(57)【要約】  本発明は癌罹患患者の治療用としての治療剤組合せに関し、前記組合せは少なくとも１種の倍数性誘導剤と少なくとも１種のＢｅｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤を含む。更に、本発明は１種以上の治療剤による治療のために患者を分類するのに有用な診断アッセイにも関する。
2013512911.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌罹患患者の治療方法であって、
ａ）癌罹患患者に治療有効量の少なくとも１種の倍数性誘導剤を投与する段階と；
ｂ）前記患者に治療有効量の少なくとも１種のＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤を投与する段階
を含む前記方法。
【請求項２】
少なくとも１種の倍数性誘導剤がオーロラキナーゼ阻害剤である請求項１の方法。
【請求項３】
オーロラキナーゼ阻害剤がオーロラキナーゼＢ阻害剤である請求項２の方法。
【請求項４】
オーロラキナーゼＢ阻害剤がＶＸ−６８０、ＡＺＤ１１５２、ＺＭ４４７３９又はヘスペラジンである請求項３の方法。
【請求項５】
Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤がＡＢＴ−２６３、ＡＢＴ−７３７、Ｂｃｌ−ＸＬ選択的阻害剤又はその組合せである請求項１の方法。
【請求項６】
癌罹患患者の治療用としての治療剤組合せであって、前記組合せが、
ａ）前記患者における１個以上の癌細胞に倍数化を誘導するために使用される少なくとも１種の倍数性誘導剤と；
ｂ）少なくとも１種のＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤
を含む前記組合せ。
【請求項７】
少なくとも１種の倍数性誘導剤がオーロラキナーゼ阻害剤である請求項６の組合せ。
【請求項８】
オーロラキナーゼ阻害剤がオーロラキナーゼＢ阻害剤である請求項７の組合せ。
【請求項９】
オーロラキナーゼＢ阻害剤がＶＸ−６８０、ＡＺＤ１１５２、ＺＭ４４７３９又はヘスペラジンである請求項８の組合せ。
【請求項１０】
Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤がＡＢＴ−２６３、ＡＢＴ−７３７、Ｂｃｌ−ＸＬ選択的阻害剤又はその組合せである請求項６の組合せ。
【請求項１１】
倍数性誘導剤、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤又は倍数性誘導剤とＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤の組合せによる治療に対する適格性について患者を分類する方法であって、前記方法が、
ａ）患者からの試験サンプルを提供する段階と；
ｂ）試験サンプル中でＢＡＸ遺伝子、ＢＡＫ遺伝子又はＮＯＸＡ遺伝子から構成される群から選択される少なくとも１種の遺伝子における少なくとも１カ所の突然変異の有無を判定する段階と；
ｃ）段階ｂ）で判定した少なくとも１カ所の突然変異の有無に基づいて倍数性誘導剤、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤又は倍数性誘導剤とＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤の組合せによる治療を受けるのに適格である患者を分類する段階
を含む前記方法。
【請求項１２】
倍数性誘導剤がオーロラキナーゼ阻害剤である請求項１１の方法。
【請求項１３】
オーロラキナーゼ阻害剤がオーロラキナーゼＡ阻害剤、オーロラキナーゼＢ阻害剤、オーロラキナーゼＣ阻害剤又はその組合せである請求項１２の方法。
【請求項１４】
オーロラキナーゼ阻害剤がオーロラキナーゼＢ阻害剤である請求項１３の方法。
【請求項１５】
オーロラキナーゼＢ阻害剤がＡＺＤ１１５２、ＺＭ４４７４３９、ＶＸ−６８０／ＭＫ０４５７又はヘスペラジンである請求項１４の方法。
【請求項１６】
Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤がＡＢＴ−２６３、ＡＢＴ−７３７、Ｂｃｌ−ＸＬ選択的阻害剤又はその組合せである請求項１１の方法。
【請求項１７】
試験サンプルが組織サンプルを含む請求項１１の方法。
【請求項１８】
組織サンプルが末梢血サンプル、腫瘍組織もしくは腫瘍の疑いのある組織、薄層細胞診サンプル、細針吸引サンプル、骨髄サンプル、リンパ節サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄液サンプル、食道ブラシ擦過サンプル、膀胱もしくは肺洗浄液サンプル、髄液サンプル、脳水サンプル、管吸引サンプル、乳頭分泌物サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結組織サンプル、パラフィン包埋組織サンプル又は末梢血サンプル、腫瘍組織もしくは腫瘍の疑いのある組織、薄層細胞診サンプル、細針吸引サンプル、骨髄サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄液サンプル、食道ブラシ擦過サンプル、膀胱もしくは肺洗浄液サンプル、髄液サンプル、脳水サンプル、管吸引サンプル、乳頭分泌物サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結組織サンプルもしくはパラフィン包埋組織サンプルのいずれかから作製された抽出液もしくは処理サンプルを含む請求項１７の方法。
【請求項１９】
判定段階（ｂ）をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより実施する請求項１１の方法。
【請求項２０】
蛍光標識した核酸プローブを使用してｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施する請求項１９の方法。
【請求項２１】
少なくとも２個の核酸プローブを使用してｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施する請求項２０の方法。
【請求項２２】
ペプチド核酸プローブを使用してｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施する請求項２０の方法。
【請求項２３】
判定段階（ｂ）をポリメラーゼ連鎖反応により実施する請求項１１の方法。
【請求項２４】
患者がまた化学療法、放射線療法又はその組合せで治療される請求項１１の方法。
【請求項２５】
倍数性誘導剤、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤又は倍数性誘導剤とＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤の組合せで治療される癌罹患患者のモニター方法であって、前記方法が、
ａ）少なくとも１種の倍数性誘導剤、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤又は倍数性誘導剤とＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤の組合せで現在治療中の癌罹患患者からの試験サンプルを提供する段階と；
ｂ）試験サンプル中でＢＡＸ遺伝子、ＢＡＫ遺伝子又はＮＯＸＡ遺伝子から構成される群から選択される少なくとも１種の遺伝子における少なくとも１カ所の突然変異の有無を判定する段階と；
ｃ）段階ｂ）で判定した少なくとも１カ所の突然変異の有無に基づいて倍数性誘導剤、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤又は倍数性誘導剤とＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤の組合せにより患者を治療し続けるべきか否かを判定する段階
を含む前記方法。
【請求項２６】
倍数性誘導剤がオーロラキナーゼ阻害剤である請求項２５の方法。
【請求項２７】
オーロラキナーゼ阻害剤がオーロラキナーゼＡ阻害剤、オーロラキナーゼＢ阻害剤、オーロラキナーゼＣ阻害剤又はその組合せである請求項２６の方法。
【請求項２８】
オーロラキナーゼ阻害剤がオーロラキナーゼＢ阻害剤である請求項２７の方法。
【請求項２９】
オーロラキナーゼＢ阻害剤がＡＺＤ１１５２、ＺＭ４４７４３９、ＶＸ−６８０／ＭＫ０４５７又はヘスペラジンである請求項２８の方法。
【請求項３０】
Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤がＡＢＴ−２６３、ＡＢＴ−７３７、Ｂｃｌ−ＸＬ選択的阻害剤又はその組合せである請求項２５の方法。
【請求項３１】
試験サンプルが組織サンプルを含む請求項２５の方法。
【請求項３２】
組織サンプルが末梢血サンプル、腫瘍組織もしくは腫瘍の疑いのある組織、薄層細胞診サンプル、細針吸引サンプル、骨髄サンプル、リンパ節サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄液サンプル、食道ブラシ擦過サンプル、膀胱もしくは肺洗浄液サンプル、髄液サンプル、脳水サンプル、管吸引サンプル、乳頭分泌物サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結組織サンプル、パラフィン包埋組織サンプル又は末梢血サンプル、腫瘍組織もしくは腫瘍の疑いのある組織、薄層細胞診サンプル、細針吸引サンプル、骨髄サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄液サンプル、食道ブラシ擦過サンプル、膀胱もしくは肺洗浄液サンプル、髄液サンプル、脳水サンプル、管吸引サンプル、乳頭分泌物サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結組織サンプルもしくはパラフィン包埋組織サンプルのいずれかから作製された抽出液もしくは処理サンプルを含む請求項３１の方法。
【請求項３３】
判定段階（ｂ）をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより実施する請求項２５の方法。
【請求項３４】
蛍光標識した核酸プローブを使用してｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施する請求項３３の方法。
【請求項３５】
少なくとも２個の核酸プローブを使用してｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施する請求項３３の方法。
【請求項３６】
ペプチド核酸プローブを使用してｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施する請求項３３の方法。
【請求項３７】
判定段階（ｂ）をポリメラーゼ連鎖反応により実施する請求項２５の方法。
【請求項３８】
患者がまた化学療法、放射線療法又はその組合せで治療される請求項２５の方法。
【請求項３９】
倍数性誘導剤、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤又は倍数性誘導剤とＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤の組合せによる治療に対して耐性の癌をもつ患者を分類する方法であって、前記方法が、
ａ）癌罹患患者からの試験サンプルを提供する段階と；
ｂ）試験サンプル中でＢＡＸ遺伝子、ＢＡＫ遺伝子又はＮＯＸＡ遺伝子から構成される群から選択される少なくとも１種の遺伝子における少なくとも１カ所の突然変異の有無を判定する段階と；
ｃ）段階ｂ）で判定した少なくとも１カ所の突然変異の有無に基づいて倍数性誘導剤、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤又は倍数性誘導剤とＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤の組合せによる治療に対して耐性の癌をもつ患者を分類する段階
を含む前記方法。
【請求項４０】
倍数性誘導剤がオーロラキナーゼ阻害剤である請求項３９の方法。
【請求項４１】
オーロラキナーゼ阻害剤がオーロラキナーゼＡ阻害剤、オーロラキナーゼＢ阻害剤、オーロラキナーゼＣ阻害剤又はその組合せである請求項４０の方法。
【請求項４２】
オーロラキナーゼ阻害剤がオーロラキナーゼＢ阻害剤である請求項４１の方法。
【請求項４３】
オーロラキナーゼＢ阻害剤がＡＺＤ１１５２、ＺＭ４４７４３９、ＶＸ−６８０／ＭＫ０４５７又はヘスペラジンである請求項４２の方法。
【請求項４４】
Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤がＡＢＴ−２６３、ＡＢＴ−７３７及びＢｃｌ−ＸＬ選択的阻害剤又はその組合せである請求項３９の方法。
【請求項４５】
試験サンプルが組織サンプルを含む請求項３９の方法。
【請求項４６】
組織サンプルが末梢血サンプル、腫瘍組織もしくは腫瘍の疑いのある組織、薄層細胞診サンプル、細針吸引サンプル、骨髄サンプル、リンパ節サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄液サンプル、食道ブラシ擦過サンプル、膀胱もしくは肺洗浄液サンプル、髄液サンプル、脳水サンプル、管吸引サンプル、乳頭分泌物サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結組織サンプル、パラフィン包埋組織サンプル又は末梢血サンプル、腫瘍組織もしくは腫瘍の疑いのある組織、薄層細胞診サンプル、細針吸引サンプル、骨髄サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄液サンプル、食道ブラシ擦過サンプル、膀胱もしくは肺洗浄液サンプル、髄液サンプル、脳水サンプル、管吸引サンプル、乳頭分泌物サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結組織サンプルもしくはパラフィン包埋組織サンプルのいずれかから作製された抽出液もしくは処理サンプルを含む請求項４５の方法。
【請求項４７】
判定段階（ｂ）をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより実施する請求項３９の方法。
【請求項４８】
蛍光標識した核酸プローブを使用してｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施する請求項４７の方法。
【請求項４９】
少なくとも２個の核酸プローブを使用してｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施する請求項４７の方法。
【請求項５０】
ペプチド核酸プローブを使用してｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施する請求項４７の方法。
【請求項５１】
判定段階（ｂ）をポリメラーゼ連鎖反応により実施する請求項３９の方法。
【請求項５２】
患者がまた化学療法、放射線療法又はその組合せで治療される請求項３９の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌に罹患している対象である患者の治療用としての治療剤組合せに関する。前記組合せは、（１）少なくとも１種の倍数性誘導剤と、（ｂ）少なくとも１種のＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤を含む。更に、本発明は倍数性誘導剤、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤又は倍数性誘導剤とＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤の組合せによる治療のために患者を分類するのに有用な診断アッセイにも関する。特に、本発明はＢＡＸ遺伝子、ＢＡＫ遺伝子又はＮＯＸＡ遺伝子における少なくとも１カ所の突然変異の有無を判定した後に、倍数性誘導剤、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤又は倍数性誘導剤とＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤の組合せによる治療を受けるのに適格である患者を分類する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリー蛋白質メンバーは多数の疾病に関係があるため、潜在的な治療薬ターゲットとして試験中である。介入治療のこれらの重要なターゲットとしては、例えば、Ｂｃｌ−２ファミリーの蛋白質であるＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ及びＢｃｌ−ｗが挙げられる。最近では、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーの阻害剤が文献に報告されている（例えば、ＷＯ２００５／０４９５９４、Ｏｌｔｅｒｓｄｏｒｆ，ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４３５：６７７−６８１（２００５）、ＵＳ６，７２０，３３８及びＵＳ７，０３０，１１５参照）。この従来技術は標的蛋白質に対して高い結合性をもつ阻害剤を教示しているが、薬剤開発の促進又は継続のために化合物を試験するので、これは検討すべき多数のパラメータの１つに過ぎない。この開発の一環としては、経口投与後に癌の動物モデルで有効となる化合物群を製造することが非常に望ましい。この経口効力を達成するためには、化合物が試験中の腫瘍型又は細胞株に対して強力な活性を示す必要があるのみならず、経口投与後に許容可能なレベルの全身暴露を達成する必要があることは当分野で周知である。化合物の細胞活性の典型的な尺度は５０％細胞効果を誘発する濃度（ＥＣ５０）である。全身暴露の典型的な尺度は経口投与後の血漿中の化合物濃度を時間に対してプロットすることにより得られる曲線下の面積（ＡＵＣ）である。これらのパラメータ間の比（ＡＵＣ／ＥＣ５０）は経口効力を予測するために有用な薬力学的パラメータを構成することが当分野で周知である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００５／０４９５９４号
【特許文献２】米国特許第６，７２０，３３８号明細書
【特許文献３】米国特許第７，０３０，１１５号明細書
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｏｌｔｅｒｓｄｏｒｆ，ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４３５：６７７−６８１（２００５）
【発明の概要】
【０００５】
１側面において、本発明は動物に経口投与後の細胞効力と全身暴露に関して予想外の優れた性質を示す一連のハロアルキルスルホニルアリールアナログに関する。特に、本発明の化合物は動物に経口投与後に適切な全身暴露を示しながら強力な細胞効力を維持する。この結果、従来技術に教示されている化合物よりも有意に高いＡＵＣ／ＥＣ５０比が得られる。本発明の他の側面は本願に開示及び明示される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】Ｂ細胞性リンパ腫に対する実施例１、エトポシド及びその組合せの抗腫瘍形成効果を比較して示す。
【図２】Ｂ細胞性リンパ腫に対する実施例１、ビンクリスチン及びその組合せの抗腫瘍形成効果を比較して示す。
【図３】Ｂ細胞性リンパ腫に対する実施例１、ＣＨＯＰ及びその組合せの抗腫瘍形成効果を比較して示す。
【図４】Ｂ細胞性リンパ腫に対する実施例１、リツキシマブ及びその組合せの抗腫瘍形成効果を比較して示す。
【図５】Ｂ細胞性リンパ腫に対する実施例１、ラパマイシン及びその組合せの抗腫瘍形成効果を比較して示す。
【図６】マントル細胞リンパ腫に対する実施例１、Ｒ−ＣＨＯＰ及びその組合せの抗腫瘍形成効果を比較して示す。
【図７】マントル細胞リンパ腫に対する実施例１、ボルテゾミブ及びその組合せの抗腫瘍形成効果を比較して示す。
【図８Ａ】ＢＨ３がＡＢＴ−２６３と似ており、汎オーロラ阻害剤であるＶＸ−６８０が相乗的に致死性であることを示す。図８Ａは各種充実性悪性腫瘍に由来する７種類の細胞株で単一の一定用量（１μＭ）のＶＸ−６８０を６点用量応答により１９種類の他の化学療法剤と併用してスクリーニングした結果を示す。併用レジメン暴露から３日後に細胞生存率を測定した。薬物間相互作用のＢｌｉｓｓ相加作用モデル（Ｂｅｒｅｎｂａｕｍ，Ｍ．Ｃ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ３５，２６９−３３５（１９８１）参照）を使用して薬剤組合せの相乗作用又は拮抗作用を判定した。全組合せについて用量毎にＢｌｉｓｓ相加作用に対する超過値を求め、＞１５＝相乗作用、０〜１５＝相互作用なし、＜−１５＝拮抗作用と判定した。ＳＰＯＴＦＩＲＥ（登録商標）（ＴＩＢＣＯ（登録商標））データ解析ソフトウェアを使用してこれらの数値をヒートマップで表し、相乗作用を赤、相互作用なしをグレー、拮抗作用を青で示す。各用量応答にはＶＸ−６８０単独（併用化合物０μＭ）の点も含めた。これらの数値はＢｌｉｓｓ解析には適用できないため、ヒートマップから外した。併用試験した化合物を右側に示す。これらの薬剤の各々の標的／作用メカニズムと、併用スクリーニングの対応する用量応答を実施例４０で表Ａにまとめる。
【図８Ｂ】図８ＢはＤ５４ＭＧ、ＨＣＴ１１６、ＳＷ６２０、Ａ５４９、ＰＣ３及びＥＪ１細胞にＶＸ−６８０をＡＢＴ−２６３と併用投与した場合の用量応答による細胞生存率測定値のＢｌｉｓｓ解析を示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは図８Ｂで解析した細胞生存率測定値を示す。
【図９Ａ】オーロラＢ及びＢｃｌ−ＸＬの阻害が相乗的細胞傷害作用に十分であることを示す。全図において、トランスフェクトせずにＤＭＳＯで処理した対照細胞の百分率として細胞生存率を表した。赤の生存率曲線は相乗的組合せを表す。図９ＡはＨＣＴ１１６結腸癌細胞に夫々ルシフェラーゼ、オーロラＡ又はオーロラＢ  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした場合とトランスフェクトしなかった場合を示す。トランスフェクションから２４時間後に細胞を用量応答によりＡＢＴ−２６３で処理し、ＡＢＴ−２６３の添加から７２時間後に細胞生存率を測定した。
【図９Ｂ】図９ＢはＨＣＴ１１６溶解液のイムノブロットが図９Ａで使用したｓｉＲＮＡのトランスフェクションから７２時間後に標的蛋白質のノックダウンを実証したことを示す。
【図９Ｃ】ＭＬＮ８０５４をＤＭＳＯ又は１μＭ  ＡＢＴ−２６３と併用してＨＣＴ１１６細胞で試験した。処理から７２時間後に細胞生存率を測定した。
【図９Ｄ】ＡＺＤ１１５２をＤＭＳＯ又は１μＭ  ＡＢＴ−２６３と併用してＨＣＴ１１６細胞で試験した。処理から７２時間後に細胞生存率を測定した。
【図９Ｅ】図９ＥはＨＣＴ１１６溶解液のイムノブロットがトランスフェクションから７２時間後にＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ及びＭｃｌ−１のノックダウンを実証したことを示す。
【図９Ｆ】ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ又は図９Ｅと同一セットのＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬもしくはＭｃｌ−１に対するｓｉＲＮＡをＥＪ１細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後に細胞を種々の量のＡＺＤ１１５２で処理した。ＡＺＤ１１５２暴露から７２時間後に細胞生存率を測定した。
【図９Ｇ】ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ又は図９Ｅと同一セットのＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬもしくはＭｃｌ−１に対するｓｉＲＮＡをＨＣＴ１１６細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後に細胞を種々の量のＡＺＤ１１５２で処理した。ＡＺＤ１１５２暴露から７２時間後に細胞生存率を測定した。
【図９Ｈ】図９ＨはＨＣＴ１１６細胞に種々の量のオーロラＢ又はＢｃｌ−ＸＬ  ｓｉＲＮＡを個別に又は併用してトランスフェクトしたことを示す。トランスフェクションから７２時間後に細胞生存率を測定した。
【図１０Ａ】倍数化が細胞をＢｃｌ−ＸＬ依存性にすることを示す。図１０ＡはＨＣＴ１１６細胞にＩＮＣＥＮＰ又はＢｃｌ−ＸＬ  ｓｉＲＮＡを個別に又は併用して用量応答によりトランスフェクトしたことを示す。トランスフェクションから７２時間後に細胞生存率を測定した。赤曲線は相乗的組合せを表す。
【図１０Ｂ】図１０ＢはＨＣＴ１１６溶解液のイムノブロットが図１０Ａと同一のｓｉＲＮＡのトランスフェクションから７２時間後にＩＮＣＥＮＰのノックダウンを実証したことを示す。
【図１０Ｃ】ＨＣＴ１１６細胞（図１０Ｃ）をＤＭＳＯ又は２００ｎＭ  ＡＺＤ１１５２で２４時間処理した。次にＡＺＤ１１５２を培養培地（ＡＺＤ１１５２）中に残すか、又は培地を薬剤非添加増殖培地に交換することによりウォッシュアウトした（ＡＺＤ１１５２ウォッシュアウト）。細胞を更に７２時間培養後、以下の処理／分析を行った。即ちウェスタン解析法（図１０Ｃ）によりｐ５３、リン酸化（ｐＳｅｒ１０）及び非リン酸化ヒストンＨ３の量を測定し、ウォッシュアウトに関係なくＡＺＤ１１５２で処理した細胞では細胞寸法の劇的な増加や多核化等の倍数性の形態的特徴が認められた。
【図１０Ｄ】ＨＣＴ１１６細胞（図１０Ｄ）をＤＭＳＯ又は２００ｎＭ  ＡＺＤ１１５２で２４時間処理した。次にＡＺＤ１１５２を培養培地（ＡＺＤ１１５２）中に残すか、又は培地を薬剤非添加増殖培地に交換することによりウォッシュアウトした（ＡＺＤ１１５２ウォッシュアウト）。細胞を更に７２時間培養後、以下の処理／分析を行った。即ち位相差顕微鏡撮影（図１０Ｄ）の結果、ウォッシュアウトに関係なくＡＺＤ１１５２で処理した細胞では細胞寸法の劇的な増加や多核化等の倍数性の形態的特徴が認められた。
【図１０Ｅ】ＨＣＴ１１６細胞（図１０Ｅ）をＤＭＳＯ又は２００ｎＭ  ＡＺＤ１１５２で２４時間処理した。次にＡＺＤ１１５２を培養培地（ＡＺＤ１１５２）中に残すか、又は培地を薬剤非添加増殖培地に交換することによりウォッシュアウトした（ＡＺＤ１１５２ウォッシュアウト）。細胞を更に７２時間培養後、以下の処理／分析を行った。即ちウェスタン解析法（図１０Ｃ）によりｐ５３、リン酸化（ｐＳｅｒ１０）及び非リン酸化ヒストンＨ３の量を測定し、あるいは位相差顕微鏡撮影（図１０Ｄ）の結果、ウォッシュアウトに関係なくＡＺＤ１１５２で処理した細胞では細胞寸法の劇的な増加や多核化等の倍数性の形態的特徴が認められ、更に１μＭ  ＡＢＴ−２６３で４時間処理し（図１０Ｅ）、カスパーゼ−３活性をアッセイした。
【図１０Ｆ】ＨＣＴ１１６細胞（図１０Ｆ）をＤＭＳＯ又は２００ｎＭ  ＡＺＤ１１５２で２４時間処理した。次にＡＺＤ１１５２を培養培地（ＡＺＤ１１５２）中に残すか、又は培地を薬剤非添加増殖培地に交換することによりウォッシュアウトした（ＡＺＤ１１５２ウォッシュアウト）。細胞を更に７２時間培養後、以下の処理／分析を行った。即ちウェスタン解析法（図１０Ｃ）によりｐ５３、リン酸化（ｐＳｅｒ１０）及び非リン酸化ヒストンＨ３の量を測定し、あるいは位相差顕微鏡撮影（図１０Ｄ）の結果、ウォッシュアウトに関係なくＡＺＤ１１５２で処理した細胞では細胞寸法の劇的な増加や多核化等の倍数性の形態的特徴が認められ、更に１μＭ  ＡＢＴ−２６３で４時間処理し（図１０Ｅ）、更に１μＭ  ＡＢＴ−２６３で２４時間処理し（図１０Ｆ）、細胞生存率をアッセイした。
【図１１Ａ】倍数化中のＢｃｌ−２ネットワークの変調を示す。ＨＣＴ１１６細胞（図１１Ａ）をＤＭＳＯ又は２００ｎＭ  ＡＺＤ１１５２で７２時間処理した後、１μＭ  ＡＢＴ−２６３で２時間処理した。立体配座的に活性なＢＡＫ又はＢＡＸを免疫沈降させ、イムノブロッティングにより検出した。
【図１１Ｂ】Ｄ５４ＭＧ及びＨＣＴ１１６細胞（図１１Ｂ）をＤＭＳＯ又は２００ｎＭ  ＡＺＤ１１５２で７２時間処理した後、１μＭ  ＡＢＴ−２６３を４時間加えた。立体配座的に活性なＢＡＫ又はＢＡＸを免疫沈降させ、イムノブロッティングにより検出した（上段及び中段）。細胞溶解液を更に分画し、サイトゾル画分へのチトクロームＣ放出をイムノブロッティングにより検出した。
【図１１Ｃ】ＨＣＴ１１６、ＳＷ６２０及びＤ５４ＭＧ細胞（図１１Ｃ）をＤＭＳＯ（未処理）又は２００ｎＭ  ＡＺＤ１１５２（ＡＺＤ１１５２）で７２時間処理し、Ｂｃｌ−２ネットワーク成分の発現をイムノブロッティングにより検出した（図１１Ｄ〜図１１Ｅ）。ＨＣＴ１１６細胞を図１１Ｂと同様に処理した。内在性Ｂｃｌ−ＸＬ及びＭｃｌ−１を免疫沈降させ、免疫複合体中のＢｃｌ−２ネットワーク成分をイムノブロッティングにより検出した。
【図１１Ｄ】ＨＣＴ１１６、ＳＷ６２０及びＤ５４ＭＧ細胞（図１１Ｃ）をＤＭＳＯ（未処理）又は２００ｎＭ  ＡＺＤ１１５２（ＡＺＤ１１５２）で７２時間処理し、Ｂｃｌ−２ネットワーク成分の発現をイムノブロッティングにより検出した（図１１Ｄ）。ＨＣＴ１１６細胞を図１１Ｂと同様に処理した。内在性Ｂｃｌ−ＸＬ及びＭｃｌ−１を免疫沈降させ、免疫複合体中のＢｃｌ−２ネットワーク成分をイムノブロッティングにより検出した。
【図１１Ｅ】倍数化中のＢｃｌ−２ネットワークの変調を示す。ＨＣＴ１１６、ＳＷ６２０及びＤ５４ＭＧ細胞（図１１Ｃ）をＤＭＳＯ（未処理）又は２００ｎＭ  ＡＺＤ１１５２（ＡＺＤ１１５２）で７２時間処理し、Ｂｃｌ−２ネットワーク成分の発現をイムノブロッティングにより検出した（図１１Ｅ）。ＨＣＴ１１６細胞を図１１Ｂと同様に処理した。内在性Ｂｃｌ−ＸＬ及びＭｃｌ−１を免疫沈降させ、免疫複合体中のＢｃｌ−２ネットワーク成分をイムノブロッティングにより検出した。
【図１２Ａ】倍数体細胞におけるＢｃｌ−ＸＬ「依拠」と倍数化介在性アポトーシスにはＢｃｌ−２ネットワークの要素が必要であることを示す。図１２ＡはＢｃｌ−２ネットワーク成分を標的とするｓｉＲＮＡの対象ライブラリーを個々のオリゴとしてＨＣＴ１１６細胞にトランスフェクトしたことを示す。ＥＪ１及びＤＬＤ１細胞（図１２Ｂ）に個々のＮＯＸＡ  ｓｉＲＮＡ又はＢＡＸ及びＢＡＫ  ｓｉＲＮＡの組合せをトランスフェクトした。図１２Ａにおいて、トランスフェクションから２４時間後に細胞を２００ｎＭ  ＡＺＤ１１５２で処理し、倍数性を誘導した。ＡＺＤ１１５２の添加から７２時間後に細胞を１μＭ  ＡＢＴ−２６３で処理し、ＡＢＴ−２６３の添加から２４時間後に細胞生存率を測定した。
【図１２Ｂ】ＥＪ１及びＤＬＤ１細胞（図１２Ｂ）に個々のＮＯＸＡ  ｓｉＲＮＡ又はＢＡＸ及びＢＡＫ  ｓｉＲＮＡの組合せをトランスフェクトした。図１２Ｂにおいて、トランスフェクションから２４時間後に細胞を２００ｎＭ  ＡＺＤ１１５２で処理し、倍数性を誘導した。ＡＺＤ１１５２の添加から７２時間後に細胞を１μＭ  ＡＢＴ−２６３で処理し、ＡＢＴ−２６３の添加から２４時間後に細胞生存率を測定した。
【図１２Ｃ】ＨＣＴ１１６細胞（図１２Ｃ）に対照として非標的ｓｉＲＮＡ又はＮＯＸＡ  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後に、細胞を２００ｎＭ  ＡＺＤ１１５２で７２時間処理した。次に１μＭ  ＡＢＴ−２６３を２時間加えた後、細胞溶解させ、Ｂｃｌ−ＸＬ又はＭｃｌ−１を免疫沈降させた。
【図１２Ｄ】ＨＣＴ１１６細胞（図１２Ｄ）に対照として非標的ｓｉＲＮＡ又はＮＯＸＡ  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後に、細胞を２００ｎＭ  ＡＺＤ１１５２で７２時間処理した。次に１μＭ  ＡＢＴ−２６３を２時間加えた後、細胞溶解させ、Ｂｃｌ−ＸＬ又はＭｃｌ−１を免疫沈降させた。
【図１２Ｅ】ＨＣＴ１１６（図１２Ｅ）細胞に図１２Ａと同様に対象ｓｉＲＮＡライブラリーをトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後に細胞を２００ｎＭ  ＡＺＤ１１５２で処理し、倍数性を誘導した。ＡＺＤ１１５２の添加から３日後と７日後に培地を薬剤非添加増殖培地に交換することによりＡＺＤ１１５２をウォッシュアウトした。ＡＺＤ１１５２の添加から１０日後に細胞生存率を測定し、倍数化により誘導される致死性を評価した。
【図１３Ａ】ＡＢＴ−２６３とＡＺＤ１１５２がインビボで相乗的腫瘍増殖阻害を生じることを示す。図１３Ａは実施例４０に示すように溶媒、ＡＢＴ−２６３、ＡＺＤ１１５２、又はＡＺＤ１１５２とＡＢＴ−２６３の組合せを投与した場合のマウスにおけるＨＣＴ１１６腫瘍の増殖曲線を示す。
【図１３Ｂ】ＣＴ１１６腫瘍をもつマウス（図１３Ｂ）に溶媒又はＡＺＤ１１５２（１００ｍｇ／ｋｇ／日（以下、「ｍｋｄ」と言う）、ＩＰ，ＱＤ）を連続して３日間投与後、溶媒又はＡＢＴ−２６３（７５ｍｋｄ，ＰＯ）を投与した。ＡＢＴ−２６３の投与から４時間後と８時間後に腫瘍を採取し、ｐ５３と立体配座的に活性なＢＡＸの量について腫瘍溶解液を分析した（活性なＢＡＸを特異的に検出する抗体である６Ａ７でＩＰ後にＢＡＸイムノブロッティング）。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは倍数体細胞におけるＢｃｌ−ＸＬ「依拠」とＡＢＴ−２６３感受性のモデルを示す。倍数化はＭｃｌ−１蛋白質のダウンレギュレーション、ＮＯＸＡの誘導、ＮＯＸＡとＭｃｌ−１の相互作用の強化又はこれらの作用の何らかの組合せによりＭｃｌ−１を機能的に中和する。更に、Ｂｃｌ−ＸＬはｔＢＩＤやＢＩＫ等のＢＨ３−ｏｎｌｙ蛋白質の負荷を受ける。このため、細胞生存は益々Ｂｃｌ−ＸＬに依存性になる。Ｂｃｌ−ＸＬの抗アポトーシス機能を無効にするＡＢＴ−２６３は倍数体腫瘍細胞に迅速で確実なアポトーシスを誘発するので、この依存性ないし「依拠」は分子レベルで倍数化のアキレス腱となる。
【図１４】腫瘍細胞株におけるＢＡ及びＢＡＸ活性化を示す。Ｄ５４ＭＧ、ＳＷ６２０及びＥＪ１細胞を図１７Ｂと同様に処理した。立体配座的に活性なＢＡＫ及びＢＡＸを免疫沈降させ、イムノブロッティングにより検出した。
【図１５】Ｂｃｌ−２ネットワークにおける遺伝子発現変化を示す。Ｄ５４ＭＧ、ＳＷ６２０及びＨＣＴ１１６細胞を２００ｎＭ  ＡＺＤ１１５２、２５０ｎＭ  ＭＬＮ８０５４、又は１μＭ  ＶＸ−６８０で７２時間処理した。これらの処理の結果、以下の細胞オーロラ選択性、即ち夫々オーロラＢ、オーロラＡ又は汎オーロラ選択性が生じる。Ｂｃｌ−２ネットワークにおける遺伝子発現変化をマイクロアレイにより検出した。ＳＰＯＴＦＩＲＥ（登録商標）（ＴＩＢＣＯ（登録商標））データ解析ソフトウェアを使用して相関類似性尺度によりこれらのデータを階層的にクラスタリングした。
【図１６Ａ】Ｂｃｌ−ＸＬ及びＭｃｌ−１インタラクトームの同定を示す。ＨＣＴ１１６細胞を未処理のままとするか、又は２００ｎＭ  ＡＺＤ１１５２、１μＭ  ＡＢＴ−２６３もしくはその組合せで処理する。内在性Ｂｃｌ−ＸＬ及びＭｃｌ−１を免疫沈降させ、免疫沈降した蛋白質をゲル内トリプシン消化し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供する。全処理条件から同定された蛋白質をＢｃｌ−ＸＬ及びＭｃｌ−１インタラクトームとして単一リストに統合し、手動で作成したＢｃｌ−２ネットワークマップに当てはめる。相互作用を緑色で示す。
【図１６Ｂ】Ｂｃｌ−ＸＬ及びＭｃｌ−１インタラクトームの同定を示す。ＨＣＴ１１６細胞を未処理のままとするか、又は２００ｎＭ  ＡＺＤ１１５２、１μＭ  ＡＢＴ−２６３もしくはその組合せで処理する。内在性Ｂｃｌ−ＸＬ及びＭｃｌ−１を免疫沈降させ、免疫沈降した蛋白質をゲル内トリプシン消化し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供する。全処理条件から同定された蛋白質をＢｃｌ−ＸＬ及びＭｃｌ−１インタラクトームとして単一リストに統合し、手動で作成したＢｃｌ−２ネットワークマップに当てはめる。相互作用を緑色で示す。
【図１６Ｃ】Ｂｃｌ−ＸＬ及びＭｃｌ−１インタラクトームの同定を示す。ＨＣＴ１１６細胞を未処理のままとするか、又は２００ｎＭ  ＡＺＤ１１５２、１μＭ  ＡＢＴ−２６３もしくはその組合せで処理する。内在性Ｂｃｌ−ＸＬ及びＭｃｌ−１を免疫沈降させ、免疫沈降した蛋白質をゲル内トリプシン消化し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供する。全処理条件から同定された蛋白質をＢｃｌ−ＸＬ及びＭｃｌ−１インタラクトームとして単一リストに統合し、手動で作成したＢｃｌ−２ネットワークマップに当てはめる。相互作用を緑色で示す。
【図１７Ａ】Ｂｃｌ−ＸＬ及びＭｃｌ−１相互作用因子を同定するためのワークフローの模式図。
【図１７Ｂ】インタラクトーム成分を共免疫沈降により確認したもの。
【図１７Ｃ】インタラクトーム成分をイムノブロッティングにより確認したもの。
【図１８】Ｂｃｌ−２ネットワーク成分のｓｉＲＮＡ介在性ノックダウンを示す。ＨＣＴ１１６細胞に指定通りにｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後に細胞を２００ｎＭ  ＡＺＤ１１５２で処理し、７２時間後に溶解液を調製し、イムノブロッティングにより分析した。Ｒａｌ−Ａをローディング対照とし、ｓｉＮＴは非標的対照ｓｉＲＮＡである。
【図１９Ａ】倍数化介在性アポトーシスの経時的変化を示す。ＨＣＴ１１６細胞を２００ｎＭ  ＡＺＤ１１５２で処理し、指定時間にわたってカスパーゼ活性を測定した。
【図１９Ｂ】倍数化介在性アポトーシスの経時的変化を示す。ＨＣＴ１１６細胞を２００ｎＭ  ＡＺＤ１１５２で処理し、指定時間にわたって生存率を測定した。
【図２０】Ｍｃｌ−１が倍数体細胞をＡＢＴ−２６３に感受性にする点においてＮＯＸＡよりも上位にあることを示す。ＨＣＴ１１６細胞（図２０Ａ）に指定通りにｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後に細胞を２００ｎＭ  ＡＺＤ１１５２で更に７２時間処理した。次に細胞を１μＭ  ＡＢＴ−２６３で４時間処理し、カスパーゼ−３活性を測定した。ＨＣＴ１１６細胞（図２０Ｂ）に指定通りにｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後に細胞を２００ｎＭ  ＡＺＤ１１５２で更に７２時間処理した。次に細胞を１μＭ  ＡＢＴ−２６３で２４時間処理し、細胞生存率を測定した。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
１側面において、本発明は式（ＩＩ）；
【化１】
2013512911.tif 000003
［式中、Ｘ３はＣｌ又はＦであり；
Ｘ４はアゼパン−１−イル、モルホリン−１−イル、１，４−オキサゼパン−４−イル、ピロリジン−１−イル、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）（ＣＨ（ＣＨ３）２）、７−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−１−イル又は２−オキサ−５−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−イルであり、Ｒ０は
【化２】
2013512911.tif 000004
であり、式中、
Ｘ５はＣＨ２、Ｃ（ＣＨ３）２又はＣＨ２ＣＨ２であり；
Ｘ６及びＸ７は両方水素であるか又は両方メチルであり；
Ｘ８はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩであるか；あるいは
Ｘ４はアゼパン−１−イル、モルホリン−１−イル、ピロリジン−１−イル、Ｎ（ＣＨ３）（ＣＨ（ＣＨ３）２）又は７−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−１−イルであり、Ｒ０は
【化３】
2013512911.tif 000005
であるか；あるいは
Ｘ４はＮ（ＣＨ３）２又はモルホリン−１−イルであり、Ｒ０は
【化４】
2013512911.tif 000006
である］を有する化合物と、治療薬として許容可能なその塩、プロドラッグ、プロドラッグの塩及び代謝物を含む。
【０００８】
別の側面は、Ｘ３がＣｌ又はＦであり；
Ｘ４がアゼパン−１−イル、モルホリン−１−イル、１，４−オキサゼパン−４−イル、ピロリジン−１−イル、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）（ＣＨ（ＣＨ３）２）、７−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−１−イル又は２−オキサ−５−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−イルであり、Ｒ０が
【化５】
2013512911.tif 000007
であり、式中、
Ｘ５はＣＨ２、Ｃ（ＣＨ３）２又はＣＨ２ＣＨ２であり；
Ｘ６及びＸ７は両方水素であるか又は両方メチルであり；
Ｘ８はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩであるか；あるいは
Ｘ４がアゼパン−１−イル、モルホリン−１−イル、ピロリジン−１−イル、Ｎ（ＣＨ３）（ＣＨ（ＣＨ３）２）又は７−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−１−イルであり、Ｒ０が
【化６】
2013512911.tif 000008
であるか；あるいは
Ｘ４がＮ（ＣＨ３）２又はモルホリン−１−イルであり、Ｒ０が
【化７】
2013512911.tif 000009
である式（ＩＩ）を有する化合物と、治療薬として許容可能なその塩、プロドラッグ、プロドラッグの塩及び代謝物を含む。
【０００９】
更に別の側面は、Ｘ３がＣｌ又はＦであり；
Ｘ４がアゼパン−１−イル、モルホリン−１−イル、１，４−オキサゼパン−４−イル、ピロリジン−１−イル、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）（ＣＨ（ＣＨ３）２）、７−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−１−イル又は２−オキサ−５−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−イルであり、Ｒ０が
【化８】
2013512911.tif 000010
であり、式中、
Ｘ５はＣＨ２、Ｃ（ＣＨ３）２又はＣＨ２ＣＨ２であり；
Ｘ６及びＸ７は両方水素であるか又は両方メチルであり；
Ｘ８はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩである式（ＩＩ）を有する化合物と、治療薬として許容可能なその塩、プロドラッグ、プロドラッグの塩及び代謝物を含む。
【００１０】
更に別の側面は、Ｘ３がＣｌ又はＦであり；
Ｘ４がアゼパン−１−イル、モルホリン−１−イル、ピロリジン−１−イル、Ｎ（ＣＨ３）（ＣＨ（ＣＨ３）２）又は７−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−１−イルであり；
Ｒ０が
【化９】
2013512911.tif 000011
であり、式中、
Ｘ６及びＸ７は両方水素であるか又は両方メチルであり；
Ｘ８はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩである式（ＩＩ）を有する化合物と、治療薬として許容可能なその塩、プロドラッグ、プロドラッグの塩及び代謝物を含む。
更に別の側面は、Ｘ３がＣｌ又はＦであり；
Ｘ４がＮ（ＣＨ３）２又はモルホリン−１−イルであり；
Ｒ０が
【化１０】
2013512911.tif 000012
であり；
Ｘ８がＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩである式（ＩＩ）を有する化合物と、治療薬として許容可能なその塩、プロドラッグ、プロドラッグの塩及び代謝物を含む。
【００１１】
更に別の側面は、Ｘ３がＦであり；Ｘ４がモルホリン−１−イルであり；
Ｒ０が
【化１１】
2013512911.tif 000013
であり、式中、
Ｘ５はＣ（ＣＨ３）２であり；Ｘ６及びＸ７は両方メチルであり；Ｘ８はＣｌである式（ＩＩ）を有する化合物と、治療薬として許容可能なその塩、プロドラッグ、プロドラッグの塩及び代謝物を含む。
【００１２】
更に別の側面は、
Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチル−１−シクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（モルホリン−４−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミド（本願ではＡＢＴ−２６３とも言う）、
３−（（クロロ（ジフルオロ）メチル）スルホニル）−Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−４，４−ジメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（モルホリン−４−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド、
３−（（クロロ（ジフルオロ）メチル）スルホニル）−Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−１−シクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（モルホリン−４−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド、
Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（イソプロピル（メチル）アミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミド、
Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−１−シクロヘプテン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（イソプロピル（メチル）アミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミド、
３−（（クロロ（ジフルオロ）メチル）スルホニル）−Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）シクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（（１Ｓ，４Ｓ）−２−オキサ−５−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド、
Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）シクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（モルホリン−４−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミド、
４−（（（１Ｒ）−３−（７−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ−７−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）シクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−３−（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミド、
Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）シクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（２−オキサ−５−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミド、
Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（２−オキサ−５−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミド、
３−（（クロロ（ジフルオロ）メチル）スルホニル）−Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（２−オキサ−５−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド、
Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）シクロヘプタ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（２−オキサ−５−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミド、
３−（（クロロ（ジフルオロ）メチル）スルホニル）−Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）シクロヘプタ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（２−オキサ−５−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド、
Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−４，４−ジメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（イソプロピル（メチル）アミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミド、
Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）シクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（１，４−オキサゼパン−４−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミド、
４−（（（１Ｒ）−３−（アゼパン−１−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−１−シクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミド、
Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）シクロヘプタ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミド、
３−（（クロロ（ジフルオロ）メチル）スルホニル）−Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）シクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド、
３−（（クロロ（ジフルオロ）メチル）スルホニル）−Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（モルホリン−４−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド、
Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチル−１−シクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミド、
Ｎ−（４−（４−（（４−（４−クロロフェニル）−５，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（モルホリン−４−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミド、
３−（（クロロ（ジフルオロ）メチル）スルホニル）−Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−４，４−ジメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（イソプロピル（メチル）アミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド、
３−（（クロロ（ジフルオロ）メチル）スルホニル）−Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（イソプロピル（メチル）アミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド、
Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−４，４−ジメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（モルホリン−４−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミド、
３−（（クロロ（ジフルオロ）メチル）スルホニル）−Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−４，４−ジメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（（１Ｓ，４Ｓ）−２−オキサ−５−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド、
Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）シクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミド、
Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）シクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）−３−（ピロリジン−１−イル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミド、
３−（（クロロ（ジフルオロ）メチル）スルホニル）−Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−４，４−ジメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド、
Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）シクロヘプタ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）−３−（ピロリジン−１−イル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミド、
３−（（クロロ（ジフルオロ）メチル）スルホニル）−Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）−３−（ピロリジン−１−イル）プロピル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド、
３−（（クロロ（ジフルオロ）メチル）スルホニル）−Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−４，４−ジメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）−３−（ピロリジン−１−イル）プロピル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド、
３−（（クロロ（ジフルオロ）メチル）スルホニル）−Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）シクロヘプタ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）−３−（ピロリジン−１−イル）プロピル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド、
Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）シクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（イソプロピル（メチル）アミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミド、
Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−４，４−ジメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）−３−（ピロリジン−１−イル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミド、
３−（（クロロ（ジフルオロ）メチル）スルホニル）−Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）シクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）−３−（ピロリジン−１−イル）プロピル）アミノ）ベンゼンスルホンアミド、
Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−４，４−ジメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミド、
Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−４，４−ジメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（（１Ｓ，４Ｓ）−２−オキサ−５−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミド、
Ｎ−（４−（４−（（４’−クロロ（１，１’−ビフェニル）−２−イル）メチル）−１−ピペラジニル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミド、及び
Ｎ−（４−（４−（（４’−クロロ（１，１’−ビフェニル）−２−イル）メチル）−１−ピペラジニル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（４−モルホリニル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミドと、
治療薬として許容可能なその塩、プロドラッグ、プロドラッグの塩及び代謝物を含む。
【００１３】
更に別の側面は疾病期間中に抗アポトーシスＢｃｌ−ＸＬ蛋白質、抗アポトーシスＢｃｌ−２蛋白質又は抗アポトーシスＢｃｌ−ｗ蛋白質の１種以上が発現される疾病の治療用組成物を含み、前記組成物は賦形剤と治療有効量の式（ＩＩ）を有する化合物を含有する。
【００１４】
更に別の側面は疾病期間中に抗アポトーシスＢｃｌ−ＸＬ蛋白質、抗アポトーシスＢｃｌ−２蛋白質又は抗アポトーシスＢｃｌ−ｗ蛋白質の１種以上が発現される疾病の患者における治療方法を含み、前記方法は治療有効量の式（ＩＩ）を有する化合物を前記患者に投与する段階を含む。
【００１５】
更に別の側面は賦形剤と治療有効量の式（ＩＩ）を有する化合物を含有する組成物であって、例えば、中皮腫、膀胱癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚もしくは眼内メラノーマ、卵巣癌、乳癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、骨癌、卵巣癌、子宮頸癌、結腸癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、胃腸癌（胃、結腸・直腸及び十二指腸）、慢性リンパ球性白血病、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、精巣癌、肝細胞癌（肝細胞及び胆管細胞）、原発性もしくは二次性中枢神経系腫瘍、原発性もしくは二次性脳腫瘍、ホジキン病、慢性もしくは急性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ球性リンパ腫、リンパ芽球性白血病、濾胞性リンパ腫、Ｔ細胞もしくはＢ細胞性悪性リンパ腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、口腔癌、卵巣癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、小細胞肺癌、腎臓・尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系の新生物、原発性中枢神経系リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、脊椎腫瘍、脳幹部神経膠腫、下垂体腺腫、副腎皮質癌、胆嚢癌、脾臓癌、胆管癌、線維肉腫、神経芽腫、網膜芽細胞腫又はその併発を含む癌等の異常細胞増殖及び／又はアポトーシス調節異常を治療するための組成物を含む。
【００１６】
更に別の側面は患者における中皮腫、膀胱癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚もしくは眼内メラノーマ、卵巣癌、乳癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、骨癌、卵巣癌、子宮頸癌、結腸癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、胃腸癌（胃、結腸・直腸及び十二指腸）、慢性リンパ球性白血病、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、精巣癌、肝細胞癌（肝細胞及び胆管細胞）、原発性もしくは二次性中枢神経系腫瘍、原発性もしくは二次性脳腫瘍、ホジキン病、慢性もしくは急性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ球性リンパ腫、リンパ芽球性白血病、濾胞性リンパ腫、Ｔ細胞もしくはＢ細胞性悪性リンパ腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、口腔癌、卵巣癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、小細胞肺癌、腎臓・尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系の新生物、原発性中枢神経系リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、脊椎腫瘍、脳幹部神経膠腫、下垂体腺腫、副腎皮質癌、胆嚢癌、脾臓癌、胆管癌、線維肉腫、神経芽腫、網膜芽細胞腫又は上記癌の１種以上の併発の治療方法を含み、前記方法は治療有効量の式（ＩＩ）を有する化合物を前記患者に投与する段階を含む。
【００１７】
更に別の側面は膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、骨髄癌、子宮頚癌、慢性リンパ球性白血病、結腸・直腸癌、食道癌、肝細胞癌、リンパ芽球性白血病、濾胞性リンパ腫、Ｔ細胞又はＢ細胞性悪性リンパ腫、メラノーマ、骨髄性白血病、骨髄腫、口腔癌、卵巣癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、小細胞肺癌及び脾臓癌の治療用組成物を含み、前記組成物は賦形剤と治療有効量の式（ＩＩ）を有する化合物を含有する。
【００１８】
更に別の側面は患者における膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、骨髄癌、子宮頚癌、慢性リンパ球性白血病、結腸・直腸癌、食道癌、肝細胞癌、リンパ芽球性白血病、濾胞性リンパ腫、Ｔ細胞又はＢ細胞性悪性リンパ腫、メラノーマ、骨髄性白血病、骨髄腫、口腔癌、卵巣癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、小細胞肺癌及び脾臓癌の治療方法を含み、前記方法は治療有効量の式（ＩＩ）を有する化合物を前記患者に投与する段階を含む。
【００１９】
更に別の側面は疾病期間中に抗アポトーシスＢｃｌ−ＸＬ蛋白質、抗アポトーシスＢｃｌ−２蛋白質又は抗アポトーシスＢｃｌ−ｗ蛋白質の１種以上が発現される疾病の治療用組成物を含み、前記組成物は賦形剤と、治療有効量の式（ＩＩ）を有する化合物と、治療有効量の１種の他の治療剤又は２種以上の他の治療剤を含有する。
【００２０】
更に別の側面は疾病期間中に抗アポトーシスＢｃｌ−ＸＬ蛋白質、抗アポトーシスＢｃｌ−２蛋白質又は抗アポトーシスＢｃｌ−ｗ蛋白質の１種以上が発現される患者における疾病の治療方法を含み、前記方法は治療有効量の式（ＩＩ）を有する化合物と、治療有効量の１種の他の治療剤又は２種以上の他の治療剤を前記患者に投与する段階を含む。
【００２１】
更に別の側面は中皮腫、膀胱癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚もしくは眼内メラノーマ、卵巣癌、乳癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、骨癌、卵巣癌、子宮頸癌、結腸癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、胃腸癌（胃、結腸・直腸及び十二指腸）、慢性リンパ球性白血病、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、精巣癌、肝細胞癌（肝細胞及び胆管細胞）、原発性もしくは二次性中枢神経系腫瘍、原発性もしくは二次性脳腫瘍、ホジキン病、慢性もしくは急性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ球性リンパ腫、リンパ芽球性白血病、濾胞性リンパ腫、Ｔ細胞もしくはＢ細胞性悪性リンパ腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、口腔癌、卵巣癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、小細胞肺癌、腎臓・尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系の新生物、原発性中枢神経系リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、脊椎腫瘍、脳幹部神経膠腫、下垂体腺腫、副腎皮質癌、胆嚢癌、脾臓癌、胆管癌、線維肉腫、神経芽腫、網膜芽細胞腫又は上記癌の１種以上の併発の治療用組成物を含み、前記組成物は賦形剤と、治療有効量の式（ＩＩ）を有する化合物と、１種の他の治療剤又は２種以上の他の治療剤を含有する。
【００２２】
更に別の側面は患者における中皮腫、膀胱癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚もしくは眼内メラノーマ、卵巣癌、乳癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、骨癌、卵巣癌、子宮頸癌、結腸癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、胃腸癌（胃、結腸・直腸及び十二指腸）、慢性リンパ球性白血病、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、精巣癌、肝細胞癌（肝細胞及び胆管細胞）、原発性もしくは二次性中枢神経系腫瘍、原発性もしくは二次性脳腫瘍、ホジキン病、慢性もしくは急性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ球性リンパ腫、リンパ芽球性白血病、濾胞性リンパ腫、Ｔ細胞もしくはＢ細胞性悪性リンパ腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、口腔癌、卵巣癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、小細胞肺癌、腎臓・尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系の新生物、原発性中枢神経系リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、脊椎腫瘍、脳幹部神経膠腫、下垂体腺腫、副腎皮質癌、胆嚢癌、脾臓癌、胆管癌、線維肉腫、神経芽腫、網膜芽細胞腫又は上記癌の１種以上の併発の治療方法を含み、前記方法は治療有効量の式（ＩＩ）を有する化合物と１種の他の治療剤又は２種以上の他の治療剤を前記患者に投与する段階を含む。
【００２３】
更に別の側面は患者における中皮腫、膀胱癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚もしくは眼内メラノーマ、卵巣癌、乳癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、骨癌、卵巣癌、子宮頸癌、結腸癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、胃腸癌（胃、結腸・直腸及び十二指腸）、慢性リンパ球性白血病、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、精巣癌、肝細胞癌（肝細胞及び胆管細胞）、原発性もしくは二次性中枢神経系腫瘍、原発性もしくは二次性脳腫瘍、ホジキン病、慢性もしくは急性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ球性リンパ腫、リンパ芽球性白血病、濾胞性リンパ腫、Ｔ細胞もしくはＢ細胞性悪性リンパ腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、口腔癌、卵巣癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、小細胞肺癌、腎臓・尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系の新生物、原発性中枢神経系リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、脊椎腫瘍、脳幹部神経膠腫、下垂体腺腫、副腎皮質癌、胆嚢癌、脾臓癌、胆管癌、線維肉腫、神経芽腫、網膜芽細胞腫又は上記癌の１種以上の併発の治療方法を含み、前記方法は治療有効量の式（ＩＩ）を有する化合物と、エトポシド、ビンクリスチン、ＣＨＯＰ、リツキシマブ、ラパマイシン、Ｒ−ＣＨＯＰ、ボルテゾミブ、ＭＬＮ８２３７、トザセルチブ（別称ＶＸ−６８０又はＭＫ−０４５７）、ＰＨＡ−７３９３５８、ＡＴ９２８３、ＡＺＤ１１５２、ＢＩ８１１２８３、ＥＮＭＤ−２０７６、ＣＹＣ１１６、ＡＭＧ９００、ＰＦ−０３８１４７３５、Ｒ７６３、ＳＮＳ−３１４又はＴＡＫ−９０１の１種以上を前記患者に投与する段階を含む。
【００２４】
更に別の側面は患者におけるＢ細胞性リンパ腫の治療方法を含み、前記方法は治療有効量の式（ＩＩ）を有する化合物とエトポシドを前記患者に投与する段階を含む。
【００２５】
更に別の側面は患者におけるＢ細胞性リンパ腫の治療方法を含み、前記方法は治療有効量の式（ＩＩ）を有する化合物とビンクリスチンを前記患者に投与する段階を含む。
【００２６】
更に別の側面は患者におけるＢ細胞性リンパ腫の治療方法を含み、前記方法は治療有効量の式（ＩＩ）を有する化合物とＣＨＯＰを前記患者に投与する段階を含む。
【００２７】
更に別の側面は患者におけるＢ細胞性リンパ腫の治療方法を含み、前記方法は治療有効量の式（ＩＩ）を有する化合物とリツキシマブを前記患者に投与する段階を含む。
【００２８】
更に別の側面は患者におけるＢ細胞性リンパ腫の治療方法を含み、前記方法は治療有効量の式（ＩＩ）を有する化合物とラパマイシンを前記患者に投与する段階を含む。
【００２９】
更に別の側面は患者におけるマントル細胞リンパ腫の治療方法を含み、前記方法は治療有効量の式（ＩＩ）を有する化合物とＲ−ＣＨＯＰを前記患者に投与する段階を含む。
【００３０】
更に別の側面は患者におけるマントル細胞リンパ腫の治療方法を含み、前記方法は治療有効量の式（ＩＩ）を有する化合物とボルテゾミブを前記患者に投与する段階を含む。
【００３１】
更に別の側面において、本発明は癌罹患患者の治療方法に関する。前記方法は、
ａ）癌罹患患者に治療有効量の少なくとも１種の倍数性誘導剤を投与する段階と；
ｂ）前記患者に治療有効量の少なくとも１種のＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤を投与する段階を含む。
【００３２】
上記方法において、倍数性誘導剤はオーロラキナーゼ阻害剤とすることができる。オーロラキナーゼ阻害剤はオーロラキナーゼＡ阻害剤、オーロラキナーゼＢ阻害剤、オーロラキナーゼＣ阻害剤又はその組合せとすることができる。より特定的には、オーロラキナーゼ阻害剤はオーロラキナーゼＢ阻害剤である。例えば、オーロラキナーゼＢ阻害剤はＡＺＤ１１５２、ＺＭ４４７４３９、ＶＸ−６８０／ＭＫ０４５７又はヘスペラジンである。
【００３３】
上記方法において、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤はＡＢＴ−２６３、ＡＢＴ−７３７、Ｂｃｌ−ＸＬ選択的阻害剤又はその組合せとすることができる。
【００３４】
別の側面において、本発明は癌罹患患者の治療用としての治療剤組合せに関する。前記組合せは、
ａ）患者における１個以上の癌細胞に倍数化を誘導するために使用される少なくとも１種の倍数性誘導剤と；
ｂ）少なくとも１種のＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤
を含む。
【００３５】
上記組合せにおいて、倍数性誘導剤はオーロラキナーゼ阻害剤とすることができる。オーロラキナーゼ阻害剤はオーロラキナーゼＡ阻害剤、オーロラキナーゼＢ阻害剤、オーロラキナーゼＣ阻害剤又はその組合せとすることができる。より特定的には、オーロラキナーゼ阻害剤はオーロラキナーゼＢ阻害剤である。例えば、オーロラキナーゼＢ阻害剤はＡＺＤ１１５２、ＺＭ４４７４３９、ＶＸ−６８０／ＭＫ０４５７又はヘスペラジンである。
【００３６】
上記組合せにおいて、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤はＡＢＴ−２６３、ＡＢＴ−７３７、Ｂｃｌ−ＸＬ選択的阻害剤又はその組合せとすることができる。
【００３７】
更に別の側面において、本発明は倍数性誘導剤、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤又は倍数性誘導剤とＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤の組合せによる治療に対する適格性について患者を分類する方法に関する。前記方法は、
ａ）患者からの試験サンプルを提供する段階と；
ｂ）試験サンプル中でＢＡＸ遺伝子、ＢＡＫ遺伝子又はＮＯＸＡ遺伝子から構成される群から選択される少なくとも１種の遺伝子における少なくとも１カ所の突然変異の有無を判定する段階と；
ｃ）段階ｂ）で判定した少なくとも１カ所の突然変異の有無に基づいて倍数性誘導剤、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤又は倍数性誘導剤とＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤の組合せによる治療を受けるのに適格である患者を分類する段階
を含む。
【００３８】
上記方法において、倍数性誘導剤はオーロラキナーゼ阻害剤とすることができる。オーロラキナーゼ阻害剤はオーロラキナーゼＡ阻害剤、オーロラキナーゼＢ阻害剤、オーロラキナーゼＣ阻害剤又はその組合せとすることができる。より特定的には、オーロラキナーゼ阻害剤はオーロラキナーゼＢ阻害剤である。例えば、オーロラキナーゼＢ阻害剤はＡＺＤ１１５２、ＺＭ４４７４３９、ＶＸ−６８０／ＭＫ０４５７又はヘスペラジンである。
【００３９】
上記方法において、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤はＡＢＴ−２６３、ＡＢＴ−７３７、Ｂｃｌ−ＸＬ選択的阻害剤又はその組合せとすることができる。
【００４０】
上記方法において、試験サンプルは組織サンプルを含むことができる。例えば、組織サンプルは末梢血サンプル、腫瘍組織もしくは腫瘍の疑いのある組織、薄層細胞診サンプル、細針吸引サンプル、骨髄サンプル、リンパ節サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄液サンプル、食道ブラシ擦過サンプル、膀胱もしくは肺洗浄液サンプル、髄液サンプル、脳水サンプル、管吸引サンプル、乳頭分泌物サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結組織サンプル、パラフィン包埋組織サンプル又は末梢血サンプル、腫瘍組織もしくは腫瘍の疑いのある組織、薄層細胞診サンプル、細針吸引サンプル、骨髄サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄液サンプル、食道ブラシ擦過サンプル、膀胱もしくは肺洗浄液サンプル、髄液サンプル、脳水サンプル、管吸引サンプル、乳頭分泌物サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結組織サンプルもしくはパラフィン包埋組織サンプルのいずれかから作製された抽出液もしくは処理サンプルを含む。
【００４１】
更に、上記方法において、判定段階（ｂ）はｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより実施することができる。例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは蛍光標識した核酸プローブを使用して実施することができる。あるいは、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは少なくとも２個の核酸プローブを使用して実施する。更に別の代替例において、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションはペプチド核酸プローブを使用して実施する。
【００４２】
あるいは、上記方法において、判定段階（ｂ）はポリメラーゼ連鎖反応により実施することができる。
【００４３】
上記方法において、患者は上記治療と同時に化学療法、放射線療法又はその組合せによる治療も受けていてもよい。
【００４４】
別の側面において、本発明は倍数性誘導剤、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤又は倍数性誘導剤とＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤の組合せで治療中の癌罹患患者のモニター方法に関する。前記方法は、
ａ）少なくとも１種の倍数性誘導剤、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤又は倍数性誘導剤とＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤の組合せで現在治療中の癌罹患患者からの試験サンプルを提供する段階と；
ｂ）試験サンプル中でＢＡＸ遺伝子、ＢＡＫ遺伝子又はＮＯＸＡ遺伝子から構成される群から選択される少なくとも１種の遺伝子における少なくとも１カ所の突然変異の有無を判定する段階と；
ｃ）段階ｂ）で判定した少なくとも１カ所の突然変異の有無に基づいて倍数性誘導剤、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤又は倍数性誘導剤とＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤の組合せにより患者を治療し続けるべきか否かを判定する段階
を含む。
【００４５】
上記方法において、倍数性誘導剤はオーロラキナーゼ阻害剤とすることができる。オーロラキナーゼ阻害剤はオーロラキナーゼＡ阻害剤、オーロラキナーゼＢ阻害剤、オーロラキナーゼＣ阻害剤又はその組合せとすることができる。より特定的には、オーロラキナーゼ阻害剤はオーロラキナーゼＢ阻害剤である。例えば、オーロラキナーゼＢ阻害剤はＡＺＤ１１５２、ＺＭ４４７４３９、ＶＸ−６８０／ＭＫ０４５７又はヘスペラジンである。
【００４６】
上記方法において、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤はＡＢＴ−２６３、ＡＢＴ−７３７、Ｂｃｌ−ＸＬ選択的阻害剤又はその組合せとすることができる。
【００４７】
上記方法において、試験サンプルは組織サンプルを含むことができる。例えば、組織サンプルは末梢血サンプル、腫瘍組織もしくは腫瘍の疑いのある組織、薄層細胞診サンプル、細針吸引サンプル、骨髄サンプル、リンパ節サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄液サンプル、食道ブラシ擦過サンプル、膀胱もしくは肺洗浄液サンプル、髄液サンプル、脳水サンプル、管吸引サンプル、乳頭分泌物サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結組織サンプル、パラフィン包埋組織サンプル又は末梢血サンプル、腫瘍組織もしくは腫瘍の疑いのある組織、薄層細胞診サンプル、細針吸引サンプル、骨髄サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄液サンプル、食道ブラシ擦過サンプル、膀胱もしくは肺洗浄液サンプル、髄液サンプル、脳水サンプル、管吸引サンプル、乳頭分泌物サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結組織サンプルもしくはパラフィン包埋組織サンプルのいずれかから作製された抽出液もしくは処理サンプルを含む。
【００４８】
更に、上記方法において、判定段階（ｂ）はｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより実施することができる。例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは蛍光標識した核酸プローブを使用して実施することができる。あるいは、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは少なくとも２個の核酸プローブを使用して実施する。更に別の代替例において、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションはペプチド核酸プローブを使用して実施する。
【００４９】
あるいは、上記方法において、判定段階（ｂ）はポリメラーゼ連鎖反応により実施することができる。
【００５０】
上記方法において、患者は上記治療と同時に化学療法、放射線療法又はその組合せによる治療も受けていてもよい。
【００５１】
別の側面において、本発明は倍数性誘導剤、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤又は倍数性誘導剤とＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤の組合せによる治療に対して耐性の癌をもつとして患者を分類する方法に関し、前記方法は、
ａ）癌罹患患者からの試験サンプルを提供する段階と；
ｂ）試験サンプル中でＢＡＸ遺伝子、ＢＡＫ遺伝子又はＮＯＸＡ遺伝子から構成される群から選択される少なくとも１種の遺伝子における少なくとも１カ所の突然変異の有無を判定する段階と；
ｃ）段階ｂ）で判定した少なくとも１カ所の突然変異の有無に基づいて倍数性誘導剤、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤又は倍数性誘導剤とＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤の組合せによる治療に対して耐性の癌をもつとして患者を分類する段階
を含む。
【００５２】
上記方法において、倍数性誘導剤はオーロラキナーゼ阻害剤とすることができる。オーロラキナーゼ阻害剤はオーロラキナーゼＡ阻害剤、オーロラキナーゼＢ阻害剤、オーロラキナーゼＣ阻害剤又はその組合せとすることができる。より特定的には、オーロラキナーゼ阻害剤はオーロラキナーゼＢ阻害剤である。例えば、オーロラキナーゼＢ阻害剤はＡＺＤ１１５２、ＺＭ４４７４３９、ＶＸ−６８０／ＭＫ０４５７又はヘスペラジンである。
【００５３】
上記方法において、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤はＡＢＴ−２６３、ＡＢＴ−７３７、Ｂｃｌ−ＸＬ選択的阻害剤又はその組合せとすることができる。上記方法において、試験サンプルは組織サンプルを含むことができる。例えば、組織サンプルは末梢血サンプル、腫瘍組織もしくは腫瘍の疑いのある組織、薄層細胞診サンプル、細針吸引サンプル、骨髄サンプル、リンパ節サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄液サンプル、食道ブラシ擦過サンプル、膀胱もしくは肺洗浄液サンプル、髄液サンプル、脳水サンプル、管吸引サンプル、乳頭分泌物サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結組織サンプル、パラフィン包埋組織サンプル又は末梢血サンプル、腫瘍組織もしくは腫瘍の疑いのある組織、薄層細胞診サンプル、細針吸引サンプル、骨髄サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄液サンプル、食道ブラシ擦過サンプル、膀胱もしくは肺洗浄液サンプル、髄液サンプル、脳水サンプル、管吸引サンプル、乳頭分泌物サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結組織サンプルもしくはパラフィン包埋組織サンプルのいずれかから作製された抽出液もしくは処理サンプルを含む。
【００５４】
更に、上記方法において、判定段階（ｂ）はｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより実施することができる。例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは蛍光標識した核酸プローブを使用して実施することができる。あるいは、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは少なくとも２個の核酸プローブを使用して実施する。更に別の代替例において、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションはペプチド核酸プローブを使用して実施する。
【００５５】
あるいは、上記方法において、判定段階（ｂ）はポリメラーゼ連鎖反応により実施することができる。
【００５６】
上記方法において、患者は上記治療と同時に化学療法、放射線療法又はその組合せによる治療も受けていてもよい。
【００５７】
（詳細な説明）
１側面において、本発明は腫瘍及び癌細胞に治療有効量の少なくとも１種の倍数性誘導剤と治療有効量の少なくとも１種のＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤を投与した場合にこれらの細胞で生じる相乗効果の発見に関する。具体的に言うと、本発明者らは所定の腫瘍及び癌細胞に倍数化を誘導すると、その結果として得られるこれらの倍数体細胞の生存がＢｃｌ−ＸＬの抗アポトーシス活性に依存性になることを発見した。より具体的には、これらの腫瘍及び癌細胞に倍数性を誘導すると、これらの細胞はＢｃｌ−ＸＬ阻害に感受性になる。従って、本発明者らはこれらの細胞に倍数性を介してアポトーシス又は細胞死を誘導する方法を発見した。この方法は癌罹患患者に治療剤組合せを投与する段階を含む。具体的には、少なくとも１種の倍数性誘導剤を患者に投与する。倍数性誘導剤の目的は１個以上の癌細胞に倍数性を誘導することである。先述したように、倍数性の誘導後、これらの倍数体腫瘍及び癌細胞の生存はＢｃｌ−ＸＬに依存性になる。これらの倍数体腫瘍及び癌細胞のアポトーシスないし死は少なくとも１種のＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤を患者に投与することにより達成ないし実現することができる。少なくとも１種の倍数性誘導剤と少なくとも１種のＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤を投与する順序は重要ではない。しかし、腫瘍及び癌細胞は倍数性の誘導後までＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤に感受性にならないので、少なくとも１種のＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤よりも前又はそれと同時に少なくとも１種の倍数性誘導剤を患者に投与することが好ましい。上記発見と共に、本発明者らは、（ｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）、（ｉｉ）ヒトＮＯＸＡ遺伝子、又は（ｉｉｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）とヒトＮＯＸＡ遺伝子に少なくとも１カ所の突然変異を含む腫瘍及び癌細胞が（これらの細胞が倍数体になるように誘導されているか否かに関係なく）（例えば少なくとも１種の倍数性誘導剤による）倍数性の誘導後にＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤による治療に対して免疫性になるか又は耐性を示すことも発見した。換言するならば、（ｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）、（ｉｉ）ヒトＮＯＸＡ遺伝子、又は（ｉｉｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）とヒトＮＯＸＡ遺伝子に少なくとも１カ所の突然変異を含む倍数体腫瘍及び癌細胞は少なくとも１種のＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤を同時に又は後で投与した場合にアポトーシス又は細胞死を示さないか又は生じない。
【００５８】
従って、この別の発見に鑑み、別の側面において、本発明は倍数性誘導剤（例えばオーロラキナーゼ阻害剤）療法、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤療法又は倍数性誘導剤とＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤の併用療法に対する耐性について癌及び腫瘍細胞をモニターするための方法及び組成物も提供する。本発明は癌患者を同定、分類及びモニターするための診断アッセイも提供し、前記アッセイは、（ｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）、（ｉｉ）ヒトＮＯＸＡ遺伝子、又は（ｉｉｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）とヒトＮＯＸＡ遺伝子における少なくとも１カ所の突然変異の有無について試験サンプルを評価する段階を含む。本発明のアッセイとしては、倍数性誘導剤療法、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤療法又は（併用療法として又は（例えば化学療法、放射線療法又はその組合せによる）更に別の療法と併用して）倍数性誘導剤とＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤の療法を受けるのに適格な患者を同定し、このような療法に対する患者応答をモニターするアッセイ方法が挙げられる。本発明は、例えば、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより（ｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）、（ｉｉ）ヒトＮＯＸＡ遺伝子、又は（ｉｉｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）とヒトＮＯＸＡ遺伝子における少なくとも１カ所の突然変異の有無を判定する段階を含む。本願の方法は倍数性の誘導前又は倍数性の誘導後に実施することができる。（ｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）、（ｉｉ）ヒトＮＯＸＡ遺伝子、又は（ｉｉｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）とヒトＮＯＸＡ遺伝子に１カ所以上の突然変異をもつか又は１カ所以上の突然変異が基線（又は所定）レベルよりも高いと分類される患者は少なくとも１種の倍数性誘導剤、少なくとも１種のＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤又は倍数性誘導剤とＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤の併用療法の各々に応答しにくいとみなされるので、このような患者はこれらの療法を受けるには不適格であるとみなされる。具体的には、（ｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）、（ｉｉ）ヒトＮＯＸＡ遺伝子、又は（ｉｉｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）とヒトＮＯＸＡ遺伝子に１カ所以上の突然変異をもつと同定される患者は（倍数化を誘導するための）少なくとも１種の倍数性誘導剤による治療の前又は後に少なくとも１種のＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤による治療に免疫性、耐性又は低感受性であると考えられる。
【００５９】
１側面において、本発明は倍数性誘導剤、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤又は（相互に併用又は第３の療法と併用した）倍数性誘導剤とＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤による治療に適格である患者を同定又は分類する方法を含む。前記方法は、
（ａ）患者からの組織サンプルを提供する段階と；
（ｂ）（ｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）、（ｉｉ）ヒトＮＯＸＡ遺伝子、又は（ｉｉｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）とヒトＮＯＸＡ遺伝子における少なくとも１カ所の突然変異の有無を判定する段階と；
（ｃ）（ｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）、（ｉｉ）ヒトＮＯＸＡ遺伝子、又は（ｉｉｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）とヒトＮＯＸＡ遺伝子における少なくとも１カ所の突然変異の有無に基づいて倍数性誘導剤、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤又は倍数性誘導剤とＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤の両方による治療に適格である患者を分類する段階
を含む。上記方法では、（ｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）、（ｉｉ）ヒトＮＯＸＡ遺伝子、又は（ｉｉｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）とヒトＮＯＸＡ遺伝子において少なくとも１カ所の突然変異が存在する場合又は１カ所以上の突然変異数が基線（又は所定）レベルよりも増加する場合に患者は倍数性誘導剤、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤又は倍数性誘導剤とＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤の両方による治療に不適格となる。先述の方法と同様に、この方法も患者に倍数性の誘導前又は誘導後に実施することができる。
【００６０】
この側面において、癌は結腸・直腸癌や膵臓癌等の任意種類の癌とすることができる。更に、この側面において、遺伝子増幅は例えば肺癌腫瘍生検サンプルで実施される多色蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイにより測定することができる。他の側面では、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣ）法を使用する。
【００６１】
更に別の側面において、本発明は倍数性誘導剤、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤、又は倍数性誘導剤とＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤の組合せによる治療に対して耐性の癌をもつ患者を同定又は分類する方法を含み、前記方法は、
（ａ）患者からの試験サンプル（例えば組織サンプル）を提供する段階と；
（ｂ）（ｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）、（ｉｉ）ヒトＮＯＸＡ遺伝子、又は（ｉｉｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）とヒトＮＯＸＡ遺伝子における少なくとも１カ所の突然変異の有無を判定する段階と；
（ｃ）（ｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）、（ｉｉ）ヒトＮＯＸＡ遺伝子、又は（ｉｉｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）とヒトＮＯＸＡ遺伝子における少なくとも１カ所の突然変異の存在に基づいて倍数性誘導剤、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤又は倍数性誘導剤とＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤の組合せによる治療に対して耐性の癌をもつとして患者を分類する段階
を含む。先述の方法と同様に、この方法も患者に倍数性の誘導前又は誘導後に実施することができる。
【００６２】
この側面において、癌は結腸・直腸癌や膵臓癌等の任意種類の癌とすることができる。更に、この側面において、遺伝子増幅は例えば肺癌腫瘍生検サンプルで実施される多色蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイにより測定することができる。他の側面では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する。
【００６３】
更に別の側面において、本発明は倍数性誘導剤、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤又は倍数性誘導剤とＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤の組合せで治療中の患者のモニター方法に関し、前記方法は、
（ａ）少なくとも１種の倍数性誘導剤、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤又は倍数性誘導剤とＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤の組合せで治療中の癌患者からの試験サンプルを提供する段階と（場合により、組織サンプルから得られた腫瘍又は癌細胞を同定又は抽出してもよい）；
（ｂ）試験サンプル中で（例えば、腫瘍又は癌細胞中で）（ｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）、（ｉｉ）ヒトＮＯＸＡ遺伝子、又は（ｉｉｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）とヒトＮＯＸＡ遺伝子における少なくとも１カ所の突然変異の有無を判定する段階と；
（ｃ）試験サンプルからの（例えば腫瘍又は癌細胞中の）（ｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）、（ｉｉ）ヒトＮＯＸＡ遺伝子、又は（ｉｉｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）とヒトＮＯＸＡ遺伝子における突然変異数を基線レベル又は所定レベルと比較する段階と；
（ｄ）段階（ｃ）の比較に基づいて倍数性誘導剤、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤又は倍数性誘導剤とＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤の組合せにより患者を治療し続けるべきか否かを判定する段階
を含む。先述の方法と同様に、この方法も患者に倍数性の誘導前又は誘導後に実施することとができる。
【００６４】
試験サンプルから測定された１カ所以上の突然変異の数と基線又は所定レベルの比較（又は情報解析）はアッセイを実施する機器（例えばコンピュータープラットフォーム）の一部であるか又はこれと適合可能なソフトウェアプログラム又はインテリジェンスシステム等の自動システムにより実施することができる。あるいは、この比較又は情報解析は医師が実施することができる。
【００６５】
具体的には、（ｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）、（ｉｉ）ヒトＮＯＸＡ遺伝子、又は（ｉｉｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）とヒトＮＯＸＡ遺伝子に少なくとも１カ所の突然変異をもつ試験サンプル（例えば腫瘍又は癌細胞）が基線レベル又は所定レベル以上であるならば、倍数性誘導剤、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤又は倍数性誘導剤とＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤の組合せによる治療を中断、停止又は終了することができる。あるいは、倍数性誘導剤を併用療法として少なくとも第２の療法（例えば、第２の小分子による治療）と併用することを治療医が決定してもよい。更に別の代替例では、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤を併用療法として少なくとも第２の療法（例えば、第２の小分子による治療）と併用することを治療医が決定してもよい。一方、（ｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）、（ｉｉ）ヒトＮＯＸＡ遺伝子、又は（ｉｉｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）とヒトＮＯＸＡ遺伝子における少なくとも１カ所の突然変異が基線レベル又は所定レベルよりも低い場合、あるいは（ｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）、（ｉｉ）ヒトＮＯＸＡ遺伝子、又は（ｉｉｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）とヒトＮＯＸＡ遺伝子に突然変異が検出されない場合には、倍数性誘導剤、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤又は倍数性誘導剤とＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤の組合せによる治療を続けることができる。この場合も、前記治療により得られる結果に応じて、治療医は倍数性誘導剤を併用療法として少なくとも第２の療法（例えば、第２の小分子による治療）と併用することを決定してもよい。あるいは、前記治療により得られる結果に応じて、治療医はＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤を併用療法として少なくとも第２の療法（例えば、第２の小分子による治療）と併用することを決定してもよい。
【００６６】
この場合も、患者から得られた試験サンプル中の（ｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）、（ｉｉ）ヒトＮＯＸＡ遺伝子、又は（ｉｉｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）とヒトＮＯＸＡ遺伝子における少なくとも１カ所の突然変異の有無を検出するには、ＦＩＳＨ法とＰＣＲ法を使用することができる。
【００６７】
本発明は更に、例えば、ＰＣＲプライマー、ＦＩＳＨプローブ等として使用するように構築されたオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをパッケージングしたキットにも関する。
【００６８】
本発明は癌療法、特に倍数性誘導剤療法、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤療法又は倍数性誘導剤療法とＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤療法の併用について患者の層化改善を可能にするという重要な特徴がある。本発明によるこれらのバイオマーカーの評価は治療に対する個々の患者の応答の追跡も可能にする。
【００６９】
Ａ．定義
本セクション及び本願の全開示で使用するセクション見出しは限定的なものではない。
【００７０】
本願で使用する単数形の不定冠詞と定冠詞はそうでないことが内容から明白である場合を除き、複数の記載を包含する。本願で数値範囲を記載する場合には、同一精度で両端間に含まれる各数値が明白に想定される。例えば、６〜９の範囲では、６と９以外に７と８の数値も想定され、６．０〜７．０の範囲では、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９及び７．０の数値が明白に想定される。
【００７１】
ａ）抗腫瘍形成
本願で使用する「抗腫瘍形成」なる用語は腫瘍増殖の低下を意味する。
【００７２】
ｂ）オーロラキナーゼ阻害剤
「オーロラキナーゼ阻害剤」とは、オーロラキナーゼＡ、オーロラＡ、オーロラキナーゼＢ、オーロラＢ、オーロラキナーゼＣ又はオーロラＣの少なくとも１種と結合し、少なくとも１種のオーロラキナーゼＡ、オーロラＡ、オーロラキナーゼＢ、オーロラＢ、オーロラキナーゼＣ又はオーロラＣに関連する核酸又は蛋白質の活性に拮抗する任意型（例えば非選択的又は選択的）の治療用化合物を意味し、小分子、抗体、アンチセンス、低分子干渉ＲＮＡ又はマイクロＲＮＡを主成分とする化合物を含む。
【００７３】
ｃ）オーロラキナーゼＡ阻害剤
「オーロラキナーゼＡ阻害剤」とは、オーロラキナーゼＡ又はオーロラＡの少なくとも一方と結合し、オーロラキナーゼＡ又はオーロラＡに関連する核酸又は蛋白質の活性に拮抗する任意型（例えば非選択的又は選択的）の治療用化合物を意味し、小分子、抗体、アンチセンス、低分子干渉ＲＮＡ又はマイクロＲＮＡを主成分とする化合物を含む。本発明の方法は任意の公知オーロラキナーゼＡ阻害剤又は将来開発されるオーロラキナーゼＡ阻害剤で有用である。オーロラキナーゼＡ阻害剤の例はＰＨＡ−７３９３５８、ＭＬＮ−８０５４、Ｒ−７６３、ＪＮＪ−７７０６６２１、ＭＰ−５２９及びＭＰ−２３５である。
【００７４】
ｄ）オーロラキナーゼＢ阻害剤
「オーロラキナーゼＢ阻害剤」とは、オーロラキナーゼＢ又はオーロラＢの少なくとも一方と結合し、オーロラキナーゼＢ又はオーロラＢに関連する核酸又は蛋白質の活性に拮抗する任意型（例えば非選択的又は選択的）の治療用化合物を意味し、小分子、抗体、アンチセンス、低分子干渉ＲＮＡ又はマイクロＲＮＡを主成分とする化合物を含む。例えば、多数のオーロラキナーゼＢ阻害剤はヒストンＨ３リン酸化又は細胞分裂の少なくとも一方を阻害することが知られている。更に、多数のオーロラキナーゼＢ阻害剤は少なくとも１種の細胞系（例えば急性骨髄性白血病細胞株、急性骨髄性白血病一次培養液等）にアポトーシスを誘発することが知られている。本発明の方法は任意の公知オーロラキナーゼＢ阻害剤又は将来開発されるオーロラキナーゼＢ阻害剤で有用である。オーロラキナーゼＢ阻害剤の例はＡＺＤ１１５２、ＺＭ４４７４３９、ＶＸ−６８０／ＭＫ０４５７及びヘスペラジンである。
【００７５】
ＡＺＤ１１５２は２−［［３−（｛４−［（５−｛２−［（３−フルオロフェニル）アミノ］−２−オキソエチル｝−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］キナゾリン−７−イル｝オキシ）プロピル］（エチル）アミノ］エチルリン酸二水素塩とも呼ばれ、ピロゾロキナゾリンオーロラキナーゼ阻害剤（ＡＺＤ１１５２−ヒドロキシキナゾリンピラゾールアニリド（ＨＱＰＡ））のプロドラッグであり、血漿中で迅速に活性なＡＺＤ１１５２−ＨＱＰＡに変換される（Ｍｏｒｔｌｏｃｋ，ＡＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５０：２２１３−２４（２００７）参照）。ＡＺＤ１１５２−ＨＱＰＡは非常に強力で選択的なオーロラＢ阻害剤である。
【００７６】
ＺＭ４４７４３９は４−（４−（Ｎ−ベンゾイルアミノ）アニリノ）−６−メトキシ−７−（３−（１−モルホリノ）プロポキシ）キナゾリンとも呼ばれ、キナゾリン誘導体であり、オーロラＡとオーロラＢを阻害する。ＺＭ４４７４３９の化学構造はＤｉｔｃｈｆｉｅｌｄ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．，１６１（２）：２６７−２８０（２００３）及びＭｏｎｔｅｍｂａｕｌｔ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ，３０（１）：１−９（２００５）に記載されている。
【００７７】
ＶＸ−６８０／ＭＫ０４５７は｛４−［４−（４−メチルピペラジン−１−イル）−６−（５−メチル−２Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピリミジン−２−イルスルファニル］フェニル｝アミドのシクロプロパンカルボン酸であり、オーロラＡ。オーロラＢ及びオーロラＣを阻害する。ＶＸ−６８０／ＭＫ０４５７の化学構造はＭｏｎｔｅｍｂａｕｌｔ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ，３０（１）：１−９（２００５）に記載されている。
【００７８】
ヘスペラジンはインドリノンであり、オーロラＢを阻害する。ヘスペラジンの化学構造はＨａｕｆ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．，１６１（２）：２８１−２９４（２００３）及びＭｏｎｔｅｍｂａｕｌｔ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ，３０（１）：１−９（２００５）に記載されている。
【００７９】
ｅ）オーロラキナーゼＣ阻害剤
「オーロラキナーゼＣ阻害剤」とは、オーロラキナーゼＣ又はオーロラＣの少なくとも一方と結合し、オーロラキナーゼＣ又はオーロラＣに関連する核酸又は蛋白質の活性に拮抗する任意型（例えば非選択的又は選択的）の治療用化合物を意味し、小分子、抗体、アンチセンス、低分子干渉ＲＮＡ又はマイクロＲＮＡを主成分とする化合物を含む。本発明の方法は任意の公知オーロラキナーゼＣ阻害剤又は将来開発されるオーロラキナーゼＣ阻害剤で有用である。オーロラキナーゼＣ阻害剤の例はＡＺＤ１１５２及びＶＸ−６８０／ＭＫ−０４５７である。
【００８０】
ｆ）％の配列一致度を有するポリヌクレオチドから本質的に構成される
「％の配列一致度を有するポリヌクレオチドから本質的に構成される」とは、ポリヌクレオチドが長さは実質的に相違しないが、配列は実質的に相違していてもよいことを意味する。従って、１００ヌクレオチドの既知配列「Ｂ」に対して少なくとも８０％の配列一致度を有するポリヌクレオチドから本質的に構成されるポリヌクレオチド「Ａ」と言う場合には、ポリヌクレオチド「Ａ」が約１００ヌクレオチド（ｎｔ）長であるが、２０ｎｔまで「Ｂ」配列と相違していてもよいことを意味する。目的の二次構造を作製するために実質的に一致しない配列を付加する場合のように、例えば特定型のプローブ、プライマー及び他の分子ツール等を作製するために１〜１５ヌクレオチドを付加する等の末端修飾により、該当ポリヌクレオチド配列を延長又は短縮することができる。配列が「から本質的に構成される」と言う場合には、このような不一致のヌクレオチドは配列一致度の計算で考慮しない。
【００８１】
ｇ）Ｂｃｌ−２
本願で使用する「Ｂｃｌ−２」なる用語はアポトーシスの臨界制御点を構成するアポトーシス促進蛋白質と抗アポトーシス蛋白質のファミリーを意味する。このファミリーのメンバーとしては、アポトーシス促進蛋白質と抗アポトーシス蛋白質の両者が挙げられ、Ｂｃｌ−２ホモロジー（ＢＨ）１〜４ドメインと呼ばれる４個までの保存領域に相同性をもつ。このファミリーは抗アポトーシス蛋白質、アポトーシス促進蛋白質、「ＢＨ３−ｏｎｌｙ」蛋白質の主に３種類のサブクラスに分けることができる。
【００８２】
抗アポトーシス蛋白質としてはＢｃｌ−２やＢｃｌ−ＸＬが挙げられ、いずれも全４個のＢＨドメインに相同性をもつ「マルチドメイン」である。他方、アポトーシス促進蛋白質は更に細分類することができ、ＢＨ１−３ドメインに配列相同性をもつＢＡＸやＢＡＫ等のマルチドメイン蛋白質を含む。遠縁の「ＢＨ３−ｏｎｌｙ」蛋白質はこれまでのところではいずれもアポトーシス促進性であり、そのアポトーシス機能に必要な両親媒性α螺旋ＢＨ３領域内に配列相同性をもつ。
【００８３】
ヒトＢＡＫをコードするヒトＢＡＫ遺伝子はアクセション番号Ｕ２３７６５であり、Ｃｈｉｔｔｅｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：７３３−７３６（１９９５）に記載されている。ヒトＢＡＫ−２遺伝子はアクセション番号Ｕ１６８１２であり、Ｋｉｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：７３６−７３９（１９９５）に記載されている。ヒトＢＡＸをコードするヒトＢＡＸ遺伝子はアクセション番号Ｌ２２４７５、Ｌ２２４７４及びＬ２２４７３であり、Ｏｌｔｖａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７４：６０９−６１９（１９９３）に記載されている。
【００８４】
本願で使用する「アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子」なる用語は少なくとも１種のヒトＢｃｌ−２アポトーシス促進蛋白質又はそのフラグメントをコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＫ又はヒトＢＡＸ）を意味する。
【００８５】
「ＢＨ３−ｏｎｌｙ蛋白質」はＢｃｌ−２ファミリーの第３のサブセットを構成し、例えば、ＢＩＤ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＩＫ、ＢＩＭ及びＢＡＤが挙げられる。突然変異解析によると、アポトーシス促進メンバーではその細胞死活性に両親媒性α螺旋ＢＨ３領域が必要であることが分かっているが、これらの蛋白質はこの領域のみに配列相同性をもつ。
【００８６】
ヒトＢＩＤをコードするヒトＢＩＤ遺伝子はアクセション番号ＮＭ＿１９７９６６、ＮＭ＿１９７９６７、ＮＭ＿００１１９６であり、Ｇｅｎｂａｎｋに記載されている。ヒトＮＯＸＡをコードするヒトＮＯＸＡ遺伝子はアクセション番号ＮＭ＿０２１１２７であり、Ｇｅｎｂａｎｋに記載されている。ヒトＰＵＭＡをコードするヒトＰＵＭＡ遺伝子はアクセション番号ＮＭ＿００１１２７２４２、ＮＭ＿００１１２７２４１、ＮＭ＿００１１２７２４０、ＮＭ＿０１４４１７であり、Ｇｅｎｂａｎｋに記載されている。ヒトＢＩＫをコードするヒトＢＩＫ遺伝子はアクセション番号ＮＭ＿００１１９７であり、Ｇｅｎｂａｎｋに記載されている。ヒトＢＩＭをコードするヒトＢＩＭ遺伝子はアクセション番号ＮＭ＿１３８６２１、ＮＭ＿２０７００２、ＮＭ＿００６５３８、ＢＣ０３３６９４、ＡＹ３０５７１４、ＡＹ３０５７１６、ＡＹ４２３４４３、ＡＹ４２３４４２、ＡＹ４２３４４１であり、Ｇｅｎｂａｎｋに記載されている。ヒトＢＡＤをコードするヒトＢＡＤ遺伝子はアクセション番号ＮＭ＿０３２９８９、ＮＭ＿００４３２２、ＢＣ０９５４３１であり、Ｇｅｎｂａｎｋに記載されている。
【００８７】
本願で使用する「ヒトＢＨ３をコードする遺伝子」なる用語は少なくとも１種のヒトＢｃｌ−２  ＢＨ３−ｏｎｌｙ蛋白質又はそのフラグメントをコードする遺伝子（例えば、ヒトＢＩＤ、ヒトＮＯＸＡ、ヒトＰＵＭＡ、ヒトＢＩＫ、ヒトＢＩＭ及びヒトＢＡＤ）を意味する。
【００８８】
ｈ）Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤、Ｂｃｌ−２ファミリー阻害剤又はＢｃｌ−２ファミリー蛋白質の阻害剤
本願で使用する「Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤」、「Ｂｃｌ−２ファミリー阻害剤」又は「Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質の阻害剤」なる用語は本願では同義に使用し、ミトコンドリア外膜透過性（ＭＯＭＰ）を支配する抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーの少なくとも１種の遺伝子又は蛋白質（例えばＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｂｃｌ−Ｂ、ＢＦＬ−１及びＭＣｌ−１）と結合してその活性に拮抗ないし阻害する任意型（例えば非選択的又は選択的）の治療用化合物を意味し、小分子、抗体、アンチセンス、低分子干渉ＲＮＡ又はマイクロＲＮＡを主成分とする化合物を含む。Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤の例としては、本願のセクションＢに記載する化合物（即ち、ＡＢＴ−２６３（即ちＮ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチル−１−シクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（モルホリン−４−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミド））、米国特許出願公開第２００５０１５９４２７号及び２００６０１２８７０６号に記載されているＡＢＴ−７３７（Ｎ−（４−（４−（（４’−クロロ（１，１’−ビフェニル）−２−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−ニトロベンゼンスルホンアミド）、Ｂｃｌ−ＸＬ阻害剤並びにその組合せが挙げられる。
【００８９】
ｉ）Ｂｃｌ−ＸＬ選択的阻害剤
本願で使用する「Ｂｃｌ−ＸＬ選択的阻害剤」なる用語はＢｃｌ−２よりもＢｃｌ−ＸＬに選択性を示すＢｃｌ−ＸＬ阻害剤を意味する。Ｂｃｌ−ＸＬ阻害剤がＢｃｌ−ＸＬ選択的阻害剤であるか否かを判定する方法は当分野で周知である。具体的には、このような方法はＢｃｌ−ＸＬ阻害剤化合物の阻害定数（Ｋｉ）と結合選択性比（例えば、Ｂｃｌ−ＸＬ  Ｋｉ：Ｂｃｌ−２  Ｋｉ）を求める。阻害定数（Ｋｉ）は酵素−阻害剤複合体又は蛋白質／小分子複合体の解離定数であり、ここで小分子はある蛋白質が別の蛋白質又はペプチドと結合するのを阻害している。阻害定数は時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＴＲ−ＦＲＥＴ）アッセイを使用して求めることができる。ある化合物のＫｉが所定数値よりも「＞」（よりも大）と記載する場合には、（例えばＢｃｌ−ＸＬに対する）結合親和性値がアッセイで求めた値よりも大きいという意味である。ある化合物の結合選択性比が所定数値よりも「＞」（よりも大）と記載する場合には、Ｂｃｌ−２と比較したＢｃｌ−ＸＬに対する特定化合物の選択性が少なくとも指定数値と同等であるという意味である。ある化合物のＫｉが所定数値よりも「＜」（よりも小）と記載する場合には、（例えばＢｃｌ−２に対する）結合親和性値が使用したアッセイの検出限界値未満であるという意味である。阻害定数はＷａｎｇの式を使用して求めた（Ｗａｎｇ  Ｚｘ，．Ａｎ  Ｅｘａｃｔ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｆｏｒ  Ｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｏｆ  Ｔｗｏ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｌｉｇａｎｄｓ  Ｔｏ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９５，３６０：１１１−４）。
【００９０】
ｊ）発現、アンチセンス阻害及び共抑制
「発現」とは機能的最終産物の生産を意味する。遺伝子の発現は遺伝子の転写と、前駆体又は成熟蛋白質へのｍＲＮＡの翻訳を伴う。「アンチセンス阻害」とは、標的蛋白質の発現を抑制することが可能なアンチセンスＲＮＡ転写産物の生産を意味する。「共抑制」とは、同一又は実質的に類似する外来性又は内在性遺伝子の発現を抑制することが可能なセンスＲＮＡ転写産物の生産を意味する（米国特許第５，２３１，０２０号）。
【００９１】
ｋ）単離型
核酸分子又はポリヌクレオチドに関して本願で使用する「単離型」なる用語は核酸分子又はポリヌクレオチドの天然資源中に存在する他の核酸分子又はポリヌクレオチドから分離された核酸分子又はポリヌクレオチドを意味する。更に、ｃＤＮＡ分子等の「単離型」核酸分子又はポリヌクレオチドは組換え技術により作製する場合には他の細胞材料又は培養培地を実質的に除去することができ、あるいは化学的に合成する場合には化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に除去することができる。１側面において、核酸分子又はポリヌクレオチドは単離型である。
【００９２】
ｌ）遺伝子
「遺伝子」とは特定蛋白質を発現する核酸フラグメントを意味し、コーディング配列の前（５’非コーディング配列）と後（３’非コーディング配列）の調節配列を含む。
【００９３】
ｍ）阻害定数ないしＫｉ
本願で使用する「阻害定数」ないし「Ｋｉ」とは、酵素−阻害剤複合体又は蛋白質／小分子複合体の解離定数を意味し、ここで、小分子はある蛋白質が別の蛋白質と結合するのを阻害している。Ｋｉ値が大きいほど結合親和性は低く、Ｋｉ値が小さいほど結合親和性は高い。ＫｉはＷａｎｇの式を使用する等の当分野で公知の任意方法を使用して求めることができる（Ｗａｎｇ  Ｚ  Ｘ，．Ａｎ  Ｅｘａｃｔ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｆｏｒ  Ｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｏｆ  Ｔｗｏ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｌｉｇａｎｄｓ  Ｔｏ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９５；３６０：１１１−４）。抗アポトーシス蛋白質阻害剤の結合親和性の典型的な尺度は蛋白質と阻害剤の間の結合プロセスと解離プロセスのバランス（Ｋｉ）である。
【００９４】
ｎ）天然遺伝子及びキメラ構築物
「天然遺伝子」とは、それ自体の調節配列と共に自然界に存在する遺伝子を意味する。これに対して「キメラ構築物」とは通常では自然界に共存しない核酸フラグメントの組合せを意味する。従って、キメラ構築物は異なる起源に由来する調節配列とコーディング配列を含むことができ、あるいは同一起源に由来するが、自然界に通常存在する配置とは異なるように配置された調節配列とコーディング配列を含むことができる。
【００９５】
ｏ）核酸配列一致度百分率（％）
核酸配列に関する「核酸配列一致度百分率（％）」は候補配列と目的配列を整列させ、必要に応じて最大の配列一致度百分率に達するようにギャップを導入した後に目的配列中のヌクレオチドと一致する候補配列中のヌクレオチドの百分率として定義される。核酸配列一致度％を求める目的で行われる整列は例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公共入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して当業者が利用可能な各種方法により実施することができる。当業者は比較する配列の全長で最大アラインメントを達成するために必要な任意アルゴリズムを含めてアラインメントの測定に適したパラメータを決定することができる。
【００９６】
ヌクレオチド配列を整列させる場合には、所与核酸配列Ｄに対する所与核酸配列Ｃ（あるいは所与核酸配列Ｄに対して所定の核酸配列一致度％を保持又は包含する所与核酸配列Ｃと言うこともできる）の核酸配列一致度％は次のように計算することができる：
核酸配列一致度％＝Ｗ／Ｚ＊１００
（式中、
Ｗは配列アラインメントプログラム又はアルゴリズムによりＣとＤを整列させた場合に一致するマッチ数として記録されたヌクレオチド数であり、
ＺはＤにおける合計ヌクレオチド数である）。
【００９７】
核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さに等しくない場合には、Ｄに対するＣの核酸配列一致度％はＣに対するＤの核酸配列一致度％と等しくならない。
【００９８】
ｐ）ポリメラーゼ連鎖反応ないしＰＣＲ
「ポリメラーゼ連鎖反応」ないし「ＰＣＲ」は大量の特定ＤＮＡセグメントの合成技術であり、一連の反復サイクルから構成される（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）。通例では、２本鎖ＤＮＡを熱変性し、標的セグメントの３’境界に相補的な２個のプライマーを低温でアニールした後、中温で伸長させる。これらの３連続段階１組をサイクルと言う。
【００９９】
ＰＣＲは短時間で鋳型の反復複製によりＤＮＡを数百万倍に増幅するために使用される強力な技術である。（Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｓｙｍｐ  Ｑｕａｎｔ  Ｂｉｏｌ．５１  Ｐｔ  １：２６３−７３（１９８６）；ヨーロッパ特許出願第５０，４２４号；ヨーロッパ特許出願第８４，７９６号；ヨーロッパ特許出願第２５８，０１７号；ヨーロッパ特許出願第２３７，３６２号；ヨーロッパ特許出願第２０１，１８４号、米国特許第４，６８３，２０２号；米国特許第４，５８２，７８８号；及び米国特許第４，６８３，１９４号）。この方法はインビトロ合成した特定オリゴヌクレオチドのセットをプライマーとしてＤＮＡ合成を開始する。プライマーの設計は分析しようとするＤＮＡ配列に依存する。この技術は鋳型を高温で溶融し、プライマーを鋳型内の相補的配列にアニールさせた後、ＤＮＡポリメラーゼで鋳型を複製するサイクルを多数回（通常は２０〜５０回）反復することにより実施される。
【０１００】
ＰＣＲ反応産物はアガロースゲルで分離後に臭化エチジウム染色とＵＶ照射による可視化より分析することができる。あるいは、産物にラベルを組込むために放射性ｄＮＴＰをＰＣＲに加えてもよい。この場合には、ゲルをＸ線フィルムに露光することによりＰＣＲ産物を可視化する。放射性標識ＰＣＲ産物は個々の増幅産物の量を定量できるという利点もある。
【０１０１】
ｑ）ポリヌクレオチド
「ポリヌクレオチド」はリボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡ、又はＲＮＡもしくはＤＮＡミメティクス（例えばＰＮＡ）、並びにその誘導体及びそのホモログの核酸ポリマーである。従って、ポリヌクレオチドは天然ヌクレオ塩基、糖及び共有的ヌクレオシド間（主鎖）結合から構成されるポリマーと、同様に機能する非天然部分をもつポリマーを含む。このような修飾又は置換核酸ポリマーは当分野で周知であり、「アナログ」と呼ばれる。オリゴヌクレオチドは一般に約１０ヌクレオチドから約１６０又は２００ヌクレオチドまでの短いポリヌクレオチドである。
【０１０２】
ポリヌクレオチドは核酸配列のアナログ及び／又は誘導体とそのホモログを含めて標的核酸と特異的にハイブリダイズするプライマーも含む。
【０１０３】
ポリヌクレオチドはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ；ＵＳＡ）、ＤｕＰｏｎｔ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ；ＵＳＡ）又はＭｉｌｌｉｇｅｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ；ＵＳＡ）から市販されているもの等の市販機器を使用して固相合成法等の慣用技術により作製することができる。ホスホロチオエートやアルキル化誘導体等の修飾ポリヌクレオチドも当分野で公知の同様の方法により容易に作製することができる（米国特許第４，９４８，８８２号、５，４６４，７４６号及び５，４２４，４１４号参照）。
【０１０４】
ｒ）ポリヌクレオチドアナログ
本願で使用する「ポリヌクレオチドアナログ」なる用語は修飾主鎖又は非天然ヌクレオシド間結合をもつポリマーを意味する。修飾主鎖としては、主鎖にリン原子をもつもの（例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロトリエステル、アミノアルキルホスホロトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート）と、リン原子をもたないもの（例えば短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、ヘテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルの混合によるヌクレオシド間結合、又は１以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間結合により形成される主鎖）が挙げられる。修飾核酸ポリマー（アナログ）は１以上の修飾糖部分を含むことができる。
【０１０５】
ヌクレオチド単位の糖とヌクレオシド間結合の両方が新規基で置換されたＲＮＡ又はＤＮＡミメティクスであるアナログも有用である。これらのミメティクスでは、塩基単位は標的配列とのハイブリダイゼーションのために維持されている。優れたハイブリダイゼーション特性をもつことが分かっているこのようなミメティクスの１例はペプチド核酸（ＰＮＡ）である（Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｏ．，Ｐ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，ａｎｄ  Ｒ．Ｂｅｒｇ．１９９２．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ参照）。
【０１０６】
ｓ）倍数性誘導剤
本願で使用する「倍数性誘導剤」なる用語は１個以上の細胞に倍数性を誘導する任意型（例えば非選択的又は選択的）の治療用化合物を意味し、小分子、抗体、アンチセンス、低分子干渉ＲＮＡ又はマイクロＲＮＡを主成分とする化合物を含む。１個以上の細胞における倍数性の誘導又は徴候を判定する方法は当分野で公知の日常的技術を使用して達成することができる。例えば、倍数性の徴候はｐ５３の発現増加を検出することにより判定することができる。ｐ５３は野生型ｐ５３を保有する細胞における倍数化の代替マーカーである（Ｇｉｚａｔｕｌｌｉｎ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ａｕｒｏｒａ  Ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＶＸ−６８０  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｅｎｄｏｒｅｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｉｎ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ  ｐ５３−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｏｓｔｍｉｔｏｔｉｃ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，”Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６，７６６８−７７．（２００６）参照）。更に、倍数性が誘導されている細胞は細胞寸法の著しい形態的増加と多核化を示し、いずれも当分野で公知の日常的技術を使用して検出することができる。
【０１０７】
倍数性誘導剤の例としては、限定されないが、オーロラキナーゼ阻害剤、微小管阻害剤（例えばタキソテール、ビンクリスチン、ノコダゾール、パクリタキセル又はコルセミド）、汎キナーゼ阻害剤（例えばスタウロスポリン）、腫瘍溶解性ウイルス（例えばＯＮＹＸ−０１５）、アクリジンオレンジ、ドラスタチン１０、ノスカピン、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えばＩＣＲＦ−１８７又はＩＣＲＦ−１９３）、２−｛４−［（７−クロロ−２−キノキサリニル）オキシ］フェノキシ｝プロピオン酸、２−｛４−［（７−ブロモ−２−キノリニル）オキシ］フェノキシ｝プロピオン酸、プラチコジンＤ、微小管毒（例えばＪＧ−０３−１４）、アクチン重合阻害剤（例えばサイトカラシンＢ）、ビストラミドＡ又は抗腫瘍性抗生物質（例えばミトラマイシンＳＫＩ）が挙げられる。
【０１０８】
ｔ）所定レベル
本願で使用する「所定レベル」なる用語は一般にアッセイ結果を所定レベルと比較することにより診断結果を評価するために使用されるアッセイカットオフ値を意味し、所定レベルは各種臨床パラメーター（例えば危険、疾患重篤度、進行／非進行／改善の評価、試験サンプルの年齢の判定、試験サンプル（例えば血清又は血漿）が溶血しているか否かの判定等）に予め関連又は関係付けられている。使用することができる所定レベルの１例は場合により１種以上の疾患又は病態に罹患している可能性のある１以上の対象から得られた基線レベルである。カットオフ値がアッセイの種類によって変動し得ることは周知である。更に、本願の記載に基づいて他のアッセイのアッセイ特異的カットオフ値を得るように本発明をこれらの他のアッセイに適応させることも当業者が十分になし得る範囲内である。
【０１０９】
ｕ）プライマー又はプローブ
本願で使用する「プローブ」又は「プライマー」とは、プライマー又はプローブ中の少なくとも１個の配列と標的領域中の配列の相補性により、標的配列とハイブリッド構造を形成する少なくとも８ヌクレオチド長のポリヌクレオチドである。プローブのポリヌクレオチド領域はＤＮＡ及び／又はＲＮＡ及び／又は合成ヌクレオチドアナログから構成することができる。好ましくは、プローブはポリメラーゼ連鎖反応中に標的配列のプラマーとして使用される１以上の配列に相補的な配列を含まない。
【０１１０】
ｖ）組換え
「組換え」とは、通常では分離している２つの配列セグメントを例えば化学的合成や、遺伝子組換え技術による核酸の単離セグメントの操作により人工的に結合することを意味する。
【０１１１】
ｗ）特異的にハイブリダイズする
「特異的にハイブリダイズする」とは、核酸が第２の核酸と検出可能且つ特異的に結合できることを意味する。ポリヌクレオチドは非特異的核酸との感知可能な量の検出可能な結合を最小限にするハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で標的核酸鎖と特異的にハイブリダイズする。
【０１１２】
ｘ）ストリンジェンシー又はストリンジェント条件
相補的フラグメントとハイブリダイズするための１本鎖ＤＮＡの特異性は反応条件のストリンジェンシーにより決定される。ＤＮＡ２本鎖を形成する傾向が減るにつれてハイブリダイゼーションストリンジェンシーは増加する。核酸ハイブリダイゼーション反応において、ストリンジェンシーは特異的ハイブリダイゼーションを助長するように選択することができる（高ストリンジェンシー）。近縁であるが、厳密に同じではない（相同であるが、一致しない）ＤＮＡ分子又はセグメントを同定するには低特異性ハイブリダイゼーション（低ストリンジェンシー）を使用することができる。
【０１１３】
ＤＮＡ２本鎖は（１）相補的塩基対の数、（２）塩基対の種類、（３）反応混合物の塩濃度（イオン強度）、（４）反応温度、及び（５）ＤＮＡ２本鎖安定性を低下させる所定の有機溶媒（例えばホルムアミド）の存在に応じて安定化される。一般的なアプローチは温度を変動させる方法であり、相対温度が高いほど、ストリンジェントな反応条件となる（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．１９８７．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。前記文献にはハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーについて優れた説明が記載されている。
【０１１４】
「ストリンジェント条件」下のハイブリダイゼーションとは、相互に少なくとも６０％相同のヌクレオチド配列がハイブリダイズされる状態に保たれるハイブリダイゼーションプロトコルを意味する。（例えば宿主細胞受容体にインビボ標的するための）ペプチドや、細胞膜を通る輸送を助長する物質等の他の付加基をポリヌクレオチドに付加することができる。更に、ハイブリダイゼーション誘導型開裂剤（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．６：９５８−７６（１９８８参照））やインターカレーター（Ｚｏｎ，Ｇ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．５：５３９−４９（１９８８））でオリゴヌクレオチドを修飾することもできる。オリゴヌクレオチドを別の分子（例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘導型架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘導型開裂剤等）と共役してもよい。
【０１１５】
ｙ）対象又は患者
本願で使用する「対象」及び「患者」なる用語は、対象が何らかの治療を受けたことがあるか又は現在受けているかに関係なく、同義に使用する。本願で使用する「対象」なる用語は任意脊椎動物を意味し、限定されないが、哺乳動物（例えばウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット及びマウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルやチンパンジー等のサル）並びにヒト）が挙げられる。好ましくは、対象はヒトである。対象又は患者は生死を問わない。
【０１１６】
ｚ）標的配列又は標的核酸配列
「標的配列」又は「標的核酸配列」とは、例えばポリヌクレオチドプライマー又はプローブを使用して増幅、検出又は増幅・検出される遺伝子又はその相補配列もしくはフラグメントを含む核酸配列を意味する。更に、標的配列なる用語は２本鎖核酸配列を意味する場合もあるが、標的核酸は１本鎖でもよい。標的が２本鎖の場合には、ポリヌクレオチドプライマー配列は標的配列の両方の鎖を増幅することが好ましい。特定生物に多かれ少なかれ特異的な標的核酸を選択することができる。例えば、標的配列は属全体、２種以上の属、種もしくは亜種、血清群、栄養要求型、血清型、株、単離株又は生物の他のサブセットに特異的であり得る。
【０１１７】
ａａ）試験サンプル
「試験サンプル」とは、対象又は体液から採取されたサンプルを意味し、サンプルは標的配列を含んでいる可能性がある。試験サンプルは任意ソース（例えば組織、血液、唾液、喀痰、粘液、汗、尿、尿道スワブ、子宮頸部スワブ、泌尿・生殖器スワブ又は肛門スワブ、結膜スワブ、水晶体液、脳脊髄液等）から採取することができる。試験サンプルは（ｉ）ソースから採取したまま使用してもよいし、（ｉｉ）サンプルの特徴を改変するように前処理後に使用してもよい。従って、例えば、血液から血漿又は血清の調製、細胞又はウイルス粒子の破砕、固体材料から液体の調製、粘性液体の希釈、液体の濾過、試薬添加、核酸精製等により試験サンプルを使用前に前処理することができる。
【０１１８】
ｂｂ）治療有効量
「治療有効量」なる用語は患者に投与後に所望の治療効果を生じるため、例えば癌性腫瘍の増殖を阻止するため、もしくは癌性腫瘍を縮小させるため、又は癌性細胞もしくは腫瘍の死を生じるために有効な薬剤の量を意味する。
【０１１９】
ｃｃ）「時間分解蛍光共鳴エネルギー転移」
本願で使用する「時間分解蛍光共鳴エネルギー転移」ないし「ＴＲ−ＦＲＥＴ」なる用語はＴＲＦ（時間分解蛍光）とＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）の原理を統合したアッセイを意味する。多数のＴＲ−ＦＲＥＴアッセイが公知であり、当分野で市販されている。本発明で使用することができるＴＲ−ＦＲＥＴの１例を以下に記載する。
【０１２０】
プローブ合成
特に指定しない限り、下記全試薬は業者から入手する。ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）及びピペリジンを含むペプチド合成試薬はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ＡＢＩ），Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ又はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡから入手する。プレロード９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸カートリッジ（Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｒ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ）はＡＢＩ又はＡｎａｓｐｅｃ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡから入手する。ペプチド合成用樹脂（Ｆｍｏｃ−ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂）及びＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨはＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手する。単一異性体６−カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（６−ＦＡＭ−ＮＨＳ）はＡｎａｓｐｅｃから入手する。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）はＯａｋｗｏｏｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗｅｓｔ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＳＣから入手する。チオアニソール、フェノール、トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）、３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール（ＤＯＤＴ）及びイソプロパノールはＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩから入手する。マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量スペクトル（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＰＲＯ  ＭＳで記録する。エレクトロスプレー質量スペクトル（ＥＳＩ−ＭＳ）はＦｉｎｎｉｇａｎ  ＳＳＱ７０００（Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で正負両イオンモードにて記録する。
【０１２１】
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）の一般手順
２５０μｍｏｌスケールＦａｓｔｍｏｃ（登録商標）カップリングサイクルを使用し、ＡＢＩ４３３Ａペプチド合成器で容器当たり最大２５０μｍｏｌプレロードＷａｎｇ樹脂を使用してペプチドを合成する。フルオロフォアの結合位置には１ｍｍｏｌ  Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨをカートリッジに配置し、それ以外は１ｍｍｏｌ標準Ｆｍｏｃ−アミノ酸を充填したプレロードカートリッジを導電率フィードバックモニター下に使用する。Ｎ末端アセチル化は標準カップリング条件下にカートリッジ内で１ｍｍｏｌ酢酸を使用することにより実施する。
【０１２２】
リジンからの４−メチルトリチル（Ｍｔｔ）の除去
合成器からの樹脂をジクロロメタンで３回洗浄し、湿潤状態に維持する。９５：４：１ジクロロメタン：トリイソプロピルシラン：トリフルオロ酢酸１５０ｍＬを樹脂ベッドに３０分間流す。混液は濃黄色になった後、淡黄色になる。ＤＭＦ  １００ｍＬをベッドに１５分間流す。次に樹脂をＤＭＦで３回洗浄し、濾過する。ニンヒドリン試験は第１級アミンに対して強いシグナルを示す。
【０１２３】
６−カルボキシフルオレセイン−ＮＨＳ（６−ＦＡＭ−ＮＨＳ）による樹脂標識
樹脂を１％  ＤＩＥＡ／ＤＭＦ中、６−ＦＡＭ−ＮＨＳ  ２当量で処理し、周囲温度で一晩撹拌ないし振盪する。完了したら、樹脂を排出し、ＤＭＦで３回、（１％  ＤＣＭ及び１％メタノール）で３回洗浄し、乾燥し、ニンヒドリン試験により陰性のオレンジ色の樹脂を得る。
【０１２４】
樹脂固定化ペプチドの開裂及び脱保護の一般手順
８０％  ＴＦＡ、５％水、５％チオアニソール、５％フェノール、２．５％  ＴＩＳ及び２．５％  ＥＤＴから構成される開裂カクテル（１ｍＬ／０．１ｇ樹脂）中、周囲温度で３時間振盪することによりペプチドを樹脂から開裂させる。濾過とＴＦＡで２回リンスすることにより樹脂を除去する。ＴＦＡを濾液から蒸発させ、生成物をエーテル（１０ｍＬ／０．１ｇ樹脂）で沈殿させ、遠心により回収し、エーテル（１０ｍＬ／０．１ｇ樹脂）で２回洗浄し、乾燥し、粗製ペプチドを得る。
【０１２５】
ペプチド精製の一般手順
Ｕｎｉｐｏｉｎｔ（登録商標）分析ソフトウェア（Ｇｉｌｓｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＷＩ）をＧｉｌｓｏｎ分取ＨＰＬＣシステムで動作させ、細孔寸法１００ÅのＤｅｌｔａ−Ｐａｋ（登録商標）Ｃ１８  １５μｍ粒子を充填した２５×１００ｍｍセグメント２個を入れたラジアル圧縮カラムで以下の勾配法の１種を使用して溶出下に粗製ペプチドを精製する。１回注入当たり粗製ペプチド溶液（９０％  ＤＭＳＯ／水中１０ｍｇ／ｍＬ）１〜２ｍｌを精製する。各ランからの生成物を含むピークをプールし、凍結乾燥する。全分取ランはバッファーＡ：０．１％  ＴＦＡ水溶液及びバッファーＢ：アセトニトリルを溶離液として２０ｍＬ／分で実施する。
【０１２６】
分析用ＨＰＬＣの一般手順
Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  １２００シリーズシステムにダイオードアレイ検出器とＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  １０４６Ａ蛍光検出器を接続し、ＨＰＬＣ  ３Ｄ  ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアバージョンＡ．０３．０４（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ．Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を動作させ、出発条件で７分間予め平衡化後に細孔寸法１２０ÅのＯＤＳ−ＡＱ  ５μｍ粒子を充填した４．６×２５０ｍｍ  ＹＭＣカラムで以下の勾配法の１種を使用して溶出下に分析用ＨＰＬＣを実施する。溶離液はバッファーＡ：０．１％  ＴＦＡ水溶液及びバッファーＢ：アセトニトリルとする。全勾配の流速は１ｍＬ／分とする。
【０１２７】
Ｆ−Ｂａｋ：ペプチドプローブ：アセチル−（配列番号１）ＧＱＶＧＲＱＬＡＩＩＧＤＫ（６−ＦＡＭ）−（配列番号２）ＩＮＲ−ＮＨ２
【０１２８】
一般ペプチド合成手順を使用してＦｍｏｃ−ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂を延長し、保護された樹脂固定化ペプチド（１．０２０ｇ）を得る。上記のようにＭｔｔ基を除去し、６−ＦＡＭ−ＮＨＳで標識し、開裂及び脱保護し、オレンジ色固体として粗生成物を得る（０．３７ｇ）。この生成物をＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する。主ピークに含まれる画分を分析用ＲＰ−ＨＰＬＣにより試験し、純画分を単離し、凍結乾燥し、主ピークから黄色い固体として標記化合物（０．０８０２ｇ）を得る；ＭＡＬＤＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ＝２１３７．１（（Ｍ＋Ｈ）＋）。
【０１２９】
ペプチドプローブＦ−Ｂａｋ：アセチル−（配列番号１）ＧＱＶＧＲＱＬＡＩＩＧＤＫ（６−ＦＡＭ）−（配列番号２）ＩＮＲ−ＮＨ２の代替合成法
フルオレセイン（６−ＦＡＭ）標識リジンには１ｍｍｏｌ  Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（４−メチルトリチル）をカートリッジに添加し、それ以外はプレロード１ｍｍｏｌアミノ酸カートリッジを使用し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３３Ａ自動ペプチド合成器でＦａｓｔｍｏｃ（登録商標）カップリングサイクルを実施し、０．２５ｍｍｏｌ  Ｆｍｏｃ−ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）上に保護ペプチドをアセンブリする。１ｍｍｏｌ酢酸をカートリッジに添加し、上記のようにカップリングさせることによりＮ末端アセチル基を導入する。９５：４：１  ＤＣＭ：ＴＩＳ：ＴＦＡ（ｖ／ｖ／ｖ）の溶液を樹脂に１５分間流した後、ジメチルホルムアミドを流してクエンチすることにより、４−メチルトリチル基の選択的除去を行う。単一異性体６−カルボキシフルオレセイン−ＮＨＳを１％  ＤＩＥＡ／ＤＭＦ中でリジン側鎖と反応させ、ニンヒドリン試験により反応の完了を確認する。ペプチドを樹脂から開裂させ、８０：５：５：５：２．５：２．５  ＴＦＡ／水／フェノール／チオアニソール／トリイソプロピルシラン：３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール（ｖ／ｖ／ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）で処理することにより側鎖を脱保護し、粗製ペプチドをジエチルエーテルで沈殿させることにより回収する。粗製ペプチドを逆相高性能液体クロマトグラフィーにより精製し、その純度と種類を分析用逆相高性能液体クロマトグラフィーとマトリックス支援レーザー脱離質量分析法により確認する（ｍ／ｚ＝２１３７．１（（Ｍ＋Ｈ）＋））。
【０１３０】
時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＴＲ−ＦＲＥＴ）アッセイ
５０μＭ（２×出発濃度；１０％  ＤＭＳＯ）から出発して代表的化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で系列希釈し、１０μＬを３８４ウェルプレートに移す。次に、蛋白質／プローブ／抗体混液１０μＬを表ＡＡに示す最終濃度で各ウェルに加える。
【０１３１】
【表１】
2013512911.tif 000014
【０１３２】
次にサンプルをシェーカーで１分間混合し、更に３時間室温でインキュベートする。アッセイ毎にプローブ／抗体及び蛋白質／プローブ／抗体を夫々陰性及び陽性対照として各アッセイプレートに加える。３４０／３５ｎｍ励起フィルターと５２０／５２５（Ｆ−Ｂａｋペプチド）及び４９５／５１０ｎｍ（Ｔｂ標識抗ヒスチジン抗体）発光フィルターを使用してＥｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で蛍光を測定する。
【０１３３】
ｄｄ）治療する、治療用又は治療
本願で使用する「治療する」、「治療用」又は「治療」なる用語は、（ｉ）病態の発生を防止するため（例えば予防）；（ｉｉ）病態を抑制するためもしくはその進行を阻止するため；（ｉｉｉ）病態を軽減するため、及び／又はこのような病態に関連する１種以上の症状を予防もしくはその重篤度を軽減するために、１種以上の活性剤又は化合物を対象に投与することを意味し、項目（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかが対象において奏功するか否かは問わない。
【０１３４】
ｅｅ）変異体ポリヌクレオチド又は変異体核酸配列
「変異体ポリヌクレオチド」又は「変異体核酸配列」とは所与核酸配列に対して少なくとも約６０％の核酸配列一致度、より好ましくは少なくとも約６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％の核酸配列一致度、更に好ましくは少なくとも約９９％の核酸配列一致度をもつポリヌクレオチドを意味する。変異体は天然ヌクレオチド配列を含まない。
【０１３５】
通常では、変異体ポリヌクレオチドは少なくとも約８ヌクレオチド長であり、多くの場合には少なくとも約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０ヌクレオチド長であり、あるいは約７５〜２００ヌクレオチド長、又はそれ以上の場合もある。
【０１３６】
核酸の範囲は、核酸分子が置換、化学的手段、酵素的手段又は他の適切な手段により天然ヌクレオチド以外の部分で共有結合的に修飾された誘導体を含む。
【０１３７】
Ｂ．Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤
１側面において、本発明は所定のＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤化合物に関する。
【０１３８】
本願の化合物の可変部分は記号（大文字と上付き英数字）により表し、具体的に例示する場合もある。
【０１３９】
全部分及びその組合せに適正な原子価が維持され、２個以上の原子をもつ１価部分はその左端で結合しているものとする。
【０１４０】
更に、可変部分の特定例は同一記号で表される別の特定例と同一でも異なっていてもよいものとする。
【０１４１】
本発明の化合物はＲ又はＳ配置の不斉置換炭素原子を含む場合があり、ここで、「Ｒ」及び「Ｓ」なる用語はＰｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７６）４５，１３−１０に定義されている通りである。Ｒ配置とＳ配置が等量の不斉置換炭素原子をもつ化合物はこれらの原子においてラセミである。一方の配置が他方よりも多い原子は多いほうの配置、好ましくは約８５％〜９０％過剰、より好ましくは約９５％〜９９％過剰、更に好ましくは約９９％を越えて過剰に存在する配置に帰属する。従って、本発明はその化合物のラセミ混合物と、相対及び絶対ジアステレオ異性体を包含するものとする。
【０１４２】
本発明の化合物は更にＥ又はＺ配置の炭素−炭素二重結合又は炭素−窒素二重結合を含む場合があり、ここで、「Ｚ」なる用語は大きいほうから２個の置換基が炭素−炭素又は炭素−窒素二重結合の同一側にあることを意味し、「Ｅ」なる用語は大きいほうから２個の置換基が炭素−炭素又は炭素−窒素二重結合の反対側にあることを意味する。本発明の化合物は「Ｅ」及び「Ｚ」異性体の混合物として存在する場合もある。
【０１４３】
本発明の化合物は化合物のプロトンが原子間で移動する互変異性体又はその平衡混合物として存在する場合もある。互変異性体の例としては、限定されないが、ケト−エノール、フェノール−ケト、オキシム−ニトロソ、ニトロ−アシ、イミン−エナミン等が挙げられる。
【０１４４】
ＮＨ、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、ＯＨ又はＳＨ部分を含む式（ＩＩ）を有する化合物にはプロドラッグ形成部分が結合している場合がある。プロドラッグ形成部分は代謝プロセスにより除去され、遊離ＮＨ、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、ＯＨ又はＳＨをもつ化合物をインビボ放出する。プロドラッグは溶解度及び／又は疎水性、胃腸管吸収性、生体利用性、組織浸透性並びにクリアランス速度等の化合物の薬物動態特性の調節に有用である。
【０１４５】
インビトロ又はインビボ代謝プロセスで生産される式（ＩＩ）を有する化合物の代謝物もＢｃｌ−ＸＬ蛋白質、Ｂｃｌ−２蛋白質又はＢｃｌ−ｗ蛋白質等の抗アポトーシスファミリー蛋白質メンバーの発現を伴う疾病の治療に有用であると思われる。
【０１４６】
インビトロ又はインビボ代謝され、式（ＩＩ）を有する化合物を形成することができる所定の前駆体化合物もＢｃｌ−ＸＬ蛋白質、Ｂｃｌ−２蛋白質又はＢｃｌ−ｗ蛋白質等の抗アポトーシスファミリー蛋白質メンバーの発現を伴う疾病の治療に有用であると思われる。
【０１４７】
式（ＩＩ）を有する化合物は酸付加塩、塩基付加塩又は両性イオンとして存在する場合がある。式（ＩＩ）を有する化合物の塩は化合物の単離中又は精製後に製造される。酸付加塩は式（ＩＩ）を有する化合物と酸の反応から誘導される塩である。従って、式（ＩＩ）を有する化合物の酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、重炭酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩（ベシル酸塩）、重硫酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、ジグルコン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グリセロリン酸塩、グルタミン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メシチレンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフチレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、蓚酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、プロピオン酸塩、琥珀酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トリクロロ酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、パラトルエンスルホン酸塩及びウンデカン酸塩を含む塩を本発明に包含するものとする。化合物の塩基付加塩は式（ＩＩ）を有する化合物と、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム及びマグネシウム等のカチオンの重炭酸塩、炭酸塩、水酸化物又はリン酸塩の反応から誘導される塩である。
【０１４８】
式（ＩＩ）を有する化合物は、例えば口腔、眼内、経口、浸透圧ポンプ、非経口（筋肉内、腹腔内、大槽内、静脈内、皮下）、直腸、局所、経皮、膣及び動脈内の各経路で投与することができ、更に関節内注射、輸液、及び例えばステントによる体内（例えば血管内）留置により投与することもできる。
【０１４９】
式（ＩＩ）を有する化合物の治療有効量は治療レシピエント、治療する疾患とその重篤度、化合物を含有する組成物、投与時期、投与経路、治療期間、効力、クリアランス速度及び別の薬剤の併用投与の有無により異なる。単回投与又は分割投与で患者に毎日投与する組成物を製造するために使用される式（ＩＩ）を有する化合物の量は体重１ｋｇ当たり約０．０３〜約２００ｍｇである。単回投与用組成物はこれらの量又はその約数の組合せを含有する。
【０１５０】
式（ＩＩ）を有する化合物は賦形剤を加えて投与してもよいし、加えずに投与してもよい。賦形剤としては、限定されないが、カプセル材料と、吸収促進剤、酸化防止剤、結合剤、緩衝剤、コーティング剤、着色剤、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、増量剤、充填剤、着香剤、保湿剤、滑沢剤、香料、防腐剤、噴射剤、離型剤、滅菌剤、甘味剤、溶解補助剤、湿潤剤、その混合物等の添加剤が挙げられる。
【０１５１】
式（ＩＩ）を有する化合物を含有する経口投与用組成物の製造用賦形剤としては、限定されないが、寒天、アルギン酸、水酸化アルミニウム、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、１，３−ブチレングリコール、カルボマー、ひまし油、セルロース、酢酸セルロース、カカオバター、コーンスターチ、コーン油、綿実油、クロスポビドン、ジグリセリド、エタノール、エチルセルロース、ラウリン酸エチル、オレイン酸エチル、脂肪酸エステル、ゼラチン、胚芽油、グルコース、グリセロール、落花生油、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、イソプロパノール、等張生理食塩水、ラクトース、水酸化マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、麦芽、マンニトール、モノグリセリド、オリーブ油、ピーナツ油、リン酸カリウム塩、ジャガイモ澱粉、ポビドン、プロピレングリコール、リンゲル液、サフラワー油、ゴマ油、カルボキシメチルセルロースナトリウム、リン酸ナトリウム塩、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムソルビトール、大豆油、ステアリン酸、フマル酸ステアリル、スクロース、界面活性剤、タルク、トラガカントガム、テトラヒドロフルフリルアルコール、トリグリセリド、水、その混合物等が挙げられる。式（ＩＩ）を有する化合物を含有する眼内又は経口投与用組成物の製造用賦形剤としては、限定されないが、１，３−ブチレングリコール、ひまし油、コーン油、綿実油、エタノール、ソルビタンの脂肪酸エステル、胚芽油、落花生油、グリセロール、イソプロパノール、オリーブ油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ゴマ油、水、その混合物等が挙げられる。式（ＩＩ）を有する化合物を含有する浸透圧ポンプ投与用組成物の製造用賦形剤としては、限定されないが、クロロフルオロハイドロカーボン、エタノール、水、その混合物等が挙げられる。式（ＩＩ）を有する化合物を含有する非経口投与用組成物の製造用賦形剤としては、限定されないが、１，３−ブタンジオール、ひまし油、コーン油、綿実油、デキストロース、胚芽油、落花生油、リポソーム、オレイン酸、オリーブ油、ピーナツ油、リンゲル液、サフラワー油、ゴマ油、大豆油、Ｕ．Ｓ．Ｐ．ないし等張塩化ナトリウム溶液、水、その混合物等が挙げられる。式（ＩＩ）を有する化合物を含有する直腸又は膣投与用組成物の製造用賦形剤としては、限定されないが、カカオバター、ポリエチレングリコール、ロウ、その混合物等が挙げられる。
【０１５２】
本発明は更に患者における癌等の異常細胞増殖及び／又はアポトーシス調節異常を伴う病態の併用治療方法を含み、前記方法は式（ＩＩ）を有する化合物を含有する治療有効量の医薬組成物と、治療有効量の１種以上の他の治療剤及び／又は電離放射線を前記患者に投与する段階を含む。
【０１５３】
前記併用治療方法は、任意の所望投薬及び／又はスケジューリングレジメンを使用して式（ＩＩ）を有する化合物の組成物と、１種以上の他の治療剤又は電離放射線を患者に投与する段階を含む。
【０１５４】
式（ＩＩ）を有する化合物はアルキル化剤、血管新生阻害剤、抗体、抗代謝剤、抗有糸分裂剤、抗増殖剤、抗ウイルス剤、オーロラキナーゼ阻害剤、他のアポトーシス促進剤（例えば、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂｃｌ−ｗ及びＢｆｌ−１）阻害剤、細胞死受容体経路のアクチベーター、Ｂｃｒ−Ａｂ１キナーゼ阻害剤、ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞誘引）抗体、抗体薬剤コンジュゲート、生体応答調節剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、細胞周期阻害剤、シクロオキシゲナーゼ２阻害剤、ＤＶＤ、白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＥｒｂＢ２）受容体阻害剤、増殖因子阻害剤、熱ショック蛋白質（ＨＳＰ）９０阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、ホルモン療法剤、免疫療法剤、アポトーシス蛋白質阻害剤（ＩＡＰ）の阻害剤、インターカレーティング抗生物質、キナーゼ阻害剤、キネシン阻害剤、Ｊａｋ２阻害剤、哺乳類ラパマイシン標的阻害剤、マイクロＲＮＡ、マイトジェン活性化細胞外シグナル制御キナーゼ阻害剤、多価結合性蛋白質、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ポリＡＤＰ（アデノシン二リン酸）リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤、白金系化学療法剤、ポロ様キナーゼ（Ｐｌｋ）阻害剤、ホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤、プロテオソーム阻害剤、プリンアナログ、ピリミジンアナログ、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、レチノイド／デルトイド、植物アルカロイド、低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、トポイソメラーゼ阻害剤、ユビキチンリガーゼ阻害剤等、及びこれらの作用剤の１種以上の組合せと併用した場合に有用であると予想される。
【０１５５】
ＢｉＴＥ抗体は同時に２つの細胞と結合することによりＴ細胞に癌細胞を攻撃させる二重特異性抗体である。従って、Ｔ細胞は標的癌細胞を攻撃する。ＢｉＴＥ抗体の例としては、アデカツムマブ（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ  ＭＴ２０１）、ブリナツモマブ（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ  ＭＴ１０３）等が挙げられる。理論に限定するものではないが、Ｔ細胞が標的癌細胞のアポトーシスを誘発するメカニズムの１つはパーフォリンとグランザイムＢを含む細胞溶解性顆粒成分のエキソサイトーシスによる。この点で、Ｂｃｌ−２はパーフォリンとグランザイムＢの両方によるアポトーシスの誘導を低下させることが分かっている。これらのデータは、癌細胞を標的とした場合にＢｃｌ−２の阻害がＴ細胞により誘発される細胞傷害性作用を強化し得ることを示唆している（Ｖ．Ｒ．Ｓｕｔｔｏｎ，Ｄ．Ｌ．Ｖａｕｘ  ａｎｄ  Ｊ．Ａ．Ｔｒａｐａｎｉ（１９９７）Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１５８（１２）：５７８３）。
【０１５６】
ＳｉＲＮＡは内在性ＲＮＡ塩基又は化学的に修飾されたヌクレオチドをもつ分子である。修飾は細胞活性を損なわず、高い安定性及び／又は高い細胞効力を付与する。化学修飾の例としては、ホスホロチオエート基、２’−デオキシヌクレオチド、２’−ＯＣＨ３含有リボヌクレオチド、２’−Ｆ−リボヌクレオチド、２’−メトキシエチルリボヌクレオチド、その組合せ等が挙げられる。ｓｉＲＮＡは種々の長さ（例えば１０〜２００ｂｐ）と構造（例えばヘアピン、１本／２本鎖、バルジ、ニック／ギャップ、ミスマッチ）をとることができ、活性遺伝子サイレンシングを起こすように細胞内でプロセシングされる。２本鎖ｓｉＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は各鎖のヌクレオチド数が同一（平滑末端）でもよいし、不斉末端（オーバーハング）でもよい。１〜２ヌクレオチドのオーバーハングがセンス及び／又はアンチセンス鎖上に存在してもよいし、所与鎖の５’末端及び／又は３’末端に存在してもよい。例えば、Ｍｃｌ−１を標的とするｓｉＲＮＡは複数の腫瘍細胞株でＡＢＴ−２６３（即ちＮ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチル−１−シクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（モルホリン−４−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミド）又はＡＢＴ−７３７（即ちＮ−（４−（４−（（４’−クロロ（１，１’−ビフェニル）−２−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−ニトロベンゼンスルホンアミド）の活性を増強することが分かっている（Ｔｓｅ  ｅｔ．ａｌ（２００８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．６８（９）：３４２１とその引用文献）。
【０１５７】
多価結合性蛋白質は２個以上の抗原結合部位を含む結合性蛋白質である。多価結合性蛋白質は３個以上の抗原結合部位をもつように作製され、一般に天然に存在しない抗体である。「多重特異性結合性蛋白質」なる用語は２個以上の相互に関連する標的又は関連しない標的と結合することが可能な結合性蛋白質を意味する。二重可変領域（ＤＶＤ）結合性蛋白質は２個以上の抗原結合部位を含む四価以上の結合性蛋白質である。このようなＤＶＤは単一特異性（即ち１個の抗原と結合可能）でもよいし、多重特異性（即ち２個以上の抗原と結合可能）でもよい。２本の重鎖ＤＶＤポリペプチドと２本の軽鎖ＤＶＤポリペプチドを含むＤＶＤ結合性蛋白質をＤＶＤＩｇと言う。ＤＶＤＩｇの半分ずつは重鎖ＤＶＤポリペプチドと、軽鎖ＤＶＤポリペプチドと、２個の抗原結合部位を含む。各結合部位は重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、抗原結合部位当たり合計６個のＣＤＲが抗原結合に関与する。
【０１５８】
アルキル化剤としては、アルトレタミン、ＡＭＤ−４７３、ＡＰ−５２８０、アパジコン、ベンダムスチン、ブロスタリシン、ブスルファン、カルボコン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、クロラムブシル、ＣＬＯＲＥＴＡＺＩＮＥ（登録商標）（ラロムスチン、ＶＮＰ４０１０１Ｍ）、シクロホスファミド、デカルバジン、エストラムスチン、フォテムスチン、グルフォスファミド、イフォスファミド、ＫＷ−２１７０、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、マフォスファミド、メルファラン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ニムスチン、窒素マスタードＮ−オキシド、ラニムスチン、テモゾロミド、チオテパ、ＴＲＥＡＮＤＡ（登録商標）（ベンダムスチン）、トレオスルファン、ロフォスファミド等が挙げられる。
【０１５９】
血管新生阻害剤としては、内皮細胞特異的受容体チロシンキナーゼ（Ｔｉｅ−２）阻害剤、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤、インスリン増殖因子２受容体（ＩＧＦＲ−２）阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ−２）阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ−９）阻害剤、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）阻害剤、トロンボスポンジンアナログ、血管内皮増殖因子受容体チロシンキナーゼ（ＶＥＧＦＲ）阻害剤等が挙げられる。
【０１６０】
抗代謝剤としては、ＡＬＩＭＴＡ（登録商標）（ペメトレキセド二ナトリウム、ＬＹ２３１５１４、ＭＴＡ）、５−アザシチジン、ＸＥＬＯＤＡ（登録商標）（カペシタビン）、カルモフール、ＬＥＵＳＴＡＴ（登録商標）（クラドリビン）、クロファラビン、シタラビン、シタラビンオクフォスファート、シトシンアラビノシド、デシタビン、デフェロキサミン、ドキシフルリジン、エフロルニチン、ＥＩＣＡＲ（５−エチニル−１−β−Ｄ−リボフラノシルイミダゾール−４−カルボキサミド）、エノシタビン、エチニルシチジン、フルダラビン、５−フルオロウラシル単剤又はロイコボリンとの併用、ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）（ゲムシタビン）、ヒドロキシ尿素、ＡＬＫＥＲＡＮ（登録商標）（メルファラン）、メルカプトプリン、６−メルカプトプリンリボシド、メトトレキサート、ミコフェノール酸、ネララビン、ノラトレキセド、オクフォスファート、ペリトレキソール、ペントスタチン、ラルチトレキセド、リバビリン、トリアピン、トリメトレキサート、Ｓ−１、チアゾフリン、テガフール、ＴＳ−１、ビダラビン、ＵＦＴ等が挙げられる。
【０１６１】
抗ウイルス剤としては、リトナビル、ヒドロキシクロロキン等が挙げられる。
【０１６２】
Ｂｃｒ−Ａｂ１キナーゼ阻害剤としては、ＤＡＳＡＴＩＮＩＢ（登録商標）（ＢＭＳ−３５４８２５）、ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）（イマチニブ）等が挙げられる。
【０１６３】
ＣＤＫ阻害剤としては、ＡＺＤ−５４３８、ＢＭＩ−１０４０、ＢＭＳ−０３２、ＢＭＳ−３８７、ＣＶＴ−２５８４、フラボピリドール、ＧＰＣ−２８６１９９、ＭＣＳ−５Ａ、ＰＤ０３３２９９１、ＰＨＡ−６９０５０９、セリシクリブ（ＣＹＣ−２０２、Ｒ−ロスコビチン）、ＺＫ−３０４７０９等が挙げられる。
【０１６４】
ＣＯＸ−２阻害剤としては、ＡＢＴ−９６３、ＡＲＣＯＸＩＡ（登録商標）（エトリコキシブ）、ＢＥＸＴＲＡ（登録商標）（バルデコキシブ）、ＢＭＳ３４７０７０、ＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標）（セレコキシブ）、ＣＯＸ−１８９（ルミラコキシブ）、ＣＴ−３、ＤＥＲＡＭＡＸＸ（登録商標）（デラコキシブ）、ＪＴＥ−５２２、４−メチル−２−（３，４−ジメチルフェニル）−１−（４−スルファモイルフェニル−１Ｈ−ピロール）、ＭＫ−６６３（エトリコキシブ）、ＮＳ−３９８、パレコキシブ、ＲＳ−５７０６７、ＳＣ−５８１２５、ＳＤ−８３８１、ＳＶＴ−２０１６、Ｓ−２４７４、Ｔ−６１４、ＶＩＯＸＸ（登録商標）（ロフェコキシブ）等が挙げられる。
【０１６５】
ＥＧＦＲ阻害剤としては、ＡＢＸ−ＥＧＦ、抗ＥＧＦＲイムノリポソーム、ＥＧＦワクチン、ＥＭＤ−７２００、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ）、ＨＲ３、ＩｇＡ抗体、ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）（ゲフィチニブ）、ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）（エルロチニブないしＯＳＩ−７７４）、ＴＰ−３８、ＥＧＦＲ融合蛋白質、ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）（ラパチニブ）等が挙げられる。
【０１６６】
ＥｒｂＢ２受容体阻害剤としては、ＣＰ−７２４−７１４、ＣＩ−１０３３（カネルチニブ）、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラツズマブ）、ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）（ラパチニブ）、ＯＭＮＩＴＡＲＧ（登録商標）（２Ｃ４、ペルツズマブ）、ＴＡＫ−１６５、ＧＷ−５７２０１６（ロナファルニブ）、ＧＷ−２８２９７４、ＥＫＢ−５６９、ＰＩ−１６６、ｄＨＥＲ２（ＨＥＲ２ワクチン）、ＡＰＣ−８０２４（ＨＥＲ−２ワクチン）、抗ＨＥＲ／２ｎｅｕ二重特異性抗体、Ｂ７．ｈｅｒ２ＩｇＧ３、ＡＳ  ＨＥＲ２三官能性二重特異性抗体、ｍＡＢ  ＡＲ−２０９、ｍＡＢ  ２Ｂ−１等が挙げられる。
【０１６７】
ヒストンデアセチラーゼ阻害剤としては、デプシペプチド、ＬＡＱ−８２４、ＭＳ−２７５、トラポキシン、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、ＴＳＡ、バルプロ酸等が挙げられる。
【０１６８】
ＨＳＰ−９０阻害剤としては、１７−ＡＡＧ−ｎａｂ、１７−ＡＡＧ、ＣＮＦ−１０１、ＣＮＦ−１０１０、ＣＮＦ−２０２４、１７−ＤＭＡＧ、ゲルダナマイシン、ＩＰＩ−５０４、ＫＯＳ−９５３、ＭＹＣＯＧＲＡＢ（登録商標）（ＨＳＰ−９０に対するヒト組換え抗体）、ＮＣＳ−６８３６６４、ＰＵ２４ＦＣ１、ＰＵ−３、ラディシコール、ＳＮＸ−２１１２、ＳＴＡ−９０９０、ＶＥＲ４９００９等が挙げられる。
【０１６９】
アポトーシス蛋白質阻害剤の阻害剤としては、ＨＧＳ１０２９、ＧＤＣ−０１４５、ＧＤＣ−０１５２、ＬＣＬ−１６１、ＬＢＷ−２４２等が挙げられる。
【０１７０】
抗体薬剤コンジュゲートとしては、抗ＣＤ２２−ＭＣ−ＭＭＡＦ、抗ＣＤ２２−ＭＣ−ＭＭＡＥ、抗ＣＤ２２−ＭＣＣ−ＤＭ１、ＣＲ−０１１−ｖｃＭＭＡＥ、ＰＳＭＡ−ＡＤＣ、ＭＥＤＩ−５４７、ＳＧＮ−１９Ａ、ＳＧＮ−３５、ＳＧＮ−７５等が挙げられる。
【０１７１】
細胞死受容体経路のアクチベーターとしては、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ又は細胞死受容体（例えばＤＲ４及びＤＲ５）を標的とする抗体又は他の物質（例えばＡｐｏｍａｂ）、コナツムマブ、ＥＴＲ２−ＳＴ０１、ＧＤＣ０１４５（レキサツムマブ）、ＨＧＳ−１０２９、ＬＢＹ−１３５、ＰＲＯ−１７６２及びトラスツズマブが挙げられる。
【０１７２】
キネシン阻害剤としては、Ｅｇ５阻害剤（例えばＡＺＤ４８７７、ＡＲＲＹ−５２０）、ＣＥＮＰＥ阻害剤（例えばＧＳＫ９２３２９５Ａ）等が挙げられる。
【０１７３】
ＪＡＫ−２阻害剤としては、ＣＥＰ−７０１（レスタウルチニブ）、ＸＬ０１９及びＩＮＣＢ０８４２４等が挙げられる。
【０１７４】
ＭＥＫ阻害剤としては、ＡＲＲＹ−１４２８８６、ＡＲＲＹ−４３８１６２、ＰＤ−３２５９０１、ＰＤ−９８０５９等が挙げられる。
【０１７５】
ｍＴＯＲ阻害剤としては、ＡＰ−２３５７３、ＣＣＩ−７７９、エベロリムス、ＲＡＤ−００１、ラパマイシン、テムシロリムス、ＡＴＰ競合性ＴＯＲＣ１／ＴＯＲＣ２阻害剤（例えばＰＩ−１０３、ＰＰ２４２、ＰＰ３０、Ｔｏｒｉｎ  １）等が挙げられる。
【０１７６】
非ステロイド性抗炎症薬としては、ＡＭＩＧＥＳＩＣ（登録商標）（サルサレート）、ＤＯＬＯＢＩＤ（登録商標）（ジフルニサル）、ＭＯＴＲＩＮ（登録商標）（イブプロフェン）、ＯＲＵＤＩＳ（登録商標）（ケトプロフェン）、ＲＥＬＡＦＥＮ（登録商標）（ナブメトン）、ＦＥＬＤＥＮＥ（登録商標）（ピロキシカム）、イブプロフェンクリーム、ＡＬＥＶＥ（登録商標）（ナプロキセン）及びＮＡＰＲＯＳＹＮ（登録商標）（ナプロキセン）、ＶＯＬＴＡＲＥＮ（登録商標）（ジクロフェナク）、ＩＮＤＯＣＩＮ（登録商標）（インドメタシン）、ＣＬＩＮＯＲＩＬ（登録商標）（スリンダク）、ＴＯＬＥＣＴＩＮ（登録商標）（トルメチン）、ＬＯＤＩＮＥ（登録商標）（エトドラク）、ＴＯＲＡＤＯＬ（登録商標）（ケトロラク）、ＤＡＹＰＲＯ（登録商標）（オキサプロジン）等が挙げられる。
【０１７７】
ＰＤＧＦＲ阻害剤としては、Ｃ−４５１、ＣＰ−６７３、ＣＰ−８６８５９６等が挙げられる。
【０１７８】
白金系化学療法剤としては、シスプラチン、ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標）（オキサリプラチン）、エプタプラチン、ロバプラチン、ネダプラチン、ＰＡＲＡＰＬＡＴＩＮ（登録商標）（カルボプラチン）、サトラプラチン、ピコプラチン等が挙げられる。
【０１７９】
ポロ様キナーゼ阻害剤としては、ＢＩ−２５３６等が挙げられる。
【０１８０】
ホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤としては、ワートマニン、ＬＹ２９４００２、ＸＬ−１４７、ＣＡＬ−１２０、ＯＮＣ−２１、ＡＥＺＳ−１２７、ＥＴＰ−４５６５８、ＰＸ−８６６、ＧＤＣ−０９４１、ＢＧＴ２２６、ＢＥＺ２３５、ＸＬ７６５等が挙げられる。
【０１８１】
トロンボスポンジンアナログとしては、ＡＢＴ−５１０、ＡＢＴ−５６７、ＡＢＴ−８９８、ＴＳＰ−１等が挙げられる。
【０１８２】
ＶＥＧＦＲ阻害剤としては、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ）、ＡＢＴ−８６９、ＡＥＥ−７８８、ＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（登録商標）（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ．）とＣｈｉｒｏｎ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）が共同開発した血管新生を阻害するリボザイム）、アキシチニブ（ＡＧ−１３７３６）、ＡＺＤ−２１７１、ＣＰ−５４７，６３２、ＩＭ−８６２、ＭＡＣＵＧＥＮ（ペガプタニブ）、ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標）（ソラフェニブ、ＢＡＹ４３−９００６）、パゾパニブ（ＧＷ−７８６０３４）、バタラニブ（ＰＴＫ−７８７、ＺＫ−２２２５８４）、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）（スニチニブ、ＳＵ−１１２４８）、ＶＥＧＦトラップ、ＺＡＣＴＩＭＡ（登録商標）（バンデタニブ、ＺＤ−６４７４）等が挙げられる。
【０１８３】
抗生物質としては、インターカレーティング抗生物質であるアクラルビシン、アクチノマイシンＤ、アムルビシン、アナマイシン、アドリアマイシン、ＢＬＥＮＯＸＡＮＥ（登録商標）（ブレオマイシン）、ダウノルビシン、ＣＡＥＬＹＸ（登録商標）ないしＭＹＯＣＥＴ（登録商標）（リポソームドキソルビシン）、エルサミトルシン、エピルビシン、ガラルビシン、ＺＡＶＥＤＯＳ（登録商標）（イダルビシン）、マイトマイシンＣ、ネモルビシン、ネオカルジノスタチン、ペプロマイシン、ピラルビシン、レベッカマイシン、スチマラマー、ストレプトゾシン、ＶＡＬＳＴＡＲ（登録商標）（バルルビシン）、ジノスタチン等が挙げられる。
【０１８４】
トポイソメラーゼ阻害剤としては、アクラルビシン、９−アミノカンプトテシン、アモナフィド、アムサクリン、ベカテカリン、ベロテカン、ＢＮ−８０９１５、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標）（塩酸イリノテカン）、カンプトテシン、ＣＡＲＤＩＯＸＡＮＥ（登録商標）（デクスラゾキサン）、ジフロモテカン、エドテカリン、ＥＬＬＥＮＣＥ（登録商標）ないしＰＨＡＲＭＯＲＵＢＩＣＩＮ（登録商標）（エピルビシン）、エトポシド、エクサテカン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、ギマテカン、ルルトテカン、ミトキサントロン、オラテシン、ピラルビシン、ピキサントロン、ルビテカン、ソブゾキサン、ＳＮ−３８、タフルポシド、トポテカン等が挙げられる。
【０１８５】
抗体としては、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ）、ＣＤ４０特異抗体、ｃｈＴＮＴ−１／Ｂ、デノスマブ、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ）、ＨＵＭＡＸ−ＣＤ４（登録商標）（ザノリムマブ）、ＩＧＦ１Ｒ特異抗体、リンツズマブ、ＰＡＮＯＲＥＸ（登録商標）（エドレコロマブ）、ＲＥＮＣＡＲＥＸ（登録商標）（ＷＸ  Ｇ２５０）、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（レツズキシマブ）、チシリムマブ、トラスツズマブ、Ｉ型及びＩＩ型ＣＤ２０抗体等が挙げられる。
【０１８６】
ホルモン療法剤としては、ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）（アナストロゾール）、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）（エクセメスタン）、アルゾキシフェン、ＣＡＳＯＤＥＸ（登録商標）（ビカルタミド）、ＣＥＴＲＯＴＩＤＥ（登録商標）（セトロレリクス）、デガレリクス、デスロレリン、ＤＥＳＯＰＡＮ（登録商標）（トリロスタン）、デキサメタゾン、ＤＲＯＧＥＮＩＬ（登録商標）（フルタミド）、ＥＶＩＳＴＡ（登録商標）（ラロキシフェン）、ＡＦＥＭＡ（登録商標）（ファドロゾール）、ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）（トレミフェン）、ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標）（フルベストラント）、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）（レトロゾール）、フォルメスタン、グルココルチコイド、ＨＥＣＴＯＲＯＬ（登録商標）（ドキセルカルシフェロール）、ＲＥＮＡＧＥＬ（登録商標）（炭酸セベラマー）、ラソフォキシフェン、酢酸ロイプロリド、ＭＥＧＡＣＥ（登録商標）（メゲストロール）、ＭＩＦＥＰＲＥＸ（登録商標）（ミフェプリストン）、ＮＩＬＡＮＤＲＯＮ（登録商標）（ニルタミド）、ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）（クエン酸タモキシフェン）、ＰＬＥＮＡＸＩＳ（登録商標）（アバレリクス）、プレドニゾン、ＰＲＯＰＥＣＩＡ（登録商標）（フィナステリド）、トリロスタン、ＳＵＰＲＥＦＡＣＴ（登録商標）（ブセレリン）、ＴＲＥＬＳＴＡＲ（登録商標）（黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ））、ＶＡＮＴＡＳ（登録商標）（ヒストレリンインプラント）、ＶＥＴＯＲＹＬ（登録商標）（トリロスタンないしモドラスタン）、ＺＯＬＡＤＥＸ（登録商標）（フォスレリン、ゴセレリン）等が挙げられる。
【０１８７】
デルトイド及びレチノイドとしては、セオカルシトール（ＥＢ１０８９、ＣＢ１０９３）、レキサカルシトール（ＫＨ１０６０）、フェンレチニド、ＰＡＮＲＥＴＩＮ（登録商標）（アリトレチノイン）、ＡＴＲＡＧＥＮ（登録商標）（リポソームトレチノイン）、ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標）（ベキサロテン）、ＬＧＤ−１５５０等が挙げられる。
【０１８８】
ＰＡＲＰ阻害剤としては、ＡＢＴ−８８８、オラパリブ、ＫＵ−５９４３６、ＡＺＤ−２２８１、ＡＧ−０１４６９９、ＢＳＩ−２０１、ＢＧＰ−１５、ＩＮＯ−１００１、ＯＮＯ−２２３１等が挙げられる。
【０１８９】
植物アルカノイドとしては、限定されないが、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン等が挙げられる。
【０１９０】
プロテオソーム阻害剤としては、ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）（ボルテゾミブ）、ＭＧ１３２、ＮＰＩ−００５２、ＰＲ−１７１等が挙げられる。
【０１９１】
免疫療法剤の例としては、インターフェロン及び他の免疫増強剤が挙げられる。インターフェロンとしては、インターフェロンα、インターフェロンα２ａ、インターフェロンα２ｂ、インターフェロンβ、インターフェロンγ１ａ、ＡＣＴＩＭＭＵＮＥ（登録商標）（インターフェロンγ１ｂ）又はインターフェロンγ−ｎ１、その組合せ等が挙げられる。他の免疫療法剤としては、ＡＬＦＡＦＥＲＯＮＥ（登録商標）（ＩＦＮα）、ＢＡＭ−００２（酸化型グルタチオン）、ＢＥＲＯＭＵＮ（登録商標）（タソネルミン）、ＢＥＸＸＡＲ（登録商標）（トシツモマブ）、ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標）（アレムツズマブ）、ＣＴＬＡ４（細胞傷害性リンパ球抗原４）、デカルバジン、デニロイキン、エプラツズマブ、ＧＲＡＮＯＣＹＴＥ（登録商標）（レノグラスチム）、レンチナン、白血球αインターフェロン、イミキモド、ＭＤＸ−０１０（抗ＣＴＬＡ−４）、メラノーマワクチン、ミツモマブ、モルグラモスチム、ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標）（ゲムツズマブオゾガマイシン）、ＮＥＵＰＯＧＥＮ（登録商標）（フィルグラスチム）、ＯｎｃｏＶＡＣ−ＣＬ、ＯＶＡＲＥＸ（登録商標）（オレゴボマブ）、ペムツモマブ（Ｙ−ｍｕＨＭＦＧ１）、ＰＲＯＶＥＮＧＥ（登録商標）（シプロイセル−Ｔ）、サルグラモスチム、シゾフィラン、テセロイキン、ＴＨＥＲＡＣＹＳ（登録商標）（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）、ウベニメクス、ＶＩＲＵＬＩＺＩＮ（登録商標）（免疫療法剤，Ｌｏｒｕｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、Ｚ−１００（丸山ワクチン（ＳＳＭ））、ＷＦ−１０（テトラクロロデカオキシド（ＴＣＤＯ））、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）（アルデスロイキン）、ＺＡＤＡＸＩＮ（登録商標）（サイマルファシン）、ＺＥＮＡＰＡＸ（登録商標）（ダクリズマブ）、ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）（９０Ｙ−イブリツモマブチウキセタン）等が挙げられる。
【０１９２】
生体応答調節剤は例えば組織細胞に抗腫瘍活性をもたせるように生存、増殖又は分化等の生体の防御メカニズムないし生体応答を調節する物質であり、クレスチン、レンチナン、シゾフィラン、ピシバニール、ＰＦ−３５１２６７６（ＣｐＧ−８９５４）、ウベニメクス等が挙げられる。
【０１９３】
ピリミジンアナログとしては、シタラビン（ａｒａ  ＣないしアラビノシドＣ）、シトシンアラビノシド、ドキシフルリジン、ＦＬＵＤＡＲＡ（登録商標）（フルダラビン）、５−ＦＵ（５−フルオロウラシル）、フロクスウリジン、ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）（ゲムシタビン）、ＴＯＭＵＤＥＸ（登録商標）（ラルチトレキセド）、ＴＲＯＸＡＴＹＬ（登録商標）（トリアセチルウリジントロキサシタビン）等が挙げられる。
【０１９４】
プリンアナログとしては、ＬＡＮＶＩＳ（登録商標）（チオグアニン）及びＰＵＲＩ−ＮＥＴＨＯＬ（登録商標）（メルカプトプリン）が挙げられる。
【０１９５】
抗有糸分裂剤としては、バタブリン、エポチロンＤ（ＫＯＳ−８６２）、Ｎ−（２−（（４−ヒドロキシフェニル）アミノ）ピリジン−３−イル）−４−メトキシベンゼンスルホンアミド、イクサベピロン（ＢＭＳ２４７５５０）、パクリタキセル、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）（ドセタキセル）、ＰＮＵ１００９４０（１０９８８１）、パツピロン、ＸＲＰ−９８８１（ラロタキセル）、ビンフルニン、ＺＫ−ＥＰＯ（合成エポチロン）等が挙げられる。
【０１９６】
ユビキチンリガーゼ阻害剤としては、ＭＤＭ２阻害剤（例えばヌトリン）、ＮＥＤＤ８阻害剤（例えばＭＬＮ４９２４）等が挙げられる。
【０１９７】
本発明の化合物は放射線療法の効力を増強する放射線増感剤として使用することもできる。放射線療法の例としては、外照射療法、遠隔照射療法、近接照射療法、及び密封線源、非密封線源放射線療法等が挙げられる。
【０１９８】
更に、式（ＩＩ）を有する化合物はＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（ＡＢＩ−００７）、ＡＢＴ−１００（ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤）、ＡＤＶＥＸＩＮ（登録商標）（Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３ワクチン）、ＡＬＴＯＣＯＲ（登録商標）ないしＭＥＶＡＣＯＲ（登録商標）（ロバスタチン）、ＡＭＰＬＩＧＥＮ（登録商標）（ポリＩ：ポリＣ１２Ｕ、合成ＲＮＡ）、ＡＰＴＯＳＹＮ（登録商標）（エクシスリンド）、ＡＲＥＤＩＡ（登録商標）（パミドロン酸）、アルグラビン、Ｌ−アスパラギナーゼ、アタメスタン（１−メチル−３，１７−ジオンアンドロスタ−１，４−ジエン）、ＡＶＡＧＥ（登録商標）（タザロテン）、ＡＶＥ−８０６２（コンブレタスタチン誘導体）、ＢＥＣ２（ミツモマブ）、カヘクチンないしカヘキシン（腫瘍壊死因子）、カンバクシン（ワクチン）、ＣＥＡＶＡＣ（登録商標）（癌ワクチン）、ＣＥＬＥＵＫ（登録商標）（セルモロイキン）、ＣＥＰＬＥＮＥ（登録商標）（ヒスタミン二塩酸塩）、ＣＥＲＶＡＲＩＸ（登録商標）（ヒトパピローマウイルスワクチン）、ＣＨＯＰ（登録商標）（Ｃ：ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）（シクロホスファミド）；Ｈ：ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）（ヒドロキシドキソルビシン）；Ｏ：ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；Ｐ：プレドニゾン）、ＣＹＰＡＴ（登録商標）（酢酸シプロテロン）、コンブレスタチンＡ４Ｐ、ＤＡＢ（３８９）ＥＧＦ（Ｈｉｓ−Ａｌａリンカーを介してヒト上皮成長因子と融合したジフテリア毒素の触媒及び転座領域）ないしＴｒａｎｓＭＩＤ−１０７Ｒ（登録商標）（ジフテリア毒素）、ダカルバジン、ダクチノマイシン、５，６−ジメチルキサンテノン−４−酢酸（ＤＭＸＡＡ）、エニルウラシル、ＥＶＩＺＯＮ（登録商標）（乳酸スクアラミン）、ＤＩＭＥＲＩＣＩＮＥ（登録商標）（Ｔ４Ｎ５リポソームローション）、ジスコデルモリド、ＤＸ−８９５１ｆ（メシル酸エキサテカン）、エンザスタウリン、ＥＰＯ９０６（エポチロンＢ）、ＧＡＲＤＡＳＩＬ（登録商標）（四価ヒトパピローマウイルス（タイプ６、１１、１６、１８）組換えワクチン）、ＧＡＳＴＲＩＭＭＵＮＥ（登録商標）、ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標）、ＧＭＫ（ガングリオシドコンジュゲートワクチン）、ＧＶＡＸ（登録商標）（前立腺癌ワクチン）、ハロフジノン、ヒステレリン、ヒドロキシカルバミド、イバンドロン酸、ＩＧＮ−１０１、ＩＬ−１３−ＰＥ３８、ＩＬ−１３−ＰＥ３８ＱＱＲ（シントレデキンベスドトクス）、ＩＬ−１３−シュードモナス外毒素、インターフェロンα、インターフェロンγ、ＪＵＮＯＶＡＮ（登録商標）ないしＭＥＰＡＣＴ（登録商標）（ミファムルチド）、ロナファルニブ、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸、ミルテフォシン（ヘキサデシルホスホコリン）、ＮＥＯＶＡＳＴＡＴ（登録商標）（ＡＥ−９４１）、ＮＥＵＴＲＥＸＩＮ（登録商標）（グルクロン酸トリメトレキサート）、ＮＩＰＥＮＴ（登録商標）（ペントスタチン）、ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）（リボヌクレアーゼ酵素）、ＯＮＣＯＰＨＡＧＥ（登録商標）（メラノーマワクチン治療薬）、ＯＮＣＯＶＡＸ（登録商標）（ＩＬ−２ワクチン）、ＯＲＡＴＨＥＣＩＮ（登録商標）（ルビテカン）、Ｏ��ＩＤＥＭ（登録商標）（抗体細胞薬）、ＯＶＡＲＥＸ（登録商標）ＭＡｂ（マウスモノクローナル抗体）、パクリタキセル、ＰＡＮＤＩＭＥＸ（登録商標）（２０（Ｓ）プロトパナキサジオール（ａＰＰＤ）及び２０（Ｓ）プロトパナキサトリオール（ａＰＰＴ）を含有する朝鮮人参に由来するアグリコンサポニン）、パニツムマブ、ＰＡＮＶＡＣ（登録商標）−ＶＦ（治験中の癌ワクチン）、ペグアスパラガーゼ、ペグインターフェロンＡ、フェノキソジオール、プロカルバジン、レビマスタット、ＲＥＭＯＶＡＢ（登録商標）（カツマキソマブ）、ＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標）（レナリドミド）、ＲＳＲ１３（エファプロキシラール）、ＳＯＭＡＴＵＬＩＮＥ（登録商標）ＬＡ（ランレオチド）、ＳＯＲＩＡＴＡＮＥ（登録商標）（アシトレチン）、スタウロスポリン（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｅｓ）、タラボスタット（ＰＴ１００）、ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標）（ベキサロテン）、ＴＡＸＯＰＲＥＸＩＮ（登録商標）（ＤＨＡ−パクリタキセル）、ＴＥＬＣＹＴＡ（登録商標）（カンホスファミド、ＴＬＫ２８６）、テミリフェン、ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標）（テモゾロミド）、テスミリフェン、サリドマイド、ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）（ＳＴｎ−ＫＬＨ）、チミタク（２−アミノ−３，４−ジヒドロ−６−メチル−４−オキソ−５−（４−ピリジルチオ）キナゾリン二塩酸塩）、ＴＮＦＥＲＡＤＥ（登録商標）（アデノベクター：腫瘍壊死因子αの遺伝子を組込んだＤＮＡキャリヤー）、ＴＲＡＣＬＥＥＲ（登録商標）ないしＺＡＶＥＳＣＡ（登録商標）（ボセンタン）、トレチノイン（レチンＡ）、テトランドリン、ＴＲＩＳＥＮＯＸ（登録商標）（三酸化ヒ素）、ＶＩＲＵＬＩＺＩＮ（登録商標）、ウクライン（クサノオウ（ｇｒｅａｔｅｒ  ｃｅｌａｎｄｉｎｅ）植物に由来するアルカノイドの誘導体）、ビタキシン（抗ανβ３抗体）、ＸＣＹＴＲＩＮ（登録商標）（モテキサフィンガドリニウム）、ＸＩＮＬＡＹ（登録商標）（アトラセンタン）、ＸＹＯＴＡＸ（登録商標）（パクリタキセルポリグルメクス）、ＹＯＮＤＥＬＩＳ（登録商標）（トラベクテジン）、ＺＤ−６１２６、ＺＩＮＥＣＡＲＤ（登録商標）（デクスラゾキサン）、ＺＯＭＥＴＡ（登録商標）（ゾレンドロン酸）、ゾルビシン等の他の化学療法剤と併用してもよい。
【０１９９】
ＢＡＸ及びＢＡＤペプチドはＺｈａｎｇ，Ｈ．Ｃ．，Ｎｉｍｍｅｒ，Ｐ．，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｈ．，Ｎｇ，Ｓ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｊｏｓｅｐｈ，Ｍ．（２００２）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｂｃｌ−ｘ（Ｌ）．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０７，７０−７５に報告されている。
【０２００】
Ｂｃｌ−ＸＬ蛋白質に対する式（ＩＩ）を有する化合物の結合親和性はこの蛋白質の活性に対するこれらの化合物の阻害の指標である。Ｂｃｌ−ＸＬ蛋白質に対する式（ＩＩ）を有する化合物の結合親和性を測定するために、代表的実施例をＤＭＳＯで１００μＭ〜１ｐＭの濃度まで希釈し、９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。アッセイバッファー（２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４），１ｍＭ  ＥＤＴＡ，５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０５％  ＰＦ−６８）１２５μＬ／ウェルと、（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９７，２７５，９８３−９８６に記載されているように製造した）Ｂｃｌ−ＸＬ蛋白質６ｎＭと、（社内製造した）フルオレセイン標識ＢＡＤペプチド１ｎＭと、化合物のＤＭＳＯ溶液を含む混合物を２分間振盪し、ＬＪＬ  Ａｎａｌｙｓｔ（ＬＪＬ  Ｂｉｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ）にセットした。陰性対照（ＤＭＳＯ，１５ｎＭ  ＢＡＤペプチド，アッセイバッファー）と陽性対照（ＤＭＳＯ，１ｎＭ  ＢＡＤペプチド，６ｎＭ  Ｂｃｌ−ＸＬ，アッセイバッファー）を使用し、アッセイの範囲を決定した。連続蛍光ランプ（励起４８５ｎｍ、発光５３０ｎｍ）を使用して室温にて偏光を測定した。（１−（（十分に陰性の対照のｍＰ値）／範囲））×１００％により阻害百分率を求めた。結果を表１に示す。
【０２０１】
Ｂｃｌ−２蛋白質に対する式（ＩＩ）を有する化合物の結合親和性はこの蛋白質の活性に対するこれらの化合物の阻害の指標である。Ｂｃｌ−２に対する式（ＩＩ）を有する化合物の結合親和性を測定するために、代表的実施例をＤＭＳＯで１０μＭ〜１０ｐＭの濃度まで希釈し、９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。アッセイバッファー（２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４），１ｍＭ  ＥＤＴＡ，５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０５％  ＰＦ−６８）１２５μＬ／ウェルと、（ＰＮＡＳ  ２００１，９８，３０１２−３０１７に記載されている手順に従って製造した）Ｂｃｌ−２蛋白質１０ｎＭと、（社内製造した）フルオレセイン標識ＢＡＸペプチド１ｎＭと、代表的実施例のＤＭＳＯ溶液を含む混合物を２分間振盪し、ＬＪＬ  Ａｎａｌｙｓｔ（ＬＪＬ  Ｂｉｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ）にセットした。連続蛍光ランプ（励起４８５ｎｍ、発光５３０ｎｍ）を使用して室温にて偏光を測定した。この結果も表１に示す。
【０２０２】
これらのデータによると、式（ＩＩ）を有する化合物は抗アポトーシスＢｃｌ−ＸＬ蛋白質及び抗アポトーシスＢｃｌ−２との結合剤及びその阻害剤として有用であることが明かである。
【０２０３】
式（ＩＩ）を有する化合物はＢｃｌ−ＸＬ及びＢｃｌ−２と結合し、その活性を阻害するので、Ｂｃｌ−ＸＬ及びＢｃｌ−２に近似する構造相同性をもつ抗アポトーシスファミリー蛋白質メンバー（例えば、抗アポトーシスＢｃｌ−ｗ蛋白質）の阻害剤としても有用であると予想される。
【０２０４】
従って、式（ＩＩ）を有する化合物は疾病期間中に抗アポトーシスＢｃｌ−ＸＬ蛋白質、抗アポトーシスＢｃｌ−２蛋白質、抗アポトーシスＢｃｌ−ｗ蛋白質又はその組合せが発現される疾病の治療に有用であると予想される。
【０２０５】
ヒト腫瘍細胞株における細胞効力の測定
ウシ胎仔血清の代わりに１０％ヒト血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ．）を加えた合計体積１００μＬの組織培養培地でＮＣＩ−Ｈ１４６（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ．）ヒト小細胞肺癌細胞を９６ウェル組織培養プレートにウェル当たり５０，０００個の割合で撒き、１０μＭから０．０２０μＭまでの被験化合物の２倍系列希釈液で処理した。各濃度を２枚ずつ別々に少なくとも３回試験した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ非放射性細胞増殖ＭＴＳアッセイを製造業者の推奨（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に従って使用し、化合物処理から４８時間後の生存細胞数を調べた。この結果も表１に示す。
【０２０６】
ラットにおける選択化合物の薬物動態評価
雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ由来ラット（各群ｎ＝３）に２ｍｇ／ｋｇを静脈内又は５ｍｇ／ｋｇを経口で単回投与後の本発明の化合物の薬物動態挙動を調べた。経口及び静脈内両者の投与用にＰＥＧ−４００中１０％  ＤＭＳＯ製剤中で２ｍｇ／ｍＬ溶液として化合物を調製した。１ｍＬ／ｋｇを弱い麻酔下にラットの頸静脈にスローボーラス（約１〜２分間）として静脈内投与した。経口投与は強制飼養により投与した。投与前と投与から０．１時間（ＩＶのみ）、０．２５時間、０．５時間、１時間、１．５時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間及び２４時間後に各ラットの尾静脈から連続血液サンプルを採取した。ヘパリン処理したサンプルを十分に混合し、氷浴に浸した。血漿を遠心分離し、凍結保存後に分析した。この結果も表１に示す。
【０２０７】
アセトニトリルによる蛋白質沈殿を使用して血漿から被験化合物を分離した。９６ウェルポリプロピレンディープウェルプレートで血漿（１００〜２００μＬ、サンプル又はスパイク標準）アリコートに内部標準（アセトニトリル中で調製した構造的に関連するアナログ）５０μＬとアセトニトリル１ｍｌを加えた。プレートを３０秒間ボルテックスした後、遠心した（３５００ｒｐｍ×１５分間、４℃）。自動法で上清を清浄な９６ウェルプレートに移した。サンプルを低温加熱（〜３７℃）下の乾燥窒素流下にＭｉｃｒｏ−Ｖａｐ（登録商標）でほぼ蒸発乾涸した。サンプルをボルテックス下に５％  ＤＭＳＯのアセトニトリル溶液０．２ｍＬで再構成した。アセトニトリル：０．１％トリフルオロ酢酸（２０：８０、体積比）の０．１〜０．２ｍｌアリコートを各ウェルに加えた後、更に３０秒間ボルテックスした。プレートを遠心（３５００ｒｐｍ×１５分間、４℃）後、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に供した。サンプルをスパイク血漿標準と同時に分析した。各試験からの全サンプルをＬＣ−ＭＳ／ＭＳで単一バッチとして分析した。
【０２０８】
被験化合物と内部標準を相互に分離し、５０×３ｍｍ  Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｂｅｔａｓｉｌ  ＣＮ  ５μｍカラムでアセトニトリル：０．１％トリフルオロ酢酸移動相（５０：５０、体積比）を流速０．７ｍｌ／分にて使用し、汚染物質と共抽出した。加熱式ネブライザー界面を使用してＳｃｉｅｘ  ＡＰＩ  ３００（登録商標）Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍａｓｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒで分析を行った。Ｓｃｉｅｘ  ＭａｃＱｕａｎ（登録商標）ソフトウェアを使用して標記化合物と内部標準のピーク面積を測定した。閾値濃度に対する比の最小二乗法直線回帰を使用してスパイクラット血漿標準のピーク面積比（親薬剤／内部標準）から検量線を作成した。方法は推定定量限界０．０１μｇ／ｍＬで標準曲線の範囲にわたってほぼ線形であった（相関係数＞０．９９）。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎを使用して各動物の血漿濃度データを多次指数関数曲線フィットに供した。血漿濃度−時間プロファイルの直線台形法を使用して投与後０時間からｔ時間（最後の測定可能な血漿濃度の時点）までの血漿濃度−時間曲線下の面積（ＡＵＣ０−ｔ）を計算した。最終血漿濃度測定値（Ｃｔ）を最終消失速度定数（β）で割った値として無限時間まで外挿した残余面積を求め、ＡＵＣ０−ｔに加え、曲線下総面積（ＡＵＣ０−∞）を得た。この結果も表１に示す。下表に示すＫｉ値はＷａｎｇの式を使用して求めた（Ｗａｎｇ  Ｚ  Ｘ，．Ａｎ  Ｅｘａｃｔ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｆｏｒ  Ｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｏｆ  Ｔｗｏ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｌｉｇａｎｄｓ  Ｔｏ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９５；３６０：１１１−４）。
【０２０９】
【表２】
2013512911.tif 000015
【０２１０】
全身暴露と細胞効力の比を求めることにより、本発明の化合物をＷＯ２００５／０４９５９４に開示されている化合物（本願では実施例Ａ〜Ｌと言う）と比較した。この比はＡＵＣ／ＥＣ５０として報告される場合もあり、経口効力の有用な薬物動態予測因子として医薬発見及び薬剤開発分野の当業者に周知である。
【０２１１】
本発明の実施例とＷＯ２００５／０４９５９４に開示されている化合物を先述したようにＨ１４６細胞アッセイで試験し、ラットにおける経口薬物動態特性について評価した。結果を表２及び３に示す。データを参照すると明らかなように、本発明の化合物は当分野で公知の化合物よりも好ましい薬物動態プロファイルをもつ（即ち、本発明の化合物のほうが高いＡＵＣ／ＥＣ５０値を示す）。これらの結果から、多数の所見を得ることができる。Ｗ１位にＮＯ２部分をもつ化合物は良好〜優良な細胞効力（例えばＥＣ５０＜１μＭ）をもつ傾向があると言うことができる。しかし、これらの同一化合物の薬物動態特性を検討すると、経口投与後の全身暴露は不良であり、ＡＵＣ／ＥＣ５０比は０．５〜１９．７になることが認められる。他方、Ｗ１位にＣＦ３又はＣＮ部分をもつ化合物を細胞アッセイで試験すると、これらの誘導体は経口投与後の全身暴露が適切であるとしても、細胞効力が比較的不良である（例えばＥＣ５０＞１μＭ）。また、この組合せでは全体的なＡＵＣ／ＥＣ５０比が約２．８〜約＜７．４となる。驚くべきことに、本発明の化合物は経口投与後に適切な全身暴露を維持しながらＮＯ２部分をもつ化合物と同等の細胞効力を示す。本発明の化合物で得られるＡＵＣ／ＥＣ５０比は約２０〜約５５４である。
【０２１２】
【表３】
2013512911.tif 000016
【０２１３】
【表４】
2013512911.tif 000017
2013512911.tif 000018
【０２１４】
図１〜７に示すように、エトポシド、ビンクリスチン、ＣＨＯＰ、リツキシマブ、リツキシマブ＋ＣＨＯＰ、ラパマイシン及びＶＥＬＣＡＤＥと併用した実施例１の経口効力に関する試験の結果、実施例１は経口投与した場合に併用療法中にこれらの細胞傷害性物質の効力を相乗的に増強することが判明した。
【０２１５】
更に、実施例１とビンクリスチンの併用の結果、１０％の完全腫瘍退縮が得られた。
【０２１６】
更に、リツキシマブ単独では腫瘍退縮は認められなかったが、実施例１とリツキシマブの併用の結果、７０％の完全腫瘍退縮が得られた。
【０２１７】
更に、ラパマイシン単独では１０％の腫瘍退縮しか認められなかったが、実施例１とラパマイシンの併用の結果、７０％の完全腫瘍退縮が得られた。
【０２１８】
更に、リツキシマブ＋ＣＨＯＰだけでは１０％の腫瘍退縮しか認められなかったが、実施例１とリツキシマブ＋ＣＨＯＰの併用の結果、９０％の完全腫瘍退縮が得られた。
【０２１９】
更に、ボルテゾミブ単独では腫瘍退縮は認められなかったが、実施例１とボルテゾミブの併用の結果、１０％の完全腫瘍退縮が得られた。
【０２２０】
疾病期間中に抗アポトーシスＢｃｌ−ＸＬ蛋白質、抗アポトーシスＢｃｌ−２蛋白質、抗アポトーシスＢｃｌ−ｗ蛋白質又はその組合せが発現される疾病としては、限定されないが、癌及び自己免疫疾患が挙げられ、癌としては、限定されないが、聴神経腫瘍、急性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病（単球性、骨髄芽球性、腺癌、血管肉腫、星状細胞腫、骨髄単球性及び前骨髄球性）、急性Ｔ細胞白血病、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、気管支原性癌、子宮頸癌、軟骨肉腫、脊索腫、絨毛癌、慢性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、結腸・直腸癌、頭蓋咽頭腫、嚢胞腺癌、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、増殖異常変化（異形成及び化生）、胎児癌、子宮内膜癌、内皮肉腫、上衣腫、上皮癌、赤白血病、食道癌、エストロゲン受容体陽性乳癌、本態性血小板血症、ユーイング腫瘍、線維肉腫、濾胞性リンパ腫、胚細胞性精巣癌、神経膠腫、重鎖病、血管芽腫、肝臓癌、肝細胞癌、ホルモン非感受性前立腺癌、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、肺癌、リンパ管内皮細胞肉腫、リンパ管肉腫、リンパ芽球性白血病、リンパ腫（ホジキン及び非ホジキン）、膀胱、乳房、結腸、肺、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚及び子宮の悪性腫瘍及び過剰増殖疾患、Ｔ細胞又はＢ細胞性悪性リンパ腫、白血病、リンパ腫、髄様癌、髄芽腫、メラノーマ、髄膜腫、中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄性白血病、骨髄腫、粘液肉腫、神経芽腫、非小細胞肺癌、乏突起膠腫、口腔癌、骨原性肉腫、卵巣癌、膵臓癌、乳頭腺癌、乳頭癌、松果体腫、真性多血症、前立腺癌、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、脂腺癌、セミノーマ、小細胞肺癌、充実性腫瘍（癌及び肉腫）、小細胞肺癌、扁平上皮癌、滑膜腫、汗腺癌、ワルデンストローム型マクログロブリン血症、精巣癌、子宮癌並びにウィルムス腫瘍が挙げられ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２０００，６０，６１０１−１０及びＭｅｄｉｃｉｎｅ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９８５））、自己免疫疾患としては、限定されないが、後天性免疫不全症候群、自己免疫性リンパ増殖症候群、溶血性貧血、炎症性疾患及び血小板減少症が挙げられる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ａｓｔｈｍａ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２００３，３：３７８−３８４；Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．２０００  Ｓｅｐ；１１０（３）：５８４−９０；Ｂｌｏｏｄ  ２０００  Ｆｅｂ  １５；９５（４）：１２８３−９２；及びＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００４  Ｓｅｐ；３５１（１４）：１４０９−１４１８）。
【０２２１】
式（ＩＩ）を有する化合物は乳癌（エストロゲン受容体陽性乳癌を含む）、結腸・直腸癌、子宮内膜癌、肺癌（小細胞肺癌を含む）、リンパ腫（濾胞性又はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含む）、リンパ腫（非ホジキンリンパ腫を含む）、神経芽腫、卵巣癌、前立腺癌（ホルモン非感受性前立腺癌を含む）、精巣癌（胚細胞性精巣癌を含む）等の癌又は新生物に由来する細胞の増殖を阻害することも予想される。
【０２２２】
式（ＩＩ）を有する化合物は胎児型横紋筋肉腫、小児急性リンパ芽球性白血病、小児急性骨髄性白血病、小児胞巣型横紋筋肉腫、小児退形成性上衣腫、小児退形成性大細胞型リンパ腫、小児退形成性髄芽腫、中枢神経系の小児非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、小児二重表現型急性白血病、小児バーキットリンパ腫、ユーイングファミリー腫瘍の小児癌（例えば未分化神経外胚葉性腫瘍）、小児びまん性退形成性ウィルムス腫瘍、小児予後良好組織型ウィルムス腫瘍、小児神経膠芽腫、小児髄芽腫、小児神経芽細胞腫、小児神経芽細胞腫由来骨髄球腫症、小児プレＢ細胞癌（例えば白血病）、小児骨肉腫、小児腎横紋筋肉腫様腫瘍、小児横紋筋肉腫及び小児Ｔ細胞癌（例えばリンパ腫及び皮膚癌）等の小児癌又は新生物に由来する細胞の増殖を阻害することも予想され（同一名義の米国出願第１０／９８８，３３８号、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２０００，６０，６１０１−１０）、自己免疫疾患としては、限定されないが、後天性免疫不全症候群、自己免疫性リンパ増殖症候群、溶血性貧血、炎症性疾患及び血小板減少症が挙げられる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ａｓｔｈｍａ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２００３，３：３７８−３８４；Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．２０００  Ｓｅｐ；１１０（３）：５８４−９０；Ｂｌｏｏｄ  ２０００  Ｆｅｂ  １５；９５（４）：１２８３−９２；及びＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００４  Ｓｅｐ；３５１（１４）：１４０９−１４１８）。
【０２２３】
式（ＩＩ）を有する化合物は以下に例示する合成化学製法により製造することができる。当然のことながら、製法における工程の順序は変えてもよく、具体的に記載する試薬、溶媒及び反応条件以外のものを使用してもよく、攻撃を受け易い部分は必要に応じて保護・脱保護してもよい。
【０２２４】
Ｃ（Ｏ）ＯＨ部分の保護基としては、限定されないが、アセトキシメチル、アリル、ベンゾイルメチル、ベンジル、ベンジルオキシメチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル、ジフェニルメチル、シクロブチル、シクロヘキシル、シクロペンチル、シクロプロピル、ジフェニルメチルシリル、エチル、パラメトキシベンジル、メトキシメチル、メトキシエトキシメチル、メチル、メチルチオメチル、ナフチル、パラニトロベンジル、フェニル、ｎ−プロピル、２，２，２−トリクロロエチル、トリエチルシリル、２−（トリメチルシリル）エチル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル、トリフェニルメチル等が挙げられる。
【０２２５】
Ｃ（Ｏ）及びＣ（Ｏ）Ｈ部分の保護基としては、限定されないが、１，３−ジオキシルケタール、ジエチルケタール、ジメチルケタール、１，３−ジチアニルケタール、Ｏ−メチルオキシム、Ｏ−フェニルオキシム等が挙げられる。
【０２２６】
ＮＨの保護基としては、限定されないが、アセチル、アラニル、ベンゾイル、ベンジル（フェニルメチル）、ベンジリデン、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、３，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ジフェニルメチル、ジフェニルホスホリル、ホルミル、メタンスルホニル、パラメトキシベンジルオキシカルボニル、フェニルアセチル、フタロイル、スクシニル、トリクロロエトキシカルボニル、トリエチルシリル、トリフルオロアセチル、トリメチルシリル、トリフェニルメチル、トリフェニルシリル、パラトルエンスルホニル等が挙げられる。
【０２２７】
ＯＨ及びＳＨ部分の保護基としては、限定されないが、アセチル、アリル、アリルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、ベンゾイル、ベンジル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル、３，４−ジメトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、１，１−ジメチル−２−プロペニル、ジフェニルメチル、ホルミル、メタンスルホニル、メトキシアセチル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、パラメトキシベンジル、メトキシカルボニル、メチル、パラトルエンスルホニル、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエチル、トリエチルシリル、トリフルオロアセチル、２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、２−トリメチルシリルエチル、トリフェニルメチル、２−（トリフェニルホスフィノ）エトキシカルボニル等が挙げられる。
【０２２８】
以下の略語は指定通りの意味である。ＡＤＤＰは１，１’−（アゾジカルボニル）ジピペリジンを意味し；ＡＤ−ミックス−βは（ＤＨＱＤ）２ＰＨＡＬ、Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、Ｋ２ＣＯ３及びＫ２ＳＯ４の混合物を意味し；ＡＩＢＮは２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル）を意味し；９−ＢＢＮは９−ボラビシクロ［３．３．１］ノナンを意味し；（ＤＨＱＤ）２ＰＨＡＬはヒドロキニジン１，４−フタラジンジイルジエチルエーテルを意味し；ＤＢＵは１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エンを意味し；ＤＩＢＡＬは水素化ジイソブチルアルミニウムを意味し；ＤＩＥＡはジイソプロピルエチルアミンを意味し；ＤＭＡＰはＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンを意味し；ＤＭＥは１，２−ジメトキシエタンを意味し；ＤＭＦはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを意味し；ｄｍｐｅは１，２−ビス（ジメチルホスフィノ）エタンを意味し；ＤＭＳＯはジメチルスルホキシドを意味し；ｄｐｐｂは１，４−ビス（ジフェニルホスフィノ）ブタンを意味し；ｄｐｐｅは１，２−ビス（ジフェニルホスフィノ）エタンを意味し；ｄｐｐｆは１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセンを意味し；ｄｐｐｍは１，１−ビス（ジフェニルホスフィノ）メタンを意味し；ＥＤＡＣは１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドを意味し；Ｆｍｏｃはフルオレニルメトキシカルボニルを意味し；ＨＡＴＵはＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファートを意味し；ＨＭＰＡはヘキサメチルホスホルアミドを意味し；ＩＰＡはイソプロピルアルコールを意味し；ＬＤＡはリチウムジイソプロピルアミドを意味し；ＬＨＭＤＳはリチウムビス（ヘキサメチルジシリルアミド）を意味し；ＭＰ−ＢＨ３はマクロ多孔質トリエチルアンモニウムメチルポリスチレンシアノ水素化ホウ素を意味し；ＬＡＨは水素化アルミニウムリチウムを意味し；ＮＣＳはＮ−クロロスミシンイミドを意味し；ＰｙＢＯＰはベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファートを意味し；ＴＤＡ−１はトリス（２−（２−メトキシエトキシ）エチル）アミンを意味し；ＴＥＡはトリエチルアミンを意味し；ＴＦＡはトリフルオロ酢酸を意味し；ＴＨＦはテトラヒドロフランを意味し；ＮＣＳはＮ−クロロスミシンイミドを意味し；ＮＭＭはＮ−メチルモルホリンを意味し；ＮＭＰはＮ−メチルピロリジンを意味し；ＰＰＰｈ３はトリフェニルホスフィンを意味する。
【０２２９】
【化１２】
2013512911.tif 000019
【０２３０】
スキーム１に示すように、式（１）を有する化合物とクロロスルホン酸とアンモニアを反応させることにより、式（２）を有する化合物に変換することができる。
【０２３１】
【化１３】
2013512911.tif 000020
【０２３２】
塩基の存在下又は不在下で式（２）を有する化合物と式（３）を有する化合物とカップリング剤を反応させることにより、式（ＩＩ）を有する化合物に変換することができる。カップリング剤の例としては、ＥＤＣＩ、ＣＤＩ及びＰｙＢｏｐが挙げられる。塩基の例としては、ＴＥＡ、ＤＩＥＡ、ＤＭＡＰ及びその混合物が挙げられる。
【０２３３】
式（２）を有する化合物とＺ１−ＣＯＣｌを有する化合物と塩基を反応させることにより、式（ＩＩ）を有する化合物に変換することができる。
【０２３４】
Ｃ．癌治療用としての倍数性誘導剤とＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤の相乗的組合せ
別の側面において、本発明は癌罹患患者の治療に有用な相乗的治療剤組合せの発見に関する。先述したように、本発明者らは所定の腫瘍及び癌細胞に倍数化を誘導すると、この結果として得られるこれらの倍数体細胞の生存がＢｃｌ−ＸＬの抗アポトーシス活性に依存性になることを発見した。これらの倍数体細胞はその生存に関してＢｃｌ−ＸＬに依存性になったので、これらの腫瘍及び癌細胞はＢｃｌ−ＸＬ阻害に感受性になる。
【０２３５】
従って、本発明は（１）少なくとも１種の倍数性誘導剤と；（２）少なくとも１種のＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤を含む治療剤組合せ（即ち併用療法）に関する。少なくとも１種の倍数性誘導剤はオーロラキナーゼ阻害剤（例えばオーロラキナーゼＢ阻害剤）、微小管阻害剤（例えばタキソテール、ビンクリスチン、ノコダゾール、パクリタキセル又はコルセミド）、汎キナーゼ阻害剤（例えばスタウロスポリン）、腫瘍溶解性ウイルス（例えばＯＮＹＸ−０１５）、アクリジンオレンジ、ドラスタチン１０、ノスカピン、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えばＩＣＲＦ−１８７又はＩＣＲＦ−１９３）、２−｛４−［（７−クロロ−２−キノキサリニル）オキシ］フェノキシ｝プロピオン酸、２−｛４−［（７−ブロモ−２−キノリニル）オキシ］フェノキシ｝プロピオン酸、プラチコジンＤ、微小管毒（例えばＪＧ−０３−１４）、アクチン重合阻害剤（例えばサイトカラシンＢ）、ビストラミドＡ又は抗腫瘍性抗生物質（例えばミトラマイシンＳＫＩ）とすることができる。典型的な倍数性誘導剤はオーロラキナーゼ阻害剤である。使用することができる典型的なオーロラキナーゼ阻害剤はオーロラキナーゼＢ阻害剤である。使用することができる典型的なオーロラキナーゼＢ阻害剤としては、限定されないが、ＡＺＤ１１５２、ＺＭ４４７４３９、ＶＸ−６８０／ＭＫ０４５７及びヘスペラジンが挙げられる。使用することができる典型的なオーロラキナーゼＢ阻害剤はＡＺＤ１１５２である。
【０２３６】
１個以上の細胞における倍数性の誘導又は徴候を判定する方法は当分野で公知の日常的技術を使用して達成又は決定することができる。例えば、倍数性の徴候はｐ５３の発現増加を検出することにより判定することができる。ｐ５３は野生型ｐ５３を保有する細胞における倍数化の代替マーカーである（Ｇｉｚａｔｕｌｌｉｎ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ａｕｒｏｒａ  Ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＶＸ−６８０  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｅｎｄｏｒｅｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｉｎ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ  ｐ５３−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｏｓｔｍｉｔｏｔｉｃ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，”Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６，７６６８−７７．（２００６）参照）。更に、倍数性が誘導されている細胞は＞４ＮのＤＮＡ含有量と、細胞寸法の著しい形態的増加と、多核化を示し、いずれも当分野で公知の日常的技術を使用して検出することができる。
【０２３７】
少なくとも１種のＢｃｌ−２ファミリーメンバー阻害剤は本願のセクションＢに記載した化合物（例えばＡＢＴ−２６３）、ＡＢＴ−７３７、Ｂｃｌ−ＸＬ阻害剤（例えばＡ−１１１３５６７やＡ−１１８２８４８）及びその組合せのいずれかとすることができる。典型的なＢｃｌ−２ファミリーメンバー阻害剤はＡＢＴ−２６３である。
【０２３８】
少なくとも１種の癌に罹患している患者を治療するために上記治療剤組合せ、即ち少なくとも１種の倍数性誘導剤と少なくとも１種のＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤を使用することができる。具体的には、このような治療方法は治療を必要とする癌罹患患者に治療有効量の少なくとも１種の倍数性誘導剤と治療有効量の少なくとも１種のＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤を投与する段階を含む。少なくとも１種の倍数性誘導剤と少なくとも１種のＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤を患者に投与する順序は重要ではない。しかし、腫瘍及び癌細胞は倍数性の誘導後までＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤に感受性にならないので、治療有効量の少なくとも１種のＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤よりも前又はそれに続いて治療有効量の少なくとも１種の倍数性誘導剤を患者に投与すると最も有益である。
【０２３９】
本願に記載する治療剤組合せで治療する患者に投与する少なくとも１種の倍数性誘導剤の治療有効量と少なくとも１種のＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤の治療有効量は当業者、即ち治療医が容易に決定することができる。
【０２４０】
癌罹患患者の治療に使用される典型的な治療剤組合せは倍数性誘導剤としての治療有効量のＡＺＤ１１５２と、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤としての治療有効量のＡＢＴ−２６３の使用を含む。
【０２４１】
任意種類の腫瘍、癌、悪性腫瘍又はその併発に罹患している患者に上記治療剤組合せを投与することができる。例えば、聴神経腫瘍、急性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病（単球性、骨髄芽球性、腺癌、血管肉腫、星状細胞腫、骨髄単球性及び前骨髄球性）、急性Ｔ細胞白血病、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、気管支原性癌、子宮頸癌、軟骨肉腫、脊索腫、絨毛癌、慢性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、結腸・直腸癌、頭蓋咽頭腫、嚢胞腺癌、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、増殖異常変化（異形成及び化生）、胎児癌、子宮内膜癌、内皮肉腫、上衣腫、上皮癌、赤白血病、食道癌、エストロゲン受容体陽性乳癌、本態性血小板血症、ユーイング腫瘍、線維肉腫、濾胞性リンパ腫、胚細胞性精巣癌、神経膠腫、重鎖病、血管芽腫、肝臓癌、肝細胞癌、ホルモン非感受性前立腺癌、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、肺癌、リンパ管内皮細胞肉腫、リンパ管肉腫、リンパ芽球性白血病、リンパ腫（ホジキン及び非ホジキン）、膀胱、乳房、結腸、肺、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚及び子宮の悪性腫瘍及び過剰増殖疾患、Ｔ細胞又はＢ細胞性悪性リンパ腫、白血病、リンパ腫、髄様癌、髄芽腫、メラノーマ、髄膜腫、中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄性白血病、骨髄腫、粘液肉腫、神経芽腫、非小細胞肺癌、乏突起膠腫、口腔癌、骨原性肉腫、卵巣癌、膵臓癌、乳頭腺癌、乳頭癌、松果体腫、真性多血症、前立腺癌、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、脂腺癌、セミノーマ、小細胞肺癌、充実性腫瘍（癌及び肉腫）、小細胞肺癌、扁平上皮癌、滑膜腫、汗腺癌、ワルデンストローム型マクログロブリン血症、精巣癌、子宮癌並びにウィルムス腫瘍（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２０００，６０，６１０１−１０及びＭｅｄｉｃｉｎｅ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９８５））に罹患している患者を治療するために治療剤組合せを使用することができる。
【０２４２】
Ｄ．ポリヌクレオチドアッセイ
セクションＣに記載した上記発見と共に、本発明者らは、（ｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）、（ｉｉ）ヒトＮＯＸＡ遺伝子、又は（ｉｉｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）とヒトＮＯＸＡ遺伝子に少なくとも１カ所の突然変異を含む腫瘍及び癌細胞が（これらの細胞が倍数体になるように誘導されているか否かに関係なく）少なくとも１種の倍数性誘導剤による倍数性の誘導後にＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤による治療に免疫性になるか又は耐性を示すことも発見した。換言するならば、（ｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）、（ｉｉ）ヒトＮＯＸＡ遺伝子、又は（ｉｉｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）とヒトＮＯＸＡ遺伝子に少なくとも１カ所の突然変異を含む倍数体腫瘍及び癌細胞は少なくとも１種のＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤を同時に又は後で投与した場合にアポトーシス又は細胞死を示さないか又は生じない。
【０２４３】
従って、この発見に鑑み、別の側面において、本発明は（ｉ）無傷組織又は細胞サンプルに対するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイと、（ｉｉ）組織サンプルから抽出した染色体ＤＮＡに対するマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイと、（ｉｉｉ）組織サンプルから抽出した染色体ＤＮＡに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は他の増幅アッセイにより、（ｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）、（ｉｉ）ヒトＮＯＸＡ遺伝子、又は（ｉｉｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）とヒトＮＯＸＡ遺伝子における少なくとも１カ所の突然変異の有無を検出するための核酸アッセイ法を提供する。これらのフォーマットのいずれかでペプチド核酸等の核酸の合成アナログを使用するアッセイを使用することもできる。
【０２４４】
本発明のアッセイは治療応答を予測する目的と、倍数性誘導剤療法、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤療法又は倍数性誘導剤とＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤の併用療法に対する患者応答をモニターする目的で、（ｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）、（ｉｉ）ヒトＮＯＸＡ遺伝子、又は（ｉｉｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）とヒトＮＯＸＡ遺伝子における少なくとも１カ所の突然変異を同定するために使用される。応答予測アッセイは（倍数性を誘導するために）少なくとも１種の倍数性誘導剤の投与前又は倍数性の誘導後で少なくとも１種のＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤の投与前に実施することができ、（ｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）、（ｉｉ）ヒトＮＯＸＡ遺伝子、又は（ｉｉｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）とヒトＮＯＸＡ遺伝子に少なくとも１カ所の突然変異を示さないか又は示す徴候のない患者は倍数性誘導剤、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤又は倍数性誘導剤とＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤の併用による療法に適格であるとみなされる。
【０２４５】
患者応答をモニターするには、治療の開始時（即ち少なくとも１種の倍数性誘導剤の投与時又は少なくとも１種の倍数性誘導剤の投与後で少なくとも１種のＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤の投与前）にアッセイを実施し、組織サンプルにおける突然変異の基線レベル（例えば、サンプル中で少なくとも１カ所の突然変異を示す合計細胞の百分率又は細胞数）を設定する。次に同一組織をサンプリングし、アッセイした後、突然変異量又は数を基線又は所定レベルと比較する。突然変異数が同一であるか又は減少している場合には、治療は有効である可能性が高く、持続することができる。基線レベルに対して突然変異の有意増加が生じる場合には、患者は倍数性誘導剤療法、Ｂｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤療法又は倍数性誘導剤療法とＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤療法の併用の持続に対して応答していないか、又は耐性を生じている可能性がある。
【０２４６】
本発明のアッセイは、限定されないが、聴神経腫瘍、急性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病（単球性、骨髄芽球性、腺癌、血管肉腫、星状細胞腫、骨髄単球性及び前骨髄球性）、急性Ｔ細胞白血病、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、気管支原性癌、子宮頸癌、軟骨肉腫、脊索腫、絨毛癌、慢性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、結腸・直腸癌、頭蓋咽頭腫、嚢胞腺癌、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、増殖異常変化（異形成及び化生）、胎児癌、子宮内膜癌、内皮肉腫、上衣腫、上皮癌、赤白血病、食道癌、エストロゲン受容体陽性乳癌、本態性血小板血症、ユーイング腫瘍、線維肉腫、濾胞性リンパ腫、胚細胞性精巣癌、神経膠腫、重鎖病、血管芽腫、肝臓癌、肝細胞癌、ホルモン非感受性前立腺癌、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、肺癌、リンパ管内皮細胞肉腫、リンパ管肉腫、リンパ芽球性白血病、リンパ腫（ホジキン及び非ホジキン）、膀胱、乳房、結腸、肺、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚及び子宮の悪性腫瘍及び過剰増殖疾患、Ｔ細胞又はＢ細胞性悪性リンパ腫、白血病、リンパ腫、髄様癌、髄芽腫、メラノーマ、髄膜腫、中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄性白血病、骨髄腫、粘液肉腫、神経芽腫、非小細胞肺癌、乏突起膠腫、口腔癌、骨原性肉腫、卵巣癌、膵臓癌、乳頭腺癌、乳頭癌、松果体腫、真性多血症、前立腺癌、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、脂腺癌、セミノーマ、小細胞肺癌、充実性腫瘍（癌及び肉腫）、小細胞肺癌、扁平上皮癌、滑膜腫、汗腺癌、ワルデンストローム型マクログロブリン血症、精巣癌、子宮癌並びにウィルムス腫瘍（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２０００，６０，６１０１−１０）等の癌に罹患している患者から得られた試験サンプルで使用することができる。
【０２４７】
本発明のアッセイは任意型の試験サンプル（例えば任意型の患者組織サンプル）又はその誘導体で実施され、末梢血、腫瘍組織又は腫瘍の疑いのある組織（新鮮凍結組織及び固定パラフィン包埋組織を含む）、単離細胞（例えば血液サンプル中で分離又は同定された循環上皮細胞）、リンパ節組織、骨髄及び細針吸引液が挙げられる。
【０２４８】
本発明はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）プローブもしくは蛋白質核酸（ＰＮＡ）プローブ等の検出可能に標識された核酸プローブ又は特定染色体標的とハイブリダイズするように設計／選択された未標識プライマーを使用したハイブリダイゼーションアッセイによるゲノムバイオマーカーの検出を含む。未標識プライマーはプライマー結合後にポリメラーゼが次の検出のために標的核酸配列を増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の増幅アッセイで使用される。ＰＣＲ又は他の増幅アッセイで使用される検出プローブは好ましくは蛍光プローブであり、より好ましくは「リアルタイムＰＣＲ」で有用な検出プローブである。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用蛍光ラベルも好ましいが、ハイブリダイゼーション技術で広く使用されている他の検出可能なラベル（例えば酵素、発色物質及び同位体ラベル）も使用できる。有用なプローブ標識技術は文献に記載されている（その開示内容を本願に援用するＦａｎ，Ｙ．−Ｓ．２００２．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ：ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．ｘｉｖ，ｐ．４１１）。マイクロアレイ分析によるゲノムバイオマーカーの検出では、これらのプローブ標識技術を適用し、患者サンプルから抽出した染色体ＤＮＡを標識した後に、マイクロアレイにハイブリダイズさせる。
【０２４９】
好ましくは、（ｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）、（ｉｉ）ヒトＮＯＸＡ遺伝子、又は（ｉｉｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）とヒトＮＯＸＡ遺伝子における少なくとも１カ所の突然変異の有無を検出するためにｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用する。少なくとも１カ所の突然変異の有無を検出する典型的な遺伝子はヒトＢＡＸ遺伝子、ヒトＢＡＫ遺伝子、ヒトＮＯＸＡ遺伝子及びその任意組合せである。当業者は当分野の日常的技術を使用するか、あるいはＢＡＸ、ＢＡＫ及びＮＯＸＡ遺伝子の発現の検出及び／又は判定用市販キット（例えばＴＡＱＭＡＮ（登録商標）遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ））で入手可能なプローブ等のプローブを使用してプライマーとプローブを作製することができる。使用することができるＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製品ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）遺伝子発現アッセイの例を下表３に示す。
【０２５０】
【表５】
2013512911.tif 000021
【０２５１】
本発明のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法で使用されるプローブは主に２分類に分けられ、一方は染色体計数プローブ、即ちある染色体領域、通常では反復配列領域とハイブリダイズし、染色体全体の有無を指示するプローブであり、他方は遺伝子座特異的プローブ、即ち染色体上の特定遺伝子座とハイブリダイズし、特定遺伝子座の有無を検出するプローブである。染色体アームプローブ、即ちある染色体領域とハイブリダイズし、特定染色体のアームの有無を指示するプローブを使用することもできる。例えばヒトＢＡＸ、ＢＡＫ及びＮＯＸＡ遺伝子座の１個以上等の調査対象遺伝子座におけるユニークな染色体ＤＮＡ配列の変化を検出することができる遺伝子座特異的プローブを使用することが好ましい。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用のユニークな配列プローブの使用方法はその開示内容を本願に援用する米国特許第５，４４７，８４１号に記載されている。
【０２５２】
染色体計数プローブはセントロメアの近く又は遠くに位置する反復配列とハイブリダイズすることもできるし、染色体上の任意位置に位置するユニークな配列とハイブリダイズすることもできる。例えば、染色体計数プローブは染色体のセントロメアに結び付けられる反復ＤＮＡとハイブリダイズすることができる。霊長類染色体のセントロメアは約１７１塩基対のモノマー反復長から構成される長いＤＮＡタンデムリピート（αサテライトＤＮＡと言う）の複雑なファミリーを含む。染色体１４及び１８の各々に対するセントロメア蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプローブはＡｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ，ＩＬ）から市販されている。
【０２５３】
特に有用なｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプローブは本願に援用する米国特許第５，４９１，２２４号に記載されているような直接標識蛍光プローブである。米国特許第５，４９１，２２４号は２個以上の蛍光標識プローブを使用する同時ＦＩＳＨアッセイも記載している。
【０２５４】
有用な遺伝子座特異的プローブはどのように作製してもよく、一般に約１０，０００〜約１，０００，０００塩基長の染色体ＤＮＡ標的配列とハイブリダイズするための配列を含む。好ましくは、プローブは標的遺伝子座における少なくとも１００，０００塩基長〜５００，０００塩基長の染色体ＤＮＡ標的配列とハイブリダイズし、更に、プローブの非特異的結合を避けるために、その内容を本願に援用する米国特許第５，７５６，６９６号に開示されているように、プローブミックス中に未標識ブロッキング核酸も含む。ブロッキング核酸として未標識合成オリゴマー核酸又はペプチド核酸を使用することも可能である。特定の遺伝子座を標的とするために、プローブは遺伝子の全長にまたがる核酸配列を含み、従って、遺伝子の完全なゲノムをコードする遺伝子座の両側とハイブリダイズすることが好ましい。プローブはＢａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ（ＢＡＣ’ｓ）等のヒトＤＮＡ含有クローンから出発して作製することができる。ヒトゲノムのＢＡＣライブラリーはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手可能であり、有用なクローンを同定するために調査することができる。標的遺伝子座におけるＤＮＡ配列を同定するにはカリフォルニア大学サンタクルーズ校Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒを使用することが好ましい。その後、これらのＤＮＡ配列を使用してＰＣプライマーを合成し、ＢＡＣライブラリーをスクリーニングして有用なクローンを同定することができる。その後、クローンを従来のニック翻訳法により標識し、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプローブとして試験することができる。
【０２５５】
本願に記載するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法で使用することができるフルオロフォアの例は、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）；Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；５−（及び−６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン；リサミンローダミンＢ；５−（及び−６）−カルボキシフルオレセイン；フルオレセイン−５−イソチオシアナート（ＦＩＴＣ）；７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボン酸；テトラメチルローダミン−５−（及び−６）−イソチオシアナート；５−（及び−６）−カルボキシテトラメチルローダミン；７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸；６−［フルオレセイン−５−（及び−６）−カルボキサミド］ヘキサン酸；Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−３−インダセンプロピオン酸；エオシン−５−イソチオシアナート；エリスロシン−５−イソチオシアナート；５−（及び−６）−カルボキシローダミン６Ｇ；及びＣａｓｃａｄｅ（登録商標）ブルーアセチルアジド（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのブランドであるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）である。
【０２５６】
蛍光顕微鏡と各フルオロフォアに適したフィルター、又は複数のフルオロフォアを観察するためのデュアルもしくはトリプルバンドパスフィルターセットを使用してプローブを観察することができる。例えば、その開示内容を本願に援用する米国特許第５，７７６，６８８号参照。ハイブリダイズしたプローブを可視化するためには任意の適切な顕微鏡撮影法を使用することができ、自動デジタル撮影システムが挙げられる。あるいは、フローサイトメトリー等の技術を使用して染色体プローブのハイブリダイゼーションパターンを試験することもできる。
【０２５７】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる細胞毎の遺伝子増幅解析が好ましいが、定量的ＰＣＲによりゲノムバイオマーカーを検出することもできる。この態様では、ＤＮＡを組織サンプルから抽出後、（ｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）、（ｉｉ）ヒトＢＨ３をコードする遺伝子（例えばヒトＢＩＤ遺伝子、ヒトＮＯＸＡ遺伝子、ヒトＰＵＭＡ遺伝子、ヒトＢＩＫ遺伝子、ヒトＢＩＭ遺伝子及びヒトＢＡＤ遺伝子）、又は（ｉｉｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）と、ヒトＢＨ３をコードする遺伝子（例えばヒトＢＩＤ遺伝子、ヒトＮＯＸＡ遺伝子、ヒトＰＵＭＡ遺伝子、ヒトＢＩＫ遺伝子、ヒトＢＩＭ遺伝子及びヒトＢＡＤ遺伝子）の少なくとも１種に特異的な１対のプライマーを使用してＰＣＲにより増幅するか、あるいは複数対のプライマーを使用して多重ＰＣＲにより増幅する。バイオマーカーには任意のプライマー配列を使用することができる。使用することができるプライマーの例を下表４に示す。その後、参照増幅標準との比較により少なくとも１カ所の突然変異の存在を調べる。
【０２５８】
【表６】
2013512911.tif 000022
【０２５９】
マイクロアレイによるコピー数解析も使用できる。この態様では、複数の固定化未標識核酸プローブを基板上に基板表面積１平方センチメートル当たり数百万個までのプローブ密度で配列したマイクロアレイとのハイブリダイゼーションのために抽出後の染色体ＤＮＡを標識する。複数のマイクロアレイフォーマットが存在しており、本発明ではこれらのいずれを使用してもよい。使用することができるマイクロアレイの例は、各々Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡの市販品であるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍａｐｐｉｎｇ  １００Ｋ  Ｓｅｔ  ＳＮＰ  Ａｒｒａｙ（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｖｅｒ  １００，０００  ＳＮＰｓ  ｏｎ  ａ  ｐａｉｒ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ，”Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１：１０９−１１（２００４）参照）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍａｐｐｉｎｇ  ２５０Ｋ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（例えば、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｍａｐｐｉｎｇ  ２５０Ｋ  Ｎｓｐ  Ａｒｒａｙ又はＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｍａｐｐｉｎｇ  ２５０Ｋ  Ｓｔｙ  Ａｒｒａｙ）又はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍａｐｐｉｎｇ  ５００Ｋ  Ａｒｒａｙ  Ｓｅｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  ａＣＧＨ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ４４Ｂ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡの市販品）、Ｉｌｌｕｍｉｎａマイクロアレイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ  ａＣＧＨマイクロアレイ（Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）等である。増幅を検出するためにオリゴヌクレオチドマイクロアレイを使用する場合には、標的領域の４個以上の別個の位置にプローブ配列を配置したマイクロアレイを使用することが好ましい。マイクロアレイで使用することができるプローブの例を下表５に示す。
【０２６０】
【表７】
2013512911.tif 000023
【０２６１】
Ｅ．発現検出：ｍＲＮＡ
試験サンプル中の１以上のｍＲＮＡの量を測定することにより、（ｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）、（ｉｉ）ヒトＮＯＸＡ遺伝子、又は（ｉｉｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）とヒトＮＯＸＡ遺伝子の遺伝子発現レベルを測定することができる。サンプル中のｍＲＮＡの測定方法は当分野で公知である。ｍＲＮＡレベルを測定するためには、試験サンプル中の細胞を溶解させ、当業者に周知の任意の各種方法により溶解液中又は溶解液から精製もしくは半精製したＲＮＡ中のｍＲＮＡ濃度を測定することができる。このような方法としては、検出可能に標識したＤＮＡ又はＲＮＡプローブを使用したハイブリダイゼーションアッセイ（即ちノーザンブロッティング）や、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用した定量的又は半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法が挙げられる。あるいは、例えば、組織切片又は未溶解細胞懸濁液と、検出可能に標識した（例えば蛍光又は酵素標識した）ＤＮＡ又はＲＮＡプローブを使用して定量的又は半定量的ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイを実施することもできる。他のｍＲＮＡ定量法としては、ＲＮＡプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）、ｃＤＮＡ及びオリゴヌクレオチドマイクロアレイ、発現差解析法（ＲＤＡ）、ディファレンシャルディスプレイ法、ＥＳＴ配列解析法並びに逐次遺伝子発現解析法（ＳＡＧＥ）が挙げられる。
【０２６２】
適切な態様では、試験サンプル中で（ｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）、（ｉｉ）ヒトＮＯＸＡ遺伝子、又は（ｉｉｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）とヒトＮＯＸＡ遺伝子における少なくとも１カ所の突然変異を検出するためにＰＣＲ増幅を使用する。要約すると、ＰＣＲでは、例えば（ｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）、（ｉｉ）ヒトＮＯＸＡ遺伝子、又は（ｉｉｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）とヒトＮＯＸＡ遺伝子の配列を含むマーカー配列の対向する相補鎖上の領域に相補的な２個のプライマー配列を作製する。過剰のデオキシヌクレオチド三リン酸をＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑポリメラーゼ）と共に反応混合物に加える。標的配列がサンプル中に存在するならば、プライマーはこの配列と結合し、ポリメラーゼはヌクレオチドを付加することによりプライマーをマーカー配列に沿って伸長させる。反応混合物の温度を増減することにより、伸長したプライマーはマーカーから解離して反応産物を形成し、過剰のプライマーはマーカーと反応産物に結合し、このプロセスの反復により増幅産物が得られる。ｍＲＮＡの増幅量を定量するためには逆転写酵素ＰＣＲ増幅法を実施することができる。
【０２６３】
（ｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）、（ｉｉ）ヒトＮＯＸＡ遺伝子、又は（ｉｉｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）とヒトＮＯＸＡ遺伝子の任意の適切なフラグメントを増幅し、検出することができる。効率的なＰＣＲ用プライマーを設計することは当業者がなし得る範囲内である。通例では、検出用増幅フラグメントは約５０〜３００ヌクレオチド長である。
【０２６４】
増幅産物は数種の方法により検出することができる。サンプルをゲル電気泳動後にＤＮＡ結合色素（例えば臭化エチジウム）で染色することにより増幅産物を可視化することができる。あるいは、増幅産物を放射性又は蛍光ヌクレオチドで一体的に標識した後、Ｘ線フィルムを使用するか又は適切な刺激スペクトル下で可視化することができる。
【０２６５】
「リアルタイム」法を使用して増幅をモニターすることもできる。リアルタイムＰＣＲは核酸標的の検出と定量を可能にする。通例では、この定量的ＰＣＲのアプローチは２本鎖特異的色素であり得る蛍光色素（例えばＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ（登録商標））を利用する。あるいは、他の蛍光色素（例えばＦＡＭやＨＥＸ）をオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーに共役してもよい。リアルタイムＰＣＲを実施することが可能な各種機器が当分野で公知であり、例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）システム（Ｒｏｃｈｅ）が挙げられる。ＰＣＲの各サイクルで発生される蛍光シグナルはＰＣＲ産物の量に比例する。サイクル数に対する蛍光量のプロットを使用して増幅反応速度をグラフに表し、蛍光閾値レベルを使用して初期鋳型濃度に対するサイクル数の比を求める。熱サイクリング中に蛍光量を読取ることが可能な機器で増幅を実施・検出する場合には、融点測定を使用して非特異的ＰＣＲ産物から目的のＰＣＲ産物を区別することができる。増幅及びシグナル発生後の反応温度を漸増しながら蛍光変化を測定することにより、目的産物のＴｍと非特異的産物のＴｍを求めることが可能である。
【０２６６】
上記方法はサンプル中の複数の核酸を増幅する方法（「多重検出」又は「多重化」とも呼ばれる）を含むことができる。「多重ＰＣＲ」とは、１以上の標的遺伝子マーカーに由来する核酸を含む複数の核酸を検出・定量するために２セット以上のＰＣＲプライマーを反応に加えるＰＣＲを意味する。更に、内部対照（例えば１８Ｓ  ｒＲＮＡ、ＧＡＤＰＨ又はアクチン）を加えて多重化すると、無反応ＰＣＲの対照が得られる。
【０２６７】
Ｆ．サンプル処理及びアッセイ性能
先述したように、本発明の試験サンプルは組織サンプルとすることができる。本発明の方法によりアッセイする組織サンプルは任意型のサンプルを含むことができ、末梢血サンプル、腫瘍組織もしくは腫瘍の疑いのある組織、薄層細胞診サンプル、細針吸引サンプル、骨髄サンプル、リンパ節サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄液サンプル、食道ブラシ擦過サンプル、膀胱もしくは肺洗浄液サンプル、髄液サンプル、脳水サンプル、管吸引サンプル、乳頭分泌物サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結組織サンプル、パラフィン包埋組織サンプル又は末梢血サンプル、腫瘍組織もしくは腫瘍の疑いのある組織、薄層細胞診サンプル、細針吸引サンプル、骨髄サンプル、リンパ節サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄液サンプル、食道ブラシ擦過サンプル、膀胱もしくは肺洗浄液サンプル、髄液サンプル、脳水サンプル、管吸引サンプル、乳頭分泌物サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結組織サンプルもしくはパラフィン包埋組織サンプルのいずれかから作製された抽出液もしくは処理サンプルが挙げられる。例えば、先ず患者末梢血サンプルを処理して上皮細胞集団を抽出後、この抽出液をアッセイすることができる。腫瘍の疑いのある細胞を多量に含む細胞サンプルを得るために組織サンプルの顕微解剖も使用できる。本願で使用するのに好ましい組織サンプルは末梢血、腫瘍組織又は腫瘍の疑いのある組織（細針吸引液、新鮮凍結組織及びパラフィン包埋組織を含む）、及び骨髄である。
【０２６８】
組織サンプルはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション又は他の核酸アッセイを実施するために任意の望ましい方法により処理することができる。好ましいｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイでは、パラフィン包埋腫瘍組織サンプル又は骨髄サンプルを顕微鏡ガラススライドに固定し、溶媒（典型的にはキシレン）で脱パラフィンする。組織脱パラフィン及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの有用なプロトコルはＡｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｃ．（Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）から入手可能である。本発明のアッセイの実施には任意の適切な機器又は自動化を使用することができる。ＰＣＲアッセイはｍ２０００機器システム（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ，ＩＬ）で実施することができる。好ましい蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイには自動撮影法を使用することができる。
【０２６９】
１態様において、サンプルは（ｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）、（ｉｉ）ヒトＮＯＸＡ遺伝子、又は（ｉｉｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）とヒトＮＯＸＡ遺伝子における少なくとも１カ所の突然変異の有無について試験しようとする循環腫瘍又は癌細胞の抽出液を作製するように処理される患者由来末梢血サンプルを含む。循環腫瘍細胞はＩｍｍｕｎｉｃｏｎ（Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ  Ｖａｌｌｅｙ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）から入手可能な技術等の免疫磁気分離技術により分離することができる。循環腫瘍細胞について少なくとも１カ所の突然変異を判定後、先の時点（例えば治療開始時）に１カ所以上の突然変異の有無を判定した循環腫瘍細胞の基線レベル又は所定レベルと比較する。少なくとも１カ所の突然変異が基線レベル又は所定レベルに比較して増加又は存在しているならば、治療に失敗したと判断することができる。
【０２７０】
試験サンプルは臨床診断に十分な任意数の細胞を含むことができ、通例では少なくとも約１００個の細胞を含む。典型的なＦＩＳＨアッセイでは、約２５〜１，０００個の細胞でハイブリダイゼーションパターンを評価する。試験サンプルがサンプルの十分な比率で遺伝子増幅を含むと認められた場合には通例では「試験陽性」とみなす。少なくとも１カ所の突然変異を含むと判定され、特定サンプルを陽性に分類するために使用される細胞の数は一般にサンプル中の細胞数と共に変動する。陽性分類に使用される細胞数はカットオフ値とも呼ばれる。測定に使用することができるカットオフ値の例としては、細胞約５個、２５個、５０個、１００個及び２５０個、又はサンプル集団中の細胞の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％及び６０％が挙げられる。サンプルを陽性に分類するために細胞１個でも十分な場合もある。典型的なパラフィン包埋組織サンプルでは、少なくとも１カ所の突然変異の有無について少なくとも３０個の細胞を陽性と判定することが好ましく、少なくとも２０個の細胞を陽性と判定することがより好ましい。例えば、組織を陽性で治療に適格であると分類するためには典型的なパラフィン包埋結腸・直腸癌で３０個の細胞を検出すれば十分であると思われる。
【０２７１】
Ｇ．キット
本発明は各種キットにも関する。１側面において、キットは少なくとも以下の２種類の治療剤、即ち（１）少なくとも倍数性誘導剤と；（２）少なくとも１種のＢｃｌ−２ファミリー蛋白質阻害剤を含む。更に、キットは場合により使用説明書、即ち治療を必要とする癌罹患患者に前記少なくとも２種類の治療剤を投与するための説明書を含むことができる。これらの説明書は紙形態又はディスク、ＣＤ、ＤＶＤ等のコンピュータ読取り可能な形態で提供することができる。
【０２７２】
別の側面において、本発明のキットは試験サンプル中の（ｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）、（ｉｉ）ヒトＮＯＸＡ遺伝子、又は（ｉｉｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）とヒトＮＯＸＡ遺伝子における少なくとも１カ所の突然変異の有無の検出用キットである。前記キットを使用して少なくとも１カ所の突然変異の有無を検出する典型的な遺伝子はヒトＢＡＸ遺伝子、ヒトＢＡＫ遺伝子、ヒトＮＯＸＡ遺伝子及びその任意組合せである。このようなキットは上記少なくとも１カ所の突然変異の有無を判定するための１種以上の試薬を含むことができる。例えば、前記キットは１個以上の核酸プローブを含むことができる。プローブの代わりに、又はプローブに加えて、キットは１個以上の核酸プライマーを含むことができる。
【０２７３】
従って、本発明は本願に記載する１個以上の核酸プライマー、核酸プローブ又は核酸プライマーと核酸プローブを含む診断及び品質管理用キットも提供する。場合により、本発明のアッセイ、キット及びキットコンポーネントを市販プラットフォーム用に最適化することができる（例えばＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬのＰＲＩＳＭ（登録商標）、ＡｘＳＹＭ（登録商標）、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）及びＥＩＡ（ビーズ）プラットフォームでのイムノアッセイ、並びに他の市販及び／又はインビトロ診断アッセイ）。更に、アッセイ、キット及びキットコンポーネントを他のフォーマット、例えば電気化学的又は他の携帯型もしくはポイントオブケアアッセイシステムで利用することもできる。本発明は例えば、ＴｎＩ、ＣＫＭＢ及びＢＮＰを含む数種の心臓マーカーについてサンドイッチイムノアッセイを実施する市販Ａｂｂｏｔｔポイントオブケア（ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標），Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）電気化学的イムノアッセイシステムに適用可能である。イムノセンサーと使い捨て試験装置におけるその操作方法は例えば、本願に援用する米国特許出願公開第２００３／０１７０８８１号、２００４／００１８５７７号、２００５／００５４０７８号及び２００６／０１６０１６４号に記載されている。電気化学的及び他の型のイムノセンサーの製造に関する他の背景技術はこの点に関するその教示について同様に本願に援用する米国特許第５，０６３，０８１号に記載されている。
【０２７４】
場合により、キットは品質管理用試薬（例えば感受性パネル、キャリブレーター及び陽性対照）を含む。品質管理用試薬の調製は当分野で周知であり、例えば各種免疫診断製品の添付シートに記載されている。
【０２７５】
キットはフルオロフォア、放射性部分、酵素、ビオチン／アビジンラベル、クロモフォア、化学発光ラベル等の検出可能なラベルを含むことができ、あるいは、キットは本願に記載するように少なくとも１カ所の突然変異の有無を検出するための核酸プライマー、核酸プローブ又は核酸プライマーと核酸プローブを標識するための試薬を含むことができる。プライマー及び／又はプローブ、キャリブレーター及び／又は対照は別々の容器で提供することもできるし、適切なアッセイフォーマット（例えばマイクロタイタープレート）に予め分配することもできる。
【０２７６】
キットは場合により診断アッセイを実施するため、又は品質管理評価を助長するために必要な他の試薬（例えば緩衝液、塩、酵素、酵素補因子、基質、検出試薬等）を含むことができる。試験サンプルの単離及び／又は処理用緩衝液及び溶液（例えば前処理用試薬）等の他のコンポーネントもキットに加えてもよい。キットは更に１種以上の他の対照を含んでいてもよい。キットのコンポーネントの１個以上を凍結乾燥してもよく、キットは更に、凍結乾燥コンポーネントの再構成に適した試薬を含んでいてもよい。
【０２７７】
キットの各種コンポーネントは場合により適切な容器に入れて提供される。上記のように、容器の１個以上はマイクロタイタープレートでもよい。キットは更にサンプルを保持又は保存するための容器（例えば血液又は尿サンプル用容器又はカートリッジ）を含むことができる。必要に応じて、キットは更に場合により反応容器、混合容器及び試薬又は試験サンプルの調製を容易にする他のコンポーネントを含んでいてもよい。キットは更に、試験サンプルを採取し易くするための１個以上の器具（例えばシリンジ、ピペット、ピンセット、計量スプーン等）を含んでいてもよい。
【０２７８】
キットは更に、場合により、紙形態又はディスク、ＣＤ、ＤＶＤ等のコンピュータ読取り可能な形態で提供され得る説明書を含むことができる。
【０２７９】
Ｈ．キットの適応
本願に記載するコンポーネント及び方法を使用して（ｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）、（ｉｉ）ヒトＮＯＸＡ遺伝子、又は（ｉｉｉ）アポトーシス促進性ヒトＢｃｌ−２をコードする遺伝子（例えばヒトＢＡＸ遺伝子及びヒトＢＡＫ遺伝子）とヒトＮＯＸＡ遺伝子における少なくとも１カ所の突然変異の有無を判定するキット（又はそのコンポーネント）及び方法は、例えば米国特許第５，０８９，４２４号及び５，００６，３０９号に記載され、例えばＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）からＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）として市販されているような各種自動及び半自動システム（固相が微粒子からなるものを含む）で使用するように適応させることができる。
【０２８０】
自動又は半自動システムと非自動システム（例えばＥＬＩＳＡ）の相違をいくつか挙げると、第１の特異的結合パートナー（例えば捕捉抗体）を固定化する（サンドイッチ形成と検体反応性に影響を与える可能性のある）基質、並びに捕捉工程、検出工程及び／又は実施する場合には洗浄工程の時間とタイミングが挙げられる。ＥＬＩＳＡ等の非自動フォーマットはサンプル及び捕捉試薬の存在下で比較的長いインキュベーション時間（例えば約２時間）を必要とする場合があるが、自動又は半自動フォーマット（例えばＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標），Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）はインキュベーション時間を比較的短くすることがてきる（例えばＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）では約１８分間）。同様に、ＥＬＩＳＡ等の非自動フォーマットはコンジュゲート試薬等の検出抗体を比較的長いインキュベーション時間（例えば約２時間）インキュベートする場合があるが、自動又は半自動フォーマット（例えばＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標））ではインキュベーション時間を比較的短くすることができる（例えばＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）では約４分間）。
【０２８１】
Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから市販されている他のプラットフォームとしては、限定されないが、ＡｘＳＹＭ（登録商標）、ＩＭｘ（登録商標）（例えばその開示内容全体を本願に援用する米国特許第５，２９４，４０４号参照）、ＰＲＩＳＭ（登録商標）、ＥＩＡ（ビーズ）及びＱｕａｎｔｕｍ（登録商標）ＩＩ、並びに他のプラットフォームが挙げられる。更に、アッセイ、キット及びキットコンポーネントを他のフォーマット、例えば電気化学的又は他の携帯型もしくはポイントオブケアアッセイシステムで利用することもできる。本発明は例えば、サンドイッチイムノアッセイを実施する市販Ａｂｂｏｔｔポイントオブケア（ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標），Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）電気化学的イムノアッセイシステムに適用可能である。イムノセンサーとその製造方法及び使い捨て試験装置におけるその操作方法は例えば、この点に関する教示についてその開示内容全体を本願に援用する米国特許第５，０６３，０８１号、米国特許出願公開第２００３／０１７０８８１号、２００４／００１８５７７号、２００５／００５４０７８号及び２００６／０１６０１６４号に記載されている。
【０２８２】
更に言うまでもなく、本願に記載する方法及びキットはアッセイを実施するための他の試薬及び方法を必然的に包含する。例えば、当分野で公知及び／又は容易に製造可能もしくは利用に合わせて最適化可能なもの等の各種緩衝液を包含する。
【０２８３】
以下、本発明の手順及び概念的側面の最も有用で理解し易い説明と考えられるものを提供するために実施例を記載する。
【実施例】
【０２８４】
（実施例１Ａ）
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８６，１０８，４９４３−４９５２に記載されているように製造した３−（Ｒ）−（（カルボベンジルオキシ）アミノ）−γ−ブチロラクトン（６２ｇ）とモルホリン（４６ｍＬ）をジオキサン（７００ｍＬ）中で６５℃にて２４時間撹拌し、冷却し、濃縮した。濃縮液をシリカゲルクロマトグラフィー（１０％メタノール／酢酸エチル）に供した。
【０２８５】
（実施例１Ｂ）
実施例１Ａ（１６．５ｇ）と、ジフェニルジスルフィド（１４．５ｇ）と、トリブチルホスフィン（１６．６ｍＬ）をトルエン（２５０ｍＬ）中で８０℃にて２４時間撹拌し、冷却し、濃縮した。濃縮液をシリカゲルクロマトグラフィー（１：１酢酸エチル／ヘキサン）に供した。
【０２８６】
（実施例１Ｃ）
実施例１Ｂ（１８ｇ）を３０％  ＨＢｒの酢酸（２５０ｍＬ）溶液中で２５℃にて２４時間撹拌し、濃縮し、１Ｍ  ＨＣｌに注ぎ、ジエチルエーテルで抽出した。抽出液を１Ｍ  ＨＣｌで抽出し、この抽出液を０℃まで冷却し、ＫＯＨでｐＨ１２に調整し、ジクロロメタンで抽出した。抽出液をブラインで洗浄し、脱水し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮した。
【０２８７】
（実施例１Ｄ）
実施例１Ｃ（４５．４ｇ）をＴＨＦ（５００ｍＬ）中で５５℃にて１Ｍ  ＢＨ３・ＴＨＦ（６５０ｍＬ）で２時間処理し、２４時間撹拌し、０℃まで冷却し、メタノール（８０ｍＬ）で処理し、メタノール（５００ｍＬ）に注ぎ、濃縮した。濃縮液をメタノール（４００ｍＬ）に加えた混合物をＨＣｌ−飽和メタノール（８００ｍＬ）で処理し、２４時間還流し、冷却し、濃縮し、２Ｍ  ＮａＯＨに注ぎ、酢酸エチルで抽出した。抽出液を１Ｍ  ＮａＯＨとブラインで洗浄し、脱水し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮した。濃縮液をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル１０％メタノール／酢酸エチル及び１０％メタノール／１０％アセトニトリル／５％  ＴＥＡ／７５％酢酸エチル）に供した。
【０２８８】
（実施例１Ｅ）
メチルビオロゲン塩酸塩（１．１７ｇ）をＤＭＦ（８０ｍＬ）中で２５℃にてヨウ化トリフルオロメチルで飽和させ、２−フルオロベンゼンチオール（９．７ｍＬ）とＴＥＡ（２０ｍＬ）で処理し、２４時間撹拌し、水（２４０ｍＬ）で希釈し、ジエチルエーテルで抽出した。抽出液を１Ｍ  ＮａＯＨと飽和塩化アンモニウムとブラインで洗浄し、濃縮した。
【０２８９】
（実施例１Ｆ）
実施例１Ｅ（１７．３４６ｇ）を１：１：２四塩化炭素／アセトニトリル／水（８００ｍＬ）中で２５℃にて過ヨウ素酸ナトリウム（５６．８ｇ）と塩化ルテニウム（ＩＩＩ）水和物（１８３ｍｇ）で処理し、１８時間撹拌し、ジクロロメタン（１００ｍＬ）で希釈し、珪藻土（Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標））で濾過した。濾液を飽和重炭酸ナトリウムで洗浄し、ジクロロメタンで抽出した。濾液をブラインで洗浄し、脱水し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮した。濃縮液をシリカゲルで濾過した。
【０２９０】
（実施例１Ｇ）
実施例１Ｆ（３７．３ｇ）をクロロスルホン酸（３２．８ｍＬ）中で１２０℃にて１８時間撹拌し、２５℃まで冷却し、砕氷上にピペットで注いだ。混合物を酢酸エチルで抽出し、抽出液を水とブラインで洗浄し、脱水し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮した。
【０２９１】
（実施例１Ｈ）
実施例１Ｇ（２３ｇ）をイソプロパノール（７０６ｍＬ）中で−７８℃にて水酸化アンモニウム（９８ｍＬ）で１時間処理し、１時間撹拌し、６Ｍ  ＨＣｌ（３５３ｍＬ）でクエンチし、２５℃まで昇温し、濃縮した。濃縮液を水と混合し、酢酸エチルで抽出した。抽出液を脱水し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮した。濃縮液を酢酸エチル／ヘキサンから再結晶させた。
【０２９２】
（実施例１Ｉ）
実施例１Ｈ（１３．４８ｇ）と実施例１Ｄ（１１．５６ｇ）をＴＨＦ（２１８ｍＬ）中、ＤＩＥＡ（１５．１ｍＬ）で処理し、５０℃にて４時間撹拌し、冷却し、飽和重炭酸ナトリウムで処理し、酢酸エチルで抽出した。抽出液を脱水し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮した。濃縮液をヘキサン／酢酸エチルから再結晶させた。
【０２９３】
（実施例１Ｊ）
ＤＭＦ（１０ｍＬ）とクロロホルム（８０ｍＬ）を３℃にてＰＢｒ３（１２ｍＬ）で処理し、２０分間２５℃にて撹拌し、クロロホルム（５０ｍＬ）中で４，４−ジメチルシクロヘキサノン（７．１５ｇ）で処理し、１８時間撹拌し、氷上に注ぎ、固体重炭酸ナトリウムで中和し、ジエチルエーテルで抽出した。抽出液をブラインで洗浄し、脱水し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮した。濃縮液をシリカゲルクロマトグラフィー（０−１０％酢酸エチル／ヘキサン）に供した。
【０２９４】
（実施例１Ｋ）
実施例１Ｊ（１．７ｇ）と４−ピペラジン−１−イル安息香酸エチルエステル（１．９ｇ）をメタノール（３０ｍＬ）中、固体シアノ水素化ホウ素ナトリウム（０．６ｇ）で処理し、酢酸でｐＨ５に調整し、１８時間撹拌し、珪藻土（Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標））で濾過した。濾液を濃縮し、濃縮液をシリカゲルクロマトグラフィー（１０−３０％酢酸エチル／ヘキサン）に供した。
【０２９５】
（実施例１Ｌ）
実施例１Ｋ（１．１ｇ）と、４−クロロフェニルボロン酸（０．６ｇ）と、２Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３（２ｍＬ）と、ＰｄＣｌ２（ＰＰｈ３）２（０．１ｇ）を７：３：２  ＤＭＥ／水／エタノール（２０ｍＬ）中で８５℃にて１８時間撹拌し、珪藻土（Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標））で濾過し、濃縮した。濃縮液をシリカゲルクロマトグラフィー（１０−３０％酢酸エチル／ヘキサン）に供した。
【０２９６】
（実施例１Ｍ）
実施例１Ｌ（４．５９ｇ）とＬｉＯＨ（１．２５ｇ）をジオキサン（７５ｍＬ）と水（１０ｍＬ）中で１００℃にて１８時間撹拌し、２５℃まで冷却し、濃縮した。濃縮液を水に溶解し、加熱還流し、１Ｍ  ＨＣｌ（２８．５ｍＬ）で中和し、２５℃まで冷却し、濾過し、濃縮した。
【０２９７】
（実施例１Ｎ）
実施例１Ｍ（３１．５ｇ）と、実施例１Ｉ（３９．９３ｇ）と、ＥＤＡＣ・ＨＣｌ（２０．６０ｇ）と、ＤＭＡＰ（１３．１５ｇ）をジクロロメタン（５００ｍＬ）中で２５℃にて１８時間撹拌し、ジクロロメタンで希釈し、飽和塩化アンモニウムとブラインで洗浄し、脱水し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮した。濃縮液をシリカゲルクロマトグラフィー（０−１０％メタノール／アンモニア飽和ジクロロメタン）に供した。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．１２（ｄ，１Ｈ），７．９４（ｄｄ，１Ｈ），７．７１（ｄ，２Ｈ），７．３８（ｄ，２Ｈ），７．３０（ｍ，４Ｈ），７．１８（ｍ，１Ｈ），７．１２（ｄ，２Ｈ），６．９８（ｄ，１Ｈ），６．８５（ｄ，３Ｈ），４．０７（ｍ，１Ｈ），３．５３（ｂｒ，４Ｈ），３．２８（ｍ，１２Ｈ），２．４４（ｍ，８Ｈ），１．９９（ｍ，３Ｈ），１．８０（ｍ，１Ｈ），１．４４（ｔ，２Ｈ），０．９７（ｓ，６Ｈ）。
【０２９８】
（実施例２Ａ）
粉末ＮａＯＨ（３１．２ｇ）と、ＴＤＡ−１（５ｍＬ）と、２−フルオロベンゼンチオール（３３．６ｍＬ）をベンゼン（４００ｍＬ）中、クロロジフルオロメタンで飽和させ、８０℃で３０分間撹拌し、珪藻土（Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標））で濾過した。濾液を飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、水層をジエチルエーテルで抽出した。抽出液を合わせて脱水し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮した。
【０２９９】
（実施例２Ｂ）
実施例２Ａ（４６ｇ）を１：１：２  ＣＣｌ４／ＣＨ３ＣＮ／水（１．２Ｌ）中で２５℃にてＮａＩＯ４（１６５．６ｇ）とＲＵＣｌ３・ｘＨ２Ｏ（５３４ｍｇ）で処理し、１８時間撹拌し、ジクロロメタンで希釈し、珪藻土（Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標））で濾過した。濾液を飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、脱水し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮した。濃縮液をシリカゲルで濾液した。
【０３００】
（実施例２Ｃ）
実施例２Ｂ（２５ｇ）とＮＣＳ（１７．５５ｇ）をＴＨＦ（７００ｍＬ）中で−７８℃にてＬＨＭＤＳ（１７８．５ｍＬ）て１時間処理し、１時間撹拌し、塩化アンモニウムでクエンチした。混合物を酢酸エチルで抽出し、濾液をブラインで洗浄し、脱水し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮した。濃縮液をシリカゲルクロマトグラフィー（０−５％酢酸エチル／ヘキサン）に供した。
【０３０１】
（実施例２Ｄ）
実施例２Ｃ（４４ｇ）をクロロスルホン酸（３６．７ｍＬ）中で１２０℃にて１８時間撹拌した、２５℃まで冷却し、ピペットで砕氷上に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。抽出液を水とブラインで洗浄し、脱水し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮した。
【０３０２】
（実施例２Ｅ）
実施例２Ｄ（２２ｇ）をイソプロパノール（７００ｍＬ）中で−７８℃にてアンモニア水（９０ｍＬ）で１時間処理し、更に１時間撹拌し、６Ｍ  ＨＣｌ（３００ｍＬ）でクエンチし、２５℃まで昇温し、濃縮した。濃縮液を水と混合し、酢酸エチルで抽出した。抽出液を脱水し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮した。濃縮液をヘキサン／酢酸エチルから再結晶させた。
【０３０３】
（実施例２Ｆ）
実施例２Ｅ（２．８９ｇ）と実施例１Ｄ（２．３９ｇ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）中、ジイソプロピルエチルアミン（３．２ｍＬ）で処理し、６０℃にて１８時間撹拌し、冷却し、飽和重炭酸ナトリウムで処理し、酢酸エチルで抽出した。抽出液を脱水し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮した。濃縮液をシリカゲルクロマトグラフィー（メタノール／ジクロロメタン中１．５−５％  ７Ｍアンモニア）に供した。
【０３０４】
（実施例２Ｇ）
ヘキサンで洗浄した６０％油性ＮａＨ（１７ｇ）をジクロロメタン（３００ｍＬ）中、−５℃にてＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９９２），４８（２１），４４５９−６４に記載されているように製造した４，４−ジメチル−２−オキソ−シクロホキサンカルボン酸メチルエステル（５３．８９ｇ）で処理し、３０分間撹拌し、−７８℃まで冷却し、トリフルオロメタンスルホン酸無水物で処理し、２５℃まで昇温し、１８時間撹拌し、ブラインで洗浄し、脱水し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮した。
【０３０５】
（実施例２Ｈ）
実施例２Ｇ（８６ｇ）と、４−クロロフェニルボロン酸（５０ｇ）と、ＣｓＦ（１０４ｇ）と、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（２．５ｇ）を２：１  ＤＭＥ／メタノール（６００ｍＬ）中で７０℃にて１８時間撹拌し、濃縮した。濃縮液をジエチルエーテルに溶解し、溶液を脱水し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮した。２０％酢酸エチル／ヘキサンを溶媒として濃縮液をシリカゲルで濾過した。
【０３０６】
（実施例２Ｉ）
水素化ホウ素リチウム（１８ｇ）をジエチルエーテル（４００ｍＬ）とメタノール（２３ｍＬ）中、実施例２Ｈ（７６ｇ）で処理し、還流下に４時間撹拌し、冷却し、１Ｍ  ＨＣｌでクエンチし、水で希釈し、ジエチルエーテルで抽出した。抽出液を脱水し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮した。濃縮液をシリカゲルクロマトグラフィー（０−３０％酢酸エチル／ヘキサン）に供した。
【０３０７】
（実施例２Ｊ）
実施例２Ｉ（１７．５ｇ）をジクロロメタン（１００ｍＬ）中、０℃にてメタンスルホニルクロリド（５．６ｍＬ）とＴＥＡ（２１ｍＬ）で同時に処理し、５分間撹拌し、４−ピペラジン−１−イル安息香酸エチルエステル（１７ｇ）で処理し、２５℃にて１８時間撹拌し、塩化アンモニウムで洗浄し、脱水し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮した。濃縮液をシリカゲルクロマトグラフィー（１０％酢酸エチル／ヘキサン）に供した。
【０３０８】
（実施例２Ｋ）
本実施例は実施例１Ｍで実施例１Ｌの代わりに実施例２Ｊを使用することにより製造した。
【０３０９】
（実施例２Ｌ）
実施例２Ｋ（１６．９ｇ）と実施例２Ｆ（２２ｇ）をジクロロメタン（２００ｍＬ）中、２５℃にてＥＤＡＣ・ＨＣｌ（１１．０６ｇ）とＤＭＡＰ（７．０６ｇ）で処理し、１８時間撹拌し、ジクロロメタン（４００ｍＬ）で希釈し、飽和塩化アンモニウムとブラインで洗浄し、脱水し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮した。濃縮液をシリカゲルクロマトグラフィー（０−１０％メタノール／アンモニア飽和ジクロロメタン）に供した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．０７（ｄ，１Ｈ），７．９０（ｄｄ，１Ｈ），７．７１（ｄ，２Ｈ），７．３６（ｍ，４Ｈ），７．２９（ｍ，２Ｈ），７．２０（ｍ，１Ｈ），７．０９（ｄ，２Ｈ），６．８６（ｄ，１Ｈ），６．８０（ｄ，２Ｈ），６．７６（ｄ，１Ｈ），４．０２（ｍ，１Ｈ），３．５０（ｍ，４Ｈ），３．３３（ｍ，２Ｈ），３．１６（ｍ，４Ｈ），２．８１（ｓ，２Ｈ），２．２９（ｍ，１２Ｈ），１．９９（ｓ，２Ｈ），１．９４（ｍ，１Ｈ），１．７１（ｍ，１Ｈ），１．４２（ｔ，２Ｈ），０．９６（ｓ，６Ｈ）。
【０３１０】
（実施例３Ａ）
本実施例は実施例１Ｋで実施例１Ｊの代わりにＣｏｌｌｅｃｔ．Ｃｚｅｃｈ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９６１，２６，３０５９に記載されているように製造した２−ブロモシクロヘキサ−１−エンカルボアルデヒドを使用することにより製造した。
【０３１１】
（実施例３Ｂ）
本実施例は実施例１Ｌで実施例１Ｋの代わりに実施例３Ａを使用することにより製造した。
【０３１２】
（実施例３Ｃ）
本実施例は実施例１Ｍで実施例１Ｌの代わりに実施例３Ｂを使用することにより製造した。
【０３１３】
（実施例３Ｄ）
本実施例は実施例１Ｎで夫々実施例１Ｍと実施例１Ｉの代わりに実施例３Ｃと実施例２Ｆを使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．１１（ｄ，１Ｈ），７．９２（ｄｄ，１Ｈ），７．７１（ｄ，２Ｈ），７．３７（ｄ，２Ｈ），７．３４（ｍ，２Ｈ），７．２７（ｔ，２Ｈ），７．１８（ｔ，１Ｈ），７．１２（ｄ，２Ｈ），６．９４（ｄ，１Ｈ），６．８４（ｍ，３Ｈ），４．０４（ｍ，１Ｈ），３．５１（ｂｒ，４Ｈ），３．２７（ｂｒ，１０Ｈ），２．８４（ｂｒ，２Ｈ），２．３３（ｂｒ，６Ｈ），２．１８（ｂｒ，４Ｈ），１．９７（ｍ，１Ｈ），１．７６（ｍ，１Ｈ），１．６６（ｓ，４Ｈ）。
【０３１４】
（実施例４Ａ）
（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８６，１０８，４９４３−４９５２に記載されている手順に従って製造した）３−（Ｒ）−（（カルボベンジルオキシ）アミノ）−γ−ブチロラクトン（７．７２ｇ，３２．８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１００ｍＬ）溶液をジメチルアミンガスで飽和させ、室温にて１６時間撹拌し、濃縮した。ヘキサン中５０％アセトンを溶離液として残渣をシリカゲルプラグで濾過し、所望の生成物を得た。
【０３１５】
（実施例４Ｂ）
実施例４Ａ（８．４５ｇ，３０．１４ｍｍｏｌ）のトルエン（１５ｍＬ）溶液をトリブチルホスフィン（９．７６ｍＬ，３９．２０ｍｍｏｌ）とジフェニルジスルフィド（７．３０ｇ，３９．２０ｍｍｏｌ）で処理し、８０℃まで１６時間加熱した。反応混合物を濃縮し、ヘキサン中０−５０％酢酸エチルの勾配を溶離液としてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、所望の生成物を得た。
【０３１６】
（実施例４Ｃ）
実施例４Ｂ（７．５ｇ）と水素化塩化ビス（シクロペンタジエニル）ジルコニウム（ＩＶ）（１０．３１ｇ）をＴＨＦ（１００ｍＬ）中で２５℃にて２０分間撹拌し、濃縮した。濃縮液をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中５０％酢酸エチル）に供した。
【０３１７】
（実施例４Ｄ）
実施例４Ｃ（２．８７ｇ）とＮ−イソプロピルメチルアミン（１．９２ｇ）を１，２−ジクロロエタン（５０ｍＬ）中、２５℃にてトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（３ｇ）で処理し、２時間撹拌し、酢酸エチルで希釈し、２Ｍ  ＮａＯＨ、水及びブラインで洗浄し、脱水し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮した。濃縮液をシリカゲルクロマトグラフィー（１％メタノール／ジクロロメタン）に供した。
【０３１８】
（実施例４Ｅ）
本実施例は実施例１Ｃで実施例１Ｂの代わりに実施例４Ｄを使用することにより製造した。
【０３１９】
（実施例４Ｆ）
本実施例は実施例１Ｉで実施例１Ｄの代わりに実施例４Ｅを使用することにより製造した。
【０３２０】
（実施例４Ｇ）
本実施例は実施例１Ｎで実施例１Ｉの代わりに実施例４Ｆを使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．０８（ｓ，１Ｈ），７．９８（ｄ，１Ｈ），７．７１（ｄ，２Ｈ），７．３７（ｍ，４Ｈ），７．２８（ｔ，２Ｈ），７．２０（ｔ，１Ｈ），７．１２（ｄ，２Ｈ），６．８９（ｄ，１Ｈ），６．７８（ｄ，２Ｈ），６．７０（ｄ，１Ｈ），４．０１（ｍ，１Ｈ），３．１３（ｍ，６Ｈ），２．７５（ｍ，２Ｈ），２．２８（ｍ，６Ｈ），２．０４（ｍ，４Ｈ），１．９９（ｍ，２Ｈ），１．４３（ｍ，２Ｈ），１．１２（ｍ，１０Ｈ），０．９７（ｓ，６Ｈ）。
【０３２１】
（実施例５）
本実施例は実施例１Ｎで夫々実施例１Ｍと実施例１Ｉの代わりに同一名義の米国特許出願第１０／９８８，３３８号に記載されているように製造した４−（４−（２−（４−クロロフェニル）シクロ−１−エニルメチル）ピペラジン−１−イル）安息香酸と実施例４Ｆを使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．００（ｍ，１Ｈ），８．０９（ｓ，１Ｈ），７．９８（ｄ，１Ｈ），７．７１（ｄ，２Ｈ），７．３６（ｍ，４Ｈ），７．３０（ｔ，２Ｈ），７．２０（ｔ，１Ｈ），７．０９（ｄ，２Ｈ），６．９０（ｄ，１Ｈ），６．７８（ｄ，２Ｈ），６．６５（ｄ，１Ｈ），４．００（ｍ，２Ｈ），３．１３（ｍ，４Ｈ），２．７８（ｍ，２Ｈ），２．５５（ｍ，２Ｈ），２．４０（ｍ，４Ｈ），２．３１（ｍ，４Ｈ），２．００（ｍ，３Ｈ），１．７９（ｍ，４Ｈ），１．５８（ｍ，４Ｈ），１．５１（ｍ，２Ｈ），１．１２（ｍ，６Ｈ）。
【０３２２】
（実施例６Ａ）
本実施例は実施例１Ｃで実施例１Ｂの代わりに実施例４Ｂを使用することにより製造した。
【０３２３】
（実施例６Ｂ）
実施例６Ａ（６．１３ｇ）をＴＨＦ（２００ｍＬ）中、２５℃にて二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（７ｇ）で処理し、４時間撹拌し、濃縮した。濃縮液を酢酸エチル（５００ｍＬ）に溶解し、１Ｍ  ＮａＯＨ、水及びブラインで洗浄し、脱水し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮した。濃縮液をＴＨＦ（２００ｍＬ）中、２５℃にて１Ｍ  ＮａＯＨ（２００ｍＬ）で処理し、５時間撹拌し、単離した。水層を酢酸エチルで抽出し、ＴＨＦ抽出液と酢酸エチル抽出液を合わせて水とブラインで洗浄し、脱水し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮した。
【０３２４】
（実施例６Ｃ）
本実施例は実施例４Ｃで実施例５Ｂの代わりに実施例６Ｂを使用することにより製造した。
【０３２５】
（実施例６Ｄ）
本実施例は実施例４Ｄで実施例４ＣとＮ−イソプロピルメチルアミンの代わりに実施例６Ｃと同一名義の米国特許出願第１０／９８８，３３８号に記載されているように製造した２−オキサ−５−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタンを使用することにより製造した。
【０３２６】
（実施例６Ｅ）
実施例６Ｄ（７．８６ｇ）をジクロロメタン（２００ｍＬ）中、２５℃にて２Ｍ  ＨＣｌのジエチルエーテル（２００ｍＬ）溶液で処理し、１８時間撹拌し、濃縮した。
【０３２７】
（実施例６Ｆ）
本実施例は実施例２Ｆで実施例１Ｄの代わりに実施例６Ｅを使用することにより製造した。
【０３２８】
（実施例６Ｇ）
本実施例は実施例１Ｎで実施例１Ｉと実施例１Ｍの代わりに実施例６Ｆと実施例３Ｃを使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．０７（ｓ，１Ｈ），７．９２（ｄ，１Ｈ），７．７０（ｄ，２Ｈ），７．３７（ｍ，４Ｈ），７．３０（ｔ，２Ｈ），７．２１（ｔ，１Ｈ），７．１２（ｄ，２Ｈ），６．８４（ｄ，１Ｈ），６．７９（ｄ，２Ｈ），４．２１（ｍ，１Ｈ），４．０９（ｍ，１Ｈ），４．０１（ｍ，２Ｈ），３．８２（ｍ，２Ｈ），３．４６（ｍ，１Ｈ），３．１８（ｍ，６Ｈ），２．８６（ｍ，４Ｈ），２．７５（ｍ，４Ｈ），２．２８（ｍ，２Ｈ），２．１８（ｍ，４Ｈ），１．８８（ｍ，４Ｈ），１．６６（ｍ，４Ｈ）。
【０３２９】
（実施例７）
本実施例は実施例１Ｎで実施例１Ｍの代わりに実施例３Ｃを使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．０９（ｄ，１Ｈ），７．９２（ｄｄ，１Ｈ），７．７１（ｄ，２Ｈ），７．３１（ｍ  ７Ｈ），７．１８（ｔｔ，１Ｈ），７．１２（ｄｔ，２Ｈ），６．９２（ｄ，１Ｈ），６．８２（ｍ，３Ｈ），４．０４（ｍ，１Ｈ），３．５１（ｍ，４Ｈ），３．２６（ｍ，１０Ｈ），２．８２（ｍ，２Ｈ），２．３０（ｍ，１０Ｈ），１．９４（ｍ，１Ｈ），１．７２（ｍ，５Ｈ）。
【０３３０】
（実施例８Ａ）
同一名義の米国特許出願第１０／９８８，３３８号に記載されているように製造した３−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−４−フェニルスルファニル酪酸とＨＡＴＵのＤＭＦ溶液をＯｒｇ．Ｌｅｔｔ．，２００１，３，１３７１−１３７４に記載されているように製造した７−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタンとＮ−メチルモルホリンで処理し、周囲温度で３０分間撹拌し、酢酸エチルで希釈し、１．５％  ＨＣｌ、ＮａＨＣＯ３（水溶液）、Ｈ２Ｏ及びブラインで洗浄し、脱水し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮し、所望の生成物を得た。
【０３３１】
（実施例８Ｂ）
実施例８ＡのＴＨＦ溶液をジエチルアミンで処理し、周囲温度で２時間撹拌し、濃縮した。ＣＨ２Ｃｌ２（ＮＨ３で飽和）後に酢酸エチルを溶離液としてシリカゲルクロマトグラフィーにより残渣を精製し、所望の生成物を得た。
【０３３２】
（実施例８Ｃ）
本実施例は実施例１Ｄで実施例１Ｃの代わりに実施例８Ｂを使用することにより製造した。
【０３３３】
（実施例８Ｄ）
本実施例は実施例１Ｉで実施例１Ｄの代わりに実施例８Ｃを使用することにより製造した。
【０３３４】
（実施例８Ｅ）
本実施例は実施例１Ｎで夫々実施例１Ｉと実施例１Ｍの代わりに実施例８Ｄと実施例３Ｃを使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．１９（ｍ，１Ｈ），８．０７（ｄ，１Ｈ），７．９７（ｄ，１Ｈ），７．７１（ｄ，２Ｈ），７．３１（ｍ  ６Ｈ），７．２０（ｔｔ，１Ｈ），７．１２（ｄｔ，２Ｈ），６．８９（ｄ，１Ｈ），６．７６（ｄ，２Ｈ），６．６５（ｄ，１Ｈ），４．０３（ｍ，２Ｈ），３．３１（ｍ，４Ｈ），３．１２（ｍ，４Ｈ），２．９０（ｂｒ，２Ｈ），２．７６（ｍ  ２Ｈ），１．９６（ｍ，２１Ｈ）。
【０３３５】
（実施例９Ａ）
本実施例は実施例１Ｉで実施例１Ｄの代わりに実施例６Ｅを使用することにより製造した。
【０３３６】
（実施例９Ｂ）
本実施例は実施例１Ｎで夫々実施例１Ｉと実施例１Ｍの代わりに実施例９Ａと実施例３Ｃを使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．０８（ｄ，１Ｈ），７．９４（ｄ，１Ｈ），７．７１（ｄ，２Ｈ），７．３２（ｍ  ７Ｈ），７．２０（ｔｔ，１Ｈ），７．１２（ｄｔ，２Ｈ），６．８７（ｄ，１Ｈ），６．７８（ｄ，３Ｈ），４．４０（ｍ，１Ｈ），４．０３（ｍ，２Ｈ），３．８３（ｍ，２Ｈ），３．５４（ｍ，２Ｈ），３．２６（ｍ，２Ｈ），３．１４（ｍ，４Ｈ），２．８０（ｂｒ，２Ｈ），２．７８（ｍ，４Ｈ），１．９７（ｍ，１４Ｈ）。
【０３３７】
（実施例１０）
本実施例は実施例１Ｎで実施例１Ｉの代わりに実施例９Ａを使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．０９（ｄ，１Ｈ），７．９５（ｄ，１Ｈ），７．７１（ｄ，２Ｈ），７．３３（ｍ  ７Ｈ），７．２０（ｔｔ，１Ｈ），７．１２（ｄｔ，２Ｈ），６．９０（ｄ，１Ｈ），６．７９（ｄ，３Ｈ），４．４４（ｍ，１Ｈ），４．０３（ｍ，１Ｈ），３．８４（ｍ，１Ｈ），３．５７（ｍ，１Ｈ），３．０２（ｍ，１３Ｈ），２．２５（ｍ，６Ｈ），１．９９（ｍ，６Ｈ），１．４３（ｔ，２Ｈ），０．９７（ｓ，６Ｈ）。
【０３３８】
（実施例１１）
本実施例は実施例１Ｎで実施例１Ｉの代わりに実施例６Ｆを使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．０７（ｄ，１Ｈ），７．９３（ｄ，１Ｈ），７．７０（ｄ，２Ｈ），７．３３（ｍ  ７Ｈ），７．２０（ｔｔ，１Ｈ），７．１２（ｄｔ，２Ｈ），６．８１（ｍ，４Ｈ），４．４１（ｍ，１Ｈ），４．０６（ｍ，１Ｈ），３．８３（ｍ，１Ｈ），３．４７（ｍ，１Ｈ），３．０２（ｍ，１３Ｈ），２．２５（ｍ，６Ｈ），１．９９（ｍ，６Ｈ），１．４３（ｔ，２Ｈ），０．９７（ｓ，６Ｈ）。
【０３３９】
（実施例１２）
本実施例は実施例１Ｎで夫々実施例１Ｍと実施例１Ｉの代わりに同一名義の米国特許出願第１０／９８８，３３８号に記載されているように製造した４−（４−（２−（４−クロロフェニル）シクロヘプタ−１−エニルメチル）ピペラジン−１−イル）安息香酸と実施例９Ａを使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．０９（ｄ，１Ｈ），７．９５（ｄｄ，１Ｈ），７．７１（ｄ，２Ｈ），７．３２（ｍ  ７Ｈ），７．１９（ｔｔ，１Ｈ），７．０９（ｄｔ，２Ｈ），６．９０（ｄ，１Ｈ），６．７９（ｄ，３Ｈ），４．４５（ｍ，１Ｈ），４．０３（ｍ，２Ｈ），３．８５（ｍ，２Ｈ），３．５５（ｍ，２Ｈ），３．０４（ｍ，８Ｈ），２．３４（ｍ，８Ｈ），１．８５（ｍ，７Ｈ），１．５４（ｍ，５Ｈ）。
【０３４０】
（実施例１３）
本実施例は実施例１Ｎで夫々実施例１Ｍと実施例１Ｉの代わりに同一名義の米国特許出願第１０／９８８，３３８号に記載されているように製造した４−（４−（２−（４−クロロフェニル）シクロヘプタ−１−エニルメチル）ピペラジン−１−イル）安息香酸と実施例６Ｆを使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．０７（ｄ，１Ｈ），７．９３（ｄｄ，１Ｈ），７．７１（ｄ，２Ｈ），７．３２（ｍ  ７Ｈ），７．２０（ｔｔ，１Ｈ），７．０９（ｄｔ，２Ｈ），６．８７（ｄ，１Ｈ），６．７９（ｄ，３Ｈ），４．４５（ｍ，１Ｈ），４．０２（ｍ，２Ｈ），３．８４（ｍ，２Ｈ），３．５６（ｍ，２Ｈ），３．０７（ｍ，８Ｈ），２．３３（ｍ，８Ｈ），１．８５（ｍ，７Ｈ），１．５４（ｍ，５Ｈ）。
【０３４１】
（実施例１４）
本実施例は実施例１Ｎで夫々実施例１Ｍと実施例１Ｉの代わりに実施例２Ｋと実施例４Ｆを使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．０７（ｄ，１Ｈ），７．９６（ｄｄ，１Ｈ），７．７１（ｄ，２Ｈ），７．３３（ｍ  ７Ｈ），７．２０（ｔｔ，１Ｈ），７．０９（ｄｔ，２Ｈ），６．８７（ｄ，１Ｈ），６．７７（ｄ，２Ｈ），６．７２（ｄ，１Ｈ），４．００（ｍ，１Ｈ），３．２８（ｍ，４Ｈ），３．１２（ｍ，４Ｈ），２．７９（ｍ，２Ｈ），２．４８（ｍ，２Ｈ），２．２３（ｍ，８Ｈ），２．０２（ｍ，４Ｈ），１．４２（ｔ，２Ｈ），１．０８（ｍ，６Ｈ），０．９６（ｓ，６Ｈ）。
【０３４２】
（実施例１５Ａ）
本実施例は実施例４Ｄで実施例４ＣとＮ−イソプロピル−Ｎ−メチルアミンの代わりに実施例６Ｃと１，４−オキサゼパンを使用することにより製造した。
【０３４３】
（実施例１５Ｂ）
本実施例は実施例６Ｅで実施例６Ｄの代わりに実施例１５Ａを使用することにより製造した。
【０３４４】
（実施例１５Ｃ）
本実施例は実施例１Ｉで実施例１Ｄの代わりに実施例１５Ｂを使用することにより製造した。
【０３４５】
（実施例１５Ｄ）
本実施例は実施例１Ｎで夫々実施例１Ｉと実施例１Ｍの代わりに実施例１５Ｃと実施例３Ｃを使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．３２（ｓ，１Ｈ），８．０１（ｂｒ，１Ｈ），７．６７（ｄ，２Ｈ），７．３４（ｔ，４Ｈ），７．２４（ｍ，３Ｈ），６．９９（ｍ，３Ｈ），６．６７（ｂｒ，３Ｈ），３．９７（ｂｒ，１Ｈ），３．８８（ｓ，２Ｈ），３．７９（ｓ，２Ｈ），３．７３−３．２３（ｂｒ  ｍ，１２Ｈ），３．１４（ｍ，６Ｈ），２．２９（ｓ，６Ｈ），２．０８（ｍ，２Ｈ），１．７４（ｓ，４Ｈ）。
【０３４６】
（実施例１６Ａ）
本実施例は実施例４ＤでＮ−イソプロピル−Ｎ−メチルアミンの代わりにアゼパンを使用することにより製造した。
【０３４７】
（実施例１６Ｂ）
本実施例は実施例４Ｅで実施例４Ｄの代わりに実施例１６Ａを使用することにより製造した。
【０３４８】
（実施例１６Ｃ）
本実施例は実施例１Ｉで実施例１Ｄの代わりに実施例１６Ａを使用することにより製造した。
【０３４９】
（実施例１６Ｄ）
本実施例は実施例１Ｎで夫々実施例１Ｉと実施例１Ｍの代わりに実施例１６Ｃと実施例３Ｃを使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．３３（ｓ，１Ｈ），８．０１（ｄ，１Ｈ），７．６７（ｄ，２Ｈ），７．３４（ｔ，４Ｈ），７．２３（ｍ，３Ｈ），６．９８（ｍ，３Ｈ），６．６７（ｍ，３Ｈ），３．９９（ｍ，１Ｈ），３．８２−３．１９（ｂｒ  ｍ，１０Ｈ），３．１２（ｓ，４Ｈ），２．８６（ｍ，２Ｈ），２．５５（ｂｒ，２Ｈ），２．２９（ｓ，４Ｈ），２．０６（ｍ，１Ｈ），１．９３（ｍ，３Ｈ），１．７４（ｓ，８Ｈ），１．６０（ｍ，２Ｈ）。
【０３５０】
（実施例１７Ａ）
本実施例は実施例１Ｄで実施例１Ｃの代わりに実施例６Ａを使用することにより製造した。
【０３５１】
（実施例１７Ｂ）
本実施例は実施例１Ｉで実施例１Ｄの代わりに実施例１７Ｂを使用することにより製造した。
【０３５２】
（実施例１７Ｃ）
本実施例は実施例１Ｎで夫々実施例１Ｍと実施例１Ｉの代わりに同一名義の米国特許出願第１０／９８８，３３８号に記載されているように製造した４−（４−（２−（４−クロロフェニル）シクロヘプタ−１−エニルメチル）ピペラジン−１−イル）安息香酸と実施例１７Ｂを使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．５８（ｂｒｓ，１Ｈ），９．４６（ｂｒｓ，１Ｈ），８．１８（ｄ，１Ｈ），８．００（ｄｄ，１Ｈ），７．７７（ｄ，２Ｈ），７．４１（ｄ，２Ｈ），７．２９（ｄ，２Ｈ），７．２４（ｍ，２Ｈ），７．１３（ｍ，４Ｈ），６．９６（ｍ，３Ｈ），４．１２（ｍ，１Ｈ），３．８７（ｍ，１Ｈ），３．６３（ｍ，１Ｈ），３．３８（ｍ，４Ｈ），３．１５（ｍ，４Ｈ），３．０２（ｍ，２Ｈ），２．７４（ｓ，６Ｈ），２．４６（ｍ，４Ｈ），２．０９（ｍ，２Ｈ），１．８１（ｍ，２Ｈ），１．５７（ｍ，４Ｈ）。
【０３５３】
（実施例１８Ａ）
本実施例は実施例１Ｉで実施例１Ｈと実施例１Ｄの代わりに実施例２Ｅと実施例１７Ｂを使用することにより製造した。
【０３５４】
（実施例１８Ｂ）
本実施例は実施例１Ｎで夫々実施例１Ｉと実施例１Ｍの代わりに実施例１８Ａと実施例３Ｃを使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．６０（ｂｒｓ，１Ｈ），９．４７（ｂｒｓ，１Ｈ），８．１８（ｄ，１Ｈ），７．９９（ｄｄ，１Ｈ），７．７７（ｄ，２Ｈ），７．４１（ｄ，２Ｈ），７．３０（ｄ，２Ｈ），７．２４（ｍ，２Ｈ），７．１５（ｍ，３Ｈ），７．１２（ｄ，１Ｈ），６．９６（ｍ，３Ｈ），６．９２（ｄ，１Ｈ），４．１０（ｍ，１Ｈ），３．９１（ｍ，２Ｈ），３．６０（ｍ，２Ｈ），３．３７（ｍ，４Ｈ），３．１５（ｍ，２Ｈ），３．０２（ｍ，１Ｈ），２．７４（ｓ，６Ｈ），２．２５（ｄ，４Ｈ），２．０８（ｍ，２Ｈ），１．７１（ｍ，４Ｈ）。
【０３５５】
（実施例１９）
本実施例は実施例１Ｎで実施例１Ｉの代わりに実施例２Ｆを使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．１１（ｄ，１Ｈ），７．９３（ｄｄ，１Ｈ），７．７１（ｄ，２Ｈ），７．３６（ｍ，４Ｈ），７．２７（ｍ，２Ｈ），７．１８（ｍ，１Ｈ），７．１２（ｄ，２Ｈ），６．９７（ｄ，１Ｈ），６．８５（ｍ，３Ｈ），４．０５（ｍ，１Ｈ），３．５３（ｍ，４Ｈ），３．２３（ｍ，１Ｈ），２．８３（ｍ，１Ｈ），２．３４（ｍ，８Ｈ），２．２２（ｍ，２Ｈ），１．９９（ｍ，２Ｈ），１．９６（ｍ，１Ｈ），１．７７（ｍ，１Ｈ），１．４４（ｔ，２Ｈ），０．９７（ｓ，６Ｈ）。
【０３５６】
（実施例２０）
本実施例は実施例１Ｎで実施例１Ｉの代わり実施例１７Ｂにを使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．４６（ｂｒｓ，１Ｈ），８．１８（ｄ，１Ｈ），７．９９（ｄｄ，１Ｈ），７．７６（ｄ，２Ｈ），７．４０（ｄ，２Ｈ），７．２９（ｄ，２Ｈ），７．２３（ｔ，２Ｈ），７．１４（ｓ，４Ｈ），６．９５（ｍ，３Ｈ），４．１１（ｍ，１Ｈ），３．８８（ｍ，２Ｈ），３．５８（ｍ，４Ｈ），３．０８（ｍ，４Ｈ），２．７３（ｓ，６Ｈ），２．２７（ｍ，２Ｈ），２．０８（ｍ，２Ｈ），２．０２（ｓ，２Ｈ），１．４７（ｔ，２Ｈ），１．００（ｓ，６Ｈ）。
【０３５７】
（実施例２１）
本実施例は実施例１Ｎで実施例１Ｍの代わりに同一名義の米国特許出願第１０／９８８，３３８号に記載されているように製造した４−（４−（４−（４−クロロフェニル）−５，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−イルメチル）ピペラジン−１−イル）安息香酸を使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．２７（ｄ，１Ｈ），８．１１（ｄ，１Ｈ），７．８９（ｄ，２Ｈ），７．５９（ｄ，２Ｈ），７．４８（ｍ，４Ｈ），７．３７（ｍ，３Ｈ），７．１３（ｍ，１Ｈ），７．０１（ｍ，３Ｈ），４．３５（ｓ，２Ｈ），４．２４（ｍ，１Ｈ），３．９７（ｍ，２Ｈ），３．６８（ｍ，４Ｈ），３．３６（ｍ，６Ｈ），３．０７（ｍ，３Ｈ），２．６８（ｓ，２Ｈ），２．５９（ｍ，４Ｈ），２．１４（ｍ，２Ｈ），１．９３（ｍ，２Ｈ）。
【０３５８】
（実施例２２Ａ）
本実施例は実施例２Ｆで実施例２Ｅの代わりに実施例４Ｅを使用することにより製造した。
【０３５９】
（実施例２２）
本実施例は実施例１Ｎで夫々実施例１Ｍと実施例１Ｉの代わりに実施例２Ｋと実施例２２Ａを使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．２１（ｂｒｓ，１Ｈ），８．１７（ｍ，１Ｈ），８．００（ｄｄ，１Ｈ），７．７７（ｄ，２Ｈ），７．４２（ｍ，２Ｈ），７．３１（ｍ，２Ｈ），７．２４（ｍ，２Ｈ），７．１４（ｍ，４Ｈ），６．９７（ｍ，３Ｈ），４．１１（ｍ，１Ｈ），３．９０（ｍ，１Ｈ），３．１２（ｍ，６Ｈ），２．８４（ｍ，３Ｈ），２．６３（ｍ，３Ｈ），２．２５（ｍ，２Ｈ），２．０７（ｍ，４Ｈ），１．４９（ｔ，２Ｈ），１．１６（ｍ，６Ｈ），０．９７（ｓ，６Ｈ）。
【０３６０】
（実施例２３）
本実施例は実施例１Ｎで実施例１Ｉの代わりに実施例２２Ａを使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．２１（ｂｒｓ，１Ｈ），８．１８（ｍ，１Ｈ），７．９９（ｄｄ，１Ｈ），７．７８（ｄ，２Ｈ），７．４０（ｄ，２Ｈ），７．３０（ｄ，２Ｈ），７．２４（ｍ，２Ｈ），７．１５（ｍ，４Ｈ），６．９７（ｍ，３Ｈ），４．１１（ｍ，１Ｈ），３．８９（ｍ，１Ｈ），３．１３（ｍ，６Ｈ），２．８４（ｍ，２Ｈ），２．６３（ｍ，３Ｈ），２．２８（ｍ，２Ｈ），２．０７（ｍ，４Ｈ），１．４８（ｔ，２Ｈ），１．１７（ｍ，６Ｈ），１．００（ｓ，６Ｈ）。
【０３６１】
（実施例２４）
本実施例は実施例１Ｎで実施例１Ｍの代わりに実施例２Ｋを使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．１４（ｂｒｓ，１Ｈ），９．８９（ｂｒｓ，１Ｈ），９．５２（ｓ，１Ｈ），８．１８（ｄ，１Ｈ），８．００（ｄｄ，１Ｈ），７．７７（ｄ，２Ｈ），７．４１（ｄ，２Ｈ），７．３０（ｄ，２Ｈ），７．２４（ｔ，２Ｈ），７．１４（ｍ，４Ｈ），６．９６（ｍ，３Ｈ），４．１２（ｍ，１Ｈ），３．９３（ｍ，３Ｈ），３．６３（ｍ，４Ｈ），２．９３（ｍ，１０Ｈ），２．２４（ｍ，２Ｈ），２．０９（ｍ，４Ｈ），１．４８（ｔ，２Ｈ），０．９７（ｓ，６Ｈ）。
【０３６２】
（実施例２５）
本実施例は実施例１Ｎで夫々実施例１Ｍと実施例１Ｉの代わりに実施例２Ｋと実施例６Ｆを使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．５８（ｂｒｓ，１Ｈ），９．３９（ｂｒｓ，１Ｈ），８．１７（ｓ，１Ｈ），７．９９（ｄｄ，１Ｈ），７．７７（ｄ，２Ｈ），７．４１（ｄ，２Ｈ），７．３０（ｄ，２Ｈ），７．２４（ｔ，２Ｈ），７．１４（ｍ，４Ｈ），６．９７（ｍ，３Ｈ），４．６３（ｄ，１Ｈ），４．４３（ｄ，１Ｈ），４．１３（ｍ，１Ｈ），３．９２（ｍ，２Ｈ），３．６９（ｍ，２Ｈ），３．５２（ｍ，２Ｈ），３．０１（ｍ，６Ｈ），２．２５（ｍ，２Ｈ），２．０４（ｍ，６Ｈ），１．４９（ｍ，２Ｈ），０．９８（ｓ，６Ｈ）。
【０３６３】
（実施例２６）
本実施例は実施例１Ｎで夫実施例１Ｉと実施例１Ｍ々の代わりに実施例１７Ｂと実施例３Ｃを使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．４９（ｂｒｓ，１Ｈ），８．０８（ｄ，１Ｈ），７．９５（ｄｄ，１Ｈ），７．７１（ｄ，２Ｈ），７．３６（ｍ，４Ｈ），７．３０（ｔ，２Ｈ），７．２０（ｔ，１Ｈ），７．１２（ｄ，２Ｈ），６．８４（ｍ，２Ｈ），６．７８（ｄ，２Ｈ），３．９８（ｍ，１Ｈ），３．２８（ｍ，２Ｈ），３．１２（ｂｒｓ，４Ｈ），２．８１（ｂｒｓ，１Ｈ），２．７７（ｓ，１Ｈ），２．４６（ｓ，６Ｈ），２．２８（ｓ，４Ｈ），２．１９（ｍ，４Ｈ），２．００（ｍ，１Ｈ），１．９０（ｍ，１Ｈ），１．６５（ｍ，４Ｈ）。
【０３６４】
（実施例２７Ａ）
本実施例は実施例４ＤでＮ−イソプロピルエチルアミンの代わりにピロリジンを使用することにより製造した。
【０３６５】
（実施例２７Ｂ）
本実施例は実施例４Ｅで実施例４Ｄの代わりに実施例２７Ａを使用することにより製造した。
【０３６６】
（実施例２７Ｃ）
本実施例は実施例１Ｉで実施例１Ｄの代わりに実施例２７Ｂを使用することにより製造した。
【０３６７】
（実施例２７Ｄ）
本実施例は実施例１Ｎで夫々実施例１Ｉと実施例１Ｍの代わりに実施例２７Ｃと実施例３Ｃを使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．０８（ｄ，１Ｈ），７．９６（ｄｄ，１Ｈ），７．７１（ｄ，２Ｈ），７．３６（ｍ，４Ｈ），７．３０（ｔ，２Ｈ），７．２０（ｔ，１Ｈ），７．１２（ｄ，２Ｈ），６．８７（ｍ，１Ｈ），６．７７（ｄ，２Ｈ），６．７２（ｄ，１Ｈ），４．００（ｍ，１Ｈ），３．２６（ｍ，２Ｈ），３．１２（ｂｒｓ，４Ｈ），２．９７（ｍ，６Ｈ），２．７６（ｓ，１Ｈ），２．２８（ｂｒｓ，４Ｈ），２．１９，（ｍ，４Ｈ），２．０５（ｍ，１Ｈ），１．９５（ｍ，１Ｈ），１．８２（ｂｒｓ，４Ｈ），１．６５（ｍ，４Ｈ）。
【０３６８】
（実施例２８）
本実施例は実施例１Ｎで夫々実施例１Ｍと実施例１Ｉの代わりに実施例２Ｋと実施例１７Ｂを使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．５９（ｂｒｓ，１Ｈ），８．０８（ｄ，１Ｈ），７．９４（ｄｄ，１Ｈ），７．７０（ｄ，２Ｈ），７．３６（ｍ，４Ｈ），７．３０（ｔ，２Ｈ），７．２１（ｔｔ，１Ｈ），７．０９（ｄ，２Ｈ），６．８３（ｄ，１Ｈ），６．７８（ｄ，３Ｈ），３．９７（ｍ，１Ｈ），３．２８（ｍ，２Ｈ），３．１３（ｂｒｓ，４Ｈ），２．９０（ｂｒｓ，２Ｈ），２．７９（ｓ，２Ｈ），２．５５（ｓ，６Ｈ），２．２８（ｂｒｓ，４Ｈ），２．２０（ｍ，２Ｈ），１．９９（ｓ，２Ｈ），１．９０（ｍ，２Ｈ），１．４２（ｔ，２Ｈ），０．９６（ｓ，６Ｈ）。
【０３６９】
（実施例２９）
本実施例は実施例１Ｎで夫々実施例１Ｍと実施例１Ｉの代わりに同一名義の米国特許出願第１０／９８８，３３８号に記載されているように製造した４−（４−（２−（４−クロロフェニル）シクロ−１−エニルメチル）ピペラジン−１−イル）安息香酸と実施例２７Ｃを使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．６０（ｂｒｓ，１Ｈ），８．０８（ｄ，１Ｈ），７．９４（ｄｄ，１Ｈ），７．７１（ｄ，２Ｈ），７．３６（ｍ，４Ｈ），７．３０（ｔ，２Ｈ），７．２０（ｔ，１Ｈ），７．０９（ｄ，２Ｈ），６．８３（ｄ，１Ｈ），６．７７（ｄ，３Ｈ），３．９９（ｍ，１Ｈ），３．２６（ｍ，２Ｈ），３．１２（ｂｒｓ，４Ｈ），２．８０（ｍ，５Ｈ），２．７６（ｓ，２Ｈ），２．４０（ｍ，４Ｈ），２．３１（ｂｒｓ，４Ｈ），１．９９（ｍ，１Ｈ），１．８９（ｍ，１Ｈ），１．７７（ｂｒｓ，６Ｈ），１．５８（ｍ，２Ｈ），１．１（ｍ，２Ｈ）。
【０３７０】
（実施例３０Ａ）
本実施例は実施例１Ｉで実施例１Ｈと実施例１Ｄの代わりに実施例２Ｅと実施例２７Ｂを使用することにより製造した。
【０３７１】
（実施例３０Ｂ）
本実施例は実施例１Ｎで実施例１Ｉと実施例１Ｄの代わりに実施例３０Ａを使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．５７（ｂｒｓ，１Ｈ），８．０７（ｄ，１Ｈ），７．９３（ｄｄ，１Ｈ），７．７０（ｄ，２Ｈ），７．３６（ｍ，４Ｈ），７．３０（ｔ，２Ｈ），７．２１（ｔ，１Ｈ），７．１２（ｄ，２Ｈ），６．８１（ｄ，１Ｈ），６．７７（ｄ，３Ｈ），３．９９（ｍ，１Ｈ），３．２６（ｍ，２Ｈ），３．１２（ｂｒｓ，４Ｈ），２．８０（ｍ，５Ｈ），２．７６（ｓ，２Ｈ），２．２７（ｍ，４Ｈ），２．２２（ｍ，２Ｈ），１．９９（ｍ，３Ｈ），１．８８（ｍ，１Ｈ），１．７７（ｂｒｓ，４Ｈ），１．４３（ｔ，２Ｈ），０．９７（ｓ，６Ｈ）。
【０３７２】
（実施例３１）
本実施例は実施例１Ｎで夫々実施例１Ｍと実施例１Ｉの代わりに実施例２Ｋと実施例３０Ａを使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．５２（ｂｒｓ，１Ｈ），８．０６（ｄ，１Ｈ），７．９２（ｄｄ，１Ｈ），７．７０（ｄ，２Ｈ），７．３６（ｍ，４Ｈ），７．３０（ｔ，２Ｈ），７．２１（ｔ，１Ｈ），７．０８（ｄ，２Ｈ），６．８１（ｄ，１Ｈ），６．７７（ｄ，３Ｈ），３．９９（ｍ，１Ｈ），３．２６（ｍ，２Ｈ），３．１２（ｂｒｓ，４Ｈ），２．７６（ｓ，２Ｈ），２．７５（ｍ，５Ｈ），２．２６（ｍ，４Ｈ），２．２０（ｍ，２Ｈ），１．９９（ｍ，３Ｈ），１．８６（ｍ，１Ｈ），１．７６（ｂｒｓ，４Ｈ），１．４２（ｔ，２Ｈ），０．９６（ｓ，６Ｈ）。
【０３７３】
（実施例３２）
本実施例は実施例１Ｎで夫々実施例１Ｍと実施例１Ｉの代わりに同一名義の米国特許出願第１０／９８８，３３８号に記載されているように製造した４−（４−（２−（４−クロロフェニル）シクロヘプタ−１−エニルメチル）ピペラジン−１−イル）安息香酸と実施例３０Ａを使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．５０（ｂｒｓ，１Ｈ），８．０８（ｄ，１Ｈ），７．９４（ｄｄ，１Ｈ），７．７１（ｄ，２Ｈ），７．３６（ｍ，４Ｈ），７．３０（ｔ，２Ｈ），７．２０（ｔ，１Ｈ），７．０９（ｄ，２Ｈ），６．８３（ｄ，１Ｈ），６．７７（ｄ，３Ｈ），３．９９（ｍ，１Ｈ），３．２６（ｍ，２Ｈ），３．１２（ｂｒｓ，４Ｈ），２．８０（ｍ，５Ｈ），２．７６（ｓ，２Ｈ），２．４０（ｍ，４Ｈ），２．３１（ｂｒｓ，４Ｈ），１．９８（ｍ，１Ｈ），１．８７（ｍ，１Ｈ），１．７６（ｂｒｓ，６Ｈ），１．５８（ｍ，２Ｈ），１．５１（ｍ，２Ｈ）。
【０３７４】
（実施例３３）
本実施例は実施例１Ｎで夫々実施例１Ｉと実施例１Ｍの代わりに実施例４Ｆと実施例３Ｃを使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．０３（ｓ，１Ｈ），８．０８（ｄ，１Ｈ），７．９７（ｄ，１Ｈ），７．７１（ｄ，２Ｈ），７．３９−７．３４（ｍ，４Ｈ），７．３０（ｔ，２Ｈ），７．２０（ｔｔ，１Ｈ），７．１３（ｄｔ，２Ｈ），６．８８（ｍ，１Ｈ），６．７８（ｄ，２Ｈ），６．７０（ｍ，１Ｈ），３．９９（ｍ，１Ｈ），３．３７−３．２６（ｍ，４Ｈ），３．１２（ｓ，４Ｈ），２．７６（ｓ，２Ｈ），２．６８−２．５３（ｍ，２Ｈ），２．３４−２．１３（ｍ，１０Ｈ），２．１０−１．９５（ｍ，２Ｈ），１．６６（ｓ，４Ｈ），１．１３（ｍ，６Ｈ）。
【０３７５】
（実施例３４）
本実施例は実施例１Ｎで夫々実施例１Ｍと実施例１Ｉの代わりに実施例２Ｋと実施例２７Ｃを使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．５３（ｓ，１Ｈ），８．０８（ｄ，１Ｈ），７．９７（ｄｄ，１Ｈ），７．７１（ｄ，２Ｈ），７．４０−７．３４（ｍ，４Ｈ），７．３０（ｔ，２Ｈ），７．２０（ｔｔ，１Ｈ），７．０９（ｄ，２Ｈ），６．８９（ｄ，１Ｈ），６．７８（ｄ，２Ｈ），６．７１（ｄ，１Ｈ），４．０１（ｍ，１Ｈ），３．３８−３．２７（ｍ，４Ｈ），３．２０−２．８４（ｍ，１０Ｈ），２．７９（ｓ，２Ｈ），２．２７（ｓ，４Ｈ），２．２０（ｔ，２Ｈ），２．０３（ｍ，２Ｈ），１．８５（ｍ，４Ｈ），１．４２（ｔ，２Ｈ），０．９６（ｓ，６Ｈ）。
【０３７６】
（実施例３５）
本実施例は実施例１Ｎで夫々実施例１Ｍと実施例１Ｉの代わりに実施例３Ｃと実施例３０Ａを使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ  ８．０６（ｄ，１Ｈ），７．９３（ｄｄ，１Ｈ），７．７１（ｄ，２Ｈ），７．３６（ｍ，４Ｈ），７．３０（ｍ，２Ｈ），７．２１（ｍ，１Ｈ），７．１２（ｄ，２Ｈ），６．８１（ｄ，１Ｈ），６．７７（ｄ，３Ｈ），３．９７（ｍ，１Ｈ），３．２６（ｍ，４Ｈ），３．１２（ｓ，４Ｈ），２．７８（ｍ，６Ｈ），２．２７（ｓ，４Ｈ），２．１８（ｍ，４Ｈ），１．９９（ｍ，１Ｈ），１．８７（ｍ，１Ｈ），１．７６（ｓ，４Ｈ），１．６６（ｓ，４Ｈ）。
【０３７７】
（実施例３６）
本実施例は実施例１Ｎで夫々実施例１Ｍと実施例１Ｉの代わりに実施例２Ｋと実施例９Ａを使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．０９（ｄ，１Ｈ），７．９７（ｄｄ，１Ｈ），７．７１（ｄ，２Ｈ），７．３３（ｍ，６Ｈ），７．２１（ｍ，１Ｈ），７．０８（ｄ，２Ｈ），６．８７（ｍ，１Ｈ），６．７８（ｍ，３Ｈ），３．９９（ｍ，１Ｈ），３．１４（ｍ，４Ｈ），２．９５（ｍ，１Ｈ），２．８０（ｍ，３Ｈ），２．５８（ｓ，６Ｈ），２．２８（ｍ，４Ｈ），２．２０（ｍ，２Ｈ），１．９９（ｍ，４Ｈ），１．４２（ｔ，２Ｈ），０．９６（ｓ，６Ｈ）。
【０３７８】
（実施例３７）
本実施例は実施例１Ｎで夫々実施例１Ｍと実施例１Ｉの代わりに実施例２Ｋと実施例１７Ｂを使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．０９（ｄ，１Ｈ），７．９７（ｄｄ，１Ｈ），７．７１（ｄ，２Ｈ），７．３３（ｍ，６Ｈ），７．２１（ｍ，１Ｈ），７．０８（ｄ，２Ｈ），６．８７（ｍ，１Ｈ），６．７８（ｍ，３Ｈ），３．９９（ｍ，１Ｈ），３．１４（ｍ，４Ｈ），２．９５（ｍ，１Ｈ），２．８０（ｍ，３Ｈ），２．５８（ｓ，６Ｈ），２．２８（ｍ，４Ｈ），２．２０（ｍ，２Ｈ），１．９９（ｍ，４Ｈ），１．４２（ｔ，２Ｈ），０．９６（ｓ，６Ｈ）。
【０３７９】
（実施例３８）
本実施例は実施例１Ｎで夫々実施例１Ｍの代わりに同一名義の米国特許出願第１０／９８８，３３８号に記載されているように製造した４−（４−（１，１’−ビフェニル−２−イルメチル）−１−ピペラジニル）安息香酸を使用し、実施例１Ｉの代わりに実施例１７Ｂを使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．１９（ｄ，１Ｈ），７．９９（ｄｄ，１Ｈ），７．７６（ｄ，３Ｈ），７．５２（ｄ，４Ｈ），７．４０（ｄ，２Ｈ），７．３５（ｍ，１Ｈ），７．３０（ｄ，２Ｈ），７．２４（ｔ，２Ｈ），７．１６（ｔ，２Ｈ），６．９６（ｍ，３Ｈ），４．２５（ｂｒ，２Ｈ），４．１２（ｍ，１Ｈ），３．３７（ｍ，２Ｈ），３．１４（ｍ，１Ｈ），３．１０（ｂｒ，８Ｈ），２．７４（ｓ，６Ｈ），２．１０（ｍ，２Ｈ）。
【０３８０】
（実施例３９）
本実施例は実施例１Ｎで実施例１Ｍの代わりに同一名義の米国特許出願第１０／９８８，３３８号に記載されているように製造した４−（４−（１，１’−ビフェニル−２−イルメチル）−１−ピペラジニル）安息香酸を使用することにより製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．１９（ｄ，１Ｈ），８．００（ｄｄ，１Ｈ），７．７６（ｄ，２Ｈ），７．５２（ｍ，５Ｈ），７．１４（ｍ，８Ｈ），６．９６（ｍ，３Ｈ），４．２９（ｍ，２Ｈ），４．１４（ｍ，２Ｈ），４．０２（ｍ，１Ｈ），３．１０（ｍ，８Ｈ），２．１３（ｍ，２Ｈ）。
【０３８１】
（実施例４０）
抗体
全抗体は以下の業者から購入した。ＩＮＣＥＮＰ、ヒストンＨ３、ヒストンＨ３−（ｐＳｅｒ１０）、ＢＩＫ、ＰＵＭＡ及びＢＡＫに対する抗体はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入し；オーロラＢ、Ｂａｄ及びＲａｌ−Ａに対する抗体はＥｐｉｔｏｍｉｃｓから購入し；オーロラＡ、ｐ５３、チトクロームＣ、Ｂｉｄ及びＢｉｍに対する抗体はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入し；Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｍｃｌ−１及びＳ６Ｋ１に対する抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入し；ＢＡＸに対する抗体はＡｂｃａｍから購入し；ＮＯＸＡに対する抗体はＩｍｇｅｎｅｘから購入し；活性なＢＡＸコンフォーマーに対する抗体（６Ａ７）はＳｉｇｍａから購入し；活性なＢＡＫコンフォーマーに対する抗体（Ａｂ２）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入し；βアクチンに対する抗体はＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
【０３８２】
小分子及びｓｉＲＮＡ
臨床薬であるＢＣＮＵ、ドキソルビシン、ゲムシタビン、エトポシド、５−ＦＵ、ＡＬＩＭＴＡ、ラパマイシンの有効成分と、従来開示されているＡｂｂｏｔｔ製品化合物であるＡＢＴ−７５１（βチューブリン阻害剤）、ＡＢＴ−８８８（ＰＡＲＰ阻害剤）（Ｄｏｎａｗｈｏ，Ｃ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，“ＡＢＴ−８８８，ａｎ  ｏｒａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ  ＤＮＡ−ｄａｍａｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌｓ，”Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １３，２７２８−３７（２００７）参照）、ＡＢＴ−２６３（Ｂｃｌ−２蛋白質ファミリー阻害剤）（Ｔｓｅ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，“ＡＢＴ−２６３：ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｏｒａｌｌｙ  ｂｉｏａｖａｉｌａｂｌｅ  Ｂｃｌ−２  ｆａｍｉｌｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，”Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８，３４２１−８（２００８）参照）、リトナビル（Ｋｅｍｐｆ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｒｉｔｏｎａｖｉｒ、ｐｏｔｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ＨＩＶ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｏｒａｌ  ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｆｆｉｃａｃｙ，”Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４１，６０２−１７（１９９８）参照）、Ａ−４４３６５４（ＡＫＴ阻害剤）（Ｌｕｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ａｋｔ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｓｌｏｗ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，”Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ４，９７７−８６（２００５）参照）、及びＡ−４０７８４６（ヒストンデアセチラーゼ）（Ｖａｓｕｄｅｖａｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  ｋｅｔｏｎｅｓ  ａｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ，”Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ  １３，３９０９−１３（２００３）参照）は本願の譲受人であるＡｂｂｏｔｔ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＣｏｍｐｏｕｎｄ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙから入手した。１７−ＡＡＧはＡＧ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。ＭＬＮ８０５４（Ｍａｎｆｒｅｄｉ，Ｍ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＭＬＮ８０５４，ａｎ  ｏｒａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ａｕｒｏｒａ  Ａ  ｋｉｎａｓｅ，”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０４，４１０６−１１（２００７）参照）、ＡＺＤ１１５２（Ｍｏｒｔｌｏｃｋ，Ａ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｐｙｒａｚｏｌｏｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｅｓ  ａｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ａｕｒｏｒａ  Ｂ  ｋｉｎａｓｅ，”Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５０，２２１３−２４（２００７）参照）、ＶＸ−６８０／ＭＫ−０４５７（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，“ＶＸ−６８０、ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｕｒｏｒａ  Ｋｉｎａｓｅｓ，ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，”Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １０，２６２−７（２００４）参照）及びＢＩ２５３６の化学構造は開示されている。これらの化合物は比較の目的のためにＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓで合成した。ＡＺＤ１１５２−ヒドロキシキナゾリンピラゾールアニリド（ＨＱＰＡ）は血漿の存在下でリン酸二水素プロドラッグであるＡＺＤ１１５２から迅速に変換される（Ｍｏｒｔｌｏｃｋ，Ａ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｐｙｒａｚｏｌｏｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｅｓ  ａｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ａｕｒｏｒａ  Ｂ  ｋｉｎａｓｅ，”Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５０，２２１３−２４（２００７）参照）。全試験でＡＺＤ１１５２−ＨＱＰＡを使用し、ＡＺＤ１１５２と呼称した。
【０３８３】
Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｍｃｌ−１、オーロラＡ、オーロラＢ、ＩＮＣＥＮＰ、ＢＩＫ、ＮＯＸＡ、ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＰＵＭＡ、ＢＡＤ及びＢＩＭに対するｓｉＲＮＡはＤｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）から購入した。標的毎に４個１組のＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ  Ｐｌｕｓ  ｓｉＲＮＡを標的ノックダウンとオフターゲット細胞傷害作用についてプレスクリーニングした。７２時間増殖アッセイで１０％を上回るオフターゲット増殖阻害を生じずに７０％を上回る標的蛋白質の減少を誘発したｓｉＲＮＡを全ｓｉＲＮＡ関連試験に選択した。ｓｉＲＮＡ／標的を１個だけ使用した実験では各標的に対して最も強力なｓｉＲＮＡを使用した。対照、非標的ｓｉＲＮＡ及び従来記載されているルシフェラーゼｓｉＲＮＡ（Ｌｉｎ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，“‘Ｓｅｅｄ’ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｓｉＲＮＡｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｍｃｌ−１  ｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｂｃｌ−２／Ｂｃｌ−ＸＬ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＡＢＴ−７３７，”Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２６，３９７２−９（２００７）参照）もＤｈａｒｍａｃｏｎから購入した。
【０３８４】
細胞培養及び動物試験
ヒト癌細胞株ＳＷ６２０、Ｄ５４ＭＧ、Ａ５４９、ＰＣ３、ＥＪ１、ＤＬＤ１、ＨＣＴ１１６及び７８６−０はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。全細胞株は供給元の推奨に従って培養した。
【０３８５】
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから５〜６週齢のＣ．Ｂ．−１７  ｓｃｉｄ−ｂｇ（ｓｃｉｄ−ｂｇ）又はＣ．Ｂ．−１７  ｓｃｉｄ（ｓｃｉｄ）マウスを入手し、８週齢及び／又は寸法〜２０ｇを越えてから試験に使用した。米国農務省動物福祉法、動物愛護及び使用に関する公衆衛生サービス政策、並びに実験動物福祉に関するＮＩＨ指針に定められた規範に合致するか又はこれを上回る条件下で米国実験動物管理協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）により公認された社内動物管理使用委員会（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ））に従って特定のパイロジェンフリー環境で全動物試験を実施した。顕在的な脱水徴候、グルーミングの欠如、嗜眠、＞１５％体積減少、及び体重の＞２０％の腫瘍体積を使用して腫瘍終点を判定した。
【０３８６】
腫瘍細胞株ＨＣＴ１１６をマイコプラズマについて慣例通りに試験し、インビボ接種前に感染性微生物ＰＣＲ増幅試験（ＩＭＰＡＣＴ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）により微生物を含まないことを確認した。１ｍＭ  Ｌ−グルタミンと１０％ウシ胎仔血清を加えたＲＰＭＩで細胞を増殖させ、５％  ＣＯ２、９５％空気で平衡化した加湿雰囲気下で３７℃に維持し、対数増殖期の３〜７継代で腫瘍細胞接種に使用した。細胞（１×１０６個）をマトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と１：１で混合し、雌性マウスの剃毛した脇腹にｓ．ｃ．注射（０．２ｍＬ）した。腫瘍をサイズマッチさせ（４８２〜６０６ｍｍ３）、治療群に割当てた後に投薬を開始した。二等分する２つの直径をキャリパーで測定し、式：（長さ×幅２）／２から腫瘍体積を算出した。ＶＸ−６８０は１０％  Ｓｏｌｕｔｏｌ（ＢＡＳＦ，Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ，ＮＪ）と９０％酒石酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有する溶媒に加えて腹腔内投与した（Ｉ．Ｐ．，５０ｍｇ／ｋｇ／ｄを終わりまで１日２回；終点に達し、試験を終了した時点に応じて１７日間）。ＡＺＤ１１５２は２％エタノール、５％  Ｔｗｅｅｎ−８０、２０％  ＰＥＧ−４００、７３％  ＨＰＭＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する溶媒に加えてＩ．Ｐ．投与した（１００ｍｇ／ｋｇ／ｄを１日２回３日間）。ＡＢＴ−２６３は６０％  Ｐｈｏｓａｌ  ５０、３０％  ＰＥＧ４００、１０％エタノールを含有する溶媒に加えて７５又は１００ｍｇ／ｋｇ／ｄを１日１回１３〜１７日間ＰＯ投与した。薬剤を先ず併用療法で同時に指定期間投与した。
【０３８７】
ｓｉＲＮＡトランスフェクション
典型的には、細胞を９６ウェルプレートに５，０００個／ウェルの割合で抗生物質不含増殖培地に播種し、一晩培養した。翌日、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はＤｈａｒｍａＦＥＣＴトランスフェクション試薬を製造業者の推奨に従って使用し、細胞にｓｉＲＮＡオリゴをトランスフェクトした。個々のｓｉＲＮＡを最終濃度１０ｎＭでトランスフェクトした。イムノブロッティング実験のために、細胞を更に３日間培養後、溶解液を調製した。ｓｉＲＮＡ／薬剤組合せでは、トランスフェクションから２４時間後に細胞を化合物で処理した後、更に７２時間培養した。長期倍数化では、トランスフェクション後１０日間まで細胞を培養した。
【０３８８】
細胞生存率アッセイ及びカスパーゼ３／７アッセイ
製造業者の推奨するプロトコルに従い、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧＬＯ発光アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して細胞生存率を測定した。一般に、（トリパンブルー色素排除試験法により測定した場合に）＞９０％生存率となるように細胞を９６ウェルプレートに一晩播種し、化合物又はｓｉＲＮＡで指定期間処理し、発光を測定することにより総合細胞生存率を測定した。
【０３８９】
カスパーゼ−ＧＬＯ  ３／７アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧＬＯ生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と並行使用してカスパーゼ−３活性を測定した。並行実験を実施し、一方の実験ではカスパーゼ−３／７活性を測定し、他方では細胞生存率を測定した。細胞１個当たりのカスパーゼ−３／７活性はカスパーゼ−３酵素の比活性と生存細胞数の両者を反映するので、カスパーゼ−３／７活性を細胞生存率で割った値としてデータを表す。
【０３９０】
イムノブロッティング及び免疫沈降
ＣＨＡＰＳ溶解用バッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％  ＣＨＡＰＳ）又は１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％  ＳＤＳ及び０．５％デオキシコール酸を含有する細胞抽出バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞溶解液を調製した。全バッファーに使用前にプロテアーゼとホスファターゼの阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）を加えた。イムノブロッティングでは、溶解液を３×ローディングバッファー（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と混合し、等量の蛋白質をＢｉｓ／Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で電気泳動により分離した。免疫沈降では、ＣＨＡＰＳ溶解バッファーで溶解液を調製し、細胞溶解液＞４ｍｇを少なくとも８μｇの免疫沈降抗体と４℃で一晩混合した。翌日、プロテインＡ−又はプロテインＧ−アガローススラリー３０μＬを更に２時間加えた。免疫沈降物をＣＨＡＰＳ溶解バッファーで３回洗浄し、１．５×ローディングバッファー中で９５℃に５分間加熱した。
【０３９１】
サイトゾルの精製
細胞約２０×ｌ０６個を氷冷ＰＢＳで１回リンスし、トリプシン処理し、２５℃にて２分間１，３００ｒｐｍで遠心した。細胞ペレットをＰＢＳで１回リンスし、マイクロ遠心管に移した。ペレットを均質化バッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，２５０ｍＭ  Ｄ−マンニトール，１ｍＭ  ＥＧＴＡ，１０ｍＭ  ＫＣｌ及び５ｍＭ  ＭｇＣｌ２＋ホスファターゼ及びプロテアーゼ阻害剤）２００μＬで３０分間膨潤させた後、Ｂ型乳棒を使用してダウンス型ホモジナイザーで５０ストローク均質化した。細胞ホモジネートを１，０００×ｇで５分間４℃にて２回遠心し、核酸及び細胞破片をペレット化した。上清を１０，０００×ｇで１０分間４℃にて遠心した。この遠心からのペレットを「ミトコンドリア」と称し、ＣＨＡＰＳ溶解バッファー８０μＬで更に抽出した。ミトコンドリアの抽出はサンプルを１分ずつ〜２０分間反復ボルテックスすることにより氷上で実施した。１４，０００×ｇで１０分間４℃にて遠心することにより最終抽出液を清澄化し、汚染性の細胞破片を除去した。サイトゾルと低密度の膜を含む１０，０００×ｇ上清を再び１００，０００×ｇ（ＴＬＡ  １２０．２ローターで５５，０００ｒｐｍ）で１時間遠心し、膜をペレット化した。上清を「サイトゾル」と称し、同一緩衝液中で直接煮沸した。
【０３９２】
薬剤−薬剤相互作用の測定
夫々Ａ及びＢの効果をもつ２つの薬剤の合計応答ＣをＣ＝Ａ＋Ｂ−（Ａ・Ｂ）（式中、Ａ及びＢは０〜１の阻害率を表す）で表すＢｌｉｓｓ相加性モデル（Ｂｅｒｅｎｂａｕｍ，Ｍ．Ｃ．，“Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔｓ，”Ａｄｖ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ３５，２６９−３３５（１９８１）参照）を使用してＶＸ−６８０と化学療法剤の相乗活性を求めた。１５よりも大きい合計応答得点を相乗とみなした。
【０３９３】
マイクロアレイによる遺伝子発現分析
凍結細胞ペレットを溶解させ、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ  ａｎｄ  ＲＮｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して全長ＲＮＡを単離した。マイクロアレイ製造業者のプロトコルに従って標識ｃＲＮＡを作製し、ヒトゲノムＵ１３３Ａ  ２．０アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）にハイブリダイズさせた。マイクロアレイデータファイルを解析用Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｒｅｓｏｌｖｅｒソフトウェアにロードし、Ｒｅｓｏｌｖｅｒの実験定義を使用して全プローブセットの強度値を正規化した。Ｒｅｓｏｌｖｅｒ内のクラスタリング解析は１処理条件で１．５倍以上変化した遺伝子を使用して凝集型アルゴリズムとピアソン相関を類似度測定に使用した。ｐ値が０．００１未満の差のみを示す。経路解析では、１．５倍カットオフを適用し、５％偽発見率をｐ値カットオフに使用した（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ，Ｙ．＆  Ｈｏｃｈｂｅｒｇ，Ｙ．，“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｅｓｔｉｎｇ，”Ｊ  Ｒ  Ｓｔａｔｉｓｔ  Ｓｏｃ  Ｂ  ５７，２８９−３００（１９９５）参照）。
【０３９４】
免疫沈降蛋白質の質量分析
内在性Ｂｃｌ−ＸＬ及びＭｃｌ−１をＨＣＴ１１６細胞から免疫沈降させた。質量分析用に処理するサンプルを１０ウェル×１ｍｍ  ４〜１２％  Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに１つ置きにロードし、横方向汚染を抑えた。ゲルを２００Ｖの定電圧でＭＯＰＳランニングバッファー中にて４５〜６０分間泳動させた後、５０％メタノール、７％酢酸の溶液で１５分間固定した。水でリンス後、ゲルをＳｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ蛋白質ゲル色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３時間室温にて処理した。完了後、ゲルを１０％メタノール、７％酢酸の溶液で１０分間脱染した後、洗浄し、水中で３０分間インキュベートした。次に緑色チャネルを使用してＦｕｊｉイメージャーで蛋白質バンドを撮像した。
【０３９５】
ゲルの各レーンを２４個の等寸法の切片に手動で切断し、９６ウェルプレートに加え、細断した。細断したゲル切片をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＭａｓｓＰｒｅｐユニットとシーケンシンググレード修飾トリプシン（６ｎｇ／μＬ）で３７℃にて５時間ゲル内トリプシン消化した。各サンプルについて抽出したペプチドを凍結乾燥後、５％アセトニトリル、０．１％ギ酸の溶液１０μＬに再懸濁した。Ｍｉｃｈｒｏｍ  Ｃ１８ＡＱマジック逆相樹脂を充填した１５ｃｍ分析用キャピラリーカラム（Ｉ．Ｄ．７５μｍ，粒径５μ，細孔寸法２００Å）に再懸濁サンプル９．５μＬを注入した。Ｅｉｋｓｉｇｅｎｔ  ｎａｎｏ−ＬＣユニットを３５分間直線勾配（０．１％ギ酸中１５−３５％アセトニトリル）中で使用してペプチドを溶出させた。続いてアセトニトリル組成を次の５分間で３５％から８０％まで上げることにより疎水性ペプチドを除去した。溶離液をリニアトラップ四重極型（ＬＴＱ）質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）のオリフィスに注入した。クロマトグラフィー分離時間の間、データ依存ダブルプレイモードでスキャンを収集した。
【０３９６】
哺乳動物分類に限定したＮＣＢＩ非冗長データベースに対してＭａｓｃｏｔ  Ｄａｅｍｏｎ  ｖ．２．２を使用して各ＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータファイルを検索した。最大２カ所のトリプシン切断ミス、固定修飾としてのカルボキシアミドメチル、可変修飾としての酸化メチオニン及び無傷ペプチドで＋１．２Ｄａとタンデム質量分析から生じたイオンで＋０．８Ｄａの質量窓を使用し、２＋〜３＋電荷状態のペプチドを検索した。ＭｕｄＰＩＴコンパイル特徴を使用してＳｃａｆｆｏｌｄ  ｖ．１．０でゲルレーンにより各データファイルのＭａｓｃｏｔ検索結果をコンパイルし、処理による蛋白質同定を得た。
【０３９７】
Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用してＢｃｌ−２ネットワークのインタラクトームマップを手動で構築した。全処理条件下でＢｃｌ−ＸＬ免疫沈降物から得られた全蛋白質同定の集合をＢｃｌ−２ネットワークマップに適用した。Ｍｃｌ−１免疫沈降物を同様に解析した。
【０３９８】
結果
ＶＸ−６８０／ＭＫ−０５４７及びＡＢＴ−２６３は相乗的細胞傷害作用を誘発する。
オーロラファミリーのセリン／スレオニンキナーゼを特異的標的とする小分子阻害剤は単独療法として臨床評価中であり、将来他の化学療法剤と併用されることは疑いない。治療薬としてオーロラキナーゼ阻害剤と併用することができる薬剤を実験により同定するために、汎オーロラ阻害剤であるＶＸ−６８０を１９種類の臨床薬及び治験薬である癌治療薬と共に細胞生存率に及ぼすその効果についてスクリーニングした。Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂｃｌ−２及びＢｃｌ−ｗを阻害する経口生体利用性小分子ＢＨ３ミメティックであるＡＢＴ−２６３（図８Ａ）とＶＸ−６８０を併用すると、ユニークな相乗活性が認められた（図８Ａ）。Ｂｌｉｓｓ解析の結果、ＶＸ−６８０は組織型に関係なく腫瘍細胞株でＡＢＴ−２６３と相乗的に作用することが判明し（例えばＤ５４ＭＧ（神経膠腫）、ＮＣＩ−Ｈ４６０及びＡ５４９（肺癌）、ＰＣ３（前立腺癌）、ＥＪ１（膀胱癌）、ＨＣＴ１１６、ＤＬＤ１及びＳＷ６２０（結腸癌）、並びに７８６−Ｏ（腎癌）；図８Ａ〜Ｂ、データは示さず）、これらの２種類の抗腫瘍薬に認められる相乗作用は癌細胞に広がる分子感受性を反映し得ると思われた。１９種類の臨床薬及び治験薬である癌治療薬の各々の標的／作用メカニズムと併用スクリーニングの対応する用量応答を下表Ａにまとめる。
【０３９９】
【表８】
2013512911.tif 000024
【０４００】
ＶＸ−６８０とＡＢＴ−２６３の相乗活性はオーロラＢとＢｃｌ−ＸＬの同時阻害に完全に帰属させることができる。
ＶＸ−６８０はオーロラＡ、Ｂ及びＣキナーゼの強力な阻害剤であり、Ｋｉ（概数）値は夫々０．６、１８及び４．６ｎＭである。オーロラＡの阻害は主に有糸分裂の遅延又は停止をもたらす（Ｍａｎｆｒｅｄｉ，Ｍ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＭＬＮ８０５４，ａｎ  ｏｒａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ａｕｒｏｒａ  Ａ  ｋｉｎａｓｅ，”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０４，４１０６−１１（２００７）参照）が、オーロラＢの阻害は顕著な倍数化をもたらす（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｒ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，“ＡＺＤ１１５２，ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ａｕｒｏｒａ  Ｂ  ｋｉｎａｓｅ，ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｂｙ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，”Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３，３６８２−８（２００７）参照）。従って、ＶＸ−６８０の汎オーロラプロファイルからＡＢＴ−２６３との相乗作用に十分なオーロラキナーゼ活性を引き出すことが重要であった。同様に、ＡＢＴ−２６３はＢｃｌ−ＸＬ、Ｂｃｌ−２及びＢｃｌ−ｗを同等効力で阻害し、夫々≦０．５、≦１及び≦１ｎＭのＫｉ値を示し、同様の合併症を示す。従って、これらの活性を逆重畳し、ｓｉＲＮＡと選択的小分子の両者を使用して相乗作用に十分な活性を求めた。ＡＢＴ−２６３と共に添加すると、オーロラＢ  ｓｉＲＮＡはＡＢＴ−２６３と相乗的に抗増殖性であったが、オーロラＡはそうではなく、どちらのｓｉＲＮＡも夫々の標的を効率的にノックダウンした（図９Ａ及び９Ｂ）。オーロラＡの小分子阻害剤であるＭＬＮ８０５４はオーロラＡ選択的濃度（＜５μＭ）でＡＢＴ−２６３（図９Ｃ）と相乗作用を示さなかった（Ｍａｎｆｒｅｄｉ，Ｍ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＭＬＮ８０５４，ａｎ  ｏｒａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ａｕｒｏｒａ  Ａ  ｋｉｎａｓｅ，”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０４，４１０６−１１（２００７）及びＬｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｕｒｏｒａ  Ｂ  ｋｉｎａｓｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓ  ａ  ｓｕｂｓｅｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ＴＲＡＩＬ  ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ  ｗｉｔｈ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＲＡＩＬ−Ｒ２，”Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ，Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ（２００８）参照）。これに対して、ＡＢＴ−２６３をオーロラＢ選択的阻害剤であるＡＺＤ１１５２と併用した場合には相乗作用が認められた（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｒ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，“ＡＺＤ１１５２，ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ａｕｒｏｒａ  Ｂ  ｋｉｎａｓｅ，ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｂｙ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，”Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３，３６８２−８．（２００７）及びＭｏｒｔｌｏｃｋ，Ａ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｐｙｒａｚｏｌｏｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｅｓ  ａｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ａｕｒｏｒａ  Ｂ  ｋｉｎａｓｅ，”Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５０，２２１３−２４（２００７）参照）（図９Ｄ）。
【０４０１】
ＡＢＴ−２６３はＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ及びＢｃｌ−ｗを阻害するが、Ｍｃｌ−１やＢｃｌ−Ａｌ等のＢｃｌ−２ファミリーの他の抗アポトーシスメンバーに対しては比較的不活性である。Ｂｃｌ−２とＢｃｌ−ＸＬは多くのヒト癌細胞で広く発現されるので、これらの２種類のＡＢＴ−２６３標的が阻害された場合にはそのどちらがＡＺＤ１１２との併用下でＡＢＴ−２６３に認められる相乗活性を表現型模写するのかを調べるために、ｓｉＲＮＡを使用した。種々の起源の癌細胞（ＨＣＴ１１６、ＤＬＤ１、ＥＪ１、ＰＣ３、Ｄ５４ＭＧ）にトランスフェクトした場合に、Ｂｃｌ−ＸＬ  ｓｉＲＮＡはＡＺＤ１１５２と共に細胞増殖の相乗的阻害を示したが、ルシフェラーゼ、Ｂｃｌ−２又はＭｃｌ−１  ｓｉＲＮＡは示さなかった（図９Ｅ〜図９Ｇ、データは示さず）。従って、Ｂｃｌ−ＸＬの阻害はオーロラＢ阻害と共働し、これらの細胞株に細胞死を誘導するが、Ｂｃｌ−２では誘導されない。Ｂｃｌ−ＸＬ及びオーロラＢ  ｓｉＲＮＡは更に相乗的に抗増殖性であった（図９Ｈ）。総合すると、これらのデータからＶＸ−６８０とＡＢＴ−２６３の相乗活性はオーロラＢとＢｃｌ−ＸＬの阻害に完全に帰属できると判断される。
【０４０２】
ＡＢＴ−２６３は倍数体細胞に迅速なアポトーシスを誘発する。
倍数性はオーロラＢの持続的阻害に結び付けられる最終的な細胞結末であるため、本発明者らはＢｃｌ−ＸＬ阻害と倍数化がオーロラＢから独立して相乗的に細胞傷害性であるか否かを調べることにした。ＣＰＣはオーロラＢ、スルビビン、ＩＮＣＥＮＰ及びボレアリンを含む上位群であり、有糸分裂紡錘体アセンブリチェックポイントの中核である（Ｒｕｃｈａｕｄ，Ｓ．，Ｃａｒｍｅｎａ，Ｍ．＆  Ｅａｒｎｓｈａｗ，Ｗ．Ｃ．，“Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｐａｓｓｅｎｇｅｒｓ：ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ，”Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８，７９８−８１２（２００７）参照）。ＣＰＣの分裂は細胞質分裂の失敗と倍数性をもたらす（Ｈｏｎｄａ，Ｒ．，Ｋｏｒｎｅｒ，Ｒ．＆  Ｎｉｇｇ，Ｅ．Ａ．，“Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ａｕｒｏｒａ  Ｂ，ＩＮＣＥＮＰ，ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｉｎ  ｍｉｔｏｓｉｓ”Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １４，３３２５−４１（２００３）参照）。倍数性に対する防衛というＩＮＣＥＮＰの役割（Ｕｒｅｎ，Ａ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｎｅｒ  ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＮＣＥＮＰ  ｓｈｏｗ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｃｅｌｌ−ｃｙｃｌｅ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ，”Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １０，１３１９−２８（２０００）参照）に従い、ＩＮＣＥＮＰ  ｓｉＲＮＡは複数の小核をもつ非常に大きな細胞等の倍数性の形態的特徴を誘導した（データは示さず）。ＩＮＣＥＮＰのノックダウンはＢｃｌ−ＸＬノックダウンと相乗的に抗増殖性であり（図１０Ａ〜Ｂ）、Ｂｃｌ−ＸＬの阻害は倍数体細胞に有害であると思われた。他方、ＩＮＣＥＮＰを標的としてｓｉＲＮＡを投与してもオーロラＢは非局在化され、その活性は阻害される（Ｋｌｅｉｎ，Ｕ．Ｒ．，Ｎｉｇｇ，Ｅ．Ａ．＆  Ｇｒｕｎｅｂｅｒｇ，Ｕ．，“Ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｐａｓｓｅｎｇｅｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ａ  ｔｅｒｎａｒｙ  ｓｕｂｃｏｍｐｌｅｘ  ｏｆ  Ｂｏｒｅａｌｉｎ，Ｓｕｒｖｉｖｉｎ，ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ＩＮＣＥＮＰ，”Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １７，２５４７−５８（２００６）参照）。従って、ＩＮＣＥＮＰ  ｓｉＲＮＡの効果をオーロラＢの分裂から完全に切り離すことはできない。細胞をＢｃｌ−ＸＬ阻害に対して感受性にするためには倍数性だけで十分であったか否かを最終点に判定するために、細胞をＡＺＤ１１５２で処理して倍数性を誘導し、薬剤をウォッシュアウトし、オーロラＢ活性が回復するまで倍数体細胞を培養した。倍数性は野生型ｐ５３を保有する細胞における倍数化の代替マーカーであるｐ５３（Ｇｉｚａｔｕｌｌｉｎ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ａｕｒｏｒａ  Ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＶＸ−６８０  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｅｎｄｏｒｅｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｉｎ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ  ｐ５３−ｄｅｐｅｎｄｅｎ��  ｐｏｓｔｍｉｔｏｔｉｃ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，”Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６，７６６８−７７．（２００６），Ｌｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｕｒｏｒａ  Ｂ  ｋｉｎａｓｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓ  ａ  ｓｕｂｓｅｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ＴＲＡＩＬ  ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ  ｗｉｔｈ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＲＡＩＬ−Ｒ２，”Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ，Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ（２００８）及びＫｏｊｉｍａ，Ｋ．，Ｋｏｎｏｐｌｅｖａ，Ｍ．，Ｔｓａｏ，Ｔ．，Ｎａｋａｋｕｍａ，Ｈ．＆  Ａｎｄｒｅｅｆｆ，Ｍ．，“Ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｄｍ２−ｐ５３  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｕｒｏｒａ  Ｋｉｎａｓｅｓ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｐ５３−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｏｓｔｍｉｔｏｔｉｃ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ  ａｎｄ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｐ５３−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｌｏｎｇ  ｗｉｔｈ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｅｎｄｏｒｅｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ，”Ｂｌｏｏｄ  １１２，２８８６−９５（２００８）参照）の発現増加（図１０Ｃ）と、細胞寸法の著しい形態的増加と多核化（図１０Ｄ）により立証された。ＡＺＤ１１５２ウォッシュアウト後、ヒストンＨ３リン酸化は未処理レベルに戻り、倍数体細胞（図１０Ｄ）ではオーロラＢ活性が完全に回復している（図１０Ｃ）と判断された。ＡＢＴ−２６３はオーロラＢの活性化状態から独立して倍数体細胞にカスパーゼ−３活性と生存率低下を誘導したが、二倍体細胞には誘導しなかった（図１０Ｅ〜Ｆ）。これらのデータは倍数性の急性誘導が細胞生存をＢｃｌ−ＸＬの抗アポトーシス活性に依存性にすることを示唆している。
【０４０３】
倍数化は生存負荷をＢｃｌ−ＸＬへとシフトさせる。
マルチドメインアポトーシス蛋白質ＢＡＸ及びＢＡＫは共働してアポトーシスに不可欠な入口を構成する（Ｗｅｉ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ＢＡＸ  ａｎｄ  ＢＡＫ：ａ  ｒｅｑｕｉｓｉｔｅ  ｇａｔｅｗａｙ  ｔｏ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅａｔｈ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２，７２７−３０（２００１）及びＺｏｎｇ，Ｗ．Ｘ．，Ｌｉｎｄｓｔｅｎ，Ｔ．，Ｒｏｓｓ，Ａ．Ｊ．，ＭａｃＧｒｅｇｏｒ，Ｇ．Ｒ．＆  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．，“ＢＨ３−ｏｎｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄ  ｐｒｏ−ｓｕｒｖｉｖａｌ  Ｂｃｌ−２  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｆａｉｌ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ＢＡＸ  ａｎｄ  ＢＡＫ，”Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １５，１４８１−６（２００１）参照）。Ｂｃｌ−ＸＬ中和が倍数体細胞に細胞死を誘発するメカニズムの解明を開始するために、活性なＢＡＸ及びＢＡＫコンフォーマーを選択的に認識する抗体を使用してＡＺＤ１１５２で倍数体にした細胞中のＢＡＸ及びＢＡＫの活性化を試験した。倍数体ＨＣＴ１１６、Ｄ５４ＭＧ、ＳＷ６２０及びＥＪ１細胞にＡＢＴ−２６３を加えると、迅速且つ相乗的にＢＡＸとＢＡＫの活性化を誘導した（図１１Ａ及び図１４）。アポトーシス関与における決定的なイベントであるミトコンドリアからサイトゾルへのチトクロームＣ放出によりＢＡＸとＢＡＫの活性化を追跡した（図１１Ｂ）。
【０４０４】
ＢＡＸとＢＡＫのアポトーシス促進機能は通常ではＢｃｌ−ＸＬやＭｃｌ−１等のＢｃｌ−２ファミリーの抗アポトーシスメンバーにより阻害され、内在経路によるアポトーシスの閾値を決定するのはＢＨ３−ｏｎｌｙ蛋白質とマルチドメイン蛋白質間の相互作用のバランスである（Ｋｉｍ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｂｙ  ＢＣＬ−２  ｓｕｂｆａｍｉｌｉｅｓ，”Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８，１３４８−５８（２００６）及びＷｉｌｌｉｓ，Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，“Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  ｗｈｅｎ  ＢＨ３  ｌｉｇａｎｄｓ  ｅｎｇａｇｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｂｃｌ−２  ｈｏｍｏｌｏｇｓ，ｎｏｔ  ＢＡＸ  ｏｒ  ＢＡＫ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１５，８５６−９（２００７）参照）。倍数体細胞で認められた結果とは対照的に、Ｂｃｌ−ＸＬの中和は二倍体又は異数体細胞にアポトーシスを誘発するには通常では不十分である（図８Ｃ）。どのようにして倍数化がアポトーシス機構の要素を絡み合わせ、倍数体細胞生存をＢｃｌ−ＸＬ依存性にするのかを解明するために、Ｂｃｌ−２ネットワークを倍数化に応じてｍＲＮＡ及び蛋白質レベルでモニターした。Ｂｃｌ−２ネットワーク遺伝子の階層的クラスタリングによると、倍数化の転写プロファイル（ＶＸ−６８０及びＡＺＤ１１５２）は一貫してオーロラＡ阻害（ＭＬＮ８０５４）と最も類似しているが、細胞株間では相違していることが分かった（図１５）。蛋白質レベルでは、多数のアポトーシス促進性ＢＨ３−ｏｎｌｙ蛋白質が倍数化後にアップレギュレートされた（図１１Ｃ）。ＰＵＭＡとＮＯＸＡの増加は細胞株間で保存された効果であったが、ｔＢＩＤ、ＢＩＫ、ＢＩＭ及びＢＡＸは細胞株依存的に増加した。Ｂｃｌ−２とＢｃｌ−ＸＬでは発現変化はほんの僅かしか認められなかったが、Ｍｃｌ−１はＨＣＴ１１６、ＳＷ６２０及びＥＪ１細胞で著しく減少した（図１１Ｃ、データは示さず）。ＮＯＸＡはＭｃｌ−１と結合し、その抗アポトーシス機能を阻害する（Ｃｈｅｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｓｕｒｖｉｖａｌ  Ｂｃｌ−２  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｔｈｅｉｒ  ＢＨ３−ｏｎｌｙ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｌｌｏｗｓ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，”Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  １７，３９３−４０３（２００５）参照）。従って、Ｄ５４ＭＧにおけるＮＯＸＡのアップレギュレーションはＭｃｌ−１に拮抗すると予想されるが、Ｄ５４ＭＧ細胞中のＭｃｌ−１の量は減少しなかった（図１１Ｃ）。総合すると、倍数化はＭｃｌ−１機能を低下しながらアポトーシスのエフェクターを誘導した。細胞生存はこの倍数化期間中に維持されるので、生存率を支えるための負荷はＭｃｌ−１からＢｃｌ−ＸＬにシフトすると推測された。
【０４０５】
遺伝子発現はＢｃｌ−２ネットワークが変調される１つのレベルに相当するが、アポトーシス促進蛋白質と抗アポトーシス蛋白質間の結合イベントの蓄積が最終的に生存とアポトーシスのバランスを決定する。Ｂｃｌ−ＸＬ及びＭｃｌ−１インタラクトームを経験的に構築し、これらの相互作用に及ぼす倍数化の効果をモニターした。ＨＣＴ１１６細胞をＤＭＳＯ、ＡＢＴ−２６３、ＡＺＤ１１５２又はＡＺＤ１１５２とＡＢＴ−２６３で処理した。次に内在性Ｂｃｌ−ＸＬ又はＭｃｌ−１を免疫沈降させ、免疫複合体をゲル内トリプシン消化とＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより解析した。全処理から蛋白質同定を集め、検出された全Ｂｃｌ−ＸＬ及びＭｃｌ−１相互作用を表す複合インタラクトームを得た（図１６）。次に各処理条件下の共免疫沈降とイムノブロッティングにより相互作用を確認した（図１１Ｄ〜Ｅ）。ＩｇＧアイソタイプをマッチさせた抗体を使用して抗Ｓ６Ｋｌ免疫沈降物中に免疫沈降蛋白質は全く検出されず（図１Ｅ〜Ｆ）、これらの相互作用の特異性が明白になった。倍数体細胞（ＡＺＤ１１５２）では、Ｂｉｋ及びｔＢｉｄとＢｃｌ−ＸＬの相互作用は増加したが、ＢＡＤ、ＢＩＭ、ＢＡＸ及びＰＵＭＡの結合は変わらず（図１１Ｅ）、Ｂｃｌ−ＸＬは倍数化後に益々アポトーシス促進蛋白質の負荷を受けることが分かった。Ｍｃｌ−１蛋白質レベルの低下と一致して、倍数体細胞では免疫沈降により捕捉されるＭｃｌ−１の量は低下した（図１１Ｅ）。更に、倍数化中にＮＯＸＡ結合には化学量論的増加があった（図１１Ｅ）。更に、Ｍｃｌ−１とＢｉｍ及びＰｕｍａとの結合は倍数体細胞では有意に低下し（図１１Ｅ）、Ｍｃｌ−１の減少とそれに伴うＮＯＸＡの増加はＭｃｌ−１を部分的に中和するために十分であったと考えられた。
【０４０６】
Ｂｃｌ−ＸＬ／オーロラＢ阻害剤相乗作用に必要なＢｃｌ−２ネットワーク成分の同定
複数のＢｃｌ−２ファミリー蛋白質が発現及び／又は蛋白質−蛋白質相互作用のレベルで倍数化により変調されたが、倍数体細胞をＢｃｌ−ＸＬ阻害に対して感受性にするために必須のものがあるならば、それが何であるかは不明であった。Ｂｃｌ−ＸＬ及びＭｃｌ−１インタラクトームに重点をおいてｓｉＲＮＡスクリーニングを実施し、ノックダウン後にオーロラＢとＢｃｌ−ＸＬの二重阻害の存在下で生存率を回復できたＢｃｌ−２ネットワークの要素を同定した。ＮＯＸＡ、ＢＡＸを標的とする複数のｓｉＲＮＡと、程度は劣るが、ＢＡＫを標的とするｓｉＲＮＡが倍数体細胞をＡＢＴ−２６３介在性細胞死から救出することが判明した（図１２Ａ及び図１７）。実際に、数種類の細胞株におけるＮＯＸＡ及びＢＡＸのｓｉＲＮＡ介在性減少は倍数体細胞をＢｃｌ−ＸＬ阻害に耐性にした（図１２Ｂ及び図１７）。これらのデータは倍数体細胞中のＢｃｌ−ＸＬ阻害の相乗活性におけるＮＯＸＡ及びＢＡＸの原因的役割を示唆している。
【０４０７】
Ｎｏｘａ阻害が倍数体細胞をＡＢＴ−２６３介在性アポトーシスからどのように保護するかを更に解明するために、対照又はＮＯＸＡ  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞における倍数化前後のＢｃｌ−ＸＬ及びＭｃｌ−１インタラクトームを比較した。上記と同様に、ＡＺＤ１１５２を使用して倍数体にされた細胞ではＭｃｌ−１蛋白質の減少とＮＯＸＡとＭｃｌ−１の化学量論的増加が認められた（図１２Ｄ）。ＮＯＸＡの減少は倍数体細胞におけるＰｕｍａ及びＢｉｍとＭｃｌ−１の結合を回復させ、アポトーシス促進エフェクターと結合するＭｃｌ−１の能力が回復していると判断された。ＡＺＤ１１５２／ＡＢＴ−２６３により誘導されるアポトーシスはＭｃｌ−１ノックダウンにより強化されるので、倍数化中のＭｃｌ−１の阻害はＢｃｌ−ＸＬ依存を生じるには十分であるが、不完全であると思われる（図１９）。
【０４０８】
倍数化介在性アポトーシスはオーロラＢ／Ｂｃｌ−ＸＬの二重阻害とは別のメカニズムを含む。
癌細胞は倍数化中に生存細胞集団を蓄積し、ＡＺＤ１１５２の添加から１週間後まで蓄積し続ける。しかし、倍数性の発生から１０日後に、細胞は倍数化プロセスに屈服するため、生存率は急激に低下する（図１８）。長期倍数化後のアポトーシスがオーロラＢ／Ｂｃｌ−ＸＬの二重阻害に比較して遅れる以外は同一のアポトーシスプログラムに従うか否かを調べるために、別のｓｉＲＮＡレスキュースクリーニングを実施し、機能的に妨害されたときに倍数体細胞の長期生存率を維持するＢｃｌ−２ネットワークの成分を同定した（図１２Ｅ）。ＡＺＤ１１５２／ＡＢＴ−２６３組合せにより誘導される急性アポトーシスには主にＢＡＸとＮＯＸＡが必要であるが、ＢＡＸとＢＡＫに対するｓｉＲＮＡは同程度の保護を付与し、初期レスキュースクリーニングで無効であったＢＩＫとＢＩＤに対するｓｉＲＮＡは倍数化介在性の生存率低下から細胞を保護した（図１２Ｆ）。更に、ＮＯＸＡの減少はこの状況で保護効果を生じることができなかった（図１２Ｆ）。
【０４０９】
ＡＢＴ−２６３はオーロラキナーゼ阻害剤の効力をインビボ増強する。
オーロラキナーゼ阻害剤は前臨床試験で有効であることが分かっているが、倍数体腫瘍細胞中でＢｃｌ−ＸＬを標的とすると、単独療法としてのオーロラキナーゼ阻害剤よりも優れた効力を発揮すると思われる。既知の大型腫瘍（〜０．５ｇ）とＡＺＤ１１５２の最大耐量というストリンジェントな治療該当条件で単剤ＡＺＤ１１５２投与の抗腫瘍効力をＡＺＤ１１５２／ＡＢＴ−２６３の併用と比較することによりこれを評価した。単剤としてのＡＺＤ１１５２はＨＣＴ１１６結腸癌モデルで有意な腫瘍増殖阻害を生じたが、（腫瘍再増殖により明らかなように）腫瘍は１週間以内に治療から回復し始めた。これに対して、ＡＺＤ１１５２／ＡＢＴ−２６３の併用レジメンは迅速でより持続的な腫瘍退縮を生じ、退縮は少なくとも２週間持続した（図１３Ａ）。３日間ＡＺＤ１１５２を前投与した腫瘍では、倍数化の代替マーカーであるｐ５３の誘導が認められた（図６Ｂ）。ＡＺＤ１１５２を投与したマウスからの腫瘍にはＡＢＴ−２６３投与から４時間以内に活性なＢＡＸコンフォーマーが検出されたが、ナイーブ腫瘍には検出されず、倍数体腫瘍細胞におけるＡＢＴ−２６３介在性アポトーシスの迅速な開始を裏付けた（図１３Ｂ）。
【０４１０】
本発明が目的を実施し、記載した結果と利点及びそれに内在する結果と利点を得るために好適であることは当業者に容易に理解されよう。本願に記載する分子複合体と、方法、手順、処理、分子、特定化合物は好ましい側面の目下の代表であり、例示であり、本発明の範囲を制限するものではない。本発明の範囲と趣旨から逸脱せずに本願に開示する発明に種々の代用及び変更を実施してもよいことは当業者に容易に理解されよう。
【０４１１】
本明細書に引用した全特許及び刊行物は本発明が属する分野の当業者の技術水準を示す。全特許及び刊行物は各個刊行物を個別に本願に援用すると記載すると同程度まで本願に援用する。本願に具体的に記載する発明は本願に具体的に開示しない１以上の要素、限定の不在下で実施することができる。従って、例えば、本願で各場合に、「含む」、「本質的に〜から構成される」及び「〜から構成される」なる用語は他の２種類の用語のいずれかで置き換えることができる。利用した用語及び表現は限定ではなく、説明の用語として使用しており、明示及び記載する構成要素又はその部分の等価物をこのような用語及び表現の使用で除外するという意図はなく、請求する本発明の範囲内で各種変更が可能であるとみなされる。従って、当然のことながら、好ましい側面と非必須構成要素により本発明を具体的に開示したが、当業者は本願に開示した概念の変更及び変形も採用することができ、このような変更及び変形も以下の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲内に含むものとみなす。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１７Ｇ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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