21は、実施例11において記載されるEzyAmp標的のタイトレーションの結果を示している。これらの反応は、MNAザイムによる標的依存的な基質の切断によって開始されてDFを産生し、その後に、それぞれが互いに対するDFを産生する2種のPESA複合体を含有しているEzyAmpフィードバックカスケードを用いたシグナル増幅が続いた。すべての工程は、1本のチューブ内で実施された。パネルAおよびBは、減少する濃度の標的（i〜vii）を含有しているMNAザイムによって開始されるEzyAmp反応における、経時的な蛍光の変化（それぞれ、線形および対数プロット）を示している。経時的な蛍光の変化は、標的を含有している反応において指数関数的に増大した。反応（viii）は、標的なしの対照（NTC）である。パネルCは、Ctに対して標的の濃度をプロットすることによって生成された検量線を示すものであって、Ctとは、濃度が検出閾値に到達する時点である。Ctと標的濃度の対数との間の関係は、0.99の回帰値を有する直線を呈する。
【図２２】図22は、分岐した構造体内にPESA複合体を組み入れることによってEzyAmp成分を局在化させるための例示的な方法を図解している。パネルAは、（i）（5'から3'に）EAS1B、骨格1、およびEAS2Aを含有している第1のオリゴヌクレオチド（構成単位1）；（ii）EAS2Aに相補的である第2のオリゴEAS1Aであって、（i）および（ii）はハイブリダイズしてPESA Aを形成し得る、第2のオリゴEAS1A；ならびに（iii）ESA1Bに相補的である第3のオリゴEAS2Bであって、（i）および（iii）はハイブリダイズしてPESA Bを形成し得る、第3のオリゴEAS2B；からなり得る、分岐した構造体を形成するために必要とされる第1の基本的な構成単位を図解している。パネルBは、（5'から3'に）EAS1B、骨格2、およびEAS2Aからなる構成単位2（iv）；（ii）EAS2Aに相補的である第2のオリゴEAS1Aであって、（i）および（ii）はハイブリダイズしてPESA Aを形成し得る、第2のオリゴEAS1A；ならびに（iii）ESA1Bに相補的である第3のオリゴEAS2Bであって、（i）および（iii）はハイブリダイズしてPESA Bを形成し得る、第3のオリゴEAS2B；をなし得る第4のオリゴを図解している。骨格1は、骨格2に相補的であり得る。これは、構成単位1および2を含有している分岐した複合体の形成をもたらす。各構成単位は、結合したEAS1AおよびEAS2Bを有し、そのため、複合体は2つのPESA Aおよび2つのPESA Bを含有している。構成単位1および2をフルオロフォア（F）で標識することができ、かつ各構成単位の第2および第3のオリゴを、構成単位1および2と結合すると、これらのオリゴ上の標識からの蛍光が消光され得るように位置づけられたクエンチャー（Q）で標識することができる。  パネルCは、標的特異的な様式でのDF-aの生成後の、パネルBにおいて図解される分岐した複合体を使用し得るEzyAmpカスケードにおける工程を図解している。工程1において、PESA A（例えば、構成単位1上の）へのDF-aのハイブリダイゼーションは、この配置におけるCESA Aの形成をもたらす。工程2において、制限酵素（例えば、Mnl I）によるCESA Aの切断は、EAS1A切断断片の解離をもたらし、フルオロフォアとクエンチャーの分離による蛍光の増大およびDF-bの生成を引き起こす。工程2において、構成単位1または2のEAS1B領域へのDF-bのハイブリダイゼーションは、CESA Bの形成につながる。工程3において、制限酵素（例えば、Mnl I）によるCESA Bの切断は、EAS2B切断断片の解離をもたらし、蛍光の増大およびDF-aの生成を引き起こす。次いで、これらの工程は、同じ複合体上または別の同様の複合体上で繰り返され得る。すべての構成単位が切断されるまで、プロセスは継続し得る。あるいは、標的特異的な様式でのDF-bの生成によって、同様のカスケードが開始され得る。  分岐した構造体の複雑性を、いくつかのストラテジーによって増大させることができる。例として、EAS1Aの5'末端がビオチン化されている場合、構成単位とアビジンとのインキュベーションによって、パネルDに示される構造体が形成され得る。これは、構成単位複合体のアビジン分子を介した一斉の連接をもたらす。この分岐した構造体およびその変異型（任意のオリゴ成分上のビオチンまたは他の連接分子の付加を介した）は、放出されたDFのPESA複合体との局在化を可能にする。
【図２３】図23は、シグナル増幅がエキソヌクレアーゼIII（Exo III）によって開始および仲介され得る、EzyAmp反応の例示的なスキーマである。この酵素は、末端が平滑または陥凹である場合に、DNA二重鎖の3'ヒドロキシル末端からヌクレオチドを除去することが知られている。該酵素は、少なくとも5個の塩基を有する3'突出を有する二重鎖を含む、一本鎖オリゴを消化しない。ホスホロチオエートヌクレオチド（オリゴ上の空洞の四角によって示される）の存在によって、エキソヌクレアーゼ活性をブロックされることが知られている。灰色の縞模様の線はDNA標的（T）を表し、黒い実線は、DFの生成を助長するために混合物に添加される合成イニシエーターオリゴ（SIO）を表す。フルオロフォア（F）およびクエンチャー（Q）で標識され得るSIOを、突出した3'末端を有するヘアピン立体構造で表す。SOIは5個より多い塩基の3'突出を含有しているため、標的結合前にExo IIIはそれを消化することができない。SIOにおけるホスホロチオエートヌクレオチドによって、この位置から前方への加水分解が阻止され、ゆえにDFは無傷のままである。閉じた丸は、SIO、PESA、およびCESAオリゴの5'末端を表す。灰色の実線は、少なくとも5個の塩基を含む2つの3'突出末端を有するPESAを表す。PESAを、EAS1がフルオロフォアおよびクエンチャーで標識されている、2種のオリゴ（EAS1およびEAS2）として表す。PESAの3'末端は5個より多い塩基の3'突出を含有しているため、DFの結合前にExo IIIはPESAを消化することができない。  EzyAmp反応は、以下の工程を有する：工程1において、SIOは標的の相補的領域に結合し得、および工程2において、SIOのここでは陥凹した3'末端は、Exo IIIによってホスホロチオエート塩基まで加水分解され、ゆえに無傷DFを放出し、かつ蛍光の増大を引き起こす。DFは、標的に相補的でないSIOの5'部分に相当する。もはやSIOに結合していない標的は、次いで遊離して再利用され、別のSIOと結合し、ゆえに別のDFを生成する（工程3）。DFは、次いでPESAのEAS1に結合し得（工程4）、かつEAS1の3'末端がここでは陥凹しているCESAを形成し得る。Exo IIIは、次いでCESAのEAS1鎖を加水分解し（工程5）、蛍光の増大およびDFの放出を引き起こし得る。DFはここでは遊離して再利用され（工程6）、より多くのPESAをCESAに変換する。
【図２４】図24は、標的依存的MNAザイムを用いた、ドライバー断片（DF）を生成するための種々の方法を図解している例示的なスキーマである。DFを黒い輪郭を有する白い線として表し；MNAザイム基質の切断部位を十字として表し；基質配列を含有しているオリゴを灰色の線として表し；RE切断部位を矢頭として表し；RERSを点線のボックスとして提示し；標的を黒と白の縞模様の線として表し；DFと組み合わさってCESAを形成し得るPESAオリゴヌクレオチドを灰色の縞模様の線として表し；かつMNAザイムを黒い実線として表す。  パネルAは、DF配列が基質配列の一部である、MNAザイム基質の直接切断によるDFの生成を図解している。標的の存在下において、触媒活性MNAザイムは組織化し、かつその基質を切断する。切断された基質の一方の断片はPESAと結合し、そこでそれはDFとして機能しかつCESAの形成をもたらす。次いで、十分に組織化したCESAは、REによって切断され得る。実施例2、4、および11は、DFを生成するためのこのストラテジーの使用を実証している。  パネルBは、DF配列が、MNAザイムによって認識される基質配列の一部の内にないが、それでも基質と同じオリゴヌクレオチド内に含有されている、MNAザイム基質の切断によるDFの生成を可能にする方法を図解している。基質を含有しているオリゴヌクレオチドは、ヘアピン構造を形成し得、そのため、MNAザイムによって認識される基質の領域はヘアピンのループを形成し、かつDFはヘアピンのステム内のハイブリダイゼーションによって固定される。標的の存在下において、触媒活性MNAザイムは組織化し、かつその基質を切断する。基質の切断は、ヘアピンを妨害し、ステムの解離、ゆえに切断された断片の分離につながる。切断された断片の一方はPESAと結合し得、そこでそれはDFとして機能し得かつCESAの形成をもたらし得る。次いで、十分に組織化したCESAは、REによって切断され得る。  パネルCは、二本鎖の基質−ブロッカー−DF複合体のMNAザイム切断によるDFの生成を図解している。この複合体において、DF配列は、MNAザイムによって認識される基質配列の一部でなく、かつ基質と同じオリゴヌクレオチド内に含有されていない。DFは、基質オリゴとハイブリダイズする第2のオリゴ内に含有されている。基質オリゴにおいて、MNAザイム基質として認識され得る配列の側面には、DFオリゴに相補的である付加的配列が位置する。基質およびDFに結合する（ゆえに、ブロックする）ものの両方として働くこのオリゴを、基質−ブロッカーオリゴと称する。MNAザイムによって認識される、基質−ブロッカーオリゴ内の配列は、DFオリゴヌクレオチドに相補的でなく、したがって、この基質配列は外側にループを作る。標的の非存在下では、二本鎖の基質−ブロッカー−DF複合体の形成が優先され、DFがPESAと相互作用するのを阻止する。標的の存在下において、触媒活性MNAザイムは組織化し、かつ基質ループを切断する。基質ループの切断は、DFに結合している基質−ブロッカーオリゴの部分の解離をもたらし、ゆえにDFが放出され、そのため、それはPESAと結合してCESAを形成し得る。次いで、十分に組織化したCESAは、REによって切断され得る。実施例9は、DFを生成するためのこのストラテジーの使用を実証している。  パネルDは、ヘアピン型の基質−ブロッカー−DF複合体のMNAザイム切断によ���DFの生成を図解している。この複合体において、DF配列は、MNAザイムによって認識される基質配列の一部でないが、それでもそれは基質と同じオリゴヌクレオチド内に含有されている。ヘアピン型の基質−ブロッカー−DF複合体は、基質−ブロッカーオリゴとDFオリゴとの間にここでは連結配列があり、ヘアピンの形成をもたらすという点を除いて、パネルCにおいて記載される二本鎖の基質−ブロッカー−DF複合体に類似している。標的の非存在下では、基質−ブロッカー−DFヘアピン構造体の形成が優先され、DFがPESAと相互作用するのを阻止する。標的の存在下において、触媒活性MNAザイムは組織化し、かつループ型基質部分を切断する。基質ループの切断は、DFに結合しているステム部分の解離をもたらす。一本鎖のDF配列は、ここではPESAと結合してCESAを形成し得る。次いで、十分に組織化したCESAは、REによって切断され得る。実施例14は、DFを生成するためのこのストラテジーの使用を実証している。
【図２５】図25は、2つのEzyAmp反応が1本のチューブ内で同時に起こりかつ独立して観測される、多重解析を実証している。反応は、PESA AおよびPESA Bの両方の存在下において、DF-aおよび／またはDF-bのいずれかで開始された。PESA AへのDF-aの結合は、CESA Aの形成をもたらし、それは切断された場合にJOE蛍光の増大を生成する（太い黒の実線）。PESA BへのDF-bの結合は、CESA Bの形成をもたらし、それは切断された場合にFAM蛍光の増大を生成する（太い黒の点線）。試験反応は、100nMの各PESA、ならびに（i）100nM DF-a、（ii）90nM DF-aおよび10nM DF-b、（iii）100nM DF-aおよび100nM DF-b、（iv）10nM DF-aおよび90nM DF-b、または（v）100nM DF-bのいずれかを含有していた。対照反応は、DFを含有しておらず、細い実線（JOE）または細い点線（FAM）によって示される。FAMおよび／またはJOEに対する蛍光の増大が、時間に対してプロットされている。反応（i）において、JOE蛍光の増大はあったが、FAM蛍光の増大はなく、DFaのみによってPESA Aが形成されたことを示した。反応（v）において、FAM蛍光の増大はあったが、JOE蛍光の増大はなく、DF-bのみによってPESA Bが形成されたことを示した。反応（ii）、（iii）、（iv）、および（v）においては、FAMおよびJOE蛍光の両方の増大があり、DF-aおよびDF-bの両方が存在した場合のCESA AおよびCESA Bの両方の切断を示しており、蛍光シグナルの強度は、用いたDFの濃度に関係した。
【図２６】図26は、ヒトcDNA標的（PPIA cDNA）の検出を可能にした、MNAザイムによって開始されるEzyAmp反応を図解している。EzyAmpシグナル増幅は、フィードバックループを形成する複数種のCESAのMnl I切断によって生じた。本実施例において、開始およびシグナル増幅の両方を、（i）レポーターMNAザイム基質の標的依存的なMNAザイム切断、ならびに（ii）MNAザイム基質の切断からのDF-aの産生後のCESA AおよびCESA Bの切断、によって生成される蛍光の累積変化を観察することによって観測した。図は、経時的にプロットされた正規化した蛍光を示している。150分の時点で、cDNAの非存在下（細い線）におけるごく低レベルの蛍光と比較して、115pg（太い黒の実線）および23pg（点線）のcDNAを含有している反応において強い蛍光シグナルが観察された。
【図２７】図27は、RE Mnl IによるCESAの切断のための例示的なストラテジーを図解している。CESAを、PESAに結合し得るDFを生成して、同じCESAを形成するように設計した（パネルA）。CESA（上段の複合体、パネルA）は、PESA（下段の複合体、パネルA）およびDF（黒い縞模様の線によって示される）から構成される。各線上の丸は、各オリゴの5'末端を示す。RERSを点線のボックスとして示し、RE切断部位を実線の垂直矢印として示す。フルオロフォアおよびクエンチャー部分の存在を、それぞれFおよびQによって示す。  パネルAは、CESAの切断がその相当するPESAに対するDFを生成し得るストラテジーを図解している。PESAはEAS1およびEAS2から構成されており、EAS2は、EAS2から切断されるとDFとして機能し得る配列をその中に含有している。開始DFの標的依存的な生成およびそれに続くPESAへの結合は、CESAの形成をもたらす（工程1）。CESAは、次いでREによって切断され得、DFとして機能し得る断片を含む切断された断片の解離につながる（工程2）。この断片は、次いで別のPESAに結合してDFとして機能し得、より多くのCESAの形成を可能にする（工程3）。  パネルBは、パネルAにおいて図解されるCESAのMnl I切断に相当する蛍光の増大を示している。DFの存在下において、経時的な蛍光の増大が観察された（i）。対照的に、DFを添加しない対照反応において、蛍光の増大は観察されなかった（ii）。このことは、REによって切断されるCESAを形成するためにDFが必要とされることを示している。CESAの切断は、断片の解離をもたらし、そのうちの1つは元のDFの短縮バージョンを含有している。
【発明を実施するための形態】
【０３１７】
定義
ある種の用語および語句を本明細書で用いており、それらは以下に規定する意味を有するものとする。
【０３１８】
本出願で用いる場合、単数形の「1つの（an）」、「1つの（an）」および「その（the）」は、文脈によって明らかに別のことが指定されている場合を除き、複数の言及物も含む。例えば、「1つのMNAザイム」または1つの「完全酵素シグナル増幅因子（Complete Enzyme Signal Amplifier）複合体」または1つの「部分的酵素シグナル増幅因子（Partial Enzyme Signal Amplifier）複合体」という用語はそれぞれ、複数のMNAザイムまたは完全部分的酵素シグナル増幅因子複合体または部分的酵素シグナル増幅因子複合体も含む。文脈によって別のことが要求されるか、または逆のことが明記されている場合を除き、本明細書で単数の完全体（integer）、段階または要素として挙げられた本発明の完全体、段階または要素には、挙げられた完全体、段階または要素の単数形および複数形の両方が明らかに含まれる。
【０３１９】
「含む（comprising）」という用語は、「を主に含む（include）が、必ずしもそれだけを含むのではない」ことを意味する。さらに、「含む（comprising）」という語の変化形、例えば「含む（comprise）」および「含む（comprises）」などは、相応して変化した意味を有する。したがって、例えば、ある所与の段階を「含む」方法は、排他的にその段階だけからなってもよく、または1つもしくは複数の別の段階を含んでもよい。
【０３２０】
「完全酵素シグナル増幅因子複合体」、「CESA複合体」および「CESA」は、本明細書中で互換的に用いられ、同じ意味を有する。本明細書で称するCESA複合体とは、酵素（例えば、ヌクレアーゼ）によって認識されて切断されることが可能であり、かつ酵素認識配列／部位および酵素切断配列／部位を含む、多オリゴヌクレオチド複合体のことである。酵素は例えば、ヌクレアーゼ（例えば、制限酵素酵素、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ）であってよい。酵素切断配列／部位は、酵素認識配列／部位の内側にあっても、外側にあっても、または一部が重なり合ってもよい。本明細書で称するCESA複合体は、少なくとも2つの酵素増幅因子基質（Enzyme Amplifier Substrate）（EAS）オリゴヌクレオチド、および少なくとも1つのドライバー断片（Driver Fragment）（DF）を含み、それぞれについては以下で定義する。CESA複合体の1つのEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、複合体の中のもう1つのEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に対して相補的である。加えて、前記EASオリゴヌクレオチドの1つの少なくとも一部分は、少なくとも1つのDFの少なくとも一部分に対しても相補的である。DFが1つまたは複数の塩基を、酵素認識配列／部位および／または酵素切断配列／部位に寄与してもよいが、必ずしもそうである必要はない。上記に述べた意味を逸脱することなく、本明細書におけるCESA複合体を、例えば、「第1の」CESA複合体、「第2の」CESA複合体、「第3の」CESA複合体などのように数字で称してもよいことに留意されたい。
【０３２１】
「酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド」、「酵素増幅因子基質（EAS）オリゴヌクレオチド」、「EASオリゴヌクレオチド」、「EASオリゴ」および「EAS」は、本明細書中で互換的に用いられ、同じ意味を有する。本明細書で称するEASオリゴヌクレオチドとは、オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分がもう1つのEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に対して相補的であり、その結果、適切な条件下でその2つの間のハイブリダイゼーションが起こるようなオリゴヌクレオチドのことである。EASオリゴヌクレオチドが任意で、以下に定義するようなドライバー断片（DF）の少なくとも一部分に対して相補的な少なくとも1つの部分を含んでもよい。EASオリゴヌクレオチドが、例えば、CESA複合体および部分的酵素シグナル増幅因子（PESA）複合体（以下に定義するような）などの複合体の成分であってもよい。上記に述べた意味を逸脱することなく、本明細書におけるEASオリゴヌクレオチドを、例えば、「第1の」酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド（EAS1）、「第2の」酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド（EAS2）、「第3の」酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド（EAS3）などのように数字で称してもよいことに留意されたい。いくつかの態様において、EASオリゴヌクレオチドが、リンカーによってもう1つのEASオリゴヌクレオチドとつなぎ合わされてもよい。例えば、EAS1およびEAS2が同一のオリゴヌクレオチド中に存在し、そこでそれらがヘアピン構造の形成を可能にする連結性核酸配列によってつなぎ合わされてもよい。
【０３２２】
「部分的酵素シグナル増幅因子複合体」、「部分的酵素シグナル増幅因子（PESA）複合体」、「PESA複合体」および「PESA」は、本明細書中で互換的に用いられ、同じ意味を有する。本明細書で称するPESA複合体とは、少なくとも2つの酵素増幅因子基質（EAS）オリゴヌクレオチドを含む多オリゴヌクレオチド複合体のことであり、ここで1つのEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、複合体の中のもう1つのEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に対して相補的である。加えて、前記EASオリゴヌクレオチドの1つの少なくとも一部分は、少なくとも1つのDF（以下に定義するような）の少なくとも一部分に対しても相補的である。DFとハイブリダイズする能力を有するにもかかわらず、DFはPESA複合体とハイブリダイズせず、それ故にPESA複合体の成分ではない。PESA複合体は酵素による少なくとも部分的な認識配列／部位および／または少なくとも部分的な切断配列／部位を含み、それが酵素による完全な認識配列／部位および／または完全な切断配列／部位を含有してもよい。酵素は例えば、ヌクレアーゼ（例えば、制限酵素、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ）であってよい。いくつかの態様において、PESA複合体の2つのEASオリゴヌクレオチドがリンカーによってつなぎ合わされてもよい。例えば、2つのEASオリゴヌクレオチドが同一のオリゴヌクレオチド中に存在し、そこでそれらがヘアピン構造の形態で連結性核酸配列によってつなぎ合わされてもよい。上記に述べた意味を逸脱することなく、本明細書におけるPESA複合体を、例えば、「第1の」PESA複合体、「第2の」PESA複合体、「第3の」PESA複合体などのように数字で称してもよいことに留意されたい。
【０３２３】
「ドライバー断片オリゴヌクレオチド」、「ドライバー断片（DF）オリゴヌクレオチド」、「ドライバー断片オリゴ」、「DFオリゴヌクレオチド」、「DFオリゴ」および「DF」は、本明細書中で互換的に用いられ、同じ意味を有する。本明細書で称するDFオリゴヌクレオチドとは、オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分が、少なくとも1つのEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に対して相補的であり、その結果、適切な条件下でその2つの間のハイブリダイゼーションが起こるようなオリゴヌクレオチドのことである。DFオリゴヌクレオチドは、本発明の方法によって検出しようとする標的分子（例えば、核酸）であってもよく、そうでなくともよい。DFオリゴヌクレオチドが、複合体、例えばCESA複合体などの成分であってもよい。そのような場合に、DFオリゴヌクレオチドが、1つまたは複数のヌクレオチドを、複合体の中に存在する可能性のある酵素認識配列／部位および／または酵素切断配列／部位に寄与してもよいが、必ずしもそうである必要はない。酵素は例えば、ヌクレアーゼ（例えば、制限酵素、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ）であってよい。上記に述べた意味を逸脱することなく、本明細書におけるDFオリゴヌクレオチドを、例えば、「第1の」DF、「第2の」DF、「第3の」DFなどのように数字で称してもよいことに留意されたい。
【０３２４】
「合成イニシエーターオリゴ（Synthetic Initiator Oligo）」または「SIO」とは、試料中の標的核酸とハイブリダイズして、それにより、ヌクレアーゼによる切断を受けやすい基質を形成することができ、この切断によって、ドライバー断片（DF）として機能しうるより短いオリゴが生じるようなオリゴヌクレオチドのことである。SIOは、ヌクレアーゼによるその切断の前には阻害性断片（InF）として機能してもよい。SIOは、部分的または完全に二本鎖コンフォメーションにある1つまたは複数のオリゴヌクレオチドで構成されうる。複数のオリゴヌクレオチドを有するSIOを、本明細書では「SIO複合体」と称する。上記に述べた意味を逸脱することなく、本明細書におけるSIOを、例えば、「第1の」SIO、「第2の」SIO、「第3の」SIOなどのように数字で称してもよいことに留意されたい。
【０３２５】
「酵素阻害性複合体」または「EIC」とは、酵素による切断を受けやすい二重鎖構造の形成を妨害する余分な配列の存在が原因で、酵素による切断を受けにくい二重鎖を形成する、2つまたは3つ以上の相補的核酸断片またはオリゴヌクレオチドによって形成される複合体のことである。1つの態様において、EICはEAS1、EAS2および阻害性断片（InF）を含む。もう1つの態様において、EICはPESAおよびInFを含む。1つのさらなる態様において、InFは、DFとして有用であるものの、切断を受けやすい二重鎖CESAの形成を妨げる付加的なヌクレオチドも有する配列を含む。さらなる態様において、InFは、標的分析物の存在下でのみ切断されて、DFとして機能してCESAの組織化を完了させることのできる、より小型のオリゴヌクレオチド断片となるオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、InFは、標的の存在下でのみヌクレアーゼによって切断されてDFを生じる「合成イニシエーターオリゴ」または「SIO」であってよい。他の態様において、InFは、標的の存在下でのみMNAザイムによって切断されてDFになることのできる「MNAザイム基質」であってよい。いくつかの態様において、InFの切断は核酸酵素またはアプタザイム（aptazyme）に依存する。いくつかの態様において、核酸酵素またはアプタザイムにはMNAザイムが含まれる。他の態様において、切断はタンパク質酵素によって媒介される。いくつかの態様において、酵素はエンドヌクレアーゼである。いくつかの態様において、酵素はエキソヌクレアーゼである。さらに他の態様において、切断は化学的手段によって実現される。
【０３２６】
「Ezy-amp」または「EzyAmp」反応は、ヌクレアーゼによるCESAの標的依存的切断によってシグナルの発生および／または増幅が助長され、そのシグナルによって標的の存在が指し示される過程である。EzyAmp反応は、1つまたは複数のPESA複合体およびCESA複合体を含みうる。いくつかの態様において、複数のPESA複合体からの複数のCESAの形成は、第1のPESAに対する第1のDF（標的依存性イベントにより生じる）の結合によって第1のCESAが形成され、第1のCESAの切断によって第2のDFが放出され、それが第2のPESAと結合して第2のCESAを形成し、第2のCESAの切断によって、第1のPESAと結合しうる第1のDFが放出されて、もう1つの第1のCESAが形成されるという、フィードバックループを形成することができる。続いてこの第1のCESAが切断されて、もう1つの第2のDFが生成され、それがもう1つの第2のPESAと結合してもう1つの第2のCESAを形成することができ、以下も同様である。検出可能なシグナルは、第1および／または第2のCESAの切断のたびごとに発生し、それ故に、単一の標的依存性イベントに由来するシグナルを増幅する手段となる。本明細書で称するEzyAmp反応が、直線的およびフィードバック性のシグナル増幅カスケードの両方を範囲に含むことは理解されるであろう。
【０３２７】
「酵素」とは、化学反応を触媒することのできるあらゆる分子のことを指す。「触媒性タンパク質」、「触媒性アミノ酸」および「タンパク質酵素」は同じ意味を有し、基質を認識して化学修飾を触媒する、アミノ酸の鎖で構成される分子を記述するために、本明細書中で互換的に用いられる。酵素は別の酵素、アプタマー、分子または核酸を認識して、結合を切断すること、付加すること、または修飾することができる。
【０３２８】
「触媒性核酸分子」、「触媒性核酸」、「核酸酵素」および「触媒性核酸配列」は同じ意味を有し、DNA分子もしくはDNA含有分子（当技術分野において「DNA酵素」、「デオキシリボザイム」または「DNAザイム」としても公知）またはRNAもしくはRNA含有分子（当技術分野において「RNA酵素」または「リボザイム」としても公知）または「MNAザイム」を記述するために本明細書中で互換的に用いられ、これらはすべて、基質を認識して基質の化学修飾を触媒する。MNAザイム、アプタ-MNAザイム、DNAザイム、リボザイム、アプタザイム、EAS、CESA複合体、PESA複合体、SIO、ドライバー断片または阻害性断片におけるヌクレオチド残基には、塩基A、C、G、TおよびU、ならびにそれらの誘導体または類似体が含まれてよく、それらの例は表1に列記されている。MNAザイム、アプタ-MNAザイム、DNAザイム、リボザイム、アプタザイム、EAS、CESA複合体、PESA複合体、SIO、ドライバー断片または阻害性断片の1つまたは複数の成分を、ビーズ、チップ、アレイ、マイクロキャリア、ナノキャリア、コードされたマイクロキャリア、コードされたナノキャリアを非限定的に含みうる固体支持体に付着させることができる。
【０３２９】
「誘導体」という用語は、本発明の核酸またはヌクレオチドに関連して用いられる場合、一体的に産生されるか（例えば、組換え手段によって）または合成後に付加される（例えば、化学的手段によって）任意の融合分子を含む、任意の機能的に同等な核酸またはヌクレオチドを含む。そのような融合体には、RNAまたはDNAを有する本発明のオリゴヌクレオチドに、ポリペプチド（例えば、ピューロマイシンもしくは他のポリペプチド）、小分子（例えば、ソラレン）または抗体が付加もしくは結合体化されたものが含まれうる。
【０３３０】
「類似体」という用語は、本発明の核酸またはヌクレオチドに関連して用いられる場合、DNAまたはRNAの分子または残基と類縁関係にあって、DNA残基もしくはRNA残基またはそれらの類似体と水素結合を形成できてもよい（すなわち、それはDNA残基もしくはRNA残基またはそれらの類似体とアニーリングして塩基対を形成することができる）物理的構造を有する化合物を含むが、そのような結合は、前記化合物を「類似体」という用語の範囲に含めるのにそれほど必要とされない。そのような類似体は、それらが構造的に類縁関係にあるリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基とは異なる化学特性および生物学的特性を有してもよい。メチル化残基、ヨウ化残基、臭素化残基またはビオチン化残基は、類似体の例である。デオキシイノシン、C-5-イミダゾール デオキシウリジン、3-(アミノプロピニル)-7-デアザ-dATP、2'-O-メチルRNA、2'-O-メチルキャップを含む、ヌクレオチド類似体を含有する活性DNAザイムが記載されている。他の類似体も、DNAザイムおよびMNAザイムの触媒活性との適合性がある可能性がある。触媒活性による核酸の改変、例えば、1つの塩基の別の塩基への置換による、1つの塩基の類似体への置換によるか、または糖成分もしくはホスホジエステル骨格の改変によるものは、当業者にとって簡単である。例えば、改変を合成中に行うこともでき、または合成後に特定塩基の修飾によって行うこともできる。塩基変化または塩基類似体などの改変を組み込んだ触媒性核酸の実験的検討により、改変された配列または特定の類似体が触媒活性に及ぼす影響を評価することが可能になる。塩基A、C、G、TおよびUの類似体は当技術分野において公知であり、サブセットを表1に列挙している。ヌクレアーゼ消化を阻害しうる類似体の例も当技術分野において周知である。そのような類似体は、エキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼによる切断を防ぐために、オリゴヌクレオチド内部に戦略的に配置することができる。一例として、ホスホロチオエート結合のSp立体異性体は、λエキソヌクレアーゼ、T7エキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼIII（大腸菌（E. coli））、エキソヌクレアーゼI（大腸菌）、エキソヌクレアーゼTおよびRecJを含む多くのヌクレアーゼの切断を大きく阻害することが知られている。複数のホスホロチオエート結合を含めることは、ヌクレアーゼ活性をブロックするのに極めて有効な可能性がある。
【０３３１】
（表１）ヌクレオチド類似体の例
2013542738.tif 000002
2013542738.tif 000003
【０３３２】
「組織化助長因子（assembly facilitator）分子」、「組織化助長因子」、「MNAザイム組織化助長因子分子」、「MNAザイム組織化助長因子」は同じ意味を有し、成分パートザイムの自己組織化を助長して触媒活性のあるMNAザイムを形成させる分子を指して、本明細書中で互換的に用いられる。好ましい態様において、組織化助長因子はMNAザイムの自己組織化のために必要とされる。組織化助長因子分子には、いくつかの態様において、「標的」、「標的分析物」または「分析物」が含まれ、これらはそれぞれ、本明細書で用いる場合、特定のMNAザイムによって存在を検出または測定しようとする分子のことを指す。組織化助長因子分子は、「MNAザイム」の成分または部分を構成する1つまたは複数のオリゴヌクレオチド「パートザイム」と対合するかまたは結合する、1つまたは複数の領域を含む。組織化助長因子は、それがMNAザイムの成分パートザイムの少なくとも1つと相互作用するか、対合するか、または結合するのであれば、それぞれの成分パートザイムまたはオリゴヌクレオチドと相互作用したり、対合したり、あるいは結合したりする必要はない。本明細書で用いる場合、MNAザイム組織化助長因子分子は、MNAザイムの自己組織化を助長しうる、最も広範囲にわたる成分を範囲に含むものとする。標的および分析物も、最も広範囲にわたる検出可能な成分を範囲に含むものとし、それらに対しては高感度の検出方法が望ましい。例示的な標的のいくつかには、核酸配列、ウイルス、細菌、プリオン、タンパク質、抗体および小分子が含まれる。他の標的分析物についても、本明細書における使用を想定している。
【０３３３】
「基質」、「基質分子」および「化学基質」は同じ意味を有し、触媒性分子によって認識されて化学修飾されるあらゆる分子を指して、本明細書中で互換的に用いられる。特定の態様において、基質は酵素によって認識されて修飾され、他の態様において、基質は触媒性核酸分子によって認識されて修飾される。特定の態様において、基質はタンパク質酵素によって認識されて修飾され、他の態様において、基質は核酸酵素によって認識されて修飾される。特定の態様において、基質は一本鎖核酸分子を含んでよく、他の態様において、基質は二本鎖核酸分子を含んでよい。さらなる態様において、基質はヘアピン分子を形成しうる。基質の化学修飾は、反応の生成物の出現もしくは増加によって、または反応の基質の消失もしくは減少によって測定することができる。1つの特定の触媒性分子が1つまたは複数の異なる基質分子を認識することも、各基質分子が触媒性分子による触媒活性にとって認識可能な少なくとも最小限の構造を有するのであれば可能である。
【０３３４】
本明細書で用いる場合、「パートザイム」および「成分パートザイム」という用語は同じ意味を有し、その2つまたはそれ以上がMNAザイム組織化助長因子分子の存在下でのみ相伴って「MNAザイム」を形成することのできる、DNA含有性またはRNA含有性オリゴヌクレオチドのことを指して、本明細書中で互換的に用いられる。ある好ましい態様において、1つまたは複数の、好ましくは少なくとも2つの成分パートザイムは、3つの領域またはドメインを含む：化学修飾を触媒するMNAザイムの触媒性コアの一部を形作る「触媒性」ドメイン；標的分析物と会合および／または結合する「センサーアーム」ドメイン；ならびに基質と会合および／または結合する「基質アーム」ドメイン。当業者は、パートザイムは必ずMNAザイム構造の一部を形作らなくてはならないものの、それがMNAザイム組織化助長因子分子を特異的に認識する必要も、それと直接結合したり会合したりする必要もないことを理解するであろう。したがって、ある所与のMNAザイムに対する1つまたは複数のパートザイムが、前述のドメインの1つまたは複数またはすべてを全体的または部分的に欠いてもよいことは明らかである。ある態様において、1つまたは複数のパートザイムは他のパートザイムと相互作用するが、組織化助長因子分子とは必ずしも相互作用しない。他の態様において、1つまたは複数の特定のパートザイムは、組織化助長因子分子と間接的にのみ相互作用し、それと直接的に結合することも対合することもない。
【０３３５】
本明細書で用いる「MNAザイム」および「多成分核酸酵素」という用語は、MNAザイム組織化助長因子分子（例えば、標的分析物）の存在下でのみ基質分子を触媒的に修飾することのできる活性核酸酵素を形成する、2つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド配列（例えば、パートザイム）のことを指す。1つの態様において、パートザイムAおよびBはそれぞれ、標的分析物と結合する（例えば、核酸標的とのWatson-Crick塩基対合によって）。MNAザイムは、パートザイムAおよびBのセンサーアームが標的上で互いに隣接してハイブリダイズした時にのみ形成される。MNAザイムの基質アームは基質と係合し、その切断は、パートザイムAおよびB上の部分的触媒性ドメインの相互作用によって形成されたMNAザイムの触媒性コアによって触媒される。いくつかの態様において、MNAザイムは基質をフルオロフォアとクエンチャー色素の対の間で切断し、それによってシグナルを発生させる。DNA／RNAキメラ（基質）の切断は、図面に例示されている（図5A）。他の態様において、MNAザイムが、パートザイムとの結合後に基質分子を核酸連結させてもよい。
【０３３６】
本明細書で用いる「MNAザイム」および「多成分核酸酵素」という用語が、PCT特許公報第WO／2007／041774号、第WO／2008／040095号、第WO2008／122084号、ならびに関連する米国特許出願公開第2007-0231810号、第2010-0136536号および第2011-0143338号（これらの文書のそれぞれの内容はすべて、相互参照により本明細書に組み入れられる）のいずれか1つまたは複数に開示されたものを含め、あらゆる公知のMNAザイムおよび修飾MNAザイムを範囲に含むことは理解されるであろう。「MNAザイム」および「多成分核酸酵素」という用語の範囲に含まれるMNAザイムおよび修飾MNAザイムの非限定的な例には、切断触媒活性を有するMNAザイム（本明細書中で例示するような）、1つまたは複数の組織化阻害因子を含む、解体しているかまたは部分的に組織化したMNAザイム、1つまたは複数のアプタマーを含むMNAザイム（「アプタ-MNAザイム」）、1つまたは複数の短縮型センサーアームおよび任意で1つまたは複数の安定化オリゴヌクレオチドを含むMNAザイム、1つまたは複数の活性阻害因子を含むMNAザイム、多成分核酸不活性プロ酵素（MNAi）、ならびにリガーゼ触媒活性を有するMNAザイム（「MNAザイムリガーゼ」）が含まれ、これらはそれぞれ、WO／2007／041774号、WO／2008／040095号、WO2008／122084号、US 2007-0231810号、US 2010-0136536号および／またはUS 2011-0143338号の1つまたは複数に詳細に記載されている。
【０３３７】
本明細書で用いる場合、「アプタマー」は、その高次構造、例えば3-D結合ドメインまたはポケットなどが理由で、1つまたは複数のリガンドを高い親和性および特異性で認識する能力を有する核酸配列またはペプチド配列を含む。アプタマーは、核酸、タンパク質、プリオン、小型有機化合物または生物体全体と結合することができる。本明細書における好ましいアプタマーは、合成核酸の複合的ライブラリーから、吸着、回収および再増幅の反復過程によって単離しうる、短い一本鎖DNAまたはRNAオリゴマーである。アプタマーは、アミノ酸または抗生物質などの小分子から、タンパク質および核酸の構造体までの範囲にわたる、ほとんどあらゆる標的に対して作製することができる。
【０３３８】
本明細書で用いる「オリゴヌクレオチド」または「オリゴ」は、DNAもしくはDNA含有核酸分子、またはRNAもしくはRNA含有分子のセグメントまたは断片のことを表す。オリゴヌクレオチドの例には、核酸標的；基質、例えば、MNAザイムによって修飾されうるもの；プライマー、例えば、PCRなどの方法によるインビトロ標的増幅のために用いられるもの、およびMNAザイムの成分が含まれる。MNAザイム組織化助長因子は、ある態様において、本明細書で定義されたようなオリゴヌクレオチドを含む。本明細書で用いるパートザイムには、オリゴヌクレオチドも含まれる。オリゴヌクレオチドの他の例には、EAS、InF、SIOおよびDFが含まれる。本明細書で言及するオリゴヌクレオチドは、別のオリゴヌクレオチドに対して「相補的」であってよい。第2の核酸分子に対して「相補的」であると本明細書で称する任意の核酸分子は、適切な条件下で、その第2の核酸分子（全体的または部分的に）と、Watson-Crick塩基対合を介してハイブリダイズすることができる。
【０３３９】
本明細書で用いる場合、「塩基」という用語は、塩基が結びついているリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの全体を範囲に含むことが理解されるであろう。
【０３４０】
「ヘアピンオリゴヌクレオチド」または「ヘアピン」とは、本明細書で用いる場合、分子内ハイブリダイゼーション結合の形成をもたらす配列相補性をそれ自体の内部に含むオリゴヌクレオチドのことを表す。相補性部分は「ステム」と呼ばれ、一方、ステムを形成するものの間の領域は「ループ」と命名されている。ヘアピンは、5'末端または3'末端のいずれかでステムから伸びる余剰配列を有してもよい。ヘアピンが、別のオリゴヌクレオチド、例えばDFなどに対して相補的な配列を含んでもよい。
【０３４１】
「蛍光標識」および「フルオロフォア」とは、蛍光を発することができる物質または部分のことを指す。「クエンチャー」は、フルオロフォアの放出エネルギーを、この2つの部分が近接した時に吸収することができる部分のことである。フルオロフォアはさまざまな波長でエネルギーを吸収および放出することができ、それ故に種々の波長で消光を受ける。フルオロフォアおよびクエンチャーは、近接するように容易に操作することができる。例えば、両者を同一のDNA鎖上に0〜20塩基単位以内の間隔で配置してもよく、またはDNA鎖の両端に配置してもよい。この空間配置により、フルオロフォアの発光波長では実質的にシグナルが生じなくなる。物理的分離が、例えば、DNA鎖の酵素的切断の結果として起こると、クエンチャーおよびフルオロフォアは、クエンチャーがフルオロフォアからのエネルギーをうまく吸収するには隔たりが大き過ぎるようになり、その結果、検出可能なシグナルがフルオロフォアの発光波長で生じる。
【０３４２】
本明細書で用いる場合、「カスケード」という用語は、各段階の発生が典型的には直前の段階の発生に依存する、連続的段階として起こる任意の一連の過程または動作のことを指す。カスケードにはこのため、酵素的カスケードまたは任意の他のシグナル伝達カスケードが非限定的に含まれる。いくつかの態様において、カスケードは、ヌクレアーゼの触媒活性に起因するシグナルの増幅を伴いうる。好ましい態様において、そのような増幅カスケードは、第1の分子の、またはそれらによる触媒性修飾によって、第2の分子の、またはそれらによる触媒性修飾のために必要な分子が得られ、それによって今度は、第1の分子の、またはそれらによる触媒性修飾のために必要な分子が得られるという、シグナルの反復的であってそれ故に周期的な増幅を伴いうる。いくつかの態様において、必要な分子には、ドライバー断片、パートザイム、酵素、組織化助長因子、基質、標的、それらの一部分もしくは断片、またはそれらの組み合わせが含まれうる。いくつかの態様において、カスケードはそれ故に、累積作用の産生を伴うことができ、そのようにして、シグナルを検出しうるレベルで発生させることによって、存在量の少ない標的を検出することができる。他の態様において、3つ以上の触媒段階を利用することもできる。カスケードが直線的であってもよい。好ましい態様において、カスケードは指数関数的であってもよい。
【０３４３】
本明細書で用いる場合、「フィードバックカスケード」という用語は、後の段階の発生が前の段階の発生に依存し、かつその同一の前の段階の発生が、少なくとも一部には後の段階の発生に依存するという、連続的段階として起こる任意の一連の過程または動作のことを指す。
【０３４４】
略号
本明細書中および本明細書の全体を通じて、以下の略号を用いる：
RE：制限エンドヌクレアーゼ、制限酵素
CESA：完全酵素シグナル増幅因子複合体
PESA：部分的酵素シグナル増幅因子複合体
SIO：合成イニシエーターオリゴ
EIC：酵素阻害性複合体
RERS：制限酵素認識部位／配列
RER：制限酵素認識
EAS：酵素増幅因子基質オリゴ
EAS1：第1の酵素増幅因子基質オリゴ
EAS2：第2の酵素増幅因子基質オリゴ
EAS3：第3の酵素増幅因子基質オリゴ
EAS4：第4の酵素増幅因子基質オリゴ
EAS5：第5の酵素増幅因子基質オリゴ
EAS6：第6の酵素増幅因子基質オリゴ
EAS7：第7の酵素増幅因子基質オリゴ
EAS8：第8の酵素増幅因子基質オリゴ
InF：阻害性断片
DF：ドライバー断片
MNAザイム：多成分核酸酵素
DNAザイム：デオキシリボ核酸酵素；
PCR：ポリメラーゼ連鎖反応；
dH2O：脱イオン蒸留水；
LNA：ロックド核酸；
PNA：ペプチド核酸；
bDNA：分枝DNAアッセイ；
FCS：蛍光相関分光法；
TSA：チラミドシグナル増幅因子；
An：分析物または標的；
F：フルオロフォア色素分子；
Q：クエンチャー分子；
N＝A、C、T、Gまたはそれらの任意の類似体；
N'＝Nに対して相補的な、またはNと塩基対合することができる任意のヌクレオチド；
(N)x：Nの任意の数；
(N')x：N'の任意の数；
n＝rNと互換
W：AまたはT；
K：A、GまたはAA；
rN：任意のリボヌクレオチド塩基；
(rN)x：rNの任意の数；
rR：aまたはg；
rY：cまたはu；
M：AまたはC；
H：A、CまたはT；
D：G、AまたはT；
JOEまたは6-JOE：6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン；
FAMまたは6-FAM：6-カルボキシフルオレセイン
Oligo：オリゴヌクレオチド
BHQ＝black holeクエンチャー
BHQ1＝Black Holeクエンチャー1
BHQ2＝Black Holeクエンチャー2
TXR＝テキサスレッドまたはスルホローダミン
IAbFQまたはIAbkFQ＝Iowa black蛍光クエンチャー
【０３４５】
詳細な説明
本明細書において提供される図面および実施例は、本発明およびそのさまざまな態様を例示することを目的としており、限定するためのものではないことが、最初に理解されるべきである。
【０３４６】
標的の検出、同定および／または定量のための組成物、方法およびキットを提供する。本方法は全体として、完全酵素シグナル増幅因子複合体の中に組み込まれた時に検出可能なシグナルのヌクレアーゼ媒介性増幅を助長する、ドライバー断片（DF）の標的依存的生成のための成分を含む組成物の使用を含む。ある態様においては、ドライバー断片（DF）の標的依存的生成によって生じた初期シグナルが、新たな標的分子が提供されるか否かとは関係なく増幅される（すなわち、初期標的認識イベント後のシグナル増幅が標的分子とは独立に起こりうる）、フィードバックカスケードを提供する。DFが標的認識イベントによって生じる手段に関しては、何ら特定の限定は存在しないものの、いくつかの態様において、DFは、多成分核酸酵素（MNAザイム）による基質の切断によって生じる。MNAザイムは好ましくは、組織化助長因子の存在下で自己組織化して活性核酸酵素を形成する複数の核酸パートザイムによって形成される。好ましい態様において、組織化助長因子は標的であり、それ故にMNAザイムは標的の存在下でのみ形成される。他の態様において、DFは、合成イニシエーターオリゴヌクレオチド（SIO）と標的配列とのハイブリダイゼーションによって形成される二重鎖の標的依存的ヌクレアーゼ切断によって生じる。
【０３４７】
1. 組成物およびキット
本明細書では、本発明の方法を実施するための組成物およびキットを提供する。あくまでも非限定的な例に過ぎないが、組成物およびキットは、酵素増幅因子基質（EAS）オリゴヌクレオチド、ドライバー断片（DF）、部分的酵素シグナル増幅因子（PESA）複合体、完全酵素シグナル増幅因子（CESA）複合体、酵素阻害性複合体（EIC）、阻害性断片（InF）、合成イニシエーターオリゴ（SIO）、触媒性核酸、MNAザイム、MNAザイム成分、パートザイム、組織化助長因子、MNAザイム基質、酵素、制限酵素、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、基質、アプタマー、および／またはヘアピンオリゴヌクレオチドのうち任意の1つまたは複数を含みうる。
【０３４８】
1.1 MNAザイム
本発明の組成物およびキットは、1つまたは複数のMNAザイムを含みうる。MNAザイムとは、2つまたは3つ以上のオリゴヌクレオチド成分から自己組織化しうる触媒活性のある核酸酵素のことであり、本明細書中ではパートザイムとも称される。パートザイムオリゴヌクレオチドは、MNAザイム自己組織化助長因子の存在下で自己組織化してMNAザイムを形成する。いくつかの態様において、MNAザイムの存在を検出することができ、そしてそれは標的の存在を指し示すが、これはMNAザイムが、組織化助長因子を含む標的である標的の存在下でのみ形成されるためである。MNAザイムは当技術分野において周知であり、PCT特許公報第WO／2007／041774号、第WO／2008／040095号、第WO2008／122084号、ならびに関連した米国特許出願公開第2007-0231810号、第2010-0136536号および第2011-0143338号のうち任意の1つまたは複数に、さらに詳細に記載されている（これらの文書のそれぞれの内容はすべて、相互参照により本明細書に組み入れられる）。
【０３４９】
好ましい態様において、MNAザイム構造は、1つまたは複数のDNAザイムおよび／またはリボザイムに基づく。特定のDNAザイム構造に基づくMNAザイム構造がより好ましい。現時点で好ましい構造は、10：23および8：17 DNAザイムを含むDNAザイムである。さまざまな態様において、MNAザイムはリボヌクレオチド塩基およびデオキシリボヌクレオチド塩基の一方または両方を含む。より好ましい態様において、MNAザイム構造は、少なくとも一部にはDNAザイムの構造に基づく。他の好ましい態様において、MNAザイムは、少なくともいくつかのデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体を含む。より好ましい態様において、MNAザイムの触媒性コアは、1つまたは複数のデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体を含む。さらにより好ましい態様において、1つまたは複数のデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体は、基質の触媒作用に関与する。他の態様において、触媒性コアの中の少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体は、触媒活性を向上させる。さらに他の態様において、MNAザイムの触媒性コアの中の少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体については、デオキシリボヌクレオチド塩基が存在しない同等なMNAザイムのものに比して、触媒作用が測定可能な速度で起こるという厳密な必要条件が存在する。
【０３５０】
MNAザイムは、当業者に周知の1つまたは複数の置換、例えば、類似体、誘導体、修飾もしくは改変された塩基、リボヌクレオチド、糖もしくはリン酸骨格の改変、さまざまな欠失、挿入、置換、重複もしくは他の修飾、またはこれらの任意の組み合わせなどを含みうる。そのような修飾、置換、欠失、挿入などを、分子が触媒活性を保つように、センサーおよび／もしくは基質アームに、ならびに／または触媒性コア部分に加えることができる。基質または組織化助長因子と結合するアームの、置換および修飾に対する忍容性は十分であり、このため種々の基質／組織化助長因子に向けての分子の個別適合化（tailoring）が可能になる。例えば、センサーアームの修飾により、種々の組織化助長因子に向けての個別適合化が可能になり、一方、基質アームの修飾により、種々の基質に向けての個別適合化が可能になる。
【０３５１】
パートザイムのセンサーアームのみを改変し、基質アームは変化させずにおくことにより、そのすべてがユニバーサルMNAザイム基質を検出のために利用する、多数の標的のそれぞれに対して特異的な多種多様なMNAザイムを設計することができる。当業者は、このことが、各標的に対して個別化されるかまたは一意的な基質の必要性をなくすという利点を理解するであろう。それぞれの新たな標的に必要なのは、パートザイムのセンサーアーム部分のうち1つまたは複数における1つまたは複数の変化のみである；基質アーム部分および触媒コア部分は不変のままであってよい。したがって、単一のMNAザイム基質を、MNAザイムを用いる単一の標的に対して、および、改変されたMNAザイムを用いる一連のアッセイにおいて複数の標的に対して用いることができる。多数のレポーター基質により、各標的ごとに1つずつの複数のMNAザイムを用いる単一のアッセイにおいて複数の標的を検出するという多重化が可能になる。MNAザイムを用いるそのような多重化された方法は、溶液中で、または支持系への付着により、容易に実現することができる。多重化アッセイをこのように、基質またはMNAザイムパートザイムまたは組織化助長因子または追加の酵素活性のうち1つまたは複数を、本明細書に記載したように支持体に付着させることによって実現しうることを、本明細書では想定している。
【０３５２】
当業者は、MNAザイムがデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはその両方を含むことを理解するであろう。少なくとも1つの、より好ましくはすべてのデオキシリボヌクレオチド成分オリゴヌクレオチドを含むMNAザイムが現時点では好ましい。また、MNAザイムの触媒性コアの内部に少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体を含むMNAザイムも好ましい。そのような塩基が触媒活性のために必要である態様が、さらにより好ましい。
【０３５３】
いくつかの態様において、パートザイム、組織化助長因子または基質のうち少なくとも1つが、標的と結合しうるアプタマーを含有すること／含むこともできる。
【０３５４】
好ましいアプタマーには、合成核酸またはペプチドの複合的ライブラリーから、吸着、回収および再増幅の反復過程によって単離しうる、短い一本鎖DNAもしくはRNAオリゴマー、またはペプチドが含まれうる。アプタマーはこのように、アミノ酸または抗生物質などの小分子から、タンパク質および核酸の構造体までの範囲にわたる、ほとんどあらゆる標的に対して作製することができる。好ましい態様において、アプタマーには、例えば、好ましくは進化および選択の手法によって生成される核酸結合分子が含まれる。好ましくは、アプタマーは、例えば、上記の表1のようなヌクレオチド類似体を非限定的に含む、DNAもしくはRNA分子またはその両方の組み合わせを含みうる。
【０３５５】
アプタマーの使用とMNAザイムを組み合わせるための戦略は、当技術分野において公知である。例えば、MNAザイムの少なくとも1つのパートザイムにアプタマーを組み込んでもよく（アプタ-パートザイム）、さらに、ヘアピンを形成することができ、それ故にMNAザイム組織化を阻害しうる相補的配列を組み込んでもよい。検出しようとする分析物または標的はアプタ-パートザイムと結合し、その結果、活性MNAザイムの組織化が可能になる。標的分析物の非存在下では、アプタ-パートザイムは、活性MNAザイムの組織化を阻害するヘアピン構造をとる。標的分析物の存在下では、標的分析物はアプタ-パートザイムのアプタマードメインと結合し、その結果、ヘアピン構造を妨害して、アプタ-パートザイムが活性MNAザイムの組織化に加わることが可能になる。続いて、活性MNAザイムがMNAザイム基質を修飾して、ドライバー断片を生成させることができる。
【０３５６】
他の態様において、アプタマーが、アプタマーならびにヘアピン構造を形成しうる相補的阻害因子配列を組み込んだ組織化助長因子の一部として存在してもよい。標的分析物の非存在下では、組織化助長因子は、この成分が活性MNAザイムの組織化を導く能力を阻害するヘアピン構造をとる。標的分析物の存在下では、標的分析物は組織化助長因子のアプタマードメインと結合し、その結果、ヘアピン構造が妨害されて、成分が活性MNAザイムの組織化を導くことを可能にする。続いて活性MNAザイムがMNAザイム基質を修飾して、ドライバー断片を生成させることができる。
【０３５７】
当業者は、アプタマーを組織化助長因子分子のいずれかの末端に組み込みうることを理解するであろう。さらに、複数のアプタマーを、パートザイムオリゴヌクレオチド成分のうち1つまたは複数に組み込むこともできると考えられることも理解されるであろう。
【０３５８】
1つのさらなる態様において、アプタマー配列を、活性MNAザイムが標的分析物の存在下でのみ形成されるような立体配置で、パートザイムの末端に組み込むこともできる（アプタ-パートザイム）。この場合、MNAザイム検出戦略のために必要なオリゴヌクレオチド成分には以下のものが含まれる；標準的なパートザイム；末端の一方にアプタマーが組み込まれたパートザイムであるアプタ-パートザイム；（標的の存在下で）アプタ-パートザイムおよびパートザイムの両方と結合して活性MNAザイムの組織化を可能にする組織化助長因子；基質；ならびに、アプタ-パートザイムと、パートザイム配列の少なくともアプタマー配列の一部および基質結合アームの一部にわたる領域内で結合する組織化阻害因子。標的の非存在下では、組織化阻害因子はアプタ-パートザイムと結合し、その結果、MNAザイム基質の結合（および切断）をブロックする。標的の存在下では、標的はアプタ-パートザイムのアプタマー配列と結合し、組織化阻害因子の結合を妨げて、MNAザイム基質の結合および切断を可能にする。そのため、活性MNAザイムは標的の存在下でのみ形成され、MNAザイム基質を修飾して切断断片、例えばドライバー断片を生成することができる。
【０３５９】
さらに、組織化阻害因子が別個の分子であってもよく、またはMNAザイム複合体に加わる成分の1つの中に組み込まれてもよいことは、当業者には理解されるであろう。
【０３６０】
また、1つまたは複数のアプタマーを、パートザイム、組織化助長因子またはMNAザイム基質を含むオリゴヌクレオチド成分のいずれかの中に組み込むこともできると考えられることも、当業者には理解されるであろう。さらに、アプタマーを、これらのオリゴヌクレオチドのいずれか1つの一方の末端に組み込むこともできると考えられる。
【０３６１】
1.2 MNAザイム基質
本発明の組成物およびキットは、1つまたは複数のMNAザイム基質を含みうる。基質は、ある所与のMNAザイムに対して特異的であってもよく、または異なる標的特異性を有する複数のMNAザイムによる修飾が可能なユニバーサル／ジェネリック基質であってもよい。MNAザイムは、ある態様において、ユニバーサルまたはジェネリックな基質を利用しうるという有利な特性を有する。ユニバーサルMNAザイム基質は、複数の異なる標的を認識する新たなMNAザイムを作り出すための設計変更を容易にすることによって、迅速アッセイの開発を可能にする。パートザイムの基質アーム部分および触媒性コア部分を不変のままにして、新たな標的に対して必要な、1つまたは複数のパートザイムのセンサーアーム部分のみを変化させてもよい。ユニバーサル基質配列は提供されており、このため、同一の基質を、多くの異なる標的に関するアッセイに組み入れることができる。さらに、同一の基質を、基質が溶液中に遊離しているか、または支持体に連接されるかもしくは付着されているアッセイを含む、本明細書中のさまざまな態様における方法に組み入れることもできる。一連のユニバーサル基質を、複数の標的の同時検出を可能にする多重的反応に用いることができる。
【０３６２】
ユニバーサル基質を用いるMNAザイム戦略には、新たな各標的に対して特異的なプローブの設計および使用を必要とする、TaqMan（登録商標）または分子ビーコン（Molecular Beacons）またはハイブリダイゼーションプローブなどの検出技術を上回る、大きな利点がある。
【０３６３】
ある態様において、MNAザイム基質は、部分的酵素基質増幅因子複合体（PESA）と結合して、ヌクレアーゼ、例えば制限エンドヌクレアーゼによる切断に対する感受性のない酵素阻害性複合体（EIC）を形成する阻害性断片として作用しうる。
【０３６４】
MNAザイムによるMNAザイム基質の修飾により、本発明の方法（例えば、EzyAmp反応）に用いるための1つまたは複数の成分を得ることができる。修飾は例えば、MNAザイム基質の切断または複数のMNAザイム基質の核酸連結であってよい。
【０３６５】
いくつかの態様においては、MNAザイム基質の切断によって、ドライバー断片として機能し、PESAと組織化して、制限酵素または他のヌクレアーゼによる切断を受けやすいCESAを形成する、より小さな断片が生成されうる。MNAザイム基質はユニバーサルであって任意の標的に対して有用でありうるため、ユニバーサルMNAザイム基質の切断はユニバーサルドライバー断片の生成をもたらしうる。その結果、ユニバーサルDFはユニバーサルPESAと結合して、任意の標的の存在下で切断されてシグナルの増幅を可能にするユニバーサルCESAをもたらすことができる。
【０３６６】
他の態様においては、複数のMNAザイム基質の核酸連結によって、ドライバー断片として機能し、PESAと組織化して、制限酵素または他のヌクレアーゼによる切断を受けやすいCESAを形成する、より大きな断片が生成されうる。MNAザイム基質はユニバーサルであって任意の標的に対して有用でありうるため、ユニバーサルMNAザイム基質の核酸連結は、ユニバーサルドライバー断片の生成をもたらしうる。その結果、ユニバーサルDFはユニバーサルPESAと結合して、任意の標的の存在下で切断されてシグナルの増幅を可能にするユニバーサルCESAをもたらすことができる。
【０３６７】
1.3 ドライバー断片
本発明の組成物およびキットは、1つまたは複数のドライバー断片（DF）を含みうる。追加的または代替的に、本発明の方法による組成物およびキットの使用中にDFを生成させることもできる。
【０３６８】
ある態様において、ドライバー断片を、オリゴヌクレオチドの成分として提供することもできる。オリゴヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチドであっても二本鎖オリゴヌクレオチドであってもよい。例えば、オリゴヌクレオチドは、酵素増幅因子基質（EAS）オリゴヌクレオチド、合成イニシエーターオリゴヌクレオチド、MNAザイム基質オリゴヌクレオチド、ヘアピンオリゴヌクレオチド（例えば、複数のEAS、好ましくは2つのEASを含むヘアピンオリゴヌクレオチド）、連接されたオリゴヌクレオチド、または一方の鎖に内部ループ部分を有する二本鎖オリゴヌクレオチドであってよい。二本鎖および／またはヘアピンオリゴヌクレオチドは、一方の鎖がその相補的鎖よりもさらに伸びている突出部分（例えば、5'または3'突出部）を含みうる。オリゴヌクレオチドを、複合体（例えば、PESAまたはCESA）の中の他の成分と複合体化させてもよい。
【０３６９】
ある態様において、ドライバー断片はEASオリゴヌクレオチドの成分として提供され、このEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は別の異なるEASオリゴヌクレオチドに対して相補的であり、この異なるEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分はドライバー断片の少なくとも一部分に対して相補的である。
【０３７０】
ドライバー断片は、本明細書に開示されたシグナル増幅方法（例えば、EzyAmp反応）を惹起させるために用いることができる。例えば、標的検出時にのみ利用可能になるドライバー断片を、PESA複合体の中のEASに対する結合後にシグナル増幅カスケードを惹起させるために用いることができる。そのような態様において、カスケードはドライバー断片の非存在下では始まらず、それ故にそれは「イニシエーター」ドライバー断片とも称されるが、この用語は暗示的であるに過ぎず、そのようなドライバー断片を記述する上での必要条件ではないことは理解されるであろう。
【０３７１】
例えば、ドライバー断片が、標的配列の存在下でのみ組織化されるMNAザイム基質によるMNAザイムの切断によって生成されてもよい。また、ドライバー断片が、標的の存在下でのみ組織化する、リガーゼ活性を有するMNAザイムによる複数の基質の核酸連結によって生成されうることも想定している。ドライバー断片が、タンパク質、脂質、小分子、ウイルス、またはアプタマーを組み込んだこれらの種類の触媒性核酸によって検出可能な他のリガンドを含む標的リガンドの存在下でのみMNAザイム基質を切断する、アプタ-MNAザイムまたはアプタザイム（DNA、RNAまたはキメラ）の触媒活性によって生成されてもよい。
【０３７２】
ある態様において、ドライバー断片は、例えば、図19および24ならびに実施例9および14に記載されたような標的依存性MNAザイムを用いて生成されうる。これらの態様は、基質としてとの、ならびにDFと結合してそれ故にそれをブロックするためとの両方の役割を果たし、それ故に本明細書中で基質ブロッカー（substrate-blocker）オリゴヌクレオチドと称される二本鎖オリゴヌクレオチド複合体からのドライバー断片の生成を説明している。
【０３７３】
非限定的な例に過ぎないが、MNAザイム基質が第1および第2の鎖を含む二本鎖オリゴヌクレオチド複合体の成分であって、ここで第1の鎖が、MNAザイムの触媒活性によって修飾（例えば、切断）されうる内部ループ部分を含んでもよい。いくつかの態様において、第1および第2の鎖はヘアピンループ部分によって連結されており、ここで一方の鎖の5'末端はもう一方の鎖の3'末端と連結されていてもよい。内部ループ部分の内部の塩基は、第2の鎖の塩基とハイブリダイズしていない。オリゴヌクレオチド複合体は、ループ部分の外側にあって、対向鎖の一部分とハイブリダイズしている、少なくとも1つのドライバー断片を含む。例えば、ドライバー断片が複合体の第2の鎖の成分であってもよい。標的の存在下では、MNAザイムが組織化して、ループ部分を切断し、それにより、別の実体（例えば、EAS）とハイブリダイズしうる一本鎖ドライバー断片を放出する様式で複合体を修飾することができる。例えば、ループの切断によって、ループの一部分が複合体から除去され、それにより、ドライバー断片とあらかじめハイブリダイズした二本鎖複合体の一部分が除去されうる。標的依存的な様式で生成されたこのドライバー断片が、増幅カスケードを誘発させることができる。
【０３７４】
または、MNAザイム基質が、第1および第2の鎖を含む二本鎖オリゴヌクレオチド複合体の成分であって、ここで第1および第2の鎖が、一方の鎖の5'末端をもう一方の鎖の3'末端と接続するヘアピンループ部分によって連結されていてもよい。ヘアピンループ部分は、組織化標的の存在下で組織化が起こると、MNAザイムの触媒活性によって修飾（例えば、切断）されうる。オリゴヌクレオチド複合体は、ヘアピン部分の外側にあって、対向鎖の一部分とハイブリダイズしている少なくとも1つのドライバー断片を含む。標的の存在下では、MNAザイムが組織化し、ヘアピンループ部分を切断して、それにより、別の実体（例えば、EAS）とハイブリダイズしうる一本鎖ドライバー断片をもたらす様式で複合体を修飾することができる。例えば、ヘアピンループの切断によって、ループの一部分が複合体から放出され、それにより、ドライバー断片とあらかじめハイブリダイズした二本鎖複合体の一部分が除去されうる。標的依存的な様式で生成されたこのドライバー断片が、増幅カスケードを誘発することができる。
【０３７５】
また、制限酵素切断によってドライバー断片を生成させることが可能であることも想定している。例えば、二本鎖ゲノムDNAテンプレートの一方または両方の鎖の切断により、解離し、続いて、PESAと結合してCESAを形成し、その結果、ひとたび惹起されるとゲノムDNA由来の惹起性ドライバー断片の存在のみに依拠するのではなく、CESAの切断によって生成される新たなドライバー断片に依存すると考えられる、EzyAmpカスケード反応を惹起しうると考えられる、惹起性ドライバー断片として機能しうる特異的断片が生成されうると考えられる。標的DNA中のシトシン残基をメチル化するには、メチル化感受性REを用いうると考えられる。
【０３７６】
他の態様においては、ミスマッチ性ヘテロ二重鎖配列またはDNA／RNA二重鎖配列のいずれかを認識して切断する酵素または化学物質を用いて、ドライバー断片を生成させうることを想定している。ミスマッチは、調査している配列に関係する天然のミスマッチであってよいと考えられ、例えば、後天性突然変異または遺伝性SNPであってよいと考えられる。
【０３７７】
惹起性ドライバー断片を、例えば、不溶性支持体に連接されたSIOを含む、標的と複合体化された合成イニシエーターオリゴヌクレオチド（SIO）の切断によって生成させることもできる。
【０３７８】
本発明の組成物およびキットに含められるドライバー断片を、CESA複合体のヌクレアーゼ消化によって生成させることもできる。ヌクレアーゼは、制限酵素、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼであってよい。任意の適した制限酵素、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを用いることができる。
【０３７９】
ある態様において、ヌクレアーゼは制限酵素である。制限酵素は、少なくとも1つのニックを含む二重鎖オリゴヌクレオチドを認識して切断することが可能であってよい。ニックは、制限酵素の認識部位の内側にあってもよく、または外側にあってもよい。ニックは、制限酵素の切断部位の内側にあってもよく、または外側にあってもよい。あらゆる制限酵素を用いうる可能性があるものの、適した制限酵素の非限定的な例には、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear IおよびTspR I、ならびに、表2および表3に示された制限酵素のうち任意の1つまたは複数が含まれる。
【０３８０】
ある態様において、ヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼである。いかなる種類のエンドヌクレアーゼにも限定されないが、適した例には、T7エンドヌクレアーゼI、マングビーンヌクレアーゼ、RNase H、Flapヌクレアーゼ、およびMNAザイムが含まれる。
【０３８１】
ある態様において、ヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼであり、その非限定的な例には、ヌクレアーゼBAL-31、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼIII、T7エキソヌクレアーゼ、T7エキソヌクレアーゼIおよびエキソヌクレアーゼTが含まれる。
【０３８２】
1.4 合成イニシエーターオリゴ（SIO）
本発明の組成物およびキットは、1つまたは複数の合成イニシエーターオリゴ（SIO）を含みうる。SIOとは、SIOと試料中に存在する標的核酸との間での二重鎖の形成を誘導するために試料に添加されるオリゴヌクレオチドのことである。ヌクレアーゼによるSIO／標的二重鎖の対形成領域または非対形成領域のいずれかの切断を利用して、ドライバー断片として機能する核酸断片を生成させることができる。
【０３８３】
いくつかの態様においては、ミスマッチ性ヘテロ二重鎖配列またはDNA／RNA二重鎖配列のいずれかを認識して切断する酵素または化学物質を用いて、ドライバー断片を生成させうることを想定している。この態様には、SIOは必要ないと考えられる。ミスマッチは、調査している配列に関係する天然のミスマッチであってよいと考えられ、例えば、後天性突然変異または遺伝性SNPであってよいと考えられる。突然変異またはSNPが起こる箇所以外の箇所で配列を切断することを望むならば、生物試料中に存在する核酸の特定部位での切断を誘導するために、合成イニシエーターオリゴ（SIO）を添加することが可能と考えられる。SIOは、標的生体テンプレートと比較して1つまたは複数のミスマッチを含有しうると考えられる。または、SIOが、例えば、DNA配列と結合して、その結果、そのようなハイブリッド配列を認識する酵素を用いる切断のための部位を提供する短いRNA／DNA二重鎖が形成されるような、RNA／DNAキメラオリゴであってもよいと考えられる。
【０３８４】
そのような追加的な態様においては、生物検体をSIOおよびエキソヌクレアーゼ活性またはエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素とともにインキュベートして、その結果、酵素がより大きな断片を消化してドライバー断片を生み出すようにすることによって、ドライバー断片を生成させうると考えられる。このようにして利用しうると考えられる酵素の非限定的な例は、表2（以下）に列記されている。2段階プロトコールを必要とする酵素もあるが、1段階反応に適用しうるものもある。当業者は、多くの他の酵素を、DNAおよび／またはRNAで構成される、マッチするSIOまたはミスマッチのあるSIO、ならびにエキソヌクレアーゼ活性またはエンドヌクレアーゼ活性のいずれかを有する酵素を用いてドライバー断片を生成させるために利用しうると考えられることを認識しているであろう。
【０３８５】
例示的なエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼの使用の機序は、図8〜11を参照することによって、さらによく理解されるであろう。
【０３８６】
図8は、大腸菌由来のエキソヌクレアーゼIによる3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を利用してドライバー断片を生成させるための2つの機序を図示している。この酵素は、DNA二重鎖からの3'一本鎖突出部を加水分解する。標的DNAを含有する試料に合成イニシエーターオリゴ（SIO）を添加して、ドライバー断片の生成を助長する。右のパネルでは、DFはSIOの切断に由来し、部分標的断片はインタクトのまま残り、再利用されて、より多くのDFを生成させる。左のパネルでは、DFは標的の切断に由来する。エキソヌクレアーゼIによるこの複合体の切断を防ぐために、ホスホロチオエート塩基をPESA複合体の3'突出伸長部に組み込むことができる。ひとたびDFが生成されると、それはPESAとハイブリダイズして、その結果、それをCESA複合体に変換させる。
【０３８７】
図9は、マングビーンヌクレアーゼのエキソヌクレアーゼ活性を利用してDFを生成させるための2つの機序を図示している。このエンドヌクレアーゼは、DNA二重鎖からの一本鎖突出部を3'方向または5'方向のいずれかに分解して、平滑末端を残す。ドライバー断片の生成を助長するために、DNAを含有する標的試料に合成イニシエーターオリゴ（SIO）を添加する。右のパネルでは、DFはSIOに由来し、一方、左のパネルではドライバー断片は標的に由来する。PESAまたはCESAのヌクレアーゼ消化を防ぐために、左（L）または右（R）に示された反応を2段階（1および2）で行うことができる。これは物理的分離によって実現しうると考えられる。ひとたびDFが生成されれば、それはPESAとハイブリダイズし、その結果、それをCESA複合体に変換させる。
【０３８８】
図10は、エキソヌクレアーゼIIIのエキソヌクレアーゼ活性を利用してDFを生成させるための機序を図示している。この酵素は、DNA二重鎖の3'末端からヌクレオチドを除去する。この酵素は平滑または陥凹3'末端に対しては活性があるが、一本鎖DNAに対する活性はなく、それ故に3'突出末端を切断しないと考えられる。この酵素はまた、二重鎖DNA中のニックから加水分解を開始して、一本鎖ギャップを生じさせる。成分オリゴヌクレオチド上のホスホロチオエートヌクレオチドの存在によって、このエキソヌクレアーゼ活性がブロックされる。DFの生成を助長するために、標的DNAを含有する試料にSIOを添加する。SIOに組み込まれたホスホロチオエートは、DF断片がPESAまたはCESAとハイブリダイズした時に生み出されるニックでの切断を防ぐ。DFはSIOに由来し、標的は再利用されて、より多くのDFを生成させる。この態様において、SIOは、標的と二重鎖を形成する標的特異的領域、およびユニバーサルな標的非結合領域を含みうると考えられる。エキソヌクレアーゼIIIによる標的特異的領域の切断により、ユニバーサルPESAと結合して、その結果、ユニバーサルCESAを形成させうると考えられる、ユニバーサルドライバー断片の生成（SIOの標的非結合領域に対応）をもたらしうると考えられる。
【０３８９】
図11は、T7エキソヌクレアーゼのエキソヌクレアーゼ活性を利用してDFを生成させるための機序を図示している。この酵素は、DNA二重鎖またはDNA／RNA二重鎖から、特にリン酸化された5'末端から、5'方向にヌクレオチドを除去する。リン酸化された基質の存在下では、5'リン酸を有しない他の5'末端に対する活性は大きく低下する。DFの生成を助長するために、標的DNAまたはRNAを含有する試料にSIOを添加する。DFは合成イニシエーターオリゴ（SIO）に由来し、RNAまたはDNA標的は再びサイクルに利用されて、より多くのDFを生成させうる。PESAはDNAで構成されるが、T7エキソヌクレアーゼによる分解を防ぐために、ある程度の二重鎖RNAを二重鎖の5'末端に有してもよい（点線ボックス）。この態様において、SIOは、標的と二重鎖を形成する標的特異的領域、およびユニバーサルな非結合領域を含みうると考えられる。T7エキソヌクレアーゼによる標的特異的領域の切断は、ユニバーサルPESAと結合し、その結果、ユニバーサルCESAを形成させうると考えられるユニバーサルドライバー断片（SIOの標的非結合領域に対応）の生成をもたらしうると考えられる。
【０３９０】
さらに、SIOが、代替的または追加的に、標識された核酸、ナノ粒子、微粒子、タンパク質、抗体、RNA、DNA、核酸類似体、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ペプチド核酸、ロックド核酸、ペプチド-核酸キメラ、アプタマー、またはそれらの任意の組み合わせなどの実体を組み込んでもよい。例えば、ナノ粒子は金ナノ粒子であってよい。
【０３９１】
ある態様において、本発明の組成物およびキットは、不溶性支持体に連接されたSIOを含む。
【０３９２】
ある態様において、SIOはヘアピンコンフォメーションとして提供されてよい。非限定的な例として、SIOは、分子内結合を形成させるオリゴの一部分と、内部の塩基が相補的でない、ステムの一方の端にあるヘアピンループ部分との間の配列相補性のために生じる二本鎖ステム部分を含みうる。ヘアピンSIOは、5'または3'末端のいずれかでステムから伸びて、それにより、一本鎖配列の5'または3'突出部を形成する余分な配列を有しうる。ヘアピン状SOIが、別のオリゴヌクレオチド、例えばDFなどに対して相補的な配列を含んでもよい。図23は、ヘアピンSIOの非限定的な例を提示している。
【０３９３】
1.5 完全酵素シグナル増幅因子（CESA）複合体および部分的酵素シグナル増幅因子（PESA）複合体
本発明の組成物およびキットは、1つもしくは複数の完全酵素シグナル増幅因子（CESA）複合体および／または1つもしくは複数の部分的酵素シグナル増幅因子（PESA）複合体を含みうる。
【０３９４】
完全酵素シグナル増幅因子（CESA）複合体は、典型的には、2つの酵素増幅因子基質（EAS）オリゴヌクレオチド（例えば、第1の酵素増幅因子基質（EAS1）オリゴおよび第2の酵素増幅因子基質（EAS2）オリゴ）ならびにドライバー断片を含む。EAS1は典型的には二重鎖の一方の鎖を含み、これは二本鎖になった時に、ヌクレアーゼによる認識配列および切断配列を組み込む。ヌクレアーゼは例えば、制限酵素、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼであってよい。好ましい態様において、EAS1は二重鎖の一方の鎖を含み、これは二本鎖になった時に、一方の鎖に制限酵素認識配列および切断部位を組み込む。
【０３９５】
例示的なCESA複合体は図14および15に提示されている。CESA複合体の1つのEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、複合体の中のもう1つのEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に対して相補的であり、前記EASオリゴヌクレオチドのうち1つの少なくとも一部分は、少なくとも1つのDFの少なくとも一部分に対しても相補的である。上述したように、CESA複合体は、ヌクレアーゼによる認識配列および切断配列を含む。DFは、認識配列および／またはヌクレアーゼ切断配列について1つまたは複数のヌクレオチドを寄与しうるが、必ずしもそうである必要はない。
【０３９６】
2つのEASオリゴによって形成される部分認識配列および／または部分的酵素切断配列への、DFによる1つまたは複数のヌクレオチドの寄与は、DFがPESA複合体と結合してCESA複合体を形成した際に、ヌクレアーゼ媒介性切断の誘因となる。DFが認識配列および／または切断配列について1つまたは複数のヌクレオチドを寄与する態様において、DFは任意の数のヌクレオチド、例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つ以上のヌクレオチドを寄与しうる。または、DFが5つ未満、4つ未満または3つ未満のヌクレオチドを寄与してもよい。DFによって寄与されるヌクレオチドは、例えば、2つのEASオリゴによって形成される部分ヌクレアーゼ認識配列または部分ヌクレアーゼ切断配列のすぐ5'側またはすぐ3'側にあってよい。または、DFによって寄与されるヌクレオチドが、2つのEASオリゴによって形成される完全ヌクレアーゼ認識配列または完全ヌクレアーゼ切断配列から5'側または3'側に1、2、3、4、5または6ヌクレオチドの位置にあってもよい。
【０３９７】
代替的な態様において、DFは、CESA複合体のヌクレアーゼ認識配列および／またはヌクレアーゼ切断配列について、ヌクレオチドを全く寄与しない。にもかかわらず、本明細書の実施例5に提示した実験データによって確かめられたように、完全ヌクレアーゼ認識および切断配列を既に含むPESAに対するDFの結合により、CESA複合体の切断に際して生成されるシグナルは増強されうる。
【０３９８】
CESA複合体の切断は、典型的には、特定イベントを指し示す検出可能なシグナルを発生させるために用いられる。図3および5を参照すると、第1の酵素増幅因子基質オリゴ（EAS1）は、検出可能な部分（F）およびクエンチャー部分（Q）の両方を含む。第2の酵素増幅因子基質オリゴ（EAS2）もクエンチャー部分（Q）を含む。クエンチャー部分は、CESAが制限酵素または他のヌクレアーゼによって切断されるまで、第1のEAS1の検出可能な部分からの検出可能なシグナルを減じさせるか、または消失させるように適合化されている。例えば、クエンチャー部分が、「Black Holeクエンチャー1」（BHQ1）または「Black Holeクエンチャー2」（BHQ2）を含んでもよい。当業者は、任意の適したフルオロフォア-クエンチャー色素のペアをそのようなプロトコールに用いうることを理解しているであろう。さらに、CESA複合体（例えば、EAS1）の1つまたは複数のEASオリゴが、代替的または追加的に、標識された核酸、ナノ粒子、微粒子、タンパク質、抗体、RNA、DNA、核酸類似体、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ペプチド核酸、ロックド核酸、ペプチド-核酸キメラ、アプタマーまたはそれらの任意の組み合わせなどの実体を組み込んでもよい。例えば、ナノ粒子は金ナノ粒子であってよい。
【０３９９】
ヌクレアーゼによるCESAの切断の結果として、検出可能な影響が生じ、その効果の大きさおよび／または速さは、それ故に試料中の標的の数量を指し示しうる。検出可能な影響は、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分析法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円偏光二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射分析、光度計測法、シンチグラフィー、電気光学的方法、UV、可視光もしくは赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせを含む、種々の方法によって検出することができる。
【０４００】
いくつかの態様において、CESA複合体の1つのEASオリゴは、制限酵素認識配列の一部分および／または制限酵素切断配列の一部分を含む、二重鎖の一方の鎖を含む。図1、2および3を参照すると、第1および第2の酵素増幅因子基質オリゴEAS1およびEAS2はそれらの全長の少なくとも一部分にわたって相補的であり、その結果、第1および第2のEASオリゴの相補性部分はハイブリダイズして、部分的に二本鎖の制限酵素認識配列および／または制限酵素切断配列を形成する。図4および5を参照すると、第2のEAS（EAS2）は、EAS1との結合に際して、EAS1上に位置する検出可能な部分を消光させうるクエンチャー部分を含みうる。または、EAS2は、EAS1上に位置するクエンチャー部分によって蛍光が消光される検出可能な部分を含みうる。EAS1とEAS2とのハイブリダイゼーションによって形成される複合体は、部分的酵素シグナル増幅因子（PESA）複合体と称される。
【０４０１】
PESA複合体は、少なくとも2つの酵素増幅因子基質（EAS）オリゴヌクレオチドを含む多オリゴヌクレオチド複合体であり、ここで1つのEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、複合体の中のもう1つのEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に対して相補的である。加えて、前記EASオリゴヌクレオチドのうち1つの少なくとも一部分は、少なくとも1つのDFの少なくとも一部分に対しても相補的である。DFとハイブリダイズする能力を有するものの、このDFはハイブリダイズしておらず、それ故、PESA複合体の成分ではない。PESA複合体は、酵素の少なくとも部分的な認識配列／部位および／または少なくとも部分的な切断配列／部位を含み、酵素の完全な認識配列／部位および／または完全な切断配列／部位を含んでもよい。例示的なPESAは、図1C、3C、4、5B、7A、7B、8（左および右のパネルの両方）、14C、17A、18A、19A、20および22に図示されている。
【０４０２】
MNAザイムによるMNAザイム基質の切断によって、またはタンパク質エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼを含む他のヌクレアーゼによるSIO／標的二重鎖の切断によって生じるドライバー断片（DF）は、完全制限酵素認識配列（図2に破線ボックスで表示）に必要であってもよく、および／または、それが制限酵素による切断のために必要な制限酵素認識配列に隣接する付加的な配列であってもよい。図2を参照すると、切断部位が黒の縦向き実線矢印によって表示されている。ドライバー断片の少なくとも一部分は、第1の酵素増幅因子基質オリゴEAS1の少なくとも一部分に対して相補的である。図1、2および3を参照すると、ドライバー断片および第1のEAS1はそれらの全長の少なくとも一部分にわたって相補的であり、その結果、ドライバー断片および第1の酵素増幅因子基質オリゴの相補的部分が、例えばハイブリダイゼーションによって組織化して、完全または部分的な制限酵素認識部を含む二本鎖配列を形成することができる。CESA中に組み込まれる完全または部分二本鎖制限酵素切断配列を、このようにして形成させてもよい。EAS1、EAS2およびDFのハイブリダイゼーションによって組織化されたCESAは、REによる認識および切断の両方のために必要な配列すべてを含む。
【０４０３】
1つの態様において、適切なREによるCESAの切断は、第1の酵素増幅因子基質オリゴEAS1の検出可能な部分とクエンチャー部分との間での切断をもたらし、この2つの部分が分離して、それにより、クエンチャー部分が検出可能な部分の局所環境から隔てられるかまたは事実上除去されるのに伴って、検出可能なシグナルが出現するかまたは増加することを可能にする。他の態様において、CESAの切断は、さらなるPESAとハイブリダイズしてさらなるCESAを形成させる新たなドライバー断片の生成をもたらしうる（例えば、図7、17A、18A、19A、20および22）。このさらなるCESAは、同じREまたは異なるREによる切断を受けやすいと考えられる。
【０４０４】
図2および15を参照すると、いくつかの態様において、完全に組織化したCESAは、異なるデザインを有しうる。DF（中央が白い黒線）は、制限酵素の完全認識配列に必要なこともあれば、および／または、それが制限酵素による切断のために必要な制限酵素認識部位に隣接して付加的な配列を与えることもある。制限酵素による切断は5'突出部、3'突出部のいずれかをもたらすこともあれば、またはそれが平滑末端を生成させせることもある。制限酵素は、EAS1、EAS2およびDFの二本鎖組織化複合体の一方または両方の鎖を切断しうる。EAS2とDFが隣接する位置は、連続した二本鎖二重鎖をREが正常に切断する位置であってもよく、またはそれが、制限酵素による認識および切断のために必要な配列のある別の場所であってもよい。EAS2と隣接するDFの末端は、前の段階でより長い分子の切断の結果として生じたものでなければならない。例えば、ドライバー断片が、MNAザイムによるMNAザイム基質の5'および3'断片への切断によって生成されるのであれば、隣接する末端は、切断されたMNAザイム基質の3'断片の5'末端、または5'断片の3'末端でなければならない。もう1つの例として、ドライバー断片がエキソヌクレアーゼIIIによるSIOの切断によって生成され、それ故に5'断片が生み出されるのであれば（図10）、隣接する末端はこの5'断片の3'末端でなければならない。
【０４０５】
図1Bを参照すると、「酵素阻害性複合体」または「EIC」とは、EAS1、EAS2および阻害性断片（InF）を含みうる複数のオリゴヌクレオチドによって形成される複合体のことである。EICは、複数のオリゴ上に存在する酵素認識部位および切断部位の配列を含むだけでなく、制限酵素による切断または他のヌクレアーゼの阻害を引き起こす付加的な配列も含む。
【０４０６】
EICがPESAおよびInFを含む態様において、そのCESAへの変換のためには阻害性断片（InF）の切断によってドライバー断片（DF）として機能してCESAを完成させるより小型の断片が生成されることが必要である。InFの切断はいくつかの手段によって実現しうる。InFが、標的分析物の存在下で組織化し、InF／MNAザイム基質を切断してDFを生成させるMNAザイムの基質であってもよい。または、InFが、標的配列とハイブリダイズして、タンパク質エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによって認識される二重鎖を形成させる合成イニシエーターオリゴヌクレオチド（SIO）であり、その結果、InF／標的複合体の対形成した塩基または対形成しない塩基が切断されて、CESAを完成させるDFが生成されてもよい。
【０４０７】
ある態様において、PESA複合体およびCESA複合体はヘアピン構造の形態で提供される。非限定的な例として、PESA複合体は、複合体の中の各EASオリゴの少なくとも一部分と、その内部のループ塩基が相補的でない、ステムの一方の端にあるヘアピンループ部分との間の配列相補性のために生じる二本鎖ステム部分を含みうる。ヘアピンPESA複合体は、5'または3'末端のいずれかでステムから伸びて、それにより、一本鎖配列の5'または3'突出部を形成する余分な配列を有しうる。ヘアピンPESA複合体が、別のオリゴヌクレオチド、例えばDFなどに対して相補的な配列を含んでもよい。ヘアピンCESA複合体は、ヘアピンPESA複合体にDFが結合すると形成されうる。図18は、ヘアピンPESA複合体およびヘアピンCESA複合体の非限定的な例を提示している。
【０４０８】
ドライバー断片などの成分を複数の複合体の間に局在させるため、およびその移行を向上させるために、CESA複合体を形成する潜在能力のあるPESA複合体を複合的構造体に組み込んでもよい。図22は、PESA複合体を分枝構造に組み込むことによってEzyAmp成分を局在されるための例示的な方法を図示している。骨格オリゴヌクレオチド、EAS1、EAS2、EAS3およびEAS4を含む第1の複合体を用意する。骨格オリゴヌクレオチドは、EAS1、EAS 3、およびEAS1とEAS3を隔てる介在部分を含む。EAS1の一部分は、（それがハイブリダイズする）EAS2の一部分に対して相補的であり、EAS2の一部分は第1のDFの一部分に対して相補的であり、かつ、EAS1またはEAS2の一部分は第2のDFを含む。EAS3の一部分は、（それがハイブリダイズする）EAS4の一部分に対して相補的であり、EAS3の一部分は第2のDFの一部分に対して相補的であり、かつ、EAS3またはEAS4の一部分は第2のDFを含む。第1の複合体はC形状をとり、EAS1およびEAS3を隔てる介在部分は、相補的配列を含む第2の複合体の対応する部分とのハイブリダイゼーションに向けた位置にある。図22のパネルBに示されているように、これにより、4つの別個のPESA複合体を有する二重複合体の形成が可能になる。図22Dに図示されているように、単一複合体または二重複合体のそれぞれの1つまたは複数のアームを、任意の適した試薬（例えば、ビオチン／アビジン、化学試薬、抗体、ペプチドリンカーなど）を用いて、別の単一複合体または二重複合体の1つまたは複数のアームと連結させることができる。さまざまなPESA複合体を互いに近接させることにより、CESA複合体の形成および切断に際して、さまざまなPESA複合体間でのドライバー断片の効率的な移行が可能になる。
【０４０９】
1.6 オリゴヌクレオチド
ドライバー断片、阻害因子断片、合成イニシエーターオリゴヌクレオチドおよび酵素増幅因子基質はオリゴヌクレオチドであり、当業者に周知である、類似体（例えば、表1に列記されたもの）、誘導体、修飾もしくは改変された塩基、リボヌクレオチド、糖骨格もしくはリン酸骨格の改変さまざまな欠失、挿入、置換、重複もしくは他の修飾、またはこれらの任意の組み合わせといったといった1つまたは複数の置換を含みうる。そのような修飾、置換、欠失、挿入などは、それがその機能を実質的に保つ限り、オリゴヌクレオチド中の任意の位置に加えることができる。オリゴヌクレオチドに対する置換および修飾は十分な忍容性があってよく、ある特定の条件下で機能するように、または完全酵素シグナル増幅因子複合体を伴う反応の効率の向上のために、分子を個別適合化することを可能にする。例えば、1つまたは複数のヌクレオチド類似体を含めることによる酵素増幅因子基質またはドライバー断片の修飾によって、より不安定な完全酵素シグナル増幅因子複合体の組織化が助長され、それにより、例えば、ヌクレアーゼによる完全酵素シグナル増幅因子複合体の切断の効率が向上する可能性がある。
【０４１０】
当業者は、本発明のオリゴヌクレオチド、例えば、ドライバー断片、合成イニシエーターオリゴヌクレオチド、阻害性断片、基質、アプタマーおよび酵素増幅因子基質オリゴなどが、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドの一方、またはその両方を含みうることを理解するであろう。ある態様において、オリゴヌクレオチドは少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチドを含む。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは主としてデオキシリボヌクレオチドを含み、さらにより好ましくは、デオキシリボヌクレオチドのみを含む。
【０４１１】
1.7 制限酵素
本発明の組成物およびキットは、1つまたは複数の制限酵素、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼまたはそれらの組み合わせを含みうる。本発明の組成物、方法およびキットにおいて有用な制限酵素は、I型、II型、III型またはIV型制限酵素でありうる。制限酵素は一般に、サブユニット組成、切断位置、配列特異性および補助因子要求性に基づいて、これらの型に分類される（表2参照）。
【０４１２】
（表２）制限酵素の型
2013542738.tif 000004
2013542738.tif 000005
【０４１３】
表2に列記された制限酵素は、例示のみを目的として提示されており、本発明の範囲をいかなる形でも制限するものではない。当業者は、広範囲にわたる制限酵素がCESAおよびEzyAmp反応の開発に適合すると考えられることを理解するであろう。例えば、制限酵素データベースREBASE（http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html）にリスト化されている多くの制限酵素が、CESAおよびEzyAmp反応の開発に適合すると考えられる。以下の表3は、本発明における多様な特異性および特性を有する制限酵素の例を提示している。
【０４１４】
（表３）制限酵素の例（これらの群は相互排他的ではない）
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【０４１５】
これも一例として挙げるに過ぎないが、Mnl Iは、EzyAmp反応に用いるのに特に有用な酵素である。Mnl Iは4つのヌクレオチド二本鎖認識配列を必要とする。切断部位はRERSから一定の距離の場所にあり、この酵素は介在空間に何ら特異的な配列を必要としない。DNAの各鎖は部分認識配列を与え、それは完全な二本鎖認識配列をもたらすためにその相補物とハイブリダイズしなければならない。認識配列、介在配列および切断部位は以下のように描写することができる（ここでNは任意のデオキシリボヌクレオチドであってよく、「／」は切断部位を指し示す：
2013542738.tif 000009
【０４１６】
二本鎖配列の一方の鎖が非連続的である場合（すなわち、隣接するデオキシリボヌクレオチドがホスホジエステル結合で連結していない）、DNA二重鎖は「ニック」を含むと言う。Mnl Iの標準の認識配列は、ニックを全く含まない連続した二本鎖DNAで構成される。RERS内部の種々の位置にニックを有するさまざまな二重鎖構造、ならびにミスマッチ性ヌクレオチド、チオ基およびリボヌクレオチドを含む構造をMnl Iが切断する能力を特徴づけるために広範な研究が着手された。これらの研究の目的は、部分的Mnl I認識部位を含む一定範囲にわたるPESAおよびDFの設計を可能にする柔軟性のレベルを判定することであった（表4）。他のREに対して行われたそのような広範な特性決定からも、EzyAmp反応に他のREを用いることに関する情報が得られると考えられる。
【０４１７】
（表４）Mnl Iによって切断される能力に関して試験した構造
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*：‐CCTCまたはGGAGはMnl I認識部位を形作る部分配列である。
‐Nは任意のヌクレオチドであり、N'はNに対して相補的である
‐rNはリボヌクレオチドである
‐↓↑はREによる切断である
‐^はニックを指し示す
【０４１８】
1.8. エキソヌクレアーゼ活性またはエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素
本発明の組成物およびキットは、エキソヌクレアーゼ活性またはエンドヌクレアーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素を含みうる。
【０４１９】
制限酵素および触媒性核酸酵素に加えて、核酸配列を切断する能力を有する他のタンパク質酵素も、本明細書に記載の組成物、方法およびキットにおいて有用である。これらの酵素のいくつかは、一本鎖または二本鎖核酸の末端からのヌクレオチドの除去をもたらすエキソヌクレアーゼ活性を有する。また別の酵素はエンドヌクレアーゼ活性を有し、配列を内部結合で切断して、より小型の断片を生じさせる。
【０４２０】
適したエキソヌクレアーゼの非限定的な例には、ヌクレアーゼBAL-31、エキソヌクレアーゼI（大腸菌）、エキソヌクレアーゼIII（大腸菌）、T7エキソヌクレアーゼ、T7エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼT、およびヌクレアーゼBAL-31が含まれる。適したエンドヌクレアーゼの非限定的な例には、T7エンドヌクレアーゼI、RNase H、Flapヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼおよびMNAザイムが含まれる。
【０４２１】
適したヌクレアーゼのサブセットの特性を表5に列記している。
【０４２２】
（表５）ヌクレアーゼの特性
2013542738.tif 000012
【０４２３】
1.9 アプタマー
本発明の組成物およびキットは、1つまたは複数のアプタマーを含みうる。アプタマーとは、それらの比較的高次の構造、例えば、3-D結合ドメインまたはポケットが原因で、1つまたは複数のリガンドを高い親和性および特異性で認識する能力を有する核酸配列またはペプチド配列である。例えば、アプタマーは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、生物体全体、小分子、重合体、金属イオン、金属塩、プリオン、またはそれらの任意の誘導体、部分もしくは組み合わせ、または他の任意の実体と結合してよい。
【０４２４】
いくつかの態様において、アプタマーは、1つまたは複数のリガンドを認識する能力を有する、核酸、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはそれらの組み合わせを含みうる。本明細書における好ましいアプタマーには、短い一本鎖DNA、RNAオリゴマー、またはペプチドが含まれる。これらは、吸着、回収および再増幅の反復過程によって合成核酸の複合ライブラリーから単離することができる。アプタマーは、アミノ酸または抗生物質などの小分子からタンパク質および核酸構造までの範囲にわたるほぼあらゆる標的に対して作製することができる。好ましくは、アプタマーは、例えば、上記の表1の通りのヌクレオチド類似体を非限定的に含む、DNA分子またはRNA分子またはその両方の組み合わせを含みうる。
【０４２５】
当業者は、アプタマーを、本発明の方法に用いられる他の任意の成分（例えば、MNAザイム成分）に組み込みうることを理解するであろう。
【０４２６】
1.10 キット
本発明はまた、本明細書に開示された方法を遂行するためのキットも提供する。典型的には、本発明の方法を実施するためのキットは、本方法を実施するために必要な試薬のすべてを含む。
【０４２７】
キットは、本発明の任意の1つもしくは複数の組成物、および／または本発明の組成物の任意の1つもしくは複数の成分を含みうる。例えば、1つの態様において、キットは、MNAザイム成分の入った第1の容器、MNAザイム基質の入った第2の容器、およびPESA成分の入った第3の容器、および制限酵素の入った第4の容器を含みうる。MNAザイムの自己組織化は、被験試料中に存在する組織化助長因子または標的の会合を必要とする。このため、そのような態様においては、キットの成分を配合すると、被験試料中に存在する組織化助長因子または標的の存在下でMNAザイムが組織化して、基質を切断してDFを生じさせる。続いてDFがPESA成分と会合して、制限酵素による認識部位および切断部位を含むCESAをもたらす。
【０４２８】
他の態様において、キットが、SIOの入った第1の容器、PESA成分の入った第2の容器、およびSIOと標的との間で二重鎖が形成された時に切断することができるヌクレアーゼの入った第3の容器、および制限酵素を含む第4の容器を含んでもよい。使用中に、被験試料中に存在するSIOと標的との会合によって二重鎖が形成される。したがって、そのような態様においては、キットの成分を配合すると、被験試料中に存在する標的の存在下でSIOが二重鎖を形成し、二重鎖が形成された場合にはヌクレアーゼが切断してDFを形成させる。続いてDFがPESA成分と会合して、制限酵素による認識部位および切断部位を含むCESAをもたらす。
【０４２９】
典型的には、本発明のキットは、例えば、洗浄用試薬、および／または本発明の方法の遂行に必要とされる他の試薬を含む、1つまたは複数の他の容器も含むと考えられる。
【０４３０】
本発明に関連して、キットは試薬が別々の容器に収容されている任意のキットを含むことができ、それは小型ガラス容器、プラスチック容器、またはプラスチックもしくは紙の小片を含むことができる。そのような容器は、試料および試薬の交差汚染を回避しながらの1つの区画から別の区画への試薬の効率的な移行、ならびに1つの区画から別の区画への各容器の薬剤または溶液の定量的様式での添加を可能にすることができる。そのようなキットはまた、被験試料を収容するであろう容器、アッセイに用いられる試薬を収めた容器、洗浄試薬を収めた容器、および検出試薬を収めた容器も含みうる。典型的には、本発明のキットは、キット成分を用いて適切な方法を実行するための使用説明書も含むと考えられる。本発明のキットおよび方法は、例えばリアルタイムPCR装置を非限定的に含む、自動分析機器およびシステムとともに用いうる。
【０４３１】
複数の異なる標的の検出、同定または定量への適用のために、本発明の単一のキットを適用しうることもあれば、または代替的に、例えば各標的に対して特異的な試薬を含む複数の異なるキットが必要なこともある。本発明の方法およびキットは、任意の実体を検出、同定または定量することが望ましいあらゆる状況において用途がある。
【０４３２】
2. 検出およびシグナル増幅
本発明は、少なくとも1つの標的の検出、同定および／または定量のためのさまざまな方法を提供する。さらに、本発明は、標的の検出によって生じたシグナルの増幅のためのさまざまな方法も提供する。
【０４３３】
本方法は、本発明の組成物およびキット、ならびに、上記のセクション1に記載されたものを含む、それらの成分を用いて行うことができる。
【０４３４】
2.1 イニシエータードライバー断片
本発明の方法による標的の検出、定量および／または増幅は、典型的には、1つまたは複数のドライバー断片（DF）の使用に依拠する。特に、本方法は、典型的には、標的分子の検出に際して生じる初期DF（本明細書では「イニシエーターDF」とも称する）の生成に依拠する。ひとたび生成されると、イニシエーターDFは、例えば、PESA複合体とハイブリダイズして、酵素による認識および修飾が可能なCESA複合体を形成させることによって、シグナルの発生を惹起することができる。酵素（例えば、ヌクレアーゼ）によるCESA複合体の修飾（例えば、切断）は検出可能な影響をもたらすほか、別のPESA複合体と結合して、それによってシグナル増幅を助長することのできるさらなるDFを放出させることもできる。
【０４３５】
好ましい態様において、イニシエーターDFは標的とは明確に異なるものの、いくつかの態様において、イニシエーターDFは標的の一部分を含んでもよく、かつ他の態様において、イニシエーターDFが標的であってもよい。
【０４３６】
好ましい態様において、イニシエーターDFの生成は制限酵素による標的の酵素的切断を伴わないが、この可能性は必ずしも除外されない。イニシエーターDFが標的特異的イベントによって生成され、これが本発明のシグナル検出経路およびシグナル増幅経路を活性化するための誘因としての役を果たしてもよい。一般に、イニシエーターDFの生成は、本発明のオリゴヌクレオチド（例えば、SIO、MNAザイムまたはPESA複合体）に対する標的分子の結合によって、ヌクレアーゼなどの酵素による修飾を受けることのできる複合体を形成することを伴う。例えば、オリゴヌクレオチドに対する標的の結合により、部分的酵素認識部位および／または切断部位が完成してもよい。いくつかの態様において、標的が結合するオリゴヌクレオチドはDFを含み、そのようにして形成された複合体の酵素的修飾は、オリゴヌクレオチドからイニシエーターDFを放出させるのに役立つ（例えば、図8B、9B、10、11および23を参照）。他の態様において、オリゴヌクレオチドに対する標的の結合は、標的の酵素的修飾による、標的からのイニシエーターDFの直接的な生成を助長する（例えば、図8Aおよび9Aを参照）。さらに他の態様において、オリゴヌクレオチドは、標的と結合すると触媒的に活性となり、1つまたは複数の基質を修飾してDFを形成させる（例えば、図5、13、19および24を参照）。
【０４３７】
非限定的な例に過ぎないが、イニシエーターDFは、サブセクション1.3で上述したように、MNAザイムによる基質の切断または核酸連結によって生成させることができる。基質は基質-ブロッカーオリゴヌクレオチドであってよい（サブセクション1.3、図19および24B、24C、24D、ならびに実施例9および14を参照）。
【０４３８】
他の態様において、イニシエーターDFを、標的（例えば、ゲノムDNA）の制限酵素切断、標的と複合体化した合成イニシエーターオリゴヌクレオチド（SIO）の切断（例えば、上記のサブセクション1.4、図8〜11および図23）によって、またはミスマッチ性ヘテロ二重鎖配列もしくはDNA／RNA二重鎖配列のいずれかを認識して切断する酵素もしくは化学物質によって生成させることもできる。ミスマッチは、調査している配列に関係する天然のミスマッチであってよいと考えられ、例えば、後天性突然変異または遺伝性SNPであってよいと考えられる。
【０４３９】
当業者は、上記に言及したイニシエータードライバー断片を生成させるための方法が例示のみを目的としていること、および他の適した方法も利用しうることを認識しているであろう。
【０４４０】
2.2 標的の検出
本発明の方法は、標的の存在を指し示すシグナルを得るために用いることができる。
【０４４１】
ある態様においては、イニシエーターDFの生成により、検出可能な影響を得ることができる。上記のサブセクション2.1で述べたように、イニシエーターDFは、本発明のオリゴヌクレオチドに対する標的の結合によって形成される複合体の酵素的修飾（例えば、切断）によって生成させることができる。例えば、フルオロフォアおよびクエンチャー部分で標識されたSIOに対する標的の結合により、部分が分離され、それ故に、イニシエーターDFの放出時に検出可能な影響が得られる様式で、SIOの酵素的修飾を助長させることができる（例えば、図23を参照）。追加的または代替的に、標的の存在を、オリゴヌクレオチド／標的複合体の酵素的修飾によって生じた生成物のサイズおよび配列などの特性に基づいて検出し、さらに可能性としては定量することもできると考えられる。
【０４４２】
2.2.1 直線的カスケード
好ましい態様において、標的認識イベントに際して生成されたイニシエーターDFは、PESA複合体の完成を介してシグナルを発生させてCESA複合体を形成させるために用いられる。CESA複合体の酵素的切断を利用して、検出可能な影響を生成させること、ならびに／または、別のPESA複合体と結合して、酵素的切断およびシグナル生成を行えるさらなるCESA複合体を形成することができ、このようにして直線的カスケードをもたらすことのできる、1つもしくは複数の追加的なDFを得ることもできる。
【０４４３】
この過程は図4に図示されており、ここでは、前の段階で生成されたドライバー断片（例えば、イニシエーターDF）が、第1の酵素増幅因子基質（EAS1）オリゴおよび第2の酵素増幅因子基質（EAS2）オリゴを含むPESA複合体と組織化する。DFがPESA複合体と組織化すると、制限エンドヌクレアーゼ認識部位（図4中の破線ボックス）および制限エンドヌクレアーゼ切断部位（図4中の塗りつぶされた縦向き矢印）を含むCESAが生み出される。1つの態様において、第1のEAS1はクエンチャー（Q）で標識されており、第2のEAS2はフルオロフォア（F）で標識されている。組織化したCESAの切断の後に引き続いて成分の解離が起こる結果、フルオロフォアとクエンチャーの分離が起こり、それに随伴して蛍光性シグナルの発生およびインタクトDFの放出が起こる（図4）。続いてDFは別のPESAと会合して別のCESAを形成することができ、それはさらに制限エンドヌクレアーゼ切断および蛍光の増加を招く。この過程はこのようにして続き、図4に図示されているように、制限酵素で媒介されるさらなるEAS1の切断によって蛍光性シグナルが生じるシグナル増幅をもたらす。さらに他の態様において、CESAを切断する酵素は、制限エンドヌクレアーゼではないヌクレアーゼである。
【０４４４】
図5に図示されているもう1つの態様において、第1および第2のパートザイムは、組織化助長因子を含有する試料と接触すると自己組織化して、触媒活性のあるMNAザイムとなる。MNAザイムはMNAザイム基質と結合してMNAザイム基質の修飾を助長し、前記修飾はそれにより、組織化助長因子の存在を指し示し、ここで組織化助長因子は標的である（図5A）。アプタマーを伴うもののような他の態様において、組織化助長因子は標的でなくてもよく、それ故にMNAザイムの自己組織化のために必要な要素のみを含んでもよい。
【０４４５】
触媒活性のあるMNAザイムによるMNAザイム基質の切断（図5A、段階1）によって、PESAと組織化しうるドライバー断片（DF）が生じ（図5B）（図5、段階2）、それは第1のEAS（EAS1）および第2のEAS（EAS2）、ならびに制限酵素認識部位（破線ボックス）および制限酵素切断部位（黒の縦向き矢印）を形成するDFを含むCESA（図5C）を生み出す。1つの態様において、第1の酵素増幅因子基質オリゴはフルオロフォア（F）およびクエンチャー（Q）で標識され、EAS2はクエンチャー（Q）で標識される。制限酵素によるこの組織化した構造の切断（図5、段階3）および引き続いての成分の解離（図5、段階4）により、蛍光性シグナルの発生およびDFの放出がもたらされる。続いてDFは別のPESAと会合して別のCESAを形成させることができ（図5、段階5）、それがさらに制限酵素切断を招く（図5、段階6、段階3と同様）。この過程はこのようにして続き、図5の段階4、5および6に示されているように、制限酵素で媒介されるさらなるEAS1の切断によって蛍光性シグナルが生じるシグナル増幅をもたらす。
【０４４６】
MNAザイムの性質、およびREを含むヌクレアーゼの特性の多様性が理由で、広範囲にわたる温度で反応を行いうるため、課せられるのは、MNAザイムの組織化、MNAザイム基質の触媒性修飾（例えば、切断）のための必要条件、ならびにPESAおよびDFからのCESAの組織化およびヌクレアーゼの活性のための必要条件のみである。本方法の各段階は異なる温度で行うことができ、例えばMNAザイムの形成を標的の存在下で行い、引き続いてのMNAザイム基質の切断をある温度で実現して、DFを含むCESAの形成およびシグナル増幅を生じさせる引き続いての制限酵素による切断を異なる温度で起こさせることができる。または、MNAザイムおよび制限酵素を含むヌクレアーゼの両方の触媒活性を支える環境で、すべての段階を単一の温度で行うこともできる。
【０４４７】
タンパク質エキソヌクレアーゼ（exonclease）またはエンドヌクレアーゼを用いる標的指向性切断によってドライバー断片が生成される他の態様においては、EzyAmpのために必要なすべてのタンパク質酵素と適合性のある反応条件が、当業者によって容易に決定されうる。
【０４４８】
本明細書においてさらに提示するように、制限酵素を含むヌクレアーゼを単独で、またはMNAザイムと組み合わせて使用する、標的検出のためのいくつかの方法は、標的の熱サイクリングおよび／または変性を必要としない。等温法は熱サイクリングを必要とする方法よりも融通が利き、一本鎖核酸および二本鎖核酸を含む標的間の区別も可能にする。さらに、熱サイクリングの必要がないことにより、そのような方法は、より容易でかつより安価になりうる。本明細書における方法に従って提供されるのは、試料中の合成性でも天然性でもよい関心対象の標的を検出する、簡単で、迅速で、費用効率が良く、等温で、かつ手順に融通性がある方法である。
【０４４９】
2.2.2 フィードバックカスケード
本発明の好ましい態様において、標的認識イベントに際して生成されるイニシエーターDFは、複数のPESAおよびCESA複合体を伴うフィードバックカスケードにおいてシグナルを生じさせるために用いられる。
【０４５０】
非限定的な例に過ぎないが、図17Aおよび18Aを参照すると、イニシエーターDF（DF-a）は第1のPESA複合体（PESA A）と結合して、それにより、ヌクレアーゼによる認識部位および切断部位を有する第1のCESA複合体（CESA A）を形成させることができる。PESA Aは第1および第2のEASオリゴ（EAS1およびEAS2）を含んでよく、ここでEAS1の一部分はEAS2に対して相補的であり、かつEAS1の一部分はDF-aに対して相補的である。また、EAS1を、EAS1がインタクトのままでシグナルが生成されることを防ぐかまたは実質的に防ぐのに十分なほど近傍に配置されたフルオロフォアおよびクエンチャー部分で標識することもできる。EAS2は、DF-aとは明確に異なる第2のDF（DF-b）を含みうる。ヌクレアーゼによるPESA Aの切断によってEAS1が切断され、それにより、フルオロフォアおよびクエンチャー部分が分離されて検出可能なシグナルが得られ、同じくEAS2を切断してDF-bが放出され、その結果、それはPESA Bと複合体化してCESA Bを形成する。CESA Bは第3のおよび第4のEASオリゴ（EAS3およびEAS4）を含んでよく、ここでEAS3の一部分はEAS4に対して相補的であり、かつEAS3の一部分はDF-bに対して相補的である。また、EAS3を、EAS3がインタクトのままでシグナルが生じるのを防ぐかまたは実質的に防ぐのに十分なほど近傍に配置されたフルオロフォアおよびクエンチャー部分で標識することもできる。EAS4はDF-aを含みうる。ヌクレアーゼによるPESA Bの切断によってEAS3が切断され、それにより、フルオロフォアおよびクエンチャー部分が分離されて検出可能なシグナルが得られ、同じくEAS4を切断してDF-aが放出され、その結果、それは新たなPESA Aと複合体化してCESA Aを形成することができ、その結果、フィードバック性シグナル増幅ループが得られる。新たなDF-aおよびDF-bの連続的生成によって補給されるCESA AおよびCESA Bの以後の切断ラウンドは、PESA Aに対するイニシエーターDF（DF-a）の初期結合から生成されるシグナルを増幅する役割を果たし、追加的な標的分子の存在とは関係なくそれを行う。にもかかわらず、新たなイニシエーターDFオリゴ（すなわち、DF-a）も、追加的な標的分子の認識に際して、系に入る可能性がある。したがって、本方法は、最小数の標的分子から生じたシグナルを増幅して、存在する標的分子の量の検出および定量の両方を行う手段として役立てるために用いることができる。ある態様において、PESA Aおよび／またはPESA Bはヘアピンオリゴヌクレオチドである（図18Aを参照）。
【０４５１】
図19は、MNAザイムを伴うフィードバックシグナル増幅カスケードのもう1つの例を提示している。この例では、惹起性DF配列はMNAザイム基質配列の一部ではない。オリゴヌクレオチドパートザイムは基質ブロッカー-DF-aオリゴヌクレオチドのループ部分の内部に存在する標的を認識すると組織化して、ループを切断することのできるMNAザイムを形成する。この態様において、惹起性DF（DF-a）は基質-ブロッカーオリゴの対向鎖上に存在する（ループを基準として）。MNAザイムによるループの切断は、DF-aに対して相補的である基質-ブロッカーオリゴの一部分の解離をもたらし、それにより、DF-aがPESA AとハイブリダイズしてCESA Aを形成することを可能にする。CESA Aの引き続いての切断により、検出可能なシグナルが生じて（例えば、フルオロフォアおよびクエンチャー部分の分離により）、DF-bが放出される。放出されたDF-bはPESA Bと会合して、CESA Bを形成させ、それはREによって切断されうる。CESA Bの切断により、検出可能なシグナルが生じて（例えば、フルオロフォアおよびクエンチャー部分の分離により）、DF-aとして機能しうるオリゴの放出がもたらされる。このようにして、CESA AおよびCESA Bが連続的に形成され、切断されて、より多くのDF-aおよびDF-bを放出し、より多くのCESA AおよびCESA Bの形成をもたらすというフィードバックカスケードが形成される。より複雑な反応では、一意的なMNAザイムによって放出されるように設計された一意的な惹起性DFをそれぞれが含む複数の二本鎖オリゴ複合体が存在してもよい。
【０４５２】
フィードバックシグナル増幅カスケードのさらに非限定的な例は、図22に提示されている。上記の図22のさまざまな説明において詳述したように（サブセクション1.5および「図面の簡単な説明」を参照）、PESA複合体を分枝構造に組み込むことによってEzyAmp成分を局在させることによって、フィードバックカスケードシステムの効率を向上させることができる。これらの構造は複数のPESA複合体を互いに近接させて、CESA複合体の形成および切断に際してさまざまなPESA複合体間でのドライバー断片のより効率的な移行を可能にする。例えば、図22Aに示された態様で示されているように、単一分枝構造は少なくとも2つのPESA複合体（PESA AおよびPESA B）を含んでよく、各複合体は別個のDF（DF-aまたはDF-b）と結合するとヌクレアーゼ切断を行うことができる。PESA Aに対してDF-aが結合すると形成されるCESA複合体（CESA A）のヌクレアーゼ切断は、検出可能な影響をもたらしてDF-bを放出させることができる。DF-bはPESA Bと結合してCESA Bを形成させることができ、それはヌクレアーゼによって切断されて、さらなる検出可能な影響をもたらして、さらなるPESA Aと結合しうるさらなるDF-aを放出させることができ、このようにしてフィードバックループが形成される。図22Bに示された態様に示されているように、単一分枝構造はそれらの各々の骨格部分を介してハイブリダイズして二重分枝構造を形成し、そのようにして、構造内部に存在するPESA AおよびPESA B複合体の数を効果的に倍加させることができる。単一分枝構造および二重分枝構造を、1つまたは複数の連結試薬を用いて他の単一分枝構造および／または他の二重分枝構造と連結させて、分枝構造のネットワークを形成させることができる。例えば、図22Dに示された態様で示されているように、任意の適した試薬（例えば、ビオチン／アビジン、化学試薬、抗体、ペプチドリンカーなど）を用いて、単一分枝構造および／または二重分枝構造の1つまたは複数のアームを、他の単一分枝構造および／または二重分枝構造の1つまたは複数のアームと連結させることができる。
【０４５３】
図23は、単一のPESA構造およびSIOを用いてフィードバックカスケードが生成されるもう1つの態様を図示している。この例では、エキソヌクレアーゼIII（Exo III）などの適したエキソヌクレアーゼによってシグナル増幅を惹起させて媒介させる。Exo IIIは、末端が平滑または陥凹であればDNA二重鎖の3'ヒドロキシル末端からのヌクレオチドを除去するが、少なくとも5ヌクレオチドの3'突出部を有する二重鎖を含め、一本鎖オリゴは消化しない。ホスホロチオエートヌクレオチドもエキソヌクレアーゼ活性をブロックすることが知られている。フルオロフォア（F）およびクエンチャー（Q）で標識しうると考えられるSIOは、突出3'末端を有するヘアピンコンフォメーションで表される。SIOは5ヌクレオチドを上回る3'突出部を有するため、Exo IIIは標的結合前のSIOを消化することができない。SIO中のホスホロチオエートヌクレオチドは、SIO中のその箇所を越える加水分解を防ぎ、そうすることでDFをインタクトのままにする。SIOは、Exo IIIによってホスホロチオエート塩基まで加水分解されうるSIO中の陥凹3'末端を形成する標的の相補的領域と結合して、そうすることでインタクトDFを遊離させて、蛍光の増加を引き起こすことができる。この例では、DFは、標的に対して相補的ではないSIOの5'部分（すなわち、ホスホロチオエートヌクレオチドに対して5'側の配列）に対応する。SIOとはもはや結合していない標的は、続いて再利用されて別のSIOと結合することができ、そうすることで別のDFを生成させる。そのようにして生成されたDFは、PESAのEAS1と結合して、EAS1の3'末端が陥凹しているCESAを形成する。ExoIIIは続いてCESAのEAS1鎖を加水分解して、蛍光の増加およびDFの放出を引き起こし、このDFは再利用されてより多くのPESAをCESAに変換することができる。
【０４５４】
2.2.3 多重化
本発明の方法は、複数の標的を単一のEzyAmp反応で検出するために用いることができ、別個の標的の検出によって生じた個々のシグナルは同時に増幅することができる。
【０４５５】
一般に、本明細書に記載の方法を用いる複数の異なる標的の多重的な検出／シグナル増幅は、それぞれが特定の標的に由来する一連の異なるイニシエータードライバー断片を生成させることによって実現することができる。対応するPESA複合体は、特定の各種類のイニシエーターDFに関して用意することができ、各PESA複合体は、他のPESA複合体のものと区別しうる別個の検出可能な要素（例えば、一意的なフルオロフォア）を含む。そのような反応のためのイニシエータードライバー断片は、上記のサブセクション2.1で言及した方法のうちいずれか1つまたは複数を含む、任意の適した様式で生成させることができる。
【０４５６】
ある態様においては、それぞれが複数の異なる標的に由来する複数の別個のイニシエータードライバー断片を、複数の異なる標的特異性を有し、かつ別個のドライバー断片を含む、2つもしくはそれ以上の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド、別個の標的特異性を有し、かつ1つもしくは複数のMNAザイム基質の触媒性修飾によって別個のドライバー断片を生じうる2つもしくはそれ以上のMNAザイム、または、それぞれが複数の異なる標的特異性を有し、かつそれぞれが別個のDFを生じうる、1つもしくは複数の合成イニシエーターオリゴヌクレオチドと1つもしくは複数のMNAザイムとの組み合わせを用いて生成させることができる。
【０４５７】
当業者はこのため、本明細書で提供された組成物および方法を、反応当たり単一の標的を検出するため、または複数の標的を単一の反応で検出するために用いうることを認識しているであろう。複数の標的を検出する場合には、そのアッセイおよび検出しようとするものに応じて、1つまたは複数のMNAザイムを用いることができる。例えば、類縁関係にある複数の構造、例えば、例えば決定的な配列（MNAザイムによって認識される）を共有し、かつ例えば、決定的な配列の外側での長さまたは配列のみに違いのある一群の配列を検出する場合には、単一のMNAザイムで十分と考えられる。決定的な配列を有するあらゆる配列を検出しうると考えられる。複数のMNAザイムは、単一ヌクレオチド程度のわずかしか違いのない類縁関係にある配列を検出する場合、またはさらには大きく異なる標的を検出しようとする場合、およびそれぞれの有無を把握することが望ましい場合に、有用であると想定している。同様に、いくつかの態様においては、単一のMNAザイム基質で十分と考えられるが、一方、他においては、いくつかの標的のそれぞれの検出を可能にする、一意的なDFを形成させるために一意的なMNAザイム基質が必要である。
【０４５８】
場合によっては、方法の多重化は、方法の設計を助長すると考えられる別個または一意的なMNAザイムの形成を必要とする。別個または一意的なDFは、基質を支持体に対して固定する場合には必要でないと考えられ、支持体上のそれぞれの局在によって区別することができる。これらの設計の特徴は、当業者によって容易に理解されるであろう。いくつかの態様において、本方法は、1つの反応で種々の異なるタイプの標的、例えば核酸標的およびタンパク質の検出を可能にする。
【０４５９】
同様に、複数の標的に向かう複数のSIOを用いる反応により、複数の標的を同時に分析する複数のアッセイを開発することが可能になると考えられる。このスキームまたは他のものでは、CESAを制限酵素または別のヌクレアーゼによって切断させて、シグナル増幅を助長することができる。
【０４６０】
非限定的な例に過ぎないが、複数の標的を、一連のユニバーサル基質を修飾する複数のMNAザイムを用いて検出することができ、各基質の修飾は、別個のPESAと組織化して別個の制限酵素に対するCESAを生成する別個のDFをもたらし、それにより、別個に検出可能なシグナル（例えば、異なる蛍光）がもたらされると考えられる。
【０４６１】
多重EzyAmp系に関する例示的な戦略は図13に示されており、そこではさまざまな別個のイニシエータードライバー断片が、標的特異性が異なる一連の3種のMNAザイムを用いて、標的特異的な様式で生成されている。生成された異なる各DFは別個のPESA複合体と結合し、別個のPESA複合体はそれぞれ別個のフルオロフォアを含む。そのようにして形成された3つのCESA複合体はヌクレアーゼによって切断され、それぞれのケースで、3種の異なるフルオロフォアによって別個のシグナルが生成される。図25は、2つのEzyAmp反応が単一のチューブ内で同時に起こり、このようにして独立にモニターされる、多重分析の結果を示している。
【０４６２】
上記のような複数の異なる標的の認識によって生じた別個のシグナルを、同時または実質的に同時な様式で独立に増幅しうることは理解されるであろう。例えば、別個の標的の検出によって生じ、別個のイニシエータードライバー断片とともに形成されたCESA複合体は、例えば、上記のサブセクション2.2.2および／または2.2.3に記載した方法を用いて、それぞれ別々の直線的および／またはフィードバックカスケードに組み込まれ、それぞれ別個のシグナルを増幅すると考えられる。直線的および／またはフィードバックカスケードは合わせて進行して、異なるシグナルを独立に増幅すると考えられる。
【０４６３】
また、単一の標的の内部の複数の領域を、本発明の方法を用いて同時にまたは実質的に同時に検出することもできる。そのようなケースでは、一連の別個または同一な惹起性ドライバー断片を、所与の標的の内部の異なる領域に基づいて、一連の標的認識イベントによって生成させる。例えば、標的内部の異なる領域に対する特異性を有する複数の異なるMNAザイムを、この目的に利用しうる。MNAザイムは単一のユニバーサル基質を利用して、それぞれが単一の種類のPESAと結合して一連の同一のCESAを形成させて同一な検出可能な影響を生じさせる、単一の種類のDFの複数のコピーを生成させることができる。または、MNAザイムが一連の異なるユニバーサル基質を触媒的に修飾し、各基質の修飾が、別個のPESAと組織化して、別個の検出可能なシグナルを生じる別個のCESAを生成させる、別個のDFをもたらしてもよい。
【０４６４】
2.2.4 不溶性および固体支持体を用いる方法
また、一般に、本発明の方法は、多重化されているか否かにかかわらず、溶液状態で、または例えば、MNAザイム基質、パートザイム、PESA、CESA、EAS、DF、EIC、InF、SIO、制限酵素、ヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、アプタマー、ヘアピンオリゴヌクレオチド、MNAザイム組織化助長因子および／または標的を含む1つもしくは複数のアッセイ成分が結合された、付着された、または連接された不溶性支持体または固体支持体と組み合わせて、適用可能であることも理解されるべきである。そのような系の特徴は、本明細書で考察した方法および変法の提供を受けた当業者には一般に理解されるであろう。したがって、本発明は、本明細書における文字通りの教示に限定されるとみなされるべきではなく、本明細書において提供する教示の原理および範囲ならびに当技術分野における知識に矛盾することなく修正および変更することができる。
【０４６５】
好ましくは、支持体は、基質を保持し、それが反応混合物の大部分の中に自由に移動することを許さない不溶性材料またはマトリックスである。核酸オリゴヌクレオチドを含む基質の固定化および局在化のためのそのような支持体は、当技術分野において公知である。当業者は、支持体を、マイクロアッセイにおける使用に好都合なビーズ、ならびに反応条件との適合性がある他の材料を含む、種々の形態にある多種多様なマトリックス、重合体などから選択しうることを理解するであろう。ある好ましい態様において、支持体は、プラスチックビーズもしくはウェーハなどのプラスチック材料、または特定のアッセイを内部で実施するウェルもしくはチューブのプラスチック材料であってよい。ある態様において、支持体はマイクロキャリアまたはナノキャリアである。ある態様において、支持体はコード化されていてもよい。
【０４６６】
例えば、支持体に係留されたMNAザイム、MNAザイム基質、CESAおよび／またはPESAを用いて標的を検出するための方法を想定している。好ましい態様においては、PESAを好ましくは支持体と付着させる。もう1つの好ましい態様において、SIOを支持体と付着させる。支持体に対するPESAまたはそれらの成分の結びつけは、ドライバー断片のPESAとの組織化、ならびに引き続いての、フルオロフォア（F）およびクエンチャー（Q）で標識されたCESAの制限酵素による切断が起こると、フルオロフォアが、支持体に連結されたまま残るクエンチャーから離れて、反応混合物の大部分の中に放出される。このように、検出可能なシグナルは、クエンチャー部分と検出可能な部分が切断によって隔てられると大きく増加する。1つの代替的な態様において、フルオロフォアを含有する検出可能な部分が切断後に結びついたまま残ってもよい。これにより、支持体上でのシグナルの局在が可能になる。ある場合には、フルオロフォアを溶液中に遊離させることも想定している。
【０４６７】
ある態様において、反応は、溶液中で起こるように設定されてもよく、および／または固体支持体に付着された成分を含んでもよい。図20に示された反応は、連接された成分を用いるアッセイに関する例示的なシェーマを示している。この図において、ステーション1は連接されたオリゴヌクレオチドを有するものとして描写されており、このオリゴヌクレオチドは標的依存的な様式で切断されると（段階1）、第1のDFを放出すると考えられる（斜線入りの線）。続いてこのDFはステーション2に連接されたPESA Aへと移動して、それとハイブリダイズしてCESA Aを形成する（段階2）。CESA Aの切断（段階3）により、第2のドライバー断片（黒の実線）が放出され、それはステーション3のPESA Bへと移動すると考えられる。第2のDFがPESA Bとハイブリダイズすると、CESA Bが形成されうると考えられる（段階4）。CESA Bの切断は、第1のDFと同等な配列の放出をもたらす（斜線入りの線）。この第1のDFは続いてステーション2に移動して（段階5）、より多くのCESA Aを形成させ、それが切断されてより多くの第2のDFを放出させうると考えられる。このようにしてカスケード反応が惹起され、そうすることでCESAの連続的な形成および切断が可能になると考えられる（段階3、4および5）。各PESAがフルオロフォア（F）およびクエンチャー（Q）で標識されるアッセイでは、これらの部分間の切断により、蛍光性シグナルが生成されると考えられる。このシグナルは固体表面2もしくは3に保持させてもよく（図示された通り）、またはフルオロフォアおよびクエンチャーの位置が逆であるならば、溶液中に放出させることもできると考えられる。
【０４６８】
ステーションは別々のチャンバーであってもよく、またはそれらが例えば、チップまたはマイクロキャリアなどの別々の固体表面であってもよい。この戦略は、EzyAmpカスケードを開発する上で有用な制限酵素の数を増加させると考えられる。この筋書きでは、唯一の必要条件は、標的依存性切断によって生成されるドライバー断片が、REによる認識および切断のために必要な配列を完成させることのみと考えられる。この筋書きには、もはや、REが、その標的依存的な切断の前に、ドライバー断片を含む完全長オリゴヌクレオチドによって阻害されるという必要条件はないと考えられる。この場合には、切断されていない長い断片がPESAと物理的に隔てられ、標的依存的な様式での切断後に初めてPESAと接触しうると考えられる。したがって、PESA断片と標的特異的断片との接合部に追加的な配列が存在しても阻害されないREをEzyAmpアッセイに用いて、カスケード反応を作り出すことができる。
【０４６９】
2.2.5. アプタマー
当業者は、本明細書に記載の方法をアプタマーとともに用いることができ、前記アプタマーが核酸以外の標的を含む標的の検出、同定および／または定量を助長することを容易に理解するであろう。本発明の方法に用いるのに適したアプタマーの非限定的な例には、上記のサブセクション1.8に記載されたものが含まれる。
【０４７０】
例えば、核酸以外の実体を含む標的を検出するために、MNAザイムおよび制限酵素を用いる方法を想定している。当業者は、アプタマーをMNAザイム成分の任意のものに組み込みうることを理解するであろう。さらに、複数のアプタマーを、パートザイムオリゴヌクレオチド成分の1つまたは複数に組み込みうると考えられることも理解されるであろう。
【０４７１】
MNAザイムの組織化のために標的が必要とされない態様においては、アプタマーを組織化助長因子に組み込むことができる。アプタマー配列を、活性MNAザイムが標的の存在下でのみ形成される立体配置で、パートザイムの末端に組み込む（アプタ-パートザイム）という関連した戦略も考えている。そのような検出戦略のために必要なオリゴヌクレオチド成分には、以下が含まれる；標準的なパートザイム；その末端の一方にアプタマーが組み込まれているパートザイムであるアプタ-パートザイム；（標的の存在下で）アプタ-パートザイムおよびパートザイムの両方と結合して活性MNAザイムの組織化を可能にするオリゴヌクレオチドである組織化助長因子；MNAザイム基質；ならびに、アプタ-パートザイムと、パートザイム配列の少なくともアプタマー配列の一部および基質結合アームの一部にわたる領域でハイブリダイズする組織化阻害因子。標的の非存在下では、組織化阻害因子はアプタ-パートザイムと結合し、その結果、MNAザイム基質の結合（および切断）をブロックする。標的の存在下では、標的はアプタ-パートザイムのアプタマー配列と結合し、組織化阻害因子の結合を妨げて、MNAザイム基質の結合および切断を可能にする。そのため、活性MNAザイムは標的の存在下でのみ形成されて、蛍光シグナル生成を生じさせることができる。
【０４７２】
上記の戦略において、阻害因子配列が別個の分子であってもよく、またはMNAザイム複合体に加わる成分の1つの中に組み込まれてもよいことは、当業者には理解されるであろう。また、1つまたは複数のアプタマーを、パートザイム、組織化助長因子または基質を含む、いずれかのオリゴヌクレオチド成分の中に組み込みうると考えられることも理解されるであろう。さらに、アプタマーを、これらのオリゴヌクレオチドのいずれか1つの一方の末端に組み込むことも可能と考えられる。
【０４７３】
2.2.6. 方法の最適化
当業者は、本明細書に記載の方法を、標的の検出、同定および／または定量を最適化する目的で、種々の実験パラメーターを用いて最適化しうることを容易に理解するであろう。最適化される具体的な実験パラメーター、およびそのような最適化のレベルは、使用する具体的な方法、ならびに検出、同定および／または定量しようとする具体的な標的に依存すると考えられる。そのようなパラメーターには、時間、温度、pH、塩の濃度、オリゴヌクレオチドの濃度、緩衝液の類類および濃度、制限酵素補助因子、界面活性剤、陽イオンおよびジメチルスルホキシド（DMSO）、EDTA、ATP、グリセロールを非限定的に含む他の試薬の濃度、相補性の長さ、GC含量、ならびにMNAザイムおよび／またはCESAの核酸成分の融解点（Tm）が非限定的に含まれる。
【０４７４】
いくつかの態様において、例えば、特定の核酸配列の検出を伴う方法では、その方法を行う温度を好ましくは含む実験パラメーターを、配列の変異を含む標的核酸と含まない標的核酸に対するMNAザイム成分の結合を区別しうるように最適化することができる。そのような方法を行う温度は、約20℃〜約96℃、約20℃〜約75℃、約20℃〜約60℃、または約20℃〜約55℃の範囲内にあってよい。
【０４７５】
1つの好ましい態様においては、本明細書に記載の方法を実施するために最適化された反応を提供する。そのような最適化された反応では、検出されたシグナルを、最適化されていない反応よりも最大で10％、20％または30％増加させる。より好ましい反応条件は、検出されるシグナルを、少なくとも35％または40％、好ましくは最大50％またはそれ以上向上させる。さらにより好ましい態様において、最適化された反応は、触媒活性の50％を上回る、さらに最大で66％、75％、またはさらには100％を上回る増加を有する。さらにより好ましい態様において、完全に最適化された反応方法は、シグナル検出の100％、200％またはさらには300％またはそれ以上の増加を与えると考えられる。他の好ましい反応条件は、最適化されていない反応条件を用いて実施した方法よりも、触媒活性を最大で1000％またはそれ以上向上させることができる。本明細書で提供される方法を最適化するための非常に好ましい反応条件は、ある種の二価陽イオンを含めることである。ほとんどの核酸酵素およびタンパク質酵素の触媒活性は、二価陽イオンの濃度により、濃度依存的な様式で影響される。好ましい最適化された反応は、Ba2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+およびPb2+のうち1つまたは複数に関して最適化される。
【０４７６】
2.2.7 方法の適用
当業者は、MNAザイム、CESAおよび制限酵素を、広範囲にわたる応用分野で、標的の検出、同定または定量のための戦略に用いうることを認識しているするであろう。これらの分野には、医学、獣医学、農業、食品工学、品質管理、環境試験、生命科学研究、法医学、同定試験、画像化およびバイオテロリズム向けの用途が非限定的に含まれる。
【０４７７】
医学的用途の非限定的な例には、特定の疾患もしくは病状、またはそのような疾患もしくは病状を発症するリスクの診断、および／または疾患もしくは病状に関して予後予測を行うことがある。
【０４７８】
生物学的用途に関しては、可能性を否定するのではないものの、生きている動物またはヒトの身体に対して本発明の方法を実施することに関して何ら特定の必要条件はないこと、および本方法をインビトロ／エクスビボで行ってもよいことは、理解されるであろう。例えば、本方法は、生物試料（例えば、血液試料または組織試料）に対して、そのような細胞および核酸の凍結試料、パラフィン包埋試料を含む、対象から前もって単離された細胞または核酸に対して、ならびに培養細胞に対して実施することができる。
【０４７９】
本明細書に記載の方法を用いて、溶液中の標的を検出、同定および／または定量しうることも直ちに明らかであろう。例えば、単一の基質を用いて単一の標的を検出、同定および／または定量することを伴う戦略を、そのような検出のために適用することができる。いくつかの態様において、これはユニバーサル基質の使用を伴いうる。
【０４８０】
本発明をこれから、以下の具体的な例を参照しながらさらに詳細に説明するが、これらの例は、本発明の範囲を限定するものとはまったく見なされるべきではない。
【実施例】
【０４８１】
実施例1
以下の実施例は、ヌクレアーゼによって切断可能または切断不可能である種々の二重鎖構造体を形成する、オリゴヌクレオチドの能力を実証する。ヌクレアーゼによって切断可能である構造体は、CESA複合体等の二重鎖構造体であり、本実施例におけるヌクレアーゼは制限酵素（RE）である。
【０４８２】
1.1. オリゴヌクレオチド
以下の反応について、オリゴヌクレオチド断片を組み合わせて、切断可能な二重鎖基質を形成し得るそれらの能力について試験した。例示的な構造体を図3において図解する。本実施例において、二重鎖には、酵素Mnl Iに対する二本鎖の制限酵素認識部位（RERS）のうちの一方の鎖を形成するのに必要とされるすべてのヌクレオチドを含む1種の鎖が含有されている。
【０４８３】
REの切断活性を、二重標識したDNA複合体の切断によって観測した。本実施例において、酵素増幅因子基質オリゴ1（EAS1）を、5'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）部分で、3'末端において6-フルオレセイン（「6-FAM」）部分で末端標識し、EAS1-5(23)-BFと命名した。EAS2-5(16)-Bと命名された、第2の酵素増幅因子基質オリゴEAS2も、5'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）部分で末端標識されており、EAS1-5(23)-BFとアニールしてPESAを産生する。完全酵素シグナル増幅因子（CESA）複合体と称される十分に組織化した切断可能な二重鎖基質のREによる切断を、485nm（FAM励起波長）における励起を用いて530nm（FAM発光波長）において観測した。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5'から3'に列挙されており、太字でかつ下線が引かれている塩基は、Mnl Iに対する認識配列の少なくとも一部を形成する。この酵素に対する認識配列に寄与する塩基は、下線が引かれており、上段の鎖5' NNCCTCN7／ 3'および下段の鎖3' NNGGAGN6／ 5'であり、／は切断部位を示す。阻害性断片（Sub1(8:9)-TRB2）およびDFに共通している領域は、イタリック体でかつ下線が引かれている。大文字はDNAを示し、小文字はRNAを示す。
2013542738.tif 000013
【０４８４】
1.4. 反応成分
図3において図解したオリゴヌクレオチドおよび構造体に関して、反応A、B、C、およびDを、表6に列挙した以下のオリゴヌクレオチド断片を含有するように準備した。
【０４８５】
（表６）切断可能および切断不可能な構造体のための成分
2013542738.tif 000014
【０４８６】
EAS1、EAS2、およびDFによるCESAの形成を、蛍光標識したEAS1（EAS1-5(23)-BF）のRE（10U Mnl I）による切断によって生じる蛍光シグナルの増大によって測定した。反応A、B、C、およびDのすべてをSmartCycler（登録商標）Systemサーモサイクラー（Cepheid）において37℃で行い、すべての反応の総容量は25μLであった。各反応に対する蛍光を、36秒おきに合計60分間読み取った。すべての反応は、1×BSA（New England Biolabs）中に100nMのEAS1-5(23)-BF、1.25×NEBuffer 4（New England Biolabs）、および10単位のMnl Iを含有していた。加えて、反応Aは100nMのEAS2-5(16)-Bおよび100nM DF1を含有しており、反応Bは100nMのEAS2-5(16)-Bおよび100nM Sub1(8:9)-TRB2を含有しており、反応Cは100nMのEAS2-5(16)-Bを含有しており、一方で、反応DはEAS1のみを含有していた。
【０４８７】
1.5. 結果：REによる切断の検出
反応Aにおいて、EAS1（EAS1-5(23)-BF）、EAS2-5(16)-B、およびDF1の添加は、経時的なFAM蛍光の増大によって示されるように（図14A；＋RE）、RE Mnl Iに対する切断可能なCESA二重鎖基質の形成をもたらした。この観察結果は、REによる認識および切断に必要とされる領域内の2本の鎖のうちの少なくとも一方に断裂またはニックを含有している二本鎖複合体を認識および切断し得る制限酵素の能力と一致する。言い換えれば、切断可能な二重鎖基質は、2本の断裂していない連続した相補鎖から必ずしも形成されるのではなく、むしろ相補的二重鎖を形成する複数のオリゴから作製され得る。
【０４８８】
対照的に、DF1断片を欠いているがSub1(8:9)-TRB2を含む反応Bでは、Sub1(8:9)-TRB2がInFとして作用するため、形成した二重鎖は切断されず、ゆえに蛍光は経時的に増大しなかった（図14B；＋RE）。これは、Sub1(8:9)-TRB2がDF1の配列全体を含むという事実にもかかわらず起こった。、Inf Sub1(8:9)-TRB2中に存在する配列は、DF中にも存在するその特異的配列に付加的であるが、切断可能な二重鎖基質の形成を阻害した。実際、付加的配列は、酵素阻害性複合体（EIC）と称される切断不可能な複合体の形成をもたらした。
【０４８９】
EAS1-5(23)-BFおよびEAS2-5(16)-Bのみを含有しており、DF1およびSub1(8:9)-TRB2の両方を欠いている反応Cにおいて、蛍光の増大は観察されず、これら2種のオリゴ（EAS1およびEAS2）だけでは、REによる二重鎖の認識および切断に不充分であることを示した（図14C；＋RE）。オリゴEAS1およびEAS2はハイブリダイズして部分的酵素シグナル増幅因子（PESA）複合体を形成するが、しかしながら、切断不可能なPESAを切断可能なCESAに変換するためには、付加的オリゴ、すなわちDFが必要とされる。
【０４９０】
最後に、EAS1のみを含有している対照反応Dにおいて、経時的な蛍光の増大は観察されず、この構造体がMnl Iに対する認識配列の一方の鎖を含有しているという事実にもかかわらず、この構造体は切断を受けにくいことを示した。EAS1を組み入れている切断可能な二重鎖を形成するためには相補的配列が必要とされるため、切断は起こり得ない。
【０４９１】
実施例2
以下の実施例は、ヌクレアーゼ（制限酵素）を介したシグナル増幅につながる、蛍光標識したオリゴの切断をもたらす、CESAにおいて制限酵素認識部位を生成するための複数種のオリゴヌクレオチド断片の使用に基づいた。ヌクレアーゼ切断がシグナル増幅をもたらす反応を、EzyAmp反応と称する。
【０４９２】
2.1. EzyAmpオリゴヌクレオチド
このEzyAmp反応に対して、制限酵素認識部位を形成するために、ドライバー断片と組み合わせた2種のオリゴヌクレオチドEAS1およびEAS2が必要とされる。本実施例において、EzyAmpシステム1を用いて、酵素Mnl Iに対する制限酵素認識部位（RERS）を形成する。EzyAmpシステム1（EzyAmp 1）は、酵素増幅因子基質オリゴ1（EAS1-1(20)-JB）、酵素増幅因子基質オリゴ2（EAS2-1(13)）、およびMNAザイム基質Sub1（Sub1(8:9)-FB）の切断によって生成されるドライバー断片1（DF1）から構成される。ストラテジーは、図5において図解されるとおりである。
【０４９３】
EzyAmp活性を、二重標識した断片の切断によって観測する。本実施例において、EAS1（EAS1-1(20)-JB）を、5'末端においてJOE部分で、3'末端においてBlack Holeクエンチャー1（「BHQ1」）部分で末端標識した。EAS2（EAS2-1(13)）は、EAS1-1(20)-JBとアニールする。十分に組織化したCESAのRE切断を、520nm（JOE励起波長）における励起を用いて548nm（JOE発光波長）において観測した。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5'から3'に列挙されており、下線が引かれている塩基は、Mnl Iに対する認識配列の少なくとも一部を形成する（上段の鎖5' NNCCTCN7／ 3'および下段の鎖3' NNGGAGN6／ 5'）。
2013542738.tif 000015
【０４９４】
2.2. パートザイムオリゴヌクレオチドおよび組織化助長因子
ドライバー断片1（DF1）を生成するために、MNAザイム基質Sub1(8:9)-FBを、合成標的、すなわち組織化助長因子AF-PD1の存在下で形成する触媒活性MNAザイムによって切断する。組織化助長因子、ならびにパートザイムAおよびBの配列は、以下に5'から3'に列挙されており、下線が引かれている塩基は、組織化したMNAザイムの活性触媒コアの少なくとも一部を形成し、太字の塩基は標的組織化助長因子とハイブリダイズし、かつイタリック体の塩基はMNAザイム基質にハイブリダイズする。
2013542738.tif 000016
【０４９５】
2.3. MNAザイム基質
MNAザイム活性を、二重標識した核酸レポーターMNAザイム基質（Sub1(8:9)-FB）の切断によって観測する。MNAザイム基質配列は、より長いバージョンが8:17 DNAザイム基質として以前に用いられている（Li et al., 2000）、RNAおよびDNA塩基の両方を含有しているキメラ配列である。本実施例において、レポーターMNAザイム基質をSub1(8:9)-FBと命名し、5'末端において6-カルボキシフルオレセイン（「6-FAM」）部分で、3'末端においてBlack Holeクエンチャー1（「BHQ1」）部分で末端標識した。MNAザイムによるSub1(8:9)-FBの切断を、485nm（FAM励起波長）における励起を用いて530nm（FAM発光波長）において観測した。Sub1(8:9)-FBの標識配列は、5'から3'に以下のとおりである。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。イタリック体の塩基は、切断後にDFとして作用する部分（protion）に相当する。
2013542738.tif 000017
【０４９６】
2.4. 反応成分
EAS1、EAS2、およびドライバー断片によるCESAの形成を、蛍光標識したEAS1-1(20)-JBのRE（20U Mnl I；New England Biolabs）による切断によって生じる蛍光シグナルの増大によって測定した。試験反応を20nMの標的組織化助長因子AF-PD1の添加によって開始し、対照反応をH2Oの添加によって開始した。すべての反応をSmartCycler（登録商標）Systemサーモサイクラー（Cepheid）において35℃で行い、すべての反応の総容量は25μLであった。各反応に対する蛍光を、チャンネル1（FAM）およびチャンネル2（Cy3）において72秒おきに合計120分間読み取って、それぞれFAMおよびJOEを観測した。すべての反応は、50mM MgCl2（Ambion）中に50nMのパートザイムA（PD1A2/1(8)）、50nMパートザイムB（PD1B3/1(9)）、50nM Sub1(8:9)-FB、100nM EAS1-1(20)-JB、および100nM EAS2-1(13)のバルク混合物、1×BSA（New England Biolabs）、ならびに1×NEBuffer 4（New England Biolabs）を含有していた。
【０４９７】
2.5. 結果：EAS1の切断の検出
試験反応への標的組織化助長因子の添加によって、パートザイムAおよびBは、（i）ドライバー断片DF1（DF1：GGAAGAGAT）の生成、および（ii）Sub1(8:9)-FBのMNAザイム切断を示す、経時的に増大しかつFAMチャンネルにおいてリアルタイムで観測され得る検出可能なシグナルをもたらす、レポーターMNAザイム基質 Sub1(8:9)-FBを切断する触媒活性MNAザイムに組織化した（図6（i）標的AF-PD1）。DFは、次いでPESA複合体（EAS1およびEAS2によって形成される）に結合して、Mnl Iによって切断される二重鎖基質として機能するCESA複合体を形成し得た。これは、今度は標的AF-PD1の存在の指標である、CESA複合体中に存在するEAS1のRE切断を示す、JOEにおいて経時的に増大する検出可能なシグナルをもたらした（図6（iii）標的AF-PD1）。
【０４９８】
混合物に標的組織化助長因子を添加しない対照反応において、触媒活性MNAザイムは形成せず、ゆえにレポーターMNAザイム基質 Sub1(8:9)-FBは切断されず、DFは生成されず、かつCESAは生成されなかった。したがって、FAMまたはJOEシグナルのいずれにおいても、経時的に増大するシグナルはなかった（図6（ii）および（iv）標的なしの対照）。このことは、CESAの形成のためのDFを供給するために、MNAザイムによるSub1(8:9)-FBの切断が必要とされることを示している。対照的に、これらの標的なしの反応において、PESAとSub1(8:9)-FBとの間のハイブリダイゼーションによって、その切断されていない状態でInFとして機能するEICが形成された。
【０４９９】
実施例3
本実施例は、完全酵素シグナル増幅因子（CESA）複合体および関連するオリゴヌクレオチドの設計のためのストラテジーを提供する。
【０５００】
例として、8-17 DNAザイムに基づくMNAザイムによる切断に適したMNAザイム基質は、以下の配列：
2013542738.tif 000018
（大文字はDNAを示し、小文字はRNAを示す）を有してよい。適当な組織化助長因子の存在下においてMNAザイムによって切断されると、このMNAザイム基質は2種の断片、すなわち：
2013542738.tif 000019
を産生する。CESA複合体を産生するための、ドライバー断片としての3'オリゴヌクレオチド断片：
2013542738.tif 000020
の使用法の例を、以下の表に明示する。以下の例において、Nは任意のヌクレオチドであり、N'はその相補体である。EAS1およびSub1(8:9)の3'切断断片の配列（以下を参照）をわずかに修正して、異なる認識配列を有する様々な異なる制限酵素とともに用いられるように設計された、多くの異なるPESAおよびそれに続くCESAを提供することができる。
2013542738.tif 000021
【０５０１】
オリゴヌクレオチドEAS1は、制限酵素に対する制限認識部位が、例えば上記に示したユニバーサルまたはジェネリックなESA1配列に従った種々の位置で始まる配列を含有してよい。
【０５０２】
例として、RE部位が6の位置で始まる場合、BsaW1に対する認識配列（TCCGGA）を、RER部位に下線が引かれている以下に例証されるように、EAS1、EAS2、およびドライバー断片内に組み入れることができる。
2013542738.tif 000022
【０５０３】
あるいは、RE部位が7の位置で始まる場合、Mnl 1に対する認識配列（CCTC）を、RER部位に下線が引かれている以下に例証されるように、EAS1、EAS2、およびドライバー断片内に組み入れることができる。
2013542738.tif 000023
【０５０４】
さらなる例において、RE部位が8の位置で始まる場合、Ear1に対する認識配列（CTCTTC）を、RER部位に下線が引かれている以下に例証されるように、EAS1、EAS2、およびドライバー断片内に組み入れることができる。
2013542738.tif 000024
【０５０５】
この一般的ストラテジーを用いると、このDFとともに使用するRE候補には、その5'末端にCまたはCCまたはTCCのいずれかを有する認識配列を有するREが含まれるであろう。以下の表におけるRE等（他の多くのものに加えて）を、このドライバー断片との使用について試験することができる。
2013542738.tif 000025
【０５０６】
例証される他の例では、上記のそれらの例と反対向きでの同じドライバー断片の使用が示されている。これらの場合、RE候補は、GまたはGGまたはGGAで終わるRERSを有してよい。そのようなシステムにおける使用のためのEAS1、EAS2、およびDFのジェネリック配列は、以下のとおりである。
2013542738.tif 000026
【０５０７】
例として、RE部位が4の位置で始まる場合、BstU1に対するRERS（CGCG）を、該部位に下線が引かれている以下に例証されるように、EAS1、EAS2、およびドライバー断片内に組み入れることができる。
2013542738.tif 000027
【０５０８】
任意の特定のDFとともに使用し得る有用な制限酵素の範囲は、切断を可能にするために存在する、認識配列の5'または3'のいずれかの付加的配列に対するいくつかのREによる必要条件を上手く活用することによって拡張され得る。
【０５０９】
実施例4
以下の実施例は、ヌクレアーゼ（制限酵素）を介したシグナル増幅につながる、蛍光標識したオリゴの切断をもたらす、CESAにおいて制限酵素認識部位を生成するための複数種のオリゴヌクレオチド断片の使用に基づいた。ヌクレアーゼ切断がシグナル増幅をもたらす反応を、EzyAmp反応と称する。
【０５１０】
4.1. EzyAmpオリゴヌクレオチド
このEzyAmp反応に対して、制限酵素認識部位を形成するために、ドライバー断片と組み合わせた2種のオリゴヌクレオチドEAS1およびEAS2が必要とされる。本実施例において、EzyAmpシステム1を用いて、酵素Mnl Iに対する制限酵素認識部位（RERS）を形成する。EzyAmpシステム1（EzyAmp 1）は、酵素増幅因子基質オリゴ1（EAS1-1(20)）、酵素増幅因子基質オリゴ2（EAS2-1(13)）、およびMNAザイム基質Sub1の切断によって生成されるドライバー断片1（DF1）から構成される。ストラテジーは、図5において図解されるとおりである。
【０５１１】
EzyAmp活性を、二重標識した断片の切断によって観測する。本実施例において、EAS1（EAS1-1(20)-BJ）を、5'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）部分で、3'末端においてJOE部分で末端標識した。EAS2（EAS2-1(13)）は、Iowa Black FQ（「IAbFQ」）で末端標識され、EAS1-1(20)-BJとアニールする。十分に組織化したCESAのRE切断を、520nm（JOE励起波長）における励起を用いて548nm（JOE発光波長）において観測した。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5'から3'に列挙されており、下線が引かれている塩基は、Mnl Iに対する認識配列（CCTC）の少なくとも一部を形成する。
2013542738.tif 000028
【０５１２】
4.2. パートザイムオリゴヌクレオチドおよび組織化助長因子
ドライバー断片1（DF1）を生成するために、MNAザイム基質Sub1(8:9)-TRB2を、合成標的、すなわち組織化助長因子AF-PD1の存在下で形成する触媒活性MNAザイムによって切断する。組織化助長因子、ならびにパートザイムAおよびBの配列は、以下に5'から3'に列挙されており、下線が引かれている塩基は、組織化したMNAザイムの活性触媒コアの少なくとも一部を形成し、太字の塩基は標的とハイブリダイズし、かつイタリック体の塩基はMNAザイム基質にハイブリダイズする。
2013542738.tif 000029
【０５１３】
4.3. MNAザイム基質
MNAザイム活性を、二重標識した核酸レポーターMNAザイム基質（Sub1(8:9)-TRB2）の切断によって観測する。MNAザイム基質配列は、より長いバージョンが8:17 DNAザイム基質として以前に用いられている（Li et al., 2000）、RNAおよびDNA塩基の両方を含有しているキメラ配列である。本実施例において、レポーターMNAザイム基質をSub1(8:9)-TRB2と命名し、5'末端においてスルホローダミン（「TXR」）部分で、3'末端においてBlack Holeクエンチャー2（「BHQ2」）部分で末端標識した。MNAザイムによるSub1(8:9)-TRB2の切断を、598nm（TXR励起波長）における励起を用いて617nm（TXR発光波長）において観測した。Sub1(8:9)-TRB2の標識配列は、5'から3'に以下のとおりである。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。イタリック体の塩基は、DFとして作用し得る部分に相当する。
2013542738.tif 000030
【０５１４】
4.4. 反応成分
EAS1、EAS2、およびドライバー断片によるCESAの形成を、蛍光標識したEAS1-1(20)-BJのRE（Mnl I）による切断によって生じる蛍光シグナルの増大によって測定した。反応を10U Mnl I（New England Biolabs）の添加によって開始した。すべての反応をSmartCycler（登録商標）Systemサーモサイクラー（Cepheid）において35℃で行い、すべての反応の総容量は25μLであった。各反応に対する蛍光を、72秒おきに合計120分間読み取った。すべての反応は、50mM MgCl2（Ambion）中に50nMパートザイムA（PD1A2/1(8)）、50nMパートザイムB（PD1B3/1(9)）、100nMのSub1(8:9)-TRB2、100nM EAS1-1(20)-BJ、および100nM EAS2-1(13)-Bのバルク混合物、1×BSA（New England Biolabs）、ならびに1.2×NEBuffer 4（New England Biolabs）を含有していた。加えて、試験反応は20nMの標的組織化助長因子（AF-PD1）を含有しており、対照反応はH2Oを含有していた。
【０５１５】
4.5. 結果：EAS1の切断の検出
試験反応への標的組織化助長因子の添加によって、パートザイムAおよびBは、（i）ドライバー断片DF1（DF1：GGAAGAGAT）の生成、および（ii）Sub1(8:9)-TRB2のMNAザイム切断を示す、経時的に増大しかつTXRチャンネルにおいてリアルタイムで観測され得る検出可能なシグナルをもたらす、レポーターMNAザイム基質 Sub1(8:9)-TRB2を切断する触媒活性MNAザイムに組織化した。DFは、次いでPESA複合体（EAS1およびEAS2によって形成される）に結合して、Mnl Iによって切断される二重鎖基質として機能するCESA複合体を形成し得た。これは、今度は標的AF-PD1の存在の指標である、CESA複合体中に存在するEAS1のRE切断を示す、JOEチャンネルにおいて経時的に増大する検出可能なシグナルをもたらした（図12）。
【０５１６】
混合物に標的組織化助長因子を添加しない対照反応において、触媒活性MNAザイムは形成せず、ゆえにレポーターMNAザイム基質 Sub1(8:9)-TRB2は切断されず、DFは生成されず、かつCESAは生成されなかった。したがって、TXRまたはJOEチャンネルのいずれにおいても、経時的なシグナルの増大はなかった（図12）。このことは、CESAの形成のためのDFを供給するために、MNAザイムによるSub1(8:9)-TRB2の切断が必要とされることを示している。対照的に、この反応において、PESAとSub1(8:9)-TRB2との間のハイブリダイゼーションによって、その切断されていない状態でInFとして機能するEICが形成された。
【０５１７】
実施例5
以下の実施例は、（i）認識配列の特定の塩基に隣接したおよびその範囲内の種々の位置におけるニックを許容し得る、（ii）認識配列における特定の塩基に隣接した非相補的塩基を許容し得る、（iii）認識配列と切断部位との間の非相補的塩基を許容し得る、ならびに（iv）認識配列に隣接したまたはその範囲内のリボヌクレオチドの存在を許容し得る、Mnl Iの能力を実証する。
【０５１８】
5.1. オリゴヌクレオチド
5.1.1 反応1：DF結合はRERS「GAGG」の3'末端にすぐ隣接したニックをもたらす。
以下の反応において、PESAを、EAS1（EAS1_10_2）およびEAS2（EAS2_11_2(16)）から構成した。EAS1は、5'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）部分で、3'末端において6-フルオレセイン（「6-FAM」）部分で標識され、かつ5'CCTC3'という部分的Mnl I認識配列を含有していた。EAS2を、EAS1とアニールするように設計し、かつ5'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）部分で標識した。EAS2は、その3'末端において5'GAGG3'という部分的Mnl I認識配列を含有していた。DF（DF1(8)）を、EAS2における部分的Mnl I認識配列5'GAGG3'の直前の3'配列として、EAS1にハイブリダイズするように設計した（表4B）。DFは、Mnl I認識配列のいかなる部分も含有していなかった。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5'から3'に列挙されており、下線が引かれている塩基は、Mnl Iに対する認識配列の少なくとも一部を形成する。Mnl Iに対する認識配列に寄与する塩基は、：
2013542738.tif 000031
であり、／は切断部位を示す。
2013542738.tif 000032
【０５１９】
5.1.2 反応2：DF結合は部分的RERS「GAGG」の3'末端から1塩基内側にニックをもたらす。
以下の反応において、PESAを、EAS1（EAS1_10_2）およびEAS2（EAS2_11_2(15)）から構成した。EAS1は、5'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）部分で、3'末端において6-フルオレセイン（「6-FAM」）部分で標識され、かつ5'CCTC3'という部分的Mnl I認識配列を含有していた。EAS2を、EAS1とアニールするように設計し、かつ5'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）部分で標識した。EAS2は、その3'末端において5'GAGG3'という部分的Mnl I認識配列の断片（5'GAG3'）を含有していた。DF（DF1(9)）を、EAS2に隣接させて、EAS1にハイブリダイズするように設計した。DFは、5'GAGG3'という部分的Mnl I認識配列の断片（3'G）を含有しており、EAS2からなくなっている1塩基を付加することによってそれを完成させた（表4C）。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5'から3'に列挙されており、下線が引かれている塩基は、Mnl Iに対する認識配列の少なくとも一部を形成する。Mnl Iに対する認識配列に寄与する塩基は、：
2013542738.tif 000033
であり、／は切断部位を示す。
2013542738.tif 000034
【０５２０】
5.1.3 反応3：DF結合は部分的RERS「GAGG」の3'末端から2塩基内側にニックをもたらす。
以下の反応において、PESAを、EAS1（EAS1_10）およびEAS2（EAS2_11）から構成した。
【０５２１】
EAS1は、5'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）部分で、3'末端において6-フルオレセイン（「6-FAM」）部分で標識され、かつ5'CCTC3'という部分的Mnl I認識配列を含有していた。EAS2を、EAS1とアニールするように設計し、かつ5'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）部分で標識した。EAS2の3'末端は、5'GAGG3'という部分的Mnl I認識配列の断片（5'GA3'）を含有していた。DF（DF1）は、EAS2に隣接させて、EAS1にハイブリダイズするように設計され、かつ5'GAGG3'という部分的Mnl I認識配列の断片（5'GG3'）を含有しており、EAS2からなくなっている2塩基（GG）を付加することによってそれを完成させた（表4D）。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5'から3'に列挙されており、下線が引かれている塩基は、Mnl Iに対する認識配列の少なくとも一部を形成する。Mnl Iに対する認識配列に寄与する塩基は、：
2013542738.tif 000035
であり、／は切断部位を示す。
2013542738.tif 000036
【０５２２】
5.1.4 反応4：DF結合は部分的RERS「GAGG」へ2塩基内側にニックおよび1塩基のリボヌクレオチド塩基をもたらす。
以下の反応において、PESAを、EAS1（Re1F1(20T)(20)-BJ）およびEAS2（Re1S1(1A)(13)-5-B）から構成した。EAS1は、5'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）部分で、3'末端においてJoe_N（「JOE」）部分で標識され、かつ5'CCTC3'という部分的Mnl I認識配列を含有していた。EAS2を、EAS1とアニールするように設計し、かつ5'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）部分で標識した。EAS2は、5'GAGG3'という部分的Mnl I認識配列の断片（5'GA3'）を含有していた。DF（rRe1S1(9)-3）を、EAS2に隣接させて、EAS1とアニールするように設計した。DFの5'末端は、5'GAGG3'という部分的Mnl I認識配列の断片（5'GG3'）を含有しており、EAS2からなくなっている2塩基を付加することによってそれを完成させた。DFは、認識配列内にリボヌクレオチドを導入するために、リボヌクレオチド（Gg）も含有していた（表4E）。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5'から3'に列挙されており、下線が引かれている塩基は、Mnl Iに対する認識配列の少なくとも一部を形成し、かつリボヌクレオチド塩基は小文字gとして示される。Mnl Iに対する認識配列に寄与する塩基は、：
2013542738.tif 000037
であり、／は切断部位を示す。
2013542738.tif 000038
【０５２３】
5.1.5 反応5：DF結合は部分的RERS GAGGの3'末端から3塩基内側にニックをもたらす。
以下の反応において、PESAを、EAS1（EAS1_10_2）およびEAS2（EAS2_11_2(13)）から構成した。EAS1は、5'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）部分で、3'末端において6-フルオレセイン（「6-FAM」）部分で標識され、かつ5'CCTC3'という部分的Mnl I認識配列を含有していた。EAS2を、EAS1とアニールするように設計し、かつ5'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）部分で標識した。EAS2は、その3'末端において5'GAGG3'という部分的Mnl I認識配列の断片（5'G3'）を含有していた。DF（DF1(11)）を、EAS2に隣接させて、EAS1にハイブリダイズするように設計した。DFの5'末端は、5'GAGG3'という部分的Mnl I認識配列の断片（5'GGA3'）を含有しており、EAS2からなくなっている3塩基を付加することによってそれを完成させた（表4F）。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5'から3'に列挙されており、下線が引かれている塩基は、Mnl Iに対する認識配列の少なくとも一部を形成する。Mnl Iに対する認識配列に寄与する塩基は、：
2013542738.tif 000039
であり、／は切断部位を示す。
2013542738.tif 000040
【０５２４】
5.1.6 反応6：DF結合はRERS「GAGG」の5'末端にすぐ隣接したニックをもたらす。
DFは、認識配列および切断配列の一部を形成する。以下の反応において、PESAを、EAS1（Mnl I/DFS_F1-BF）およびEAS2（Mnl I/DFS_F2）から構成する。EAS1は、5'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）部分で、3'末端において6-フルオレセイン（「6-FAM」）部分で標識され、かつ5'CCTC3'という部分的Mnl I認識配列を含有していた。EAS2を、EAS1にハイブリダイズするように設計した。EAS2の5'末端は、5'GAGG3'という部分的Mnl I認識配列を含有していた。DF（Mnl I/DFS_DF）を、EAS2におけるMnl I認識部位5'-GAGG3'のすぐ上流にある5'配列として、EAS1とアニールするように設計した。DFは、Mnl I認識配列のいかなる部分も含有していなかったが、切断部位を含有していた（表4G）。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5'から3'に列挙されており、下線が引かれている塩基は、Mnl Iに対する認識配列の少なくとも一部を形成する。Mnl Iに対する認識配列に寄与する塩基は、：
2013542738.tif 000041
であり、／は切断部位を示す。
2013542738.tif 000042
【０５２５】
5.1.7 反応7：DF結合は部分的RERS GAGGの5'末端から2塩基上流にニックをもたらす。DFは切断部位の一部を形成する。
以下の反応において、PESAを、EAS1（Mnl IDFS_F1-BF）およびEAS2（Mnl I/DFS_F2(13)）から構成した。EAS1は、5'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）部分で、3'末端において6-フルオレセイン（「6-FAM」）部分で標識され、かつ5'CCTC3'という部分的Mnl I認識配列を含有していた。EAS2は、EAS1にハイブリダイズするように設計され、かつ5'GAGG3'という部分的Mnl I認識配列、さらにこの配列に対して5'に追加の2塩基を含有していた。DF（Mnl I/DFS_DF(8)）を、EAS2の5'末端から2塩基上流に、EAS1にハイブリダイズするように設計した。このDFは、Mnl I認識配列のいかなる部分も含有していなかったが、切断部位を含有していた（表4H）。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5'から3'に列挙されており、下線が引かれている塩基は、Mnl Iに対する認識配列の少なくとも一部を形成する。Mnl Iに対する認識配列に寄与する塩基は、：
2013542738.tif 000043
であり、／は切断部位を示す。
2013542738.tif 000044
【０５２６】
5.1.8 反応8：DF結合は部分的RERS「CCTC」の5'末端から2塩基内側にニックをもたらす。
以下の反応において、PESAを、EAS1（EAS1_28）およびEAS2（EAS2_27）から構成した。EAS1は、5'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）部分で標識され、かつ5'GAGG3'という部分的Mnl I認識配列を含有していた。EAS2を、EAS1にハイブリダイズするように設計し、かつ3'末端において6-フルオレセイン（「6-FAM」）部分で標識した。EAS2は、5'CCTC3'という部分的Mnl I認識配列の断片（5'TC3）を含有していた。EAS2を、認識配列と切断部位との間で非相補的な1塩基対を生成するように設計した。DF（DF-3EAS2_26）は、EAS1にハイブリダイズするように設計され、かつ5'CCTC3'という部分的Mnl I認識配列の断片（5'CC3'）を含有しており、EAS2からなくなっている2塩基を付加することによってそれを完成させた（表4I）。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5'から3'に列挙されており、下線が引かれている塩基は、Mnl Iの認識配列の少なくとも一部を形成する。Mnl Iに対する認識配列に寄与する塩基は、：
2013542738.tif 000045
であり、／は切断部位を示す。
2013542738.tif 000046
【０５２７】
5.2. 反応成分
EAS1、EAS2、およびDFから構成されるCESA候補のRE Mnl Iによる切断を、フルオロフォアとクエンチャー部分の分離に応答して産生される蛍光シグナルの変化を測定することによって観測した。試験反応を100nmのDFの添加によって開始し、対照反応を水の添加によって開始した（対照反応はいかなるDFも含有していなかった）。反応をCFX96（商標）Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad）において実施し、反応の総容量は25μLであった。反応を二つ組で実施した。すべてのオリゴヌクレオチドをIntegrated DNA Technologies（IDT）から購入した。反応はそれぞれ、100nMのEAS1、100mMのEAS2、1×BSA（New England Biolabs）、1×NEBuffer 4（New England Biolabs）、およびヌクレアーゼを含まない水（Ambion）を含有していた。各反応間の変動を表7に列挙する。
【０５２８】
（表７）実施例5における実験の反応条件の変動
2013542738.tif 000047
【０５２９】
5.3. 結果：CESAの切断の検出
試験反応へのDFの添加によって、DFはPESA複合体（EAS1およびEAS2によって形成される）に結合した。このことによって、RE Mnl Iに対する完全認識部位を含有しているCESA複合体が形成された。蛍光シグナルの増大は、CESA複合体候補の切断の指標であった。
【０５３０】
5.3.1：DF結合はRERS「GAGG」の3'末端にすぐ隣接したニックをもたらす。
反応1へのDFの添加は、経時的に増大する蛍光をもたらした（図15.1（i））。このことは、DFが結合して、5'GAGG3'というMnl I RERSの3'末端にすぐ隣接したニックを形成した場合に、Mnl Iによって切断可能であるCESAが形成され得ることを示している。本実施例において、PESAは、RERS全体ならびに切断部位を含有しており、ゆえにより低効率ではあるがMnl Iによって切断もされる。そのため、DFの非存在下において、蛍光は依然として増大したが、DFを含有している反応よりも遅い速度であった（図15.1（ii））。
【０５３１】
5.3.2：DF結合は部分的RERS「GAGG」の3'末端内にあら1塩基内側にニックをもたらす。
反応2へのDFの添加は、経時的に増大する蛍光をもたらした（図15.2（i））。対照的に、DFを添加しない場合、経時的なシグナルの増大は観察されなかった（図15.2（ii））。このことは、DFが、PESA内に部分的Mnl I認識配列5'GAGG3'の3'の最後の塩基（G）を供給することによってこの配列を完成させた場合に、Mnl Iによって切断可能なCESAが形成され得ることを示している。
【０５３２】
5.3.3：DF結合は部分的RERS「GAGG」の3'末端から2塩基内側にニックをもたらす。
反応3へのDFの添加は、経時的に増大する蛍光をもたらした（図15.3（i））。対照的に、DFを添加しない場合、経時的なシグナルの増大は観察されなかった（図15.3（ii））。このことは、DFが、PESA内に部分的Mnl I認識配列5'GAGG3'の3'の最後の2塩基（GG）を供給することによってこの配列を完成させた場合に、Mnl Iによって切断可能なCESAが形成され得ることを示している。
【０５３３】
5.3.4：DF結合は部分的RERS「GAGG」へ2塩基内側にニックおよび1塩基のリボヌクレオチド塩基をもたらす。
反応4へのDFの添加は、経時的に増大する蛍光をもたらした（図15.4（i））。対照的に、DFを添加しない場合、経時的なシグナルの増大は観察されなかった（図15.4（ii））。このことは、DFが、PESA内に部分的Mnl I認識配列5'GAGG3'の3'の最後の2塩基（GG）を供給することによってこの配列を完成させた場合に、たとえ2番目の塩基がリボヌクレオチド（Gg）である場合でさえ、Mnl Iによって切断可能なCESAが形成され得ることを示している。
【０５３４】
5.3.5：DF結合は部分的RERS「GAGG」の3'末端から3塩基内側にニックをもたらす。
反応5へのDFの添加は、経時的に増大する蛍光をもたらした（図15.5（i））。対照的に、DFを添加しない場合、経時的なシグナルの増大は観察されなかった（図15.5（ii））。このことは、DFが、PESA内に部分的Mnl I認識配列5'GAGG3'の3'の最後の3塩基（GGA）を供給することによってこの配列を完成させた場合に、Mnl Iによって切断可能なCESAが形成され得ることを示している。
【０５３５】
5.3.6：DF結合はRERS「GAGG」の5'末端にすぐ隣接したニックをもたらす。
DFは、認識配列および切断配列の一部を形成する。DFの存在下（図15.6（i））または非存在下（図15.6（ii））において経時的な蛍光の増大はなく、DFが、5'GAGG3'という部分的Mnl I認識配列からすぐ上流にあるEAS1の3'末端に結合した場合に、切断可能なCESAは形成されないことを示した。DFの添加は、おそらくEAS1へのDFのハイブリダイゼーションによってより柔軟性が低くかつより消光される構造が誘導されるために、PESAに対する消光効果を有すると思われる。
【０５３６】
5.3.7：DF結合はRERS「GAGG」の5'末端から2塩基上流にニックをもたらす。
DFは、認識配列および切断配列の一部を形成する。反応7において、DFの添加は、経時的に増大する蛍光をもたらした（図15.7（i））。対照的に、DFを添加しない場合、経時的なシグナル増大は観察されなかった（図15.7（ii））。このことは、DFが、PESA内の部分的Mnl I認識配列5'GAGG3'の2塩基上流にある配列に結合し、かつ切断部位の一方を提供した場合に、Mnl Iによって切断可能なCESAが形成され得ることを示している。
【０５３７】
5.3.8：DF結合は部分的RERS「CCTC」の5'末端内に2塩基のニックをもたらす。
反応8において、DFの添加は、経時的に増大する蛍光をもたらした（図15.8（i））。対照的に、DFを添加しない場合、経時的なシグナルの増大は観察されなかった（図15.8（ii））。このことは、DFが、5'末端由来の2塩基（CC）によって5'CCTC3'という部分的Mnl I認識配列を完成させた場合に、Mnl Iによって切断可能なCESAが形成され得ることを示している。
【０５３８】
反応1〜8の全般的結果は、PESAおよび相当するDFが切断可能なCESA構造体を産生するように、当業者がどのようにそれらを設計し得るかということにおいてかなりの柔軟性があることを実証している。特に留意すべきは、PESAをCESAに変換し得る、DFにリボヌクレオチドを含み得る能力である（図15.4（i））。リボヌクレオチドを含有しているDFを使用し得る能力は、EzyAmp反応を開始する多様なMNAザイムを使用し得る能力を拡張させる。10:23 DNAザイムに由来するMNAザイムを用いて標的特異的な様式で基質を切断して、DFを直接生成する形式において、切断された両方の断片は、両方ともその切断された末端においてリボヌクレオチドを含有すると考えられる。これらの切断された断片は、リボヌクレオチドがRERS内で許容され得るため、EzyAmp反応におけるDFとして有用であろう。
【０５３９】
実施例6
以下の実施例は、特定の酵素によって切断可能または切断不可能である種々の二重鎖構造体を形成する、オリゴヌクレオチドの能力を実証する。ヌクレアーゼによって切断可能な構造体は、CESA複合体等の二重鎖構造体であり、本実施例におけるヌクレアーゼは制限酵素（RE）である。
【０５４０】
6.1. オリゴヌクレオチド
以下の反応について、オリゴヌクレオチド断片を組み合わせて、二重鎖基質を切断し得る種々のREの能力を試験するための基質として用いた。CESA、PESA、およびEICの例示的な構造体を図1において図解する。本実施例において、種々の二重鎖には、スクリーニングされる特定のREに対するRERSのうちの一方の鎖を形成するのに必要とされるすべての塩基を含む1種のオリゴヌクレオチドが含有されていた。
【０５４１】
REの切断活性を、フルオロフォアとクエンチャーとの間の物理的分離によって検出可能なシグナルが産生されるようにフルオロフォアおよびクエンチャーが複合体上に位置している、標識した複合体の切断によって観測した。本実施例において、EAS1と命名された酵素増幅因子基質オリゴ1は、フルオロフォアおよびクエンチャーで標識され、加えて、各REに対するRERSの一方の鎖を形成するのに必要とされる塩基のすべてに相当する配列を含有していた。RE1F1(20)-JBを、5'末端上でJOEで、3'末端上でBHQで標識した。EAS7-1(21)-FBを、5'末端上で6-FAMで、3'末端上でIaBFQで標識した。REF4F1-F1Bを、4の位置においてフルオレセインで、15の位置においてIaBFQで内部標識した。EAS1-4(16)-BFを、5'末端上でIaBFQで、3'末端上で6-FAMで標識した。EAS5-1(18)-BFを、5'末端上でIaBFQで、3'末端上で6-FAMで標識した。EAS3-1(18)-BFを、5'末端上でIaBFQで、3'末端上で6-FAMで標識した。
【０５４２】
EAS2と命名された第2の酵素増幅因子基質オリゴは、部分的RERSを含有しており、EAS1とアニールし、いくつかの例ではクエンチャー部分で標識されており、例えばEAS6-1(10)-Bは5'末端上でIaBFQで標識された。EAS1およびEAS2は、PESA複合体の構造的同等物を一緒に形成する（図1C）。ドライバー断片（DF）の構造的同等物に相当する第3の断片のハイブリダイゼーションは、完全酵素シグナル増幅因子（CESA）複合体と構造において同等であるが、機能においては必ずしも同等でない二重鎖構造体の形成をもたらす（図1A）。あるいは、阻害性断片（InF）の構造的同等物に相当する第3の断片のハイブリダイゼーションは、酵素阻害性複合体（EIC）と構造において同等であるが、機能においては必ずしも同等でない二重鎖構造体の形成をもたらす（図1B）。いくつかの例において、InFをフルオロフォアおよび／またはクエンチャー部分で標識した。Sub1(8:9)TRB2を、5'末端上でTexas redフルオロフォアで、3'末端上でBHQ2で標識し、RE1S1(1A)(13)-5-Bを、5'末端上でIaBFQで標識した。最後に、EAS1の十分に相補的なRE認識配列のすべてを含有しているアンチセンス対照鎖（ASC）を、無傷二重鎖のRE切断に対する陽性対照として含んだ。いくつかの例において、ASCをクエンチャー部分で標識し、例えばASC-EAS6-1(8)-Bを、5'末端上でIaBFQで標識した。
【０５４３】
上記の十分に組織化した二重鎖構造体を切断し得る種々のREの能力またはその欠如を、EAS1上に存在するフルオロフォアに対する適当なチャンネルにおいて観測した。各反応内に存在するこれらのオリゴヌクレオチドの名前を、以下の表8において5'から3'に列挙する。REの認識配列に寄与する塩基を表9に提供しており、「／」は切断部位を示す。
【０５４４】
（表８）EzyAmp用のREのスクリーニングに用いられたREおよびオリゴ
2013542738.tif 000048
2013542738.tif 000049
2013542738.tif 000050
【０５４５】
表8におけるオリゴのそれぞれに対する配列を表9に提供する。
【０５４６】
（表９）
2013542738.tif 000051
【０５４７】
6.2. 反応成分
反応A、B、C、D、E、およびFを、表10に列挙した以下のオリゴヌクレオチド断片を含有するように準備した。
【０５４８】
（表１０）反応A〜Fのオリゴヌクレオチド成分
2013542738.tif 000052
【０５４９】
すべての反応は、1×NEBバッファー（表11）中に100nMのEAS1および特定の単位数のRE（表11）を含有していた。加えて、反応Aはそれぞれ100nMのEAS2およびDFを含有しており、反応Bはそれぞれ100nMのEAS2およびInFを含有しており、反応Cは100nMのEAS2を含有しており、反応DはEAS1のみを含有しており、一方で、反応EおよびFは100nMのASCを含有していた。オリゴヌクレオチドをIDTから購入した。いくつかの反応には、その特別なREに対する使用に関するメーカー推奨によって指示されたとおり、1×BSA（New England Biolabs）の添加も含まれた。反応A〜Eに対する具体的な反応条件を表11に示す。各反応Fは、混合物にREを添加しないという点を除いて、反応Eと同一であった。種々のオリゴ構造体の切断またはその欠如を、蛍光標識したEAS1のREによる切断によるその改変に伴う蛍光シグナルの変化を観測することによって測定した。すべての反応A、B、C、D、E、およびFをCFX96（商標）Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad）において特定の温度で行い、すべての反応の総容量は25μLであった。各反応に対する蛍光を、1秒おきに合計100サイクル読み取るようにプログラムした。すべての反応を二つ組で実施した。
【０５５０】
（表１１）各特定のREに対する反応条件
2013542738.tif 000053
*6-フルオレセイン（FAM）部分または6-JOE（JOE）部分を含有している反応に対する蛍光の増大を、CFX96（商標）Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad）のFAMまたはJOEチャンネル（チャンネル1または2）においてそれぞれ検出した。FAM/Sybrのスキャンモードを用いた反応において、実行時間は17分間であり、全チャンネルのスキャンモードを用いた反応において、反応時間は24分間であった。
**Fermentasによって供給されている（残りのREおよびバッファーはNew England Biolabsによって供給されている）。
***濃度が供給元によって開示されておらず、したがって、これらの反応は1反応あたりのμLに基づいて実施された。
【０５５１】
6.3. 結果：切断の検出
反応A〜Fに対して、フルオロフォアとクエンチャーの分離を示す蛍光の増大が検出された場合、これを表12において「切断」として記録した。蛍光の増大が検出されなかった場合、これはフルオロフォアとクエンチャーの分離がなかったことを示し、これを表12において「切断なし」として記録した。
【０５５２】
（表１２）結果
2013542738.tif 000054
【０５５３】
EAS1とその十分な相補鎖ASCを含有している陽性対照の反応Eのすべてにおいて、経時的な蛍光シグナルの増大が観察され、この構造体が切断を受けやすいことを示した。REのそれぞれは二本鎖の複合体を認識かつ切断し得るため、切断が起こり得る。反対に、EAS1とその十分な相補鎖ASCを含有しているが、いかなるREも欠いている陰性対照の反応Fに対して、予測されたとおり、蛍光シグナルの増大は観察されなかった。
【０５５４】
種々の完全なおよび部分的な二重鎖構造体の切断に関して、種々のREによって切断されるオリゴ構造体に依存して、REは4つの基本的パターン（I〜IV）のうちの1つに分類された。各パターンに従って挙動した酵素の一例を、図16において例証する。表12において提示された上記の結果の意義を、表13において要約する。
【０５５５】
（表１３）
2013542738.tif 000055
【０５５６】
しかしながら、各REの挙動は、イオン強度、pH、Mg濃度、およびRE濃度を含む多くの要素に大きく依存し、そのため、これらのグループ化およびパターンは、これらの反応条件下でのみこれらのREに付属し得るにすぎないことに留意すべきである。それでも、これらの実験は、ヌクレアーゼがそのようなパターンで二重鎖構造体を切断するような適切な反応条件を用いてヌクレアーゼの組み合わせを見出すためのスクリーニングアッセイが設定され得るプロセスを示すものであって、それによって、それらはEzyAmp反応を進めるために活用されるのに適したものとなる。
【０５５７】
実施例7
以下の実施例は、2種の異なるCESA複合体（CESA AおよびCESA B）が、それらそれぞれのDFのいずれかによる開始に応答したこれらのCESA複合体の完成後に、1本の反応チューブ内で単一の制限酵素によって切断される能力を実証する。この反応ためのストラテジーを図17Aにおいて図解する。本実施例におけるCESAを、各CESAの切断によって他方のCESAに対する新たなDFが生成されるように設計した。本実施例において、CESA AおよびCESA Bを、各CESAの切断によって生成される蛍光シグナルを独立して観測し得るように、異なるフルオロフォアで標識した。
【０５５８】
7.1. オリゴヌクレオチド
以下の反応において、CESA AをPESA AおよびDF-a（DF1）から構成し、一方で、CESA BをPESA BおよびDF-b（DF-3EAS1_11）から構成する。今度は、PESA AをEAS1A（EAS1_10）およびEAS2A（EAS2_11）から構成し、PESA BをEAS1B（EAS1_12）およびEAS2B（EAS2_13）から構成する。PESA AのEAS2Aは、DF-bの配列と同等である領域をその中に含有しており、PESA BのEAS2Bは、DF-aの配列と同等である領域をその中に含有している。そのため、反応の開始時にDF-aまたはDF-bのいずれかを添加し得、次いで、反応の間にCESA BまたはCESA Aの切断によって各DFがそれぞれ生成され得るように、本実験を設計した。プロセスの概略図を図17Aにおいて図解する。
【０５５９】
RE活性を、フルオロフォアとクエンチャーの分離に相当する蛍光の変化によって観測した。本実施例において、EAS1Aを、5'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）部分で、3'末端においてJOE部分で末端標識した。EAS2Aも、5'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）部分によって標識されており、EAS1Aとアニールする。EAS1Bを、5'末端において6-フルオレセイン（「6-FAM」）部分で末端標識した。EAS2Bは、3'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）部分によって標識されており、EAS1Bとアニールする。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5'から3'に列挙されており、下線が引かれている塩基は、Mnl Iに対する認識配列（CCTCまたはGAGG）の少なくとも一部を形成し、かつイタリック体の塩基は、より長いオリゴヌクレオチドの状況で存在するDFと同等であるものを表す。
2013542738.tif 000056
【０５６０】
7.2. 反応条件
オリゴヌクレオチドをIntegrated DNA Technologies（IDT）から購入した。すべての反応は、それぞれ100nMのEAS1_10、EAS2_11、EAS1_12、EAS2_13、および10mM MgCl2（Ambion）のバルク混合物、1×BSA（New England Biolabs）、1×NEBuffer 4（New England Biolabs）、ヌクレアーゼを含まない水（Ambion）、ならびに0.75U Mnl I（New England Biolabs）を含有していた。反応Aを100nM DF1（I）または等量の水（II）の添加によって開始し、反応Bを100nM DF3ESA1_11（III）または等量の水（IV）の添加によって開始した。すべての反応は、25μLの総反応容量を有した。チャンネル1（FAM）およびチャンネル2（HEX）の両方において蛍光シグナルを同時に測定して、FAMおよびJOEをそれぞれ観測した。反応をCFX96（商標）Real-Time PCR Detection System（BioRad）において35℃で行った。各サンプルに対する蛍光を、1秒後おきに150サイクル読み取るようにプログラムした（スキャンモード：全チャンネル）。総実行時間は40分間であった。すべての反応を二つ組で実施した。
【０５６１】
7.3. 結果：CESA AおよびCESA Bの切断の検出
各反応における蛍光の変化を、時間に対してプロットし、図17Bに示した。反応Aにおいて、DF-aの添加は、経時的なJOE蛍光の増大によって示されるように（反応A（ii）JOE：CESA A＋DF-a）、RE Mnl Iに対する切断可能なCESA A二重鎖基質の形成をもたらした。それと同時に、同じRE Mnl Iに対する切断可能なCESA B二重鎖基質を形成する、CESA A切断からのDF-bの産生の指標である、経時的なFAM蛍光の増大もこの反応において観察された（反応A（i）FAM：CESA B＋DF-a）。対照的に、DF-aを添加しない対照反応において、JOEまたはFAM蛍光の増大は観察されず（反応A（II）DF-aなしの対照）、開始DF-aの非存在下において、CESA AまたはCESA Bのどちらも形成されなかったことを示した。
【０５６２】
反応Bにおいて、DF-bの添加は、経時的なFAM蛍光の増大によって示されるように（反応B（v）FAM：CESA B＋DF-b）、RE Mnl Iに対する切断可能なCESA B二重鎖基質の形成をもたらした。それと同時に、同じRE Mnl Iに対する切断可能なCESA B二重鎖基質を形成する、CESA B切断からのDF-aの産生の指標である、経時的なJOE蛍光の増大もこの反応において観察された（反応B（vi）JOE：CESA A＋DF-b）。対照的に、DF-bを添加しない対照反応において、JOEまたはFAM蛍光の増大は観察されず（反応B（IV）DF-bなしの対照）、開始DF-bの非存在下において、CESA AまたはCESA Bのどちらも形成されなかったことを示した。
【０５６３】
PESA A（EAS1AおよびEAS2A）とEAS2B（この状況ではInFとして作用する）との間のハイブリダイゼーション、および／またはPESA B（EAS1BおよびEAS2B）とEAS2A（この状況ではInFとして作用する）との間のハイブリダイゼーションによって、さらなる切断不可能なEIC複合体が形成されることも期待されている。
【０５６４】
全般的に、DF-aの添加は、Mnl Iによるその切断をもたらすCESA Aを形成し得、それはa）JOE蛍光の増大、およびb）Mnl Iによるその切断をもたらす今度はCESA Bを形成し得る、EAS2Aオリゴヌクレオチドの切断によるDF-b断片の生成、および付随するc）FAM蛍光の増大、ならびにd）EAS2Bオリゴヌクレオチドの切断によるDF-a断片の生成をさらに引き起こすことが実験によって実証されている。さらに、反応BへのDF-bの添加は、Mnl Iによるその切断をもたらすCESA Bを形成し得、それはa）FAM蛍光の増大、およびb）Mnl Iによるその切断をもたらす今度はCESA Aを形成し得る、EAS2Bオリゴヌクレオチドの切断によるDF-a断片の生成、および付随するc）JOE蛍光の増大、ならびにd）EAS1Bオリゴヌクレオチドの切断によるDF-b断片の生成をさらに引き起こすことが実験によって実証されている。そのため、CESA AおよびCESA Bの両方とも、それらそれぞれのドライバー断片の添加によって形成され得、かつ各CESAの切断によって、他方のPESAを完成させ得るドライバー断片が生成され得る。
【０５６５】
実施例8
以下の実施例は、2種の異なるヘアピン型のCESA複合体（CESA AおよびCESA B）が、それらそれぞれのDFのいずれかによるこれらの複合体の完成後に、1本の反応チューブ内で単一の制限酵素によって切断される能力を実証する。本実施例において、PESA AおよびPESA Bを、5'から3'にEAS1、連結配列、およびEAS2を含有している単一のオリゴヌクレオチドから構成する。PESA AおよびPESA Bは、分子内ヘアピンを形成し得る。ストラテジーを図18のパネルAにおいて図解する。さらに、本実施例におけるヘアピン型のCESAを、各CESAの切断によって他方のCESAに対する新たなDFが生成されるように設計した。本実施例において、PESA AおよびPESA Bの両方は同じフルオロフォアで標識されており、そのため、結果として得られるCESAの切断によって生成される蛍光シグナルは相加的であると考えられる。
【０５６６】
8.1. オリゴヌクレオチド
以下の反応において、CESA AをPESA A（PESA_35）およびDF-a（D1F_3Sub1）から構成し、CESA BをPESA B（PESA_36）およびDF-b（DF-3PESA_35）から構成する。
【０５６７】
PESA A（PESA_35）はヘアピンを形成し得、かつそれは、DF-bの配列と同等である領域をその中に含有している。PESA B（PESA_36）もヘアピンを形成し得、かつそれは、DF-aの配列と同等である領域をその中に含有している。そのため、DF-aまたはDF-bのいずれかを添加して反応を開始し得、次いで、フィードバックカスケード反応の反応の間にCESA AまたはCESA Bの切断によって両方のDFがそれぞれ生成され得るように、本実験を設計した。
【０５６８】
本実施例において、RE活性を、二重標識した各PESAの切断に伴う蛍光の変化によって観測した。本実施例において、PESA A（PESA_35）を、Iowa Black FQ（「IAbFQ」）部分で末端標識し、フルオレセイン部分で（22の位置におけるTの塩基上で）内部標識し、PESA B（PESA_36）を、Iowa Black FQ（「IAbFQ」）部分で5'末端標識し、フルオレセイン部分で（21の位置におけるTの塩基上で）内部標識した。
【０５６９】
これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5'から3'に列挙されており、下線が引かれている塩基は、Mnl Iに対する認識配列（CCTCまたはGAGG）の少なくとも一部を形成し、かつイタリック体の塩基は、より長いオリゴヌクレオチドの状況で存在するDFと同等であるものを表す。内部フルオレセインの位置を太字で示す。5'末端の枠で囲まれた塩基はEAS1を示し、3'側の枠で囲まれた塩基はEAS2を示す。
2013542738.tif 000057
【０５７０】
8.2. 反応成分
オリゴヌクレオチドをintegrated DNA technologiesから購入した。すべての反応は、ヌクレアーゼを含まない水（Ambion）、1×NEBuffer 4、1×BSA、および0.75U Mnl I（すべてNew England Biolabs）のバルク混合物を含有していた。反応を25μLの最終容量に作製し、二つ組で実施した。
【０５７１】
反応（i）は、100nM PESA_35および10nM DF1を含有しており；反応（ii）は、100nM PESA_35を含有しており；反応（iii）は、100nM PESA_36および10nM DF-3PESA_35を含有しており；反応（iv）は、100nM PESA_36を含有しており；反応（v）は、100nM PESA_35、100nM PESA_36、および10nM DF1を含有しており；反応（vi）は、100nM PESA_35、100nM PESA_36、および10nM DF-3PESA_35を含有しており；反応（vii）は、100nM PESA_35および100nM PESA_36を含有しており；反応（viii）は、100nM PESA_35、100nM PESA_36、100nM DF1、および100nM DF-3PESA_35を含有していた。
【０５７２】
反応をCFX96（商標）Real-Time PCR Detection System（BioRad）において33℃で実施した。各反応に対する蛍光を、5秒後おきに60サイクル（スキャンモードFAM/SYBR；チャンネル1 FAM）、次いで25秒後おきに100サイクル（スキャンモードFAM/SYBR；チャンネル1 FAM）読み取った。総実行時間は65分間であった。同じ数、種類、および濃度のPESAを含有しているが開始DFを欠いている、それぞれの相当する反応のサイクル1に対して蛍光を正規化した。
【０５７３】
8.3. 結果：PESA_35およびPESA_36の切断の検出
反応（i）において、ヘアピンPESA Aと一緒のDF-aの添加は、経時的な蛍光の増大によって示されるように（図18B；反応（i））、RE Mnl Iに対する切断可能なCESA A二重鎖基質の形成をもたらした。対照的に、PESA AとともにはDF-aを添加しない反応（ii）において、経時的な蛍光の増大の欠如によって示されるように（図18B；反応（ii））、切断可能なCESA A二重鎖基質は形成されなかった。
【０５７４】
反応（iii）において、ヘアピンPESA Bと一緒のDF-bの添加は、経時的な蛍光の増大によって示されるように（図18B；反応（iii））、RE Mnl Iに対する切断可能なCESA B二重鎖基質の形成をもたらした。対照的に、PESA BとともにはDF-bを添加しない反応（iv）において、経時的な蛍光の増大の欠如によって示されるように（図18B；反応（iv））、切断可能なCESA B二重鎖基質は形成されなかった。
【０５７５】
反応（v）において、PESA AおよびPESA Bの両方を含有している混合物へのDF-aの添加は、反応（i）と比較して、経時的な蛍光の増大のほぼ倍増をもたらした（図18B；反応（v））。これはCESA A切断後のDF-bの放出の指標であり、次いでそれはPESA Bにハイブリダイズして、今度は切断されてより多くのDF-aの放出をもたらし得るCESA Bを形成する。反応（vi）において、PESA AおよびPESA Bの両方を含有している混合物へのDF-bの添加も、反応（iii）と比較して、経時的な蛍光の増大のほぼ倍増をもたらした（図18B；反応（vi））。これはCESA Bの切断後のDF-aの放出の指標であり、次いでそれはPESA Aにハイブリダイズして、今度は切断されてより多くのDF-bの放出をもたらし得るCESA Aを形成する。どちらのDFの添加もなく、PESA AおよびPESA Bの混合物を含有している対照の反応（vii）は、経時的な蛍光の増大を示さなかった（図18B；反応（vii））。このことは、いかなるDFも存在していない下では、PESA AとPESA Bとの間に切断可能なCESA構造体は形成され得ないことを示している。
【０５７６】
最後に、両方のPESAのすべてが利用可能なDFを有するように、DF-a、DF-b、PESA A、およびPESA Bが等濃度（それぞれ100nM）で混合されている陽性対照として、反応（viii）（図18B）を設計した。そのため、すべてのPESAは、CESAを形成しかつ切断されて、このシステムにおいて獲得され得る最大の蛍光の変化を産生するはずである。反応（viii）は、反応（v）および（vii）と比較して、より速い反応速度を呈したが、最終的な蛍光は、反応（v）および（vii）において観察されたものと同程度であった。このことは、10nMのDF-a（反応v）またはDF-b（反応vii）のいずれかが、CESA Bが切断された場合にはより多くのDF-aの生成によって、CESA Aが切断された場合にはより多くのDF-bの生成によって推進される、それぞれ100nMのCESA AおよびCESA Bの切断を究極的にもたらすカスケード反応を開始し得るという付加的証拠を提供している。このことは、PESA AおよびPESA BとともにDF-aまたはDF-bのいずれかを含むことで反応を開始させることは、反応が観察された時間枠内でPESA AおよびPESA Bオリゴヌクレオチドの両方の十分な切断をもたらすことを示している。
【０５７７】
要約すると、実験によって、以下のことが実証されている：
（a）DF（DF-aまたはDF-b）のその適合するヘアピンPESA（それぞれ、PESA AまたはPESA B）への添加は、RE Mnl Iに対する切断可能なCESA AまたはCESA B二重鎖基質を形成し得、蛍光の増大をもたらす。
（b）PESA AおよびPESA Bの混合物へのDF-aの添加は、CESA Aの形成およびそれに続く切断をもたらし、それは、PESA Bとハイブリダイズして、今度は、切断されかつDF-aを放出するCESA Bを形成し得るDF-bを生成する。同様に、PESA AおよびPESA Bの混合物へのDF-bの添加は、CESA Bの形成およびそれに続く切断をもたらし、それは、PESA Aとハイブリダイズして、今度は、切断されかつDF-bを放出するCESA Aを形成し得るDF-aを生成する。このフィードバックは、PESA AおよびPESA Bのすべてが切断されるまで起こり続ける。
【０５７８】
この増幅カスケードを用いてシグナルを増幅することができ、標的特異的な様式でDFが生成され得るという条件で、任意の標的の検出が可能となる。ヘアピンPESAの特定の配列を変更して、本実施例におけるDFの1種、または新たなPESAに相補的である異なるDFによって活性化され得るさらなるPESAを生成することができる。
【０５７９】
実施例9
以下の実施例は、DF配列がMNAザイム基質配列の一部でないストラテジーを用いた、MNAザイムによって開始されるEzyAmp反応を実証する。本実施例において実証されるストラテジーを図19Aにおいて図解する。本実施例において、基質配列の側面には、DFに相補的な配列およびDF伸長に相補的な配列が位置した。基質自体の配列はこれらのいかなる領域とも相補的でなく、そのため、オリゴを含有している基質がDFに結合した場合に、一本鎖の基質ループが生成された。十分な基質の結合によって、DFはブロックされ、それはPESAとハイブリダイズできなくなった。特異的標的の存在下で形成されるMNAザイムによってループ型基質が切断された場合に、DFのみがこの複合体から放出されるようにシステムを設計した。基質ループのMNAザイム切断によって、DFが放出され、EzyAmpシグナル増幅反応が開始する。
【０５８０】
9.1. EzyAmpオリゴヌクレオチド
このEzyAmp反応に対して、2種の異なるPESA複合体（PESA AおよびPESA B）が1つの反応内に存在した。PESA AとDF-a（DF-3EAS2_11(22)）とのハイブリダイゼーションはCESA Aの形成をもたらし、一方で、PESA BとDF-bとのハイブリダイゼーションはCESA Bの形成をもたらす。PESA AをEAS1A（EAS1_12）およびEAS2A（EAS2_13）から構成し、PESA BをEAS1B（EAS1_10）およびEAS2B（EAS2_11）から構成する。PESA AのEAS2Aは、DF-bの配列と同等である領域をその中に含有している。PESA BのEAS2Bは、DF-aの配列と同等である領域をその中に含有している。そのため、反応の間に、基質−ブロッカーの切断によって、またはCESA BもしくはCESA Aの切断によって、DF-aまたはDF-bのいずれかがそれぞれ生成され得るように、本実験を設計した。プロセスの概略図を図19のパネルAにおいて図解する。
【０５８１】
RE活性を、オリゴが切断された際のフルオロフォアとクエンチャーの分離に相当する蛍光の変化によって観測した。本実施例において、EAS1Aを5'末端において6-フルオレセイン（「6-FAM」）部分で末端標識し、EAS2Aを3'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）部分で末端標識した。EAS1AおよびEAS2Aは、互いにアニールしてPESA Aを形成した。EAS1Bを、5'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）部分で、3'末端において6-フルオレセイン（「6-FAM」）部分で末端標識した。EAS2Bを3'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）部分で標識した。EAS1BおよびEAS2Bは、互いにアニールしてPESA Bを形成した。
【０５８２】
これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5'から3'に列挙されており、下線が引かれている塩基は、Mnl Iに対する認識配列（CCTCまたはGAGG）の少なくとも一部を形成し、かつイタリック体の太字の塩基は、より長いオリゴヌクレオチドの状況で存在するDFまたはそのより短いバーションと同等であるものを表す。
2013542738.tif 000058
【０５８３】
9.2. パートザイムオリゴヌクレオチドおよび組織化助長因子
合成標的、すなわち組織化助長因子AF-RO5の存在下で触媒活性MNAザイムが形成されるように、パートザイムを設計した。組織化助長因子、パートザイムA（RO5A4/3(8)）、およびパートザイムB（RO5B5/3(7)）の配列は、以下に5'から3'に列挙されており、下線が引かれている塩基は、組織化したMNAザイムの活性触媒コアの少なくとも一部を形成し、太字の塩基は標的とハイブリダイズし、かつイタリック体の塩基はMNAザイム基質にハイブリダイズする。
2013542738.tif 000059
【０５８４】
9.3. MNAザイム基質−ブロッカー
MNAザイム基質配列は、10:23 DNAザイムに由来するMNAザイムに対する基質として以前に用いられている配列の伸長をなすオリゴ内に、RNAおよびDNA塩基の両方を含有しているキメラ配列であった。本実施例において、レポーターMNAザイム基質をSub3(8:7)と命名し、その側面には、DF-aに相補的な配列およびDF伸長に相補的な配列が位置した。MNAザイム基質自体の配列はこれらのいかなる領域とも相補的でなく、そのため、それがDFに結合した場合に、一本鎖の基質ループが生成された。基質−ブロッカーの配列は、5'から3'方向に以下のとおりである。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表し、太字の塩基はパートザイムとハイブリダイズし、かつ下線が引かれている塩基はDF-aに結合する。
2013542738.tif 000060
【０５８５】
9.4. 反応成分
標的の存在下における切断可能なCESAの形成を、蛍光の増大を検出することによって測定した。試験反応を100nMの標的組織化助長因子AF-RO5の添加によって開始し、対照反応をH2Oの添加によって開始した。25μLの総反応容量を有するすべての反応を、CFX96（商標）Real-Time PCR Detection System（BioRad）において35℃で行った。各サンプルに対する蛍光を、チャンネル1（FAM）において1分後おきに100サイクル読み取るようにプログラムした（スキャンモード：FAM/SYBRのみ）。総実行時間は115分間であった。すべての反応は、15mM MgCl2（Ambion）中に200nMパートザイムA（RO5A4/3(8)）、200nMパートザイムB（RO5B5/3(7)）、200nMの基質−ブロッカー（14Sub3(8:7)_16)(21)Inh(D2F-3EAS2_11)；それぞれ100nMのDF-3ESA1_11(22)、EAS1_10、EAS2_11、EAS1_12、およびEAS2_13のバルク混合物、1×BSA（New England Biolabs）、1×NEBuffer 4（New England Biolabs）、ヌクレアーゼを含まない水（Ambion）、ならびに0.75U Mnl I（New England Biolabs）を含有していた。すべての反応を二つ組で実施した。すべてのオリゴヌクレオチドをIntegrated DNA Technologies（IDT）から購入した。
【０５８６】
9.5. 結果：CESA AおよびCESA Bの切断の検出
標的が存在する試験反応において、蛍光の指数関数的な増大が観察された（図19のパネルB；標的）。このことは、標的組織化助長因子によって、パートザイムA およびBが、MNAザイム基質を切断する触媒活性MNAザイムに組織化したことを示している。基質の切断は、DF-aに接着した断片の解離につながり、ゆえにDF-aが、それに続くEzyAmpカスケード反応（PESA AおよびPESA Bから構成される）を開始するのを可能にする。この反応は、放出されたDF-aがPESA A（EAS1AおよびEAS1Bによって形成される）に結合して、Mnl Iによって次いで切断されるCESA Aを形成した場合に始動した。これは、今度はDF-bを放出し、フルオロフォアとクエンチャー部分の分離に相当する、付随した蛍光の増大も生成した。DF-bは、次いでPESA B（EAS1BおよびEAS2Bによって形成される）に結合して、Mnl Iによるその切断を可能にするCESA Bを形成する。これは、より多くのDF-aを放出して他のCESA AとCESA Bとの間のフィードバックカスケードを完成させ、かつフルオロフォアとクエンチャー部分の分離に相当する、付随した蛍光の増大も生成した。
【０５８７】
標的組織化助長因子を添加しない「標的なしの対照」反応において、80分後に、FAMシグナルの指数関数的な増大は観察されず、低レベルの蛍光のドリフトのみが観察された（図19のパネルB；標的なしの対照）。このことは、基質のMNAザイム切断を開始してDF-aを放出し、それに続くEzyAmp反応を開始するためには、標的の存在が必要とされることを示している。
【０５８８】
結果は、EzyAmp反応を、DFの配列がMNAザイム基質配列の一部である必要はない標的依存的MNAザイム切断工程によって開始されるように設計することができることを実証している。この反応において、PESA AとEAS2Bとの間のハイブリダイゼーション、およびPESA BとEAS1Aとの間のハイブリダイゼーションによって、その切断されていない状態でInFとして機能するEIC複合体が形成されることも期待されている。
【０５８９】
実施例10
以下の実施例は、完全制限部位を含有している2種の部分的相補的オリゴヌクレオチドを切断し得る、制限酵素の能力を実証する。
【０５９０】
10.1. オリゴヌクレオチド
以下の反応において、オリゴヌクレオチド1（EAS1_1）およびオリゴヌクレオチド2（ASC-RE5F2(22)-FB）は2つの向きで潜在的にハイブリダイズし得、その両方が、Mnl Iに対する完全認識部位を含有している部分的相補的二重鎖をもたらすと考えられるが、しかしながら、両方の二重鎖は認識部位と切断部位との間にいくつかの不対塩基を有すると考えられる。
【０５９１】
RE Mnl Iが部分的に相補的でない二重鎖を切断する潜在力を、二重標識した断片の切断後のフルオロフォアとクエンチャー部分の分離による蛍光の変化を観測することによって検討した。オリゴヌクレオチド1を、5'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）部分で、その3'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）部分で末端標識した。オリゴヌクレオチド2を、5'末端において6-フルオレセイン（「6-FAM」）部分で、3'末端においてBlack Holeクエンチャー（「BHQ_1」）部分で末端標識した。オリゴヌクレオチドの配列は、以下に5'から3'に列挙されており、下線が引かれている塩基は、Mnl Iに対する認識配列（CCTCまたはGAGG）の一方の鎖を形成する。
2013542738.tif 000061
【０５９２】
10.2. 反応成分
すべての反応は二つ組で実施され、（i）100nMのオリゴヌクレオチド1または（ii）H2Oの添加とともに、ヌクレアーゼを含まない水（Ambion）中に100nMのオリゴヌクレオチド2および2UのMnl I、1×BSA（New England Biolabs）、ならびに1×NEBuffer 4（New England Biolabs）を含有していた。蛍光シグナルをチャンネル1（FAM）において測定した。25μLの総反応容量を有する反応を、CFX96（商標）Real-Time PCR Detection System（BioRad）において35℃で行った。各サンプルに対する蛍光を、8秒後おきに100サイクル読み取るようにプログラムした（スキャンモード：FAM/SYBRのみ）。総実行時間は40分間であった。
【０５９３】
10.3. 結果：オリゴヌクレオチド1および2の切断の検出
反応（i）において、オリゴヌクレオチド1および2の両方の存在は、オリゴヌクレオチド2におけるクエンチャーからフルオロフォアを分離するMnl I切断の指標である蛍光の増大をもたらした。対照的に、オリゴヌクレオチド1の非存在下において（反応（ii））、増大する蛍光は観察されず、オリゴヌクレオチド2の切断はオリゴヌクレオチド1との部分的二重鎖の形成に依存していること、およびMnl Iの存在下におけるシグナルは一本鎖のオリゴヌクレオチド2の切断によるものではないことを示した。
【０５９４】
結果は、Mnl I等のあるREは、完全な二本鎖の認識配列を含有し得るが、認識部位および切断部位を網羅する領域全体にわたって十分に相補的ではない、部分的相補的二重鎖を切断することができることを実証している。この観察結果によって、認識部位と切断部位との間の介在配列にミスマッチを含む1種または複数種のオリゴヌクレオチドからなるPESA複合体を設計するための新たな手段が提供され、ゆえにDFとして機能し得る切断断片の解離の温度および速度の操作が可能となる。
【０５９５】
実施例11
以下の実施例は、1つの反応内で並行して起こる以下の工程：工程（i）MNAザイムが標的の存在下で形成され、MNAザイム基質を切断して第1のDFを生成する；工程（ii）このDFがPESAにハイブリダイズしてCESAを生成し、それがREによって切断された場合に別のDFを生成し、かつフルオロフォアとクエンチャーの分離を付随して引き起こし、蛍光シグナルの生成をもたらす；工程（iv）第1のCESAの切断によって生成されたDFが、第2のPESAにハイブリダイズして第2のCESAを生成し、それがREによって切断された場合に蛍光シグナルを生成し、かつ第1のDFと同じ機能を果たし得るDFを放出する；工程（v）工程（iv）および（v）が繰り返されるフィードバックループが生成される；を用いた、種々の濃度における特異的標的の検出および定量化を例証する。ヌクレアーゼ切断がシグナル増幅をもたらす反応を、EzyAmp反応と称する。本実施例において、EzyAmp反応を、1本の反応チューブ内で単一のREによって切断される2種の異なるCESA複合体（CESA AおよびCESA B）から構成する。本実施例において、両方のPESA複合体は同じフルオロフォアで標識され、そのため、結果として得られるCESA AおよびCESA Bの切断によって生成されるシグナルは相加的である。
【０５９６】
11.1. EzyAmpオリゴヌクレオチド
このEzyAmp反応に対して、2種の異なるCESA複合体（CESA AおよびCESA B）が1つの反応内に存在する。CESA AをPESA AおよびDF-aから構成し、一方で、CESA BをPESA BおよびDF-bから構成する。今度は、PESA AをEAS1A（EAS1_10）およびEAS2A（EAS2_11）から構成し、PESA BをEAS1B（EAS1_12）およびEAS2B（EAS2_13）から構成する。PESA AのEAS2Aは、DF-bの配列と機能的に同等である領域をその中に含有している。PESA BのEAS2Bは、DF-aの配列と機能的に同等である領域をその中に含有している。そのため、標的の存在下において反応の開始時にDF-aが生成され得、次いで、反応の間にCESA BまたはCESA Aの切断によって各DFがそれぞれ生成され得るように、本実験を設計した。フィードバックし得るCESA複合体のプロセスの例示的な概略図を図17A、図18A、図19A、および図27Aにおいて図解する。
【０５９７】
RE活性を、フルオロフォアとクエンチャーの分離に相当する蛍光の変化によって観測した。本実施例において、EAS1Aを、5'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）部分で、3'末端において6-フルオレセイン（「6-FAM」）部分で末端標識した。EAS2Aも、5'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）部分によって標識されており、EAS1Aとアニールする。EAS1Bは、5'末端において6-フルオレセイン（「6-FAM」）部分で末端標識されており、一方で、EAS2Bは、3'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）部分によって標識されており、EAS1Aとアニールする。
【０５９８】
これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5'から3'に列挙されており、下線が引かれている塩基は、Mnl Iに対する認識配列（CCTCまたはGAGG）の少なくとも一部を形成し、かつイタリック体の塩基は、より長いオリゴヌクレオチドの状況で存在するDFと同等であるものを表す。
2013542738.tif 000062
【０５９９】
11.2. パートザイムオリゴヌクレオチドおよび標的組織化助長因子
DF-aを生成するために、合成標的、すなわち標的組織化助長因子AF-TL5の存在下で形成する触媒活性MNAザイムによって切断されるように、基質（Sub1i-FIB）を設計した。標的組織化助長因子、パートザイムA（TL5A2(12)/1）、およびパートザイムB（TL5B5(12)/1）の配列は、以下に5'から3'に列挙されており、下線が引かれている塩基は、組織化したMNAザイムの活性触媒コアの少なくとも一部を形成し、太字の塩基は標的とハイブリダイズし、かつイタリック体の塩基はMNAザイム基質にハイブリダイズする。
2013542738.tif 000063
【０６００】
11.3. MNAザイム基質
MNAザイム活性を、二重標識したレポーターMNAザイム基質の切断によって観測する。MNAザイム基質配列は、8:17 DNAザイム基質として以前に用いられている（Li et al., 2000）、RNAおよびDNA塩基の両方を含有しているキメラ配列である。本実施例において、レポーターMNAザイム基質をSub1i-FIBと命名し、3'末端において内部フルオレセインdT（「iFluorT」）部分およびIowa Black FQ（「IAbFQ」）部分で標識した。Sub1i-FIBの標識配列は、5'から3'に以下のとおりであり、小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。イタリック体の塩基は、より長いオリゴヌクレオチドの状況で存在するDFとして作用するものを表す。
【０６０１】
基質、Sub1i-FIB；
2013542738.tif 000064
【０６０２】
11.4. 反応成分
触媒活性MNAザイムによるMNAザイム基質の切断を、蛍光の増大によって測定した（MNAザイム基質切断およびCESA切断の両方は、同じチャンネルにおいて検出されるフルオロフォアを放出するため、この蛍光をEASオリゴの切断によって生成される蛍光と区別することはできなかったが）。CESA AがEAS1_10、EAS2_11、およびDF-1aのハイブリダイゼーションによって形成され、CESA BがEAS_12、EAS2_13、およびDF-bによって形成されるように、オリゴを設計した。蛍光標識したCESA成分であるEAS1_10およびEAS1_12の切断も、蛍光の増大によって測定した。二重試験反応を、（i）1nM、（ii）800pM、（iii）600pM、（iv）400pM、（v）200nM、（vi）100nM、または（vii）50nMの濃度の標的組織化助長因子AF-TL5の添加によって開始した。「標的なしの対照」（NTC）二重反応を、H2Oの添加によって開始した。25μLの総反応容量を有するすべての反応を、CFX96（商標）Real-Time PCR Detection System（BioRad）において35℃で行った。各サンプルに対する蛍光を、チャンネル1（FAM）において1分後おきに110サイクル読み取るようにプログラムした（スキャンモード：FAM/SYBRのみ）。総実行時間は120分間であった。すべての反応は、10mM MgCl2（Ambion）中に0.75U Mnl Iとともに300nMパートザイムA（TL5A2(12)/1）、150nMパートザイムB（TL5B3(12)/1）、および30nM Sub1i-FIB；それぞれ100nMのEAS1_10、EAS2_11、EAS1_12、およびEAS2_13のバルク混合物、1×BSA（New England Biolabs）、ヌクレアーゼを含まない水（Ambion）、ならびにKOHを用いてpH8.3に調整されている1×NEBuffer 1（New England Biolabs）を含有していた。すべてのオリゴヌクレオチドをIntegrated DNA Technologies（IDT）から購入した。標的濃度の対数値に対して、反応に添加された標的の濃度のCt値から検量線をプロットした。Ct値とは、所定量の標的が閾値蛍光に相当するシグナルを生成するのにかかる時間の量である（1サイクルは、およそ1分間に等しい）。蛍光の増大の対数期の始動時に閾値を設定した。
【０６０３】
11.5. 結果：標的核酸の検出および定量化
図21Aおよび21Bは、試験反応（i）〜（vii）に添加された標的の量に相当する種々の時点において始動する、増大する蛍光シグナル（対数および線形プロット）を示している。標的の量によって、EzyAmp反応においてシグナルを生成するのに必要とされる時間が決定した。存在する標的が少ないほど、EzyAmpフィードバック反応を始動するDF-aを産生するのに時間がより長くかかっており、ゆえに閾値蛍光に到達するのにかかる時間がより長くなる。標的を添加しない対照反応では（（viii）NTC）、増大するシグナルは120分後に観察されず、DF産生およびそれに続くEzyAmpシグナル増幅には、触媒活性MNAザイムの標的依存的形成が必要とされることを示唆している。さらなるより低濃度の標的も解析しており（データ示さず）、鋳型なしの対照のシグナルを上回って、わずか1pMを検出可能であった。これは、25μLの反応物において、およそ25aモルまたは107コピーの標的核酸配列に相当する。
【０６０４】
図21Cは、試験された標的濃度の範囲内で線形の検量線を産生することができるという観察結果による、アッセイの定量能を示している。DF産生は制限酵素切断事象ごとに倍増し、経時的なシグナルの指数関数的な増大をもたらす。この指数関数的な増大によって、PCR指数関数的サイクル閾値法（14.4. 反応成分において記載される）を用いて、0.99の回帰値を有する線形曲線においてCtと標的濃度との間の関係を示すことが可能となる。これらの結果は、標的配列の高感度かつ定量的な検出を可能にするEzyAmpの能力を実証している。
【０６０５】
実施例12
本実施例は、仮説に基づくものであり、シグナル増幅カスケードを開始および仲介し得るエキソヌクレーゼIII（ExoIII）のヌクレアーゼ能を利用したストラテジーを提供する（図23）。この酵素は、DNA二重鎖の3'末端からヌクレオチドを除去する。それは、平滑のまたは陥凹した3'末端上で活性を有するが、5個またはそれより多いヌクレオチドを含む一本鎖DNA上では活性を有さず、ゆえに少なくとも5個のヌクレオチドまたはそれより長いヌクレオチドを有する3'突出末端を切断しない。それは、二重鎖DNAにおけるニックからの加水分解を始動して、一本鎖のギャップを産生することもできる。オリゴ内のホスホロチオエートヌクレオチドの存在によって、エキソヌクレアーゼ活性はブロックされる。
【０６０６】
この方法には、1つのまたは分離した反応チャンバー内に存在し得るが同じヌクレアーゼExoIIIを利用する、開始工程およびシグナル増幅工程が含まれる。
【０６０７】
12.1. 開始工程：標的依存的な様式でのドライバー断片の生成
合成イニシエーターオリゴ（SIO）のみが標的核酸の存在下で加水分解される、ExoIIIに対する基質として、SIOを設計することができる（図23）。SIOは、特異的標的の検出を可能にする、標的に相補的である約20個のヌクレオチドをその3'末端において有してよい。SIOは、標的に相補的でないDFの配列を5'末端において含有していてもよい。最後に、SIOは、標的結合部分とDF部分との接合部において1個または複数個のホスホロチオエート化（phosphorothiolated）ヌクレオチドを含有していてよく、それはフルオロフォアおよびクエンチャーで二重標識されてよい。いくつかの態様において、SIOはヘアピン構造を有し得る。
【０６０８】
反応における工程を図23において図解する。SIOが標的に結合すると（工程1）、SIOのDF部分は一本鎖の5'突出を形成し、一方で、SIOの標的結合領域は、SIOが、ExoIIIに対する適切な基質として働き得る3'陥凹末端を有する二重鎖を形成する。ExoIIIは、次いでホスホロチオエート化ヌクレオチドの位置に対して後部にあるSIOを加水分解し得、ゆえにSIOのDF部分を放出する（工程2）。付随して、加水分解はフルオロフォアとクエンチャーの分離をもたらし、それは蛍光の増大を引き起こす。標的は、無傷のままであり、かつ遊離して再利用されてさらなるSIOに結合する（工程3）。
【０６０９】
12.2. シグナル増幅工程：CESA複合体の形成および切断
シグナル増幅工程は、EzyAmp反応の他の変形型にあるような類似した断片、すなわち相補的オリゴヌクレオチドEAS1およびEAS2を含有している。EAS1を、フルオロフォアおよびクエンチャーで標識することができる。互いに結合すると、EAS1およびEAS2は、各末端に少なくとも5個のヌクレオチドの3'突出を有するPESAを形成して、DFの非存在下においてExoIII分解を阻止することができる。EAS1は、DFに対する結合部位として働き得るより長い突出を有してよい。DFの5'末端における配列は、EAS1に相補的であるものを超えて伸長し得、そのため、DF結合によって、EAS1上に3'陥凹末端を有するCESA複合体が生成される。
【０６１０】
開始工程において、標的の存在下においてDFがSIOから放出された場合、それは、次いで遊離してPESAに結合し、かつExoIIIに対する基質として働き得るCESAを生成する。DFの3'末端におけるホスホロチオエート化塩基の存在によって、DFがPESAに結合した場合に生成されるニックからのヌクレアーゼ分解が阻止される。しかしながら、CESAのEAS1鎖の3'陥凹末端はExoIIIによって加水分解され（工程5）、これはフルオロフォアとクエンチャーの分離による蛍光の増大をもたらす。加えて、DFは、無傷で放出され、かつ遊離して再利用され（工程6）、別のPESAに結合して別のCESAを生成する。このストラテジーにおいて、開始工程および増幅工程の両方は、感度を増大させるためのシグナル増幅を、標的およびDFの再利用に頼る。
【０６１１】
上記スキームの多くの変異型が、当業者によって考案され得る。上述のように、PESAは、分離したEAS1およびEAS2オリゴから形成されてよく、またはEAS1およびEAS2をリンカー配列によって接続して、ヘアピン構造を有するPESAを生成してよい。各工程を、1つのチャンバー内または分離したチャンバー内で行ってよい。さらに、フルオロフォアおよびクエンチャー標識の位置については柔軟性がある。
【０６１２】
それでも、この提案されたストラテジーは、EzyAmp反応の基本的工程、すなわち（i）標的依存的な様式で、オリゴヌクレオチド（例えば、SIO）をDFに変換する工程；（ii）それ自体はヌクレアーゼに対する基質でないPESAを提供する工程；（iii）DFをPESAにハイブリダイズさせて、CESAを生成する工程；および（iv）CESAをヌクレアーゼで加水分解して検出可能なシグナルを生成し、加えてDFを放出し、それによって、それはより多くのPESAをCESA複合体に変換し得る工程、に従う。
【０６１３】
実施例13
以下の実施例は、2種の異なるDFの存在下において2種の独立したCESAの形成を同時に観測し得るような、EzyAmpシステムを多重化する能力を実証する。本実施例において、2種の異なるPESA複合体（PESA AおよびPESA B）を2種の異なるフルオロフォアで標識し、それによって、それらを独立して観測することができた。PESA Aは、DF-aの存在下でのみCESA Aを形成し、PESA Bは、DF-bの存在下でのみCESA Bを形成する。十分に組織化したCESA AおよびCESA B複合体の形成は、RE Mnl Iに対するRERSの完成につながる。
【０６１４】
13.1.オリゴヌクレオチド
以下の反応において、CESA AをPESA AおよびDF-aから構成し、一方で、CESA BをPESA BおよびDF-bから構成する。今度は、PESA AをEAS1AおよびEAS2Aから構成し、PESA BをEAS1BおよびEAS2Bから構成する。DF-aのみがPESA Aに結合してCESA Aを形成し得、かつDF-bのみがPESA Bに結合してCESA Aを形成し得るように、本実験を設計した。
【０６１５】
RE活性を、フルオロフォアとクエンチャー部分の分離に相当する蛍光の変化によって観測する。本実施例において、EAS1A（RE1F1(20T)(20)-BJ）を、5'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）で、3'末端においてJOEで末端標識した。EAS1AとアニールするEAS2A（RE1S1(1A)(13)-5-B）も、5'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）で標識した。EAS2B（ESA33）を、5'末端において6-フルオレセイン（「FAM」）で末端標識し、EAS2BとアニールするEAS1B（ESA34_2）を、3'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）で標識した。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5'から3'に列挙されており、下線が引かれている塩基は、Mnl Iに対する認識配列（CCTCまたはGAGG）の少なくとも一部を形成する。
2013542738.tif 000065
【０６１６】
13.2. 反応条件
オリゴヌクレオチドをIntegrated DNA Technologies（IDT）から購入した。すべての反応は、15mM MgCl2（Ambion）中にそれぞれ100nMのEAS1A（RE1F1(20T)(20)-BJ）、EAS2A（RE1F1(20T)(20)-BJ）、EAS1B（ESA34_2）、およびEAS2B（ESA33）のバルク混合物、1×BSA（New England Biolabs）、ヌクレアーゼを含まない水（Ambion）、1×NEBuffer 4（New England Biolabs）、ならびに2U Mnl Iを含有していた。25μLの総反応容量で、反応をDF-a（DF1-(10)）および／またはDF-b（D2F-3ESA31(22)）の添加によって開始し、一方で、対照反応を水の添加によって開始した。各反応に用いられたDF-aおよび／またはDF-bの濃度を表14に提供する。チャンネル1（FAMを観測する）およびチャンネル2（JOEを観測する）の両方において、蛍光シグナルを同時に測定した。反応をCFX96（商標）Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad）において35℃で行った。各サンプルに対する蛍光を、1秒後おきに100サイクル読み取るようにプログラムした（スキャンモード：全チャンネル）。総実行時間は29分間であった。
【０６１７】
（表１４）
2013542738.tif 000066
【０６１８】
13.3. 結果：切断の検出
図25において、各反応に対するJOEおよびFAMの両方に対する蛍光シグナルを、時間に対してプロットしている。DF-aの添加は、経時的なJOE蛍光の増大をもたらした。増大するJOEシグナルは、DF-aがPESA Aを完成させてCESA Aになり、次いでそれがMnl Iによって切断されたことの指標である。今度は、切断されたEAS1AおよびEAS2Aのオリゴ断片の解離は、JOEフルオロフォアとクエンチャーの分離につながる。反応（i）〜（v）において観察されるように（図25）、JOE蛍光シグナルの増大の速度は、各反応内に存在するDF-aの割合が低下するにつれて減少した。
【０６１９】
DF-bの添加は、経時的なFAM蛍光の増大をもたらした。増大するFAMシグナルは、DF-bがPESA Bを完成させてCESA Bになることの指標である。Mnl IによるCESA Bの切断は、切断されたEAS1BおよびEAS2Bのオリゴ断片の解離を引き起こし、FAMフルオロフォアとそのクエンチャーの分離につながった。反応（i）〜（v）において観察されるように（図25）、蛍光FAMシグナルの増大の速度は、各反応に添加されたDF-bの割合が低下するにつれて減少した。
【０６２０】
DF-aまたはDF-bのどちらも添加しない対照反応において、FAMまたはJOE蛍光のどちらの増大も観察されず、二重化EzyAmp反応が1種または複数種のDFの存在に特異的であることを実証した。
【０６２１】
DF-aのみが存在する反応（i）において、蛍光の増大は、JOEに対してのみ観察され、FAMに対しては観察されず、DF-aがCESA Aの形成に特異的であることを示した。同様に、DF-bのみが存在する反応（v）において、蛍光の増大は、FAMに対してのみ観察され、JOEに対しては観察されず、DF-bがCESA Bの形成に特異的であることを示した。DF-aプラスDF-bの総量中に存在するDF-aの割合が（i）100％から（ii）90％に、（iii）50％に、（v）10％に変化するにつれて、相当するJOE蛍光の減少が観察された（図25）。同様に、DF-aプラスDF-bの総量中に存在するDF-bの割合が（v）100％から（iv）90％に、（iii）50％に、（ii）10％に変化するにつれて、相当するJOE蛍光の減少が観察された。
【０６２２】
多重化EzyAmpシステムのための例示的なストラテジーを図13において図解する。本実験は、1つの多重化EzyAmp反応において1種より多くの標的を多重検出する潜在力を実証している。例えば、DF-aは、標的Aの存在下でのみ標的特異的な様式で生成され得（第1のMNAザイムによる第1のMNAザイム基質の切断によって）、DF-bは、標的Bの存在下でのみ標的特異的な様式で生成され得る（第2のMNAザイムによる第2のMNAザイム基質の切断によって）。本実施例において実証されたEzyAmpシステムを用いてDF-aおよび／またはDF-bの存在が検出された場合、JOEの増大は標的Aの存在を示し、FAMの増大は標的Bの存在を示す。JOEまたはFAMのどちらも増大しないことは、どちらの標的も存在しないことを示し、JOEおよびFAMの増大は、両方の標的の存在を示す。
【０６２３】
実施例14
以下の実施例は、DF配列がMNAザイムによって基質として認識される配列の一部でないが、それでもそれが同じ分子内に含有されているストラテジーを用いた、MNAザイムによって開始されるEzyAmp反応を実証する（図24D）。本実施例において、基質およびDFは、基質−ブロッカー−DFオリゴと称される長いヘアピン型分子の一部である。ヘアピン内の一本鎖ループは、MNAザイムによって基質として認識される配列を含有している。このヘアピンのステムは、相補的なブロッカー配列にハイブリダイズし得るDF-aの配列を含有している。この立体構造において、DFはPESAとハイブリダイゼーションすることができない。標的の存在下で形成されるMNAザイムによってMNAザイム基質ループが切断された場合に、DFのみが放出されるようにシステムを設計した。MNAザイムによって開始されるDFの放出によって、EzyAmpシグナル増幅反応が開始する。
【０６２４】
14.1. EzyAmpオリゴヌクレオチド
このEzyAmp反応に対して、2種の異なるPESA複合体（PESA AおよびPESA B）が1つの反応内に存在した。PESA AとDF-aとのハイブリダイゼーションはCESA Aの形成をもたらし、一方で、PESA BとDF-bとのハイブリダイゼーションはCESA Bの形成をもたらす。PESA AをEAS1A（EAS1_12）およびEAS2A（EAS2_13）から構成し、PESA BをEAS1B（EAS1_10）およびEAS2B（EAS2_11）から構成する。PESA AのEAS2Aは、DF-bの配列と同等である領域をその中に含有している。PESA BのEAS2Bは、DF-aの配列と同等である領域をその中に含有している。そのため、基質−ブロッカー−DFヘアピンオリゴのMNAザイム切断によって、開始DF-aが標的依存的な様式で生成され得るように、本実験を設計した。その後、EzyAmpカスケード反応の間に、DF-aおよびDF-bは、CESA BまたはCESA Aの切断によってそれぞれ生成され得る。類似した例示的なカスケード反応が図19Aにおいて図解されているが、開始工程は図24Dにおいて図解されている（図19Aにおける開始構造体に類似している、図24Cにおいて図解される工程と対立するものとして）。
【０６２５】
RE活性を、オリゴが切断された際のフルオロフォアとクエンチャーの分離に相当する蛍光の変化によって観測した。本実施例において、EAS1Aを5'末端において6-フルオレセイン（「6-FAM」）部分で末端標識し、EAS2Aを3'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）部分で末端標識した。EAS1AおよびEAS2Aは、互いにアニールしてPESA Aを形成した。EAS1Bを、5'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）部分で、3'末端において6-フルオレセイン（「6-FAM」）部分で末端標識した。EAS2Bを3'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）部分で標識した。EAS1BおよびEAS2Bは、互いにアニールしてPESA Bを形成した。
【０６２６】
これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5'から3'に列挙されており、下線が引かれている塩基は、Mnl Iに対する認識配列（CCTCまたはGAGG）の少なくとも一部を形成し、かつイタリック体の太字の塩基は、より長いオリゴヌクレオチドの状況で存在するDFまたはそのより短いバーションと同等であるものを表す。
2013542738.tif 000067
【０６２７】
14.2. パートザイムオリゴヌクレオチドおよび標的組織化助長因子
合成標的、すなわち組織化助長因子AF-RO5の存在下で触媒活性MNAザイムが形成するように、パートザイムを設計した。組織化助長因子、パートザイムA（RO5A4/3(8)）、およびパートザイムB（RO5B5/3(7)）の配列は、以下に5'から3'に列挙されており、下線が引かれている塩基は、組織化したMNAザイムの活性触媒コアの少なくとも一部を形成し、太字の塩基は標的とハイブリダイズし、かつイタリック体の塩基はMNAザイム基質にハイブリダイズする。
2013542738.tif 000068
【０６２８】
14.3. MNAザイム基質−ブロッカー−DF
MNAザイム基質配列は、10:23 DNAザイムに由来するMNAザイムに対する基質として以前に用いられている配列の伸長をなすオリゴ内に、RNAおよびDNA塩基の両方を含有しているキメラ配列である。基質は、配列がオリゴの配列のいかなる部分とも相補的でないため、ヘアピン型の基質−ブロッカー−DF分子のステムから外側にループを作る。ステムは、DF-aの配列も含有している。このヘアピン分子の中央にある（基質でない）ループは、相補的でないdT塩基の伸張から構成される。ヘアピン型の基質−ブロッカー−DFオリゴの配列は、5'から3'方向に以下に付されている。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表し、太字の塩基はパートザイムとハイブリダイズし、下線が引かれている塩基は、DF-aの配列（太字のイタリック体）も含むステムを形成し、かつイタリック体の塩基Tの伸張はヘアピンの中央ループを形成する。
2013542738.tif 000069
【０６２９】
14.4. 反応成分
標的の存在下における切断可能なCESAの形成を、蛍光を観測することによって測定した。試験反応を100nMの標的組織化助長因子AF-RO5の添加によって開始し、対照反応をH2Oの添加によって開始した。25μLの総反応容量を有するすべての反応を、CFX96（商標）Real-Time PCR Detection System（BioRad）において35℃で行った。各サンプルに対する蛍光を、チャンネル1（FAM）において1分後おきに100サイクル読み取るようにプログラムした（スキャンモード：FAM/SYBRのみ）。総実行時間は115分間であった。すべての反応は、15mM MgCl2（Ambion）中に200nMパートザイムA（RO5A4/3(8)）、200nMパートザイムB（RO5B5/3(7)）、70nM Hp5(Sub3(8:7))Inh(D2F-3EAS2_11)、それぞれ100nMのEAS1_10、EAS2_11、EAS1_12、およびEAS2_13のバルク混合物、1×BSA（New England Biolabs）、1×NEBuffer 4（New England Biolabs）、ヌクレアーゼを含まない水（Ambion）、ならびに0.75U Mnl I（New England Biolabs）を含有していた。すべての反応を二つ組で実施した。すべてのオリゴヌクレオチドをIntegrated DNA Technologies（IDT）から購入した。
【０６３０】
14.5. 結果：CESA AおよびCESA Bの切断の検出
標的が存在する試験反応において、蛍光の増大が観察された。このことは、標的組織化助長因子によって、パートザイムA およびBが、基質−ブロッカー−DFヘアピンオリゴのMNAザイム基質部分を切断する触媒活性MNAザイムに組織化したことを示した。基質の切断は、DF-aに結合している断片の解離につながり、ゆえにDF-aが、それに続くEzyAmp反応（PESA AおよびPESA Bを含む）を開始するのを可能にした。このEzyAmpカスケードは、放出されたDF-aがPESA A（EAS1AおよびEAS1Bによって形成される）に結合してCESA Aを形成した場合に始動した。CESA AがMnl Iによって切断された場合に、DF-bは放出された。加えて、CESA A上に存在するフルオロフォアとクエンチャー部分の分離に相当する、付随した蛍光の増大もあった。次に、DF-bは、Mnl Iによって切断されるCESA Bを形成するPESA B（EAS1BおよびEAS2Bによって形成される）に結合した。これは、より多くのDF-aを放出して他のCESA AとCESA Bとの間のフィードバックカスケードを完成させ、かつCESA B上に存在するフルオロフォアとクエンチャー部分の分離に相当する、付随した蛍光の増大も生成した。
【０６３１】
標的組織化助長因子を添加しない「標的なしの対照」反応において、FAMシグナルの指数関数的な増大は観察されなかった。このことは、ヘアピン型の基質−ブロッカー−DFオリゴ内の基質部分のMNAザイム切断を開始してDF-aを放出し、かつそれに続くEzyAmp反応を開始するためには、標的の存在が必要とされることを示している。
【０６３２】
結果は、先行するMNAザイム工程の付加によって、標的依存的であるようにEzyAmp反応を設計することができること、および開始DFの配列がMNAザイムによってその基質として認識される配列の一部である必要はないことを実証している。
【０６３３】
実施例15
以下の実施例は、1つの反応内で並行して起こる以下の工程：工程（i）MNAザイムが標的cDNAの存在下で形成され、MNAザイムレポーター基質を切断して第1のDF（DF-a）を生成する；工程（ii）このDF-aがPESA AにハイブリダイズしてCESA Aを生成し、それがREによって切断された場合に別のDF（DF-b）を生成し、かつフルオロフォアとクエンチャーの分離を付随して引き起こし、検出可能な蛍光シグナルの生成をもたらす；工程（iv）DF-bが第2のPESA（PESA B）にハイブリダイズしてCESA Bを生成し、それが切断された場合に検出可能な蛍光シグナルを生成し、かつDF-aと同じ機能を果たし得るDFを放出する；工程（v）工程（iv）および（v）が繰り返されるフィードバックループが生成される；を用いた、2つの濃度におけるcDNA（RNAから逆転写される）の検出を例証する。ヌクレアーゼ切断がシグナル増幅をもたらす反応を、EzyAmp反応と称する。
【０６３４】
15.1. EzyAmpオリゴヌクレオチド
このEzyAmp反応に対して、2種の異なるCESA複合体（CESA AおよびCESA B）が1つの反応内に存在する。CESA AをPESA AおよびDF-a（MNAザイム基質の切断によってまたはCESA Bの切断によって生成される）から構成し、一方で、CESA BをPESA BおよびDF-b（EAS2A（EAS2_11）の切断によって生成される）から構成する。今度は、PESA AをEAS1A（EAS1_10）およびEAS2A（EAS2_11）から構成し、PESA BをEAS1B（EAS1_12）およびEAS2B（EAS1_13）から構成する。PESA AのEAS2Aは、DF-bの配列と機能的に同等である領域をその中に含有しており、PESA BのEAS2Bは、DF-aの配列と機能的に同等である領域をその中に含有している。そのため、反応の間にCESA BまたはCESA Aの切断によって各DFがそれぞれ生成され得る。
【０６３５】
RE活性を、フルオロフォアとクエンチャーの分離に相当する蛍光を測定することによって観測した。本実施例において、EAS1Aを、5'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）部分で、3'末端において6-フルオレセイン（「6-FAM」）部分で末端標識した。EAS2Aも、5'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）部分で標識されており、EAS1Aとアニールする。EAS1Bは、5'末端において6-フルオレセイン（「6-FAM」）部分で末端標識されており、一方で、EAS2Bは、3'末端においてBlack Hole FQ（「BHQ1」）部分で標識されており、EAS1Aとアニールする。
【０６３６】
これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5'から3'に列挙されており、下線が引かれている塩基は、Mnl Iに対する認識配列（CCTCまたはGAGG）の少なくとも一部を形成し、かつイタリック体の塩基は、より長いオリゴヌクレオチドの状況で存在するDFと同等であるものを表す。
2013542738.tif 000070
【０６３７】
15.2. パートザイムオリゴヌクレオチドおよび標的
標的であるPPIAのcDNAの存在下で触媒活性MNAザイムが形成されるように、パートザイムを設計した。パートザイムA（PPIAA2/1）およびパートザイムB（PPIAB3/1）の配列は、以下に5'から3'に列挙されており、下線が引かれている塩基は、組織化したMNAザイムの活性触媒コアの少なくとも一部を形成し、太字の塩基は標的とハイブリダイズし、かつイタリック体の塩基はMNAザイム基質にハイブリダイズする。
2013542738.tif 000071
遺伝子特異的3'プライマー（3PPIA）を用いて、PPIA cDNA標的を生成した。プライマーの配列を、以下に5'から3'に列挙する。
2013542738.tif 000072
【０６３８】
15.3. MNAザイム基質
MNAザイム活性を、二重標識した核酸レポーターMNAザイム基質の切断によって観測した。MNAザイム基質配列は、8:17 DNAザイム基質として以前に用いられている（Li et al., 2000）、RNAおよびDNAヌクレオチドの両方を含有しているキメラ配列である。本実施例において、レポーターMNAザイム基質を（Sub1i-FIB）と命名し、3'末端において内部フルオレセインdT（「iFluorT」）部分およびIowa Black FQ（「IAbFQ」）部分で標識した。Sub1i-FIBの標識配列は、5'から3'に以下のとおりである。小文字の塩基はRNAを表し、大文字の塩基はDNAを表す。イタリック体の塩基はDF-aを形成し、かつ下線が引かれている塩基はRE Mnl Iに対する認識配列の一部を形成すると考えられる。
【０６３９】
基質、Sub1i-FIB；
2013542738.tif 000073
【０６４０】
15.4. cDNA標的の生成
標的cDNAを、K562細胞株（Promega）に由来する全RNAの逆転写によって生成した。200nMの遺伝子特異的3'プライマー（3PPIA）を用いてPPIA cDNAを生成したという点を除いて、メーカーの使用説明書に従って、Tetro cDNA synthesis kit（Bioline、Aust）を用いて逆転写を実施した。
【０６４１】
15.5. EzyAmp反応成分および反応条件
触媒活性MNAザイムによるMNAザイム基質の切断、ならびに蛍光標識したCESA成分であるEAS1_10およびEAS1_12のRE Mnl Iによる切断を、蛍光の増大によって測定した。試験反応を標的の添加によって開始し（PPIA cDNA；反応（i）115pg、反応（ii）23pg）、「標的なしの対照」反応（反応（iii））をH2Oの添加によって開始した。すべての反応を、25μLの総反応容量で、CFX96（商標）Real-Time PCR Detection System（BioRad）において35℃で二つ組で行った。各反応に対する蛍光シグナルを、チャンネル1（FAM）において1分後おきに150サイクル読み取った（スキャンモード：FAM/SYBRのみ）。すべての反応は、10mM MgCl2（Ambion）中に0.75U Mnl Iとともに300nMパートザイムA（PPIAA2/1）、150nMパートザイムB（PPIAB3/1）、および30nM Sub1i-FIB；それぞれ100nMのEAS1_10、EAS2_11、EAS1_12、およびEAS2_13のバルク混合物、1×BSA（New England Biolabs）、ヌクレアーゼを含まない水（Ambion）、ならびに1×NEBuffer 1（New England Biolabs；KOHでpH8.5に調整されている）を含有していた。すべてのオリゴヌクレオチドをIntegrated DNA Technologies（IDT）から購入した。
【０６４２】
15.6. 結果：標的cDNAの存在の検出
図26は、115pgのcDNAを含有している反応（i）、および23pgのcDNAを含有している反応（ii）に対する蛍光の増大を示している。標的の量によって、EzyAmp反応において蛍光シグナルを生成するのに必要とされる時間が決定する。存在する標的分子が少ないほど、検出可能な蛍光シグナルを産生するのに時間がより長くかかった。「標的なしの対照」反応（反応（iii））の最初のおよそ110分間、シグナルの増大は観察されなかった（この時間の後、蛍光のいくらかのドリフトは観察されたが）。このことは、DF産生およびそれに続くEzyAmpシグナル増幅には、触媒活性MNAザイムの形成が必要とされ、かつこれは適切な標的（本実施例ではPPIA cDNA）の存在下でのみ開始されたことを示している。
【０６４３】
実施例16
以下の実施例は、TspRIとして知られる熱安定性REによって切断可能または切断不可能である種々の二重鎖構造体を形成する、オリゴヌクレオチドの能力を実証する。
【０６４４】
16.1. オリゴヌクレオチド
以下の反応について、オリゴヌクレオチド断片を組み合わせて二重鎖を形成し、それらをRE TspRIに対する基質として挙動し得るそれらの能力について試験した。CESA、PESA、およびEICの例示的な構造体を図1において図解する。本実施例において、種々の二重鎖には、それぞれ、TspRIに対する二本鎖RERSのうちの一方の鎖を形成するのに必要とされるすべての塩基を含む1種のオリゴヌクレオチドが含有されていた。
【０６４５】
RE切断活性を、TspRIによるCESA複合体の切断後のフルオロフォアとクエンチャー部分の分離による蛍光の変化を観察することによって観測した。本実施例において、EAS1は、その5'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）部分で末端標識され、RE TspRIに対するRERSの一方の鎖を形成するのに必要とされる塩基のすべてに相当する配列を含有していた。EAS2は、その3'末端において6-フルオレセイン（「FAM」）部分で末端標識され、RERSの第2の鎖を形成するのに必要とされる塩基のいくつかを含有していた。EAS2およびEAS1を、アニールしてPESA複合体を形成するように設計した（図1C）。PESAとDF-1（デオキシリボヌクレオチドのみから構成される）またはDF-2（デオキシリボヌクレオチドおよび1個のリボヌクレオチドから構成される）のいずれかとのハイブリダイゼーションを、すべてがDNAヌクレオチドであるRERSまたは1個のRNAヌクレオチドを有するRERSを含有するCESAを形成するようにそれぞれ設計した（図1A）。あるいは、阻害性断片（InF）のハイブリダイゼーションを、酵素阻害性複合体（EIC）を形成するように設計した（図1B）。InFを、14の位置におけるTの塩基上でフルオレセイン部分で内部標識し、IaBFQ部分で3'末端標識した。最後に、十分に連続したRERSを含有しているアンチセンス対照鎖（ASC）を、陽性対照として含んだ。各反応内に存在するオリゴヌクレオチドを、以下の表15において5'から3'に列挙する。TspRIの認識部位および切断部位に寄与する塩基は、：
2013542738.tif 000074
であり、「N」は任意の塩基であってよく、「S」はCまたはGであってよく、かつ「／」は切断部位を示す。
【０６４６】
（表１５）TspRIに対する反応A〜Fのオリゴヌクレオチド成分
2013542738.tif 000075
【０６４７】
表15におけるオリゴのそれぞれに対する配列を表16に提供する。大文字はDNAを示し、小文字はRNAを示す。TspRIの認識部位および切断部位に潜在的に寄与し得る塩基は、太字で書かれている。
【０６４８】
（表１６）
2013542738.tif 000076
【０６４９】
16.2. 反応成分
反応A、B、C、D、E、およびFを、表15に列挙したオリゴヌクレオチドを含有するように準備した。すべての反応は、ヌクレアーゼを含まない水（Ambion）、1×BSA（New England Biolabs）、20mM MgCl2（Ambion）、および20mM Tris HCl pH8.5（Sigma-Aldrich）中に100nMのEAS1、50mMの酢酸カリウム（Sigma-Aldrich）、1mM DTT（Sigma-Aldrich）、ならびに10mMの酢酸マグネシウム（Sigma-Aldrich）を含有していた。反応A〜Eは2U TspRI（New England Biolabs）を含有しており、一方で、反応Fは含有していなかった。加えて、反応Aはそれぞれ100nMのEAS2およびDF-1を含有しており、反応Bはそれぞれ100nMのEAS2およびDF-2を含有しており、反応Cはそれぞれ100nMのEAS2およびInFを含有しており、反応Dは100nMのEAS2を含有しており、かつ反応EおよびFは100nMのASCを含有していた。オリゴヌクレオチドをIDTから購入した。反応を、25μLの総容量で、CFX96（商標）Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad）において47℃で行った。各サンプルに対する蛍光を、チャンネル1（FAM；スキャンモード：SYBR/FAMのみ）において1秒後おきに合計100サイクル読み取るようにプログラムした（総反応時間はおよそ17分間であった）。
【０６５０】
16.3. 結果：切断の検出
EAS1およびその十分な相補鎖ASCを含有している反応Eにおいて、経時的な蛍光シグナルの増大が観察され、この構造体がTspRIによる切断を受けやすいことを示した。EAS1およびその十分な相補鎖ASCを含有しているが、TspRIを欠いている反応Fに対して、蛍光の増大は観察されなかった。
【０６５１】
反応Aにおいて、経時的な蛍光の増大が観察され、DF-1（DNAのみから構成される）がPESAに結合し、RERを完成させ、かつREによって切断されるCESAを形成し得ることを示した。このことは、TspRIが、その制限部位内にニックを含有している二重鎖を切断し得ることを実証している。RERSを完成させる配列の一部としてリボヌクレオチドを有するDF-2を含有している反応Bにおいても、蛍光の増大が観察された。このことは、CESAが形成され、かつTspRIが、その認識配列および切断配列内にニックおよびリボヌクレオチドを含有している二重鎖を切断し得ることを示している。対照的に、PESAおよびInFを含有している反応Cにおいて、蛍光の増大は見られず、これらのオリゴがEICを形成していたことを示した。同様に、PESAのみを含有している反応Dにおいて、蛍光の増大は見られず、REが切断するには十分なRERSが必要とされることを示した。そのため、TspRIは、実施例6の表13において詳述されるパターンIIを呈する酵素に類似している。
【０６５２】
TspRIは、二重鎖基質の構造を変化させることによってその活性を操作し得るため、EzyAmpにおける使用のための理想的なRE候補であると結論づけることができる。この酵素は、高度に熱安定性でもあり、したがって、過熱による変性に抵抗性がある。そのため、この酵素は、ゲノムDNA等の鋳型と混合し得、かつ二重らせんの2本の鎖を分離するために加熱し得、ゆえにタンパク質酵素または核酸酵素を用いた切断に適した一本鎖鋳型を提供する。例えば、一本鎖DNA鋳型は、MNAザイムに対する組織化助長因子として機能し得、ゆえにEzyAmp反応を開始するために使用され得る。TspRIと同様に、MNAザイムは、それはPCR反応における有用性を実証しているように、加熱変性工程による影響を受けないと考えられる。あるいは、一本鎖DNAは、図8〜11において図解されているものに類似したストラテジーにおいて、熱安定性タンパク質ヌクレアーゼによって次いで切断され得る合成オリゴイニシエーター（SIO）による結合に利用可能であると考えられる。
【０６５３】
実施例17
以下の実施例は、CESAが、その適合するDFの存在下におけるその形成後に、REによって切断される能力を実証する。このストラテジーにおいて、CESAの切断によって生成される断片の1つは、元のDFの短縮バージョンに相当する。そのため、この切断断片は、図27Aにおいて図解される別のPESAに対するDFとして機能し、自己フィードバックシグナル増幅をもたらす潜在力を有する。
【０６５４】
17.1. オリゴヌクレオチド
以下の反応において、CESAをPESAおよびDF（DF1）から構成する。今度は、PESAをEAS1（EAS1_1）およびEAS2（EAS2_2）から構成する。PESAのEAS2は、DFの短縮配列と同等である領域をその中に含有している。
【０６５５】
RE活性を、フルオロフォアとクエンチャーの分離に相当する蛍光の変化によって観測した。本実施例において、EAS1を、5'末端においてIowa Black FQ（「IAbFQ」）で、3'末端においてBlack Holeクエンチャー1（「BHQ_1」）で末端標識した。EAS2は、5'末端において6-フルオレセイン（「6-FAM」）で標識されており、EAS1とアニールする。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、以下に5'から3'に列挙されており、下線が引かれている塩基は、Mnl Iに対する認識配列（CCTCまたはGAGG）の少なくとも一部を形成する。イタリック体の太字の塩基は、EAS2の状況で存在するDF1の短縮バージョンと同等であるものを表す。
2013542738.tif 000077
【０６５６】
17.2. 反応条件
オリゴヌクレオチドをIntegrated DNA Technologies（IDT）から購入した。すべての反応は、10mM MgCl2（Ambion）中にそれぞれ100nMのEAS1_1およびEAS2_2のバルク混合物、1×BSA（New England Biolabs）、1×NEBuffer 4（New England Biolabs）、ヌクレアーゼを含まない水（Ambion）、ならびに0.75U Mnl I（New England Biolabs）を含有していた。総反応容量は25μLであった。試験反応（i）を100nM DFの添加によって開始し、対照反応（ii）をH2Oの添加によって開始した。反応をCFX96（商標）Real-Time PCR Detection System（BioRad）において35℃で二つ組で実行した。各サンプルに対する蛍光を、30秒後おきに200サイクル読み取るようにプログラムした（スキャンモード：FAM/SBYRのみ）。総実行時間は125分間であった。
【０６５７】
17.3. 結果：CESA切断の検出
それぞれ二つ組の反応に対する平均蛍光読み取り値を、時間に対してプロットしており、図27Bに示す。反応（i）において、DFの添加は、経時的な蛍光の増大をもたらした（i）。対照的に、DFの非存在下において、経時的な蛍光の増大は観察されなかった（ii）。
【０６５８】
結果は、CESAの形成にはDFの添加が必要とされることを実証している。今度は、Mnl IによるCESAの切断は、フルオロフォアおよびクエンチャー部分を含有しているものを含む断片の解離をもたらす（蛍光の増大によって示される）。加えて、切断断片の1つは、元のDF配列の短縮バージョンに相当する。この新たなDFは、別のPESAに結合することによって、開始DFと同じ機能を潜在的に実施し得る。
【図１】
2013542738.tif 000078
【図２】
2013542738.tif 000079
【図３】
2013542738.tif 000080
【図４】
2013542738.tif 000081
【図５】
2013542738.tif 000082
【図６】
2013542738.tif 000083
【図７】
2013542738.tif 000084
【図８】
2013542738.tif 000085
【図９】
2013542738.tif 000086
【図１０】
2013542738.tif 000087
【図１１】
2013542738.tif 000088
【図１２】
2013542738.tif 000089
【図１３】
2013542738.tif 000090
【図１４】
2013542738.tif 000091
【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2013542738.tif 000099
【図２１】
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【図２２】
2013542738.tif 000101
【図２２Ｄ】
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【図２３】
2013542738.tif 000103
【図２４】
2013542738.tif 000104
【図２５】
2013542738.tif 000105
【図２６】
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【図２７】
2013542738.tif 000107
【手続補正書】
【提出日】平成25年8月21日(2013.8.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第1の酵素増幅因子基質(Enzyme Amplifier Substrate)オリゴヌクレオチド(EAS1)および第2の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS2)を含む組成物であって、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、EAS1およびEAS2が、第1のドライバー断片オリゴヌクレオチド(DF)と組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識および切断配列を含む第1の完全酵素シグナル増幅因子(CESA)複合体を形成し、第1のDFの一部がEAS1の一部と相補的であり、かつ第1のDFの前記EAS1への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識配列または切断配列を完成する、組成物。
【請求項２】
EAS1、EAS2、および第1のヌクレアーゼを含む組成物であって、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、EAS1およびEAS2が、第1のDFと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成し、第1のDFの一部がEAS1の一部と相補的であり、かつ第1のDFの前記EAS1への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識配列または切断配列を完成する、組成物。
【請求項３】
多成分核酸酵素(MNAザイム(MNAzyme))、MNAザイム基質、EAS1、EAS2、および第1のヌクレアーゼを含む組成物であって：
MNAザイムが、MNAザイム組織化助長因子(assembly facilitator)の存在下で自己組織化してMNAザイムを形成する少なくとも第1のパートザイム(partzyme)および第2のパートザイムを含み、少なくとも第1および第2のパートザイムのそれぞれが基質アーム部分、触媒コア部分、およびセンサーアーム部分を含み、かつ第1および第2のパートザイムをそれらそれぞれの触媒コア部分が会合するように近接して維持して、MNAザイムの触媒コアを形成するように、センサーアームがMNAザイム組織化助長因子と相互作用し、かつ触媒コアがMNAザイム基質を修飾して第1のDFを形成することができ；
かつ、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部が第1のDFの一部と相補的であり、第1のDFがEAS1およびEAS2と組織化して、少なくとも第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESA複合体を形成することができ、かつ第1のDFの前記EAS1への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識配列または切断配列を完成する、
組成物。
【請求項４】
MNAザイム基質が、第1の鎖および第2の鎖を含むオリゴヌクレオチド複合体の第1の鎖であり、第1の鎖が内部ループ部分を含み、かつ内部ループ部分内の塩基が第2の鎖の塩基とハイブリダイズせず、かつMNAザイムが内部ループ部分を切断することができる、請求項3記載の組成物。
【請求項５】
第2の鎖が第1のDFを含む、請求項4記載の組成物。
【請求項６】
第1の鎖と第2の鎖とがヘアピンループ部分によって一方の末端で連結されている、請求項4または請求項5記載の組成物。
【請求項７】
MNAザイム基質がヘアピンオリゴヌクレオチドのヘアピンループ部分であり、かつMNAザイムがヘアピンループ部分を切断することができ、かつ第1のドライバー断片がヘアピンオリゴヌクレオチド内の二本鎖基部の一方の鎖中に位置する、請求項3記載の組成物。
【請求項８】
組織化助長因子が、同定される標的である、請求項3〜7のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９】
第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド(Synthetic Initiator Oligonucleotide, SIO)、EAS1、EAS2、第1のヌクレアーゼ、および第2のヌクレアーゼを含む組成物であって：
SIOが標的とハイブリダイズして二重鎖基質を形成することができ、第1のヌクレアーゼが二重鎖基質を切断して第1のDFを生成することができ；かつ
EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部が第1のDFの一部と相補的であり、EAS1およびEAS2が、第1のDFと組織化した場合にのみ、第2のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成し、かつ第1のDFの前記EAS1への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識配列または切断配列を完成する、
組成物。
【請求項１０】
第1のヌクレアーゼが、SIOが標的とハイブリダイズした場合にのみ、SIOを切断して第1のDFを生成することができる、請求項9記載の組成物。
【請求項１１】
第1ヌクレアーゼが、標的がSIOとハイブリダイズした場合にのみ、標的を切断して第1のDFを生成することができる、請求項9記載の組成物。
【請求項１２】
第1のヌクレアーゼが制限酵素ではない、請求項11記載の組成物。
【請求項１３】
第1のヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼである、請求項9〜12のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１４】
第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼが同じヌクレアーゼである、請求項9〜13のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１５】
第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼが異なるヌクレアーゼである、請求項9〜13のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１６】
第1のヌクレアーゼが、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、請求項1〜8のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１７】
第2のヌクレアーゼが、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、請求項9〜15のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１８】
前記ニックが、ヌクレアーゼ認識部位内に、ヌクレアーゼ切断部位に、またはヌクレアーゼ認識部位と切断部位の間に位置する、請求項16または請求項17記載の組成物。
【請求項１９】
前記ヌクレアーゼが、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspR Iからなる群より選択される、請求項16〜18のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２０】
第1のDFのEAS1への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識配列を完成する、請求項1〜19のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２１】
第1のDFのEAS1への結合が、部分的ヌクレアーゼ切断配列を完成する、請求項1〜19のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２２】
第1のDFが前記配列に少なくとも1つの塩基を寄与する、請求項20または請求項21記載の組成物。
【請求項２３】
第1のDFが前記配列に少なくとも2つの塩基を寄与する、請求項20〜22のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２４】
第1のDFが前記配列に少なくとも3つの塩基を寄与する、請求項20〜23のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２５】
前記塩基が、EAS1とEAS2との結合によって形成される部分的ヌクレアーゼ認識部位のすぐ3'側にある、請求項22〜24のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２６】
前記塩基が、EAS1とEAS2との結合によって形成される部分的ヌクレアーゼ認識部位のすぐ5'側にある、請求項22〜24のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２７】
EAS1およびEAS2が、EAS1およびEAS2の相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、ならびにEAS1の一方の末端とEAS2の一方の末端を連結するヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である、請求項1〜26のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２８】
前記ヘアピンループ部分がオリゴヌクレオチドリンカーまたは非オリゴヌクレオチドリンカーである、請求項27記載の組成物。
【請求項２９】
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドが、EAS1またはEAS2のいずれかから伸長した一本鎖5'または3'オーバーハング部分を含む、請求項27または請求項28記載の組成物。
【請求項３０】
EAS1またはEAS2の一部が第2のDFを含み、かつ第2のDFが、ヌクレアーゼによる第1のCESA複合体の修飾時に放出され得る、請求項1〜29のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３１】
ヘアピンループ部分の一部が第2のDFを含み、かつ第2のDFが、ヌクレアーゼによる第1のCESA複合体の修飾時に放出され得る、請求項27〜29のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３２】
第1のDFと第2のDFが同一ではない、請求項30または請求項31記載の組成物。
【請求項３３】
第1のDFと第2のDFが同一である、請求項30または請求項31記載の組成物。
【請求項３４】
第2のDFが第1のDFの断片であるか、または第1のDFが第2のDFの断片である、請求項30または請求項31記載の組成物。
【請求項３５】
第2のDF、EAS1、およびEAS2が組織化して、第1のCESA複合体を形成することができる、請求項33または請求項34記載の組成物。
【請求項３６】
第3の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS3)および第4の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS4)をさらに含み、EAS3の一部がEAS4の一部と相補的であり、かつEAS3の一部が第2のDFの一部と相補的であり、EAS3およびEAS4が、第2のDFと組織化した場合にのみ、付加的なヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第2のCESA複合体を形成する、請求項30〜32のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３７】
EAS3またはEAS4が第3のDFを含む、請求項36記載の組成物。
【請求項３８】
第3のDFが第1のDFと同一である、請求項37記載の組成物。
【請求項３９】
第3のDFが第1のDFと同一ではない、請求項37記載の組成物。
【請求項４０】
付加的なヌクレアーゼが組成物中の別のヌクレアーゼと同一である、請求項36〜39のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４１】
付加的なヌクレアーゼが組成物中の別のヌクレアーゼと同一ではなく、かつ組成物が該付加的なヌクレアーゼを含む、請求項36〜39のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４２】
付加的なヌクレアーゼが、第2のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、請求項36〜41のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４３】
前記ヌクレアーゼが、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspR Iからなる群より選択される、請求項36〜42のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４４】
第2のDFのEAS3への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識配列および/またはヌクレアーゼ切断配列を完成する、請求項36〜43のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４５】
第2のDFが、ヌクレアーゼ認識配列またはヌクレアーゼ切断配列に塩基を寄与しない、請求項36〜43のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４６】
EAS3およびEAS4が、EAS3およびEAS4の相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、ならびにEAS3の一方の末端とEAS4の一方の末端とを連結するヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である、請求項36〜45のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４７】
前記ヘアピンループ部分がオリゴヌクレオチドリンカーまたは非オリゴヌクレオチドリンカーである、請求項46記載の組成物。
【請求項４８】
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドが、EAS3またはEAS4のいずれかから伸長した一本鎖5'または3'オーバーハング部分を含む、請求項46または請求項47記載の組成物。
【請求項４９】
骨格オリゴヌクレオチド、EAS1、EAS2、EAS3、およびEAS4を含む第1の複合体を含む組成物であって、該骨格オリゴヌクレオチドが：
(i) EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、EAS2の一部は第1のDFの一部と相補的であり、かつEAS1またはEAS2の一部は第2のDFを含み、EAS1およびEAS2は、第1のDFと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成し、かつ前記第1のDFの前記EAS2への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識配列および/または部分的ヌクレアーゼ切断配列を完成する、EAS1を含む第1の部分；
(ii) EAS3の一部はEAS4の一部と相補的であり、EAS3の一部は第2のDFの一部と相補的であり、かつEAS3またはEAS4の一部は第1のDFを含み、かつEAS3およびEAS4は、第2のDFと組織化した場合にのみ、第2のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第2のCESA複合体を形成する、EAS3を含む第2の部分；ならびに
(iii) 第1の部分と第2の部分を接続する第3の部分
を含む、組成物。
【請求項５０】
骨格オリゴヌクレオチド、第5の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS5)、第6の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS6)、第7の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS7)、および第8の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS8)を含む第2の複合体をさらに含み、該骨格オリゴヌクレオチドが：
(i) EAS5の一部はEAS6の一部と相補的であり、EAS5の一部は第2のDFの一部と相補的であり、かつEAS5またはEAS6の一部は第1のDFを含み、かつEAS5およびEAS6は、第2のDFと組織化した場合にのみ、第3のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第3のCESA複合体を形成する、EAS5を含む第1の部分；ならびに
(ii) EAS7の一部はEAS8の一部と相補的であり、EAS8の一部は第1のDFの一部と相補的であり、かつEAS7またはEAS8の一部は第2のDFを含み、かつEAS7およびEAS8は、第1のDFと組織化した場合にのみ、第4のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第4のCESA複合体を形成する、EAS7を含む第2の部分；ならびに
(iii) 第1の部分と第2の部分を接続する第3の部分であって、第1の複合体の骨格の第3の部分と相補的である、第3の部分
を含む、請求項49記載の組成物。
【請求項５１】
EAS1がEAS7と同一であり、EAS2がEAS8と同一であり、EAS3がEAS5と同一であり、かつ/またはEAS4がEAS6と同一である、請求項50記載の組成物。
【請求項５２】
第1のヌクレアーゼが第3のヌクレアーゼと同一であり、かつ/または第2のヌクレアーゼが第4のヌクレアーゼと同一であり、かつ/または第1、第2、第3、および第4のヌクレアーゼが同一である、請求項50または請求項51記載の組成物。
【請求項５３】
第1の複合体と第2の複合体が、それらそれぞれの相補的な第3の部分を介してハイブリダイズして、第1の二重複合体を形成する、請求項50〜52のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５４】
第1の二重複合体が第2の二重複合体に連結している、請求項53記載の組成物。
【請求項５５】
第1の二重複合体のEAS1〜EAS8のうちのいずれか1つまたは複数と第2の二重複合体のEAS1〜EAS8のうちのいずれか1つまたは複数の連結により、第1の二重複合体が第2の二重複合体に連結している、請求項54記載の組成物。
【請求項５６】
第1の二重複合体のEAS2および/またはEAS8と第2の二重複合体のEAS2および/またはEAS8の連結により、第1の二重複合体が第2の二重複合体に連結している、請求項54または請求項55記載の組成物。
【請求項５７】
連結が、化学的ハイブリダイゼーション、抗体、オリゴヌクレオチドリンカー、非オリゴヌクレオチドリンカー、共有結合、およびペプチドリンカーのうちのいずれか1つまたは複数を用いて達成される、請求項55または請求項56記載の組成物。
【請求項５８】
連結が、酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドのうちのいずれか1つまたは複数のビオチン化、およびアビジンを用いた複数のビオチン化酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドの複合体化により達成される、請求項55または請求項56記載の組成物。
【請求項５９】
第1および/または第2のヌクレアーゼが、第2のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、請求項49〜58のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６０】
第1および/または第2のヌクレアーゼが、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspR Iからなる群より選択される、請求項49〜59のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６１】
第1のDFのEAS2もしくはEAS8への結合、および/または第2のDFのEAS3もしくはEAS5への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識配列および/または部分的ヌクレアーゼ切断配列を完成する、請求項50〜60のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６２】
EAS1およびEAS2；EAS3およびEAS4；EAS5およびEAS6；ならびにEAS7およびEAS8より選択される一対の酵素増幅因子基質が、該対の各メンバーの相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、および基部の一方の末端に連結しているヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である、請求項50〜61のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６３】
前記ヘアピンループ部分がオリゴヌクレオチドリンカーまたは非オリゴヌクレオチドリンカーである、請求項62記載の組成物。
【請求項６４】
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドが一本鎖5'または3'オーバーハング部分を含む、請求項62または請求項63記載の組成物。
【請求項６５】
以下のものを含む組成物：
(i) 標的鎖と相補的な第1の部分および該標的鎖と相補的でない第2の部分を含むSIOであって、第1の部分と第2の部分はホスホロチオエートによって分離されており、かつ第2の部分は第1のDFを含む、SIO；ならびに
(ii) EAS1およびEAS2であって、
EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、EAS1とEAS2のハイブリダイゼーションは、両末端に3'オーバーハングを有する二重鎖構造を提供し、
EAS1の一部は第1のDFの一部と相補的であり、かつ
EAS1およびEAS2は、第1のDFと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼによって消化され得る陥凹3'末端を含む第1のCESA複合体を形成することができる、EAS1およびEAS2。
【請求項６６】
SIOが、2つの相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、一本鎖ヘアピンループ、および3'オーバーハングを含むヘアピンオリゴヌクレオチドである、請求項65記載の組成物。
【請求項６７】
ヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼである、請求項65または請求項66記載の組成物。
【請求項６８】
エキソヌクレアーゼが、一本鎖オリゴヌクレオチド、5個もしくはそれ以上の塩基の3'オーバーハングを含む二本鎖オリゴヌクレオチド、またはホスホロチオエートヌクレオチド間連結を消化することができない、請求項67記載の組成物。
【請求項６９】
任意の第1のDFが、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼを用いて生成される、請求項1〜68のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７０】
エキソヌクレアーゼが、ヌクレアーゼBAL-31、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼIII、T7エキソヌクレアーゼ、T7エキソヌクレアーゼI、およびエキソヌクレアーゼTからなるより選択される、請求項69記載の組成物。
【請求項７１】
エキソヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼIIIである、請求項69または請求項70記載の組成物。
【請求項７２】
エンドヌクレアーゼが、T7エンドヌクレアーゼI、RNase H、フラップヌクレアーゼ、またはマングビーン(Mung Bean)ヌクレアーゼである、請求項69記載の組成物。
【請求項７３】
任意のEASが1つまたは複数の検出可能な標識を含む、請求項1〜72のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７４】
任意のEASがフルオロフォア部分および/またはクエンチャー部分を含む、請求項1〜73のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７５】
任意のパートザイム、組織化助長因子、MNAザイム基質、DF、EAS1、EAS2、EAS3、EAS4、EAS5、EAS6、EAS7、EAS8、またはSIOが、ホスホロチオエート、4-アセチルシチジン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウリジン、2'-O-メチルシチジン、5-カルボキシメチルアミノメチルチオウリジン、ジヒドロウリジン、2'-O-メチルプソイドウリジン、β D-ガラクトシルケオシン、2'-O-メチルグアノシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデノシン、1-メチルアデノシン、1-メチルプソイドウリジン、1-メチルグアノシン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアノシン、2-メチルアデノシン、2-メチルグアノシン、3-メチルシチジン、5-メチルシチジン、N6-メチルアデノシン、7-メチルグアノシン、5-メチルアミノメチルウリジン、5-メトキシアミノメチル-2-チオウリジン、β D-マンノシルメチルウリジン、5-メトキシカルボニルメチルウリジン、5-メトキシウリジン、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデノシン、N-((9-β-リボフラノシル-2-メチルチオプリン-6-イル)カルバモイル)スレオニン、N-((9-β-リボフラノシルプリン-6-イル)N-メチル-カルバモイル)スレオニン、ウリジン-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウリジン-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、プソイドウリジン、ケオシン、2-チオシチジン、5-メチル-2-チオウリジン、2-チオウリジン、4-チオウリジン、5-メチルウリジン、N-((9-β-D-リボフラノシルプリン-6-イル)カルバモイル)スレオニン、2'-O-メチル-5-メチルウリジン、2'-O-メチルウリジン、ワイブトシン、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン、β D-アラビノシルウリジン、およびβ D-アラビノシルチミジンからなる群より選択される、少なくとも1つのヌクレオチド置換または付加を含む、請求項1〜74のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７６】
MNAザイムパートザイム、MNAザイム基質、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも1つが、アプタマーまたはその一部をさらに含む、請求項3〜8のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７７】
アプタマーまたはその一部が、核酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、それらの誘導体、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも1つを含む、請求項76記載の組成物。
【請求項７８】
任意のMNAザイムパートザイム、MNAザイム基質、EAS1、EAS2、EAS3、EAS4、EAS5、EAS6、EAS7、EAS8、SIO、DF、またはヌクレアーゼが、固体支持体に付着している、請求項1〜77のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７９】
第1のDFが標的の存在下でのみ産生される、請求項1、2、または49のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８０】
第1のDFが標的とは異なる、請求項3、9、または49のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８１】
組成物が標的を検出するためのものであり、かつ第1のDFが該標的とは異なる、請求項1または請求項2記載の組成物。
【請求項８２】
任意のEASが、別のEASとハイブリダイズして、複数のDFとハイブリダイズし得る部分的酵素シグナル増幅因子(PESA)複合体を形成することができる、請求項1〜81のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８３】
標的分子の異なる部分に特異的な第1および第2のMNAザイムを含む、請求項3〜8のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８４】
標的分子の異なる部分に特異的なMNAザイムが、該標的の存在下で組織化した場合に、同じ基質を認識し切断する、請求項83記載の組成物。
【請求項８５】
異なる標的に対して特異性を有する少なくとも2つの異なるMNAザイムを含む、請求項3〜8のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８６】
異なる標的に対して相補性を有する少なくとも2つの異なるSIOを含む、請求項9または請求項65記載の組成物。
【請求項８７】
異なる第1のDFと組織化される少なくとも2つの異なる第1のCESA複合体を含む、請求項1〜3、9、49、または65のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８８】
以下の段階を含む、標的を検出するための方法：
(a) 2つまたはそれ以上のパートザイムおよび少なくとも1つの多成分核酸(MNAザイム)基質を提供する段階であって、該パートザイムは標的の存在下で自己組織化して、少なくとも1つのMNAザイムを形成する、段階；
(b) MNAザイムの自己組織化および触媒活性を可能にする条件下で、標的を含むと推定される試料にパートザイムを接触させる段階であって、MNAザイムの触媒活性により、前記少なくとも1つのMNAザイム基質から第1のドライバー断片オリゴヌクレオチド(DF)が産生される、段階；
(c) 第1の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS1)および第2の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS2)を提供する段階であって、EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部は第1のDFの一部と相補的である、段階；
(d) 以下を可能にする条件下で、EAS1およびEAS2を第1のDFに接触させる段階であって：
(1) 第1の完全酵素シグナル増幅因子(CESA)複合体を形成するための、第1のDFとEAS1およびEAS2との組織化、ならびに
(2) 第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位の形成、
ここで、第1のDFの前記EAS1への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識部位および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位を完成する、段階；
(e) 第1のヌクレアーゼを提供する段階；ならびに
(f) ヌクレアーゼと認識部位との相互作用および切断部位での切断を可能にする条件下で、第1のヌクレアーゼを第1のCESA複合体と接触させる段階であって、第1のヌクレアーゼによる切断は、標的の存在を示す検出可能な影響をもたらす、段階。
【請求項８９】
第1のヌクレアーゼが、第1のヌクレアーゼの認識部位および/または切断部位を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、請求項88記載の方法。
【請求項９０】
第1のDFが、MNAザイム基質の切断によって産生される、請求項88または請求項89記載の方法。
【請求項９１】
第1のDFが、2つまたはそれ以上のMNAザイム基質の核酸連結によって産生される、請求項88または請求項89記載の方法。
【請求項９２】
MNAザイム基質が、第1の鎖および第2の鎖を含むオリゴヌクレオチド複合体の第1の鎖であり、第1の鎖が内部ループ部分を含み、かつ内部ループ部分内の塩基が第2の鎖の塩基とハイブリダイズせず、かつMNAザイムが内部ループ部分を切断することができる、請求項88〜90のいずれか一項記載の方法。
【請求項９３】
第2の鎖が第1のDFを含む、請求項92記載の方法。
【請求項９４】
第1の鎖と第2の鎖がヘアピンループ部分によって一方の末端で連結されている、請求項92または請求項93記載の方法。
【請求項９５】
MNAザイム基質がヘアピンオリゴヌクレオチドのヘアピンループ部分であり、前記MNAザイムがヘアピンループ部分を切断することができ、かつ第1のドライバー断片が該ヘアピンオリゴヌクレオチド内の二本鎖基部の一方の鎖中に位置する、請求項88〜90のいずれか一項記載の方法。
【請求項９６】
以下の段階を含む、標的を検出する方法：
(a) 少なくとも第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド(SIO)を提供する段階；
(b) SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、ひいては第1のヌクレアーゼの二重鎖基質を作出する条件下で、標的を含むと推定される試料とSIOを接触させる段階；
(c) SIOと標的のハイブリダイゼーションによって形成された二重鎖基質を切断し得る第1のヌクレアーゼを提供する段階であって、第1のヌクレアーゼによる二重鎖基質の切断により第1のDFが生成される、段階；
(d) EAS1およびEAS2を提供する段階であって、EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部は第1のDFの一部と相補的である、段階；
(e) 以下を可能にする条件下で、EAS1およびEAS2を第1のDFと接触させる段階であって：
(1) 第1のCESAを形成するための、第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化、ならびに
(2) 第2のヌクレアーゼの認識部位および切断部位の形成、
ここで、第1のDFの前記EAS1への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識部位および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位を完成する、段階；
(f) 第2のヌクレアーゼを提供する段階；ならびに
(g) 第2のヌクレアーゼと認識部位との相互作用および切断部位での切断を可能にする条件下で、第2のヌクレアーゼを第1のCESAと接触させる段階であって、第2のヌクレアーゼによる切断は、標的の存在を示す検出可能な影響をもたらす、段階。
【請求項９７】
第1のヌクレアーゼが、SIOが標的とハイブリダイズした場合にのみ、SIOを切断して第1のDFを生成する、請求項96記載の方法。
【請求項９８】
第1のヌクレアーゼが、標的がSIOとハイブリダイズした場合にのみ、標的を切断して第1のDFを生成する、請求項96記載の方法。
【請求項９９】
第1のヌクレアーゼが制限酵素ではない、請求項98記載の方法。
【請求項１００】
第1のヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼである、請求項96〜99のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０１】
第1のCESA複合体の切断によりさらなるDFの放出が可能になり、かつさらなるDFがさらなる酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドと組織化してさらなるCESA複合体を形成し、かつ少なくとも1つのヌクレアーゼを用いてさらなるCESA複合体が切断されて、さらなる検出可能な影響がもたらされ、かつさらなるDFが放出され、それによって検出可能な影響のさらなる増加が促進される、請求項88〜100のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０２】
以下の段階を含む、カスケードを用いて標的を検出する方法であって：
(a) 第1のDFを産生する段階であって、第1のDFは標的の存在下でのみ産生される、段階；
(b) 以下のものを提供する段階：
(i) EAS1およびEAS2であって、
EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、
EAS1の一部は第1のDFの一部と相補的であり、かつ
EAS1またはEAS2の一部は第2のDFを含む、EAS1およびEAS2、
ならびに、
(ii) 第3の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS3)および第4の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS4)であって、
EAS3の一部はEAS4の一部と相補的であり、
EAS3の一部は第2のDFの一部と相補的である、EAS3およびEAS4；
(c) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化を可能にして、第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESA複合体を形成させる条件下における、第1のDFの前記EAS1への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識部位および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位を完成する、EAS1およびEAS2と(a)の第1のDF；
(ii) 第1のヌクレアーゼと第1のCESA複合体の認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第1のヌクレアーゼによる切断部位での切断により第2のDFが放出される、第1のCESA複合体と第1のヌクレアーゼ；
(d) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第2のDFとEAS3およびEAS4の組織化を可能にして、第2のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第2のCESA複合体を形成させる条件下における、EAS3およびEAS4と第2のDF；
(ii) 第2のヌクレアーゼと第2のCESA複合体の認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第2のヌクレアーゼは該切断部位で第2のCESA複合体を切断する、第2のCESA複合体と第2のヌクレアーゼ；
ここで、第1のCESA複合体および/または第2のCESA複合体の切断は、検出可能な影響をもたらす、方法。
【請求項１０３】
第1のCESA複合体および第2のCESA複合体の切断がそれぞれ、検出可能な影響をもたらす、請求項102記載の方法。
【請求項１０４】
第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼが同じヌクレアーゼである、請求項102および請求項103記載の方法。
【請求項１０５】
第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼが異なるヌクレアーゼである、請求項102および請求項103記載の方法。
【請求項１０６】
EAS3またはEAS4の一部が付加的なDFを含み、かつ第2のヌクレアーゼによる第2のCESA複合体の切断部位での切断により、該付加的なDFが放出される、請求項102〜105のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０７】
前記付加的なDFの一部が第5の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS5)の第1の部分と相補的であり、EAS5の第2の部分が第6の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS6)の一部と相補的であり、かつEAS5およびEAS6が該付加的なDFと組織化して第3のCESA複合体を形成する、請求項106記載の方法。
【請求項１０８】
(i) 付加的なDFの一部が第1のDFと同一であるか；
(ii) 付加的なDFが第1のDFと同一であるか；または
(iii) 付加的なDFが第1のDFの断片であり；
該付加的なDFがEAS1およびEAS2と組織化して、第1のCESA複合体を形成することができる、請求項106記載の方法。
【請求項１０９】
以下の段階を含む、カスケードを用いて複数の異なる標的を検出する方法であって：
(a) 少なくとも第1のDFおよび第2のDFを産生する段階であって、第1のDFは第1の標的の存在下でのみ産生され、第2のDFは第2の標的の存在下でのみ産生される、段階；
(b) 以下のものを提供する段階：
(i) EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、
EAS1の一部は第1のDFの一部と相補的である、EAS1およびEAS2、ならびに
(ii) EAS3の一部はEAS4の一部と相補的であり、
EAS3の一部は第2のDFの一部と相補的である、EAS3およびEAS4；
(c) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化を可能にして、第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESA複合体を形成させる条件下における、第1のDFの前記EAS1への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識部位および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位を完成する、EAS1およびEAS2と(a)の第1のDF；
(ii) 第1のヌクレアーゼと第1のCESA複合体の認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第1のヌクレアーゼは該切断部位で第1のCESA複合体を切断して、第1の検出可能な影響をもたらす、第1のCESA複合体と第1のヌクレアーゼ；
(d) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第2のDFとEAS3およびEAS4の組織化を可能にして、第2のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第2のCESA複合体を形成させる条件下における、EAS3およびEAS4と第2のDF；
(ii) 第2のヌクレアーゼと第2のCESA複合体の認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第2のヌクレアーゼは該切断部位で第2のCESA複合体を切断して、第2の検出可能な影響をもたらす、第2のCESA複合体と第2のヌクレアーゼ；
ここで、第1の検出可能な影響は第2の検出可能な影響とは異なる、方法。
【請求項１１０】
第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼが同じヌクレアーゼである、請求項109記載の方法。
【請求項１１１】
第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼが異なるヌクレアーゼである、請求項109および請求項110記載の方法。
【請求項１１２】
(i) EAS1またはEAS2の一部が付加的なDFを含み、かつ第1のヌクレアーゼによる第1のCESA複合体の切断部位での切断により、該付加的なDFが放出される；かつ
(ii) 該付加的なDFが少なくとも2つの付加的なEASオリゴヌクレオチドと組織化して付加的なCESA複合体を形成し、ヌクレアーゼによる該付加的なCESA複合体の切断により、第1の検出可能な影響が増加する、
請求項109〜111のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１３】
(i) EAS3またはEAS4の一部が付加的なDFを含み、かつ第2のヌクレアーゼによる第2のCESA複合体の切断部位での切断により、該付加的なDFが放出される；かつ
(ii) 該付加的なDFが少なくとも2つの付加的なEASオリゴヌクレオチドと組織化して付加的なCESA複合体を形成し、ヌクレアーゼによる該付加的なCESA複合体の切断により、第2の検出可能な影響が増加する、
請求項109〜112のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１４】
以下の段階を含む、カスケードを用いて標的を検出する方法であって：
(a) 第1のドライバー断片を産生する段階であって、第1のドライバー断片は該標的の存在下でのみ提供される、段階；
(b) 以下のものを提供する段階：
(i) EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、
EAS1の一部は第1のDFの一部と相補的であり、
EAS1またはEAS2の一部は第2のDFを含み、かつ
EAS1またはEAS2は支持体に連接されている、EAS1およびEAS2、
(ii) EAS3の一部はEAS4の一部と相補的であり、
EAS3の一部は第2のDFの一部と相補的であり、
EAS3またはEAS4の一部は第3のDFを含み、かつ
EAS3またはEAS4は支持体に連接されている、EAS3およびEAS4；
(c) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化を可能にして、第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESAを形成させる条件下における、第1のDFの前記EAS1への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識配列および/または部分的ヌクレアーゼ切断配列を完成する、EAS1およびEAS2と(a)の第1のDF；
(ii) 第1のヌクレアーゼと第1のCESAの認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第1のものによる該切断部位での切断により第2のDFが放出される、第1のCESAと第1のヌクレアーゼ；
(d) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第2のDFとEAS3およびEAS4の組織化を可能にして、第2のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第2のCESAを形成させる条件下における、EAS3およびEAS4と第2のDF；
(ii) 第2のヌクレアーゼと第2のCESAの認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第2のヌクレアーゼによる該切断部位での切断により、EAS1およびEAS2と組織化して第1のCESAを形成し得る第3のDFが放出される、第2のCESAと第2のヌクレアーゼ；
ここで、第1のCESA複合体および/または第2のCESA複合体の切断は、検出可能な影響をもたらす、方法。
【請求項１１５】
(a)の第1のDFが、
SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、イニシエーターヌクレアーゼ(initiator nuclease)による修飾に適した二重鎖構造を形成させる条件下で、標的を含むと推定される試料とSIOを接触させること、および
二重鎖構造を前記イニシエーターヌクレアーゼと接触させること
によって産生され、
前記イニシエーターヌクレアーゼによる二重鎖構造中の対形成または非対形成領域の修飾により、第1のDFが放出される、
請求項102〜114のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１６】
(a)の第2のDFが、
SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、イニシエーターヌクレアーゼによる修飾に適した二重鎖構造を形成させる条件下で、標的を含むと推定される試料とSIOを接触させること、および
二重鎖構造を前記イニシエーターヌクレアーゼと接触させること
によって産生され、
前記イニシエーターヌクレアーゼによる二重鎖構造中の対形成または非対形成領域の修飾により、第2のDFが放出される、
請求項109〜113のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１７】
前記イニシエーターヌクレアーゼが、SIOが標的とハイブリダイズした場合にのみ、SIOを切断して前記DFを生成する、請求項115または請求項116記載の方法。
【請求項１１８】
前記イニシエーターヌクレアーゼが、標的がSIOとハイブリダイズした場合にのみ、標的を切断して前記DFを生成する、請求項115または請求項116記載の方法。
【請求項１１９】
前記イニシエーターヌクレアーゼが制限酵素ではない、請求項118記載の方法。
【請求項１２０】
前記イニシエーターヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼである、請求項115〜119のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２１】
SIOが支持体に付着している、請求項115〜120のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２２】
(a)の第1のDFが、2つまたはそれ以上のパートザイムおよび少なくとも1つのMNAザイム基質を提供すること、および標的を含むと推定される試料とパートザイムを、該標的の存在下でMNAザイムの自己組織化および触媒活性を可能にする条件下で接触させることによって産生され、該触媒活性により該基質が修飾され、それによって第1のDFが提供される、請求項102〜114のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２３】
(a)の第2のDFが、2つまたはそれ以上のパートザイムおよび少なくとも1つのMNAザイム基質を提供すること、および標的を含むと推定される試料とパートザイムを、該標的の存在下でMNAザイムの自己組織化および触媒活性を可能にする条件下で接触させることによって産生され、該触媒活性により該基質が修飾され、それによって第2のDFが提供される、請求項109〜113のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２４】
MNAザイム基質が、第1の鎖および第2の鎖を含むオリゴヌクレオチド複合体の第1の鎖であり、第1の鎖が内部ループ部分を含み、かつ内部ループ部分内の塩基が第2の鎖の塩基とハイブリダイズせず、かつMNAザイムが内部ループ部分を切断することができる、請求項122または請求項123記載の方法。
【請求項１２５】
第2の鎖が前記DFを含む、請求項124記載の方法。
【請求項１２６】
第1の鎖と第2の鎖がヘアピンループ部分によって一方の末端で連結されている、請求項124または請求項125記載の方法。
【請求項１２７】
前記ヘアピンループ部分がオリゴヌクレオチドリンカーまたは非オリゴヌクレオチドリンカーである、請求項126記載の方法。
【請求項１２８】
前記MNAザイム基質がヘアピンオリゴヌクレオチドのヘアピンループ部分であり、MNAザイムがヘアピンループ部分を切断することができ、かつ前記ドライバー断片がヘアピンオリゴヌクレオチド内の二本鎖基部の一方の鎖中に位置する、請求項122または請求項123記載の方法。
【請求項１２９】
EAS3およびEAS4が、EAS3およびEAS4の相補的部分の間で形成される二本鎖部分、ならびにEAS3の一方の末端とEAS4の一方の末端とを連結するヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチド複合体の成分である、請求項102〜128のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３０】
EAS1およびEAS2が、EAS1およびEAS2の相補的部分の間で形成される二本鎖部分、ならびにEAS1の一方の末端とEAS2の一方の末端とを連結するヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチド複合体の成分である、請求項88〜128のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３１】
前記ヘアピンループ部分がオリゴヌクレオチドリンカーまたは非オリゴヌクレオチドリンカーである、請求項129または請求項130記載の方法。
【請求項１３２】
前記ヘアピンオリゴヌクレオチド複合体が、1つのEASオリゴヌクレオチドから伸長した5'または3'オーバーハング一本鎖部分をさらに含む、請求項129〜131のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３３】
前記ヘアピンループ部分が、検出可能な部分および/またはクエンチャー部分を含む、請求項129〜132のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３４】
EAS3および/またはEAS4が検出可能な部分および/またはクエンチャー部分を含み、かつ該検出可能な部分とクエンチャー部分とが、第2のヌクレアーゼによる第2のCESAの切断時に分離して、検出可能な影響を提供する、請求項102〜128のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３５】
EAS3が検出可能な部分およびクエンチャー部分を含み、EAS4がさらなるクエンチャー部分を含み、かつ該検出可能な部分とさらなるクエンチャー部分とが、第2のヌクレアーゼによる第2のCESAの切断時に分離して、検出可能な影響を提供する、請求項134記載の方法。
【請求項１３６】
EAS1および/またはEAS2が検出可能な部分および/またはクエンチャー部分を含み、かつ該検出可能な部分とクエンチャー部分とが、第1のヌクレアーゼによる第1のCESAの切断時に分離して、検出可能な影響を提供する、請求項88〜128のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３７】
EAS1が検出可能な部分およびクエンチャー部分を含み、EAS2がさらなるクエンチャー部分を含み、かつ該検出可能な部分とさらなるクエンチャー部分とが、第1のヌクレアーゼによる第1のCESAの切断時に分離して、検出可能な影響を提供する、請求項136記載の方法。
【請求項１３８】
検出可能な部分がフルオロフォアである、請求項133〜137のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３９】
第1のヌクレアーゼが、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、請求項88〜95のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４０】
第2のヌクレアーゼが、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、請求項96〜101のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４１】
第1のヌクレアーゼが、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができ、かつ/または第2のヌクレアーゼが、第2のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、請求項102〜135のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４２】
前記ニックが、ヌクレアーゼ認識部位内に、ヌクレアーゼ切断部位に、またはヌクレアーゼ認識部位と切断部位の間に位置する、請求項139〜141のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４３】
前記ヌクレアーゼが、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspR Iからなる群より選択される、請求項139〜142のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４４】
第1のDFのEAS1への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識部位を完成する、請求項88〜143のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４５】
第2のDFのEAS2への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識部位を完成する、請求項102〜135のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４６】
第1のDFのEAS1への結合が、部分的ヌクレアーゼ切断部位を完成する、請求項144または請求項145記載の方法。
【請求項１４７】
第2のDFのEAS2への結合が、部分的ヌクレアーゼ切断部位を完成する、請求項144〜146のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４８】
前記DFが、部分的ヌクレアーゼ認識部位および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位に少なくとも1つ、2つ、または3つの塩基を寄与する、請求項144〜147のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４９】
前記塩基が、酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドの結合によって形成される部分的ヌクレアーゼ認識部位のすぐ3'側にある、請求項146〜148のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５０】
前記塩基が、酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドの結合によって形成される部分的ヌクレアーゼ認識部位のすぐ5'側にある、請求項146〜148のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５１】
第2のDFが、ヌクレアーゼ認識部位またはヌクレアーゼ切断部位に塩基を寄与しない、請求項102〜135のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５２】
以下の段階を含む、カスケードを用いて標的を検出する方法であって：
(a) 第1のドライバー断片を産生する段階であって、第1のドライバー断片は標的の存在下でのみ産生される、段階；
(b) 以下のものを含む第1の骨格オリゴヌクレオチドを含む第1の複合体を提供する段階：
(i) EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、
EAS2の一部は第1のドライバー断片の一部と相補的であり、かつ
EAS1またはEAS2の一部は第2のドライバー断片を含む、EAS1を含む第1の部分、
(ii) EAS3の一部はEAS4と相補的であり、
EAS3の一部は第2のドライバー断片の一部と相補的であり、かつ
EAS3またはEAS4の一部は第1のドライバー断片を含む、EAS3を含む第2の部分、および
(iii) 第1の部分と第2の部分を接続する第3の部分；
ならびに、
(c) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化を可能にして、第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESAを形成させる条件下における、第1のDFの前記EAS1への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識部位および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位を完成する、EAS1およびEAS2と(a)の第1のDF；
(ii) 第1のヌクレアーゼと第1のCESAの認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第1のヌクレアーゼによる該切断部位での切断により第2のDFが放出される、第1のCESAと第1のヌクレアーゼ；
(d) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第2のDFとEAS3およびEAS4の組織化を可能にして、第2のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第2のCESAを形成させる条件下における、EAS3およびEAS4と第2のDF；
(ii) 第2のヌクレアーゼと第2のCESAの認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第2のヌクレアーゼによる該切断部位での切断により、EAS1およびEAS2と組織化して第1のCESAを形成し得る第1のDFが放出される、第2のCESAと第2のヌクレアーゼ；
ここで、第1のCESA複合体および/または第2のCESA複合体の切断は、検出可能な影響をもたらす、方法。
【請求項１５３】
第1のCESA複合体の切断および第2のCESA複合体の切断がそれぞれ、検出可能な影響をもたらす、請求項152記載の方法。
【請求項１５４】
以下の段階をさらに含む、方法であって：
(a) 以下のものを含む骨格オリゴヌクレオチドを含む第2の複合体を提供する段階：
(i) 第5の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS5)を含む第1の部分であって、
EAS5の一部は第6の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS6)の一部と相補的であり、かつ
EAS5の一部は第2のドライバー断片の一部と相補的であり、かつ
EAS5またはEAS6の一部は第1のドライバー断片を含む、第1の部分、および
(ii) 第7の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS7)を含む第2の部分であって、
EAS7の一部は第8の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS8)の一部と相補的であり、
EAS8の一部は第1のドライバー断片の一部と相補的であり、
EAS7またはEAS8の一部は第2のドライバー断片を含む、第2の部分、および
(iii) 第1の部分と第2の部分を接続する第3の部分であって、第1の複合体の骨格の第3の部分と相補的である、第3の部分；
ならびに、
(b) 第1の複合体の第3の部分と第2の複合体の第3の部分とのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、第1の複合体と第2の複合体を接触させ、それによって第1の二重複合体を形成させる段階；
(c) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第2のDFとEAS5およびEAS6の組織化を可能にして、第3のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第3のCESAを形成させる条件下における、EAS5およびEAS6と(a)の第2のDF；
(ii) 第3のヌクレアーゼと第3のCESAの認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第3のヌクレアーゼによる該切断部位での切断により、EAS1およびEAS2と組織化して第1のCESAを形成し得、かつEAS7およびEAS8と組織化して第4のCESAを形成し得る第1のDFが放出される、第3のCESAと第3のヌクレアーゼ；ならびに
(d) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第1のDFとEAS7およびEAS8の組織化を可能にして、第4のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第4のCESAを形成させる条件下における、EAS7およびEAS8と第1のDF；
(ii) 第4のヌクレアーゼと第4のCESAの認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第4のヌクレアーゼによる該切断部位での切断により、EAS3およびEAS4と組織化して第2のCESAを形成し得、かつEAS5およびEAS6と組織化して第3のCESAを形成し得る第2のDFが放出される、第4のCESAと第4のヌクレアーゼ；
ここで、第3のCESA複合体および/または第4のCESA複合体の切断は、検出可能な影響をもたらす、請求項152または請求項153記載の方法。
【請求項１５５】
第3のCESA複合体の切断および第4のCESA複合体の切断がそれぞれ、検出可能な影響をもたらす、請求項154記載の方法。
【請求項１５６】
EAS1がEAS7と同一であり、EAS2がEAS8と同一であり、EAS3がEAS5と同一であり、かつ/またはEAS4がEAS6と同一である、請求項154または請求項155記載の方法。
【請求項１５７】
第1の二重複合体が第2の二重複合体に連結している、請求項154〜156のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５８】
第1の二重複合体のEAS1〜EAS8のうちのいずれか1つまたは複数と第2の二重複合体のEAS1〜EAS8のうちのいずれか1つまたは複数との連結により、第1の二重複合体が第2の二重複合体に連結している、請求項157記載の方法。
【請求項１５９】
第1の二重複合体のEAS2および/またはEAS8と第2の二重複合体のEAS2および/またはEAS8の連結により、第1の二重複合体が第2の二重複合体に連結している、請求項157または請求項158記載の方法。
【請求項１６０】
連結が、化学的ハイブリダイゼーション、抗体、オリゴヌクレオチドリンカー、非オリゴヌクレオチドリンカー、およびペプチドリンカーのうちのいずれか1つまたは複数を用いて達成される、請求項158または請求項159記載の方法。
【請求項１６１】
連結が、酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドのうちのいずれか1つまたは複数のビオチン化、およびアビジンを用いた複数のビオチン化酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドの複合体化により達成される、請求項158または請求項159記載の方法。
【請求項１６２】
(a)の第1のDFが、
SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、イニシエーターヌクレアーゼによる修飾に適した二重鎖構造を形成させる条件下で、標的を含むと推定される試料とSIOを接触させること、および
二重鎖構造を前記イニシエーターヌクレアーゼと接触させること
によって産生され、
前記イニシエーターヌクレアーゼによる二重鎖構造中の対形成または非対形成領域の修飾により、第2のDFが放出される、
請求項152〜請求項161のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６３】
前記イニシエーターヌクレアーゼが、SIOが標的とハイブリダイズした場合にのみ、SIOを切断して前記DFを生成する、請求項162記載の方法。
【請求項１６４】
前記イニシエーターヌクレアーゼが、標的がSIOとハイブリダイズした場合にのみ、標的を切断して前記DFを生成する、請求項162記載の方法。
【請求項１６５】
前記イニシエーターヌクレアーゼが制限酵素ではない、請求項164記載の方法。
【請求項１６６】
(a)の第1のDFが、2つまたはそれ以上のパートザイムおよび少なくとも1つのMNAザイム基質を提供すること、および標的を含むと推定される試料とパートザイムを、該標的の存在下でMNAザイムの自己組織化および触媒活性を可能にする条件下で接触させることによって産生され、該触媒活性により該基質が修飾され、それによって第1のDFが提供される、請求項152〜161のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６７】
EAS1、EAS2、EAS3、EAS4、EAS5、EAS6、EAS7、およびEAS8のうちのいずれか1つまたは複数が、検出可能な部分およびクエンチャー部分を含み、該検出可能な部分およびクエンチャー部分が、第1、第2、第3、および/または第4のCESAの切断時に分離して、検出可能な影響を提供する、請求項154〜166のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６８】
(i) EAS1が検出可能な部分を含み、かつEAS2がクエンチャー部分を含む、もしくはその逆である；および/または
(ii) EAS3が検出可能な部分を含み、かつEAS4がクエンチャー部分を含む、もしくはその逆である；および/または
(iii) EAS5が検出可能な部分を含み、かつEAS6がクエンチャー部分を含む、もしくはその逆である；
(iv) EAS7が検出可能な部分を含み、かつEAS8がクエンチャー部分を含む、もしくはその逆である；
ここで、検出可能な部分とクエンチャー部分は、第1、第2、第3、および/または第4のCESAの切断時に分離して、検出可能な影響を提供する、
請求項154〜166のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６９】
任意の前記ヌクレアーゼが、第1、第2、または第3のヌクレアーゼの認識配列を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、請求項152〜168のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７０】
前記ヌクレアーゼが、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspRIからなる群より選択される、請求項169記載の方法。
【請求項１７１】
任意の前記DFの酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドへの結合が、部分的ヌクレアーゼ認識部位および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位を完成する、請求項152〜168のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７２】
EAS1およびEAS2；EAS3およびEAS4；EAS5およびEAS6；ならびにEAS7およびEAS8より選択される一対の酵素増幅因子基質が、該対の各メンバーの相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、および基部の一方の末端に連結しているヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である、請求項154〜165のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７３】
任意の第1のDFが、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼより選択されるヌクレアーゼを用いて生成される、請求項88〜172のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７４】
エキソヌクレアーゼが、ヌクレアーゼBAL-31、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼIII、T7エキソヌクレアーゼ、T7エキソヌクレアーゼI、およびエキソヌクレアーゼTからなる群より選択される、請求項173記載の方法。
【請求項１７５】
エンドヌクレアーゼが、T7エンドヌクレアーゼI、RNase H、フラップヌクレアーゼ、またはマングビーンヌクレアーゼである、請求項173記載の方法。
【請求項１７６】
以下の段階を含む、カスケードを用いて標的を検出する方法であって：
(a) 以下のものを提供する段階：
(i) 標的鎖と相補的な第1の部分および該標的鎖と相補的でない第2の部分を含むSIOであって、第1の部分と第2の部分はホスホロチオエートによって分離されており、かつ第2の部分は第1のDFを含む、SIO； 
(ii) EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1とEAS2のハイブリダイゼーションは、両末端に3'オーバーハングを有する二重鎖構造を提供し、かつEAS1の一部は第1のDFの一部と相補的である、EAS1およびEAS2；ならびに
(iii) 第1のエキソヌクレアーゼ；ならびに
(b) 以下のものを接触させる段階：
(i) SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、ひいては第1のエキソヌクレアーゼの二重鎖基質を作出する条件下における、第1のエキソヌクレアーゼによる二重鎖構造の修飾により、二重鎖基質から第1のDFが放出される、標的を含むと推定される試料とSIO；
(ii) 第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化を可能にして、第2のエキソヌクレアーゼの基質を含む第1のCESA複合体を形成させる条件下における、EAS1およびEAS2と(b)の第1のDF；
(iii) 第2のエキソヌクレアーゼと第1のCESA複合体との相互作用を可能にする条件下における、第2のエキソヌクレアーゼによる第1のCESA複合体の修飾により、第1のCESA複合体から、付加的なEAS1およびEAS2と組織化して付加的な第1のCESA複合体を形成し得る第1のDFが放出される、第1のCESAと第2のエキソヌクレアーゼ；
ここで、二重鎖構造の該修飾および/または第1のCESA複合体の該修飾は、検出可能な影響を提供する、方法。
【請求項１７７】
二重鎖構造の前記修飾および第1のCESA複合体の前記修飾が、検出可能な影響を提供する、請求項176記載の方法。
【請求項１７８】
SIOが、2つの相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、一本鎖ヘアピンループ、および3'オーバーハングを含むヘアピンオリゴヌクレオチドである、請求項176または請求項177記載の方法。
【請求項１７９】
第1および/または第2のエキソヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼIIIである、請求項176〜178のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８０】
SIOおよび/またはEAS1が検出可能な部分およびクエンチャー部分を含み、かつ該検出可能な部分とクエンチャー部分が、前記エキソヌクレアーゼによる修飾時に分離して、検出可能な影響を提供し得る、請求項176〜179のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８１】
前記検出可能な部分がフルオロフォアである、請求項180記載の方法。
【請求項１８２】
前記検出可能な影響が、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分光法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射測定、測光法、シンチグラフィー、電子的方法、UV、可視光もしくは赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせによって検出される、請求項88〜181のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８３】
検出可能な影響が測定され、かつ該測定の大きさおよび/または検出可能な影響の蓄積率が標的の量を示す、請求項88〜182のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８４】
標的が、核酸、タンパク質、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオン、核酸、またはそれらの任意の誘導体、部分、もしくは組み合わせからなる群より選択される、請求項88〜183のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８５】
核酸が、DNA、メチル化DNA、アルキル化DNA、RNA、メチル化RNA、マイクロRNA、siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、プレおよびプリマイクロRNA、他の非コードRNA、リボソームRNA、それらの誘導体、それらの単位複製配列、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項184記載の方法。
【請求項１８６】
核酸の供給源が、合成、哺乳動物、ヒト、動物、植物、真菌、細菌、ウイルス、古細菌、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項184または請求項185記載の方法。
【請求項１８７】
核酸が増幅される、請求項184〜186のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８８】
第1のDFが標的とは異なる、請求項96、102、109、114、または152のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８９】
任意のEASが別のEASとハイブリダイズして、複数のDFとハイブリダイズし得る部分的酵素シグナル増幅因子(PESA)複合体を形成することができる、請求項88〜188のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９０】
標的分子の異なる部分に特異的な第1および第2のMNAザイムを用いる段階を含む、請求項88〜95、122、123、または166のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９１】
標的分子の異なる部分に特異的なMNAザイムが、該標的の存在下で組織化した場合に、同じ基質を認識し切断する、請求項190記載の方法。
【請求項１９２】
異なる標的に対して特異性を有する少なくとも2つの異なるMNAザイムを用いる段階を含む、請求項88〜95、122、123、または166のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９３】
異なる標的に対して相補性を有する少なくとも2つの異なるSIOを用いる段階を含む、請求項96、115、116、および162のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９４】
異なる第1のDFと組織化される少なくとも2つの異なる第1のCESA複合体を用いる段階を含む、請求項88、96、102、114、または152のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９５】
ヌクレアーゼ；ならびに
EAS1とEAS2の一部は相補的であり、EAS1およびEAS2は、ドライバー断片オリゴヌクレオチドと組織化した場合にのみ、該ヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む複合体を形成し、かつ第1のDFの前記EAS1への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識配列および/または部分的ヌクレアーゼ切断配列を完成する、EAS1およびEAS2
を含む、シグナルを増幅するためのキット。
【請求項１９６】
ヌクレアーゼ；
EAS1とEAS2の一部が相補的である、EAS1およびEAS2；
標的に対応するMNAザイムを組織化するように設計された複数のパートザイム；ならびに
MNAザイム基質であって、ただし、該基質の一部はEAS1の一部と相補的である、MNAザイム基質
を含む、標的を検出するためのキットであって、
ここで、EAS1およびEAS2は、ドライバー断片オリゴヌクレオチドと組織化した場合にのみ、該ヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む複合体を形成し、かつ第1のDFの前記EAS1への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識部位および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位を完成する、キット。
【請求項１９７】
ヌクレアーゼ；
EAS1とEAS2の一部が相補的である、EAS1およびEAS2；
標的とハイブリダイズしてヌクレアーゼ基質を形成するように設計された複数のSIO
を含む、標的を検出するためのキットであって、
ここで、ヌクレアーゼ基質の一部はEAS1の一部と相補的であり、
EAS1およびEAS2は、ドライバー断片オリゴヌクレオチド(DF)と組織化した場合にのみ、該ヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む複合体を形成し、かつ第1のDFの前記EAS1への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識部位および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位を完成する、キット。
【請求項１９８】
第1の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS1)および第2の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS2)を含むキットであって、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1およびEAS2が、第1のドライバー断片オリゴヌクレオチド(DF)と組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識および切断配列を含む第1の完全酵素シグナル増幅因子(CESA)複合体を形成し、第1のDFの一部がEAS1の一部と相補的であり、かつ第1のDFの前記EAS1への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識部位および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位を完成する、キット。
【請求項１９９】
EAS1、EAS2、および第1のヌクレアーゼを含むキットであって、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、EAS1およびEAS2が、第1のDFと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成し、第1のDFの一部がEAS1の一部と相補的であり、かつ第1のDFの前記EAS1への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識部位および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位を完成する、キット。
【請求項２００】
多成分核酸酵素(MNAザイム)、MNAザイム基質、EAS1、EAS2、および第1のヌクレアーゼを含むキットであって：
MNAザイムが、MNAザイム組織化助長因子の存在下で自己組織化してMNAザイムを形成する少なくとも第1のパートザイムおよび第2のパートザイムを含み、少なくとも第1および第2のパートザイムのそれぞれが基質アーム部分、触媒コア部分、およびセンサーアーム部分を含み、かつ第1および第2のパートザイムをそれらそれぞれの触媒コア部分が会合するように近接して維持して、MNAザイムの触媒コアを形成するように、センサーアームがMNAザイム組織化助長因子と相互作用し、かつ触媒コアがMNAザイム基質を修飾して第1のDFを形成することができ；
ならびに、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部が第1のDFの一部と相補的であり、第1のDFがEAS1およびEAS2と組織化して、少なくとも第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESA複合体を形成することができ、かつ第1のDFの前記EAS1への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識部位および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位を完成する、
キット。
【請求項２０１】
前記MNAザイム基質が、第1の鎖および第2の鎖を含むオリゴヌクレオチド複合体の第1の鎖であり、第1の鎖が内部ループ部分を含み、かつ内部ループ部分内の塩基が第2の鎖の塩基とハイブリダイズせず、かつMNAザイムが内部ループ部分を切断することができる、請求項200記載のキット。
【請求項２０２】
第2の鎖が第1のDFを含む、請求項201記載のキット。
【請求項２０３】
第1の鎖と第2の鎖がヘアピンループ部分によって一方の末端で連結されている、請求項201または請求項202記載のキット。
【請求項２０４】
前記MNAザイム基質がヘアピンオリゴヌクレオチドのヘアピンループ部分であり、MNAザイムがヘアピンループ部分を切断することができ、かつ第1のドライバー断片がヘアピンオリゴヌクレオチド内の二本鎖基部の一方の鎖中に位置する、請求項200記載のキット。
【請求項２０５】
組織化助長因子が、同定される標的である、請求項200〜204のいずれか一項記載のキット。
【請求項２０６】
第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド(SIO)、EAS1、EAS2、第1のヌクレアーゼ、および第2のヌクレアーゼを含むキットであって：
SIOが標的とハイブリダイズして二重鎖基質を形成することができ、第1のヌクレアーゼが二重鎖基質を切断して第1のDFを生成することができ；かつ
EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部が第1のDFの一部と相補的であり、EAS1およびEAS2が、第1のDFと組織化した場合にのみ、第2のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成し、かつ第1のDFの前記EAS1への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識部位および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位を完成する、
キット。
【請求項２０７】
第1のヌクレアーゼが、SIOが標的とハイブリダイズした場合にのみ、SIOを切断して第1のDFを生成することができる、請求項206記載のキット。
【請求項２０８】
第1のヌクレアーゼが、標的がSIOとハイブリダイズした場合にのみ、標的を切断して第1のDFを生成することができる、請求項206記載のキット。
【請求項２０９】
第1のヌクレアーゼが制限酵素ではない、請求項208記載のキット。
【請求項２１０】
第1のヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼである、請求項206〜209のいずれか一項記載のキット。
【請求項２１１】
第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼが同じヌクレアーゼである、請求項206〜210のいずれか一項記載のキット。
【請求項２１２】
第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼが異なるヌクレアーゼである、請求項206〜210のいずれか一項記載のキット。
【請求項２１３】
第1のヌクレアーゼが、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、請求項198〜206のいずれか一項記載のキット。
【請求項２１４】
第2のヌクレアーゼが、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、請求項206〜212のいずれか一項記載のキット。
【請求項２１５】
前記ニックが、ヌクレアーゼ認識部位内に、ヌクレアーゼ切断部位に、またはヌクレアーゼ認識部位と切断部位の間に位置する、請求項213または請求項214記載のキット。
【請求項２１６】
前記ヌクレアーゼが、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspR Iからなる群より選択される、請求項213〜215のいずれか一項記載のキット。
【請求項２１７】
EAS1およびEAS2が、EAS1およびEAS2の相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、ならびにEAS1の一方の末端とEAS2の一方の末端を連結するヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である、請求項195〜216のいずれか一項記載のキット。
【請求項２１８】
ヘアピンオリゴヌクレオチドが、EAS1またはEAS2のいずれかから伸長した一本鎖5'または3'オーバーハング部分を含む、請求項217記載のキット。
【請求項２１９】
EAS1またはEAS2の一部が第2のDFを含み、かつ第2のDFが、ヌクレアーゼによる第1のCESA複合体の修飾時に放出され得る、請求項195〜218のいずれか一項記載のキット。
【請求項２２０】
ヘアピンループ部分の一部が第2のDFを含み、かつ第2のDFが、ヌクレアーゼによる第1のCESA複合体の修飾時に放出され得る、請求項217〜218のいずれか記載のキット。
【請求項２２１】
第1のDFと第2のDFが同一ではない、請求項219または請求項220記載のキット。
【請求項２２２】
第1のDFと第2のDFが同一である、請求項219または請求項220記載のキット。
【請求項２２３】
第2のDFが第1のDFの断片であるか、または第1のDFが第2のDFの断片である、請求項219または請求項220記載のキット。
【請求項２２４】
第2のDF、EAS1、およびEAS2が組織化して、第1のCESA複合体を形成することができる、請求項222または請求項223記載のキット。
【請求項２２５】
第3の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS3)および第4の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS4)をさらに含む、キットであって、EAS3の一部がEAS4の一部と相補的であり、かつEAS3の一部が第2のDFの一部と相補的であり、かつEAS3およびEAS4が、第2のDFと組織化した場合にのみ、付加的なヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第2のCESA複合体を形成する、請求項219〜221のいずれか一項記載のキット。
【請求項２２６】
EAS3またはEAS4が第3のDFを含む、請求項225記載のキット。
【請求項２２７】
第3のDFが第1のDFと同一である、請求項226記載のキット。
【請求項２２８】
第3のDFが第1のDFと同一ではない、請求項226記載のキット。
【請求項２２９】
付加的なヌクレアーゼがキット中の別のヌクレアーゼと同一である、請求項225〜228のいずれか一項記載のキット。
【請求項２３０】
付加的なヌクレアーゼがキット中の別のヌクレアーゼと同一ではなく、かつキットが該付加的なヌクレアーゼを含む、請求項225〜228のいずれか一項記載のキット。
【請求項２３１】
付加的なヌクレアーゼが、第2のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、請求項225〜230のいずれか一項記載のキット。
【請求項２３２】
前記ヌクレアーゼが、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspR Iからなる群より選択される、請求項225〜231のいずれか一項記載のキット。
【請求項２３３】
EAS3およびEAS4が、EAS3およびEAS4の相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、ならびにEAS3の一方の末端とEAS4の一方の末端を連結するヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である、請求項225〜232のいずれか一項記載のキット。
【請求項２３４】
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドが、EAS3またはEAS4のいずれかから伸長した一本鎖5'または3'オーバーハング部分を含む、請求項233記載のキット。
【請求項２３５】
骨格オリゴヌクレオチド、EAS1、EAS2、EAS3、およびEAS4を含む第1の複合体を含むキットであって、該骨格オリゴヌクレオチドが：
(i) EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、EAS2の一部は第1のDFの一部と相補的であり、かつEAS1またはEAS2の一部は第2のDFを含み、EAS1およびEAS2は、第1のDFと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成し、第1のDFの前記EAS1への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識部位および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位を完成する、EAS1を含む第1の部分；
(ii) EAS3の一部はEAS4の一部と相補的であり、EAS3の一部は第2のDFの一部と相補的であり、かつEAS3またはEAS4の一部は第1のDFを含み、かつEAS3およびEAS4は、第2のDFと組織化した場合にのみ、第2のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第2のCESA複合体を形成する、EAS3を含む第2の部分；ならびに
(iii) 第1の部分と第2の部分を接続する第3の部分
を含む、キット。
【請求項２３６】
骨格オリゴヌクレオチド、第5の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS5)、第6の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS6)、第7の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS7)、および第8の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS8)を含む第2の複合体をさらに含む、キットであって、該骨格オリゴヌクレオチドが：
(i) EAS5の一部はEAS6の一部と相補的であり、EAS5の一部は第2のDFの一部と相補的であり、かつEAS5またはEAS6の一部は第1のDFを含み、かつEAS5およびEAS6は、第2のDFと組織化した場合にのみ、第3のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第3のCESA複合体を形成する、EAS5を含む第1の部分；ならびに
(ii) EAS7の一部はEAS8の一部と相補的であり、EAS8の一部は第1のDFの一部と相補的であり、かつEAS7またはEAS8の一部は第2のDFを含み、かつEAS7およびEAS8は、第1のDFと組織化した場合にのみ、第4のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第4のCESA複合体を形成する、EAS7を含む第2の部分；ならびに
(iii) 第1の部分と第2の部分を接続する第3の部分であって、第1の複合体の骨格の第3の部分と相補的である、第3の部分
を含む、請求項235記載のキット。
【請求項２３７】
EAS1がEAS7と同一であり、EAS2がEAS8と同一であり、EAS3がEAS5と同一であり、かつ/またはEAS4がEAS6と同一である、請求項236記載のキット。
【請求項２３８】
第1のヌクレアーゼが第3のヌクレアーゼと同一であり、かつ/または第2のヌクレアーゼが第4のヌクレアーゼと同一であり、かつ/または第1、第2、第3、および第4のヌクレアーゼが同一である、請求項236または請求項237記載のキット。
【請求項２３９】
第1の複合体と第2の複合体が、それらそれぞれの相補的な第3の部分を介してハイブリダイズして、第1の二重複合体を形成する、請求項236〜238のいずれか一項記載のキット。
【請求項２４０】
第1の二重複合体が第2の二重複合体に連結している、請求項239記載のキット。
【請求項２４１】
第1の二重複合体のEAS1〜EAS8のうちのいずれか1つまたは複数と第2の二重複合体のEAS1〜EAS8のうちのいずれか1つまたは複数の連結により、第1の二重複合体が第2の二重複合体に連結している、請求項240記載のキット。
【請求項２４２】
第1の二重複合体のEAS2および/またはEAS8と第2の二重複合体のEAS2および/またはEAS8との連結により、第1の二重複合体が第2の二重複合体に連結している、請求項240または請求項241記載のキット。
【請求項２４３】
連結が、化学的ハイブリダイゼーション、抗体、オリゴヌクレオチドリンカー、非オリゴヌクレオチドリンカー、およびペプチドリンカーのうちのいずれか1つまたは複数を用いて達成される、請求項241または請求項242記載のキット。
【請求項２４４】
連結が、酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドのうちのいずれか1つまたは複数のビオチン化、およびアビジンを用いた複数のビオチン化酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドの複合体化により達成される、請求項241または請求項242記載のキット。
【請求項２４５】
第1および/または第2のヌクレアーゼが、第2のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、請求項236〜244のいずれか一項記載のキット。
【請求項２４６】
第1および/または第2のヌクレアーゼが、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspR Iからなる群より選択される、請求項236〜245のいずれか一項記載のキット。
【請求項２４７】
EAS1およびEAS2；EAS3およびEAS4；EAS5およびEAS6；ならびにEAS7およびEAS8より選択される一対の酵素増幅因子基質が、該対の各メンバーの相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、および基部の一方の末端に連結しているヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である、請求項236〜246のいずれか一項記載のキット。
【請求項２４８】
以下のものを含むキット：
(i) 標的鎖と相補的な第1の部分および該標的鎖と相補的でない第2の部分を含むSIOであって、第1の部分と第2の部分はホスホロチオエートによって分離されており、かつ第2の部分は第1のDFを含む、SIO；ならびに
(ii) EAS1およびEAS2であって、
EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、EAS1とEAS2のハイブリダイゼーションは、両末端に3'オーバーハングを有する二重鎖構造を提供し、
EAS1の一部は第1のDFの一部と相補的であり、かつ
EAS1およびEAS2は、第1のDFと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼによって消化され得る陥凹3'末端を含む第1のCESA複合体を形成することができる、EAS1およびEAS2。
【請求項２４９】
SIOが、2つの相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、一本鎖ヘアピンループ、および3'オーバーハングを含むヘアピンオリゴヌクレオチドである、請求項248記載のキット。
【請求項２５０】
前記ヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼである、請求項248または249記載のキット。
【請求項２５１】
任意のEASが1つまたは複数の検出可能な標識を含む、請求項195〜250のいずれか一項記載のキット。
【請求項２５２】
任意のEASがフルオロフォア部分およびクエンチャー部分を含む、請求項195〜251のいずれか一項記載のキット。
【請求項２５３】
任意のMNAザイムパートザイム、MNAザイム基質、EAS1、EAS2、EAS3、EAS4、EAS5、EAS6、EAS7、EAS8、SIO、DF、またはヌクレアーゼが、固体支持体に付着している、請求項195〜252のいずれか一項記載のキット。
【請求項２５４】
第1のDFが標的とは異なる、請求項196、197、205、または206のいずれか一項記載のキット。
【請求項２５５】
標的分子の異なる部分に特異的な第1および第2のMNAザイムを含む、請求項196または請求項200記載のキット。
【請求項２５６】
標的分子の異なる部分に特異的なMNAザイムが、該標的の存在下で組織化した場合に、同じ基質を認識し切断する、請求項255記載のキット。
【請求項２５７】
異なる標的に対して特異性を有する少なくとも2つの異なるMNAザイムを含む、請求項196または請求項200記載のキット。
【請求項２５８】
異なる標的に対して相補性を有する少なくとも2つの異なるSIOを含む、請求項197、206、または248のいずれか一項記載のキット。
【請求項２５９】
請求項1〜87のいずれか一項記載の組成物を含むキット。
【請求項２６０】
キットを使用するための説明書をさらに含む、請求項195〜259のいずれか一項記載のキット。
【請求項２６１】
第1の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS1)および第2の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS2)を含む組成物であって、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、EAS1およびEAS2が、第1のドライバー断片オリゴヌクレオチド(DF)と組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識および切断配列を含む第1の完全酵素シグナル増幅因子(CESA)複合体を形成し、第1のDFの一部がEAS1の一部と相補的であり、かつ第1のDFが第1のヌクレアーゼの切断配列にすぐ隣接してEAS1に結合することができる、組成物。
【請求項２６２】
以下の段階を含む、標的を検出するための方法：
(a) 2つまたはそれ以上のパートザイムおよび少なくとも1つの多成分核酸(MNAザイム)基質を提供する段階であって、該パートザイムは標的の存在下で自己組織化して、少なくとも1つのMNAザイムを形成する、段階；
(b) MNAザイムの自己組織化および触媒活性を可能にする条件下で、標的を含むと推定される試料にパートザイムを接触させる段階であって、MNAザイムの触媒活性により、前記少なくとも1つのMNAザイム基質から第1のドライバー断片オリゴヌクレオチド(DF)が産生される、段階；
(c) 第1の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS1)および第2の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS2)を提供する段階であって、EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部は第1のDFの一部と相補的である、段階；
(d) 以下を可能にする条件下で、EAS1およびEAS2を第1のDFに接触させる段階であって：
(1) 第1の完全酵素シグナル増幅因子(CESA)複合体を形成するための、第1のDFとEAS1およびEAS2との組織化、ならびに
(2) 第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位の形成、
ここで、第1のDFの前記EAS1への結合が、第1のヌクレアーゼの切断部位にすぐ隣接している、段階；
(e) 第1のヌクレアーゼを提供する段階；ならびに
(f) ヌクレアーゼと認識部位との相互作用および切断部位での切断を可能にする条件下で、第1のヌクレアーゼを第1のCESA複合体と接触させる段階であって、第1のヌクレアーゼによる切断は、標的の存在を示す検出可能な影響をもたらす、段階。
【請求項２６３】
以下の段階を含む、標的を検出する方法：
(a) 少なくとも第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド(SIO)を提供する段階；
(b) SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、ひいては第1のヌクレアーゼの二重鎖基質を作出する条件下で、標的を含むと推定される試料とSIOを接触させる段階；
(c) SIOと標的のハイブリダイゼーションによって形成された二重鎖基質を切断し得る第1のヌクレアーゼを提供する段階であって、第1のヌクレアーゼによる二重鎖基質の切断により第1のDFが生成される、段階；
(d) EAS1およびEAS2を提供する段階であって、EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部は第1のDFの一部と相補的である、段階；
(e) 以下を可能にする条件下で、EAS1およびEAS2を第1のDFと接触させる段階であって：
(1) 第1のCESAを形成するための、第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化、ならびに
(2) 第2のヌクレアーゼの認識部位および切断部位の形成、
ここで、第1のDFの前記EAS1への結合が、第2のヌクレアーゼの切断部位にすぐ隣接している、段階；
(f) 第2のヌクレアーゼを提供する段階；ならびに
(g) 第2のヌクレアーゼと認識部位との相互作用および切断部位での切断を可能にする条件下で、第2のヌクレアーゼを第1のCESAと接触させる段階であって、第2のヌクレアーゼによる切断は、標的の存在を示す検出可能な影響をもたらす、段階。
【請求項２６４】
ヌクレアーゼ；ならびに
EAS1とEAS2の一部は相補的であり、EAS1およびEAS2は、ドライバー断片オリゴヌクレオチドと組織化した場合にのみ、該ヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む複合体を形成し、かつ第1のDFがヌクレアーゼの切断部位にすぐ隣接してEAS1に結合することができる、EAS1およびEAS2
を含む、シグナルを増幅するためのキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照による組み入れ
本出願は、2010年11月19日に出願されたオーストラリア仮特許出願第2010905152号の優先権を主張し、その全内容は相互参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
技術分野
本発明は、標的の存在を示すシグナルを生成および増幅するために、核酸から構成される酵素および/またはタンパク質酵素を使用するための組成物および方法に関する。より具体的には、本発明は、部分的また完全な酵素基質としての機能を果たす核酸構造を含む組成物、および標的の検出を容易にするためにこれらの構造を使用するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヌクレアーゼ
ヌクレアーゼとは、核酸のヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合を切断する酵素である。デオキシリボヌクレアーゼはDNAに作用し、リボヌクレアーゼはRNAに作用するが、いくつかのヌクレアーゼは基質としてDNAおよびRNAの両方を利用する。
【０００４】
ヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼにさらに分類され得るが、いくつかの酵素は複数の機能を有し、エンドヌクレアーゼ活性およびエキソヌクレアーゼ活性の両方を示し得る。エンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する。対照的に、エキソヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖の末端でホスホジエステル結合を切断する。エキソヌクレアーゼは、DNA鎖またはRNA鎖の5'末端もしくは3'末端のいずれかから、または両末端からヌクレオチドを除去し得る。フラップエンドヌクレアーゼは、二本鎖オリゴヌクレオチドの分岐末端を認識し、最初の重複塩基後で一本鎖5'アームを除去して2つのオリゴヌクレオチド間に3'ヒドロキシルニックを残す構造特異的5'エンドヌクレアーゼである。
【０００５】
ヌクレアーゼは、分子生物学のためのツールとして広く用いられている。タンパク質エンドヌクレアーゼの例には、制限エンドヌクレアーゼ、マングビーン(Mung Bean)ヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼIV(大腸菌(E. coli))、RNase A、RNase I(大腸菌)、RNase III(大腸菌)、またはRNase H(大腸菌)が含まれる。タンパク質エキソヌクレアーゼの例には、エキソヌクレアーゼI(大腸菌)、エキソヌクレアーゼIII(大腸菌)、エキソヌクレアーゼVII、およびT7エキソヌクレアーゼが含まれる。DNAザイム、リボザイム、およびMNAザイム(MNAzyme)を含む触媒核酸もまたエンドヌクレアーゼとして機能し、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断し得る。
【０００６】
制限酵素
制限酵素(RE)または制限エンドヌクレアーゼとは、核酸の特異的な制限酵素認識(RER)部位または配列(RERS)を認識し、RERSにおいて、またはRERSから離れて核酸を切断する触媒タンパク質である。制限酵素は、分子生物学において最も広く用いられているツールの1つであり、それらは典型的に細菌または古細菌から精製される。例えば、EcoRIは大腸菌(Escherichia coli)から精製され、Hind IIIはインフルエンザ菌(Haemophilus influenza)から精製される。何千もの制限酵素が精製され特徴づけられており、250種を超える様々な制限酵素認識配列が同定されている。
【０００７】
制限酵素切断によって生じる末端の種類には、5'オーバーハングもしくは3'オーバーハングが存在する末端、または切断が平滑であり得る末端(オーバーハングなし)が含まれる。大部分の制限酵素は、二本鎖二重鎖の両鎖を切断する。ニッキング酵素は二本鎖DNA基質を必要とするが、一方の鎖のみが切断される。この種の酵素の例はNt.AlwIであり、これは配列GGATCNNNN/N (SEQ ID NO: 1)を認識し、フォワードスラッシュ(/)によって示される位置でこの鎖を切断する。大多数は基質として二本鎖DNAを必要とするが、一本鎖DNAを認識し切断する少数の制限酵素も報告されている。
【０００８】
触媒核酸酵素
触媒核酸酵素とは、核酸基質を修飾し得る核酸から構成される酵素(非タンパク質酵素)である。例えば、触媒核酸酵素は、DNA分子(DNAザイムまたはデオキシリボザイムまたはDNA酵素としても知られる)またはRNA分子(当技術分野でリボザイムとして知られる)、または複数のDNAもしくはRNA分子から構成される多成分核酸酵素(当技術分野でMNAザイムとして知られる)であってよい。触媒核酸エンドヌクレアーゼは、異なる核酸基質配列を特異的に認識し、切断する。DNAザイムおよびリボザイムは、RNA基質、DNA基質、および/またはキメラDNA/RNA基質を切断し得ることが示されている。触媒核酸酵素は、基質配列が最低限の配列要件を満たす場合にのみ、核酸基質(標的)を切断し得る。標的基質は、触媒核酸の基質認識ドメイン(結合アーム)と相補的でなければならず、基質は切断部位において特異的配列を含まなくてはならない。切断部位におけるそのような配列要件の例には、DNAザイム切断(10-23モデル)のためのプリン：ピリミジン配列の要件、およびハンマーヘッドリボザイムのための配列ウリジン：X、ただしXはA、C、またはUと等しくてよいが、Gとは等しくない、の要件が含まれる。10-23 DNAザイムは、特定のRNAホスホジエステル結合において核酸基質を切断し得るDNAザイムである。このDNAザイムは、2つの基質認識ドメイン(結合アーム)が隣接したデオキシヌクレオチド15個の触媒ドメインを有する。DNAザイムおよびリボザイムの場合、認識される標的基質配列は、切断される分子と同じ分子である。
【０００９】
MNAザイムとは、組織化助長因子(assembly facilitator)の存在下で組織化し、そうして初めて触媒活性を有する多成分核酸酵素である。これらの酵素は、1つまたは複数の組織化助長因子の存在下で自己組織化し、基質を触媒修飾する活性MNAザイムを形成する複数の部分酵素、すなわちパートザイム(partzyme)から構成される。基質と組織化助長因子(標的)は、別個の核酸分子である。パートザイムは、(i) 組織化助長因子(標的核酸など)に結合するセンサーアーム；(ii) 基質と結合する基質アーム、および(iii) 組織化すると組み合わさって完全な触媒コアを提供する部分的触媒コア配列を有する。MNAザイムは、例えば異なる標的核酸配列を含む幅広い組織化助長因子を認識するように設計することができる。組織化助長因子の存在に応答して、MNAザイムはそれらの基質を修飾する。この基質修飾をシグナル生成と結びつけることができ、よってMNAザイムは酵素的に増幅された出力シグナルを生成し得る。組織化助長因子は、生体試料または環境試料中に存在する標的核酸であってよい。このような場合、MNAザイム活性による基質の修飾の検出は、標的の存在を示す。核酸基質を切断し得るいくつかのMNAザイムが報告されており、核酸基質を連結し得るさらなるMNAザイムもまた当技術分野で公知である。
【００１０】
標的検出またはシグナル増幅のために制限酵素を使用する方法
標的核酸の検出のために制限酵素(RE)を使用する方法は、当技術分野で公知である。制限酵素は、DNA中の一塩基多型(SNP)を特異的に認識することによって、遺伝子対立遺伝子を識別し得る。しかしながら、これは、SNPが、ある対立遺伝子内に存在する天然RERSを変化させる場合にのみ達成され得る。この方法では、配列決定を必要とせずに、制限酵素を用いてDNA試料の遺伝子型を同定することができる。REでゲノムDNAを消化した後、得られたDNA断片をゲル電気泳動によって分離し、解析することができる。稀な例では、天然RERS内に後天性の突然変異が偶然に存在する場合に、それらの突然変異が検出され得る。
【００１１】
異なる戦略を用いて、標的検出のためにREを利用する、いくつかの他の方法が公表されている。制限増幅アッセイとして知られる1つの方法は、検出される標的と相補的であり、かつ特異的RER部位を含む標的の領域にまたがる標識オリゴヌクレオチドプローブを使用する(米国特許第5,102,784号(特許文献1))。標識プローブと標的とのハイブリダイゼーション後、得られた二重鎖がREで切断され、切断されたプローブの検出によって標的の存在が示される。続いて、別の無傷のプローブが、第2の相補的オリゴヌクレオチドおよび切断された標的断片に結合し得る。この第2のオリゴヌクレオチドは、切断された標的断片にすぐ近接して結合し、RE部位の再構成をもたらして、別のプローブの切断を可能にする。このアプローチの不利点には、(i) 関心対象の領域内に特異的RERSを含む標的を有するという要件、および(ii) 任意の時点で切断可能な二重鎖の最大数が、存在する標的分子の元の数に等しいために、感度が限定されることが含まれる。関心対象の領域内に特異的RERSを含むという標的の要件によって、このアッセイの適応性が顕著に限定される。任意の時点でアッセイ中に存在するシグナル生成複合体の量は、存在する標的分子の数に限定され、これはシグナル強度、および十分なシグナル強度を得るために必要とされる実行時間に悪影響を及ぼすため、上記の第2の不利点もまた特に重要である。REを使用する標的検出アッセイの別の例は、ニッキングエンドヌクレアーゼシグナル増幅(NESA)と称される。制限増幅アッセイと同様に、この方法は、検出される標的と相補的であり、かつこの場合にはニッキングREのための特異的なRER部位を含む標的の領域にまたがる標識オリゴヌクレオチドプローブを使用する(Kiesling et al, NAR; 35; 18; e117, 2007(非特許文献1))。標識プローブと標的とのハイブリダイゼーション後、得られた二重鎖の一方の鎖がニッキングREで切断され、この切断によりプローブの解離が生じるが、標的は無傷のままである。プローブの切断は、特定の標的の存在を示すシグナルを生成する。次に、標的はさらなるプローブとハイブリダイズして、シグナルの増加をもたらし得る。この場合も同様に、このアプローチの不利点は、(i) 関心対象の領域内に特異的な天然RERS(この場合、具体的には、標的に隣接した数少ないニッキングRERSのうちの1つのRERS)を含む標的を有するという要件、および(ii) 任意の時点で切断可能な二重鎖の最大数が標的分子の元の数に等しいために、このアプローチの感度が限定されることである。
【００１２】
カスケード酵素シグナル増幅因子(Zou et al, Angew. Chem. Int Ed; 49 p1-5; 2010(非特許文献2))と称される別のプロトコールは、複数の段階、すなわち；(i) 2つのプローブが標的に結合して重複を生じ、これがフラップエンドヌクレアーゼによって切断される；(ii) 切断されたフラップ断片が、同様にループに結合している別のオリゴヌクレオチドに隣接した位置で分子ビーコンのループに結合し、次にT4リガーゼがこれら2つのオリゴヌクレオチドを結合(連結)し、これによりビーコンが開き、ニッキングREのためのRERSが作出される；次いで最後に(iii) ニッキングREがビーコンを切断し、連結された断片を放出して、これが別のビーコンに結合する段階を必要とする。この方法は、ニッキングRERSが標的中に天然に存在する特異的必要性を克服するが、本方法により、2つの断片が連結されて新たなRER部位を作出しなければならないことが教示される。さらに、本方法は厄介であり、エンドヌクレアーゼ、連結、および切断活性のそれぞれに特異的な3つの逐次的緩衝液を必要とする。
【００１３】
これらの方法はいずれも、特定の標的が都合のよい天然RERSを有するかどうかにかかわらず、最初の標的認識事象後に標的のシグナルを独立して増幅する様式で、標的の検出によって生じるシグナルを増幅するための簡便なプロトコールを提供するものではない。
【００１４】
他の標的およびシグナル増幅技術
標的検出の感度を高めるために、標的増幅またはシグナル増幅のための戦略が使用されている。標的増幅を使用する方法の例には、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)、鎖置換増幅(SDA)、ループ媒介性等温増幅(LAMP)、ローリングサークル増幅(RCA)、転写物媒介性増幅(TMA)；自律的配列複製(3SR)、または核酸配列に基づく増幅(NASBA)が含まれる。
【００１５】
触媒核酸を用いるシグナル増幅カスケードのいくつかの例は、当技術分野で公知である。連結カスケードは、オリゴヌクレオチドを含む2つのRNAを連結する第1のリボザイム(A)を用いて、第2のリボザイム(B)を形成する。次に、リボザイム(B)は、オリゴヌクレオチドを含む他の2つのRNAを連結して、新たな第1のリボザイム(A)を形成し、このようにしてカスケード反応を誘発する。他のシグナル増幅カスケードは、環状化DNAザイム/基質分子を用いる。DNAザイム(A)は環状である場合には不活性であるが、環状DNAザイム(A)を切断する第2のDNAザイム(B)による線状化によって活性化された状態になる。次に、活性のある線状DNAザイム(A)は環状DNAザイム(B)分子を切断して、それらを線状化し、活性化する。互いに切断/線状化し得る2つのDNAザイムが、触媒核酸活性のカスケードをもたらす。
【００１６】
例えば、DNAザイムの使用と、アプタマーの多用途性および/または伝統的なタンパク質酵素の触媒力を併用することを含む、他のアプローチが利用可能である。この方法はタンパク質酵素の放出をもたらし、今度はその酵素が検出可能な分子の形成を触媒し、それによってシグナルが生じ、増幅され得る。このアプローチにより高感度検出が可能になるが、各アッセイのために高度にカスタマイズされた分子を必要とするため、費用がかかる。代替的な方法には、例えば、反応を媒介する標識プローブに付着させた二次レポーター分子(例えば、アルカリホスファターゼ)を使用することによってシグナルを増幅する分枝DNAアッセイ(bDNA)が含まれる。チラミドシグナル増幅(TSA)法は、西洋ワサビペルオキシダーゼを用いてチラミドをその活性型に変換し、これがタンパク質中のチロシン残基に結合する。インベーダーアッセイはヌクレアーゼ切断を可能にして、時間と共に標的分子当たり1000を超える切断事象をもたらす。しかしながら、公知のシグナル増幅法には限界および欠陥がある。例えば、bDNAアッセイは、標的増幅法ほど高感度ではない。感度以外にも、公知のシグナル増幅アッセイは、実行時間の長期化、過度に複雑なプロトコール、および/またはコストの増加を含む他の不利点と関連づけられている。
【００１７】
したがって、シグナル増幅を組み入れた、核酸配列および他の標的を検出および定量するための新たな改良法の必要性が続いている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】米国特許第5,102,784号
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Kiesling et al, NAR; 35; 18; e117, 2007
【非特許文献２】Zou et al, Angew. Chem. Int Ed; 49 p1-5; 2010
【発明の概要】
【００２０】
第1の局面において、本発明は、第1の酵素増幅因子基質(Enzyme Amplifier Substrate)オリゴヌクレオチド(EAS1)および第2の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS2)を含む組成物であって、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、EAS1およびEAS2が、第1のドライバー断片オリゴヌクレオチド(DF)と組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識および切断配列を含む第1の完全酵素シグナル増幅因子(CESA)複合体を形成し、第1のDFの一部がEAS1の一部と相補的である、組成物を提供する。
【００２１】
第2の局面において、本発明は、EAS1、EAS2、および第1のヌクレアーゼを含む組成物であって、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、EAS1およびEAS2が、第1のDFと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成し、第1のDFの一部がEAS1の一部と相補的である、組成物を提供する。
【００２２】
第3の局面において、本発明は、多成分核酸酵素(MNAザイム)、MNAザイム基質、EAS1、EAS2、および第1のヌクレアーゼを含む組成物であって：
MNAザイムが、MNAザイム組織化助長因子の存在下で自己組織化してMNAザイムを形成する少なくとも第1のパートザイムおよび第2のパートザイムを含み、少なくとも第1および第2のパートザイムのそれぞれが基質アーム部分、触媒コア部分、およびセンサーアーム部分を含み、第1および第2のパートザイムをそれらそれぞれの触媒コア部分の会合のために近接して維持して、MNAザイムの触媒コアを形成するように、センサーアームがMNAザイム組織化助長因子と相互作用し、触媒コアがMNAザイム基質を修飾して第1のDFを形成することができ；
ならびに、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部が第1のDFの一部と相補的であり、第1のDFがEAS1およびEAS2と組織化して、少なくとも第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESA複合体を形成することができる、
組成物を提供する。
【００２３】
第3の局面の1つの態様において、MNAザイム基質は、第1の鎖および第2の鎖を含むオリゴヌクレオチド複合体の第1の鎖であり、第1の鎖は内部ループ部分を含み、内部ループ部分内の塩基は第2の鎖の塩基とハイブリダイズせず、MNAザイムは内部ループ部分を切断することができる。
【００２４】
第3の局面の1つの態様において、第2の鎖は第1のDFを含む。
【００２５】
第3の局面の1つの態様において、第1の鎖と第2の鎖はヘアピンループ部分によって一方の末端で連結されている。
【００２６】
第3の局面の1つの態様において、MNAザイム基質はヘアピンオリゴヌクレオチドのヘアピンループ部分であり、MNAザイムはヘアピンループ部分を切断することができ、第1のドライバー断片はヘアピンオリゴヌクレオチド内の二本鎖基部の一方の鎖中に位置する。
【００２７】
第3の局面の1つの態様において、組織化助長因子は、同定される標的である。
【００２８】
第4の局面において、本発明は、第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド(Synthetic Initiator Oligonucleotide, SIO)、EAS1、EAS2、第1のヌクレアーゼ、および第2のヌクレアーゼを含む組成物であって：
SIOが標的とハイブリダイズして二重鎖基質を形成することができ、第1のヌクレアーゼが二重鎖基質を切断して第1のDFを生成することができ；ならびに
EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部が第1のDFの一部と相補的であり、EAS1およびEAS2が、第1のDFと組織化した場合にのみ、第2のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成する、
組成物を提供する。
【００２９】
第5の局面において、本発明は、第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド(SIO)、EAS1、EAS2、および第1のヌクレアーゼ、および第2のヌクレアーゼを含む組成物であって：
SIOが標的とハイブリダイズして二重鎖構造を形成することができ、第1のヌクレアーゼが、SIOが標的とハイブリダイズした場合にのみ、SIOを切断して第1のDFを生成することができ；ならびに
EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部が第1のDFの一部と相補的であり、EAS1およびEAS2が、第1のDFと組織化した場合にのみ、第2のヌクレアーゼの認識および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成する、
組成物を提供する。
【００３０】
第6の局面において、本発明は、第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド(SIO)、EAS1、EAS2、第1のヌクレアーゼ、および第2のヌクレアーゼを含む組成物であって、
SIOが標的とハイブリダイズして二重鎖構造を形成することができ、第1のヌクレアーゼが、標的がSIOとハイブリダイズした場合にのみ、標的を切断して第1のDFを生成することができ；
EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部が第1のDFの一部と相補的であり、EAS1およびEAS2が、第1のDFと組織化した場合にのみ、第2のヌクレアーゼの認識および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成し；
ならびに、第1のヌクレアーゼが制限エンドヌクレアーゼではない、
組成物を提供する。
【００３１】
第4〜第6の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼは、SIOが標的とハイブリダイズした場合にのみ、SIOを切断して第1のDFを生成することができる。
【００３２】
第4〜第6の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼは、標的がSIOとハイブリダイズした場合にのみ、標的を切断して第1のDFを生成することができる。
【００３３】
第4〜第6の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼは制限酵素ではない。
【００３４】
第4〜第6の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼである。
【００３５】
第4〜第6の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼは同じヌクレアーゼである。
【００３６】
第4〜第6の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼは異なるヌクレアーゼである。
【００３７】
第4〜第6の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼは、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる。
【００３８】
第4〜第6の局面の1つの態様において、第2のヌクレアーゼは、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる。
【００３９】
第4〜第6の局面の1つの態様において、ニックは、ヌクレアーゼ認識部位内に、ヌクレアーゼ切断部位に、またはヌクレアーゼ認識部位と切断部位の間に位置する。
【００４０】
第4〜第6の局面の1つの態様において、ヌクレアーゼは、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspR Iからなる群より選択される。
【００４１】
第4〜第6の局面の1つの態様において、第1のDFのEAS1への結合は、部分的ヌクレアーゼ認識配列を完成する。
【００４２】
第1〜第6の局面の1つの態様において、第1のDFのEAS1への結合は、部分的ヌクレアーゼ切断配列を完成する。
【００４３】
第1〜第6の局面の1つの態様において、第1のDFは前記配列に少なくとも1つの塩基を寄与する。
【００４４】
第1〜第6の局面の1つの態様において、第1のDFは前記配列に少なくとも2つの塩基を寄与する。
【００４５】
第1〜第6の局面の1つの態様において、第1のDFは前記配列に少なくとも3つの塩基を寄与する。
【００４６】
第1〜第6の局面の1つの態様において、前記塩基は、EAS1とEAS2の結合によって形成される部分的ヌクレアーゼ認識部位のすぐ3'側にある。
【００４７】
第1〜第6の局面の1つの態様において、前記塩基は、EAS1とEAS2の結合によって形成される部分的ヌクレアーゼ認識部位のすぐ5'側にある。
【００４８】
第1〜第6の局面の1つの態様において、第1のDFはヌクレアーゼ認識配列またはヌクレアーゼ切断配列に塩基を寄与しない。
【００４９】
第1〜第6の局面の1つの態様において、EAS1およびEAS2は、EAS1およびEAS2の相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、ならびにEAS1の一方の末端とEAS2の一方の末端を連結するヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である。
【００５０】
第1〜第6の局面の1つの態様において、ヘアピンループ部分はオリゴヌクレオチドリンカーまたは非オリゴヌクレオチドリンカーである。
【００５１】
第1〜第6の局面の1つの態様において、ヘアピンオリゴヌクレオチドは、EAS1またはEAS2のいずれかから伸長した一本鎖5'または3'オーバーハング部分を含む。
【００５２】
第1〜第6の局面の1つの態様において、EAS1またはEAS2の一部は第2のDFを含み、第2のDFは、ヌクレアーゼによる第1のCESA複合体の修飾時に放出され得る。
【００５３】
第1〜第6の局面の1つの態様において、ヘアピンループ部分の一部は第2のDFを含み、第2のDFは、ヌクレアーゼによる第1のCESA複合体の修飾時に放出され得る。
【００５４】
第1〜第6の局面の1つの態様において、第1のDFと第2のDFは同一ではない。
【００５５】
第1〜第6の局面の1つの態様において、第1のDFと第2のDFは同一である。
【００５６】
第1〜第6の局面の1つの態様において、第2のDFは第1のDFの断片であるか、または第1のDFは第2のDFの断片である。
【００５７】
第1〜第6の局面の1つの態様において、第2のDF、EAS1、およびEAS2は組織化して、第1のCESA複合体を形成することができる。
【００５８】
第1〜第6の局面の1つの態様において、組成物は、第3の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS3)および第4の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS4)をさらに含み、EAS3の一部はEAS4の一部と相補的であり、かつEAS3の一部は第2のDFの一部と相補的であり、EAS3およびEAS4は、第2のDFと組織化した場合にのみ、付加的なヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第2のCESA複合体を形成する。
【００５９】
第1〜第6の局面の1つの態様において、EAS3またはEAS4は第3のDFを含む。
【００６０】
第1〜第6の局面の1つの態様において、第3のDFは第1のDFと同一である。
【００６１】
第1〜第6の局面の1つの態様において、第3のDFは第1のDFと同一ではない。
【００６２】
第1〜第6の局面の1つの態様において、付加的なヌクレアーゼは前記組成物中の別のヌクレアーゼと同一である。
【００６３】
第1〜第6の局面の1つの態様において、付加的なヌクレアーゼは前記組成物中の別のヌクレアーゼと同一ではなく、該組成物は該付加的なヌクレアーゼを含む。
【００６４】
第1〜第6の局面の1つの態様において、付加的なヌクレアーゼは、第2のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる。
【００６５】
第1〜第6の局面の1つの態様において、ヌクレアーゼは、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspR Iからなる群より選択される。
【００６６】
第1〜第6の局面の1つの態様において、第2のDFのEAS3への結合は、部分的ヌクレアーゼ認識配列および/またはヌクレアーゼ切断配列を完成する。
【００６７】
第1〜第6の局面の1つの態様において、第2のDFは、ヌクレアーゼ認識配列またはヌクレアーゼ切断配列に塩基を寄与しない。
【００６８】
第1〜第6の局面の1つの態様において、EAS3およびEAS4は、EAS3およびEAS4の相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、ならびにEAS3の一方の末端とEAS4の一方の末端を連結するヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である。
【００６９】
第1〜第6の局面の1つの態様において、ヘアピンループ部分はオリゴヌクレオチドリンカーまたは非オリゴヌクレオチドリンカーである。
【００７０】
第1〜第6の局面の1つの態様において、ヘアピンオリゴヌクレオチドは、EAS3またはEAS4のいずれかから伸長した一本鎖5'または3'オーバーハング部分を含む。
【００７１】
第7の局面において、本発明は、骨格オリゴヌクレオチド、EAS1、EAS2、EAS3、およびEAS4を含む第1の複合体を含む組成物であって、該骨格オリゴヌクレオチドが：
(i) EAS1を含む第1の部分、ただし、EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、EAS2の一部は第1のDFの一部と相補的であり、EAS1またはEAS2の一部は第2のDFを含み、EAS1およびEAS2は、第1のDFと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成する；
(ii) EAS3を含む第2の部分、ただし、EAS3の一部はEAS4の一部と相補的であり、EAS3の一部は第2のDFの一部と相補的であり、EAS3またはEAS4の一部は第1のDFを含み、EAS3およびEAS4は、第2のDFと組織化した場合にのみ、第2のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第2のCESA複合体を形成する；ならびに
(iii) 第1の部分と第2の部分を接続する第3の部分
を含む、組成物を提供する。
【００７２】
第7の局面の1つの態様において、組成物は、骨格オリゴヌクレオチド、第5の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS5)、第6の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS6)、第7の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS7)、および第8の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS8)を含む第2の複合体をさらに含み、該骨格オリゴヌクレオチドは：
(i) EAS5を含む第1の部分、ただし、EAS5の一部はEAS6の一部と相補的であり、EAS5の一部は第2のDFの一部と相補的であり、EAS5またはEAS6の一部は第1のDFを含み、EAS5およびEAS6は、第2のDFと組織化した場合にのみ、第3のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第3のCESA複合体を形成する；ならびに
(ii) EAS7を含む第2の部分、ただし、EAS7の一部はEAS8の一部と相補的であり、EAS8の一部は第1のDFの一部と相補的であり、EAS7またはEAS8の一部は第2のDFを含み、EAS7およびEAS8は、第1のDFと組織化した場合にのみ、第4のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第4のCESA複合体を形成する；ならびに
(iii) 第1の部分と第2の部分を接続する第3の部分、ただし、第3の部分は第1の複合体の骨格の第3の部分と相補的である
を含む。
【００７３】
第7の局面の1つの態様において、EAS1はEAS7と同一であり、EAS2はEAS8と同一であり、EAS3はEAS5と同一であり、および/またはEAS4はEAS6と同一である。
【００７４】
第7の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼは第3のヌクレアーゼと同一であり、ならびに/または第2のヌクレアーゼは第4のヌクレアーゼと同一であり、ならびに/または第1、第2、第3、および第4のヌクレアーゼは同一である。
【００７５】
第7の局面の1つの態様において、第1の複合体と第2の複合体は、それらそれぞれの相補的な第3の部分を介してハイブリダイズして、第1の二重複合体を形成する。
【００７６】
第7の局面の1つの態様において、第1の二重複合体は第2の二重複合体に連結している。
【００７７】
第7の局面の1つの態様において、第1の二重複合体のEAS1〜EAS8のうちのいずれか1つまたは複数と第2の二重複合体のEAS1〜EAS8のうちのいずれか1つまたは複数の連結により、第1の二重複合体は第2の二重複合体に連結している。
【００７８】
第7の局面の1つの態様において、第1の二重複合体のEAS2および/またはEAS8と第2の二重複合体のEAS2および/またはEAS8の連結により、第1の二重複合体は第2の二重複合体に連結している。
【００７９】
第7の局面の1つの態様において、連結は、化学的ハイブリダイゼーション、抗体、オリゴヌクレオチドリンカー、非オリゴヌクレオチドリンカー、共有結合、およびペプチドリンカーのうちのいずれか1つまたは複数を用いて達成される。
【００８０】
第7の局面の1つの態様において、連結は、酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドのうちのいずれか1つまたは複数のビオチン化、およびアビジンを用いた複数のビオチン化酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドの複合体化により達成される。
【００８１】
第7の局面の1つの態様において、第1および/または第2のヌクレアーゼは、第2のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる。
【００８２】
第7の局面の1つの態様において、第1および/または第2のヌクレアーゼは、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspR Iからなる群より選択される。
【００８３】
第7の局面の1つの態様において、第1のDFのEAS2もしくはEAS8への結合、および/または第2のDFのEAS3もしくはEAS5への結合は、部分的ヌクレアーゼ認識配列および/または部分的ヌクレアーゼ切断配列を完成する。
【００８４】
第7の局面の1つの態様において、第1のDFのEAS2もしくはEAS8への結合、および/または第2のDFのEAS3もしくはEAS5への結合は、ヌクレアーゼ認識配列またはヌクレアーゼ切断配列に塩基を寄与しない。
【００８５】
第7の局面の1つの態様において、EAS1およびEAS2；EAS3およびEAS4；EAS5およびEAS6；ならびにEAS7およびEAS8より選択される一対の酵素増幅因子基質は、該対の各メンバーの相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、および基部の一方の末端に連結しているヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である。
【００８６】
第7の局面の1つの態様において、ヘアピンループ部分はオリゴヌクレオチドリンカーまたは非オリゴヌクレオチドリンカーである。
【００８７】
第7の局面の1つの態様において、ヘアピンオリゴヌクレオチドは一本鎖5'または3'オーバーハング部分を含む。
【００８８】
第8の局面において、本発明は、以下のものを含む組成物を提供する：
(i) 標的鎖と相補的な第1の部分および該標的鎖と相補的でない第2の部分を含むSIOであって、ただし、第1の部分と第2の部分はホスホロチオエートによって分離されており、第2の部分は第1のDFを含む、SIO；ならびに
(ii) EAS1およびEAS2、ただし
EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、EAS1とEAS2のハイブリダイゼーションは、両末端に3'オーバーハングを有する二重鎖構造を提供し、
EAS1の一部は第1のDFの一部と相補的であり、かつ
EAS1およびEAS2は、第1のDFと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼによって消化され得る陥凹3'末端を含む第1のCESA複合体を形成することができる、EAS1およびEAS2。
【００８９】
第8の局面の1つの態様において、SIOは、2つの相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、一本鎖ヘアピンループ、および3'オーバーハングを含むヘアピンオリゴヌクレオチドである。
【００９０】
第8の局面の1つの態様において、ヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼである。
【００９１】
第8の局面の1つの態様において、エキソヌクレアーゼは、一本鎖オリゴヌクレオチド、5個もしくはそれ以上の塩基の3'オーバーハングを含む二本鎖オリゴヌクレオチド、またはホスホロチオエートヌクレオチド間連結を消化することができない。
【００９２】
第1〜第8の局面の1つの態様において、任意の第1のDFは、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼを用いて生成される。
【００９３】
第1〜第8の局面の1つの態様において、エキソヌクレアーゼは、ヌクレアーゼBAL-31、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼIII、T7エキソヌクレアーゼ、T7エキソヌクレアーゼI、およびエキソヌクレアーゼTからなるより選択される。
【００９４】
第1〜第8の局面の1つの態様において、エキソヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼIIIである。
【００９５】
第1〜第8の局面の1つの態様において、エンドヌクレアーゼは、T7エンドヌクレアーゼI、RNase H、フラップヌクレアーゼ、またはマングビーンヌクレアーゼである。
【００９６】
第1〜第8の局面の1つの態様において、任意のEASは1つまたは複数の検出可能な標識を含む。
【００９７】
第1〜第8の局面の1つの態様において、任意のEASはフルオロフォア部分および/またはクエンチャー部分を含む。
【００９８】
第1〜第8の局面の1つの態様において、任意のパートザイム、組織化助長因子、MNAザイム基質、DF、EAS1、EAS2、EAS3、EAS4、EAS5、EAS6、EAS7、EAS8、またはSIOは、ホスホロチオエート、4-アセチルシチジン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウリジン、2'-O-メチルシチジン、5-カルボキシメチルアミノメチルチオウリジン、ジヒドロウリジン、2'-O-メチルプソイドウリジン、β D-ガラクトシルケオシン、2'-O-メチルグアノシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデノシン、1-メチルアデノシン、1-メチルプソイドウリジン、1-メチルグアノシン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアノシン、2-メチルアデノシン、2-メチルグアノシン、3-メチルシチジン、5-メチルシチジン、N6-メチルアデノシン、7-メチルグアノシン、5-メチルアミノメチルウリジン、5-メトキシアミノメチル-2-チオウリジン、β D-マンノシルメチルウリジン、5-メトキシカルボニルメチルウリジン、5-メトキシウリジン、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデノシン、N-((9-β-リボフラノシル-2-メチルチオプリン-6-イル)カルバモイル)スレオニン、N-((9-β-リボフラノシルプリン-6-イル)N-メチル-カルバモイル)スレオニン、ウリジン-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウリジン-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、プソイドウリジン、ケオシン、2-チオシチジン、5-メチル-2-チオウリジン、2-チオウリジン、4-チオウリジン、5-メチルウリジン、N-((9-β-D-リボフラノシルプリン-6-イル)カルバモイル)スレオニン、2'-O-メチル-5-メチルウリジン、2'-O-メチルウリジン、ワイブトシン、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン、β D-アラビノシルウリジン、およびβ D-アラビノシルチミジンからなる群より選択される、少なくとも1つのヌクレオチド置換または付加を含む。
【００９９】
第3の局面の1つの態様において、MNAザイムパートザイム、MNAザイム基質、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも1つは、アプタマーまたはその一部をさらに含む。
【０１００】
第3の局面の1つの態様において、アプタマーまたはその一部は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、それらの誘導体、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも1つを含む。
【０１０１】
第1〜第8の局面の1つの態様において、任意のMNAザイムパートザイム、MNAザイム基質、EAS1、EAS2、EAS3、EAS4、EAS5、EAS6、EAS7、EAS8、SIO、DF、またはヌクレアーゼは、固体支持体に付着している。
【０１０２】
第1、第2、および第7の局面の1つの態様において、第1のDFは標的の存在下でのみ産生される。
【０１０３】
第3の局面および第4〜第7の局面の1つの態様において、第1のDFは標的とは異なる。
【０１０４】
第1および第2の局面の1つの態様において、組成物は標的を検出するためのものであり、第1のDFは該標的とは異なる。
【０１０５】
第3の局面の1つの態様において、任意のEASは、別のEASとハイブリダイズして、複数のDFとハイブリダイズし得る部分的酵素シグナル増幅因子(PESA)複合体を形成することができる。
【０１０６】
第3の局面の1つの態様において、組成物は、標的分子の異なる部分に特異的な第1および第2のMNAザイムを含む。
【０１０７】
第3の局面の1つの態様において、標的分子の異なる部分に特異的なMNAザイムは、該標的の存在下で組織化した場合に、同じ基質を認識し切断する。
【０１０８】
第3の局面の1つの態様において、組成物は、異なる標的に対して特異性を有する少なくとも2つの異なるMNAザイムを含む。
【０１０９】
第4〜第6および第8の局面の1つの態様において、組成物は、異なる標的に対して相補性を有する少なくとも2つの異なるSIOを含む。
【０１１０】
第4〜第6および第8の局面の1つの態様において、組成物は、異なる第1のDFと組織化される少なくとも2つの異なる第1のCESA複合体を含む。
【０１１１】
第9の局面において、本発明は、以下の段階を含む、標的を検出するための方法を提供する：
(a) 2つまたはそれ以上のパートザイムおよび少なくとも1つの多成分核酸(MNAザイム)基質を提供する段階であって、パートザイムは標的の存在下で自己組織化して、少なくとも1つのMNAザイムを形成する、段階；
(b) MNAザイムの自己組織化および触媒活性を可能にする条件下で、標的を含むと推定される試料とパートザイムを接触させる段階であって、MNAザイムの触媒活性により、少なくとも1つのMNAザイム基質から第1のドライバー断片オリゴヌクレオチド(DF)が生成される、段階；
(c) 第1の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS1)および第2の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS2)を提供する段階であって、EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部は第1のDFの一部と相補的である、段階；
(d) 以下を可能にする条件下で、EAS1およびEAS2を第1のDFと接触させる段階：
(1) 第1の完全酵素シグナル増幅因子(CESA)複合体を形成するための、第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化、ならびに
(2) 第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位の形成；
(e) 第1のヌクレアーゼを提供する段階；ならびに
(f) ヌクレアーゼと認識部位との相互作用および切断部位での切断を可能にする条件下で、第1のヌクレアーゼを第1のCESA複合体と接触させる段階であって、第1のヌクレアーゼによる切断は、標的の存在を示す検出可能な影響をもたらす、段階。
【０１１２】
第9の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼは、第1のヌクレアーゼの認識部位および/または切断部位を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる。
【０１１３】
第9の局面の1つの態様において、第1のDFは、MNAザイム基質の切断によって産生される。
【０１１４】
第9の局面の1つの態様において、第1のDFは、2つまたはそれ以上のMNAザイム基質の核酸連結によって産生される。
【０１１５】
第9の局面の1つの態様において、MNAザイム基質は、第1の鎖および第2の鎖を含むオリゴヌクレオチド複合体の第1の鎖であり、第1の鎖は内部ループ部分を含み、内部ループ部分内の塩基は第2の鎖の塩基とハイブリダイズせず、MNAザイムは内部ループ部分を切断することができる。
【０１１６】
第9の局面の1つの態様において、第2の鎖は第1のDFを含む。
【０１１７】
第9の局面の1つの態様において、第1の鎖と第2の鎖はヘアピンループ部分によって一方の末端で連結されている。
【０１１８】
第9の局面の1つの態様において、MNAザイム基質はヘアピンオリゴヌクレオチドのヘアピンループ部分であり、MNAザイムはヘアピンループ部分を切断することができ、第1のドライバー断片はヘアピンオリゴヌクレオチド内の二本鎖基部の一方の鎖中に位置する。
【０１１９】
第10の局面において、本発明は、以下の段階を含む、標的を検出する方法を提供する：
(a) 少なくとも第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド(SIO)を提供する段階；
(b) SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、ひいては第1のヌクレアーゼの二重鎖基質を作出する条件下で、標的を含むと推定される試料とSIOを接触させる段階；
(c) SIOと標的のハイブリダイゼーションによって形成された二重鎖基質を切断し得る第1のヌクレアーゼを提供する段階であって、第1のヌクレアーゼによる二重鎖基質の切断により第1のDFが生成される、段階；
(d) EAS1およびEAS2を提供する段階であって、EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部は第1のDFの一部と相補的である、段階；
(e) 以下を可能にする条件下で、EAS1およびEAS2を第1のDFと接触させる段階：
(1) 第1のCESAを形成するための、第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化、ならびに
(2) 第2のヌクレアーゼの認識部位および切断部位の形成；
(f) 第2のヌクレアーゼを提供する段階；ならびに
(g) 第2のヌクレアーゼと認識部位との相互作用および切断部位での切断を可能にする条件下で、第2のヌクレアーゼを第1のCESAと接触させる段階であって、第2のヌクレアーゼによる切断は、標的の存在を示す検出可能な影響をもたらす、段階。
【０１２０】
第11の局面において、本発明は、以下の段階を含む、標的を検出する方法を提供する：
(a) 少なくとも第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド(SIO)を提供する段階；
(b) SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、ひいては第1のヌクレアーゼのための二重鎖構造を作出する条件下で、標的を含むと推定される試料とSIOを接触させる段階；
(c) SIOが標的とハイブリダイズした場合にのみSIOを切断し得る第1のヌクレアーゼと二重鎖構造を接触させる段階であって、第1のヌクレアーゼはSIOを切断して第1のDFを生成する、段階；
(d) EAS1およびEAS2を提供する段階であって、EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部は第1のDFの一部と相補的である、段階；
(e) 以下を可能にする条件下で、EAS1およびEAS2を第1のDFと接触させる段階：
(1) 第1のCESAを形成するための、第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化、ならびに
(2) 第2のヌクレアーゼの認識部位および切断部位の形成；
(f) 第2のヌクレアーゼを提供する段階；ならびに
(g) 第2のヌクレアーゼと認識部位との相互作用および切断部位での切断を可能にする条件下で、第2のヌクレアーゼを第1のCESAと接触させる段階であって、第2のヌクレアーゼによる切断は、標的の存在を示す検出可能な影響をもたらす、段階。
【０１２１】
第12の局面において、本発明は、以下の段階を含む、標的を検出する方法を提供する：
(a) 少なくとも第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド(SIO)を提供する段階；
(b) SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、ひいては第1のヌクレアーゼのための二重鎖構造を作出する条件下で、標的を含むと推定される試料とSIOを接触させる段階；
(c) 標的がSIOとハイブリダイズした場合にのみ標的を切断し得る第1のヌクレアーゼと二重鎖構造を接触させる段階であって、第1のヌクレアーゼは標的を切断して第1のDFを生成する、段階；
(d) EAS1およびEAS2を提供する段階であって、EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部は第1のDFの一部と相補的である、段階；
(e) 以下を可能にする条件下で、EAS1およびEAS2を第1のDFと接触させる段階：
(1) 第1のCESAを形成するための、第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化、ならびに
(2) 第2のヌクレアーゼの認識部位および切断部位の形成；
(f) 第2のヌクレアーゼを提供する段階；ならびに
(g) 第2のヌクレアーゼと認識部位との相互作用および切断部位での切断を可能にする条件下で、第2のヌクレアーゼを第1のCESAと接触させる段階であって、第2のヌクレアーゼによる切断は、標的の存在を示す検出可能な影響をもたらす、段階。
【０１２２】
第10〜第12の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼは、SIOが標的とハイブリダイズした場合にのみ、SIOを切断して第1のDFを生成する。
【０１２３】
第10〜第12の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼは、標的がSIOとハイブリダイズした場合にのみ、標的を切断して第1のDFを生成する。
【０１２４】
第10〜第12の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼは制限酵素ではない。
【０１２５】
第10〜第12の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼである。
【０１２６】
第10〜第12の局面の1つの態様において、第1のCESA複合体の切断によりさらなるDFの放出が可能になり、さらなるDFはさらなる酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドと組織化してさらなるCESA複合体を形成し、少なくとも1つのヌクレアーゼを用いてさらなるCESA複合体が切断されて、さらなる検出可能な影響がもたらされ、かつさらなるDFが放出され、それによって検出可能な影響のさらなる増加が促進される。
【０１２７】
第13の局面において、本発明は、以下の段階を含む、カスケードを用いて標的を検出する方法を提供する：
(a) 第1のDFを生成する段階であって、第1のDFは標的の存在下でのみ生成される、段階；
(b) 以下のものを提供する段階：
(i) EAS1およびEAS2、ただし：
EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり：
EAS1の一部は第1のDFの一部と相補的であり；かつ
EAS1またはEAS2の一部は第2のDFを含む；
ならびに、
(ii) 第3の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS3)および第4の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS4)、ただし：
EAS3の一部はEAS4の一部と相補的であり；
EAS3の一部は第2のDFの一部と相補的である；
(c) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化を可能にして、第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESA複合体を形成させる条件下における、EAS1およびEAS2と(a)の第1のDF；
(ii) 第1のヌクレアーゼと第1のCESA複合体の認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第1のCESA複合体と第1のヌクレアーゼ、ただし、第1のヌクレアーゼによる切断部位での切断により第2のDFが放出される；
(d) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第2のDFとEAS3およびEAS4の組織化を可能にして、第2のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第2のCESA複合体を形成させる条件下における、EAS3およびEAS4と第2のDF；
(ii) 第2のヌクレアーゼと第2のCESA複合体の認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第2のCESA複合体と第2のヌクレアーゼ、ただし、第2のヌクレアーゼは該切断部位で第2のCESA複合体を切断する；
ただし、第1のCESA複合体および/または第2のCESA複合体の切断は、検出可能な影響をもたらす。
【０１２８】
第13の局面の1つの態様において、第1のCESA複合体および第2のCESA複合体の切断はそれぞれ、検出可能な影響をもたらす。
【０１２９】
第13の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼは同じヌクレアーゼである。
【０１３０】
第13の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼは異なるヌクレアーゼである。
【０１３１】
第13の局面の1つの態様において、EAS3またはEAS4の一部は付加的なDFを含み、第2のヌクレアーゼによる第2のCESA複合体の切断部位での切断により、該付加的なDFが放出される。
【０１３２】
第13の局面の1つの態様において、付加的なDFの一部は第5の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS5)の第1の部分と相補的であり、EAS5の第2の部分は第6の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS6)の一部と相補的であり、かつEAS5およびEAS6は該付加的なDFと組織化して、第3のCESA複合体を形成する。
【０１３３】
第13の局面の1つの態様において：
(i) 付加的なDFの一部は第1のDFと同一であるか；
(ii) 付加的なDFは第1のDFと同一であるか；または
(iii) 付加的なDFは第1のDFの断片であり；
該付加的なDFはEAS1およびEAS2と組織化して、第1のCESA複合体を形成することができる。
【０１３４】
第14の局面において、本発明は、以下の段階を含む、カスケードを用いて複数の異なる標的を検出する方法を提供する：
(a) 少なくとも第1のDFおよび第2のDFを産生する段階であって、第1のDFは第1の標的の存在下でのみ生成され、第2のDFは第2の標的の存在下でのみ産生される、段階；
(b) 以下のものを提供する段階：
(i) EAS1およびEAS2、ただし：
EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり：
EAS1の一部は第1のDFの一部と相補的である；ならびに、
(ii) EAS3およびEAS4、ただし：
EAS3の一部はEAS4の一部と相補的であり：
EAS3の一部は第2のDFの一部と相補的である；
(c) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化を可能にして、第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESA複合体を形成させる条件下における、EAS1およびEAS2と(a)の第1のDF；
(ii) 第1のヌクレアーゼと第1のCESA複合体の認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第1のCESA複合体と第1のヌクレアーゼ、ただし、第1のヌクレアーゼは該切断部位で第1のCESA複合体を切断して、第1の検出可能な影響をもたらす；
(d) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第2のDFとEAS3およびEAS4の組織化を可能にして、第2のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第2のCESA複合体を形成させる条件下における、EAS3およびEAS4と第2のDF；
(ii) 第2のヌクレアーゼと第2のCESA複合体の認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第2のCESA複合体と第2のヌクレアーゼ、ただし、第2のヌクレアーゼは該切断部位で第2のCESA複合体を切断して、第2の検出可能な影響をもたらす；
ただし、第1の検出可能な影響は第2の検出可能な影響とは異なる。
【０１３５】
第14の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼは同じヌクレアーゼである。
【０１３６】
第14の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼは異なるヌクレアーゼである。
【０１３７】
第14の局面の1つの態様において：
(i) EAS1またはEAS2の一部は付加的なDFを含み、第1のヌクレアーゼによる第1のCESA複合体の切断部位での切断により、該付加的なDFが放出される；および
(ii) 該付加的なDFは少なくとも2つの付加的なEASオリゴヌクレオチドと組織化して付加的なCESA複合体を形成し、ヌクレアーゼによる該付加的なCESA複合体の切断により、第1の検出可能な影響が増加する。
【０１３８】
第14の局面の1つの態様において：
(i) EAS3またはEAS4の一部は付加的なDFを含み、第2のヌクレアーゼによる第2のCESA複合体の切断部位での切断により、該付加的なDFが放出される；および
(ii) 該付加的なDFは少なくとも2つの付加的なEASオリゴヌクレオチドと組織化して付加的なCESA複合体を形成し、ヌクレアーゼによる該付加的なCESA複合体の切断により、第2の検出可能な影響が増加する。
【０１３９】
第15の局面において、本発明は、以下の段階を含む、カスケードを用いて標的を検出する方法を提供する：
(a) 第1のドライバー断片を生成する段階であって、第1のドライバー断片は標的の存在下でのみ提供される、段階；
(b) 以下のものを提供する段階：
(i) EAS1およびEAS2、ただし：
EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり；
EAS1の一部は第1のDFの一部と相補的であり； 
EAS1またはEAS2の一部は第2のDFを含み；かつ
EAS1またはEAS2は支持体に連接されている；
(ii) EAS3およびEAS4、ただし：
EAS3の一部はEAS4の一部と相補的であり：
EAS3の一部は第2のDFの一部と相補的であり；
EAS3またはEAS4の一部は第3のDFを含み；かつ
EAS3またはEAS4は支持体に連接されている；
(c) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化を可能にして、第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESAを形成させる条件下における、EAS1およびEAS2と(a)の第1のDF；
(ii) 第1のヌクレアーゼと第1のCESAの認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第1のCESAと第1のヌクレアーゼ、ただし、第1のものによる該切断部位での切断により第2のDFが放出される；
(d) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第2のDFとEAS3およびEAS4の組織化を可能にして、第2のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第2のCESAを形成させる条件下における、EAS3およびEAS4と第2のDF；
(ii) 第2のヌクレアーゼと第2のCESAの認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第2のCESAと第2のヌクレアーゼ、ただし、第2のヌクレアーゼによる該切断部位での切断により、EAS1およびEAS2と組織化して第1のCESAを形成し得る第3のDFが放出される；
ただし、第1のCESA複合体および/または第2のCESA複合体の切断は、検出可能な影響をもたらす。
【０１４０】
第13〜第15の局面の1つの態様において、(a)の第1のDFは、
SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、イニシエーターヌクレアーゼによる修飾に適した二重鎖構造を形成させる条件下で、標的を含むと推定される試料とSIOを接触させること、および
二重鎖構造をイニシエーターヌクレアーゼと接触させること
によって産生され、
イニシエーターヌクレアーゼによる二重鎖構造中の対形成または非対形成領域の修飾により、第1のDFが放出される。
【０１４１】
第14の局面の1つの態様において、(a)の第2のDFは、
SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、イニシエーターヌクレアーゼによる修飾に適した二重鎖構造を形成させる条件下で、標的を含むと推定される試料とSIOを接触させること、および
二重鎖構造をイニシエーターヌクレアーゼと接触させること
によって産生され、
イニシエーターヌクレアーゼによる二重鎖構造中の対形成または非対形成領域の修飾により、第2のDFが放出される。
【０１４２】
第13〜第15の局面の1つの態様において、イニシエーターヌクレアーゼは、SIOが標的とハイブリダイズした場合にのみ、SIOを切断して前記DFを生成する。
【０１４３】
第13〜第15の局面の1つの態様において、イニシエーターヌクレアーゼは、標的がSIOとハイブリダイズした場合にのみ、標的を切断して前記DFを生成する。
【０１４４】
第13〜第15の局面の1つの態様において、イニシエーターヌクレアーゼは制限酵素ではない。
【０１４５】
第13〜第15の局面の1つの態様において、イニシエーターヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼである。
【０１４６】
第13〜第15の局面の1つの態様において、SIOは支持体に付着している。
【０１４７】
第13〜第15の局面の1つの態様において、(a)の第1のDFは、2つまたはそれ以上のパートザイムおよび少なくとも1つのMNAザイム基質を提供すること、および標的を含むと推定される試料とパートザイムを、該標的の存在下でMNAザイムの自己組織化および触媒活性を可能にする条件下で接触させることによって産生され、該触媒活性により該基質が修飾され、それによって第1のDFを提供する。
【０１４８】
第14の局面の1つの態様において、(a)の第2のDFは、2つまたはそれ以上のパートザイムおよび少なくとも1つのMNAザイム基質を提供すること、および標的を含むと推定される試料とパートザイムを、該標的の存在下でMNAザイムの自己組織化および触媒活性を可能にする条件下で接触させることによって産生され、該触媒活性により該基質が修飾され、それによって第2のDFを提供する。
【０１４９】
第13〜第15の局面の1つの態様において、MNAザイム基質は、第1の鎖および第2の鎖を含むオリゴヌクレオチド複合体の第1の鎖であり、第1の鎖は内部ループ部分を含み、内部ループ部分内の塩基は第2の鎖の塩基とハイブリダイズせず、MNAザイムは内部ループ部分を切断することができる。
【０１５０】
第13〜第15の局面の1つの態様において、第2の鎖は前記DFを含む。
【０１５１】
第13〜第15の局面の1つの態様において、第1の鎖と第2の鎖はヘアピンループ部分によって一方の末端で連結されている。
【０１５２】
第13〜第15の局面の1つの態様において、ヘアピンループ部分はオリゴヌクレオチドリンカーまたは非オリゴヌクレオチドリンカーである。
【０１５３】
第13〜第15の局面の1つの態様において、MNAザイム基質はヘアピンオリゴヌクレオチドのヘアピンループ部分であり、MNAザイムはヘアピンループ部分を切断することができ、前記ドライバー断片はヘアピンオリゴヌクレオチド内の二本鎖基部の一方の鎖中に位置する。
【０１５４】
第13〜第15の局面の1つの態様において、EAS3およびEAS4は、EAS3およびEAS4の相補的部分の間で形成される二本鎖部分、ならびにEAS3の一方の末端とEAS4の一方の末端を連結するヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチド複合体の成分である。
【０１５５】
第9〜第15の局面の1つの態様において、EAS1およびEAS2は、EAS1およびEAS2の相補的部分の間で形成される二本鎖部分、ならびにEAS1の一方の末端とEAS2の一方の末端を連結するヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチド複合体の成分である。
【０１５６】
第9〜第15の局面の1つの態様において、ヘアピンループ部分はオリゴヌクレオチドリンカーまたは非オリゴヌクレオチドリンカーである。
【０１５７】
第9〜第15の局面の1つの態様において、ヘアピンオリゴヌクレオチド複合体は、1つのEASオリゴヌクレオチドから伸長した5'または3'オーバーハング一本鎖部分をさらに含む。
【０１５８】
第9〜第15の局面の1つの態様において、ヘアピンループ部分は、検出可能な部分および/またはクエンチャー部分を含む。
【０１５９】
第9〜第15の局面の1つの態様において、EAS3および/またはEAS4は検出可能な部分および/またはクエンチャー部分を含み、検出可能な部分とクエンチャー部分は、第2のヌクレアーゼによる第2のCESAの切断時に分離して、検出可能な影響を提供する。
【０１６０】
第9〜第15の局面の1つの態様において、EAS3は検出可能な部分およびクエンチャー部分を含み、EAS4はさらなるクエンチャー部分を含み、検出可能な部分とさらなるクエンチャー部分は、第2のヌクレアーゼによる第2のCESAの切断時に分離して、検出可能な影響を提供する。
【０１６１】
第9〜第15の局面の1つの態様において、EAS1および/またはEAS2は検出可能な部分および/またはクエンチャー部分を含み、検出可能な部分とクエンチャー部分は、第1のヌクレアーゼによる第1のCESAの切断時に分離して、検出可能な影響を提供する。
【０１６２】
第9〜第15の局面の1つの態様において、EAS1は検出可能な部分およびクエンチャー部分を含み、EAS2はさらなるクエンチャー部分を含み、検出可能な部分とさらなるクエンチャー部分は、第1のヌクレアーゼによる第1のCESAの切断時に分離して、検出可能な影響を提供する。
【０１６３】
第9〜第15の局面の1つの態様において、検出可能な部分はフルオロフォアである。
【０１６４】
第9の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼは、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる。
【０１６５】
第10〜第12の局面の1つの態様において、第2のヌクレアーゼは、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる。
【０１６６】
第13〜第15の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼは、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができ、および/または第2のヌクレアーゼは、第2のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる。
【０１６７】
第9〜第15の局面の1つの態様において、ニックは、ヌクレアーゼ認識部位内に、ヌクレアーゼ切断部位に、またはヌクレアーゼ認識部位と切断部位の間に位置する。
【０１６８】
第9〜第15の局面の1つの態様において、ヌクレアーゼは、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspR Iからなる群より選択される。
【０１６９】
第9〜第15の局面の1つの態様において、第1のDFのEAS1への結合は、部分的ヌクレアーゼ認識部位および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位を完成する。
【０１７０】
第9〜第15の局面の1つの態様において、第2のDFのEAS2への結合は、部分的ヌクレアーゼ認識部位および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位を完成する。
【０１７１】
第9〜第15の局面の1つの態様において、前記DFは、部分的ヌクレアーゼ認識配列および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位に少なくとも1つの塩基を寄与する。
【０１７２】
第9〜第15の局面の1つの態様において、前記DFは、部分的ヌクレアーゼ認識部位および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位に少なくとも2つの塩基を寄与する。
【０１７３】

【０１７４】
第9〜第15の局面の1つの態様において、前記塩基は、酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドの結合によって形成される部分的ヌクレアーゼ認識部位のすぐ3'側にある。
【０１７５】
第9〜第15の局面の1つの態様において、前記塩基は、酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドの結合によって形成される部分的ヌクレアーゼ認識部位のすぐ5'側にある。
【０１７６】
第9〜第15の局面の1つの態様において、第1のDFは、ヌクレアーゼ認識部位またはヌクレアーゼ切断部位に塩基を寄与しない。
【０１７７】
第13〜第15の局面の1つの態様において、第2のDFは、ヌクレアーゼ認識部位またはヌクレアーゼ切断部位に塩基を寄与しない。
【０１７８】
第16の局面において、本発明は、以下の段階を含む、カスケードを用いて標的を検出する方法を提供する：
(a) 第1のドライバー断片を産生する段階であって、第1のドライバー断片は標的の存在下でのみ産生される、段階；
(b) 以下のものを含む第1の骨格オリゴヌクレオチドを含む第1の複合体を提供する段階：
(i) EAS1を含む第1の部分、ただし
EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり；
EAS2の一部は第1のドライバー断片の一部と相補的であり；かつ
EAS1またはEAS2の一部は第2のドライバー断片を含む；
(ii) EAS3を含む第2の部分、ただし
EAS3の一部はEAS4と相補的であり；
EAS3の一部は第2のドライバー断片の一部と相補的であり；かつ
EAS3またはEAS4の一部は第1のドライバー断片を含む；および
(iii) 第1の部分と第2の部分を接続する第3の部分；
ならびに、
(c) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化を可能にして、第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESAを形成させる条件下における、EAS1およびEAS2と(a)の第1のDF；
(ii) 第1のヌクレアーゼと第1のCESAの認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第1のCESAと第1のヌクレアーゼ、ただし、第1のヌクレアーゼによる該切断部位での切断により第2のDFが放出される；
(d) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第2のDFとEAS3およびEAS4の組織化を可能にして、第2のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第2のCESAを形成させる条件下における、EAS3およびEAS4と第2のDF；
(ii) 第2のヌクレアーゼと第2のCESAの認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第2のCESAと第2のヌクレアーゼ、ただし、第2のヌクレアーゼによる該切断部位での切断により、EAS1およびEAS2と組織化して第1のCESAを形成し得る第1のDFが放出される；
ただし、第1のCESA複合体および/または第2のCESA複合体の切断は、検出可能な影響をもたらす。
【０１７９】
第16の局面の1つの態様において、第1のCESA複合体の切断および第2のCESA複合体の切断はそれぞれ、検出可能な影響をもたらす。
【０１８０】
第16の局面の1つの態様において、方法は以下の段階をさらに含む：
(a) 以下のものを含む骨格オリゴヌクレオチドを含む第2の複合体を提供する段階：
(i) 第5の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS5)を含む第1の部分、ただし
EAS5の一部は第6の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS6)の一部と相補的であり；かつ
EAS5の一部は第2のドライバー断片の一部と相補的であり；かつ
EAS5またはEAS6の一部は第1のドライバー断片を含む；および
(ii) 第7の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS7)を含む第2の部分、ただし
EAS7の一部は第8の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS8)の一部と相補的であり；
EAS8の一部は第1のドライバー断片の一部と相補的であり；
EAS7またはEAS8の一部は第2のドライバー断片を含む；および
(iii) 第1の部分と第2の部分を接続する第3の部分、ただし、第3の部分は第1の複合体の骨格の第3の部分と相補的である；ならびに、
(b) 第1の複合体の第3の部分と第2の複合体の第3の部分のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、第1の複合体と第2の複合体を接触させ、それによって第1の二重複合体を形成させる段階；
(c) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第2のDFとEAS5およびEAS6の組織化を可能にして、第3のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第3のCESAを形成させる条件下における、EAS5およびEAS6と(a)の第2のDF；
(ii) 第3のヌクレアーゼと第3のCESAの認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第3のCESAと第3のヌクレアーゼ、ただし、第3のヌクレアーゼによる該切断部位での切断により、EAS1およびEAS2と組織化して第1のCESAを形成し得る、ならびにEAS7およびEAS8と組織化して第4のCESAを形成し得る第1のDFが放出される；ならびに
(d) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第1のDFとEAS7およびEAS8の組織化を可能にして、第4のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第4のCESAを形成させる条件下における、EAS7およびEAS8と第1のDF；
(ii) 第4のヌクレアーゼと第4のCESAの認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第4のCESAと第4のヌクレアーゼ、ただし、第4のヌクレアーゼによる該切断部位での切断により、EAS3およびEAS4と組織化して第2のCESAを形成し得る、ならびにEAS5およびEAS6と組織化して第3のCESAを形成し得る第2のDFが放出される；
ただし、第3のCESA複合体および/または第4のCESA複合体の切断は、検出可能な影響をもたらす。
【０１８１】
第16の局面の1つの態様において、第3のCESA複合体の切断および第4のCESA複合体の切断はそれぞれ、検出可能な影響をもたらす。
【０１８２】
第16の局面の1つの態様において、EAS1はEAS7と同一であり、EAS2はEAS8と同一であり、EAS3はEAS5と同一であり、および/またはEAS4はEAS6と同一である。
【０１８３】
第16の局面の1つの態様において、第1の二重複合体は第2の二重複合体に連結している。
【０１８４】
第16の局面の1つの態様において、第1の二重複合体のEAS1〜EAS8のうちのいずれか1つまたは複数と第2の二重複合体のEAS1〜EAS8のうちのいずれか1つまたは複数の連結により、第1の二重複合体は第2の二重複合体に結合している。
【０１８５】
第16の局面の1つの態様において、第1の二重複合体のEAS2および/またはEAS8と第2の二重複合体のEAS2および/またはEAS8の連結により、第1の二重複合体は第2の二重複合体に結合している。
【０１８６】
第16の局面の1つの態様において、連結は、化学的ハイブリダイゼーション、抗体、オリゴヌクレオチドリンカー、非オリゴヌクレオチドリンカー、およびペプチドリンカーのうちのいずれか1つまたは複数を用いて達成される。
【０１８７】
第16の局面の1つの態様において、連結は、酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドのうちのいずれか1つまたは複数のビオチン化、およびアビジンを用いた複数のビオチン化酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドの複合体化により達成される。
【０１８８】
第16の局面の1つの態様において、(a)の第1のDFは、
SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、イニシエーターヌクレアーゼによる修飾に適した二重鎖構造を形成させる条件下で、標的を含むと推定される試料とSIOを接触させること、および
二重鎖構造をイニシエーターヌクレアーゼと接触させること
によって産生され、
イニシエーターヌクレアーゼによる二重鎖構造中の対形成または非対形成領域の修飾により、第2のDFが放出される。
【０１８９】
第16の局面の1つの態様において、イニシエーターヌクレアーゼは、SIOが標的とハイブリダイズした場合にのみ、SIOを切断して前記DFを生成する。
【０１９０】
第16の局面の1つの態様において、イニシエーターヌクレアーゼは、標的がSIOとハイブリダイズした場合にのみ、標的を切断して前記DFを生成する。
【０１９１】
第16の局面の1つの態様において、イニシエーターヌクレアーゼは制限酵素ではない。
【０１９２】
第16の局面の1つの態様において、(a)の第1のDFは、2つまたはそれ以上のパートザイムおよび少なくとも1つのMNAザイム基質を提供すること、および標的を含むと推定される試料とパートザイムを、該標的の存在下でMNAザイムの自己組織化および触媒活性を可能にする条件下で接触させることによって生成され、該触媒活性により該基質が修飾され、それによって第1のDFが提供される。
【０１９３】
第16の局面の1つの態様において、EAS1、EAS2、EAS3、EAS4、EAS5、EAS6、EAS7、およびEAS8のうちのいずれか1つまたは複数は、検出可能な部分およびクエンチャー部分を含み、検出可能な部分とクエンチャー部分は、第1、第2、第3、および/または第4のCESAの切断時に分離して、検出可能な影響を提供する。
【０１９４】
第16の局面の1つの態様において：
(i) EAS1は検出可能な部分を含み、かつEAS2はクエンチャー部分を含む、もしくはその逆である；および/または
(ii) EAS3は検出可能な部分を含み、かつEAS4はクエンチャー部分を含む、もしくはその逆である；および/または
(iii) EAS5は検出可能な部分を含み、かつEAS6はクエンチャー部分を含む、もしくはその逆である；
(iv) EAS7は検出可能な部分を含み、かつEAS8はクエンチャー部分を含む、もしくはその逆である；
ただし、検出可能な部分とクエンチャー部分は、第1、第2、第3、および/または第4のCESAの切断時に分離して、検出可能な影響を提供する。
【０１９５】
第16の局面の1つの態様において、ヌクレアーゼは、第1、第2、または第3のヌクレアーゼの認識配列を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる。
【０１９６】
第16の局面の1つの態様において、ヌクレアーゼは、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspRIからなる群より選択される。
【０１９７】
第16の局面の1つの態様において、任意の前記DFの酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドへの結合は、部分的ヌクレアーゼ認識部位および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位を完成する。
【０１９８】
第9〜16の局面の1つの態様において、EAS1およびEAS2；EAS3およびEAS4；EAS5およびEAS6；ならびにEAS7およびEAS8より選択される一対の酵素増幅因子基質は、該対の各メンバーの相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、および基部の一方の末端に連結しているヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である。
【０１９９】
第9〜第16の局面の1つの態様において、任意の第1のDFは、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼより選択されるヌクレアーゼを用いて生成される。
【０２００】
第9〜第16の局面の1つの態様において、エキソヌクレアーゼは、ヌクレアーゼBAL-31、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼIII、T7エキソヌクレアーゼ、T7エキソヌクレアーゼI、およびエキソヌクレアーゼTからなるより選択される。
【０２０１】
第9〜第16の局面の1つの態様において、エンドヌクレアーゼは、T7エンドヌクレアーゼI、RNase H、フラップヌクレアーゼ、またはマングビーンヌクレアーゼである。
【０２０２】
第17の局面において、本発明は、以下の段階を含む、カスケードを用いて標的を検出する方法を提供する：
(a) 以下のものを提供する段階：
(i) 標的鎖と相補的な第1の部分および該標的鎖と相補的でない第2の部分を含むSIOであって、ただし、第1の部分と第2の部分はホスホロチオエートによって分離されており、第2の部分は第1のDFを含む、SIO； 
(ii) EAS1およびEAS2、ただし、EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、EAS1とEAS2のハイブリダイゼーションは、両末端に3'オーバーハングを有する二重鎖構造を提供し、かつEAS1の一部は第1のDFの一部と相補的である、EAS1およびEAS2；ならびに
(iii) 第1のエキソヌクレアーゼ；ならびに
(b) 以下のものを接触させる段階：
(i) SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、ひいては第1のエキソヌクレアーゼの二重鎖基質を作出する条件下における、標的を含むと推定される試料とSIO、ただし、第1のエキソヌクレアーゼによる二重鎖構造の修飾により、二重鎖基質から第1のDFが放出される；
(ii) 第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化を可能にして、第2のエキソヌクレアーゼの基質を含む第1のCESA複合体を形成させる条件下における、EAS1およびEAS2と(b)の第1のDF；
(iii) 第2のエキソヌクレアーゼと第1のCESA複合体との相互作用を可能にする条件下における、第1のCESAと第2のエキソヌクレアーゼ、ただし、第2のエキソヌクレアーゼによる第1のCESA複合体の修飾により、第1のCESA複合体から、付加的なEAS1およびEAS2と組織化して付加的な第1のCESA複合体を形成し得る第1のDFが放出される；
ただし、二重鎖構造の該修飾および/または第1のCESA複合体の該修飾は、検出可能な影響を提供する。
【０２０３】
第17の局面の1つの態様において、二重鎖構造の前記修飾および第1のCESA複合体の前記修飾は、検出可能な影響をもたらす。
【０２０４】
第17の局面の1つの態様において、SIOは、2つの相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、一本鎖ヘアピンループ、および3'オーバーハングを含むヘアピンオリゴヌクレオチドである。
【０２０５】
第17の局面の1つの態様において、第1および/または第2のエキソヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼIIIである。
【０２０６】
第17の局面の1つの態様において、SIOおよび/またはEAS1は検出可能な部分およびクエンチャー部分を含み、検出可能な部分とクエンチャー部分は、エキソヌクレアーゼによる修飾時に分離して、検出可能な影響を提供し得る。
【０２０７】
第17の局面の1つの態様において、検出可能な部分はフルオロフォアである。
【０２０８】
第9〜第17の局面の1つの態様において、検出可能な影響は、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分光法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射測定、測光法、シンチグラフィー、電子的方法、UV、可視光、もしくは赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせによって検出される。
【０２０９】
第9〜第17の局面の1つの態様において、検出可能な影響が測定され、該測定の大きさおよび/または検出可能な影響の蓄積率は、標的の量を示す。
【０２１０】
第9〜第17の局面の1つの態様において、標的は、核酸、タンパク質、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオン、核酸、またはそれらの任意の誘導体、部分、もしくは組み合わせからなる群より選択される。
【０２１１】
第9〜第17の局面の1つの態様において、核酸は、DNA、メチル化DNA、アルキル化DNA、RNA、メチル化RNA、マイクロRNA、siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、プレおよびプリマイクロRNA、他の非コードRNA、リボソームRNA、それらの誘導体、それらの単位複製配列、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
【０２１２】
第9〜第17の局面の1つの態様において、核酸の供給源は、合成、哺乳動物、ヒト、動物、植物、真菌、細菌、ウイルス、古細菌、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
【０２１３】
第9〜第17の局面の1つの態様において、核酸は増幅される。
【０２１４】
第10〜第16の局面の1つの態様において、第1のDFは標的とは異なる。
【０２１５】
第9〜第17の局面の1つの態様において、任意のEASは別のEASとハイブリダイズして、複数のDFとハイブリダイズし得る部分的酵素シグナル増幅因子(PESA)複合体を形成することができる。
【０２１６】
第9および第13〜第16の局面の1つの態様において、方法は、標的分子の異なる部分に特異的な第1および第2のMNAザイムを用いる段階を含む。
【０２１７】
第9および第13〜第16の局面の1つの態様において、標的分子の異なる部分に特異的なMNAザイムは、該標的の存在下で組織化した場合に、同じ基質を認識し切断する。
【０２１８】
第9および第13〜第16の局面の1つの態様において、方法は、異なる標的に対して特異性を有する少なくとも2つの異なるMNAザイムを用いる段階を含む。
【０２１９】
第10〜第16の局面の1つの態様において、方法は、異なる標的に対して相補性を有する少なくとも2つの異なるSIOを用いる段階を含む。
【０２２０】
第9〜第16の局面の1つの態様において、方法は、異なる第1のDFと組織化される少なくとも2つの異なる第1のCESA複合体を用いる段階を含む。
【０２２１】
第18の局面において、本発明は、以下のものを含む、シグナルを増幅するためのキットを提供する：
ヌクレアーゼ；ならびに
EAS1およびEAS2、ただし、EAS1とEAS2の一部は相補的であり、EAS1およびEAS2は、ドライバー断片オリゴヌクレオチドと組織化した場合にのみ、該ヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む複合体を形成する。
【０２２２】
第19の局面において、本発明は、以下のものを含む、標的を検出するためのキットを提供する：
ヌクレアーゼ；
EAS1およびEAS2、ただし、EAS1とEAS2の一部は相補的である；
標的に対応するMNAザイムを組織化するように設計された複数のパートザイム；ならびに
MNAザイム基質、ただし、該基質の一部はEAS1の一部と相補的である；
ただし、EAS1およびEAS2は、ドライバー断片オリゴヌクレオチドと組織化した場合にのみ、該ヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む複合体を形成する。
【０２２３】
第20の局面において、本発明は、以下のものを含む、標的を検出するためのキットを提供する：
ヌクレアーゼ；
EAS1およびEAS2、ただし、EAS1とEAS2の一部は相補的である；
標的とハイブリダイズしてヌクレアーゼ基質を形成するように設計された複数のSIO；
ただし、ヌクレアーゼ基質の一部はEAS1の一部と相補的であり、
EAS1およびEAS2は、ドライバー断片オリゴヌクレオチド(DF)と組織化した場合にのみ、該ヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む複合体を形成する。
【０２２４】
第21の局面において、本発明は、第1の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS1)および第2の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS2)を含むキットであって、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、EAS1およびEAS2が、第1のドライバー断片オリゴヌクレオチド(DF)と組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識および切断配列を含む第1の完全酵素シグナル増幅因子(CESA)複合体を形成し、第1のDFの一部がEAS1の一部と相補的である、キットを提供する。
【０２２５】
第22の局面において、本発明は、EAS1、EAS2、および第1のヌクレアーゼを含むキットであって、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、EAS1およびEAS2が、第1のDFと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成し、第1のDFの一部がEAS1の一部と相補的である、キットを提供する。
【０２２６】
第23の局面において、本発明は、多成分核酸酵素(MNAザイム)、MNAザイム基質、EAS1、EAS2、および第1のヌクレアーゼを含むキットであって：
MNAザイムが、MNAザイム組織化助長因子の存在下で自己組織化してMNAザイムを形成する少なくとも第1のパートザイムおよび第2のパートザイムを含み、少なくとも第1および第2のパートザイムのそれぞれが基質アーム部分、触媒コア部分、およびセンサーアーム部分を含み、第1および第2のパートザイムをそれらそれぞれの触媒コア部分の会合のために近接して維持して、MNAザイムの触媒コアを形成するように、センサーアームがMNAザイム組織化助長因子と相互作用し、触媒コアがMNAザイム基質を修飾して第1のDFを形成することができ；
ならびに、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部が第1のDFの一部と相補的であり、第1のDFがEAS1およびEAS2と組織化して、少なくとも第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESA複合体を形成することができる、
キットを提供する。
【０２２７】
第23の局面の1つの態様において、MNAザイム基質は、第1の鎖および第2の鎖を含むオリゴヌクレオチド複合体の第1の鎖であり、第1の鎖は内部ループ部分を含み、内部ループ部分内の塩基は第2の鎖の塩基とハイブリダイズせず、MNAザイムは内部ループ部分を切断することができる。
【０２２８】
第23の局面の1つの態様において、第2の鎖は第1のDFを含む。
【０２２９】
第23の局面の1つの態様において、第1の鎖と第2の鎖はヘアピンループ部分によって一方の末端で連結されている。
【０２３０】
第23の局面の1つの態様において、MNAザイム基質はヘアピンオリゴヌクレオチドのヘアピンループ部分であり、MNAザイムはヘアピンループ部分を切断することができ、第1のドライバー断片はヘアピンオリゴヌクレオチド内の二本鎖基部の一方の鎖中に位置する。
【０２３１】
第23の局面の1つの態様において、組織化助長因子は、同定される標的である。
【０２３２】
第24の局面において、本発明は、第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド(SIO)、EAS1、EAS2、第1のヌクレアーゼ、および第2のヌクレアーゼを含むキットであって：
SIOが標的とハイブリダイズして二重鎖基質を形成することができ、第1のヌクレアーゼが二重鎖基質を切断して第1のDFを生成することができ；ならびに
EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部が第1のDFの一部と相補的であり、EAS1およびEAS2が、第1のDFと組織化した場合にのみ、第2のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成する、
キットを提供する。
【０２３３】
第25の局面において、本発明は、第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド(SIO)、EAS1、EAS2、および第1のヌクレアーゼ、および第2のヌクレアーゼを含むキットであって：
SIOが標的とハイブリダイズして二重鎖構造を形成することができ、第1のヌクレアーゼが、SIOが標的とハイブリダイズした場合にのみ、SIOを切断して第1のDFを生成することができ；ならびに
EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部が第1のDFの一部と相補的であり、EAS1およびEAS2が、第1のDFと組織化した場合にのみ、第2のヌクレアーゼの認識および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成する、
キットを提供する。
【０２３４】
第26の局面において、本発明は、第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド(SIO)、EAS1、EAS2、第1のヌクレアーゼ、および第2のヌクレアーゼを含むキットであって：
SIOが標的とハイブリダイズして二重鎖構造を形成することができ、第1のヌクレアーゼが、標的がSIOとハイブリダイズした場合にのみ、標的を切断して第1のDFを生成することができ；
EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部が第1のDFの一部と相補的であり、EAS1およびEAS2が、第1のDFと組織化した場合にのみ、第2のヌクレアーゼの認識および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成し；
ならびに、第1のヌクレアーゼが制限エンドヌクレアーゼではない、
キットを提供する。
【０２３５】
第24〜第26の局面の1つの態様において、ヌクレアーゼは、SIOが標的とハイブリダイズした場合にのみ、SIOを切断して第1のDFを生成することができる。
【０２３６】
第24〜第26の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼは、標的がSIOとハイブリダイズした場合にのみ、標的を切断して第1のDFを生成することができる。
【０２３７】
第24〜第26の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼは制限酵素ではない。
【０２３８】
第24〜第26の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼである。
【０２３９】
第24〜第26の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼは同じヌクレアーゼである。
【０２４０】
第24〜第26の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼは異なるヌクレアーゼである。
【０２４１】
第21〜第26の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼは、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる。
【０２４２】
第24〜第26の局面の1つの態様において、第2のヌクレアーゼは、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる。
【０２４３】
第21〜第26の局面の1つの態様において、ニックは、ヌクレアーゼ認識部位内に、ヌクレアーゼ切断部位に、またはヌクレアーゼ認識部位と切断部位の間に位置する。
【０２４４】
第21〜第26の局面の1つの態様において、ヌクレアーゼは、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspR Iからなる群より選択される。
【０２４５】
第18〜第26の局面の1つの態様において、EAS1およびEAS2は、EAS1およびEAS2の相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、ならびにEAS1の一方の末端とEAS2の一方の末端を連結するヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である。
【０２４６】
第18〜第26の局面の1つの態様において、ヘアピンオリゴヌクレオチドは、EAS1またはEAS2のいずれかから伸長した一本鎖5'または3'オーバーハング部分を含む。
【０２４７】
第18〜第26の局面の1つの態様において、EAS1またはEAS2の一部は第2のDFを含み、第2のDFは、ヌクレアーゼによる第1のCESA複合体の修飾時に放出され得る。
【０２４８】
第18〜第26の局面の1つの態様において、ヘアピンループ部分の一部は第2のDFを含み、第2のDFは、ヌクレアーゼによる第1のCESA複合体の修飾時に放出され得る。
【０２４９】
第18〜第26の局面の1つの態様において、第1のDFと第2のDFは同一ではない。
【０２５０】
第18〜第26の局面の1つの態様において、第1のDFと第2のDFは同一である。
【０２５１】
第18〜第26の局面の1つの態様において、第2のDFは第1のDFの断片であるか、または第1のDFは第2のDFの断片である。
【０２５２】
第18〜第26の局面の1つの態様において、第2のDF、EAS1、およびEAS2は組織化して、第1のCESA複合体を形成することができる。
【０２５３】
第18〜第26の局面の1つの態様において、キットは、第3の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS3)および第4の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS4)をさらに含み、EAS3の一部はEAS4の一部と相補的であり、かつEAS3の一部は第2のDFの一部と相補的であり、EAS3およびEAS4は、第2のDFと組織化した場合にのみ、付加的なヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第2のCESA複合体を形成する。
【０２５４】
第18〜第26の局面の1つの態様において、EAS3またはEAS4は第3のDFを含む。
【０２５５】
第18〜第26の局面の1つの態様において、第3のDFは第1のDFと同一である。
【０２５６】
第18〜第26の局面の1つの態様において、第3のDFは第1のDFと同一ではない。
【０２５７】
第18〜第26の局面の1つの態様において、付加的なヌクレアーゼは前記キット中の別のヌクレアーゼと同一である。
【０２５８】
第18〜第26の局面の1つの態様において、付加的なヌクレアーゼは前記キット中の別のヌクレアーゼと同一ではなく、該キットは該付加的なヌクレアーゼを含む。
【０２５９】
第18〜第26の局面の1つの態様において、付加的なヌクレアーゼは、第2のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる。
【０２６０】
第18〜第26の局面の1つの態様において、ヌクレアーゼは、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspR Iからなる群より選択される。
【０２６１】
第18〜第26の局面の1つの態様において、EAS3およびEAS4は、EAS3およびEAS4の相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、ならびにEAS3の一方の末端とEAS4の一方の末端を連結するヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である。
【０２６２】
第18〜第26の局面の1つの態様において、ヘアピンオリゴヌクレオチドは、EAS3またはEAS4のいずれかから伸長した一本鎖5'または3'オーバーハング部分を含む。
【０２６３】
第27の局面において、本発明は、骨格オリゴヌクレオチド、EAS1、EAS2、EAS3、およびEAS4を含む第1の複合体を含むキットであって、該骨格オリゴヌクレオチドが：
(i) EAS1を含む第1の部分、ただし、EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、EAS2の一部は第1のDFの一部と相補的であり、EAS1またはEAS2の一部は第2のDFを含み、EAS1およびEAS2は、第1のDFと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成する；
(ii) EAS3を含む第2の部分、ただし、EAS3の一部はEAS4の一部と相補的であり、EAS3の一部は第2のDFの一部と相補的であり、EAS3またはEAS4の一部は第1のDFを含み、EAS3およびEAS4は、第2のDFと組織化した場合にのみ、第2のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第2のCESA複合体を形成する；ならびに
(iii) 第1の部分と第2の部分を接続する第3の部分
を含む、キットを提供する。
【０２６４】
第27の局面の1つの態様において、キットは、骨格オリゴヌクレオチド、第5の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS5)、第6の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS6)、第7の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS7)、および第8の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS8)を含む第2の複合体をさらに含み、該骨格オリゴヌクレオチドは以下を含む：
(i) EAS5を含む第1の部分、ただし、EAS5の一部はEAS6の一部と相補的であり、EAS5の一部は第2のDFの一部と相補的であり、EAS5またはEAS6の一部は第1のDFを含み、EAS5およびEAS6は、第2のDFと組織化した場合にのみ、第3のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第3のCESA複合体を形成する；ならびに
(ii) EAS7を含む第2の部分、ただし、EAS7の一部はEAS8の一部と相補的であり、EAS8の一部は第1のDFの一部と相補的であり、EAS7またはEAS8の一部は第2のDFを含み、EAS7およびEAS8は、第1のDFと組織化した場合にのみ、第4のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第4のCESA複合体を形成する；ならびに
(iii) 第1の部分と第2の部分を接続する第3の部分、ただし、第3の部分は第1の複合体の骨格の第3の部分と相補的である。
【０２６５】
第27の局面の1つの態様において、EAS1はEAS7と同一であり、EAS2はEAS8と同一であり、EAS3はEAS5と同一であり、および/またはEAS4はEAS6と同一である。
【０２６６】
第27の局面の1つの態様において、第1のヌクレアーゼは第3のヌクレアーゼと同一であり、ならびに/または第2のヌクレアーゼは第4のヌクレアーゼと同一であり、ならびに/または第1、第2、第3、および第4のヌクレアーゼは同一である。
【０２６７】
第27の局面の1つの態様において、第1の複合体と第2の複合体は、それらそれぞれの相補的な第3の部分を介してハイブリダイズして、第1の二重複合体を形成する。
【０２６８】
第27の局面の1つの態様において、第1の二重複合体は第2の二重複合体に連結している。
【０２６９】
第27の局面の1つの態様において、第1の二重複合体のEAS1〜EAS8のうちのいずれか1つまたは複数と第2の二重複合体のEAS1〜EAS8のうちのいずれか1つまたは複数の連結により、第1の二重複合体は第2の二重複合体に連結している。
【０２７０】
第27の局面の1つの態様において、第1の二重複合体のEAS2および/またはEAS8と第2の二重複合体のEAS2および/またはEAS8の連結により、第1の二重複合体は第2の二重複合体に連結している。
【０２７１】
第27の局面の1つの態様において、連結は、化学的ハイブリダイゼーション、抗体、オリゴヌクレオチドリンカー、非オリゴヌクレオチドリンカー、およびペプチドリンカーのうちのいずれか1つまたは複数を用いて達成される。
【０２７２】
第27の局面の1つの態様において、連結は、酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドのうちのいずれか1つまたは複数のビオチン化、およびアビジンを用いた複数のビオチン化酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドの複合体化により達成される。
【０２７３】
第27の局面の1つの態様において、第1および/または第2のヌクレアーゼは、第2のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる。
【０２７４】
第27の局面の1つの態様において、第1および/または第2のヌクレアーゼは、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspR Iからなる群より選択される。
【０２７５】
第27の局面の1つの態様において、EAS1およびEAS2；EAS3およびEAS4；EAS5およびEAS6；ならびにEAS7およびEAS8より選択される一対の酵素増幅因子基質は、該対の各メンバーの相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、および基部の一方の末端に連結しているヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である。
【０２７６】
第28の局面において、本発明は、以下のものを含むキットを提供する：
(i) 標的鎖と相補的な第1の部分および該標的鎖と相補的でない第2の部分を含むSIOであって、ただし、第1の部分と第2の部分はホスホロチオエートによって分離されており、第2の部分は第1のDFを含む、SIO；ならびに
(ii) EAS1およびEAS2、ただし
EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、EAS1とEAS2のハイブリダイゼーションは、両末端に3'オーバーハングを有する二重鎖構造を提供し、
EAS1の一部は第1のDFの一部と相補的であり、かつ
EAS1およびEAS2は、第1のDFと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼによって消化され得る陥凹3'末端を含む第1のCESA複合体を形成することができる、EAS1およびEAS2。
【０２７７】
第28の局面の1つの態様において、SIOは、2つの相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、一本鎖ヘアピンループ、および3'オーバーハングを含むヘアピンオリゴヌクレオチドである。
【０２７８】
第28の局面の1つの態様において、ヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼである。
【０２７９】
第18〜第28の局面の1つの態様において、任意のEASは1つまたは複数の検出可能な標識を含む。
【０２８０】
第18〜第28の局面の1つの態様において、任意のEASはフルオロフォア部分およびクエンチャー部分を含む。
【０２８１】
第18〜第28の局面の1つの態様において、任意のMNAザイムパートザイム、MNAザイム基質、EAS1、EAS2、EAS3、EAS4、EAS5、EAS6、EAS7、EAS8、SIO、DF、またはヌクレアーゼは、固体支持体に付着している。
【０２８２】
第19、第20、および第23〜第26の局面の1つの態様において、任意の第1のDFは標的とは異なる。
【０２８３】
第19および第23の局面の1つの態様において、キットは、標的分子の異なる部分に特異的な第1および第2のMNAザイムを含む。
【０２８４】
第19および第23の局面の1つの態様において、標的分子の異なる部分に特異的なMNAザイムは、該標的の存在下で組織化した場合に、同じ基質を認識し切断する。
【０２８５】
第19および第23の局面の1つの態様において、キットは、異なる標的に対して特異性を有する少なくとも2つの異なるMNAザイムを含む。
【０２８６】
第20、第24〜第26、および第28の局面の1つの態様において、キットは、異なる標的に対して相補性を有する少なくとも2つの異なるSIOを含む。
【０２８７】
第29の局面において、本発明は第1〜第8の局面のいずれか1つの組成物を含むキットを提供する。
【０２８８】
第19〜第29の局面の1つの態様において、キットは、該キットを使用するための説明書をさらに含む。
【０２８９】
別の局面において、少なくとも第1の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS1)および少なくとも第2の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS2)を含む組成物であって、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、EAS1およびEAS2が、ドライバー断片オリゴヌクレオチド(DF)と組織化した場合にのみ、ヌクレアーゼの認識および切断配列を含む完全酵素シグナル増幅因子複合体(CESA)を形成し、DFの一部がEAS1の一部と相補的である、組成物が提供される。
【０２９０】
別の局面において、少なくとも第1の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS1)および少なくとも第2の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS2)および少なくとも第1のヌクレアーゼを含む組成物であって、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、EAS1およびEAS2が、ドライバー断片オリゴヌクレオチド(DF)と組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識および切断配列を含む完全酵素シグナル増幅因子複合体(CESA)を形成し、DFの一部がEAS1の一部と相補的である、組成物が提供される。ヌクレアーゼは制限酵素であってよい。
【０２９１】
別の局面において、少なくとも第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド(SIO)、少なくとも第1の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS1)、少なくとも第2の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS2)、少なくとも第1のヌクレアーゼ、および少なくとも第2のヌクレアーゼを含む組成物であって；
SIOが標的とハイブリダイズして二重鎖基質を形成することができ、第1のヌクレアーゼが二重鎖基質を切断してドライバー断片(DF)を生成することができ；ならびに
EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部がDFの一部と相補的であり、EAS1およびEAS2が、DFと組織化した場合にのみ、第2のヌクレアーゼの認識および切断配列を含む完全酵素シグナル増幅因子複合体(CESA)を形成する、
組成物が提供される。
【０２９２】
第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼは同じヌクレアーゼであってよく、あるいは第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼは異なるヌクレアーゼであってもよい。
【０２９３】
別の局面において、少なくとも1つのMNAザイム、少なくとも1つのMNAザイム基質、および少なくとも第1の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS1)、および少なくとも第2の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS2)、および少なくとも第1のヌクレアーゼを含む組成物であって：
MNAザイムが、MNAザイム組織化助長因子の存在下で自己組織化してMNAザイムを形成する少なくとも第1のパートザイムおよび第2のパートザイムを含み、少なくとも第1および第2のパートザイムのそれぞれが基質アーム部分、触媒コア部分、およびセンサーアーム部分を含み、第1および第2のパートザイムをそれらそれぞれの触媒コア部分の会合のために近接して維持して、MNAザイムの触媒コアを形成するように、センサーアームがMNAザイム組織化助長因子と相互作用し、触媒コアがMNAザイム基質を修飾してドライバー断片(DF)を形成することができ；
ならびに、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部がDFの一部と相補的であり、DFがEAS1およびEAS2と組織化して、少なくとも第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む完全酵素シグナル増幅因子複合体(CESA)を形成することができる、
組成物が提供される。
【０２９４】
組織化助長因子は、同定される標的であってよい。第1および/または第2のヌクレアーゼは、制限酵素、エンドヌクレアーゼ、またはエキソヌクレアーゼからなる群より選択され得る。エンドヌクレアーゼは、T7エンドヌクレアーゼIまたはマングビーンヌクレアーゼであってよい。エキソヌクレアーゼは、ヌクレアーゼBAL-31、エキソヌクレアーゼ1、エキソヌクレアーゼIII、T7エキソヌクレアーゼ、T7エキソヌクレアーゼI、またはエキソヌクレアーゼTであってよい。1つの態様において、エキソヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼIIIである。
【０２９５】
別の局面において、以下の段階を含む、標的を検出する方法が提供される：
(a) 少なくとも第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド(SIO)を提供する段階；
(b) SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、ひいては第1のヌクレアーゼの二重鎖基質を作出する条件下で、標的を含むと推定される試料とSIOを接触させる段階；
(c) SIOと標的のハイブリダイゼーションによって形成された二重鎖基質を切断し得る第1のヌクレアーゼを提供する段階であって、第1のヌクレアーゼによる二重鎖基質の切断によりドライバー断片(DF)が生成される、段階；
(d) 第1の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS1)および第2の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS2)を提供する段階であって、EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部はDFの一部と相補的である、段階；
(e) 以下を可能にする条件下で、EAS1およびEAS2をドライバー断片と接触させる段階：
(1) CESAを形成するための、DFとEAS1およびEAS2の組織化、ならびに
(2) 第2のヌクレアーゼの認識および切断部位の形成；
(f) 第2のヌクレアーゼを提供する段階；ならびに
(g) 第2のヌクレアーゼと認識部位との相互作用および切断部位での切断を可能にする条件下で、第2のヌクレアーゼをCESAと接触させる段階であって、第2のヌクレアーゼによる切断は、標的の存在を示す検出可能な影響をもたらす、段階。
【０２９６】
別の局面において、以下の段階を含む、標的を検出するための方法が提供される：
(a) 2つまたはそれ以上のパートザイムおよび少なくとも1つのMNAザイム基質を提供する段階であって、パートザイムは標的の存在下で自己組織化して、少なくとも1つのMNAザイムを形成する、段階；
(b) MNAザイムの自己組織化および触媒活性を可能にする条件下で、標的を含むと推定される試料とパートザイムを接触させる段階であって、MNAザイムの触媒活性により、少なくとも1つのMNAザイム基質からドライバー断片(DF)が産生される、段階；
(c) 第1の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS1)および第2の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS2)を提供する段階であって、EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部はDFの一部と相補的である、段階；
(d) 以下を可能にする条件下で、EAS1およびEAS2をドライバー断片と接触させる段階：
(1) CESAを形成するための、DFとEAS1およびEAS2の組織化、ならびに
(2) ヌクレアーゼの認識および切断部位の形成
(e) ヌクレアーゼを提供する段階；
(f) ヌクレアーゼと認識部位との相互作用および切断部位での切断を可能にする条件下で、ヌクレアーゼをCESAと接触させる段階であって、ヌクレアーゼによる切断は、標的の存在を示す検出可能な影響をもたらす、段階。
【０２９７】
第5および第6の局面の方法におけるヌクレアーゼは、制限酵素、エンドヌクレアーゼ、またはエキソヌクレアーゼの群より選択され得る。エンドヌクレアーゼは、T7エンドヌクレアーゼIまたはマングビーンヌクレアーゼであってよい。エキソヌクレアーゼは、ヌクレアーゼBAL-31、エキソヌクレアーゼ1、エキソヌクレアーゼIII、T7エキソヌクレアーゼ、T7エキソヌクレアーゼI、またはエキソヌクレアーゼTであってよい。1つの態様において、エキソヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼIIIである。
【０２９８】
ドライバー断片は、MNAザイム基質の切断、または2つもしくはそれ以上のMNAザイム基質の核酸連結によって産生され得る。
【０２９９】
EAS1は検出可能な部分およびクエンチャー部分を含んでよく、ヌクレアーゼによるEAS1の切断時に、検出可能な部分によって提供される検出可能な影響は増加または減少する。別の態様において、EAS1は検出可能な部分を含んでよく、かつEAS2はクエンチャー部分を含んでよい。あるいは、EAS2は検出可能な部分を含んでよく、かつEAS1はクエンチャー部分を含んでよい。ヌクレアーゼによる切断時に、検出可能な部分によって提供される検出可能な影響は増加または減少し得る。
【０３００】
CESAの切断によりさらなるドライバー断片の放出が可能になり、ドライバー断片はさらなるEAS1およびEAS2と組織化してさらなるCESAを形成してよく、少なくとも1つのさらなるヌクレアーゼはさらなるCESAを切断して、さらなる検出可能な影響をもたらし、かつさらなるドライバー断片を放出させ、それによって検出可能な影響のさらなる増加が促進される。
【０３０１】
検出可能な影響は、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分光法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射測定、測光法、シンチグラフィー、電子的方法、UV、可視光、もしくは赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせによって検出され得る。
【０３０２】
検出可能な影響を測定することができ、測定の大きさは標的の量を示し得る。
【０３０３】
標的は、核酸、タンパク質、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオン、核酸、またはそれらの任意の誘導体、部分、もしくは組み合わせの群より選択され得る。
【０３０４】
核酸は、DNA、メチル化DNA、アルキル化DNA、RNA、メチル化RNA、マイクロRNA、siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、プレおよびプリマイクロRNA、他の非コードRNA、リボソームRNA、それらの誘導体、それらの単位複製配列、またはそれらの任意の組み合わせの群より選択され得る。
【０３０５】
核酸の供給源は、合成、哺乳動物、ヒト、動物、植物、真菌、細菌、ウイルス、古細菌、およびそれらの任意の組み合わせの群より選択され得る。
【０３０６】
核酸を増幅することができる。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)、鎖置換増幅(SDA)、ループ媒介性等温増幅(LAMP)、ローリングサークル増幅(RCA)、転写物媒介性増幅(TMA)、自律的配列複製(3SR)、核酸配列に基づく増幅(NASBA)、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法(RT-PCR)のうちの1つまたは複数を含み得る。
【０３０７】
パートザイム、組織化助長因子、MNAザイム基質、ドライバー断片、EAS1、EAS2、またはSIOのうちの少なくとも1つは、ホスホロチオエート、4-アセチルシチジン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウリジン、2'-O-メチルシチジン、5-カルボキシメチルアミノメチルチオウリジン、ジヒドロウリジン、2'-O-メチルプソイドウリジン、β D-ガラクトシルケオシン、2'-O-メチルグアノシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデノシン、1-メチルアデノシン、1-メチルプソイドウリジン、1-メチルグアノシン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアノシン、2-メチルアデノシン、2-メチルグアノシン、3-メチルシチジン、5-メチルシチジン、N6-メチルアデノシン、7-メチルグアノシン、5-メチルアミノメチルウリジン、5-メトキシアミノメチル-2-チオウリジン、β D-マンノシルメチルウリジン、5-メトキシカルボニルメチルウリジン、5-メトキシウリジン、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデノシン、N-((9-β-リボフラノシル-2-メチルチオプリン-6-イル)カルバモイル)スレオニン、N-((9-β-リボフラノシルプリン-6-イル)N-メチル-カルバモイル)スレオニン、ウリジン-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウリジン-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、プソイドウリジン、ケオシン、2-チオシチジン、5-メチル-2-チオウリジン、2-チオウリジン、4-チオウリジン、5-メチルウリジン、N-((9-β-D-リボフラノシルプリン-6-イル)カルバモイル)スレオニン、2'-O-メチル-5-メチルウリジン、2'-O-メチルウリジン、ワイブトシン、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン、β D-アラビノシルウリジン、およびβ D-アラビノシルチミジンからなる群より選択される、少なくとも1つのヌクレオチド置換または付加を含む。
【０３０８】
いくつかの態様において、CESAの標的化切断によるシグナルの生成を妨げる部位における、オリゴヌクレオチド断片の特異的なエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ消化を妨げるために、ヌクレオチド類似体を含めることができる。好ましい態様において、ホスホロチオエート連結を用いて、T7エキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼIII、および/またはエキソヌクレアーゼIなどのヌクレアーゼの切断を阻害することができる。
【０３０９】
MNAザイムパートザイム、MNAザイム基質、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも1つは、少なくとも1つのアプタマーまたはその一部をさらに含み得る。アプタマーまたはその一部は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質、またはそれらの誘導体もしくは組み合わせのうちの少なくとも1つを含み得る。
【０３１０】
アプタマーまたはその一部は、核酸、タンパク質、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオン、またはそれらの任意の誘導体、部分、もしくは組み合わせの群より選択される標的と結合し得る。
【０３１１】
MNAザイムパートザイム、MNAザイム基質、EAS1、EAS2、SIO、または少なくとも1つのヌクレアーゼのうちの少なくとも1つは、固体支持体に付着していてよい。
【０３１２】
別の局面において、以下のものを含む、シグナルを増幅するためのキットが提供される：
ヌクレアーゼ；ならびに
EAS1およびEAS2、ただし、EAS1とEAS2の一部は相補的であり、EAS1およびEAS2は、ドライバー断片オリゴヌクレオチドと組織化した場合にのみ、該ヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む完全酵素シグナル増幅因子複合体(CESA)を形成する。
【０３１３】
別の局面において、以下のものを含む、標的を検出するためのキットが提供される：
ヌクレアーゼ；
EAS1およびEAS2、ただし、EAS1とEAS2の一部は相補的である；
標的に対応するMNAザイムを組織化するように設計された複数のパートザイム；ならびに
MNAザイム基質、ただし、該基質の一部はEAS1の一部と相補的である；
ただし、EAS1およびEAS2は、ドライバー断片オリゴヌクレオチドと組織化した場合にのみ、該ヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む完全酵素シグナル増幅因子複合体(CESA)を形成する。
【０３１４】
別の局面において、以下のものを含む、標的を検出するためのキットが提供される：
ヌクレアーゼ；
EAS1およびEAS2、ただし、EAS1とEAS2の一部は相補的である；
標的とハイブリダイズしてヌクレアーゼ基質を形成するように設計された複数のSIO；
ただし、ヌクレアーゼ基質の一部はEAS1の一部と相補的であり；かつ
EAS1およびEAS2は、ドライバー断片オリゴヌクレオチドと組織化した場合にのみ、該ヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む完全酵素シグナル増幅因子複合体(CESA)を形成する。
【０３１５】
[本発明1001]
第1の酵素増幅因子基質(Enzyme Amplifier Substrate)オリゴヌクレオチド(EAS1)および第2の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS2)を含む組成物であって、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1およびEAS2が、第1のドライバー断片オリゴヌクレオチド(DF)と組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識および切断配列を含む第1の完全酵素シグナル増幅因子(CESA)複合体を形成し、かつ第1のDFの一部がEAS1の一部と相補的である、組成物。
[本発明1002]
EAS1、EAS2、および第1のヌクレアーゼを含む組成物であって、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1およびEAS2が、第1のDFと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成し、第1のDFの一部がEAS1の一部と相補的である、組成物。
[本発明1003]
多成分核酸酵素(MNAザイム(MNAzyme))、MNAザイム基質、EAS1、EAS2、および第1のヌクレアーゼを含む組成物であって：
MNAザイムが、MNAザイム組織化助長因子(assembly facilitator)の存在下で自己組織化してMNAザイムを形成する少なくとも第1のパートザイム(partzyme)および第2のパートザイムを含み、少なくとも第1および第2のパートザイムのそれぞれが基質アーム部分、触媒コア部分、およびセンサーアーム部分を含み、かつ第1および第2のパートザイムをそれらそれぞれの触媒コア部分が会合するように近接して維持して、MNAザイムの触媒コアを形成するように、センサーアームがMNAザイム組織化助長因子と相互作用し、かつ触媒コアがMNAザイム基質を修飾して第1のDFを形成することができ；
かつ、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部が第1のDFの一部と相補的であり、かつ第1のDFがEAS1およびEAS2と組織化して、少なくとも第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESA複合体を形成することができる、
組成物。
[本発明1004]
MNAザイム基質が、第1の鎖および第2の鎖を含むオリゴヌクレオチド複合体の第1の鎖であり、第1の鎖が内部ループ部分を含み、かつ内部ループ部分内の塩基が第2の鎖の塩基とハイブリダイズせず、かつMNAザイムが内部ループ部分を切断することができる、本発明1003の組成物。
[本発明1005]
第2の鎖が第1のDFを含む、本発明1004の組成物。
[本発明1006]
第1の鎖と第2の鎖とがヘアピンループ部分によって一方の末端で連結されている、本発明1004または本発明1005の組成物。
[本発明1007]
MNAザイム基質がヘアピンオリゴヌクレオチドのヘアピンループ部分であり、かつMNAザイムがヘアピンループ部分を切断することができ、かつ第1のドライバー断片がヘアピンオリゴヌクレオチド内の二本鎖基部の一方の鎖中に位置する、本発明1003の組成物。
[本発明1008]
組織化助長因子が、同定される標的である、本発明1003〜1007のいずれかの組成物。
[本発明1009]
第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド(Synthetic Initiator Oligonucleotide, SIO)、EAS1、EAS2、第1のヌクレアーゼ、および第2のヌクレアーゼを含む組成物であって：
SIOが標的とハイブリダイズして二重鎖基質を形成することができ、第1のヌクレアーゼが二重鎖基質を切断して第1のDFを生成することができ；かつ
EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部が第1のDFの一部と相補的であり、かつEAS1およびEAS2が、第1のDFと組織化した場合にのみ、第2のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成する、
組成物。
[本発明1010]
第1のヌクレアーゼが、SIOが標的とハイブリダイズした場合にのみ、SIOを切断して第1のDFを生成することができる、本発明1009の組成物。
[本発明1011]
第1ヌクレアーゼが、標的がSIOとハイブリダイズした場合にのみ、標的を切断して第1のDFを生成することができる、本発明1009の組成物。
[本発明1012]
第1のヌクレアーゼが制限酵素ではない、本発明1011の組成物。
[本発明1013]
第1のヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼである、本発明1009〜1012のいずれかの組成物。
[本発明1014]
第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼが同じヌクレアーゼである、本発明1009〜1013のいずれかの組成物。
[本発明1015]
第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼが異なるヌクレアーゼである、本発明1009〜1013のいずれかの組成物。
[本発明1016]
第1のヌクレアーゼが、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、本発明1001〜1008のいずれかの組成物。
[本発明1017]
第2のヌクレアーゼが、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、本発明1009〜1015のいずれかの組成物。
[本発明1018]
前記ニックが、ヌクレアーゼ認識部位内に、ヌクレアーゼ切断部位に、またはヌクレアーゼ認識部位と切断部位の間に位置する、本発明1016または本発明1017の組成物。
[本発明1019]
前記ヌクレアーゼが、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspR Iからなる群より選択される、本発明1016〜1018のいずれかの組成物。
[本発明1020]
第1のDFのEAS1への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識配列を完成する、本発明1001〜1019のいずれかの組成物。
[本発明1021]
第1のDFのEAS1への結合が、部分的ヌクレアーゼ切断配列を完成する、本発明1001〜1019のいずれかの組成物。
[本発明1022]
第1のDFが前記配列に少なくとも1つの塩基を寄与する、本発明1020または本発明1021の組成物。
[本発明1023]
第1のDFが前記配列に少なくとも2つの塩基を寄与する、本発明1020〜1022のいずれかの組成物。
[本発明1024]
第1のDFが前記配列に少なくとも3つの塩基を寄与する、本発明1020〜1023のいずれかの組成物。
[本発明1025]
前記塩基が、EAS1とEAS2との結合によって形成される部分的ヌクレアーゼ認識部位のすぐ3'側にある、本発明1022〜1024のいずれかの組成物。
[本発明1026]
前記塩基が、EAS1とEAS2との結合によって形成される部分的ヌクレアーゼ認識部位のすぐ5'側にある、本発明1022〜1024のいずれかの組成物。
[本発明1027]
第1のDFがヌクレアーゼ認識配列またはヌクレアーゼ切断配列に塩基を寄与しない、本発明1001〜1019のいずれかの組成物。
[本発明1028]
EAS1およびEAS2が、EAS1およびEAS2の相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、ならびにEAS1の一方の末端とEAS2の一方の末端を連結するヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である、本発明1001〜1027のいずれかの組成物。
[本発明1029]
前記ヘアピンループ部分がオリゴヌクレオチドリンカーまたは非オリゴヌクレオチドリンカーである、本発明1028の組成物。
[本発明1030]
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドが、EAS1またはEAS2のいずれかから伸長した一本鎖5'または3'オーバーハング部分を含む、本発明1028または本発明1029の組成物。
[本発明1031]
EAS1またはEAS2の一部が第2のDFを含み、かつ第2のDFが、ヌクレアーゼによる第1のCESA複合体の修飾時に放出され得る、本発明1001〜1030のいずれかの組成物。
[本発明1032]
ヘアピンループ部分の一部が第2のDFを含み、かつ第2のDFが、ヌクレアーゼによる第1のCESA複合体の修飾時に放出され得る、本発明1028〜1030のいずれかの組成物。
[本発明1033]
第1のDFと第2のDFが同一ではない、本発明1031または本発明1032の組成物。
[本発明1034]
第1のDFと第2のDFが同一である、本発明1031または本発明1032の組成物。
[本発明1035]
第2のDFが第1のDFの断片であるか、または第1のDFが第2のDFの断片である、本発明1031または本発明1032の組成物。
[本発明1036]
第2のDF、EAS1、およびEAS2が組織化して、第1のCESA複合体を形成することができる、本発明1034または本発明1035の組成物。
[本発明1037]
第3の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS3)および第4の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS4)をさらに含み、EAS3の一部がEAS4の一部と相補的であり、かつEAS3の一部が第2のDFの一部と相補的であり、EAS3およびEAS4が、第2のDFと組織化した場合にのみ、付加的なヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第2のCESA複合体を形成する、本発明1031〜1033のいずれかの組成物。
[本発明1038]
EAS3またはEAS4が第3のDFを含む、本発明1037の組成物。
[本発明1039]
第3のDFが第1のDFと同一である、本発明1038の組成物。
[本発明1040]
第3のDFが第1のDFと同一ではない、本発明1038の組成物。
[本発明1041]
付加的なヌクレアーゼが組成物中の別のヌクレアーゼと同一である、本発明1037〜1040のいずれかの組成物。
[本発明1042]
付加的なヌクレアーゼが組成物中の別のヌクレアーゼと同一ではなく、かつ組成物が該付加的なヌクレアーゼを含む、本発明1037〜1040のいずれかの組成物。
[本発明1043]
付加的なヌクレアーゼが、第2のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、本発明1037〜1042のいずれかの組成物。
[本発明1044]
前記ヌクレアーゼが、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspR Iからなる群より選択される、本発明1037〜1043のいずれかの組成物。
[本発明1045]
第2のDFのEAS3への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識配列および/またはヌクレアーゼ切断配列を完成する、本発明1037〜1044のいずれかの組成物。
[本発明1046]
第2のDFが、ヌクレアーゼ認識配列またはヌクレアーゼ切断配列に塩基を寄与しない、本発明1037〜1044のいずれかの組成物。
[本発明1047]
EAS3およびEAS4が、EAS3およびEAS4の相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、ならびにEAS3の一方の末端とEAS4の一方の末端とを連結するヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である、本発明1037〜1046のいずれかの組成物。
[本発明1048]
前記ヘアピンループ部分がオリゴヌクレオチドリンカーまたは非オリゴヌクレオチドリンカーである、本発明1047の組成物。
[本発明1049]
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドが、EAS3またはEAS4のいずれかから伸長した一本鎖5'または3'オーバーハング部分を含む、本発明1047または本発明1048の組成物。
[本発明1050]
骨格オリゴヌクレオチド、EAS1、EAS2、EAS3、およびEAS4を含む第1の複合体を含む組成物であって、該骨格オリゴヌクレオチドが：
(i) EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、EAS2の一部は第1のDFの一部と相補的であり、かつEAS1またはEAS2の一部は第2のDFを含み、かつEAS1およびEAS2は、第1のDFと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成する、EAS1を含む第1の部分；
(ii) EAS3の一部はEAS4の一部と相補的であり、EAS3の一部は第2のDFの一部と相補的であり、かつEAS3またはEAS4の一部は第1のDFを含み、かつEAS3およびEAS4は、第2のDFと組織化した場合にのみ、第2のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第2のCESA複合体を形成する、EAS3を含む第2の部分；ならびに
(iii) 第1の部分と第2の部分を接続する第3の部分
を含む、組成物。
[本発明1051]
骨格オリゴヌクレオチド、第5の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS5)、第6の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS6)、第7の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS7)、および第8の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS8)を含む第2の複合体をさらに含み、該骨格オリゴヌクレオチドが：
(i) EAS5の一部はEAS6の一部と相補的であり、EAS5の一部は第2のDFの一部と相補的であり、かつEAS5またはEAS6の一部は第1のDFを含み、かつEAS5およびEAS6は、第2のDFと組織化した場合にのみ、第3のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第3のCESA複合体を形成する、EAS5を含む第1の部分；ならびに
(ii) EAS7の一部はEAS8の一部と相補的であり、EAS8の一部は第1のDFの一部と相補的であり、かつEAS7またはEAS8の一部は第2のDFを含み、かつEAS7およびEAS8は、第1のDFと組織化した場合にのみ、第4のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第4のCESA複合体を形成する、EAS7を含む第2の部分；ならびに
(iii) 第1の部分と第2の部分を接続する第3の部分であって、第1の複合体の骨格の第3の部分と相補的である、第3の部分
を含む、本発明1050の組成物。
[本発明1052]
EAS1がEAS7と同一であり、EAS2がEAS8と同一であり、EAS3がEAS5と同一であり、かつ/またはEAS4がEAS6と同一である、本発明1051の組成物。
[本発明1053]
第1のヌクレアーゼが第3のヌクレアーゼと同一であり、かつ/または第2のヌクレアーゼが第4のヌクレアーゼと同一であり、かつ/または第1、第2、第3、および第4のヌクレアーゼが同一である、本発明1051または本発明1052の組成物。
[本発明1054]
第1の複合体と第2の複合体が、それらそれぞれの相補的な第3の部分を介してハイブリダイズして、第1の二重複合体を形成する、本発明1051〜1053のいずれかの組成物。
[本発明1055]
第1の二重複合体が第2の二重複合体に連結している、本発明1054の組成物。
[本発明1056]
第1の二重複合体のEAS1〜EAS8のうちのいずれか1つまたは複数と第2の二重複合体のEAS1〜EAS8のうちのいずれか1つまたは複数の連結により、第1の二重複合体が第2の二重複合体に連結している、本発明1055の組成物。
[本発明1057]
第1の二重複合体のEAS2および/またはEAS8と第2の二重複合体のEAS2および/またはEAS8の連結により、第1の二重複合体が第2の二重複合体に連結している、本発明1055または本発明1056の組成物。
[本発明1058]
連結が、化学的ハイブリダイゼーション、抗体、オリゴヌクレオチドリンカー、非オリゴヌクレオチドリンカー、共有結合、およびペプチドリンカーのうちのいずれか1つまたは複数を用いて達成される、本発明1056または本発明1057の組成物。
[本発明1059]
連結が、酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドのうちのいずれか1つまたは複数のビオチン化、およびアビジンを用いた複数のビオチン化酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドの複合体化により達成される、本発明1056または本発明1057の組成物。
[本発明1060]
第1および/または第2のヌクレアーゼが、第2のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、本発明1050〜1059のいずれかの組成物。
[本発明1061]
第1および/または第2のヌクレアーゼが、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspR Iからなる群より選択される、本発明1050〜1060のいずれかの組成物。
[本発明1062]
第1のDFのEAS2もしくはEAS8への結合、および/または第2のDFのEAS3もしくはEAS5への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識配列および/または部分的ヌクレアーゼ切断配列を完成する、本発明1051〜1061のいずれかの組成物。
[本発明1063]
第1のDFのEAS2もしくはEAS8への結合、および/または第2のDFのEAS3もしくはEAS5への結合が、ヌクレアーゼ認識配列またはヌクレアーゼ切断配列に塩基を寄与しない、本発明1051〜1061のいずれかの組成物。
[本発明1064]
EAS1およびEAS2；EAS3およびEAS4；EAS5およびEAS6；ならびにEAS7およびEAS8より選択される一対の酵素増幅因子基質が、該対の各メンバーの相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、および基部の一方の末端に連結しているヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である、本発明1051〜1063のいずれかの組成物。
[本発明1065]
前記ヘアピンループ部分がオリゴヌクレオチドリンカーまたは非オリゴヌクレオチドリンカーである、本発明1064の組成物。
[本発明1066]
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドが一本鎖5'または3'オーバーハング部分を含む、本発明1064または本発明1065の組成物。
[本発明1067]
以下のものを含むSIOを含む組成物：
(i) 標的鎖と相補的な第1の部分および該標的鎖と相補的でない第2の部分であって、第1の部分と第2の部分はホスホロチオエートによって分離されており、かつ第2の部分は第1のDFを含む、第1の部分および第2の部分；ならびに
(ii) EAS1およびEAS2であって、
EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、EAS1とEAS2のハイブリダイゼーションは、両末端に3'オーバーハングを有する二重鎖構造を提供し、
EAS1の一部は第1のDFの一部と相補的であり、かつ
EAS1およびEAS2は、第1のDFと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼによって消化され得る陥凹3'末端を含む第1のCESA複合体を形成することができる、EAS1およびEAS2。
[本発明1068]
SIOが、2つの相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、一本鎖ヘアピンループ、および3'オーバーハングを含むヘアピンオリゴヌクレオチドである、本発明1067の組成物。
[本発明1069]
ヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼである、本発明1067または本発明1068の組成物。
[本発明1070]
エキソヌクレアーゼが、一本鎖オリゴヌクレオチド、5個もしくはそれ以上の塩基の3'オーバーハングを含む二本鎖オリゴヌクレオチド、またはホスホロチオエートヌクレオチド間連結を消化することができない、本発明1069の組成物。
[本発明1071]
任意の第1のDFが、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼを用いて生成される、本発明1001〜1070のいずれかの組成物。
[本発明1072]
エキソヌクレアーゼが、ヌクレアーゼBAL-31、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼIII、T7エキソヌクレアーゼ、T7エキソヌクレアーゼI、およびエキソヌクレアーゼTからなるより選択される、本発明1071の組成物。
[本発明1073]
エキソヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼIIIである、本発明1071または本発明1072の組成物。
[本発明1074]
エンドヌクレアーゼが、T7エンドヌクレアーゼI、RNase H、フラップヌクレアーゼ、またはマングビーン(Mung Bean)ヌクレアーゼである、本発明1071の組成物。
[本発明1075]
任意のEASが1つまたは複数の検出可能な標識を含む、本発明1001〜1074のいずれかの組成物。
[本発明1076]
任意のEASがフルオロフォア部分および/またはクエンチャー部分を含む、本発明1001〜1075のいずれかの組成物。
[本発明1077]
任意のパートザイム、組織化助長因子、MNAザイム基質、DF、EAS1、EAS2、EAS3、EAS4、EAS5、EAS6、EAS7、EAS8、またはSIOが、ホスホロチオエート、4-アセチルシチジン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウリジン、2'-O-メチルシチジン、5-カルボキシメチルアミノメチルチオウリジン、ジヒドロウリジン、2'-O-メチルプソイドウリジン、β D-ガラクトシルケオシン、2'-O-メチルグアノシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデノシン、1-メチルアデノシン、1-メチルプソイドウリジン、1-メチルグアノシン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアノシン、2-メチルアデノシン、2-メチルグアノシン、3-メチルシチジン、5-メチルシチジン、N6-メチルアデノシン、7-メチルグアノシン、5-メチルアミノメチルウリジン、5-メトキシアミノメチル-2-チオウリジン、β D-マンノシルメチルウリジン、5-メトキシカルボニルメチルウリジン、5-メトキシウリジン、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデノシン、N-((9-β-リボフラノシル-2-メチルチオプリン-6-イル)カルバモイル)スレオニン、N-((9-β-リボフラノシルプリン-6-イル)N-メチル-カルバモイル)スレオニン、ウリジン-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウリジン-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、プソイドウリジン、ケオシン、2-チオシチジン、5-メチル-2-チオウリジン、2-チオウリジン、4-チオウリジン、5-メチルウリジン、N-((9-β-D-リボフラノシルプリン-6-イル)カルバモイル)スレオニン、2'-O-メチル-5-メチルウリジン、2'-O-メチルウリジン、ワイブトシン、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン、β D-アラビノシルウリジン、およびβ D-アラビノシルチミジンからなる群より選択される、少なくとも1つのヌクレオチド置換または付加を含む、本発明1001〜1076のいずれかの組成物。
[本発明1078]
MNAザイムパートザイム、MNAザイム基質、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも1つが、アプタマーまたはその一部をさらに含む、本発明1003〜1008のいずれかの組成物。
[本発明1079]
アプタマーまたはその一部が、核酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、それらの誘導体、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも1つを含む、本発明1078の組成物。
[本発明1080]
任意のMNAザイムパートザイム、MNAザイム基質、EAS1、EAS2、EAS3、EAS4、EAS5、EAS6、EAS7、EAS8、SIO、DF、またはヌクレアーゼが、固体支持体に付着している、本発明1001〜1079のいずれかの組成物。
[本発明1081]
第1のDFが標的の存在下でのみ産生される、本発明1001、1002、または1050のいずれかの組成物。
[本発明1082]
第1のDFが標的とは異なる、本発明1003、1009、または1050のいずれかの組成物。
[本発明1083]
組成物が標的を検出するためのものであり、かつ第1のDFが該標的とは異なる、本発明1001または本発明1002の組成物。
[本発明1084]
任意のEASが、別のEASとハイブリダイズして、複数のDFとハイブリダイズし得る部分的酵素シグナル増幅因子(PESA)複合体を形成することができる、本発明1001〜1083のいずれかの組成物。
[本発明1085]
標的分子の異なる部分に特異的な第1および第2のMNAザイムを含む、本発明1003〜1008のいずれかの組成物。
[本発明1086]
標的分子の異なる部分に特異的なMNAザイムが、該標的の存在下で組織化した場合に、同じ基質を認識し切断する、本発明1085の組成物。
[本発明1087]
異なる標的に対して特異性を有する少なくとも2つの異なるMNAザイムを含む、本発明1003〜1008のいずれかの組成物。
[本発明1088]
異なる標的に対して相補性を有する少なくとも2つの異なるSIOを含む、本発明1009または本発明1067の組成物。
[本発明1089]
異なる第1のDFと組織化される少なくとも2つの異なる第1のCESA複合体を含む、本発明1001〜1003、1009、1050、または1067のいずれかの組成物。
[本発明1090]
以下の段階を含む、標的を検出するための方法：
(a) 2つまたはそれ以上のパートザイムおよび少なくとも1つの多成分核酸(MNAザイム)基質を提供する段階であって、該パートザイムは標的の存在下で自己組織化して、少なくとも1つのMNAザイムを形成する、段階；
(b) MNAザイムの自己組織化および触媒活性を可能にする条件下で、標的を含むと推定される試料にパートザイムを接触させる段階であって、MNAザイムの触媒活性により、前記少なくとも1つのMNAザイム基質から第1のドライバー断片オリゴヌクレオチド(DF)が産生される、段階；
(c) 第1の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS1)および第2の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS2)を提供する段階であって、EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部は第1のDFの一部と相補的である、段階；
(d) 以下を可能にする条件下で、EAS1およびEAS2を第1のDFに接触させる段階：
(1) 第1の完全酵素シグナル増幅因子(CESA)複合体を形成するための、第1のDFとEAS1およびEAS2との組織化、ならびに
(2) 第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位の形成；
(e) 第1のヌクレアーゼを提供する段階；ならびに
(f) ヌクレアーゼと認識部位との相互作用および切断部位での切断を可能にする条件下で、第1のヌクレアーゼを第1のCESA複合体と接触させる段階であって、第1のヌクレアーゼによる切断は、標的の存在を示す検出可能な影響をもたらす、段階。
[本発明1091]
第1のヌクレアーゼが、第1のヌクレアーゼの認識部位および/または切断部位を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、本発明1090の方法。
[本発明1092]
第1のDFが、MNAザイム基質の切断によって産生される、本発明1090または本発明1091の方法。
[本発明1093]
第1のDFが、2つまたはそれ以上のMNAザイム基質の核酸連結によって産生される、本発明1090または本発明1091の方法。
[本発明1094]
MNAザイム基質が、第1の鎖および第2の鎖を含むオリゴヌクレオチド複合体の第1の鎖であり、第1の鎖が内部ループ部分を含み、かつ内部ループ部分内の塩基が第2の鎖の塩基とハイブリダイズせず、かつMNAザイムが内部ループ部分を切断することができる、本発明1090〜1092のいずれかの方法。
[本発明1095]
第2の鎖が第1のDFを含む、本発明1094の方法。
[本発明1096]
第1の鎖と第2の鎖がヘアピンループ部分によって一方の末端で連結されている、本発明1094または本発明1095の方法。
[本発明1097]
MNAザイム基質がヘアピンオリゴヌクレオチドのヘアピンループ部分であり、前記MNAザイムがヘアピンループ部分を切断することができ、かつ第1のドライバー断片が該ヘアピンオリゴヌクレオチド内の二本鎖基部の一方の鎖中に位置する、本発明1090〜1092のいずれかの方法。
[本発明1098]
以下の段階を含む、標的を検出する方法：
(a) 少なくとも第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド(SIO)を提供する段階；
(b) SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、ひいては第1のヌクレアーゼの二重鎖基質を作出する条件下で、標的を含むと推定される試料とSIOを接触させる段階；
(c) SIOと標的のハイブリダイゼーションによって形成された二重鎖基質を切断し得る第1のヌクレアーゼを提供する段階であって、第1のヌクレアーゼによる二重鎖基質の切断により第1のDFが生成される、段階；
(d) EAS1およびEAS2を提供する段階であって、EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部は第1のDFの一部と相補的である、段階；
(e) 以下を可能にする条件下で、EAS1およびEAS2を第1のDFと接触させる段階：
(1) 第1のCESAを形成するための、第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化、ならびに
(2) 第2のヌクレアーゼの認識部位および切断部位の形成；
(f) 第2のヌクレアーゼを提供する段階；ならびに
(g) 第2のヌクレアーゼと認識部位との相互作用および切断部位での切断を可能にする条件下で、第2のヌクレアーゼを第1のCESAと接触させる段階であって、第2のヌクレアーゼによる切断は、標的の存在を示す検出可能な影響をもたらす、段階。
[本発明1099]
第1のヌクレアーゼが、SIOが標的とハイブリダイズした場合にのみ、SIOを切断して第1のDFを生成する、本発明1098の方法。
[本発明1100]
第1のヌクレアーゼが、標的がSIOとハイブリダイズした場合にのみ、標的を切断して第1のDFを生成する、本発明1098の方法。
[本発明1101]
第1のヌクレアーゼが制限酵素ではない、本発明1100の方法。
[本発明1102]
第1のヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼである、本発明1098〜1101のいずれかの方法。
[本発明1103]
第1のCESA複合体の切断によりさらなるDFの放出が可能になり、かつさらなるDFがさらなる酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドと組織化してさらなるCESA複合体を形成し、かつ少なくとも1つのヌクレアーゼを用いてさらなるCESA複合体が切断されて、さらなる検出可能な影響がもたらされ、かつさらなるDFが放出され、それによって検出可能な影響のさらなる増加が促進される、本発明1090〜1102のいずれかの方法。
[本発明1104]
以下の段階を含む、カスケードを用いて標的を検出する方法であって：
(a) 第1のDFを産生する段階であって、第1のDFは標的の存在下でのみ産生される、段階；
(b) 以下のものを提供する段階：
(i) EAS1およびEAS2であって、
EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、
EAS1の一部は第1のDFの一部と相補的であり、かつ
EAS1またはEAS2の一部は第2のDFを含む、EAS1およびEAS2、
ならびに、
(ii) 第3の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS3)および第4の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS4)であって、
EAS3の一部はEAS4の一部と相補的であり、
EAS3の一部は第2のDFの一部と相補的である、EAS3およびEAS4；
(c) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化を可能にして、第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESA複合体を形成させる条件下における、EAS1およびEAS2と(a)の第1のDF；
(ii) 第1のヌクレアーゼと第1のCESA複合体の認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第1のヌクレアーゼによる切断部位での切断により第2のDFが放出される、第1のCESA複合体と第1のヌクレアーゼ；
(d) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第2のDFとEAS3およびEAS4の組織化を可能にして、第2のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第2のCESA複合体を形成させる条件下における、EAS3およびEAS4と第2のDF；
(ii) 第2のヌクレアーゼと第2のCESA複合体の認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第2のヌクレアーゼは該切断部位で第2のCESA複合体を切断する、第2のCESA複合体と第2のヌクレアーゼ；
ここで、第1のCESA複合体および/または第2のCESA複合体の切断は、検出可能な影響をもたらす、方法。
[本発明1105]
第1のCESA複合体および第2のCESA複合体の切断がそれぞれ、検出可能な影響をもたらす、本発明1104の方法。
[本発明1106]
第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼが同じヌクレアーゼである、本発明1104および本発明1105の方法。
[本発明1107]
第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼが異なるヌクレアーゼである、本発明1104および本発明1105の方法。
[本発明1108]
EAS3またはEAS4の一部が付加的なDFを含み、かつ第2のヌクレアーゼによる第2のCESA複合体の切断部位での切断により、該付加的なDFが放出される、本発明1104〜1107のいずれかの方法。
[本発明1109]
前記付加的なDFの一部が第5の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS5)の第1の部分と相補的であり、EAS5の第2の部分が第6の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS6)の一部と相補的であり、かつEAS5およびEAS6が該付加的なDFと組織化して第3のCESA複合体を形成する、本発明1108の方法。
[本発明1110]
(i) 付加的なDFの一部が第1のDFと同一であるか；
(ii) 付加的なDFが第1のDFと同一であるか；または
(iii) 付加的なDFが第1のDFの断片であり；
該付加的なDFがEAS1およびEAS2と組織化して、第1のCESA複合体を形成することができる、本発明1108の方法。
[本発明1111]
以下の段階を含む、カスケードを用いて複数の異なる標的を検出する方法であって：
(a) 少なくとも第1のDFおよび第2のDFを産生する段階であって、第1のDFは第1の標的の存在下でのみ産生され、第2のDFは第2の標的の存在下でのみ産生される、段階；
(b) 以下のものを提供する段階：
(i) EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、
EAS1の一部は第1のDFの一部と相補的である、EAS1およびEAS2、ならびに
(ii) EAS3の一部はEAS4の一部と相補的であり、
EAS3の一部は第2のDFの一部と相補的である、EAS3およびEAS4；
(c) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化を可能にして、第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESA複合体を形成させる条件下における、EAS1およびEAS2と(a)の第1のDF；
(ii) 第1のヌクレアーゼと第1のCESA複合体の認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第1のヌクレアーゼは該切断部位で第1のCESA複合体を切断して、第1の検出可能な影響をもたらす、第1のCESA複合体と第1のヌクレアーゼ；
(d) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第2のDFとEAS3およびEAS4の組織化を可能にして、第2のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第2のCESA複合体を形成させる条件下における、EAS3およびEAS4と第2のDF；
(ii) 第2のヌクレアーゼと第2のCESA複合体の認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第2のヌクレアーゼは該切断部位で第2のCESA複合体を切断して、第2の検出可能な影響をもたらす、第2のCESA複合体と第2のヌクレアーゼ；
ここで、第1の検出可能な影響は第2の検出可能な影響とは異なる。
[本発明1112]
第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼが同じヌクレアーゼである、本発明1111の方法。
[本発明1113]
第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼが異なるヌクレアーゼである、本発明1111および本発明1112の方法。
[本発明1114]
(i) EAS1またはEAS2の一部が付加的なDFを含み、かつ第1のヌクレアーゼによる第1のCESA複合体の切断部位での切断により、該付加的なDFが放出される；かつ
(ii) 該付加的なDFが少なくとも2つの付加的なEASオリゴヌクレオチドと組織化して付加的なCESA複合体を形成し、ヌクレアーゼによる該付加的なCESA複合体の切断により、第1の検出可能な影響が増加する、
本発明1111〜1113のいずれかの方法。
[本発明1115]
(i) EAS3またはEAS4の一部が付加的なDFを含み、かつ第2のヌクレアーゼによる第2のCESA複合体の切断部位での切断により、該付加的なDFが放出される；かつ
(ii) 該付加的なDFが少なくとも2つの付加的なEASオリゴヌクレオチドと組織化して付加的なCESA複合体を形成し、ヌクレアーゼによる該付加的なCESA複合体の切断により、第2の検出可能な影響が増加する、
本発明1111〜1114のいずれかの方法。
[本発明1116]
以下の段階を含む、カスケードを用いて標的を検出する方法であって：
(a) 第1のドライバー断片を産生する段階であって、第1のドライバー断片は該標的の存在下でのみ提供される、段階；
(b) 以下のものを提供する段階：
(i) EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、
EAS1の一部は第1のDFの一部と相補的であり、
EAS1またはEAS2の一部は第2のDFを含み、かつ
EAS1またはEAS2は支持体に連接されている、EAS1およびEAS2、
(ii) EAS3の一部はEAS4の一部と相補的であり、
EAS3の一部は第2のDFの一部と相補的であり、
EAS3またはEAS4の一部は第3のDFを含み、かつ
EAS3またはEAS4は支持体に連接されている、EAS3およびEAS4；
(c) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化を可能にして、第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESAを形成させる条件下における、EAS1およびEAS2と(a)の第1のDF；
(ii) 第1のヌクレアーゼと第1のCESAの認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第1のものによる該切断部位での切断により第2のDFが放出される、第1のCESAと第1のヌクレアーゼ；
(d) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第2のDFとEAS3およびEAS4の組織化を可能にして、第2のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第2のCESAを形成させる条件下における、EAS3およびEAS4と第2のDF；
(ii) 第2のヌクレアーゼと第2のCESAの認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第2のヌクレアーゼによる該切断部位での切断により、EAS1およびEAS2と組織化して第1のCESAを形成し得る第3のDFが放出される、第2のCESAと第2のヌクレアーゼ；
ここで、第1のCESA複合体および/または第2のCESA複合体の切断は、検出可能な影響をもたらす、方法。
[本発明1117]
(a)の第1のDFが、
SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、イニシエーターヌクレアーゼ(initiator nuclease)による修飾に適した二重鎖構造を形成させる条件下で、標的を含むと推定される試料とSIOを接触させること、および
二重鎖構造を前記イニシエーターヌクレアーゼと接触させること
によって産生され、
前記イニシエーターヌクレアーゼによる二重鎖構造中の対形成または非対形成領域の修飾により、第1のDFが放出される、
本発明1104〜1116のいずれかの方法。
[本発明1118]
(a)の第2のDFが、
SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、イニシエーターヌクレアーゼによる修飾に適した二重鎖構造を形成させる条件下で、標的を含むと推定される試料とSIOを接触させること、および
二重鎖構造を前記イニシエーターヌクレアーゼと接触させること
によって産生され、
前記イニシエーターヌクレアーゼによる二重鎖構造中の対形成または非対形成領域の修飾により、第2のDFが放出される、
本発明1111〜1115のいずれかの方法。
[本発明1119]
前記イニシエーターヌクレアーゼが、SIOが標的とハイブリダイズした場合にのみ、SIOを切断して前記DFを生成する、本発明1117または本発明1118の方法。
[本発明1120]
前記イニシエーターヌクレアーゼが、標的がSIOとハイブリダイズした場合にのみ、標的を切断して前記DFを生成する、本発明1117または本発明1118の方法。
[本発明1121]
前記イニシエーターヌクレアーゼが制限酵素ではない、本発明1120の方法。
[本発明1122]
前記イニシエーターヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼである、本発明1117〜1121のいずれかの方法。
[本発明1123]
SIOが支持体に付着している、本発明1117〜1122のいずれかの方法。
[本発明1124]
(a)の第1のDFが、2つまたはそれ以上のパートザイムおよび少なくとも1つのMNAザイム基質を提供すること、および標的を含むと推定される試料とパートザイムを、該標的の存在下でMNAザイムの自己組織化および触媒活性を可能にする条件下で接触させることによって産生され、該触媒活性により該基質が修飾され、それによって第1のDFが提供される、本発明1104〜1116のいずれかの方法。
[本発明1125]
(a)の第2のDFが、2つまたはそれ以上のパートザイムおよび少なくとも1つのMNAザイム基質を提供すること、および標的を含むと推定される試料とパートザイムを、該標的の存在下でMNAザイムの自己組織化および触媒活性を可能にする条件下で接触させることによって産生され、該触媒活性により該基質が修飾され、それによって第2のDFが提供される、本発明1111〜1115のいずれかの方法。
[本発明1126]
MNAザイム基質が、第1の鎖および第2の鎖を含むオリゴヌクレオチド複合体の第1の鎖であり、第1の鎖が内部ループ部分を含み、かつ内部ループ部分内の塩基が第2の鎖の塩基とハイブリダイズせず、かつMNAザイムが内部ループ部分を切断することができる、本発明1124または本発明1125の方法。
[本発明1127]
第2の鎖が前記DFを含む、本発明1126の方法。
[本発明1128]
第1の鎖と第2の鎖がヘアピンループ部分によって一方の末端で連結されている、本発明1126または本発明1127の方法。
[本発明1129]
前記ヘアピンループ部分がオリゴヌクレオチドリンカーまたは非オリゴヌクレオチドリンカーである、本発明1128の方法。
[本発明1130]
前記MNAザイム基質がヘアピンオリゴヌクレオチドのヘアピンループ部分であり、MNAザイムがヘアピンループ部分を切断することができ、かつ前記ドライバー断片がヘアピンオリゴヌクレオチド内の二本鎖基部の一方の鎖中に位置する、本発明1124または本発明1125の方法。
[本発明1131]
EAS3およびEAS4が、EAS3およびEAS4の相補的部分の間で形成される二本鎖部分、ならびにEAS3の一方の末端とEAS4の一方の末端とを連結するヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチド複合体の成分である、本発明1104〜1130のいずれかの方法。
[本発明1132]
EAS1およびEAS2が、EAS1およびEAS2の相補的部分の間で形成される二本鎖部分、ならびにEAS1の一方の末端とEAS2の一方の末端とを連結するヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチド複合体の成分である、本発明1090〜1130のいずれかの方法。
[本発明1133]
前記ヘアピンループ部分がオリゴヌクレオチドリンカーまたは非オリゴヌクレオチドリンカーである、本発明1131または本発明1132の方法。
[本発明1134]
前記ヘアピンオリゴヌクレオチド複合体が、1つのEASオリゴヌクレオチドから伸長した5'または3'オーバーハング一本鎖部分をさらに含む、本発明1131〜1133のいずれかの方法。
[本発明1135]
前記ヘアピンループ部分が、検出可能な部分および/またはクエンチャー部分を含む、本発明1131〜1134のいずれかの方法。
[本発明1136]
EAS3および/またはEAS4が検出可能な部分および/またはクエンチャー部分を含み、かつ該検出可能な部分とクエンチャー部分とが、第2のヌクレアーゼによる第2のCESAの切断時に分離して、検出可能な影響を提供する、本発明1104〜1130のいずれかの方法。
[本発明1137]
EAS3が検出可能な部分およびクエンチャー部分を含み、EAS4がさらなるクエンチャー部分を含み、かつ該検出可能な部分とさらなるクエンチャー部分とが、第2のヌクレアーゼによる第2のCESAの切断時に分離して、検出可能な影響を提供する、本発明1136の方法。
[本発明1138]
EAS1および/またはEAS2が検出可能な部分および/またはクエンチャー部分を含み、かつ該検出可能な部分とクエンチャー部分とが、第1のヌクレアーゼによる第1のCESAの切断時に分離して、検出可能な影響を提供する、本発明1090〜1130のいずれかの方法。
[本発明1139]
EAS1が検出可能な部分およびクエンチャー部分を含み、EAS2がさらなるクエンチャー部分を含み、かつ該検出可能な部分とさらなるクエンチャー部分とが、第1のヌクレアーゼによる第1のCESAの切断時に分離して、検出可能な影響を提供する、本発明1138の方法。
[本発明1140]
検出可能な部分がフルオロフォアである、本発明1135〜1139のいずれかの方法。
[本発明1141]
第1のヌクレアーゼが、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、本発明1090〜1097のいずれかの方法。
[本発明1142]
第2のヌクレアーゼが、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、本発明1098〜1103のいずれかの方法。
[本発明1143]
第1のヌクレアーゼが、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができ、かつ/または第2のヌクレアーゼが、第2のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、本発明1104〜1137のいずれかの方法。
[本発明1144]
前記ニックが、ヌクレアーゼ認識部位内に、ヌクレアーゼ切断部位に、またはヌクレアーゼ認識部位と切断部位の間に位置する、本発明1141〜1143のいずれかの方法。
[本発明1145]
前記ヌクレアーゼが、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspR Iからなる群より選択される、本発明1141〜1144のいずれかの方法。
[本発明1146]
第1のDFのEAS1への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識部位および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位を完成する、本発明1090〜1145のいずれかの方法。
[本発明1147]
第2のDFのEAS2への結合が、部分的ヌクレアーゼ認識部位および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位を完成する、本発明1104〜1137のいずれかの方法。
[本発明1148]
前記DFが、部分的ヌクレアーゼ認識配列および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位に少なくとも1つの塩基を寄与する、本発明1146または本発明1147の方法。
[本発明1149]
前記DFが、部分的ヌクレアーゼ認識部位および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位に少なくとも2つの塩基を寄与する、本発明1146〜1148のいずれかの方法。
[本発明1150]
前記DFが、部分的ヌクレアーゼ認識部位および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位に少なくとも3つの塩基を寄与する、本発明1146〜1149のいずれかの方法。
[本発明1151]
前記塩基が、酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドの結合によって形成される部分的ヌクレアーゼ認識部位のすぐ3'側にある、本発明1148〜1150のいずれかの方法。
[本発明1152]
前記塩基が、酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドの結合によって形成される部分的ヌクレアーゼ認識部位のすぐ5'側にある、本発明1148〜1150のいずれかの方法。
[本発明1153]
第1のDFが、ヌクレアーゼ認識部位またはヌクレアーゼ切断部位に塩基を寄与しない、本発明1090〜1145のいずれかの方法。
[本発明1154]
第2のDFが、ヌクレアーゼ認識部位またはヌクレアーゼ切断部位に塩基を寄与しない、本発明1104〜1137のいずれかの方法。
[本発明1155]
以下の段階を含む、カスケードを用いて標的を検出する方法であって：
(a) 第1のドライバー断片を産生する段階であって、第1のドライバー断片は標的の存在下でのみ産生される、段階；
(b) 以下のものを含む第1の骨格オリゴヌクレオチドを含む第1の複合体を提供する段階：
(i) EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、
EAS2の一部は第1のドライバー断片の一部と相補的であり、かつ
EAS1またはEAS2の一部は第2のドライバー断片を含む、EAS1を含む第1の部分、
(ii) EAS3の一部はEAS4と相補的であり、
EAS3の一部は第2のドライバー断片の一部と相補的であり、かつ
EAS3またはEAS4の一部は第1のドライバー断片を含む、EAS3を含む第2の部分、および
(iii) 第1の部分と第2の部分を接続する第3の部分；
ならびに、
(c) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化を可能にして、第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESAを形成させる条件下における、EAS1およびEAS2と(a)の第1のDF；
(ii) 第1のヌクレアーゼと第1のCESAの認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第1のヌクレアーゼによる該切断部位での切断により第2のDFが放出される、第1のCESAと第1のヌクレアーゼ；
(d) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第2のDFとEAS3およびEAS4の組織化を可能にして、第2のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第2のCESAを形成させる条件下における、EAS3およびEAS4と第2のDF；
(ii) 第2のヌクレアーゼと第2のCESAの認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第2のヌクレアーゼによる該切断部位での切断により、EAS1およびEAS2と組織化して第1のCESAを形成し得る第1のDFが放出される、第2のCESAと第2のヌクレアーゼ；
ここで、第1のCESA複合体および/または第2のCESA複合体の切断は、検出可能な影響をもたらす、方法。
[本発明1156]
第1のCESA複合体の切断および第2のCESA複合体の切断がそれぞれ、検出可能な影響をもたらす、本発明1155の方法。
[本発明1157]
以下の段階をさらに含む、方法であって：
(a) 以下のものを含む骨格オリゴヌクレオチドを含む第2の複合体を提供する段階：
(i) 第5の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS5)を含む第1の部分であって、
EAS5の一部は第6の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS6)の一部と相補的であり、かつ
EAS5の一部は第2のドライバー断片の一部と相補的であり、かつ
EAS5またはEAS6の一部は第1のドライバー断片を含む、第1の部分、および
(ii) 第7の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS7)を含む第2の部分であって、
EAS7の一部は第8の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS8)の一部と相補的であり、
EAS8の一部は第1のドライバー断片の一部と相補的であり、
EAS7またはEAS8の一部は第2のドライバー断片を含む、第2の部分、および
(iii) 第1の部分と第2の部分を接続する第3の部分であって、第1の複合体の骨格の第3の部分と相補的である、第3の部分；
ならびに、
(b) 第1の複合体の第3の部分と第2の複合体の第3の部分とのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、第1の複合体と第2の複合体を接触させ、それによって第1の二重複合体を形成させる段階；
(c) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第2のDFとEAS5およびEAS6の組織化を可能にして、第3のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第3のCESAを形成させる条件下における、EAS5およびEAS6と(a)の第2のDF；
(ii) 第3のヌクレアーゼと第3のCESAの認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第3のヌクレアーゼによる該切断部位での切断により、EAS1およびEAS2と組織化して第1のCESAを形成し得、かつEAS7およびEAS8と組織化して第4のCESAを形成し得る第1のDFが放出される、第3のCESAと第3のヌクレアーゼ；ならびに
(d) 以下のものを接触させる段階：
(i) 第1のDFとEAS7およびEAS8の組織化を可能にして、第4のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第4のCESAを形成させる条件下における、EAS7およびEAS8と第1のDF；
(ii) 第4のヌクレアーゼと第4のCESAの認識部位および切断部位との相互作用を可能にする条件下における、第4のヌクレアーゼによる該切断部位での切断により、EAS3およびEAS4と組織化して第2のCESAを形成し得、かつEAS5およびEAS6と組織化して第3のCESAを形成し得る第2のDFが放出される、第4のCESAと第4のヌクレアーゼ；
ここで、第3のCESA複合体および/または第4のCESA複合体の切断は、検出可能な影響をもたらす、本発明1155または本発明1156の方法。
[本発明1158]
第3のCESA複合体の切断および第4のCESA複合体の切断がそれぞれ、検出可能な影響をもたらす、本発明1157の方法。
[本発明1159]
EAS1がEAS7と同一であり、EAS2がEAS8と同一であり、EAS3がEAS5と同一であり、かつ/またはEAS4がEAS6と同一である、本発明1157または本発明1158の方法。
[本発明1160]
第1の二重複合体が第2の二重複合体に連結している、本発明1157〜1159のいずれかの方法。
[本発明1161]
第1の二重複合体のEAS1〜EAS8のうちのいずれか1つまたは複数と第2の二重複合体のEAS1〜EAS8のうちのいずれか1つまたは複数との連結により、第1の二重複合体が第2の二重複合体に連結している、本発明1160の方法。
[本発明1162]
第1の二重複合体のEAS2および/またはEAS8と第2の二重複合体のEAS2および/またはEAS8の連結により、第1の二重複合体が第2の二重複合体に連結している、本発明1160または本発明1161の方法。
[本発明1163]
連結が、化学的ハイブリダイゼーション、抗体、オリゴヌクレオチドリンカー、非オリゴヌクレオチドリンカー、およびペプチドリンカーのうちのいずれか1つまたは複数を用いて達成される、本発明1161または本発明1162の方法。
[本発明1164]
連結が、酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドのうちのいずれか1つまたは複数のビオチン化、およびアビジンを用いた複数のビオチン化酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドの複合体化により達成される、本発明1161または本発明1162の方法。
[本発明1165]
(a)の第1のDFが、
SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、イニシエーターヌクレアーゼによる修飾に適した二重鎖構造を形成させる条件下で、標的を含むと推定される試料とSIOを接触させること、および
二重鎖構造を前記イニシエーターヌクレアーゼと接触させること
によって産生され、
前記イニシエーターヌクレアーゼによる二重鎖構造中の対形成または非対形成領域の修飾により、第2のDFが放出される、
本発明1155〜本発明1164のいずれかの方法。
[本発明1166]
前記イニシエーターヌクレアーゼが、SIOが標的とハイブリダイズした場合にのみ、SIOを切断して前記DFを生成する、本発明1165の方法。
[本発明1167]
前記イニシエーターヌクレアーゼが、標的がSIOとハイブリダイズした場合にのみ、標的を切断して前記DFを生成する、本発明1165の方法。
[本発明1168]
前記イニシエーターヌクレアーゼが制限酵素ではない、本発明1167の方法。
[本発明1169]
(a)の第1のDFが、2つまたはそれ以上のパートザイムおよび少なくとも1つのMNAザイム基質を提供すること、および標的を含むと推定される試料とパートザイムを、該標的の存在下でMNAザイムの自己組織化および触媒活性を可能にする条件下で接触させることによって産生され、該触媒活性により該基質が修飾され、それによって第1のDFが提供される、本発明1155〜1164のいずれかの方法。
[本発明1170]
EAS1、EAS2、EAS3、EAS4、EAS5、EAS6、EAS7、およびEAS8のうちのいずれか1つまたは複数が、検出可能な部分およびクエンチャー部分を含み、該検出可能な部分およびクエンチャー部分が、第1、第2、第3、および/または第4のCESAの切断時に分離して、検出可能な影響を提供する、本発明1157〜1169のいずれかの方法。
[本発明1171]
(i) EAS1が検出可能な部分を含み、かつEAS2がクエンチャー部分を含む、もしくはその逆である；および/または
(ii) EAS3が検出可能な部分を含み、かつEAS4がクエンチャー部分を含む、もしくはその逆である；および/または
(iii) EAS5が検出可能な部分を含み、かつEAS6がクエンチャー部分を含む、もしくはその逆である；
(iv) EAS7が検出可能な部分を含み、かつEAS8がクエンチャー部分を含む、もしくはその逆である；
ここで、検出可能な部分とクエンチャー部分は、第1、第2、第3、および/または第4のCESAの切断時に分離して、検出可能な影響を提供する、
本発明1157〜1169のいずれかの方法。
[本発明1172]
任意の前記ヌクレアーゼが、第1、第2、または第3のヌクレアーゼの認識配列を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、本発明1155〜1171のいずれかの方法。
[本発明1173]
前記ヌクレアーゼが、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspRIからなる群より選択される、本発明1172の方法。
[本発明1174]
任意の前記DFの酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドへの結合が、部分的ヌクレアーゼ認識部位および/または部分的ヌクレアーゼ切断部位を完成する、本発明1155〜1171のいずれかの方法。
[本発明1175]
EAS1およびEAS2；EAS3およびEAS4；EAS5およびEAS6；ならびにEAS7およびEAS8より選択される一対の酵素増幅因子基質が、該対の各メンバーの相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、および基部の一方の末端に連結しているヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である、本発明1157〜1168のいずれかの方法。
[本発明1176]
任意の第1のDFが、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼより選択されるヌクレアーゼを用いて生成される、本発明1090〜1175のいずれかの方法。
[本発明1177]
エキソヌクレアーゼが、ヌクレアーゼBAL-31、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼIII、T7エキソヌクレアーゼ、T7エキソヌクレアーゼI、およびエキソヌクレアーゼTからなる群より選択される、本発明1176の方法。
[本発明1178]
エンドヌクレアーゼが、T7エンドヌクレアーゼI、RNase H、フラップヌクレアーゼ、またはマングビーンヌクレアーゼである、本発明1176の方法。
[本発明1179]
以下の段階を含む、カスケードを用いて標的を検出する方法であって：
(a) 以下のものを提供する段階：
(i) 標的鎖と相補的な第1の部分および該標的鎖と相補的でない第2の部分であって、第1の部分と第2の部分はホスホロチオエートによって分離されており、かつ第2の部分は第1のDFを含む、第1の部分および第2の部分；ならびに
(ii) EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1とEAS2のハイブリダイゼーションは、両末端に3'オーバーハングを有する二重鎖構造を提供し、かつEAS1の一部は第1のDFの一部と相補的である、EAS1およびEAS2；
(iii) 第1のエキソヌクレアーゼ；ならびに
(b) 以下のものを接触させる段階：
(i) SIOと標的のハイブリダイゼーションを可能にして、ひいては第1のエキソヌクレアーゼの二重鎖基質を作出する条件下における、第1のエキソヌクレアーゼによる二重鎖構造の修飾により、二重鎖基質から第1のDFが放出される、標的を含むと推定される試料とSIO；
(ii) 第1のDFとEAS1およびEAS2の組織化を可能にして、第2のエキソヌクレアーゼの基質を含む第1のCESA複合体を形成させる条件下における、EAS1およびEAS2と(b)の第1のDF；
(iii) 第2のエキソヌクレアーゼと第1のCESA複合体との相互作用を可能にする条件下における、第2のエキソヌクレアーゼによる第1のCESA複合体の修飾により、第1のCESA複合体から、付加的なEAS1およびEAS2と組織化して付加的な第1のCESA複合体を形成し得る第1のDFが放出される、第1のCESAと第2のエキソヌクレアーゼ；
ここで、二重鎖構造の該修飾および/または第1のCESA複合体の該修飾は、検出可能な影響を提供する、方法。
[本発明1180]
二重鎖構造の前記修飾および第1のCESA複合体の前記修飾が、検出可能な影響を提供する、本発明1179の方法。
[本発明1181]
SIOが、2つの相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、一本鎖ヘアピンループ、および3'オーバーハングを含むヘアピンオリゴヌクレオチドである、本発明1179または本発明1180の方法。
[本発明1182]
第1および/または第2のエキソヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼIIIである、本発明1179〜1181のいずれかの方法。
[本発明1183]
SIOおよび/またはEAS1が検出可能な部分およびクエンチャー部分を含み、かつ該検出可能な部分とクエンチャー部分が、前記エキソヌクレアーゼによる修飾時に分離して、検出可能な影響を提供し得る、本発明1179〜1182のいずれかの方法。
[本発明1184]
前記検出可能な部分がフルオロフォアである、本発明1183の方法。
[本発明1185]
前記検出可能な影響が、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分光法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射測定、測光法、シンチグラフィー、電子的方法、UV、可視光もしくは赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせによって検出される、本発明1090〜1184のいずれかの方法。
[本発明1186]
検出可能な影響が測定され、かつ該測定の大きさおよび/または検出可能な影響の蓄積率が標的の量を示す、本発明1090〜1185のいずれかの方法。
[本発明1187]
標的が、核酸、タンパク質、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオン、核酸、またはそれらの任意の誘導体、部分、もしくは組み合わせからなる群より選択される、本発明1090〜1186のいずれかの方法。
[本発明1188]
核酸が、DNA、メチル化DNA、アルキル化DNA、RNA、メチル化RNA、マイクロRNA、siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、プレおよびプリマイクロRNA、他の非コードRNA、リボソームRNA、それらの誘導体、それらの単位複製配列、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、本発明1187の方法。
[本発明1189]
核酸の供給源が、合成、哺乳動物、ヒト、動物、植物、真菌、細菌、ウイルス、古細菌、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、本発明1187または本発明1188の方法。
[本発明1190]
核酸が増幅される、本発明1187〜1189のいずれかの方法。
[本発明1191]
第1のDFが標的とは異なる、本発明1098、1104、1111、1116、または1155のいずれかの方法。
[本発明1192]
任意のEASが別のEASとハイブリダイズして、複数のDFとハイブリダイズし得る部分的酵素シグナル増幅因子(PESA)複合体を形成することができる、本発明1090〜1191のいずれかの方法。
[本発明1193]
標的分子の異なる部分に特異的な第1および第2のMNAザイムを用いる段階を含む、本発明1090〜1097、1124、1125、または1169のいずれかの方法。
[本発明1194]
標的分子の異なる部分に特異的なMNAザイムが、該標的の存在下で組織化した場合に、同じ基質を認識し切断する、本発明1193の方法。
[本発明1195]
異なる標的に対して特異性を有する少なくとも2つの異なるMNAザイムを用いる段階を含む、本発明1090〜1097、1124、1125、または1169のいずれかの方法。
[本発明1196]
異なる標的に対して相補性を有する少なくとも2つの異なるSIOを用いる段階を含む、本発明1098、1117、1118、および1165のいずれかの方法。
[本発明1197]
異なる第1のDFと組織化される少なくとも2つの異なる第1のCESA複合体を用いる段階を含む、本発明1090、1098、1104、1011、1116、または1155のいずれかの方法。
[本発明1198]
ヌクレアーゼ；ならびに
EAS1とEAS2の一部は相補的であり、かつEAS1およびEAS2は、ドライバー断片オリゴヌクレオチドと組織化した場合にのみ、該ヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む複合体を形成する、EAS1およびEAS2
を含む、シグナルを増幅するためのキット。
[本発明1199]
ヌクレアーゼ；
EAS1とEAS2の一部が相補的である、EAS1およびEAS2；
標的に対応するMNAザイムを組織化するように設計された複数のパートザイム；ならびに
MNAザイム基質であって、ただし、該基質の一部はEAS1の一部と相補的である、MNAザイム基質
を含む、標的を検出するためのキットであって、
ここで、EAS1およびEAS2は、ドライバー断片オリゴヌクレオチドと組織化した場合にのみ、該ヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む複合体を形成する、キット。
[本発明1200]
ヌクレアーゼ；
EAS1とEAS2の一部が相補的である、EAS1およびEAS2；
標的とハイブリダイズしてヌクレアーゼ基質を形成するように設計された複数のSIO
を含む、標的を検出するためのキットであって、
ここで、ヌクレアーゼ基質の一部はEAS1の一部と相補的であり、
EAS1およびEAS2は、ドライバー断片オリゴヌクレオチド(DF)と組織化した場合にのみ、該ヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む複合体を形成する、キット。
[本発明1201]
第1の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS1)および第2の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS2)を含むキットであって、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1およびEAS2が、第1のドライバー断片オリゴヌクレオチド(DF)と組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識および切断配列を含む第1の完全酵素シグナル増幅因子(CESA)複合体を形成し、かつ第1のDFの一部がEAS1の一部と相補的である、キット。
[本発明1202]
EAS1、EAS2、および第1のヌクレアーゼを含むキットであって、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1およびEAS2が、第1のDFと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成し、第1のDFの一部がEAS1の一部と相補的である、キット。
[本発明1203]
多成分核酸酵素(MNAザイム)、MNAザイム基質、EAS1、EAS2、および第1のヌクレアーゼを含むキットであって：
MNAザイムが、MNAザイム組織化助長因子の存在下で自己組織化してMNAザイムを形成する少なくとも第1のパートザイムおよび第2のパートザイムを含み、少なくとも第1および第2のパートザイムのそれぞれが基質アーム部分、触媒コア部分、およびセンサーアーム部分を含み、かつ第1および第2のパートザイムをそれらそれぞれの触媒コア部分が会合するように近接して維持して、MNAザイムの触媒コアを形成するように、センサーアームがMNAザイム組織化助長因子と相互作用し、かつ触媒コアがMNAザイム基質を修飾して第1のDFを形成することができ；
ならびに、EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部が第1のDFの一部と相補的であり、かつ第1のDFがEAS1およびEAS2と組織化して、少なくとも第1のヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第1のCESA複合体を形成することができる、
キット。
[本発明1204]
前記MNAザイム基質が、第1の鎖および第2の鎖を含むオリゴヌクレオチド複合体の第1の鎖であり、第1の鎖が内部ループ部分を含み、かつ内部ループ部分内の塩基が第2の鎖の塩基とハイブリダイズせず、かつMNAザイムが内部ループ部分を切断することができる、本発明1203のキット。
[本発明1205]
第2の鎖が第1のDFを含む、本発明1204のキット。
[本発明1206]
第1の鎖と第2の鎖がヘアピンループ部分によって一方の末端で連結されている、本発明1204または本発明1205のキット。
[本発明1207]
前記MNAザイム基質がヘアピンオリゴヌクレオチドのヘアピンループ部分であり、MNAザイムがヘアピンループ部分を切断することができ、かつ第1のドライバー断片がヘアピンオリゴヌクレオチド内の二本鎖基部の一方の鎖中に位置する、本発明1203のキット。
[本発明1208]
組織化助長因子が、同定される標的である、本発明1203〜1207のいずれかのキット。
[本発明1209]
第1の合成イニシエーターオリゴヌクレオチド(SIO)、EAS1、EAS2、第1のヌクレアーゼ、および第2のヌクレアーゼを含むキットであって：
SIOが標的とハイブリダイズして二重鎖基質を形成することができ、第1のヌクレアーゼが二重鎖基質を切断して第1のDFを生成することができ；かつ
EAS1の一部がEAS2の一部と相補的であり、かつEAS1の一部が第1のDFの一部と相補的であり、かつEAS1およびEAS2が、第1のDFと組織化した場合にのみ、第2のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成する、
キット。
[本発明1210]
第1のヌクレアーゼが、SIOが標的とハイブリダイズした場合にのみ、SIOを切断して第1のDFを生成することができる、本発明1209のキット。
[本発明1211]
第1のヌクレアーゼが、標的がSIOとハイブリダイズした場合にのみ、標的を切断して第1のDFを生成することができる、本発明1209のキット。
[本発明1212]
第1のヌクレアーゼが制限酵素ではない、本発明1211のキット。
[本発明1213]
第1のヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼである、本発明1209〜1212のいずれかのキット。
[本発明1214]
第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼが同じヌクレアーゼである、本発明1209〜1213のいずれかのキット。
[本発明1215]
第1のヌクレアーゼと第2のヌクレアーゼが異なるヌクレアーゼである、本発明1209〜1213のいずれかのキット。
[本発明1216]
第1のヌクレアーゼが、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、本発明1201〜1209のいずれかのキット。
[本発明1217]
第2のヌクレアーゼが、第1のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、本発明1209〜1215のいずれかのキット。
[本発明1218]
前記ニックが、ヌクレアーゼ認識部位内に、ヌクレアーゼ切断部位に、またはヌクレアーゼ認識部位と切断部位の間に位置する、本発明1216または本発明1217のキット。
[本発明1219]
前記ヌクレアーゼが、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspR Iからなる群より選択される、本発明1216〜1218のいずれかのキット。
[本発明1220]
EAS1およびEAS2が、EAS1およびEAS2の相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、ならびにEAS1の一方の末端とEAS2の一方の末端を連結するヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である、本発明1198〜1219のいずれかのキット。
[本発明1221]
ヘアピンオリゴヌクレオチドが、EAS1またはEAS2のいずれかから伸長した一本鎖5'または3'オーバーハング部分を含む、本発明1220のキット。
[本発明1222]
EAS1またはEAS2の一部が第2のDFを含み、かつ第2のDFが、ヌクレアーゼによる第1のCESA複合体の修飾時に放出され得る、本発明1198〜1221のいずれかのキット。
[本発明1223]
ヘアピンループ部分の一部が第2のDFを含み、かつ第2のDFが、ヌクレアーゼによる第1のCESA複合体の修飾時に放出され得る、本発明1220〜1221のいずれかのキット。
[本発明1224]
第1のDFと第2のDFが同一ではない、本発明1222または本発明1223のキット。
[本発明1225]
第1のDFと第2のDFが同一である、本発明1222または本発明1223のキット。
[本発明1226]
第2のDFが第1のDFの断片であるか、または第1のDFが第2のDFの断片である、本発明1222または本発明1223のキット。
[本発明1227]
第2のDF、EAS1、およびEAS2が組織化して、第1のCESA複合体を形成することができる、本発明1225または本発明1226のキット。
[本発明1228]
第3の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS3)および第4の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS4)をさらに含む、キットであって、EAS3の一部がEAS4の一部と相補的であり、かつEAS3の一部が第2のDFの一部と相補的であり、かつEAS3およびEAS4が、第2のDFと組織化した場合にのみ、付加的なヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第2のCESA複合体を形成する、本発明1222〜1224のいずれかのキット。
[本発明1229]
EAS3またはEAS4が第3のDFを含む、本発明1228のキット。
[本発明1230]
第3のDFが第1のDFと同一である、本発明1229のキット。
[本発明1231]
第3のDFが第1のDFと同一ではない、本発明1229のキット。
[本発明1232]
付加的なヌクレアーゼがキット中の別のヌクレアーゼと同一である、本発明1228〜1231のいずれかのキット。
[本発明1233]
付加的なヌクレアーゼがキット中の別のヌクレアーゼと同一ではなく、かつキットが該付加的なヌクレアーゼを含む、本発明1228〜1231のいずれかのキット。
[本発明1234]
付加的なヌクレアーゼが、第2のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、本発明1228〜1233のいずれかのキット。
[本発明1235]
前記ヌクレアーゼが、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspR Iからなる群より選択される、本発明1228〜1234のいずれかのキット。
[本発明1236]
EAS3およびEAS4が、EAS3およびEAS4の相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、ならびにEAS3の一方の末端とEAS4の一方の末端を連結するヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である、本発明1228〜1235のいずれかのキット。
[本発明1237]
前記ヘアピンオリゴヌクレオチドが、EAS3またはEAS4のいずれかから伸長した一本鎖5'または3'オーバーハング部分を含む、本発明1236のキット。
[本発明1238]
骨格オリゴヌクレオチド、EAS1、EAS2、EAS3、およびEAS4を含む第1の複合体を含むキットであって、該骨格オリゴヌクレオチドが：
(i) EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、EAS2の一部は第1のDFの一部と相補的であり、かつEAS1またはEAS2の一部は第2のDFを含み、かつEAS1およびEAS2は、第1のDFと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第1のCESA複合体を形成する、EAS1を含む第1の部分；
(ii) EAS3の一部はEAS4の一部と相補的であり、EAS3の一部は第2のDFの一部と相補的であり、かつEAS3またはEAS4の一部は第1のDFを含み、かつEAS3およびEAS4は、第2のDFと組織化した場合にのみ、第2のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第2のCESA複合体を形成する、EAS3を含む第2の部分；ならびに
(iii) 第1の部分と第2の部分を接続する第3の部分
を含む、キット。
[本発明1239]
骨格オリゴヌクレオチド、第5の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS5)、第6の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS6)、第7の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS7)、および第8の酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド(EAS8)を含む第2の複合体をさらに含む、キットであって、該骨格オリゴヌクレオチドが：
(i) EAS5の一部はEAS6の一部と相補的であり、EAS5の一部は第2のDFの一部と相補的であり、かつEAS5またはEAS6の一部は第1のDFを含み、かつEAS5およびEAS6は、第2のDFと組織化した場合にのみ、第3のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第3のCESA複合体を形成する、EAS5を含む第1の部分；ならびに
(ii) EAS7の一部はEAS8の一部と相補的であり、EAS8の一部は第1のDFの一部と相補的であり、かつEAS7またはEAS8の一部は第2のDFを含み、かつEAS7およびEAS8は、第1のDFと組織化した場合にのみ、第4のヌクレアーゼの認識配列および切断配列を含む第4のCESA複合体を形成する、EAS7を含む第2の部分；ならびに
(iii) 第1の部分と第2の部分を接続する第3の部分であって、第1の複合体の骨格の第3の部分と相補的である、第3の部分
を含む、本発明1238のキット。
[本発明1240]
EAS1がEAS7と同一であり、EAS2がEAS8と同一であり、EAS3がEAS5と同一であり、かつ/またはEAS4がEAS6と同一である、本発明1239のキット。
[本発明1241]
第1のヌクレアーゼが第3のヌクレアーゼと同一であり、かつ/または第2のヌクレアーゼが第4のヌクレアーゼと同一であり、かつ/または第1、第2、第3、および第4のヌクレアーゼが同一である、本発明1239または本発明1240のキット。
[本発明1242]
第1の複合体と第2の複合体が、それらそれぞれの相補的な第3の部分を介してハイブリダイズして、第1の二重複合体を形成する、本発明1239〜1241のいずれかのキット。
[本発明1243]
第1の二重複合体が第2の二重複合体に連結している、本発明1242のキット。
[本発明1244]
第1の二重複合体のEAS1〜EAS8のうちのいずれか1つまたは複数と第2の二重複合体のEAS1〜EAS8のうちのいずれか1つまたは複数の連結により、第1の二重複合体が第2の二重複合体に連結している、本発明1243のキット。
[本発明1245]
第1の二重複合体のEAS2および/またはEAS8と第2の二重複合体のEAS2および/またはEAS8との連結により、第1の二重複合体が第2の二重複合体に連結している、本発明1243または本発明1244のキット。
[本発明1246]
連結が、化学的ハイブリダイゼーション、抗体、オリゴヌクレオチドリンカー、非オリゴヌクレオチドリンカー、およびペプチドリンカーのうちのいずれか1つまたは複数を用いて達成される、本発明1244または本発明1245のキット。
[本発明1247]
連結が、酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドのうちのいずれか1つまたは複数のビオチン化、およびアビジンを用いた複数のビオチン化酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチドの複合体化により達成される、本発明1244または本発明1245のキット。
[本発明1248]
第1および/または第2のヌクレアーゼが、第2のCESA複合体を形成する2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドを切断することができる、本発明1239〜1247のいずれかのキット。
[本発明1249]
第1および/または第2のヌクレアーゼが、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear I、およびTspR Iからなる群より選択される、本発明1239〜1248のいずれかのキット。
[本発明1250]
EAS1およびEAS2；EAS3およびEAS4；EAS5およびEAS6；ならびにEAS7およびEAS8より選択される一対の酵素増幅因子基質が、該対の各メンバーの相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、および基部の一方の末端に連結しているヘアピンループ部分を含むヘアピンオリゴヌクレオチドの成分である、本発明1239〜1249のいずれかのキット。
[本発明1251]
以下のものを含むSIOを含むキット：
(i) 標的鎖と相補的な第1の部分および該標的鎖と相補的でない第2の部分であって、第1の部分と第2の部分はホスホロチオエートによって分離されており、かつ第2の部分は第1のDFを含む、第1の部分および第2の部分；ならびに
(ii) EAS1およびEAS2であって、
EAS1の一部はEAS2の一部と相補的であり、EAS1とEAS2のハイブリダイゼーションは、両末端に3'オーバーハングを有する二重鎖構造を提供し、
EAS1の一部は第1のDFの一部と相補的であり、かつ
EAS1およびEAS2は、第1のDFと組織化した場合にのみ、第1のヌクレアーゼによって消化され得る陥凹3'末端を含む第1のCESA複合体を形成することができる、EAS1およびEAS2。
[本発明1252]
SIOが、2つの相補的部分のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖基部、一本鎖ヘアピンループ、および3'オーバーハングを含むヘアピンオリゴヌクレオチドである、本発明1251のキット。
[本発明1253]
前記ヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼである、本発明1251または1252のキット。
[本発明1254]
任意のEASが1つまたは複数の検出可能な標識を含む、本発明1198〜1253のいずれかのキット。
[本発明1255]
任意のEASがフルオロフォア部分およびクエンチャー部分を含む、本発明1198〜1254のいずれかのキット。
[本発明1256]
任意のMNAザイムパートザイム、MNAザイム基質、EAS1、EAS2、EAS3、EAS4、EAS5、EAS6、EAS7、EAS8、SIO、DF、またはヌクレアーゼが、固体支持体に付着している、本発明1198〜1255のいずれかのキット。
[本発明1257]
第1のDFが標的とは異なる、本発明1199、1200、1208、または1209のいずれかのキット。
[本発明1258]
標的分子の異なる部分に特異的な第1および第2のMNAザイムを含む、本発明1199または本発明1203のキット。
[本発明1259]
標的分子の異なる部分に特異的なMNAザイムが、該標的の存在下で組織化した場合に、同じ基質を認識し切断する、本発明1258のキット。
[本発明1260]
異なる標的に対して特異性を有する少なくとも2つの異なるMNAザイムを含む、本発明1199または本発明1203のキット。
[本発明1261]
異なる標的に対して相補性を有する少なくとも2つの異なるSIOを含む、本発明1200、1209、または1251のいずれかのキット。
[本発明1262]
本発明1001〜1089のいずれかの組成物を含むキット。
[本発明1263]
キットを使用するための説明書をさらに含む、本発明1198〜1262のいずれかのキット。
本発明のこれらおよび他の局面を、図面および実施例を参照して、以下により詳細に記載するが、図面および実施例は本発明のいくつかの局面を説明するものであり、本発明の全体を包含しているわけではなく、それらは添付の特許請求の範囲の意義および範囲の中で変化形および変更が可能であることを当業者は明白に理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０３１６】
添付の図面に関して、本発明の好ましい態様を、ほんの一例としてここで記載する。
【図１】図1は、種々の切断可能および切断不可能な二重鎖オリゴヌクレオチド構造体の例示的な図解を提供している。各オリゴヌクレオチド断片の5'末端を丸によって示す。構造体A（i）は、ヌクレアーゼによる切断を受けやすいマルチオリゴヌクレオチド複合体である完全酵素シグナル増幅因子（CESA）複合体の例を図解している。このCESAは、3種のオリゴヌクレオチド、すなわち酵素増幅因子基質オリゴ1（EAS1）、酵素増幅因子基質オリゴ2（EAS2）、およびドライバー断片（DF）から構成される。A（i）に図解されているCESAにおいて、DFの5'末端はEAS2の3'末端と接している。DFの3'末端がEAS2の5'末端と接している第2のCESAは、A（ii）に図解されている。  構造体B（i）は、切断を受けやすい二重鎖構造体の形成を妨害する付加的配列の存在により、RE等のヌクレアーゼによる切断に抵抗性のマルチオリゴヌクレオチド複合体である酵素阻害性複合体（EIC）の例を図解している。このEICは、3種のオリゴヌクレオチド、すなわちEAS1、EAS2、および阻害性断片（InF）から構成される。InFは、DFの配列に加えて、EAS2との接合を妨害しかつEIC複合体をヌクレアーゼ消化に対して抵抗性にする付加的配列を含有している。EIC B（i）において、InFの5'末端はEAS2の3'末端を妨害する。InFの3'末端がEAS2の5'末端を妨害する第2のEICは、B（ii）に図解されている。  構造体C（i）は、切断を受けやすい二重鎖構造体を形成するのに必要とされる配列の欠如により、RE等のヌクレアーゼによる切断に抵抗性があるマルチオリゴヌクレオチド複合体である部分的酵素シグナル増幅因子（PESA）複合体の例を図解している。この図解において、PESAは、2種のオリゴヌクレオチド、すなわちEAS1およびEAS2から構成される。このPESAは、ヌクレアーゼによる認識および／または切断に充分な二重鎖配列を含有していない。PESA C（i）において、EAS1の5'末端に不充分な二重鎖配列が存在する。EAS1の3'末端に不充分な二重鎖配列が存在する第2のPESAは、C（ii）に図解されている。
【図２】図2は、制限エンドヌクレアーゼ（RE）によって切断されるように設計された、種々の十分に組織化した完全酵素シグナル増幅因子（CESA）複合体の例示的なスキーマを示している。これらの略図において、上段の黒い実線はCESAの酵素増幅因子基質オリゴ断片1（EAS1）を表し、下段の黒い実線はCESAの酵素増幅因子基質オリゴ断片2（EAS2）を表す。ドライバー断片（白い中央部を有する黒い線によって表されるDF）は、RE（陰影線のボックスとして表される）の認識配列を完成させるのに必要とされ得、かつ／またはREによる切断に必要とされるRE認識部位に隣接した付加的配列を提供し得る。切断部位は、黒い実線の垂直矢印によって表される。  REによる切断は、5'突出、3'突出のいずれかをもたらし得、またはそれは平滑末端を生成し得る。REは、EAS1、EAS2、およびDFを含む二本鎖の組織化したCESAのうちの一方または両方の鎖を切断し得る。EAS2とDFとが接する位置は、連続した（断裂していない）二本鎖の二重鎖をREが通常切断する位置であってよく、またはそれは、REによる認識および切断に必要とされる配列を有する他の位置であってよい。EAS2に接するDFの末端は、より長いオリゴ、例えば前の工程における阻害性断片（InF）の切断によって生成され得る。InFは、例えばヌクレアーゼによって切断可能な合成イニシエーターオリゴ（SIO）、またはMNAザイムによって切断可能なMNAザイム基質を含んでよい。タンパク質酵素またはMNAザイムによるそのようなより長いオリゴの切断は、5'および3'断片をもたらし得、それらの一方または両方は、CESAの完成のためのDFとして働き得る。そのような場合、EAS2に接するDFの末端は、切断されたオリゴの3'断片の5'末端、または切断されたオリゴの5'断片の3'末端でなければならない。  パネル（a）：REの認識配列を完成させるためにDFが必要とされ、かつRE切断が3'突出をもたらす、DFを有する組織化したCESA。この例において、EAS2と接するDFの末端は、3'切断断片の5'末端である。  パネル（b）：REの認識配列を完成させるためにDFが必要とされ、かつRE切断が5'突出をもたらす、DFを有する組織化したCESA。この例において、EAS2と接するDFの末端は、3'切断断片の5'末端である。  パネル（c）：REの認識配列を完成させるためにDFが必要とされ、かつRE切断が平滑末端をもたらす、DFを有する組織化したCESA。この例において、EAS2と接するDFの末端は、3'切断断片の5'末端である。  パネル（d）：REの認識配列を完成させるためにDFが必要とされ、かつREが一方の鎖のみを、この図解においてはEAS1を切断する、DFを有する組織化したCESA。この例において、EAS2と接するDFの末端は、3'切断断片の5'末端である。  パネル（e）：DFは、REの認識配列を完成させるために必要とされず、むしろREによる切断のために必要とされるRE認識部位に隣接する配列を提供する、DFを有する組織化したCESA。この例において、EAS2と接するDFの末端は、3'切断断片の5'末端である。  パネル（f）：REの認識配列を完成させるためにDFが必要とされ、かつRE切断が5'突出をもたらす、DFを有する組織化したCESA。この例において、EAS2と接するDFの末端は、5'切断断片の3'末端である。  パネル（g）：DFが、REによる切断のために必要とされる完全なRE認識配列の一方の鎖を提供することによってREの認識配列を完成させる、DFを有する組織化したCESA。この例において、EAS2と接するDFの末端は、3'切断断片の5'末端である。  パネル（h）：DFが、REによる切断のために必要とされる完全なRE認識配列の一方の鎖を提供することによってREの認識配列を完成させる、DFを有する組織化したCESA。この例において、EAS2と接するDFの末端は、5'切断断片の3'末端である。
【図３】図3は、実施例1の種々の切断可能および切断不可能な二重鎖オリゴヌクレオチド構造体の例示的な図解である。各オリゴヌクレオチド断片の5'末端を丸によって示す。完全または部分的な制限酵素認識部位を点線のボックスとして示し、制限酵素切断部位を実線の垂直矢印として示す。パネルAは、酵素による切断を受けやすいマルチオリゴヌクレオチド複合体である完全酵素シグナル増幅因子（CESA）複合体の例を図解している。この図および実施例1において、酵素は、その認識部位から離れて切断する制限酵素（RE）Mnl Iである。このCESAは、3種のオリゴヌクレオチド、すなわちフルオロフォアおよびクエンチャーで標識されている酵素増幅因子基質オリゴ1（上段の黒い実線によって表されるEAS1）、クエンチャーで標識された酵素増幅因子基質オリゴ2（下段の黒い実線によって表されるEAS2）、ならびにドライバー断片（白い中央部を有する黒い線によって表されるDF）から構成される。このCESAにおいて、DFの5'末端はEAS2の3'末端と接している。このCESAの切断は、REによるEAS1およびEAS2オリゴヌクレオチドの切断により蛍光の増大をもたらすが、しかしながら、DFは切断されず、そのため、別の部分的酵素シグナル増幅因子（PESA）複合体に結合することができる。このような、CESAの切断を用いてシグナルを増幅する反応を「EzyAmp」反応と称する。  パネルBは、REによる切断に抵抗性があるマルチオリゴヌクレオチド複合体である酵素阻害性複合体（EIC）の例を図解している。このEICは、3種のオリゴヌクレオチド、すなわちEAS1、EAS2、および阻害性断片（InF）から構成される。InFは、DFの配列全体（RERを完成させるために必要とされる塩基を含む）を含むが、REによる切断に必要とされる構造体の形成を妨害する付加的配列も含む。このEICにおいて、InFの5'末端は、EAS2の3'末端に接し、かつEAS2の3'末端における結合を妨害する。InFは、標的の存在下においてのみ切断されてDFを産生し得るオリゴ配列を含んでよい。例えば、InFは、標的特異的な様式でヌクレアーゼによって切断可能なSIO、またはMNAザイムによって切断可能なMNAザイム基質を含んでよい。  パネルCは、ヌクレアーゼ、例えばRE Mnl Iによる切断に抵抗性があるマルチオリゴヌクレオチド複合体である部分的酵素シグナル増幅因子複合体（PESA）の例を図解している。このPESAは、2種のオリゴヌクレオチド、すなわちEAS1およびEAS2から構成される。このPESAは、REによって必要とされる二本鎖の認識配列を含有していない。  パネルDは、EAS1のみを含有しており、ゆえにREによる切断を受けにくい対照の例を図解している。RE認識部位および切断部位を形成するためには、EAS1に相補的な配列が必要とされるため、切断は起こり得ない。
【図４】図4は、EzyAmp反応の一例を図解している。第1の酵素増幅因子基質オリゴ（EAS1）および第2の酵素増幅因子基質（EAS2）オリゴを含むPESA複合体を含有している反応において、ドライバー断片（DF）（標的依存的な酵素修飾によって生成される、または反応混合物に直接添加される）が存在する。DFは、PESA複合体と組織化して、ヌクレアーゼ認識部位および切断部位を含有しているCESAを生成するものであって、この図解において、ヌクレアーゼは制限酵素である。EAS1、EAS2、およびDFのそれぞれにおける丸は、各オリゴの5'末端を示す。制限酵素認識部位を点線のボックスとして示し、制限酵素切断部位を実線の垂直矢印によって示す。この図解において、第1のEAS1はフルオロフォア（F）で標識されており、第2のEAS2はクエンチャー（Q）で標識されている。後に成分の解離が続く、組織化したCESAの切断は、蛍光シグナルの生成および無傷DFの放出をもたらす。DFは、次いで遊離して別のPESAと結びつき、オリゴのさらなる酵素的切断およびそれに続く蛍光につながる別のCESAを形成する。ゆえに、プロセスは継続し、かつさらなるCESAのヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）を介した切断によって蛍光シグナルが産生されるシグナル増幅をもたらす。
【図５】図5は、REによるCESAの切断によってシグナル増幅が仲介される、MNAザイムによって開始されるEzyAmp反応の例示的なスキーマである。Aのボックスは、その基質（白い中央部を有する黒い線）に結合している組織化したMNAザイム（灰色の実線）を図解しており、Bのボックスは、2つの部分的酵素シグナル増幅因子（PESA）複合体（黒い実線）を図解するものであって、そのそれぞれは、この図解においてフルオロフォア（F）およびクエンチャー（Q）で標識された酵素増幅因子基質オリゴ1（EAS1）、ならびにこの図解においてクエンチャー（Q）で標識された酵素増幅因子基質オリゴ2（EAS2）をなす。Cのボックスは、EAS1、EAS2、およびここではドライバー断片（DF）として機能する、切断されたMNAザイム基質の一方の断片によって形成される、完全酵素シグナル増幅因子（CESA）複合体を図解している。EAS1、EAS2、MNAザイムパートザイム、MNAザイム基質、およびDFのそれぞれにおける丸は、各オリゴヌクレオチドの5'末端を示す。制限酵素認識部位を点線のボックスとして示し、制限酵素切断部位を実線の垂直矢印として示す。反応における種々の工程に、1〜6の番号が付されている。以下の工程を用いたこの反応によって、標的DNAまたはRNAの検出が可能となる。工程1において、標的は、パートザイムと組織化して、MNAザイム基質を切断するMNAザイムを形成する。工程2において、切断されたMNAザイム基質の一方の断片は、PESAと結合し、そこでそれはDFとして機能しかつCESAの形成をもたらす。工程3において、十分に組織化したCESAはREによって切断される。工程4において、切断されたCESA断片は解離し、フルオロフォアとクエンチャーの分離につながり、ゆえに標的核酸の存在の指標である蛍光の増大を産生する。このスキームにおいて、DF自体は実際にはREによって切断されないため、それは遊離して別のPESAと結びつき（工程5）、REによって切断され得る新たなCESAを形成し（工程6）、ゆえに蛍光シグナルのさらなる増幅につながる。
【図６】図6は、REによる、本例ではMnl IによるCESAの切断によってシグナル増幅が仲介される、MNAザイムによって開始されるEzyAmp反応によって生成される蛍光シグナルの図解である。本例において、開始（MNAザイムによる）およびシグナル増幅（REによる）の2つの工程は、各工程に伴う蛍光の変化を観察することによって同時に観測された。標的組織化助長因子（AF-PD1）の存在下におけるMNAザイムレポーター基質（Sub1(8:9)-FB）のMNAザイム切断の標的依存的な開始工程を、クエンチャーからのFAMの分離後（両方とも、MNAザイムレポーター基質上に存在する）のFAMの増大によって観測した。EAS1、EAS2、およびDFから形成されるCESA複合体内にEAS1を組み入れた場合、シグナルを増幅するEzyAmp工程を、JOEとクエンチャーとの間にあるこのEAS1オリゴの切断後のJOE蛍光の増大によって観測した。標的（AF-PD1）を含有している反応または標的を欠いている反応（対照）のすべての成分は、1つの反応チャンバー内に存在しており、FAMおよびJOEの両方の蛍光は同時に観測された。FAMチャンネルにおいて、標的組織化助長因子AF-PD1の存在下におけるSub1(8:9)-FBのMNAザイムを介した切断は（（i）標的AF-PD1）、経時的なFAM蛍光の増大およびDFの産生をもたらした。AF-PD1を欠いている反応において（（ii）標的なしの対照）、経時的なFAM蛍光の増大はなかった。JOEチャンネルにおいて、標的AF-PD1の存在下におけるSub1-FBのMNAザイム切断によって生成されるDFの存在下におけるRE活性は（（iii）標的AF-PD1）、CESAの切断および経時的なJOE蛍光の増大を引き起こした。対照的に、AF-PD1を欠いている反応は（（iv）標的なしの対照）、経時的なJOE蛍光の増大を示さなかった。
【図７】図7は、複数種のCESA複合体を含有しているEzyAmpシステムの例示的なスキーマである。EAS1、EAS2、およびDFのそれぞれにおける丸は、各オリゴの5'末端を示す。制限酵素認識部位を点線のボックスとして示し、制限酵素切断部位を実線の垂直矢印として示す。この図解において、CESA A*は、DF-aと組み合わせたPESA Aから形成される。CESA B*は、DF-bと組み合わせたPESA Bから形成される。DF-aは、分析物の存在がより大きなオリゴヌクレオチド断片の切断、例えばSIOの標的依存的ヌクレアーゼ切断またはMNAザイム基質の標的依存的MNAザイム切断をもたらす条件下で、標的分析物の存在下において形成される。DF-aは、PESA Aと組み合わさって、REによって切断されるCESA A*を形成し、DF-aへの改変なしでDF-bを産生し、かつシグナルが生成され得る。次いで、DF-aは、新たなCESA A*を形成し、かつDF-b分子のシグナルおよび数の両方を増幅し得る。加えて、DF-bは、PESA Bと組み合わさって、REによって切断され得るCESA B*を形成し、DF-bを改変することなくさらなるシグナルを産生し得る。したがって、DF-bは、さらなるCESA B*を形成し、かつシグナルをさらに増幅することができる。
【図８】図8は、大腸菌（E.coli）由来のエキソヌクレアーゼIの3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を用いた、ドライバー断片（DF）を生成するためのメカニズムを図解している。この酵素は、DNA二重鎖から3'一本鎖突出を除去する。灰色の縞模様の線は標的DNAを表し、黒い実線は、ドライバー断片の生成を助長するために混合物に添加された合成イニシエーターオリゴ（SIO）を表す。閉じた丸はオリゴの5'末端を表す。灰色の実線は、DFのハイブリダイゼーションによってCESAに変換されるPESAを表す。開いた丸は、この位置でのエキソヌクレアーゼIによる複合体の切断を阻止するために組み入れられた、3'突出上のホスホロチオエートを表す。左のパネルにおいて、ドライバー断片は標的に由来する。右のパネルにおいて、DFは合成イニシエーターオリゴに由来する。右のパネルのスキームにおいて、標的は再利用されて、より多くのDFを生成することができる。
【図９】図9は、マングビーンヌクレアーゼのエキソヌクレアーゼ活性を用いた、ドライバー断片を生成するためのメカニズムを図解している。このエンドヌクレアーゼは、3'または5'方向のいずれかから、DNA二重鎖から一本鎖突出を分解し、平滑末端を残す。縞模様の灰色の線は標的DNAを表し、黒い実線は、DFの生成を助長するために混合物に添加された合成イニシエーターオリゴ（SIO）を表す。閉じた丸はオリゴの5'末端を表す。灰色の実線は、DFのハイブリダイゼーションによってCESAに変換されるPESAを表す。左のパネルにおいて、ドライバー断片は標的に由来する。右のパネルにおいて、DFは合成イニシエーターオリゴに由来する。左（L）または右（R）のパネルの両方に描かれている方法は、2つの工程（1および2）で実施されて、マングビーンヌクレアーゼによるPESAまたはCESAの消化を阻止し得る。これは、物理的分離または他の手段によって達成され得る。
【図１０】図10は、エキソヌクレアーゼIIIのエキソヌクレアーゼ活性を用いた、ドライバー断片を生成するためのメカニズムを図解している。この酵素は、DNA二重鎖の3'末端からヌクレオチドを除去する。該酵素は、平滑のまたは陥凹した3'末端上で活性を有するが、一本鎖DNA上では活性を有さず、ゆえに3'突出末端を切断しない。該酵素は、二重鎖DNAにおけるニックからの加水分解を始動して、一本鎖のギャップを産生することもできる。オリゴ上のホスホロチオエートヌクレオチド（空洞の丸によって示される）の存在によって、このエキソヌクレアーゼ活性はブロックされる。縞模様の灰色の線は標的DNAを表し、黒い実線は、DFの生成を助長するために混合物に添加された合成イニシエーターオリゴを表す。閉じた丸はオリゴの5'末端を表す。灰色の実線は、DFのハイブリダイゼーションによってCESAに変換されるPESAを表す。DFの3'フラップにおけるホスホロチオエートによって、この断片がCESAを完成させた場合に生成されるニックでの切断が阻止される。DFはSIOに由来し、無傷の標的は再利用されて、より多くのDFを生成することができる。
【図１１】図11は、T7エキソヌクレアーゼのエキソヌクレアーゼ活性を用いた、ドライバー断片を生成するためのメカニズムを図解している。この酵素は、リン酸化された5'ヌクレオチド上でより高い活性を有して、DNA二重鎖またはDNA/RNA二重鎖の5'末端からヌクレオチドを除去する。5'ホスフェートのない5'末端上での活性は、リン酸化基質の存在下において大幅に低下する。縞模様の灰色の線は標的RNAを表し、黒い実線は、DFの生成を助長するために混合物に添加された合成イニシエーターオリゴを表す。Pは5'末端におけるリン酸化されたヌクレオチドを表す。灰色の実線は、DFのハイブリダイゼーションによってCESAに変換されるPESAを表す。DFは合成イニシエーターオリゴ（SIO）に由来し、RNA標的は再利用されて、より多くのDFを生成することができる。PESAは、DNAから構成されるが、T7エキソヌクレアーゼによる分解を阻止するために、二重鎖の5'末端（点線のボックス）にいくつかのRNAを有してもよい。
【図１２】図12は、Mnl I等のREによるCESAの切断によってシグナル増幅が仲介される、MNAザイムによって開始されるEzyAmp反応によって生成される蛍光シグナルの図解である。本例において、開始およびシグナル増幅の2つの工程は、各工程に伴う蛍光の変化を観察することによって同時に観測された。標的組織化助長因子（AF-PD1）の存在下におけるMNAザイムレポーター基質（Sub1-TRB2：TXRおよびクエンチャーで標識されている）のMNAザイム切断の標的依存的な開始工程を、クエンチャーからのTXRの分離後のTXRの増大によって観測した。EAS1、EAS2、およびDFから形成されるCESA複合体内にEAS1を組み入れた場合、シグナルを増幅するEzyAmp工程を、JOEとクエンチャーとの間にあるこのEAS1オリゴの切断後のJOE蛍光の増大によって観測した。標的（AF-PD1）を含有している反応または標的を欠いている反応（対照）のすべての成分は、1つの反応チャンバー内に存在しており、TXRおよびJOEの両方の蛍光は同時に観測された。TXRチャンネルにおいて、標的組織化助長因子AF-PD1の存在下におけるSub1-TRB2のMNAザイム切断は（（i）標的AF-PD1）、経時的なTXR蛍光の増大およびDFの産生をもたらした。AF-PD1を欠いている反応において（（ii）標的なしの対照）、経時的なTXR蛍光の増大はなかった。JOEチャンネルにおいて、標的AF-PD1の存在下におけるMNAザイム切断によって生成されるDFの存在下におけるRE活性は（（iii）標的AF-PD1）、CESAの切断および経時的なJOE蛍光の増大を引き起こした。対照的に、AF-PD1を欠いている反応は（（iv）標的なしの対照）、経時的なJOE蛍光の増大を示さなかった。
【図１３】図13は、任意の標的のセットに対する等温のユニバーサルな多重化シグナル増幅のためのストラテジーを図解している。オリゴヌクレオチドのそれぞれにおける丸は、各オリゴの5'末端を表す。制限酵素認識部位を点線のボックスとして示す。複数種の標的の多重解析のためのストラテジーは、複数種のユニバーサル基質を切断する複数種のMNAザイムを用いて、複数種のユニバーサルPESAと組織化し得る複数種のユニバーサルドライバー断片を生成して、複数種のユニバーサルCESAを形成する。3種の標的、標的1、標的2、および標的3の検出のためのストラテジーを図解している。標的1は、ユニバーサルMNAザイム基質1を切断し得るMNAザイムの組織化を引き起こし得る。ユニバーサルMNAザイム基質1の切断は、PESA1と組織化し得るユニバーサルドライバー断片1の生成をもたらして、CESA1を形成し得る。CESA1を固有のフルオロフォア1で標識することができ、ヌクレアーゼで切断されると、標的1の存在を示す固有の波長における蛍光をもたらす。同様に、標的2は、ユニバーサルMNAザイム基質2を切断し得るMNAザイムの組織化を引き起こし得る。ユニバーサルMNAザイム基質2の切断は、PESA2と組織化し得るユニバーサルドライバー断片2の生成をもたらして、CESA2を形成し得る。CESA2を固有のフルオロフォア2で標識することができ、ヌクレアーゼで切断されると、標的2の存在を示す固有の波長における蛍光をもたらし得る。標的3は、ユニバーサルMNAザイム基質3を切断し得るMNAザイムの組織化を引き起こし得る。ユニバーサルMNAザイム基質3の切断は、PESA3と組織化し得るユニバーサルドライバー断片3の生成をもたらして、CESA3を形成し得る。CESA3を固有のフルオロフォア3で標識することができ、ヌクレアーゼで切断されると、標的3の存在を導く固有の波長における蛍光をもたらし得る。CESA1および2および3が切断されると、フルオロフォア1および2および3に伴う蛍光を、1つの反応で同時に観測することができる。  そのようなユニバーサル多重化システムにおいて、新たな標的を多重化反応内に容易に代入することができる。例えば、ユニバーサルMNAザイム基質1／PESA1／CESA1／フルオロフォア1のシステムは、新たな標的に特異的なセンサーアームを有し、しかしながらMNAザイム基質1への結合に適した基質アームを保持し続ける、新たなMNAザイムの合成を必要とするのみである。MNAザイム基質1の切断は常に同じドライバー断片1を産生するため、新たな標的は、以前のとおりCESA1の組織化およびそれに続く切断をもたらす。
【図１４】図14は、種々の二重鎖構造体の解析の結果を示す。パネルA、B、およびCに図解されている二重鎖構造体はすべて、フルオロフォア（F）およびクエンチャー（Q）で標識された上段の黒い実線のオリゴ（EAS1）、ならびにクエンチャーで標識された下段の黒い実線（EAS2）を含む。EAS1およびEAS2は一緒にPESAを含む。加えて、パネルAは、ドライバー断片（DF）を表す下段の縞模様のオリゴを有し、パネルBは、阻害性断片（InF）を表す下段の縞模様のオリゴを有する。  パネルAにおいて、反応におけるEAS1、EAS2、およびDF1の存在は、観察された経時的なFAM蛍光の増大によって示されるように（図14A）、RE Mnl Iに対する切断可能なCESA二重鎖基質の形成をもたらした。この観察結果は、REによる認識および切断に必要とされる領域内の2本の鎖のうちの少なくとも一方に断裂またはニックを含有している二本鎖複合体を認識および切断し得る制限酵素の能力と一致する。対照的に、反応はDF1断片を欠いているがInFを含むパネルBにおいて、形成した二重鎖は切断されず、ゆえに経時的な蛍光の増大は観察されなかった（図14B）。これは、InFがDF1の配列全体を含むという事実にもかかわらず起こった。DF中にも存在するその特異的配列に付加的である、InF中に存在する配列は、切断可能な二重鎖基質の形成を阻害した。実際、付加的配列は、酵素阻害性複合体（EIC）と称される切断不可能な複合体の形成をもたらした。  反応はEAS1およびEAS2のみを含有しており、DF1およびInFの両方を欠いているパネルCにおいて、蛍光の増大は観察されず、これら2種のオリゴ（EAS1およびEAS2）だけでは、REによる二重鎖の認識および切断に不充分であることを示した（図14C）。オリゴEAS1およびEAS2はハイブリダイズして部分的酵素シグナル増幅因子（PESA）複合体を形成するが、しかしながら、切断不可能なPESAを切断可能なCESAに変換するためには、付加的オリゴ、すなわちDFが必要とされる。
【図１５】図15は、いくつかの変形型はRE Mnl Iに対する切断可能なCESA二重鎖基質をもたらす、DFがPESA候補に結合し得る種々の構造体を図解している。これらの構造体を、実施例5の反応1〜8において試験した。本実施例において、DFの存在下（（i）とラベルされた線）または非存在下（（ii）とラベルされた線）における、フルオロフォアとクエンチャー部分の分離に伴う蛍光の変化を観察することによって、Mnl I切断を観測した。1〜8の番号が付されている各パネルは、PESA候補の構造（黒い実線）およびDF候補の位置（縞模様の線）を示している。丸はオリゴヌクレオチドの5'末端を示す。RERSを点線のボックスとして示す。反応7におけるNがDFとRERSとの間に存在するデオキシリボヌクレオチドを指すという点を除いて、「N」は、RERSを完成させるために必要とされる、DFに存在するデオキシリボヌクレオチド（すなわち、PESAからなくなっている、RERS由来のヌクレオチド）に等しい。反応4において、「n」はリボヌクレオチドを示す。実線の垂直矢印はMnl Iに対する切断部位を示し、「^」は隣接したヌクレオチド間にホスホジエステル結合がないことを示す。PESAおよびDF構造体候補の図式の下は、実施例5において記載されるように、これらのオリゴヌクレオチドとMnl Iとのインキュベーションの間の経時的な蛍光レベルのプロットである。二つ組の反応の平均を示す。  パネル1（実施例5の反応1）において、DFを、部分的Mnl I認識部位5'GAGG3'の直前の3'配列として設計した（GAGG^）。DFの非存在下（ii）における蛍光の増大と比較して、DFの存在下（i）ではより速い速度の蛍光の増大が観察された。この反応におけるPESAは、RER配列全体を含有していたが、RERSの側面に位置する追加配列の付加（DFによって提供される）によって、より速い切断がもたらされた。  パネル2（実施例5の反応2）において、DFを、3'末端からの1個のヌクレオチドによって5'GAGG3'という部分的Mnl I認識配列を完成させるように設計した（GAG^G）。DFの存在下において、経時的な蛍光の増大が観察された（i）。対照的に、DFが存在しない場合、経時的な蛍光の増大は観察されなかった（ii）。この結果は、DFが3'末端からの1個のヌクレオチド（G）によって5'GAGG3'という部分的Mnl I認識配列を完成させた場合に、切断可能なCESAが形成され得ることを示している。  パネル3（実施例5の反応3）において、DFを、3'末端からの2個のヌクレオチドによって5'GAGG3'という部分的Mnl I認識配列を完成させるように設計した（GA^GG）。DFの存在下において、経時的な蛍光の増大が観察された（i）。対照的に、DFが存在しない場合、経時的な蛍光の増大は観察されなかった（ii）。この結果は、DFが3'末端からの2個のヌクレオチド（GG）によって5'GAGG3'という部分的Mnl I認識配列を完成させた場合に、切断可能なCESAが形成され得ることを示している。  パネル4（実施例5の反応4）において、DFを、2番目の塩基がリボヌクレオチドである、3'末端からの2個のヌクレオチドによって5'GAGG3'という部分的Mnl I認識配列を完成させるように設計した（GA^gG）。DFの存在下において、経時的な蛍光の増大が観察された（i）。対照的に、DFが存在しない場合、経時的な蛍光の増大は観察されなかった（ii）。この結果は、DFが3'末端からの2個のヌクレオチド（GG）によって5'GAGG3'という部分的Mnl I認識配列を完成させた場合に��たとえ2番目のヌクレオチドがリボヌクレオチド（Gg）である場合でさえ、切断可能なCESAが形成され得ることを示している。  パネル5（実施例5の反応5）において、DFを、3'末端からの3個のヌクレオチドによって5'GAGG3'という部分的Mnl I認識配列を完成させるように設計した（G^AGG）。DFの存在下において、経時的な蛍光の増大が観察された（i）。対照的に、DFが存在しない場合、経時的な蛍光の増大は観察されなかった（ii）。この結果は、DFが3'末端からの3個のヌクレオチド（GGA）によって5'GAGG3'という部分的Mnl I認識配列を完成させた場合に、切断可能なCESAが形成され得ることを示している。  パネル6（実施例5の反応6）において、DFを、5'GAGG3'というMnl I認識配列から直接上流にある5'配列として結合するように設計した（^GAGG）。DFの存在下（i）または非存在下（ii）において、経時的な蛍光の増大は観察されなかった。この結果は、DFが5'GAGG3'というMnl I認識配列から直接上流にある5'末端で結合した場合に、切断可能なCESAは形成されないことを示している。  パネル7（実施例5の反応7）において、DFを、5'GAGG3'というMnl I認識配列から2ヌクレオチド上流にある5'配列として結合するように設計した（^NNGAGG）。DFの存在下において、経時的な蛍光の増大が観察された（i）。対照的に、DFが存在しない場合、経時的な蛍光の増大は観察されなかった（ii）。この結果は、DFがMnl I RERSから2ヌクレオチド上流で結合し、RE切断部位を完成させた場合に、切断可能なCESAが形成され得ることを示している。  パネル8（実施例5の反応8）において、DFを、5'末端からの2個のヌクレオチドによって5'CCTC3'という部分的Mnl I認識配列を完成させるように設計した（CC^TC）。DFの存在下において、経時的な蛍光の増大が観察された（i）。対照的に、DFが存在しない場合、経時的な蛍光の増大は観察されなかった（ii）。この結果は、DFが5'末端からの2個のヌクレオチド（CC）によって5'CCTC3'という部分的Mnl I認識配列を完成させた場合に、切断可能なCESAが形成され得ることを示している。
【図１６】図16は、実施例6において記載されるREのStyD 4I（パネルI）、Rsa I（パネルII）、Msp I（パネルIII）、およびBssK I（パネルIV）による、例示される種々の構造体に対する切断のパターンを図解している。反応は、以下のとおり列挙される構造体を含有していた：反応A：CESA、反応B：PESA＋InF、反応C：PESA、反応D：標識したEAS1オリゴ、反応E（陽性対照）および反応F（陰性対照）：連続した二本鎖のRE基質。反応A〜EはREを含有していたが、一方で、陰性対照の反応FはREを含有していなかった。二つ組の反応の平均を示す。  これらの酵素、および本実験において解析された他のすべての酵素（データ示さず）は、陽性対照（反応E）に対して、経時的な蛍光の増大を呈した。これらの観察結果は、十分なRERSを含有している連続した二本鎖複合体を認識および切断し得るREの能力と一致する。すべての陰性対照の反応（反応F）は、経時的な蛍光の増大を呈しなかった。  パネルIは、表13の列Iに記載されるRE StyD4 Iに対して得られたデータを示している。このREに対する反応A〜Dにおいて、経時的な蛍光の増大は観察されなかった。このことは、このREが、試験された条件下で、該REによる認識および切断に必要とされる領域内の2本の鎖のうちの少なくとも一方にニックを含有している二本鎖複合体を切断することができないことの指標である。さらに、反応が部分的に形成されたRERSのみを含有している場合、このREは切断することができなかった。  パネルIIは、表13の列IIに記載されるRE Rsa Iに対して得られたデータを示している。他の2つのREのPme IおよびHpy 8Iも、Rsa Iに対して報告されるものと同様のパターンを示した。反応Aにおいて、EAS1、EAS2、およびDFの存在は、観察された経時的な蛍光の増大によって示されるように、切断可能なCESAの形成をもたらした。これらの観察結果は、これらのREが、試験された反応条件下で、RERS内にニックを含有している二本鎖複合体を認識かつ切断することができることの指標である。対照的に、DFを欠いているがInFを含む反応Bにおいて、経時的な蛍光の増大は観察されず、形成した二本鎖複合体が切断されなかったことを示した。この反応条件下では、EICが形成された。これらのREに対する反応CおよびDに対して、経時的な蛍光の増大は観察されず、このREは、不完全なRERSを含有している構造体を切断することができないことを示した。  パネルIIIは、表13の列IIIに記載されるRE Msp Iに対して得られたデータを示している。RE Ear Iも、Msp Iに対して報告されるものと同様のパターンの結果を示した。反応Aおよび反応Bに対して、経時的な蛍光の増大が観察された。反応Aにおいて、EAS1、EAS2、およびDFの存在は、経時的な蛍光の増大によって示されるように、切断可能なCESAの形成をもたらした。これらの観察結果は、該REが、RERS内にニックを含有している二本鎖複合体を認識かつ切断することができることの指標である。しかしながら、該REは、DFを欠いているがInFを含む反応Bにおいても、蛍光の増大を呈した。これらの観察結果は、該反応条件下で、InFはEICを形成しないことを示している。これらのREに対する反応CおよびDに対して、蛍光の増大は観察されず、このREは、不完全なRERSを含有している構造体を切断することができないことを示した。  図16のパネルIVは、表13の列IVに記載されるRE BssK Iに対して得ら��たデータを示している。RE Alw Iも、BssK Iに対して報告されるものと同様のパターンの結果を示した。反応A〜Dにおいて、経時的な蛍光の増大が観察された。これらの反応において、複合体は十分なまたは部分的なRERSを含有していた。このことは、これらのREが、試験された反応条件下で、十分なRERSおよび部分的なRERSの両方を認識かつ切断することができることの指標である。
【図１７】図17のパネルAは、EzyAmpフィードバックカスケード反応のためのストラテジーを図解している。本実施例では、2種のPESA（PESA AおよびPESA B）が存在している。PESA A（黒）はESA1A（上段の鎖）およびEAS2A（下段の鎖）を含み、PESA B（灰色）はEAS1B（上段の鎖）およびEA2B（下段の鎖）を含む。両方のPESAは、REに対する、本実施例ではMnl Iに対する部分的な認識部位を含有している。PESA A（上段の構造体、左側）がDF-a（白い線、灰色の境界線）とハイブリダイズした場合、Mnl Iに対する完全な認識部位（黒い点線のボックス）を含有している切断可能なCESA A複合体（中段の構造体、左側）が形成される。CESA Aの切断（下段の断片、左側）は、フルオロフォア、例えばJOE（J）とクエンチャー（Q）の分離による蛍光の増大をもたらす。加えて、CESA Aの切断は、複数の切断断片の放出をもたらし、そのうちの1つは新たなDF-b（縞模様の線）として機能し得る。PESA B（上段の構造体、右側）がDF-bとハイブリダイズした場合、Mnl Iに対する完全な認識部位（灰色の点線のボックス）を含有しているCESA B（中段の構造体、右側）が形成される。CESA Bの切断は、フルオロフォア、例えばFAM（F）とクエンチャー（Q）の分離による蛍光の増大をもたらす（下段の断片、右側）。加えて、CESA Bの切断は、複数の切断断片の放出をもたらし、そのうちの1つは新たなDF-aとして機能し得る。各CESA Aの切断は、新たなCESA Bの形成をもたらし得る新たなDFを生成し、かつ各CESA Bの切断は、新たなCESA Aの形成をもたらし得る新たなDFを生成し、ゆえにフィードバックカスケードを生成する。各工程における新たなDFの生成に加えて、混合物中にすでに存在しているDFは、再利用されてさらなるCESAを形成することができる。このストラテジーを用いて、DF-aまたはDF-bのいずれかの標的依存的な生成に応答してシグナルを増幅することができる。  パネルBおよびCは、パネルAにおいて記載されるカスケードの例からの蛍光の結果を示している。示されたデータは、二つ組の平均を表す。パネルB（反応A）は、PESA AおよびBにDF-aを添加した際の、JOEおよびFAMチャンネルの両方における蛍光の増大を示している。JOEチャンネルにおける増大するシグナル（「（ii）JOE：CESA A＋DF-a」とラベルされた線）は、DF-aがPESA AにハイブリダイズしてCESA Aを形成することの指標である。CESA AはMnl Iによって切断され、2箇所のクエンチャー部分からのJOEフルオロフォアの分離につながる、EAS1AおよびEAS2Aのオリゴヌクレオチド断片の解離をもたらした。FAMチャンネルにおける増大するシグナル（「（i）FAM：CESA B＋DF-a」とラベルされた線）は、EASA2の切断断片の1つであるDF-bが、切断されたCESA Aから解離し、かつPESA Bにハイブリダイズして、CESA Bを産生したことを示している。Mnl IによるCESA Bの切断は、クエンチャー部分からのFAMフルオロフォアの分離につながる、EAS1BおよびEAS2Bのオリゴヌクレオチド断片の解離をもたらした。EAS2Bの切断断片の1つは、PESA Aにハイブリダイズしてより多くのCESA Aを産生する新たなDF-a分子である。これによって、PESA A、PESA B、CESA A、およびCESA B間のフィードバックカスケードが完成された。FAMチャンネルにおける蛍光の増大の遅延は、この反応が、CESA Aの切断からのDF-bの産生に頼っていることを示している。DF-aを欠いている反応において（「（II）DF-aなしの対照」とラ���ルされた線）、JOEまたはFAM蛍光の増大はなかった。  パネルB（反応B）は、PESA AおよびPESA Bの両方を含有している反応にDF-bを添加した際の、FAMおよびJOEチャンネルの両方における蛍光の増大を示している。FAMチャンネルにおける増大するシグナル（「（v）FAM：CESA B＋DF-b」とラベルされた線）は、DF-bがPESA BにハイブリダイズしてCESA Bを形成することの指標である。CESA BはMnl Iによって切断され、FAMフルオロフォアとクエンチャー部分の分離につながる、EAS1BおよびEAS2Bのオリゴヌクレオチド断片の解離をもたらした。JOEチャンネルにおける増大するシグナル（「（vi）JOE：CESA A＋DF-b」とラベルされた線）は、EAS2Bの切断断片の1つであるDF-aが、切断されたCESA Bから解離し、かつPESA Aにハイブリダイズして、CESA Aを産生したことを示している。Mnl IによるCESA Aの切断は、JOEフルオロフォアと2箇所のクエンチャー部分の分離につながる、EAS1AおよびEAS2Aのオリゴヌクレオチド断片の解離をもたらした。EAS2Aの切断断片の1つは、PESA Bにハイブリダイズしてより多くのCESA Bを産生する新たなDF-b分子である。これによって、PESA A、PESA B、CESA A、およびCESA B間のフィードバックカスケードが完成された。JOEチャンネルにおける蛍光の増大の遅延は、この反応が、CESA Bの切断からのDF-aの産生に頼っていることを示している。DF-bを欠いている反応において（「（IV）DF-bなしの対照」とラベルされた線）、JOEまたはFAM蛍光の増大はなかった。  本実験において、2種のCESA複合体間のカスケード反応を実証するために、PESA AおよびPESA Bは異なるフルオロフォアのFAMおよびJOEで標識された。他の形式において、PESA AおよびPESA Bの両方を同じフルオロフォアで標識することができ、そのため、CESA AおよびCESA Bの切断からのシグナルは相加的である。
【図１８】図18のパネルAは、ヘアピンPESAを形成するESAオリゴヌクレオチドを採用した、EzyAmpフィードバックカスケード反応のためのストラテジーを図解している。このカスケード反応には、2種の二重標識した（フルオロフォア−クエンチャー）PESAヘアピンオリゴヌクレオチドが存在している。両方とも、REについての、本例ではMnl Iについての部分的部位を含有している。PESA A（上段の構造体、左側）がDF-a（白い線）とハイブリダイズした場合、Mnl Iの完全な認識部位（点線のボックス）をここでは含有しているCESA A（中段の構造体、左側）が形成される。CESA Aの切断（下段の断片、左側）は、PESA A上のフルオロフォア（F）とクエンチャー（Q）部分の分離による蛍光の増大をもたらす。加えて、CESA Aの切断は、複数の切断断片の放出をもたらし、そのうちの1つは新たなDF-b（縞模様の線）として機能し得る。PESA B（上段の構造体、右側）がDF-bとハイブリダイズした場合、Mnl Iの完全な認識部位（点線のボックス）をここでは含有しているCESA B（中段の構造体、右側）が形成される。CESA Bの切断は、PESA B上のフルオロフォアとクエンチャー部分の分離による蛍光の増大をもたらす（下段の断片、右側）。加えて、CESA Bの切断は、複数の切断断片の放出をもたらし、そのうちの1つは新たなDF-aとして機能し得る。各CESA A複合体の切断は、新たなCESA Bの形成をもたらし得る新たなDF-bを生成し、かつ各CESA B複合体の切断は、新たなCESA Aの形成をもたらし得る新たなDF-aを生成し、ゆえにフィードバックカスケードを生成する。各工程における新たなDFの生成に加えて、混合物中にすでに存在しているDFは、再利用されてさらなるCESAを形成することができる。このストラテジーを用いて、DF-aまたはDF-bのいずれかの標的依存的な生成に応答してシグナルを増幅することができる。  パネルBは、パネルAにおけるストラテジーを用いた実施例7において得られた結果を示している。本実験において、CESA AはPESA AおよびDF-aから構成され、CESA BはPESA BおよびDF-bから構成された。PESA Aは、DF-bとして機能し得る領域をその中に含有しており、かつPESA Bは、DF-aとして機能し得る領域をその中に含有していた。各反応において、すべての成分は1つの反応チャンバー内に存在していた。RE活性を、二重標識したPESAの切断に伴う蛍光の変化によって観測した。蛍光を、二つ組の反応の正規化した平均として示す。  パネルBにおける結果は、DF-aおよびヘアピンPESA Aの存在が、経時的な蛍光の増大によって示されるように、切断可能なCESA Aの形成をもたらしたことを実証している（反応 （i））。対照的に、いかなるDFも存在していない下でPESA Aを含有している反応（反応（ii））は、経時的な蛍光の変化を示さず、PESA Aだけでは切断可能なオリゴヌクレオチドでないことを示した。反応（iii）において、ヘアピンPESA BとのDF-bの存在は、経時的な蛍光の増大によって示されるように、切断可能なCESA Bの形成をもたらした。対照的に、いかなるDFも存在していない下でPESA Bを含有している反応（iv）では、経時的な蛍光の変化は観察されず、PESA Bだけでは切断可能なオリゴヌクレオチドでないことを示した。反応（v）において、PESA AおよびPESA Bの両方と一緒のDF-aの存在は、反応（i）と比較して、経時的な蛍光の増大のほぼ倍増をもたらした。これはCESA A切断からのDF-bの放出の指標であり、次いでそれは、今度は切断されかつより多くのDF-aを放出する、切断可能なCESA Bを形成した。この反応は、DF-aの存在によって開始されるシグナル増幅フィードバックカスケードを表す。反応（vi）において、PESA AおよびPESA Bの両方とのDF-bの存在は、反応（iii）と比較して、経時的な蛍光の増大のほぼ倍増をもたらした。これはCESA B切断からのDF-aの放出の指標であり、次いでそれは、今度はより多くのDF-bを放出する、切断可能なCESA Aを形成した。この反応は、DF-bの存在によって開始されるシグナル増幅フィードバックカスケードを表す。反応（vii）は、DFが存在せずにPESA AおよびPESA Bを含有している陰性対照反応である。この反応は経時的な蛍光の増大を示さず、DFの非存在下においてPESA AとPESA Bとの間に切断可能なCESA構造体は形成されないことを示した。反応（viii）は、等濃度でDF-a、DF-b、PESA A、およびPESA Bを含有しており、そのため、存在するすべてのPESAがCESAを形成し得かつ切断され得、ゆえにシステムにおいて獲得され得る最大の蛍光を表示する、陽性対照反応である。反応（viii）、（vi）、および（v）において、70分の時点での最終蛍光レベルは同程度であり、反応（v）および（vi）におけるフィードバックカスケードが完成に到達していることを示した。
【図１９】図19のパネルAは、開始DF配列がMNAザイム基質配列の一部でない、EzyAmpカスケードシステムの例示的なスキーマを図解している。このシステムの成分を、パネルAの左側の表中に図解する。これらの構造体に関して、黒丸は各オリゴヌクレオチドの5'末端を示し、RE認識部位は点線のボックスとして示され、制限酵素切断部位は実線の矢頭として示され、フルオロフォアおよびクエンチャー部分の存在は、それぞれFおよびQによって示されている。構造体（i）は、標的の存在下で結びついてMNAザイムを形成する、標的特異的パートザイムを図解している。複合体（ii）は、DF-aを部分的に含むオリゴヌクレオチド（（v）にある）と、DFオリゴヌクレオチドに相補的である配列が側面に位置する基質配列を含有している基質ブロッカーオリゴヌクレオチドと呼ばれる第2のオリゴとからなる、基質ブロッカー−DF-a複合体を図解している。これらのオリゴは、ハイブリダイゼーションによって固定されて、MNAザイムに対する基質である外側にループを作った領域（基質ループは円形の領域によって示されており、灰色の十字（X）はMNAザイムによる切断の部位を示す）を含有している、二本鎖オリゴ複合体を形成する。複合体（ii）は、MNAザイムによる基質ループの切断が、DF-aに結合している切断された断片の解離をもたらし、ゆえにより長い二本鎖オリゴ複合体の一本鎖伸長としてDF-aを放出するように設計されている。構造体（iii）は、CESA Aを形成するためにDF-a配列を必要とする、第1のPESA（PESA A）を図解している。このPESA Aは、REによるCESA Aの切断後に放出されるように設計されているDF-b（オリゴvi）をなす領域を、その配列内に含有している。構造体（iv）は、CESA Bを形成するためにDF-bを必要とする、第2のPESA（PESA B）を図解している。このPESA Bは、REによるCESA Bの切断後に放出されるように設計されているDF-aとして機能し得る領域を、その配列内に含有している。構造体（v）は、PESA AからCESA Aを形成するのに必要とされるDF-aを示している。構造体（vi）は、PESA BからCESA Bを形成するのに必要とされるDF-bを示している。  パネルAの右側にあるスキームは、この設計のアッセイにおける工程を図解している。工程1において、パートザイムは標的上に組織化し、構造体（ii）の基質ループを切断するように設計されたMNAザイムを形成する。工程2において、MNAザイムによる切断は、DF-aに相補的な配列の解離をもたらし、ゆえにDF-aがPESA AにハイブリダイズしてCESA Aを形成する（工程3に描かれる）ことが可能となる。工程4において、CESA Aの切断によってDF-bが放出される。この工程は、CESA Aの切断によってフルオロフォアとクエンチャー部分が分離された場合、付随した蛍光の増大も生成し得る。工程4において、放出されたDF-bは、PESA Bと結びついて、REによって次いで切断可能であるCESA Bを形成し得る。CESA Bの切断は、DF-aの放出をもたらし、かつ切断によってフルオロフォアとクエンチャー部分が分離された場合、付随した蛍光の増大も生成し得る。工程5および6において、システムは、CESA AおよびCESA Bが連続的に形成されかつ切断されてより多くのDF-aおよびDF-bを放出し、より多くのCESA AおよびCESA Bの形成をもたらす、フィードバックカスケードを形成する。より複雑な反応では、固有のMNAザイム（固有の標的を示す）によって放出され���ように設計された固有のDFをそれぞれが含有している、複数種の基質−ブロッカー−DF複合体が存在してよい。  パネルBは、パネルAにおいて記載されるものと類似したスキーマを用いて、MNAザイムによって開始されるEzyAmp反応を実証している実施例9において記載されるデータを示している。EzyAmp反応における成分には、基質−ブロッカーオリゴヌクレオチド；DF-aオリゴヌクレオチド（基質−ブロッカー−DF-a複合体を一緒に形成する）；標的にハイブリダイズし得、かつループ型基質を切断し得るMNAザイムを形成し得るパートザイム；PESA A；およびPESA Bが含まれた。PESA AはEAS1AおよびEAS2Aから構成されており、ESA2AはDF-bとして機能し得る配列を含む。PESA BはEAS1BおよびEAS2Bから構成されており、ESA2BはDF-aとして機能し得る配列を含む。反応のすべての成分は1つの反応チャンバー内に存在しており、かつ標的を含有している（標的）または標的を欠いている（標的なしの対照）のいずれかであった。FAMとクエンチャー部分の分離につながるEAS1AおよびEAS1Bの切断後のFAM蛍光の増大によって、シグナル増幅を観測した。標的の存在下におけるループ型基質のMNAザイム切断は、二本鎖の基質ブロッカー−DF-bオリゴヌクレオチド複合体の部分的な解離をもたらした。解離した複合体のDF-a部分は、PESA Aとハイブリダイズし、Mnl Iによって次いで切断されるCESA Aの形成をもたらした。これは、今度は、CESA Bの形成を可能にするDF-bを放出して、Mnl IによるCESA Bの切断をもたらし、ゆえにより多くのDF-aを放出して、CESA AとCESA Bとの間のフィードバックカスケードを完成させた。  対照的に、標的を欠いている反応（標的なしの対照）は、経時的な蛍光の指数関数的な増大を示さなかった（80分後に、低レベルの蛍光のドリフトのみが観察された）。このことは、ループ型基質のMNAザイム切断を開始してDF-aを放出し、今度は、それに続くEzyAmpカスケード反応を開始するために、標的が必要とされることを示している。
【図２０】図20は、固形担体に連接されている複数種のCESA複合体を含有しているEzyAmpシステムの例示的なスキーマを図解している。このシステムの成分は、以下のように図解されている：黒丸は各オリゴヌクレオチドの5'末端を示し、RERSは点線のボックスとして示され、切断部位は実線の矢印として示されている。ステーション1は、標的依存的な様式で切断された場合に（工程1−例えばMNAザイムを用いてMNAザイム基質を切断する）、第1のDF（縞模様の線）の放出をもたらす、連接したオリゴヌクレオチド（MNAザイム基質またはSIO）を図解している。このDFは、次いでステーション2における連接したPESA Aに移動しかつハイブリダイズして、CESA Aを形成し得る（工程2）。REによるCESA Aの切断（工程3）は、ステーション3におけるPESA Bに移動し得る第2のDF（黒い実線）を放出する。第2のDFがPESA Bとハイブリダイズした場合、CESA Bが形成される（工程4）。REによるCESA Bの切断は、第1のDF（縞模様の線）として機能し得る配列の放出をもたらす。この第1のDFは、次いでステーション2に移動し（工程5）、かつ、切断されてより多くの第2のDFを放出し得るより多くのCESA Aを形成し得る。このように、カスケード反応は開始され得、CESA AおよびCESA Bの連続的な形成および切断を可能にする（工程3、4、および5）。PESAがフルオロフォア（F）およびクエンチャー（Q）部分で標識されている場合、これらの部分の間にあるEASの切断によって蛍光シグナルが生成され得る。このシグナルは、ステーション2もしくは3における固体表面上で保持され得（この図において図解されるように）、または例えばフルオロフォアおよびクエンチャー部分の配置が反転している場合には、溶液中に放出され得る。
【図２１】図21は、実施例11において記載されるEzyAmp標的のタイトレーションの結果を示している。これらの反応は、MNAザイムによる標的依存的な基質の切断によって開始されてDFを産生し、その後に、それぞれが互いに対するDFを産生する2種のPESA複合体を含有しているEzyAmpフィードバックカスケードを用いたシグナル増幅が続いた。すべての工程は、1本のチューブ内で実施された。パネルAおよびBは、減少する濃度の標的（i〜vii）を含有しているMNAザイムによって開始されるEzyAmp反応における、経時的な蛍光の変化（それぞれ、線形および対数プロット）を示している。経時的な蛍光の変化は、標的を含有している反応において指数関数的に増大した。反応（viii）は、標的なしの対照（NTC）である。パネルCは、Ctに対して標的の濃度をプロットすることによって生成された検量線を示すものであって、Ctとは、濃度が検出閾値に到達する時点である。Ctと標的濃度の対数との間の関係は、0.99の回帰値を有する直線を呈する。
【図２２】図22は、分岐した構造体内にPESA複合体を組み入れることによってEzyAmp成分を局在化させるための例示的な方法を図解している。パネルAは、（i）（5'から3'に）EAS1B、骨格1、およびEAS2Aを含有している第1のオリゴヌクレオチド（構成単位1）；（ii）EAS2Aに相補的である第2のオリゴEAS1Aであって、（i）および（ii）はハイブリダイズしてPESA Aを形成し得る、第2のオリゴEAS1A；ならびに（iii）ESA1Bに相補的である第3のオリゴEAS2Bであって、（i）および（iii）はハイブリダイズしてPESA Bを形成し得る、第3のオリゴEAS2B；からなり得る、分岐した構造体を形成するために必要とされる第1の基本的な構成単位を図解している。パネルBは、（5'から3'に）EAS1B、骨格2、およびEAS2Aからなる構成単位2（iv）；（ii）EAS2Aに相補的である第2のオリゴEAS1Aであって、（i）および（ii）はハイブリダイズしてPESA Aを形成し得る、第2のオリゴEAS1A；ならびに（iii）ESA1Bに相補的である第3のオリゴEAS2Bであって、（i）および（iii）はハイブリダイズしてPESA Bを形成し得る、第3のオリゴEAS2B；をなし得る第4のオリゴを図解している。骨格1は、骨格2に相補的であり得る。これは、構成単位1および2を含有している分岐した複合体の形成をもたらす。各構成単位は、結合したEAS1AおよびEAS2Bを有し、そのため、複合体は2つのPESA Aおよび2つのPESA Bを含有している。構成単位1および2をフルオロフォア（F）で標識することができ、かつ各構成単位の第2および第3のオリゴを、構成単位1および2と結合すると、これらのオリゴ上の標識からの蛍光が消光され得るように位置づけられたクエンチャー（Q）で標識することができる。  パネルCは、標的特異的な様式でのDF-aの生成後の、パネルBにおいて図解される分岐した複合体を使用し得るEzyAmpカスケードにおける工程を図解している。工程1において、PESA A（例えば、構成単位1上の）へのDF-aのハイブリダイゼーションは、この配置におけるCESA Aの形成をもたらす。工程2において、制限酵素（例えば、Mnl I）によるCESA Aの切断は、EAS1A切断断片の解離をもたらし、フルオロフォアとクエンチャーの分離による蛍光の増大およびDF-bの生成を引き起こす。工程2において、構成単位1または2のEAS1B領域へのDF-bのハイブリダイゼーションは、CESA Bの形成につながる。工程3において、制限酵素（例えば、Mnl I）によるCESA Bの切断は、EAS2B切断断片の解離をもたらし、蛍光の増大およびDF-aの生成を引き起こす。次いで、これらの工程は、同じ複合体上または別の同様の複合体上で繰り返され得る。すべての構成単位が切断されるまで、プロセスは継続し得る。あるいは、標的特異的な様式でのDF-bの生成によって、同様のカスケードが開始され得る。  分岐した構造体の複雑性を、いくつかのストラテジーによって増大させることができる。例として、EAS1Aの5'末端がビオチン化されている場合、構成単位とアビジンとのインキュベーションによって、パネルDに示される構造体が形成され得る。これは、構成単位複合体のアビジン分子を介した一斉の連接をもたらす。この分岐した構造体およびその変異型（任意のオリゴ成分上のビオチンまたは他の連接分子の付加を介した）は、放出されたDFのPESA複合体との局在化を可能にする。
【図２３】図23は、シグナル増幅がエキソヌクレアーゼIII（Exo III）によって開始および仲介され得る、EzyAmp反応の例示的なスキーマである。この酵素は、末端が平滑または陥凹である場合に、DNA二重鎖の3'ヒドロキシル末端からヌクレオチドを除去することが知られている。該酵素は、少なくとも5個の塩基を有する3'突出を有する二重鎖を含む、一本鎖オリゴを消化しない。ホスホロチオエートヌクレオチド（オリゴ上の空洞の四角によって示される）の存在によって、エキソヌクレアーゼ活性をブロックされることが知られている。灰色の縞模様の線はDNA標的（T）を表し、黒い実線は、DFの生成を助長するために混合物に添加される合成イニシエーターオリゴ（SIO）を表す。フルオロフォア（F）およびクエンチャー（Q）で標識され得るSIOを、突出した3'末端を有するヘアピン立体構造で表す。SOIは5個より多い塩基の3'突出を含有しているため、標的結合前にExo IIIはそれを消化することができない。SIOにおけるホスホロチオエートヌクレオチドによって、この位置から前方への加水分解が阻止され、ゆえにDFは無傷のままである。閉じた丸は、SIO、PESA、およびCESAオリゴの5'末端を表す。灰色の実線は、少なくとも5個の塩基を含む2つの3'突出末端を有するPESAを表す。PESAを、EAS1がフルオロフォアおよびクエンチャーで標識されている、2種のオリゴ（EAS1およびEAS2）として表す。PESAの3'末端は5個より多い塩基の3'突出を含有しているため、DFの結合前にExo IIIはPESAを消化することができない。  EzyAmp反応は、以下の工程を有する：工程1において、SIOは標的の相補的領域に結合し得、および工程2において、SIOのここでは陥凹した3'末端は、Exo IIIによってホスホロチオエート塩基まで加水分解され、ゆえに無傷DFを放出し、かつ蛍光の増大を引き起こす。DFは、標的に相補的でないSIOの5'部分に相当する。もはやSIOに結合していない標的は、次いで遊離して再利用され、別のSIOと結合し、ゆえに別のDFを生成する（工程3）。DFは、次いでPESAのEAS1に結合し得（工程4）、かつEAS1の3'末端がここでは陥凹しているCESAを形成し得る。Exo IIIは、次いでCESAのEAS1鎖を加水分解し（工程5）、蛍光の増大およびDFの放出を引き起こし得る。DFはここでは遊離して再利用され（工程6）、より多くのPESAをCESAに変換する。
【図２４】図24は、標的依存的MNAザイムを用いた、ドライバー断片（DF）を生成するための種々の方法を図解している例示的なスキーマである。DFを黒い輪郭を有する白い線として表し；MNAザイム基質の切断部位を十字として表し；基質配列を含有しているオリゴを灰色の線として表し；RE切断部位を矢頭として表し；RERSを点線のボックスとして提示し；標的を黒と白の縞模様の線として表し；DFと組み合わさってCESAを形成し得るPESAオリゴヌクレオチドを灰色の縞模様の線として表し；かつMNAザイムを黒い実線として表す。  パネルAは、DF配列が基質配列の一部である、MNAザイム基質の直接切断によるDFの生成を図解している。標的の存在下において、触媒活性MNAザイムは組織化し、かつその基質を切断する。切断された基質の一方の断片はPESAと結合し、そこでそれはDFとして機能しかつCESAの形成をもたらす。次いで、十分に組織化したCESAは、REによって切断され得る。実施例2、4、および11は、DFを生成するためのこのストラテジーの使用を実証している。  パネルBは、DF配列が、MNAザイムによって認識される基質配列の一部の内にないが、それでも基質と同じオリゴヌクレオチド内に含有されている、MNAザイム基質の切断によるDFの生成を可能にする方法を図解している。基質を含有しているオリゴヌクレオチドは、ヘアピン構造を形成し得、そのため、MNAザイムによって認識される基質の領域はヘアピンのループを形成し、かつDFはヘアピンのステム内のハイブリダイゼーションによって固定される。標的の存在下において、触媒活性MNAザイムは組織化し、かつその基質を切断する。基質の切断は、ヘアピンを妨害し、ステムの解離、ゆえに切断された断片の分離につながる。切断された断片の一方はPESAと結合し得、そこでそれはDFとして機能し得かつCESAの形成をもたらし得る。次いで、十分に組織化したCESAは、REによって切断され得る。  パネルCは、二本鎖の基質−ブロッカー−DF複合体のMNAザイム切断によるDFの生成を図解している。この複合体において、DF配列は、MNAザイムによって認識される基質配列の一部でなく、かつ基質と同じオリゴヌクレオチド内に含有されていない。DFは、基質オリゴとハイブリダイズする第2のオリゴ内に含有されている。基質オリゴにおいて、MNAザイム基質として認識され得る配列の側面には、DFオリゴに相補的である付加的配列が位置する。基質およびDFに結合する（ゆえに、ブロックする）ものの両方として働くこのオリゴを、基質−ブロッカーオリゴと称する。MNAザイムによって認識される、基質−ブロッカーオリゴ内の配列は、DFオリゴヌクレオチドに相補的でなく、したがって、この基質配列は外側にループを作る。標的の非存在下では、二本鎖の基質−ブロッカー−DF複合体の形成が優先され、DFがPESAと相互作用するのを阻止する。標的の存在下において、触媒活性MNAザイムは組織化し、かつ基質ループを切断する。基質ループの切断は、DFに結合している基質−ブロッカーオリゴの部分の解離をもたらし、ゆえにDFが放出され、そのため、それはPESAと結合してCESAを形成し得る。次いで、十分に組織化したCESAは、REによって切断され得る。実施例9は、DFを生成するためのこのストラテジーの使用を実証している。  パネルDは、ヘアピン型の基質−ブロッカー−DF複合体のMNAザイム切断によ���DFの生成を図解している。この複合体において、DF配列は、MNAザイムによって認識される基質配列の一部でないが、それでもそれは基質と同じオリゴヌクレオチド内に含有されている。ヘアピン型の基質−ブロッカー−DF複合体は、基質−ブロッカーオリゴとDFオリゴとの間にここでは連結配列があり、ヘアピンの形成をもたらすという点を除いて、パネルCにおいて記載される二本鎖の基質−ブロッカー−DF複合体に類似している。標的の非存在下では、基質−ブロッカー−DFヘアピン構造体の形成が優先され、DFがPESAと相互作用するのを阻止する。標的の存在下において、触媒活性MNAザイムは組織化し、かつループ型基質部分を切断する。基質ループの切断は、DFに結合しているステム部分の解離をもたらす。一本鎖のDF配列は、ここではPESAと結合してCESAを形成し得る。次いで、十分に組織化したCESAは、REによって切断され得る。実施例14は、DFを生成するためのこのストラテジーの使用を実証している。
【図２５】図25は、2つのEzyAmp反応が1本のチューブ内で同時に起こりかつ独立して観測される、多重解析を実証している。反応は、PESA AおよびPESA Bの両方の存在下において、DF-aおよび／またはDF-bのいずれかで開始された。PESA AへのDF-aの結合は、CESA Aの形成をもたらし、それは切断された場合にJOE蛍光の増大を生成する（太い黒の実線）。PESA BへのDF-bの結合は、CESA Bの形成をもたらし、それは切断された場合にFAM蛍光の増大を生成する（太い黒の点線）。試験反応は、100nMの各PESA、ならびに（i）100nM DF-a、（ii）90nM DF-aおよび10nM DF-b、（iii）100nM DF-aおよび100nM DF-b、（iv）10nM DF-aおよび90nM DF-b、または（v）100nM DF-bのいずれかを含有していた。対照反応は、DFを含有しておらず、細い実線（JOE）または細い点線（FAM）によって示される。FAMおよび／またはJOEに対する蛍光の増大が、時間に対してプロットされている。反応（i）において、JOE蛍光の増大はあったが、FAM蛍光の増大はなく、DFaのみによってPESA Aが形成されたことを示した。反応（v）において、FAM蛍光の増大はあったが、JOE蛍光の増大はなく、DF-bのみによってPESA Bが形成されたことを示した。反応（ii）、（iii）、（iv）、および（v）においては、FAMおよびJOE蛍光の両方の増大があり、DF-aおよびDF-bの両方が存在した場合のCESA AおよびCESA Bの両方の切断を示しており、蛍光シグナルの強度は、用いたDFの濃度に関係した。
【図２６】図26は、ヒトcDNA標的（PPIA cDNA）の検出を可能にした、MNAザイムによって開始されるEzyAmp反応を図解している。EzyAmpシグナル増幅は、フィードバックループを形成する複数種のCESAのMnl I切断によって生じた。本実施例において、開始およびシグナル増幅の両方を、（i）レポーターMNAザイム基質の標的依存的なMNAザイム切断、ならびに（ii）MNAザイム基質の切断からのDF-aの産生後のCESA AおよびCESA Bの切断、によって生成される蛍光の累積変化を観察することによって観測した。図は、経時的にプロットされた正規化した蛍光を示している。150分の時点で、cDNAの非存在下（細い線）におけるごく低レベルの蛍光と比較して、115pg（太い黒の実線）および23pg（点線）のcDNAを含有している反応において強い蛍光シグナルが観察された。
【図２７】図27は、RE Mnl IによるCESAの切断のための例示的なストラテジーを図解している。CESAを、PESAに結合し得るDFを生成して、同じCESAを形成するように設計した（パネルA）。CESA（上段の複合体、パネルA）は、PESA（下段の複合体、パネルA）およびDF（黒い縞模様の線によって示される）から構成される。各線上の丸は、各オリゴの5'末端を示す。RERSを点線のボックスとして示し、RE切断部位を実線の垂直矢印として示す。フルオロフォアおよびクエンチャー部分の存在を、それぞれFおよびQによって示す。  パネルAは、CESAの切断がその相当するPESAに対するDFを生成し得るストラテジーを図解している。PESAはEAS1およびEAS2から構成されており、EAS2は、EAS2から切断されるとDFとして機能し得る配列をその中に含有している。開始DFの標的依存的な生成およびそれに続くPESAへの結合は、CESAの形成をもたらす（工程1）。CESAは、次いでREによって切断され得、DFとして機能し得る断片を含む切断された断片の解離につながる（工程2）。この断片は、次いで別のPESAに結合してDFとして機能し得、より多くのCESAの形成を可能にする（工程3）。  パネルBは、パネルAにおいて図解されるCESAのMnl I切断に相当する蛍光の増大を示している。DFの存在下において、経時的な蛍光の増大が観察された（i）。対照的に、DFを添加しない対照反応において、蛍光の増大は観察されなかった（ii）。このことは、REによって切断されるCESAを形成するためにDFが必要とされることを示している。CESAの切断は、断片の解離をもたらし、そのうちの1つは元のDFの短縮バージョンを含有している。
【発明を実施するための形態】
【０３１７】
定義
ある種の用語および語句を本明細書で用いており、それらは以下に規定する意味を有するものとする。
【０３１８】
本出願で用いる場合、単数形の「1つの（an）」、「1つの（an）」および「その（the）」は、文脈によって明らかに別のことが指定されている場合を除き、複数の言及物も含む。例えば、「1つのMNAザイム」または1つの「完全酵素シグナル増幅因子（Complete Enzyme Signal Amplifier）複合体」または1つの「部分的酵素シグナル増幅因子（Partial Enzyme Signal Amplifier）複合体」という用語はそれぞれ、複数のMNAザイムまたは完全部分的酵素シグナル増幅因子複合体または部分的酵素シグナル増幅因子複合体も含む。文脈によって別のことが要求されるか、または逆のことが明記されている場合を除き、本明細書で単数の完全体（integer）、段階または要素として挙げられた本発明の完全体、段階または要素には、挙げられた完全体、段階または要素の単数形および複数形の両方が明らかに含まれる。
【０３１９】
「含む（comprising）」という用語は、「を主に含む（include）が、必ずしもそれだけを含むのではない」ことを意味する。さらに、「含む（comprising）」という語の変化形、例えば「含む（comprise）」および「含む（comprises）」などは、相応して変化した意味を有する。したがって、例えば、ある所与の段階を「含む」方法は、排他的にその段階だけからなってもよく、または1つもしくは複数の別の段階を含んでもよい。
【０３２０】
「完全酵素シグナル増幅因子複合体」、「CESA複合体」および「CESA」は、本明細書中で互換的に用いられ、同じ意味を有する。本明細書で称するCESA複合体とは、酵素（例えば、ヌクレアーゼ）によって認識されて切断されることが可能であり、かつ酵素認識配列／部位および酵素切断配列／部位を含む、多オリゴヌクレオチド複合体のことである。酵素は例えば、ヌクレアーゼ（例えば、制限酵素酵素、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ）であってよい。酵素切断配列／部位は、酵素認識配列／部位の内側にあっても、外側にあっても、または一部が重なり合ってもよい。本明細書で称するCESA複合体は、少なくとも2つの酵素増幅因子基質（Enzyme Amplifier Substrate）（EAS）オリゴヌクレオチド、および少なくとも1つのドライバー断片（Driver Fragment）（DF）を含み、それぞれについては以下で定義する。CESA複合体の1つのEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、複合体の中のもう1つのEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に対して相補的である。加えて、前記EASオリゴヌクレオチドの1つの少なくとも一部分は、少なくとも1つのDFの少なくとも一部分に対しても相補的である。DFが1つまたは複数の塩基を、酵素認識配列／部位および／または酵素切断配列／部位に寄与してもよいが、必ずしもそうである必要はない。上記に述べた意味を逸脱することなく、本明細書におけるCESA複合体を、例えば、「第1の」CESA複合体、「第2の」CESA複合体、「第3の」CESA複合体などのように数字で称してもよいことに留意されたい。
【０３２１】
「酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド」、「酵素増幅因子基質（EAS）オリゴヌクレオチド」、「EASオリゴヌクレオチド」、「EASオリゴ」および「EAS」は、本明細書中で互換的に用いられ、同じ意味を有する。本明細書で称するEASオリゴヌクレオチドとは、オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分がもう1つのEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に対して相補的であり、その結果、適切な条件下でその2つの間のハイブリダイゼーションが起こるようなオリゴヌクレオチドのことである。EASオリゴヌクレオチドが任意で、以下に定義するようなドライバー断片（DF）の少なくとも一部分に対して相補的な少なくとも1つの部分を含んでもよい。EASオリゴヌクレオチドが、例えば、CESA複合体および部分的酵素シグナル増幅因子（PESA）複合体（以下に定義するような）などの複合体の成分であってもよい。上記に述べた意味を逸脱することなく、本明細書におけるEASオリゴヌクレオチドを、例えば、「第1の」酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド（EAS1）、「第2の」酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド（EAS2）、「第3の」酵素増幅因子基質オリゴヌクレオチド（EAS3）などのように数字で称してもよいことに留意されたい。いくつかの態様において、EASオリゴヌクレオチドが、リンカーによってもう1つのEASオリゴヌクレオチドとつなぎ合わされてもよい。例えば、EAS1およびEAS2が同一のオリゴヌクレオチド中に存在し、そこでそれらがヘアピン構造の形成を可能にする連結性核酸配列によってつなぎ合わされてもよい。
【０３２２】
「部分的酵素シグナル増幅因子複合体」、「部分的酵素シグナル増幅因子（PESA）複合体」、「PESA複合体」および「PESA」は、本明細書中で互換的に用いられ、同じ意味を有する。本明細書で称するPESA複合体とは、少なくとも2つの酵素増幅因子基質（EAS）オリゴヌクレオチドを含む多オリゴヌクレオチド複合体のことであり、ここで1つのEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、複合体の中のもう1つのEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に対して相補的である。加えて、前記EASオリゴヌクレオチドの1つの少なくとも一部分は、少なくとも1つのDF（以下に定義するような）の少なくとも一部分に対しても相補的である。DFとハイブリダイズする能力を有するにもかかわらず、DFはPESA複合体とハイブリダイズせず、それ故にPESA複合体の成分ではない。PESA複合体は酵素による少なくとも部分的な認識配列／部位および／または少なくとも部分的な切断配列／部位を含み、それが酵素による完全な認識配列／部位および／または完全な切断配列／部位を含有してもよい。酵素は例えば、ヌクレアーゼ（例えば、制限酵素、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ）であってよい。いくつかの態様において、PESA複合体の2つのEASオリゴヌクレオチドがリンカーによってつなぎ合わされてもよい。例えば、2つのEASオリゴヌクレオチドが同一のオリゴヌクレオチド中に存在し、そこでそれらがヘアピン構造の形態で連結性核酸配列によってつなぎ合わされてもよい。上記に述べた意味を逸脱することなく、本明細書におけるPESA複合体を、例えば、「第1の」PESA複合体、「第2の」PESA複合体、「第3の」PESA複合体などのように数字で称してもよいことに留意されたい。
【０３２３】
「ドライバー断片オリゴヌクレオチド」、「ドライバー断片（DF）オリゴヌクレオチド」、「ドライバー断片オリゴ」、「DFオリゴヌクレオチド」、「DFオリゴ」および「DF」は、本明細書中で互換的に用いられ、同じ意味を有する。本明細書で称するDFオリゴヌクレオチドとは、オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分が、少なくとも1つのEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に対して相補的であり、その結果、適切な条件下でその2つの間のハイブリダイゼーションが起こるようなオリゴヌクレオチドのことである。DFオリゴヌクレオチドは、本発明の方法によって検出しようとする標的分子（例えば、核酸）であってもよく、そうでなくともよい。DFオリゴヌクレオチドが、複合体、例えばCESA複合体などの成分であってもよい。そのような場合に、DFオリゴヌクレオチドが、1つまたは複数のヌクレオチドを、複合体の中に存在する可能性のある酵素認識配列／部位および／または酵素切断配列／部位に寄与してもよいが、必ずしもそうである必要はない。酵素は例えば、ヌクレアーゼ（例えば、制限酵素、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ）であってよい。上記に述べた意味を逸脱することなく、本明細書におけるDFオリゴヌクレオチドを、例えば、「第1の」DF、「第2の」DF、「第3の」DFなどのように数字で称してもよいことに留意されたい。
【０３２４】
「合成イニシエーターオリゴ（Synthetic Initiator Oligo）」または「SIO」とは、試料中の標的核酸とハイブリダイズして、それにより、ヌクレアーゼによる切断を受けやすい基質を形成することができ、この切断によって、ドライバー断片（DF）として機能しうるより短いオリゴが生じるようなオリゴヌクレオチドのことである。SIOは、ヌクレアーゼによるその切断の前には阻害性断片（InF）として機能してもよい。SIOは、部分的または完全に二本鎖コンフォメーションにある1つまたは複数のオリゴヌクレオチドで構成されうる。複数のオリゴヌクレオチドを有するSIOを、本明細書では「SIO複合体」と称する。上記に述べた意味を逸脱することなく、本明細書におけるSIOを、例えば、「第1の」SIO、「第2の」SIO、「第3の」SIOなどのように数字で称してもよいことに留意されたい。
【０３２５】
「酵素阻害性複合体」または「EIC」とは、酵素による切断を受けやすい二重鎖構造の形成を妨害する余分な配列の存在が原因で、酵素による切断を受けにくい二重鎖を形成する、2つまたは3つ以上の相補的核酸断片またはオリゴヌクレオチドによって形成される複合体のことである。1つの態様において、EICはEAS1、EAS2および阻害性断片（InF）を含む。もう1つの態様において、EICはPESAおよびInFを含む。1つのさらなる態様において、InFは、DFとして有用であるものの、切断を受けやすい二重鎖CESAの形成を妨げる付加的なヌクレオチドも有する配列を含む。さらなる態様において、InFは、標的分析物の存在下でのみ切断されて、DFとして機能してCESAの組織化を完了させることのできる、より小型のオリゴヌクレオチド断片となるオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、InFは、標的の存在下でのみヌクレアーゼによって切断されてDFを生じる「合成イニシエーターオリゴ」または「SIO」であってよい。他の態様において、InFは、標的の存在下でのみMNAザイムによって切断されてDFになることのできる「MNAザイム基質」であってよい。いくつかの態様において、InFの切断は核酸酵素またはアプタザイム（aptazyme）に依存する。いくつかの態様において、核酸酵素またはアプタザイムにはMNAザイムが含まれる。他の態様において、切断はタンパク質酵素によって媒介される。いくつかの態様において、酵素はエンドヌクレアーゼである。いくつかの態様において、酵素はエキソヌクレアーゼである。さらに他の態様において、切断は化学的手段によって実現される。
【０３２６】
「Ezy-amp」または「EzyAmp」反応は、ヌクレアーゼによるCESAの標的依存的切断によってシグナルの発生および／または増幅が助長され、そのシグナルによって標的の存在が指し示される過程である。EzyAmp反応は、1つまたは複数のPESA複合体およびCESA複合体を含みうる。いくつかの態様において、複数のPESA複合体からの複数のCESAの形成は、第1のPESAに対する第1のDF（標的依存性イベントにより生じる）の結合によって第1のCESAが形成され、第1のCESAの切断によって第2のDFが放出され、それが第2のPESAと結合して第2のCESAを形成し、第2のCESAの切断によって、第1のPESAと結合しうる第1のDFが放出されて、もう1つの第1のCESAが形成されるという、フィードバックループを形成することができる。続いてこの第1のCESAが切断されて、もう1つの第2のDFが生成され、それがもう1つの第2のPESAと結合してもう1つの第2のCESAを形成することができ、以下も同様である。検出可能なシグナルは、第1および／または第2のCESAの切断のたびごとに発生し、それ故に、単一の標的依存性イベントに由来するシグナルを増幅する手段となる。本明細書で称するEzyAmp反応が、直線的およびフィードバック性のシグナル増幅カスケードの両方を範囲に含むことは理解されるであろう。
【０３２７】
「酵素」とは、化学反応を触媒することのできるあらゆる分子のことを指す。「触媒性タンパク質」、「触媒性アミノ酸」および「タンパク質酵素」は同じ意味を有し、基質を認識して化学修飾を触媒する、アミノ酸の鎖で構成される分子を記述するために、本明細書中で互換的に用いられる。酵素は別の酵素、アプタマー、分子または核酸を認識して、結合を切断すること、付加すること、または修飾することができる。
【０３２８】
「触媒性核酸分子」、「触媒性核酸」、「核酸酵素」および「触媒性核酸配列」は同じ意味を有し、DNA分子もしくはDNA含有分子（当技術分野において「DNA酵素」、「デオキシリボザイム」または「DNAザイム」としても公知）またはRNAもしくはRNA含有分子（当技術分野において「RNA酵素」または「リボザイム」としても公知）または「MNAザイム」を記述するために本明細書中で互換的に用いられ、これらはすべて、基質を認識して基質の化学修飾を触媒する。MNAザイム、アプタ-MNAザイム、DNAザイム、リボザイム、アプタザイム、EAS、CESA複合体、PESA複合体、SIO、ドライバー断片または阻害性断片におけるヌクレオチド残基には、塩基A、C、G、TおよびU、ならびにそれらの誘導体または類似体が含まれてよく、それらの例は表1に列記されている。MNAザイム、アプタ-MNAザイム、DNAザイム、リボザイム、アプタザイム、EAS、CESA複合体、PESA複合体、SIO、ドライバー断片または阻害性断片の1つまたは複数の成分を、ビーズ、チップ、アレイ、マイクロキャリア、ナノキャリア、コードされたマイクロキャリア、コードされたナノキャリアを非限定的に含みうる固体支持体に付着させることができる。
【０３２９】
「誘導体」という用語は、本発明の核酸またはヌクレオチドに関連して用いられる場合、一体的に産生されるか（例えば、組換え手段によって）または合成後に付加される（例えば、化学的手段によって）任意の融合分子を含む、任意の機能的に同等な核酸またはヌクレオチドを含む。そのような融合体には、RNAまたはDNAを有する本発明のオリゴヌクレオチドに、ポリペプチド（例えば、ピューロマイシンもしくは他のポリペプチド）、小分子（例えば、ソラレン）または抗体が付加もしくは結合体化されたものが含まれうる。
【０３３０】
「類似体」という用語は、本発明の核酸またはヌクレオチドに関連して用いられる場合、DNAまたはRNAの分子または残基と類縁関係にあって、DNA残基もしくはRNA残基またはそれらの類似体と水素結合を形成できてもよい（すなわち、それはDNA残基もしくはRNA残基またはそれらの類似体とアニーリングして塩基対を形成することができる）物理的構造を有する化合物を含むが、そのような結合は、前記化合物を「類似体」という用語の範囲に含めるのにそれほど必要とされない。そのような類似体は、それらが構造的に類縁関係にあるリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基とは異なる化学特性および生物学的特性を有してもよい。メチル化残基、ヨウ化残基、臭素化残基またはビオチン化残基は、類似体の例である。デオキシイノシン、C-5-イミダゾール デオキシウリジン、3-(アミノプロピニル)-7-デアザ-dATP、2'-O-メチルRNA、2'-O-メチルキャップを含む、ヌクレオチド類似体を含有する活性DNAザイムが記載されている。他の類似体も、DNAザイムおよびMNAザイムの触媒活性との適合性がある可能性がある。触媒活性による核酸の改変、例えば、1つの塩基の別の塩基への置換による、1つの塩基の類似体への置換によるか、または糖成分もしくはホスホジエステル骨格の改変によるものは、当業者にとって簡単である。例えば、改変を合成中に行うこともでき、または合成後に特定塩基の修飾によって行うこともできる。塩基変化または塩基類似体などの改変を組み込んだ触媒性核酸の実験的検討により、改変された配列または特定の類似体が触媒活性に及ぼす影響を評価することが可能になる。塩基A、C、G、TおよびUの類似体は当技術分野において公知であり、サブセットを表1に列挙している。ヌクレアーゼ消化を阻害しうる類似体の例も当技術分野において周知である。そのような類似体は、エキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼによる切断を防ぐために、オリゴヌクレオチド内部に戦略的に配置することができる。一例として、ホスホロチオエート結合のSp立体異性体は、λエキソヌクレアーゼ、T7エキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼIII（大腸菌（E. coli））、エキソヌクレアーゼI（大腸菌）、エキソヌクレアーゼTおよびRecJを含む多くのヌクレアーゼの切断を大きく阻害することが知られている。複数のホスホロチオエート結合を含めることは、ヌクレアーゼ活性をブロックするのに極めて有効な可能性がある。
【０３３１】
（表１）ヌクレオチド類似体の例
2013542738.tif 000108
2013542738.tif 000109
【０３３２】
「組織化助長因子（assembly facilitator）分子」、「組織化助長因子」、「MNAザイム組織化助長因子分子」、「MNAザイム組織化助長因子」は同じ意味を有し、成分パートザイムの自己組織化を助長して触媒活性のあるMNAザイムを形成させる分子を指して、本明細書中で互換的に用いられる。好ましい態様において、組織化助長因子はMNAザイムの自己組織化のために必要とされる。組織化助長因子分子には、いくつかの態様において、「標的」、「標的分析物」または「分析物」が含まれ、これらはそれぞれ、本明細書で用いる場合、特定のMNAザイムによって存在を検出または測定しようとする分子のことを指す。組織化助長因子分子は、「MNAザイム」の成分または部分を構成する1つまたは複数のオリゴヌクレオチド「パートザイム」と対合するかまたは結合する、1つまたは複数の領域を含む。組織化助長因子は、それがMNAザイムの成分パートザイムの少なくとも1つと相互作用するか、対合するか、または結合するのであれば、それぞれの成分パートザイムまたはオリゴヌクレオチドと相互作用したり、対合したり、あるいは結合したりする必要はない。本明細書で用いる場合、MNAザイム組織化助長因子分子は、MNAザイムの自己組織化を助長しうる、最も広範囲にわたる成分を範囲に含むものとする。標的および分析物も、最も広範囲にわたる検出可能な成分を範囲に含むものとし、それらに対しては高感度の検出方法が望ましい。例示的な標的のいくつかには、核酸配列、ウイルス、細菌、プリオン、タンパク質、抗体および小分子が含まれる。他の標的分析物についても、本明細書における使用を想定している。
【０３３３】
「基質」、「基質分子」および「化学基質」は同じ意味を有し、触媒性分子によって認識されて化学修飾されるあらゆる分子を指して、本明細書中で互換的に用いられる。特定の態様において、基質は酵素によって認識されて修飾され、他の態様において、基質は触媒性核酸分子によって認識されて修飾される。特定の態様において、基質はタンパク質酵素によって認識されて修飾され、他の態様において、基質は核酸酵素によって認識されて修飾される。特定の態様において、基質は一本鎖核酸分子を含んでよく、他の態様において、基質は二本鎖核酸分子を含んでよい。さらなる態様において、基質はヘアピン分子を形成しうる。基質の化学修飾は、反応の生成物の出現もしくは増加によって、または反応の基質の消失もしくは減少によって測定することができる。1つの特定の触媒性分子が1つまたは複数の異なる基質分子を認識することも、各基質分子が触媒性分子による触媒活性にとって認識可能な少なくとも最小限の構造を有するのであれば可能である。
【０３３４】
本明細書で用いる場合、「パートザイム」および「成分パートザイム」という用語は同じ意味を有し、その2つまたはそれ以上がMNAザイム組織化助長因子分子の存在下でのみ相伴って「MNAザイム」を形成することのできる、DNA含有性またはRNA含有性オリゴヌクレオチドのことを指して、本明細書中で互換的に用いられる。ある好ましい態様において、1つまたは複数の、好ましくは少なくとも2つの成分パートザイムは、3つの領域またはドメインを含む：化学修飾を触媒するMNAザイムの触媒性コアの一部を形作る「触媒性」ドメイン；標的分析物と会合および／または結合する「センサーアーム」ドメイン；ならびに基質と会合および／または結合する「基質アーム」ドメイン。当業者は、パートザイムは必ずMNAザイム構造の一部を形作らなくてはならないものの、それがMNAザイム組織化助長因子分子を特異的に認識する必要も、それと直接結合したり会合したりする必要もないことを理解するであろう。したがって、ある所与のMNAザイムに対する1つまたは複数のパートザイムが、前述のドメインの1つまたは複数またはすべてを全体的または部分的に欠いてもよいことは明らかである。ある態様において、1つまたは複数のパートザイムは他のパートザイムと相互作用するが、組織化助長因子分子とは必ずしも相互作用しない。他の態様において、1つまたは複数の特定のパートザイムは、組織化助長因子分子と間接的にのみ相互作用し、それと直接的に結合することも対合することもない。
【０３３５】
本明細書で用いる「MNAザイム」および「多成分核酸酵素」という用語は、MNAザイム組織化助長因子分子（例えば、標的分析物）の存在下でのみ基質分子を触媒的に修飾することのできる活性核酸酵素を形成する、2つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド配列（例えば、パートザイム）のことを指す。1つの態様において、パートザイムAおよびBはそれぞれ、標的分析物と結合する（例えば、核酸標的とのWatson-Crick塩基対合によって）。MNAザイムは、パートザイムAおよびBのセンサーアームが標的上で互いに隣接してハイブリダイズした時にのみ形成される。MNAザイムの基質アームは基質と係合し、その切断は、パートザイムAおよびB上の部分的触媒性ドメインの相互作用によって形成されたMNAザイムの触媒性コアによって触媒される。いくつかの態様において、MNAザイムは基質をフルオロフォアとクエンチャー色素の対の間で切断し、それによってシグナルを発生させる。DNA／RNAキメラ（基質）の切断は、図面に例示されている（図5A）。他の態様において、MNAザイムが、パートザイムとの結合後に基質分子を核酸連結させてもよい。
【０３３６】
本明細書で用いる「MNAザイム」および「多成分核酸酵素」という用語が、PCT特許公報第WO／2007／041774号、第WO／2008／040095号、第WO2008／122084号、ならびに関連する米国特許出願公開第2007-0231810号、第2010-0136536号および第2011-0143338号（これらの文書のそれぞれの内容はすべて、相互参照により本明細書に組み入れられる）のいずれか1つまたは複数に開示されたものを含め、あらゆる公知のMNAザイムおよび修飾MNAザイムを範囲に含むことは理解されるであろう。「MNAザイム」および「多成分核酸酵素」という用語の範囲に含まれるMNAザイムおよび修飾MNAザイムの非限定的な例には、切断触媒活性を有するMNAザイム（本明細書中で例示するような）、1つまたは複数の組織化阻害因子を含む、解体しているかまたは部分的に組織化したMNAザイム、1つまたは複数のアプタマーを含むMNAザイム（「アプタ-MNAザイム」）、1つまたは複数の短縮型センサーアームおよび任意で1つまたは複数の安定化オリゴヌクレオチドを含むMNAザイム、1つまたは複数の活性阻害因子を含むMNAザイム、多成分核酸不活性プロ酵素（MNAi）、ならびにリガーゼ触媒活性を有するMNAザイム（「MNAザイムリガーゼ」）が含まれ、これらはそれぞれ、WO／2007／041774号、WO／2008／040095号、WO2008／122084号、US 2007-0231810号、US 2010-0136536号および／またはUS 2011-0143338号の1つまたは複数に詳細に記載されている。
【０３３７】
本明細書で用いる場合、「アプタマー」は、その高次構造、例えば3-D結合ドメインまたはポケットなどが理由で、1つまたは複数のリガンドを高い親和性および特異性で認識する能力を有する核酸配列またはペプチド配列を含む。アプタマーは、核酸、タンパク質、プリオン、小型有機化合物または生物体全体と結合することができる。本明細書における好ましいアプタマーは、合成核酸の複合的ライブラリーから、吸着、回収および再増幅の反復過程によって単離しうる、短い一本鎖DNAまたはRNAオリゴマーである。アプタマーは、アミノ酸または抗生物質などの小分子から、タンパク質および核酸の構造体までの範囲にわたる、ほとんどあらゆる標的に対して作製することができる。
【０３３８】
本明細書で用いる「オリゴヌクレオチド」または「オリゴ」は、DNAもしくはDNA含有核酸分子、またはRNAもしくはRNA含有分子のセグメントまたは断片のことを表す。オリゴヌクレオチドの例には、核酸標的；基質、例えば、MNAザイムによって修飾されうるもの；プライマー、例えば、PCRなどの方法によるインビトロ標的増幅のために用いられるもの、およびMNAザイムの成分が含まれる。MNAザイム組織化助長因子は、ある態様において、本明細書で定義されたようなオリゴヌクレオチドを含む。本明細書で用いるパートザイムには、オリゴヌクレオチドも含まれる。オリゴヌクレオチドの他の例には、EAS、InF、SIOおよびDFが含まれる。本明細書で言及するオリゴヌクレオチドは、別のオリゴヌクレオチドに対して「相補的」であってよい。第2の核酸分子に対して「相補的」であると本明細書で称する任意の核酸分子は、適切な条件下で、その第2の核酸分子（全体的または部分的に）と、Watson-Crick塩基対合を介してハイブリダイズすることができる。
【０３３９】
本明細書で用いる場合、「塩基」という用語は、塩基が結びついているリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの全体を範囲に含むことが理解されるであろう。
【０３４０】
「ヘアピンオリゴヌクレオチド」または「ヘアピン」とは、本明細書で用いる場合、分子内ハイブリダイゼーション結合の形成をもたらす配列相補性をそれ自体の内部に含むオリゴヌクレオチドのことを表す。相補性部分は「ステム」と呼ばれ、一方、ステムを形成するものの間の領域は「ループ」と命名されている。ヘアピンは、5'末端または3'末端のいずれかでステムから伸びる余剰配列を有してもよい。ヘアピンが、別のオリゴヌクレオチド、例えばDFなどに対して相補的な配列を含んでもよい。
【０３４１】
「蛍光標識」および「フルオロフォア」とは、蛍光を発することができる物質または部分のことを指す。「クエンチャー」は、フルオロフォアの放出エネルギーを、この2つの部分が近接した時に吸収することができる部分のことである。フルオロフォアはさまざまな波長でエネルギーを吸収および放出することができ、それ故に種々の波長で消光を受ける。フルオロフォアおよびクエンチャーは、近接するように容易に操作することができる。例えば、両者を同一のDNA鎖上に0〜20塩基単位以内の間隔で配置してもよく、またはDNA鎖の両端に配置してもよい。この空間配置により、フルオロフォアの発光波長では実質的にシグナルが生じなくなる。物理的分離が、例えば、DNA鎖の酵素的切断の結果として起こると、クエンチャーおよびフルオロフォアは、クエンチャーがフルオロフォアからのエネルギーをうまく吸収するには隔たりが大き過ぎるようになり、その結果、検出可能なシグナルがフルオロフォアの発光波長で生じる。
【０３４２】
本明細書で用いる場合、「カスケード」という用語は、各段階の発生が典型的には直前の段階の発生に依存する、連続的段階として起こる任意の一連の過程または動作のことを指す。カスケードにはこのため、酵素的カスケードまたは任意の他のシグナル伝達カスケードが非限定的に含まれる。いくつかの態様において、カスケードは、ヌクレアーゼの触媒活性に起因するシグナルの増幅を伴いうる。好ましい態様において、そのような増幅カスケードは、第1の分子の、またはそれらによる触媒性修飾によって、第2の分子の、またはそれらによる触媒性修飾のために必要な分子が得られ、それによって今度は、第1の分子の、またはそれらによる触媒性修飾のために必要な分子が得られるという、シグナルの反復的であってそれ故に周期的な増幅を伴いうる。いくつかの態様において、必要な分子には、ドライバー断片、パートザイム、酵素、組織化助長因子、基質、標的、それらの一部分もしくは断片、またはそれらの組み合わせが含まれうる。いくつかの態様において、カスケードはそれ故に、累積作用の産生を伴うことができ、そのようにして、シグナルを検出しうるレベルで発生させることによって、存在量の少ない標的を検出することができる。他の態様において、3つ以上の触媒段階を利用することもできる。カスケードが直線的であってもよい。好ましい態様において、カスケードは指数関数的であってもよい。
【０３４３】
本明細書で用いる場合、「フィードバックカスケード」という用語は、後の段階の発生が前の段階の発生に依存し、かつその同一の前の段階の発生が、少なくとも一部には後の段階の発生に依存するという、連続的段階として起こる任意の一連の過程または動作のことを指す。
【０３４４】
略号
本明細書中および本明細書の全体を通じて、以下の略号を用いる：
RE：制限エンドヌクレアーゼ、制限酵素
CESA：完全酵素シグナル増幅因子複合体
PESA：部分的酵素シグナル増幅因子複合体
SIO：合成イニシエーターオリゴ
EIC：酵素阻害性複合体
RERS：制限酵素認識部位／配列
RER：制限酵素認識
EAS：酵素増幅因子基質オリゴ
EAS1：第1の酵素増幅因子基質オリゴ
EAS2：第2の酵素増幅因子基質オリゴ
EAS3：第3の酵素増幅因子基質オリゴ
EAS4：第4の酵素増幅因子基質オリゴ
EAS5：第5の酵素増幅因子基質オリゴ
EAS6：第6の酵素増幅因子基質オリゴ
EAS7：第7の酵素増幅因子基質オリゴ
EAS8：第8の酵素増幅因子基質オリゴ
InF：阻害性断片
DF：ドライバー断片
MNAザイム：多成分核酸酵素
DNAザイム：デオキシリボ核酸酵素；
PCR：ポリメラーゼ連鎖反応；
dH2O：脱イオン蒸留水；
LNA：ロックド核酸；
PNA：ペプチド核酸；
bDNA：分枝DNAアッセイ；
FCS：蛍光相関分光法；
TSA：チラミドシグナル増幅因子；
An：分析物または標的；
F：フルオロフォア色素分子；
Q：クエンチャー分子；
N＝A、C、T、Gまたはそれらの任意の類似体；
N'＝Nに対して相補的な、またはNと塩基対合することができる任意のヌクレオチド；
(N)x：Nの任意の数；
(N')x：N'の任意の数；
n＝rNと互換
W：AまたはT；
K：A、GまたはAA；
rN：任意のリボヌクレオチド塩基；
(rN)x：rNの任意の数；
rR：aまたはg；
rY：cまたはu；
M：AまたはC；
H：A、CまたはT；
D：G、AまたはT；
JOEまたは6-JOE：6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン；
FAMまたは6-FAM：6-カルボキシフルオレセイン
Oligo：オリゴヌクレオチド
BHQ＝black holeクエンチャー
BHQ1＝Black Holeクエンチャー1
BHQ2＝Black Holeクエンチャー2
TXR＝テキサスレッドまたはスルホローダミン
IAbFQまたはIAbkFQ＝Iowa black蛍光クエンチャー
【０３４５】
詳細な説明
本明細書において提供される図面および実施例は、本発明およびそのさまざまな態様を例示することを目的としており、限定するためのものではないことが、最初に理解されるべきである。
【０３４６】
標的の検出、同定および／または定量のための組成物、方法およびキットを提供する。本方法は全体として、完全酵素シグナル増幅因子複合体の中に組み込まれた時に検出可能なシグナルのヌクレアーゼ媒介性増幅を助長する、ドライバー断片（DF）の標的依存的生成のための成分を含む組成物の使用を含む。ある態様においては、ドライバー断片（DF）の標的依存的生成によって生じた初期シグナルが、新たな標的分子が提供されるか否かとは関係なく増幅される（すなわち、初期標的認識イベント後のシグナル増幅が標的分子とは独立に起こりうる）、フィードバックカスケードを提供する。DFが標的認識イベントによって生じる手段に関しては、何ら特定の限定は存在しないものの、いくつかの態様において、DFは、多成分核酸酵素（MNAザイム）による基質の切断によって生じる。MNAザイムは好ましくは、組織化助長因子の存在下で自己組織化して活性核酸酵素を形成する複数の核酸パートザイムによって形成される。好ましい態様において、組織化助長因子は標的であり、それ故にMNAザイムは標的の存在下でのみ形成される。他の態様において、DFは、合成イニシエーターオリゴヌクレオチド（SIO）と標的配列とのハイブリダイゼーションによって形成される二重鎖の標的依存的ヌクレアーゼ切断によって生じる。
【０３４７】
1. 組成物およびキット
本明細書では、本発明の方法を実施するための組成物およびキットを提供する。あくまでも非限定的な例に過ぎないが、組成物およびキットは、酵素増幅因子基質（EAS）オリゴヌクレオチド、ドライバー断片（DF）、部分的酵素シグナル増幅因子（PESA）複合体、完全酵素シグナル増幅因子（CESA）複合体、酵素阻害性複合体（EIC）、阻害性断片（InF）、合成イニシエーターオリゴ（SIO）、触媒性核酸、MNAザイム、MNAザイム成分、パートザイム、組織化助長因子、MNAザイム基質、酵素、制限酵素、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、基質、アプタマー、および／またはヘアピンオリゴヌクレオチドのうち任意の1つまたは複数を含みうる。
【０３４８】
1.1 MNAザイム
本発明の組成物およびキットは、1つまたは複数のMNAザイムを含みうる。MNAザイムとは、2つまたは3つ以上のオリゴヌクレオチド成分から自己組織化しうる触媒活性のある核酸酵素のことであり、本明細書中ではパートザイムとも称される。パートザイムオリゴヌクレオチドは、MNAザイム自己組織化助長因子の存在下で自己組織化してMNAザイムを形成する。いくつかの態様において、MNAザイムの存在を検出することができ、そしてそれは標的の存在を指し示すが、これはMNAザイムが、組織化助長因子を含む標的である標的の存在下でのみ形成されるためである。MNAザイムは当技術分野において周知であり、PCT特許公報第WO／2007／041774号、第WO／2008／040095号、第WO2008／122084号、ならびに関連した米国特許出願公開第2007-0231810号、第2010-0136536号および第2011-0143338号のうち任意の1つまたは複数に、さらに詳細に記載されている（これらの文書のそれぞれの内容はすべて、相互参照により本明細書に組み入れられる）。
【０３４９】
好ましい態様において、MNAザイム構造は、1つまたは複数のDNAザイムおよび／またはリボザイムに基づく。特定のDNAザイム構造に基づくMNAザイム構造がより好ましい。現時点で好ましい構造は、10：23および8：17 DNAザイムを含むDNAザイムである。さまざまな態様において、MNAザイムはリボヌクレオチド塩基およびデオキシリボヌクレオチド塩基の一方または両方を含む。より好ましい態様において、MNAザイム構造は、少なくとも一部にはDNAザイムの構造に基づく。他の好ましい態様において、MNAザイムは、少なくともいくつかのデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体を含む。より好ましい態様において、MNAザイムの触媒性コアは、1つまたは複数のデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体を含む。さらにより好ましい態様において、1つまたは複数のデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体は、基質の触媒作用に関与する。他の態様において、触媒性コアの中の少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体は、触媒活性を向上させる。さらに他の態様において、MNAザイムの触媒性コアの中の少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体については、デオキシリボヌクレオチド塩基が存在しない同等なMNAザイムのものに比して、触媒作用が測定可能な速度で起こるという厳密な必要条件が存在する。
【０３５０】
MNAザイムは、当業者に周知の1つまたは複数の置換、例えば、類似体、誘導体、修飾もしくは改変された塩基、リボヌクレオチド、糖もしくはリン酸骨格の改変、さまざまな欠失、挿入、置換、重複もしくは他の修飾、またはこれらの任意の組み合わせなどを含みうる。そのような修飾、置換、欠失、挿入などを、分子が触媒活性を保つように、センサーおよび／もしくは基質アームに、ならびに／または触媒性コア部分に加えることができる。基質または組織化助長因子と結合するアームの、置換および修飾に対する忍容性は十分であり、このため種々の基質／組織化助長因子に向けての分子の個別適合化（tailoring）が可能になる。例えば、センサーアームの修飾により、種々の組織化助長因子に向けての個別適合化が可能になり、一方、基質アームの修飾により、種々の基質に向けての個別適合化が可能になる。
【０３５１】
パートザイムのセンサーアームのみを改変し、基質アームは変化させずにおくことにより、そのすべてがユニバーサルMNAザイム基質を検出のために利用する、多数の標的のそれぞれに対して特異的な多種多様なMNAザイムを設計することができる。当業者は、このことが、各標的に対して個別化されるかまたは一意的な基質の必要性をなくすという利点を理解するであろう。それぞれの新たな標的に必要なのは、パートザイムのセンサーアーム部分のうち1つまたは複数における1つまたは複数の変化のみである；基質アーム部分および触媒コア部分は不変のままであってよい。したがって、単一のMNAザイム基質を、MNAザイムを用いる単一の標的に対して、および、改変されたMNAザイムを用いる一連のアッセイにおいて複数の標的に対して用いることができる。多数のレポーター基質により、各標的ごとに1つずつの複数のMNAザイムを用いる単一のアッセイにおいて複数の標的を検出するという多重化が可能になる。MNAザイムを用いるそのような多重化された方法は、溶液中で、または支持系への付着により、容易に実現することができる。多重化アッセイをこのように、基質またはMNAザイムパートザイムまたは組織化助長因子または追加の酵素活性のうち1つまたは複数を、本明細書に記載したように支持体に付着させることによって実現しうることを、本明細書では想定している。
【０３５２】
当業者は、MNAザイムがデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはその両方を含むことを理解するであろう。少なくとも1つの、より好ましくはすべてのデオキシリボヌクレオチド成分オリゴヌクレオチドを含むMNAザイムが現時点では好ましい。また、MNAザイムの触媒性コアの内部に少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体を含むMNAザイムも好ましい。そのような塩基が触媒活性のために必要である態様が、さらにより好ましい。
【０３５３】
いくつかの態様において、パートザイム、組織化助長因子または基質のうち少なくとも1つが、標的と結合しうるアプタマーを含有すること／含むこともできる。
【０３５４】
好ましいアプタマーには、合成核酸またはペプチドの複合的ライブラリーから、吸着、回収および再増幅の反復過程によって単離しうる、短い一本鎖DNAもしくはRNAオリゴマー、またはペプチドが含まれうる。アプタマーはこのように、アミノ酸または抗生物質などの小分子から、タンパク質および核酸の構造体までの範囲にわたる、ほとんどあらゆる標的に対して作製することができる。好ましい態様において、アプタマーには、例えば、好ましくは進化および選択の手法によって生成される核酸結合分子が含まれる。好ましくは、アプタマーは、例えば、上記の表1のようなヌクレオチド類似体を非限定的に含む、DNAもしくはRNA分子またはその両方の組み合わせを含みうる。
【０３５５】
アプタマーの使用とMNAザイムを組み合わせるための戦略は、当技術分野において公知である。例えば、MNAザイムの少なくとも1つのパートザイムにアプタマーを組み込んでもよく（アプタ-パートザイム）、さらに、ヘアピンを形成することができ、それ故にMNAザイム組織化を阻害しうる相補的配列を組み込んでもよい。検出しようとする分析物または標的はアプタ-パートザイムと結合し、その結果、活性MNAザイムの組織化が可能になる。標的分析物の非存在下では、アプタ-パートザイムは、活性MNAザイムの組織化を阻害するヘアピン構造をとる。標的分析物の存在下では、標的分析物はアプタ-パートザイムのアプタマードメインと結合し、その結果、ヘアピン構造を妨害して、アプタ-パートザイムが活性MNAザイムの組織化に加わることが可能になる。続いて、活性MNAザイムがMNAザイム基質を修飾して、ドライバー断片を生成させることができる。
【０３５６】
他の態様において、アプタマーが、アプタマーならびにヘアピン構造を形成しうる相補的阻害因子配列を組み込んだ組織化助長因子の一部として存在してもよい。標的分析物の非存在下では、組織化助長因子は、この成分が活性MNAザイムの組織化を導く能力を阻害するヘアピン構造をとる。標的分析物の存在下では、標的分析物は組織化助長因子のアプタマードメインと結合し、その結果、ヘアピン構造が妨害されて、成分が活性MNAザイムの組織化を導くことを可能にする。続いて活性MNAザイムがMNAザイム基質を修飾して、ドライバー断片を生成させることができる。
【０３５７】
当業者は、アプタマーを組織化助長因子分子のいずれかの末端に組み込みうることを理解するであろう。さらに、複数のアプタマーを、パートザイムオリゴヌクレオチド成分のうち1つまたは複数に組み込むこともできると考えられることも理解されるであろう。
【０３５８】
1つのさらなる態様において、アプタマー配列を、活性MNAザイムが標的分析物の存在下でのみ形成されるような立体配置で、パートザイムの末端に組み込むこともできる（アプタ-パートザイム）。この場合、MNAザイム検出戦略のために必要なオリゴヌクレオチド成分には以下のものが含まれる；標準的なパートザイム；末端の一方にアプタマーが組み込まれたパートザイムであるアプタ-パートザイム；（標的の存在下で）アプタ-パートザイムおよびパートザイムの両方と結合して活性MNAザイムの組織化を可能にする組織化助長因子；基質；ならびに、アプタ-パートザイムと、パートザイム配列の少なくともアプタマー配列の一部および基質結合アームの一部にわたる領域内で結合する組織化阻害因子。標的の非存在下では、組織化阻害因子はアプタ-パートザイムと結合し、その結果、MNAザイム基質の結合（および切断）をブロックする。標的の存在下では、標的はアプタ-パートザイムのアプタマー配列と結合し、組織化阻害因子の結合を妨げて、MNAザイム基質の結合および切断を可能にする。そのため、活性MNAザイムは標的の存在下でのみ形成され、MNAザイム基質を修飾して切断断片、例えばドライバー断片を生成することができる。
【０３５９】
さらに、組織化阻害因子が別個の分子であってもよく、またはMNAザイム複合体に加わる成分の1つの中に組み込まれてもよいことは、当業者には理解されるであろう。
【０３６０】
また、1つまたは複数のアプタマーを、パートザイム、組織化助長因子またはMNAザイム基質を含むオリゴヌクレオチド成分のいずれかの中に組み込むこともできると考えられることも、当業者には理解されるであろう。さらに、アプタマーを、これらのオリゴヌクレオチドのいずれか1つの一方の末端に組み込むこともできると考えられる。
【０３６１】
1.2 MNAザイム基質
本発明の組成物およびキットは、1つまたは複数のMNAザイム基質を含みうる。基質は、ある所与のMNAザイムに対して特異的であってもよく、または異なる標的特異性を有する複数のMNAザイムによる修飾が可能なユニバーサル／ジェネリック基質であってもよい。MNAザイムは、ある態様において、ユニバーサルまたはジェネリックな基質を利用しうるという有利な特性を有する。ユニバーサルMNAザイム基質は、複数の異なる標的を認識する新たなMNAザイムを作り出すための設計変更を容易にすることによって、迅速アッセイの開発を可能にする。パートザイムの基質アーム部分および触媒性コア部分を不変のままにして、新たな標的に対して必要な、1つまたは複数のパートザイムのセンサーアーム部分のみを変化させてもよい。ユニバーサル基質配列は提供されており、このため、同一の基質を、多くの異なる標的に関するアッセイに組み入れることができる。さらに、同一の基質を、基質が溶液中に遊離しているか、または支持体に連接されるかもしくは付着されているアッセイを含む、本明細書中のさまざまな態様における方法に組み入れることもできる。一連のユニバーサル基質を、複数の標的の同時検出を可能にする多重的反応に用いることができる。
【０３６２】
ユニバーサル基質を用いるMNAザイム戦略には、新たな各標的に対して特異的なプローブの設計および使用を必要とする、TaqMan（登録商標）または分子ビーコン（Molecular Beacons）またはハイブリダイゼーションプローブなどの検出技術を上回る、大きな利点がある。
【０３６３】
ある態様において、MNAザイム基質は、部分的酵素基質増幅因子複合体（PESA）と結合して、ヌクレアーゼ、例えば制限エンドヌクレアーゼによる切断に対する感受性のない酵素阻害性複合体（EIC）を形成する阻害性断片として作用しうる。
【０３６４】
MNAザイムによるMNAザイム基質の修飾により、本発明の方法（例えば、EzyAmp反応）に用いるための1つまたは複数の成分を得ることができる。修飾は例えば、MNAザイム基質の切断または複数のMNAザイム基質の核酸連結であってよい。
【０３６５】
いくつかの態様においては、MNAザイム基質の切断によって、ドライバー断片として機能し、PESAと組織化して、制限酵素または他のヌクレアーゼによる切断を受けやすいCESAを形成する、より小さな断片が生成されうる。MNAザイム基質はユニバーサルであって任意の標的に対して有用でありうるため、ユニバーサルMNAザイム基質の切断はユニバーサルドライバー断片の生成をもたらしうる。その結果、ユニバーサルDFはユニバーサルPESAと結合して、任意の標的の存在下で切断されてシグナルの増幅を可能にするユニバーサルCESAをもたらすことができる。
【０３６６】
他の態様においては、複数のMNAザイム基質の核酸連結によって、ドライバー断片として機能し、PESAと組織化して、制限酵素または他のヌクレアーゼによる切断を受けやすいCESAを形成する、より大きな断片が生成されうる。MNAザイム基質はユニバーサルであって任意の標的に対して有用でありうるため、ユニバーサルMNAザイム基質の核酸連結は、ユニバーサルドライバー断片の生成をもたらしうる。その結果、ユニバーサルDFはユニバーサルPESAと結合して、任意の標的の存在下で切断されてシグナルの増幅を可能にするユニバーサルCESAをもたらすことができる。
【０３６７】
1.3 ドライバー断片
本発明の組成物およびキットは、1つまたは複数のドライバー断片（DF）を含みうる。追加的または代替的に、本発明の方法による組成物およびキットの使用中にDFを生成させることもできる。
【０３６８】
ある態様において、ドライバー断片を、オリゴヌクレオチドの成分として提供することもできる。オリゴヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチドであっても二本鎖オリゴヌクレオチドであってもよい。例えば、オリゴヌクレオチドは、酵素増幅因子基質（EAS）オリゴヌクレオチド、合成イニシエーターオリゴヌクレオチド、MNAザイム基質オリゴヌクレオチド、ヘアピンオリゴヌクレオチド（例えば、複数のEAS、好ましくは2つのEASを含むヘアピンオリゴヌクレオチド）、連接されたオリゴヌクレオチド、または一方の鎖に内部ループ部分を有する二本鎖オリゴヌクレオチドであってよい。二本鎖および／またはヘアピンオリゴヌクレオチドは、一方の鎖がその相補的鎖よりもさらに伸びている突出部分（例えば、5'または3'突出部）を含みうる。オリゴヌクレオチドを、複合体（例えば、PESAまたはCESA）の中の他の成分と複合体化させてもよい。
【０３６９】
ある態様において、ドライバー断片はEASオリゴヌクレオチドの成分として提供され、このEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は別の異なるEASオリゴヌクレオチドに対して相補的であり、この異なるEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分はドライバー断片の少なくとも一部分に対して相補的である。
【０３７０】
ドライバー断片は、本明細書に開示されたシグナル増幅方法（例えば、EzyAmp反応）を惹起させるために用いることができる。例えば、標的検出時にのみ利用可能になるドライバー断片を、PESA複合体の中のEASに対する結合後にシグナル増幅カスケードを惹起させるために用いることができる。そのような態様において、カスケードはドライバー断片の非存在下では始まらず、それ故にそれは「イニシエーター」ドライバー断片とも称されるが、この用語は暗示的であるに過ぎず、そのようなドライバー断片を記述する上での必要条件ではないことは理解されるであろう。
【０３７１】
例えば、ドライバー断片が、標的配列の存在下でのみ組織化されるMNAザイム基質によるMNAザイムの切断によって生成されてもよい。また、ドライバー断片が、標的の存在下でのみ組織化する、リガーゼ活性を有するMNAザイムによる複数の基質の核酸連結によって生成されうることも想定している。ドライバー断片が、タンパク質、脂質、小分子、ウイルス、またはアプタマーを組み込んだこれらの種類の触媒性核酸によって検出可能な他のリガンドを含む標的リガンドの存在下でのみMNAザイム基質を切断する、アプタ-MNAザイムまたはアプタザイム（DNA、RNAまたはキメラ）の触媒活性によって生成されてもよい。
【０３７２】
ある態様において、ドライバー断片は、例えば、図19および24ならびに実施例9および14に記載されたような標的依存性MNAザイムを用いて生成されうる。これらの態様は、基質としてとの、ならびにDFと結合してそれ故にそれをブロックするためとの両方の役割を果たし、それ故に本明細書中で基質ブロッカー（substrate-blocker）オリゴヌクレオチドと称される二本鎖オリゴヌクレオチド複合体からのドライバー断片の生成を説明している。
【０３７３】
非限定的な例に過ぎないが、MNAザイム基質が第1および第2の鎖を含む二本鎖オリゴヌクレオチド複合体の成分であって、ここで第1の鎖が、MNAザイムの触媒活性によって修飾（例えば、切断）されうる内部ループ部分を含んでもよい。いくつかの態様において、第1および第2の鎖はヘアピンループ部分によって連結されており、ここで一方の鎖の5'末端はもう一方の鎖の3'末端と連結されていてもよい。内部ループ部分の内部の塩基は、第2の鎖の塩基とハイブリダイズしていない。オリゴヌクレオチド複合体は、ループ部分の外側にあって、対向鎖の一部分とハイブリダイズしている、少なくとも1つのドライバー断片を含む。例えば、ドライバー断片が複合体の第2の鎖の成分であってもよい。標的の存在下では、MNAザイムが組織化して、ループ部分を切断し、それにより、別の実体（例えば、EAS）とハイブリダイズしうる一本鎖ドライバー断片を放出する様式で複合体を修飾することができる。例えば、ループの切断によって、ループの一部分が複合体から除去され、それにより、ドライバー断片とあらかじめハイブリダイズした二本鎖複合体の一部分が除去されうる。標的依存的な様式で生成されたこのドライバー断片が、増幅カスケードを誘発させることができる。
【０３７４】
または、MNAザイム基質が、第1および第2の鎖を含む二本鎖オリゴヌクレオチド複合体の成分であって、ここで第1および第2の鎖が、一方の鎖の5'末端をもう一方の鎖の3'末端と接続するヘアピンループ部分によって連結されていてもよい。ヘアピンループ部分は、組織化標的の存在下で組織化が起こると、MNAザイムの触媒活性によって修飾（例えば、切断）されうる。オリゴヌクレオチド複合体は、ヘアピン部分の外側にあって、対向鎖の一部分とハイブリダイズしている少なくとも1つのドライバー断片を含む。標的の存在下では、MNAザイムが組織化し、ヘアピンループ部分を切断して、それにより、別の実体（例えば、EAS）とハイブリダイズしうる一本鎖ドライバー断片をもたらす様式で複合体を修飾することができる。例えば、ヘアピンループの切断によって、ループの一部分が複合体から放出され、それにより、ドライバー断片とあらかじめハイブリダイズした二本鎖複合体の一部分が除去されうる。標的依存的な様式で生成されたこのドライバー断片が、増幅カスケードを誘発することができる。
【０３７５】
また、制限酵素切断によってドライバー断片を生成させることが可能であることも想定している。例えば、二本鎖ゲノムDNAテンプレートの一方または両方の鎖の切断により、解離し、続いて、PESAと結合してCESAを形成し、その結果、ひとたび惹起されるとゲノムDNA由来の惹起性ドライバー断片の存在のみに依拠するのではなく、CESAの切断によって生成される新たなドライバー断片に依存すると考えられる、EzyAmpカスケード反応を惹起しうると考えられる、惹起性ドライバー断片として機能しうる特異的断片が生成されうると考えられる。標的DNA中のシトシン残基をメチル化するには、メチル化感受性REを用いうると考えられる。
【０３７６】
他の態様においては、ミスマッチ性ヘテロ二重鎖配列またはDNA／RNA二重鎖配列のいずれかを認識して切断する酵素または化学物質を用いて、ドライバー断片を生成させうることを想定している。ミスマッチは、調査している配列に関係する天然のミスマッチであってよいと考えられ、例えば、後天性突然変異または遺伝性SNPであってよいと考えられる。
【０３７７】
惹起性ドライバー断片を、例えば、不溶性支持体に連接されたSIOを含む、標的と複合体化された合成イニシエーターオリゴヌクレオチド（SIO）の切断によって生成させることもできる。
【０３７８】
本発明の組成物およびキットに含められるドライバー断片を、CESA複合体のヌクレアーゼ消化によって生成させることもできる。ヌクレアーゼは、制限酵素、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼであってよい。任意の適した制限酵素、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを用いることができる。
【０３７９】
ある態様において、ヌクレアーゼは制限酵素である。制限酵素は、少なくとも1つのニックを含む二重鎖オリゴヌクレオチドを認識して切断することが可能であってよい。ニックは、制限酵素の認識部位の内側にあってもよく、または外側にあってもよい。ニックは、制限酵素の切断部位の内側にあってもよく、または外側にあってもよい。あらゆる制限酵素を用いうる可能性があるものの、適した制限酵素の非限定的な例には、Mnl I、Rsa I、Pme I、Hpy 8I、Msp I、Ear IおよびTspR I、ならびに、表2および表3に示された制限酵素のうち任意の1つまたは複数が含まれる。
【０３８０】
ある態様において、ヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼである。いかなる種類のエンドヌクレアーゼにも限定されないが、適した例には、T7エンドヌクレアーゼI、マングビーンヌクレアーゼ、RNase H、Flapヌクレアーゼ、およびMNAザイムが含まれる。
【０３８１】
ある態様において、ヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼであり、その非限定的な例には、ヌクレアーゼBAL-31、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼIII、T7エキソヌクレアーゼ、T7エキソヌクレアーゼIおよびエキソヌクレアーゼTが含まれる。
【０３８２】
1.4 合成イニシエーターオリゴ（SIO）
本発明の組成物およびキットは、1つまたは複数の合成イニシエーターオリゴ（SIO）を含みうる。SIOとは、SIOと試料中に存在する標的核酸との間での二重鎖の形成を誘導するために試料に添加されるオリゴヌクレオチドのことである。ヌクレアーゼによるSIO／標的二重鎖の対形成領域または非対形成領域のいずれかの切断を利用して、ドライバー断片として機能する核酸断片を生成させることができる。
【０３８３】
いくつかの態様においては、ミスマッチ性ヘテロ二重鎖配列またはDNA／RNA二重鎖配列のいずれかを認識して切断する酵素または化学物質を用いて、ドライバー断片を生成させうることを想定している。この態様には、SIOは必要ないと考えられる。ミスマッチは、調査している配列に関係する天然のミスマッチであってよいと考えられ、例えば、後天性突然変異または遺伝性SNPであってよいと考えられる。突然変異またはSNPが起こる箇所以外の箇所で配列を切断することを望むならば、生物試料中に存在する核酸の特定部位での切断を誘導するために、合成イニシエーターオリゴ（SIO）を添加することが可能と考えられる。SIOは、標的生体テンプレートと比較して1つまたは複数のミスマッチを含有しうると考えられる。または、SIOが、例えば、DNA配列と結合して、その結果、そのようなハイブリッド配列を認識する酵素を用いる切断のための部位を提供する短いRNA／DNA二重鎖が形成されるような、RNA／DNAキメラオリゴであってもよいと考えられる。
【０３８４】
そのような追加的な態様においては、生物検体をSIOおよびエキソヌクレアーゼ活性またはエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素とともにインキュベートして、その結果、酵素がより大きな断片を消化してドライバー断片を生み出すようにすることによって、ドライバー断片を生成させうると考えられる。このようにして利用しうると考えられる酵素の非限定的な例は、表2（以下）に列記されている。2段階プロトコールを必要とする酵素もあるが、1段階反応に適用しうるものもある。当業者は、多くの他の酵素を、DNAおよび／またはRNAで構成される、マッチするSIOまたはミスマッチのあるSIO、ならびにエキソヌクレアーゼ活性またはエンドヌクレアーゼ活性のいずれかを有する酵素を用いてドライバー断片を生成させるために利用しうると考えられることを認識しているであろう。
【０３８５】
例示的なエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼの使用の機序は、図8〜11を参照することによって、さらによく理解されるであろう。
【０３８６】
図8は、大腸菌由来のエキソヌクレアーゼIによる3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を利用してドライバー断片を生成させるための2つの機序を図示している。この酵素は、DNA二重鎖からの3'一本鎖突出部を加水分解する。標的DNAを含有する試料に合成イニシエーターオリゴ（SIO）を添加して、ドライバー断片の生成を助長する。右のパネルでは、DFはSIOの切断に由来し、部分標的断片はインタクトのまま残り、再利用されて、より多くのDFを生成させる。左のパネルでは、DFは標的の切断に由来する。エキソヌクレアーゼIによるこの複合体の切断を防ぐために、ホスホロチオエート塩基をPESA複合体の3'突出伸長部に組み込むことができる。ひとたびDFが生成されると、それはPESAとハイブリダイズして、その結果、それをCESA複合体に変換させる。
【０３８７】
図9は、マングビーンヌクレアーゼのエキソヌクレアーゼ活性を利用してDFを生成させるための2つの機序を図示している。このエンドヌクレアーゼは、DNA二重鎖からの一本鎖突出部を3'方向または5'方向のいずれかに分解して、平滑末端を残す。ドライバー断片の生成を助長するために、DNAを含有する標的試料に合成イニシエーターオリゴ（SIO）を添加する。右のパネルでは、DFはSIOに由来し、一方、左のパネルではドライバー断片は標的に由来する。PESAまたはCESAのヌクレアーゼ消化を防ぐために、左（L）または右（R）に示された反応を2段階（1および2）で行うことができる。これは物理的分離によって実現しうると考えられる。ひとたびDFが生成されれば、それはPESAとハイブリダイズし、その結果、それをCESA複合体に変換させる。
【０３８８】
図10は、エキソヌクレアーゼIIIのエキソヌクレアーゼ活性を利用してDFを生成させるための機序を図示している。この酵素は、DNA二重鎖の3'末端からヌクレオチドを除去する。この酵素は平滑または陥凹3'末端に対しては活性があるが、一本鎖DNAに対する活性はなく、それ故に3'突出末端を切断しないと考えられる。この酵素はまた、二重鎖DNA中のニックから加水分解を開始して、一本鎖ギャップを生じさせる。成分オリゴヌクレオチド上のホスホロチオエートヌクレオチドの存在によって、このエキソヌクレアーゼ活性がブロックされる。DFの生成を助長するために、標的DNAを含有する試料にSIOを添加する。SIOに組み込まれたホスホロチオエートは、DF断片がPESAまたはCESAとハイブリダイズした時に生み出されるニックでの切断を防ぐ。DFはSIOに由来し、標的は再利用されて、より多くのDFを生成させる。この態様において、SIOは、標的と二重鎖を形成する標的特異的領域、およびユニバーサルな標的非結合領域を含みうると考えられる。エキソヌクレアーゼIIIによる標的特異的領域の切断により、ユニバーサルPESAと結合して、その結果、ユニバーサルCESAを形成させうると考えられる、ユニバーサルドライバー断片の生成（SIOの標的非結合領域に対応）をもたらしうると考えられる。
【０３８９】
図11は、T7エキソヌクレアーゼのエキソヌクレアーゼ活性を利用してDFを生成させるための機序を図示している。この酵素は、DNA二重鎖またはDNA／RNA二重鎖から、特にリン酸化された5'末端から、5'方向にヌクレオチドを除去する。リン酸化された基質の存在下では、5'リン酸を有しない他の5'末端に対する活性は大きく低下する。DFの生成を助長するために、標的DNAまたはRNAを含有する試料にSIOを添加する。DFは合成イニシエーターオリゴ（SIO）に由来し、RNAまたはDNA標的は再びサイクルに利用されて、より多くのDFを生成させうる。PESAはDNAで構成されるが、T7エキソヌクレアーゼによる分解を防ぐために、ある程度の二重鎖RNAを二重鎖の5'末端に有してもよい（点線ボックス）。この態様において、SIOは、標的と二重鎖を形成する標的特異的領域、およびユニバーサルな非結合領域を含みうると考えられる。T7エキソヌクレアーゼによる標的特異的領域の切断は、ユニバーサルPESAと結合し、その結果、ユニバーサルCESAを形成させうると考えられるユニバーサルドライバー断片（SIOの標的非結合領域に対応）の生成をもたらしうると考えられる。
【０３９０】
さらに、SIOが、代替的または追加的に、標識された核酸、ナノ粒子、微粒子、タンパク質、抗体、RNA、DNA、核酸類似体、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ペプチド核酸、ロックド核酸、ペプチド-核酸キメラ、アプタマー、またはそれらの任意の組み合わせなどの実体を組み込んでもよい。例えば、ナノ粒子は金ナノ粒子であってよい。
【０３９１】
ある態様において、本発明の組成物およびキットは、不溶性支持体に連接されたSIOを含む。
【０３９２】
ある態様において、SIOはヘアピンコンフォメーションとして提供されてよい。非限定的な例として、SIOは、分子内結合を形成させるオリゴの一部分と、内部の塩基が相補的でない、ステムの一方の端にあるヘアピンループ部分との間の配列相補性のために生じる二本鎖ステム部分を含みうる。ヘアピンSIOは、5'または3'末端のいずれかでステムから伸びて、それにより、一本鎖配列の5'または3'突出部を形成する余分な配列を有しうる。ヘアピン状SOIが、別のオリゴヌクレオチド、例えばDFなどに対して相補的な配列を含んでもよい。図23は、ヘアピンSIOの非限定的な例を提示している。
【０３９３】
1.5 完全酵素シグナル増幅因子（CESA）複合体および部分的酵素シグナル増幅因子（PESA）複合体
本発明の組成物およびキットは、1つもしくは複数の完全酵素シグナル増幅因子（CESA）複合体および／または1つもしくは複数の部分的酵素シグナル増幅因子（PESA）複合体を含みうる。
【０３９４】
完全酵素シグナル増幅因子（CESA）複合体は、典型的には、2つの酵素増幅因子基質（EAS）オリゴヌクレオチド（例えば、第1の酵素増幅因子基質（EAS1）オリゴおよび第2の酵素増幅因子基質（EAS2）オリゴ）ならびにドライバー断片を含む。EAS1は典型的には二重鎖の一方の鎖を含み、これは二本鎖になった時に、ヌクレアーゼによる認識配列および切断配列を組み込む。ヌクレアーゼは例えば、制限酵素、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼであってよい。好ましい態様において、EAS1は二重鎖の一方の鎖を含み、これは二本鎖になった時に、一方の鎖に制限酵素認識配列および切断部位を組み込む。
【０３９５】
例示的なCESA複合体は図14および15に提示されている。CESA複合体の1つのEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、複合体の中のもう1つのEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に対して相補的であり、前記EASオリゴヌクレオチドのうち1つの少なくとも一部分は、少なくとも1つのDFの少なくとも一部分に対しても相補的である。上述したように、CESA複合体は、ヌクレアーゼによる認識配列および切断配列を含む。DFは、認識配列および／またはヌクレアーゼ切断配列について1つまたは複数のヌクレオチドを寄与しうるが、必ずしもそうである必要はない。
【０３９６】
2つのEASオリゴによって形成される部分認識配列および／または部分的酵素切断配列への、DFによる1つまたは複数のヌクレオチドの寄与は、DFがPESA複合体と結合してCESA複合体を形成した際に、ヌクレアーゼ媒介性切断の誘因となる。DFが認識配列および／または切断配列について1つまたは複数のヌクレオチドを寄与する態様において、DFは任意の数のヌクレオチド、例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つ以上のヌクレオチドを寄与しうる。または、DFが5つ未満、4つ未満または3つ未満のヌクレオチドを寄与してもよい。DFによって寄与されるヌクレオチドは、例えば、2つのEASオリゴによって形成される部分ヌクレアーゼ認識配列または部分ヌクレアーゼ切断配列のすぐ5'側またはすぐ3'側にあってよい。または、DFによって寄与されるヌクレオチドが、2つのEASオリゴによって形成される完全ヌクレアーゼ認識配列または完全ヌクレアーゼ切断配列から5'側または3'側に1、2、3、4、5または6ヌクレオチドの位置にあってもよい。
【０３９７】
代替的な態様において、DFは、CESA複合体のヌクレアーゼ認識配列および／またはヌクレアーゼ切断配列について、ヌクレオチドを全く寄与しない。にもかかわらず、本明細書の実施例5に提示した実験データによって確かめられたように、完全ヌクレアーゼ認識および切断配列を既に含むPESAに対するDFの結合により、CESA複合体の切断に際して生成されるシグナルは増強されうる。
【０３９８】
CESA複合体の切断は、典型的には、特定イベントを指し示す検出可能なシグナルを発生させるために用いられる。図3および5を参照すると、第1の酵素増幅因子基質オリゴ（EAS1）は、検出可能な部分（F）およびクエンチャー部分（Q）の両方を含む。第2の酵素増幅因子基質オリゴ（EAS2）もクエンチャー部分（Q）を含む。クエンチャー部分は、CESAが制限酵素または他のヌクレアーゼによって切断されるまで、第1のEAS1の検出可能な部分からの検出可能なシグナルを減じさせるか、または消失させるように適合化されている。例えば、クエンチャー部分が、「Black Holeクエンチャー1」（BHQ1）または「Black Holeクエンチャー2」（BHQ2）を含んでもよい。当業者は、任意の適したフルオロフォア-クエンチャー色素のペアをそのようなプロトコールに用いうることを理解しているであろう。さらに、CESA複合体（例えば、EAS1）の1つまたは複数のEASオリゴが、代替的または追加的に、標識された核酸、ナノ粒子、微粒子、タンパク質、抗体、RNA、DNA、核酸類似体、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ペプチド核酸、ロックド核酸、ペプチド-核酸キメラ、アプタマーまたはそれらの任意の組み合わせなどの実体を組み込んでもよい。例えば、ナノ粒子は金ナノ粒子であってよい。
【０３９９】
ヌクレアーゼによるCESAの切断の結果として、検出可能な影響が生じ、その効果の大きさおよび／または速さは、それ故に試料中の標的の数量を指し示しうる。検出可能な影響は、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分析法、NMR、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円偏光二色性、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射分析、光度計測法、シンチグラフィー、電気光学的方法、UV、可視光もしくは赤外分光法、酵素的方法、またはそれらの任意の組み合わせを含む、種々の方法によって検出することができる。
【０４００】
いくつかの態様において、CESA複合体の1つのEASオリゴは、制限酵素認識配列の一部分および／または制限酵素切断配列の一部分を含む、二重鎖の一方の鎖を含む。図1、2および3を参照すると、第1および第2の酵素増幅因子基質オリゴEAS1およびEAS2はそれらの全長の少なくとも一部分にわたって相補的であり、その結果、第1および第2のEASオリゴの相補性部分はハイブリダイズして、部分的に二本鎖の制限酵素認識配列および／または制限酵素切断配列を形成する。図4および5を参照すると、第2のEAS（EAS2）は、EAS1との結合に際して、EAS1上に位置する検出可能な部分を消光させうるクエンチャー部分を含みうる。または、EAS2は、EAS1上に位置するクエンチャー部分によって蛍光が消光される検出可能な部分を含みうる。EAS1とEAS2とのハイブリダイゼーションによって形成される複合体は、部分的酵素シグナル増幅因子（PESA）複合体と称される。
【０４０１】
PESA複合体は、少なくとも2つの酵素増幅因子基質（EAS）オリゴヌクレオチドを含む多オリゴヌクレオチド複合体であり、ここで1つのEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、複合体の中のもう1つのEASオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に対して相補的である。加えて、前記EASオリゴヌクレオチドのうち1つの少なくとも一部分は、少なくとも1つのDFの少なくとも一部分に対しても相補的である。DFとハイブリダイズする能力を有するものの、このDFはハイブリダイズしておらず、それ故、PESA複合体の成分ではない。PESA複合体は、酵素の少なくとも部分的な認識配列／部位および／または少なくとも部分的な切断配列／部位を含み、酵素の完全な認識配列／部位および／または完全な切断配列／部位を含んでもよい。例示的なPESAは、図1C、3C、4、5B、7A、7B、8（左および右のパネルの両方）、14C、17A、18A、19A、20および22に図示されている。
【０４０２】
MNAザイムによるMNAザイム基質の切断によって、またはタンパク質エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼを含む他のヌクレアーゼによるSIO／標的二重鎖の切断によって生じるドライバー断片（DF）は、完全制限酵素認識配列（図2に破線ボックスで表示）に必要であってもよく、および／または、それが制限酵素による切断のために必要な制限酵素認識配列に隣接する付加的な配列であってもよい。図2を参照すると、切断部位が黒の縦向き実線矢印によって表示されている。ドライバー断片の少なくとも一部分は、第1の酵素増幅因子基質オリゴEAS1の少なくとも一部分に対して相補的である。図1、2および3を参照すると、ドライバー断片および第1のEAS1はそれらの全長の少なくとも一部分にわたって相補的であり、その結果、ドライバー断片および第1の酵素増幅因子基質オリゴの相補的部分が、例えばハイブリダイゼーションによって組織化して、完全または部分的な制限酵素認識部を含む二本鎖配列を形成することができる。CESA中に組み込まれる完全または部分二本鎖制限酵素切断配列を、このようにして形成させてもよい。EAS1、EAS2およびDFのハイブリダイゼーションによって組織化されたCESAは、REによる認識および切断の両方のために必要な配列すべてを含む。