(57)【要約】  本発明は、一般的には、炎症応答をもたらし、組織破壊の増加の悪循環の道を開く組織分解プロセスを判定するための方法、アッセイ及びキットに関する。さらに具体的には、本発明は、補体を活性化したＣＯＭＰと補体因子Ｃ３ｂ又はＣ３ｂの天然の分解断片との間の複合体により例示されるＣＯＭＰ断片複合体の存在について、ヒト試料を分析することが可能なアッセイのためのキット及び方法に関する。
2013524213.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＯＭＰと１つ又は複数の補体因子又はその断片との間の複合体の存在を検出することを含む、補体活性化をもたらす組織分解プロセスを判定する方法。
【請求項２】
以下のステップ、
ａ）試料を準備するステップ、
ｂ）ａ）の試料を分析するステップ、
ｃ）ヒトＣＯＭＰと補体因子との間の複合体の存在を検出するステップ
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料が臨床試料、好ましくは血清又は滑液由来の臨床試料である、請求項１又は２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
補体因子がヒトＣ３ｂ又はその断片である、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
補体因子がヒトＣ３ｂ又はその断片である請求項１から４までのいずれか一項において定義される試料を、炎症成分を有し結合組織を冒す疾患における補体活性化を測定するため又はモニターするために使用する、アッセイ。
【請求項６】
試料を、疑われているＲＡ及びＯＡにおける補体活性化を測定するために使用する、請求項５に記載のアッセイ。
【請求項７】
試料を、乾癬性関節炎、慢性若年性関節炎及び骨盤脊椎炎における補体活性化を測定するために使用する、請求項５に記載のアッセイ。
【請求項８】
試料を、ＲＡ及びＯＡ、全身性硬化症、腱炎並びにアテローム性動脈硬化症を含む心血管疾患などの、炎症性成分を有し結合組織を冒す疾患における補体活性化を測定するために使用する、請求項５に記載のアッセイ。
【請求項９】
試料を、ＲＡ及びＯＡ、全身性硬化症、腱炎並びにアテローム性動脈硬化症を含む心血管疾患などの炎症性成分を有し結合組織を冒す疾患に罹患した患者における疾患進行をモニターするために使用する、請求項５に記載のアッセイ。
【請求項１０】
試料中のヒトＣＯＭＰと補体因子との間の複合体の存在を検出することを含む、補体活性化をもたらす組織分解プロセスを判定するためのキット。
【請求項１１】
ａ）ＣＯＭＰ−Ｃ３ｂ複合体を形成する成分のうちの１つに結合する、１つ又は複数の抗体、又は別のリガンド、
ｂ）前記複合体のその他の成分に結合する１つ又は複数の抗体の形態のディテクター、及び
ｃ）１つ又は複数の抗体が上記の断片の１つ又は複数のエピトープと反応したかどうかを検出するための手段
を含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
臨床試料中の補体因子と複合体になっているヒトＣＯＭＰの存在を分析するための、請求項１０又は１１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１３】
補体因子がヒトＣ３ｂ又はその断片である、請求項１０又は１１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１４】
ａ）溶液である又は固相担体に結合している、ヒトＣＯＭＰに対する抗体、好ましくはモノクローナル抗体又は別のリガンド、
ｂ）ヒトＣＯＭＰ−Ｃ３ｂ断片複合体を含有することが疑われる試料であって、ステップａ）の第１の抗体に対し、得られた混合物を水溶液中でインキュベートする試料、
ｃ）ヒトＣ３ｂ又はその断片に対する第２の抗体、好ましくはモノクローナル抗体又は別のリガンドであって、検出可能で定量できるシグナルを発する標識を含む第２の抗体、
ｄ）標識由来のシグナルを定量する手段であって、前記シグナルが前記試料においてヒトＣＯＭＰ−Ｃ３ｂ複合体の濃度の測定値である手段
を含む、請求項１１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、組織分解プロセス並びに、特に、関節疾患における炎症及び伝播に関連する事象を判定するための方法及び製品に関する。本発明は、補体系を活性化したＣＯＭＰと補体因子Ｃ３ｂ又はＣ３ｂの天然の分解断片との間の複合体で例示されるＣＯＭＰ断片複合体の存在について、血清及び他のヒト試料（滑液を含むがこれに限定されない）を分析するのに使用することが可能なアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
関節炎には１００を超える異なった種類が存在するが、もっとも一般的なものは、関節リウマチ（ＲＡ）及び骨関節炎（ＯＡ）並びに脊椎関節炎及び若年性特発性関節炎である。米国では約１３０万人がＲＡに罹患しており、このほぼ１０倍がＯＡに罹患している。
【０００３】
軟骨などの関節構造を破壊する組織分解をもたらす病態は、大きな医学的、社会的及び経済的問題をなす。６５歳を超える人では、１，０００人のうち約５００人が関節炎に罹患している。組織分解プロセスは、組織分子成分の分解の結果である。これは、たとえば、物理的ストレス、毒性化合物により、又は分解酵素の産生をもたらす炎症により誘発されることがある。このために、数多くの方法により診断、疾病モニタリング、治療等の目的で組織分解プロセスを判定するが可能である。関節炎状態、動脈硬化症、変形性関節炎状態等などの結合組織疾患において分解プロセスを判定する１つの方法は、結合組織成分の分解産物の存在を検出することである。たとえば、関節炎状態などの炎症プロセスの診断において用いられてきた白血球の増加量を測定する間接的方法と比べて、これにより分解プロセスの直接検出が可能になる。別のパラメータは、Ｘ線又はＭＲＩなどの画像法により検出されるプロセスの終期に観察される組織の消失である。
【０００４】
従来、関節炎の臨床診断は、患者病歴、理学的検査に基づき、ＲＡの場合には、特にある種の抗体についての臨床検査及びＸ線像に基づいている。関節炎患者の予後、治療及び臨床成績は、一連の判定により評価される。しかし、軟骨変性に関連する病態により引き起こされる永久的組織損傷を最小限に抑えるためには、そのような状態を早期の段階で診断し、特に、そのプロセスを伝播し症状を強める可能のある事象のリスクを評価できることが重要である。したがって、この１０年間、病的な軟骨変性を早期に検出できる適切な生物学的マーカーを見つける努力が払われてきた。
【０００５】
１つのそのような生物学的マーカーは、軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ又はトロンボスポンジンＶ）である。ＣＯＭＰの血清レベルの上昇はこれまでＲＡにおける関節破壊と関連付けられてきた。
【０００６】
ＣＯＭＰは軟骨の構造成分であり、ＣＯＭＰは成長している組織においてはコラーゲン原線維形成の触媒としての機能を果たすと思われ、高齢者においては組織完全性を維持する上で構造的役割を有すると思われる。さらに、ＣＯＭＰは軟骨において優勢発現するペンタマー糖タンパク質である。このタンパク質は関節破壊の主要な分子マーカーの１つであり、ＣＯＭＰレベルの上昇は活動性関節疾患患者の滑液においても血清においても見られる［１、２］。ＣＯＭＰは軟骨［３］及び腱の圧力負荷部分においてもっとも豊富に認められる。さらに、滑膜及び皮膚の線維芽細胞並びにアテローム性動脈硬化症における血管壁においてもある程度の発現が報告されてきた。興味深いことに、ＣＯＭＰレベルの上昇は、皮膚病変の全身性硬化症患者の血液中で見出すことができる［４］。
【０００７】
ＣＯＭＰの主要な機能の１つは、コラーゲン原線維形成を触媒してＩ型／ＩＩ型コラーゲンとの直接相互作用により組織構造を安定化し、コラーゲン線維の末梢におけるＩＸ型コラーゲン及びマトリリンとの相互作用を介してコラーゲン網を安定化することである。ＣＯＭＰは、細胞表面インテグリンとの相互作用を通じて細胞外基質への軟骨細胞の付着を媒介することも提唱されてきた。構造的には、ＣＯＭＰは、Ｎ末端に近いコイルドコイル構造により互いに連結されている５個の同一のサブユニットからなるペンタマーである。Ｎ末端には４つの上皮増殖因子（ＥＧＦ）ドメイン、８つの３型トロンボスポンジン（ＴＳＰ３）反復及び球状Ｃ末端が続く［５］。ＣＯＭＰの変異は偽性軟骨形成不全症及び多発性骨端異形成症をもたらすことが明らかにされている。
【０００８】
補体系は、自然免疫系の一部としての防御に際して急速に活性化され得る一連の因子である。補体は炎症応答を活性化し、免疫細胞をその部位に動員する。補体はまた、たとえば、損傷を受けて死にかけている細胞、ミスフォールドしたタンパク質、病原体及び生物由来の外来物質の除去において適応免疫系を支援する。しかし、別の重要な事象は、Ｂ細胞の食作用及び活性化を表す強力なシグナルである、Ｃ３ｂ及びその断片を有する補体により認識される標的のオプソニン化である。
【０００９】
補体系は、通常は不活性前駆物質（プロタンパク質）として循環しているいくつかのタンパク質からなる。グリコシル化された血清タンパク質及び細胞膜受容体を含む、３０を超えるタンパク質及びタンパク質断片が補体系を構成している。これらのタンパク質は主に肝臓で合成され、血清のグロブリン分画の約５％を占めている。いくつかの誘因のうちの１つによって刺激されると、系中のプロテアーゼは、特定のタンパク質を切断して化学遊走物質アナフィラトキシンを放出し、さらなる切断の増幅カスケードを開始する。この活性化カスケードの最終結果は応答の大幅な増幅であり、細胞動員に活性な因子が形成され、ポア形成膜侵襲複合体が最終的に活性化される。
【００１０】
補体系は、アポトーシス細胞及びネクローシス細胞並びに免疫複合体の除去を支援する危険センサーであると共に外来病原体に対する防御機構である。一方、制御されない補体の活性化は、いくつかの自己免疫障害及び病的炎症状態の一因となることがある。補体の活性化はＲＡ患者の関節において起こることが明らかにされており、ＲＡの病態に補体が関与していることは動物モデルにおいて実証されている［６］。
【００１１】
３つの生化学的経路、すなわち、古典的補体経路、第２の補体経路及びマンノース結合レクチン経路が補体系を活性化し、これらの経路は主要な補体成分であるＣ３を活性化するＣ３コンバターゼのレベルで合わさる。古典的経路は典型的には免疫複合体により誘発されるが、レクチン経路は病原体表面に存在する特定の糖鎖構造により開始される。第２の補体経路は他の２つの経路の増幅ループとしての機能も果たす自己活性化経路である。最近、プロパージンが第２の経路を直接活性化することができることが確かめられている［７］。補体活性化の３つの経路すべてにおいて、極めて重要なステップは成分Ｃ３のＣ３ｂへのタンパク質分解性転換である。補体カスケードの酵素によりＣ３ｂが切断されると、アミノ基又はヒドロキシル基のどちらかを捕獲するチオエステル結合によりＣ３ｂは抗原表面上に共有結合することが可能になる。これは補体オプソニン化の最初のステップであり、続いて結合しているＣ３ｂが補体阻害因子Ｉによりタンパク質分解されると、異なった受容体により認識される断片であるｉＣ３ｂ、Ｃ３ｃ及びＣ３ｄｇが生成される。Ｃ３は、１３の別個のドメインからなる複合した柔軟なタンパク質である。Ｃ３ｂ及びＣ３ｃ構造をＣ３と比べると、この分子は各タンパク質分解ステップで大きな立体構造の再構成を受けて、細胞受容体及び他のリガンドと相互作用することが可能な分子の追加の新たな表面が露出することが示されている。補体活性化の大半の阻害剤は、補体コンバターゼの中心的成分であるＣ３ｂのレベルで作用する。
【００１２】
補体は、小ロイシンリッチリピートタンパク質（ＳＬＲＰ）ファミリーのメンバーなどのいくつかの内在性リガンドにより誘発されることもある［８］。ＳＬＲＰは軟骨において、たとえば、組織の構造的安定性に寄与するいくつかの役割を有する。病的軟骨破壊中、ＳＬＲＰは断片化されて滑液中に放出され、そこで補体と相互作用をすることができる。これが、ＲＡ及びＯＡなどの関節疾患に罹患している患者の、炎症が蔓延している関節において局所的炎症環境の一因になると提唱されてきた。
【００１３】
上記のように、組織分解プロセス並びにＯＡ及びＲＡの発症を判定するためのさらに優れた改良された方法及び製品の必要性が存在する。本発明は、新しいアプローチを使用して、組織破壊プロセスの結果として放出される産物により推進される補体活性化／炎症の特定のプロセスを同定する。組織から放出される分子／断片と補体活性化から生じる補体因子との間で形成される複合体は、ＣＯＭＰとＣ３ｂ又はＣ３ｂの天然の／追加の分解産物との間の複合体のアッセイを説明している本明細書の本発明における免疫化学的方法によりアッセイされる。
【００１４】
ＷＯ０１３８８７６には、細胞系から産生される２種類のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ技術を使用して臨床試料中のヒトＣＯＭＰの存在を分析する方法のためのアッセイが記載されている。ＷＯ０１３８８７６に記載される方法は本発明において部分的に使用することが可能であり、前記特許文献はこれにより参照によって完全に組み込まれるが、補体活性化又はＣ３ｂとの複合体形成におけるＣＯＭＰの役割に関して現在提供されている概念に関する情報はそこにはない。
【００１５】
ＷＯ０５１１６６５８には、本発明と同じ群からのＣＯＭＰネオエピトープの検出により組織分解プロセスを判定するためのアッセイが記載されている。ＷＯ０５１１６６５８に記載される方法の一部は本発明において使用することが可能であり、前記特許文献はこれにより参照によって完全に組み込まれるが、ＣＯＭＰとＣ３ｂなどの別の因子との間の複合体をアッセイすることに関する情報もそこにはない。
【００１６】
ＵＳ２００８２３３１１３は、対象におけるＣ３ｂ阻害剤による補体活性化を抑制する方法に関するものであるが、補体を活性化する作用薬及び得られるＣＯＭＰとＣ３ｂとの間の複合体についてのアッセイに関連してはいない。その手法は、ＯＡとＲＡ両方の滑液における補体活性化がＣＯＭＰ放出に関係していることを示すことに適用されていない。
【００１７】
ＷＯ２００４０３１２４０は、炎症反応、さらに具体的には、補体系の活性化をインビボで抑制する方法を記載している。この発明は、Ｃ３の活性化には不可欠なドメインである、補体の天然の第３成分であるＣ３上の新規の機能的ドメインの同定及び抑制からなるが、この活性化を実現するどんな作用薬にも、ＣＯＭＰとＣ３ｂとの間の複合体のアッセイにも関連していない。
【００１８】
ＷＯ２００８１５４２５１では、この発明はＣ３ｂに対する特定の抗体並びにそのような抗体を使用する補体関連障害の予防及び治療に関する。しかし、この発明はＣＯＭＰとＣ３ｂとの間の複合体のアッセイには関連していない。
【００１９】
関節疾患中に軟骨が過剰に分解すると、滑膜内で分子変化が起こる。軟骨からのＣＯＭＰ放出は、ＲＡでもＯＡでも、放射線学的に観察される軟骨損傷に先行する初期事象であることが明らかにされている。したがって、ＣＯＭＰレベルの上昇は、活動性疾患に罹患した患者の滑液においても血清においても検出することができる。補体活性化は、特に、ある種の軟骨プロテオグリカンにより補体の古典的経路が活性化されることが発見されて以来、関節において炎症状態を持続する要因のうちの１つであることが提案されてきた。古典的経路でも第２の経路でも補体活性化産物は、活動性ＲＡに罹患した患者の滑液に見出すことができ、これは関節炎疾患モデルにおける補体タンパク質の欠損の保護的効果並びに補体阻害の治療的効果を示すいくつかの動物モデルにより支持されるシナリオである［６］。
【００２０】
我々の発明は、ＣＯＭＰ−Ｃ３ｂ複合体が、インビボにおけるＣＯＭＰ誘導補体活性化の指標としてＲＡ患者の血清中にも滑液中にも存在することに基づいている。血清又は滑液においてはＣＯＭＰの量とＣＯＭＰ−Ｃ３ｂ複合体との間には相関関係はなく、ＣＯＭＰのある種の放出された断片のみが補体活性化特性を有していること、又は他の制限する要因が存在することを示している。ＲＡ患者の滑液中のＣＯＭＰレベルは血清中よりも有意に高く、ＣＯＭＰ−Ｃ３ｂレベルは血清に比べていくらか低い。１つの説は、血液中の事象は違った寄与をする可能性のある多くの関節を反映しているというものであり、別の説は、補体の他に全タンパク質レベルも一般に血清中よりも滑液中のほうがはるかに低く、プロパージン及びＣ３の利用可能性は制限要因である可能性があるというものである。
【００２１】
本明細書の発明は、補体調節におけるＣＯＭＰの役割についての発見及びＣＯＭＰが第２の経路を通じて補体活性化を誘導することができることに基づいている。
【００２２】
ＣＯＭＰだけではなく、血清中でＣＯＭＰ−Ｃ３ｂ複合体を検出することにより、循環ＣＯＭＰレベルが正常な範囲に留まっていることがある患者において、活動性疾患、たとえば、ＲＡ又はＯＡを同定することが可能である。これらの複合体は、本発明の方法に、アッセイ及びキットに含まれる。
【００２３】
本発明は、ＣＯＭＰ放出を伴う他の炎症状態、たとえば、脊椎関節炎及び若年性特発性関節炎並びに全身性硬化症及び腱病のような他の状態における、軟骨から放出される断片により推進される補体活性化の役割を同定するのにも有用であることが判明するであろう。これは、診断を迅速に確定するための追加の価値あるツールを提供し、広範な関節破壊を回避するための患者の早期治療を選択し開始することになる。本発見及び本発明、たとえば、ＣＯＭＰと補体成分Ｃ３ｂ又はＣ３ｂの天然の分解産物との間の共有結合性複合体を検出するバイオアッセイは、疾患治療をモニターするのに特に有用なＲＡ病の新しいバイオマーカーを検出することになる。前記アッセイは、特に出現する補体阻害剤を用いた治療を受け入れられるＲＡ患者の下位群もおそらく同定することになる。
【００２４】
したがって、活動性疾患に罹患した患者を同定する他にも活動性疾患に罹患した患者の関節腔において局所的炎症を引き起こす事象を同定することが本発明の目的である。
【００２５】
上記の発明及び先行技術は、単独で採用されても組み合わせて採用されても、どれ１つとして、本発明を記載していないし本発明をもたらす情報を提供してはいない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
炎症は大半の疾患の特徴である。以前の発見では、組織から放出される分子は、炎症の重要な一部としての補体活性化に影響を与えうることが示されている。そのような分子は体液中で同定することが可能である。本発明は、組織破壊プロセスにより誘導される進行中の補体活性化を検出する新しい方法を示している。ＣＯＭＰだけではなく、血清中においてＣＯＭＰ−Ｃ３ｂ複合体を検出することにより、ＲＡについて数倍より感度の高い特異的検出を得ることが可能である。関節疾患に罹患した患者の滑液中のそのような複合体を同定することにより、軟骨分解から生じる炎症の局所的活性化を同定することが可能である。
【００２７】
たとえば、ＲＡ、ＯＡなどの関節疾患並びに腱炎、全身性硬化症及び主要な血管を冒す心血管疾患（アテローム性動脈硬化症を含む）の潜在的なある種の段階に罹患した患者由来の血液及び滑液試料を、ＣＯＭＰ−Ｃ３ｂ複合体の内容物について分析することが可能である。
【００２８】
本発明の主目的は、進行中の治療計画の成功を測定しモニターするために使用することができるアッセイを提供することであり、すなわち、ＣＯＭＰ−Ｃ３ｂアッセイにおけるシグナルは患者の疾患活動性に従う。
【００２９】
本発明の別の目的は、ＲＡに罹患した患者を同定するための改良されたアッセイを提供することである。
【００３０】
本発明の実施形態は、本発明の方法においてのように、臨床試料を、炎症性成分を有し結合組織を冒す疾患における補体活性化を測定するために使用するアッセイである。
【００３１】
本発明の実施形態は、本発明の方法においてのように、試料を、疑われているＲＡ及びＯＡにおける補体活性化を測定するために使用するアッセイである。
【００３２】
本発明の実施形態は、本発明の方法においてのように、試料を、乾癬性関節炎、慢性若年性関節炎及び骨盤脊椎炎における補体活性化を測定するために使用するアッセイである。
【００３３】
本発明の実施形態は、本発明の方法においてのように、試料を、ＲＡ及びＯＡ、全身性硬化症、腱炎並びにアテローム性動脈硬化症を含む心血管疾患における補体活性化を測定するために使用するアッセイである。
【００３４】
本発明の実施形態は、本発明の方法においてのように、ＲＡ及びＯＡ、全身性硬化症、腱炎並びにアテローム性動脈硬化症を含む心血管疾患などの炎症性成分を有し結合組織を冒す疾患に罹患した患者において疾患進行をモニターするためのアッセイである。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、様々な疾患群における血清ＣＯＭＰ−Ｃ３ｂ複合体のレベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
炎症は大半の疾患の構成要素である。以前の発見では、組織から放出される分子は、炎症の重要な一部としての補体活性化に影響を与えうることが示されている。ＣＯＭＰは、主にプロパージンとの相互作用を通じて補体系の第２の経路を活性化することができ、これにより補体攻撃をＣＯＭＰが露出している表面に向けられる可能性があることを我々は発見していた。ＣＯＭＰのペンタマー構造（ｐＣＯＭＰ）はプロパージンの結合を促進するのに必要ではなく、血清中において切断されたＣＯＭＰの放出された断片は補体活性化特性を有するというインビボの知見を支持していた。興味深いことに、Ｃ３及びＣ３ｂはＣＯＭＰと直接相互作用することも見出された。これにより、ＣＯＭＰの効果は、Ｃ３ｂとプロパージン両方との相互作用を通じて代替Ｃ３コンバターゼを安定化することであるのか、又はもっと単純に、プロパージンを動員し、したがってコンバターゼ会合体にプラットホームを提供することにより補体活性化を標的にすることなのかどうかという疑問が生じる。
【００３７】
本発明は、患者において炎症全般を検出するために使用することを目的とする。
【００３８】
本発明は、たとえば、以下の成分、
ｉ）ＷＯ０１３８８７６／ＡＵ９９０４２３６（本明細書に組み込まれている）に記載される手順に従ってＣＯＭＰに対する抗体により本出願において例示されている、ＣＯＭＰ−Ｃ３ｂ複合体を形成する成分のうちの１つを捕獲する１つ又は複数の抗体又は他のリガンドを含む第１の成分（前記抗体は、ＣＯＭＰのリガンド、ファージディスプレイ法により同定される断片を含むＦａｂ若しくはＦ（ａｂ）’２などの抗体断片又はＣＯＭＰエピトープに結合する無傷の抗体であることが可能である）、
ｉｉ）補体因子Ｃ３ｂ若しくは天然の分解産物に対する抗体又はその断片により本出願において例示されている、前記複合体のその他の成分に結合する１つ又は複数の抗体の形態のディテクターを含む第２の成分、
ｉｉｉ）１つ又は複数の抗体が上記の断片の１つ又は複数のエピトープと反応したかどうかを検出するための手段を含む第３の成分（これは、標識されたディテクター抗体又は前記ディテクター抗体に結合する標識されたリガンドを使用することにより実現することが可能である。典型的なアプローチでは、最終的な検出は、一般に使用されているアプローチ、たとえば、結合した酵素又は他の任意のプローブの活性を測定することを含むアプローチによるものである）
を含む、本発明に従った方法により組織分解プロセスを判定するためのキットに関する。
【００３９】
さらに、本発明は、以下の成分、
ｉ）抗体、たとえば、溶液又はプレートのウェルなどの固相担体に結合している、ヒトＣＯＭＰに対するモノクローナル抗体又は他のリガンドを提供する第１の成分、
ｉｉ）ヒトＣＯＭＰ−Ｃ３ｂ断片複合体を含有すると疑われている臨床試料をステップ１）の第１の抗体に添加し、得られた混合物を水溶液中でインキュベートすること、
ｉｉｉ）第２の抗体、たとえば、ヒトＣ３ｂに対するモノクローナル抗体若しくは他のリガンド又はその断片をステップｉｉ）の混合物に添加し（前記第２の抗体は検出可能であり定量できるシグナルを発する標識を含む）、標識由来のシグナルを定量する（前記シグナルは前記試料中のヒトＣＯＭＰ−Ｃ３ｂ複合体の濃度の測定値となる）こと
を含む、本発明に従った方法により組織分解プロセスを判定するためのキットにも関することが可能である。
【００４０】
本発明の抗体は、試料中に存在するＣＯＭＰ−Ｃ３ｂ複合体に結合した抗体のレベルを測定するために、たとえば、酵素、放射性の、蛍光性の又は発光性の標識で随意に標識されている。
【００４１】
サンドイッチアッセイでは、固相に結合している成分は、第１の成分でも第２の成分でもよい。上に与えられた例では、第１の成分は固相に結合している。サンドイッチアッセイの別の例では、本発明の抗体を含む第２の成分は、たとえば、プレートのウェルなどの固相に結合している。次に、試料中におけるＣＯＭＰ−Ｃ３ｂ断片の存在は、先ず試料をプレートのウェルに添加することにより検出することが可能である。ＣＯＭＰ−Ｃ３ｂ断片を含有する１つ又は複数の複合体が試料中に存在する場合には、断片は抗体を介して固相に結合しており、この抗体はＣＯＭＰ−Ｃ３ｂ複合体に結合する。次に、Ｃ３ｂエピトープを含有する断片の存在は、１つ又は複数の物質を含む第１の成分を添加することにより測定することが可能であり、この物質は１つ又は複数の断片に結合する。前記１つ又は複数の物質は、試料中に存在する断片に結合している物質のレベルを測定するために、たとえば、酵素又は放射性若しくは蛍光性標識で随意に標識されている。第２の抗体と反応する、抗体などの標識されたリガンドも検出のために使用することが可能である。
【００４２】
本発明は、関節疾患における軟骨分解プロセスにより誘導される補体活性化の滑液レベルに関する情報を提供することになる。血清分析は、ＣＯＭＰの放出された断片により誘導される補体活性化のレベルに関する情報を提供し、ＲＡ及びＯＡに罹患している患者をさらにうまく同定することになる。特に、炎症を誘発する際の基質成分の役割に関する情報は、将来の治療努力を評価すること並びにそのような治療のために患者を選択することにも重要な成分を提供する。
【００４３】
本発明は、活動性疾患に罹患したＲＡ患者を明確にする新規の手段を提供し、前臨床段階において現在の診断を行うことができる前の患者を含むことになる。
【００４４】
本発明は、組織破壊の強度が低すぎて従来からある現在のアッセイにより検出することができない場合でも、ＣＯＭＰについての疾患活動性を含む疾患活動性を明確にすることになる。
【００４５】
本発明は、疾患進行が比較的激しい高リスク患者を明確にすることになる。
【００４６】
本発明は、外傷後に変性関節疾患を発症する比較的高いリスクを有する患者を滑液の分析により明確にすることになる。
【００４７】
本発明は、乾癬性関節炎、慢性若年性関節炎及び骨盤脊椎炎における補体活性化を明確にすることになる。
【００４８】
本発明は、血清試料の分析により、背痛をもたらす脊椎におけるプロセスを同定することになる。その理論的根拠は、放出されるＣＯＭＰ断片が補体を活性化して炎症プロセスを誘導し、今度は疼痛を生じるというものである。補体活性化を示す複合体は、前記プロセスの直接の評価基準を提供することになる。
【実施例】
【００４９】
（例１）
血液試料を、静脈穿刺により収集し、凝固させる。血清を遠心分離により分離する。次に、試料を、試料希釈液（０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．９０パーセント（ｗｔ）ＮａＣｌ、１パーセントウシ血清アルブミン、０．０５パーセントＴｗｅｅｎ２０、０．１５パーセントＫａｔｈｏｎｅ  ＣＧ、０．０１パーセントタートラジン、０．００１Ｍ  ＣａＣｌ２、０．０１パーセントウシＩｇＧ、０．４５マイクロｍフィルターを使用して濾過される）で１対１０で希釈する（１２μＬ（マイクロリットル）試料対１０８μＬ（マイクロリットル）試料希釈液）。
【００５０】
滑液は関節吸引により収集しれ、直ちに遠心分離して、細胞及びすべての粒子を除去する。滑液は、血清試料と同様に、試料希釈液で１対１０で希釈する。
【００５１】
各判定は、標準及び未知の試料では２通りに実施される。細胞系ＤＳＭ  ＡＣＣ２４０６により産生されるモノクローナル抗体がウェルに固定化されている、ポリスチレン９６ウェルマイクロタイタープレートを使用する。５０μＬの未知の試料又は標準試料（我々の場合は、標準として１．７Ｕ／ｌキャリブレーション対照を使用した）をウェルに添加し、プレートを回転プレート上、室温で１２０分間インキュベートする。３５０μＬの洗浄緩衝液（０．１４Ｍ  ＮａＣｌ、０．００３Ｍ  ＫＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．０１Ｍリン酸緩衝液  ｐＨ７．４）を用いて４回洗浄した後、Ｓｉｇｍａ社製（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ６３１７８、米国）のＣ３ｂ認識抗体Ｃ７７６１を含有する５０μＬのコンジュゲート溶液希釈液（０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓベース  ｐＨ７．５、０．９パーセント（ｗｔ）ＮａＣｌ、０．００１Ｍ  ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、１パーセントＢＳＡ、０．０５パーセント  Ｔｗｅｅｎ２０、０．１５パーセントＫａｔｈｏｎ  ＣＧ、０．０３パーセントパテントブルー、０．０１パーセントウシＩｇＧ、０．００５パーセントヘテロ親和性ブロッキング試薬−１）（１対３０００に希釈する）をすべてのウェルに添加し、プレートを室温で６０分間、回転板上でインキュベートする。プレートは洗浄緩衝液を用いて４回洗浄し、コンジュゲート溶液希釈液中のウサギ抗ヤギＨＲＰ（Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社製のＰ０４４９、１対２０００に希釈される）５０μＬを各ウェルに添加する。プレートを、回転板上、ＲＴ（室温）で６０分間インキュベートし、その後、上記と同じように洗浄緩衝液を用いて４回洗浄する。２００μＬの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（１ｍＭ）を各ウェルに添加し、プレートを室温で３分３０秒間インキュベートする。呈色反応は、各ウェルに５０μＬの０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加することにより停止する。４５０ｎｍの吸光度を測定する。標準試料の吸光度を１に設定し、患者試料の読み出しは標準に対して規準化する。
【００５２】
（例２）
例１と同じであるが、未知の試料におけるＣＯＭＰ−Ｃ３ｂレベルの定量的評価基準を得るための直接的な標準参照としての１つ又は複数のレベルの複合体を表す血清の陽性プールも使用する。
（参考文献）
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【図１】
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【国際調査報告】
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