(57)【要約】本発明は、以下のポリペプチドのうちの１つの阻害剤の使用であって、前記ポリペプチドが配列番号１〜３２の群から選択される配列により表され、前記ポリペプチドの各々が、好ましくは請求項１で同定されるように、好ましくは癌患者における転移を防止し、遅延し、および／または処置するための医薬剤として用いられる阻害剤に関する。本発明は、以下の配列番号１〜３２または配列番号１〜１６９の配列により表される遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せの単離核酸配列、その相補体またはその部分を含むかまたはそれらからなる診断ポートフォリオにも関する。【選択図】図なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドの阻害剤であって、前記ポリペプチドがヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、以下の：
（１）酵素ＰＡＩＣＳ、ＡＢＨＤ１１、ＡＵＲＫＢ、ＣＨＭＬ、ＥＺＨ２、ＦＥＮ１、ＩＧＦＢＰ３、ＰＣＯＬＮ３、ＰＰＰ２Ｒ３Ａ、ＰＴＧＥＳ、ＰＴＰ４Ａ１およびＳＣＤをコードするヌクレオチド配列、
（２）転写因子Ｅ２Ｆ１、ＦＯＳ１およびＦＯＸＭ１をコードするヌクレオチド配列、
（３）構造タンパク質Ｃ２２ｏｒｆｌ  ８、ＣＨＡＦ１Ａ、Ｈ２ＡＦＺ、ＳＭＴＮ、ＴＪＡＰ１、Ｄ２１Ｓ２０５６Ｅをコードするヌクレオチド配列、
（４）受容体ＡＤＯＲＡ２Ｂをコードするヌクレオチド配列、
（５）接着分子ＭＴＤＨをコードするヌクレオチド配列、
（６）アポトーシス抑制因子ＢＩＲＣ５およびＰＨＬＤＡ１をコードするヌクレオチド配列、
（７）ＤＮＡ複製／転写に関与するタンパク質ＭＣＭ１０、ＭＣＭ２およびＴＲＦＰに関与するタンパク質をコードするヌクレオチド、ならびに
（８）ＳＥＣ１４Ｌ１、ＳＦＮ、ＳＨ３ＧＬ１およびＹＴＨＤＦ１をコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択される阻害剤であり、好ましくは癌患者における転移を防止し、遅延し、および／または処置するための医薬剤として用いるためである阻害剤。
【請求項２】
前記ヌクレオチド配列が、以下の：
（ａ）配列番号１９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２から選択される配列と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列；ならびに
（ｂ）配列番号１９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２から選択されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
から選択される請求項１記載の阻害剤・
【請求項３】
前記阻害剤が、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子、優性阻害型変異体、前記ポリペプチドに対して生じる抑制抗体である請求項１または２記載の阻害剤。
【請求項４】
前記ＤＮＡ分子が、以下の：
（ａ）配列番号１〜３２から選択される配列と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列；ならびに
（ｂ）配列番号１〜３２から選択されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
から選択されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現を抑制し得るＲＮＡｉ因子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物である請求項３記載の阻害剤であって、任意に、ＲＮＡｉ因子をコードするヌクレオチド配列が細胞中のヌクレオチド配列の発現を誘導し得るプロモーターと操作可能的に連結される阻害剤。
【請求項５】
前記核酸構築物において、ヌクレオチド配列が、以下の：
（ａ）配列番号１、２、３、７、１０、１１、１２、１５、１９、２０、２２、２３、２４、２５と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列、ならびに
（ｂ）ヌクレオチド配列  配列番号１、２、３、７、１０、１１、１２、１５、１９、２０、２２、２３、２４、２５によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
から選択される請求項４記載の阻害剤。
【請求項６】
癌患者における転移を防止し、遅延し、および／または処置するための医薬剤の製造のための前記請求項のいずれか一項に記載の阻害剤の使用。
【請求項７】
癌患者における転移を防止し、遅延し、および／または処置するための請求項１〜５のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項８】
癌患者、好ましくは乳癌患者における転移を防止し、遅延し、および／または処置するための方法であって、配列番号１〜３２により表される配列の群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされ、請求項１で定義されるようなポリペプチドの活性または定常状態レベルを薬理学的に変更することを包含する方法。
【請求項９】
請求項４または５記載の核酸構築物を含む治療的有効量の薬学的組成物を患者に投与することを包含する請求項８記載の方法であって、好ましくは前記薬学的組成物が処置されるべき癌患者の腫瘍細胞に投与される方法。
【請求項１０】
癌患者における転移を防止し、遅延し、および／または処置し得る物質の同定方法であって、以下の：
（ａ）核酸構築物中に存在するようなヌクレオチド配列（ここで、前記ヌクレオチド配列は、請求項１で定義されたような配列番号１〜３２から、または配列番号１〜１６９から選択される配列と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列、配列番号１〜３２または配列番号１〜１６９から選択されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である）を発現し得る試験細胞集団を提供するステップ；
（ｂ）試験細胞集団を当該物質と接触させるステップ；
（ｃ）当該物質と接触された試験集団中のヌクレオチド配列の発現レベルあるいはポリペプチドの活性または定常状態レベルを確定するステップ；
（ｄ）（ｃ）で確定される発現、活性または定常状態レベルを、当該物質と接触されていない試験細胞集団中のヌクレオチドの、またはポリペプチドの発現、活性または定常状態レベルと比較するステップ；そして
（ｅ）当該物質と接触されている試験細胞集団と当該物質と接触されていない試験細胞集団との間で、ヌクレオチド配列またはポリペプチドの発現レベル、活性または定常状態レベルにおいて差を生じる物質を同定するステップ
を包含する方法。
【請求項１１】
癌患者、好ましくは乳癌患者における転移を予後判定するｅｘ  ｖｉｖｏ方法であって、以下の配列：請求項１で同定されるような配列番号１〜３２、あるいは配列番号１〜１６９により表される遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せにおける遺伝子の示差的変調（対照における同一遺伝子の発現と比較）を同定することを、任意にこの結果を用いて、患者に施されるべき処置について決定することを包含する方法。
【請求項１２】
癌患者、好ましくは乳癌患者における転移の非存在を予後判定するｅｘ  ｖｉｖｏ方法であって、以下の配列：請求項１で同定されるような配列番号１〜３２、あるいは配列番号１〜１６９により表される遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せにおける遺伝子の示差的変調の欠如（対照における同一遺伝子の発現と比較）を同定することを、任意にこの結果を用いて、患者に施されるべき処置について決定することを包含する方法。
【請求項１３】
転移の非存在についての前記診断が５年という期間の間である請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
配列番号１〜３２または配列番号１〜１６９の配列により表される遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せの単離核酸配列、それらの相補体またはその部分を含むかまたはそれからなる診断ポートフォリオ。
【請求項１５】
癌患者における転移を予後判定するためのキットであって、配列番号１〜３２または配列番号１〜１６９の配列により表される遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せにおける核酸配列、それらの相補体またはその部分を検出するための試薬を含み、ならびに任意に使用説明書をさらに含むキット。
【請求項１６】
マイクロアレイ分析を実行するための試薬をさらに含み、そして任意に、前記核酸配列またはその相補体が検定される媒体をさらに含む請求項１５記載のキットであって、好ましくは前記媒体がマイクロアレイであるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、以下のポリペプチドのうちの１つの阻害剤の使用であって、前記ポリペプチドが配列番号１〜３２の群から選択される配列により表され、前記ポリペプチドの各々が、好ましくは請求項１で同定されるように、好ましくは癌患者における転移を防止し、遅延し、および／または処置するための医薬剤として用いられる阻害剤に関する。本発明は、癌患者における転移を予後判定するｅｘ  ｖｉｖｏ方法であって、以下の配列番号１〜１６９および／または配列番号１〜３２の配列により表される遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せにおける遺伝子の示差的変調（対照における同一遺伝子の発現と比較）を同定することを包含する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍細胞の転移性伝播は、腫瘍細胞が多数の関門を克服し、そしていわゆる「転移カスケード」のステップすべてを完了しなければならない非常に複雑な過程である。上皮組織から生じる最も頻発する固形腫瘍である癌腫において、これらのステップは、正常上皮細胞−細胞接触の崩壊、基底膜の破損、隣接組織の侵襲、血管またはリンパ管中の異物侵入、血管による運搬、溢出および二次部位での増殖を包含する（Ｇｕｐｔａ  ａｎｄ  Ｍａｓｓａｇｕｅ，  ２００６）。これらのステップのいくつかは、細胞自動性の獲得を要し、前提条件として正常上皮組織化の崩壊を伴う（Ｃａｖａｌｌａｒｏ  ａｎｄ  Ｃｈｒｉｓｔｏｆｏｒｉ，  ２００４）。これらの過程は、上皮細胞が、間充織細胞のものを連想させるより柔軟で且つ可動的な特性を獲得する上皮間充織移行（ＥＭＴ）として既知の胚性プログラムの癌細胞による強奪を包含する、ということがしばしば示唆されてきた（Ｔｈｉｅｒｙ  ａｎｄ  Ｓｌｅｅｍａｎ，  ２００６；Ｙａｎｇ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，  ２００８）。ＥＭＴの一主要特徴は、上皮タンパク質、特にＥ−カドヘリンの下方調節である。さらに、細胞は、しばしば、間充織タンパク質、例えばＮ−カドヘリンの発現も獲得する。
【０００３】
古典的には、転移は、癌腫進行の後期の且つ稀な事象とみなされてきた（Ｆｉｄｌｅｒ，  ２００３）。選択過程を通して、または確率論的に、原発性腫瘍におけるいくつかの細胞は、転移する能力をそれらに与える新規の変更を獲得すると考えられる。さらに近年、一モデルは、原発性腫瘍形成を誘導する突然変異の型の一関数として、いくつかの腫瘍が転移する傾向を容易に付与されることを提案した（Ｂｅｒｎａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，  ２００２）。腫瘍形成の後期に生じる他の変更は、最終的には、腫瘍細胞の小集合に、十分な転移能力を付与する。この考え方は、原発性乳癌細胞の大部分の遺伝子構成に基づいた遺伝子発現分類子が、腫瘍再発を予測し得る、という観察から生じる（ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｉｊｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２；Ｒａｍａｓｗａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。この見方と一致して、腫瘍形成の前提条件である安全を保証された細胞周期プログラムからの逸脱を可能にするいくつかの癌遺伝子は、同時に、乳房上皮細胞におけるＥＭＴを誘導し（Ａｎｓｉｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）、それにより転移性伝播を助長する、ということが近年示された。
【０００４】
転移過程に関与する遺伝子を同定することは、転移を理解するためにならびに新規の療法を開発するために重要である。いくつかの癌療法が既に開発されている。しかしながら、それらのうち、完全に上手くいったものはない。これが、癌を処置するために用いられ得る新規の化合物を同定する必要性が依然として存在する理由である。
【０００５】
新規の転移遺伝子を同定するために、以前に、ラット腸上皮（ＲＩＥ−１）細胞を利用して、アノイキス（接着誘導性細胞死）の抑制因子に関するゲノム幅スクリーニングを実施した（Ｄｏｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。これは、その一次リガンドＢＤＮＦとの同時発現時に、親細胞を、アノイキス感受性非発癌性細胞からアノイキス耐性腫瘍形成性および高転移性細胞に転換する神経栄養性受容体チロシンキナーゼＴｒｋＢ（Ｄｏｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）の同定をもたらした（Ｇｅｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｅｐｅｒ，  ２００５）。これらの細胞は、独立して工学処理されるＴｒｋＢ発現ラット腎臓上皮（ＲＫ３Ｅ）細胞と同様に、それらの発癌性および転移性潜在力に関するＴｒｋＢ活性に完全に左右されるので、そしてこれは非常に短い潜伏期で症状発現されるため（Ｄｏｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４および本論文）、これらの強固な細胞系を利用して、新規の重要な転移遺伝子に関してスクリーニングした。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
腫瘍細胞の転移性伝播は、癌死亡率の大半の原因となり、その駆動機序の多くは、依然として解明されていない。転移モデルにおいて遺伝的および機能的解析とＲＮＡｉとを組合せることにより、腫瘍細胞播種における転写因子Ｆｒａ−１（Ｆｏｓ関連抗原−１）に関する厳密な要件をここで同定する。これは、上皮間充織移行（ＥＭＴ）、細胞移動および侵襲（すべて、転移に関与する過程である）におけるＦｒａ−１に関する重要な役割と関連づけられた。これらの観察の支持に際して、ヒト乳癌細胞からのＦｒａ−１枯渇が、正所性原発性腫瘍から転移するそれらの能力を抑圧する、ということをわれわれは実証する。乳癌転移におけるＦｒａ−１に関する重要な役割を力説すると、Ｆｒａ−１枯渇乳癌細胞のマイクロアレイ解析は、高精度で腫瘍再発を予測する遺伝子発現署名を同定した。さらに、その発現が転移細胞中で有意に変更されるＦｒａ−１の１６８の遺伝子標的を、われわれは同定した。これらの遺伝子は、表２で同定されており、その任意の組合せは本明細書中で説明されるような分析器として用いられ得た。さらに、これら１６８の遺伝子およびＦｏｓ１１（Ｆｒａ１をコードする）の間で（すなわち、１６９の遺伝子間で）、Ｆｏｓ１１を含めた３２の遺伝子を、貧予後乳癌細胞において有意に過剰発現されるものとして、われわれは同定した。これらの遺伝子は、機能的群団で分類された（表５参照）。乳癌およびその他の腫瘍におけるＦｒａ−１過剰発現の蔓延を考えると、これらのデータは、これらの遺伝子のうちの少なくとも１つの抑制が、癌を、特に転移を処置するために用いられ得る、ということを強く示唆する。要するに、本明細書中で提示される結果は、Ｆｒａ−１および／またはその下流エフェクターのうちのいくつかが、癌、好ましくは乳癌における転移発症を防止し、遅延し、および／または処置する場合の有益な標的を表し得る、ということを示す。
ｅｘ  ｖｉｖｏ方法
【０００７】
第一の態様では、癌患者における転移のｅｘ  ｖｉｖｏ予後判定方法であって、以下の配列：配列番号１〜１６９または配列番号１〜３２の配列により表される遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せにおける遺伝子の示差的変調（基線における同一遺伝子の発現と比較）を同定することを包含する方法が提供される。
【０００８】
本発明の状況において、「予後判定すること」は、転移に関する癌患者の予測的危険査定（すなわち、将来における転移の存在を予測する、または転移の危険の前症候性予測）、あるいは患者における転移化癌の査定を意味する。それは、患者が所定の療法に応答する見込み、あるいは既に施されている療法に対する患者の応答も指し得る。通常は癌患者において一旦転移が査定されると、患者の生存の機会は劇的に減少するため、このような予後判定方法は有することが極めて重要である。
【０００９】
本発明の状況において、「患者」は動物またはヒトであり得る。好ましくは、患者はヒトである。
【００１０】
本発明の状況において、「転移」は、好ましくは、リンパ節、肝臓、胸郭または超音波検査に適した任意の他の器官の超音波検査、リンパ節切開、骨またはシンチグラフィーに適した任意の他の器官のシンチグラフィー、標準放射線撮影、あるいは転移の検出に適した任意の他の技法により、癌患者において査定されるような「転移」を指す。さらに好ましくは、「転移」は、後述されるようなｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルのうちの１つにおける腫瘍細胞内の「転移活性の検出」を指す。転移は、マウス（ヌードマウスまたは他の適切なマウス系統）における異種移植実験においてｉｎ  ｖｉｖｏで最良に研究され得る。要するに、約１．１０５〜１．１０７個の腫瘍細胞は、皮下に（Ｄｏｕｍａ  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００４），  Ｎａｔｕｒｅ，  ４３０：  １０３４−１０４０に記載）、あるいは正所的に（すなわち、腫瘍細胞の組織型に対応する器官または組織中に）注入される。例えば、乳房腫瘍細胞は、乳腺に注入される（Ｅｒｌｅｒ  Ｊ．Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ，  （２００６），  Ｎａｔｕｒｅ，  ４４０：  １２２２−１２２６に記載）。代替的には、細胞は、マウスの血液循環中に直接注入され得る（Ｅｒｌｅｒ  Ｊ．Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ，  （２００６），  Ｎａｔｕｒｅ，  ４４０：  １２２２−１２２６に記載）。注入部位から離れた部位で腫瘍細胞により形成される少なくとも１つの可視的病変の可視化は、腫瘍細胞の転移活性を明示する。病変の検出は、通常は、パラフィン包埋組織の一連の横断切片の顕微鏡分析により実行される。可視的転移病変は、少なくとも４、６、８、１０、１２、１４、１５、１７、１９、２０、２２、２４、２５個以上の腫瘍細胞を含み得る。転移の播種および増殖は、腫瘍細胞の型によってある時点で起こり、典型的には、摂取の数日後、あるいは数週間または数ヵ月後に開始する。
【００１１】
本発明の状況において、「遺伝子」は、好ましくは、核酸配列により表される、そしてタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。遺伝子は、調節領域を含み得る。
【００１２】
本発明の状況において、「配列番号１〜３２の配列により表される遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せ」は、好ましくは、以下の：
「遺伝子、あるいはヌクレオチドであって、ヌクレオチド配列が、以下の：
（１）酵素ＡＢＨＤ１１、ＡＵＲＫＢ、ＣＨＭＬ、ＥＺＨ２、ＦＥＮ１、ＩＧＦＢＰ３、ＰＡＩＣＳ、ＰＣＯＬＮ３、ＰＰＰ２Ｒ３Ａ、ＰＴＧＥＳ、ＰＴＰ４Ａ１およびＳＣＤをコードするヌクレオチド配列、
（２）転写因子Ｅ２Ｆ１、ＦＯＳ１およびＦＯＸＭ１をコードするヌクレオチド配列、
（３）構造タンパク質Ｃ２２ｏｒｆｌ  ８、ＣＨＡＦ１Ａ、Ｈ２ＡＦＺ、ＳＭＴＮ、ＴＪＡＰ１、Ｄ２１Ｓ２０５６Ｅをコードするヌクレオチド配列、
（４）受容体ＡＤＯＲＡ２Ｂをコードするヌクレオチド配列、
（５）接着分子ＭＴＤＨをコードするヌクレオチド配列、
（６）アポトーシス抑制因子ＢＩＲＣ５およびＰＨＬＤＡ１をコードするヌクレオチド配列、
（７）ＤＮＡ複製／転写に関与するタンパク質ＭＣＭ１０、ＭＣＭ２およびＴＲＦＰをコードするヌクレオチド、ならびに
（８）ＳＥＣ１４Ｌ１、ＳＦＮ、ＳＨ３ＧＬ１およびＹＴＨＤＦ１をコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択される遺伝子またはヌクレオチド」
を意味する。
【００１３】
本発明の状況において、「癌患者」という表現における「癌」は、好ましくは、癌が所定の患者において既に診断されている、ということを意味する。本発明の方法を用いる場合、転移は、任意の種類の癌において予後判定され得る。好ましくは、癌は、潜在的に転移を引き起こし得ると当業者に既知であるようなものである。別の好ましい実施形態では、癌は、腫瘍細胞を含有する試料を単離することが技術的に可能なものである。癌は、黒色腫、結腸癌、前立腺癌、肺癌、甲状腺癌または乳癌であり得る。選択される癌は、乳癌である。
【００１４】
「変調された」遺伝子は、好ましくは、非正常細胞（腫瘍細胞または転移腫瘍細胞）中で上方調節されるかまたは下方調節される場合、示差的に発現されるものである。上方調節および下方調節は相対的用語であって、検出可能な差（それを測定するために用いられる系においてノイズの関与を越える）が基線に比して遺伝子の発現の量で見出される、ということを意味する。この場合、基線は、好ましくは、非癌患者のプールから、あるいは好ましくは、癌は有するが、検出可能な転移を有さない患者のプールから得られる。これらの患者のプールは、好ましくは、１、３、５、１０、２０、３０、１００、４００、５００、６００名またはそれ以上の患者を含有する。非正常細胞中の当該遺伝子の発現レベルは、その場合、同一測定方法を用いて、基線レベルに比して上方調節されるかまたは下方調節されると考えられる。診断ポートフォリオの使用の状況では、基線は、癌患者の大きいプールの測定遺伝子発現である。通常は、大きいは、少なくとも５０名の癌患者、少なくとも７０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００名またはそれ以上を意味する。好ましくは、この大きいプールの癌患者における遺伝子発現は、「分類子生成」の節における実験部分で広範に説明されるように、良好なおよび不十分な予後セントロイドを生成するために本出願で用いられる。
【００１５】
遺伝子の発現レベルの査定は、遺伝子が変調されるか否かを査定するために、好ましくは、ｍＲＮＡレベルを検出するための古典的生物学的技法、例えば（実時間）逆転写酵素ＰＣＲ（定量的または半定量的）、ｍＲＮＡ（マイクロ）アレイ解析またはノーザンブロット解析、あるいはＲＮＡを検出するための他の方法を用いて実施される。代替的には、別の好ましい実施態様によれば、予後判定方法において、遺伝子の発現レベルは、上記遺伝子によりコードされるポリペプチドの量を定量することにより間接的に決定される。ポリペプチド量の定量は、任意の既知の技法により実行され得る。好ましくは、ポリペプチド量は、ウエスタンブロットにより定量される。代替的に、もしくは同定遺伝子および／または対応するポリペプチドの定量と組合せて、特定検定を用いる上記対応するポリペプチドの、または上記対応するポリペプチドの機能と関連することが既知である任意の化合物の基質の定量、あるいは上記対応するポリペプチドの機能または活性の定量は、本発明の予後判定方法の範囲内に包含される、と当業者は理解する。好ましい実施形態では、遺伝子の発現レベルの査定は、本明細書中で後述されるように、（マイクロ）アレイを用いて実行される。
【００１６】
遺伝子の発現レベルおよび／または対応するポリペプチドの量を癌患者で測定することは難しいことがあるため、好ましくは、患者からの試料が用いられる。別の好ましい実施形態によれば、（遺伝子またはポリペプチドの）発現レベルは、患者から得られる試料中でｅｘ  ｖｉｖｏで決定される。試料は、液体、半液体、半固体または固体であり得る。好ましい試料は、生検で採取される処置されるべき癌患者からの１００以上の腫瘍細胞および／または腫瘍組織を含む。代替的には、および／または前記の好ましい実施形態と組合せて、試料は、好ましくは患者の血液を含む。このような試料中に存在するＲＮＡおよび／またはタンパク質を単離し、任意に精製する方法は、当業者には既知である。ＲＮＡの場合、当業者は、既知の技法を用いてそれをさらに増幅し得る。
【００１７】
遺伝子の発現レベル（またはコード化ポリペプチドの定常状態レベル）の増大（または上方調節）（高発現レベルと同義である）または減少（または下方調節）（低発現レベルと同義である）は、好ましくは、基線における対応する遺伝子の発現レベル（または対応するコード化ポリペプチドの定常状態レベル）と比較した場合の、前記のような方法を用いる、遺伝子の発現レベル（またはコード化ポリペプチドの定常状態レベル）の検出可能変化（またはポリペプチドの生物学的活性における任意の検出可能変化）であると定義される。好ましい実施形態によれば、ポリペプチド活性の増大または減少は、ポリペプチド活性に関する特定の検定を用いて定量される。
【００１８】
好ましくは、遺伝子の発現レベルの増大は、アレイを用いた上記遺伝子の発現レベルの少なくとも５％の増大を意味する。さらに好ましくは、遺伝子の発現レベルの増大は、少なくとも１０％、さらに好ましくは少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも１５０％またはそれ以上の増大を意味する。
【００１９】
好ましくは、遺伝子の発現レベルの減少は、アレイを用いた上記遺伝子の発現レベルの少なくとも５％の減少を意味する。さらに好ましくは、遺伝子の発現レベルの減少は、少なくとも１０％、さらに好ましくは少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも１５０％またはそれ以上の減少を意味する。
【００２０】
好ましくは、ポリペプチドの発現レベルの増大は、ウエスタンブロットを用いた上記ポリペプチドの発現レベルの少なくとも５％の増大を意味する。さらに好ましくは、ポリペプチドの発現レベルの増大は、少なくとも１０％、さらに好ましくは少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも１５０％またはそれ以上の増大を意味する。
【００２１】
好ましくは、ポリペプチドの発現レベルの減少は、ウエスタンブロットを用いた上記ポリペプチドの発現レベルの少なくとも５％の減少を意味する。さらに好ましくは、ポリペプチドの発現レベルの減少は、少なくとも１０％、さらに好ましくは少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも１５０％またはそれ以上の減少を意味する。
【００２２】
好ましくは、ポリペプチド活性の増大は、適切な検定を用いた上記ポリペプチド活性の少なくとも５％の増大を意味する。さらに好ましくは、上記ポリペプチド活性の増大は、少なくとも１０％、さらに好ましくは少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも１５０％またはそれ以上の増大を意味する。
【００２３】
好ましくは、ポリペプチド活性の減少は、適切な検定を用いた上記ポリペプチド活性の少なくとも５％の減少を意味する。さらに好ましくは、上記ポリペプチド活性の減少は、少なくとも１０％、さらに好ましくは少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも１５０％またはそれ以上の減少を意味する。
【００２４】
本発明の好ましい予後判定方法では、本明細書中に記載されるような１つより多い、さらに好ましくは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１６８、１６９の遺伝子の発現レベル、および／または上記対応するポリペプチドの定常状態レベルが決定される。別の好ましい方法では、その発現レベルが決定される遺伝子は、以下の配列：配列番号１〜３２または配列番号１〜１６９の配列により表される遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せにおいて選択される。第一群の１〜３２までの遺伝子、それぞれ第二群の１〜１６９までの遺伝子の各組合せが用いられ得る。好ましい実施形態では、配列番号１〜１６９の群の１６９個の遺伝子が、用いられるものである。別の好ましい実施形態では、配列番号１〜３２の群の３２個の遺伝子が、用いられるものである。別の好ましい実施形態では、配列番号１〜３２により形成される群からの各群団からの一遺伝子が選択される。酵素をコードするとして分類される遺伝子が、好ましい。遺伝子ＦＯＳＬ１は、好ましい１つである。遺伝子ＡＤＯＲＡ２Ｂは、別の好ましい１つである。表３は、配列番号１〜３２の３２個の遺伝子を同定する（注解および寄託番号）。番号１として同定される遺伝子は、配列番号１により表されているそのｃＤＮＡ配列を有する。同じことが、表３で同定される他の遺伝子にも当てはまる。配列番号１〜１６９により表される１６９個の遺伝子はすべて、表２で同定される。表５は、群団への遺伝子の分類を同定し、そしてそれらの対応する配列番号を同定する。配列番号１〜３２を有する３２個の遺伝子の各々の発現レベルは、非転移細胞との比較により、転移細胞において上方調節されるかまたは増大されることが見出されている。表６に提示された遺伝子も好ましい。表６は、転移に不可欠であることが判明した１２のＦｒａ−１調節遺伝子を同定する。
【００２５】
転移を予後判定するための信頼できる方法は、配列番号１〜３２または配列番号１〜１６９の部分的組合せに基づいて実行され得る。
【００２６】
遺伝子（ヌクレオチド、核酸）またはポリペプチドを含む（マイクロ）アレイ（または他の高処理量スクリーニング装置）は、本発明の方法を実行するための好ましい一方法である。マイクロアレイは、核酸またはアミノ酸配列あるいはその混合物を分析するための１つより多い固定化核酸またはポリペプチド断片を含有する固体支持体または担体である（例えば、ＷＯ  ９７／２７３１７、ＷＯ  ９７／２２７２０、ＷＯ  ９７／４３４５０、ＥＰ  ０  ７９９  ８９７、ＥＰ  ０  ７８５  ２８０、ＷＯ  ９７／３１２５６、ＷＯ  ９７／２７３１７、ＷＯ  ９８／０８０８３およびＺｈｕ  ａｎｄ  Ｓｎｙｄｅｒ，  ２００１，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ５：  ４０−４５参照）。（マイクロ）アレイ技術は、数千の遺伝子の定常状態ｍＲＮＡレベルの同時的な測定を可能にして、それにより、本明細書中に記載されるような遺伝子の所定の群に関する遺伝子変調を同定するための強力なツールを提供する。２つのマイクロアレイ技術が、一般に広く用いられている。第一の技術はｃＤＮＡアレイであり、第二はオリゴヌクレオチドアレイである。これらのチップの構築に差が存在するが、しかし本質的には、すべての下流データ分析および出力は同一である。これらの分析の産物は、典型的には、マイクロアレイ上の既知の場所での核酸配列とハイブリダイズする試料からのｃＤＮＡ配列を検出するために用いられる標識化プローブから受け取るシグナルの強度の測定値である。典型的には、シグナルの強度は、試験されるべき癌患者からの細胞中で発現されるｃＤＮＡの量に、したがってｍＲＮＡに比例する。多数のこのような技法が利用可能であり、有用である。遺伝子発現を決定するための好ましい方法は、米国特許第６，２７１，００２号（Ｌｉｎｓｌｅｙ等）；第６，２１８，１２２号（Ｆｒｉｅｎｄ等）；第６，２１８，１１４号（Ｐｅｃｋ等）および第６，００４，７５５号（Ｗａｎｇ等）に見出され得る（これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される）。
【００２７】
発現レベルの分析は、好ましくは、これらの技法を用いて発現レベルを測定することにより実行される。一般に、これは、マイクロアレイ・プラットフォーム上での単一チャンネルハイブリダイゼーションを用いて試験試料（試験されるべき癌患者からの細胞からのＲＮＡ）中の遺伝子の発現強度のマトリックスを生成し、これらの強度を、参照群または基線（この場合、本明細書中で上記したような良好なおよび不十分な予後セントロイド）のうちの一つと比較することにより、最良に実行される。例えば、非正常組織（癌）からの遺伝子発現強度は、同一型の非正常組織から生じる発現強度と比較される。それは、好ましくは、本発明の状況内では、「対照」は、好ましくは本明細書中で上記したような方法を用いた、本明細書中に上記したような多数の癌患者を指す、ということを意味する。
【００２８】
好ましくは、その遺伝子発現強度を用いて、各試料は、単一試料予測器を用いて良好診断または悪診断に割り当てられる。この好ましい方法では、各患者は、各試料の対応する遺伝子組の遺伝子発現値と「不十分診断」および「良好診断」セントロイドのセントロイド値との間の最高スピアマンの順位相関スコアにより決定した場合の、最も近いセントロイドに割り当てられる。本発明の分類子は、好ましくは、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ  ２００６に記載されたように用いられる。
【００２９】
さらなる態様において、第二のｅｘ  ｖｉｖｏ方法が提供されるが、この方法は、癌患者における転移の非存在を予後判定するために用いられる方法であって、以下の配列：配列番号１〜３２または配列番号１〜１６９の配列により表される遺伝子からなる群から選択される遺伝子と組合せて、遺伝子の示差的変調の欠如（対照における同一遺伝子の発現と比較）を同定することを包含する方法である。
【００３０】
上記第二の方法のすべての要素（例えば、癌の型、患者の同一性、遺伝子の変調を同定する方法）は、第一の方法に関して既に同定されている。転移の非存在は、好ましくは、本明細書中に上記した方法と同一方法で査定される（シンチグラフィーまたはｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデル）。さらに好ましい方法では、転移の非存在は、１、２、３、４、５年またはそれより長い期間に関して予後判定される。これらの方法の各々は、任意に、患者に関する好ましい処置を決定するために用いられ得る。例えば、遺伝子発現パターンが良好な予後（すなわち、転移なし）を示す患者は、標準処置（すなわち低攻撃的処置）を施される。別の例として、遺伝子パターンが不十分な予後（すなわち転移）を示す患者は、より攻撃的な処置を施される。さらに、本明細書中に記載されるようなＦｒａ−１遺伝子発現プロフィール（すなわち、以下の配列：配列番号１〜３２または配列番号１〜１６９の配列により表される遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せ）は、配列番号１〜３２からの１つ以上の遺伝子の標的化抑制から利益を得ると予測される患者を同定するために用いられ得る。好ましい一実施形態では、好ましくは不十分予後群に属する患者において、本明細書中に記載されるような基線との比較により上方調節される配列番号１〜３２群から選択される遺伝子が存在するか否かを先ず同定する。
【００３１】
このような遺伝子が見出される場合、上記遺伝子の阻害剤を用いることにより、このような個体を処置するのが好ましい。したがって本発明は、この型の患者の個別的処置を可能にする。
診断プロフィール
【００３２】
本発明の別の態様は、配列番号１〜３２または配列番号１〜１６９の配列により表される遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せの単離核酸（またはヌクレオチド）配列、それらの相補体またはその部分を含むかまたはそれからなる診断ポートフォリオに関する。本明細書中に記載されるような任意の組合せまたは副組合せを含むかまたはそれらからなる診断ポートフォリオも、本発明に包含される。好ましい診断ポートフォリオは、そこに含入される遺伝子の示差的発現を同定するのに適したマトリックスを含む。さらに好ましい診断ポートフォリオはマトリックスを含み、そのマトリックスはマイクロアレイに用いられる。上記マトリックスは、好ましくはｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド・マイクロアレイである。診断ポートフォリオに用いられるマーカー（すなわち、遺伝子または核酸、ヌクレオチド）は、前節で既に記載されている。
キット
【００３３】
さらなる態様において、転移を予後判定するかまたは転移の非存在を予後判定するために有用なポートフォリオを作り上げる遺伝子発現プロフィールの表示を含めた商品を提供する。これらの表示は、コンピューター読取り媒体（磁気、光学的等）のような機械により自動的に読まれ得る媒体に置き換えられる。商品は、このような媒体における遺伝子発現プロフィールを査定するための使用説明書も含む。例えば、商品は、上記の遺伝子のポートフォリオの遺伝子発現プロフィールを比較するためのコンピューター使用説明書を有するＣＤ  ＲＯＭを含み得る。商品は、癌患者試料からの遺伝子発現データと比較され得るよう、そこにデジタルに記録される遺伝子発現プロフィールも有し得る。代替的には、プロフィールは、異なる表示フォーマットで記録され得る。グラフによる記録は、このようなフォーマットの１つである。本発明による異なる型の製品は、遺伝子発現プロフィールを明示するために用いられる媒体またはフォーマット化された検定である。これらは、例えば、当該遺伝子を示す配列がそれらの存在の読取り可能な決定因子を作製することを併有するマトリックスに配列相補体またはプローブが添付されるマイクロアレイを含むかそれからなり得る。このようなマイクロアレイが最適化ポートフォリオを含有する場合、基質に適用され、試料と反応され、分析器により読取られ、結果に関して処理され、そして（時として）立証されなければならないｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドの数を最小限にすることにより、時間、工程段階およびリソースの大きな節減が得られる。本発明による他の商品は、本明細書中に記載されるようなポートフォリオ中の遺伝子の発現のレベルを示すハイブリダイゼーション、増幅およびシグナル生成を実行するための試薬キットに造り上げられ得る。本発明に従って作製されるキットは、遺伝子発現プロフィールを確定するためのフォーマット化検定を包含する。これは、試薬および使用説明書のような検定を実行するために必要とされる材料のうちのすべてまたはいくつかを包含し得る。したがって、さらなる態様では、癌患者における転移を予後判定するかまたは転移の非存在を予後判定するためのキットであって、以下の配列：配列番号１〜３２または配列番号１〜１６９の配列により表される遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せにおいて核酸配列、それらの相補体またはその部分を検出するための試薬を含むキットが提供される。本明細書中に記載されるような任意の組合せまたは副組合せを含むかまたはそれらからなるキットも、本発明に包含される。
【００３４】
好ましいキットは、さらに、マイクロアレイ解析を実行するための試薬を含む。さらに好ましくは、キットはさらに、上記核酸配列、それらの相補体またはその部分が検定される媒体を含む。さらに好ましくは、上記媒体はマイクロアレイである。キットはさらに、使用説明書を含み得る。
阻害剤
【００３５】
さらなる態様では、ポリペプチドの阻害剤であって、前記ポリペプチドがヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、以下の：
（１）酵素ＡＢＨＤ１１、ＡＵＲＫＢ、ＣＨＭＬ、ＥＺＨ２、ＦＥＮ１、ＩＧＦＢＰ３、ＰＡＩＣＳ、ＰＣＯＬＮ３、ＰＰＰ２Ｒ３Ａ、ＰＴＧＥＳ、ＰＴＰ４Ａ１およびＳＣＤをコードするヌクレオチド配列、
（２）転写因子Ｅ２Ｆ１、ＦＯＳ１およびＦＯＸＭ１をコードするヌクレオチド配列、
（３）構造タンパク質Ｃ２２ｏｒｆｌ  ８、ＣＨＡＦ１Ａ、Ｈ２ＡＦＺ、ＳＭＴＮ、ＴＪＡＰ１、Ｄ２１Ｓ２０５６Ｅをコードするヌクレオチド配列、
（４）受容体ＡＤＯＲＡ２Ｂをコードするヌクレオチド配列、
（５）接着分子ＭＴＤＨをコードするヌクレオチド配列、
（６）アポトーシス抑制因子ＢＩＲＣ５およびＰＨＬＤＡ１をコードするヌクレオチド配列、
（７）ＤＮＡ複製／転写に関与するタンパク質ＭＣＭ１０、ＭＣＭ２およびＴＲＦＰに関与するタンパク質をコードするヌクレオチド、ならびに
（８）ＳＥＣ１４Ｌ１、ＳＦＮ、ＳＨ３ＧＬ１およびＹＴＨＤＦ１をコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択される阻害剤であり、好ましくは医薬剤として用いるため、さらに好ましくは癌患者における転移を防止し、遅延し、および／または処置するためである阻害剤が提供される。
【００３６】
このポリペプチドは、それをコードするヌクレオチドであって、以下の：
（１）酵素ＡＢＨＤ１１、ＡＵＲＫＢ、ＣＨＭＬ、ＥＺＨ２、ＦＥＮ１、ＩＧＦＢＰ３、ＰＡＩＣＳ、ＰＣＯＬＮ３、ＰＰＰ２Ｒ３Ａ、ＰＴＧＥＳ、ＰＴＰ４Ａ１およびＳＣＤをコードし、配列番号１、３、７、１０、１１、１５、１９、２０、２２、２３、２４、２５と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列、ならびに配列番号１、３、７、１０、１１、１５、１９、２０、２２、２３、２４、２５から選択されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
（２）転写因子Ｅ２Ｆ１、ＦＯＳ１およびＦＯＸＭ１をコードし、配列番号９、１２、１３と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列、ならびに配列番号９、１２、１３から選択されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
（３）構造タンパク質Ｃ２２ｏｒｆｌ  ８、ＣＨＡＦ１Ａ、Ｈ２ＡＦＺ、ＳＭＴＮ、ＴＪＡＰ１、Ｄ２１Ｓ２０５６Ｅをコードし、配列番号５、６、１４、２９、３０、８と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列、ならびに配列番号５、６、１４、２９、３０、８から選択されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
（４）受容体ＡＤＯＲＡ２Ｂをコードし、配列番号２と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列、ならびに配列番号２から選択されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
（５）接着分子ＭＴＤＨをコードし、配列番号１８と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列、ならびに配列番号１８から選択されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
（６）アポトーシス抑制因子ＢＩＲＣ５およびＰＨＬＤＡ１をコードし、配列番号４、２１と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列、ならびに配列番号４、２１から選択されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
（７）ＤＮＡ複製／転写に関与するタンパク質ＭＣＭ１０、ＭＣＭ２およびＴＲＦＰに関与するタンパク質をコードし、配列番号１６、１７、３１と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列、ならびに配列番号１６、１７、３１から選択されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド、ならびに
（８）ＳＥＣ１４Ｌ１、ＳＦＮ、ＳＨ３ＧＬ１およびＹＴＨＤＦ１をコードし、配列番号２６、２７、２８、３２と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列、ならびに配列番号２６、２７、２８、３２から選択されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチドに言及することによっても同定され、上記阻害剤は、好ましくは、医薬剤として用いるため、さらに好ましくは、癌患者における転移を防止し、遅延し、および／または処置するためである。
【００３７】
本明細書中に記載されるような酵素の阻害剤が好ましい。ＦＯＳＬ１の阻害剤も好ましい。ＡＤＯＲＡ２Ｂの阻害剤も好ましい。
【００３８】
ポリペプチドの阻害剤はさらにまた、以下の：
（ａ）配列番号１〜３２から選択される配列と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列、ならびに
（ｂ）配列番号１〜３２から選択されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドの阻害剤であると定義され得るが、この場合、上記阻害剤は、好ましくは医薬剤として用いるため、さらに好ましくは癌患者における転移を防止し、遅延し、および／または処置するためである。
【００３９】
本出願全体を通して、ポリペプチドは、別記しない限り、「以下の：
（ａ）配列番号１〜３２から選択される配列と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列、ならびに
（ｂ）配列番号１〜３２から選択されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
から選択されるヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド」に置き換えられ得る。
【００４０】
阻害剤は、ポリペプチドの活性を減少し、および／またはその発現レベルおよび／または細胞下局在性を減少し得る化合物である。
【００４１】
「ポリペプチドの活性の減少あるいは上記ポリペプチドをコードする遺伝子またはヌクレオチドの発現レベルの減少」は、本明細書中では、配列番号１〜３２によりコードされるもののような野生型ポリペプチドの上記活性または発現と比較した場合の、上記ポリペプチドにより発揮される生物学的活性における、あるいは上記ポリペプチドの発現レベルにおける任意の検出可能な変化を意味すると理解される。上記ポリペプチドをコードするヌクレオチドのレベルまたは量の減少は、好ましくは、古典的分子生物学的技法、例えば（実時間）ＰＣＲ、アレイまたはノーザン分析を用いて査定される。代替的には、別の好ましい実施形態によれば、上記ポリペプチドの発現レベルの減少は、上記ポリペプチドの量を定量することにより直接的に確定される。ポリペプチド量の定量は、任意の既知の技法、例えばウエスタンブロットまたは上記ポリペプチドに対して産生される抗体を用いるイムノアッセイにより実行され得る。代替的には、または核酸配列および／または対応するポリペプチドの定量と組合せて、特定の検定を用いての、基質の定量、あるいは上記ポリペプチドの標的遺伝子の発現の、または上記ポリペプチドの機能または活性と関連することが既知である任意の化合物の定量、あるいは上記ポリペプチドの上記機能または活性の定量は、上記ポリペプチドの活性または発現レベルの減少を査定するために用いられ得る、と当業者は理解する。
【００４２】
好ましくは、上記ポリペプチドをコードするヌクレオチドの発現レベルの減少または下方調節は、アレイまたはノーザンブロットを用いたヌクレオチド配列の発現レベルの少なくとも５％の減少を意味する。さらに好ましくは、ヌクレオチド配列の発現レベルの減少は、少なくとも１０％、さらに好ましくは少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％またはそれ以上の減少を意味する。好ましくは、発現は、もはや検出可能でない。別の好ましい実施形態では、上記ポリペプチドの発現レベルの減少は、ウエスタンブロットを用いた、および／またはＥＬＩＳＡまたは適切な検定を用いた上記ポリペプチドの発現レベルの少なくとも５％の減少を意味する。さらに好ましくは、上記ポリペプチドの発現レベルの減少は、少なくとも１０％、さらに好ましくは少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも１５０％またはそれ以上の減少を意味する。好ましくは、発現は、もはや検出可能でない。別の好ましい実施形態では、ポリペプチド活性の減少は、本明細書中で前記されたような適切な検定を用いた上記活性の少なくとも５％の減少を意味する。さらに好ましくは、上記活性の減少は、少なくとも１０％、さらに好ましくは少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも１５０％またはそれ以上の減少を意味する。好ましくは、上記活性は、もはや検出可能でない。
【００４３】
阻害剤は、任意の化合物であり得る。本発明は、ポリペプチドの付加的阻害剤を同定するための方法も提供する（後記参照）。好ましくは、阻害剤は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子、優性阻害型分子、上記ポリペプチドに対して産生される抑制抗体、ペプチド様分子（ペプチド模倣物とも呼ばれる）または非ペプチド分子である。これらの阻害剤の各々は、以下でさらに詳細に示される。阻害剤は、例えば細胞に上記ポリペプチドのアンタゴニストまたは阻害剤、例えば上記ポリペプチドに対して産生される抑制抗体（本明細書中では抗体と呼ばれる）または優性阻害型の上記ポリペプチドまたはアンチセンス（本明細書中ではアンチセンス分子と呼ばれる）を提供することにより、ポリペプチドそれ自体のレベルで作用し得る。本発明の抗体、アンチセンス分子または優性阻害型は、下記のようにして得られる。代替的には、阻害剤は、上記ポリペプチドをコードするヌクレオチドのレベルで作用し得る。この場合、ポリペプチドの発現レベルは、上記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現レベルを調節することにより減少される。
【００４４】
したがって、第一の好ましい実施形態では、阻害剤はＤＮＡ分子である。本発明は、先ず、以下の：
（ａ）配列番号１〜３２から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列；および／または
（ｂ）配列番号１〜３２から選択されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８または９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
から選択されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の全部または一部を含む核酸構築物を提供する。
【００４５】
好ましくは、ヌクレオチド配列は、細胞、さらに好ましくはヒトおよび／または腫瘍細胞における上記ヌクレオチド配列の発現を駆動し得るプロモーターと操作可能的に連結される。さらに好ましくは、細胞はヒト乳房細胞である。
【００４６】
したがって、さらに好ましい実施形態では、本発明の核酸構築物は、ＲＮＡｉ因子、すなわち、ＲＮＡ干渉が可能であるＲＮＡ分子またはＲＮＡ干渉が可能であるＲＮＡ分子の一部をコードするヌクレオチド配列を含むかまたはそれらからなる。このようなＲＮＡ分子は、小ＲＮＡ分子、例えばｓｉＲＮＡ（短い干渉ＲＮＡ、例えば短いヘアピンＲＮＡ）として言及される。ＲＮＡｉ因子をコードするヌクレオチド配列は、好ましくは、以下の：
（ａ）配列番号１〜３２から選択される配列と少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列；および／または
（ｂ）配列番号１〜３２から選択されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８または９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
から選択されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現を抑制し得るべき細胞ヌクレオチド配列と十分な相補性を有する。
【００４７】
さらなる好ましい実施形態では、本発明の核酸構築物は、以下の：
（ａ）本明細書中に記載されるような配列番号１、２、３、７、１０、１１、１５、１９、２０、２２、２３、２４、２５、１２と少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列；および／または
（ｂ）配列番号１、２、３、７、１０、１１、１５、１９、２０、２２、２３、２４、２５、１２から選択されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８または９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
から選択されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現を抑制し得るＲＮＡｉ因子をコードするヌクレオチド配列を含むかまたはそれらからなるが、この場合、任意に、ＲＮＡｉ因子をコードするヌクレオチド配列は、細胞、さらに好ましくはヒトおよび／または腫瘍細胞におけるヌクレオチド配列の発現を駆動し得るプロモーターと操作可能的に連結される。さらに好ましくは、細胞はヒト乳房細胞である。
【００４８】
転移におけるこれらの遺伝子の各々の役割は、本出願の実施例で明白に実証されている。したがって、これらの遺伝子のうちのいずれか１つまたは本明細書中に記載されるようなその任意の組合せの発現レベルを下方調節し得るＲＮＡｉ因子をコードする配列を含む核酸構築物を含めた任意の物質は、本発明による好ましい一実施形態である。しかしながら、配列番号１〜３２により同定される、好ましくは本明細書中で後述されるような本発明の方法で同定される遺伝子のいずれかの発現レベルを下方調節するというこの能力を有する任意の他の物質は、本発明に包含される。
【００４９】
代替的には、またはアンチセンスアプローチと組合せて、不活性化アプローチも用い得る。このアプローチでは、不活性化核酸構築物が細胞中に導入される。上記不活性化構築物は、ポリペプチドの発現を不活性化するために設計されるヌクレオチド分子を含むかまたはそれからなる。不活性化構築物の設計方法を、当業者は既知である。例えば、ポリペプチドをコードする遺伝子の少なくとも一部は、ネオマイシン遺伝子のようなマーカーにより置き換えられる。
【００５０】
代替的には、またはアンチセンスおよび不活性化アプローチと組合せて、優性阻害型アプローチも用い得る。このアプローチでは、核酸構築物が細胞中に導入されるが、この場合、上記核酸構築物は、対応する内因性ポリペプチドの活性を抑制するかまたは下方調節し得る優性阻害型ヌクレオチド配列を含み、そして任意に、優性阻害型ヌクレオチド配列は、細胞中の上記優性阻害型ヌクレオチド配列の発現を駆動し得るプロモーターの制御下にある。本明細書中に前記された好ましい一実施形態では、本明細書中で用いられる核酸構築物は、本明細書中で前記されたような優性阻害型のポリペプチドを含むかまたはそれからなる。代替的には、優性阻害型分子は、被験者に直接投与され得る。優性阻害型のポリペプチドの設計方法を、当業者は既知である。上記ポリペプチドの機能または活性によって優性阻害型のポリペプチドを設計することに関しては、いくつかの戦略が既に知られている。ポリペプチドがキナーゼである場合、優性阻害型キナーゼは、通常は、触媒ドメイン（単数または複数）を伴わない、あるいは不活性触媒ドメイン（単数または複数）を伴う切頭化キナーゼである。不活性触媒ドメインは、上記キナーゼドメイン（単数または複数）における点突然変異（単数または複数）を導入することにより生成され得る。
【００５１】
本発明の核酸構築物において（優性阻害型アプローチ、不活性化アプローチまたはアンチセンスアプローチ）、存在し得るプロモーターは、好ましくはヒトおよび／または腫瘍細胞および／または乳房細胞に特異的であるプロモーターである。さらに好ましくは、選択されるプロモーターは、ヒトおよび／または腫瘍細胞および／または乳房細胞に特異的であり、それらにおいて機能的である。ヒトおよび／または腫瘍細胞および／または乳房細胞に特異的であるプロモーターは、他の種類の細胞よりこのような細胞において高い転写率を有するプロモーターである。好ましくは、このような細胞におけるプロモーターの転写率は、他の種類の細胞と比較した場合、このような細胞における構築物のＰＣＲにより測定されるように他の種類の細胞におけるよりも少なくとも１．１、１．５、２．０または５．０倍高い。
【００５２】
本明細書中に記載されるような核酸構築物は、医薬剤として用いるための、好ましくは癌患者における転移を防止し、遅延し、および／または処置するためのものである。
【００５３】
好ましい実施形態では、核酸構築物は、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびレトロウイルスを基礎にした遺伝子療法ベクターから選択されるウイルス遺伝子療法ベクターである。好ましいウイルス遺伝子療法ベクターは、ＡＡＶまたはレンチウイルスベクターである。このようなベクターは、本明細書中でさらに後述される。
【００５４】
さらに、本明細書中に記載されるようなポリペプチドのいくつかに関して、阻害剤が既に同定されている（表４参照）。さらに、ＡＤＯＲＡ２Ｂの阻害剤も既知である：７−クロロ−４−ヒドロキシ−２−フェニル−１，８−ナフチリジン（Ａ１アデノシン受容体アンタゴニスト）、ＣＧＳ−１５９４３（非常に強力な非選択的Ａ１アデノシン受容体アンタゴニスト）。
【００５５】
これら２つの化合物は、市販されている（Ｓｉｇｍａ）。したがって、本発明は、医薬剤として用いるための、好ましくは癌患者における転移を防止し、遅延し、および／または処置するためのこれらの阻害剤の各々も包含する。
核酸構築物の使用
【００５６】
さらなる態様では、本発明は、好ましくは本明細書中に記載されるような本発明の方法において、癌患者における転移を防止し、および／または遅延し、および／または処置するための医薬剤の製造のための、本明細書中に記載されるような遺伝子の発現レベル、および／またはポリペプチドの活性または定常状態レベルを調整するための本明細書中に記載されるような核酸構築物の使用に関する。
癌患者における転移を防止し、遅延し、および／または処置し得る物質の同定
【００５７】
さらなる態様において、本発明は、癌患者における転移を防止し、遅延し、および／または処置し得る物質の同定方法に関する。当該方法は、好ましくは、以下の：
（ａ）核酸構築物中に存在するようなヌクレオチド配列（ここで、前記ヌクレオチド配列は、請求項１で定義されたような配列番号１〜３２から、または配列番号１〜１６９から選択される配列と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列、配列番号１〜３２または配列番号１〜１６９から選択されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である）を発現し得る試験細胞集団を提供するステップ；
（ｂ）試験細胞集団を当該物質と接触させるステップ；
（ｃ）当該物質と接触された試験集団中のヌクレオチド配列の発現レベルあるいはポリペプチドの活性または定常状態レベルを確定するステップ；
（ｄ）（ｃ）で確定される発現、活性または定常状態レベルを、当該物質と接触されていない試験細胞集団中のヌクレオチドの、またはポリペプチドの発現、活性または定常状態レベルと比較するステップ；そして
（ｅ）当該物質と接触されている試験細胞集団と当該物質と接触されていない試験細胞集団との間で、ヌクレオチド配列またはポリペプチドの発現レベル、活性または定常状態レベルにおいて差を生じる物質を同定するステップ
を包含する。
【００５８】
好ましくは、ステップａ）において、一方法では、試験細胞は本発明の核酸構築物を含む。好ましくは、１つより多いヌクレオチド配列または１つより多いポリペプチドの発現レベル、活性または定常状態レベルが比較される。好ましくは、一方法では、試験細胞集団は、乳房細胞、さらに好ましくはヒトおよび／または腫瘍細胞を含む。さらに好ましくは、試験細胞集団は、骨髄および／または末梢血および／または多能性幹細胞および／または乳房細胞を含む。これらの細胞は、当業者に既知の技法を用いて採取され、精製され得る。さらに好ましくは、試験細胞集団は、細胞株を含む。好ましくは、細胞株は、ヒトまたはラット細胞株である。さらに好ましくは、ヒト細胞株ＬＭ２またはラット細胞株ＲＫ３Ｅが用いられるものである。別の好ましい実施形態では、試験細胞は、本明細書中に前記されたようなｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルの一部である。一態様では、本発明は、前記の方法の一方法で同定される物質にも関する。
【００５９】
好ましい一実施形態では、転移を「防止すること」は、本明細書中に前記したようなシンチグラフィーを用いて少なくとも１、２、３、４、５年またはそれより長い間、転移病変が本明細書中で前記したようなｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルにおいて、および／または癌患者において検出されない、ということを意味するが、この場合、上記腫瘍細胞は、非処置対照における転移病変の潜在的発症との比較により、上記物質で処置された。
【００６０】
好ましい一実施形態では、転移を「遅延すること」は、上記物質で処置された前段落で記載したものと同一の検定を用いた所定の系における転移病変の検出が、上記物質で処置されない対応する対照において一転移病変の検出が生じる時間と比較して、少なくとも１、６、１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６ヶ月またはそれ以上遅延される、ということを意味する。
【００６１】
好ましい一実施形態では、転移を「処置すること」は、処置されていない同一系における転移病変の量と比較して、少なくとも１（２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２）ヵ月後またはそれ以後に、上記物質で処置された全段落に記載したものと同一検定を用いた所定の系における転移病変の量の検出可能な減少が認められる、ということを意味する。検出可能な減少は、好ましくは、少なくとも１％減少、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％減少またはそれ以上の、転移が検出可能でなくなるまでの減少であると定義される。
転移を防止し、遅延し、および／または処置するための方法
【００６２】
癌患者においてこのような方法で用いられ得る既知の医薬剤は、一般に存在しない。単なる標準処置は、放射線照射、ホルモン療法および／または化学療法を包含する。したがって、さらなる態様では、本発明は、癌患者における転移を防止し、遅延し、および／または処置するための方法であって、表題「阻害剤」の節で同定される遺伝子またはヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの遺伝子の発現レベル、および／または活性または定常状態レベルを薬理学的に変更することを包含する方法を提供する。この節では、ポリペプチドは、コード配列が表題「阻害剤」の節で同定されたポリペプチドを意味する。本発明の好ましい一方法において、上記ポリペプチドの遺伝子の発現レベル、および／または活性および／または定常状態レベルは、転移を有さない（検出可能な転移なし）ことが既知の癌患者における、または健常被験者におけるその生理学的レベルを模倣するために変更される。
【００６３】
「転移を防止する、遅延するおよび／または処置する」という表現は、前節と同じ意味を与えられる。
【００６４】
ポリペプチドの活性または定常状態レベルは、例えば、ポリペプチドに対する抗体、好ましくは中和抗体のようなポリペプチドのアンタゴニストまたは阻害剤を患者に、好ましくは細胞に、さらに好ましくは上記癌患者の腫瘍細胞に提供することにより、ポリペプチドそれ自体のレベルで変更され得る。外因性供給源からの優性阻害型ポリペプチドまたはアンチセンスの提供のために、優性阻害型ポリペプチドまたはアンチセンスは、下記のような適切な宿主細胞における優性阻害型ポリペプチドまたはアンチセンスをコードする核酸の発現により産生され得るのが便利である。本発明のポリペプチドに対する抗体は、下記のようにして得られる。
【００６５】
しかしながら、好ましくは、ポリペプチドの活性または定常状態レベルは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現レベルを調節することにより変更される。好ましくは、ヌクレオチド配列の発現レベルは、ヒトおよび／または腫瘍細胞において調節される。
【００６６】
ポリペプチドの発現レベルは、阻害剤、好ましくはアンチセンス分子を、ヒトおよび／または腫瘍細胞に提供し、それによりアンチセンス分子が、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の生合成（通常は翻訳）を抑制し得ることにより減少され得る。アンチセンスまたは干渉ＲＮＡ分子を提供することによる遺伝子発現の減少は、本明細書中で後述されており、そして、例えばＦａｍｕｌｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２０（１１）：  ４６２−４６６）により再検討されている。アンチセンス分子は、そのようなものとして細胞に提供され得るし、またはそれは、発現構築物をヒトおよび／または腫瘍細胞中に導入することにより提供され、それにより発現構築物が、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を抑制し得るアンチセンスヌクレオチド配列を含み、それによりアンチセンスヌクレオチド配列が、ヒトおよび／または腫瘍細胞におけるアンチセンスヌクレオチド配列の転写を駆動し得るプロモーターの制御下にある。ポリペプチドの発現レベルは、ヒトおよび／または腫瘍細胞中への発現構築物の導入によっても減少され、それにより、発現構築物は、ポリペプチドをコードする内因性ヌクレオチド配列のトランス抑制し得る因子をコードするヌクレオチド配列を含む。アンチセンスまたは干渉核酸分子は、「そのようなものとして」直接的に、任意に適切な処方物中で、細胞中に導入され得るし、あるいは、それは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を抑制し得る（アンチセンスまたは干渉）ヌクレオチド配列を含む発現構築物を細胞中に導入することにより、細胞中でｉｎ  ｓｉｔｕで産生され、それにより、任意に、アンチセンスまたは干渉ヌクレオチド配列は、ヒトおよび／または腫瘍細胞中でのヌクレオチド配列の発現を駆動し得るプロモーターの制御下にある。
【００６７】
「遺伝子（ヌクレオチド）または対応するポリペプチドの発現を増大するかまたは減少する」ことの意味は、表題「ｅｘ  ｖｉｖｏ方法」の節で示されたものと同じである。
【００６８】
本発明の方法は、好ましくは、本明細書中に記載されるような阻害剤：ポリペプチドの活性または定常状態レベルを調整するための核酸構築物、および／または中和抗体、および／または本明細書中に記載されるようなポリペプチドを含む治療的有効量の薬学的組成物を癌患者に投与するステップを包含する。核酸構築物は、本明細書中の以下でさらに明示されるような発現構築物であり得る。好ましくは、発現構築物は、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびレトロウイルスを基礎にした遺伝子療法ベクターから選択されるウイルス遺伝子療法ベクターである。好ましいウイルス遺伝子療法ベクターは、ＡＡＶまたはレンチウイルスベクターである。代替的には、核酸構築物、例えばアンチセンス分子またはＲＮＡ干渉を可能にするＲＮＡ分子は、本発明のポリペプチドの発現を抑制するためであり得る（下記参照）。本発明の方法において、ヒトおよび／または腫瘍細胞は、好ましくは、例えば、その年齢および／またはその遺伝的背景および／またはその食餌および／または彼が有する癌の種類のために、転移癌を有する高い危険を有することが疑われる癌患者からの細胞である。代替的には、別の好ましい実施形態では、本発明の方法は、転移癌を有する危険を有すると診断された癌患者からの細胞に適用される。用いられる予後判定方法は、好ましくは、本明細書中に既に前記した本発明のうちの１つである。さらに好ましくは、このような方法において、好ましくは貧予後群に属する患者において、その発現が本明細書中に記載したような基線との比較により上方調節される配列番号１〜３２の群から選択される遺伝子が存在する、ということが判明した場合、上記遺伝子の阻害剤を用いることによりこのような個体または患者を処置することが好ましい。したがって、本発明は、この型の患者の個別的処置を可能にする。
【００６９】
一方法において、処置されるために選択されるヒトおよび／または腫瘍細胞は、好ましくは、それらが属する患者から単離される（ｅｘ  ｖｉｖｏ法）。細胞は、その後、本発明のポリペプチドの活性または定常状態レベルを変更することにより処置される。この処置は、好ましくは、本発明のポリペプチドおよび／または核酸構築物、および／または本明細書中に前記したような中和抗体をそれらに潜入させることにより実施される。最後に、処置細胞は、それらが属する患者に置き戻される。
【００７０】
別の処置方法において、本明細書中で記述される本発明は、化学療法および／または放射線照射のような転移の標準処置と併用され得る。
【００７１】
遺伝子療法は、転移を防止し、遅延し、および／または処置するための実行可能な手段であるが、しかし他の考え得る処置も予想され得る。例えば、意図された方向である種の分子経路を進めるための「小分子」による処置も好ましい。これらの小分子は、好ましくは本明細書中で後記されるような本発明のスクリーニング方法により同定される。
配列番号および配列同一性により限定される遺伝子
【００７２】
所定の配列同一性番号（配列番号１〜１６９）により本明細書中で同定されるような各遺伝子は、開示される場合、この特定の配列に限定されない、と理解されるべきである。本明細書中で同定されるような遺伝子配列またはヌクレオチド配列は、各々、表３で同定されるような所定のタンパク質またはポリペプチドをコードする。本出願全体を通して、特定のヌクレオチド配列の配列番号（例として配列番号１を挙げる）に言及するたびに、それを以下のものと置き換え得る：
ｉ．  表３で、あるいは配列番号１によりコードされるものとしてここで提供される配列の一覧で同定される場合、配列番号１のアミノ酸と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｉｉ．  （例えば）配列番号１と少なくとも６０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、
ｉｉｉ．  その相補鎖が（ｉ）または（ｉｉ）の配列の核酸分子とハイブリダイズするヌクレオチド配列、
ｉｖ．  その配列が遺伝暗号の縮重のために（ｉｉｉ）の核酸分子の配列とは異なるヌクレオチド配列、
ｖ．  配列番号１のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
【００７３】
それぞれ所定のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列とのその同一性パーセンテージ（少なくとも６０％）に基づいて本明細書中に記載されるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、各々、さらなる好ましい実施態様では、それぞれ所定のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を有する。好ましい一実施形態では、配列同一性は、本明細書中で同定されるような配列の全長と比較することにより決定される。
【００７４】
「配列同一性」は、本明細書中では、当該配列を比較することにより確定した場合の、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチドまたはタンパク質）配列あるいは２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列間の関係として定義される。当該技術分野では、「同一性」は、このような配列の鎖間の整合により確定されるような（この場合も同じく）アミノ酸または核酸配列間の配列関連性の程度も意味する。２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、あるポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存アミノ酸置換基を、第二のポリペプチドの配列と比較することにより決定される。「同一性」および「類似性」は、例えば以下に記載されたような既知の方法（これらに限定されない）により容易に算定され得る：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｌｅｓｋ，  Ａ．  Ｍ．，  ｅｄ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８８；  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．  Ｗ．，  ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９３；  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  Ｉ，
Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｈ．  Ｇ．，  ｅｄｓ．，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  １９９４；  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｅ，  Ｇ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８７；  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  ｅｄｓ．，  Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９１；  ａｎｄ  Ｃａｒｉｌｌｏ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｄ．，  ＳＩＡＭ  Ｊ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，  ４８：  １０７３  （１９８８）。
【００７５】
同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間の最大整合を提供するよう意図される。同一性および類似性を決定するための方法は、公的に利用可能なコンピュータープログラムで体系的にまとめられている。２つの配列間の同一性および類異性を決定するための好ましいコンピュータープログラムとしては、例えばＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２  （１）：  ３８７  （１９８４））、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０  （１９９０））が挙げられる。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、ＮＣＢＩおよびその他の供給元から公的に入手可能である（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ，  ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ  ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０  （１９９０））。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも、同一性を決定するために用いられ得る。
【００７６】
ポリペプチド配列非核のための好ましいパラメーターとしては、以下のものが挙げられる：アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３−４５３  （１９７０）；比較マトリックス：ＢＬＯＳＳＵＭ６２  ｆｒｏｍ  Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ８９：  １０９１５−１０９１９  （１９９２）；ギャップペナルティ：１２；およびギャップ長ペナルティ：４。これらのペナルティを有する有用なプログラムは、「Ｏｇａｐ」プログラムとしてＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ｌｏｃａｔｅｄ  ｉｎ  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩから公的に入手可能である。前記のパラメーターは、アミノ酸比較のためのデフォルトパラメーターである（末端ギャップに関するペナルティなし）。
【００７７】
核酸比較のための好ましいパラメーターとしては、以下のものが挙げられる：アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８  ：４４３−４５３  （１９７０）；比較マトリックス：整合＝＋１０、不整合＝０；ギャップペナルティ：５０；ギャップ長ペナルティ：３。Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ｌｏｃａｔｅｄ  ｉｎ  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓからのギャッププログラムとして利用可能。上記は、核酸比較のためのデフォルトパラメーターである。
【００７８】
任意に、アミノ酸類似性の程度を決定するに際して、当業者に明らかであるよう、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を当業者は考慮に入れる。保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の一群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンである；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の一群は、セリンおよびトレオニンである；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の一群は、アスパラギンおよびグルタミンである；芳香族側鎖を有するアミノ酸の一群は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンである；塩基性側鎖を有するアミノ酸の一群は、リシン、アルギニンおよびヒスチジンである；そしてイオウ含有側鎖を有するアミノ酸の一群は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は、以下のものである：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミン。本明細書中に開示されるアミノ酸配列の置換変異体は、開示された配列中の少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がその位置に挿入されたものである。好ましくは、アミノ酸変化は保存的である。天然アミノ酸の各々に関する好ましい保存的置換を以下に示す：Ａｌａ→ｓｅｒ；Ａｒｇ→ｌｙｓ；Ａｓｎ→ｇｉｎまたはｈｉｓ；Ａｓｐ→ｇｌｕ；Ｃｙｓ→ｓｅｒまたはａｌａ；Ｇｉｎ→ａｓｎ；Ｇｌｕ→ａｓｐ；Ｇｌｙ→ｐｒｏ；Ｈｉｓ→ａｓｎまたはｇｉｎ；Ｈｅ→ｌｅｕまたはｖａｌ；Ｌｅｕ→ｉｌｅまたはｖａｌ；Ｌｙｓ→ａｒｇ、ｇｉｎまたはｇｌｕ；Ｍｅｔ→ｌｅｕまたはｉｌｅ；Ｐｈｅ→ｍｅｔ、ｌｅｕまたはｔｙｒ；Ｓｅｒ→ｔｈｒ；Ｔｈｒ→ｓｅｒ；Ｔｒｐ→ｔｙｒ；Ｔｙｒ→ｔｒｐまたはｐｈｅ；ならびにＶａｌ→ｉｌｅまたはｌｅｕ。
ポリペプチドの組換え的産生のための組換え技術および方法
【００７９】
阻害剤がポリペプチドである場合には、前期ポリペプチドは組換え技術を用いて調製され得るが、この場合、当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は適切な宿主細胞中で発現される。したがって、本発明は、核酸構築物、好ましくは上記のようなヌクレオチド配列により表される核酸分子を含むベクターである核酸構築物の使用にも関する。好ましくは、ベクターは、ベクターのための適切な宿主中でのベクターの増殖を保証する複製の起点を含む複製可能ベクター（または自律複製配列）である。代替的には、ベクターは、例えば相同組換えまたは他の方法によって、宿主細胞のゲノム中に組込み可能である。特に好ましいベクターは、上記のようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、ベクターに関する宿主細胞中でのコード配列の発現を指図し得るプロモーターと操作可能的に連結される発現ベクターである。
【００８０】
本明細書中で用いる場合、「プロモーター」という用語は、遺伝子の転写開始部位の転写の方向に関して上流に位置する１つ以上の遺伝子の転写を制御するよう機能する核酸断片を指し、そしてＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに関する結合部位、転写開始部位、ならびに任意の他のＤＮＡ配列、例えば転写因子結合部位、レプレッサーおよびアクチベータータンパク質結合部位、ならびにプロモーターからの転写の量を直接または間接的に調節するよう作用することが当業者に既知である任意の他の配列（これらに限定されない）の存在により構造的に同定される。「構成的」プロモーターは、ほとんどの生理学的および発生的条件下で活性であるプロモーターである。「誘導可能」プロモーターは、生理学的または発生的条件によって調節されるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、特定の型の分化細胞／組織、例えば好ましくはヒトおよび／または腫瘍および／または乳房細胞またはそれに由来する組織においてのみ活性である。
【００８１】
発現ベクターは、上記のような本発明のポリペプチドが、上記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が適切な細胞、例えば培養細胞または多細胞生物の細胞中で発現される組換え技術を用いて調製されるのを可能にし得る（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，  “Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８７）およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  （２００１，  ｓｕｐｒａ）（これらの記載内容はともに、参照により本明細書中で援用される）に記載；Ｋｕｎｋｅｌ  （１９８５）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８２：４８８  （部位特異的突然変異誘発を記載）およびＲｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：７３１−７３４  ｏｒ  Ｗｅｌｌｓ，  Ｊ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｇｅｎｅ  ３４：  ３１５  （カセット突然変異誘発を記載）も参照）。
【００８２】
典型的には、上記ポリペプチドをコードする核酸は、発現ベクター中で用いられる。「発現ベクター」という語句は、一般的に、このような配列と適合性である宿主中での遺伝子の発現を実行し得るヌクレオチド配列を指す。これらの発現ベクターは、典型的には、少なくとも適切なプロモーター配列、および任意に、転写終結シグナルを包含する。発現を実行するのに必要なまたは役立つ付加的因子は、さらにまた、本明細書中に記載されるように用いられ得る。上記ポリペプチドをコードする核酸またはＤＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養中への導入およびその中での発現を可能にするＤＮＡ構築物中に組入れられる。具体的には、ＤＮＡ構築物は、原核生物宿主、例えば細菌、例えば大腸菌中での複製に適しており、あるいは培養哺乳動物、植物、昆虫、例えばＳｆ９、酵母、心筋またはその他の真核生物細胞株中に導入され得る。
【００８３】
特定の宿主中への導入のために調製されるＤＮＡ構築物は、典型的には、宿主により認識される複製系、所望のポリペプチドをコードする意図されたＤＮＡセグメント、ならびにポリペプチドコードセグメントと操作可能的に連結される転写および翻訳開始および終結調節配列を包含する。ＤＮＡセグメントは、それが別のＤＮＡセグメントと機能的関係に配置される場合、「操作可能的に連結」される。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写を刺激する場合、コード配列と操作可能的に連結される。シグナル配列に関するＤＮＡは、それが上記ポリペプチドの分泌に参加する前タンパク質として発現される場合、ポリペプチドをコードするＤＮＡと操作可能的に連結される。一般的に、操作可能的に連結されるＤＮＡ配列は、連続しており、シグナル配列の場合、連続であり且つ読取り相にある。しかしながら、エンハンサーは、それらが制御するその転写のコード配列と連続である必要はない。連結は、好都合な制限部位で、またはその代わりに挿入されるアダプターまたはリンカーでの結紮により成し遂げられる。
【００８４】
適切なプロモーター配列の選択は、一般的に、ＤＮＡセグメントの発現のために選択される宿主細胞によって決まる。適切なプロモーター配列の例としては、当該技術分野で周知の原核生物および真核生物プロモーターが挙げられる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ    ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  ２００１、上記、参照）。転写調節配列は、典型的には、宿主により認識される異種エンハンサーまたはプロモーターを包含する。適切なプロモーターの選択は宿主により左右されるが、しかしプロモーター、例えばｔｒｐ、ｌａｃおよびファージプロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、ならびに解糖酵素プロモーターが既知であり、利用可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ    ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  ２００１、上記、参照）。発現ベクターは、複製系、ならびに転写および翻訳調節配列を、用いられ得るポリペプチドコードセグメントのための挿入部位と一緒に包含する。細胞株および発現ベクターの実現可能な組合せの例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ    ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１、上記）に、ならびにＭｅｔｚｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：  ３１−３６に記載されている。例えば、適切な発現ベクターは、酵母、例えば出芽酵母で、例えば昆虫細胞、例えばＳｆ９細胞で、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞で、および細菌細胞、例えば大腸菌で発現され得る。したがって宿主細胞は、原核生物または真核生物宿主細胞であり得る。宿主細胞は、液体培地中での、または固体培地上での培養に適している宿主細胞であり得る。宿主細胞は、好ましくは、上記のような本発明のポリペプチドを産生するための方法において、あるいは本明細書中に記載されるような物質の同定のための方法において用いられる。上記の方法は、上記ポリペプチドの発現を助成する条件下で宿主細胞を培養するステップを包含し得る。任意に、当該方法は、上記ポリペプチドの回収を包含し得る。ポリペプチドは、標準タンパク質精製技法、例えばそれ自体当該技術分野で既知の種々のクロマトグラフィー法により、培地から回収され得る。
【００８５】
代替的には、宿主細胞は、多細胞生物、例えばトランスジェニック植物または動物、好ましくは非ヒト動物の一部である細胞である。トランスジェニック植物は、その細胞の少なくとも一部に、上記のようなベクターを含む。トランスジェニック植物の生成方法は、例えば、米国特許第６，３５９，１９６号に、ならびにそこで引用される参考文献中に記載されている。このようなトランスジェニック植物または動物は、上記のような本発明のポリペプチドを産生するための方法に、および／または本明細書中に記載されるような物質の同定のための方法に用いられ得る。トランスジェニック植物に関しては、好ましい方法は、その細胞中にベクターを含むトランスジェニック植物の一部、またはこのようなトランスジェニック植物の子孫の一部を回収し、それにより植物部分は上記ポリペプチドを含有するステップ、ならびに任意に、植物部分から上記ポリペプチドを回収するステップを包含する。このような方法も、米国特許第６，３５９，１９６号に、ならびにそこで引用される参考文献中に記載されている。同様に、トランスジェニック動物は、その体細胞および生殖細胞中に、上記のようなベクターを含む。トランスジェニック動物は、好ましくは、非ヒト動物である。トランスジェニック動物を生成するための方法は、例えばＷＯ  ０１／５７０７９に、ならびにそこで引用される参考文献中に記載されている。このようなトランスジェニック動物は、上記のような本発明のポリペプチドを産生するための方法に用いられ、その方法は、ベクターまたはその雌性子孫を含むトランスジェニック動物からの体液（上記ポリペプチドを含有する）を回収するステップ、そして任意に、上記体液から上記ポリペプチドを回収するステップを包含する。このような方法も、ＷＯ  ０１／５７０７９に、ならびにそこで引用される参考文献中に記載されている。ポリペプチドを含有する体液は、好ましくは血液であり、さらに好ましくは乳汁である。
【００８６】
ポリペプチドを調製するための別の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系を用いることである。ポリペプチドをコードするＤＮＡは、上記のような発現ベクター中でクローン化される。次いで、発現ベクターは転写され、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳される。翻訳産物は、直接用いられ得るか、あるいは先ず精製され得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳から生じるポリペプチドは、典型的には、ｉｎ  ｖｉｖｏで合成されるポリペプチドに存在する翻訳後修飾を含有しないが、しかし、ミクロソームの固有の存在のために、いくつかの翻訳後修飾が起こり得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳によるポリペプチドの合成方法は、例えばＢｅｒｇｅｒ  ＆  Ｋｉｍｍｅｌ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  １５２，  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ，  １９８７により記載されている。
遺伝子療法
【００８７】
本発明のいくつかの態様は、上記のようなヌクレオチド配列を含む核酸構築物または発現ベクターの使用に関するが、この場合、前記ベクターは、遺伝子療法に適しているベクターである。遺伝子療法に適したベクターは、以下に記載されている：Ａｎｄｅｒｓｏｎ  １９９８，  Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：  ２５−３０；  Ｗａｌｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎ，  ２０００，  Ｄｒｕｇｓ  ６０：  ２４９−７１；Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ，  ２００１，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ７：  ３３−４０；Ｒｕｓｓｅｌｌ，  ２０００，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８１  ：  ２５７３−６０４；Ａｍａｄｏ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，  １９９９，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：  ６７４−６；Ｆｅｄｅｒｉｃｏ，  １９９９，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：  ４４８−５３；Ｖｉｇｎａ  ａｎｄ  Ｎａｌｄｉｎｉ，  ２０００，  Ｊ．  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．  ２：  ３０８−１６；Ｍａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ，  １９９７，  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  Ｔｏｄａｙ  ３：  ３９６−４０３；Ｐｅｎｇ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  １９９９，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １０：  ４５４−７；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ，  １９９９，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８０：  ３０４９−６４；Ｒｅｉｓｅｒ，  ２０００，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ７：  ９１０−３；ならびにそれらで引用された参考文献。
【００８８】
特に適切な遺伝子療法ベクターとしては、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられる。これらのベクターは、多数の分裂中のおよび非分裂中の細胞型、例えばニューロン細胞に潜入する。さらに、アデノウイルスベクターは、高レベルの導入遺伝子発現が可能である。しかしながら、細胞進入後のアデノウイルスおよびＡＡＶベクターのエピソーム的性質のため、これらのウイルスベクターは、上記のように導入遺伝子の単なる一過性発現を要する治療的適用に最も適合する（Ｒｕｓｓｅｌｌ，  ２０００，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８１  ：  ２５７３−２６０４；Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ，  ２００５，  Ｖｉｒｏｌ  Ｊ．  ２（１）：４３）。好ましいアデノウイルスベクターは、Ｒｕｓｓｅｌｌ（２０００、上記）により再検討されたように宿主応答を低減するよう修飾される。ＡＡＶベクターを用いるニューロン遺伝子療法のための方法は、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  ２００５，  Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．  Ｍａｒｃｈ  ９  （Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ），  Ｍａｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ，  ２００４，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ６（５）：４８２−９０およびＭａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ，  ２００４，  Ｅｙｅ  １８（１１）：  １０４９−５５により記載されている。ヒトおよび／または腫瘍および／または乳房細胞中への遺伝子移入に関して、ＡＡＶ血清型２は有効なベクターであり、したがって、好ましいＡＡＶ血清型である。
【００８９】
本発明における適用のための好ましいレトロウイルスベクターは、レンチウイルスベースの発現構築物である。レンチウイルスベクターは、非分裂中細胞に潜入する独特の能力を有する（Ａｍａｄｏ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，  １９９９  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５  ：  ６７４−６）。レンチウイルスベースの発現構築物の構築および使用のための方法は、米国特許第６，１６５，７８２号、第６，２０７，４５５号、第６，２１８，１８１号、第６，２７７，６３３号および第６，３２３，０３１号に、ならびにＦｅｄｅｒｉｃｏ  （１９９９，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １０：  ４４８−５３）およびＶｉｇｎａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００，  Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  ２０００；  ２：  ３０８−１６）に記載されている。
【００９０】
一般的に、遺伝子療法ベクターは、それらが発現さえるべき本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、それにより、前記ヌクレオチド配列は上記のように適切な調節配列と操作可能的に連結される、という意味で、上記の発現ベクターと同様である。このような調節配列は、少なくともプロモーター配列を含む。遺伝子療法ベクターからの上記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現のための適切なプロモーターとしては、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ウイルス長い末端反復プロモーター（ＬＴＲ）、例えばネズミモロニー白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルスまたはＨＴＬＶ−１からのもの、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、ならびに単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。適切なプロモーターは、以下に記載される。
【００９１】
小有機または無機化合物の投与により誘導され得るいくつかの誘導可能プロモーター系が記載されている。このような誘導可能プロモーターとしては、重金属により制御されるもの、例えばメタロチオネインプロモーター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９８２  Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：  ３９−４２；  Ｍａｙｏ  ｅｔ  ａｌ．  １９８２  Ｃｅｌｌ  ２９：  ９９−１０８）、ＲＵ−４８６（プロゲステロンアンタゴニスト）（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１  ：  ８１８０−８１８４）、ステロイド（Ｍａｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ，  １９９３  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：  ５６０３−５６０７）、テトラサイクリン（Ｇｏｓｓｅｎ  ａｎｄ  Ｂｕｊａｒｄ  １９９２  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：  ５５４７−５５５１；米国特許第５，４６４，７５８号；Ｆｕｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１  ：  ９３０２−９３０６；Ｈｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０：  １４１６８−１４１７４；Ｒｅｓｎｉｔｚｋｙ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １４：  １６６９−１６７９；Ｓｈｏｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２：  ６５２２−６５２６）、ならびにｔＴＡＥＲ系（ＶＰ１６の活性化ドメインおよびエストロゲン受容体のリガンド結合ドメインとしての、ｔｅｔＲポリペプチドからなるマルチキメラトランス活性化因子を基礎にしている）（Ｙｅｅ  ｅｔ  ａｌ，  ２００２、米国特許第６，４３２，７０５号）が挙げられる。
【００９２】
ＲＮＡ干渉による特定遺伝子のノックダウン（下記参照）のための小ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に適したプロモーターとしては、上記のポリメラーゼＩＩプロモーターのほかに、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターが挙げられる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌＩＩＩ）は、多数の種々の小型の核および細胞質非コードＲＮＡ、例えば５Ｓ、Ｕ６、アデノウイルスＶＡ１、Ｖａｕｌｔ、テロメラーゼ  ＲＮＡならびにｔＲＮＡの合成に関与する。これらのＲＮＡをコードする多数の遺伝子のプロモーター構造が決定されており、そして、ＲＮＡ  ｐｏｌＩＩＩプロモーターは３つの型の構造に分類される、ということが判明している（再検討のためには、Ｇｅｉｄｕｓｃｈｅｋ  ａｎｄ  Ｔｏｃｃｈｉｎｉ−Ｖａｌｅｎｔｉｎｉ，  １９８８  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５７：  ８７３−９１４；Ｗｉｌｌｉｓ，  １９９３  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２１２：  １−１１；Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，  ２００１，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６：  ２６７３３−３６参照）。ｓｉＲＮＡの発現に特に適しているのは、ＲＮＡ  ｐｏｌＩＩＩプロモーターの型３であり、それにより、転写が、５’フランキング領域、すなわち転写開始部位の上流にのみ見出されるシス作用素子により駆動される。上流配列素子としては、伝統的ＴＡＴＡボックス（Ｍａｔｔａｊ  ｅｔ  ａｌ，  １９８８  Ｃｅｌｌ  ５５，  ４３５−４４２）、近位配列素子および遠位配列素子（ＤＳＥ；  Ｇｕｐｔａ  ａｎｄ  Ｒｅｄｄｙ，  １９９１  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９，  ２０７３−２０７５）が挙げられる。型３  ｐｏｌＩＩＩプロモーターの制御下の遺伝子の例は、Ｕ６小型の核ＲＮＡ（Ｕ６ｓｎＲＮＡ）、７ＳＫ、Ｙ、ＭＲＰ、Ｈ１およびテロメラーゼＲＮＡ遺伝子である（例えばＭｙｓｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ，  ２００１，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２１  ：  ２５０２−０９参照）。
【００９３】
遺伝子療法ベクターは、任意に、第二のまたはさらなるポリペプチドをコードする第二の、または１つ以上のさらなるヌクレオチド配列を含み得る。第二のまたはさらなるポリペプチドは、発現構築物を含有する細胞に関する同定、選択および／またはスクリーニングを可能にする（選択可能）マーカーポリペプチドであり得る。この目的のための適切なマーカータンパク質は、例えば蛍光タンパク質ＧＦＰ、ならびに選択可能マーカー遺伝子ＨＳＶチミジンキナーゼ（ＨＡＴ培地上での選択のため）、細菌ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ヒグロマイシンＢに関する選択のため）、Ｔｎ５アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（Ｇ４１８に関する選択のため）およびジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）（メトトレキサートに関する選択のため）、ＣＤ２０、低親和性神経成長因子遺伝子である。これらのマーカー遺伝子を得るための供給源、ならびにそれらの使用方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ  （２００１）  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに提示されている。
【００９４】
代替的には、第二のまたはさらなるヌクレオチド配列は、必要と思われる場合には、トランスジェニック細胞から被験者を救済することが可能であるフェイル・セーフ機序を提供するポリペプチドをコードし得る。このようなヌクレオチド配列（しばしば、自殺遺伝子と呼ばれる）は、上記ポリペプチドが発現されるトランスジェニック細胞を殺害し得る毒性物質にプロドラッグを転換し得るポリペプチドをコードする。このような自殺遺伝子の適切な例としては、例えば大腸菌シトシンデアミナーゼ遺伝子、あるいは単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルスおよび水痘帯状疱疹ウイルスからのチミジンキナーゼ遺伝子のうちの１つ（この場合、ガンシクロビルがプロドラッグとして用いられて、被験者におけるＩＬ−トランスジェニック細胞を殺害する）が挙げられる（例えばＣｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ，  １９８７，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ３１  ：  ８４４−８４９参照）。
【００９５】
遺伝子療法ベクターは、好ましくは、下記のような適切な薬学的担体を含む薬学的組成物中に処方される。
ＲＮＡ干渉
【００９６】
表題「阻害剤」の節で同定されたような本発明の特定のポリペプチドの発現のノックダウンに関しては、好ましくはＲＮＡｉ因子、すなわちＲＮＡ干渉が可能であるかまたはＲＮＡ干渉が可能なＲＮＡ分子の一部であるＲＮＡ分子をコードする所望のヌクレオチド配列の発現のために、遺伝子療法ベクターまたは他の発現構築物が用いられる。このようなＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ（短い干渉ＲＮＡ、例えば短いヘアピンＲＮＡ）と呼ばれる。代替的には、ｓｉＲＮＡ分子は、例えば薬学的組成物中で、ヒトおよび／または腫瘍および／または乳房細胞内にまたはその近隣に、直接的に投与される。
【００９７】
所望のヌクレオチド配列は、標的遺伝子ｍＲＮＡの領域に対して向けられるアンチセンスＲＮＡをコードするアンチセンスコードＤＮＡ、および／または標的遺伝子ｍＲＮＡの同一領域に対して向けられるセンスＲＮＡをコードするセンスコードＤＮＡを含む。本発明のＤＮＡ構築物では、アンチセンスおよびセンスコードＤＮＡは、それぞれアンチセンスおよびセンスＲＮＡを発現し得る本明細書中で上記した１つ以上のプロモーターと操作可能的に連結される。「ｓｉＲＮＡ」は、哺乳動物細胞において有毒でない長さが短い二本鎖ＲＮＡである小干渉ＲＮＡを意味する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ，  ２００１，  Ｎａｔｕｒｅ  ４Π  ：  ４９４−９８；Ｃａｐｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  ２００１，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９８：  ９７４２−４７）。長さは、必ずしも２１〜２３ヌクレオチドに限定されない。毒性を示さない限り、ｓｉＲＮＡの長さに特別な制限はない。「ｓｉＲＮＡ」は、例えば少なくとも１５、１８または２１ヌクレオチド長、および２５、３０、３５または４９ヌクレオチド長までであり得る。代替的には、発現されるべきｓｉＲＮＡの最終転写産物の二本鎖ＲＮＡ部分は、例えば少なくとも１５、１８または２１ヌクレオチド長、および２５、３０、３５または４９ヌクレオチド長までであり得る。
【００９８】
「アンチセンスＲＮＡ」は、標的遺伝子ｍＲＮＡと相補的な配列を有し、標的遺伝子ｍＲＮＡと結合することによりＲＮＡｉを誘導すると考えられるＲＮＡ鎖である。「センスＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡと相補的な、そしてその相補的アンチセンスＲＮＡとアニーリングされてｓｉＲＮＡを形成する配列を有する。「標的遺伝子」という用語は、この状況では、本発明の系により発現されるべきｓｉＲＮＡのためにその発現がサイレンシングされるべきであるし、そして随意に選択され得る遺伝子を指す。この標的遺伝子と同様に、例えばその配列が既知であるが、しかしその機能は依然として解明されていない遺伝子、ならびにその発現が疾患の原因となると考えられる遺伝子が、好ましくは選択される。ｓｉＲＮＡの鎖（アンチセンスＲＮＡ鎖）のうちの１つと結合し得る長さである少なくとも１５ヌクレオチドまたはそれ以上を有する遺伝子のｍＲＮＡの部分配列が決定されている限り、標的遺伝子は、そのゲノム配列が完全に解明されているわけではないものであり得る。したがって、遺伝子、発現配列タグ（ＥＳＴ）およびｍＲＮＡの部分（そのうちのいくつかの配列（好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド）が解明されている）は、それらの全長配列が決定されているわけではない場合でも、「標的遺伝子」として選択され得る。
【００９９】
２つのＲＮＡ鎖が対になるｓｉＲＮＡの二本鎖ＲＮＡ部分は完全対合化するものに限定されないし、不整合（対応するヌクレオチドが相補性でない）、バルジ（１つの鎖上の対応する相補的ヌクレオチドの欠如）等のため、非対合部分を含有し得る。非対合部分は、それらがｓｉＲＮＡ形成を妨げない程度に含有され得る。「バルジ」は、本明細書中で用いる場合、好ましくは１〜２つの非対合ヌクレオチドを含み、そして２つのＲＮＡ鎖が対を成すｓｉＲＮＡの二本鎖ＲＮＡ領域は、好ましくは１〜７、さらに好ましくは１〜５つのバルジを含有する。さらに、「不整合」は、本明細書中で用いる場合、２つのＲＮＡ鎖が対を成すｓｉＲＮＡの二本鎖ＲＮＡ領域中に、好ましくは１〜７、さらに好ましくは１〜５の数で含有される。好ましい不整合では、ヌクレオチドのうちの一方はグアニンであり、他方はウラシルである。このような不整合は、センスＲＮＡをコードするＤＮＡにおけるＣからＴへの、ＧからＡへの、またはその混合物の突然変異のためであるが、それらに限定されない。さらに、本発明において、２つのＲＮＡ鎖が対を成すｓｉＲＮＡの二本鎖ＲＮＡ領域は、バルジと不整合の両方（これは合計で好ましくは１〜７個まで、さらに好ましくは１〜５個までの数である）を含有し得る。このような非対合部分（不整合またはバルジ等）は、アンチセンスおよびセンスコードＤＮＡ間の下記の組換えを抑制し、柿のようなｓｉＲＮＡ発現系を安定にし得る。さらに、２つのＲＮＡ鎖が対を成さないｓｉＲＮＡの二本鎖ＲＮＡ領域に非対合部分を含有しないステムループＤＮＡをシーケンシングすることは難しいが、しかし上記のような不整合またはバルジを導入することにより、シーケンシングは可能にされる。さらに、対合二本鎖ＲＮＡ領域に不整合またはバルジを含有するｓｉＲＮＡは、大腸菌または動物細胞中で安定であるという利点を有する。
【０１００】
ｓｉＲＮＡがそのＲＮＡｉ作用のために標的遺伝子発現を無症候性にし得る限り、ｓｉＲＮＡの末端構造は平滑であるかまたは粘着性（オーバーハング）であり得る。粘着性（オーバーハング）末端構造は３’オーバーハングのみに限定され、５’オーバーハング構造は、それがＲＮＡｉ作用を誘導し得る限り、含まれ得る。さらに、オーバーハングヌクレオチドの数は、既に報告された２または３に限定されないが、しかしオーバーハングがＲＮＡｉ作用を誘導し得る限り、任意数であり得る。例えば、オーバーハングは、１〜８、好ましくは２〜４ヌクレオチドからなる。本明細書中では、粘着末端構造を有するｓｉＲＮＡの全体的長さは、対合二本鎖部分の長さと、両末端にオーバーハング一本鎖を含む対の長さの合計として表される。例えば、両端に４ヌクレオチドオーバーハングを有する１９ｂｐ二本鎖ＲＮＡ部分では、全体的長さは、２３ｂｐとして表される。さらに、このオーバーハング配列は標的遺伝子に対する低特異性を有するため、それは、標的遺伝子配列と必ずしも相補的（アンチセンス）または同一（センス）でない。さらに、ｓｉＲＮＡが標的遺伝子に及ぼすその遺伝子サイレンシング作用を保持しうる限り、ｓｉＲＮＡは、例えばその一端のオーバーハング部分に低分子量ＲＮＡ（これは天然ＲＮＡ分子、例えばｔＲＮＡ、ｒＲＮＡまたはウイルスＲＮＡ、あるいは人工ＲＮＡ分子であり得る）を含有し得る。
【０１０１】
さらに、「ｓｉＲＮＡ」の末端構造は、必然的に上記のような両端でカットオフ構造であり、そして二本鎖ＲＮＡの一側の末端がリンカーＲＮＡにより連結されるステムループ構造を有し得る（「ｓｈＲＮＡ」）。二本鎖ＲＮＡ領域（ステムループ部分）の長さは、例えば少なくとも１５、１８または２１ヌクレオチド長、および２５、３０、３５または４９ヌクレオチド長までであり得る。代替的には、発現されるべきｓｉＲＮＡの最終転写産物である二本鎖ＲＮＡ領域の長さは、例えば少なくとも１５、１８または２１ヌクレオチド長、および２５、３０、３５または４９ヌクレオチド長までであり得る。さらに、ステム部分の対合を妨げないような長さを有する限り、リンカーの長さに特定の制限はない。他と、ステム部分の安定対合ならびにその部分をコードするＤＮＡ間の組換えの抑制のために、リンカー部分はクローバー葉ｔＲＮＡ構造を有し得る。リンカーがステム部分の対合を妨げる長さを有する場合でも、例えば、イントロンが前駆体ＲＮＡのプロセシング中に成熟ＲＮＡに切り取られ、それによりステム部分の対合を可能にするよう、イントロンを含むためにリンカー部分を構築することが出来る。ステムループｓｉＲＮＡの場合、ループ構造を有さないＲＮＡのいずれかの末端（頭または尾）は、低分子量ＲＮＡを有し得る。上記のように、この低分子量ＲＮＡは、天然ＲＮＡ分子、例えばｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡまたはウイルスＲＮＡ、あるいは人工ＲＮＡ分子であり得る。
【０１０２】
アンチセンスおよびセンスコードＤＮＡからそれぞれアンチセンスおよびセンスＲＮＡを発現するために、本発明のＤＮＡ構築物は上記のようなプロモーターを含む。アンチセンスおよびセンスコードＤＮＡを発現し得る限り、構築物中のプロモーターの数および位置は原則的に、随意に選択され得る。本発明のＤＮＡ構築物の簡単な例として、プロモーターがアンチセンスおよびセンスコードＤＮＡの上流に配置されるタンデム発現系が形成され得る。このタンデム発現系は、両端に前記のカットオフ構造を有するｓｉＲＮＡを産生し得る。ステムループｓｉＲＮＡ発現系（ステム発現系）において、アンチセンスおよびセンスコードＤＮＡは反対方向に整列され、これらのＤＮＡはリンカーＤＮＡを介して連結されて、ユニットを構築する。プロモーターは、このユニットの一側に連結されて、ステムループｓｉＲＮＡ発現系を構築する。本明細書中では、リンカーＤＮＡの長さおよび配列に特別な制限はなく、これは、その配列が終結配列でなく、その長さおよび配列が上記のような成熟ＲＮＡ産生中にステム部分対合を妨げない限り、任意の長さおよび配列を有する。一例として、上記ｔＲＮＡをコードするＤＮＡ等はリンカーＤＮＡとして用いられ得る。
【０１０３】
タンデムおよびステムループ発現系の両方の場合において、５’末端は、プロモーターからの転写を促し得る配列を有し得る。さらに具体的には、タンデムｓｉＲＮＡの場合、ｓｉＲＮＡ産生の効率は、アンチセンスおよびセンスコードＤＮＡの５’末端にプロモーターからの転写を促し得る配列を付加することにより改善され得る。ステムループｓｉＲＮＡの場合、このような配列は上記ユニットの５’末端に付加され得る。ｓｉＲＮＡによる標的遺伝子サイレンシングが妨げられない限り、このような配列からの転写物は、ｓｉＲＮＡに結合されている状態で用いられ得る。この状態が遺伝子サイレンシングを妨げる場合、トリミング手段（例えば、当該技術分野で既知であるようなリボザイム）を用いて転写物のトリミングを実施するのが好ましい。アンチセンスおよびセンスＲＮＡが、同一ベクター中で、または異なるベクター中で発現され得る、ということは当業者には明らかである。センスおよびアンチセンスＲＮＡの下流の過剰量の配列の付加を回避するためには、それぞれの鎖（アンチセンスおよびセンスＲＮＡをコードする鎖）の３’末端に転写のターミネーターを置くのが好ましい。ターミネーターは、４つ以上の連続アデニン（Ａ）ヌクレオチドの配列であり得る。
抗体
【０１０４】
本発明のいくつかの態様は、表題「阻害剤」の節で上記したような本発明のポリペプチドと特異的に結合する、そして上記ポリペプチドの活性を抑制し得る抗体または抗体断片の使用に関する。上記抗体は、抑制抗体と呼ばれる。所定のポリペプチドと特異的に結合する抗体または抗体断片を生成するための方法は、例えばＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  （１９８８，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ）およびＷＯ  ９１／１９８１８；ＷＯ  ９１／１８９８９；ＷＯ  ９２／０１０４７；ＷＯ  ９２／０６２０４；ＷＯ  ９２／１８６１９；およびＵＳ６，４２０，１１３、ならびにそこに引用された参考文献中に記載されている。「特異的に結合する」という用語は、本明細書中で用いる場合、低および高親和性特異的結合の両方を包含する。特異的結合は、例えば、少なくとも約１０−４ＭのＫｄを有する低親和性抗体または抗体断片により示され得る。特異的結合は、高親和性抗体または抗体断片、例えば少なくとも約１０−７Ｍ、少なくとも約１０−８Ｍ、少なくとも約１０−９Ｍ、少なくとも約１０−１０ＭのＫｄを有する抗体または抗体断片によっても示され得るし、あるいは少なくとも約１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍまたはそれ以上のＫｄを有し得る。
ペプチド模倣物
【０１０５】
表題「阻害剤」の節で上記したような本発明のポリペプチドと、あるいはその受容体ポリペプチドと特異的に結合市、そして本発明のポリペプチドのアンタゴニストまたは阻害剤として、（例えば、本発明のポリペプチドの活性または定常状態レベルを変更するために）本明細書中に記載するような本発明の方法のいずれかに適用され得るペプチド様分子（ペプチド模倣物と呼ばれる）または非ペプチド分子は、例えば米国特許第６，１８０，０８４号（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に詳細に記載されているように、それ自体当該技術分野で既知の方法を用いて同定され得る。このような方法としては、例えばペプチド模倣物のスクリーニングライブラリー、ペプチド、ＤＮＡまたはｃＤＮＡ発現ライブラリー、組合せ化学、特に有用なファージ表示ライブラリーが挙げられる。これらのライブラリーは、本発明の実質的に精製されたポリペプチド、その断片またはその構造的類似物とライブラリーを接触することにより、ポリペプチドのアンタゴニストに関してスクリーニングされ得る。
薬学的組成物
【０１０６】
本発明はさらに、活性成分として本明細書中で同定されるような阻害剤を含む薬学的調製物に関するが、この場合、上記阻害剤は、以下の：ポリペプチド、核酸、核酸構築物、遺伝子療法ベクターおよび抗体からなる群から選択される。これらの成分はすべて、本明細書中に既に明示されている。上記の調製物または組成物は、好ましくは、少なくとも１つの製薬上許容可能な担体を、活性成分のほかに含む。
【０１０７】
いくつかの方法において、哺乳動物、昆虫または微生物細胞培養から、トランスジェニック哺乳動物の乳汁または他の供給源から精製されるような本発明のポリペプチドまたは抗体が、薬学的組成物として、薬学的担体と一緒に精製形態で投与される。ポリペプチドを含む薬学的組成物の製造方法は、米国特許第５，７８９，５４３号および第６，２０７，７１８号に記載されている。好ましい形態は、意図される投与方式および治療的用途によって決まる。
【０１０８】
薬学的担体は、患者にポリペプチド、抗体または遺伝子両方を送達するのに適した任意の相溶性非毒性物質であり得る。滅菌水、アルコール、脂肪、蝋および不活性固体が、担体として用いられ得る。製薬上許容可能なアジュバント、緩衝剤、分散剤等も、薬学的組成物中に組み入れられ得る。
【０１０９】
薬学的組成物中の本発明のポリペプチドまたは抗体の濃度は広範に変化し、すなわち約０．１重量％未満から２０重量％以上まで、通常は少なくとも約１重量％である。
【０１１０】
経口投与のためには、活性成分は、固体剤形で、例えばカプセル、錠剤および粉末で、あるいは液体剤形で、例えばエリキシル、シロップおよび懸濁液で投与され得る。活性構成成分または成分は、不活性成分および粉末化担体、例えばグルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロースまたはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、タルク、炭酸マグネシウム等と一緒にゼラチンカプセル中に封入され得る。望ましい色、味、安定性、緩衝能力、分散またはその他の既知の望ましい特徴を提供するために付加され得る付加的不活性成分の例は、赤色酸化鉄、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、食用白色インク等である。類似の希釈剤が、圧縮錠剤を製造するために用いられ得る。錠剤およびカプセルはともに、徐放性製品として製造されて、数時間に亘る医薬剤の連続放出を提供する。圧縮錠剤は、糖衣されるかまたは皮膜被覆されて、任意の嫌な味を遮蔽し、空気から錠剤を保護するか、あるいは消化管中での選択的崩壊のために腸溶性にされ得る。経口投与のための液体剤形は、着色剤および風味剤を含有して、患者の受容性を増大し得る。
【０１１１】
ポリペプチド、抗体または核酸構築物あるいは遺伝子療法は、好ましくは非経口的にまたは全身的に施される。調製物のためのポリペプチド、抗体、核酸構築物またはベクターは、滅菌性でなければならない。滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後に、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、容易に達成される。好ましい投与経路の１つは、全身的、さらに好ましくは経口的である。別の好ましい経路は、ポリペプチド、抗体、核酸構築物またはベクターの投与のための非経口経路であり、既知の方法、例えば皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病変内、頭蓋内、くも膜下腔内、経皮、鼻、頬、直腸または膣経路による注射または注入である。さらに好ましくは、投与経路は、静脈内または皮下である。ポリペプチド、抗体、核酸構築物またはベクターは、注入により、または大量瞬時注射により、継続的に投与される。静脈内注入のための典型的組成物は、１０〜５０ｍｌの滅菌０．９％ＮａＣｌまたは５％グルコースを含有し、任意に２０％アルブミン溶液および１〜５０μｇのポリペプチド、抗体、核酸構築物またはベクターを補足されるよう作製され得る。筋肉内注射のための典型的薬学的組成物は、例えば、１〜１０ｍｌの滅菌緩衝水および１〜１００μｇの本発明のポリペプチド、抗体、核酸構築物またはベクターを含有するよう作製される。非経口的に投与可能な組成物の調製方法は当該技術分野で周知であり、種々の情報源、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （  １５ｔｈ  ｅｄ．  ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ，  １９８０）（この記載内容はすべての目的のために参照により本明細書中で援用される）にさらに詳細に記載されている。
【０１１２】
治療的適用に関しては、薬学的組成物は、好ましくは、症候の重症度を低減し、および／または症候のさらなる発症を防止するかまたは停止するのに十分な量で、本明細書中で前記したような癌患者に投与される。これを達成するのに適切な量は、「治療的有効用量」または「予防的有効用量」と定義される。このような有効投与量は、症状の重症度に、ならびに患者の健康の全身状態によって決まる。概して、治療的または予防的有効用量は、好ましくは、症候を逆方向にするのに、すなわち本明細書中で前記したような転移を防止し、遅延しおよび／または処置するのに十分な用量である。
【０１１３】
本発明の方法では、ポリペプチドまたは抗体は、通常は、約１μｇ／被験者の体重１ｋｇまたはそれ以上の投与量で、毎週、被験者に投与される。しばしば、投与量は、１０μｇ／ｋｇ／週より多い。投与量レジメンは、１０μｇ／ｋｇ／週から少なくとも１ｍｇ／ｋｇ／週までの範囲であり得る。典型的には、投与量レジメンは、１０μｇ／ｋｇ／週、２０μｇ／ｋｇ／週、３０μｇ／ｋｇ／週、４０μｇ／ｋｇ／週、６０μｇ／ｋｇ／週、８０μｇ／ｋｇ／週および１２０μｇ／ｋｇ／週である。好ましいレジメンでは、１０μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇまたは４０μｇ／ｋｇが、シュウに１回、２回または３回投与される。処置は、好ましくは、非経口経路により施される。
【０１１４】
この文書において、ならびにその特許請求の範囲において、「〜を含む」という動詞およびその活用型は、その非限定的意味で、当該語に従う事項は包含されるが、しかし、具体的に記述されない事項は排除されない、ということを意味するために用いられる。さらに、「〜からなる」という動詞は「本質的に〜からなる」に置き換えられ、本明細書中で定義されるようなポリペプチドまたは核酸構築物または抗体または組成物が、具体的に同定されたもの以外の付加的構成成分（単数または複数）を含み得る、ということを意味し、前記付加的構成成分（単数または複数）は本発明の独特の特性を変更しない。さらに、不定冠詞「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、状況が、素子のうちの１つおよび１つのみが存在する、ということを明らかに必要としない限り、素子のうちの１つより多くが存在する、という可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、通常は「少なくとも１つ」を意味する。
【０１１５】
本明細書中で確認されるような各実施形態は、別記しない限り、一緒に組合され得る。本明細書中で引用される特許および参考文献はすべて、それらの記載内容が参照により本明細書中で援用される。
【０１１６】
以下の実施例により本発明をさらに説明するが、それらは本発明の範囲を限定するよう意図されるべきでない。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１Ａ】転移モデル系の遺伝子発現プロファイリングは候補転移遺伝子としてＦｒａ−１を同定する。  Ａ．  リガンド活性化ＴｒｋＢ（「ＲＫ３ＥＴＢ」および「ＲＩＥＴＢ」細胞）または空ベクターを発現するＲＫ３ＥおよびＲＩＥラット上皮細胞の位相差顕微鏡写真。画像は倍率４０倍で撮影した。
【図１Ｂ】転移モデル系の遺伝子発現プロファイリングは候補転移遺伝子としてＦｒａ−１を同定する。  Ｂ．  ＲＫ３ＥＴＢおよびＲＩＥＴＢ細胞のマイクロアレイ遺伝子発現分析。両細胞系で上方または下方調節される上部１０個の遺伝子を、ヒートマップで示す。
【図１Ｃ】転移モデル系の遺伝子発現プロファイリングは候補転移遺伝子としてＦｒａ−１を同定する。  Ｃ．  定量的ＲＴ−ＰＣＲ（上部パネル）およびウエスタンブロット（下部パネル；ＰＣＲに関するｎ＝３、誤差バー：Ｓ．Ｄ．星印、片側スチューデントｔ検定に基づいてＰ＜０．０１で対照と異なる）により測定されたＦｒａ−１発現レベル。α−チューブリンは負荷対照として役立つ。
【図１Ｄ】転移モデル系の遺伝子発現プロファイリングは候補転移遺伝子としてＦｒａ−１を同定する。  Ｄ．  ＡＰ−１  ＤＮＡ結合活性を測定するゲルシフト分析。Ｆｒａ−１抗体を用いたスーパーシフトを、実施して、総ＤＮＡ結合活性に対するＦｒａ−１の相対的貢献度を決定した（中白矢印は、スーパーシフト化ＡＰ−１複合体を示す）。
【図２Ａ】Ｆｒａ−１はＴｒｋＢ発現腫瘍細胞のＥＭＴに必要とされる。  Ａ．  指示されたようなＦｒａ−１をターゲッティングする個々のｓｈＲＮＡを発現するＲＫ３ＥＴＢ細胞におけるウエスタンブロットにより測定されたＦｒａ−１およびＥ−カドヘリン発現レベル。α−チューブリンは負荷対照として役立つ。
【図２Ｂ】Ｆｒａ−１はＴｒｋＢ発現腫瘍細胞のＥＭＴに必要とされる。  Ｂ．  細胞形態に及ぼすＦｒａ−１枯渇の作用を示す位相差顕微鏡写真。画像は倍率４０倍で撮影した。
【図２Ｃ】Ｆｒａ−１はＴｒｋＢ発現腫瘍細胞のＥＭＴに必要とされる。  Ｃ．  指示されたような細胞におけるＦｒａ−１およびＥ−カドヘリンの免疫蛍光法による検出。細胞骨格を可視化するために、平行してプレート化された細胞におけるファロイジン染色を含む。参照として、親ＲＫ３Ｅ細胞を含む。
【図２Ｄ】Ｆｒａ−１はＴｒｋＢ発現腫瘍細胞のＥＭＴに必要とされる。  Ｄ．  Ｆｒａ−１枯渇の一関数としての移動（上部パネル）および侵襲（下部パネル）能力（ｎ＝３、誤差バー：Ｓ．Ｄ．星印、片側ＡＮＯＶＡとその後のＬＳＤ検定に基づいてＰ＜０．００１で対照クローンと異なる）。
【図２Ｅ】Ｆｒａ−１はＴｒｋＢ発現腫瘍細胞のＥＭＴに必要とされる。  Ｅ．  Ｆｒａ−１枯渇の一関数としてのＲＫ３ＥＴＢ腫瘍細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖曲線（ｎ＝３、誤差バー：Ｓ．Ｄ．）。
【図３Ａ】Ｆｒａ−１の抑制はＴｒｋＢ発現原発性腫瘍の転移可能性を阻止する。  Ａ．  Ｆｒａ−１枯渇の一関数としての、ヌードマウスに皮下注射したＲＫ３ＥＴＢ腫瘍細胞により形成される腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖曲線（ｎ＝６、誤差バー：Ｓ．Ｅ．）。
【図３Ｂ】Ｆｒａ−１の抑制はＴｒｋＢ発現原発性腫瘍の転移可能性を阻止する。  Ｂ．  Ｆｒａ−１枯渇の一関数としての、皮下拡張ＲＫ３ＥＴＢ腫瘍の組織切片のヘマトキシリン・エオシン染色（尺度バー：１００μｍ；Ｔ：腫瘍、Ｓ：皮膚）。
【図３Ｃ】Ｆｒａ−１の抑制はＴｒｋＢ発現原発性腫瘍の転移可能性を阻止する。  Ｃ．  接種後３週間目に分析した場合の、皮下対照またはＦｒａ−１−枯渇ＲＫ３ＥＴＢ腫瘍を保有するマウスにおける肺転移の肉眼的定量（Ｓｕｐｐｌ．図２Ａにおける顕微鏡的定量）。
【図３Ｄ】Ｆｒａ−１の抑制はＴｒｋＢ発現原発性腫瘍の転移可能性を阻止する。  Ｄ．  Ｃに記載したマウスからの肉眼的肺転移の代表的画像（左パネル）および肺組織切片のヘマトキシリン・エオシン染色（右パネル、尺度バー：２００μｍ；Ｍ：転移）。
【図４Ａ】Ｆｒａ−１の抑制はＥＭＴを逆転し、ヒト乳癌細胞の肺コロニー形成を遮断する。  Ａ．  Ｆｒａ−１枯渇の一関数としての、ヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞における指示されたような上皮タンパク質の発現レベル。α−チューブリンは負荷対照として役立つ。
【図４Ｂ】Ｆｒａ−１の抑制はＥＭＴを逆転し、ヒト乳癌細胞の肺コロニー形成を遮断する。Ｂ．  対照およびＦｒａ−１サイレンシングＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＥ−カドヘリン（上部パネル）および細胞骨格アクチン（ファロイジン染色による；下部パネル）の免疫蛍光法による検出。
【図４Ｃ】Ｆｒａ−１の抑制はＥＭＴを逆転し、ヒト乳癌細胞の肺コロニー形成を遮断する。Ｃ．  対照およびＦｒａ−１サイレンシングＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖曲線（ｎ＝３、誤差バー：Ｓ．Ｄ．）。
【図４Ｄ】Ｆｒａ−１の抑制はＥＭＴを逆転し、ヒト乳癌細胞の肺コロニー形成を遮断する。Ｄ．  接種後３ヶ月目に撮影した、指示されたような個々のＦｒａ−１ｓｈＲＮＡを発現する１．１０６ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を静脈内注射されたマウスの肺（上部パネル）および肺のヘマトキシリン・エオシン染色切片（下部パネル、尺度バー：１００μｍ；Ｔ：腫瘍）の画像。
【図４Ｅ】Ｆｒａ−１の抑制はＥＭＴを逆転し、ヒト乳癌細胞の肺コロニー形成を遮断する。Ｅ．  Ｄに記載されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞により形成された転移の肉眼的定量（ｎ＝５肺、誤差バー：Ｓ．Ｄ．星印、片側ＡＮＯＶＡとその後のＬＳＤ検定に基づいてＰ＜０．００１で対照クローンと異なる）。
【図４Ｆ】Ｆｒａ−１の抑制はＥＭＴを逆転し、ヒト乳癌細胞の肺コロニー形成を遮断する。Ｆ．  対照またはＦｒａ−１枯渇ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を静脈内接種されたマウスにおいて発症する肺腫瘍におけるＦｒａ−１およびＫｉ６７発現の免疫組織学的分析（挿入部分は高倍率図）。
【図５Ａ】Ｆｒａ−１の抑制は正所性ヒト乳房腫瘍から転移を遮断する。Ａ．  接種３５日後の指示されたような個々のＦｒａ−１ｓｈＲＮＡを発現する１．１０６ＧＦＰ標識ＬＭ２細胞を静脈内接種されたヌードマウスの肺における蛍光の定量（ｎ＝５肺、誤差バー：Ｓ．Ｄ．星印、一方向ＡＮＯＶＡとその後のＬＳＤ検定に基づいてＰ＜０．００１で対照クローンと異なる）。
【図５Ｂ】Ｆｒａ−１の抑制は正所性ヒト乳房腫瘍から転移を遮断する。Ｂ．  Ａに記載したマウスの肺の蛍光画像。
【図５Ｃ】Ｆｒａ−１の抑制は正所性ヒト乳房腫瘍から転移を遮断する。Ｃ．  原発性腫瘍の外科的除去の６週間後の、個々のＦｒａ−１ｓｈＲＮＡを発現するＧＦＰ標識ＬＭ２細胞を４番目の乳腺の脂肪パッドに注射したヌードマウスの肺における転移結節の定量（ｎ＝１０）。
【図５Ｄ】Ｆｒａ−１の抑制は正所性ヒト乳房腫瘍から転移を遮断する。Ｄ．  Ｃに記載したマウスの肺の蛍光画像。
【図６Ａ】Ｆｒａ−１関連遺伝子発現プロフィールはヒト乳癌の臨床結果を精確に予測する。Ａ．  Ｆｒａ−１機能に関連し、ＬＭ２細胞におけるＦｒａ−１依存性トランスクリプトームを基礎にした遺伝子発現プロフィールを生成するために用いられる手順の大要。
【図６Ｂ】Ｆｒａ−１関連遺伝子発現プロフィールはヒト乳癌の臨床結果を精確に予測する。Ｂ．  Ｆｒａ−１分類子を用いて「不十分な」予後（青線）、または「良好な」予後（黒線）を有すると分類されたＮＫＩ２９５データ組からの患者の遠位無転移生存（ＤＭＦＳ）およびアフィメトリクス確証組からの患者の乳癌特異的生存（ＢＣＳＳ）。（表示ｐ値はログランク検定に基づいている）。
【図７Ａ】ＲＫ３ＥＴＢ細胞におけるＦｒａ−１枯渇抑制は形態学的形質転換を逆転する。  Ａ．  指示されたような空ベクターまたはＦｒａ−１をターゲッティングする個々のｓｈＲＮＡを含有するＲＫ３ＥＴＢ細胞のポリクローナルプールにおけるＦｒａ−１発現レベル。
【図７Ｂ】ＲＫ３ＥＴＢ細胞におけるＦｒａ−１枯渇抑制は形態学的形質転換を逆転する。Ｂ．  Ｂに記載した細胞の位相差顕微鏡写真。
【図７Ｃ】ＲＫ３ＥＴＢ細胞におけるＦｒａ−１枯渇抑制は形態学的形質転換を逆転する。Ｃ．  ｓｈ−Ｆｒａ１（１）ＲＫ３ＥＴＢ細胞におけるＦｒａ−１発現の回復、その結果生じる形態学的形質転換。
【図７Ｄ】ＲＫ３ＥＴＢ細胞におけるＦｒａ−１枯渇抑制は形態学的形質転換を逆転する。Ｄ．  Ｃに記載し阿多細胞の位相差顕微鏡写真。ＡおよびＣの両方において、パネルは単一ブロットから得られ、α−チューブリンは負荷対照として役立つ。倍率４０倍で細胞を撮影した。
【図８Ａ】Ｆｒａ−１はＴｒｋＢ駆動性転移に不可欠である。  Ａ．  Ｆｒａ−１枯渇の一関数としての、ＲＫ３ＥＴＢ腫瘍から播種された肺転移の顕微鏡的定量。３つの個々の実験を代表する８つの個々の切片／マウスにおける転移の総数が示されている（星印、Ｓｕｐｐｌ．  図２ｅ参照）。
【図８Ｂ】Ｆｒａ−１はＴｒｋＢ駆動性転移に不可欠である。Ｂ．  Ｆｒａ−１枯渇ＲＫ３ＥＴＢ腫瘍細胞を皮下接種され、肺血管から浸出できなかった微小転移（矢頭）を示すマウスの肺の組織切片のヘマトキシリン・エオシン染色（尺度バー：１００μｍ）。
【図９】Ｆｒａ−１は一般にヒト乳癌細胞株中で過剰発現される。ヒト乳癌細胞株におけるＦｒａ−１発現のウエスタンブロット分析。β−アクチンは負荷対照として役立つ。
【図１０Ａ】Ｆｒａ−１はヒト乳癌細胞の肺転移に必要とされる。  Ａ．  ｉｎ  ｖｉｖｏ接種前の対照およびＦｒａ−１サイレンシングＬＭ２細胞におけるＧＦＰシグナル強度のフローサイトメトリー分析。
【図１０Ｂ】Ｆｒａ−１はヒト乳癌細胞の肺転移に必要とされる。Ｂ．  接種３５日後の指示されたような個々のＦｒａ−１ｓｈＲＮＡを発現する１．１０５ＧＦＰ標識ＬＭ２細胞を静脈内接種されたマウスの肺における蛍光の定量（ｎ＝５肺、誤差バー：Ｓ．Ｄ．星印、一方向ＡＮＯＶＡとその後のＬＳＤ検定に基づいてＰ＜０．００１で対照と異なる）。
【図１０Ｃ】Ｆｒａ−１はヒト乳癌細胞の肺転移に必要とされる。Ｃ．  Ｂに記載したマウスの肺の代表的免疫蛍光画像。
【図１０Ｄ】Ｆｒａ−１はヒト乳癌細胞の肺転移に必要とされる。Ｄ．  Ｆｒａ−１枯渇の一関数としてのＬＭ２細胞における上皮タンパク質の発現レベル。
【図１０Ｅ】Ｆｒａ−１はヒト乳癌細胞の肺転移に必要とされる。Ｅ．  Ｆｒａ−１枯渇の一関数としての、増殖１ヵ月後の外科的除去時の正所性ＬＭ２腫瘍の重量。
【図１１Ａ】肺転移形成に不可欠なＦｒａ−１調節遺伝子の同定。  Ａ．  接種５週間後の指示されたようなＦｒａ−１調節遺伝子に対して向けられる個々のｓｈＲＮＡを発現する１．１０５ＧＦＰ標識ＬＭ２細胞を静脈内接種されたマウスの肺における蛍光の定量（ｎ＝３肺、誤差バー：Ｓ．Ｄ．星印、非対合片側ｔ検定に基づいてＰ＜０．０５で２つの個々のｓｈ−ＲＮＡに関して対照と異なる）。
【図１１Ｂ】肺転移形成に不可欠なＦｒａ−１調節遺伝子の同定。Ｂ．  マウスに注射したＬＭ２細胞における定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定されるＦｒａ−１調節遺伝子の発現レベル。
【図１１Ｃ】肺転移形成に不可欠なＦｒａ−１調節遺伝子の同定。Ｃ．  Ａに記載したマウスの肺の代表的免疫蛍光画像。
【発明を実施するための形態】
【０１１８】
実施例
結果
転移モデル系の遺伝子発現プロファイリングはＦｒａ−１を候補転移遺伝子として同定する
ＴｒｋＢおよびＢＤＮＦを異所的に発現するＲＩＥおよびＲＫ３Ｅ細胞（ここでは以後、ＲＩＥＴＢまたはＲＫ３ＥＴＢ細胞；図１Ａ）の両方に関するマイクロアレイ遺伝子発現プロファイリングを、実施した。共通調節異常値は、潜在的転移プロモーターまたは抑制因子とみなされた（マイクロアレイ分析の生データは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ−ａｓ／ａｅｒ／♯ａｅ−ｍａｉｎ［０］、寄託番号Ｅ−ＮＣＭＦ−２１で利用可能である）。いくつかの他の潜在的に興味深い異常値の１つはＦＯＳＬ１であった（図１Ｂ）。われわれのマイクロアレイ発現データを確証する場合、転写およびタンパク質レベルの両方で活性化ＴｒｋＢにより、Ｆｒａ−１を＞５０倍まで上方調節した（図１Ｃ）。ゲルシフト実験は、これが、Ｆｒａ−１を両細胞系においても、ＡＰ−１  ＤＮＡ結合複合体の主要構成成分となるようにする、ということを明示した（図１Ｄ）。この設定でのＦｒａ−１上方調節は、Ｒａｓ活性化のために最も見込みがあり、ＴｒｋＢシグナル伝達の下流エフェクターとして作用する（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）。
Ｆｒａ−１の抑制はＥＭＴを逆転し、ＴｒｋＢ発現原発性腫瘍の転移可能性を阻止する
【０１１９】
発癌性形質転換および転移におけるＦｒａ−１の機能的関連性を取り扱うために、個々の短いヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ（ｓｈ−Ｆｒａ−１（１）および（２））をコードするレトロウイルスベクターを用いてＲＫ３ＥＴＢ細胞からそれを枯渇させた。Ｆｒａ−１タンパク質レベルが親細胞において観察されるレベルに低減され戻されるいくつかのクローン細胞集団を確立した（図２Ａ、および示されていないデータ）。
【０１２０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施された分析は、Ｆｒａ−１サイレンシングが紡錘糸様細胞表現型の活性化ＴｒｋＢによる誘導を逆転して、細胞は、広範な細胞−細胞接合部およびアクチン細胞骨格再組織化を伴う典型的上皮「玉石」形態を取り戻す、ということを明示した（図１Ａ、２Ｂ、Ｃ）。これは、非重複ｓｈＲＮＡを発現する細胞クローンに関して、ならびにポリクローナルｓｈ−Ｆｒａ−１細胞プールにおいて観察された（Ｓｕｐｐｌ．図１Ａ、Ｂ）。さらに、Ｆｒａ−１発現の回復は、Ｆｒａ−１サイレンシングの作用を逆転したが（Ｓｕｐｐｌ．図１Ｃ、Ｄ）、すべてがＲＮＡｉオフ・ターゲット効果に強く反論する。これらの形態学的再整列は、ＥＭＴの逆転を高度に思い出させた。この見解を支持する場合、Ｆｒａ−１枯渇は、Ｅ−カドヘリンの発現および正確な細胞下局在化を完全に回復した（図２Ａ、Ｃ）。これは、ＲＫ３ＥＴＢ細胞の移動および侵襲特性の両方の完全な抹消と平行して生じた（図２Ｄ）。
【０１２１】
これらの作用にもかかわらず、Ｆｒａ−１枯渇は培養中のＲＫ３ＥＴＢ細胞の増殖活性に全く影響を及ぼさなかった、ということは重要である（図２Ｅ）。同様に、無胸腺ヌードマウスに皮下接種した場合、Ｆｒａ−１に関してサイレンシングされた細胞は、対照腫瘍と同じく迅速に広げられる、そして区別不可能な形態を有する腫瘍を産生した（図３Ａ、Ｂ）。次いで、Ｆｒａ−１が異種移植実験におけるこれらの腫瘍細胞の転移可能性の重要な決定因子に対応するか否かを検討した。対照腫瘍細胞を施されたマウスはすべて、皮下原発性腫瘍から播種された肉眼的に検出可能な肺転移を発症した（図３Ｃ、Ｄ）。これと顕著に対比して、Ｆｒａ−１サイレンシング腫瘍細胞を注射されたマウスは何れも、如何なる可視的転移も示さなかった。肺の顕微鏡的組織検査は、対照細胞を摂取したすべてのマウスにおいて肺実質に侵入する転移病変の存在を確証したが、一方、肺転移は、Ｆｒａ−１サイレンシング腫瘍細胞のレシピエントにおいては事実上存在しなかった（図８Ａ）。実際、Ｆｒａ−１枯渇腫瘍を保有する３６匹のマウスの肺では、肺血管から浸出できなかった２〜３個の細胞のみを含む２つのコロニーのみが観察された（図８Ｂ）。これらの結果は、少なくともＴｒｋＢ駆動性齧歯類上皮腫瘍細胞転移の状況では、Ｆｒａ−１は原発性腫瘍形成に必須ではないが、しかし原発性腫瘍から遠位の転移を生じるこれらの腫瘍の能力のためには極めて重要である、ということを実証する。
Ｆｒａ−１の抑制はＥＭＴを逆転し、ヒト乳癌細胞の肺コロニー形成を遮断する
【０１２２】
Ｆｒａ−１は、しばしば、ヒト固形腫瘍、例えば乳房、結腸、甲状腺組織由来のものにおいて、および中皮腫において、ならびに種々のヒト腫瘍型由来の多数の細胞株において、過剰発現される（Ｍｉｌｄｅ−Ｌａｎｇｏｓｃｈ，  ２００５で再検討されている）。マイクロアレイ遺伝子発現分析では、ヒト乳癌細胞株におけるＦｒａ−１発現レベルとｉｎ  ｖｉｔｒｏ侵襲可能性との間に相関が認められた（Ｚａｊｃｈｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。さらにまた専らｉｎ  ｖｉｔｒｏで、弱侵襲性乳房腫瘍細胞におけるＦｒａ−１過剰発現はそれらの侵襲可能性を増大することが示されているが、一方、高侵襲性細胞株におけるＦｒａ−１のサイレンシングはそれを低減した（Ｂｅｌｇｕｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。これらの結果はｉｎ  ｖｉｖｏでもヒト乳癌細胞の転移におけるＦｒａ−１の役割に関する可能性を提起するが、しかしこれは未だ検討されていない。
【０１２３】
Ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒト乳癌細胞の発癌および転移可能性におけるＦｒａ−１の任意の役割を試験するために、２つの非重複ｓｈＲＮＡのいずれかのレンチウイルス形質導入により、Ｆｒａ−１を強力に過剰発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞からそのＲＮＡを枯渇させた（Ｂｅｌｇｕｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５およびＳｕｐｐｌ．図３）。齧歯類細胞系に関して観察したものと同様に、ポリクローナル細胞集団におけるＦｒａ−１のサイレンシングは、他の上皮タンパク質と同様に、Ｅ−カドヘリン発現の強力な上方調節をもたらした（図４Ａ）。同時に、Ｆｒａ−１のサイレンシングは、Ｅ−カドヘリンを細胞膜に再局在化させた（図４Ｂ、上パネル）。全体的に、これらの結果は、Ｆｒａ−１が齧歯類腫瘍細胞およびヒト乳癌細胞の両方において上皮特質の下方調節に必要とされる、ということを示す。従来の知見（Ｂｅｌｇｕｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５；Ｖｉａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）と一致して、これは、広範な細胞骨格再組織化に関連付けられた（図４Ｂ、下パネル）。
【０１２４】
齧歯類細胞に関して観察したものと同様に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の増殖可能性は、Ｆｒａ−１のサイレンシングによる影響を全く受けなかった、ということは重要である（図４Ｃ）。これは、従来の知見（Ｂｅｌｇｕｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）と矛盾しており、トランスフェクト化ｓｉＲＮＡのそれらの使用とは対照的に、安定的に組み込まれたプロウイルスｓｈＲＮＡについてのわれわれの使用により説明され得る。齧歯類細胞系と同様に、Ｆｒａ−１が肺をコロニー形成するヒト乳癌細胞の能力において重要な役割を有するか否かを調べるために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を無胸腺マウスに静脈内接種した。実際、Ｆｒａ−１枯渇は、肺における腫瘍負荷の強力な減少を引き起こした（図４Ｄ、Ｅ）。出現したＦｒａ−１枯渇ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の稀な肺腫瘍は正常レベルのＦｒａ−１を発現し、対照細胞により形成されるコロニーと同じ速さで増殖した（図４Ｆ）。Ｆｒａ−１枯渇細胞のポリクローナルプールをわれわれは用いたため、これらの腫瘍は、おそらくほとんどがＦｒａ−１の不完全サイレンシングを有する細胞から出現した（Ｔｗｉｓｔに関して以前に観察されたものと同様−Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。これらの結果は、ヒト乳癌細胞からのＦｒａ−１の枯渇は重要な上皮特質を回復し、肺をコロニー形成するそれらの能力を遮断する、ということを示す。
Ｆｒａ−１の抑制は正所性ヒト乳房腫瘍からの転移を遮断する
【０１２５】
個々の測定値として、１．１０６ＧＦＰ標識ＬＭ２細胞（肺に転移する傾向が高いことで関連づけられるＭＤＡ−ＭＢ−２３１由来細胞株）を静脈内接種した（Ｍｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。注射直前のフローサイトメトリーは、すべての細胞株が、Ｆｒａ−１サイレンシングに関係なく、等レベルのＧＦＰを発現する、ということを示した（Ｓｕｐｐｌ．図４Ａ）。肺の蛍光画像は、Ｆｒａ−１のサイレンシング時に腫瘍負荷のほぼ２０，０００倍の低減を明示した（図５Ａ、Ｂ）。Ｆｒａ−１枯渇による転移の類似の強力な抑制は、１．１０５細胞の接種を用いて観察された（Ｓｕｐｐｌ．図４Ｂ、Ｃ）。肺コロニー形成の低減は、Ｆｒａ−１ノックダウンレベルとこれらの細胞のコロニー形成能力との間（ｓｈ−Ｆｒａ−１（２）は両設定において最良に遂行する；図５Ａおよび図１０Ｂ〜１０Ｄを比較）で観察される相関により例証されるように、用量依存性であった。全体的に、これらの結果は、実験的肺転移を形成するヒト乳癌細胞の能力におけるＦｒａ−１の重要な役割を明示する。
【０１２６】
静脈内接種は腫瘍細胞が侵入し、血管内侵入する必要性を回避するので、次に、Ｆｒａ−１も全転移カスケードに必要とされるか否かを決定した。このために、ＧＦＰ標識化ＬＭ２細胞がヌードマウスの乳房脂肪パッド中に注射される正所性モデルを用いた。対照プラスミドを摂取する細胞は、原発性腫瘍を発症し、これは動物のほとんどで肺に転移した（図５Ｃ、Ｄ）。それに反して、Ｆｒａ−１に対するｓｈＲＮＡを発現するＬＭ２細胞は、よりゆっくりと増殖する腫瘍を発症し（図１０Ｅ）、検出可能な肺転移を発症することは出来なかった（図５Ｃ、Ｄ）。さらにまた、肺コロニー形成腫瘍活性の抑制は、Ｅ−カドヘリン発現の上方調節と関連した（図１０Ｄ）。したがって、合わせて考えると、これらの結果は、原発性腫瘍から肺転移を形成するヒト乳癌細胞の能力におけるＦｒａ−１の重要な役割を明示する。転移におけるこの遮断は静脈内接種腫瘍細胞に関しても観察されることをわれわれが示す場合、これらのデータは、Ｆｒａ−１が転移過程の後期段階において不可欠な役割を果たす、ということも示す。
Ｆｒａ−１発現およびその関連遺伝子発現プロフィールは乳癌再発の決定因子である
【０１２７】
さらに、転移するヒト乳癌細胞の能力におけるＦｒａ−１の重要な役割を支持して、原発性ヒト乳癌におけるＦｒａ−１  ｍＲＮＡ発現レベルと、アフィメトリクス訓練組（５０９名の乳癌患者のコホート）における遠位部位転移を発症する危険との間の関連を観察した（ｐ＝０．０３；ログランク検定、方法参照）。Ｆｒａ−１が転写因子に対応するという事実は、その関連トランスクリプトームもまた臨床結果に関する予後予測力を伴って付与されるという可能性を提起する。実際、遺伝子発現パターンと腫瘍行動との間のつながりを見出すためのいわゆるデータ駆動型アプローチにおいて、転写因子の活性の一関数として発現され、まさにその発現ではないので、転写因子の標的遺伝子はしばしば、転写因子それ自体より良好なバイオマーカーを務める、ということが示唆されている（ｖａｎ  ’ｔ  Ｖｅｅｒ  ａｎｄ  Ｂｅｒｎａｒｄｓ，  ２００８）。
【０１２８】
Ｆｒａ−１標的遺伝子発現レベルが乳癌再発と相関するか否かを確定するために、Ｆｒａ−１がｓｈＲＮＡを用いてサイレンシングされるＬＭ２細胞のマイクロアレイ遺伝子発現プロファイリングを実施した。両ｓｈＲＮＡにより有意に上方または下方調節される（ｐ＜１．１０−５）プローブが、選択された（示されていない）。この組のＡｇｉｌｅｎｔプローブを、対応するアフィメトリクスプローブにマッピングした。次に、アフィメトリクス訓練組（５０９名患者コホート）における診断値を示すプローブを用いてＦｒａ−１分類子を生成したが、これは、４４７のプローブを含有した（図６Ａ、ならびに示されていない）。
【０１２９】
Ｆｒａ−１セントロイド分類子は、ヒト乳癌遺伝子発現プロフィールの２つのシリーズに関して独立して確証された：アフィメトリクス確証組（維持管理された利用可能なデータベースから得られる一組）およびＮＫＩ２９データ組（これらの組の組成の詳細に関しては方法を参照）。珍しいことに、Ｆｒａ−１分類子により限定されるような良好および不良予後群間の生存の差は、両シリーズにおいて高度に有意であって、ＮＫＩ２９５組ではｐ＝２．１９×１０−９（ログランク検定、終点としてＤＭＦＳ）、アフィメトリクス確証組ではｐ＝１．８２×１０−６（ログランク検定、終点としてＢＣＳＳ）であった。多変量Ｃｏｘ解析では、Ｆｒａ−１分類子は、既知の臨床的予測子、例えばＮＫＩからの２９５名の患者におけるリンパ節状態、腫瘍のサイズ、エストロゲン受容体状態およびエルストン・エリス類別の存在下では依然として個々の予測子のままであった（表１）。別の乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）において類似の手法を用いて、４４５個のプローブを含有する分類子を生成し、類似の結果を得た。
【０１３０】
興味深いことに、１６８の異なる遺伝子に対してマッピングする１８８のプローブは、ＬＭ２細胞由来の４４７プローブ組ならびにＭＤＡ−ＢＭ−２３１細胞由来の４４５プローブ組の両方に共通であった（表２）。それらの遺伝子は潜在的に、転移に因果的に関与する遺伝子産物を含む。この点で、その発現が良好予後腫瘍においてより不良予後腫瘍において高い遺伝子産物の抑制は、転移発症の抑制を生じ得る。
Ｆｒａ−１調節遺伝子の系統的分析はヒト乳癌細胞の転移に不可欠な１２の遺伝子を同定する
【０１３１】
次に、ヒト乳癌細胞の転移活性に決定的に関与するＦｒａ−１調節遺伝子を探索するためのプラットフォームとして、Ｆｒａ−１分類子の使用を目指した。ＬＭ２およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１分類子間で共通の１６８の遺伝子の中で、両細胞系における２つのｓｈ−ＲＮＡターゲッティングＦｒａ−１により一般に下方調節される遺伝子を選択したが、これは、それらの遺伝子の発現が、直接的であれ、間接的であれ、Ｆｒａ−１により活性化される、ということを示唆する。それらの遺伝子の中で、次に、不良予後乳癌患者において特異的に高度発現されるものを選択したが、これは、それらが、その過剰発現が転移形成に関与し得る遺伝子に対応するためであった。この戦略は、３１の遺伝子の一覧を産生した。これらの遺伝子の大多数は、癌（進行）において一役を果たすことが示されている。それらのうちの１つ（メタドヘリン遺伝子）は、肺への乳癌細胞の転移性伝播に不可欠であることが近年示されており（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）、このアプローチを確証している、ということは重要である。
【０１３２】
次いで、ｉｎ  ｖｉｖｏでの転移形成に及ぼすＬＭ２細胞におけるこれら３１の遺伝子の各々のサイレンシングの作用を、系統的に試験した。この目的のために、レンチウイルス媒介性送達を用いて、少なくとも２つの別個のｓｈ−ＲＮＡを用いて、これらの遺伝子の各々の発現を抑制した。ヌードマウス中への当該細胞の静脈内注射後のｉｎ  ｖｉｖｏでの肺転移形成に関して、それらの安定的に修飾された細胞株を試験した。ＧＦＰ標識細胞を用いて、次に、細胞注射の５週間後のＧＦＰ蛍光の画像処理により、マウスの肺における転移形成を定量した（図１１）。統計学的分析後、その抑制が転移を有意に抑制する（表６）、そして多くが劇的にそのようであった１２の遺伝子を同定した。
【０１３３】
これらの遺伝子のうちのいくつかは、薬剤能力を有すると思われる酵素、受容体または他のタンパク質をコードする、ということは重要である。これらのうちのいくつかに関して、小分子阻害剤は既に知られており、利用可能である（表４）。ここで、ｉｎ  ｖｉｖｏでの転移形成に及ぼすこれらの薬理学的阻害剤の作用を精査している。これらの観察をさらに確証し、拡大するために、そして転移形成における遮断の動力学および機序に関する付加的上方を提供するために、個々の実験系、ルシフェラーゼｉｎ  ｖｉｖｏ画像処理系を用いた１２の陽性遺伝子に関するこれらの実験も繰り返し行なっている。最後に、マウスの乳房脂肪パッドにおける正所性注射後の原発性腫瘍増殖に及ぼすこれら１２の遺伝子の作用を研究して、それらの作用が転移に特異的であるか、あるいは原発性腫瘍発症にも当てはまるかを確定しているところである。
考察
【０１３４】
腫瘍細胞の転移性伝播は癌死亡率のほとんどの原因であり、その重要な働きをするものは未だに明らかにされていない。療法的介入に関する標的を同定するためには、転移の基礎を成す分子過程を解明することは絶対必要である。転移モデル系において遺伝子および機能的分析とＲＮＡ干渉とを組合せることにより、転写因子Ｆｒａ−１が転移腫瘍細胞伝播に断固として必要である、ということを実証する。対応的に、それは、いくつかのヒト腫瘍、例えば乳癌において過剰発現される。ヒト乳癌細胞からのＦｒａ−１枯渇は、原発性正所性腫瘍から肺に転移するそれらの能力に劇的な影響を及ぼした、ということをわれわれは示している。
【０１３５】
多数の早期発癌性変更、例えばＲａｓ突然変異または受容体チロシンキナーゼの過剰発現は、ＭＡＰキナーゼ経路ならびにその下流エフェクター転写因子の活性化をもたらす。それらのうちの１つは、転写因子のＦｏｓ（ｃ−Ｆｏｓ、ＦｏｓＢ、Ｆｒａ−１およびＦｒａ−２）およびＪｕｎ（ｃ−Ｊｕｎ、ＪｕｎＢ、ＪｕｎＤ）ファミリーの成員であって、これらはＡＰ−１複合体の形成に関与する（Ｅｆｅｒｌ  ａｎｄ  Ｗａｇｎｅｒ，  ２００３）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質は、確立された癌遺伝子であり（Ｅｆｅｒｌ  ａｎｄ  Ｗａｇｎｅｒ，  ２００３）、Ｆｒａ−１はいくつかの設定２置いて細胞形質転換または腫瘍形成に関与することが示されている（Ａｄｉｓｅｓｈａｉａｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；Ｒａｍｏｓ−Ｎｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２；Ｖａｌｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。Ｆｒａ−１枯渇はｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのヒト乳癌細胞の増殖活性にほとんど影響を及ぼさなかった、ということを観察した。これに対して、Ｆｒａ−１は、ラットおよびヒト腫瘍細胞の両方において、転移発症のために断固として必要であった。これらの結果は、Ｆｒａ−１が、少なくともこれら２つの個々の実験設定において、原発性腫瘍増殖よりも転移に、相対的により多く関与する、ということを示唆する。これは同様に早期腫瘍形成への関与を除外しないが、しかしＦｒａ−１は腫瘍抑制因子というよりむしろ、腫瘍進行因子として振舞うように見える。
【０１３６】
細胞形質転換におけるその含意のほかに、腫瘍細胞侵襲および移動におけるＦｒａ−１の役割は、長年に亘って関心が増大されてきた（Ｏｚａｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。しかしながら、これらのデータのｉｎ  ｖｉｖｏ関連性、すなわち、Ｆｒａ−１が事象の複合カスケードにおける重要な決定因子に対応して、最後に転移をもたらすか否かは、いままで検討されてこなかった。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、Ｆｒａ−１は細胞自動性または侵襲を媒介することが示されている（Ａｄｉｓｅｓｈａｉａｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；Ｂｅｌｇｕｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５；Ｖｉａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。これらの結果は、Ｆｒａ−１サイレンシング時の転移の抑制が、細胞アクチン組織化の逆転ならびに細胞移動および侵襲の低減と関連づけられた、というわれわれの観察と一致する。Ｆｒａ−１サイレンシングは、Ｅ−カドヘリンの再発現および正確な細胞下局在化も誘導して、Ｆｒａ−１が乳癌細胞におけるＥ−カドヘリン下方調節に因果的に関与するという証拠を提供する、ということをここで示す。これは、Ｆｒａ−１発現レベルが乳癌細胞株におけるＥ−カドヘリン発現と負の相関を示す、という知見と一致する（Ｚａｊｃｈｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。面白いことに、順次、Ｅ−カドヘリン機能の抑制を介したＥＭＴの誘導はＦｒａ−１発現を上方調節するので、この調節は相互的であると思われる（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。Ｅ−カドヘリン発現の抑制は、ＥＭＴにおける中心的事象を意味し、腫瘍侵襲性、転移伝播および不十分な患者の予後と関連する（Ｔｈｉｅｒｙ  ａｎｄ  Ｓｌｅｅｍａｎ，  ２００６）。臨床的乳癌検体における豊富なＥＭＴの証明は遅れをとっている（Ｈｕｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）が、一方、腫瘍細胞が細胞−細胞接触を分断して、アノイキス耐性になり、そして侵入する（すべて、転移過程に関与している）のを可能にする場合のＥＭＴに関する密接な役割を支持する十分な実験的証拠が存在する（Ｃｈｒｉｓｔｏｆｏｒｉ，  ２００６；Ｌｉｏｔｔａ  ａｎｄ  Ｋｏｈｎ，  ２００４；Ｔｈｉｅｒｙ  ａｎｄ  Ｓｌｅｅｍａｎ，  ２００６；Ｙａｎｇ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，  ２００８）。興味深いことに、ヒト幹様乳癌細胞はＥＭＴに関連したマーカーを発現する、ということが近年実証された（Ｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ，  ２００８）。Ｆｒａ−１は、ＥＭＴの重要な調節因子として作用することにより、少なくとも一部は、乳癌転移における中心的決定因子として作用する、ということを、われわれの結果は示唆する。
【０１３７】
転移の重要な一因としてのＦｒａ−１についてのわれわれの同定を拡張して、Ｆｒａ−１依存性トランスクリプトーム（これはＦｒａ−１枯渇ヒト乳癌細胞に基づいている）は、ヒト乳癌における高予後予測力と関連する、ということを実証する。したがって、本明細書中で提示される分類子は、疾患に関する原因因子として機能的に確証される単一転写因子によりその発現が調節される限定組の遺伝子と乳癌再発における予後予測力とを機能的に結びつける。このようなものとして、それは、ヒト患者における乳癌転移でのＦｒａ−１の重要性を際立たせ、そして患者層化のための新規のツールをわれわれに提示する。それは転移におけるＦｒａ−１の機能的特性と直接的に結び付けられるので、分類子は、療法的介入に利用され得る候補標的遺伝子も含有し得る。その発現が増大されるヒト乳癌およびいくつかの他の癌の臨床的介入のためのＦｒａ−１またはそのシグナル伝達経路を不活性化する努力に、われわれのデータは値する。
方法
ベクターおよび抗体
【０１３８】
ＲＩＥ（Ｒ．Ｄ．  Ｂｅａｕｃｈａｍｐ，  Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，  ＴＮ，  ａｎｄ  Ｋ．Ｄ．  Ｂｒｏｗｎ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫから贈呈）およびＲＫ３Ｅ（ＡＴＣＣ）細胞を、以前に記載されたように（Ｄｏｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）、レトロウイルスによりネズミＴｒｋＢおよびＢＤＮＦ発現構築物で形質導入したが、但し、ＴｒｋＢ  ｃＤＮＡは、ｐＭＳＣＶ−ブラスチシジン中でサブクローニングした。ＢＤＮＦ（Ｎ−２０）、Ｆｒａ−１（Ｒ−２０）およびＴｒｋ（Ｃ−１４）抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚから、α−カテニン（６１０１９３）、β−カテニン（１４）、γ−カテニン（６１０２５３）およびＥ−カドヘリン（６１０１８１）抗体はＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，から、α−チューブリン抗体（ＤＭ１Ａ）はＳｉｇｍａからであった。Ｋｉ６７抗体（ＭＭ１）Ｖｉｓｉｏｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからであった。ホスホ−Ｓｍａｄ２（３１０１）抗体はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからであった。
細胞培養
【０１３９】
ＲＩＥ−１細胞、ＲＫ３Ｅ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（Ｌ．  Ｓｍｉｔ，  Ａｍｓｔｅｒｄａｍから贈呈）およびＬＭ細胞（亜継東＃４１７３、Ｊ．  Ｍａｓｓａｇｕｅ教授（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）から贈呈）を、ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（１０％  ＦＣＳ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）、２ｍＭグルタミン、１００単位／ｍｌペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（すべてＧｉｂｃｏ）を補足）中で培養した。増殖率を測定するために、細胞を、３．１０５（ＲＫ３Ｅ）または１．１０６（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）／１００ｍｍ皿で植えつけた。各細胞株に関して、３つの皿からの細胞をトリプシン処理し、２日毎に計数した。
レトロウイルスおよびレンチウイルス形質導入
【０１４０】
レトロウイルス形質導入を、記載された通りに実施した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｇｒｏｕｐ／ｎｏｌａｎ／ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ＿ｓｙｓｔｅｍｓ／ｐｈｘ．ｈｔｍｌ）。ＲＫ３Ｅ細胞におけるＦｒａ−１のレトロウイルスサイレンシングを、ｐＲＳ−ｐｕｒｏベクター（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ，  ２００２）を用いて、以下のターゲッティング配列で実施した：ｓｈ−Ｆｒａ−ｌ（ｌ）（ＴＡＡＣＴＡＧＣＣＴＡＧＡＡＣＡＣＴＡ）およびｓｈ−Ｆｒａ−ｌ（２）（ＧＡＡＧＴＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧＣＣＡ）。陰性対照として、挿入物を有さないｐＲＳ−ｐｕｒｏを用いた。ＲＫ３Ｅ細胞を、ウイルス上清で３回感染させて、プロマイシン耐性に関して選択した。すべての細胞集団において、ＴｒｋＢおよびＢＮＤＦの類似の発現レベルを確証した。レンチウイルス形質導入を、以前記載されたとおりに実施した（Ｉｖａｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。ＬＭ２およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞中でのＦｒａ−１のサイレンシングを、以下のターゲッティング配列を用いて実施した：ｓｈ−Ｆｒａ−１（１）（ＧＴＡＧＡＴＣＣＴＴＡＧＡＧＧＴＣＣＴ）およびｓｈ−Ｆｒａ−ｌ（２）（ＧＧＣＣＴＧＴＧＣＴＴＧＡＡＣＣＴＧＡ）。陰性対照として、挿入物を有さないベクターを用いた。細胞を１回感染させて（２．１０６細胞：１，５．１０７  ウイルス粒子を有する）、ＧＦＰ陽性細胞を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により選択した。
腫瘍細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ接種
【０１４１】
動物実験倫理委員会に認可されたプロトコールに従って、すべての動物研究を実行した。６〜８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスを、すべての異種移植実験に用いた。ＲＫ３Ｅ細胞を皮下注射した（各フラスコ中のＰＢＳ１５０μｌ中１０５個の生細胞）。腫瘍長が１５ｍｍに達した時に、または腫瘍が潰瘍化し始めた時に、マウスを屠殺した。腫瘍の幅（Ｗ）および長さ（Ｌ）をカリパスを用いて週２回測定し、腫瘍容積を式（Ｌ．Ｗ２／２）を用いて概算した。ＬＭ２細胞を、ヌードマウスの第四乳房脂肪パッドに注射した（ＰＢＳおよび成長因子低減マトリゲルの１：１混合物５０μｌ中１０６細胞）。１ヵ月後、腫瘍を外科的に除去し、マウスをさらに６週間保持した。実験的肺転移形成のために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＬＭ２細胞を外側尾静脈中に注射した（ＰＢＳ１５０μｌ中１０６または１０５生細胞）。それぞれ注射の３ヵ月後または１ヵ月後に、全動物を屠殺した。
肺転移の定量
【０１４２】
ＣＯ２窒息を用いてマウスを屠殺し、その後、肺を取り出して、切開した。肺をエタノール／酢酸／ホルモル食塩水固定液（ＥＡＦ）中で固定し、立体顕微鏡下で検査した。肉眼的肺転移は、肺の表面の異所性白色塊として同定された。転移の組織学的査定のために、肺の個々の位置からの８つの切片を、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、これらの切片中の転移の総数を確定した。代替的には、肺をホルムアルデヒド中で固定し、ＧＦＰ標識ＬＭ２細胞により発光される蛍光の量に関して蛍光顕微鏡により２時間以内に画像処理した。画像を同一強度および露出時間で撮影し、腫瘍細胞が占める表面あたりの平均蛍光強度を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／ｄｏｗｎｌｏａｄ．ｈｔｍｌ）をＭＢＦプラグイン・バンドル（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｃｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ．ｃａ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ．ｈｔｍ）とともに用いて定量した。
Ｆｒａ−１標的遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ分析
【０１４３】
ＬＭ２細胞中のＦｒａ−１調節遺伝子のサイレンシングを、Ｓｉｇｍａ  Ｍｉｓｓｉｏｎ  ｓｈ−ＲＮＡライブラリーから入手したｐＬＫＯ．１ベクターを用いて実施した。ＧＦＰ標識ＬＭ２細胞をレンチウイルス発現ｓｈ−ＲＮＡに感染させて、プロマイシンで２日間選択し、レンチウイルス感染の７日後にマウスに注射した。空ベクターに感染した細胞を、対照として用いた。６〜８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスを、すべての異種移植実験に用いた。ＬＭ２細胞を外側尾静脈に注射した（ＰＢＳ１５０μｌ中１０５個の生細胞）。注射の５週間後に、ＣＯ２窒息を用いてマウスを屠殺し、その後、肺を切開し、ＧＦＰ標識ＬＭ２細胞により発光される蛍光の量に関して蛍光顕微鏡により２時間以内に画像処理した。画像を同一強度および露出時間で撮影し、平均蛍光強度を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／ｄｏｗｎｌｏａｄ．ｈｔｍｌ）をＭＢＦプラグイン・バンドル（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｃｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ．ｃａ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ．ｈｔｍ）とともに用いて定量した。ｓｈ−ＲＮＡを保有する細胞を注射したマウスの肺で観察された蛍光強度を、対照細胞を用いて同一時間に注射したマウスの肺の蛍光強度に対して正規化した。
移動および侵襲検定
【０１４４】
ＲＫ３Ｅクローン（２，５．１０５細胞／ウェル）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（３．１０５細胞／ウェル）を、移動検定のためにＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔ（商標）Ｃｏｎｔｒｏｌ  ８．０μｍ  ＰＥＴ膜６−ウェル細胞培養インサート、あるいは侵襲検定のためにＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔ（商標）ＢＤ  マトリゲル（商標）侵襲小室、８．０μｍ  ＰＥＴ膜６−ウェル細胞培養インサートの上部ウェル中の無血清培地中に播種した。１０％血清を有する培地を含有する下部ウェルに対する移動および侵襲を、２４時間後に査定した。メーカーの推奨に従って膜を処理した。移動中の細胞をクリスタルバイオレットで染色し、明視野顕微鏡を用いて計数した（倍率１００倍での８つの視野の平均細胞数）。
免疫蛍光
【０１４５】
１．１０５個の細胞をコラーゲン被覆ラブテック（商標）スライド（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）上でプレート化して、完全倍地中に一晩放置し、ＰＢＳ中で洗浄し、４％ＰＢＳ緩衝ホルムアルデヒド中で固定し、間接免疫蛍光法のために処理した。Ｆｒａ−１抗体（１：２００）、Ｅ−カドヘリン抗体（１：２００）およびＡｌｅｘａ５６８結合ファロイジン（Ａ１２３８０、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ；１：２００）を用いた。
免疫組織化学
【０１４６】
標準手法を用いて、組織学的切片作製およびヘマトキシリン・エオシン染色を実施した。パラフィン切片を脱パラフィン処理して、再水和市、０．１ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０中で前処理して、洗浄し、過酸化物とともにインキュベートした。組織を、Ｆｒａ−１（１：２００）またはＫｉ−６７（１：４０００）に関する一次抗体とともにインキュベートした。二次抗体は、ＰｏｗｅｒＶｉｓｉｏｎ＋（ＤＰＶＢ＋９９９ＨＲＰ；ＩｍｍｕｎｏＬｏｇｉｃ）であった。ペルオキシダーゼ活性を、液体ＤＡＢ（Ｋ３４６８；ＤＡＫＯ）で検出した。
ＳＹＢＲ−グリーン実時間ＲＴ−ＰＣＲ
【０１４７】
総ＲＮＡをＲＱ１  ＲＮアーゼ無含有ＤＮアーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）でＤＮアーゼ処理した。スーパースクリプトＩＩ第一鎖キット（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、逆転写を実施した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００配列検出系上でＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスター・ミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。用いたプライマー組を以下に示す：
ラットＦｒａ−１：５’−ＧＣＡＧＡＣＡＣＡＧＡＣＡＧＴＣＣＡＧ−３’および
５’−ＣＣＡＴＣＣＡＣＴＧＣＡＡＴＴＣＣＴＧ−３’；
ラットＨＰＲＴ１：５’−ＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＧＧＡＣＣＴＣＴＣＧ−３’および
５’−ＴＧＡＡＧＴＧＣＴＣＡＴＴＡＴＡＧＴＣＡＡＧＧＧＣＡ−３’。ｍＲＮＡレベルを、ＨＰＲＴ１  ｍＲＮＡレベルを用いて正規化した。
【０１４８】
Ｆｒａ−１調節遺伝子を検出するために用いたプライマー組を、以下に示す：
ヒトＡＢＨＤ１１：５’−ＴＴＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＧＣＣＡＡＧＡＴ−３’および
５’−ＣＡＣＣＧＴＧＧＴＴＡＣＧＡＧＣＡＴＣ−３’；
ヒトＡＤＯＲＡ２Ｂ：５’−ＴＣＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＴＣＡＧＧＴ−３’および
５’−ＧＡＴＧＣＣＡＡＡＧＧＣＡＡＧＧＡＣ−３’；
ヒトＢＩＲＣ５：  ５’−ＧＣＣＣＡＧＴＧＴＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴ−３’および
５’−ＣＣＧＧＡＣＧＡＡＴＧＣＴＴＴＴＴＡＴＧ−３’；
ヒトＣＥＮＰＭ：  ５’−ＡＡＣＡＣＧＧＣＣＡＣＣＡＴＣＴＴＧ−３’および
５’−ＧＧＧＡＣＴＴＴＧＣＣＡＡＧＴＧＧＡＣ−３’；
ヒトＣＨＡＦ１Ａ：５’−ＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＣＧＡＧＣＡＧＡ−３’および
５’−ＣＴＴＧＣＴＣＣＣＧＴＴＣＡＣＡＴＴＧ−３’；
ヒトＣＨＭＬ：  ５’−ＴＴＡＴＣＴＣＣＣＡＣＣＡＧＧＴＴＣＣＴＣ−３’および
５’−ＴＴＣＴＣＴＴＡＴＴＴＣＴＴＣＴＴＴＧＡＡＧＧＴＧＡＴ−３’；
ヒトＤ２１Ｓ２０５６Ｅ：５’−ＧＣＡＡＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＡＡＡＧＡ−３’および                ５’−ＧＧＧＴＧＣＡＧＧＡＴＣＴＣＡＧＴＣＡＴ−３’；
ヒトＥ２Ｆ１：  ５’−ＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＣＡＴＣＣＡＧＴＧ−３’および
５’−ＣＴＧＧＧＴＣＡＡＣＣＣＣＴＣＡＡＧ−３’；
ヒトＥＺＨ２：  ５’−ＴＧＧＴＣＴＣＣＣＣＴＡＣＡＧＣＡＧＡＡ−３’および
５’−ＴＣＡＴＣＴＣＣＣＡＴＡＴＡＡＧＧＡＡＴＧＴＴＡＴＧ−３’；
ヒトＦＥＮ１：  ５’−ＡＣＣＣＣＧＡＡＣＣＡＡＧＣＴＴＴＡＧ−３’および
５’−ＧＧＧＣＣＡＣＡＴＣＡＧＣＡＡＴＴＡＧＴ−３’；
ヒトＨ２ＡＦＺ：５’−ＣＡＣＣＧＴＧＧＧＴＣＣＧＡＴＴＡＧ−３’および
５’−ＧＴＣＣＴＴＴＣＣＡＧＣＣＴＴＡＣＣＧ−３’；
ヒトＩＧＦＢＰ３：５’−ＡＡＣＧＣＴＡＧＴＧＣＣＧＴＣＡＧＣ−３’および
５’−ＣＧＧＴＣＴＴＣＣＴＣＣＧＡＣＴＣＡＣ−３’；
ヒトＰＡＩＣＳ：  ５’−ＴＴＴＴＣＡＧＴＴＡＴＴＡＣＡＧＧＡＡＧＣＡＧＧＴ−３’および
５’−ＴＧＡＡＡＧＣＴＧＴＣＴＣＣＣＣＡＣＡＴ−３’；
ヒトＰＨＬＤＡ１：５’−ＴＣＴＧＣＡＣＡＡＡＡＡＣＴＧＧＴＧＡＧＡＣ−３’および
５’−ＡＣＴＧＣＴＣＡＧＣＣＴＧＣＣＡＴＣ−３’；
ヒトＰＰＰ２Ｒ３Ａ：５’−ＣＡＧＡＣＴＣＣＡＧＡＧＧＴＧＡＴＣＡＡＧＡ−３’および
５’−ＣＧＧＧＧＡＣＴＡＣＴＴＧＧＡＧＡＧＧＴ−３’；
ヒトＰＴＧＥＳ：  ５’−ＡＣＧＣＴＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣＡＡＧＡ−３’および
５’−ＴＣＴＴＣＣＧＣＡＧＣＣＴＣＡＣＴＴ−３’；
ヒトＰＴＰ４Ａ１：５’−ＧＧＣＣＡＣＡＡＴＣＴＴＣＡＡＴＧＡＧＴＡＡ−３’および
５’−ＴＧＣＴＧＴＧＣＣＴＧＧＣＡＧＴＡＡ−３’；
ヒトＳＥＣ１４Ｌ１：５’−ＡＧＧＧＧＣＴＧＡＧＴＧＧＴＧＡＴＧ−３’および
５’−ＧＴＡＧＴＣＧＧＣＡＴＣＴＡＧＴＴＴＧＴＣＧＴ−３’；
ヒトＳＦＮ：      ５’−ＣＡＧＡＧＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＧＴＣ−３’および
５’−ＧＣＴＣＴＧＧＧＧＡＣＡＣＡＣＡＧＧ−３’；
ヒトＳＨ３ＧＬ１：５’−ＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧ−３’および
５’−ＴＧＡＣＴＣＡＣＣＴＧＣＴＣＧＡＴＧＴＣ−３’；
ヒトＴＪＡＰ１：  ５’−ＡＧＡＧＣＴＧＣＣＧＡＣＡＡＡＣＡＧＡＣ−３’および
５’−ＡＧＴＣＡＴＴＣＴＧＧＧＡＧＧＴＧＡＣＧ−３’；
ヒトＴＲＦＰ：    ５’−ＧＧＡＡＣＣＣＴＧＣＧＴＴＴＣＴＡＣＴＧ−３’および
５’−ＡＣＡＧＧＣＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＣＡＣ−３’；
ヒトＹＴＨＤＦ１：５’−ＣＧＡＣＧＡＣＴＴＴＧＣＴＣＡＣＴＡＣＧ−３’および
５’−ＴＴＣＧＡＣＴＣＴＧＣＣＧＴＴＣＣＴＴ−３’；
ベータアクチン  ｍＲＮＡレベルを用いて、ｍＲＮＡレベルを正規化した。
ウエスタンブロット分析
【０１４９】
標準手法を用いて、ウエスタンブロッティングを実施した。二次抗体としてホースラディッシュペルオキシダーゼと接合されたマウスに対するヤギ抗体（１７０６５１６、ＢｉｏＲａｄ）およびウサギに対するヤギ抗体（ＡＬＩ０４０４、ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）を用い、そしてＥＣＬ（Ｄｕｒａ，  Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてブロットを展開させた。
ゲルシフト実験
【０１５０】
以前の記載どおりに（Ｄｅｓｍｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）、ゲルシフト実験を実施した。用いたＡＰ−１プローブのセンス鎖を以下に示す：５’−ＧＧＴＴＣＧＣＴＴＧＡＴＧＡＧＴＣＡＧＣＣＧＧＡＡ−３’。スーパーシフト実験に関しては、核抽出物を、２μｇの抗Ｆｒａ−１抗体とともに３０分間予備インキュベートした。
マイクロアレイ遺伝子発現プロファイリング
【０１５１】
各実験に関する方法の詳細な説明は、以下の：
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ−ａｓ／ａｅｒ／♯ａｅ−ｍａｉｎ［０］（寄託番号  Ｅ−ＮＣＭＦ−２０およびＥ−ＮＣＭＦ−２１）で入手可能である。要するに、総ＲＮＡを単離し、精製し、増幅した。その後、増幅（ａ）ＲＮＡを、Ｃｙ５またはＣｙ３で標識した。標識化ａＲＮＡを、オリゴアレイ（ラットまたはヒトに関するＡｇｉｌｅｎｔ４×全ゲノムアレイ）とハイブリダイズして、各実験試料に関してダイスワップを実施した。
分類子生成
【０１５２】
乳癌試料ならびに遠位無転移性損および乳癌特異的生存に関する対応する情報の両方の生遺伝子発現マイクロアレイデータを含有する６つの公的に利用可能なデータ組を収集した。交差プラットフォーム不一致を回避するために、試験をヒトゲノムＨＧＵ−１３３Ａアフィメトリクス（Ｃ）アレイに限定した。以下の識別子を用いて、ＮＣＢＩ遺伝子発現オムニバス（ＧＥＯ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／）から、データ組をダウンロードした：ＧＳＥ６５３２（Ｌｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）、ＧＳＥ３４９４  （Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）、ＧＳＥ１４５６（Ｐａｗｉｔａｎ  ｅｔ  ａｌ，  ２００５）、ＧＳＥ７３９０（Ｄｅｓｍｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ，  ２００７）およびＧＳＥ５３２７（Ｍｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ，  ２００５）。Ｃｈｉｎ等（Ｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ，  ２００６）のデータ組を、ＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓ  （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／、識別子  Ｅ−ＴＡＢＭ−１５８）からダウンロードした。
【０１５３】
異なるデータ組間の互換性を保証するために、それらをすべて、同一前処理手順に付した。Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ）から入手可能なＲ  ＡｆｆｙＰＬＭパッケージを用いて、マイクロアレイ品質管理査定を実行した。正規化拡大縮小なし標準誤差（ＮＵＳＥ）検定を適用した。チップ擬似画像を作成して、先行品質管理試験に合格できなかったアレイ上の人工物を査定した。データ組のアレイの約１〜５％は、品質管理試験に合格しなかった。ＲＭＡ発現測定アルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ）：ＲＭＡバックグラウンド補正回線、各データ組に関して別個にアレイを横断する各遺伝子の中央値センタリングならびに全アレイの変位値正規化を用いて、３段階手法に従って、選択アレイを正規化した。十分量の９４７の独自収集マイクロアレイ試料のうち、５０９が利用可能な遠位転移生存（ＤＭＦＳ）データを有した。これらの試料を訓練組として用いたが、この組を「アフィメトリクス訓練組」と呼ぶ。９４７の試料から、乳癌特異的生存（ＢＣＳＳ）が利用可能である３８８の試料からなる別個の確証組も選択した。この組を、「アフィメトリクス確証組」と呼ぶ。この組は、アフィメトリクス訓練組を有する試料に関して完全に非重複であり、したがって、完全に独立した確証組である。
【０１５４】
Ｆｒａ−１枯渇ＬＭ２細胞対空ベクター対照細胞のマイクロアレイ分析から、実験的Ｆｒａ−１用法指示を得た。ｓｈ−Ｆｒａ−１細胞集団において、ならびに２つの個々のマイクロアレイ分析において有意に調節されたプローブを選択した。これは、有意に調節された１１４０プローブの一組を生じた（ｐ＜１０−８）。そのプローブを、ＢｉｏＭａｒｔからのＭａｒｔｖｉｅｗによりアフィメトリクスＵ１３３Ａアレイ上の対応するプローブに変換した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｍａｒｔ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。このプローブ組は同一Ｅｎｔｒｅｚ  ＩＤに対する多数のプローブマッピングを含有したので、以下のようにして、各Ｅｎｔｒｅｚ  ＩＤに関する単一アフィメトリクス（Ｃ）ＨＧＵ−１３３Ａプローブを選択した。アフィメトリクスアルゴリズムプローブエクステンション、好ましくは’＿ａｔ’ｏｖｅｒ’＿ｘ＿ａｔ’ｏｖｅｒ’＿ｓ＿ａｔ’を基礎にして、プローブを選択した。残りの二重反復実験プローブの発現を平均した。この組の１２３４の独自プローブから、アフィメトリクス訓練組に関する有意のｐ値（ｐ＜０．０５、ログランク検定）を示すプローブを抽出した。これは、１８３プローブ、Ｆｒａ−１用法表示のサブセットを生じた。超幾何検定を用いて、このサイズの、そして結果と有意に関連するプローブの一組が１２３４プローブの無作為選択組から選択され得るか否かを決定した。次いで、アフィメトリクス訓練組を用いて、これら１８３プローブに関する最も近いセントロイド分類子を限定した。「不良予後」セントロイドは、６０ヶ月の追跡調査前の転移事象を有する試料から得られた。「良好予後」セントロイドは、転移事象なしおよび６０ヶ月より長い追跡調査を有する試料から得られた。
【０１５５】
Ｆｒａ−１分類子の確証のために、アフィメトリクス訓練組のほかに、オランダ癌研究所からの２９５例の乳癌試料のシリーズを用いた（ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｉｊｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。この組を「ＮＫＩ２９５」と呼ぶ。個々の確証組における各試料を、各試料の対応するプローブ組の遺伝子発現値と「不良予後」および「良好予後」セントロイドのセントロイド値との間の最高スピアマン順位相関スコアにより確定した場合の、最も近いセントロイドに割り当てた。ＮＫＩ２９５におけるＦｒａ−１分類子の確証のために、Ｒｏｓｅｔｔａ（Ｃ）レポーターＩＤを、対応するＥｎｔｒｅｚＩＤにマッピングした。多数のレポーターが同一ＥｎｔｒｅｚＩＤにマッピングした場合、最高変動を有するプローブを選択した。
【０１５６】
生存関数のカプラン・マイヤー推定値を用いて、生存分析を実施した。ログランク検定を用いて、生存曲線間の比較を実施した。多変量Ｃｏｘ比例ハザードモデルを用いて、ハザード比を概算した。これらの分析の終点は、アフィメトリクス訓練組に関してはＤＭＦＳ、アフィメトリクス確証組に関してはＮＫＩ２９５およびＢＣＳＳであった。
表１．ＮＫＩ２９５に関するＦｒａ−１分類子および臨床変数の多変量解析
【表１】
2013505232.tif 000002
ＬＮ：リンパ節状態
ＥＲ：エストロゲン受容体状態
表２：３２の遺伝子の印を付けた選択を伴う１６９の遺伝子
Ｆｒａ−１発現に関して無症候化されたＬＭ２およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から生成された両分類子に共通の遺伝子
【表２】
2013505232.tif 000003
2013505232.tif 000004
2013505232.tif 000005
2013505232.tif 000006
2013505232.tif 000007
2013505232.tif 000008
2013505232.tif 000009
2013505232.tif 000010
2013505232.tif 000011
2013505232.tif 000012
良好予後と比較した場合の不良予後患者におけるより高いセントロイド値を有する、そして扱い易い薬剤標的であり得る遺伝子を、太字で目立つようにしている。Ｆｒａ１（ＦＯＳＬ１）もこの一覧に含まれている。
表３：阻害剤が特許請求されている３２の遺伝子
【表３】
2013505232.tif 000013
2013505232.tif 000014
2013505232.tif 000015
表４：表３の遺伝子からの既知の阻害剤
【表４】
2013505232.tif 000016
2013505232.tif 000017
2013505232.tif 000018
＊ＬＯＰＡＣライブラリーを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬剤スクリーニングにおいて、それら２つのＡＤＯＲＡ２Ｂ阻害剤を、高レベルのＦｒａ−１を発現する乳癌細胞に関して選択的に細胞傷害性であると同定した。
表５：阻害剤が特許請求されている３２の遺伝子の群分け
【表５】
2013505232.tif 000019
表６：転移に不可欠な１２のＦｒａ−１調節遺伝子
ＬＭ２におけるｓｈＲＮＡ媒介性サイレンシングが肺転移形成を有意に抑制した１２の遺伝子
【表６】
2013505232.tif 000020
【０１５７】
参考文献
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Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏｒａｌ、Ｓｍａｌｌ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｍｉｔｏｇｅｎ−  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  タンパク質  Ｋｉｎａｓｅ  Ｋｉｎａｓｅ  １／２  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＡＺＤ６２４４  （ＡＲＲＹ−１４２８８６）  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃａｎｃｅｒｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２６、２１３９−２１４６．
Ａｎｄｅｒｓｅｎ、Ｈ．、Ｍｅｊｌｖａｎｇ、Ｊ．、Ｍａｈｍｏｏｄ、Ｓ．、Ｇｒｏｍｏｖａ、Ｉ．、Ｇｒｏｍｏｖ、Ｐ．、Ｌｕｋａｎｉｄｉｎ、Ｅ．、Ｋｒｉａｊｅｖｓｋａ、Ｍ．、Ｍｅｌｌｏｎ、Ｊ．  Ｋ、ａｎｄ  Ｔｕｌｃｈｉｎｓｋｙ、Ｅ．  （２００５）．  Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ａｎｄ  Ｄｅｌａｙｅｄ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｃｅｌｌｓ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２５、９１３８−９１５０．
Ａｎｓｉｅａｕ、Ｓ．、Ｂａｓｔｉｄ、Ｊ．、Ｄｏｒｅａｕ、Ａ．、Ｍｏｒｅｌ、Ａ．  −Ｐ．、Ｂｏｕｃｈｅｔ、Ｂ．  Ｐ．、Ｔｈｏｍａｓ、Ｃ、Ｆａｕｖｅｔ、Ｆ．、Ｐｕｉｓｉｅｕｘ、Ｉ．、Ｄｏｇｌｉｏｎｉ、Ｃ、Ｐｉｃｃｉｎｉｎ、Ｓ．、ｅｔ  ａｌ．  （２００８）．  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＥＭＴ  ｂｙ  Ｔｗｉｓｔ  タンパク質ｓ  ａｓ  ａ  Ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ−Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  
Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １４、７９−８９．
Ｂｅｌｇｕｉｓｅ、Ｋ、Ｋｅｒｓｕａｌ、Ｎ．、Ｇａｌｔｉｅｒ、Ｆ．、ａｎｄ  Ｃｈａｌｂｏｓ、Ｄ．  （２００５）．  ＦＲＡ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｅｖｅｌ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２４、１４３４−１４４４．
Ｂｅｒｎａｒｄｓ、Ｒ．、ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、Ｒ．  Ａ．  （２００２）．  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｇｅｎｅｓ：  Ａ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｕｚｚｌｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４１８、８２３−８２３．
Ｂｌａｒｎｅｙ、Ｒ．  Ｗ．、Ｅｌｌｉｓ、Ｉ．  Ｏ．、Ｐｉｎｄｅｒ、Ｓ．  Ｅ．、Ｌｅｅ、Ａ．  Ｈ．  Ｓ．、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ、Ｒ．  Ｄ．、Ｍｏｒｇａｎ、Ｄ．  Ａ．  Ｌ．、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｊ．  Ｆ．  Ｒ．、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ、Ｍ．  Ｊ．、Ｂａｌｌ、Ｇ．  Ｒ．、Ｈａｙｂｉｔｔｌｅ、Ｊ．  Ｌ．、ａｎｄ  Ｅｌｓｔｏｎ、Ｃ．  Ｗ．  （２００７）．  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ａｃｃｏｒｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ  Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｄｅｘ  ｉｎ  ｃａｓｅｓ  ｄｉａｇｎｏｓｅｄ  ｉｎ  １９９０−１９９９．  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ４３、１５４８−１５５５．  
Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ、Ｔ．  Ｒ．、Ｂｅｒｎａｒｄｓ、Ｒ．、ａｎｄ  Ａｇａｍｉ、Ｒ．  （２００２）．  Ｓｔａｂｌｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｂｙ  ｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２、２４３−２４７．
Ｃａｒｔｅｒ、Ｂ．  Ｄ．、Ｚｉｒｒｇｉｅｂｅｌ、Ｕ．、ａｎｄ  Ｂａｒｄｅ、Ｙ．−Ａ．  （１９９５）．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ２１ｒａｓ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｎｓ  ｂｙ  Ｎｅｒｖｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  Ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０、２１７５１−２１７５７．
Ｃａｖａｌｌａｒｏ、Ｕ．、ａｎｄ  Ｃｈｒｉｓｔｏｆｏｒｉ、Ｇ．  （２００４）．  Ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｂｙ  ｃａｄｈｅｒｉｎｓ  ａｎｄ  Ｉｇ−ＣＡＭｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ４、１１８−  １３２．
Ｃｈｉｎ、Ｋ．、ＤｅＶｒｉｅｓ、Ｓ．、Ｆｒｉｄｌｙａｎｄ、Ｊ．、Ｓｐｅｌｌｍａｎ、Ｐ．  Ｔ．、Ｒｏｙｄａｓｇｕｐｔａ、Ｒ．、Ｋｕｏ、Ｗ．−Ｌ．、Ｌａｐｕｋ、Ａ．、Ｎｅｖｅ、Ｒ．  Ｍ．、Ｑｉａｎ、Ｚ．、Ｒｙｄｅｒ、Ｔ．、ｅｔ  ａｌ．  （２００６）．  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｅｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １０、５２９−５４１．
Ｃｈｒｉｓｔｏｆｏｒｉ、Ｇ．  （２００６）．  Ｎｅｗ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｆｒｏｎｔ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４４１、４４４−４５０．
Ｄｅｓｍｅｄｔ、Ｃ、Ｐｉｅｔｔｅ、Ｆ．、Ｌｏｉ、Ｓ．、Ｗａｎｇ、Ｙ．、Ｌａｌｌｅｍａｎｄ、Ｆ．、Ｈａｉｂｅ−Ｋａｉｎｓ、Ｂ．、Ｖｉａｌｅ、Ｇ．、Ｄｅｌｏｒｅｎｚｉ、Ｍ．、Ｚｈａｎｇ、Ｙ．、ｄＡｓｓｉｇｎｉｅｓ、Ｍ．  Ｓ．、ｅｔ  ａｌ．  （２００７）．  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｔｉｍｅ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ７６−Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  Ｎｏｄｅ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＴＲＡＮＳＢＩＧ  Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｉｅｓ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １３、３２０７−３２１４．
Ｄｅｓｍｅｔ、Ｃ、Ｇｏｓｓｅｔ、Ｐ．、Ｐａｊａｋ、Ｂ．、Ｃａｔａｌｄｏ、Ｄ．、Ｂｅｎｔｉｒｅｓ−Ａｌｊ、Ｍ．、Ｌｅｋｅｕｘ、Ｐ．、ａｎｄ  Ｂｕｒｅａｕ、Ｆ．  （２００４）．  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ＮＦ−｛ｋａｐｐａ｝Ｂ  活性  ｉｎ  Ａｉｒｗａｙ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｐｈａｓｅ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｓｔｈｍａ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７３、５７６６−５７７５．
Ｄｏｕｍａ、Ｓ．、ｖａｎ  Ｌａａｒ、Ｔ．、Ｚｅｖｅｎｈｏｖｅｎ、Ｊ．、Ｍｅｕｗｉｓｓｅｎ、Ｒ．、ｖａｎ  Ｇａｒｄｅｒｅｎ、Ｅ．、ａｎｄ  Ｐｅｅｐｅｒ、Ｄ．  Ｓ．  （２００４）．  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｏｉｋｉｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＴｒｋＢ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４３０、１０３４−１０３９．
Ｄｕｎｋｌｅｒ、Ｄ．、Ｍｉｃｈｉｅｌｓ、Ｓ．、ａｎｄ  Ｓｃｈｅｍｐｅｒ、Ｍ．  （２００７）．  Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ：  Ｄｏｅｓ  ｉｔ  ａｄｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ａｃｃｕｒａｃｙ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ？  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ４３、７４５−７５１．
Ｅｆｅｒｌ、Ｒ．、ａｎｄ  Ｗａｇｎｅｒ、Ｅ．  Ｆ．  （２００３）．  ＡＰ−１  ：  ａ  ｄｏｕｂｌｅ−ｅｄｇｅｄ  ｓｗｏｒｄ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ３、８５９−８６８．
Ｅｉｆｅｌ、Ｐ．、Ａｘｅｌｓｏｎ、Ｊ．  Ａ．、Ｃｏｓｔａ、Ｊ．、Ｃｒｏｗｌｅｙ、Ｊ．、Ｃｕｒｒａｎ、Ｗ．  Ｊ．  Ｊ．、Ｄｅｓｈｌｅｒ、Ａ．、Ｆｕｌｔｏｎ、Ｓ．、Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓ、Ｃ．  Ｂ．、Ｋｅｍｅｎｙ、Ｍ．、Ｋｏｒｎｂｌｉｔｈ、Ａ．  Ｂ．、ｅｔ  ａｌ．  （２００１）．  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ：  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ、Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １−３、２０００．  Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ９３、９７９−９８９．
Ｆｉｄｌｅｒ、Ｉ．  Ｊ．  （２００３）．  Ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ：  ｔｈｅ  ‘ｓｅｅｄ  ａｎｄ  ｓｏｉｌ’  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ  ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ３、４５３−４５８．
Ｇｅｉｇｅｒ、Ｔ．  Ｒ．、ａｎｄ  Ｐｅｅｐｅｒ、Ｄ．  Ｓ．  （２００５）．  Ｔｈｅ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＴｒｋＢ  ｉｎ  Ａｎｏｉｋｉｓ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ：  Ａ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５、７０３３−７０３６．
Ｇｏｌｄｈｉｒｓｃｈ、Ａ．、Ｗｏｏｄ、Ｗ．  Ｃ、Ｇｅｌｂｅｒ、Ｒ．  Ｄ．、Ｃｏａｔｅｓ、Ａ．  Ｓ．、Ｔｈｕｒｌｉｍａｎｎ、Ｂ．、Ｓｅｎｎ、Ｈ．  Ｊ．、ａｎｄ  Ｐａｎｅｌ、Ｍ．  （２００７）．  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｉｓｅ：  ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｅｒｔ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ２００７．  Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  １８、１１３３−１１４４．
Ｇｕｐｔａ、Ｇ．  Ｐ．、ａｎｄ  Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｊ．  （２００６）．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ：  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ａ  Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ．  Ｃｅｌｌ  １２７、６７９−６９５．
Ｈｕ、Ｇ．、Ｃｈｏｎｇ、Ｒ．  Ａ．、Ｙａｎｇ、Ｑ．、Ｗｅｉ、Ｙ．、Ｂｌａｎｃｏ、Ｍ．  Ａ．、Ｌｉ、Ｆ．、Ｒｅｉｓｓ、Ｍ．、Ａｕ、Ｊ．  Ｌ．、Ｈａｆｆｔｙ、Ｂ．  Ｇ．  ａｎｄ  Ｋａｎｇ、Ｙ．  （２００９）．  ＭＴＤＨ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ８ｑ２２  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｇａｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｏｒ−ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １５、９−２０．
Ｈｕｇｏ、Ｈ．、Ａｃｋｌａｎｄ、Ｍ．  Ｌ．、Ｂｌｉｃｋ、Ｔ．、Ｌａｗｒｅｎｃｅ、Ｍ．  Ｇ．、Ｃｌｅｍｅｎｔｓ、Ｊ．  Ａ．、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｅ．  Ｄ．、ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｅ．  Ｗ．  （２００７）．  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ａｎｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２１３、３７４−３８３．
Ｉｖａｎｏｖａ、Ｎ．、Ｄｏｂｒｉｎ、Ｒ．、Ｌｕ、Ｒ．、Ｋｏｔｅｎｋｏ、Ｉ．、Ｌｅｖｏｒｓｅ、Ｊ．、ＤｅＣｏｓｔｅ、Ｃ、Ｓｃｈａｆｅｒ、Ｘ．、Ｌｕｎ、Ｙ．、ａｎｄ  Ｌｅｍｉｓｃｈｋａ、Ｉ．  Ｒ．  （２００６）．  Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ｉｎ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４４２、５３３−５３８．
Ｌｉｏｔｔａ、Ｌ．  Ａ．、ａｎｄ  Ｋｏｈｎ、Ｅ．  （２００４）．  Ａｎｏｉｋｉｓ：  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｈｏｍｅｌｅｓｓ  ｃｅｌｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４３０、９７３−９７４．
Ｌｏｉ、Ｓ．、Ｈａｉｂｅ−Ｋａｉｎｓ、Ｂ．、Ｄｅｓｍｅｄｔ、Ｃ、Ｌａｌｌｅｍａｎｄ、Ｆ．、Ｔｕｔｔ、Ａ．  Ｍ．、Ｇｉｌｌｅｔ、Ｃ、Ｅｌｌｉｓ、Ｐ．、Ｈａｒｒｉｓ、Ａ．、Ｂｅｒｇｈ、Ｊ．、Ｆｏｅｋｅｎｓ、Ｊ．  Ａ．、ｅｔ  ａｌ．  （２００７）．  Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｇｒａｄｅ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２５、１２３９−１２４６．
Ｌｕｓａ、Ｌ．、Ｍｉｃｅｌｉ、Ｒ．、ａｎｄ  Ｍａｒｉａｎｉ、Ｌ．  （２００７）．  Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ａｃｃｕｒａｃｙ  ｉｎ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｒ  ａｎｄ  Ｓ−ＰＬＵＳ．  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｉｎ  
Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８７、１３２−１３７．
Ｍａｎｉ、Ｓ．  Ａ．、Ｇｕｏ、Ｗ．、Ｌｉａｏ、Ｍ．−Ｊ．、Ｅａｔｏｎ、Ｅ．  Ｎ．、Ａｙｙａｎａｎ、Ａ．、Ｚｈｏｕ、Ａ．  Ｙ．、Ｂｒｏｏｋｓ、Ｍ．、Ｒｅｉｎｈａｒｄ、Ｆ．、Ｚｈａｎｇ、Ｃ．  Ｃ、Ｓｈｉｐｉｔｓｉｎ、Ｍ．、ｅｔ  ａｌ．  （２００８）．  Ｔｈｅ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．  Ｃｅｌｌ  １３３、７０４−７１５．
Ｍｉｌｄｅ−Ｌａｎｇｏｓｃｈ、Ｋ．  （２００５）．  Ｔｈｅ  Ｆｏｓ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｕｍｏｕｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ４１、２４４９−２４６１．
Ｍｉｌｌｅｒ、Ｌ．  Ｄ．、Ｓｍｅｄｓ、Ｊ．、Ｇｅｏｒｇｅ、Ｊ．、Ｖｅｇａ、Ｖ．  Ｂ．、Ｖｅｒｇａｒａ、Ｌ．、Ｐｌｏｎｅｒ、Ａ．、Ｐａｗｉｔａｎ、Ｙ．、Ｈａｌｌ、Ｐ．、Ｋｌａａｒ、Ｓ．、Ｌｉｕ、Ｅ．  Ｔ．、ａｎｄ  Ｂｅｒｇｈ、Ｊ．  （２００５）．  Ａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｐ５３  ｓｔａｔｕｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｕｓ、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ、ａｎｄ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．  ＰＮＡＳ  １０２、１３５５０−１３５５５．
Ｍｉｎｎ、Ａ．  Ｊ．、Ｇｕｐｔａ、Ｇ．  Ｐ．、Ｓｉｅｇｅｌ、Ｐ．  Ｍ．、Ｂｏｓ、Ｐ．  Ｄ．、Ｓｈｕ、Ｗ．、Ｇｉｎ、Ｄ．  Ｄ．、Ｖｉａｌｅ、Ａ．、Ｏｌｓｈｅｎ、Ａ．  Ｂ．、Ｇｅｒａｌｄ、Ｗ．  Ｌ．、ａｎｄ  Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｊ．  （２００５）．  Ｇｅｎｅｓ  ｔｈａｔ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｔｏ  ｌｕｎｇ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４３６、５１８−５２４．
Ｏｚａｎｎｅ、Ｂ．  Ｗ．、Ｓｐｅｎｃｅ、Ｈ．  Ｊ．、ＭｃＧａｒｒｙ、Ｌ．  Ｃ、ａｎｄ  Ｈｅｎｎｉｇａｎ、Ｒ．  Ｆ．  （２００６）．  
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ：  ＡＰ−１  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ａｍｏｎｇ  ｅｑｕａｌｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２６、１−  １０．
Ｐａｗｉｔａｎ、Ｙ．、Ｂｊｏｈｌｅ、Ｊ．、Ａｍｌｅｒ、Ｌ．、Ｂｏｒｇ、Ａ．−Ｌ．、Ｅｇｙｈａｚｉ、Ｓ．、Ｈａｌｌ、Ｐ．、Ｈａｎ、Ｘ．、Ｈｏｌｍｂｅｒｇ、Ｌ．、Ｈｕａｎｇ、Ｆ．、Ｋｌａａｒ、Ｓ．、ｅｔ  ａｌ．  （２００５）．  Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｓｐａｒｅｓ  ｅａｒｌｙ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ：  ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｎｄ  ｖａｌｉｄａｔｅｄ  ｉｎ  ｔｗｏ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｈｏｒｔｓ．  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７、Ｒ９５３  −  Ｒ９６４．
Ｒａｍａｓｗａｍｙ、Ｓ．、Ｒｏｓｓ、Ｋ．  Ｎ．、Ｌａｎｄｅｒ、Ｅ．  Ｓ．、ａｎｄ  Ｇｏｌｕｂ、Ｔ．  Ｒ．  （２００３）．  Ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３３、４９−５４．
Ｒａｍｏｓ−Ｎｉｎｏ、Ｍ．  Ｅ．、Ｔｉｍｂｌｉｎ、Ｃ．  Ｒ．、ａｎｄ  Ｍｏｓｓｍａｎ、Ｂ．  Ｔ．  （２００２）．  Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｑｕｉｒｅｓ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ＡＰ−１  Ｂｉｎｄｉｎｇ  活性  ａｎｄ  ＥＲＫ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｆｒａ−１  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２、６０６５−６０６９．
Ｒａｖｄｉｎ、Ｐ．  Ｍ．、Ｓｉｍｉｎｏｆｆ、Ｌ．  Ａ．、Ｄａｖｉｓ、Ｇ．  Ｊ．、Ｍｅｒｃｅｒ、Ｍ．  Ｂ．、Ｈｅｗｌｅｔｔ、Ｊ．、Ｇｅｒｓｏｎ、Ｎ．、ａｎｄ  Ｐａｒｋｅｒ、Ｈ．  Ｌ．  （２００１）．  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｔｏ  Ａｓｓｉｓｔ  ｉｎ  Ｍａｋｉｎｇ  Ｄｅｃｉｓｉｏｎｓ  Ａｂｏｕｔ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｗｏｍｅｎ  Ｗｉｔｈ  Ｅａｒｌｙ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １９、９８０−９９１．
Ｓｃｈｅｍｐｅｒ、Ｍ．、ａｎｄ  Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ、Ｒ．  （２０００）．  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ａｃｃｕｒａｃｙ  ａｎｄ  ｅｘｐｌａｉｎｅｄ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｏｘ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ  ５６、２４９−２５５．
Ｔｈｉｅｒｙ、Ｊ．  Ｐ．、ａｎｄ  Ｓｌｅｅｍａｎ、Ｊ．  Ｐ．  （２００６）．  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７、１３１−１４２．
Ｖａｌｌｏｎｅ、Ｄ．、Ｂａｔｔｉｓｔａ、Ｓ．、Ｐｉｅｒａｎｔｏｎｉ、Ｇ．  Ｍ．、Ｆｅｄｅｌｅ、Ｍ．、Ｃａｓａｌｉｎｏ、Ｌ．、Ｓａｎｔｏｒｏ、Ｍ．，
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ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｉｊｖｅｒ、Ｍ．  Ｊ．、Ｈｅ、Ｙ．  Ｄ．、ｖａｎ  ‘ｔ  Ｖｅｅｒ、Ｌ．  Ｊ．、Ｄａｉ、Ｈ．、Ｈａｒｔ、Ａ．  Ａ．  Ｍ．、Ｖｏｓｋｕｉｌ、Ｄ．  
Ｗ．、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ、Ｇ．  Ｊ．、Ｐｅｔｅｒｓｅ、Ｊ．  Ｌ．、Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｃ、Ｍａｒｔｏｎ、Ｍ．  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）．  Ａ  Ｇｅｎｅ−Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ａｓ  ａ  Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ  ｏｆ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４７、１９９９−２００９．
Ｖｉａｌ、Ｅ．、Ｓａｈａｉ、Ｅ．、ａｎｄ  Ｍａｒｓｈａｌｌ、Ｃ．  Ｊ．  （２００３）．  ＥＲＫ−ＭＡＰＫ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  活性  ｏｆ  Ｒａｃｌ  ａｎｄ  ＲｈｏＡ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ４、６７−７９．
Ｙａｎｇ、Ｊ．、Ｍａｎｉ、Ｓ．  Ａ．、Ｄｏｎａｈｅｒ、Ｊ．  Ｌ．、Ｒａｍａｓｗａｍｙ、Ｓ．、Ｉｔｚｙｋｓｏｎ、Ｒ．  Ａ．、Ｃｏｍｅ、Ｃ、Ｓａｖａｇｎｅｒ、Ｐ．、Ｇｉｔｅｌｍａｎ、Ｉ．、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、Ａ．、ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、Ｒ．  Ａ．  （２００４）．  Ｔｗｉｓｔ、ａ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ、Ｐｌａｙｓ  ａｎ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．  Ｃｅｌｌ  １１７、９２７−９３９．
Ｙａｎｇ、Ｊ．、ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、Ｒ．  Ａ．  （２００８）．  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ：  Ａｔ  ｔｈｅ  Ｃｒｏｓｓｒｏａｄｓ  ｏｆ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｔｕｍｏｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  １４、８１８−８２９．
Ｚａｊｃｈｏｗｓｋｉ、Ｄ．  Ａ．、Ｂａｒｔｈｏｌｄｉ、Ｍ．  Ｆ．、Ｇｏｎｇ、Ｙ．、Ｗｅｂｓｔｅｒ、Ｌ．、Ｌｉｕ、Ｈ．−Ｌ．、Ｍｕｎｉｓｈｋｉｎ、Ａ．、Ｂｅａｕｈｅｉｍ、Ｃ、Ｈａｒｖｅｙ、Ｓ．、Ｅｔｈｉｅｒ、Ｓ．  Ｐ．、ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｐ．  Ｈ．  （２００１）．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｅｓ  Ｔｈａｔ  Ｐｒｅｄｉｃｔ  ｔｈｅ  Ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６７、５１６８−５１７８．  
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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