(57)【要約】  本発明は、野菊抽出物またはこの分画物を含む抗炎症活性を持つ組成物に関し、前記組成物は、炎症疾患、特に、アトピーに対する予防及び治療効果を持つところ、薬学組成物に利用されることができ、この他に医薬外品、化粧品組成物、食品、及び軟水器などで様々な用途として利用され得る。
2013512235.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野菊(Chrysanthemum boreale Makino)抽出物またはこの分画物を含む、抗炎症活性を持つ組成物。
【請求項２】
前記野菊抽出物は、野菊の水抽出物または野菊のメタノール抽出物である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記野菊の抽出物は、熱水抽出方法によって抽出されたものである請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記分画物は、クロロホルム、エタノール、酢酸エチルまたはこれらの混合溶媒のうち、いずれか一つの溶媒を用いた分画物である請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物は、下記特性中の一つ以上を持つ請求項１に記載の組成物：
１）紅斑、浮腫、血腫、掻痒、皮膚乾燥症、糜爛及び苔癬化の減少；
２）耳浮腫の減少；
３）掻く行動の減少；
４）血清免疫グロブリンＥ(ＩｇＥ)、インターフェロン−γ(ＩＦＮ−γ)またはインターロイキン４(ＩＬ−４)濃度の減少；
５）細胞内酸化窒素(ＮＯ)発現の減少；
６）細胞内酸化窒素合成剤(ｉＮＯＳ)の発現の減少；
７）細胞内プロスタグランジンＥ２(ＰＧＥ２)生成の減少；
８）細胞内ＣＯＸ−２発現の減少；
９）ＩκＢリン酸化抑制及びＮＦ−κＢの細胞質から核への移動減少；及び
１０）線維芽細胞増殖、コラーゲン層異常増殖、及び潰瘍の抑制、肥満細胞の浸潤の減少、及び好中球及びリンパ球の浸潤による炎症の減少。
【請求項６】
請求項１〜５のうち、いずれか一項の組成物を有効成分として含む、炎症疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項７】
前記炎症疾患は、アレルギー性炎症疾患である請求項６に記載の炎症疾患の予防または治療用薬学組成物
【請求項８】
前記アレルギー性炎症疾患は、アトピー皮膚炎である請求項７に記載の炎症疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項９】
前記炎症疾患の予防または治療用薬学組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌された水溶液、非水性溶剤、凍結乾燥製剤及び坐剤からなる群から選択されるいずれか一つの剤形を持つことを特徴とする請求項６に記載の炎症疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項１０】
請求項１〜５のうち、いずれか一項の組成物を有効成分として含む、炎症疾患の予防または改善用化粧品組成物。
【請求項１１】
請求項１〜５のうち、いずれか一項の組成物を有効成分として含む、炎症疾患の予防または改善用食品組成物。
【請求項１２】
前記食品組成物は、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディー類、  スナック類、クッキ類、ピザ、ラーメン、ガム類、アイスクリーム類、スープ、飲料水、茶、機能水、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする請求項１１に記載の炎症疾患の予防または改善用食品組成物。
【請求項１３】
請求項１〜５のうち、いずれか一項の組成物を有効成分として含む、炎症疾患の予防または改善用医薬外品組成物。
【請求項１４】
前記医薬外品組成物は、消毒清潔剤、シャワーフォーム、口腔洗浄薬、ウェットティッシュ、洗剤石鹸、ハンドウォッシュ、加湿器充填剤、マスク、軟膏剤、コーティング剤またはフィルター充填剤からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする請求項１３に記載の炎症疾患の予防または改善用医薬外品組成物。
【請求項１５】
請求項１〜５のうち、いずれか一項の組成物を有効成分として含むフィルター充填剤を含む、炎症疾患の予防または改善用軟水器。
【請求項１６】
請求項１〜５のうち、いずれか一項の組成物を炎症疾患が発病したまたは発病可能性のある患者に投与して炎症疾患を予防または治療する方法。
【請求項１７】
前記組成物を経口投与または皮膚塗布投与する請求項１６に記載の炎症疾患を予防または治療する方法。
【請求項１８】
前記炎症疾患は、アレルギー性炎症疾患である請求項１６に記載の炎症疾患を予防または治療する方法。
【請求項１９】
前記アレルギー性炎症疾患は、アトピー皮膚炎である請求項１８に記載の炎症疾患を予防または治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、野菊(Chrysanthemum boreale Makino)抽出物またはこの分画物を含む抗炎症活性を持つ組成物に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
人の皮膚は、老化が進行されるに応じて様々な内的及び外的要因による変化を経験する。内的には、新陳代謝を調節する各種ホルモンの分泌が減少し、兔疫細胞の機能及び細胞の活性が減少し、従って、生体及び生体タンパク質に必要な免疫タンパク質の生合成が減る。外的には、環境汚染及び紫外線がシワの増加、弾力減少、皮膚乾燥を含む、様々な変化を起こし、肝斑、そばかす、及び黒い斑点(age spot)などを増加させて皮膚悪化に至るようにする。現在は、ほとんどの人々が若くて美しく見えることを望むので、内的要因だけでなく、紫外線及びストレスのような、外的要因に起因した皮膚老化を予防または、改善しようとする強い欲求を持つ。
【０００３】
皮膚疾患中の一つであるアトピー皮膚炎(ＡＤ)は、免疫学的、遺伝的、薬理的、生理学的、及び環境的など複合因子的要因によって発病されるが、特に、感染、ストレス、季節と気候変化、刺激、及びアレルギー抗原などによって発病される。アトピー皮膚炎は、幼児から大人まで、すべての年齢層に発生する皮膚の慢性的な炎症である。
【０００４】
一般的に、アトピー皮膚炎の中で約８０％程度がＩｇＥと関連付けられてあり、これは、外因性形態(ＩｇＥ−媒介された)及び内因性形態(非−ＩｇＥ−媒介された)の２つの形態で分類され得る。増加されたＩｇＥ反応及び好酸球増加がアトピー皮膚炎患者で観察され、これは、Ｔｈ１サイトカインである、インターフェロン−γ生産の減少が隋伴する、ＩＬ−４、ＩＬ−５のようなＴｈ２サイトカインの増加された反応を反映する。これに係って、ピメクロリムス(pimecrolimus)、タクロリムス(tacrolimus)のような様々な免疫治療剤などの使用が試みされた。特に、免疫反応を直接的に抑制することができるＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞(Treg cells)の存在が最近知られた。Ｔｒｅｇ細胞は胸腺から起源し、様々なＴリンパ球の活性を制御する能力を持っている。更に、Ｔｒｅｇ細胞はそれらの表面にＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、ＣＤ２５及びＬＡＧ３の発現による大食細胞及びＢ細胞のような兔疫細胞などの間に免疫抑制信号を伝達するとか相互作用を抑制する。Ｔｒｅｇ細胞はＩＬ−１０の外にＴＧＦ−β、ＩＬ−３５のようなサイトカインを介して免疫抑制反応を誘導する。アトピー皮膚炎において、ＩＬ−４及びＩＬ−５のようなＴｈ２サイトカインはＴｈ２細胞発達の欠陷によって過量生産される一方、ＩＦＮ−γのようなＴｈ１サイトカインの生産は抑制される。最近、ＴＡＲＣ／ＣＣＬ１７、ＭＤＣ／ＣＣＬ２２、及びＣＴＡＣＫ／ＣＣＬ２に代表される、Ｔｈ２ケモカインがＴｈ２細胞発達に直接的な影響を及ぼすということが知られた。
【０００５】
サイトカインなどは、様々な細胞によって作られ、多くの互いに異なる作用をする。特に、同一のサイトカインが互いに異なる機能ができるから、サイトカインなどは分類するのに非常に難しい。Ｔ細胞が大食細胞が提示した抗原を認識して活性化されて免疫反応を誘導する場合、多数のサイトカインなどがこの過程に関与する。先天免疫と適応免疫の各段階、抗原認識からエフェクター段階まで関与し、一部サのイトカインなどはリンパ球やその他の血球の生成にも関与している。核心的サイトカインの作用は下記の通りである。
【０００６】
ＩＬ−１(インターロイキン１)は、活性化された単核食菌細胞 、上皮細胞、または血管内皮細胞などによって作られ、炎症反応を媒介するサイトカインである。ＩＬ−１には、ＩＬ−１αとＩＬ−１βの２つの類型がある。少量のＩＬ−１は、ＣＤ４−Ｔ細胞とＢ細胞を活性化し、炎症細胞を刺激することができる。しかし、過量のＩＬ−１は、ホルモンとして作用して発熱及び急性期反応を誘導する。
【０００７】
ＩＬ−４(インターロイキン４)は、約２０ｋＤａのサイズを持ったタンパク質であって、ＣＤ４Ｔ細胞及び活性化された肥満細胞によって作られ、Ｂ細胞成長因子として作用する。ＩＬ−４は、またＢ細胞の兔疫グロブリンのクラススィッチに関与する分化因子として作用し、ＣＤ４Ｔ細胞、肥満細胞、大食細胞などをまた活性化することができる。
【０００８】
ＩＬ−１０(インターロイキン１０)は、ＩＬ−２と相乗作用によって活性化されたＴ細胞のＣＴＬｓへの分化を誘導し、またＮＫ細胞とＬＡＫ細胞、及び活性化されたＴ細胞の増殖を誘導する。
【０００９】
ＩＦＮ−γ(インターフェロン−γ、またＩＩ型インターフェロンとして公知される)は、ＣＤ４Ｔ細胞またはＣＤ８Ｔ細胞によって作られて免疫反応を調節するので、従って免疫インターフェロンとも呼ぶ。ＩＦＮ−γはＴ細胞、Ｂ細胞、好中性ＮＫ細胞、血管内皮細胞に作用してそれらを活性化させることができ、大食細胞活性化因子として作用して１種と２種ＭＨＣの発現を増加させる。ＩＦＮ−γは、また他のインターフェロンのように、ウイルスの増殖を抑制することができる。
【００１０】
ＮＯは、生理的状態下で血管拡張剤として機能する。しかし、大食細胞が炎症サイトカインによって刺激された場合、ｉＮＯＳ(誘導型酸化窒素合成剤)  によって生成されたＮＯは、病理的状態下で炎症反応を誘導してＣＯＸ−２(シクロオキシゲナーゼ−２)の活性を増加させ、アラキドン酸カスケードを介した炎症反応を増幅させる。
【００１１】
ＣＯＸ−２は、アラキドン酸からプロスタグランジンを生産するようにする核心的な調節子である。ＣＯＸ−２は、アラキドン酸をＰＧＧ２に転換する。酵素によってＰＧＧ２はＰＧＥ２、ＰＧＤ２、ＰＧＦ２、ＰＧＩ２、またはＴＸＡ２に転換され、これらは体内で互いに異なる作用をする。代表的なＣＯＸ−２阻害剤としてはアスピリンである。
【００１２】
最近の研究傾向は、免疫調節によるＩｇＥ生産の上向及び下向調節に焦点を合わせており、またアトピー皮膚炎を持った患者に対する臨床的に活用可能な、漢方薬の効果が活発に研究されている。しかし、野菊のアトピー皮膚炎に対する効果に対しては全然報告されたところがない。
【００１３】
〔発明の開示〕
〔技術的課題〕
従って、本発明者などは野菊抽出物及びこの分画物に血清ＩｇＥ濃度減少効果を含めて炎症疾患で炎症−関連の因子に対する抑制効果を持つことを証明した。この研究を基礎にして、本発明者らは野菊抽出物及びこの分画物が各種炎症疾患、特に、アトピー皮膚炎の予防的及び治療的効果を奏することを見つけ、これによって本発明を完成した。
【００１４】
〔課題解決方法〕
本発明の目的は、野菊抽出物またはこの分画物を含む、抗炎症活性を持つ組成物を提供することである。
【００１５】
本発明のまた他の目的は、野菊抽出物またはこの分画物を含む組成物を有効成分として含む、炎症疾患の予防または治療用薬学組成物、及び化粧品組成物、食品組成物、炎症疾患の予防または改善用医薬外品組成物を提供することである。
【００１６】
本発明のまた他の目的は、野菊抽出物またはこの分画物を含む組成物を有効成分として含むフィルター充填剤を含む、炎症疾患の予防または改善用軟水器を提供することである。
【００１７】
本発明のまた他の目的は、野菊抽出物またはこの分画物を含む組成物を炎症疾患が発病した、または発病可能性のある患者に投与して炎症疾患を予防または治療する方法を提供することである。
【００１８】
〔発明の効果〕
本発明による組成物は、抗炎症活性を持つので、アトピー皮膚炎のような炎症疾患の予防または治療に使用することができ、また医薬外品、化粧品、食品、及び軟水器を含む、様々な用途に適用され得る。
【００１９】
〔図面の簡単な説明〕
＜図１＞  図１は野菊抽出物とこの分画物取得過程を示したフローチャートである；
＜図２＞  図２はＤＮＣＢ処理されたＮＣ／Ｎｇａマウスの感作スケジュールを示したものである;
＜図３＞  図３は薬物処理前及び薬物処理後のスコアによるＮＣ／Ｎｇａ  マウスモデルの変化を示す写真である。
【００２０】
＜図４＞  図４は野菊、タンポポ、黄伯、石菖蒲、ヒイラギモチ、及びソメイヨシノ抽出物処理後のアトピー皮膚炎が誘導されたＮＣ／Ｎｇａマウスモデルの掻く行動変動値を示すものである；
＜図５＞  図５は野菊、タンポポ、黄伯、石菖蒲、ヒイラギモチ、及びソメイヨシノ抽出物処理後のアトピー皮膚炎が誘導されたＮＣ／Ｎｇａマウスモデルの臨床評価結果を示すものである；
＜図６＞  図６は野菊、タンポポ、黄伯、石菖蒲、ヒイラギモチ、及びソメイヨシノ抽出物処理後のアトピー皮膚炎が誘導されたＮＣ／Ｎｇａマウスモデルの血清ＩｇＥ濃度変化を示したものである；
＜図７＞  図７は薬物処理前及び野菊抽出物処理後のスコアによるＮＣ／Ｎｇａマウスモデルのアトピー症状の変化過程を示す写真である；
＜図８＞  図８は野菊抽出物処理後のアトピー皮膚炎が誘導されたＮＣ／Ｎｇａマウスモデルの臨床評価結果を示すものである；
＜図９＞  図９は野菊抽出物処理後のアトピー皮膚炎が誘導されたＮＣ／Ｎｇａマウスモデルの掻く行動結果を示すものである；
＜図１０＞  図１０は野菊抽出物処理後のアトピー皮膚炎が誘導されたＮＣ／Ｎｇａマウスモデルの耳厚さを長さ(ｍｍ)で測定した結果を示すものである；
＜図１１＞  図１１は野菊抽出物処理後のアトピー皮膚炎が誘導されたＮＣ／Ｎｇａマウスモデルの耳厚さを体積(％)で測定した結果を示すものである；
＜図１２＞  図１２は（ａ）野菊抽出物の経口投与後のアトピー皮膚炎が誘導されたＮＣ／Ｎｇａマウスモデルの血清中のＩｇＥ濃度を測定した結果を示すものである；（ｂ）野菊抽出物の皮膚塗布後のアトピー皮膚炎が誘導されたＮＣ／Ｎｇａマウスモデルの血清中のＩｇＥ濃度を測定した結果を示すものである；
＜図１３＞  図１３は野菊抽出物処理後のアトピー皮膚炎が誘導されたＮＣ／Ｎｇａマウスモデルの血清中のＩＦＮ−γ濃度を測定した結果を示すものである；
＜図１４＞  図１４は野菊抽出物処理後のアトピー皮膚炎が誘導されたＮＣ／Ｎｇａマウスモデルの血清中のＩＬ−４濃度を測定した結果を示すものである；
＜図１５＞  図１５は野菊抽出物処理後のアトピー皮膚炎が誘導されたＮＣ／Ｎｇａマウスモデルの耳組織断面を撮影したものである；
＜図１６＞  図１６は野菊抽出物の分画物処理後のＬＰＳ−誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞内酸化窒素生成を測定したものである；
＜図１７＞  図１７は野菊抽出物の分画物処理後のＬＰＳ−誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞内ｉＮＯＳ(誘導型酸化窒素合成剤)  生成を測定したものである；
＜図１８＞  図１８は野菊抽出物の分画物処理後のＬＰＳ−誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞内ＰＧＥ２生成を測定したものである；
＜図１９＞  図１９は野菊抽出物の分画物処理後のＬＰＳ−誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞内ＣＯＸ−２生成を測定したものである；
＜図２０＞  図２０は野菊抽出物の分画物処理後のＬＰＳ−誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞内ＩκＢ生成を測定したものである；
＜図２１＞  図２１は野菊抽出物の分画物処理後のＬＰＳ−誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞内Ｐ５０生成を測定したものである；
＜図２２＞  図２２は野菊抽出物の分画物処理後のＬＰＳ−誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞内Ｐ６５生成を測定したものである；
＜図２３＞  図２３は甘菊抽出物の分画物処理後のＬＰＳ−誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞内酸化窒素生成を測定したものである；
＜図２４＞  図２４は甘菊抽出物の分画物処理後のＬＰＳ−誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞内ｉＮＯＳ(誘導型酸化窒素合成剤)  発生量を測定したものである；
＜図２５＞  図２５は甘菊抽出物の分画物処理後のＬＰＳ−誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞内ＰＧＥ２生成を測定したものである；
＜図２６＞  図２６は甘菊抽出物の分画物処理後のＬＰＳ−誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞内ＣＯＸ−２生成を測定したものである；
＜図２７＞  図２７は甘菊抽出物の分画物処理後のＬＰＳ−誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞内ＩκＢ生成を測定したものある；
＜図２８＞  図２８は甘菊抽出物の分画物処理後のＬＰＳ−誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞内Ｐ６５生成を測定したものである；
＜図２９＞  図２９はＭＴＳ分析方法による野菊抽出物及びこの分画物の細胞毒性を測定したものである。
【００２１】
〔発明を実施するための最良の形態〕
前記目的を達成するための一態様として、本発明は、野菊抽出物またはこの分画物を含む、抗炎症活性を持つ組成物を提供する。
【００２２】
本発明者らは野菊、タンポポ、黄伯、石菖蒲、ヒイラギモチ及びソメイヨシノの抽出物を選択し、炎症疾患に対するこれらの効果を試した。その結果、野菊が最も優れた効果を奏することを確認した。具体的な実験例(実施例１)によれば、アトピー皮膚炎誘導モデルに野菊、タンポポ、黄伯、石菖蒲、ヒイラギモチ及びソメイヨシノの抽出物を処理し、その後、臨床評価を行った場合、野菊抽出物が紅斑、浮腫、血腫(excoriation)、掻痒、皮膚乾燥症、糜爛及び苔癬化で低い点数を記録し(表１と２、及び図４と５)、血中兔疫グロブリンＥ濃度が他の植物に比べて、著しく低いことを確認することができた(表３及び図６)。
【００２３】
野菊はキキョウ目に属する菊科の一種で宿根性多年草であり、韓国、日本、中国北部、シベリアに分布し、主に谷または野で見られる。全体の高さは１−１．５ｍである。葉は互生し、下部の物は花が咲く時に倒れる。中央部の物は長い楕円状の卵形であり、長さ５−７ｍ、幅４−６ｃｍである。基部が少し心臟底であるとか截底であり、羽状で裂け、裂片はサイズがほとんど類似し、長い楕円形であり、鈍頭であり、端に鋭い欠刻状の鋸歯がある。葉柄は、長さ１−２ｃｍである。側裂片は２対であって、裂片の間が広く、表面に毛が少しあり、裏面の中間に付く毛がある。花は９−１０月に咲いて、直径１．５ｃｍとして枝の端と主茎の端に山状のように垂れ下がる。総苞の長さは４ｍｍ、直径が８ｍｍである。苞片は３−４行に配列され、外片は線形または長い楕円形であって表に毛があり、内片は長い楕円形で端が膜質である。舌状花冠は長さ５−７ｍｍであって黄色であり、筒状花冠は端が５つに裂ける。痩果は倒卵形で長さ１ｍｍ程度であり、５−６行があり、冠毛が無く、１０−１１月に実る。茎の高さは１−１．５ｍで枝が多く裂けて、全体に短い白色毛がある。この植物は四方に多くの根が伸びている。どのような土壌でもよく育ち、特に肥沃な所でよく育ち、じめじめする所よりも乾燥した所が好きである。
【００２４】
本発明での野菊は、学名Chrysanthemum boreale Makinoをいい、商業的に販売されるものを購入して使用するとか、自然から採取、または栽培されたものを使用することができる。さらに、本発明による野菊抽出物は、天然、雑種、または変種植物の様々な器官から抽出されることができ、例えば、根、茎、葉、花、実の果肉及び皮だけでなく植物組織培養物から抽出可能であるが、野菊の花から抽出するのが最も好ましい。
【００２５】
本発明による野菊抽出物は、水、有機溶媒またはこれらの混合溶媒を用いて抽出することによって取得することができる。好ましくは、野菊を一定時間乾燥させて粉砕し、続いて熱水抽出、冷浸抽出、加熱抽出、超音波抽出、及び冷却抽出のような当業界に公知された通常的な方法によって抽出する。抽出方法は特に制限されず、有効成分が破壊されないとか最小化された条件で室温または加温して抽出することができる。好ましくは、洗浄及び乾燥で異物が除去された野菊を粉砕して取得した野菊乾燥物を水、低級Ｃ１〜Ｃ４のアルコール、またはこれらの混合溶媒で抽出することができ、より好ましくは、水またはメタノールを使用して抽出することができる。
【００２６】
前記野菊の熱水抽出は、野菊を水に入れて沸かした後、野菊をフィルタリングする段階、ろ過液を濃縮させた後、賦形剤で粉末化させる段階、及び粉末化された野菊抽出物を結合剤と共に混合して打錠する段階からなることができる。
【００２７】
前記賦形剤は、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、またはゼラチンであり得る。
【００２８】
また、前記結合剤は、例えば、デキストリン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、予備ゼラチン化澱粉、ポビドン(ポリビニルピロリドン)、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、またはエチルセルロースであり得る。
【００２９】
抽出時間は特に限定はないが、約２〜５時間程度であることができ、熱水抽出時の温度は７０〜１００℃、好ましくは８０〜１００℃であり得る。野菊重量の１０〜３０体積倍、好ましくは１５体積倍〜２５体積倍、より好ましくは約２０体積倍の水を用いて野菊熱水抽出物を製造するのに使用することができる。
【００３０】
一方、本発明で野菊分画物は、前記野菊抽出物から分画して得ることができる。分画物を得るために、当業界に公知された様々な溶媒が使用されることができ、好ましくは有機溶媒が使用され得る。例えば、ペンタン、ヘキサン、２、２、４−トリメチルペンタン、ジカイン、シクロヘキサン、二硫化炭素、四塩化炭素、クロロブタン、ジイソプロピルエテル、クロロホルム、アセトン、ニトロプロパン、ブタノン、ジクロロエタン、ピリジン、プロパノール、メタノール、及び酢酸エチルが含まれる。前記有機溶媒としては、非極性有機溶媒が好ましく、特に好ましいものとして、クロロホルム、エタノール、酢酸エチルまたはこれらの混合溶媒などがあるが、これに限定されない。本発明の具体的な実施例でクロロホルム、エタノールまたはこれらの混合溶媒を使用してそれぞれの分画物を得り、すべての分画物が活性を示した。これらのうち、クロロホルム分画物が最高の抗炎症活性を示した(表８、９及び１０)。
【００３１】
本願における用語‘‘抗炎症活性’’は、炎症を抑制することをいい、前記炎症はどのような刺激に対する身体の内部防御メカニズムの一つであって、３つを併発する複雑な病変をいう：組織変質、循環障害と滲出、組織増殖。より具体的に、炎症は先天性免疫の一部であり、他の動物でのように人間の先天性免疫は、病原体に特異的に存在する細胞表面のパターンを認識する。貪食細胞はそのような表面を持つ細胞を非自己として認識する。もし、病源菌が身体の物理的な障壁を破って入って来たら炎症反応が生じる。炎症反応は、傷部位に侵入した微生物などに対する敵対環境を作る非特異的な防御作用である。炎症反応で、傷がつくとか外部感染体が体内に入って来た時、初期段階免疫反応に関与する白血球などが寄り集まってサイトカインを放出する。従って、細胞内サイトカインの発現量が炎症反応活性化の指標になる。
【００３２】
本発明者らは、野菊を対象に実験を行い、野菊抽出物及びこの分画物に抗炎症活性があることを見つけた。本発明の具体的な実験例(実施例３)で、本発明者らは野菊抽出物またはこの分画物を処理した後の炎症疾患動物モデルで血清ＩｇＥ(兔疫グロブリンＥ)、ＩＦＮ−γ(インターフェロン−γ)、ＩＬ−４(インターロイキン４)の濃度の減少(それぞれ図１２、１３、１４)；細胞内ＮＯ(酸化窒素)の発現量の減少(図１５)；ｉＮＯＳ(誘導型酸化窒素合成剤)  発現の減少(図１７)；細胞内ＰＧＥ２(プロスタグランジンＥ２)発現量の減少(図１８)；細胞内ＣＯＸ−２タンパク質発現量の減少(図１８)；及びＩκＢのリン酸化抑制、ＮＦ−κＢの細胞核内移動の減少(図２０、図２１、図２２)を示すことを確認した。これら物質は、すべて炎症反応またはアレルギー反応で特異的に発現量が増加される物質であるので、これら物質の発現量減少は、野菊抽出物が抗炎症活性を持つことを示す。
【００３３】
特に、菊科の多年草で高さ６０〜９０ｃｍであり、茎は普通赤黒い色を帯び、葉は筋違いに出て羽状で深く裂けてあり、１０〜１１月に茎の端に香ばしい黄色い花が咲く特性を持つ甘菊と比較した時、野菊(５ｕｇ／ｍｌ)のメタノール(ＭｅＯＨ)抽出物、クロロホルム(ＣＨＣｌ３)抽出物、及びエタノール(ＥｔＯＡｃ)抽出物が炎症疾患動物モデルで細胞内酸化窒素(ＮＯ)の量をそれぞれ約３８％、７８％、３０％減少することを確認し(実施例３−２)、一方、それぞれの濃度２．５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌの甘菊のメタノール抽出物は９７．９％、８９．０％、３７．３％、及び１７．８％に減少することを確認し、甘菊のクロロホルム分画物では５０．６％、１９．２％、１６．６％、７．５％に減少することを確認した(表１４)。このような結果は、野菊抽出物はより少量で甘菊抽出物と同等なまたは上昇された効果を示すことが分かった。また、ｉＮＯＳ(誘導型酸化窒素合成剤)  量の減少(図２４)；細胞内ＰＧＥ２(プロスタグランジンＥ２)量の減少(図２５)；細胞内ＣＯＸ−２タンパク質発現量の減少(図２６)；及びＩκＢのリン酸化抑制及びＮＦ−κＢの細胞質から細胞核への移動の減少(図２７及び図２８)を比較した時、野菊抽出物及びこの分画物が甘菊抽出物及びこの分画物に比べて少ない含量でもより効果的に示された。
【００３４】
酸化窒素(ＮＯ)は、生理的状態で拡張剤として機能する。しかし、大食細胞が炎症サイトカインによって刺激された場合、ｉＮＯＳによって生成された酸化窒素は、病理的状態で炎症反応を起こして、ＣＯＸ−２(シクロシクロオキシゲナーゼ−２)の活性を増強させ、アラキドン酸カスケードを介した炎症反応を増幅させる。
【００３５】
ＩＦＮ−γは、タイプＩＩインターフェロンとも呼ばれ、ＣＤ４Ｔ細胞またはＣＤ８Ｔ細胞によって作られて免疫反応を調節し、従って、免疫インターフェロンとも呼ぶ。ＩＦＮ−γはＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、及び内皮細胞に作用してそれらを活性化させ、大食細胞活性因子として作用して１種と２種ＭＨＣ発現を増加させる。ＩＦＮ−γは、また他のインターフェロンのようにウイルスの増殖を抑制することができる。
【００３６】
ＩＬ−４は、約２０ｋＤａサイズを持つタンパク質であり、ＣＤ４Ｔ細胞及び活性化された肥満細胞によって作られ、Ｂ細胞成長因子として作用する。ＩＬ−４は、またＢ細胞で兔疫グロブリンのクラススイチングに関与する分化因子として作用することができ、ＣＤ４Ｔ細胞、肥満細胞、及び大食細胞をまた活性化することができる。
【００３７】
前記の結果などによって、本発明による野菊抽出物またはこの分画物は、炎症疾患、特にアレルギー性炎症疾患に対する優秀な予防及び治療活性を持つ。
【００３８】
前記野菊抽出物及びこの分画物は、人工的に合成された化合物ではなく、天然抽出物から獲得した成分を基盤にする。従って、これらは安全で、非毒性であり、副作用がなくて長期間の服用が可能である。また、前記組成物は、人間だけでなく、炎症疾患を持った猿、犬、猫、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、牛、羊、豚、ヤギを含む、炎症性疾患を持った動物に使用されることもできる。
【００３９】
従って、本発明は、野菊抽出物またはこの分画物を有効成分として含む炎症疾患予防及び治療用薬学組成物の製造に適用されることができ、この組成物を投与して炎症疾患を予防または治療することができる。
【００４０】
本発明のまた他の態様として、本発明は、野菊抽出物またはこの分画物を有効成分として含む炎症疾患の予防または治療用薬学組成物、及びこの分画物を含む組成物を炎症疾患が発病したまたは発病する可能性がある患者に投与して炎症疾患を予防または治療する方法に関する。
【００４１】
前記炎症疾患は、アレルギー性炎症疾患であることができ、前記アレルギー性炎症疾患には、慢性閉鎖性肺疾患(ＣＯＰＤ)、喘息、リウマチ関節炎、アトピー皮膚炎、及び炎症性腸疾患が含まれることができる。しかし、炎症反応及びアレルギー反応によって誘導される疾病は制限なく含まれることができ、好ましくはアトピー皮膚炎である。
【００４２】
本願における用語‘‘予防’’は、本発明による野菊抽出物またはこの分画物を含む組成物の投与で前記疾患の発病を抑制または遅延させるすべての行為を意味する。
【００４３】
本願における用語‘‘治療’’は、本発明による野菊抽出物またはこの分画物を含む組成物の投与で前記疾患の症状が好転するとか良いに変更するすべての行為をいう。
【００４４】
本発明の具体的な実験例(実施例２)によれば、本発明者らは野菊抽出物を処理した後の炎症疾患動物モデルで、１）紅斑、浮腫、血腫、掻痒、皮膚乾燥症、糜爛及び苔癬化の減少(図７及び図８)；２）耳浮腫の減少(図１０及び図１１)；３）掻く行動の減少(図９)及び４）線維芽細胞増殖、コラーゲン層異常増殖、及び潰瘍の抑制、肥満細胞の浸潤の減少、及び好中球とリンパ球の浸潤による炎症減少(図１５)が示されることを確認し、これは炎症疾患、特に、アトピー皮膚炎に対する治療学的効果を示すものである。
【００４５】
本発明による野菊抽出物またはこの分画物を含む炎症疾患予防及び治療用薬学組成物は、ラット、マウス、家畜、人間を含む哺乳動物に様々な経路で投与され得る。投与のすべての方式は予想されることができ、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内注射によって投与され得る。好ましくは、前記組成物は皮膚などに塗布することができ、経口投与が最も好ましい。
【００４６】
本発明の炎症疾患予防及び治療用薬学組成物は、薬学的に有効な量で投与される。本願における用語‘‘薬学的に有効な量’’は、医学的治療に適用可能である合理的な受益／危険の比率で疾患を治療するに十分な量を意味する。本組成物の有効用量水準は、個体及び重症度、年齢、性別、感染されたウイルス種類、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路、排出比率、治療期間、同時使用される薬物、及びその他に医学分野によく知られた要因に応じて決定され得る。前記有効な量は、当業者に認識されたように、投与の経路、賦形剤の使用及び他の薬剤との同時使用に応じて異なることができる。
【００４７】
本発明の炎症疾患予防及び治療用薬学的組成物は、これらの薬学的に許容される塩の形態、及びまた単独でまたは他の薬学的に活性化合物と組み合わせて使用され得る。
【００４８】
本発明の炎症疾患予防及び治療用薬学組成物は、哺乳動物に投与された後、活性成分の迅速、持続または遅延された放出を提供するように当業界によく知られた方法を使用して薬学的剤形に製造され得る。剤形の製造において、活性成分を担体とともに混合または希釈するとか、容器形態の担体内に封入させることが好ましい。
【００４９】
従って、本発明の炎症疾患予防及び治療用薬学組成物は、通常の方法によって散剤、  顆粒剤、  錠剤、  カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液の形態に剤形化して使用され得る。組成物の製造に通常的に使用する適切な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含むことができる。
【００５０】
例えば、本発明の薬学組成物に含まれることができる担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱油を持つことができる。剤形化する場合には、普通使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調製される。
【００５１】
経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれる。このような固形製剤は、前記抽出物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調製される。また、賦形剤の以外にステアリン酸マグネシウム及びタルクのような潤滑剤も使用され得る。
【００５２】
経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが含まれる。よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。
【００５３】
非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、  凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが含まれ得る。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール、マクロゴ−ル、ツイン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用され得る。
【００５４】
また他の態様として、本発明は、野菊抽出物またはこの分画物を有効成分として含む炎症疾患改善用食品組成物を提供する。
【００５５】
本発明の食品組成物は、丸剤、散剤、顆粒剤、注射剤、錠剤、カプセル剤または液剤の形態で製造されることができ、様々な食品など、例えば、飲み物、ガム、茶、ビタミン複合剤、健康補助食品類などに添加され得る。
【００５６】
本発明の食品組成物で含むことができる必須成分として、前記野菊抽出物またはこの分画物を含む組成物の他には、他の成分には特別な制限がなく、通常の食品のように様々な生薬抽出物、食品補助添加剤または天然炭水化物などを追加成分として含むことができる。
【００５７】
前記食品組成物は、野菊、タンポポ、黄伯、石菖蒲、ヒイラギモチ、及びソメイヨシノからなる群から選択された１種以上の生薬抽出物を更に含むことができる。
【００５８】
また、食品補助添加剤を更に含むことができるが、食品補助添加剤は、当業界に通常的に知られた、香味剤、風味剤、着色剤、充填剤、安定化剤などを含む。
【００５９】
前記天然炭水化物の例は、モノサッカライド(例えば、ブドウ糖、果糖など)、ジサッカライド(例えば、マルトス、スクロースなど)、及びポリサッカライド (例えば、デキストリン、シクロデキストリンなど)のような通常的な糖、及びキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどを含む。また、香味制として、タウマチン、ステビア抽出物(例えば、レバウジオシドＡ、グリチルリチンなど)のような天然香味剤及びサッカリン、アスパルテームなどのような合成香味剤を適切に使用することができる。
【００６０】
さらに、本発明の食品組成物は、様々な営養剤、ビタミン、鉱物(電解質)、風味剤(合成風味剤及び天然風味剤などのような)、着色剤、増進剤(チーズ、チョコレートなど)、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含むことができる。また、本発明の食品組成物は、天然フルーツジュース、フルーツジュース飲料、及び野菜飲料の製造のために使用され得る果肉を含むことができる。前記のこのような成分のそれぞれは、独立、またはこれらのどのような組み合わせでも使用することができる。
【００６１】
さらに、適用可能な飲食物には、いかなる制限もなく、例えば、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンデー類、スナック類、クッキー類、ピザ、ラーメン、ガム類、アイスクリーム類、スープ、飲料、茶、機能水、ドリンク剤、アルコール飲物、及びビタミン複合剤である。
【００６２】
また他の態様として、本発明は、野菊抽出物またはこの分画物を有効成分として含む組成物を含む化粧品組成物に関する。
【００６３】
本発明による化粧品組成物には、ｐＨ調節物質、香料、乳化剤、及び防腐剤などを通常的な方法を使用して付加し、化粧水、ゲル、水溶性パウダー、脂溶性パウダー、水溶性リキッド、クリームまたはエッセンスなどで剤形化され得る。
【００６４】
また他の態様として、本発明は、野菊抽出物またはこの分画物を有効成分として含む組成物を含む医薬外品組成物に関する。すなわち、本発明の組成物は、炎症疾患の予防または改善を目的に医薬外品組成物に添加され得る。
【００６５】
本発明の野菊抽出物またはこの分画物を医薬外品添加物として使用する場合、前記抽出物またはこの分画物をそのまま添加するとか、または通常的な方法によって他の医薬外品または医薬外品成分とともに使用され得る。有効成分の混合量は、使用目的(予防、健康または治療的処理)によって適合に決定され得る。好ましくは、前記医薬外品組成物は、消毒清潔剤、シャワーフォーム、口腔洗浄薬、ウェットティッシュ、洗剤石鹸、ハンドウォッシュ、加湿器充填剤、マスク、軟膏剤、コーティング剤またはフィルター充填剤の製造に使用され得る。本発明によるフィルター充填剤を含むフィルターは、様々な領域に使用されることができ、当業界に公知されたすべてのフィルタリング機器に使用され得る。
【００６６】
従って、また他の態様として、本発明は、前記フィルター充填剤を含む炎症疾患の予防または改善用軟水器を提供する。
【００６７】
本願における用語‘‘軟水器’’は、硬水に入っているカルシウムとマグネシウムのような陽イオンを除去して軟水を作る器具であって、硬水軟化機ともいうことで、軟水製造機能の他に空気清浄機能、浄水機能などを含むことができる。本軟水器は、この分画物を含む組成物を有効成分として含むフィルター充填剤を含むので、炎症疾患、特に、アトピー皮膚炎予防及び改善に効果的である。本軟水器は、その目的に応じて野菊抽出物またはこの分画物外に漢方薬を含んだ様々な成分を含むことができる。
【００６８】
〔発明の実施のための形態〕
以下、本発明を実施例によってより詳細に説明する。ただし、下記実施例は、本発明を例示するというだけ、本発明の内容が下記実施例によって限定されるのではない。
【００６９】
実施例１．サンプル抽出及びスクリーニング
（１）候補薬剤サンプル抽出
野菊、タンポポ、黄伯、石菖蒲、ヒイラギモチ、及びソメイヨシノをそれぞれ１００ｇを１００％メタノール(ＭｅＯＨ)を溶媒として１１０℃抽出器で３回繰り返し抽出し、ロータリー蒸発器を用いて減圧濃縮し、その後、凍結乾燥してそれぞれの１００％メタノール抽出物を取得した。
【００７０】
（２）ＮＣ／Ｎｇａマウスモデル導入
ＮＣ／Ｎｇａマウスは、ＪＡＫ３キナーゼの過リン酸化によるＩｇＥの生成の亢進によってもたらされた、自発的アトピー皮膚炎マウスモデルとしてよく知られている。最近、ＩｇＥとＴｈ２サイトカイン生成に必須なＳＴＡＴ６ノックアウトＮＣ／Ｎｇａマウスを作って試した結果、皮膚炎も自発的に誘導されたところ、これは皮膚炎が他の予想外のメカニズムによって誘導されることを示唆する(Ｊ．Ｉ．１９９９，１６２：１０５６−６３)。このような長所にもかかわらず、自発的な皮膚炎誘導比率が低く、誘導された皮膚炎の深刻性に大きい差がある。事実上、前記マウスモデルは、評価のための信頼できるモデルではない。従って、日本ではハプテン、ピクリルクロライドを用いて皮膚炎を人為的に誘導してこのような問題を解決している。しかし、ピクリルクロライドの場合、韓国内搬入が禁止されているので、本願では、構造的にピクリルクロライドと類似する、ＤＮＣＢ(１−クロロ２、４−ジニトロベンゼン、シグマ２３７３２−９)を用いて試験を進行して類似の結果を得ることができた。
【００７１】
このモデルによれば、アトピー皮膚炎の主な症状など(掻痒、ＩｇＥ生成増加、皮膚炎症)がすべて観察され、さらには、アトピー皮膚炎の治療剤としてよく知られている、局所ステロイドまたは経口用シクロスポリンによって症状が完全に癒された。従って、アトピー皮膚炎治療剤の効能を評価するための生体内モデルとしてＮＣ／Ｎｇａマウスモデルを導入した。
【００７２】
（３）ＮＣ／Ｎｇａマウスを用いたスクリーニング方法
自発的アトピー皮膚炎マウスモデルとして知られたＮＣ／Ｎｇａマウスを用いてアトピー皮膚炎を誘導し、その後、次のような方法を行って最も有用な薬剤を選定した。薬物選定は、次の実験群を用いて行った：ＤＮＣＢ溶液を処理しないアトピー皮膚炎が誘導されない正常群、ＤＮＣＢ溶液を処理してアトピー皮膚炎を誘導させた対照群、野菊抽出物を処理した経口投与群(１００ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ)、及び野菊抽出物(２００μｌ；１％希釈、２％希釈）を処理した皮膚塗布群。
【００７３】
Ａ．臨床評価
臨床評価は、ＤＮＣＢ(シグマ２３７３２−９)処理後、及び治療薬物(野菊、ヒイラギモチ、黄伯、タンポポ、石菖蒲、及びソメイヨシノの各１００ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ)の処理後、それぞれ２回実施した。アトピー皮膚炎の臨床評価は、実験有経験者２人以上がそれぞれ実施し、協議して決定した。特に、薬物処置が終わった後には写真を撮って保管した。目視評価結果は、次の５つの項目をそれぞれ評価したスコアの総合として示した。評価項目は、紅斑、掻痒と皮膚乾燥症、浮腫と血腫、糜爛、そして、苔癬化に分け、このそれぞれの項目を次のように採点した：無し（０）、僅か（１）、重症度（２）、及び激しい（３）：従って、スコアは、最小０点から最高１５点範囲であった。薬物処理の前と後のスコアを比較して減少した比率を決定し、運搬体を処理した群の減少比率と比較して有意性を検証した。
【００７４】
Ｂ．掻く行動評価
薬物投与後、即時、掻痒症を意味する掻く行動を３０分間観察した。後肢で掻く行動は、掻く行動１回として記録し、１秒以内に急速で頻繁に掻く行動も掻く行動１回として記録した。
【００７５】
Ｃ．血清ＩｇＥ濃度
血清ＩｇＥ濃度は、ＤＮＣＢ(シグマ２３７３２−９)を処理して皮膚炎症を誘導した後、候補者治療薬物(野菊、ヒイラギモチ、黄伯、タンポポ、石菖蒲、及びソメイヨシノの各１００ｍｇ／ｋｇ及び４００ｍｇ／ｋｇ)を処理した後、ＥＬＩＳＡを用いて決定した。薬物処理の前及び後の血清ＩｇＥ濃度を比較して減少した比率を求めた後、運搬体を処理した群の減少比率と比較して有意性を検証した。
【００７６】
Ａ．薬物処理群：[処理前ＩｇＥ(薬物)−処理後ＩｇＥ(薬物)]／処理前ＩｇＥ(薬物)
Ｂ．運搬体処理群：[処理前ＩｇＥ(運搬体)−処理後ＩｇＥ(運搬体)]／処理前ＩｇＥ(運搬体)。
【００７７】
（４）結果
Ａ．評価結果
臨床評価結果、野菊は、他の候補者薬物に比べて低いスコアを記録し、そのスコアは正常群に近接した。さらに、表１は、アトピー皮膚炎が誘導されたＮＣ／Ｎｇａマウスモデルの臨床評価を示したものである(図５)。
【００７８】
【表１】
2013512235.tif 000003
【００７９】
Ｂ．掻く行動評価結果
表２は、アトピー皮膚炎が誘導されたＮＣ／Ｎｇａマウスモデルの掻く行動の変動値を示したものである。掻痒症を意味する掻く行動を示すのか調査した結果、それぞれ野菊１００(ｍｇ／ｋｇ)及び野菊４００(ｍｇ／ｋｇ)を処理した時、３０．４±１．１(点)、２１．８±２．８(点)を記録した。この結果は、他の薬物のスコアと比較する際に低い(図４)。
【００８０】
【表２】
2013512235.tif 000004
【００８１】
Ｃ．血清ＩｇＥ濃度測定結果
血清ＩｇＥ濃度で、他の候補者薬物と比較する時、野菊が低いスコアを記録した。野菊１００(ｍｇ／ｋｇ)及び野菊４００(ｍｇ／ｋｇ)をそれぞれ処理した時、６３．４６±１６．９２(ｎｇ／ｍｌ)、４６．９９±８．８８(ｎｇ／ｍｌ)を記録した。表３は、アトピー皮膚炎が誘導されたＮＣ／Ｎｇａマウスモデルの血清中のＩｇＥ濃度変化を示したものである(図６)。
【００８２】
【表３】
2013512235.tif 000005
【００８３】
実施例２．アトピー皮膚炎に対する実験：ＮＣ／Ｎｇａマウス実験
２−１．実験方法
（１）ＮＣ／Ｎｇａマウスモデル導入
ＮＣ／Ｎｇａマウスをアトピー皮膚炎の主な症状など(掻痒、ＩｇＥ増加など)に対する野菊抽出物及びこの分画物の効果を試すために使用した。
【００８４】
（２）野菊の抽出及び分画
野菊１００ｇを１００％メタノール(ＭｅＯＨ)を溶媒として１１０℃抽出器で３回繰り返し抽出し、ロータリー蒸発器を用いて減圧濃縮した後、凍結乾燥してそれぞれの１００％メタノール抽出物を取得した。前記で取得した野菊の１００％メタノール抽出物のうち、３２．３ｇを熱水に溶かした後、クロロホルムと酢酸エチルを用いて分画した。その後、各分画物を濃縮して水分画物４．３ｇ、クロロホルム分画物２．７ｇ、及び酢酸エチル分画物０．５６ｇをそれぞれ取得した(図１)。
【００８５】
（３）試薬及び器機
１）試薬
−ＤＮＣＢ(Sigma 23732-9)
−オリーブオイル(Shinyo Chemical 912193)
−ＮＣ／Ｎｇａマウス(Central Lab．animal Inc., 韓国)
−マウスＩｇＥマウス用ＥＬＩＳＡキット(SHIBAYAGI Co., Ltd，日本)
−ＩＬ−４(R&D systems，Quantikine Immunoassay Kit，MN．米国)
−ＩＦＮ−γ(R&D systems，Quantikine Immunoassay Kit，MN．米国)
−退行性染色(Harris’hematoxylin，MUTO，日本)
−エオシン(MUTO，日本)
−カナダバルサム(JUNSEI，日本)。
【００８６】
２）器機
−ＥＬＩＳＡプレートリーダー：Versamax(Molecular Devices Co., 米国)
−プレートシェーカ：REO ROTOR(Hoefer Pharmacia Biotech Inc.)
−マイクロメータ(IP65 coolant proof，#293-240，mitutoyo，日本)
−マイクロトーム(HM325)
−クリッパ(JC-4005，JOAS Elec．CO., 韓国)。
【００８７】
（４）皮膚炎誘導及びサンプル処理
１）実験動物
５週齢のＮＣ／Ｎｇａマウスを中央実験動物(株)から供給されて実験動物として使用し、飼育場で１週間適応させた後、体重を測定(２２±３ｇ)した。１群当り６〜８匹を実験に使用した。実験期間中、固形飼料と水は自由に攝取させ、飼育室の温度(２１±１℃)、湿度(５０±５％)は、一定に維持した。実験開始の一日前、実験動物の耳の下端部分から尾の上端部分まで背中部位全体をマウス除毛用クリッパー(JC-4005，JOAS Elec．CO., 韓国)できれいに毛を除去した。すべての動物実験手続きは、韓国の慶煕大学校実験動物倫理委員会の事前審議を受けて動物実験倫理委員会の規定によって行われた。
【００８８】
２）アトピー皮膚炎の誘導及びサンプル処理
アトピー皮膚炎誘導のためにＮｃ／Ｎｇａマウスの背中部位を除毛した後、２４時間目に、免疫化のために０．５％ＤＮＣＢ(シグマ２３７３２−９)溶液(アセトン：オリーブオイル＝３：１)２００μｌを２週間毎日背中部位に塗布した。サンプル投与開始後３週目からは、１週間に３回ずつ０．５％ＤＮＣＢ溶液２００μｌを除毛された背中部位に塗布してアトピー皮膚炎を誘導した。各マウスの除毛された背中部位は、２週間ＤＮＣＢ処理してアトピーを誘導した後、４週間毎日サンプルを投与した(経口と皮膚塗布)。経口では１００ｍｇ／ｋｇ及び４００ｍｇ／ｋｇをそれぞれ投与し、外用では１％及び２％に希釈して２００μｌずつをそれぞれ塗布した。ＤＮＣＢ処理されたＮＣ／Ｎｇａマウスを用いたアトピー皮膚炎の誘導及びサンプル処理実験の過程は、図２に示した。
【００８９】
（５）評価方法
Ａ．臨床評価
ＮＣ／Ｎｇａマウスのアトピー皮膚炎は、一般的に使用される臨床的目視評価法を用いた。臨床評価は、ＤＮＣＢ処理直前、処理中間、薬物処理直前、薬物処理中間と薬物処理が終わる時にそれぞれ実施した。アトピー皮膚炎の臨床評価は、実験有経験者２人以上がそれぞれ実施し、協議して決定した。特に、薬物処理が終了した後には写真を撮って保管した。目視評価結果は、次の５つの項目をそれぞれ評価したスコアの総合として示した。評価項目は、紅斑、掻痒と皮膚乾燥症、浮腫と血腫、糜爛、そして、苔癬化を含み、これはそれぞれ次のように記録される：無し（０）、僅か（１）、重症度（２）、及び激しい（３）。従って、前記スコアは、最小０点から最高１５点の間の範囲である。アトピー皮膚炎のスコアリングは、実験有経験者２人以上がそれぞれ実施し、協議して決定した。特に、薬物処理が終了した後には写真を撮って保管した。
【００９０】
Ｂ．掻く行動評価
薬物投与直後、掻痒症を意味する掻く行動評価を３０分間観察した。後肢で掻く行動は、掻く行動１回として記録し、また１秒以内に急速で頻繁に掻く行動も掻く行動１回として記録した。
【００９１】
Ｃ．耳の厚さ測定
右耳の中央の厚さをマイクロメーター(IP65 coolant proof，#293-240，mitutoyo，日本)を用いて測定した。
【００９２】
Ｄ．血清ＩｇＥ、ＩＦＮ−γ、及びＩＬ−４濃度の測定
実験終了日に、マウスの心臓から採血した後、５、０００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離して血清を分離した。実験に使用する前まで−７０℃冷凍庫で保管し、使用する前に溶かして実験に使用した。Ｎｃ／Ｎｇａマウスの血清ＩｇＥ、ＩＬ−４、及びＩＦＮ−γ濃度は、それぞれマウス用ＥＬＩＳＡキット(SHIBAYAGI Co., Ltd，日本)、ＩＬ−４(R&D systems，Quantikine Immunoassay Kit，MN．米国)、ＩＦＮ−γ(R&D systems，Quantikine Immunoassay Kit，MN．米国)を使用して測定した。
【００９３】
ＩｇＥ濃度は、ＩｇＥマウス用ＥＬＩＳＡキット(SHIBAYAGI Co., Ltd，日本)の手続きによって測定した。すべての試薬は、室温で準備し、その後、直ちに使用した。
【００９４】
プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した後、ＩｇＥ標準溶液またはサンプル溶液(サンプル５μｌ＋バッファ４５μｌ)を５０μｌずつ各ウェルに分注し、マイクロプレートシェーカで軽く混合した。プレートを２時間室温(２０−２５℃)で培養させて反応させた後、緩衝溶液でプレートを３回洗浄した。ビオチン−コンジュゲートされた抗−ＩｇＥ抗体５０μｌを各ウェルに分注し、マイクロプレートシェーカで軽く混合した。プレートを２時間室温で培養させて反応させた後、洗浄緩衝液でプレートを３回洗浄した。各ウェルにＨＲＰ−アビジン溶液５０μｌを入れ、マイクロプレートシェーカで軽く混合した。前記プレートを１時間室温で培養させて反応させた。その後にクロマジェニック基質溶液５０μｌを入れ、マイクロプレートシェーカで軽く混合した。プレートを２０分間室温で培養させて反応させた。その後、各ウェルに反応中断剤５０μｌを入れて追加の色発現が止めるようによく混合した後、３０分内に４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００９５】
ＩＬ−４とＩＦＮ−γ濃度は、ＩＬ−４(R&D systems，Quantikine Immunoassay Kit，MN．米国)とＩＦＮ−γ(R&D systems，Quantikine Immunoassay Kit，MN．米国)の方法に従って測定した。
【００９６】
指示に従って、すべての試薬とサンプルを準備し、すべての試薬溶液は、室温で維持させ、２回繰り返し実験した。各ウェルにAssay Diluent ＲＤ１−１８(ＩＬ−４)またはＲＤ１−２１(ＩＦＮ−γ)５０μｌを入れた。正常群、対照群及びサンプルを各ウェル当り５０μｌずつ入れ、１分間負域をゆっくり軽くたたいて混合した。プレートを覆って、２時間室温で培養した。各ウェルの溶液をアスピレータで完壁に除去して洗浄した。この手続きを５回繰り返した。ＩＬ−４(マウスＩＬ−４コンジュゲート)またはＩＦＮ−γ(ＩＦＮ−γコンジュゲート)１００μｌを各ウェルに入れた。プレートを新しい接着カバーで覆って、２時間室温で培養した後、再び５回繰り返して洗浄した。  各ウェルに基質溶液１００μｌを入れ、遮光状態で３０分間室温で培養した。終結溶液１００μｌを各ウェルに入れ、プレートを軽くたたいて完全に混合した。３０分内に、各ウェルの吸光度は、４５０ｎｍで測定した値を５４０ｎｍ(または５７０ｎｍ)で測定した値で差し引いて補正した。
【００９７】
Ｅ．組織染色及び評価
実験終了後、マウスを犠牲させて背中と耳の組織を取り外して１０％中性ホルマリンで固定させた。その組織をパラフィンで包埋してパラフィン包埋ブロックを製作した。パラフィンブロックは、マイクロトーム(Ｍｉｃｒｏｍ−ＨＭ３２５)を用いてトリミングの薄切厚さを１０μｍ程度に整えた後、切断時３〜４μｍの厚さで組織切片を得る。得られた組織切片は、キシレンで脱パラフィン化させ、浸水段階[１００％アルコール(３分)→９０％アルコール(３分)→８０％アルコール(３分)→７０％アルコール(３分)→Ｄ．Ｗ(３分)]を経って、その後、染色[ハリスヘマトキシリン(４分)→洗浄→１％ＨＣｌアルコール(１回)→洗浄(１０分)→エオシン(１０−２０秒)]させた後、脱水段階[７０％アルコール(ディッピング)→８０％アルコール(ディッピング)→９５％アルコール(ディッピング)→１００％アルコール(ディッピング)→１００％アルコール(ディッピング)]と脱染色段階[キシレン(３分)→キシレン(３分)]を経って続いて密封した。
【００９８】
また、炎症の程度を評価するために、アトピー皮膚炎誘導皮膚の表皮厚さ、肥満細胞浸潤、好酸球浸潤、好中球とリンパ球浸潤、及び線維芽細胞増殖及びコラーゲン層異常増殖で組織学実験を行った。組織中の肥満細胞は、アルシアンブルーで染色して観察した。
【００９９】
Ｆ．統計分析
測定結果は、実験前後の平均を比較する時、対応t検定(paired t-test)で検定した。統計的有意性は、Ｐ＜０．０５、すなわち、５％未満にした。
【０１００】
２−２．実験結果
Ａ．臨床評価結果
正常群、ＤＮＣＢ誘導されたアトピー皮膚炎対照群、経口投与群(野菊抽出物１００ｍｇ／ｍＬ及び４００ｍｇ／ｍＬ)、皮膚塗布群(１％及び２％の野菊抽出物２００μｌ)の総６群でマウスの背中皮膚と耳で生じされたアトピー症状を１週間間隔で総５回繰り返し観察した。臨床評価では、図３を参考インデックスにした。
【０１０１】
正常群の皮膚はきれいだったし、対照群では紅斑、浮腫、角化、外被形成、及び苔癬化のような明白なアトピー症状が示された。サンプル経口投与群と皮膚塗布群で、いずれも対照群に比べてアトピー症状が著しく抑制されることを確認することができたが、経口投与群が皮膚塗布群より目視で観察する時、速く皮膚炎改善症状を示すことを観察することができた(図７)。
【０１０２】
アトピー皮膚炎誘導１週間目の臨床評価スコアは、対照群で６．２±O．８、経口投与群(野菊１００ｍｇ／ｋｇ及び４００ｍｇ／ｋｇ)でそれぞれ５．５±２．１、５．５±１．１であり、皮膚塗布群(野菊１％及び２％)でそれぞれ５．２±１．０、５．５±１．４で示され、アトピー皮膚炎がすべての群で誘導されることを示す。
【０１０３】
アトピー皮膚炎誘導後２週目の臨床評価スコアは、対照群で１１．３±１．５、経口投与群(野菊１００ｍｇ／ｋｇ及び４００ｍｇ／ｋｇ)でそれぞれ１０．０±３．３、１０．７±２．１で示され、皮膚塗布群(野菊１％及び２％)でそれぞれ１０．３±２．０、１０．３±２．８で示され、まだ野菊抽出物の効果が発揮されなかったことを確認することができた。
【０１０４】
アトピー皮膚炎誘導後４週目、すなわち、薬物を２週間投与した後の臨床評価スコアは、対照群はで７．３±０．８であり、経口投与群(野菊１００ｍｇ／ｋｇ及び４００ｍｇ／ｋｇ)でそれぞれ４．７±１．３、５．２±１．３で示され、野菊抽出物の効果が発揮され始めて、アトピー皮膚炎が改善されていることが有意に認められた。臨床評価スコアは、皮膚塗布群(野菊１％及び２％)でそれぞれ７．５±１．５及び８．３±１．９でアトピー皮膚炎が改善されなかったことを示した。
【０１０５】
アトピー皮膚炎誘導後６週目、すなわち、薬物を４週間投与した後の臨床評価スコアは、対照群で７．３±０．８であり、経口投与群(野菊１００ｍｇ／ｋｇ及び４００ｍｇ／ｋｇ)でそれぞれ３．４±２．１及び３．３±０．５、皮膚塗布群(野菊１％及び２％)でそれぞれ４．５±２．１及び６．３±１．０でそれぞれ示され、アトピー皮膚炎が野菊抽出物によって改善されたことを示した。
【０１０６】
本実験結果を介して、正常群の皮膚はきれいだったし、アトピー誘導対照群では紅斑、浮腫、角化、外被形成、及び苔癬化のような様々なアトピー症状が明らかに示された。サンプル経口投与群とサンプル皮膚塗布群で、いずれもアトピー皮膚炎誘導された対照群に比べてアトピー症状が著しく抑制されることを確認した。しかし、アトピー皮膚炎誘導後の４週目に、アトピー皮膚炎の改善は経口投与群で観察され、アトピー皮膚炎誘導後の６週目に、アトピー皮膚炎の改善は皮膚塗布群で観察され、これは皮膚塗布群より経口投与群でアトピー皮膚炎がより速く緩和されることを示す(図８)。言い換えれば、経口投与群が皮膚塗布群よりアトピー皮膚炎をより効果的に改善することを示した。
【０１０７】
下記の表で、ＮＯＲは正常群、ＣＯＮは対照群、ＣＢＰ１は経口投与群(野菊抽出物１００ｍｇ／ｋｇ)、ＣＢＰ４は経口投与群(野菊抽出物４００ｍｇ／ｋｇ)、ＣＢＳ１は皮膚塗布群(野菊の１％抽出物２００μｌ)、ＣＢＳ２は皮膚塗布群(野菊の２％抽出物２００μｌ)を示す。表４は、アトピー皮膚炎が誘導されたＮＣ／Ｎｇａマウスモデルの臨床評価結果を示したものである。
【０１０８】
【表４】
2013512235.tif 000006
【０１０９】
すべてのデータは、平均±ＳＤ(Ｎ＝５)で表された。
＃＃：ｐ＜０．０１、正常群と比較
＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、対照群と比較。
【０１１０】
Ｂ．掻く行動
マウスの掻く行動は、対照群では３０分当り６３．０±２．９回、経口投与群(野菊１００ｍｇ／ｋｇと４００ｍｇ／ｋｇ)でそれぞれ３０分当り３０．４±１．４回と２１．８±２．９回、皮膚塗布群(野菊１％と２％)でそれぞれ４５．４±２．７回と４５．０±３．４回の掻く行動が観察された。
【０１１１】
すなわち、すべての処理群で掻く行動の減少が観察され、掻く行動は、経口投与群と皮膚塗布群で約５１〜６５％と２８〜２９％程度に抑制された(図９)。表５は、アトピー皮膚炎が誘導されたＮＣ／Ｎｇａマウスモデルの掻く行動測定結果を示したものである。
【０１１２】
【表５】
2013512235.tif 000007
【０１１３】
すべてのデータは、平均±ＳＤ(Ｎ＝５)で表された。
＃＃：ｐ＜０．０１、正常群と比較
＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、対照群と比較。
【０１１４】
Ｃ．アトピー皮膚炎誘導された組織表皮厚さ測定結果−耳浮腫に対する効果
浮腫を測定するために、マウスの耳厚さを実験開始から終了まで毎週測定した。正常群では耳の厚さは変化がなかったが、アトピー皮膚炎誘発対照群では耳の厚さが著しく増加した。耳浮腫の抑制は、野菊の経口投与群と皮膚塗布群で観察された。特に、耳浮腫の著しい抑制は経口投与群で観察された。表６(上端及び下端)は、アトピー皮膚炎が誘導されたＮＣ／Ｎｇａマウスモデルの耳厚さを測定した結果を示したものであるm(図１０と１１)。
【０１１５】
【表６】
2013512235.tif 000008
【０１１６】
すべてのデータは、平均±ＳＤ(Ｎ＝５)で表された。
＃＃：ｐ＜０．０１、正常群と比較
＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、対照群と比較。
【０１１７】
Ｄ．血清ＩｇＥ、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４測定結果
表７は、ＤＮＣＢ感作と攻撃によってアトピー皮膚炎誘導されたマウスで血清ＩｇＥ、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の濃度を測定するためのＥＬＩＳＡの結果を示す。
【０１１８】
＜１＞血清ＩｇＥ濃度測定
経口投与実験において、対照群で１０６．８±１３．４ｎｇ／ｍｌであり、経口投与群(野菊１００ｍｇ／ｋｇ及び４００ｍｇ／ｋｇ)ではそれぞれ６３．５±１６．９ｎｇ／ｍｌと４７．６±８．９ｎｇ／ｍｌであって、これは有意味した減少を示す(Ｐ≦０．００１)(図１２ａ)。皮膚塗布実験で、血清ＩｇＥの濃度は対照群で６１．６±９．３ｎｇ／ｍｌであり、皮膚塗布群(野菊１％と２％)ではそれぞれ３７．２±６．６ｎｇ／ｍｌと４６．７±７．１ｎｇ／ｍｌであり、これは濃度の減少を示す(図１２ｂ)。
【０１１９】
＜２＞血清ＩＦＮ−γ濃度測定
血清ＩＦＮ−γ濃度は対照群で４６．７±２１．５ｐｇ／ｍｌであり、経口投与群(野菊１００ｍｇ／ｋｇ及び４００ｍｇ／ｋｇ)ではそれぞれ３．３±０．４ｐｇ／ｍｌと３．５±０．５ｎｇ／ｍｌ、皮膚塗布群(野菊１％と２％)ではそれぞれ３．５±０．４ｐｇ／ｍｌと３．６±０．４ｐｇ／ｍｌで、これは有意味した減少を示す(図１３)。
【０１２０】
＜３＞血清ＩＬ−４濃度測定結果
血清中ＩＬ−４濃度は対照群で５．４±０．７ｐｇ／ｍｌであり、経口投与群(野菊１００ｍｇ／ｋｇ及び４００ｍｇ／ｋｇ)ではそれぞれ１．８±１．０ｐｇ／ｍｌと２．３±１．０ｐｇ／ｍｌ、皮膚塗布群(野菊１％と２％)では１．７±０．５ｐｇ／ｍｌと１．８±１．１ｐｇ／ｍｌで、これは有意味した減少を示す(図１４)。表７は、血清ＩｇＥ、ＩＦＮ−γ、及びＩＬ−４の濃度測定結果を示したものである。
【０１２１】
【表７】
2013512235.tif 000009
【０１２２】
すべてのデータは、平均±ＳＤ(Ｎ＝５)で表された。
＃＃：ｐ＜０．０１、正常群と比較
＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、対照群と比較。
【０１２３】
Ｅ．組織の観察
実験に使用されたマウスは、実験終了後に犠牲させ、その後、耳組織を取り外して１０％ホルマリン溶液で固定させた。その組織をパラフィン包埋し、３〜４μｍの厚さで切断し、Ｈ＆Ｅ(Hematoxylin & Eosin)方法で染色した。潰瘍、アトピー皮膚炎誘導された組織の表皮厚さ、肥満細胞浸潤、好酸球浸潤、好中球とリンパ球浸潤、及び線維芽細胞増殖とコラーゲン層異常増殖を調査した。
【０１２４】
正常群の耳組織写真で耳軟骨組織が均一に配列されており、皮下層、真皮、及び表皮のすべてが均一に配列されており、潰瘍、出血または炎症は観察されなかった(図１５)。
【０１２５】
対照群の耳組織写真で、深刻な重症の潰瘍と出血が観察され、好中球浸潤による炎症が組織に散在されており、耳軟骨組織は好中球浸潤による炎症によって一部が破壊され、皮膚の中まで好中球浸潤による炎症が拡散していることも観察された。深刻な重症の線維芽細胞増殖とコラーゲン層異常増殖が観察され、バクテリア群集による化膿性炎症も観察された(図１５)。
【０１２６】
皮膚塗布群の耳組織写真(野菊１％)で皮膚の中に好中球浸潤による軽微な出血及び軽微な炎症が観察され、コラーゲン層異常増殖も観察されたが、対照群に比べてはその症状が改善された(図１５)。
【０１２７】
皮膚塗布群の耳組織写真(野菊２％)で軽微な好中球浸潤が観察され、一部の個体では軽微な潰瘍及び出血が観察されたが、対照群に比べてはその症状が改善された(図１５)。
【０１２８】
経口投与群(野菊１００ｍｇ／ｋｇ)の耳組織写真で、潰瘍及び出血が観察されなかったし、一部の個体でコラーゲン層の異常増殖による皮膚層の炎症及び線維芽細胞増殖が観察されたが、対照群に比べてはその症状が改善された(図１５)。
【０１２９】
経口投与群(野菊４００ｍｇ／ｋｇ)の耳組織写真で、潰瘍と出血、及びコラーゲン層の異常増殖による炎症及び線維芽細胞増殖が観察されなかったし、これはその症状が対照群に比べてかなり改善されたことを示した(図１５)。
【０１３０】
結論的に、正常群では潰瘍が観察されなかったが、対照群では深刻な潰瘍が観察された。大部分の経口投与群(野菊１００ｍｇ／ｋｇと４００ｍｇ／ｋｇ)及び皮膚塗布群(野菊１％と２％)では潰瘍が観察されなかった。
【０１３１】
好中球とリンパ球浸潤は正常群では観察されなかったし、対照群では激しい好中球とリンパ球浸潤が観察された。大部分の経口投与群(野菊１００ｍｇ／ｋｇ及び４００ｍｇ／ｋｇ)と皮膚塗布群(野菊１％及び２％)では軽微な好中球とリンパ球の浸潤が観察されたが、対照群に比べては改善された。
【０１３２】
線維芽細胞増殖とコラーゲン層異常増殖は正常群では観察されなかったし、対照群では深刻な重症の線維芽細胞増殖とコラーゲン層異常増殖が観察された。経口投与群(４００ｍｇ／ｋｇ)と皮膚塗布群(２％野菊)では線維芽細胞増殖とコラーゲン層異常増殖が観察されなかったが、経口投与群(野菊１００ｍｇ／ｋｇ)と皮膚塗布群(１％野菊)の一部の個体では様々な線維芽細胞増殖とコラーゲン層異常の段階が観察されたが、その症状は対照群に比べては改善された。
【０１３３】
また、４００倍の比率で顕微鏡の一視野中に入って来た肥満細胞個数を確認した場合に、正常群では２．３５個が観察され、アトピー皮膚炎誘導された群では７．６５個が観察され、対照群で肥満細胞の数が増加したことを確認した。皮膚塗布群(野菊１％)では８．５個肥満細胞、皮膚塗布群(野菊２％)では８．８５個肥満細胞、経口投与群(野菊１００ｍｇ／ｋｇ)では７．１５個肥満細胞、経口投与群(野菊４００ｍｇ／ｋｇ)では６．２６５個肥満細胞が観察され、経口投与群(野菊４００ｍｇ／ｋｇ)で肥満細胞の数が対照群より改善されたことを示した。
【０１３４】
実施例３．細胞性炎症因子の測定
３−１．実験方法
（１）実験方法
Ａ．細胞の培養
本実験では、ミューリン大食細胞ＲＡＷ２６４．７細胞株を韓国細胞株銀行から分譲受けて実験を行ったた。ＲＡＷ２６４．７細胞をＤＭＥＭ。ＲＡＷ２６４．７細胞で育ち、２×１０５細胞／ｍｌの濃度でＴ−フラスコに接種してじめじめするＣＯ２培養器(５％ＣＯ２、９５％空気)で３７℃の条件で２４時間培養した。その後、細胞をＦＢＳが入っていない培地に希釈されたＬＰＳ(１０μｇ／ｍｌ)で２４時間処理し、ＦＢＳが入っていない培地に希釈された薬物(１ｍｇ／ｍｌ)で再び処理した。２４時間後に、前記細胞を実験に使用した。
【０１３５】
Ｂ．亜硝酸塩の測定
誘導型酸化窒素合成剤(ｉＮＯＳ)の活性をＮＯ(酸化窒素)の生成量を測定することによって決定した。ＲＡＷ２６４．７細胞でＮＯ生成を測定するために、硝酸塩／亜硝酸塩色度分析法キット(Nitrate/Nitrite Colorimetric assay kit)を細胞質ＮＯ２−を測定するのに使用した。実験方法は、グリース溶液を用いて製造者の指示(Cayman Chemical Company)に従って行った。
【０１３６】
Ｃ．ｉＮＯＳ(誘導型酸化窒素合成剤)  発現のウエスタンブロット分析
ＲＡＷ２６４．７細胞でｉＮＯＳ(誘導型酸化窒素合成剤)  発現に対する野菊抽出物及びこの分画物の効果を確認するためにウエスタンブロットを行った。
【０１３７】
野菊抽出物及びこの分画物を処理した細胞及び対照群を採取してＰＢＳで２回洗浄した。Ｐｒｏ−ｐｒｅｐＴＭ(イントロン、韓国)試薬１００μｌを加えて−２０℃で１０分間放置した。その後、４℃で１２、０００ｒｐｍで１０分遠心分離して上澄液を取得した。取得したタンパク質溶液をＰｒｏ−ｍｅａｓｕｒｅＴＭ(イントロン、韓国)試薬を使用して測定し、５０μｇのタンパク質を取ってサンプル緩衝液と混合した。混合物を９５℃で５分間加熱した後、−２０℃で保管した。準備したサンプルは、１２％のＳＤＳ−アクリルアミドゲルに電気泳動させた後、ＰＶＤＦ膜でタンパク質を移動させた。移動が終わった膜を５％のスキムミルク溶液に室温で１時間ブロックさせた後、ｉＮＯＳ１次抗体を５％スキムミルク溶液に決められた比率で希釈して４℃で一晩置いた。翌日、ＴＢＳＴで５分ずつ３回洗浄した後、抗−マウス２次抗体を１時間室温で培養させた。その後、ＴＢＳＴで１０分ずつ３回洗浄した後、ＥＣＬウエスタン基質(ピアス、＃３２１６)溶液と１分間反応させた後、Ｘ−線フィルム(コダック)で現像した。
【０１３８】
Ｄ．ＣＯＸ−２抑制のウエスタンブロット分析
ＰＧＥ２を生成するＣＯＸ−２の発現に対する野菊抽出物及びこの分画物の効果を調査するために、ウエスタンブロット分析を実施した。野菊抽出物を処理した細胞及び対照群を採取してＰＢＳで２回洗浄した。Ｐｒｏ−ｐｒｅｐＴＭ試薬１００μｌを加えて−２０℃で１０分間放置した。その後、４℃で１２、０００ｒｐｍで１０分遠心分離して上澄液を取得した。取得されたタンパク質溶液をＰｒｏ−ｍｅａｓｕｒｅＴＭ試薬を使用してタンパク質濃度を測定し、５０μｇのタンパク質を取ってサンプル緩衝液と混合した。混合物を９５℃で５分間加熱した後、−２０℃で保管した。完成されたサンプルは、１２％のＳＤＳ−アクリルアミドゲルに電気泳動させた後、ＰＶＤＦ膜でタンパク質を移動させた。その後、移動が終わった膜を５％のスキムミルク溶液に室温で１時間ブロックさせ、ＣＯＸ−２の１次抗体を５％スキムミルク溶液に決められた比率で希釈して４℃で一晩中培養した。翌日、ＴＢＳＴで５分ずつ３回洗浄し、抗−マウスとヤギ２次抗体を１時間室温で培養させた。その後、膜をＴＢＳＴで１０分ずつ３回洗浄し、ＥＣＬウエスタン基質(ピアス、＃３２１６)溶液と１分間反応させた後、Ｘ−線フィルム(コダック)に露出させて現像した。
【０１３９】
Ｅ．ＰＧＥ２生成測定
野菊抽出物及びこの分画物によるＣＯＸ−２の活性を調査するために、細胞内ＰＧＥ２の濃度を測定した。実験は、ＮＯ分析(亜硝酸塩分析法)と同様な方法で行い、細胞質溶液を取って遊離されたＰＧＥ２の量をＰＧＥ２  ＥＩＡシステム(アマシャム、ＲＰＮ２２２)のプロトコルに従って測定した。
【０１４０】
Ｆ．ＩκＢタンパク質のリン酸化及び分解(ウエスタンブロット)
ＬＰＳ誘導されたＩκＢタンパク質のリン酸化及び分解に対する野菊抽出物及びこの分画物の効果を調査するためにウエスタンブロットを実施した。
【０１４１】
それぞれのサンプルを処理した細胞及び対照群を採取してＰＢＳで２回洗浄した後、Ｐｒｏ−ｐｒｅｐＴＭ(イントロン)試薬１００μｌを加えて−２０℃で１０分間放置した後、４℃で１２、０００ｒｐｍで１０分遠心分離して上澄液を取得した。取得された細胞内タンパク質溶液をＰｒｏ−ｍｅａｓｕｒｅＴＭ試薬(イントロン)を使用してタンパク質濃度を測定し、５０μｇのタンパク質を取ってサンプル緩衝液と混合した。混合物を９５℃で５分間加熱した後、−２０℃で保管した。準備したサンプルを１２％のＳＤＳ−アクリルアミドゲルに電気泳動させた後、ＰＶＤＦ膜でタンパク質を移動させた。その後、移動が終わった膜を５％のスキムミルク溶液に室温で１時間ブロックさせ、ＩκＢα一次抗体を５％スキムミルク溶液に決められた比率で希釈して４℃で一晩置いた。翌日、ＴＢＳＴで５分ずつ３回洗浄した後、抗−マウス２次抗体を１時間室温で反応させた。その後、ＴＢＳＴで１０分ずつ３回洗浄した後、ＢＣＩＰ−ＮＢＴ溶液(ナカライテスク、日本)で発色させた。
【０１４２】
Ｇ．細胞質及び核内のＮＦ−κＢ発現
ＬＰＳ誘導されたＮＦ−κＢタンパク質の核内移動に対する野菊抽出物及びこの分画物の効果を調査するために、細胞質及び核内ＮＦ−κＢを分離(ｐ５０、ｐ６５)してウエスタンブロットを実施した。
【０１４３】
それぞれのサンプルを処理した実験群及び対照群を採取してＰＢＳで2回洗浄した。０．４ｍｌ細胞溶解緩衝液(１０ｍＭのＨＥＰＥＳ(ｐＨ７．９)、１０ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＰＭＳＦ、２．０μｇ／μｌアプロチニン)を添加し、それを１５分間４℃で放置した。１０％ＮＰ４０の２５μｌを添加し、ボルテックスで１０秒間激しく混合した。反応液を４℃で１、３００ｒｐｍで２分間遠心分離して細胞質内タンパク質である上澄液を取得した。上層液を除去した沈殿物に５０μｌのアイス−コールド核抽出緩衝液(２０ｍＭのＨＥＰＥＳ(ｐＨ７．９)、０．４ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＰＭＳＦ、２．０μｇ／μｌのロイペプチン、そして、２．０μｇ／μｌのアプロチニン含有)を添加し、間歇的に振ってながら１５分間４℃で培養した。その後、サンプルを４℃で１、３００ｒｐｍで２分間遠心分離して核蛋白質である上澄液を取得した。取得された細胞質及び核溶液をＰｒｏ−ｍｅａｓｕｒｅＴＭ試薬を使用してタンパク質濃度を測定し、３０μｇのタンパク質を取ってサンプル緩衝液と混合した。混合物を９５℃で５分間加熱した後、−２０℃で保管した。準備したサンプルを１２％のＳＤＳ−アクリルアミドゲルに電気泳動させた後、ＰＶＤＦ膜でタンパク質を移動させた。移動が終わった後、膜を５％のスキムミルク溶液に室温で１時間ブロックさせた後、ＮＦ−κＢｐ６５1次抗体を５％スキムミルク溶液に決められた比率で希釈して４℃で一晩置いた。翌日ＴＢＳＴで５分ずつ３回洗浄した後、抗−マウス２次抗体を１時間室温で反応させた。その後、ＴＢＳＴで１０分ずつ３回洗浄した後、ＢＣＩＰ−ＮＢＴ溶液(ナカライテスク、日本)で発色させた。
【０１４４】
（２）試薬及び器機
−ＤＭＥＭ培地(Gibco BRL Co., 米国)
−ＲＰＭＩ１６０４培地((Gibco BRL Co., 米国)
−牛胎児血清(Fetal bovine serum，FBS，Gibco BRL Co.，米国)
−ペニシリン(Gibco BRL Co., 米国)
−ストレプトマイシン(Gibco BRL Co., 米国)
−硝酸塩／亜硝酸塩色度分析法キット(Cayman Chemical Co.，米国)
−脂質多糖類(Sigma Co.，米国)
−Ｐｒｏ−ｐｒｅｐＴＭタンパク質抽出溶液(Intron Biotechnology Co.，韓国)
−Ｐｒｏ−ｍｅａｓｕｒｅＴＭタンパク質測定溶液(Intron Biotechnology Co.，韓国)
−ＣＯＸ−２単一クローン抗体(Santa Cruz Biotechnology Co.，米国)
−アンチ−ヤギアンチボディー(Zymed Co.，米国)
−メタノール(ＭｅＯＨ)(徳山工業(株)、韓国)
−クロロホルム(徳山工業(株)、韓国)
−ＥＬＩＳＡリーダー：バルサマックス(Molecular Devices Co.，米国)
−ＦＴ−０３(Grass，米国）。
【０１４５】
３−２．実験結果
Ａ．亜硝酸塩の測定結果
ＬＰＳ誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞で生成されたＮＯの量を測定するために、硝酸塩／亜硝酸塩色度分析法キットを用いて細胞質に存在する亜硝酸塩の形態として測定した。実験方法は、グリース試薬を使用して製造者(Cayman Chemical Company)の指示に従って行った。その結果、５μｇ／ｍｌの濃度で亜硝酸塩の生成が対照群に比べてメタノール(ＭｅＯＨ)抽出物、クロロホルム(ＣＨＣｌ３)分画物、酢酸エチル(ＥｔＯＡｃ)分画物でそれぞれ約３８％、７８％、３０％減少した(図１６)。表８は、ＲＡＷ２６４．７細胞内ＬＰＳ−誘導された亜硝酸塩生成に対する野菊抽出物及びこの分画物の効果を示したものである。
【０１４６】
【表８】
2013512235.tif 000010
【０１４７】
Ｂ．ｉＮＯＳ(誘導型酸化窒素合成剤)  発現のウエスタンブロット分析
野菊がＲＡＷ２６４．７細胞でｉＮＯＳ(誘導型酸化窒素合成剤)  発現に対する効果をウエスタンブロット分析を介して確認した。その結果、ｉＮＯＳ(誘導型酸化窒素合成剤)発現が対照群に比べてメタノール(ＭｅＯＨ)抽出物、クロロホルム(ＣＨＣｌ３)分画物、酢酸エチル(ＥｔＯＡｃ)分画物でそれぞれ、約１９％、約９８％、約０．５％が減少した(図１７)。表９は、ＲＡＷ２６４．７細胞内ＬＰＳ−誘導されたｉＮＯＳ(誘導型酸化窒素合成剤)  発現に対する野菊抽出物及び分画物の効果を示したものである。
【０１４８】
【表９】
2013512235.tif 000011
【０１４９】
Ｃ．ＰＧＥ２測定結果
野菊抽出物によるＣＯＸ−２の活性を調査するために、細胞内ＰＧＥ２量を測定した。その結果、各ＰＧＥ２の生成が対照群に比べてメタノール抽出物、クロロホルム(ＣＨＣｌ３)分画物、酢酸エチル(ＥｔＯＡＣ)分画物でそれぞれ約２４％、８８％、及び１０％減少した(図１８)。表１０は、ＲＡＷ２６４．７細胞内ＬＰＳ−誘導されたＰＧＥ２発現に対する野菊抽出物及びこの分画物の効果を示したものである。
【０１５０】
【表１０】
2013512235.tif 000012
【０１５１】
Ｄ．ＣＯＸ−２発現のウエスタンブロット分析
ＲＡＷ２６４．７細胞でＣＯＸ−２発現に対する野菊抽出物の効果をウエスタンブロットを介して確認した。その結果、ＣＯＸ−２の発現が対照群に比べてＣＨＣｌ３分画物、ＥｔＯＡｃ分画物ではそれぞれ約３７％、２３％が減少したが、ＭｅＯＨ抽出物では約２６％増加した(図１９)。表１１は、ＲＡＷ２６４．７細胞内ＣＯＸ−２発現に対する野菊抽出物及びこの分画物の効果を示したものである。
【０１５２】
【表１１】
2013512235.tif 000013
【０１５３】
Ｅ．ＩκＢ発現のウエスタンブロット分析
野菊抽出物によるＰ５０／Ｐ６５の活性を調査するために、Ｐ５０／Ｐ６５の抑制子であるＩκＢの量を測定した。その結果、対照群に比べて、ＭｅＯＨ抽出物、ＣＨＣｌ３分画物、及びＥｔＯＡｃ分画物でその量がそれぞれ約６１％、６５％、及び３９．６％減少した(図２０)。表１２は、ＲＡＷ２６４．７細胞内ＬＰＳ−誘導されたＩκＢ発現に対する野菊抽出物及びこの分画物の効果を示したものである。
【０１５４】
【表１２】
2013512235.tif 000014
【０１５５】
Ｆ．ＮＦ−κＢ(Ｐ５０、Ｐ６５)発現のウエスタンブロット分析
Ｐ５０／Ｐ６５活性に対する野菊抽出物の効果を確認した。その結果、Ｐ５０発現が、対照群に比べて、ＭｅＯＨ抽出物、ＣＨＣｌ３分画物、及びＥｔＯＡｃ分画物でそれぞれ約２８％、４２％、及び３６％減少し(図２１)、Ｐ６５発現が、対照群に比べて、ＭｅＯＨ抽出物、ＣＨＣｌ３分画物、及びＥｔＯＡｃ分画物でそれぞれ約１８％、２２％、及び２０％減少した(図２２)。表１３は、ＲＡＷ２６４．７細胞内ＬＰＳ−誘導されたＮＦ−Κｂ(Ｐ５０、Ｐ６５)発現に対する野菊抽出物及びこの分画物の効果を示したものである。
【０１５６】
【表１３】
2013512235.tif 000015
【０１５７】
３−３．比較例−甘菊
（１）サンプルの抽出
１）材料
本実験で使用された甘菊(学名：Chrysanthemi Indici Flos)は、小菊類の花で、雪菊、黄菊、または金菊と呼ばれ、韓国の慶尚北道永川で栽培され、２００７年１０月３日に採取した。サンプルで使用された薬剤の一部は韓国の慶煕大学校漢方医科大学本草学教室に保管した。
【０１５８】
２）サンプルの抽出と分画
＜１＞サンプルの抽出
甘菊１００ｇを１００％メタノール(ＭｅＯＨ)を溶媒として１１０℃抽出器で３時間ずつ３回繰り返し抽出し、回転濃縮蒸発機を用いて減圧濃縮して１００％メタノール抽出物３２．５ｇを取得した。
【０１５９】
＜２＞分画
上で取得した甘菊メタノール抽出物３２．５ｇを蒸溜水に溶かした後、クロロホルム(ＣＨＣｌ３)を用いて分画し、水(Ｈ２Ｏ)分画物１２．９ｇとクロロホルム分画物２．９ｇを取得した。
【０１６０】
３）試薬及び器機
−ＤＭＥＭ培地(Hyclone，米国)
−牛胎児血清(Fetal bovine serum，FBS，Gibco BRL Co.，米国)
−ペニシリン(Gibco BRL Co.，米国)
−ストレプトマイシン(Gibco BRL Co.，米国)
−細胞Ｔｉｔｅｒ９６(Promega Co.，米国)
−硝酸塩／亜硝酸塩色度分析法キット(Cayman Chemical Co.，米国)
−脂質多糖類(Sigma Co.，米国)
−Ｐｒｏ−ｐｒｅｐＴＭタンパク質抽出溶液(Intron Biotechnology Co.，韓国)
−Ｐｒｏ−ｍｅａｓｕｒｅＴＭタンパク質測定溶液(Intron Biotechnology Co.，韓国)
−ＣＯＸ−２単一クローン抗体(BD Bioscience Pharmingen Co.，米国)
−ｉＮＯＳ単一クローン抗体(BD Bioscience Pharmingen Co.，米国)
−アンチ−マウスアンチボディー(cell Signalling Co.，米国)
−プロスタグランジンＥ２ｂｉｏｔｒａｋ ＥＬＩＳＡシステム(BD Bioscience Pharmingen Co.，米国)
−ＥＣＬウエスタン基質(ピアス、＃３２１６、Rockford、  米国。）
−RayBio mouse Inflammation Antibody Array I(AAM-INF-1-8，RayBiotech，Norcross，GA，米国)
−ＥＬＩＳＡリーダー：バルサマックス(Molecular Devices Co.，米国)
−ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計(Spectrophotometer)(Gilson Co.，米国)。
【０１６１】
（２）実験方法
１）亜硝酸塩の測定
ＮＯ(酸化窒素)の生成を測定することによってｉＮＯＳ(誘導型酸化窒素合成剤)の活性を測定した。ＲＡＷ２６４．７細胞内でＮＯ生成は、硝酸塩／亜硝酸塩色度分析法キットを用いて細胞質に存在する亜硝酸塩の形態として測定した。実験方法は、製造者(Cayman Chemical Company)の指示に従って測定した。すべての測定値は、平均±ＳＤ(標準偏差)で表された。有意性判定のためにスチューデントＴ−テストを使用した。すべての実験は３回繰り返し実験した。
【０１６２】
２）ｉＮＯＳ発現測定
ＮＯの生成を誘導する酵素であるｉＮＯＳ発現に対する甘菊抽出物及びこの分画物の効果を調査するためにウエスタンブロットを行った。
【０１６３】
甘菊抽出物を処理した細胞及び対照群を採取してＰＢＳで２回洗浄した。Ｐｒｏ−ｐｒｅｐＴＭ(イントロン、韓国)試薬１００μｌを加えて−２０℃で１０分間放置した。４℃で１２、０００ｒｐｍで１０分遠心分離して上澄液を取得した。取得されたタンパク質溶液をＰｒｏ−ｍｅａｓｕｒｅＴＭ(イントロン、韓国)試薬を使用して測定し、５０μｇのタンパク質を取ってサンプル緩衝液と混合した。９５℃で５分間加熱した後、−２０℃で保管した。準備したサンプルを１２％のＳＤＳ−アクリルアミドゲルに電気泳動させた後、ＰＶＤＦ膜でタンパク質を移動させた。移動が終わった膜を５％のスキムミルク溶液に室温で１時間ブロックさせた後、ｉＮＯＳ一次抗体を５％スキムミルク溶液に決められた比率で希釈して４℃で一晩置いた。翌日、ＴＢＳＴで５分ずつ３回洗浄した後、抗−マウス２次抗体を１時間室温で培養させた。再びＴＢＳＴで１０分ずつ３回洗浄し、ＥＣＬウエスタン基質(ピアス、＃３２１６)溶液と１分間反応させた後、Ｘ−線フィルム(コダック)で現像した。
【０１６４】
３）ＰＧＥ２生成測定
甘菊抽出物及びこの分画物によるＣＯＸ−２の活性を調査するために、細胞内ＰＧＥ２(プロスタグランジンＥ２)の量を測定した。実験は、ＮＯ分析と同様の方法で行い、細胞質溶液を取って放出されたＰＧＥ２の量をプロスタグランジンＥ２酵素免疫分析Ｂｉｏｔｒａｋ(ＥＩＡ)システム(アマシャム、ＲＰＮ２２２)の実験法に従って測定した。
【０１６５】
４）ＣＯＸ−２発現測定
ＰＧＥ２を生成するＣＯＸ−２の発現に対する甘菊抽出物及びこの分画物の効果を調査するためにウエスタンブロットを行った。
【０１６６】
それぞれのサンプルを処理した細胞及び対照群を採取してＰＢＳで２回洗浄した。Ｐｒｏ−ｐｒｅｐＴＭ試薬１００μｌを加えて−２０℃で１０分間放置した後、４℃で１２、０００ｒｐｍで１０分遠心分離して上澄液を取得した。取得されたタンパク質溶液をＰｒｏ−ｍｅａｓｕｒｅＴＭ試薬を使用してタンパク質濃度を測定し、５０μｇのタンパク質を取ってサンプル緩衝液と混合した。混合物を９５℃で５分間加熱した後、−２０℃で保管した。準備したサンプルを１２％のＳＤＳ−アクリルアミドゲルに電気泳動させた後、ＰＶＤＦ膜でタンパク質を移動させた。移動が終わった膜を５％のスキムミルク溶液に室温で１時間ブロックさせた後、ＣＯＸ−２の１次抗体を５％スキムミルク溶液に決められた比率で希釈して４℃で一晩置いた。翌日、ＴＢＳＴで５分ずつ３回洗浄した後、抗−マウス２次抗体を１時間室温で培養させた。その後、ＴＢＳＴで１０分ずつ３回洗浄し、ＥＣＬウエスタン基質(ピアス、＃３２１６)溶液と１分間反応させた後、Ｘ−線フィルム(コダック)で現像した。
【０１６７】
５）ＩκＢタンパク質のリン酸化及び分解測定
ＬＰＳ誘導されたＩκＢリン酸化及び分解に対する甘菊抽出物及びこの分画物の効果を調査するために、ウエスタンブロットを行った。
【０１６８】
それぞれのサンプルを処理した細胞及び対照群を採取してＰＢＳで２回洗浄した。Ｐｒｏ−ｐｒｅｐＴＭ試薬１００μｌを加えて−２０℃で１０分間放置した後、４℃で１２、０００ｒｐｍで１０分遠心分離して上澄液を取得した。取得されたタンパク質溶液をＰｒｏ−ｍｅａｓｕｒｅＴＭ試薬(イントロン)を使用してタンパク質濃度を測定し、５０μｇのタンパク質を取ってサンプル緩衝液と混合した。混合物を９５℃で５分間加熱した後、−２０℃で保管した。準備したサンプルを１２％のＳＤＳ−アクリルアミドゲルに電気泳動させた後、ＰＶＤＦ膜でタンパク質を移動させた。移動が終わった膜を５％のスキムミルク溶液に室温で１時間ブロックさせた後、ＩκＢα一次抗体を５％スキムミルク溶液に決められた比率で希釈して４℃で一晩置いた。翌日、ＴＢＳＴで５分ずつ３回洗浄した後、抗−マウス２次抗体を１時間室温で反応させた。その後、ＴＢＳＴで１０分ずつ３回洗浄し、ＢＣＩＰ−ＮＢＴ溶液(ナカライテスク、日本)で発色させた。
【０１６９】
６）細胞質及び核内のＮＦ−κＢ発現測定
ＬＰＳ誘導されたＮＦ−κＢ核内の移動に対する甘菊抽出物及びこの分画物の効果を調査するために、細胞質及び核タンパク質を分離してウエスタンブロット分析を行った。
【０１７０】
それぞれのサンプルを処理した実験群及び対照群を採取してＰＢＳで２回洗浄した。０．４ｍｌ細胞溶解緩衝液(１０ｍＭのＨＥＰＥＳ(ｐＨ７．９)、１０ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＰＭＳＦ、２．０μｇ／μｌのアプロチニン)を添加した。その後、１５分間４℃で放置し、２５μｌ１０％ＮＰ４０を添加した後、ボルテックスで１０秒間激しく混合した。反応液を４℃で１、３００ｒｐｍで２分間遠心分離して細胞質内タンパク質を含む上澄液を取得した。上層液を除去した沈殿物に５０μｌアイス−コールド核抽出物緩衝液(２０ｍＭのＨＥＰＥＳ(ｐＨ７．９)、０．４ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＰＭＳＦ、２．０μｇ／μｌのロイペプチン、そして、２．０μｇ／μｌのアプロチニン含有)を添加して間歇的に振ってながら１５分間４℃で培養した。その後、反応液を４℃で１、３００ｒｐｍで２分間遠心分離して核蛋白質上澄液を取得した。取得された細胞質及び核溶液をＰｒｏ−ｍｅａｓｕｒｅＴＭ試薬を使用してタンパク質濃度を測定し、３０μｇのタンパク質を取ってサンプル緩衝液と混合した。混合物を９５℃で５分間加熱した後、−２０℃で保管した。準備したサンプルを１２％のＳＤＳ−アクリルアミドゲルに電気泳動させた後、ＰＶＤＦ膜でタンパク質を移動させた。移動が終わった後、膜を５％のスキムミルク溶液に室温で１時間ブロックさせた後、ＮＦ−κＢｐ６５１次抗体を５％スキムミルク溶液に決められた比率で希釈して４℃で一晩置いた。翌日、ＴＢＳＴで５分ずつ３回洗浄した後、抗−マウス２次抗体を１時間室温で反応させた。その後、ＴＢＳＴで１０分ずつ３回洗浄し、ＢＣＩＰ−ＮＢＴ溶液(ナカライテスク、日本)で発色させた。
【０１７１】
（３）実験結果
１）亜硝酸塩の測定結果
亜硝酸塩発現を測定した結果、それぞれの亜硝酸塩生成は、サンプル１２．５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、及び１００μｇ／ｍｌの濃度で、対照群に比べて、メタノール抽出物ではそれぞれ９７．９％、８９．０％、３７．３％、１７．８％、クロロホルム分画物ではそれぞれ５０．６％、１９．２％、１６．６％、７．５％で示された。すなわち、メタノール分画物５０μｇ／ｍｌ以上とクロロホルム分画物２５μｇ／ｍｌ以上の濃度で５０％以上亜硝酸塩生成を抑制されたこととして示された。表１４は、２６４．７細胞内ＬＰＳ−誘導されたＲＡＷ亜硝酸塩生成に対する甘菊抽出物及びこの分画物の効果を示したものである(図２３)。
【０１７２】
【表１４】
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【０１７３】
＃：ｐ＜０．０５、正常群と比較
＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、対照群と比較
すべてのデータは、平均±ＳＤ(Ｎ＝３)で表された。
【０１７４】
総合すれば、甘菊抽出物は、メタノール抽出物５０μｇ／ｍｌ以上とクロロホルム分画物２５μｇ／ｍｌ以上の濃度で５０％以上亜硝酸塩生成を抑制するが、野菊抽出物は、(実施例３−２)メタノール抽出物１０μｇ／ｍｌ以上、クロロホルム分画物１．２５μｇ／ｍｌ以上及び酢酸エチル分画物１０μｇ／ｍｌ以上の濃度で５０％以上亜硝酸塩生成を抑制したところ、これは著しく低い濃度の野菊抽出物及びこの分画物が、甘菊抽出物及びこの分画物と比較して、同等またはそれ以上の亜硝酸塩生成抑制効果を示す。
【０１７５】
２）ｉＮＯＳ発現測定結果
甘菊抽出物及びこの分画物の細胞毒性結果及び亜硝酸塩生成結果を参考して２５μｇ／ｍｌ濃度でｉＮＯＳ発現を測定した。ｉＮＯＳ発現は、ウエスタンブロットを介してＲＡＷ２６４．７細胞で確認した。
【０１７６】
それぞれのｉＮＯＳ発現量がメタノール抽出物及びクロロホルム抽出物で７４．９％及び０．０％であり、２５．１％及び１００．０％の減少率を示し、水分画物では６９．７％で示され、３０．３％の減少率を示した(図２４)。表１５は、ＲＡＷ２６４．７細胞内ＬＰＳ−誘導されたｉＮＯＳ発現量に対する甘菊抽出物及びこの分画物の効果を示したものである。
【０１７７】
【表１５】
2013512235.tif 000017
【０１７８】
３）ＰＧＥ２測定結果
甘菊抽出物によるＣＯＸ−２の活性を調査するために、細胞内ＰＧＥ２の量を測定した。
【０１７９】
ＰＧＥ２の生成は、サンプル２５μｇ／ｍｌ濃度でメタノール抽出物では３２５０．３±２２．８ｐｇ／ｍｌで、対照群の３４２５．１±２３９．６ｐｇ／ｍｌに比べて５．１％の減少率を示した。ＰＧＥ２の生成は、水分画物では３４３９．５±１５９．３ｐｇ／ｍｌで示されたが、クロロホルム分画物では６１２．０±８５．４ｐｇ／ｍｌで８２．１％の減少率を示した(図２５)。表１６は、ＲＡＷ２６４．７細胞内ＬＰＳ−誘導されたＰＧＥ２発現に対する甘菊抽出物及びこの分画物の効果を示したものである。
【０１８０】
【表１６】
2013512235.tif 000018
【０１８１】
４）ＣＯＸ−２測定結果
ＲＡＷ２６４．７細胞内でＣＯＸ−２発現に対する甘菊抽出物の効果をウエスタンブロットを介して確認した。実験は、２５μｇ／ｍｌ濃度の甘菊抽出物で行った。対照群と比較する時、それぞれのＣＯＸ−２発現はメタノール抽出物では１２７．０％で示されて２７．０％の増加率を示し、クロロホルム分画物では９４．７％で示されて５．３％の減少率を示し、水分画物では１３６．３％で示されて３６．３％の増加率を示した(図２６)。表１７は、ＲＡＷ２６４．７細胞内ＬＰＳ−誘導されたＣＯＸ−２発現に対する甘菊抽出物及びこの分画物の効果を示したものである。
【０１８２】
【表１７】
2013512235.tif 000019
【０１８３】
５）ＩκＢリン酸化及び分解測定の結果
ＲＡＷ２６４．７大食細胞株でＬＰＳに誘導されたＩκＢリン酸化及び分解に対する甘菊抽出物の抑制効果を確認した。実験は、２５μｇ／ｍｌ濃度の甘菊抽出物で行った。それぞれのＩκＢの発現は、メタノール抽出物では１２．６％で示されて８７．４％の減少率を示し、クロロホルム分画物では４９．６％で示されて５０．４％の減少率を示し、水分画物では２８．９％で示されて７１．１％の減少率を示し、これはＬＰＳに誘導されたＩκＢタンパク質のリン酸化及び分解に対する甘菊抽出物の抑制効果を示す(図２７)。表１８は、ＲＡＷ２６４．７細胞内ＬＰＳ−誘導されたＩκＢタンパク質のリン酸化及び分解に対する甘菊抽出物及びこの分画物の効果を示したものである。
【０１８４】
【表１８】
2013512235.tif 000020
【０１８５】
６）細胞質及び核内でのＮＦ−κＢ発現
ＲＡＷ２６４．７大食細胞株でＬＰＳに誘導されたＩκＢから放出された後細胞質から核内へＮＦ−κＢタンパク質の移動に対する甘菊抽出物の抑制効果を確認した。
【０１８６】
２５μｇ／ｍｌ濃度の甘菊抽出物で、それぞれのｐ６５発現量は、対照群に比べてメタノール抽出物及びクロロホルム分画物で７１．６％及び８７．９％で示されてそれぞれ２８．４％及び１２．１％の減少率を示し、水分画物では８６．１％で示されて１３．９％の減少率を示した。このように、甘菊抽出物はＮＦ−κＢタンパク質の核内移動において抑制効果が示された。すなわち、ＮＦ−κＢ核移動に対する抑制効果を示した(図２８)。表１９は、ＲＡＷ２６４．７細胞内ＬＰＳ−誘導された細胞質及び核ＮＦ−κＢタンパク質発現に対する甘菊抽出物及びこの分画物の効果を示したものである。
【０１８７】
【表１９】
2013512235.tif 000021
【０１８８】
実施例４．ＭＴＳ分析の結果
野菊抽出物及びこの分画物の細胞毒性を確認するために、ＲＡＷ２６４．７細胞でＭＴＳ／ＰＭＳ(Cell Titer 96TM Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, Cat. G5421-Promega)を用いてＭＴＳ分析を行った。ＲＡＷ２６４．７細胞を９６ウェルプレートに５×１０４細胞／ｍＬに接種し、２４時間培養した。前記細胞を１．２５μｇ／ｍＬ、２．５０μｇ／ｍＬ、５．００μｇ／ｍＬの濃度の野菊抽出物を含む、血清が添加されないＤＭＥＭで２４時間培養した。２４時間後、ＭＴＳとＰＭＳを２０：１の比率でよく混合し、３時間培養した。その後、ＥＬＩＳＡリーダーｅｒ(Versamax, Molecular Devices Co., 米国)  を用いて４９０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１８９】
図２９に示されたように、メタノール抽出物、酢酸エチル分画物、及びクロロホルム分画物は、すべての濃度でＲＡＷ２６４．７の細胞生存力にほとんど影響を与えないことを確認することができ、これは野菊抽出物及びこの分画物が毒性がないことを示す(図２９)。
【０１９０】
〔産業上利用の可能性〕
本発明による組成物は、抗炎症活性を持つので、アトピー皮膚炎のような炎症疾患の予防または治療の用途として使用されることができ、また、医薬外品、化粧品、食品、及び軟水器を含む、様々な分野に適用され得る。
【図面の簡単な説明】
【０１９１】
【図１】図１は野菊抽出物とこの分画物取得過程を示したフローチャートである；
【図２】図２はＤＮＣＢ処理されたＮＣ／Ｎｇａマウスの感作スケジュールを示したものである;
【図３】図３は薬物処理前及び薬物処理後のスコアによるＮＣ／Ｎｇａ  マウスモデルの変化を示す写真である。
【図４】図４は野菊、タンポポ、黄伯、石菖蒲、ヒイラギモチ、及びソメイヨシノ抽出物処理後のアトピー皮膚炎が誘導されたＮＣ／Ｎｇａマウスモデルの掻く行動変動値を示すものである；
【図５】図５は野菊、タンポポ、黄伯、石菖蒲、ヒイラギモチ、及びソメイヨシノ抽出物処理後のアトピー皮膚炎が誘導されたＮＣ／Ｎｇａマウスモデルの臨床評価結果を示すものである；
【図６】図６は野菊、タンポポ、黄伯、石菖蒲、ヒイラギモチ、及びソメイヨシノ抽出物処理後のアトピー皮膚炎が誘導されたＮＣ／Ｎｇａマウスモデルの血清ＩｇＥ濃度変化を示したものである；
【図７】図７は薬物処理前及び野菊抽出物処理後のスコアによるＮＣ／Ｎｇａマウスモデルのアトピー症状の変化過程を示す写真である；
【図８】図８は野菊抽出物処理後のアトピー皮膚炎が誘導されたＮＣ／Ｎｇａマウスモデルの臨床評価結果を示すものである；
【図９】図９は野菊抽出物処理後のアトピー皮膚炎が誘導されたＮＣ／Ｎｇａマウスモデルの掻く行動結果を示すものである；
【図１０】図１０は野菊抽出物処理後のアトピー皮膚炎が誘導されたＮＣ／Ｎｇａマウスモデルの耳厚さを長さ(ｍｍ)で測定した結果を示すものである；
【図１１】図１１は野菊抽出物処理後のアトピー皮膚炎が誘導されたＮＣ／Ｎｇａマウスモデルの耳厚さを体積(％)で測定した結果を示すものである；
【図１２】図１２は（ａ）野菊抽出物の経口投与後のアトピー皮膚炎が誘導されたＮＣ／Ｎｇａマウスモデルの血清中のＩｇＥ濃度を測定した結果を示すものである；（ｂ）野菊抽出物の皮膚塗布後のアトピー皮膚炎が誘導されたＮＣ／Ｎｇａマウスモデルの血清中のＩｇＥ濃度を測定した結果を示すものである；
【図１３】図１３は野菊抽出物処理後のアトピー皮膚炎が誘導されたＮＣ／Ｎｇａマウスモデルの血清中のＩＦＮ−γ濃度を測定した結果を示すものである；
【図１４】図１４は野菊抽出物処理後のアトピー皮膚炎が誘導されたＮＣ／Ｎｇａマウスモデルの血清中のＩＬ−４濃度を測定した結果を示すものである；
【図１５】図１５は野菊抽出物処理後のアトピー皮膚炎が誘導されたＮＣ／Ｎｇａマウスモデルの耳組織断面を撮影したものである；
【図１６】図１６は野菊抽出物の分画物処理後のＬＰＳ−誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞内酸化窒素生成を測定したものである；
【図１７】図１７は野菊抽出物の分画物処理後のＬＰＳ−誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞内ｉＮＯＳ(誘導型酸化窒素合成剤)  生成を測定したものである；
【図１８】図１８は野菊抽出物の分画物処理後のＬＰＳ−誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞内ＰＧＥ２生成を測定したものである；
【図１９】図１９は野菊抽出物の分画物処理後のＬＰＳ−誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞内ＣＯＸ−２生成を測定したものである；
【図２０】図２０は野菊抽出物の分画物処理後のＬＰＳ−誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞内ＩκＢ生成を測定したものである；
【図２１】図２１は野菊抽出物の分画物処理後のＬＰＳ−誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞内Ｐ５０生成を測定したものである；
【図２２】図２２は野菊抽出物の分画物処理後のＬＰＳ−誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞内Ｐ６５生成を測定したものである；
【図２３】図２３は甘菊抽出物の分画物処理後のＬＰＳ−誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞内酸化窒素生成を測定したものである；
【図２４】図２４は甘菊抽出物の分画物処理後のＬＰＳ−誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞内ｉＮＯＳ(誘導型酸化窒素合成剤)  発生量を測定したものである；
【図２５】図２５は甘菊抽出物の分画物処理後のＬＰＳ−誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞内ＰＧＥ２生成を測定したものである；
【図２６】図２６は甘菊抽出物の分画物処理後のＬＰＳ−誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞内ＣＯＸ−２生成を測定したものである；
【図２７】図２７は甘菊抽出物の分画物処理後のＬＰＳ−誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞内ＩκＢ生成を測定したものある；
【図２８】図２８は甘菊抽出物の分画物処理後のＬＰＳ−誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞内Ｐ６５生成を測定したものである；
【図２９】図２９はＭＴＳ分析方法による野菊抽出物及びこの分画物の細胞毒性を測定したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年5月29日(2012.5.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野菊(Chrysanthemum boreale Makino)抽出物またはこの分画物を含む、抗炎症活性を持つ組成物。
【請求項２】
前記野菊抽出物は、野菊の水抽出物またはメタノール抽出物である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記野菊の抽出物は、熱水抽出方法によって抽出されたものである請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記分画物は、クロロホルム、エタノール、酢酸エチルまたはこれらの混合溶媒からなる群から選択されるいずれかの溶媒を用いた分画物である請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物は、下記効果中の一つ以上を持つ請求項１に記載の組成物：
１）紅斑、浮腫、血腫、掻痒、皮膚乾燥症、糜爛及び苔癬化の減少；
２）耳浮腫の減少；
３）掻く行動の減少；
４）血清免疫グロブリンＥ(ＩｇＥ)、インターフェロン−γ(ＩＦＮ−γ)またはインターロイキン４(ＩＬ−４)濃度の減少；
５）細胞内酸化窒素(ＮＯ)発現の減少；
６）細胞内酸化窒素合成剤(ｉＮＯＳ)の発現の減少；
７）細胞内プロスタグランジンＥ２(ＰＧＥ２)生成の減少；
８）細胞内ＣＯＸ−２発現の減少；
９）ＩκＢリン酸化抑制及びＮＦ−κＢの細胞質から核への移動減少；及び
１０）線維芽細胞増殖、コラーゲン層異常増殖、及び潰瘍の抑制、肥満細胞の浸潤、及び好中球及びリンパ球の浸潤による炎症の減少。
【請求項６】
請求項１〜５のうち、いずれか一項の組成物を有効成分として含む、炎症疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項７】
前記炎症疾患は、アレルギー性炎症疾患である請求項６に記載の炎症疾患の予防または治療用薬学組成物
【請求項８】
前記アレルギー性炎症疾患は、アトピー皮膚炎である請求項７に記載の炎症疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項９】
前記炎症疾患の予防または治療用薬学組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌された水溶液、非水性溶剤、凍結乾燥製剤及び坐剤からなる群から選択されるいずれか一つの剤形を持つことを特徴とする請求項６に記載の炎症疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項１０】
請求項１〜５のうち、いずれか一項の組成物を有効成分として含む、炎症疾患の予防または改善用化粧品組成物。
【請求項１１】
請求項１〜５のうち、いずれか一項の組成物を有効成分として含む、炎症疾患の予防または改善用食品組成物。
【請求項１２】
前記食品組成物は、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディー類、  スナック類、クッキ類、ピザ、ラーメン、ガム類、アイスクリーム類、スープ、飲料水、茶、機能水、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする請求項１１に記載の炎症疾患の予防または改善用食品組成物。
【請求項１３】
請求項１〜５のうち、いずれか一項の組成物を有効成分として含む、炎症疾患の予防または改善用医薬外品組成物。
【請求項１４】
前記医薬外品組成物は、消毒清潔剤、シャワーフォーム、口腔洗浄薬、ウェットティッシュ、洗剤石鹸、ハンドウォッシュ、加湿器充填剤、マスク、軟膏剤、コーティング剤またはフィルター充填剤からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする請求項１３に記載の炎症疾患の予防または改善用医薬外品組成物。
【請求項１５】
請求項１〜５のうち、いずれか一項の組成物を有効成分として含むフィルター充填剤を含む、炎症疾患の予防または改善用軟水器。
【請求項１６】
請求項１〜５のうち、いずれか一項の組成物を炎症疾患が発病したまたは発病可能性のある患者に投与して炎症疾患を予防または治療する方法。
【請求項１７】
前記組成物を経口投与または皮膚塗布投与する請求項１６に記載の炎症疾患を予防または治療する方法。
【請求項１８】
前記炎症疾患は、アレルギー性炎症疾患である請求項１６に記載の炎症疾患を予防または治療する方法。
【請求項１９】
前記アレルギー性炎症疾患は、アトピー皮膚炎である請求項１８に記載の炎症疾患を予防または治療する方法。
【国際調査報告】
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