(57)【要約】  本発明は、スルホン化非対称ペンタメチン光学色素組成物、特にインビトロでの生物学的用途及びインビボイメージングのために適した色素に関する。望ましくない新たに同定された不純物の抑制を可能にする改良色素組成物及び中間体が提供される。また、生物学的ターゲティング分子とのコンジュゲートの製造における改良色素組成物の使用も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式Ａの非対称シアニン色素を次の式Ｂ及び式Ｃの対称シアニン色素と共に含んでなる色素組成物であって、９２％以上のＡを２％未満のＢ及び２％未満のＣと共に含むことを特徴とする色素組成物。
【化１】
2013534557.tif 000017
（前記組成物中で、
Ｒ1及びＲ2は独立にＨ、−ＳＯ3Ｍ1（式中、Ｍ1はＨ又はＢcであり、Ｂcは生体適合性陽イオンである。）又はＲaであり、
Ｒ3はＨ又はＲd基であり、
Ｒ4及びＲ5は独立にＲd基であり、
Ｒ6〜Ｒ9は独立にＣ1-3アルキル又はＲc基であって、式Ａ中でＲ6〜Ｒ9の少なくとも１つがＲcであるように選択され、
ＲaはＣ1-4スルホアルキルであり、
ＲbはＣ1-6カルボキシアルキルであり、
ＲcはＲa又はＲb基であり、
ＲdはＣ1-5アルキル又はＲc基であり、
式Ａ中で
（ｉ）置換基対Ｒ1／Ｒ2、Ｒ4／Ｒ5、Ｒ6／Ｒ8及びＲ7／Ｒ9の少なくとも１つは異なっており、
（ｉｉ）該シアニン色素は１個以上のＲb基並びにＲ1、Ｒ2、Ｒa及びＲc基から選択される全部で３〜６個のスルホン酸置換基を含む
ことを条件とする。）
【請求項２】
Ｒ3がＨである、請求項１記載の色素組成物。
【請求項３】
Ｒ6〜Ｒ9が独立にＣＨ3又はＲc基である、請求項１又は請求項２記載の色素組成物。
【請求項４】
さらに次の式Ｈのアシル化インドールを１％未満含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の色素組成物。
【化２】
2013534557.tif 000018
（式中、
Ｒ6及びＲ7は独立にＣ1-3アルキル又はＲc基であって、式Ｈ中でＲ6及びＲ7の少なくとも１つがＲc基であるように選択され、
Ｒ1及びＲcは請求項１で定義した通りである。）
【請求項５】
さらに、式中のＲ1及びＲ2の少なくとも１つが−ＳＯ2−ＯＲd（式中、Ｒdは請求項１で定義した通りである。）である式Ａ、Ｂ又はＣの色素にそれぞれ対応する式Ａ1、Ｂ1又はＣ1のスルホネートエステル誘導体を１％未満含む、請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の色素組成物。
【請求項６】
次の式Ｅのヘミシアニン色素及び次の式Ｚのアミジン塩を含んでなる色素中間体組成物であって、９２％以上のＥを２％未満のＺと共に含むことを特徴とする色素中間体組成物。
【化３】
2013534557.tif 000019
（前記組成物中で、Ｒ1、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ6及びＲ7は請求項１で定義した通りである。）
【請求項７】
次の式Ｆのインドリニウム塩及び次の式Ｇのインドールを含んでなる色素頭部基組成物であって、９２％以上のＦ及び３％未満のＧを含むことを特徴とする色素頭部基組成物。
【化４】
2013534557.tif 000020
（前記組成物中で、
Ｒ1及びＲ4は請求項１で定義した通りであり、
Ｒ6及びＲ7は独立にＣ1-3アルキル又はＲc基であって、式Ｆ及び式Ｇ中でＲ6及びＲ7の少なくとも１つがＲc基であるように選択される。）
【請求項８】
請求項６記載の色素中間体組成物の製造方法であって、請求項７記載の色素頭部基組成物を請求項６に記載した式Ｚのアミジン塩の１．０５〜１．２５モル当量と反応させることを含んでなる方法。
【請求項９】
請求項７に記載した式Ｇのインドール及び次の式Ｈのアシル化インドールを含んでなるインドール組成物であって、９０％以上のＧ及び５％未満のＨを含むことを特徴とするインドール組成物。
【化５】
2013534557.tif 000021
（式中、
Ｒ1は請求項１で定義した通りであり、
Ｒ6及びＲ7は独立にＣ1-3アルキル又はＲc基であって、式Ｇ及び式Ｈ中でＲ6及びＲ7の少なくとも１つがＲc基であるように選択される。）
【請求項１０】
請求項７記載の頭部基組成物の製造方法であって、請求項９記載のインドール組成物を式Ｒ4−Ｘ（式中、Ｒ4は請求項１で定義した通りであり、Ｘは脱離基である。）のアルキル化剤と反応させることを含んでなる方法。
【請求項１１】
請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の色素組成物の製造方法であって、請求項６記載の中間体組成物を次の式Ｊのインドリニウム塩の１モル当量と反応させることを含んでなる方法。
【化６】
2013534557.tif 000022
（式中、
Ｒ2及びＲ5は請求項１で定義した通りであり、
Ｒ8及びＲ9は独立にＣ1-3アルキル又はＲc基である。）
【請求項１２】
請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の色素組成物を哺乳動物への投与に適した無菌形態で生体適合性キャリヤー媒質中に含んでなる医薬組成物。
【請求項１３】
式Ａの非対称色素と生物学的ターゲティング部分又は合成巨大分子とのコンジュゲートの製造における、請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の色素組成物又は請求項１２記載の医薬組成物の使用。
【請求項１４】
生物学的ターゲティング部分が、
（ｉ）３〜１００量体ペプチド、
（ｉｉ）酵素基質、酵素アンタゴニスト又は酵素阻害剤、
（ｉｉｉ）レセプター結合化合物、
（ｉｖ）オリゴヌクレオチド、及び
（ｖ）オリゴＤＮＡ又はオリゴＲＮＡフラグメント
から選択される、請求項１３記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スルホン化非対称ペンタメチン光学色素の分野、特にインビトロでの生物学的用途及びインビボイメージングのために適した色素に関する。望ましくない新たに同定された不純物の抑制を可能にする改良色素組成物及び中間体が提供される。
【背景技術】
【０００２】
スルホネート（−ＳＯ3Ｈ又は−ＳＯ3-）置換基の導入による色素のスルホン化は、色素の水溶性を高めるための確立された方法である。
【０００３】
国際公開第２００５／０４４９２３号及び米国特許出願公開第２００７／０２０３３４３号は、生物学的分子の標識及び検出のために有用な新しい種類のスルホン化ペンタメチン及びヘプタメチンシアニン色素の合成法を開示している。非対称シアニン色素Ｃｙ７及びそのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルの合成法が含まれている。
【０００４】
【化１】
2013534557.tif 000002
国際公開第２００５／１２３７６８号は、スルホン化シアニン色素とＲＧＤペプチドとのコンジュゲート及び診断用光学イメージング技法における該コンジュゲートの使用を開示している。
【０００５】
Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ［Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．，４８，５８２５−５８２９（２００７）］は、可溶性支持体としてポリ（エチレングリコール）を用いて非対称水溶性シアニン色素を合成するための効率的なアプローチを開示している。
【０００６】
国際公開第２００８／１３９２０６号は、特定の種類の非対称ペンタメチンシアニン色素の合成法及びインビボ光学イメージング用イメージング剤としてのその使用を開示している。国際公開第２００８／１３９２０６号の実施例３は、次のＣｙ５**の合成法を示している。
【０００７】
【化２】
2013534557.tif 000003
式中、Ｍ1はＨ又は生体適合性陽イオンである。
【０００８】
しかし、先行技術の色素合成法、特に非対称シアニン色素合成法は、試料装填の点から考えてミリグラムスケールに最も適する複雑で労働集約的な精製方法（例えば、分取ＨＰＬＣ）の使用による低い収量に欠点がある。生物学的用途、特にインビボ光学イメージングのために使用する場合、かかる色素は不要の不純物を抑制しながら医薬品グレードにおいてマルチグラムの量で得られることが必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００５／０４４９２３号
【特許文献２】米国特許出願公開第２００７／０２０３３４３号
【特許文献３】国際公開第２００５／１２３７６８号
【特許文献４】国際公開第２００８／１３９２０６号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Jiang et al, Tet.  Lett.,  48,  5825-5829  (2007)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、非対称スルホン化光学色素の合成において有用な組成物であって、以前には認識されなかった不純物が同定されかつ抑制される組成物を提供する。かかる不純物の同定及び制御は、医薬品製造品質管理基準（ＧＭＰ）にとって重要である。非対称光学色素の合成において有用な色素中間体組成物、並びに主要不純物の抑制によって改良された色素組成物を与える色素製造方法も提供される。
【００１２】
本発明は、不要の不純物を抑制しながら医薬品グレードにおいてグラム単位の量でスルホン化非対称ペンタメチンシアニン色素を製造することを可能にする。本組成物及び方法は、生物学的用途のためのかかるスルホン化色素を製造する場合、特にインビボ光学イメージングのために該色素と生物学的分子とのコンジュゲートを製造する場合に特に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
第１の態様では、本発明は、次の式Ａの非対称シアニン色素を次の式Ｂ及び式Ｃの対称シアニン色素と共に含んでなる色素組成物であって、９２％以上のＡを２％未満のＢ及び２％未満のＣと共に含むことを特徴とする色素組成物を提供する。
【００１４】
【化３】
2013534557.tif 000004
前記組成物中で、
Ｒ1及びＲ2は独立にＨ、−ＳＯ3Ｍ1（式中、Ｍ1はＨ又はＢcであり、Ｂcは生体適合性陽イオンである。）又はＲaであり、
Ｒ3はＨ又はＲd基であり、
Ｒ4及びＲ5は独立にＲd基であり、
Ｒ6〜Ｒ9は独立にＣ1-3アルキル又はＲc基であって、式Ａ中でＲ6〜Ｒ9の少なくとも１つがＲcであるように選択され、
ＲaはＣ1-4スルホアルキルであり、
ＲbはＣ1-6カルボキシアルキルであり、
ＲcはＲa又はＲb基であり、
ＲdはＣ1-5アルキル又はＲc基であり、
式Ａ中で
（ｉ）置換基対Ｒ1／Ｒ2、Ｒ4／Ｒ5、Ｒ6／Ｒ8及びＲ7／Ｒ9の少なくとも１つは異なっており、
（ｉｉ）該シアニン色素は１個以上のＲb基並びにＲ1、Ｒ2、Ｒa及びＲc基から選択される全部で３〜６個のスルホン酸置換基を含む
ことを条件とする。
【００１５】
「組成物」という用語は、式Ａ、式Ｂ及び式Ｃの化合物並びに場合によっては他の化合物からなる混合物を意味する。組成物は乾燥形態であってもよいし、或いは溶液状態の混合物であってもよい。
【００１６】
「対称」という用語は、例えば式Ｂにおいて、式中のＲ1、Ｒ4、Ｒ6及びＲ7基の各対が同一である結果、メチン鎖の末端にある各インドール頭部基部分上の置換基のパターンが同一であることを意味する。「非対称」という用語は、式Ａにおいて、Ｒ1、Ｒ4、Ｒ6及びＲ7の少なくとも１つが他方の頭部基上にあるそれぞれの対応置換基Ｒ2、Ｒ5、Ｒ8及びＲ9と異なることを意味する。その結果、メチン鎖の末端にある各インドール頭部基部分上の置換基のパターンが異なる。
【００１７】
「生体適合性陽イオン」（Ｂc）という用語は、イオン化して負に帯電した基（この場合にはスルホネート基）と共に塩を形成する正に帯電した対イオンを意味する。ここで、前記正に帯電した対イオンも無毒性であり、したがって哺乳動物体（特に人体）への投与に適している。好適な生体適合性陽イオンの例には、アルカリ金属であるナトリウム及びカリウム、アルカリ土類金属であるカルシウム及びマグネシウム、並びにアンモニウムイオンがある。好ましい生体適合性陽イオンはナトリウム及びカリウムであり、最も好ましくはナトリウムである。
【００１８】
「対称シアニン色素を２％未満含む」という用語は、組成物が式Ｂの対称シアニン色素を２．０モル％未満含みかつ式Ｃの対称シアニン色素を２．０モル％未満含むことを意味する。
【００１９】
本発明の組成物を用いて製造できる「色素」には、シアニン色素がある。かかる色素はスルホン化されている。「スルホン化されている」という用語は、前記色素が１個以上のスルホン酸置換基を有することを意味する。「スルホン酸置換基」という用語は式−ＳＯ3Ｍ1の置換基を意味し、式中のＭ1はＨ又はＢc（ここで、Ｂcは生体適合性陽イオンである。）である。−ＳＯ3Ｍ1置換基は炭素原子に共有結合しており、かかる炭素原子はアリール又はアルキルであり得る。
【００２０】
式Ａの非対称シアニン色素のいくつかは先行技術で知られているものの、第１の態様の非対称シアニン色素組成物は理解されていなかった。それは、主要不純物の正体が知られていなかったからである。かかる不純物を同定することに加えて、本発明は、かかる不純物を制御して改良された組成物を与えるための方法を提供する。同様な光学的性質を有する式Ｂ及び式Ｃの対称不純物色素は、インビトロ及びインビボでの式Ａの色素の生物学的用途を妨害するかもしれない。ひとたび生成されて組成物中に存在すると、これらの不純物色素は所望の非対称色素と同様な特性を有する。その結果、これらを製造規模でクロマトグラフィーにより分離するのは困難であり、したがって最初にこれらの生成を抑制することが重要である。本発明は、合成全体を通して初期及び重要段階で不純物を抑制するための色素中間体及び合成方法を提供することでその問題を解決する。色素組成物中において対称不純物色素が抑制されなければ、色素を生物学的ターゲティング部分又は合成ポリマーにコンジュゲートする際にこれらもコンジュゲートされる結果、収量の減少及びコンジュゲートの精製時における問題の増加が生じることがある。
【００２１】
「含む」という用語は、本願全体を通してその通常の意味を有していて、組成物は記載された成分を有していなければならないが、それに加えて他の明記されない化合物又は化学種が存在してもよいことを意味する。「含む」という用語は、好ましい部分集合として、組成物が他の化合物又は化学種の存在なしに記載された成分を有することを意味する「から本質的になる」を包含する。
【００２２】
好ましい態様
第１の態様の色素組成物は、好ましくは９４％以上のＡを１．５％未満のＢ及び１．５％未満のＣと共に含んでいる。式Ｂ中で、各Ｒ4基は好ましくは同一のＲa基である。式Ｃ中で、各Ｒ5は好ましくは同一のＲb基である。
【００２３】
本色素組成物中で、Ｒ3は好ましくはＨである。Ｒ6〜Ｒ9は好ましくは、Ｒ6〜Ｒ9の１つ（だけ）がＲc基であり、他の３つがそれぞれＣ1-2アルキル、好ましくはＣＨ3であるように選択される。
【００２４】
第１の態様の色素組成物は、好ましくは第５の実施形態（下記）に記載される式Ｈのアシル化インドールを１％未満、さらに好ましくは０．５％未満、最も好ましくは０．３％未満含んでいる。
【００２５】
第１の態様の色素組成物は、好ましくはさらに、式中のＲ1及びＲ2の少なくとも１つが−ＳＯ2−ＯＲd（式中、Ｒdは上記に定義した通りである。）である式Ａ、Ｂ又はＣの色素にそれぞれ対応する式Ａ1、Ｂ1又はＣ1のスルホネートエステル誘導体を１％未満含んでいる。さらに好ましくは、本色素組成物はかかるスルホネートエステル誘導体を０．５％未満含んでいる。最も好ましくは、０．３％以下である。本発明者らは、先行技術の合成法が２〜２．５％のかかるスルホネートエステル不純物を有する化合物５を与えることを見出した。かかる不純物は、色素を例えば生物学的ターゲティング部分又は合成ポリマーにコンジュゲートする際にさらに反応する可能性を有するで問題である。
【００２６】
−ＳＯ2−ＯＲd置換基は「スルホネートエステル」と呼ばれる。それは、Ｒdの定義により、−ＳＯ2−ＯＣ−エステル共有結合が存在することが要求されるからである。かかるスルホネートエステルは、第１の態様の色素組成物中において以前には知られていない不純物である。これらは、色素中間体の合成時における所望のＮ−アルキル化に加えて、望ましくないＯ−アルキル化から生じる。前記スルホネートエステルの抑制は重要である。それは、これらが所望のスルホン化シアニン色素中において恐らく蛍光性で親油性の高い不純物をなすからである。かくして、完全にイオン化して負に帯電したスルホン酸置換基は非イオン性のスルホネートエステルに変化している。
【００２７】
式Ａの非対称シアニン色素は、好ましくはＲ1、Ｒ2、Ｒa及びＲc基から選択される全部で４個のスルホン酸置換基を含んでいる。Ｒa基は、好ましくは式−(ＣＨ2)kＳＯ3Ｍ1を有している。式中、Ｍ1はＨ又はＢcであり、ｋは１〜４の値を有する整数であり、Ｂcは（上記に定義した）生体適合性陽イオンである。ｋは好ましくは３又は４である。
【００２８】
第１の態様の色素組成物では、Ｒ1及びＲ2は好ましくは同一であり、さらに好ましくは共にＳＯ3Ｍ1である。Ｒ1及びＲ2が共にＳＯ3Ｍ1である場合、ＳＯ3Ｍ1置換基は好ましくはインドール／インドリン環の５位にある。
【００２９】
式Ａの色素は、１個以上（さらに好ましくは１個）のＲb基、即ちカルボキシアルキル置換基を含んでいる。その結果、第９の態様（下記）に記載されるように、色素を生物学的部分（ＢＴＭ）に結合するための官能基（カルボキシル）を提供することによって色素は二官能性となる。１個のかかるカルボキシアルキル置換基を有することで、色素はＢＴＭに対してただ１つの結合点を有することが好ましい。
【００３０】
特に好ましい非対称シアニン色素は、次の式１Ａを有するものである。
【００３１】
【化４】
2013534557.tif 000005
式中、
Ｒ14及びＲ15は独立にＲc基であり、
Ｒ10〜Ｒ13は独立にＣ1-5アルキル又はＲc基であって、Ｒ10＝Ｒ11＝Ｒe又はＲ12＝Ｒ13＝Ｒe（ここで、ＲeはＣ1-2アルキルである。）であるように選択され、
Ｒc及びＭ1は式Ａに関して上記に定義した通りである。
【００３２】
式１ＡのＲa基は、好ましくは独立に−(ＣＨ2)kＳＯ3Ｍ1である。式中、ｋは１〜４の値を有する整数であり、ｋは好ましくは３又は４である。好ましくは、式１Ａの色素は、生物学的分子への容易な共有結合を可能にするため、１個のＣ1-6カルボキシアルキル（即ち、Ｒb）を有している。
【００３３】
式１Ａの好ましい色素は、Ｒ10〜Ｒ13の１つがＲc基であり、他がそれぞれＲe基であり、最も好ましくは各Ｒc  がＣＨ3に等しいように選択される。式１Ａの特に好ましい色素は、Ｒ10〜Ｒ13の１つがＲa基であり、他がそれぞれＲe基であり、最も好ましくは各々 がＣＨ3に等しい式１Ｂを有するものである。式１Ａの好ましい色素では、Ｒc基の１つがＣ1-6カルボキシアルキルであるように選択される。
【００３４】
式１Ａ及び式１Ｂの最も好ましい特定の色素はそれぞれＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）及びＣｙ５**であり、Ｃｙ５**が理想的である。
【００３５】
【化５】
2013534557.tif 000006
第１の態様の色素組成物は、第７の態様（下記）に記載されるようにして得ることができる。
【００３６】
色素組成物の純度は、４種の波長（即ち、２１４ｎｍ、２７３ｎｍ、４５０ｎｍ及び６５０ｎｍ）での分析ＨＰＬＣ測定（曲線下の面積）によって評価される。組成物の成分の正体はＬＣＭＳによって測定され、ＮＭＲによって確認された。
【００３７】
第２の態様では、本発明は、
次の式Ｅのヘミシアニン色素及び次の式Ｚのアミジン塩を含んでなる色素中間体組成物であって、９２％以上のＥを２％未満のＺと共に含むことを特徴とする色素中間体組成物を提供する。
【００３８】
【化６】
2013534557.tif 000007
前記組成物中で、Ｒ1、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ6及びＲ7並びにこれらの好ましい実施形態は第１の態様で定義した通りである。
【００３９】
第２の態様の色素中間体組成物は、第４の態様（下記）に記載されるようにして得ることができる。式Ｚのアミジン塩は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から商業的に入手できる。
【００４０】
第２の態様の色素中間体組成物は、第１の態様の所望非対称色素組成物を得るために重要な貢献をする。第４の態様（下記）を参照されたい。色素中間体組成物は、好ましくは０．５％未満のＺ、さらに好ましくは０．３％未満のＺを含んでいる。
【００４１】
第３の態様では、本発明は、次の式Ｆのインドリニウム塩及び次の式Ｇのインドールを含んでなる色素頭部基組成物であって、９２％以上のＦ及び３％未満のＧを含むことを特徴とする色素頭部基組成物を提供する。
【００４２】
【化７】
2013534557.tif 000008
前記組成物中で、
Ｒ1及びＲ4並びにこれらの好ましい態様は第１の態様で定義した通りであり、
Ｒ6及びＲ7は独立にＣ1-3アルキル又はＲc基であって、式Ｆ及び式Ｇ中でＲ6及びＲ7の少なくとも１つがＲc基であるように選択され、
Ｒc及びその好ましい態様は第１の態様で定義した通りである。）
「頭部基」という用語は、光学色素（好適にはシアニン色素）のポリメチン基の一方又は他方の末端にある基をいう。
【００４３】
第３の態様の頭部基組成物に関しては、Ｒcは好ましくはＲa基であり、その好ましい態様は第１の態様で定義した通りである。Ｒ6及びＲ7の一方はＲa基であり、他方はＲe基どあることが好ましい。ここで、Ｒa及びＲe並びにこれらの好ましい態様は第１の態様（上記）で定義した通りである。
【００４４】
色素頭部基組成物はまた、好ましくは第５の実施形態（下記）に記載される式Ｈのアシル化インドールを１％未満含んでいる。化合物１に関しては、式Ｈのアシル化インドールは重要な潜在的不純物である。したがって、もし制御又は除去しなければ、それは非対称色素合成法（スキーム１参照）の以後の段階にまで持ち越されることがある。
【００４５】
第３の態様の色素頭部基組成物は、第６の態様（下記）に記載されるようにして得ることができる。
【００４６】
第４の態様では、本発明は、第２の態様の色素中間体組成物の製造方法であって、第３の態様の色素頭部基組成物を第２の態様に記載した式Ｚのアミジン塩の１．０５〜１．２５モル当量と反応させることを含んでなる方法を提供する。
【００４７】
第６の態様の反応は、好ましくはスルホラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド及び１，４−ブタンスルトンから選択される適当な溶媒中で実施される。
【００４８】
このように本発明者らは、式Ｆのインドリニウム塩が色素中間体組成物中に存在すると、それは次の段階で反応して式Ｂの対称不純物色素を与えることを見出した。色素中間体組成物中に過剰のアミジン塩Ｚが存在すれば、それは式Ｊのインドリニウム塩（下記）と反応して式Ｃの望ましくない対称不純物色素を生成するであろう。
【００４９】
かかる対称色素の生成を抑制するためには、僅かに過剰のアミジン塩Ｚを用いて色素頭部基組成物のインドリニウム塩を完全に消費させ、続く精製によって色素中間体組成物中の過剰のＺを除去し、その後に式Ｊのインドリニウム塩の正確に１モル当量を添加することで対称色素の生成を抑制する。
【００５０】
本発明の化合物３の精製は、それを５５℃のメタノールに溶解し、それを２−プロパノールで沈殿させ、沈殿した固体を濾別することで達成される。アミジン塩は溶媒混合物から沈殿しない。
【００５１】
第５の態様では、本発明は、第３の態様に記載した式Ｇのインドール及び次の式Ｈのアシル化インドールを含んでなるインドール組成物であって、９０％以上のＧ及び５％未満のＨを含むことを特徴とするインドール組成物を提供する。
【００５２】
【化８】
2013534557.tif 000009
式中、
Ｒ1は第１の態様で定義した通りであり、
Ｒ6及びＲ7は独立にＣ1-3アルキル又はＲc基であって、式Ｇ及び式Ｈ中でＲ6及びＲ7の少なくとも１つがＲc基であるように選択される。
【００５３】
第５の態様における式Ｇのインドールの好ましい態様は、第３の態様（上記）に記載した通りである。第５の態様におけるＲ1、Ｒ6及びＲ7の好ましい態様は、第１の態様（上記）で定義した通りである。インドール組成物は、好ましくは２％未満のＨ、さらに好ましくは１％未満のＨを含んでいる。
【００５４】
本発明者らは、第５の態様のインドール組成物の先行技術の合成法が１０〜１５％の化合物Ｈを含むことを見出した。その不純物は非対称色素合成法（スキーム１参照）の次の段階にまで未変化のままに持ち越されるであろうから、それを早い機会に抑制することが重要である。
【００５５】
化合物１から化合物２への転化に関しては、溶媒の温度及び量は、反応中に式ＨのＮ−アセチルインドールが不純物として生成されるのを防止するために検討すべき主要パラメーターであることが判明した。反応の温度を１００℃に低下させ、溶媒の量を４−ヒドラジノベンゼンスルホン酸（４−ＨＢＳＡ）に対して（重量で）２５〜３０倍にした場合、９０％を超えるＨＰＬＣ純度を有する生成物が得られた。かかる技法を用いて、本発明は化合物２中の化合物Ｈを１％未満に抑制した。
【００５６】
第６の態様では、本発明は、第３の態様の頭部基組成物の製造方法であって、第５の態様のインドール組成物を式Ｒ4−Ｘ（式中、Ｒ4は第１の態様で定義した通りであり、Ｘは脱離基である。）のアルキル化剤と反応させることを含んでなる方法を提供する。
【００５７】
第６の態様における「アルキル化剤」という用語は、有機化学におけるその通常の意味を有する。「脱離基」という用語は、これに関係した有機化学におけるその通常の意味を有する。好適なかかる脱離基（Ｘ）には、Ｘ＝Ｈａｌ（ここで、Ｈａｌはハロゲンである。）及びスルホネートエステル（例えば、メシレート、トシレート又はトリフレート）がある。スルホアルキル置換基の導入のためには、アルキル化剤として環状スルホネートエステル（即ち、スルトン、例えば１，４−ブタンスルトン）を使用することが好ましい。Ｒ4−Ｘ及びＸ＝Ｈａｌに関しては、Ｈａｌは好ましくはＣｌ、Ｂｒ又はＩであり、最も好ましくはＢｒである。好適なかかるアルキル化剤は商業的に入手できる。
【００５８】
第６の態様の反応は適当な溶媒中で実施される。適当な溶媒は、スルホラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド及びスルトン（スルトンは溶媒兼試薬として使用できる。）であり得る。反応は、好適には１００〜１５０℃（好ましくは約１４０℃）で約４８時間実施される。
【００５９】
本発明者らは、かかるインドールアルキル化反応によれば、通例は中程度の純度（６５〜７０％）及び７〜８％のレベルの遊離インドール（Ｎ−Ｈ）出発原料含有量を有するＮ−アルキル化インドールが得られることを見出した。第５の態様のインドール組成物を製造するためには、約７〜８％で存在する式Ｇのインドールを含む式Ｆの粗インドリニウム塩をメタノール中に懸濁し、メタノールに可溶の塩を生成することで溶解を容易にするために触媒量（約０．１５モル当量）のトリエチルアミンと共に加熱還流する。続いて、０．２〜０．５％、好ましくは０．３％の水性２−プロパノールを添加することで所望生成物の沈殿を達成する。それより高い含水量（２〜３％）を使用すると生成物が粘着性になり、そのために濾過プロセスが不可能になる。化合物２に関しては、精製のために触媒量のトリエチルアミンを使用した場合、化合物１不純物レベルは約８５六〜９０％減少し、それによって化合物１の純度は９２〜９５％に増加した。トリエチルアミンを使用せずに精製を行った場合、化合物１不純物の減少は１０〜１５％にすぎなかった。
【００６０】
第７の態様では、本発明は、第１の態様の色素組成物の製造方法であって、第２の態様の色素中間体組成物を次の式Ｊのインドリニウム塩の１モル当量と反応させることを含んでなる方法を提供する。
【００６１】
【化９】
2013534557.tif 000010
式中、
Ｒ2及びＲ5は第１の態様で定義した通りであり、
Ｒ8及びＲ9は独立にＣ1-3アルキル又はＲc基であり、Ｒcは第１の態様で定義した通りである。
【００６２】
第７の態様における色素中間体組成物の好ましい態様は、第２の態様に記載した通りである。第７の態様におけるＲ2、Ｒ5、Ｒ8及びＲ9の好ましい態様は、第１の態様に記載した通りである。
【００６３】
第４の態様（上記）に記載した通り、（式Ｅのヘミシアニン色素に基づいて）式Ｊのインドリニウム塩の正確に１モル当量を使用することが重要である。さもないと、対称色素不純物が生成する危険性が増大する。
【００６４】
第８の態様では、本発明は、第１の態様の色素組成物を哺乳動物への投与に適した無菌形態で生体適合性キャリヤー媒質中に含んでなる医薬組成物を提供する。
【００６５】
「生体適合性キャリヤー媒質」は、１種以上の薬学的に許容される補助剤、賦形剤又は希釈剤を含んでいる。それは、好ましくは、組成物が生理学的に認容されるようにして（即ち、毒性又は過度の不快感なしに哺乳動物体に投与できるようにして）式（Ｉ）の化合物を懸濁又は溶解するための流体（特に液体）である。生体適合性キャリヤー媒質は、好適には、無菌のパイロジェンフリー注射用水、（有利には注射用の最終生成物が等張性又は非低張性になるように平衡させ得る）食塩水のような水溶液、或いは１種以上の張度調整物質（例えば、血漿陽イオンと生体適合性対イオンとの塩）、糖（例えば、グルコース又はスクロース）、糖アルコール（例えば、ソルビトール又はマンニトール）、グリコール（例えば、グリセロール）又は他の非イオン性ポリオール物質（例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）の水溶液のような注射可能なキャリヤー液体である。生体適合性キャリヤー媒質はまた、エタノールのような生体適合性有機溶媒を含んでいてもよい。かかる有機溶媒は、親油性の高い化合物又は配合物を可溶化するために有用である。好ましくは、生体適合性キャリヤー媒質はパイロジェンフリー注射用水、等張食塩水又はエタノール水溶液である。静脈内注射用生体適合性キャリヤー媒質のｐＨは、好適には４．０〜１０．５の範囲内にある。
【００６６】
かかる医薬組成物は、抗菌防腐剤、ｐＨ調整剤、フィラー、安定剤又は重量オスモル濃度調整剤のような追加賦形剤を任意に含むことができる。「抗菌防腐剤」という用語は、潜在的に有害な微生物（例えば、細菌、酵母又はかび）の増殖を阻止する薬剤を意味する。抗菌防腐剤はまた、使用する用量に応じて多少の殺菌性を示すこともある。本発明の抗菌防腐剤の主な役割は、医薬組成物中におけるこのような微生物の増殖を阻止することである。しかし、抗菌防腐剤は、任意には投与に先立って前記組成物を製造するために使用されるキットの１種以上の成分中における潜在的に有害な微生物の増殖を阻止するためにも使用できる。好適な抗菌防腐剤には、パラベン類（即ち、メチル、エチル、プロピル又はブチルパラベン或いはこれらの混合物）、ベンジルアルコール、フェノール、クレゾール、セトリミド及びチオメルサールがある。好ましい抗菌防腐剤はパラベン類である。
【００６７】
「ｐＨ調整剤」という用語は、組成物のｐＨがヒト又は哺乳動物への投与のために許容される範囲（およそｐＨ４．０〜１０．５）内にあることを保証するために有用な化合物又は化合物の混合物を意味する。好適なかかるｐＨ調整剤には、トリシン、リン酸塩又はＴＲＩＳ［即ち、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］のような薬学的に許容される緩衝剤、及び炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム又はこれらの混合物のような薬学的に許容される塩基がある。組成物をキットの形態で使用する場合には、ｐＨ調整剤を任意には独立のバイアル又は容器に入れて供給することができ、その結果としてキットのユーザーは多段操作の一部としてｐＨを調整することができる。
【００６８】
「フィラー」という用語は、製造及び凍結乾燥中における材料の取扱いを容易にすることができる薬学的に許容される増量剤を意味する。好適なフィラーには、塩化ナトリウムのような無機塩、及びスクロース、マルトース、マンニトール又はトレハロースのような水溶性糖又は糖アルコールがある。
【００６９】
かかる医薬組成物は、無菌製造条件下で（即ち、クリーンルーム内で）製造して所望の無菌で非発熱性の生成物を得ることができる。基本構成部分、特に関連する試薬並びにイメージング剤に接触する装置部品（例えば、バイアル）は無菌であることが好ましい。かかる構成部分及び試薬は、無菌濾過或いは（例えば、γ線照射、オートクレーブ処理、乾熱又は（例えば、エチレンオキシドによる）化学処理を用いる）終末滅菌をはじめとする、当技術分野で公知の方法によって滅菌できる。一部の構成部分を予め滅菌しておけば、最小数の操作を実施すれば済むので好ましい。しかし、予防策として、医薬組成物の製造における最終段階として少なくとも無菌濾過段階を含めることが好ましい。
【００７０】
第８の態様の医薬組成物中における色素の好ましい態様は、第１の態様に記載した通りである。
【００７１】
第９の態様では、本発明は、式Ａの非対称色素と生物学的ターゲティング部分又は合成巨大分子とのコンジュゲートの製造における、第１の態様の色素組成物又は第８の態様の医薬組成物の使用を提供する。
【００７２】
第９の態様の使用は、第１の態様の色素組成物又は第８の態様の医薬組成物から出発して前記コンジュゲートを製造する方法を包含する。この態様の色素−ＢＴＭコンジュゲートは、インビトロ及びインビボでの用途を有している。
【００７３】
「生物学的ターゲティング部分」（ＢＴＭ）という用語は、投与後、インビボで哺乳動物体の特定部位に選択的に取り込まれるか又は特定部位に局在する化合物を意味する。かかる部位は、例えば、特定の疾患状態に関係するものであるか、或いは器官又は代謝過程がいかに機能しているかを表すものであり得る。
【００７４】
「合成巨大分子」という用語は、分子量２〜１００ｋＤａ、好ましくは３〜５０ｋＤａ、最も好ましくは４〜３０ｋＤａのポリマーを意味する。かかるポリマーは、ポリリシン又はポリグリコール酸のようなポリアミノ酸、或いはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり得る。「合成」という用語は下記に定義される通りである。
【００７５】
ＢＴＭは合成品又は天然品であり得るが、好ましくは合成品である。「合成品」という用語はその通常の意味を有し、即ち、天然の供給源（例えば、哺乳動物体）から単離されるものではなく人造のものをいう。かかる化合物は、その製造及び不純物プロファイルを完全に制御できるという利点を有している。したがって、天然由来のモノクローナル抗体及びそのフラグメントは、本明細書中で使用する「合成品」という用語の範囲外にある。
【００７６】
ＢＴＭの分子量は、好ましくは３００００ダルトン以下である。さらに好ましくは、分子量は２００〜２００００ダルトンの範囲内にあり、最も好ましくは３００〜１８０００ダルトンの範囲内にあり、４００〜１６０００ダルトンが特に好ましい。ＢＴＭが非ペプチドである場合、ＢＴＭの分子量は好ましくは３０００ダルトン以下、さらに好ましくは２００〜２５００ダルトン、最も好ましくは３００〜２０００ダルトンであり、４００〜１５００ダルトンが特に好ましい。
【００７７】
生物学的ターゲティング部分は、好ましくは、線状ペプチド、環状ペプチド又はこれらの組合せであり得る３〜１００量体ペプチド、ペプチド類似体、ペプトイド又はペプチド模倣体、単一のアミノ酸、酵素基質、酵素アンタゴニスト、酵素アゴニスト（部分アゴニストを含む）又は酵素阻害剤、レセプター結合化合物（レセプター基質、アンタゴニスト、アゴニスト又は基質を含む）、オリゴヌクレオチド、或いはオリゴＤＮＡフラグメント又はオリゴＲＮＡフラグメントからなる。
【００７８】
「ペプチド」という用語は、ペプチド結合（即ち、１つのアミノ酸のアミンを別のアミノ酸のカルボキシルに連結するアミド結合）によって連結された（下記に定義するような）２以上のアミノ酸を含む化合物を意味する。「ペプチド模倣体」又は「模倣体」という用語は、ペプチド又はタンパク質の生物学的活性を模倣するが、化学的性質がペプチド的でない（即ち、いかなるペプチド結合（つまり、アミノ酸間のアミド結合）も含まない）生物学的活性化合物をいう。ここでは、ペプチド模倣体という用語は広い意味で使用され、性質が完全にはペプチド的でない分子（例えば、プソイドペプチド、セミペプチド及びペプトイド）を包含する。「ペプチド類似体」という用語は、下記に記載するような１種以上のアミノ酸類似体を含むペプチドをいう。“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ”，Ｍ．Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ  Ｅ２２ｃ，Ｔｈｉｅｍｅも参照されたい。
【００７９】
「アミノ酸」という用語は、Ｌ−又はＤ−アミノ酸、アミノ酸類似体（例えば、ナフチルアラニン）或いはアミノ酸模倣体を意味し、これらは天然のもの又は純粋に合成由来のものであってよく、光学的に純粋なもの（即ち、単一の鏡像異性体）、したがってキラルなものであるか、或いは鏡像異性体の混合物であってよい。本明細書中では、アミノ酸に関する通常の三文字略語又は一文字略語が使用される。好ましくは、本発明のアミノ酸は光学的に純粋なものである。「アミノ酸模倣体」という用語は、アイソスター（即ち、天然化合物の立体構造及び電子構造を模倣するように設計されたもの）である天然アミノ酸の合成類似体を意味する。かかるアイソスターは当業者にとって公知であり、特に限定されないが、デプシペプチド、レトロ−インベルソペプチド、チオアミド、シクロアルカン又は１，５−二置換テトラゾールを包含する［Ｍ．Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２４，１３７（１９８５）を参照されたい］。放射性標識されたアミノ酸（例えば、チロシン、ヒスチジン又はプロリン）は、有用なインビボイメージング剤であることが知られている。
【００８０】
ＢＴＭが酵素基質、酵素アンタゴニスト、酵素アゴニスト、酵素阻害剤又はレセプター結合化合物である場合、それは好ましくは非ペプチドであり、さらに好ましくは合成品である。「非ペプチド」という用語は、いかなるペプチド結合（即ち、２つのアミノ酸残基間のアミド結合）も含まない化合物を意味する。好適な酵素の基質、アンタゴニスト、アゴニスト又は阻害剤には、グルコース及びグルコース類似体（例えば、フルオロデオキシグルコース）、脂肪酸、或いはエラスターゼ、アンギオテンシンＩＩ又はメタロプロテイナーゼ阻害剤がある。好適な合成レセプター結合化合物には、エストラジオール、エストロゲン、プロゲスチン、プロゲステロン及び他のステロイドホルモン、ドーパミンＤ−１又はＤ−２レセプター用リガンド又はトロパンのようなドーパミン輸送体用リガンド、並びにセロトニンレセプター用リガンドがある。
【００８１】
ＢＴＭは、最も好ましくは３〜１００量体ペプチド又はペプチド類似体である。ＢＴＭがペプチドである場合、それは好ましくは４〜３０量体ペプチドであり、最も好ましくは５〜２８量体ペプチドである。
【００８２】
ＢＴＭが酵素基質、酵素アンタゴニスト、酵素アゴニスト又は酵素阻害剤である場合、本発明の好ましいかかる生物学的ターゲティング分子は合成の薬物様小分子（即ち、医薬品分子）である。その好ましい例は、トロパンのようなドーパミン輸送体リガンド、脂肪酸、ドーパミンＤ−２レセプターリガンド、ベンズアミド類、アンフェタミン類、ベンジルグアニジン類、イオマゼニル、ベンゾフラン（ＩＢＦ）又は馬尿酸である。
【００８３】
ＢＴＭがペプチドである場合、好ましいかかるペプチドには以下のものがある。
−ソマトスタチン、オクトレオチド及び類似体。
−ＳＴレセプターに結合するペプチド（ここで、ＳＴとは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び他の微生物によって産生される耐熱性毒素をいう。）。
−ボンベシン。
−血管作用性小腸ペプチド。
−ニューロテンシン。
−ラミニンフラグメント、例えばＹＩＧＳＲ、ＰＤＳＧＲ、ＩＫＶＡＶ、ＬＲＥ及びＫＣＱＡＧＴＦＡＬＲＧＤＰＱＧ。
−白血球集積部位をターゲティングするためのＮ−ホルミル走化性ペプチド。
−血小板第４因子（ＰＦ４）及びそのフラグメント。
−例えば血管形成をターゲティングし得るＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）含有ペプチド［Ｒ．Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７  Ｊｕｎ；１５（６）：５４２−６］、［Ｅ．Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．１９９７  Ｍａｙ；５１（５）：１４１３−７］。
−α2−抗プラスミン、フィブロネクチン、β−カゼイン、フィブリノーゲン又はトロンボスポンジンのペプチドフラグメント。α2−抗プラスミン、フィブロネクチン、β−カゼイン、フィブリノーゲン及びトロンボスポンジンのアミノ酸配列は、以下の参考文献中に見出すことができる。α2−抗プラスミン前駆体［Ｍ．Ｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１０２，１０３３，（１９８７）］、β−カゼイン［Ｌ．Ｈａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ，１３９，１９３，（１９９４）］、フィブロネクチン［Ａ．Ｇｕｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２０７，１４５，（１９９６）］、トロンボスポンジン１前駆体［Ｖ．Ｄｉｘｉｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８３，５４４９，（１９８６）］、Ｒ．Ｆ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５３，１９５，（１９８４）。
−アンギオテンシンＩＩ：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（Ｅ．Ｃ．Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９７９，Ｖｏｌ  ２２，９，１０３８−１０４４）及び［Ｓａｒ，Ｉｌｅ］アンギオテンシンＩＩ：Ｓａｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ（Ｒ．Ｋ．Ｔｕｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９７２，１７７，１２０３）のようなアンギオテンシンの基質又は阻害剤であるペプチド。
−アンギオテンシンＩ：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ。
【００８４】
ＢＴＭがペプチドである場合、ペプチドの一方又は両方の末端（好ましくは両方の末端）に代謝阻害基（ＭIG）がコンジュゲートされる。このようにして両方のペプチド末端を保護することは、インビボイメージング用途のために重要である。さもないと、急速な代謝の結果としてＢＴＭペプチドに対する選択的結合親和性が失われると予想されるからである。「代謝阻害基」（ＭIG）という用語は、アミノ末端又はカルボキシ末端におけるＢＴＭペプチドの酵素（特にカルボキシペプチダーゼのようなペプチダーゼ）代謝を阻止又は抑制する生体適合性基を意味する。かかる基はインビボ用途のために特に重要であって、これらは当業者にとって公知であり、好適にはペプチドアミン末端に関してはＮ−アシル化基−ＮＨ(Ｃ＝Ｏ)ＲG（式中、アシル基−(Ｃ＝Ｏ)ＲGはＣ1-6アルキル基及びＣ3-10アリール基から選択されるＲGを有するか、或いはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位を含む。）から選択される。好ましいかかるアミノ末端ＭIG基はアセチル、ベンジルオキシカルボニル又はトリフルオロアセチルであり、最も好ましくはアセチルである。
【００８５】
ペプチドカルボキシル末端に関して好適な代謝阻害基には、カルボキサミド、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、ベンジルエステル、シクロヘキシルエステル、アミノアルコール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成単位がある。ＢＴＭペプチドのカルボキシ末端アミノ酸残基にとって好適なＭIG基は、アミノ酸残基の末端アミンをＣ1-4アルキル基（好ましくはメチル基）でＮ−アルキル化したものである。好ましいかかるＭIG基はカルボキサミド又はＰＥＧであり、最も好ましいかかる基はカルボキサミドである。
【００８６】
シアニン色素を生物学的分子にコンジュゲートするための一般的方法は、Ｌｉｃｈａ  ｅｔ  ａｌ［Ｔｏｐｉｃｓ  Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．，２２２，１−２９（２００２）；Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，５７，１０８７−１１０８（２００５）］によって記載されている。本発明で使用するためのペプチド、タンパク質及びオリゴヌクレオチド基質は、末端位置で標識することができ、或いは別法として１以上の内部位置で標識することもできる。蛍光色素標識試薬を用いるタンパク質標識の総説及び例に関しては、“Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ，ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”，Ｇａｒｍａｎ，Ａ．Ｊ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７、及び“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  −  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，Ａｓｌａｍ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｎｔ，Ａ．，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．（１９９８）を参照されたい。合成ペプチドにおいて部位特異的標識を達成するためのプロトコルが利用できる。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたい。
【実施例】
【００８７】
以下の非限定的な実施例によって本発明を例証する。言及される化合物は図１に示されており、反応の概要はスキーム１に示されている。実施例１は、化合物２の合成で使用される特定のスルホン化インドールである化合物１の合成を示している。化合物２は、第３の態様の色素頭部基組成物をなす式Ｆの特定の色素である。実施例２は、化合物１のＮ−アルキル化による化合物２の製造、及びその精製による第３の態様の色素頭部基組成物をなす特定の色素頭部基組成物の分取を示している。実施例３は、第２の態様の色素中間体組成物をなす式Ｅの特定のヘミシアニン色素である化合物３の合成を示している。実施例４は、カルボキシアルキル置換基を有する式Ｊのインドリニウム塩である化合物４の合成を示している。実施例５は、第１の態様の色素組成物をなす式Ａの特定の色素である化合物５（Ｃｙ５**）の合成を示している。実施例６は、化合物５を含む色素組成物のＨＰＬＣ精製及び分析を示している。
【００８８】
本発明の合成法は、化合物５に関してスキーム１に要約されている。反応は４つの段階で実施され、最初に第５の実施形態のインドール組成物及び化合物！（式Ｇ）が製造される。次に、化合物１を１，４−ブタンスルトンでＮ−アルキル化することで化合物２が製造される。第３の段階では、図示されるように頭部基組成物を化合物Ｚと反応させることで、化合物３を含む第２の態様のヘミシアニン色素中間体組成物が製造される。中間体組成物は、好ましくは単離及び／又は精製した後に次の段階で使用される。最後の段階では、中間体組成物は、式Ｊの特定のインドリニウム塩（化合物４）との反応によって第１の態様の所望非対称色素組成物に転化される。
【００８９】
【化１０】
2013534557.tif 000011
式中、
Ｒx＝(ＣＨ2)4ＳＯ2Ｈ、
Ｒy＝(ＣＨ2)5ＣＯ2Ｈ。
【００９０】
図１：本発明の特定の化合物
【００９１】
【化１１】
2013534557.tif 000012
【００９２】
【表１】
2013534557.tif 000013
実施例１：２，３−ジメチル−３−（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドール−５−スルホン酸二ナトリウム（化合物１）の合成
段階（ａ）：５−（エトキシカルボニル）−５−メチル−６−オキソヘプタン−１−スルホン酸ナトリウム
水素化ナトリウム（２９．２ｇ、パラフィン油中６０％ｗ／ｗ）をＤＭＦ（４００ｍｌ）中に懸濁し、懸濁液を５〜１０℃に冷却した。温度を５〜１０℃に保ちながら、上記の懸濁液に２−メチルアセト酢酸エチル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、１００ｇ）を１時間かけて添加した。次いで、反応塊の温度をゆっくりと２５〜３０℃に上昇させ、水素の発生が完全に止まるまで塊を１時間撹拌した。残留水素化ナトリウムを含まない透明な淡黄色の溶液を得た。次いで、反応フラスコを１０〜１５℃に冷却し、１，４−ブタンスルトン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、９４．５ｇ）を１時間かけて添加した。次いで、反応塊の温度をゆっくりと５０〜６０℃に上昇させ、５０〜６０℃に１５時間保った。反応の完了後、反応塊を５〜１０℃に冷却し、２−プロパノール（２０ｍｌ）を添加して残留する過反応／未反応水素化ナトリウムを破壊した。その後、反応塊を真空中６０℃で濃縮して濃厚な残留物を得た。残留物をそのまま段階（ｂ）で使用した。
【００９３】
段階（ｂ）：５−メチル−６−オキソヘプタン−１−スルホン酸
段階（ａ）からの残留物を水（５００ｍｌ）に溶解し、水酸化ナトリウム（３５．６ｇ）を添加した。反応物を８５〜９０℃に加熱し、８５〜９０℃に１５時間保った。その後、反応塊を３５℃に冷却し、ヘキサン（２×２００ｍｌ）で抽出してパラフィン油を除去した。３５％塩酸水溶液を用いて、水性層のｐＨをゆっくりとｐＨ１．０に調整した。次いで、反応塊を真空中６０℃で濃縮すると塩化ナトリウムが沈殿し始めた。２−プロパノール（７５０ｍｌ）を残留物に添加し、６０℃に加熱した。塩化ナトリウムを濾過によって除去した。有機層を真空中６０℃で濃縮した。残留物を６０℃の２−プロパノールに溶解し、溶解しない塩化ナトリウムを濾別した。濾液を真空中６０℃で濃縮して濃厚な残留物を得た（収量１４０ｇ、９６％）。
【００９４】
段階（ｃ）：化合物１
４−ヒドラジノベンゼンスルホン酸（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ社、４０ｇ）を酢酸（１２０ｍｌ）中に懸濁し、５−メチル−６−オキソヘプタン−１−スルホン酸［段階（ｂ）からのもの、７２ｇ］を添加した。反応塊を１００℃に加熱し、１００℃に１０〜１２時間保ち、その間に４−ヒドラジノベンゼンスルホン酸は完全に溶解した。反応塊の定性的ＨＰＬＣ分析は、１．５％未満の４−ヒドラジノベンゼンスルホン酸を示した。反応塊を４０℃に冷却し、溶解しない物質を濾過によって除去した。次いで、反応塊を真空中６０℃で濃縮し、それ以上の酢酸が留出しなくなるまで続けた。残留物を５５℃のメタノール（８０ｍｌ）に溶解し、２−プロパノール（８００ｍｌ）を５５℃で３０分かけて添加した。反応塊を５５℃で２時間撹拌した。生成物を窒素雰囲気下で熱間濾別し、吸引下で乾燥した。湿った生成物を３０℃の蒸留水（４００ｍｌ）に溶解し、真空中で濃縮して微量の２−プロパノールを除去した。１０％ｗ／ｖ水酸化ナトリウム水溶液を用いて反応塊のｐＨをｐＨ８．０〜８．５に調整し、反応塊を７５〜８０℃に加熱し、１０時間撹拌した。反応塊を真空中６０℃で濃縮し、それ以上の水が留出しなくなるまで続けた。残留物に２−プロパノール（６００ｍｌ）を添加し、３０分間撹拌した。反応塊を真空中６０℃で蒸発乾固することで、化合物１を微細な粉末として得た。生成物を真空中６０℃で１２時間乾燥した。収量６１．２ｇ。
【００９５】
実施例２：２，３−ジメチル−１，３−ビス（４−スルホナトブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホン酸二ナトリウム（化合物２）
段階（ａ）：
化合物１（微細な乾燥粉末、５３ｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（１５００ｍｌ）中に懸濁し、懸濁液を１５０℃に加熱して溶解を達成した。１，４−ブタンスルトン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、１００ｇ）を溶液に添加し、混合物を１５０℃に４８時間保った。反応の進行を定性的ＨＰＬＣ分析によってモニターした。６時間ごとに、追加の１，４−ブタンスルトン（１０ｇ）を添加した。４８時間後、反応塊を４０℃に冷却し、生成物を窒素雰囲気下で濾別した。湿った生成物を酢酸エチル（５００ｍｌ）中に懸濁し、懸濁液を６０℃に１時間加熱した。次いで、反応塊を冷却し、窒素雰囲気下で濾別し、吸引下で乾燥した。粗生成物の収量は５５ｇであった。
【００９６】
段階（ｂ）：精製
段階（ａ）からの粗生成物（５５ｇ）をメタノール（５００ｍｌ）中に懸濁し、混合物を６５〜７０℃（浴温度）に加熱した。トリエチルアミン（２ｍｌ）を添加し、混合物を６５〜７０℃（浴温度）に１５分間保った。０．３４％水性イソプロパノール（１５００ｍｌ、１５００ｍｌの２−プロパノール中に５ｍｌの水）を反応塊に３０分かけて添加し、その間に生成物が沈殿した。反応塊を２時間撹拌した。生成物を窒素雰囲気下で濾別し、吸引下で乾燥した。精製された化合物２生成物を真空中５０℃で乾燥した（収量４５ｇ）。
【００９７】
実施例３：２−［（１Ｅ，３Ｅ）−４-アニリノブタ−１，３−ジエニル］−３−メチル−１，３−ビス（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート（化合物３）の合成
化合物４（２０ｇ）及びマロンアルデヒドビス（フェニルイミン）・ＨＣｌ（化合物Ｚ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、１０．８ｇ）を無水酢酸（１００ｍｌ）と酢酸（３００ｍｌ）との混合物中に懸濁し、内容物を１１０℃に加熱し、１１０℃に１５時間保った。その後、反応塊を６０℃に冷却し、真空下で蒸留した。残留物を酢酸（１００ｍｌ）に溶解し、酢酸エチル（１０００ｍｌ）中に注ぎ、室温（２５〜３０℃）で２時間撹拌した。沈殿した固体を窒素雰囲気下で濾別し、吸引下で乾燥した。次いで、粗物質をメタノール（１００ｍｌ）中に懸濁し、加熱還流した。２−プロパノール（５００ｍｌ）を反応塊にゆっくりと添加し、１時間撹拌した。生成物を窒素雰囲気下で濾別し、吸引下で乾燥した。化合物３を真空中４０℃で乾燥した。収量２２ｇ（８８％）。
【００９８】
実施例４：１−（ε−カルボキシペンチル）−２，３，３−トリメチルインドレニウム−５−スルホネート（化合物４）の製造
【００９９】
【化１２】
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スルホ−２，３，３−トリメチルインドレニンナトリウム塩（Ｉｎｔａ．Ｔｒａｄｅ社から購入、化合物１、１００ｇ、０．３８１ｍｏｌ）を反応器（３Ｌ）に仕込んだ。スルホラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、４００ｍｌ）をそれに添加した。次いで、エチル−６−ブロモヘキソネート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、１４０ｍｌ、０．７６０ｍｏｌ）を混合物に添加した。内容物を撹拌しながら１１０℃に加熱し、反応混合物をこの温度に１６時間保った。次いで、反応混合物を約２５℃に冷却した。酢酸エチル（１Ｌ）を添加した。混合物を１５分間撹拌し、酢酸エチル層をデカントした。フラスコ内の赤褐色の残留物を酢酸エチル（３００ｍｌ×２）で洗浄した。脱イオン水（１Ｌ）を添加し、混合物を１５分間撹拌して透明な溶液を得た。新鮮な酢酸エチル（５００ｍｌ×２）を用いて溶液を再び洗浄した。得られた溶液から、ロータリーエバポレーター上で微量の酢酸エチルを除去した。上記の溶液に水酸化ナトリウム（３６ｇ、０．９０ｍｏｌ）を添加し、ｐＨを１０〜１２の範囲内に保った（注意：ｐＨ＞１０は反応の完結のために極めて重要である）。反応混合物を７０℃に１時間加熱した。反応混合物をＨＣｌ（６０ｍｌ）で中和し、ロータリーエバポレーター上で水を蒸発乾固した。この物質を真空中３０℃で１６時間乾燥した。上記の乾燥物質にアセトニトリル（９００ｍｌ）を添加した。撹拌しながら、濃塩酸（１２６ｍｌ）をゆっくりと添加した。混合物を約２５℃で１５分間撹拌した。懸濁液を濾過し、９：１のアセトニトリル／濃ＨＣｌ（１００ｍｌ×２）で洗浄し、乾燥した。
【０１００】
濾液を濃縮して粘稠な塊状物とした（注意：完全に乾燥した物質は結晶化するために長い時間を要し、化合物４のイソプロピルカルボキシレートエステルを生成する危険がある）。得られた残留物をイソプロピルアルコール／アセトン（１５０ｍｌ／３５０ｍｌ）の混合物と共に１５分間トリチュレートした（イソプロピルエステルの生成を回避するために混合物を直ちに濾過すべきである）。懸濁液を濾過し、イソプロピルアルコール／アセトン混合物（３０／７０ｍｌ）で洗浄し、真空下５０℃で８時間乾燥した。収量：９０ｇ（６６％）。ＨＰＬＣ純度：（２７０ｎｍで）９５％。
【０１０１】
実施例５：３，３−ジメチル−５−スルホ−１，３−ジヒドロ−インドール−（２Ｅ）−イリデン］−ペンタ−１，３−ジエニル｝−３−メチル−５−スルホ−１，３−ビス（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドリウム（化合物５、Ｃｙ５**）の製造
化合物３（２２ｇ）及び化合物４（１２．５ｇ）を無水酢酸（１３０ｍｌ）と酢酸（３７０ｍｌ）との混合物中に懸濁し、内容物を１１０℃に加熱した。酢酸カリウム（６．５ｇ）を添加し、反応塊を１１０℃に４時間保ち、その間にすべての化合物３が消費された。反応塊を冷却し、真空中６０℃で濃縮した。残留物を酢酸（１００ｍｌ）に溶解し、酢酸エチル（７５０ｍｌ）中に注ぎ、室温で２時間撹拌した。沈殿した固体を窒素雰囲気下で濾別し、吸引下で乾燥した。生成物を水（１００ｍｌ）に溶解し、（ＨＰＬＣにより）無水物の加水分解をモニターしながら２時間撹拌した。真空中又は分離によって微量の酢酸エチルを除去し、水性層を凍結乾燥した。生成物の乾燥重量＝２９．８ｇ（収率約１００％）。
【０１０２】
実施例６：本発明の色素組成物のＨＰＬＣ精製及び分析
分取分離：
試料調製：
各々２〜５ｇの化合物５を含む２個のボトルを水中０．１％ＴＦＡ（５０ｍｌ）に溶解した。水中約１ＭのＴＨＦ（１０ｍｌの水中に０．８ｍｌのＴＦＡ）でｐＨを２．１に調整し、濾過した後、ＬａＰｒｅｐシステム上で精製した。４回の試験を実施した。
【０１０３】
システムパラメーター：
試験は下記の表に記載するようにして実施した。
【０１０４】
【表２】
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分析方法：
カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｓｈｉｅｌｄ  ＲＰ１８，（４．６×５０），２．５μｍ，Ｗａｔｅｒｓ
移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ約６．８
移動相Ｂ：１０％ＭＦ−Ａ及び９０％アセトニトリル
【０１０５】
【表３】
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流量：１．０ｍｌ／分
カラムオーブン：４０℃
試料濃度：水中０．０２０ｍｇ／ｍｌ
【国際調査報告】
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