(57)【要約】  本願は、活性な３‐ＨＰ発酵経路を含む遺伝子組み換え酵母細胞、及び３‐ＨＰを生産するためのこれらの細胞の使用を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性な３‐ＨＰ発酵経路を含む遺伝子組み換え酵母細胞であって、
外来性ＰＰＣ遺伝子；
外来性ＰＹＣ遺伝子；
外来性ＡＡＴ遺伝子；
外来性ＡＤＣ遺伝子；
外来性ＢＡＡＴ又はｇａｂＴ遺伝子；及び
外来性３‐ＨＰＤＨ遺伝子、
から選択される１若しくは複数の外来性３‐ＨＰ経路遺伝子を含む、細胞。
【請求項２】
外来性ＰＹＣ遺伝子を含む、請求項１に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項３】
前記ＰＹＣ遺伝子が、配列番号２、３、４、５、６、７、８から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項２に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項４】
前記ＰＹＣ遺伝子が、配列番号１のヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項２又は３に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項５】
外来性ＡＡＴ遺伝子を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項６】
前記ＡＡＴ遺伝子が、配列番号１４、１５、及び１６から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項５に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項７】
前記ＡＡＴ遺伝子が、配列番号１３のヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項５又は６に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項８】
外来性ＡＤＣ遺伝子を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項９】
前記ＡＤＣ遺伝子が、配列番号１７、１８、１３３、１３５、１３７、及び１３９から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項９に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項１０】
前記ＡＤＣ遺伝子が、配列番号１３０、１３１、１３２、１３４、１３６、及び１３８から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項８又は９に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項１１】
外来性ＢＡＡＴ遺伝子又は外来性ｇａｂＴ遺伝子を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項１２】
前記ＢＡＡＴ遺伝子又はｇａｂＴ遺伝子が、配列番号２０、２１、２２、２３、及び２４から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項１１に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項１３】
前記ＢＡＡＴ遺伝子又はｇａｂＴ遺伝子が、配列番号１９、１４０、１４１、及び１４２から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１１又は１２に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項１４】
前記ＢＡＡＴ遺伝子又はｇａｂＴが、ｇａｂＴ遺伝子でもあるＢＡＡＴ遺伝子である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項１５】
外来性３‐ＨＰＤＨ遺伝子を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項１６】
前記３‐ＨＰＤＨ遺伝子が、配列番号２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、及び１２９から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項１５に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項１７】
前記３‐ＨＰＤＨ遺伝子が、配列番号２５、１４３、１４４、及び３４３から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１５又は１６に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項１８】
３‐ＨＰＤＨ遺伝子が、ＨＩＢＡＤＨ遺伝子でもある、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項１９】
３‐ＨＰＤＨ遺伝子が、４‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子でもある、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項２０】
外来性ＰＰＣ遺伝子を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項２１】
前記ＰＰＣ遺伝子が、配列番号１０、１１、及び１２から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項２０に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項２２】
前記ＰＰＣ遺伝子が、配列番号９のヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項２０又は２１に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項２３】
前記酵母細胞が、クラブトリー陰性である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項２４】
前記酵母細胞が、イサタケンキア属、カンジダ属、クルイベロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属、トルラスポラ属、チゴサッカロマイセス属、及びサッカロマイセス属から選択される属に属している、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項２５】
前記酵母細胞が、Ｉ．オリエンタリス／Ｐ．ファーメンタンス分岐群及びサッカロマイセス分岐群から選択される分岐群に属している、請求項２４に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項２６】
前記酵母細胞が、Ｉ．オリエンタリス、Ｃ．ランビカ、及びＳ．ブルデリから選択される、請求項２４に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項２７】
前記細胞が、ＰＤＣ、ＡＤＨ、ＧＡＬ６、ＣＹＢ２Ａ、ＣＹＢ２Ｂ、ＧＰＤ、ＧＰＰ、ＡＬＤ、及びＰＣＫ遺伝子から選択される天然遺伝子の１若しくは複数の欠失又は破壊をさらに含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項２８】
前記１若しくは複数の欠失又は破壊が、１若しくは複数の外来性３‐ＨＰ経路遺伝子の挿入に起因する、請求項２７に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項２９】
前記１若しくは複数の外来性３‐ＨＰ経路遺伝子が、１若しくは複数の外来性調節要素に作動可能なように連結されている、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項３０】
前記細胞が、７５ｇ／Ｌ以上の３‐ＨＰを含む培地中、４未満のｐＨで増殖できる、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項３１】
前記細胞が、３‐ＨＰ耐性酵母細胞である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項３２】
前記細胞が、突然変異及び／又は選択細胞が同種の野生型細胞より高い３‐ＨＰ耐性を有するように、突然変異及び／又は選択を受ける、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項３３】
前記細胞が、１若しくは複数の外来性３‐ＨＰ経路遺伝子を用いて遺伝子組み換えされる前に、突然変異及び／又は選択を受ける、請求項３２に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項３４】
前記細胞が、乳酸又は３‐ＨＰの存在下で選択を受ける、請求項３２又は３３に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項３５】
前記選択が、ケモスタット選択である、請求項３４に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項３６】
以下：
（ｉ）少なくとも１種類の炭素源を含む培地の存在下、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞を培養し；そして
（ｉｉ）培養物から３‐ＨＰを単離すること、
を含む３‐ＨＰの生産方法。
【請求項３７】
前記炭素源が、グルコース、キシロース、アラビノース、スクロース、フルクトース、セルロース、グルコースオリゴマー、及びグリセロールから選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記培地が、５未満のｐＨ、例えば、約１．５〜約４．５、約２．０〜約４．０、又は約２．０〜約３．５の範囲内である、請求項３６又は３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
配列表への言及
本出願は、コンピューターが読取可能な形式で配列表を含んでおり、そしてそれを参照により本明細書中に援用する。
【０００２】
背景
３‐ヒドロキシプロピオン酸（３‐ＨＰ）は、米国エネルギー省によって、発酵により作ることができる有望なビルディングブロック化学物質トップ１２のうちの１に挙げられた三炭素カルボン酸である。乳酸（２‐ヒドロキシプロピオン酸）の異性体である３‐ＨＰの別名には、エチレン乳酸や３‐ヒドロキシプロピオナートがある。３‐ＨＰは、グルコースからの１００％の理論収率、さまざまな化学反応に参加することを可能にする複数の官能基、及び低毒性を有する魅力的な再生可能なプラットフォーム化学物質である。３‐ＨＰは、例えば、１，３‐プロパンジオール、マロン酸、アクリルアミド、及びアクリル酸などのいくつかの汎用化学製品を形成するための基質として使用できる。アクリル酸は、アクリラートエステルや超吸水性高分子を作るのに使用される大規模化学物質（＞７０億ポンド（約３５０万ｔ）／年）であり、現在、プロピレンの触媒酸化によってもたらされている。３‐ＨＰの発酵生産は、これらの商業的に重要な化学物質の原料として石油化学品に対する持続可能な代替品を提供し、それにより、エネルギー消費量、外国産オイルへの米国の依存度、及び地球温暖化ガスの産生を減少させると思われる。
【０００３】
細菌は、糖を有機酸に発酵させるのに使用できる。しかしながら、細菌には、大規模な有機酸生産に関していくつかの欠点がある。有機酸が産生されるに従って、発酵培地は酸性が強くなってゆく。得られた産物が部分的に又は完全に酸性型で存在するので、低ｐＨ条件は実際に望ましい。しかしながら、有機酸を産生するほとんどの細菌は、強い酸性環境内ではうまく働けず、そしてそのため、死滅するか、又は培地がより酸性になるに従って、採算が合わなくなるほどゆっくりとした産生を始める。これを予防するために、より高いｐＨを維持するように培地を緩衝化することが必要になる。しかしながら、このことが、有機酸産物の回収をより困難にし、そして費用のかかるものにする。
【０００４】
ここ数年間、糖を有機酸に発酵させる酵母の使用に注目が高まっていた。酵母は、生体触媒として多くの工業的発酵に使用されて、細菌を超えるいくつかの利点を提供している。多くの細菌が、それらの成長に必要な特定のアミノ酸又はタンパク質を合成できない、及び効率的に糖を代謝できないのに対して、ほとんどの酵母種が、それらに必要なアミノ酸又はタンパク質を無機窒素化合物から合成できる。酵母はさらに、（細菌の生産能又は発酵全体の生産量の損失につながり得る）バクテリオファージ感染に対する感受性もない。
【０００５】
酵母は、有機酸生産の魅力的な候補であるが、それらにはいくつかの困難が存在している。まず最初に、酵母の経路技術は、典型的に細菌より難しい。酵母内の酵素は、細胞質、ミトコンドリア、又はペルオキシソーム内に局在化されている一方、細菌では、それらは細胞質中に貯留されている。このことは、生合成経路のすべての酵素が１つの細胞内の同じ区画内に共存するのを確実にするために、標的シグナルが取り出される必要があることを意味している。区画間の経路中間体の輸送の制御もまた、所望の製品への炭素流動を最大にするために必要とされることがある。第二に、すべての酵母種が大規模な経済的発酵に必要な基準を満たすというわけではない。実際には、わずかなパーセンテージの酵母しか、低ｐＨ条件下で強壮に成長する能力と、十分に高い容量的、且つ、特異的な糖利用との組み合わせを有していない。米国エネルギー省は、約２．５ｇ／Ｌ／時間の生産率が３‐ＨＰを含めた数種類の有機酸の経済的発酵に必要である見積もった（http://www1.eere.energy.gov/biomass/pdfs/35523.pdf）。
【０００６】
多くの酵母種がヘキソース糖をエタノールへと自然に発酵させるが、相当な収量の有機酸を自然に産生する酵母種は、存在したとしてもごく少数である。このことが、有機酸を産生するように様々な酵母種を遺伝子組み換えする取り組みにつながった。乳酸を産生する遺伝子組み換え酵母株は、以前、天然のピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）遺伝子を破壊又は欠失し、そして乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）遺伝子を挿入して、エタノール産生を断ち切ることによって作出された（例えば、ＷＯ９９／１４３３５、ＷＯ００／７１７３８、ＷＯ０２／４２４７１、ＷＯ０３／０４９５２５、ＷＯ０３／１０２１５２及びＷＯ０３／１０２２０１を参照のこと）。この変更は、糖質代謝をエタノール産生から乳酸産生へと転換する。酵母の発酵産物と発酵経路は細菌のものと異なっており、そのため、異なった工学的アプローチが、収量の最大化するのに必要である。有機酸産物の収量又は純度を高めるために排除又は低減を必要とする可能性がある他の天然産物は、グリセロール、アセタート、及びジオールである。遺伝子操作された酵母株におけるグリセロールの低減は、例えばＷＯ０７／１０６５２４に記載されている。
【０００７】
乳酸と異なり、３‐ＨＰは、天然に知られているいずれかの経路の主要な最終産物でなく、それは、一部の細菌や真菌において微量にしか見られない。よって、相当な遺伝子工学が、３‐ＨＰを産生する酵母を作り出すのに必要である。サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株は、以前、ラクタート中間体を経て極低レベルの３‐ＨＰを産生するように操作された（ＷＯ０２／０４２４１８を参照のこと）。しかしながら、野生型Ｓ．セレビシエの許容レベルは、３‐ＨＰ産生向けの最適宿主になるには不十分である。そのため、工業規模においてより費用対効果に優れた様式で３‐ＨＰを生産する改良された酵母株を必要としている。
【発明の概要】
【０００８】
概要
ＰＥＰ、ピルバート、及び／又はグリセロールから３‐ＨＰへの活性な３‐ＨＰ発酵経路を含んでいる遺伝子組み換え酵母細胞を、特定の実施形態で本明細書中に規定する。特定の実施形態において、本明細書中で規定する細胞は、ＰＰＣ、ＰＹＣ、ＡＡＴ、ＡＤＣ、ＢＡＡＴ、ｇａｂＴ、３‐ＨＰＤＨ、ＨＩＢＡＤＨ、４‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、ＡＣＣ、ＡＡＭ、アラニンデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＢＣＫＡ、ＫＧＤ、４‐アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ、β‐アラニル‐ＣｏＡアンモニアリアーゼ、Ｃｏ‐Ａアシル化マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＣｏＡシンテターゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、グリセロールデヒドラターゼ、ＩＰＤＡ、ＬＤＨ、ラクチル‐ＣｏＡデヒドラターゼ、リンゴ酸デカルボキシラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、マロニル‐ＣｏＡレダクターゼ、ＯＡＡギ酸リアーゼ、ＯＡＡデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸／アラニンアミノトランスフェラーゼ、ＰＤＨ、２‐ケト酸デカルボキシラーゼ、３‐ＨＰ‐ＣｏＡデヒドラターゼ、３‐ＨＰ‐ＣｏＡヒドロラーゼ、又は３‐ヒドロキシイソブチリル‐ＣｏＡヒドロラーゼ活性を有する酵素をコードする１若しくは複数の３‐ＨＰ経路遺伝子を含んでいる。
【０００９】
ＰＥＰ又はピルバートから３‐ＨＰへの活性な３‐ＨＰ発酵経路を含んでいる遺伝子組み換え酵母細胞を特定の実施形態で本明細書中に規定するが、ここで、該細胞は、ＰＰＣ、ＰＹＣ、ＡＡＴ、ＡＤＣ、ＢＡＡＴ、ｇａｂＴ、３‐ＨＰＤＨ、ＨＩＢＡＤＨ、及び４‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする１若しくは複数の遺伝子を含んでいる。特定の実施形態において、３‐ＨＰ経路遺伝子の１若しくは複数は外来性であり、そしてこれらの実施形態において、その遺伝子は、酵母、真菌、細菌、植物、昆虫、又は哺乳類の起源から得ることもできる。例えば、細胞は、Ｉ．オリエンタリス（I. orientalis）から得られる酵母ＰＹＣ遺伝子又はＲ．スフェロイデス（R. sphaeroides）、Ｒ．エトリ（R. etli）、Ｐ．フルオレッセンス（P. fluorescens）、Ｃ．グルタミクム（C. glutamicum）、若しくはＳ．メリロティ（S. meliloti）から得られる細菌ＰＹＣ遺伝子；Ｅ．コリ（E. coli）、Ｍ．サーモオートトロフィカム（M. thermoautotrophicum）、又はＣ．パーフリンゲンス（C. perfringens）から得られる細菌ＰＰＣ遺伝子、Ｉ．オリエンタリス若しくはＳ．セレビシエから得られる酵母ＡＡＴ遺伝子又はＥ．コリから得られる細菌ＡＡＴ遺伝子；
Ｓ．アベルミチリス（S. avermitilis）、Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）、Ｈ．ピロリ（H. pylori）、Ｂ．リチェニフォルミス（B. licheniformis）、若しくはＣ．グルタミクムから得られる細菌ＡＤＣ遺伝子；Ｉ．オリエンタリス若しくはＳ．クルイベリ（S. kluyveri）から得られる酵母ＢＡＡＴ遺伝子、又はＳ．アベルミチリスから得られる細菌ＢＡＡＴ遺伝子；Ｓ．セレビシエから得られる酵母ｇａｂＴ遺伝子又はＳ．アベルミチリスから得られる細菌ｇａｂＴ遺伝子；Ｉ．オリエンタリス若しくはＳ．セレビシエから得られる酵母３‐ＨＰＤＨ遺伝子又はＥ．コリ若しくはＭ．セデュラ（M. sedula）から得られる細菌３‐ＨＰＤＨ遺伝子；Ａ．フェカリス（A. faecalis）、Ｐ．プチダ（P. putida）、若しくはＰ．エルギノーサ（P. aeruginosa）から得られる細菌ＨＩＢＡＤＨ遺伝子；Ｃ．クルイベリから得られる酵母４‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子又はＲ．ユートロファ（R. eutropha）から得られる細菌４‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含んでいてもよい。
【００１０】
ＰＥＰ又はピルバートから３‐ＨＰへの活性な３‐ＨＰ発酵経路を含んでいる遺伝子組み換え酵母細胞を特定の実施形態で本明細書中に規定するが、ここで、該細胞は、ＰＰＣ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、及びリンゴ酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする１若しくは複数の遺伝子を含んでいる。
特定の実施形態において、３‐ＨＰ経路遺伝子１若しくは複数のは外来性であり、そしてこれらの実施形態において、該遺伝子は、酵母、真菌、細菌、植物、昆虫、又は哺乳類起源から得ることもできる。
【００１１】
ＰＥＰ又はピルバートから３‐ＨＰへの活性な３‐ＨＰ発酵経路を含んでいる遺伝子組み換え酵母細胞を特定の実施形態で本明細書中に規定するが、ここで、該細胞は、ＰＰＣ、２‐ケト酸デカルボキシラーゼ、ＫＧＤ、ＢＣＫＡ、インドールピルビン酸デカルボキシラーゼ、３‐ＨＰＤＨ、ＨＩＢＡＤＨ、又は４‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする１若しくは複数の遺伝子を含んでいる。特定の実施形態において、１若しくは複数の３‐ＨＰ経路遺伝子は外来性であり、そしてこれらの実施形態において、該遺伝子は、酵母、真菌、細菌、植物、昆虫、又は哺乳類起源から得ることもできる。
【００１２】
ＰＥＰ又はピルバートから３‐ＨＰへの活性な３‐ＨＰ発酵経路を含んでいる遺伝子組み換え酵母細胞を特定の実施形態で本明細書中に規定するが、ここで、該細胞は、ＰＰＣ、ＯＡＡギ酸リアーゼ、マロニル‐ＣｏＡレダクターゼ、Ｃｏ‐Ａアシル化マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、３‐ＨＰＤＨ、ＨＩＢＡＤＨ、及び４‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする１若しくは複数の遺伝子を含んでいる。特定の実施形態において、１若しくは複数の３‐ＨＰ経路遺伝子は外来性であり、そしてこれらの実施形態において、該遺伝子は、酵母、真菌、細菌、植物、昆虫、又は哺乳類起源から得ることができる。
【００１３】
ピルバートから３‐ＨＰへの活性な３‐ＨＰ発酵経路を含んでいる遺伝子組み換え酵母細胞を特定の実施形態で本明細書中に規定するが、ここで、該細胞は、ＰＤＨ、アセチル‐ＣｏＡカルボキシラーゼ、マロニル‐ＣｏＡレダクターゼ、ＣｏＡアシル化マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、３‐ＨＰＤＨ、ＨＩＢＡＤＨ、及び４‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする１若しくは複数の遺伝子を含んでいる。特定の実施形態において、１若しくは複数の３‐ＨＰ経路遺伝子は外来性であり、そしてこれらの実施形態において、該遺伝子は、酵母、真菌、細菌、植物、昆虫、又は哺乳類起源から得ることができる。
【００１４】
ピルバートから３‐ＨＰへの活性な３‐ＨＰ発酵経路を含んでいる遺伝子組み換え酵母細胞を特定の実施形態で本明細書中に規定するが、ここで、該細胞は、アラニンデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸／アラニンアミノトランスフェラーゼ、アラニン２，３アミノムターゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、ＣｏＡシンテターゼ、β‐アラニル‐ＣｏＡアンモニアリアーゼ、３‐ＨＰ‐ＣｏＡデヒドラターゼ、３‐ＨＰ‐ＣｏＡヒドロラーゼ、３‐ヒドロキシイソブチリル‐ＣｏＡヒドロラーゼ、ＢＡＡＴ、３‐ＨＰＤＨ、ＨＩＢＡＤＨ、及び４‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする１若しくは複数の遺伝子を含んでいる。特定の実施形態において、１若しくは複数の３‐ＨＰ経路遺伝子は外来性であり、そしてこれらの実施形態において、該遺伝子は、酵母、真菌、細菌、植物、昆虫、又は哺乳類起源から得ることができる。
【００１５】
ピルバートから３‐ＨＰへの活性な３‐ＨＰ発酵経路を含んでいる遺伝子組み換え酵母細胞を特定の実施形態で本明細書中に規定するが、ここで、該細胞は、ＬＤＨ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、ラクチル‐ＣｏＡデヒドラターゼ、３‐ＨＰ‐ＣｏＡデヒドラターゼ、３‐ＨＰ‐ＣｏＡヒドロラーゼ、及び３‐ヒドロキシイソブチリル‐ＣｏＡヒドロラーゼ活性を有する酵素をコードする１若しくは複数の遺伝子を含んでいる。特定の実施形態において、１若しくは複数の３‐ＨＰ経路遺伝子は外来性であり、そしてこれらの実施形態において、該遺伝子は、酵母、真菌、細菌、植物、昆虫、又は哺乳類起源から得ることができる。
【００１６】
ＰＥＰ又はピルバートから３‐ＨＰへの活性な３‐ＨＰ発酵経路を含んでいる遺伝子組み換え酵母細胞を特定の実施形態で本明細書中に規定するが、ここで、該細胞は、グリセロールデヒドラターゼ及びアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする１若しくは複数の遺伝子を含んでいる。特定の実施形態において、１若しくは複数の３‐ＨＰ経路遺伝子は外来性であり、そしてこれらの実施形態において、該遺伝子は、酵母、真菌、細菌、植物、昆虫、又は哺乳類起源から得ることができる。
【００１７】
本明細書中に規定する遺伝子組み換え酵母細胞は、いずれの酵母種であってもよい。特定の実施形態において、細胞はクラブトリー陰性であり、そして、特定のこれらの実施形態において、それらは、イサタケンキア（Issatchenkia）属、カンジダ（Candida）属、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）属、ピキア（Pichia）属、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属、トルラスポラ（Torulaspora）属、チゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）属、又はサッカロマイセス（Saccharomyces）属に属する。特定のこれらの実施形態において、細胞は、Ｉ．オリエンタリス／Ｐ．ファーメンタンス（P. fermentans）分岐群又はサッカロマイセス分岐群に属していてもよく、そして、これらの実施形態において、それらは、Ｉ．オリエンタリス、Ｃ．ランビカ（C. lambica）、又はＳ．ブルデリ（S. bulderi）であってもよい。特定の実施形態において、酵母細胞は、３‐ＨＰ耐性酵母細胞であってもよい。３‐ＨＰ耐性は、その細胞の天然の形質であっても、それが活性な３‐ＨＰ発酵経路に関連する遺伝子組み換えの導入前、その最中、若しくはその後の突然変異及び／又は選択に起因していても、あるいはそれらの組み合わせであってもよい。特定の実施形態において、酵母細胞は、３‐ＨＰ以外の有機酸、他の発酵産物若しくは副産物、及び／又は様々な培地成分に対して、同種の野生型酵母細胞によって示されるものより高い耐性の程度を示し得る。特定の実施形態において、酵母細胞は、同種の野生型細胞に比べて突然変異及び／又は選択細胞が３‐ＨＰに対してより高度な耐性を有するような突然変異及び／又は選択を受けた。これらの実施形態のいくつかにおいて、細胞は、１若しくは複数の外来性３‐ＨＰ経路遺伝子を用いて遺伝子組み換えされる前に突然変異及び／又は選択を受けた。いくつかの実施形態において、細胞は、乳酸又は３‐ＨＰの存在下で選択を受けた。いくつかの実施形態において、選択は、ケモスタット選択である。
【００１８】
活性な３‐ＨＰ発酵経路に関連する改変に加えて、本明細書中に規定する細胞は、１若しくは複数の天然遺伝子の欠失又は破壊を含み得る。例えば、細胞は、１若しくは複数のＰＤＣ、ＡＤＨ、ＧＡＬ６、ＣＹＢ２Ａ、ＣＹＢ２Ｂ、ＧＰＤ、ＧＰＰ、ＡＬＤ、又はＰＣＫ遺伝子の欠失又は破壊を含み得る。特定の実施形態において、これらの欠失又は破壊は、活性な３‐ＨＰ発酵経路に関連する１若しくは複数の遺伝子の導入と一緒にされてもよい。
【００１９】
少なくとも１種類の炭素源の存在下で細胞を培養し、そして培地から３‐ＨＰを単離することによる、本明細書中に規定する遺伝子組み換え酵母細胞を使用した３‐ＨＰ生産方法を、特定の実施形態で本明細書中に規定する。特定のこれらの実施形態において、炭素源は、グルコース、キシロース、アラビノース、スクロース、フルクトース、セルロース、グルコースオリゴマー、及びグリセロールのうちの１若しくは複数から選択され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】３‐ＨＰ発酵経路選択の概要
【図２】プラスミドｐＭＩＢａ１０７
【図３】標的組み込み技術の略図
【図４】プラスミドｐＧＭＥｒ１２５（ａ）
【図５】プラスミドｐＧＭＲｒ１２５（ｂ）
【図６】プラスミドｐＧＭＥｒ１２１
【図７】プラスミドｐＭｈＣｔ０７４
【図８】プラスミドｐＭｈＣｔ０８３
【図９】プラスミドｐＭｈＣｔ０８７
【図１０】プラスミドｐＭｈＣｔ０７５
【図１１】プラスミドｐＭｈＣｔ０７７
【図１２】プラスミドｐＭｈＣｔ０９５
【図１３】プラスミドｐＭｈＣｔ０９６
【図１４】プラスミドｐＭｅＪｉ３１０‐２
【図１５】プラスミドｐＭｅＪｉ３１２‐２
【図１６】プラスミドｐＧＭＥｒ１２６
【図１７】プラスミドｐＧＭＥｒ１３０
【図１８】プラスミドｐＧＭＥｒ１３７
【図１９】プラスミドｐＡＣＮ５
【図２０】プラスミドｐＡＣＮ２３
【図２１】プラスミドｐＨＪＪ２７
【図２２】プラスミドｐＡＣＮ４３
【図２３】プラスミドｐＨＪＪ７５
【図２４】プラスミドｐＨＪＪ７６
【図２５】プラスミドｐＪＬＪ４９
【図２６】プラスミドｐＪＬＪ６２
【図２７】プラスミドｐＭＩ４５８
【図２８】プラスミドｐＣＭ２０８
【図２９】プラスミドｐＪＹ３９
【図３０】プラスミドｐＭｃＴｓ６４
【図３１】プラスミドｐＭｃＴｓ６５
【図３２】プラスミドｐＪＬＪ８
【発明を実施するための形態】
【００２１】
詳細な説明
以下の本発明の説明は、本発明の様々な実施形態を例示することを意図したにすぎない。そのため、議論した具体的な改変は、本発明の範囲に対する制限と解釈されるものではない。様々な同等物、変更、及び改変が本発明の範囲から逸脱することなくなされ得ることは、当業者にとって明らかであろうから、係る同等の実施形態が、本明細書中に含まれるべきことも理解されている。
【００２２】
本明細書中に引用されたすべての引用文献は、参照によりその全体を本明細書中に援用する。
【００２３】
略語
３‐ＨＰ、３‐ヒドロキシプロピオン酸；３‐ＨＰＡ、３‐ヒドロキシプロピオンアルデヒド；３‐ＨＰＤＨ、３‐ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ；ＡＡＭ、アラニン２，３アミノムターゼ；ＡＡＴ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ；ＡＣＣ、アセチル‐ＣｏＡカルボキシラーゼ；ＡＤＣ、アスパラギン酸１‐デカルボキシラーゼ；ＡＫＧ、α‐ケトグルタル酸；ＡＬＤ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ；ＢＡＡＴ、β‐アラニンアミノトランスフェラーゼ；ＢＣＫＡ、分岐鎖α‐ケト酸デカルボキシラーゼ；ｂｐ、塩基対；ＣＹＢ２、Ｌ‐（＋）‐乳酸シトクロムｃオキシドレダクターゼ；ＣＹＣ、イソ‐２‐シトクロムｃ；ＥＭＳ、エタンスルホン酸メチル；ＥＮＯ、エノラーゼ；ｇａｂＴ、４‐アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ；ＧＡＰＤＨ、グリセルアルデヒド‐３‐リン酸デヒドロゲナーゼ３；ＧＰＤ、グリセロール３‐リン酸デヒドロゲナーゼ；ＧＰＰ、グリセロール３‐リン酸ホスファターゼ；ＨＩＢＡＤＨ、３‐ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ；ＩＰＤＡ、インドールピルビン酸デカルボキシラーゼ；ＫＧＤ、α‐ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ；ＬＤＨ、乳酸デヒドロゲナーゼ；ＭＡＥ、リンゴ酸酵素；ＯＡＡ、オキサロ酢酸；ＰＣＫ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ；ＰＤＣ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ；ＰＤＨ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ；ＰＥＰ、ホスホエノールピルビン酸；ＰＧＫ、ホスホグリセリン酸キナーゼ；ＰＰＣ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ；ＰＹＣ、ピルビン酸カルボキシラーゼ；ＲＫＩ、リボース５‐リン酸ケトールイソメラーゼ；ＴＡＬ、トランスアルドラーゼ；ＴＥＦ１、翻訳延長因子‐１；ＴＥＦ２、翻訳延長因子‐２；ＴＫＬ、トランスケトラーゼ；ＸＤＨ、キシリトールデヒドロゲナーゼ；ＸＲ、キシロースレダクターゼ；ＹＰ、酵母抽出物／ペプトン。
【００２４】
説明
３‐ＨＰ生産用の遺伝子組み換え酵母細胞、これらを酵母細胞の作製方法、及び３‐ＨＰを生産するためのこれらの細胞の使用方法を、本明細書中に規定する。本明細書中で使用される「３‐ＨＰ」としては、塩及び酸形態の３‐ヒドロキシプロピオン酸が挙げられる。
【００２５】
多くの３‐ＨＰ発酵経路が当該技術分野で知られている（例えば、米国特許第６，８５２，５１７号；同第７，３０９，５９７号；米国特許出願公開第２００１／００２１９７８号；同第２００８／０１９９９２６号；ＷＯ０２／４２４１８；及びＷＯ１０／０３１０８３を参照のこと、これらの文献を参照により本明細書中に援用する）。ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、ピルバート、オキサロ酢酸（ＯＡＡ）、アスパラタート、β‐アラニン、マロン酸セミアルデヒド、リンゴ酸、マロニル‐ＣｏＡ、アセチル‐ＣｏＡ、アラニン、ラクタート、ラクチル‐ＣｏＡ、アクリロイル‐ＣｏＡ、グリセロール、３‐ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３‐ＨＰＡ）、β‐アラニル‐ＣｏＡ、３‐ＨＰ‐ＣｏＡ、及びグリセラートを含めた一連の中間体を経て、３‐ＨＰ発酵経路は作動する。いくつかの公知の３‐ＨＰ発酵経路に関する総説を、図１に説明する。
【００２６】
本明細書中に開示されるように、多様な種からの酵母細胞の一群を、３‐ＨＰ耐性について試験した。３‐ＨＰ耐性を示した細胞を、異なった濃度の３‐ＨＰを含む培地中でそれらの増殖速度及びグルコース消費量に基づいてさらに評価した。これらの実験に基づいて、３‐ＨＰ生産のための１群の理想的な宿主細胞を特定した。次に、これらの宿主細胞を、活性な３‐ＨＰ発酵経路を含むように遺伝子組み換えし、そして、低ｐＨ条件下で３‐ＨＰを産生する遺伝子組み換え酵母細胞を得た。
【００２７】
ＰＥＰ、ピルバート、及び／又はグリセロールから３‐ＨＰへの少なくとも１種類の活性な３‐ＨＰ発酵経路を持つ遺伝子組み換え酵母細胞を、特定の実施形態で本明細書中に規定する。本明細書中で使用される「活性な３‐ＨＰ発酵経路」を持つ酵母細胞は、
３‐ＨＰ発酵経路の各反応を触媒するのに必要とされる活性な酵素を産生するので、そのため、少なくとも１種類の発酵性糖の存在する発酵条件下で培養されると、計測可能な収量で３‐ＨＰを産生することができる。活性な３‐ＨＰ発酵経路を持つ酵母細胞は、１若しくは複数の３‐ＨＰ経路遺伝子を含んでいる。本明細書中で使用される「３‐ＨＰ経路遺伝子」は、３‐ＨＰ発酵経路に関与する酵素をコードするヌクレオチド配列のコード領域を指す。
【００２８】
特定の実施形態において、本明細書中に規定する酵母細胞は、ＰＥＰ若しくはピルバートからＯＡＡ、アスパラタート、β‐アラニン、そしてマロン酸セミアルデヒド中間体を経る活性な３‐ＨＰ発酵経路を持つ（例えば、米国特許出願公開第２０１０／００２１９７８号、図１を参照のこと）。これらの実施形態において、酵母細胞は、ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＹＣ）、ＰＥＰカルボキシラーゼ（ＰＰＣ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＡＴ）、アスパラギン酸１‐デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）、β‐アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＢＡＡＴ）、アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ（ｇａｂＴ）、３‐ＨＰデヒドロゲナーゼ（３‐ＨＰＤＨ）、３‐ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＨＩＢＡＤＨ）、及び４‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの１若しくは複数を含む一連の３‐ＨＰ発酵経路遺伝子を含む。３‐ＨＰ発酵経路遺伝子はさらに、好ましくはＰＥＰからＯＡＡへの転換を触媒するポリペプチドを産生するように改変されたＰＥＰカルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）遺伝子を含んでいてもよい（一般に、天然のＰＣＫ遺伝子は、好ましくはＯＡＡからＰＥＰへの逆の反応を触媒するポリペプチドを産生する）。
【００２９】
特定の実施形態において、本明細書中に規定する酵母細胞は、ＰＥＰ若しくはピルバートから、ＯＡＡ、そしてリンゴ酸中間体を経る活性な３‐ＨＰ発酵経路を持つ（例えば、米国特許出願公開第２０１０／００２１９７８号、図４を参照のこと）。これらの実施形態において、酵母細胞は、ＰＰＣ、ＰＹＣ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、及びリンゴ酸デカルボキシラーゼ遺伝子のうちの１若しくは複数を含む一連の３‐ＨＰ発酵経路遺伝子を含む。３‐ＨＰ発酵経路遺伝子はまた、好ましくはＰＥＰからＯＡＡへの転換を触媒するポリペプチドを産生するように改変されたＰＣＫ遺伝子を含んでもよい。
【００３０】
特定の実施形態において、本明細書中に規定する酵母細胞は、ＰＥＰ若しくはピルバートから、ＯＡＡ、そしてマロン酸セミアルデヒド中間体を経て活性な３‐ＨＰ発酵経路を持つ（例えば、米国特許出願公開第２０１０／００２１９７８号、図１を参照のこと）。これらの実施形態において、酵母細胞は、ＰＰＣ、ＰＹＣ、２‐ケト酸デカルボキシラーゼ、α‐ケトグルタル酸（ＡＫＧ）デカルボキシラーゼ（ＫＧＤ）、分岐鎖α‐ケト酸デカルボキシラーゼ（ＢＣＫＡ）、インドールピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＩＰＤＡ）、３‐ＨＰＤＨ、ＨＩＢＡＤＨ、及び４‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの１若しくは複数を含む一連の３‐ＨＰ発酵経路遺伝子を含む。３‐ＨＰ発酵経路遺伝子はまた、好ましくはＰＥＰからＯＡＡへの転換を触媒するポリペプチドを産生するように改変されたＰＣＫ遺伝子を含んでもよい。さらに、３‐ＨＰ発酵経路遺伝子は、ＯＡＡからマロン酸セミアルデヒドへの転換を触媒することができるポリペプチドをコードするように改変されたＰＤＣ遺伝子及び／又はベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含んでもよい。
【００３１】
特定の実施形態において、本明細書中に規定する酵母細胞は、ＰＥＰ若しくはピルバートから、ＯＡＡ、マロニル‐ＣｏＡ、そしてマロン酸セミアルデヒド中間体（該マロン酸セミアルデヒド中間体は任意である）を経る活性な３‐ＨＰ発酵経路を持つ（例えば、米国特許出願公開第２０１０／００２１９７８号、図２を参照のこと）。これらの実施形態において、酵母細胞は、ＰＰＣ、ＰＹＣ、ＯＡＡギ酸リアーゼ、マロニル‐ＣｏＡレダクターゼ、ＣｏＡアシル化マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、３‐ＨＰＤＨ、ＨＩＢＡＤＨ、及び４‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの１若しくは複数を含む一連の３‐ＨＰ発酵経路遺伝子を含む。３‐ＨＰ発酵経路遺伝子はまた、好ましくはＰＥＰからＯＡＡへの転換を触媒するポリペプチドを産生するように改変されたＰＣＫ遺伝子を含んでもよい。さらに、３‐ＨＰ発酵経路遺伝子は、ＯＡＡからマロニルＣｏＡへの転換を触媒するポリペプチドを産生するように２‐ケト酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を改変することによって得られるＯＡＡデヒドロゲナーゼ遺伝子を含んでもよい。
【００３２】
特定の実施形態において、本明細書中に規定する酵母細胞は、ピルバートから、アセチル‐ＣｏＡ、マロニル‐ＣｏＡ、及びマロン酸セミアルデヒド中間体（マロン酸セミアルデヒド中間体は任意である）を経る活性な３‐ＨＰ発酵経路を持つ（例えば、ＷＯ０２／０４２４１８、図４４を参照のこと）。これらの実施形態において、酵母細胞は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）、アセチル‐ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）、マロニル‐ＣｏＡレダクターゼ、ＣｏＡアシル化マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、３‐ＨＰＤＨ、ＨＩＢＡＤＨ、及び４‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの１若しくは複数を含む一連の３‐ＨＰ発酵経路遺伝子を含む。
【００３３】
特定の実施形態において、本明細書中に規定する酵母細胞は、ピルバートから、アラニン、β‐アラニン、β‐アラニル‐ＣｏＡ、アクリロイル‐ＣｏＡ、３‐ＨＰ‐ＣｏＡ、そしてマロン酸セミアルデヒド中間体（β‐アラニル‐ＣｏＡ、アクリロイル‐ＣｏＡ、３‐ＨＰ‐ＣｏＡ、及びマロン酸セミアルデヒド中間体は任意である）を経る活性な３‐ＨＰ発酵経路を持つ（β‐アラニンは、マロン酸セミアルデヒド中間体を経て、又はβ‐アラニル‐ＣｏＡ、アクリロイル‐ＣｏＡ、そして３‐ＨＰ‐ＣｏＡ中間体を経て３‐ＨＰに転換される）（例えば、米国特許第７，３０９，５９７号、図１を参照のこと）。これらの実施形態において、酵母細胞は、アラニンデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸／アラニンアミノトランスフェラーゼ、アラニン２，３アミノムターゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、ＣｏＡシンテターゼ、β‐アラニル‐ＣｏＡアンモニアリアーゼ、３‐ＨＰ‐ＣｏＡデヒドラターゼ、３‐ＨＰ‐ＣｏＡヒドロラーゼ、３‐ヒドロキシイソブチリル‐ＣｏＡヒドロラーゼ、ＢＡＡＴ、３‐ＨＰＤＨ、ＨＩＢＡＤＨ、及び４‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの１若しくは複数を含む一連の３‐ＨＰ発酵経路遺伝子を含む。
【００３４】
特定の実施形態において、本明細書中に規定する酵母細胞は、ピルバートから、ラクタート、ラクチル‐ＣｏＡ、アクリロイル‐ＣｏＡ、そして３‐ＨＰ‐ＣｏＡ中間体を経る活性な３‐ＨＰ発酵経路を持つ（例えば、ＷＯ０２／０４２４１８、図１を参照のこと）。これらの実施形態において、酵母細胞は、ＬＤＨ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、ＣｏＡシンテターゼ、ラクチル‐ＣｏＡデヒドラターゼ、３‐ＨＰ‐ＣｏＡデヒドラターゼ、３‐ＨＰ‐ＣｏＡヒドロラーゼ、及び３‐ヒドロキシイソブチリル‐ＣｏＡヒドロラーゼ遺伝子のうちの１若しくは複数を含む一連の３‐ＨＰ発酵経路遺伝子を含む。
【００３５】
特定の実施形態において、本明細書中に規定する酵母細胞は、グリセロールから３‐ＨＰＡ中間体を経る活性な３‐ＨＰ発酵経路を持つ（例えば、米国特許第６，８５２，５１７号を参照のこと）。これらの実施形態において、酵母細胞は、グリセロールデヒドラターゼ及びアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの１若しくは複数を含む一連の３‐ＨＰ発酵経路遺伝子を含む。
【００３６】
特定の実施形態において、本明細書中に規定する酵母細胞は、ＰＥＰ若しくはピルバートから、ＯＡＡ、アスパラタート、β‐アラニン、β‐アラニル‐ＣｏＡ、アクリロイル‐ＣｏＡ、３‐ＨＰ‐ＣｏＡ、そしてアラニン中間体（ＯＡＡ、アスパラタート、及びアラニン中間体は任意である）を経る活性な３‐ＨＰ発酵経路を持つ（ＰＥＰ又はピルバートは、ＯＡＡとアスパラタートを経て、又はアラニンを経てβ‐アラニンへと転換される）（ＷＯ０２／０４２４１８、図５４、米国特許第７，３０９，５９７号、図１を参照のこと）。これらの実施形態において、酵母細胞は、ＰＰＣ、ＰＹＣ、ＡＡＴ、ＡＤＣ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、ＣｏＡシンテターゼ、β‐アラニル‐ＣｏＡアンモニアリアーゼ、３‐ＨＰ‐ＣｏＡデヒドラターゼ、３‐ＨＰ‐ＣｏＡヒドロラーゼ、３‐ヒドロキシイソブチリル‐ＣｏＡヒドロラーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸／アラニンアミノトランスフェラーゼ、及びＡＡＭ遺伝子のうちの１若しくは複数を含む一連の３‐ＨＰ発酵経路遺伝子を含む。３‐ＨＰ発酵経路遺伝子はまた、好ましくはＰＥＰからＯＡＡへの転換を触媒するポリペプチドを産生するように改変されたＰＣＫ遺伝子を含んでもよい。
【００３７】
本明細書中に規定する酵母細胞における３‐ＨＰ発酵経路遺伝子は、内在性であっても、外来性であってもよい。例えば、遺伝子、プロモーター、及びターミネータ配列など遺伝子成分に関して本明細書中で使用される「内在性」とは、その遺伝子成分が天然型の特定の酵母細胞のゲノム内の特定の位置に存在していることを意味する。遺伝子成分に関して本明細書中で使用される「外来性」とは、その遺伝子成分が天然型の特定の酵母細胞のゲノム内の特定の位置に存在していないことを意味する。酵母細胞に関して本明細書中で使用される「天然」とは、特定の酵母種の野生型酵母細胞を指す。代謝経路に関して本明細書中で使用される「天然」とは、天然酵母細胞内に存在し、且つ、活性な代謝経路を指す。
【００３８】
外来性遺伝子成分には、天然又は非天然のいずれかの配列があり得る。天然配列を持つ外来性遺伝子成分は、（機能に影響しない個人ごとの突然変異は別として）天然の細胞のゲノム内に存在している遺伝子成分と同一の配列を含む（すなわち、外来性遺伝子成分は内在性遺伝子成分と同一である）。しかしながら、外来性成分は、内在性成分に比べて宿主細胞ゲノム内の別の場所に存在している。例えば、内在性ＰＹＣ遺伝子と同一の外来性ＰＹＣ遺伝子は、酵母細胞内に挿入されるが、非天然（増加した）数のＰＹＣ遺伝子コピーを持つ改変細胞をもたらす。非天然配列を持つ外来性遺伝子成分は、天然細胞のゲノム内には見られない配列を含む。例えば、特定の種からの外来性ＰＹＣ遺伝子が、別の種の酵母細胞内に挿入されてもよい。外来遺伝子は、好ましくは機能的な様式で宿主細胞ゲノム内に組み込まれるが、それは、宿主細胞内で活性タンパク質を産生することができることを意味している。しかしながら、特定の実施形態において、外来遺伝子は、宿主細胞質内で安定して維持されるベクターの一部として細胞内に導入され得る。
【００３９】
特定の実施形態において、本明細書中に規定する酵母細胞は、１若しくは複数の外来性３‐ＨＰ発酵経路遺伝子を含む。特定の実施形態において、本明細書中に開示された遺伝子組み換え酵母細胞は、１種類の外来遺伝子を含む。他の実施形態において、酵母細胞は、複数の外来遺伝子を含む。これらの実施形態において、酵母細胞は、１種類の外来遺伝子の複数のコピー、及び／又は別々の外来遺伝子の２コピー以上を含んでもよい。複数の外来遺伝子を含む酵母細胞は、いろいろな外来遺伝子を含んでもよい。例えば、これらの酵母細胞は、１〜２０個の外来遺伝子を含んでもよい、そして、特定の好ましい実施形態において、それらは１〜７個の外来遺伝子を含んでもよい。外来遺伝子の複数のコピーは、それらが互いに隣接するように、１つの遺伝子座に組み込まれてもよい。あるいは、それらは宿主細胞のゲノム内の数個の遺伝子座に組み込まれてもよい。
【００４０】
特定の実施形態において、本明細書中に規定する酵母細胞は、１若しくは複数の内在性３‐ＨＰ発酵経路遺伝子を含む。特定のこれらの実施形態において、細胞は、これらの内在性遺伝子のうちの１若しくは複数を過剰発現するように操作されてもよく、そしてそれは、改変細胞が少なくともいくつかの条件下で天然の細胞より高いレベルで内在性遺伝子を発現することを意味している。特定のこれらの実施形態において、過剰発現される内在性遺伝子は、１若しくは複数の外来性調節要素に作動可能なように連結され得る。例えば、１若しくは複数の天然又は非天然の外来性強力プロモーターが、それらが１若しくは複数の内在性３‐ＨＰ経路遺伝子に作動可能なように連結されるように細胞内に導入されてもよい。
【００４１】
本明細書中に規定する改変酵母細胞における３‐ＨＰ発酵経路遺伝子は、例えば、プロモーター又はターミネータなどの１若しくは複数の調節要素に作動可能なように連結されてもよい。本明細書中に使用される「プロモーター」という用語は、その遺伝子の転写の開始を制御する、ある遺伝子（一般に、約１〜１０００塩基対（ｂｐ）の範囲内、好ましくは約１〜５００ｂｐの範囲内）の翻訳開始コドンの上流（すなわち、５’）に位置する非翻訳配列を指す。本明細書中で使用される「ターミネータ」という用語は、その遺伝子の転写の終わりを制御する、ある遺伝子（一般に、約１〜１０００ｂｐの範囲内、好ましくは約１〜５００ｂｐの範囲内、特に約１〜１００ｂｐの範囲内）の翻訳終止コドンの下流（すなわち、３’）に位置した非翻訳配列を指す。プロモーター又はターミネータは、その遺伝子の関連するゲノム内のその位置が、場合によって、そのプロモーター又はターミネータの転写調節機能を果たすような位置であれば、ある遺伝子に「作動可能なように連結され」ている。好適なプロモーター及びターミネータは、例えば、ＷＯ９９／１４３３５、ＷＯ００／７１７３８、ＷＯ０２／４２４７１、ＷＯ０３／１０２２０１、ＷＯ０３／１０２１５２、及びＷＯ０３／０４９５２５に記載されている（それらの全体を参照により本明細書中に援用する）。
【００４２】
本明細書中に規定する細胞の３‐ＨＰ発酵経路遺伝子に連結された調節要素は、内在性であっても、外来性であってもよい。例えば、外来性３‐ＨＰ発酵経路遺伝子は、それが内在性プロモーター及び／又はターミネータの転写調節下にあるように、酵母細胞内に挿入されてもよい。あるいは、外来性３‐ＨＰ発酵経路遺伝子は、１若しくは複数の外来性調節要素に連結されてもよい。例えば、外来遺伝子は、１若しくは複数の外来性調節要素を含む遺伝子発現構築物の一部として細胞内に導入されてもよい。特定の実施形態において、外来性調節要素又は少なくとも外来性調節要素の機能部分が、天然配列を含んでもよい。他の実施形態において、外来性調節要素は、非天然配列を含んでもよい。これらの実施形態において、外来性調節要素は、天然調節要素に対して比較的高度な配列同一性を有する配列を含んでもよい。例えば、外来遺伝子は、天然プロモーター又はターミネータに対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の配列同一性を有する外来プロモーター又はターミネータに連結されてもよい。ヌクレオチド又はアミノ酸配列の配列同一性のパーセンテージは、例えば、既定のパラメーターを用いたＢＬＡＳＴ（National Center for Biological Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool）バージョン２．２．１ソフトウェアを使用などの当該技術分野で公知の方法によって計算できる。例えば、既定のパラメーターを用いたＢＬＡＳＴバージョン２．２．１アルゴリズムを使用して、少なくとも９０％の同一性スコアを持つ配列は、少なくとも９０％の配列同一性を有すると考えられる。ＢＬＡＳＴソフトウェアは、NCBI, Bethesda, Marylandから入手可能である。
【００４３】
特定の態様において、本明細書中に規定する細胞の３‐ＨＰ発酵経路遺伝子に連結された調節要素（例えば、プロモーター）は、経路遺伝子にとって外来のものであってもよい。経路遺伝子にとって外来のものである調節要素は、その天然の形態では該遺伝子に連結されていない調節要素である。経路遺伝子と酵母細胞とのその関係によって、当業者は、経路遺伝子にとって外来のものである調節要素が内在性であっても、外来性であってもよいことを理解できる。場合によっては、内在性３‐ＨＰ発酵経路遺伝子は、経路遺伝子にとって外来のものである調節要素（例えば、プロモーター）に作動可能なように連結される。他の例では、外来性３‐ＨＰ発酵経路遺伝子は、経路遺伝子にとって外来のものである外来性調節要素（例えば、プロモーター）に作動可能なように連結される。
【００４４】
複数の外来遺伝子が宿主細胞内に挿入されているそれらの実施形態において、各外来遺伝子は、異なった調節要素の制御下にあっても、又は２個以上の外来遺伝子が同じ調節要素の制御下にあってもよい。例えば、第１の外来遺伝子が第１の調節要素に連結される場合、第２の外来遺伝子は、第１の調節要素に連結されていても、又はそれが第２の調節要素に連結されていてもよい。第１及び第２の調節要素は、同一であっても、高度な配列同一性を共有していても、又はそれらは完全に無関係であってもよい。
【００４５】
本明細書中に規定する酵母細胞の１若しくは複数の３‐ＨＰ発酵経路遺伝子に連結され得るプロモーターの例としては、これだけに限定されるものではないが、ＰＤＣ１、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、キシロースレダクターゼ（ＸＲ）、キシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）、Ｌ‐（＋）‐乳酸シトクロムｃオキシドレダクターゼ（ＣＹＢ２）、翻訳延長因子‐１（ＴＥＦ１）、翻訳延長因子‐２（ＴＥＦ２）、エノラーゼ（ＥＮＯ１）、グリセルアルデヒド‐３‐リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、及びオロチジン５’‐リン酸デカルボキシラーゼ（ＵＲＡ３）遺伝子のプロモーターが挙げられる。これらの例において、３‐ＨＰ発酵経路遺伝子は、ＰＤＣ１、ＰＧＫ、ＸＲ、ＸＤＨ、ＣＹＢ２、ＴＥＦ１、ＴＥＦ２、ＥＮＯ１、ＧＡＰＤＨ、又はＵＲＡ３遺伝子の内在性又は外来性プロモーターに連結され得る。プロモーターが外来性である場合、それらは、ＰＤＣ１、ＰＧＫ、ＸＲ、ＸＤＨ、ＣＹＢ２、ＴＥＦ１、ＴＥＦ２、ＥＮＯ１、ＧＡＰＤＨ、又はＵＲＡ３遺伝子の天然プロモーターと同一であるか、又は高い配列同一性（すなわち、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％）を共有し得る。
【００４６】
本明細書中に規定する酵母細胞の１若しくは複数の３‐ＨＰ発酵経路遺伝子に連結され得るターミネータの例としては、これだけに限定されるものではないが、ＰＤＣ１、ＸＲ、ＸＤＨ、トランスアルドラーゼ（ＴＡＬ）、トランスケトラーゼ（ＴＫＬ）、リボース５‐リン酸ケトールイソメラーゼ（ＲＫＩ）、ＣＹＢ２、若しくはイソ‐２‐シトクロムｃ（ＣＹＣ）遺伝子又はガラクトースファミリーの遺伝子のターミネータ（特にＧＡＬ１０ターミネータ）が挙げられる。これらの例において、３‐ＨＰ発酵経路遺伝子は、ＰＤＣ１、ＸＲ、ＸＤＨ、ＴＡＬ、ＴＫＬ、ＲＫＩ、ＣＹＢ２、若しくはＣＹＣ遺伝子又はガラクトースファミリー遺伝子の内在性又は外来性ターミネータに連結され得る。ターミネータが外来性である場合、それらは、ＰＤＣ１、ＸＲ、ＸＤＨ、ＴＡＬ、ＴＫＬ、ＲＫＩ、ＣＹＢ２、ＣＹＣ遺伝子又はガラクトースファミリー遺伝子の天然ターミネータと同一であるか、又は高い配列同一性（すなわち、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％）を共有し得る。特定の実施形態において、３‐ＨＰ発酵経路遺伝子は、宿主細胞にとって固有の天然ＧＡＬ１０遺伝子の機能部分を含むターミネータ、又は天然ＧＡＬ１０ターミネータと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を共有する配列に連結される。
【００４７】
外来遺伝子は、当該技術分野で公知ないずれかの方法によって酵母宿主細胞内に挿入され得る。好ましい実施形態において、遺伝子は、宿主細胞ゲノム内に組み込まれる。外来遺伝子は、標的化又はランダムな様式でゲノム内に組み込まれ得る。それらの実施形態において、遺伝子が標的化様式で組み込まれた場合、それは、特定の遺伝子の遺伝子座に組み込まれることができ、外来遺伝子の組み込みは天然遺伝子の欠失又は破壊と対にされる。例えば、外来性３‐ＨＰ経路遺伝子の導入は、他の発酵産物経路に関与する酵素をコードする１若しくは複数の遺伝子の欠失又は破壊と対にされ得る。あるいは、外来遺伝子は、遺伝子に相当しないゲノムの一部に組み込まれてもよい。
【００４８】
標的組み込み及び／又は欠失は、組み込み構築物を利用してもよい。本明細書中で使用される「構築物」という用語は、宿主細胞を形質転換するのに使用されるＤＮＡ配列を指す。構築物は、例えば、環状プラスミド又はベクター、環状プラスミド又はベクターの一部分（例えば、制限酵素消化産物など）、線状プラスミド又はベクター、あるいは鋳型としてプラスミド又はゲノムＤＮＡを使用した調製したＰＣＲ産物である。外来性構築物で酵母細胞を形質転換する方法は、例えば、ＷＯ９９／１４３３５、ＷＯ００／７１７３８、ＷＯ０２／４２４７１、ＷＯ０３／１０２２０１、ＷＯ０３／１０２１５２、及びＷＯ０３／０４９５２５に記載されている。組み込み構築物は、挿入部位標的からの２つのクローン標的ＤＮＡ配列を使用することで組み立てることができる。２つの標的ＤＮＡ配列は、天然宿主ゲノム内で隣接していても、隣接していなくてもよい。これに関連して、「隣接していない」とは、天然ゲノム内で互いに直に隣接していないが、その代わりに、欠失されるべき領域によってＤＮＡ配列が切り離されていることを意味する。本明細書中で使用される「隣接」配列は、天然ゲノム内で互い直に隣接している。標的組み込みが標的遺伝子の欠失又は破壊と対にされる場合、組み込み構築物はまた、欠失構築物と呼ばれることもある。欠失構築物において、標的配列の１つには、標的遺伝子の５’からプロモーターまでの領域、プロモータ領域の全部若しくは一部、標的遺伝子コード配列の全部若しくは一部、又はそのうちのいくつかの組み合わせを含み得る。他の標的配列は、標的遺伝子の３’からターミネータまでの領域、ターミネータ領域の全部若しくは一部、及び／又は標的遺伝子コード配列の全部若しくは一部を含み得る。標的組み込みが天然遺伝子の欠失又は破壊と対にされない場合、標的配列は、介在配列の挿入が天然遺伝子発現を中断しないように選択される。組み込み又は欠失構築物は、宿主細胞のゲノム内に天然に現れた場合に、２つの標的配列が相互の関連で同方向に向けられるように調製される。組み込み又は欠失構築物が宿主細胞内に外来遺伝子を導入するのに使用される場合、遺伝子発現カセットが、外来遺伝子の発現を可能にするように２つの標的遺伝子配列の間の構築物内にクローン化される。遺伝子発現カセットは、外来遺伝子を含んでいて、さらに外来遺伝子に作動可能なように連結された１若しくは複数の調節配列、例えば、プロモーター又はターミネータなどを含み得る。遺伝子発現カセットを含まない欠失構築物もまた、構築できる。そうした構築物は、外来遺伝子の挿入なしで遺伝子配列を欠失又は破壊するように設計されている。
【００４９】
組み込み又は欠失構築物は、２つの標的遺伝子配列の間の構築物内にクローン化された１若しくは複数の選択マーカーカセットを含み得る。選択マーカーカセットは、形質転換体の選択を可能にする少なくとも１種類の選択マーカー遺伝子を含んでいる。「選択マーカー遺伝子」とは、選択培養培地中での形質転換細胞の生存及び／又は成長に必要とされるタンパク質をコードする遺伝子なので、そのため、細胞に対して選択圧を加えるのに使用できる。成功した形質転換体は、選択マーカー遺伝子を含んでおり、そしてそれが、うまく形質転換された細胞に選択の基礎を規定する少なくとも１つの特徴を与える。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）抗生物質又は他の毒素に対する耐性（例えば、ブレオマイシン若しくはゼオマイシン（例えば、ストレプトアロテイカス・ヒンダスタヌス（Streptoalloteichus hindustanus）ｂｌｅ遺伝子）、例えば、Ｇ４１８若しくはカナマイシンなどのアミノグルコシド（例えば、トランスポゾンＴｎ９０３からのカナマイシン耐性遺伝子）、又はハイグロマイシン（例えば、Ｅ．コリからのアミノグルコシド抗生物質耐性遺伝子）耐性）を与えるか、（ｂ）細胞の栄養要求性欠乏（例えば、ロイシン（例えば、Ｋ．マルキシアヌス（K. marxianus）ＬＥＵ２遺伝子）、ウラシル（例えば、Ｋ．マルキシアヌス、Ｓ．セレビシエ、又はＩ．オリエンタリスＵＲＡ３遺伝子）、又はトリプトファン（例えば、Ｋ．マルキシアヌス、Ｓ．セレビシエ、又はＩ．オリエンタリスＴＲＰ遺伝子）の欠乏）を補うか、（ｃ）単純培地から入手できない重要な栄養素を細胞が合成できるようにするか、あるいは（ｄ）特定の炭素源で細胞が成長する能力を与える（例えば、（α‐ガラクトシダーゼ（メリビアーゼ）酵素をコードし、単一炭素源としてのメリビオースにより成長する能力を与える）Ｓ．セレビシエからのＭＥＬ５遺伝子）タンパク質をコードする。好ましい選択マーカーとしては、ＵＲＡ３遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、Ｇ４１８耐性遺伝子、ＭＥＬ５遺伝子、及びハイグロマイシン耐性遺伝子が挙げられる。別の好ましい選択マーカーは、Ｌ‐乳酸：フェリシトクロムｃオキシドレダクターゼ（ＣＹＢ２）遺伝子カセットであるが、但し、宿主細胞が天然にそうした遺伝子を欠いているか、又は（単数若しくは複数の）その天然ＣＹＢ２遺伝子が最初に欠失又は破壊されるものとする。選択マーカー遺伝子は、宿主細胞内で作動可能である１若しくは複数のプロモーター及び／又はターミネータ配列に作動可能なように連結される。特定の実施形態において、これらのプロモーター及び／又はターミネータ配列は、選択マーカーカセットに含まれている外来性プロモーター及び／又はターミネータ配列である。好適なプロモーター及びターミネータは、本明細書中に記載されているとおりである。
【００５０】
組み込み又は欠失構築物は、宿主細胞を形質転換するのに使用される。形質転換は、例えば、エレクトロポレーション及び／又は化学的形質転換（例えば、塩化カルシウム、酢酸リチウムベースのもの、など）の方法を使用することで達成され得る。選択マーカーの存在又は不存在に基づく選択又はスクリーニングは、成功した形質転換体を特定するために実施されてもよい。成功した形質転換体において、標的部位の遺伝子座における相同組み換え事象は、標的部位配列の破壊又は欠失をもたらす。構築物が欠失又は破壊のために天然遺伝子を標的とする場合、天然標的遺伝子、そのプロモーター、及び／又はそのターミネータの全部若しくは一部がこの組み換え事象中に欠失され得る。発現カセット、選択マーカーカセット、及び組み込み構築物の標的配列の間のその他の遺伝物質が、標的配列に相当する遺伝子座において宿主ゲノム内に挿入される。ＰＣＲ又はサザン解析による分析を、所望の挿入／欠失がおこなわれたことを確認するために実施できる。
【００５１】
いくつかの実施形態において、細胞の形質転換は、単独の構築物又はＰＣＲ産物よりむしろ、２個以上の構築物、ＰＣＲ産物、又はその組み合わせからのＤＮＡを使用することで実施され得る。これらの実施形態において、１つの組み込み断片の３’末端は、別の組み込み断片の５’末端に重なっている。一例において、一方の構築物は、標的配列の遺伝子座からの第１の配列及びマーカー遺伝子カセットの無機能性部分を含むが、もう片方のものは、標的配列の遺伝子座からの第２の配列及びマーカー遺伝子カセットの第２の無機能性部分を含む。マーカー遺伝子カセットの部分は、それらが完全なカセットを形成するように組み合わせられるように選択される。細胞は、これらのピースで同時に形質転換され、そして完全で、機能的なマーカー又は構造的な遺伝子カセットの形成をもたらす。成功した形質転換体は、選択マーカーによって与えられた特徴に基づいて選択される。別の例において、選択マーカーは、１つの断片上に常駐するが、標的配列は別々の断片上に存在しているので、組み込み断片は着目の部位において高確率の組み込みがある。他の実施形態において、３つの直鎖ＤＮＡからの形質転換が、外来性遺伝物質を組み込むために使用できる。これらの実施形態において、一方の断片が、５’末端において第２の断片に、そして、３’末端において第３の断片に重なる。
【００５２】
組み込み又は欠失構築物は、選択マーカー遺伝子又はその調節要素のいくつか若しくはすべてがその後の相同組み換え事象の結果として自然に欠失されるように設計されてもよい。これを達成する簡便な方法は、選択マーカー遺伝子及び／又は調節要素が反復配列に隣接するように構築物を設計することである。反復配列は、宿主細胞にとって天然又は非天然の、そして構築物上では互いに同方向又は逆方向を向いている同一のＤＮＡ配列である。反復配列は、有利なことには、長さ約５０〜１５００ｂｐであり、そして、何かをコードする必要もない。反復配列の包含は、相同組み換え事象の発生を可能にし、そしてそれが、選択マーカー遺伝子及び一方の反復配列の欠失をもたらす。相同組み換えは比較的低い頻度でしか起こらないので、いくつかの細胞で自然発生的な相同組み換えが起こるのを可能にさせるには、非選択的培地における数ラウンドの間、形質転換体を培養することが必要とされることもある。選択マーカー遺伝子が自然に欠失された細胞は、それらの選択マーカー遺伝子によって与えられた選択特徴の喪失に基づいて選択又はスクリーニングできる。ある場合には、リコンビナーゼ酵素の発現が、反復部位の間の組み換えを促進し得る。
【００５３】
本明細書中に規定する改変酵母細胞の外来性３‐ＨＰ発酵経路遺伝子は、あらゆる好適な起源からの起源遺伝子から得られる。例えば、外来遺伝子は、酵母、真菌、細菌、植物、昆虫、又は哺乳類の起源から得てもよい。本明細書中に使用される、天然の起源遺伝子から「得られる」外来遺伝子は、１）天然遺伝子によってコードされるポリペプチドへの同一である、２）天然遺伝子によってコードされるポリペプチドと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を共有する、及び／又は３）３‐ＨＰ発酵経路の中で天然遺伝子によってコードされるポリペプチドと同じ機能を持つ、ポリペプチドをコードする。例えば、Ｉ．オリエンタリスＰＹＣ遺伝子から得られるＰＹＣ遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド、及び／又はピルバートからＯＡＡへの転換を触媒する能力を持つポリペプチドをコードし得る。天然遺伝子から得られる遺伝子は、天然遺伝子のコード領域と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。特定の実施形態において、天然遺伝子から得られる遺伝子は、起源遺伝子のコード領域と同一のヌクレオチド配列を含み得る。例えば、Ｉ．オリエンタリスＰＹＣ遺伝子から得られるＰＹＣ遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド配列を含んでも、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでもよい。
【００５４】
本明細書中に規定する改変酵母細胞の特定の実施形態において、外来性３‐ＨＰ発酵経路遺伝子を得た天然起源遺伝子は、３‐ＨＰ発酵経路に関与するポリペプチドを産生する。しかしながら、他の実施形態において、天然起源遺伝子は、３‐ＨＰ発酵経路にかかわらないか、又は３‐ＨＰ発酵経路において逆反応を触媒するポリペプチドをコードし得る。これらの実施形態において、外来性３‐ＨＰ経路遺伝子は、天然起源遺伝子に対する、改変された活性及び／又は基質選択性をもたらす１若しくは複数の標的化又はランダム突然変異を受ける。例えば、天然起源遺伝子は、３‐ＨＰ発酵経路において所望の反応方向で高い活性を有し、及び／又は望ましくない方向で低い活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を作り出すようい変異させてもよい。例えば、天然起源遺伝子が、３‐ＨＰ発酵経路で順反応と逆反応の両方を触媒することができるポリペプチドをコードする場合、遺伝子は、得られた外来遺伝子が順方向で高い活性を、そして逆方向で低い活性を有するように改変されてもよい。同様に、天然起源遺伝子を、天然ポリペプチドに比べて異なった基質選択性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を産生するように変異させてもよい。例えば、３‐ＨＰ経路遺伝子を、天然ポリペプチドが好まない又は全く作用しない基質に作用する能力を有するポリペプチドを産生するように変異させてもよい。これらの実施形態において、外来性３‐ＨＰ経路遺伝子によってコードされたポリペプチドは、天然起源遺伝子によってコードされたポリペプチドが完全に触媒できない反応を触媒してもよい。天然起源遺伝子はまた、１若しくは複数の下流の３‐ＨＰ経路中間体又は副生物の存在下で、得られた３‐ＨＰ経路遺伝子がＤＮＡ、ＲＮＡ、又はタンパク質レベルでフィードバック阻害の低減を示すように変異されてもよい。
【００５５】
本明細書中に規定する改変酵母細胞の特定の実施形態において、外来性３‐ＨＰ経路遺伝子は、宿主酵母種から得てもよい。例えば、宿主細胞がＩ．オリエンタリスである場合、外来遺伝子をＩ．オリエンタリスの遺伝子から得てもよい。これらの実施形態において、外来遺伝子は、宿主細胞内へのその外来遺伝子の取り込みが天然遺伝子配列のコピー数を増やす、及び／又は野生型細胞内の遺伝子の発現を駆動するプロモーターと異なるプロモーター制御下にあるのであれば、その遺伝子の調整又は発現レベルを変更するような、天然遺伝子のコード領域と同一のヌクレオチド配列を含み得る。他の実施形態において、外来性３‐ＨＰ経路遺伝子は、天然３‐ＨＰ経路遺伝子のコード領域と異なるが、それにもかかわらず、天然３‐ＨＰ経路遺伝子によってコードされたポリペプチドと同一のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。さらに他の実施形態において、外来性３‐ＨＰ経路遺伝子は、１若しくは複数の天然３‐ＨＰ経路遺伝子によってコードされたポリペプチドと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。特定のこれらの実施形態において、外来遺伝子は、１若しくは複数の天然遺伝子と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。さらに他の実施形態において、外来性３‐ＨＰの遺伝子は、天然３‐ＨＰ経路遺伝子によってコードされるポリペプチドと５０％未満の配列同一性しか有していないが、それにもかかわらず、３‐ＨＰ発酵経路において天然ポリペプチドと同じ機能（すなわち、同じ反応を触媒する能力）を持つポリペプチドをコードし得る。天然起源遺伝子は、普通の真核開始コドン（ＡＴＧ）で開始されるコード配列を提供するために必要であれば、又は他の目的のために突然変異誘発に供されてもよい。
【００５６】
他の実施形態において、外来性３‐ＨＰ経路遺伝子は、宿主酵母細胞の種と異なった種から得てもよい。特定のこれらの実施形態において、外来性３‐ＨＰ経路遺伝子は、宿主細胞と異なった酵母種から得てもよい。例えば、宿主細胞がＩ．オリエンタリスである場合、外来遺伝子をＳ．セレビシエから得てもよい。他の実施形態において、外来性３‐ＨＰ経路遺伝子は、真菌、細菌、植物、昆虫、又は哺乳類の起源から得てもよい。例えば、宿主細胞がＩ．オリエンタリスである場合、Ｅ．コリなどの細菌起源から外来遺伝子を得てもよい。外来性３‐ＨＰ経路遺伝子を酵母起源以外から得るそれらの実施形態において、外来遺伝子配列は、酵母宿主細胞内での発現のために最適化されたコドンであってもよい。
【００５７】
外来性３‐ＨＰ経路遺伝子を宿主細胞種以外の種から得るそれらの実施形態において、外来遺伝子は、起源生物体からの天然３‐ＨＰ経路遺伝子によってコードされたポリペプチドと同一のポリペプチドをコードし得る。特定のこれらの実施形態において、外来性３‐ＨＰ経路遺伝子は、起源生物体からの天然３‐ＨＰ経路遺伝子と同一のものであってもよい。他の実施形態において、外来遺伝子は、起源生物体からの天然３‐ＨＰ経路遺伝子と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を共有し得る。他の実施形態において、外来性３‐ＨＰ経路遺伝子は、起源生物体からの天然３‐ＨＰ経路遺伝子によってコードされるポリペプチドと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を共有するポリペプチドをコードし得る。特定のこれらの実施形態において、外来遺伝子は、起源生物体からの１若しくは複数の天然３‐ＨＰ経路遺伝子と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。さらに他の実施形態において、外来性３‐ＨＰの遺伝子は、起源生物体からの天然３‐ＨＰ経路遺伝子によってコードされるポリペプチドと５０％未満の配列同一性しかないが、それにもかかわらず、３‐ＨＰ発酵経路において起源生物体からの天然ポリペプチドと同じ機能を持つポリペプチドをコードし得る。
【００５８】
特定の実施形態において、本明細書中に規定する酵母細胞は、次の酵素から成る群から選択される酵素をコードする１若しくは複数の３‐ＨＰ経路遺伝子を発現する：ＡＣＣ（アセチル‐ＣｏＡからマロニル‐ＣｏＡへの転換を触媒する）、アラニン２，３アミノムターゼ（ＡＡＭ、アラニンからβ‐アラニンへの転換を触媒する）、アラニンデヒドロゲナーゼ（ピルバートからアラニンへの転換を触媒する）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（３‐ＨＰＡから３‐ＨＰへの転換を触媒する）、ＫＧＤ（ＯＡＡからマロン酸セミアルデヒドへの転換を触媒する）、ＡＡＴ（ＯＡＡからアスパラタートへの転換を触媒する）、ＡＤＣ（アスパラタートからβ‐アラニンへの転換を触媒する）、ＢＣＫＡ（ＯＡＡからマロン酸セミアルデヒドへの転換を触媒する）、ＢＡＡＴ（β‐アラニンからマロン酸セミアルデヒドへの転換を触媒する）、４‐アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ、（ｇａｂＴ、β‐アラニンからマロン酸セミアルデヒドへの転換を触媒する、）、β‐アラニル‐ＣｏＡアンモニアリアーゼ（β‐アラニル‐ＣｏＡからアクリロイル‐ＣｏＡへの転換を触媒する）、Ｃｏ‐Ａアシル化マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（マロニル‐ＣｏＡからマロン酸セミアルデヒドへの転換を触媒する）、ＣｏＡシンテターゼ（β‐アラニンからβ‐アラニル‐ＣｏＡへの転換又はラクタートからラクチル‐ＣｏＡへの転換を触媒する）、ＣｏＡトランスフェラーゼ（β‐アラニンからβ‐アラニル‐ＣｏＡへの転換及び／又はラクタートからラクチル‐ＣｏＡへの転換を触媒する）、グリセロールデヒドラターゼ（グリセロールから３‐ＨＰＡへの転換を触媒する）、ＩＰＤＡ（ＯＡＡからマロン酸セミアルデヒドへの転換を触媒する）、ＬＤＨ（ピルバートからラクタートへの転換を触媒する）、ラクチル‐ＣｏＡデヒドラターゼ（ラクチル‐ＣｏＡからアクリロイル‐ＣｏＡへの転換を触媒する）、リンゴ酸デカルボキシラーゼ（リンゴ酸から３‐ＨＰへの転換を触媒する）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＯＡＡからリンゴ酸への転換を触媒する）、マロニル‐ＣｏＡレダクターゼ（マロニル‐ＣｏＡからマロン酸セミアルデヒド又は３‐ＨＰへの転換を触媒する）、ＯＡＡギ酸リアーゼ（ピルビン酸‐ギ酸リアーゼやケト酸ギ酸リアーゼとしても知られている、ＯＡＡからマロニル‐ＣｏＡへの転換を触媒する）、ＯＡＡデヒドロゲナーゼ（ＯＡＡからマロニルＣｏＡへの転換を触媒する）、ＰＰＣ（ＰＥＰからＯＡＡへの転換を触媒する）、ピルビン酸／アラニンアミノトランスフェラーゼ（ピルバートからアラニンへの転換を触媒する）、ＰＹＣ（ピルバートからＯＡＡへの転換を触媒する）、ＰＤＨ（ピルバートからアセチル‐ＣｏＡへの転換を触媒する）、２ケト酸デカルボキシラーゼ（ＯＡＡからマロン酸セミアルデヒドへの転換を触媒する）、３‐ＨＰ‐ＣｏＡデヒドラターゼ（アクリロイルＣｏＡヒドラターゼとしても知られている、アクリロイルＣｏＡから３‐ＨＰ‐ＣｏＡへの転換を触媒する）、３‐ＨＰＤＨ（マロン酸セミアルデヒドから３‐ＨＰへの転換を触媒する）、３‐ＨＰ‐ＣｏＡヒドロラーゼ（３‐ＨＰ‐ＣｏＡから３‐ＨＰへの転換を触媒する）、ＨＩＢＡＤＨ（マロン酸セミアルデヒド���ら３‐ＨＰへの転換を触媒する）、３‐ヒドロキシイソブチリル‐ＣｏＡヒドロラーゼ（３‐ＨＰ‐ＣｏＡから３‐ＨＰへの転換を触媒する）、及び４‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（マロン酸セミアルデヒドから３‐ＨＰへの転換を触媒する）。これらの酵素活性のそれぞれについて、括弧内の着目の反応は、天然の活性の結果であっても、非天然の活性の結果であってもよい。
【００５９】
本明細書中で使用される「ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子」又は「ＰＹＣ遺伝子」は、（ピルバート、ＣＯ2、及びＡＴＰからＯＡＡ、ＡＤＰ、及びホスファートへの転換を触媒する能力を意味する）ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。特定の実施形態において、ＰＹＣ遺伝子を酵母起源から得てもよい。例えば、ＰＹＣ遺伝子を、配列番号２に規定するアミノ酸配列をコードするＩ．オリエンタリスＰＹＣ遺伝子から得てもよい。他の実施形態において、遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態において、Ｉ．オリエンタリス由来ＰＹＣ遺伝子は、配列番号１に規定するヌクレオチド配列、又は配列番号１に規定するヌクレオチド配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。他の実施形態において、ＰＹＣ遺伝子を細菌起源から得てもよい。例えば、補充反応にＰＰＣ（以下を参照のこと）ではなくＰＹＣだけを使用する数種類の細菌種、例えば、Ｒ．スフェロイデスなど、又はＰＹＣとＰＰＣの両方を持つ細菌種、例えば、Ｒ．エトリなどのうちの１つからＰＹＣ遺伝子を得てもよい。Ｒ．スフェロイデス及びＲ．エトリのＰＹＣ遺伝子によってコードされたアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３及び４に規定する。ＰＹＣ遺伝子は、配列番号３又は４のアミノ酸配列をコードする遺伝子から得ても、配列番号３又は４のアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子から得てもよい。あるいは、ＰＹＣ遺伝子は、活性化に関してアセチル‐ＣｏＡに依存性を持っていない酵素をコードするＰＹＣ遺伝子、例えば、配列番号５（カルボキシトランスフェラーゼサブユニット）又は配列番号６（ビオチンカルボキシラーゼサブユニット）に規定するアミノ酸配列をコードするＰ．フルオレッセンスＰＹＣ遺伝子、配列番号７に規定するアミノ酸配列をコードするＣ．グルタミクムＰＹＣ遺伝子などから、あるいは、配列番号５、６、又は７のアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子から得てもよい。ＰＹＣ遺伝子はまた、アスパラタートによって阻害されない酵素をコードするＰＹＣ遺伝子、例えば、配列番号８（Sauer FEMS Microbiol Rev 29: 765 (2005)）に規定するアミノ酸配列をコードするＳ．メリロティＰＹＣ遺伝子から得ても、又は配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、��なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子から得てもよい。
【００６０】
本明細書中で使用される「ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子」又は「ＰＰＣ遺伝子」は、（ＰＥＰとＣＯ2からＯＡＡとホスファートへの転換を触媒する能力を意味する）ＰＥＰカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。特定の実施形態において、ＰＰＣの遺伝子を細菌ＰＰＣの遺伝子から得てもよい。例えば、ＰＰＣ遺伝子は、配列番号１０に規定するアミノ酸配列をコードするＥ．コリＰＰＣ遺伝子から得ても、又は配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列から得てもよい。特定の実施形態において、Ｅ．コリ由来ＰＰＣ遺伝子は、配列番号９に規定するヌクレオチド配列、又は配列番号９に規定するヌクレオチド配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。他の実施形態において、ＰＰＣ遺伝子は、アセチルＣｏＡで活性化されない、且つ、アスパラタートでそれほど阻害されない、多くの始原細菌（archea）と限られた数の細菌に見られる「Ａ」タイプＰＰＣから得ることができる。例えば、ＰＰＣ遺伝子は、配列番号１１に規定するアミノ酸配列をコードするＭ．サーモオートトロフィカムＰＰＣ Ａ遺伝子、配列番号１２に規定するアミノ酸配列をコードするＣ．パーフリンゲンスＰＰＣ Ａ遺伝子、又は配列番号１１又は１２のアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子から得てもよい。特定のこれらの実施形態において、遺伝子は、改良された特徴を有する酵素を作り出すために天然遺伝子に対して１若しくは複数の突然変異を受けてもよかった。例えば、遺伝子は、天然ポリペプチドに対して、アスパラタートフィードバックに対する耐性を高めたＰＰＣポリペプチドをコードするように変異させてもよかった。他の実施形態において、ＰＰＣ遺伝子を植物起源から得てもよい。
【００６１】
本明細書中で使用される「アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子」又は「ＡＡＴ遺伝子」は、（ＯＡＡからアスパラタートへの転換を触媒する能力を意味する）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、ＥＣ２．６．１．１に分類される。特定の実施形態において、ＡＡＴ遺伝子をＩ．オリエンタリス又はＳ．セレビシエなどの酵母起源から得てもよい。例えば、ＡＡＴ遺伝子は、配列番号に１４に規定するアミノ酸配列をコードするＩ．オリエンタリスＡＡＴ遺伝子、又は配列番号１５に規定するアミノ酸配列をコードするＳ．セレビシエＡＡＴ２遺伝子から得てもよい。他の実施形態において、遺伝子は、配列番号１４又は１５のアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態において、Ｉ．オリエンタリス由来ＡＡＴ遺伝子は、配列番号１３に規定するヌクレオチド配列、又は配列番号１３に規定するヌクレオチド配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。他の実施形態において、ＡＡＴ遺伝子を細菌起源から得てもよい。例えば、ＡＡＴ遺伝子は、配列番号１６に規定するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＥ．コリａｓｐＣ遺伝子から得てもよい。他の実施形態において、遺伝子は、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。
【００６２】
本明細書中で使用される「アスパラギン酸デカルボキシラーゼ遺伝子」又は「ＡＤＣ遺伝子」は、（アスパラタートからβ‐アラニンへの転換を触媒する能力を意味する）アスパラギン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。アスパラギン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、ＥＣ４．１．１．１１に分類される。特定の実施形態において、細菌起源からＡＤＣ遺伝子を得てもよい。活性なアスパラギン酸デカルボキシラーゼが不活性なプロ酵素のタンパク質分解的プロセシングを必要とする可能性があるので、これらの実施形態において、酵母宿主細胞は、細菌ＡＤＣ遺伝子によってコードされた活性酵素の形成をサポートするように選択されなければならない。
【００６３】
いくつかの実施形態において、ＡＤＣ遺伝子は、配列番号１７が規定されるアミノ酸配列をコードするＳ．アベルミチリスｐａｎＤ遺伝子から得てもよい。いくつかの実施形態において、ＡＤＣ遺伝子は、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態において、Ｓ．アベルミチリス由来ＡＤＣ遺伝子は、配列番号１３０、１４５、１４６、又は１４７のいずれか１つに規定するヌクレオチド配列、又は配列番号１３０、１４５、１４６、又は１４７のいずれか１つに規定するヌクレオチド配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。
【００６４】
他の実施形態において、ＡＤＣ遺伝子を、配列番号１８に規定するアミノ酸配列をコードするＣ．アセトブチリカムｐａｎＤ遺伝子から得てもよい。いくつかの実施形態において、ＡＤＣ遺伝子は、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態において、Ｃ．アセトブチリカム由来ＡＤＣ遺伝子は、配列番号１３１に規定するヌクレオチド配列、又は配列番号１３１に規定するヌクレオチド配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。
【００６５】
他の実施形態において、ＡＤＣ遺伝子を、配列番号１３３に規定するアミノ酸配列をコードするＨ．ピロリＡＤＣ遺伝子から得てもよい。いくつかの実施形態において、ＡＤＣ遺伝子は、配列番号１３３のアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態において、Ｈ．ピロリ由来ＡＤＣ遺伝子は、配列番号１３３に規定するヌクレオチド配列、又は配列番号１３３に規定するヌクレオチド配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。
【００６６】
他の実施形態において、ＡＤＣ遺伝子を、配列番号１３５に規定するアミノ酸配列をコードするバチルス属（Bacillus sp.）ＴＳ２５ ＡＤＣ遺伝子から得てもよい。いくつかの実施形態において、ＡＤＣ遺伝子は、配列番号１３５のアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態において、バチルス属ＴＳ２５由来ＡＤＣ遺伝子は、配列番号１３４に規定するヌクレオチド配列、又は配列番号１３４に規定するヌクレオチド配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。
【００６７】
他の実施形態において、ＡＤＣ遺伝子を、配列番号１３７に規定するアミノ酸配列をコードするＣ．グルタミクムＡＤＣ遺伝子から得てもよい。いくつかの実施形態において、ＡＤＣ遺伝子は、配列番号１３７のアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態において、Ｃ．グルタミクム由来ＡＤＣ遺伝子は、配列番号１３６に規定するヌクレオチド配列、又は配列番号１３６に規定するヌクレオチド配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。
【００６８】
他の実施形態において、ＡＤＣ遺伝子を、配列番号１３９に規定するアミノ酸配列をコードするＢ．リチェニフォルミスＡＤＣ遺伝子から得てもよい。いくつかの実施形態において、ＡＤＣ遺伝子は、配列番号１３９のアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態において、Ｂ．リチェニフォルミス由来ＡＤＣ遺伝子は、配列番号１３８、１４８、１４９、１５０、又は１５１のいずれか１つに規定するヌクレオチド配列、又は配列番号１３８、１４８、１４９、１５０、又は１５１のいずれか１つに規定するヌクレオチド配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。
【００６９】
本明細書中で使用される「β‐アラニンアミノトランスフェラーゼ遺伝子」又は「ＢＡＡＴ遺伝子」は、（β‐アラニンからマロン酸セミアルデヒドへの転換を触媒する能力を意味する）β‐アラニンアミノトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。β‐アラニンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、ＥＣ２．６．１．１９に分類される。特定の実施形態において、酵母起源からＢＡＡＴ遺伝子を得てもよい。例えば、ＢＡＡＴ遺伝子は、配列番号２０に規定するアミノ酸配列をコードするｐｙｄ４遺伝子のＩ．オリエンタリス相同体から得られてもよい。いくつかの実施形態において、ＢＡＡＴ遺伝子は、配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態において、Ｉ．オリエンタリス由来ＢＡＡＴ遺伝子は、配列番号１９に規定するヌクレオチド配列、又は配列番号１９に規定するヌクレオチド配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。他の実施形態において、ＢＡＡＴ遺伝子は、配列番号２１に規定するアミノ酸配列をコードするＳ．クルイベリｐｙｄ４遺伝子から得てもよい。いくつかの実施形態において、ＢＡＡＴ遺伝子は、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態において、Ｓ．クルイベリ由来ＢＡＡＴ遺伝子は、配列番号１４２に規定するヌクレオチド配列、又は配列番号１４２に規定するヌクレオチド配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。他の実施形態において、細菌起源からＢＡＡＴ遺伝子を得てもよい。例えば、ＢＡＡＴ遺伝子を、配列番号２２に規定するアミノ酸配列をコードするＳ．アベルミチリスＢＡＡＴ遺伝子から得てもよい。いくつかの実施形態において、ＢＡＡＴ遺伝子は、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態において、Ｓ．アベルミチリス由来ＢＡＡＴ遺伝子は、配列番号１４０に規定するヌクレオチド配列、又は配列番号１４０に規定するヌクレオチド配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７���、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。
【００７０】
ＢＡＡＴ遺伝子はまた、（それが４‐アミノブチラート並びにβ‐アラニンに対して天然活性を有することを意味する）「４‐アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ」又は「ｇａｂＴ遺伝子」であってもよい。あるいは、ＢＡＡＴ遺伝子は、ＢＡＡＴ活性を有するポリペプチドをコードするための、細菌又は酵母起源からの天然ｇａｂＴ遺伝子のランダム又は部位指定操作によって得られてもよい。例えば、ＢＡＡＴ遺伝子を、配列番号２３に規定するアミノ酸配列をコードするＳ．アベルミチリスｇａｂＴから得てもよい。いくつかの実施形態において、Ｓ．アベルミチリス由来ＢＡＡＴ遺伝子は、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。他の実施形態において、ＢＡＡＴ遺伝子を、配列番号２４に規定するアミノ酸配列をコードするＳ．セレビシエｇａｂＴ遺伝子ＵＧＡ１から得てもよい。いくつかの実施形態において、Ｓ．セレビシエ由来ＢＡＡＴ遺伝子は、配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態において、Ｓ．セレビシエ由来ＢＡＡＴ遺伝子は、配列番号１４１に規定するヌクレオチド配列、又は配列番号１４１に規定するヌクレオチド配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。
【００７１】
本明細書中で使用される「３‐ＨＰデヒドロゲナーゼ遺伝子」又は「３‐ＨＰＤＨ遺伝子」は、（マロン酸セミアルデヒドから３‐ＨＰへの転換を触媒する能力を意味する）３‐ＨＰデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。
３‐ＨＰデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、それらがＮＡＤ（Ｈ）補因子を利用するなら、ＥＣ１．１．１．５９に分類され、そして、それらがＮＡＤＰ（Ｈ）補因子を利用するなら、ＥＣ１．１．１．２９８に分類される。あるいは、ＥＣ１．１．１．２９８に分類される酵素は、マロン酸セミアルデヒドレダクターゼとも呼ばれる。
【００７２】
特定の実施形態において、酵母起源から３‐ＨＰＤＨ遺伝子を得てもよい。例えば、３‐ＨＰＤＨ遺伝子は、配列番号２６に規定するアミノ酸配列をコードするＹＭＲ２２６Ｃ遺伝子のＩ．オリエンタリス相同体から得られてもよい。いくつかの実施形態において、３‐ＨＰＤＨ遺伝子は、配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態において、Ｉ．オリエンタリス由来３‐ＨＰＤＨ遺伝子は、配列番号２５に規定するヌクレオチド配列、又は配列番号２５に規定するヌクレオチド配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。他の実施形態において、３‐ＨＰＤＨ遺伝子は、配列番号１２９に規定するアミノ酸配列をコードするＳ．セレビシエＹＭＲ２２６Ｃ遺伝子から得てもよい。いくつかの実施形態において、３‐ＨＰＤＨ遺伝子は、配列番号１２９のアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態において、Ｓ．セレビシエ由来３‐ＨＰＤＨ遺伝子は、配列番号１４４に規定するヌクレオチド配列、又は配列番号１４４に規定するヌクレオチド配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。
【００７３】
他の実施形態において、細菌起源から３‐ＨＰＤＨ遺伝子を得てもよい。例えば、３‐ＨＰＤＨ遺伝子は、配列番号２７のアミノ酸配列をコードするＥ．コリｙｄｆＧ遺伝子から得てもよい。いくつかの実施形態において、遺伝子は、配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態において、Ｅ．コリ由来３‐ＨＰＤＨ遺伝子は、配列番号１４３に規定するヌクレオチド配列、又は配列番号１４３に規定するヌクレオチド配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。他の実施形態において、３‐ＨＰＤＨ遺伝子は、配列番号２９に規定するアミノ酸配列をコードするＭ．セデュラマロン酸セミアルデヒドレダクターゼ遺伝子から得てもよい。いくつかの実施形態において、３‐ＨＰＤＨ遺伝子は、配列番号２９に規定するアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態において、Ｍ．セデュラ由来３‐ＨＰＤＨ遺伝子は、配列番号３４３に規定するヌクレオチド配列、又は配列番号３４３に規定するヌクレオチド配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。
【００７４】
本明細書中で使用される「３‐ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子」又は「ＨＩＢＡＤＨ遺伝子」は、（３‐ヒドロキシイソ酪酸からメチルマロン酸セミアルデヒドへの転換を触媒する能力を意味する）３‐ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。３‐ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、ＥＣ１．１．１．３１に分類される。一部の３‐ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼにはさらに、３‐ＨＰＤＨ活性もある。特定の実施形態において、細菌起源からＨＩＢＡＤＨ遺伝子を得てもよい。例えば、ＨＩＢＡＤＨ遺伝子は、配列番号２８に規定するアミノ酸配列をコードするＡ．フェカリスＭ３Ａ遺伝子、それぞれ配列番号３０又は配列番号３１に規定するアミノ酸配列をコードする、Ｐ．プチダＫＴ２４４０又はＥ２３４４０ ｍｍｓＢ遺伝子、あるいは、配列番号３２に規定するアミノ酸配列をコードするＰ．エルギノーサＰＡＯ１ ｍｍｓＢ遺伝子から得てもよい。特定の実施形態において、ＨＩＢＡＤＨ遺伝子は、配列番号２８、３０、３１、又は３２に規定するアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。
【００７５】
本明細書中で使用される「４‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子」は、（４‐ヒドロキシブタノアートからコハク酸セミアルデヒドへの転換を触媒する能力を意味する）４‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。４‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、ＥＣ１．１．１．６１に分類される。一部の４‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼにはさらに、３‐ＨＰＤＨ活性もある。特定の実施形態において、細菌起源から４‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を得てもよい。例えば、４‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、配列番号３３に規定するアミノ酸配列をコードするＲ．ユートロファＨ１６ ４ｈｂｄ遺伝子、又は配列番号３４に規定するアミノ酸配列をコードするＣ．クルイベリＤＳＭ５５５ ｈｂｄ遺伝子から得てもよい。他の実施形態において、遺伝子は、配列番号３３又は３４に規定するアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。
【００７６】
本明細書中で使用される「ＰＥＰカルボキシキナーゼ遺伝子」又は「ＰＣＫ遺伝子」は、（ＰＥＰ、ＣＯ2、及びＡＤＰ又はＧＤＰからＯＡＡ及びＡＴＰ又はＧＴＰへの転換、あるいはその逆を触媒する能力を意味する）ＰＥＰカルボキシキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。ＰＥＰカルボキシキナーゼ活性を有する酵素は、ＥＣ４．１．１．３２（ＧＴＰ／ＧＤＰ資化性）及びＥＣ４．１．１．４９（ＡＴＰ／ＡＤＰ資化性）に分類される。特定の実施形態において、酵母起源からＰＣＫ遺伝子を得てもよい。他の実施形態において、細菌起源からＰＣＫ遺伝子を得てもよく、そして、特定のこれらの実施形態において、遺伝子は、ＰＣＫ反応が脱炭酸が優位である反応のより一般的な形態よりむしろＯＡＡの産生を支持する細菌から得てもよい。例えば、ＰＣＫ遺伝子は、配列番号３５に規定するアミノ酸配列をコードするＭ．スクシニシプロデュセンス（M. succiniciproducens）ＰＣＫ遺伝子、配列番号３６に規定するアミノ酸配列をコードするＡ．スクシニシプロデュセンスＰＣＫ遺伝子、配列番号３７に規定するアミノ酸配列をコードするＡ．スクシノゲネスＰＣＫ遺伝子、又は配列番号３８に規定するアミノ酸配列をコードするＲ．ユートロファＰＣＫ遺伝子から得てもよい。他の実施形態において、ＰＣＫ遺伝子は、得られた遺伝子がＰＥＰからＯＡＡへの転換を好ましくは触媒するポリペプチドをコードするように、ＰＣＫ遺伝子をそこから得る天然遺伝子に対して１若しくは複数の突然変異が加えられた。例えば、ＰＣＫ遺伝子は、遺伝子が好ましくはＰＥＰからＯＡＡへの転換を触媒するように変異させた場合に、配列番号３９に規定するアミノ酸配列をコードするＥ．コリＫ１２株ＰＣＫ遺伝子から得てもよい。他の実施形態において、ＰＥＰからＯＡＡへの転換は、ＡＴＰ／ＡＤＰやＧＴＰ／ＧＤＰよりむしろ無機リン酸塩や二リン酸とを使用するプロピオン酸菌（例えば、Ｐ．シャーマニイ（P. shermanii）、Ａ．ウーディイ（A. woodii）に見られるＰＥＰカルボキシトランスホスホリラーゼによって触媒される。
【００７７】
本明細書中で使用される「リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子」は、（ＯＡＡからリンゴ酸への転換を触媒する能力を意味する）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。特定の実施形態において、細菌又は酵母起源からリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を得てもよい。
【００７８】
本明細書中で使用される「リンゴ酸デカルボキシラーゼ遺伝子」は、（マレアートから３‐ＨＰへの転換を触媒する能力を意味する）リンゴ酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。リンゴ酸デカルボキシラーゼ活性は、天然に起こらないことが知られている。そのため、リンゴ酸デカルボキシラーゼ遺伝子は、アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする天然起源遺伝子に１若しくは複数の突然変異を組み入れることによって得ることができる。アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドは、２‐ヒドロキシ‐２‐メチル‐３‐オキソブタノアートから２‐アセトインへの転換を触媒するので、ＥＣ４．１．１．５に分類される。特定の実施形態において、細菌起源からリンゴ酸デカルボキシラーゼ遺伝子を得てもよい。例えば、リンゴ酸デカルボキシラーゼ遺伝子は、配列番号４０に規定するアミノ酸配列をコードするＬ．ラクチス（L. lactis）ａｌｄＢ遺伝子、配列番号４１に規定するアミノ酸配列をコードするＳ．サーモフィルス（S. thermophilus）ａｌｄＢ遺伝子、配列番号４２に規定するアミノ酸配列をコードするＢ．ブレビス（B. brevis）ａｌｄＢ遺伝子、又は配列番号４３に規定するアミノ酸配列をコードするＥ．アエロゲネス（E. aerogenes）ｂｕｄＡ遺伝子から得てもよい。
【００７９】
本明細書中で使用される「α‐ケトグルタル酸（ＡＫＧ）デカルボキシラーゼ遺伝子」又は「ＫＧＤ遺伝子」は、（α‐ケトグルタラート（２‐オキソグルタラート）からコハク酸セミアルデヒドへの転換を触媒する能力を意味する）α‐ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。ＡＫＧデカルボキシラーゼ活性がある酵素は、ＥＣ４．１．１．７１に分類される。ＫＧＤ遺伝子は、ＯＡＡからマロン酸セミアルデヒドへの転換を触媒することができるポリペプチドをコードする遺伝子を得るために使用され得る。この活性は、天然ＫＧＤ遺伝子に見られるか、又は天然ＫＧＤ遺伝子に１若しくは複数の突然変異を組み入れることによって得られる。特定の実施形態において、細菌起源からＫＧＤ遺伝子を得てもよい。例えば、ＫＧＤ遺伝子は、配列番号４４に規定するアミノ酸配列をコードするＭ．ツベルクロシス（M. tuberculosis）ＫＧＤ遺伝子、配列番号４５に規定するアミノ酸配列をコードするＢ．ジャポニクム（B. japonicum）ＫＧＤ遺伝子、又は配列番号４６に規定するアミノ酸配列をコードするＭ．ロティ（M. loti）（別名、リゾビウム・ロティ（Rhizobium loti））ＫＧＤ遺伝子から得てもよい。
【００８０】
本明細書中で使用される「分岐鎖α‐ケト酸デカルボキシラーゼ遺伝子」又は「ＢＣＫＡ遺伝子」は、分岐鎖α‐ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指し、そしてそれは、３〜６個の炭素の長さのα‐ケト酸の範囲を脱炭酸する役割を果たすことができる。ＢＣＫＡ活性を有する酵素は、ＥＣ４．１．１．７２に分類される。ＢＣＫＡ遺伝子は、ＯＡＡからマロン酸セミアルデヒドへの転換を触媒することができるポリペプチドをコードする遺伝子を得るために使用され得る。この活性は、天然ＢＣＫＡ遺伝子に見られるか、又はそれは、天然ＢＣＫＡ遺伝子に１若しくは複数の突然変異を組み入れることによって得ることができる。特定の実施形態において、細菌起源からＢＣＫＡ遺伝子を得てもよい。例えば、ＢＣＫＡ遺伝子は、配列番号４７に規定するアミノ酸配列をコードするＬ．ラクチスｋｄｃＡ遺伝子から得てもよい。
【００８１】
本明細書中で使用される「インドールピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子」又は「ＩＰＤＡ遺伝子」は、（インドールピルバートからインドールアセトアルデヒドへの転換を触媒する能力を意味する）インドールピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。ＩＰＤＡ活性を有する酵素は、ＥＣ４．１．１．７４に分類される。ＩＰＤＡ遺伝子は、ＯＡＡからマロン酸セミアルデヒドへの転換を触媒することができるポリペプチドをコードする遺伝子を得るために使用され得る。この活性は、天然ＩＰＤＡ遺伝子に見られるか、又はそれは、天然ＩＰＤＡ遺伝子に１若しくは複数の突然変異を組み入れることによって得ることができる。特定の実施形態において、インドールピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子は、酵母、細菌、又は植物起源から得てもよい。
【００８２】
本明細書中で使用される「ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子」又は「ＰＤＣ遺伝子」は、（ピルバートからアセトアルデヒドへの転換を触媒する能力を意味する）ピルバートデカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。ＰＤＣ活性を有する酵素は、ＥＣ４．１．１．１に分類される。好ましい実施形態において、本明細書中に規定されているように改変酵母細胞に組み入れられるＰＤＣ遺伝子は、得られた遺伝子がＯＡＡからマロン酸セミアルデヒドへの転換を触媒することができるポリペプチドをコードするように、そこからＰＤＣ遺伝子を得た天然遺伝子に対して１若しくは複数の突然変異が加えられた。特定の実施形態において、酵母起源からＰＤＣ遺伝子を得てもよい。例えば、ＰＤＣ遺伝子は、配列番号４９に規定するアミノ酸配列をコードするＩ．オリエンタリスＰＤＣ遺伝子、配列番号５０に規定するアミノ酸配列をコードするＳ．セレビシエＰＤＣ１遺伝子、又は配列番号５１に規定するアミノ酸配列をコードするＫ．ラクチスＰＤＣから得てもよい。特定の実施形態において、Ｉ．オリエンタリスＰＤＣ遺伝子から得られるＰＤＣ遺伝子は、配列番号４８に規定するヌクレオチド配列、又は配列番号４８に規定するヌクレオチド配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。他の実施形態において、細菌起源からＰＤＣ遺伝子を得てもよい。例えば、ＰＤＣ遺伝子は、配列番号５２に規定するアミノ酸配列をコードするＺ．モビリス（Z. mobilis）ＰＤＣ遺伝子、又は配列番号５３に規定するアミノ酸配列をコードするＡ．パスツリアヌス（A. pasteurianus）ＰＤＣ遺伝子から得てもよい。
【００８３】
本明細書中で使用される「ベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ」遺伝子は、（ベンゾイルホルマートからベンズアルデヒドへの転換を触媒する能力を意味する）ベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。ベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、ＥＣ４．１．１．７に分類される。好ましい実施形態において、本明細書中に規定されているように改変酵母細胞に組み入れられるベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ遺伝子は、得られた遺伝子がＯＡＡからマロン酸セミアルデヒドへの転換を触媒することができるポリペプチドをコードするように、そこからベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ遺伝子を得た天然遺伝子に対して１若しくは複数の突然変異が加えられた。特定の実施形態において、細菌起源からベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ遺伝子を得てもよい。例えば、ベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ遺伝子は、配列番号５４に規定するアミノ酸配列をコードするＰ．プチダｍｄｌＣ遺伝子、配列番号５５に規定するアミノ酸配列をコードするＰ．エルギノーサｍｄｌＣ遺伝子、配列番号５６に規定するアミノ酸配列をコードするＰ．スツットゼリ（P. stutzeri）ｄｐｇＢ遺伝子、又は配列番号５７に規定するアミノ酸配列をコードするＰ．フルオレッセンスｉｌｖＢ‐１遺伝子から得てもよい。
【００８４】
本明細書中で使用される「ＯＡＡギ酸リアーゼ遺伝子」は、（アシレートケト酸からその対応するＣｏＡ誘導体への転換を触媒する能力を意味する）ＯＡＡギ酸リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。ＯＡＡギ酸リアーゼ遺伝子によってコードされたポリペプチドは、ピルバート又は別のケト酸に対する活性を有し得る。特定の実施形態において、ＯＡＡギ酸リアーゼ遺伝子は、ＯＡＡをマロニルＣｏＡに転換するポリペプチドをコードする。
【００８５】
本明細書中で使用される「マロニル‐ＣｏＡレダクターゼ遺伝子」は、（マロニル‐ＣｏＡからマロン酸セミアルデヒドへの転換を触媒する能力を意味する（Ｃｏ‐Ａアシル化マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性とも呼ばれる））マロニル‐ＣｏＡレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。特定の実施形態において、マロニル‐ＣｏＡレダクターゼ遺伝子は、マロン酸セミアルデヒドから３‐ＨＰへの転換を触媒する能力も持つ二機能性マロニル‐ＣｏＡレダクターゼ遺伝子から得ることもできる。特定のこれらの実施形態において、細菌起源からマロニル‐ＣｏＡレダクターゼ遺伝子を得てもよい。例えば、マロニル‐ＣｏＡレダクターゼ遺伝子は、配列番号５８に規定するアミノ酸配列をコードするＣ．アウランティアクス（C. aurantiacus）マロニル‐ＣｏＡレダクターゼ遺伝子、配列番号５９に規定するアミノ酸配列をコードするＲ．カステンホルジイ（R. castenholzii）マロニル‐ＣｏＡレダクターゼ遺伝子、又は配列番号６０に規定するアミノ酸配列をコードするエリスロバクター属（Erythrobacter sp.）ＮＡＰ１マロニル‐ＣｏＡレダクターゼ遺伝子から得てもよい。他の実施形態において、マロニル‐ＣｏＡレダクターゼ遺伝子は、マロニル‐ＣｏＡからマロン酸セミアルデヒドへの転換を触媒するだけのポリペプチドをコードするマロニル‐ＣｏＡレダクターゼ遺伝子から得ることもできる。例えば、マロニル‐ＣｏＡレダクターゼ遺伝子は、配列番号に６１に規定するアミノ酸配列をコードするＭ．セデュラＭｓｅｄ＿０７０９遺伝子、又は配列番号６２に規定するアミノ酸配列をコードするＳ．トコダイイ（S. tokodaii）マロニル‐ＣｏＡレダクターゼから得てもよい。
【００８６】
本明細書中で使用される「ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子」又は「ＰＤＨ遺伝子」は、（ピルバートからアセチルＣｏＡへの転換を触媒する能力を意味する）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。特定の実施形態において、酵母起源からＰＤＨ遺伝子を得てもよい。例えば、ＰＤＨ遺伝子は、それぞれ配列番号６３〜６６に規定するアミノ酸配列をコードするＳ．セレビシエＬＡＴ１、ＰＤＡ１、ＰＤＢ１、又はＬＰＤ遺伝子から得てもよい。他の実施形態において、細菌起源からＰＤＨ遺伝子を得てもよい。例えば、ＰＤＨ遺伝子は、それぞれ配列番号６７〜６９に規定するアミノ酸配列をコードするＥ．コリ株Ｋ１２亜株ＭＧ１６５５ ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、又はｌｐｄ遺伝子、又はそれぞれ配列番号７０〜７３に規定するアミノ酸配列をコードするＢ．ズブチリス（B. subtilis）ｐｄｈＡ、ｐｄｈＢ、ｐｄｈＣ、又はｐｄｈＤ遺伝子から得てもよい。
【００８７】
本明細書中で使用される「アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子」又は「ＡＣＣ遺伝子」は、（アセチル‐ＣｏＡからマロニルＣｏＡへの転換を触媒する能力を意味する）アセチル‐ＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。アセチル‐ＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、ＥＣ６．４．１．２に分類される。特定の実施形態において、酵母起源からアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子を得てもよい。例えば、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子は、配列番号７４に規定するアミノ酸配列をコードするＳ．セレビシエＡＣＣ１遺伝子から得てもよい。他の実施形態において、細菌起源からアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子を得てもよい。例えば、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子は、それぞれ配列番号７５〜７８に規定するアミノ酸配列をコードするＥ．コリａｃｃＡ、ａｃｃＢ、ａｃｃＣ、又はａｃｃＤ遺伝子、又はそれぞれ配列番号７９〜８２に規定するアミノ酸配列をコードするＣ．アウランティアクスａｃｃＡ、ａｃｃＢ、ａｃｃＣ、又はａｃｃＤ遺伝子から得てもよい。
【００８８】
本明細書中で使用される「アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子」は、（ピルバートからアラニンへのＮＡＤ依存性還元的アミノ化を触媒する能力を意味する）アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、ＥＣ１．４．１．１に分類される。特定の実施形態において、細菌起源からアラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子を得てもよい。例えば、アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子は、配列番号８３に規定するアミノ酸配列をコードするＢ．ズブチリスから得られるアラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子から得てもよい。
【００８９】
本明細書中で使用される「ピルビン酸／アラニンアミノトランスフェラーゼ遺伝子」は、（ピルバートとＬ‐グルタマートからアラニンと２‐オキソグルタラートへの転換を触媒する能力を意味する）ピルビン酸／アラニンアミノトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。特定の実施形態において、酵母起源からピルビン酸／アラニンアミノトランスフェラーゼ遺伝子から得られる。例えば、ピルビン酸／アラニンアミノトランスフェラーゼ遺伝子は、配列番号８４に規定するアミノ酸配列をコードするＳ．ポンベ（S. pombe）ピルビン酸／アラニンアミノトランスフェラーゼ遺伝子、又は配列番号８５に規定するアミノ酸配列をコードするＳ．セレビシエＡＬＴ２遺伝子から得てもよい。
【００９０】
本明細書中で使用される「アラニン２，３アミノムターゼ遺伝子」又は「ＡＡＭ遺伝子」は、（アラニンからβ‐アラニンへの転換を触媒する能力を意味する）アラニン２，３アミノムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を指す。アラニン２，３アミノムターゼ活性は、天然に生じないことが知られている。そのため、アラニン２，３アミノムターゼ遺伝子は、例えば、リジン２，３アミノムターゼ活性などの類似活性を有するポリペプチドをコードする天然起源遺伝子に１若しくは複数の突然変異を組み入れることによって得られる（例えば、米国特許第７，３０９，５９７号を参照のこと）。特定の実施形態において、その天然起源遺伝子は、配列番号８６に規定するアミノ酸配列をコードするＢ．ズブチリスリジン２，３アミノムターゼ遺伝子、配列番号８７に規定するアミノ酸配列をコードするＰ．ジンジバリス（P. gingivalis）リジン２，３アミノムターゼ遺伝子、又は配列番号８８に規定されてもアミノ酸配列をコードするＦ．ヌクレアツム（F. nucleatum）（ＡＴＣＣ‐１０９５３）リジン２，３アミノムターゼ遺伝子であってもよい。
【００９１】
本明細書中で使用される「ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子」は、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指し、そしてそれには、一例において、β‐アラニンからβ‐アラニル‐ＣｏＡへの転換、及び／又はラクタートからラクチル‐ＣｏＡへの転換を触媒する能力が含まれる。特定の実施形態において、酵母起源からＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子を得てもよい。他の実施形態において、細菌起源からＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子を得てもよい。例えば、ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子は、配列番号８９に規定するアミノ酸配列をコードするＭ．エルスデニイ（M. elsdenii）ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子から得てもよい。
【００９２】
本明細書中で使用される「ＣｏＡシンテターゼ遺伝子」は、ＣｏＡシンテターゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。一例において、これには、β‐アラニンからβ‐アラニル‐ＣｏＡへの転換を触媒する能力が含まれる。別の例において、これには、ラクタートからラクチル‐ＣｏＡへの転換を触媒する能力が含まれる。特定の実施形態において、酵母起源からＣｏＡシンテターゼ遺伝子を得てもよい。例えば、ＣｏＡシンテターゼ遺伝子は、Ｓ．セレビシエＣｏＡシンテターゼ遺伝子から得てもよい。他の実施形態において、細菌起源からＣｏＡシンテターゼ遺伝子を得てもよい。例えば、ＣｏＡシンテターゼ遺伝子は、Ｅ．コリＣｏＡシンテターゼ、Ｒ．スフェロイデス、又はＳ．エンテリカ（S. enterica）ＣｏＡシンテターゼ遺伝子から得てもよい。
【００９３】
本明細書中で使用される「β‐アラニル‐ＣｏＡアンモニアリアーゼ遺伝子」は、（β‐アラニル‐ＣｏＡからアクリロイル‐ＣｏＡへの転換を触媒する能力を意味する）β‐アラニル‐ＣｏＡアンモニアリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。特定の実施形態において、β‐アラニル‐ＣｏＡアンモニアリアーゼ遺伝子は、細菌起源、例えば、配列番号９０に規定するアミノ酸配列をコードするＣ．プロピオニクム（C. propionicum）β‐アラニル‐ＣｏＡアンモニアリアーゼ遺伝子などから得てもよい。
【００９４】
本明細書中で使用される「３‐ＨＰ‐ＣｏＡデヒドラターゼ遺伝子」又は「アクリロイル‐ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子」は、（アクリロイル‐ＣｏＡから３‐ＨＰ‐ＣｏＡへの転換を触媒する能力を意味する）３‐ＨＰ‐ＣｏＡデヒドラターゼ遺伝子活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。３‐ＨＰ‐ＣｏＡデヒドラターゼ活性を有する酵素は、ＥＣ４．２．１．１１６に分類される。特定の実施形態において、３‐ＨＰ‐ＣｏＡデヒドラターゼ遺伝子は、酵母又は真菌起源、例えば、配列番号９１に規定するアミノ酸配列をコードするＰ．ソーヤ（P. sojae）３‐ＨＰ‐ＣｏＡデヒドラターゼ遺伝子などから得てもよい。他の実施形態において、細菌起源から３‐ＨＰ‐ＣｏＡデヒドラターゼ遺伝子を得てもよい。例えば、３‐ＨＰ‐ＣｏＡデヒドラターゼ遺伝子は、配列番号９２に規定するアミノ酸配列をコードするＣ．アウランティアクス３‐ＨＰ‐ＣｏＡデヒドラターゼ遺伝子、配列番号９３に規定するアミノ酸配列をコードするＲ．ルブルム（R. rubrum）３‐ＨＰ‐ＣｏＡデヒドラターゼ遺伝子、又は配列番号９４に規定するアミノ酸配列をコードするＲ．カプスラツス（R. capsulates）３‐ＨＰ‐ＣｏＡデヒドラターゼ遺伝子から得てもよい。さらに他の実施形態において、哺乳類起源から３‐ＨＰ‐ＣｏＡデヒドラターゼ遺伝子を得てもよい。例えば、３‐ＨＰ‐ＣｏＡデヒドラターゼ遺伝子は、配列番号９５に規定するアミノ酸配列をコードするＨ．サピエンス（H. sapiens）３‐ＨＰ‐ＣｏＡデヒドラターゼから得てもよい。
【００９５】
本明細書中で使用される「３‐ＨＰ‐ＣｏＡヒドロラーゼ遺伝子」は、（３‐ＨＰ‐ＣｏＡから３‐ＨＰへの転換を触媒する能力を意味する）３‐ＨＰ‐ＣｏＡヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。特定の実施形態において、酵母又は真菌起源から３‐ＨＰ‐ＣｏＡ遺伝子を得てもよい。他の実施形態において、細菌又は哺乳類起源から３‐ＨＰ‐ＣｏＡ遺伝子を得てもよい。
【００９６】
本明細書中で使用される「３‐ヒドロキシイソブチリル‐ＣｏＡヒドロラーゼ遺伝子」は、３‐ヒドロキシイソブチリル‐ＣｏＡヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指し、そしてそれには、一例において、３‐ＨＰ‐ＣｏＡから３‐ＨＰへの転換を触媒する能力が含まれる。特定の実施形態において、例えば、配列番号９６に規定するアミノ酸配列をコードするＰ．フルオレッセンス３‐ヒドロキシイソブチリル‐ＣｏＡヒドロラーゼ遺伝子、又は配列番号９７に規定するアミノ酸配列をコードするＢ．セレウス（B. cereus）３‐ヒドロキシイソブチリル‐ＣｏＡヒドロラーゼ遺伝子など、細菌起源から３‐ヒドロキシイソブチリル‐ＣｏＡヒドロラーゼ遺伝子を得てもよい。他の実施形態において、例えば、配列番号９８に規定するアミノ酸配列をコードするＨ．サピエンス３‐ヒドロキシイソブチリル‐ＣｏＡヒドロラーゼ遺伝子など、哺乳類起源から３‐ヒドロキシイソブチリル‐ＣｏＡヒドロラーゼ遺伝子を得てもよい。
【００９７】
本明細書中で使用される「乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子」又は「ＬＤＨ遺伝子」は、（ピルバートからラクタートへの転換を触媒する能力を意味する）乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。特定の実施形態において、真菌、細菌、又は哺乳類起源からＬＤＨ遺伝子を得てもよい。
【００９８】
本明細書中で使用される「ラクチル‐ＣｏＡデヒドラターゼ遺伝子」は、（ラクチル‐ＣｏＡからアクリロイル‐ＣｏＡへの転換を触媒する能力を意味する）ラクチル‐ＣｏＡデヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。特定の実施形態において、細菌起源からラクチル‐ＣｏＡデヒドラターゼ遺伝子を得てもよい。例えば、ラクチル‐ＣｏＡデヒドラターゼ遺伝子は、配列番号９９〜１０１に規定するアミノ酸配列をコードするＭ．エルスデニイラクチル‐ＣｏＡデヒドラターゼＥ１、ＥＩＩａ、又はＥＩＩｂサブユニット遺伝子から得てもよい。
【００９９】
本明細書中で使用される「アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子」は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指し、そしてそれには、一例において、３‐ＨＰＡから３‐ＨＰへの転換を触媒する能力及びその逆の能力が含まれる。特定の実施形態において、例えば、配列番号１０２に規定するアミノ酸配列をコードするＳ．セレビシエ・アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子、又は配列番号１２２、１２４、又は１２６に規定するアミノ酸配列をコードするＩ．オリエンタリスアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子など、酵母起源からアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を得てもよい。他の実施形態において、例えば、配列番号１０３に規定するアミノ酸配列をコードするＥ．コリａｌｄＨ遺伝子、又は配列番号１０４に規定するアミノ酸配列をコードするＫ．ニューモニエ（K. pneumoniae）デヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子など、細菌起源からアルデヒドデヒドロゲナーゼを得てもよい。
【０１００】
本明細書中で使用される「グリセロールデヒドラターゼ遺伝子」は、（グリセロールから３‐ＨＰＡへの転換を触媒する能力を意味する）グリセロールデヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。特定の実施形態において、例えば、Ｋ．ニューモニエ（K. pneumonia）又はＣ．フレアンディイ（C. freundii）グリセロールデヒドラターゼ遺伝子など、細菌起源からグリセロールデヒドラターゼ遺伝子を得てもよい。
【０１０１】
特定の実施形態において、本明細書中に規定する遺伝子組み換え酵母細胞は、１若しくは複数の天然遺伝子の欠失又は破壊をさらに含む。天然遺伝子に関する「欠失又は破壊」とは、遺伝子の全コード領域が排除（欠失）されること、あるいは、遺伝子のコード領域、プロモーター、及び／又はターミネータ領域が、遺伝子がもう活性酵素を生じさせないように改変（例えば、欠失、挿入、又は突然変異など）され、大きく低減された量（少なくとも７５％の低減、好ましくは少なくとも９０％の低減）の活性酵素が産生されるか、又は大きく低減された活性（少なくとも７５％は低減、好ましくは少なくとも９０％の低減）の酵素が産生されることを意味する。
【０１０２】
特定の実施形態において、１若しくは複数の天然遺伝子の欠失又は破壊は、１若しくは複数の天然代謝経路の欠失又は破壊をもたらす。代謝経路に関する「欠失又は破壊」とは、その経路が働かないか、又は天然経路に比べて少なくとも７５％、少なくとも８５％、又は少なくとも９５％低減された活性を示すことを意味する。特定の実施形態において、天然代謝経路の欠失又は破壊は、３‐ＨＰ産生を低減する１若しくは複数の天然遺伝子の発現低下をもたらす１若しくは複数の遺伝子組み換えを組み込むことによって達成される。
【０１０３】
特定の実施形態において、天然遺伝子の欠失又は破壊は、強制進化、突然変異誘発、又は遺伝子工学的方法と、それに続く、所望の突然変異体を確認するための適当な選択又はスクリーニングによって達成される。特定の実施形態において、天然宿主細胞遺伝子の欠失又は破壊は、宿主細胞内への１若しくは複数の外来遺伝子の取り込みと対にされることもある、すなわち、外来遺伝子は、欠失構築物でもある遺伝子発現組み込み構築物を使用することで組み込まれてもよい。他の実施形態において、欠失又は破壊は、外来遺伝子を含まない欠失構築物を使用することで、又は当該技術分野で知られている他の方法によって達成され得る。
【０１０４】
特定の実施形態において、本明細書中に規定する遺伝子組み換え酵母細胞は、例えばピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ、ピルバートをアセトアルデヒドに転換する）、及び／又はアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ、アセトアルデヒドをエタノールに転換する）遺伝子を含めたエタノール発酵に関与する酵素をコードする１若しくは複数の天然遺伝子の欠失又は破壊を含む。これらの改変は、エタノールを産生する酵母細胞の能力を減少させ、その結果、３‐ＨＰ産生を最大化する。しかしながら、特定の実施形態において、本明細書中に規定する遺伝子組み換え酵母細胞は、３‐ＨＰとエタノールを同時産生するように設計されてもよい。それらの実施形態において、エタノール発酵に関与する酵素をコードする天然遺伝子は、好ましくは欠失も破壊もさせられず、そして、特定の実施形態において、酵母細胞は、エタノール産生を増強する１若しくは複数の外来遺伝子を含み得る。
【０１０５】
特定の実施形態において、本明細書中に規定する遺伝子組み換え酵母細胞は、例えば、グリセロール、又は、例えば、アセタートやジオールなどの他の副産物などの別の発酵産物を産生するのに関与する酵素をコードする１若しくは複数の天然遺伝子の欠失又は破壊を含む。例えば、本明細書中に規定する細胞は、グリセロール３‐リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ、ジヒドロキシアセトンリン酸からグリセロール３‐リン酸への反応を触媒する）、グリセロール３‐ホスファターゼ（ＧＰＰ、グリセロール‐３ホスファートからグリセロールへの転換を触媒する）、グリセロールキナーゼ（グリセロール３‐リン酸からグリセロールへの転換を触媒する）、ジヒドロキシアセトンキナーゼ（ジヒドロキシアセトンリン酸からジヒドロキシアセトンへの転換を触媒する）、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ジヒドロキシアセトンからグリセロールへの転換を触媒する）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤ、例えば、アセトアルデヒドをアセタート又は３‐ＨＰを３‐ＨＰＡにに転換する）、又はブタンジオールデヒドロゲナーゼ（ブタンジオールからアセトインへの転換又はその逆を触媒する）遺伝子のうちの１若しくは複数の欠失又は破壊を含み得る。
【０１０６】
特定の実施形態において、本明細書中に規定する遺伝子組み換え酵母細胞は、例えば、ＰＥＰカルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）、ＯＡＡデカルボキシラーゼ活性を有する酵素、又はＣＹＢ２Ａ若しくはＣＹＢ２Ｂ（ラクタートからピルバートへの転換を触媒する）を含めた３‐ＨＰ発酵経路において逆反応を触媒する酵素をコードする１若しくは複数の天然遺伝子の欠失又は破壊を含む。ＰＣＫは、ＰＥＰからＯＡＡへの転換又はその逆を触媒するが、ＯＡＡからＰＥＰへの反応を優先する。ＯＡＡからＰＥＰへの転換を低減するために、天然ＰＣＫ遺伝子の１若しくは複数のコピーが、欠失又は破壊させられてもよい。特定の実施形態において、１若しくは複数の天然ＰＣＫ遺伝子が欠失又は破壊された酵母細胞は、ＰＥＰからＯＡＡへの転換を好むポリペプチドをコードするように変異させた１若しくは複数の外来性ＰＣＫ遺伝子を発現してもよい。ＯＡＡデカルボキシラーゼは、ＯＡＡからピルバートへの転換を触媒する。ＯＡＡデカルボキシラーゼ活性を有する酵素、例えば、Ｅ．コリでｅｄａ遺伝子によってコードされるもの、及び酵母や真菌のリンゴ酸酵素（ＭＡＥ）などが、同定された。ＯＡＡデカルボキシラーゼ活性を低減するために、ＯＡＡデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする天然遺伝子の１若しくは複数のコピーが、欠失又は破壊させられてもよい。特定の実施形態において、１若しくは複数の天然ＯＡＡ脱炭酸遺伝子が欠失又は破壊させられた酵母細胞は、ピルバートからＯＡＡへの転換を触媒するポリペプチドをコードするように変異させた１若しくは複数の外来性ＯＡＡ脱炭酸遺伝子を発現してもよい。
【０１０７】
特定の実施形態において、本明細書中に規定する遺伝子組み換え酵母細胞は、３‐ＨＰ発酵経路産物又は中間体との望ましくない反応に関与する酵素をコードする１若しくは複数の天然遺伝子の欠失又は破壊を含む。そうした遺伝子の例としては、３‐ＨＰを３‐ＨＰのアルデヒドに転換する酵素をコードするものが挙げられ、そしてそれは、細菌細胞に毒性であることが知られている。
【０１０８】
特定の実施形態において、本明細書中に規定する遺伝子組み換え酵母細胞は、例えばＧＡＬ６（ガラクトースをグルコースに転換するＧＡＬシステムの負の調節因子）を含めた３‐ＨＰ発酵経路に中立的効果を持つ酵素をコードする１若しくは複数の天然遺伝子の欠失又は破壊を含む。中立遺伝子の欠失又は破壊は、天然発酵経路に影響しない１若しくは複数の外来遺伝子の挿入を可能にする。
【０１０９】
特定の実施形態において、本明細書中に規定する酵母細胞は、３‐ＨＰ耐性酵母細胞である。本明細書中で使用される「３‐ＨＰ耐性酵母細胞」は、４．０未満のｐＨにて７５ｇ／Ｌ以上の３‐ＨＰを含む培地において、少なくとも２．５ｇ／Ｌ／時間の平均解糖速度を示す酵母細胞を指す。そうした速度と条件は、経済的な３‐ＨＰ生産工程の典型である。特定のこれらの実施形態において、酵母細胞は、それらの天然型において３‐ＨＰ耐性を示していてもよい。他の実施形態において、細胞は、突然変異及び／又は選択された細胞が同種の野生型細胞より高度な３‐ＨＰ耐性を持つように、活性な３‐ＨＰ発酵経路に関連する遺伝子組み換えの導入前、導入中、又は導入後に突然変異及び／又は選択（例えば、ケモスタット選択又は頻回連続継代培養（repeated serial subculturing））を受けてもよい。例えば、いくつかの実施形態において、細胞は、１若しくは複数の外来性３‐ＨＰ経路遺伝子で遺伝子を組み換えられる前に３‐ＨＰ又は乳酸の存在下で突然変異及び／又は選択を受けた。特定の実施形態において、突然変異及び／又は選択は、それらの天然型で３‐ＨＰ耐性を示す細胞でおこなわれ得る。突然変異及び／又は選択を受けた細胞は、異なったレベルの３‐ＨＰの存在下で３‐ＨＰ生産のための工業的宿主としてのそれらの能力を測定するために糖消費と他の特性について試験されてもよい。３‐ＨＰ耐性に加えて、本明細書中に規定する酵母細胞は、１若しくは複数の追加の有機酸（例えば、乳酸）又は他の発酵産物、副産物、若しくは培地成分に対する耐性に関する突然変異及び／又は選択を受けてもよかった。
【０１１０】
３‐ＨＰ又は他の化合物への耐性に関する選択などの選択は、当該技術分野で周知の方法を使用することで実行され得る。例えば、先に言及されたとおり、選択はケモスタット選択であってもよい。ケモスタット選択は、比成長速度と細胞数が独立に制御できる、微生物（例えば、酵母）の連続培養を可能にするケモスタットを使用する。連続培養は、そこに培地が連続的に加えられ、且つ、そこからのあらゆるオーバーフローの除去が連続的に起こる、本質的に一定体積の流動系である。そうした系がいったん平衡状態になると、細胞数と栄養状態は一定なままなので、その系は定常状態になる。ケモスタットは、希釈率及び、例えば、炭素源若しくは窒素源などの栄養制限物質の濃度の変更により、培養物の個体群密度と比成長速度の両方の制御を可能にする。培養物を培養した条件を変更する（例えば、特に、接種株の成長に必要な第二級炭素起源の濃度を減少させる）ことによって、集団における変更された条件で早く成長できる微生物は、選択され、そして、新しい条件下で同じように機能しない微生物より成長する。典型的に、そうした選択は、えるところでケモスタット培養の一連の培養にわたる、少なくとも１種類の培養成分の漸進的な増加又は減少を必要とする。ケモスタットの運転と微生物の定向進化におけるその利用は、当該技術分野で周知である（例えば、Novick Proc Natl Acad Sci USA 36: 708-719 (1950), Harder J Appl Bacteriol 43: 1-24 (1977)を参照のこと）。選択のための他の方法としては、これだけに限定されるものではないが、例えば、米国特許第７，６２９，１６２号に記載の選択条件下の頻回連続継代培養が挙げられる。そうした方法は、先に記載したグルコース制限ケモスタット法の代わりに、又はそれに加えて使用できる。
【０１１１】
以下の実施例で開示されるように３‐ＨＰ培地中で成長とグルコース消費量の最良の組み合わせを示す酵母株が、３‐ＨＰ発酵経路に関連する様々な遺伝子組み換えのための好ましい宿主細胞である。４未満のｐＨにて７５ｇ／Ｌ超の３‐ＨＰの存在下での成長で示されるように、比較的高度の３‐ＨＰ耐性の可能性を持つ酵母属としては、例えば、カンジダ、クルイベロマイセス、イサタケンキア、サッカロマイセス、ピキア、シゾサッカロマイセス、トルラスポラ、及びチゴサッカロマイセスが挙げられる。３‐ＨＰ耐性を示す種としては、Ｉ．オリエンタリス（Ｃ．クルセイ（C. krusei）としても知られている）、Ｃ．ランビカ（ピキア・ファーメンタンスとしても知られている）、及びＳ．ブルデリ（カザチスタニア・ブルデリ（Kazachstania bulderi）としても知られている）が挙げられる。Ｉ．オリエンタリスとＣ．ランビカは、Ｉ．オリエンタリス／Ｐ．ファーメンタンス分岐群からである一方、Ｓ．ブルデリは、サッカロマイセス分岐群からである。３‐ＨＰ耐性示す具体的な株としては、Ｉ．オリエンタリス株２４２１０、ＰＴＡ‐６６５８、６０５８５、及びＣＤ１８２２、Ｓ．ブルデリ株ＭＹＡ‐４０２及びＭＹＡ‐４０４、並びにＣ．ランビカＡＴＣＣ ３８６１７が挙げられる。
【０１１２】
本明細書中に記載した高レベルの３‐ＨＰの存在下で合格レベルの成長とグルコース利用率を持つか、他の野生型酵母又は真菌を同様に試験し、そして判断することもできる。例えば、GrossとRobbins（Hydrobiologia 433(103): 91-109）は、潜在的な生産宿主としての試験に関連し得る低ｐＨ（＜４）環境で同定された８１の真菌種から成るリストを編集した。
【０１１３】
特定の実施形態において、本明細書中に規定する改変酵母細胞は、クラブトリー陰性の宿主酵母細胞に１若しくは複数の遺伝子組み換えを組み入れることによって作り出される。特定のこれらの実施形態において、宿主酵母細胞は、イサタケンキア属、カンジダ属、又はサッカロマイセス属に属し、そして、特定のこれらの実施形態において、宿主細胞は、Ｉ．オリエンタリス／Ｐ．ファーメンタンス又はサッカロマイセス属分岐群に属する。特定の実施形態において、宿主細胞は、Ｉ．オリエンタリス、Ｃ．ランビカ、又はＳ．ブルデリである。
【０１１４】
Ｉ．オリエンタリス／Ｐ．ファーメンタンス分岐群は、少なくとも種、Ｉ．オリエンタリス、Ｐ．ガレフォルミス（P. galeiformis）、Ｐ．ｓｐ．ＹＢ‐４１４９（ＮＲＲＬ指定番号）、Ｃ．エタノリカ（C. ethanolica）、Ｐ．デセルティコラ（P. deserticola）、Ｐ．メンブラニファシエンス（P. membranifaciens）、及びＰ．ファーメンタンスを含めた最も端末の分岐群である。Ｉ．オリエンタリス／Ｐ．ファーメンタンス分岐群のメンバーは、（参照により本明細書中に援用する）"Identification and Phylogeny of Ascomycetous Yeasts from Analysis of Nuclear Large Subunit (26S) Ribosomal DNA Partial Sequences," Antonie van Leeuwenhoek 73: 331-371, 1998（特に３４９頁を参照のこと）の中でKurtzmanとRobnettにより記載された方法を使用して、酵母種の２６ＳリボソームＤＮＡの可変Ｄ１／Ｄ２ドメインの分析によって同定される。何百もの子嚢菌からの２６ＳリボソームＤＮＡの可変Ｄ１／Ｄ２ドメインの分析では、Ｉ．オリエンタリス／Ｐ．ファーメンタンス分岐群が非常に近い近縁種を含むことが明らかなった。Ｉ．オリエンタリス／Ｐ．ファーメンタンス分岐群のメンバーは、分岐群以外の酵母種に比べて分岐群のメンバーに対して２６ＳリボソームＤＮＡ可変のＤ１／Ｄ２ドメインの高い類似性を示す。そのため、Ｉ．オリエンタリス／Ｐ．ファーメンタンス分岐群の他のメンバーが、それらのそれぞれのリボソームＤＮＡのＤ１／Ｄ２ドメインの比較によって、及びKurtzmanとRobnettの方法を使用して、分岐群の他のメンバーのものと分岐群以外の近縁種のものを比較することによって同定できる。
【０１１５】
特定の実施形態において、本明細書中に規定する遺伝子組み換え酵母細胞は、イサタケンキア属に属し、そして、特定のこれらの実施形態において、酵母細胞はＩ．オリエンタリスである。最初に特徴づけされたとき、菌種Ｉ．オリエンタリスは、ピキア・クドリアヴゼヴィイと命名された。Ｉ．オリエンタリスのアナモルフ（無性形態）は、カンジダ・クルセイとして知られている。菌種Ｉ．オリエンタリスの多数の更なる同義語を、ほかの場所に列挙した（Kurtzman and Fell, The Yeasts, a Taxonomic Study. Section 35. Issatchenkia Kudryavtsev, pp 222-223 (1998)）。
【０１１６】
３‐ＨＰ生産に理想的な酵母細胞は、低ｐＨレベルで理想的に成長できる。低ｐＨで発酵を行う能力は、下流の回収コストを削減させ、そして、より経済的な生産をもたらす。そのため、特定の実施形態において、酵母宿主細胞は低ｐＨレベル（例えば、７、６、５、４、又は３より低いｐＨレベル）で成長できる。
【０１１７】
好適な宿主細胞は、３‐ＨＰ耐性及び／又は低ｐＨ成長能力に加えて１若しくは複数の長所を有することもある。例えば、３‐ＨＰ耐性を示す潜在的宿主細胞は、解糖速度、比成長速度、熱耐性、バイオマス加水分解物阻害剤への耐性、総合的な工程ロバスト性などに基づいてさらに選択されてもよい。これらの基準が、３‐ＨＰ発酵経路に関連するいずれかの遺伝子組み換え前に評価されても、又はそれらは、１若しくは複数の係る改変がおこなわれた後に評価されてもよい。
【０１１８】
ほとんどの酵母がエタノールの天然産生体であるので、ピルバート（ＰＤＣ）からのエタノール産生における第１ステップを触媒する酵素の排除又は大きな低減は、十分な収量の代替産物を必要とする。例えば、サッカロマイセスなどのクラブトリー陽性の酵母では、欠失又は破壊されたＰＤＣ遺伝子が、宿主に例えば、エタノール又はアセタートなどの二炭素化合物に対する栄養要求性を獲得させ、そして、グルコース含有培地での成長不足をもたらす。これらの制限を克服できる突然変異体は、アセタート独立性及び耐糖性に関する漸進的な選択を使用することで得ることができる（例えば、van Maris AppI Environ Microbiol 70: 159 (2004)を参照のこと）。そのため、特定の実施形態において、好ましい酵母宿主細胞は、クラブトリー陰性の酵母細胞であり、そしてその中のＰＤＣ欠失株は、グルコースにより成長でき、且つ、Ｃ２原栄養性を維持している。
【０１１９】
所定の細胞で利用されるべき遺伝子発現レベル及び／又は外来遺伝子の数は、選択した酵母種によって異なる。完全にゲノム配列決定された酵母に関して、全ゲノム量論モデルが、所望の経路の３‐ＨＰ発酵経路を起こすために発現されなければならない酵素を決定するのに使用できる。全ゲノム量論モデルは、例えば、Hjersted et al., "Genome-scale analysis of Saccharomyces cerevisiae metabolism and ethanol production in fed-batch culture," Biotechnol. Bioeng. 2007；及びFamili et al., "Saccharomyces cerevisiae phenotypes can be predicted by using constraint-based analysis of a genome-scale reconstructed metabolic network," Proc.Natl.Acad.Sci.2003, 100(23): 13134-9に記載されている。
【０１２０】
ゲノム配列が知られていない酵母に関して、（過剰発現候補として又は挿入部位として）着目の遺伝子配列は、典型的に、例えば、以下の実施例２Ａに記載したものなどの技術を使用することで得られる。３‐ＨＰ経路で機能する遺伝子及び酵素を含めて、様々な遺伝子の発現や様々な酵素の活性を試験するために、日常的な実験計画が利用できる。各酵素を、好ましくはすべての経路酵素を含むそれ以下の酵素の個別に若しくはブロックで酵母内で発現させる実験をおこない、どれが改良された３‐ＨＰ生産に必要であるか（又は所望されるか）を証明することができる。１つの説明に役立つ実験計画で、それぞれの個々の酵素、並びにそれぞれの独特な酵素ペアの発現を試験し、そしてさらに、すべての必要な酵素又はそれぞれの独特な酵素の組み合わせの発現を試験できる。理解されるように、多くのアプローチを取ることができる。
【０１２１】
特定の実施形態において、本明細書中に規定する遺伝子組み換え酵母細胞からの３‐ＨＰを生産する方法が提供される。特定の実施形態において、これらの方法は、少なくとも１種類の炭素源の存在下で本明細書中に規定する遺伝子組み換え酵母細胞を培養し、一定期間、細胞に３‐ＨＰを産生させ、次に、培養物から細胞が産生した３‐ＨＰを単離することを含む。炭素源は、規定する酵母によって発酵できるいずれの炭素源であってもよい。炭素源は、十二炭素糖、例えば、スクロースなど、ヘキソース糖、例えば、グルコース若しくはフルクトースなど、グリカン又は他のグルコースの重合体、グルコースオリゴマー、例えば、マルトース、マルトトリオース及びイソマルトトリオースなど、パノース、並びにフルクトースオリゴマーであってもよい。五炭糖を発酵させる能力を与えるために細胞が改変されるのであれば、発酵培地には、例えば、キシロース、キシラン若しくはキシロースのその他のオリゴマー、及び／又はアラビノースなどの五炭糖が含まれ得る。そうした五炭糖は、ヘミセルロース含有バイオマスの加水分解物に適当である。オリゴマーの糖の場合には、細胞による発酵のためにこれらを対応する単糖に消化するために、発酵ブロスに酵素を加えるのが必要なこともある。特定の実施形態において、２タイプ以上の遺伝子組み換え酵母細胞が培養物中に存在していてもよい。同様に、特定の実施形態において、遺伝子組み換え酵母細胞と同じ又はそれとは異なった種の１若しくは複数の天然酵母細胞が培養物中に存在していてもよい。
【０１２２】
特定の実施形態において、３‐ＨＰを産生するように本明細書中に規定する細胞の培養は、相に分割され得る。例えば、細胞培養プロセスは、培養相、産生相、及び回収相に分割され得る。当業者は、これらの相に使用される条件が、例えば、使用される酵母種、酵母によって利用される具体的な３‐ＨＰ発酵経路、所望の収量、又は他の因子などの因子に基づいて変化し得る。
【０１２３】
培地は、窒素源（例えば、アミノ酸、タンパク質、例えば、アンモニア若しくはアンモニウム塩などの無機窒素源など）、及び様々なビタミン、ミネラルなどを含め、特定の細胞の必要に応じた栄養素を典型的に含んでいる。いくつかの実施形態において、本発明の細胞は、化学的に定義された培地中で培養できる。一例において、培地は、約５ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、約３ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、約０．５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、微量元素、ビタミン、及び約１５０ｇ／Ｌのグルコースを含んでいる。ｐＨは、培養中、自由に変動させててもよいが、ｐＨが所定のレベルより下がるか若しくはそれを超えるのを防ぐために、必要であれば緩衝化されてもよい。特定の実施形態において、発酵培地は、約１．０のＯＤ600を生じるのに十分な（評価の対象である）酵母細胞が植菌される。別段の明らか注意がない限り、本明細書中で使用されるＯＤ600は、モデルＤＵ６００分光光度計（Beckman Coulter）を使用して１ｃｍの路程で６００ｎｍの波長にて計測された吸光度を指す。培養温度は約３０〜４０℃の範囲をとることができ、そして、培養時間は最長で約１２０時間になり得る。
【０１２４】
一例において、発酵培地中の細胞濃度は、典型的に、産生相の間、約０．１〜２０、好ましくは０．１〜５、より一層好ましくは１〜３ｇ乾燥細胞／リットルの発酵培地の範囲内にある。発酵は、経路要件によって、好気的に、微好気的に、又は嫌気的におこなわれ得る。所望であれば、酸素摂取速度（ＯＵＲ）が、工程管理として発酵を通じて変更できる（例えば、ＷＯ０３／１０２２００を参照のこと）。いくつかの実施形態において、本明細書中に規定する改変酵母細胞は、２〜４５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、例えば、２〜２５、２〜２０、２〜１５、２〜１０、１０〜４５、１５〜４０、２０〜３５、又は２５〜３５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、の酸素吸収速度を特徴とする微好気性条件下で培養される。特定の実施形態において、本明細書中に規定する改変酵母細胞は、２〜２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間の酸素吸収速度を特徴とする微好気性条件下で培養されると、特に良好に機能し得る。培地は、産生相の間、ｐＨが約３．０〜約７．０、又は約４．０〜約６．０の範囲内で維持されるように緩衝化されてもよい。好適な緩衝剤には、それが形成されるときに酸を中和する塩基性物質、例えば、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸アンモニウム、アンモニア、水酸化アンモニウムなどが含まれる。一般に、従来の発酵工程で使用される緩衝剤もまた、ここで好適である。
【０１２５】
緩衝化された発酵が利用される実施形態において、酸性発酵産物は、それらが形成されるときに対応する塩へと中和される。それらの実施形態において、酸の回収は、遊離酸の再生に関与する。これは、細胞を取り除き、そして、例えば硫酸などの強酸で発酵ブロスを酸性化することによっておこなわれる。このことは、塩副産物の形成をもたらす。例えば、カルシウム塩が中和剤として利用され、硫酸が酸性化剤として利用される場合、石膏が塩副産物として産生される。この副産物は、ブロスから分離され、そして、酸が、例えば、液体‐液体抽出、蒸留、吸収、及びその他のものなどの技術を使用して回収される（例えば、T.B. Vickroy, Vol. 3, Chapter 38 of Comprehensive Biotechnology, (M. Moo-Young編), Pergamon, Oxford, 1985；R. Datta, et al., FEMS Microbiol Rev, 1995, 16: 221-231；米国特許第４，２７５，２３４号、同第４，７７１，００１号、同第５，１３２，４５６号、同第５，４２０，３０４号、同第５，５１０，５２６号、同第５，６４１，４０６号、及び同第５，８３１、１２２号、並びにＷＯ９３／００４４０を参照のこと）。
【０１２６】
他の実施形態において、発酵培地のｐＨは、培養中、開始ｐＨ、つまり、３‐ＨＰのｐＫａ以上、典型的には４．５以上から、酸性発酵産物のｐＫａ以下、例えば、４．５未満又は４．０、例えば、約１．５〜約４．５の範囲内、約２．０〜約４．０の範囲内、若しくは約２．０〜約３．５の範囲内などに下がることが容認され得る。
【０１２７】
さらに他の実施形態において、発酵は、発酵工程の開始前又は開始時に産物の酸のｐＫａ以下に発酵ブロスのｐＨを調整することによって、産物の酸を産生するように実施できる。ｐＨはその後、培養を通じて産物の酸のｐＫａ以下に維持され得る。特定の実施形態において、ｐＨは、４．５未満又は４．０、例えば、約１．５〜約４．５の範囲内、約２．０〜約４．０の範囲内、又は約２．０〜約３．５の範囲内に維持され得る。
【０１２８】
本明細書中に規定する方法の特定の実施形態において、遺伝子組み換え酵母細胞は、比較的低レベルのエタノールを産生する。特定のこれらの実施形態において、エタノールは、１０％以下の収率、好ましくは２％以下の収率で産生され得る。特定のこれらの実施形態において、エタノールは検出可能なほど産生されない。他の実施形態において、しかしながら、３‐ＨＰとエタノールは同時に産生され得る。これらの実施形態において、エタノールは、１０％超、２５％超、又は５０％超の収率にて産生され得る。
【０１２９】
本明細書中に規定する方法の特定の実施形態において、炭素源に対する３‐ＨＰの最終収率は、理論収率の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、又は５０％超である。３‐ＨＰの濃度又は力価は、収率、並びに炭素源の開始濃度の関数になる。特定の実施形態において、力価は発酵中のある時点、そして好ましくは発酵の終了時に少なくとも１〜３、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、又は５０ｇ／Ｌ超に達することもある。特定の実施形態において、３‐ＨＰの最終収率は、特に産生相中に、発酵培地の温度を変更することによって増強されることもある。
【０１３０】
産生されれば、発酵培地から３‐ＨＰを単離するために、当該技術分野で公知のいずれかの方法を使用できる。例えば、一般的な分離技法が、ブロスからバイオマスを取り出すのに使用でき、そして、一般的な単離手順（例えば、抽出、蒸留、及びイオン交換手順）が、微生物不含ブロスから３‐ＨＰを得るのに使用できる。加えて、３‐ＨＰは、それが産生されている間に単離できるし、それは、産物産生相が終了した後でもブロスから単離できる。
【０１３１】
本明細書中に開示された方法を使用することで、産生された３‐ＨＰを、他の有機化合物に化学的に転換できる。例えば、３‐ＨＰを、水素化させて、貴重なポリエステル単量体である１，３プロパンジオールを形成できる。プロパンジオールはまた、試験管内又は生体内において、オキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドを使用することで３‐ＨＰから作り出すことができる。例えば、３‐ＨＰなどの有機酸の水素化は、例えば、コハク酸及び／又は乳酸を水素化するのに使用される方法などのいずれかの方法を使用することで実施できる。例えば、３‐ＨＰは、金属触媒を使用することで水素化できる。別の実施例において、３‐ＨＰは、脱水反応をおこなうことが知られているいずれかの方法を使用することで、脱水されて、アクリル酸を形成することができる。例えば、３‐ＨＰは、触媒（例えば、金属又は鉱酸触媒）の存在下で加熱されて、アクリル酸を形成することができる。
【０１３２】
以下の実施例は、請求項に記載した発明をよりよく例示するために提供しているので、本発明の範囲を制限していると解釈されることはない。具体的な物質に触れる程度で、それは単に例示目的のためだけに存在し、本発明を限定することは意図していない。当業者は、本発明の発明能力及び本発明の範囲から逸脱することなく、同党の手段又は反応物を作り出すこともできる。当然のことながら、本発明の制限の範囲内に留まったままでも、本明細書中に記載した手順にはまだ多くの変更を加えることができる。そうした変更が本発明の範囲内に含まれるという本発明者の意図である。
【実施例】
【０１３３】
培地と溶液
ＴＥは、１０ｍＭのＴｒｉｓ塩基及び１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０から構成された。
２× ＹＴ＋ａｍｐプレートは、１６ｇ／Ｌのトリプトン、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン、及び１５ｇ／ＬのＢａｃｔｏアガーから構成された。
ｕｒａ選択プレートは、６．７ｇの硫酸アンモニウム含有酵母窒素塩基、５ｇのカザミノ酸、１００ｍＬの０．５Ｍ コハク酸ｐＨ５、２０ｇのＮｏｂｌｅアガー、及び８５５ｍＬの脱イオン水から構成された。
オートクレーブ滅菌後に、４０ｍＬの無菌の５０％のグルコース及び２ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬ クロラムフェニコールを加え、そしてプレートに注ぎ入れた。
ｕｒａ選択培地は、６．７ｇの硫酸アンモニウム含有酵母窒素塩基、５ｇのカザミノ酸、１００ｍＬの０．５Ｍ コハク酸ｐＨ５、及び８５５ｍＬの脱イオン水から構成された。オートクレーブ滅菌後に、４０ｍＬの無菌の５０％グルコース及び２ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬ クロラムフェニコールを加えた。
ＹＰ＋１０％グルコース培地は、５００ｍＬのＹＰブロスと１００ｍＬの無菌の５０％グルコースから構成された。
ＹＰブロスは、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２０ｇ／Ｌのペプトンから構成された。
ＹＰＤプレートは、１０ｇの酵母抽出物、２０ｇのペプトン、２０ｇのバクトアガー、及び９６０ｍＬまでの脱イオン水から構成された。オートクレーブ滅菌後に、４０ｍＬの無菌の５０％グルコースを加え、そして、プレートに注ぎ入れた。
ＴＡＥは、４．８４ｇ／ＬのＴｒｉｓ塩基、１．１４ｍＬ／Ｌの氷酢酸、及び２ｍＬ／Ｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０から構成された。
ＴＢＥは、１０．８ｇ／ＬのＴｒｉｓ塩基、５．５ｇ／Ｌのホウ酸、及び４ｍＬ／Ｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０から構成された。
ＬｉＯＡｃ／ＴＥ溶液は、８部の滅菌水、１部の１Ｍ ＬｉＯＡｃ、及び１部の１０× ＴＥから構成された。
【０１３４】
１０× ＴＥ（２００ｍＬ）は、２．４２ｇのＴｒｉｓ塩基、４ｍＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０から構成された。５ＭのＨＣｌを、７．５にｐＨを調整するのに使用し、そして、溶液をオートクレーブで滅菌した。
ＰＥＧ／ＬｉＯＡｃ／ＴＥ溶液は、８部の５０％ ＰＥＧ３３５０、１部の１Ｍ ＬｉＯＡｃ、及び１部の１０× ＴＥから構成された。
５０％のＰＥＧ３３５０は、１００ｇのＰＥＧ３３５０を１５０ｍＬの水に加え、加熱し、そして溶解するまで撹拌することによって調製された。そして、水で体積を２００ｍＬに合わせ、そしてオートクレーブで滅菌処理した。
ＳｃＤ ＦＯＡプレートは、２７５ｍＬの２×‐ＳｃＤ ２× ＦＯＡ液体培地及び２７５ｍＬの２×‐ＳｃＤ ２× ＦＯＡプレート培地から構成され、溶解させ、そして、６５℃まで冷やした。
２×‐ＳｃＤ ２× ＦＯＡ液体培地は、６．６６ｇのアミノ酸不含酵母窒素塩基、１．５４ｇのｕｒａ‐ＤＯサプリメント（Clontech、Mountain View, CA, USA）、２０ｇのデキストロース、５０ｍｇのウラシル、２ｍｇのウリジン、２ｇの５‐ＦＯＡ（５‐フルオロオロチン酸、一水和物；Toronto Research Chemicals, North York, ON, Canada）、及び１Ｌまでの水から構成された。得られた溶液を、滅菌するために濾過した。
２×‐ＳｃＤ ２× ＦＯＡプレート培地は、１１ｇのバクトアガーと２７５ｍＬの水から構成された。得られた溶液を、滅菌するためにオートクレーブ処理した。
【０１３５】
ＤＭ２培地は、硫酸アンモニウム（５．０ｇ／Ｌ）、硫酸マグネシウム七水和物（０．５ｇ／Ｌ）、リン酸二水素カリウム（３．０ｇ／Ｌ）、微量元素溶液（１ｍＬ／Ｌ）、及びビタミン溶液（１ｍＬ／Ｌ）から構成された。すべての培地成分を溶解した後に、培地のｐＨを、適当な塩基（例えば、ＫＯＨ）を使用して所望の初期ｐＨに調整した。
微量元素溶液は、ＥＤＴＡ（１５．０ｇ／Ｌ）、硫酸亜鉛７水和物（４．５ｇ／Ｌ）、無水塩化マンガン（１．０ｇ／Ｌ）、塩化コバルト（ＩＩ）六水和物（０．３ｇ／Ｌ）、硫酸銅（ＩＩ）五水和物（０．３ｇ／Ｌ）、無水モリブデン二ナトリウム（０．４ｇ／Ｌ）、無水塩化カルシウム（４．５ｇ／Ｌ）、硫酸鉄七水和物（３ｇ／Ｌ）、ホウ酸（１．０ｇ／Ｌ）、及びヨウ化カリウム（０．１ｇ／Ｌ）から構成された。
ビタミン溶液は、ビオチン（Ｄ−；０．０５ｇ／Ｌ）、パントテン酸カルシウム（Ｄ＋；１ｇ／Ｌ）、ニコチン酸（５ｇ／Ｌ）、ミオイノシトール（２５ｇ／Ｌ）、塩酸ピリドキシン（１ｇ／Ｌ）、ｐ‐アミノ安息香酸（０．２ｇ／Ｌ）、及び塩酸チアミン（１ｇ／Ｌ）から構成された。
Butterfieldsリン酸バッファーは、１．２５ｍＬ／Ｌの原液（２６．２２ｇ／Ｌのリン酸二水素ナトリウムと７．７８ｇ／Ｌの炭酸ナトリウム）及び５ｍＬ／Ｌの塩化マグネシウム溶液（８１．１ｇ／ＬのＭｇＣｌ2‐６Ｈ2Ｏ）から構成された。得られた溶液を、滅菌するためにオートクレーブ処理し、そして、ｐＨを７．２に調整した。
ＣＮＢ１振盪フラスコ培地は、尿素（２．３ｇ／Ｌ）、硫酸マグネシウム七水和物（０．５ｇ／Ｌ）、リン酸二水素カリウム（３．０ｇ／Ｌ）、微量元素溶液（１ｍＬ／Ｌ）及びビタミン溶液（１ｍＬ／Ｌ）、グルコース（１２０．０ｇ／Ｌ）、２‐（Ｎ‐モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（９７．６ｇ／Ｌ）から構成された。すべての培地成分を溶解させた後に、培地のｐＨを、適当な塩基（例えば、ＫＯＨ）を使用して５．８の初期ｐＨに調整した。
【０１３６】
【表１】
2013542747.tif 000002
【０１３７】
【表２】
2013542747.tif 000003
【０１３８】
【表３】
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【０１３９】
【表４】
2013542747.tif 000005
【０１４０】
多岐にわたる配列
プロモーター：実施例に記載のＰＤＣ、ＴＤＨ３、ＥＮＯ１、及びＰＧＫ１プロモーターをそれぞれ、配列番号２４４、２４５、２４６、及び２４７のＩ．オリエンタリス配列から得た。ターミネータ：実施例に記載のＴＡＬ、ＴＫＬ、ＲＫＩ、及びＰＤＣターミネータをそれぞれ、配列番号２４８、２４９、２５０、及び２５１のＩ．オリエンタリス配列から得た。実施例に記載のＵＲＡ３プロモーター、ＯＲＦ、及びターミネータを、配列番号２５２のＩ．オリエンタリス配列から得た。
【０１４１】
実施例１Ａ：３‐ＨＰ耐性に基づく宿主酵母細胞の選択
一群の野生型酵母株を、３‐ＨＰの存在下で成長するそれらの能力について試験した。
【０１４２】
一次スクリーニング手順で利用する３‐ＨＰ濃度の範囲は、７種の野生型酵母株（表１、セットＡ）が様々なレベルの３‐ＨＰを含む培地上で成長する能力を評価することによって決定した。これらの実験に使用する３‐ＨＰは、ＷＯ０４／０７６３９８に記載のとおり、２００ｐｓｉ及び１７５℃にて水性アクリル酸溶液（３０％）及びＣＯ2触媒から化学的に合成した。残留アクリル酸を、室温にてイソプロピルエーテルを用いた向流抽出を使用して取り除いた（ＷＯ０５／０２１４７０を参照のこと）。
【０１４３】
細胞を、ＹＰＤプレート上に画線接種し、そして一晩培養した。約４のＯＤ600を有する細胞スラリーを、ＹＰＤ培地、ｐＨ３．０中で作製し、そしてこのスラリーを、様々な濃度の３‐ＨＰ（ｐＨ３．９）を含むマイクロタイターウェルに０．０５のＯＤ600まで植菌するのに使用した。プレートを、ガス浸透性膜によって覆い、そして３０℃／３００ＲＰＭの振盪機内で一晩インキュベートした。各ウェルへの吸光度を、ＧＥＮｉｏｓモデルプレートリーダ（Tecan）により６００ｎｍの波長で計測し、そしてプレートを目視で成長について観察した。１若しくは複数の株がその中に成長した最も高い３‐ＨＰ濃度（１２５ｇ／Ｌ）を、一次スクリーニング手順の範囲の上限として選んだ。
【０１４４】
一次スクリーニング
一次スクリーニング手順のために、８９種の野生型酵母株を、範囲を見つけるために使用したのと同じプロトコールを使用して、０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、又は１２５ｇ／Ｌの３‐ＨＰ（ｐＨ３．９）のマイクロタイタープレートにおける成長についてスクリーニングした。新しいＹＰＤプレートを各株に使用し、そして約４のＯＤ600を有するスラリーを、ＹＰＤ培地、ｐＨ３．０中に作製した。そのスラリーを、０．０５のＯＤ600までの各ウェルに植菌に使用した。プレートを、ガス浸透性膜によって覆い、３０℃／３００ＲＰＭの振盪機内で一晩インキュベートした。各ウェルの吸光度を、ＧＥＮｉｏｓモデルプレートリーダにより６００ｎｍの波長で計測し、そしてプレートを目視により成長について観察した。同様のプロトコールを、０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、及び６０ｇ／Ｌの乳酸濃度における成長を評価するために実行した。表１に成長が観察された最高濃度の３‐ＨＰ又は乳酸をまとめた。
【０１４５】
１００ｇ／Ｌの３‐ＨＰにて成長できたか、又は７５ｇ／Ｌの３‐ＨＰにて成長が良好であった１５株を同定した（表１、セットＢ）。株をさらに絞るために、第２のマイクロタイタープレート試験をおこなった。この試験は、第１と同様であったが、しかし、１００ｇ／Ｌ、１１２．５ｇ／Ｌ、及び１２５ｇ／Ｌ（ｐＨ３．９）の３‐ＨＰ濃度を利用した。この試験から、７５ｇ／Ｌの３‐ＨＰにて成長が良かったか、又は７５及び１１２．５ｇ／Ｌの両方の３‐ＨＰにて何らかの成長を示した１１株を同定した（表１、セットＣ）。これらの１１株を、二次スクリーニングに進めた。７５ｇ／Ｌの３‐ＨＰにて成長が乏しかった、及び１１２．５ｇ／Ｌの３‐ＨＰにて成長がなかった、４株は二次スクリーニングには進めなかった。二次スクリーンに至らなかった株は、商業的発酵工程において経済的に劣った能力を示すと予想される。しかしながら、そうした株の１若しくは複数を、それにもかかわらず商業的に実施可能な発酵工程の最低限の要求を満たすことができるようにすることは可能である。
【０１４６】
【表５】
2013542747.tif 000006
【０１４７】
【表６】
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【０１４８】
【表７】
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【０１４９】
先に試験したＩ．オリエンタリス株ＣＤ１８２２は、グルコース制限ケモスタット内で９１日間、Ｉ．オリエンタリスＡＴＣＣ ＰＴＡ‐６６５８を進化させることによって作り出した。系には、ＤＭ培地中の１５ｇ／Ｌのデキストロースを与え、そして餌料培地中の追加の乳酸を用いてｐＨ＝３にて０．０６ｈ-1の希釈速度で運転した。条件を、約２ｍｍｏｌＬ-1ｈ-1の低い酸素移動速度に維持し、そして、溶存酸素濃度を０％の空気飽和度で一定に維持した。最後の時点からの単離したシングルコロニーを、２つの振盪フラスコアッセイで特徴づけした。第１のアッセイで、株を、ｐＨ調節していないＤＭ１既知組成培地中の２５ｇ／Ｌの総乳酸の存在下でグルコースをエタノールに発酵させるそれらの能力について特徴づけした。第２のアッセイで、単離株の成長速度を、ｐＨ調節のないＤＭ１既知組成培地中の２５、３２、及び４５ｇ／Ｌの総乳酸の存在下で計測した。菌株ＣＤ１８２２は、計測した発酵速度及び増殖速度に基づいて選択しただ一つの単離株であった。Ｉ．オリエンタリスのための他の進化方法は、これだけに限定されるものではないが、
含んでいるが、が制限されない、例えば、米国特許第７，６２９，１６２号に記載のような、選択条件下での頻回連続継代培養である。そうした方法を、使用するか、又は先に記載したグルコース制限ケモスタット法の使用の代わりに又はそれに加えて使用できる。当業者によって理解され得るように、菌株は、改善された３‐ＨＰ耐性を作製するために乳酸よりむしろ３‐ＨＰの存在下で同様の進化手順を用いて作り出される場合がある。さらに、菌株は、本明細書中に記載したように、選択前に突然変異誘発される場合がある（例えば、実施例１Ｂを参照のこと）。
【０１５０】
二次スクリーニング
二次スクリーンの第１部に関して、増殖速度を、ｐＨ３．９にて、０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、又は７５ｇ／Ｌの３‐ＨＰを含むＹＰＤ培地中で計測した。振盪フラスコに、６〜１０のＯＤ600まで一晩培養した種菌用フラスコから集菌したバイオマスを植菌した。２５０ｍＬのバッフル付き増殖速度フラスコ（５０ｍＬの作業容量）に、０．１のＯＤ600まで植菌し、２５０ｒｐｍ及び３０℃にて培養した。サンプルを、アッセイの時間経過の至るところで採取し、そして、ＯＤ600によってバイオマスの成長を分析した。得られたＯＤ600データをプロットし、そして増殖速度を確立した。
【０１５１】
【表８】
2013542747.tif 000009
【０１５２】
二次スクリーンの第２部に関して、グルコース消費量を、１００ｇ／Ｌのグルコース及び０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、又は７５ｇ／Ｌの３‐ＨＰを含むＹＰＤ培地中、ｐＨ３．９にて同じ１０株に関して計測した。６〜１０のＯＤ600まで一晩培養した種菌用フラスコから集菌したバイオマスを、振盪フラスコに植菌した。２５０ｍＬ容バッフル付き糖分解アッセイフラスコ（５０ｍＬの作業容量）に、０．１のＯＤ600まで植菌し、そして２５０ＲＰＭ及び３０℃にて培養した。サンプルをアッセイの時間経過の至るところで採取し、そしてYellow Springs Instruments（YSI）製の2700 Biochemistry Analyzerを使用してグルコース消費量を分析した。得られたデータをプロットし、そしてグルコース消費量を確立した。
【０１５３】
【表９】
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【０１５４】
前記菌株のうち４株（Ｐ．メンブラニファシエンス、Ｓ．ポンベ、Ｃ．バリダ（C. valida）、及びＺ．レンツス（Z. lentus））は、経済的発酵工程に必要とされるであろう７５ｇ／Ｌの３‐ＨＰ（ｐＨ３．９）の条件下での２．５ｇ／Ｌ／時間のグルコース利用速度を達成しなかった。
【０１５５】
３‐ＨＰに関して優れた菌株を同定するために、菌株の能力を、３つのカテゴリで等級付けした。これらのうちの２つのカテゴリは、増殖速度の異なった側面：１）最高の酸濃度における増殖速度）及び２）酸濃度に対してプロットした増殖速度のスロープ、に基づいた。第３のカテゴリは、最高の酸濃度における解糖速度であった。この等級付けは、標準化境界としてそれぞれ等級の最高値及び最低値を使用した標準化等級においておこなった。よって、各菌株は、各カテゴリにつき、（１が最高スコアである）０〜１の等級を受けた。菌株の総合的な格付け法は、３つのカテゴリに関する標準化数値の合計であった。増殖速度と解糖速度に等しく加重した加重スコアを導いた。この場合、最高の酸濃度における解糖速度には５０％加重した一方、２つの増殖速度の格付けにはそれぞれ２５％加重した。カテゴリごとに標準化した数値、合計、及び加重スコアを、表４にまとめる。
【０１５６】
【表１０】
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【０１５７】
試験した菌株のうち、Ｉ．オリエンタリス種、Ｃ．ランビカ種、及びＳ．ブルデリ種からの菌株が、低ｐＨにおける３‐ＨＰ産生宿主として最高の可能性を示した。
【０１５８】
同じ手順を、ｐＨ２．８５にて０、２５、及び５０ｇ／Ｌの乳酸（〜８０％の遊離酸）を含む培地を用いた一次スクリーンからの元の９１株の野生型酵母菌株のスクリーニング、格付け、そしてスコア化に利用した。標準化数値と加重及び合計スコアを、二次スクリーンを進めた１３菌株について得た。
【０１５９】
【表１１】
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【０１６０】
乳酸に関して、Ｓ．ジャベンシス（S. javensis）だけが、５０ｇ／Ｌ乳酸を含む培地中、ｐＨ２．８５にて２．５ｇ／Ｌ／時間のグルコース利用速度を達成しなかった。その一方、Ｉ．オリエンタリス、Ｃ．ランビカ、及びＳ．ブルデリは、３‐ＨＰと乳酸の両方に対する酸耐性を示したが、酸の一方にしか耐性がない多数の菌株が存在した。このことはまた、一次スクリーニングの結果でも分かる（表１）。例えば、Ｃ．ミレリ（C.milleri）、Ｃ．ルゴサ（C.rugosa）、Ｃ．バンデルワルチイ（C.vanderwaltii）、Ｋ．オーメリ（K.ohmeri）、Ｓ．バヤヌス（S.bayanus）、Ｓ．ジャベンシス、Ｙ．リポリチカ、Ｚ．ビスポルス（Z.bisporus）、及びＺ．コンブカエンシス（Z.kombuchaensis）はすべて、４５〜６０ｇ／Ｌの乳酸における成長を実証したにもかかわらず、試験した３‐ＨＰの最低濃度（３５ｇ／Ｌ）においてさえ成長しなかった。よって、１種類の有機酸に対する菌株の耐性は、他の酸に対する耐性の予測因子として断定的に使用できない。このことは、上記の３‐ＨＰ耐性を示した菌株を、ＷＯ０３／０４９５２５で有機酸生産の好ましい宿主として同定された８菌株のリストと比較することによってさらに注目される。それらの菌株のうちの２種類（Ｃ．ジッデンシア（C.diddensiae）とＣ．エントモフィラ（C.entomophila））は試験のために入手できなかったが、その他の６種類は先に記載した一次スクリーンに含まれていた。これらの６種類のうち、（Ｉ．オリエンタリスとして試験した）Ｃ．クルセイだけが３５ｇ／Ｌの３‐ＨＰの存在下で成長できた。
【０１６１】
実施例１Ｂ：突然変異誘発と、３‐ＨＰに対して耐性を持つ突然変異株の選択
実施例１Ａで選択した酵母細胞を、高い３‐ＨＰ耐性を有する突然変異体を同定するために、突然変異誘発にかけ、そして選択圧に晒す。
【０１６２】
例えば、新しいＹＰ（酵母抽出物／ペプトン）＋２０ｇ／Ｌグルコースプレート又は液中培養（ＯＤ600 １〜４）からの酵母細胞を、滅菌水で約１０のＯＤ600に再懸濁する。この細胞懸濁液の２００μＬのアリコートを、個々のチューブにピペットで計り取り、そして３μＬのエタンスルホン酸メチル（ＥＭＳ）に約一時間、晒すが、これで、細胞の約６５％が死滅する。より高いＥＭＳ濃度もまた、殺傷率を高めるのに使用する。晒した後に、細胞を、５％のチオ硫酸ナトリウムによって中和し、ＰＢＳバッファー中で洗浄し、リッチ培地中で約４時間、回復させ、そして選択培地上で培養する。条件が選択的であることを保証するために、模擬サンプル（ＥＭＳ不含）もまた実施する。あるいは、ＵＶ照射を使用することで、細胞に突然変異を誘発できる。
【０１６３】
３‐ＨＰ耐性突然変異菌株を選択するために、ＥＭＳ処理細胞懸濁液（約２ｘ１０8個の突然変異細胞）のアリコートを、親系統が成長しないか又は非常に成長が遅いレベルで３‐ＨＰを含むポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）又は別の培地上で平板培養する。これらのプレートを、コロニーが現れるまで数日間インキュベートする。シングルコロニーを、精製し、非選択培地上で画線接種して選択のあらゆる順応効果を断ち、そして選択培地で再テストして耐性増大を確認する。そして、耐性菌を、産物及び基質のＨＰＬＣ分析の定期的サンプル抽出を伴った振盪フラスコ形式で試験した。あるいは、３‐ＨＰ耐性の選択を、ケモスタット又は連続振盪フラスコ進化によっておこなってもよい。突然変異誘発及び選択の追加ラウンドを実施できる。突然変異誘発は、商業的な３‐ＨＰ生産に必要とされる特性を有するように、３‐ＨＰ生産要件を自然には満たさない宿主の耐性を増強するのに使用できる。
【０１６４】
実施例２Ａ：宿主ゲノム内へのＤＮＡの形質転換手順
以下の実施例に記載の改変酵母菌株を作り出すための酵母宿主ゲノム内へのＤＮＡ形質転換を、以下の具体的な手順に基づいておこなった。
【０１６５】
４ｍＬのＹＰ＋１０％グルコース培地を、１４ｍＬのFalconチューブに加え、そして、所望の菌株を、無菌の白金耳を使用してこの培地に植菌した。培養物を、２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃にて一晩培養した（〜１６時間）。一晩培養物１ｍＬを、５０ｍＬの液体ＹＰ＋１０％のグルコース培地を入れた２５０ｍＬ容バッフル付きのフラスコに加えた。フラスコを、２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃にて培養した。培養物の小量のアリコートを、約１時間の間隔で抜き取り、そしてＯＤ600を計測した。培養物を、ＯＤ600が０．６〜１．０になるまで培養した。
【０１６６】
細胞を、室温にて２２７９×ｇで遠心分離で集菌し、ペレットを、２５ｍＬの滅菌水で再懸濁し、次に、室温にて２２７９×ｇで遠心分離した。ペレットを１ｍＬの滅菌水で再懸濁し、再懸濁した細胞を、１．５ｍＬ容チューブに移し、次に、１６１００×ｇにてペレット状にした。細胞を、１ｍＬのＬｉＯＡｃ／ＴＥ溶液で再懸濁し、次に、１６１００×ｇでペレット状にした。そして、細胞ペレットを、５００μＬのＬｉＯＡｃ／ＴＥ溶液で再懸濁した。
【０１６７】
以下の成分：１００μＬの上記細胞、１０μＬの新たに沸騰し、そして氷冷したサケ精子ＤＮＡ（Agilent Technologies, Santa Clara, CA、USA）、及び１０μＬの所望の線状形質転換ＤＮＡ、を１．５ｍＬ容チューブに加えた。ＤＮＡの代わりに水を用いた対照反応物もまた、調製した。各形質転換反応物に、６００μＬのＰＥＧ／ＬｉＯＡｃ／ＴＥ溶液を加え、そして反応物を、横にして２５０ｒｐｍの振盪機プラットフォーム上で３０℃にて３０分間インキュベートした。４０μＬのＤＭＳＯを各反応物に加え、次に、４２℃の水浴中で５分間インキュベートした。細胞を、５，４００×ｇにて１分間でペレット状にした。細胞を水で再懸濁し、２つに分け、そして、形質転換反応物の半分のそれぞれをｕｒａ選択培地プレート上で平板培養した。プレートを３７℃に置いた。コロニーは、一般に１８〜２４時間の培養後に目視できるが、それは、菌株の背景による。
【０１６８】
無菌の白金耳を使用して、ペトリディッシュから３００μＬのYeast Lysis溶液（EPICENTRE（登録商標）Biotechnologies、Madison, Wl, USA）の入った１．５ｍＬ容チューブに少量の酵母を移し、そして、ゲノムＤＮＡを、製造業者の取扱説明書に従ってMasterPure（商標）Yeast DNA Purification Kit（EPICENTRE（登録商標）Biotechnologies）を使用して抽出した。
【０１６９】
単離した形質転換体で正しい組み込み事象が起こっているかどうか判断するために、MasterPure（商標）Yeast DNA Purification Kit（EPICENTRE（登録商標）Biotechnologies）を使用して調製したゲノムＤＮＡを、ＰＣＲ反応に使用した。ＰＣＲ反応物（２５μＬ）には、０．５μＬのスクリーニングされるべき菌株のゲノムＤＮＡ、１×Crimson Taq（商標）反応バッファー（New England Biolabs、Ipswich, MA, USA）、それぞれ２５ｐｍｏｌのセンス及びアンチセンスプライマー、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、並びに０．６２５単位のCrimson Taq（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs）が含まれていた。ＰＣＲを、９５℃にて３０秒間を１サイクル、続いてそれぞれ９５℃にて３０秒間、５０℃にて３０秒間、及び６８℃にて予想される最大産物１ｋｂｐにつき１分間を３０サイクル、それと６８℃にて１０分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific、Westbury, New York, USA）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、ＴＡＥ又はＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そしてバンドのサイズを可視化し、記載した特異的プライマーセットに関するものと見なした。
【０１７０】
実施例２Ｂ：挿入部位の選択
宿主酵母細胞内に外来遺伝子を組み入れるための好適な挿入部位は、酵母宿主細胞内で欠失する３‐ＨＰ産生に有益であるか又は中立の効果を持つ遺伝子の遺伝子座であり得る。選択した酵母菌株の好適な挿入部位の制限されることのない例は、本明細書中の実施例に記載されている。当業者は、これら及び他の挿入部位、例えば、ＰＤＣ（例えば、配列番号４９に規定するアミノ酸配列をコードする、及び／又は配列番号４８に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むＩ．オリエンタリスＰＤＣ遺伝子）、ＡＤＨ（例えば、配列番号１０６、１０８、又は１１０に規定するアミノ酸配列をコードする、及び／又は配列番号１０５、１０７、又は１０９に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むＩ．オリエンタリスＡＤＨ遺伝子）、ＧＡＬ６（例えば、配列番号１１２に規定するアミノ酸配列をコードする、及び／又は配列番号１１１に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むＩ．オリエンタリスＧＡＬ６遺伝子）、ＣＹＢ２Ａ（例えば、配列番号１１４に規定するアミノ酸配列をコードする、及び／又は配列番号１１３に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むＩ．オリエンタリスＣＹＢ２Ａ遺伝子）、ＣＹＢ２Ｂ（例えば、配列番号１１６に規定するアミノ酸配列をコードする、及び／又は配列番号１１５に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むＩ．オリエンタリスＣＹＢ２Ｂ遺伝子）、ＧＰＤ（例えば、配列番号１１８に規定するアミノ酸配列をコードする、及び／又は配列番号１１７に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むＩ．オリエンタリスＧＰＤ遺伝子）、ＡＬＤ（例えば、配列番号１２０に規定するアミノ酸配列をコードする、及び／又は配列番号１１９に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むＩ．オリエンタリスＡＬＤ相同性遺伝子５６８０、配列番号１２２に規定するアミノ酸配列をコードする、及び／又は配列番号１２１は規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むＩ．オリエンタリスＡＬＤ相同性遺伝子４２０２６、配列番号１２４に規定するアミノ酸配列をコードする、及び／又は配列番号１２３に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むＩ．オリエンタリスＡＬＤ相同性遺伝子４２４２６、あるいは、配列番号１２６に規定するアミノ酸配列をコードする、及び／又は配列番号１２５は規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むＩ．オリエンタリスＡＬＤ相同性遺伝子４２７２７）、又はＰＣＫ（例えば、配列番号１２８に規定するアミノ酸配列をコードする、及び／又は配列番号１２７に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むＩ．オリエンタリスＰＣＫ遺伝子）遺伝子又はその相同体の１若しくは複数の遺伝子座、の使用に関する本明細書中の教示を容易に適用できる。これら遺伝子の配列が未発表である場合、それらは、例えば、ゲノム配列決定、ゲノム又はｃＤＮＡライブラリーのプローブハイブリダイゼーション、又は公知の相同体配列に基づく縮重プライマーを使用する遺伝子断片の増幅と、それに続く完全な配列を得るためのゲノムウォーキングなどの標準手続きを使用して得られる。挿入部位のための他の好適な位置としては、オープンリーディングフレームを含まない遺伝子間領域が挙げられる。
【０１７１】
実施例２Ｃ：挿入ベクター、選択マーカーカセット、遺伝子発現カセット、及び組み込み構築物のための技術
挿入部位ベクターを、１若しくは複数の外来性遺伝子を宿主酵母細胞内に組み込むために作製する。宿主酵母細胞は、実施例１に記載の選択過程を受けた細胞であってもよいし、それらは、突然変異誘発及び／又は選択を受けていない細胞であってもよい。
【０１７２】
挿入部位ベクターを作り出すために、所望の挿入部位の領域上流（５’）及び領域下流（３’）を、鋳型として宿主ゲノムＤＮＡを使用して両方とも増幅する。上流領域は、好ましくは７０ｂｐ超且つ１．５ｋｂｐ未満である。得られた標的配列は、クローニングベクターに同時又は連続して連結されて、その断片が隣接するか又はほとんど隣接するように、１コピーのそれぞれの断片を持つベクターを得る。独特な制限部位が断片の間に組み込まれて、遺伝子発現カセット及び／又は選択マーカーカセットの挿入を可能にし得る。独特な制限酵素部位はまた、上流断片の５’末端若しくはその付近、及び下流の断片の３’末端若しくはその付近に組み込まれて、クローニングベクターからこれらの部位の間のＤＮＡのその後の除去を可能にする。
【０１７３】
挿入部位ベクター内への取り込みのための選択マーカーカセットを、標準的なクローニング技術を使用して作製する。これらの選択マーカーカセットは、選択マーカーのため遺伝子を含んでいて、上流プロモーター及び／又は下流ターミネータ配列もまた含み得る。好適な選択マーカー遺伝子の例としては、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＨＩＳ、ＭＥＬ５、ＣＹＢ２Ａ、ＬＥＵ２、及びＧ４１８遺伝子が挙げられる。組み換えによるマーカーの将来的な破壊を可能にするために、フランキング配列を、プロモーター／マーカー遺伝子／ターミネータ配列のどちらの側のカセット内に組み入れることもできる。これらのフランキング配列は、直接反復配列若しくは逆位反復配列（機能性若しくは無機能性配列のどちらか）又は１若しくは複数のｌｏｘＰ部位を含み得る。
【０１７４】
遺伝子発現カセットを、標準的なクローニング技術を使用して作製する。これら遺伝子発現カセットは、過剰発現されるべき遺伝子を含んでいて、上流プロモーター及び／又は下流ターミネータ配列もまた含み得る。特定の実施形態において、これらのプロモーター／遺伝子／ターミネータ組み合わせの２以上のコピーを、１つの遺伝子発現カセット内に組み入れてもよい。宿主酵母菌株における改善された発現のために、異種遺伝子をコドン最適化してもよい。本明細書中に記載の選択マーカーカセットを、それが過剰発現されるべき遺伝子、並びにいずれかの関連プロモーター及び／又はターミネータに隣接又はほとんど隣接するように、遺伝子発現カセット内にクローン化できる。
【０１７５】
あるいは、天然プロモーターの外来プロモーターでの置き換えのために、発現カセットには、ターゲッティング配列の間に組み込まれるべきプロモーターの上流に選択カセットがあってもよい。
【０１７６】
遺伝子発現カセットを、遺伝子発現組み込み構築物を作り出すための標準的なクローニング技術を使用した本明細書中に記載した挿入部位ベクター内の２つの標的部位配列の間に挿入できる。１若しくは複数の選択マーカーカセットもまた、どちらか遺伝子発現カセットの一部として又は別個に標的配列の間に挿入してもよい。特定の変形形態において、遺伝子発現カセットのピースは、組み込み断片の間で共通したオーバーラップ断片が存在するように、異なった挿入部位ベクター内にクローン化されることができる。例えば、あるベクターには、上流挿入断片、プロモーター、遺伝子、及びターミネータが含まれるかもしれず、そして２つ目のベクターには、ターミネータ、選択マーカーカセット、及び下流挿入断片が含まれるかもしれない。別の例において、２つ遺伝子の同時挿入を可能にするために、あるベクターには、上流挿入断片、プロモーター、遺伝子、ターミネータ、及び選択マーカーカセットの全部若しくは一部が含まれる場合があり、そして２つ目のベクターには、選択マーカーカセットの全部若しくは一部、第２のプロモーター、遺伝子、ターミネータ、及び下流挿入断片が含まれるだろう。
【０１７７】
遺伝子ノックアウト構築物を作り出すために、挿入部位ベクターを、欠失又は破壊すべき遺伝子の上流及び下流のフランキング領域から得られる標的ＤＮＡ配列を使用して作る。選択した標的配列は、標的遺伝子の上流及び下流フランキング領域、及び／又は標的遺伝子コード配列の全部若しくは一部、又はその調節要素（例えば、プロモーター又はターミネータ）を含み得る。１若しくは複数の選択マーカーカセットを、２つの標的配列の間の挿入部位ベクター内に組み入れてもよい。ノックアウトが外来遺伝子の発現と対にされる場合、１若しくは複数の遺伝子発現カセットもまた、挿入部位ベクター内に組み入れられる。
【０１７８】
宿主酵母ゲノムに組み込まれるべきＤＮＡ断片を、クローニングベクターからの断片、又は複数のベクターからのオーバーラップ断片の制限酵素消化によって線状できる。あるいは、線状組み込み断片を、ＰＣＲ、又はＰＣＲと制限酵素消化の組み合わせを使用して作製できる。挿入部位フランキング領域を、ベクター鋳型内のそれらの存在によって、又は増幅プライマー内への取り込みによって組み込み断片に組み入れることができる。後者の場合では、最短で７０ヌクレオチドのフランキング領域が好ましくはプライマーに組み入れられる。
【０１７９】
選択酵母菌株のための好適な挿入ベクター、選択マーカーカセット、遺伝子発現カセット、及び組み込み構築物の制限されることのない例を、以下の実施例に記載する。当業者は、これらの実施例からの教示と先の明細書を３‐ＨＰを産生する代替の改変酵母菌株を作出するために容易に適用できる。
【０１８０】
実施例２Ｄ：ａｄｈ１２０２遺伝子座の外来遺伝子を発現するための挿入ベクターの構築
プラスミドｐＭＩＢａ１０７を、選択マーカーとしてＵＲＡ３を使用して、ＰＤＣプロモーターとターミネータの制御下でＩ．オリエンタリスａｄｈ１２０２遺伝子座における単一遺伝子の組み込みを可能にするために作製した。ｕｒａ選択マーカーを伴ったＰＤＣプロモーターとターミネータを、以下で記載するようにＰＣＲ増幅し、そしてpCR4（商標）BLUNT TOPO（登録商標）（Invitrogen、La Jolla, CA, USA）内にクローン化した。ＰＤＣプロモーター、ターミネータ、及びＵＲＡ３選択マーカーを含むＰＣＲ断片を、ＳＯＥ ＰＣＲによって組み立てた。ＰＤＣプロモーターを、ＰＣＲ産物の３’末端にＰＤＣターミネータに対する相同性を持つプライマーで増幅し、そして、ＰＤＣターミネータ及びＵＲＡ３選択マーカーを、産物の５’末端にＰＤＣプロモーターに対する相同性を有するプライマーを使用して増幅した。そして、これらの２つの断片を、ＳＯＥ ＰＣＲを介して組み立てた。
【０１８１】
ＰＤＣプロモーターを、ｐＡＣＮ５（図１９）からプライマー０６１１１８４と０６１１１９５を使用して増幅した。プライマー０６１１１８４は、ＰＣＲ産物の５’末端にＮｏｔＩ制限部位を導入する。プライマー０６１１１９５は、ＰＤＣプロモーターの後にＸｂａＩ制限部位を導入し、且つ、ＰＣＲ産物の３’末端にＰＤＣターミネータに対する相同性を導入する。
【０１８２】
増幅反応を、製造業者の取扱説明書に従ってPlatinum（登録商標）Pfx DNAポリメラーゼ（Invitrogen）を使用して実施した。各ＰＣＲ反応は、５０μＬの終量の中に０．５μＬの希釈したｐＡＣＮ５（図１９）、それぞれ２５ｐＭのプライマー０６１１１８４と０６１１１９５、１× Pfx増幅バッファー（Invitrogen）、２ｍＭのＭｇＳＯ4、０．２ｍＭのｄＮＴＰミックス、１．２５単位のPlatinum（登録商標）Pfx DNAポリメラーゼ（Invitrogen）を含んでいた。増幅反応物を、９５℃にて２分間を１サイクル；それぞれ９５℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、そして７２℃にて２分間を３０サイクル、それと７２℃にて３分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）でインキュベートした。
【０１８３】
ＰＣＲ産物を、８９ｍＭのＴｒｉｓ塩基‐８９ｍＭのホウ酸‐２ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム（ＴＢＥ）バッファーを使用した１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。約７００ｂｐの断片を、ゲルから切り出し、そしてQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen、Valencia, CA, USA）を使用してアガロースから抽出した。
【０１８４】
ＰＤＣターミネータとＵＲＡ３選択マーカーを、ｐＨＪＪ７６（図２４）からプライマー０６１１１８９及び０６１１１８５を使用して増幅した。プライマー０６１１１８９は、ＰＣＲ産物の５’末端にＰＤＣプロモーターに対する相同性を導入し、且つ、ＰＤＣターミネータの前に直接ＰａｃＩ制限部位を導入する。プライマー０６１１１８５は、ＰＣＲ産物の３’末端にＮｏｔＩ制限部位を導入する。増幅反応を、製造業者の取扱説明書に従ってPlatinum（登録商標）Pfx DNAポリメラーゼ（Invitrogen）を使用して実施した。各ＰＣＲ反応物は、５０μＬの終量に０．５μＬの希釈したｐＨＪＪ７６、それぞれ２５ｐＭのプライマー０６１１１８９及び０６１１１８５、１× Pfx増幅バッファー（Invitrogen）、２ｍＭのＭｇＳＯ4、０．２ｍＭのｄＮＴＰミックス、１．２５単位のPlatinum（登録商標）Pfx DNAポリメラーゼ（Invitrogen）を含んでいた。増幅反応物を、９５℃にて２分間を１サイクル；それぞれ９５℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、そして７２℃にて２分間を３０サイクル、それと７２℃にて３分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）でインキュベートした。
【０１８５】
ＰＣＲ産物を、８９ｍＭのＴｒｉｓ塩基‐８９ｍＭのホウ酸‐２ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム（ＴＢＥ）バッファーを使用した１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。約２０００ｂｐの断片を、ゲルから切り出し、そしてQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用してアガロースから抽出した。
【０１８６】
２０００ｂｐのＰＤＣターミネータ、ＵＲＡ３選択マーカーＰＣＲ産物、及び７００ｂｐのＰＤＣプロモーターＰＣＲ産物を、ＳＯＥ‐ＰＣＲを使用して融合させた。増幅反応を、製造業者の取扱説明書に従ってPlatinum（登録商標）Pfx DNAポリメラーゼ（Invitrogen）を使用して実施した。各ＰＣＲ反応物は、１００μＬの終量に８ｎｇの２０００ｂｐのＰＤＣターミネータ及びＵＲＡ３選択マーカーＰＣＲ産物、２４ｎｇの７００ｂｐのＰＤＣプロモーターＰＣＲ産物、それぞれ５０ｐＭのプライマー０６１１１８４及び０６１１１８５、１× Pfx増幅バッファー（Invitrogen）、２ｍＭのＭｇＳＯ4、０．２ｍＭのｄＮＴＰミックス、２．５単位のPlatinum（登録商標）Pfx DNAポリメラーゼ（Invitrogen）を含んでいた。増幅反応物を、９５℃にて２分間を１サイクル；それぞれ９５℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、そして６８℃にて３分間を３０サイクル、さらに６８℃にて３分間を１サイクルをプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）でインキュベートした。
【０１８７】
２７００ｂｐのＰＣＲ産物を、８９ｍＭのＴｒｉｓ塩基‐８９ｍＭのホウ酸‐２ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム（ＴＢＥ）バッファーを使用した１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。約２７００ｂｐの断片を、ゲルから切り出し、そしてQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用してアガロースから抽出した。
【０１８８】
２７００ｂｐのＰＣＲ産物を、製造業者の取扱説明書に従って配列決定のためのにZero Blunt（登録商標）TOPO（登録商標）PCRクローニングキット（Invitrogen）を使用してpCR（商標）4BLUNT TOPO（登録商標）（Invitrogen）ベクター内にクローン化した。６μＬの総反応容量中で、１又は４μＬの２７００ｂｐのＰＣＲ産物、１μＬの塩類溶液（Invitrogen）及び１μＬのpCR（商標）4BLUNT TOPO（登録商標）（Invitrogen）を、室温にて１５分間、一緒にインキュベートした。２μＬのそれぞれのクローニング反応物を、製造業者の取扱説明書に従って、One Shot（登録商標）TOP10 Chemically CompetentＥ．コリ（Invitrogen）細胞内に形質転換した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＮｏｔＩ消化によって所望のＰＣＲ産物の適切な挿入に関してスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、ＤＮＡ配列決定によって正しいことを確認し、ｐＭＩＢａ１００と呼んだ。
【０１８９】
プラスミドｐＨＪＪ７６（図２４）は、ａｄｈ１２０２遺伝子座に遺伝子組み込みを可能にする相同性を含んでいる。プラスミドｐＨＪＪ７６を、ＮｏｔＩで消化し、ａｄｈ１２０２相同配列の内側に存在しているＵＲＡ３選択マーカーを切り出した。消化したｐＨＪＪ７６を、８９ｍＭのＴｒｉｓ塩基‐８９ｍＭのホウ酸‐２ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム（ＴＢＥ）バッファーを使用した１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。５．２ｋｂｐの断片を、QIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用してアガロースから抽出し、次に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して一つに連結し直した。連結産物を、製造業者の取扱説明書に従って、One Shot（登録商標）TOP10 Chemically CompetentＥ．コリ（Invitrogen）細胞内に形質転換した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＡｐａＩ及びＳａｃＩ消化によってスクリーニングした。所望の消化産物をもたらしたクローンを、ｐＨＪＪ７６‐ｎｏ ｕｒａと呼んだ。
【０１９０】
ｐＭＩＢａ１００（前掲）からのＰＤＣプロモーターとターミネータ、及びＵＲＡ３選択マーカーを、ｐＨＪＪ７６‐ｎｏ ｕｒａ内にクローン化して、遺伝子がａｄｈ１２０２における組み込みのためのＰＤＣプロモーターとターミネータの制御下に置かれるプラスミドを作製した。ｐＨＪＪ７６‐ｎｏ ｕｒａを、ＮｏｔＩで消化し、続いてＣＩＰで処理した。線状の５．２ｋｂｐの断片を、QIAQUICK（登録商標）PCR Purification Kit（Qiagen）を使用して精製した。ｐＭＩＢａ１００を、ＮｏｔＩで消化し、そして８９ｍＭのＴｒｉｓ塩基‐８９ｍＭのホウ酸‐２ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム（ＴＢＥ）バッファーを使用して１％アガロースゲルで泳動した。２７４２ｂｐの断片を、ゲルから切り出し、そしてQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して抽出し、次に、Ｔ４ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅを使用してｐＨＪＪ７６‐ｎｏ ｕｒａの５．２ｋｂｐの断片に連結した。連結産物を、製造業者の取扱説明書に従って、One Shot（登録商標）TOP10 Chemically Competent Ｅ．コリ（Invitrogen）細胞内に形質転換した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩でインキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＫｐｎＩ及びＸｂａＩ消化によってスクリーニングした。所望の消化産物をもたらしたクローンを、ｐＭＩＢａ１０７と呼んだ（図２）。
【０１９１】
実施例２Ｅ：ＰＤＣ遺伝子座において複数の外来遺伝子を発現するための挿入ベクター断片の構築
以下の挿入ベクター断片を、内在性Ｉ．オリエンタリスＰＤＣ遺伝子を、複数の遺伝子、例えば、ＰＤＣ、ＥＮＯ１、及びＴＤＨ３プロモーターから発現される本明細書中に記載した３つ遺伝子を発現するカセットに置き換える設計ＤＮＡ構築物を作り出すのに使用できる。左の構築物（ｐＭｈＣｔ０６８及び誘導体）と右の構築物（ｐＭｈＣｔ０６９及び誘導体）の間の相同組み換えは、ＵＲＡ３タンパク質の発現をもたらし、そしてそれは、菌株のウラシル栄養要求性からウラシル原栄養性への転換をもたらして、所望の組み込み体の選択を可能にする。それぞれの左側構築物の５’末端は、ＰＤＣ遺伝子座のＤＮＡ上流に相同であるのに対して、それぞれの右側構築物の３’末端は、ＰＤＣ遺伝子座のＤＮＡ下流に相同である。これらの相同領域は、ＰＤＣ遺伝子座に発現カセットを標的化するのに役立つ。この標的化アプローチを、図３に図式的に示し、そして、いずれかの好適な遺伝子座を標的とするために、本明細書中に記載した複数の遺伝子のいずれかの組み合わせ、例えば、先に記載したいずれかの遺伝子座、例えば、ＡＤＨ遺伝子座（以下の例を参照のこと）又はＡＬＤ遺伝子座など、を使用するように改変できる。
【０１９２】
左側断片の構築
空ベクターである左側構築物（ｐＭｈＣｔ０６８）を、以下で記載するように複数のステップでクローン化した。
【０１９３】
ＰＤＣプロモータ領域と所望の追加制限部位を含むＰＣＲ断片及びフランキングＤＮＡを、ゲノムＩ．オリエンタリスＤＮＡからプライマー０６１１１６６と０６１１１６７を使用して増幅した。
【０１９４】
ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１００ｎｇのゲノムＩ．オリエンタリスＤＮＡ（例えば、EPICENTRE（登録商標）BiotechnologiesからMasterPure（商標）Yeast DNA Purification Kitを使用して調製可能）、１× ThermoPol反応バッファー（New England Biolabs）、それぞれ１００ｐｍｏｌのプライマー０６１１１６６と０６１１１６７、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、２μＬの１００ｍＭ ＭｇＳＯ4、及び２単位のVentR（登録商標）(exo-) DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を含んでいた。ＰＣＲを、９４℃にて２分間を１サイクル分と続く、それぞれ９４℃にて３０秒間、５４℃にて３０秒間、そして７２℃にて１分間を３４サイクル、それと７２℃にて１０分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約７８０塩基対のＰＣＲ産物を、ゲルから切り出す、ＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel、Bethlehem, PA, USA）を使用して精製した。
【０１９５】
ＴＡＬターミネータ領域と所望の追加制限部位を含むＰＣＲ断片、及びフランキングＤＮＡを、ｐＡＣＮ５（図１９）からプライマー０６１１１６８と０６１１１６９を使用して増幅した。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１μＬのｐＡＣＮ５ミニプレッププラスミドＤＮＡ、１× iProof（商標）HFバッファー（Bio-Rad Laboratories、Hercules, CA, USA）、それぞれ１００ｐｍｏｌのプライマー０６１１１６８と０６１１１６９、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、１．５μＬのＤＭＳＯ、及び１単位のiProof（商標）High Fidelity DNAポリメラーゼ（Bio-Rad Laboratories）を含んていた。ＰＣＲを、９８℃にて３０秒間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて１０秒間、５９℃にて２０秒間、そして７２℃にて４５秒間を３４サイクル、それと７２℃にて１０分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約４６０塩基対のＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０１９６】
次に、ＰＣＲを、上記の産物の両方を融合して一つの増幅産物を作製するのに使用した。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１２５ｎｇのＰＤＣプロモーター含有ＰＣＲ産物、７６ｎｇのＴＡＬターミネータ含有ＰＣＲ産物、１× ThermoPol反応バッファー（New England Biolabs）、それぞれ１００ｐｍｏｌのプライマー０６１１１６６と０６１１１６９、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、２μＬの１００ｍＭ ＭｇＳＯ4、及び２単位のVentR（登録商標）(exo-) DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を含んでいた。ＰＣＲを、９４℃にて２分間を１サイクルと続く、それぞれ９４℃にて３０秒間、５４℃にて３０秒間、そして７２℃にて１分と３０秒間を３４サイクル、それと７２℃にて１０分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約１２５０塩基対のＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０１９７】
ＥＮＯ１プロモータ領域と所望の追加制限部位を含むＰＣＲ断片、及びフランキングＤＮＡを、ｐＡＣＮ４３（図２２）からプライマー０６１１１７０と０６１１１７１を使用して増幅した。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１μＬのｐＡＣＮ４３ミニプレッププラスミドＤＮＡ、１× Phusion HFバッファー（New England Biolabs）、それぞれ１００ｐｍｏｌのプライマー０６１１１７０と０６１１１７１、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、並びに１単位のPhusion（商標）High Fidelity DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を含んでいた。ＰＣＲを、９８℃にて３０秒間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて１０秒間、５９℃にて２０秒間、そして７２℃にて４５秒間を３４サイクル、それと７２℃にて１０分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、１０５０塩基対のＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０１９８】
所望の追加制限部位及びフランキングＤＮＡと共に、ＲＫＩターミネータ領域とそれに続く、ＵＲＡ３プロモータ領域とＵＲＡ３ ＯＲＦの５’末端を含むＰＣＲ断片を、ｐＡＣＮ４３（図２２）からプライマー０６１１１７２と０６１１１７３を使用して増幅した。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１μＬのｐＡＣＮ４３ミニプレッププラスミドＤＮＡ、１× iProof（商標）HFバッファー（Bio-Rad Laboratories）、それぞれ１００ｐｍｏｌのプライマー０６１１１７２と０６１１１７３、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、１．５μＬのＤＭＳＯ、並びに１単位のiProof（商標）High Fidelity DNAポリメラーゼ（Bio-Rad Laboratories）を含んでいた。ＰＣＲを、９８℃にて３０秒間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて１０秒間、５９℃にて２０秒間、そして７２℃にて４５秒間を３４サイクル、それと７２℃にて１０分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物は、１４００塩基対のＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０１９９】
ＰＣＲを、上記の産物の両方を融合して一つの増幅産物を作製するのに使用した。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、９３ｎｇのＥＮＯ１プロモーター含有ＰＣＲ産物（前掲）；１２５ｎｇのＲＫＩターミネータ、ＵＲＡ３プロモーター、及び部分的なＯＲＦ含有ＰＣＲ産物（前掲）；１× Phusion HFバッファー（New England Biolabs）；それぞれ１００ｐｍｏｌのプライマー０６１１１７０と０６１１１７３；それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ；１．５μＬのＤＭＳＯ；並びに１単位のPhusion（商標）High Fidelity DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を含んでいた。
ＰＣＲを、９８℃にて３０秒間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて１０秒間、５６℃にて２０秒間、そして７２℃にて２分と４５秒間を３４サイクル、それと７２℃にて１０分間の最終伸長をでをプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、２４６０塩基対のＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０２００】
ＰＣＲ産物のための受容ベクターを作製するために、プラスミドｐＭｈＣｔ０１７（無関係の挿入物を有する標準的なクローニングベクターｐＵＣ１９）を、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、１０単位の仔ウシ腸ホスファターゼ（New England Biolabs）で３７℃にて３０分間処理し、そしてＴＡＥバッファー中の０．９％がアガロースゲル電気泳動によって精製し、さらに、約２．６ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。得られたＨｉｎｄＩＩＩ〜ＥｃｏＲＩ精製断片は、ｐＵＣ１８（Yanisch-Perron, C, Vieira, J. and Messing, J. (1985) Gene, 33, 103-119）で見られたものと同一であった。
【０２０１】
そして、先の精製した１２５０ｂｐ及び２４６０ｂｐのＰＣＲ産物を、１２５ｎｇのｐＭｈＣｔ０１７のＨｉｎｄＩＩＩ〜ＥｃｏＲＩベクター断片、９２ｎｇのＰＤＣプロモーターとＴＡＬターミネータＰＣＲ産物、１６５ｎｇのＥＮＯ１プロモーターとＵＲＡ３プロモーター、及び部分的なＯＲＦ含有ＰＣＲ産物、１× In-Fusionバッファー（Clontech）、及び１μＬのIn-Fusion（商標）酵素（Clontech）から構成される１０μＬの総反応物容量でIn-Fusion（商標）Advantage PCR Cloning Kit（Clontech）を使用して消化したｐＭｈＣｔ０１７断片内に挿入した。反応を、３７℃にて分間、５０℃にて１５分間インキュベートし、その後、氷上に置いた。次に、反応物を、４０μＬのＴＥバッファーで希釈し、そして、２．５μＬを、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPack Gold SuperCompetent Cells（Agilent Technologies）を形質転換するのに使用した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、Ａｐａ ＬＩ消化によって所望のＰＣＲ産物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、ＤＮＡ配列決定によって正しいと確認し、そしてｐＭｈＣｔ０６８と呼んだ。
【０２０２】
プラスミドｐＭｈＣｔ０６８は、ＰＤＣプロモータ領域とそれに続く、本明細書中に記載した着目の異所性遺伝子の追加のためのＮｈｅＩ及びＡｓｃＩ制限部位、ＴＡＬターミネータ、ＥＮＯ１プロモータ領域とそれに続く、本明細書中に記載した着目の第２の異所性遺伝子のクローニングのためのＸｂａＩ及びＰａｃＩ制限部位、ＲＫＩターミネータ、Ｉ．オリエンタリスＵＲＡ３プロモーター、並びにＩ．オリエンタリスＵＲＡ３ ＯＲＦの５’末端を含んでいる。プラスミドｐＭｈＣｔ０６８は、ＰＤＣプロモーター内に約２００ｂｐのＡからＴへのヌクレオチド変化、ＰＤＣプロモータ内にその約２／３にＧからＴへの変化、並びにＮｈｅＩ制限部位の５’側に存在する未熟開始コドン（ＡＴＧ）を持つことがわかった。従って、ｐＭｈＣｔ０６８の修正版を、以下で記載するように構築した。
【０２０３】
ＰＤＣプロモータ領域を、ｐＡＣＮ５（図１９）からプライマー０６１１１６６と０６１１８２８を用いてＰＣＲ増幅し、これで、上記の望ましくない開始コドンを導入することはない。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１μＬの１〜５０倍希釈のｐＡＣＮ５のミニプレップ、１× ThermoPol反応バッファー（New England Biolabs）、それぞれ１００ｐｍｏｌのプライマー０６１１１６６と０６１１８２８、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、２μＬの１００ｍＭ ＭｇＳＯ4、並びに２単位のVentR（登録商標）(exo-) DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を含んでいた。ＰＣＲを、９４℃にて２分間を１サイクルと続く、それぞれ９４℃にて３０秒間、５４℃にて３０秒間、そして７２℃にて１分間を３４サイクル、それと７２℃にて１０分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約７８０塩基対のＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０２０４】
そして、ＰＤＣプロモーター含有ＰＣＲ産物を、先に記載したように、ＴＡＬターミネータ含有ＰＣＲ産物に融合させた。ＴＡＬターミネータＰＣＲ断片は０６１１１６８プライマーを用いて作製したので、得られたＰＣＲ融合産物は、未熟開始コドンを欠き、且つ、望ましくない開始コドンを含んでいる産物を伴った混合物のはずである。得られた〜１２５０ｂｐのＰＣＲ産物を、精製し、そしてIn-Fusion（商標）Advantage PCR Cloning Kit（Clontech）によってＲＫＩターミネータ、ＵＲＡ３プロモーター、及び先に記載した融合ＰＣＲ産物とｐＵＣ１８を含む部分的なＯＲＦと組み合わせた。予想されるＡｐａＬＩ消化パターンをもたらすクローンは、ＰＤＣプロモーター内の変異群の所望の不存在、及びＮｈｅＩ制限部位の未熟ＡＴＧ５’の欠損を含めて、ＤＮＡ配列決定によって正しいことが示され、そしてｐＭｈＣｔ０８２と呼ばれた。
【０２０５】
右側断片の構築
空ベクターである右側構築物（ｐＭｈＣｔ０６９）を、以下で記載するように複数のステップでクローン化した。
【０２０６】
Ｉ．オリエンタリスＵＲＡ３ ＯＲＦの３’末端、ＵＲＡ３ターミネータ（ＵＲＡ３終止コドンの２７５ｂｐ下流）、ＵＲＡ３プロモーター（酵母宿主内への組み込み後にマーカーのループアウトための反復領域として機能する）及び所望の追加制限部位、並びにフランキングＤＮＡを含むＰＣＲ断片を、ｐＡＣＮ４３（図２２）からプライマー０６１１１７４と０６１１１７５を使用して増幅した。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１μＬのｐＡＣＮ４３ミニプレッププラスミドＤＮＡ、１× Phusion HFバッファー（New England Biolabs）、それぞれ１００ｐｍｏｌのプライマー０６１１１７４と０６１１１７５、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、並びに１単位のPhusion（商標）High Fidelity DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を含んでいた。ＰＣＲを、９８℃にて３０秒間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて１０秒間、５９℃にて２０秒間、そして７２℃にて４５秒間を３４サイクル、それと７２℃にて１０分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約１２１０ｂｐのＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０２０７】
ＴＤＨ３プロモータ領域と所望の追加制限部位を含むＰＣＲ断片、及びフランキングＤＮＡを、ｐＡＣＮ２３（図２０）からプライマー０６１１１７６と０６１１１７７を使用して増幅した。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１μＬのｐＡＣＮ２３ミニプレッププラスミドＤＮＡ、１× Phusion HFバッファー（New England Biolabs）、それぞれ１００ｐｍｏｌのプライマー０６１１１７６と０６１１１７７、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、並びに１単位のPhusion（商標）High Fidelity DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を含んでいた。ＰＣＲを、９８℃にて３０秒間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて１０秒間、５９℃にて２０秒間、そして７２℃にて４５秒間を３４サイクル、それと７２℃にて１０分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約１０２８ｂｐのＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０２０８】
Ｉ．オリエンタリスＰＤＣ遺伝子領域の終止コドンの３’領域（ＰＤＣターミネータ領域）と所望の追加制限部位を含むＰＣＲ断片、及びフランキングＤＮＡを、Ｉ．オリエンタリスゲノムＤＮＡからプライマー０６１１１７８と０６１１１７９を使用して増幅した。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１００ｎｇのＩ．オリエンタリスゲノムＤＮＡ、１× iProof（商標）HFバッファー（Bio-Rad Laboratories）、それぞれ１００ｐｍｏｌのプライマー０６１１１７８と０６１１１７９、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、１．５μＬのＤＭＳＯ、並びに１単位のiProof（商標）High Fidelity DNAポリメラーゼ（Bio-Rad Laboratories）を含んでいた。ＰＣＲを、９８℃にて３０秒間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて１０秒間、５９℃にて２０秒間、そして７２℃にて４５秒間を３４サイクル、それと７２℃にて１０分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約９３８塩基対のＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０２０９】
ＰＣＲを、先に記載した最後の２つのＰＣＲ産物の両方を融合して一つの増幅産物を作製するのに使用した。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１２５ｎｇＴのＤＨ３プロモーター含有ＰＣＲ産物、１１４ｎｇのＰＤＣターミネータ領域含有ＰＣＲ産物、１× Phusion HFバッファー（New England Biolabs）、それぞれ１００ｐｍｏｌのプライマー０６１１１７６と０６１１１７９、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、並びに１単位のPhusion（商標）High Fidelity DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を含んでいた。ＰＣＲを、９８℃にて３０秒間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて１０秒間、５６℃にて２０秒間、そして７２℃にて２分と３０秒間を３４サイクル、それと７２℃にて１０分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、１９６６塩基対のＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして、製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０２１０】
次に、精製した１２１０ｂｐのＰＣＲ産物と、上記からの１９６６ｂｐのＰＣＲ融合産物を、先に記載したＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ消化ｐＭｈＣｔ０１７断片内に、In-Fusion（商標）Advantage PCR Cloning Kit（Clontech）を使用して、１２５ｎｇのｐＭｈＣｔ０１７ＨｉｎｄＩＩＩ〜ＥｃｏＲＩベクター断片、５４ｎｇのＵＲＡ３ ＯＲＦの３’末端とそれに続くＵＲＡ３ターミネータを含むＰＣＲ産物は、２００ｎｇのＴＤＨ３プロモーター及びＰＤＣターミネータ融合ＰＣＲ産物、１× In-Fusion反応バッファー（Clontech）、及び１μＬのIn-Fusion（商標）酵素（Clontech）から構成される１０μＬの総反応物容量中で挿入した。反応物を、３７℃にて１５分間、５０℃にて１５分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。反応物を、４０μＬのＴＥバッファーで希釈し、そして、２．５μＬを、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPack Gold SuperCompetent Cells（Agilent Technologies）を形質転換するのに使用した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、Ａｐａ ＬＩ消化によって所望のＰＣＲ産物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、ＤＮＡ配列決定によって正しいと確認し、ｐＭｈＣｔ０６９と呼んだ。
【０２１１】
プラスミドｐＭｈＣｔ０６９は、Ｉ．オリエンタリスＵＲＡ３マーカーの３’末端、対応するＵＲＡ３ターミネータ、ＵＲＡ３プロモーター（後のＵＲＡ３マーカーのループアウトための）、ＴＤＨ３プロモーター、異所性発現のための所望遺伝子のサブクローニングのためのＸｂａＩ及びＰａｃＩ制限部位、並びにＰＤＣ遺伝子座の３’フランキング領域を含んでいる。
【０２１２】
実施例２Ｆ：ａｄｈ９０９１遺伝子座において複数の外来遺伝子を発現するための挿入ベクター断片の構築：
以下の挿入ベクター断片を、内在性Ｉ．オリエンタリスａｄｈ９０９１遺伝子を本明細書中に記載した着目の複数の遺伝子を発現するカセットに置き換えるために、実施例２Ｅに記載のものと同様のアプローチを使用して設計した。
【０２１３】
左側断片の構築
空ベクターである左側構築物（ｐＧＲＥｒ１２５）を、以下で記載するように複数のステップでクローン化した。
【０２１４】
Ｉ．オリエンタリスａｄｈ９０９１遺伝子座における相同組み換えに必要である５’隣接部を含んだ構築物、並びに空の発現カセットＰＤＣプロモーター／ＴＡＬターミネータを、ベクタープラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Invitrogen）内にＰＣＲクローン化した。ＰＤＣプロモーター断片を、プラスミドｐＡＣＮ５（図１９）からプライマー０６１１２５０と０６１１２５１を使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１５ｎｇのプラスミドｐＡＣＮ５ＤＮＡ、１× Phusion HFバッファー（New England Biolabs）、それぞれ５０ｐｍｏｌのプライマー０６１１２５０と０６１１２５１、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、１．５μＬの１００％ ＤＭＳＯ（New England Biolabs）、並びに１単位のPhusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を含んでいた。ＰＣＲを、９８℃にて２分間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、そして７２℃にて１分と３０秒間を３５サイクル、それと７２℃にて７分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約９００ｂｐのＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＢＥバッファー中での０．８％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。得られたＰＣＲ断片の全長は、約７５３ｂｐであり、断片の５’末端にＮｏｔＩ制限部位があり、且つ、断片の３’末端にＰａｃＩ及びＸｂａＩ制限部位がある。
【０２１５】
プライマー０６１１２５２と０６１１２５３を使用してプラスミドｐＡＣＮ５（図１９）からＴＡＬターミネータ領域を増幅するために、ＸｂａＩ及びＰａｃＩ制限部位を含む先のＰＣＲ産物に対する５’相同性を含む第２のＰＣＲ断片を作製した。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１５ｎｇのプラスミドｐＡＣＮ５ＤＮＡ（前掲）、１× Phusion HFバッファー（New England Biolabs）、それぞれ５０ｐｍｏｌのプライマー０６１１２５２と０６１１２５３、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、１．５μＬの１００％ ＤＭＳＯ（New England Biolabs）、並びに１単位のPhusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を含んでいた。ＰＣＲを、９８℃にて２分間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、そして７２℃にて１分と３０秒間を３５サイクル、それと７２℃にて７分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約９００ｂｐのＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＢＥバッファー中での０．８％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。得られたＰＣＲ断片の全長は、約４３５ｂｐであり、断片の５’末端にＸｂａＩ及びＰａｃＩ制限部位があり、３’末端にはＰｍｅＩ制限部位があった。
【０２１６】
７５３ｂｐの断片と４３５ｂｐの断片を、プライマー０６１１２５０と０６１１２５３を使用したＰＣＲによって１つに融合させ、そして、ＰＤＣプロモーターがＴＡＬターミネータの上流にある１１４９ｂｐの断片を得た。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１２５ｎｇの７５３ｂｐの断片、７５ｎｇの４３５ｂｐの断片、１× Phusion HFバッファー（New England Biolabs）、それぞれ５０ｐｍｏｌのプライマー０６１１２５０と０６１１２５３、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、１．５μＬの１００％ ＤＭＳＯ（New England Biolabs）、並びに１単位のPhusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を含んでいた。ＰＣＲを、９８℃にて２分間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、そして７２℃にて１分間を３５サイクル、それと７２℃にて７分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約１１４９ｂｐのＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＢＥバッファー中での０．８％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。
【０２１７】
プライマー０６１１２５４と０６１１２５５を使用してＩ．オリエンタリスａｄｈ９０９１遺伝子座の５’隣接部を増幅するために、ＮｏｔＩ制限部位を含む、先の１１４９ｂｐのＰＣＲ産物に対して３’相同性を含むＰＣＲ断片を作製した。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１５ｎｇの鋳型ＤＮＡとしてのプラスミドｐＨＪＪ２７（図２１）、１× Phusion HFバッファー（New England Biolabs）、それぞれ５０ｐｍｏｌのプライマー０６１１２５４と０６１１２５５、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、１．５μＬの１００％ ＤＭＳＯ（New England Biolabs）、並びに１単位のPhusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を含んでいた。ＰＣＲを、９８℃にて２分間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、そして７２℃にて１分と３０秒間を３５サイクル、それと７２℃にて７分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約９００ｂｐのＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＢＥバッファー中での０．８％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。得られたＰＣＲ断片の全長は、約８９１ｂｐであり、断片の５’末端にはＨｐａＩ制限部位があり、且つ、３’末端にはＮｏｔＩ制限部位があった。
【０２１８】
そして、８９１ｂｐの断片を、プライマー０６１１２５４と０６１１２５３を使用したＰＣＲによって１１４９ｂｐのＰＤＣプロモーター／ＴＡＬターミネータ断片の上流に融合させ、そして約２００５ｂｐの断片を作製した。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１２５ｎｇの１１４９ｂｐの断片、９５ｎｇの８９１ｂｐの断片、１× Phusion HFバッファー（New England Biolabs）、それぞれ５０ｐｍｏｌのプライマー０６１１２５４と０６１１２５３、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、１．５μＬの１００％ ＤＭＳＯ（New England Biolabs）、並びに１単位のPhusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を含んでいた。ＰＣＲを、９８℃にて２分間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、そして７２℃にて２分間を３５サイクル、それと７２℃にて７分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約２００５ｂｐのＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＢＥバッファー中での０．８％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。
【０２１９】
ａｄｈ９０９１遺伝子座における組み込みのための５’隣接部を含む２００５ｂｐの得られた断片、ＰＤＣプロモーター、及びＴＡＬターミネータを、製造業者の取扱説明書に従ってTOPO TA Cloningキット（Invitrogen）を使用して、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター内にクローン化し、そしてOne-Shot TOP10Ｅ．コリ細胞内に形質転換した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＡｖａＩ消化によって所望の断片の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを確認し、そしてｐＧＭＥｒ１１２と呼んだ。プラスミドｐＧＭＥｒ１１２は、ａｄｈ９０９１遺伝子座における相同組み換えのための５’隣接部と、それに続く空の発現カセットＰＤＣプロモーター／ＴＡＬターミネータを含む。
【０２２０】
ＵＲＡ３プロモーター断片によって駆動される切断５’ＵＲＡ３マーカー遺伝子を、プラスミドｐＨＪＪ２７（図２１）からプライマー０６１１２８３と０６１１２６３を使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１５ｎｇのプラスミドｐＨＪＪ２７、１× Phusion HFバッファー（New England Biolabs）、それぞれ５０ｐｍｏｌのプライマー０６１１２６３と０６１１２８３、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、１．５μＬの１００％ ＤＭＳＯ（New England Biolabs）、並びに１単位のPhusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を含んでいた。ＰＣＲを、９８℃にて２分間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、そして７２℃にて１分と３０秒間を３５サイクル、それと７２℃にて７分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約９００ｂｐのＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＢＥバッファー中での０．８％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。得られたＰＣＲ断片の全長は約８８５ｂｐであり、断片の５’末端にはＨｐａＩ及びＰｍｅＩ制限部位があり、且つ、３’末端にはＮｈｅＩ制限部位がある。
【０２２１】
得られた８８５ｂｐの断片を、製造業者の取扱説明書に従ってTOPO TA Cloningキット（Invitrogen）を使用してｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター内にクローン化し、そしてOne-Shot TOP10Ｅ．コリ細胞内に形質転換した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＢｇｌＩ消化によって所望の挿入物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを確認し、そしてｐＧＭＥｒ１０８と呼んだ。プラスミドｐＧＭＥｒ１０８は、ＵＲＡ３プロモーターとそれに続く、ＵＲＡ３遺伝子の切断５’セグメントを含んでおり、そうした断片には、５’末端にＨｐａＩ及びＰｍｅＩが、３’末端にＮｏｔＩ制限部位が隣接する。
【０２２２】
５’ａｄｈ９０９１隣接部とそれに続く、構築物ＰＤＣプロモーター／ＴＡＬターミネータを含んでいる、プラスミドｐＧＭＥｒ１１２（前掲）からの１９９８ｂｐのＨｐａＩ及びＰｍｅＩ制限断片を、ＨｐａＩ及びＰｍｅＩによって線状にしたｐＧＭＥｒ１０８（前掲）からの４８０６ｂｐのベクターに連結した。二重制限反応産物を、１９９８ｂｐの挿入物断片及び４８０６ｂｐのベクター断片をゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製する、ＴＢＥバッファー中での０．８％アガロースゲル電気泳動によって分離した。連結反応を、１：３のベクター：挿入物比を使用して実施した；特に反応物を、２μＬの４８０６ｂｐの線状ベクター、６μＬの１９９８ｂｐの挿入物断片、９μＬの２× Quick Ligation反応バッファー、及び１μＬのQuick T4 DNA Ligase（New England Biolabs）を用いてセットし、そして製造業者の取扱説明書に従って実施した。
【０２２３】
５μＬの連結産物を、製造業者の取扱説明書に従って、Ｅ．コリXL10-Gold（登録商標）Ultracompetent Cells（Agilent Technologies）に形質転換した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＨｉｎｄＩＩＩ消化によって所望の挿入物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、確認し、そしてｐＧＭＥｒ１１７と呼んだ。
【０２２４】
プラスミドｐＧＭＥｒ１１７は、５’ａｄｈ９０９１隣接部とそれに続く、空の発現カセットＰＤＣプロモーター／ＴＡＬターミネータ、及びＵＲＡ３プロモーターによって駆動される切断５’ＵＲＡ３遺伝子を含む。さらに、プラスミドｐＧＭＥｒ１１７は、異なった２つのＸｂａＩ制限部位：着目遺伝子を挿入するのに使用できるＰＤＣプロモーターとＴＡＬターミネータの間の（且つ、制限部位ＰａｃＩに隣接する）第１の制限部位、及び本来のｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ骨格から引き継がれた第２のＸｂａＩ制限部位、を担持する。この第２のＸｂａＩ制限部位を取り除くために、プラスミドｐＧＭＥｒ１１７を、制限酵素ＡｐａＩで消化し、次に、線状プラスミドを、製造業者の取扱説明書に従って酵素ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージ（クレノー）フラグメント（New England Biolabs）で処理した。得られた線形ベクター（平滑末端を含む）を、制限酵素ＥｃｏＲＶで消化し、そしてそれは、ベクターからＸｂａＩ制限部位を含む４３ｂｐの断片を切り取った。制限反応産物を、ＴＢＥバッファー中での０．８％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして６７６１ｂｐのベクター断片を、ゲルから切り出し、製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。自己連結反応物を、３μＬの線状ベクター、６μＬの無菌の再蒸留水、１０μＬの２× Quick Ligation反応バッファー、及び１μＬのQuick T4 DNA Ligase（New England Biolabs）を用いて準備し、そして製造業者の取扱説明書に従って実施した。
【０２２５】
５μＬの連結産物を、製造業者の取扱説明書に従ってＥ．コリXL10-Gold（登録商標）Ultracompetent Cells（Agilent Technologies）に形質転換した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＸｂａＩ消化によって所望の挿入物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、確認し、そしてｐＧＭＥｒ１２２と呼んだ。
【０２２６】
ＥＮＯ１プロモーター断片を、プラスミドｐＡＣＮ４３（図２２）からプライマー０６１１２９５と０６１１２９６を使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１５ｎｇのプラスミドｐＡＣＮ４３、１× Phusion HFバッファー（New England Biolabs）、それぞれ５０ｐｍｏｌのプライマー０６１１２９５と０６１１２９６、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、１．５μＬの１００％ ＤＭＳＯ（New England Biolabs）、並びに１単位のPhusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を含んでいた。ＰＣＲを、９８℃にて２分間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、そして７２℃にて１分間を３５サイクル、それと７２℃にて７分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約１００９ｂｐのＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＢＥバッファー中での０．８％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。得られたＰＣＲ断片の全長は約１００９ｂｐであって、断片の５’末端にはＰｍｅＩ制限部位があり、且つ、３’末端にはＡｐａＩ及びＮｒｕＩ制限部位がある。
【０２２７】
ＮｒｕＩ及びＡｐａＩ制限部位を含んでいる、先のＰＣＲ産物に対する５’相同性を含む第２のＰＣＲ断片を、ＲＫＩターミネータ領域を増幅するために、プラスミドｐＡＣＮ４３（図２２）からプライマー０６１１２９７と０６１１２９８を使用して作製した。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１５ｎｇのプラスミドｐＡＣＮ４３ＤＮＡ、１× Phusion HFバッファー（New England Biolabs）、それぞれ５０ｐｍｏｌプライマーの０６１１２９７と０６１１２９８、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、１．５μＬの１００％ ＤＭＳＯ（New England Biolabs）、並びに１単位のPhusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を含んでいた。ＰＣＲを、９８℃にて２分間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、そして７２℃にて１分間を３５サイクル、それと７２℃にて７分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約４３８ｂｐのＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＢＥバッファー中での０．８％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。得られたＰＣＲ断片の全長は約４３８ｂｐであって、その断片の５’末端にはＮｒｕＩ及びＡｐａＩ制限部位があり、且つ、その断片の３’末端にはＰｍｅＩ制限部位があった。
【０２２８】
１００９ｂｐのプロモーター断片と４３８ｂｐのターミネータ断片を、プライマー０６１１２９５と０６１１２９８を使用したＰＣＲによって１つに融合させ、ＥＮＯ１プロモーターがＲＫＩターミネータの上流に存在する、約１４４７ｂｐの断片を得た。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１２５ｎｇの１００９ｂｐの断片、６５ｎｇの４３８ｂｐの断片、１× Phusion HFバッファー（New England Biolabs）、それぞれ５０ｐｍｏｌのプライマー０６１１２９５と０６１１２９８、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、１．５μＬのＤＭＳＯ（New England Biolabs）、並びに１単位のPhusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を含んでいた。ＰＣＲを、９８℃にて２分間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、そして７２℃にて２分間を３５サイクル、それと７２℃にて７分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約１４４７ｂｐのＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＢＥバッファー中での０．８％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。
【０２２９】
ＥＮＯ１プロモーター／ＲＫＩターミネータ構築物を含んでいる、得られた１４４７ｂｐの断片を、製造業者の取扱説明書に従ってTOPO TA Cloningキット（Invitrogen）を使用して、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター内にクローン化し、そしてOne-Shot TOP10Ｅ．コリ細胞内に形質転換する。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上に平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＢａｍＨＩ消化によって所望の断片の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、確認し、そしてｐＧＭＥｒ１１４と呼ぶが、それは、空の発現カセットＥＮＯ１プロモーター／ＲＫＩターミネータを含んでいた。
【０２３０】
プラスミドｐＧＭＥｒ１２２及びｐＧＭＥｒ１１４を、３７℃にて３時間、制限酵素ＰｍｅＩで消化した。末端を脱リン酸化し、そして自己連結を予防するために、それぞれの消化反応を止める約一時間前に、１μＬのCalf Intestinal Alkaline Phosphatase（New England Biolabs）をそれぞれの消化チューブに加えた。プラスミドｐＧＭＥｒ１２２からの６７６１ｂｐの得られたベクター断片、及びプラスミドｐＧＭＥｒ１１４からの構築物ＥＮＯ１プロモーター／ＴＡＬターミネータ（１４３９ｂｐ）を含んでいる得られた挿入物断片を、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製する、１× ＴＢＥバッファー中での０．８％アガロースゲル電気泳動によって分離した。
【０２３１】
次に、３μＬのプラスミドｐＧＭＥｒ１２２からベクター断片、４μＬのプラスミドｐＧＭＥｒ１１４からの挿入物断片、２μＬの無菌のｄｄ水、１０μＬの２× Quick Ligaseバッファー、及び１μＬのQuick T4 Ligase（New England Biolabs）を含んでいる、それに続く連結反応物を調製し、そして製造業者の取扱説明書に従って実施した。５μＬの先の連結反応物のアリコートを、製造業者の取扱説明書に従ってXL10-Gold（登録商標）UltracompetentＥ．コリ細胞（Agilent Technologies）に形質転換した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＸｂａＩ及びＢｓｔＢＩを使用した消化によって所望の挿入物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、配列決定によって確認し、そしてｐＧＭＥｒ１２５と呼んだ。ＥＮＯ１プロモーター／ＲＫＩターミネータ構築物を、反対方向に挿入し、（ａ）及び（ｂ）と呼ぶ２つのバージョンのプラスミドｐＧＭＥｒ１２５を得た（図４及び５）。
【０２３２】
プラスミドｐＧＭＥｒ１２５ａ及びｐＧＭＥｒ１２５ｂは、
ＰＤＣプロモータ領域、ＴＡＬターミネータ、ＥＮＯ１プロモータ領域、ＲＫＩターミネータ、Ｉ．オリエンタリスＵＲＡ３プロモーター、対応するＵＲＡ３マーカーの５’末端、及びＩ．オリエンタリスａｄｈ９０９１遺伝子座の５’フランキング領域を含んでいる。
【０２３３】
右側断片の構築
空ベクターである右側構築物（ｐＧＲＥｒ１２１）を、以下で記載するように複数のステップでクローン化した。
【０２３４】
ＴＤＨ３プロモーター断片を、プラスミドｐＡＣＮ２３（図２０）からプライマー０６１１２５６と０６１１２５７を使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１５ｎｇのプラスミドｐＡＣＮ２３ＤＮＡ、１× Phusion HFバッファー（New England Biolabs）、それぞれ５０ｐｍｏｌのプライマー０６１１２５６と０６１１２５７、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、１．５μＬの１００％ ＤＭＳＯ（New England Biolabs）、並びに１単位のPhusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を含んでいた。ＰＣＲを、９８℃にて２分間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、そして７２℃にて１分と３０秒間を３５サイクル、それと７２℃にて７分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約９９４ｂｐのＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＢＥバッファー中での０．８％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。得られたＰＣＲ断片の全長は約９９４ｂｐであって、その断片の５’末端にはＳｆｏＩ制限部位があり、且つ、３’ 末端にはＰａｃＩ及びＮｒｕＩ制限部位があった。
【０２３５】
ＮｒｕＩ及びＰａｃＩ制限部位を含んでいる、先のＰＣＲ産物に対して５’相同性を含む第２のＰＣＲ断片を、ＴＫＬターミネータ領域を増幅するために、プラスミドｐＡＣＮ２３（図２０）からプライマー０６１１２５８と０６１１２５９を使用して作製した。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１５ｎｇのプラスミドｐＡＣＮ２３ＤＮＡ、１× Phusion HFバッファー（New England Biolabs）、それぞれ５０ｐｍｏｌのプライマー０６１１２５８と０６１１２５９、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、１．５μＬの１００％ ＤＭＳＯ（New England Biolabs）、並びに１単位のPhusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を含んでいた。ＰＣＲを、９８℃にて２分間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、そして７２℃にて１分と３０秒間を３５サイクル、それと７２℃にて７分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約４６９ｂｐのＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＢＥバッファー中で０．８％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。得られたＰＣＲ断片の全長は約４６９ｂｐであって、その断片の５’末端にはＮｒｕＩ及びＰａｃＩ制限部位があり、且つ、３’末端にはＮｏｔＩ制限部位があった。
【０２３６】
先の９９４ｂｐ及び４６９ｂｐの断片を、プライマー０６１１２５６と０６１１２５９を使用したＰＣＲによって１つに融合させ、そしてＴＤＨ３プロモーターがＴＫＬターミネータの上流にある約１４３３ｂｐの断片を得た。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１２５ｎｇの９９４ｂｐの断片、６０ｎｇの４６９ｂｐの断片、１× Phusion HFバッファー（New England Biolabs）、それぞれ５０ｐｍｏｌのプライマー０６１１５９と０６１１２５６、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、１．５μＬの１００％ ＤＭＳＯ（New England Biolabs）、並びに１単位のPhusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を含んでいた。ＰＣＲを、９８℃にて２分間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、そして７２℃にて１分間を３５サイクル、それと７２℃にて７分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約１４３３ｂｐのＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＢＥバッファー中での０．８％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。
【０２３７】
ＮｏｔＩ制限部位を含んでいる先の１４３３ｂｐのＰＣＲ産物の３’末端に対して５’相同性を含むＰＣＲ断片を、ａｄｈ９０９１遺伝子座の３’隣接部を増幅するために、プライマー０６１１２６０と０６１１２６１を使用して作製した。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、鋳型ＤＮＡとして１５ｎｇのプラスミドｐＨＪＪ２７ＤＮＡ（図２１）、１× Phusion HFバッファー（New England Biolabs）、それぞれ５０ｐｍｏｌのプライマー０６１１２６０と０６１１２６１、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、１．５μＬの１００％ ＤＭＳＯ（New England Biolabs）、並びに１単位のPhusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を含んでいた。ＰＣＲを、９８℃にて２分間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、そして７２℃にて１分と３０秒間を３５サイクル、それと７２℃にて７分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約１０１９ｂｐのＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＢＥバッファー中での０．８％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。得られたＰＣＲ断片の全長は約１０１９ｂｐであって、その片の５’末端にはＮｏｔＩ制限部位があり、且つ、３’末端にはＡｐａＩ制限部位があった。
【０２３８】
次に、１０１９ｂｐの断片を、プライマー０６１１２５６と０６１１２６１を使用したＰＣＲによって１４３３ｂｐのＴＤＨ３プロモーター／ＴＫＬターミネータ断片の下流に融合させ、そして約２４０５ｂｐの断片を作製した。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１２５ｎｇの１４３３ｂｐの断片、９０ｎｇの１０１９ｂｐの断片、１× Phusion HFバッファー（New England Biolabs）、それぞれ５０ｐｍｏｌのプライマー０６１１２５６と０６１１２６１、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、１．５μＬの１００％ ＤＭＳＯ（New England Biolabs）、並びに１単位のPhusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を含んでいた。ＰＣＲを、９８℃にて２分間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、そして７２℃にて２分間を３５サイクル、それと７２℃にて７分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約２４０５ｂｐのＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＢＥバッファー中での０．８％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。
【０２３９】
ＴＤＨ３プロモーター／ＴＡＬターミネータ構築物の下流のａｄｈ９０９１遺伝子座における組み込みのための３’隣接部を含んでいる得られた２４０５ｂｐの断片を、製造業者の取扱説明書に従ってTOPO TA Cloningキット（Invitrogen）を使用してｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター内にクローン化し、そしてOne-Shot TOP10Ｅ．コリ細胞内に形質転換した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＡｖａＩ消化によって所望の断片の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、確認し、そしてｐＧＭＥｒ１１３と呼んだ。プラスミドｐＧＭＥｒ１１３は、空の発現カセットＴＤＨ３プロモーター／ＴＫＬターミネータが前にあるＩ．オリエンタリスａｄｈ９０９１遺伝子座における相同組み換えのための３’隣接部を含んでいる。
【０２４０】
プライマー０６１１２６４と０６１１２８４を使用してプラスミドｐＨＪＪ２７（図２１）からＵＲＡ３ ＯＲＦの切断３’断片、ＵＲＡ３ターミネータ、及びＵＲＡ３プロモーター（先に記載したように酵母宿主への組み込み後のマーカーのループアウトための反復領域として機能する）を増幅するために、ＰＣＲを使用した。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１５ｎｇのプラスミドｐＨＪＪ２７ＤＮＡ、１× Phusion HFバッファー（New England Biolabs）、それぞれ５０ｐｍｏｌのプライマー０６１１２６４と０６１１２８４、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、１．５μＬの１００％ ＤＭＳＯ（New England Biolabs）、並びに１単位のPhusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を含んでいた。ＰＣＲを、９８℃にて２分間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、そして７２℃にて１分と３０秒間を３５サイクル、それと７２℃にて７分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約１３２４ｂｐのＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＢＥバッファー中での０．８％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。得られたＰＣＲ断片の全長は約１３２４ｂｐであって、その断片の５’末端にはＮｈｅＩ制限部位があり、且つ、３’ 末端にはＡｐａＩ及びＳｆｏＩ制限部位があった。
【０２４１】
先のゲル精製した１３２４ｂｐの断片を、製造業者の取扱説明書に従ってTOPO TA Cloningキット（Invitrogen）を使用してｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター内にクローン化し、そしてOne-Shot TOP10Ｅ．コリ細胞内に形質転換した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＨｉｎｄＩＩＩ消化によって所望の挿入物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、確認し、そしてｐＧＭＥｒ１０９と呼んだ。プラスミドｐＧＭＥｒ１０９は、ＵＲＡ３ ＯＲＦの３’断片とＵＲＡ３プロモーターとそれに続く、ＵＲＡ３ターミネータを含んでいる。プラスミドｐＧＭＥｒ１０９内のＵＲＡ３遺伝子の３’断片の上流部分は、プラスミドｐＧＭＥｒ１０８内にクローン化された切断５’ＵＲＡ３断片の先端との４６０ｂｐの相同性を有する。相同部分は、両セグメントを含んでいる構築物を用いた宿主生物の同時形質転換により、機能的選択マーカーを作り出す遺伝子の２つの部分の間での組み換えを可能にする。
【０２４２】
プラスミドｐＧＭＥｒ１０９を、ＫｐｎＩで消化し、そして製造業者の取扱説明書に従って、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージ（クレノー）フラグメント（New England Biolabs）で処理した。線状ｐＧＭＥｒ１０９プラスミド（平滑末端を含む）をＢａｍＨＩで消化した。産物を、ＴＢＥバッファー中での０．８％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして５２４７ｂｐのベクター断片を、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。
【０２４３】
プラスミドｐＧＭＥｒ１１３を、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＶで消化し、そしてそれが、ＵＲＡ３ターミネータとそれに続くＵＲＡ３プロモーターを伴う構築物ＴＤＨ３プロモーター／ＴＫＬターミネータとそれに続く、ＵＲＡ３ ＯＲＦの切断３’断片を担持する２４６６ｂｐの断片をもたらした。二重制限反応産物を、ＴＢＥバッファー中での０．８％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして約２４６６ｂｐのベクター断片を、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。次に、２４６６ｂｐのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ消化断片を、プラスミドｐＧＭＥｒ１０９からの５２４７ｂｐのベクター断片に連結した。連結反応物を、３μＬの５２４７ｂｐの線状ベクター、３μＬの２４６６ｂｐの挿入物断片、３μＬの無菌のｄｄ水、１０μＬの２× Quick Ligation反応バッファー、及び１μＬのQuick T4 DNA Ligase（New England Biolabs）を用いて準備し、そして製造業者の取扱説明書に従って実施した。
【０２４４】
５μＬの連結産物を、製造業者の取扱説明書に従って、Ｅ．コリXL10-Gold（登録商標）Ultracompetent Cells（Agilent Technologies）内に形質転換した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＸｂａＩ及びＰａｃＩを用いた消化によって所望の挿入物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、確認し、そしてｐＧＭＥｒ１２１（図６）と呼んだ。
【０２４５】
プラスミドｐＧＭＥｒ１２１は、Ｉ．オリエンタリスＵＲＡ３マーカーの３’末端とそれに続く対応するＵＲＡ３プロモーター、ＴＤＨ３プロモーター、ＴＫＬターミネータ、及びａｄｈ９０９１遺伝子座の３’フランキング領域を含んでいる。
【０２４６】
実施例２Ｇ：Ｉ．オリエンタリスＣＮＢ１の構築
Ｉ．オリエンタリスＣＮＢ１を、以下で記載するように、Ｉ．オリエンタリスＣＤ１８２２から構築した（Ｉ．オリエンタリスＡＴＣＣ ＰＴＡ‐６６５８からＩ．オリエンタリスＣＤ１８２２の作出に関する実施例１Ａを参照のこと）。菌株ＣＤ１８２２に含まれているＵＲＡ３遺伝子の両方のコピーを、遺伝子工学の選択マーカーとしてこの遺伝子の使用できるように欠失させた。遺伝子の存在（ウラシル欠乏培地での成長による）と不存在（５‐フルオロオロチン酸の存在下での成長による）の両方に利用可能な選択であるため、ＵＲＡ３は酵母遺伝学の多目的マーカーである。
ＵＲＡ３遺伝子のうちの１つの破壊を、反復ＤＮＡ配列が隣接するＭＥＬ５選択マーカーを含んでいる選択カセットでの置き換えによっておこなった。次に、ＭＥＬ５選択カセットについての検査で陽性であった菌株を、ＭＥＬ５マーカー遺伝子の欠失についてスクリーニングした。そして、第２のＵＲＡ３遺伝子の欠失を、５‐フルオロオロチン酸の存在下での成長によって選択した。
【０２４７】
ＣＤ１８２２を、２．８μｇのベクターｐＭＩ４５８のＳａｃＩ／ＰｓｐＯＭＩ消化ＤＮＡ（図２７）で形質転換した。プラスミドｐＭＩ４５８は、Ｉ．オリエンタリスＵＲＡ３遺伝子の上流の配列（Ｐ‐ｌｏＵＲＡ３、配列番号２５３）及び下流の配列（Ｔ‐ｌｏＵＲＡ３、配列番号２５４）に対して相同のＤＮＡ断片が隣接するＩ．オリエンタリスＰＧＫプロモーター（Ｐ‐ｌｏＰＧＫ、配列番号２４７）の制御下にあるＳ．セレビシエＭＥＬ５遺伝子（配列番号２５５）を含んでいる。Ｐ‐ｌｏＵＲＡ３及びＴ‐ｌｏＵＲＡ３断片は、Ｉ．オリエンタリスゲノム内と同じ相対的配向で存在している。約５００個のＭｅｌ＋コロニーを、３０℃にて５日後に得た。１０個のコロニーを、１０ｍＬのＢＦＰ（Butterfieldsリン酸バッファー）チューブに植菌し、そしてＤＭ１ Ｘ‐α‐ｇａｌプレート上で２５μＬを平板培養することによってシングルコロニーに単離した。次に、初期の単離菌株からの単一ブルーコロニーのそれぞれを、更なる分析のためにＹＰＤ上に釣り出した。
【０２４８】
ＰＣＲを、所望の遺伝的事象について形質転換体をスクリーニングするために使用した。ＰＣＲスクリーニングで鋳型として使用するためのゲノムＤＮＡを得るために、１．５ｍＬの一晩培養物からの細胞を、スクリューキャップ微小遠心管で遠沈し、０．２ｍｌの２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００、１％のＳＤＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭのＮａ2ＥＤＴＡ ｐＨ８．０溶液中に再懸濁した。１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０／１ｍＭのＥＤＴＡ（Sigma）で平衡化した、０．２ｍＬのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）混合物、及び０．３ｇのガラスビーズを加えた。チューブを、Mini‐BeadBeater‐8（BioSpec）により全速力で２分間、振盪した。０．２ｍＬのＴＥは加え、そして、チューブを簡単にボルテックスにかけた。水相を、１６１００×ｇにて５分間の遠心分離によって分離した。上清を、新しいチューブに取り出し、そして１ｍＬの１００％ エタノールを加えた。
分間５、そして、チューブを、２０℃にて３０分間置いておき、１６１００×ｇで遠心分離し、そして液体をデカンテーションにより除いた。ＤＮＡを、風乾し、そして５００μＬのＴＥ中に再懸濁した。
【０２４９】
所望の５’交差についてのＰＣＲスクリーンを、プライマーｏＣＡ４０５とｏＣＡ４０６を使用しておこない、そして１．５ｋｂｐの産物を作製した。所望の３’交差についてのスクリーンを、プライマーＷＧ２６とＣＭ６４７を使用しておこない、そして１．６ｋｂｐの産物を作製した。ｐＭＩ４５８を作製するのに使用されるＵＲＡ３領域の外側（さらに上流又は下流）のプライマーは、ｏＣＡ４０５とＣＭ６４７であり、それらは、野性型では３．２ｋｂｐの産物を生じ、ｐＭＩ４５８破壊対立遺伝子では５．０ｋｂｐの産物を生じ、そして、選択マーカーがループアウトされた場合には２．２ｋｂｐの産物を生じる。これらのＰＣＲ反応物を、５５℃のアニーリング温度を使用しておこなった。ＰＣＲはまた、４プライマーアプローチを使用したＵＲＡ３オープンリーディングフレームの欠失についてのスクリーニングにも使用した。プライマーｐＪＬＪ２８及びｐＪＬＪ２９は、アクチン遺伝子の８００ｂｐの断片を増幅し、そしてプライマーｐＪＬＪ３０及びｐＪＬＪ３１は、ＵＲＡ３遺伝子の６００ｂｐの断片を増幅する。１つの反応におけるすべてのプライマーの使用は、内的な陽性対照（アクチン断片）を提供する。Roche製のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを、製造業者のプロトコールに従って６１℃のアニーリング温度で使用した。菌株１８２２ｕｒａ ｈｅｔ ＭＥＬ‐１及び１８２２ｕｒａ ｈｅｔ ＭＥＬ‐２を、ＵＲＡ３遺伝子座にＭＥＬ５選択カセットが組み込まれたと確認した。
【０２５０】
次に、ＫｔＳＥＱ１ａ（配列番号２５６）配列とＫｔＳＥＱ１ｂ（配列番号２５７）配列の間の組み換えを起こすことによって、１８２２ｕｒａ ｈｅｔ ＭＥＬ‐１及び１８２２ｕｒａ ｈｅｔ ＭＥＬ‐２のゲノムからＭＥＬ５マーカーは取り除いた。ＭＥＬ＋菌株を、約０．５〜２．０のＯＤ600までＹＰＤ培地中で一晩培養した。次に、培養物を、ＹＰＤ培地で希釈して約０．００００１のＯＤ600に戻した。２００μＬの培養希釈物を、９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに移した。そのプレートを、粘着性のカバーで覆い、そして、最も強く撹拌しながら６〜７時間（菌株の増殖速度により約６回の細胞分裂）、３０℃のインキュベータ内でインキュベートした。各ウェルから１００μＬ（１プレートあたり約〜１０００ｃｆｕ）を、ＤＭ１＋Ｘ‐α‐ｇａｌ培地上で平板培養した。プレートを、３０℃にて一晩又は室温にて２日間インキュベートして、呈色性分化を観察した。ホワイトコロニー（推定上ｍｅｌ−）を、同様の培地に画線接種し、そして先に記載したようにＰＣＲによってスクリーニングした。２つの独立したループアウトを見つけ出し、１８２２ｕｒａ ｈｅｔ ＭＥＬ‐１からの一つを、１８２２ｕｒａ ｈｅｔ ｍｅｌ‐１として保存し、そして１８２２ｕｒａ ｈｅｔ ＭＥＬ‐２からのもう一つを１８２２ｕｒａ ｈｅｔ ｍｅｌ‐２としてを保存した。不思議なことに、得られたホワイトコロニーの大部分は、２．２ｋｂｐの予想したバンドをもたらさなかった。
【０２５１】
ｕｒａ−誘導体を得るために、１８２２ｕｒａ ｈｅｔ ｍｅｌ‐１及び１８２２ｕｒａ ｈｅｔ ｍｅｌ‐２を、ＹＰ５Ｄ培地（ＹＰ＋１００ｇ／Ｌのデキストロース）中で一晩培養し、そして、一晩培養物のアリコート（０．５、５、及び５０μＬ）をＳｃＤ‐２× ＦＯＡプレート上で平板培養した。ＦＯＡ耐性コロニーを、シングルコロニー用に画線接種し、そしてＳｃＤ‐ｕｒａプレート上で平板培養することによって、ｕｒａ−表現型を確認した。１８２２ｕｒａ ｈｅｔ ｍｅｌ‐２からの２つのコロニーと１８２２ｕｒａ ｈｅｔ ｍｅｌ‐１からの６つのコロニーを更なる分析のために釣り出した。これらのコロニーを、ＹＰＤ中で一晩培養し、そして、ゲノムＤＮＡを、上記のフェノール／クロロホルム法を使用して抽出した。
【０２５２】
ＵＲＡ３オープンリーディングフレームの存在を、ＰＣＲでスクリーニングした；８つの菌株のいずれもＵＲＡ３遺伝子を含まなかった。１８２２ｕｒａ ｈｅｔ ｍｅｌ‐１の２つのｕｒａ−子孫を、ｙＪＬＪ３（ＣＮＢ１）及びｙＪＬＪ４と命名した。ゲノム配列決定に基づいて、ｙＪＬＪ３（ＣＮＢ１）及びｙＪＬＪ４が、ＵＲＡ３遺伝子とすぐ隣のパーミアーゼ遺伝子の両方の欠失を含むと決定した；好ましくはＵＲＡ３遺伝子だけが欠失していると思う。このパーミアーゼ遺伝子の破壊なしにＣＤ１８２２のｕｒａ３栄養要求変異菌株を作製するために、ＣＤ１８２２を、１μｇのＳａｃＩ／ＡｐａＩ消化ｐＣＭ２０８（図２８）で形質転換した。プラスミドｐＣＭ２０８は、Ｉ．オリエンタリスＵＲＡ３遺伝子の隣接領域の上流（５’ＵＲＡ隣接部（近接）、配列番号２５８）と下流（３’ＵＲＡ３隣接部（近接）、配列番号２５９）に対するＤＮＡ配列相同性を含んでいる。約２００個のＭｅｌ＋コロニーを、３０℃にて５日後に得た。８つのブルーコロニーを、ＳｃＤ Ｘ‐α‐ｇａｌプレート上に画線接種することによって単離した。形質転換体を所望の遺伝的事象についてスクリーニングするために、ＰＣＲを使用した。５’交差スクリーンを、プライマーｏＪＹ１１とｏＪＹ１２を使用しておこない、そしてそれは、所望の形質転換体で０．９ｋｂｐの産物を生じる。３’交差スクリーンを、プライマーｏＪＹ１３とｏＪＹ１４を使用しておこない、そしてそれは、所望の形質転換体で１．０ｋｂｐの産物を生じる。８つのコロニーのうち３つは所望のＰＣＲ産物を示した。これらのコロニーのＭＥＬマーカーは、ループアウトされることができるので、先に記載したように、第２のＵＲＡ３遺伝子は欠失した。あるいは、ｙＪＬＪ３又はｙＪＬＪ４から得られる菌株におけるＵＲＡ３及びパーミアーゼ遺伝子欠失を、実施例２Ｈに記載のワンステップ形質転換で解決できる。
【０２５３】
実施例２Ｈ：ＵＲＡ３選択マーカーを含むＭＢｉｎ５００対照菌株の構築
前掲に記載したように、ＵＲＡ３遺伝子のホモ接合欠失のため、本明細書中に使用したＣＮＢ１と呼ばれたＩ．オリエンタリス菌株は、ウリジン栄養要求変異菌株であった。ＵＲＡ３遺伝子座の異型接合修復を、６９１ｂｐの５’隣接ＤＮＡ、及び１５００ｂｐの３’隣接ＤＮＡを含んでいるＵＲＡ３遺伝子を含むｕｒａフィックスカセットを含むｕｒａフィックスベクター、ｐＪＬＪ６２（図２６）を使用しておこなった。ｕｒａフィックスカセットは、５’ＮｏｔＩ制限部位及び３’ＡｐａＩ制限部位によって隣接する。ＮｏｔＩ及びＡｐａＩを使用した制限消化を実施し、ベクター骨格から２７９６ｂｐのｕｒａフィックスカセットを切り出した。消化産物を、製造業者によって指定されているとおりQIAquick PCR Purificationキット（Qiagen）を使用して精製した。ＤＮＡを、ガラス蒸留水で溶出し、そして１μｇを、Ｉ．オリエンタリスＣＮＢ１の形質転換に使用した。形質転換体を、ｕｒａ選択プレート上で選択し、そしてウリジン追加を必要としなかったシングルコロニーを、ＭＢｉｎ５００と呼んだ。
【０２５４】
実施例２Ｉ：ＵＲＡ３選択マーカーの除去
組み込みカセット内に存在している２つのＵＲＡ３プロモータ領域の組み換えによって、ＵＲＡ３選択マーカー遺伝子を取り除いた菌株を単離するために、着目のｕｒａ＋菌株を、３ｍＬのＹＰ＋１０％ グルコース培地中に植菌し、そして２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃にて少なくとも４時間、そして最長一晩培養した。５０‐１００μＬの培養物を、ＳｃＤ ＦＯＡプレート上で平板培養し、そしてコロニーが現れるまで３７℃にて４８〜６０時間培養した。ＦＯＡはＵＲＡ３タンパク質によって毒性化合物に転換され、そしてｕｒａ＋細胞の死滅をもたらすので、ＦＯＡ上での培養は、ＵＲＡ３マーカーの除去について選択した。いくつかのＦＯＡ耐性コロニーを、３７℃にてＹＰＤプレート上で培養することによって二度精製した。次に、これらの精製単離菌株を、本明細書中に記載したように、ＰＣＲによって適当なＵＲＡ３ループアウトについてスクリーニングした。
【０２５５】
実施例２Ｊ：ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）分析及び酵素アッセイのための改変酵母菌株の振盪フラスコ培養の手順
４ｍＬのｕｒａ選択培地を１４ｍＬ容Falconチューブに加え、そして所望の菌株を、無菌の白金耳を使用してこの培地に植菌した。培養物を、２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃にて一晩（〜１６時間）培養した。Ｉ．オリエンタリス遺伝子座の少なくとも１種類の野生型コピーを持つ菌株については、５００μＬの一晩培養物を、２５ｍＬのＹＰ＋１０％ グルコース培地の入った１２５ｍＬ容バッフル付きフラスコに加えた。ｐｄｃΔ／ｐｄｃΔ菌株については、１ｍＬの一晩培養物を、２５ｍＬの液体ＹＰ＋１００ｇ／Ｌ デキストロース培地の入った１２５ｍＬ容バッフル付きフラスコに加えた。フラスコを、２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃にて培養した。培養物の少量アリコートを、ほとんど１時間おきの間隔で取り出し、そしてＯＤ600を計測した。ＯＤ600が４〜６になるまで、培養物を培養した。
【０２５６】
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析のために細胞の少量サンプルを調製するために、２．５ＯＤ単位に相当する量の培養物を、培養物から採取し、そして１．５ｍＬ容チューブに加えた。細胞を、１６１００×ｇにてペレット状にし、上清を取り除き、そして細胞ペレットを−２０℃にて使用まで保存した。
【０２５７】
培養フラスコ内に残っている細胞を、室温にて２２７９×ｇの遠心分離により集菌し、ペレットを、１２．５ｍＬの０．８５Ｍ ＮａＣｌ中に再懸濁し、次に、室温にて２２７９×ｇで遠心分離した。ペレットを、１ｍＬの０．８５Ｍ ＮａＣｌで再懸濁し、そして再懸濁細胞を、２．０ｍＬ容チューブに移し、次に、１６１００×ｇでペレット状にした。次に、上清は取り除き、そして、それらが１週間以内に酵素分析法に使用される場合には、ペレットを−２０℃にて保存し、より長期間の保存のためには−８０℃にて保存した。
【０２５８】
２．５ＯＤ単位に相当する細胞ペレットのＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析のために、細胞を、１００ｄＨ2Ｏで再懸濁し、次に、１００μＬの０．２Ｍ ＮａＯＨを加えた。サンプルを、室温にて５分間インキュベートし、次に、細胞を、１６１００×ｇの遠心分離によってペレット状にし、そして１００μＬのＳＤＳサンプルバッファー（Bio-Rad Laboratories）で再懸濁した。サンプルを、９５℃にて５分間加熱し、そして、細胞を、簡単な遠心分離によってペレット状にした。１〜５μＬの上清を、製造業者の取扱説明書に従ってCriterion８〜１６％Pre‐Castゲル（Bio-Rad Laboratories）で分析した。バンドを、InstantBlue（商標）Coomassie-Based Staining溶液（Expedeon Protein Solutions、San Diego, CA, USA）を使用して可視化した。
【０２５９】
実施例２Ｋ：産物分析のための改変酵母菌株の振盪フラスコ培養の手順
菌株を、シングルコロニー用にUra Selection Plates上に画線接種し、３０℃にて１〜２日間インキュベートした。種菌用培養物を、Ura Selection Plateからの１〜２個のコロニーを植菌した５０ｍＬのＣＮＢ１振盪フラスコ培地の入った２５０ｍｌ容バッフル付きフラスコ内に調製した。種菌用培養物を、２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃にて約１８時間培養した。次に、４〜６のＯＤ600に達するまで、培養物の少量アリコートをＯＤ600を計測するために取り出した。残留グルコースの存在を、Uristix（登録商標）Reagent Strip（Bayer、Elkhart, IN, USA）を使用して計測した。種菌用フラスコ培養物を、５０ｍＬのＣＮＢ１振盪フラスコ培地の入った１２５ｍｌ容バッフル付きフラスコにＯＤ600＝０．２まで植菌するのに使用した。培養物を、３０℃にて１４０ｒｐｍで２０時間振盪しながらインキュベートした。ブロスのサンプルを、分析のために以下で記載するように取り出した。サンプルのアリコートを、培養物の吸光度（ＯＤ）を計測するのに使用し、そして、残留グルコースの存在を、Uristix（登録商標）Reagent Stripを使用して計測した。次に、サンプルの残りを遠心分離し、そして上清を産物分析に使用した。
【０２６０】
実施例２Ｌ：産物分析のための改変酵母菌株の発酵手順
本明細書中に記載した菌株を、種子繁殖期を使用して培養し、それに続いて２Ｌ容バイオリアクター（Applikon、Foster City, CA, USA）でのシングルステップ発酵をおこなった。
【０２６１】
種子期の準備のために、２５ｍＬの１× ＤＭ２培地（ＫＯＨで所望のｐＨに調整した）を１２５ｍＬ容バッフル付きフラスコに加え、それに続いて無菌の白金耳を使用して着目の菌株を植菌した。培養物を、２５０ｒｐｍで振盪しながら所望の温度で一晩、約１６時間培養した。次に、４〜６のＯＤ600に達するまで、培養物の少量アリコートをほとんど１時間おきの間隔で取り出して、ＯＤ600を計測した。
【０２６２】
残留グルコースの存在を、Uristix（登録商標）Reagent Strip（Bayer、Elkhart, IN, USA）を使用して計測した。次に、１２ｍＬの培養物を、４ｍＬの無菌の冷蔵７５％ グリセロールに加え、十分に混合し、そして氷上で１０分間インキュベートした。次に、培養物とグリセロール混合液を、再び混合し、そして１．０ｍＬを、１０個の無菌の１．８ｍＬ容クライオバイアル（Thermo Scientific、Rochester, NY, USA）のそれぞれに等分し、そして−８０℃にて保存した。
【０２６３】
２５ｍＬの種菌用フラスコ培養物を、１．５ＬのＤＭ２培地が入った２Ｌ容バイオリアクターの植菌に使用した。バイオリアクター内での発酵を、約３０℃〜４０℃の温度にて、約２．０〜７．０の範囲内に制御したｐＨ、並びに２〜４５ｍＭｏｌ／Ｌ／時間の範囲内の酸素吸収速度（ＯＵＲ）につながる撹拌及び通気条件下で実施した。本明細書中に提示した実施例において、バイオリアクターにおける培養のための温度、ｐＨ、及びＯＵＲは、それぞれ３０℃、４．０、及び２５〜３０であった。
【０２６４】
発酵ブロスのサンプルを、分析のために定期的に取り出した。簡単に言えば、サンプルのアリコートを、培養物の吸光度（ＯＤ）、グルコース濃度、及びｐＨを計測するのに使用した。そして、サンプルの残りを遠心分離した。ペレットを、酵素アッセイのために−８０℃にて保存し、そして、上清を、３‐ＨＰ及び他の細胞外の化合物の分析に使用した。本明細書中に報告した全３‐ＨＰ産生値は、別段の指定がない限り、発酵の４８時間の時点についてである。発酵工程中の二酸化炭素産生と酸素消費を、バイオリアクターから排気される気体中の二酸化炭素含量及び酸素含有量を測定することによって計測した。
【０２６５】
実施例２Ｍ：改変酵母菌株によって産生される３‐ＨＰ及びβ‐アラニンの分析手順
培養物のサンプルを、１％のギ酸中への１０×希釈で酸性化し、そして０．４６μｍの９６ウェルフィルタープレートを通して濾過した。サンプル中の被分析物濃度によっては、水で更なる希釈をした。更なる１０×希釈を、１ｍＭのＮＨ4Ａｃ、０．１％のＮＨ3、及び５ｍｇ／Ｌの13Ｃ均一標識３‐ＨＰ（３‐ＨＰの内部標準として）、又は１％のギ酸及び３ｍｇ／Ｌの13Ｃ均一標識β‐アラニン（β‐アラニンの内部標準として）のサンプルバッファー中でおこなった。総希釈係数は、β‐アラニン又は３‐ＨＰの濃度によって約１００〜１０００を使用した。
【０２６６】
２μＬのサンプルを、表６で列挙した機器の設定及びカラムを使用して、Agilent6410Triple Quad MS/MS検出装置を備え、MassHunterプログラムによって制御されたAgilent1200HPLC（Agilent）に注入した。定量化イオンフラグメントピーク面積対（内部標準からの）その安定同位体対応物の比を、イオン抑制効果及び機器のドリフティングを排除するために定量化に使用した。標準偏差は、日々のアッセイごと５％未満であった。
【０２６７】
【表１２】
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【０２６８】
実施例３：３‐ＨＰ発酵経路遺伝子を発現する改変酵母菌株
様々な３‐ＨＰ発酵経路に関与する酵素をコードする１若しくは複数の遺伝子を、酵母宿主細胞内で単独又は組み合わせで発現させることができる。３‐ＨＰ経路酵素は、外来遺伝子から発現されても、内在性遺伝子から発現されても、又はその組み合わせから発現されてもよい。発現されるべき外来遺伝子は、遺伝子発現構築物、例えば、実施例２に記載の発現構築物、を使用して酵母細胞内に導入してもよい。外来遺伝子は、単独の部位にも、複数の位置にも宿主酵母ゲノム内に組み込まれることができ、且つ、外来遺伝子の組み込みは、以下で記載するように、挿入部位における標的遺伝子の欠失又は破壊と対にされてもよい。
【０２６９】
実施例３Ａ：アスパラギン酸／マロン酸セミアルデヒド経路遺伝子を発現する改変酵母菌株
経路に関与する１若しくは複数の酵素を発現することによって、ＰＥＰ及び／又はピルバート、ＯＡＡ、アスパラタート、β‐アラニン、及びマロン酸セミアルデヒド中間体を利用する経路を経て３‐ＨＰを産生する酵母細胞を操作できる。発現遺伝子には、ＰＰＣ、ＰＹＣ、ＡＡＴ、ＡＤＣ、ＢＡＡＴ、ｇａｂＴ、３‐ＨＰＤＨ（マロン酸セミアルデヒドレダクターゼを含む）、ＨＩＢＡＤＨ、又は４‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの１若しくは複数が含まれ得る。
【０２７０】
発現遺伝子は、宿主細胞にとって天然のものである遺伝子から得られる。例えば、酵母宿主細胞がＩ．オリエンタリスである場合、発現遺伝子は、Ｉ．オリエンタリスＰＹＣ（例えば、配列番号２に規定するアミノ酸配列をコードする、及び／又は配列番号１に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むＩ．オリエンタリスＰＹＣ遺伝子）、ＡＡＴ（例えば、配列番号１４に規定するアミノ酸配列をコードする、及び／又は配列番号１３に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むＩ．オリエンタリスＡＡＴ遺伝子）、ＢＡＡＴ（例えば、配列番号２０に規定するアミノ酸配列をコードする、及び／又は配列番号１９に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むＩ．オリエンタリスｐｙｄ４相同性遺伝子）、又は３‐ＨＰＤＨ（例えば、配列番号２６に規定するアミノ酸配列をコードする、及び／又は配列番号２５に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むＹＭＲ２２６Ｃ遺伝子に対するＩ．オリエンタリス相同体）遺伝子から得られる。酵母宿主細胞が別の３‐ＨＰ耐性酵母菌株である場合、当該技術分野で公知の技術を使用して遺伝子配列を得ることができ、そして、経路遺伝子の天然相同体を、外来的に又は外来性調節要素と組み合せて発現させることができる。天然の経路遺伝子は、１若しくは複数のＰＰＣ、ＰＹＣ、ＡＡＴ、ＢＡＡＴ、及び／又は３‐ＨＰＤＨ遺伝子を含み得る。
【０２７１】
あるいは、発現される３‐ＨＰ遺伝子のうちの１若しくは複数が、宿主細胞にとって非天然である起源遺伝子から得ることもできる。例えば、酵母宿主細胞がＩ．オリエンタリスである場合、細胞は、１若しくは複数の非天然のＰＹＣ遺伝子、例えば、配列番号３のアミノ酸配列をコードするＲ．スフェロイデスＰＹＣ遺伝子、配列番号４のアミノ酸配列をコードするＲ．エトリＰＹＣ遺伝子、配列番号５又は６のアミノ酸配列をコードするＰ．フルオレッセンスＰＹＣ遺伝子、配列番号７のアミノ酸配列をコードするＣ．グルタミクム  ＰＹＣ遺伝子、又は配列番号８のアミノ酸配列をコードするＳ．メリロティＰＹＣ遺伝子など；１若しくは複数の非天然のＰＰＣ遺伝子、例えば、配列番号１０のアミノ酸配列をコードするＥ．コリＰＰＣ遺伝子、配列番号１１のアミノ酸配列をコードするＭ．サーモオートトロフィカムＰＰＣ遺伝子、又は配列番号１２のアミノ酸配列をコードするＣ．パーフリンゲンスＰＰＣ遺伝子など；１若しくは複数の非天然のＡＡＴ遺伝子、例えば、配列番号１６のアミノ酸配列をコードするＥ．コリａｓｐＣ遺伝子又は配列番号１５のアミノ酸配列をコードするＳ．セレビシエＡＡＴ２遺伝子など；１若しくは複数の非天然のＡＤＣ遺伝子、例えば、配列番号１７のアミノ酸配列をコードする（及び／又は配列番号１３０、１４５、１４６、又は１４７のいずれか１つに規定するヌクレオチド配列のコード領域を含む）Ｓ．アベルミチリスｐａｎＤ遺伝子、配列番号１８のアミノ酸配列をコードする（及び／又は配列番号１３１に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含む）Ｃ．アセトブチリカムｐａｎＤ遺伝子、配列番号１３３のアミノ酸配列をコードする（及び／又は配列番号１３２に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含む）Ｈ．ピロリＡＤＣ遺伝子、配列番号１３５のアミノ酸配列をコードする（及び／又は配列番号１３４に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含む）バチルス属ＴＳ２５ ＡＤＣ遺伝子、配列番号１３７のアミノ酸配列をコードする（及び／又は配列番号１３６に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含む）Ｃ．グルタミクムＡＤＣ遺伝子、又は配列番号１３９のアミノ酸配列をコードする（及び／又は配列番号１３８、１４８、１４９，１５０、又は１５１のいずれか１つに規定するヌクレオチド配列のコード領域を含む）Ｂ．リチェニフォルミスＡＤＣ遺伝子など；１若しくは複数の非天然のＢＡＡＴ又はｇａｂＴ遺伝子、例えば、配列番号２１のアミノ酸配列をコードする（及び／又は配列番号１４２に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含む）Ｓ．クルイベリｐｙｄ４遺伝子、配列番号２２のアミノ酸配列をコードする（及び／又は配列番号１４０に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含む）Ｓ．アベルミチリスＢＡＡＴ遺伝子、配列番号２３に規定するアミノ酸配列をコードするＳ．アベルミチリスｇａｂＴ遺伝子、又は配列番号２４に規定するアミノ酸配列をコードする（及び／又は配列番号１４１に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含む）Ｓ．セレビシエＵＧＡ１遺伝子など；１若しくは複数の非天然の３‐ＨＰＤＨ遺伝子、例えば、配列番号２７のアミノ酸配列をコードする（及び／又は配列番号１４３に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含む）Ｅ．コリｙｄｆＧ遺伝子又は配列番号１２９のアミノ酸配列をコードする（及び／又は配列番号１４４に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含む）Ｓ．セレビシエＹＭＲ２２６Ｃ遺伝子など；１若しくは複数の非天然のマロン酸セミアルデヒドレダクターゼ遺伝子、例えば、配列番号２９に規定するアミノ酸配列をコードする（及び／又は配列番号３４３に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含む）Ｍ．セデュラマロン酸セミアルデヒドレダクターゼ遺伝子など；１若しくは複数の非天然のＨＩＢＡＤＨ遺伝子、例えば、配列番号２８に規定するアミノ酸配列をコードするＡ．フェカリスＭ３Ａ遺伝子、それぞれ配列番号３０又は配列番号３１に規定するアミノ酸配列をコードするＰ．プチダＫＴ２４４０又はＥ２３４４０ｍｍｓＢ遺伝子、又は配列番号３２に規定するアミノ酸配列をコードするＰ．エルギノーサＰＡＯ１ ｍｍｓＢ遺伝子など；及び／又は１若しくは複数の非天然の４‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、例えば、配列番号に３３に規定するアミノ酸配列をコードするＲ．ユートロファＨ１６ ４ｈｂｄ遺伝子又は配列番号３４に規定するアミノ酸配列をコードするＣ．クルイベリＤＳＭ５５５ｈｂｄ遺伝子など、を発現するように操作され得る。
【０２７２】
実施例３Ａ‐０：酵素活性は、アスパラギン酸／マロン酸セミアルデヒド経路遺伝子を発現する改変酵母菌株の酵素活性アッセイ
酵素アッセイ用の未精製無細胞抽出物（ＣＦＥ）の調製：
振盪フラスコ又はバイオリアクタ培養からの本明細書中に示した細胞を、遠心分離で回収し、上清を捨て、そして、細胞ペレットを、先に記載したように−８０℃にて保存した。ＣＦＥの調製のために、細胞ペレットを、解凍し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、そして再び遠心分離で回収した。上清を捨て、そして細胞ペレットを、２．０ｍＬ容微小遠心管内で、１％のProtease Inhibitor Cocktail、Ｐ８２１５（Sigma）を含んでいる約等量の溶解バッファー中に再懸濁した。約３００μＬの０．５ｍｍ ジルコニアビーズ（BioSpec）を加え、そして、細胞分解を、６／２０秒の設定にて３ラウンド、FastPrep（登録商標）‐24破壊器（MP Biomedicals）で実施した。各ラウンドの間、サンプルチューブを氷で５分間冷やした。溶解後に、サンプルを、最高速度の微小遠心分離器により４℃にて１５分間遠心分離した。上清を新しい１．５ｍＬ容チューブに移し、そして氷上に維持した。溶解物中の総タンパク質濃度、及び標準としてのウシ血清アルブミンを、製造業者によって規定される取扱説明書に従って、Bio‐Radタンパク質分析試薬（ブラッドフォードアッセイ）を使用して測定した。
【０２７３】
ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＹＣ）活性：
本明細書中に示した細胞のＣＦＥのピルビン酸カルボキシラーゼ活性を、以下の通り測定した。アッセイ反応混合物においてＣＦＥに組み合わせられた場合に、以下の成分終濃度を提供する、ストック反応ミックス溶液を調製した：Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ；ＮａＨＣＯ3、１０ｍＭ；ＭｇＣｌ2、５ｍＭ；ＮＡＤＨ、０．２ｍＭ；ＡＴＰ、１ｍＭ；アセチルＣｏＡ、１ｍＭ；ピルバート、１ｍＭ；ビオチン（アッセイするＰＹＣ酵素に必要であれば）、５μＭ；ウシ心臓リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、０．０２単位／ｍＬ。２７０μＬのこの混合物を、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに加え、そして３０μＬの適切に希釈したＣＦＥを加えて、反応物を開始させる。ＮＡＤＨの消費を、SpectraMax 340 PCプレートリーダを使用して３４０ｎｍにて観察した。
ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を、ｎｍｏｌ ＮＡＤＨ消費／秒／ｍｇタンパク質と表現する。
【０２７４】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＰＣ）活性：
ＣＦＥのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＰＣ）活性を、以下の通り測定し得る。アッセイ反応混合物においてＣＦＥと組み合わせられた場合に、以下の成分終濃度を提供する、ストック反応ミックス溶液を調製する：Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ；ＮａＨＣＯ3、１０ｍＭ；ＭｇＣｌ2、５ｍＭ；ＮＡＤＨ、０．１ｍＭ；アセチルＣｏＡ、０．５ｍＭ；ホスホエノールピルビン酸、３．３ｍＭ；ウシ心臓（又はブタ心臓）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、０．０２単位／ｍＬ。２７０μＬのこの混合物を、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに加え、そして、３０μＬの適切に希釈したＣＦＥを加えて、反応を開始させた。ＮＡＤＨの消費を、SpectraMax 340 PCプレートリーダを使用して３４０ｎｍにて観察する。
【０２７５】
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＡＴ）活性：
本明細書中に示した細胞のＣＦＥのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を、以下の通り測定した。アッセイ反応混合物においてＣＦＥと組み合わせられた場合に、以下の成分終濃度を提供する、ストック反応ミックス溶液を調製した：１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ；ＮａＨＣＯ3、１０ｍＭ；ＭｇＣｌ2、５ｍＭ；ＮＡＤＨ、０．１ｍＭ；アスパラタート、１ｍＭ；ケトグルタル酸、１ｍＭ；リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、０．０２単位／ｍＬ。いくつかのアッセイにおいて、ストック反応混合物はまた、ピリドキサール５’‐リン酸（０．１ｍＭ）も含んでいた。２７０μＬのこの混合物を、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに加え、そして、３０μＬの適切に希釈したＣＦＥを加えて、反応を開始させた。ＮＡＤＨの消費を、SpectraMax 340 PCプレートリーダを使用して３４０ｎｍにて観察した。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を、ｎｍｏｌ ＮＡＤＨ消費／秒／ｍｇタンパク質と表現する。
【０２７６】
アスパラギン酸デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）活性：
本明細書中に示した細胞のＣＦＥのアスパラギン酸デカルボキシラーゼ活性を、以下の通り測定した。１６５μＬの１００ｍＭ ＮＨ4Ａｃバッファー（ｐＨ６．８）及び２５μＬの８０ｍＭ アスパラタートを、３７℃に温度設定した９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。反応を、１０μＬのＣＦＥを加えることによって開始させた。異なった時間間隔（５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、６０分）に、２０μＬのサンプルを、反応混合物から取り出し、そして１８０μＬのクエンチングバッファー（２％のギ酸＋内部標準としての２ｍｇ／Ｌの13Ｃ標識β‐アラニン）に加えた。濾過後に、サンプル中のβ‐アラニンを、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析した。β‐アラニン対時間のプロットからスロープを得た。活性は、反応物中の総細胞タンパク質濃度でスロープを割ることによって計算した。ＡＤＣ活性を、μｍｏｌ 形成されたβ‐アラニン／秒／ｇタンパク質と表現する。
【０２７７】
変法ＡＤＣアッセイを、いくつかの実験に使用した。これらの場合では、本明細書中に示した細胞のＣＦＥのＡＤＣ活性を、以下の通り測定した。１１０μＬの１００ｍＭ ＮＨ4Ａｃバッファー（ｐＨ７．６）及び８０μＬの２５ｍＭ アスパラタート（ＮａＯＨで中和後）を、４０℃に温度設定した９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。反応を、１０μＬのＣＦＥを加えることによって開始させた。異なった時間間隔（２、４、６、８、１０分）に、２０μＬのサンプルを、反応混合物から取り出し、内部としてのβ‐アラニン標準に標識であった１８０μＬのクエンチングバッファー（２％のギ酸（２ｍｇ／Ｌの内部標準としての13Ｃ標識β‐アラニンを伴う）又は２％のギ酸中でクエンチし、次に、１：１０で２０％ メタノール／８０％ 水（２ｍｇ／Ｌの内部標準としての13Ｃ標識β‐アラニンを伴う）中に移した）に加えた。濾過後に、サンプル中のβ‐アラニンを、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析した。β‐アラニン対時間のプロットからスロープを得た。活性は、反応物中の総細胞タンパク質濃度でスロープを割ることによって計算した。ＡＤＣ活性を、μｍｏｌ 形成されたβ‐アラニン／秒／ｇタンパク質と表現した。
【０２７８】
β‐アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＢＡＡＴ）活性：
ＣＦＥのβ‐アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＢＡＡＴ）活性を、以下の通り測定した。１００ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3（ｐＨ７．６）、８ｍＭのα‐ケトグルタル酸、０．５ｍＭのアセチル‐ＣｏＡ、０．１ｍＭのピリドキサール‐５’‐リン酸、及び２００ｍＭのβ‐アラニンを含む１９０μＬの反応混合物を、室温にて９６ウェルマイクロタイタープレートに加えた。反応を、１０μＬのＣＦＥを加えることによって開始した。それぞれ２０μＬのサンプルを、２、４、６、８、１０、１２、１５、及び２０分に取り出し、そして７５μＬのクエンチングバッファー（２．５％のギ酸）に加えた。サンプルを、中和し、そして５μＬの１０Ｍ ＮａＯＨ及び５０μＬの１００ｍＭ ＮａＣＯ3（ｐＨ１０）を加えることによって、ｐＨを制御した。濾過したサンプルを、注入時にＯＰＡ（ｏ‐フタルジアルデヒド）試薬１０ｍｇ／ｍＬ（Agilent Technologies 5061‐3335）と混合することによって誘導体化した。ＯＰＡで誘導体化したグルタミン酸を、ＨＰＬＣ分離後に蛍光検出（３４０ｎｍの励起；４６０ｎｍの発光）によって定量化した。１５μＬのサンプルを、５μｍパッキング（Phenomonex １５０×４．６ｍｍ）を用いた分析逆相Gemini C18カラムに注入した。カラムを、６２．５％の２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．８）（Ａ）及び３７．５％のメタノール（Ｂ）で平衡化した。線形グラジエントは、以下の通りであった：４０％のＢに勾配、０〜０．３分；４０％のＢ、０．３〜１分；８５％のＢに勾配、１〜１．７５分；８５％のＢ、１．７５〜２．２５分；３７．５％に勾配、２．２５〜３分；３７．５％のＢ、３〜４分。流量は２ｍＬ／分であった。反応バッファー中のグルタミン酸の検量線を、サンプルの濃度を決定するのに使用した。スロープを、［グルタミン酸］対時間プロットから得た。活性を、スロープを反応物中の総細胞タンパク質濃度で割ることによって計算した。
【０２７９】
３‐ＨＰデヒドロゲナーゼ（３‐ＨＰＤＨ）活性：
本明細書中に示した細胞のＣＦＥの３‐ＨＰデヒドロゲナーゼ活性を、以下の通り測定した。１００ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3（ｐＨ７．６）中の希釈（典型的に１００×希釈）ＣＦＥ１９０μＬ、及びＮＡＤＰＨを、３７℃に温度設定した９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。反応を、１０μＬの６０ｍＭ マロン酸セミアルデヒド（ＭＳＡ、１０ｍＭのＨ2ＳＯ4中の２００ｍＭのＭＳＡストック溶液から１０ｍＭのＨ2ＳＯ4中に新たに調製した）を加えることによって開始した。それぞれ２０μＬのサンプルを、１、２、４、６、８、１０、及び１２分に取り出し、そして８０μＬの熱湯中でクエンチした。冷却後に、７５μＬの冷却混合物を、７５μＬのバッファーの含有の２ｍＭのＮＨ4Ａｃ（ｐＨ６．８）及び３ｍｇ／Ｌの13Ｃ標識３‐ＨＰと混合する。濾過後に、サンプル中の３‐ＨＰを、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって定量化した。スロープを、３‐ＨＰ対時間プロットから得た。活性を、スロープを反応物中の総細胞タンパク質濃度で割ることによって計算した。３‐ＨＰデヒドロゲナーゼ活性を、ｎｍｏｌ 形成されたＮＡＤＰＨ／秒／ｍｇタンパク質と表現する。
【０２８０】
変法３‐ＨＰＤＨアッセイを、いくつかの実験に使用した。これらの場合には、本明細書中に示した細胞のＣＦＥの３‐ＨＰＤＨ活性を、以下の通り測定した。マロン酸セミアルデヒドの減少を、３４０ｎｍでの経時的なＮＡＤＰＨの消滅をたどることによって計測した。マロン酸セミアルデヒドを、Yamada及びJacoby（Yamada, E.W., Jacoby, W.B., 1960, Direct conversion of malonic semialdehyde to acetyl-coenzyme A, Journal of Biological Chemistry, Volume 235, Number 3, pp. 589-594）によって開発されたプロトコールに従って合成した。アッセイを、９６ウェルマイクロプレート上でおこない、そして、終量は２００μＬであった。反応を、１７０μＬのアッセイバッファー（２ｍＭのマロン酸セミアルデヒド、１００ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０及び０．５ｍＭのＮＡＤＰＨ）中に３０μＬのＣＣＥを追加することによって開始させた。３４０ｎｍの吸収度を、室温（〜２５℃）にて１０分間、マイクロプレートリーダー（Spectra Max340PC、Molecular Devices LLC、Sunnyvale, CA）により追跡した。一単位の３‐ＨＰＤＨ活性を、マロン酸セミアルデヒドの存在下、１分以内に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨを酸化するのに必要な酵素の量と規定する。
【０２８１】
実施例３Ａ‐１：ａｄｈ１２０２遺伝子座においてアスパラギン酸デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）を発現するための挿入ベクター
いくつかのアスパラギン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を、Ｉ．オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化し、そしてGeneArt（登録商標）（Burlingame、CA, USA）によって合成し、表７で列挙したプラスミドを得た。合成遺伝子は、ベクターｐＭＡ‐Ｔに至り、そしてＸｂａＩ及びＰａｃＩ制限消化によってベクターから取り出せる。次に、制限断片を、遺伝子をＰＤＣプロモーター及びターミネータの制御下に置くｐＭＩＢａ１０７の同じ部位内にクローン化できるので、組み込みがＩ．オリエンタリスａｄｈ１２０２遺伝子座で起こるようにできる。
【０２８２】
【表１３】
2013542747.tif 000014
【０２８３】
プラスミド１０４５１７２、１０５３８７、１０５３８８、１０５３８９、１０５３９０、及び１０５３９１を、ＸｂａＩ及びＰａｃＩで消化し、ＴＢＥバッファーを使用した１．３％アガロースゲルで泳動した。ＡＤＣ（ｐａｎＤ）遺伝子に相当するそれぞれの消化からの４００〜５００ｂｐの断片を、ゲルから切り出し、そしてQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用してアガロースから抽出した。
【０２８４】
プラスミドｐＭＩＢａ１０７を、ＸｂａＩとＰａｃＩで消化し、仔ウシ腸ホスファターゼ（New England Biolabs）で処理し、そしてベクターバンドを、ＴＢＥバッファー中でのアガロースゲル電気泳動法後に精製した。ＸｂａＩとＰａｃＩで消化したｐａｎＤ断片を、製造業者の取扱説明書に従ってＴ４ ＤＮＡリガーゼとQuick Ligation反応キット（New England Biolabs）を使用してこの精製ｐＭＩＢａ１０７ベクターに連結した。連結産物を、製造業者の取扱説明書に従って、XL10-Gold ULTRA細胞（Agilent Technologies）内に形質転換した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。各反応物からの２４の形質転換体を２× ＹＴ＋ａｍｐプレートに釣り出した。４つのそれぞれの得られた形質転換体からのミニプレップＤＮＡを、ＡｐａＩ、ＮｃｏＩ、及びＳａｄ消化によってスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、ＤＮＡ配列決定で正しいと確認し、そして表７に示したように呼んだ。得られたプラスミドは、順方向に向いた発現カセットを用いたａｄｈ１２０２遺伝子座におけるそれぞれのＡＤＣ遺伝子の組み込みを可能にする。
【０２８５】
それぞれ約１０μｇのそれぞれの組み込み構築物を、ＡｐａＩとＫｐｎＩで消化し、そして８９ｍＭのＴｒｉｓ塩基‐８９ｍＭのホウ酸‐２ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム（ＴＢＥ）バッファーを使用した１％アガロースゲルで泳動した。各プラスミドの約４４５０ｂｐの断片を、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAquickゲル抽出キット（Qiagen）を使用して抽出した。精製産物の濃度が、３９〜１３８ｎｇ／μｌであることがわかった。（ＡｐａＩとＫｐｎＩで消化した）組み込み構築物からの０．３９〜１．４μｇの断片を、先に記載したようにＩ．オリエンタリスＣＮＢ１に形質転換した。形質転換体を、ｕｒａ選択培地に平板培養し、３７℃にてインキュベートし、ｕｒａ選択培地に再び画線接種し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。ゲノムＤＮＡを、ＵＲＡ３＋コロニーから調製し、そしてＰＣＲによってチェックして組み込みを確認した。組み込みを確認するために２．５ｋｂｐの断片を増幅するために、プライマー０６１１７１８と０６１１６３２を使用した。各ＰＣＲ反応物は、２５μＬの終量に２．５μＬのゲノムＤＮＡ、それぞれ１２．５ｐＭのプライマー０６１１７１８と０６１１６３２、１× Crimson Taq（商標）反応バッファー（New England Biolabs）、０．２ｍＭのｄＮＴＰミックス、０．６２５単位のCrimson Taq（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs）を含んでいた。増幅反応物を、９５℃にて３０秒間を１サイクル；それぞれ９５℃にて３０秒間、５０℃にて３０秒間、そして６８℃にて３分間を３０サイクル；６８℃にて１０分間を１サイクルとプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）でインキュベートした。
【０２８６】
各構築物のための２つのＵＲＡ３＋確認形質転換体を、表７に示したように呼んだ。これらの菌株は、Ｉ．オリエンタリスからのＰＤＣプロモーターとターミネータによって駆動される発現を伴う、指示したＡＤＣ遺伝子にとってａｄｈ１２０２において異型接合である。
【０２８７】
表７で列挙した菌株（及び陰性対照としての菌株ＭＢｉｎ５００、前掲）からのＰａｎＤ発現と酵素活性を試験した。それぞれの菌株の一晩培養物を、ＹＰＤ ＯＮ中で３７℃にて一晩培養し、１２５ｍＬ容バッフル付きフラスコ内、３７℃にて２５ｍＬの新しいＹＰＤ中に１：５０に希釈し、そしてＯＤ600〜２‐８まで培養した。次に、細胞ペレットを、ＣＦＥを調製するのに使用し、そしてそれを、前掲に記載したようにＡＤＣ活性についてアッセイした。代表的な結果を表８に示す。
【０２８８】
【表１４】
2013542747.tif 000015
【０２８９】
次に、ｙＷＴＹ５‐１７とｙＷＴＹ７‐２５のホモ接合バージョンを作製した。最初に、ｕｒａ−誘導体ｙＷＴＹ５‐１７とｙＷＴＹ７‐２５を、先に記載したように単離した。ゲノムＤＮＡを、ＦＯＡ耐性コロニーから調製し、ＵＲＡ３選択マーカーの欠失を確認するために先に記述のとおりＰＣＲによってチェックした。プライマー０６１１７１８と０６１１６３２を、ｕｒａマーカーが存在している組み込みのための２．４ｋｂｐの断片、及び、ｕｒａマーカーがない１１００ｂｐの断片を増幅するのに使用した。プライマー０６１１７１８と０６１１６３２を用いて１１００ｂｐのＰＣＲ断片をもたらしたＵｒａ−菌株のｙＷＴＹ５‐１７及びｙＷＴＹ７‐２５を、それぞれＭＩＢａ３３１及びＭＩＢａ３３２と呼んだ。
【０２９０】
それぞれ１０μｇのｐＷＴＹ１０‐００３３‐５とｐＷＴＹ１０‐００３３‐７を、ＡｐａＩ、ＫｐｎＩ、及びＮｃｏＩで消化し、そして８９ｍＭのＴｒｉｓ塩基‐８９ｍＭのホウ酸‐２ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム（ＴＢＥ）バッファーを使用した１％アガロースゲルで泳動した。各プラスミドに関して約４４５０ｂｐの断片を、ゲルから切り出し、そしてQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して抽出した。ｐＷＴＹ１０‐００３３‐５とｐＷＴＹ１０‐００３３‐７からの精製断片を、先に記載したように、それぞれＭＩＢａ３３１とＭＩＢａ３３２に形質転換した。形質転換体を、ｕｒａ選択培地に平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートし、次に、ｕｒａ選択培地に再び画線接種し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。ゲノムＤＮＡを調製した、そして先に記載したようにCrimson Taq（商標）ＰＣＲを実施して、組み込みを確認した。プライマー０６１１７１８と０６１１６３２は、ｕｒａマーカーが存在している組み込みに関して２．４ｋｂｐの断片を増幅し、ｕｒａマーカーがないとき１１００ｂｐの断片を増幅する。プライマー０６１１７１８と０６１１６３２を用いて１１００ｂｐと２．４ｋｂｐのＰＣＲ断片をもたらしたＭＩＢａ３３１とＭＩＢａ３３２の形質転換体を、保存し、それぞれＭＩＢａ３３８とＭＩＢａ３３７と呼んだ。ＭＩＢａ３３７は、ａｄｈ１２０２遺伝子座におけるＳ．アベルミチリスからのＡＤＣ遺伝子のホモ接合であり、そして、ＭＩＢａ３３８は、ａｄｈ１２０２遺伝子座におけるＢ．リチェニフォルミスからのＡＤＣ遺伝子のホモ接合である。両菌株とも、Ｉ．オリエンタリスからのＰＤＣプロモーターとターミネータ下でそれぞれのＡＤＣ遺伝子を制御する。
【０２９１】
ｐａｎＤホモ接合菌株ＭＩＢａ３３７及びＭＩＢａ３３８からのＡＤＣ発現と酵素活性を、異型接合ｐａｎＤ菌株ｙＷＴＹ５‐１７及びｙＷＴＹ７‐２５と比較した。培養物を、ＹＰＤ中で３７℃にて一晩培養し、次に、３７℃にて１２５ｍＬ容バッフル付きフラスコ内で２５ｍＬの新しいＹＰＤ中に１：５０に希釈し、そしてＯＤ600〜２‐８まで培養した。細胞ペレットをＣＦＥを調製するのに使用し、次にそれを、先に記載したようにＡＤＣ活性についてアッセイした。２回の独立した実験の代表的な結果を、表９Ａに示す。
【０２９２】
【表１５】
2013542747.tif 000016
【０２９３】
菌株ＭＩＢａ３３７とＭＩＢａ３３８から調製したＣＦＥのＡＤＣ活性の比較のための第３の独立した実験の結果を、表９Ｂに示す。
【０２９４】
【表１６】
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【０２９５】
上記のサンプルのＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析は、ＭＩＢａ３３８からのｐａｎＤ発現がこれらの菌株の中で最も高いことを示した。
【０２９６】
本明細書中に記載した方法を使用して、菌株ＭＢｉｎ５００、ＭＩＢａ３３７、及びＭＩＢａ３３８を、３‐ＨＰ生産についてバイオリアクター内で評価した。対照菌株ＭＢｉｎ５００は、検出可能な３‐ＨＰを生じなかった（２回の独立した発酵の平均）。菌株ＭＩＢａ３３７は、１．３３ｇ／Ｌの３‐ＨＰを生じ（実施した１回の発酵）、そして菌株ＭＩＢａ３３８は、３．１５ｇ／Ｌの３‐ＨＰを生じた（３回の独立した発酵の平均）。菌株ＭＩＢａ３３７とＭＩＢａ３３８の個々の発酵を、それらの３‐ＨＰ生産能力とＡＤＣ活性に関してさらに比較した（表１０）。これらの発酵における細胞質量の違いを考慮するために、３‐ＨＰ生産能力を、細胞質量の単位あたりの３‐ＨＰ濃度（［ｇ／Ｌ ３‐ＨＰ］／［ｇ／Ｌ 乾燥細胞重量］と表現する）として表１０で報告する。
バチルス・リケニホルミスｐａｎＤ遺伝子（菌株ＭＩＢａ３３８）対ストレプトマイセス・アベルミチリスｐａｎＤ遺伝子（菌株ＭＩＢａ３３７）を使用したとき、結果は、改善されたＡＤＣ活性及び３‐ＨＰ生産能力を示す。
【０２９７】
【表１７】
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【０２９８】
実施例３Ａ‐２：ａｄｈ１２０２遺伝子座においてβ‐アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＢＡＡＴ）又は３‐ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ（３‐ＨＰＤＨ）を発現するための挿入ベクター
Ｓ．アベルミチリスからのＢＡＡＴ、Ｓ．セレビシエからのＵＧＡ１、Ｓ．クルイベリからのＰＹＤ４、Ｓ．セレビシエからのＹＭＲ２２６ｃ、及びＥ．コリからのｙｄｆＧのＩ．オリエンタリスのコドン最適化バージョンを、GeneArt（登録商標）によって合成し、そして以下で列挙したプラスミドを得た。合成遺伝子は、ベクターｐＭＡ‐Ｔに至り、そしてＸｂａＩとＰａｃＩを使用した消化によってベクターから取り出せる。次に、消化断片を、ｐＭＩＢａ１０７の同じ部位にクローン化し、ＰＤＣプロモーターとターミネータの制御下にその遺伝子を置き、そしてａｄｈ１２０２遺伝子座において組み込みが起こるようにできる。
【０２９９】
【表１８】
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【０３００】
プラスミド１０５４１６８、１０５４１６９、１０５４１７０、１０５４１７１、１０５４１７２、及び１０５４１７３を、ＸｂａＩとＰａｃＩで消化し、そして８９ｍＭのＴｒｉｓ塩基‐８９ｍＭのホウ酸‐２ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム（ＴＢＥ）バッファーを使用して１％アガロースゲルで泳動した。１０４５１６８から７６１（ｙｄｆＧ）ｂｐ、１０４５１６９から１４３０（ＵＧＡ１）ｂｐ、１０４５１７０から１３７０（ＢＡＡＴ）ｂｐ、１０４５１７１から１４４２（ＰＹＤ４）ｂｐ、又は１０４５１７３から８１４（ＹＭＲ２２６ｃ）ｂｐの断片を、ゲルから切り出し、そしてQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用してアガロースから抽出した。プラスミドｐＭＩＢａ１０７を、ＸｂａＩとＰａｃＩで消化し、続いてＣＩＰで処理し、そして７．９ｋｂｐの線状断片を得た。消化産物を、QIAQUICK（登録商標）PCR Purification Kit（Qiagen）を使用して精製した。次に、ｙｄｆＧ、ＵＧＡ１、ＢＡＡＴ、ＰＹＤ４、又はＹＭＲ２２６ｃの消化断片を、本明細書中に記載したようにＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用してｐＭＩＢａ１０７（ＸｂａＩとＰａｃＩで消化し、そしてＣＩＰで処理した）に連結した。連結産物を、製造業者の取扱説明書に従って、One Shot（登録商標）TOP10 Chemically Competent Ｅ．コリ細胞（Invitrogen）内に形質転換した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＸｂａＩとＰａｃＩでの消化によってスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、ＤＮＡ配列決定によって正しいことを確認し、そしてそれぞれｙｄｆＧ、ＢＡＡＴ、ＵＧＡ１、ＹＭＲ２２６ｃ、又はＰＹＤ４のためのｐＭＩＢａ１２０、ｐＭＩＢａ１２１、ｐＭＩＢａ１２２、ｐＭＩＢａ１２３、及びｐＭＩＢａ１２４と呼んだ。得られたプラスミドは、順方向に向けられた発現カセットを用いたａｄｈ１２０２遺伝子座において所望遺伝子の組み込みを可能にする。
【０３０１】
表１１の組み込み構築物を、ＰＤＣプロモーターとターミネータの制御下のａｄｈ１２０２遺伝子座に、Ｉ．オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化した着目の遺伝子を組み込むために使用した。発現カセットはまた、本明細書中に記載したように、ｕｒａ−宿主内の形質転換体の選択を可能にするＵＲＡ３選択マーカーも含んでいる。発現カセットとａｄｈ１２０２ホモロジー領域は、プラスミドからの断片の切り出しを可能にするために、ＡｐａＩ及びＫｐｎＩ制限部位が隣接している。
【０３０２】
それぞれ１５μｇの表１１の組み込み構築物を、ＡｐａＩ、ＫｐｎＩ、及びＮｃｏＩで消化し、８９ｍＭのＴｒｉｓ塩基‐８９ｍＭのホウ酸‐２ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム（ＴＢＥ）バッファーを使用して１％アガロースゲルで泳動した。ＮｃｏＩによる消化は、ベクター骨格を壊すので、アガロースゲルから着目の断片を抽出するのがより簡単になる。ｐＭＩＢａ１２０、ｐＭＩＢａ１２１、ｐＭＩＢａ１２２、ｐＭＩＢａ１２３、及びｐＭＩＢａ１２４からの、それぞれ４８８４ｂｐ、５４９３ｂｐ、５５５３ｂｐ、４９３７ｂｐ、及び５５６５ｂｐの断片を、ゲルから切り出し、そしてQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用してアガロースから抽出した。精製産物の濃度は、８０〜１２０ｎｇ／μＬにあるのがわかった。０．８〜１．２μｇのｐＭＩＢａ１２０‐４からの制限断片を、本明細書中に記載したように、Ｉ．オリエンタリスＣＮＢ１（ｕｒａ−）内に形質転換した。次に、形質転換体を、ｕｒａ選択培地に平板培養し、そして室温にて６０時間培養した。形質転換体を、ｕｒａ選択培地に再び画線接種し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。
【０３０３】
それぞれのいくつかの形質転換体を、組み込みを確認するためにコロニーＰＣＲによってチェックした。正しい組み込みを、組み込みの５’ 末端と３’末端をチェックする、そして以下で列挙するプライマー対を使用することによって確認した。プライマー０６１１７１７が、逆方向のＰＤＣプロモーターにアニールするのに対して、プライマー０６１１２２５は、順方向のＵＲＡ３選択マーカーにアニールする。プライマー０６１１６３１と０６１１６３２は、それぞれ順方向と逆方向で組み込み部位の外側にアニールし；プライマー０６１１７１７と０６１１６３１は、正しい組み込み体では９７６ｂｐの断片を増幅し；プライマー０６１１２２５と０６１１６３２は、正しい組み込み体では１．４ｋｂｐの断片を増幅し；そして、プライマー０６１１６３１と０６１１６３２は、２．７ｋｂｐの断片を増幅し、それは野生型染色体を示しているので、組み込みに対しては〜５ｋｂｐの断片を増幅する。ゲノムＤＮＡを作製するために、それぞれの形質転換体の１つのコロニーを、ＴＥ中の０．０５Ｕ／μＬのlyticase（Sigma、St. Louis, MO, USA）５０μＬ中、３７℃にて３０分間インキュベートし、続いて、９５℃にて１０分間インキュベトした。組み込みを確認するために、ＰＣＲを、本明細書中に記載したように実施した。０６１１７１７と０６１１６３１を用いて９７６ｂｐ、０６１１２２５と０６１１６３２を用いて１．４ｋｂｐ、及び０６１１６３１と０６１１６３２を用いて２．７ｋｂｐのＰＣＲ断片をもたらすそれぞれの異型接合組み込み体の１つの形質転換体を保存し、そして表１１に示すようにＭＩＢａ３０８、ＭＩＢａ３０９、ＭＩＢａ３１０、ＭＩＢａ３１１、及びＭＩＢａ３１２と呼んだ。
【０３０４】
形質転換体ＭＩＢａ３０８、ＭＩＢａ３０９、ＭＩＢａ３１０、ＭＩＢａ３１１、及びＭＩＢａ３１２の培養物を、ＹＰＤ中で３７℃にて一晩培養した。次に、培養物を、３７℃にて１２５ｍＬ容バッフル付きフラスコ内の２５ｍＬの新しいＹＰＤで１：５０に希釈し、そしてＯＤ600〜４‐１０まで培養した。細胞のサンプルを、本明細書中に記載した方法を使用したＳＤＳ‐ＰＡＧＥによってタンパク質の発現について分析した。ＣＦＥもまた、培養物からの細胞ペレットから調製し、そして３‐ＨＰデヒドロゲナーゼ活性を、ＣＦＥで本明細書中に記載した方法を使用して計測した。菌株ＭＩＢａ３１０とＭＩＢａ３１２からのＵＧＡ１及びＰＹＤ４の発現を、どちら遺伝子についても組み込みがなかった菌株内に存在する〜５３ＫＤａのバンドの出現をＳＤＳ‐ＰＡＧＥによってそれぞれ検出した。ＭＩＢａ３０９のＢＡＡＴ発現は、これらの条件下でＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって検出されなかった。表１２Ａは、菌株のＣＦＥにおける３‐ＨＰデヒドロゲナーゼ（３‐ＨＰＤＨ）活性を示す。
【０３０５】
【表１９】
2013542747.tif 000020
【０３０６】
改善された測定条件を使用した独立した実験において、菌株ＭＢｉｎ５００（対照）、ＭＩＢａ３１０、ＭＩＢａ３０９、及びＭＩＢａ３１２から調製したＣＦＥのＢＡＡＴ活性を比較した。この実験の結果を表１２Ｂに示す。
【０３０７】
【表２０】
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【０３０８】
プラスミドｐＭＩＢａ１２０‐４（前掲）は、以下の発現カセット：ＰＤＣプロモーター、着目の遺伝子（ＢＡＡＴ又は３‐ＨＰＤＨ）、ＰＤＣターミネータ、及びＵＲＡ３選択マーカー、に隣接するＮｏｔＩ制限部位を含んでいる。ａｄｈ１２０２遺伝子座における組み込みのための相同性は、ＮｏｔＩ制限部位の外側に存在する。これらのプラスミドはすべて、順方向に向いた発現カセットを持つ。
【０３０９】
ホモ接合組み込み菌株のスクリーニングを容易にするために、新しいプラスミドを、逆方向に向いている発現カセットを組み立てた。プラスミドｐＭＩＢａ１２０‐４を、ＮｏｔＩで消化し、そして８９ｍＭのＴｒｉｓ塩基‐８９ｍＭのホウ酸‐２ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム（ＴＢＥ）バッファーを使用して１％アガロースゲルで泳動した。３．５ｋｂｐ（ｐＭＩＢＡ１２０）、４．２ｋｂｐ（ｐＭＩＢａ１２１）、４．２ｋｂｐ（ｐＭＩＢＡ１２２）、３．５ｋｂｐ（ｐＭＩＢａ１２３）、及び４．２ｋｂｐ（ｐＭＩＢＡ１２４）の断片を、ゲルから切り出し、そしてQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用してアガロースから抽出した。これらの断片のそれぞれを、本明細書中に記載したように、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して５．２ｋｂｐの線状ＮｏｔＩ／ＣＩＰ処理ｐＨＪＪ７６‐ｎｏ ｕｒａに連結した。連結産物を、製造業者の取扱説明書に従って、One Shot（登録商標）TOP10 Chemically CompetentＥ．コリ細胞（Invitrogen）内に形質転換した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＸｂａＩとＫｐｎＩ消化によってスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらしたクローンを、それぞれＵＧＡ１、ＹＭＲ２２６ｃ、ＰＹＤ４、ｙｄｆＧ、及びＢＡＡＴに関して、ｐＭＩＢａ１３１、ｐＭＩＢａ１３２、ｐＭＩＢａ１３３、ｐＭＩＢａ１３４、及びｐＭＩＢａ１３５と呼んだ。得られたプラスミドは、逆方向に向いた発現カセットを用いたａｄｈ１２０２遺伝子座における所望の遺伝子の組み込みを可能にする。
【０３１０】
Ｕｒａ−誘導体のＭＩＢａ３０８‐１２を、本明細書中に記載したように単離した。ＭＩＢＡ３０８‐１のいくつかのＦＯＡ耐性コロニーは、３７℃にてＹＰＤプレート上で培養することによって二度精製したコロニーであった。ゲノムＤＮＡを、ＦＯＡ耐性コロニーから調製し、そして本明細書中に記載したように、ＵＲＡ３選択マーカーの欠失を確認するためにＰＣＲによってチェックした。プライマー０６１１６３１と０６１１６３２は、それぞれ順方向と逆方向で組み込み部位の外側にアニールする。プライマー０６１１７１８は、ｕｒａ選択マーカーのＰＤＣターミネータ上流にアニールし；プライマー０６１１６３２と０６１１６３１は、野生型染色体に対して２．７ｋｂｐの断片を増幅し；そしてプライマー０６１１７１８と０６１１６３２は、ｕｒａマーカーが存在している組み込みに対して２．４ｋｂｐの断片を増幅し、且つ、ｕｒａマーカーの不存在下で１１００ｂｐの断片を増幅する。０６１１７１８と０６１１６３２を用いると１１００ｂｐ、０６１１６３１と０６１１６３２を用いると２．７ｋｂｐのＰＣＲ断片をもたらすＭＩＢａ３０８‐１２の１つのｕｒａ−菌株を保存し、そしてＭＩＢａ３１４（ＭＩＢａ３１０のｕｒａ−菌株）、ＭＩＢａ３１５（ＭＩＢａ３１２のｕｒａ−菌株）、ＭＩＢａ３１６（ＭＩＢａ３１１のｕｒａ−菌株）、ＭＩＢａ３２６（ＭＩＢａ３０８のｕｒａ−菌株）、及びＭＩＢＡ３２８（ＭＩＢａ３０９のｕｒａ−菌株）と呼んだ。
【０３１１】
それぞれ１０〜１５μｇのｐＭＩＢａ１３１、ｐＭＩＢａ１３２、ｐＭＩＢａ１３３、及びｐＭＩＢａ１３５を、ＡｐａＩ、ＫｐｎＩ、及びＮｃｏＩで消化し、８９ｍＭのＴｒｉｓ塩基‐８９ｍＭのホウ酸‐２ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム（ＴＢＥ）バッファーを使用して１％アガロースゲルで泳動した。ＮｃｏＩによる消化は、着目の断片のアガロースゲルからの抽出を容易にする。ｐＭＩＢａ１３１‐３、ｐＭＩＢａ１３５からのそれぞれ５５５３ｂｐ、４９３７ｂｐ、５５６５ｂｐ、５４９３ｂｐの断片を、ゲルから切り出し、そしてQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用してアガロースから抽出した。精製産物の濃度が、６７〜８０ｎｇ／μＬにあることがわかった。０．６７〜０．８μｇのｐＭＩＢａ１３１‐３及びｐＭＩＢａ１３５からの制限断片を、本明細書中に記載したように、ＭＩＢａ３１４、ＭＩＢａ３１６、ＭＩＢａ３１５、又はＭＩＢａ３２８に形質転換する。形質転換体を、ｕｒａ選択培地に平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートし、次に、ｕｒａ選択培地に再び画線接種し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。ゲノムＤＮＡを、ＵＲＡ３＋コロニーから調製し、そして着目の遺伝子についてホモ接合菌株を作る第２の発現カセットの組み込みを確認するために、本明細書中に記載したようにＰＣＲによってチェックした。プライマー０６１１７１８と０６１１６３２は、先に記載した第１の組み込みの１１００ｂｐの断片を増幅し、そして、プライマー０６１１６３２と０６１１７１７は、逆方向で第２の組み込みの８１４ｂｐの断片を増幅する。０６１１７１８と０６１１６３２を用いると１１００ｂｐの断片、そして０６１１７１７と０６１１６３２を用いると８１４ｂｐの断片が増幅されるそれぞれの系統のＵＲＡ３＋形質転換体を、ＭＩＢＡ３１７、ＭＩＢＡ３１８、ＭＩＢＡ３１９、及びＭＩＢａ３２９と呼んだ（表１３を参照のこと）
【０３１２】
【表２１】
2013542747.tif 000022
【０３１３】
ＹＭＲ２２６Ｃ、ＵＧＡ１、ＰＹＤ４、及びＢＡＡＴに関して、ホモ接合と異型接合の菌株からの発現と酵素活性を測定した。ＭＩＢＡ３０９‐１２、ＭＩＢａ３１７‐９、及びＭＩＢａ３２９の一晩培養物を、３７℃にてＹＰＤ ＯＮ中で培養し、次に、３７℃にて１２５ｍＬ容バッフル付きフラスコ内で２５ｍＬの新しいＹＰＤに１：５０に希釈し、そしてＯＤ600〜４‐１０まで培養した。細胞のサンプルを、本明細書中に記載した方法を使用したＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって、タンパク質の発現について分析した。ＣＦＥもまた、培養物からの細胞ペレットから調製し、そして３‐ＨＰデヒドロゲナーゼ活性を、本明細書中に記載した方法を使用してＣＦＥにおいて計測した。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥの結果に基づくと、菌株ＭＩＢａ３１０、ＭＩＢａ３１８、ＭＩＢａ３１２、及びＭＩＢａ３１９は、〜５３ＫＤａ（ＵＧＡ１又はＰＹＤ４遺伝子によってコードされるタンパク質の予想サイズ）の質量を有するタンパク質を含んでいた。このタンパク質に相当するバンドは、菌株ＭＢｉｎ５００のＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析において観察されなかった。加えて、ホモ接合菌株ＭＩＢａ３１８及びＭＩＢａ３１９からのそれぞれＵＧＡ１及びＰＹＤ４の発現は、（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析によって判断されるように）対応する異型接合の菌株ＭＩＢａ３１０又はＭＩＢａ３１２より優れていた。これらの条件下では、菌株ＭＩＢａ３０９又はＭＩＢａ３２９において、ＢＡＡＴ発現は（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって）検出されなかった。表１４Ａは、菌株ＭＢｉｎ５００、ＭＩＢａ３１１、及びＭＩＢａ３１７のＣＦＥにおける３‐ＨＰデヒドロゲナーゼ（「３‐ＨＰＤＨ」）活性を示す。
【０３１４】
【表２２】
2013542747.tif 000023
【０３１５】
改善された測定条件を使用した独立した実験において、菌株ＭＢｉｎ５００（対照）、ＭＩＢａ３１９、及びＭＩＢａ３２９から調製したＣＦＥのＢＡＡＴ活性を比較した。この実験の結果を、表１４Ｂに示す。
【０３１６】
【表２３】
2013542747.tif 000024
【０３１７】
菌株ＭＩＢａ３１７、ＭＩＢａ３１８、及びＭＩＢａ３１９のＵｒａ−誘導体を、本明細書中に記載したように単離した。ＭＩＢａ３１７、ＭＩＢａ１８、及びＭＩＢａ１９のいくつかのＦＯＡ耐性コロニーは、３７℃にてＹＰＤプレート上で培養することによって精製したコロニーであった。ゲノムＤＮＡを、ＦＯＡ耐性コロニーから調製し、そして本明細書中に記載したように、ＵＲＡ３選択マーカーの欠失を確認するためにＰＣＲによってチェックした。プライマー０６１１７１８と０６１１６３２は、先に記載した第１の組み込みを示す１１００ｂｐの断片を増幅し、そしてプライマーに０６１１６３２と０６１１７１７は、逆方向での第２の組み込みの存在を示す８１４ｂｐの断片を増幅する。プライマー０６１１７１８と０６１１６３１は、ｕｒａマーカーを伴う第２の組み込みを示す２．６ｋｂｐの断片、及びｕｒａマーカーを伴わない１２００ｂｐの断片を増幅する。００６１１７１８と０６１１６３２により１１００ｂｐ、０６１１６３２と０６１１７１７により８１４ｂｐ又は６１１７１８と０６１１６３１により１２００ｂｐのＰＣＲ断片をもたらすＭＩＢａ３１７とＭＩＢａ３１８のＵｒａ−菌株を保存し、そしてそれぞれＭＩＢａ３２０とＭＩＢａ３２１と呼んだ。ｕｒａマーカーをＭＩＢａ３１９から取り除いたとき、予想された遺伝子転換事象が起き、そして両方の発現セットが順方向に向けられるような（０６１１６３２と０６１１６３１プライマーによる２．７ｋｂｐの断片又は０６１１６３２と０６１１７１７による８１４ｂｐの断片はないが、０６１１７１８と０６１１６３２により１１００ｂｐの断片は増幅される）ＰＣＲによって示されるＭＩＢａ３２２をもたらした。
【０３１８】
実施例３Ａ‐３：ｐｄｃ遺伝子座においてアスパラギン酸１‐デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）、β‐アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＢＡＡＴ）、及び３‐ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ（３‐ＨＰＤＨ）を発現するための挿入ベクターの左側断片の構築
左側断片を含んでいるＳ．アベルミチリスＡＤＣ（配列番号１３０）及びＳ．アベルミチリスＢＡＡＴ（配列番号１４０）
【０３１９】
ＥＮＯ１プロモーターとＰＤＣターミネータ領域の間の発現のため遺伝子の挿入を可能にするために、ｐＭｈＣｔ０６８ベクターを、ＸｂａＩとＰａｃＩで消化し、１０単位の仔ウシ腸ホスファターゼ（New England Biolabs）を用いて３７℃にて３０分間処理し、ＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約６．１ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０３２０】
次に、サッカロマイセス・クルイベリ（Saccharomyces kluvyeri）ＢＡＡＴ（ｐｙｄ４）遺伝子（配列番号１４２）を、この後のサブクローニングのための制限部位を含むプライマー０６１１１９６と０６１１１８６で増幅した。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１μＬのＳ．クルイベリｐｙｄ４遺伝子を含むプラスミドのミニプレップの１〜５０倍希釈物、１× Pfx増幅バッファー（Invitrogen）、それぞれ１００ｐｍｏｌのプライマー０６１１１９６と０６１１１８６、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、１．５μＬのＤＭＳＯ、及び２．５単位のPlatinum（登録商標）Pfx DNAポリメラーゼ（Invitrogen）を含んでいた。ＰＣＲを、９５℃にて２分間を１サイクルと続く、それぞれ９５℃にて３０秒間、４０．８℃にて３０秒間、そして７２℃にて１分３０秒を３４サイクル、それと７２℃にて５分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約１４２８ｂｐのＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によってし、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製分離した。
【０３２１】
先に作製したｐｙｄ４ＰＣＲ産物を、ＸｂａＩとＰａｃＩで消化し、ＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約１．４ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。この精製ＤＮＡを、１× Quick Ligation反応バッファー（New England Biolabs）、１００ｎｇのＸｂａＩ／ＰａｃＩ ｐＭｈＣｔ０６８ベクター、７０．５ｎｇのＸｂａＩ／ＰａｃＩ ｐｙｄ４挿入物、及び１μＬのQuick T4 DNA Ligase（New England Biolabs）を含んでいる連結反応物（２０μＬ）中で、先に記載したＸｂａＩとＰａｃＩで制限消化したｐＭｈＣｔ０６８ベクター内にクローン化した。連結反応物を、室温にて５分間インキュベートし、次に、氷で冷やした。５μＬのこの反応物を、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPack Gold SuperCompetent Cells（Agilent Technologies）を形質転換するのに使用した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、本明細書中に記載したように、ＸｂａＩとＰａｃＩとの消化によって所望のＰＣＲ産物の適切な挿入についてスクリーニングし、検証済み単離菌株の１つを「左側＋ｐｙｄ４＃１」と呼んだ。
【０３２２】
配列番号１７のＳ．アベルミチリスＡＤＣをコードし、且つ、Ｅ．コリにおける発現のためにコドン最適化したポリヌクレオチドを、プライマー０６１１３７６と０６１１３７７で増幅する（プライマー０６１１３７６は、In‐FusionによるｐＭｈＣｔ０６８への挿入後にＮｈｅＩ制限部位の５’末端における「Ｔ」塩基の除去をもたらし、そしてそれが、最初のｐＭｈＣｔ０６８クローンに存在している好ましくないＡＴＧ開始コドンを取り除くことに注意する）。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１μＬのＥ．コリに最適化したＳ．アベルミチリスＡＤＣ遺伝子を含むプラスミドのミニプレップの１〜５０倍希釈物、１× ThermoPol反応バッファー（New England Biolabs）、それぞれ１００ｐｍｏｌのプライマー０６１１３７６と０６１１３７７、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰとｄＣＴＰ、ｄＧＴＰとｄＴＴＰ、２μＬの１００ｍＭ ＭｇＳＯ4、及び２単位のVentR（登録商標）(exo-) DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を含んでいた。ＰＣＲを、９４℃にて２分間を１サイクルと続く、それぞれ９４℃にて３０秒間、５４℃にて３０秒間、そして７２℃にて１分間を３４サイクル、それと７２℃にて１０分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約４２０ｂｐのＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０３２３】
次に、「左側＋ｐｙｄ４＃１」プラスミドを、ＮｈｅＩとＡｓｃＩで消化し、３７℃にて３０分間１０単位の仔ウシ腸ホスファターゼ（New England Biolabs）で処理し、ＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約７．５ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。Ｅ．コリのために最適化したＳ．アベルミチリスＡＤＣ遺伝子を含む先の精製ＰＣＲ断片を、ＮｈｅＩとＡｓｃＩで消化し、ＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって精製し、約４２０ｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。次に、得られた断片を、１× Quick ligation反応バッファー（New England Biolabs）、１００ｎｇのＮｈｅＩ／ＡｓｃＩ「左側＋ｐｙｄ４＃１」ベクター、３１ｎｇのＮｈｅＩとＡｓｃＩで消化したｐａｎＤ挿入物、及び１μＬのQuick T4 DNAリガーゼ（New England Biolabs）を含む連結反応物（２０μＬ）中で線状「左側＋ｐｙｄ４＃１」ベクターに連結した。連結反応物を、室温にて５分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。５μＬのこの反応物を、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPack Gold SuperCompetent Cells（Agilent Technologies）を形質転換するのに使用した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、本明細書中に記載したように、ＡｓｃＩとＰｖｕＩＩでの消化によって、Ｅ．コリのために最適化したＳ．アベルミチリスＡＤＣ遺伝子の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、ＤＮＡ配列決定によって正しいと確認し、そしてｐＭｈＣｔ０７０と呼んだ。
【０３２４】
プラスミドｐＭｈＣｔ０７０は、酵母宿主における発現のためにコドン最適化したＡＤＣ及びＢＡＡＴ相同体の追加のためのベースベクターとして機能した。ｐＭｈＣｔ０７０を、ＸｂａＩとＰａｃＩで消化し、３７℃にて３０分間１０単位の仔ウシ腸ホスファターゼ（New England Biolabs）で処理し、ＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約６．５ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。Ｓ．アベルミチリスＢＡＡＴ（配列番号１４０）をコードし、且つ、Ｉ．オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したポリヌクレオチドを含む先に記載したＸｂａＩ及びＰａｃＩ消化断片を、以下の通りｐＭｈＣｔ０７０切断ベクターに連結した：連結反応物（２０μＬ）は、１× Quick Ligation反応バッファー（New England Biolabs）、４２ｎｇのＸｂａＩ及びＰａｃＩ消化ｐＭｈＣｔ０７０ベクター、４μＬのコドン最適化Ｓ．アベルミチリスＢＡＡＴのＸｂａＩ及びＰａｃＩ消化挿入物、及び１μＬのQuick T4 DNA Ligase（New England Biolabs）を含んでいた。連結反応物を、室温にて５分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。５μＬのこの反応物を、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPack Gold SuperCompetent Cells（Agilent Technologies）を形質転換するのに使用した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、本明細書中に記載したように、ＸｂａＩ、ＰａｃＩ及びＥｃｏＲＶ消化によって所望のＢＡＡＴ ＯＲＦの適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、ＤＮＡ配列決定によって正しいと確認し、そしてｐＭｈＣｔ０７２と呼んだ。
【０３２５】
次に、ｐＭｈＣｔ０７２中の、Ｅ．コリにおける発現のためにコドン最適化したＳ．アベルミチリスＡＤＣ遺伝子を、Ｉ．オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したバージョン（配列番号１３０）と置き換えた。Ｉ．オリエンタリスコドン最適化ＡＤＣ遺伝子（配列番号１３０）、所望の追加制限部位、及びフランキングＤＮＡを、プライマー０６１１３７８と０６１１３７９で増幅した。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１μＬの、コドン最適化Ｓ．アベルミチリスｐａｎＤを含んでいるプラスミド（GeneArt（登録商標））のミニプレップの１〜５０倍希釈物、１× ThermoPol反応バッファー（New England Biolabs）、それぞれ１００ｐｍｏｌのプライマー０６１１３７８と０６１１３７９、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰとｄＣＴＰ、ｄＧＴＰとｄＴＴＰ、２μＬの１００ｍＭ ＭｇＳＯ4、及び２単位のVentR（登録商標）(exo-) DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を含んでいた。ＰＣＲを、９４℃にて２分間を１サイクルと続く、それぞれ９４℃にて３０秒間、５４℃にて３０秒間、そして７２℃にて４５秒間を３４サイクル、それと７２℃にて１０分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約４２０塩基対のＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＡＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０３２６】
５μＬのｐＭｈＣｔ０７２のミニプレップを、ＸｂａＩとＰａｃＩで消化し、３７℃にて３０分間１０単位の仔ウシ腸ホスファターゼ（New England Biolabs）で処理し、ＴＡＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約７．５ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。上記からのコドン最適化Ｓ．アベルミチリスＡＤＣ遺伝子を含む単離ＰＣＲ産物を、以下のIn-Fusion（商標）Advantage PCR Cloning Kit（Clontech）反応においてベクターに加えた：１０μＬの反応物容量は、６μＬのｐＭｈＣｔ０７２の消化及び精製ベクター、１μＬの精製コドン最適化ｐａｎＤ ＰＣＲ産物、１× In-Fusion反応バッファー（Clontech）、及び１μＬのIn-Fusion（商標）酵素（Clontech）から構成された。反応物を、３７℃にて１５分間、そして５０℃にて１５分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。反応物を、４０μＬのＴＥバッファーで希釈し、そして２．５μＬを、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPack Gold SuperCompetent Cells（Agilent Technologies）を形質転換するのに使用した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＮｈｅＩ、ＡｓｃＩ、及びＣｌａＩ消化によって、所望のＰＣＲ産物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、ＤＮＡ配列決定によって正しいと確認し、そしてｐＭｈＣｔ０７４と呼んだ（図７）。
【０３２７】
ｐＭｈＣｔ０７４は、コドン最適化Ｓ．アベルミチリスＡＤＣ（ｐａｎＤ、配列番号１３０）の発現を駆動するＰＤＣプロモーター、ＴＡＬターミネータ、コドン最適化Ｓ．アベルミチリスＢＡＡＴ（配列番号１４０）の発現を駆動するＥＮＯ１プロモーター、ＲＫＩターミネータ、Ｉ．オリエンタリスＵＲＡ３プロモーター、及びＩ．オリエンタリスＵＲＡ３ ＯＲＦの５’断片を含んでいる左側ＰＤＣターゲッティング構築物である。
Ｓ．アベルミチリスＡＤＣ（配列番号１３０）及びＳ．クルイベリＢＡＡＴ（配列番号１４２）を含んでいる左側断片
【０３２８】
Ｓ．クルイベリＢＡＡＴ（ｐｙｄ４）を発現する左側ＤＮＡ構築物を作製するために、Ｉ．オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したＳ．クルイベリＢＡＡＴ配列（配列番号１４２、前掲）を含むＸｂａＩ及びＰａｃＩ消化からの断片を、以下の通り先のｐＭｈＣｔ０７０消化ベクターに連結した：連結反応物（２０μＬ）には、１× Quick Ligation反応バッファー（New England Biolabs）、４２ｎｇのＸｂａＩ及びＰａｃＩ消化ｐＭｈＣｔ０７０ベクター、４μＬのＸｂａＩ及びＰａｃＩで消化したコドン最適化Ｓ．クルイベリｐｙｄ４挿入物、及び１μＬのQuick T4 DNA Ligase（New England Biolabs）が含まれていた。連結反応物を、室温にて５分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。５μＬのこの反応物を、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPack Gold SuperCompetent Cells（Agilent Technologies）を形質転換するのに使用した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＸｂａＩ、ＰａｃＩ、及びＥｃｏＲＶ消化によって、所望のｐｙｄ４ ＯＲＦの適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、ＤＮＡ配列決定によって正しいと確認し、そしてｐＭｈＣｔ０７３と呼んだ。
【０３２９】
プラスミドｐＭｈＣｔ０７３は、Ｉ．オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化した所望のＳ．クルイベリＢＡＡＴ（ｐｙｄ４）配列を含んでいるが、Ｉ．オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化した所望のＳ．アベルミチリスＡＤＣ（ｐａｎＤ）配列は含んでいない。このＯＲＦに入れるために、５μＬのｐＭｈＣｔ０７３のミニプレップを、ＸｂａＩとＰａｃＩで消化し、３７℃にて３０分間１０単位の仔ウシ腸ホスファターゼ（New England Biolabs）で処理し、そしてＴＡＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。約７．５ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。コドン最適化Ｓ．アベルミチリスｐａｎＤ（前掲）を含む単離ＰＣＲ産物を、以下のIn-Fusion（商標）Advantage PCR Cloning Kit（Clontech）反応においてベクターに加えた：１０μＬの反応物容量は、６μＬのｐＭｈＣｔ０７３の消化及び精製ベクター、１μＬの精製コドン最適化ｐａｎＤ ＰＣＲ産物、１× In-Fusion反応バッファー（Clontech）、及び１μＬのIn-Fusion（商標）酵素（Clontech）から構成された。反応物を、３７℃にて１５分間、５０℃にて１５分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。反応物を、４０μＬのＴＥバッファーで希釈し、そして、２．５μＬを、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPack Gold SuperCompetent Cells（Agilent Technologies）を形質転換するのに使用した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＮｈｅＩ、ＡｓｃＩ、及びＣｌａＩ消化によって、所望のＰＣＲ産物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、ＤＮＡ配列決定によって正しいと確認し、そしてｐＭｈＣｔ０７６と呼んだ。
【０３３０】
プラスミドｐＭｈＣｔ０７６は、Ｉ．オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したＳ．アベルミチリスＡＤＣの発現を駆動するＰＤＣのプロモーター（ｐａｎＤ、配列番号１３０）、ＴＡＬターミネータ、Ｉ．オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したＳ．クルイベリＢＡＡＴの発現を駆動するＥＮＯ１プロモーター（ｐｙｄ４、配列番号１４２）、ＲＫＩターミネータ、Ｉ．オリエンタリスＵＲＡ３プロモーター、及びＩ．オリエンタリスＵＲＡ３ ＯＲＦの５’断片を含む左側ＰＤＣターゲッティング構築物である。
【０３３１】
配列決定では、プラスミドｐＭｈＣｔ０７６が、ＰＤＣプロモーター内に約２００ｂｐのＡからＴへのヌクレオチド変化、及びｐＭｈＣｔ０６８親ベクター（前掲）内に存在しているＰＤＣプロモーターを通じて〜全体の２／３にＧからＴへのヌクレオチド変化を含んでいると断定した。遺伝子発現の潜在的改変に関するいずれかの懸念に対処するために、ｐＭｈＣｔ０７６に類似しているが、修正ＰＤＣプロモーターを含む構築物を、以下で記載するようにクローン化した。
【０３３２】
５μＬのｐＭｈＣｔ０８２のミニプレップを、ＮｈｅとＰａｃＩで消化し、３７℃にて３０分間１０単位の仔ウシ腸ホスファターゼ（New England Biolabs）で処理し、ＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約４．７ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。４μＬのｐＭｈＣｔ０７６のミニプレップを、ＮｈｅＩとＰａｃＩで消化し、ＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約３．３ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。次に、精製した４．７ｋｂｐのベクターと３．３ｋｂｐの挿入物を、１× Quick Ligation反応バッファー（New England Biolabs）、３μＬのｐＭｈＣｔ０８２ベクター、６μＬのｐＭｈＣｔ０７６挿入物、及び１μＬのQuick T4 DNA Ligase（New England Biolabs）を含む連結反応物（２０μＬ）中で一つに連結した。連結反応物を、室温にて５分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。５μＬのこの反応物を、製造業者の取扱説明書に従ってOne Shot（登録商標）TOP10化学的コンピテントＥ．コリ細胞（Invitrogen）を形質転換するのに使用した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして室温にて３日間インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＳｔｕＩとＮｏｔＩでの消化によって、所望のＰＣＲ産物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、ＤＮＡ配列決定によって正しいと確認し、そしてｐＭｈＣｔ０８３と呼んだ（図８）。
【０３３３】
プラスミドｐＭｈＣｔ０８３は、前者が正しいＰＤＣプロモータ配列を含んでいる一方、後者が先に記載したから１つのＡからＴへのヌクレオチド変化と１つのＧからＴへのヌクレオチド変化を持つということを除いて、ｐＭｈＣｔ０７６と同一である。試験は、ｐＭｈＣｔ０８３及びｐＭｈＣｔ０７７と比較した場合、ｐＭｈＣｔ０７６及びｐＭｈＣｔ０７７の組み込みからＳ．アベルミチリスｐａｎＤを発現する菌株と、ｐａｎＤ酵素活性に違いがないことを示した。
【０３３４】
Ｓ．アベルミチリスＡＤＣ（配列番号１３０）及びサッカロマイセス・セレビシエｇａｂＴ（配列番号１４１）を含む左側断片
４μＬのｐＭｈＣｔ０８３のミニプレップを、ＸｂａＩとＰａｃＩで消化し、３７℃にて３０分間１０単位の仔ウシ腸ホスファターゼ（New England Biolabs）で処理し、ＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約６．５ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。Ｉ．オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したサッカロマイセス・セレビシエｇａｂＴ（ＵＧＡ１、配列番号１４１）を含んでいる、ＸｂａＩ及びＰａｃＩ消化した断片を、以下の通りｐＭｈＣｔ０８３切断ベクターに連結した：連結反応物（２０μＬ）は、１× Quick Ligation反応バッファー（New England Biolabs）、１μＬのＸｂａＩとＰａｃＩで消化した精製ｐＭｈＣｔ０８３ベクター、３μＬのコドン最適化Ｓ．セレビシエＵＧＡ１のＸｂａＩ及びＰａｃＩ消化挿入物、及び１μＬのQuick T4 DNA Ligase（New England Biolabs）を含んでいる。連結反応物を、室温にて５分間インキュベートし、次に、チューブを氷上に置いた。５μＬのこの反応物を、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPack Gold SuperCompetent Cells（Agilent Technologies）を形質転換するのに使用した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＸｂａＩ及びＢｇｌＩＩ消化によって、所望のＢＡＡＴ ＯＲＦの適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらしたクローンを、ｐＭｈＣｔ０８７と呼んだ（図９）。
【０３３５】
プラスミドｐＭｈＣｔ０８７は、Ｉ．オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したＳ．アベルミチリスＡＤＣの発現を駆動するＰＤＣのプロモーター（ｐａｎＤ、配列番号１３０）、ＴＡＬターミネータ、Ｉ．オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したＳ．セレビシエｇａｂＴの発現を駆動するＥＮＯ１プロモーター（ＵＧＡ１、配列番号１４１）、ＲＫＩターミネータ、Ｉ．オリエンタリスＵＲＡ３プロモーター、及びＩ．オリエンタリスＵＲＡ３ ＯＲＦの５’断片を含む左側ＰＤＣターゲッティング構築物である。
【０３３６】
実施例３Ａ‐４：ｐｄｃ遺伝子座においてアスパラギン酸１‐デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）、β‐アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＢＡＡＴ）、及び３‐ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ（３‐ＨＰＤＨ）を発現するための挿入ベクターの右側断片の構築
Ｅ．コリ３‐ＨＰＤＨを含む右側断片（配列番号１４３）
【０３３７】
２μｇのｐＭｈＣｔ０６９（前掲）のミニプレップを、ＸｂａＩとＰａｃＩで消化し、３７℃にて３０分間１０単位の仔ウシ腸ホスファターゼ（New England Biolabs）で処理し、ＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約２．２ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
Ｉ．オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したＥ．コリ３‐ＨＰＤＨ遺伝子を含むＸｂａＩ及びＰａｃＩで消化した断片（ｙｄｆＧ、配列番号１４３）を、以下の通りｐＭｈＣｔ０６９切断ベクターに連結した：連結反応物（２０μＬ）は、１× Quick Ligation反応バッファー（New England Biolabs）、２μＬのＸｂａＩとＰａｃＩで消化した精製ｐＭｈＣｔ０６９ベクター、４μＬのＸｂａＩとＰａｃＩで消化したコドン最適化Ｅ．コリｙｄｆＧ挿入物、及び１μＬのQuick T4 DNA Ligase（New England Biolabs）が含まれた。連結反応物を、室温にて５分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。５μＬのこの反応物を、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPack Gold SuperCompetent Cells（Agilent Technologies）を形質転換するのに使用した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして室温にて３日間インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＸｂａＩ、ＰａｃＩ、及びＥｃｏＲＶ消化によって、所望のｙｄｆＧ ＯＲＦの適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、本明細書中に記載したように、ＤＮＡ配列決定によって正しいと確認し、そしてｐＭｈＣｔ０７５と呼んだ（図１０）。
【０３３８】
プラスミドｐＭｈＣｔ０７５は、Ｉ．オリエンタリスＵＲＡ３ ＯＲＦの３’断片、（後でＵＲＡ３マーカーのその後のループアウトための）ＵＲＡ３プロモーターが続くＩ．オリエンタリスからのＵＲＡ３ターミネータ、Ｉ．オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化し、且つ、Ｉ．オリエンタリスＴＤＨ３プロモーターによって駆動されるＥ．コリ３‐ＨＰＤＨ遺伝子（ｙｄｆＧ、配列番号１４３）、及びＩ．オリエンタリスＰＤＣターミネータ領域を含んでいる。
サッカロマイセス・セレビシエ３‐ＨＰＤＨを含む右側断片（配列番号１４４）
【０３３９】
Ｉ．オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したＳ．セレビシエＹＭＲ２２６Ｃ遺伝子を含む、ＸｂａＩとＰａｃＩで消化した断片（前掲）を、以下の通りｐＭｈＣｔ０６９切断ベクターに連結した：連結反応物（２０μＬ）は、１× Quick Ligation反応バッファー（New England Biolabs）、２μＬのＸｂａＩとＰａｃＩで消化した精製ｐＭｈＣｔ０６９ベクター、４μＬのＸｂａＩとＰａｃＩで消化したコドン最適化Ｓ．セレビシエ３‐ＨＰＤＨ挿入物（ＹＭＲ２２６Ｃ、配列番号１４４）、及び１μＬのQuick T4 DNA Ligase（New England Biolabs）を含んでいた。連結反応物を、室温にて５分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。５μＬのこの反応物を、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPack Gold SuperCompetent Cells（Agilent Technologies）を形質転換するのに使用した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして、室温にて３日間インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＸｂａＩ、ＰａｃＩ、及びＥｃｏＲＶ消化によって、所望のＹＭＲ２２６Ｃ ＯＲＦの適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらしたクローンを、ＤＮＡ配列決定によって正しいと確認し、そしてｐＭｈＣｔ０７７と呼んだ（図１１）。
【０３４０】
プラスミドｐＭｈＣｔ０７７は、Ｉ．オリエンタリスＵＲＡ３ ＯＲＦの３’断片、（後のＵＲＡ３マーカーのループアウトための）ＵＲＡ３プロモーターが続くＩ．オリエンタリスからのＵＲＡ３ターミネータ、Ｉ．オリエンタリスＴＤＨ３プロモーターによって駆動されるＩ．オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したＳ．セレビシエ３‐ＨＰＤＨ遺伝子（ＹＭＲ２２６Ｃ、配列番号１４４）、及びＩ．オリエンタリスＰＤＣターミネータ領域を含む。
【０３４１】
実施例３Ａ‐５：ＰＤＣ遺伝子座においてアスパラギン酸１‐デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）、β‐アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＢＡＡＴ）、及び３‐ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ（３‐ＨＰＤＨ）を発現する異型接合及びホモ接合酵母菌株
先の実施例３Ａ‐３及び実施例３Ａ‐４は、Ｉ．オリエンタリスＰＤＣ遺伝子座に対する、３つの異所性遺伝子の同時ターゲッティング発現のための様々な左側又は右側構築物の構築を記載している。形質転換前に、約１０μｇのそれぞれの構築物（１つの所望の左側構築物と１つの所望の右側構築物）をＮｏｔＩで消化し、ｐＵＣ１８骨格ベクターから所望の形質転換ＤＮＡを切り出した；ほとんどの消化について、制限酵素ＰｖｕＩもまた、ＮｏｔＩ消化に含まれていた。制限酵素ＰｖｕＩは、ｐＵＣ１８ベクター断片を約半分に消化し、ゲル電気泳動によるより大きな、所望のＤＮＡ断片の分離をより容易にする。より大きな発現カセットを含んでいるバンドを、ゲル電気泳動によってｐＵＣ１８骨格ＤＮＡと分離し、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。３０μＬの溶出バッファーを溶出ステップに使用した。合計で１０μＬの等モル比の１の左側構築物と１の右側構築物を、Ｉ．オリエンタリス菌株ＣＮＢ１又は適当な誘導体を形質転換するのに使用した。形質転換体を、ｕｒａ選択プレート上で選択し、培養のために３７℃に置いた。翌日、約１２の形質転換体を、釣り出し、そしてシングルコロニー用にｕｒａ選択プレートに再び画線接種し、そして３７℃にて培養した。翌日、シングルコロニーを、それぞれの最初の形質転換体によって作り出されたそれぞれの画線から釣り出し、そしてシングルコロニー用にｕｒａ選択プレートに再び画線接種した。３７℃にてもう一晩の培養後に、最終的なシングルコロニーを、各画線から釣り出し、そしてｕｒａ選択プレート上に再び画線接種し、３７℃にて一晩培養した。この第２ラウンドのシングルコロニー精製及び増殖後に、ゲノムＤＮＡを、先に記載した通り所望の標的組み込みが起こったのを確かめるためのＰＣＲでの使用のために調製した。左側及び右側構築物を使用したＰＤＣに対する標的化のために、所望の組み込み事象の検証を、プライマー０６１１８１４、０６１１５５４、及び０６１１５５５を使用して判断した。プライマー０６１１５５４は、右側ＰＤＣターゲッティング構築物内に存在しているＩ．オリエンタリスゲノムＤＮＡのちょうど３’のＰＤＣターミネータ領域に結合し；プライマー０６１１５５５は、ＰＤＣ ＯＲＦ内に結合し、終止に向かって増幅をおこない；そしてプライマー０６１１８１４は、右側構築物内に存在しているＴＤＨ３プロモータ領域の３’末端の近くに結合し、３’方向に増幅する。プライマー０６１１８１４及び０６１１５５４を含んだＰＣＲからの約１．９ｋｂｐのバンドの発生は、ＰＤＣ遺伝子座における所望の組み込み事象の出現を示した。プライマー０６１１５５５及び０６１１５５４を含んだＰＣＲからの約１．４ｋｂｐのバンドの発生は、野生型ＰＤＣ遺伝子座の存在を示した。この組み込み事象は二倍体Ｉ．オリエンタリスＣＮＢ１における第１のターゲッティング事象であるので、所望の組み込み体は、プライマー０６１１８１４及び０６１１５５４に関して１．９ｋｂｐのバンド、及びプライマー０６１１５５５及び０６１１５５４から１．４ｋｂｐのバンドの両方を示す。各プラスミドに所望のバンドパターンをもたらす２つの独立した形質転換体を、表１５に示すように呼んだ。
【０３４２】
【表２４】
2013542747.tif 000025
【０３４３】
次に、ｙＭｈＣｔ００４又はｙＭｈＣｔ００５のｕｒａ−誘導体を、先に記載したように単離した。それぞれの親菌株のいくつかのＦＯＡ耐性コロニーからのゲノムＤＮＡを、プライマー０６１１８１５と０６１１８１７を用いた所望のループアウト事象についてＰＣＲによってスクリーニングした。プライマー０６１１８１５は、左側構築物のＲＫＩターミネータにアニールし、そしてＵＲＡ３プロモーターに向かって増幅する。プライマー０６１１８１７は、ＴＤＨ３プロモーターにアニールし、そしてＵＲＡ３カセットに向かって戻る方向に増幅する。８２８ｂｐのバンドの存在が、所望のｕｒａ３の瘢痕部位（親菌株の２つのＵＲＡ３プロモーターの間の相同組み換え後に取り残された１つのＵＲＡ３プロモーター）だけが存在することを示すのに対して、約２．２ｋｂｐのバンドは、完全なＵＲＡ３プロモーター‐ＵＲＡ３ ＯＲＦ‐ＵＲＡ３ターミネータ‐ＵＲＡ３プロモーターカセットの存在を示し、そしてそれは、所望の組み換え事象が起こらなかったことを示す。Crimson Taq（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs）を用いたＰＣＲ反応を、先に記載したように実施した。ｙＭｈＣｔ０１２と呼ばれる、親菌株ｙＭｈＣｔ００４からの１つのＦＯＡ耐性コロニー、及びｙＭｈＣｔ００７と呼ばれる、親菌株ｙＭｈＣｔ００５からの１つのＦＯＡ耐性コロニーは、所望の８２８ｂｐのバンドをもたらす。
【０３４４】
菌株ｙＭｈＣｔ０１２とｙＭｈＣｔ００７を次に、形質転換して、ＰＤＣ遺伝子を欠失し、且つ、それぞれｐａｎＤ、ｐｙｄ４、及びＹＭＲ２２６Ｃ若しくはｐａｎＤ、ＵＧＡ１、及びＹＭＲ２２６Ｃの発現カセットで置き換えたホモ接合菌株を作出した。菌株ｙＭｈＣｔ０１２を、ｐＭｈＣｔ０８３とｐＭｈＣｔ０７７からの線状ＤＮＡによって形質転換したのに対して、ｙＭｈＣｔ００７を、ｐＭｈＣｔ０８７とｐＭｈＣｔ０７７からの線状ＤＮＡによって形質転換した。２ラウンドのシングルコロニー精製後に、各親菌株からのいくつかの形質転換体からのゲノムＤＮＡを、先に記載したようにプライマー０６１１８１５と０６１１８１７を用いたＰＣＲによってスクリーニングした。（元々標的としていたＰＤＣ遺伝子座からのｕｒａ３瘢痕領域の増幅からの）８２８ｂｐのバンドと（もう一つの染色体における第２の組み込み事象からのＵＲＡ３プロモーター‐ＵＲＡ３ ＯＲＦ‐ＵＲＡ３ターミネータ‐ＵＲＡ３プロモーターカセットの組み込みからの）２．２ｋｂｐのバンドの両方を持つ各親菌株からの独立に単離した２つの組み込み体を、表１６に示すように呼んだ。
【０３４５】
【表２５】
2013542747.tif 000026
【０３４６】
ｙＭｈＣｔ００８のｕｒａ−誘導体を、先に記載したように単離した。ｙＭＨＣｔ００８親菌株からのいくつかのＦＯＡ耐性コロニーからのゲノムＤＮＡを、本明細書中に記載したように、プライマー０６１１８１５と０６１１８１７を用いて、所望のループアウト事象についてＰＣＲによってスクリーニングした。
８２８ｂｐのバンドの存在は、所望されるｕｒａ３瘢痕部位（親菌株における２つのＵＲＡ３プロモーターの間の相同組み換え後に取り残された１つのＵＲＡ３プロモーター）だけが存在することを示した。８２８ｂｐのバンドだけを示した単離菌株を、本明細書中に記載したように、プライマー０６１１５５５と０６１１５５４を使用してさらにスクリーニングした。プライマー０６１１５５５と０６１１５５４を含んだＰＣＲからの約１．４ｋｂｐのバンドの発生は、野生型ＰＤＣ遺伝子座の存在を示した。両染色体上のＰＤＣ遺伝子座が欠失したことを示す、このバンドを欠く単離菌株を、ｙＭｈＣｔ０１０と呼んだ。
【０３４７】
菌株を、振盪フラスコで培養し、ＣＦＥを調製し、そして本明細書中に記載のとおり、アスパラギン酸デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）活性及び３‐ＨＰデヒドロゲナーゼ（３‐ＨＰＤＨ）活性についてアッセイした。いくつかのアッセイセット（トライアル１〜４と表す）の実験結果を表１７に示す。表１７のトライアル１からの菌株もまた、本明細書中に記載したようにＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって分析した。トライアル１の菌株７４／７５＃１及び菌株ｙＭｈＣｔ００２は、トライアル１の対照菌株（ＭＢｉｎ５００）に存在していない２７ｋＤにＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析いおいてバンドをもたらした。このタンパク質バンドのサイズは、ｙｄｆＧ遺伝子によってコードされるタンパク質の正体と一致している。
【０３４８】
【表２６】
2013542747.tif 000027
【０３４９】
別のアッセイセットについての実験結果を、表１７（トライアル２）に示す。表１７のトライアル２からの菌株もまた、本明細書中に記載したようにＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって分析した。ＭＢｉｎ５００以外のトライアル２の全菌株が、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析において２９ｋＤにバンドをもたらした。このタンパク質バンドのサイズは、ＹＭＲ２２６ｃ遺伝子によってコードされるタンパク質の正体と一致している。トライアル２の菌株ｙＭｈＣｔ００５及び８７／７７＃２は、このトライアルの他の３サンプルに存在しない５３ｋＤのバンドをもたらした。このタンパク質バンドのサイズは、ＵＧＡ１遺伝子によってコードされるタンパク質の正体と一致している。
【０３５０】
別のアッセイセットについての実験結果を、表１７（トライアル３）に示す。表１７のトライアル３からの菌株もまた、本明細書中に記載したようにＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって分析した。ＭＢｉｎ５００以外のトライアル３の全菌株が、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析において２９ｋＤのバンドと５３ｋＤのバンドをもたらした。これらのタンパク質バンドのサイズは、それぞれＵＧＡ１遺伝子とＹＭＲ２２６ｃ遺伝子によってコードされるタンパク質と一致している。トライアル３の菌株ＭＢｉｎ５００及びｙＭｈＣｔ００５は、このトライアルのｙＭｈＣｔ００８及びｙＭｈＣｔ００９には不存在のＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析における６４ｋＤのバンドを示した。このタンパク質バンドのサイズは、Ｉ．オリエンタリスＣＮＢ１の天然ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）遺伝子によってコードされるタンパク質の正体と一致している。
【０３５１】
別のアッセイセットについての実験結果を、表１７（トライアル４）に示す。表１７のトライアル４からの菌株もまた、本明細書中に記載したようにＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって分析した。ＭＢｉｎ５００以外のトライアル４の全菌株が、２９ｋＤのバンドをもたらした。このタンパク質バンドのサイズは、ＹＭＲ２２６ｃ遺伝子によってコードされるタンパク質の正体と一致している。トライアル４の菌株ｙＭｈＣｔ００５、ｙＭｈＣｔ００８、及びｙＭｈＣｔ００９は、５３ｋＤのバンドを示した。このバンドのサイズは、ＵＧＡ１遺伝子によってコードされるタンパク質と一致している。トライアル４の菌株ｙＭｈＣｔ０１３及びｙＭｈＣｔ０１４は、５３ｋＤのほのかなバンドを示した。このバンドのサイズは、ＰＹＤ４遺伝子によってコードされるタンパク質と一致している。トライアル４の菌株ＭＢｉｎ５００、ｙＭｈＣｔ００４、及びｙＭｈＣｔ００５は、菌株ｙＭｈＣｔ００８、ｙＭｈＣｔ００９、ｙＭｈＣｔ０１３、及びｙＭｈＣｔ０１４に不存在の６４ｋＤのバンドを示した。このタンパク質バンドのサイズは、Ｉ．オリエンタリスＣＮＢ１の天然ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）遺伝子によってコードされるタンパク質の正体と一致している。
【０３５２】
菌株ＭＢｉｎ５００及びｙＭｈＣｔ００８を、本明細書中に記載した方法を使用して、３‐ＨＰ生産についてバイオリアクターにおいて試験及び評価した。対照菌株ＭＢｉｎ５００は、検出可能な３‐ＨＰを産生しなかった（２回の独立した発酵の平均）。菌株ｙＭｈＣｔ００８は、２．４５ｇ／Ｌの３‐ＨＰを産生した（１２回の独立した発酵の平均）。
【０３５３】
実施例３Ａ‐６：ａｄｈ１２０２遺伝子座においてβ‐アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＢＡＡＴ）又は３‐ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ（３‐ＨＰＤＨ）を発現し、且つ、ｐｄｃ遺伝子座においてアスパラギン酸１‐デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）、β‐アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＢＡＡＴ）、及び３‐ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ（３‐ＨＰＤＨ）を発現する酵母菌株
【０３５４】
２０μｇのｐＭｈＣｔ０７７、ｐＭｈＣｔ０８３、及びｐＭｈＣｔ０８７（前掲）を、ＮｏｔＩとＰｖｕＩで消化し、次に、８９ｍＭのＴｒｉｓ塩基‐８９ｍＭのホウ酸‐２ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム（ＴＢＥ）バッファーを使用して１％アガロースゲルで泳動した。それぞれｐＭｈＣｔ０７７、ｐＭｈＣｔ０８３、及びｐＭｈＣｔ０８７からの３８１５ｂｐ、５３３２ｂｐ、又は５３２０ｂｐのＮｏｔＩ消化断片を、ゲルから切り出し、そしてQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用してアガロースから抽出した。５６０ｎｇのＮｏｔＩ消化ｐＭｈＣｔ０７７及び５６０ｎｇのＮｏｔＩ消化ｐＭｈＣｔ０８３又はｐＭｈＣｔ０８７を、菌株ＭＩＢａ３２０、ＭＩＢａ３２１、及びＭＩＢａ３２２に形質転換した。ＭＩＢａ３２０を、ｐＭｈＣｔ０７７／８３及びｐＭｈＣｔ０７７／８７の組み合わせで形質転換した。ＭＩＢａ３２１をｐＭｈＣｔ０７７／８７で本明細書中に記載したように形質転換し、そしてＭＩＢａ３２２をｐＭｈＣｔ０７７／８３で本明細書中に記載したように形質転換した。形質転換体を、ｕｒａ選択培地に平板培養し、室温にて約６０時間インキュベートした。形質転換体を、ｕｒａ選択培地に再び画線接種し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。ゲノムＤＮＡを、ＵＲＡ３＋コロニーから調製し、そして、発現カセットの組み込みを確認するために、本明細書中に記載したようにＰＣＲによってチェックした。プライマー対６１１８１４と６１１５５４は、組み込みを示す１．９ｋｂｐの断片を増幅する。プライマー対６１１５５５と６１１５５４は、野生型遺伝子座を示す１．４ｋｂｐの断片を増幅する。６１１５５４と６１１８１４により１．９ｋｂｐのＰＣＲ断片を増幅し、且つ、６１１５５５と６１１５５４により１．４ｋｂｐのＰＣＲ断片を増幅したそれぞれの系統の１つのＵＲＡ３＋形質転換体を保存し；これらを、ＭＩＢａ３２３、ＭＩＢａ３２４、ＭＩＢａ３２５、及びＭＩＢａ３２７と呼んだ（遺伝子型に関しては表１８を参照のこと）。プロモーターとターミネータを、Ｉ．オリエンタリス遺伝子から得た。
【０３５５】
【表２７】
2013542747.tif 000028
【０３５６】
菌株を、振盪フラスコで培養し、ＣＦＥを調製し、そして３‐ＨＰデヒドロゲナーゼ（３‐ＨＰＤＨ）活性について、本明細書中に記載したようにアッセイした。結果を表１９に示す。
【０３５７】
【表２８】
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【０３５８】
ＭＩＢａ３２３、ＭＩＢａ３２４、ＭＩＢａ３２５、及びＭＩＢａ３２７のＵｒａ−誘導体を、本明細書中に記載したように単離した。ゲノムＤＮＡを、ＦＯＡ耐性コロニーから調製し、そしてＵＲＡ３選択マーカーの欠失を確認するために、本明細書中に記載したようにＰＣＲによってチェックした。プライマー０６１１８１５は、左側構築物のＲＫＩターミネータにアニールし、そしてＵＲＡ３プロモーターに向かって増幅する、そしてプライマー０６１１８１７は、ＴＤＨ３プロモーターにアニールし、ＵＲＡ３カセットに向かって戻る方向に増幅する。８２８ｂｐのバンドの存在は、所望される、ＵＲＡ３の瘢痕部位（親菌株の２つのＵＲＡ３プロモーターの間の相同組み換え後に取り残された１つのＵＲＡ３プロモーター）の存在を示すのに対して、約２．２ｋｂｐのバンドは、完全なＵＲＡ３プロモーター‐ＵＲＡ３ ＯＲＦ‐ＵＲＡ３ターミネータ‐ＵＲＡ３プロモーターカセットの存在を示し、そしてそれは、所望の組み換え事象が起きなかったことを示す。プライマー０６１１８１５と０６１１８１７により８２８ｂｐのＰＣＲ断片をもたらす、Ｕｒａ−菌株のＭＩＢａ３２３、ＭＩＢａ３２４、ＭＩＢａ３２５、及びＭＩＢａ３２７を保存し、そしてそれぞれＭＩＢａ３３５、ＭＩＢａ３３３、ＭＩＢａ３３４、及びＭＩＢａ３３６と呼んだ。
【０３５９】
ＭＩＢａ３２０‐２の形質転換の項において先に記載したように、菌株ＭＩＢａ３３３及びＭＩＢａ３３４を、ｐＭｈＣｔ０７７及びｐＭｈＣｔ０８７からの断片で形質転換し、そして、菌株ＭＩＢａ３３５及びＭＩＢａ３３６を、ｐＭｈＣｔ０７７及びｐＭｈＣｔ０８３からの断片で形質転換した。形質転換体を、本明細書中に記載したように、ｕｒａ選択培地での培養によって選択した。発現カセットの組み込みを確認するために、ゲノムＤＮＡを、本明細書中に記載したようにＵＲＡ３＋コロニーから調製し、そしてＰＣＲによってチェックした。プライマー０６１１８１５は、左側構築物のＲＫＩターミネータにアニールし、そしてＵＲＡ３プロモーターに向かって増幅する。プライマー０６１１８１７は、ＴＤＨ３プロモーターにアニールし、そしてＵＲＡ３カセットに向かって戻る方向に増幅する。８２８ｂｐのバンドの存在は、第１の組み込みに関して所望される、ＵＲＡ３の瘢痕部位（親菌株の２つのＵＲＡ３プロモーターの間の相同組み換え後に取り残された１つのＵＲＡ３プロモーター）の存在を示すのに対して、約２．２ｋｂｐのバンドは、第２の組み込みのための完全なＵＲＡ３プロモーター‐ＵＲＡ３ ＯＲＦ‐ＵＲＡ３ターミネータ‐ＵＲＡ３プロモーターカセットの存在を示す。ｕｒａマーカーが存在しているとき、プライマー対０６１１８１５と０６１１８１６は、６２５ｂｐの断片を増幅する。ＰＤＣ遺伝子座が存在しているとき、プライマー０６１１５５５及び０６１１５５４は、１．４ｋｂｐの断片を増幅する。ホモ接合の組み込み体は、これらのプライマーでは断片を増幅しないはずである。プライマー０６１１８１５と０６１１８１７により８２８ｂｐと２．２ｋｂｐのＰＣＲ断片が増幅され、プライマー０６１１８１５と０６１１８１６により６２５ｂｐのＰＣＲ断片が増幅され、そしてプライマー０６１１５５５と０６１１５５４では断片が増幅されないそれぞれの系統の１つのＵＲＡ３＋形質転換体を保存した；これらを、ＭＩＢａ３４０、ＭＩＢａ３４１、ＭＩＢａ３４５、及びＭＩＢａ３４８と呼んだ（表２０Ａを参照のこと）。
【０３６０】
【表２９】
2013542747.tif 000030
【０３６１】
菌株ＭＢｉｎ５００（対照）、ＭＩＢａ３４５、ＭＩＢａ３４８、ＭＩＢａ３４０、及びＭＩＢａ３４１から調製したＣＦＥにおけるアスパラギン酸１‐デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）、β‐アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＢＡＡＴ）、及び３‐ＨＰデヒドロゲナーゼ（３‐ＨＰＤＨ）活性を比較した。この実験の結果を表２０Ｂに示す。
【０３６２】
【表３０】
2013542747.tif 000031
【０３６３】
実施例３Ａ‐７：ａｄｈ１２０２遺伝子座においてアスパラギン酸１‐デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）を発現するための複数のヌクレオチド配列を持つ挿入ベクターの左側断片
構築物を、Ｉ．オリエンタリスａｄｈ１２０２遺伝子座にＡＤＣをコードするヌクレオチド（配列番号１７）を４コピー組み込むように設計した。ＰＤＣ遺伝子座に関して本明細書中に記載したものと同様のアプローチにおいて、相同組み換えを可能にするように、左側構築物と右側構築物を設計した。組み込みベクターの全体的な設計と所望の組み換え事象を図３に示す。このアプローチはまた、以下の実施例に記載の代替ＡＤＣ（配列番号１３９）の発現にも使用した。
【０３６４】
組み換えが同じＡＤＣ配列をコードするヌクレオチド配列の複数のコピーの間で起こるのを予防するために、Ｉ．オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化した４つの異なったヌクレオチド配列（配列番号１３０、１４５、１４６、及び１４７）を、配列番号１７と同じＡＤＣ配列をコードするように設計した。さらに、Ｉ．オリエンタリスのａｌｄ５６８０遺伝子座を標的化するように、最初の構築物セットを設計したので、ａｄｈ１２０２ターゲッティング配列を、クローニングの後期ステップでこれらのベクターに組み入れた。ａｌｄ５６８０構築物は、ａｌｄ５６８０におけるｐａｎＤの更なる４コピーを用いて、ａｄｈ１２０２におけるｐａｎＤの異所性の４コピーに関して既にホモ接合であるＩ．オリエンタリスＣＮＢ１菌株の第２の遺伝子座を標的化するのに使用できる。
【０３６５】
左側ａｌｄ５６８０ターゲッティングベクターを、以下の通り構築した。ａｌｄ５６８０ ＯＲＦのすぐ５’側の配列を、クローニングのための所望の追加制限部位及びフランキングＤＮＡと共に含むＰＣＲ産物を、プライマー０６１２２７１と０６１２２７２で増幅する。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１μＬのｐＨＪＪ７５のニプレッププラスミドＤＮＡの１〜５０倍希釈物（図２３）、１× iProof（商標）HFバッファー（Bio-Rad Laboratories）、それぞれ１００ｐｍｏｌのプライマー０６１２２７１と０６１２２７２、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、及び１単位のiProof（商標）High Fidelity DNAポリメラーゼ（Bio-Rad Laboratories）を含んでいた。ＰＣＲを、９８℃にて３０秒間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて１０秒間、５９℃にて２０秒間、そして７２℃にて４５秒間を３２サイクル、それと７２℃にて１０分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、製造業者の取扱説明書に従って約９３０塩基対のＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＡＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そしてNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０３６６】
大量のＤＮＡの精製を可能にするために、先に記載したＰＣＲ反応物を、鋳型ＤＮＡとして９３０ｂｐの精製ＰＣＲ産物を使用して繰り返した。５つの５０μＬの反応物を、準備し、そして鋳型ＤＮＡとして、１μＬの９３０ｂｐの精製ＰＣＲ産物をｐＨＪＪ７５プラスミド（前掲）と置き換えたことを除いて、先に記載の条件で増幅した。サーモサイクリングに続いて、９３０ｂｐの増幅産物を上述のとおり精製した。
【０３６７】
（配列番号１３０のＩ．オリエンタリスコドン最適化Ｓ．アベルミチリスＡＤＣコード配列を含む）ＰＤＣ ｐｒｏｍｏ‐ｏｐｔＰａｎＤ‐ＥＮＯ１‐ＵＧＡ１を含む断片を、ＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＩ消化によってｐＭｈＣｔ０８７（前掲）から切り出した。１０μｇのｐＭｈＣｔ０８７のミディプレップを、ＮｏｔＩとＥｃｏＲＩで消化し、次に、ＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって精製した。約４．４ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０３６８】
クローニングのための所望の追加制限部位及びフランキングＤＮＡを持つＵＲＡ３スプリットマーカーの５’側半分を含むＰＣＲ産物を、プライマー０６１２２７３と０６１２２７４を使用して増幅した。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１μＬのｐＭｈＣｔ０８２ミニプレッププラスミドＤＮＡ（前掲）の１〜５０倍希釈物、１× iProof（商標）HFバッファー（Bio-Rad Laboratories）、それぞれ１００ｐｍｏｌのプライマー０６１２２７３と０６１２２７４、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、及び１単位のiProof（商標）High Fidelity DNAポリメラーゼ（Bio-Rad Laboratories）を含んでいた。ＰＣＲを、９８℃にて３０秒間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて１０秒間、５９℃にて２０秒間、そして７２℃にて４５秒間を３２サイクル、それと７２℃にて１０分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約９６０の塩基対のＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＡＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０３６９】
上記のＤＮＡ断片のための受容ベクターを作製するために、プラスミドｐＵＣ１９（Yanisch-Perron, C, Vieira, J. and Messing, J. (1985) Gene, 33, 103-119）を、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、３７℃にて３０分間１０単位の仔ウシ腸ホスファターゼ（New England Biolabs）で処理し、ＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約２．６ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０３７０】
次に、先の精製した９３０ｂｐ、４．４ｋｂｐ、及び９６０ｂｐのＤＮＡ断片を、１５０ｎｇのＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化したｐＵＣ１９ベクター、５６ｎｇのａｌｄ５６８０フランキングＤＮＡを含む９３０ｂｐのＤＮＡ、２５０ｎｇのＮｏｔＩとＥｃｏＲＩで消化したｐＭｈＣｔ０８７からのＰＤＣ ｐｒｏｍｏ‐ｏｐｔＰａｎＤ‐ＥＮＯ１‐ＵＧＡ１断片、５５ｎｇのＵＲＡ３スプリットマーカーの５’側半分を含む９６０ｂｐの５’側のＰＣＲ産物、１× In-Fusion反応バッファー（Clontech）、及び１μＬのIN‐FUSION（商標）が酵素（Clontech）から構成された１０μＬの総反応物容量中でIn-Fusion（商標）Advantage PCR Cloning Kit（Clontech）を使用して消化ｐＵＣ１９断片内に挿入した。反応物を、３７℃にて１５分間、そして５０℃にて１５分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。次に、反応物を、４０μＬのＴＥバッファーで希釈し、そして、２．５μＬを、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPack Gold SuperCompetent Cells（Agilent Technologies）を形質転換するのに使用した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、室温にて３日間インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＳａｌＩ及びＨｐａＩ消化によって、所望のＰＣＲ産物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、ＤＮＡ配列決定によって正しいと確認し、そしてｐＭｈＣｔ０８９と呼んだ。
【０３７１】
次に、ｐＭｈＣｔ０８９内のＵＧＡ１ ＯＲＦを、配列番号１７のＡＤＣをコードする、Ｉ．オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したＳ．アベルミチリスｐａｎＤ遺伝子と置き換えた。Ｓ．アベルミチリスｐａｎＤバージョンｒ１（配列番号１４５）を、ベクターｐＭＡ‐Ｔ内にGeneArt（登録商標）によって合成した。プラスミドｐＭＡ‐Ｔを、ＸｂａＩ及びＰａｃＩで消化し、得られた断片をＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして約４３４ｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。プラスミドｐＭｈＣｔ０８９を、ＸｂａＩとＰａｃＩで消化し、３７℃にて３０分間１０単位の仔ウシ腸ホスファターゼ（New England Biolabs）で処理し、得られた断片をＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして約４．５ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。ｐＭｈＣｔ０８９ベクターとＳ．アベルミチリスｐａｎＤバージョンｒ１を、１× Quick Ligation反応バッファー（New England Biolabs）、２μＬのＸｂａＩ／ＰａｃＩ ｐＭｈＣｔ０８９ベクター、２μＬのＸｂａＩ／ＰａｃＩ Ｓ．アベルミチリスｐａｎＤバージョンｒ１挿入物、及び１μＬのQuick T4 DNA Ligase（New England Biolabs）を含む連結反応物（２０μＬ）中で接合した。連結反応物を、室温にて５分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。５μＬのこの反応物を、製造業者の取扱説明書に従ってOne Shot（登録商標）TOP10化学的コンピテントＥ．コリ細胞（Invitrogen）を形質転換するのに使用した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして室温にて３日間インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＸｂａＩ及びＰａｃＩ消化によって、所望のＰＣＲ産物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、ＤＮＡ配列決定で正しいと確認し、そしてｐＭｈＣｔ０９２と呼んだ。
【０３７２】
左側構築物の最終的なクローニングステップは、ｐＭｈＣｔ０９２内に存在しているａｌｄ５６８０の５’ホモロジー領域を、ａｄｈ１２０２の５’ホモロジー領域に置き換えることであった。ａｄｈ１２０２ ＯＲＦの５’側 配列を、クローニングのための所望の追加制限部位及びフランキングＤＮＡと共に含むＰＣＲ産物を、プライマー０６１２４７０と０６１２４７１で増幅した。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１μＬのｐＧＭＥｒ１４０ミニプレッププラスミドＤＮＡ（ＰＣＲ増幅領域が同一である、本明細書中に記載したｐＭＩＢａ１０７誘導体）の１〜５０倍希釈物、１× iProof（商標）HFバッファー（Bio-Rad Laboratories）、それぞれ１００ｐｍｏｌのプライマー０６１２４７０と０６１２４７１、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、及び１単位のiProof（商標）High Fidelity DNAポリメラーゼ（Bio-Rad Laboratories）を含んでいた。ＰＣＲを、９８℃にて３０秒間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて１０秒間、５９℃にて２０秒間、そして７２℃にて３０秒間を３４サイクル、それと７２℃にて１０分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約７９０ｂｐのＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＡＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０３７３】
上記のＰＣＲ産物のための受容ベクターを作製するために、プラスミドｐＭｈＣｔ０９２を、ＨｐａＩとＮｏｔＩで消化し、３７℃にて３０分間１０単位の仔ウシ腸ホスファターゼ（New England Biolabs）で処理し、ＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約７．０ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。ＰＣＲ産物と線形ベクターを、１２０ｎｇのＨｐａＩとＮｏｔＩで消化したｐＭｈＣｔ０９２ベクター、３０ｎｇのａｄｈ１２０２の５’側の相同性を含むＰＣＲ産物、１× In-Fusion反応バッファー（Clontech）、及び１μＬのIn-Fusion（商標）酵素（Clontech）から構成された１０μＬの総反応物容量中でIn-Fusion（商標）Advantage PCR Cloning Kit（Clontech）を使用して接合した。反応物を、３７℃にて１５分間、そして５０℃にて１５分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。反応物を、４０μＬのＴＥバッファーで希釈し、そして、２．５μＬを、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPack Gold SuperCompetent Cells（Agilent Technologies）を形質転換するのに使用した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩでの消化によって、所望のＰＣＲ産物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、ＤＮＡ配列決定によって正しいと確認し、そしてｐＭｈＣｔ０９５と呼んだ（図１２）。
【０３７４】
プラスミドｐＭｈＣｔ０９５は、Ｉ．オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したＳ．アベルミチリスＡＤＣ遺伝子の発現を駆動するＰＤＣのプロモーター（配列番号１３０）、ＴＡＬターミネータ、Ｉ．オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化した第２のＳ．アベルミチリスＡＤＣ遺伝子の発現を駆動するＥＮＯ１プロモーター（配列番号１４５）、Ｉ．オリエンタリスＲＫＩターミネータ、Ｉ．オリエンタリスＵＲＡ３プロモーター、及びＩ．オリエンタリスＵＲＡ３ ＯＲＦの５’断片を含む左側Ｉ．オリエンタリスａｄｈ１２０２ターゲッティング構築物である。
【０３７５】
実施例３Ａ‐８：ａｄｈ１２０２遺伝子座においてアスパラギン酸１‐デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）を発現するための複数のヌクレオチド配列を有する挿入ベクターの右側断片
Ｉ．オリエンタリスＵＲＡ３ ＯＲＦの３’断片を、クローニングのための所望の追加制限部位及びフランキングＤＮＡと共に含むＰＣＲ産物を、プライマー０６１２２７５と０６１２２７６で増幅した。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１μＬのｐＭｈＣｔ０６９ミニプレッププラスミドＤＮＡ（前掲）の１〜５０倍希釈物、１× iProof（商標）HFバッファー（Bio-Rad Laboratories）、それぞれ１００ｐｍｏｌのプライマー０６１２２７５と０６１２２７６、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、及び１単位のiProof（商標）High Fidelity DNAポリメラーゼ（Bio-Rad Laboratories）を含んでいた。ＰＣＲを、９８℃にて３０秒間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて１０秒間、５９℃にて２０秒間、そして７２℃にて４５秒間を３２サイクル、それと７２℃にて１０分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約１１５５ｂｐのＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＡＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０３７６】
ＴＤＨ３プロモーター、異所性遺伝子の挿入のためのＸｂａＩ及びＰａｃＩ制限部位、及びＰＤＣターミネータを含む断片を、ＮｏｔＩ及びＰｍｅＩでの消化によってｐＭｈＣｔ０６９から切り出した。１０μｇのｐＭｈＣｔ０６９のミディプレップを、ＮｏｔＩとＰｍｅＩで消化し、次に、ＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約１．８５のｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０３７７】
ａｌｄ５６８０ ＯＲＦの３’側の配列を、クローニングのための所望の追加制限部位及びフランキングＤＮＡと共に含むＰＣＲ産物を、プライマー０６１２２７７と０６１２２７８で増幅した。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１μＬのｐＨＪＪ７５ミニプレッププラスミドＤＮＡ（図２３）の１〜５０倍希釈物、１× iProof（商標）HFバッファー（Bio-Rad Laboratories）、それぞれ１００ｐｍｏｌのプライマー０６１２２７７と０６１２２７８、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、及び１単位のiProof（商標）High Fidelity DNAポリメラーゼ（Bio-Rad Laboratories）を含んでいた。ＰＣＲを、９８℃にて３０秒間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて１０秒間、５９℃にて２０秒間、そして７２℃にて４５秒間を３２サイクル、それと７２℃にて１０分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約８４４ｂｐのＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＡＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０３７８】
次に、先の精製した１１５５ｂｐ、１．８５ｋｂｐ、及び８４４ｂｐのＤＮＡ断片を、１５０ｎｇのＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化したｐＵＣ１９ベクターからの断片；６６ｎｇのＵＲＡ３分割マーカーの３’部分を含む１１５５ｂｐのＤＮＡ；１０６ｎｇの、ｐＭｈＣｔ０６９からのＴＤＨ３プロモーター、異所性遺伝子の挿入のためのＸｂａＩ及びＰａｃＩ制限部位、及びＰＤＣターミネータを含むＰｍｅＩとＮｏｔＩで消化した１．８５ｋｂｐの断片；４８ｎｇのａｌｄ５６８０フランキングＤＮＡの３’側を含む８４４ｂｐのＰＣＲ産物；１× In-Fusion反応バッファー（Clontech）、並びに１μＬのIn-Fusion（商標）酵素（Clontech）から構成された１０μＬの総反応物容量中でIn-Fusion（商標）Advantage PCR Cloning Kit（Clontech）を使用して、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣ１９内に挿入した。反応物を、３７℃にて１５分間、そして５０℃にて１５分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。反応物を、４０μＬのＴＥバッファーで希釈し、そして、２．５μＬを、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPack Gold SuperCompetent Cells（Agilent Technologies）を形質転換するのに使用した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして室温にて３日間インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＳａｌＩ及びＨｐａＩ消化によって、所望のＰＣＲ産物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、ＤＮＡ配列決定によって正しいと確認し、そしてａｌｄ５６８０右側＃２０と呼んだ。
【０３７９】
ＴＫＬターミネータ、ＰＧＫ１プロモーター、ＸｂａＩ及びＰａｃＩ制限部位、及びＰＤＣターミネータ領域のより短いバージョンを、以下の通り、ａｌｄ５６８０右側＃２０のＴＤＨ３プロモーターと３’ａｌｄ５６８０フランキングＤＮＡの間に付加した。ＴＫＬターミネータを、クローニングのための所望の追加制限部位及びフランキングＤＮＡと共に、プライマー０６１２３５６と０６１２３５７で増幅した。所望のＰＣＲ産物は、いくつかの反応でアニール温度の代わりに温度勾配、及びＤＭＳＯを使用して増幅した。４つの同一のＰＣＲ反応物を、１μＬのｐＡＣＮ２３ミニプレッププラスミドＤＮＡの１〜５０倍希釈物（図２０）、１× iProof（商標）HFバッファー（Bio-Rad Laboratories）、それぞれ１００ｐｍｏｌのプライマー０６１２３５６と０６１２３５７、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、並びに１単位のiProof（商標）High Fidelity DNAポリメラーゼ（Bio-Rad Laboratories）を含むそれぞれのＰＣＲ反応物（５０μＬ）によって調製した。第２セットの４本のチューブを、反応物が追加の１．５μＬのＤＭＳＯをそれぞれ含んでいることを除いて、上記の通り準備した。ＰＣＲを、９８℃にて３０秒間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて１０秒間、Ｘ℃にて２０秒間｛Ｘ＝４７．６℃、５１．８℃、５７．１℃又は６２．１℃｝、そして７２℃にて４５秒間を３２サイクル、それと７２℃にて１０分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。ＤＭＳＯの有無にかかわらず、ＰＣＲを示した各アニール温度で実施した。サーモサイクリングに続いて、１０μＬのそれぞれのＰＣＲ反応物を、ＴＡＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって分離した。このゲルの視覚化は、２つの最高のアニール温度にてＤＭＳＯを用いて、及び２つの最低アニール温度にてＤＭＳＯなしで実施したＰＣＲ反応が８４４ｂｐの所望の産物の最も高い収率をもたらしたことを明らかにした。これらの４つのＰＣＲを、組み合わせ、約８４４の塩基対のＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＡＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０３８０】
所望のＰＧＫ１プロモーター領域のＰＣＲ増幅をツーステップ工程としておこなった。最初に、ＰＧＫ１プロモーターＤＮＡを含んだＰＣＲ産物を、以下のプライマー０６１２１５０と０６１２１５１を用いた増幅に続いてクローン化した。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、３μＬのｐＪＬＪ４９ミニプレップＤＮＡ（図２５）、１× Pfx増幅バッファー（Invitrogen）、２ｍＭのＭｇＳＯ4、それぞれ１００ｐｍｏｌのプライマー０６１２１５０と０６１２１５１、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、並びに１．２５単位のPlatinum（登録商標）Pfx DNAポリメラーゼ（Invitrogen）を含んでいた。ＰＣＲを、９５℃にて２分間を１サイクルと続く、それぞれ９５℃にて１分間、５５℃にて１分間、そして７２℃にて３分間を２５サイクル、それと７２℃にて１０分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約６３０ｂｐのＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＡＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０３８１】
約６３０ｂｐのＰＣＲ産物を、製造業者の取扱説明書に従って、配列決定のためのZero Blunt（登録商標） TOPO（登録商標）PCRクローニングキット（Invitrogen）を使用してpCR4（商標）BLUNT TOPO（登録商標）（Invitrogen）ベクター内にクローン化した。６μＬの総反応物容量中、０．５若しくは４μＬの６３０ｂｐのＰＣＲ産物、１μＬの塩類溶液（Invitrogen）及び１μＬのpCR4（商標）BLUNT TOPO（登録商標）（Invitrogen）を、室温にて１５分間一緒にインキュベートした。２μＬのそれぞれのクローニング反応物を、製造業者の取扱説明書に従って、One Shot（登録商標）TOP10 Chemically CompetentＥ．コリ（Invitrogen）細胞内に形質転換した。形質転換体を、ＬＢ＋ｋａｎプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＥｃｏＲＩ消化によって、所望のＰＣＲ産物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、ＤＮＡ配列決定によって正しいと確認し、そしてＰＧＫ１＿ｉｎ＿ＴＯＰＯと呼んだ。
【０３８２】
ＰＧＫ１＿ｉｎ＿ＴＯＰＯからのＰＧＫ１プロモーターを、以下の通りＰＣＲ鋳型としての使用する前に単離し、そして精製した。２５μＬのＰＧＫ１＿ｉｎ＿ＴＯＰＯのミディプレップを、ＸｂａＩ及びＰａｃＩで消化し、そしてＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約６４０ｂｐのバンドをゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０３８３】
ＰＧＫ１プロモーターを、クローニングのための所望の追加制限部位及びフランキングＤＮＡと共に、プライマー０６１２３５８と０６１２３５９を用いて温度勾配を使用して増幅した。８つの同一のＰＣＲ反応物を準備し、各ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、２０ｎｇのＰＧＫ１＿ｉｎ＿ＴＯＰＯのＸｂａＩ及びＰａｃＩ消化による精製ＰＧＫ１プロモーターＤＮＡ、１× Herculase反応バッファー（Agilent Technologies）、それぞれ１００ｐｍｏｌのプライマー０６１２３５８と０６１２３５９、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、並びに２．５単位のHerculase HotStart DNA Polymerase（Agilent Technologies）を含んでいた。ＰＣＲを、９８℃にて３０秒間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて１０秒間、Ｘ℃にて２０秒間（Ｘ＝５３．７℃、５５．４℃、５７．６℃と、６０．０℃、６２．４℃、６４．８℃、６６．９℃、６８．６℃）、そして７２℃にて４５秒間を３２サイクル、それと７２℃にて１０分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、１０μＬのそれぞれのＰＣＲ反応物を、ＴＡＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって分離した。このゲルの視覚化は、最高アニール温度で実施した４つのＰＣＲ反応物が、約７００ｂｐの所望の産物の最も高い収率をもたらすことを明らかにした。これら４つのＰＣＲを、組み合わせ、約７００の塩基対のＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＡＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０３８４】
プラスミドａｌｄ５６８０＿右側＃２０は、約８７０ｂｐの、ＰＤＣターミネータ領域としてのＩ．オリエンタリスＰＤＣ ＯＲＦから下流の領域を含む。しかしながら、この領域は、ターミネータとしての正常機能に必要とされているよりおそらく大きいので、その現在のサイズで維持するのであれば、ＰＤＣ遺伝子座への好ましくない相同組み換えの触媒として機能するだろう。そのため、より小さいバージョンでａｌｄ５６８０＿右側＃２０のＰＤＣターミネータを置き換えるためのＰＣＲ産物を、プライマー０６１２３６０と０６１２３６１で増幅した。所望のＰＣＲ産物を、いくつかの反応において、アニール温度の代わりの温度勾配、及びＤＭＳＯを使用して増幅した。４つの同一のＰＣＲ反応物を準備し、各ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１μＬのｐＪＬＪ４９ミニプレッププラスミドＤＮＡ（図２５）の１〜５０倍希釈物、１× iProof（商標）HFバッファー（Bio-Rad Laboratories）、それぞれ１００ｐｍｏｌのプライマー０６１２３６０と０６１２３６１、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、並びに１単位のiProof（商標）High Fidelity DNAポリメラーゼ（Bio-Rad Laboratories）を含んでいた。第２セットの４本のチューブを、反応物がそれぞれ追加の１．５μＬのＤＭＳＯを含んでいることを除いて、上述の通り準備した。ＰＣＲを、９８℃にて３０秒間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて１０秒間、Ｘ℃にて２０秒間（Ｘ＝４７．６℃、５１．８℃、５７．１℃、又は６２．１℃）、そして７２℃にて４５秒間を３２サイクル、それと７２℃にて１０分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。ＤＭＳＯの有無にかかわらず、ＰＣＲを示した各アニール温度で実施した。サーモサイクリングに続いて、１０μＬのそれぞれのＰＣＲ反応物を、ＴＡＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって分離した。このゲルの視覚化は、ＤＭＳＯを用いて実施した４つのＰＣＲ反応物がアニール温度にかかわらず３３８ｂｐの所望の産物の最も高い収率をもたらすことを明らかにした。これらの４つのＰＣＲを、組み合わせ、約３３８塩基対のＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＡＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０３８５】
ＰＣＲを、約７００ｂｐのＰＧＫ１含有ＰＣＲ産物を、３３８ｂｐのＰＤＣターミネータ産物に融合する１つの増幅産物を作製するのに使用した。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１０７ｎｇのＰＧＫ１含有ＰＣＲ産物、５６ｎｇのＰＤＣターミネータ含有ＰＣＲ産物、１× Phusion HFバッファー（New England Biolabs）、それぞれ１００ｐｍｏｌのプライマー０６１２３５８と０６１２３６１、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、並びに１単位のPhusion（商標）High Fidelity DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を含んでいた。ＰＣＲを、９８℃にて３０秒間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて１０秒間、５６℃にて２０秒間、そして７２℃にて２分と４５秒間を３４サイクル、それと７２℃にて１０分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、１０２０塩基対のＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０３８６】
プラスミドａｌｄ５６８０＿右側＃２０を、ＸｂａＩとＮｏｔＩで消化し、３７℃にて３０分間１０単位の仔ウシ腸ホスファターゼ（New England Biolabs）で処理し、そしてＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって精製した。約５．６ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０３８７】
次に、先の精製した４８７ｂｐ及び１０２０ｂｐのＰＣＲ産物を、１５０ｎｇのＸｂａＩとＮｏｔＩで消化したａｌｄ５６８０＿右側＃２０ベクター、１３ｎｇのＴＫＬターミネータＰＣＲ産物、２８ｎｇのＰＧＫ１プロモーター‐ＰＤＣターミネータＰＣＲ産物、１× In-Fusion反応バッファー（Clontech）、及び１μＬのIn-Fusion（商標）酵素（Clontech）から構成される１０μＬの総反応物容量中でIn-Fusion（商標）Advantage PCR Cloning Kit（Clontech）を使用して消化したａｌｄ５６８０＿右側＃２０断片に挿入した。反応物を、３７℃にて１５分間、そして５０℃にて１５分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。反応物を、４０μＬのＴＥバッファーで希釈し、そして、２．５μＬを、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPack Gold SuperCompetent Cells（Agilent Technologies）を形質転換するのに使用した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＡｃｃＩ消化によって、所望のＰＣＲ産物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、ＤＮＡ配列決定によって正しいと確認し、そしてｐＭｈＣｔ０９１と呼んだ。
【０３８８】
プラスミドｐＭｈＣｔ０９１は、Ｉ．オリエンタリスＵＲＡ３ ＯＲＦの３’断片、Ｉ．オリエンタリスＴＤＨ３プロモーターとそれに続く着目遺伝子の追加のためのＮｈｅＩ及びＡｓｃＩ制限部位、Ｉ．オリエンタリスＴＫＬターミネータ、Ｉ．オリエンタリスＰＧＫ１プロモーターとそれに続く第２の着目遺伝子の追加のためのＸｂａＩ及びＰａｃＩ制限部位、並びにＩ．オリエンタリスＰＤＣターミネータと、３’ａｌｄ５６８０遺伝子座への標的相同組み換えのためのフランキングＤＮＡを含む空の右側Ｉ．オリエンタリスａｌｄ５６８０標的構築物である。
【０３８９】
Ｓ．アベルミチリスｐａｎＤバージョンｒ５（配列番号１４６）を、ベクター１０７５３２８＿ＳａＰａｎＤ＿ｒ５内にGeneArt（登録商標）によって合成した。ＰＣＲによるｐＭｈＣｔ０９１の５’クローニング部位へのクローニングのために、ＸｂａＩ及びＰａｃＩ制限部位を所望のＮｈｅＩ及びＡｓｃＩ部位に変更した。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１μＬの１０７５３２８＿ＳａＰａｎＤ＿ｒ５ミニプレッププラスミドＤＮＡ（GeneArt（登録商標））の１〜５０倍希釈物、１× iProof（商標）HFバッファー（Bio-Rad Laboratories）、それぞれ１００ｐｍｏｌのプライマー０６１２３７８と０６１２３７９、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、１．５μＬのＤＭＳＯ、並びに１単位のiProof（商標）High Fidelity DNAポリメラーゼ（Bio-Rad Laboratories）を含んでいた。ＰＣＲを、９８℃にて３０秒間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて１０秒間、５９℃にて２０秒間、そして７２℃にて３０秒間を３４サイクル、それと７２℃にて１０分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約４７１塩基対のＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０３９０】
プラスミドｐＭｈＣｔ０９１（前掲）を、ＮｈｅＩ及びＡｓｃＩで消化し、３７℃にて３０分間１０単位の仔ウシ腸ホスファターゼ（New England Biolabs）で処理し、ＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって精製した。約６．９ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。次に、先の精製したｐａｎＤ ｒ５含有ＰＣＲ産物を、１５０ｎｇのＮｈｅＩ及びＡｓｃＩで消化したｐＭｈＣｔ０９１ベクター、１９ｎｇのｐａｎＤ ｒ５ＰＣＲ産物、１× In-Fusion反応バッファー（Clontech）、及び１μＬのIn-Fusion（商標）酵素（Clontech）から構成された１０μＬの総反応物容量中でIn-Fusion（商標）Advantage PCR Cloning Kit（Clontech）を使用して、消化したｐＭｈＣｔ０９１断片内に挿入した。反応物を、３７℃にて１５分間、そして５０℃にて１５分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。反応物を、４０μＬのＴＥバッファーで希釈し、そして、２．５μＬを、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPack Gold SuperCompetent Cells（Agilent Technologies）を形質転換するのに使用した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＳｍａＩ消化によって、所望のＰＣＲ産物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、ＤＮＡ配列決定によって正しいと確認し、そしてｐＭｈＣｔ０９３と呼んだ。
【０３９１】
プラスミドｐＭｈＣｔ０９３を、ＸｂａＩ及びＰａｃＩで消化し、３７℃にて３０分間１０単位の仔ウシ腸ホスファターゼ（New England Biolabs）で処理し、ＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約７．４ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。Ｓ．アベルミチリスｐａｎＤバージョンｒ２（配列番号１４７）を、Ｉ．オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化し、そしてベクターｐＭＡ‐Ｔ内にGeneArt（登録商標）によって合成した。プラスミドを、ＸｂａＩ及びＰａｃＩで消化し、そして、得られた断片を、ＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって分離した。約４３４ｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０３９２】
先の精製した〜４３４ｂｐの断片を、１× Quick Ligation反応バッファー（New England Biolabs）、２μＬのＸｂａＩとＰａｃＩで消化したｐＭｈＣｔ０９３ベクター、２μＬの先の〜４３４ｂｐの断片、並びに１μＬのQuick T4 DNA Ligase（New England Biolabs）を含んでいる連結反応物（２０μＬ）中で、ＸｂａＩ及びＰａｃＩで消化したｐＭｈＣｔ０９３ベクター内にクローン化した。連結反応物を、室温にて５分間インキュベートした、次に、そのチューブを氷上に置いた。５μＬのこの反応物を、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPack Gold SuperCompetent Cells（Agilent Technologies）を形質転換するのに使用した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして室温にて３日間インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＸｂａＩ及びＰａｃＩでの消化によって、所望のＰＣＲ産物の適切な挿入についてスクリーニングした。単離ｐＭｈＣｔ０９４を今後の作業のために選択した。
【０３９３】
右側構築物の最終的なクローニングステップは、ｐＭｈＣｔ０９４内に存在しているａｌｄ５６８０３’ホモロジー領域をａｄｈ１２０２の３’ホモロジー領域に置き換えることであった。ａｄｈ１２０２ ＯＲＦのすぐ３’側の配列を、クローニングのための所望の相加制限部位及びフランキングＤＮＡと共にを含んでいるＰＣＲ産物を、プライマー６１２４７２と６１２４７３で増幅した。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、１μＬのｐＧＭＥｒ１４０（前掲）ミニプレッププラスミドＤＮＡの１〜５０倍希釈物、１× iProof（商標）HFバッファー（Bio-Rad Laboratories）、それぞれ１００ｐｍｏｌのプライマー０６１２４７２と０６１２４７３、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、並びに１単位のiProof（商標）High Fidelity DNAポリメラーゼ（Bio-Rad Laboratories）を含んでいた。ＰＣＲを、９８℃にて３０秒間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて１０秒間、５９℃にて２０秒間、そして７２℃にて３０秒間を３４サイクル、それと７２℃にて１０分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約６２０塩基対のＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＡＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０３９４】
上記ＰＣＲ産物のための受容ベクターを作製するために、プラスミドｐＭｈＣｔ０９４を、ＳａｃＩＩ及びＮｏｔＩで消化し、３７℃にて３０分間１０単位の仔ウシ腸ホスファターゼ（New England Biolabs）で処理し、ＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約７．０ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。ＰＣＲ産物と線形ベクターを、１９１ｎｇのＳａｃＩＩ及びＮｏｔＩで消化したｐＭｈＣｔ０９４ベクター、３６ｎｇのａｄｈ１２０２の３’相同性を持つＰＣＲ産物、１× In-Fusion反応バッファー（Clontech）、並びに１μＬのIn-Fusion（商標）酵素（Clontech）から構成された１０μＬの総反応物容量中でIn-Fusion（商標）Advantage PCR Cloning Kit（Clontech）を使用して接合した。反応物を、３７℃にて１５分間、そして５０℃にて１５分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。反応物を、４０μＬのＴＥバッファーで希釈し、そして、２．５μＬを、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPack Gold SuperCompetent Cells（Agilent Technologies）を形質転換するのに使用した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＮｓｉＩ及びＰｖｕＩでの消化によって、所望のＰＣＲ産物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、ＤＮＡ配列決定によって正しいと確認し、そしてｐＭｈＣｔ０９６と呼んだ（図１３）。
【０３９５】
プラスミドｐＭｈＣｔ０９６は、Ｉ．オリエンタリスＵＲＡ３ ＯＲＦの３’断片、Ｉ．オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化した第３のＳ．アベルミチリスＡＤＣ遺伝子（配列番号１４６）の発現を駆動するＩ．オリエンタリスＴＤＨ３プロモーター、Ｉ．オリエンタリスＴＫＬターミネータ、Ｉ．オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化した第４のＳ．アベルミチリスＡＤＣ遺伝子（配列番号１４７）の発現を駆動するＩ．オリエンタリスＰＧＫ１プロモーター、Ｉ．オリエンタリスＰＤＣターミネータ、及び標的ａｄｈ１２０２遺伝子座の３’側への相同組み換えのためのフランキングＤＮＡを含んでいる右側Ｉ．オリエンタリスａｄｈ１２０２ターゲッティング構築物である。
【０３９６】
実施例３Ａ‐９：ｐｄｃ遺伝子座においてアスパラギン酸１‐デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）、β‐アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＢＡＡＴ）、及び３‐ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ（３‐ＨＰＤＨ）を発現し、且つ、ａｄｈ１２０２遺伝子座において４つのヌクレオチド配列からアスパラギン酸１‐デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）を発現する酵母菌株
先の実施例３Ａ‐７及び３Ａ‐８は、ａｄｈ１２０２遺伝子座における、Ｉ．オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したＳ．アベルミチリスＡＤＣ遺伝子の４つのヌクレオチド多型の発現を標的化するための左側及び右側構築物の作製を説明している。Ｉ．オリエンタリスＣＮＢ１への形質転換の前に、１０μｇのｐＭｈＣｔ０９５を、ＨｐａＩとＳａｃＩＩで消化して、ｐＵＣ１９骨格ベクターから所望の形質転換ＤＮＡを切り出した。同様に、１０μｇのｐＭｈＣｔ０９６を、ＥｃｏＲＩとＳａｃＩＩで消化して、ｐＵＣ１９骨格ベクターから所望の形質転換ＤＮＡを切り出した。〜５ｋｂｐの発現カセット含有バンドを、ゲル電気泳動によってｐＵＣ１９骨格ＤＮＡと分離し、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。３０μＬの溶出バッファーを溶出ステップに使用した。合計で１０μＬになる等モル比のｐＭｈＣｔ０９５及びｐＭｈＣｔ０９６線形形質転換ＤＮＡを、菌株ｙＭｈＣｔ０１０（前掲）を形質転換するのに使用した。形質転換体を、ｕｒａ選択プレート上で選択し、培養のために３７℃に置いた。１２個位の形質転換体を、翌日釣り出し、シングルコロニーのためにｕｒａ選択プレートに再び画線接種し、そして３７℃にて一晩培養し、次に、それぞれの最初の形質転換体及びｕｒａ選択プレートへの再画線接種によって生じた画線のそれぞれからシングルコロニーを釣り出した。３７℃にてのもう一晩の培養後に、最終的なシングルコロニーを、各画線から釣り出し、ｕｒａ選択プレートに再び画線接種し、そして３７℃にて一晩培養した。この第２ラウンドのシングルコロニー精製及び増殖の後、本明細書中に記載したように起こった所望の標的組み込みを確かめるためのＰＣＲに使用するために、ゲノムＤＮＡを調製した。ａｄｈ１２０２遺伝子座へのｐＭｈＣｔ０９５及びｐＭｈＣｔ０９６断片の正しいターゲッティングを、プライマー０６１１７１８と０６１１６３２（前掲）を使用して検証した。プライマー０６１１７１８は、ｐＭｈＣｔ０９６内に存在しているＰＤＣターミネータ領域に結合するのに対して、プライマー０６１１６３２は、標的とした領域のａｄｈ１２０２遺伝子座ＤＮＡの３’側に結合し、そしてアンチセンス方向に増幅する。これらのプライマーを用いたＰＣＲからの約７２７ｂｐのバンドの発生は、ａｄｈ１２０２遺伝子座における所望の組み込み事象の出現を示した。
【０３９７】
ＰＣＲ反応物（２５μＬ）は、０．５μＬのスクリーニングされるべき菌株のゲノムＤＮＡ、１× Crimson Taq（商標）反応バッファー（New England Biolabs）、２５ｐｍｏｌのセンスプライマー、２５ｐｍｏｌのアンチセンスプライマー、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、並びに０．６２５単位のCrimson Taq（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs）が含まれていた。ＰＣＲを、９５℃にて３０秒間を１サイクルと続く、それぞれ９５℃にて３０秒間、５０℃にて３０秒間、そして６８℃にて２．５分間を３０サイクル、それと６８℃にて１０分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、ＴＡＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって分離し、バンドのサイズを可視化し、そして先に記載したように判断した。所望の７２７ｂｐのバンドをもたらす独立に単離した２つの形質転換体を、ｙＭｈＣｔ０１９又は９５／９６ ２と呼んだ（表２１の遺伝子型を参照のこと）。
【０３９８】
【表３１】
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【０３９９】
次に、ｙＭｈＣｔ０１９のｕｒａ−誘導体を、本明細書中に記載したように単離した。ｙＭｈＣｔ０１９のいくつかのＦＯＡ耐性コロニーからのゲノムＤＮＡを、プライマー０６１１８１５と０６１２７９５を用いたＰＣＲによって、所望のループアウト事象についてスクリーニングした。プライマー０６１１８１５が、左側構築物のＲＫＩターミネータにアニールし、そしてＵＲＡ３プロモーターに向かって増幅するのに対して、プライマー０６１２７９５は、（ｐＭｈＣｔ０９６又は内在性ａｄｈ１２０２遺伝子座の）３’ａｄｈ１２０２相同内にアニールし、そして５’領域に向かって戻る方向に増幅する。ＰＣＲ反応を、伸長相の長さを３．５分間に変更したことを除いて、先にｙＭｈＣｔ０１９の分離について記載したようにおこなった。これらのプライマーによる３．７ｋｂｐのバンドの発生が、所望のループアウト事象が起こったので、改変ａｄｈ１２０２遺伝子座にＵＲＡ３プロモーターの瘢痕だけが残っていることを示すのに対して、約５．１ｋｂｐのバンドは、完全なＵＲＡ３プロモーター‐ＵＲＡ３ ＯＲＦ‐ＵＲＡ３ターミネータ‐ＵＲＡ３プロモーターカセットの存在を示し、そしてそれは、所望の組み換え事象が起こらなかったことを示しているはずである。所望の３．７ｋｂｐのバンドをもたらした菌株を、保存し、そしてｙＭｈＣｔ０２１と呼んだ。
【０４００】
ａｄｈ１２０２における複数のｐａｎＤ発現カセット用にｙＭｈＣｔ０２１ホモ接合誘導体を単離するために、ｙＭｈＣｔ０２１を、先に記載したように、線状ｐＭｈＣｔ０９５及びｐＭｈＣｔ０９６で形質転換した。２ラウンドのシングルコロニー精製及び増殖の後に、所望の標的組み込みが起こったことを確認するためのＰＣＲにおける使用のために、ゲノムＤＮＡを調製した。ｙＭｈＣｔ０２１の残っている野生型ａｄｈ１２０２遺伝子座へのｐＭｈＣｔ０９５及びｐＭｈＣｔ０９６断片の正しいターゲッティングを、プライマー０６１２８９１と０６１２８９３によって確認した。プライマー０６１２８９１は、ｒ１終止後にｐＭｈＣｔ０９５のＳａＰａｎＤ ｒ１の３’領域＋ＰａｃＩ部位の半分にアニールする。プライマー０６１２８９３は、ＳａＰａｎＤ ｒ５の５’領域の末端にアニールし、ＮｈｅＩ部位及びｐＭｈＣｔ０９６のリーダを含み、そして相補的な向きで戻る方向に増幅する。
【０４０１】
これらのプライマーによる３．２ｋｂｐのバンドの発生が、ｙＭｈＣｔ０２１の残っているａｄｈ１２０２野生型遺伝子座におけるｐＭｈＣｔ０９５及びｐＭｈＣｔ０９６による第２の組み込み事象から予想される完全なＵＲＡ３プロモーター‐ＵＲＡ３ ＯＲＦ‐ＵＲＡ３ターミネータ‐ＵＲＡ３プロモーターカセットの存在を示すのに対して、約１．７ｋｂｐのバンドは、（最初の組み込み事象とその後のＵＲＡ３マーカーのループアウトからの）他のａｄｈ１２０２遺伝子座におけるＵＲＡ３瘢痕部位の存在を示すはずである。ＰＣＲ反応を、伸長相の長さを３．５分間に変更したことを除いて、先のｙＭｈＣｔ０１９の分離について記載したようにおこなった。これらのバンドサイズの両方をもたらす菌株を、ｙＭｈＣｔ０２２と呼んだ（遺伝子型に関しては表２２を参照のこと）。
【０４０２】
【表３２】
2013542747.tif 000033
【０４０３】
菌株を、振盪フラスコで培養し、ＣＦＥを調製し、そしてアスパラギン酸デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）活性について本明細書中のようにアッセイした。実験結果を表２３Ａに示す。
【０４０４】
【表３３】
2013542747.tif 000034
【０４０５】
菌株ＭＢｉｎ５００（対照）、ｙＭｈＣｔ０１９、９５／９６‐２、ｙＭｈＣｔ００８、及びｙＭｈＣｔ０２２から調製したＣＦＥにおけるアスパラギン酸１‐デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）、β‐アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＢＡＡＴ）、及び３‐ＨＰデヒドロゲナーゼ（３‐ＨＰＤＨ）活性を比較した。この実験の結果を表２３Ｂに示す。
【０４０６】
【表３４】
2013542747.tif 000035
【０４０７】
菌株ｙＭｈＣｔ０１９及び９５／９６ ２もまた、本明細書中に記載したようにＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって分析した。両菌株とも、５３ｋＤ、２９ｋＤ、〜１４ｋＤ、及び〜３ｋＤにタンパク質バンドを示した。５３ｋＤ及び２９ｋＤのタンパク質バンドのサイズは、それぞれＵＧＡ１及びＹＭＲ２２６ｃ遺伝子によってコードされるタンパク質のサイズと一致している。１４ｋＤと３ｋＤのタンパク質バンドを合わせたサイズは、ｐａｎＤ遺伝子によってコードされる翻訳後切断タンパク質と一致している。５３ｋＤ、２９ｋＤ、１４ｋＤ、及び３ｋＤタンパク質は、対照菌株ＭＢｉｎ５００のＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析で観察されなかった。
【０４０８】
菌株ＭＢｉｎ５００及びｙＭｈＣｔ０１９を、本明細書中に記載した方法を使用して、３‐ＨＰ生産のためのバイオリアクターにおいて評価した。対照菌株ＭＢｉｎ５００は検出可能な３‐ＨＰを産生しなかった（２回の独立した発酵の平均）。菌株ｙＭｈＣｔ０１９は、５．２３ｇ／Ｌの３‐ＨＰを産生した（３回の独立した発酵の平均）。
【０４０９】
実施例３Ａ‐１０：ａｄｈ１２０２遺伝子座において４つのヌクレオチド配列からアスパラギン酸１‐デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）を発現する酵母菌株
追加の構築物を、ａｄｈ１２０２遺伝子座においてＢ．リチェニフォルミスからの代替のＡＤＣをコードするヌクレオチド（配列番号１３９）４コピーを組み込むように設計した。先に記載したものと同様のアプローチにおいて、左側構築物及び右側構築物を、Ｉ．オリエンタリスａｄｈ１２０２遺伝子座における相同組み換えを可能にするように設計した。
【０４１０】
左側断片の構築
プラスミドｐＭｈＣｔ０９５（前掲）を、本明細書中に記載したように、ＸｂａＩ及びＰａｃＩで消化し、そしてＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。約７．３ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０４１１】
バチルス・リケニホルミスのアスパラギン酸デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）ｐａｎＤ遺伝子を、Ｉ．オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化し（バージョン１；配列番号１４９）、そしてプラスミド１１１０２０６（GeneArt（登録商標））内に合成により構築した。プラスミド１１１０２０６を、本明細書中に記載したように、ＸｂａＩ及びＰａｃＩで消化し、そしてＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。約３８０ｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０４１２】
〜３８０ｂｐの精製断片を、６０．５ｎｇの消化ｐＭｈＣｔ０９５、６．３ｎｇの３８０ｂｐの１１１０２０６からの断片、１μＬの１０ｍＭ ＡＴＰ（New England Biolabs）含有１０×連結反応バッファー、及び１μＬのＴ４リガーゼ（New England Biolabs）から構成された１０μＬの総反応物容量中でＴ４リガーゼ（New England Biolabs）を使用して７．３ｋｂｐのｐＭｈＣｔ０９５線状ベクターに連結した。反応物を、室温にて１．５時間インキュベートし、そして、反応物の３μＬのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従ってOne Shot（登録商標）TOP10化学的コンピテントＥ．コリ細胞（Invitrogen）内に形質転換した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＸｂａＩとＰａｃＩを使用した制限消化によって、適切な挿入についてスクリーニングした。正しい消化バンドサイズをもたらしたクローンを、ｐＭｅＪｉ３０９と呼んだ。
【０４１３】
プラスミドｐＭｅＪｉ３０９を、ＮｈｅＩ及びＡｓｃＩで消化し、そしてＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。約７．３ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０４１４】
バチルス・リケニホルミスのアスパラギン酸デカルボキシラーゼｐａｎＤ遺伝子を、Ｉ．オリエンタリスにおける発現のために再びコドン最適化し（バージョン２；配列番号１４８）、そしてプラスミド１１１０２０５（GeneArt（登録商標））内に合成によって構築した。ＰＣＲを、５０μＬの終量中に、３μＬの１１１０２０５、それぞれ２５ｐＭのプライマー０６１２６９５と０６１２７２４、１× ｐｆｘ増幅バッファー（Invitrogen）、２ｍＭのＭｇＳＯ4、１．２５単位のPlatinum（登録商標）Pfx DNAポリメラーゼ（Invitrogen）を含む混合物により実施した。増幅反応物を、９５℃にて２分間を１サイクル；それぞれ９５℃にて１分間、５５℃にて１分間、そして７２℃にて１分間を２５サイクル；そして７２℃にて３分間を１サイクルとプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）でインキュベートした。
【０４１５】
増幅反応物からのＰＣＲ産物を、ＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。約４００ｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。精製したＰＣＲ産物を、９３ｎｇのｐＭｅＪｉ３０９ベクター断片、５２ｎｇの上記ＰＣＲ産物、２μＬの１× In-Fusion（商標）反応バッファー（Clontech）、及び１μＬのIn-Fusion（商標）酵素（Clontech）を含む反応物中でIn-Fusion（商標）Advantage PCR Cloning Kit（Clontech）を使用して先の消化ｐＭｅＪｉ３０９ベクター内に挿入した。反応物を、３７℃にて１５分間、そして５０℃にて１５分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。反応物の２．５μＬのサンプルを、製造業者の取扱説明書に従ってOne Shot（登録商標）TOP10化学的コンピテントＥ．コリ細胞（Invitrogen）内に形質転換した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＸｂａＩ及びＰａｃＩを使用した制限消化によって、適切な挿入についてスクリーニングした。正しい消化バンドサイズをもたらすクローンを、ＤＮＡ配列決定によって正しいと確認し、そしてｐＭｅＪｉ３１０‐２と呼んだ（図１４）。
【０４１６】
右側断片の構築
プラスミドｐＭｈＣｔ０９６（前掲）を、ＸｂａＩ及びＰａｃＩで消化し、そしてＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。約４．８ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０４１７】
バチルス・リケニホルミスのアスパラギン酸デカルボキシラーゼｐａｎＤ遺伝子を、Ｉ．オリエンタリスにおける発現のために再びコドン最適化し（バージョン３；配列番号１５１）、そしてプラスミド１１１０２０８（GeneArt（登録商標））内に合成により構築した。プラスミド１１１０２０８を、ＸｂａＩ及びＰａｃＩで消化し、そしてＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約３８０ｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０４１８】
先の３８０ｂｐの断片を、７２．２ｎｇの消化ｐＭｈＣｔ０９６、６．９ｎｇの３８０ｂｐの１１１０２０８からの断片、１μＬの１０ｍＭ ＡＴＰ含有１０×連結反応バッファー、及び１μＬのＴ４リガーゼから構成された１０μＬの総反応物容量中でＴ４リガーゼ（New England Biolabs）を使用して７．３ｋｂｐのｐＭｈＣｔ０９６線状ベクターに連結した。反応物を、室温にて１時間半インキュベートし、そして、反応物の３μＬのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従ってOne Shot（登録商標）TOP10化学的コンピテントＥ．コリ細胞（Invitrogen）内に形質転換した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＮｈｅＩ及びＡｓｃＩを使用した制限消化によって、適切な挿入についてスクリーニングした。正しい消化バンドサイズをもたらしたクローンを、ｐＭｅＪｉ３１１と呼んだ。
【０４１９】
プラスミドｐＭｅＪｉ３１１を、酵素ＮｈｅＩ及びＡｓｃＩで消化し、そしてＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約７．３ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０４２０】
バチルス・リケニホルミスのアスパラギン酸デカルボキシラーゼｐａｎＤ遺伝子を、Ｉ．オリエンタリスにおける発現のために再びコドン最適化し（バージョン４；配列番号１５０）、そしてプラスミド１１１０２０７（GeneArt（登録商標））内に合成によって構築した。ＰＣＲを、５０μＬの終量中に、３μＬの１１１０２０７、それぞれ２５ｐＭの０６１２６９８と０６１２７２５、１× ｐｆｘ増幅バッファー（Invitrogen）、２ｍＭのＭｇＳＯ4、１．２５単位のPlatinum（登録商標）Pfx DNAポリメラーゼ（Invitrogen）を含む混合物により実施した。増幅反応物を、９５℃にて２分間を１サイクル；それぞれ９５℃にて１分間、５５℃にて１分間、そして７２℃にて１分間を２５サイクル；そして７２℃にて３分間を１サイクルとプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）でインキュベートした。
【０４２１】
増幅反応物からのＰＣＲ産物を、ＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。約４００ｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。精製したＰＣＲ産物を、６５．１ｎｇのｐＭｅＪｉ３１１ＮｈｅＩ及びＡｓｃＩ消化ベクター断片、８５ｎｇの上記ＰＣＲ産物、２μＬの１× In-Fusion（商標）反応バッファー（Clontech）、及び１μＬのIn-Fusion（商標）酵素（Clontech）を含む反応物中でIn-Fusion（商標）Advantage PCR Cloning Kit（Clontech）を使用して先の消化ｐＭｅＪｉ３１１ベクター内に挿入した。反応物を、３７℃にて１５分間、そして５０℃にて１５分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。反応物の２．５μＬのサンプルを、製造業者の取扱説明書に従ってOne Shot（登録商標）TOP10化学的コンピテントＥ．コリ細胞（Invitrogen）内に形質転換した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして室温にて二日間インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＮｈｅＩ及びＡｓｃＩを使用した制限消化によって、適切な挿入についてスクリーニングした。正しい消化バンドサイズをもたらすクローンを、ＤＮＡ配列決定によって正しいと確認し、そしてｐＭｅＪｉ３１２‐２と呼んだ（図１５）。
【０４２２】
左側及び右側断片の組み込み
プラスミドｐＭｅＪｉ３１０‐２を、本明細書中に記載したように、ＨｐａＩ及びＳａｃＩＩで消化し、そしてプラスミドｐＭｅＪｉ３１２‐２を、ＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩＩで消化した。これらを、ＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約５ｋｂｐのバンド２本を、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０４２３】
Ｉ．オリエンタリスＣＮＢ１を、消化ｐＭｅＪｉ３１０‐２及びｐＭｅＪｉ３１２‐２ＤＮＡで形質転換し、そして正しい遺伝子座ターゲッティング及び形質転換を、本明細書中に記載のように、Crimson Taq（New England Biolabs）ＰＣＲによって確認した。プライマー０６１２７９４と０６１１２４５は、約３．１７ｋｂｐのバンドをもたらし；プライマー６１２４７９と０６１１６３２は、約１．４８ｋｂｐのバンドをもたらし；そして、プライマー６１１２４８と６１２７９５は、約２．３ｋｂｐのバンドをもたらした。発現カセットの適切な組み込みが予想されるバンドをもたらした菌株を、ＭｅＪｉ４０９‐２と呼んだ。そして、先に記載したように、菌株ＭｅＪｉ４０９‐２のｕｒａ−誘導体を得た。
【０４２４】
本明細書中に記載した方法を使用して、菌株ＭＢｉｎ５００及びＭｅＪｉ４０９‐２を、３‐ＨＰ生産について発酵バイオリアクター内で評価した。対照菌株ＭＢｉｎ５００は、検出可能な３‐ＨＰを産生しなかった（２回の独立した発酵の平均）。菌株ＭｅＪｉ４０９‐２は４．６２ｇ／Ｌを産生した（１回の発酵）。他の（例えば、今後の）発酵と比較したこれらの発酵における細胞質量の違いを考慮するために、単位細胞質量あたりの３‐ＨＰ濃度（［ｇ／Ｌ ３‐ＨＰ］／［ｇ／Ｌ 乾燥細胞重量］と表現される）が、ＭｅＪｉ４０９‐２に関しては０．２０になることを計算した。
【０４２５】
実施例３Ａ‐１１：ａｄｈ９０９１遺伝子座においてアスパラギン酸１‐デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＡＴ）を発現する酵母菌株
配列番号１４のＩ．オリエンタリスのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＡＴ）をコードするヌクレオチド配列（配列番号１３）を、Ｉ．オリエンタリスゲノムＤＮＡからプライマー０６１１２６８と０６１１２６９を使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、５０ｎｇの菌株Ｉ．オリエンタリスゲノムＤＮＡ、１× Phusion HFバッファー（New England Biolabs）、それぞれ５０ｐｍｏｌのプライマー０６１１２６８と０６１１２６９、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、１．５μＬの１００％ ＤＭＳＯ（New England Biolabs）、及び１単位のPhusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を含んでいた。ＰＣＲを、９８℃にて２分間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、そして７２℃にて１分と３０秒間を３５サイクル、それと７２℃にて７分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約１２７８ｂｐのＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＢＥバッファー中での０．８％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。得られたＰＣＲ断片の全長は、約１２７８ｂｐであり、そして５’末端にＮｒｕＩ制限部位を有し、且つ、３’末端にＰａｃＩ制限部位を有する。
【０４２６】
次に、ＡＡＴ遺伝子ＣＤＳ（配列番号１３）を含む先の１２７８ｂｐの得られた断片を、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター内にクローン化し、そして製造業者の取扱説明書に従って、One-Shot TOP10Ｅ．コリ細胞（Invitrogen）内に形質転換した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＢａｍＨＩ消化によって、所望の断片の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、配列決定によって確認し、そしてｐＧＭＥｒ１１１と呼んだ。
【０４２７】
プラスミドｐＧＭＥｒ１２１とｐＧＭＥｒ１１１を、制限酵素ＰａｃＩ及びＮｒｕＩで二重消化した。プラスミドｐＧＭＥｒ１２１からの７６９５ｂｐの得られたベクター断片、及びプラスミドｐＧＭＥｒ１１１からのＡＡＴコード配列を含む１２７２ｂｐの得られた挿入物断片を、１× ＴＢＥバッファー中での０．８％アガロースゲル電気泳動によって分離し、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。
【０４２８】
次に、連結反応物を、３μＬのベクター断片、４μＬの挿入物断片、２μＬの無菌ｄｄ水、１０μＬの２× Quick Ligaseバッファー、及び１μＬのQuick T4 Ligase（Quick Ligation Kit、New England Biolabs）で準備し、そして製造業者の取扱説明書に従って実施した。上記の連結反応物の５μＬのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従ってXL10-Gold（登録商標）UltracompetentＥ．コリ細胞（Agilent Technologies）に形質転換した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＳｍａＩ／ＰｐｕＭＩ二重消化によって、所望の挿入物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、配列決定で確認し、そしてｐＧＭＥｒ１２６と呼んだ（図１６）。
【０４２９】
プラスミドｐＧＭＥｒ１２６は、Ｉ．オリエンタリスＡＡＴ発現カセットを含み、そしてそこでは、遺伝子転写は、上流にＵＲＡ３コード配列の切断３’領域及びＵＲＡ３プロモーターが隣接し、且つ、下流にＩ．オリエンタリスａｄｈ９０９１遺伝子座を含む３’相同性領域が隣接している、Ｉ．オリエンタリスＴＤＨ３プロモーター及びＴＫＬターミネータによって制御されている。
【０４３０】
Ｉ．オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したＳ．アベルミチリスｐａｎＤ遺伝子（配列番号１３０）を、プライマー０６１１６６と０６１１６６２を使用してGeneArt（登録商標）製のｐＭＡ‐ＴベクターからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、５０ｎｇの菌株プラスミドＤＮＡ、１× Phusion HFバッファー（New England Biolabs）、それぞれ５０ｐｍｏｌのプライマー０６１１６６１と０６１１６６２、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、１．５μＬの１００％ ＤＭＳＯ（New England Biolabs）、並びに１単位のPhusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を含んでいた。ＰＣＲを、９８℃にて２分間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、そして７２℃にて３０秒間を３５サイクル、それと７２℃にて７分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約４５３ｂｐのＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＢＥバッファー中での０．８％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。得られたＰＣＲ断片の全長は、約４５３ｂｐであり、その断片の５’末端にＮｒｕＩ制限部位を、そして３’末端にＡｐａＩ制限部位を有していた。
【０４３１】
コドン最適化バージョンのＳ．アベルミチリスｐａｎＤ遺伝子を含む、４５３ｂｐの得られた断片を、製造業者の取扱説明書に従って、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター内にクローン化し、そしてOne-Shot TOP10Ｅ．コリ細胞（Invitrogen）内に形質転換した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＥｃｏＲＩ消化によって所望の断片の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすプラスミドを、配列決定によって確認し、そしてｐＧＭＥｒ１２７と呼んだ。
【０４３２】
プラスミドｐＧＭＥｒ１２７及びｐＧＭＥｒ１２５（ａ）を、制限酵素ＮｒｕＩ及びＡｐａＩで消化した。消化反応を止める前に、末端の脱リン酸化と自己連結防止のためにｐＧＭＥｒ１２５（ａ）消化物に１μＬのCalf Intestinal Alkaline Phosphatase（New England Biolabs）を加えた。プラスミドｐＧＭＥｒ１２５（ａ）からの得られた８１８８ｂｐのベクター断片（前掲）、及びプラスミドｐＧＭＥｒ１２７（前掲）からのＳ．アベルミチリスｐａｎＤ遺伝子（配列番号１３０）のコドン最適化バージョンを含む４４０ｂｐの挿入物断片を、１× ＴＢＥバッファー中での０．８％アガロースゲル電気泳動によって分離し、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。
【０４３３】
次に、連結反応を、４μＬのベクター断片、４μＬの挿入物断片、９μＬの２× Quick Ligaseバッファー、及び１μＬのQuick T4 Ligase（New England Biolabs）を用いて準備し、そして製造業者の取扱説明書に従って実施した。上記の連結反応物の５μＬのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従って、XL10-Gold（登録商標）UltracompetentＥ．コリ細胞（Stratagene）内に形質転換した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＢａｍＨＩ消化によって所望の挿入物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、確認し、そしてｐＧＭＥｒ１３０と呼んだ（図１７）。
【０４３４】
プラスミドｐＧＭＥｒ１３０は、以下の断片：Ｉ．オリエンタリスａｄｈ９０９１遺伝子座の５’隣接部、Ｉ．オリエンタリスＰＤＣプロモーター／ＴＡＬターミネータを含む空の発現カセット、Ｉ．オリエンタリスＥＮＯ１プロモーターとＲＫＩターミネータの制御下にあるｐａｎＤ発現カセット（配列番号１３０を含む）、及びＩ．オリエンタリスＵＲＡ３プロモーターの制御下にあるＵＲＡ３マーカー遺伝子の切断５’断片からできた構築物を含む。
【０４３５】
酵母菌株Ｉ．オリエンタリスＣＮＢ１が、Ｓ．アベルミチリスｐａｎＤ遺伝子のＩ．オリエンタリスコドン最適化バージョン（配列番号１３０）及びＩ．オリエンタリスＡＡＴ遺伝子（配列番号１３）を発現することができるかどうか判断するために、発現プラスミドｐＧＭＥｒ１３０及びｐＧＭＥｒ１２６を構築した。プラスミドｐＧＭＥｒ１３０は、（５’から３’へ）Ｉ．オリエンタリスａｄｈ９０９１遺伝子座における構築物のゲノムの組み込みのための５’フランキング領域、ＥＮＯ１プロモーター及びＲＫＩターミネータの制御下にあるｐａｎＤ発現カセット、並びにＵＲＡ３プロモーターによって駆動されるＵＲＡ３選択マーカーの切断５’部分を含んでいる。プラスミドｐＧＭＥｒ１２６は、（５’から３’へ）ＵＲＡ３選択マーカーの３’部分、ＴＤＨ３プロモーター及びＴＫＬターミネータの制御下にあるＡＡＴ遺伝子発現カセット、及びはＩ．オリエンタリスａｄｈ９０９１遺伝子座における構築物のゲノム組み込みのための３’隣接部を含んでいる。すべてのプロモーターとターミネータをＩ．オリエンタリスから得た。
【０４３６】
プラスミドｐＧＭＥｒ１２６を、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、そしてそれが、着目の４７５８ｂｐの断片を切り出したのに対して、プラスミドｐＧＭＥｒ１３０を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして形質転換に必要な５０３４ｂｐの断片を作製した。４７５８ｂｐ及び５０３４ｂｐの断片を、１× ＴＢＥバッファー中での０．８％アガロースゲル電気泳動によって分離し、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。
【０４３７】
Ｉ．オリエンタリスＣＮＢ１を、本明細書中に記載したように、培養し、そして約５００ｎｇの４７５８ｂｐと５０３４ｂｐの線状断片の両方を用いて同時形質転換した。８つの形質転換体菌株を得、次に、振盪フラスコで培養した。得られたブロスを、Ｉ．オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したＳ．アベルミチリスｐａｎＤ遺伝子（配列番号１３０）及びＩ．オリエンタリスＡＡＴ遺伝子（配列番号１３）の発現を検出するためのＳＤＳ‐ＰＡＧＥ、Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（Bio-Rad Laboratories）ゲルに泳動するために使用した。陽性菌株を、ｙＧＭＥｒ００８と呼び、そしてそのブロスもまた、先に記載したように、ＡＤＣ及びＡＡＴ活性レベルを測定するのに使用した。
【０４３８】
実施例３Ａ‐１２：ａｄｈ９０９１遺伝子座においてピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＹＣ）、アスパラギン酸１‐デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＡＴ）を発現する酵母菌株
配列番号２のＩ．オリエンタリスのピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＹＣ）をコードするヌクレオチド配列を、Ｉ．オリエンタリスゲノムＤＮＡからプライマー０６１１２６６と０６１１２６７を使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応物（５０μＬ）は、５０ｎｇのＩ．オリエンタリスゲノムＤＮＡ、１× Phusion HFバッファー（New England Biolabs）、それぞれ５０ｐｍｏｌのプライマー０６１１２６６と０６１１２６７、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、１．５μＬの１００％ ＤＭＳＯ（New England Biolabs）、並びに１単位のPhusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を含んでいた。ＰＣＲを、９８℃にて２分間を１サイクルと続く、それぞれ９８℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、そして７２℃にて１分と３０秒間を３５サイクル、それと７２℃にて７分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約３５５７ｂｐのＰＣＲ産物をゲルから切り出す、ＴＢＥバッファー中での０．８％アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。得られたＰＣＲ断片は、その断片の５’末端にＸｂａＩ制限部位を、そして３’末端にＰａｃＩ制限部位を持っていた。
【０４３９】
Ｉ．オリエンタリスＰＹＣ遺伝子ＣＤＳ（配列番号１）を含む、得られた３５５７ｂｐの断片を、製造業者の取扱説明書に従って、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター内にクローン化し、そしてOne-Shot TOP10Ｅ．コリ細胞（Invitrogen）内に形質転換する。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＥｃｏＲＩ消化によって所望の断片の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらす６個のクローンを、確認し、そしてｐＧＭＥｒ１３２．７、ｐＧＭＥｒ１３２．１４、ｐＧＭＥｒ１３２．１６、ｐＧＭＥｒ１３２．２５、ｐＧＭＥｒ１３２．２７、及びｐＧＭＥｒ１３２．３０と呼んだ。配列解析は、プラスミドｐＧＭＥＲＩ３２．１４には適切なＰＹＣ ＣＤＳがあるが、ＣＤＳ５’末端のＸｂａＩ、制限部位を失ったことを明らかにした。この制限部位が発現プラスミドｐＧＭＥｒ１２５にＰＹＣ ＣＤＳを挿入するのに必要なので、プラスミドｐＧＭＥｒ１３２．１４の３１５ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ断片（変更されたＸｂａＩ部位を有するＰＹＣ ＣＤＳの５’末端を含む）を、プラスミドｐＧＭＥｒ１３２．７からの３１５ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ断片と置き換えたが、それは、正しいＸｂａＩ部位を含んでいるＰＹＣ ＣＤＳの変更のない５’末端を持つ。プラスミドｐＧＭＥｒ１３２．１４からの、得られた７１７３ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩベクター断片、及びプラスミドｐＧＭＥｒ１３２．７からの、３１５ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ挿入物断片を、１× ＴＢＥバッファー中での０．８％アガロースゲル電気泳動によって分離し、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。
【０４４０】
次に、連結反応を、４μＬのベクター断片、５μＬの挿入物断片、１０μＬの２× Quick Ligaseバッファー、及び１μＬのQuick T4 Ligase（New England Biolabs）を用いて準備し、製造業者の取扱説明書に従って実施した。上記の連結反応物の５μＬのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従って、One-Shot TOP10Ｅ．コリ細胞（Invitrogen）内に形質転換した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩの二重消化によって、所望の挿入物の適切な挿入と方向についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、確認し、そしてｐＧＭＥｒ１３３と呼んだ。
【０４４１】
ＰＤＣプロモーターのＩ．オリエンタリスＰＹＣ ＣＤＳ下流をプラスミドｐＧＭＥｒ１２５（ｂ）内に挿入するために、プラスミドｐＧＭＥｒ１２５（ｂ）及びｐＧＭＥｒ１３３（前掲）をＰａｃＩ及びＸｂａＩで消化した。プラスミドｐＧＭＥｒ１２５（ｂ）からの、得られた８１８８ｂｐのベクター断片、及びプラスミドｐＧＭＥｒ１３３からの、Ｉ．オリエンタリスＰＹＣ ＣＤＳ（配列番号１）を含む３５５３ｂｐの挿入物断片を、１× ＴＢＥバッファー中での０．８％アガロースゲル電気泳動によって分離し、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。
【０４４２】
次に、連結反応を、３μＬのベクター断片、６μＬの挿入物断片、１０μＬの２× Quick Ligaseバッファー、及び１μＬのQuick T4 Ligase（New England Biolabs）を用いて準備し、製造業者の取扱説明書に従って実施した。上記の連結反応物の５μＬのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従って、One-Shot TOP10Ｅ．コリ細胞（Invitrogen）内に形質転換した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＢａｍＨＩ消化によって所望の断片の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、確認し、そしてｐＧＭＥｒ１３６と呼んだ。
【０４４３】
プラスミドｐＧＭＥｒ１３６は、
Ｉ．オリエンタリスａｄｈ９０９１遺伝子座の５’隣接部、Ｉ．オリエンタリスＰＤＣプロモーター及びＴＡＬターミネータの制御下にあるＩ．オリエンタリスＰＹＣ遺伝子発現カセット（配列番号１）、Ｉ．オリエンタリスＥＮＯ１プロモーター／ＲＫＩターミネータを有する空の発現カセット、及びＵＲＡ３プロモーターの制御下にあるＩ．オリエンタリスＵＲＡ３マーカー遺伝子の切断５’断片を含んでいる。
【０４４４】
約５μｇのプラスミドｐＧＭＥｒ１３６（前掲）及び４μｇのプラスミドｐＧＭＥｒ１２７を、制限酵素ＡｐａＩ及びＮｒｕＩで消化した。プラスミドｐＧＭＥｒ１３６からの、得られた１１７２９ｂｐのベクター断片、及びプラスミドｐＧＭＥｒ１２７からのＩ．オリエンタリスにおける発現のためにコドンで最適化したＳ．アベルミチリスｐａｎＤ遺伝子（配列番号１３０）（４３６ｂｐ）を含む得られた挿入物断片を、製造業者の取扱説明書に従ってNucleoSpin（登録商標）Extract II（Macherey-Nagel）を使用した１× ＴＢＥバッファー中での０．８％アガロースゲル電気泳動によって精製した。
【０４４５】
次に、連結反応を、５μＬのベクター断片、４μＬの挿入物断片、９μＬの２× Quick Ligaseバッファー、及び１μＬのQuick T4 Ligase（New England Biolabs）を用いて準備した。反応物を、室温にて１時間インキュベートした。
上記の連結反応物の５μＬのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従って、One Shot（登録商標）TOP10化学的コンピテントＥ．コリ細胞（Invitrogen）内に形質転換した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＢａｍＨＩ消化によって所望の挿入物についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、選択し、そしてｐＧＭＥｒ１３７と呼んだ（図１８）。
【０４４６】
プラスミドｐＧＭＥｒ１３７は、Ｉ．オリエンタリスＰＤＣプロモーターとＴＡＬターミネータの転写調節下にあるＩ．オリエンタリスＰＹＣ遺伝子（配列番号１）、Ｉ．オリエンタリスＥＮＯ１プロモーター及びＲＫＩターミネータの転写調節の下にある、Ｉ．オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したＳ．アベルミチリスｐａｎＤ遺伝子（配列番号１３０）、ＵＲＡ３プロモーターとそれに続くＵＲＡ３マーカーの５’末端、並びにＩ．オリエンタリスａｄｈ９０９１遺伝子座の５’フランキング領域を含む。
【０４４７】
プラスミドｐＧＭＥｒ１２６（前掲）を、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、そしてそれで、着目の４７５８ｂｐの断片を切り出した；その一方、プラスミドｐＧＭＥｒ１３７（前掲）を、制限酵素ＨｐａＩとＮｈｅＩで消化し、８４００ｂｐの断片を作製した。４７５８ｂｐ及び８４００ｂｐの断片の両方を、１× ＴＢＥバッファー中での０．８％アガロースゲル電気泳動によって分離し；バンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNucleoSpin（登録商標）Extract II（Macherey-Nagel）を使用して精製した。形質転換体ｙＧＭＥｒ００９をもたらして、Ｉ．オリエンタリスＣＮＢ１を培養し、そして本明細書中に記載したように、約５００ｎｇの４７５８ｂｐと８４００ｂｐの線状断片の両方で同時形質転換した。
【０４４８】
実施例３Ａ‐１３：ｐｄｃ遺伝子座においてアスパラギン酸１‐デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）、β‐アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＢＡＡＴ）、及び３‐ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ（３‐ＨＰＤＨ）を発現し；且つ、ａｄｈ９０９１遺伝子座においてピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＹＣ）、アスパラギン酸１‐デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＡＴ）を発現する酵母菌株
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＡＴ）、β‐アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＢＡＡＴ）、及び３‐ＨＰデヒドロゲナーゼ（３‐ＨＰＤＨ）を既に過剰発現している菌株でピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＹＣ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＡＴ）活性を増強するために、菌株ｙＭｈＣｔ０１０（前掲）を、先に記載したように、ｐＧＭＥｒ１３７（前掲）及びｐＧＭＥｒ１２６（前掲）の線状断片で形質転換した。２ラウンドのシングルコロニー精製及び増殖の後に、所望の標的組み込みが記載するように起こったの立証するために、ゲノムＤＮＡをＰＣＲにおける使用のために調製した。ａｄｈ９０９１遺伝子座へのｐＧＭＥｒ１３７及びｐＧＭＥｒ１２６断片の正しいターゲッティングを、プライマー０６１１８１４と０６１２０５５を使用して確認した。プライマー０６１１８１４は、ｐＧＭＥｒ１２６のＴＤＨ３プロモーターの３’末端にアニールし、そして３’方向に増幅する。プライマー０６１２０５５は、ｐＧＭＥｒ１２６内に存在しているａｄｈ９０９１３の３’フランキング相同部にアニールする、したがって、組み込みＤＮＡが相同組み換えによって正しい遺伝子座路に標的化された場合にだけ、このプライマー対を用いたＰＣＲ産物の増幅が起こる。プライマー０６１１８１４と０６１２０５５を含むＰＣＲからの約３０６６ｂｐのバンドの存在は、ｐＧＭＥｒ１２６及びｐＧＭＥｒ１３７断片の所望の組み込みがａｄｈ９０９１遺伝子座で起こったことを示す。
【０４４９】
ｐＧＭＥｒ１３７及びｐＧＭＥｒ１２６の線状断片を用いたｙＭｈＣｔ０１０のいくつかの独立した形質転換体の２ラウンドのシングルコロニー精製及び増殖の後に、所望の標的組み込みが先に記載したように起こったことを確かめるためのＰＣＲにおける使用のために、ゲノムＤＮＡを調製した。プライマー０６１１８１４と０６１２０５５を含むＰＣＲから約３０６６ｂｐのバンドをもたらす、３つの独立に単離した菌株を、ｙＭｈＣｔ０２０、ＧＭＥｒｉｎ０１０＃２、及びＧＭＥｒｉｎ０１０＃３と呼んだ。これらの菌株は、両方のｐｄｃ遺伝子座及び１つのａｄｈ９０９１遺伝子座で対応するＡＤＣ（配列番号１７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１３０）；両方のｐｄｃ遺伝子座で対応するｇａｂＴ（配列番号２４）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１４１）；両方のｐｄｃ遺伝子座で対応する３‐ＨＰＤＨ（配列番号１２９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１４４）；１つのａｄｈ９０９１遺伝子座で対応するＰＹＣ（配列番号２）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１）；及び１つのａｄｈ９０９１遺伝子座で対応するＡＡＴ（配列番号１４）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１３）を含んでいる（表２４を参照のこと）。
【０４５０】
【表３５】
2013542747.tif 000036
【０４５１】
菌株ｙＭｈＣｔ０２０、ＧＭＥｒｉｎ０１０＃２、及びＧＭＥｒｉｎ０１０＃３を、振盪フラスコで培養し、ＣＦＥを調製し、そして本明細書中に記載のように、ＰＹＣ、ＡＡＴ、及び３‐ＨＰＤＨ活性についてアッセイした。実験結果を表２５に示す。
【０４５２】
【表３６】
2013542747.tif 000037
【０４５３】
表２５の菌株をさらに、本明細書中に記載したように、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによっても分析した。ＭＢｉｎ５００及びＧＭＥｒ００９‐２は、他の４サンプルで欠けている〜６４ｋＤのタンパク質バンドを示した。これらのタンパク質の質量は、Ｉ．オリエンタリスＣＮＢ１の天然ピルビン酸デカルボキシラーゼとしてのそれらの正体と一致している。菌株ｙＭｈＣｔ００８、ｙＭｈＣｔ０２０、ＧＭＥｒｉｎ０１０＃２、及びＧＭＥｒｉｎ０１０＃３は、５３ｋＤ及び２９ｋＤのバンドを示した。これらのタンパク質の質量は、それぞれＵＧＡ１及びＹＭＲ２２６ｃ遺伝子によってコードされるタンパク質の質量と一致している。菌株ＧＭＥｒ００９‐２、ｙＭｈＣｔ０２０、ＧＭＥｒｉｎ０１０＃２、及びＧＭＥｒｉｎ０１０＃３はすべて、４６．３ｋＤにバンドを示した。これらのタンパク質の質量は、ＡＡＴ遺伝子によってコードされるタンパク質の質量と一致している。
【０４５４】
実施例３Ａ‐１４：両方のａｄｈ１２０２遺伝子座において４つのヌクレオチド配列からアスパラギン酸１‐デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）を発現する酵母菌株
配列番号１３９（前掲）のＢ．リチェニフォルミスＡＤＣをコードする４コピーのヌクレオチドを含むＭｅＪｉ４０９‐２のｕｒａ３−誘導体を、先に記載したＦＯＡ対抗選択ループアウトプロトコールを使用して単離した。親菌株ＭｅＪｉ４０９‐２のいくつかのＦＯＡ耐性コロニーのゲノムＤＮＡを、所望のループアウト事象について、プライマー０６１１８１５と０６１１８１７を用いたＰＣＲによってスクリーニングした。プライマー０６１１８１５は、左側構築物のＲＫＩターミネータにアニールし、そしてｕｒａ３プロモーターに向かって増幅する。プライマー０６１１８１７は、ＴＤＨ３プロモーターにアニールし、そしてｕｒａ３カセットに向かって戻る方向に増幅する。８２８ｂｐのバンドの存在が、所望されるｕｒａ３瘢痕部位（親菌株における２つのＵＲＡ３プロモーターの間の相同組み換え後に取り残された１つのＵＲＡ３プロモーター）のみの存在を示すのに対して、約２．２ｋｂｐのバンドは、完全なＵＲＡ３プロモーター‐ＵＲＡ３ ＯＲＦ‐ＵＲＡ３ターミネータ‐ＵＲＡ３プロモーターカセットの存在を示し、そして所望の組み換え事象が起こらなかったことを示す。Crimson Taq（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs）を用いたＰＣＲ反応物を、先に記載したようにおこなった。ＭｅＪｉ４１１と呼ばれる、親菌株ＭｅＪｉ４０９‐２からの１つのＦＯＡ耐性コロニーは、所望の８２８ｂｐのバンドを得た。
【０４５５】
左側断片及び右側断片の組み込み
本明細書中に記載したように、プラスミドｐＭｅＪｉ３１０‐２を、ＨｐａＩ及びＳａｃＩＩで消化し、そして、プラスミドｐＭｅＪｉ３１２‐２を、ＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩＩで消化した。これらを、ＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製し、２本の約５ｋｂｐのバンドをゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０４５６】
ＭｅＪｉ４１１を、消化したｐＭｅＪｉ３１０‐２及びｐＭｅＪｉ３１２‐２ＤＮＡで形質転換し、そして、正しい遺伝子座ターゲッティング及び形質転換を、本明細書中に記載したように、Crimson Taq（New England Biolabs）ＰＣＲによって確認した。プライマー０６１１２２５と０６１１６３２は、約５ｋｂｐのバンドをもたらし；プライマー０６１１８１５と０６１１６３２は、ｕｒａマーカーを含む約６ｋｂｐのバンドをもたらしたが、４．５ｋｂｐのバンドはなかった。プライマー０６１１６３１と０６１２５７９は、野生型ａｄｈ１２０２遺伝子座がまだ完全である場合に、約９３６ｂｐのバンドをもたらす（このバンドを示さなかった菌株を選択した）。発現カセットの適切な組み込みが予想されるバンドをもたらした菌株を、ＭｅＪｉ４１２と呼んだ。
【０４５７】
実施例３Ａ‐１５：ＰＤＣプロモーターの制御下にあるアスパラギン酸１‐デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）をコードするヌクレオチドの２つのコピー、及びＴＤＨ３プロモーターの制御下にある２つのコピーを含む、ａｄｈ１２０２遺伝子座においてアスパラギン酸１‐デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）をコードするヌクレオチドの４つのコピーを発現する酵母菌株
この実施例では、Ｉ．オリエンタリスＰＤＣプロモーター制御下にある２つのコピー及びＩ．オリエンタリスＴＤＨ３プロモーターの制御下にある２つのコピーを含んでいる、ａｄｈ１２０２遺伝子座において配列番号１３９のＢ．リチェニフォルミスＡＤＣをコードするヌクレオチドの４つのコピー４を組み込むように設計した構築物を説明する。先に記載したものへの同様のアプローチにおいて、左側及び右側構築物を、Ｉ．オリエンタリスＣＮＢ１のａｄｈ１２０２遺伝子座における相同組み換えを可能にするように設計した。
【０４５８】
左側断片の構築
プラスミドｐＭｅＪｉ３１０‐２（前掲；図１４を参照のこと）を、ＸｂａＩとＳｔｕＩで消化し、続いてＣＩＰで処理し、そして本明細書中に記載したように、ＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。約６．７ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。
【０４５９】
ＮｏｔＩでの消化、それに続くクレノーを用いた補充反応、そしてその後のＮｈｅＩでの消化によって、ＰＤＣプロモーターをｐＭｅＪｉ３１０‐２から切り出した。約７０８ｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。
【０４６０】
７０８ｂｐの精製断片を、１μＬのｐＭｅＪｉ３１０‐２からの６．７ｋｂｐの断片、１又は５μＬのｐＭｅＪｉ３１０‐２からの７０８ｂｐの断片、１μＬの１０ｍＭ ＡＴＰ（New England Biolabs）含有１０×連結反応バッファー、並びに１μＬのＴ４リガーゼ（New England Biolabs）から構成された１０μＬの総反応物容量中でＴ４リガーゼ（New England Biolabs）を使用して線状ベクターを６．７ｋｂｐのｐＭｅＪｉ３１０‐２に連結した。反応物を、１６℃にて一晩インキュベートし、そして反応物の４μＬのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従って、One Shot（登録商標）TOP10化学的コンピテントＥ．コリ細胞（Invitrogen）内に形質転換した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＡｐａＬＩを使用した制限消化によって適切な挿入についてスクリーニングした。正しい消化バンドサイズをもたらしたクローンを、ｐＭＩＢａ１３７と呼んだ。
【０４６１】
右側断片の構築
プラスミドｐＭｅＪｉ３１２‐２（前掲）を、ＸｂａＩとＳｔｕＩで消化し、続いてＣＩＰで処理し、そして本明細書中に記載したように、ＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。約６．８ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。
【０４６２】
ＴＤＨ３プロモーターを、ＰｍｅＩ及びＮｈｅＩで消化することによってｐＭｅＪｉ３１２‐２から切り出した。約９６６ｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。
【０４６３】
９６６ｂｐの精製断片を、１μＬのｐＭｅＪｉ３１２‐２からの６．８ｋｂｐの断片、１〜５μＬの９６６ｂｐのｐＭｅＪｉ３１２‐２からの断片、１μＬの１０ｍＭ ＡＴＰ（New England Biolabs）含有１０×連結反応バッファー、及び１μＬのＴ４リガーゼ（New England Biolabs）から構成された１０μＬの総反応物容量中でＴ４リガーゼ（New England Biolabs）を使用して６．８のｋｂｐのｐＭｅＪｉ３１２‐２の線状ベクターに連結した。反応物を、１６℃にて約６時間インキュベートし、そして、反応物の４μＬのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従ってOne Shot（登録商標）TOP10化学的コンピテントＥ．コリ細胞（Invitrogen）内に形質転換した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＳａｌＩを使用した制限消化によって適切な挿入についてスクリーニングした。正しい消化バンドサイズをもたらしたクローンを、ｐＭＩＢａ１３６と呼んだ。
【０４６４】
左側断片及び右側断片の組み込み
本明細書中に記載したように、プラスミドｐＭＩＢａ１３７をＨｐａＩ及びＳａｃＩＩで消化し、そしてプラスミドｐＭＩＢａ１３６をＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩＩで消化した。これらを、ＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製し、約５ｋｂｐのバンド２本を、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。
【０４６５】
Ｉ．オリエンタリスＣＮＢ１を、消化ｐＭＩＢａ１３７及びｐＭＩＢａ１３６ＤＮＡで形質転換し、そして本明細書中にに記載したように、正しい遺伝子座ターゲッティング及び形質転換についてCrimson Taq（New England Biolabs）ＰＣＲによって確認した。プライマー０６１１７１７と０６１１６３１は、約２．５ｋｂｐ及び９５５ｂｐのバンドをもたらし；プライマー０６１１７１８と０６１１６３２は、約７３３ｂｐのバンドをもたらし；プライマー０６１２７９４と０６１１２４５は、約２．７ｋｂｐのバンドをもたらし；プライマー０６１１２２５と０６１２７９５は、約４．２ｋｂｐのバンドをもたらした。発現カセットの適切な組み込みが予想されるバンドをもたらした菌株を、ＭＩＢａ３５１と呼んだ。
【０４６６】
ＭＩＢａ３５１からのｕｒａマーカーの除去
ＭＩＢａ３５１のｕｒａ−誘導体を、先に記載したように単離した。ＭＩＢａ３５１のいくつかのＦＯＡ耐性コロニーからのゲノムＤＮＡを、プライマー０６１１８１５と０６１１８１７を用いたＰＣＲによって、所望のループアウト事象についてスクリーニングした。プライマー０６１１８１５は、左側構築物のＲＫＩターミネータにアニールし、そしてｕｒａ３プロモーターに向かって増幅する。プライマー０６１１８１７は、ＴＤＨ３プロモーターにアニールし、そしてｕｒａ３カセットに向かって戻る方向に増幅する。８２８ｂｐのバンドの存在が、所望されるｕｒａ３瘢痕部位のみ（親菌株の２つのＵＲＡ３プロモーターの間の相同組み換え後に取り残された１つのＵＲＡ３プロモーター）の存在を示すのに対して、約２．２ｋｂｐのバンドは、完全なＵＲＡ３プロモーター‐ＵＲＡ３ ＯＲＦ‐ＵＲＡ３ターミネータ‐ＵＲＡ３プロモーターカセットの存在を示し、そして所望の組み換え事象が起きなかったことを示す。Crimson Taq（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs）を用いたＰＣＲ反応物を、先に記載したように実施した。上記のプライマーにより８２８ｂｐの断片をもたらしたＦＯＡ耐性コロニーを、配列番号１３９のＢ．リチェニフォルミスＡＤＣをコードする配列番号１３８のヌクレオチド配列の４つのコピーが元の状態のまま残っていることを確認するために、（２．７ｋｂｐ産物をもたらす）プライマー０６１２７９４と０６１１２４５、及び（４ｋｂｐの産物をもたらす）プライマー０６１１８１５と０６１２７９５を用いて試験した。ＭＩＢａ３５３と呼ばれる親菌株ＭＩＢａ３５１からの１つのＦＯＡ耐性コロニーは、３つのプライマーセットのすべてで所望のＰＣＲ産物をもたらした。
【０４６７】
逆発現カセットの右側断片の構築
プラスミドｐＭＩＢａ１３６は、前進の方向に進行する２個の発現カセットを含んでいる。ホモ接合菌株のスクリーニングを簡単にするために、ｐＭＩＢａ１３６のｐａｎＤｂｌ発現カセットを逆方向に置いた新しいプラスミドを構築した。プラスミドｐＭＩＢａ１３６（前掲）を、本明細書中に記載したように、ＮｏｔＩとＰｍｅＩで消化し、続いてクレノーを用いた補充反応に供し、そしてＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。約３．４及び４．４ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。ｐＭＩＢａ１３６からの４．４ｋｂｐの断片を、ＣＩＰで処理し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）PCR Purification Kit（Qiagen）を使用して精製した。
【０４６８】
ｐＭＩＢａ１３６からの３．４ｋｂｐの精製断片を、１μＬのｐＭＩＢａ１３６からの４．４ｋｂｐの断片、１〜５μＬのｐＭＩＢａ１３６からの３．４ｋｂｐの断片、１μＬの１０ｍＭ ＡＴＰ（New England Biolabs）含有１０×連結反応バッファー、及び１μＬのＴ４リガーゼ（New England Biolabs）から構成された１０μＬの総反応物容量中でＴ４リガーゼ（New England Biolabs）を使用して４．４ｋｂｐのｐＭＩＢａ１３６ベクター内に連結した。反応物を、１６℃にて一晩インキュベートし、そして反応物の４μＬのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従って、One Shot（登録商標）TOP10化学的コンピテントＥ．コリ細胞（Invitrogen）内に形質転換した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＰａｃＩＩとＥｃｏＲＩを使用した制限消化によって、適切な挿入についてスクリーニングした。正しい消化バンドサイズをもたらしたクローンを、ｐＭＩＢａ１３８と呼んだ。
【０４６９】
左側断片及び右側断片の組み込み
共に本明細書中に記載したように、プラスミドｐＭＩＢａ１３７を、ＨｐａＩとＳａｃＩＩで消化し、そしてプラスミドｐＭＩＢａ１３８を、ＥｃｏＲＩとＳａｃＩＩで消化した。これらを、ＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製し、約５ｋｂｐのバンド２本をゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。
【０４７０】
ＭＩＢａ３５３を、消化ｐＭＩＢａ１３７及びｐＭＩＢａ１３８ＤＮＡで形質転換し、そして正しい遺伝子座ターゲッティング及び形質転換を、製造業者の取扱説明書に従ってPhire（登録商標）Plant Direct PCR kit（Finnzymes）を使用したＰＣＲによって確認した。プライマー０６１１７１８と０６１１６３２は、約７３３ｂｐのバンドをもたらし（第１の組み込みがまだ存在していることを確認するため）；プライマー０６１２３６７と０６１１６３２は、約９６０ｂｐのバンドをもたらし（第２のコピーが組み込まれたことを確認するため）；プライマー０６１１６３１と０６１２５７９は、野生型ａｄｈ１２０２遺伝子座がまだ存在しているのであれば、約９３６ｂｐのバンドをもたらした（このバンドの欠如はｗｔ ａｄｈ１２０２遺伝子座の欠失を確認する）。発現カセットの適切な組み込みが予想されるバンドをもたらした２つの菌株を、保存し、そしてＭＩＢａ３５５及びＭＩＢａ３５６と呼んだ。
【０４７１】
ＭｅＪｉ４０９‐２、ＭｅＪｉ４１２、ＭＩＢａ３５１、及びＭＩＢａ３５５のアスパラギン酸１‐デカルボキシラーゼ活性
菌株ＭｅＪｉ４０９‐２、ＭｅＪｉ４１２、ＭＩＢａ３５１、及びＭＩＢａ３５５を、振盪フラスコで培養し、そして本明細書中に記載したように、ＣＦＥを調製し、そしてアスパラギン酸１‐デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）活性についてアッセイした。結果を表２６に示す。各菌株の活性は、２つの独立した振盪フラスコ培養物の平均である。菌株ＭｅＪｉ４０９‐２、ＭｅＪｉ４１２、ＭＩＢａ３５１、及びＭＩＢａ３５５もまた、本明細書中に記載した方法を使用して、３‐ＨＰ生産についてバイオリアクター内で試験した。これらのバイオリアクター実験からの結果もまた、表２６に示す。これらの発酵における細胞質量の違いを考慮するために、表２６に示した３‐ＨＰ生産能力を、単位細胞質量あたりの３‐ＨＰ濃度として表現した（［ｇ／Ｌ ３‐ＨＰ］／［ｇ／Ｌ 乾燥細胞重量］として表現した）。結果は、細胞内のＡＤＣ活性のレベルが増強するのに従って３‐ＨＰ生産能力が増強されることを示している。
【０４７２】
【表３７】
2013542747.tif 000038
【０４７３】
実施例３Ａ‐１６：ＰＤＣ遺伝子座におけるピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＹＣ）を発現するためのプラスミドの構築
ＰＤＣ遺伝子座における組み込みのための（配列番号２のＩ．オリエンタリスＰＹＣをコードする）配列番号１のヌクレオチド配列を含むプラスミドｐＡＮＮ２８を、以下で記載するように構築した。
【０４７４】
Ｉ．オリエンタリスＰＤＣの上流及び下流フランキング領域を、製造業者の取扱説明書に従って、鋳型（Ｐｆｕポリメラーゼ、Stratagene）としてゲノムＤＮＡを使用したＰＣＲによって増幅した。プライマーｏＡＮＮ７とｏＡＮＮ８は、上流領域に隣接する独特な制限部位の取り込みを可能にし、プライマーｏＡＮＮ９とｏＡＮＮ１０は、下流領域に隣接する独特な制限部位の取り込みを可能にした。ＰＣＲ産物を、本明細書中に記載したように、ＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。各ＰＣＲ産物の約８００ｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってゲル抽出キット（Qiagen）を使用して精製した。精製したＰＣＲ産物を、製造業者の取扱説明書に従って、TOPOベクター（Invitrogen）内にクローン化し、そして電気的コンピテントＥ．コリDH10B細胞（Invitrogen）内に形質転換した。得られた形質転換体のいくつかを、ＰＣＲ産物を作製するのと同じプライマーを使用したコロニーＰＣＲによって適切な挿入についてスクリーニングした。陽性クローンを、配列決定によってさらに確認した。正しいＰＤＣ下流の隣接部をもたらしたクローンを、ｐＡＮＮ０４と呼んだ。正しいＰＤＣ上流の隣接部をもたらしたクローンを、ｐＡＮＮ０７と呼んだ。
【０４７５】
プラスミドｐＡＮＮ０４を、ＡｐａＩとＳａｃＩで消化し（ベクター／骨格としての使用のため）；プラスミドｐＡＮＮ０４を、ＮｏｔＩとＳａｃＩで消化し；プラスミドｐＡＮＮ０７を、ＮｏｔＩとＡｐａＩで消化した。各断片を、本明細書中に記載したように、ＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。ベクターのための約３．５ｋｂｐのバンド、及び各挿入物のための約１ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってゲル抽出キット（Qiagen）を使用して精製した。精製産物を、４９ｎｇのベクター、１２０ｎｇの下流挿入物、４１ｎｇの上流挿入物、１μＬの１０ｍＭ ＡＴＰ（New England Biolabs）含有１０×連結反応バッファー、及び１μＬのＴ４リガーゼ（New England Biolabs）から構成された１０μＬの総反応物容量中でＴ４リガーゼ（New England Biolabs）を使用して連結した。反応物を、室温にて３０分間インキュベートし、そして反応物の２μＬのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従って、One Shot TOP10電気的コンピテントＥ．コリ細胞（Invitrogen）内に形質転換した。形質転換体を、ＬＢ＋カナマイシンプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、（約１．７ｋｂｐのバンドをもたらす）プライマーｏＡＮＮ７とｏＡＮＮ１０を用いたコロニーＰＣＲによって適切な挿入についてスクリーニングした。正しい挿入をもたらしたクローンを、ｐＡＮＮ１２と呼んだ。
【０４７６】
ｐＧＭＥｒ１３７（前掲）からのＩ．オリエンタリスＰＹＣコード配列（配列番号１）を、部位特異的突然変異誘発によって改変し、コードしている酵素のアミノ酸配列を変更しない３つのＥｃｏＲＩ制限部位を排除した。プラスミドｐＧＭＥｒ１３７を、製造業者の取扱説明書に従ってMulti change kit（Stratagene）を使用した、先に触れた制限部位の排除に使用するプライマーｏＡＮＮ１３、ｏＡＮＮ１４、及びｏＡＮＮ１５を伴って鋳型として使用した。得られた形質転換体のいくつかを、ＥｃｏＲＩを使用した制限消化によってスクリーニングした。陽性クローンを、配列決定によってさらに確認した。正しいｐｙｃコード配列をもたらしたクローンを、ｐＡＮＮ１４と呼んだ。
【０４７７】
プラスミドｐＪＹ３９（図２９）を、ＸｈｏＩとＰａｃＩで消化し；プラスミドｐＡＣＮ５（前掲；図１９を参照のこと）を、ＸｈｏＩとＸｂａＩで消化し；プラスミドｐＡＮＮ１４を、ＸｂａＩとＰａｃＩで消化した。各断片を、本明細書中に記載したように、ＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。ベクターのための約８ｋｂｐのバンド、第１の挿入物のための約７００ｂｐのバンド、及びＰＹＣをコードする第２の挿入物のための約３．６ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってゲル抽出キット（Qiagen）を使用して精製した。精製産物を、５１ｎｇのベクター、４９ｎｇの第１の挿入物、２１０ｎｇの第２の挿入物、１μＬの１０ｍＭ ＡＴＰ（New England Biolabs）含有１０×連結反応バッファー、及び１μＬのＴ４リガーゼ（New England Biolabs）から構成された１０μＬの総反応物容量中でＴ４リガーゼ（New England Biolabs）を使用して連結した。反応物を、室温にて３０分間インキュベートし、そして、反応物の２μＬのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従って、One Shot TOP10電気的コンピテントＥ．コリ細胞（Invitrogen）内に形質転換した。形質転換体を、ＬＢ＋カナマイシンプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、プライマーｏＪＬＪ５７とｏＪＬＪ４３（約１ｋｂｐのバンドをもたらす）、プライマーｏＪＬＪ４５とｏＡＮＮ１６（約７３０ｂｐのバンドをもたらす）、及びプライマーｏＡＮＮ２０とｏＪＹ４５（約１．２ｋｂｐのバンドをもたらす）を用いたコロニーＰＣＲによって、適切な挿入についてスクリーニングした。正しい挿入をもたらしたクローンを、ｐＡＮＮ１５と呼んだ。
【０４７８】
プラスミドｐＡＮＮ１２及びｐＡＮＮ１５を、ＮｏｔＩで消化した。プラスミドｐＡＮＮ１５を、骨格の更なる分画及び所望の断片の分離の改善のために、ＮｃｏＩでさらに消化した。消化したｐＡＮＮ１２を、製造業者の取扱説明書に従ってQiagenキットを使用して精製した。ＮｏｔＩ断片を、本明細書中に記載したように、ＴＢＥバッファー中でのアガロースゲル電気泳動によって精製した。約５ｋｂｐ（ｐＡＮＮ１２から）及び約６．３ｋｂｐ（ｐＡＮＮ１５から）のバンドを、製造業者の取扱説明書に従ってゲル抽出キット（Qiagen）を使用してゲル精製した。
【０４７９】
ｐＡＮＮ１５からの精製産物を、５０ｎｇのベクター、１１５ｎｇの挿入物、１μＬの１０ｍＭ ＡＴＰ（New England Biolabs）含有１０×連結反応バッファー、及び１μＬのＴ４リガーゼ（New England Biolabs）から構成された１０μＬの総反応物容量中でにＴ４リガーゼ（New England Biolabs）を使用してｐＡＮＮ１２線状ベクターに連結した。反応物を、室温にて１．５時間インキュベートし、そして、反応物の２μＬのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従って、One Shot TOP10電気的コンピテントＥ．コリ細胞（Invitrogen）内に形質転換した。形質転換体を、ＬＢ＋カナマイシンプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、（約１．２ｋｂｐのバンドをもたらす）プライマーｏＡＮＮ２０とｏＪＹ４５を用いたコロニーＰＣＲによって、適切な挿入についてスクリーニングした。正しい挿入をもたらすクローンを、挿入方向を識別するために、ＳａｃＩ／ＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩ／ＥｃｏＲＶで制限酵素消化によってさらにスクリーニングした。上流ＰＤＣ隣接部に近いｕｒａ３マーカーをもたらしたクローンを、ｐＡＮＮ２７と呼んだ。下流ＰＤＣ隣接部に近いｕｒａ３マーカーをもたらしたクローンを、ｐＡＮＮ２８と呼んだ。
【０４８０】
実施例３Ａ‐１７：ａｄｈ１２０２遺伝子座における４つのヌクレオチド配列からアスパラギン酸１‐デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）を、及びｐｄｃ遺伝子座においてピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＹＣ）を発現する酵母菌株
この実施例は、ａｄｈ１２０２遺伝子座において配列番号１３９のＢ．リチェニフォルミスＡＤＣをコードするヌクレオチドの４つのコピー及びｐｄｃ遺伝子座において配列番号２のＩ．オリエンタリスＰＹＣをコードするヌクレオチドを発現する酵母菌株の構築を説明する。
【０４８１】
ＭｅＪｉ４１２からのｕｒａマーカーの除去
ＭｅＪｉ４１２のｕｒａ−誘導体を、先に記載したように単離した。ＭｅＪｉ４１２のいくつかのＦＯＡ耐性コロニーを、０６１１８１５と０６１１８１７プライマーを用いたコロニーＰＣＲによって、所望のループアウト事象についてスクリーニングした。プライマー０６１１８１５は、左側構築物のＲＫＩターミネータにアニールし、そしてｕｒａ３プロモーターに向かって増幅する。プライマー０６１１８１７は、ＴＤＨ３プロモーターにアニールし、そしてｕｒａ３カセットに向かって戻る方向に増幅する。８６９ｂｐのバンドの存在が、所望されるｕｒａ３瘢痕部位のみ（親菌株の２つのＵＲＡ３プロモーターの間の相同組み換え後に取り残された１つのＵＲＡ３プロモーター）の存在を示すのに対して、約２．６ｋｂｐのバンドは、完全なＵＲＡ３プロモーター‐ＵＲＡ３ ＯＲＦ‐ＵＲＡ３ターミネータ‐ＵＲＡ３プロモーターカセットの存在を示し、そして所望の組み換え事象が起こらなかったことを示す。Phire（登録商標）Plant Direct PCR kit（Finnzymes）を用いたＰＣＲ反応を、先に記載したように実施した。上記のプライマーにより８６９ｂｐの断片をもたらしたＦＯＡ耐性コロニーを、（３．８ｋｂｐの産物をもたらす）プライマー０６１２７９４と０６１１８１７、及び（３．７ｋｂｐの産物をもたらす）プライマー６１１８１５と６１２７９５を用いてさらに試験して、配列番号１３９のＢ．リチェニフォルミスＡＤＣをコードする配列番号１３８のヌクレオチド配列の４つのコピーが元の状態のまま残っていることを確認した。ＭｅＪｉ４１３と呼んだ、親菌株ＭｅＪｉ４１２からの１つのＦＯＡ耐性コロニーは、３つのプライマーセットすべてで所望のＰＣＲ産物をもたらした。
【０４８２】
断片の組み込み
プラスミドｐＡＮＮ２８（前掲）を、ＡｓｃＩとＳａｃＩで消化し、そしてＴＢＥバッファー中でのアガロースゲル電気泳動によって精製した。約７．１ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってゲル精製キット（Qiagen）を使用して精製した。
【０４８３】
菌株ＭｅＪｉ４１３を、ｐＡＮＮ２８からの消化及び精製した断片で形質転換し、そして、製造業者の取扱説明書に従って、正しい遺伝子座ターゲッティング及び形質転換について、コロニーＰＣＲ（Failsafe, mix E, Epicenter）によって確認した。プライマーｏＡＮＮ１２とｏＪＬＪ４４は、約１ｋｂｐのバンドをもたらし；プライマーｏＡＮＮ１１とｏＡＮＮ１６は、約１．３ｋｂｐのバンドをもたらした。発現カセットの適切な組み込みが予想されるバンドをもたらした菌株を、ｙＡＮＮ３５と呼んだ。
【０４８４】
次に、ｙＡＮＮ３５のｕｒａ−誘導体を、先に記載したように単離した。いくつかのＦＯＡ耐性コロニーを、所望のループアウト事象について、プライマーｏＡＮＮ１２とｏＪＹ４４を用いたコロニーＰＣＲによってスクリーニングした。プライマーｏＡＮＮ１２は、下流隣接領域の外側にアニールする。プライマーｏＪＹ４４は、ＴＡＬターミネータにアニールする。１．５ｋｂｐのバンドの存在が、所望されるｕｒａ３瘢痕部位のみ（親菌株の２つのＵＲＡ３プロモーターの間の相同組み換え後に取り残された１つのＵＲＡ３プロモーター）の存在を示すのに対して、約２．８ｋｂｐのバンドは、完全なＵＲＡ３プロモーター‐ＵＲＡ３ ＯＲＦ‐ＵＲＡ３ターミネータ‐ＵＲＡ３プロモーターカセットの存在を示し、そして所望の組み換え事象が起こらなかったことを示す。FailsafeＤＮＡポリメラーゼ（Epicenter）を用いたＰＣＲ反応を、先に記載したように実施した。この事象に関して陽性の単離菌株を、プライマーｏＡＮＮ１６とｏＡＮＮ１１を用いたコロニーＰＣＲによってさらに確認した。１つのＦＯＡ耐性コロニーを、ｙＡＮＮ３７と呼んだ。
【０４８５】
菌株ｙＡＮＮ３７を、ｐＡＮＮ２８からの消化及び精製断片で形質転換し、そして正しい遺伝子座ターゲッティング及び形質転換について、製造業者の取扱説明書に従ってコロニーＰＣＲ（Failsafe, mix E, Epicenter）によって確認した。ＰＤＣ遺伝子に特異的なプライマーｏＨＪＪ１１６とｏＨＪＪ１１７を用いて予備的なスクリーンをした。約５００ｂｐのバンドは、遺伝子の存在を示し、それにより所望の組み込みについて陰性を示す。ＰＤＣの欠失について陽性である単離菌株を、追加のＰＣＲ反応物でさらに確認した。プライマーｏＡＮＮ１１とｏＡＮＮ１６は、約１．３ｋｂｐのバンドをもたらし；プライマーｏＡＮＮ１２とｏＪＬＪ４４は、約１ｋｂｐのバンドをもたらし；プライマーｏＡＮＮ１２とｏＪＹ４４は、約１．５ｋｂｐのバンドと約２．９ｋｂｐのバンドをもたらした（それぞれ第１及び第２の組み込み事象に対応する）。
【０４８６】
さらに、ａｄｈ１２０２遺伝子座における先の組み込み事象を、先に記載したように、コロニーＰＣＲによって確認した。プライマー０６１１６３１と０６１１２４５は、約３．８ｋｂｐのバンドをもたらした。プライマー０６１１２４５とｏＮｏｖｏ３は、約３ｋｂｐのバンドをもたらした。プライマー０６１１８１５と０６１２７９５は、約３．６ｋｂｐのバンドをもたらした。発現カセットの適切な組み込みが予想されるバンドをもたらした菌株を、ｙＡＮＮ４１と呼んだ。
【０４８７】
実施例３Ａ‐１８：ａｄｈ１２０２遺伝子座における４つのヌクレオチド配列からアスパラギン酸１‐デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）及びｐｄｃ遺伝子座においてピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＹＣ）を発現する酵母菌株
この実施例は、ａｄｈ１２０２遺伝子座における配列番号１３９のＢ．リチェニフォルミスＡＤＣをコードするヌクレオチドの４つのコピー（ＰＤＣプロモーター制御下の２つのコピーとＴＤＨ３プロモーター制御下の２つのコピーによる）及びｐｄｃ遺伝子座において配列番号２のＩ．オリエンタリスＰＹＣをコードするヌクレオチドを発現する酵母菌株の構築を説明する。
【０４８８】
ＭＩＢａ３５５からのｕｒａマーカーの除去
ＭＩＢａ３５５のｕｒａ−誘導体を、先に記載したように単離した。ＭＩＢａ３５５のいくつかのＦＯＡ耐性コロニーからのゲノムＤＮＡを、プライマー０６１１８１５と０６１１７１８を用いたＰＣＲによって、所望のループアウト事象についてスクリーニングした。約５００ｂｐのバンドの存在が、所望されるｕｒａ３瘢痕部位のみの（親菌株の２つのＵＲＡ３プロモーターの間の相同組み換え後に取り残された１つのＵＲＡ３プロモーター）の存在を示すのに対して、約１．９ｋｂｐのバンドは、完全なＵＲＡ３プロモーター‐ＵＲＡ３ ＯＲＦ‐ＵＲＡ３ターミネータ‐ＵＲＡ３プロモーターカセットの存在を示し、そして所望の組み換え事象が起こらなかったことを示す。ＰＣＲを、製造業者の取扱説明書に従ってPhire（登録商標）Plant Direct PCR kit（Finnzymes）を使用して実施した。上記のプライマーにより約５００ｂｐの断片をもたらしたＦＯＡ耐性コロニーを、（３．５ｋｂｐの産物をもたらす）プライマー０６１１６３１と０６１１２４５、及び（４．５ｋｂｐの産物をもたらす）プライマー０６１１８１５と０６１１６３２を用いてさらに試験し、配列番号１３９のＢ．リチェニフォルミスＡＤＣをコードする配列番号１３８のヌクレオチド配列の４つのコピーが元の状態のまま残っていることを確認した。それらをまた、ａｄｈ１２０２における第１の改変が存在していることを確認するために、プライマー０６１１８１５と０６１１８１７を使用したＰＣＲを用いて試験した。これらのＰＣＲプライマーは、８２８ｂｐの断片をもたらした。ＭＩＢａ３５７と呼ばれる、親菌株ＭＩＢａ３５５からの１つのＦＯＡ耐性コロニーは、４つのプライマーセットすべてで所望のＰＣＲ産物をもたらした。
【０４８９】
プラスミドｐＡＮＮ２８（前掲）を、ＡｓｃＩとＳａｃＩで消化し、そしてＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。約７．１ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０４９０】
ＭＩＢａ３５７を、消化ｐＡＮＮ２８ＤＮＡで形質転換し、そしてPhire Plant Direct PCR kit（Finnzymes）を使用したＰＣＲによって、正しい遺伝子座ターゲッティング及び形質転換について確認した。プライマー０６１１６２２と０６１１５５２は、約８５０ｂｐのバンドをもたらし；プライマー０６１１２４５と０６１２７９４は、約２．８ｋｂｐのバンドをもたらし；プライマー０６１１８１５と０６１２７９５は、約３．９ｋｂｐのバンドをもたらした。
発現カセットの適切な組み込みが予想されるバンドをもたらした菌株を、ＭｃＴｓ２４１と呼んだ。
【０４９１】
次に、ＭｃＴｓ２４１のｕｒａ−誘導体を、以前に記載したように単離した。ＭｃＴｓ２４１のいくつかのＦＯＡ耐性コロニーを、所望のループアウト事象について、プライマー０６１４２３３と０６１１５５４を用いたＰＣＲ、及びｕｒａマイナス選択プレート上での成長の欠如によってスクリーニングした。４．６ｋｂｐのバンドの存在が、所望されるｕｒａ３瘢痕部位のみ（親菌株の２つのＵＲＡ３プロモーターの間の相同組み換え後に取り残された１つのＵＲＡ３プロモーター）の存在を示すのに対して、約５．９ｋｂｐのバンドは、完全なＵＲＡ３プロモーター‐ＵＲＡ３ ＯＲＦ‐ＵＲＡ３ターミネータ‐ＵＲＡ３プロモーターカセットの存在を示し、そして所望の組み換え事象が起こらなかったことを示した。Phire Plant Direct PCR kit（Finnzymes）を使用するＰＣＲ反応を、先に記載したように実施した。所望のループアウト事象があった親菌株ＭｃＴｓ２４１からの１つのＦＯＡ耐性コロニーを、ＭｃＴｓ２４７と呼んだ。
【０４９２】
ホモ接合組み込み体を作製するために、ＭｃＴｓ２４７を、消化ｐＡＮＮ２８ＤＮＡで形質転換し、そして正しい遺伝子座ターゲッティング及び形質転換について、Phire Plant Direct PCR kit（Finnzymes）を使用したＰＣＲによって確認した。第１のスクリーンとして、形質転換体を、ｐｄｃ遺伝子座が完全である、よって、ＰＤＣ遺伝子座におけるＰＹＣのホモ接合組み込みが起こらなかった場合にだけ約８５０ｂｐのバンドをもたらすはずであるプライマー０６１１５５２と０６１１５５３を用いたＰＣＲによってスクリーニングした。このＰＣＲからのバンドが陰性であったものを、次に、プライマー０６１１５５５と０６１１５５４を用いた追加ＰＣＲによってスクリーニングした。これらのプライマーにより、産物は、ＰＤＣが完全であり、よって、ＰＤＣ遺伝子座におけるＰＹＣのホモ接合組み込みがない場合にだけ、１．４ｋｂｐのバンドを増幅するはずである。形質転換体の更なるスクリーニングを、（約８５０ｂｐのバンドをもたらす）プライマー０６１１６２２と０６１１５５２；（約２．８ｋｂｐのバンドをもたらした）プライマー０６１１２４５と０６１２７９４；（約３．９ｋｂｐのバンドをもたらした）プライマー０６１１８１５と０６１２７９５を使用したＰＣＲによっておこなった。発現カセットの正しい組み込みが予想されるバンドをもたらした菌株を、ＭｃＴｓ２５３と呼んだ。
【０４９３】
実施例３Ａ‐１９：菌株ＭｅＪｉ４１２、ｙＡＮＮ３５、ｙＡＮＮ４１、ＭＩＢａ３５５、ＭｃＴｓ２４１、及びＭｃＴｓ２５３のＰＹＣ活性、ＡＤＣ活性、及び３‐ＨＰ生産能力
菌株ＭｅＪｉ４１２、ｙＡＮＮ３５、ｙＡＮＮ４１、ＭＩＢａ３５５、ＭｃＴｓ２４１、及びＭｃＴｓ２５３を、振盪フラスコで培養し、ＣＦＥを調製し、そして本明細書中に記載したように、ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＹＣ）活性、アスパラギン酸１‐デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）活性についてアッセイした。結果を表２７に示す、菌株ＭｅＪｉ４１２、ｙＡＮＮ３５、ｙＡＮＮ４１、ＭＩＢａ３５５、ＭｃＴｓ２４１、及びＭｃＴｓ２５３はまた、本明細書中に記載した方法を使用して、３‐ＨＰ生産についてバイオリアクター内で試験した。これらのバイオリアクター実験からの結果もまた、表２７に示す。これらの発酵における細胞質量の違いを考慮するため、示した３‐ＨＰ生産能力は、（［ｇ／Ｌ ３‐ＨＰ］／［ｇ／Ｌ 乾燥細胞重量］と表現される）細胞質量単位あたりの３‐ＨＰ濃度として表現されている。結果は、細胞のＰＹＣ活性レベルに増強に従って３‐ＨＰ生産能力が増強したことを示している。
【０４９４】
【表３８】
2013542747.tif 000039
【０４９５】
実施例３Ａ‐２０：ａｄｈ１２０２遺伝子座における４つのヌクレオチド配列からβ‐アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＢＡＡＴ）を発現し、且つ、アスパラギン酸１‐デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）の欠失がある酵母菌株
この実施例は、ａｄｈ１２０２遺伝子座において配列番号１３９のＢ．リチェニフォルミスＡＤＣをコードするヌクレオチドの４つのコピーを発現し、且つ、配列番号２０のＢＡＡＴ（ＰＹＤ４）をコードする天然Ｉ．オリエンタリス遺伝子の欠失がある酵母菌株の構築と能力を説明する。
【０４９６】
Ｉ．オリエンタリスＢＡＡＴ（ＰＹＤ４）欠失プラスミドの構築
プラスミドｐＭＩＢａ１２３（前掲）は、本明細書中に記載したように、ＮｏｔＩ、ＫｐｎＩ、ＡｐａＩで消化し、そしてＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動法によって精製した。約３．６ｋｂｐと３．８ｋｂｐの２本のバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。これらの２つのピースが、プラスミド骨格及び配列番号１４４のＳ．セレビシエ３‐ＨＰＤＨ遺伝子（ＹＭＲ２２６ｃ）を持つｕｒａ選択カセットを含んでいた。
【０４９７】
上流Ｉ．オリエンタリスＰＹＤ４相同性のためのＰＣＲ産物を、プライマー０６１３１７８及び０６１３１８０を使用して、先に記載したように調製したＩ．オリエンタリスＭＢｉｎ５００ゲノムＤＮＡを使用したＰＣＲ増幅によって作製した。下流Ｉ．オリエンタリスＰＹＤ４相同ピースを、プライマー０６１３１７９と０６１３１８１を使用して、ＭＢｉｎ５００ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅によって調製した。それぞれの５０ｐｍｏｌのプライマーを、５０μＬの終量中に０．５μＬの鋳型としてのＭＢｉｎ５００ゲノムＤＮＡ、０．２ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、１× Expand High Fidelityバッファー（Roche）、３．５ＵのExpand High Fidelity Enzyme Mix（Roche）を含むＰＣＲ反応物において使用した。増幅反応物を、９５℃にて３分間を１サイクル；そしてそれぞれ９５℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、そして７２℃にて１分間を３０サイクルをプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）5333（Eppendorf）で実施した。サイクル後に、反応物を、７２℃にて５分間インキュベートし、次に、さらに処理するまで１０℃に冷やした。プライマー０６１３１７８と０６１３１８０を使用したＰＣＲからの約８００ｂｐのバンド、及びプライマー０６１３１７９と０６１３１８１を使用したＰＣＲからの約９００ｂｐのバンドを、ＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。バンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０４９８】
ＰＹＤ４上流ＰＣＲ産物、ＰＹＤ４下流ＰＣＲ産物、及びｐＭＩＢａ１２３のＮｏｔＩ／ＫｐｎＩ／ＡｐａＩ消化プラスミドを、製造業者の取扱説明書に従って、IN‐FUSION HD（商標）（Clontech Laboratories, Inc.）を用いた反応で構築した。In‐FUSION反応物から、２μＬを、製造業者の取扱説明書に従って、One Shot（登録商標）TOP10化学的コンピテントＥ．コリ細胞（Invitrogen）に形質転換した。回復期間後に、形質転換反応物からの１００μＬの２つのアリコートを、１ｍＬあたりの１００μｇのアンピシリンを補った１５０ｍＭの２× ＹＴプレート上で平板培養した。プレートを、３７℃にて一晩インキュベートした。推定上の組み換えクローンを選択プレートから選択した、そしてプラスミドＤＮＡを、それぞれからBIOROBOT（登録商標）9600（Qiagen）を使用して調製した。クローンを、制限消化及び配列決定によって分析した。正しい配列を有するプラスミドを、配列決定によって確認し、そしてｐＭｃＴｓ６１と命名した。
【０４９９】
プラスミドｐＭｃＴｓ６１は、ＰＤＣプロモーター、Ｓ．セレビシエからのＹＭＲ２２６ｃ遺伝子、及びＰＤＣターミネータをまだ含んでいる。これらが望ましくないセグメントを取り出すために、ｐＭｃＴｓ６１を、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化し、続いてクレノー断片を加えて、平滑末端を作製した。７．１ｋｂｐの断片を、ＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。バンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。消化した平滑プラスミドを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs、Ipswich, MA, USA）を使用して一つに連結した。反応混合物は、２０μＬの全容積中に１× Ｔ４ ＤＮＡリガーゼバッファー、１μＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼ、５μＬのｐＭｃＴｓ６１消化及び平滑化精製ＤＮＡを含んでいた。反応物を、室温にて２時間インキュベートした。連結反応物の１０μＬのサンプルを、製造業者の取扱説明書に従って、One Shot（登録商標）TOP10化学的コンピテントＥ．コリ細胞（Invitrogen）を形質転換するのに使用した。回復期間後に、形質転換反応物からの１００μＬの２つのアリコートを、１ｍＬあたりの１００μｇのアンピシリンを補った１５０ｍＭの２× ＹＴプレート上で平板培養した。プレートを、３７℃にて一晩インキュベートした。推定上の組み換えクローンを、選択プレートから選択した。クローンを、コロニーＰＣＲによって分析した。各コロニーからの鋳型ＤＮＡを、１つのコロニーを５０μＬの滅菌水中に溶解することによって調製し、９５℃にて１０分間加熱し、次に、使用まで氷上で冷やした。プライマー０６１２９１１と０６１２９０９を、形質転換体をスクリーニングするのに使用した。これらのプライマーを用いたＰＣＲ反応物は、プラスミドが正しければ、１ｋｂｐのバンドを増幅する。１０ｐｍｏｌのそれぞれのプライマーを、２０μＬの終量中に２μＬのコロニーＤＮＡ鋳型、０．１ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、１× Crimson Taq反応バッファー（New England Biolabs）、１ＵのCrimson Taq DNA Polymerase（New England Biolabs）を含むＰＣＲ反応物中で使用した。増幅反応を、９５℃にて３分間を１サイクル；そして、それぞれ９５℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、そして７２℃にて３分間を３０サイクルをプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）5333（Eppendorf）で実施した。サイクル後に、反応物を、７２℃にて５分間インキュベートし、次に、さらに処理するまで１０℃に冷やした。５μＬのＰＣＲ反応物から、１ｋｂｐのＰＣＲ断片を、ＴＡＥバッファー中のエチジウムブロマイドを用いて１％のＴＡＥ‐アガロースゲル上で可視化した。正しいサイズＰＣＲ産物を有する１つの形質転換体を、選択し、そしてｐＭｃＴｓ６４と命名した（図３０）。ｐＭｃＴｓ６４のプラスミドＤＮＡを、BIOROBOT（登録商標）9600（Qiagen）を使用して調製した。
【０５００】
ｐＭｃＴｓ６４構築物を使用したＭｅＪｉ４１３からの天然Ｉ．オリエンタリスＢＡＡＴ（ＰＹＤ４）の欠失
プラスミドｐＭｃＴｓ６４（前掲；図３０を参照のこと）を、ＡｐａＩ、ＮｃｏＩ、ＫｐｎＩで消化し、１％ＴＢＥバッファー中でのアガロースゲル電気泳動によって精製した。約３．３ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０５０１】
菌株ＭｅＪｉ４１３（前掲）を、消化ｐＭｃＴｓ６４ＤＮＡで形質転換し、そして正しい遺伝子座ターゲッティング及び形質転換を、Phire Plant Direct PCR kit（Finnzymes）を使用したＰＣＲによって確認した。プライマー０６１２９０８と０６１３２４２は、約１．７ｋｂｐのバンドをもたらし；プライマー０６１３２４１と０６１２９０９は、欠失カセットの組み込みを確認するために約１．５ｋｂｐのバンドをもたらす。プライマー０６１１８１５と０６１１６３２は、約４．２ｋｂｐのバンドをもたらし；プライマー０６１１８１７と０６１１６３１は、ＡＤＨ１２０２遺伝子座におけるＡＤＣカセットが完全なままであることを確認するために約４．８ｋｂｐのバンドをもたらす。欠失カセットとＡＤＣカセットの適切な組み込みが予想されるバンドをもたらした菌株を、ＭｃＴｓ２２５と呼んだ。
【０５０２】
次に、ＭｃＴｓ２２５のｕｒａ−誘導体を、以前に記載したように単離した。ＭｃＴｓ２２５のいくつかのＦＯＡ耐性コロニーを、プライマー０６１２９１１と０６１２９１０を用いたＰＣＲによって、所望のループアウト事象についてスクリーニングした。１．１ｋｂｐのバンドの存在が、所望される、ｕｒａ３瘢痕部位のみ（親菌株の２つのＵＲＡ３プロモーターの間の相同組み換え後に取り残された１つのＵＲＡ３プロモーター）の存在を示すのに対して、約２．５ｋｂｐのバンドは、完全なＵＲＡ３プロモーター‐ＵＲＡ３ ＯＲＦ‐ＵＲＡ３ターミネータ‐ＵＲＡ３プロモーターカセットの存在を示し、そして所望の組み換え事象が起こらなかったことを示した。プライマー０６１１８１５と０６１１６３２は、約４．２ｋｂｐのバンドをもたらし；プライマー０６１１８１７と０６１１６３１は、ａｄｈ１２０２遺伝子座にＡＤＣカセットが完全なままであることを確認するために約４．８ｋｂｐのバンドをもたらす。Phire Plant Direct PCR kit（Finnzymes）を使用したＰＣＲ反応を、先に記載したように実施した。所望のループアウト事象があった親菌株ＭｃＴｓ２２５からの１つのＦＯＡ耐性コロニーを、ＭｃＴｓ２２８と呼んだ。
【０５０３】
配列番号２０のＩ．オリエンタリスＢＡＡＴ（ＰＹＤ４）をコードする天然遺伝子のホモ接合欠失を作製するために、ＭｃＴｓ２２８を、消化ｐＭｃＴｓ６４で形質転換し、そして正しい遺伝子座ターゲッティング及び形質転換について、Phire Plant Direct PCR kit（Finnzymes）を使用するＰＣＲによって確認した。２つのプライマーセットを、ＰＹＤ４遺伝子座の欠失についてのＰＣＲによるスクリーニングに使用した。プライマー０６１３５５０と０６１２９１０は、ＰＹＤ４のホモ接合欠失が起こらなかったのを示す、ＰＹＤ４遺伝子座が完全である場合にだけ、約７００ｂｐのバンドをもたらす。さらに、形質転換体を、ＰＹＤ４が欠失されていなければ、約６００ｂｐのバンドをもたらすプライマー０６１２９１１と０６１３５５１を用いてスクリーニングした。Ｉ．オリエンタリスＰＹＤ４遺伝子座に関して陰性であった形質転換体を、約３．５ｋｂｐと２．１ｋｂｐのバンドをもたらすプライマー０６１３２４２と０６１３２４３；約１．７ｋｂｐのバンドをもたらしたプライマー０６１２９０８と０６１３２４３；約９５０ｂｐのバンドをもたらしたプライマー０６１２９０９と０６１２９１１でスクリーニングした。約４．８ｋｂｐをもたらすプライマー０６１１８１７と０６１１６３１、及び約４．２ｋｂｐのバンドをもたらすプライマー６１１８１５と６１２７１２を用いて、ａｄｈ１２０２遺伝子座のＡＤＣカセットが、まだ完全なままであることを確認した。発現カセットの適切な組み込みが予想されるバンドをもたらした菌株を、ＭｃＴｓ２３６と呼んだ。
【０５０４】
次に、ＭｃＴｓ２３６のｕｒａ−誘導体を、以前に記載したように単離した。ＭｃＴｓ２３６のいくつかのＦＯＡ耐性コロニーを、所望のループアウト事象について、約２．１ｋｂｐのバンドをもたらすプライマー０６１３２４２及び０６１３２４３を用いたＰＣＲによってスクリーニングした。ＡＤＨ１２０２遺伝子座のＡＤＣカセットを、約３ｋｂｐをもたらすプライマー０６１１２４５と０６１２７９４、並びに約３．６ｋｂｐのバンドをもたらすプライマー０６１１８１５と０６１２７９５を用いて、ＡＤＨ１２０２遺伝子座のＡＤＣカセットが完全なままであることを確認した。発現カセットの適切な組み込みが予想されるバンドをもたらした菌株を、ＭｃＴｓ２４５と呼んだ。
【０５０５】
菌株ＭＩＢａ３７２及びＭｃＴｓ２４５を、本明細書中に記載した方法を使用して、３‐ＨＰ生産についてバイオリアクター内で試験した。これらの発酵における細胞質量の違いを考慮するため、３‐ＨＰ生産能力を、単位細胞質量あたりの３‐ＨＰ濃度として表現する（［ｇ／Ｌ ３‐ＨＰ］／［ｇ／Ｌ 乾燥細胞重量］と表現する）。菌株ＭＩＢａ３７２及びＭｃＴｓ２４５のｇ／Ｌ ３‐ＨＰ／ｇ／Ｌ 乾燥細胞重量は、それぞれ１．６６及び０．１６である。これらの結果は、Ｉ．オリエンタリスの天然ＰＹＤ４遺伝子がβ‐アラニンからマロン酸セミアルデヒドへの転換に関与することを示唆している、なぜならば、この遺伝子の欠失が３‐ＨＰ生産能力の１０分の１への減少につながるからである。
【０５０６】
実施例３Ａ‐２１：ａｄｈ１２０２遺伝子座における４つのヌクレオチド配列からのアスパラギン酸１‐デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）の発現、且つ、３‐ＨＰデヒドロゲナーゼ（３‐ＨＰＤＨ）を欠失した酵母菌株
この実施例は、ａｄｈ１２０２遺伝子座において配列番号１３９のＢ．リチェニフォルミスＡＤＣをコードするヌクレオチドの４つのコピーを発現し、且つ、配列番号２６の３‐ＨＰＤＨ（ＰＹＤ４）をコードする天然Ｉ．オリエンタリス遺伝子を欠失した酵母菌株の構築と能力を説明する。
【０５０７】
Ｉ．オリエンタリス３‐ＨＰＤＨ欠失プラスミドの構築
プラスミドｐＭＩＢａ１２３（前掲）は、本明細書中に記載したように、ＮｏｔＩ、ＫｐｎＩ、ＡｐａＩで消化し、そしてＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動法によって精製した。約３．６ｋｂｐと３．８ｋｂｐの２本のバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。これらの２つのピースが、プラスミド骨格及び配列番号１４４のＳ．セレビシエ３‐ＨＰＤＨ遺伝子を持つｕｒａ選択カセットを含んでいた。
【０５０８】
上流Ｉ．オリエンタリス３‐ＨＰＤＨ相同性のためのＰＣＲ産物を、プライマー０６１３１８３及び０６１３１８４を使用して、先に記載したように調製したＩ．オリエンタリスＭＢｉｎ５００ゲノムＤＮＡから増幅した。下流Ｉ．オリエンタリス３‐ＨＰＤＨ相同ピースを、プライマー０６１３１８５と０６１３１８６を使用して、Ｉ．オリエンタリスＭＢｉｎ５００ゲノムＤＮＡから増幅した。それぞれの５０ｐｍｏｌのプライマーを、５０μＬの終量中に０．５μＬの鋳型としてのＭＢｉｎ５００ゲノムＤＮＡ、０．２ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、２％のＤＭＳＯ、１× Phusion HFバッファー（Finnzymes）、２ＵのPhusion（登録商標）Hot Start High Fidelity DNA Polymerase（Finnzymes）を含むＰＣＲ反応物において使用した。増幅反応物を、９５℃にて３分間を１サイクル；そしてそれぞれ９５℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、そして７２℃にて１分間を３０サイクルをプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）5333（Eppendorf Scientific, Inc.、Westbury, NY, USA）で実施した。サイクル後に、反応物を、７２℃にて５分間インキュベートし、次に、さらに処理するまで４℃に冷やした。プライマー０６１３１８３と０６１３１８４のＰＣＲからの約６４０ｂｐのバンド、及びプライマー０６１３１８５と０６１３１８６を使用したＰＣＲからの約６７０ｂｐのバンドを、ＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。バンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０５０９】
Ｉ．オリエンタリス３‐ＨＰＤＨ上流ＰＣＲ産物、Ｉ．オリエンタリス３‐ＨＰＤＨ下流ＰＣＲ産物、及びｐＭＩＢａ１２３のＮｏｔＩ／ＫｐｎＩ／ＡｐａＩ消化プラスミドを、製造業者の取扱説明書に従って、IN‐FUSION HD（商標）（Clontech Laboratories, Inc.）を用いた反応で構築した。In‐FUSION反応物から、２μＬを、製造業者の取扱説明書に従って、One Shot（登録商標）TOP10化学的コンピテントＥ．コリ細胞（Invitrogen）に形質転換した。回復期間後に、形質転換反応物からの１００μＬの２つのアリコートを、１ｍＬあたりの１００μｇのアンピシリンを補った１５０ｍＭの２× ＹＴプレート上で平板培養した。プレートを、３７℃にて一晩インキュベートした。推定上の組み換えクローンを選択プレートから選択した、そしてプラスミドＤＮＡを、それぞれからBIOROBOT（登録商標）9600（Qiagen）を使用して調製した。クローンを、制限消化及び配列決定によって分析した。正しい配列を有するプラスミドを、配列決定によって確認し、そしてｐＭｃＴｓ６０と命名した。
【０５１０】
プラスミドｐＭｃＴｓ６０はまだＰＤＣプロモーター、Ｓ．セレビシエからのＹＭＲ２２６ｃ遺伝子、及びＰＤＣターミネータを含んでいる。これらの望ましくないセグメントを取り出すために、ｐＭｃＴｓ６０をＮｏｔＩ及びＸｂａＩで消化し、そして３‐ＨＰＤＨホモロジー領域及びプラスミド骨格を含んでいる約５ｋｂｐのバンドを、ＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。バンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。ｕｒａ３選択カセットを、１回がプライマー０６１３４１６と０６１３４１７を用い、もう１回がプライマー０６１３４１８と０６１３４１９を用いる、２回のＰＣＲ反応で増幅した。５０ｐｍｏｌの各プライマーを、５０μＬの終量中に０．５μＬの鋳型としてｐＭｃＴｓ６０プラスミドＤＮＡ、０．２ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、１× Expand High Fidelityバッファー（Roche）、３．５ＵのExpand High Fidelity Enzyme Mix（Roche）を含むＰＣＲ反応物に使用した。増幅反応を、９５℃にて３分間を１サイクル；それぞれ９５℃にて３０秒間５５℃にて３０秒間、そして７２℃にて１分間を３０サイクルをプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）5333（Eppendorf Scientific, Inc.）で実施した。サイクル後に、反応物を、７２℃にて５分間インキュベートし、次に、さらに処理するまで４℃に冷やした。プライマー０６１３４１６と０６１３４１７のＰＣＲからの約７００ｂｐのバンド及びプライマー０６１３４１８と０６１３４１９からのＰＣＲの約１ｋｂｐのバンドを、ＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。バンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。Ｉ．オリエンタリス３‐ＨＰＤＨホモロジー領域とｕｒａ３カセットＰＣＲ産物を含むプラスミド骨格を、製造業者の取扱説明書に従って、IN‐FUSION HD（商標）（Clontech Laboratories, Inc.）を用いた反応で構築した。In‐FUSIONからの反応物２μＬを、製造業者の取扱説明書に従って、Solo Pack Gold Super Competent Cells（Stratagene）に形質転換した。回復期間後に、形質転換反応物からの１００μＬの２つのアリコートを、１ｍＬあたりの１００μｇのアンピシリンを補った１５０ｍＭの２× ＹＴプレート上で平板培養した。プレートを、３７℃にて一晩インキュベートした。推定上の組み換えクローンを、選択プレートから選択し、そしてプラスミドＤＮＡを、それぞれからBIOROBOT（登録商標）9600（Qiagen）を使用して調製した。クローンを、制限消化によって分析し、そして正しい制限消化パターンを有するプラスミドを、ｐＭｃＴｓ６５と命名した（図３１）。
【０５１１】
ｐＭｃＴｓ６５構築物を使用したＭｅＪｉ４１３からの天然Ｉ．オリエンタリス３‐ＨＰＤＨの欠失
プラスミドｐＭｃＴｓ６５（前掲；図３１を参照のこと）を、ＡｐａＩ、ＳｐｈＩ、ＫｐｎＩで消化し、１％ＴＢＥバッファー中でのアガロースゲル電気泳動によって精製した。約２．９ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０５１２】
菌株ＭｅＪｉ４１３（前掲）を、消化ｐＭｃＴｓ６５ＤＮＡで形質転換し、そして正しい遺伝子座ターゲッティング及び形質転換を、Phire Plant Direct PCR kit（Finnzymes）を使用したＰＣＲによって確認した。プライマー０６１３０３４と０６１３０３５は、欠失カセットの組み込みを確認するために約２．７ｋｂｐのバンドをもたらす。プライマー０６１１８１５と０６１１６３２は、約４．２ｋｂｐのバンドをもたらし；プライマー０６１１８１７と０６１１６３１は、ａｄｈ１２０２遺伝子座におけるＡＤＣカセットが完全なままであることを確認するために約４．８ｋｂｐのバンドをもたらす。欠失カセットとＡＤＣカセットの適切な組み込みが予想されるバンドをもたらした菌株を、ＭｃＴｓ２２９と呼んだ。
【０５１３】
次に、ＭｃＴｓ２２９のｕｒａ−誘導体を、以前に記載したように単離した。ＭｃＴｓ２２９のいくつかのＦＯＡ耐性コロニーを、プライマー０６１３０３４と０６１３２４１を用いたＰＣＲによって、所望のループアウト事象についてスクリーニングした。１．４ｋｂｐのバンドの存在が、所望される、ｕｒａ３瘢痕部位のみ（親菌株の２つのＵＲＡ３プロモーターの間の相同組み換え後に取り残された１つのＵＲＡ３プロモーター）の存在を示すのに対して、約２．８ｋｂｐのバンドは、完全なＵＲＡ３プロモーター‐ＵＲＡ３ ＯＲＦ‐ＵＲＡ３ターミネータ‐ＵＲＡ３プロモーターカセットの存在を示し、そして所望の組み換え事象が起こらなかったことを示した。１．９ｋｂｐのバンドの存在は、これらは欠失のための異型接合部であるので、これらの形質転換体に存在している野生型遺伝子座を示す。プライマー０６１１６３１と０６１２３６６は、約４．５ｋｂｐのバンドをもたらし；プライマー０６１１８１７と０６１１６３１は、ａｄｈ１２０２遺伝子座にＡＤＣカセットが完全なままであることを確認するために約４．８ｋｂｐのバンドをもたらす。Phire Plant Direct PCR kit（Finnzymes）を使用したＰＣＲ反応を、先に記載したように実施した。所望のループアウト事象があった親菌株ＭｃＴｓ２２５からの１つのＦＯＡ耐性コロニーを、ＭｃＴｓ２３８と呼んだ。
【０５１４】
配列番号２６のＩ．オリエンタリス３‐ＨＰＤＨをコードする天然遺伝子のホモ接合欠失を作製するために、ＭｃＴｓ２３８を、消化ｐＭｃＴｓ６５で形質転換し、そして正しい遺伝子座ターゲッティング及び形質転換について、Phire Plant Direct PCR kit（Finnzymes）を使用するＰＣＲによって確認した。２つのプライマーセットを、ＹＭＲ２２６ｃ遺伝子座の欠失についてのＰＣＲによるスクリーニングに使用した。プライマー０６１３０３４と０６１３７４７は、３‐ＨＰＤＨのホモ接合欠失が起こらなかったのを示す、３‐ＨＰＤＨ遺伝子座が完全である場合にだけ、約５００ｂｐのバンドをもたらす。さらに、形質転換体を、３‐ＨＰＤＨが欠失されていなければ、約６６０ｂｐのバンドをもたらすプライマー０６１３７４６と０６１３２４１を用いてスクリーニングした。Ｉ．オリエンタリス３‐ＨＰＤＨ遺伝子座に関して野生型陰性であった形質転換体を、約２．８ｋｂｐと１．４ｋｂｐのバンドをもたらすプライマー０６１３０３４と０６１３２４１；約１．５ｋｂｐのバンドをもたらしたプライマー０６１２９０８と０６１３２４１；約１ｋｂｐのバンドをもたらしたプライマー０６１３０３４と０６１２９０９でスクリーニングした。約３ｋｂｐをもたらすプライマー０６１１２４５と０６１２７９４、及び約３．６ｋｂｐのバンドをもたらすプライマー６１１８１５と６１２７９５を用いて、ａｄｈ１２０２遺伝子座のＡＤＣカセットが、まだ完全なままであることを確認した。発現カセットの適切な組み込みが予想されるバンドをもたらした菌株を、ＭｃＴｓ２４４と呼んだ。
【０５１５】
次に、ＭｃＴｓ２４４のｕｒａ−誘導体を、以前に記載したように単離した。ＭｃＴｓ２４４のいくつかのＦＯＡ耐性コロニーを、所望のループアウト事象について、約１．４ｋｂｐのバンドをもたらすプライマー０６１３０３４と０６１３２４１を用いたＰＣＲによってスクリーニングした。約３ｋｂｐのバンドをもたらすプライマー０６１１２４５と０６１２７９４、及び約３．６ｋｂｐのバンドをもたらすプライマー０６１１８１５と０６１２７９５を用いて、ＡＤＨ１２０２遺伝子座のＡＤＣカセットがまだ完全なままであることを確認した。所望のループアウト事象があった親菌株ＭｃＴｓ２４４からの１つのＦＯＡ耐性コロニーを、ＭｃＴｓ２５９と呼んだ。
【０５１６】
菌株ＭＩＢａ３７２とＭｃＴｓ２４４を、本明細書中に記載した方法を使用して、３‐ＨＰ生産についてバイオリアクター内で試験した。これらの発酵における細胞質量の違いを考慮するため、３‐ＨＰ生産能力を、細胞質量単位あたりの３‐ＨＰ濃度として表現する（ｇ／Ｌ ３‐ＨＰ／ｇ／Ｌ 乾燥細胞重量と表現する）。
菌株ＭＩＢａ３７２とＭｃＴｓ２５９のｇ／Ｌ ３‐ＨＰ／ｇ／Ｌ 乾燥細胞重量は、それぞれ１．６６と＜０．１であった。これらの結果は、Ｉ．オリエンタリス内の天然３‐ＨＰＤＨ遺伝子がマロン酸セミアルデヒドから３‐ＨＰへの転換に関与することを示す、なぜならば、この遺伝子の欠失が３‐ＨＰ生産を止めるからである。
【０５１７】
実施例３Ａ‐２２：ｐｄｃ遺伝子座においてピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＹＣ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＡＴ）、β‐アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＢＡＡＴ）、及び３‐ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ（３‐ＨＰＤＨ）、並びにａｄｈ１２０２遺伝子座における４つのヌクレオチド配列からアスパラギン酸１‐デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）を発現する酵母菌株
追加構築物を、ａｄｈ１２０２遺伝子座に配列番号１３９のＢ．リチェニフォルミスＡＤＣをコードする４つのコピーのヌクレオチドも含む菌株のＩ．オリエンタリスｐｄｃ遺伝子座に、配列番号２のＩ．オリエンタリスＰＹＣをコードするヌクレオチド配列配列番号１、配列番号１４のＩ．オリエンタリスＡＡＴをコードするヌクレオチド配列配列番号１３、配列番号２１のＳ．クルイベリＢＡＡＴをコードするヌクレオチド配列配列番号１４２、及び配列番号１２９のＳ．セレビシエ３‐ＨＰＤＨをコードするヌクレオチド配列配列番号１４４を組み込むように設計した。先に記載したものへの同様のアプローチでは、左側構築物と右側構築物を、Ｉ．オリエンタリスＣＮＢ１ｐｄｃ遺伝子座における相同組み換えを可能にするように設計した。これらの構築物を調製し、そして以下に記載したようにＭＩＢａ３５７内に形質転換した。
【０５１８】
左側断片の構築
配列番号１４のＩ．オリエンタリスＡＡＴをコードするヌクレオチド配列配列番号１３を、製造業者の取扱説明書に従って鋳型としてプラスミドｐＧＭＥｒ１２６（図１６）を使用したＰＣＲによって増幅した（Ｐｆｕポリメラーゼ、Stratagene）。プライマーのｏＡＮＮ１とｏＡＮＮ２は、遺伝子コード配列に隣接する独特な制限部位の取り込みを可能にした。ＰＣＲ産物を、本明細書中に記載したように、ＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。約１．３ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってゲル抽出キット（Qiagen）を使用して精製した。精製したＰＣＲ産物を、ＡｐａＩ及びＮｒｕＩで消化し、そして本明細書中に記載したようにゲル精製した。
【０５１９】
プラスミドｐＧＭＥｒ１３５（ＥＮＯ１プロモーター／ＲＫＩターミネータ挿入物が反対方向であることを除いて、上記のｐＧＭＥｒ１３６と同一である）を、本明細書中に記載したように、ＡｐａＩとＮｒｕＩで消化し、そしてＴＢＥバッファー中でのアガロースゲル電気泳動によって精製した。約１１．７ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってゲル抽出キット（Qiagen）を使用して精製した。
【０５２０】
精製した１．３ｋｂｐのＰＣＲ産物を、４９．８ｎｇのベクター、３５４ｎｇの１．３ｋｂｐの挿入物、１μＬの１０ｍＭ ＡＴＰ（New England Biolabs）含有１０×連結反応バッファー、及び１μＬのＴ４リガーゼ（New England Biolabs）から構成された１０μＬの総反応物容量中でＴ４リガーゼ（New England Biolabs）を使用して１１．７ｋｂｐのｐＧＭＥｒ１３５線状ベクター内に連結した。反応物を、室温にて３０分間インキュベートし、そして製造業者の取扱説明書に従って、反応物の２μＬのアリコートを、電気的コンピテントＥ．コリDH10B細胞（Invitrogen）内に形質転換した。形質転換体を、ＬＢ＋カナマイシンプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、適切な挿入について、プライマーｏＨＪ２とｏＡＮＮ１（約２．３ｋｂｐのバンドをもたらす）及びプライマーｏＡＮＮ５とｏＡＮＮ６（約８７７ｂｐのバンドをもたらす）を用いたコロニーＰＣＲによってスクリーニングした。ＰＣＲによって増幅したａａｔ断片の配列もまた確認した。正しい挿入及び配列をもたらすクローンを、本明細書中に記載したように、ＡｐａＩとＮｒｕＩで消化し、そしてゲルが精製した。約１．３ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってゲル抽出キット（Qiagen）を使用して精製した。
【０５２１】
配列番号２のＩ．オリエンタリスＰＹＣをコードする所望のヌクレオチド配列配列番号１を含むプラスミドｐＧＭＥｒ１３７（前掲；図１８を参照のこと）を、本明細書中に記載したように、ＡｐａＩとＮｒｕＩで消化し、ＴＢＥバッファー中でのアガロースゲル電気泳動によって精製した。約１１．７ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってゲル抽出キット（Qiagen）を使用して精製した。
【０５２２】
精製した１．３ｋｂｐのＰＣＲ産物を、４９．４ｎｇのベクター、５４ｎｇの１．３ｋｂｐの挿入物、１μＬの１０ｍＭ ＡＴＰ（New England Biolabs）含有１０×連結反応バッファー、及び１μＬのＴ４リガーゼ（New England Biolabs）から構成された１０μＬの総反応物容量中でＴ４リガーゼ（New England Biolabs）を使用して１１．７ｋｂｐのｐＧＭＥｒ１３７線状ベクター内に連結した。反応物を、室温にて３０分間インキュベートし、そして製造業者の取扱説明書に従って、反応物の２μＬのアリコートを電気的コンピテントＥ．コリDH10B細胞（Invitrogen）内に形質転換した。形質転換体を、ＬＢ＋カナマイシンプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、適切な挿入について、プライマーｏＨＪ２とｏＡＮＮ１（約２．３ｋｂｐのバンドをもたらす）、プライマーｏＡＮＮ５とｏＡＮＮ６（約８７７ｂｐのバンドをもたらす）を用いたコロニーＰＣＲによってスクリーニングした。正しい挿入と配列をもたらしたクローンを、ｐＡＮＮ０２と呼んだ。
【０５２３】
反対向きにＡＡＴコード配列を含む左側断片の構築
プラスミドｐＡＮＮ０２を、本明細書中に記載したように、ＰｍｅＩで消化し、そしてＴＢＥバッファーでアガロースゲル電気泳動によって精製した。約１０．３ｋｂｐのバンド及び約２．７ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってゲル抽出キット（Qiagen）を使用して精製した。ｐＡＮＮ２からの１０．３ｋｂｐのベクター断片を、ＣＩＰ（New England Biolabs）で脱リン酸化し、そして製造業者の取扱説明書に従って、精製キット（Qiagen）で精製した。ｐＡＮＮ０２からの２．７ｋｂｐの断片を、ｐＡＮＮ０２からの脱リン酸化した１０．３ｋｂｐの線状ベクターを、３６ｎｇのベクター、２８ｎｇの挿入物、１μＬの１０ｍＭ ＡＴＰ（New England Biolabs）含有１０×連結反応バッファー、及び１μＬのＴ４リガーゼ（New England Biolabs）から構成された１０μＬの総反応物容量中でＴ４リガーゼ（New England Biolabs）を使用して連結した。反応物を、間室温にて３０分インキュベートした、そして製造業者の取扱説明書に従って、反応物の２μＬのアリコートを電気的コンピテントＥ．コリTOP10細胞（Invitrogen）内に形質転換した。形質転換体を、ＬＢ＋カナマイシンプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、適切な挿入について、プライマーｏＪＹ４４とｏＨＪ１（約１．３ｋｂｐのバンドをもたらす）を用いたコロニーＰＣＲによってスクリーニングした。正しい挿入をもたらしたクローンを、ｐＡＮＮ５と呼んだ。
【０５２４】
右側断片の構築
２つのＢ．リチェニフォルミスＡＤＣコード領域、及びＩ．オリエンタリスＰＤＣ遺伝子座３’ターゲッティングフランキングＤＮＡを含む右側構築物を、以下の通り構築した。ｐＭｈＣｔ０７１プラスミド（Ｓ．セレビシエ３‐ＨＰＤＨ ＯＲＦがＩ．オリエンタリスに最適化したコドンでないことを除いて、先のｐＭｈＣｔ０７７と同一のプラスミド）を、ＰｍｅＩとＰａｃＩで消化し、１０単位の仔ウシ腸ホスファターゼ（New England Biolabs）で処理し、ＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって精製して、そして約４．７ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kitを使用して精製した。
【０５２５】
プラスミドｐＭｅＪｉ３１２‐２（前掲；図１５を参照のこと）を、２個のＢ．リチェニフォルミスＡＤＣ発現カセットを抽出するために、ＰｍｅＩとＰａｃＩで消化し、ＴＡＥバッファー中での０．９％アガロースゲル電気泳動によって精製した。約２．８ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kitを使用して精製した。
【０５２６】
次に、ｐＭｅＪｉ３１２‐２からの二つのＢ．リチェニフォルミスＡＤＣコード領域を含む断片を、１× Quick Ligation反応バッファー（New England Biolabs）、１μＬの４．７ｋｂｐのｐＭｈＣｔ０７１ベクター断片、３μＬのｐＭｅＪｉ３１２‐２からの２．８ｋｂｐの挿入物、及び１μＬのQuick T4 DNA Ligase（New England Biolabs）を含んでいる連結反応物（２０μＬ）中で線状ｐＭｈＣｔ０７１ベクター断片内に連結した。連結反応物を、室温にて５分間インキュベートし、次に、チューブを氷上に置いた。この反応物５μＬを、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPack Gold SuperCompetent Cells（Agilent Technologies）を形質転換するのに使用した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＡｐａＬＩ消化によって所望の断片の適切な連結についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、保存し、そしてｐＭｈＣｔ１１０と呼んだ。
【０５２７】
プラスミドｐＭｈＣｔ１１０を、本明細書中に記載したように、ＸｂａＩとＰａｃＩで消化し、続いてＣＩＰで処理し、そしてＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。約７．１ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。
【０５２８】
配列番号１４４のコドン最適化Ｓ．セレビシエ３‐ＨＰＤＨコード配列を、ｐＭＩＢａ１２３（前掲）からＸｂａＩとＰａｃＩでの消化によって切り出し、そして本明細書中に記載したように、ＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。約８１４ｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。８１４ｂｐの精製断片を、１μＬの消化ｐＭｈＣｔ１１０、１〜７μＬのｐＭＩＢａ１２３からの８１４ｂｐの断片、１μＬの１０ｍＭ ＡＴＰ（New England Biolabs）含有１０×連結反応バッファー、及び１μＬのＴ４リガーゼ（New England Biolabs）から構成された１０μＬの総反応物容量中でＴ４リガーゼ（New England Biolabs）を使用してｐＭｈＣｔ１１０からの７．１ｋｂｐの断片内に連結した。反応物を、室温にて３０分間インキュベートし、そして反応物の４μＬのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従って、One Shot（登録商標）TOP10化学的コンピテントＥ．コリ細胞（Invitrogen）内に形質転換した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして室温にて週末の間インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、適切な挿入について、酵素ＸｂａＩとＰａｃＩ及びＡｓｃＩとＰａｃＩの２つの組み合わせを使用した制限消化によってスクリーニングした。各消化産物からの正しい消化バンドサイズをもたらしたクローンを、ｐＭＩＢａ１４２と呼んだ。
【０５２９】
プラスミドｐＭＩＢａ１４２を、ＡｓｃＩで消化し、続いてクレノーを用いた補充反応に供し、そしてその後、ＮｈｅＩで消化し、そしてＣＩＰで処理した。消化産物を、本明細書中に記載したように、ＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。約７．５ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。
【０５３０】
配列番号２１のＳ．クルイベリＢＡＡＴをコードするヌクレオチド配列配列番号１４２を、ＰａｃＩで消化し、続いてクレノーを用いた補充反応に供し、そしてその後、ＸｂａＩで消化して、ｐＭＩＢａ１２４（前掲）から切り出した。消化産物を、本明細書中に記載したように、ＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。約１．４ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。
【０５３１】
ｐＭＩＢａ１２４からの１．４ｋｂｐの精製断片を、１μＬの消化ｐＭＩＢａ１４２、７μＬのｐＭＩＢａ１２４からの１．４断片、１μＬの１０ｍＭ ＡＴＰ（New England Biolabs）含有１０×連結反応バッファー、及び１μＬのＴ４リガーゼ（New England Biolabs）から構成された１０μＬの総反応物容量中でＴ４リガーゼ（New England Biolabs）を使用してｐＭＩＢａ１４２からの７．５ｋｂｐの断片に連結した。反応物を、１６℃にて２．５時間インキュベートし、そして、連結反応物の全部を、製造業者の取扱説明書に従って、Ｓｕｒｅ細胞（Agilent）内に形質転換した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩であるとインキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、適切な挿入についてＳｔｕＩとＰｍｅＩでの制限消化によってスクリーニングした。正しい消化バンドサイズをもたらしたクローンを、ｐＭＩＢａ１４４と呼んだ。
【０５３２】
ＭＩＢａ３５７内への左側断片及び右側断片の組み込み
本明細書中に記載したように、プラスミドｐＡＮＮ５を、ＮｏｔＩとＮｈｅＩで消化し、そしてプラスミドｐＭＩＢａ１４４を、ＮｏｔＩで消化した。これらを、ＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製し、ｐＡＮＮ５からの８．２ｋｂｐの断片とｐＭＩＢａ１４４からの６ｋｂｐの断片を、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０５３３】
ＭＩＢａ３５７を、消化ｐＡＮＮ５及びｐＭＩＢａ１４４ＤＮＡで形質転換し、そして正しい遺伝子座ターゲッティング及び形質転換について、製造業者の取扱説明書に従ってPhire（登録商標）Plant Direct PCR kit（Finnzymes）を使用したＰＣＲによって確認した。プライマー０６１１５５２と０６１３６９５は、約４．１ｋｂｐのバンドをもたらし（ｐｄｃ遺伝子座における左側半分の組み込みを確認する）；プライマー０６１２３５８と０６１１５５４は、約２．５ｋｂｐのバンドをもたらし（ｐｄｃ遺伝子座における右側半分の組み込みを確認する）；０６１１２４５と０６１１６３１は、約３．５ｋｂｐのバンドをもたらし（左側半分の４× ＡＤＣ組み込みがａｄｈ１２０２遺伝子座に残ったことを確認する）；そして、プライマー０６１１８１５と０６１１６３２は、約４．６ｋｂｐのバンドをもたらした（右側半分の４× ＡＤＣ組み込みがａｄｈ１２０２遺伝子座に残ったことを確認する）。ｐｄｃ遺伝子座における発現カセットの適切な組み込みが予想されるバンドをもたらし、且つ、ａｄｈ１２０２遺伝子座に発現カセットを保有する１個の単離菌株を、保存し、そしてＭＩＢａ３６０と呼んだ。
【０５３４】
ＭＩＢａ３６０からのｕｒａマーカーの除去
ＭＩＢａ３６０のｕｒａ−誘導体を、先に記載したように単離した。ＭＩＢａ３６０のいくつかのＦＯＡ耐性コロニーからのゲノムＤＮＡを、所望のループアウト事象について、プライマー０６１１８１５と０６１３６８９を用いたＰＣＲによってスクリーニングした。約１．９ｋｂｐのバンドの存在が、所望される、ｕｒａ３瘢痕部位（親菌株の２つのＵＲＡ３プロモーターの間の相同組み換え後に取り残された１つのＵＲＡ３プロモーター）によるｕｒａマーカーの除去を示すのに対して、約３．３ｋｂｐのバンドは、完全なＵＲＡ３プロモーター‐ＵＲＡ３ ＯＲＦ‐ＵＲＡ３ターミネータ‐ＵＲＡ３プロモーターカセットの存在を示し、そして所望の組み換え事象が起こらなかったことを示した。ＰＣＲを、製造業者の取扱説明書に従ってPhire（登録商標）Plant Direct PCR kit（Finnzymes）を使用して実施した。上記のプライマーにより約１．９ｋｂｐの断片をもたらした２つのＦＯＡ耐性コロニーを、保存し、そしてＭＩＢａ３６３及びＭＩＢａ３６４と呼んだ。
【０５３５】
逆発現カセットの右側断片の構築
プラスミドｐＭＩＢａ１４４は、順方向に進む所望のＡＤＣ及び３‐ＨＰＤＨ発現カセットを含んでいる。ホモ接合菌株のスクリーニングを簡単にするために、ｐＭＩＢａ１４４のＡＤＣ発現カセットが逆の方向に置かれた新しいプラスミドを構築した。プラスミドｐＭＩＢａ１４４（前掲）を、本明細書中に記載したように、ＳｔｕＩとＰｍｅＩで消化し、そしてＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。約６．１ｋｂｐと２．８ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。ｐＭＩＢａ１４４からの６．１ｋｂｐの断片を、ＣＩＰで処理し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）PCR Purification Kit（Qiagen）を使用して精製した。
【０５３６】
ｐＭＩＢａ１４４からの２．８ｋｂｐの精製断片を、１μＬのｐＭＩＢａ１４４からの６．１ｋｂｐの断片、７μＬのｐＭＩＢａ１４４からの２．８ｋｂｐの断片、１μＬの１０ｍＭ ＡＴＰ含有１０×連結反応バッファー（New England Biolabs）、及び１μＬのＴ４リガーゼ（New England Biolabs）から構成された１０μＬの総反応物容量中でＴ４リガーゼ（New England Biolabs）を使用して６．１ｋｂｐのｐＭＩＢａ１４４線状ベクター内に連結した。反応物を、１６℃で４時間インキュベートし、そして反応物の４μＬのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従って、One Shot（登録商標）TOP10化学的コンピテントＥ．コリ細胞（Invitrogen）内に形質転換した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、適切な挿入についてＳｐｈＩとＸｂａＩを使用した制限消化によってスクリーニングした。正しい消化バンドサイズをもたらしたクローンを、ｐＭＩＢａ１４６と呼んだ。
【０５３７】
ＭＩＢａ３６３への左側断片及び右側断片の組み込み
本明細書中に記載したように、プラスミドｐＡＮＮ５を、ＮｏｔＩとＮｈｅＩで消化し、そしてプラスミドｐＭＩＢａ１４６を、ＮｏｔＩで消化した。これらを、ＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製し、そしてｐＡＮＮ５からの８．２ｋｂｐの断片とｐＭＩＢａ１４６からの６．２ｋｂｐの断片を、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従って、QIAQUICK（登録商標）PCR Purification Kit（Qiagen）によって精製した。
【０５３８】
ＭＩＢａ３６３を、消化ｐＡＮＮ５及びｐＭＩＢａ１４４ＤＮＡで形質転換し、そして正しい遺伝子座ターゲッティング及び形質転換について、製造業者の取扱説明書に従ってPhire（登録商標）Plant Direct PCR kit（Finnzymes）又はKapa Robust ＤＮＡポリメラーゼを使用するＰＣＲによって確認した。ｐｄｃ遺伝子座における組み込みを確認するのに、以下のプライマー対を使用した。プライマー０６１３６８９と０６１１８１５は、約１．９ｋｂｐのバンドをもたらし；プライマー０６１２３６６と０６１１５５４は、約２．５ｋｂｐのバンドをもたらし；０６１３６８８と０６１１８１５は、約３．２ｋｂｐのバンドをもたらし；０６１１６２２と０６１１５５２は、約９４５ｂｐのバンドをもたらした。ａｄｈ１２０２における組み込みを確認するために、以下のプライマー対を使用した。プライマー０６１１２４５と０６１２７９４は、約２．８ｋｂｐのバンドをもたらし、そしてプライマー０６１１８１５と０６１２７９５は、約３．９ｋｂｐのバンドをもたらした。ｐｄｃ遺伝子座における発現カセットの適切な組み込み、及びａｄｈ１２０２遺伝子座における発現カセットの保有が予想されるバンドをもたらす２個の単離菌株を、保存し、そしてＭＩＢａ３７２及びＭＩＢａ３７３と呼んだ。
【０５３９】
ＭＩＢａ３７２からのｕｒａマーカーの除去
ＭＩＢａ３７２のｕｒａ−誘導体を、先に記載したように単離した。ＭＩＢａ３７２のいくつかのＦＯＡ耐性コロニーからのゲノムＤＮＡを、所望のループアウト事象について、プライマー０６１１８１５と０６１３６８８を用いたＰＣＲによってスクリーニングした。約２．１ｋｂｐのバンドの存在が、所望される、ｕｒａ３瘢痕部位（親菌株の２つのＵＲＡ３プロモーターの間の相同組み換え後に取り残された１つのＵＲＡ３プロモーター）によるｕｒａマーカーの除去を示すのに対して、約３．３ｋｂｐのバンドは、完全なＵＲＡ３プロモーター‐ＵＲＡ３ ＯＲＦ‐ＵＲＡ３ターミネータ‐ＵＲＡ３プロモーターカセットの存在を示し、そして所望の組み換え事象が起こらなかったことを示した。ＭＩＢＡ３７２のＦＯＡ耐性コロニーもまた、第１の染色体の改変を確認するために、プライマー０６１１８１５と０６１３６８９（１．９ｋｂｐの断片を増幅する）及びｐｄｃ遺伝子座の欠失を確認するために、０６１１５５２と０６１１５５３（ｐｄｃ遺伝子座が存在していれば、８５０ｂｐの断片を増幅する）を用いたＰＣＲによってスクリーニングした。ＰＣＲを、製造業者の取扱説明書に従って、Phire（登録商標）Plant Direct PCR kit（Finnzymes）を使用して実施した。０６１１８１５と０６１３６８９で約１．９ｋｂｐの断片をもたらすが、０６１３６８８と０６１１８１５又は０６１１５５２と０６１１５５３で断片を増幅しないＦＯＡ耐性コロニーを、保存し、そしてＭＩＢａ３７５と呼んだ。
【０５４０】
【表３９】
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【０５４１】
実施例３Ａ‐２３：グリセロール３‐リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）遺伝子を欠失した酵母菌株
菌株ＭＩＢａ３７５におけるＧＰＤ遺伝子の欠失
追加の構築物を、宿主Ｉ．オリエンタリスゲノムから両コピーのグリセロール３‐リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（配列番号１１７、配列番号１１８のＧＰＤをコードする）を欠失するように設計した。これらの構築物は、中間にクローン化されたＴPDC‐ＵＲＡ３マーカーカセット（ＰＤＣターミネータ‐ＵＲＡ３プロモーター‐ＵＲＡ３遺伝子-ＵＲＡ３ターミネータ‐ＵＲＡ３プロモーター）を含む、ＧＰＤ遺伝子の上流配列に相同な約１００３ｂｐのヌクレオチド配列とＧＰＤ遺伝子の下流配列に相同な約８５２ｂｐの配列を含んでいた。
【０５４２】
ＧＰＤの上流及び下流の領域を、生産者の仕様書に従って、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを使用してＩ．オリエンタリスＣＮＢ１ゲノムＤＮＡから増幅した。上流領域はＡｐａＩ部位を含んでいた；これは、ＡｐａＩ認識配列内のヌクレオチドの１つに対するミスマッチを想定して設計したオーバーラッププライマーを使用したＰＣＲによって排除された。プライマー対ｏＡＣＮ４８／ｏＡＣＮ５１とｏＡＣＮ４９／ｏＡＣＮ５０を、上流領域に対してこれらの２つのオーバーラップ断片を増幅するのに使用した。これらのＰＣＲ産物を、分離し、１％アガロースゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQiaquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製し、そしてそれらを、（順方向ＡｐａＩ／逆方向ＮｏｔＩ部位を持つ）プライマーｏＡＣＮ４８／ｏＡＣＮ４９を用いた第２のラウンドのＰＣＲの鋳型として使用した。下流領域を、製造業者の仕様書に従ってＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、（順方向ＮｏｔＩ／逆方向ＳａｃＩ部位を持つ）プライマーｏＡＣＮ５２／ｏＡＣＮ５３を用いてＩ．オリエンタリスゲノムＤＮＡから増幅した。両ＰＣＲ産物を、ゲル精製し、そしてベクターｐＣＲ（登録商標）‐ＢｌｕｎｔＩＩ‐ＴＯＰＯ（登録商標）（Invitrogen）内に別々にクローン化した。単離菌株を、プラスミドＤＮＡの制限消化によって所望の挿入物を持つことを確認し、そして配列決定によって確認した。ベクターｐＡＣＮ５８はクローン化上流断片を含み、そしてｐＡＣＮ５９は下流断片を含んでいた。プラスミドｐＡＣＮ５８を、ＡｐａＩ／ＮｏｔＩで消化し、上流隣接部を切り出し、プラスミドｐＡＣＮ５９をＳａｃＩ／ＮｏｔＩで消化し、下流隣接部を切り出し、そしてｐＡＣＮ５９を、ＡｐａＩ／ＳａｃＩで消化して、ベクター骨格を得た。３つの所望の断片を、１％アガロースゲルで分離し、切り出し、精製し、そしてＴ４リガーゼ（New England Biolabs）を使用した３‐ピース連結反応によって連結した。連結反応物を、Ｅ．コリTOP10電気的コンピテント細胞内に形質転換し、そして、形質転換体を、プラスミドＤＮＡの制限消化によって確認した。この手順の間、下流領域の追加ＳａｃＩ部位を検出したが、それは、（１ｋｂｐと対照的に）８５３ｂｐの下流領域をもたらした。所望の挿入物を有する２つの単離菌株を、ｐＡＣＮ６２及びｐＡＣＮ６３と命名した。
【０５４３】
ＴPDC1‐ＵＲＡ３カセットを、ＮｏｔＩ消化とゲル精製を使用してベクターｐＪＬＪ８（図３２）から単離した。この断片を、次に、ＮｏｔＩで消化し、そして脱リン酸化したｐＡＣＮ６２（前掲）に連結し、そして、連結反応物を、Ｅ．コリDH10B的コンピテント細胞（Invitrogen）内に形質転換した。ＵＲＡ３挿入物を有するコロニーを、プライマーｏＡＣＮ４８／ｏＪＬＪ４４とｏＡＣＮ４８／ｏＪＬＪ４６を使用したＰＣＲによって確認した。プライマーｏＪＬＪ４４は、下流ＵＲＡ３プロモーターの末端にアニールし、そしてＴPDC1‐ＵＲＡ３カセットから外側に向かって増幅する。プライマーｏＪＬＪ４６は、ＰＤＣターミネータの５’末端にアニールし、そしてＴPDC1‐ＵＲＡ３カセットから外側に向かって増幅する。ベクターｐＨＪＪ５６は、下流ＧＰＤ領域に面するＵＲＡ３を含み、そして、ｐＨＪＪ５７は、上流ＧＰＤ領域に面するＵＲＡ３を含んでいる。
【０５４４】
プラスミドｐＨＪＪ５６とｐＨＪＪ５７を、ＫｐｎＩとＡｐａＩで消化することによって線状にし、そして欠失カセットを含む断片をゲル抽出で精製した。線状ｐＨＪＪ５６を、ｕｒａ−菌株ＭＩＢａ３７５内に形質転換した。シングルコロニーを、精製のために再び画線接種し、そして所望のＧＰＤ欠失について、プライマーｏＪＬＪ４４、ｏＪＬＪ４６、ｏＡＣＮ５４、及びｏＡＣＮ５５を使用したＰＣＲによって試験した。細胞を、４０μＬのY‐Lysisバッファー及び２μＬのザイモリエース（ZymoResearch）中で３７℃にて３０分間溶菌し、そして１μＬの溶解反応物を、２５μＬのＰＣＲ反応物に使用した。ＰＣＲ反応は、生産者の仕様書通りにFailsafe ＤＮＡポリメラーゼとバッファー Ｅを使用し、５５℃のアニール温度と以下のサイクルプロフィール：９４℃にて２分間を１サイクル；それぞれ９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、そして７２℃にて１．５分間を２９サイクル；及び７２℃にて３分間を１サイクル、を用いた。１コピーのＧＰＤノックアウトを持つ菌株は、約０．９と１．２ｋｂｐのバンドを生じるので、ｙＨＪＮ１とｙＨＪＮ２と命名した。
【０５４５】
菌株ｙＨＪＮ１及びｙＨＪＮ２を、一晩ＹＰＤ培地で培養し、そしてＵＲＡ３マーカーの欠失を選択するためにＳｃＤ‐２× ＦＯＡ培地上に平板培養した。シングルコロニーを、ＹＰＤで精製し、そしてｕｒａ−表現型を確認するためにＳｃＤ‐ｕｒａとＹＰＤ培地上にパッチした。Ｕｒａ−コロニーを、第１の組み込みを確認するのに使用したのと同じＰＣＲ反応物を使用してノックアウトを保有することを確認した。ｙＨＪＮ１のｕｒａ−誘導体を、ｙＨＪＮ３と命名し、そしてｙＨＪＮ２のｕｒａ−誘導体を、ｙＨＪＮ４と命名した。
【０５４６】
線状ｐＨＪＪ５７を、ｙＨＪＮ３及びｙＨＪＮ４内に形質転換し、そしてシングルコロニーをＳｃＤ‐ｕｒａ培地で精製した。２コピーのＧＰＤノックアウトの存在を、１つの反応物にプライマーｏＪＬＪ４４、ｏＡＣＮ５４、及びｏＡＣＮ５５を使用し、そして２番目の反応にプライマーｏＪＬＪ４６、ｏＡＣＮ５４、及びｏＡＣＮ５５を使用したＰＣＲによって確認した。
プライマーｏＡＣＮ５４が、ＧＰＤの上流フランキング配列の約３７ｂｐ上流の領域にアニールするのに対し、ｏＡＣＮ５５は、下流隣接部の約２４ｂｐ下流の領域にアニールする。ＧＰＤの両コピーが欠失すれば、前者の反応は約９００と１０５０ｂｐのバンドを生じ、そして後者の反応は約１０２５と１２００ｂｐのバンドを生じる。ＧＰＤノックアウトの２つのコピーを有するコロニーは、１コピーの欠失があるものよりＳｃＤ‐ｕｒａプレート上でゆっくり増殖した。ＧＰＤ遺伝子の両方のコピーを欠失した菌株を、ｙＨＪＮ７（ｙＨＪＮ３由来）及びｙＨＪＮ８（ｙＨＪＮ４由来）と命名した。
【０５４７】
本明細書中に記載した方法を使用して、菌株ＭＩＢａ３７２、ｙＨＪＮ７、及びｙＨＪＮ８を、グリセロール生産についてバイオリアクター内で試験した。菌株ＭＩＢａ３７２は、４８時間で２９．５ｇ／Ｌグリセロールを産生した。菌株ｙＨＪＮ７又はｙＨＪＮ８は、発酵中に、検出可能なグリセロールを産生しなかった。最終的な発酵ブロス中のグリセロールの不存在は、発酵ブロスからの３‐ＨＰの回収及び精製に利点を提供し得る。
【０５４８】
実施例３Ａ‐２４：ａｄｈ１２０２遺伝子座における４つのヌクレオチド配列からアスパラギン酸１‐デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）を、及びａｄｈ９０９１遺伝子座において３‐ＨＰデヒドロゲナーゼ（３‐ＨＰＤＨ）を発現し、且つ、天然３‐ＨＰデヒドロゲナーゼ（３‐ＨＰＤＨ）を欠失した酵母菌株
ａｄｈ９０９１遺伝子座におけるＩ．オリエンタリス３‐ＨＰＤＨの組み込みのためのプラスミドの構築
配列番号２６のＩ．オリエンタリス３‐ＨＰＤＨをコードする配列番号２５のヌクレオチド配列、及び配列番号２０のＩ．オリエンタリスＢＡＡＴ（ＰＹＤ４）をコードする配列番号１９のヌクレオチド配列を、以前に記載したように、プライマー０６１１９５４と０６１１９５７（３‐ＨＰＤＨのため）又は０６１１９９７と０６１１９９８（ＰＹＤ４）を使用して調製したＭＢｉｎ５００のＩ．オリエンタリスゲノムＤＮＡから増幅した。増幅中に、プライマー０６１１９５４は、５’末端にｋｏｚａｋ配列（ＴＡＡＡ）とＮｈｅＩ部位を加え、そしてプライマー０６１１９５７は、３‐ＨＰＤＨの３’末端にＰａｃＩ部位を加える。増幅中に、プライマー０６１１９９７は、５’末端にｋｏｚａｋ配列（ＴＡＡＡ）とＰａｃＩ部位を加え、そしてプライマー０６１１９９８は、ＰＹＤ４の３’末端にＰａｃＩ部位を加える。５０ｐｍｏｌのそれぞれのプライマーを、５０μＬの終量中に、５０ｎｇの鋳型としてＭＢｉｎ５００ゲノムＤＮＡ、０．２ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、１× Expand High Fidelityバッファー（Roche）、及び２．６単位のExpand High Fidelity DNA Polymerase（Roche）を含むＰＣＲ反応物に使用した。ＰＣＲを、９５℃にて３分間を１サイクルと続く、それぞれ９５℃にて１分間、５５℃にて１分間、そして７２℃にて１分間（３‐ＨＰＤＨ ＰＣＲ）又は２分間（ＰＹＤ４ ＰＣＲ）を３０サイクル、それと７２℃にて５分間最終伸長をプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific）で実施した。サーモサイクリングに続いて、ＰＣＲ反応産物を、約８３１ｂｐの３‐ＨＰＤＨ ＰＣＲ産物又は１．４ｋｂｐのＰＹＤ４ ＰＣＲ産物をゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製する、ＴＡＥバッファー中での１．０％アガロースゲル電気泳動によって分離した。精製した３‐ＨＰＤＨ又はＰＹＤ４の５μＬを、製造業者の取扱説明書に従ってTOPO‐TA Cloning Kit（Invitrogen）を使用してｐＣＲ２．１（Invitrogen）内にクローン化した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＥｃｏＲＩでの消化によってスクリーニングした。所望の挿入物サイズをもたらすクローンを、ＤＮＡ配列決定によって正しいと確認した。３‐ＨＰＤＨ含む１つのクローンを、ｐＭＢｉｎ１９０と呼び、そしてＰＹＤ４を含む別のクローンを、ｐＭＢｉｎ１９３と呼んだ。
【０５４９】
プラスミドｐＭＢｉｎ１９３を、ＸｂａＩとＰａｃＩで消化し、そして１．４ｋｂｐのＰＹＤ４バンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製する、ＴＡＥバッファー中での１．０％アガロースゲルで泳動した。消化ＰＹＤ４断片を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用してＸｂａＩとＰａｃＩで制限処理した線状ｐＭＩＢａ１０７プラスミド（前掲）に連結した。連結産物を、製造業者の取扱説明書に従って、One Shot（登録商標）TOP10 Chemically Competent Ｅ．コリ細胞（Invitrogen）内に形質転換した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＳｎａＢＩ又はＥｃｏＲＩでの消化によってスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらした１個のクローンを、ｐＭＢｉｎ２０３と呼んだ。プラスミドｐＭＢｉｎ２０３は、以下の発現カセットに隣接するＮｏｔＩ部位を含んでいる：ＰＹＤ４ ＣＤＳターミネータの上流と下流のＰＤＣプロモーター及びターミネータ、ＵＲＡ３プロモーター、ＵＲＡ３ ＯＲＦ、及びＵＲＡ３ターミネータとそれに続くＵＲＡ３プロモーター。
【０５５０】
プラスミドｐＭＢｉｎ２０３を、ＮｏｔＩで消化し、そして（ＰＤＣプロモーター、ＰＹＤ４ ＣＤＳ、ＰＤＣターミネータ、及びＵＲＡ３選択マーカーを含む）約４．１ｋｂｐの断片を、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製する、ＴＡＥバッファー中での１．０％アガロースゲルによって分離した。プラスミドｐＨＪＪ２７（ａｄｈ９０９１遺伝子座に対する５’及び３’相同領域を含む；図２１を参照のこと）を、ＮｏｔＩで消化し、ＣＩＰで処理し、約５．７ｋｂｐ線状プラスミドを、先に記載したように精製する、ＴＡＥバッファー中での１．０％アガロースゲルで分離した。次に、ｐＭＢｉｎ２０３からの断片を、先に記載したように、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用してＮｏｔＩ制限処理したｐＨＪＪ２７内に連結した。連結産物を、製造業者の取扱説明書に従って、One Shot（登録商標）TOP10 Chemically Competent Ｅ．コリ細胞（Invitrogen）内に形質転換した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ＰｓｔＩで消化することによってスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらす１個のクローンを、ｐＭＢｉｎ２０４と呼んだ。プラスミドｐＭＢｉｎ２０４は、ａｄｈ９０９１遺伝子座におけるＰＹＤ４のターゲッティングを可能にする。
【０５５１】
配列番号２６のＩ．オリエンタリス３‐ＨＰＤＨをコードする配列番号２５のヌクレオチド配列を、本明細書中に記載したように、ＮｈｅＩとＰａｃＩでの消化によってプラスミドｐＭＢｉｎ１９０（前掲）から切り出し、ＴＢＥバッファー中でのアガロースゲル電気泳動によって精製した。約８２７ｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。プラスミドｐＭＢｉｎ２０４（前掲）を、本明細書中に記載したように、ＸｂａＩとＰａｃＩで消化し、そしてＴＢＥバッファー中でのアガロースゲル電気泳動によって精製した。約８．４ｋｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０５５２】
上記の約８２７ｂｐの精製したＩ．オリエンタリス３‐ＨＰＤＨ遺伝子産物を、１μＬの８．４ｋｂｐベクター、１０μＬの８２７ｂｐの挿入物、２μＬの１０ｍＭ ＡＴＰ（New England Biolabs）含有１０×連結反応バッファー、及び１μＬのＴ４リガーゼ（New England Biolabs）から構成された２０μＬの総反応物容量中でＴ４リガーゼ（New England Biolabs）を使用して８．４ｋｂｐのｐＭＢｉｎ２０４線状ベクター内に連結した。反応物を、１６℃にて１８時間インキュベートし、そして反応物の１０μＬのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従って、One Shot TOP10細胞（Invitrogen）内に形質転換した。回復期間後に、形質転換反応物からの１００μＬの２つのアリコートを、１ｍｌあたりの１００μｇのアンピシリンを補った１５０ｍＭの２× ＹＴプレート上で平板培養した。プレートを、３７℃にて一晩インキュベートした。推定上の組み換えクローンを、選択プレートから釣り出し、そしてプラスミドＤＮＡを、それぞれからBIOROBOT（登録商標）9600（Qiagen）を使用して調製した。クローンを、制限消化によって分析した、そして正しい制限消化パターンを有するプラスミドを、ｐＭｃＴｓ９０と呼んだ。
【０５５３】
ａｄｈ９０９１遺伝子座におけるＳ．セレビシエ３‐ＨＰＤＨの組み込みのためのプラスミドの構築
配列番号１２９のＳ．セレビシエ３‐ＨＰＤＨをコードする８２６ｂｐの野生型ヌクレオチド配列を、ＪＧＩ６９ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、そして遺伝子の５’末端のＸｂａＩ部位及び遺伝子の３’末端のＰａｃＩ部位で修正した。増幅反応物は、製造業者の取扱説明書に従ってPlatinum（登録商標）Pfx DNAポリメラーゼ（InVitrogen）を使用して実施した。Master PCR反応物は、２００μＬの終量中に１．１２５μｌのＳ．セレビシエゲノムＤＮＡ、それぞれ１１２．５ｐＭのプライマー６１１１９１と６１１１９９、１× Pfx増幅バッファー（InVitrogen）、２ｍＭのＭｇＳＯ4、０．２ｍＭのｄＮＴＰミックス、５単位のPlatinum（登録商標）Pfx DNAポリメラーゼ（InVitrogen）を含んでいた。混合物を、８本のチューブに等分し、そしてグラジエントＰＣＲを実施した。増幅反応を、９５℃にて２分間を１サイクル；それぞれ９５℃にて３０秒間、勾配４０‐５５℃にて３０秒間、そして７２℃にて２分間を３０サイクル；及び７２℃にて３分間を１サイクルとプログラムしたEppendorf（登録商標）MASTERCYCLER（登録商標）（Eppendorf Scientific Inc.）でインキュベートした。
【０５５４】
８２６ｂｐの野生型ＹＭＲ２２６ｃ ＰＣＲ遺伝子産物を、本明細書中に記載したように、ＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。約８２６ｂｐの断片を、ゲルから切り出し、そしてQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用してアガロースから抽出した。ＰＣＲ産物を、ＸｂａＩとＰａｃＩを用いて３７℃にて一晩消化し、次に、QIAQUICK（登録商標）PCR Purification Kit（Qiagen）を使用して精製した。
【０５５５】
プラスミドｐＭＩＢａ１００（前掲）を、ＸｂａＩとＰａｃＩで消化し、続いて、ＣＩＰで処理し、そして約６．８ｋｂｐの線状断片を得た。消化産物を、製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）PCR Purification Kit（Qiagen）を使用して精製した。
【０５５６】
８２６ｂｐのＹＭＲ２２６ｃ精製及び消化ＰＣＲ断片を、１μＬのｐＭＩＢａ１００から６．７ｋｂｐの断片、１μＬ又は７μＬの８２６ｂｐのＹＭＲ２２６ｃ ＰＣＲ産物、１μＬの１０ｍＭ ＡＴＰ（New England Biolabs）含有１０×連結反応バッファー、及び１μＬのＴ４リガーゼ（New England Biolabs）から構成された１０μＬ、の総反応物容量中でＴ４リガーゼ（New England Biolabs）を使用して６．８ｋｂｐのｐＭＩＢａ１００線状ベクター内に連結した。反応物を、１６℃にて約４時間インキュベートし、そして反応物全体を、製造業者の取扱説明書に従って、化学的コンピテント細胞（Aglient）内に形質転換した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、適切な挿入についてＸｂａＩとＰａｃＩを使用した制限消化によってスクリーニングした。消化による正しいクローンを、ＤＮＡ配列決定で確認した。正しい消化バンドサイズとＤＮＡ配列をもたらしたクローンを、ｐＭＩＢａ１０１と呼んだ。
【０５５７】
プラスミドｐＨＪＪ７６‐ｎｏ ｕｒａ（前掲）を、ＮｏｔＩで消化し、それに続いてＣＩＰで処理した。５．２ｋｂｐの線状断片を、QIAQUICK（登録商標）PCR Purification Kit（Qiagen）を使用して精製した。
【０５５８】
ＹＭＲ２２６ｃ発現カセットを、ＮｏｔＩでの消化でｐＭＩＢａ１０１から切り出した。約３５４６ｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK（登録商標）Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。
【０５５９】
ｐＭＩＢａ１０１からの３５４６ｂｐの精製断片を、１μＬの５．２ｋｂｐのｐＨＪＪ７６‐ｎｏ ｕｒａから断片、１μＬ又は５μＬのｐＭＩＢａ１０１からの３５４６ｂｐの断片、１μＬの１０ｍＭ ＡＴＰ（New England Biolabs）含有１０×連結反応バッファー、及び１μＬのＴ４リガーゼ（New England Biolabs）から構成された１０μＬの総反応物容量中でＴ４リガーゼ（New England Biolabs）を使用して５．２のｋｂｐのｐＨＪＪ７６ ｎｏ‐ｕｒａ線状ベクター内に連結した。反応物を、１６℃にて一晩インキュベートし、そして、反応物の４ｐＬアリコートを、製造業者の取扱説明書に従って、One Shot（登録商標）TOP10化学的コンピテントＥ．コリ細胞（Invitrogen）内に形質転換した。形質転換体を、２× ＹＴ＋ａｍｐプレート上で平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、適切な挿入についてＸｂａＩとＫｐｎＩを使用した制限消化によってスクリーニングした。正しい消化バンドサイズをもたらしたクローンを、ｐＭＩＢａ１０９と呼んだ。
【０５６０】
配列番号１２９のＳ．セレビシエ３‐ＨＰＤＨをコードする野生型ヌクレオチド配列を、本明細書中に記載したように、プラスミドｐＭＩＢａ１０９からＸｂａＩとＰａｃＩとの消化によって切り出し、そしてＴＢＥバッファー中でのアガロースゲル電気泳動によって精製した。約８１８ｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０５６１】
精製した約８１８ｂｐのＳ．セレビシエ３‐ＨＰＤＨ遺伝子産物を、１μＬの８．４ｋｂｐベクター、１０μＬの８１８ｂｐの挿入物、２μＬの１０ｍＭ ＡＴＰ（New England Biolabs）含有１０×連結反応バッファー、及び１μＬのＴ４リガーゼ（New England Biolabs）から構成された２０μＬの総反応物容量中でＴ４リガーゼ（New England Biolabs）を使用して、先の８．４ｋｂｐのｐＭＢｉｎ２０４線状ベクター内に連結した。反応物を、１６℃にて１８時間インキュベートし、そして、反応物の１０μＬのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従って、One Shot TOP10細胞（Invitrogen）内に形質転換した。回復期間後に、形質転換反応物からの１００μＬの２つのアリコートを、１ｍＬあたりの１００μｇのアンピシリンを補った１５０ｍＭの２× ＹＴプレート上で平板培養した。プレートを、３７℃にて一晩インキュベートした。推定上の組み換えクローンを、選択プレートから釣り出し、そしてプラスミドＤＮＡをそれぞれからBIOROBOT（登録商標）9600（Qiagen）を使用して調製した。クローンを制限消化によって分析し、そして正しい制限消化パターンを有するプラスミドを、ｐＭｃＴｓ９１と呼んだ。
【０５６２】
ａｄｈ９０９１遺伝子座におけるＭ．セデュラ３‐ＨＰＤＨの組み込みのためのプラスミドの構築
配列番号２９のＭ．セデュラ３‐ＨＰＤＨをコードする配列番号３４３のＩ．オリエンタリスコドン最適化ヌクレオチド配列を、GeneArt（登録商標）によって合成し、そしてプラスミド１１ＡＡＥ２ＡＰを得た。合成遺伝子を、本明細書中に記載したように、ＸｂａＩとＰａｃＩを用いてプラスミドから消化し、そしてＴＢＥバッファー中でのアガロースゲル電気泳動によって精製した。約９５９ｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０５６３】
精製した約９５９ｂｐのＭ．セデュラ３‐ＨＰＤＨ遺伝子産物を、１μＬの８．４ｋｂｐベクター、１６μＬの９５９ｂｐの挿入物、２μＬの１０ｍＭ ＡＴＰ（New England Biolabs）含有１０×連結反応バッファー、及び１μＬのＴ４リガーゼ（New England Biolabs）から構成された２０μＬの総反応物容量中でＴ４リガーゼ（New England Biolabs）を使用して８．４ｋｂｐのｐＭＢｉｎ２０４線状ベクター内に連結した。反応物を、室温にて１時間インキュベートし、そして反応物の１０μＬのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従って、Solo Pack Gold Super Competent細胞（Agilent）内に形質転換した。回復期間後に、形質転換反応物からの１００μＬの２つのアリコートを、１ｍｌあたりの１００μｇのアンピシリンを補った１５０ｍＭの２× ＹＴプレート上で平板培養した。プレートを、３７℃にて一晩インキュベートした。推定上の組み換えクローンを、選択プレートから釣り出し、そしてプラスミドＤＮＡを、それぞれからBIOROBOT（登録商標）9600（Qiagen）を使用して調製した。クローンを、制限消化によって分析し、そして正しい制限消化パターンを有するプラスミドを、ｐＭｃＴｓ７６と呼んだ。
【０５６４】
ａｄｈ９０９１遺伝子座におけるＥ．コリ３‐ＨＰＤＨ組み込みのためのプラスミドの構築
配列番号２７のＥ．コリ３‐ＨＰＤＨをコードする配列番号１４３のＩ．オリエンタリスコドン最適化ヌクレオチド配列を、GeneArt（登録商標）によって合成し、そしてプラスミド１０４５１６８を得た。合成遺伝子を、本明細書中に記載したように、ＸｂａＩとＰａｃＩを用いてプラスミドから消化し、そしてＴＢＥバッファー中でのアガロースゲル電気泳動によって精製した。約７６１ｂｐのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０５６５】
精製した約７６１ｂｐのＥ．コリ３‐ＨＰＤＨ遺伝子産物を、１μＬの８．４ｋｂｐベクター、１６μＬの７６１ｂｐの挿入物、２μＬの１０ｍＭ ＡＴＰ（New England Biolabs）含有１０×連結反応バッファー、及び１μＬのＴ４リガーゼ（New England Biolabs）から構成された２０μＬの総反応物容量中でＴ４リガーゼ（New England Biolabs）を使用して８．４ｋｂｐのｐＭＢｉｎ２０４線状ベクター内に連結した。反応物を、室温にて１時間インキュベートし、そして反応物の１０μＬのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従って、Solo Pack Gold Super Competent細胞（Agilent）内に形質転換した。回復期間後に、形質転換反応物からの１００μＬの２つのアリコートを、１ｍｌあたりの１００μｇのアンピシリンを補った１５０ｍＭの２× ＹＴプレート上で平板培養した。プレートを、３７℃にて一晩インキュベートした。推定上の組み換えクローンを、選択プレートから釣り出し、そしてプラスミドＤＮＡを、それぞれからBIOROBOT（登録商標）9600（Qiagen）を使用して調製した。クローンを、制限消化によって分析し、そして正しい制限消化パターンを有するプラスミドを、ｐＭｃＴｓ７７と呼んだ。
ＭｃＴｓ２５９のａｄｈ９０９１における３‐ＨＰＤＨ断片の組み込み
【０５６６】
本明細書中に記載したように、プラスミドｐＭｃＴｓ７６、ｐＭｃＴｓ７７、ｐＭｃＴｓ９１を、ＫｐｎＩとＡｐａＩで消化し、そして、プラスミドｐＭｃＴｓ９０を、ＳａｃＩとＡｐａＩで消化した。得られた消化産物を、ＴＢＥバッファー中での１％アガロースゲル電気泳動によって精製し、ｐＭｃＴｓ７６からの５．５ｋｂｐの断片、ｐＭｃＴｓ７７からの５．３ｋｂｐの断片、ｐＭｃＴｓ９０からの５．４ｋｂｐの断片、及びｐＭｃＴｓ９１からの５．４ｋｂｐの断片を、ゲルから切り出し、そして、製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN（登録商標）Extract II Kit（Macherey-Nagel）を使用して精製した。
【０５６７】
ａｄｈ１２０２遺伝子座において配列番号１３９のＢ．リチェニフォルミスＡＤＣをコードするヌクレオチドの４つのコピーを発現し、且つ、配列番号２６（前掲）の３‐ＨＰＤＨをコードする天然Ｉ．オリエンタリス遺伝子を欠失した菌株ＭｃＴｓ２５９を、消化したｐＭｃＴｓ７６、ｐＭｃＴｓ７７、ｐＭｃＴｓ９０、又はｐＭｃＴｓ９１ＤＮＡで形質転換した。正しい遺伝子座ターゲッティング及び形質転換を、製造業者の取扱説明書に従ってPhire（登録商標）Plant Direct PCR kit（Finnzymes）を使用したＰＣＲによって確認した。ａｄｈ９０９１遺伝子座における組み込みを確認するために、以下のプライマー対を使用した。プライマー０６１４６２７と０６１２９０９は、組み込まれたｐＭｃＴｓ７６からの断片に対する約３．４７ｋｂｐのバンド、組み込まれたｐＭｃＴｓ７７からの断片に対する約３．２７ｋｂｐのバンド、組み込まれたｐＭｃＴｓ９０からの断片に対する約３．３４ｋｂｐのバンド、組み込まれたｐＭｃＴｓ９１からの断片に対する約３．３３ｋｂｐのバンドをもたらし；プライマー０６１２９０８と０６１４６２６は、約１．９７ｋｂｐのバンドをもたらした。ａｄｈ１２０２における組み込みをチェックするために、以下のプライマー対は使用した。プライマー０６１１２４５と０６１２７９４は、約３．０ｋｂｐのバンドをもたらし、そしてプライマー０６１１８１５と０６１２７９５は約３．６ｋｂｐのバンドをもたらした。天然Ｉ．オリエンタリス３‐ＨＰＤＨ遺伝子の欠失をチェックするために、以下のプライマーを使用した。プライマー０６１３０３４と０６１３２４１は、約１．４ｋｂｐのバンドをもたらした。ａｄｈ９０９１遺伝子座における発現カセットの適切な組み込みが予想されるバンドをもたらし、ａｄｈ１２０２に発現カセットを保有し、且つ、Ｉ．オリエンタリス３‐ＨＰＤＨ遺伝子座の欠失を保有した単離菌株を、表２９に示すように、保存し、そしてＭｃＴｓ２６１（ｐＭｃＴｓ７６断片）、ＭｃＴｓ２６３（ｐＭｃＴｓ７７断片）、ＭｃＴｓ２６７（ｐＭｃＴｓ９０断片）、及びＭｃＴｓ２６９（ｐＭｃＴｓ９１断片）と呼んだ。
【０５６８】
【表４０】
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【０５６９】
形質転換菌株を、３‐ＨＰ生産について、先に記載した振盪フラスコ法を使用して試験した。異型接合の形質転換体ＭｃＴｓ２６７、ＭｃＴｓ２６９、及びＭｃＴｓ２６３は、それぞれ、０．１４９（＋／−０．０２４）、０．１６８（＋／−０．０５２）、及び０．１６２（＋／−０．０１８）ｇ／Ｌ ３‐ＨＰ／ｇ／Ｌ 乾燥細胞重量を生じた。天然菌株ＭｅＪｉ４１２は、０．２６３（＋／−０．０２６）ｇ／Ｌ ３‐ＨＰ／ｇ／Ｌ 乾燥細胞重量を産生し、そして３‐ＨＰＤＨ欠失菌株は、検出可能な３‐ＨＰを生じなかった。この実験で、異型接合の形質転換体ＭｃＴｓ２６１は検出可能な３‐ＨＰを生じなかった。これらの結果は、異型接合の３‐ＨＰＤＨ形質転換体であっても、外来性又は内在性の３‐ＨＰＤＨ遺伝子配列を使用して３‐ＨＰＤＨ欠失菌株の３‐ＨＰＤＨ活性をいくらか復元できることを示している。
【０５７０】
実施例３Ｂ：リンゴ酸経路遺伝子を発現する改変酵母菌株
ＰＥＰ、ＯＡＡ、及びリンゴ酸中間体を利用する経路を経て３‐ＨＰを産生する酵母細胞を、経路に関与する１若しくは複数の酵素の発現によって変更できる。発現遺伝子は、ＰＰＣ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、及びリンゴ酸デカルボキシラーゼ遺伝子のうちの１若しくは複数を含み得る。発現遺伝子は、宿主細胞にとって天然である遺伝子から得ても、宿主細胞にとって非天然である起源遺伝子から得てもよい。
【０５７１】
実施例３Ｃ：マロン酸セミアルデヒド経路遺伝子を発現する改変酵母菌株
ＰＥＰ、ＯＡＡ、及びマロン酸セミアルデヒド中間体を利用する経路を経て３‐ＨＰを産生する酵母細胞を、経路に関与する１若しくは複数の酵素の発現によって変更できる。発現遺伝子は、ＰＰＣ、２‐ケト酸デカルボキシラーゼ、ＫＧＤ、ＢＣＫＡ、インドールピルビン酸デカルボキシラーゼ、３‐ＨＰＤＨ（マロン酸セミアルデヒドレダクターゼを含む）、ＨＩＢＡＤＨ、及び４‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの１若しくは複数を含み得る。発現遺伝子は、宿主細胞にとって天然である遺伝子から得ても、宿主細胞にとって非天然である起源遺伝子から得てもよい。
【０５７２】
実施例３Ｄ：マロニル‐ＣｏＡ経路遺伝子を発現する改変酵母菌株
ＰＥＰ、ＯＡＡ、マロニル‐ＣｏＡ、及び任意にマロン酸セミアルデヒド中間体を利用する経路を経て３‐ＨＰを産生する酵母細胞を、経路に関与する１若しくは複数の酵素の発現によって変更できる。発現遺伝子は、ＰＰＣ、ＯＡＡギ酸リアーゼ、マロニル‐ＣｏＡレダクターゼ、ＣｏＡアシル化マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、３‐ＨＰＤＨ（マロン酸セミアルデヒドレダクターゼを含む）、ＨＩＢＡＤＨ、及び４‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの１若しくは複数を含み得る。発現遺伝子は、宿主細胞にとって天然である遺伝子から得ても、宿主細胞にとって非天然である起源遺伝子から得てもよい。
【０５７３】
実施例３Ｅ：マロニル‐ＣｏＡ経路遺伝子を発現する改変酵母菌株
ピルバート、アセチル‐ＣｏＡ、マロニル‐ＣｏＡ、及び任意にマロン酸セミアルデヒド中間体を利用する経路を経て３‐ＨＰを産生する酵母細胞を、経路に関与する１若しくは複数の酵素の発現によって変更できる。発現遺伝子は、ＰＤＨ、アセチル‐ＣｏＡカルボキシラーゼ、マロニル‐ＣｏＡレダクターゼ、ＣｏＡアシル化マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、３‐ＨＰＤＨ（マロン酸セミアルデヒドレダクターゼを含む）、ＨＩＢＡＤＨ、及び４‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの１若しくは複数を含み得る。発現遺伝子は、宿主細胞にとって天然である遺伝子から得ても、宿主細胞にとって非天然である起源遺伝子から得てもよい。
【０５７４】
実施例３Ｆ：アラニン経路遺伝子を発現する改変酵母菌株
ピルバート、アラニン、β‐アラニン、及び任意にマロン酸セミアルデヒド、β‐アラニル‐ＣｏＡ、アクリロイル‐ＣｏＡ、及び３‐ＨＰ‐ＣｏＡ中間体を利用する経路を経て３‐ＨＰを産生する酵母細胞を、経路に関与する１若しくは複数の酵素の発現によって変更できる。発現遺伝子は、アラニンデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸／アラニンアミノトランスフェラーゼ、アラニン２，３アミノムターゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、ＣｏＡシンテターゼ、β‐アラニル‐ＣｏＡアンモニアリアーゼ、３‐ＨＰ‐ＣｏＡデヒドラターゼ、３‐ＨＰ‐ＣｏＡヒドロラーゼ、３‐ヒドロキシイソブチリル‐ＣｏＡヒドロラーゼ、ＢＡＡＴ、３‐ＨＰＤＨ（マロン酸セミアルデヒドレダクターゼを含む）、ＨＩＢＡＤＨ、及び４‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの１若しくは複数を含み得る。発現遺伝子は、宿主細胞にとって天然である遺伝子から得ても、宿主細胞にとって非天然である起源遺伝子から得てもよい。
【０５７５】
実施例３Ｇ：乳酸経路遺伝子を発現する改変酵母菌株
ピルバート、ラクタート、ラクチル‐ＣｏＡ、アクリロイル‐ＣｏＡ、及び３‐ＨＰ‐ＣｏＡ中間体を利用する経路を経て３‐ＨＰを産生する酵母細胞を、この経路に関与する１若しくは複数の酵素の発現によって変更できる。発現遺伝子は、ＬＤＨ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、ＣｏＡシンテターゼ、ラクチル‐ＣｏＡデヒドラターゼ、３‐ＨＰ‐ＣｏＡデヒドラターゼ、３‐ＨＰ‐ＣｏＡヒドロラーゼ、及び３‐ヒドロキシイソブチリル‐ＣｏＡヒドロラーゼ遺伝子のうちの１若しくは複数を含み得る。発現遺伝子は、宿主細胞にとって天然である遺伝子から得ても、宿主細胞にとって非天然である起源遺伝子から得てもよい。
【０５７６】
実施例３Ｈ：グリセロール経路遺伝子を発現する改変酵母菌株
グリセロールと３‐ＨＰＡ中間体を利用する経路を経て３‐ＨＰを産生する酵母細胞を、この経路に関与する１若しくは複数の酵素の発現によって変更できる。発現遺伝子は、グリセロールデヒドラターゼとアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの１若しくは複数を含み得る。発現遺伝子は、宿主細胞にとって天然である遺伝子から得ても、宿主細胞にとって非天然である起源遺伝子から得てもよい。
【０５７７】
実施例３１：β‐アラニルＣｏＡ経路遺伝子を発現する改変酵母菌株
ＰＥＰ若しくはピルバート、β‐アラニン、β‐アラニル‐ＣｏＡ、アクリロイル‐ＣｏＡ、３‐ＨＰ‐ＣｏＡ、並びに任意に、ＯＡＡ、アスパラタート、及びアラニン中間体を利用する経路を経て３‐ＨＰを産生する酵母細胞を、この経路に関与する１若しくは複数の酵素の発現によって変更できる。発現遺伝子は、ＰＰＣ、ＰＹＣ、ＡＡＴ、ＡＤＣ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、ＣｏＡシンテターゼ、β‐アラニル‐ＣｏＡアンモニアリアーゼ、３‐ＨＰ‐ＣｏＡデヒドラターゼ、３‐ＨＰ‐ＣｏＡヒドロラーゼ、３‐ヒドロキシイソブチリル‐ＣｏＡヒドロラーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸／アラニンアミノトランスフェラーゼ、及びＡＡＭ遺伝子のうちの１若しくは複数を含み得る。発現遺伝子は、宿主細胞にとって天然である遺伝子から得ても、宿主細胞にとって非天然である起源遺伝子から得てもよい。
【０５７８】
いくつかの態様において、酵母細胞又はその使用方法を、次の番号付きの段落によって説明できる。
［Ｂ１］
活性な３‐ＨＰ発酵経路を含む遺伝子組み換え酵母細胞であって、以下の：
外来性ＰＰＣ遺伝子；
外来性ＰＹＣ遺伝子；
外来性ＡＡＴ遺伝子；
外来性ＡＤＣ遺伝子；
外来性ＢＡＡＴ又はｇａｂＴ遺伝子；及び
外来性３‐ＨＰＤＨ遺伝子、
から選択される１若しくは複数の外来性３‐ＨＰ経路遺伝子を含む細胞。
［Ｂ２］
外来性ＡＡＴ遺伝子を含む、段落Ｂ１に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ３］
外来性ＰＹＣ遺伝子を含む、段落Ｂ１又はＢ２に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ４］
外来性ＡＤＣ遺伝子を含む、段落Ｂ１〜Ｂ３のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ５］
外来性ＢＡＡＴ又はｇａｂＴ遺伝子を含む、段落Ｂ１〜Ｂ４のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ６］
外来性３‐ＨＰＤＨ遺伝子を含む、段落Ｂ１〜Ｂ５のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ７］
以下の：
外来性ＰＹＣ遺伝子；
外来性ＡＡＴ遺伝子；
外来性ＡＤＣ遺伝子；
外来性ＢＡＡＴ又はｇａｂＴ遺伝子；及び
外来性３‐ＨＰＤＨ遺伝子、
を含む、段落Ｂ１に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ８］
外来性ＰＰＣ遺伝子を含む、段落Ｂ１〜Ｂ７のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ９］
前記外来性ＰＹＣ遺伝子が、配列番号２、３、４、５、６、７、及び８から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ１〜Ｂ７のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ１０］
前記外来性ＰＹＣ遺伝子が、配列番号２から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ９に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ１１］
前記外来性ＰＹＣ遺伝子が、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ９に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ１２］
前記外来性ＰＹＣ遺伝子が、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ９に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ１３］
前記外来性ＰＹＣ遺伝子が、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ９に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ１４］
前記外来性ＰＹＣ遺伝子が、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ９に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ１５］
前記外来性ＰＹＣ遺伝子が、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ９に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ１６］
前記外来性ＰＹＣ遺伝子が、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ９に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ１７］
前記外来性ＰＹＣ遺伝子が、配列番号１のヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落Ｂ１〜Ｂ１６のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ１８］
前記ＡＡＴ遺伝子が、配列番号１４、１５、及び１６から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ１〜Ｂ１７のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ１９］
前記ＡＡＴ遺伝子が、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ１８に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ２０］
前記ＡＡＴ遺伝子が、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ１８に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ２１］
前記ＡＡＴ遺伝子が、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ１８に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ２２］
前記ＡＡＴ遺伝子が、配列番号１３のヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落Ｂ１〜Ｂ２１のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ２３］
前記ＡＤＣ遺伝子が、配列番号１７、１８、１３３、１３５、１３７、及び１３９から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ１〜Ｂ２２のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ２４］
前記ＡＤＣ遺伝子が、配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ２３に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ２５］
前記ＡＤＣ遺伝子が、配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ２３に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ２６］
前記ＡＤＣ遺伝子が、配列番号１３３のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ２３に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ２７］
前記ＡＤＣ遺伝子が、配列番号１３５のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ２３に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ２８］
前記ＡＤＣ遺伝子が、配列番号１３７のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ２３に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ２９］
前記ＡＤＣ遺伝子が、配列番号１３９のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ２３に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ３０］
前記ＡＤＣ遺伝子が、配列番号１３０、１３１、１３２、１３４、１３６、及び１３８から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落Ｂ１〜Ｂ２９のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ３１］
前記ＡＤＣ遺伝子が、配列番号１３０のヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落Ｂ３０に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ３２］
前記ＡＤＣ遺伝子が、配列番号１３１のヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落Ｂ３０に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ３３］
前記ＡＤＣ遺伝子が、配列番号１３２のヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落Ｂ３０に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ３４］
前記ＡＤＣ遺伝子が、配列番号１３４のヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落Ｂ３０に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ３５］
前記ＡＤＣ遺伝子が、配列番号１３６のヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落Ｂ３０に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ３６］
前記ＡＤＣ遺伝子が、配列番号１３８のヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落Ｂ３０に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ３７］
前記外来性ＢＡＡＴ又はｇａｂＴ遺伝子が、配列番号２０、２１、２２、２３、及び２４から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ１〜Ｂ３６のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ３８］
前記外来性ＢＡＡＴ又はｇａｂＴ遺伝子が、配列番号２０のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ３７に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ３９］
前記外来性ＢＡＡＴ又はｇａｂＴ遺伝子が、配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ３７に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ４０］
前記外来性ＢＡＡＴ又はｇａｂＴ遺伝子が、配列番号２２のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ３７に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ４１］
前記外来性ＢＡＡＴ又はｇａｂＴ遺伝子が、配列番号２３のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ３７に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ４２］
前記外来性ＢＡＡＴ又はｇａｂＴ遺伝子が、配列番号２４のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ３７に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ４３］
前記ＢＡＡＴ遺伝子又はｇａｂＴ遺伝子が、配列番号１９、１４０、１４１、及び１４２から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落Ｂ１〜Ｂ４２のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ４４］
前記ＢＡＡＴ遺伝子又はｇａｂＴ遺伝子が、配列番号１９のヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落Ｂ４３に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ４５］
前記ＢＡＡＴ遺伝子又はｇａｂＴ遺伝子が、配列番号１４０のヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落Ｂ４３に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ４６］
前記ＢＡＡＴ遺伝子又はｇａｂＴ遺伝子が、配列番号１４１のヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落Ｂ４３に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ４７］
前記ＢＡＡＴ遺伝子又はｇａｂＴ遺伝子が、配列番号１４２のヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落Ｂ４３に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ４８］
前記外来性ＢＡＡＴ遺伝子又は外来性ｇａｂＴが、ｇａｂＴ遺伝子でもあるＢＡＡＴ遺伝子である、段落Ｂ１〜Ｂ４７のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ４９］
前記３‐ＨＰＤＨ遺伝子が、配列番号２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、及び１２９から成る群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ１〜Ｂ４８のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ５０］
前記３‐ＨＰＤＨ遺伝子が、配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ４９に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ５１］
前記３‐ＨＰＤＨ遺伝子が、配列番号２７のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ４９に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ５２］
前記３‐ＨＰＤＨ遺伝子が、配列番号２８のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ４９に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ５３］
前記３‐ＨＰＤＨ遺伝子が、配列番号２９のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ４９に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ５４］
前記３‐ＨＰＤＨ遺伝子が、配列番号３０のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ４９に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ５５］
前記３‐ＨＰＤＨ遺伝子が、配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ４９に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ５６］
前記３‐ＨＰＤＨ遺伝子が、配列番号３２のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ４９に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ５７］
前記３‐ＨＰＤＨ遺伝子が、配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ４９に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ５８］
前記３‐ＨＰＤＨ遺伝子が、配列番号３４のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ４９に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ５９］
前記３‐ＨＰＤＨ遺伝子が、配列番号１２９のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ４９に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ６０］
前記３‐ＨＰＤＨ遺伝子が、配列番号２５、１４３、１４４、及び３４３から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落Ｂ１〜Ｂ５９のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ６１］
前記３‐ＨＰＤＨ遺伝子が、配列番号２５のヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落Ｂ６０に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ６２］
前記３‐ＨＰＤＨ遺伝子が、配列番号１４３のヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落Ｂ６０に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ６３］
前記３‐ＨＰＤＨ遺伝子が、配列番号１４４のヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落Ｂ６０に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ６４］
前記３‐ＨＰＤＨ遺伝子が、配列番号３４３のヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落Ｂ６０に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ６５］
前記３‐ＨＰＤＨ遺伝子が、ＨＩＢＡＤＨ遺伝子でもある、段落Ｂ１〜Ｂ６４のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ６６］
前記３‐ＨＰＤＨ遺伝子が、４‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子でもある、段落Ｂ１〜Ｂ６５のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ６７］
前記ＰＰＣ遺伝子が、配列番号１０、１１、及び１２から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ１〜Ｂ６６のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ６８］
前記ＰＰＣ遺伝子が、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ６７に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ６９］
前記ＰＰＣ遺伝子が、配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ６７に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ７０］
前記ＰＰＣ遺伝子が、配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落Ｂ６７に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ７１］
前記ＰＰＣ遺伝子が、配列番号９のヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落Ｂ１〜Ｂ７０のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ７２］
前記酵母細胞が、クラブトリー陰性である、段落Ｂ１〜Ｂ７１のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ７３］
前記酵母細胞が、イサタケンキア属、カンジダ属、クルイベロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属、トルラスポラ属、チゴサッカロマイセス属、及びサッカロマイセス属から選択される属に属している、段落Ｂ１〜Ｂ７２のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ７４］
前記酵母細胞が、Ｉ．オリエンタリス／Ｐ．ファーメンタンス分岐群及びサッカロマイセス分岐群から選択される分岐群に属している、段落Ｂ７３に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ７５］
前記酵母細胞が、Ｉ．オリエンタリス、Ｃ．ランビカ、及びＳ．ブルデリから選択される、段落Ｂ７３に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ７６］
前記細胞が、ＰＤＣ、ＡＤＨ、ＧＡＬ６、ＣＹＢ２Ａ、ＣＹＢ２Ｂ、ＧＰＤ、ＧＰＰ、ＡＬＤ、及びＰＣＫ遺伝子から選択される天然遺伝子の１若しくは複数の欠失又は破壊をさらに含む、段落Ｂ１〜Ｂ７５のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ７７］
前記１若しくは複数の欠失又は破壊が、１若しくは複数の外来性３‐ＨＰ経路遺伝子の挿入の結果である、段落Ｂ７６に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ７８］
１若しくは複数の外来性３‐ＨＰ経路遺伝子が、１若しくは複数の外来性調節要素に作動可能なように連結されている、段落Ｂ１〜Ｂ７７のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ７９］
前記１若しくは複数の調節要素が、１若しくは複数の３‐ＨＰ経路遺伝子にとって外来のものである、段落Ｂ７８に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ８０］
前記外来性ＰＹＣ遺伝子が、ＰＹＣ遺伝子にとって外来のものである外来プロモーターに作動可能なように連結されている、段落Ｂ１〜Ｂ７９のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ８１］
前記外来性ＡＡＴ遺伝子が、ＡＡＴ遺伝子にとって外来のものである外来プロモーターに作動可能なように連結されている、段落Ｂ１〜Ｂ８０のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ８２］
前記外来性ＡＤＣ遺伝子が、ＡＤＣ遺伝子にとって外来のものである外来プロモーターに作動可能なように連結されている、段落Ｂ１〜Ｂ８１のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ８３］
前記外来性ＢＡＡＴ又はｇａｂＴ遺伝子が、ＢＡＡＴ又はｇａｂＴ遺伝子にとって外来のものである外来プロモーターに作動可能なように連結されている、段落Ｂ１〜Ｂ８２のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ８４］
前記外来性３‐ＨＰＤＨ遺伝子が、３‐ＨＰＤＨ遺伝子にとって外来のものである外来プロモーターに作動可能なように連結されている、段落Ｂ１〜Ｂ８３のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ８５］
前記外来性ＰＰＣ遺伝子が、ＰＰＣ遺伝子にとって外来のものである外来プロモーターに作動可能なように連結されている、段落Ｂ１〜Ｂ８４のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ８６］
前記細胞が、７５ｇ／Ｌ以上の３‐ＨＰを含む培地中、４未満のｐＨでも培養できる、段落Ｂ１〜Ｂ８５のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ８７］
前記細胞が、３‐ＨＰ耐性酵母細胞である、段落Ｂ１〜Ｂ８６のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ８８］
前記細胞が、突然変異及び／又は選択細胞が同種の野生型細胞より高い３‐ＨＰ耐性を有するように突然変異及び／又は選択を受ける、段落Ｂ１〜Ｂ８７のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ８９］
前記細胞が、１若しくは複数の外来性３‐ＨＰ経路遺伝子を用いて遺伝子組み換えされる前に、突然変異及び／又は選択を受ける、段落Ｂ８８に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ９０］
前記細胞が、乳酸又は３‐ＨＰの存在下で選択を受ける、段落Ｂ８８又はＢ８９に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ９１］
前記選択が、ケモスタット選択である、段落Ｂ９１に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
［Ｂ９２］
以下の：
（ｉ）少なくとも１種類の炭素源を含む培地の存在下で、段落Ｂ１〜Ｂ９１のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞を培養し；そして
（ｉｉ）培養物から３‐ＨＰを単離すること、
を含む３‐ＨＰの生産方法。
［Ｂ９３］
前記炭素源が、グルコース、キシロース、アラビノース、スクロース、フルクトース、セルロース、グルコースオリゴマー、及びグリセロールから選ばれる、段落Ｂ９２に記載の方法。
［Ｂ９４］
培地が、５未満のｐＨ、例えば、約１．５〜約４．５、約２．０〜約４．０、又は約２．０〜約３．５の範囲内のｐＨである、段落Ｂ９２又はＢ９３に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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