(57)【要約】  本発明は、（ｉ）コア核酸、及び（ｉｉ）それぞれが２以上のリボキャプシド（ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ）サブユニットのポリマーを含む１又は複数のリボキャプシドを備え、リボキャプシドサブユニットが核酸を含む、単離されたヌクリオン（ｎｕｃｌｉｏｎ）に関する。本発明はまた、単離されたヌクリオンの製造方法にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）コア核酸、及び（ｉｉ）それぞれが２以上のリボキャプシド（ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ）サブユニットのポリマーを含む１又は複数のリボキャプシドを備え、
前記リボキャプシドサブユニットが核酸を含む、単離されたヌクリオン（ｎｕｃｌｉｏｎ）。
【請求項２】
（ａ）ほとんどのリボキャプシドサブユニットがコア核酸の少なくとも一部と結合しており、かつ（ｂ）ほとんどのリボキャプシドサブユニットが１又は複数の隣接するリボキャプシドサブユニットの少なくとも一部に結合している、請求項１に記載の単離されたヌクリオン。
【請求項３】
１又は複数のヌクリオンエンベロープを更に備える、請求項１に記載の単離されたヌクリオン。
【請求項４】
少なくとも１つのヌクリオンエンベロープが、（ａ）ヌクリオン中の基本ヌクリオン部分、（ｂ）コア核酸、（ｃ）１又は複数のリボキャプシド、（ｄ）１又は複数のリボキャプシドサブユニット、（ｅ）ヌクリオン中の他のヌクリオンエンベロープ、又は（ｆ）これらの任意の組み合わせ、の少なくとも一部と結合している、請求項３に記載の単離されたヌクリオン。
【請求項５】
１又は複数のリボキャプシドサブユニットがＲＮＡを含む、請求項１に記載の単離されたヌクリオン。
【請求項６】
１又は複数のリボキャプシドサブユニットがトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を含む、請求項１に記載の単離されたヌクリオン。
【請求項７】
１又は複数のリボキャプシドサブユニットが開始ｔＲＮＡを含み、かつ１又は複数のリボキャプシドサブユニットが伸長ｔＲＮＡを含む、請求項１に記載の単離されたヌクリオン。
【請求項８】
ヌクリオンが、平常のヌクリオンの模倣物又は偽造物であり、
ヌクリオンは、細胞性生物、感染性物質、ウイルス、レトロウイルス、レトロウイルスのｔＲＮＡプライマー複合体、ヒト免疫不全ウイルスのｔＲＮＡプライマー複合体、模倣ヌクリオンの任意の他の天然源、又は模倣ヌクリオンの任意の他の非天然源が会合したヌクリオン様の組成物である、請求項１に記載の単離されたヌクリオン。
【請求項９】
コア核酸が、ＤＮＡを含む、請求項１に記載の単離されたヌクリオン。
【請求項１０】
コア核酸が、ＲＮＡを含む、請求項１に記載の単離されたヌクリオン。
【請求項１１】
コア核酸が、ｍＲＮＡを含む、請求項１に記載の単離されたヌクリオン。
【請求項１２】
コア核酸が、ｍＲＮＡを含み、
１又は複数のリボキャプシドサブユニットが、ｍＲＮＡの開始コドン又は開始コドン付近に結合している、請求項１に記載の単離されたヌクリオン。
【請求項１３】
コア核酸が、ｍＲＮＡを含み、
１又は複数のリボキャプシドサブユニットが、ｍＲＮＡのタンパク質合成マーカー配列に結合している、請求項１に記載の単離されたヌクリオン。
【請求項１４】
コア核酸が、ｍＲＮＡを含み、
１又は複数のリボキャプシドサブユニットが、ｍＲＮＡのシャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列又はコザック（コザック配列）配列に結合している、請求項１に記載の単離されたヌクリオン。
【請求項１５】
コア核酸が、ｍＲＮＡを含み、
ヌクリオン中の１又は複数のヌクリオン成分がリボソームの少なくとも１部に結合している、請求項１に記載の単離されたヌクリオン。
【請求項１６】
コア核酸が、ｍＲＮＡを含み、
ｍＲＮＡがリボソームの少なくとも１部に結合している、請求項１に記載の単離されたヌクリオン。
【請求項１７】
単離されたヌクリオンが、開始ヌクリオンであり、
（ｉ）コア核酸が、ｍＲＮＡを含み、かつ
（ｉｉ）ｍＲＮＡの少なくとも１部は、ｍＲＮＡの開始コドンに作動可能に連結されたリボキャプシド結合配列及び／又はリボキャプシドサブユニット結合配列を含む、請求項１に記載の単離されたヌクリオン。
【請求項１８】
２又は３以上のヌクリオン成分を互いに会合させるステップを備える、請求項１に記載の単離されたヌクリオンの製造方法。
【請求項１９】
ヌクリオンが、ヌクリオン成分の組み合わせを会合させるステップにより製造され、
当該組み合わせが、（ｉ）コア核酸と、２又は３以上のリボキャプシドサブユニット、（ｉｉ）コア核酸と、２又は３以上のリボキャプシドサブユニットと、１又は複数の所定のヌクリオンエンベロープ、（ｉｉｉ）基本ヌクリオンと、１又は複数の所定のヌクリオンエンベロープ、（ｉｖ）コア核酸と、２又は３以上のｔＲＮＡリボキャプシドサブユニット、（ｖ）コア核酸と、２又は３以上のｔＲＮＡリボキャプシドサブユニットと、１又は複数の所定のヌクリオンエンベロープ、（ｖｉ）基本ｔＲＮＡヌクリオンと、１又は複数の所定のヌクリオンエンベロープ、（ｖｉｉ）エンベロープされたヌクリオンと、１又は複数の所定のヌクリオンエンベロープ、（ｖｉｉｉ）これらの２又は３以上の任意の組み合わせ、及び（ｉｘ）これらの２又は３以上の任意の混成からなる群から選択される、請求項１８に記載の製造方法。
【請求項２０】
製造方法が、（１）コア核酸調製物と、１又は複数のリボキャプシドサブユニット調製物とを組み合わせる、（２）リボキャプシドサブユニット調製物に、１又は複数のコア核酸調製物を添加する、（３）コア核酸調製物に、１又は複数のリボキャプシドサブユニット調製物を添加する、（４）固相に直接又は非直接に固定化されたコア核酸調製物と、固定化されていない１又は複数のリボキャプシドサブユニット調製物を組み合わせる、（５）固相に直接又は非直接に固定化された１又は複数のリボキャプシドサブユニット調製物と、固定化されていないコア核酸調製物を組み合わせる、（６）固相に直接又は非直接に固定化されたコア核酸調製物と、固相に直接又は非直接に固定化された１又は複数のリボキャプシドサブユニット調製物を組み合わせる、（７）コア核酸調製物と、１又は複数のリボキャプシドサブユニット調製物をバッチ処理を利用して組み合わせる、（８）コア核酸調製物と、１又は複数のリボキャプシドサブユニット調製物を連続工程を利用して組み合わせる、（９）コア核酸調製物と、１又は複数のリボキャプシドサブユニット調製物を組み合わせ、次いで混合する、（１０）コア核酸調製物と、１又は複数のリボキャプシドサブユニット調製物を組み合わせ、次いでヌクリオン中にないコア核酸から得られたヌクリオンを分離する、（１１）コア核酸調製物と、１又は複数のリボキャプシドサブユニット調製物を組み合わせ、次いでヌクリオン中にないリボキャプシドサブユニットから得られたヌクリオンを分離する、（１２）コア核酸調製物と、１又は複数のリボキャプシドサブユニット調製物を組み合わせ、次いでヌクリオン中にないコア核酸及びリボキャプシドサブユニットの双方から得られたヌクリオンを分離する、（１３）基本ヌクリオン調製物と、１又は複数のヌクリオンエンベロープ調製物を組み合わせる、（１４）１又は複数の基本ヌクリオン調製物をヌクリオンエンベロープ調製物へ添加する、（１５）１又は複数の基本ヌクリオンエンベロープ調製物をヌクリオン調製物へ添加する、（１６）固相に直接又は非直接に固定化された基本ヌクリオンを含む調製物と、固定化されていないヌクリオンエンベロープを含む１又は複数の調製物を組み合わせる、（１７）固相に直接又は非直接に固定化されたヌクリオンエンベロープを含む調製物と、固定化されていない基本ヌクリオンを含む１又は複数の調製物を組み合わせる、（１８）固相に直接又は非直接に固定化された基本ヌクリオンを含む調製物と、固相に直接又は非直接に固定化されたヌクリオンエンベロープを含む調製物を組み合わせる、（１９）１又は複数の基本ヌクリオン調製物と、１又は複数のヌクリオンエンベロープ調製物をバッチ処理を利用して組み合わせる、（２０）１又は複数の基本ヌクリオン調製物と、１又は複数のヌクリオンエンベロープ調製物を連続工程を利用して組み合わせる、（２１）１又は複数の基本ヌクリオン調製物と、１又は複数のヌクリオンエンベロープ調製物を組み合わせ、次いで混合する、（２２）１又は複数の基本ヌクリオン調製物と、１又は複数のヌクリオンエンベロープ調製物を組み合わせ、次いでエンベロープされたヌクリオン中にないヌクリオンから得られたエンベロープされたヌクリオンを分離する、（２３）１又は複数の基本ヌクリオン調製物と、１又は複数のヌクリオンエンベロープ調製物を組み合わせ、次いでエンベロープされたヌクリオン中にないヌクリオンエンベロープから得られたエンベロープされたヌクリオンを分離する、（２４）１又は複数の基本ヌクリオン調製物と、１又は複数のヌクリオンエンベロープ調製物を組み合わせ、次いでエンベロープされたヌクリオン中にない基本ヌクリオン及びヌクリオンエンベロープの双方から得られたエンベロープされたヌクリオンを分離する、（２５）１又は複数のコア核酸調製物と、１又は複数のリボキャプシドユニット調製物、及び１又は複数のヌクリオンエンベロープ調製物とを組み合わせる、（２６）１又は複数のコア核酸調製物と、１又は複数のリボキャプシドユニット調製物、及び１又は複数のヌクリオンエンベロープ調製物とを組み合わせ、次いで混合する、（２７）１又は複数のコア核酸調製物と、１又は複数のリボキャプシドユニット調製物、及び１又は複数のヌクリオンエンベロープ調製物とを組み合わせ、次いで得られた組み合わせから得られたエンベロープされたヌクリオンを分離する、（２８）１又は複数のコア核酸調製物と、１又は複数のリボキャプシドユニット調製物、及び１又は複数のヌクリオンエンベロープ調製物とをバッチ処理において組み合わせる、（２９）１又は複数のコア核酸調製物と、１又は複数のリボキャプシドユニット調製物、及び１又は複数のヌクリオンエンベロープ調製物とを連続工程において組み合わせる、（３０）これらの２又は３以上の任意の組み合わせ、及び（３１）これらの２又は３以上の任意の混成からなる群から選択される、請求項１８に記載の製造方法。
【請求項２１】
製造方法が、（１）リボキャプシドサブユニットのコア核酸に対するモル比として、約１、２、５，１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００又は１０００を超えるモル比を採用する、（２）１リットルあたり約１、２、５，１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００又は１０００ミリモルを超える濃度の塩化マグネシウム、マグネシウムイオン、又はマグネシウム塩を含む溶液を含ませる、（３）全ての溶液及び調製物からポリアミンを除去する、（４）全ての溶液及び調製物が核酸分解酵素を含まないことを保証する、（５）反応物又は生産物と接触する全ての溶液、装置、補助具、使い捨て器具、備品及びその他の物品が実質的にＲＮＡ分解酵素を含まないことを保証する、（６）ヌクリオン集合体又は生産物の統合性に影響しない１又は複数のＲＮＡ分解酵素阻害剤を採用する、（７）０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、１２０、１８０、２４０又は３００秒を超える十分な時間をかけて会合させる、（８）非変性会合環境を採用する、（９）摂氏約０、４、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５又は６０度以下の温度で会合活動を実施する、（１０）１又は複数のヌクリオン成分を化学的に架橋する、（１１）これらの２つ以上の任意の組み合わせ、及び（１２）これらの２つ以上の任意の混成からなる群から選択される１又は複数のステップを更に含む、請求項１８に記載の製造方法。
【請求項２２】
サイズによる分離、形状による分離、質量による分離、化学的親和性による分離、免疫学的な特性による分離、ヌクリオン成分へのビオチン部分の結合を利用した分離、ヌクリオン成分への核酸プローブの結合を利用した分離、電気的特性を利用した分離、浸透圧の特性を利用した分離、磁気の特性を利用した分離、溶解性を利用した分離、非変性ゲルによる電気泳動に基づく分離、非変性ゲルでの電気泳動分離に続くバンドの分画、濾過、透析、ゲル排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びこれらの２又は３以上の任意の組み合わせからなる群から選択される１又は複数のステップによりヌクリオンを単離するステップを更に含む、請求項１８に記載の製造方法。
【請求項２３】
化学的修飾、物理的修飾、架橋、ヌクリオン成分の架橋、１又は複数のヌクリオン成分の架橋、核酸の分離鎖上の２又は３以上の塩基間の共有結合の導入、二官能性のナイトロジェンマスタードへの暴露、シスシスジアミノジクロロプラチニウムへの暴露、ホルムアルデヒドへの暴露、ソラレン（ｐｓｏｌａｒｅｎ）への暴露、４，５’，８−トリメチルソラレンへの暴露、８−メトキシソラレンへの暴露、４−アミノメチル−４，５’，８−トリメチルソラレンへの暴露、凍結乾燥、凍結、乾燥、冷却、スカベンジャーの添加、抗酸化剤の添加、金属イオン封鎖剤の添加、乳化剤の添加、賦形剤の添加、界面活性剤の添加、紫外線安定剤の添加、ＲＮＡ分解酵素阻害剤の添加、これらの２又は３以上の任意の組み合わせからなる群から選択される１又は複数のステップにより、製造中又は製造後のヌクリオンを安定化するステップを更に含む、請求項１８に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１０年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／４１１，９７４号の関連出願であり、米国特許法第１１９条（ｅ）の下でこの仮出願に基づく優先権を主張する。本願で開示されていないこの仮特許出願の対象に関しては、本出願の出願時にここに明示的に破棄されている。
【０００２】
［連邦支援の研究］：なし
【０００３】
［配列表］
コンピュータ読み取り可能なテキストファイルとして、２０１１年１０月３１日前後に１．１３キロバイト程度のファイルサイズの題’ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ’を作成した。このファイルには本願のための配列リストが含まれており、このファイルは本願全体この参照により開示に含まれる。
【０００４】
［著作権表示］
この特許文書の開示の一部は、著作権保護の対象となる物質が含まれています。著作権者は、特許文献又は特許開示の如何なるものによる複製が米国特許商標局内で公的に入手可能なファイル又は記録を生じる場合、これに異議を申し立てないが、その他の場合の全ての著作権は如何なる場合にも保護される。
【０００５】
［カラー図面］
この特許のファイルには、少なくとも１つのカラー図面を含んでいる。カラー図面と特許の複写が必要な手数料の支払い時に米国特許商標局内により提供されます。
【０００６】
［発明の背景］
本発明は、特定の天然リボ核酸が、ヌクリオン（ｎｕｃｌｉｏｎ）と名付ける生物学的な構造を形成する他の核酸の周囲に、リボキャプシド（ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ）と名付けたポリマーシェルを形成するという発見に関連する。トランスファーＲＮＡ（’ｔＲＮＡ’）分子は、互いに結合したり、リボソームの関与なしメッセンジャーＲＮＡ（’ｍＲＮＡ’）と結合した際に、ｎｕｃｌｉｏｎｓを形成する。これらのｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎｓが資格を得て、ｍＲＮＡを保護し、翻訳開始コドンに旗を立て、フレームの登録を確認し、装填されたｔＲＮＡを格納し、タンパク質合成を促進します。異常ｎｕｃｌｉｏｎｓとｒｉｂｏｃａｐｓｉｄｓは、いくつかのヒト疾患及び障害を引き起こす可能性があります。例えば、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄにある隣接ｔＲＮＡへの結合するｔＲＮＡ部位にある変異は、特定の種類の癌に関与する細胞の形質転換に関連しています。
【０００７】
製薬、バイオテクノロジー産業は、人間の病気や障害の治療のための新規の診断、治療及び予防的な製品の開発のために新たな生物学的標的を緊急に必要としている。本発明のいくつかの実施形態は、製薬研究開発に利用するために単離されたｎｕｃｌｉｏｎｓを提供することにより、この要請に直接に取り組むことである。Ｎｕｃｌｉｏｎｓは、ヒトにおけるすべてのタンパク質合成に重要な役割を果たしており、このように、医療介入のための最重要な候補であることを意味する。いくつかの実施形態は、ある種のがんやウイルス感染に限定せず、ｎｕｃｌｉｏｎ媒介の疾患及び障害の治療薬の開発のための特殊なｎｕｃｌｉｏｎ標的を明確にすることである。他の実施形態では、製薬及びバイオテクノロジー業界の研究者及び関係者が利用するために、単離されたｎｕｃｌｉｏｎｓの製造方法を指導することである。
【０００８】
［発明の概要］
本発明は単離されたｎｕｃｌｉｏｎに関するものであり、（ｉ）コア核酸と、（ｉｉ）それぞれが２つ以上のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄｓサブユニットからなるポリマーを含む１つ以上のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄを含み、前記のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットは核酸を含む、ことを特徴とするｎｕｃｌｉｏｎである。さらなる実施形態では、（ａ）ほとんどのｒｉｂｏｃａｐｓｉｄがコア核酸の少なくとも一部に結合しており、（ｂ）ほとんどのｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットが、１つ以上の隣接ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットの少なくとも一部に結合してます。さらなる実施形態では、このｎｕｃｌｉｏｎはさらに１つ以上のｎｕｃｌｉｏｎエンベロープを含み、少なくとも１つのｎｕｃｌｉｏｎエンベロープは、（ａ）ｎｕｃｌｉｏｎ基本ｎｕｃｌｉｏｎ部分、（ｂ）コア核酸、（ｃ）１つ以上ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄｓ、（ｄ）１つ以上のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニット、（ｅ）ｎｕｃｌｉｏｎの別のｎｕｃｌｉｏｎエンベロープ、（ｆ）又は前述のいずれかの組み合わせ、の少なくとも一部に必要に応じて結合する。さらに別の実施形態では、１つ以上のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットは、ＲＮＡ、例えば、トランスファーＲＮＡを含む。さらなる実施形態では、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットは１つ以上のイニシエータトランスファーＲＮＡを含み、１つ以上のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットは１つ以上の伸長トランスファーＲＮＡを含む。まだ追加の実施形態では、通常のｎｕｃｌｉｏｎの模倣あるいは偽造であり、前記のｎｕｃｌｉｏｎは、細胞生物、外来性病原体、ウイルス、レトロウイルス、レトロウイルスのｔＲＮＡプライマー複合体、ヒト免疫不全ウイルスのｔＲＮＡプライマー複合体、模倣ｎｕｃｌｉｏｎの何らかの他の天然資源、あるいは模倣ｎｕｃｌｉｏｎの何らかの他の非天然資源、に関連するｎｕｃｌｉｏｎ様の組成である。
【０００９】
一態様では、コア核酸はＤＮＡを含む。別の態様においては、コア核酸は、ＲＮＡ、例えば、メッセンジャーＲＮＡを含む。別の態様において、１つ以上のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットは、開始コドン付近で前記のｍＲＮＡに結合しています。別の態様において、１つ以上のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットは、前記のｍＲＮＡののタンパク質合成マーカー配列の一部とさらに結合し、このようなマーカー配列としてはシャイン・ダルガノ配列あるいはコザック配列を特徴とする。別の態様において、ｎｕｃｌｉｏｎの一つ以上のｎｕｃｌｉｏｎ成分、例えばｍＲＮＡは、リボソームの少なくとも一部にさらに結合する。別の態様において単離されたｎｕｃｌｉｏｎはイニシエーターｎｕｃｌｉｏｎであり、ここでは、（ｉ）コア核酸はｍＲＮＡを包含し且つ、（ｉｉ）前記のｍＲＮＡの少なくとも１部は、この前記のｍＲＮＡ内の開始コドンへ作動可能に連結されるｒｉｂｏｃａｐｓｉｄあるいはｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニット結合配列を包含する特徴とする。
【００１０】
本発明はまた、単離ｎｕｃｌｉｏｎを２つ以上のｎｕｃｌｉｏｎ成分それぞれの会合として製造する方法に関連している。一態様では、ｎｕｃｌｉｏｎはｎｕｃｌｉｏｎ成分の混合や会合として製造され、この混合は（ｉ）コア核酸と２つ以上のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニット、（ｉｉ）コア核酸と２つ以上の前定義の核エンベロープ、（ｉｉｉ）基本ｎｕｃｌｉｏｎと単独又は複数の前定義の核エンベロープ、（ｉｖ）コア核酸と２つ以上のｔＲＮＡ  ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニット、（ｖ）コア核酸と２つ以上のｔＲＮＡ  ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットと単独又は複数の前定義の核エンベロープ、（ｖｉ）基本ｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎと単独又は複数の前定義の核エンベロープ、（ｖｉｉ）エンベロープに包まれたｎｕｃｌｉｏｎと単独又は複数の前定義の核エンベロープ、（ｖｉｉｉ）この群のいずれか２つ以上の組み合わせ、そして（ｉｘ）この群の２つ以上の構成要素の混成型から選ばれる。別の態様において、この方法は（１）単独又は複数のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットの調整とコア核酸の調整の混合、（２）ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニット調整に単独又は複数のコア核酸の調整の追加、（３）コア核酸の調整に単独又は複数のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットの調整の追加、（４）固相に直接あるいは非直接に固定化されたコア核酸の調整と非固定化された単独又は複数のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットの調整の混合、（５）固相に直接あるいは非直接に固定化された単独又は複数のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットの調整と非固定化されたコア核酸の調整の混合、（６）固相に直接あるいは非直接に固定化されたコア核酸の調整と固相に直接あるいは非直接に固定化された単独又は複数のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニット調整の混合、（７）コア核酸の調整とバッチ処理を利用した単独又は複数のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットの調整の混合、（８）コア核酸の調整と連続工程による単独又は複数のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットの調整の混合、（９）コア核酸の調整と単独又は複数のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットの調整の混合してから混ぜ合わせ、（１０）コア核酸の調整と単独又は複数のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットの調整を混合した後に、ｎｕｃｌｉｏｎにないコア核酸から得られるｎｕｃｌｉｏｎを分離、（１１）コア核酸の調整と単独又は複数のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットの調整を混合した後に、ｎｕｃｌｉｏｎにないｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットから得られるｎｕｃｌｉｏｎを分離、（１２）コア核酸の調整と単独又は複数のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットの調整を混合した後に、ｎｕｃｌｉｏｎにないコア核酸とｎｕｃｌｉｏｎにないｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットの両方から得られるｎｕｃｌｉｏｎを分離、（１３）コア核酸の調整と単独又は複数のｎｕｃｌｉｏｎエンベロープの調整の混合、（１４）単独又は複数の基本ｎｕｃｌｉｏｎの調整をｎｕｃｌｉｏｎエンベロープの調整へ追加、（１５）単独又は複数の基本ｎｕｃｌｉｏｎエンベロープの調整をｎｕｃｌｉｏｎの調整へ追加、（１６）固相に直接あるいは非直接に固定化された基本ｎｕｃｌｉｏｎを含んだ調整と非固定化されたｎｕｃｌｉｏｎエンベロープを含んだ単独又は複数の調整の混合、（１７）固相に直接あるいは非直接に固定化されたｎｕｃｌｉｏｎエンベロープを含んだ単独又は複数の調整と非固定化された基本ｎｕｃｌｉｏｎを含んだ調整の混合、（１８）固相に直接あるいは非直接に固定化された基本ｎｕｃｌｉｏｎを含んだ単独又は複数の調整と固相に直接あるいは非直接に固定化されたｎｕｃｌｉｏｎエンベロープを含んだ単独又は複数の調整の混合、（１９）固相に直接あるいは非直接に固定化された基本ｎｕｃｌｉｏｎを含んだ単独又は複数の調整とバッチ処理を利用した単独又は複数のｎｕｃｌｉｏｎエンベロープの調整の混合、（２０）単独又は複数の基本ｎｕｃｌｉｏｎエンベロープの調整と連続工程による単独又は複数のｎｕｃｌｉｏｎエンベロープの調整の混合、（２１）単独又は複数の基本ｎｕｃｌｉｏｎエンベロープの調整と単独又は複数のｎｕｃｌｉｏｎエンベロープの調整の混合その後に混ぜ合わせ、（２２）単独又は複数の基本ｎｕｃｌｉｏｎエンベロープの調整と単独又は複数のｎｕｃｌｉｏｎエンベロープの調整の混合その後エンベロープに包まれたｎｕｃｌｉｏｎにないｎｕｃｌｉｏｎから得られるエンベロープに包まれたｎｕｃｌｉｏｎの分離、（２３）単独又は複数の基本ｎｕｃｌｉｏｎエンベロープの調整と単独又は複数のｎｕｃｌｉｏｎエンベロープの調整の混合その後エンベロープに包まれたｎｕｃｌｉｏｎにないｎｕｃｌｉｏｎエンベロープから得られるエンベロープに包まれたｎｕｃｌｉｏｎの分離、（２４）単独又は複数の基本ｎｕｃｌｉｏｎエンベロープの調整と単独又は複数のｎｕｃｌｉｏｎエンベロープの調整の混合その後エンベロープに包まれたｎｕｃｌｉｏｎにない基本ｎｕｃｌｉｏｎとエンベロープに包まれたｎｕｃｌｉｏｎにないｎｕｃｌｉｏｎエンベロープの両方から得られるエンベロープに包まれたｎｕｃｌｉｏｎの分離、（２５）単独又は複数の基本ｎｕｃｌｉｏｎエンベロープの調整に単独又は複数のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットの調整と単独又は複数のｎｕｃｌｉｏｎエンベロープの調整の組み合わせ、（２６）単独又は複数のコア核酸の調整に単独又は複数のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットの調整と単独又は複数のｎｕｃｌｉｏｎエンベロープの調整を混合した後に混ぜ合わせ、（２７）単独又は複数のコア核酸の調整に単独又は複数のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットの調整と単独又は複数のｎｕｃｌｉｏｎエンベロープの調整を混合した後に結果として得られた組み合わせから得られるエンベロープに包まれたｎｕｃｌｉｏｎの分離、（２８）単独又は複数のコア核酸の調整に単独又は複数のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットの調整と単独又は複数のバッチ処理を利用したｎｕｃｌｉｏｎエンベロープの調整の混合、（２９）単独又は複数のコア核酸の調整に単独又は複数のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットの調整と単独又は複数の連続工程によるｎｕｃｌｉｏｎエンベロープの調整の混合、（３０）この群のいずれか２つ以上の組み合わせ、そして（３１）この群の２つ以上の構成要素の混成型、から構成された群から選ばれた方法である。
【００１１】
別の態様において、この方法は（１）ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットのコア核酸に対するモル比が約１、２、５，１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００又は１０００を超える利用、（２）リッターあたり約１、２、５，１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００又は１０００ミリモルを超える濃度の塩化マグネシウム、マグネシウムイオン、マグネシウム塩を含む溶液、（３）すべての溶液及び調整からポリアミンを除去、（４）すべての溶液及び調整から核酸分解酵素を含まないことを確証、（５）反応物や生産物と接触するあらゆる溶液と装置と補助具と使い捨て器具と備品とその他の物品に核酸分解酵素を実質的に含まないことを確証、（６）ｎｕｃｌｉｏｎ集合体あるいは生産物の整合性には影響しない単独又は複数の核酸分解酵素阻害剤の利用、（７）前記の０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、１２０、１８０、２４０又は３００秒を超える時間を特徴とした十分な時間での会合、（８）非変性会合環境の利用、（９）摂氏約０、４、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、３７，４０、４５、５０、５５又は６０度以下の温度で会合活性の実施、（１０）単独又は複数のｎｕｃｌｉｏｎ成分の化学的な架橋反応、（１１）この群のいずれか２つ以上の組み合わせ、そして（１２）この群の２つ以上の構成要素の混成型、から構成された群から選ばれた単独又は複数の手順をさらに包含する。
【００１２】
別の態様において、この方法は、サイズによる分離、形状による分離、質量による分離、化学親和性による分離、免疫学的な特性による分離、ｎｕｃｌｉｏｎ成分へのビオチン成分の結合を利用した分離、ｎｕｃｌｉｏｎ成分への核酸標識の結合を利用した分離、電気的特性を利用した分離、浸透圧の特性を利用した分離、磁気の特性を利用した分離、溶解性を利用した分離、非変性ゲルによる電気泳動に基づく分離、非変性ゲルでの電気泳動分離に続くバンドの分画、濾過、透析、ゲル排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びこの群のいずれか２つ以上の組み合わせ、より構成される群から選ばられた単独又は複数の手順によるｎｕｃｌｉｏｎの単離をさらに包含する。別の態様において、この方法は、化学修飾、物理的修飾、架橋、ｎｕｃｌｉｏｎ成分の架橋、単独又は複数のｎｕｃｌｉｏｎ成分の架橋、核酸の分離鎖上の２つ以上の塩基間の共有結合の導入、二官能性のニトロゲンマスタードへの暴露、シスシスジアミノジクロロプラチニウムへの暴露、ホルムアルデヒドへの暴露、ソラレン（ｐｓｏｌａｒｅｎ）への暴露、４，５’，８−トリメチルソラレンへの暴露、８−メトキシソラレンへの暴露、４−アミノメチル−４，５’，８−トリメチルソラレンへの暴露、凍結乾燥、凍結、乾燥、冷却、スカベンジャーの添加、抗酸化剤の添加、金属イオン封鎖剤の添加、乳化剤の添加、賦形剤の添加、界面活性剤の添加、紫外線安定剤の添加、核酸分解酵素阻害剤阻害剤の添加、この群の２つ以上の構成要素の混成型、より構成される群より選ばれた単独又は複数の手順により、製造中や製造後にｎｕｃｌｉｏｎの安定化をさらに包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、１つのコア核酸（ＣＮＡ）分子に結合した４つのｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニット（Ｒ１〜Ｒ４は標識されている）を含むｎｕｃｌｉｏｎの一例の模式図である。Ｃは、ＣＡＮ上のコドンを表す。ＡＣはｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ核酸上のアンチコドンを表す。矢印は、別のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニット上のリンクサイト（ＬＳ）へのｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニット上のコネクトサイト（ＣＳ）の結合を示しています。
【図２】図２は、１つのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に結合した４つのアミノアシル転移ＲＮＡ分子（Ｔ１〜Ｔ４の標識が付いたもの）を含むｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎの一例の模式図である。５’及び３’は、ｍＲＮＡの末端の方向を示してます。ＡＡ１からＡＡ４は、ｔＲＮＡ分子へのアシル化アミノ酸を表す。Ｃは、ｍＲＮＡ上のコドンを表す。ＡＣはｔＲＮＡのアンチコドン上を表す。矢印は別のｔＲＮＡ上のｔＲＮＡのリンクサイト（ＴＬＳ）への１つのｔＲＮＡ上のｔＲＮＡのコネクタ（ＴＣ）の結合を示しています。
【図３Ａ】図３Ａは、コンセンサスｔＲＮＡの二次構造のフォーマットにある最も保存されたｔＲＮＡヌクレオシドを示し、ここではｔＲＮＡｄｂデータベースの作者によって採用された規則に従いヌクレオシドの位置を番号で表示してある。点線は、基準塩基対を示し、矢印は、（ｉ）プソイドウリジンステム（４９−５３位まで、６１−６５位まで）のスタッキングアミノ酸ステム（１−７位、６６から７２位まで）と、（ｉｉ）アンチコドンステム（２７−３１位まで、３９−４３位まで）ジヒロドウリジンステム（１０−１３、２２−２５）の積み重ねを示している。他の顕著なｔＲＮＡの構造要素は、アミノ酸の結合部位（７６位の隣のサークル内の“ＡＡ”）、プソイドウリジンループ（５４−６０位）、アンチコドン（緑の箱の３４−３６位）を含むアンチコドンループ（３２−３８位）、ジヒロドウリジンループ（１４−２１位）と可変ループ（４４−４７位）を含む。有病を示す標識がない限り（下記参照）、１−７６とラベルが付いた７６の場所は、通常、ヌクレオシド及びＯ標識（占有を意味する）によって占められている。これとは対照的に、２３カ所（０、１７ａ、２０ａ、２０ｂ、ｅ１−５、ｅ１１−１７及びｅ２１−２７）は、通常は占められておらず、Ｅ標識（余分）で示してある。黄色のボックスは１ヌクレオシド群（Ｇ、Ａ、Ｃ又はＵであり、それらは何からの修飾がある）は、これらの６２３配列中で９０％以上のヌクレオシド有病（ＳＰ）のある位置を示している。このような黄色のボックス内の通常又はイタリック体の文字は、（ｉ）その位置（Ｇ、Ａ、Ｃ又はＵ）で９０％以上のＳＰのヌクレオシド群、又は（ｉｉ）この位置（Ｐ又はＴ）で５０％以上のＳＰの修飾ヌクレオシド、をそれぞれ示している。青色のボックスは、ヌクレオシドクラス（プリン又はピリミジン）が９０％以上のＳＰのある位置を示している。このようなヌクレオシドクラスボックス内の通常又はイタリック体の文字が示しているのは、それぞれ（ｉ）その位置（プリンを示すＲ，ピリミジンを示すＹ）で９０％以上のＳＰのヌクレオシドクラス、又は（ｉｉ）その位置（修飾アデノシンを示すＨ）で５０％以上のＳＰの修飾ヌクレオシドである。２０位のＤはその位置で５０％以上のＳＰのジヒロドウリジンステムを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、図３Ａに使用されるヌクレオシド有病の記号及びヌクレオシドの略語表です。アスタリスクが付いている特定のヌクレオシドが示すのは、関連するデータが基本及び修飾ヌクレオシドの両方に言及していることです。
【図４Ａ】図４Ａは、分子の右側から見たときで、リン酸ジエステルバックボーンの位置とそれらに付属するヌクレオシドを説明するためにＰｙＭＯＬソフトウェアを使用して用意された１０報のｔＲＮＡ構造（ｔＲＮＡ結晶のＸ線回折実験により決定）のコンピュータ・モデリング・オーバーレイである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、図４Ａに提示されたものと同じ構造のアミノ酸部位の遠位ｔＲＮＡの側から見た図である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、図４及び図４Ｂで説明した構造体のカラーキーやその他の情報を提供しています。ＡＡで標識された列には、各ｔＲＮＡのアミノ酸特異性を示します。ＰＤＢで標識された列には、データの由来であったり、研究調査に引用されているプロテインデータバンクに登録されている構造体への参照を提供します。
【図５Ａ】図５ＡはトランスファーＲＮＡのためのヌクレオシド有病トポグラムであり、ここでは９０％以上のヌクレオシド有病を伴うヌクレオシドのためのトランスファーＲＮＡ配列について報告された６２３報のデータマイニングの結果を報告しており、酵母ｔＲＮＡＰｈｅの三次構造をＰｙＭＯＬにより生み出されたコンピューターモデルを提示している。すべてのコンポーネント原子（水素を除く）の空間充填表現を試みた。四箇所の保存ゾーンが同定された。
【図５Ｂ】図５Ｂは、図３Ｂで定義されている略語を使用して、図５Ａでのヌクレオチドにカラーキーを提供している。
【図６Ａ】図６Ａは、酵母ｔＲＮＡＰｈｅにあるｔＲＮＡリンクサイト（ＴＬＳ）のコンピューター・モデルであり、その９つの保存ＴＬＳヌクレオシドにはＬ１からＬ５Ｌと標識された５層に積層されて、８つのＧＳＰ９０ヌクレオシド及び１ＰＳＰ９０プリンを含んでいる。これらのＴＬＳヌクレオシド中の原子は空間充填として示されているが、他のヌクレオシドはメッシュで表されている。
【図６Ｂ】図６Ｂは、図６ＡのどのＴＬＳヌクレオシドが他のＴＬＳヌクレオシドへの塩基対であり、どの方法によるものか示している。
【図６Ｃ】図６Ｃは、図３Ｂに定義されている略語を使用して、図６ＡのＴＬＳヌクレオチドにカラーキーを提供している。
【図７Ａ】図７Ａは、図４Ａと図４Ｂで表現した１０報のｔＲＮＡ構造（ｔＲＮＡ結晶のＸ線回折実験により決定）のコンピュータ・モデリング・オーバーレイであるが、ヌクレオシドのスティック表現を利用している。このＴＬＳは、ｔＲＮＡの上方からの視線で、ｚ方向にアンチコドンステム（見ているのとは離れた）とｙ方向にアミノ酸ステム（ページの上部に向かって）が位置する。
【図７Ｂ】図７Ｂは、図７Ａで説明した構造体のカラーキーやその他の情報を提供しています。ＡＡで標識された列には、各ｔＲＮＡのアミノ酸特異性を示します。ＰＤＢで標識された列には、データの由来であったり、研究調査に引用されているプロテインデータバンクに登録されている構造体への参照を提供します。
【図８Ａ】図８Ａは、Ｔ−形ｎｕｃｌｉｏｎ内のｍＲＮＡ上の隣接するコドンに結合した２つのアミノアシル化Ｌ−高次構造の酵母ｔＲＮＡＰｈｅ分子（ｔＲＮＡ１とｔＲＮＡ２の標識）のコンピューター・モデルである。破線はｎｕｃｌｉｏｎ軸であり、ｍＲＮＡの方向を示すために、５’及び３’を表示してある。
【図８Ｂ】図８Ｂは、図３Ｂで定義した略語を使用して、図８Ａにヌクレオチドにカラーキーを提供している。
【図９Ａ】図９Ａは、５’方向からｎｕｃｌｉｏｎ軸上の視線での、Ｔ−形ｎｕｃｌｉｏｎ内でｍＲＮＡ上の連続したコドンに結合した３つのアミノアシル化Ｌ−高次構造の酵母ｔＲＮＡＰｈｅの分子（ｔＲＮＡ１、ｔＲＮＡ２とｔＲＮＡ３の標識）のコンピューター・モデルである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、図３Ｂに定義されている略語を使用して、図９Ａのヌクレオチドにカラーキーを提供している。
【図１０Ａ】図１０Ａは、Ｔ−形ｎｕｃｌｉｏｎでｍＲＮＡ上の連続したコドンに結合した１０個のアミノアシル化Ｌ−高次構造の酵母ｔＲＮＡＰｈｅ分子のコンピュータモデルである。破線はｎｕｃｌｉｏｎ軸であり、ｍＲＮＡの方向を示すために、５’及び３’を表示してある。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、図３Ｂに定義されている略語を使用して、図１０Ａのヌクレオチドにカラーキーを提供している。
【図１１】図１１は、ｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎ（他のｔＲＮＡ原子は非表示）の隣接するＳ−構造及びＴ−構造にあるｔＲＮＡアンチコドンに結合するｍＲＮＡコドンのコンピュータモデルです。ｍＲＮＡコドンはオレンジです。他のすべての色は、ｔＲＮＡアンチコドンを示している。隣接するテーブルは、関連するｔＲＮＡアンチコドンの構造と共に、これらの２つのｎｕｃｌｉｏｎ高次構造内に対応するｎｕｃｌｉｏｎヘリックスのためのｔＲＮＡ当たりのヘリックライズとへリックススターン値を提示している。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ｔＲＮＡのアンチコドンループのＫ−高次構造のコンピュータモデルであり、結合に関わるコドンも示し、アンチコドンループとコドンは棒により表現されている。ｔＲＮＡのアンチコドンステムは、メッシュで表されている。Ｕ３３は、位置３３における保存ＧＳＰ９０ウリジンです。Ｐｕ３７は位置３７における保存ＰＳＰ９０プリンです。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ｔＲＮＡのアンチコドンループのＬ−高次構造のコンピュータモデルであり、結合に関わるコドンも示し、アンチコドンループとコドンは棒により表現されている。ｔＲＮＡのアンチコドンステムは、メッシュで表されている。Ｕ３３は、位置３３における保存ＧＳＰ９０ウリジンです。Ｐｕ３７は位置３７における保存ＰＳＰ９０プリンです。
【図１３Ａ】図１３Ａは、Ｓ−形ｎｕｃｌｉｏｎ内ｍＲＮＡ上の隣接するコドンに結合した４つのアミノアシル化Ｋ−高次構造の酵母ｔＲＮＡ  Ｐｈｅ分子（ｔＲＮＡ１、ｔＲＮＡ２、ｔＲＮＡ３とｔＲＮＡ４の標識）のコンピューター・モデルである。破線はｎｕｃｌｉｏｎ軸であり、ｍＲＮＡの方向を示すために、５’及び３’を表示してある。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、図３Ｂに定義されている略語を使用して、図１３Ａのヌクレオチドにカラーキーを提供している。
【図１４Ａ】図１４Ａは、Ｒ−高次構造ｎｕｃｌｉｏｎキャップとして、ｍＲＮＡ上のコドンへ結合するＬ−高次構造の酵母ｔＲＮＡＰｈｅ分子のコンピュータモデルである。いくつかの下流ｔＲＮＡのアンチコドンが示されているが（対応するコドンと共に）、これらの分子のバランスが示されていない。破線はｎｕｃｌｉｏｎ軸であり、ｍＲＮＡの方向を示すために、５’及び３’を表示してある。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、図３Ｂで定義されている略語を使用して図１４Ａのヌクレオチドにカラーキーを提供している。
【図１５】図１５は、関連情報表で同定されており、３つのｎｕｃｌｉｏｎ高次構造内の１１個のアミノアシル化ｔＲＮＡ分子を含有する化合物のｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎの概略図である。ｔＲＮＡのための図式規則は左下隅に表示された画像で定義される。
【図１６】図１６は、化合物のｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎ及び関連情報表のコンピューター・モデルであり、どちらも図１５の模式図に対応している。２つアミノアシル化ｔＲＮＡはｎｕｃｌｉｏｎから下流のｍＲＮＡの結合で表示されている。破線はｎｕｃｌｉｏｎ軸であり、オレンジ色であるｍＲＮＡの方向を示すために、５’及び３’を表示してある。
【図１７】図１７は、ｔＲＮＡのｎｕｃｌｉｏｎｓの３つの高次構造の特徴表である。記号“〜”は、実質的に提示された数値の範囲内を意味する。
【図１８】図１８は、細菌と同類の真核生物の細胞小器官でのｔＲＮＡによるイニシエーション（開始）コドンマーキングの図であり、イニシエーターｎｕｃｌｉｏｎの形成前（上）及び形成後（下）を表す。Ｔ（Ｎ−１）からＴ（Ｎ＋２）はｔＲＮＡ分子を表す。ＡＡは伸長ｔＲＮＡに結合したアミノ酸を表す。Ｆ−Ｍｅｔ（ホルミルメチオニン）はイニシエーターｔＲＮＡに結合する。５’及び３’は、ｍＲＮＡの末端の方向を表示している。ＣはｍＲＮＡ上のコドンを表す。ＡＣはｔＲＮＡのアンチコドン上を表す。ＲとＳがそのｔＲＮＡのでｎｕｃｌｉｏｎ高次構造を示す。斜めの矢印は別のｔＲＮＡ上のｔＲＮＡのリンクサイト（ＴＬＳ）への１つのｔＲＮＡ上のｔＲＮＡコネクタ（ＴＣ）の結合を示す。’駐車禁止’記号は、ＴＣコネクタが隣接する上流のｔＲＮＡ上でＴＬＳ部位に結合できないことを示す。
【図１９】図１９は、真核生物の細胞質内のｔＲＮＡによるイニシエーション（開始）コドンマーキングの図であり、イニシエーターｎｕｃｌｉｏｎの形成前（上）及び形成後（下）を表す。Ｔ（Ｎ−１）からＴ（Ｎ＋２）はｔＲＮＡ分子を表し、ＡＡは伸長ｔＲＮＡに結合したアミノ酸を表す。Ｍｅｔ（メチオニン）はイニシエーターｔＲＮＡに結合する。５’及び３’は、ｍＲＮＡの末端の方向を表示している。ＣはｍＲＮＡ上のコドンを表す。ＡＣはｔＲＮＡのアンチコドン上を表す。ＲとＳがそのｔＲＮＡのでｎｕｃｌｉｏｎ高次構造を示す。斜めの矢印は別のｔＲＮＡ上のｔＲＮＡのリンクサイト（ＴＬＳ）への１つのｔＲＮＡ上のｔＲＮＡコネクタ（ＴＣ）の結合を示す。’駐車禁止’記号は、ＴＣコネクタが隣接する上流のｔＲＮＡ上でＴＬＳ部位に結合できないことを示す。
【図２０Ａ】図２０Ａは、続く二つの下流ｔＲＮＡのＣＣＡテイルつまりｔＲＮＡ２（成長中のポリペプチド鎖を保持する）とｔＲＮＡ３（その次のアミノ酸を保持している）の間でペプチジル転移を触媒する始原的（又は異常な現代な）Ｒ形ｎｕｃｌｉｏｎ  ｔＲＮＡのキャップ（ｔＲＮＡ１）のコンピュータモデルである。破線はｎｕｃｌｉｏｎ軸であり、ｍＲＮＡの方向を示すために、５’及び３’を表示してある。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、図３Ｂで定義されている略語を使用して図２０Ａでヌクレオチドにカラーキーを提供している。
【図２１】図２１は、１１個のｔＲＮＡ分子からなり、その中の９つはアミノアシル化、その中（ｔＲＮＡ２、緑）の１つが成長中ポリペプチド（’タンパク質’と表示）でアシル化され、そしてその中の１つｔＲＮＡキャップ（ｔＲＮＡ１、赤）はアミノ酸又はペプチドでアシル化されていない、このような始原的（又は異常な現代な）化合物ｎｕｃｌｉｏｎによるタンパク質合成の模式図である。自由溶液中の２つのｔＲＮＡが装填とリサイクルされる自由なｔＲＮＡとして模式的に示されている。ｔＲＮＡのための図式規則は右上隅に表示された画像で定義される。
【図２２】図２２は、自由溶液中でｎｕｃｌｉｏｎと帯電していないｔＲＮＡからｍＲＮＡの下流にある２つのアミノアシル化ｔＲＮＡを追加した、図２１の模式図に対応する化合物ｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎによるタンパク質合成のコンピューター・モデルであり。赤い小さな分子はアミノ酸である。ｎｕｃｌｉｏｎの上部から出ているポリペプチドは赤色です。ｍＲＮＡはオレンジです。
【図２３Ａ】図２３Ａは、ｍＲＮＡに結合する続く二つのｔＲＮＡのＣＣＡテイル間で、つまり成長中のポリペプチド鎖を保持するｔＲＮＡ２（ここで最初のアミノ酸のみ示し、“ポリペプチド”と表記）とその次のアミノ酸を保持しているｔＲＮＡ３（’アミノ酸’と表記）、ペプチジル転移を触媒する始原的（又は異常な現代な）ｔＲＮＡのキャップ（ｔＲＮＡ１）のコンピュータモデルである。関与しているヌクレオチドはＬ０からＬ５で表記された、６層に積層されている。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、図３Ｂに定義されている略語を使用して図２３Ａでヌクレオチドにカラーキーを提供している。特定のヌクレオシドで両端が丸で黒線で連結された箇所は、ペプチジル伝達に寄与する分子間相互作用の一部を示している。テーブル内の列は、３つのｔＲＮＡのどのヌクレオシドがＬ０からＬ５で表記された６活性部位層に整列するかを示す。
【図２４Ａ】図２４Ａは、リボザイムｔＲＮＡ１でプソイドウリジンステムの方向からの視線で、始原的（又は異常な現代な）ｎｕｃｌｉｏｎのペプチジル移転センター（ＰＴＣ）に関与する３つのｔＲＮＡによって形成された４次構造複合体のレベル３と４にある６つのヌクレオシドのコンピューターモデルである。’反応’と表記された楕円は、アミノアシル化ｔＲＮＡ３におけるアミノ基がペプチジルｔＲＮＡ２のカルボキシル基を攻撃する活性部位を強調する。ポリペプチド鎖内の最初のアミノ酸のみ表示する。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、始原的（又は異常な現代な）ｎｕｃｌｉｏｎのＰＴＣ上部の視線で、ｔＲＮＡ２とｔＲＮＡ３上の２つのＡ７６アデノシンヌクレオチド間のペプチジル転移反応を示しており、ｔＲＮＡ２からｔＲＮＡ３へ成長中のポリペプチド鎖の転移する。’Ｒｅａｃｔｉｏｎ’と表記された楕円は、アミノアシル化ｔＲＮＡ３におけるアミノ基がペプチジルｔＲＮＡ２のカルボキシル基を攻撃する活性部位を強調する。ポリペプチド鎖内の最初のアミノ酸のみ表示する。
【図２４Ｃ】図２４Ｃは、図３Ｂに定義されている略語を使用して、図２４Ａと図２４Ｂのヌクレオチドにカラーキーを提供している。特定のヌクレオシドで両端が丸で黒線で連結された箇所は、ペプチジル転移に寄与するＬ３とＬ４層の分子間相互作用を示す。
【図２５Ａ】図２５Ａは、通常の現代のｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ１）のＴＬＳの位置５４（Ｔ５４）でのリボシルチミンのコンピュータモデルを示す。強調したメチル基はｔＲＮＡ２上のＣＣＡの位置７６のアデノシンの結合を阻害する（図示せず）。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、図３Ｂで定義されている略語を使用して、図２５Ａでヌクレオチドにカラーキーを提供している。
【図２５Ｃ】図２５Ｃは、隣接する下流のｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ２）のＣＣＡの位置７６におけるアデノシンの可能な結合と共に、始原的又は異常な現代のｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ１）上のＰＬＳの位置５４（Ｐ５４）のプソイドウリジンのコンピュータモデルを示す。
【図２５Ｄ】図２５Ｄは、図３Ｂで定義されている略語を使用して図２５Ｃのヌクレオチドにカラーキーを提供している。特定のヌクレオシドで両端が丸で黒線で連結された箇所は、ペプチジル伝達に寄与する分子間塩基対を示す。
【図２６】図２６は、ｎｕｃｌｉｏｎオペレーションのための制御ロジックの表であり、関連したり結果として生じるｎｕｃｌｉｏｎ条件と共にｔＲＮＡ  Ｔ（Ｎ）の位置５４及び５５におけるヌクレオシドによって部分的に駆動される左右のＴＬＳサイトの状態を要約したものある。Ｔ（Ｎ−１）は最初のｔＲＮＡのすぐ上流に隣接するｔＲＮＡに言及し、Ｔ（Ｎ＋１）は最初のｔＲＮＡのすぐ下流に隣接したｔＲＮＡを指します。ｔＲＮＡ（Ｎ＋２）はｔＲＮＡ（Ｎ＋１）のすぐ下流のｔＲＮＡです。
【図２７Ａ】図２７Ａは、ＴＬＳの左側から見た酵母ｔＲＮＡＰｈｅのとして報告された高分解能構造からスペルミン結合部位のコンピューターモデルである。スペルミンは、位置５４（Ｔ５４）でリボシルチミンと位置５５（Ｐ５５）でプソイドウリジンによって大部分が結合している。
【図２７Ｂ】図２７Ｂはアミノ酸テイルのＴＬＳ遠位の端から見た図２７Ａで示したコンピュータモデルです。
【図２８】図２８は、核酸ｎｕｃｌｉｏｎ周囲にキャプシドタンパク質を生成し、Ｔ形ｎｕｃｌｉｏｎの１２のｔＲＮＡに結合した１２のＥＦ−Ｔｕ分子（Ｅ１からＥ１２で表示）のコンピューター・モデルである。Ｔ１２はＥ１２が結合したｔＲＮＡ１２を示す。破線はｎｕｃｌｉｏｎ軸であり、ｍＲＮＡの方向を示すために、５’及び３’を表示してある。
【図２９】図２９にＳ−形ｎｕｃｌｉｏｎで４つのｔＲＮＡに結合した４ＥＦ−Ｔｕの分子（Ｅ１からＥ４で表示）のコンピューター・モデルである。トランスファーＲＮＡ３，４、及び５は、それぞれ、Ｔ３、Ｔ４とＴ５で表示されている。破線はｎｕｃｌｉｏｎ軸であり、ｍＲＮＡの方向を示すために、５’及び３’を表示してある。
【図３０Ａ】図３０Ａは、ｔＲＮＡ１すぐ上流に結合するｔＲＮＡ２（Ｔ２と表示）と整列されたＥＦ−Ｔｕの結合前の高次構造のコンピュータ・モデルである。ｔＲＮＡのヌクレオチドのカラーキーは、図８Ｂのと同じである。破線はｎｕｃｌｉｏｎ軸であり、ｍＲＮＡの方向を示すために、５’及び３’を表示してある。
【図３０Ｂ】図３０Ｂは別の角度から、図３０Ａで提示したコンピュータモデルの拡大図である。のＥＦ−ＴｕはＥと表示されている。
【図３０Ｃ】図３０Ｃは、ｔＲＮＡ１すぐ上流から削除されたｔＲＮＡ２と整列されたＥＦ−Ｔｕの結合後の高次構造のコンピュータモデルです。
【図３０Ｄ】図３０Ｄは、図３０Ｂと同じ角度からの図３０Ｃで提示されたコンピュータモデルの拡大図ですｔＲＮＡ１はＴ１で表示されている。
【図３１Ａ】図３１Ａは、Ｓ−形ｎｕｃｌｉｏｎの４つの同族ｔＲＮＡに結合した４ＥＦ−Ｔｕ分子のコンピュータモデル（Ｅ２からＥ５で表示）です。破線はｎｕｃｌｉｏｎ軸であり、一般的なｍＲＮＡの方向を示すために、５’及び３’を表示してある。
【図３１Ｂ】図３１Ｂは、ｔＲＮＡのキャップ（Ｔ１）がエンベロープｎｕｃｌｉｏｎに追加されたときの、図３１Ａで提示された分子構造のコンピュータモデルである。このｔＲＮＡキャップからＣＣＡ−アミノ酸テイルは、ｔＲＮＡ４に付着するＥＦ−Ｔｕ４（Ｅ４）での間隙に位置する。
【図３１Ｃ】図３１Ｃは、ＥＦ−Ｔｕ１（Ｅ１）がその後ＥＦ−Ｔｕ１とＥＦ−Ｔｕ４間に挟まれるｔＲＮＡキャップＴ１に結合したときの図３１Ｂに提示された分子構造のコンピュータモデルである。
【図３２Ａ】図３２Ａは、ｎｕｃｌｉｏｎ軸上の５’方向の視線による図３１Ａのコンピュータモデルである。表示方法は同じある。
【図３２Ｂ】図３２Ｂはｎｕｃｌｉｏｎ軸上で５’方向の視線による図３１Ｂのコンピュータモデルである。表示方法は同じである。
【図３２Ｃ】図３２Ｃはｎｕｃｌｉｏｎ軸上で５’方向の視線による図３１Ｃのコンピューターモデルである。表示方法は同様。
【図３３Ａ】図３３Ａは、３７℃の温度で、分単位の時間（ｘ軸）に対する加水分解したＭｅｔ−ｔＲＮＡｅＭｅｔの割合（ｙ軸）を示すグラフである。
【図３３Ｂ】図３３Ｂは、１０℃の温度で、分単位の時間（ｘ軸）に対する加水分解したＭｅｔ−ｔＲＮＡｅＭｅｔの割合（ｙ軸）を示すグラフである。
【図３３Ｃ】図３３Ｃは、３７℃の温度で、分単位の時間（ｘ軸）に対する加水分解のＣｙｓ−ｔＲＮＡＣｙｓの割合（ｙ軸）を示すグラフである。
【図３４Ａ】図３４Ａは、３７℃の反応温度（’室温’）と氷浴中でのｎｕｃｌｉｏｎ会合でのｍＲＮＡに対するｔＲＮＡ比（’モル比’）の効果を比較するために室温（’室温’）での非変性ゲルのホスフォイメージャーである。ｍＲＮＡとｎｕｃｌｉｏｎ複合体１〜５に関連したゲルバンドは、それに応じて標識されている。
【図３４Ｂ】図３４Ｂは、３７℃の反応温度（’ＲＸＮ  ＴＥＭＰ’）と氷浴中でのｎｕｃｌｉｏｎ会合でのｍＲＮＡに対するｔＲＮＡ比（’モル比’）の効果を比較するために低温室での非変性ゲルのホスフォイメージャーである。
【図３４Ｃ】図３４Ｃは、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ使用して、図３４ＡでのｍＲＮＡと複合体１−５に相当する３２Ｐ標識されたバンドを定量化により得られたグラフである。
【図３４Ｄ】図３４Ｄは、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ使用して、図３４ＢでのｍＲＮＡと複合体１−５に相当する３２Ｐ標識されたバンドを定量化により得られたグラフである。
【図３５Ａ】図３５Ａは、ｎｕｃｌｉｏｎ会合での塩化マグネシウム濃度（’ＭｇＣｌ２’）の効果を特定するための１研究での非変性ゲルのホスフォイメージャーである。ｍＲＮＡとｎｕｃｌｉｏｎ複合体１〜５に関連したゲルバンドは、それに応じて標識されている。
【図３５Ｂ】図３５Ｂは、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ使用して、図３５ＡでのｍＲＮＡと複合体１−５に相当する３２Ｐ標識されたバンドを定量化により得られたグラフである。
【図３５Ｃ】図３５Ｃは１００ｍＭの塩化マグネシウムの濃度以下のとき図３５Ｂからデータをグラフ化した。
【図３６】図３６は、１５０ｍＭの塩化マグネシウムの存在下又は非存在下におけるｎｕｃｌｉｏｎ会合でのアミノアシル化ステータスとコドン認識の影響を特定するための１研究での非変性ゲルのホスフォイメージャーです。
【図３７】図３７は、ｔＲＮＡとｍＲＮＡとのモル比が３２００の時の（分表示）ｎｕｃｌｉｏｎ会合のタイムコースを特定するための１研究での非変性ゲルのホスフォイメージャーです。
【図３８Ａ】図３８Ａは、競合的なｍＲＮＡの添加（分表示）によって引き起こさるｎｕｃｌｉｏｎ解離の経時変化を特定するための１研究での非変性ゲルのホスフォイメージャーです。
【図３８Ｂ】図３８Ｂは、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔを使用して、図３８ＡでのｍＲＮＡと複合体に相当する３２Ｐ標識されたバンドを定量化し、ｎｕｃｌｉｏｎｓでのｍＲＮＡ複合体の割合を算出した。
【図３９Ａ】図３９Ａは、ｍＲＮＡが１、２、３、４、６又は９つのＡＵＧコドンを有する際で、ｎｕｃｌｉｏｎｓにあるｍＲＮＡとｔＲＮＡのモル比を特定するための１研究での非変性ゲルのホスフォイメージャーです。
【図３９Ｂ】図３９Ｂは、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔを使用して、図３９ＡでｍＲＮＡと複合体に相当する３２Ｐ標識されたバンドを定量化し、それぞれのバンドにおけるｍＲＮＡ複合体の割合を提示した。
【図４０】図４０は、０．０７５から２０マイクロモル（’ｕＭ’）の範囲の濃度で、アミノアシル化ｔＲＮＡ単独で高分子複合体が形成するかどうかを特定するための１研究での非変性ゲルのホスフォイメージャーです。
【図４１】図４１は、ｆＭＦ３ＣＦＣのための配列コードの上流にあるシャイン・ダルガーノ配列を含むｍＲＮＡと４つのアミノアシル化ｔＲＮＡの様々な組合せの結合を特定するための１研究での非変性ゲルのホスフォイメージャーです。第一レーンはｍＲＮＡ単独での結果を反映しており、二番目のレーン以降は、ｍＲＮＡと次のように表示された特異性を持つ１つ以上のアミノアシル化ｔＲＮＡとの結果が反映されてます。Ｃ＝システイン、Ｆ＝フェニルアラニン、ＩＭ＝メチオニン（イニシエータｔＲＮＡ）とし、ＥＭ＝メチオニン（伸長ｔＲＮＡ）。
【図４２Ａ】図４２Ａは、ｆＭＦ３ＣＦＣのための配列コードの上流にあるシャイン・ダルガーノ配列を含むｍＲＮＡを用いて、ｎｕｃｌｉｏｎ形成の程度に関してｍＲＮＡにｔＲＮＡのモル比の効果を測定するための１研究での非変性ゲルのホスフォイメージャーです。
【図４２Ｂ】図４２Ｂは、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔを使用して、図４２Ａで得ｍＲＮＡと複合体に相当する３２Ｐ標識されたバンドを定量化し、ｎｕｃｌｉｏｎｓでのｍＲＮＡ複合体の割合を算出した。
【００１４】
［発明の詳細な説明］
本発明は、ｎｕｃｌｉｏｎと名付ける生物学的構造の発明者による発見に関する。図１の模式図は、本発明のいくつかの実施形態によって教示されるようｎｕｃｌｉｏｎのいくつかの機能を示している。我々は、無傷のウイルス粒子を記述するために科学者や医師によって使用される用語、’ｖｉｌｌｉｏｎ’と似たような用語’ｎｕｃｌｉｏｎ’を採択した。但し、ほとんどのウイスルとは実質的に異なる属性をほとんどのｎｕｃｌｉｏｎは有しているが。
【００１５】
この発明の実施形態はｎｕｃｌｉｏｎｓとｒｉｂｏｃａｐｓｉｄｓに基づいて、新しいプラットフォーム技術を紹介し、製薬、バイオテクノロジー、ナノテクノロジー産業のためのこの技術の特定の利用を教授する。いくつかの実施形態が取り組むのは、（ｉ）ｎｕｃｌｉｏｎｓ、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄｓ、それらのコンポーネントと関連する構造体、（ｉｉ）これらの組成物の製造、分離、精製、テスト、及びこれらの組成物のカスタマイズの方法、（ｉｉｉ）とりわけ  医学的意義の新規分子標的を同定のためのｎｕｃｌｉｏｎとｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ技術  の産業上の利用である。例えば、前述のｎｕｃｌｉｏｎｓ、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄｓ、それらの組成物と関連する構造体は  、関連する天然ｎｕｃｌｉｏｎｓの構造や活性の調整により、ＲＮＡからタンパク質の翻訳を推進したり阻害するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ法の開発への産業上の利用を含む。さらに、前述のｎｕｃｌｉｏｎｓ及び関連構造は、ｉｎ  ｖｉｖｏで天然のｎｕｃｌｉｏｎ形成を阻害し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏバイオアッセイのための実験モデルとして、天然ｎｕｃｌｉｏｎ組成物及び他の組成物をスクリーニングし、それにより医学的な治療、診断又は予防的結果を生成するなどのの産業上の利用を含む。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態では、各ｎｕｃｌｉｏｎはコア核酸（ＣＮＡ）を含み、その全部又は一部が１つ以上のオリゴマー又はほとんどが核酸のサブユニットのポリマーシェルに結合している。我々は、ウイルスで発見されたタンパク質’ｃａｐｓｉｄ’タンパク質と核酸コートを区別するために、ｎｕｃｌｉｏｎのシェルを’ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ’と呼び。いくつかの実施形態では、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニット（図１のＲ１〜Ｒ４をして識別される）はその化学組成が異なるが、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ整合性を維持するために十分な構造的相同性を持っている。  いくつかの実施形態では、各ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットは、少なくとも３つの分子間の結合部位が含まれうる。これらの２つの部位は、’コネクタサイト’（’ＣＳ’）そして’リンクサイト’（’ＬＳ’）と呼ばれ、相互に隣接するサブユニットへの結合を担う。各ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニット上のが第三番目の分子間部位は、コア核酸の実質的に相補的’コドン“（’Ｃ’）に結合する塩基配列“アンチコドン“（“ＡＣ“）と称される。コドン−アンチコドン相互作用は、以前、当業者に知られていたが、隣接するｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニット上のコネクタとリンクサイト間の相互作用は、今まで報告されていない。
【００１７】
いくつかの実施形態において、これらの分子上のアンチコドンがＣＡＮのそれぞれのコドンに結合すると同時に、隣接ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニット上でＣＳとＬＳのサイトとの間の結合によってｎｕｃｌｉｏｎは部分的に安定化される。いくつかの実施形態において、個々のサブユニット分子の定義された領域内の特定の許容な構造変化と同時に、これらのＣＳとＬＳサイトの構造と位置は、全体のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ形状を安定化するために、併用を標準化するために、異なるサブユニット間で十分にで保存されています。いくつかの実施形態において、ＣＳとＬＳのサイトは、コア核酸の３’及び５’にそれぞれ配向されている。他の実施形態において、ＣＳとＬＳのサイトはそれぞれ、コア核酸の５’及び３’にそれぞれ配向されている。いくつかの実施形態において、コドンとアンチコドン部位のヌクレオチドは、ＣＮＡが異なるサブユニットに特異的に結合したり、他の生物学的機能を実行できるように（実質的に相補的なままで）日常的に変化する。
【００１８】
いくつかの実施形態において、図２の模式図に示すように、メッセンジャーＲＮＡ分子の周りのｔＲＮＡ  ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄを形成するために、オリゴマー又はポリマーサブユニットとして複数のｔＲＮＡ分子が機能しており、ｎｕｃｌｉｏｎの一態様はこのようなトランスファーＲＮＡ（’ｔＲＮＡ’）ｎｕｃｌｉｏｎである。各ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄのｔＲＮＡ（Ｔ１〜Ｔ４）上のアンチコドン（’ＡＣ’）は、ｎｕｃｌｉｏｎのコア内のｍＲＮＡに相補的なヌクレオチドのコドン（’Ｃ’）に結合する３つのヌクレオチドの配列であってもよい。連続したｔＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ上の連続した対応するコドンに結合する。それぞれのｔＲＮＡ（’ｔＲＮＡのコネクタ“又は“ＴＣ’と称される）のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ  ＣＳのサイトは、アミノ酸（’アミノアシル化’）へ（通常はアシル化により）付着されたりされないが、その“ＣＣＡのテイル”（ｔＲＮＡ分子の３’末端上に３つのヌクレオチド配列）である。ｔＲＮＡのｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ  ＬＳのサイト（’ｔＲＮＡのリンクサイト“又は“ＴＬＳを’と称される）は、プソイドウリジンとジヒドロウリジンループ間の分子内相互作用によって形成されたｔＲＮＡのエルボーに位置しています。ｔＲＮＡ上のＴＣは、上流（５’ｍＲＮＡ）の方向にｍＲＮＡに結合した隣接ｔＲＮＡのＴＬＳで接続しうる。
【００１９】
現代の細胞では、天然のｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎｓは、メッセンジャーＲＮＡを評価と保護し、開始コドンを標識し、フレームの登録を提供し、アミノアシル化ｔＲＮＡを備蓄し、そして翻訳効率を増加するための役目を担う。ＴＬＳの先祖のバージョンを含む始原的なｎｕｃｌｉｏｎｓは、リボソームの出現の前にタンパク質合成を開拓してきた。
現代の細胞内で適切な細胞制御を維持するためには、リボソーム外のｎｕｃｌｉｏｎｓによるそのようなタンパク質合成は許されるべきではない。それにもかかわらず、いくつかの実施形態において、データマイニングの研究が提示していることは、始原的な構成へのＴＬＳへの逆戻りが自然界で実際に起こること、別の実施形態において、このことは、制御されていないペプチジル転移及び／又は細胞増殖を誘発することにより、高等生物である種のがんを引き起こす可能性である。他の実施形態では、ある種のウイルスは、細胞の翻訳機構を乗っ取ったり阻害するために細胞に侵入しする際に、ｎｕｃｌｉｏｎ構造を偽造することがあります。本発明のいくつかの実施形態において、生物学的限界や機能不全の前例のない理解と共に、ｎｕｃｌｉｏｎｓとｒｉｂｏｃａｐｓｉｄｓの存在、構造、機能及び特性におけるこれらの驚くべき洞察力が、バイオテクノロジーやナノテクノロジーのための新しいテクノロジー・プラットフォームを提供し、そして、生物製剤、診断薬、治療薬や予防薬に限らず、新しいクラスの医薬品の製造及び開発のための新たなとりわけ新薬の標的を提示する。
【００２０】
ｎｕｃｌｉｏｎｓ発見と本発明の実施形態は、多くの理由のために驚くべきものである。  従来、１つの核酸分子が他の核酸分子のポリマーシェルによってカプセル化されていることを示す、生物学的な構造が報告も主張されたことがない。特定のタンパク質が核酸（特にウイルス）の周りに高分子キャプシドを形成する方法を記述する科学の体系があるが、核酸がそのような殻を形成する報告がない。
【００２１】
第二驚くべき発見は、トランスファーＲＮＡ分子が以前に理解されていたよりも進化や現代生物学においてきわめて重要な役割を果たしていることです。この存在が最初にＦｒａｎｃｉｓ  Ｃｒｉｃｋ（Ｃｒｉｃｋ，  １９５７，  Ａ  Ｎｏｔｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＲＮＡ  Ｔｉｅ  Ｃｌｕｂ，  未発表；  Ｃｒｉｃｋ，  １９５８，  Ｓｙｍｐ．  Ｓｏｃ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ．，  １２：１３８）により推定されそしてＰａｕｌ  Ｚａｍｅｃｎｉｋの研究室（Ｈｏａｇｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９５８，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２３１：２４１）で発見されるよりも半世紀以上も前に、トランスファーＲＮＡ分子が、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の情報をタンパク質に翻訳する分子アダプターとして通常は記述されていた。タンパク質合成では、各ｔＲＮＡは特異的なアミノ酸で装填され、リボソームに入ると、即座に装填されたｔＲＮＡは対応するコドンに結合し、そして前のｔＲＮＡ上の成長中のポリペプチド鎖が、次のｔＲＮＡ分子上のアミノ酸に転送される。
【００２２】
ｎｕｃｌｉｏｎｓ発見と本発明のいくつかの実施形態は、以前に報告のないトランスファーＲＮＡの、次のような更なる生物学的特性と機能を明らかにした：
【００２３】
１．トランスファーＲＮＡ分子は、リボソームが存在しない場合にメッセンジャーＲＮＡに結合し、ｍＲＮＡの周りに１つ以上のポリマーｒｉｂｏｃａｐｓｉｄｓを形成すると、得られた四次構造は、ｔＲＮＡのｎｕｃｌｉｏｎとなる。
【００２４】
２．各ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄでは、全ての生物学的な領域の中でほとんどのｔＲＮＡで実質的に保存されている分子間の結合部位を介して隣接ｔＲＮＡが直接結合する。
【００２５】
３．保存されたｔＲＮＡ配列Ｇ５３−Ｔ５４−Ｐ５５−Ｃ５６の主な役割は転移ＲＮＡリンクサイト（“ＴＬＳ“）として機能することで、以前信じられていたようなリボソーム結合部位（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，１９６９，Ｎａｔｕｒｅ，２２３：３４７）としてではなく、隣接ｔＲＮＡのＣＣＡのテイル（ｔＲＮＡコネクタ又は’ＴＣ’）にＴＬＳは通常結合する。
【００２６】
４．特定のイニシエータｔＲＮＡは、正しいフレームの登録を確保する間に、翻訳開始コドンを識別するためにＴＬＳ−ＴＣのリンクやトリガーｎｕｃｌｉｏｎキャッピングを阻害する、修飾されたＴＬＳ又はＴＣサイトを持つ。これにより、ｎｕｃｌｉｏｎ  ’がイニシエーターｎｕｃｌｉｏｎ’と称される。
【００２７】
５．イニシエータｔＲＮＡは、イニシエーターｎｕｃｌｉｏｎｓを登録して安定させるために、シャイン・ダルガーノ配列・シーケンスのような明確なｍＲＮＡマーカー構造と相互作用する。
【００２８】
６．Ｎｕｃｌｉｏｎは、の倉庫には、タンパク質合成開始のためにｔＲＮＡの保管する。このキャッシュ装填により、電荷ｔＲＮＡの供給源と配信の両方が促進され、翻訳ロジックスが改善される。
【００２９】
７．Ｎｕｃｌｉｏｎｓは高エネルギーを安定させるが、ｔＲＮＡ及びそれらのアミノ酸間での不安定な化学結合ではなく、そうでなければ無駄になるエネルギーの節約である。実際には、ｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎは充電器である。
【００３０】
８．特定のｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎｓは、ｎｕｃｌｉｏｎ倉庫からタンパク質合成のためのリボソーム工場に装填されたｔＲＮＡ輸送する、ＥＦ−ＴｕとｅＥＦ１Ａなどのタンパク質伸長因子と結合する。
【００３１】
９．近代的なｔＲＮＡ（位置５４でリボシルチミン）でのＴＬＳヌクレオシドの少なくとも一つは、非リボソームタンパク質の合成を最小限に抑えるためにとりわけ  発展してきた。しかし、特定の変異が位置５４におけるプソイドウリジンの始原的な配置をもつｔＲＮＡを生み出し  、これらの逆戻りは、特定の癌における細胞の形質転換に関与している。
【００３２】
１０．一部又はすべてのレトロウイルスを含むある種のウイルスは、ｎｕｃｌｉｏｎとｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ構造を偽造し、おそらく正常な生物制御システムを潜り抜け、細胞のタンパク質合成機構を乗っ取る。
【００３３】
１１．熱力学的な力だけが、螺旋エンジンのための職工とパワーを供給して、徐々に低いエネルギー状態で段階に応じた高次構造になるように、特定のｎｕｃｌｉｏｎｓを駆動することができます。つまり、始原的なＲＮＡの世界では、ヘリカルＲＮＡのエンジンがリボソームの出現の前にタンパク質合成を先駆けていた。
【００３４】
１２．最初のリボソームは２つのｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットの融合から生じた。現代のリボソームにおけるペプチジル移転センターは、リボソームのＡとＰサイトでアミノアシル化及びペプチジルｔＲＮＡのＣＣＡのテイルが整列する２つのｔＲＮＡのプソイドウリジンループから進化した。
【００３５】
ｔＲＮＡの初期の祖先がｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットであったという認識は、分子生物学における最大の謎の一つで、タンパク質合成の開始（’翻訳’）を解明した。ＷｏｌｆとＫｏｏｎｉｎが（Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｄｉｒｅｃｔ，２：１４）に述べたように、翻訳系の開始は、間違いなく、生命の起源の研究における最も中心でかつ難解な問題であり、それは進化生物学で最も難しい問題の１つである。その問題は明らかなＣａｔｃｈ−２２アスペクトがあります。つまり、ＲＮＡ及びタンパク質の複雑で高度に進化したセットなくしては、高い翻訳忠実度はほぼ達成し難い。しかし、精巧なタンパク質機構は正確な翻訳システムなしで進化可能ではなかった。
【００３６】
簡単に言えば、過去５０年間の極めて重要な分子生物学の質問は、そう、遺伝子が先か？又はタンパク質が先か？となる。この自明のパラドックスに対する驚くべき答えはどちらでもない。始原的なｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ  ＲＮＡ、現代のｔＲＮＡの祖先が先であった。ｎｕｃｌｉｏｎ構造モデルが我々に教授することは、ＲＮＡの世界でのダーウィンの選択が特定のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ  ＲＮＡ（アミノ酸でない）に結合するＲＮＡ遺伝子の進化をもたらし、次いでこのｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ  ＲＮＡがアミノ酸（修飾ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ面がｎｕｃｌｉｏｎ上の選択的優位性に寄与）に結合するための分子アダプタとして進化し、その後ＲＮＡ螺旋エンジンがタンパク質合成を生み出した。リボソームは後に２つのｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ  ＲＮＡの融合から進化した。この予想外の洞察力は、生物の王国（たとえば、翻訳開始の実質的な相違）の間のいくつかの医学的に重要な相違点を説明し、さらに、これらの相違点（たとえば、新しい抗生物質や抗ウイルス薬の設計、開発、製造及び使用）を活用する改良された医学的そして産業的な製品、工程、サービスの設計、開発、製造及び展開のための新しいプラットフォーム技術としての本発明のいくつかの実施形態を支持する。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎ構造や製造方法は、当業者には驚くべきものである。例えば、いくつかの実施形態において、３７℃での製造されたｎｕｃｌｉｏｎｓの収量は８°Ｃの同じ製造手順で観察されたｎｕｃｌｉｏｎ収率よりも相当高い。このより高い収率は今やｎｕｃｌｉｏｎｓの四次構造に関連した相乗熱力学にとりわけ起因している。しかし、この発明が教示するｎｕｃｌｉｏｎ技術の出現前では、温度上昇に伴い展開したり不安定になる三次核酸構造の観察に慣れている一般の分子生物学者には、この技術的な現象は予測不能でした。
【００３８】
［定義］
以下の単語又はフレーズは、本明細書において使用される場合、本セクションで定義された意味を有するものとする。頭文字が大文字か否か、単語若しくはフレーズが、単数で使用されているか、又は若しくは複数で使用されているか、又は又は異なる時制で用いられているかに関わらない。本セクションの定義と、本明細書中の他の定義、理解又は又は示唆との間で矛盾がある場合、本セクションの定義を適用するものとする。特許請求の範囲において、本セクションで定義された単語又はフレーズが使用される場合、その単語又はフレーズは、当該単語又は又はフレーズに関連し、かつ矛盾しない一切の追加情報と共に、本セクションの定義に従って解釈されるものとする。
【００３９】
アミノ酸：
実施形態本明細書中、いくつかの実施形態で用いられる用語“アミノ酸”は、ポリペプチド鎖に組み込むことができる任意の化合物及び／又は物質又はを意味する。いくつかの実施形態では、アミノ酸は一般式Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−ＣＯＯＨを有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸は天然に存在するアミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は合成アミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸はＤ−アミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸はＬ−アミノ酸である。“標準アミノ酸”又は又は“天然アミノ酸”は、天然に存在するペプチドで共通に見つかる２０個の標準Ｌ−アミノ酸のいずれかを意味する。“非標準アミノ酸”は、合成により調製されたもの、又は又は天然源から得られたものかどうかに関係なく、標準アミノ酸以外のアミノ酸を意味する。本明細書で使用する場合、“非天然アミノ酸”は、化学的に製造されたアミノ酸、又は修飾されたアミノ酸を包含し、これに限定されるものではないが、塩類、誘導体（アミド等）及び／又は置換体を含む。又は又はアミノ酸（ペプチドのカルボキシ末端及び／又はアミノ末端にあるアミノ酸を含む）は、又はメチル化、アミド化、アセチル化及び／又はアミノ酸の活性悪影響を与えることなくペプチドの循環半減期を変化できる他の化学基による置換又はにより修飾できる。アミノ酸は、ジスルフィド結合、並びに及び他の分子内及び及び分子間結合に関与することができる。用語“アミノ酸”は、“アミノ酸残基”と同じ意味で使用されており、遊離アミノ酸、ペプチドのアミノ酸残基、又は又は核酸、リボキャプシド、ヌクリオン又はこれらの成分に又は結合したアミノ酸複合体であってもよい。この用語が、遊離アミノ酸、ペプチド残基、又は核酸、リボキャプシド、ヌクリオン若しくはこれらの成分に結合したアミノ酸に言及しているか否かは、この用語が使用されている文脈から明らかになるであろう。
【００４０】
会合：
本明細書において、用語“会合”及び“会合した”とは、任意の直接的又は間接的な共有結合性又は非共有結合性の相互作用によって結びつけられている又は又は２以上の要素の状態を意味します。いくつかの実施形態では、会合が共有結合性である。いくつかの実施形態では、共有結合性の会合は、リンカー部分によって媒介される。いくつかの実施形態では、会合は非共有結合性（例えば、電荷相互作用、親和性の相互作用、金属配位、物理吸着、ホスト−ゲスト相互作用、疎水性相互作用、ＴＴのスタッキング相互作用、水素結合相互作用、ファンデルワールス相互作用、磁気的相互作用、静電相互作用、双極子−双極子相互作用等）である。
【００４１】
基本ヌクリオン（ｎｕｃｌｉｏｎ）：
本明細書において、用語“基本ヌクリオン”は、ヌクリオンエンベロープを有しないヌクリオンを意味する。用語“基本ヌクリオン部分”は、ヌクリオンのヌクリオンエンベロープ内のヌクリオンの部分を意味する。特に、基本ヌクリオン部分は、いかなるヌクリオンエンベロープを含まない。
【００４２】
結合（又は結合する又は結合した）：
本明細書において、用語“結合”“結合する（ｂｉｎｄ）”、“結合する（ｂｉｎｄｓ）”、“結合した”は、任意の物理的、化学的、共有結合性、非共有結合性、イオン性、静電的、エントロピー性、水素結合、スタッキング、双極子−双極子、溶媒、ファンデルワールス力、電荷、親和性、金属配位、物理吸着、ホスト−ゲスト、疎水性、塩基のスタッキング、熱的、磁気的、若しくはその他の相互作用、若しくはこれらの任意の組み合わせ、又はこれらの任意の混成により、２個以上の原子、化合物、分子、高分子、複合体、凝集体、キレート、物質、材料又は表面の会合又は接続を意味する。
【００４３】
コア核酸：
本明細書において、用語“コア核酸”は、大部分が核酸である組成物を意味し、当該組成物を少なくとも１つのリボキャプシド（ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ）へ結合させる手段を含む。いくつかの実施形態では、“コア核酸”は、一つのリボキャプシドのみに結合できる組成物を意味する。いくつかの実施形態では、““コア核酸“は２つ以上のリボキャプシドに結合できる組成物を意味する。
【００４４】
コア核酸調製物：
本明細書において、“コア核酸調製物”は組成物（方法又は工程ではない）を意味し、天然のコア核酸、非天然のコア核酸、複数の天然のコア核酸、複数の非天然のコア核酸、均質なコア核酸、非均質なコア核酸、この群の任意の要素の溶液、この群の任意の要素の固体形態、この群の任意の要素の液体形態、この群の任意の要素のエアロゾル形態、この群の任意の要素の製剤、この群の任意の要素を含有する混合物、この群の２種以上の要素の任意の混合物、この群の２種以上の要素の任意の組み合わせ、この群と２種以上の要素の任意の混成物、を含む群から選択される要素の調製物を意味する。
【００４５】
エンベロープされたヌクリオン：
本明細書において、用語“エンベロープされたヌクリオン”は、１つ以上のヌクリオンエンベロープによって、又は１つ以上のヌクリオンエンベロープで全体、一部、又は複数の部分において、封入された、被膜された、囲まれた、被覆された、保護された、箱入された、覆われた、処理された、カプセル化された、又は会合されたヌクリオンを意味する。
【００４６】
エンベロープされたヌクリオン調製物：
本明細書において、用語“エンベロープされたヌクリオン調製物”は、１つ以上のエンベロープヌクリオンを含むヌクリオン調製物を意味する組成物（方法又は工程ではない）である。
【００４７】
エンベロープされたｔＲＮＡヌクリオン調製物：
本明細書において、用語“エンベロープされたｔＲＮＡヌクリオン調製物”は、１つ以上のエンベロープされたｔＲＮＡヌクリオンを含むヌクリオン調製物を意味する組成物（方法又は工程ではない）である。
【００４８】
エンベロープされたリボキャプシド（ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ）：
本明細書において、用語“エンベロープされたリボキャプシド”は、ヌクリオンエンベロープを含むがこれに限定されるものではない、エンベロープによって、又はエンベロープで全体、一部、又は複数の部分において、封入された、被膜された、覆われた、処理された、カプセル化された、又は会合されたリボキャプシドを意味する。
【００４９】
エンベロープされたｔＲＮＡヌクリオン：
本明細書において、用語“エンベロープされたｔＲＮＡヌクリオン”は、１つ以上のヌクリオンエンベロープによって、又は１つ以上のヌクリオンエンベロープで全体、一部、又は複数の部分において、封入された、被膜された、囲まれた、被覆された、保護された、箱入された、覆われた、処理された、カプセル化された、又は会合されたｔＲＮＡヌクリオンを意味する。
【００５０】
均質：
本明細書において、用語“均質”は、調製物、溶液、中間体、産物、抽出物、単離物、画分、混合物、又は分子、複合体若しくは構造の集合（例えば、ヌクリオン中のリボキャプシド又はリボキャプシドサブユニットの集合）の、１以上の所与の特性（組成物、構造、配置、配列、三次構造、又は別のパラメータを含むがこれらに限定されない）の均等度を意味する。いくつかの実施形態で、１つの特性に関して、組成物間で、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％が同一であるとき、組成物の集合が“均質”であると認められる。いくつかの実施形態で、１つの特性に関して、組成物間で、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％で同じクラスの組成物における組成物と似ていないとき、組成物の集合が“均質”であると認められる。例えば、いくつかの実施形態では、ｔＲＮＡヌクリオンの調製物が、調製物中のヌクリオンの少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％が、ｔＲＮＡリボキャプシドサブユニット分子のコア核酸分子に対する比に関して、実質的に同じ所与の比を有する場合に、“均質”であると認められる。
【００５１】
不均質：
本明細書において、“不均質“という用語は、調製物、溶液、中間体、産物、抽出物、単離物、画分、混合物、又は分子、複合体若しくは構造の集合の１以上の所与の特性（組成物、構造、配置、配列、三次構造、又は別のパラメータを含むがこれらに限定されない）に関して、均質性がないことを意味する。
【００５２】
相同性：
本明細書において、用語“相同性“及び“相同“は、生物学的高分子間、例えば核酸分子間（例えば、ＤＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子）、及び／又はポリペプチド分子間、の全体的な関連性を意味する。本明細書において、用語“相同体”は、別の組成物と相同な組成物を意味する。いくつかの実施形態では、高分子の三次構造が実質的に関連している場合、高分子は“相同“であると考えられる。たとえば、すべてのｔＲＮＡ分子は、個々のｔＲＮＡ間の構造的な相違に関係なく、その全体的なＬ字型の構造のために、構造的に相同であると考えられる。いくつかの実施形態では、高分子の骨格（例えば、いくつかの核酸のホスホジエステル骨格）の三次構造が実質的に関連している場合、高分子は“相同“であると考えられる。いくつかの実施形態では、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％でそれらの配列が同一であれば、巨大分子は互いに“相同“であると考えられる。いくつかの実施形態では、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％でそれらの配列が類似であれば、巨大分子は互いに“相同“であると考えられる。いくつかの実施形態では、１つのピリミジンを別のピリミジンに置換、又は１つのプリンを他のプリンへの置換は、相同性を同程度に維持する。いくつかの実施形態では、未修飾塩基の修飾塩基への置換、修飾塩基の未修飾塩基への置換、又は修飾塩基の別の修飾塩基への置換は、いずれも元の塩基が同一である場合は、相同性を同程度に維持すると考えられる。
【００５３】
同一性：
本明細書において、用語“同一性”は、ポリマー分子間、例えば核酸分子間（例えば、ＤＮＡ分子間及び／又はＲＮＡ分子間）及び／又はポリペプチド分子間、の全体的な関連性を指す。２つの核酸配列の同一性パーセントの計算は、例えば、最適な比較目的（例えば、最適な整列のために第１と第２つ塩基配列の一方又は両方にギャップを導入することができ、そして非同一配列は比較目的のために無視できる）で２つの核酸配列をアラインメントすることで実行することができる。特定の実施形態では、比較目的のために整列される配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、あるいは１００％である。次いで、対応するヌクレオチド位置にあるヌクレオチドを比較する。第１の配列のある位置が第２の配列の対応する位置と同じ塩基によって占められた時、その分子はその位置において同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適な整列のために導入する必要があったギャップの数及びギャップの長さを考慮した、配列により共有される同一位置の数の関数である。配列の比較及び２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成されうる。
【００５４】
開始ヌクリオン（Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｎｕｃｌｉｏｎ）：
本明細書において、用語“開始ヌクリオン（Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｎｕｃｌｉｏｎ“及び“開始ヌクリオン（Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ  ｎｕｃｌｉｏｎ）“は、（ｉ）コア核酸としてｍＲＮＡの少なくとも一部、及び（ｉｉ）１つ以上のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄｓと前記ｍＲＮＡにおける開始コドンの位置又はその近傍で前記ｍＲＮＡに結合する１つ以上のリボキャプシド及び／又は二つ以上のリボキャプシドサブユニットを含むヌクリオンを意味する。いくつかの実施形態では、開始ヌクリオン中のリボキャプシド及び／又はリボキャプシドサブユニットは更に、前記ｍＲＮＡ上の開始マーカー構造（シャイン・ダルガノ配列又はコザック配列を含むがこれに限定されるものではない）に結合する手段を含む。いくつかの実施形態では、開始ヌクリオン中のリボキャプシド及び／又はリボキャプシドサブユニットは更に、リボソームに結合する手段を備えている。さらなる実施形態では、開始ヌクリオンのコア核酸は、ｍＲＮＡの開始コドンに作動可能に連結されたリボキャプシド結合配列及び／又はリボキャプシドサブユニット結合配列を含む。用語“作動可能に連結された“は、ある生物学的構造、組成物、成分又は活性と、他の生物学的構造、組成物、成分又は活性との機能的関係を意味する。いくつかの実施形態では、用語“作動可能に連結された“は、あるヌクリオン、リボキャプシド、リボキャプシドサブユニット、又はコア核酸と、他の核酸配列、他の核酸構造体、又は生物学的活性との機能的関係を意味する。
【００５５】
単離：
本明細書において、“単離“、“単離する“、“単離された“及び“別個の（ｄｉｓｔｉｎｃｔ）”は、それぞれ、物質、組成物、構造体、情報、又は実体を含有する初期混合物が、２以上の画分又は混合物に変換され、そのうちの少なくとも一方において、物質、組成物、構造体、情報、又は実体が濃縮される、プロセス、動作又は状態を意味する。本明細書において“単離された形態で“は、物質、組成物、構造体、情報又は実体が以前の状態又は状況と比べて単離されたことを意味する。いくつかの実施形態では、部分構造に適用した場合、“単離された形態で“という用語は、周囲の構造体から情報的に又は物理的に単離された又は別個の部分構造を意味する。さらに、本明細書において、“単離されたヌクリオン“は、天然の環境から完全に又は部分的に取り出されたヌクリオンを意味することが意図される。例えば、細胞から取り出された、又は精製されたヌクリオンは単離されたものとみなされる。さらにまた、通常それらが形成されないか、又は見いだされない細胞、組織又はマトリックスで見出されるヌクリオンも、本発明の目的においては、単離されたものとみなされる。同様に、合成されたヌクリオンは単離されたものとみなされる。宿主細胞中に含まれる合成されたヌクリオンは、本発明の目的においては、単離されたものとみなされる。一方、“精製された“は本技術分野においてよく理解され、一般的に、ヌクリオンが、緩衝液又は溶剤以外の細胞物質、細胞成分、化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まないことを意味している。“実質的に含まない“とは、新規ヌクリオン以外の別の成分が検出されるないことを意味するとは意図されていない。本発明のヌクリオンは単離又は精製することができる。
【００５６】
ほとんどの（Ｍｏｓｔ）（又はほとんど（Ｍｏｓｔｌｙ））：
本明細書において、用語“ほとんど（Ｍｏｓｔ）“と“ほとんどの（Ｍｏｓｔｌｙ）“は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、及び９９．９％以上、並びに及び１００％を含むが、これに限定されるものではなく、５０％以上を意味する。
【００５７】
ネイティブｔＲＮＡ：
本明細書において、用語“ネイティブｔＲＮＡ“は、天然のｔＲＮＡに見出される構造及び／又は成分と実質的に類似又は相同な構造体及び／又は成分を有するｔＲＮＡを意味する。ここで、ネイティブｔＲＮＡは、別々に定義される天然のｔＲＮＡ又は非天然のｔＲＮＡであってもよい。
【００５８】
核酸：
本明細書において、用語“核酸“は、ヌクレオチドのポリマー又はオリゴマーを意味する。用語“核酸“及び“ポリヌクレオチド“は、置き換え可能である。いくつかの実施形態では、“核酸“は、ＲＮＡ及びＤＮＡを包含する。用語“核酸“及び“ポリヌクレオチド“は、１本鎖及び／又は二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ及びこれらの複合体を含む。さらに、用語“核酸“、“ＤＮＡ“、“ＲＮＡ“及び／又は類似の用語は、核酸アナログ（例えば、ホスホジエステル骨格以外の骨格を有するアナログ）を含む。例えば、当業者において周知で骨格にホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有する、いわゆる“ペプチド核酸は、本発明の範囲に含まれる。用語“アミノ酸配列をコードする塩基配列“は、互いに縮重されている核酸配列及び／又は同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列の全てを含む。タンパク質及び／又はＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含んでもよい。例えば、核酸は、天然の供給源から精製されたり、組換え発現系を用いて製造されたり、オプションで精製されたり、あるいは化学的に合成されてもよい。適当な例として、化学的に合成された分子では、核酸は化学的に修飾された塩基又は糖、修飾された骨格を有するアナログなどのヌクレオチド類似体を含むことができる。本明細書において、用語“核酸配列“は、核酸物質自体も意味し、特定の核酸、つまりＤＮＡ又はＲＮＡ分子などを生化学的に特徴付ける配列情報（５つの基本文字Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ又はＵの間で、例えば、選択した文字の連続）に限定されるものではない。特に断らない限り、核酸配列は、５’から３’の方向で記載される。いくつかの実施形態では、“核酸“又は“ポリヌクレオチド“が含むのは、天然ヌクレオシド（例えばアデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、及びデオキシシチジン）；ヌクレオシド類縁体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオサイミジン、イノシン、ピロロピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニル−シチジン、Ｃ−５プロピニルウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２アミノアデノシン、７ジアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、２−チオシチジン）；化学的に修飾された塩基；生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化塩基、シュードウリジン）；インターカレートされた塩基；ロックされた核酸モノマー；修飾された糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、ヘキソース、及び２’酸素と４’炭素が架橋された変性リボース部分）；及び／又は修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエート及び５’−Ｎ−ホスリンケージ）を含む。本明細書において、用語“核酸“及び“ポリヌクレオチド“はまた、任意の天然又は非天然のヌクレオチド鎖を含み、これに限定されるものではないが、任意の、及びすべての修飾体、誘導体、共役体、変異体、欠失、高次構造、構造体、対称性、ヘリックス、枝、異性体、鏡像異性、同位体、類似体、等価体、置換体、組合せ、代替、機能的等価、代替機能、ペプチド核酸、ロックされた核酸、前駆体、祖先、後継者、分解、合成バージョン、人工的な会合、そして、このような鎖又はそのヌクレオチドの他の組合せ、及びこれらの２種以上の任意の組み合わせ、並びに、これらの２種以上の任意の混成を含む。
【００５９】
ヌクレオシド：
いくつかの実施形態では、用語“ヌクレオシド“は、共有結合（通常、β−グリコシド結合）を介して糖（通常はリボース又は２’−デオキシリボース）に結合した核酸塩基（多くの場合、単に“塩基“と呼ばれる。）を含む天然のグリコシルアミンを意味する。いくつかの実施形態では、用語“ヌクレオシド“は、天然ヌクレオシドの非天然バージョン、修飾体、置換体又は等価体等価を意味する。用語“ヌクレオシド“は、一般的に核酸中の隣接するヌクレオチドを結ぶリンカー部分（例えば、ホスホジエステル結合）は除外される。
【００６０】
ヌクレオチド：
いくつかの実施形態では、本明細書における“ヌクレオチド“という用語は、共有結合（典型的に、β−グリコシド結合）を介して糖（通常はリボース又は２’−デオキシリボース）に結合した核酸塩基（多くの場合、単に“塩基“と呼ばれる。）を含む天然の組成物を意味し、その糖はリン酸基に共有結合的（通常は５−炭素部位を介して、ときには２−炭素又は３−炭素を介して）に結合している。用語“リボヌクレオチド“は、糖がリボースであるヌクレオチドを指し、用語“デオキシリボヌクレオチド“は、糖がデオキシリボースであるヌクレオチドを指す。天然ヌクレオチドは、プリン又はピリミジン塩基のいずれかを含めることができる。いくつかの実施形態では、“ヌクレオチド“という用語は、天然のヌクレオチドの非天然バージョン、修飾体、置換体又は等価体を指す。“ヌクレオチド“という用語は、核酸中の隣接するヌクレオチドを結ぶリンカー部分（例えば、ホスホジエステル結合）を一般的に含む。核酸中の隣接するヌクレオチドの間のリンカー部分は、ヌクレオチドを連結するための任意の化学的メカニズムを含むことができ、ホスホジエステル結合である必要はない。
【００６１】
ヌクリオン（Ｎｕｃｌｉｏｎ）：
本明細書において、用語“ヌクリオン（ｎｕｃｌｉｏｎ）“は、（ｉ）コア核酸、及び（ｉｉ）１つ以上のリボキャプシド（ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄｓ）を含む成分を意味し、当該リボキャプシドは、それぞれが、２以上のリボキャプシドサブユニットのポリマーを含み、かつ当該リボキャプシドサブユニットは核酸を含む。いくつかの実施形態では、（ａ）リボキャプシドサブユニットのほとんどが、コア核酸の少なくとも一部に結合し、及び（ｂ）リボキャプシドサブユニットのほとんどが、１以上の隣接するリボキャプシドサブユニットの少なくとも一部に結合している。いくつかの実施形態では、用語“ヌクリオン（ｎｕｃｌｉｏｎ）“は、１以上のヌクリオンエンベロープを追加的に含む、又は含まない組成物を意味する。いくつかの実施形態では、用語“ヌクリオン（ｎｕｃｌｉｏｎ）“は、ヌクリオンエンベロープを含まない組成物（“基本ヌクリオン”）を意味する。いくつかの実施形態では、用語’ヌクリオン（ｎｕｃｌｉｏｎ）“は、１以上のヌクリオンエンベロープを有する組成物（“エンベロープされたヌクリオン”）を意味する。いくつかの実施形態では、用語“ヌクリオン（ｎｕｃｌｉｏｎ）“は、ｔＲＮＡヌクリオンを意味する。いくつかの実施形態では、用語“ヌクリオン（ｎｕｃｌｉｏｎ）“は、ｔＲＮＡヌクリオン以外のタイプのヌクリオンを意味する。いくつかの実施形態では、用語“ヌクリオン（ｎｕｃｌｉｏｎ）“は１以上のヌクリオンエンベロープの有する、又は有しないすべてのタイプのヌクリオンを意味する。いくつかの実施形態では、用語“ヌクリオン（ｎｕｃｌｉｏｎ）“は、ヌクリオン調製物を意味する。いくつかの実施形態では、用語“ヌクリオン（ｎｕｃｌｉｏｎ）“はエンベロープされたヌクリオン調製物を意味する。
【００６２】
ヌクリオン（Ｎｕｃｌｉｏｎ）成分：
本明細書において、用語“ヌクリオン（ｎｕｃｌｉｏｎ）成分“は、リボキャプシドサブユニット、リボキャプシド、コア核酸、ヌクリオンエンベロープ、及びこれらのいずれか２以上の組み合わせ、並びにこれらのいずれか２以上の混成からなる群より選択される要素を意味する。
【００６３】
ヌクリオン（Ｎｕｃｌｉｏｎ）デバイス：
本明細書において、用語“ヌクリオン（ｎｕｃｌｉｏｎ）デバイス“は、ヌクリオン、及び当該ヌクリオンをデバイスとして機能させるための手段を含む組成物を意味する。いくつかの実施形態では、このようなデバイスは、機械装置や機械である。いくつかの実施形態では、このようなデバイスは、化学的装置である。いくつかの実施形態では、このような装置は、情報を取り扱う、処理する、又は記憶するための手段である。
【００６４】
ヌクリオン（Ｎｕｃｌｉｏｎ）エンベロープ：
本明細書において、用語“ヌクリオン（ｎｕｃｌｉｏｎ）エンベロープ“は、（ｉ）エンベロープ、シェル、筐体、層、膜、表面、周囲、コーティング、覆い、保護、ケース、カバー、処理、カプセル化、これらのいずれか２以上の組み合わせ、又はこれらのいずれか２以上の混成、及び（ｉｉ）ヌクリオンエンベロープを有しないヌクリオンの全体、一部若しくは複数部、又は１以上のヌクリオン成分の全体、一部又は複数部への組成物を結合する手段、を含む当該組成物を意味する。いくつかの実施形態では、このような組成物は、原子、金属、分子、高分子、天然分子、非天然分子、生体分子、生体高分子、タンパク質、酵素、伸長因子、開始因子、合成酵素、抗体、ハプテン、核酸、アプタマー、リボザイム、脂質、リン脂質、炭水化物、化学、複合体、シグナル伝達分子、ホルモン、細胞成分、体成分、組織成分、抗原、免疫物質、複合体、凝集体、物質、天然物質、非天然物質、造影剤、薬剤、治療薬、診断薬、予防薬、三元構造、放射性医薬品、放射性物質、キレート、混合、表面、粒子、小胞、カプセル剤、丸剤、接着剤、賦形剤、アジュバント、コロイド、フィルム、これらのいずれか２以上の組合わせ、これらのいずれか２以上の混成からなる群から選択される項目を更に含んでいてもよい。
【００６５】
ヌクリオン（Ｎｕｃｌｉｏｎ）エンベロープ調製物：
本明細書において、“ヌクリオン（ｎｕｃｌｉｏｎ）エンベロープ調製物“は、天然のヌクリオンエンベロープ、非天然のヌクリオンエンベロープ、複数の天然のヌクリオンエンベロープ、複数の非天然のヌクリオンエンベロープ、均質のヌクリオンエンベロープ、異種のヌクリオンエンベロープ、これらのいずれかの要素の溶液、これらのいずれかの要素の固体形態、これらのいずれかの要素の液体形態、これらのいずれかの要素のエアロゾル形態、これらのいずれかの要素の製剤、これらのいずれかの要素を含む混合物、これらのいずれか２以上の要素の任意の混合物、ここれらのいずれか２以上の任意の組み合わせ、及びこれらのいずれか２以上の要素の任意の混成、を含む群から選択された要素の調製物を意味する組成物（方法又は工程ではない）である。
【００６６】
ヌクリオン（Ｎｕｃｌｉｏｎ）調整物：
本明細書において、“ヌクリオン（ｎｕｃｌｉｏｎ）調製物“は、天然のヌクリオン、非天然のヌクリオン、天然のエンベロープされたヌクリオン、非天然のエンベロープされたヌクリオン、複数の天然のヌクリオン、複数の非天然のヌクリオン、複数の天然エンベロープされたヌクリオン、複数の非天然エンベロープされたヌクリオン、均質ヌクリオン（単複両形）、異種ヌクリオン（単複両形）、均質なエンベロープされたヌクリオン（単複両形）、異種のエンベロープされたヌクリオン（単複両形）、天然のｔＲＮＡヌクリオン、非天然のｔＲＮＡヌクリオン、天然のエンベロープされたｔＲＮＡヌクリオン、非天然のエンベロープされたｔＲＮＡヌクリオン、複数の天然のｔＲＮＡヌクリオン、複数の非天然のｔＲＮＡヌクリオン、複数の天然のエンベロープされたｔＲＮＡヌクリオン、複数の非天然のエンベロープされたｔＲＮＡヌクリオン、均質のｔＲＮＡヌクリオン（単複両形）、異種のｔＲＮＡヌクリオン（単複両形）、均質なエンベロープされたｔＲＮＡヌクリオン（単複両形）、異種のエンベロープされたｔＲＮＡヌクリオン（単複両形）、これらのいずれかの要素の溶液、これらのいずれかの要素の固体形態、これらのいずれかの要素の液体形態、これらのいずれかの要素のエアロゾル形態、これらのいずれかの要素の製剤、これらのいずれかの要素を含む混合物、これらのいずれか２以上の要素の任意の混合物、これらのいずれか２以上の任意の組み合わせ、及びこれらのいずれか２以上の要素の任意の混成、を含む群から選択された要素の調製物を意味する組成物（方法又は工程ではない）である。
【００６７】
ヌクリオン（Ｎｕｃｌｉｏｎ）標的：
本明細書において、用語“ヌクリオン標的（ｎｕｃｌｉｏｎ  ｔａｒｇｅｔ）“は、ヌクリオン部分構造と、ヌクリオンの構造、機能又は活性を阻害、促進、変更又は妨害するための手段とを含む組成物を意味し、ヌクリオン部分構造は、ヌクリオン、ヌクリオンの成分、又はこれらの成分の任意の組み合わせの構造の予め定められた部分を含む。いくつかの実施形態では、そのような構造の予め定められた部分は、一次構造、二次構造、三次構造、四次構造、Ｒ体構造、Ｓ体構造、Ｔ形構造、これらの２以上の要素の任意の組み合わせ、及びこれらの２以上の要素の任意の混成、を含む群から選択される。
【００６８】
ヌクリオン（Ｎｕｃｌｉｏｎ）収率：
本明細書において、用語“ヌクリオン（ｎｕｃｌｉｏｎ）収率“は、ヌクリオンのアセンブリー時にヌクリオンに変換されたコア核酸の割合（％）を意味する。
【００６９】
オリゴマー（又はオリゴマーの）：
本明細書において、用語“オリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）“及び“オリゴマーの（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ）“は、長さに制限がある、繰り返しサブユニットのセットを意味する。ここで、ほとんどのサブユニットがオリゴマーの統合性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）のための十分な構造的相同性を有する。いくつかの実施形態では、ほとんどのサブユニットは、隣接するサブユニット、コア分子又は両方に結合する１つ以上の手段を有する。いくつかの実施形態では、この手段は、非共有結合である。いくつかの実施形態では、この手段は共有結合である。いくつかの実施形態では、この手段は、非共有結合と共有結合の組み合わせである。
【００７０】
ポリマー（又はポリマーの）：
本明細書において、用語“ポリマー（ｐｏｌｙｍｅｒ）“及び“ポリマーの（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ）“は、原理的に長さの制限がない、繰り返しサブユニットのセットを意味する。ここで、ほとんどのサブユニットがポリマーの統合性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）のための十分な構造的相同性を有する。いくつかの実施形態では、ほとんどのサブユニットは、隣接するサブユニット、コア分子又は両方に結合する１つ以上の手段を有する。いくつかの実施形態では、この手段は、非共有結合である。いくつかの実施形態では、この手段は共有結合である。いくつかの実施形態では、この手段は、非共有結合と共有結合の組み合わせである。本明細書において用いられる場合、用語“ポリマー“と“ポリマーの“は、それぞれ、“オリゴマー”及び“オリゴマーの”をも意味する。
【００７１】
分布率トポグラム（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｔｏｐｏｇｒａｍ）：
本明細書において、用語“分布率トポグラム（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｔｏｐｏｇｒａｍ）“は、（ｉ）対象の組成物に関する統計情報と、（ｉｉ）その対象の三次元描写とのプレゼンテーションを意味する。いくつかの実施形態では、“分布率トポグラム“と“ヌクレオシド分布率トポグラム“は、トランスファーＲＮＡ分子の三次構造上のヌクレオシド分布率データのプレゼンテーションを意味する。
【００７２】
タンパク質合成マーカー配列：
本明細書において、用語“タンパク質合成マーカー配列“は、（ｉ）開始コドンの上流、下流又は開始コドンを含む、及び（ｉｉ）タンパク質合成の開始、終了、促進、阻害又は制御のために作動可能に連結されたｍＲＮＡ中の核酸配列を意味する。例えば、タンパク質合成マーカー配列は、シャイン・ダルガーノ配列及びコザック配列を含むが、これらに限定されるものではない。
【００７３】
純粋：
上述のように、他の成分を実質的に含まない場合、物質又は実体は、’純粋（ｐｕｒｅ）’又は’精製された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）’ものである。例えば、特定の物質及び／又は実体が約９０％以上含まれている調製物は、典型的に純粋な調製物であると認められる。いくつかの実施形態では、物質及び／又は実体が、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９．９％純粋である。
【００７４】
リボキャプシド（Ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ）：
本明細書において、用語“リボキャプシド（ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ）“は、２以上のリボキャプシドサブユニットからなるオリゴマー又はポリマーを意味し、当該オリゴマー又はポリマーはコア核酸の全体、一部又は複数部にオリゴマー又はポリマーを結合する手段を含む。いくつかの実施形態では、用語“リボキャプシド（ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ）“は’コア核酸に結合した、連続した隣接するリボキャプシドサブユニットのセットを意味する。いくつかの実施形態では、１つのコア核酸に結合しているリボキャプシドサブユニットのオリゴマー又はポリマーの数を反映して、ヌクリオンは、１又は２以上のリボキャプシドを含み得る。
【００７５】
リボキャプシド（Ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ）サブユニット：
本明細書において、“リボキャプシド（ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ）サブユニット“は、主に核酸である組成物を意味し、当該組成物はコア核酸へ前記組成物を結合するための手段を有し、かつ同じコア核酸に結合した少なくとも１つの隣接するリボキャプシドサブユニットへの前記組成物を結合するための手段を有する。疑義を避けるため、リボキャプシドサブユニットは単一のヌクレオチドでもなく、又はヌクレオシドでもない。
【００７６】
リボキャプシド（Ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ）サブユニット調製物：
本明細書において、“リボキャプシド（ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ）サブユニット調製物“は、天然のリボキャプシドサブユニット、非天然のリボキャプシドサブユニット、複数の天然のリボキャプシドサブユニット、複数の非天然のリボキャプシドサブユニット、均質なリボキャプシドサブユニット（単複両形）、異種のリボキャプシドサブユニット（単複両形）、これらの任意の要素の溶液、これらの任意の要素の固体形態、これらの任意の要素の液体形態、これらの任意の要素のエアロゾル形態、これらの任意の要素の製剤、これらの任意の要素を含む混合物、これらの２以上の要素の任意の混合物、これらの２以上の要素の任意の組み合わせ、及びこれらの２以上の要素の任意の混成、を含む群から選択された要素の調製物を意味する組成物（方法又は工程ではない）である。
【００７７】
対称性：
本明細書において、用語“対称性（ｓｙｍｍｅｔｒｙ）“と“対称な（ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ）“は、２次元又は３次元ユークリッド空間内の等長写像のユークリッド群の部分集合にある幾何学的な対称性を意味する。これらの等長写像は、反射、回転、平行移動、これらの基本的な幾何学的な操作の任意の組み合わせで構成されている。らせん対称性は、回転と平行移動を組み合わせた対称性の例である。例えば、本発明のいくつかの実施形態において、ｔＲＮＡから実質的に構成されたリボキャプシドサブユニットは、前記のＳ形ｔＲＮＡヌクリオンに配置され、いくつかの実施形態では、これらのサブユニットは、コア核酸を通る中心軸の周りにらせん対称性を示す。本明細書において、用語“非対称性（ａｓｙｍｍｅｔｒｙ）“と“非対称の（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ）“は、対称性の欠如を意味する。
【００７８】
トランスファーＲＮＡ：
分子生物学の分野における当業者は、用語“転移ＲＮＡ（ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＲＮＡ）“及び“ｔＲＮＡ“が、メッセンジャーＲＮＡの遺伝コードをタンパク質のアミノ酸のポリマーに翻訳するためのアダプタ分子として機能するリボ核酸を意味しており、そしてこの翻訳が通常リボソームで行われることを、以前から理解している。本明細書において、用語“転移ＲＮＡ“と“ｔＲＮＡ“は、次の群から選択される要素を意味する。アミノ酸付加のないｔＲＮＡ（’非装填（ｃｈａｒｇｅ）ｔＲＮＡ’）、ＣＣＡテイルにアミノ酸付加されたｔＲＮＡ（‘装填（ｃｈａｒｇｅ）ｔＲＮＡ’）、ＣＣＡテイル以外の位置にアミノ酸付加されたｔＲＮＡ、修飾ｔＲＮＡ、選択されたｔＲＮＡ、天然のｔＲＮＡ、非天然のｔＲＮＡ、古細菌のｔＲＮＡ、細菌のｔＲＮＡ、ウイルスのｔＲＮＡ、植物細胞小器官のｔＲＮＡ、真核生物のｔＲＮＡ、細胞質のｔＲＮＡ、ミトコンドリアのｔＲＮＡ、未変性のｔＲＮＡ、非未変性のｔＲＮＡ、装填された（ｃｈａｒｇｅｄ）ｔＲＮＡ、装填されていないｔＲＮＡ、装填不能なｔＲＮＡ、天然アミノ酸が装填されたｔＲＮＡ、非天然アミノ酸が装填されたｔＲＮＡ、標準アミノ酸が装填されたｔＲＮＡ、非標準アミノ酸が装填されたｔＲＮＡ、正しいアミノ酸が装填されたｔＲＮＡ、間違ったアミノ酸が装填されたｔＲＮＡ、アミノ酸を結合するために通常のアシル化を採用した装填ｔＲＮＡ、アミノ酸を結合するために通常のアシル化を採用していない装填ｔＲＮＡ、一つのアミノ酸を装填可能なｔＲＮＡ、一つ以上のアミノ酸を装填可能なｔＲＮＡ、開始ｔＲＮＡ、伸長ｔＲＮＡ、サプレッサーｔＲＮＡ、プライマーとして機能するｔＲＮＡ、酵素合成のためのプライマーとして機能するｔＲＮＡ、リボザイムとして機能するｔＲＮＡ、リボザイムのためのプライマーとして機能するｔＲＮＡ、レトロウイルスプライマーとして機能するｔＲＮＡ、機能亢進性のｔＲＮＡ、減弱性のｔＲＮＡ、正しいアンチコドンを持つｔＲＮＡ、誤ったアンチコドンを持つｔＲＮＡ、３つのヌクレオチドのアンチコドンを持つｔＲＮＡ、３つ以上のヌクレオチドのアンチコドンを持つｔＲＮＡ、リボソームで正常に機能するｔＲＮＡ、リボソームでは正常に機能しないｔＲＮＡ、アミノアシル化合成酵素によって正しく装填されたｔＲＮＡ、アミノアシル化合成酵素によって正しく装填されていないｔＲＮＡ、伸長因子に結合するｔＲＮＡ、伸長因子に結合してないｔＲＮＡ、三重複合体を形成するｔＲＮＡ、三重複合体を形成しないｔＲＮＡ、開始複合体を形成するｔＲＮＡ、開始複合体を形成しないｔＲＮＡ、標識されたｔＲＮＡ、分析用のｔＲＮＡ、診断用のｔＲＮＡ、治療用のｔＲＮＡ、イメージング用のｔＲＮＡ、予防のｔＲＮＡ、ｔＲＮＡワクチン、標準ｔＲＮＡ、放射性ｔＲＮＡ、ｔＲＮＡ放射性医薬品、蛍光標識されたｔＲＮＡ、酵素的に標識されたｔＲＮＡ、ビオチン化ｔＲＮＡ、磁気的に標識されたｔＲＮＡ、造影剤を結合したｔＲＮＡ、造影剤に改変されたｔＲＮＡ、精製ｔＲＮＡ、未精製のｔＲＮＡ、分離されたｔＲＮＡ、分離されていないｔＲＮＡ、単離されたｔＲＮＡ、単離されていないｔＲＮＡ、ｉｎ  ｖｉｖｏのｔＲＮＡ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのｔＲＮＡ、ｅｘ  ｖｉｖｏのｔＲ���Ａ、ｔＲＮＡの調製物、ｔＲＮＡの均質な調製物、ｔＲＮＡの不均一な調製物、天然のｔＲＮＡの結合部位（’ＴＬＳ’）を有するｔＲＮＡ、非天然のＴＬＳを有するｔＲＮＡ、天然のｔＲＮＡコネクタ（’ＴＣ’）を有するｔＲＮＡ、非天然のＴＣを有するｔＲＮＡ、ＴＬＳを有しないｔＲＮＡ、ＴＣを有しないｔＲＮＡ、現代的なｔＲＮＡ、ＣＣＡテイルを有するｔＲＮＡ、ＣＣＡテイルを有しないｔＲＮＡ、ＣＣＡのテイルの一部を有するｔＲＮＡ、ｔＲＮＡの祖先、ｔＲＮＡ前駆体、未成熟ｔＲＮＡ、成熟ｔＲＮＡ、ｔＲＮＡ代謝産物、始原的なｔＲＮＡ、異常なｔＲＮＡ、コンセンサスｔＲＮＡ、複合ｔＲＮＡ、１つ以上の突然変異を有するｔＲＮＡ、一つ以上の天然修飾を有するｔＲＮＡ、１つ以上の非天然の修飾を有するｔＲＮＡ、非天然ヌクレオチド又はヌクレオシドを有するｔＲＮＡ、非天然の修飾塩基を有するｔＲＮＡ、非天然骨格を有するｔＲＮＡ、修飾された骨格を有するｔＲＮＡ、リン酸ジエステル結合の代用で一つ以上のペプチド結合を有するｔＲＮＡ、非天然アミノ酸ステムを有するｔＲＮＡ、非天然ジヒドロウリジンステムを有するｔＲＮＡ、非天然アンチコドンステムを有するｔＲＮＡ、非天然プソイドウリジンステムを有するｔＲＮＡ、非天然ジヒドロウリジンループを有するｔＲＮＡ、非天然アンチコドンループを有するｔＲＮＡ、非天然プソイドウリジンループを有するｔＲＮＡ、修飾されたアミノ酸ステムを有するｔＲＮＡ、修飾されたジヒドロウリジンステムを有するｔＲＮＡ、修飾されたアンチコドンステムを有するｔＲＮＡ、修飾プソイドウリジンステムを有するｔＲＮＡ、修飾ジヒドロウリジンループを有するｔＲＮＡ、修飾されたアンチコドンループを有するｔＲＮＡ、修飾プソイドウリジンループを有するｔＲＮＡ、別の分子が結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ｔＲＮＡ、別の分子に結合したｔＲＮＡ、別の分子に会合したｔＲＮＡ、一次構造を有するｔＲＮＡ、二次構造を有するｔＲＮＡ、三次構造を有するｔＲＮＡ、四次構造を有するｔＲＮＡ、多量体ｔＲＮＡ、二量体ｔＲＮＡ、三量体ｔＲＮＡ、コーティングされたｔＲＮＡ、活性化ｔＲＮＡ、不活性化ｔＲＮＡ、ブロックされたｔＲＮＡ、カスタマイズされたｔＲＮＡ、特殊なｔＲＮＡ、製剤化されたｔＲＮＡ、賦形剤を伴う製剤化されたｔＲＮＡ、安定化されたｔＲＮＡ、架橋されたｔＲＮＡ、乾燥したｔＲＮＡ、凍結乾燥したｔＲＮＡ、溶液中のｔＲＮＡ、ｔＲＮＡ結晶、ｔＲＮＡの粉、ｔＲＮＡのアマルガム、ｔＲＮＡ懸濁液、ｔＲＮＡコロイド、ｔＲＮＡ沈殿物、ｔＲＮＡエアロゾル、ｔＲＮＡ軟膏、ｔＲＮＡ混合物、これらの２以上の要素の任意の組み合わせ、及び、これらの２以上の要素の任意の混成。
【００７９】
ｔＲＮＡヌクリオン（ｎｕｃｌｉｏｎ）：
本明細書において、“ｔＲＮＡヌクリオン（ｎｕｃｌｉｏｎ）“は、少なくとも一つのｔＲＮＡリボキャプシドを有するヌクリオンを意味する。
【００８０】
ｔＲＮＡヌクリオン（ｎｕｃｌｉｏｎ）調製物：
本明細書において、“ｔＲＮＡヌクリオン（ｎｕｃｌｉｏｎ）調製物“は、少なくとも一つのヌクリオンがｔＲＮＡヌクリオンであるヌクリオン調製物を意味する組成物（方法又は工程ではない）である。
【００８１】
ｔＲＮＡリボキャプシド（ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ）：
本明細書において、“ｔＲＮＡリボキャプシド（ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ）“は、少なくとも一つのリボキャプシドサブユニットが、ｔＲＮＡリボキャプシドサブユニットであるリボキャプシドを意味する。
【００８２】
ｔＲＮＡリボキャプシド（ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ）サブユニット：
本明細書において、“ｔＲＮＡリボキャプシド（ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ）サブユニット“は、ほとんどがｔＲＮＡであるリボキャプシドサブユニットを意味する。
【００８３】
ｔＲＮＡリボキャプシド（ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ）サブユニット調製物：
本明細書において、“ｔＲＮＡリボキャプシド（ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ）サブユニット調製物“は、リボキャプシドサブユニットの少なくとも一つがｔＲＮＡリボキャプシドサブユニットである組成物（方法又は工程ではない）である。
【００８４】
トランスファーＲＮＡ
現代的なトランスファーＲＮＡ分子は、メッセンジャーＲＮＡ上の塩基配列情報をアミノ酸のポリマー（このポリマーの伸長につれて、この意味は、徐々にペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド又はタンパク質として）に翻訳するための分子のアダプタとして機能する。各ｔＲＮＡは、タンパク質酵素（アミノアシル化ｔＲＮＡ合成酵素）により、特定のアミノ酸とアミノアシル化（’装填’）される。すべてのｔＲＮＡは、ｍＲＮＡ上の対応する三ヌクレオチドコドンに特異的に結合し、三ヌクレオチドアンチコドンを通常含む（Ｌａｂｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８２，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  ６８９：２３０）。１つのｔＲＮＡ分子は通常のアミノ酸の一種類のみに付着さするが、遺伝コードが同じアミノ酸を指定する複数のコドンを含むので、異なるアンチコドンをもつｔＲＮＡ分子は同じアミノ酸を運ぶかもしれない。与えられたｔＲＮＡの特異性は、’ｔＲＮＡａａａ’又は’ｔＲＮＡａａａ’の形式で、関連するアミノ酸についての参照を含めることによって本書面上で示されており、この  ’ａａａ’はアミノ酸の名前（例、メチオニン）あるいはアミノ酸の標準的な３文字の記号（例、’Ｍｅｔ’又は’ｍｅｔ’は  メチオニン）である。装填された（アミノアシル化）ｔＲＮＡは形式’ＡＡＡ−ｔＲＮＡ’、“ＡＡＡ−ｔＲＮＡａａａ’又は’ＡＡＡ−ｔＲＮＡａａａ“を使用して本書面上でに記載されており、’ＡＡＡ’はｔＲＮＡに接続されているアミノ酸又はアミノ酸の標準３文字の名前である。
【００８５】
現代のリボソームの内部では、コドンに結合する１つのｔＲＮＡ上のポリペプチドは、ポリペプチド鎖が一つのアミノ酸によって拡張されるとすぐに、次のコドン（  ’ペプチジル転移’）に結合するｔＲＮＡ上のアミノ酸に転送されます。すでにポリペプチドを有するｔＲＮＡはリボソームを脱して、再装填のために利用できるようになります。各生物では、２つのクラスのトランスファーＲＮＡ分子、伸長のｔＲＮＡ及びイニシエータｔＲＮＡがあります。ｔＲＮＡ分子の大半を占める伸長ｔＲＮＡは、成長中のポリペプチド鎖にアミノ酸の所定の配達を担当している。イニシエータｔＲＮＡは、ｍＲＮＡ上の開始コドンの認識に関与する特殊なｔＲＮＡ分子であり、この役割を果たすために構造上の最適化した。細菌及び関連真核生物の細胞小器官で、ホルミル基はイニシエーターｔＲＮＡの  ＣＣＡテイルにメチオニンに追加されます。多くの真核生物は、一方で、細胞質イニシエータｔＲＮＡの位置５４のリボシルチミンをアデノシンに変換している。与えられたｔＲＮＡのクラス、つまりイニシエータ又は伸長は、前の段落で定義されたｔＲＮＡの略語で、それぞれ、文字’ｉ’又は’ｅ’を含めることによって、本書面上で示されている。
【００８６】
メッセンジャーＲＮＡに結合する隣接トランスファーＲＮＡ分子間の分子間相互作用の可能性について憶測があったが（Ｗｅｂｂ，  １９７３，  Ａ  Ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  Ｐｓｅｕｄｏ−ｕｒｉｄｉｎｅ，  ｐａｇｅｓ  １−７，  ２０−２３  ａｎｄ  ２２３−２４０  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ．  Ａ  ｔｈｅｓｉｓ  ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  Ｄｏｃｔｏｒ  ｏｆ  Ｐｈｉｌｏｓｏｐｈｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｏｎｄｏｎ  ｂｙ  Ｎｉｇｅｌ  Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｗｅｂｂ，  Ｋｉｎｇ’ｓ  Ｃｏｌｌｅｇｅ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  Ｕ．Ｋ．；  Ｓｃｈｉｍｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ９１：１１２８３）、この憶測はいずれも、本発明のいくつかの実施形態によって教示されるようにｔＲＮＡ分子がｎｕｃｌｉｏｎｓやｒｉｂｏｃａｐｓｉｄｓを形成できることを予測せず、自然界で見られる内部ＲＮＡ結合メカニズムを正しく予測するものでもなかった。ｔＲＮＡ分子の合成四次構造は構築されたが（Ｓｅｖｅｒｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０，  Ｎａｔ．  Ｃｈｅｍ．，  ２：７７２）、しかし、そのような構造が自然界に存在することが示されてはおらず、またｎｕｃｌｉｏｎｓ又はｒｉｂｏｃａｐｓｉｄｓの、これは核酸をカプセル化することができる手段に限定されないが、物理的及び化学的特性あるいは利点を持ち合わせていない。
【００８７】
分子生物学では、典型的な枝分かれのない一次構造、つまりＤＮＡ，ＲＮＡやタンパク質のような未架橋高分子は、その原子組成及びそれらの原子をつなぐ化学結合の仕様です。生体高分子の一次構造は、例えばヌクレオチド又はアミノ酸の、モノマーの化学配列を指定することと等価である。巨大分子の方向は通常一本鎖の末端から末端への化学方向を指します。核酸でヌクレオチド中の炭素原子の命名の化学的な慣例は、数値的に５’末端及び３’末端を生じさせる。５’−末端は、その末端それぞれに、デオキシリボース又はリボースの糖リングにある第五炭素を有するＤＮＡ又はＲＮＡ鎖の末端を指定する。一本鎖の３’末端は、糖リング三番目の炭素の水酸基の終端に起因する名前で、’テイル’として知られている。などの核酸の一本鎖に沿ってた構造物の相対的な位置、つまり遺伝子、コドンと様々な結合部位などは、通常、’上流’（５’−末端方向）又は“下流“（３’−末端方向）いずれかが記載されている。
【００８８】
二次構造は、通常、分子内の水素結合で定義される：タンパク質ではアミド基とカルボキシル基骨格間、核酸では窒素塩基（’塩基対’）のペア間。ＲＮＡの二次構造はしばしば分解（ステム及びループ）され、さらにに分類（例えば、ヘアピン、積み重ねられたステム、ステムループ  、  テトラループ、偽結び目構造）することができる。これらの二次構造要素の多くは、トランスファーＲＮＡなどの生体分子ＲＮＡと機能的に重要である。
【００８９】
Ｎｕｃｌｉｏｎｓとｒｉｂｏｃａｐｓｉｄｓ
本発明のいくつかの実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎｓとｒｉｂｏｃａｐｓｉｄｓは、１つ以上の下記の方法で、特徴づけられ、製造され、試験される。
【００９０】
データマイニング
ｔＲＮＡ分子の構造と成分の保存パターンは、ｔＲＮＡ配列と修飾されたｔＲＮＡ塩基の大量なデータセットから識別される。
【００９１】
コンピュータモデリング
コンピューターモデリングは、ｍＲＮＡに結合した隣接するｔＲＮＡと結果として生じるその構造間の相互作用を定義するために執り行われている。
【００９２】
Ｎｕｃｌｉｏｎ製造
Ｎｕｃｌｉｏｎｓとｒｉｂｏｃａｐｓｉｄｓは、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ及び合成ＲＮＡ分子の複数のタイプを使用した様々な条件下で製造され、試験される。
【００９３】
データマイニング
１つの実施形態では、図３Ａは、本書面上で’ｔＲＮＡｄｂ’（Ｊuｈｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３７：Ｄ１５９）として参照した公開データベースに報告された６２３トランスファーＲＮＡ配列中のヌクレオシドの有病率の我々のデータマイニング研究の結果を提示しており、ここに、すべての生物領域、クラス、特異性と細胞区画（“データマイニング方法とコンピュータモデリング“のための材料及び方法を参照）の天然イニシエータと伸長ｔＲＮＡが含まれている。図３ＡのｔＲＮＡヌクレオシドの番号の位置は、Ｊuｈｌｉｎｇで採択された規則に従っている（この番号付け規則が、ｔＲＮＡのために本書面全体で採用されている）。図３に示されているコンセンサスｔＲＮＡの二次構造では、点線は標準的な塩基対を示すものであり、矢印は（ｉ）プソイドウリジンステム（４９から５３、６１から６５）をもつアミノ酸ステム（１から７、６６から７２）の、（ｉｉ）ジヒドロウリジンステム（１０から１３、２２から２５）をもつアンチコドンステム（２７−３１、３９から４３まで）、の積み重ねを示している。この図における“ヌクレオシド“は、塩基分子及びそれらの任意の修飾の両方が含まれている。ＲＮＡの５’末端から３’末端方向にある特定のｔＲＮＡのヌクレオチドの線形表現は、分子の一次構造を構成しうる。
【００９４】
アミノ酸（“ＡＡ“）、シュードウリジン（’Ｐ’）、アンチコドン（“ＡＣ“）とジヒドロウリジン（’Ｄ’）ステムは図３Ａで標識され、他の場所で、ＡＡ−ステム、Ｐステム、ＡＣステムとＤ−ステムと、それぞれ称されている。本書面全体で、’ａａ’と’’ＡＡ“はアミノ酸の略語として使用されている。図３Ａで標識された他のｔＲＮＡの構造要素が含むのは、アミノ酸の結合部位（７６の隣の円内の“ａａ“）、プソイドウリジンループ（５４から６０、Ｐ−ループ）、アンチコドンループ（３２から３８、ＡＣ−ループ）アンチコドン（緑のボックス内３４−３６）、ジヒドロウリジンループ（１４から２１、Ｄループ）と可変ループ（４４から４７、Ｖループ）である。それ以外で有病のために標識されない限り（下記参照）、１から７６までのラベルの付いた７６箇所は、通常、ヌクレオチド及びＯ（占有）によって占有されている。これとは対照的に、２３カ所（０、１７ａ、２０ａ、２０ｂ、ｅ１−５、ｅ１１−１７、ｅ２１−２７）は、通常は占有されてなく、Ｅ（追加用）標識が付いています。
【００９５】
図３Ａの黄色のボックスは、１ヌクレオシド群（Ｇ、Ａ、Ｃ又はＵ）が、それらのいずれかの修飾と合わせて、分析した６２３配列内で９０％以上のヌクレオシド有病（ＳＰ）のある位置を示すしている。このような黄色のボックス内の通常書体又はイタリック体の文字が示すのは、それぞれ、（ｉ）その位置（Ｇ、Ｃ又はＵ）で９０％以上のＳＰのヌクレオシド群、又は（ｉｉ）その位置（ＰやＴ）で５０％以上のＳＰの修飾ヌクレオシドである。青色のボックスは、ヌクレオシドクラス（プリン又はピリミジン）は以上の９０％のＳＰを持っている位置を示します。このような青いボックス内の通常書体又はイタリック体の文字が示すのは、それぞれ、（ｉ）は、それぞれ、その位置（プリンのためのＲ、ピリミジンためのＹ）で９０％以上のＳＰのヌクレオシドクラス、又は（ｉｉ）その位置（変更されたアデノシンのＨ）で５０％以上のＳＰの修飾ヌクレオシドである。２０位のＤは、その位置で５０％以上のＳＰとジヒドロウリジンを示す。図３Ｂは、図３Ａに使用されるヌクレオシド有病の記号及びヌクレオシドの略語表である。特定のヌクレオシドは関連データがそのようなヌクレオシドの基本及び修飾形態の両方に言及したデータであることを示すために星印が付いている。
【００９６】
４つの二本鎖ＲＮＡのヘリックスで合計２１塩基対のために、ＡＡ−、Ｐ−、ＡＣとＤ−ステムには、それぞれ通常７、５、５、４塩基対ある。ヌクレオシド、ヌクレオシドクラスとらせん構造の高水準の保存は、これらの６２３の配列によって表されるすべての生物領域、ｔＲＮＡのクラス、アミノ酸特異性と細胞区画にわたって実質的に観察される。
【００９７】
コンピュータモデリング
巨大分子の三次構造は、好ましくは原子座標によって定義された一本鎖の三次元構造体である。１つの実施形態で、図４Ａで示しているのは、ｔＲＮＡ結晶からのＸ線回折により決定され報告された１０種のｔＲＮＡの三次構造が、分子の右側（この文書全体を通して、’右’はｔＲＮＡを３’−テイルから見たときで、ＡＣ−ステムは下方）から重ね合わせて観察した我々のコンピュータモデリング研究の結果である。図４Ｂは、図４Ａに示したものと同じ構造の３’−テイルに遠位側からの眺めである。図４Ｃは、図４Ａ及び図４Ｂで説明した構造体のカラーキーやその他の情報を提供している。
【００９８】
ｔＲＮＡの二次構造の初期の解析による示唆された、すべての生物の領域間でのｔＲＮＡ構造保存の顕著な水準は、ｔＲＮＡ三次構造の比較でも裏付けられた。現在までに決定された全てのｔＲＮＡの結晶構造において、アンチコドンとジヒドロウリジンステムヘリックスは互いに重なり合う間に、アミノ酸ステムとプソイドウリジンステムヘリックスは互いに重なり合い、。この保存されたＬ字型のｔＲＮＡ構造のエルボーは、主にプソイドウリジン（ＯＫ）とジヒドロウリジンループ間の分子内相互作用によって形成される。
【００９９】
四次構造は三次構造の２つ以上の巨大分子の定義された組織である。これまでに報告された天然四次構造の大部分は、タンパク質分子（例：ヘモグロビン、筋肉フィラメント）、あるいは核酸（例：リボソーム、ウイルス）をもつタンパク質分子の組み合わせです。これらのすべての四次構造は水素結合、ファンデルワールス力と静電気力の組み合わせにより一緒に保持されている。用語’四次順’は、ＤＮＡがヒストンと複合体を形成しているクロマチンにある高水準の組織のＤＮＡに適用された。リボソーム内の別のＲＮＡユニットとスプライソソーム間の相互作用は、また、核酸四次構造として記述されているが、すべてではないが、これらの複合体のほとんどはタンパク質を含む。核酸の二重らせん以外で、核酸のみから構成されるいくつかの天然な四次構造が、現在までに報告されている。特定のアプタマーは、複数のＲＮＡ分子の四次構造であるが、これらのＲＮＡはｎｕｃｌｉｏｎｓの特徴であるオリゴマー又はポリマーサブユニットとｒｉｂｏｃａｐｓｉｄシェルを持っていない。
【０１００】
コンピュータモデリングは（インシリコ研究）ｔＲＮＡ分子の２次構造、３次構造を予測し、決定するために使用されている（参照例、米国特許出願公開２０１１／０１１２８１７）が、本発明のいくつかの実施形態により教授されたｎｕｃｌｉｏｎ又はｒｉｂｏｃａｐｓｉｄの構造を得るコンピューターモデリング研究の報告や請求はない。
【０１０１】
内部ｔＲＮＡ結合部位
１つの実施形態では、図５Ａは、９０％以上のグローバルヌクレオシド有病（’ＧＳＰ９０’）を持つ１５のｔＲＮＡヌクレオシドは酵母ｔＲＮＡＰｈｅの三次構造に提示されているヌクレオシド有病トポグラムです（Ｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ、２０００、ＲＮＡ、６：１０９１）。図５Ｂは、図５Ａのヌクレオチドにカラーキーを提供している。このトポグラムは、単なるヌクレオシド型（プリン又はピリミジン）ではなく、個々のヌクレオシドの有病を報告している。
【０１０２】
ｔＲＮＡのこれら１５ＧＳＰ９０ヌクレオシドは、４つの保存地帯に位置しており、そのうちの２つは機能についてよく報告されており、アンチコドンループと３’ＣＣＡテイルがアミノ酸ステムに付着している。高度に保存されたＣＣＡのテイルは、タンパク質合成へのｔＲＮＡの調整のための特定のアミノ酸で（’アミノアシル化’）エステル化されており、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄのｔＲＮＡコネクタ（ＴＣ）としての役割を果たし、そして通常、同じｍＲＮＡに結合する５’の隣接ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ  ｔＲＮＡのｔＲＮＡリンク部位に結合する。
【０１０３】
１５のうち１１のほとんどのＧＳＰ９０ヌクレオシドがｔＲＮＡのエルボーの領域にある。これらの１１ＧＳＰ９０ヌクレオシドの３つ（ＤループからＡ１４とＡ２１とＡＡ−ステムとＤ−ステムの間のＵ８、）が、エルボー（’ＡＵＡトリプル’）の塩基で平面トリプル構造を形成し、ｔＲＮＡ分子が特定の状況下でその構造を調整するようである。
【０１０４】
１つの実施形態では、１１のエルボーヌクレオシドの８は、９つのヌクレオチド（図６Ａに示されている）から構築された実質的に五層積み重ね内で一緒に配置されている：Ｐ−ループから６つのＧＳＰ９０ヌクレオシド（Ｇ５３−Ｔ５４−Ｐ５５−Ｃ５６、Ａ５８、Ｃ９３）、Ｄループ（Ｇ１８−Ｇ１９）から２つのＧＳＰ９０ヌクレオシド、及び１つのＰＳＰ９０プリン（Ｒ５７）、さらにＰ−ループからも含む。図６Ｂは、図６ＡのＴＬＳのどのヌクレオシドが他のＴＬＳヌクレオシドへの塩基対となり、及びその方法（“ワトソン・クリック“は、標準的な塩基対を示し、“その他“は塩基対のＨｏｏｇｓｔｅｅｎ又は他のタイプを示す）を示している。図６Ｃは、図３Ａで定義されている略語を使用して、図６ＡのＴＬＳのヌクレオチドにカラーキーを提供しているしている。ｔＲＮＡのエルボーの９のヌクレオチドの積み重ねは、通常３’−隣接ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ  ｔＲＮＡのＣＣＡテイルを結合するｔＲＮＡのリンクサイトの活性中心である。このｔＲＮＡリンクサイトにおけるヌクレオシドの種類はすべての生物学領域にまたがり高度に保存されているだけでなく、その高次構造もまた高度に保存されている。４０年以上当業者の理解されていたことは、ｔＲＮＡのヌクレオチド配列の主な役割Ｇ５３−Ｔ５４−Ｐ５５−Ｃ５６は、リボソーム（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，  １９６９，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２２３：３４７）に特異的に結合することであったので、内部ｔＲＮＡリンクの本発明といくつかの実施形態の発見は予期さていなかった。
【０１０５】
１つの実施形態で、図７Ａは、前述の図４Ａで比較した報告された１０のｔＲＮＡ構造でこれらＴＬＳヌクレオチドの拡大図である。図７Ｂは図７Ａで説明した構造体のカラーキーやその他の情報を提供しています。一つの例外を除いて、これら構造体のこれらＴＬＳヌクレオチド中の原子の位置は、実質的空間に固定されている。９つの同調構造は、３種（酵母フェニルアラニン、アスパラギン酸、牛リジンと人間のセレノシステインｔＲＮＡ）からの大腸菌由来の細菌イニシエータメチオニンｔＲＮＡと真核生物由来の伸長ｔＲＮＡが含まれていることを考えると、この観察結果は注目に値する。全伸長  ｔＲＮＡにあるＴＬＳ及びＴＣ結合部位の構造の標準化により、そして保存された形状（限りｎｕｃｌｉｏｎの形成に影響を与える限り）を持つｔＲＮＡ分子を使用することにより、成分ｔＲＮＡと関連アンチコドンがメッセンジャーＲＮＡ上のコドンによって特異的にプログラムされた必須アミノ酸に応じて変化させる間に、生物は均一なｒｉｂｏｃａｐｓｉｄｓを会合できる。
【０１０６】
図７Ａの１つの実質的な構造の例外は、酵母開始ｔＲＮＡです。酵母は、多くの真核生物のための典型であり、その細胞質イニシエータｔＲＮＡでＴ５４をアデノシンに置換しており（Ｋｏｌｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ２１：５８４）、それ故に、観測された空間的な不一致である。後述するように、真核生物において、この非定型アデノシンは、ｎｕｃｌｉｏｎ構造の調節とｍＲＮＡの開始コドンに関連するフラグにおいて重要な役割を果たしている。イニシエータｔＲＮＡは選択したＴＬＳ及びＴＣの結合部位を静止でき、それによって、正確にｒｉｂｏｃａｐｓｉｄセグメントを中断し、異なるｎｕｃｌｉｏｎフラグ構造を持つ開始コドンを標識するための強力なメカニズムを提供することができる。
【０１０７】
ｎｕｃｌｉｏｎｓとｒｉｂｏｃａｐｓｉｄｓの発見、本発明の実施形態の前は、核酸、ｔＲＮＡと他の分子との間の結合や複合体形成の実験が数例報告（参照、米国特許例の番号第７９０２１６９、７７４５５９４、７０４９４３１、５８２１０５２、及び米国特許出願公開２０１０／００５６７６８、２０１０／００１６４０９、２００８／００２６３８９、２００５／０２６６４１６、２００４／０１５７３０４）されており、それらはｔＲＮＡのアンチコドンのｍＲＮＡと相補的なコドンへの結合や他のｔＲＮＡの相補的なコドンへの結合を含むがその限りでない。しかし、高分子ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ形成につながるｔＲＮＡ分子上でＴＬＳとＴＣのサイト間の内部ｔＲＮＡ結合を調べるような報告された研究や特許請求の範囲はない。
【０１０８】
Ｔ−形ｎｕｃｌｉｏｎ
１つの実施形態において、図８Ａは、ｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎ（“Ｔ形’が指定）の１つの立体構造の典型的な繰り返し構造にある隣接するｍＲＮＡコドンに結合した２つのｔＲＮＡ分子のコンピュータモデル（“データマイニング方法とコンピュータモデリング“のための材料及び方法を参照）を示している。図８Ｂは、図３Ｂで定義されている略語を使用して、図８Ａでヌクレオチドにカラーキーを提供しているしている。
【０１０９】
３’ｍＲＮＡ（下流）方向（青）にあるｔＲＮＡ上のＴＣにおけるアミノアシル化ＣＣＡは、５’−隣接（上流）のｔＲＮＡ（暗緑色）でＴＬＳに結合する。ＴＬＳの左右両側には、配列Ｔ５４−Ｐ５５−Ｃ５６（黄色）とＧ１８−Ｇ１９（シアン）で、それぞれ標識されています。ｍＲＮＡの（オレンジ）は、破線で表示されているｎｕｃｌｉｏｎ軸に近接しています。これ以降のｎｕｃｌｉｏｎｓのコンピューター・モデルでは、酵母ｔＲＮＡＰｈｅ  の結晶構造（例えば、構造体の対応するコドンループの高次構造は“Ｌ型“として指定される）を用いた。フェニルアラニン分子（赤）は、ＣＣＡテイル（ラズベリー）へのアミノアシル化構造物の可視化と分析を容易にするモデリングのためにに、ＰｙＭＯＬコンピュータ・ソフトウェアのビルド機能を使用して追加された（ＰｙＭＯＬ  ｂｙ  Ｓｕｒｈｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ＶＤＭ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｈｏｕｓｅ，  ２０１０）。しかしながら、Ｘ線構造解析から報告されたテールの設定は保持されていた。実際には、このＣＣＡのテイルは非常に柔軟であることが知られている。その結果、生体内での可能なＣＣＡの構成は、これ以降のコンピューター・モデルに示されているよりもＴＬＳサイトに近い。
【０１１０】
Ｔ−形ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄリピートでのｔＲＮＡは、３’ｍＲＮＡの方向の各アンチコドン（色光緑）、５’ｍＲＮＡの方向のそれぞれのＣＣＡテイル（有色のラズベリー）で、表示された軸に対して右巻き螺旋で繰り返される（以後、５’及び３’はｍＲＮＡの向き意味する）。各ｔＲＮＡのＡ７６は５’方向で隣接するｔＲＮＡのＴＬＳの右側に配置されます（’右’は、ｔＲＮＡのＡＡ−ステムから見た時で、アンチコドンを下方）。ｔＲＮＡ毎のｔＲＮＡ螺旋回転（〜９８±１０°）は、実質的に正規のＡ−形ＲＮＡ（９８°）における３つのヌクレオチドのことですあるが、ｔＲＮＡ毎のＴ形の螺旋上昇（Ａ−ＲＮＡにおける３つのヌクレオチド；〜１５±３Å対〜８．４Å）は異なる。このドキュメント中では、シンボル’〜’はおよそを意味します。
【０１１１】
１つの実施形態では、図９Ａに５’方向からｎｕｃｌｉｏｎ軸上の視線で、３つのそのようなｔＲＮＡのコンピュータモデルである。図９Ｂは、図３Ｂで定義されている略語を使用して、図９Ａのヌクレオチドにカラーキーを提供しているしている。それぞれのｔＲＮＡのジヒドロウリジン部分は、おそらく、ＴＣ−ＴＬＳのリンク特異性を高めるために、ＴＣ及びＴＬＳのサイト間の分子間の静電絶縁体としてＤＨＵｓの役割と一致し、３’−隣接ｔＲＮＡ上のアミノアシル化ステムに隣接している。
【０１１２】
別の実施形態では、図１０Ａは、Ｔ−形ｎｕｃｌｉｏｎにある１０のそのようなＬ−形ｔＲＮＡのコンピュータ・モデルを示しています。立体干渉が軸圧縮のこのレベルでは観察されなかったので、原理的には、その長さには幾何学的な限界が実質的には存在しないが（従って、Ｔ形ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄにおけるｔＲＮＡサブユニットは“高分子“とみなされる）、ただし、その熱力学安定性が特定の環境条件の下で実際にその長さを制限することがある。図１０Ｂは図３Ｂで定義されている略語を使用して、図１０Ａでヌクレオチドにカラーキーを提供している。
【０１１３】
このＴ形ｎｕｃｌｉｏｎ内に隣接するｔＲＮＡ間の全体的な安定感は良好だが、しかし、いくつかの空間が軸方向のｔＲＮＡの間に残っている。このｒｉｂｏｃａｐｓｉｄにおけるＬ形ｔＲＮＡがらせん構造で配置されているが、Ｔ形ｎｕｃｌｉｏｎにおける各ｔＲＮＡのためのコドンとアンチコドンは、別の実施形態では、図１１に示すように、隣接したｔＲＮＡのものとは積み重ならない。
【０１１４】
酵母ｔＲＮＡＰｈｅの結晶に見られるのＡＣループＬ−立体配座では、隣接したＡＣ−ステム間の潜在的な立体干渉が、このＴ−形ｎｕｃｌｉｏｎにおけるｔＲＮＡの大きい軸方向の圧縮を防ぐ。このコドンは、軸外アンチコドンと、ｎｕｃｌｉｏｎ軸に近い。そのアンチコドンのみが、相互ではなく、その親のｔＲＮＡ内に積層されている。このＴ形ｎｕｃｌｉｏｎのコドンは互いに積み重ねられない。
【０１１５】
Ｓ−形ｎｕｃｌｉｏｎ
第２のｔＲＮＡのアンチコドンループの高次構造（“Ｋ−形“）の証拠は、溶液中の大腸菌ｔＲＮＡＰｈｅ（Ｃａｂｅｌｌｏ−Ｖｉｌｌｅｇａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３３：６９６１）のＮＭＲ研究に由来し、この研究が、ヌクレオチド３２から３３と３７から３８は、アンチコドンステムの下で互いに向かい合って積み重なることを示唆している。本発明の１つの実施形態では、この第２のＡＣループの高次構造の我々のコンピュータのモデル（図１２Ａ）は、ｔＲＮＡステムから解離した３つのアンチコドンヌクレオチド３４から３６を示しており、ｔＲＮＡ結晶構造のＸ線測定から報告された一般的なＬ型のＡＣ−ループ構造に見られるＡＣステムの３  ’側の下に積み重ねられたアンチコドンとは対照的である（図１２Ｂ）。ｔＲＮＡ構造上のマグネシウム濃度の効果の研究はまた、複数のコドンループを指摘し（Ｂｕｊａｌｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２５：６３６５）、全体のｔＲＮＡの三次構造がマグネシウム依存性であることを示唆する（Ｆｒｉｅｄｅｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ３６：６０９０）。蛍光標識されたｔＲＮＡ上の修飾塩基を用いた温度上昇動態は、アンチコドンループは柔軟かつ、コドンの結合で高次構造を変化することを示す（Ｙｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７５，  Ｊ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．，  ９９：  ５０７）。電気泳動の研究はまた、アンチコドンループの複数の高次構造を示唆している（Ｐｉｅｃｚｅｎｉｋ，  １９８０，  Ｊ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  １３８：８９７）。従って、それらの物理的や化学的環境に応じて、ＡＣループが複数の構造やそのような高次構造の混成を採用できることは、とりわけ。ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄｓとｎｕｃｌｉｏｎｓにおけるｔＲＮＡの関与を容易にするためである。
【０１１６】
１つの実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎのＡＣループのＫ−形の採用は、それぞれのｔＲＮＡの近隣のそれらとコドンとアンチコドンの両方を積み重ね、標準Ａ形ＲＮＡ螺旋のものと実質的に類似の寸法を有する螺旋コア構造を形成する（図１１）。結果として得られる圧縮ｎｕｃｌｉｏｎ（“Ｓ−形’と指定）の低エネルギー状態では熱力学的に望ましいあまり積み重ねてないＴ形であり、ＬからＫ形へのアンチコドンループ遷移とＴ−形からＳ形ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄの併用へ自動遷移を促進する。Ｔ−形ｎｕｃｌｉｏｎでは、Ｌ形のアンチコドンがＡＣ  ステム（隣接するアンチコドンを伴わず）の下に積層されており、保存されたウリジン３３は弾き出され、修飾されたプリン３７は部分的に積層され、コドンのいずれもその近隣とは積み重ねていない。Ｓ−形ｎｕｃｌｉｏｎでは、各Ｋ−形アンチコドンは親ｔＲＮＡの代わりに隣接するアンチコドンと主に積み重なり、しかし、Ｕ３３とＲ３７は今親のｔＲＮＡと積み重らず、隣接するコドンも積み重ねられている。このＳ−形ｎｕｃｌｉｏｎは、Ｔ−形ｎｕｃｌｉｏｎ  や二重らせんにある塩基以上にｔＲＮＡ毎の合計積み重ね塩基を生成する。一度、ｔＲＮＡがｍＲＮＡに結合し、それらのＴＬＳ接続がＴ−形ｎｕｃｌｉｏｎを整列させると、この熱力学的な相違が、どんな上流の幾何学的な制約なしに、Ｔ−形からＳ−形にｎｕｃｌｉｏｎ遷移を自動的に駆動できる。
【０１１７】
１つの実施形態では、図１３Ａは、全てのコドンとアンチコドンがその近隣のｔＲＮＡと積み重なるＳ−形ｎｕｃｌｉｏｎにある４つの  Ｋ−形アミノアシル化ｔＲＮＡのコンピュータモデルを示している。図１３Ｂは、図３Ｂに定義されている略語を使用した図１３Ａ中のヌクレオチドにカラーキーを提供している。ｔＲＮＡあたりのヘリックスターンの結果は〜９８°（Ａ−ＲＮＡとＴ−形ｎｕｃｌｉｏｎは実質的に同じ）ですが、ｔＲＮＡのあたり螺旋上昇は現在〜８．４Å（〜１５±３  Ａ、Ｔ−形に対して）、Ａ−ＲＮＡらせんの３つのヌクレオチドではそれらは同程度。Ｓ形転移に対するＴ形の一次構造の影響は、ｍＲＮＡ周りのｔＲＮＡの圧縮近くになる、ｎｕｃｌｉｏｎの〜４５％軸圧縮です。Ｓ形ｎｕｃｌｉｏｎでは、ＴＬＳへのアミノアシル化Ａ７６の進入角度は、Ｔ形のものとほぼ同様である。推定Ｔ−  Ｓ遷移への立体障害は、コンピュータモデリング研究で全く不明であった。立体的な干渉及びＴ−形とは対照的なために、Ｓ形のｎｕｃｌｉｏｎに関与している隣接するｔＲＮＡの数は、実質的に４つに限られる（従って、Ｓ形のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄにおけるｔＲＮＡサブユニットは“オリゴマー“とみなされている）。Ｓ形（ｔＲＮＡ１）における５  ’ｔＲＮＡとの距離の４コドン離れたｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ５）との間の接触は、実質的に、Ｓ−形ｎｕｃｌｉｏｎの参入から後者を防止し、Ｔ−形又は複合Ｓ／Ｔ構造体を保持する。
【０１１８】
Ｒ−形ｎｕｃｌｉｏｎキャップ
コンピュータモデリングは、Ｓ−形ｎｕｃｌｉｏｎが単一ｔＲＮＡ分子にその５  ’末端にキャッピングすることができることを示した。本発明での１つの実施形態では、Ｌ型のアンチコドンループは親のＡＣステムとコアｎｕｃｌｉｏｎらせんの両方をにより積み重ねられているので、ｎｕｃｌｉｏｎのＳ又はＴ形の内のｔＲＮＡよりも更に低いエネルギー状態を有するＲ体ｎｕｃｌｉｏｎ  ｔＲＮＡのキャップのコンピュータ・モデルを、図１４Ａは示している。図１４Ｂは、図３Ｂに定義されている略語を使用して図１４Ａのヌクレオチドにカラーキーを提供しているしている。
【０１１９】
一方、Ｓ及びＴ形ｎｕｃｌｉｏｎｓにあるｔＲＮＡのＡＣループは、親のＡＣステム又はｎｕｃｌｉｏｎヘリックスのいずれかで積み重ねれており、しかし同時に両方ということはない。  コンピュータモデリング研究が、完全なＡＣの積み重ねを持つそのようなｔＲＮＡのキャップは、一度に１つのｔＲＮＡ分子のためだけに発生すること、ＴＣ−ＴＬＳ接続を最初に切断されなければならないことを示した。そのような積み重ねや切断のための熱力学駆動は、ｎｕｃｌｉｏｎコアらせんを持つｔＲＮＡキャップのＡＣ−ステムの同軸整列によって増幅され、そのＡＣループ上のキャッピングｔＲＮＡに１０塩基対以上の添加を通じて積み重ねＳ形ＲＮＡらせんの長さを効果的に３倍にする。
【０１２０】
本発明の一実施形態では、Ｒ−形ｎｕｃｌｉｏｎにおけるキャッピングｔＲＮＡのアミノアシル化ステムがＲＮＡにおける上流の構造に特異的に結合するのは、開始ｔＲＮＡ分子の結合を特に登録し段階的行うためで、ｍＲＮＡの開始部位を標識するために、ｎｕｃｌｉｏｎ複合体の正確なフレーム登録及び改良された組成を両立させる。一実施形態では、細菌におけるそのような相互作用の一例は、タンパク質合成のマーカー配列に開始ｔＲＮＡのアミノアシル化ステムの結合であり、シャインダルガルノ（’ＳＤ’）配列等は細菌のｍＲＮＡの開始コドンの上流の短い距離にしばしば位置している。シャインダルガルノ配列はリボソームを結合するために機能し、開始ｔＲＮＡはおそらくＳＤの部位への結合からはずれる。
【０１２１】
Ｎｕｃｌｉｏｎダイナミクス
現代的な細胞内の一実施形態では、ｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎの異なる形の熱力学的特性は、あらかじめ定義された条件下で、（ｉ）可変長の相対的に圧縮されていないＴ形ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ構造に結合する初期ｍＲＮＡへ、その後に（ｉｉ）最大４ｔＲＮＡ長の完全に圧縮されたＳ形ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄへ、そして最後に（ｉｉｉ）のｎｕｃｌｉｏｎ構造をキャッピングする単一の同軸Ｒ形ｔＲＮＡへ、自由溶液のアミノアシル化ｔＲＮＡの転移を駆動することができます。このｎｕｃｌｉｏｎ構造の中で最も安定した部分は、合計５つのｔＲＮＡ（又は６つのｔＲＮＡ。複合Ｓ／Ｔ  ｔＲＮＡが含まれている場合）のために、ＲとＳ形を含む。一実施形態では、得られた化合物のｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎの模式図を図１５に、このｎｕｃｌｉｏｎのコンピュータモデルを図１６に示してある。
【０１２２】
別の実施形態では、図１７は、ｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎの３つの異なる形態の物理的特性を要約したものであり、そして、Ｔ形とＳ形とＲ形で徐々に低いエネルギー状態を与える、積み重なり、塩基対形成と軸双極子特性を示している。３つのｎｕｃｌｉｏｎ形間のエネルギー関係は、メッセンジャーＲＮＡは通常、５  ’から３’の方向に翻訳されていることで、説明されている。ｔＲＮＡ分子の構造が必要とすることは、第一に３’方向からＴ形ｎｕｃｌｉｏｎに入ること、次いで５  ’方向でＲ−形にＳ体に徐々に遷移することである。各時間、Ｒ−形ｔＲＮＡはタンパク質合成のために削除され、３’−隣接するＳ−形ｔＲＮＡはＲ形に遷移し、そして１コドンによって５  ’から３’方向のｍＲＮＡに沿ってｎｕｃｌｉｏｎは動く。
【０１２３】
細胞生物におけるｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎダイナミクスのこのモデルでは、ｔＲＮＡは徐々に伸長因子タンパク質によってｎｕｃｌｉｏｎからリボソームに輸送され、これはＲとＳ形での５つの現在のｔＲＮＡを含むｎｕｃｌｉｏｎセグメントが、Ｔ形テイルを持つ５  ’から３’方向へのｍＲＮＡに沿って動き出すとすぐに起こり、その方向の長さはアミノアシル化ｔＲＮＡの供給に部分的に依存する。次期の装填されたｔＲＮＡは、短い滞留時間で、ｍＲＮＡ上のトリプレット（必ずしもコドンでなく）に無秩序に結合するが、その後急速にｒｉｂｏｃａｐｓｉｄで認定されます。任意の時点で、１つの装填されたｔＲＮＡだけが、Ｔ−ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄの３’末端に直接隣接するコドンに適切に結合し、利用可能な１箇所に固定し、５’−隣接のｔＲＮＡ上のＴＬＳを開き、より低いＴ形エネルギー状態を採用し、そして留まる。この選択工程は、効率的に装填されたｔＲＮＡを認定し、非同族ｔＲＮＡの拒絶反応を増幅する一方で、フレーム整合性を保持する。  そうすることで、Ｎｕｃｌｉｏｎはまた、初期の自由溶液からのアミノアシル化ｔＲＮＡを結合することで装填アクセレータとして機能し、そこでは今後の翻訳（すなわち、キャッシュプレロード）のために必要な実質的な量であり、このことによりその合成を調節するフィードバックループを進めている。このモデルは、キャッピング状態やその他の要因によって、ｍＲＮＡのサイトで連続して結合した現代的なｔＲＮＡの数が、ＲとＳ  ｎｕｃｌｉｏｎ形の集合に対応して４又は５つでありことを提示している。いくつかの実施形態では、所定の条件下で、このＴ形構造の相対的な安定性がＳ形のそれよりも実質的に小さい。いくつかの実施形態では、Ｓ形のｔＲＮＡに直接隣接する複合Ｓ／Ｔ  ｔＲＮＡは後者と積み重ねることができ、圧縮ｎｕｃｌｉｏｎで合計６つの連続したｔＲＮＡを与える。
【０１２４】
この発明の一実施形態では、Ｔ−形構造からＳ形構造へ遷移するためにｔＲＮＡはアミノアシル化されてる必要があり、そしてこの必要性が、装填されたｔＲＮＡの整合性を確保するための追加のスクリーニング方法を提供している。一方、この実施形態では、Ｓ形のｔＲＮＡは装填されなければならず、Ｔ形ｎｕｃｌｉｏｎは、装填と非装填ｔＲＮＡの両方を収容することができます。ｔＲＮＡのアミノアシル化は、その電気的特性を変化させ、Ｓ−形ｎｕｃｌｉｏｎ構造に適した立体構造にそのアンチコドンの変換を容易にすることも可能にする。
【０１２５】
現代のｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎは確実にアミノアシル化ｔＲＮＡを保管し、そうでなければ自由溶液では比較的短い半減期となり（Ｐuｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １２５：１８６２）、貴重な自由エネルギーを無駄にする。言い換えれば、充電器としてのｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎ機能。ＦＩＦＯ（先入れ先出し）在庫管理システムは、また、ｍＲＮＡをプリロードによる翻訳アクセレータとして機能し、それ故、リボソームのペプチジル移転センターは、必要な装填のｔＲＮＡによってシーケンシャルブラウンアクセス用として長く待つ必要はありません。入力動態は好意的に飽和している。ｎｕｃｌｉｏｎキャップは認定されたコドン伸長を標識し、他の分子による制御を容易にする。イニシエータ又はその近隣によるキャッピングの引き金となって、ＴＣ−ＴＬＳリンクを阻害する開始ｔＲＮＡによって翻訳が開始されます。ｔＲＮＡ  ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄはまた、加水分解、酵素による攻撃や破損からメッセンジャーＲＮＡを保護し、細胞内や真核細胞内の異なる区画間でメッセージを転送するための車両として働くことができる。これらの洞察が、本発明のいくつかの実施形態の基礎を形成する。
【０１２６】
イニシエータｎｕｃｌｉｏｎｓ
隣接ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ  ｔＲＮＡ間のＴＣ−ＴＬＳリンクの中心的役割は、メッセンジャーＲＮＡ上の開始コドンを標識するためのｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎのための天然のメカニズムを提供したことである。このようなｎｕｃｌｉｏｎは、本申請で’イニシエータｎｕｃｌｉｏｎ’を指す。イニシエータｔＲＮＡは、ｔＲＮＡをｎｕｃｌｉｏｎのキャップ位置に強要し、そしてタンパク質合成を開始させるためのリボソームのためにｒｉｂｏｃａｐｓｉｄフラグを提供するように、ｍＲＮＡ上のそれらの５’及び３’近隣と２つのＴＣ−ＴＬＳリンクのいずれかを阻害するように進化してきてきた。図１８と図１９の模式図に示すように、２つのリンク阻害方向が進化の過程で可能だった：開始ｔＲＮＡの上流又は下流、それがそれぞれ、その５’又は３’近隣に向かっています。これらのブロッキングの方向のいずれか又は両方が本発明のいくつかの実施形態で使用される。
【０１２７】
細菌や真核生物の細胞小器官の関連で利用されている上流のブロック（図１８を参照）は、上流のｔＲＮＡとの接続を防止するために、開始ｔＲＮＡにアミノアシル化ＴＣテールの修飾を必要とし、それによって開始ｔＲＮＡを強制的にＲ−キャップの位置を形成する。得られた細菌イニシエーターｎｕｃｌｉｏｎはタンパク質合成の開始コドンを標識する。細菌におけるこのタイプの開始ｔＲＮＡでは、ホルミル基は、このＴＣサイトの上流の隣接ｔＲＮＡのＴＬＳへの結合を阻害するために、ＣＣＡテイル部にメチオニンに装着されている。このホルミル化の更なる利点は、開始ｔＲＮＡのアミノアシル化リンケージを安定することです。開始ｔＲＮＡが最も５’のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットであるため、この結合は暴露され、通常のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ結合による保護されない。
【０１２８】
これとは対照的に、真核生物の細胞質イニシエータｔＲＮＡを利用した下流のブロックは（図１９に示すように）、３’隣接−ｔＲＮＡのＣＴ結合を阻害するために、イニシエータＴＬＳサイトへの修飾を採用し、このことから、この下流の近隣をキャップ位置に強制し、真核生物のイニシエーターｎｕｃｌｉｏｎを生成する。
【０１２９】
これらｎｕｃｌｉｏｎの開始メカニズムは、２種類のリンクブロックのために異なるキャッピング成果を生成する。上流のブロックで、イニシエーターｎｕｃｌｉｏｎのキャップは、ｍＲＮＡ上の開始コドンを占有する開始ｔＲＮＡ自体です。下流のブロックでは、しかし、イニシエータｎｕｃｌｉｏｎ上のキャップは、イニシエータｔＲＮＡではなく、その３’近隣で開始コドンが空く。イニシエータｎｕｃｌｉｏｎｓ間のこの区別は、細菌や真核生物間のリボソーム翻訳開始において観察された差異と一致している。細菌のリボソームが占有開始コドンで直接翻訳開始するのに対し、真核生物のリボソームはイニシエータｔＲＮＡを含む複合体を開始コドンから離れて最初に形成し、次にリボソーム複合体が開放された開始コドンを探してｍＲＮＡを精査する。翻訳される第２コドン上のＲ−ｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎキャップのついて翻訳開始部位の標識する真核生物は、精査するリボソームのために顕著な標的を提供し、上流コドンの認識又は予備フレームの登録の必要性を減少させる。Ｎｕｃｌｉｏｎ翻訳開始機構におけるこれらの相違は、細菌や関連する真核生物の細胞小器官におけるメッセンジャーＲＮＡは、一般にポリシストロン（つまり、複数の翻訳領域を持つ、又は’ＯＲＦ’）で、一方、真核生物（動物と人間を含む）の細胞質のほとんどのｍＲＮＡがモノシストロン（１ＯＲＦを持つ）であるという事実と一致している。細菌では、真核生物におけるリボソームは通常、ｍＲＮＡの５  ’末端に単に付着するのに対し、リボソームは、複数のｎｕｃｌｉｏｎ構造によってフラグが立てられた複数の開始コドンでｍＲＮＡに結合することができます。本発明の一実施形態では、我々のコンピュータのモデル研究は、真核生物における種のウイルスは、ｍＲＮＡの途中でｎｕｃｌｉｏｎ開始信号を模擬実験とこれら内部リボソーム進入部位（“ＩＲＥＳ“）への直接のリボソーム誘致により、これらｎｕｃｌｉｏｎフラグ制御システムを迂回する方法を学んできたことを示している。
【０１３０】
すべての生物領域では、センスコドン上（１つのＲ形に４つのＳ形を加えた）の５つの下流の修飾されたｔＲＮＡのｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎ構造は、少なくとも１５の連続した、積み上げられた標準ＲＮＡ塩基対の精度で優れたコドンフレームの登録を提供している。プレ修飾、装填ｔＲＮＡのキャッシュは、アミノアシル化ｔＲＮＡの体系化され物品の構築とそれらの合成の加速により、リボソームの効率的な運用のためにも重要である。真核生物は、感染を阻止するために、選択的優位性として細菌とは異なる開始ｔＲＮＡリンクブロッキング戦略を進化させてきた可能性がある。それにもかかわらず、ｎｕｃｌｉｏｎ形成のための厳しい立体要件は、ｎｕｃｌｉｏｎのＲＮＡらせんの物理と化学に牽引され、根本的なｔＲＮＡの形状が保持されなければならなかったことを意味した。
【０１３１】
ｎｕｃｌｉｏｎｓによるタンパク質合成
ｔＲＮＡのリンクサイトにおけるヌクレオシドの我々の研究は、位置５４及び５５両方で（この始原的なｔＲＮＡのリンクサイトを“ＰＬＳ“と名付ける）プソイドウリジンヌクレオシドを含む始原ＴＬＳと共に、リボソームの出現前に現代のｎｕｃｌｉｏｎｓの先祖がタンパク質合成を行ったことを示す。プソイドウリジンは、タンパク質なし（それはウリジンから異性化）でＲＮＡにより確実に合成されうる唯一の修飾ヌクレオシドであり、ペプチジル転移でプソイドウリジンの早期かつ重要な役割のための支援の理論的根拠を提供している。例えば、ＴＬＳをその先祖のＰＬＳの構成に先祖返りする現代のｔＲＮＡの変化はオフリボソームペプチジル転移を誘起することができるので、初期進化にあるこの洞察は、現代医学と本発明のいくつかの実施形態に関連しています。このような不要なタンパク質合成は細胞制御の撹乱をもたらし、そして特定の状況において、制御されない細胞増殖や癌などの関連疾患を引き起こしえる。本発明のいくつかの実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎｓによるタンパク質合成の起源を理解は、リボソームの可用前に、産業応用の範囲のためのｎｕｃｌｉｏｎｓとｒｉｂｏｃａｐｓｉｄｓを設計、製造及び使用する当業者を支援する。
【０１３２】
排他的なＲＮＡ世界（Ｔｈｅ  ＲＮＡ  Ｗｏｒｌｄ  ｂｙ  Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２００５）から地球上の生命を、タンパク質への核酸の翻訳に基づいている我々の現在の生物圏に移行したイベントの重要な配列は、以下のように折り畳まれいた可能性が高い（以下の説明が正確かどうかということは、本発明の実施形態の性質、範囲又は有用性に与える影響はありません）。
【０１３３】
ＲＮＡ世界では、分子は無秩序に複製され、相補的ないくつかの部分で、プラスＲＮＡ鎖とマイナスＲＮＡ鎖の複雑な混合物を齎した。それらは速やかに分解されており、そこで、選択圧がより良い環境に耐えるように二次その後三次構造を持つＲＮＡを齎した。分子は偶然の交換で結合した。次に、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄで自身の包囲と複製の両方を行える現代的なトランスファーＲＮＡ（Ｂｅｒｎｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０，  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｄｉｒｅｃｔ，  ５：１６）、より大きなＲＮＡに２つのヘアピン構造は融合された。Ｎｕｃｌｉｏｎｓは世界に入っていた。
【０１３４】
その後、１ＲＮＡの子孫の異常高次構造は、３’−隣接ＲＮＡのアデノシンの結合でｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ安定性を高めたプソイドウリジンに異性化するＵ５５の原因となった。そこにこの時点では細胞はなかったが、それにもかかわらず、特殊化は起きた。ＲＮＡ分子の混合物の中では、相補性を維持しながら、プラス鎖とマイナス鎖は異なるが相乗スキルを開発した。マイナス鎖のプラス鎖への無限転写は継続し、その逆も同様であった。ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄｓによって現在もたらされる強化された保護とともに、ｎｕｃｌｉｏｎのコアにあるプラスＲＮＡ鎖は徐々に伸長した。これは、新たに形成されたマイナス鎖を切断し複数のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ  ＲＮＡセグメントにするリボザイム活性に依存した。
【０１３５】
各長、コアプラスＲＮＡ鎖は、アミノ酸の任意の先見欲求ではなく、ＲＮＡのヘリックスの立体化学とｎｕｃｌｉｏｎ熱力学によって駆動されて、トリプレットのペアでいくつかの短いマイナス鎖を結合した。すべての３つのｎｕｃｌｉｏｎ高次構造は、Ｔの圧縮でＳついでＲでキャッピング、という所定の一連の方法で形成された。Ｒ−ＣＡＰは、進化のこの段階で、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ  ＲＮＡの最低エネルギー状態であったので、一度も形成を動かさなかった。彼らは安定性が増加するにつれて、これらの部分的なＲＳ構造がｎｕｃｌｉｏｎｓに選択的優位性を与えた。  ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ  ＲＮＡは、すべてが１つのコアストランドによってプログラムされた場合でも、徐々に異なる特性を進化させた。
【０１３６】
プラス鎖ＲＮＡはすぐにいくつかのマイナス鎖ＲＮＡがｒｉｂｏｃａｐｓｉｄのさまざまな場所で、他のものより優れていたことを学んだ。未発達の遺伝コードは、３つのｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ結合ヌクレオシドの単に１つ又は２つを使用して、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ結合を計画通りに進めるために、このコアのＲＮＡ上に出現した。ダーウィン生存圧力は、現代のｔＲＮＡ前駆体であり、複数のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ  ＲＮＡを計画したより洗練されたコードにつながったが、まだアミノ酸で装填されていなかった。ｎｕｃｌｉｏｎｓは、多くの構造を示すようになった。内部ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ  ＲＮＡ結合の阻害を計画通りに進めることで、はっきりと異なるがリンクされたｎｕｃｌｉｏｎセグメントは高次構造に組み立てることができた。始原的な遺伝子及び翻訳開始力学は進化し始めていた。それにもかかわらず、第一ｎｕｃｌｉｏｎゲノムの主要な役割は、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ  ＲＮＡの仕様及び会合であり、アミノ酸ではなく、タンパク質を別の話であった。
【０１３７】
これらの初期のｎｕｃｌｉｏｎｓはそれらのＲＮＡゲノムを保護し、その後、豊富なアミノ酸がｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ  ＲＮＡの３  ’末端に無秩序に結合した海洋表面のような場所にそれらを輸送した。彼らの子孫は、アミノ酸でそのｒｉｂｏｃａｐｓｉｄｓを有用に飾り、そして、後で、個々のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ  ＲＮＡに特異的なアミノ酸を招く方法を学びました。時間の経過ともに、ｎｕｃｌｉｏｎゲノムの部分は、ｎｕｃｌｉｏｎの整合性、生存と複製へのアミノ酸の増加の貢献を認識し、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ  ＲＮＡの計画利用から、それらのＲＮＡに付着したアミノ酸の計画利用へ論理的に移行した。すべてではありませんがほとんどｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ  ＲＮＡは、アミノ酸のための分子のアダプタの役割に徐々に移行しました。しかし、タンパク質はまだ存在しなかった。
【０１３８】
その後、先祖ｔＲＮＡのＵ５４によるプソイドウリジンとｎｕｃｌｉｏｎへの異性化は、螺旋エンジンに形質転換した。１つのｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットから次へと連続するアミノ酸の転移を触媒した繰り返しキャッピングをしながら、ｎｕｃｌｉｏｎはＲＮＡゲノムに沿って移動を開始しました。当初、結果生じるペプチド中のアミノ酸の混合はカプシドアミノ酸のことを受動的に反映している。これらの初期のポリペプチドは、何らかの生化学的な利用性は僅かであったが、それらの電気化学及び新規構造がｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ安定性とｎｕｃｌｉｏｎ熱力学を改善しました。自由エネルギーの増加を必要とせずにすべてが、このＲＮＡらせんエンジンを駆動するために追加の燃料として、海の表面のような場所でアミノアシル化から齎された。タンパク質合成は生まれていた。
【０１３９】
分子進化のこの要点として、唯一の生命体は、１つ以上のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ内に単一のＲＮＡ分子を含むｎｕｃｌｉｏｎｓあった。ＲＮＡゲノムは、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ  ＲＮＡをてるためのすべてのデータ、それらを製造するためのリボザイム活性、及びそれらを会合するためのプログラムを含んでいた。ｎｕｃｌｉｏｎｓは何百万年もよく働いたが、それらのＲＮＡ成分を分散する傾向があったブラウン運動によって最終的には制限されてた。コンパートメントが必要となった。当初は、軽石の小さな穴が足りていた可能性があり、あるいはペプチドの装飾は海での溶液表面にｎｕｃｌｉｏｎを保持した。任意のイベントでは、ＲＮＡゲノムは、新しい家を必要とした。
【０１４０】
最初に計画利用されたタンパク質はおそらく、βシートの糊を作り、ブラウンの移行を低減するためにグリシン、アラニンなどのアミノ酸が豊富シンプルな繰り返しのポリマーである。後で、この便利な接着剤は、より良い地域環境を制約するために、より洗練された構造タンパク質、ケラチンの祖先へと進化した。ずっと後に、タンパク質酵素が進化し、それは、最初に、タンパク質の接着剤により抑制された高分子上で唯一の動作した可能性があった。最終的には、生の細胞は小分子の移動を減らし、進化酵素によってそれらの生化学的変換を可能にするために発展した。
【０１４１】
ｎｕｃｌｉｏｎにおけるＲＮＡゲノムは、リボザイムサービスを提供し続けている間、複製、翻訳、制御に必要な全ての情報を正確に維持するには、今や肥大化し不器用になっていた。いったんその新しい細胞の家に移動していた、この先駆的な分子は、他の人が行うことができる外注活動を開始した。第一リボソームを形成するために２つのｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ  ＲＮＡは融合した（現代のリボソームのペプチジル移転センターにおけるＲＮＡ配列の我々の分析が示していることは、このＰＴＣは２つのｔＲＮＡのようなＰ−ループから進化し、ＡとＰサイトにおけるｔＲＮＡのＣＣＡテイルを整列するのに役立っていることである）。その後、すべてのプログラムやデータは、ＲＮＡゲノムがメッセンジャーＲＮＡの役割を引き受けるとすぐに、再現と保存の点で卓越したＤＮＡと名付ける新しい分子上に複写された。タンパク質及び他のＲＮＡは、構造と触媒作業を分割し続け、その時々に協力した。今、私たちは生物圏でそれを知っているように生命は進化し始めていた。
【０１４２】
本発明の一実施形態では、図２０Ａは、先祖の、異常な、現代的な、又は非天然なｎｕｃｌｉｏｎの５’末端の３つの相互作用しているｔＲＮＡによるペプチジル転移のコンピュータモデルであり、少なくともキャッピングｔＲＮＡ  Ｔ１が、位置５４と５５に２つの  プソイドウリジンを含む始原的タイプＴＬＳサイト（’ＰＬＳ’）を持つことを特徴とする。図２０Ｂは図３Ｂで定義されている略語を使用して、図２０Ａのヌクレオチドにカラーキーを提供しているしている。
【０１４３】
ｔＲＮＡ１キャップのこのＰＬＳはｎｕｃｌｉｏｎ軸に近く、これは、次の二つのｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ２及びｔ−ＲＮＡ３）上のＣＣＡコネクターが、タンパク質合成のためこのｎｕｃｌｉｏｎの５’末端を構成し、ｔＲＮＡ１のＰＬＳに同時に結合することができるようにすることによる。別の実施形態では、図２１の模式図に一致し、結果生じるペプチジル移転センター（’ＰＴＣ’）以下のとおり作動する（’左’と’右’はｔＲＮＡ１上のアミノアシル化ステムからのＰＬＳの眺望、アンチコドンは下方）。
１．ｔＲＮＡ１はｎｕｃｌｉｏｎ軸の近傍にＰＬＳを配置しているｎｕｃｌｉｏｎをキャップ；
２．ｔＲＮＡ２上のＣＣＡ−ペプチドは、ＰＬＳの左側に結合する；
３．ｔＲＮＡ３上のＣＣＡ−アミノ酸は、ＰＬＳの右側に結合する；
４．成長しているペプチドはｔＲＮＡ２からｔＲＮＡ３上のアミノ酸に転送；
５．ペプチドの接続されていないｔＲＮＡ２はｔＲＮＡ１に置換；
６．ｔＲＮＡ１はｎｕｃｌｉｏｎを退場させる；及び
７．キャップとしてのｔＲＮＡ２と共に、このサイクルの繰り返し（ｔＲＮＡ番号は１刻みで増加）。
【０１４４】
一実施形態では、図２２は、図２１の模式図に対応した始原的な（又は異常な現代）ｎｕｃｌｉｏｎによるタンパク質合成のコンピューター・モデルである。この過程を駆動するエネルギーはｎｕｃｌｉｏｎ遷移の熱力学駆動に由来し、高エネルギーの連続放出が連結しているアミノ酸をｔＲＮＡに結合させる。得られたポリペプチド鎖は、実質的にｎｕｃｌｉｏｎと同軸になり、タンパク質のα−ヘリックス（１００°）で１アミノ酸辺りのヘリックスターンは（おそらく偶然ではない）は、ｎｕｃｌｉｏｎ（〜９８°）にある各々のＳとＴ形ｔＲＮＡの場合と実質的に同様であった。従って、ｍＲＮＡ又はタンパク質成長上のいかなるねじりストレスに対応して、ｎｕｃｌｉｏｎ駆動のペプチジル転移は最小限に進むことができる。
【０１４５】
一実施形態では、図２３Ａは始原的な（又は現代的な異常）ｎｕｃｌｉｏｎにあるペプチジル移転センターのコンピュータモデルであり、Ｒ−キャップｔＲＮＡ１上のＰＬＳの左側には、成長中のポリペプチド鎖ＰＰを持つｔＲＮＡ２のＣＣＡテールを結合し、及びｔＲＮＡ１上のＰＬＳの右側には、次のアミノ酸ＡＡを持つ  ｔＲＮＡ３のＣＣＡテールの結合を示している。図２３Ｂは、図３Ｂで定義されている略語を使用して図２３Ａのヌクレオチドにカラーキーを提供している。特定のヌクレオシド間で丸端を持つ黒線は、ペプチジル伝達に寄与する分子間相互作用のいくつかを示している。この表の列は、３つのｔＲＮＡのどのヌクレオシドが、Ｌ０からＬ５と標識された６活性部位層に整列するかを示している。
【０１４６】
すべての３つのｔＲＮＡのアンチコドンは、依然としてそれぞれの対応コドンに標準形に結合するため、これらの３つのコドン−アンチコドン対は完全にコアｎｕｃｌｉｏｎヘリックスの密接グリップ内でお互いに積み重ねたままであった。ｔＲＮＡ３とｔＲＮＡ２がｔＲＮＡ１へ結合するとき、他のｔＲＮＡ３を持つＴＣ−ＴＬＳのリンクは切断される。ＲＮＡ１  ＰＬＳで保存された９つのＧＳＰ９０ヌクレオシドは、連続した５層Ｌ１からＬ５に積層されている。酵母ｔＲＮＡＰｈｅの例では、第１層は、ｔＲＮＡ２のアミノ酸ステムに積み重ねることができる裸のワトソン−クリック塩基対Ｃ５６−Ｇ１９を含有し、ＰＬＳにある第２層は、レイヤます７０Ｓリボソームにある保存されたアデノシンＡ２６０２に類似していて、ペプチジル転移で触媒的に作用するプリンＲ５７を保存する。ＰＬＳにある第３層は、フーグスティーン構造にあるＧ１８により結合したユビキタスなＰ５５であり、第４層はフーグスティーン構造ごとのＡ５８に結合したＰ５４である。そのＰＬＳを束ねる第５層は、別のワトソン・クリックのペアのＧ５３−Ｃ３１、である。
【０１４７】
一実施形態では、図２４Ａは、ｔＲＮＡ１にあるプソイドウリジンステムの方向から見た図面で、３つのｔＲＮＡによって形成された第４次複合体のレベル３とレベル４にある６つのヌクレオシドを示している。ｔＲＮＡ２とｔＲＮＡ３がｔＲＮＡ１へ結合する時、３’−末端アデノシン（Ａ７６）は、Ｐ５４及びＰ５５にそれぞれ結合する。楕円の’反応’の標識は、アミノアシル化ｔＲＮＡ３におけるアミノ基がペプチジルｔＲＮＡ２にあるカルボキシル基を攻撃する活性部位を強調している。関連する実施形態では、図２４Ｂは、ｔＲＮＡ２からｔＲＮＡ３に成長中のポリペプチド鎖を転送する２つのＡ７６アデノシンヌクレオチド間（ＰＴＣ上部からの眺め）のペプチジル転移反応の拡大図を示している。楕円で’反応’の標識は、アミノアシル化ｔＲＮＡ３におけるアミノ基がペプチジルｔＲＮＡ２にあるカルボキシル基を攻撃する活性部位を強調している。
【０１４８】
図２４Ｃは、図３Ｂに定義されている略語を使用している図２４Ａと図２４Ｂのヌクレオチドにカラーキーを提供しているしている。特定のヌクレオシド間の丸端をもつ黒線は、ペプチジル伝達に寄与するＬ３とＬ４層における分子間相互作用を示す。
【０１４９】
この第４次複合体では、Ｐ５５トリプル塩基対（Ｔ１：Ｇ１８  −  Ｔ１：Ｐ５５  −  Ｔ３：Ａ７６）とＰ５４トリプル塩基対（Ｔ１：Ａ５８  −  Ｔ１：Ｐ  ５４  −  Ｔ２：Ａ７６）は、ｔＲＮＡ１にある同軸アミノアシル化及びプソイドウリジンステムから双子らせんによって増幅された６つのレベル上の１４プラスヌクレオシドの複数鎖のＲＮＡ積層の強固なグリップ内で、隣接する第３層と第４層上にそれぞれ積み重ねられる。３つのｔＲＮＡの間の水素結合、スタッキング、静電相互作用の実質量は、複合体の形成を駆動する。この四次構造では、３つのｔＲＮＡはペプチジル転移のために正確に整列される。アミノアシル化ｔＲＮＡ３のアミノ基はペプチジルｔＲＮＡ２内にカルボキシル基を常に攻撃できる。Ｐ５４〜Ｐ５５を含むＰＬＳの装備により、先祖ｎｕｃｌｉｏｎにおけるｔＲＮＡリボザイムは、タンパク質又はリボソームなしで、基質としてのｔＲＮＡの同胞と、タンパク質合成が可能であった。
【０１５０】
ほとんどの正常な現代のｔＲＮＡのＴＬＳでは、現代の細胞には非リボソームタンパク質の合成が望ましくないものとして、位置５４でプソイドウリジンは、ペプチジル転移（図２５Ａ参照）に必要なｔＲＮＡ２におけるＡ７６の結合を阻害するリボシルチミンに置き換えられる。図２５Ｂは、図３Ｂで定義されている略語を使用して図２５Ａのヌクレオチドにカラーキーを提供しているしている。
【０１５１】
一実施形態では、図２５Ｃは、Ｔ１によるＴ２の結合を誘起できる、先祖ＰＬＳ構成にあるＰ５４により可能なトリプル塩基構造を示す。図２５Ｄは、図３で定義されている略語を使用している図２５Ｃのヌクレオチドにカラーキーを提供している。丸端をもつ黒線は、分子間塩基対形成を示す。
【０１５２】
現在までに報告されたＰ５４〜Ｐ５５構築を有するトランスファーＲＮＡ配列は、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）に及びに感染したニワトリの細胞からのｔＲＮＡＴｒｐ（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １１：４８２３）、そしてマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）に感染したマウス細胞からｔＲＮＡＰｒｏ（（Ｈａｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７９，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５４：０９７９）を含むが、これらに限定されない。これらのウイルスはいずれも、レトロウイルスである。
【０１５３】
図２６は、ｎｕｃｌｉｏｎオペレーションのための制御ロジックの表であり、関連したり結果として生じるｎｕｃｌｉｏｎ条件と共にｔＲＮＡ  Ｔ（Ｎ）の位置５４及び５５におけるヌクレオシドによって部分的に駆動される左右のＴＬＳサイトの状態を要約したものある。Ｔ（Ｎ−１）はｔＲＮＡ（Ｎ）のすぐ上流に隣接するｔＲＮＡに言及し、Ｔ（Ｎ＋１）はｔＲＮＡ（Ｎ）のすぐ下流に隣接したｔＲＮＡを指します。ｔＲＮＡ（Ｎ＋２）はｔＲＮＡ（Ｎ＋１）のすぐ下流のｔＲＮＡです。いくつかの実施形態では、このｎｕｃｌｉｏｎロジック・テーブルは、新しいバイオ医薬品の製品やサービスの設計、開発、製造、導入及び使用するために採用される。
【０１５４】
ＴＬＳ調節
いくつかの実施形態では、天然及び非天然化合物は、特定のｎｕｃｌｉｏｎ構造と活動のアゴニスト又はアンタゴニストとして作動できる、とりわけｎｕｃｌｉｏｎ形成を変更するためであり、関連する生物学的効果を調節し、ｎｕｃｌｉｏｎ媒介医学的障害を治療するためである。  これらの化合物は、又はＴＬＳとＴＣ構造の両方あるいはその一方にあるｎｕｃｌｉｏｎ標的あるいはそのような構造のサブセットへ結合するため、あるいは競合するようにに設計されるかもしれない。
【０１５５】
ペプチジル転移のためのオリジナルのリボザイムサイトとしての役割において、ｔＲＮＡ１キャップ上の先祖のＰＬＳのサイトでは、主にその左側にｔＲＮＡ２のＣＣＡテイル（成長中のポリペプチド鎖を持つ）を結合でき、一方、主にその右側にｔＲＮＡ３のＣＣＡテイル（次のアミノ酸）を結合できた。ＴＬＳの右側が現在通常で使用されているように、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄにある隣接ｔＲＮＡ分子間の通例のリンクのために、ＰＬＳの右側も使用されていた。隣接ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ  ｔＲＮＡを結合するのＴＬＳ−ＴＣの相互作用の重要な能力は、私たちの生物圏全体で８つのＧＳＰ９０ヌクレオシドの実質的な保存を説明している。７０Ｓリボソームにおける２３Ｓ  ＲＮＡ上ペプチジル転移サイトを持つこのｔＲＮＡはサブ構造の比較は、ｎｕｃｌｉｏｎｓは初期進化でタンパク質合成を行った際に、ｔＲＮＡ中の保存されたプリンＲ５７はペプチジル転移のための触媒として役目を果たしていたことを示す。リボソームＡ２６０２と同様に、このプリンは水素結合していないが、もともと２つの他のｔＲＮＡから２つのＡ７６ｓを保持するために進化したＲＮＡヘリックス内に戦略的に位置している。突出しているリボソームＡ２６０２とは対照的に、しかし、ｔＲＮＡの結晶構造に見られるＲ５７は、その親らせん内に積層されている。
【０１５６】
一実施形態では、我々のコンピュータ・モデリング研究は、通常の現代ｎｕｃｌｉｏｎ形成において、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ  ｔＲＮＡの３’Ａ７６は５’−隣接ｔＲＮＡのＴＬＳの右側にあるＰ５５に結合することを示しているが、本研究は３’−隣接ｔＲＮＡからＣ７４とＣ７５を結合するための開放ＴＬＳサイトを同定してなかった。ＴＬＳでのＧ１８とＧ１９はＣ７４−Ｃ７５の近傍にあるが、現在までに報告されたｔＲＮＡの結晶構造その全てが実質的に結晶化のためのポリアミンでは少なくとも、それ以外はＴＬＳ−積み重ね結合に従事している。それは、これらのポリアミンが、始原的なタンパク質合成におけるＴ２結合のために展示したものと同様の立体構造にＴＬＳサイトを固定している可能性があり、それより、ＴＬＳの現代ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ形Ｔ２結合を阻害している。
【０１５７】
ＴＬＳサイトのこのポリアミン固定の証拠は、ｔＲＮＡ結晶化のために通常必要とされるポリアミンの一つ、スペルミンを用いたｔＲＮＡの結晶のＸ線構造解析に起因する（Ｄｏｃｋ  ｅ  ａｌ．，  １９８４，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ６６：１７９）。図２７Ａは、ＴＬＳ  の左側から見たときの酵母ｔＲＮＡＰｈｅについて報告された高分解能構造によるスペルミン結合部位を示している（Ｊｏｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３０１：４０１）。図２７Ｂは、ＴＬＳの端から見た時と同じ構造。
【０１５８】
スペルミンは、ＴＬＳの高次構造ロックに一致して、ｔＲＮＡリンクサイトの左側のヌクレオシドＴ５４とＰ５５によって大部分が結合されている。報告された溶液中でのｔＲＮＡエルボー領域の柔軟性を考えると、そのような高次構造ロックはｔＲＮＡの結晶化に不可欠であるかもしれない。そのようなポリアミンのロックの一つの予期せぬ結果は、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ形成で通常用いられるＴＬＳの右側の歪みである。ＴＬＳはｔＲＮＡの結晶構造では見られない１つ以上の代替高次構造があり、それは３’隣接でｔＲＮＡでＴＬＳのＧ１８とＧ１９はＣ７５とＣ７４にそれぞれ結合し、７０ＳリボソームにおけるＡ２６０２観察されたものと類似したＲ５７の付随突起を伴っている。この洞察は、スペルミンようなポリアミンがｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ形成を阻害し、実験試薬内でのこれまで広く普及した封入（’ＲＮＡを安定させるために’）が、おそらくｎｕｃｌｉｏｎｓの発見遅らせたことを示唆している。本発明のいくつかの実施形態で、一定の製造ソリューション、反応混合物からポリアミンは具体的に除外されます。
【０１５９】
Ｎｕｃｌｉｏｎ標的
本発明のいくつかの実施形態は、ｎｕｃｌｉｏｎの前記１つ以上の成分の少なくとも一部に結合する化合物に前記ｎｕｃｌｉｏｎを会合させることでｎｕｃｌｉｏｎを解離するための方法に関連している。さらなる実施形態では、そのような化合物の１つ以上を結合するｎｕｃｌｉｏｎサブ構造は、ｎｕｃｌｉｏｎ標的です。さらなる実施形態において、ｎｕｃｌｉｏｎｓ及び本書面中に記載のようにして製造された関連構造は、ｎｕｃｌｉｏｎ標的に結合する化合物をスクリーニングするために使用することができる。いくつかの実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎ構造と活動のアゴニスト又はアンタゴニストとして作動できる化合物は、標的となったｎｕｃｌｉｏｎに組み込またｎｕｃｌｉｏｎ成分以外のｎｕｃｌｉｏｎ成分である。
【０１６０】
本発明のいくつかの実施形態では、前記の構造、機能又は活動の上、阻害、促進、装填、調節又は構造、機能、ｎｕｃｌｉｏｎの活性の阻害に作動可能に関連付けられたｎｕｃｌｉｏｎサブ構造を含むｎｕｃｌｉｏｎ標的に関連しており、（ｉ）ｎｕｃｌｉｏｎサブ構造が一定のｎｕｃｌｉｏｎ構造、その成分、又はそのような成分の任意の組み合わせの部分を含み、且つ（ｉｉ）構造の一定の部分は、一次構造、二次構造、三次構造、四次構造、Ｒ形構造、Ｓ形構造、Ｔ形構造、この群のいずれか２つ以上の構成要素の組み合わせ、この群の任意の２つ以上の構成要素の混成、から形成された群から選択される、ことを特徴とする。さらなる実施形態において、ｎｕｃｌｉｏｎ標的は、自然から単離されたｎｕｃｌｉｏｎ標的、精製されたｎｕｃｌｉｏｎ標的、増幅されたｎｕｃｌｉｏｎ標的、細胞成分から分離されたｎｕｃｌｉｏｎ標的、実質的に他のｎｕｃｌｉｏｎ構造のないｎｕｃｌｉｏｎ標的、他のｎｕｃｌｉｏｎ構造から抽出されたｎｕｃｌｉｏｎ標的、他のｎｕｃｌｉｏｎ構造から区別されたｎｕｃｌｉｏｎ標的、この群のいずれか２つ以上の構成要素の組み合わせにおいては、自然に起こりえないｎｕｃｌｉｏｎ標的を包含する郡から選択される。
【０１６１】
一態様では、ｎｕｃｌｉｏｎ標的は、基本ｎｕｃｌｉｏｎ、エンベロープｎｕｃｌｉｏｎ、イニシエーターｎｕｃｌｉｏｎ、ｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎ、エンベロープｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎ、正常ｎｕｃｌｉｏｎ、異常ｎｕｃｌｉｏｎ、復帰ｎｕｃｌｉｏｎ、変異ｎｕｃｌｉｏｎ、始原的なｎｕｃｌｉｏｎ、天然ｎｕｃｌｉｏｎ、非天然ｎｕｃｌｉｏｎ、古ｎｕｃｌｉｏｎ、細菌ｎｕｃｌｉｏｎ、ウイルスｎｕｃｌｉｏｎ、プラスミドｎｕｃｌｉｏｎ、真核ｎｕｃｌｉｏｎ、細胞質ｎｕｃｌｉｏｎ、プラスチドｎｕｃｌｉｏｎ、ミトコンドリアｎｕｃｌｉｏｎ、ｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎ、エンベロープｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎ、この群のいずれか２つ以上の構成要素の組み合わせ、この群の任意の２つ以上の構成要素の混成、から形成された群から選択、からなる群から選ばれたｎｕｃｌｉｏｎ内又はｎｕｃｌｉｏｎ上に位置している。
【０１６２】
別の態様において、全体、一部あるいは複数の部分でのｎｕｃｌｉｏｎ標的は、部品は、全体、部分又は接続サイト、リンクサイト、ｔＲＮＡコネクタ、ｔＲＮＡリンクサイト、アンチコドン、コドン、リンクサイトに結合した、ｔＲＮＡネクタサイトとｔＲＮＡリンクサイトの相互束ね、アンチコドンとコドンの相互束ね、コネクタサイトとそれが結合するコア核酸構造、ｔＲＮＡのコネクタとそれが結合するｍＲＮＡ構造、ｔＲＮＡコネクタ及びそれが結合するｍＲＮＡ開始構造、ｔＲＮＡコネクタとそれが結合するｍＲＮＡ上のシャインダルガーノ構造、ｔＲＮＡのコネクタとそれが結合するコザック構造、リンクサイトとそれが結合するコア核酸構造、ｔＲＮＡリンクサイトとそれが結合するｍＲＮＡ構造、ｔＲＮＡのリンクサイトとそれが結合するｍＲＮＡ開始構造、ｔＲＮＡリンクサイトととそれが結合するｍＲＮＡ上のシャインダルガーノ構造、ｔＲＮＡリンクサイトとそれが結合するｍＲＮＡ上のコザック構造、プソイドウリジンループ、ループジヒドロウリジン、ジヒドロウリジンループに結合するプソイドウリジンループ、アンチコドンループ、コア核酸に結合するアンチコドンループ、ＣＣＡテイル、Ｐスタック、位置５３から位置５６までのｔＲＮＡヌクレオチドを含むサブ構造、Ｇ５３−Ｔ５４−Ｐ５５−Ｃ５６ヌクレオチドを含むｔＲＮＡのサブ構造、ヌクレオチドＧ５３−Ｐ５４−Ｐ５５−Ｃ５６含むｔＲＮＡサブ構造、ヌクレオチドＧ５３−Ｔ５４−Ｐ５５−Ｃ５６とＧ１８−Ｇ１９とＲ５７−Ａ５８とＣ６１を含むｔＲＮＡサブ構造、ｔＲＮＡヌクレオチドＧ５３−Ｐ５４−Ｐ５５−Ｃ５６とＧ１８−Ｇ１９とＲ５７−Ａ５８とＣ６１含むｔＲＮＡサブ構造、この群の任意の１つ以上の構成要素の相同体、この群のいずれか２つ以上の組み合わせ、そしてこの群のいずれか２つ以上の混成、からなる群から選択された、全体、一部あるいは複数の部分構成要素である。
【０１６３】
別の態様では、ｎｕｃｌｉｏｎの構造、機能又は活性を、促進、阻害、変更あるいは中断するための手段は、ｎｕｃｌｉｏｎ形成を阻害、ｎｕｃｌｉｏｎ形成の鈍化、ｎｕｃｌｉｏｎ形成の阻止、ｎｕｃｌｉｏｎ形成の可能化、ｎｕｃｌｉｏｎ形成の促進、ｎｕｃｌｉｏｎ破壊の促進、ｎｕｃｌｉｏｎ解離の促進、ｎｕｃｌｉｏｎ解離の加速化、ｎｕｃｌｉｏｎ構造変化、ｎｕｃｌｉｏｎ高次構造の変化、ｎｕｃｌｉｏｎ構造の破壊、ｎｕｃｌｉｏｎ構造の修飾、ｎｕｃｌｉｏｎ成分の変更、一つ以上のｎｕｃｌｉｏｎ成分の解離、ｎｕｃｌｉｏｎ機能又は活動の阻害、ｎｕｃｌｉｏｎ機能又は活性の亢進、ｎｕｃｌｉｏｎ機能又は活性の下方制御、ｎｕｃｌｉｏｎ機能又は活性の上方制御、ｎｕｃｌｉｏｎ機能又は活性の促進、ｎｕｃｌｉｏｎ機能又は活性の減速、ｎｕｃｌｉｏｎ機能又は活性の妨害、ｎｕｃｌｉｏｎ機能又は活性の遮断、ｎｕｃｌｉｏｎの機能又は活性の開始、ｎｕｃｌｉｏｎの機能又は活性の停止、ｎｕｃｌｉｏｎ機能又は活性の調節、ｎｕｃｌｉｏｎ機能又は活性の競合、ｎｕｃｌｉｏｎ機能又は活性の追加、ｎｕｃｌｉｏｎ機能又は活性を削除、ｎｕｃｌｉｏｎの機能又は活性の変更、ｎｕｃｌｉｏｎ機能又は活性の制御、この群のいずれか２つ以上の組み合わせ、この群のいずれか２つ以上の混成、の群から選択された効果を得るための手段である。
【０１６４】
別の態様において、ｎｕｃｌｉｏｎの構造、機能又は活性を、促進、阻害、変更あるいは中断するための上記の手段は、別のｎｕｃｌｉｏｎ、ｎｕｃｌｉｏｎ成分、物理薬剤、化学薬剤、生物薬剤、抗体、酵素、リボザイム、核酸、アンチセンス化合物、アプタマー、ＲＮＡ干渉剤、遺伝子薬剤、ワクチン、外来エージェント、ウイルス、医薬品、治療薬、予防薬、診断薬、この群のいずれか２つ以上の組み合わせで、この群のいずれか２つ以上の混成、からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本発明は、ｎｕｃｌｉｏｎ又は本書面上でに記載された関連する構造体を合成することにより、本書面上でに記載されたｎｕｃｌｉｏｎ標的をスクリーンするための方法に関しており、天然及び非天然のライブラリから１つ又はそれ以上の化合物を持つｎｕｃｌｉｏｎ又は関連する構造体を接触させて、そして、ｎｕｃｌｉｏｎ又は関連する構造体の活性と構造の両方又はいずれか一方に結合し調節する化合物を同定することである。具体的には、この方法は、ｎｕｃｌｉｏｎの構造、機能又は活動を促進、阻害、変更あるいは中断するための化合物をスクリーニングするために実施することができる。さらなる実施形態において、この方法は、生体の天然ｎｕｃｌｉｏｎの構造、機能又は活動を促進、阻害、変更あるいは中断するため、天然及び非天然ｎｕｃｌｉｏｎ成分をスクリーンするためににｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施することができる。例えば、本書面に記載したｎｕｃｌｉｏｎ又は関連する構造の合成は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで適切なｎｕｃｌｉｏｎ成分と接触させたときに、ｎｕｃｌｉｏｎ又は関連構造物の構造高次構造は破壊され、ｎｕｃｌｉｏｎ又は関連する構造の機能又は活性の変化をもたらす。
【０１６５】
ｎｕｃｌｉｏｎｓに結合する伸長因子
細菌の伸長因子ＥＦ−Ｔｕとその真核生物の対応するｅＥＦ１Ａは通常、タンパク質合成のためのリボソーム（Ｍａｔｅｙａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２８５：２１２０９）にアミノアシル化ｔＲＮＡを伝達する。一実施形態では、当社のコンピュータ・モデリング研究は、ｎｕｃｌｉｏｎ倉庫からリボソーム工場へのアミノアシル化ｔＲＮＡの輸送に一貫性があり、これらの伸長因子はあらかじめ定義された条件下で特定のｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎｓに結合することを示している。これらの伸長因子もｎｕｃｌｉｏｎ形成の速度と種類の制御と抑制で重要な役割を果たしています。その表面に結合した１つ以上の伸長因子を持つｎｕｃｌｉｏｎは、本発明のいくつかの実施形態によって教示された’エンベロープ状のｎｕｃｌｉｏｎ“の一例であり、結果生じる伸長因子分子のコートは、他の実施形態によって教示された“ｎｕｃｌｉｏｎエンベロープ“の一例です。
【０１６６】
一実施形態では、図２８は、ｎｕｃｌｉｏｎにあるコア核酸ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄの周りにタンパク質キャプシドを生成している、Ｔ形ｎｕｃｌｉｏｎの１２個のｔＲＮＡに結合した１２個のＥＦ−Ｔｕ分子（Ｅ１からＥ１２標識が付いたもの）のコンピューター・モデルを示している。Ｔ１２はＥ１２が結合するｔＲＮＡ１２を示しています。コンピュータ研究では、下流が（ｍＲＮＡの３’末端方向で）を正方向でした場合に、各々のＥＦ−Ｔｕ（Ｎ）はＥＦ−Ｔｕ（Ｎ＋４）にも結合しうることを示した。Ｔ−形ｎｕｃｌｉｏｎに結合したＥＦ−Ｔｕ分子の数に明らかな幾何学的な制限はない（実際には、熱力学的因子が数を制限するが）。これとは対照的に、最大４つのＥＦ−Ｔｕ分子がＳ−形ｎｕｃｌｉｏｎにぴたりと結合しているかもしれませんが（図２９）、しかし原因のＥＦ−Ｔｕ（Ｎ）と入来するＥＦ−Ｔｕ（Ｎ＋４）間の干渉のために、実質的にそれ以上はない。  Ｓ−ｎｕｃｌｉｏｎｓにおけるＥＦ−Ｔｕに対するこの立体化学結合制限は、別の実施形態でのコンピュータモデリング研究で既に前述した、Ｓ−ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄにある４つのｔＲＮＡの限界と一致している。
【０１６７】
一実施形態では、ＥＦ−Ｔｕが各々のアミノアシル化ｔＲＮＡをｎｕｃｌｉｏｎから苦労して引き出すメカニズムのコンピュータモデルが図３０Ａ、図３０Ｂ、図３０Ｃ及び図３０Ｄに示されている。図３０Ａ及び図３０Ｂモデルは、結合前の高次構造を示しており、図３０Ｃと図３０Ｄモデルは、結合後の構成を示している。これらのモデルは、２ＷＲＮに報告されたようにｔＲＮＡＴｈｒを持つＥＦ−Ｔｕ複合体の結晶構造を利用していて（Ｓｃｈｍｅｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３２６［５９５３］：６８８）、前述したＳ形ｎｕｃｌｉｏｎ形式にある３’ｔＲＮＡのそれを持つｔＲＮＡＴｈｒのアミノ酸ステムを整列させている。この結合前のモデルでは、ｔＲＮＡＴｈｒは隠されており、結合後のモデルではｔＲＮＡＰｈｅが隠されている。
【０１６８】
ＥＦ−Ｔｕ分子は、その機能に一貫して、ｎｕｃｌｉｏｎの外側表面上に完全に位置しています。ＥＦ−ＴｕがｎｕｃｌｉｏｎからｔＲＮＡを苦労して引き出すときに、同時にそのｍＲＮＡコドンからｔＲＮＡのアンチコドンを除去しながら、上流のｔＲＮＡでＴＬＳからアミノアシル化ＣＣＡを退縮させる（図３０Ｃ及び図３０Ｄ）。ｔＲＮＡに付着したＥＦ−Ｔｕ分子が、ｎｕｃｌｉｏｎに同時に結合する複数のＥＦ−Ｔｕ分子を考慮して、同族ｔＲＮＡのＴＬＳに著しく侵害しない。
【０１６９】
一実施形態では、我々のコンピュータの研究は、ＥＦ−Ｔｕが、カップｎｕｃｌｉｏｎを整理して終了するために、そして前述した関連した潜在的に負の影響を持つ非リボソーム系のタンパク質合成を阻害するために、第二ｔＲＮＡ結合部位を有することを示している。図３１Ａ、図３１Ｂと図３１Ｃは、の同じｎｕｃｌｉｏｎ上の２つのＥＦ−Ｔｕ分子間に挟まれたＲ−ｔＲＮＡキャップに関するコンピュータモデルでｎｕｃｌｉｏｎ軸に平行な視線で図示されています。図３１Ａは、４つのＥＦ−Ｔｕ分子（ＥＦ−Ｔｕ２からＥＦ−Ｔｕ５）がＳ−形ｎｕｃｌｉｏｎにおけるその４つの同族ｔＲＮＡへの結合を示す。図３１Ｂは、Ｒ−ｔＲＮＡのキャップ（Ｔ１）の次の構造体への追加を示す。つまり、ＥＦ−Ｔｕ４（Ｅ４）の裂に位置するこのｔＲＮＡキャップからＣＣＡ−ＡＡテールがｔＲＮＡ４に付着した構造。最初に報告されたＥＦ−Ｔｕ上の結合部位とは対照的に、この第２の部位はｔＲＮＡ１のアミノアシル化ステムの右側に結合し、ｔＲＮＡ１に対して、ＥＦ−Ｔｕ１とＥＦ−Ｔｕ４間に強固に挟まれることを可能にする（図３１Ｃ）。図３２Ａ、図３２Ｂ、図３２Ｃは、図３１Ａ、図３１Ｂと図３１Ｃの３の構造に対応し、ｎｕｃｌｉｏｎ軸上の５’方向によるこれらの同じ四次構造の３つの図である。ｎｕｃｌｉｏｎ持つこれらのＥＦ−Ｔｕの四次構造は、報告されたＥＦ−Ｔｕの構造及び機能と互換性があり、また始原的なｎｕｃｌｉｏｎを取り巻くタンパク質カプシドとしてＥＦ−Ｔｕの先祖代々の役割と一致している。キャッピングｔＲＮＡを取り囲むＥＦ−Ｔｕ分子の付加的な利点は、それらがこのキャッピングｔＲＮＡのアミノ酸とＣＣＡテイルの間で不安定なアミノアシル化結合を保護し、安定させることである。そのような保護（及びそのようなシャインダルガーノ配列などの開始構造の相互作用の非存在下）の非存在下では、最初の（ほとんど５’）ｔＲＮＡ上のアミノアシル化結合は暴露されたり加水分解を受けやすいが、Ｓ−形ｎｕｃｌｉｏｎにある別のアシル化ｔＲＮＡがＴＬＳ結合により保護されている。
【０１７０】
ｔＲＮＡと伸長因子ＥＦ−Ｔｕは（又は真核生物におけるｅＥＦ１Ａに相当する分子）の両方の濃度は、細胞内の非常に高いです。ｔＲＮＡは、細胞内で最も頻度の高いＲＮＡ分子の一つであり、リボソームＲＮＡについで通常は２番目に多い。大腸菌ではＥＦ−Ｔｕの頻度は高く、翻訳機構の他の重要なタンパク質成分よりも大幅になモル過剰で、全細胞タンパク質の５−１０％を占めている。ｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎｓがＥＦ−Ｔｕ（規定では、又はｅＥＦ１Ａ）を結合できることを考えると、生体内のｎｕｃｌｉｏｎｓのほとんどは、細胞内でのＥＦ−Ｔｕ（又はｅＥＦ１Ａ、規定では）でコーティングされ、エンベロープｎｕｃｌｉｏｎｓの例を提供してる。ほとんどのｎｕｃｌｉｏｎｓが正常に伸長因子タンパク質でコーティングされているという事実は、本発明のいくつかの実施形態によれば、それらが天然の供給源から単離される方法に影響を与える。そのような精製されるエンベロープｎｕｃｌｉｏｎｓに対して、当業者に知られている穏やかな方法がｒｉｂｏｃａｐｓｉｄにこのタンパク質コートの結合を保持するために採用されなければならない。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎの会合は、根本的なメッセンジャーＲＮＡに相対して結果生じる四次構造の集合体の分子量が著名に増大する。例えば、約５００から６００ヌクレオチド長辺りの成熟真核メッセンジャーＲＮＡは、約１７０，０００万の分子量を持つことができる。典型的なｔＲＮＡ分子は２５，０００〜３０，０００の範囲の分子量を有する。一実施形態では、５つのｔＲＮＡ分子が小さいｎｕｃｌｉｏｎを形成するために、このｍＲＮＡ（ＲとＳ−高次構造の場合）に追加された時、結果として生じるｎｕｃｌｉｏｎの集合分子量は約３００，０００である。５つのｅＥＦ１Ａ分子の伸長因子コートがこのｎｕｃｌｉｏｎに適用される場合、抽出されたエンベロープｎｕｃｌｉｏｎは５００，０００を超える分子量の集合体である。いくつかの実施形態では、これらの四次構造の明確な物理的、化学的、電気的性質と共に、集合体の分子量におけるこの著名な差は、他の材料からｎｕｃｌｉｏｎｓとエンベロープｎｕｃｌｉｏｎｓを単離し、精製するために活用されます。
【０１７２】
Ｎｕｃｌｉｏｎ対称性
いくつかの実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎの対称性の程度とタイプは、そのｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットが編成されていた方法でかつ程度を反映している。いくつかの実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎでのｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットが対称に配置されており、このようなｎｕｃｌｉｏｎは’対称性ｎｕｃｌｉｏｎ’と称される。他の実施形態では、Ｎｕｃｌｉｏｎでのｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットが対称なく配置されており、そのようなｎｕｃｌｉｏｎは“非対称ｎｕｃｌｉｏｎ’と称される。いくつかの実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎが対称に配置されたいくつかのｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットと非対称に配置されたいくつかのｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットを含み、そのようなｎｕｃｌｉｏｎは’部分的対称性ｎｕｃｌｉｏｎ’と称される。いくつかの実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎは、１つ以上のタイプの対称性を持つｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットを含み、そのようなｎｕｃｌｉｏｎを“混合対称性ｎｕｃｌｉｏｎ’と称される。ｎｕｃｌｉｏｎに配置されたｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットが、ウイルス（ウイルスについてのセクションを参照）で観察されるようｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットと実質的に同様な対称性を提示するが、しかしｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットは、主に核酸であり、一方、ウイルスキャプシドサブユニット（’キャプソメア’）は主にタンパク質である。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、ｔＲＮＡ分子を実質的に包含するｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットは、Ｓ形ｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎに配置され、いくつかの実施形態では、これらのＲＮＡサブユニットはコア核酸を通じて中心軸の周りにらせん対称性を示す特徴がある。比較において、螺旋ウイルス（例えば、タバコモザイクウイルスなど）は、中空管、中心空洞がありうるらせん構造の軸の周りに積み重ねられた実質的に同一のタンパク質キャプソメアから典型的に構成されている。しかしながら、このようなウイルスでは、ウイルス核酸が必ずしもこのチューブに含まれているとは限らない。言い換えれば、対称の同一又は類似の型への本書面上の参考文献は、構造の異なる成分が必ずしも互いに対する同一又は類似の空間的な関係を持っていることを意味するものではありません。
【０１７３】
異なる種類のｎｕｃｌｉｏｎ
別の実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎの異なる種類があります。いくつかの実施形態では、機能的なｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットの大半のための基本的な要件は、コア核酸と別ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットの両方に同時に結合するための手段を持っているということです。実際には、これらの実施形態では、このｒｉｂｏｃａｐｓｉｄがこれらの役割の両方と互換性がある分子構造と大きさを持つことが必要である。しかしながら、いくつかの実施形態では、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットがトランスファーＲＮＡであることを必要条件とはせず、その構造がトランスファーＲＮＡに類似していることも必要条件とはならない。現代のトランスファーＲＮＡは、基本的なｎｕｃｌｉｏｎ形成の要件を実質的に超えて複数の役割を果たすように進化してきたので、ｔＲＮＡはｎｕｃｌｉｏｎ形成に必須でない特定の特殊な属性と関連する構造的な要素を持っている。さらに、いくつかの実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎ形成にとって、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットが同じ螺旋方向で積み重なることも、天然なトランスファーＲＮＡ分子のようにまた同じ５’から３’方向へ、積み重なることも必須ではない。いくつかの実施形態では、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットが、ｔＲＮＡ分子よりも小さいても又は大きくても良く、さらにｔＲＮＡが実質的に異なる形状を有することができる。いくつかの実施形態では、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニット（ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ単位Ｎ）が隣接ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニット（Ｎ＋１とＮ−１の両方又はいずれか一方）に特異的に結合するが間に、他の実施形態でのｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットが非隣接ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニット（例：Ｎ＋２とＮ−２両方又はいずれか一方。Ｎ＋３とＮ−３両方又はいずれか一方など）に結合する。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、アンチコドンとコドンはいずれも、３つのヌクレオチドの長さである。しかし、この長さはｎｕｃｌｉｏｎ形成のための必要条件ではない。特定の実施形態では、アンチコドンとコドンの長さは３ヌクレオチド以上もあればそれ以下もある（例えば、４つのヌクレオチド）。さらに、いくつかの実施形態では、それはアンチコドンとコドンは天然のヌクレオチドの構成が必要条件ではない。実際、いくつかの実施形態では、結果得られるｎｕｃｌｉｏｎｓ上の特定の望ましい属性を付与するために非天然ヌクレオチドを使用することが望ましい。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、アミノ酸の付加に関わらずリンクサイトはＣＣＡテールです。いくつかの実施形態では、リンクサイトはＧＴＰＣ配列を含む。しかしながら、これらの構造のどちらもｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニット間のリンクが要件とはならない。いくつかの実施形態では、ＣＣＡ又はＧＴＰＣに実質的に無関係である分子構造はｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットをリンクするために使用されている。他の実施形態では、サブユニット間のリンクの１つ以上のタイプが同じｎｕｃｌｉｏｎ内で採用されている。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニット構造、接続形状、リンク機構、及びコドンの一定の置換：アンチコドン相互作用が、有用な産業用アプリケーションの広範で多量な異なるｎｕｃｌｉｏｎ構造を生む。
【０１７７】
データマイニングとコンピュータモデリングのための材料及び方法
本発明のいくつかの実施形態では、このヌクレオシドデータマイニングの研究は、他の実施形態では他のデータベースが使用されているが、ドイツのライプチヒ大学（Ｊuｈｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３７：Ｄ１５９）によって維持されているｔＲＮＡｄｂデータベースからの情報を使用して実施された。他の実施形態では、配列情報は、遺伝情報に優先して使用されている。これは、遺伝情報が他の実施形態で用いているが、前者が修飾されたヌクレオシドの存在を報告することによる。いくつかの実施形態では、修飾又は未修飾された各ヌクレオシドの情報が別々に分離され、すべてのｔＲＮＡの位置での各ヌクレオシドの配列有病率（“ＳＰ“）を計算するために、アルゴリズムはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌで記載された。集合（６２３）にある配列の総数のパーセントで表示し、特定のｔＲＮＡの位置でヌクレオシドの出現回数としてＳＰは算出された。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、適応可能で利用可能なときに、以下のコホート内で、ＳＰデータは配分されそして分析された：［伸長又はイニシエーター］と［古細菌、細菌、真核生物又はウイルス］と［細胞質やオルガネラ］。すべてのコホートが適切に表現されていない、又は、いくつかのケースでは、まったく表現されていないため、ＳＰの結果は標準化されていなかった。従って、その結果は、ｔＲＮＡｄｂデータベースに貢献した配列集団を反映して、コホートによる不均衡な配列表現により、統計的に不可避に偏りがあった。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、コホートによる有病トポグラムは、任意のｔＲＮＡの最高解像度を得るために、独立した研究所による結晶研究で決定されていた、酵母ｔＲＮＡＰｈｅの構造（ＰＤＢ：１ＥＨＺ）（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  ＲＮＡ，  ６：１０９１）にＳＰの結果を投影することにより構築された。結晶構造がすべてのコホートでは使用できなかったので、保存された二次構造は、三次構造の保存への指針に利用され、先に述べた例外にすべての対象を用いた。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、この本書面で参照したコンピュータモデリング研究は、他の実施形態で他のソフトウェアが使用されているが、コンピュータプログラムのＰｙＭＯＬバージョン１．２ｒ３ｐｒｅ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ  ＬＬＣ；  ＰｙＭＯＬ  ｂｙ  Ｓｕｒｈｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ＶＤＭ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｈｏｕｓｅ，  ２０１０）を使用して行った。その酵母ｔＲＮＡＰｈｅの構造は、モデルのほとんどのための構造プラットフォームであり、他のｔＲＮＡは状況に応じて置換又は追加された。  調査を容易にするために、ＰｙＭＯＬのビルド機能を使用して、アミノ酸がこれらｔＲＮＡに時には追加された。
【０１８１】
次の表は、この研究で使用され、結晶の研究から決定された１０のｔＲＮＡの構造を含む。前述のタンパク質構造データバンク（’ＰＤＢ’）ＩＤに対応する参照は次の通り。ＣＷ５と３ＣＷ６（Ｂａｒｒａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １５：４８９４）；  １ＹＦＧ（Ｂａｓａｖａｐｐａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １０：３１０５）；  ２ＴＲＡと３ＴＲＡ（Ｗｅｓｔｈｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ａｃｔａ．  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  Ａ．，  ４４：１１２）；１ＥＨＺ（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  ＲＮＡ，  ６：１０９１）、１ＥＶＶ（Ｊｏｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．    ３０１：４０１）、２ＷＤＫ（Ｖｏｏｒｈｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ５：５２８）；１ＦＩＲ（Ｂeｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  ＲＮＡ，  ６：１３４７）；  ３Ａ３Ａ（Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３７：６２５９）。
【０１８２】
【表１】
2013545462.tif 000002
【０１８３】
高度好熱菌リボソームの構造が２ＷＤＧ−Ｎ（Ｖｏｏｒｈｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ５：５２８）に、３Ｉ８Ｆ−Ｉ  と３Ｉ９Ｂ−Ｅ（Ｊｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０，  Ｎａｔ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １７：５５５）として報告され、７０Ｓ  リボソームの研究に使用された。ＡサイトにあるｔＲＮＡに対して報告された２ＷＤＫでのコドン−アンチコドン構造は、アンチコドンループのＬ−立体配座のために使用された。高度好熱菌ＥＦ−Ｔｕを用いたモデリングは２ＷＲＮの構造を使用した（Ｓｃｈｍｅｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３２６［５９５３］：６８８）。関連三次構造の限定された可用性により、いくつかのコンセンサスコンピュータモデルは、異なる種由来の分子成分で構成された。生物学的な領域間でのｔＲＮＡの形状の高度の保存は、このアプローチを容易にした。特定のキーコンピュータモデリングのよる前段階の地形的な結論はスケールモデルを構築することで確認された。
【０１８４】
Ｎｕｃｌｉｏｎ製造
本発明のいくつかの実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎｓとｒｉｂｏｃａｐｓｉｄｓはｔＲＮＡ分子及びＲＮＡ分子の範囲から製造されています。一連の製造研究で、本発明のいくつかの実施形態によって教示されるように、その生化学的及び生物物理学的特性を決定し、我々はそのようなｎｕｃｌｉｏｎｓとｒｉｂｏｃａｐｓｉｄｓを組み立て、それらの機能を試験した。
【０１８５】
実施例１：アミノアシル化リンケージの安定性
本発明の特定の実施形態では、ｔＲＮＡのｎｕｃｌｉｏｎ製造用のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットとして使用する装填されたｔＲＮＡのアミノアシル化結合の安定性を決定するために、我々は、１０℃と３７℃でのメチオニン特異的伸長ｔＲＮＡ（’ｔＲＮＡｅＭｅｔ’）の加水分解速度を測定し、そして３７℃でのシステイン特異的ｔＲＮＡ（’ｔＲＮＡＣｙｓ’）の加水分解速度を測定した。この結果は図３３に、ｙ軸は加水分解の割合を示しｘ軸は時間を分単位で示している。アミノアシル化ｔＲＮＡ（３５Ｓ−標識メチオニンやシステインと）は最初に調整し、下記’ｎｕｃｌｉｏｎ製造のための材料及び方法“に記載した。その後、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５及び１０ｍＭのＭｇＣｌ２で示した温度で加水分解反応を行った。反応分割物はギ酸で反応停止し、酸性条件下でのセルロースＴＬＣ上の電気泳動分離によってアミノアシル化ｔＲＮＡから遊離アミノ酸は除去された。３５Ｓ標識製品は、蛍光画像で可視化されとＩｍａｇｅＱｕａｎｔを用いて定量化した。
【０１８６】
これらの条件下でメチオニン特異的伸長ｔＲＮＡ上のアミノアシル化結合の半減期は、３７℃で２０分（図３３Ａ）、１０℃で約１００分であった（図３３Ｂ）。システイン特異的ｔＲＮＡ上のアミノアシル化リンケージの半減期は、これらの条件下で、３７℃で約４０分であった（図３３Ｃ）。これらの半減期は、以前に報告されたデータと実質的にほぼ一致しており、本発明のいくつかの実施形態でのｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎモデルによって予測されたように、ｎｕｃｌｉｏｎ形成がアミノアシル化結合の安定性を増大させるか否かを決定するための基礎を提供する。アミノアシル化結合の半減期は、ｔＲＮＡの種類と本発明の他の実施形態によって異なる。
【０１８７】
実施例２：ｍＲＮＡに対するｔＲＮＡのモル比の効果
一実施形態では、９連続のＡＵＧトリプレット（ＡＵＧコドンが伸長とイニシエーターメチオニン特異的ｔＲＮＡの両方に特異的である）を含む３２Ｐ標識されたｍＲＮＡでアミノアシル化メチオニン特異的な伸長ｔＲＮＡ（’Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｅＭｅｔ’）のモル比を変化して保温することによって、ｔＲＮＡのｎｕｃｌｉｏｎｓは会合された。メチオニンコドンを含むこのｍＲＮＡの配列（’ｍＲＮＡＭｅｔ’）は、ＡＵＧに下線：
５’−ＧＧＧ−ＡＵＧ−ＡＵＧ−ＡＵＧ−ＡＵＧ−ＡＵＧ−ＡＵＧ−ＡＵＧ−ＡＵＧ−ＡＵＧ−ＣＵＵ−ＵＣＵ−ＡＧＧ−ＣＡＣ−３’（配列番号：１）。
【０１８８】
反応物［緩衝液Ａ（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５、４％グリセロール、０．０５％キシレンシアノール、０．０５％ブロモフェノールブルー）に１５μＭの未変性Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｅＭｅｔ、０．００４７から３．６μＭの３２Ｐ−ｍＲＮＡＭｅｔ、１５０ｍＭのＭｇＣｌ２を添加した６μＬ］は、３７℃あるいは氷浴（４℃）で１０分間保温した。ｍＲＮＡへのｔＲＮＡのモル比は、一定量の３２Ｐ−標識されたｍＲＮＡＭｅｔを含んだ反応混合物に非標識ｍＲＮＡＭｅｔを様々な量で添加することにより調整した。２μＬの反応分割物は、５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む８９ＭＭ  Ｔｒｉｓ−ホウ酸緩衝液中（ｐＨ８．３）で非変性１２％ＰＡＧＥゲル（８センチメートル×７センチ×０．８ミリメートル）に添加され、２００Ｖでブロモフェノールブルー色素が底に到達するまで電気泳動された。１つのゲルは室温（約４５分、２２℃）で電気泳動され、一方、他のゲルは低温室（〜８０分、８℃）で電気泳動された。乾燥させた後、ゲルは３．２５時間蛍光スクリーンに感光させ、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒで可視化した。
【０１８９】
図３４Ａ及び図３４Ｂは、室温又は低温室でそれぞれに電気泳動されたこれらのゲルの結果を報告している（’Ｇｅｌｔｅｍｐ“）。各図は、３７℃と氷浴中の両方での複合体の会合に関してｍＲＮＡに対するｔＲＮＡの異なるモル比の効果を示している（’ＲＸＮ  ｔｅｍｐ’）。未結合のｍＲＮＡは、ゲルの遠い下方に分離バンドとして移動しており、このことはｍＲＮＡ単体を用いた別途の解析により検証された（実験提示なし）。少なくとも５つｔＲＮＡのバンドを分離した：ｍＲＮＡの複合体はゲルに表示した（’複合体１−５’）。複合体の隣接バンドは実質的に互いにほぼ等距離であり、連続したバンドがｍＲＮＡ当たりｎ＋１個の追加のｔＲＮＡを含んだ、高分子のｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎ構造と一致した。この実施形態では、３７℃で行った反応は、４℃で行われたものよりｎｕｃｌｉｏｎｓの収量が良く、個々の多量体の電気泳動解像度は室温と比較すると低温室で実施したゲルの方が良好であった。異なる温度の影響は、本発明の異なる実施形態で観察されています。
【０１９０】
図３４Ｃと図３４Ｄのデータは、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔを用いて、図３４Ａ及び図３４Ｂそれぞれで３２Ｐ標識されたｍＲＮＡに相当するバンドとの複合体１−５の定量化によって得られた。結果は、遊離ｍＲＮＡのポリマーｔＲＮＡへの進行性の変換を示している：ｍＲＮＡへのｔＲＮＡの増加モル比における３７℃時のｍＲＮＡ複合体。  ｍＲＮＡに対してｔＲＮＡが高いモル比では、実質的にすべてのｍＲＮＡは、ポリマーのｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎ複合体に変換した。この実施形態では、低温室で電気泳動した非変性ゲルは、ｔＲＮＡ：ｍＲＮＡ複合体を維持しやすく、室温によるゲルで比較すると、わずかならながら、３７℃で形成されたものよりも若干良かった。ゲルが８℃で電気泳動されたとき、保持された高次複合体の割合は、室温での電気泳動ゲルで観察される割合よりもモル比の増加に伴い増え、いずれの条件もｎｕｃｌｉｏｎ会合は３７℃で行われた。
【０１９１】
ｎｕｃｌｉｏｎ会合の速度と種類に関してｍＲＮＡへのｔＲＮＡのモル比の影響は、現在の発明の異なる実施形態に応じて変化しうる。
【０１９２】
実施例３：マグネシウム濃度の影響
別の実施形態では、９連続メチオニンコドンを含む３２Ｐ−標識されたｍＲＮＡＭｅｔを用いて、アミノアシル化メチオニン特異的な伸長  ｔＲＮＡのｎｕｃｌｉｏｎ複合体の会合に関して、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）の濃度による効果を調べた。ｍＲＮＡＭｅｔ（０．２４μＭ）へのＭｅｔ−ｔＲＮＡｅＭｅｔ（１５．５μＭ）のモル比は、６５であった。指示されたＭｇＣｌ２の濃度を補充した緩衝液中Ａで実施した反応は、氷浴中で１０分間保温した。複合体形成は、実施形態２に記載のように、低温室中での反応の分割物の電気泳動分析により観察された。乾燥ゲルは１０時間蛍光イメージさせた。図３５Ａは、高分子ｔＲＮＡ：ｍＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎ複合体（’複合体１−５’）の分離バンドの形成が再び示しされたゲルイメージである。図３５Ｂは、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔを用いて、図３５Ａで３２Ｐ標識されたｍＲＮＡに相当するバンドとの複合体１−５の定量化によって得られたグラフである。図３５Ｃは、塩化マグネシウムの濃度１００ｍＭ以下で、図３５Ｂから得られたデータを表示してある。
【０１９３】
この実施形態では、ｍＲＮＡへの装填されたｔＲＮＡの結合は、ＭｇＣｌ２の濃度に所定の増加に伴い実質促進される。１００  ｍＭ濃度を実質的に超えるＭｇＣｌ２では、試験したこの条件下で、ｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎ形成のために望ましい。ＭｇＣｌ２の異なる濃度は、本発明の他の実施形態では望まれる。
【０１９４】
実施例４：アミノアシル化化ステータスとコドンの認識に及ぼす影響
別の実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎ会合におけるアミノアシル化ステータスと同族対非同族アンチコドンとコドンの組み合わせにおける影響を、メチオニン特異的ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡＭｅｔ、９連続したＡＵＧのコドン）と未変性Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｅＭｅｔ、未変性脱アシルｔＲＮＡｅＭｅｔ、未変性Ｃｙｓ−ｔＲＮＡＣｙｓ間の比較反応により検討した。１５０ｍＭのＭｇＣｌ２を添加あるいは無添加の緩衝液Ａに１５μＭのｔＲＮＡと４．７ｎＭの３２Ｐ−標識されたｍＲＮＡＭｅｔ（ｍＲＮＡに対するｔＲＮＡのモル比が３２００）を含む反応混合物は、氷浴中で１０分間保温された。各反応混合物の分割物を、低温室の中で５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む８９ｍＭトリス−ホウ酸ｐＨ８．３緩衝液で実行１２％ＰＡＧＥゲルで２００Ｖで８０分間電気泳動された。図３６は結果報告する。ゲルの最初の２レーン（レーン１の標識が付いた）は、３２Ｐ−標識されたｍＲＮＡを含むが、ｔＲＮＡを含まない。未変性メチオニン特異的伸長ｔＲＮＡ（レーン２の標識が付いたもの）又はアミノアシル化メチオニン特異的伸長ｔＲＮＡ（レーン３の標識が付いたもの）のいずれかの添加は、ｎｕｃｌｉｏｎ複合体形成の相当量をもたらすが、しかし、アミノアシル化システインｔＲＮＡの添加（レーン４の標識が付いたもの）は１５０ｍＭのＭｇＣｌ２の存在の有無とは無関係に起きなかった。この実施形態では、高分子のバンド数とパターンは、ｔＲＮＡのアミノアシル化状態に依存します。１５０ｍＭのＭｇＣｌ２及びアミノアシル化メチオニン特異的伸長ｔＲＮＡの存在下では、ｎｕｃｌｉｏｎ複合体のラダーは、未変性脱アシル化メチオニン特異的伸長ｔＲＮＡを使用した際のラダーよりも低度の高分子を提示する。この観察は、Ｔ形ｎｕｃｌｉｏｎが装填及び非装填ｔＲＮＡの両方を収容することができ、Ｓ−形ｎｕｃｌｉｏｎは装填されたｔＲＮＡをだけを収容することができるという、この実施形態にある説明に一致する。この説明は、既存のＳ−形ｎｕｃｌｉｏｎにｔＲＮＡを追加するための自然の中での審査基準の一つが前記のｔＲＮＡがアミノ酸で装填しなければならないとする、本実施のためｎｕｃｌｉｏｎモデルを支持する。これらの結果は、この実施形態では、装填及び非装填ｔＲＮＡｅＭｅｔ両方がｍＲＮＡＭｅｔ上にｎｕｃｌｉｏｎを形成できるが、ＡＵＧのコドンに結合しないＣｙｓ−ｔＲＮＡＣｙｓ上には形成できないことを示している。このことは、この種類のｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎの形成における特定のコドン−アンチコドン相互作用のための要件と一致しています。本発明の他の実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎ形成の程度や種類とコドン−アンチコドン相互作用の特異性の程度は、この段落で説明した結果とは異なる。
【０１９５】
実施例５：ｔＲＮＡがｎｕｃｌｉｏｎ会合のキネティクス
本発明の一実施例では、３７℃でのｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎ複合物の会合の経時変化は、１５０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む緩衝液Ａにの３２Ｐ−標識されたｍＲＮＡＭｅｔ（９連続したＡＵＧ）へのＭｅｔ−ｔＲＮＡｅＭｅｔのモル比が３２００を含む溶液を用いて測定した。指定された時間（図３７のゲルの結果について’分’を参照）で、反応混合物の分割物は、共同群として解凍され、そして低温室の中で反応成分の電気泳動分離（８９  ｍＭトリス−ホウ酸ｐＨ８．３緩衝液中で２００Ｖで８０分）のために１２％ゲル上にロードされるまで、ドライアイス浴に移された。この結果得られた蛍光イメージは、初期ｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎ形成は非常に急速（１分以下）であるのに対し、が高次構造の出現には多少時間がかかることを示す。我々は、ここで観察された反応コースは、複合体形成がゲル上で解凍し、サンプルのロードに必要な時間にも起こりうるという事実に照らして解釈されるべきであることに注意してください。他の実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎ複合体形成の速度論は、この段落に記載したものとは異なっている。
【０１９６】
実施例６：ｎｕｃｌｉｏｎ標的に結合する薬剤によるＮｕｃｌｉｏｎ解離
いくつかの実施形態では、生物由来あるいは生物に備わる天然ｎｕｃｌｉｏｎｓとｒｉｂｏｃａｐｓｉｄｓが、一定の生化学的、生理的又は医学的効果を達成するための手段の備わった天然又は非天然物質を投与することによって、調節され、阻害され、中断され、あるいは亢進された。いくつかの実施形態では、投与された物質が、特定のｎｕｃｌｉｏｎ標的に会合する手段として設計されている。いくつかの実施形態では、標的にされたｎｕｃｌｉｏｎｓは、その標的とされたｎｕｃｌｉｏｎｓの濃度を実質的に低減するために、ｎｕｃｌｉｏｎ成分の１つ以上と競合する化合物を投与することによって解離される。一実施形態の例では、ｎｕｃｌｉｏｎｓコア核酸と競合する手段を含む化合物が添加された条件で、所定のｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎｓの解離の動態を検討した。この手段は、標的とされたｎｕｃｌｉｏｎにあるｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ上のアンチコドンのセットに相補的であった、追加されたＲＮＡの上に複数のコドンのセットだった。  この例では、アンチコドンのこのセットは“ｎｕｃｌｉｏｎ標的“を構成し、追加されたＲＮＡは有効な薬剤である。
【０１９７】
この例では、Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｅＭｅｔ（１５μＭ）及び３２Ｐ−標識されたｍＲＮＡＭｅｔ（９連続したＡＵＧのトリプレット；０．００７５μＭ）との間に形成されたｒｉｂｏｃａｐｓｉｄの解離に関する時間経過が、１５０ｍＭのＭｇＣｌ２を含む緩衝液Ａに１５μＭ非放射性ｍＲＮＡＭｅｔ（ＲＮＡ薬剤）の存在下で予め形成された複合体を３７℃で保温することにより決定した。前と同様に、分割物は、５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む８９ｍＭトリス−ホウ酸ｐＨ８．３緩衝液で１２％ポリアクリルアミドゲルで８℃で２００Ｖで８０分間電気泳動におけるその後の分析のために、ドライアイス浴中に移された。得られた蛍光イメージ（図３８Ａ）及び関連した時間経過（図３８Ｂ）は、本実施形態で、大幅に過剰のフリーｍＲＮＡＭｅｔ（コア核酸の濃度の〜１０００倍）が、ｎｕｃｌｉｏｎｓ中のｍＲＮＡＭｅｔを競合したりあるいは置換するために存在するとき、加算されたｎｕｃｌｉｏｎ複合体は約３分の半減期で解離することを示している。一実施形態のこの例では、追加されたＲＮＡのエージェントは、ｎｕｃｌｉｏｎ標的を構成するｒｉｂｏｃａｐｓｉｄアンチコドンに結合することによってｎｕｃｌｉｏｎｓを急速に妨害した。他の実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎ複合体の解離の動態は、本項に記載したものとは異なっている。
【０１９８】
実施例７：ｎｕｃｌｉｏｎ長とモル比の変動
一実施形態の例では、連続したＡＵＧのトリプレットの数（すなわち、１、２、３、４、６、９）で異なっていた固定長の４２−ｍｅｒのｍＲＮＡのセットを調整することによって、一連のｔＲＮＡのｎｕｃｌｉｏｎｓにあるｍＲＮＡに対するｔＲＮＡのモル比を、我々は決定した。これらのｍＲＮＡは３２Ｐで５’末端が標識されており、１５０ｍＭのＭｇＣｌ２を含む緩衝液Ａ（ｍＲＮＡへのｔＲＮＡのモル比は２００であった）で、３７℃で１０分間、１５μＭのｍＲＮＡＭｅｔ（ＲＮＡ薬剤）の存在下で保温された。得られたＰＡＧＥゲルの蛍光イメージは図３９Ａに示されている。各ｍＲＮＡ中の連続したＡＵＧのトリプレットの数はゲルの上部に表示され、一方、各バンドでのｍＲＮＡへのｔＲＮＡの見掛けのモル比が両側に表示されている。この蛍光イメージのＩｍａｇｅＱｕａｎｔ分析の結果は、図３９Ｂに示されている。付属の棒グラフに、それぞれのバンドの各ｍＲＮＡの画分が定量化されている。この結果のパターンに基づいて、我々は個々の多量体にモル比を割り当てた。この実施形態で、観測されたモル比が示していることは、１つのＡＵＧトリプレットへの１つのＭｅｔ−ｔＲＮＡｅＭｅｔの結合が、追加ｔＲＮＡの非鋳型重合を、ある程度促進できることである。
【０１９９】
実施例８：コア核酸はｎｕｃｌｉｏｎ形成のために必要とされる
Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｅＭｅｔとｍＲＮＡＭｅｔ間で、我々が観察したいくつかの高分子複合体に対して、理論的だが可能性の低い説明は、放射性標識ｍＲＮＡそれ自身でたまたま会合し、より高次の多量体をｔＲＮＡが形成することがありえるということである。我々はこの説明を排除するために、１５０ｍＭのＭｇＣｌ２を含む緩衝液Ａで、３７℃で１０分間、１５μＭのｍＲＮＡＭｅｔ（ＲＮＡ薬剤）の存在下で保温された３２Ｐで３’末端が標識されたＭｅｔ−ｔＲＮＡｅＭｅｔの濃度系列の移動度を分析した。ｔＲＮＡの濃度は、０．０７５〜２０マイクロモル（’μＭ’又は’ｕＭ’）の範囲であった。反応分割物を、５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む８９ｍＭトリス−ホウ酸ｐＨ８．３緩衝液で、低温室で１２％ＰＡＧＥゲルで２００Ｖで８０分間電気泳動した。得られたゲルの蛍光イメージを図４０に示します。二量体及び三量体ｔＲＮＡ種に対応するバンドは、ほぼすべてのレーン（ｔＲＮＡの二量体及び三量体形成の公表された報告と一致する）で観察されますが、それらは全ｔＲＮＡの少数成分であり（それぞれ１５％、３％）、ｍＲＮＡ主導のｎｕｃｌｉｏｎｓ形成が高次のオリゴマーの明確なラダーを発生することと対照的にｔＲＮＡの濃度増加伴う割合の増加がない。従って、本実施形態の条件の下で、アミノアシル化ｔＲＮＡがコア核酸などの同族ｍＲＮＡの非存在下ではｎｕｃｌｉｏｎｓを形成しない。
【０２００】
実施例９：イニシエータｎｕｃｌｉｏｎはシャイン・ダルガーノ配列に結合する
一実施形態の例では、ｎｕｃｌｉｏｎ形成の一般性を検証し、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ  ｔＲＮＡがｍＲＮＡに結合しているときに、シャインダルガルノ（  ’ＳＤ’）のこのｍＲＮＡの配列をｆＭｅｔ−ｔＲＮＡｉＭｅｔが認識できるかどうかを検討した。それはＳＤ配列は細菌では起こり、ｍＲＮＡ上に存在下でそのＳＤ配列がリボソームに結合できることは、当業者に知られていたが、しかし、ＳＤ配列のｔＲＮＡへの結合が報告されたことはない。ヒトなどの真核生物は、翻訳に関与する類似ｍＲＮＡ配列はコザック配列です。しかし、細菌と真核生物のタンパク質合成を開始するためのリボソームを利用する仕様には大きな違いが認められる。本発明のいくつかの実施形態によって教えられたものを含むそのような相違にある洞察が、抗生物質などの新規医薬化合物を製造し、使用して、設計するための医学的及び商業的に重要な新しい戦略とツールを提供することができます。  シャイン・ダルガーノとコザック配列は、細胞生物における翻訳の効率、精度と制御を改善するのに役立つタンパク質合成マーカー配列の一例である。
【０２０１】
我々は、以下の配列を有するｍＲＮＡを調製した：
５’−−ＧＧＧＡＡＧＧＡＧＧＵＡＡＡＡ−ＡＵＧ−ＵＵＵ−ＵＵＵ−ＵＵＵ−ＵＧＣ−ＵＵＵ−ＵＧＣ−ＵＡＧ−ＧＣＡ−−３’（配列番号：２）
【０２０２】
このｍＲＮＡは、シャイン・ダルガーノ配列（下線付き）Ａ４リンカー（４つの連続したアデノシン）によってコーディングトリプレットから分離されている。翻訳では、アミノ酸配列ｆＭＦ３ＣＦＣ（ホルミル−メチオニン、フェニルアラニン、フェニルアラニン、フェニルアラニン、システイン、フェニルアラニン、システイン）のヘプタペプチドの合成を、このｍＲＮＡが指定することになります。３２Ｐで末端標識した後に、このｍＲＮＡは、１５０ｍＭのＭｇＣｌ２を含む緩衝液Ｂ（１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、４％グリセロール、０．０５％キシレンシアノール、０．０５％ブロモフェノールブルー）にＭｅｔ−ｔＲＮＡｅＭｅｔ、ｆＭｅｔ−ｔＲＮＡｉＭｅｔは、Ｐｈｅ−ｔＲＮＡＰｈｅ、及びＣｙｓ−ｔＲＮＡＣｙｓの様々な組み合わせで共に、氷浴中で１０分間保温された（ｆＭｅｔ−ｔＲＮＡｉＭｅｔがＮ−ホルミルメチオニンでアミノアシル化された開始メチオニン特異的ｔＲＮＡ；Ｐｈｅ−ｔＲＮＡＰｈｅがアミノアシル化されたフェニルアラニン特異的ｔＲＮＡ）。各ｔＲＮＡは、ｍＲＮＡに対するｔＲＮＡのモル比が２０００となるように、１５μＭであった。実施形態８に記載のように、反応物は低温室で電気泳動的で分析され、ゲルの蛍光イメージは図４１に示されている。ｆＭｅｔ−ｔＲＮＡｉＭｅｔが存在下では、常にゲル上のバンドに大きな変化が見られます。これとは対照的に、イニシエータメチオニルｔＲＮＡが伸長メチオニルｔＲＮＡに置き換えられた装填されたｔＲＮＡの完全なセットは有意なゲルシフトを示されず、このことはｆＭｅｔ−ｔＲＮＡｉＭｅｔが、イニシエーターｎｕｃｌｉｏｎを安定させるために、シャイン・ダルガーノ配列と特異的に相互作用でき、おそらく、イニシエータｎｕｃｌｉｏｎを正しい読み枠への段取りを支援すうことを意味する。
【０２０３】
実施例１０：イニシエータｎｕｃｌｉｏｎ・会合ー上のモル比の影響
一実施形態では、上述したｆＭＦ３ＣＦＣのための配列コードをもつ同じ放射標識されたｍＲＮＡを用いて、ｍＲＮＡへのｔＲＮＡのモル比を１０から２０００に変化させたときに、我々はイニシエータｎｕｃｌｉｏｎ形成の程度を調べた。前と同じように、反応は、それぞれ１５μＭのｆＭｅｔ−ｔＲＮＡｉＭｅｔ、Ｐｈｅ−ｔＲＮＡＰｈｅ、及びＣｙｓ−ｔＲＮＡＣｙｓ用いて、氷浴中で１０分間、１５０ｍＭのＭｇＣｌ２を含む緩衝液Ｂ（１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、４％グリセロール、０．０５％キシレンシアノール、０．０５％ブロモフェノールブルー）で行われた。図４２Ａは、実施形態８に記載のように実施された、これらの反応の電気泳動の蛍光イメージを示す。図４２Ｂは、図４２Ａに示された蛍光イメージから決定した、ｔＲＮＡ：ｍＲＮＡのモル比の関数としてｎｕｃｌｉｏｎ形成の程度を示すグラフである。結合曲線は、Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｅＭｅｔがｍＲＮＡＭｅｔとともに保温されたときに観察されたものと実質的に同様で、検討された条件に対して、ｎｕｃｌｉｏｎ会合の動態は、実質的に類似していたことを示している。本発明の他の実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎ会合の動態は、所定の条件により異なります。
【０２０４】
ｎｕｃｌｉｏｎ製造のための材料及び方法
他の材料及び方法が、他の実施形態で使用されるが、本発明のいくつかの実施形態では、我々のｎｕｃｌｉｏｎ製造研究のために以下の材料及び方法を我々は採用した。
【０２０５】
ネイティブトランスファーＲＮＡ
大腸菌（Ａ２６０単位あたり１０００ピコモルメチオニンアクセプタ活性）からメチオニン特異的伸長のｔＲＮＡ（ｔＲＮＡｅＭｅｔ）及び酵母（Ａ２６０単位あたり１０００ピコモルフェニルアラニンアクセプタ活性）からフェニルアラニン特異的ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＰｈｅ）は、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｌｏｃｋ社（モスクワ、ロシア）から購入した。他の未変性ｔＲＮＡ（例；ホルミルメチオニン特異的ｔＲＮＡ、ｔＲＮＡｉＭｅｔ、システイン特異的ｔＲＮＡ、ｔＲＮＡＣｙｓ）はｐＫＫ２２３−３（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１，  Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ２：３２９）のＩＰＴＧ誘導性プロモーターから大腸菌で過剰発現させた。ｔＲＮＡの転写後修飾のための十分な時間を確保するように誘導した後、培養は１２から１８時間維持され、そして、各ｔＲＮＡはフェノール溶解により全ｔＲＮＡのプールの一部として単離され、続いて一連の異なる沈殿を行った。ｔＲＮＡのプールは、ｐＨ９．０のトリス緩衝液で３７℃で３時間保温することにより脱アシル化された。ネイティブｔＲＮＡＣｙｓはさらに、相補的なビオチン化オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションにより精製され、続いてストレプトアビジン−セファロース上で捕捉され、洗浄、高温で保温することにより、固体支持体から遊離された（Ｙｏｋｏｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３８：ｅ８９）。
【０２０６】
アミノアシル化
組み換えＨｉｓ−タグｅＭｅｔＲＳとｅＣｙｓＲＳは０．４ｍＭのＩＰＴＧで誘導でＢＬ２１（ＤＥ３）内で３７℃でそれぞれ発現させ、タロン樹脂を続いてＡＫＴＡ  ＦＰＬＣのＭｏｎｏ  Ｑカラムを通してクロマトグラフィを用いて精製した。  酵素濃度は、標準としてＢＳＡを用いてＢｒａｄｆｏｒｄ法により測定し、活性部位バーストアッセイ（Ｆｅｒｓｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７５，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １４：１）で補正された。ネイティブｔＲＮＡＣｙｓ（９０μＭ）は、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＡＴＰで３７℃で１０分間、２０μＭのＣｙｓＲＳとの保温によりシステイン（１８０μＭ）でアミノアシル化された。その反応物は２．５  Ｍ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ５．０の０．１ボリュームの追加により停止され、等量のｐＨ５．２フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出された。エタノール沈殿後、ｔＲＮＡは、２５ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．０）に溶解され、−２０℃で保存された。装填効率は、反応中に、少量の３Ｈ−システインを入れることによって、決定された。エタノール沈殿に続いて、装填されたｔＲＮＡの分割物は、遊離アミノ酸とＡＴＰの完全な除去を確実にするためにＣｅｎｔｒｉｓｐｉｎ−２０ゲルろ過カートリッジ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を介して遠心分離された。通過分画のＡ２６０及びトリチウムカウントから、装填されたｔＲＮＡの画分を計算できた。３５Ｓ標識されたネイティブＣｙｓ−ｔＲＮＡＣｙｓは装填反応に３Ｈ−システインを３５Ｓ−システインへの交換により調製した。ネイティブｔＲＮＡｅＭｅｔとｔＲＮＡｉＭｅｔの装填は、３Ｈ−メチオニン又は  ３５Ｓ−メチオニンの存在下で、ＭｅｔＲＳを使用して、同様の方法で行った。Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｉＭｅｔのホルミル化反応は、その反応にメチオニルホルミルトランスフェラーゼ及びＮ１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸を含めることによるアミノアシル化で同時に行われた。
【０２０７】
伸長Ｍｅｔ−ｔＲＮＡは、５ｍＭ  ＣＴＰとの一定量のα−３２Ｐ−ＡＴＰの存在下で、酵素を添加しＣＣＡと脱アシル化ｔＲＮＡの保温により、３’末端が標識された。標識されたｔＲＮＡはフェノール抽出され、Ｃｅｎｔｒｉｓｐｉｎ−２０カートリッジを通して遠心分離され、エタノール沈殿させた。上記のように回収したｔＲＮＡは装填されていた。
【０２０８】
ネイティブ酵母ｔＲＮＡＰｈｅは、村上（Ｍｕｒａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ３：３５７）により記載された、Ｐｈｅ−ＣＭＥの存在下でｅＦＸ  Ｆｌｅｘｉｚｙｍｅを使用して装填された。装填効率は、同じ著者によって説明されているようにビオチン化し、ストレプトアビジンを添加後、アミノアシル化ｔＲＮＡを１２％変性ＰＡＧＥゲルで電気泳動によって決定された。
【０２０９】
メッセンジャーＲＮＡの調製
ｍＲＮＡはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含んでいた合成二本鎖ＤＮＡの鋳型を使用して  、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  転写  により調製された。転写産物を、７Ｍ尿素による変性１２％ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動により精製した。バンドがＵＶシャドウイングによって可視化され、一晩振とうすることにより、ＴＥ緩衝液中にｍＲＮＡを抽出した。ｍＲＮＡを澄んだ上清からエタノール沈殿させ、ＴＥ溶液に−２０℃で保存した。最初にエビアルカリホスファターゼとの保温し、次いで、γ３２Ｐ−ＡＴＰ又はγ３２Ｐ−ＧＴＰの存在下でＴ４キナーゼ処理により、ｍＲＮＡは５’−末端が標識された。遊離放射性元素はエタノール沈殿及びＣｅｎｔｒｉｓｐｉｎ−２０カートリッジを通して遠心分離により除去した。
【０２１０】
電気泳動分離
３５Ｓ−Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｅＭｅｔ及び３５Ｓ−Ｃｙｓ−ｔＲＮＡＣｙｓは、ピリジン−酢酸ｐＨ  ２．８緩衝液内で、プラスチックシートを背部にしたセルロース上でＴＬＣ電気泳動により遊離アミノ酸から分離された（Ｚａｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４５７：１６１；  Ｙｏｕｎｇｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｃｅｌｌ，  １１７：５８９）。５ｍＭ  ＭｇＣ２を含むでトリス−ホウ酸ｐＨ８．３緩衝液で、１２％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動により、３２Ｐで標識されたｍＲＮＡからＮｕｃｌｉｏｎｓを分解した。オリゴマー形成のための３２Ｐで標識されたＭｅｔ−ｔＲＮＡｅＭｅｔの分析は、同じゲルシステムを用いて行った。これらのゲル（通常は６．５センチメートル×８センチメートル×０．７５ミリメートル）は、ブロモフェノールブルーがゲルの底に到達するまで、低温室又は室温で２００Ｖで電気泳動された。電気泳動後、ゲルは吸引下で濾紙上で乾燥させた。３２Ｐで標識されたバンドは、蛍光イメージによって可視化され、それらの強度をＩｍａｇｅｑｕａｎｔソフトウェアを用いて決定した。  ＴＬＣは、同様の方法で分析された。ここで用いたゲル電気泳動法の一般的な概要については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌを参照してください（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【０２１１】
製造工程
いくつかの実施形態では、（ｉ）天然ｎｕｃｌｉｏｎｓ（得られた物質は、本書面上で“生物学的ｎｕｃｌｉｏｎ“又は“生物学的ｎｕｃｌｉｏｎｓ’と名付ける）を精製すること、又は（ｉｉ）天然又は合成成分（得られた材料は本書面上で’合成ｎｕｃｌｉｏｎ’又は’合成ｎｕｃｌｉｏｎｓ’）からｎｕｃｌｉｏｎｓを会合すること、によりｎｕｃｌｉｏｎｓが製造されています。“天然ｎｕｃｌｉｏｎｓを精製すること“は、細胞又は細胞溶解物中に存在すると、それらが結合するような細胞成分からｎｕｃｌｉｏｎｓを単離することを意味する。いくつかの実施形態において、精製には、同一もしくは実質的に同一の成分のｎｕｃｌｉｏｎｓの均質な製剤の調製も含めることができます。いくつかの実施形態では、生物学的ｎｕｃｌｉｏｎｓの製造は、生物、生物学的製剤、細胞培養又は発酵源からの天然ｎｕｃｌｉｏｎｓを単離し、その使用目的に適切な範囲にそれらを精製することを含む。いくつかの実施形態では、合成ｎｕｃｌｉｏｎｓの製造はｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ核酸分子とコア核酸分子を組み合わせることを含む。いくつかの実施形態では、生物学と合成ｎｕｃｌｉｏｎｓ両方が、精製や更なる修飾を含んだ追加製造工程に供されてる。いくつかの実施形態では、得られたｎｕｃｌｉｏｎ製剤は、均質である（実質的にすべてのｎｕｃｌｉｏｎｓが同じ組成を有している）、又は不均一（組成の異なるｎｕｃｌｉｏｎｓの混合物を含む）である。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、核酸のための化学、生物学及び薬学分野での当業者は、ｎｕｃｌｉｏｎｓ、ｎｕｃｌｉｏｎコアで使用するための核酸分子、それにｒｉｂｏｃａｐｓｉｄで使用するためのサブユニット分子、を生産するための２つの主原料を単離又は製造手順に精通している（Ｖｏｍｅｌｏｖa  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｆｏｌｉａ．  Ｂｉｏｌ．  Ｐｒａｈａ，  ５５：２４３；  Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２００９：５７４３９８）。一実施形態では、コア核酸（’ＣＮＡ’）は、一本鎖ＲＮＡである。別の実施形態では、一本鎖ＤＮＡが使用されます。いくつかの実施形態において、１種以上のトランスファーＲＮＡがｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットに使用されています。他の実施形態では、他の態様の核酸を用いてもよい。いくつかの実施形態では、コアとｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットの一次、二次及び三次構造は、自然界に見られるものもあれが、ないものあり、あるいはそれらの混生である。コアとｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットは、天然源から抽出されたり、合成的に産生されたり、又は天然及び合成材料の組み合わせから誘導できる。いくつかの実施形態では、コアとｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットは、天然ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、修飾された天然ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、ヌクレオチド置換し、これらの任意の組み合わせ、又は、それらの任意の混成からなる鎖である。いくつかの実施形態では、コアとｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットの骨格は、（ｉ）ＤＮＡ又はＲＮＡ、又はそれらの任意の組み合わせにある、自然にある核酸で発見された骨格であり、（ｉｉ）非天然骨格、天然骨格の修飾、自然の類似バックボーン、天然骨格の類似体、天然骨格の置換、又はそれらの任意の組み合わせ、（ｉｉｉ）任意の天然及び非天然骨格の組み合わせ、又は（ｉｖ）天然及び非天然骨格の任意の混成である。ｎｕｃｌｉｏｎ生産のための原材料を構成するヌクレオチド、それらの類似体又は置換体のポリマーを製造あるいは修飾するために利用された方法は、天然又は非天然の工程を採用するか、又はそれらの任意の組み合わせがあります。
【０２１３】
ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットをトランスファーＲＮＡ分子を用いる実施形態では、このようなｔＲＮＡ分子は、自然の中で見つかった形、又は自然には存在しない形、又はそれらの組み合わせ、複合又はそれらの混合物で見つかった形である。このような天然のｔＲＮＡ分子は、（ｉ）いかなる生物学的な領域、ウィルスや他の生命体に自然の中で発見されたあらゆるアミノ酸のための受容体特異性をもつすべての種のｔＲＮＡ、及び（ｉｉ）追加のアミノ酸、酵素活性のためのプライマー分子、又はいくつかの他の機能を果たす分子に貢献する開始コドン、伸長分子を認識するために開始分子であるかどうかに関係なく、すべてのｔＲＮＡのクラス、を含むがこれらに限定はなく、自然界に見られるすべての転送分子を含む。非天然のｔＲＮＡは、（ｉ）完全な天然のｔＲＮＡのものとは異なるヌクレオチド配列の一定の長さあるいは任意の部分を有する、（ｉｉ）同じ位置に自然の中で見つかったものとは異なる１つ以上のヌクレオチドを含む、（ｉｉｉ）全部又は一部に、同じ位置に自然界に見られるものとは異なる骨格型又は修飾をもつ、（ｉｖ）自然界に見られるヌクレオチド配列に対して又はこの中にある、任意の伸長、あるいは１つ以上のヌクレオチドの欠失を有する、又は（ｖ）その位置に自然界では見られないｔＲＮＡ分子の任意の部分に対して又はこの間での任意の修飾又は架橋を有するような、任意のｔＲＮＡ分子を含むがこれに限定されない。いくつかの実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎｓは、ｎｕｃｌｉｏｎが使用されることを意図されているあるいは対する種、又はｎｕｃｌｉｏｎが使用されることを意図されているあるいは対する種とは別の種、あるいは他の種に由来するｔＲＮＡの混合物を用いて調製される。いくつかの実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎ生産のためのｔＲＮＡはｎｕｃｌｉｏｎが、免疫原性、発熱又は派生ｎｕｃｌｉｏｎの他の副作用を最小限に抑えるたり、軽減するために、ｎｕｃｌｉｏｎが使用されることを意図されているあるいは対する種に限定される。
【０２１４】
いくつかの実施形態において、１つ以上のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニット分子（’ＲＳＭ’）は、１つ以上のｔＲＮＡ分子を含むがこれに限定されるものではないが、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットがｎｕｃｌｉｏｎｓを作るために利用される前に、アミノ酸、アミノ酸の前駆体又は修飾されたアミノ酸と共役している。アミノ酸や核酸に適用されるような化学、生物、医薬分野における当業者は、アミノ酸の単離、製造及びを修飾、そして、それらあるいは核酸への前駆物質を共役するための手法に精通しているであろう。いくつかの実施形態では、そのような共役のためのアミノ酸は、（ｉ）タンパク質合成（“翻訳“）のために自然の中で使用される、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、ピロリジン、セレノシステイン、セリン、チロシン、バリン、タウリン、スレオニン、トリプトファン、（個別及び集合的に“標準アミノ酸’）、を含むがこれらに限定されないアミノ酸であり、（ｉｉ）翻訳後修飾又は他の生物学的工程の結果として自然に発生する’非標準“アミノ酸、（ｉｉｉ）自然には存在しないの合成と修飾された標準又は非標準アミノ酸、又は（ｉｖ）前駆体又はそれら（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）カテゴリ中にある任意のアミノ酸の組み合わせである。一実施形態では、アミノ酸がｔＲＮＡの３’末端に共役され、その共役がｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットとして使用されます。別の実施形態では、３’末端のｔＲＮＡ分子に共役したアミノ酸は、自然の中でそのようなｔＲＮＡ分子が特異的であるため、標準アミノ酸又はその前駆体である（’いつものアミノ酸’）。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、通常のアミノ酸の代用、これへの付加、あるいはこの欠如に、原子、分子、高分子、ポリマー、又は通常のアミノ酸（個別及び集合的に、“ＡＡ置換’）以外の部分が、１つ以上のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ核酸分子に共役している（ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ  ｔＲＮＡ分子を含むがこれに限定されない）。ＡＡの置換はアミノ酸自体であっても良いが、それが通常のアミノ酸ではないことを提供する。一実施形態では、ＡＡ置換はｔＲＮＡ分子の３’端に共有結合される。別の実施形態では、ｔＲＮＡ分子の３’末端へのＡＡ置換の共役は、通常のアミノ酸以外の標準的なアミノ酸である。ＡＡ置換は、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ内で隣接するｔＲＮＡの間のリンク（ＴＣ−ＴＬＳリンクを含むがこれに限定されるものではない）の量、質や安定性を、増加、減少又は調節するためにとりわけ使用され、そしてｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ、ｎｕｃｌｉｏｎ又は両方で特定の属性を付与するために使用されるかしれない。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、ｔＲＮＡにアミノ酸又はＡＡ置換を共役するために使用される化学リンクは、自然の中で使用されるエステル結合、又は、アミド結合を含むがこれらに限定されない他の天然又は非天然のエステル又は化学結合である。一実施形態では、この共役リンクは、ｔＲＮＡの３’末端の位置にアデノシンヌクレオチドの糖環内のアミノ酸のカルボキシル基と間の２’又は３’ヒドロキシル基の間のエステル結合である。一実施形態では、共役リンクは、アミノアシル化合成酵素含むがこれらに限定されない目的のために特定の天然酵素を用いて形成されたり（Ｉｂｂａａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．，  ２：３８２）あるいは、専用の触媒を使用せずに有機又は無機化学の方法によって形成される。
【０２１７】
未修飾ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットと未修飾コア核酸の組み合わせは、本書面上で“基本ｎｕｃｌｉｏｎ’と名付ける。いくつかの実施形態では、基本ｎｕｃｌｉｏｎに存在するもの以外の分子や修飾は、その構造や機能、又はその両方を変更するために、基本ｎｕｃｌｉｏｎに追加されたり、製造される。（さらに、その得られたｎｕｃｌｉｏｎは、本書面上で“複雑なｎｕｃｌｉｏｎ’と名付ける）。いくつかの実施形態では、このような付加的な分子及び修飾が以下を含むがこれに限定されるものではない。（ｉ）付加的な分子の結合は、水素結合、塩基対積み重ね、共有結合、イオン相互作用、又はそれ以外によって達成されることを特徴とし、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットを結合することには関与していないコア核酸分子の部分に結合するための、１つ以上の分子の添加（核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、ポリマー、小さな化学部分又は他の分子を含むが限定はされません）、（ｉｉ）いかなる手段によって付着されたり、いかなる目的のために意図された（半減期、酵素感受性やｎｕｃｌｉｏｎの輸送又はその成分の調整を含むがそれに限定されるものではなく）、キャップは任意の化学物質又は材料を特徴とする（メチル化グアノシン５’キャップ、端末三リン酸５’キャップあるいは３’末端付近のポリ（Ａ）テイルを含むがこれに限定されない）、コア核酸分子の５’又は３’末端（又はその両方の末端）への化学キャップの付加あるいは修飾、（ｉｉｉ）上記のアミノ酸、その前駆体、修飾及び置換の域を超えた、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ核酸に付加分子の共役、（ｉｖ）天然又は非天然材料タンパク質、炭水化物、脂質、コレステロール、核酸、合成ポリマー、リポソーム、凝集物、分散剤、誘引剤、忌避剤、アジュバント、蛍光材料、磁性材料、放射性物質、放射線不透過性材料、金属、セルロース、シリカ、プラスチック、又は任意の他の有機又は無機材料を含むがこれに限定されない）による、又はｎｕｃｌｉｏｎとの組み合わせて、ｎｕｃｌｉｏｎ、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ又はコア核酸への、追加の処置やコーティング、あるいはエンベロープの提供、（ｖ）追加の一級、二級、三級、又は四次構造（二重らせん、三重らせん、ステム、ループ、ステムループ、ヘアピン、シュードノット、テトラループ、リボスイッチ、リボザイム、ポリアデノシン配列、シャイン・シーケンス、又はコザック配列を含むがこれに限定されない）、をもたらす、基本ｎｕｃｌｉｏｎにおける核酸成分の１つ以上の設計又は製造の変更、及び（ｖｉ）ｎｕｃｌｉｏｎの構造又は機能に協働して影響したり作用する、接続、封入、組み込み、導入、混合、会合、又は、追加の分子又は分子成分の同時投与。これには、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡは、コードＲＮＡ、非コードＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、イントロン、エクソン、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、センスＲＮＡ、ナンセンスＲＮＡ、調節ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ、核小体低分子ＲＮＡ、スプライソソーム、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡの組み合わせ、アプタマー、インターカレート物質、ウイルス、ウイルス成分、ウイルスＲＮＡ、ウイルスＤＮＡ、タンパク質、酵素、ヒストン、抗体、開始因子、伸長因子、終結因子、翻訳因子、脂質、炭水化物、対照化合物、又は他の生化学的、化学的又は無機的な原子、元素、分子、化合物、材料又はこの段落に記載されているいずれかの分子の前駆体、を含むがこれに限定されるものではない、（ｖｉｉ）前述のフレーズ（ｉ）から（ｖｉ）に記載された分子あるいは修飾の任意の組み合わせ、複合又は混合。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、複雑なｎｕｃｌｉｏｎｓは次の１つ以上の特性を含むがこれに限定されない：
（ｉ）ｎｕｃｌｉｏｎを製造するために使用されたコア核酸は、５’末端に化学キャップを持つ一本鎖ＲＮＡ分子である。
（ｉｉ）ｎｕｃｌｉｏｎを製造するために使用されたコア核酸は、３’末端に化学キャップを持つ一本鎖ＲＮＡ分子である。
（ｉｉｉ）ｎｕｃｌｉｏｎを製造するために使用されたコア核酸は、任意にさらに分解に抵抗しｎｕｃｌｉｏｎの性能を改善するために修飾された、３’末端にポリ（アデノシン）テイルを持つ一本鎖ＲＮＡ分子である。
（ｉｖ）ｎｕｃｌｉｏｎを製造するために使用されたコア核酸は、５’末端に化学キャップ’及び３’末端にポリ（Ａ）テイルを持つ一本鎖ＲＮＡ分子である。
（ｖ）コア核酸は安定性とｎｕｃｌｉｏｎの性能を改善するために、５’末端で自己アニールヘアピンループを持つように設計された一本鎖ＲＮＡ分子である。
（ｖｉ）コアＲＮＡ分子は、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットにより部分的に囲まれており、残りのコア核酸分子はｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットに結合していない。
（ｖｉｉ）コアＲＮＡ分子はｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットにより部分的に囲まれており、残りのコア核酸分子は、１つ以上の’スマートＲＮＡ成分’が含まれている。この実施形態には、リボザイム、リボスイッチ、アプタマー、スプライソソーム、ポリ（Ａ）配列又は、生物学的効果を持っている任意のＲＮＡ成分又は構造、を含むがこれには限定されていない。
（ｖｉｉｉ）コアＲＮＡ分子はｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ核酸に部分的に結合しており、残りのコア核酸の一部又はすべてに対して補完的な１つ以上の他の核酸分子は、前記の残りのコア核酸に結合している。
（ｉｘ）コアＲＮＡ分子はｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットに部分的に結合しており、残りのコア核酸の一部又はすべてに対して補完的な１つ以上の他の核酸分子はそれに結合し、この他のＲＮＡ分子は１つ以上のスマートＲＮＡ成分を含むことを特徴とする。又は
（ｘ）コア核酸又は１つ以上ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ核酸は、ｎｕｃｌｉｏｎ製造の前後に放射性又は放射線不透過性物質で標識されています。
【０２１９】
Ｎｕｃｌｉｏｎ設計の要因
いくつかの実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎ製造、コア核酸とｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ核酸のために選択された原料（上記のように修飾するかどうか）で、実質的に以下の受け入れ基準を遵守しなければならない：（ｉ）コア核酸分子（’ＣＮＡ’）ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ核酸を結合する複数の結合部位（’コドン’）を持つ構造、領域の一部又は全部必ず含むこと、（ｉｉ）すべてのｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットは、ＣＮＡ上のコドンに結合する少なくとも１つの結合部位（’アンチコドン’）を必ず含むこと、（ｉｉｉ）ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットのほとんどは、同じＣＮＡに結合した隣接ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニット上のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄコネクタサイト（ＣＳ）に結合するために、少なくとも１つのｒｉｂｏｃａｐｓｉｄリンクサイト（ＬＳ）を全部必ず含むこと、及び（ｉｖ）ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットのほとんどが同じＣＮＡ上の隣接するＲＮＡ上のＬＳに結合するために、少なくとも１つのＣＳを必ず含むこと。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、与えられたｎｕｃｌｉｏｎ内の実質的にすべてのｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットは、コア核酸に結合しているが、すべてのｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットが必ずしもコア核酸の両方向の隣接ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットに直接結合してない。一実施形態では、図１でｎｕｃｌｉｏｎと４つのｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットとの模式図で例示した通り、左端ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットＲ１は唯一ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニット（Ｒ２）に直接結合し、右端のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニット（Ｒ４）は唯一ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄに直接結合し、サブユニット（Ｒ３）は、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットＲ２とＲ３各々は２つのｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットに直接結合する。いくつかの実施形態では、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットは、ＣＳ−ＬＳのリンクを経由して別のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットに結合できない可能性もある。一実施形態では、図１４ＡでＲ形ｔＲＮＡのモデルと図１５のｔＲＮＡのｎｕｃｌｉｏｎの模式図で例示したように、ｎｕｃｌｉｏｎにあるｒｉｂｏｃａｐｓｉｄをキャップするコア核酸は別のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄに直接結合しないが、それは依然同じコア核酸に結合したままである。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、図１８の概略図面に例示したように、ｎｕｃｌｉｏｎの構造又は機能を変更するために、ＣＳ−ＬＳのリンクが設計により阻害あるいは破砕しされた。いくつかの実施形態では、上流及び下流のＣＳ−ＬＳリンク（ｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎｓにあるＴＣ−ＴＬＳリンクに相当）の阻害は、メッセンジャーＲＮＡ上の翻訳開始部位で開始コドン標識するために利用されている。上流阻害の実施形態では、開始ｔＲＮＡ上のアミノ酸は、その５’近傍での接続を阻害するためにホルミル化されており、それにより、開始ｔＲＮＡをＲ形キャップ位置に強要し、タンパク質合成のための開始コドンを標識することになる。下流阻害の実施形態では、３’−隣接のｔＲＮＡ上のＣＳ（ｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎｓにおけるＣＴ）の結合を阻害するために、開始ｔＲＮＡ上のＬＳサイト（ｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎｓのＴＬＳ）は修飾され、それにより、この隣接をャップの位置に強要する。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎｓは構造体の広い範囲で会合され、単一ｎｕｃｌｉｏｎ構造は、１つ又は複数のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ高次構造を含んでもよい。図１６で提示された複数のｎｕｃｌｉｏｎ高次構造（“化合物ｎｕｃｌｉｏｎ’）を含むｎｕｃｌｉｏｎのデザインで例示された一実施形態では、三つの異なるｎｕｃｌｉｏｎ高次構造は、統合されたｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎ構造を形成するために混合されて示されています。複合ｎｕｃｌｉｏｎのこの例では、Ｒ形ｔＲＮＡはｎｕｃｌｉｏｎの５’末端をキャップし、の終わり、４つのＳ形ｔＲＮＡは中間部を形成するために一緒に結合し、ｎｕｃｌｉｏｎの３’側に一連のＴ−形ｔＲＮＡが続く。二つの追加アミノアシル化ｔＲＮＡは、ｎｕｃｌｉｏｎからｍＲＮＡの下流に結合して表示されている。
【０２２３】
一実施形態では、図１７は化合物ｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎのこの例での３つの  ｎｕｃｌｉｏｎ高次構造の特性及び寸法の要約です。複合ｎｕｃｌｉｏｎの別の実施形態では、シングルコア核酸上の近接するｒｉｂｏｃａｐｓｉｄの複数のセクションは、構造上の改行で区切られています。一実施形態では、これらの改行は、特定のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニット（例えば、ホルミルメチオニンでアミノアシル化される細菌のイニシエータのｔＲＮＡなど）を選択することにより達成され、これらのｎｕｃｌｉｏｎｓセクションを囲んでいる。  これらの囲まれたｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットのＣＳ又はＬＳのサイトが、それらの位置でｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ構造の継続を阻害するためにブロックされている。
【０２２４】
本発明のいくつかの実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎｓは、核酸複合体の形成に適していることが、製薬、化学的、生物学分野における当業者に知られている、バッチ、連続的又は他の工程を使用してコア核酸とｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ核酸から会合され、採用された方法、試薬及び溶液は、核酸を変性せず、原料のいずれかが修飾されたような機会で、そのような修飾を変更したり削除しない。ＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎｓの製造に適応されているいくつかの実施形態では、コアＲＮＡとｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ核酸（任意の変更を含む）の溶液は、（ｉ）ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ核酸の各々の種のモル濃度が、（ｉｉ）コアＲＮＡのモル濃度を乗じコアＲＮＡ上の対応するコドンの数、よりも過剰になるように調製し、混合される。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、会合したｎｕｃｌｉｏｎｓその後、結合していない原料から分離され、当業者に公知の核酸分画のための標準的な生化学や生物物理学のいずれかの方法により精製される（吸着、親和性、分画、遠心分離、クロマトグラフィー、結晶化、透析、電気分解、電気泳動、酵素処理、蒸発、フィルター処理、限外濾過、ゲル分離、磁気分離、ミニカラム、ｐＨ分離、温度変化、塩勾配、溶媒勾配、温度勾配、沈殿、固相分離や溶剤分別を含むがこれに限定されるものではない）。
【０２２６】
ｎｕｃｌｉｏｎｓの製造、分離、精製手順のいくつかの実施形態では、十分にｎｕｃｌｉｏｎの整合性を維持し、最大化するために、核酸に対して十分に未変性な条件化で行われる。いくつかの実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎｓの製造、分離、精製を行うための溶液は、ｎｕｃｌｉｏｎ内分子間結合を妨げない十分に低量の成分がある。このような化合物は、１つ以上の（ｉ）ｎｕｃｌｉｏｎ内の隣接するｔＲＮＡ間のＬＳ−ＣＳリンク（一実施形態では、スペルミン及びスペルミジンなどのようなポリアミンを含むがこれら限定されないｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎｓに関係した妨害する化合物など）、が十分に低いレベルに限定されるものではない）、（ｉｉ）ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ核酸とコア核酸の間のコドン−アンチコドンのリンク（いくつかの実施形態では、このような干渉化合物の例はコドンやアンチコドンの全部又は一部に相補的であるオリゴヌクレオチドを含む）、あるいは（ｉｉｉ）追加された分子のいずれかと、コア核酸又はｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ核酸の間の複雑なｎｕｃｌｉｏｎにあるリンク、の１つ以上を阻害する十分に低量の成分を含むがこれに限定しない。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎｓは、それらの成分核酸に多種多様な情報を含むために設計及び製造れ、そこにはＤＮＡ情報、ＲＮＡ情報、ウイルス情報、又はそれらの組み合わせ（個別と総称して“核酸情報“と名付ける）を含むがこれに限定されるものではない。一実施形態では、核酸情報がコア核酸分子内、分子上又は分子に付随して保管されています。別の実施形態において、核酸情報は、１つ以上のサブユニットｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ分子内や分子上又は付随して保管されています。別の実施形態において、核酸情報は、１つ以上のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニット内や上又は付随と、又はコア核酸内や上又は付随した両方に保存さている。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、ｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎｓは、特定のアプリケーションに必要な核酸の情報を含む、特定の塩基配列を有する一本鎖コアＲＮＡ分子を最初に合成することにより製造されています。このＣＮＡはその後に、ＣＮＡ上のヌクレオチドの連続したトリプレットに結合するアンチコドンを有する装填されたｔＲＮＡ分子を用いて処理されるが、リプレットが自然の中でコドンの有効な配列を表示しているかどうかは無関係である。未結合のｔＲＮＡはそれから分離され、ＣＮＡのヌクレオチド配列は後の生物学的機能のための核酸情報を保持している完成ｎｕｃｌｉｏｎｓを残し、同時にｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ  ＲＮＡの結合部位を提供する。別の実施形態では、ｔＲＮＡを結合するＣＮＡの上の最初の（最も５’）ヌクレオチドトリプレットは、開始ｔＲＮＡ分子を結合するイニシエーター配列（ＡＵＧ配列を含むがこれに限定されない）です。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎで核酸情報をパッケージ化することにより、ウイルスのキャプシド内のウイルスゲノムのパッケージとは異なり、この情報を保護しそしてその意図された標的への送達を容易にすることができる。しかしながら、ｎｕｃｌｉｏｎカプシドは実質的に核酸から構成されているものの、ウイルスカプシドは実質的にタンパク質から構成されている。いくつかの実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎｓにおける核酸情報のパッケージングは、ビリオンのパッケージ化核酸情報に比べて重要な利点を提供することができます。例えば、トランスファーＲＮＡなどｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットを含むｎｕｃｌｉｏｎｓはビリオンよりも実質的に免疫原性が低くすることができ、これは１つには、ウイルスに用いられるタンパク質のキャプシドは、一般的に、人間のような高等生物における細胞性及び液性免疫システムによって実質的に強い反応を引き出すということによる。ｎｕｃｌｉｏｎが、’トロイの木馬’伝達アプローチともいうべき、そのような宿主の防御システムをうまく回避できるように、この免疫応答がウイルスとそのゲノム核酸情報の阻害や減少につながることができます。この実施形態では、ホストは、投与された（  ’非自己’）ｎｕｃｌｉｏｎを、まるでホスト（“自己“）物質のような扱い、その配信された核酸情報の少なくとも部分又はのかなりの部分を許容する。いくつかの実施形態では、ｔＲＮＡのｎｕｃｌｉｏｎ中の核酸は、埋め込  まれた核酸情報のその後の処理と活性化を促進する形で標的細胞に提示されます。  特定の実施形態では、標的となった細胞では、細胞工程の正常な部分としてｎｕｃｌｉｏｎ構造をみなし、それゆえ、それらを転写するために（いくつかの実施形態において）、翻訳するために（いくつかの実施形態の場合）作用し、そうでなければ（他の実施形態では）埋め込まれた核酸情報を実装する。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎは、シェルなしコア核酸の１つ以上の部分を残して、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄによりコア核酸が部分的カプセル化されるように製造されています。一実施形態では、それはコア核酸の一部が他の分子又は細胞成分との相互作用のために利用可能であることを望まれる場合には、とりわけこの戦略を採用しています。別の実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎシェル外側のコア核酸の一部が、細胞標的に結合するアプタマーとして機能したり、あるいはそれに接続しており、それ故、関連する実施形態では、標的到着で活性化されるシェル内に核酸を伝達する。別の実施形態では、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄシェル外側コア核酸の部分は、シェル外側に実質的に二本鎖ＲＮＡ構造を形成するために、投与前に別のＲＮＡ分子を結合する一本鎖ＲＮＡである。一実施形態では、この二本鎖ＲＮＡは、干渉ＲＮＡとして機能するように長さ、構成、及び修飾状態である。いくつかの実施形態では、コア核酸のバランス周りのシェルは、それによってその目的の標的に干渉ＲＮＡの標的化を容易にして、全体ｎｕｃｌｉｏｎための伝達媒体として機能します。別の実施形態では、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄシェル外側コア核酸は、細胞動作を変更するために設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、一方、ｎｕｃｌｉｏｎ構造は、活性成分の安定性を向上させ、所望の組織への薬物送達を増加させる。
【０２３１】
製造上の考慮事項
ｎｕｃｌｉｏｎの単離と合成の効率や収量に影響を与える要因は多数あります。いくつかの実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎ特定の種類の重要な製造上の配慮は、コア核酸コアや原材料として使用されてｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ核酸の安定性である。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、ｔＲＮＡ分子とアミノアシル化（装填）ｔＲＮＡの付着されたアミノ酸間の結合は、特定の環境化（Ｐuｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １２５：１８６２）で、自由溶液中で僅か２０−３０分の半減期かもしれず、アミノ酸はすぐ解放される。一実施形態では、アミノアシル化ｔＲＮＡテールはコネクタサイトであるｔＲＮＡのｎｕｃｌｉｏｎｓの生産に用いる製造工程は、完了ｎｕｃｌｉｏｎｓに組み込まれたアミノアシル化ｔＲＮＡ分子の経済的に合理的な収量を達成するために完全に十分に速くなります。アミノアシル化ｔＲＮＡから製造されたｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎｓのいくつかの実施形態では、成長ｎｕｃｌｉｏｎは、アミノ酸なしの非装填ｔＲＮＡ分子を区別する傾向があり、そこで、全体的な収量の減少にもかかわらず、そのようなｔＲＮＡのｎｕｃｌｉｏｎの純度が大幅に低減されず、十分資格のあるアミノアシル化ｔＲＮＡがｎｕｃｌｉｏｎ会合を適切に完了するにために残ることになる。いくつかの実施形態では、一度これらのアミノアシル化ｔＲＮＡがｎｕｃｌｉｏｎに組み込まれると、隣接のｔＲＮＡ上のリンクサイトで行われたアミノアシル化結合が安定化され、アミノアシル化ｔＲＮＡの半減期が大幅に延長されます。いくつかの実施形態では、しかしながら、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄセグメントの最初の（最も５’）ｔＲＮＡのアミノアシル化結合は、通常それほど保護されていないので、シャイン・ダルガーノ配列に限定せずそのようなｍＲＮＡ構造への結合など実施形態の例にある他の方法で安定化されるまで、その半減期は比較的短いままである。自然界では、開始因子と特定のｍＲＮＡの構造は、このような安定性を提供できる。ｎｕｃｌｉｏｎ製造の一実施形態では、アミノ酸が最初のｔＲＮＡ（必ずしもそうではありませんが）上に保持される必要があるところでは、代替の結合は（アミド結合を含むがこれに限定されない）を利用した。
【０２３３】
ｎｕｃｌｉｏｎ製造に関連するいくつかの実施形態では、コア核酸は第一に実質的に固相支持体に結合された（に結合するが、吸着、吸収、アビジン−ビオチン結合、ハプテン−抗体結合、共有結合、イオン結合、そのような支持上のコア核酸を実質的に固定化するいかなる他の方法を含み、これらにいは限定されるものではない方法による）。ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ核酸はその後実質的にコア核酸に結合しするために加えられ、そしてコア核酸に結合していないｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ核酸はその後実質的に除去される。最後に、会合されたｎｕｃｌｉｏｎｓは、実質的に固相から削除されます。生化学、生物学、製薬、化学技術分野における当業者は、このような固相材料から、投与、吸着、結合、溶出及びそれらへの核酸分子や複合体の分画に用いられている方法に精通しています。一実施形態では、ビオチンがコア核酸に接続又は結合し、そしてストレプトアビジンカラムは、固相支持体として使用されています。関連する実施形態においては、Ｔ７  ＲＮＡＰの基質であるビオチン修飾ＧＭＰの誘導体の存在下で、このＲＮＡの転写を行うことにより、５’末端に結合したフォト開裂性のビオチン基によりコア核酸は最初に調整された。つまり、ｎｕｃｌｉｏｎｓが会合し、そその後、混合物は、ストレプトアビジンセファロースを通し、洗浄操作を経て、そして、精製されたｎｕｃｌｉｏｎは適正な波長の一定の光量への暴露により固定支持体から回収される。別の実施形態では、ハプテン分子は、コア核酸に接続したり結合し、そしてハプテンに特異的なモノクローナル抗体は固相に結合する。別の実施形態では、コア核酸に特異的なモノクローナル抗体は、固相に結合する。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、このようなｎｕｃｌｉｏｎ会合に用いる固相物質は、シリカ基盤あるいはシリカ被覆物質、ベンゾイル化イオン交換物質、ＤＥＡＥセルロース、樹脂、プラスチック、金属、ヒドロキシアパタイト、磁気材料、ガラス、プラスチック、ナイロン、セルロース、ゲル、セファロース、アガロース、ストレプトアビジンカラム、そのような物質の改変された構築物、を含むがこれらに限らない天然又は非天然の物質である。ｎｕｃｌｉｏｎｓのそのような固相会合に用いる方法論としては、バッチ化学、遠心分離、カラムクロマトグラフィー、磁気分離、温度勾配、溶媒グラジエント、塩勾配、ｐＨ勾配、電気泳動、濾過、又は固相に結合した物質から未結合物質を分離する他の方法あるいはその逆の方法を含むがこれらに限らない。
【０２３５】
固相ｎｕｃｌｉｏｎ会合の一実施形態では、コア核酸は、望ましいが必須ではないコア核酸の３’末端の近傍に、ポリ（Ａ）配列を含むように単離又は製造されています。固相は、ポリＡテイルを有するＲＮＡのみが実質的に樹脂に結合するように、デオキシチミジンのオリゴ（ｄＴ）オリゴマーが付着されている樹脂である（Ａｖｉｖ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７２，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ６９：１４０８）。この樹脂はコア核酸と共に充填され、その後、溶液やｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ核酸の溶液又は溶液にさらされた（例えば、ｔＲＮＡやアミノアシル化ｔＲＮＡなどのそのような核酸、ただしこれらには限定されない）。未結合のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ核酸は、溶出、遠心分離、磁気分離、又は他の手段によって樹脂に結合したｎｕｃｌｉｏｎｓから分離される。その後ｎｕｃｌｉｏｎｓは、樹脂の化学的又は物理的環境を調整することによって、又はそのような樹脂にあるそれらの結合部位からｎｕｃｌｉｏｎｓを置換するオリゴヌクレオチドなどの分子を導入することにより、樹脂から遊離される。オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムのクロマトグラフィーは、ポリ（Ａ）配列を含むコア核酸から会合したｎｕｃｌｉｏｎｓの大規模調製の一実施形態である。ほとんどの真核生物の細胞質内のメッセンジャーＲＮＡはポリ（Ａ）テイルを有しているが、細菌や真核生物の関連する細胞内小器官にあるｍＲＮＡはそうではないという点には、留意すべきである。従って、このようなオリゴ（ｄＴ）カラムの使用は、動物やヒトなどの真核生物での使用にｎｕｃｌｉｏｎｓとｒｉｂｏｃａｐｓｉｄｓを調整のための一実施形態である。
【０２３６】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドはｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ形成（’ＣＮＡプローブ“）のために意図されていないコア核酸（’ＣＮＡ’）の一部に相補的に合成される。その後、ＣＮＡプローブは固相支持体又は他の分離装置に固定されるが、先に、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットの結合部位を露出した状態で、コア核酸をその支持体又は装置に適用する。未結合のコア核酸が除去され、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットはｎｕｃｌｉｏｎｓを形成するためにそのカラムに適用され、その後、非結合サブユニットが除去される。最後に、会合したｎｕｃｌｉｏｎｓはｎｕｃｌｉｏｎｓの整合性を保持する方法を用いて、ＣＮＡとＣＮＡのプローブ間の結合を阻害することによって溶出される。一実施形態では、ビオチンは、ＣＮＡプローブに共役している。ビオチンを共役させたＣＮＡプローブはストレプトアビジンカラムに固定される。コア核酸はその後、ＣＮＡの一部がＣＮＡプローブに結合すると、カラムに適用されます。ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットはその後、会合したｎｕｃｌｉｏｎｓを固相により保持されると、カラムに適用されます。最後に、会合したｎｕｃｌｉｏｎｓはＣＮＡと固定化された相補的ポリヌクレオチド間の結合を切断することによってカラムから溶出される。いくつかの実施形態では、間接的にＣＮＡを固定するためのＣＮＡプローブの使用は、部分的には、ＣＮＡを直接固定化するための貴重な代替手段を提供しているが、これは、１つには、前者の方法の使用が、後者で用いたものとは異なる方法で最終段階の溶出を行うことが理由である。
【０２３７】
会合したｎｕｃｌｉｏｎｓの単離、精製の適用できる別の実施形態では、Ｃｈｉｎａｌｉの方法に従ってＥＦ−Ｔｕは又はｅＥＦ１Ａのような伸長因子が固相マトリックスにリンクされて、カラムが調製される（Ｃｈｉｎａｌｉ，  １９７７，  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ３４：１）。固形物質に固定されたＥＦ−Ｔｕ（又はｅＥＦ１Ａ）分子は、ｎｕｃｌｉｏｎのｒｉｂｏｃａｐｓｉｄシェルでｔＲＮＡ分子に結合し、他の材料からｎｕｃｌｉｏｎｓの分離を可能にします。一実施形態では、当業者に公知の方法（たとえば、カラム内のセファデックスゲルろ過）により、Ｎｕｃｌｉｏｎｓに結合していないｔＲＮＡ分子が混合物から最初に除去される場合、ＥＦ−Ｔｕ（又はｅＥＦ１Ａ）カラムは、エンベロープれていないｎｕｃｌｉｏｎｓを分離するのに有用な方法を提供する。
【０２３８】
ＥＦ−Ｔｕ（細菌及び真核生物における関連する細胞小器官）とｅＥＦ１Ａ（真核生物の細胞質内）などの細胞内に存在する特定の伸長因子タンパク質が高濃度である場合、いくつかの実施形態では、天然資源から単離されたｎｕｃｌｉｏｎｓのかなりの部分は、このようなタンパク質により包まれているかもしれません。いくつかの実施形態では、このようなエンベロープｎｕｃｌｉｏｎｓが存在しこれに対処するために、天然資源からｎｕｃｌｉｏｎｓを単離する際には、特別な手順が組み込まれている。一実施形態では、高分子量のエンベロープｎｕｃｌｉｏｎｓは、まず結合していない低分子量の伸長要因から単離される（例えばゲルろ過、遠心分離又は沈殿によるが、これらに限定されない）。一実施形態では、この高分子量分画は、適用可能な伸長因子（ＥＦ−Ｔｕ又はｅＥＦ１Ａを含むがこれらに限らない）に特異的なモノクローナル抗体が事前に共役された固相担体を含むカラムに適用されます。エンベロープｎｕｃｌｉｏｎｓがカラム上の抗体に結合する可能性から条件が選択され、不純物はカラムから洗い流される。次にカラムの化学、ｐＨ、温度やその他の条件の変更を適用することによって、エンベロープｎｕｃｌｉｏｎｓは、モノクローナル抗体から切り離され、カラムから回収される。
【０２３９】
ｎｕｃｌｉｏｎ精製のいくつかの実施形態では、他の材料からｎｕｃｌｉｏｎｓとエンベロープｎｕｃｌｉｏｎｓを単離するために電気泳動が使用される。  電気泳動を使用するいくつかの例は、“Ｎｕｃｌｉｏｎ製造“と題する項目に提示されている。いくつかの実施形態では、このような電気泳動方法論は、他の材料からｎｕｃｌｉｏｎｓの単離度を向上させるために、温度勾配を含むがこれに限定されない他の技術を組み合わされている。
【０２４０】
ｎｕｃｌｉｏｎ会合の別の重要な考慮事項は、ヌクレアーゼに対するＲＮＡの感受性です。一実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎｓ又はエンベロープｎｕｃｌｉｏｎｓが、天然資源から単離されたとき、分子生物学の当業者に周知の方法を用いて、リボヌクレアーゼが急速に不活性化される順序でそれらは処理されます。一実施形態では、細胞の破壊に続き、それらは直後また迅速に回収されます。別の実施形態では、リボヌクレアーゼ阻害剤は、リボヌクレアーゼを不活性化するために回収後に追加されます。別の実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎｓが天然又は非天然の原料から合成的に会合されるとき、その原料はリボヌクレアーゼを実質的に含まないように調整されるか、又は現存リボヌクレアーゼが十分に不活性される。いくつかの実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎｓの製造及び精製に用いた溶液及び機器は、リボヌクレアーゼ活性を実質的に含まない。
【０２４１】
いくつかの実施形態において、一つ以上の間接的な部分画方法論を使用することにより、他の細胞成分から単離又は他のｎｕｃｌｉｏｎｓから単離されて、天然資源から天然ｎｕｃｌｉｏｎｓ又は天然エンベロープｎｕｃｌｉｏｎｓを単離できる。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、天然資源からｎｕｃｌｉｏｎｓ又はエンベロープｎｕｃｌｉｏｎｓを単離する際の別の考慮事項は、コア核酸を形成するために使用されるメッセンジャーＲＮＡの半減期は比較的短い場合があることです。細菌や関係する真核生物細胞小器官におけるｍＲＮＡの半減期は、平均的には、真核生物の細胞質内のｍＲＮＡの半減期よりも実質的に極めて短い。その上、ほとんどの真核生物のｍＲＮＡはモノシストロンあり、そして短くすることができるのに対し、細菌における成熟ｍＲＮＡはしばしばポリシストロンである。いくつかの実施形態では、これらの違いの正味の影響は、一定の条件下で、と真核生物の供給源から単離されたｎｕｃｌｉｏｎｓやエンベロープｎｕｃｌｉｏｎｓは、細菌源からのものとは別の処理を必要とすることです。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、製造工程で続いているｎｕｃｌｉｏｎの特定の種類のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ会合の優先順位があります。一実施形態では、コアＲＮＡとｒｉｂｏｃａｐｓｉｄアミノアシル化−ｔＲＮＡから製造されたｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎｓは、ＣＮＡ上のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ領域の５’末端のコドンにある装填されたｔＲＮＡで会合が開始され、その後５’から３’方向にあるｒｉｂｏｃａｐｓｉｄへ装填されたｔＲＮＡを付加することにより、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄは徐々に伸長され、その後、付加される最後の装填されたｔＲＮＡはＣＮＡの上ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ領域の３’末端のコドンに結合される。他の実施形態では、ｔＲＮＡの付加のような配列は必要ではなく、あるいは望ましいくはない。他の実施形態では、１つのコア核酸上の複数のコドンがｔＲＮＡの同じ種に特異的である場合は、このような進行性のｔＲＮＡの付加は、実用的でもなく又は望ましくないないかもしれない。いくつかの実施形態では、コア核酸及び同族ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ核酸の適切な混合物を提示された際には、ｎｕｃｌｉｏｎは自動的に会合する。
【０２４４】
モル比とｎｕｃｌｉｏｎ収率
いくつかの実施形態では、コア核酸分子に対するｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ分子の一定のモル比を実質的に達成、維持、あるいは超過することが、ｎｕｃｌｉｏｎｓを製造する際に望ましい。例えば、ｔＲＮＡのｎｕｃｌｉｏｎｓを製造するいくつかの実施形態で、１０−１５μＭ濃度の製剤でのｔＲＮＡと  ０．０５−０．３μＭ濃度のコア核酸をそれぞれ用いることが望ましい。いくつかの実施形態では、そのような条件が採用され、そしてｔＲＮＡ：ＣＮＡのモル比が５０：１のとき、ＣＮＡの約７５％がｎｕｃｌｉｏｎｓに変換されます（つまり、’ｎｕｃｌｉｏｎ収量’は７５％であること）。他の実施形態では、モル比が２００：１に上昇させると、このｎｕｃｌｉｏｎ収率は９５％以上に増加します。いくつかの実施形態では、与えられたｎｕｃｌｉｏｎ収率を達成するために必要なモル比は、反応液のｐＨや温度同様に、使用された特定のｔＲＮＡ及びＣＮＡ、緩衝液に存在する一価、二価、及び多価の陽イオンの濃度、に応じて変化する。
【０２４５】
同種及び異種の調整
いくつかの実施形態では、製造業者は、特定のアプリケーションのための設計と機能仕様に従って、ｎｕｃｌｉｏｎｓとｒｉｂｏｃａｐｓｉｄｓの同種又は異種のいずれかの試料を生成するために選択できます。いくつかの実施形態では、コア核酸（’ＣＮＡ’）の安定性は、コア核酸分子のｔＲＮＡ  ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニット分子の比率（’ｔＲＳＭ’）が変化する異種ｎｕｃｌｉｏｎ調整を製造することによって、十分に増加される。例えば、一実施形態では、所定のコア核酸は、所定の条件下で、ｔＲＮＡ  ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットの所定のセットと混合され、その際、会合したｎｕｃｌｉｏｎｓは全ての同じコア核酸を持っていますが、ｔＲＳＭ／ＣＮＡ比は４から６まで変化する。すべての３つのｎｕｃｌｉｏｎカテゴリ（４、５と６のｔＲＳＭ／ＣＮＡの比）にあるｎｕｃｌｉｏｎｓは、その後、意図された目的のために異種の調整として回収され、精製され、使用される。
【０２４６】
他の実施形態では、それは別ＲＳＭ／ＣＮＡ比を持つｎｕｃｌｉｏｎｓから特定のＲＳＭ／ＣＮＡ比を持つｎｕｃｌｉｏｎｓを分離することが望ましい。例えば、一実施形態では、所定のコア核酸は、所定の条件下で、ｔＲＮＡ  ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットの所定のセットと混合され、会合したｎｕｃｌｉｏｎｓは、すべて同じコア核酸を持っていますが、ｔＲＳＭ／ＣＮＡ比は４から６まで変化する。ｔＲＳＭ／ＣＮＡ比が５のｎｕｃｌｉｏｎｓは、その後、意図された目的のために均質な調製物として回収され、精製され、使用される。
【０２４７】
ｎｕｃｌｉｏｎｓのさらなる分離・精製するための方法は、本書面上での他の箇所に記載されており、いくつかの実施形態では、これらの方法はｎｕｃｌｉｏｎｓの異質と同質な調整に適用されます。いくつかの実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎｓの分離に適用可能な方法の例としては、調整用ゲル電気泳動、ゲル濾過、高速タンパク質液体クロマトグラフィー、ショ糖密度勾配による超遠心分離法を含むがこれらにはに限定されない。いくつかの実施形態では、ゲル電気泳動は、優先されるｎｕｃｌｉｏｎの分離法である。一実施形態では、このｎｕｃｌｉｏｎ分離法は、５ｍＭのＭｇＣｌ２含む９０ｍＭトリス−ホウ酸ｐＨ８．３の緩衝液で、７．５−１５ｃｍの長さの非変性１２％ポリアクリルアミドゲルに、ｎｕｃｌｉｏｎｓの異種調整を適用することによって実装される。ゲルの幅と厚さ（０．１５〜２．０ミリメートル）に応じて、数μＬから数ｍＬの範疇でｎｕｃｌｉｏｎ調整物は、ゲルに適用することができます。ゲルにロードする前に、その反応物は、２０％グリセロール、０．２５％ブロモフェノールブルー、０．２５％キシレンシアノールなどからなる０．１体積の溶液が混合される。ブロモフェノールブルー指示薬がゲルの底に到達するまで電気泳動は、その後、室温又は低温室で行われる。ＣＮＡが放射性標識されている場合は、分離されたｎｕｃｌｉｏｎｓが（ｔＲＳＭ／ＣＮＡ比で変動する）オートラジオグラフィー又は蛍光イメージによって可視化され、そうでなければ、ＵＶシャドウイングが使用されます。注目する各バンドをゲルから切り出し、ｎｕｃｌｉｏｎは電気溶出又は任意の緩衝液に単純な抽出によって回収される。異なる実施形態では、調整されたｎｕｃｌｉｏｎｓの性状、ゲル中のアクリルアミドパーセンテージ、及び実行中の緩衝液の組成に応じて、電気泳動の時間は（インジケーターがゲルの底に到達した時点で決定される）変化する。
【０２４８】
二価の陽イオンとマグネシウム濃度
一つ以上の二価の陽イオンを所定の濃度を実質的に達成、維持、あるいは超えることが、ｎｕｃｌｉｏｎｓを製造する際に、望まれる。いくつかの実施形態で、二価の陽イオンは、好ましくはマグネシウムイオンである。いくつかの実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎ形成が二価の陽イオンの非存在下で行われることがあるが、他の実施形態では、マグネシウムイオンの存在が、収量を増強させる。二価陽イオンの非存在下で試行されたｎｕｃｌｉｏｎ会合に対して、いくつかの実施形態でのｎｕｃｌｉｏｎ収量は、１０ｍＭのＭｇＣｌ２の存在下で４０％と、それらの実施形態では飽和状態に近い８０ｍＭのＭｇＣｌ２の存在下で、６０％増加している。従って、ｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎｓを製造するいくつかの実施形態で、４０から８０ｍＭのＭｇＣｌ２濃度を維持することが望ましい。
【０２４９】
温度
いくつかの実施形態では、所定の温度を実質的に維持するか、又は越えることが、ｎｕｃｌｉｏｎｓを製造する際に、望まれる。例えば、いくつかの実施形態において、同一の反応が３７℃と氷浴中で行われると、反応の速度及び程度の両方がより高い温度で大きくなる。従って、ｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎｓを製造する際に、いくつかの実施形態では、２５〜３７℃の所定の温度で反応を行うことが望ましい。他の実施形態では、所定の温度以下に製造温度を維持することが望ましい。
【０２５０】
架橋とソラレン
いくつかの実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎｓを製造する際に、会合したｎｕｃｌｉｏｎｓの安定性を向上させることが望ましい。いくつかの実施形態において、このことが、一つ以上のｎｕｃｌｉｏｎ成分を架橋することによって達成される。いくつかの実施形態では、所定の架橋剤が、別のＲＮＡ鎖上の２つの塩基間で共有結合を導入するために採用される。その鎖は、塩基対であったり単に近接しているものもある。いくつかの実施形態では、架橋剤は、効率的、迅速、かつ可逆であるた、全体のｎｕｃｌｉｏｎ構造を破壊しないものであるべきである。例えば、二官能性のナイトロジェンマスタードは非効率的な架橋剤であり、そして非可逆的な結合を導入する。しかし、同じ鎖上隣接するＧに反応するシスジアミノジクロロプラチニウムは、鎖間架橋を導入しない。ホルムアルデヒドは、優れた二官能性の架橋剤であるが、ワトソン・クリック型決定基と反応し、そして、いくつかの二本鎖ＤＮＡとＲＮＡを変性する。これとは対照的に、いくつかの実施形態では、ソラレンは、ｎｕｃｌｉｏｎ構造の安定化のための望ましい光化学架橋剤を表す。これらの化合物は、ＲＮＡ−ＲＮＡ二重鎖を含む二本鎖核酸中に挿入し、近紫外光の存在下で、二本鎖のＡ−Ｕ又はＵ−Ａ配列中の２つのウリジン間に共有結合を形成する。いくつかの実施形態では、フォトクロスリンクは、迅速かつ効率的であり、結果得られた架橋は２６０  ｎｍの光への照射によって、簡便に光逆転させることができます。例えば、いくつかの実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎの一部である一つ以上のｔＲＮＡがＡＵ又はＵＡを有するアンチコドンベアリングを持つ限り、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットのアンチコドンとコドン核酸のコドンでは、ソラレンにより光架橋できる。代表的なソラレンは、いくつかの実施形態では、４，５’，８−トリメチルソラレン、８−メトキシ、４−アミノメチル−４，５’，８−トリメチルソラレンを含む。他の実施形態では、ｎｕｃｌｉｏｎ成分の所定の架橋のために、異なる方法を採用している。いくつかの実施形態では、架橋は、ｎｕｃｌｉｏｎ複合体におけるコア核酸として組み立てられた活性核酸成分の半減期を、増加させるために望まれる。他の実施形態では、架橋の必要はない。
【０２５１】
実施例１１：基本ｎｕｃｌｉｏｎの製造
一実施形態では、のＭｅｔ−ｔＲＮＡｅＭｅｔ  ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄのサブユニットから構成されるｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎは、以下のように製造される：１５μＭのＭｅｔ−ｔＲＮＡｅＭｅｔ及び０．１５μＭ  コアｍＲＮＡ（９連続したＡＵＧのコドン；５’−ＧＧＧ−ＡＵＧ−ＡＵＧ−ＡＵＧ−ＡＵＧ−ＡＵＧ−ＡＵＧ−ＡＵＧ−ＡＵＧ−ＡＵＧ−ＣＵＵ−ＵＣＵ−ＡＧＧ−ＣＡＣ−ＡＣＧ−ＡＧＡ−３’配列番号：３）は、２ｍＬの５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、８０ｍＭのＭｇＣｌ２（’Ｘ１反応緩衝液’）で３７℃で１０分間保温する。この方法により製造された製品は、基本的ｎｕｃｌｉｏｎの一例です。
【０２５２】
この基本ｎｕｃｌｉｏｎを精製するためには、ｎｕｃｌｉｏｎｓを過剰のｔＲＮＡから精製できるように、ＣＮＡにデスチオビオチン群を追加することが有利である。ｍＲＮＡが化学的に合成されている場合、デスチオビオチン群は、合成時にＲＮＡの３’末端に直接共役することができます。それ以外の場合は、ｍＲＮＡが転写によって調製されている場合、自身がデスチオビオチンに連結されている相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチドにハイブリダイズできる（例えば、５’−デスチオビオチン−ＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＣＴＡＧＡＡＡＧ−３’：配列番号：４）。ｍＲＮＡの５’末端は、γ３２Ｐ−ＡＴＰ存在下でＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより、必要ならエビアルカリホスファターゼで事前処理することにより、状況に応じて放射性標識することができます。
【０２５３】
ｎｕｃｌｉｏｎｓのアフィニティー精製はデスチオビオチンに相対するビオチンに対するストレプトアビジンの親和性の差を利用しています。関連する実施形態において、ｎｕｃｌｉｏｎ形成後、反応溶液は、いくつかのウルトラフリー−ＭＣフィルターカートリッジ（ミリポア社製）の上部カップにストレプトアビジン−セファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）と混合される。１０分間保温した後、カートリッジは、水溶液を除去するために、１０，０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離される。そのセファロースは、いかなる遊離ｔＲＮＡを排除するために二回洗浄される。ＣＮＡと関連したｎｕｃｌｉｏｎｓは、デスチオビオチンよりも、ストレプトアビジンに対してより高い親和性を持っている遊離ビオチンの添加により、ストレプトアビジン−セファロースからはずれる。これ及び他のいくつかの実施形態では、すべての精製工程は５℃  から１０℃で反応緩衝液Ｘ１で実施されることに注意してください。
【０２５４】
電気泳動分析がｎｕｃｌｉｏｎ製剤中の不均一性を示していた場合、個々の多量体は、通常、ゲル濾過クロマトグラフィーによって解決できます。いくつかの実施形態では、４−アミノメチル−４，５’，８  −トリメチルソラレンの存在下で、近紫外光への曝露により、コドン−アンチコドンのトリプレットを光化学的に架橋することで、ｒｉｂｏｃａｐｓｉｄサブユニットを共有結合的に安定させることは有利である。
【０２５５】
実施例１２：開始ｎｕｃｌｉｏｎの製造
一実施形態では、混合されたｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ配列を持つｔＲＮＡが開始ｎｕｃｌｉｏｎは、ｆＭｅｔ−（Ｐｈｅ）３−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓをコードして上流にシャイン・ダルガーノ配列（５’−ＧＧＧＡＡＧＧＡＧＧＵＡＡＡＡ−ＡＵＧ−ＵＵＵ−ＵＵＵ−ＵＵＵ−ＵＧＣ−ＵＵＵ−ＵＧＣ−ＵＡＧ−ＧＣＡ−３’；配列番号：５）を含む０．１５μＭのＣＡＮと、それぞれ１５μＭのｆＭｅｔ−ｔＲＮＡｉＭｅｔ、Ｐｈｅ−ｔＲＮＡＰｈｅ及びＣｙｓ−ｔＲＮＡＣｙｓを保温することによって製造される。反応物は、２ｍＬの５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５と８０ｍＭのＭｇＣｌ２で、３７℃で１０分間保温された。この結果得られた開始ｎｕｃｌｉｏｎの精製は、実施形態１１に記載されている。この方法により製造された製品は、開始ｎｕｃｌｉｏｎの一例です。
【０２５６】
実施例１３：天然ｎｕｃｌｉｏｎの単離
一実施形態では、天然のｔＲＮＡ  ｎｕｃｌｉｏｎは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳を触媒できる人間の無細胞抽出液から単離されています。このような抽出物は、外因的に添加されたｍＲＮＡ上のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ形成をサポートするために、装填されたｔＲＮＡの十分な量を含んでいる必要があり、そしてその抽出物はＰｉｅｒｃｅ社とＡｖｉｄｉｔｙ社の両方から市販されている。この実施形態では、βアクチン又はその一部をコードするｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写産物が、そのような抽出物に添加される。使用前に、そのｍＲＮＡは、放射性標識されるか、あるいはデスチオビオチンを有する相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチドへハイブリダイズされる、あるいはこの両方で処理され、こうして検出及びアフィニティー精製を容易にさせる。ｍＲＮＡが放射性標識されている場合は、標準的な電気泳動又はクロマトグラフィー法により、ｎｕｃｌｉｏｎ形成について直接分析することができる。ｍＲＮＡがデスチオビオチン親和性タグを持つ場合、別の方法として、実施形態１１で説明したように、それらをストレプトアビジン−セファロースを用いて精製することができる。
【０２５７】
一実施形態では、未修飾βアクチンｍＲＮＡの添加は、新鮮に溶解したヒト細胞から、内因性のｍＲＮＡのｎｕｃｌｉｏｎｓを単離、特徴付けをできるかどうかに関する試験を提供する。この実施形態では、βアクチンｍＲＮＡが、コード配列の５’又は３’に位置したｍＲＮＡの領域へ相補的なデスチオビオチンを共役したＤＮＡオリゴヌクレオチドと一緒に追加されます。保温中、ｎｕｃｌｉｏｎ形成とハイブリダイゼーションの両方が実施され、そこで、得られたｍＲＮＡを親和性で単離できる。電気泳動又はクロマトグラフィー分析後、ＤＮＡ捕捉プローブの放射性標識を取り入れたり又はノーザンハイブリダイゼーション等の例により、ｍＲＮＡの検出が促進される。最後に、βアクチンｍＲＮＡを単離する前に、追加される安定性のために、ソラレンでの光架橋によりｎｕｃｌｉｏｎ構造は固定される。３’及び５’非翻訳領域を含むヒトのβアクチンのｍＲＮＡ配列は、Ｐｏｎｔｅ達によって記載されている（Ｐｏｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：  １６８７）。
【０２５８】
この工程由来の製品は、単離されたｎｕｃｌｉｏｎの一例です。
【０２５９】
対応特許と範囲
当業者が認識するか、又は通常の実験以上のものを使用して確認できるように、本発明の特定の実施形態に対する多くの対応特許は、本書面上でに記載する。本発明の範囲は上記の説明に限定されることを意図しているのではなく、付記の特許請求の範囲に記載されている。
【０２６０】
この請求内で、’ａ’、’ａｎ’、及び’ｔｈｅ’のような記事は、１つ以上を意味し、別の指示がなければ、あるいはそれ以外は文脈から自明である。従って、例えば、’ｎｕｃｌｉｏｎ’への参照は、そのような複数のｎｕｃｌｉｏｎｓを含み、そして’ｔＲＮＡ’への参照は、当業者に知られている１つ以上の細胞への参照を含み、その他いろいろである。群にある１つ以上のメンバー間に’又は’や’あるいは’を含む請求項又は記述は、１つ、１つ以上、あるいは全ての群メンバーが、指示がない限り文脈から明らかに、特定の産物又は工程に、存在したり、採用されたり、又はそうでなけれが関連している場合には、満足とみなされる。本発明は、その群から選ばれる正確に１つのメンバーが、特定の製品又は工程に、存在し、採用され、又はそうでなければ関連している実施形態を含む。本発明は、１つ以上あるいは全ての群メンバーが、特定の製品又は工程に、存在し、採用され、又はそうでなければ関連している実施形態を含む。さらに、当然のことながら、本発明は、１つ以上の記載されている請求項からの１つ以上の制限、要素、節、記述用語、その他諸々、が他の請求項に導入される、すべての変形、組み合わせ、複合、及び置換を網羅している。たとえば、他の請求項に依存しているすべての請求項は、同じ基本請求項に依存している他の請求項で発見された１以上の制限を含むように変更することができる。さらに、請求項は、組成を列挙する箇所では、特に明記しない限り、あるいは当業者には、矛盾や不正確さを生じることが明白である場合を除き、本書面上で開示されたいずれかの目的のための成分を使用する方法は含まれており、本書面上で開示された製造方法に従いその成分を製造する方法あるいは当業者に周知の他の方法は含まれていると理解するべきである。
【０２６１】
要素がリストとして表示されている箇所では、例えば、マーカッシュ群形式で、その要素の各サブ群も開示されており、任意の要素が、その群から削除することができる、と理解するべきである。一般的に、発明、又は発明の側面が、特定の要素、特徴から構成されるあるいは含むものとして参照されいている箇所では、本発明又は発明の側面の特定の実施形態は、特定の要素、特徴等を構成する、あるいはそれらの本質的要素を構成する、と理解するべきである。簡素化の目的のために、それらの実施形態は本書面上にこれらの言葉では記載されていない。用語“構成する“と“含む“は制限のないことを意図し、そして追加の要素や工程の包含を可能にすることに留意されたい。
【０２６２】
範囲が示されている場合は、終点が含まれている。さらに、特に断らない限り、又は文脈そして当業者の理解から明白でない場合、範囲として表現されている値は、任意の特定の値又は本発明の異なる実施形態に記載された範囲内のサブ値を、文脈から明らかでない限り、範囲の下限の単位の１０分の１に想定できる、ことを理解すべきである。
【０２６３】
また、先行技術の範囲内にある本発明の任意の特定の実施形態は、明示的に請求項のいずれか一つ以上から除外することができることを理解すべきである。このような実施形態は、当業者に周知と見なされるので、それらは除外が明示的に本書面上に記載されていない場合でも、除外される。本発明の成分（例えば、任意のｎｕｃｌｉｏｎ組成、任意のｒｉｂｏｃａｐｓｉｄ組成、任意のｎｕｃｌｉｏｎ成分、任意の修飾、ｎｕｃｌｉｏｎｓやｒｉｂｏｃａｐｓｉｄｓ又はｎｕｃｌｉｏｎ成分を製造する任意の方法、ｎｕｃｌｉｏｎｓやｒｉｂｏｃａｐｓｉｄｓ又はｎｕｃｌｉｏｎ成分などの任意のアプリケーション）の任意の特定の実施形態は、先行技術の存在に関連するかどうかにかかわらず、何らかの理由で、任意の１つ又は複数の特許請求の範囲から除外することができます。
【０２６４】
上記及び本書面全体で議論した刊行物は、本出願の出願日前に公開されたもののみ提供されています。本発明者らは、事前開示のおかげで、そのような開示に先行する権利を与えられないことを認めるものと解釈されるべきではありません。
【図１】
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【図２】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図９Ａ】
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【図１０Ａ】
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【図１３Ａ】
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【図２２】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３０Ｄ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図４０】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｃ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図３３Ａ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図４１】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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