(57)【要約】  【解決手段】  血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アイソフォームの発現を阻害するために有用なｓｉＲＮＡ組成物および方法が本明細書で開示される。糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性および多くの型の癌などの、ＶＥＧＦの過剰発現によって刺激される血管新生を含む疾患が、開示される低分子干渉ＲＮＡを投与することによって治療できる。  【選択図】      図１４
2013512677.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
センスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖を含む単離されたｓｉＲＮＡであって、前記センスＲＮＡ鎖と前記アンチセンスＲＮＡ鎖はＲＮＡ二本鎖を形成し、前記センスＲＮＡ鎖はヒトＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ中の約１９〜約２５個の連続するヌクレオチドの標的配列と同一のヌクレオチド配列を含み、前記センスＲＮＡ鎖は配列番号：１１９から成るヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は配列番号：１２０から成るヌクレオチド配列を含む、単離されたｓｉＲＮＡ。
【請求項２】
請求項１記載のｓｉＲＮＡにおいて、前記ＲＮＡ二本鎖を形成する前記第一および前記第二ＲＮＡ鎖は一本鎖ヘアピンによって共有結合されているものである、ｓｉＲＮＡ。
【請求項３】
請求項１記載のｓｉＲＮＡにおいて、前記ｓｉＲＮＡは非ヌクレオチド物質をさらに含むものである、ｓｉＲＮＡ。
【請求項４】
請求項１記載のｓｉＲＮＡにおいて、前記第一および前記第二ＲＮＡ鎖はヌクレアーゼ分解に対して安定化されているものである、ｓｉＲＮＡ。
【請求項５】
センスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖を含む単離されたｓｉＲＮＡの有効量を含む医薬組成物であって、前記センスＲＮＡ鎖と前記アンチセンスＲＮＡ鎖はＲＮＡ二本鎖を形成し、前記センスＲＮＡ鎖は配列番号：１１９から成るヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は配列番号：１２０から成るヌクレオチド配列を含む、医薬組成物。
【請求項６】
請求項５記載の医薬組成物において、前記第一および第二ＲＮＡ鎖はヌクレアーゼ分解に対して安定化されているものである、医薬組成物。
【請求項７】
被験者において血管新生疾患を治療する方法であって、前記血管新生疾患に関連する血管新生を阻害するように、センスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖を含み、前記センスＲＮＡ鎖と前記アンチセンスＲＮＡ鎖はＲＮＡ二本鎖を形成し、前記センスＲＮＡ鎖はヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ｍＲＮＡ中の約１９〜約２５個の連続するヌクレオチドの標的配列と同一のヌクレオチド配列を含み、前記センスＲＮＡ鎖は配列番号：１１９から成るヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は配列番号：１２０から成るヌクレオチド配列を含む短鎖干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）の有効量を被験者に投与することを含む方法。
【請求項８】
請求項７記載の方法において、前記血管新生疾患は癌に関連する腫瘍を含むものである、方法。
【請求項９】
請求項８記載の方法において、前記癌は、乳癌、肺癌、頭頸部癌、脳の癌、腹部の癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、消化器癌、神経膠腫、肝臓癌、舌癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、多発性骨髄腫、皮膚癌、リンパ腫および血液の癌から成る群から選択されるものである、方法。
【請求項１０】
請求項７記載の方法において、前記血管新生疾患は、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性および炎症性疾患から成る群から選択されるものである、方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の方法において、前記炎症性疾患は乾癬または関節リウマチである、方法。
【請求項１２】
請求項７記載の方法において、前記血管新生疾患は加齢性黄斑変性である、方法。
【請求項１３】
請求項７記載の方法において、前記医薬組成物を、前記短鎖干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）とは異なる、前記血管新生疾患を治療するための薬剤と組み合わせて投与するものである、方法。
【請求項１４】
請求項７記載の方法において、前記血管新生疾患は癌であり、前記薬剤は化学療法剤を含むものである、方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法において、前記化学療法剤は、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシンおよびタモキシフェンから成る群から選択されるものである、方法。
【請求項１６】
請求項７記載の方法において、前記医薬組成物を、前記血管新生疾患を治療するために設計された別の治療方法と組み合わせて被験者に投与するものである、方法。
【請求項１７】
請求項７記載の方法において、前記血管新生疾患は癌であり、前記医薬組成物を放射線療法、化学療法または手術と組み合わせて投与するものである、方法。
【請求項１８】
ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現を阻害する方法であって、センスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖を含み、前記センスＲＮＡ鎖と前記アンチセンスＲＮＡ鎖はＲＮＡ二本鎖を形成し、前記センスＲＮＡ鎖はヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ｍＲＮＡ中の約１９〜約２５個の連続するヌクレオチドの標的配列と同一のヌクレオチド配列を含み、前記センスＲＮＡ鎖は配列番号：１１９から成るヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は配列番号：１２０から成るヌクレオチド配列を含む短鎖干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）の有効量を被験者に投与することを含む方法。
【請求項１９】
請求項１８記載の方法において、前記有効量は、前記短鎖干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）の約１ｎＭ〜約１００ｎＭを含むものである、方法。
【請求項２０】
請求項１８記載の方法において、前記医薬組成物は送達試薬をさらに含むものである、方法。
【請求項２１】
請求項１８記載の方法において、前記送達試薬は、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオンおよびリポソームから成る群から選択されるものである、方法。
【請求項２２】
請求項２１記載の方法において、前記送達試薬はリポソームである、方法。
【請求項２３】
請求項２２記載の方法において、前記リポソームは、血管新生の部位またはその近傍の細胞に前記リポソームを標的とするリガンドを含むものである、方法。
【請求項２４】
請求項２３記載の方法において、前記リガンドは腫瘍細胞または血管内皮細胞上の受容体に結合するものである、方法。
【請求項２５】
請求項２３記載の方法において、前記リガンドはモノクローナル抗体を含むものである、方法。
【請求項２６】
請求項２２記載の方法において、前記リポソームはオプソニン化阻害部分で修飾されているものである、方法。
【請求項２７】
請求項２６記載の方法において、前記オプソニン化阻害部分はＰＥＧ、ＰＰＧまたはその誘導体を含むものである、方法。
【請求項２８】
請求項１８記載の方法において、前記短鎖干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）は組換えプラスミドから発現されるものである、方法。
【請求項２９】
請求項１８記載の方法において、前記短鎖干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）は組換えウイルスベクターから発現されるものである、方法。
【請求項３０】
請求項２９記載の方法において、前記組換えウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはヘルペスウイルスベクターを含むものである、方法。
【請求項３１】
請求項３０記載の方法において、前記組換えウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルスまたはモコラウイルスからの表面タンパク質で偽型化されているものである、方法。
【請求項３２】
請求項２９記載の方法において、前記組換えウイルスベクターはアデノ随伴ウイルスベクターを含むものである、方法。
【請求項３３】
請求項１８記載の方法において、前記医薬組成物は経腸的経路によって投与されるものである、方法。
【請求項３４】
請求項３３記載の方法において、前記経腸的投与経路は、経口、経直腸および鼻内から成る群から選択されるものである、方法。
【請求項３５】
請求項１８記載の方法において、前記医薬組成物は非経口投与経路によって投与されるものである、方法。
【請求項３６】
請求項３５記載の方法において、前記非経口投与経路は、血管内投与、組織周囲および組織内注射、皮下注射またはデポジション、皮下注入および新生血管形成の部位またはその近傍での直接適用から成る群から選択されるものである、方法。
【請求項３７】
請求項３５記載の方法において、前記血管内投与は、静脈内ボーラス注射、静脈内注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入および血管系へのカテーテル点滴注入から成る群から選択されるものである、方法。
【請求項３８】
ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ｍＲＮＡを分解する方法であって、センスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖を含み、前記センスＲＮＡ鎖と前記アンチセンスＲＮＡ鎖はＲＮＡ二本鎖を形成し、前記センスＲＮＡ鎖はヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ｍＲＮＡ中の約１９〜約２５個の連続するヌクレオチドの標的配列と同一のヌクレオチド配列を含み、前記センスＲＮＡ鎖は配列番号：１１９から成るヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は配列番号：１２０から成るヌクレオチド配列を含む短鎖干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）の有効量を被験者に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照：
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＩＮＨＩＢＩＴＩＯＮ  ＯＦ  ＶＥＧＦ」と題する２００９年１２月４日出願の米国特許仮出願第６１／２６６，６４５号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
新たな毛細血管の増殖または「新生血管形成」と定義される血管新生は、増殖および発生において基本的な役割を果たす。成人では、血管新生を開始する能力はすべての組織に存在するが、厳密な制御下に置かれている。血管新生の鍵となる調節因子は、血管透過因子（「ＶＰＦ」）とも呼ばれる血管内皮増殖因子（「ＶＥＧＦ」）である。血管新生は、分泌されたＶＥＧＦが、内皮細胞の表面で発現されるＦｌｔ−１およびＦｌｋ−１／ＫＤＲ受容体（ＶＥＧＦ受容体１およびＶＥＧＦ受容体２とも呼ばれる）に結合したときに開始される。Ｆｌｔ−１およびＦｌｋ−１／ＫＤＲは膜貫通タンパク質チロシンキナーゼであり、ＶＥＧＦの結合は、周囲組織において最終的な新生血管形成を生じさせる細胞シグナルカスケードを開始させる。
【０００３】
ヒトでは３つの異なる主要なＶＥＧＦ選択的スプライス型（すなわちアイソフォーム）が存在する（ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５およびＶＥＧＦ１８９）が、いくつかの他の変異体も存在する（ＶＥＧＦ２０６、ＶＥＧＦ１８３、ＶＥＧＦ１４８、ＶＥＧＦ１６５ｂおよびＶＥＧＦ１４５）。注目すべきことに、必ずしもすべてのアイソフォームが前血管新生性というわけではない。少なくともＶＥＧＦ１６５ｂはＶＥＧＦ１６５が誘導する血管新生の作用に対抗できることが明らかにされている。理論に拘束されるものではないが、ＶＥＧＦ１６５ｂはＶＥＧＦ受容体２のシグナル伝達を阻害することができると思われる。そのため、ＶＥＧＦ１６５ｂの分泌は病的状態における血管新生を阻害するまたは遅延させることができ得る。
【０００４】
異常な血管新生または新しい血管の病的増殖は、多くの状態に関与する。これらの状態には、糖尿病性網膜症、乾癬、滲出性または「湿性」加齢性黄斑変性（「ＡＲＭＤ」）、関節リウマチおよび他の炎症性疾患、ならびに大部分の癌がある。これらの状態に関連する疾患組織または腫瘍は、異常に高いレベルのＶＥＧＦを発現し、高度の血管新生または血管透過性を示す。
【０００５】
特にＡＲＭＤは臨床的に重要な血管新生疾患である。この状態は、高齢個体での一方の眼または両眼における脈絡膜新生血管形成を特徴とし、先進工業国での失明の主要原因である。
【０００６】
ＲＮＡ干渉（以下「ＲＮＡｉ」）は、多くの真核生物にわたって保存されている転写後遺伝子調節の方法である。ＲＮＡｉは、細胞内に存在する短い（すなわち<３０ヌクレオチド）二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）分子によって誘導される。「短鎖干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」と呼ばれるこれらの短いｄｓＲＮＡ分子は、１ヌクレオチド分解能までｓｉＲＮＡと配列相同性を共有するメッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）の破壊を生じさせる。ｓｉＲＮＡおよび標的ｍＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを切断する、「ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体」または「ＲＩＳＣ」に結合すると考えられる。ｓｉＲＮＡは、見かけ上多代謝回転酵素とよく似たように再利用され、１個のｓｉＲＮＡ分子は約１０００個のｍＲＮＡ分子の切断を誘導することができる。それゆえ、ｓｉＲＮＡを介したｍＲＮＡのＲＮＡｉ分解は、標的遺伝子の発現を阻害するために現在利用可能な技術よりも有効である。しかし、そのような方法を、直ちに疾患の治療のための治療薬に変換できるわけではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
それゆえ、求められているのは、抗血管新生性ＶＥＧＦアイソフォームの分泌を誘導または維持しつつ、哺乳動物において触媒量または化学量論以下の量で前血管新生性ＶＥＧＦの発現を選択的に阻害する作用物質である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、ＶＥＧＦおよびそのアイソフォームからのｍＲＮＡを特異的に標的とし、ＲＮＡｉを介したその分解を生じさせるｓｉＲＮＡを対象とする。本開示のｓｉＲＮＡ化合物および組成物は、血管新生を阻害するため、特に癌性腫瘍、加齢性黄斑変性および他の血管新生疾患の治療のために使用される。
【０００９】
したがって、本開示は、ヒトＶＥＧＦ  ｍＲＮＡまたはその選択的スプライス型、突然変異体もしくはコグネイトを標的とする単離されたｓｉＲＮＡを提供する。例えば、１つの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ２０６、ＶＥＧＦ１８３、ＶＥＧＦ１４８および／またはＶＥＧＦ１４５などの前血管新生性ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡアイソフォームを標的とする。ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ二本鎖を形成するセンスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖を含む。センスＲＮＡ鎖は、標的ｍＲＮＡ中の約１９〜約２５個の連続するヌクレオチドの標的配列と同一のヌクレオチド配列を含む。
【００１０】
本開示はまた、本明細書で開示されるｓｉＲＮＡを発現する組換えプラスミドおよびウイルスベクター、ならびにそのようなｓｉＲＮＡと医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１１】
本開示はさらに、抗血管新生性ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡを保存しつつ、ヒト前血管新生性ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡまたはその選択的スプライス型、突然変異体もしくはコグネイトの発現を阻害する方法であって、標的ｍＲＮＡが分解されるようにｓｉＲＮＡの有効量を被験者に投与することを含む方法を提供する。
【００１２】
本開示はさらに、被験者において血管新生を阻害する方法であって、前血管新生性ヒトＶＥＧＦ  ｍＲＮＡまたはその選択的スプライス型、突然変異体もしくはコグネイトを標的とするｓｉＲＮＡの有効量を被験者に投与することを含む方法を提供する。
【００１３】
本開示はさらに、血管新生疾患を治療する方法であって、血管新生疾患に関連する血管新生が阻害されるように、ヒト前血管新生性ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡまたはその選択的スプライス型、突然変異体もしくはコグネイトを標的とするｓｉＲＮＡの有効量を、そのような治療を必要とする被験者に投与することを含む方法を提供する。
【００１４】
本特許のファイルは、カラーで作製された少なくとも１つの写真または図面を含む。カラーの図面または写真を伴う本特許のコピーは、請求と必要な手数料の支払いに応じて特許商標庁によって提供される。
【００１５】
本発明の性質および利点のより完全な理解のために、添付の図面に関連して為される以下の詳細な説明を参照しなければならない。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、ｓｉＲＮＡなし（「−」）、非特異的ｓｉＲＮＡ（「非特異的」）またはヒトＶＥＧＦ  ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ（「ＶＥＧＦ」）で処理した低酸素２９３およびＨｅＬａ細胞におけるＶＥＧＦ濃度（ｐｇ／ｍｌ）のヒストグラムである。非低酸素２９３およびＨｅＬａ細胞中のＶＥＧＦ濃度（ｐｇ／ｍｌ）も示す。各々のバーは４回の実験の平均値を表し、誤差は平均値の標準偏差である。
【００１７】
【図２】図２は、ｓｉＲＮＡなし（「−」）、非特異的ｓｉＲＮＡ（「非特異的」）またはヒトＶＥＧＦ  ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ（「ＶＥＧＦ」）で処理した低酸素ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞におけるマウスＶＥＧＦ濃度（ｐｇ／ｍｌ）のヒストグラムである。各々のバーは６回の実験の平均値を表し、誤差は平均値の標準偏差である。
【００１８】
【図３】図３は、ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ（暗灰色のバー）またはヒトＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ（明灰色のバー）のいずれかの存在下でヒトＶＥＧＦを発現するアデノウイルス（「ＡｄＶＥＧＦ」）を注射したマウスからの網膜におけるヒトＶＥＧＦ濃度（ｐｇ／総タンパク質）のヒストグラムである。各々のバーは５つの眼の平均値を表し、誤差バーは平均値の標準誤差を表す。
【００１９】
【図４】図４は、ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ（Ｎ＝９；「ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ」）の網膜下注射を行った対照眼、およびマウスＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ（Ｎ＝７；「マウスＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ」）の網膜下注射を行った眼におけるレーザー誘発ＣＮＶの平均面積（ｍｍ２）を示すヒストグラムである。誤差バーは平均値の標準誤差を表す。
【００２０】
【図５】図５は、本発明の組換えＡＡＶウイルスベクターを作製するために使用したシス作用性プラスミド、ｐＡＡＶｓｉＲＮＡの略図である。「ＩＴＲ」：ＡＡＶ逆方向末端反復配列；「Ｕ６」：Ｕ６  ＲＮＡプロモータ；「センス」：ｓｉＲＮＡセンスコード配列；「アンチ」：ｓｉＲＮＡアンチセンスコード配列；「ポリＴ」：ポリチミジン終結シグナル。
【００２１】
【図６】図６は、マウス抗ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ（「ｍＶＥＧＦ１．ｓｉＲＮＡ」）または対照ｓｉＲＮＡ（「ＧＦＰ１．ｓｉＲＮＡ」）を（Ａ）網膜下または（Ｂ）硝子体内に注射したマウス眼の治療におけるレーザー誘発ＣＮＶの平均面積（ｍｍ２）のヒストグラムを示す。誤差バーは平均値の標準誤差を表す。（Ｃ）は、レーザー誘発後１日目にｓｉＲＮＡを含まないリン酸緩衝食塩水（「ＰＢＳ」；レーザー誘発後１４日目に測定したＣＮＶ面積）；レーザー誘発後１４日目に対照ｓｉＲＮＡ（「ＧＦＰ１．ｓｉＲＮＡ」；レーザー誘発後２１日目に測定したＣＮＶ面積）；またはレーザー誘発後１４日目にマウス抗ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ（「ｍＶＥＧＦ１．ｓｉＲＮＡ」；レーザー誘発後２１日目に測定したＣＮＶ面積）を硝子体内に注射したマウス眼におけるレーザー誘発ＣＮＶの平均面積（ｍｍ２）のヒストグラムである。誤差バーは平均値の標準誤差を表す。
【００２２】
【図７】図７は、注射後０日目（ｎ＝２；プレｓｉＲＮＡ注射）、６日目（ｎ＝３）、１０日目（ｎ＝３）および１４日目（ｎ＝３）にヒト抗ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ（「Ｃａｎｄ５」）および対照ｓｉＲＮＡ（「ＧＦＰ１．ｓｉＲＮＡ」）を網膜下に注射したマウス眼におけるＶＥＧＦタンパク質のパーセント（「％ＶＥＧＦ」）のグラフである。％ＶＥＧＦ＝（Ｃａｎｄ５の眼における［ＶＥＧＦ］／ＧＦＰ１．ｓｉＲＮＡの眼における［ＶＥＧＦ］）×１００。
【００２３】
【図８】図８は、ヒトＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ、非特異的ｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ）でトランスフェクトしたまたはｓｉＲＮＡなしでの偽トランスフェクトした２９３細胞におけるｈＶＥＧＦタンパク質レベルのグラフである。
【００２４】
【図９】図９は、Ｃａｎｄ５（ベバシラニブ）、ｈＶＥＧＦ  Ｎｏ．１、ｈＶＥＧＦ  Ｎｏ．２、ｈＶＥＧＦ  Ｎｏ．３、ｈＶＥＧＦ  Ｎｏ．４、ｈＶＥＧＦ  Ｎｏ．６およびｈＶＥＧＦ  Ｎｏ．７に関する用量反応試験のグラフである。
【００２５】
【図１０】図１０は、ＶＥＧＦの様々なアイソフォームおよびそれらのエクソン使用頻度の概要図である。
【００２６】
【図１１】図１１は、エクソン７／８接合部におけるＶＥＧＦ１６５とＶＥＧＦ１６５ｂの相同性を比較した略図である。
【００２７】
【図１２】図１２は、ＶＥＧＦ１６５エクソン７／８接合部を標的とする様々なｓｉＲＮＡに関して発現されたＶＥＧＦタンパク質の量を示す。
【００２８】
【図１３】図１３は、ＶＥＧＦ１６５エクソン７／８接合部を標的とする様々なｓｉＲＮＡに関するヒトＶＥＧＦタンパク質のノックダウンパーセントを示す。
【００２９】
【図１４】図１４は、ＶＥＧＦ１６５エクソン７／８接合部を標的とするｓｉＲＮＡの二次スクリーニングに関して発現されたＶＥＧＦタンパク質の量を示す。
【００３０】
【図１５】図１５は、ＶＥＧＦ１６５エクソン７／８接合部を標的とするｓｉＲＮＡの二次スクリーニングに関するヒトＶＥＧＦタンパク質のノックダウンパーセントを示す。
【００３１】
【図１６】図１６は、様々な濃度でのＶＥＧＦ１６５エクソン７／８接合部を標的とするｓｉＲＮＡの二次スクリーニングに関するヒトＶＥＧＦタンパク質のノックダウンパーセントを示す。
【００３２】
【図１７】図１７は、ＶＥＧＦ１６５エクソン７／８接合部を標的とするｓｉＲＮＡの二次スクリーニングについての７日間にわたるヒトＶＥＧＦタンパク質のノックダウンパーセントを示す。
【００３３】
【図１８】図１８は、ＲＴ−ＰＣＲを使用した、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現へのＶＥＧＦ１６５エクソン７／８接合部を標的とするｓｉＲＮＡの作用を示す。
【００３４】
【図１９】図１９は、ＲＴ−ＰＣＲを使用した、ＶＥＧＦ１６５  ｍＲＮＡ発現へのＶＥＧＦ１６５エクソン７／８接合部を標的とするｓｉＲＮＡの作用を示す。
【００３５】
【図２０】図２０は、ＲＴ−ＰＣＲを使用した、ＶＥＧＦ１８９  ｍＲＮＡ発現へのＶＥＧＦエクソン７／８接合部を標的とするｓｉＲＮＡの作用を示す。
【００３６】
【図２１】図２１は、ＲＴ−ＰＣＲを使用した、ＶＥＧＦ１２１  ｍＲＮＡ発現へのＶＥＧＦエクソン７／８接合部を標的とするｓｉＲＮＡの作用を示す。
【００３７】
【図２２】図２２は、ＲＴ−ＰＣＲを使用した、ＶＥＧＦ１６５ｂ  ｍＲＮＡ発現へのＶＥＧＦ１６５エクソン７／８接合部を標的とするｓｉＲＮＡの作用を示す。約６００ｂｐの二重バンドは人為的である。
【００３８】
【図２３】図２３は、選択したｓｉＲＮＡでの処理後のＡＲＰＥ１９細胞のサイトカインプロフィールを示す。
【００３９】
【図２４】図２４は、ＡＲＰＥ１９細胞による総ＶＥＧＦタンパク質分泌へのｓｉＲＮＡの作用を示す。
【００４０】
【図２５】図２５は、ＡＲＰＥ１９細胞による総ＶＥＧＦタンパク質分泌へのｓｉＲＮＡの作用を示す。
【００４１】
【図２６】図２６は、ＡＲＰＥ１９細胞による総ＶＥＧＦタンパク質分泌へのｓｉＲＮＡの作用を示す。
【００４２】
【図２７】図２７は、ＡＲＰＥ１９細胞による総ＶＥＧＦタンパク質分泌へのｓｉＲＮＡの作用を示す。
【００４３】
【図２８】図２８は、種々の温度条件下での経時的なベバシラニブの安定性を示す。
【００４４】
【図２９】図２９は、種々の温度条件下での経時的なベバシラニブの安定性を示す。
【００４５】
【図３０】図３０は、種々の温度条件下での経時的なＯＰＫ−ＨＶＢ−００４の安定性を示す。
【００４６】
【図３１】図３１は、種々の温度条件下での経時的なＯＰＫ−ＨＶＢ−００９の安定性を示す。
【００４７】
【図３２】図３２は、種々の温度条件下での経時的なＯＰＫ−ＨＶＢ−０１０の安定性を示す。
【００４８】
【図３３】図３３は、３’末端のヒト、ラットおよびマウスＶＥＧＦ配列の間の相同性を示す。
【００４９】
【図３４】図３４は、Ｃ６細胞によるラットＶＥＧＦ分泌へのｓｉＲＮＡの作用を示す。
【００５０】
【図３５】図３５は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞によるマウスＶＥＧＦ分泌へのｓｉＲＮＡの作用を示す。
【００５１】
【図３６】図３６は、ＡＲＰＥ１９細胞によるＶＥＧＦ分泌へのｓｉＲＮＡの作用を示す。
【００５２】
【図３７】図３７は、ＡＲＰＥ１９細胞によるＶＥＧＦ分泌へのｓｉＲＮＡの作用を示す。
【００５３】
【図３８】図３８は、ＡＲＰＥ１９細胞によるＶＥＧＦ分泌へのｓｉＲＮＡの作用を示す。
【００５４】
【図３９】図３９は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞によるマウスＶＥＧＦ分泌へのｓｉＲＮＡの作用を示す。
【００５５】
【図４０】図４０は、ＡＲＰＥ１９細胞におけるＶＥＧＦ  ｍＲＮＡメッセージへのｓｉＲＮＡの作用を示す。
【００５６】
【図４１】図４１は、Ｃ６細胞におけるＶＥＧＦ発現へのｓｉＲＮＡの作用を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
本発明の組成物および方法を説明する前に、本発明が記述される特定の工程、組成物または方法に限定されず、これらは変化し得ることが理解されるべきである。また、本説明において使用される用語は、特定の型または実施形態を説明することだけを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図されず、本発明の範囲は付属の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および学術用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で述べるものと類似または等価の任意の方法および材料を本発明の実施形態の実施または試験において使用できるが、好ましい方法、装置および材料をここで述べる。本明細書で言及されるすべての公表文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本発明が先行発明によるそのような開示に先行する権利を有さないことの承認と解釈されるべきではない。
【００５８】
また、本明細書および付属の特許請求の範囲で使用される、単数形態「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈によって明らかに指示されない限り、複数の言及を含むことも留意しなければならない。したがって、例えば、１つの「分子」への言及は、１以上の分子および当業者に公知のその等価物への言及である、等である。本明細書で使用される、「約」という用語は、それが使用されている数の数値のプラスまたはマイナス１０％を意味する。それゆえ、約５０％は４５％〜５５％の範囲内を意味する。
【００５９】
本明細書で使用される、「被験者」は、ヒトまたは非ヒト動物を含む。ある実施形態では、被験者はヒトである。
【００６０】
本明細書で使用される、ｓｉＲＮＡの「有効量」は、細胞においてＲＮＡｉを介した標的ｍＲＮＡの分解を生じさせるのに十分な量である。臨床有効量という用語は、被験者に投与された場合、ＲＮＡサイレンシングにより被験者において血管新生の進行を阻害する量である。
【００６１】
本明細書で使用される、「単離された」は、ヒトの介入を通して天然状態から変化したまたは取り出されたことを意味する。例えば、生存動物中に天然に存在するｓｉＲＮＡは「単離されて」いないが、合成ｓｉＲＮＡ、またはその天然状態の共存物質から部分的にまたは完全に分離されたｓｉＲＮＡは「単離されて」いる。単離されたｓｉＲＮＡは、実質的に精製された形態で存在することができるか、または、例えばｓｉＲＮＡが送達された細胞などの非天然環境で存在することができる。
【００６２】
本明細書で使用される、「標的ｍＲＮＡ」は、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖に相補的なセンス配列を含むｍＲＮＡを意味する。そのような標的ｍＲＮＡは、ｓｉＲＮＡが標的ｍＲＮＡを沈黙させるまたは標的ｍＲＮＡとＲＩＳＣ複合体を形成するように機能する限り、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖に１００％相同である必要はない。本開示の方法において特に有用な標的ｍＲＮＡは、例えば、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、およびＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ２０６、ＶＥＧＦ１８３、ＶＥＧＦ１４８およびＶＥＧＦ１４５などの前血管新生性ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡアイソフォームならびにそれらの組合せを含む。他のある実施形態では、標的ｍＲＮＡは抗血管新生性ＶＥＧＦ１６５ｂ  ｍＲＮＡを含まないが、少なくとも１つの他のＶＥＧＦアイソフォームを標的とする。
【００６３】
本明細書で使用される「部分的に非相補的」という用語は、おそらく非標的配列にある程度の配列相同性を共有するが、非標的配列に対してＲＮＡサイレンシングが起こらない程度にまだ十分に異なるｓｉＲＮＡ配列を意味することが意図されている。部分的に非相補的とは、非標的配列に９０％相同、８５％相同、８０％相同、７５％相同、７０％相同、６５％相同、６０％相同、５５％相同、５０％相同、４５％相同、４０％相同、３５％相同、３０％相同、２５％相同、２０％相同、１５％相同、１０％相同、５％相同、２％相同および１％相同な配列を含む。非標的配列に完全に非相同である配列は、配列に非相補的とみなされる。
【００６４】
本明細書で使用される、ヒトＶＥＧＦまたはヒトＶＥＧＦに相同な別の哺乳動物種に由来するｍＲＮＡに「コグネイト」である遺伝子またはｍＲＮＡ。例えば、マウスからのコグネイトＶＥＧＦ  ｍＲＮＡを配列番号：１に示す。
【００６５】
特に指示されない限り、本明細書ではすべての核酸配列を５’から３’方向に示す。また、核酸配列中のすべてのデオキシリボヌクレオチドを大文字で表記し（例えばデオキシチミジンは「Ｔ」である）、核酸配列中のリボヌクレオチドを小文字で表記する（例えばウリジンは「ｕ」である）。
【００６６】
ＶＥＧＦおよびその様々なアイソフォームを標的とするｓｉＲＮＡを含む組成物および方法は、血管新生を阻害するため、特に血管新生疾患の治療のために使用できる。ｓｉＲＮＡは、ＶＥＧＦおよびそのアイソフォームのタンパク質産物が生成されないまたは低い量で生成されるように、ＲＮＡｉを介したこれらのｍＲＮＡの分解を生じさせると考えられる。血管新生を開始させ、維持するためにはＦｌｔ−１またはＦｌｋ−１／ＫＤＲ受容体へのＶＥＧＦ結合が必要であるので、ｓｉＲＮＡを介したＶＥＧＦおよびそのアイソフォームならびにＦｌｔ−１またはＦｌｋ−１／ＫＤＲ  ｍＲＮＡの分解はまた、血管新生過程を阻害するためにも使用し得る。
【００６７】
それゆえ、本開示の１つの態様は、標的ｍＲＮＡを標的とする、約１７ヌクレオチド〜約２９ヌクレオチド長、ある実施形態では約１９〜約２５ヌクレオチド長の短い二本鎖ＲＮＡを含む単離されたｓｉＲＮＡを提供する。ｓｉＲＮＡは、標準的なワトソン−クリック型塩基対合相互作用（以下「塩基対合」）によって共にアニーリングされるセンスＲＮＡ鎖および相補的アンチセンスＲＮＡ鎖を含む。以下でより詳細に述べるように、センス鎖は、標的ｍＲＮＡ内に含まれる標的配列に同一または極めて相同な核酸配列を含む。
【００６８】
ｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖は、２つの相補的な一本鎖ＲＮＡ分子を含み得るか、または２つの相補的な部分が塩基対合し、一本鎖「ヘアピン」領域によって共有結合される単一分子を含み得る。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、後者のタイプのｓｉＲＮＡ分子のヘアピン領域は、「ダイサー」タンパク質（またはその等価物）によって細胞内で切断されて、２つの個別に塩基対合したＲＮＡ分子のｓｉＲＮＡを形成すると考えられる。
【００６９】
ヒトＶＥＧＦのスプライス変異体は公知であり、例えばＶＥＧＦ１２１（配列番号：２）、ＶＥＧＦ１６５（配列番号：３）、およびＶＥＧＦ１８９（配列番号：４）、ＶＥＧＦ２０６（配列番号：５；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＳ２４５５７９）、ＶＥＧＦ１８３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ０１０４３８）、ＶＥＧＦ１４８（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０９１３５２）およびＶＥＧＦ１４５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＳ２４５５７８）などの前血管新生性ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡアイソフォーム、ならびに抗血管新生性ＶＥＧＦ１６５ｂ  ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４３０８０６）を含む。ヒトＶＥＧＦおよびそのアイソフォーム、ならびにＦｌｔ−１（配列番号：６）またはＦｌｋ−１／ＫＤＲ（配列番号：７）遺伝子から転写されたｍＲＮＡを、当分野で周知の技術を用いてさらなる選択的スプライス型に関して分析することができる。そのような技術は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法およびインサイチューハイブリダイゼーションを含む。ｍＲＮＡ配列を分析するための技術は、例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｕｓｔｉｎｇ  ＳＡ（２０００），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２５：１６９−１９３に記載されている。選択的にスプライシングされたｍＲＮＡを同定するための代表的な技術も以下で述べる。
【００７０】
例えば、所与の疾患遺伝子に関連するヌクレオチド配列を含むデータベースを使用して、選択的にスプライシングされたｍＲＮＡを同定することができる。そのようなデータベースは、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥｍｂａｓｅおよびＣａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｔｏｍｙ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＣＧＡＰ）データベースを含む。ＣＧＡＰデータベースは、例えば、様々なタイプのヒト癌からの発現配列タグ（ＥＳＴ）を含む。ＶＥＧＦおよびそのアイソフォームならびにＦｌｔ−１またはＦｌｋ−１／ＫＤＲ遺伝子からのｍＲＮＡまたは遺伝子配列を使用して、選択的にスプライシングされたｍＲＮＡを示すＥＳＴがこれらの遺伝子に関して見出されているかどうかを決定するためにそのようなデータベースに問い合わせることができる。
【００７１】
「ＲＮアーゼプロテクション」と呼ばれる技術も、選択的にスプライシングされたＶＥＧＦおよびそのアイソフォームならびにＦｌｔ−１またはＦｌｋ−１／ＫＤＲ  ｍＲＮＡを同定するために使用できる。ＲＮアーゼプロテクションは、遺伝子配列の合成ＲＮＡへの翻訳を含み、合成ＲＮＡを他の細胞、例えば血管新生の部位またはその近傍の組織からの細胞に由来するＲＮＡにハイブリダイズする。次に、ハイブリダイズしたＲＮＡを、ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドミスマッチを認識する酵素と共にインキュベートする。予想されるフラグメントより小さいことは、選択的にスプライシングされたｍＲＮＡの存在を指示する。推定上の選択的にスプライシングされたｍＲＮＡをクローニングし、当業者に周知の方法によって配列決定することができる。
【００７２】
ＲＴ−ＰＣＲも、選択的にスプライシングされたＶＥＧＦおよびそのアイソフォームならびにＦｌｔ−１またはＦｌｋ−１／ＫＤＲ  ｍＲＮＡを同定するために使用できる。ＲＴ−ＰＣＲでは、組織または細胞からのｍＲＮＡを、当業者に周知の方法を用いて、逆転写酵素によりｃＤＮＡに変換する。次に、ｃＤＮＡのコード配列を、５’翻訳領域に位置する正プライマーおよび３’翻訳領域に位置する逆プライマーを使用するＰＣＲによって増幅する。一部の実施形態では、ｃＤＮＡをコードするすべての塩基を増幅する。増幅産物を、例えば増幅産物の大きさを、例えばアガロースゲル電気泳動によって、正常にスプライシングされたｍＲＮＡからの予想産物の大きさと比較することにより、選択的スプライス型に関して分析できる。増幅産物の大きさのあらゆる変化は選択的スプライシングを指示し得る。
【００７３】
突然変異体ＶＥＧＦおよびそのアイソフォームならびにＦｌｔ−１またはＦｌｋ−１／ＫＤＲ遺伝子から生成されるｍＲＮＡも、選択的スプライス型を同定するための上述した技術を介して容易に同定できる。本明細書で使用される、「突然変異体」ＶＥＧＦおよびそのアイソフォームならびにＦｌｔ−１またはＦｌｋ−１／ＫＤＲ遺伝子またはｍＲＮＡは、本明細書で示すＶＥＧＦおよびそのアイソフォームならびにＦｌｔ−１またはＦｌｋ−１／ＫＤＲ配列とは配列が異なるヒトＶＥＧＦおよびそのアイソフォームならびにＦｌｔ−１またはＦｌｋ−１／ＫＤＲ遺伝子またはｍＲＮＡを含む。したがって、これらの遺伝子の対立遺伝子型およびそれらから生成されるｍＲＮＡは、本発明の目的に関して「突然変異体」とみなされる。
【００７４】
ヒトＶＥＧＦおよびそのアイソフォームならびにＦｌｔ−１またはＦｌｋ−１／ＫＤＲ  ｍＲＮＡは、それらのそれぞれの選択的スプライス型、コグネイトまたは突然変異体と共通の標的配列を含み得ることが理解される。それゆえ、そのような共通標的配列を含む単一ｓｉＲＮＡは、共通標的配列を含む異なるＲＮＡ型のＲＮＡｉを介した分解を誘導し得る。例えば、図１０に示すように、すべてのＶＥＧＦアイソフォームはエクソン１〜５を共有する。しかし、ＶＥＧＦ１２１（配列番号：２）ではエクソン６および７（７ａおよび７ｂ）が欠失している。ＶＥＧＦ１６５（配列番号：３）ではエクソン６（６ａおよび６ｂ）が欠失している。ＶＥＧＦ１８９（配列番号：４）ではエクソン６ｂが欠失している。ＶＥＧＦ１８３では、エクソン６ａの一部ならびに完全なエクソン６ｂ配列が欠失している。ＶＥＧＦ１４８は、エクソン６（６ａおよび６ｂ）ならびにエクソン７ｂおよびエクソン８の一部の欠失を有する。ＶＥＧＦ１４５ではエクソン６ｂおよびエクソン７（７ａおよび７ｂ）が欠失している。ＶＥＧＦの唯一の公知の抗血管新生性アイソフォーム、ＶＥＧＦ１６５ｂは、エクソン６（６ａおよび６ｂ）を欠くが、偽エクソン９を付加的に含む。偽エクソン９は、終結コドンの欠失によって引き起こされるリーディングフレームシフトの結果であり、したがって３’ＵＴＲの一部がタンパク質として翻訳されることを可能にする。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂａｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎ．Ｒｅｓ．６２：４１２３（２００２）参照。ＶＥＧＦ２０６（配列番号：５）は、欠失を有さない完全長配列ＶＥＧＦである。したがって、ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ＶＥＧＦ１２１（配列番号：２）、ＶＥＧＦ１６５（配列番号：３）、およびＶＥＧＦ１８９（配列番号：４）、ＶＥＧＦ２０６（配列番号：５；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＳ２４５５７９）、ＶＥＧＦ１８３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ０１０４３８）、ＶＥＧＦ１４８（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０９１３５２）および／またはＶＥＧＦ１４５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＳ２４５５７８）などの１以上のアイソフォームを標的とするが、ｓｉＲＮＡは特定のアイソフォーム間で共有されるエクソンを標的とするが他のアイソフォームは標的としないので、ＶＥＧＦ１６５ｂなどの他のアイソフォームは標的とされない。
【００７５】
１つの実施形態では、第一ＲＮＡ鎖と第二ＲＮＡ鎖の二本鎖を含む単離されたｓｉＲＮＡが提供され、前記第一ＲＮＡ鎖は、ヒトＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５  ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ２０６、ＶＥＧＦ１８３、ＶＥＧＦ１４８、ＶＥＧＦ１４５およびそれらの組合せから成る群から選択される血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アイソフォームの約１９〜約２５個の連続するヌクレオチドの標的配列と同一のヌクレオチド配列を含み、さらに前記ｓｉＲＮＡはＶＥＧＦ１６５ｂに少なくとも部分的に非相補的であり、但し、ヒトＶＥＧＦ  ｍＲＮＡは配列番号：４２ではない。さらなる実施形態は、血管新生を阻害するためにそのようなｓｉＲＮＡを使用する方法、および血管新生を阻害するためのそのようなｓｉＲＮＡの治療有効量を含む医薬組成物を含む。
【００７６】
ｓｉＲＮＡは、部分的に精製されたＲＮＡ、実質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡまたは組換え生産されたＲＮＡ、ならびに１以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または変化により天然に存在するＲＮＡとは異なる変化したＲＮＡを含み得る。そのような変化は、ｓｉＲＮＡをヌクレアーゼ消化に対して抵抗性にする修飾を含む、例えばｓｉＲＮＡの末端またはｓｉＲＮＡの１以上の内部ヌクレオチドなどへの、非ヌクレオチド物質の付加を含み得る。
【００７７】
ｓｉＲＮＡの一方または両方の鎖はまた、３’突出部を含み得る。本明細書で使用される、「３’突出部」は、二本鎖形成したＲＮＡ鎖の３’末端から伸びる少なくとも１つの非対合ヌクレオチドを指す。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは突出部を含まず、平滑末端を有する。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡの両方の末端が平滑末端を含む。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡと隣接する１７量体およびｄＴｄＴ突出部を含む。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、異なる種に由来する細胞からのＶＥＧＦの分泌または産生を阻害することができるｓｉＲＮＡである。例えば、一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ヒト細胞、ラット細胞および／またはマウス細胞からのＶＥＧＦの分泌または阻害を阻害することができる。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、マウス細胞およびヒト細胞からのＶＥＧＦの分泌または産生を阻害できるが、ラット細胞からのＶＥＧＦの分泌または産生は阻害できない。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ラット細胞およびヒト細胞からのＶＥＧＦの分泌または産生を阻害できるが、マウス細胞からのＶＥＧＦの分泌または産生は阻害できない。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ヒト細胞、マウス細胞およびラット細胞からのＶＥＧＦの分泌または産生を阻害できる。ｓｉＲＮＡの選択性は、異なる配列間の相同性に基づき得る。例えば、図３３は、ヒト、マウスおよびラットＶＥＧＦをコードする末端コドンの間の相同性を示す。これらの相違は、１以上の種からのＶＥＧＦの産生を選択的に阻害できるｓｉＲＮＡを作製するために利用できる。
【００７８】
一部の実施形態では、２１未満のヌクレオチド、例えば１７、１８、１９または２０のヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡは、任意の潜在的な非特異的インビボ応答を回避するために使用できる（Ａｍｂａｔｉ，Ｎａｔｕｒｅ，４５２，５９１−５９７（３  Ａｐｒｉｌ  ２００８）参照）。例えば、２１未満のヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡは、インビボでＴＬＲ３応答を活性化することを回避するために使用できる。
【００７９】
したがって１つの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、１〜約６ヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドを含む）長、好ましくは１〜約５ヌクレオチド長、より好ましくは１〜約４ヌクレオチド長、特に好ましくは約２〜約４ヌクレオチド長の少なくとも１つの３’突出部を含む。
【００８０】
ｓｉＲＮＡ分子の両方の鎖が３’突出部を含む実施形態では、突出部の長さは各々の鎖について同じかまたは異なり得る。最も好ましい実施形態では、３’突出部はｓｉＲＮＡの両方の鎖に存在し、２ヌクレオチド長である。例えば、ｓｉＲＮＡの各々の鎖はジチミジル酸（「ＴＴ」）またはジウリジル酸（「ｕｕ」）の３’突出部を含み得る。
【００８１】
本発明のｓｉＲＮＡの安定性を高めるために、３’突出部を分解に対して安定化することもできる。１つの実施形態では、突出部は、アデノシンまたはグアノシンヌクレオチドなどのプリンヌクレオチドを含むことにより安定化される。あるいは、ピリミジンヌクレオチドの修飾類似体による置換、例えば３’突出部内のウリジンヌクレオチドの２’−デオキシチミジンによる置換は許容され、ＲＮＡｉ分解の効率に影響を及ぼさない。特に、２’−デオキシチミジン中に２’ヒドロキシルが存在しないことは、組織培養培地における３’突出部のヌクレアーゼ耐性を有意に増強する。
【００８２】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは配列ＡＡ（Ｎ１９）ＴＴまたはＮＡ（Ｎ２１）を含み、Ｎは任意のヌクレオチドである。これらのｓｉＲＮＡは、約３０〜７０％のＧＣを含み、好ましくは約５０％のＧ／Ｃを含む。センスｓｉＲＮＡ鎖の配列は、それぞれ（Ｎ１９）ＴＴまたはＮ２１（すなわち３〜２３位）に対応する。後者の場合、センスｓｉＲＮＡの３’末端はＴＴに変換される。この配列変換の理論的根拠は、センスおよびアンチセンス鎖の３’突出部の配列組成に関して対称な二本鎖を生成することである。次に、アンチセンスＲＮＡ鎖を、センス鎖の１〜２１位に対する相補鎖として合成する。
【００８３】
これらの実施形態における２３ヌクレオチドのセンス鎖の１位は、アンチセンス鎖によって配列特異的な様式では認識されないので、アンチセンス鎖の最も３’側のヌクレオチド残基を意図的に選択することができる。しかし、アンチセンス鎖の末位から２番目のヌクレオチド（両実施形態における２３ヌクレオチドセンス鎖の２位に相補的）は、一般に標的配列に相補的である。
【００８４】
別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列ＮＡＲ（Ｎ１７）ＹＮＮを含み、Ｒはプリン（例えばＡまたはＧ）であり、Ｙはピリミジン（例えばＣまたはＵ／Ｔ）である。それゆえ、この実施形態のそれぞれの２１ヌクレオチドセンスおよびアンチセンスＲＮＡ鎖は、一般にプリンヌクレオチドから始まる。ｐｏｌ  ＩＩＩプロモータからのＲＮＡの発現は、最初に転写されるヌクレオチドがプリンである場合にのみ効率的であると考えられるので、標的部位の変化を伴わずにそのようなｓｉＲＮＡをｐｏｌ  ＩＩＩ発現ベクターから発現させることができる。
【００８５】
さらなる実施形態では、ｓｉＲＮＡは、５個以下の連続するプリンまたはピリミジンを有する配列を含む。さらなる実施形態では、ｓｉＲＮＡは、同じヌクレオ塩基（すなわちＡ、Ｃ、ＧまたはＵ／Ｔ）を有する５個以下の連続するヌクレオチドを有する配列を含む。
【００８６】
ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ配列（「標的配列」）のいずれか中の任意の一続きの約１９〜２５個の連続するヌクレオチドを標的とすることができる。ｓｉＲＮＡについての標的配列を選択するための技術は、例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｕｓｃｈｌ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  ｓｉＲＮＡ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ，」ｒｅｖｉｓｅｄ  Ｏｃｔ．１１，２００２に示されている。「Ｔｈｅ  ｓｉＲＮＡ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ」は、Ｄｒ．Ｔｈｏｍａｓ  Ｔｕｓｃｈｌ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＡＧ  １０５，Ｍａｘ−Ｐｌａｎｃｋ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７０７７  Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙによって維持されるウエブサイトにおいて世界中で利用可能であり、Ｍａｘ  Ｐｌａｎｃｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウエブサイトにアクセスし、「ｓｉＲＮＡ」のキーワードで検索することによって見出され得る。したがって、本ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、標的ｍＲＮＡ中の任意の連続する一続きの約１９〜約２５個のヌクレオチドと同一のヌクレオチド配列を含む。
【００８７】
一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは１９ヌクレオチドであり、標的ｍＲＮＡと同一の１７ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの平滑末端を含む１９ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、１９量体の各々の末端は平滑末端を有する。一部の実施形態では、１９量体は少なくとも１つのｄＴ突出部を含む。一部の実施形態では、１９量体は２つのｄＴ突出部を含む。
【００８８】
一般に、標的ｍＲＮＡ上の標的配列は、好ましくは開始コドンから５０〜１００ヌクレオチド下流（すなわち３’方向）から始まる、標的ｍＲＮＡに対応する所与のｃＤＮＡ配列から選択され得る。しかし、標的配列は、５’もしくは３’非翻訳領域内、または開始コドンに近接する領域内（例えば、ＶＥＧＦ１２１  ｃＤＮＡの５’末端の１００ヌクレオチド内である、以下の表１における配列番号：７３および７４の標的配列参照）に位置し得る。
【００８９】
本発明のさらなる実施形態では、標的ｍＲＮＡ配列は、５個以下の連続するプリンまたはピリミジンを含む。例えば、ＶＥＧＦ１２１  ｃＤＮＡ配列内の適切な標的配列は、
ＴＣＡＴＣＡＣＧＡＡＧＴＧＧＴＧＡＡＧ（配列番号：８）
である。
【００９０】
したがって、この配列を標的とし、各々の鎖に３’ｕｕ突出部を有する（突出部を太字で示す）ｓｉＲＮＡは、
５’−ｕｃａｕｃａｃｇａａｇｕｇｇｕｇａａｇｕｕ−３’（配列番号：９）
３’−ｕｕａｇｕａｇｕｇｃｕｕｃａｃｃａｃｕｕｃ−５’（配列番号：１０）
である。
【００９１】
この同じ配列を標的とするが、各々の鎖に３’ＴＴ突出部を有する（突出部を太字で示す）ｓｉＲＮＡは、
５’−ｕｃａｕｃａｃｇａａｇｕｇｇｕｇａａｇＴＴ−３’（配列番号：１１）
３’−ＴＴａｇｕａｇｕｇｃｕｕｃａｃｃａｃｕｕｃ−５’（配列番号：１２）
である。
【００９２】
ｓｉＲＮＡが由来し得る他のＶＥＧＦ１２１標的配列を表１に示す。表１に列挙するすべてのＶＥＧＦ１２１標的配列は、すべてのヒトＶＥＧＦ選択的スプライス型に共通する、ＶＥＧＦ１２１選択的スプライス型のその部分内にあることが理解される。したがって、表１のＶＥＧＦ１２１標的配列はまた、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９およびＶＥＧＦ２０６  ｍＲＮＡも標的とすることができる。特定のＶＥＧＦアイソフォームを標的とする標的配列も容易に同定できる。例えば、ＶＥＧＦ１６５  ｍＲＮＡを標的とするがＶＥＧＦ１２１  ｍＲＮＡは標的としない標的配列は、ＡＡＣＧＴＡＣＴＴＧＣＡＧＡＴＧＴＧＡＣＡ（配列番号：１３）である。逆に、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、およびＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ２０６、ＶＥＧＦ１８３、ＶＥＧＦ１４８およびＶＥＧＦ１４５などの前血管新生性ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡアイソフォームならびにそれらの組合せを標的とするが、抗血管新生性ＶＥＧＦ１６５ｂ  ｍＲＮＡは標的としない標的配列は、表２に認められる配列を含むが、但し、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡは配列番号：４２ではない。ある実施形態では、前記ヒトＶＥＧＦ  ｍＲＮＡは、配列番号：８６；配列番号：８７；配列番号：８８；配列番号：８９；配列番号：９０；配列番号：９１；配列番号：９２；配列番号：９３；配列番号：９４；配列番号：９５；配列番号：９６；配列番号：９７；および配列番号：９８から成る群から選択される。ある実施形態では、前記ヒトＶＥＧＦ  ｍＲＮＡは、配列番号：８８および配列番号：９４から選択される。
【００９３】
抗血管新生性アイソフォームを保存しつつ、血管新生性アイソフォームのＶＥＧＦを選択的に標的とすることにより、ｓｉＲＮＡ治療の抗血管新生作用を増強することが可能である。図１１に示すように、エクソン７と９の間の領域は、血管新生性配列と抗血管新生性配列の間で異なる。様々な実施形態によれば、ｓｉＲＮＡが血管新生性アイソフォームに少なくとも部分的に相補的であるが、抗血管新生性アイソフォームには少なくとも部分的にまたは完全に非相補的であるこの領域を選択的に標的とすることが可能である。その結果として、ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは抗血管新生性アイソフォーム、ＶＥＧＦ１６５ｂの発現を阻害しないが、但し、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡは配列番号：４２ではない。ある実施形態では、前記ヒトＶＥＧＦ  ｍＲＮＡは、配列番号：８６；配列番号：８７；配列番号：８８；配列番号：８９；配列番号：９０；配列番号：９１；配列番号：９２；配列番号：９３；配列番号：９４；配列番号：９５；配列番号：９６；配列番号：９７；配列番号：９８；配列番号：９９；配列番号：１００；配列番号：１０１；配列番号：１０２；配列番号：１０３；配列番号：１０４；配列番号：１０５；配列番号：１０６；配列番号：１０７；配列番号：１０８；配列番号：１０９；配列番号：１１０；配列番号：１１１；配列番号：１１２；配列番号：１１３；配列番号：１１４；配列番号：１１５；配列番号：１１６；配列番号：１１７および配列番号：１１８から成る群から選択される。ある実施形態では、前記ヒトＶＥＧＦ  ｍＲＮＡは、配列番号：８８および配列番号：９４から選択される。
【００９４】
ヒトＦｌｔ−１およびヒトＦｌｋ−１／ＫＤＲについての例示的な標的配列は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００３年７月１８日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００３／００２２４４４号に示されている。
【００９５】
【表１】
2013512677.tif 000003
【００９６】
2013512677.tif 000004
【００９７】
【表２】
2013512677.tif 000005
【００９８】
2013512677.tif 000006
【００９９】
他の平滑末端核酸分子も使用できるが、必ずしもＶＥＧＦ１６５ｂを保存するとは限らない。例えば、配列番号：１１９を含むセンス鎖と配列番号：１２０を含むアンチセンス鎖を有するｓｉＲＮＡが使用できる。各々のｓｉＲＮＡが平滑末端を含む、配列番号：１１９と配列番号：１２０を含むｓｉＲＮＡは、ベバシラニブ−ｂｅとも称され得る。例えば、一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号：１１９と配列番号：１２０を含む、平滑末端を有する１９量体である（図３６参照）。
【０１００】
ｓｉＲＮＡは、当業者に公知の多くの技術を利用して入手できる。例えば、ｓｉＲＮＡは、化学合成することができるかまたは当分野で公知の方法、例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｕｓｃｈｌ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許出願公開第２００２／００８６３５６号に記載されているキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）インビトロ系などを使用して組換え生産することができる。
【０１０１】
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホルアミダイトおよび従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いて化学合成される。ｓｉＲＮＡは、２つの別々の相補的なＲＮＡ分子として、または２つの相補的な領域を有する単一ＲＮＡ分子として合成できる。合成ＲＮＡ分子または合成試薬の商業的供給者は、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ，ＵＳＡ）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（ｐａｒｔ  ｏｆ  Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ，ＵＳＡ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）およびＣｒｕａｃｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ）を含む。
【０１０２】
あるいは、ｓｉＲＮＡはまた、任意の適切なプロモータを使用して組換え環状または直鎖状ＤＮＡプラスミドから発現させることもできる。プラスミドからｓｉＲＮＡを発現させるための適切なプロモータは、例えばＵ６またはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモータ配列およびサイトメガロウイルスプロモータを含む。他の適切なプロモータの選択は当分野の技術範囲内である。本発明の組換えプラスミドはまた、特定の組織または特定の細胞内環境におけるｓｉＲＮＡの発現のための誘導的または調節可能なプロモータを含み得る。
【０１０３】
組換えプラスミドから発現されるｓｉＲＮＡは、標準的な技術によって培養細胞発現系から単離することができるか、またはインビボで血管新生の領域もしくはその近傍において細胞内で発現させることができる。インビボでｓｉＲＮＡを細胞に送達するための組換えプラスミドの使用を以下でより詳細に論じる。
【０１０４】
ｓｉＲＮＡは、２つの別々の相補的なＲＮＡ分子としてまたは２つの相補的な領域を有する単一ＲＮＡ分子として組換えプラスミドから発現させることができる。
【０１０５】
ｓｉＲＮＡを発現するのに適したプラスミドの選択、ｓｉＲＮＡを発現するための核酸配列をプラスミドに挿入する方法、および組換えプラスミドを対象の細胞に送達する方法は当分野の技術範囲内である。例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０：４４６−４４８；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ＴＲ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０−５５３；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４９７−５００；Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ＰＪ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：９４８−９５８；Ｌｅｅ  ＮＳ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５００−５０５；およびＰａｕｌ  ＣＰ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５０５−５０８参照。
【０１０６】
ｓｉＲＮＡを発現するための核酸配列を含むプラスミドを以下の実施例７で述べる。ｐＡＡＶｓｉＲＮＡと呼ばれるそのプラスミドは、ヒトＵ６  ＲＮＡプロモータの制御下でポリＴ終結配列に作動可能に連結されたセンスＲＮＡ鎖をコードする配列、およびヒトＵ６  ＲＮＡプロモータの制御下でポリＴ終結配列に作動可能に連結されたアンチセンスＲＮＡ鎖をコードする配列を含む。プラスミドｐＡＡＶｓｉＲＮＡは、最終的に、ｓｉＲＮＡを発現するための同じ核酸配列を含む組換えアデノ随伴ウイルスベクターの生成における使用を意図されている。
【０１０７】
本明細書で使用される、「ポリＴ終結配列に作動可能に連結された」は、センスまたはアンチセンス鎖をコードする核酸配列が、５’方向にポリＴ終結シグナルと直接隣接することを意味する。プラスミドからのセンスまたはアンチセンス配列の転写の際に、ポリＴ終結シグナルは転写を終結させるように働く。
【０１０８】
本明細書で使用される、プロモータの「制御下で」は、プロモータがセンスまたはアンチセンスコード配列の転写を開始させることができるように、センスまたはアンチセンス鎖をコードする核酸配列がプロモータの３’側に位置することを意味する。
【０１０９】
ｓｉＲＮＡはまた、インビボで血管新生の領域またはその近傍において細胞内で組換えウイルスベクターから発現させることもできる。本発明の組換えウイルスベクターは、ｓｉＲＮＡをコードする配列およびｓｉＲＮＡ配列を発現するための任意の適切なプロモータを含む。適切なプロモータとしては、例えばＵ６またはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモータ配列およびサイトメガロウイルスプロモータが含まれる。他の適切なプロモータの選択は当分野の技術範囲内である。本発明の組換えウイルスベクターはまた、特定の組織または特定の細胞内環境におけるｓｉＲＮＡの発現のための誘導的または調節可能なプロモータを含み得る。インビボでｓｉＲＮＡを細胞に送達するための組換えウイルスベクターの使用を以下でより詳細に論じる。
【０１１０】
ｓｉＲＮＡは、２つの別々の相補的なＲＮＡ分子としてまたは２つの相補的な領域を有する単一ＲＮＡ分子として組換えウイルスベクターから発現させることができる。
【０１１１】
発現されるべきｓｉＲＮＡ分子のコード配列を受け入れることができる任意のウイルスベクター、例えばアデノウイルス（ＡＶ）；アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；レトロウイルス（例えばレンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）；ヘルペスウイルス等に由来するベクターが使用できる。ウイルスベクターの親和性はまた、他のウイルスからのエンベロープタンパク質または他の表面抗原でベクターを偽型化することによっても改変できる。例えば、本発明のＡＡＶベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、モコラウイルス等からの表面タンパク質で偽型化することができる。
【０１１２】
本発明における使用に適した組換えウイルスベクターの選択、ｓｉＲＮＡを発現するための核酸配列をベクターに挿入する方法、およびウイルスベクターを対象の細胞に送達する方法は当分野の技術範囲内である。例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｏｒｎｂｕｒｇ  Ｒ（１９９５），Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐ．２：３０１−３１０；Ｅｇｌｉｔｉｓ  ＭＡ（１９８８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６０８−６１４；Ｍｉｌｌｅｒ  ＡＤ（１９９０），Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐ．１：５−１４；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ  ＷＦ（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２５−３０参照。
【０１１３】
好ましいウイルスベクターは、ＡＶおよびＡＡＶに由来するものである。特に好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは、例えばＵ６もしくはＨ１  ＲＮＡプロモータまたはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータのいずれかを含む、組換えＡＡＶベクターから２つの別々の相補的な一本鎖ＲＮＡ分子として発現される。
【０１１４】
ｓｉＲＮＡを発現するための適切なＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築する方法、およびベクターを標的細胞に送達する方法は、Ｘｉａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６−１０１０に記載されている。
【０１１５】
ｓｉＲＮＡを発現するための適切なＡＡＶベクター、組換えＡＡＶベクターを構築する方法、およびベクターを標的細胞に送達する方法は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１；Ｆｉｓｈｅｒ  ＫＪ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０−５３２；Ｓａｍｕｌｓｋｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２６；米国特許第５，２５２，４７９号；米国特許第５，１３９，９４１号；国際特許出願第ＷＯ９４／１３７８８号；および国際特許出願第ＷＯ９３／２４６４１号に記載されている。本発明の組換えＡＡＶベクターを作製するための例示的な方法を以下の実施例７で述べる。
【０１１６】
所与の標的配列を含むｓｉＲＮＡの、ＲＮＡｉを介した標的ｍＲＮＡの分解を生じさせる能力は、細胞中のＲＮＡまたはタンパク質のレベルを測定するための標準的な技術を用いて評価することができる。例えば、ｓｉＲＮＡを培養細胞に送達し、標的ｍＲＮＡのレベルをノーザンブロットもしくはドットブロット技術によって、または定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定することができる。あるいは、培養細胞中のＶＥＧＦおよびそのアイソフォームならびにＦｌｔ−１またはＦｌｋ−１／ＫＤＲ受容体タンパク質のレベルをＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット法によって測定することができる。標的ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルへの本発明のｓｉＲＮＡの作用を測定するための適切な細胞培養系を以下の実施例１で述べる。
【０１１７】
所与の標的配列を含むｓｉＲＮＡによる、ＲＮＡｉを介した標的ｍＲＮＡの分解はまた、ＲＯＰまたはＣＮＶマウスモデルなどの血管新生の動物モデルを用いて評価することもできる。例えば、ＲＯＰまたはＣＮＶマウスにおける血管新生の領域をｓｉＲＮＡの投与の前後に測定することができ、一部の実施形態では、未処置動物と比較することができる。ｓｉＲＮＡの投与後にこれらのモデルにおいて血管新生の領域が減少することは、一部の実施形態では、標的ｍＲＮＡの下方調節を指示する  （以下の実施例６参照）。
【０１１８】
上記で論じたように、ｓｉＲＮＡは、ＶＥＧＦおよびそのアイソフォームならびにＦｌｔ−１もしくはＦｌｋ−１／ＫＤＲ  ｍＲＮＡ、またはその選択的スプライス型、突然変異体もしくはコグネイト、好ましくはＶＥＧＦ、より好ましくはヒトＶＥＧＦを標的とすることができ、ＲＮＡｉを介したそれらの分解を引き起こすことができる。本発明のｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡの分解は、ＶＥＧＦおよびそのアイソフォームならびにＦｌｔ−１またはＦｌｋ−１／ＫＤＲ遺伝子からの機能的遺伝子産物の生成を低減させる。したがって、本発明の別の実施形態は、被験者においてＶＥＧＦおよびそのアイソフォーム、例えばＶＥＧＦ１２１（配列番号：２）、ＶＥＧＦ１６５（配列番号：３）、およびＶＥＧＦ１８９（配列番号：４）、ＶＥＧＦ２０６（配列番号：５；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＳ２４５５７９）、ＶＥＧＦ１８３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ０１０４３８）、ＶＥＧＦ１４８（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０９１３５２）および／またはＶＥＧＦ１４５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＳ２４５５７８）、ならびにＦｌｔ−１またはＦｌｋ−１／ＫＤＲの発現を阻害する方法であって、標的ｍＲＮＡが分解されるように、ｓｉＲＮＡの有効量を被験者に投与することを含む方法を提供する。ＶＥＧＦおよびそのアイソフォームならびにＦｌｔ−１およびＦｌｋ−１／ＫＤＲ遺伝子の産物は、血管新生を開始させ、維持するために必要であるので、本発明の別の実施形態は、本発明のｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉを介した標的ｍＲＮＡの分解により、被験者において血管新生を阻害する方法を提供する。
【０１１９】
標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉを介した分解は、上述したようなｍＲＮＡまたはタンパク質を単離し、定量するための標準的な技術を用いて、被験者の細胞中の標的ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを測定することによって検出できる。
【０１２０】
血管新生の阻害は、例えば、ｓｉＲＮＡでの治療の前後に血管新生領域の大きさを観察することにより、被験者において病原性または非病原性血管新生の進行を直接測定することによって評価できる。血管新生領域の大きさが同じままであるかまたは減少している場合は、血管新生の阻害が指示される。被験者において血管新生領域の大きさを観察し、測定するための技術は当分野の技術範囲内である；例えば、脈絡膜血管新生の領域は、例えば蛍光眼底血管造影法によって観察することができる。
【０１２１】
血管新生の阻害はまた、血管新生に関連する病原性状態の変化または逆転を観察することを通して推測することもできる。例えば、ＡＲＭＤでは、視力喪失の鈍化、停止または逆転は脈絡膜の血管新生の阻害を指示する。腫瘍に関しては、腫瘍増殖の鈍化、停止もしくは逆転、または腫瘍転移の鈍化もしくは停止は、腫瘍部位またはその近傍での血管新生の阻害を指示する。非病原性血管新生の阻害も、例えばｓｉＲＮＡの投与後の脂肪減少またはコレステロールレベルの低下から推測できる。
【０１２２】
ｓｉＲＮＡが化学量論量以下の量で標的ｍＲＮＡを分解する（したがって血管形成を阻害する）ことができることは理解される。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、ｓｉＲＮＡは触媒的に標的ｍＲＮＡの分解を引き起こすと考えられる。したがって、標準的な抗血管新生療法と比較して、治療効果を及ぼすべく血管新生の部位またはその近傍に送達されるために、有意に少ない量のｓｉＲＮＡしか必要としない。
【０１２３】
当業者は、被験者の大きさおよび体重；血管新生または疾患浸透の程度；被験者の年齢、健康状態および性別；投与経路；ならびに投与が局所的であるか全身的であるかなどの因子を考慮に入れることにより、所与の被験者に投与すべきｓｉＲＮＡの有効量を容易に決定することができる。一般に、ｓｉＲＮＡの有効量は、約１ナノモル（ｎＭ）〜約１００ｎＭ、好ましくは約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、より好ましくは約２．５ｎＭ〜約１０ｎＭの血管新生部位またはその近傍での細胞間濃度を含む。より多いまたはより少ない量のｓｉＲＮＡを投与できることが企図される。
【０１２４】
本発明の方法は、非病原性である血管新生、すなわち被験者における正常過程から生じる血管新生を阻害するために使用できる。非病原性血管新生の例としては、子宮内膜血管新生、および脂肪組織またはコレステロールの産生に関与する過程が含まれる。したがって、本発明は、非病原性血管新生を阻害するため、例えば体重を制御するもしくは脂肪減少を促進するため、コレステロールレベルを低下させるための方法、または堕胎薬としての方法を提供する。
【０１２５】
本発明の方法はまた、血管新生疾患、すなわち病原性が不適切なまたは制御されない血管新生に関連する疾患に関連する血管新生を阻害することもできる。例えば、大部分の癌性固形腫瘍は、腫瘍部位内およびその周囲で血管新生を誘導することにより、それ自体のための十分な血液供給を生じさせる。この腫瘍誘導性血管新生は、しばしば腫瘍増殖のために必要であり、同時に転移細胞が血流に入り込むことを可能にする。
【０１２６】
他の血管新生疾患としては、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性（ＡＲＭＤ）、乾癬、関節リウマチおよび他の炎症性疾患が含まれる。これらの疾患は、血管新生領域において新たに形成された血管による正常組織の破壊を特徴とする。例えば、ＡＲＭＤでは、脈絡膜が侵襲され、毛細血管によって破壊される。ＡＲＭＤにおいて血管新生が促進する脈絡膜の破壊は、最終的に部分的なまたは完全な失明をもたらす。
【０１２７】
好ましくは、ｓｉＲＮＡは、癌、例えば乳癌、肺癌、頭頸部癌、脳の癌、腹部の癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、消化器癌、神経膠腫、肝臓癌、舌癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、多発性骨髄腫、皮膚癌（例えば黒色腫）、リンパ腫および血液の癌に関連する固形腫瘍の増殖または転移を阻害するために使用される。
【０１２８】
より好ましくは、ｓｉＲＮＡは、加齢性黄斑変性における脈絡膜血管新生を阻害するために使用される。
【０１２９】
血管新生疾患を治療するために、ｓｉＲＮＡを、本発明のｓｉＲＮＡとは異なる薬剤と組み合わせて被験者に投与することができる。あるいは、ｓｉＲＮＡを、血管新生疾患を治療するために設計された別の治療方法と組み合わせて被験者に投与することができる。例えば、ｓｉＲＮＡを、癌を治療するためまたは腫瘍転移を防ぐために現在使用される治療方法（例えば放射線療法、化学療法および手術）と組み合わせて投与することができる。腫瘍を治療するために、ｓｉＲＮＡを、好ましくは放射線療法と組み合わせて、またはシスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシンもしくはタモキシフェンなどの化学療法剤と組み合わせて被験者に投与する。
【０１３０】
本発明の方法では、本発明のｓｉＲＮＡを、送達試薬と共に裸のｓｉＲＮＡとして、またはｓｉＲＮＡを発現する組換えプラスミドもしくはウイルスベクターとして被験者に投与することができる。
【０１３１】
本発明のｓｉＲＮＡと共に投与するための適切な送達試薬は、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ親油性試薬；リポフェクチン；リポフェクタミン；セルフェクチン；またはポリカチオン（例えばポリリシン）またはリポソームを含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、送達試薬は、アミンおよび脂質ベースの試薬を含む、ｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬、ＲｉｂｏＪｕｉｃｅ（商標）（Ｎｏｖａｇｅｎ）である。好ましい送達試薬はリポソームである。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡはリポソーム送達試薬なしで送達される。
【０１３２】
リポソームは、網膜または腫瘍組織などの特定の組織へのｓｉＲＮＡの送達を助けることができ、またｓｉＲＮＡの血中半減期も延長させ得る。本発明における使用に適したリポソームは、標準的な小胞形成脂質から形成され、脂質は一般に、中性または負に荷電したリン脂質およびコレステロールなどのステロールを含む。脂質の選択は、一般に所望のリポソームの大きさおよび血流中でのリポソームの半減期などの因子を考慮することによって導かれる。例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｚｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７；および米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号および同第５，０１９，３６９号に記載されているように、リポソームを調製するための様々な方法が公知である。
【０１３３】
好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡを被包するリポソームは、リポソームを血管新生の部位またはその近傍の特定の細胞または組織に標的とすることができるリガンド分子を含む。腫瘍抗原または内皮細胞表面抗原に結合するモノクローナル抗体などの、腫瘍または血管内皮細胞で広く認められる受容体に結合するリガンドが好ましい。
【０１３４】
特に好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡを被包するリポソームは、例えばオプソニン化阻害部分を構造の表面に結合させることにより、単核マクロファージおよび細網内皮系によるクリアランスを回避するように修飾される。１つの実施形態では、本発明のリポソームは、オプソニン化阻害部分およびリガンドの両方を含み得る。
【０１３５】
本発明のリポソームを調製する際に使用するためのオプソニン化阻害部分は、典型的にはリポソーム膜に結合する大型親水性ポリマーである。本明細書で使用される場合、オプソニン化阻害部分は、例えば脂溶性アンカーの膜自体へのインターカレーションによって、または膜脂質の活性基に直接結合することによって、リポソーム膜に化学的または物理的に付着している場合、リポソーム膜に「結合」している。これらのオプソニン化阻害親水性ポリマーは、例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，９２０，０１６号に記載されているように、マクロファージ−単球系（「ＭＭＳ」）および細網内皮系（「ＲＥＳ」）によるリポソームの取込みを有意に減少させる保護的な表面層を形成する。したがって、オプソニン化阻害部分で修飾されたリポソームは、非修飾リポソームよりもはるかに長く循環中に残存する。この理由から、そのようなリポソームは時として「ステルス」リポソームと呼ばれる。
【０１３６】
ステルスリポソームは、多孔性または「漏れやすい」微小血管系によって供給される組織中に蓄積することが公知である。したがって、そのような微小血管系の欠陥を特徴とする標的組織、例えば固形腫瘍は、これらのリポソームを効率的に蓄積する；Ｇａｂｉｚｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８），Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，ＵＳＡ，１８：６９４９−５３参照。加えて、ＲＥＳによる取込みの減少は、肝臓および脾臓における有意の蓄積を防止することによってステルスリポソームの毒性を低下させる。したがって、オプソニン化阻害部分で修飾された本発明のリポソームは、本発明のｓｉＲＮＡを腫瘍細胞に送達することができる。
【０１３７】
リポソームを修飾するのに適したオプソニン化阻害部分は、好ましくは、約５００〜約４０，０００ダルトン、より好ましくは約２，０００〜約２０，０００ダルトンの数平均分子量を有する水溶性ポリマーである。そのようなポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体、例えばメトキシＰＥＧまたはＰＰＧ、およびステアリン酸ＰＥＧまたはＰＰＧ；ポリアクリルアミドまたはポリＮ−ビニルピロリドンなどの合成ポリマー；直鎖状、分枝またはデンドリマーポリアミドアミン；ポリアクリル酸；ポリアルコール、例えばカルボキシル基またはアミノ基が化学結合しているポリビニルアルコールおよびポリキシリトール、ならびにガングリオシドＧＭ１などのガングリオシドが含まれる。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧもしくはメトキシＰＰＧのコポリマー、またはその誘導体も適切である。加えて、オプソニン化阻害ポリマーは、ＰＥＧとポリアミノ酸、多糖類、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミンまたはポリヌクレオチドのいずれかとのブロックコポリマーであり得る。オプソニン化阻害ポリマーはまた、アミノ酸もしくはカルボン酸を含む天然多糖類、例えばガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラゲナン；アミノ化多糖類もしくはオリゴ糖類（直鎖状もしくは分枝）；または、例えばカルボン酸の誘導体と反応してカルボキシル基の結合を生じた、カルボキシル化多糖類もしくはオリゴ糖類であり得る。
【０１３８】
好ましくは、オプソニン化阻害部分は、ＰＥＧ、ＰＰＧまたはその誘導体である。ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体で修飾されたリポソームは、時として「ＰＥＧ化リポソーム」と呼ばれる。
【０１３９】
オプソニン化阻害部分は、多くの周知の技術のいずれか１つによってリポソーム膜に結合させることができる。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをホスファチジルエタノールアミン脂溶性アンカーに結合させ、次に膜に結合させることができる。同様に、デキストランポリマーを、Ｎａ（ＣＮ）ＢＨ３および溶媒混合物、例えば３０：１２の比率のテトラヒドロフランと水を６０℃で使用する還元的アミノ化によって、ステアリルアミン脂溶性アンカーで誘導体化することができる。
【０１４０】
ｓｉＲＮＡを発現する組換えプラスミドは上記で論じられている。そのような組換えプラスミドはまた、直接投与することもでき、またはＭｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＬＴ１親油性試薬；リポフェクチン；リポフェクタミン；セルフェクチン；ポリカチオン（例えばポリリシン）もしくはリポソームを含む適切な送達試薬と共に投与することもできる。ｓｉＲＮＡを発現する組換えウイルスベクターも上記で論じられており、患者においてそのようなベクターを血管新生の領域に送達するための方法は当分野の技術範囲内である。
【０１４１】
ｓｉＲＮＡは、血管新生の領域またはその近傍の組織の細胞にｓｉＲＮＡを送達するのに適した任意の手段によって被験者に投与できる。例えば、ｓｉＲＮＡは、遺伝子銃、電気穿孔法によって、または他の適切な非経口もしくは経腸投与経路によって投与することができる。
【０１４２】
適切な経腸投与経路は、経口、経直腸または鼻内送達を含む。
【０１４３】
適切な非経口投与経路は、血管内投与（例えば静脈内ボーラス注射、静脈内注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入および血管系へのカテーテル点滴注入）；組織周囲および組織内投与（例えば腫瘍周囲および腫瘍内注射、網膜内注射または網膜下注射）；皮下注射または皮下注入を含むデポジション（浸透圧ポンプなどによる）；例えばカテーテルまたは他の配置用装置（例えば角膜ペレットまたは坐剤、点眼器、または多孔性、非多孔性もしくはゼラチン状物質を含むインプラント）による、血管新生の部位またはその近傍の領域への直接  （例えば局所）  適用；ならびに吸入を含む。適切な配置用装置は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９０２，５９８号および同第６，３７５，９７２号に記載されている眼内インプラント、ならびに米国特許第６，３３１，３１３号に記載されている生分解性眼内インプラントを含む。そのような眼内インプラントは、Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ）およびＯｃｕｌｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）から入手可能である。
【０１４４】
好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡの注射または注入は血管新生の部位またはその近傍で行われる。より好ましくは、ｓｉＲＮＡは、当分野の技術範囲内であるように、眼に局所的に、例えば液体またはゲル形態で下眼瞼または結膜円蓋に投与される（例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｃｈｅａｍｐｏｎｇ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌ．ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ３０：４２１−４２９参照）。
【０１４５】
典型的には、ｓｉＲＮＡは、約５マイクロリットル〜約７５マイクロリットル、例えば約７マイクロリットル〜約５０マイクロリットル、好ましくは約１０マイクロリットル〜約３０マイクロリットルの量で眼に局所投与される。７５マイクロリットルを超える容積のｓｉＲＮＡの眼への局所点滴注入は、流出および排液を通してｓｉＲＮＡの眼からの喪失を生じさせ得ることが理解される。したがって、高濃度のｓｉＲＮＡ（例えば１００〜１０００ｎＭ）を可能な限り小さな容積で投与することが好ましい。
【０１４６】
特に好ましい非経口投与経路は眼内投与である。本発明のｓｉＲＮＡの眼内投与は、その投与経路が、ｓｉＲＮＡが眼に入ることを可能にする限り、眼への注射または直接（例えば局所）投与によって達成され得ることが理解される。上述した眼への局所投与経路に加えて、適切な眼内投与経路には、硝子体内、網膜内、網膜下、テノン嚢下、眼窩周囲および眼窩後、経角膜および経強膜投与が含まれる。そのような眼内投与経路は当分野の技術範囲内であり、例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｃｈｅａｍｐｏｎｇ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ，２００２，前出；およびＢｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１７６３−１７６９およびＡｍｂａｔｉ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｒｅｔｉｎａｌ  ａｎｄ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．２１：１４５−１５１参照。別の好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは硝子体内注射によって投与される。
【０１４７】
ｓｉＲＮＡは、単回投与または多回投与で投与され得る。ｓｉＲＮＡの投与が注入による場合、注入は、単回持続投与であり得るかまたは多回注入によって送達され得る。組織への薬剤の直接注射は、血管新生の部位またはその近傍であることが好ましい。血管新生の部位またはその近傍の組織への薬剤の多回注射が特に好ましい。
【０１４８】
当業者はまた、ｓｉＲＮＡを所与の被験者に投与するための適切な投薬レジメンを容易に決定することができる。例えば、ｓｉＲＮＡを、血管新生部位またはその近傍での単回注射またはデポジションなどにより、被験者に１回投与することができる。あるいは、ｓｉＲＮＡを毎日または毎週、多数回にわたって被験者に投与することができる。例えば、ｓｉＲＮＡを、約３〜約２８週間、あるいは約７〜約１０週間の期間にわたって週に１回被験者に投与することができる。ある投薬レジメンでは、ｓｉＲＮＡを週に１回、７週間にわたって血管新生の部位またはその近傍に（例えば硝子体内に）注射する。湿性ＡＲＭＤまたは糖尿病性網膜症などの慢性血管新生疾患に罹患している被験者については、ｓｉＲＮＡの無期限の定期的投与が必要であり得ることが理解される。
【０１４９】
投薬レジメンが多回投与を含む場合、被験者に投与されるｓｉＲＮＡの有効量は、投薬レジメン全体にわたって投与されるｓｉＲＮＡの総量を含み得ることが理解される。
【０１５０】
ｓｉＲＮＡは、好ましくは、当分野で公知の技術によって、被験者への投与の前に医薬組成物として製剤される。本発明の医薬組成物は、少なくとも無菌および発熱物質不含であることを特徴とする。本明細書で使用される、「医薬製剤」は、ヒトおよび動物での使用のための製剤を含む。本発明の医薬組成物を調製するための方法は、例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１７ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９８５）に記載されているように、当分野の技術範囲内である。
【０１５１】
１つの実施形態では、医薬製剤は、生理的に許容される担体媒質と混合した、ｓｉＲＮＡ（例えば０．１〜９０重量％）または生理的に許容されるその塩を含む。好ましい生理的に許容される担体媒質は、水、緩衝水、塩類溶液（例えば通常生理食塩溶液またはハンクスもしくはアール平衡塩類溶液などの平衡塩類溶液）、０．４％塩類溶液、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等である。
【０１５２】
医薬組成物はまた、従来の医薬賦形剤および／または添加剤を含み得る。適切な医薬賦形剤としては、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、緩衝剤およびｐＨ調整剤が含まれる。適切な添加剤としては、生理的に生体適合性の緩衝剤（例えば塩酸トロメタミン）、キレート剤の添加物（例えばＤＴＰＡもしくはＤＴＰＡ−ビスアミドなど）またはカルシウムキレート錯体（例えばカルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミドなど）、または、場合により、カルシウムもしくはナトリウム塩の添加物（例えば塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウムもしくは乳酸カルシウム）が含まれる。本発明の医薬組成物は、液体形態での使用のために包装され得るか、または凍結乾燥され得る。
【０１５３】
眼への局所投与のために、従来の眼内送達試薬が使用できる。例えば、局所眼内送達のための本発明の医薬組成物は、上述したような塩類溶液、角膜透過促進剤、不溶性粒子、ワセリンもしくは他のゲルベースの軟膏、眼への点滴注入時に粘度が上昇するポリマー、または粘膜付着性ポリマーを含み得る。好ましくは、眼内送達試薬は、粘性作用を介してまたは角膜上皮を覆うムチン層との物理化学的相互作用を確立することによって、ｓｉＲＮＡの角膜透過性を高めるまたは前眼保持を延長させる。
【０１５４】
局所眼内送達のための適切な不溶性粒子は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第６，３５５，２７１号に記載されているリン酸カルシウム粒子を含む。眼への点滴注入時に粘度が上昇する適切なポリマーとしては、ポロキサマー４０７（例えば２５％の濃度で）などのポリエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー、セルロースアセトフタレート（例えば３０％の濃度で）、またはＧｅｌｒｉｔｅ（登録商標）（ＣＰ  Ｋｅｌｃｏ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥより入手可能）などの低アセチルゲランガムが含まれる。適切な粘膜付着性ポリマーとしては、カルボキシル、ヒドロキシル、アミドおよび／または硫酸基などの複数の親水性官能基を有する親水コロイド、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリアクリル酸、高分子量ポリエチレングリコール（例えば>２００，０００の数平均分子量）、デキストラン、ヒアルロン酸、ポリガラクツロン酸およびキシロカンが含まれる。適切な角膜透過促進剤としては、シクロデキストリン、塩化ベンザルコニウム、ポリオキシエチレングリコールラウリルエーテル（例えばＢｒｉｊ（登録商標）３５）、ポリオキシエチレングリコールステアリルエーテル（例えばＢｒｉｊ（登録商標）７８）、ポリオキシエチレングリコールオレイルエーテル（例えばＢｒｉｊ（登録商標）９８）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジギトニン、タウロコール酸ナトリウム、サポニンおよびＣｒｅｍａｐｈｏｒ  ＥＬなどのポリオキシエチル化ヒマシ油が含まれる。
【０１５５】
固体組成物に関しては、従来の非毒性固体担体、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等が使用できる。
【０１５６】
例えば、経口投与用の固体医薬組成物は、上記に列挙した担体および賦形剤の任意のものならびに１０〜９５％、好ましくは２５〜７５％の１以上のｓｉＲＮＡを含み得る。エアロゾル（吸入）投与用の医薬組成物は、上述したリポソームに封入された０．０１〜２０重量％、好ましくは１〜１０重量％の１以上のｓｉＲＮＡ、および噴射剤を含有し得る。担体、例えば鼻内送達のためのレシチンも、所望に応じて含まれ得る。
【０１５７】
ここで、本発明を以下の非限定的実施例を用いて説明する。
【実施例１】
【０１５８】
インビトロでのｓｉＲＮＡのトランスフェクションおよび低酸素の誘導
【０１５９】
ｓｉＲＮＡの設計−ヒトＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの５’末端から３２９ヌクレオチドに位置する１９ヌクレオチドの配列を標的配列として選択した：ＡＡＡＣＣＴＣＡＣＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＣ（配列番号：５１）。それがいかなる他の遺伝子に由来するｍＲＮＡにも含まれないことを確実にするために、この標的配列を、ＮＣＢＩにより提供されるＢＬＡＳＴ検索エンジンに入力した。ＢＬＡＳＴアルゴリズムの使用は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載されている。標的配列を含む他のｍＲＮＡは見出されなかったので、ｓｉＲＮＡ二本鎖を、この配列を標的とするように合成した（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）。
【０１６０】
ｓｉＲＮＡ二本鎖は、以下のセンスおよびアンチセンス鎖を有していた。
【０１６１】
センス：
５’−ａｃｃｕｃａｃｃａａｇｇｃｃａｇｃａｃＴＴ−３’（配列番号：７７）。
【０１６２】
アンチセンス：
５’−ｇｕｇｃｕｇｇｃｃｕｕｇｇｕｇａｇｇｕＴＴ−３’（配列番号：７８）。
【０１６３】
合わせて、ｓｉＲＮＡセンス鎖とアンチセンス鎖は、各々の鎖上にＴＴ  ３’突出部  （太字で示す）を有する１９ヌクレオチドの二本鎖ｓｉＲＮＡを形成した。このｓｉＲＮＡを「候補物５」または「Ｃａｎｄ５」と称した。ヒトＶＥＧＦ  ｍＲＮＡを標的とする他のｓｉＲＮＡを設計し、Ｃａｎｄ５（ベバシラニブ）について述べたように試験した。
【０１６４】
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ｍＲＮＡ中の以下の配列を標的とするｓｉＲＮＡを非特異的対照として使用した：ＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＣＧＣＡＣＣ（配列番号：７９）。ｓｉＲＮＡはＤｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）より購入した。
【０１６５】
インビトロでのｓｉＲＮＡのトランスフェクションおよび低酸素の誘導−ヒト細胞株（２９３；ＨｅｌａおよびＡＲＰＥ１９）を、細胞がトランスフェクションの時点で〜５０％集密となるように、トランスフェクションの１日前に完全ＤＭＥＭ培地２５０マイクロリットル中で２４穴プレートに別々に接種した。細胞を２．５ｎＭ  Ｃａｎｄ５  ｓｉＲＮＡで、および対照としてｓｉＲＮＡなしまたは２．５ｎＭの非特異的ｓｉＲＮＡ（ＧＦＰを標的とする）のいずれかでトランスフェクトした。トランスフェクションは、すべての細胞株において「Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ」試薬を用いて製造者（Ｍｉｒｕｓ）によって推奨されるように実施した。
【０１６６】
トランスフェクションの２４時間後、デフェロキサミンメシレートを各々のウエル中１３０マイクロモルの最終濃度に添加することにより、細胞において低酸素を誘導した。トランスフェクションの２４時間後、細胞培養培地をすべてのウエルから取り出し、ヒトＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ&Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、製造者から入手可能なＱｕａｎｔｉｋｉｎｅヒトＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡプロトコールに記載されているように培地に関して実施した。
【０１６７】
図１に見られるように、Ｃａｎｄ５  ｓｉＲＮＡによって誘導されるＲＮＡｉ分解は、低酸素２９３およびＨｅＬａ細胞によって産生されるＶＥＧＦの濃度を有意に低下させる。ｓｉＲＮＡなしまたは非特異的ｓｉＲＮＡ対照のいずれかで処理した低酸素細胞によって産生されるＶＥＧＦの量には基本的に差がなかった。同様の結果が、同じ条件下で処理したヒトＡＲＰＥ１９細胞に関しても認められた。したがって、ＶＥＧＦを標的とするｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉は、インビトロでヒト培養細胞におけるＶＥＧＦの病原性上方調節を破壊する。
【０１６８】
上記で概説した実験を、マウス特異的ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡを使用してマウスＮＩＨ  ３Ｔ３細胞に関して反復し（以下の実施例６参照）、ＶＥＧＦ産生を、マウスＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ&Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、製造者から入手可能なＱｕａｎｔｉｋｉｎｅマウスＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡプロトコールに記載されているように定量した。ヒト細胞株について図１で報告したのと同様の結果を得た。
【実施例２】
【０１６９】
ヒト培養細胞におけるＶＥＧＦ産生への漸増ｓｉＲＮＡ濃度の影響
【０１７０】
実施例１で概説した実験を、１０ｎＭ〜５０ｎＭの一連のｓｉＲＮＡ濃度を用いてヒト２９３、ＨｅＬａおよびＡＲＰＥ１９細胞に関して反復した。ＶＥＧＦ産生を下方調節するＣａｎｄ５  ｓｉＲＮＡの能力は、約１３ｎＭ  ｓｉＲＮＡまで穏やかに増大したが、この濃度より上ではプラトー効果が見られた。プラトー効果は、ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされなかった少数の細胞からのＶＥＧＦ産生を反映すると思われるので、これらの結果は、ｓｉＲＮＡを介したｍＲＮＡのＲＮＡｉ分解の触媒的性質を強調する。このｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞の大部分について、低酸素によって誘導されるＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ産生の増大は、約１３ｎＭより高いｓｉＲＮＡ濃度ではｓｉＲＮＡが誘導する標的ｍＲＮＡの分解に凌駕される。
【実施例３】
【０１７１】
ｓｉＲＮＡターゲティングの特異性
【０１７２】
ＮＩＨ  ３Ｔ３マウス線維芽細胞を、細胞がトランスフェクションの１日前に〜５０％集密になるように、２４穴プレートにおいて標準的な条件下で増殖させた。ヒトＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ  Ｃａｎｄ５を、実施例１におけるようにＮＩＨ  ３Ｔ３マウス線維芽細胞にトランスフェクトした。次に、トランスフェクトした細胞において低酸素を誘導し、マウスＶＥＧＦ濃度を、実施例１におけるようにＥＬＩＳＡによって測定した。
【０１７３】
ヒトＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ  Ｃａｎｄ５が標的とする配列は、マウスＶＥＧＦ  ｍＲＮＡと１個のヌクレオチドが異なる。図２に見られるように、ヒトＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡは、低酸素後にマウスＶＥＧＦを上方調節するマウス細胞の能力に影響を及ぼさない。これらの結果は、ｓｉＲＮＡが誘導するＲＮＡｉ分解が、１ヌクレオチド分解能まで配列特異的であることを示す。
【実施例４】
【０１７４】
マウス網膜色素上皮細胞へのｓｉＲＮＡのインビボ送達
【０１７５】
ＶＥＧＦは、加齢性黄斑変性（ＡＲＭＤ）を有するヒト患者の網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞において上方調節される。機能的ｓｉＲＮＡがインビボでＲＰＥ細胞に送達され得ることを示すため、組換えアデノウイルスを用いてＧＦＰをマウス網膜で発現させ、ＧＦＰ発現をｓｉＲＮＡで抑制した。実験は以下のように実施した。
【０１７６】
５匹の成体Ｃ５７／Ｂｌａｃｋ６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）の各々からの一方の眼に、ＣＭＶプロモータによって駆動されるｅＧＦＰを含有するアデノウイルス約１ｘ１０８粒子およびｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ試薬（Ｍｉｒｕｓ）と結合したｅＧＦＰを標的とするｓｉＲＮＡ  ２０ピコモルを含有する混合物を、Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）、前出に記載されているように網膜下に注射した。
【０１７７】
陽性対照として、反対側の眼に、ＣＭＶプロモータによって駆動されるｅＧＦＰを含有するアデノウイルス約１×１０８粒子およびｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ試薬（Ｍｉｒｕｓ）と結合したヒトＶＥＧＦを標的とするｓｉＲＮＡ  ２０ピコモルを含有する混合物を注射した。ＧＦＰの発現を、注射の４８時間および６０時間後に眼底鏡検査によって検出した。動物を注射の４８時間または６０時間後に犠死させた。眼を摘出し、４％パラホルムアルデヒドに固定して、平板スライドとして調製するかまたは蛍光顕微鏡検査用の１０ミクロン凍結切片に処理した。
【０１７８】
ＧＦＰ蛍光は、５匹のマウスの内の４匹において、ＧＦＰ  ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを摂取した眼の眼底鏡検査によって検出されなかったが、非特異的対照ｓｉＲＮＡを摂取した反対側の眼ではＧＦＰ蛍光が検出可能であった。蛍光顕微鏡検査によって分析した代表的な平板スライドは、非特異的対照ｓｉＲＮＡを摂取した眼と比較して、ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡを摂取した眼ではＧＦＰ蛍光が存在しないことを示した。別の網膜の凍結切片は、組換えアデノウイルスがＲＰＥ細胞を効率的に標的とし、アデノウイルスがＧＦＰ  ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを伴う場合は、ＧＦＰ導入遺伝子の発現が停止することを示した。
【０１７９】
ＧＦＰ  ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを摂取した眼では蛍光顕微鏡検査によって検出可能なある程度のＧＦＰ蛍光が存在するが、蛍光は、非特異的ｓｉＲＮＡを摂取した対照と比較して大きく抑制されている。これらのデータは、機能的ｓｉＲＮＡがインビボでＲＰＥ細胞に送達され得ることを明らかにする。
【実施例５】
【０１８０】
マウス網膜におけるヒトＶＥＧＦのインビボ発現およびｓｉＲＮＡが誘導するＲＮＡｉ分解
【０１８１】
ＶＥＧＦを標的とするｓｉＲＮＡがインビボで機能したことを明らかにするため、外因性ヒトＶＥＧＦ発現カセットを、実施例４におけるように、網膜下注射によりアデノウイルスを介してマウスＲＰＥ細胞に送達した。一方の眼はＣａｎｄ５  ｓｉＲＮＡを摂取し、反対側の眼はＧＦＰ  ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを摂取した。動物を注射の６０時間後に犠死させ、注射した眼を取り出して、摘出後液体Ｎ２中で瞬間凍結した。次に眼を溶解緩衝液中でホモジナイズし、標準的なＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて総タンパク質を測定した。試料を総タンパク質に関して基準化した後、実施例１で述べたようにＥＬＩＳＡによってヒトＶＥＧＦを検定した。
【０１８２】
ＶＥＧＦの発現は動物によっていくぶん変動があった。ＶＥＧＦレベルの変動性は実施例４のＧＦＰ実験で認められたものと良好に相関し、注射によるある程度の誤差、および各動物において標的遺伝子を送達するアデノウイルスの能力の差異に帰することができる。しかし、非特異的対照ｓｉＲＮＡを摂取した眼と比較して、ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡを摂取した各々の眼ではＶＥＧＦ発現の有意の減弱が存在した（図４）。これらのデータは、Ｃａｎｄ５  ｓｉＲＮＡがインビボでマウスＲＰＥ細胞におけるヒトＶＥＧＦ発現を抑制するのに効力があり、有効であったことを指示する。
【実施例６】
【０１８３】
マウスＣＮＶモデルにおける脈絡膜血管新生の阻害
ＡＲＭＤでの脈絡膜血管新生はＲＰＥ細胞におけるＶＥＧＦの上方調節によるものであるという証拠が存在する。このヒトの病的状態は、レーザーを用いて網膜上の斑を焼くこと（「レーザー光凝固」または「レーザー誘起」）によりマウスにおいてモデル化することができる。治癒過程の間に、ＶＥＧＦは焼けた領域のＲＰＥ細胞において上方調節され、脈絡膜の再血管新生を導くと考えられる。このモデルはマウス脈絡膜血管新生（「ＣＮＶ」）モデルと呼ばれる。
【０１８４】
マウスＣＮＶモデルの救済のために、実施例１からのヒト「Ｃａｎｄ５」ｓｉＲＮＡから１ヌクレオチド変化を組み込んだマウスｓｉＲＮＡを設計した。このマウスｓｉＲＮＡは、配列ＡＡＡＣＣＵＣＡＣＣＡＡＡＧＣＣＡＧＣＡＣ（配列番号：８０）においてマウスＶＥＧＦ  ｍＲＮＡを特異的に標的とした。マウスＶＥＧＦを標的とする他のｓｉＲＮＡも設計し、試験した。実施例１で非特異的対照として使用したＧＦＰ  ｓｉＲＮＡをここでも非特異的対照として使用した。
【０１８５】
レーザー誘起の２４時間後に、１１匹の成体Ｃ５７／Ｂｌａｃｋ６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）の各々からの一方の眼に、実施例４におけるように、ＣＭＶプロモータによって駆動されるＬａｃＺを含有するアデノウイルス約１ｘ１０８粒子およびｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ試薬（Ｍｉｒｕｓ）と結合したマウスＶＥＧＦを標的とするｓｉＲＮＡ  ２０ピコモルを含有する混合物を網膜下に注射した。対照として、反対側の眼には、ＣＭＶプロモータによって駆動されるＬａｃＺを含有するアデノウイルス約１×１０８粒子およびｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ試薬（Ｍｉｒｕｓ）と結合したＧＦＰを標的とするｓｉＲＮＡ  ２０ピコモルを含有する混合物を注射した。
【０１８６】
レーザー処理の１４日後、マウスをフルオレセインで灌流し、血管新生の領域を熱傷斑の周囲で測定した。反対側の眼の熱傷斑の領域を対照として使用した。マウスＶＥＧＦを標的とするｓｉＲＮＡを摂取した動物における熱傷斑の周囲の血管新生の部位は、平均すると、対照領域の１／４の面積であった。これらのデータは、ＡＲＭＤの治療のためのＶＥＧＦ指向性ｓｉＲＮＡ（「抗ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ」とも呼ばれる）の使用を支持する。
【実施例７】
【０１８７】
ｓｉＲＮＡの発現のためのアデノ随伴ウイルスベクターの作製
ｓｉＲＮＡを送達するための組換えＡＡＶベクターを作製するための「シス作用性」プラスミドを、基本的にＳａｍｕｌｓｋｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）前出に記載されているように、ＰＣＲに基づくサブクローニングによって作製した。このシス作用プラスミドを「ｐＡＡＶｓｉＲＮＡ」と称した。
【０１８８】
ｐｓｕｂ２０１のｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を、以下の配列によりこの順序で置換した：ヒトＵ６  ＲＮＡプロモータの制御下でポリＴ終結配列に作動可能に連結された１９ヌクレオチドのセンスＲＮＡ鎖をコードする配列、およびヒトＵ６  ＲＮＡプロモータの制御下でポリＴ終結配列に作動可能に連結された１９ヌクレオチドのアンチセンスＲＮＡ鎖をコードする配列。ｐＡＡＶｓｉＲＮＡの略図を図５に示す。
【０１８９】
Ｆｉｓｈｅｒ  ＫＪ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）前出に記載されているように、ｐＡＡＶｓｉＲＮＡを、あらかじめＥ１欠失アデノウイルスに感染させたヒト２９３細胞にトランスフェクトすることによって組換えＡＡＶ  ｓｉＲＮＡベクターを得た。ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ機能は、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）前出に記載されているようにトランス作用性プラスミドｐＡＡＶ／Ａｄによって与えられた。組換えＡＡＶ  ｓｉＲＮＡベクターの生産ロットを、Ｆｉｓｈｅｒ  ＫＪ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）前出に記載されているように、ゲノムコピー数／ｍｌによって力価測定した。
【実施例８】
【０１９０】
ＶＥＧＦ指向性ｓｉＲＮＡは実験的脈絡膜血管新生を阻害する
マウスにおいて実験的レーザー誘発性脈絡膜血管新生を阻害するマウスＶＥＧＦ指向性ｓｉＲＮＡの能力を以下のように試験した。
【０１９１】
成体雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの網膜を、８１０ｎｍダイオードレーザー（７５μｍ、１４０ｍｗ、０．１０秒）（ＯｃｕＬｉｇｈｔ  Ｓｉｘ；ＩＲＩＳ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用してレーザー光凝固した。３つのレーザースポットを各々のマウスの両眼に適用した。レーザー光凝固の３６時間後、マウスＶＥＧＦを標的とするｓｉＲＮＡ（「ｍＶＥＧＦ１．ｓｉＲＮＡ」）を各マウスの一方の眼に網膜下または硝子体内経路で送達した。網膜下注射については、ｓｉＲＮＡをＴｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯトランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ）と結合し、組換えアデノウイルス（ｒアデノウイルス）と混合した。硝子体内注射については、ｓｉＲＮＡをトランスフェクション試薬およびｒアデノウイルスなしで送達した。対照として、各マウスの反対側の眼に、マウスＶＥＧＦと相同性を有さない、ＧＦＰを標的とするｓｉＲＮＡ（「ＧＦＰ１．ｓｉＲＮＡ」）を含む同一製剤の網膜下または硝子体内注射を実施した。
【０１９２】
レーザー処理の１４日後、すべての動物を高分子量ＦＩＴＣ−デキストランで灌流し、脈絡膜平板スライドを上述したように調製して、平板スライドを写真撮影し、盲検的に顕微鏡で分析した。各々の平板スライドにおけるＣＮＶの面積をＯｐｅｎｌａｂソフトウエア（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で測定した。ｍＶＥＧＦ１．ｓｉＲＮＡで処置した眼におけるＣＮＶの平均面積は、網膜下（図６Ａ；Ｐ<０．００３）および硝子体内（図６Ｂ；Ｐ<０．０４）送達の両方についてＧＦＰ１．ｓｉＲＮＡ処置眼からの面積よりも有意に小さかった。
【０１９３】
２番目の実験では、成体雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの網膜を上述したようにレーザー光凝固し、動物を対照群と試験群に分けた。レーザー光凝固の１日後、リン酸緩衝食塩水を対照群の動物に硝子体内送達し、レーザー処理の１４日後に対照群の動物をデキストラン−フルオレセインで灌流した。次に、上記のように脈絡膜平板スライドを調製し、各々の平板スライドにおけるＣＮＶの面積を測定した。
【０１９４】
レーザー光凝固の１４日後、ｍＶＥＧＦ１．ｓｉＲＮＡを試験群の各々のマウスの一方の眼に硝子体内注射によって送達した。反対側の眼には、対照としてＧＦＰ１．ｓｉＲＮＡを注射した。試験群の動物をレーザー処理の２１日後に高分子量デキストラン−フルオレセインで灌流した。次に、上記のように脈絡膜平板スライドを調製し、各々の平板スライドにおけるＣＮＶの面積を測定した。
【０１９５】
この後者の実験では、抗ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡを、ＣＮＶ増殖の前ではなくＣＮＶ増殖の間に投与しており、したがって湿性ＡＭＤを呈するヒト患者の状態をよりよく示す。図６からわかるように、ｍＶＥＧＦ１．ｓｉＲＮＡ処置眼におけるＣＮＶの平均面積はＧＦＰ１．ｓｉＲＮＡ処置眼で測定された面積よりも有意に小さかった（図６Ｃ；Ｐ<０．０５）。２１日目のｍＶＥＧＦ１．ｓｉＲＮＡ処置眼と１４日目の対照（「ＰＢＳ」）眼におけるＣＮＶの平均面積には有意の差がなかった（図６Ｃ；Ｐ＝０．４６９）。
【０１９６】
これらの実験の結果は、加齢性黄斑変性が抗ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡで治療できることを指示する。
【実施例９】
【０１９７】
マウスＲＰＥ細胞において抗ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡによって誘導されるヒトＶＥＧＦのインビボＲＮＡ干渉
【０１９８】
インビボで経時的にＶＥＧＦのＲＮＡｉを誘導するＣａｎｄ５  ｓｉＲＮＡの能力を以下のように評価した。
【０１９９】
アデノ随伴ウイルスベクターからヒトＶＥＧＦを発現するＡＡＶ．ＣＭＶ．ＶＥＧＦをＤｒ．Ａ．Ａｕｒｉｃｃｈｉｏの好意により提供された。５匹のＣ５７Ｂｌ／６マウスの両眼にＡＡＶ．ＣＭＶ．ＶＥＧＦを網膜下注射した。ＡＡＶ．ＣＭＶ．ＶＥＧＦの注射の２８日後、Ｃａｎｄ５  ｓｉＲＮＡを硝子体内注射によって一方の眼に送達し、対照ＧＦＰ１．ｓｉＲＮＡを各動物の反対側の眼に硝子体内注射によって送達した。
【０２００】
０日目（ｓｉＲＮＡ注射前）ならびにｓｉＲＮＡ注射後６、１０および１４日目に、マウスを犠死させ、眼を摘出し、その後液体窒素中で瞬間凍結した。次に、上記実施例５におけるように、眼を溶解緩衝液（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中でホモジナイズし、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて総タンパク質を測定した。２匹のマウスを０日目時点のために使用し（ｎ＝２）、各々３匹のマウスを６、１０および１４日目時点のために使用した（ｎ＝３）。試料を総タンパク質に関して基準化した後、ＥＬＩＳＡにより、製造者の推奨にしたがって（Ｒ&Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）ヒトＶＥＧＦを検定した。各々のマウスについてのＶＥＧＦのパーセント（％ＶＥＧＦ）を、Ｃａｎｄ５を注射した眼におけるＶＥＧＦの濃度（「［ＶＥＧＦ］」）をＧＦＰ１．ｓｉＲＮＡを注射した眼における［ＶＥＧＦ］で除し、１００を乗じて計算した。
【０２０１】
図７からわかるように、Ｃａｎｄ５の単回注射は、ｓｉＲＮＡ注射後６日目までに約７０％のＶＥＧＦレベルのＲＮＡｉ媒介性低下を誘導し、少なくともｓｉＲＮＡ注射後１４日目まで約３５％のＶＥＧＦ産生の減少が持続した。これらの結果は、ヒトＶＥＧＦに対するｓｉＲＮＡが持続的な期間にわたってインビボでヒトＶＥＧＦのＲＮＡｉを誘導できることを指示する。
【実施例１０】
【０２０２】
抗ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡでのサルにおけるＶＥＧＦのインビボＲＮＡ干渉
【０２０３】
この試験の目的は、ＣＮＶの誘導後に単回硝子体内注射によって雄性カニクイザルに投与した場合のＣａｎｄ５の安全性と効果を測定することであった。Ｃａｎｄ５を、以下の用量レベル：０ｍｇ／眼（対照）、０．０７ｍｇ／眼、０．１８ｍｇ／眼、０．３５ｍｇ／眼および０．７０ｍｇ／眼で、ビヒクル対照品中にてナイーブ雄性カニクイザルに投与した。
【０２０４】
ＣＮＶを、各動物の両眼の斑へのレーザー処理によって誘導し、Ｃａｎｄ５の用量をレーザー処理後すぐに投与した。動物を臨床徴候、体重および眼状態（詳細な眼科検査、網膜電図検査および眼圧測定）の変化に関して評価した。蛍光眼底血管造影法を実施し、血液試料を収集した。試験の終了時（４４日目）に、すべての動物を安楽死させ、完全な肉眼的剖検を実施した。選択した組織を収集し、組織学的評価のために保存した。
【０２０５】
サルに、斑のレーザー損傷後およびその後のＣＮＶの発症の間、０．７０ｍｇ／眼までの用量で両眼に単回硝子体内注射によって投与した場合、Ｃａｎｄ５の有害な全身または局所（眼）作用は検出されなかった。
【実施例１１】
【０２０６】
ヒト胚性腎２９３細胞における抗ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡによるＶＥＧＦのインビトロＲＮＡ干渉
【０２０７】
ヒト胚性腎２９３細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから得た）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳから）および細胞培養増殖夾雑物の防止のために使用される抗生物質−抗真菌薬（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｃｅｌｌｇｒｏ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡから得た）で培養した。
【０２０８】
ｓｉＲＮＡはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）によって合成された。ｓｉＲＮＡ標的配列を表２に示す。増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の遺伝子を標的とする付加的なｓｉＲＮＡをこの試験で陰性対照として使用した。
【０２０９】
【表３】
2013512677.tif 000007
【０２１０】
インビトロでのｓｉＲＮＡのトランスフェクションおよび低酸素の誘導。ヒト２９３細胞を２４穴プレートにおいて３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。その翌日、細胞が約５０％〜７０％集密になったときトランスフェクションを実施した。細胞をヒトＶＥＧＦに対するｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡをＣａＰｉ試薬に混合し、２５０ｍＭ  ＣａＣｌ２溶液２０μｌに添加した。ｓｉＲＮＡ／ＣａＣｌ２混合物を、ボルテックスして混合しながら、２Ｘハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳ）２０μｌに滴加した。ｓｉＲＮＡ／ＣａＣｌ２／ＨＢＳ複合体を各ウエル中の培地に直接添加した（３００μＬ／ウエル）。３７℃で４時間のインキュベーション後、培地を取り出し、細胞を１０％ＤＭＳＯ含有無血清培地と共にさらにインキュベートした（３００μＬ／ウエル、室温で１〜２分間）。次にこの培地を取り出し、再び細胞に増殖培地を供給した（５００μＬ／ウエル）。陰性対照は、ｓｉＲＮＡを欠くトランスフェクション試薬および非特異的ｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＰ１  ｓｉＲＮＡ）を含んだ。スクリーニング実験については、ｓｉＲＮＡを２５ｎＭの濃度で使用した。用量反応実験については、ｓｉＲＮＡを１ｎＭ、５ｎＭおよび２５ｎＭの濃度で使用した。トランスフェクションを実施した４時間後、１３０μＭの最終濃度のデスフェリオキサミンで低酸素を誘導した。デスフェリオキサミンは、ヘム−Ｆｅ２＋相互作用を阻害することによって哺乳動物細胞における正常な酸素センシング経路を破壊すると考えられるので、低酸素状態を模倣する。
【０２１１】
ＶＥＧＦタンパク質の定量。トランスフェクションの約４８時間後、上清をすべてのウエルから取り出し、ヒトＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ  &  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を、ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅヒトＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡプロトコールに記載されているように２９３細胞に関して実施した。ＶＥＧＦ特異的抗体を各ウエルに添加し、プレートに結合したＶＥＧＦの量に比例して発色を生じさせた。ＥＬＩＳＡの結果をＡＤ３４０プレートリーダーにて４５０ｎｍで読み取った（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）。
【０２１２】
結果。ヒトＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡは２９３細胞において低酸素が誘導するヒトＶＥＧＦタンパク質の上方調節を抑制する。ヒトＶＥＧＦはデスフェリオキサミンを介した低酸素の誘導によって上方調節された。ＯＤ４５０ｎｍでの読取りは細胞試料中のヒトＶＥＧＦタンパク質レベルを反映した。ｈＶＥＧＦタンパク質レベルの低酸素誘導性上昇は、すべてのヒトＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞において有意に低減した（図８）。非特異的ｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ）でのトランスフェクションまたはｓｉＲＮＡなしでのモックトランスフェクションに関しては、ｈＶＥＧＦレベルへの影響を認めなかった。用量反応試験をＣａｎｄ５、ｈＶＥＧＦ  Ｎｏ．１、ｈＶＥＧＦ  Ｎｏ．２、ｈＶＥＧＦ  Ｎｏ．３、ｈＶＥＧＦ  Ｎｏ．４、ｈＶＥＧＦ  Ｎｏ．６およびｈＶＥＧＦ  Ｎｏ．７に関して実施した（図９）。
【実施例１２】
【０２１３】
ＶＥＧＦアイソフォームのインビトロＲＮＡ干渉
【０２１４】
ＶＥＧＦ１６５ｂは内因性抗血管新生性ＶＥＧＦアイソフォームとして同定されている。ｓｉＲＮＡを、ＶＥＧＦ１６５などの特定のＶＥＧＦアイソフォームを選択的に阻害するが、ＶＥＧＦ１６５ｂは保存するように設計した。
【０２１５】
方法：ＡＲＰＥ１９細胞を２４穴プレートに接種した（５０，０００細胞／ウエル）。接種の１８〜２４時間後、細胞は５０〜７５％集密であり、これらをトランスフェクションのために使用した。１４のヒトＶＥＧＦ−Ａ特異的ｓｉＲＮＡを設計し、試験した。ＲｉｂｏＪｕｉｃｅ（商標）ｓｉＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を製造者のプロトコールにしたがって使用して、細胞をｓｉＲＮＡ（２５ｎＭ）でトランスフェクトした。詳細には、細胞の単一ウエルについて、無血清ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）４０．５μＬをピペットでエッペンドルフ管に分注し、次にＲｉｂｏＪｕｉｃｅ（商標）２μＬをＯＰＴＩ−ＭＥＭに添加した。溶液を静かにボルテックスして混合し、短時間遠心分離して管の底部の内容物を収集し、室温で５分間インキュベートした。ｓｉＲＮＡ（１μＭ保存溶液７．５μＬ）をＲｉｂｏＪｕｉｃｅ（商標）／培地混合物に添加して、静かに混合し、短時間遠心分離して管の底部の内容物を収集した。混合物を室温で１５分間インキュベートした。インキュベーションの間に、培地を細胞から取り出し、新鮮完全ＡＲＰＥ１９増殖培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２；１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）２５０μｌと交換した。１５分間のインキュベーション後、ｓｉＲＮＡ／ＲｉｂｏＪｕｉｃｅ（商標）／培地混合物（５０μＬ）を細胞に滴加した。３００μＬ容積中のｓｉＲＮＡの最終濃度は２５ｎＭであった。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間維持した。さらなる実験では、反応をスケールアップして、３組のウエル中の細胞を各々のｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、トランスフェクション混合物を取り出し、細胞を無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０ｎｇ／ｍＬヒト組換えＴＧＦβＩＩを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２、または１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦβＩＩおよび５μｇ／ｍＬシクロヘキシミドを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２  ５００μＬで処理した。細胞をさらに２４時間、３７℃、５％ＣＯ２に戻した。その後、培地を細胞から取り出し、ＥＬＩＳＡ（ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅヒトＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ））によってタンパク質発現を分析した。培地を細胞から取り出し、エッペンドルフ管に収集して、氷上に置き、直ちにＥＬＩＳＡによってＶＥＧＦタンパク質に関して分析するか、または−８０℃で保存し、後の時点でＶＥＧＦタンパク質に関して分析した。
【０２１６】
これらの結果に基づき、選択数のｓｉＲＮＡ候補物をさらなるトランスフェクションスクリーニングに供した。細胞を収集し、ＲＮＡを抽出して、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１６５ｂ、ＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１８９へのｓｉＲＮＡの阻害作用を測定するために半定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子発現を対照として使用した。詳細には、ウエルから培地を取り出した後、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）からの溶解／結合溶液２００μＬを各々のウエルに添加した。分光測光法（ＯＤ  ２６０ｎＭ）によってＲＮＡを定量した。溶解した細胞を収集し、製造者のプロトコールにしたがってＲＮＡを抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者のプロトコールにしたがって使用してＲＮＡを逆転写した。ｃＤＮＡを、ＰＣＲを用いてＧＡＰＤＨ、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１６５ｂ、ＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１８９に関して分析した。ＰＣＲのために使用したプライマーを表３に示す。
【０２１７】
【表４】
2013512677.tif 000008
【０２１８】
ＰＣＲ分析のために、ｃＤＮＡ  ３μＬを各々の適切な正プライマー（１０μＭ）および逆プライマー（１０μＭ）１μＬならびにＰｌａｔｉｎｕｍ  ＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）４５μＬと組み合わせて、各プライマーの最終濃度が２００ｎＭになるようにした。ｃＤＮＡを以下のＰＣＲ条件でサーモサイクラーにおいて増幅した：
【０２１９】
工程１：９４℃、２分間
【０２２０】
工程２：９４℃、１５秒間
【０２２１】
工程３：５５℃、３０秒間
【０２２２】
工程４：７２℃、３０秒間
【０２２３】
工程５：工程２〜４をＧＡＰＤＨ、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１８９については３０回またはＶＥＧＦ１６５ｂについては３５回反復する
【０２２４】
工程６：７２℃、１０分間
【０２２５】
工程７：４℃
【０２２６】
次に、ＰＣＲ産物を、１Ｘ  ＴＡＥ緩衝液中で調製した２％アガロースゲル上で視覚化した。
【０２２７】
結果：ＴＧＦβＩＩでのＡＲＰＥ１９細胞の処理はＡＲＰＥ１９細胞におけるＶＥＧＦ産生を誘導し、ＥＬＩＳＡの結果は、いくつかのｓｉＲＮＡ候補物がＡＲＰＥ１９細胞におけるＴＧＦβＩＩ誘導のＶＥＧＦ産生を阻害することを明らかにした。ＲＴ−ＰＣＲは、２つの候補物が、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１８９の産生を阻害するが、ＶＥＧＦ１６５ｂは保存することを確認した。図１２（ｐｇ／ｍＬ  ｈＶＥＧＦ）および１３（ｈＶＥＧＦノックダウン％）に示すように、ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ候補物（表２）を、ＥＬＩＳＡによって試験される、ＡＲＰＥ１９細胞によるＶＥＧＦタンパク質産生を阻害する能力に関してスクリーニングした。細胞を１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦβＩＩで処理して、ＶＥＧＦ産生を上方調節した。ＥＬＩＳＡは総ＶＥＧＦタンパク質を測定し、いかなる特定のスプライス変異体に対しても選択的ではなかった。いくつかの候補物（ＯＰＫ−ＨＶＢ−００４、ＯＰＫ−ＨＶＢ−０１０およびＯＰＫ−ＨＶＢ−０１１）は阻害作用を示し、さらなる試験を裏付けた。図１４（ｐｇ／ｍＬ  ｈＶＥＧＦ）および１５（ｈＶＥＧＦノックダウン％）に示すように、図１２および１３と同じ方法を用いたＶＥＧＦ産生の二次スクリーニングは、ＯＰＫ−ＨＶＢ−００４およびＯＰＫ−ＨＶＢ−０１０がＶＥＧＦタンパク質産生を阻害することを明らかにし、さらなる検討を裏付けた。
【０２２８】
図１６、２４および２７は、様々な濃度でのいくつかの候補物（ＯＰＫ−ＨＶＢ−００４、ＯＰＫ−ＨＶＢ−０１０およびＯＰＫ−ＨＶＢ−０１２）によるヒトＶＥＧＦノックダウンの用量反応効果を示す。
【０２２９】
図１７は、いくつかの候補物（ＯＰＫ−ＨＶＢ−００４、ＯＰＫ−ＨＶＢ−０１０およびＯＰＫ−ＨＶＢ−０１２）の１週間（７日間）にわたるヒトＶＥＧＦの下方調節を示す。
【０２３０】
対照として、ＧＡＰＤＨ  ＲＴ−ＰＣＲを、図１８に示すように様々に処理した細胞に関して実施した。存在するＲＮＡの実際の量は定量しなかったが、手順は、参考対照レーン３と比較した場合半定量的である。詳細には、バンドがより弱く表れる場合にＲＮＡ産生の下方調節が明らかにされる。この実験において、レーン２〜１１の試料は、１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦβＩＩで処理してＶＥＧＦの産生を上方調節した。ＦＡＭ−ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡはＧＡＰＤＨメッセージを下方調節した（レーン４）が、その他の処理はＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡに影響を及ぼさず、したがって処理した細胞における総ＲＮＡ産生の変動性が存在しないことを確認した。
【０２３１】
ＶＥＧＦ１６５アイソフォームのＲＴ−ＰＣＲも、図１９に示すように処理細胞に関して実施した。レーン２〜１１の試料は、１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦβＩＩで処理してＶＥＧＦの産生を上方調節した。すべてのＶＥＧＦアイソフォームを下方調節することが公知の２５ｎＭベバシラニブ（レーン６）、２５ｎＭ  ＯＰＫ−ＨＶＢ−００４（レーン７）および２５ｎＭ  ＯＰＫ−ＨＶＢ−０１０（レーン８）は、バンドがレーン３の対照よりも明るいことによって明らかにされるように、ＴＧＦβＩＩでの誘導後に（レーン２）ＶＥＧＦ１６５  ｍＲＮＡの産生を下方調節した。
【０２３２】
ＶＥＧＦ１８９アイソフォームのＲＴ−ＰＣＲも、図２０に示すように実施した。レーン２〜１１の試料は、１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦβＩＩで処理してＶＥＧＦの産生を上方調節した。
【０２３３】
２５ｎＭベバシラニブ（レーン６）、２５ｎＭ  ＯＰＫ−ＨＶＢ−００４（レーン７）および２５ｎＭ  ＯＰＫ−ＨＶＢ−０１０（レーン８）は、バンドがレーン３の対照よりも明るいことによって明らかにされるように、ＴＧＦβＩＩでの誘導後に（レーン２）ＶＥＧＦ１８９  ｍＲＮＡの産生を下方調節した。
【０２３４】
次に、ＶＥＧＦ１２１アイソフォームのＲＴ−ＰＣＲを、図２１に示すように実施した。レーン２〜１１の試料は、１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦβＩＩで処理してＶＥＧＦの産生を上方調節した。
【０２３５】
ＶＥＧＦ１２１  ｍＲＮＡは、バンドがレーン３の対照よりも明るいことによって明らかにされるようにレーン６（２５ｎＭベバシラニブ）では下方調節された。
【０２３６】
最後に、ＶＥＧＦ１６５ｂアイソフォームのＲＴ−ＰＣＲを図２２に示すように実施した。
【０２３７】
レーン２〜１１の試料は、１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦβＩＩで処理してＶＥＧＦの産生を上方調節した。最初の問題として、>６００ｂｐの二重のバンドは人為的であると判定した。しかし、ＶＥＧＦ１６５ｂ  ｍＲＮＡは、バンドがレーン３の対照よりも弱いことによって示されるようにベバシラニブ（レーン６）によって下方調節される。これに対し、ＯＰＫ−ＨＶＢ−００４（レーン７）およびＯＰＫ−ＨＶＢ−０１０（レーン８）についてのバンドはレーン３の対照よりも弱くなかった。したがって、これらのｓｉＲＮＡ構築物はＶＥＧＦ１６５ｂ発現を保存したが、同時に様々な他のＶＥＧＦアイソフォームを阻害することも可能であった。したがって、ＶＥＧＦＡ１６５ｂを保存するｓｉＲＮＡを合成することができ、ｓｉＲＮＡは、すべてのＶＥＧＦ−ＡアイソフォームをノックダウンするｓｉＲＮＡよりも有効であり得る。ＶＥＧＦ１６５ｂを保存するｓｉＲＮＡは、眼血管新生の治療のための強力な治療候補物であり得る。
【実施例１３】
【０２３８】
ｓｉＲＮＡでの治療後のサイトカインプロフィール
【０２３９】
ｄｓＲＮＡ類似体であるポリイノシン・ポリシチジン酸ナトリウム塩［ポリ（Ｉ：Ｃ）］での処理後のＡＲＰＥ１９細胞のサイトカイン分泌プロフィールを測定した。ｓｉＲＮＡがポリ（Ｉ：Ｃ）のように挙動し、細胞に同じサイトカインの産生を生じさせるかどうかを判定するためのさらなる試験を実施した。
【０２４０】
方法。ＡＲＰＥ１９細胞を２４穴プレートに接種した（５０，０００細胞／ウエル）。２４時間後、培地を取り出し、細胞を、無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で調製した、ポリ（Ｉ：Ｃ）；０〜１０００ｍｇ／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはポリデオキシイノシン・デオキシシチジル酸ナトリウム塩［ポリ（ｄＩ：ｄＣ）；５０ｍＵ／ｍＬ〜８００ｍＵ／ｍＬ］（Ｓｉｇｍａ）で処理した。処理の４８時間後、培地を細胞から収集し、ＥＬＩＳＡ（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＣＡＭ、ＩＬ−１２およびＭＣＰ−１用のＱＵＡＮＴＩＫＩＮＥ（登録商標）免疫測定法、Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）；ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β用のＶｅｒｉＫｉｎｅ（商標）ＥＬＩＳＡキット、ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって、製造者のプロトコールにしたがってＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＣＡＭ、ＩＬ−１２およびＭＣＰ−１に関して分析した。
【０２４１】
ＡＲＰＥ１９細胞をベバシラニブ、ＯＰＫ−ＨＶＢ−００４、ＯＰＫ−ＨＶＢ−００９、ＯＰＫ−ＨＶＢ−０１０およびＯＰＫ−ＨＶＢ−０１２（Ｄｈａｍａｃｏｎ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）でトランスフェクトした。細胞を２４穴プレートに接種した（４０，０００細胞／ウエル）。２４時間後、ＲｉｂｏＪｕｉｃｅ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ／ＥＭＤ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を製造者のプロトコールにしたがって使用して、細胞を２５ｎＭ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を１０ｎｇ／ｍＬヒト組換えＴＧＦβＩＩ（Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で処理した。トランスフェクションの４８時間後（すなわちＴＧＦβＩＩ処理の２４時間後）、上述したように培地を収集し、サイトカインレベルを分析した。加えて、培地をＥＬＩＳＡ（Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によってｈＶＥＧＦに関して分析した。結果を図２３に示す。
【０２４２】
結論。上記に基づき、（ｉｉ）ＡＲＰＥ１９細胞は、ｄｓＲＮＡ類似体であるポリ（Ｉ：Ｃ）に応答していくつかの炎症性サイトカインを産生するが、３つの鍵となるメディエイタ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βまたはＩＦＮ−γは産生しない；（ｉｉ）ＡＲＰＥ１９細胞は、ｓｉＲＮＡなどのｄｓＲＮＡの炎症潜在能および特異的作用を検討するために使用できる；ならびに（ｉｉｉ）ＯＰＫ−ＨＶＢ−００９およびＯＰＫ−ＨＶＢ−０１０は、ＡＲＰＥ１９細胞に試験したサイトカインのいずれの分泌も生じさせず、それらが低い炎症潜在能を有し得ることを示唆した、と提案される。
【実施例１４】
【０２４３】
用量反応曲線はｓｉＲＮＡの特異性を示す
【０２４４】
図２６および２７に示すように、２１量体の様々なｓｉＲＮＡを使用して用量反応曲線を作成した。特定のｓｉＲＮＡに関して用量反応が認められ、使用したｓｉＲＮＡに対する特異的応答を指示した。図２５および２６に示すようにＯＰＫ−ＨＶＢ−００９についても用量反応曲線を作成した。実施例１２および１３で述べたように細胞を処理し、トランスフェクトした。細胞を２４穴プレートに接種した（４０，０００細胞／ウエル）。加えて、種々の濃度を使用し、それゆえ、５０μｌのトランスフェクション混合物を調製する際にＯＰＴＩ−ＭＥＭ、ＲｉｂｏＪｕｉｃｅ（商標）およびｓｉＲＮＡの容量をそれに応じて調整した。
【実施例１５】
【０２４５】
ｓｉＲＮＡの安定性
【０２４６】
ＡＲＰＥ１９細胞を、図２８、２９、３０、３１および３２に示す様々な条件下で保存しておいたｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。細胞を実施例１２および１３で述べたようにトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡ分子は、図２８、２９、３０、３１および３２に示すような様々な条件下で安定であることが認められた。例えば、ｓｉＲＮＡ  ７．５μＭを３つの管に分取し、各々の管を異なる温度（３７℃、室温、４℃）で８週間まで保存した。各々の管のアリコートをあらかじめ定められた時点（２４時間目、４８時間目およびその後週に１回）で収集した。収集後、アリコートを−８０℃で保存した。その後、各アリコートを、ｓｉＲＮＡが種々の環境条件下で安定性を維持するかどうかを調べるためにＡＲＰＥ１９細胞における効果に関して試験した。４０，０００細胞／ウエルを接種する実施例１２で述べた方法を用いて、ｓｉＲＮＡをＡＲＰＥ１９細胞にトランスフェクトした。
【実施例１６】
【０２４７】
ＶＥＧＦの異種間下方調節
【０２４８】
Ｃ６細胞を２４穴プレートに接種した（Ｐ１２、４０，０００細胞／ウエル）。接種の１８〜２４時間後、細胞は５０〜７０％集密であり、これらをトランスフェクションのために使用した。ＲｉｂｏＪｕｉｃｅ（商標）ｓｉＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を製造者のプロトコールにしたがって使用して、細胞をＯＰＫ−ＨＶＢ−００４、ＯＰＫ−ＨＶＢ−００９、ＯＰＫ−ＨＶＢ−０１０およびＯＰＫ−ＨＶＢ−０１２でトランスフェクトした。簡単に述べると、単一ウエルについて、無血清ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（４０．５μＬ〜４７μＬ）をピペットでエッペンドルフ管に分注し、次にＲｉｂｏＪｕｉｃｅ（商標）２μＬをＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）に添加した。溶液を静かにボルテックスして混合し、短時間遠心分離して管の底部の内容物を収集し、室温で５分間インキュベートした。ｓｉＲＮＡ（１００ｎＭまたは１μＭ保存溶液０．３μＬ〜７．５μＬ）をＲｉｂｏＪｕｉｃｅ（商標）／培地混合物に添加して、静かに混合し、短時間遠心分離して管の底部の内容物を収集した。混合物を室温で１５分間インキュベートした。インキュベーションの間に、培地を細胞から取り出し、新鮮Ｃ６増殖培地（Ｆ−１２  Ｋａｉｇｈｎ培地、２．５％ウシ胎仔血清、１５％ウマ血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）２５０μＬと交換した。１５分間のインキュベーション後、ｓｉＲＮＡ／ＲｉｂｏＪｕｉｃｅ（商標）／培地混合物（５０μＬ）を細胞に滴加した。複合体がウエル全体に均一に分散することを確実にするためプレートを静かに揺り動かした。３００μＬ容積中のｓｉＲＮＡの最終濃度は、２５０ｐＭ、５００ｐＭ、１ｎＭ、５ｎＭまたは２５ｎＭであった。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間維持した。各々のｓｉＲＮＡが各々の濃度で３組試験されるようにすべての容積をスケールアップした。トランスフェクションの２４時間後、トランスフェクション混合物を取り出し、細胞を新鮮Ｃ６増殖培地または１０ｎｇ／ｍＬヒト組換えＴＧＦβＩＩを添加した新鮮Ｃ６増殖培地５００μＬで処理した。細胞をさらに２４時間、３７℃、５％ＣＯ２に戻した。その後、培地を細胞から取り出し、ＥＬＩＳＡ（ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅラットＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡキット、Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によってタンパク質発現を分析した。
【０２４９】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞を２４穴プレートに接種した（Ｐ２〜Ｐ６、４０，０００細胞／ウエル）。接種の１８〜２４時間後、細胞は５０〜７０％集密であり、これらをトランスフェクションのために使用した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）Ｒｅａｇｅｎｔ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者のプロトコールにしたがって使用して、細胞をｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。簡単に述べると、単一ウエルについて、ｓｉＲＮＡ（１μＭまたは７．５μＭ）をエッペンドルフ管中のＯＰＴＩ−ＭＥＭ  ５０μＬに希釈して、静かに混合し、ボルテックスした。２番目のエッペンドルフ管中でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  １μＬをＯＰＴＩ−ＭＥＭ  ４９μＬと混合した。混合物を静かに混合し、ボルテックスして、室温で５分間インキュベートした。５分後、希釈したｓｉＲＮＡ（容積５０μＬ）を希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（５０μＬ）に添加した。内容物を静かに混合し、室温で２０分間インキュベートした。２０分間のインキュベーションの間に、培地を細胞から取り出し、新鮮ＮＩＨ３Ｔ３増殖培地（ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清）５００μＬと交換した。２０分後、ｓｉＲＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００複合体（１００μＬ）を細胞に滴加した。複合体がウエル全体に均一に分散することを確実にするためプレートを静かに揺り動かした。次に細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。５００μＬ容積中のｓｉＲＮＡの最終濃度は、１ｎＭ、５ｎＭまたは２５ｎＭであった。トランスフェクションの２４時間後、トランスフェクション混合物を取り出し、細胞を新鮮ＤＭＥＭまたは１０ｎｇ／ｍＬヒト組換えＴＧＦβＩＩを添加した新鮮ＤＭＥＭ５００μＬで処理した。細胞をさらに２４時間、３７℃、５％ＣＯ２に戻した。その後、培地を細胞から取り出し、ＥＬＩＳＡ（ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅマウスＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡキット、Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によってタンパク質発現を分析した。
【０２５０】
実験の結果を図３４、３５および３９に示す。ＯＰＫ−ＨＶＢ−００４およびＯＰＫ−ＨＶＢ−００９は、図３４に示すようにＣ６細胞によるＶＥＧＦ分泌を阻害することができた。同様の実験をマウス細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）において実施し、ＯＰＫ−ＨＶＢ−００４、ＯＰＫ−ＨＶＢ−００９およびＯＰＫ−ＨＶＢ−０１０は、図３５および３９に示すようにマウスＶＥＧＦの分泌を阻害することができた。
【実施例１７】
【０２５１】
種々のｓｉＲＮＡの比較
【０２５２】
突出部を含む２１量体のｓｉＲＮＡを１９量体の平滑末端対応物と比較した。ＡＲＰＥ１９細胞を実施例１２、１３および１４で述べたように種々のｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、ＶＥＧＦ産生を測定した。平滑末端対応物は、図３６に示すように２１量体と等しく有効にＡＲＰＥ１９細胞においてＶＥＧＦ産生をノックダウンすることが認められた。例えば、配列番号：１１９および配列番号：１２０を含むベバシラニブの平滑末端型は、図３６に示すようにＶＥＧＦ産生をノックダウンするうえで等しく有効であった。
【実施例１８】
【０２５３】
１７ｂｐおよび突出部を含む１９量体のスクリーニングはＶＥＧＦ産生を阻害することができる
【０２５４】
１７量体およびｄＴｄＴ突出部を含むｓｉＲＮＡを、実施例１２、１３および１４で述べたようにＡＲＰＥ１９細胞にトランスフェクトした。いくつかのｓｉＲＮＡは、図３７に示すようにＶＥＧＦ産生を阻害することが認められた。
【実施例１９】
【０２５５】
ｓｉＲＮＡの用量反応
【０２５６】
平滑末端を含む１９量体または突出部を含む１９量体（１７ｂｐ＋ｄＴｄＴ突出部）を、図３８に示すように様々な用量でＡＲＰＥ１９細胞にトランスフェクトした。実施例１２、１３および１６で述べたようにＶＥＧＦ分泌を測定することによって用量反応曲線を作成した。認められた用量反応は、ｓｉＲＮＡに対する反応がｓｉＲＮＡに特異的であり、非特異的ｓｉＲＮＡ反応によって生じたのではないことを指示する。結果は図３８からわかる。ＮＩＨ３Ｔ３細胞において試験した平滑末端ｓｉＲＮＡは特異的用量反応を示した（図３９参照）。
【実施例２０】
【０２５７】
ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ発現へのｓｉＲＮＡの作用
【０２５８】
ＡＲＰＥ１９細胞をｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡの最終濃度＝２５ｎＭ）でトランスフェクトした。細胞を１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦβＩＩで処理してｈＶＥＧＦの産生を上方調節した。ＲＮＡを細胞から単離し、逆転写ＰＣＲを実施して、ＧＡＰＤＨ（図４０Ａ；４７２ｂｐフラグメント）、ＶＥＧＦ１６５（図４０Ｂ；２８４ｂｐフラグメント）およびＶＥＧＦ１６５ｂ（図４０Ｃ；１９９ｂｐフラグメント）を増幅した。Ｃｙ３−ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡ（図４０Ａ、レーン４）はＧＡＰＤＨメッセージを抑制したが、その他の処理は影響を及ぼさなかった。ＯＰＫ−ＨＶＢ−００４、ＯＰＫ−ＨＶＢ−００９およびＯＰＫ−ＨＶＢ−０１０（図４０Ｂ、レーン６、７および８）ならびにＯＰＫ−ＨＶＢ−００４ｂｅ、ＯＰＫ−ＨＶＢ−００９ｂｅおよびＯＰＫ−ＨＶＢ−０１０ｂｅ（図４０Ｂ、レーン１０、１１および１２）はＶＥＧＦ１６５メッセージを抑制した。ベバシラニブ（図４０Ｃ、レーン４）はＶＥＧＦ１６５ｂを抑制したが、ＯＰＫ−ＨＶＢ−００４、ＯＰＫ−ＨＶＢ−００９、ＯＰＫ−ＨＶＢ−００４ｂｅおよびＯＰＫ−ＨＶＢ−００９ｂｅ（図１３Ｃ、レーン５、６、８および９）はＶＥＧＦ１６５ｂのレベルを保持した（図４０参照）。
【実施例２１】
【０２５９】
ラットＣ６細胞におけるｓｉＲＮＡの効果
【０２６０】
ラットＣ６細胞をｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡの最終濃度＝２５ｎＭ）でトランスフェクトした。細胞を１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦβＩＩで処理してラットＶＥＧＦの産生を上方調節した。分泌された総ＶＥＧＦのレベルを培地中でＥＬＩＳＡによって測定した。ノックダウンパーセントは、ＲｉｂｏＪｕｉｃｅ（商標）で処理した細胞と比較した、細胞によって産生されるＶＥＧＦのレベルを反映する。ＯＰＫ−ＨＶＢ−００４およびＯＰＫ−ＨＶＢ−００４ｂｅは、ラットＶＥＧＦのレベルを低下させるうえで最も有効であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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