(57)【要約】  本出願は、ＰＥＴまたはＭＲＩ画像化に用いる６８Ｇａ、１８Ｆまたは１９Ｆ標識化分子の合成および使用のための組成物および方法を開示する。好ましくは１８Ｆまたは１９Ｆは、第ＩＩＩＡ族金属との錯体の形成および錯体とキレート部分との結合によって標的化分子と共役体されており、該標的化分子に直接的に付着していても間接的に付着していてもよい。他の実施形態では、６８Ｇａ、１８Ｆまたは１９Ｆ標識化部分は、疾患関連抗原を標的とするために二重特異性抗体と組み合わせて用いられる標的化可能な構築物を含んでいてよい。より好ましい実施形態において、キレート部分または標的化可能な構築物は、抗体または抗体フラグメントなどの標的化分子に共役体されていてよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子を１８Ｆまたは１９Ｆによって標識化する方法であって、１８Ｆまたは１９Ｆおよび第ＩＩＩＡ族金属の錯体をキレート部分に付着させることを含み、キレート部分は、分子に共役体されており、キレート部分は、後に分子に付着される、方法。
【請求項２】
キレート部分が、分子に共役体されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
キレート部分が、後に分子に付着されており、キレート部分を分子に付着させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
分子が、タンパク質またはペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
分子が、抗体、モノクローナル抗体、二重特異的抗体、多重特異的抗体、抗体融合タンパク質および抗原結合抗体フラグメントからなる群から選択される標的化分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
キレート部分が、標的化可能な構築物に共役体されている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ｃ）標的化分子を対象に投与することと；ｄ）標的抗原に結合するのに十分な時間を標的化分子に付与することと；ｅ）続いて、標的化分子に結合する標的化可能な構築物を対象に投与することとを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
第ＩＩＩＡ族金属が、アルミニウム、ガリウム、インジウム、ルテニウム、およびタリウムからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
第ＩＩＩＡ族金属が、アルミニウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
キレート部分が、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ、ＮＯＴＡ、ＮＯＤＡ、ＮＯＤＡ誘導体、（ｔｅｒｔ−ブチル）２ＮＯＤＡ、ＮＯＤＡ−ＭＰＡＡ、ＮＥＴＡ、Ｃ−ＮＥＴＡ、Ｚ−ＮＥＴＡ、Ｓ−ＮＥＴＡおよびＮＯＴＡ誘導体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
標的化可能な構築物が、ＩＭＰ４４８、ＩＭＰ４４９、ＩＭＰ４６０、ＩＭＰ４６１、ＩＭＰ４６２、ＩＭＰ４６５、ＩＭＰ４６６、ＩＭＰ４６７、ＩＭＰ４６８、ＩＭＰ４６９、ＩＭＰ４７０、ＩＭＰ４７１、ＩＭＰ４７３、ＩＭＰ４７９、ＩＭＰ４８５、ＩＭＰ４８６およびＩＭＰ４８７からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
１８Ｆまたは１９Ｆ標識化分子が、方法の開始から３０分未満で精製される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＰＥＴ走査を用いて対象における１８Ｆ標識化分子の分布を画像化することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
１８Ｆまたは１９Ｆ錯体が、水性媒体においてキレート部分に付着される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
有機溶媒が媒体に添加されて、１８Ｆまたは１９Ｆ錯体をキレート部分に付着させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
１８Ｆまたは１９Ｆ錯体が、マイクロ波照射によってキレート部分に付着される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
１８Ｆまたは１９Ｆ錯体が、加熱によってキレート部分に付着される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
標的化分子が、ドック・ロック技術によって調製される、請求項５に記載の方法。
【請求項１９】
標的化分子が、ＴＦ２またはＴＦ１０である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
キレート部分が、クリックケミストリー反応によって分子に付着される、請求項３に記載の方法。
【請求項２１】
キレート部分が、マレイミド−スルフヒドリル反応によって分子に付着される、請求項３に記載の方法。
【請求項２２】
放射性標識化された標的化可能な構築物の収率が、少なくとも８５％である、請求項６に記載の方法。
【請求項２３】
標的化可能な構築物の比放射活性度が、少なくとも１１５ＧＢｑ／μｍｏｌである、請求項６に記載の方法。
【請求項２４】
標的化可能な構築物が、放射性標識化の前に貯蔵のために凍結乾燥される、請求項６に記載の方法。
【請求項２５】
標的化可能な構築物が、ソルビトール、マンニトールおよびトレハロースからなる群から選択される充填剤において凍結乾燥される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
キレート部分が、３．８から４．５の間のｐＨで１８Ｆまたはｌ９Ｆ錯体に付着される、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
標的化分子が、罹患細胞または病原体に結合しており、１８Ｆ標識化分子のＰＥＴ画像化または１９Ｆ標識化分子のＮＭＲ画像化によって疾患または病原体の存在を検出、診断または画像化することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項２８】
疾患が、癌、心臓血管疾患、感染性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、免疫機能不全疾患、移植片対宿主疾患、移植臓器拒絶および神経疾患からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
標的化分子が、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、ＣＳＡｐ、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＩＧＦ−１Ｒ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ−ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１２、ＨＩＦ−ｌａ、ＡＦＰ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ−６、ｃ−ｍｅｔ、Ｂ７、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂ、ＦａｃｔｏｒＨ、ＦＨＬ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、ＧＲＯＢ、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＨＭ１．２４、インスリン様成長因子−１（ＩＬＧＦ−１）、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−ａ、ＩＦＮ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２５、ＩＰ−１０、ＭＡＧＥ、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＮＣＡ−９５、ＮＣＡ−９０、ｌａ、ＨＭ１．２４、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、Ｌｅ（ｙ）、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＴＡＣ、Ｔｎ抗原、トムゾン‐フリーデンライヒ抗原、腫瘍壊死抗原、ＴＮＦ−ａ、ＴＲＡＩＬ受容体（Ｒ１およびＲ２）、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、Ｐ１ＧＦ、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、および癌遺伝子産物からなる群から選択される抗原に結合する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
感染性疾患が、菌類、ウイルス、寄生生物、細菌、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、ヒト血清パルボ様ウイルス、サルウイルス４０、呼吸器合胞体ウイルス、マウス乳腺腫瘍ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、デング熱ウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ネズミ白血病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、疣贅ウイルス、疣贅ウイルス、Ｂ群連鎖球菌、レジオネラ・ニューモフィラ、化膿連鎖球菌、大腸菌、淋菌、髄膜炎菌、肺炎球菌、Ｂ型インフルエンザ菌、梅毒トレポネーマ、ライム病スピロヘータ、緑膿菌、ライ菌、ウシ流産菌、結核菌および破傷風菌からなる群から選択される病原菌に関連する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
自己免疫疾患が、免疫介在性血小板減少症、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、レンサ球菌感染後の腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多型性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓性血管炎、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺機能亢進症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ヴェーゲナー肉芽腫、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎および線維化性肺胞炎からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
標的化分子が、ｈＲ１（抗ＩＧＦ−１Ｒ）、ｈＰＡＭ４（抗膵癌ムチン）、ｈＡ２０（抗ＣＤ２０）、ｈＡ１９（抗ＣＤ１９）、ｈＩＭＭＵ３１（抗ＡＦＰ）、ｈＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ｈＬＬ２（抗ＣＤ２２）、ｈＭｕ−９（抗ＣＳＡｐ）、ｈＬ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ）、ｈＭＮ−１４（抗ＣＥＡＣＡＭ５）、ｈＭＮ−１５（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、ｈＲＳ７（抗ＥＧＰ−１）およびｈＭＮ−３（抗ＣＥＡＣＡＭ６）からなる群から選択される抗体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
金属−１８Ｆ、金属−１９Ｆまたは６８Ｇａに付着されたキレート部分を含む、標的化可能な構築物。
【請求項３４】
ＩＭＰ４４８、ＩＭＰ４４９、ＩＭＰ４６０、ＩＭＰ４６１、ＩＭＰ４６２、ＩＭＰ４６５、ＩＭＰ４６６、ＩＭＰ４６７、ＩＭＰ４６８、ＩＭＰ４６９、ＩＭＰ４７０、ＩＭＰ４７１、ＩＭＰ４７３、ＩＭＰ４７９、ＩＭＰ４８５、ＩＭＰ４８６およびＩＭＰ４８７からなる群から選択される、請求項３３に記載の標的化可能な構築物。
【請求項３５】
キレート部分が、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ、ＮＯＴＡ、ＮＯＤＡ、ＮＯＤＡ誘導体、（ｔｅｒｔ−ブチル）２ＮＯＤＡ、ＮＯＤＡ−ＭＰＡＡ、ＮＥＴＡ、Ｃ−ＮＥＴＡ、Ｌ−ＮＥＴＡ、Ｓ−ＮＥＴＡおよびＮＯＴＡ誘導体からなる群から選択される、請求項３３に記載の標的化可能な構築物。
【請求項３６】
キレート部分が、ＮＯＴＡまたはＮＯＤＡのアルキルまたはアリール誘導体である、請求項３２に記載の標的化可能な構築物。
【請求項３７】
ＮＯＤＡ−ＭＰＡＡを含む組成物。
【請求項３８】
ＮＯＤＡ−ＭＰＡＡが、分子に共役体されている、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
ＮＯＤＡ−ＭＰＡＡが、金属−１８Ｆと錯体化されている、請求項３７に記載の組成物。
【請求項４０】
ＮＯＤＡ−ＭＰＡＡが、Ａ１−１８Ｆと錯体化されている、請求項３７に記載の組成物。
【請求項４１】
ＮＯＤＡ−ＭＰＡＡが、６８Ｇａと錯体化されている、請求項３７に記載の組成物。
【請求項４２】
分子を１８Ｆまたは１９Ｆによって標識化する方法であって：
ａ）水性媒体において第ＩＩＩＡ族金属をキレート部分に付着させて、金属−キレート部分錯体を形成すること、ここで、キレート部分は、分子に共役体されているか、または後に分子に付着されることと；
ｂ）金属に結合している１８Ｆまたはｌ９Ｆを金属−キレート部分錯体に添加することと
を含む方法。
【請求項４３】
キレート部分がNODA-MPAAである、請求項４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００９年１２月４日に提出された米国仮特許出願第６１／２６６，７７３号；２０１０年２月８日に提出された同第６１／３０２，２８０号；２０１０年３月２２日に提出された同第６１／３１６，１２５号；２０１０年５月２４日に提出された同第６１／３４７，４８６号；２０１０年９月１０日に提出された同第６１／３８１，７２０号および２０１０年９月３０日に提出された同第６１／３８８，２６８号に対する優先権を主張し、各々の優先権出願は、全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された、全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０１０年１２月２日に作成された該ＡＳＣＩＩの複写は、ＩＭＭ３１Ｗ０７．ｔｘｔの名称を有し、サイズが１６，８８９バイトである。
【０００３】
分野
本発明は、例えば、ＰＥＴまたはＮＭＲインビボ画像化において使用するペプチドまたは他の分子を１８Ｆまたは１９Ｆによって標識化する方法に関する。好ましくは、１８Ｆまたは１９Ｆは、キレート部分を介してアルミニウムまたは別の金属に共役体［錯体］として付着され、タンパク質、ペプチドまたは他の分子と共有結合的に連結されてよい。本明細書に記載されている技術を用いることで、高い比活性度の１８Ｆまたは１９Ｆ標識化分子は、３０分以下で調製され得、標識化分子のＨＰＬＣ精製を必要とすることなく画像化技術における使用に好適である。標識化は、インビボでの直接使用に好適な生理食塩水媒体において起こり得る。代替の実施形態において、有機溶媒が添加されて、標識化の効率を改善することができる。標識化分子はインビボ条件下で安定であるが、キット製剤などのある一定の目的のために、アスコルビン酸、トレハロース、ソルビトールまたはマンニトールなどの安定化剤が添加されていてよい。他の代替の実施形態において、キレート部分は、１８Ｆまたは１９Ｆによる標識化の前に、アルミニウムと共に予め投入されていてよく、貯蔵のために凍結乾燥されていてよい。
【背景技術】
【０００４】
陽電子放出型断層撮影法（ＰＥＴ）は、適切に定量化することができる非常に高い感度（ｆｍｏｌ）、高い解像度（４〜１０ｍｍ）および組織増加を有して、診断医学において最も卓越した機能イメージングモダリティの１つとなっている（Ｖｏｌｋｏｗら、１９８８、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ  ３：１４２）。［１８Ｆ］２−デオキシ−２−フルオロ−Ｄ−グルコース（［１８Ｆ］ＦＤＧ）は、腫瘍学において最も広く用いられている機能イメージング剤である（Ｆｌｅｔｃｈｅｒら、２００８、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４９：４８０）が、特に、現在使用されているハイブリッドＰＥＴ／コンピュータ断層診断システムによって、解剖学的イメージング方法を補完および補強する機能イメージングのための他の標識化された化合物を開発することに強い関心がある（Ｔｏｒｉｇｉａｎら、２００７、ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．５７：２０６）。したがって、生物学的および医学的に関心のある種々の分子に陽電子放出核種を共役体する簡易な方法が必要とされている。
【０００５】
ペプチドまたは他の低分子は、陽電子放射体１８Ｆ、６４Ｃｕ、１１Ｃ、６６Ｇａ、６８Ｇａ、７６Ｂｒ、９４ｍＴｃ、８６Ｙ、および１２４Ｉによって標識化され得る。陽電子がＰＥＴカメラによって画像化される２つの５１１ｋｅＶのガンマ線を発生させる前に標的部位から移動する距離を最小にするには、ＰＥＴ同位体の放出エネルギーが低いことが望ましい。陽電子を放出する多くの同位体は、減衰系列においてガンマ線、α粒子またはβ粒子などの他の放出物も有する。あらゆる線量測定の問題を最小にするように、純粋な陽電子放射体であるＰＥＴ同位体を有することが望ましい。同位体の半減期も重要である、なぜなら、半減期は、同位体を標的化分子に付着させ、生成物を分析し、これを患者に注入して局在化させ、非標的組織を排除し、次いで画像化するのに十分に長くなければならないからである。半減期は、長すぎると、比活性度が、明確な画像に十分な光子を得るのに十分に高くない場合があり、短すぎると、製造、流通および生体内分布に必要とされる時間が十分でない場合がある。１８Ｆ（β＋６３５ｋｅＶ  ９７％、ｔ１／２  １１０分）は、その低い陽電子放出エネルギー、サイドエミッションの欠如、および適切な半減期のために、最も広く使用されているＰＥＴ放出同位体の１つである。
【０００６】
慣用的には、１８Ｆは、炭素原子と結合することにより化合物と結合される（Ｍｉｌｌｅｒら、２００８，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ４７：８９９８−９０３３）が、しかし、ケイ素（Ｓｈｉｒｒｍａｃｈｅｒら、２００７，Ｂｉｏｃｏｎｊ  Ｃｈｅｍ  １８：２０８５−８９；Ｈｏｈｎｅら、２００８，Ｂｉｏｃｏｎｊ  Ｃｈｅｍ  １９：１８７１−７９）およびホウ素（Ｔｉｎｇら、２００８，Ｆｌｕｏｒｉｎｅ  Ｃｈｅｍ  １２９：３４９−５８）との結合も報告されている。炭素との結合は、通常は、多段階合成、例えば１１０分の半減期を有する同位体に関して問題となる多精製工程を包含する。ペプチドの１８Ｆ標識化のための一般的方法は、典型的には、低い比活性度での試薬の標識化、試薬のＨＰＬＣ精製、およびその後の該ペプチドへの共役を典型的には包含する。共役体は、標識化ペプチドの所望の比活性度を得るための共役後に、しばしば、再精製される。
【０００７】
一例は、４−［１８Ｆ］フルオロベンズアルデヒドがまず合成されて精製され（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１９９０；ＸＸＶＩＩＩ：１１８９−１１９９）、次いでペプチドに共役体される、Ｐｏｅｔｈｋｏら（Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２００４；４５：８９２−９０２）の標識化方法である。ペプチド共役体は、次いで、共役を完了させるために用いられた過剰量のペプチドを除去するためにＨＰＬＣにより精製される。他の例として、スクシニル［１８Ｆ］フルオロベンゾエート（ＳＦＢ）（例えば、Ｖａｉｄｙａｎａｔｈａｎら、１９９２，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄ．Ａｐｐｌ．Ｉｎｓｔｒｕｍ．Ｂ  １９：２７５）、他のアシル化合物（Ｔａｄａら、１９８９，Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｏｍｐｄ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．ＸＸＶＩＩ：１３１７；Ｗｅｓｔｅｒら、１９９６，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２３：３６５；Ｇｕｈｌｋｅら、１９９４，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ  ２１：８１９）、またはクリックケミストリー付加物（Ｌｉら、２００７，Ｂｉｏ共役体  Ｃｈｅｍ．１８：１９８７）による標識化が挙げられる。これらの方法のための全体の合成および製剤化時間は、１〜３時間の範囲であり、その大半は、インビボ標的化のために必要とされる比活性度を得るための標識化ペプチドのＨＰＬＣ精製にあてられる時間である。２時間の半減期を有する場合、１８Ｆをペプチドに付着させるのに要求される操作の全てが有意の負担である。これらの方法はまた、標識化産物を産生するよう具体的に設計された設備の使用および／または専門熟練化学者の尽力を実施および必要とするためには冗長でもある。それらはまた、臨床的設定で常套的に用いられ得るキット製剤に貢献しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特殊な設備または高度熟練職員に関する要件を最小限にしつつ、高レベルの放射線へのオペレータの曝露を低減しながら、検出および／または画像化に好適な比活性度およびインビボ安定性を有する標的化構築物を生じる、タンパク質またはペプチドなどの標的化部位の１８Ｆ標識化の迅速で簡単な方法に対する必要性が存在する。より好ましくは、前標的化技法での使用のための１８Ｆ標識化標的化ペプチドを調製する方法に対する必要性が存在する。かかる新規の方法を実施するために必要とされる組成物を提供し得るプレパッケージ型キットに対するさらなる必要性も存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
種々の実施形態において、本発明は、ＰＥＴまたはＮＭＲ画像化に使用される１８Ｆまたは１９Ｆ標識化分子に関する組成物および方法に関する。本明細書において議論されているように、本出願が１８Ｆに言及する場合、当業者は、１８Ｆ、１９Ｆまたは別の金属結合放射性核種、例えばＧａのいずれかが利用されてよいことを認識するであろう。例示的なアプローチにおいて、１８Ｆは、金属に結合し、１８Ｆ−金属錯体は、ペプチドまたは他の分子上の配位子に付着される。以下に記載されているように、第ＩＩＩＡ族の金属（アルミニウム、ガリウム、インジウム、およびタリウム）が、１８Ｆの結合に好適であるが、アルミニウムが好ましい。ルテニウムを使用してもよい。金属結合配位子は、好ましくはキレート剤、例えば、ＮＯＴＡ、ＮＥＴＡ、ＤＯＴＡ、ＤＴＰＡおよび以下により詳細に議論されている他のキレート基である。代替的には、配位子は、金属を分子にまず付着させ、次いで、１８Ｆを添加して金属に結合させることができる。
【００１０】
当業者は、実質的にあらゆる送達分子が、送達分子と細胞または組織標的受容体との間の配位子−受容体結合相互作用に影響することなく修飾され得る誘導体化可能な基を含有している限り、画像化目的で１８Ｆに付着され得ることを認識するであろう。以下の実施例は、１８Ｆ標識化ペプチド部分に主に関係するが、他の多くの種類の送達分子、例えばオリゴヌクレオチド、ホルモン、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、血管新生因子、抗血管新生因子、免疫賦活剤、タンパク質、核酸、抗体、抗体フラグメント、薬物、インターロイキン、インターフェロン、オリゴ糖、多糖、脂質などが１８Ｆ標識化され、画像化目的に利用され得る。
【００１１】
１８Ｆまたは他の剤の前標的化送達に使用される、以下の実施例に記載されている例示的な標的化可能な構築物ペプチドとして、限定されないが、ＩＭＰ４４９、ＩＭＰ４６０、ＩＭＰ４６１、ＩＭＰ４６７、ＩＭＰ４６９、ＩＭＰ４７０、ＩＭＰ４７１、ＩＭＰ４７９、ＩＭＰ４８５およびＩＭＰ４８７が挙げられ、限定されないが、ＤＴＰＡ、ＮＯＴＡ、ベンジル−ＮＯＴＡ、アルキル、または、ＮＯＴＡ、ＮＯＤＡ−ＧＡ、Ｃ−ＮＥＴＡ、スクシニル−Ｃ−ＮＥＴＡおよびビス−ｔ−ブチル−ＮＯＤＡのアリール誘導体を含めたキレート部分を含む。
【００１２】
ある一定の実施形態において、例示的なＦ標識化ペプチドは、二重特異的もしくは多重特異的抗体または抗体フラグメントを利用して、前標的化方法における標的化可能な構築物として用いられてよい。この場合、抗体またはフラグメントは、疾患または症状に関連する標的、例えば腫瘍関連もしくは自己免疫疾患関連抗原、またはウイルス、細菌、真菌もしくは他の微生物などの病原性生物によって産生もしくは表示される抗原のための１個以上の結合部位を含む。第２の結合部位は、具体的には、標的化可能な構築物と結合する。二重特異的または多重特異的抗体を用いた前標的化方法は、当該分野で周知である（例えば、米国特許第６，９６２，７０２号を参照されたい（これの実施例節は参照により本明細書に組み込まれる）。同様に、標的化可能な構築物と結合する抗体またはそのフラグメント、例えばＨＳＧ（ヒスタミンスクシニルグリシン）と結合する６７９モノクローナル抗体またはＩｎ−ＤＴＰＡと結合する７３４抗体も、当該技術分野において周知である（米国特許第７，４２９，３８１号；同第７，５６３，４３９号；同第７，６６６，４１５号；および同第７，５３４，４３１号、これらの実施例節は参照により本明細書に組み込まれる）。一般に、前標的化方法において、二重特異的または多重特異的抗体がまず投与され、細胞または組織標的抗原と結合される。非結合抗体を循環から取り除くための適切な時間量の後、例えば、１８Ｆ標識化された標的化可能な構築物が患者に投与され、標的細胞または組織に局在化される抗体と結合し、次いで、例えばＰＥＴ走査により画像化される。
【００１３】
代替の実施形態において、受容体、例えば、ソマトスタチン、オクトレオチド、ボンベシン、葉酸もしくは葉酸類似体、ＲＧＤペプチドまたは他の公知の受容体配位子と直接結合する分子は、標識化されて画像化に用いられてよい。受容体標的化剤として、インテグリンανβ３受容体（Ｌｉｕら、２００３、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１４：１０５２−５６）のための非ペプチドアンタゴニスト、例えば、ＴＡ１３８を挙げることができる。金属キレートを用いた受容体標的化画像化の他の方法は、当該分野において公知であり、特許請求されている方法の実施において利用されてよい（例えば、Ａｎｄｒｅら、２００２、Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８８：１−６；Ｐｅａｒｓｏｎら、１９９６、Ｊ．Ｍｅｄ、Ｃｈｅｍ．３９：１３６１−７１を参照されたい）。
【００１４】
画像化され得る疾患または状態の種類は、疾患または状態に関連する細胞または組織を標的化するのに好適な送達分子の利用可能性のみによって制限される。多くのかかる送達分子が公知である。例えば、罹患した組織または標的、例えば癌に結合するあらゆるタンパク質またはペプチドが、開示された方法により１８Ｆによって標識化され得、検出および／または画像化に用いられ得る。ある一定の実施形態において、かかるタンパク質またはペプチドとして、限定されないが、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する抗体または抗体フラグメントを挙げることができる。あらゆる公知のＴＡＡ−結合抗体またはフラグメントが、記載された方法により１８Ｆによって標識化され得、例えばＰＥＴ走査または他の公知の技術による腫瘍の画像化および／または検出に用いられ得る。
【００１５】
ある一定の代替の実施形態は、金属-１８F-キレート部分の分子への付着のためのクリックケミストリー反応の使用を含む。好ましくは、クリックケミストリーは、アルキン、ニトロンまたはアジド基などの活性化部分を含む抗体または抗原結合抗体フラグメントなどの標的化分子と、１個以上のキレート基に付着し、対応する反応性部分、例えばアジド、アルキンまたはニトロンを含むキレート部分または担体分子との反応を含む。標的化分子がアルキンを含む場合、キレート部分または担体は、アジド、ニトロンまたは同様の反応性部分を含む。クリックケミストリー反応は、インビトロで起こり、次いで対象に投与される高度に安定な標識化された標的化分子を形成することができる。
【００１６】
以下の図は、本発明の特定の実施形態を説明するために含まれ、特許請求の主題の範囲について限定することを意味していない。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】マイクロＰＥＴ画像化による腫瘍保有ヌードマウスにおける１８Ｆ標識化剤の生体内分布である。（Ａ）［１８Ｆ］ＦＤＧ、（Ｂ）抗ＣＥＡ×抗ＨＳＧ  ｂｓＭＡｂによって前標的化されたＡｌ［１８Ｆ］ＩＭＰ４４９、（Ｃ）Ａｌ［１８Ｆ］ＩＭＰ４４９単独（ｂｓＭＡｂによって前標的化されない）を注射後に、各左脇腹に小さな皮下ＬＳ１７４Ｔ腫瘍を保有する３匹のヌードマウスの冠状薄片。注射用量パーセント／グラム（％ＩＤ／ｇ）として表される生体内分布データを、画像化期間の終結時に動物から取り出された組織について与える。略記：Ｂ、骨髄；Ｈ、心臓；Ｋ、腎臓；Ｔ、腫瘍。
【図２】上部脇腹に３５ｍｇのＬＳ１７４Ｔヒト結腸直腸癌異種移植片を保有するヌードマウスに付与された前標的化Ａｌ［１８Ｆ］ＩＭＰ４４９の動的画像研究。上の３個のパネルは、１２０分の画像化期間にわたる６個の異なる５分間隔での腫瘍の周辺位置の中心にある身体の領域の、それぞれ採取された冠状、矢状および横断切片を示す。各切片図における左側の最初の画像は、矢印によって強調されている十字線の交差点における腫瘍の位置付けを示す。動物を、画像化期間の間に、その右側に部分的に傾けた。底部の２つのパネルは、肝臓および小腸における分布を強調するために冠状切片におけるより前方の平面に焦点を当てたさらなる冠状および矢状切片を示すが、矢状図は身体のより中心に横断する。略記：Ｃｏｒ、冠状；ＦＡ、前腕；Ｈ、心臓；Ｋ、腎臓；Ｌｖ、肝臓；Ｓａｇ、矢状；Ｔｒ、横断；ＵＢ、膀胱。
【図３】１８Ｆ標識化ＩＭＰ４６８ボンベシン類似体によるインビボ組織分布。
【図４】ＡＲ４２Ｊ腫瘍保有マウス（ｎ＝５）における２時間ｐ．ｉ．での１８Ｆ−ＩＭＰ４６６および６８Ｇａ−ＩＭＰ４６６の生体内分布の比較。対照として、別個の群のマウス（ｎ＝５）は、過剰の非標識化オクトレオチドを受けて、受容体特異性を実証した。
【図５】頚部にｓ．ｃ．ＡＲ４２Ｊ腫瘍を有するマウスにおける２時間ｐ.ｉ．での１８Ｆ−ＩＭＰ４６６および６８Ｇａ−ＩＭＰ４６６のＰＥＴ／ＣＴスキャンの冠状薄片。腫瘍および腎臓における蓄積が明瞭に可視化されている。
【図６】皮下ＬＳ１７４ＴおよびＳＫ−ＲＣ５２腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおける６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８のｉ．ｖ．注射後１時間の６．０ｎｍｏｌの１２５Ｉ−ＴＦ２（０．３７ＭＢｑ）および０．２５ｎｍｏｌの６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８（５ＭＢｑ）の生体内分布。値を、平均±標準偏差として与える（ｎ＝５）。
【図７】６．０ｎｍｏｌのＴＦ２による前標的化後のｉ．ｖ．注射後１時間の５ＭＢｑのＦＤＧおよび５ＭＢｑの６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８（０．２５ｎｍｏｌ）の生体内分布。値を、平均±標準偏差として与える（ｎ＝５）。
【図８】５ＭＢｑの１８Ｆ−ＦＤＧ、１日後に１６時間の間隔を有して６．０ｎｍｏｌのＴＦ２および５ＭＢｑの６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８（０．２５ｎｍｏｌ）を受けた、右後肢に皮下ＬＳ１７４Ｔ腫瘍（０．１ｇ）（明色矢印）および左大腿筋に炎症（暗色矢印）を有するＢＡＬＢ／ｃヌードマウスのＰＥＴ／ＣＴ画像。動物を、１８Ｆ−ＦＤＧおよび６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８注射後１時間に、画像化した。パネルは、ＦＤＧ−ＰＥＴスキャンの３Ｄボリュームレンダリング（Ａ）、腫瘍領域の横断面（Ｂ）、ならびに前標的化イムノＰＥＴスキャンの３Ｄボリュームレンダリング（Ｃ）、腫瘍領域の横断面（Ｄ）。
【図９】１６時間前に６．０ｎｍｏｌのＴＦ２を注射後１時間の０．２５ｎｍｏｌのＡｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４４９（５ＭＢｑ）の生体内分布、前標的化を伴わないＡｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４４９の生体内分布、またはＡｌ［１８Ｆ］の生体分布。値を、平均±標準偏差として示す。
【図１０】１６時間間隔で６．０ｎｍｏｌのＴＦ２および０．２５ｎｍｏｌのＡｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４４９（５ＭＢｑ）を静脈内に受けた、右側（矢印）に皮下ＬＳ１７４Ｔ腫瘍（０．１ｇ）を有するＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの静的ＰＥＴ／ＣＴ画像研究。動物を、Ａｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４４９の注射後１時間に、画像化した。パネルは、３Ｄボリュームレンダリング（Ａ）後面図、ならびに腫瘍領域における（Ｂ）冠状断面、（Ｃ）矢状断面を示す。
【図１１】ＩＭＰ４７９（配列番号：３５）の構造。
【図１２】ＩＭＰ４８５（配列番号：３６）の構造。
【図１３】ＩＭＰ４８７（配列番号：３７）の構造。
【図１４】ビスｔ−ブチル−ＮＯＤＡ−ＭＰＡＡの合成。
【図１５】ＮＯＴＡのマレイミド共役体の合成。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書における開示の理解を容易にするために以下の定義が提供される。明確に定義されていない用語は、それらの平易なおよび／または通常の意味に従って用いられる。
【００１９】
本明細書において用いられるとき、「１個の（ａ）」または「１個の（ａｎ）」は、1個または１個より多くの項目を意味し得る。
【００２０】
本明細書において用いられるとき、「および」および「または」は、接続語または離接語のいずれかを意味するために用いられ得る。すなわち、両方の用語は、別途記述されない限り、「および／または」と等価であると理解されるべきである。
【００２１】
本明細書において用いられるとき、「約」は、ある数のプラスまたはマイナス１０％以内を意味する。例えば、「約１００」は、９０〜１１０の間の任意の数を称する。
【００２２】
本明細書において用いられるとき、「ペプチド」は、長さが２〜１００の間のアミノ酸残基、より好ましくは２〜１０の間、さらに好ましくは２〜６の間の長さのアミノ酸の天然または非天然アミノ酸の任意の配列を称する。「アミノ酸」は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、アミノ酸類似体、アミノ酸誘導体またはアミノ酸模倣物であり得る。
【００２３】
本明細書において用いられるとき、用語「病原体」は、限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、ヒト血清パルボ様ウイルス、サルウイルス４０、呼吸器合胞体ウイルス、マウス乳腺腫瘍ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、デング熱ウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ネズミ白血病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、疣贅ウイルス、疣贅ウイルス、Ｂ群連鎖球菌、レジオネラ・ニューモフィラ、化膿連鎖球菌、大腸菌、淋菌、髄膜炎菌、肺炎球菌、Ｂ型インフルエンザ菌、梅毒トレポネーマ、ライム病スピロヘータ、緑膿菌、ライ菌、ウシ流産菌、結核菌および破傷風菌を含めた、限定されないが、菌類、ウイルス、寄生生物および細菌を含む。
【００２４】
「放射線分解防護剤」は、１８Ｆ標識化錯体または分子に添加されて、放射線分解による１８Ｆ標識化錯体または分子の分解速度を低減し得るあらゆる分子、化合物または組成物を称する。限定されないがアスコルビン酸を含めたあらゆる公知の放射線分解防護剤が用いられてよい。
１８Ｆ標識化技術の比較
【００２５】
１８Ｆによって分子を標識化するための種々の技術が公知である。表１は、より一般的に報告されているフッ化手順のいくつかの特性を列挙する。炭素を介したペプチド標識化は、通常２−または３工程での求核置換を介した補欠分子族との１８Ｆ結合をしばしば含み、この場合、補欠分子族は、標識化され、精製され、化合物に付着されて、次いで再び精製される。この一般の方法は、アミド結合、アルデヒドおよび「クリックケミストリー」を介して補欠分子族を付着するために用いられてきた（Ｍａｒｉｋら、２００６，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １７：１０１７−２１；Ｐｏｅｔｈｋｏら、２００４，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ４５：８９２−９０２；Ｌｉら、２００７，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １８：９８９−９３）。最も一般的なアミド結合形成試薬はＮ−スクシンイミジル４−１８Ｆ−フルオロベンゾエート（１８Ｆ−ＳＦＢ）であったが、多数の他の基が試験されてきた（Ｍａｒｉｋら、２００６）。いくつかの場合、例えば、１８Ｆ標識化活性エステルアミド形成基が用いられる場合、カップリング反応の間にペプチド上のある一定の基を保護する必要があり、その後、それらは開裂される。この１８Ｆ−ＳＦＢ試薬の合成ならびにその後のペプチドとの共役は、多数の合成工程を必要とし、約２〜３時間かかる。
【００２６】
より簡単で、より効率的な１８Ｆ−ペプチド標識化方法がＰｏｅｔｈｋｏら（２００４）により開発されたが、この場合、４−１８Ｆ−フルオロベンズアルデヒド試薬が、ドライダウン工程を含めて約７５〜９０分で、オキシム連結を介してペプチドと共役された。より新しい「クリックケミストリー」法は、銅触媒の存在下に、ペプチド上の１８Ｆ標識化分子をアセチレンまたはアジドで付着する（Ｌｉら、２００７；Ｇｌａｓｅｒ  ａｎｄ  Ａｒｓｔａｄ，２００７，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １８：９８９−９３）。アジドおよびアセチレン基間の反応はトリアゾール接続を形成し、これはかなり安定であり、保護基を必要とせずに非常に効率的にペプチド上に形成される。クリックケミストリーは、ドライダウン工程を伴って約７５〜９０分で、良好な収率（約５０％）で、１８Ｆ標識化ペプチドを産生する。
【表１】
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【００２７】
１８Ｆをケイ素と結合するより最近の方法は、同位体交換を用いて、１８Ｆを１９Ｆに置き換える（Ｓｈｉｒｒｍａｃｈｅｒら、２００７）。室温で１０分実施すると、この反応は、高比活性度を有する１８Ｆ−補欠分子アルデヒド基を生じる（２２５〜６８０ＧＢｑ／μｍｏｌ；６，１００〜１８，４００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）。１８Ｆ標識化アルデヒドは、その後、ペプチドと共役され、ＨＰＬＣにより精製されて、精製された標識化ペプチドが４０分以内（ドライダウンを含む）に約５５％の収率で得られる。これは、その後、標識化反応の前にペプチド内にケイ素を組み入れることによって、一工程プロセスに変更された（Ｈｏｈｎｅら、２００８）。しかし、１８Ｆ−ケイ素−ボンベシン誘導体を用いたマウスにおける生体内分布研究は、経時的に増大する骨取込みを示した（０．５時間で１．３５±０．４７％の注入用量（ＩＤ）／ｇ対４．０時間での５．１４±２．７１％ＩＤ／ｇ）。これは、ペプチドからの１８Ｆの放出を示唆しており、非結合１８Ｆが骨中に局在することが公知であるためである（Ｈｏｈｎｅら、２００８）。尿のＨＰＬＣ分析は、空隙容量中の相当量の１８Ｆ活性を示したが、これは、おそらく、ペプチドから放出される１８Ｆ−フッ化物陰イオンに起因している。したがって、１８Ｆ−ケイ素標識化分子は血清中で安定でない、ということが明らかになった。実質的な肝胆汁排泄も報告されたが、これは１８Ｆ−ケイ素結合基質の親油性の性質によるものであり、より親水性である将来的な誘導体を必要とした。１８Ｆをホウ素に付着させる方法も探究されてきた；しかし、現在のプロセスは、低い比活性度を有する共役体を生成する（Ｔｉｎｇら、２００８）。
【００２８】
抗体およびペプチドは、常套的には放射性金属と、典型的には１５分で、定量的収率でカップリングされる（Ｍｅａｒｅｓら、１９８４，Ａｃｃ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  １７：２０２−２０９；Ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇら、１９８２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１５：１５１１−１３）。ＰＥＴ画像化のために、６４Ｃｕおよび６８Ｇａが、キレートを介してペプチドと結合されており、合理的に良好なＰＥＴ画像化特性を示している（Ｈｅｐｐｌｅｒら、２０００，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ７：９７１−９４）。フッ化物はほとんどの金属と結合するため、１８Ｆ−金属錯体が標的化分子上でキレート剤と結合され得るか否かを、我々は判断しようと試みた（Ｔｅｗｓｏｎ，１９８９，Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．１６：５３３−５１；Ｍａｒｔｉｎ，１９９６，Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  １４１：２３−３２）。フッ化アルミニウムはインビボで相対的に安定であり得るため、我々は、Ａｌ  １８Ｆ錯体の結合に集中してきた（Ｌｉ、２００３，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  経口Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  １４：１００−１１４；Ａｎｔｏｎｎｙら、１９９２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７：６７１０−１８）。初期研究は、このアプローチが、いくつかの場合には１８Ｆ−ＦＤＧ（フルオロデオキシグルコース）より良好な、癌を局在化するための高度感受性および特異的技術である二重特異的抗体（ｂｓＭＡｂ）前標的化系を用いた癌のインビボ標的化のための１８Ｆ標識化ペプチドを調製するための実現可能性を示した（ＭｃＢｒｉｄｅら、２００８，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ（補足）４９：９７Ｐ；Ｗａｇｎｅｒ，２００８，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ４９：２３Ｎ−２４Ｎ；Ｋａｒａｃａｙら、２０００，Ｂｉｏｃｏｎｊ  Ｃｈｅｍ  １１：８４２−５４；Ｓｈａｒｋｅｙら、２００８，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８；５２８２−９０；Ｇｏｌｄら、２００８，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８：４８１９−２６；Ｓｈａｒｋｅｙら、２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  １１：１２５０−５５；Ｓｈａｒｋｅｙら、２００５，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：７１０９ｓ−７１２１ｓ；ＭｃＢｒｉｄｅら、２００６，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ４７：１６７８−８８；Ｓｈａｒｋｅｙら、２００８，Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ２４６：４９７−５０８）。これらの研究は、Ａｌ  １８Ｆ錯体が１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）と安定的に結合し得るが、収率は低いということを明らかにした。
【００２９】
以下の実施例において、収率を約１０％から約８０％に向上させて、ＰＥＴ画像化に使用されるペプチドおよび他の分子の１８Ｆ標識化のための実行可能な方法を提供する新規の標識化条件およびいくつかの新規のＮＯＴＡ誘導体を調べた。
標的化可能な構築物
【００３０】
ある一定の実施形態において、18Fで標識化された部分または他の診断および／もしくは治療剤は、ペプチドまたは他の標的化可能な構築物を含み得る。標識化ペプチド（またはタンパク質）は、画像化、検出および／または診断のために、標的化細胞、組織、病原性生物または他の標的と直接結合するよう選択され得る。他の実施形態において、標識化ペプチドは、例えば、標的化可能な構築物ペプチドのための１個以上の結合部位、ならびに疾患または状態に関連する標的抗原のための１個以上の結合部位を有する二重特異的抗体を用いて、間接結合するよう選択され得る。二重特異的抗体は、例えば、抗体が最初に対象に投与され得る前標的化技術において用いられ得る。二重特異的抗体が標的抗原と結合するのに、ならびに非結合抗体が循環から除去されるのに十分な時間が与えられる。次いで、標的化可能な構築物、例えば標識化ペプチドが対象に投与され、二重特異的抗体と結合されて、罹患細胞または組織に局在化し得る。１８Ｆ標識化された標的化可能な構築物の分布は、ＰＥＴ走査または他の公知の技術により決定され得る。
【００３１】
かかる標的化可能な構築物は多様な構造を有することができ、高親和性によって標的化可能な構築物と結合する抗体またはフラグメントの利用可能性に関してだけでなく、前標的化方法および二重特異的抗体（ｂｓＡｂ）または多重特異的抗体内で用いられる場合、迅速なインビボクリアランスに関しても選択される。強力な免疫応答を引き出すには疎水性薬剤が最良であるが、迅速なインビボクリアランスのためには親水性剤が好ましい。したがって、疎水性の特質と親水性の特質との平衡が確立される。これは、多くの有機部分の固有の疎水性を相殺するために親水性キレート剤を用いることにより、部分的に成し遂げられ得る。また、逆の溶液特性を有する標的化可能な構築物のサブユニット、例えば、いくらかは疎水性でありいくらかは親水性であるアミノ酸を含有するペプチドが選択され得る。ペプチドの他に、炭水化物も用いられ得る。
【００３２】
わずか２個のアミノ酸残基を有する、好ましくは、２〜１０個の残基を有するペプチドが用いられてよく、また、キレート剤などの他の部分にカップリングされていてもよい。リンカーは、好ましくは５０，０００ダルトン未満、有利には約２０，０００ダルトン未満、１０，０００ダルトン未満、または５，０００ダルトン未満の分子量を有する低分子量共役体であるべきである。より一般的には、標的化可能な構築物ペプチドは、ペプチドＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（配列番号１）など、４個以上の残基を有し、ここで、ＤＯＴＡは、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン１，４，７，１０−四酢酸であり、ＨＳＧは、ヒスタミンスクシニルグリシン基である。代替的には、ＤＯＴＡは、ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザ−シクロノナン−１，４，７−三酢酸）またはＴＥＴＡ（ｐ−ブロモアセトアミド−ベンジル−テトラエチルアミン四酢酸）または他の公知のキレート部分で置き換えられていてよい。
【００３３】
標的化可能な構築物はまた、生体内でのペプチドの安定性を増加させるために、非天然アミノ酸、例えばＤ−アミノ酸を骨格構造に含んでいてもよい。代替の実施形態において、非天然アミノ酸およびペプトイドから構築されるものなどの他の骨格構造が用いられてよい。
【００３４】
標的化可能な構築物として用いられるペプチドは、固相支持体ならびに反復直交脱保護およびカップリングの標準技術を用いた、自動ペプチド合成器において好都合に合成される。後にキレート部分または他の剤の共役に用いられる、ペプチドにおける遊離アミノ基は、Ｂｏｃ基などの標準的な保護基で有利にブロックされる一方で、Ｎ−末端残基は、血清安定性を増加させるためにアセチル化されてよい。かかる保護基は、当業者に公知である。Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ基ｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９９９（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。ペプチドは、後の使用のために二重特異的抗体系内で調製されるとき、インビボでのカルボキシペプチダーゼ活性を阻害するために、Ｃ−末端アミドを生成する樹脂から有利に開裂される。ペプチド合成の例示的な方法は、以下の実施例に開示される。
【００３５】
免疫原のハプテンは、免疫原性認識部分、例えば化学ハプテンを含む。化学ハプテン、好ましくはＨＳＧハプテンを使用して、抗体に対するリンカーの高い特異 性が発現される。これは、ＨＳＧハプテンに対し惹起される抗体が知られており、適切な二重特異性抗体に容易に組み込むことができるためである。したがっ て、付着したヘプタンとのリンカーの結合は、抗体または抗体フラグメントに対し極めて特異的となる。
【００３６】
二重特異的抗体との前標的化が用いられる場合、抗体は、標的組織によって産生されるまたはこれに関連する抗原のための第１の結合部位、および標的化可能な構築物におけるハプテンのための第２の結合部位を含有する。例示的なハプテンとして、限定されないが、ＨＳＧおよびＩｎ−ＤＴＰＡが挙げられる。ＨＳＧハプテンとなる抗体は、公知であり（例えば、６７９抗体）、適切な二重特異的抗体に容易に組み込まれ得る（実施例節に関して参照により本明細書に組み込まれる、例えば、米国特許第６，９６２，７０２号；同第７，１３８，１０３号および同第７，３００，６４４号を参照されたい）。しかし、これらに結合する他のハプテンおよび抗体は、当該分野において公知であり、Ｉｎ−ＤＴＰＡおよび７３４抗体などが用いられてよい（例えば、実施例節が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，５３４，４３１号）。
【００３７】
当業者は、以下の実施例に開示される標的化可能な構築物の大部分がペプチドであるが、他の種類の分子が標的化可能な構築物として用いられてよいことを認識するであろう。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの例えばポリマー分子は、キレート部分によって容易に誘導体化されて、１８Ｆ−Ａｌに結合することができる。限定されないが、ポリマー、ナノ粒子、ミクロスフェア、リポソームおよびミセルを含めた、かかる担体分子の多くの例が、当該分野において公知であり、利用でされてよい。Ｆの前標的化送達における使用のための唯一の要件は、担体分子が、金属−１８Ｆの付着のための１個以上のキレート部分、および二重特異的もしくは多重特異的抗体または他の標的化分子に結合する１個以上のハプテン部分を含むことである。
キレート部分
【００３８】
いくつかの実施形態において、１８Ｆ標識化分子は、金属イオンに結合することができ、迅速なインビボクリアランスを確実にすることも補助し得る、１つ以上の親水性キレート部分を含み得る。キレート剤は、その特定の金属結合特性について選択されてよく、容易に交換可能であってよい。
【００３９】
特に有用な金属−キレートの組み合わせとして、２−ベンジル−ＤＴＰＡならびにそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体が挙げられる。ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザ−シクロノナン−１,4,7-−三酢酸）、ＤＯＴＡ、およびＴＥＴＡ（ｐ−ブロモアセトアミド−ベンジル−テトラエチルアミン四酢酸）などの大環状キレート剤もまた、１８Ｆ共役の配位子として潜在的に用いられ得る様々な金属と共に用いられる。
【００４０】
配位子がカルボキシレートまたはアミン基などの硬い塩基のキレート官能基を含む、ＤＴＰＡおよびＤＯＴＡ型キレート剤は、硬い酸のカチオン、特に第ＩＩａ群および第ＩＩＩａ群金属カチオンのキレート化に最も効果的である。かかる金属−キレート錯体は、対象の金属に対して環のサイズを調整することによって大いに安定化させることができる。大環状ポリエーテルなどの他の環型キレート剤は、核種を安定に結合させるための関心対象である。ポルフィリンキレート剤は、数多くの金属錯体と共に用いられ得る。１種を超えるキレート剤が担体に共役されて複数の金属イオンを結合させることができる。米国特許第５，７５３，２０６号に記載されているものなどのキレート剤、特にチオセミカルバゾニルグリオキシルシステイン（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）およびチオセミカルバジニル−アセチルシステイン（Ｔｓｃａ−Ｃｙｓ）キレート剤が、柔らかい塩基の配位子に強固に結合されるＴｃ、Ｒｅ、Ｂｉおよび他の遷移金属、ランタニド、ならびにアクチニドの柔らかい酸のカチオンを結合させるために有利に用いられる。１種を超えるキレート剤をペプチドに連結させることが有用であり得る。ｄｉ−ＤＴＰＡハプテンに対する抗体が知られており（Ｂａｒｂｅｔら、米国特許第５，２５６，３９５号）、標的抗体に容易にカップリングされて二重特異的抗体を形成するため、前標的化プロトコルにおいて１８Ｆ錯体を結合させるために、ペプチドハプテンを冷ｄｉＤＴＰＡキレート剤および別のキレート剤と共に用いることが可能である。かかるペプチドの一例は、Ａｃ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２（配列番号２として開示されているコアペプチド）である。ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡなどの他の硬い酸のキレート剤は、ＤＴＰＡおよび／またはＴｓｃｇ−Ｃｙｓ基と置換され得、それらに特異的なＭａｂは、抗−ｄｉ−ＤＴＰＡ Ｍａｂを生成するために用いられるものと類似した技術を用いて産生され得る。
【００４１】
別の有用なキレート剤は、例えばＣｈｏｎｇら（Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂｉｍｏｄａｌ  ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｌｉｇａｎｄ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，電子出版１２−７−０７，参照により本明細書に組み入れられる）に開示されている、ＮＯＴＡ型部分を含んでいてよい。Ｃｈｏｎｇらは、ＮＯＴＡ構造に基づく二官能性Ｃ−ＮＥＴＡ配位子の生成および使用を開示しており、これは１７７Ｌｕまたは２０５／２０６Ｂｉで錯化されると最長１４日間の血清中での安定性を示した。キレート剤は限定されず、当該分野において公知であり、および／または以下の実施例において記載されているキレート剤のこれらおよび他の例は、本発明の実施において用いられ得る。
【００４２】
カチオンの異なるサイズ、キレート環の配置、およびカチオンの好ましい錯イオン構造に起因して、２種の異なる硬い酸または柔らかい酸のカチオンに優先的に結合させるために、例えば異なるキレート環サイズを有する２種の異なる硬い酸または柔らかい酸のキレート剤を、標的化可能な構築物に組み込まれ得ることが理解される。これにより、その一方または両方が１８Ｆに付着されてよい２種の異なる金属が、前標的化二重特異的抗体による最終的な捕捉のために標的化可能な構築物に組み込まれることが可能となる。
抗体
標的抗原
【００４３】
使用の標的抗体は、種々の細胞表面または疾患関連抗原に特異的であっても選択的であってもよい。種々の疾患または状態、例えば悪性疾患、心臓血管疾患、感染性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、代謝性疾患または神経学的（例えば、神経変性）疾患を画像化または処置するための使用の例示的な標的抗原として、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、ＣＳＡｐ、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＩＧＦ−１Ｒ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ−ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１２、ＨＩＦ−Ια、ＡＦＰ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ−ｍｅｔ、Ｂ７、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂ、Ｈ因子、ＦＨＬ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、ＧＲＯＢ、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＨＭ１．２４、インスリン様成長因子−１（ＩＬＧＦ−１）、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−ａ、ＩＦＮ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２５、ＩＰ−１０、ＭＡＧＥ、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＮＣＡ−９５、ＮＣＡ−９０、膵臓癌ムチン、胎盤成長因子、ｐ５３、ＰＬＡＧＬ２、前立腺酸性フォスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、Ｐ１ＧＦ、Ｉａ、ＨＭ１．２４、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、Ｌｅ（ｙ）、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＴＡＣ、Ｔｎ抗原、トムゾン‐フリーデンライヒ抗原、腫瘍壊死抗原、ＴＮＦ−ａ、ＴＲＡＩＬ受容体（Ｒ１およびＲ２）、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、ＰＬＡＧＬ２、ならびに癌遺伝子産物が挙げられ得る。
【００４４】
ある一定の実施形態において、画像化または処置腫瘍など、使用の抗体は、腫瘍関連抗原を標的化し得る。これらの抗原マーカーは、腫瘍によって生成される物質であっても、腫瘍部位において、腫瘍細胞表面上に、または腫瘍細胞内に蓄積する物質であってもよい。かかる腫瘍関連マーカーの中でも、Ｈｅｒｂｅｒｍａｎ、「Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ」によって、Ｆｌｅｉｓｈｅｒ著、「Ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ」、３４７頁（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ、１９７９）において、ならびにそれぞれの実施例節が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，１５０，１４９号；同第４，３６１，５４４号；および同第４，４４４，７４４号において開示されているものである。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に関する報告として、同定されたＴＡＡに関して参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｉｚｕｋａｍｉら、（２００５、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１１：９９２−９７）；Ｈａｔｆｉｅｌｄら、（２００５、Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ５：２２９−４８）；Ｖａｌｌｂｏｈｍｅｒら（２００５、Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３：３５３６−４４）；およびＲｅｎら（２００５、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２４２：５５−６３）が挙げられる。
【００４５】
腫瘍関連マーカーは、Ｈｅｒｂｅｒｍａｎ（同上）により、腫瘍胎児抗原、胎盤抗原、発癌性または腫瘍ウイルス関連抗原、組織関連抗原、器官関連抗原、異所性ホルモンおよび正常抗原またはその変異体を含む、数多くのカテゴリーに分類されている。時折、より高い腫瘍特異性を有する抗体を惹起するために、米国特許第４，３６１，６４４号および第４，４４４，７４４号に開示されるような、非腫瘍物質に対して大きく低減された交差反応性を有する抗体の産生を刺激する、腫瘍関連マーカーのサブユニット、例えば、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）のベータサブユニットまたは癌胎児性抗原（ＣＥＡ）のガンマ領域などが有利に用いられる。
【００４６】
対象の別のマーカーは、膜透過性活性化因子およびＣＡＭＬ−相互作用因子（ＴＡＣＩ）である。Ｙｕら、Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ， １ ：２５２−２５６（２０００）を参照されたい。簡潔には、ＴＡＣＩはＢ細胞悪性腫瘍（例えばリンパ腫）のマーカーである。さらに、ＴＡＣＩおよびＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、腫瘍壊死因子相同性−増殖誘導配位子（ＡＰＲＩＬ）により結合される。ＡＰＲＩＬは、原発性Ｂ細胞およびＴ細胞のインビトロ増殖を刺激し、インビボでのＢ細胞の蓄積により脾臓重量を増加させる。ＡＰＲＩＬはまた、受容体結合に関しＴＡＬＬ−Ｉ（ＢＬｙＳまたはＢＡＦＦとも呼ばれる）と競合する。可溶性ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩは、ＡＰＲＩＬの結合を特異的に防止し、原発性Ｂ−細胞のＡＰＲＩＬ刺激増殖を阻止する。ＢＣＭＡ−Ｆｃはまた、マウスにおけるキーホールリンペットヘモシアニンおよびＰｎｅｕｍｏｖａｘに対する抗体の産生を阻害し、これは、ＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩを介したＡＰＲＩＬおよび／またはＴＡＬＬ−Ｉシグナリングが液性免疫の生成に必要であることを示している。したがって、ＡＰＲＩＬ−ＴＡＬＬ−ＩおよびＢＣＭＡ−ＴＡＣＩは、ＢおよびＴ−細胞機能の刺激に関与する２配位子−２受容体経路を形成する。
【００４７】
疾患が、リンパ腫、白血病または自己免疫障害を含む場合、標的化抗原は、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ６７、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、ＣＤ１３８、ＣＤ１５４、Ｂ７、ＭＵＣ１、Ｉａ、Ｉｉ、ＨＭ１．２４、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、ＶＥＧＦ、Ｐ１ＧＦ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、癌遺伝子（例えば、ｃ−ｍｅｔまたはＰＬＡＧＬ２）、癌遺伝子産物、ＣＤ６６ａ−ｄ、壊死抗原、ＩＬ−２、Ｔ１０１、ＴＡＧ、ＩＬ−６、ＭＩＦ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４）およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）からなる群から選択されてよい。
抗体を生じさせる方法
【００４８】
ＭＡｂｓは、種々の定着された技術によってハイブリドーマ培養から単離および精製され得る。かかる単離技術として、タンパク質−Ａまたはタンパク質−Ｇセファロースによる親和性クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、およびイオン交換クロマトグラフィが挙げられる。例えば、２．７．１−２．７．１２頁および２．９．１−２．９．３頁におけるＣｏｌｉｇａｎを参照されたい。また、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、第１０巻、７９−１０４頁（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．１９９２）におけるＢａｉｎｅｓら、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏグロブリン  Ｇ（ＩｇＧ）」も参照されたい。抗体から免疫原を最初に生じさせた後に、抗体が配列決定され、続いて組み換え技術によって調製され得る。マウス抗体および抗体フラグメントのヒト化およびキメラ化が、以下に議論されているように、当業者に周知である。
キメラ抗体
【００４９】
キメラ抗体は、ヒト抗体の可変領域が、マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含めた、例えばマウス抗体の可変領域によって置き換えられた組み換えタンパク質である。キメラ抗体は、対象に投与されたとき、減少された免疫原性および増加された安定性を示す。マウス免疫グロブリン可変ドメインをクローニングするための一般的な技術が、例えば、Ｏｒｌａｎｄｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６：３８３３（１９８９）に開示されている。キメラ抗体を構築するための技術は、当業者に周知である。例として、Ｌｅｕｎｇら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ７３：４６９（１９９４）、マウスＬＬ２である抗ＣＤ２２モノクローナル抗体のＶＫおよびＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列を、ヒトκおよびＩｇＧＩ定常領域ドメインと組み合わせることによってＬＬ２キメラを生成した。
ヒト化抗体
【００５０】
ヒト化ＭＡｂを生成する技術は当該分野で周知である（例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、 Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４（１９８８）、Ｃａｒｔｅｒら、 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４２８５（１９９２）、Ｓａｎｄｈｕ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ、１２：４３７（１９９２）およびＳｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ、１５０：２８４４（１９９３）を参照されたい）。キメラまたはマウスモノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの重および軽可変鎖由来のマウスＣＤＲをヒト抗体の対応する可変ドメインに転移することにより、ヒト化され得る。キメラモノクローナル抗体におけるマウスフレームワーク領域（ＦＲ）もまた、ヒトＦＲ配列と置き換えられる。マウスＣＤＲをヒトＦＲに単に転移すると、抗体親和性の低下または喪失もしばしば結果として生じるため、マウス抗体の本来の親和性を回復するためには、さらなる改変が必要とされる。このことは、ＦＲ領域における１個以上のヒト残基を、それらのマウスの対応部分と置き換えて、エピトープに対する良好な結合親和性を有する抗体を得ることにより達成され得る。例えば、Ｔｅｍｐｅｓｔら、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、９：２６６（１９９１）およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」、２３９：１５３４（１９８８）を参照されたい。
【００５１】
置換に好ましい残基として、ＣＤＲ配列と隣接して位置し、またはＣＤＲ残基と相互作用すると予測される、ＣＤＲ残基側鎖の１、２、または３Å以内に位置するＦＲ残基が挙げられる。
ヒト抗体
【００５２】
コンビナトリアルアプローチ、またはヒト免疫グロブリン遺伝子座で転換されたトランスジェニック動物を用いる完全ヒト抗体を生成する方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｍａｎｃｉｎｉら、２００４、Ｎｅｗ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２７：３１５−２８；ＣｏｎｒａｄおよびＳｃｈｅｌｌｅｒ、２００５、Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ、８：１１７‐２６；ＢｒｅｋｋｅおよびＬｏｓｅｔ、２００３、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｍａｃｏｌ、３：５４４−５０）。完全ヒト抗体はまた、遺伝子または染色体トランスフェクション法ならびにファージディスプレイ技術によっても構築され得、これらは全て当該分野で公知である。例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、「Ｎａｔｕｒｅ」、３４８：５５２−５５３（１９９０）を参照されたい。このような完全ヒト抗体は、キメラまたはヒト化抗体よりもさらに少ない副作用を示すことおよびインビボにおいて実質的に内在性のヒト抗体として機能することが予測される。
【００５３】
一代替例において、ファージディスプレイ技術が用いられて、ヒト抗体（例えば、Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａら、２００５、Ｇｅｎｅｔ．Ｍｏｌ．Ｒｅｓ．４：１２６−４０）を生成することができる。ヒト抗体は、ヒト、または癌などの特定の病態を示すヒトから生成され得る（Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａら、２００５）。罹患した個体からヒト抗体を構築する利点は、循環する抗体レパートリーが疾患関連抗原に対する抗体に偏り得ることである。
【００５４】
この方法論の１つの非限定的な例において、Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａら（２００５）は、骨肉腫患者由来のヒトＦａｂ抗体フラグメントのファージディスプレイライブラリを構築した。概して、全ＲＮＡが循環血リンパ球から得られた（同上）。組み換えＦａｂが、μ、γおよびκ鎖抗体レパートリーからクローニングされ、ファージディスプレイライブラリ内に導入された（同上）．ＲＮＡは、ｃＤＮＡに変換され、Ｆａｂ  ｃＤＮＡ重および軽鎖免疫グロブリン配列に対して特異的なプライマーを用いてライブラリを作製するのに用いられた（Ｍａｒｋｓら、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−９７）。ライブラリ構築は、Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆらに従い行われた（２０００、Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｂａｒｂａｓら編、第１版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、ｐｐ．９．１−９．２２に掲載）。最終的なＦａｂフラグメントは、制限エンドヌクレアーゼによって消化され、バクテリオファージゲノム内に挿入されて、ファージディスプレイライブラリを作製した。かかるライブラリは、当該分野で公知の標準的なファージディスプレイ方法によってスクリーニングされ得る。ファージディスプレイは、種々の形式で実施され得、レビューについては、例えばＪｏｈｎｓｏｎおよびＣｈｉｓｗｅｌｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５５６４−５７１（１９９３）を参照されたい。
【００５５】
ヒト抗体は、インビトロ活性化Ｂ細胞により生成されてもよい。米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号（その内容全体が参照により本明細書で援用される）を参照のこと。当業者は、これらの技術が例示的なものであり、ヒト抗体または抗体フラグメントを作製およびスクリーニングするためのあらゆる公知の方法が利用されてよいことを認識するであろう。
【００５６】
別の代替例において、遺伝子操作されてヒト抗体を産生したトランスジェニック動物が、標準的な免疫化プロトコルを用いて本質的にあらゆる免疫原性標的に対する抗体を生成するために用いられてよい。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法は、Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３（１９９４）、Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３（５５：８５６（１９９４）、ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５１９（１９９４）によって開示されている。かかる系の非限定的な例は、Ａｂｇｅｎｉｘ（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）からのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｒｅｅｎら、１９９９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１−２３）。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）および同様の動物において、マウス抗体遺伝子が不活性され、機能的なヒト抗体遺伝子によって置き換えられているが、残りのマウス免疫系は元の状態に保たれている。
【００５７】
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、可変領域配列の大部分を含むヒトＩｇＨおよびＩｇκ遺伝子座の一部をアクセサリー遺伝子および調節配列と共に含有する、生殖系列構成のＹＡＣ（酵母人工染色体）によって形質転換されたものである。ヒト可変領域レパートリーが用いられて、抗体産生Ｂ細胞を生成してもよく、該細胞は公知の技術によってハイブリドーマに処理されてよい。標的抗原で免疫化されたＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、標的抗原で免疫化されたＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、通常の免疫応答によりヒト抗体を産生し、この抗体は、先で議論された標準的な技術によって採取および／または産生されてよい。様々な系統のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）が利用可能であり、それぞれが、異なるクラスの抗体を産生することが可能である。トランスジェニックにより産生されたヒト抗体は、通常のヒト抗体の薬物動態特性を保持しながら、治療的能力を有することが示されている（Ｇｒｅｅｎら、１９９９）。当業者は、特許請求される組成物および方法が、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系の使用に限定されるものではなく、ヒト抗体を産生するよう遺伝子操作されたあらゆるトランスジェニック動物を利用してヒト抗体を産生してよいことを認識するであろう。
公知の抗体
【００５８】
当業者は、画像化、検出および／または診断のために使用される標的化分子が、病態または状態と関連する標的抗原に結合特異性を有する、当該分野において公知のあらゆる抗体またはフラグメントを組み込み得ることを認識するであろう。かかる公知の抗体として、限定されないが、ｈＲ１（抗ＩＧＦ−１Ｒ、３／１２／１０に提出された米国特許出願番号第１２／７７２，６４５号）、ｈＰＡＭ４（抗膵癌ムチン、米国特許第７，２８２，５６７号）、ｈＡ２０（抗ＣＤ２０、米国特許第７，２５１，１６４号）、ｈＡ１９（抗ＣＤ１９、米国特許第７，１０９，３０４号）、ｈＩＭＭＵ３１（抗ＡＦＰ、米国特許第７，３００，６５５号）、ｈＬＬ１（抗ＣＤ７４、米国特許第７，３１２，３１８号）、ｈＬＬ２（抗ＣＤ２２、米国特許第７，０７４，４０３号）、ｈＭｕ−９（抗ＣＳＡｐ、米国特許第７，３８７，７７３号）、ｈＬ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ、米国特許第７，６１２，１８０号）、ｈＭＮ−１４（抗ＣＥＡＣＡＭ５、米国特許第６，６７６，９２４号）、ｈＭＮ−１５（抗ＣＥＡＣＡＭ６、米国特許第７，６６２，３７８、米国特許出願番号第１２／８４６，０６２号、７／２９／１０に提出）、ｈＲＳ７（抗ＥＧＰ−１、米国特許第７，２３８，７８５号）、ｈＭＮ−３（抗ＣＥＡＣＡＭ６、米国特許第７，５４１，４４０号）、Ａ２４およびＡｂｌ２５（抗ＣＸＣＲ４、米国特許第７，１３８，４９６号）が挙げられ、列挙した各特許または出願の実施例節は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５９】
候補の抗ＨＩＶ抗体として、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら（ＡＩＤＳ．２００６  Ｏｃｔ  ３；２０（１５）：１９１１−５）に記載されている抗エンベロープ抗体、ならびに米国特許第５，８３１，０３４号、米国特許第５，９１１，９８９号にも記載されているＰｏｌｙｍｕｎ（Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）によって、ならびにＶｃｅｌａｒら、ＡＩＤＳ２００７；２１（１６）：２１６１−２１７０によって、およびＪｏｏｓら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００６；５０（５）：１７７３−９によって、記載および販売されている抗ＨＩＶ抗体が挙げられ、全て参照により本明細書に組み込まれる。
【００６０】
二重特異的抗体が用いられる場合、第２のＭＡｂは、限定されないが、それぞれの実施例節が参照により本明細書に組み込まれる、ｈ６７９（米国特許第７，４２９，３８１）および７３４（米国特許第７，４２９，３８１号；同第７，５６３，４３９号；同第７，６６６，４１５号；および同第７，５３４，４３１号）を含めた、当該分野において公知のあらゆる抗ハプテン抗体から選択されてよい。
【００６１】
使用の種々の他の抗体は、当該分野において公知である（例えば、米国特許第５，６８６，０７２号；同第５，８７４，５４０号；同第６，１０７，０９０号；同第６，１８３，７４４号；同第６，３０６，３９３号；同第６，６５３，１０４号；同第６，７３０．３００号；同第６，８９９，８６４号；同第６，９２６，８９３号；同第６，９６２，７０２号；同第７，０７４，４０３号；同第７，２３０，０８４号；同第７，２３８，７８５号；同第７，２３８，７８６号；同第７，２５６，００４号；同第７，２８２，５６７号；同第７，３００，６５５号；同第７，３１２，３１８号；同第７，５８５，４９１号；同第７，６１２，１８０号；同第７，６４２，２３９号および米国特許出願公開第２００６０１９３８６５号；それぞれが参照により本明細書に組み込まれる）。かかる公知の抗体は、種々の病態または状態（例えば、ｈＭＮ−１４またはＴＦ２（ＣＥＡ−発現癌腫）、ｈＡ２０またはＴＦ−４（リンパ腫）、ｈＰＡＭ４またはＴＦ−１０（膵臓癌）、ＲＳ７（肺、乳、卵巣、前立腺癌）、ｈＭＮ−１５またはｈＭＮ３（炎症）、抗ｇｐ１２０および／または抗ｇｐ４１（ＨＩＶ）、抗血小板および抗トロンビン（凝血の画像化）、抗ミオシン（心臓壊死）、抗ＣＸＣＲ４（癌および炎症性疾患））の検出および／または画像化のための使用である。
【００６２】
使用の抗体は、広範な公知の供給源から商業的に得られ得る。例えば、種々の抗体分泌ハイブリドーマ系統が、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手可能である。限定されないが、腫瘍関連抗原を含めた種々の疾患標的に対する多数の抗体が、ＡＴＣＣに寄託されており、そして／または可変領域配列を公開しており、特許請求の方法および組成物における使用に利用可能である。例えば、米国特許第７，３１２，３１８号；同第７，２８２，５６７号；同第７，１５１，１６４号；同第７，０７４，４０３号；同第７，０６０，８０２号；同第７，０５６，５０９号；同第７，０４９，０６０号；同第７，０４５，１３２号；同第７，０４１，８０３号；同第７，０４１，８０２号；同第７，０４１，２９３号同第７，０３８，０１８号；同第７，０３７，４９８号；同第７，０１２，１３３号；同第７，００１，５９８号；同第６，９９８，４６８号；同第６，９９４，９７６号；同第６，９９４，８５２号；同第６，９８９，２４１号；同第６，９７４，８６３号；同第６，９６５，０１８号；同第６，９６４，８５４号；同第６，９６２，９８１号；同第６，９６２，８１３号；同第６，９５６，１０７号；同第６，９５１，９２４号；同第６，９４９，２４４号；同第６，９４６，１２９号；同第６，９４３，０２０号；同第６，９３９，５４７号；同第６，９２１，６４５号；同第６，９２１，６４５号；同第６，９２１，５３３号；同第６，９１９，４３３号；同第６，９１９，０７８号；同第６，９１６，４７５号；同第６，９０５，６８１号；同第６，８９９，８７９号；同第６，８９３，６２５号；同第６，８８７，４６８号；同第６，８８７，４６６号；同第６，８８４，５９４号；同第６，８８１，４０５号；同第６，８７８，８１２号；同第６，８７５，５８０号；同第６，８７２，５６８号；同第６，８６７，００６号；同第６，８６４，０６２号；同第６，８６１，５１１号；同第６，８６１，２２７号；同第６，８６１，２２６号；同第６，８３８，２８２号；同第６，８３５，５４９号；同第６，８３５，３７０号；同第６，８２４，７８０号；同第６，８２４，７７８号；同第６，８１２，２０６号；同第６，７９３，９２４号；同第６，７８３，７５８号；同第６，７７０，４５０号；同第６，７６７，７１１号；同第６，７６４，６８８号；同第６，７６４，６８１号；同第６，７６４，６７９号；同第６，７４３，８９８号；同第６，７３３，９８１号；同第６，７３９，３０７号；同第６，７２０，１５号；同第６，７１６，９６６号；同第６，７０９，６５３号；同第６，６９３，１７６号；同第６，６９２，９０８号；同第６，６８９，６０７号；同第６，６８９，３６２号；同第６，６８９，３５５号；同第６，６８２，７３７号；同第６，６８２，７３６号；同第６，６８２，７３４号；同第６，６７３，３４４号；同第６，６５３，１０４号；同第６，６５２，８５２号；同第６，６３５，４８２号；同第６，６３０，１４４号；同第６，６１０，８３３号；同第６，６１０，２９４号；同第６，６０５，４４１号；同第６，６０５，２７９号；同第６，５９６，８５２号；同第６，５９２，８６８号；同第６，５７６，７４５号；同第６，５７２，８５６号；同第６，５６６，０７６号；同第６，５６２，６１８号；同第６，５４５，１３０号；同第６，５４４，７４９号；同第６，５３４，０５８号；同第６，５２８，６２５号；同第６，５２８，２６９号；同第６，５２１，２２７号；同第６，５１８，４０４号；同第６，５１１，６６５号；同第６，４９１，９１５号；同第６，４８８，９３０号；同第６，４８２，５９８号；同第６，４８２，４０８号；同第６，４７９，２４７号；同第６，４６８，５３１号；同第６，４６８，５２９号；同第６，４６５，１７３号；同第６，４６１，８２３号；同第６，４５８，３５６号；同第６，４５５，０４４号；同第６，４５５，０４０号；同第６，４５１，３１０号；同第６，４４４，２０６号；同第６，４４１，１４３号；同第６，４３２，４０４号；同第６，４３２，４０２号；同第６，４１９，９２８号；同第６，４１３，７２６号、同第６，４０６，６９４号；同第６，４０３，７７０号；同第６，４０３，０９１号；同第６，３９５，２７６号；同第６，３９５，２７４号；同第６，３８７，３５０号；同第６，３８３，７５９号；同第６，３８３，４８４号；同第６，３７６，６５４号；同第６，３７２，２１５号；同第６，３５９，１２６号；同第６，３５５，４８１号；同第６，３５５，４４４号；同第６，３５５，２４５号；同第６，３５５，２４４号；同第６，３４６，２４６号；同第６，３４４，１９８号；同第６，３４０，５７１号；同第６，３４０，４５９号；同第６，３３１，１７５号；同第６，３０６，３９３号；同第６，２５４，８６８号；同第６，１８７，２８７号；同第６，１８３，７４４号；同第６，１２９，９１４号；同第６，１２０，７６７号；同第６，０９６，２８９号；同第６，０７７，４９９号；同第５，９２２，３０２号；同第５，８７４，５４０号；同第５，８１４，４４０号；同第５，７９８，２２９号；同第５，７８９，５５４号；同第５，７７６，４５６号；同第５，７３６，１１９号；同第５，７１６，５９５号；同第５，６７７，１３６号；同第５，５８７，４５９号；同第５，４４３，９５３号；同第５，５２５，３３８号を参照されたい。これらは、単に例示的なものであり、広範の他の抗体およびこれらのハイブリドーマが当該分野において公知である。当業者は、ほとんどのあらゆる疾患関連抗原に対する抗体配列または抗体分泌ハイブリドーマが、対象の選択された疾患関連標的に対する抗体に関するＡＴＣＣ、ＮＣＢＩおよび／またはＵＳＰＴＯデータベースの簡単な検索によって得られ得ることを認識するであろう。クローニングされた抗体の抗原結合ドメインは、当該分野で周知の標準的な技術を用いて増幅され、切除され、発現ベクター内にライゲートされ、適合した宿主細胞内にトランスフェクトされ、タンパク質産生に用いられ得る。
抗体フラグメント
【００６３】
特異的なエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術によって生成され得る。抗体フラグメントは、抗体、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖなどの抗原結合部分である。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、抗体分子のペプシン消化によって産生され得、Ｆａｂ’フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を低減することによって生成され得る。代替的には、Ｆａｂ’発現ライブラリが構築されて（Ｈｕｓｅら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７４−１２８１）、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ’フラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にすることができる。抗体フラグメントは、全長抗体のタンパク質分解による加水分解によって、またはフラグメントのためのＤＮＡコーディング大腸菌もしくは別の宿主における発現によって調製され得る。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇによる、米国特許第４，０３６，９４５号および同第４，３３１，６４７号、ならびにこれらに包含される参照文献に記載されており、これらの特許は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。また、Ｎｉｓｏｎｏｆｆら、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０（１９６０）；Ｐｏｒｔｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９（１９５９）、Ｅｄｅｌｍａｎら、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、第１巻、４２２頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９６７）、ならびにＣｏｌｉｇａｎ、２．８．１−２．８．１０および２．１０．−２．１０．４頁を参照されたい。
【００６４】
単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）は、ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含む。該ＶＬドメインとＶＨドメインとが会合して標的結合部位を形成する。これら２つのドメインは、ペプチドリンカー（Ｌ）によりさらに共有結合的に連結される。ｓｃＦｖ分子を作製し適切なペプチドリンカーを設計する方法は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，７０４，６９２号、米国特許第４，９４６，７７８号、Ｒ．ＲａａｇおよびＭ．Ｗｈｉｔｌｏｗ、「Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｆｖｓ」ＦＡＳＥＢ、第９巻：７３−８０（１９９５）ならびにＲ．Ｅ．ＢｉｒｄおよびＢ．Ｗ．Ｗａｌｋｅｒ、「Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｈａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ」、ＴＩＢＴＥＣＨ、第９巻：１３２−１３７（１９９１）に記載されている。
【００６５】
大きなレパートリーを有するｓｃＦｖライブラリは、全ての公知のＶＨ、ＶｋａｐｐａおよびＶ８０遺伝子ファミリーに対応するＰＣＲプライマーを用いて、免疫化されていないヒトドナーからＶ遺伝子を単離することにより構築され得る。例えば、Ｖａｕｇｈｎら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１４：３０９−３１４（１９９６）を参照されたい。増幅後、ＶｋａｐｐａおよびＶｌａｍｂｄａプールが組み合わされて１つのプールを形成する。これらのフラグメントは、ファージミドベクターにライゲートされる。次いで、ｓｃＦｖリンカーは、ＶＬフラグメントの上流のファージミドにライゲートされる。ＶＨおよびリンカー−ＶＬフラグメントは、増幅され、ＪＨ領域でアセンブルされる。得られるＶＨ−リンカー−ＶＬフラグメントは、ファージミドベクターにライゲートされる。ファージミドライブラリは、パニングされて、選択された抗原に結合することができる。
【００６６】
他の抗体フラグメント、例えば単一ドメイン抗体フラグメントは、当該分野において公知であり、特許請求の構築物において用いられてよい。単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）は、標準的な免疫化技術によって、例えば、ラクダ、アルパカまたはラメラから得られ得る（例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら、ＴＩＢＳ  ２６：２３０−２３５、２００１；Ｙａｕら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８１：１６１−７５、２００３；Ｍａａｓｓら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３２４：１３−２５、２００７を参照されたい）。ＶＨＨは、強力な抗原結合能力を有し得、従来のＶＨ−ＶＬ対にアクセル不可能である新規のエピトープと相互作用し得る。（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら、２００１）アルパカ血清ＩｇＧは、約５０％ラクダ重鎖のＩｇＧ抗体のみを含有する（Ｃａｂｓ）（Ｍａａｓｓら、２００７）。アルパカは、公知の抗原によって免疫化されてよく、標的抗原に結合してこれを無効にするＶＨＨが単離され得る（Ｍａａｓｓら、２００７）。全てのアルパカＶＨＨコーディング配列を事実上増幅するＰＣＲプライマーが同定されており、これが用いられてアルパカＶＨＨファージディスプレイライブラリを構築することができ、該ライブラリは、当該分野において周知の標準的なバイオパニング技術による抗体フラグメント単離に用いられ得る（Ｍａａｓｓら、２００７）。これらおよび他の公知の抗原結合抗体フラグメントは、特許請求の方法および組成物において利用されてよい。
抗体クローニングおよび産生のための一般的技術
【００６７】
キメラまたはヒト化抗体の産生などの種々の技術は、抗体のクローニングおよび構築の手順を含み得る。対象の抗体のための抗原結合Ｖκ（可変軽鎖）およびＶＨ（可変重鎖）配列は、種々の分子クローニング手順、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、５’−ＲＡＣＥ、およびｃＤＮＡライブラリスクリーニングによって得られ得る。マウスＭＡｂを発現する細胞からのＭＡｂのＶ遺伝子は、ＰＣＲ増幅によってクローニングされ、配列され得る。これらの信憑性を確認するために、クローニングされたＶＬおよびＶＨ遺伝子は、Ｏｒｌａｎｄｉら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８６：３８３３（１９８９））によって記載されているキメラＡｂとして細胞培養において発現され得る。Ｖ遺伝子配列を基準として、ヒト化ＭＡｂは、次いで、Ｌｅｕｎｇら（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、３２：１４１３（１９９５））によって記載されているように設計および構築され得る。
【００６８】
ｃＤＮＡは、一般の分子クローニング技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９））によってマウスＭＡｂを産生するあらゆる公知のハイブリドーマ系統またはトランスフェクトされた細胞株から調製され得る。ＭＡｂのためのＶκ配列は、ＭＡｂに関するＶκ配列は、プライマーＶＫ１ＢＡＣＫおよびＶＫ１ＦＯＲ（Ｏｒｌａｎｄｉら、１９８９）、またはＬｅｕｎｇら（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１５：２８６（１９９３））により記載された延長プライマー組を用いて増幅され得る。ＶＨ配列は、プライマー対ＶＨ１ＢＡＣＫ／ＶＨ１ＦＯＲ（Ｏｒｌａｎｄｉら、１９８９）、またはＬｅｕｎｇら（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３：４６９（１９９４））により記載されたマウスＩｇＧの定常領域にアニーリングするプライマーを用いて、増幅され得る。ヒト化Ｖ遺伝子は、Ｌｅｕｎｇら（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、３２：１４１３（１９９５））によって記載されているように、長オリゴヌクレオチド鋳型合成とＰＣＲ増幅との組み合わせによって構築され得る。
【００６９】
Ｖκに関するＰＣＲ産物は、例えば、Ｉｇプロモータ、シグナルペプチド配列および好都合な制限部位を含有するｐＢＲ３２７ベースのステージングベクター、ＶＫｐＢＲなどのステージングベクター内にサブクローニングされ得る。ＶＨに関するＰＣＲ産物は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベースのＶＨｐＢＳなどの類似のステージングベクター内にサブクローニングされ得る。プロモータおよびシグナルペプチド配列と共にＶκおよびＶＨ配列を含有する発現カセットは、ＶＫｐＢＲおよびＶＨｐＢＳから切除されて、適切な発現ベクター、例えばｐＫｈおよびｐＧｌｇにそれぞれライゲートされ得る（Ｌｅｕｎｇら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１３：４６９（１９９４））。発現ベクターは、キメラ、ヒト化またはヒトＭＡｂの産生に関してモニタリングされた適切な細胞および上清液内に共トランスフェクトされ得る。代替的には、ＶκおよびＶＨ発現カセットは、Ｇｉｌｌｉｅｓら（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１（１９８９）およびＬｏｓｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ、８０：２６６０（１９９７）においても示されている）によって記載されているように、切除されて、単一発現ベクター、例えばｐｄＨＬ２内にサブクローニングされ得る。
【００７０】
代替的な実施形態において、発現ベクターは、血清不含媒体中でのトランスフェクション、成長および発現に予め適合された宿主細胞内にトランスフェクトされていてよい。用いられ得る例示的な細胞株として、Ｓｐ  ＥＥＥ、Ｓｐ／ＥＳＦおよびＳｐ／ＥＳＦ−Ｘ細胞株（例えば、米国特許第７，５３１，３２７号；同第７，５３７，９３０号および同第７，６０８，４２５号を参照されたい；それぞれの実施例節は、参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。これらの例示的な細胞株は、Ｓｐ２／０骨髄腫細胞株をベースとしており、変異Ｂｃｌ−ＥＥＥ遺伝子によってトランスフェクトされ、メトトレキサートに暴露されて、トランスフェクトされた遺伝子配列を増幅し、タンパク質発現のための血清不含細胞株に予め適合される。
二重特異的および多重特異的抗体
【００７１】
ある一定の実施形態は、二重特異的抗体およびハプテン保有標的化可能な構築物による前標的化方法に関する。二重特異的または多重特異的抗体を産生する多数の方法が公知であり、例えば、米国特許第７，４０５，３２０号に開示されており、実施例節は、参照により本明細書に組み込まれる。二重特異的抗体は、クアドローマ方法によって産生され得、該方法は、それぞれ異なる抗原部位を認識するモノクローナル抗体を産生する２種の異なるハイブリドーマの融合を含む（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ、１９８３；３０５：５３７−５４０）。
【００７２】
二重特異的抗体を産生する別の方法は、ヘテロ二官能性架橋剤を用いて、２種の異なるモノクローナル抗体を化学的に係留する（Ｓｔａｅｒｚら、Ｎａｔｕｒｅ．１９８５；３１４：６２８−６３１；Ｐｅｒｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ．１９８５；３１６：３５４−３５６）。二重特異的抗体はまた、２種の親のモノクローナル抗体の各々をそれぞれ半分の分子に低減させることによって産生することもでき、これらの分子は次いで混合されて再酸化して、ハイブリッド構造を得ることを可能にする（ＳｔａｅｒｚおよびＢｅｖａｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９８６；８３：１４５３−１４５７）。他の方法は、レトロウイルス由来シャトルベクターを介して、別の選択可能なマーカーを各々の親ハイブリドーマ内に遺伝子移入し、その後、これを融合することにより（ＤｅＭｏｎｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９０，８７：２９４１−２９４５）；または異なる抗体の重鎖および軽鎖遺伝子を含有する発現プラスミドを用いたハイブリドーマ細胞株のトランスフェクションにより、ハイブリッドハイブリドーマを生成する効率を改善することを含む。
【００７３】
同族ＶＨおよびＶＬドメインは、先に議論されているように、適切な組成および長さのペプチドリンカー（通常、１２個を超えるアミノ酸残基からなる）と接続されて、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を形成することができる。１２個未満のアミノ酸残基へのペプチドリンカー長の低減は、同じ鎖上でのＶＨおよびＶＬドメインの対合を防止し、他の鎖上でのＶＨおよびＶＬドメインと相補的ドメインとの対合を強いて、結果として機能性多量体の形成をもたらす。３〜１２個の間のアミノ酸残基のリンカーと接続されるＶＨおよびＶＬドメインのポリペプチド鎖は、優先的に二量体（ダイアボディと称される）を形成する。０〜２個の間のアミノ酸残基のリンカーでは、三量体（トリアボディと称される）および四量体（テトラボディと称される）が好ましいが、オリゴマー化の正確なパターンは、リンカー長に加えて、Ｖドメインの組成ならびに配向（ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨ）によると思われる。
【００７４】
多重特異的または二重特異的抗体を産生するためのこれらの技術は、該技術の低収率、精製の必要性、低安定性または労働集約性の点から種々の難点を示す。より最近では、以下にさらに詳細に議論される「ドック・アンド・ロック（ＤＮＬ）」として公知の技術は、事実上あらゆる所望の抗体、抗体フラグメントおよび他のエフェクタ分子の組み合わせを産生するために利用されてきた（例えば、米国特許出願公開第２００６０２２８３５７号；同第２００６０２２８３００号；同第２００７００８６９４２号；同第２００７０１４０９６６号および同第２００７０２６４２６５号を参照されたい）（これらの各々の実施例節は、参照により本明細書に組み込まれる）。ＤＮＬ技術は、裸の抗体部分としての、または他のエフェクタ分子、例えば免疫賦活剤、酵素、化学治療剤、ケモカイン、サイトカイン、診断剤、治療剤、放射性核種、造影剤、抗血管新生剤、成長因子、オリゴヌクレオチド、ホルモン、ペプチド、毒素、プロアポトーシス剤もしくはこれらの組み合わせを組み合わせた単一特異的、二重特異的または多重特異的抗体のアセンブリを可能にする。二重特異的または多重特異的抗体を作製するための当該技術分野において公知の技術のいずれが、本発明の特許請求の方法の実施に利用されてもよい。
ドック・アンド・ロック（ＤＮＬ）
【００７５】
好ましい実施形態において、二重特異的もしくは多重特異的抗体または他の構築物が、ドック・アンド・ロック技法を用いて産生され得る（米国特許第７，５５０，１４３号；同第７，５２１，０５６号；同第７，５３４，８６６号；同第７，５２７，７８７号および同第７，６６６，４００号を参照されたい、これらの実施例節は参照により本明細書に組み込まれる）。ＤＮＬ法は、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の調節（Ｒ）サブユニットとＡ−キナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）のアンカードメイン（ＡＤ）との間に起こる特異的なタンパク質／タンパク質相互作用を利用する（Ｂａｉｌｌｉｅら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．２００５；５７９：３２６４；Ｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００４；５：９５９）。ＰＫＡは、二次メッセンジャーｃＡＭＰとＲサブユニットとの結合により誘発される最良の試験されたシグナル伝達経路のうちの１つにおいて中心的役割を果たし、１９６８年にウサギ骨格筋から最初に単離された（Ｗａｌｓｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９６８；２４３：３７６３）。ホロ酵素の構造は、Ｒサブユニットにより不活性形態で保持される２種の触媒サブユニットからなる（Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８９；２６４：８４４３）。ＰＫＡのアイソザイムは２種類のＲサブユニット（ＲＩおよびＲＩＩ）と共に見出され、それぞれは、αおよびβアイソフォームを有する（Ｓｃｏｔｔ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９９１；５０：１２３）。Ｒサブユニットは、安定な二量体としてのみ単離されており、二量体化ドメインは第１の４４個のアミノ末端残基からなることが示されている（Ｎｅｗｌｏｎら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９９；６：２２２）。ｃＡＭＰとＲサブユニットとの結合は、広範囲のセリン／トレオニンキナーゼ活性に関する活性触媒サブユニットの放出をもたらし、これは、ＡＫＡＰとのそのドッキングを介したＰＫＡの区画化を経て選定された基質に向けられる（Ｓｃｏｔｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９０；２６５：２１５６１）。
【００７６】
第１のＡＫＡＰである微小管関連タンパク質−２は、１９８４年に特徴付けされて以来（Ｌｏｈｍａｎｎら、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９８４；８１：６７２３）、種々の細胞内部位、例えば形質膜、アクチン細胞骨格、核、ミトコンドリアおよび小胞体に局在化する５０を超えるＡＫＡＰが、酵母からヒトまでの範囲の種において多様な構造で同定されてきた（ＷｏｎｇおよびＳｃｏｔｔ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００４；５：９５９）。ＰＫＡに対するＡＫＡＰのＡＤは、１４〜１８個の残基の両親媒性ヘリックスである（Ｃａｒｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１；２６６：１４１８８）。ＡＤのアミノ酸配列は、個々のＡＫＡＰの間でかなり異なり、ＲＩＩ二量体について報告されている結合親和性は２〜９０ｎＭの範囲である（Ａｌｔｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００３；１００：４４４５）。ＡＫＡＰは、二量体Ｒサブユニットのみと結合する。ヒトＲＩＩαについて、ＡＤは、２３個のアミノ末端残基により形成される疎水性表面と結合する（ＣｏｌｌｅｄｇｅおよびＳｃｏｔｔ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９９；６：２１６）。したがって、ヒトＲＩＩαの二量体化ドメインおよびＡＫＡＰ結合ドメインは、両方とも、同じＮ末端の４４個のアミノ酸配列内に位置し、これらは本明細書においてＤＤＤと称される（Ｎｅｗｌｏｎら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９９；６：２２２；Ｎｅｗｌｏｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２００１；２０：１６５１）。
【００７７】
本明細書において、以後、ＡおよびＢと称する任意の２つの存在物を非共有結合錯体にドッキングし、これをさらに、戦略的位置におけるＤＤＤおよびＡＤの両方へのシステイン残基の導入を経て安定に係留された構造内にさらにロックしてジスルフィド結合の形成を容易にすることができるためのリンカーモジュールの優れた一対として、ヒトＲＩＩαのＤＤＤおよびＡＫＡＰのＡＤを利用するためのプラットフォーム技法を我々は開発してきた。「ドック・アンド・ロック」アプローチの一般的方法を、以下に示す。存在物Ａは、ＤＤＤ配列をＡの前駆体に連結して、以後ａと称される第１の成分を結果として生じることにより構築される。ＤＤＤ配列は、二量体の自発的形成を実行するため、Ａはａ２から構成される。存在物Ｂは、ＡＤ配列をＢの前駆体に連結して、以後ｂと呼ばれる第２の成分を結果として生じることにより構築される。ａ２中に含有されるＤＤＤの二量体モチーフは、ｂに含有されるＡＤ配列と結合するためのドッキング部位を作り出し、したがって、ａ２およびｂの即時の会合を容易にして、ａ２およびｂで構成される二元性の三量体錯体を形成する。この結合事象は、その後の反応によって不可逆性にされて、ジスルフィド架橋を介して２種の存在物を共有結合的に固定し、これは、初期の結合相互作用が、ＤＤＤおよびＡＤの両方の上に配置された反応性チオール基を近接させて（Ｃｈｉｍｕｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００１；９８：８４８０）、部位特異的にライゲートするはずであるため、有効局所濃度の原理に基づいて非常に効率的に起こる。リンカー、アダプタモジュールおよび前駆体の種々の組み合わせを用いて、異なる化学量論を有する、限定されないが二量体、三量体、四量体、五量体および六量体ＤＮＬ構築物を含めた広範な種々のＤＮＬ構築物が産生され、用いられ得る（例えば、米国特許第７，５５０，１４３号；同第７，５２１，０５６号；同第７，５３４，８６６号；同第７，５２７，７８７号および同第７，６６６，４００号を参照されたい）。
【００７８】
２種の前駆体の官能基から離れてＤＤＤおよびＡＤを付着することにより、かかる部位特異的なライゲーションは、２種の前駆体の元の活性を保存することも予測される。このアプローチは、本質的にはモジュラーであり、潜在的には、広範囲の活性を有するペプチド、タンパク質、抗体、抗体フラグメントおよび他のエフェクタ部分を含めた広範囲の物質を、部位特異的かつ共有結合的に連結するために適用され得る。以下の実施例に記載されるＡＤおよびＤＤＤ共役エフェクタを構築する融合タンパク質法を利用して、事実上あらゆるタンパク質またはペプチドがＤＮＬ構築物内に組み込まれ得る。しかしながら、該技術は非限定的であり、他の共役方法が利用されてよい。
【００７９】
対象の融合タンパク質をコードする合成二重鎖核酸を産生するための核酸合成、ハイブリッド化および／または増幅を含めた融合タンパク質を作製するための種々の方法が公知である。このような二重鎖核酸は、標準的な分子生物学的技術により、融合タンパク質の産生のために発現ベクター内に挿入され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ，１９８９を参照されたい）。かかる好ましい実施形態において、ＡＤおよび／またはＤＤＤ部分は、エフェクタタンパク質またはペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれに付着されていてもよい。しかしながら、当業者は、エフェクタ部分へのＡＤまたはＤＤＤ部分の付着の部位が、エフェクタ部分の化学的性質ならびにその生理学的活性に関与するエフェクタ部分の一部によって変わり得ることを認識するであろう。種々のエフェクタ部分の部位特異的付着は、当該技術分野において公知の技術を用いて、例えば二価の架橋試薬および／または他の化学的共役技術の使用により実施されてよい。
前標的化
【００８０】
二重特異的または多重特異的抗体は、前標的化技術に利用されてよい。前標的化は、骨髄などの正常な組織に対する望ましくない毒性の一因となる直接標的化抗体の遅い血中クリアランスを解決するために元来開発された多工程プロセスである。前標的化を用いて、放射性核種または他の診断剤もしくは治療剤が、血液から数分以内にクリアランスされる小さな送達分子（標的化可能な構築物）に付着される。前標的化二重特異的または多重特異的抗体は、標的化可能な構築物ならびに標的抗原に関する結合部位を有して、まず投与され、遊離抗体が循環からクリアランスされて、次いで、標的化可能な構築物が投与される。
【００８１】
前標的化方法は、例えば、Ｇｏｏｄｗｉｎら、米国特許第４，８６３，７１３号；Ｇｏｏｄｗｉｎら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：２２６、１９８８；Ｈｎａｔｏｗｉｃｈら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：１２９４、１９８７；Ｏｅｈｒら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：７２８、１９８８；Ｋｌｉｂａｎｏｖら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：１９５１、１９８８；Ｓｉｎｉｔｓｙｎら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３０：６６、１９８９；Ｋａｌｏｆｏｎｏｓら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３１：１７９１、１９９０；Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４８：１６７、１９９１；Ｐａｇａｎｅｌｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：５９６０、１９９１；Ｐａｇａｎｅｌｌｉら、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２：２１１、１９９１；米国特許第５，２５６，３９５号；Ｓｔｉｃｋｎｅｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：６６５０、１９９１；Ｙｕａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：３１１９、１９９１；米国特許第６，０７７，４９９号；同第７，０１１，８１２号；同第７，３００，６４４号；同第７，０７４，４０５号；同第６，９６２，７０２号；同第７，３８７，７７２号；同第７，０５２，８７２号；同第７，１３８，１０３号；同第６，０９０，３８１号；同第６，４７２，５１１号；同第６，９６２，７０２号；および同第６，９６２，７０２号に開示されており、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる。
【００８２】
対象における疾患または障害を処置または診断する前標的化方法は：（１）二重特異的抗体または抗体フラグメントを対象に投与すること；（２）場合によって、クリアランスする組成物を対象に投与し、かつ該組成物が循環から抗体をクリアランスすることを可能にすること；ならびに（３）１種以上のキレート化されたまたは化学的に結合した治療剤または診断剤を含有する標的化可能な構築物を対象に投与することによって提供され得る。
免疫共役体
【００８３】
本明細書に記載されている抗体、抗体フラグメントまたは抗体融合タンパク質のいずれがキレート部分または他の担体分子に共役されて免疫共役体を形成してもよい。キレート部分または他の官能基の共有結合的共役のための方法は、当該分野において公知であり、かかるいずれの公知の方法が利用されてもよい。
【００８４】
例えば、キレート部分または担体が、ジスルフィド結合形成を介して、低減された抗体成分のヒンジ領域で付着され得る。代替的には、かかる剤は、ヘテロ二官能性架橋剤、例えば３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシニル（ＳＰＤＰ）を用いて付着され得る。Ｙｕら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５６：２４４（１９９４）。かかる共役のための一般的な技術は、当該分野において周知である。例えば、Ｗｏｎｇ、ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＣＲＯＳＳ−ＬＩＮＫＩＮＧ  （ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）；  Ｕｐｅｓｌａｃｉｓら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳにおける「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、Ｂｉｒｃｈら（ｅｄｓ．）、１８７−２３０頁（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．１９９５）；ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳにおける、Ｐｒｉｃｅ、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」：ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ、ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ、Ｒｉｔｔｅｒら（ｅｄｓ．）、６０−８４頁（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）を参照されたい。
【００８５】
代替的には、キレート部分または担体は、抗体のＦｃ領域における炭化水素部分を介して共役され得る。抗体炭化水素部分を介して抗体成分にペプチドを共役させる方法は、当業者に周知である。例えば、Ｓｈｉｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４１：８３２（１９８８）；Ｓｈｉｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４６：１１０１（１９９０）；およびＳｈｉｈら、米国特許第５，０５７，３１３号（実施例節は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。一般的な方法は、酸化された炭化水素部分を有する抗体成分を、少なくとも１個の遊離アミン官能基を有する担体ポリマーと反応させることを含む。この反応は、最初のＳｃｈｉｆｆ塩基（イミン）連結を結果として生じ、これは、第二級アミンへの還元によって安定化されて最終共役体を形成することができる。
【００８６】
Ｆｃ領域は、免疫共役体の抗体成分として用いた抗体が抗体フラグメントであるとき、存在しなくてよい。しかし、炭化水素部分を全長抗体または抗体フラグメントの軽鎖可変領域内に導入することが可能である。例えば、Ｌｅｕｎｇら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５９１９（１９９５）；米国特許第５，４４３，９５３号および同第６，２５４，８６８号（実施例節は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。操作された炭化水素部分は、官能基を抗体フラグメントに付着させるのに用いられる。
【００８７】
キレート剤のタンパク質への共役の他の方法が当該分野において周知である（例えば、米国特許出願第７，５６３，４３３号（実施例節は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。キレートは、例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第４，８２４，６５９号に開示されているように、抗体またはペプチドに直接連結されていてよい。
クリックケミストリー
【００８８】
キレート部分、ペプチドまたは他の官能を標的化分子に付着させる代替の方法は、クリックケミストリー反応の使用を含む。クリックケミストリーアプローチは、小さなサブユニットをモジュラー様式で一緒に接続することによって錯体物質を迅速に生成させる方法として元来想到された（例えば、ｏｌｂら、２００４、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ４０：３００４−３１；Ｅｖａｎｓ、２００７、Ａｕｓｔ  Ｊ  Ｃｈｅｍ  ６０：３８４−９５を参照されたい）。種々の形態のクリックケミストリー反応、例えば、「クリック反応」としばしば称されるＨｕｉｓｇｅｎの１，３−双極子環化付加銅触媒反応（Ｔｏｒｎｏｅら、２００２、Ｊ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍ  ６７：３０５７−６４）が当該分野において公知である。他の代替案として、付加環化反応、例えば、（特に、エポキシおよびアジリジン化合物のような張力環への）Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ求核置換反応、尿素化合物のカルボニルの化学的形成、およびチオール−エン反応におけるアルキンなどの炭素−炭素二重結合が関与する反応が挙げられる。
【００８９】
アジドアルキンのＨｕｉｓｇｅｎ付加環化反応は、還元剤の存在下に銅触媒を用いて、第１の分子に付着した末端アルキン基の反応を触媒する。アジド部分を含む第２の分子の存在下に、アジドは、活性化されたアルキンと反応して１，４−置換１，２，３−トリアゾールを形成する。銅触媒反応は室温で起こり、反応生成物の精製がしばしば必要とされないように十分に特異的である（Ｒｏｓｔｏｖｓｔｅｖら、２００２、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ４１：２５９６；Ｔｏｒｎｏｅら、２００２、Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ  ６７：３０５７）。アジドおよびアルキン官能基は、水性媒体において生体分子に大幅に不活性であり、これは、反応が錯体溶液において起こることを可能にする。形成されたトリアゾールは、化学的に安定であり、酵素的開裂に付されず、これにより、クリックケミストリー生成物を生体系において高度に安定にする。銅触媒は生細胞に対して毒性であるが、銅ベースのクリックケミストリー反応は、免疫共役体形成のためにインビトロで用いられ得る。
【００９０】
銅フリークリック反応が生体分子の共有結合的修飾に関して提案されている（例えば、Ａｇａｒｄら、２００４、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２６：１５０４６−４７を参照されたい）。銅フリー反応は、銅触媒の代わりに環歪みを用いて、［３＋２］アジド−アルキン付加環化反応（同上）を促進し、例えば、シクロオクチンは、内部アルキン結合を含む８−炭素環構造である。閉じた環構造は、アセチレンのかなりの結合角度の変形を誘発し、該アセチレンは、アジド基と高度に反応性であり、トリアゾールを形成する。このように、シクロオクチン誘導体は、銅フリークリック反応に用いられ得る（同上）。
【００９１】
別の種類の銅フリークリック反応は、歪み促進アルキン−ニトロン付加環化を包含して、Ｎｉｎｇら（２０１０、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ４９：３０６５−６８）によって報告された。元来のシクロオクチン反応の遅い速度に対処するために、電子求引基が三重結合に隣接して付着される（同上）。かかる置換シクロオクチンの例として、二フッ化シクロオクチン、４−ジベンゾシクロオクチノールおよびアザシクロオクチンが挙げられる（同上）。代替の銅フリー反応は、歪み促進アルキン−ニトロン付加環化を包含して、Ｎ−アルキル化イソオキサゾリンを付与視した（同上）。該反応は、例外的に速い反応速度を有すると報告されており、ペプチドおよびタンパク質の部位特異的な修飾のためのワンポット三工程プロトコルにおいて用いられた（同上）。ニトロンは、適切なアルデヒドとＮ−メチルヒドロキシアミンとの縮合によって調製され、付加環化反応は、アセトニトリルと水との混合物中で生じた（同上）。これらおよび他の公知のクリックケミストリー反応は、キレート部分を抗体または他の標的化分子にインビトロで付着させるのに用いられ得る。
投与の方法
【００９２】
種々の実施形態において、二重特異的抗体および標的化可能な構築物は、正常なまたは罹患した組織および器官を画像化するのに用いられ得る（例えば、それぞれ実施例節において参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，１２６，９１６号；同第６，０７７，４９９号；同第６，０１０，６８０号；同第５，７７６，０９５号；同第５，７７６，０９４号；同第５，７７６，０９３号；同第５，７７２，９８１号；同第５，７５３，２０６号；同第５，７４６，９９６号；同第５，６９７，９０２号；同第５，３２８，６７９号；同第５，１２８，１１９号；同第５，１０１，８２７号；および同第４，７３５，２１０号を参照されたい）。
【００９３】
二重特異的抗体（ｂｓＡｂ）および１８Ｆ標識化された標的化可能な構築物の投与は、標的化可能な構築物の投与の前のいずれかにおいてｂｓＡｂ抗体を投与することによって行われ得る。試薬の用量およびタイミングは、当業者によって容易に考案され得、採用される試薬の特定の性質に依存する。ｂｓＡｂ−Ｆ（ａｂ’）２誘導体がまず付与されると、待機時間は、ひいては、標的化可能な構築物の投与の２４〜７２時間（代替的には４８〜９６時間）前が適切である。ＩｇＧ−Ｆａｂ’ｂｓＡｂ共役体が原発性標的ベクターであると、ひいては、標的化可能な構築物の投与の３〜１０日間前の範囲のより長い期間が指示される。罹患した組織に対する標的へのｂｓＡｂに関して十分な時間が経過した後に、１８Ｆ標識化された標的化可能な構築物が投与される。標的化可能な構築物の投与の後に、画像化が実施され得る。
【００９４】
ある一定の実施形態は、特許出願番号第６０／２２０，７８２号に記載されているように、少なくとも３種の異なる標的結合部位を有する多価の標的結合タンパク質の使用に関する。多価の標的結合タンパク質は、化学リンカーを介していくつかのＦａｂ様フラグメントを架橋することによって作製されている。米国特許第５，２６２，５２４号；同第５，０９１，５４２号およびＬａｎｄｓｄｏｒｐら、Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：６７９−８３（１９８６）を参照されたい。多価の標的結合タンパク質はまた、いくつかの単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）を共有結合的に連結させて単鎖ポリペプチドを形成することによって作製されている。米国特許第５，８９２，０２０号を参照されたい。基本的にはｓｃＦｖ分子の凝集体である多価の標的結合タンパク質が、米国特許第６，０２５，１６５号および同第５，８３７，２４２号に開示されている。３種のｓｃＦｖ分子を含む三価の標的結合タンパク質は、ＫｒｏｔｔらのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０（４）：４２３−４３３（１９９７）に記載されている。
【００９５】
代替的には、「ドック・ロック」（ＤＮＬ）として公知の技術は、以下により詳細に記載されており、２種以上の異なる抗体または抗体フラグメントを含む錯体を含めた種々の多価の錯体の簡単かつ再現可能な構築について実証されている（例えば、米国特許第７，５５０，１４３号；同第７，５２１，０５６号；同第７，５３４，８６６号；同第７，５２７，７８７号および同第７，６６６，４００号を参照されたい。それぞれの実施例節は、参照により本明細書に組み込まれる）。かかる構築物はまた、本発明に記載されている特許請求の方法および組成物の実施のために使用されている。
【００９６】
二重特異的抗体（ｂｓＡｂ）の用量と標的化可能な構築物の用量との間に付与されるクリアランス剤が用いられてよい。新規の機構的な作用のクリアランス剤、すなわち、ｂｓＡｂの疾患標的化アームに対して標的化された、グリコシル化された抗イディオタイプのＦａｂ’フラグメントが用いられてよい。一例において、抗ＣＥＡ（ＭＮ−１４  Ａｂ）×抗ペプチドｂｓＡｂが付与され、疾患標的に最大限に融合される。循環から残りのｂｓＡｂをクリアランスするために、ＷＩ２と称される、ＭＮ−１４に対する抗イディオタイプＡｂが、グリコシル化されたＦａｂ’フラグメントとして好ましくは付与される。クリアランス剤は一価でｂｓＡｂに結合するが、その付随するグリコシル残基は錯体全体を肝臓に配向させ、ここで、迅速な代謝が起こる。次いで、１８Ｆ標識化された標的化可能な構築物が対照に付与される。ｂｓＡｂのＭＮ−１４アームに対するＷＩ２Ａｂは、高い親和性を有し、クリアランス機構は、架橋を含まないため、他の開示されている機構と異なる（Ｇｏｏｄｗｉｎら、同書を参照されたい）、なぜなら、ＷＩ２−Ｆａｂ’は、一価の部分であるからでる。しかし、クリアランス剤の代替的な方法および組成物が公知であり、いずれのかかる公知のクリアランス剤が用いられてもよい。
製剤および投与
【００９７】
１８Ｆ標識化分子は、１種以上の薬学的に好適な賦形剤、１種以上の付加的成分またはこれらのいくつかの組み合わせを含む組成物を得るように処方されてよい。これらは、薬学的に有用な投与量を調製し、それにより活性成分（すなわち、１８Ｆ標識化分子）が１種以上の薬学的に好適な賦形剤との混合物にて組み合わされる公知の方法により達成され得る。滅菌リン酸塩緩衝生理食塩水は、薬学的に好適な賦形剤の一例である。他の好適な賦形剤は、当業者に周知である。例えば、Ａｎｓｅｌら、ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （ＬｅａおよびＦｅｂｉｇｅｒ  １９９０）およびＧｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）ならびにそれらの改訂版を参照されたい。
【００９８】
本明細書に記載されている組成物の好ましい投与経路は、非経口注射である。注射は、静脈内、動脈内、リンパ内、髄腔内、または腔内（すなわち、非経口的に）であり得る。非経口投与では、組成物は、単位投与量注射可能形態で、例えば薬学的に許容される賦形剤に関連して、溶液、懸濁液または乳濁液で処方される。かかる賦形剤は、本来、非毒性および非治療性である。かかる賦形剤の例は、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液およびハンクス溶液である。非水性賦形剤、例えば不揮発性油およびオレイン酸エチルが用いられてもよい。好ましい賦形剤は、生理食塩水中５％のデキストロースである。賦形剤は、緩衝剤および防腐剤を含めた、少量の添加剤、例えば等張性および化学的安定性を向上させる物質を含有していてよい。経口投与を含めた他の投与方法も意図される。
【００９９】
１８Ｆ標識化分子を含む製剤化された組成物は、例えば、ボーラス注射または連続注入を介して、静脈内投与に用いられ得る。注射用の組成物は、単位剤形で、例えばアンプル中または多用量容器中に、付加防腐剤と共に存在し得る。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または乳濁液などの形態をとることもでき、製剤化剤、例えば懸濁剤、安定化剤および／または分散剤を含有することができる。代替的には、組成物は、使用前に、好適なビヒクル、例えば滅菌された発熱物質不含水によって構成するために、粉末形態であり得る。
【０１００】
組成物は、溶液中で投与されてよい。溶液のｐＨは、ｐＨ５〜９．５、好ましくはｐＨ６．５〜７．５の範囲であるべきである。その製剤は、好適な薬学的に許容される緩衝剤、例えばリン酸塩、ＴＲＩＳ（ヒドロキシメチル）アミノメタン−ＨＣｌまたはクエン酸塩などを有する溶液で存在すべきである。緩衝剤の濃度は、１〜１００ｍＭの範囲であるべきである。製剤化された溶液は、５０〜１５０ｍＭの濃度で、塩、例えば塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含有していてもよい。有効量の安定化剤、例えばグリセロール、アルブミン、グロブリン、洗剤、ゼラチン、プロタミンまたはプロタミンの塩が含まれていてもよい。組成物は、哺乳動物に、皮下に、静脈内に、筋肉内に、または他の非経口経路により投与されてよい。さらに、投与は、連続注入であっても、単回または多数回ボーラスによるものであってもよい。
【０１０１】
二重特異的抗体が投与される場合、例えば前標的化技術においては、ヒトに関する投与抗体の投与量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全身病状および既往歴などの因子によって変動する。典型的には、画像化目的のために、単回静脈内注入として約１ｍｇ〜２００ｍｇの範囲である二重特異的抗体の投与量を受容体に提供することが望ましいが、状況によっては、より低いまたはより高い投与量が投与されてもよい。典型的には、約１０ｍｇ／体表面積１ｍ２、または典型的な成人に関しては１７〜１８ｍｇの抗体の範囲である投与量で受容体に提供することが望ましいが、状況により、より低いまたはより高い投与量が投与されてもよい。画像化目的のためにヒト対象に投与され得る二重特異的抗体の投与量の例は、１〜２００ｍｇ、より好ましくは１〜７０ｍｇ、最も好ましくは１〜２０ｍｇであるが、より高いかまたはより低い用量が用いられてもよい。
【０１０２】
概して、投与するための１８Ｆ標識化の投与量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全身病状および既往歴などの因子によって変動する。好ましくは、飽和用量の１８Ｆ標識化分子が患者に投与される。１８Ｆ標識化分子の投与に関して、投与量は、ミリキュリーによって測定されてよい。１８Ｆ画像化試験の典型的範囲は、５〜１０ｍＣｉである。
ペプチドの投与
【０１０３】
特許請求の方法および／または組成物の種々の実施形態は、対象に投与されるべき１種以上の１８Ｆ標識化ペプチドに関し得る。投与は、限定されないが、経口、鼻、頬、吸入、直腸、膣、局所、同所、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、動脈内、髄腔内または静脈内注射を含めた、当該分野で公知のあらゆる経路によって起こり得る。例えば、１８Ｆ標識化ペプチドが前標的化プロトコルで投与される場合、ペプチドは、好ましくは静脈内投与される。
【０１０４】
対象に経口投与される非修飾化ペプチドは消化管において分解され得、配列および構造によって、腸の内層を通した乏しい吸収を示し得る。しかし、内因性プロテアーゼによる分解に対して低感受性にさせ、消化管を通してより吸収可能にさせるようペプチドを化学的に修飾するための方法は、周知である（例えば、Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅら、１９９５，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６９：６０４−１１；Ｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃｒｏｏｋｅ，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：３５１−６９；Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｒｏ，１９９５，ＢＵＲＧＥＲ’Ｓ  ＭＥＤＩＣＩＮＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ，  ＶＯＬ．Ｉ，ｅｄ．Ｗｏｌｌｆ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｏ，１９９６，Ｐｕｒｅ  ＆  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６８：１３０３−０８を参照されたい）。ペプチド類似体、例えばＤ−アミノ酸を含有するペプチド；ペプチドの構造を模倣する有機分子からなるペプチド模倣体；またはペプトイド、例えばビニル性ペプトイドのライブラリを調製する方法も記載されており、対象への経口投与に好適なペプチド系の１８Ｆ標識化分子を構築するのに用いられ得る。
【０１０５】
ある一定の実施形態において、標準的ペプチド結合連結は、１種以上の代替的連結基、例えばＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ＝ＣＨ、ＣＯ−ＣＨ２、ＣＨＯＨ−ＣＨ２などによって置き換えられ得る。ペプチド模倣体を調製する方法は周知である（例えば、Ｈｒｕｂｙ，１９８２，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ３１：１８９−９９；Ｈｏｌｌａｄａｙら、１９８３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２４：４４０１−０４；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅら、１９８２，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｌｌ．２３：２５３３；Ａｌｍｑｕｉｅｓｔら、１９８０，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２−９８；Ｈｕｄｓｏｎら、１９７９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．１４：１７７−１８５；Ｓｐａｔｏｌａら、１９８６，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ３８：１２４３−４９；米国特許第５，１６９，８６２号；同第５，５３９，０８５号；同第５，５７６，４２３号；同第５，０５１，４４８号；同第５，５５９，１０３号）。ペプチド模倣体は、それらのペプチド類似体と比較して、インビボでの向上された安定性および／または吸収を示し得る。
【０１０６】
代替的には、ペプチドは、Ｎ末端および／またはＣ末端キャッピングを用いてエキソペプチダーゼ活性を防止するように経口送達によって投与されてよい。例えば、Ｃ末端は、アミドペプチドを用いてキャッピングされてよく、Ｎ末端は、ペプチドのアセチル化によりキャッピングされてよい。ペプチドはまた、例えば、環状アミド、ジスルフィド、エーテル、スルフィドなどの形成によって、エキソペプチダーゼを阻止するために環化されてもよい。
【０１０７】
ペプチド安定化は、特に、エンドペプチダーゼが作用することが公知である位置において、天然Ｌ−アミノ酸でのＤ−アミノ酸の置換によっても起こり得る。エンドペプチダーゼ結合および開裂配列は当該分野で公知であり、Ｄ−アミノ酸を組み込んでいるペプチドを作製および使用する方法が記載されている（例えば、米国特許出願公開番号２００５００２５７０９（McBrideら）、２００４年６月１４日出願。実施例節は、参照により本明細書に組み込まれる）。ある一定の実施形態において、ペプチドおよび／またはタンパク質は、プロテイナーゼ−および／またはペプチダーゼ阻害剤との同時製剤化により、経口投与され得る。
【０１０８】
治療用ペプチドの経口送達のための他の方法は、Ｍｅｈｔａ（「Ｏｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ」、Ｊｕｎｅ  ２００４，ＢｉｏＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に開示されている。ペプチドは、腸管タンパク質分解活性を調節し、腸管壁を通してのペプチド輸送を向上させる賦形剤を含む腸溶性固体剤形で投与される。この技術を用いた無傷のペプチドの相対的生物学的利用能は、投与される投与量の１％〜１０％の範囲であった。インスリンは、コール酸ナトリウムおよびプロテアーゼ阻害剤と共に腸溶性マイクロカプセルを用いて、イヌにおいて成功裏に投与されている（Ｚｉｖら、１９９４，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１８（Ｓｕｐｐｌ．２）：７９２−９４）。ペプチドの経口投与は、浸透エンハンサとしてのアシルカルニチンならびに腸溶コーティングを用いて実施されている（Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ３０Ｄ−５５，Ｒｏｈｍ  Ｐｈａｒｍａ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｍｅｈｔａ，２００４を参照されたい）。経口投与されるペプチドに使用される賦形剤は、洗剤または他の薬剤と共に腸プロテアーゼ／ペプチダーゼの１種以上の阻害剤を一般に含み、腸溶性カプセルまたは錠剤内に包装され得るペプチドの溶解性または吸収を改善することができる（Ｍｅｈｔａ，２００４）。有機酸は、カプセルに含まれて小腸を酸性化することができ、カプセルが小腸において一旦溶解すると腸管プロテアーゼ活性を抑制することができる（Ｍｅｈｔａ，２００４）。ペプチドの経口送達のための別の代替物としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）系の両親媒性オリゴマーとの共役、増加する吸収、および酵素分解に対する耐性が挙げられる（ＳｏｌｔｅｒｏおよびＥｋｗｕｒｉｂｅ，２００１，Ｐｈａｒｍ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．６：１１０）。
標識化分子を用いた画像化
【０１０９】
標識化分子を用いた画像化方法は当該分野で周知であり、かかるあらゆる公知の方法は、本明細書に開示されている１８Ｆ標識化分子とともに用いられ得る。例えば、米国特許第６，２４１，９６４号；同第６，３５８，４８９号；同第６，９５３，５６７号；ならびに公開されている米国特許出願公開番号第２００５０００３４０３号；同第２００４００１８５５７号；同第２００６０１４０９３６号（各々の実施例節は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。Ｐａｇｅら、Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１：９１１−９１９，１９９４；Ｃｈｏｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５５：５３２３−５３２９，１９９５；Ｚａｌｕｔｓｋｙら、Ｊ．Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄ．，３３：５７５−５８２，１９９２；Ｗｏｅｓｓｎｅｒら、Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｍｅｄ．２００５，５３：７９０−９９も参照されたい。
【０１１０】
ある一定の実施形態において、１８Ｆ標識化分子は、例えば、米国特許第６，１２６，９１６号；同第６，０７７，４９９号；同第６，０１０，６８０号；同第５，７７６，０９５  号；同第５，７７６，０９４号；同第５，７７６，０９３号；同第５，７７２，９８１号；同第５，７５３，２０６号；同第５，７４６，９９６号；同第５，６９７，９０２号；同第５，３２８，６７９号；同第５，１２８，１１９号；同第５，１０１，８２７号；および同第４，７３５，２１０号（それぞれが参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている方法を用いて、正常または罹患した組織および器官を画像化するのに使用され得る。かかる画像化は、適切な標的化分子の直接的な１８Ｆ標識化により、またはＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇら（２００７，Ｕｐｄａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２：１９−３１）；Ｓｈａｒｋｅｙら（２００８，Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ２４６：４９７−５０７）；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら（２００８，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４９：１５８−６３）；Ｓｈａｒｋｅｙら（２００７，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３：５７７７ｓ−５５８５ｓ）；ＭｃＢｒｉｄｅら（２００６，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４７：１６７８−８８）；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら（２００６，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２４：８２３−８５）に記載されているような、前標的化画像化方法により行われ得、米国特許公開番号第２００５０００２９４５号、同第２００４００１８５５７号、同第２００３０１４８４０９号および同第２００５００１４２０７号（それぞれが参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。
【０１１１】
標識化ペプチドまたはＭＡｂを用いた診断的画像化方法が周知である。例えば、免疫シンチグラフィの技術においては、配位子または抗体がガンマ線放出放射性同位体で標識化され、患者に導入される。ガンマカメラが用いられて、ガンマ線放出放射性同位体の位置および分布を検出する。例えば、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ（ｅｄ．），ＲＡＤＩＯＬＡＢＥＬＥＤ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＦＯＲ  ＩＭＡＧＩＮＧ  ＡＮＤ  ＴＨＥＲＡＰＹ  （Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９８８）、Ｃｈａｓｅ「Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅｓ」（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｇｅｎｎａｒｏら、（ｅｄｓ．），ｐｐ．６２４−６５２（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１９９０）、およびＢｒｏｗｎ「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」（ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＰＨＡＲＭＡＣＹ  ２２７−４９）、Ｐｅｚｚｕｔｏら（ｅｄｓ．）（Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ  １９９３）を参照されたい。例えば５１１ｋｅＶのエネルギーを有する陽電子放出核種（ＰＥＴ同位体）、例えば１８Ｆ、６８Ｇａ、６４Ｃｕおよび１２４Ｉの使用も好ましい。かかる放射性核種は、周知のＰＥＴ走査技術により画像化され得る。
【０１１２】
好ましい実施形態において、１８Ｆ標識化ペプチド、タンパク質および／または抗体は、癌の画像化のために使用される。癌の例として、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉種および白血病またはリンパ性悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。かかる癌のさらなる特定の例は下記で記述されるが、例として以下が挙げられる：扁平上皮細胞癌（例えば、上皮扁平上皮細胞癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌および肺扁平上皮癌腫を含めた肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌を含めた胃癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌腫、肛門癌腫、陰茎癌腫および頭頸部癌。用語「癌」は、原発性の悪性細胞または腫瘍（例えば、対象の身体において、元の悪性腫瘍部位または腫瘍部位以外に細胞が移動していないもの）および続発性の悪性細胞または腫瘍（例えば、転移（悪性細胞または腫瘍細胞が元の腫瘍部位と異なる第２部位に移動すること）から生じるもの）を含む。
【０１１３】
癌または悪性腫瘍の他の例として、限定されないが、小児急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌腫、成人（原発性）肝細胞癌、成人（原発性）肝臓癌、成人急性リンパ球性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキン病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ球性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝臓癌、成人軟部組織肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ＡＩＤＳ関連悪性腫瘍、肛門癌、星状細胞腫、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、腎盂および尿管の癌、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、子宮頸癌、小児（原発性）肝細胞癌、小児（原発性）肝臓癌、小児急性リンパ芽球性白血病、小児急性骨髄性白血病、小児脳幹神経膠腫、小児小脳星状細胞腫、小児大脳星状細胞腫、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、小児ホジキン病、小児ホジキンリンパ腫、小児視床下部および視覚路神経膠腫、小児リンパ芽球性白血病、小児髄芽細胞腫、小児非ホジキンリンパ腫、小児松果体およびテント上原始神経外胚葉腫瘍、小児原発性肝臓癌、小児横紋筋肉腫、小児軟部組織肉腫、小児視覚経路および視床下部神経膠腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、内分泌膵島細胞癌腫、子宮内膜癌、上衣腫、上皮癌、食道癌、ユーイング肉腫および関連腫瘍、膵外分泌癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、女性乳癌、ゴーシェ病、胆嚢癌、胃癌、胃腸管カルチノイド腫瘍、胃腸管腫瘍、生殖細胞腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍、ヘアリー細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキン病、ホジキンリンパ腫、高ガンマグロブリン血症、下咽頭癌、腸管癌、眼内黒色腫、島細胞癌腫、島細胞膵臓癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、口唇および口腔癌、肝臓癌、肺癌、リンパ球増殖性障害、マクログロブリン血症、男性乳癌、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽細胞腫、黒色腫、中皮腫、転移性潜在性原発性扁平上皮頸部癌、転移性原発性扁平上皮頸部癌、転移性扁平上皮頸部癌、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、骨髄性白血病、骨髄増殖性障害、鼻腔および副鼻腔の癌、鼻咽頭癌、神経細胞芽腫、妊娠中の非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚癌、非小細胞肺癌、潜在性原発性転移性扁平上皮頸部癌、口腔咽頭癌、骨肉腫／悪性線維性肉腫、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣上皮癌、卵巣生殖細胞腫瘍、卵巣低悪性度潜在性腫瘍、膵臓癌、異常タンパク血症、紫斑病、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、形質細胞新生物／多発性骨髄腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓細胞癌、腎盂および尿管癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮頸部癌、胃癌、テント上原子神経外胚葉および松果体腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂および尿管の移行細胞癌、移行性の腎盂および尿管癌、絨毛性腫瘍、尿管および腎盂細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視覚経路および視床下部神経膠腫、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウイルムス腫瘍、ならびに先に列挙した器官系に存在する新生組織以外のあらゆる他の過剰増殖性疾患が挙げられる。
【０１１４】
本明細書に記載されている特許請求の方法および組成物は、悪性または前悪性症状を検出または診断するのに用いられ得る。かかる使用は、新生組織または癌への進行前であることが分かっているまたは疑われる状態、特に、過形成、化生または最も特定的には異形成からなる非腫瘍性の細胞成長が生じた場合に示される（かかる異常な成長状態の検討には、Ｒｏｂｂｉｎｓ  ａｎｄ  Ａｎｇｅｌｌ，  Ｂａｓｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐｐ．６８‐７９（１９７６）を参照されたい）。
【０１１５】
異形成は癌の前兆である場合が多く、主として上皮に見出される。異形成は、非新生物性細胞成長の最も無秩序な形態であり、個々の細胞の均一性および細胞の構造的配向の喪失を含む。異形成は、慢性的な刺激または炎症が存在するところに特徴的に生じる。検出され得る異形成障害として、限定されないが、無汗性外胚葉性異形成、前後異形成、窒息性胸郭異形成、心房指異形成、気管支肺異形成、大脳異形成、子宮頸部異形成、軟骨外胚葉性異形成、鎖骨頭蓋異形成、先天性外胚葉性異形成、頭蓋骨幹異形成、頭蓋手根足根骨異形成、頭蓋骨幹端異形成、象牙質異形成、骨幹異形成、外胚葉性異形成、エナメル質異形成、脳眼異形成、骨端半肢異形成、多発性骨端異形成、点状骨端異形成、上皮異形成、顔面指趾生殖器異形成、家族性線維性顎異形成、家族性白色襞性異形成、線維筋性異形成、骨線維性異形成、開花性骨異形成、遺伝性腎網膜異形成、発汗性外胚葉性異形成、発汗減少症性外胚葉性異形成、リンパ性減少性胸腺異形成、乳腺異形成、下顎顔面異形成、骨幹端異形成、モンディーニ異形成、単骨性線維性骨異形成、粘膜上皮異形成、多発性骨端異形成、眼耳脊椎異形成、眼歯指異形成、眼脊椎異形成、歯牙異形成、眼下顎異形成、根尖端セメント質異形成、多骨性線維性骨異形成、偽軟骨発育不全脊椎骨端異形成、網膜異形成、眼中隔異形成、脊椎骨端異形成および心室橈骨異形成が挙げられる。
【０１１６】
検出され得るさらなる前新生物性障害として、限定されないは、良性の異常増殖性障害（例えば、良性腫瘍、線維嚢胞性症状、組織肥大、腸管ポリープ、結腸ポリープおよび食道異形成）、白板症、角化症、ボーエン病、農夫皮膚、日光口唇炎および日光角化症が挙げられる。
【０１１７】
さらなる過剰増殖性の疾患、障害および／または状態として、限定されないが、悪性腫瘍および関連障害、例えば、白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤血白血病を含む））および慢性白血病（例えば、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病））、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、ならびに、限定されないが、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌腫、基底細胞癌腫、腺癌腫、汗腺癌腫、脂腺癌腫、乳頭癌腫、乳頭腺癌、嚢胞腺癌腫、髄様癌腫、気管支原性癌腫、腎臓細胞癌腫、肝癌、胆管癌腫、絨毛癌腫、精上皮腫、胚性癌腫、ウイルムス癌腫、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌腫、小細胞肺癌腫、膀胱癌腫、上皮癌腫、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経細胞芽腫および網膜芽細胞腫などの肉腫および癌腫を含めた固形腫瘍の進行および／または転移が挙げられる。
【０１１８】
好ましい実施形態において、特許請求の組成物および方法を用いて処置され得る疾患として、心臓血管疾患、例えば、フィブリン凝血、アテローム性動脈硬化症、心筋虚血および梗塞が挙げられる。フィブリン（例えば、ｓｃＦｖ（５９Ｄ８）；Ｔ２Ｇ１ｓ；ＭＨ１）に対する抗体は公知であり、上記凝血および肺動脈塞栓を開示するための造影剤として臨床試験流であるが、抗顆粒球抗体、例えば、ＭＮ−３、ＭＮ−１５、抗ＮＣＡ９５、および抗ＣＤ１５抗体は、心筋梗塞および心筋虚血を標的とすることができる（例えば、米国特許第５，４８７，８９２号；同第５，６３２，９６８号；同第６，２９４，１７３号；同第７，５４１，４４０号を参照されたい。これらの実施例節は参照により本明細書に組み込まれる）。抗マクロファージ、抗低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および抗ＣＤ７４（例えば、ｈＬＬ１）抗体は、アテローム性動脈硬化プラークを標的とするのに用いられ得る。アブシキシマブ（抗糖タンパク質Ｉｌｂ／ＩＩＩａ）は、経皮冠動脈インターベンションにおける再狭窄の予防および不安定狭心症の処置のためのアジュバント使用について承認されている（Ｗａｌｄｍａｎｎら、２０００、Ｈｅｍａｔｏｌ  １：３９４−４０８）。抗ＣＤ３抗体は、アテローム性動脈硬化症の発症および進行を低減することが報告されている（Ｓｔｅｆｆｅｎｓら、２００６、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１４：１９７７−８４）。ＭＩＦ抗体を阻止することによる処置は、確立されたアテローム性動脈硬化症の退行を誘発することが報告されている（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄ  ａｎｄ  Ｓｅｓｓａ、２０１０、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ８６：１７１−７３）。酸化されたＬＤＬに対する抗体はまた、マウスモデルにおいて確立されたアテローム性動脈硬化症の退行も誘発した（Ｇｉｎｓｂｅｒｇ、２００７、Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ５２：２３１９−２１）。抗ＩＣＡＭ−１抗体は、ラットにおける大脳動脈閉塞後に虚血細胞傷害を低減することが示された（Ｚｈａｎｇら、１９９４、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ４４：１７４７−５１）。白血球抗原に対する市販のモノクローナル抗体は：正常なＴ−リンパ球に結合するＯＫＴ抗Ｔ−細胞モノクローナル抗体（Ｏｒｔｈｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能）；ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ４４、ＨＢ５５、ＨＢ１２、ＨＢ７８およびＨＢ２を有するハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体；Ｇ７Ｅ１１、Ｗ８Ｅ７、ＮＫＰ１５およびＧ０２２（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）；ＮＥＮ９．４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ）；ならびにＦＭＣ１１（Ｓｅｒａ  Ｌａｂｓ）によって表される。フィブリンおよび血小板抗原に対する抗体の記載は、Ｋｎｉｇｈｔ、Ｓｅｍｉｎ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ、２０：５２−６７（１９９０）に含まれる。
【０１１９】
一実施形態において、本発明の医薬組成物は、アミロイドーシスなどの代謝疾患、または神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、ハンチントン病、オリーブ橋小脳萎縮症、多系統萎縮症、進行性核上麻痺、びまん性レビー小体病、皮質基底核変性症、進行性家族性ミオクローヌスてんかん、線条体黒質変性症、捻転ジストニア、家族性振戦、ダウン症、ジル・ドゥ・ラ・トゥレット症候群、ハレルフォルデンスパッツ病を有する対象を処置するのに用いられ得る。バピネオズマブは、アルツハイマー病の治療に関して臨床試験中である。アルツハイマー病の治療について提案されている他の抗体として、Ａｌｚ５０（Ｋｓｉｅｚａｋ−Ｒｅｄｉｎｇら、１９８７、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６３：７９４３−４７）、ガンテネルマブおよびソラネズマブが挙げられる。インフリキシマブ、抗ＴＮＦ−ａ抗体は、アミロイドプラークを低減し、認知を改善することが報告されている。カナダの国際寄託当局に寄託されているハイブリドーマ細胞株（受託番号ＡＤＩ−２９０８０６−０１、ＡＤＩ−２９０８０６−０２、ＡＤＩ−２９０８０６−０３）によって産生される、変異ＳＯＤ１に対する抗体は、ＡＬＳ、パーキンソン病およびアルツハイマー病の治療について提案されている（米国特許出願公開第２００９００６８１９４号を参照されたい）。抗ＣＤ３抗体は、Ｉ型糖尿病の治療について提案されている（Ｃｅｒｎｅａら、２０１０、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂ  Ｒｅｖ  ２６：６０２−０５）。また、本発明の医薬組成物は、免疫異常調節障害、例えば、移植片対宿主病または移植臓器拒絶を有する対象を処置するのに用いられ得る。
【０１２０】
検出、診断、および／または画像化され得る先に列挙した例示的症状は、限定的でない。当業者は、抗体、抗体フラグメントまたは標的化ペプチドが、広範の状態、例えば、自己免疫疾患、心臓血管性疾患、神経変性疾患、代謝疾患、癌、感染性疾患および過剰増殖性疾患に関して公知であることに気づくであろう。１８Ｆ標識化分子、例えば、タンパク質またはペプチドが、本明細書に記載されている方法により調製および利用され得るあらゆるかかる状態は、本明細書に記載されているように画像化、診断および／または検出され得る。
キット
【０１２１】
種々の実施形態は、標識化された化合物を用いて、患者において罹患した組織を画像化、診断および／または検出するのに好適な成分を含有するキットに関する。例示的なキットは、本明細書に記載されているような前標的化方法に使用される抗体、フラグメントまたは融合タンパク質、例えば二重特異的抗体を含有し得る。他の成分は、かかる二重特異的抗体と共に使用する標的化可能な構築物を含み得る。好ましい実施形態において、標的化可能な構築物は、Ａｌ１８Ｆ錯体または１８Ｆと異なる金属との錯体を付着させるために用いられ得るキレート基と前共役される。しかし、代替の実施形態において、キレート剤は、Ａｌ１８Ｆキレート化部分と標的化可能な構築物は、１種以上の異なる診断剤、例えば６５Ｇａに付着され得ることが意図される。
【０１２２】
投与のための成分を含有する組成物が、消化管を介した送達、例えば、経口送達によって処方されるとき、いくつかの他の経路を経てキット成分を送達することが可能なデバイスが含まれていてよい。非経口送達などの適用のためのデバイスの１種は、対象の身体内に組成物を注射するのに用いられるシリンジである。吸入デバイスもまた、ある一定の適用に用いられ得る。
【０１２３】
キット成分は、一緒に包装されていても、２個以上の容器に分離されていてもよい。いくつかの実施形態において、容器は、再構成に好適である組成物の滅菌凍結乾燥製剤を含有するバイアルであってよい。キットはまた、他の試薬の再構成および／または希釈に好適な１腫以上の緩衝剤を含有していてもよい。用いられ得る他の容器として、限定されないが、ポーチ、トレイ、箱、チューブなどが挙げられる。キット成分は、容器内に包装され、滅菌保持され得る。含まれ得る別の成分は、その使用のためのキットを用いるヒトへの使用説明書である。
実施例
実施例１．ペプチドＩＭＰ２７２の１８Ｆ標識化
【０１２４】
調製し、１８Ｆ標識化した第１のペプチドは、ＩＭＰ２７２であった：ＤＴＰＡ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（配列番号：３）
【０１２５】
酢酸塩緩衝溶液−酢酸１．５０９ｇを約１６０ｍＬの水中で希釈し、１Ｍ  ＮａＯＨの付加によってｐＨを調整し、次いで、２５０ｍＬに希釈して、ｐＨ４．０３の０．１Ｍの溶液を作製した。
【０１２６】
酢酸アルミニウム緩衝溶液−４２．６ｍＬの脱イオン水中に０．１０２８ｇのＡｌＣｌ３・六水和物を溶解することにより、アルミニウムの溶液を調製した。アルミニウム溶液の４ｍＬのアリコートを、１６ｍＬの０．１ＭのＮａＯＡｃ溶液（ｐＨ４）と混合して、２ｍＭのＡｌストック溶液を得た。
【０１２７】
ＩＭＰ２７２酢酸塩緩衝溶液−３６４μＬの０．１Ｍ酢酸塩緩衝溶液（ｐＨ４）中にペプチド０．００１１ｇ（７．２８×１０−７ｍｏｌ  ＩＭＰ２７２）を溶解して、ペプチドの２ｍＭストック溶液を得た。
【０１２８】
ＩＭＰ２７２のＦ−１８標識化−アルミニウムストック溶液の３μＬのアリコートをＲＥＡＣＴＩ−ＶＩＡＬ（商標）中に入れて、５０μＬの１８Ｆ（受容する場合）および３μＬのＩＭＰ２７２溶液と混合した。溶液を、１１０℃で１５分間、加熱ブロック中で加熱し、逆相ＨＰＬＣにより分析した。ＨＰＬＣトレース（示さず）は、９３％の遊離１８Ｆ、および７％のペプチドとの結合を示した。さらに１０μＬのＩＭＰ２７２を反応物に付加し、再び加熱し、逆相ＨＰＬＣ（示さず）により分析した。ＨＰＬＣトレースは、空隙容量の８％の１８Ｆ、およびペプチドに付着された活性の９２％を示した。残りのペプチド溶液を、室温で約１時間、１５０μＬのＰＢＳと共にインキュベートし、次いで、逆相ＨＰＬＣにより検査した。ＨＰＬＣ（示さず）は、ペプチドと結合していない５８％の１８Ｆおよび４２％の、ペプチドに依然として付着しているものを示した。データは、１８Ｆ−Ａｌ−ＤＴＰＡ錯体が、リン酸塩と混合されると不安定になり得るということを示す。
実施例２．他の金属によるＩＭＰ２７２１８Ｆ標識化
【０１２９】
金属ストック溶液（６×１０−９ｍｏｌ）の約３μＬのアリコートをポリプロピレン円錐バイアル中に入れ、７５μＬの１８Ｆ（受容する場合）と混合し、室温で約２分間インキュベートし、次いで、０．１ＭのＮａＯＡｃ緩衝剤（ｐＨ４）中の２ｍＭ（４×１０−８ｍｏｌ）ＩＭＰ２７２溶液（２０μＬ）と混合した。溶液を、１００℃で１５分間、加熱ブロック中で加熱し、逆相ＨＰＬＣにより分析した。ＩＭＰ２７２を、インジウム（２４％）、ガリウム（３６％）、ジルコニウム（１５％）、ルテチウム（３７％）およびイットリ ウム（２％）で標識化した（示さず）。これらの結果は、１８Ｆ金属標識化技術が、アルミニウム配位子に限定されないが、同様に他の金属も利用し得ることを実証する。異なる金属配位子によって、異なるキレート化部位を利用してＦ−１８−金属共役体の結合を最適化することができる。
実施例３．血清安定性１８Ｆ標識化ペプチドＩＭＰ４４９の産生および使用
ＩＭＰ４４９
ＮＯＴＡ−ＩＴＣベンジル−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（配列番号：４）
【０１３０】
以下のアミノ酸を示す順序で樹脂に付加することにより、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂にペプチドＩＭＰ４４８Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋１００９を作製した：Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨ。Ａｌｏｃを切断し、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨ、Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨを付加し、Ａｌｏｃを切断し、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨを付加して、最後にＦｍｏｃ開裂して、所望のペプチドを作製した。次いで、ペプチドを樹脂から開裂し、ＨＰＬＣにより精製して、ＩＭＰ４４８を産生し、次いでＩＴＣ−ベンジルＮＯＴＡとカップリングさせた。
【０１３１】
ＩＭＰ４４８（０．０７５７ｇ、７．５×１０−５ｍｏｌ）を０．０５０９ｇ（９．０９×１０−５ｍｏｌ）ＩＴＣベンジルＮＯＴＡと混合して、１ｍＬの水に溶解した。次いで、無水炭酸カリウム（０．２１７１ｇ）を撹拌したペプチド／ＮＯＴＡ溶液にゆっくりと添加した。炭酸塩を全て添加した後、反応溶液はｐＨ１０．６となった。反応物を室温で一晩撹拌した。反応物を１４時間後に１Ｍ  ＨＣｌで注意深くクエンチし、ＨＰＬＣにより精製して、４８ｍｇのＩＭＰ４４９を得た。
ＩＭＰ４４９の１８Ｆ標識化
【０１３２】
ＩＭＰ４４９（０．００２ｇ，１．３７×１０−６ｍｏｌ）を、６８６μＬ（２ｍＭペプチド溶液）の０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０２）中に溶解した。ｐＨ４の酢酸塩緩衝剤中のＡｌの２ｍＭ溶液（３μＬ）を、１５μＬの、１．３ｍＣｉの１８Ｆと混合した。次いで該溶液を２０μＬの２ｍＭ  ＩＭＰ４４９と混合し、１０５℃で１５分間加熱した。逆相ＨＰＬＣ分析は、活性の３５％（ｔＲ約１０分）がペプチドに付着され、活性の６５％がカラムのボイド容量で溶離された（３．１分、図示せず）ことを示したが、このことは、活性の大部分がペプチドと関連しなかったことを示す。粗標識化混合物（５μＬ）を、プールしたヒト血清と混合し、３７℃でインキュベートした。アリコートを１５分後に取り出し、ＨＰＬＣにより分析した。ＨＰＬＣは、活性の９．８％が依然としてペプチドに付着されている（３５％から下降）ことを示した。別のアリコートを１時間後に取り出し、ＨＰＬＣにより分析した。ＨＰＬＣは、活性の７．６％が依然としてペプチドに付着されている（３５％から下降）ことを示したが、これは、１５分トレースと本質的に同じであった（データは図示せず）。
高線量の１８Ｆ標識化
【０１３３】
精製ＩＭＰ４４９を用いたさらなる試験は、１８Ｆ標識化ペプチドが、ヒト血清中、３７℃で少なくとも１時間、高度に安定であり（９１％、図示せず）、ヒト血清中、３７℃で少なくとも４時間、部分的に安定である（７６％、図示せず）ことを実証した。ＩＭＰ４４９を安定化剤としてのアスコルビン酸の存在下で調製するさらなる試験を実施した。それらの試験（示さず）において、金属−１８Ｆ−ペプチド錯体は、３７℃で４時間後の血清中で検出可能な分解を示さなかった。１８Ｆ標識化ペプチドの注射の３０分後のマウス尿は、ペプチドと結合された１８Ｆを含有することが分かった（示さず）。これらの結果は、本明細書に開示されている１８Ｆ標識化ペプチドが、１８Ｆ画像化試験に用いられるのに十分な安定性を適切なインビボ条件下で示すことを実証する。
【０１３４】
ＩＭＰ４４９ペプチドは、放射線分解に敏感であるチオウレア連結を含有するため、いくつかの生成物がＲＰ−ＨＰＬＣによって観察される。しかし、アスコルビン酸が反応混合物に添加されると、精製される副生成物は著しく低減する。
実施例４．前標的化による１８Ｆ画像化のためのＤＮＬ構築物の調製
【０１３５】
ＤＮＬ技術は、事実上あらゆる抗体もしくはそのフラグメントまたは他のエフェクタ部分を含む二量体、三量体、四量体、六量体などを作製するのに用いられ得る。ある一定の好ましい実施形態に関して、ＩｇＧ抗体、Ｆａｂフラグメントまたは他のタンパク質は、ＤＤＤ（二量体化およびドッキングドメイン）またはＡＤ（アンカードメイン）配列を含有する融合タンパク質として産生され得る。二重特異的抗体は、第１抗体のＦａｂ−ＤＤＤ融合タンパク質を第２抗体のＦａｂ−ＡＤ融合タンパク質と組み合わせることにより形成され得る。代替的には、ＩｇＧ−ＡＤ融合タンパク質をＦａｂ−ＤＤＤ融合タンパク質と組み合わせる構築物を作製することができる。１８Ｆ検出の目的のために、画像化されるべき標的組織、例えば腫瘍と関連した抗原のための結合部位を含有する抗体またはフラグメントは、金属−１８Ｆが付着され得るＩＭＰ４４９などの標的化可能な構築物上のハプテンを結合する第２の抗体またはフラグメントと組み合わされてよい。二重特異的抗体（ＤＮＬ構築物）を対象に投与し、循環抗体を血液からクリアランスして、標的組織に局在化させ、１８Ｆ標識化された標的化可能な構築物を添加し、局在化された抗体を画像化のために結合させる。
【０１３６】
独立したトランスジェニック細胞株を、各々のＦａｂまたはＩｇＧ融合タンパク質に関して開発し得る。一旦産生されると、モジュールを所望により精製し、または細胞培養上清液中に保持することができる。産生後、任意のＤＤＤ２−融合タンパク質モジュールを任意の対応するＡＤ−融合タンパク質モジュールと組み合わせて、二重特異的ＤＮＬ構築物を生成することができる。異なる種類の構築物に関しては、異なるＡＤまたはＤＤＤ配列を利用し得る。
【０１３７】
以下のＤＤＤ配列は、ＰＫＡ  ＲＩＩαのＤＤＤ部分をベースとしているが、ＡＤ配列は、最適化された合成ＡＫＡＰ−ＩＳ配列のＡＤ部分をベースとしている（Ａｌｔｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００３；１００：４４４５）。
ＤＤＤ１：ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号：６）
ＤＤＤ２：ＣＧＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号：７）
ＡＤ１：ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号：８）
ＡＤ２：ＣＧＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡＧＣ（配列番号：９）
【０１３８】
プラスミドベクターｐｄＨＬ２は、多数の抗体および抗体系構築物を産生するのに用いられてきた（Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８９），１２５：１９１−２０２；Ｌｏｓｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ（Ｐｈｉｌａ）（１９９７），８０：２６６０−６を参照されたい）。二シストロン性哺乳動物発現ベクターは、ＩｇＧの重および軽鎖の合成を指向する。ベクター配列は、多くの異なるＩｇＧ−ｐｄＨＬ２構築物に関してほぼ同じであり、差は可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）配列に存在するだけである。当業者に公知の分子生物学ツールを用いて、これらのＩｇＧ発現ベクターをＦａｂ−ＤＤＤまたはＦａｂ−ＡＤ発現ベクターに転換することができる。Ｆａｂ−ＤＤＤ発現ベクターを生成するために、重鎖のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに関するコード配列をヒンジの第１の４の残基、１４の残基Ｇｌｙ−ＳｅｒリンカーおよびヒトＲＩＩαの第１の４４残基に置き換える（ＤＤＤ１と称される）。Ｆａｂ−ＡＤ発現ベクターを生成するために、ＩｇＧのヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに関する配列を、ヒンジの第１の４の残基、１５の残基Ｇｌｙ−ＳｅｒリンカーおよびＡＫＡＰ−ＩＳと呼ばれる１７の残基合成ＡＤに置き換え（ＡＤ１と称される）、これは、バイオインフォーマティクスおよびペプチドアレイ技術を用いて生成され、非常に高い親和性（０．４ｎＭ）でＲＩＩαを結合することが示された。Ａｌｔｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００３），１００：４４４５−５０も参照されたい。
【０１３９】
以下に記載するように、Ｆａｂ−ＤＤＤ１またはＦａｂ−ＡＤ１発現ベクターへのＩｇＧ−ｐｄＨＬ２ベクターの転換を容易にするように２個のシャトルベクターを設計した。
ＣＨ１の調製
【０１４０】
ＣＨ１ドメインを、鋳型としてｐｄＨＬ２プラスミドベクターを用いたＰＣＲによって増幅した。左ＰＣＲプライマーは、ＣＨ１ドメインの上流（５’）末端およびＳａｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＣＨ１コード配列の５’である）で構成された。右プライマーは、ヒンジの第１の４の残基（ＰＫＳＣ）と、その後の４のグリシンおよびセリンをコードする配列と、ＢａｍＨＩ制限部位を含む最後の２のコドン（ＧＳ）とで構成された。４１０ｂｐＰＣＲ増幅体をｐＧｅｍＴ  ＰＣＲクローニングベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．）中にクローン化し、クローンをＴ７（５’）配向の挿入物についてスクリーニングした。
【０１４１】
二重鎖オリゴヌクレオチドを合成して、ＢａｍＨＩ制限部位を含む第１の２個のコドンによって、リンカーペプチドの１１残基が先行するＤＤＤ１のアミノ酸配列をコードした。停止コドンおよびＥａｇｌ制限部位を３’末端に付随させる。下線を付したＤＤＤ１の配列を有する、コードされたポリペプチド配列を以下に示す：
【化１】
2013512918.tif 000003
【０１４２】
それぞれの３’末端上の３０塩基対で重複するＲＩＩＡ１−４４トップおよびＲＩＩＡ１−４４ボトムと表記される２個のオリゴヌクレオチドを合成し（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ）、１７４ｂｐＤＤＤ１配列の中央の１５４塩基対を含むよう組み合わせた。オリゴヌクレオチドをアニーリングし、Ｔａｑポリメラーゼを用いてプライマー伸長反応に付した。プライマー伸長後、二重鎖をＰＣＲにより増幅した。増幅体をｐＧｅｍＴ中にクローン化し、Ｔ７（５’）配向での挿入物についてスクリーニングした。
【０１４３】
二重鎖オリゴヌクレオチドを合成して、ＢａｍＨＩ制限部位を含む第１の２個のコドンによって、リンカーペプチドの１１残基が先行するＤＤＤ１のアミノ酸配列をコードした。停止コドンおよびＥａｇｌ制限部位を３’末端に付随させる。下線を付したＡＤ１の配列を有する、コードされたポリペプチド配列を以下に示す：
【化２】
2013512918.tif 000004
【０１４４】
ＡＫＡＰ−ＩＳトップおよびＡＫＡＰ−ＩＳボトムと表記される上記ペプチド配列をコードする２つの相補的重複オリゴヌクレオチドを合成し、アニーリングした。二重鎖をＰＣＲにより増幅した。増幅体をｐＧｅｍＴベクター中にクローニングし、Ｔ７（５’）配向における挿入物についてスクリーニングした。
ＤＤＤ１とＣＨ１とのライゲーティング
【０１４５】
ＤＤＤ１配列をコードする１９０ｂｐフラグメントをＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限酵素でｐＧｅｍＴから切除し、次いで、ＣＨ１−ｐＧｅｍＴにおける同じ部位にライゲートし、シャトルベクターＣＨ１−ＤＤＤ１−ｐＧｅｍＴを生成した。
ＡＤ１とＣＨ１とのライゲーティング
【０１４６】
ＡＤ１配列を含有する１１０ｂｐフラグメントをＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限酵素でｐＧｅｍＴから切除し、次いで、ＣＨ１−ｐＧｅｍＴにおける同じ部位にライゲートし、シャトルベクターＣＨ１−ＡＤ１−ｐＧｅｍＴを生成した。
ｐｄＨＬ２系ベクター中へのＣＨ１−ＤＤＤ１またはＣＨ１−ＡＤ１のクローニング
【０１４７】
このモジュラー設計により、ＣＨ１−ＤＤＤ１またはＣＨ１−ＡＤ１をｐｄＨＬ２ベクター中のいずれのＩｇＧ構築物中に組み込んでもよい。ｐｄＨＬ２からＳａｃＩＩ／ＥａｇＩ制限断片（ＣＨ１−ＣＨ３）を除去し、それを、それぞれのｐＧｅｍＴシャトルベクターから切除したＣＨ１−ＤＤＤ１またはＣＨ１−ＡＤ１のＳａｃＩＩ／ＥａｇＩフラグメントと置き換えることにより、全重鎖定常ドメインを、上記構築物のうちの１つと置き換える。
ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤｌ−ｐｄＨＬ２の構築
【０１４８】
ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ１−ｐｄＨＬ２は、１４のアミノ酸残基から構成されるフレキシブルＧｌｙ／Ｓｅｒペプチドスペーサを介してＦｄのＣＨ１ドメインのカルボキシル末端にカップリングされるＡＤ１を有するｈ６７９Ｆａｂの産生のための発現ベクターである。ＳａｃＩＩおよびＥａｇＩによってＣＨ１−ＡＤ１−ＳＶ３シャトルベクターから切除したＣＨ１−ＡＤ１フラグメントとＳａｃＩＩ／ＥａｇＩフラグメントを置き換えることにより、ｈ６７９の可変ドメインを含有するｐｄＨＬ２系ベクターをｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ１−ｐｄＨＬ２に転換した。
Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２の構築
【０１４９】
Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２は、ＤＤＤ１がフレキシブルペプチドスペーサを介してＣＨ１のカルボキシル末端でｈＭＮ−１４Ｆａｂに連結される融合タンパク質Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４の２個のコピーを含む安定二量体の産生のための発現ベクターである。ＳａｃＩＩおよびＥａｇＩ制限エンドヌクレアーゼによって消化してＣＨ１−ＣＨ３ドメインを除去し、ＳａｃＩＩおよびＥａｇＩによってＣＨ１−ＤＤＤ１−ＳＶ３シャトルベクターから切除したＣＨ１−ＤＤＤ１フラグメントを挿入することにより、ｈＭＮ−１４ＩｇＧを産生するために用いられてきたプラスミドベクターｈＭＮ１４（Ｉ）−ｐｄＨＬ２を、Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２に転換した。
【０１５０】
同じ技術は、広範の公知の抗体、例えばｈＬＬ１、ｈＬＬ２、ｈＰＡＭ４、ｈＲ１、ｈＲＳ７、ｈＭＮ−１４、ｈＭＮ−１５、ｈＡ１９、ｈＡ２０などＦａｂ発現のためのプラスミドを産生するために利用されてきた。一般的に、抗体可変領域コード配列は、ｐｄＨＬ２発現ベクターに存在し、該発現ベクターを、上記のようにＡＤ−またはＤＤＤ−融合タンパク質の産生のために転換した。かかる抗体のいずれかのＦａｂフラグメントを含むＡＤ−およびＤＤＤ−融合タンパク質を、１個のＡＤ−融合タンパク質あたり２個のＤＤＤ−融合タンパク質を近似比率で組み合わせて、第１の抗体の２個のＦａｂフラグメントおよび第２の抗体の１個のＦａｂフラグメントを含む三量体ＤＮＬ構築物を生成することができる。
Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２
【０１５１】
Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２は、１４アミノ酸残基Ｇｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーを介してｈＭＮ−１４のＦｄのカルボキシル末端に付随したＤＤＤ２の二量体化およびドッキングドメインを保有するＣ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４の産生のための発現ベクターである。分泌される融合タンパク質は、ＤＤＤ２ドメインの非共有結合的相互作用により一緒に保持されるｈＭＮ−１４Ｆａｂの２個の同一のコピーからなる。
【０１５２】
リンカーペプチドの一部に関するコード配列およびＤＤＤ２の残基１〜１３を含む２個の重複相補的オリゴヌクレオチドを合成により作製した。オリゴヌクレオチドをアニーリングし、Ｔ４ＰＮＫでリン酸化して、それぞれ、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩによって消化されるＤＮＡとのライゲーションに適合性である５’および３’末端上にオーバーハングを生じた。
【０１５３】
二重鎖ＤＮＡを、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩによる消化によって調製したシャトルベクターＣＨ１−ＤＤＤ１−ｐＧｅｍＴとライゲートして、シャトルベクターＣＨ１−ＤＤＤ２−ｐＧｅｍＴを生成した。ＳａｃＩＩおよびＥａｇＩを用いてＣＨ１−ＤＤＤ２−ｐＧｅｍＴから５０７ｂｐフラグメントを切除して、ＳａｃＩＩおよびＥａｇＩによる消化によって調製したＩｇＧ発現ベクターｈＭＮ１４（Ｉ）−ｐｄＨＬ２とライゲートした。最終発現構築物をＣ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２と表記した。類似の技術を利用して、多数の異なるヒト化抗体のＦａｂフラグメントのＤＤＤ２−融合タンパク質を生成した。
Ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２
【０１５４】
ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２を、Ｂとして、（Ａとしての）Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４と対合するよう設計した。ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２は、１４アミノ酸残基Ｇｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーを介してＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に付随したＡＤ２のアンカードメイン配列を保有するｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２の産生のための発現ベクターである。ＡＤ２は、ＡＤ１のアンカードメイン配列に先行する１個のシステイン残基および続いてのもう１個のシステイン残基を有する。
【０１５５】
発現ベクターを、以下のように工学処理した。ＡＤ２のコード配列ならびにリンカー配列の一部を含む２個の重複相補的オリゴヌクレオチド（ＡＤ２トップおよびＡＤ２ボトム）を合成した。オリゴヌクレオチドをアニーリングし、Ｔ４ＰＮＫによってリン酸化して、それぞれ、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＰｓｅＩによって消化されるＤＮＡとのライゲーションに適合性である５’および３’末端上にオーバーハングを生じた。
【０１５６】
二重鎖ＤＮＡを、ＢａｍＨＩおよびＰｓｅＩによる消化によって調製したシャトルベクターＣＨ１−ＡＤ１−ｐＧｅｍＴとライゲートして、シャトルベクターＣＨ１−ＡＤ２−ｐＧｅｍＴを生成した。ＳａｃＩＩおよびＥａｇＩ制限酵素を用いてシャトルベクターからＣＨ１およびＡＤ２コード配列を含有する４２９塩基対フラグメントを切除して、同じ酵素による消化によって調製したｈ６７９−ｐｄＨＬ２とライゲートした。最終発現構築物は、ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２である。
実施例５．ＴＦ２ＤＮＬ構築物の生成
【０１５７】
Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４をｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２と反応させることにより、ＴＦ２と表記される三量体ＤＮＬ構築物を得た。ＴＦ２のパイロットバッチを、９０％超の収率で以下のように生成した。タンパク質Ｌ−精製Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４（２００ｍｇ）を、１．４：１のモル比でｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２（６０ｍｇ）と混合した。総タンパク質濃度は、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中に１．５ｍｇ／ｍｌであった。その後の工程は、ＴＣＥＰ還元、ＨＩＣクロマトグラフィ、ＤＭＳＯ酸化およびＩＭＰ２９１親和性クロマトグラフィを包含した。ＴＣＥＰの添加の前に、ＳＥ−ＨＰＬＣはａ２ｂ形成のいずれの証拠も示さなかった。５ｍＭのＴＣＥＰの添加は、二元構造について予測される１５７ｋＤａのタンパク質と一致するａ２ｂ錯体の形成を迅速にもたらした。ＩＭＰ２９１親和性クロマトグラフィにより、ＴＦ２をほぼ均質に精製した（示さず）。ＩＭＰ２９１は、６７９Ｆａｂが結合するＨＳＧハプテンを含有する合成ペプチドである（Ｒｏｓｓｉら、２００５，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：７１２２ｓ−２９ｓ）。ＩＭＰ２９１非結合分画のＳＥ−ＨＰＬＣ分析は、生成物からのａ４、ａ２および遊離κ鎖の除去を実証した（示さず）。
【０１５８】
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、大部分のＴＦ２が、ＩｇＧのものに近い相対移動度を有する大きな共有結合構造として存在することを実証した（示さず）。さらなる帯域は、ジスルフィド形成が実験条件下に不完全であることを示唆する（示さず）。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＴＦ２の構成ポリペプチドを表す帯域のみが明らかであるとき、非還元ゲルにおいて明らかな任意のさらなる帯域は生成物関連性である（示さず）ことを示唆する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光分析（示さず）は、１５６，４３４Ｄａの単一ピークを示し、これは、ＴＦ２の算出された質量（１５７，３１９Ｄａ）の９９．５％以内である。
【０１５９】
ＢＩＡＣＯＲＥ検定によりＴＦ２の機能性を求めた。ＴＦ２、Ｃ−ＤＤＤ１−ｈＭＮ−１４＋ｈ６７９−ＡＤ１（非共有結合ａ２ｂ錯体の対照試料として用いられる）またはＣ−ＤＤＤ２−ｈＭＮ−１４＋ｈ６７９−ＡＤ２（非還元ａ２およびｂ成分の対照試料として用いられる）を１μｇ／ｍｌ（総タンパク質）に希釈し、ＨＳＧで固定されたセンサーチップ上に通った。ＴＦ２についての応答は２個の対照試料の応答の約２倍であり、これは、対照試料中のｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ成分のみがセンサーチップと結合し、その上に残存することを示した。ｈＭＮ−１４に関する抗イディオタイプ抗体であるＷＩ２ＩｇＧのその後の注射は、さらなるシグナル応答により示されるｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤと密に関連するＤＤＤ−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４成分をＴＦ２のみが有することを実証した。センサーチップ上に固定されたＴＦ２とのＷＩ２の結合から得られる応答単位のさらなる増大は、各々がＣ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４の１個のサブユニットによって寄与される２個の完全に機能的な結合部位に対応する。これは、ＷＩ２の２つのＦａｂフラグメントを結合するＴＦ２の能力により確認された（示さず）。
実施例６．ＴＦ１０ＤＮＬ構築物の産生
【０１６０】
類似のプロトコルを用いて、Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＰＡＭ４の２個のコピーおよびＣ−ＡＤ２−Ｆａｂ−６７９の１個のコピーを含む三量体ＴＦ１０ＤＮＬを生成した。上記のような（抗ＣＥＡ）２×抗ＨＳＧｂｓＡｂＴＦ２の産生に関して開示された方法を用いて、ＴＦ１０二重特異性（［ｈＰＡＭ４］２×ｈ６７９）抗体を産生した。ＴＦ１０構築物は、２個のヒト化ＰＡＭ４Ｆａｂおよび１個のヒト化６７９Ｆａｂを保有する。
【０１６１】
２個の融合タンパク質（ｈＰＡＭ４−ＤＤＤおよびｈ６７９−ＡＤ２）を、安定的にトランスフェクトされた骨髄腫細胞中で独立して発現させた。組織培養上清液を組み合わせて、２倍モル余分量のｈＰＡＭ４−ＤＤＤを生じた。反応混合物を、１ｍＭの還元グルタチオンを用いた穏やかな還元条件下に室温で２４時間インキュベートした。還元後、２ｍＭの酸化グルタチオンを用いた穏やかな酸化によりＤＮＬ反応を完了した。ＴＦ１０を、ｈ６７９Ｆａｂと高特異性で結合するＩＭＰ２９１−アフィゲル樹脂を用いた親和性クロマトグラフィにより単離した。
実施例７．ＤＮＬに関する配列変異体
【０１６２】
ある一定の好ましい実施形態において、サイトカイン−ＭＡｂＤＮＬ錯体中に組み込まれたＡＤおよびＤＤＤ配列は、以下に議論されているＡＤ２およびＤＤＤ２のアミノ酸配列を含む。しかし、代替の実施形態において、ＡＤおよび／またはＤＤＤ部分の配列変異体は、ＤＮＬ錯体の構築において利用され得る。例えば、ＰＫＡ  ＲＩα、ＲＩＩα、ＲＩβおよびＲＩＩβのＤＤＤ部分に対応する、ヒトＰＫＡ  ＤＤＤ配列のたった４種の変異体が存在する。ＲＩＩαＤＤＤ配列は、先に開示したＤＤＤ１およびＤＤＤ２をベースとする。該４種のヒトＰＫＡ  ＤＤＤ配列を以下に示す。ＤＤＤ配列は、ＲＩＩαの残基１−４４、ＲＩＩβの残基１−４４、ＲＩαの残基１２−６１およびＲＩβの残基１３−６６を表す（ＤＤＤ１の配列は、ヒトＰＫＡ  ＲＩＩαＤＤＤ部分から僅かに修飾されていることに注意されたい）。
【化３】
2013512918.tif 000005
【０１６３】
ＡＤおよびＤＤＤドメインの構造−機能関係は、研究の対象となってきた（例えば、Ｂｕｒｎｓ−Ｈａｍｕｒｏら、２００５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １４：２９８２−９２；Ｃａｒｒら、２００１、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：１７３３２−３８；Ａｌｔｏら、２００３、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：４４４５−５０；Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒら、２００６、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３９６：２９７−３０６；  Ｓｔｏｋｋａら、２００６、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ４００：４９３−９９；Ｇｏｌｄら、２００６、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２４：３８３−９５；Ｋｉｎｄｅｒｍａｎら、２００６、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２４：３９７−４０８、それぞれの全内容は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１６４】
例えば、Ｋｉｎｄｅｒｍａｎら（２００６）は、ＡＤＤ−ＤＤＤ結合相互作用の結晶構造を調査して、ヒトＤＤＤ配列は、以下の配列番号６において下線を付した、二量体形成またはＡＫＡＰ結合のいずれかに重要である多数の保存的アミノ酸残基を含有すると結論づけた（Ｋｉｎｄｅｒｍａｎら、２００６（参照により本明細書に組み込まれる）の図１を参照されたい）。当業者は、ＤＤＤ配列の配列変異体を設計するにおいて、下線を付した残基のいずれかの変更を望ましくは回避する一方で、二量体化およびＡＫＡＰ結合にあまり重要でない残基については保存的アミノ酸置換がなされ得ることを理解する。
【化４】
2013512918.tif 000006
【０１６５】
Ａｌｔｏら（２００３）は、種々のＡＫＡＰタンパク質のＡＤ配列の生物情報学分析を実施して、０．４ｎＭのＤＤＤに関する結合定数を有する、ＡＫＡＰ−ＩＳ（配列番号：８）と呼ばれるＲＩＩ選択的ＡＤ配列を設計した。ＡＫＡＰ−ＩＳ配列を、ＰＫＡと結合するＡＫＡＰのペプチドアンタゴニストとして設計した。置換がＤＤＤとの結合を減少させる傾向があるＡＫＡＰ−ＩＳ配列中の残基に、配列番号：８において下線を付す。当業者は、ＡＤ配列の配列変異体を設計するにおいて、下線を付した残基のいずれかの変更を望ましくは回避する一方で、ＤＤＤ結合にあまり重要でない残基については保存的アミノ酸置換がなされ得ることを理解する。
【化５】
2013512918.tif 000007
【０１６６】
Ｇｏｌｄ（２００６）は、結晶学およびペプチドスクリーニングを利用してＳｕｐｅｒＡＫＡＰ−ＩＳ配列（配列番号１０）を開発して、ＲＩアイソフォームと比較して５倍の大きさのＲＩＩアイソフォームに関する選択性を示した。下線残基は、ＲＩＩαのＤＤＤ部分との結合を増大するアミノ酸置換の位置をＡＫＡＰ−ＩＳ配列と比して示す。この配列において、Ｎ末端Ｑ残基を残基番号４として番号付けし、Ｃ末端Ａ残基は残基番号２０である。置換がＲＩＩαに関する親和性に影響を及ぼすようにされた残基は、残基８、１１、１５、１６、１８、１９および２０であった（Ｇｏｌｄら、２００６）。ある一定の代替の実施形態において、ＳｕｐｅｒＡＫＡＰ−ＩＳ配列をＡＫＡＰ−ＩＳに置換してＤＮＬ構築物を調製し得るよう意図される。ＡＫＡＰ−ＩＳ  ＡＤ配列に置換され得る他の代替的配列を、配列番号１７〜１９で示す。ＡＫＡＰ−ＩＳ配列に対する置換に下線を付す。配列番号９で示されるＡＤ２配列によるとき、ＡＤ部分は、配列番号６で示されるように、さらなるＮ末端残基システインおよびグリシン、ならびにＣ末端残基グリシンおよびシステインも含み得ると予測される。
【化６】
2013512918.tif 000008
【化７】
2013512918.tif 000009
【０１６７】
Ｓｔｏｋｋａら（２００６）も、配列番号２０〜２２で示されるＰＫＡと結合するＡＫＡＰのペプチド競合物を開発した。ペプチドアンタゴニストを、Ｈｔ３１（配列番号２０）、ＲＩＡＤ（配列番号２１）およびＰＶ−３８（配列番号２２）と表記した。Ｈｔ−３１ペプチドは、ＰＫＡのＲＩＩアイソフォームに対してより大きな親和性を示す一方で、ＲＩＡＤおよびＰＶ−３８は、ＲＩに対してより高い親和性を示した。
Ｈｔ３１
ＤＬＩＥＥＡＡＳＲＩＶＤＡＶＩＥＱＶＫＡＡＧＡＹ（配列番号：２０）
ＲＩＡＤ
ＬＥＱＹＡＮＱＬＡＤＱＩＩＫＥＡＴＥ（配列番号：２１）
ＰＶ−３８
ＦＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＷＳＤＶＦＱＱＣ（配列番号：２２）
【０１６８】
Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒ等（２００６）は、ＲＩＩ形態のＰＫＡのＤＤＤとの０．４ｎＭという低い結合定数を有する、ＰＫＡに結合するＡＫＡＰについてさらに他のペプチド競合物を開発した。種々のＡＫＡＰアンタゴニストペプチドの配列は、Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒらの表１に付与されている（参照により本明細書に組み込まれる）。異なるＡＫＡＰタンパク質のＡＤドメイン間に高度に保存された残基を、ＡＫＡＰ  ＩＳ配列（配列番号：８）について下線を付して、以下に示す。残基は、Ａｌｔｏら（２００３）により観察されたものと同じであるが、Ｃ末端アラニン残基の添加を伴う（Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒら（２００６）の図４を参照されたい。参照により本明細書に組み込まれる）。ＲＩＩ  ＤＤＤ配列に対する特に高い親和性を有するペプチドアンタゴニストの配列を、配列番号２３〜２５で示す。
【化８】
2013512918.tif 000010
【０１６９】
Ｃａｒｒら（２００１）は、ヒトおよび非ヒトタンパク質からの異なるＡＫＡＰ結合ＤＤＤ配列間の配列相同性の程度を調査し、異なるＤＤＤ部分間で最も高度に保存されていると思われるＤＤＤ配列中の残基を同定した。これらを、配列番号：６のヒトＰＫＡ  ＲＩＩαＤＤＤ配列に関して下線を付して以下に示す。特に保存された残基を、さらに、イタリック体で示す。残基は、ＡＫＡＰタンパク質との結合のために重要であることがＫｉｎｄｅｒｍａｎら（２００６）により示唆されたものと重複するが、同一ではない。当業者は、ＤＤＤの配列変異体を設計するにおいて、最も保存された残基（イタリック体）の変更を回避することが最も好ましく、保存残基（下線付き）の変更を回避することも好ましい一方で、保存的アミノ酸置換は、下線を付されてもいないイタリック体で記されてもいない残基について考慮され得ることを理解する。
【化９】
2013512918.tif 000011
実施例８．前標的化抗体および１８Ｆ標識化ペプチドを用いたインビボ試験
【０１７０】
１８Ｆ標識化ＩＭＰ４４９を以下のように調製した。約０．５ｍＬの５４．７ｍＣｉの１８Ｆを、０．１ＭのＮａＯＡｃのｐＨ４の緩衝剤中の３μＬの２ｍＭのＡｌと混合した。３分後、０．５ＭのｐＨ４のＮａＯＡｃ緩衝剤中の０．０５ＭのＩＭＰ４４９（１０μＬ）を添加し、反応物を９６℃の加熱ブロック中で１５分間加熱した。次いで、粗標識化ペプチドを、Ｃ１８カラム上でＨＰＬＣにより精製した。ＨＰＬＣで精製したペプチド試料を、対象の画分を水中で２倍に希釈して該溶液を１ｃｃ  ＷＡＴＥＲＳ（登録商標）ＨＬＢカラムの樽に溶液を入れることにより、さらに処理した。カートリッジを３×１ｍＬの水で溶離して、アセトニトリルおよびＴＦＡを除去し、その後、１：１のＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏで１８Ｆ標識化ペプチドを溶離した。精製［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９が、分析用ＨＰＬＣ  Ｃ１８カラム上に単一ピークとして溶離した（示さず）。
【０１７１】
４個の緩徐増殖性ｓｃＣａＰａｎ１異種移植片を保有するＴａｃｏｎｉｃヌードマウスをインビボ試験に用いた。マウスのうちの３匹には、ＴＦ１０（１６２μｇ）を、その１８時間後に［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９を注射した。ＴＦ１０は、腫瘍画像化試験に使用するためのヒト化二重特異的抗体であって、ＰＡＭ−４規定腫瘍抗原と二価結合し、ＨＳＧと一価結合する（例えば、Ｇｏｌｄら、２００７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５（１８Ｓ）：４５６４を参照されたい）。１匹のマウスに、ペプチド単独を注射した。ペプチド注射の１時間後に、マウス全てを剖検した。組織を直ちに計数した。平均分布の比較は、腫瘍標的二重特異的抗体の存在下では、任意の正常の組織におけるよりも腫瘍中に局在化した、実質的により高レベルの１８Ｆ標識化ペプチドを示した。
【０１７２】
組織取込みは、［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９単独を投与した動物において、または前標的化設定において同様であった（表８）。１時間におけるヒト膵臓癌異種移植片ＣａＰａｎ１中の取込みは、前標的化動物においては、ペプチド単独と比較して５倍に増大された（４．６±０．９％ＩＤ／ｇ対０．８９％ＩＤ／ｇ）。例外的な腫瘍／非腫瘍比は、この時点で達成された（例えば、腫瘍／血液および肝臓比は、それぞれ２３．４±２．０および２３．５±２．８であった）。
【表２】
2013512918.tif 000012
実施例９．前標的化抗体による［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９の生体内分布
【０１７３】
本試験の目的は、二重特異的抗体ＴＦ２による前標的化後のｓｃＬＳ１７４Ｔ異種移植片を保有するヌードマウスにおける［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９の生体内分布を調査することであった。
【０１７４】
［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９：Ｋｉｍら（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ  ６１，２００４，１２４１−４６）により記載されたように、標識化前にＱＭＡカートリッジ上で１８Ｆを精製したことを除いて上記と同様に標識化を実施した。カラムを２００μＬ分画中の１ｍＬの０．４Ｍ  ＫＨＣＯ３で溶離した。１８Ｆ溶液のｐＨを１０μＬの氷酢酸で調整し、ピーク画分からの１８Ｆを０．１Ｍ、ｐＨ４、ＮａＯＡｃ緩衝剤中の２ｍＭのＡｌ（３μＬ）と混合した。次いで、試料を、０．５Ｍ、ｐＨ４、ＮａＯＡｃ緩衝剤中の０．０５ＭのＩＭＰ４４９（１０μＬ）と混合し、反応溶液を９４℃で１５分間加熱した。［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９を、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。生成物を含有する分画をＨＬＢカラムに通して、緩衝剤を交換した。生成物を、４００μＬの１：１のＥｔＯＨ：Ｈ２Ｏで溶離した。収率が低かったため、比活性度は低く、さらにペプチドをマウス内に注射すると、ｂｓＭＡｂ：ペプチドの比は１０：１でなくて６．９：１となった。
結果
【０１７５】
マウスにおける前標的化１８Ｆ標識化ＩＭＰ４４９の生体内分布を表３にまとめる。標識化されたペプチドは、二重特異的ＴＦ２抗体の存在下に、腫瘍組織への高レベルの局在化を示した。ＴＦ２の非存在下に、標識化されたペプチドは、正常組織に対してよりも腫瘍に対してあまり高度の局在化を示さなかった（示さず）。
【表３】
2013512918.tif 000013
【０１７６】
この試験は、本明細書に記載されている簡単で再現可能な方法および組成物が、種々の疾患状態のインビボ画像化での使用に好適な１８Ｆ標識化標的化ペプチドを産生することを示す。当業者は、先に開示されている二重特異的抗体が、限定されないが、広範の疾患または病原体標的抗原に対する任意の抗体を含み得ることを理解する。該方法は、二重特異的抗体による前標的化に限定されない。他の実施形態において、画像化されるべき標的細胞、組織または生物体と直接結合する分子または錯体は、本明細書に開示される方法を用  いて１８Ｆで標識化され、ＰＥＴ画像化のために対象に投与される（以下の実施例を参照されたい）。
【０１７７】
ＩＭＰ４４９により例示されるＡｌ１８Ｆ標識化ペプチドは、ＰＥＴ走査などの公知の画像化プロトコルに利用されるように、インビボ条件下で十分に安定である。さらに、特許請求の方法は、適切な画像化手順を実施させるのに十分な１８Ｆの崩壊時間内である１時間以内に注射できる準備ができている１８Ｆ標識化標的化ペプチドの調製をもたらす。最後に、記載されている特許請求の方法は、画像化試験のための１８Ｆ標識化合物の公知の調製方法と比較して、オペレータの放射性同位体への最小限の曝露をもたらす。
実施例１０．１８Ｆ標識化ペプチドを用いたインビボ画像化および１８Ｆ［ＦＤＧ］との比較
【０１７８】
二重特異的抗体による前標的化および標識化された標的化ペプチドを用いるインビボ画像化技術を用いて、相対的に小さいサイズの腫瘍を成功裏に検出した。ＷＡＴＥＲＳ（登録商標）ＡＣＣＥＬＬ（商標）Ｐｌｕｓ  ＱＭＡ  ＬＩＧＨＴカートリッジ上で１８Ｆを精製した。０．４Ｍ  ＫＨＣＯ３によって溶離した１８Ｆを３μｍの２ｍＭのＡｌ３＋とｐＨ４の酢酸塩緩衝剤中で混合した。次いでＡｌ１８Ｆ溶液をアスコルビン酸ＩＭＰ４４９標識化バイアル内に注入し、１０５℃に１５分間加熱した。反応溶液を冷却し、０．８ｍＬの脱イオン水と混合した。反応内容物をＷＡＴＥＲＳ（登録商標）ＯＡＳＩＳ（登録商標）１ｃｃ  ＨＬＢ  Ｃｏｌｕｍｎに負荷し、２×２００μＬの１：１のＥｔＯＨ／Ｈ２  Ｏで溶離した。ＴＦ２を上記のように調製した。ＴＦ２は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に二価で結合し、合成ハプテン、ＨＳＧ（ヒスタミン−スクシニル−グリシン）に一価で結合する。
生体内分布およびマイクロPET画像化
【０１７９】
６週齢ＮＣｒ  ｎｕ−ｍ雌ヌードマウスに、ヒト結腸癌細胞株ＬＳ１７４Ｔ（ＡＴＣＣ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ）を皮下移植した。腫瘍が視覚的に確立されると、前標的化動物に１６２μｇ（約１ｎｍｏｌｅ／０．１ｍＬ）のＴＦ２またはＴＦ１０（対照非標的化三Ｆａｂ  ｂｓＭＡｂ）を静脈内注射し、次いで、１６〜１８時間後、約０．１ｎｍｏｌｅの［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９（８４μＣｉ、３．１１ＭＢｑ／０．１ｍＬ）を静脈内注射した。他の前標的化対照動物は、１８Ｆ単独（１５０μＣｉ、５．５ＭＢｑ）、Ａｌ１８Ｆ錯体単独（１５０μＣｉ、５．５５ＭＢｑ）、［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９ペプチド単独（８４μＣｉ、３．１１ＭＢｑ）または［１８Ｆ］ＦＤＧ（１５０μＣｉ、５．５５ＭＢｑ）を受けた。１８Ｆおよび［１８Ｆ］ＦＤＧは、ＩＢＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（Ｓｏｍｅｒｓｅｔ，ＮＪ）から、使用当日に入手した。［１８Ｆ］ＦＤＧを受けた動物を一晩絶食させたが、水を自由に与えた。
【０１８０】
放射性トレーサ注射後１．５時間で動物を麻酔し、心臓内放血させて、剖検した。組織を計量し、それぞれの生成物の各々から調製した標準希釈液と一緒に計数した。１８Ｆの短い物理半減期のため、各動物からの各組織群間に標準を差し挟んだ。注入用量％／グラム（％ＩＤ／ｇ）を得るために、計数／ｇを総注入放射能で割った値として、組織中の取込みを表す。
【０１８１】
２種の画像化試験を実施した。１組では、小さなＬＳ１７４Ｔ皮下腫瘍を保有する３匹のヌードマウスに、前標的化［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９、［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９単独（前標的化されていない）、共に１３５μＣｉ（５ＭＢｑ；０．１ｎｍｏｌ）、または［１８Ｆ］ＦＤＧ（１３５μＣｉ、５ＭＢｑ）を投与した。静脈内放射性トレーサ注射後２時間で、Ｏ２／Ｎ２Ｏおよびイソフルラン（２％）の混合物で動物を麻酔し、スキャン中は保温し、ＩＮＶＥＯＮ（登録商標）動物ＰＥＴスキャナ（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ，ＴＮ）において実施した。
【０１８２】
ピクセル飽和が身体の任意の領域（膀胱以外）で起きるまで強度を調整し、バックグラウンド調整せずに、腫瘍の略中心に位置する平面における代表的な冠状横断切片（０．８ｍｍ厚）を示した。
【０１８３】
別個の動的画像研究において、１６時間前にＴＦ２  ｂｓＭＡｂを投与された単一ＬＳ１７４Ｔ保有ヌードマウスを、Ｏ２／Ｎ２Ｏおよびイソフルラン（２％）の混合物で麻酔し、カメラ床上に仰臥位で載せ、次いで、２１９μＣｉ（８．１ＭＢｑ）［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９（０．１６ｎｍｏｌ）を静脈内注射した。１２０分の期間にわたって、データ獲得を直ちに開始した。ＯＳＥＭ３Ｄ／ＭＡＰを用いて、スキャンを再構成した。提示のために、５、１５、３０、６０、９０および１２０分で終わる時間フレームを、各断面切片（冠状、矢状および横断）に関して表示した。腫瘍を含有する切片に関して、ピクセル飽和が最初に腫瘍で起こるまで、各間隔で、画像強度を調整した。必要な場合は経時的に画像強度を増大して、腫瘍内のピクセル飽和を保持した。同一間隔で採取した腫瘍を含有しない冠状および矢状断面切片を、腫瘍を含有する横断切片と同一強度に調整した。バックグラウンドの活性は調整しなかった。
結果
【０１８４】
１８Ｆ単独および［Ａｌ１８Ｆ］錯体は全ての組織において同様の取込みを有したが、錯体がＩＭＰ４４９とキレート形成された場合、かなりの差が見出された（表４）。最も顕著な差は、骨における取込みに見出されたが、この場合、非キレート化１８Ｆは、肩甲骨においては６０倍〜ほぼ１００倍高く、脊椎では約２００倍高かった。この分布は、１８Ｆは、または金属−フッ化物錯体でさえ骨中で増大することが公知であるため、予測される（Ｆｒａｎｋｅら、１９７２，Ｒａｄｉｏｂｉｏｌ．Ｒａｄｉｏｔｈｅｒ．（Ｂｅｒｌｉｎ）１３：５３３）。より高い取込みは、腫瘍及び腸管中でも、ならびに筋肉及び血中でも観察された。キレート化［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９は、腎臓以外の全ての組織において有意に低い取込みを示したが、これは、排尿により身体から効率的に除去されるキレート錯体の能力を示している。
【０１８５】
ＴＦ２抗ＣＥＡ  ｂｓＭＡｂを用いた［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９の前標的化は、腫瘍への取込みを変えて、それを、１．５時間での注射用量／ｇで、０．２０±０．０５から６．０１±１．７２に増大した一方で、正常組織中の取込みは［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９単独と同様であった。腫瘍／非腫瘍比は、血液、肝臓、肺および腎臓ではそれぞれ１４６±６３、５９±２４、３８±１５および２．０±１．０であり、他の腫瘍／組織比はこの時点で＞１００：１であった。１８Ｆ単独および［Ａｌ１８Ｆ］単独は、共にキレート化［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９より高い腫瘍中取込みを示し、それぞれ６．７±２．７および１１．０±４．６対５．１±１．５の腫瘍／血液比を生じ、腫瘍取込みおよび腫瘍／血液比は、前標的化により有意に増大した（全てのＰ値＜０．００１）。
【０１８６】
高いグルコース消費および代謝活性を示す組織を標的にする、最も一般的に用いられる腫瘍イメージング剤である［１８Ｆ］ＦＤＧに対する生体内分布も比較した。その取込みは、腎臓以外の全ての正常組織において、［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９よりかなり高かった。腫瘍取込みは、前標的化［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９および［１８Ｆ］ＦＤＧの両方に関して同様であったが、ほとんどの正常組織中での［１８Ｆ］ＦＤＧのより高い増大のため、［１８Ｆ］ＦＤＧに関する腫瘍／非腫瘍比は、前標的化動物の場合より有意に低かった（全てのＰ値＜０．００１）。
【表４】
2013512918.tif 000014
【０１８７】
［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９単独またはＴＦ２で前標的化した［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９、ならびに［１８Ｆ］ＦＤＧの生体内分布をさらに分析するために、数匹の動物を画像化した。放射能を注射後２．０時間で開始した静的画像は、腎臓中でほとんど専ら取込みを示す従来の組織分布データを裏付けた（図２）。２１ｍｇの腫瘍は前標的化動物において容易に可視化された一方で、［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９単独を付与された動物は腫瘍を局在化できず、腎臓取込みのみを示した。骨増大の証拠は観察されず、これは、Ａｌ１８ＦがＩＭＰ４４９に固く結合されたことを示唆する。これは、１２０分にわたって５分間隔で、［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９の分布を監視する動的画像化試験を受けた別の前標的化動物において確認された（図２）。冠状および矢状薄片は、最初の５分間の、主に心臓、腎臓および多少の肝臓取込みを示したが、心臓および肝臓活性は次の１０分間は実質的に減少した一方で、腎臓は試験全体を通して依然として顕著であった。全１２０分のスキャン全体にわたって、腸管または骨中に活性の証拠は認められなかった。３５ｍｇのＬＳ１７４Ｔ腫瘍中の取込みは、１５分でまず観察され、３０分までに、シグナルは非常に明白にバックグラウンドから減少し、全１２０分のスキャニング中、強い腫瘍活性が顕著であった。
【０１８８】
比較した場合、［１８Ｆ］ＦＤＧを付与された動物からの静止画像は、前に観察された骨、心筋および脳における放射能の予測パターンを示し（ＭｃＢｒｉｄｅら、２００６，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４７：１６７８；Ｓｈａｒｋｅｙら、２００８，Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ２４６：４９７）、身体中のバックグラウンド放射能はかなり高かった（図１）。静止画像化試験の終わりに剖検された３匹の動物で測定した組織取込みは、全組織において非常に高い組織１８Ｆ放射能を確認した。［１８Ｆ］ＦＤＧの腫瘍取込みは、この動物においては、前標的化動物より高かった一方で、腫瘍／血液比は前標的化についてより好都合であり、身体中の残留放射能が低いほど、腫瘍可視化は前標的化により向上された。
【０１８９】
これらの試験は、前標的化画像化に用いられるハプテン−ペプチドが、アルミニウム−フッ化物錯体を簡単に形成し、これは次に適切なキレート化合物により結合され、ハプテン−ペプチドに組み入れられることにより、１８Ｆで迅速に標識化され得る（総調製時間６０分）ことを実証する。これは、キレート部分に付着され、その後、精製され得る任意の分子と［Ａｌ１８Ｆ］−キレート化合物を簡単にカップリングすることにより、より一般的になされ得る。好ましい実施形態において、標識化の組み入れパーセンテージおよび標識化合物の比活性度は、標識化分子の精製が必要でないほど十分である。
【０１９０】
この報告は、アルミニウム共役体を介して１８Ｆを種々の化合物と結合する直接的な、安易な迅速な方法を記載している。［Ａｌ１８Ｆ］ペプチドは、ＮＯＴＡ系のキレート化合物により結合される場合、インビトロおよびインビボで安定であった。収率は、常套的な１８Ｆ標識化手順で見出される範囲内であった。これらの結果は、広範の標的化分子にキレート化される金属１８Ｆを用いるＰＥＴ画像化の実現可能性をさらに実証する。
実施例１１．Ａｌ−１８Ｆを用いたＩＭＰ４６０の調製および標識化
【０１９１】
ＩＭＰ４６０ＮＯＤＡ−Ｇａ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（配列番号：２６）を化学的に合成した。ＮＯＤＡ−Ｇａ配位子は、ＣＨＥＭＡＴＥＣＨ（登録商標）から購入し、他のアミノ酸のようにペプチド合成器上に載せた。以下の順序で：Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨを添加し、Ａｌｏｃを除去し、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨ、Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨを付加し、Ａｌｏｃを除去し、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨおよびＮＯＤＡ−ＧＡ（ｔＢｕ）３を添加したアミノ酸および他の剤を用いて、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂上でペプチドを合成した。次いで、ペプチドを切断し、ＨＰＬＣにより精製して、生成物を得た。ＨＲＭＳ  Ｃ６１Ｈ９２Ｎ１８Ｏ１８。
ＩＭＰ４６０の放射性標識化
【０１９２】
ＩＭＰ４６０（０．００２０ｇ）を７３２μＬの０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４）中に溶解した。１８Ｆを上記と同様に精製し、氷酢酸で中和し、Ａｌ溶液と混合した。次いで、ペプチド溶液２０μＬを付加し、溶液を９９℃で２５分間加熱した。次いで、粗生成物をＷＡＴＥＲＳ（登録商標）ＨＬＢカラムで精製した。［Ａｌ１８Ｆ］標識化ペプチドは、１：１  ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏカラム溶離液中に存在した。０．１％ＴＦＡ緩衝剤中の逆相ＨＰＬＣトレースは、標識化ペプチドに関する予測された位置にきれいな単一ＨＰＬＣピークを示した（示さず）。
実施例１２．ＩＭＰ４６１およびＩＭＰ４６２ＮＯＴＡ共役ペプチドの合成および標識化
【０１９３】
最も簡単な起こり得るＮＯＴＡ配位子（ペプチド合成に関して保護される）を調製し、ＩＭＰ４６１およびＩＭＰ４６２を前標的化するために２個のペプチド中に組み入れた。
ジ−ｔ−ブチル−ＮＯＴＡの合成
【０１９４】
ＮＯ２ＡｔＢｕ（０．５０１ｇ、１．４×１０−３ｍｏｌ）を、５ｍＬの無水アセトニトリル中に溶解した。２−ブロモ酢酸ベンジル（０．２２２ｍＬ、１．４×１０−３ｍｏｌ）を溶液に添加し、その後、０．３８７ｇの無水Ｋ２ＣＯ３を添加した。反応物を、室温で一晩撹拌した。反応混合物を濾過し、濃縮して、０．６０５ｇ（収率８６％）のベンジルエステル共役体を得た。次いで、粗生成物を５０ｍＬのイソプロパノール中に溶解し、０．２ｇの１０％Ｐｄ／Ｃと混合し（Ａｒ下）、５０ｐｓｉのＨ２下に３日間置いた。次いで、生成物を濾過し、真空下で濃縮して、０．４６２ｇの所望の生成物ＥＳＭＳ  ＭＨ−４１５を得た。
ＩＭＰ４６１の合成
【０１９５】
以下の順序で：Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨを添加し、Ａｌｏｃを除去し、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨ、Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨを添加し、Ａｌｏｃを除去し、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨおよびＢｉｓ−ｔ−ブチルＮＯＴＡ−ＯＨを添加したアミノ酸および他の剤を用いてＳｉｅｂｅｒアミド樹脂上でペプチドを合成した。次いで、ペプチドを切断し、ＨＰＬＣにより精製して、生成物ＩＭＰ４６１  ＥＳＭＳ  ＭＨ＋１２９４（ＮＯＴＡ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；配列番号：２７）を得た。
ＩＭＰ０４６２の合成
【０１９６】
以下の順序で：Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨを添加し、Ａｌｏｃを除去し、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨ、Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨを添加し、Ａｌｏｃを除去し、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｓｐ（Ｂｕｔ）−ＯＨおよびビス−ｔ−ブチルＮＯＴＡ−ＯＨを添加したアミノ酸および他の剤を用いてＳｉｅｂｅｒアミド樹脂上で、ペプチドを合成した。次いで、ペプチドを切断し、ＨＰＬＣにより精製して、生成物ＩＭＰ４６２  ＥＳＭＳ  ＭＨ＋１３３８（ＮＯＴＡ−Ｄ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；配列番号：２８）を得た。
ＩＭＰ４６１およびＩＭＰ４６２の１８Ｆ標識化
【０１９７】
ペプチドを、０．５ＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．１３）中に溶解して、０．０５Ｍペプチド溶液を作製し、これを、必要になるまで冷凍庫中に保存した。Ｆ−１８を２ｍＬの水中に入れて、ＳＥＰ−ＰＡＫ（登録商標）ＬＩＧＨＴ、ＷＡＴＥＲＳ（登録商標）ＡＣＣＥＬＬ（商標）Ｐｌｕｓ  ＱＭＡカートリッジ上に捕捉した。０．４ＭのＫＨＣＯ３の２００μＬのアリコートでカラムから１８Ｆを溶離した。活性の添加前にバイアルに１０μＬの氷酢酸を付加することにより、アリコート中の重炭酸塩を約ｐＨ４に中和した。精製１８Ｆ溶液の１００μＬのアリコートを除去して、０．１ＭのｐＨ４のＮａＯＡｃ中の２ｍＭのＡｌ（３μＬ）と混合した。ペプチド１０μＬ（０．０５Ｍ）を添加し、溶液を約１００℃で１５分間加熱した。粗反応混合物を７００μＬの脱イオン水で希釈し、ＨＬＢカラム上に載せ、洗浄後、２×１００μＬの１：１のＥｔＯＨ：Ｈ２Ｏで溶離して、精製１８Ｆ標識化ペプチドを得た。
実施例１３．ＩＭＰ４６７の調製および１８Ｆ標識化
ＩＭＰ４６７Ｃ−ＮＥＴＡ−スクシニル−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（配列番号：２９）
【０１９８】
テトラｔｅｒｔ−ブチルＣ−ＮＥＴＡ−スクシニルを生成した。ｔｅｒｔ−ブチル｛４−［２−ビス−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）メチル−３−（４−ニトロフェニル）プロピル］−７−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル［１，４，７］トリアザノナン−１−イル｝を、Ｃｈｏｎｇら（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００８，５１：１１８−１２５）に記載されたように調製した。
【０１９９】
以下の順序で、以下のアミノ酸：Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨを樹脂に添加し、Ａｌｏｃを切断し、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨ、Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨを添加し、Ａｌｏｃを切断し、｛４−［ビス−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）メチルアミノ］−３−（４−スクシニルアミノフェニル）プロピル］−７−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル［１，４，７］トリアザノナン−１−イル｝酢酸ｔｅｒｔ−ブチルを添加することにより、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂上に、ペプチドＩＭＰ４６７Ｃ−ＮＥＴＡ−スクシニル−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（配列番号：２９）を作製した。次いで、ペプチドを樹脂から切断し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製して、６．３ｍｇのＩＭＰ４６７を生じた。粗ペプチドを、Ｃ１８カラムを用いた高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によって精製した。
放射性標識化
【０２００】
ＩＭＰ４６７の２ｍＭ溶液をｐＨ４の０．１ＭのＮａＯＡｃ中で調製した。１８Ｆ（１３９ｍＣｉ）を、ＷＡＴＥＲＳ（登録商標）ＡＣＣＥＬＬ（商標）Ｐｌｕｓ  ＳＥＰ−ＰＡＫ（登録商標）ＬＩＧＨＴ  ＱＭＡカートリッジを通して溶離し、１８Ｆを０．４ＭのＫＨＣＯ３（１ｍＬ）で溶離した。標識化ＩＭＰ４６７をＨＬＢ  ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。ＲＰ−ＨＰＬＣは、２個のピークの溶離を示し（示さず）、これは、Ａｌ１８Ｆ  ＩＭＰ４６７のジアステレオマーであると考えられる。この仮説を支持すると、ＩＭＰ４６７を３７℃でインキュベートしたときの２個のＨＬＢピーク間のいくらかの相互交換であるとみなされる（示さず）。以下に議論する前標的化技術において、Ａｌ１８Ｆ−キレート剤錯体が抗体結合のためのハプテン部位の部分ではないため、ジアステレオマーの存在は、１８Ｆ標識化ペプチドの標的化を罹患した組織に対して行うとはみなされない。
放射性標識化されたペプチドの収率の比較
【０２０１】
インビボ安定性を保持しながら標識化収率を改善するための試みにおいて、前標的化ペプチドの３個の新規のＮＯＴＡ誘導体を合成した（ＩＭＰ４６０、ＩＭＰ４６１およびＩＭＰ４６７）。これらのうち、ＩＭＰ４６７は他のペプチドの標識化収率のほぼ２倍であった（表５）。表５における標識化試験の全てを、同じモル数のペプチドおよびアルミニウムを用いて実施した。表５に示した結果は、各ペプチドに関する例示的な標識化実験を表す。
【０２０２】
単に４０ｎｍｏｌ（ＩＭＰ４４９の１３分の１未満まで）だけを１．３ＧＢｑ（３５ｍＣｉ）の１８Ｆに関して用いた場合、ＩＭＰ４６７の１８Ｆ標識化収率は約７０％であった。これは、この配位子がＡｌ１８Ｆ錯体に対する改善された結合特性を有することを示している。配位子結合の動力学を向上させることにより、ＩＭＰ４４９（５２０ｎｍｏｌ、収率４４％）に対してより少ないモルのＩＭＰ４６７（４０ｎｍｏｌ）を用いながら収率を実質的に改善した（平均収率６５〜７５％）。
【表５】
2013512918.tif 000015
実施例１４．ＬＳ１７４Ｔ腫瘍保有ヌードマウスにおける１８Ｆ標識化ＩＭＰ４６７による前標的化生体内分布
【０２０３】
上記と同じ方法で調製された１８Ｆ標識化ＩＭＰ４６７を、ＬＳ１７４腫瘍保有ヌードマウスへの注射のために希釈した。Ａｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４６７を調製し、ヌードマウスに注射して、これを１．５時間後に剖検した。表６は、ＴＦ２前標的化プロトコルを用いて１８Ｆ標識化ＩＭＰ４６７の生体内分布を示す。ペプチド単独は、ＩＭＰ４４９と同様に、血液および身体から迅速にクリアランスされる（示さず）。１８ＦまたはＡｌ１８Ｆと比較して低い骨中の取込みは、Ａｌ１８Ｆキレートの安定性ならびに前標的化に対するその適合性を示す。ＩＭＰ４４９に関する場合、ＴＦ２二重特異的抗体を用いることならびに標識化ＩＭＰ４６７の分布を前標的化することは、腫瘍および腎臓に主に限定され、骨または他の正常組織への分布は非常に少なかった（表６）。１８Ｆ標識化ＩＭＰ４６７を用いた画像化試験を、以下で報告する。データは、ＡｌＦ−１８ＩＭＰ４６７がインビボで安定であり、該ペプチドは腫瘍表面の抗体を標的にしたことを示す。
【表６】
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実施例１５．ＩＭＰ４６７標識化の収率および安定性に影響を及ぼす因子
ペプチド濃度
【０２０４】
収率に及ぼす種々のペプチド濃度の効果を調べるために、ペプチドとのＡｌ１８Ｆの結合の量を、一定量のＡｌ３＋（６ｎｍｏｌ）で、しかし添加されるペプチドの量を変動させて、一定容積中で求めた。標識化ペプチドＩＭＰ４６７の収率は、以下のようにペプチドの漸減濃度に伴って低減した：４０ｎｍｏｌのペプチド（収率８２％）；３０ｎｍｏｌ（収率７９％）；２０ｎｍｏｌ（収率７５％）；１０ｎｍｏｌ（収率４９％）。したがって、２０〜４０ｎｍｏｌの間のペプチドの量の変動は、ＩＭＰ４６７に関する収率にほとんど影響を及ぼさなかった。しかし、収率低減は、標識化混合物中１０ｎｍｏｌのペプチドで出発して観察された。
アルミニウム濃度
【０２０５】
漸増量のＡｌ３＋（ｐＨ４酢酸塩緩衝剤中、０、５、１０、１５、２０μＬの２ｍＭのＡｌ、総容積を一定に保持する）の存在下にＩＭＰ４６７を標識化した場合、それぞれ３．５％、８０％、７７％、７８％および７４％の収率を達成した。これらの結果は、（ａ）Ａｌ３＋の非存在下でのこのペプチドとの１８Ｆの非特異的結合が最小であり、（ｂ）最大の１８Ｆ結合を可能にするには１０ｎｍｏｌのＡｌ３＋で十分であり、ならびに（ｃ）それより多量のＡｌ３＋は結合を実質的に低減せず、このことはこのペプチド濃度で十分なキレート化能力が存在したことを示した。
Ａｌ１８Ｆ  ＩＭＰ４６７放射性標識化の動力学
【０２０６】
動力学的試験は、結合が１０７℃で５分以内に完了し（５分、６８％；１０分、６１％；１５分、７１％；および３０分、７５％）、３０分もの長い反応時間で単離収率が中等度に増大するに過ぎないことを示した。
【０２０７】
５０℃で実施したＩＭＰ４６７の放射性標識化反応は、低温では結合は達成されないことを示した。
ｐＨの影響
【０２０８】
標識化のための最適ｐＨは、４．３〜５．５の間であった。収率は、ｐＨ２．８８で５４％；ｐＨ３．９９で７０〜７７％；ｐＨ５で７０％；ｐＨ６で４１％からｐＨ７．３で３％であった。プロセスは、ＡｌＣｌ３との混合の前に氷酢酸によって溶離液をｐＨ４に調製する必要性を排除する、炭酸塩イオンの代わりに硝酸塩または塩化物イオンによって陰イオン交換カラムから１８Ｆを溶離することによって促進され得た。
ＩＭＰ４６７の高線量放射性標識化
【０２０９】
５μＬの２ｍＭのＡｌ３＋ストック溶液を５０μＬの１８Ｆ（１．３ＧＢｑ、３５ｍＣｉ）と混合し、その後、０．１ｍＭの酢酸塩緩衝剤（ｐＨ４．１）中の２ｍＭのＩＭＰ４６７（２０μＬ）を添加した。反応溶液を１０４℃まで１５分間加熱し、次いで、上記のようにＨＬＢカラム（約１０分）上で精製して、１７ＧＢｑ／μｍｏｌ（４６０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の比活性度で、６９％の放射化学物質収率において０．６８ＧＢｑ（１８．４ｍＣｉ）の精製ペプチドを単離した。反応時間は１５分、精製時間は１２分であった。反応は、１．３ＧＢｑ（３５ｍＣｉ）１８Ｆ精製の１０分後に開始され、したがって、１８Ｆの単離から精製された最終生成物までの総時間は３７分であり、減衰を補正せずに収率５２％を得た。
ヒト血清安定性試験
【０２１０】
ＨＬＢ精製ペプチドのアリコート（約３０μＬ）を２００μＬのヒト血清（予め凍結）で希釈し、３７℃のＨＰＬＣ試料チャンバに入れた。アリコートを種々の時点で除去して、ＨＰＬＣにより分析した。ＨＰＬＣ分析は、３７℃で少なくとも５時間の血清中の１８Ｆ標識化ペプチドの非常に高い安定性を示した（示さず）。血清中で５時間インキュベーションした後の１８Ｆ標識化ペプチドの検出可能な分解は認められなかった（示さず）。
【０２１１】
ＩＭＰ４６１およびＩＭＰ４６２配位子はアルミニウムを結合するために利用可能な２個のカルボキシル基を有しする一方で、ＩＭＰ４６７中のＮＯＴＡ配位子は４個のカルボキシル基を有した。血清安定性試験は、ＩＭＰ４６７についての錯体がインビボでの使用を反復する条件下に血清中で安定であることを示した。さらに、標識化ＩＭＰ４６７についてのインビボでの生体内分布試験は、１８Ｆ−Ａｌ標識化ペプチドが実際のインビボ条件下で安定であることを示した。
【０２１２】
ＨＰＬＣ精製を必要とせずに、少なくとも１７ＧＢｑ／μｍｏｌの比活性度で、ペプチド上のＮＯＴＡ配位子と結合され得るＡｌ１８Ｆ錯体を形成することにより、ペプチドは１８Ｆで迅速に（３０分）高収率で標識化され得る。Ａｌ１８Ｆ  ＮＯＴＡ−ペプチドは、血清中で、ならびにインビボで安定である。ＮＯＴＡ配位子の修飾は収率および比活性度の改善をもたらし得る一方で、Ａｌ１８Ｆ−ＮＯＴＡ錯体のインビボ安定性を依然として保持し、親水性リンカーへの付着はペプチドの腎クリアランスを手助けする。さらに、この方法は、１８Ｆでペプチドを標識化するために一般的に用いられるドライダウン工程を回避する。以下の実施例に示すように、この新規の１８Ｆ標識化方法は、広範囲の標的化ペプチドの標識化に適用可能である。
Ａｌ１８Ｆ  ＩＭＰ４６７の最適化された標識化
【０２１３】
ＩＭＰ４６７の１８Ｆ標識化のための最適化された状態を同定した。これらは市販の滅菌生理食塩水（ｐＨ５〜７）によって１８Ｆフッ化物を溶離すること、２０ｎｍｏｌのＡｌＣｌ３および４０ｎｍｏｌ  ＩＭＰ４６７とｐＨ４の酢酸塩緩衝剤中、合計容量１００μＬで混合し、１０２℃まで１５分間加熱し、ＳＰＥ分離を実施することからなる。ＨＰＬＣ精製に必要とされない単一の固相抽出（ＳＰＥ）分離の３０分の手順の後に、単一工程においてＩＭＰ４６７によって、高収率（８５％）および高比活性度（１１５ＧＢｑ／μｍｏｌ）を得る。１８Ｆ−ＩＭＰ４６７は、ＰＢＳまたはヒト血清において安定であり、３７℃で６時間いずれかの媒体においてインキュベーションした後の１８Ｆの損失は２％であった。
１８Ｆの濃度および精製
【０２１４】
放射線化学グレードの１８Ｆは、使用前に精製および濃縮する必要がある。本発明者らは、使用前に１８Ｆを処理する４種の異なるＳＰＥ精製手順を調査した。放射性標識化手順の大部分を、常套的なプロセスによって調製される１８Ｆを用いて調製した。２ｍＬの水中の１８Ｆを、１０ｍＬの０．４ＭのＫＨＣＯ３、その後１０ｍＬの水によって前洗浄したＳＥＰ−ＰＡ（登録商標）Ｌｉｇｈｔ、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｃｅｌｌ（商標）ＱＭＡ  Ｐｌｕｓ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅに負荷した。カートリッジに１８Ｆを負荷した後、５ｍＬの水によって洗浄して、あらゆる溶解された金属および放射金属不純物を除去した。次いで、同位体を約１ｍＬの０．４ＭのＫＨＣＯ３によっていくつかの画分で溶離し、最大濃度の活性を有する画分を単離した。溶離した画分を１００μＬの溶液あたり５μＬの氷酢酸によって中和して、溶離液をｐＨ４〜５に調整した。
【０２１５】
第２のプロセスにおいて、ＱＭＡカートリッジを１０ｍＬのｐＨ８．４の０．５ＭのＮａＯＡｃ、続いて１０ｍＬのＤＩ  Ｈ２Ｏによって洗浄した。１８Ｆを上記のようにカラム上に負荷し、１画分中に６０〜７０％の活性を有する、２００μＬの画分中１ｍＬのｐＨ６の０．０５ＭのＫＮＯ３によって溶離した。
【０２１６】
第３のプロセスにおいて、ＱＭＡカートリッジを１０ｍＬのｐＨ８．４の０．５ＭのＮａＯＡｃ、続いて１０ｍＬのＤＩ  Ｈ２Ｏによって洗浄した。１８Ｆを上記のようにカラム上に負荷し、１画分中に８０％の活性を有する、２００μＬの画分中１ｍＬのｐＨ５〜７の０．１５４Ｍの市販の生理食塩水によって溶離した。この溶液のｐＨ調整は必要でなかった。
【０２１７】
最後に、本発明者らは、タンデムイオン交換を用いて、より濃縮された高い活性の１８Ｆ溶液を調製する方法を考案した。簡潔には、Ｔｙｇｏｎチューブ（長さ１．２７ｃｍ、ＯＤ０．６４ｃｍ）  をＴＲＩＣＯＲＮ（商標）５／２０カラム内に挿入し、１００〜２００メッシュの約２００μＬのＡＧ１−Ｘ８樹脂を充填した。樹脂を６ｍＬの０．４ＭのＫ２ＣＯ３、続いて６ｍＬのＤＩ  Ｈ２Ｏによって洗浄した。ＳＥＰ−ＰＡＫ（登録商標） ｌｉｇｈｔ  Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＣＥＬＬ（商標）Ｐｌｕｓ  ＣＭカートリッジをＤＩ  Ｈ２Ｏによって洗浄した。シリンジポンプを用いて、
【０２１８】
２ｍＬのＤＩ  Ｈ２Ｏ中の５ｍＬのシリンジに収容された粗１８Ｆを、ＣＭカートリッジにゆっくりと流通させ、ＴＲＩＣＯＲＮ（商標）カラムを約５分にわたって両方のイオン結合カラムを経てＤＩ  Ｈ２Ｏによって６ｍＬの洗浄を行った。最後に、０．４ＭのＫ２ＣＯ３を５０μＬの画分中、ＴＲＩＣＯＲＮ（商標）カラムのみに押し通した。典型的には、４０〜６０％の溶離された活性は、５０μＬの一画分中にあった。画分を５μＬの氷酢酸を含有する２．０ｍＬの取り付け型ねじふた付微量遠心管において収集して、炭酸塩溶液を中和した。次いで、最大活性を有する溶離バイアルを反応バイアルとして用いた。
実施例１６．ＩＭＰ４７０の合成および標識化
ＩＭＰ４７０  Ｌ−ＮＥＴＡ−スクシニル−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（配列番号：３０）
【０２１９】
以下の順序で、以下のアミノ酸：Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨを樹脂に添加し、Ａｌｏｃを切断し、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨ、Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨを添加することにより、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂上に、ペプチドＩＭＰ４７０を作製した。Ａｌｏｃの除去後に得られた遊離アミンを無水コハク酸と反応させ、Ｎ末端にカルボン酸基を生成した。これは、ＤＭＦにおいてＤＩＣを用いて活性化され、その後、ｔｅｒｔ−ブチル保護化Ｌ−ＮＥＴＡ７とカップリングされる。次いで、ペプチドを樹脂から切断し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製して、１６．４ｍｇのＩＭＰ４７０を生じた。Ｌ−ＮＥＴＡを有さず、保持時間９．００１分を有するペプチドに対応する分子量１０３７．１５の生成物も得た。
【０２２０】
１８Ｆ標識化のために、３μＬの２ｍＭのＡｌＣｌ３溶液に、４０μＬのＦ−１８溶液（１．７３６ｍＣｉの１８Ｆ）を、その後、２０μＬ（４０ｎｍｏｌ）の２ｍＭ  ＩＭＰ４７０溶液を添加して、１０１℃まで１５分間加熱した。逆相ＨＰＬＣ分析は、カラムのボイド容量で溶離された（２．７０分）活性の２６．１０％（保持時間８．９０分）および４７．２９％（保持時間９．３０分）で２個の放射能標識化ペプチドピークを示した（示さず）。
【０２２１】
ＨＬＢカラムクロマトグラフィによって、水で溶離して、１：１のＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏで溶離することにより、粗標識化ペプチドを精製し、標識化ペプチドを収集した。収集された７９０μＣｉは、標識化ペプチドの６５．８３％が回収されたことを表す。
【０２２２】
５０μＬのＨＬＢカラムの精製された１８Ｆ標識化ペプチドを１００μＬのヒト血清と混合し、試料を全ＲＰ−ＨＰＬＣ分析の間３７℃で保持した。１８Ｆ標識化ＩＭＰ４７０は、少なくとも４時間、血清中で安定であった（示さず）。
実施例１７．アルミニウムによってプレインキュベートされたペプチドへの１８Ｆの添加による標識化
【０２２３】
アルミニウムによって錯体化された大環状ＮＯＴＡに連結した、ＨＳＧ含有ペプチド（ＩＭＰ４６５、ＮＯＴＡ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２）（配列番号：３１）を、Ｆ−１８によって成功裏に標識化した。４０ｎｍｏｌのＩＭＰ４６５を用いた１８Ｆの組み込みは、１３．２０％であった。中間体ペプチド、ＩＭＰ４６１を、上記のように作製した。次いで、２５．７ｍｇのＩＭＰ４６１を、１０．２ｍｇのＡｌＣｌ３．６Ｈ２Ｏが添加された２ｍＬの脱イオン水に溶解し、得られた溶液を１００℃まで１時間加熱した。粗反応混合物をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、１９．６ｍｇのＩＭＰ４６５を生じた。
【０２２４】
１８Ｆ標識化のために、５０μＬの１８Ｆ溶液［０．７０２ｍＣｉの１８Ｆ］および２０μＬの（４０ｎｍｏｌ）２ｍＭのＩＭＰ４６５溶液（０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．１８）を１０１℃まで１７分間加熱した。逆相ＨＰＬＣ分析は、活性の１５．３８％（ＲＴ約８．６０分）をペプチドに付着させ、活性の８４．６２％がカラムの空隙用量において溶離した（２．６０分）ことを示した。
【０２２５】
別の実験において、１８Ｆ標識化ペプチドの％収率を、ペプチドの添加量を変動することによって改善することができた。ＩＭＰ４６５について観察された％収率は、１０ｎｍｏｌのペプチドで０．２７％、２０ｎｍｏｌのペプチドで１．８％、４０ｎｍｏｌのペプチドで４９％であった。
【０２２６】
ＩＭＰ４６７は、ペプチドが１８Ｆへの暴露前にアルミニウムによってプレインキュベートされたとき、ＩＭＰ４６１よりも高い収率を示した。ＩＭＰ４６７をアルミニウムによって室温でインキュベートし、次いで、凍結乾燥した。プレインキュベーションのためのアルミニウムの添加量を変動させた。
【表７】
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【０２２７】
収率は、ＩＭＰ４６７をＡｌ１８Ｆ錯体の添加によって標識化したときに得られたものに匹敵した。したがって、キレート部分に既に結合したアルミニウムによる１８Ｆのペプチドへの添加による１８Ｆ標識化は、キレート部分への添加の前に１８Ｆによって金属をプレインキュベートする実現可能な代替のアプローチである。
実施例１８．ＩＭＰ４６８ボンベシンペプチドの合成および標識化
【０２２８】
１８Ｆ標識化された標的化部位は、抗体または抗体フラグメントに限定されず、むしろ、１８Ｆ  ＰＥＴによって画像化され得る病態または他の状態に関連するまたはこれを診断する細胞標的に特異的または選択的に結合するいずれの分子であってもよい。ボンベシンは、ニューロメジンＢおよびガストリン放出性ペプチドに相同性である１４アミノ酸ペプチドであり、癌、例えば、肺および胃癌ならびに神経細胞芽腫の腫瘍マーカーである。ＩＭＰ４６８（ＮＯＴＡ−ＮＨ−（ＣＨ２  ）７ＣＯ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ２；配列番号：３２）をボンベシン類似体として合成し、１８Ｆによって標識化して、ガストリン放出性ペプチド受容体を標的化した。
【０２２９】
ペプチドを、文献（Ｐｒａｓａｎｐｈａｎｉｃｈら、２００７、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １０４：１２４６３−４６７）に報告されている合成スキームの変形を用いて、Ｆｍｏｃ系固相ペプチド合成によってＳｉｅｂｅｒアミド樹脂上で合成した。該合成は、ビス−ｔ−ブチルＮＯＴＡ配位子をペプチド合成の間に樹脂上でペプチドに添加するという点において異なった。
【０２３０】
ＩＭＰ４６８（０．０１３９ｇ、１．０２×１０−５ｍｏｌ）を２０３μＬの０．５ＭのｐＨ４．１３のＮａＯＡｃ緩衝剤に溶解した。溶解したがゲルを形成してペプチドゲルとなったペプチドを６０９μＬの０．５ＭのｐＨ４．１３のＮａＯＡｃ緩衝剤および４０６μＬのエタノールによって希釈し、８．３５×１０−３Ｍのペプチド溶液を生成した。１８ＦをＱＭＡカートリッジにおいて精製し、２００μＬの画分中０．４ＭのＫＨＣＯ３によって溶離し、１０μＬの氷酢酸で中和した。精製された１８Ｆ（４０μＬ、１．１３ｍＣｉ）を３μＬの２ｍＭのＡｌＣｌ３とｐＨ４の０．１ＭのＮａＯＡｃ緩衝剤中で混合した。ＩＭＰ４６８（５９．２μＬ、４．９４×１０−７ｍｏｌ）をＡｌ１８Ｆ溶液に添加し、１０８℃の加熱ブロックに１５分間置いた。粗生成物をＨＬＢカラムにおいて精製し、２×２００μＬの１：１のＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏによって溶離して、精製された１８Ｆ標識化ペプチドを３４％の収率で得た。
実施例１９．１８Ｆ標識化ボンベシンを用いた腫瘍の画像化
【０２３１】
ＮＯＴＡ−共役ボンベシン誘導体（ＩＭＰ４６８）を以下のように調製した。本発明者らは、Ｐｒａｓａｎｐｈａｎｉｃｈら（ＰＮＡＳ７０４：１２４６２−１２４６７、２００７）によってなされたように、放射性標識化されたボンベシンがＰＣ−３細胞に結合することを阻止する能力の試験を開始した。本発明者らの最初の実験は、ＩＭＰ４６８が、ボンベシンがＰＣ−３細胞に結合することを特異的に阻止することができるかを判断することであった。本発明者らは、ＩＭＰ３３３を非特異的な対照として用いた。この実験において、３×１０６のＰＣ−３細胞を、増大量のＩＭＰ４６８またはＩＭＰ３３３が添加された一定量（約５０，０００ｃｐｍｓ）の１２５Ｉ−ボンベシン（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）に暴露した。５６から０．４４ｎＭの範囲を本発明者らによる阻害剤濃度として用いた。
【０２３２】
結果は、１２５Ｉ−ＢＢＮの結合をＩＭＰ４６８によって阻止することができたが、対照ペプチド（ＩＭＰ３３３）によっては結合を阻止できなかったことを示し（示さず）、したがって、ＩＭＰ４６８の特異性を実証した。Ｐｒａｓａｎｐｈａｎｉｃｈは、３．２ｎＭにおいてペプチドのＩＣ５０を示し、これは、本発明者らが見出したＩＭＰ４６８によるもの（２１．５ｎＭ）よりもおよそ７倍低かった。
【０２３３】
この実験を市販のＢＢＮペプチドを用いて繰り返した。本発明者らには、阻害剤であるペプチドの量を２５０から２ｎＭに増加させて、１２５Ｉ−ＢＢＮがＰＣ−３細胞に結合することを阻止した。本発明者らは、ＩＭＰ４６８、および、以前に報告されている値（３．２ｎＭ）よりも高いがＢＢＮ対照が達成した値（２４．４ｎＭ）に近接するＩＣ５０値（３５．９ｎＭ）を有するＢＢＮポジティブ対照について非常に類似するＩＣ５０値を観察した。
【０２３４】
インビボでの標的化を調査するために、Ａｌ１８ＦＩＭＰ４６８の分布をｓｃＰＣ３前立腺癌異種移植片保有雄性ヌードマウスにおいて調査した；単独対ボンベシンによる阻止。放射性標識化に関して、塩化アルミニウム（１０μＬ、２ｍＭ）、５１．９ｍＣｉの１８Ｆ（ＱＭＡカートリッジ製）、酢酸、および６０μＬのＩＭＰ４６８（エタノール／ＮａＯＡｃ中８．４５ｍＭ）を１００℃で１５分間加熱した。反応混合物を逆相ＨＰＬＣにおいて精製した。画分４０および４１（３．５６、１．９１ｍＣｉ）をプールし、溶媒交換のためにＨＬＢカラムに適用した。生成物を８００μＬ（３．９８ｍＣｉ）で溶離して、９１０μＣｉがカラムに残存した。標準ＮａＣｌにおいて生じたＩＴＬＣは、０．１％の非結合活性を示した。
【０２３５】
６匹の腫瘍保有マウスの群に［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４６８（１６７μＣｉ、約９×１０−１０ｍｏｌ）を注射し、１．５時間後に剖検した。別の６匹のマウスの群に１００ｇ（６．２×１０−８ｍｏｌ）のボンベシンを［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４６８の投与の１８分前に注射した。第２の群も注射の１．５時間後に剖検した。データは、［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４６８による腫瘍の特異的な標的化を示す（図３）。ペプチドの腫瘍取込みは、［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４６８の１８分前にボンベシンを付与したときに低減した（図３）。生体内分布データは、少なくとも１．５時間での［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４６８のインビボでの安定性を示す（示さず）。
【０２３６】
より大きな腫瘍は、より高い［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４６８取込みを示し、恐らく、より大きな腫瘍においては受容体発現がより高いことに起因するものであった（示さず）。生体内分布データは、Ｐｒａｓａｎｐｈａｎｉｃｈらによる６８Ｇａによって標識化された同じペプチドについて報告されているのと同じ範囲内にある［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４６８腫瘍標的化を示した（示さず）。結果は、抗体の他に標的化分子を用いて、１８Ｆペプチド標識化方法をインビボで用いて、腫瘍において無秩序である受容体を標的化することができることを実証する。この場合、ＩＭＰ４６８標的化は、天然配位子−受容体相互作用の利点を享受した。腫瘍標的化は、Ｐ＝０．００１３のＰ値を有して顕著であった。かかる多くの配位子−受容体対は、公知であり、かかるあらゆる標的化相互作用は、本明細書に記載されている方法を用いて、Ｆ−画像化についての基礎を形成することができる。
実施例２０．ソマトスタチン類似体ＩＭＰ４６６の合成および標識化
【０２３７】
ソマトスタチンは、ソマトスタチン受容体タンパク質の分布の画像化に使用される別の非抗体標的化ペプチドである。ソマトスタチン類似体である１２３Ｉ標識オクトレオチドが、ソマトスタチン受容体発現腫瘍の画像化のために用いられてきた（例えばＫｖｏｌｓら、１９９３，  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  １８７：１２９−３３；Ｌｅｉｔｈａら、１９９３，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ３４：１３９７−１４０２）。しかし、１２３Ｉは、高価で、物理的半減期が短く、放射性標識化された化合物を調製するのが難しいため、画像化のために広範に用いられてきてはいない。本明細書に記載されている１８Ｆ標識化方法は、ソマトスタチン受容体発現腫瘍の画像化に好ましい。
ＩＭＰ４６６ＮＯＴＡ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｔ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒｏｌ（配列番号：３３）
【０２３８】
上記実施例に記載したように、標準Ｆｍｏｃ系固相ペプチド合成により、ＮＯＴＡ共役誘導体ソマトスタチン類似体オクトレオチド（ＩＭＰ４６６）を作製して、線状ペプチドを生成した。Ｃ末端Ｔｈｒｏｌ残基は、トレオニノールである。ペプチドを、ＤＭＳＯで一晩処理することにより環化した。０．００７３ｇのペプチド５．５９×１０−６ｍｏｌを、１１１．９μＬの０．５ＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４）緩衝剤中に溶解して、ＩＭＰ４６６の０．０５Ｍ溶液を作製した。溶液は時間が経つとゲルを形成したので、さらに０．５ＭのＮａＯＡｃ緩衝剤を付加することにより、０．０１２５Ｍに希釈した。
【０２３９】
１８ＦをＱＭＡカートリッジ上で精製し、０．４ＭのＫＨＣＯ３中の２００μＬの１８Ｆを得た。重炭酸塩溶液を１０μＬの氷酢酸で中和した。中和された１８Ｆ溶離物の４０μＬアリコートを３μＬの２ｍＭのＡｌＣｌ３と混合し、その後、４０μＬの０．０１２５ＭのＩＭＰ４６６溶液を付加した。混合物を１０５℃で１７分間加熱した。次いで、反応物をカラム上に負荷して、水（３ｍＬ）で非結合１８Ｆを洗い落とし、次いで、２×２００μＬの１：１のＥｔＯＨ／水で放射性標識化されたペプチドを溶離することにより、反応物をＷＡＴＥＲＳ  １ｃｃ（３０ｍｇ）ＨＬＢカラム上で精製した。ＨＬＢ精製後の放射性標識化されたペプチドの収率は、３４．６％であった。
イオン強度の影響
【０２４０】
反応混合物のイオン強度を低下させるために、漸増量のアセトニトリルを標識化混合物に添加した（最終濃度：０〜８０％）。放射性標識化されたＩＭＰ４６６の収率は、媒体中のアセトニトリル濃度の増大と共に増大した。容量の増加に関わらず（８０％において５００μＬ対０％アセトニトリルにおいて２００μＬ）、最適な放射性標識化収率（９８％）を８０％のアセトニトリル最終濃度において得た。０％のアセトニトリルにおいて、放射性標識化収率は、３回の実験において３６％から５５％の範囲であった。
実施例２１．１８Ｆ−および６８Ｇａ標識化ＩＭＰ４６６による神経内分泌腫瘍の画像化
【０２４１】
試験を実施して、１８Ｆ対６８Ｇａ標識化ソマトスタチン類似体ペプチドを用い、ソマトスタチン受容体発現腫瘍に対して直接標的化して得られたＰＥＴ画像を比較した。
方法
【０２４２】
１８Ｆ標識化−上記の実施例に記載した方法の変形によってＩＭＰ４６６を合成し、１８Ｆを標識化した。１８Ｆ標識ＩＭＰ４６６の分布を、６８Ｇａ標識ＩＭＰ４６６と比較した。２〜６ＧＢｑの１８Ｆによる（ＢＶ  Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ  ＶＵ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）ＱＭＡ  ＳＥＰＰＡＫ（登録商標）ｌｉｇｈｔカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を３ｍＬの金属不含水で洗浄した。１８Ｆを０．４ＭのＫＨＣＯ３  によるカートリッジから溶離し、２００μＬの画分を収集した。画分のｐＨを１０μＬの金属不含氷酸によってｐＨ４に調整した。３つの、０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ４）中２ｍＭのＡｌＣｌ３を添加した。次いで、１０〜５０μＬのＩＭＰ４６６（１０ｍｇ／ｍＬ）を０．５Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．１）に添加した。別途記載しない限り、反応混合物を１００℃で１５分間インキュベートした。放射性標識化されたペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣにおいて精製した。１８Ｆ−ＩＭＰ４６６含有画分を収集し、Ｈ２Ｏによって２倍に希釈し、１−ｃｃ  Ｏａｓｉｓ  ＨＬＢカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）において精製して、アセトニトリルおよびＴＦＡを除去した。簡潔には、画分をカートリッジに適用し、カートリッジを、３ｍＬのＨ２Ｏで洗浄した。次いで、放射性標識化されたペプチドを、２×２００μＬの５０％エタノールで溶離した。マウスへの注射において、ペプチドを０．９％のＮａＣｌで希釈した。４５，０００ＧＢｑ／ｍｍｏｌの最大比活性が得られた。
【０２４３】
６８Ｇａ標識化−０．１Ｍの超高純度ＨＣｌ（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｄｅｖｅｎｔｅｒ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて、ＴｉＯ２ベースの１，１１０ＭＢｑの６８Ｇｅ／６８Ｇａ発生器（Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｏｂｎｉｎｓｋ，Ｒｕｓｓｉａ）から溶離された６８ＧａＣｌ３で、ＩＭＰ４６６を標識化した。ＩＭＰ４６６を、１．０ＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤（ｐＨ７．０）中に溶解した。４容量の６８Ｇａ溶離液（１２０〜２４０ＭＢｑ）を添加し、混合物を９５℃で２０分間加熱した。次いで、５０ｍＭのＥＤＴＡを添加して最終濃度を５ｍＭにし、非組み込み６８Ｇａ３＋を錯化した。６８Ｇａ標識化ＩＭＰ４６６をＯａｓｉｓＨＬＢカートリッジ上で精製し、５０％エタノールで溶離した。
【０２４４】
放射性標識化されたペプチドの親油性を決定するために、約５０，０００ｄｐｍの放射性標識化されたペプチドを０．５ｍＬのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で希釈した。等しい容量のオクタノールを添加して二元の相系を得た。系を２分間ボルテックスした後で、二層を遠心分離によって分離した（１００ｘｇ、５分）。３つの１００μＬの試料を各層から採取し、放射活性をウエル型ガンマ計数器において測定した（Ｗａｌｌａｃ  Ｗｉｚａｒｄ３”、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）。
【０２４５】
安定性−１０μＬの１８Ｆ標識化ＩＭＰ４６６を、５００μＬの新たに収集したヒト血清中でインキュベートし、３７℃で４時間インキュベートした。アセトニトリルを添加し、混合物をボルテックスした後、１０００×ｇで５分間遠心分離して、血清タンパク質を沈殿させた。上清を、上記と同様にＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。
【０２４６】
細胞培養−４５００ｍｇ／ＬのＤグルコース、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、２ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補足したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）中で、ＡＲ４２Ｊラット膵臓腫瘍細胞株を培養した。細胞を、５％ＣＯ２を有する加湿大気中３７℃で培養した。
【０２４７】
ＩＣ５０決定−ＡＲ４２Ｊ細胞でソマトスタチン受容体を結合するための見かけの５０％の阻害濃度（ＩＣ５０）を、19F-IMP466、69Ga-IMP466または１１５In-DTPA-オクトレオチドを用いた競合結合アッセイにおいて決定して、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−オクトレオテート（の結合について競合させた。
【０２４８】
１９Ｆ−ＩＭＰ４６６をフッ化アルミニウム（ＡｌＦ）溶液（０．５ＭのＮａＡｃ中０．１ＭのＮａＦ（ｐＨ４）を有する、０．５ＭのＮａＡｃ中０．０２ＭのＡｌＣｌ３（ｐＨ４））をＩＭＰ４６６と混合し、１００℃で１５分間加熱することによって形成した。反応混合物を上記のようにＣ−１８カラムにおいてＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
【０２４９】
６９Ｇａ−ＩＭＰ４６６を、２０μＬのＩＭＰ４６６（１ｍｇ／ｍＬ）と混合した３０μＬの硝酸ガリウム（２．３×１０−８ｍｏｌ）を１０ｍＭのＮａＡｃ（ｐＨ５．５）に溶解することによって調製し、９０℃で１５分間加熱した。混合物の試料をさらに精製することなく用いた。
【０２５０】
塩化インジウム（１×１０−５ｍｏｌ）を５０ｍＭのＮａＡｃ（ｐＨ５．５）中１０μＬのＤＴＰＡ−オクトレオチド（１ｍｇ／ｍＬ）と混合することによって１１５Ｉｎ−ＤＴＰＡ−オクトレオチドを作製し、室温（ＲＴ）で１５分間加熱した。試料を、さらに精製することなく用いた。１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−オクトレオチド（ＯＣＴＲＥＯスキャン（登録商標））を製造者のプロトコルに従って放射性標識化した。
【０２５１】
ＡＲ４２Ｊ細胞を１２ウエルプレートにおける密集度まで成長させ、結合緩衝剤（０．５％ウシ血清アルブミンを有するＤＭＥＭ）によって２回洗浄した。結合緩衝剤中ＲＴで１０分のインキュベーション後、１９Ｆ−ＩＭＰ４６６、６９Ｇａ−ＩＭＰ４６６または１１５Ｉｎ−ＤＴＰＡ−オクトレオチドを微量（１０，０００ｃｐｍ）の１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−オクトレオチド（放射化学純度＞９５％）と一緒に０．１〜１０００ｎＭの範囲の最終濃度で添加した。Ｒｔで３時間のインキュベーション後、細胞を氷冷ＰＢＳによって２回洗浄した。細胞をスクラップし、細胞関連の放射活性を決定した。これらの状態下、限られた低度の内在化が起こり得る。したがって、本発明者らは、ＩＣ５０よりはむしろ「見かけＩＣ５０値」として競合結合アッセイの結果を記載する。見かけのＩＣ５０を競合物なしの５０％の結合が達成されるペプチド濃度として定義した。
【０２５２】
生体内分布試験−雄ヌードＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週）の右脇腹に、１０７細胞／ｍＬのＡＲ４２Ｊ細胞懸濁液を皮下注射した。腫瘍細胞接種の約２週間後、腫瘍が直径５〜８ｍｍになったら、３７０ｋＢｑの１８Ｆまたは６８Ｇａ標識化ＩＭＰ４６６を静脈内投与した（ｎ＝５）。別個の群（ｎ＝５）に、１，０００倍モル過剰量の非標識化ＩＭＰ４６６を注射した。３匹のマウスの１群には、非キレート化［Ａｌ１８Ｆ］を注射した。注射後（ｐ．ｉ．）２時間で、ＣＯ２／Ｏ２窒息により、全マウスを殺した。対照の器官を収集し、計量し、ガンマ計数器で計数した。組織１グラム当たりの注射用量のパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）を、各組織に関して算出した。動物実験は、地方動物福祉委員会により承認され、国の法令に従って実施された。
【０２５３】
ＰＥＴ／ＣＴ画像化−ｓ．ｃ．ＡＲ４２Ｊ腫瘍を有するマウスに、１０ＭＢｑのＡｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４６６または６８Ｇａ−ＩＭＰ４６６を静脈内注射した。ペプチド注射の１および２時間後に、１．５ｍｍの固有空間分解能を有するＩｎｖｅｏｎ動物ＰＥＴ／ＣＴスキャナ（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ，ＴＮ）でマウスを走査した（Ｖｉｓｓｅｒら、ＪＮＭ，２００９）。動物を、スキャナ中に仰臥位に入れた。ＰＥＴ放出スキャンを１５分にわたって取得し、その後、解剖学的参照のためにＣＴスキャンを得た（空間分解能１１３μｍ、８０ｋＶ、５００μＡ）。以下のパラメータ：マトリックス２５６×２５６×１５９、ピクセルサイズ０．４３×０．４３×０．８ｍｍおよび０．５ｍｍのＭＡＰ  ｐｒｉｏｒで、順序集合期待値最大化３Ｄ／最大事後確率（ＯＳＥＭ３Ｄ／ＭＡＰ）アルゴリズムを用いるＩＮＶＥＯＮ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  Ｗｏｒｋｐｌａｃｅソフトウエア  バージョン１．２（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ，ＴＮ）を用いて、スキャンを再構成した。
【０２５４】
緩衝剤の影響−ＩＭＰ４６６の標識化効率に及ぼす緩衝剤の影響を調べた。ＩＭＰ４６６を、クエン酸ナトリウム緩衝剤、酢酸ナトリウム緩衝剤、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）または４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤中に、１０ｍｇ／ｍＬ（７．７ｍＭ）で溶解した。全緩衝剤のモル数は１Ｍで、ｐＨは４．１であった。２００μｇ（１５３ｎｍｏｌ）のＩＭＰ４６６に、１００μＬのＡｌ−Ｆ−１８（ｐＨ４）を添加し、１００℃で１５分間インキュベートした。放射能標識収率および比活性を、ＲＰ−ＨＲＬＣで確定した。酢酸ナトリウム、ＭＥＳまたはＨＥＰＥＳを用いた場合、放射性標識化の収率は、それぞれ４９％、４４％および４６％であった。クエン酸ナトリウムの存在下で、標識化は観察されなかった（＜１％）。標識化反応を酢酸ナトリウム緩衝剤中で実行した場合、調製物の比活性は１０，０００ＧＢｑ／ｍｍｏｌであった一方で、ＭＥＳおよびＨＥＰＥＳ緩衝剤中では、それぞれ２０，５００および１６，５００ＧＢｑ／ｍｍｏｌの比活性を得た。
【０２５５】
ＡｌＣｌ３濃度の作用−酢酸ナトリウム中のＡｌＣｌ３の３つのストック溶液（ｐＨ４．１）を調製した：０．２、２．０および２０ｍＭ。これらの溶液から、３μＬを２００μＬの１８Ｆに添加して、［Ａｌ１８Ｆ］を形成した。これらの試料に、１５３ｎｍｏｌのペプチドを付加し、１００℃で１５分間インキュベートした。６ｎｍｏｌの最終濃度でのＡｌＣｌ３のインキュベーション後の放射性標識化収率は、４９％であった。０．６ｎｍｏｌのＡｌＣｌ３および６０ｎｍｏｌのＡｌＣｌ３を用いたインキュベーションは、放射性標識化収率の強度の低減（それぞれ１０％および６％）を生じた。
【０２５６】
ペプチド量の影響−標識効率に及ぼすペプチド量の影響を調べた。ＩＭＰ４６６を、酢酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ４．１）中に、７．７ｍＭ（１０ｍｇ／ｍＬ）の濃度で溶解し、３８、１５３または３６３ｎｍｏｌのＩＭＰ４６６を２００μＬ［Ａｌ１８Ｆ］（５８１〜６０３ＭＢｑ）に添加した。放射性標識化収率は、ペプチド量の増大と共に増大した。３８ｎｍｏｌでは、放射性標識化収率は４〜８％の範囲であり、１５３ｎｍｏｌでは、収率は４２〜４９％に増大し、最高濃度において、放射性標識化収率は４８〜５２％であった。
【０２５７】
オクタノール−水分配係数−１８Ｆおよび６８Ｇａ標識化ＩＭＰ４６６の親油性を決定するために、オクタノール−水分配係数を確定した。Ａｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４６６に関するｌｏｇＰオクタノール／水値は、−２．４４±０．１２であり、６８Ｇａ−ＩＭＰ４６６の値はマイナス３．７９±０．０７であった。これは、１８Ｆ標識化ＩＭＰ４６６がわずかに低親水性であったことを示す。
【０２５８】
安定性−１８Ｆ標識化ＩＭＰ４６６は、ヒト血清中３７℃で４時間インキュベート後に１８Ｆの放出を示さなかった。これは、Ａｌ１８Ｆ−ＮＯＴＡ錯体の優れた安定性を示す。
【０２５９】
ＩＣ５０の決定−Ａｌ１９Ｆ標識化ＩＭＰ４６６の見かけのＩＣ５０は、３．６±０．６ｎＭであった一方で、６９Ｇａ標識化ＩＭＰ４６６の見かけのＩＣ５０は、１３±３ｎＭであった。参照のペプチド、１１５Ｉｎ−ＤＴＰＡ−オクトレオチド（ＯＣＴＲＥＯスキャン（登録商標））の見かけのＩＣ５０は、６．３±０．９ｎＭであった。
【０２６０】
生体内分布試験−Ａｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４６６および６８Ｇａ−ＩＭＰ４６６の両方の生体内分布を、注射後２時間に，ｓ．ｃ．ＡＲ４２Ｊ腫瘍を有するヌード  ＢＡＬＢ／ｃマウスで試験した（図４）。Ａｌ１８Ｆを、対照として含めた。１８Ｆ−ＩＭＰ４６６の腫瘍標的化は高く、注射後２時間で２８．３±５．７％ＩＤ／ｇで蓄積された。過剰量の非標識化ＩＭＰ４６６の存在下での取込みは８．６±０．７％ＩＤ／ｇであった。これは、腫瘍取込みが受容体媒介性であったことを示す。血中レベルは非常に低く（０．１０±０．０７％ＩＤ／ｇ、注射後２時間）、２９９±８８という腫瘍対血液比を生じる。器官における取込みは低く、副腎、膵臓および胃などの受容体発現器官においては特異的取込みを示す。Ａｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４６６の骨取込みは非キレート化Ａｌ１８Ｆの取込みと比較して無視できる（それぞれ注射後２時間で、０．３３±０．０７対３６．９±５．０％ＩＤ／ｇ）が、これは、１８Ｆ標識化ＮＯＴＡ−ペプチドの良好なインビボでの安定性を示した。
【０２６１】
Ａｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４６６の生体内分布を６８Ｇａ−ＩＭＰ４６６のものと比較した（図４）。６８Ｇａ−ＩＭＰ４６６（２９．２±０．５％ＩＤ／ｇ、２時間ｐｉ）の腫瘍取込みはＡｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４６６（ｐ＜０．００１）のものと類似した。６８Ｇａ−ＩＭＰ４６６の肺取込みは、１８Ｆ−ＩＭＰ４６６（それぞれ、４．０±０．９％ＩＤ／ｇ対１．９±０．４％ＩＤ／ｇ）より２倍高かった。加えて、６８Ｇａ−ＩＭＰ４６６の腎臓保持は、Ａｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４６６のものよりも僅かに高かった（それぞれ１６．２±２．８６％ＩＤ／ｇ対９．９６±１．２７％ＩＤ／ｇ）。
【０２６２】
融合ＰＥＴおよびＣＴスキャンを、図５に示す。ＰＥＴスキャンは、生体内分布データを裏付けた。Ａｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４６６および６８Ｇａ−ＩＭＰ４６６は共に、腫瘍における高い取込み、ならびに腎臓における保持を示した。腎臓中の活性は、腎臓皮質中に主に局在化した。また、骨取込みは観察されなかったため、Ａｌ１８Ｆは、ＮＯＴＡキレート剤により安定的にキレート化されることを実証した。
【０２６３】
図５は、ソマトスタチン（オクトレオチド）の１８Ｆ標識化類似体の分布が６８Ｇａ標識ソマトスタチン類似体の分布を模倣することを明らかに示す。神経内分泌性腫瘍を有するヒト対象における６８Ｇａ標識化オクトレオチドＰＥＴ画像化は、９７％の感度、９２％の特異性および９６％の精度で、常套的なソマトスタチン受容体シンチグラフィおよび診断用ＣＴと比較して有意に高い検出率を有することが示されているため、これらの結果は有意である（例えば、Ｇａｂｒｉｅｌら、２００７，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ４８：５０８−１８）。６８Ｇａ標識化オクトレオチドによるＰＥＴ画像化は、１１１Ｉｎ標識化オクトレオチドを用いたＳＰＥＣＴ分析より優れていると、ならびに小さな髄膜種でさえその検出に対して高感受性であると報告されている（Ｈｅｎｚｅら、２００１，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ４２：１０５３−５６）。１８Ｆと比較して６８Ｇａのエネルギーの方が高いため、１８ＦベースのＰＥＴ画像化は６８ＧａベースのＰＥＴ画像化より良好な空間分解能を示すことが予想される。これは、１８Ｆ標識化ＩＭＰ４６６（図５、左）対６８Ｇａ標識化ＩＭＰ４６６（図５、右）で得られる腎臓画像を比較することにより、図５に例示する。６８Ｇａで得られるＰＥＴ画像は、１８Ｆで得られる画像より拡散した縁およびより低い分解能を示す。これらの結果は、本明細書に記載されている方法および組成物を用いて調製される１８Ｆ標識標的化部分で得られる優れた画像を実証し、非抗体標的化ペプチドに関して記載された１８Ｆ標識化技術の有用性を確認する。
実施例２２．前標的化を用いた６８Ｇａおよび１８Ｆ  ＰＥＴ画像化の比較
【０２６４】
本発明者らは、上記のように調製される二重特異的ＴＦ２抗体で前標的化された６８Ｇａ−または１８Ｆ標識化ペプチドを用いて得られるＰＥＴ画像を比較した。６８Ｇａ（ｔ１／２＝６８分）および１８Ｆ（ｔ１／２＝１１０分）の半減期は、時間内に腫瘍におけるその最大増大に達するため、放射性標識化ペプチドの薬物動態と一致する。さらに、６８Ｇａは６８Ｇｅ／６８Ｇａ発生器から容易に入手可能である一方で、１８Ｆは最も一般的に用いられ、ＰＥＴで広範に利用可能な放射性核種である。
方法
【０２６５】
ｓ．ｃ．ＣＥＡ発現ＬＳ１７４Ｔ腫瘍を有するマウスに、ＴＦ２（６．０ｎｍｏｌ；０．９４ｍｇ）、および５ＭＢｑの６８Ｇａ標識化ＩＭＰ２８８（０．２５ｎｍｏｌ）または１８Ｆ標識ＩＭＰ４４９（０．２５ｎｍｏｌ）を、二重特異的抗体と放射性標識化ペプチドの注射の間に１６時間の間隔で静脈内投与した。放射性標識化ペプチドの注射の１または２時間後に、ＰＥＴ／ＣＴ画像を取得し、放射性標識化ペプチドの生体内分布を決定した。ＬＳ１７４Ｔ腫瘍中の取込みを，ｓ．ｃ．ＣＥＡ陰性ＳＫ−ＲＣ５２腫瘍中の取込みと比較した。前標的化イムノＰＥＴ画像化を、ｓ．ｃ．ＬＳ１７４Ｔ腫瘍および体側に炎症大腿筋を有するマウスにおいて、１８Ｆ−ＦＤＧ−ＰＥＴ画像化と比較した。
ＩＭＰ２８８ＤＯＴＡ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（配列番号：３４）
【０２６６】
前標的化−上記のようなＤＮＬ法により、二重特異的ＴＦ２抗体を作製した。ＴＦ２は、ｈ６７９抗体からの１つのＨＳＧ結合Ｆａｂと、ｈＭＮ−１４抗体からの２つのＣＥＡ結合Ｆａｂ断片を含む三価の二重特異的抗体である。上記のように、ＤＯＴＡ共役、ＨＳＧ含有ペプチドＩＭＰ２８８を合成し、精製した。上記のように合成されたＩＭＰ４４９ペプチドは、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）キレート部分を含有して、１８Ｆによる標識化を促す。抗体成分のためのトレーサとして、ヨードゲン法（Ｆｒａｋｅｒ  ａｎｄ  Ｓｐｅｃｋ，１９７８，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ  ８０：８４９−５７）により、ＴＦ２を１２５Ｉ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で、５８ＭＢｑ／ｎｍｏｌの比活性に標識化した。
【０２６７】
ＩＭＰ２８８の標識化−厳密な金属不含条件下で、３２ＭＢｑ／ｎｍｏｌの比活性で、生体内分布試験のために１１１Ｉｎ（Ｃｏｖｉｄｉｅｎｔ，Ｐｅｔｔｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）でＩＭＰ２８８を標識化した。０．１Ｍ超高純度ＨＣｌを用いて、ＴｉＯ２ベースの１，１１０ＭＢｑの６８Ｇｅ／６８Ｇａ発生器（Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｏｂｎｉｎｓｋ，Ｒｕｓｓｉａ）から溶離された６８Ｇａで、ＩＭＰ２８８を標識化した。５つの１ｍＬの分画を収集し、第２分画を、ペプチドを標識化するために用いた。１容量の１．０ＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤、ｐＨ７．０を、３．４ｎｍｏｌのＩＭＰ２８８に添加した。４容量の６８Ｇａ溶離液（３８０ＭＢｑ）を添加し、混合物を９５℃で２０分間加熱した。次いで、５０ｍＭのＥＤＴＡを添加して最終濃度を５ｍＭにして、非キレート化６８Ｇａ３＋を錯化した。６８Ｇａ標識化ＩＭＰ２８８を１ｍＬ  ＯａｓｉｓＨＬＢカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）上で精製した。カートリッジを水で洗浄後、ペプチドを２５％エタノールで溶離した。６８ＧａでＩＭＰ２８８を標識化するための手順を４５分以内に実施し、調製物はインビボでの使用のための準備ができた。
【０２６８】
ＩＭＰ４４９の標識化−上記のように１８ＦでＩＭＰ４４９を標識化した。５５５〜７４０ＭＢｑの１８Ｆ（Ｂ．Ｖ．Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ  ＶＵ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を、０．４ＭのＫＨＣＯ３でＱＭＡカートリッジから溶離した。Ａｌ１８Ｆ活性を、ペプチド（２３０μｇ）およびアスコルビン酸（１０ｍｇ）を含入するバイアルに添加した。混合物を、１００℃で１５分間インキュベートした。ＲＰ−ＨＰＬＣにより反応混合物を精製した。１容量の水を添加後、１ｍＬ  ＯａｓｉｓＨＬＢカートリッジ上でペプチドを精製した。水で洗浄後、放射性標識化ペプチドを５０％エタノールで溶離した。１８Ｆ−ＩＭＰ４４９を６０分以内に調製した、調製物はインビボでの使用のための準備ができた。
【０２６９】
試験で用いた１２５Ｉ−ＴＦ２、１１１Ｉｎ−および６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８、ならびにＡｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４４９調製物の放射化学純度は、常に９５％を超えた。
【０２７０】
動物実験−体重２０〜２５グラムの雄性ヌードＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）で、実験を実施した。マウスに、１×１０６個のＬＳ１７４Ｔ細胞（ＣＥＡ発現ヒト結腸癌腫細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ））の０．２ｍＬの懸濁液を皮下注射した。腫瘍が約０．１〜０．３ｇの大きさになった時点（腫瘍接種後１０〜１４日目）で、試験を開始した。
【０２７１】
ＴＦ２およびＩＭＰ２８８注射間の間隔は１６時間であったが、循環から非結合ＴＦ２を除去するのに十分な期間であったためである。いくつかの試験では、１２５Ｉ−ＴＦ２（０．４ＭＢｑ）を、非標識化ＴＦ２と同時注射した。ＩＭＰ２８８を、１１１Ｉｎまたは６８Ｇａで標識した。ＩＭＰ４４９を、１８Ｆで標識した。マウスに、ＴＦ２およびＩＭＰ２８８を静脈内投与した（０．２ｍＬ）。６８Ｇａ標識ペプチドの注射の１時間後、ならびに１８Ｆ−ＩＭＰ４４９の注射の２時間後、ＣＯ２／Ｏ２によりマウスを安楽死させて、心臓穿刺により血液を採取し、組織を切り出した。
【０２７２】
Ｉｎｖｅｏｎ動物ＰＥＴ／ＣＴスキャナ（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ，ＴＮ）で、ＰＥＴ画像を取得した。解剖学的参照のためにＣＴスキャンを先行して、１５分間、ＰＥＴ放出スキャンを取得した（空間分解能１１３μｍ、８０ｋＶ、５００μＡ、曝露時間３００ミリ秒）。
【０２７３】
画像化後、目的の腫瘍および器官を切断し、計量し、１２５Ｉ、１１１Ｉｎ、６８Ｇａまたは１８Ｆに関して適切なエネルギーウィンドウを有するガンマ計数器で計数した。注射用量パーセンテージ／組織１グラム（％ＩＤ／ｇ）を算出した。
結果
【０２７４】
１時間以内に、前標的化イムノＰＥＴは腫瘍中の６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８の高く且つ特異的な標的化を生じた（１０．７±３．６％ＩＤ／ｇ）が、正常組織中（例えば、腫瘍／血液６９．９±３２．３）、ＣＥＡ陰性腫瘍（０．３５±０．３５％ＩＤ／ｇ）および炎症筋肉（０．７２±０．２０％ＩＤ／ｇ）中で非常に低い取込みを示した。ＴＦ２で前標的化されていない腫瘍も、低い６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８取込みを有した（０．２０±０．０３％ＩＤ／ｇ）。［１８Ｆ］ＦＤＧは腫瘍中で効率的に増大した（７．４２±０．２０％ＩＤ／ｇ）が、炎症筋肉中（４．０７±１．１３％ＩＤ／ｇ）および多数の正常組織においても増大し、したがって、前標的化６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８は、良好な特異性および感受性を提供した。ＴＦ２による前標的化後に６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８または１８Ｆ標識ＩＭＰ４４９を投与したマウスの対応するＰＥＴ／ＣＴ画像は、皮下ＬＳ１７４Ｔ腫瘍中の放射能標識ペプチドの効率的な標的化を明らかに示した一方で、炎症筋肉は可視化されなかった。対照的に、［１８Ｆ］ＦＤＧに関しては、腫瘍ならびに炎症は明白に描写された。
【０２７５】
用量最適化−固定された０．０１ｎｍｏｌ（１５ｎｇ）用量のＩＭＰ２８８の腫瘍標的化に及ぼすＴＦ２  ｂｓＭＡｂ用量の影響を決定した。５匹のマウスの群に、微量の１２５Ｉ（０．４ＭＢｑ）で標識化された０．１０、０．２５、０．５０または１．０ｎｍｏｌのＴＦ２（それぞれ、１６、４０、８０または１６０μｇ）を静脈内注射した。１１１Ｉｎ−ＩＭＰ２８８（０．０１ｎｍｏｌ、０．４ＭＢｑ）の注射の１時間後に、放射性標識化の生体内分布を決定した。
【０２７６】
ＴＦ２は、血液および正常組織から迅速に出て行った。注射の１８時間後、血中濃度は、試験した全てのＴＦ２用量で、０．４５％ＩＤ／ｇ未満であった。腫瘍におけるＴＦ２の標的化は、注射後２時間で３．５％ＩＤ／ｇで、ＴＦ２用量とは無関係であった（データは示さず）。全てのＴＦ２用量で、１１１Ｉｎ−ＩＭＰ２８８は腫瘍中に有効に蓄積した（示さず）。より高いＴＦ２用量では、腫瘍における１１１Ｉｎ−ＩＭＰ２８８の取込みの向上が観察された：１．０ｎｍｏｌのＴＦ２用量では、ＩＭＰ２８８の最大標的化に到達した（２６．２±３．８％ＩＤ／ｇ）。したがって、０．０１ｎｍｏｌのペプチド用量では、最大の腫瘍標的化および標的対血液比が、１．０ｎｍｏｌの最大のＴＦ２用量で到達された（ＴＦ２：ＩＭＰ２８８モル比＝１００：１）。正常組織の間で、腎臓は、１１１Ｉｎ  ＩＭＰ２８８（１．７５±０．２７％ＩＤ／ｇ）の最大の取込みを有し、ＴＦ２用量の影響を受けなかった。他の正常組織は全て、非常に低い取込みを示し、試験した全てのＴＦ２用量で５０：１を超える極端に高い腫瘍対非腫瘍比を生じた（示さず）。
【０２７７】
注射後１時間でＰＥＴ画像化が実施される場合、５〜１０ＭＢｑの６８Ｇａの最小放射能がマウス当たりで注射される必要があるため、６８Ｇａ標識化ＩＭＰ２８８を用いたＰＥＴ画像化のためには、より高いペプチド用量を要する。６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８調製物の比活性は、注射時点で５０〜１２５ＭＢｑ／ｎｍｏｌであった。したがって、ＰＥＴ画像化のためには、少なくとも０．１〜０．２５ｎｍｏｌのＩＭＰ２８８が投与されなければならなかった。同じＴＦ２：ＩＭＰ２８８モル比を、０．１ｎｍｏｌのＩＭＰ２８８用量で試験した。１．０、２．５、５．０または１０．０ｎｍｏｌのＴＦ２（１６０、４００、８００または１６００μｇ）を注射することにより、ＬＳ１７４Ｔ腫瘍を前標的化した。低ペプチド用量での結果と対照的に、腫瘍中の１１１Ｉｎ−ＩＭＰ２８８取込みはＴＦ２用量の影響を受けなかった（試験した全用量で１５％ＩＤ／ｇ、データは示さず）。％ＩＤ／ｇに換算した腫瘍におけるＴＦ２標的化は、用量が高いほど低減した（それぞれ、１．０ｎｍｏｌおよび１０．０ｎｍｏｌの注射用量で、３．２１±０．６１％ＩＤ／ｇ対１．１６±０．２７％ＩＤ／ｇ）（データは示さず）。腎臓取込みも、ｂｓＭＡｂ用量とは無関係であった（２％ＩＤ／ｇ）。これらのデータに基づいて、腫瘍に対する０．１〜０．２５ｎｍｏｌのＩＭＰ２８８の標的化に関して、６．０ｎｍｏｌというｂｓＭＡｂ用量を、本発明者らは選択した。
【０２７８】
ＰＥＴ画像化−ＣＥＡ発現腫瘍を画像処理するためのＴＦ２および６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８による前標的化イムノＰＥＴ画像化の有効性を実証するために、皮下腫瘍を５匹のマウスにおいて誘導した。右脇腹に、ｓ．ｃ．ＬＳ１７４Ｔ腫瘍を誘導した一方で、同時に、同一マウスにおいて、１×１０６個のＳＫ−ＲＣ５２細胞を左脇腹に接種して、ＣＥＡ陰性腫瘍を誘導した。１４日後、腫瘍が０．１〜０．２ｇのサイズになったら、マウスを、６．０ｎｍｏｌの１２５Ｉ−ＴＦ２で静脈内に前標的化した。１６時間後、マウスは５ＭＢｑの６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８（０．２５ｎｍｏｌ、比放活性２０ＭＢｑ／ｎｍｏｌ）を受けた。３匹のマウスの別個の群には、同量の６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８単独を投与し、ＴＦ２で前標的化しなかった。６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８の注射の１時間後に、マウスのＰＥＴ／ＣＴスキャンを獲得した。
【０２７９】
マウスにおける１２５Ｉ−ＴＦ２および６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８の生体内分布を、図６に示す。さらに、ｂｓＭＡｂ（２．１７±０．５０％ＩＤ／ｇ）およびペプチド（１０．７±３．６％ＩＤ／ｇ）の高い取込みが腫瘍において観察されたが、正常組織において取込みは非常に低かった（腫瘍対血液比：６４±２２）。ＣＥＡ陰性腫瘍ＳＫ−ＲＣ５２における６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８の標的化は、非常に低かった（０．３５±０．３５％ＩＤ／ｇ）。同様に、ＴＦ２で前標的化されなかった腫瘍は、６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８の低取込みを有した（０．２０±０．０３％ＩＤ／ｇ）。これは、ＣＥＡ発現ＬＳ１７４Ｔ腫瘍におけるＩＭＰ２８８の特異的蓄積を示した。
【０２８０】
６８Ｇａ標識化ペプチドの注射の１時間後に得られたＰＥＴ画像において、ＴＦ２で前標的化されたＣＥＡ発現腫瘍における６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８の特異的取込みが明瞭に可視化された（示さず）。最大強度の５０％閾値を用いて、対象領域（ＲＯＩ）を抜き出すことにより、腫瘍における取込みを定量的に評価した。腹部の領域を、バックグラウンド領域として用いた。ＴＦ２および６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８を投与されたマウスの画像における腫瘍対バックグラウンド比は、３８．２であった。
【０２８１】
次いで、本発明者らは、［１８Ｆ］ＦＤＧによる前標的化イムノＰＥＴを調べた。５匹のマウスの２つの群において、ｓ．ｃ．ＬＳ１７４Ｔ腫瘍を右後足に誘導し、左大腿筋中の炎症病巣を５０μＬのテルペンチンの筋肉内注射により誘導した（１８）。テルペンチン注射の３日後に、マウスの１群に、６．０ｎｍｏｌのＴＦ２を投与し、１６時間後、５ＭＢｑの６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８（０．２５ｎｍｏｌ）を投与した。他の群は、［１８Ｆ］ＦＤＧ（５ＭＢｑ）を受けた。注射前の１０時間の間はマウスを絶食させて、麻酔して、注射後１時間の安楽死まで、３７℃で温保持した。
【０２８２】
炎症筋肉中の６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８の取込みは非常に低かったが、同じ動物における腫瘍中の取込みは高かった（０．７２±０．２０％ＩＤ／ｇ対８．７３±１．６０％ＩＤ／ｇ、ｐ＜０．０５、図７）。炎症筋肉中の取込みは、肺、肝臓および脾臓中の取込みと同一範囲であった（それぞれ、０．５０±０．１４％ＩＤ／ｇ、０．７２±０．０７％ＩＤ／ｇ、０．４４±０．１０％ＩＤ／ｇ）。これらのマウスにおける６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８の腫瘍対血液比は６９．９±３２．３であった；炎症筋肉対血液比は５．９±２．９であった；腫瘍対炎症筋肉比は１２．５±２．１であった。マウスの他の群では、１８Ｆ−ＦＤＧは腫瘍中で効率的に増大した（７．４２±０．２０％ＩＤ／ｇ、腫瘍対血液比６．２４±１．５、図４）。１８Ｆ−ＦＤＧも、炎症筋肉中に実質的に蓄積し（４．０７±１．１３％ＩＤ／ｇ）、炎症筋肉対血液比は３．４±０．５、腫瘍対炎症筋肉比は１．９７±０．７１であった。
【０２８３】
ＴＦ２による前標的化後の68Ga−ＩＭＰ２８８を受けたマウスの対応するＰＥＴ／ＣＴ画像は、腫瘍中の放射能標識ペプチドの効率的な増大を明白に示したが、炎症筋肉は可視化されなかった（図８）。これに対して、１８Ｆ−ＦＤＧを受けたマウスの画像に関して、腫瘍、ならびに炎症が可視的であった（図８）。６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８を投与されたマウスでは、腫瘍対炎症組織比は５．４であった；腫瘍対バックグラウンド比は４８であった；炎症筋肉対バックグラウンド比は８．９であった。［１８Ｆ］ＦＤＧ取込みは０．８３の腫瘍対炎症筋肉比を有した；腫瘍対バックグラウンド比は２．４であった；炎症筋肉対バックグラウンド比は２．９であった。
【０２８４】
Ａｌ１８Ｆ標識ＩＭＰ４４９を用いて、前標的化イムノＰＥＴ画像化方法を試験した。５匹のマウスに、６．０ｎｍｏｌのＴＦ２を投与し、１６時間後、５ＭＢｑのＡｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４４９（０．２５ｎｍｏｌ）を受けた。別の３匹には、５ＭＢｑのＡｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４４９を投与し、ＴＦ２の前投与はしなかったが、２匹の対照マウスには、［Ａｌ１８Ｆ］（３ＭＢｑ）を注射した。この実験の結果を、図９にまとめる。ＴＦ２で前標的化された腫瘍におけるＡｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４４９の取込みは高かった（１０．６±１．７％ＩＤ／ｇ）が、非前標的化マウスでは非常に低かった（０．４５±０．３８％ＩＤ／ｇ）。［Ａｌ１８Ｆ］は骨中に蓄積した（５０．９±１１．４％ＩＤ／ｇ）が、骨における放射性標識化ＩＭＰ４４９ペプチドの取込みは非常に低かった（０．５４±０．２％ＩＤ／ｇ）が、これは、Ａｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４４９がインビボで安定であったことを示す。ｓ．ｃ．ＬＳ１７４Ｔ腫瘍を有するＴＦ２前標的化マウスにおけるＡｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４４９の生体内分布は、６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８の分布と高度に類似した。
【０２８５】
Ａｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４４９を用いた前標的化イムノＰＥＴのＰＥＴ画像は、６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８を用いたものと同じである、腫瘍における強度を示すが、１８Ｆ画像の分解能は６８Ｇａ画像より優れていた（図１０）。Ａｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４４９シグナルの腫瘍対バックグラウンド比は６６であった。
結論
【０２８６】
本試験は、抗ＣＥＡ×抗ＨＳＧ二重特異的抗体ＴＦ２を６８Ｇａ−または１８Ｆ−標識化ジ−ＨＳＧ−ＤＯＴＡ−ペプチドと組み合わせて用いた前標的化イムノＰＥＴは、ＣＥＡ発現腫瘍のＰＥＴ画像診断のための迅速かつ特異的技術であることを示した。
【０２８７】
ＴＦ２を６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８またはＡｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４４９と組み合わせて用いる前標的化イムノＰＥＴは、２回の静脈内投与を包含する。１６時間の、ｂｓＭＡｂの注入と放射性標識化ペプチドの注入との間の間隔を用いた。１６時間後、ＴＦ２のほとんどが血液からクリアランスされて（血中濃度＜１％ＩＤ／ｇ）、循環中のＴＦ２とＩＭＰ２８８との錯化を防止する。
【０２８８】
これらの試験のために、６８ＧａでＩＭＰ２８８を標識化する手順を最適化して、一工程標識化技術をもたらした。本発明者らは、Ｃ１８／ＨＬＢカートリッジが、９５℃で１５０Ｇｂｑ／ｎｍｏｌを超える比活性でペプチドが標識化される場合に形成される６８Ｇａコロイドを除去する必要があることを見出した。調製物が低い百分率のコロイドを含有して静脈内投与される場合、６８Ｇａコロイドは単核食細胞系（肝臓、脾臓および骨髄）の組織中に蓄積し、画像の質を悪くする。６８Ｇａ標識ペプチドは、Ｃ１８−カートリッジ上で迅速に精製され得る。投与のための放射性標識化および精製は、４５分以内に成し遂げられ得る。
【０２８９】
６８Ｇａの半減期は、前標的化系におけるＩＭＰ２８８ペプチドの動力学と一致する：腫瘍の最大増大は、１時間以内に到達される。６８Ｇａを、６８Ｇｅ／６８Ｇａ発生器から１日２回溶離して、オンサイト・サイクロトロンの必要性を回避する。しかし、６８Ｇａにより放出される陽電子の高エネルギー（１．９ＭｅＶ）は、取得画像の空間分解能を３ｍｍに限定するが、マイクロＰＥＴ系の固有分解能は１．５ｍｍという低さである。
【０２９０】
ＰＥＴにおいて最も広範に用いられる放射性核種である１８Ｆは、前標的化ＰＥＴ画像診断のためのより好ましい半減期を有する（ｔ１／２＝１１０分）。ＮＯＴＡ共役ペプチドＩＭＰ４４９を、上記のように１８Ｆで標識化した。６８Ｇａによる標識化と同様に、一工程手順である。５０％という高い標識化収率を得た。Ａｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４４９の生体内分布は６８Ｇａ標識化ＩＭＰ２８８と高度に類似したが、これは、この標識方法では、１８Ｆは残留核種であることを示唆した。
【０２９１】
ＦＤＧ−ＰＥＴと対比して、前標的化放射免疫検出は腫瘍特異的画像診断様式である。再発性結腸直腸癌病変の検出におけるＦＤＧ−ＰＥＴに対する高感受性および特異性が患者において報告されている（Ｈｕｅｂｎｅｒら、２０００，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ４１：１１２７７−８９）が、炎症に伴って観察された高レベルの標識化により示されるように、ＦＤＧ−ＰＥＴ画像は、悪性疾患を良性病変と区別するに際して診断的ジレンマをもたらし得る。対照的に、ＴＦ２６８Ｇａ−または１８Ｆ−標識化ペプチドによる前標的化イムノＰＥＴを用いた高い腫瘍対バックグラウンド比ならびにＣＥＡ陽性腫瘍の明瞭な可視化は、癌および他の症状の臨床的画像診断に関して記載された方法の使用を支持する。転移を検出すること、ならびにＣＥＡ陽性腫瘍を他の病変と区別することの他に、前標的化イムノＰＥＴは、前標的化放射免疫療法の前に腫瘍および正常組織への放射線量送達を概算するのにも用いられ得る。ＴＦ２がヒト化抗体である場合、低免疫原性を有し、多数の画像診断または治療サイクルのための道を開く。
実施例２３．葉酸ＮＯＴＡ共役体の合成
【０２９２】
葉酸を、上記のように活性化して（Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１９９６，７，５６−６２）、Ｂｏｃ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２と共役する。クロマトグラフィにより、共役体を精製する。次いで、ＴＦＡで処理して、Ｂｏｃ基を除去する。次いで、アミノ葉酸塩誘導体を、炭酸塩緩衝剤中でｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＮＯＴＡ（大環状物質）と混合する。次いで、生成物を、ＨＰＬＣにより精製する。葉酸塩−ＮＯＴＡ誘導体を、前記実施例に記載したようにＡｌ１８Ｆで標識し、次いで、ＨＰＬＣ精製する。１８Ｆ標識葉酸塩を、対象に静脈内注射して、例えば癌または炎症性疾患における葉酸塩受容体の分布を画像化するのに成功裏に用いる（例えば、Ｋｅら、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，５６：１１４３−６０，２００４参照）。
実施例２９．ヒトにおける前標的化ＰＥＴ画像診断
【０２９３】
再発性腫瘍を有する疑いのある患者（対表面積１．７ｍ２）に、１７ｍｇの二重特異的モノクローナル抗体（ｂｓＭａｂ）を注射する。ｂｓＭａｂを標的に局在化させて、血中からクリアランスする。ｂｓＭａの９９％が血液からクリアランスされた場合、１８Ｆ標識かペプチド（５．７×１０−９ｍｏｌに５〜１０ｍＣｉ）を注射する。ＰＥＴ画像診断は、微小転移性腫瘍の存在を示す。
実施例２５．１８Ｆ標識化による血管新生受容体の画像診断
【０２９４】
標識化されたＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチドは、αｖβ３インテグリンが関与する、例えば、虚血性組織における、血管新生の画像診断のために用いられてきた（Ｊｅｏｎｇら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２００８，Ａｐｒ．１５  ｅｐｕｂ）。Ｊｅｏｎｇら（２００８）に従って、ＲＧＤをＳＣＮ−Ｂｎ−ＮＯＴＡと共役させる。標識化反応を完了させるために過剰量のペプチドを用いて、アルミニウムストック溶液を１８Ｆおよび誘導体化ＲＧＤペプチドと混合し、１１０℃で１５分間加熱することにより、上記のように［Ａｌ１８Ｆ］をＮＯＴＡ誘導体化ＲＧＤペプチドに付着する。１８Ｆ標識化されたＲＧＤペプチドを、Ｊｅｏｎｇら（２００８）に開示されたように、インビボ生体内分布およびＰＥＴ画像診断のために用いる。ＲＧＤ−ＮＯＴＡの［Ａｌ１８Ｆ］共役体を虚血性組織中に取り上げて、血管新生のＰＥＴ画像診断を提供する。
実施例２６．炭水化物標識化
【０２９５】
ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＮＯＴＡをヒドラジンと反応させ、次いで、ＨＰＬＣにより配位子を精製することにより、ＮＯＴＡチオセミカルバジド誘導体を調製する。前記実施例に記載したように［Ａｌ１８Ｆ］を調製し、［Ａｌ１８Ｆ］をＮＯＴＡチオセミカルバジドに付加して、１５分間加熱する。場合により、［Ａｌ１８Ｆ］ＮＯＴＡチオセミカルバジド錯体を、ＨＰＬＣにより精製する。［Ａｌ１８Ｆ］ＮＯＴＡチオセミカルバジドを、公知の方法により酸化炭水化物と共役させる。ＰＥＴ走査を用いた画像診断試験のために、１８Ｆ標識化炭水化物を成功裏に用いる。
実施例２７．Ｆ−１８標識化に及ぼす有機溶媒の影響
【０２９６】
アルミニウムに対するＮＥＴＡおよびＮＯＴＡなどのキレート部分の親和性は、１８Ｆに対するアルミニウムの親和性より非常に高い。他の対イオンの存在が、正荷電アルミニウムおよび負荷電フッ化物イオンを互いから遮蔽し、イオン結合の強度を低減する傾向があるため、１８Ｆに対するＡｌの親和性は、溶液のイオン強度などの因子により影響を及ぼされる。したがって、低イオン強度媒質は、Ａｌおよび１８Ｆの有効な結合を増大するはずである。
【０２９７】
１８Ｆ反応物にエタノールを付加する初期試験は、放射性標識化ペプチドの収率を増大することが判明した。ＩＭＰ４６１を上記のように調製した。
【表８】
2013512918.tif 000018
【０２９８】
予備的結果は、反応混合物へのエタノールの添加が１８Ｆ標識ペプチドの収率を非常に倍増させることを示した。表８は、マイクロ波照射が、ＩＭＰ４６１のキレート部分への［Ａｌ１８Ｆ］の組み入れを促進するのに用いられ得ることも示す。６０秒のマイクロ波放射（＃３）は、１０１℃に５分間加熱することよりわずかに低く（１８％）有効であると思われた。
【０２９９】
ペプチドの１９Ｆ標識化に及ぼす付加的溶媒の影響を調べた。各々の場合、反応体の濃度は同一であり、溶媒のみが変化した。反応条件は、２５μＬのＮａ１９Ｆ＋２０μＬのＡｌＣｌ３＋２０μＬのＩＭＰ−４６１＋６０μＬの溶媒を混合し、その後、１０１℃で５分間加熱することを包含した。表９は、溶媒の存在が［Ａｌ１９Ｆ］ＩＭＰ−４６１（ＩＭＰ４７３）の収率をかなり改善することを示す。
【表９】
2013512918.tif 000019
実施例２８．重炭酸塩による１８Ｆの溶離
【０３００】
１８Ｆ（１０．４３ｍＣｉ）を、２ｍＬのシリンジに収容した。溶液をＳＥＰ−ＰＡＫ（登録商標）ＬＩＧＨＴ，ＷＡＴＥＲＳ（登録商標）ＡＣＣＥＬＬ（商標）Ｐｌｕｓ  ＱＭＡカートリッジに通した。次に、カラムを５ｍＬのＤＩ水で洗浄した。１８Ｆを、以下の表１０に示すような画分中の０．４ＭのＫＨＣＯ３で溶離した。
【表１０】
2013512918.tif 000020
【０３０１】
ＩＭＰ−４６１の１８Ｆ標識化に及ぼす付加的溶媒（ＣＨ３ＣＮ）の量の影響を調べた。各々の場合、反応体の濃度は同一であり、溶媒のみが変化した。反応条件は、１０μＬのＡｌＣｌ３＋２０μＬの１８Ｆ＋２０μＬのＩＭＰ−４６１＋ＣＨ３ＣＮを混合し、その後、１０１℃で５分間加熱することを包含した。表１１は、初期改善後、標識化効率が過剰量の溶媒の存在下で低減することを示す。
【表１１】
2013512918.tif 000021
【０３０２】
１８Ｆ（１６３ｍＣｉ）を、２ｍＬのシリンジに収容した。溶液をSEP-PAK（登録商標）LIGHT,WATERS（登録商標）ACCELL（商標）Plus QMAカートリッジに通した。次に、カラムを５ｍＬのＤＩ水で洗浄した。１８Ｆを、表１２に示すような画分中の０．４ＭのＫＨＣＯ３で溶離した。
【表１２】
2013512918.tif 000022
【０３０３】
塩化アルミニウム溶液（１０μＬ、２ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４）中２ｍＭ）を、表１２からのバイアル番号３に添加した。ペプチド（２０μＬ、２ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４）中２ｍＭ）をバイアルに付加し、その後、１７０μＬのＣＨ３ＣＮを付加した。溶液を１０３℃で１０分間加熱し、６ｍＬの水で希釈した。溶液を１０ｍＬのシリンジに引き入れて、タンデム配列された２つのＷＡＴＥＲＳ（登録商標）ＨＬＢ  Ｐｌｕｓカートリッジ上に注入した。カートリッジを８ｍＬの水で洗浄した。次に、放射性標識化ペプチドＡｌ１８Ｆ  ＩＭＰ４６１を１０ｍＬの１：１のＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏで溶離した。３０．３ｍＣｉ、収率６３．５％、比活性７５０Ｃｉ／ｍｍｏｌ。標識化ペプチドは、ＨＰＬＣにより非結合の１８Ｆを含有しなかった。全反応および精製時間は２０分であった。
実施例３０．１９Ｆ標識化ペプチドの調製
【０３０４】
２７Ａｌおよび／または１９Ｆを含有する物質は、ＮＭＲ画像診断のようなある種の用途に有用である。［Ａｌ１９Ｆ］標識化された化合物を調製するための改良型方法を開発した。ＩＭＰ４６１を上記のように調製し、１９Ｆで標識化した。ＩＭＰ４６１をＡｌＣｌ３＋ＮａＦと反応させて、３種の生成物を形成した（示さず）。しかし、ＩＭＰ４６１をＡｌＦ３・６Ｈ２Ｏと反応させることにより、より高い収率の［Ａｌ１９Ｆ］ＩＭＰ４６１を得た。
【０３０５】
ＩＭＰ４７３の合成：（［Ａｌ１９Ｆ］ＩＭＰ４６１）  ２ｍＬのＮａＯＡｃ（２ｍＭ、ｐＨ４．１８）溶液中の（１４．１ｍｇ、１０．９０μｍｏｌ）ＩＭＰ４６１に、（４．５１ｍｇ、３２．６８μｍｏｌ）ＡｌＦ３・６Ｈ２Ｏおよび５００μＬのエタノールを付加した。３μＬの１ＮのＮａＯＨを用いて、溶液のｐＨを４．４６に調整し、沸騰水浴中で３０分間加熱した。粗反応混合物を分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製して、４．８ｍｇ（３２．９％）のＩＭＰ４７３を得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）ＭＨ＋理論値１３３７．６３４１；実測値１３３７．６３３２
【０３０６】
これらの結果は、１８Ｆ標識化に関して上記したように、金属−１９Ｆ錯体を形成し、金属−１９Ｆをキレート部分と結合することにより、１９Ｆ標識化分子を調製し得ることを実証する。当該実施例は、前標的化検出、診断および／または画像診断に有用な標的化ペプチドが当該方法を用いて調製され得ることを示す。
実施例３１．ＩＭＰ４７９、ＩＭＰ４８５およびＩＭＰ４８７の合成および標識化
【０３０７】
１８Ｆ標識化のために設計されたさらなるペプチドＩＭＰ４７９（配列番号：３５）、ＩＭＰ４８５（配列番号：３６）およびＩＭＰ４８７（配列番号：３７）の構造を図１１〜図１３に示す。ＩＭＰ４８５を図１２に示す。ＩＭＰ４８５は、以下のアミノ酸を以下の順序：Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨで添加し、Ａｌｏｅを切断し、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨ、Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨで添加し、Ａｌｏｅを切断し、（ｔｅｒｔ−ブチル）２  ＮＯＤＡ−ＭＰＡＡ（ｍエチルフェニル酢酸）によってＳｉｅｂｅｒアミド樹脂上で作製した。次いでペプチドを樹脂から切断して、ＲＰ−ＨＰＬＣによって４４．８ｍｇのＩＭＰ４８５を得た。
【０３０８】
ＩＭＰ４８５合成のためのビス−ｔ−ブチル−ＮＯＤＡ−ＭＰＡＡ：Ｎ０２ＡｔＢｕ−ＭＰＡＡの合成
４−（ブロモメチル）フェニル酢酸（Ａｌｄｒｉｃｈ  ３１０４１７）（０．５９２５ｇ、２．５９ｍｍｏｌ）のＣＨ３ＣＮ（無水）（５０ｍＬ）の溶液を０℃でＮＯ２ＡｔＢｕ（１．００８７ｇ、２．８２ｍｍｏｌ）のＣＨ３ＣＮ溶液（５０ｍＬ）に滴加した。４時間後、無水Ｋ２ＣＯ３（０．１００８ｇ、０．７２９ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加し、室温で一晩中撹拌させた。溶媒を蒸発させ、粗混合物を分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製して白色固体を生じた（０．７１３２ｇ、５４．５％）。
【化１０】
2013512918.tif 000023
【０３０９】
これは一工程合成であるが、４−（ブロモメチル）フェニル酢酸による生成物のエステル化に起因して収率が低かった。（４−ブロモメチル）フェニル酢酸メチルを用いたＮＯ２ＡｔＢｕのアルキル化を使用してエステル化を防止した（図１４）。
１８Ｆ標識化
【０３１０】
水中での１８Ｆ標識化の試験のために、４０ｎｍｏｌのＩＭＰ−４７９／４８５／４８７（トレハロース＋アスコルビン酸＋ＡｌＣｌ３を用いて製剤化）に２５０μＬのＦ−１８溶液［約９１９〜１１１２μＣｉのＦ−１８］を添加し、１０１℃まで１５分間加熱した。エタノール中、４０ｎｍｏｌのＩＭＰ−４７９／４８５／４８７（トレハロース＋アスコルビン酸＋ＡｌＣｌ３を用いて製剤化）に２５０μＬのＦ−１８溶液［１．２４８〜１．６９３ｍＣｉのＦ−１８］、１００μＬのＥｔＯＨを添加し、１０１℃まで１５分間加熱した。異なるペプチドの標識化を示す例示的な実験を表１３に示す。最小限の最適化により、ＩＭＰ４８５の放射性標識化が最大で８８％の収率および２，５００Ｃｉ／ｍｍｏｌの比活性まで観察された。この比活性では、放射性標識化されたペプチドのＨＰＬＣ精製は、放射性標識化されたペプチドを用いたインビボでのＰＥＴ画像化に必要とされない。
【表１３】
2013512918.tif 000024
血清における安定性
【０３１１】
４０ｎｍｏｌのＩＭＰ４８５またはＩＭＰ４８７、２０ｎｍｏｌのＡｌＣｌ３  、０．１ｍｇのアスコルビン酸およびｐＨ３．９に調整した０．１ｇのトレハロースを含有するキットを２００μＬの生理食塩水中の精製された１８Ｆによって再構成し、１０６℃で１５分間加熱した。次いで反応混合物を８００μＬの水で希釈し、ＨＬＢカラムに置いた。洗浄後、カラムを２×２００の１：１のＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏで溶離し、精製された１８Ｆ−ＩＭＰ４８５を６４．６％の単離収率で得た。５０μＬ中の放射性標識化されたペプチドをバイアルにおいて２５０μＬの新鮮なヒト血清と混合し、３７℃でインキュベートした。
【０３１２】
両方の放射性標識化されたペプチドは、試験された４時間にわたって、新鮮なヒト血清中３０℃で安定であった（示さず）。
凍結乾燥されたペプチドの収率への充填剤の影響
【０３１３】
２００μＬの生理食塩水中、（同じバッチのＦ−１８からの）２ｍＣｉのＦ−１８によって標識化された種々の充填剤を有するＩＭＰ４８５キット（４０ｎｍｏｌ）を用いて収率を比較する実験を行った。２００μＬ／バイアルの用量で水中５重量％の濃度で充填剤を導入した。本発明者らは、充填剤としてソルビトール、トレハロース、スクロース、マンニトールおよびグリシンを試験した。結果を表１４に示す。
【表１４】
2013512918.tif 000025
【０３１４】
ソルビトール、マンニトールおよびトレハロースは、全て、同じ収率で、放射性標識化された生成物を与えた。マンニトールキットおよびトレハロースキットは、いずれも、良好なケークを形成した。スクロースキットおよびグリシンキットは、いずれも、かなり低い収率を有した。本発明者らはまた、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを充填剤として最近試験し、４０ｎｍｏｌのキットについて５８％の収率を得た。本発明者らは、放射性標識化が非常にｐＨに敏感であり、配位子およびペプチド＋配位子とさえなるように調整される必要があることを見出した。ＩＭＰ４８５の場合には、最適なｐＨはｐＨ４．０±０．２である一方で、ＩＭＰ４６７に最適なｐＨはｐＨ４．５±０．５であった。両方の場合において、収率は、理想的なｐＨ領域の外側において急激に低下する。
標識化の経時変化
【０３１５】
ＩＭＰ４８５の標識化の経時変化を調べた。４０ｎｍｏｌのＩＭＰ４８５（トレハロース＋ＡｌＣｌ３（２０ｎｍｏｌ）＋アスコルビン酸を用いて製剤化）に約２００〜２５０μＬのＦ−１８溶液（０．９％生理食塩水）を添加し、１０４℃まで５〜１５分加熱した。標識化収率の結果は：５分（２８．９％）、１０分（５７．９％）、１５分（８３．７％）および３０分（８８．９％）であった。したがって、標識化の経時変化は、約１５分であった。
ＩＭＰ４８５単独の生体内分布
【０３１６】
いずれの前標的化抗体も存在しないときのＩＭＰ４８５の生体内分布を、小さなＢＸＰＣ３膵臓癌異種移植片を有するまたはこれを有さない雌性ヌードマウス（１０週齢）において調べた。マウスに１８Ｆ−ＩＭＰ４８５をｉ．ｖ．注射した（３４０μＣｉ、２．２９×１０−９ｍｏｌ、１００μＬ、生理食塩水中）。各時点あたり６匹のマウスを注射後３０分および９０分で剖検した。前標的化抗体の非存在下に、低レベルの蓄積が腫瘍および大部分の正常な組織において見られた。放射性標識化は、かなりの大部分が膀胱において見出され、低い程度で腎臓において見出された。活性の大部分は、９０分の時点でクリアランスした。
ＴＦ２  ＤＮＬ標的化分子によるＩＭＰ４８５の前標的化
【０３１７】
１８Ｆ−ＩＭＰ４８５放射性標識化−１８Ｆ（２１８ｍＣｉ）を精製して１４５．９ｍＣｉを単離した。精製された１８Ｆ（１３５ｍＣｉ）を４０ｎｍｏｌの前錯化Ａｌ−ＩＭＰ４８５を含有する凍結乾燥されたバイアルに添加した。反応バイアルを１１０℃で１７分間加熱した。水（０．８ｍＬ）を反応混合物に添加した後にＨＬＢ精製した。生成物（２２ｍＣｉ）を０．６ｍＬの水：エタノール（１：１）混合物で溶離し、凍結乾燥されたアスコルビン酸を含有するバイアルに入れた。生成物を生理食塩水で希釈した。注射に用いた１８Ｆ−Ａｌ  ＩＭＰ４８５の比活性は、５５０Ｃｉ／ｍｍｏｌであった。
【０３１８】
２０：１のｂｓＭＡｂ：ペプチド比における前標的化によるＴＦ２＋１８Ｆ−Ａｌ  ＩＭＰ４８５の生体内分布−ｓｃＬＳ１７４Ｔ異種移植片保有マウスにＴＦ２（１６３．２μｇ、１．０３×１０−９ｍｏｌ、ｉｖ）を注射し、１６．３時間クリアランスした後、１８Ｆ−Ａｌ  ＩＭＰ４８５（２８μＣｉ、５．２×１０−１１ｍｏｌ、１００μＬのｉｖ）を注射した。各時点あたり７匹のマウスを注射後１時間および７時間で剖検した。
【０３１９】
尿安定性−ｓ．ｃ．Ｃａｐａｎ−１異種移植片を保有する１０匹のマウスに１８Ｆ−Ａｌ−ＩＭＰ４８５（４００μＣｉ、生理食塩水中、１００μＬ）を注射した。注射後５５分において尿を３匹のマウスから収集した。尿試料を逆相およびＳＥ  ＨＰＬＣによって分析した。放射性標識化されたＩＭＰ４８５の尿中での安定性を観察した。
【表１５】
2013512918.tif 000026
【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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結論
【０３２０】
ＩＭＰ４８５は、ＩＭＰ４６７を同様にまたはより良好に標識化し、血清において等しい安定性を有する。しかし、ＩＭＰ４８５は、ＩＭＰ４６７よりも合成がはるかに容易である。予備研究では、凍結乾燥されたＩＭＰ４８５の１８Ｆ標識化が、凍結乾燥されていないペプチドと同様に働くことが示されている（データは示さず）。ペプチドの残部にキレート部分を接続するリンカーにおけるアルキルまたはアリール基の存在を調べた。リンカーにおけるアリール基の存在は、リンカーにおけるアルキル基の存在と比較して放射性標識化収率を増大させるとみられる。
【０３２１】
前標的化抗体の存在または非存在下におけるＩＭＰ４８５の生体内分布は、ＩＭＰ４６７について観察されたものと類似する。前標的化抗体の非存在下、放射性標識化されたペプチドの腫瘍および大部分の正常な組織における分布は、低く、ペプチドは、腎臓排泄によって循環から除去される。ＴＦ２抗体の存在下、放射性標識化されたＩＭＰ４８５は、主に腫瘍において見出され、正常な組織への分布はほとんどない。腎臓放射性標識化は、前標的化抗体の存在下に実質的に減少する。本発明者らは、ＩＭＰ４８５およびリンカーにアリール基を有する他のペプチドが、１８Ｆ標識化によるＰＥＴ画像化にかなり好適であることと結論づける。
実施例３２．画像化のためのＩＭＰ４８５のキット製剤
試薬リスト
【０３２２】
試薬を以下の供給源から得た：酢酸（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ  ６９０３−０５  ｏｒ  ９５２２−０２）、水酸化ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ  ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｇｒａｄｅ  ９９．９９％  ３０，６５７−６）、α，α−トレハロース（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ  ４２２６−０４）、塩化アルミニウム六水和物（Ａｌｄｒｉｃｈ  ９９％  ２３７０７８）、アスコルビン酸（Ａｌｄｒｉｃｈ  ２５，５５６−４）
【０３２３】
酢酸塩緩衝剤２ｍＭ−酢酸、２２．９μＬ（４．０×１０−４ｍｏｌ）を２００ｍＬの水で希釈し、６ＮのＮａＯＨ（約１５μＬ）で中和して、溶液をｐＨ４．２２に調整した。
【０３２４】
アルミニウム溶液２ｍＭ−アルミニウム六水和物、０．０２２５ｇ（９．３２×１０−５ｍｏｌ）を４７ｍＬの脱イオン水に溶解した。
【０３２５】
α，α−トレハロース溶液−α，α−トレハロース、４．００４ｇを４０ｍＬの脱イオン水に溶解して、１０％溶液を作製した。
【０３２６】
ペプチド溶液、ＩＭＰ４８５  ２ｍＭ−ペプチドＩＭＰ４８５（０．００２０ｇ、１．５２μｍｏｌ）を７６２μＬの２ｍＭの酢酸塩緩衝剤に溶解した。ｐＨ２．４８（ペプチドをＴＦＡ塩として凍結乾燥した）。ペプチド溶液のｐＨを４．１μＬの１ＭのＮａＯＨの添加によってｐＨ４．５６に調整した。
【０３２７】
アスコルビン酸溶液５ｍｇ／ｍＬ−アスコルビン酸、０．０２６２ｇ（１．４９×１０−４ｍｏｌ）を５．２４ｍＬの脱イオン水に溶解した。
ペプチドキットの製剤
【０３２８】
ペプチド２０μＬ（４０ｎｍｏｌ）を、１２μＬ（２４ｎｍｏｌ）のＡｌ、１００μＬのトレハロース、２０μＬ（０．１ｍｇ）のアスコルビン酸および９００μＬの脱イオン水と、３ｍＬの凍結乾燥バイアル中で混合した。溶液の最終ｐＨは約ｐＨ４．０であるべきである。バイアルを凍結乾燥し、真空下に密封した。この製剤において、ペプチドは、１８Ｆを結合させる前にアルミニウムと共に投入する。
【０３２９】
１０および２０ｎｍｏｌのキットも作製した。これらのキットは、ペプチドを１ペプチドのＡｌ３＋比を０．６Ａｌ３＋に保持する４０ｎｍｏｌのキットと同様に作製したが、２ｍＬのバイアルにおいて製剤化し、全体の充填量が０．５ｍＬであった。
１８Ｆの精製
【０３３０】
粗１８Ｆをシリンジにおいて２ｍＬの脱イオン水中に収容した。シリンジをシリンジポンプに置き、液体をＷａｔｅｒｓ  ＣＭカートリッジ、続いてＱＭＡカートリッジに押し通した。両方のカートリッジを１０ｍＬの脱イオン水で洗浄した。２個のカートリッジ間で滅菌された使い捨ての三方弁を切り替え、１ｍＬの市販の滅菌された生理食塩水をＱＭＡカートリッジに２００μＬ画分で押し通した。第２の画分は、１８Ｆの適用量に関わらず（１０〜３００ｍＣｉ、負荷を試験した）、約８０％の１８Ｆを通常含有する。
【０３３１】
本発明者らは、ＱＭＡカートリッジで精製された、生理食塩水中の市販の１８Ｆを代替的に用いる。これは、そのまま利用可能な準備ができている市販の骨造影剤の濃縮バージョンであり、ヒトにおいて用いられる。活性は、０．５ｍＬのツベルクリンシリンジにおいて２００μＬで供給される。
放射性標識化
【０３３２】
クリンプで密閉したバイアルにおいて２００μＬの生理食塩水中の１８Ｆを凍結乾燥されたペプチドに添加し、次いで溶液を９０〜１０５℃に１５分間加熱することによって、ペプチドを放射性標識化した。１ｍＬのシリンジにおいて８００ｍＬの脱イオン水を反応バイアルに添加し、液体を１ｍＬのシリンジで除去し、液体をＷａｔｅｒｓ  ＨＬＢカラム（１ｃｃ、３０ｍｇ）に適用することによって、ペプチドを精製した。ＨＬＢカラムを、クリンプで密閉した５ｍＬのバイアルに置き、真空下に液体をバイアル内に引き抜いて、遠隔の（滅菌された使い捨ての線を用いた）１０ｍＬのシリンジによって供給した。反応バイアルを、カラムを通って引き抜かれた、２つの１ｍＬの脱イオン水アリコートによって洗浄した。次いで、カラムを１ｍＬのさらなる脱イオン水で洗浄した。次いでカラムを緩衝され凍結乾燥されたアスコルビン酸（約ｐＨ５．５、１５ｍｇ）を含有するバイアルに移動させた。放射性標識化された生成物を、３つの、２００μＬ部の１：１のＥｔＯＨ／脱イオン水で溶離した。ＨＬＢカートリッジにおいて、反応バイアルにおいて、水性洗浄液において、および生成物バイアルにおいて活性を測定することによって収率を決定し、％収率を得た。
【０３３３】
放射性標識化反応物にエタノールを添加することで、標識化収率を増大させることができる。２０ｎｍｏｌのキットを生理食塩水中２００μＬのＦ−１８と２００μＬのエタノールとの混合物によって再構成することができる。次いで溶液をクリンプで密閉したバイアルにおいて１００〜１１０℃まで１５分間加熱した。加熱後、反応物を３ｍＬの水で希釈した後、３ｃｃ（６０ｍｇ）のＨＬＢ抽出カートリッジにおいて精製した。この方法を用いて、ペプチドを良好な収率で、最大で４，１００Ｃｉ／ｍｍｏｌの比活性まで標識化することができる。
【０３３４】
記載されている該キットおよび標識化についての収率は、１．０ｍＣｉの１８Ｆで標識化されたとき、８０〜９０％であった。より高い線量の１８Ｆ（約１００ｍＣｉ）を用いると収率が降下した。しかし、エタノールを標識化混合物に添加すると、収率が上昇する。ペプチドが生理食塩水中に過度に希釈されると、収率が降下する。標識化はまた、ｐＨに非常に敏感である。この配位子を有する本発明者らのペプチドについて、本発明者らは、最終製剤に最適なｐＨがｐＨ４．０±０．２であることを見出した。
【０３３５】
５０μＬの１：１のＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ中の精製された放射性標識化されたペプチドを１５０μＬのヒト血清と混合し、３７℃に加熱したＨＰＬＣオートサンプラに置きＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。空隙容量においてバックグラウンドを超えて検出不可能な１８Ｆが４時間の後に観察された。
【表１９】
2013512918.tif 000030
ＩＭＰ４８６（Ａｌ−ＯＨＩＭＰ４８５）の合成および標識化
【０３３６】
ＩＭＰ４８５（２１．５ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）を１ｍＬの２ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．４）に溶解し、ＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（１３．２ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）で処理した。ｐＨを４．５〜５．０に調整し、反応混合物を１５分間還流した。粗混合物を分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製して、白色固体（１１．８ｍｇ）を得た。
【０３３７】
予め充填したＡｌ−ＮＯＴＡ錯体（ＩＭＰ４８６）も、凍結乾燥されたキット内に製剤化された後に優れた収率で放射性標識化された。ＩＭＰ４８６による標識化収率は、生理食塩水中で標識化されたとき、ＩＭＰ４８５キット以上である（表１９）。アルミニウムが予め投入されたキレート剤による高い放射性標識化収率は、試験した他のＡｌ−ＮＯＴＡ錯体のいずれにおいても観察されなかった（データは示さず）。生理食塩水および１：１のエタノール／水での標識化収率における標識化の等価性もまた、他のキレート部分では観察されなかった（示さず）。
【表２０】
2013512918.tif 000031
充填剤の影響
【０３３８】
異なる充填剤を含むＩＭＰ４８５キット（４０ｎｍｏｌ）を用いて収率を比較する実験を行った。２００μＬの生理食塩水中の同じバッチのＦ−１８から２ｍＣｉのＦ−１８によってペプチドを標識化した。充填剤を２００μＬ／バイアルの用量で５重量％の濃度で水中に導入した。本発明者らは、ソルビトール、トレハロース、スクロース、マンニトールおよびグリシンを充填剤として試験した。結果を表２０に示す。
表２１．充填剤の放射性標識化収率への影響
【表２１】
2013512918.tif 000032
【０３３９】
ソルビトール、マンニトールおよびトレハロースは、全て、同じ収率で、放射性標識化された生成物を与えた。スクロースキットおよびグリシンキットは、いずれも、かなり低い収率を有した。トレハロースを、２００μＬで再構成するとき、２．５重量％〜５０重量％の範囲の濃度でＩＭＰ４８５キットに製剤化した。同じ放射性標識化収率、約８３％が全ての濃度において得られ、これは、ＩＭＰ４８５の１８Ｆ−放射性標識化がトレハロース充填剤の濃度に敏感でないことを示している。ＩＭＰ４８５キットを製剤化して、窒素下２〜８℃で最大３日間保存した後、凍結乾燥して、放射性標識化における凍結乾燥の遅延の影響を評価した。放射性標識化実験は、収率は、時間ゼロにおいて全て約８０％であり、凍結乾燥前に１、２、３日の遅延があることを示した。
ｐＨの放射性標識化への影響
【０３４０】
ｐＨの、IMP485の放射性標識化への影響を表２１に示す。標識化効率は、ｐＨに敏感であり、約４．０の最適なｐＨに対して高くても低くても低減した。
【表２２】
2013512918.tif 000033
生体分布
【０３４１】
皮下ＬＳ１７４Ｔ腫瘍異種移植片を保有するＴａｃｏｎｉｃヌードマウスにおいて生体内分布研究を行った。
【０３４２】
Ａｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４８５単独：ｓｃＬＳ１７４Ｔ異種移植片を保有するマウスにＡｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４８５（２８μＣｉ、５．２×１０−１１ｍｏｌ、１００μＬ、ｉｖ）を注射した。各時点あたり６匹のマウスを注射後１時間および３時間で剖検した。
【０３４３】
２０：１のｂｓＭＡｂ：ペプチド比におけるＴＦ２＋Ａｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４８５前標的化：ｓｃＬＳ１７４Ｔ異種移植片保有マウスにＴＦ２（１６３．２μｇ、１．０３×１０−９ｍｏｌ、ｉｖ）を注射し、１６．３時間クリアランスした後、１８Ｆ−Ａｌ  ＩＭＰ４８５（２８μＣｉ、５．２×１０−１１ｍｏｌ、１００μＬのｉｖ）を注射した。各時点あたり７匹のマウスを注射後１時間および３時間で剖検した。
【表２３】
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ＩＭＰ４９２（Ａｌ１９ＦＩＭＰ４８５）の合成
【０３４４】
ＩＭＰ４８５（１６．５ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）を１ｍＬの２ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．４３）、０．５ｍＬのエタノールに溶解し、ＡｌＦ３・３Ｈ２Ｏ（２．５ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）で処理した。ｐＨを４．５〜５．０に調整し、反応混合物を１５分間還流した。冷却時にｐＨを再び４．５〜５．０まで上昇させたら、反応混合物を１５分間還流した。粗生成物を分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製して、白色固体（１０．３ｍｇ）を得た。
ＩＭＰ４９０の合成
【化１１】
2013512918.tif 000035
【０３４５】
ペプチドを、アミノ酸を以下の順序：Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨおよび（ｔＢｕ）２ＮＯＤＡ−ＭＰＡＡで添加してトレオニノール樹脂において合成した。次いでペプチドを切断し、分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。ペプチドをビス−チオールペプチドのＤＭＳＯによる処理によって環化させた。
ＩＭＰ４９１（Ａｌ１９Ｆ  ＩＭＰ４９０）の合成
【０３４６】
Ａｌ１９Ｆ  ＩＭＰ４９０を上記のように調製し（ＩＭＰ４９２）、ＨＰＬＣ精製後に所望のペプチドを生成した。
ＩＭＰ４９３の合成
ＮＯＤＡ−ＭＰＡＡ−（ＰＥＧ）３−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ２（配列番号：３９）
【０３４７】
アミノ酸を以下の順序：Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＮＨ−（ＰＥＧ）３−ＣＯＯＨおよび（ｔＢｕ）２ＮＯＤＡ−ＭＰＡＡで添加してＳｉｅｂｅｒアミド樹脂においてペプチドを合成した。次いでペプチドを切断し、分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
ＩＭＰ４９４（Ａｌ１９Ｆ  ＩＭＰ４９３）の合成
【０３４８】
Ａｌ１９ＦＩＭＰ４９３を上記のように調製し（ＩＭＰ４９２）、ＨＰＬＣ精製後に所望のペプチドを生成した。
実施例３３．Ａｌ１８ＦまたはＡｌ１９Ｆを用いた他の補欠分子族標識化方法
【０３４９】
ある一定の実施形態において、塩化アルミニウム標識化方法を、感熱性の分子のための補欠分子族標識化方法を用いて実施してよい。補欠分子族の共役は、感熱性分子のためのより低い温度で実施してよい。
【０３５０】
補欠分子族ＮＯＴＡを上記のように１８Ｆまたは１９Ｆによって標識化し、次いで標的化分子に付着させた。１つの非限定的な例において、これを、標的化分子においてアミノオキシ化合物に次いで付着されるアルデヒドＮＯＴＡによって行う。代替的には、アミノオキシマレイミドをアルデヒドと反応させ、次いで、マレイミドを標的化分子上のシステインに付着させる（Ｔｏｙｏｋｕｎｉら、２００３、Ｂｉｏｃｏｎｊ  Ｃｈｅｍ  １４：１２５３）。
【０３５１】
別の代替例において、ＡｌＦ−キレート剤錯体を、クリックケミストリーを経て標的化分子に付着させる。配位子を、上記のようにＡｌ１８ＦまたはＡｌ１９Ｆによってまず標的化する。次いでＡｌＦキレート剤を、クリックケミストリー反応を経て標的化分子に共役させる。例えば、アルキンＮＯＴＡをＭａｒｉｋおよびＳｔｕｃｌｉｆｆｅ（２００６、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ４７：６６８１）に従って標識化して、アジド含有標的化剤に共役させる。
生理食塩水中の１８Ｆによるキットの放射性標識化
【０３５２】
上記のように、１８Ｆ（０．０１ｍＣｉ以上）を０．５ｍＬのシリンジ中の２００μＬの生理食塩水に収容し、溶液を２００μＬのエタノールと混合し、凍結乾燥されたキットに注入する。溶液をクリンプで密閉したバイアルにおいて１００〜１１０℃まで１５分間加熱する。溶液を３ｍＬの水で希釈し、ＨＬＢ抽出カートリッジで溶離する。反応バイアルおよびカートリッジを２×１ｍＬの部の水で洗浄し、次いで生成物を、０．５ｍＬの画分の１：１のエタノール：水を用いて、緩衝化アスコルビン酸を含有するバイアル内に溶離する。エタノールのいくらかを不活性ガス蒸気下に蒸発させてよい。次いで溶液を生理食塩水中で希釈し、０．２μｍの滅菌されたフィルタを通した後に注射する。
実施例３４．１８Ｆ標識化のためのＮＯＴＡのマレイミド共役体
【０３５３】
先に議論されているように、ある一定の実施形態において、ＮＯＴＡのマレイミド誘導体は、分子の低温標識化に使用され得る。マレイミド誘導体化ＮＯＴＡを調製する例示的な方法を以下で議論する。詳細を図１５に示す。
ビス−ｔ−ブチル−ＮＯＤＡ−ＭＰＡＡ  ＮＨＳエステル：（ｔＢｕ）２ＮＯＤＡ−ＭＰＡＡ  ＮＨＳエステルの合成
【０３５４】
（ｔＢｕ）２ＮＯＤＡ−ＭＰＡＡ（１７５．７ｍｇ、０．３４７ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）の溶液に３４７μＬの（０．３４７ｍｍｏｌ）ＤＣＣ（ＣＨ２Ｃｌ２中１Ｍ）、４２．５ｍｇの（０．３９２ｍｍｏｌ）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、および２０μＬのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を添加した。３時間後、ＤＣＵを濾過し、溶媒を蒸発させた。粗混合物をシリカゲル上のフラッシュロマとグラフィ（２３０〜４００メッシュ）（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：１００：０〜８０：２０）によって精製し、（１２８．３ｍｇ、６１．３％）のＮＨＳエステルを得た。Ｃ３１Ｈ４６Ｎ４Ｏ８（Ｍ＋Ｈ）＋で算出したＨＲＭＳ（ＥＳＩ）は６０３．３３８８であり、実測値は６０３．３３９５であった。
ＮＯＤＡ−ＭＰＡＥＭ：（ＭＰＡＥＭ＝メチルフェニルアセトアミドエチルマレイミド）
【０３５５】
（ｔＢｕ）２ＮＯＤＡ−ＭＰＡＡ  ＮＨＳエステル（１２８．３ｍｇ、０．２１３ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）の溶液に５２．６ｍｇの（０．２０７ｍｍｏｌ）Ｎ−（２−アミノエチルマレイミドトリフルオロ酢酸塩の２５０μＬのＤＭＦおよび２０μＬのＤＩＥＡ中の溶液を添加した。３時間後、溶媒を蒸発させ、濃縮物を２ｍＬのＴＦＡで処理した。粗生成物を水で希釈し、分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製して、（４９．４ｍｇ、４５％）の所望の生成物を得た。Ｃ２５Ｈ３３Ｎ５Ｏ７（Ｍ＋Ｈ）＋で算出したＨＲＭＳ（ＥＳＩ）は５１６．２４５３であり、実測値は５１６．２４５２であった。
NODA-MPAEMの１８F標識化
【０３５６】
１０μＬ（２０ｎｍｏｌ）の２ｍＭのＮＯＤＡ−ＭＰＡＥＭ溶液に、５μＬの２ｍＭのＡｌＣｌ３  、４０μＬの１８Ｆ溶液［２．４１ｍＣｉ、Ｎａ１８Ｆ、ＰＥＴＮＥＴ］、続いて５０μＬのＣＨ３ＣＮを添加し、１１０℃まで１５分間加熱した。粗反応混合物を、得られた溶液をＯＡＳＩＳ（登録商標）ＨＬＢ  １  ｃｃ（３０ｍｇ）カートリッジ内に移し、ＤＩ  Ｈ２Ｏで溶離することによって精製し、非結合１８Ｆ、続いて１：１のＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏを除去して、１８Ｆ標識化ペプチドを溶離した。粗反応溶液をＨＬＢカートリッジを経て５ｍＬのバイアル内に引き、カートリッジを３×１ｍＬのＤＩ  Ｈ２Ｏ画分で洗浄した（４９．９μＣｉ）。次いで、ＨＬＢカートリッジ新たな３ｍＬのバイアルに置き、４×２００μＬの１：１のＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏで溶離し、標識化されたペプチドを収集した（０．９７８ｍＣｉ）。カートリッジを２２．１μＣｉの活性に保持しながら反応容器を７．７３μＣｉに保持した。
０．９７８ｍＣｉ→９２．５％のＡｌ１８Ｆ（ＮＯＤＡ−ＭＰＡＥＭ）
実施例３４．ｈＭＮ１４Ｆ（ａｂ’）２の調製および標識化
【０３５７】
ペプシン消化−９０ｍｌの９．８ｍｇ／ｍｌのｈＭＮ１４ＩｇＧ  Ｃ／Ｎ０２０６０７８（合計８８２ｍｇ）に９．０ｍｌの０．１Ｍのクエン酸塩（ｐＨ３．５）緩衝剤を添加し、１Ｍクエン酸でｐＨ３．７に調整し、０．１Ｍのクエン酸塩（ｐＨ３．５）緩衝剤中１．２ｍｌの１ｍｇ／ｍｌのペプシン（ペプシンの最終濃度は１２μｇ／ｍｌであった）を添加した。混合物を３７℃で４０分間インキュベートした。消化をＳＥ−ＨＰＬＣによってモニタリングし、１０％の３ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．６）の添加によって反応を停止させた。
【０３５８】
精製−タンパク質Ａカラム（２．５×８ｃｍ、４０ｍＬ）において行った。非結合Ｆ（ａｂ’）２ピークを含有する流れ（１５０ｍｌ）を収集した。Ｆ（ａｂ’）２を０．２２ｕｍのフィルタで濾過した。最終濃度は１５ｍｇ／ｍｌであった（３３ｍｌ、合計５００ｍｇ）。第２の工程は、Ｑ−セファロース（登録商標）カラムクロマトグラフィ（１×２０、１６ｍＬ）を含んだ。タンパク質Ａ精製ｈＭＮ１４Ｆ（ａｂ’）２を濃縮し、３０Ｋの幹細胞によって０．０２ＭのＴｒｉｓの０．０１ＭのＮａＣｌ（ｐＨ８．５）内に濾過した。Ｆ（ａｂ’）２をＱ−セファロース（登録商標）カラムに投入した。流れピークを収集時、画分３および４をプールし、濃縮し、０．０４ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に濾過した。０．２２ｕｍフィルタを用いて濾過した後、最終濃度は５．５ｍｇ／ｍｌであり、４０ｍＬの合計２２０ｍｇのタンパク質であった。
【０３５９】
凍結乾燥されたｈＭＮ１４  Ｆａｂ’ＳＨの調製−ＴＣＥＰ還元を以下のように行った。３．８ｍＬの５．５ｍｇ／ｍＬ  ｈＭＮ１４Ｆ（ａｂ’）２（合計２０．９ｍｇ）にＰＢＳ中で希釈した０．３８ｍＬの２０ｍＭのＴＣＥＰ−ＨＣｌを添加した。混合物を室温で２時間インキュベートし、還元をＳＥ−ＨＰＬＣによってモニタリングした。Ｆａｂ’ＳＨを濃縮し、１０Ｋの幹細胞によって製剤緩衝剤（０．０２５Ｍ  ＮａＯＡｃ、５％トレハロース、ｐＨ６．７）内に濾過した。約８０ｍＬの緩衝剤を用いた。抗体を０．２２ｕｍのフィルタで濾過した。最終濃度は２．３ｍｇ／ｍＬであった（９ｍＬ、合計２０．７ｍｇ）。抗体あたりのチオール含有量をＥｌｍａｎ’ｓアッセイによって求めると２．４ＳＨ／Ｆａｂであった。凍結乾燥をバイアルあたり０．４５ｍＬの（１ｍｇタンパク質）を用いて行った。
【０３６０】
ｌ８Ｆ標識化−凍結乾燥されたｈＭＮ−１４  Ｆａｂ’を１００μＬの２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．０１）に溶解した。ＮＯＤＡ−ＭＰＡＥＭを２０ｎｍｏｌの１８Ｆで標識化した。次いで１：１のＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ中６００μＬのＦ−１８ＮＯＤＡ−ＭＰＡＥＭをＦａｂ’バイアルに添加し、混合物をＲＴで１０分間インキュベートし、次いでＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ５０−８０ｓｐｉｎカラムにおいて精製した。約８０％の添加された活性（８０％の収率）をｓｐｉｎカラムから標識化抗体として溶離した。ほとんど全ての活性がＣＥＡの添加後ＳＥＣによってシフトし、これは、標識化が抗体Ｆａｂ’フラグメントに関連していることを示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
2013512918.tif 000043
【図８Ｂ】
2013512918.tif 000044
【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
2013512918.tif 000046
【図９】
2013512918.tif 000047
【図１０（Ａ）】
2013512918.tif 000048
【図１０（Ｂ）】
2013512918.tif 000049
【図１０（Ｃ）】
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【図１１】
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【図１２】
2013512918.tif 000052
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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