(57)【要約】  患者の生殖能力の回復のために、未成熟な生殖系列細胞を、半数体の配偶子に宿主外で成熟させる方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
精巣または卵巣から未成熟な生殖系列細胞を得るステップと、
本来の宿主内で前記細胞が生体内で成熟する条件を模擬した条件下で、前記未成熟な生殖系列細胞を生体外または本来のドナーを除く代理動物の生体内で培養し、前記培養が機能的な精子または卵子への前記未成熟な生殖系列細胞の成熟をもたらすステップと、
を含む、未成熟な生殖系列細胞を配偶子に宿主外で成熟させる方法。
【請求項２】
前記未成熟な生殖系列細胞は、
思春期前の患者から得られる、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記未成熟な生殖系列細胞は、
成熟前に低温保存される、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記未成熟な生殖系列細胞は、
生殖系列幹細胞または減数分裂前の生殖細胞である、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記培養は、
人工の精細管での未成熟な精巣の生殖系列細胞の培養を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記培養は、
グリア細胞株由来成長因子、線維芽細胞増殖因子、白血病抑制因子および上皮細胞増殖因子からなる群から選択される少なくとも１つの成長促進因子の存在下での未成熟な精巣の生殖系列細胞の培養を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記培養は、
卵胞刺激ホルモン、幹細胞因子およびレチノイン酸からなる群から選択される少なくとも１つの成熟誘導因子の存在下での未成熟な精巣の生殖系列細胞の培養を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記人工の精細管は、
細胞外基質で被覆された生体適合性のチューブを備える、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞外基質は、
精巣の細胞外基質である、
ことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記精巣の細胞外基質は、
前記精巣の生殖系列細胞に自己移植される、
ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記培養は、
顆粒膜細胞およびフィブリン塊の存在下における未成熟な卵巣の生殖系列細胞の培養を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記培養は、
グリア細胞株由来成長因子、線維芽細胞増殖因子、白血病抑制因子、上皮細胞増殖因子および成長ホルモンを含む成長促進因子の存在下で培養された未成熟な卵巣の生殖系列細胞の培養を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記培養は、
卵胞刺激ホルモン、幹細胞因子およびレチノイン酸を含む成熟誘導因子の存在下で培養された未成熟な卵巣の生殖系列細胞の培養を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記フィブリン塊は、
前記卵巣の生殖系列細胞に自己移植される、
ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記顆粒膜細胞は、
前記卵巣の生殖系列細胞に自己移植される、
ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生殖系列幹細胞の損傷のために不妊のおそれのある患者由来の生殖系列幹細胞の、宿主を除くまたは宿主外での成熟（生体外であっても、代理動物の生体内であっても）における成熟システムと、当該患者のその後の生殖能力の回復に関する。患者が悪性腫瘍に対する化学治療または放射線治療を受けた場合、生体外受精および、それに続く宿主外成熟と子宮への移植を組み合わせる必要がある。新たに移植された精巣または卵巣組織に混入する可能性のある腫瘍細胞を再び取り込む恐れがあるので、宿主である患者への直接の再移植または自己移植は避けるべきである。
【背景技術】
【０００２】
生殖系列幹細胞は、生殖器官、例えば、卵巣および精巣に属し、潜在的には、哺乳類の体内で最も重要かつ保護された幹細胞の種類の１つである。遺伝的保存および高いテロメラーゼ活性に加え、クロマチン染色体の修飾を伴う多くのＤＮＡ修飾がこれらの組織由来の幹細胞で報告されている。科学者の間では、成体の生殖組織に内在する幹細胞のタイプおよび分化におけるそれらの可能性についての意見が異なる。
【０００３】
化学治療および放射線治療は、癌性細胞のみならず急速に分裂する細胞も標的とする。精巣では、急速に分裂する幹細胞は、化学物質や放射線の暴露の影響を受けやすい。思春期前の精巣では、生殖系列幹細胞は、同様に影響を受けやすく、放射線への暴露によって急激かつ濃度依存的に激減する。低濃度でも細胞毒性のある薬剤および放射線照射は、分化している精原細胞を激減させるが、影響をほとんど受けない精原幹細胞、精母細胞および精子細胞は生存する。分化している生殖細胞は、精子細胞への成熟を継続することができ、生存している幹細胞群から発生する幹細胞を伴う精細管に再定着できる。
【０００４】
しかし、深刻な激減の場合、精子形成は、ごく少ない精細管で回復されるだけであって、その結果、生殖能力を制限してしまう。患者は、精巣の生殖細胞の完全な喪失後に、永久に不妊となる。精子形成への影響が思春期の時又はその前に強く現れるのは、通常精子が得られないし、思春期後の雄では低温保存されてもいないためである。もし精子形成を再び開始するのに十分な時間が与えられたら、わずかな幹細胞であっても精細管に再定着できる。
【０００５】
最近まで、ヒトを含むほとんどの哺乳類種の雌の生殖腺は原始卵胞に含まれる減数分裂で停止した有限個数の生殖細胞（卵母細胞）を有し、該生殖細胞は、各月経サイクルの間の排卵において放出される卵子の備蓄として機能することが信じられていた。卵母細胞の個数は、出産後生活を経てアポトーシスに関連する機序を介して減少し、ついには生殖細胞を欠く卵巣が残されるということが広く信じられていた。ヒトでは、５０歳代の間に卵母細胞の備蓄の完全な消耗が通常起こり、更年期障害が進む。
【０００６】
また、発生生物学のこの基本原理に従って、一度消耗してしまうと卵巣の生殖細胞のプールは再び満たされないことが信じられていた。このため、卵母細胞の消失を加速する処置はいずれも生殖能力を減少させる恐れがあって、予想よりも若い年齢で更年期障害が出る。例えば、卵巣を損傷する様々な手段、化学治療剤および放射線治療のようなものを女性が受けることは、一般には、早発閉経および不可逆の不妊につながる。現在、生殖能力および多様な悪条件下における通常の卵巣の機能を維持する治療の選択肢は限られていて、侵襲的な、例えば、卵巣の組織断片または単一の卵母細胞の低温保存のようなものであって、かつ事前のホルモン療法を必要とすることが多く、ホルモン反応性腫瘍を伴う多くの女性にとって医学的に妥当でない。さらに、今のところ、更年期障害において通常の卵巣障害を遅らせるための治療の選択肢はない。
【０００７】
雄及び雌両方における機能的な生殖細胞の回復のために、２つの主なアプローチが特定された。第１は、未成熟な組織（卵巣または精巣のどちらか）断片を生存している組織に移植することであって、第２は、幹細胞の単離と移植に基づく。
【０００８】
生殖細胞の移植は、げっ歯動物モデルで開発された。マウスまたは近縁関係にある種マウス由来の生殖細胞の、マウスの精細管への顕微注射は、供与された精原幹細胞からの精子形成を再亢進した。精原細胞は、移植前に低温保存又は培養されてもよい。同様に、低温保存された卵巣皮質組織がヒツジ及びヒトに移植された結果、発情が再開され、通常の交配に続いて子が産まれた。しかし、このような直接の自己移植を、ドナー生物に行うことは、もともと悪性腫瘍に対する治療を受けていた患者にとって最適ではない。これは、患者が化学治療または放射線治療後に再発した場合、再発が化学治療または放射線治療で殺されなかった体内の悪性細胞の蓄積によるものなのか、低温保存された生殖腺組織および細胞の再移植が当該悪性細胞を抱えていたのか明らかにならないからである。だから、そのような患者に対する最適な方法は、低温保存された生殖腺組織を機能のある精子または卵子に成熟させ、自然のまたは類似する宿主外で成熟させた相手の卵子または精子を用いて、生体外での受精（卵細胞質内精子注入法またはＩＣＳＩの使用または不使用）を行い、それから、受精した胚を雌の相手に再移植することである。受精した胚は混入のない宿主外で成熟させた精子または卵子から作製されるだけなので、この方法は、腫瘍の混入の可能性は全くない。
【０００９】
従って、成熟した精子または卵子を保存する能力を欠く患者の生殖能力を回復するため、および成熟した精子または卵子を産生するために宿主外／生体外または宿主外／生体内で保存された生殖系列細胞を成熟させるために、生殖系列細胞の保存システムがヒトにとって必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本開示は、成熟した生殖細胞を産生するために未成熟な生殖系列幹細胞を成熟させる方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本明細書で開示される１つの実施の形態では、宿主外で、未成熟な生殖系列細胞を単一の配偶子に成熟させる方法は、精巣または卵巣から未成熟な生殖系列細胞を得るステップと、細胞が生体内で成熟する条件を模擬した条件下で、未成熟な生殖系列細胞を生体外で培養し、培養が機能的な精子または卵子への生殖系列細胞の成熟をもたらすこととを、含む。
【００１２】
他の実施の形態では、未成熟な生殖系列細胞は、思春期前の患者から得られる。他の実施の形態では、未成熟な生殖系列細胞は、成熟前に低温保存される。他の実施の形態では、未成熟な生殖系列細胞は、生殖系列幹細胞または減数分裂前の生殖細胞である。
【００１３】
１つの実施の形態では、培養は、人工の精細管での未成熟な精巣の生殖系列細胞の培養を含む。他の実施の形態では、培養は、グリア細胞株由来成長因子、線維芽細胞増殖因子、白血病抑制因子および上皮細胞増殖因子からなる群から選択される少なくとも１つの成長促進因子の存在下での未成熟な精巣の生殖系列細胞の培養を含む。他の実施の形態では、培養は、卵胞刺激ホルモン、幹細胞因子およびレチノイン酸からなる群から選択される少なくとも１つの成熟誘導因子の存在下での未成熟な精巣の生殖系列細胞の培養を含む。
【００１４】
他の実施の形態では、人工の精細管は、細胞外基質で被覆された生体適合性のチューブを備える。他の実施の形態では、細胞外基質は、精巣の細胞外基質である。また、他の実施の形態では、精巣の細胞外基質は、精巣の生殖系列細胞に自己移植される。
【００１５】
１つの実施の形態では、培養は、顆粒膜細胞およびフィブリン塊の存在下における未成熟な卵巣の生殖系列細胞の培養を含む。他の実施の形態では、培養は、グリア細胞株由来成長因子、線維芽細胞増殖因子、白血病抑制因子、上皮細胞増殖因子および成長ホルモンを含む成長促進因子の存在下で培養された未成熟な卵巣の生殖系列細胞の培養を含む。また、他の実施の形態では、培養は、卵胞刺激ホルモン、幹細胞因子およびレチノイン酸を含む成熟誘導因子の存在下で培養された未成熟な卵巣の生殖系列細胞の培養を含む。
【００１６】
他の実施の形態では、フィブリン塊は、卵巣の生殖系列細胞に自己移植される。他の実施の形態では、顆粒膜細胞は、卵巣の生殖系列細胞に自己移植される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】図１は、フローサイトメトリーを用いて遺伝子組換えＯＧ２マウスから単離された精巣幹細胞のＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）陽性の分集団の濃縮を示す。ＧＦＰの発現よって示されるＯｃｔ‐４＋細胞は、野生型（図１Ａ）と比較して、新生児の（図１Ｂ）および成体の（図１Ｃ）ＯＧ２マウス両方で異なる細胞集団として見られた。Ｏｃｔ‐４＋細胞の中には、ｃ‐Ｋｉｔ＋（Ｒ５）およびｃ‐Ｋｉｔ−（Ｒ２）を含む２つの明白な分集団がみられた（図１Ｄ‐１Ｅ）。ＧＦＰおよびｃ‐Ｋｉｔの発現の相関も示されている（図１Ｆ‐１Ｈ）。
【図１Ｂ】フローサイトメトリーを用いて遺伝子組換えＯＧ２マウスから単離された精巣幹細胞のＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）陽性の分集団の濃縮を示す。
【図１Ｃ】フローサイトメトリーを用いて遺伝子組換えＯＧ２マウスから単離された精巣幹細胞のＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）陽性の分集団の濃縮を示す。
【図１Ｄ】フローサイトメトリーを用いて遺伝子組換えＯＧ２マウスから単離された精巣幹細胞のＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）陽性の分集団の濃縮を示す。
【図１Ｅ】フローサイトメトリーを用いて遺伝子組換えＯＧ２マウスから単離された精巣幹細胞のＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）陽性の分集団の濃縮を示す。
【図１Ｆ】フローサイトメトリーを用いて遺伝子組換えＯＧ２マウスから単離された精巣幹細胞のＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）陽性の分集団の濃縮を示す。
【図１Ｇ】フローサイトメトリーを用いて遺伝子組換えＯＧ２マウスから単離された精巣幹細胞のＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）陽性の分集団の濃縮を示す。
【図１Ｈ】フローサイトメトリーを用いて遺伝子組換えＯＧ２マウスから単離された精巣幹細胞のＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）陽性の分集団の濃縮を示す。
【図２】図２は、培養中の多分化能の生殖細胞（ｍＣＧ）株列の成長における形態変化を示す。マウスのＯｃｔ‐４＋／ＧＦＰ＋細胞は、培養前の細胞調製で観察された（図２Ａ；矢印；１‐３日）。培養後すぐにＯｃｔ‐４の下方調節が観察された（図２Ｂ；３‐７日）。培養２週目に細胞が接着した後で、明らかな形態変化が起きた（図２Ｃ；７‐１５日、図２Ｄ；１５‐２０日）。培養後約３週で、小円形細胞を含むコロニーが形成された（図２Ｅ；２０‐３０日）。Ｏｃｔ‐４の上方調節が培養約１ヶ月後に観察された（図２Ｆ；３０‐４０日）。新生児のＯＧ２、成体のＯＧ２または新生児のＯＧ２‐ＬａｃＺ由来の３つの確立されたｍＧＣ株列の画像が、それぞれ図２Ｇ‐Ｉに示されている（図２Ｇ、新生児のＯＧ２；図２Ｈ、成体のＯＧ２；図２Ｉ、ＯＧ２  ＬａｃＺ）。スケールバー：５０μｍ。
【図３Ａ】図３は、１５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が添加されたＰＭ‐１（商標）培地におけるマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）支持細胞層で培養された多分化能の生殖系列前駆細胞を示す。培養中の異なる時点で、蛍光補助細胞選別装置（ＦＡＣＳ）を用いてＧＦＰ＋細胞の個数が決定された（図３Ａ‐Ｄ）。スケールバーは、６０μｍ相当である。
【図３Ｂ】１５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が添加されたＰＭ‐１（商標）培地におけるマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）支持細胞層で培養された多分化能の生殖系列前駆細胞を示す。
【図３Ｃ】１５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が添加されたＰＭ‐１（商標）培地におけるマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）支持細胞層で培養された多分化能の生殖系列前駆細胞を示す。
【図３Ｄ】１５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が添加されたＰＭ‐１（商標）培地におけるマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）支持細胞層で培養された多分化能の生殖系列前駆細胞を示す。
【図３Ｅ】時間に対する細胞数のグラフを示す。
【図４】図４は、ｍＧＣの表現型と分子特性を示す。多能性かつ生殖細胞マーカーの免疫学的局在決定が、Ｏｃｔ‐４について図４Ａ‐４Ｄに、Ｎａｎｏｎｇについて図４Ｅ‐４Ｈに、ＳＳＥＡ‐１について図４Ｍ‐４Ｏ、および生殖細胞マーカーであるＶＡＳＡについて図４Ｉ−４Ｌに示されている。スケールバー：図４Ａ‐４Ｈ：２５μｍ；図４Ｉ‐４Ｏ：２０μＭ。
【図４Ｐ】免疫沈降（ＩＰ）前後のｍＧＣ細胞におけるＯｃｔ‐４、ＮａｎｏｎｇおよびＳｏｘ２のタンパク質含有量のウェスタンブロット解析が図４Ｐに示されている。
【図４Ｑ】ＲＴ‐ＰＣＲで決定された多能性かつ生殖特異的マーカーの発現が図４Ｑに示されている。
【図５Ａ】図５は、成体の脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）、マウスＥＳ細胞、ｃ‐Ｋｉｔ選別後に新鮮分離した生殖系列幹細胞および１０代継代した多分化能の生殖系列幹細胞（新生児のＯＧ２）におけるテロメラーゼ活性と核型解析を示す。生殖系列幹細胞におけるテロメラーゼ活性はマウスＥＳ細胞と同程度であって、ＡＤＳＣ細胞よりも高い（図５Ａ）。図５Ｂは、同じ新生児のＯＧ細胞列株の核型解析を示す。図は、解析された８０メタフェーズ展開を示す。１５代継代後の細胞は通常の核型を示す。
【図５Ｂ】成体の脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）、マウスＥＳ細胞、ｃ‐Ｋｉｔ選別後に新鮮分離した生殖系列幹細胞および１０代継代した多分化能の生殖系列幹細胞（新生児のＯＧ２）におけるテロメラーゼ活性と核型解析を示す。
【図６】図６は、培養前（ＮＧＣ）および培養後（ＧＣ）の多分化能の生殖系列前駆細胞のインプリンティング解析を示し、特異的なメチル化領域のＭｅｇ３、Ｐｅｇ１０、Ｏｃｔ‐４、Ｉｇｆ２ｒおよびＲａｓｇｒｆ１についてマウスＥＳ細胞と比較された。
【図７Ａ】図７は、ｍＧＣの自然発生の分化を示す。胚様体の嚢胚形成（ＥＢ；図７Ａ）および極性上皮（Ｅ‐カドヘリンおよびラミニン１；図７Ｂ‐７Ｃ）と発生初期の３種の胚葉、すなわち、外胚葉（ＺＩＣ１、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１）、内胚葉（ＧＡＴＡ４、ＦＯＸＡ２）および中胚葉（ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ、ＢＭＰ４およびＣＯＬ２Ａ１）とを示すマーカーの発現が図７Ｄ‐７Ｆに示されている。また、培養中、再プログラム化しているｍＧＣは、自発的に心筋細胞（図７Ｇ‐７Ｊ）、脂肪細胞（図７Ｋ）および神経細胞（図７Ｌおよび７Ｍ）に分化した。スケールバー：図７Ａおよび７Ｉ：５０μｍ；図７Ｃおよび７Ｅ：３０μｍ；図７Ｂおよび７Ｄ：２５μｍ；図７Ｇ、７Ｈおよび７Ｌ：４５μｍ；図７Ｋ：１２μｍ。
【図７Ｂ】ｍＧＣの自然発生の分化を示す。
【図７Ｃ】ｍＧＣの自然発生の分化を示す。
【図７Ｄ】ｍＧＣの自然発生の分化を示す。
【図７Ｅ】ｍＧＣの自然発生の分化を示す。
【図７Ｆ】ｍＧＣの自然発生の分化を示す。
【図７Ｇ】ｍＧＣの自然発生の分化を示す。
【図７Ｈ】ｍＧＣの自然発生の分化を示す。
【図７Ｉ】ｍＧＣの自然発生の分化を示す。
【図７Ｊ】ｍＧＣの自然発生の分化を示す。
【図７Ｋ】ｍＧＣの自然発生の分化を示す。
【図７Ｌ】ｍＧＣの自然発生の分化を示す。
【図７Ｍ】ｍＧＣの自然発生の分化を示す。
【図８Ａ】図８は、系統特異的な表現型へのｍＧＣの誘導された分化を示す。神経マーカーを発現した細胞の共焦点像が図８Ａ‐８Ｇに示されている。スケールバー：図８Ａ、８Ｃおよび８Ｇ：２０μｍ；図８Ｂおよび８Ｈ：５０μｍ；図８Ｄ‐８Ｆおよび８Ｊ：１０μｍ。
【図８Ｂ】系統特異的な表現型へのｍＧＣの誘導された分化を示す。
【図８Ｃ】系統特異的な表現型へのｍＧＣの誘導された分化を示す。
【図８Ｄ】系統特異的な表現型へのｍＧＣの誘導された分化を示す。
【図８Ｅ】系統特異的な表現型へのｍＧＣの誘導された分化を示す。
【図８Ｆ】系統特異的な表現型へのｍＧＣの誘導された分化を示す。
【図８Ｇ】系統特異的な表現型へのｍＧＣの誘導された分化を示す。
【図８Ｈ】系統特異的な表現型へのｍＧＣの誘導された分化を示す。ｍＧＣの分化後のアルシアンブルー陽性軟骨細胞が図８Ｈに示されている。
【図８Ｉ】系統特異的な表現型へのｍＧＣの誘導された分化を示す。心筋細胞に分化するｍＧＣの共焦点画像が図８Ｉに示されている。
【図８Ｊ】系統特異的な表現型へのｍＧＣの誘導された分化を示す。神経の遺伝子マーカーの発現が図８Ｊに示されている。
【図８Ｋ】系統特異的な表現型へのｍＧＣの誘導された分化を示す。軟骨細胞特異的な遺伝子の発現が図８Ｋに示されている。
【図８Ｌ】系統特異的な表現型へのｍＧＣの誘導された分化を示す。心筋の遺伝子マーカーの発現が図８Ｌに示されている。
【図９】図９は、マウスのＥＳ細胞を皮膚、筋肉および精巣に移植した後には形成される奇形腫を示すが（図９Ａ‐９Ｆ）、多分化能のＬａｃＺ‐ＧＦＰ  ｍＧＣ（図９Ｇ‐９Ｌ）では形成されない。ＥＳＣ由来の奇形腫の形態は、薄いパラフィン切片のＨ＆Ｅ染色によって同定され、移植された多分化能の生殖細胞（ｍＧＣｓ）の運命は、青で示されるＬａｃＺ染色によって確認された。移植後６週で、ＧＦＰ‐ＬａｃＺ＋のｍＧＣが皮膚（毛嚢および隣接する皮脂腺の隆起領域、図９Ｇ−９Ｈの矢じり）、筋肉（図９Ｉ−９Ｊの矢印）および精巣（図９Ｋの矢印）で見られた。培養前後の生殖系列幹細胞の移植に続く精巣の再生が図９Ｍ‐９Ｒに示されている。免疫不全マウスの通常の精巣の横断面が図９Ｍに示されている。ブスルファン処理後１ヶ月で精細管の大部分が内因性の精子形成を激減させた（図９Ｎ）。新鮮分離したＯｃｔ‐４＋細胞を移植したマウスの精巣が精細管断面図の５０％を超えて精子形成を示したことは、この集団内におけるＳＳＣ特性を備える細胞の存在を示唆している（図９Ｏ）。Ｏｃｔ‐４＋／ｃ‐Ｋｉｔ−細胞を移植したマウスの輸精管の８０％よりも多くが、ある程度の精子形成を示した（図９Ｐ）一方で、Ｏｃｔ‐４＋／ｃ‐Ｋｉｔ＋細胞を供与されたマウスの管横断面の大部分は空だった（図９Ｑ）。また、移植されたｍＧＣが受容精巣を再配置できなかったのは、それらがＳＳＣ特性を備えてないことを示唆する（図９Ｒ）。スケールバー：図９Ａおよび９Ｋ：２７５μｍ；図９Ｂ、９Ｄおよび９Ｉ：６０μｍ；図９Ｃ：１４０μｍ；図９Ｅ：１００μｍ；図９Ｆ：５０μｍ；図９Ｇおよび９Ｌ：１２５μｍ；図９Ｈおよび９Ｊ：４０μｍ；図９Ｍ‐９Ｒ：６０μｍ。
【図１０】図１０は、胚盤胞および宿主の胚へのｍＧＣの組み込み後のキメラ形成を示す。初期の胚発生および胚盤胞形成でのＬａｃＺ‐ＧＦＰ＋のｍＧＣ細胞の組み込みが図１０Ａ−１０Ｄに示されている。８細胞期で注入されたＧＦＰ−ｌａｃＺ細胞のほとんどは、胚発生の２日目に組み込まれ（矢じり）、一部の細胞は、まだ組み込まれてなかった（矢印）。ＧＦＰ＋細胞は、胚盤胞の内細胞塊（矢印）に３．５日目に組み込まれたことがさらにわかった。キメラ現象の異なる段階を示す４種のキメラ胚の例が、全胚染色によって図１０Ｅに示されている。内部器官を可視化するために、２つの胚（アスタリスクで表示された）の矢状断面も示されている（図１０Ｆおよび１０Ｇ）。図１０Ｈ‐１０Ｋは、分離された器官におけるキメラのパターンを示し、図１０Ｌ‐１０Ｏは、脳、心臓、肝臓および生殖隆起の組織切片におけるキメラ細胞集団を示す（キメラＬａｃＺ‐ＧＦＰ細胞は青で現れる）。スケールバー：図１０Ａおよび１０Ｃ：５０μｍ；図１０Ｂおよび１０Ｄ：２５μｍ；図１０Ｅ‐１０Ｄ：１２５０μｍ；図１０Ｈ‐１０Ｋ：６２５μｍ；図１０Ｌ‐１０Ｎ：５０μｍ；図１０Ｏ：１０μｍ。
【図１０Ｐ】キメラである子の組織におけるＧＦＰおよびＬａｃＺのＤＮＡの増幅が、それぞれ図１０Ｐおよび１０Ｑに示されている。
【図１０Ｑ】キメラである子の組織におけるＧＦＰおよびＬａｃＺのＤＮＡの増幅が、それぞれ図１０Ｐおよび１０Ｑに示されている。
【図１１Ａ】図１１は、遺伝子組換えＯＧ２マウスから新鮮分離した新生児および成体の卵巣細胞の結果をフローサイトメトリープロット図で示し、ここでそのＯｃｔ‐４プロモータはＧＦＰの発現を促進する。図１１Ａは、成体の卵巣の生殖系列幹細胞を示し、ＧＦＰの蛍光強度で図示される。
【図１１Ｂ】図１１は、遺伝子組換えＯＧ２マウスから新鮮分離した新生児および成体の卵巣細胞の結果をフローサイトメトリープロット図で示し、ここでそのＯｃｔ‐４プロモータはＧＦＰの発現を促進する。図１１Ｂは、新生児の卵巣の生殖系列幹細胞を示し、ＧＦＰの蛍光強度で図示される（ＧＦＰ＋細胞におけるｃ‐Ｋｉｔのレベル）。
【図１１Ｃ】図１１は、遺伝子組換えＯＧ２マウスから新鮮分離した新生児および成体の卵巣細胞の結果をフローサイトメトリープロット図で示し、ここでそのＯｃｔ‐４プロモータはＧＦＰの発現を促進する。図１１Ｃは、ＣＤ‐１１７としても知られるｃ‐Ｋｉｔを発現している新生児のＧＦＰ＋細胞の蛍光強度を図で示したものである。
【図１２Ａ】図１２は、生後２日目の遺伝子組換えＯＧ２マウスの卵巣における緑色蛍光タンパク質の発現によって確認できる生殖系列幹細胞を示す。図１２Ａおよび１２Ｂは、全蛍光を示し、図１２Ｃは、コンピュータで増強した、自己蛍光を除いた横断面画像を示す。
【図１２Ｂ】生後２日目の遺伝子組換えＯＧ２マウスの卵巣における緑色蛍光タンパク質の発現によって確認できる生殖系列幹細胞を示す。
【図１２Ｃ】後２日目の遺伝子組換えＯＧ２マウスの卵巣における緑色蛍光タンパク質の発現によって確認できる生殖系列幹細胞を示す。図１２Ｃは、コンピュータで増強した、自己蛍光を除いた横断面画像を示す。
【図１３】図１３は、ＯＧ２遺伝子組換えマウスから単離されたマウス胚幹細胞（レーン３）、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ、レーン４）、ＧＦＰ＋生殖系列幹細胞（レーン５）およびＧＦＰ−細胞（レーン６）から得られたｍＲＮＡのＲＴ‐ＰＣＲ解析の結果を示す。
【図１４Ａ】図１４は、単離され、十分に精製され、ＭＥＦ細胞の支持細胞層でコロニーとして確立され、成長した卵巣生殖系列幹細胞の顕微鏡画像を示す。図１４Ａは、培養４日後のコロニーを示す。
【図１４Ｂ】単離され、十分に精製され、ＭＥＦ細胞の支持細胞層でコロニーとして確立され、成長した卵巣生殖系列幹細胞の顕微鏡画像を示す。図１４Ｂは、典型となるコロニーの形態の第１のタイプを示す。
【図１４Ｃ】単離され、十分に精製され、ＭＥＦ細胞の支持細胞層でコロニーとして確立され、成長した卵巣生殖系列幹細胞の顕微鏡画像を示す。図１４Ｃは、典型となるコロニーの形態の第２のタイプを示す。
【図１４Ｄ】単離され、十分に精製され、ＭＥＦ細胞の支持細胞層でコロニーとして確立され、成長した卵巣生殖系列幹細胞の顕微鏡画像を示す。図１４Ｄは、コラゲナーゼで継代した後のコロニーの形態を示す。
【図１４Ｅ】単離され、十分に精製され、ＭＥＦ細胞の支持細胞層でコロニーとして確立され、成長した卵巣生殖系列幹細胞の顕微鏡画像を示す。図１４Ｅは、コラゲナーゼで継代した後の典型となるコロニーの形態の第３のタイプを示し、はっきりと明確な境界を有する。
【図１４Ｆ】単離され、十分に精製され、ＭＥＦ細胞の支持細胞層でコロニーとして確立され、成長した卵巣生殖系列幹細胞の顕微鏡画像を示す。図１４Ｆは、コラゲナーゼで継代した後の典型となるコロニーの形態の第４のタイプを示し、不明瞭な境界を有する。
【図１４Ｇ】単離され、十分に精製され、ＭＥＦ細胞の支持細胞層でコロニーとして確立され、成長した卵巣生殖系列幹細胞の顕微鏡画像を示す。図１４Ｇは、継代＃１の後のコロニーの形態を示す。
【図１４Ｈ】単離され、十分に精製され、ＭＥＦ細胞の支持細胞層でコロニーとして確立され、成長した卵巣生殖系列幹細胞の顕微鏡画像を示す。図１４Ｈは、継代＃２の後のコロニーの形態を示す。
【図１４Ｉ】単離され、十分に精製され、ＭＥＦ細胞の支持細胞層でコロニーとして確立され、成長した卵巣生殖系列幹細胞の顕微鏡画像を示す。図１４Ｉは、継代＃３の後のコロニーの形態を示す。
【図１４Ｊ】単離され、十分に精製され、ＭＥＦ細胞の支持細胞層でコロニーとして確立され、成長した卵巣生殖系列幹細胞の顕微鏡画像を示す。図１４Ｊおよび１４Ｋは、継代＃４の後の卵巣生殖系列幹細胞のコロニーの異なる２つの拡大図を示す。
【図１４Ｋ】単離され、十分に精製され、ＭＥＦ細胞の支持細胞層でコロニーとして確立され、成長した卵巣生殖系列幹細胞の顕微鏡画像を示す。図１４Ｊおよび１４Ｋは、継代＃４の後の卵巣生殖系列幹細胞のコロニーの異なる２つの拡大図を示す。
【図１５Ａ】図１５は、単離され、十分に精製された卵巣生殖系列幹細胞の免疫細胞化学的染色を示し、卵巣生殖系列幹細胞は、多能性の幹細胞マーカーのＯｃｔ‐４（図１５Ａ）；多能性の幹細胞マーカーのＮａｎｏｇ（図１５Ｂ）；生殖細胞マーカーのＶＡＳＡ（図１５Ｃ）；および多能性の幹細胞マーカーのアルカリホスファターゼ（図１５Ｄ）の発現を明らかにするために染色された。
【図１５Ｂ】単離され、十分に精製された卵巣生殖系列幹細胞の免疫細胞化学的染色を示す。
【図１５Ｃ】単離され、十分に精製された卵巣生殖系列幹細胞の免疫細胞化学的染色を示す。
【図１５Ｄ】単離され、十分に精製された卵巣生殖系列幹細胞の免疫細胞化学的染色を示す。
【図１６Ａ】図１６は、分化している卵巣生殖系列幹細胞の画像を示す。図１６Ａは、初期の卵母細胞に似ていて、雌の生殖細胞コロニーの中央で成長するＧＦＰ＋細胞を示す。図１６は、着色コロニーを示す。
【図１６Ｂ】分化している卵巣生殖系列幹細胞の画像を示す。図１６Ｂは、卵胞様の構造の画像を示す。
【図１６Ｃ】分化している卵巣生殖系列幹細胞の画像を示す。図１６Ｃは、初期の卵母細胞に似ていて、雌の生殖細胞コロニー付近で成長するＧＦＰ＋細胞を示す。
【図１６Ｄ】分化している卵巣生殖系列幹細胞の画像を示す。
【図１７Ａ】図１７は、図１６の培養された卵巣細胞のフローサイトメトリーによる大きさ解析の結果を散布図で示し、大きい（＞１５μｍ）卵母細胞様の細胞を確認し、特徴付ける。図１７Ａは、ＭＥＦ対照細胞（＜１５μｍ）を示し、図１７Ｂは、図１６の卵母細胞様の細胞を示す。
【図１７Ｂ】図１６の培養された卵巣細胞のフローサイトメトリーによる大きさ解析の結果を散布図で示し、大きい（＞１５μｍ）卵母細胞様の細胞を確認し、特徴付ける。
【図１８】図１８は、成体の霊長類の精巣における精原幹細胞および生殖系列細胞のマーカーの免疫組織化学的な局在を示す。
【図１９】図１９は、霊長類の精巣内の精細管の基底膜における幹細胞のマーカーで陽性に染色された細胞の分布を示す。
【図２０】図２０は、フローサイトメトリーを用いた霊長類の生殖系列幹細胞の表現型の特性を示す図である。
【図２１Ａ】図２１は、霊長類の生殖系列幹細胞のフローサイトメトリー解析を示す。
【図２１Ｂ】霊長類の生殖系列幹細胞のフローサイトメトリー解析を示す。
【図２１Ｃ】霊長類の生殖系列幹細胞のフローサイトメトリー解析を示す。
【図２２】図２２は、様々な強化された霊長類の生殖系列細胞集団におけるＧＦＲα＋／ＶＡＳＡ＋細胞を示す。
【図２３】図２３は、霊長類の生殖系列幹細胞の分集団におけるカルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル（ＣＳＦＥ）活性を示す。
【図２４】図２４は、霊長類の生殖系列幹細胞を伴うブスルファン処理した霊長類の精巣の再配置を示す。選別されていない細胞（図２４Ａ）；３種のマーカーで選別された細胞（図２４Ｂ）；ＳＳＥＡ‐４＋で選別された細胞（図２４Ｃ）を移植された；および対照の精巣を偽移植（図２４Ｄ）された受容マウスの精細管である。
【図２５】図２５は、フローサイトメトリーによって決定された、霊長類の生殖系列幹細胞におけるプロピジウムヨウ素で染色された集団のＤＮＡ含有量を示す。
【図２６Ａ】図２６は、霊長類の生殖系列幹細胞におけるＰＬＺＦ発現（図２６Ａ）の定量ＰＣＲ解析およびテロメラーゼ活性（図２６Ｂ）を示す。
【図２６Ｂ】霊長類の生殖系列幹細胞におけるＰＬＺＦ発現（図２６Ａ）の定量ＰＣＲ解析およびテロメラーゼ活性（図２６Ｂ）を示す。
【図２７】図２７は、増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）によって決定された増殖している霊長類の生殖系列幹細胞の割合を示す。
【図２８】図２８は、霊長類の生殖系列幹細胞の分集団の遺伝子発現プロファイルを示す。
【図２９Ａ】図２９は、ＭＥＦ支持細胞層における培養１０日後の拡張された霊長類の生殖系列幹細胞コロニーの形態（図２９Ａ）；拡張された霊長類の生殖系列幹細胞コロニーのＳＳＥＡ‐４染色（図２９ＢおよびＣ）；および４回継代後の拡張された霊長類の生殖系列幹細胞コロニーのＧＦＲ‐α染色（図２９Ｄ）を示す。
【図２９Ｂ】ＭＥＦ支持細胞層における培養１０日後の拡張された霊長類の生殖系列幹細胞コロニーの形態（図２９Ａ）；拡張された霊長類の生殖系列幹細胞コロニーのＳＳＥＡ‐４染色（図２９ＢおよびＣ）；および４回継代後の拡張された霊長類の生殖系列幹細胞コロニーのＧＦＲ‐α染色（図２９Ｄ）を示す。
【図２９Ｃ】ＭＥＦ支持細胞層における培養１０日後の拡張された霊長類の生殖系列幹細胞コロニーの形態（図２９Ａ）；拡張された霊長類の生殖系列幹細胞コロニーのＳＳＥＡ‐４染色（図２９ＢおよびＣ）；および４回継代後の拡張された霊長類の生殖系列幹細胞コロニーのＧＦＲ‐α染色（図２９Ｄ）を示す。
【図２９Ｄ】ＭＥＦ支持細胞層における培養１０日後の拡張された霊長類の生殖系列幹細胞コロニーの形態（図２９Ａ）；拡張された霊長類の生殖系列幹細胞コロニーのＳＳＥＡ‐４染色（図２９ＢおよびＣ）；および４回継代後の拡張された霊長類の生殖系列幹細胞コロニーのＧＦＲ‐α染色（図２９Ｄ）を示す。
【図３０Ａ】図３０は、ＳＳＥＡ‐４（図３０Ａ）およびＶＡＳＡ（図３０Ｂ）で染色されたヒトの精巣組織ＴＨＴを示す。
【図３０Ｂ】ＳＳＥＡ‐４（図３０Ａ）およびＶＡＳＡ（図３０Ｂ）で染色されたヒトの精巣組織ＴＨＴを示す。
【図３１Ａ】図３１は、ＧＦＲ‐α（図３１Ａ）およびＶＡＳＡ（図３１Ｂ）で染色されたＴＨＴを示す。
【図３１Ｂ】ＧＦＲ‐α（図３１Ａ）およびＶＡＳＡ（図３１Ｂ）で染色されたＴＨＴを示す。
【図３２Ａ】図３２は、ＶＡＳＡ（図３２Ａ）およびＮａｎｏｎｇ（図３２Ｂ）で染色されたＴＨＴを示す。
【図３２Ｂ】ＶＡＳＡ（図３２Ａ）およびＮａｎｏｎｇ（図３２Ｂ）で染色されたＴＨＴを示す。
【図３３Ａ】図３３は、ＳＳＥＡ‐４（図３３Ａ）およびα６‐インテグリン（図３３Ｂ）で染色されたＴＨＴを示す。
【図３３Ｂ】ＳＳＥＡ‐４（図３３Ａ）およびα６‐インテグリン（図３３Ｂ）で染色されたＴＨＴを示す。
【図３４Ａ】図３４は、２次抗体のみで染色したヒトの精巣切片から構成される、図３０‐３３に対する陰性対照を示す。
【図３４Ｂ】２次抗体のみで染色したヒトの精巣切片から構成される、図３０‐３３に対する陰性対照を示す。
【図３５Ａ】図３５は、ブスルファン処理された受容マウスの精巣に移植され、かつ、１ヶ月後にＳＳＥＡ‐４（図３５Ａ）およびヒト核タンパク質（図３５Ｂ）で染色された、ＴＨＴ  ＳＳＥＡ‐４＋電磁粒子で選別された細胞を示す。
【図３５Ｂ】ブスルファン処理された受容マウスの精巣に移植され、かつ、１ヶ月後にＳＳＥＡ‐４（図３５Ａ）およびヒト核タンパク質（図３５Ｂ）で染色された、ＴＨＴ  ＳＳＥＡ‐４＋電磁粒子で選別された細胞を示す。
【図３６Ａ】図３６は、ブスルファン処理された受容マウスの精巣に移植され、かつ、１ヶ月後にα６‐インテグリン（図３６Ａ）およびヒト核タンパク質（図３６Ｂ）で染色された、ＴＨＴ  ＳＳＥＡ‐４＋電磁粒子で選別された細胞を示す。
【図３６Ｂ】ブスルファン処理された受容マウスの精巣に移植され、かつ、１ヶ月後にα６‐インテグリン（図３６Ａ）およびヒト核タンパク質（図３６Ｂ）で染色された、ＴＨＴ  ＳＳＥＡ‐４＋電磁粒子で選別された細胞を示す。
【図３７Ａ】図３７は、ブスルファン処理された受容マウスの精巣に移植され、かつ、１ヶ月後にＳＳＥＡ‐４（図３７Ａ）およびα６‐インテグリン（図３７Ｂ）で染色された、ＴＨＴ  ＳＳＥＡ‐４＋電磁粒子で選別された細胞を示す。
【図３７Ｂ】ブスルファン処理された受容マウスの精巣に移植され、かつ、１ヶ月後にＳＳＥＡ‐４（図３７Ａ）およびα６‐インテグリン（図３７Ｂ）で染色された、ＴＨＴ  ＳＳＥＡ‐４＋電磁粒子で選別された細胞を示す。
【図３８Ａ】図３８は、２次抗体のみで染色したヒト精巣切片から構成される、図３６および３７に対する陰性対照を示す。
【図３８Ｂ】２次抗体のみで染色したヒト精巣切片から構成される、図３６および３７に対する陰性対照を示す。
【図３９Ａ】図３９は、成人の精巣細胞の形態および細胞表面マーカーを示す。閉塞性無精子症の男性由来の精巣（図３９Ａ）の形態が、通常のヒト精巣（図３９Ｂ）と類似することに注目されたい。また、単離後には、類似する形態を有する細胞が通常の精巣（図３９Ｃ）および無精子症患者（図３９Ｄ）から収集した精巣両方から得られた。両方の精巣分離株にＳＳＣが存在し、大きな核細胞質比、１‐３個の核小体および細胞質内封入体をもつ円形細胞として同定されたことに注目されたい。成人の精巣から単離された細胞における表面マーカーであるＳＳＥＡ‐４、ＣＤ４９ｆおよびＣＤ９０のフローサイトメトリー解析である（図３９Ｅ‐Ｈ）。ＳＳＥＡ‐４＋、ＣＤ４９ｆ＋およびＣＤ９０＋細胞の異なる集団が成人精巣の生検にみられ、ＣＤ４９ｆおよびＣＤ９０のどちらにも染色された細胞の集団は、成人の精巣にはなかった（図３９Ｅ‐Ｆ）。
【図３９Ｂ】成人の精巣細胞の形態および細胞表面マーカーを示す。
【図３９Ｃ】成人の精巣細胞の形態および細胞表面マーカーを示す。
【図３９Ｄ】成人の精巣細胞の形態および細胞表面マーカーを示す。
【図３９Ｅ】成人の精巣細胞の形態および細胞表面マーカーを示す。
【図３９Ｆ】成人の精巣細胞の形態および細胞表面マーカーを示す。
【図３９Ｇ】成人の精巣細胞の形態および細胞表面マーカーを示す。
【図３９Ｈ】成人の精巣細胞の形態および細胞表面マーカーを示す。
【図３９Ｉ】４つの独立したフロー解析のヒストグラム表現が図３９Ｉに示されている。
【図４０】図４０は、成人の精巣における精原幹細胞マーカーの免疫組織化学的な局在を示す。精細管の基底膜にＳＳＥＡ‐４およびＣＤ４９ｆの共局在（図４０Ａ‐Ｃ）がある。ＳＳＥＡ‐４は、精細管、おそらくＳＳＣの基底膜における精原細胞の分集団に特に局在する。ＳＳＥＡ‐４＋の細胞の全ては、ＣＤ４９ｆに対しても陽性であったが、ＳＳＥＡ‐４−であるＣＤ４９ｆ＋の細胞がいくつかあった。ｃ‐Ｋｉｔは、精細管の基底膜に存在する細胞および進行した生殖細胞の両方にみられた（図４０Ｅ‐Ｆ）。ＳＳＥＡ‐４およびｃ‐Ｋｉｔの共局在は、ＳＳＥＡ‐４＋の細胞の一部はｃ‐Ｋｉｔを有し、一部はｃ‐Ｋｉｔ−であることを示唆する。ＣＤ４９ｆとｃ‐Ｋｉｔの共局在（図４０Ｇ‐Ｉ）は、管の横断面の基底膜における大部分のＣＤ４９ｆ＋の細胞がｃ‐Ｋｉｔに対しても陽性に染色されたことを示した。成人の精巣におけるＮａｎｏｇの発現パターンは、ｃ‐Ｋｉｔに似ており、未分化および分化した生殖細胞療法に存在した（図４４Ｋ‐Ｌ）。ＳＳＥＡ‐４とＮａｎｏｇの共局在は、成人の精巣におけるＳＳＥＡ‐４＋の細胞の一部は、Ｎａｎｏｇ＋であることを示した。
【図４１Ａ】図４１は、成人の精巣から単離されたＳＳＣの濃縮された集団の定量ＰＣＲ解析およびテロメラーゼ活性を示す。ＳＳＥＡ‐４＋細胞は、ＧＦＲ‐α１、Ｃ‐Ｒｅｔ、ＧＰＲ‐１２５およびｈＴＥＲＴを含むＳＳＣ特異的な遺伝子の有意に（Ｐ＜０．０５）高い発現レベルを示した（図４１Ａ）。さらに、ｃ‐Ｋｉｔは、陰性の細胞と比較してＳＳＡ−４＋細胞で著しく増加した。
【図４１Ｂ】成人の精巣から単離されたＳＳＣの濃縮された集団の定量ＰＣＲ解析およびテロメラーゼ活性を示す。ＳＳＥＡ‐４＋細胞のテロメラーゼ活性も、新鮮分離された選別されてない細胞より有意に（Ｐ＜０．０１）高かった（図４１Ｂ）。
【図４２】図４２は、マウスの精巣に再配置しているヒト精原幹細胞における特異的マーカーの発現を示す。マウスの精巣におけるヒト細胞の同一性は、ヒト核タンパク質（ＨＮＰ）抗体で検出された（図４２Ａ）。マウスの精巣に定着した全てのヒトの細胞は、生殖細胞に特異的なマーカーであるＶＡＳＡに対して陽性に染色されることに注目されたい（図４２ＢおよびＣ）。マウスの精巣の基底膜におけるヒトの細胞の一部はＣＤ４９ｆと共局在し、一部はこのマーカーに対して陰性であった（図４２Ｄ‐Ｆ）。ｃ‐ＫｉｔとのＳＳＥＡ‐４の共局在は、マウスの精巣における全てのＳＳＥＡ‐４＋細胞がｃ‐Ｋｉｔを発現することを示した（図４２Ｇ‐Ｉ）。マウスの精巣に定着したヒト細胞の中には、一部がＧＰＲ‐１２５と共局在し、一部が多能性マーカーであるＮａｎｏｇに対して陽性に染色された（図４２Ｊ‐Ｌ）。ｃ‐ＫｉｔとのＨＮＰの共局在は、マウスの精巣における全てのヒトの細胞がｃ‐Ｋｉｔ＋であることを明らかにした（図４２Ｍ‐Ｏ）。
【図４３】図４３は、ヒトの精原幹細胞を特徴付けるために用いられるフローサイトメトリーによる細胞表面マーカーの発現パターンを示す。ＧＦＲ‐α１、ＣＤ２４、ＣＤ１１７およびＣＤ１６６を発現している成人の精巣で見られる微かな細胞（１‐２％）が存在した。ＢＣＲＰ、ＣＤ２９、ＭＨＣIおよびＭＨＣIIは成人の精巣細胞で中程度に（２‐５％）発現した。ＣＤ９０、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ３４およびＳＳＥＡ‐４は成人の精巣から単離された細胞の表面に豊富にみられた。値は、陽性細胞の実際の量から全ての自己蛍光分を引いたものを表す。
【図４４Ａ】図４４は、光学顕微鏡による（図４４ＡおよびＦ）、Ｈ＆Ｅ染色（図４４ＢおよびＤ）、ＤＡＰＩ染色（図４４Ｃ）、およびＰＮＡ染色（図４４Ｅ）を伴う宿主外で成熟した精巣細胞を示す。
【図４４Ｂ】光学顕微鏡による（図４４ＡおよびＦ）、Ｈ＆Ｅ染色（図４４ＢおよびＤ）、ＤＡＰＩ染色（図４４Ｃ）、およびＰＮＡ染色（図４４Ｅ）を伴う宿主外で成熟した精巣細胞を示す。
【図４４Ｃ】光学顕微鏡による（図４４ＡおよびＦ）、Ｈ＆Ｅ染色（図４４ＢおよびＤ）、ＤＡＰＩ染色（図４４Ｃ）、およびＰＮＡ染色（図４４Ｅ）を伴う宿主外で成熟した精巣細胞を示す。
【図４４Ｄ】光学顕微鏡による（図４４ＡおよびＦ）、Ｈ＆Ｅ染色（図４４ＢおよびＤ）、ＤＡＰＩ染色（図４４Ｃ）、およびＰＮＡ染色（図４４Ｅ）を伴う宿主外で成熟した精巣細胞を示す。
【図４４Ｅ】光学顕微鏡による（図４４ＡおよびＦ）、Ｈ＆Ｅ染色（図４４ＢおよびＤ）、ＤＡＰＩ染色（図４４Ｃ）、およびＰＮＡ染色（図４４Ｅ）を伴う宿主外で成熟した精巣細胞を示す。
【図４４Ｆ】光学顕微鏡による（図４４ＡおよびＦ）、Ｈ＆Ｅ染色（図４４ＢおよびＤ）、ＤＡＰＩ染色（図４４Ｃ）、およびＰＮＡ染色（図４４Ｅ）を伴う宿主外で成熟した精巣細胞を示す。
【図４４Ｇ】図４４Ｇは、培養２２日目におけるマウスの精巣細胞、マウスの精子および宿主外で成熟した細胞のフローサイトメトリーを示す。
【図４５Ａ】図４５は、雄の生殖系列幹細胞の移植の結果として妊娠されたヌードの子孫の平均体重を示す。図４５Ａは、ヌードの子孫を示し、図４５Ｂは、非ヌードの子孫を示す。
【図４５Ｂ】雄の生殖系列幹細胞の移植の結果として妊娠されたヌードの子孫の平均体重を示す。
【図４６Ａ】図４６は、不妊のマウスの右（図４６Ａ）および左（図４６Ｂ）の精巣内のＧＦＰ＋精子と管のフローサイトメトリー解析を示す。
【図４６Ｂ】図４６は、不妊のマウスの右（図４６Ａ）および左（図４６Ｂ）の精巣内のＧＦＰ＋精子と管のフローサイトメトリー解析を示す。
【図４７】図４７は、宿主外で成熟した細胞を、精子細胞の大きさと形態で示す。
【図４８】図４８は、宿主外で成熟され、精子に成熟した精巣細胞を示す。
【図４９Ａ】図４９は、宿主外で成熟された精子と正常な卵子（図４９Ａ）とから形成された受精卵の生体外での受精培養およびそれから産生された胚（図４９Ｂ）を示す。
【図４９Ｂ】図４９は、宿主外で成熟された精子と正常な卵子（図４９Ａ）とから形成された受精卵の生体外での受精培養およびそれから産生された胚（図４９Ｂ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（用語の定義）
以下の用語の定義は、読者にとって有用な参考として提供される。本明細書で使われる用語は、本発明に関連する場合に特別な意味を持つ。用語を使うためにそれらの通常かつ共通の意味に準じて、あらゆる努力がなされてきた。しかし、共通の通常の意味と以下の定義との間に矛盾が存在する場合には、それら定義が共通の使われ方に優先する。
【００１９】
関係づけられた：ここで用いられた場合、「関係づけられた」は、特異的な機能に不変に関係づけられると考えられる細胞を意味する。また、関係づけられた細胞は、“最終分化した細胞”を意味する。
【００２０】
培養：ここで用いられた場合、「培養」または「培養された」は、細胞分裂および細胞数の増加が起きるように調整された条件下での細胞の増殖を意味する。
【００２１】
分化：ここで用いられた場合、「分化」は、細胞がある形状または機能に適合することを意味する。細胞では、分化はさらに関係づけられた細胞をもたらす。
【００２２】
胚幹細胞：ここで用いられた場合、「胚幹細胞」は、全能性かつ成長中の胚であって、子宮壁に付着するまでの発生段階に達したものに由来するあらゆる細胞を意味する。本明細書では、胚幹細胞と前胚幹細胞とは同等の用語である。胚幹細胞様（ＥＳＣ様）細胞は、全能性細胞であって、胚から直接単離されたものではない。ＥＳＣ様細胞は、単離され、増殖された始原性細胞から派生し得る。
【００２３】
宿主外：ここで用いられた場合、「宿主外」は、ドナーの体外での生殖系列細胞の成熟を意味する。本開示の目的において、宿主外での成熟は、ドナーの生殖系列細胞の生体外、生体外および生体内（ドナー以外の他のヒトまたはその他の種）での成熟を含む。
【００２４】
増殖された：ここで用いられた場合、「増殖された」は、元の濃度から細胞数が増加する細胞の成長培養を意味する。
【００２５】
胎児幹細胞：ここで用いられた場合、「胎児幹細胞」は、多分化能、かつもはや初期または中期段階の器官形成ではない成長中の多細胞胎児由来の細胞を意味する。
【００２６】
配偶子：ここで用いられた場合、「配偶子」は、完全なヒトを形成するために必要な遺伝物質の半分を含む生殖細胞を意味する。受精の間、雄および雌の配偶子は（それぞれ精子と卵子）、融合し、受精卵を産生する。
【００２７】
生殖細胞：ここで用いられた場合、「生殖細胞」、「生殖系列細胞」または「生殖系列組織」は、精母細胞もしくは卵母細胞のような生殖細胞、または生殖細胞もしくはそのような細胞を含む組織に成長する細胞を意味する。
【００２８】
生殖系列前駆細胞：ここで用いられた場合、「生殖系列前駆細胞」は、精原幹細胞の前駆体または卵母前駆幹細胞のような生殖細胞を意味する。
【００２９】
生殖系列幹細胞：ここで用いられた場合、「生殖系列幹細胞」は、精原幹細胞（ＳＳＣ）または卵母前駆幹細胞のような生殖細胞を意味する。
【００３０】
生殖腺：ここで用いられた場合、「生殖腺」は、生殖細胞（配偶子）を産生する、動物のあらゆる対器官を意味する。これらは、卵子を産生する雌の卵巣、精子を産生する雄の精巣を含む。
【００３１】
未成熟な：ここで用いられた場合、用語「未成熟な」は、成熟し、機能的に分化した状態に達していない生殖系列細胞を意味する。
【００３２】
長期培養：ここで用いられた場合、「長期培養」は、少なくとも２ヶ月より長く、または１０継代を超えての調整された条件下での細胞の増殖を意味する。好ましくは、長期培養は、４ヶ月を超えて、６ヶ月を超えて、または１年を超えて培養される。好ましくは、長期培養は、１５継代を超えて、１８継代を超えて、または２０継代を超えて継代されることである。長期培養の継続時間は、個々の細胞にかなり依存しており、細胞株によってばらつきがある。
【００３３】
成熟：ここで用いられた場合、「成熟」は、最終分化した細胞タイプに導く協調的な生化学ステップの過程を意味する。
【００３４】
多分化能の：ここで用いられた場合、「多分化能の」は、数種の他の細胞タイプを生じさせることができるがそれら細胞タイプの数が有限である細胞を意味する。多分化能の細胞の例は、造血細胞‐数種類の血液細胞に成長し得るが脳細胞には成長し得ない血液幹細胞である。
【００３５】
多分化能の成熟前駆細胞：ここで用いられた場合、「多分化能の成熟前駆細胞」は、骨髄から単離された多分化能の細胞を意味し、当該細胞は外胚葉、中胚葉および内胚葉系統の細胞に分化することができる。
【００３６】
多能性の：ここで用いられた場合、「多能性の」は、胎盤のまたはその他子宮を支持する細胞を除くあらゆる細胞タイプを生じさせることができる細胞を意味する。
【００３７】
出生後幹細胞：ここで用いられた場合、「出生後幹細胞」は、出生後の多細胞生物由来のあらゆる細胞を意味する。
【００３８】
思春期前の：ここで用いられた場合、「思春期前の（ｐｒｅ−ｐｕｂｅｓｃｅｎｔ）」または「思春期前の（ｐｒｅ−ｐｕｂｅｒｔａｌ）」は、思春期に入っていない個体を意味する。思春期の始まりは、高いゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）パルスに関連し、性ホルモン、黄体形成ホルモン（ＬＨ）および卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の増加に先行する。思春期は、少女では４７ｋｇ前後、少年では５５ｋｇ前後で常に始まる。正常な年齢の幅は広いが、平均して、少女は少年よりも約１‐２年早く思春期の進行が始まり（平均年齢は少女で９‐１４歳および少年で１０‐１７歳）、少女のほうがより短い時間で完了し、通常１７歳までに思春期が終わる。
【００３９】
始原生殖細胞：ここで用いられた場合、「始原生殖細胞」（ＰＧＣ）は、初期の胚形成に存在する細胞を意味し、該細胞は生殖細胞になることが決まっている。
【００４０】
始原生殖系列性幹細胞：ここで用いられた場合、「始原生殖系列性幹細胞」は、「生殖系列性細胞」、略してＰＧＬＳＣと言われることもあり、成体の雄または雌の生殖組織由来の細胞であって、例えば放射線または化学治療後に不妊の精巣または卵巣組織を生殖可能に再定着できることからも分かるように、生殖系列幹細胞およびそれらの子孫を発生することができる細胞を意味する。生殖系列性細胞は、成体の生殖組織で休眠または活発に分裂できる。
【００４１】
再プログラミング：ここで用いられた場合、「再プログラミング」は、細胞の遺伝的プログラムのリセットを意味し、当該細胞は多能性を示し、完全に成長した生物を産生する能力を有する。加えて、この再プログラミングは、再プログラミング前の状態では通常細胞で発現してない、またはみられない再プログラミング特性を細胞に与える。
【００４２】
選択：ここで用いられた場合、「選択」は、蛍光活性化細胞選別、電磁粒子選別または所定のマーカーのプロファイルを有する細胞を収集する他の手段を意味する。
【００４３】
性細胞：ここで用いられた場合、「性細胞」は、哺乳類の雄または雌の生殖組織由来の２倍体または半数体を意味する。これらの細胞の代表例は、雄の原生殖細胞、雌の原生殖細胞、卵原細胞、Ａ型精原細胞およびＢ型精原細胞を含む。
【００４４】
体細胞：ここで用いられた場合、「体細胞」は、性細胞およびそれらの前駆体を除く体内のあらゆる組織細胞を意味する。
【００４５】
体性幹細胞：ここで用いられた場合、「体性幹細胞」は、２倍体の多分化能のまたは多能性幹細胞を意味する。体性幹細胞は、全能性幹細胞ではない。
【００４６】
幹細胞：ここで用いられた場合、「幹細胞」は、自己再生（細胞分裂の多くのサイクルを経過できる一方、未分化状態および少なくとも多分化能（１種より多くの特殊な細胞タイプに分化する能力）であることを維持する）できる細胞を意味する。
【００４７】
十分に純粋な：ここで用いられた場合、「十分に純粋な」は、７５％より多く、８５％より多く、９０％より多く、９５％より多く、９８％より多く、または９９％より多くの細胞が、要求される特性を有する細胞の集団を意味する。
【００４８】
全能性：ここで用いられた場合、「全能性」は、体に加えて胎盤の細胞全てを形成するために必要な遺伝情報の全てを含む細胞を意味する。ヒトの細胞は、受精卵の最初の数回の分裂の間に限って全能性となる能力を有する。
【００４９】
本開示は、雄および雌由来の生殖系列幹細胞の宿主外での成熟のため、および例えば、腫瘍細胞の再取り込みの恐れがあるような、自身の体内における生体内の生殖細胞を成熟できない個体における生殖能力または受精の可能性の回復のための方法を提供する。
【００５０】
骨髄幹細胞移植を施行する前に、癌および他の悪性でない疾患（これらに限定されないが、鎌状赤血球貧血および地中海貧血等）の治療で行われる化学治療および放射線治療がよく知られており、これらの治療を受けている患者の生殖能力に有害な影響を及ぼす。これらの治療は、患者の生殖能力を永久に損ない、患者が不妊になる危険性は３０％である。
【００５１】
生殖系列細胞の保存方法に関連する方法が、同時係属出願ｘｘ／ｘｘｘ，ｘｘｘに開示され、該出願は、タイトルが“生殖系列幹細胞の保存システム”（代理人明細書第１９５１３１４−０００６１）であって、本願とともに同日付けで出願され、その全体をここで参照することで本明細書に援用される。
【００５２】
男性における不妊のリスク
思春期前の患者由来の精巣の生殖腺組織および／または生殖系列幹細胞を保存し、後に、これらの細胞を宿主外で成熟し、その患者の生殖能力を回復することが望ましい。
【００５３】
男性において組織および生殖系列幹細胞の保存が求められる疾患または状態は、これらには限定されないが、両側停留精巣、精巣捻転、停留精巣、精索静脈瘤、生殖器および非生殖器癌を含む癌、細胞傷害性療法、骨随移植を含む。１つの実施の形態では、ドナーは、思春期前の男性である。他の実施の形態では、ドナーは、思春期後の男性である。
【００５４】
成人患者に対して、治療前の予防段階は生体外受精のために精子を凍らせること、または他の補助的な生殖技術の選択であり、その患者は治療後に不妊になるだろう。化学／放射線治療の時点で成熟精子を発達させていない思春期前の患者にとって、組織又は細胞の保存の他に選択肢はない。本発明者による本方法の発明以前には、思春期前の男性患者の生殖能力を維持するためにふさわしい選択肢はない。生殖能力を保存するための精原幹細胞の抽出および低温保存は、多くの研究の主題である。さらに、低温保存した卵巣組織（単個細胞の懸濁液ではない）の移植は、動物モデルでは成功したが、ヒトではまだ成功していない。精巣組織の移植に続く生殖能力の回復というコンセプトの証明が、マウス、ウシ、ブタ、霊長類モデルを含む様々な動物モデルに加えてヒトでもなされている。
【００５５】
しかし、患者が悪性腫瘍を患っている場合、精巣組織および細胞の直接の再移植または移植が何らかの腫瘍細胞が混入した状態を宿主に再導入する恐れがある；従って、精巣細胞および組織の成熟した精子への宿主外での成熟（生体外または他の非ヒトの代理動物の生体内のどちらか）、さらに卵子に対する生体外での受精を行うために成熟した精子を使用することが望ましい。そして、そのような受精卵は、腫瘍の混入の恐れがなく、患者が選んであらかじめ準備された子宮に移植される。
【００５６】
女性における不妊のリスク
思春期の患者由来の卵巣組織および細胞、成人の患者由来の卵巣組織、卵胞および細胞を保存すること、その患者の生殖能力を回復するために宿主外でこれら細胞を後に成熟することが望ましい。
【００５７】
女性において組織および生殖系列幹細胞の保存が求められる疾患または状態は、直接的または間接的に生殖能力に影響する疾患または状態を含み、例えば、これらには限定されないが、卵巣嚢胞、子宮外妊娠、子宮摘出、生殖器および非生殖器癌を含む癌、細胞傷害性療法、骨随移植、卵巣切除、子宮内膜症、もしくは生殖の全盛期に近づくか経過したが生殖能力を維持したい女性に対する家族計画を目的とする場合である。１つの実施の形態では、ドナーは、思春期前の女性である。他の実施の形態では、ドナーは、思春期後の女性である。
【００５８】
女性では、細胞傷害性治療は、卵胞破壊を引き起こし、早発閉経および不妊をもたらす。生殖能力の減少に加え、エストロゲンおよび他のホルモンの消失は、骨粗鬆症および心血管疾患のような長期の健康問題につながる。女性の小児期における癌の生存者の６％より多くが急性の卵巣障害を経験した。癌治療を受けた成人女性の、早発閉経の発生率は３０％である。卵巣切除および卵巣摘出のような他の医療処置は、女性の生殖能力を直接的に危険にさらし、あるいは影響を与える。これらの処置は、患者が悪性または良性卵巣腫瘍、子宮外妊娠、子宮内膜症および卵巣嚢胞と診断されたときに頻繁に必要とされる。乳癌患者、または乳癌もしくは卵巣癌に発展する危険のある患者がよく卵巣切除を受けるのは、ホルモンの複雑な関係および遺伝性素因のせいで癌に発展する可能性を減らすためである。
【００５９】
将来の生殖能力を確保するために細胞傷害性治療を受けている女性に対する選択肢は限られている。細胞傷害性もしくは細胞増殖抑制治療または生殖器官の外科的除去の前における予防段階で、卵母細胞または卵子が取り出され、補助的な生殖技術で用いるために低温保存され、患者は治療後に不妊になるだろう。しかし、凍結および解凍されたヒトの卵母細胞の生存能力がとても低いのは、体積に対する表面の比が小さく、抗凍結剤が細胞膜を容易に透過できない巨大な細胞の凍結における固有の困難さのためである。したがって、組織、原始卵胞または卵巣細胞（生殖系列幹細胞を含む）の保存は、卵母細胞の凍結に代わる、または追加する実行可能な選択肢である。
【００６０】
保存された、低温保存された卵巣組織または卵胞は、患者が不妊になった場合に治療後患者が生殖能力を回復する状態になった時点で患者に移植され戻される。また、癌に対する治療を受けているか無傷の生殖器官をもっていない患者に対しては、凍結された組織または卵胞が、ここで開示される宿主外の成熟方法において用いられ、生体外または動物宿主（卵母細胞または卵胞の成熟のための支持システムとしてのみ用いられる）のどちらかで、さらに成熟した卵子が補助的な生殖技術によって受精され得る。
【００６１】
ここで開示される生殖系列細胞は、哺乳動物の生殖腺組織から単離され、該哺乳動物は、これらには限定されないが、げっ歯類、家畜動物、イヌ、ネコおよび霊長類を含む。「霊長類」の用語は、これに限定されないが、ヒトを含む。
【００６２】
生殖系列細胞は、種々の生殖系列、胚および多能性細胞マーカーの発現、または発現の欠如に基づいて単離される。生殖系列細胞のマーカーは、これらには限定されないが、ＶＡＳＡ、前骨髄球性白血病亜鉛因子（ＰＬＺＦ）、グリア由来神経栄養因子受容体α１（ＧＦＲ‐α１）、α６‐インテグリン、Ｔｈｙ‐１、ＣＤ９、ＣＤ９０、ＣＤ４９ｆ、ドリコス凝集素（ＤＢＡ）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、生殖系列細胞核抗原１（ＧＣＮＡ１）およびＤＡＺＬを含む。
【００６３】
多能性細胞マーカーは、これらには限定されないが、Ｏｃｔ‐４（ＰＯＵ５Ｆ１）、Ｎａｎｏｇ、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ‐４、ＴＲＡ１‐６０およびＴＲＡ１‐８１を含む。
【００６４】
さらに、生殖系列細胞は、生殖系列および／または多能性幹細胞遺伝子の発現に基づいても単離される。生殖系列幹細胞遺伝子は、これらには限定されないが、テロメラーゼ、ＶＡＳＡ、Ｃ‐Ｒｅｔ、ｃ‐Ｋｉｔ、ＰＬＺＦ、ＤＡＺＬおよびＧＦＲ‐α１を含む。多能性細胞遺伝子は、これらには限定されないが、Ｏｃｔ‐４、Ｎａｎｏｇ、Ｄｐｐａ‐５Ｓｏｘ‐２、アルカリホスファターゼおよびＣｒｙｐｔｏを含む。
【００６５】
ここで開示される付加的な実施の形態は、長期間、多分化能または多能性の細胞株が発生するように、生殖系列幹細胞の所定の集団を長期培養することを含む。これらの細胞株は、組織特異的系統への分化のための細胞のもととして使用される。本生殖系列細胞の長期培養は、生殖系列および／または多能性細胞マーカーおよび生殖系列および／または多能性遺伝子の発現、または発現の欠如に基づいて、所望の生殖系列細胞の十分に純粋な集団を単離するステップ；実施例に開示された成長培地で細胞を培養し、細胞分裂を継続させる一方で未分化であって多分化能または多能性の状態を維持することを含む。ここに開示された長期培養は、将来の使用のために低温保存される。
【００６６】
ある実施の形態では、単離され、十分に純粋な生殖系列細胞または生殖系列細胞株の集団は、再生医療における治療用途に用いられる。ここで開示される生殖系列細胞は、より分化した生殖系列細胞、例えば雄の精母細胞、精子細胞および精子、ならびに雌の卵胞および卵母細胞等を形成でき、さらに生体内で不妊の生殖器官を再生できる。
【００６７】
本明細書で開示される生殖系列組織の保存システムは、次の構成要素および／またはステップを含む：１）組織の収集；２）中央保存場所への組織の輸送；３）中央保存で組織を処理すること；４）組織および単離された細胞を中央保存で低温保存すること；および５）品質保証および組織および／または単離された細胞の放出。任意の６番目のステップは、組織および／または単離された細胞のドナーへの再移植、あるいは宿主外での成熟に続く生体外での受精および胚移植を含む。
【００６８】
本明細書で開示されるのは、保存されたまたは新鮮な生殖系列細胞、例えば生殖系列幹細胞、精原幹細胞、卵巣幹細胞、精巣組織または卵巣組織の宿主外での成熟の方法であって、この方法によって自然な方法で妊娠できない患者が生殖能力を回復できる。
【００６９】
１．雄からの組織の収集
生殖系列細胞は、細胞傷害性治療の開始に先立って、または生殖細胞組織の破壊につながる傷害直後に精巣から取り出される。外科的な無菌状態および麻酔下で精細管組織の少なくとも１ｇが取り出される。物理的および酵素による単個細胞懸濁液への組織の分解は、中央保存設備への組織の輸送の前または後に行われる。
【００７０】
１つの実施の形態では、精巣の精細管組織は、約１０×１０ｍｍの切片に切られ、５つまでの切片が無菌の輸送培地を含む無菌のチューブに入れられる。他の実施の形態では、組織は、１個の部分で維持され、無菌の輸送培地を含む無菌の容器に入れられる。
【００７１】
輸送培地には、あらゆる培地が含まれ、該培地は、精巣の精細管組織および／または分離された細胞の生存を２４時間まで支持する。組織維持培地の限定しない例は、ＨＥＰＥＳと抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）とを添加されたＰＢＳ、ＦＲＳ、ＤＭＥＭ、さらに組織培養培地に関してそれが含む全てをここで参照することで援用される米国特許出願公開第２００７／００２０７５９号明細書に開示された独自の培地も含む。
【００７２】
２．雌からの組織の収集
生殖系列細胞は、細胞傷害性治療の開始に先立って、もしくは生殖細胞組織の破壊または卵巣切除もしくは卵巣摘出につながる傷害直後に卵巣から取り出される。外科的な無菌状態および麻酔下で卵巣組織の少なくとも１ｇが取り出される。物理的および酵素による単個細胞懸濁液への組織の分解は、中央保存設備への組織の輸送の前または後に行われる。
【００７３】
１つの実施の形態では、卵巣組織は、約１０×１０ｍｍの切片に切られ、５つまでの切片が無菌の輸送培地を含む無菌のチューブに入れられる。他の実施の形態では、組織は、１個の部分で維持され、無菌の輸送培地を含む無菌の容器に入れられる。
【００７４】
輸送培地には、各種の培地が含まれ、該培地は、卵巣組織および／または分離された細胞の生存を２４時間まで支持する。組織維持培地の限定しない例は、ＨＥＰＥＳと抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）とを添加されたＰＢＳ、ＦＲＳ、ＤＭＥＭ、さらに米国特許出願公開第２００７／００２０７５９号明細書に開示された独自の培地も含む。
【００７５】
３．組織の輸送
収集された精巣または卵巣組織は、約４℃に維持され、組織の収集から２４時間以内に中央保存設備に到着するように中央保存設備に輸送される。我々のデータは、細胞の生存能力は、輸送の４８時間後まで変化せず、輸送の７２時間後に減少することを示している。我々は収集後２４時間以内に組織を扱うことが好ましいと考える。
【００７６】
４．組織の処理
収集された卵巣および精巣組織は、酵素で分解され、低温保存の前に生存能力および細胞マーカーに関して評価される。１つの実施の形態では、生殖系列幹細胞は、低温保存の前に組織から濃縮される。他の実施の形態では、精巣および卵巣細胞の全てが、生殖系列幹細胞を濃縮せずに低温保存される。
【００７７】
他の実施の形態では、生殖系列幹細胞の濃縮は、雄および／または雌の生殖系列幹細胞に特異的な抗体を用いてフローサイトメトリー選別によって行われる。
【００７８】
５．低温保存
種々の培地および方法が生殖腺組織および／または生殖系列幹細胞の低温保存に用いられる。
【００７９】
１つの実施の形態では、生殖系列幹細胞は、これらには限定されないが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレングリコール、グリセロールおよびプロパンジオールを含む少なくとも１つの抗凍結剤と；これらには限定されないが、ＤＭＥＭ、ＭＥＭおよび上記独自の培地を含む少なくとも１つの培養培地と；これらには限定されないが、スクロース、デキストラン、血清代替物およびＨＥＰＥＳ緩衝液を含む少なくとも１つの物質と；を含む溶液に低温保存される。１つの実施の形態では、上記溶液は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（商標）  ＣＳ‐１０培地（バイオライフソリューション社、米国ワシントン州バセル）を含む。他の実施の形態では、血清代替物は、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（インビトロジェン社、１０８２８−０２８）である。
【００８０】
次に、細胞は、調整された凍結速度で、または「手動」作業によって凍結される。調整された凍結速度での凍結処理は、凍結速度を調整できる凍結装置をオンにし、組織または細胞凍結のための凍結プログラムを設定する。凍結速度を調整できる凍結装置は、内部のチャンバーの温度を下げるために液体窒素を使用してもよい（こうすることでチャンバー内のあらゆるものの温度が下がる）。細胞の凍結プログラムは、内部チャンバーを４℃に冷やすことに始まり、この処理が進むまで継続して維持する。凍結速度を調整できる凍結装置が冷えている間、４℃に冷やされた低温保存培地に細胞が懸濁される。細胞懸濁液は、冷凍バイアルにつき１ｍＬで、冷凍バイアルに分注される。そして、冷凍バイアルは、標識され、凍結速度を調整できる凍結装置のチャンバーに置かれ、プログラムは継続される。はじめに、さらに１０分間で４℃に維持された温度になる。次に、チャンバーは、温度が−８０℃に達するまで−１℃／分の速度で冷却される。さらに、チャンバーは、温度が−１２０℃に達するまで−５０℃／分の速度で冷却される。−１２０℃になって５分後、凍結された細胞の温度は−１２０℃に平衡しているはずである。そして、凍結された細胞の凍結バイアルは、長期保存のために液体窒素のデューア瓶に移される。
【００８１】
手動の凍結処理は、細胞をゆっくり凍結するために用いられる「Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ」凍結容器（ナルゲン社）を準備することから始まる。「Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ」容器は、ポリカーボネートユニットであって、細胞の低温保存および回復を成功させるために求められる、重要で、再現可能な−１℃／分の冷却速度を与える。「Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ」の基部は、２５０ｍＬの１００％イソプロパノールで満たされる。チューブ入れは上端にあり、チューブ入れを覆って蓋がねじ止めされて、「Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ」は、使用される前少なくとも１時間、４℃に置かれる。細胞は、４℃に冷却された低温保存倍地に懸濁される。細胞懸濁液は、冷凍バイアルにつき１ｍＬで、冷凍バイアルに分注される。そして、冷凍バイアルは、標識され、事前に冷却された「Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ」に置かれる。「Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ」は１０分間４℃に戻されて置かれる。次に、「Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ」は、−８０℃の凍結装置に一晩置かれる。−８０℃の凍結装置に一晩置かれた後で、凍結バイアルは、長期保存のために液体窒素のデューア瓶に移される。
【００８２】
６．品質保証ならびに卵巣および精巣由来の生殖系列組織および／または細胞の放出
【００８３】
有効性、純度、同一性、生存能力および安定性の評価が、低温保存の前または特定の時点（安定性について）で、かつ組織または細胞が移植のために正常な状態であることを確かめるために放出されたうえで、試料に対して行われる。これらの評価は、組織／細胞サンプルにおいて関連する特定のマーカーを定量化することで、存在する生殖系列幹細胞の量（移植された場合に精巣を再生できる「有効性」を推定するため）、細胞の生存能力、および細胞の同一性を確認するための任意のＤＮＡ解析に関する情報を提供する。安定性の評価は、低温保存の質を確認するために一定間隔で解凍される組織または細胞の小さなサンプルを対象とする。
【００８４】
７．精巣由来の生殖系列組織および／または細胞の再移植
【００８５】
生殖系列幹細胞の十分に純粋な単離された集団の受容個体への移植は、当業者に知られる標準的な注射手段を用いる直接的な注入によってなされる。他の実施の形態では、支持細胞、例えば精原細胞への分化に関するホルモン刺激を与えるようなライディッヒ細胞またはセルトリ細胞が、生殖系列幹細胞とともに受容個体の精巣に移される。これらの移された支持細胞は、修飾されていないか、または遺伝的に修飾されているかのどちらかである。これらの移された支持細胞は、ドナーまたは受容個体の精巣のいずれかにおいて自己のものでもよいし、異種のものであってもよい。輸送流体における細胞の濃度の例は、単純な実験で簡単に決定されるが、約１０３‐１０１０細胞／ｍｌの範囲内であるのが好ましい。輸精管、精巣網または精細管への細胞の導入は、手作業で行われる。ふさわしい染料または泡（直径２μｍ未満）が、移植される生殖系列幹細胞の精巣への十分な供給を容易に確認するために、任意に輸送流体に含まれてもよい。適切な変換器を装備した超音波が注射部位に針を位置決めするのに有用である。
【００８６】
適切な細胞移植媒体は、当業者に知られており、血清アルブミン、コレステロールおよび／またはレクチン、セレンおよび無機塩類の他に血清成分および／または成長因子および／またはサイトカイン等の分子を含む。通常は、細胞移植媒体は、おおよそ生理学的な例えば７．０から７．６のｐＨを有する。
【００８７】
本細胞組成物は、単独でまたは１種または複数の薬学的に許容される担体と組み合わせて、単一または複数の濃度で投与されてもよい。適切な薬学的な担体は、不活性な生体輸送ゲルまたは生分解性の半固体のマトリクスに加え、希釈剤または充填剤、無菌の水溶液および種々の毒性のない溶媒を含んでもよい。薬学的に許容される担体は、一般に、３つの機能を発揮する：（１）本細胞組成物において細胞を維持し保存すること；（２）再生、修復または活性化を必要とする組織部位で細胞を保持すること；および（３）実行者による本組成物の操作の容易さを改良すること、例えば、これらには限定されないが、注射可能な組成物の性質または手術による移植の操作性を改良すること。本細胞組成物と薬学的に許容される担体との組み合わせによって形成された薬学的な組成物が注射溶液等で様々な濃度にされて投与される。薬学的な担体は、必要であれば、結合体、賦形剤等のような付加的な組成物を含んでもよい。水溶液は、必要であれば適度に緩衝化され、かつ希釈液は、最初に十分な生理食塩水またはグルコースで等張させるのが好ましい。このような水溶液は、静脈内、筋肉内および腹腔内注射に適している。使用される無菌の水媒体は、当業者によく知られた一般的な技術で得ることができる。
【００８８】
８．卵巣由来の生殖系列組織および／または細胞の再移植
【００８９】
卵巣の生殖系列幹細胞は、化学または放射線治療の前に患者から単離され、生体外で数が増やされ、患者が生殖能力を取り戻すことを希望するまで凍結維持される。ヒトの卵巣から単離された細胞は、細針を用いて卵巣表面上皮に直接移植されるか、細胞はフィブリン塊に集められるかである。フィブリン塊は、患者自身の血液から調製され、移植処理の間、細胞の生存能力および生存を支持する。フィブリン塊は、患者に移植され、卵嚢下に接合される。
【００９０】
１つの実施の形態では、悪性腫瘍の患者における卵巣細胞の移植において、生殖細胞は、陽性‐陰性選択法を用いて悪性腫瘍の細胞と分けられる。しかし、悪性腫瘍でない患者には、卵巣表面上皮（ＯＳＥ）の移植がより実用的である。組織収集におけるＯＳＥは、外科用メスを用いて、残された卵巣組織から直径１ｍｍで０．５ｃｍ×０．５ｃｍの切片に切り取られる。これら切片は、ガラス化法を用いて凍結され、患者が生殖能力の回復を必要とするまで凍結維持される。必要とされたとき、ＯＳＥ切片は、解凍され、より大きな切片を形成するために縫合され、不妊の卵巣表面に移植される。
【００９１】
さらに、異なる発生段階の卵巣の卵胞は、凍結され、患者に再移植されるか、成熟卵胞への生体外培養のために用いられる。そして、これら卵胞由来の卵母細胞は、ＩＣＳＩ（卵細胞質内精子注入法）または他の補助的な生殖技術によって受精される。卵巣の生殖系列幹細胞の移植は、永続的な生殖能力の回復である。
【００９２】
９．卵巣由来の生殖系列幹細胞の宿主外成熟
【００９３】
ヒトの卵巣から単離された女性の生殖系列幹細胞は、超低粘着性の培養皿での成長因子およびβ‐メルカプトエタノールなしの凝集、それに続く成長ホルモン存在下のアルギン酸ナトリウムまたはフィブリン塊での３次元培養を経て原始卵胞に分化する。さらに生殖細胞の成熟卵子への成長を支持するために、これらの細胞は、思春期前の年齢のドナー由来の未成熟な顆粒膜細胞とともに凝集される。この方法は、初期の卵母細胞が受精可能なメタフェーズIIの卵母細胞に成長させる。顆粒膜細胞の単離のために、思春期前のヒトの卵巣由来の卵巣が切り出され、顆粒膜細胞は、２段階の粘着性の違いを利用する方法によって生殖細胞から分離される。この方法は、悪性腫瘍の患者に適用され、悪性腫瘍の細胞が取り除かれた改変卵胞が患者の卵巣に移植されて、さらに成熟化と卵胞の成長を可能にする。また、これらの卵胞は生体外で成熟されてもよい。患者から単離された卵巣の卵胞は、凍結され、その次に、このプロトコールに従う。生体外での受精か、受精のためのＩＣＳＩおよび次に続く胚発生かのいずれかの場合で、これらの卵胞由来のＭIIの卵母細胞が用いられる。
【００９４】
１０．精巣由来の生殖系列幹細胞の宿主外成熟
【００９５】
患者精巣への生殖系列幹細胞の再移植が実行可能でない場合（例えば、悪性腫瘍、精巣捻転、停留精巣）、または生殖細胞の成長が精巣支持細胞の障害のせいで損なわれた場合（成熟停止）、精巣の生殖系列幹細胞は、代理動物または生体外でさらに進んだ段階まで分化され、ＩＣＳＩまたは他の補助的な生殖技術で用いられる。１つの実施の形態では、精原幹細胞（ＳＳＣ）が、生殖細胞のさらなる成長を支持できる環境を創り出すために、適切な支持細胞および精細管細胞外マトリクス（ＥＣＭ）と混合される。
【００９６】
思春期前の患者で、完全ではないが精子形成がすでに始まった場合、すでに減数分裂に入った部分的に成熟した生殖細胞（一次および二次精母細胞）が蓄えられ、円形または細長い精子細胞へのさらなる分化のために用いられる。そして、精子細胞はＩＣＳＩのために用いられ、受精およびそれに続く胚発生を可能とする。
【００９７】
本明細書で開示されるのは、未成熟な生殖系列細胞を宿主外で半数体の配偶子に分化させる方法であって、細胞が生体内で成熟する条件を模擬する条件下で未成熟な生殖系列細胞を生体外で培養することによる。ここで、培養が機能的な精子または卵子への生殖系列細胞の成熟をもたらす。
【００９８】
未成熟な生殖系列細胞は、思春期前の哺乳類動物または生殖系列細胞の通常の成熟を妨げる状態にある哺乳類動物から得る。開示された方法は、これらには限定されないが、ヒト、マウス、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、犬、猫のような家畜動物を含むあらゆる動物に適用するのに適している。
【００９９】
精巣の生殖系列細胞の宿主外成熟において、本明細書で開示される人工の精細管が殺菌されるあらゆる生体適合性チューブで製造される。他の実施の形態では、チューブの内径が約１５０μｍから約４００μｍ、または約２００μｍから約３５０μｍ、あるいは約２５０μｍから約３００μｍである。チューブ内部の表面は、細胞外基質で被覆されており、精細管の環境を模擬している。１つの実施の形態では、細胞外基質は、精巣の細胞外基質である。細胞外基質は、生殖系列幹細胞のドナーまたは他の個体から単離される。
【０１００】
精巣の生殖系列細胞は、培養培地中の人工の精細菅中で培養される。培養培地は、例えばＰＭ‐１（商標）培地（米国特許出願公開第２００７／００２０７５９号明細書参照）である。また、培地は、ＤＭＥＭ、Ｆ１２等、またはこれらを組み合わせたものを含む。培地は、成長及び成熟因子を添加され、それは、これらには限定されないが、グリア細胞株由来成長因子、線維芽細胞増殖因子、白血病抑制因子および上皮細胞増殖因子、成長ホルモン、卵胞刺激ホルモン、幹細胞因子レチノイン酸、およびこれらを組み合わせたものを含む。
【０１０１】
精巣の生殖系列細胞は、成熟した精子が人工の精細管内に形態的に観察されるまで培養され、次に、収集され、生体外での受精を介する卵子の受精、卵細胞質内精子注入法、または膣内のもしくは子宮内受精のいずれかに用いられる。
【０１０２】
卵巣の生殖系列細胞の宿主外での成熟において、卵巣の生殖系列細胞は、本明細書で開示されるあらゆる培養培地内で顆粒膜細胞の存在下で培養される。さらに、成熟した細胞は、生体外での受精、卵細胞質内精子注入法で用いられ、あるいはドナーの卵巣に移植される。
【０１０３】
実施例
以下の実施例は、１つまたは複数の実施の形態を説明するために示されるが、以下の記載に限定されない。
【０１０４】
実施例１
雄マウスの生殖系列幹細胞の異なる集団の単離
生殖系列幹細胞の純粋な集団が生殖細胞のＯｃｔ‐４‐ＧＦＰ選別によって単離された。次に、Ｏｃｔ‐４＋生殖細胞は、ｃ‐Ｋｉｔ受容体分子の発現に基づいて細分される。ｃ‐Ｋｉｔ、チロシンキナーゼ受容体およびそのリガンドである幹細胞因子（ＳＣＦ；Ｋｉｔリガンドまたは造血幹細胞因子としても知られる）は、ＰＧＣの成長および生存の鍵となる調節因子である。ｃ‐Ｋｉｔは、ＰＧＣの初期の分離から生殖隆起における出現までＰＧＣで発現する。出生後のマウスの精巣では、ｃ‐Ｋｉｔは、未分化の、および分化しているＡ型の精原細胞の分化に関するマーカーとして用いられる。Ｏｃｔ‐４およびｃ‐Ｋｉｔの組み合わせは、生殖系列幹細胞の２つの異なる集団の単離を可能にする：一方は、ほとんど未発達な生殖細胞または生殖系列前駆細胞（Ｏｃｔ‐４＋／Ｋｉｔ＋）を含み、他方は、ＳＳＣになり（Ｏｃｔ‐４＋／ｃ‐Ｋｉｔ−）、かつ不妊の精巣を再生する能力を備える生殖系列幹細胞を含む。これらの細胞の分子および表現型の特性は、培養前および培養後の両方で解析され、成長因子の混合物を含む、決められた培養条件下において多分化能の細胞株を発生させる能力が比較された。加えて、これらの分集団および受容個体の精巣を再配置するこれらの派生したｍＧＣ系列の機能性が、精原幹細胞移植技術を用いて評価された。
【０１０５】
雄の生殖系列幹細胞（ＧＳＣ）は、ＳＳＣの自己再生による精子形成および分化に関係する精原細胞の発生を維持する。いくつかの生体外の条件では、新生児および成体両方のマウスの精巣由来のＧＳＣは、多分化能の生殖細胞（ｍＧＣ）系列を発生できると報告されており、ＥＳＣに似た特性および分化能を有する。しかし、異なる研究室で産生されたｍＧＣは、異なる生殖細胞の特性；例えば、一部はそれらＳＳＣの性質を保持し、一部はそれを完全に失っている、を示した。従って、派生した多分化能の生殖細胞株が、マウスの精巣内にある生殖系列幹細胞の異なる分集団由来であるという可能性が残されている。この疑問を調べるために、生殖細胞特異的なＯｃｔ‐４プロモータの制御下でＧＦＰを発現する遺伝子操作マウスモデルを用いた。転写因子Ｏｃｔ‐４およびｃ‐Ｋｉｔ受容体の発現に関して、生殖系列幹細胞において２つの異なる集団がみられた。マウスの生殖系列幹細胞のＯｃｔ‐４＋／ｃ‐Ｋｉｔ＋の小集団のみが、新生児または成体のどちらかから単離され、成長因子の複合混合物で培養された場合に、細胞株を産生し、該細胞株は多能性ＥＳマーカー、例えば、Ｏｃｔ‐４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｒｅｘ‐１、Ｄｐｐａ‐５、ＳＳＥＡ‐１、アルカリホスファターゼ、提示される高いテロメラーゼ活性および誘導分化プロトコールによって拍動する心筋細胞、神経細胞ならびに軟骨細胞を含む複数の系統への分化等を示す。このデータは、いくつかの多能性特性を有する多分化能の細胞株を産生できる生殖系列前駆細胞のみに由来する生殖系列幹細胞内に異なる集団があることを明示する。
【０１０６】
生殖系列細胞の濃縮に関して、新生児および成体両方の精巣組織が、生殖細胞ではなく体細胞を除く異なる接着のために、ゼラチンで被覆された培養皿で２時間培養された。接着の違いによって、ＧＦＰ陽性細胞（新生児で４‐１０％、成体で０．０１‐０．０５％）の懸濁液が回収された（図１Ａ‐Ｃ）。ＧＦＰとｃ‐Ｋｉｔの発現の間に相関があった（図１Ｆ‐１Ｈ）。
【０１０７】
収集された新生児の生殖細胞が、上述のように培養皿で成長因子の混合物を含む幹細胞培養培地で培養された。初期のＧＦＰシグナル（図２Ａ）は、培養数日後に消失した（図２Ｂ）。その後、細胞は異なる形態変化を受け、鎖状のコロニーを形成し、ＧＦＰシグナルなしで成長を続けた（図２Ｃ‐２Ｄ）。コロニー内のＧＦＰ陽性細胞の発生によって示唆されるＯｃｔ‐４の上方調節が培養の３‐４週間後に現れた（図２Ｆ）。培養の２‐４週間後、ＧＦＰ陽性コロニーが１５％ＦＢＳを添加した同じ培養培地で、マイトマイシンＣで処理したマウス胚線維芽細胞支持細胞層（ＭＥＦ）を含む培養培地に機械的に移された。３‐４回の継代後に、新しいＭＥＦ培地への移動を介して、コロニーが確立され、さらなる増殖および／または液体窒素での保管のために、培養皿から酵素的に（１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ、５‐１０分間）剥がされた。成体マウスからの細胞株の派生のために、接着の違いで収集されたＧＦＰ＋細胞は、フローサイトメトリーで選別され、ＭＥＦで直接培養された。ＯＧ２またはＯＧ２‐ｌａｃＺマウスを用いて、１９の細胞株（１０の新生児および９の成体）が産生された。全ての細胞株は、ＧＦＰ（１４株）またはＧＦＰ‐ｌａｃＺ（５株）のどちらかを発現した（図２Ｇ‐２Ｉ）。
【０１０８】
さらに、ｍＧＣ株が新生児の野生型ＣＤ‐１マウスで産生されたことは、当該方法が遺伝子操作ＯＧ２マウスに限定されないことを示唆している。選択された細胞株は、凍結され／解凍され、およそ７２時間（手動の細胞計数およびＧＦＰ選別両方を用いて）の細胞倍加時間で４０継代を超えて増殖された（図３）。培養中の異なる時点で（図３Ａが２日目、図３Ｂが５日目、図３Ｃが９日目、図３Ｄが１５日目）、ＧＦＰ＋細胞の個数がＦＡＣＳで解析された（図３Ｅ）。
【０１０９】
ｃ‐Ｋｉｔ＋／ＧＦＰ＋細胞がフローサイトメトリーによってｃ‐Ｋｉｔ−／ＧＦＰ＋細胞から分離され、ＭＥＦ支持層で培養された。ｃ‐Ｋｉｔ＋の集団だけがｍＧＣのコロニーを形成し、ｃ‐Ｋｉｔ−のプールから細胞株は産生されなかった。この研究で用いられた成長因子のうち、ＧＤＮＦを除去するとコロニーが小さくなるのは、ｍＧＣの自己再生におけるＧＤＮＦの役割を示唆する。これに対し、ＦＧＦ２を除去するとコロニーが分化することは、未分化段階のｍＧＣの維持におけるＦＧＦ２の果たし得る役割を示唆している。ＬＩＦまたはＥＧＦを除去することは、ｍＧＣの増殖または分化に影響しなかった。
【０１１０】
ｍＧＣのコロニーにおける細胞のほとんどは、Ｏｃｔ‐４（図４Ａ‐４Ｄ）、Ｎａｎｏｇ（図４Ｆ‐４Ｈ）、ＶＡＳＡ（図４Ｉ‐４Ｌ）およびＳＳＥＡ‐１（図４Ｍ‐４Ｏ）を発現した。また、それらは、Ｓｔｅｌｌａ、Ｄａｚｌ、ＶａｓａおよびｃＲａｔを含む生殖系列特異的マーカーとともに、多能性遺伝子Ｓｏｘ‐２、ＤＤＰａ５、Ｒｅｘ‐１、ｅＲａｓおよびＣｒｉｐｔｏを発現した（図４Ｑ）。加えて、Ｏｃｔ‐４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２の発現は、ウェスタンブロット解析で確認された（図４Ｐ）。
【０１１１】
２０回継代したマウスの細胞株は、高いテロメラーゼ活性（図５Ａ、ＥＳＣに類似）および正常核型（４０、ＸＹ）（図５Ｂ）を示した。
【０１１２】
また、ｍＧＣの広範囲における遺伝子の発現および刷り込みパターンが培養前後に解析され、ＥＳＣのそれと比較された。興味深いことに、培養条件は、実験された全てのＤＭＲ（特異的なメチル化領域）におけるｍＧＣでの刷り込みパターンを変化させなかった。部分的なアンドロゲンの刷り込みのみを示したマウスのＥＳＣとは対照的に、ｍＧＣは１００％のアンドロゲンの刷り込みを明示した（図６）。多少驚くべきことに、マイクロアレイ解析は、ｍＧＣの広範囲における遺伝子発現パターンが培養前後で８７％の類似性を有することを示した。
【０１１３】
ｍＧＣが胚様体（ＥＢ）を形成するために凝集したとき、原腸胚形成が９‐１５日で観察された（図７Ａ）。ＥＢにおける細胞は、Ｅ‐カドヘリンおよびラミニン１（極性上皮のマーカー、図７Ｂ‐７Ｃ）、Ｚｉｃ１、ＰＡＸ６およびＳｏｘ１（初期の外胚葉マーカー、図７Ｄと７Ｆ）、ＧＡＴＡ４およびＦｏｘＡ２（初期の内胚葉マーカー、図７Ｅ‐７Ｆ）、ならびにＢｒａｃｈｙｕｒｙ、ＢＭＰ４およびＣＯＬ２Ａ１（初期の中胚葉マーカー、図７Ｆ）を含む初期の発生マーカーを発現した。培養では、ｍＧＣのコロニーは、自発的に心筋細胞（図７Ｇ‐７Ｊ）、脂肪細胞（図７Ｋ）および神経細胞（図７Ｌおよび７Ｍ）のマーカーを発現している表現型に分化した。心筋細胞に自発的に分化した細胞の一部は、３日まで律動収縮を示した。分化誘導のプロトコールを用いた場合、ｍＧＣ株は、神経前駆細胞（ｎｅｓｔｉｎ、ｎｅｕｒｏ１）、ニューロン（ＭＡＰ２、ＮＦ‐６８、ＧＡＤ６７）およびグリア細胞（ＧＦＡＰ、ＭＢＰ、Ａ２Ｂ５、Ｏ４、ＮＧ２）に相当する神経細胞への分化のために誘導されたことが図８Ａ‐８Ｇおよび８Ｊに示された。また、それらは、心筋細胞（トロポニン１、心臓のミオシン、デスミン、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４、図８Ｉおよび８Ｌ）または軟骨細胞（コラーゲンＸａ１、およびアルシアンブルーによる染色、図８Ｈおよび８Ｋ）の形成のために誘導された。
【０１１４】
ｍＧＣに関する別の分化実験では、培養された７つのコロニーにおける神経マーカーの染色があるものとないものについて核の数が計数され、平均の割合は、ＧＦＰＡ＋細胞で１７．６％、Ｔｕｊ‐１＋細胞で２．５％およびＭＡＰ‐２＋細胞で２．３％と推定された。一般に、これらのプロトコールで誘導される分化の有効性は、ｍＧＣと比較してＥＳ細胞でずっと高かった。
【０１１５】
移植後４週では、対照動物の精巣もＯｃｔ‐４＋／ｃ‐Ｋｉｔ＋細胞を与えられた精巣も精細管の大部分で精子形成が見られなかった。しかし、新鮮分離されたＯｃｔ‐４＋／ｃ‐Ｋｉｔ−の精巣細胞を与えられたマウスの８０％が精巣のいたるところである程度の精子形成を示したことは、細胞懸濁液内の機能性ＳＳＣの存在を示唆している。生殖系列幹細胞におけるｃ‐Ｋｉｔ−分集団のみが受容個体の精巣に定着した。培養前後の生殖系列幹細胞の移植に続く精巣の再生が図９Ｍ‐９Ｒおよび表１に示された。免疫不全マウスの正常な精巣の横断面が図９Ｍに示された。ブスルファン処理の１ヶ月後、精細管の大部分が内因性の精子形成を激減させた（図９Ｎ）。Ｏｃｔ‐４＋／ｃ‐Ｋｉｔ−細胞を移植されたマウスの精細管の７３％がある程度の精子形成を示したが（図９Ｏ）、Ｏｃｔ‐４＋／ｃ‐Ｋｉｔ−細胞を与えられたマウスの管横断面の大部分は、空だった（図９Ｐ）。Ｏｃｔ‐４＋／ｃ‐Ｋｉｔ−細胞の移植直後のＣＳＦＥで標識された陽性コロニーが図９Ｒに示されている。ｍＧＣを移植された受容個体マウスの精巣内における精細管の大部分での精子形成がみられなかったことは、これらの細胞がＳＳＣ特性を有していないことを示唆している（図９Ｑ）。
【表１】
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【０１１６】
奇形腫については、同数のマウスＥＳＣ（陽性対照として）またはＯｃｔ‐４‐ＧＦＰ／ＬａｃＺのｍＧＣが、別のヌードマウス群の皮膚、筋肉および精巣に注射された（１×１０６細胞／部位）。３つの組織タイプの全てで、ＥＳＣを与えられた全ての受容個体マウス（６／６）が奇形腫を生じた。これに対し、ｍＧＣを与えられたマウスは（０／２０）、奇形腫を生じなかった（図９Ａ‐９Ｆ）。移植後６週間で、Ｏｃｔ‐４‐ＧＦＰ／ＬａｃＺ細胞は、皮膚、筋肉および精巣組織にみられた（図９Ｇ‐９Ｉ）。これらのデータは、ＥＳＣではなく、ｍＧＣが非腫瘍形成性であることを示している。
【０１１７】
キメラ形成が、培養したＯｃｔ‐４‐ＧＦＰ／ＬａｃＺ細胞を、ＣＤ‐１マウスの８細胞期の胚および未分化胚芽細胞に注射することよって評価された。図１０Ａ‐１０Ｄに示すように、Ｏｃｔ‐４‐ＧＦＰ／ＬａｃＺ細胞がマウス未分化胚芽細胞の内細胞塊に取り込まれた。擬似的に妊娠したマウスの子宮に、胚が移された（移した１１９の胚から合計４５の胎児）。１２．５ｄｐｃ（性交後の日数）で、ＬａｃＺに対する胚全体の染色（βガラクトシダーゼ活性）が眼、脳、手足において異なるパターンを示した（図１０Ｅ）。ＬａｃＺ染色の強度は、マウスＥＳ細胞を与えられたキメラ胚でのほうが、多分化能の生殖細胞株を注射されたそれらよりもずっと大きかった。また、キメラ細胞の分布は、脳、心臓、生殖隆起および肝臓の組織切片にも示された（図１０Ｌ‐１０Ｏ）。強度およびＬａｃＺ＋細胞の数は、ＬａｃＺ‐ＥＳ細胞を注射されたキメラ胚のほうが、ＬａｃＺ‐ＧＳ細胞を注射されたそれらよりもずっと大きかった。Ｏｃｔ‐４‐ＧＦＰ／ＬａｃＺキメラ組織の確認は、外胚葉性（脳）、中胚葉性（心臓）、内胚葉（肝臓）およびキメラの子の精巣にＧＦＰのＤＮＡ配列が存在し（図１０Ｐ）、かつ４つの組織全てにＬａｃＺのＤＮＡが存在する（図１０Ｑ）ことで裏付けられた。これらを組み合わせた結果は、培養されたｍＧＣは、ある程度の多能性特性を伴う非催奇形性の幹細胞であることを明らかに示している。
【０１１８】
多分化能の生殖細胞系列は、成長因子の再プログラミングなしで成体マウスの精巣から発生し、；このことは、成体の精巣内に多能性特性を有する細胞の分集団がある可能性を示唆している。
【０１１９】
一方、上述のように、出生後のマウスの生殖系列幹細胞由来の生殖系列性細胞および生殖系列前駆細胞は、全てではないが、ＥＳＣの多能性特性の一部を備えて生成した。特に注目すべきは、これら細胞株タイプ両方は、他の研究室によって樹立された多分化能の生殖細胞株と、多能性および奇形腫形成の程度の点でまったく異なることである。マイクロアレイ解析によれば、マウスのＯｃｔ‐４＋／ｃ‐Ｋｉｔ＋の生殖系列細胞株は、ＥＳＣよりも１０００倍および５０００倍低いレベルではあるが、多能性遺伝子のＮａｎｏｇおよびｃｒｙｐｔｏを発現した。同様に、生殖系列細胞株は、これらに限られないが、ｐ５３、Ｅｒａｓ、Ｂａｋ、Ｉｎｔ‐２およびｃ‐ｍｙｃを含む癌遺伝子を発現するが、その発現レベルは、ＥＳ細胞よりも数倍低い。特に、生殖細胞株は、移植されても生体内で奇形腫を形成しなかったが、それらは、限られたキメラ細胞の集団をマウスの胚で形成した。
【０１２０】
いくつかの証拠は、Ｏｃｔ‐４＋／ｃ‐Ｋｉｔ＋の生殖系列前駆細胞が生殖細胞の特性を保持し、その結果、ＥＳＣおよび従来報告されている他の精巣細胞とは異なるという概念を裏付ける。すなわち、１）派生した生殖系列前駆細胞は、約７２時間で細胞数が２倍になる細胞周期であり（ＧＦＰ選別および手作業の計数）、かつこの細胞周期は、生殖系列幹細胞のそれに類似し、かつＥＳＣのそれより約３倍長い；２）アレイでの広範囲における遺伝子発現解析に基づいて、本生殖系列前駆細胞は、ＥＳＣ又は他の多分化能の生殖細胞株と異なる分子特性を備えると思われる。遺伝子を検討したところ、本生殖系列前駆細胞株は、生殖系列特異的遺伝子（Ｖａｓａ、Ｐｌｚｆ、ＧＦＲ‐α１、Ｄａｚｌ）の顕著に高い発現レベルおよび多能性の遺伝子（Ｏｃｔ‐４、Ｎａｎｏｇ、Ｄｐｐａ‐５、Ｓｏｘ‐２、Ｃｒｙｐｔｏ）の低い発現レベルを示した；３）これらの細胞株は、自己再生においてＬＩＦまたはＦＧＦ２よりもＧＤＮＦにより依存的である。ＧＤＮＦは、雄の生殖系列幹細胞の自己再生の鍵となる調節因子であると言われており、一方、ＬＩＦおよびＦＧＦ２は、ＥＳＣの自己再生において重要な役割を果たす；４）これらの細胞株におけるＳＳＥＡ‐１の発現レベルは、報告されたように、マウスのＥＳ細胞または他の多分化能の生殖細胞株においてみられたレベルよりも低い。ＳＳＥＡ‐１がある動物モデル系での腫瘍浸潤および転移に関わることが示されたことは、より高い発現が腫瘍形成のより高い可能性を反映していることを示唆している；そして、５）多分化能のＧＣは、他の研究室で報告されたマウスＥＳＣまたは他のｍＧＣ株と異なるアンドロゲンの刷り込みパターンを示した。
【０１２１】
生殖系列の祖先との全ての類似点にも関わらず、本生殖系列前駆細胞株は、移植後に精巣を再生しなかったことは、それらが生殖系列性細胞ではなかったことを示す。
【０１２２】
遺伝子操作マウスモデルは、それらのＯｃｔ‐４発現に基づいて新生児および成体の精巣両方からの生殖系列細胞の単離を可能にした。生殖系列幹細胞は、次の所見を伴うｃ‐Ｋｉｔの発現に従って２つの分集団にさらに分けられた：１）ｃ‐Ｋｉｔ受容体分子をもつＯｃｔ‐４‐ＧＦＰ＋細胞のみが培養に応答し、多分化能の生殖細胞株を生成した；および、２）ｃ‐Ｋｉｔ−の分集団のみが精原細胞幹細胞の移植後に精巣を再生した。この結果は、生殖能力のある精巣内の少なくとも２つの異なる生殖系列幹細胞の小集団の存在を示唆する：（１）多分化能の生殖系列幹細胞になる能力を有するｃ‐Ｋｉｔ＋プール、例えば生殖系列前駆細胞、および（２）ｃ‐Ｋｉｔの発現を欠いた、かつ精巣に定着する能力を獲得した生殖系列幹細胞の小集団、例えば生殖系列性細胞である。明らかに、成体組織で生殖器官内の生殖系列幹細胞が異なる発生段階のどこかに存在し、またはその代わり、それらが成長因子シグナルおよび／または転写因子に応答する様々な能力を有する。
【０１２３】
材料および方法
精巣細胞の単離：新生児マウス（生後２‐５日）または成体マウスの精巣が無菌で体から取り出された。精巣の被膜が除去され、ＰＢＳに１ｍｇ／ｍＬでコラゲナーゼ１Ａおよび１０ユニット／ｍＬでデオキシリボヌクレアーゼを含む酵素用溶液に、精細管が懸濁された。精巣は、全ての管が分解されるまで水槽内で３７℃で分解された。反応は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で停止された。
【０１２４】
マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）支持細胞層の調製：ＭＥＦは、１２．５ｄｐｃのＣＤ‐１マウスの胚を用いて、標準的な方法で作製した。胚は、トリプシン処理前に取り出され、解離した細胞は、プレートあたり約１．５個の胚となるプレート濃度で、１５０ｍｍプレートにのせられた。初めにプレートにのせた後、ＭＥＦは、１：５に分配され、次に凍結された（継代１）。解凍されたＭＥＦ（Ｐ１）は、マイトマイシンＣ処理の前に増殖目的のために１回だけ継代された。ＭＥＦ支持細胞層が５０‐６０×１０３／ｃｍ２の密度でプレートにのせられた。新しいＭＥＦ支持細胞層が７‐１０日ごとに多能性の生殖細胞の培養のために用いられた。全ての動物実験は、実験動物の管理および使用のためのガイドライン（米国学術研究会議）に従った。
【０１２５】
テロメラーゼ活性および染色体分析の評価：テロメラーゼ活性を決定するために、細胞抽出物が生殖細胞株（１０継代かそれより多くの継代）から単離され、Ｏｃｔ‐４＋ｃ‐Ｋｉｔ＋で選別された細胞およびＯｃｔ‐４＋／ｃ‐Ｋｉｔ−で選別された細胞を１５０Ｕ／ｍｌでリボヌクレアーゼを含むＣＨＡＰＳ溶解緩衝液を用いて新鮮分離した。細胞溶解物は、１２０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離され、上清が−８０℃で保管された。タンパク質の濃度は、ＢＳＡを用いたブラッドフォード試薬を標準として評価された。テロメラーゼ活性は、ＴＲＡＰＥＺＥ検出キット（ケミコン社）を用いたＰＣＲに基づく評価で検出された。７５０μｇ／μｌの細胞抽出物２μｌが、ＴＲＡＰ反応緩衝液、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、基質オリゴヌクレオチド、テロメラーゼプライマー、内部標準プライマーおよびＴａｑポリメラーゼを含むＰＣＲ混合物に総容量で５０μｌになるように加えられた。陽性対照として、２μｌのｍＥＳＣ細胞抽出物が反応混合物に加えられ、ＣＨＡＰＳ溶解緩衝液単独および加熱不活性化したテロメラーゼが各実験試料に対する陰性対照として用いられた。各試料は、テロメラーゼの拡張のため、３０℃で３０分間保温され、ＰＣＲ増幅が行われた。染色体分析では、増殖細胞が０．１μｇ／ｍｌのＫａｒｙｏＭＡＸ  Ｃｏｌｃｅｍｉｄ（インビトロジェン社）の培養液中で３‐４時間保温され、増殖細胞が低張溶液（０．０７５ＭのＫＣＬ）に再懸濁され、室温で１０分間保温された。次に、細胞は冷却した固定剤（メタノール：酢酸が３：１）に再懸濁され、少なくとも３０分間、４℃で保管された。固定剤での洗浄に続いて、細胞は、清潔なガラススライドにのせられ、空気乾燥された。分裂中期の染色体が調製され、アプライド・スペクトル画像解析バンドビュー・デジタル画像システムを用いて核型が作成された。
【０１２６】
生体外での分化：胚様体（ＥＢ）を生成するために、ｍＧＳＣのコロニーがコラゲナーゼで分解され、１５％ＦＢＳを含むＰＭ（商標）培地（２００６年７月１７日に出願され同時係属している米国特許出願第１１／４８８，３６２号明細書に開示されており、その全体をここで参照することで本願明細書に援用される）の入った非接着培養プレートにおかれた。一部の実験では、ＥＢは、懸滴で形成された。３つの胚葉である細胞への分化において、マーカー決定のために３日おきに試料が取り出されながら、ＥＢが１５日間培養された。分化を誘導するために、ＥＢは、４日間ＰＭ培地で培養されてから、それらは、系統選択のために無血清のＮ１倍地で培養された：例えば、ＩＴＳ（１０ｍｇ／ｌのインシュリン；５．５ｍｇ／ｌのトランスフェリン；０．６７ｍｇ／ｌのセレンニウム）とフィブロネクチン（５０μｇ／ｍｌ）とを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン社）。５‐７日後、Ｎ１処理された細胞集合体が、神経前駆細胞の増殖のためにＮ２倍地の入ったゼラチンで被覆された培養プレートに移された（フィブロネクチンを含まず、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを加えたＩＴＳを含むＮ１倍地）。心筋細胞への分化のために、ＥＢが各種心原性化合物の存在下で２週間培養され、該化合物は、０．０６ＭのＤＭＳＯ、５ｍＭの５’‐アザ‐２’‐デオキシシチジン（ＡＺＡ）および２５‐５０μＭのカルディオジェノール‐Ｃを含む。分化の過程で、細胞の形態が解析され、ＲＴ‐ＰＣＲによる遺伝子発現解析および免疫組織化学染色のために試料が採取された。ｍＧＳＣの軟骨細胞への分化は、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ‐３βおよび２０％のＦＢＳを添加した軟骨形成誘導の培地（軟骨誘導性ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ、キャンブレックス社）を加えることによって誘導された。
【０１２７】
免疫細胞化学的（ＩＣＣ）および免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色：培養細胞が、４％のパラホルムアルデヒドで１０‐３０分間、室温で固定され、４℃でＰＢＳに保管された。蛍光免疫細胞化学のために、１×Ｃｙｔｏｐｅｒｍ‐ＰＢＳまたは０．２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ‐１００で１５分間、細胞が透過処理され、続いて２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２％（ｖ／ｖ）の標準ヤギ血清（ＧＳ）／１×Ｃｙｔｏｐｅｒｍ‐ＰＢＳで３０‐６０分間、どちらも室温で保温された。１次抗体は、最適な濃度で２％ＢＳＡ、２％ヤギ血清／１×Ｃｙｔｏｐｅｒｍ‐ＰＢＳで希釈され、かつ４℃で３時間反応させたか、またはブロッキング緩衝液で希釈され４℃に一晩置かれた。２回洗浄後、蛍光２次抗体が、適宜２％ＢＳＡ／２％ヤギ血清／１×Ｃｙｔｏｐｅｒｍ‐ＰＢＳで希釈され、４℃の暗室で１時間反応させられた。細胞は、ＰＢＳで２回洗浄され、顕微鏡解析までホイルで包まれて４℃に保管された。画像は、オリンパスＩＸ７１顕微鏡またはデジタル画像装置およびソフトウェアを備えるツァイスＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡を用いて記録された。
【０１２８】
明視野の免疫細胞化学のために、細胞は、１×ＰＢＳで１回洗浄された。内在性ペルオキシダーゼ活性が３％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ２で１５分間ブロックされ、続いて透過処理、２％ＢＳＡ／２％ＧＳ／１％Ｃｙｔｏｐｅｒｍ‐ＰＢＳで３０分間のブロッキングが行われた。１次抗体は、適宜２％ＢＳＡ／２％ＧＳ／１×Ｃｙｔｏｐｅｒｍ‐ＰＢＳで希釈され、４℃で３時間反応させられた。残りの染色は、ＡＢＣ染色キットを用いて製造者のマニュアルに従って完了された。可視化は、精製水に溶かしたジアミノベンジジン（ＤＡＢ）基質剤および５‐１０分間の反応で強調された。陰性対照には、１次抗体を加えなかった。
【０１２９】
フローサイトメトリー：ＳＳＥＡ‐１およびｃ‐Ｋｉｔを含む特異的抗体は、Ｉｎｆｌｕｘ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ（サイトピア社）でフローサイトメトリー解析のために最適化された。ｃ‐Ｋｉｔ選別のために、Ｏｃｔ‐４‐ＧＦＰ構成を含む新鮮分離された精巣細胞が抗ＣＤ１１７ＡＰＣ（ＢＤバイオサイエンス社）で染色された。いくつかの実験のために新鮮な生殖細胞のコロニーが分離され、細胞が抗ＳＳＥＡ‐１抗体で、続いて、ＰＥ‐Ｃｙ７と結合したヤギ抗マウスＩｇＭで染色された。
【０１３０】
遺伝子発現、刷り込み解析およびＧＦＰ増幅：全ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアジェン社）を用いて単離され、ＲＮＡがＲＴ‐ＰＣＲ、定量ＰＣＲまたはマイクロアレイ解析に用いられた。ＲＴ‐ＰＣＲのために、ｃＤＮＡがＳｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｋｉｔで合成され、ＰＣＲがＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼで実行された。全てのＰＣＲ反応は、酵素を活性化させるために、９５℃で１５分間の最初の反応で始めた。これに続いて９５℃で１５秒間の３５サイクル、適切なアニーリング温度で１分間、そして７２℃で１分間、さらに最後の反応のために７２℃で１０分間の１サイクルが続けられた。反応は、ｉＣｙｃｌｅｒ（商標）  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（バイオラッド社）を用いて行った。ＲＴ‐ＰＣＲの手順は、Ｏｃｔ‐４、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ‐１、Ｄｐｐａ５、Ｄａｚｌ、βアクチン、Ｎｋｘ２．５、ネスチン、Ｍａｂ２およびＧＦＡＰを含む特有のプライマーを用いて行った。内部対照に関しては、ＧＡＤＰＨが細胞試料に対するハウスキーピング遺伝子として用いられ、βアクチンまたはインターロイキン‐２（ＩＬ‐２）がマウス胚で用いられた。
【０１３１】
ｍＧＳＣおよびｍＥＳＣにおける刷り込みパターンがＰＣＲに基づく解析で決定された。二亜硫酸塩処理したＤＮＡ由来の各ジメチル化領域（ＤＭＲ）のＰＣＲ増幅が個別のプライマーによって実行された。刷り込まれた遺伝子の解析のためにＵＶＰ画像ソフトウェアがバンド強度の定量化に用いられた。ＧＦＰおよびＬａｃＺ増幅のために、キメラ胚由来の個々の組織が分離によって慎重に収集され、小片に細分化され、製造者のプロトコールに従ってＤＮＡの単離と精製のためにＤＮＡ抽出緩衝液（ＤＮｅａｓｙ  ｋｉｔ）に入れられた。
【０１３２】
精原幹細胞の移植：精子形成の再生に関するｍＧＣの機能性を調べるために、精原幹細胞移植が用いられた。２６‐２８週齢の免疫不全ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ）がブスルファン（４０ｍｇ／ｋｇ）で処理され、受容個体として用いられた。ブスルファン処理から１ヶ月後、２×１０５細胞が精巣網注射を介して精細管に移植された。４匹のマウスがｍＧＣ（ＧＦＰ選別細胞）を与えられた。他の４匹のマウスは新鮮分離されたＧＦＰ＋選別細胞を注射された。４匹のマウスは、新鮮分離されたＧＦＰ＋／ｃ‐Ｋｉｔ＋選別細胞を移植され、そして、４匹のマウスは、新鮮分離されたＧＦＰ＋／ｃ‐Ｋｉｔ−選別細胞を移植された。残りの４匹のマウスは、偽対照とし、注射されなかった。移植の１ヵ月後、動物は安楽死させられ、精巣が収集され、組織学的な評価に用いられた。移植の有効性を評価するために、精子形成を伴う管横断面の総数が計数された。
【０１３３】
奇形腫およびキメラ形成に関する精巣：奇形腫またはキメラを形成するｍＧＣの能力を調べるために、ＯＧ２マウス（ジャクソン研究所）がＲｏｓａ  ２６マウス（ジャクソン研究所）と交配され、新型（ＯＧ２‐Ｒ２６）が作製された。これらのマウスは、生殖細胞にＧＦＰおよびＬａｃＺ両方の構成を有している。培養は、上記のように行われ、新しいＯｃｔ‐４‐ＧＦＰ／ＬａｃＺ生殖細胞株が奇形腫およびキメラ形成の試験のために作製された。マウスのＯｃｔ‐４‐ＧＦＰ／ＬａｃＺのｍＧＳＣは、ヌードマウスの皮下、筋肉内、または精細管への注射により、生体内で奇形腫を形成する能力について評価された。奇形腫形成における陽性対照として、ＥＳ細胞が一部のマウスに注射された。皮下、筋肉内、または精細管への注射では、約１×１０６細胞が注射された。マウスが６週間後に安楽死させられ、精巣が形態および組織学的な解析のために収集された。
【０１３４】
マウスのＯｃｔ‐４＋／ＧＦＰ＋／ＬａｃＺ  ＧＳＣのキメラ細胞集団を形成する能力が宿主の未分化胚芽細胞に注射された後に、つまり桑実胚期の胚もしくは８細胞期の胚の凝集により決定された。１５‐２０個の未分化胚芽細胞の注射がＣＤ‐１マウスから得られた３．５日目の未分化胚芽細胞を用いて行われた。注射後、未分化胚芽細胞は、２．５日目の偽妊娠したＣＤ‐１の雌に移され（子宮の各突起に７‐８個の未分化胚芽細胞）、該雌は事前に精管切除された雄と交尾させておいた。ｌａｃＺ細胞の取り込みは、β‐ガラクトシダーゼ染色キット（シグマ社）によって、１２．５ｄｐｃのキメラ胚の異なる領域で検討された。加えて、ｌａｃＺおよびＧＦＰのＰＣＲが、Ｏｃｔ‐４‐ＧＦＰ／ＬａｃＺ細胞から形成されたキメラ胚の脳、心臓、肝臓および生殖隆起から単離されたＤＮＡに対して行われた。
【０１３５】
実施例２
霊長類の生殖系列幹細胞の単離、同定および特徴付け
休眠および活性化した分裂している生殖系列細胞は、マウスの精巣における２つの別々の細胞集団として存在するから（実施例１）、成体の霊長類の精巣にこれら２つの細胞集団が存在する可能性が調べられた。
【０１３６】
精子形成は、未分化の生殖細胞において高度に調節された過程であって、精原幹細胞（ＳＳＣ）分裂および精子を産生するための成熟に分類される。げっ歯類においてＡｓ（Ａｓｉｇｎａｌ）精原細胞は、自己再生および分化のどちらも可能なので、精子形成に関与する常在幹細胞であると考えられている。げっ歯類とは違って、霊長類およびヒト細胞の組織学的な研究は、精巣の精細管上皮の基底膜内に内在する核染色の異なる２つの別個のタイプ、例えばＡｄａｒｋおよびＡｐａｌｅ精原細胞とされるものを示した。
【０１３７】
以下には、マーカーおよび霊長類の精巣における生殖系列幹細胞の十分な精製のための単離方法が記載されている。
【０１３８】
アカゲザルの精巣が霊長類の生殖系列幹細胞の特徴付けに用いられた。免疫組織化学的な検討で、表面マーカーおよび蛍光活性化細胞の選別が、成体のアカゲザルの精巣由来の生殖系列幹細胞を同定すること、特徴付けることおよび十分に精製することに用いられた。各細胞集団における生殖系列幹細胞の存在は、テロメラーゼ、ＲＴ‐ＰＣＲおよび胚に特異的なマーカーであるＶＡＳＡおよびＳＳＣに特異的なマーカーＧＦＲ‐α１に対する免疫組織化学染色を用いて確認された。精原細胞の移植は、濃縮前後における細胞集団の機能的能力の決定に用いられた。
【０１３９】
免疫組織化学的な方法は、霊長類の精巣の生殖系列幹細胞を同定し、特徴付けし、局在を特定するために用いられた。これらの研究では、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）α６‐インテグリン、ＳＳＥＡ‐４およびＧＦＲ‐α１に対する特異的抗体が霊長類の精巣の組織切片を明確に染色するために用いられた。
【０１４０】
α６‐インテグリンに特異的な抗体は、精細管内の基底膜近傍に局在する細胞も精細管基底膜も染色した（図１８）。平均１３個のα６‐インテグリン＋細胞が、各精細管染色横断面にみられた。精細管切片では、α６‐インテグリン＋細胞の大部分がＶＡＳＡ＋であったことは、それら生殖系列幹細胞の状態を裏付けている。定量的に、管横断面ごとのα６‐インテグリン＋細胞は、ＧＦＲ‐α１よりも多くあったうえ、共局在研究は、α６‐インテグリン＋細胞の約６０％がＧＦＲ‐α１＋であったことを示した。霊長類の精巣に関してこれらを組み合わせた免疫組織化学研究は、精細管の基底膜近傍の細胞を明らかにし、該細胞は、α６‐インテグリンおよびＳＳＥＡ‐４細胞表面マーカーの共局在を有し、かつ生殖細胞特異的マーカーであるＶＡＳＡおよびＳＳＣ特異的マーカーであるＧＦＲ‐α１、例えば雄の生殖系列幹細胞で特異的に発現したマーカーを有する（図１９）。
【０１４１】
ＧＦＲ‐α１細胞表面マーカーは、精細管の基底膜に局在する細胞で特異的に発現した。また、ＧＦＲ‐α１＋細胞の全ては、生殖細胞特異的マーカーのＶＡＳＡに陽性だった。
【０１４２】
ＳＳＥＡ‐４＋細胞の全ては、成体霊長類の精細管の基底膜に局在し、かつそれら細胞は、ＶＡＳＡ染色で陽性だった。ＳＳＥＡ‐４＋細胞のほとんどは、α６‐インテグリン＋だった。ＳＳＥＡ‐４およびＧＦＲ‐α１の顕著な共局在がみられることは、ＳＳＥＡ‐４が生殖系列幹細胞に対する重要な細胞表面マーカーであることを示している。霊長類の精巣の組織横断面での精細管の基底膜における約４０％の精原細胞は、ＳＳＥＡ‐４を発現した。
【０１４３】
ｃ‐Ｋｉｔ＋細胞は、霊長類の精巣にはほとんど見られなかった。管横断面では、ｃ‐Ｋｉｔ染色が精細管の内腔に局在する細胞でのみ見られた。また、ｃ‐Ｋｉｔ＋細胞の全てがＶＡＳＡ＋であったことは、それらが分化した生殖細胞だったことを示している。精細管の横断面における基底膜に局在する細胞では、ｃ‐Ｋｉｔ染色が見られなかった。これらの知見は、霊長類における生殖系列幹細胞がｃ‐Ｋｉｔ−であることを示唆している。
【０１４４】
Ｎａｎｏｇは、霊長類の精巣で豊富に発現していた。Ｎａｎｏｇは、核染色として現れ、精細管におけるほとんど全ての生殖細胞でＶＡＳＡと共局在していた。Ｎａｎｏｇの発現は、基底膜の局在する未分化の生殖細胞と比較して、精細管の内腔に局在する高度な生殖細胞でより強かった。ＮａｎｏｇおよびＧＦＲ‐α１の共局在研究は、全ての生殖系列幹細胞がＮａｎｏｇの低い発現を示したことを明らかにした。
【０１４５】
ＣＤ‐９０抗体は、基底膜のみを染色し、精巣のいかなる細胞内構造も染色しなかった。
【０１４６】
霊長類の精巣試料に対する免疫組織化学的な特性評価は、成体の霊長類の精巣内の生殖系列幹細胞がα６‐インテグリン、ＳＳＥＡ‐４およびＧＦＲ‐α１に対して陽性でｃ‐Ｋｉｔに対して陰性であることを示した。
【０１４７】
安楽死させた３‐７歳のアカゲザル由来の精巣が外科的に取り出され；ペニシリン／ストレプトマイシン（それぞれセルグロ社およびインビトロジェン社）を添加したＰＢＳに入れられ、一晩のうちに氷上で輸送された。精巣嚢の外科的な取り出しの後、生体標本が組織学的および分子的解析のために取り出された。精細管組織の残りは、微細に細分化され、１５分間、往復式の３７℃の水槽内で、コラゲナーゼＡ（１ｍｇ／ｍＬ）（ロシュ社）およびデオキシリボヌクレアーゼ（１０Ｕ／ｍＬ）（インビトロジェン社）で分解された。コラゲナーゼ分解の後、未分解の組織が単位重力で沈降され、上清の細胞が除かれた。さらに未分解の組織が、２０分間、往復式の３７℃の水槽に置かれたＤＭＥＭ中で、１．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＡ、１．５ｍｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼ  タイプＶ（シグマ社）、０．５ｍｇ／ｍＬのトリプシン（ワーシントンバイオケミカル社）および１０ユニット／ｍＬのデオキシリボヌクレアーゼを含む酵素カクテルで分解された。分解されたおよび未分解の組織は、７０μｍのろ過器を通され、酵素を不活性化するためにＦＢＳ（ウシ胎仔血清；ハイクロン社）に入れられた。４００×ｇで１０分間遠心分離後、細胞沈殿物が１０％ＦＢＳのＤＭＥＭに再懸濁され、５％二酸化炭素／９５％空気の加湿培養器内で被覆された１５ｃｍの組織培養皿に入れられた。
【０１４８】
フローサイトメトリーが、成体霊長類の精巣の生殖系列幹細胞に特異的な細胞表面マーカーを同定するために用いられた（図２０）。非霊長類のＳＳＣにおける他の研究者からの報告に反して、新鮮分離された成体霊長類の精巣細胞は、上皮細胞接着／活性化分子（ＥｐＣＡＭ）を発現しなかった。しかし、生殖系列幹細胞は、ＧＤＮＦ受容体ＧＦＲ‐α１の細胞表面における発現のおかげで、成体霊長類の全ての精巣細胞の集団のごくわずか一部、全ての単離された精巣細胞の１％未満として同定された。同様に、げっ歯類の精巣の生殖系列幹細胞での結果に反して（実施例１）、新鮮分離された成体霊長類の生殖系列幹細胞は、ｃ‐Ｋｉｔを発現しなかった。しかし、成体霊長類の生殖系列幹細胞は（単離された精巣細胞の集団の約２％）、Ｄｏｌｉｃｈｏｓ  ｂｉｆｌｏｕｒｕｓの凝集素（ＤＢＡ）に結合する細胞表面糖質決定基、レクチンを発現した。さらに、成体霊長類の生殖系列幹細胞は、ＣＤ９、ＣＤ９０およびＣＤ４９ｆという細胞表面マーカーを発現した（図２１）。
【０１４９】
霊長類の生殖系列幹細胞の単離に関して、二重陽性であるＣＤ９０＋／ＣＤ４９ｆ＋細胞を同定するために、ｃ‐ＫｉｔがＣＤ９０＋とＣＤ４９ｆ＋とを両方ともプロットした陰性／親選別ウインドウに対して調べられた。生殖系列幹細胞の同定における二重陽性の細胞の選別は、成体霊長類の精巣の分離株における全ての細胞の約５．７７％という結果であった。後のＣＤ９０＋／ＣＤ４９ｆ＋二重陽性の細胞は、さらなる使用のために収集された。追加の精製は、ＳＳＥＡ４に対して陽性のｃ‐Ｋｉｔ−細胞を選択することで行われ、成体霊長類の精巣における全ての細胞の約２％を構成する２番目の十分精製された細胞集団を同定できた。さらに追加の精製が、ＣＤ９０、ＣＤ４９ｆおよびＳＳＥＡ４の全てに対して陽性だったｃ‐Ｋｉｔ−細胞を選択することで行われ、成体霊長類の精巣における全ての細胞の約１．４７％を構成する３番目の十分精製された細胞集団を同定できた。
【０１５０】
これらのフローサイトメトリーを組み合わせた解析は、成体霊長類の精巣から２つの異なる、次の特性を備える生殖系列幹細胞集団の同定および十分な精製をもたらした：つまり、（ａ）Ｔｈｙ‐１＋およびα６‐インテグリン＋細胞ならびに（ｂ）ＧＦＲ‐α１とＶＡＳＡといった細胞表面マーカーを両方発現し、かつ高いテロメラーゼ活性を備え、５０％を超える細胞がＧＦＲ‐α１およびＶＡＳＡの両方に陽性の細胞である細胞集団であるＳＳＥＡ‐４＋細胞。
【０１５１】
フローサイトメトリーおよび免疫組織化学染色をさらに拡張するために、新鮮分離された成体霊長類の精巣細胞が次のように選別された：（ｉ）α６‐インテグリン＋；（ｉｉ）ＣＤ‐９０＋；（ｉｉｉ）ＣＤ‐９０＋／α６‐インテグリン＋／ｃ‐Ｋｉｔ−（三重選別）；および（ｉｖ）ＳＳＥＡ‐４＋細胞。単離され、精製された、異なる精巣細胞の集団は、生殖細胞マーカーのＶＡＳＡおよびＳＳＣマーカーのＧＦＲ‐α１の存在について試験された（図２２）。非選別の細胞は、約７０％のＶＡＳＡ＋細胞を含むが、それらの細胞の１０％のみがＧＦＲ‐α１に対して陽性に染色された。α６‐インテグリンのみでの選別は、生殖系列およびＳＳＣマーカー両方を備える細胞、例えばＶＡＳＡ＋およびＧＦＲ‐α１＋細胞が４２．６％の集団の著しい増加をもたらした。また、ＣＤ‐９０のみまたはｃ‐Ｋｉｔ−との組み合わせ（三重選別）での選別は、それぞれ３０％および４６．４％までＶＡＳＡ＋／ＧＦＲ‐α１＋細胞を顕著に増加させた。ＳＳＥＡ‐４＋単独での選別もまた、生殖系列およびＳＳＣマーカーを発現する細胞の増加をもたらし、３７．５％の細胞にあたる選別された細胞の集団がＶＡＳＡ＋およびＧＦＲα‐１＋であった。
【０１５２】
霊長類の精巣細胞の異なる集団における機能特性が、化学治療の薬剤ブスルファンで処理された免疫不全ヌードマウスの精巣における精細管の基底膜を再配置する能力の試験によって、十分な精製の前後に決定された。本試験では、９６‐９８週齢の無胸腺ヌード雄マウスがブスルファン（４０ｍｇ／ｋｇ）で処理された。ブスルファン処理後１ヶ月で、２×１０５の成体霊長類の精巣細胞が精巣網への注射を介して精細管に移植された。これらの試験では、３匹のマウスが新鮮分離された非選別の細胞の移植を受け、；３匹のマウスが新鮮分離されたｃ‐Ｋｉｔ−／ＳＳＥＡ‐４＋の選別された細胞の移植を受け、；そして、３匹のマウスが新鮮分離されたｃ‐Ｋｉｔ−／ＳＳＥＡ‐４−の選別された細胞の移植を受けた。
【０１５３】
受容個体マウスの精巣において移植された霊長類の細胞をより確実に同定するために、生体染色色素カルボキシフルオレセイン二酢酸スクシニミジルエステル（ＣＳＦＥ）が蛍光マーカーとして用いられた。ＣＳＦＥは、酢酸基が細胞内のエステラーゼで開裂されるまで無色無蛍光の化合物であって、高い蛍光物質を産生する。後の蛍光物質は、よく保持され、アルデヒド固定剤で固定されたが、各細胞分裂において蛍光強度が急激に低下した。この生体染色のために、細胞が収集され、１％ＢＳＡを含む１×ＰＢＳで１回洗浄され、；次に１×ＰＢＳで１回洗浄され、；３７℃で１０分間、８μＭのＣＳＦＥを含む１×ＰＢＳで反応させた。結果として得られた生体染色された細胞は、２％ＦＢＳを含むＭＥＭα（インビトロジェン社）で洗浄され、；４００×ｇで５分間の遠心分離で収集され、；培地に再懸濁され、計数された。
【０１５４】
移植から２週間後、マウスが安楽死させられ、ＣＳＦＥ＋細胞のコロニー数が、マウスの精巣の組織切片において顕微鏡下で決定された（図２３）。理論上は、生殖系列幹細胞が約７２時間の細胞周期をもつならば、移植後２週間で細胞が２‐３回の細胞倍化を行い、約４‐８個の細胞から構成されるコロニーを形成する。統計解析については、分散分析が適用され、ｐ＜０．０５を有意とした。
【０１５５】
これらを組み合わせた移植研究は、ＧＦＲ‐α１およびＶＡＳＡマーカーを発現する細胞を含むＳＳＥＡ‐４＋のみがブスルファン処理されたマウスの精巣を再配置する能力を備えていたことを示した（図２４）。これらの知見は、これら細胞が原発性の生殖系列幹細胞であることを示す。
【０１５６】
各細胞集団の細胞分裂の状態を調べるために、２つの集団のＤＮＡ含有量が、フローサイトメトリーを用いて測定された（図２５）。この解析は、ＳＳＥＡ‐４＋の細胞集団が細胞周期のＧ０‐Ｇ１期の細胞に類似する細胞内のＤＮＡ含有量であったことを示した。一方、Ｔｈｙ‐１およびα６‐インテグリンといった細胞表面マーカーを有する細胞は、２つの個別の異なるＤＮＡ含有量であって、細胞周期のＧ０‐Ｇ１期またはＳ期のどちらかに類似していた。このデータは、ＳＳＣの細胞表面マーカーを伴うＳＳＷＡ‐４＋細胞の集団が生殖系列幹細胞前駆体の休止している集団であり、一方、Ｔｈｙ‐１＋およびα６‐インテグリン＋細胞の集団が活発に分裂するＳＳＣの集団であることを示す（図２７）。
【０１５７】
この結果は、成体霊長類の精巣内の生殖系列精原幹細胞がげっ歯類のＳＳＣと類似するが区別できる分子および表現型の特性を有していることを明確に示す。様々な幹細胞、生殖細胞および精原幹細胞に特異的なマーカーを用いた免疫組織的な検討は、霊長類のＧＦＲ‐α１が精細管の基底膜の精原幹細胞の表面で特異的に発現することを明らかにした。ＧＦＲ‐α１は、ＳＳＣの自己再生の重要な調節因子であるＧＤＮＦに対する受容体である。ＧＦＲ‐α１＋細胞がＶＡＳＡ＋であることは、それらが幹細胞であることを示唆している。ＧＦＲ‐α１とα６‐インテグリンとの共局在は、成体霊長類の精細管内に存在する細胞の８０％であった。α６‐インテグリン＋細胞を選択することで濃縮される細胞集団は、ＧＦＲ‐α１との共局在をかなり高いレベルで示したことが、精巣切片における生殖系列幹細胞を同定するための免疫組織化学的な方法を用いたこの結果を支持する。霊長類のＳＳＣにおけるα６‐インテグリンの発現は、マウス、マーモセットおよびヒトのＳＳＣが細胞表面にこのマーカーを有しているため、このマーカーが当該種間で保存されていることを示唆している。管の外側の間質細胞にα６‐インテグリン＋細胞がある程度局在していることは、このマーカー単独では、成体霊長類の精巣からＳＳＣの高度に純粋な集団の単離に用いられないことを示す。
【０１５８】
ＳＳＣは、全てではないがある程度、他の幹細胞、特に造血幹細胞と表現型および分子特性を共有する。種々の細胞表面マーカーを用いたフローサイトメトリーは、成体のアカゲザルの精巣に、α６‐インテグリンおよびＴｈｙ‐１を発現する異なる細胞集団があり、霊長類の精巣における細胞のほとんどがｃ‐Ｋｉｔ−だったことを明らかにした。また、霊長類の精巣の免疫組織化学的染色が精細管の基底膜の全ての細胞がｃ‐Ｋｉｔ−であったことを示し、このことは、α６‐インテグリン＋細胞がｃ‐Ｋｉｔ−であることを示唆している。α６‐インテグリンまたはＴｈｙ‐１単独による選別は、免疫組織化学的染色、ＲＴ‐ＰＣＲおよびテロメラーゼ試験で示されたように、ＳＳＣのマーカーの濃縮をもたらした。興味深いことに、α６‐インテグリン＋、Ｔｈｙ‐１＋およびｃ‐Ｋｉｔ−細胞の選別は、定量的ＲＴ‐ＰＣＲで示されたように、ＳＳＣマーカーＰＬＺＦの最も高い発現レベル（図２６Ａ）および最も活性化されたテロメラーゼ活性（図２６Ｂ）をもたらしたことは、これらのマーカーの組み合わせがＳＳＣを数倍濃縮することを示唆している。さらに、霊長類の精巣におけるＳＳＥＡ‐４＋細胞の確実な集団も存在し、これらは、高レベルのテロメラーゼ活性と生殖およびＳＳＣのマーカー両方の高いレベルの発現とを示した（図２８）。
【０１５９】
免疫組織化学的な染色は、ＳＳＥＡ‐４＋細胞が精細管の基底膜にも存在し、α６‐インテグリンおよびＧＦＲ‐α１とよく共局在していることを示した。フローサイトメトリー解析は、成体霊長類の精巣に、５‐７％のα６‐インテグリン＋、Ｔｈｙ‐１＋、ｃ‐Ｋｉｔ−で選別された細胞が存在する一方で、２‐３％のみのＳＳＥＡ‐４＋細胞が存在することを示した。また、これは、管横断面ごとにみられるα６‐インテグリン＋細胞よりもＳＳＥＡ‐４＋細胞のほうが顕著に少ないことを示す精巣切片における免疫組織化学染色のデータとも一致する。また、これは、霊長類の精巣におけるＳＳＣがＳＳＥＡ４＋とともに、α６‐インテグリン＋、Ｔｈｙ‐１＋およびｃ‐Ｋｉｔ−の表現型の特性を有することも示す。ＳＳＥＡ‐４は、段階特異的な胚の抗原であって、胚幹細胞のような多能性細胞で主に見られる。興味深いことに、ＳＳＥＡ‐４−細胞の全ては、生殖細胞マーカーのＶＡＳＡを共発現したが、これら細胞のごく一部がＧＦＲ‐α１と共局在することは、このマーカーがサルの精巣における精原幹細胞の分集団でのみ発現することを示唆している。
【０１６０】
核染色の強度に基づく霊長類の精巣に関する形態解析は、この種に２種類の未分化の精原細胞があることを示し、ＡｄａｒｋおよびＡｐａｌｅ・Ａｄａｒｋ精原細胞は、予備の幹細胞であって活発に分裂しないと考えられ、Ａｐａｌｅ精原細胞は、霊長類の精巣において活性のあるＳＳＣになることが見られる。
【０１６１】
フローサイトメトリーと組み合わせたＤＮＡ染色のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いることで、生殖系列幹細胞のＳＳＥＡ‐４＋の集団がＴｈｙ‐１＋、α６‐インテグリン＋細胞と異なるＤＮＡ含有量であることが見出された。ＳＳＥＡ‐４＋細胞は活発に分裂する細胞に類似したＤＮＡプロファイルを有するが、Ｔｈｙ‐１＋、α６‐インテグリン＋細胞は細胞周期のＳ期で停止した細胞数の蓄積を示した。さらに、ＳＳＥＡ‐４＋細胞は、ＰＣＮＡ染色で示されるようにＴｈｙ‐１＋、α６‐インテグリン＋細胞よりも顕著に高い増殖活性を示した。
【０１６２】
未分化状態でＥＳ細胞を維持する不可欠な役割を有する多能性のマーカーＮａｎｏｇは、霊長類の精巣で豊富に発現していた。ＳＳＣのみでなく、全ての生殖細胞におけるＮａｎｏｇの発現は、ＥＳ細胞と比較して、生殖系列幹細胞でのこの転写因子としての異なる役割を示している。生殖細胞内のＮａｎｏｇの消失が分化よりはむしろアポトーシスを誘導することは、Ｎａｎｏｇが生殖細胞において生存因子であることを示唆している。
【０１６３】
成体マウスの精巣内の３０００個の細胞のうちの１個がＳＳＣであることが示されている。ＳＳＣ特異的マーカーＧＦＲα１およびＰＬＺＦでの免疫組織化学染色に基づく成体のサルの精巣におけるＳＳＣの割合は、げっ歯類について記載されたものに類似する。また、精原細胞の移植研究は、成体のサルの精巣において、約０．３％のＳＳＣの存在を示した。
【０１６４】
ここで示されたことは、３重染色（ＣＤ９０＋、ＣＤ４９ｆ、ｃ‐Ｋｉｔ−）の細胞およびＳＳＥＡ‐４＋細胞がＳＳＣの分子および表現型の特性を示すが、ＳＳＥＡ‐４＋細胞のみが精原細胞の移植後に受容個体の精巣を再配置したことである。これは、ＳＳＥＡ‐４＋細胞が活発に分裂するＳＳＣに相当し、３重染色の細胞が休止した幹細胞に類似することを示す。興味深いことに、ＳＳＥＡ‐４および３重染色の細胞はどちらも、ＧＤＮＦの受容体Ｃ‐Ｒｅｔを発現したが、３重選別された細胞のみがＰＬＺＦの発現を示した。ＧＤＮＦおよびＰＬＺＦ両方は、精原幹細胞の自己再生における主要な調節因子であることが知られている。ＧＤＮＦは、ＢＣＬ６ｂ転写因子の上方調節を介してＳＳＣの自己再生を維持するが、ＰＬＺＦは、いまだに未知の機序でＳＳＣの自己再生を維持する。前骨髄球性白血病ジンクフィンガータンパク質（ＰＬＺＦ）は、様々な細胞のタイプで利用可能なサイクロンＡの抑制によって、Ｇ１／Ｓ移行およびＳ期への移行で細胞増殖を阻害することが示されている。また、ＰＬＺＦは、Ｇ１／Ｓ移行の他の調節因子であるＰ２１を阻害することが示されている。したがって、ＰＬＺＦの高いレベルは、細胞周期および休眠の阻害をもたらす。レチノイン酸受容体α（ＰＡＲ‐α）は、サイクリンＡの発現を増強することでＰＬＺＦによって誘導された細胞周期の阻害を回復することが示されている。
【０１６５】
材料および方法
フローサイトメトリーによる霊長類の生殖細胞の十分な精製：フローサイトメトリー選別がＩｎＦｌｕｘ細胞選別器を用いて行われた。表面の特徴付けおよび選別のために、非霊長類で幹細胞表面マーカーおよび精原幹細胞マーカーに特異的な、抗ＣＤ９０‐ＦＩＴＣ、抗ＣＤ４９ｆ‐ＰＥおよび抗ＣＤ１１７‐ＡＰＣを含む抗体試薬で細胞が染色された。これらのマーカー解析のために、細胞は、氷上、完全培地中で３０分間染色され、冷やした染色緩衝液で１回洗浄され、完全培地に再懸濁され、細胞蛍光分析まで氷上で維持された。
【０１６６】
霊長類の生殖細胞の磁化選別：霊長類の生殖細胞の集団が磁化微粒子によって標識され、磁化カラムに細胞が通されて濃縮された。新鮮分離された霊長類の精巣細胞は、ＳＳＥＡ‐４またはα６‐インテグリンとＴｈｙ‐１とに対するビオチン化抗体（それぞれイーバイオサイエンス社、アブカム社、ＢＤファルミゲン社）で標識された。ビオチン化されると、細胞はストレプトアビジン磁化微粒子（ミルテニーバイオテク社）で標識された。磁化で標識された細胞は、磁石を備えるカラムに細胞を通すことで選択された。磁化で標識された細胞は、磁石からカラムを取り外し、カラムから洗い落として細胞を開放することによってカラムから取り出された。この作業は、各マーカーに対して陽性の細胞の集団を、新鮮分離された細胞における元の割合に対して２２倍まで濃縮することに成功した。さらに、磁化選別は、９０％という高さで純粋に標識された細胞をもたらした。この濃縮工程は、蛍光フローサイトメトリーと併用された。蛍光フローサイトメトリーを実行する前の磁化による細胞単離選別によって、蛍光で標識された細胞を選別するのに必要な時間が減り、蛍光で標識された選別可能な細胞の数が大きく増加した。
【０１６７】
霊長類の生殖細胞の免疫組織化学的染色：組織は、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦ；エレクトロンマイクロスコピーサイエンス社）で一晩かけて固定され；２０％スクロース（シグマ社）に移され、ＯＣＴ（ＶＷＲ社）で凍結された。低温切開片は８μｍの厚さに作製され、−８０℃に保管された。保管された細胞は、４％ＰＦで固定され、約２５，０００細胞／１０μｌで１００ｍＭのスクロースに再懸濁され；１０μｌの分割量がオルニチン／リシンで被覆されたガラススライドにのせられ；そして、スライドが乾燥するまで３７℃の保温プレートに置かれた。スライドは、解析まで−８０℃に保管された。
【０１６８】
免疫組織化学染色のために、精巣切片の細胞およびＦＡＣＳで選別された試料が、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ‐Ｘ１００を用いて透過処理され、２％ＢＳＡおよび５％ヒツジ血清を含む溶液、または２％ＢＳＡ、５％ヤギ血清および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ‐Ｘ１００を含む溶液のどちらかでブロック処理された。ＤＡＰＩ（インビトロジェン社）が核の可視化に用いられた。１×ＰＢＳ＋２％ＢＳＡで複数回洗浄した後、細胞は、Ｐｅｒｍａｆｌｕｏｒ（ベックマンコールター社）を用いて保存された。組織切片および選別された細胞の表面マーカーの分布は、ＳｌｉｄｅＢｏｏｋ（商標）画像ソフトウェアで調整されたオリンパスＢＸ‐１６顕微鏡を用いて評価された。マウスまたは霊長類の組織における霊長類の精巣細胞に関して、５０個の異なる精細管が解析された。個々のマーカー染色作業それぞれについて、３個から４個の異なる切片が解析され、ＦＡＣＳ細胞試料に関しては、少なくとも２００個の異なる細胞が少なくとも３つの異なる分割量で解析された。
【０１６９】
霊長類の生殖細胞のＲＮＡ抽出、ＲＴ‐ＰＣＲ解析およびＱＲＴ‐ＰＣＲ解析：細胞内の全ＲＮＡがＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（キアジェン社）を用いて製造者の説明に基づいて単離された。そして、単離されたＲＮＡは、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  ＲＴキット（キアジェン社）を用いてＤＮＡに転写され、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  精製キットで精製された。各ＲＴ‐ＰＣＲ反応において、２０ｎｇのＤＮＡテンプレートが、ＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ  Ｐｌｕｓおよび異なる各プライマーと合わせて２５μＬの反応用量で用いられた。全ての標的ｃＤＮＡが３０サイクルで増幅された。増幅産物は、２％アガロースゲルにおけるサイズで同定された。ＱＲＴ‐ＰＣＲに関して、５ｎｇのｃＤＮＡテンプレートが、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（キアジェン社）およびバイオラッド社のｉＣｙｃｌｅｒを用いて増幅された試料と合わせて２５μＬの反応用量で用いられた。各試料は、３重に試験され、ＧＡＰＤＨ対照で標準化された。
【０１７０】
霊長類の生殖細胞のテロメラーゼ試験：ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎリアルタイム定量的テロメア反復の増幅プロトコール（ＲＱ‐ＴＲＡＰ）が用いられた。組織または細胞沈殿物がＰＢＳで１回洗浄され、再懸濁され、そしてＲＮａｓｅｏｕｔ阻害剤（インビトロジェン社）を含む１×Ｃｈａｐｓ溶解緩衝液内で、終濃度が１０００細胞／μＬおよびＲＮａｓｅｏｕｔ阻害剤が４００ユニット／ｍＬで均質化された。氷上２５分間の反応後、細胞溶解物が微小遠心管を用いて４℃で１０分間、１６，０００ｒｐｍで遠心分離された。上清が新しい微小遠心管に移され、ＮＤ‐１０００分光光度計（ナノドロップ社）を用いて２８０ｎｍの吸光度を測定することでタンパク質濃度が決められた。テロメラーゼ反応の量は、５００ｎｇのタンパク質溶解物、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ｍｉｘ、１μｇのＴＳプライマー、０．５μｇのＡＣＸプライマーおよびヌクレアーゼを含まない蒸留水を含む溶液で２５μＬとした。各試料は、テンプレートのない対照（溶解緩衝液）、陽性対照（ＥＳＣ細胞）とともに３重に試験され、標準曲線は、１０００ｎｇ、２００ｎｇ、４０ｎｇ、８ｎｇまたは１．６ｎｇのタンパク質を含むヒトＥＳＣ溶解物の分割量から作成された。ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ５（バイオラッド社）を用いて、反応が２５℃で２０分間、９５℃で１５分間行われ、次のサイクル条件：９５℃で３０秒、６０℃で９０秒、のもとで４０回のＰＣＲサイクルで増幅された。サイクルの閾値（Ｃｔ）は、半対数増幅曲線（サイクル数に対する蛍光の対数の増加）から決定され、標準曲線と比較された。閾値に関するソフトウェアの初期値は、１サイクル目を除く最初の１０サイクルを通しての各ウェルの蛍光測定値における標準偏差の平均の１０倍であった。霊長類の精巣の異なる細胞試料におけるテロメラーゼ活性は、標準曲線で読み取られ、および／またはヒトＥＳＣ溶解物による標準で記録された値の割合として表された。
【表２】
2013514760.tif 000003
【０１７１】
実施例３
霊長類の生殖系列幹細胞の培養拡大
単離後の生殖系列幹細胞（実施例２）は、ＭＥＦプレートに移され、マウス血清非添加培地（ＭＳＦＭ）、ラット血清非添加培地（ＲＳＦＭ）またはＭＥＭ‐Ｘ（登録商標）のような異なる血清非添加の培地で培養された。細胞の形態変化およびウェルごとの生殖細胞のコロニー数が培養中に評価された。培地の半分が１日おきに換えられた。
【０１７２】
培養１０日後、平らなコロニーが全ての培地のタイプに形成された（図２９Ａ）。ＭＥＭ‐Ｘにおけるコロニーは、他の２つの培養培地よりもその形態を維持した。選別されていない集団にみられたコロニーの数は、選別された細胞よりも少なかった。試験された細胞表面マーカーの中では、ＳＳＥＡ‐４および３重選別された細胞がコロニーの形成をもたらした。３重選別された細胞からＳＳＥＡ‐４＋細胞を除くと、コロニーはほとんど形成されなかった；しかし、ＳＳＥＡ‐４＋細胞から３重選別の表現型を除くと、コロニー形成の能力に変化がなかった。ＳＳＥＡ‐４および３重選別で陽性の細胞は、培養において最も多くの数のコロニーを形成し、ＳＳＥＡ‐４および３重選別を除いた細胞は、いかなるコロニーも形成しなかった。そして、コロニーは、ＳＳＥＡ‐４（図２９Ｂ‐Ｃ）、ＧＦＲ‐α（図２９Ｄ）およびα６‐インテグリンで染色された。
【０１７３】
実施例４
げっ歯類の雌の生殖系列幹細胞の単離
出生後２‐５日の遺伝子操作された４０‐６０匹のＯＧ２子マウスからマウスの卵巣が、顕微鏡下の顕微解剖で取り出され、細胞の単離に用いられた。卵巣は、４ｍＭのＥＤＴＡを添加した冷たいＤ‐ＰＢＳを含む培養皿に最初に収集された。次に、５ｍｌのピペットを用いて、卵巣が５０ｍｌの円錐管に移された。遠心分離と洗浄の後で、Ｄ‐ＰＢＳ洗浄溶液が除去され、卵巣がコラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）およびデオキシリボヌクレアーゼ‐I（２０ユニット／ｍｌ）に再懸濁され；そして、３７℃の水槽に置かれた。１０分ごとに、分解している卵巣組織がピペットで物理的に破壊され、保温の最後に（３０分）５ｍｌのＦＢＳが酵素を中和するために加えられた。残りの細胞懸濁液は、組織の残骸を除くために４０μｍのろ過器に通され、単離された細胞は４００×Ｇで１０分間の遠心分離で集められた。上清の酵素‐ＦＢＳ溶液が除かれ、細胞が培養培地に再懸濁され、使用するまで氷上で維持された。
【０１７４】
卵巣の生殖系列幹細胞がフローサイトメトリーによるＧＦＰ陽性の細胞を収集することで十分に精製され、フローサイトメトリーでは、緑色蛍光強度を同定し（図１１Ａ）、ｃ‐Ｋｉｔに対する３種のチャネル（Ｒ２、Ｒ３およびＲ４）が調べられ（図１１Ｂ）；さらにｃ‐Ｋｉｔの強度についてＲ３を選別した（図１１Ｃ）。
【０１７５】
フローサイトメトリーの使用で、ＧＦＰ／Ｏｃｔ‐４＋細胞が新生児（図１１Ａ）および成体（図１１Ｂ）のマウスで検出されたことは、出生後の卵巣における生殖系列幹細胞の存在を示唆している。マウスの卵巣での生殖系列幹細胞の割合は、年齢とともに顕著に減少した。１‐２％のＧＦＰ＋細胞が新生児マウスの卵巣で見られたが、０．０５％だけが成体の卵巣に存在した。Ｏｃｔ‐４＋細胞では、６０％が陰性または低いレベルのｃ‐Ｋｉｔを発現し、４０％が高いレベルのｃ‐Ｋｉｔの発現を示した（図１１Ｃ）ことは、生殖系列幹細胞に２つの集団があることを示している。免疫組織化学的な解析は、ＧＦＰ‐Ｏｃｔ‐４＋細胞が卵巣上皮のいたるところに存在すること明らかにした(図１２Ａ‐１２Ｃ)．ＲＴ‐ＰＣＲ解析は、新生児マウスの卵巣から単離されたＧＦＰ＋細胞が多能性マーカーＯｃｔ‐４およびこの集団に生殖系列細胞の存在を裏付ける生殖細胞マーカーＶＡＳＡおよびｃ‐Ｋｉｔのどちらも発現したことを示したが、ＧＦＰ−細胞は、生殖細胞マーカーの発現のみを示した（図１３）。
【０１７６】
予想に反して、新鮮分離された成体又は新生児の卵巣細胞は、かなり低いテロメラーゼ活性を示した。しかし、ＲＴ‐ＰＣＲ解析は、ＧＦＰ＋細胞が培養開始時に、ＥＳＣのように、Ｏｃｔ‐４を発現することを確認した（図１３）。ＧＦＰ＋細胞は、Ｏｃｔ‐４を発現したが（図１３、５レーン）、ＧＦＰ−細胞は発現しなかった（図１３、レーン６）。ＧＦＰ＋細胞は、ＧＦＰ−細胞よりも高いレベルのＶＡＳＡを発現した（図１３、レーン５）。ＧＦＰ−細胞は、ＧＦＰ＋細胞よりも高いレベルのｃ‐Ｋｉｔを発現した。
【０１７７】
いくつかの先行する科学文献では、マーカーｃ‐Ｋｉｔは、雄の生殖系列幹細胞に関連があるとされている。Ｏｃｔ‐４＋細胞では、６０％が陰性または低いレベルのｃ‐Ｋｉｔを発現し、４０％が高いレベルのｃ‐Ｋｉｔを発現した。新生児マウスの卵巣から単離されたＧＦＰ＋細胞は、多能性マーカーＯｃｔ‐４および生殖細胞マーカーＶＡＳＡおよびｃ‐Ｋｉｔのどちらも発現した。組み合わせた結果は、ＯＧ２マウスの卵巣から単離されたＧＦＰ＋細胞の集団における生殖系列幹細胞の存在を確認した。
【０１７８】
ＭＥＦの支持層で培養されたＧＦＰ＋細胞は、円形で平らなコロニーを形成し、そういったコロニーははっきりと明確な境界を有していたが（図１４Ａ‐１４Ｃおよび１４Ｅ）、他は違った（図１４Ｆ）。明確な境界および不明確な境界を有するコロニーの代表が回収され（図１４Ｂ）、コラゲナーゼを用いてＭＥＦで継代された（図１４Ｄ）。継代後、細胞は、さらに類上皮の形状をした平らな密集した細胞で囲まれた小さな円形細胞の締まった楕円形の中心グループとして認識可能な特徴のあるコロニーを作った（図１４Ｇ‐１４Ｉ）。このコロニーの出現は、４回の継代を超えて継続した（図１４Ｊ‐１４Ｋ）。
【０１７９】
予想通り、ＧＦＰ＋の卵巣細胞のコロニーはＯｃｔ‐４に対して陽性であった（図１５Ａ）。生殖系列細胞としての同定を支持することとして、それらのコロニーの細胞は、多能性の転写因子Ｎａｎｏｇに対しても陽性に染色された（図１５Ｂ）。さらに、これら細胞は、生殖系列特異的マーカーＶＡＳＡ（図１５Ｃ）および幹細胞マーカーアルカリホスファターゼ（図１５Ｄ）も発現した。これらを組み合わせた結果は、雌の生殖系列幹細胞の組織培養における単離、同定、特徴付けおよび継代を確認した。
【０１８０】
ＧＦＰ＋のコロニーは、コラゲナーゼを用いた酵素分解に耐性があり、新たなコロニーを形成した。しかし、それらは、トリプシン処理に耐性がなく、コロニーの大部分は、トリプシン処理後に分化した。ＧＦＰ−細胞は、生殖細胞マーカーのみを発現し、幹細胞マーカーは発現しなかった。ある程度の継代後（例えば、１５継代）、これらの分化したコロニーは形態を維持したがほとんどの細胞はＧＦＰを発現しなくなったことは、Ｏｃｔ‐４プロモータの下方調節および分化の可能性を示唆している。各コロニーのほんの少数の細胞、主にコロニーの中央にある大細胞は、ＧＦＰの発現を示した。経時的に、ＧＦＰ＋細胞は、かなり大きな４０μｍ以下の、卵胞に類似する形態を有する構造体に内在した楕円形の細胞を形成した（図１６Ａ、１６Ｂ）。結局は、楕円形のＧＦＰ＋細胞は、コロニーから分離し、例えば一次卵母細胞の外見を呈する（図１６Ｃ）。全体として、この結果は、単離され、十分に精製された卵巣の生殖系列幹細胞が分化し、生体外で一次卵母細胞になるまで成熟するという考えを支持する。
【０１８１】
これらの大きな卵母細胞様の細胞の存在および特性は、次のように図１６の培養からそれらを実質的に単離することおよび精製することで確認された：粒子を区別する標準的なフローサイトメトリーを用いて、１５マイクロメートル（μ）かそれ未満の全ての事象を示すゲートが形成され（Ｒ１）；ＭＥＦ細胞は、Ｒ１に蓄積した全ての均質化した集団であった（図１７Ａ）；図２０６の生殖細胞培養におけるかなりの数の大細胞（＞１５μ）がＭＥＦに成長した（図２０８Ｂ）。これらの細胞の一部は、半径約６０‐７０マイクロメートルであった。
【０１８２】
材料および方法
卵巣の生殖系列幹細胞の培養：ＧＦＰ＋細胞は、４ウェルプレートのウェルごとに５０００‐１００００の濃度でＰＭ‐１（商標）培地内のＭＥＦ支持層で培養された。培養は、３７℃で維持され、１日おきに培地の半分が交換された。２週毎に細胞は、機械的に、または酵素を用いて（コラゲナーゼ）、新しいＭＥＦプレートに移された。
【０１８３】
卵巣の生殖系列幹細胞の特徴付け：新鮮分離されたＧＦＰ陽性細胞がテロメラーゼ試験および遺伝子発現解析に用いられた。卵巣の組織学に関して、卵巣が４℃で一晩かけて、１Ｍのスクロースを含む４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定され、低温保持装置用凍結培地に入れられた。５マイクロの切片が作製され、ＧＦＰ＋細胞の局在が蛍光顕微鏡を用いて決定された。卵巣における生殖系列幹細胞の局在は、Ｏｃｔ‐４およびＶＡＳＡの２重標識によって確認された。免疫細胞化学（ＩＣＣ）のために、培養された卵巣の生殖系列幹細胞が室温で３０分間、２％ＰＦＡで固定され、ＰＢＳで洗浄され、４℃で維持された。培養された卵巣の生殖系列幹細胞の特徴付けのために、ＶＡＳＡ、Ｏｃｔ‐４、Ｎａｎｏｇおよびアルカリホスファターゼ染色が、さらに以下に記載されるように明視野のＩＣＣを用いて行われた。
【０１８４】
ＲＴ‐ＰＣＲおよびＱＲＴ‐ＰＣＲ解析：細胞内の全ＲＮＡがＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（キアジェン社）を用いて製造者の説明に基づいて単離された。そして、単離されたＲＮＡは、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  ＲＴキット（キアジェン社）を用いてＤＮＡに転写され、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  精製キットで精製された。各ＲＴ‐ＰＣＲ反応において、２０ｎｇのＤＮＡテンプレートが、ＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ  Ｐｌｕｓおよび異なる各プライマーと合わせて２５μＬの反応用量で用いられた。全ての標的ｃＤＮＡが３０サイクルで増幅された。増幅産物は、２％アガロースゲルにおけるサイズで同定された。ＱＲＴ‐ＰＣＲに関して、５ｎｇのｃＤＮＡテンプレートが、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（キアジェン社）およびバイオラッド社のｉＣｙｃｌｅｒを用いて増幅された試料と合わせて２５μＬの反応用量で用いられた。各試料は、３重に試験され、ＧＡＰＤＨ対照で標準化された。
【０１８５】
実施例５
ヒト男性の生殖系列幹細胞の単離
ヒトの精巣が非閉塞性の無精子症の患者から収集され、また精巣摘出後に回収された精巣組織の残骸が本研究のために用いられた。全ての組織は、患者に対するインフォームドコンセントを得たうえで集められた。組織は、収集から２４時間以内に４℃の抗生剤入りＰＢＳに入れられた。ヒトの精巣組織の処理方法は、実施例２に記載された霊長類のものと同様である。
【０１８６】
細胞の単離の前に、組織試料がＩＣＣのために取られ、精巣の２つの小片がＲＮＡおよびＤＮＡ抽出のために取られた。細胞の単離および生存能力と細胞数の決定に続いて、試料がＲＮＡおよびＤＮＡ解析のために取られた。ＩＣＣの方法において、ＲＮＡおよびＤＮＡ抽出は実施例２に記載された霊長類の場合と同様である。さらに、細胞が霊長類の生殖系列幹細胞の分離のために以前開発された細胞表面マーカーの発現のために標識され、磁化細胞選別およびフローサイトメトリーで使用された。フローサイトメトリーで用いられた抗体および方法は、実施例２に記載された霊長類の生殖系列幹細胞の分離で用いられたものと同様である。
【０１８７】
また、生殖細胞の集団は、磁化微粒子によって標識され、磁化カラムに細胞が通されて濃縮された。新鮮分離された精巣細胞は、ＳＳＥＡ‐４またはα６‐インテグリンとＴｈｙ‐１とに対するビオチン化抗体で標識された。ビオチン化されると、細胞は、ストレプトアビジン磁化微粒子で標識された。磁化で標識された細胞は、磁石を備えるカラムに細胞を通すことで選択された。
【０１８８】
磁化で標識された細胞は、磁石からカラムを取り外し、カラムから洗い落として細胞を開放することによってカラムから取り出された。この作業は、各マーカーに対して陽性の細胞の集団を、新鮮分離された細胞における元の割合に対して２２倍まで濃縮することに成功した。さらに、磁化選別は、９０％という高さで純粋に標識された細胞を提供した。この濃縮工程は、蛍光フローサイトメトリーと併用された。蛍光フローサイトメトリーを実行する前の磁化による細胞単離選別によって、蛍光で標識された細胞を選別するのに必要な時間が減り、蛍光で標識された選別可能な細胞の数が大きく増加した。
【０１８９】
次に、選別された細胞は、ＲＴ‐ＰＣＲおよびＤＮＡ解析に用いられた。また、試料の一部が、受容個体として免疫不全マウスを用いた精原細胞移植試験に使われた。精原幹細胞移植の方法は、実施例１および２に記載されたマウスおよび霊長類のものと同様である。
【０１９０】
精巣の生検および精巣組織の残骸から調製された凍結切片の免疫組織化学染色は、精細管横断面の基底膜に多くのα６‐インテグリン＋細胞があることを明らかにした。また、ＳＳＥＡ‐４＋細胞およびＧＦＲα１＋細胞が精細管の基底膜にみられた。
【０１９１】
次にＩＣＣが行われた：ヒト全精巣組織（ＴＨＴ）がＳＳＥＡ‐４およびＶＡＳＡで染色された（図３０）；ＴＨＴはＧＦＲ‐αおよびＶＡＳＡで染色された（図３１）；ＴＨＴはＶＡＳＡおよびＮａｎｏｇで染色された（図３２）；ヒトｂＨＴ（生検精巣組織）はＳＳＥＡ‐４およびα６‐インテグリンで染色された（図３３）；ヒトの精巣切片からなる陰性対照は、２次抗体でのみ染色された（図３４）。ヒトＴＨＴ  ＳＳＥＡ‐４＋磁化粒子で選別された細胞が、ブスルファン処理された受容個体マウスの精巣に移植され、１ヵ月後に切り出され、次のマーカーで染色された：ＳＳＥＡ‐４およびヒト核タンパク質（ＨＮＰ，図３５）；α６‐インテグリンおよびＨＮＰ（図３６）；ＳＳＥＡ‐４およびα６‐インテグリン（図３７）。マウスの精巣切片における細胞を移植されたＴＨＴからなる陰性対照は、２次抗体での染色された（図３８）。全ての染色は、通常の核染色を含む。
【０１９２】
フローサイトメトリー解析は、免疫組織化学的な所見およびα６‐インテグリンに陽性の集団がヒトの精巣から収集された試料に見られたことを確認した。さらに、Ｔｈｙ‐１＋細胞の異なる集団が見られた。Ｔｈｙ‐１およびα６‐インテグリンの共局在は、ヒトの精巣内にＴｈｙ‐１＋細胞の３つの集団があることを示した：１）Ｔｈｙ‐１が中間でα６‐インテグリンが低い、２）Ｔｈｙ‐１が高く、α６‐インテグリンが中間、および３）Ｔｈｙ‐１が高く、α６‐インテグリンが陰性。α６‐インテグリン＋細胞のほとんどがＴｈｙ‐１−であった。また、ヒトの精巣でみられたＳＳＥＡ‐４＋（１０‐１２％）およびＧＦＲ‐α＋（１‐５％）細胞の明らかな集団が存在した。磁化選別がＳＳＥＡ‐４＋細胞の割合を４４％まで顕著に向上させたことは、このマーカーに対する４倍の増加を示唆している。
【０１９３】
定量的ＲＴ‐ＰＣＲ解析は、試験された試料において、ＳＳＥＡ‐４＋細胞およびＧＦＲ‐α＋細胞がＣ‐ＲＥＴ、ＰＬＺＦおよびＴＥＲＴを含む精原幹細胞マーカー、ならびにＶＡＳＡおよびＤＡＺＬを含む生殖細胞マーカーを、最も高いレベルで発現することを明らかにした。精原幹細胞移植はＳＳＥＡ‐４＋細胞が受容個体マウスの精巣に定着し、再配置することを明らかにし、これは、これら細胞が機能的に精原幹細胞であることを示唆している。
【０１９４】
不妊の雄マウスがドナーマウス由来の雄の生殖系列幹細胞（ＧＳＣ）の移植を介して生殖可能になること、さらにこれらのマウスが子を出産できることが示された。しかし、この方法で得られたマウスの性質は、これまで調べられていない。本研究の目的は、ＧＳＣ移植で得られたマウスの性質を調べ、親株の既知の成長パターンと比較することであった。図４５は、雄のＧＳＣの移植から得られたマウスの交配で作製された雄（図４５Ａ）および雌（図４５Ｂ）の１代交配種マウスの平均的な成長を示す。これらの成長のスピードは、製造元によって提供された親マウスの成長スピードと同程度である（データは示さず）。
【０１９５】
実施例６
ヒト精原幹細胞の表現型特性
ヒトの精巣細胞がＳＳＥＡ‐４に関する磁化選別によって精原幹細胞（ＳＳＣ）のために濃縮され、濃縮された集団が受容個体マウスの精巣に顕微注射された。移植から１ヵ月後、精巣が収集され、低温切開片が作製された。マウスの精巣におけるヒトの細胞の同定は、ａｌｅｘａ‐４８８に結合したヒト核タンパク質（ＨＮＰ）を用いて行われた。幹細胞、体細胞、幹細胞および多能性マーカーとＨＮＰとの共局在が、マウスの精巣におけるヒトのＳＳＣの表現型特性を評価するために用いられた。
【０１９６】
マウスの精巣におけるＨＮＰ染色で示されるヒト細胞の広範囲に及ぶ定着は、ＳＳＥＡ‐４磁化選別された細胞内にＳＳＣのかなり濃縮された集団が存在することを示唆している。マウスの精巣に定着したヒトの細胞の全ては、生殖細胞マーカーＶＡＳＡに対して陽性に染色され、精巣のセルトリおよびライディッヒ細胞に対するマーカーであるＬＨＲに陰性に染色された。これは、定着した細胞の全てが生殖細胞であることを示唆している。本研究で用いられたマーカーでは、表面において、ヒトの細胞の１５％のみがＳＳＥＡ‐４を発現し、３１％がα６‐インテグリンを発現し、それらの４５％がＧＰＲ１２５を発現した。マウスの精巣に定着したヒトの細胞のほとんど全てがｃ‐Ｋｉｔを発現したことは、このマーカーがＳＳＣの自己再生に必要であることを示唆している。精巣の多能性マーカーでは、Ｏｃｔ‐４＋またはＴＲＡ１‐６０＋細胞はみられなかったが、ヒトの細胞の２９％がＮａｎｏｇの発現を示した。これは、ヒトのＳＳＣに、多能性の特性を備える細胞の集団があることを示す。ＳＳＥＡ‐４細胞のほとんど全てがα６‐インテグリンに対しても陽性であった。また、ＳＳＥＡ‐４＋細胞の全てがｃ‐Ｋｉｔに対して陽性であったことは、ＳＳＣのｃ‐Ｋｉｔ＋の集団のみが受容個体マウスの精巣に定着する能力を有することを示唆している。
【表３】
2013514760.tif 000004
【０１９７】
本研究は、ヒトのＳＳＣがＶＡＳＡ＋、ｃ‐Ｋｉｔ＋、ＬＨＲ−、ＴＲＡ１‐６０−、Ｏｃｔ４−の表現型特性を備え、ヒトのＳＳＣの分集団がＳＳＥＡ４＋、α６‐インテグリン＋、ＧＰＲ１２５＋およびＮａｎｏｇ＋であることを明示する。これは、ＳＳＣの異なる集団がヒトの精巣に存在することを示す。
【０１９８】
ＶＡＳＡ、ＳＳＥＡ‐４、ＧＦＲαおよびα６‐インテグリンの共局在研究で示されたように、黄体形成ホルモン受容体（ＬＨＲ）は、サル、ヒトまたはマウスの生殖細胞に共局在しない。陽性細胞の局在および形態によって示されたように、ＬＨＲは、セルトリおよびライディッヒ細胞で発現する。コネキシン‐４３は、基底膜に局在する生殖細胞、セルトリ細胞と、おそらくライディッヒ細胞とを染色すると考えられる。
【０１９９】
実施例７
マウス効力試験‐生殖能力の評価
ドナー動物から不妊の受容個体の精巣への雄の生殖系列幹細胞の移植が上述された。ドナーの生殖細胞は、受容個体の精巣に定着し、受容個体の雄がドナーの生殖細胞の遺伝物質を分配できるようにドナー由来の精子を産生する。生殖細胞移植は、雄の生殖系列幹細胞に対する機能的な再構成試験を意味し、精巣における幹細胞の生態に関する我々の理解を非常に高め、不妊の表現型を定義する。最初にげっ歯類で開発され、その技術は、家畜哺乳動物、ニワトリおよび魚類を含むいくつかの動物種で今でも用いられている。動物におけるこの技術に関する主な用途：第１に、雄の生殖系列幹細胞の生物学および雄の生殖能力に関する基本的な側面の理解；第２に、同一種または異種間での雄の生殖細胞移植によって遺伝的に利用可能な個体の生殖能力を保存する、がある。従って、雄の生殖細胞の移植は、この研究、動物の雄の生殖能力の保存および取り扱いにおいて、比類なく価値ある方法である。
【０２００】
ＧＦＰ生殖細胞移植試験を確認するべく、ブスルファン処理されたマウスに移植するためにＧＦＰ生殖細胞の妥当な移植数が調べられた。ＧＦＰ生殖細胞の最適な移植細胞数は、雌のヌードマウスとＧＦＰを移植された雄のヌードマウスとを交配することで決定される。これらの交配由来のＧＦＰ＋の子孫は、移植されたＧＦＰ生殖細胞が生殖能力を回復させ、生存能力のあるＧＦＰ子孫を生みだすかを確定する。さらに、ＧＦＰ子孫は、以下に記載されるパラメータを、移植された全ての細胞および／または他のパラメータ（マーカー発現、精巣の重量等）と比較することによって、ＧＦＰ生殖細胞移植試験を確認するために用いられる。ＧＦＰ子孫が生まれた後、ＧＦＰ生殖細胞を移植された雄親由来のこれらのＧＦＰ子孫は、生殖能力およびヌードマウスと再度交配することによる次の子孫へのＧＦＰ染色細胞の生殖系列伝達を検証することに用いられる。
【０２０１】
ＧＦＰ＋の移植された雄のマウス個体それぞれは、４匹の雌のヌードマウスと交配される。２匹の雌がそれぞれの雄と毎晩交尾した。４匹の雌は、その発情周期に応じて毎晩入れ替えられた。雄は、３週間交尾し、１週間中止し、もし雌が膣栓を形成しなかったら、さらに３週間の交尾を開始する。この手順は、妊娠するために最適な機会を雌に与え、一方で、中止期間に、雄は継続的な交尾から正常な状態に戻る。毎朝、マウスは、交尾の成功の陽性指標としての膣栓を確認される。交配の手順は、移植後５‐７ヶ月間継続される。妊娠する雌がいなかった場合、交配はさらに２ヶ月間継続される。
【０２０２】
交配期間が終わると、交尾を終了し、ＧＦＰを移植されたマウス由来の精巣が、フロー解析、ＧＦＰに関する精子解析および組織学で調べられ、精巣で発現されるＧＦＰ＋とＳＳＣ＋の数が決定される。また、１代交配種である子孫は、蛍光およびＰＣＲを用いてＧＦＰに関して試験される。ヌードマウスは毛皮を有していないので、毛皮を有する子孫は全てＧＦＰ陽性の精子から生まれるはずである。
【０２０３】
生殖能力および１代交配種の子孫からのＧＦＰまたは毛色の生殖細胞系伝達を評価するために、それらは、生後２ヶ月まで成熟させられ、さらに２匹のヌードマウス（雄か雌）と２ヶ月間、妊娠能力を確認するために交配された。１代交配種マウスが２代交配種の子孫を産んだ後、２代交配種のＧＦＰ＋および／または毛色＋のマウスが蛍光およびＰＣＲでＧＦＰに関して選ばれる。これは、ＧＦＰ＋細胞の継代生殖細胞系伝達を検証する。さらに、ＧＦＰ＋であることが証明された２代交配種の子孫が安楽死させられ、組織学的検査のために収集され、ＧＦＰ＋精子の完全な形成が確認される。
【０２０４】
思春期前のマウスから単離された新鮮な精巣細胞は、ブスルファン処理されたマウスの生殖能力を回復することができ、そのマウスの８７％は、自然な交配または補助的な生殖技術を用いることで生殖能力を取り戻した。低温保存された精巣細胞が生殖能力を回復することができるか確かめるために、５‐８週齢の雄のヌードマウスがブスルファンで処理され、その動物は１ヵ月後に不妊となった。２‐５週齢の思春期前のＧＦＰ＋である子の細胞が凍結され、移植のために供与される細胞として用いられた。マウスは４つの治療計画：手動で凍結された細胞（５×１０５）を受けた９匹のマウス；凍結速度を調整できる凍結方法で凍結された細胞（５×１０５）を受けた９匹のマウス；手動で凍結された細胞（１．２５×１０５）を受けた９匹のマウス；および凍結速度を調整できる凍結方法で凍結されたより少ない個数の細胞（５×１０４）を受けた他の９匹のマウス；のうちの１つを受けた。移植の３ヵ月後、動物は、それぞれ２匹の雌と交尾し、交尾の効果が、栓の確認および妊娠の数によって評価され、ＧＦＰの子が記録された。生殖能力を取り戻したこれら動物のうち１匹は、ヌードの子を産んだものの安楽死させられ、ＧＦＰの精子の存在がフローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡を用いて決定された（図５３）。このフローサイトメトリー解析は、左の精巣にはＧＦＰ＋精子の小さな集団がある一方で、ＧＦＰ＋精子は、右の精巣で見られなかったことを示した。ＧＦＰ＋管がそのマウスの右および左の精巣両方でみられたことは、移植された細胞が生存し、受容個体の精巣に定着したことを示唆している。フローのデータによれば、精子の０．５％のみがＧＦＰ陽性である。
【０２０５】
実施例８
生存可能な子孫を産むための、ヒトもしくはマウスにおける精原幹細胞（ＳＳＣ）あるいは早期段階の精原細胞（ＥＳＳＣ）の生体外または生体内での成熟
哺乳類の精子形成は、有糸分裂の精子形成、減数分裂する精母細胞、および体細胞のセルトリ細胞に密接に関係する配偶子の成長において高度に同期している。精子形成は、主に内分泌因子および精巣の傍分泌／自己分泌成長因子によって調節される。これらの因子はセルトリ細胞、生殖細胞、尿細管細胞および間質細胞、主にライディッヒ細胞とマクロファージとによって産生される。精細管内のセルトリ細胞と生殖細胞との相互作用および比は、精子形成の成功を保証する。精原幹細胞（ＳＳＣ）の培養は、精巣内の幹細胞の数の少なさ、ＳＳＣを同定するための特異的マーカーがないこと、さらに培養においてＳＳＣを生存させて維持することの難しさ等のために妨げられる。最近、ＳＳＣの増殖と分化に重要な成長因子、例えばグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）および白血病抑制因子（ＬＩＦ）等が同定され；また、分化段階でのＳＳＣに対するマーカーが報告された。ＳＳＣの生体外での培養は、ＳＳＣの成長／増殖および分化の制御に関わる生体分子因子の研究において強力なツールとして用いられる。
【０２０６】
精原細胞の宿主外での成熟には３つの選択肢がある：（１）皮下または代理動物、好ましくは非ヒトの精巣において宿主外／生体内での成熟（同じ宿主への精原幹細胞の再移植または自己移植は、宿主外での成熟として見なされず、これは本明細書の他の部分でも記載されている）；（２）単離された精原細胞の宿主外／生体内での培養、または（３）精細管の宿主外での培養。様々な動物モデルにおける研究は、皮下の未成熟な段階由来の、または免疫不全マウスの精巣に移植された精巣断片の異種移植が顕著な進展、場合によっては完全な精子形成をもたらすことを示した。驚くべきことに、精巣の構造およびセルトリ生殖細胞の相互作用の完全な崩壊にも関わらず、マウスおよびウシにおいて、ＩＣＳＩは、これらの半数性の細胞が成熟した卵子を受精させ得ることを示した。精細管の培養の利点は、精細管の損傷のない構造が維持されることであり、これは、精細管が精巣内で精子産生の機能的な単位として考えられているからである。
【０２０７】
実施例９
極薄内視鏡での顕微注入技術を用いたヒト精巣への精原幹細胞の移植
ガラス毛管および解剖顕微鏡を用いた、げっ歯類における精原幹細胞移植技術は十年以上前に開発された。マウスでは、精巣の構造および大きさによって精巣輸送管を介して精巣網に接近することができ、精巣輸送管への単回投与で精細管の内腔に十分な数のＳＳＣの迅速でかつ確実な移植が可能となる。げっ歯類の精巣網は精巣の外から見え、精巣の動脈および静脈から十分離れた位置に局在している。
【０２０８】
しかし、さらに大きい哺乳動物では、精巣の構造と大きさとが異なる。第１に、精巣網は、精巣にあり、精巣に対する血液供給源のすぐ近くにある。第２に、精巣網を精巣上体につなげる複数の精巣輸送管がある。最後に、精巣の大きさは、精巣を満たすためにより多量の細胞懸濁液を必要とする（マイクロリットルではなくミリリットルの量）。ウシおよびサルでは、超音波誘導の方法が精巣へのＳＳＣの移植のために開発され、精巣内腔に大きな針を注射することによる。しかし、これらの方法は、効果がなく、侵襲的であって、どちらの方法でも場合によっては精巣網の損傷および出血をもたらす。
【０２０９】
また、ここで開示されるのは、ヒトの精巣に対する顕微注射装置であって、外部からヒトの精巣上体を含む精巣部位に達することができ、かつ個々の精巣輸送管に動くことができ、動脈および静脈を損傷せずに精巣網に達することを可能にする。この装置は、２つの部分：光源と操作者がカテーテルを導くことを可能にするカメラとを備える内視鏡のような毛細管カテーテル、および内部がより細く、精巣輸送管を通って精巣網に細胞懸濁液を移すカテーテルを含む。カテーテルは、小さい切開を介して精巣上体に挿入され、精巣輸送管に案内される。細胞注射の前に超音波造影液（レボビスト）が注射され、溶液が精巣網を経由して精細管に至ることを確認するために溶液の流量が超音波装置で監視される。
【０２１０】
この装置の利点は、非侵襲性でかつヒトの精巣内腔に確実に達することである。また、この装置は、男性の不妊の診断を目的として用いられ、例えば、閉塞性無精子症部位の正確な位置を見つける。また、この装置は、侵襲性が低い態様で精巣上体および精巣網からの細胞と組織との収集に用いられる。
【０２１１】
実施例１０
思春期前の男性の生殖系列幹細胞およびそれらの不妊治療での使用
血液感染性のがん、小児期によく見られるがんの治療は、全身の放射線と骨髄移植と組み合わされて、アルキル化剤を必要とする傾向にある。これらの治療は悪性細胞を破壊するだけでなく、早い分裂を示す精原細胞にも細胞毒性を有する。結果として、精子形成の欠如および不妊は、成人期に現れる。青年期および成人の男性は、がん治療前の精液の低温保存の選択肢があり、人工授精、ＩＶＦまたはＩＣＳＩによって、彼らは遺伝的に彼ら自身の子供の父親になることができる。
【０２１２】
思春期前の患者は、彼らが完全な精子形成をできないために、生殖能力を失う大きな危険に晒されている。彼らの精上皮は、幹細胞ではセルトリ細胞および精原細胞の異なるタイプだけを含む。成熟した配偶子がないので、未成熟な組織の低温保存が、現時点で若い少年の生殖能力が保存される唯一の手段である。
【０２１３】
精巣細胞移植は、様々な動物から供与された精巣を用いて行われ、ほとんどの場合、ドナーとして免疫障害を持つマウスを使う。受容個体がマウスだった実験でドナーとして用いられた動物は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ウシ、サル、およびヒトを含む。供与された精巣細胞由来の子孫は、マウスおよびラットでのみ見られた。
【０２１４】
思春期前の患者の生殖能力を保存する戦略は、生殖系列幹細胞の単離と低温保存を含む。これらの生殖系列幹細胞は、化学治療および／または放射線治療後の患者に自己移植される。しかし、がん患者からの生殖系列細胞の自己移植は、悪性細胞の伝達の危険をもたらす。したがって、生殖系列細胞は、悪性細胞から完全に分離されるべきである。ここで開示される方法は、フローサイトメトリー選別に基づき、生殖系列幹細胞を特異的に選択し、がん細胞からそれらを精製する。
【０２１５】
また、ここで開示されるのは、生殖系列幹細胞移植に関する生理的関連性試験である。当該試験の結果は、生殖能力を回復するのに必要とされる幹細胞の量を決定することを可能にする。さらにそれは、安定性、生存能力および組織の収集ならびに放出前の時点での生殖系列幹細胞の有効性を評価するために用いられる。マウスモデルが用いられるのは、この種の精原幹細胞における表面マーカーがかなり特徴付けられており、かつ移植技術が利用可能だからである。この移植技術は、ブスルファン処理された免疫不全マウスの精巣における生殖系列幹細胞の機能性を試験し、受容個体動物におけるドナー細胞の精子形成を完全に進行させることができる。
【０２１６】
１．精巣支持細胞に適した抗体の決定
【０２１７】
黄体形成ホルモン受容体（ＬＨＲ）は、幹細胞を体細胞から分化するための特異的なマーカーである。ＬＨＲのみが精巣内のセルトリ細胞およびライディッヒ細胞に結合する。
【表４】
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【０２１８】
２．がん細胞からの生殖系列幹細胞の分離
【０２１９】
この研究の目的は、生殖系列幹細胞を濃縮し、あらゆる腫瘍細胞を患者試料から除去することであって、混入しているがん細胞が臨床応用のために十分減らされるまでの選択方法を決定するために、異質の細胞集団から生殖系列幹細胞を特異的に選択および単離する方法が開発された。これは、腫瘍の増殖を始めるためにどれぐらいのがん細胞が必要かを評価することを含む。疾患の状態に応じて各患者を治療するために、疾患に特異的な免疫表現型検査のための方法が開発される。これを行うために、個別のがんのタイプに対する特異的な細胞表面マーカーの発現が評価され、患者試料からがん細胞を減らすために用いられた。
【０２２０】
この方法に主に関連するのは、生殖系列幹細胞の単離である。フローサイトメトリー選別による白血病マウスからの生殖細胞の陰性選択のための方法が、血液がん細胞で発現するＭＨＣクラス１および白血球共通抗原（ＣＤ４５）という２種類の表面マーカーに対する抗体で確立された。この方法によれば、マウスにおいて白血病を伝達することなく受容個体の精巣へのマウスの生殖系列細胞の移植を達成できる。さらに悪性細胞を除外するために、ヒトの生殖細胞は、ＣＤ９０、ＣＤ４９ｆ、ＳＳＥＡ‐４およびＧＦＲ‐αのような生殖細胞に対する特異的マーカーで陽性として選択される。さらに、倍数性検出のような、がんに対する他の指標が用いられてもよい。このモデルの目的は、患者にがんを再導入することなく生殖能力を回復することである。
【０２２１】
実験は、生殖系列幹細胞の陽性または陰性選択の実現可能性、腫瘍がマウスモデルに再移植されるときの閾値および疾患特異的な表面マーカーの発現トポロジーを評価する。
【０２２２】
３．精原幹細胞の効力検定
【０２２３】
ブスルファン処理された精巣における生殖能力を回復するための異なる生殖系列細胞の集団の能力について結論を得るには、効力検定が必要とされる。効率の増加を評価するために、各集団が陰性対照と比較された。また、これは、ライディッヒ細胞、セルトリ細胞または筋様細胞のように共に移植される細胞タイプの必要性について結論づける。生殖系列幹細胞を増加させることは、移植された細胞と生殖能力の回復に関してより高い有効性を生じるはずである。受容個体において供与された細胞を一義的に認識できるように、生殖系列幹細胞が遺伝子操作ＧＦＰマウス（ＮＡＧＹ、ジャクソン研究所）の精巣から単離される。思春期前のヒトの患者を模擬するために、生後７‐１０日の幼若マウスの雄が生殖系列幹細胞の収集のために用いられた。
【表５】
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【０２２４】
移植効果の解析：精子形成の活発な期間がマウスでは約３５日で終わるため、移植されたマウスの２匹全てが移植４週間後に安楽死された。精巣が取り出され、活発な精子形成の指標として体重が計測された。次に、精巣は、単個細胞懸濁液に分解され、ＧＦＰの発言がフローサイトメトリーで検出された。これによりドナー幹細胞に由来するＧＦＰ＋細胞の個数を決定できる。また、精巣は、ドナーおよび受容個体内に由来する生殖系列幹細胞の存在量についての結論を得るために、同じマーカーに関するフローサイトメトリーで評価される。
【０２２５】
生殖能力の回復の検出：残りの２匹のマウスが移植後８週の交配に用いられた。各雄は、２匹のヌード雌と交配された。誕生した子は、原株が何であったかを示すためにＧＦＰの発現または毛色が評価された。移植された各マウス由来の子は、結果として生じる異常について観察された。結果は表６に示されている。
【表６】
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【０２２６】
実施例１１
分化およびマウス卵巣の培養された生殖細胞の機能性試験
卵巣組織移植（ＯＴＴ）は、生殖能力の保存および卵巣の卵胞の増殖に対して普通の方法に次第になりつつある。その範囲は、早発閉経（ＰＯＦ）に関する形質が不一致の双生児でのＯＴＴや適合したドナーの卵巣組織を用いた卵巣発育不全の女性における卵巣機能（ＯＦ）の回復、例えば異種の移植を含む。他の応用例としては、健康な女性に対する生殖可能な期間の延長が主張されている。集められた卵巣組織の使用方法は、生体内／生体外での原始卵胞の成熟、卵巣組織の異種移植、または血液凝固血漿を用いながら生殖細胞をさらに分化させるための新しい方法を使用すること、さらに成熟および卵母細胞の成長のためにそれらを卵巣組織に移植することが可能性として考えられる。
【０２２７】
雌マウスのＯＧ２生殖細胞を卵胞および／または卵母細胞に分化する方法を開発するために、卵巣組織細胞とマウスＯＧ２生殖細胞を、ともに機能的な卵巣上の血液凝固血漿に移植する、またはヌードマウスの背の皮下領域に生着したそれらを成長させる。この実験の目標は、生殖細胞を未成熟なまたは成熟した卵母細胞に分化させるため、機能的な卵巣とともにそれを培養したうえで、移植媒体として凝固血漿の機能を決定することである。卵胞の成長の早期段階について試験するために、４つの細胞凝塊がヌードマウスの背の皮下領域に移植され、１つの凝塊が２８日間で７日に１回取り除かれ、その凝塊が組織学試験によって卵胞および卵母細胞への成長に関して調べられる。宿主の卵巣へともに移植された分化した移植細胞の機能性を試験するために、マウスが自然に交配され、分化可能で、受精可能で、そして移植細胞から生きた子を産み出すことが可能である等あらゆる機能的な卵母細胞があるか調べる。凝塊方法が分化と増殖を最も達成し得ることを検証するために、卵嚢および皮下領域において宿主の卵巣に共移植される４つの凝塊条件：１）ＭＥＦで培養された雌ＯＧ２のＧＳ細胞（０日目）；２）培養された雌ＯＧ２のＧＳ細胞由来の早期におけるＥＢ’ｓ（２日目）；３）培養された雌ＯＧ２のＧＳ細胞由来のＥＢ’ｓからの末期の卵母細胞様細胞（６日目）；４）生後４‐６日のＦＶＢ  ＧＦＰマウス由来の新鮮分離された卵巣細胞および卵胞（陽性対照として使用）が用いられた。
【０２２８】
方法
生殖細胞胚様体の形成：培養された雌のＯＧ２のコロニーを含む６ウェルプレートが〜８０％の集密で得られる（コロニーは相互に最低限で接触していた）。培地が吸引され、ウェルがＰＢＳで１回洗浄され、７００μＬの暖めたトリプシンが各ウェルに添加された。次に、プレートが４分間、３７℃のインキュベータ内に置かれる。６ウェルプレートの各ウェルは、ＭＥＦ支持層の雌ＯＧ２の細胞が洗い落とされ、さらにＭＥＦ支持層をできるだけ分解するためにすりつぶされる。各ウェルがすりつぶされた後、全てのウェルが、同量（４．２ｍＬ）のＰＭ１（商標）＋１５％ＦＢＳ＋ＧＦを含む５０ｍＬの円錐管にマイクロピペットで移された。１ｍＬのＰＭ‐１＋１５％ＦＢＳ＋ＧＦが６ウェルプレートの初めの３つのウェルを洗浄するために用いられ、前回のステップからの細胞と合わせられ、今回のステップが６ウェルプレートの最後の３つのウェルで繰り返される。次に、細胞は４００×ｇで５分間遠沈され、上清が真空吸引で吸引され、さらに２００μＬピペットが残りの上清を吸引するために用いられる。細胞は、β‐メルカプトエタノールおよびＧＦを含まない８ｍＬのＰＭ‐１＋１５％ＦＢＳに再懸濁される。２ｍＬのこの細胞懸濁液が６ウェルの非接着プレートの４ウェルそれぞれにピペットで分注され、プレートが２‐９日間、２日おきに５０％の培地を交換されながら３７℃のインキュベータに置かれる。培地は、ウェルに１０００μＬの培地をピペットで加えることで交換される。
【０２２９】
担持卵巣組織の分解：生後４‐８日のＬａｃＺ／Ｏｃｔ４  ＧＰＦ  ＯＧ２マウスが単離され、上質の解剖用はさみで切り取られる。切り取った卵巣は、５％ＦＣＳとコラゲナーゼ（１．５ｍｇ／ｍｌ）とを含む２ｍｌのＨＰＥＳ緩衝されたＤＭＥＭに移される。分解溶液中の卵巣は、１０分おきに穏やかにピペッティングされながら、３７℃の水槽の中で３０分間保温される。５％ＦＣＳを含む１２ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝されたＤＭＥＭが卵巣および分解混合物の分解の停止のために３０分後に加えられる。細胞は、８０×Ｇで１０分間、４℃で遠沈される。上清が除去され、細胞が遠心分離で２回洗浄される。
【０２３０】
分化のための生殖細胞と卵巣の支持細胞との混合物の調製
１個の卵巣由来の分解された細胞が各条件において生殖細胞のための支持細胞として用いられる。各条件からの１００ＫのＧＳ細胞が完全に分解されたＯＧ２／ＬａｃＺの卵巣細胞の沈殿物の１つに加えられる。ＧＳ細胞由来の末期のＥＢ（６日目）のみに対して、１００ＫのＧＳ細胞を用いる代わりに、１００の卵母細胞様細胞（４０‐７０μｍ）が手動で取り上げられ、完全に分解されたＯＧ２／ＬａｃＺの卵巣細胞の沈殿物に加えられる。細胞混合物は、穏やかなタッピングで完全に混合される。細胞は、８０×Ｇで１０分間、４℃で遠沈され、上清の全てが除去される。
【０２３１】
血液凝固血漿の作製：調整された細胞混合物は、８０×Ｇで５分間遠沈される。上清は慎重に除去され、２０μｌの静脈血漿が加えられる。細胞と血漿とをよく混合するためにやさしくタッピングすることで、静脈血漿に細胞が再懸濁される。２０μｌの血漿と細胞とを取り、６ｃｍの皿上に滴を形成し、１Ｍの塩化カルシウムを血漿滴に加える。皿に蓋をし、細胞を含む血漿滴を３７℃のインキュベータに置く。３０分間保温することで塊が形成される。３０分の保温後、塊はゼラチンのような堅さに硬化し、卵巣に隣接する卵嚢に移植できる状態になる。
【０２３２】
生殖細胞を含む静脈塊の卵嚢への移植：６‐８週齢のヌードマウスが０．５ｍｌのアバチンで麻酔される。７０％エタノールで受容個体マウスの背を拭き取り、上質の解剖用はさみによって、末端の肋骨の高さで正中線の近くで皮膚の２箇所を均一に小さく縦に（１ｃｍ未満）切開する（一方の切開が正中線の右側、他方が正中線の左側）。切開部がどちらも体壁を通して見える卵巣（オレンジ‐ピンク）または脂肪体（白）に重なるまで左または右に皮膚をずらす。次に、鉗子で体壁を持ち上げ、鉗子で卵巣のちょうど上を小さく切開する（大きい血管を避けながら）。ピンセットを用いて、脂肪体をつまみ、脂肪体に付着した左の卵巣、卵管および子宮を引き出す。脂肪体上に止血鉗子の留め具を滑らせ、卵巣、卵管および子宮が体壁の外側に維持されるように背にそれを据える。マウスをやさしく持ち上げ、左に頭を向けて立体顕微鏡のステージ上にそれを置く。慎重に卵巣に触れ、上質の解剖用はさみで卵嚢をわずかに切開する（２ｍｍ）。事前に作製した細胞を含む血漿塊を取り、卵巣の卵嚢におけるわずかな切開部に、慎重に塊が入れられる。鉗子を用いて、卵嚢の切開部に塊をやさしく置く。止血鉗子の留め具を緩め、立体顕微鏡のステージからマウスを降ろす。脂肪体を取り上げるために鉗子を用いて、卵巣、卵管および子宮を体壁の内側に戻す。１つまたは２つの縫い目（任意）で体壁を縫合し、創傷クリップで皮膚を閉じる。マウスの反対側（右側）でも繰り返す。翌日、移植されたマウスの一般的な健康を確かめる。移植から７日後に創傷クリップが外される。
【０２３３】
生殖細胞を含む静脈塊のマウスの背における皮下領域への移植：マウスが卵嚢での移植からの麻酔下のままで、はさみを用いて２箇所の新たな切開部において皮膚から筋肉を分離する。各切開部を介して２個の塊を皮下領域に挿入する（マウスあたり計４個の塊）。一方の塊を切開部の右側、他方を切開部の左側に挿入する。さらに２個の塊のために、２つ目の切開部に対してこの方法を繰り返す。皮下に挿入された１個の塊は、２８日間で７日おきに１回、外科的手術で取り出される。取り出された細胞は、５ｍｌの４％パラホルムアルデヒドで固定され、ＯＴＣに組み込まれ、８μｍで低温切片化され、卵胞の分化および増殖が形態によって生じるかどうかをみるためにヘマトキシリンおよびエオシンで染色される。スライドは、必要であれば、卵母細胞特異的な抗体で染色される。
【０２３４】
移植されたヌードマウスの交配：移植されたヌードマウスが術後２１日で検証され、マウスが発情期に入ったか毎日調べられる。入り口の閉鎖はエストロゲン欠如の兆候とされ、再開口はエストロゲンの卵胞が移植片に現れた兆候とされる。膣が開いた後、または術後３週間で（どちらか早かったほう）、宿主の雌は生殖可能な雄と交配される。雌は、交尾の目印（膣栓）を毎日検査される。交尾した雌は、再び出産できる。移植から６‐１２週間後、全ての宿主が解剖され、生殖器官が調べられる、卵巣被膜が取り出され、５ｍｌの４％パラホルムアルデヒドで固定され、ＯＴＣに組み込まれ、８μｍの低温切片化され、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色される。
【０２３５】
実施例１２
成人の精巣由来の再配置した精原幹細胞の同定と特徴付け
精原幹細胞（ＳＳＣ）は、一生の間、自己再生および精子の継続的な産生によって精子形成を維持する。組織学的および超微形態的な研究は、非霊長類の哺乳動物においてＡｓ（Ａシングル）精原細胞が精子形成の幹細胞になると考えられることを示した。Ａの精原細胞の分裂では、娘細胞が互いに離れるように移動し、２個の新たな幹細胞になるか、細胞間の架橋を介して共存し、Ａ‐ペア（Ａｐｒ）精原細胞になるかである。Ａｐｒ精原細胞は、さらに４、８または１６個の鎖状のＡ‐アライン（Ａａｌ）精原細胞に成長する。Ａａｌ精原細胞は、Ａ１精原細胞に分化し、６回の有糸分裂後にＡ２、Ａ３、Ａ４および最終的に、Ｂ精原細胞になり、これらは、最後の有糸分裂で精母細胞に成長する。
【０２３６】
げっ歯類と異なり、ヒトおよび他の霊長類では核形態の標準的な組織学的研究が、ＡｄａｒｋとＡｐａｌｅと言われる２つの未分化の精原細胞が精細管上皮の基底膜に存在することを示唆している。悪性腫瘍および放射線ならびに化学治療のために半去勢を受けた患者由来の精巣生検の精原幹細胞の形態的な特徴付けは、ヒトの精巣の幹細胞がほとんどＡｐａｌｅである所見を示し、また、成体のアカゲザルの精巣での最近の研究は、Ａｄａｒｋ精原細胞がめったに分裂せず細胞毒性の損傷に続いて活性化される予備の幹細胞集団に存在し、一方、Ａｐａｌｅ精原細胞が通常の環境で精子形成を維持するための不変の自己再生分裂する活性のある幹細胞であることを示した。これは、ヒトおよび霊長類両方の精子形成が類似する個体発生であって、これら２つの種間でＳＳＣの分集団の特性が類似すること示唆する。
【０２３７】
一般に、特異的なマーカーを利用できないために、成人の精巣におけるＳＳＣの表現型および分子的特性がほとんど理解されていない。アカゲザルを用いて、濃縮された、成体の霊長類の精巣由来のＳＳＣの集団が特徴付けられ、単離された。霊長類のＳＳＣの表面で見出されて選択されたマーカーの使用で、成人の精巣におけるＳＳＣの異なる集団の独自性が研究された。さらに、ヒトＳＳＣの濃縮された集団が受容個体マウスの精巣に移植され、受容個体マウスの精巣でヒトの精原幹細胞を再配置することの独自性が研究された。
【０２３８】
物質および材料
【０２３９】
組織の調製と細胞の単離：腫瘍の混入していない精巣組織が、精巣摘出を受けた患者から得られ、２人の患者から十分に供与された。精巣生検がＴＥＳＥ（精巣生検および精巣からの精子抽出）処置を受けた患者から得られた。全ての患者は、組織の収集前にインフォームドコンセントに署名していた。組織の小さな一部が抽出され、この研究に使われた。精巣組織および生検が外科的に取り出され、ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＰＢＳに入れられ、短くとも２時間から一晩、氷上で輸送された。精巣組織試料は、組織学的および分子生物学的解析のために取られた。残りの組織の精細管がよく細分化され、３７℃の往復式の水槽で１５分間、コラゲナーゼＡ（１ｍｇ／ｍＬ）およびデオキシリボヌクレアーゼ（１０Ｕ／ｍＬ）で分解された。コラゲナーゼによる分解後、未分解の組織が沈降され、上清中の細胞が取り除かれた。未分解の組織は、ＤＭＥＭ中の１．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＡ、１．５ｍｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼＶ型、０．５ｍｇ／ｍＬのトリプシンおよび１０Ｕ／ｍＬのデオキシリボヌクレアーゼからなる酵素混合物で、３７℃の往復式の水槽で２０分間、さらに分解された。残りの未分解の組織をこした後、単離された細胞が４００ｇで１０分間遠心分離された。細胞沈殿物はＭＥＭ＋ＨＥＰＥＳ＋５％ＦＢＳに再懸濁され、５％二酸化炭素の加湿培養器内に置かれている組織培養用に被覆された１５ｃｍの皿に入れられた。精巣生検試料は酵素混合物で分解されただけで、サイズが小さいため、１つの目的だけのために使われた。
【０２４０】
フローサイトメトリーおよび磁化選別：細胞表面の特徴付けおよび選別のために、細胞が、ＣＤ９０‐ＦＩＴＣ、ＣＤ４９ｆ‐ＰＥおよびＣＤ１１７‐ＡＰＣおよびＳＳＥＡ‐４を含む霊長類のＳＳＣの特徴付けに用いられる、選択された幹細胞マーカーで染色された（図１０）。細胞は氷上で３０分間、ＭＥＭ＋ＨＥＰＥＳ＋５％ＦＢＳ（完全培地）で染色され、一回洗浄され、完全培地に再懸濁され、フロー解析まで氷上で維持された。フロー解析は、ＯｎＦｌｕｘ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒで行われた。フルオレセイン（ＦＩＴＣ）とフィコエリトリン（ＰＥ）が４８８ｎｍ、２００ｍＷのレーザーで励起され、発光が５３０／４０および５８０／３０バンドパスフィルターでそれぞれ集められた。アロフィコシアニン（ＡＰＣ）が６３８ｎｍ、２５ｍＷのレーザーで励起され、発光が６７０／４０バンドパスフィルターで集められた。磁化選別では、細胞（２００×１０６まで）がＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに再懸濁され、ＳＳＥＡ‐４‐ビオチンが加えられ（１：２００）、２ｍＭのＥＤＴＡが調製され、１０分間脱気された。標識緩衝液がＳＳＥＡ‐４に染色された細胞に加えられ、４００ｇで１０分間遠心分離された。ＳＳＥＡ‐４細胞は１．８ｍＬの緩衝液に再懸濁され、２００μＬのストレプトアビジン微粒子が加えられた。また、フローサイトメトリーによる磁気的に分離された細胞の純度を調べることができるように、抗体に結合した１００μＬのＳＳＥＡ‐４‐ＦＩＴＣが加えられた。さらに４℃で２０分間、インキュベートされた。１０ｍＬの緩衝液がチューブに加えられ、４００ｇで７分間、遠心分離された。
【０２４１】
組織学的および免疫組織化学的染色：組織が４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で一晩かけて固定され、平衡のために一晩、２０％スクロースに移された。組織は、ＯＣＴ化合物で凍結され、低温切片が８μｍの薄さに調製され、−８０℃で保存された。組織学のために、切片がＰＢＳで洗浄され、メイヤーヘマトキシンで５分間染色され、蒸留水で５分間洗浄され、水性封入媒体を用いて標本にされた。次に切片は、明視野の顕微鏡を用いて解析された。免疫組織化学染色では、精巣切片がブロックされ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ‐Ｘ／２％ＢＳＡ／５％ヒツジ血清を用いて透過処理された。次にスライドが、表１０に示された生殖細胞およびＳＳＣ特異的抗体で染色された。ＤＡＰＩが核の可視化に用いられた。蒸留水での複数回の洗浄後、細胞が水性の蛍光保存料を用いて保存された。スライドは、Ｓｌｉｄｅ  Ｂｏｏｋ（商標）画像ソフトウェアを備えるオリンパスＢＸ‐６１顕微鏡を用いて解析された。定量的解析のため、スライド毎に約２５の管横断面が計数され、４枚のスライドからのデータが合わせて集められ、この研究で示された。
【０２４２】
ＲＮＡ抽出およびリアルタイムＰＣＲ解析：細胞内の全ＲＮＡがＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（キアジェン社）を用いて製造者の説明に基づいて単離された。そして、単離されたＲＮＡは、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  ＲＴキット（キアジェン社）を用いてＤＮＡに転写され、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  精製キットで精製された。各ＲＴ‐ＰＣＲ反応において、２０ｎｇのＤＮＡテンプレートが、ＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ  Ｐｌｕｓおよび異なる各プライマー（表１１）と合わせて２５μＬの反応用量で用いられた。全ての標的ｃＤＮＡが３０サイクルで増幅された。増幅産物は、２％アガロースゲルにおけるサイズで同定された。ＱＲＴ‐ＰＣＲに関して、５ｎｇのｃＤＮＡテンプレートが、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（キアジェン社）およびバイオラッド社のｉＣｙｃｌｅｒを用いて増幅された試料と合わせて２５μＬの反応用量で用いられた。各試料は、３重に試験され、ＧＡＰＤＨ対照で標準化された。
【表１０】
2013514760.tif 000008
【表１１】
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【０２４３】
テロメラーゼ試験：ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎリアルタイム定量的テロメア反復の増幅プロトコール（ＲＱ‐ＴＲＡＰ）は、Ｗｅｇｅらの方法を適応させた（Ｗｅｇｅ  Ｈ，Ｃｈｕｉ  ＭＳ，ＬｅＨＴ，Ｔｒａｎ  ＪＭ，Ｚｅｒｎ  ＭＡ（２００３）ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｒｅａｌ‐ｔｉｍｅ  ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ  ｒｅｐｅａｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１，ｅ３．）。組織または細胞沈殿物がＰＢＳで１回洗浄され、再懸濁され、１×Ｃｈａｐｓ  ｌｙｓｉｓ緩衝液および４００Ｕ／ｍｌのＲＮａｓｅＯｕｔ阻害剤を含む調製されたリシス緩衝液に１０００細胞／μｌの量で均一化された。氷上でのインキュベーションの２５分後、細胞溶解物が４℃で１０分間、最高速度で遠心分離された。次に、上清が新しいマイクロ遠心管に移され、タンパク質濃度がＮＤ‐１０００分光光度計で２８０ｎｍの吸光度において決定された。反応は、５００ｎｇのタンパク質溶解物、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ｍｉｘ（キアジェン社）、１μｇのＴＳプライマー、０．５μｇのＡＣＸプライマーおよびヌクレアーゼが入ってない水を含む２５μｌの量で行われた。試験された全ての反応プレートに関して、各試料が、テンプレートのない対照（リシス緩衝液）、陽性対照（ＥＳＣ細胞）を加えて３重に試験され、標準曲線がヒトＥＳＣタンパク質溶解物（１００ｎｇ、２００ｎｇ、４０ｎｇ、８ｎｇ、１．６ｎｇ）から作成された。ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ５（バイオラッド社）を用いて、反応液が２５℃で２０分間、９５℃で１５分間インキュベートされ、９５℃で３０秒間さらに６０℃で９０秒間の４０サイクルのＰＣＲで増幅された。サイクル値の閾値（Ｃｔ）は、片対数増幅プロット（サイクル数に対する蛍光の対数増加）から決定され、標準曲線と比較された。ソフトウェアの閾値に関する初期値設定は、サイクル１を除いて、最初の１０サイクルにおける各ウェルの蛍光値の標準偏差の平均の１０倍である。テロメラーゼ活性は、ヒトＥＳＣに対する割合で表された。
【０２４４】
精原幹細胞移植：精原幹細胞移植技術が受容個体マウスの精巣に定着した細胞集団の機能性評価に用いられた。８週齢の免疫不全無胸腺ヌード‐Ｆｏｘｎ１ｎｕ雄マウス（ハーラン社）が腹腔内のブスルファン単回注射（４０ｍｇ／ｋｇ）で処理され、受容個体として用いられた。ブスルファン処理から１ヵ月後、０．３‐０．８×１０６個の磁化選別された成人の精巣のＳＳＥＡ‐４＋が精巣網への注射を介して精細管に移植された。移植から４週間後、マウスが安楽死させられ、精巣が４％ＰＦＡで固定され、低温切片が作製された。マウスの精巣におけるヒトの精原幹細胞の同定は、ヒト核タンパク質抗体を他の幹細胞または生殖細胞マーカーと組み合わせて用いて評価した。全ての動物実験は、実験動物の管理および使用のためのガイドライン（米国学術研究会議）に従った。
【０２４５】
統計解析：言及した場合を除いて、全ての実験は３回繰り返された。２標本スチューデントＴ検定および分散分析検定が統計解析に使われ、Ｐ＜０．０５が有意とされた。
【０２４６】
結果
精原幹細胞の同定および濃縮：閉塞性無精子症の男性において収集された精巣生検から単離された細胞が正常なヒト精巣と同様の精原細胞の形態および分布を示したことは、これらの患者で精子形成が進行中であることを示している。平均０．５×１０６個の細胞が８７％の生存能力をもって各試料から単離された。精原幹細胞が、細胞質に対する核の比が大きく、１‐３個の核小体および細胞質内封入体を備える円形細胞として、他の細胞の中で形態的に見分けることができ（図３９）。精原幹細胞の濃縮に関して、成人の精巣組織から分離した細胞がフローサイトメトリーを用いて様々な細胞表面マーカーについて解析された。様々な幹細胞マーカーに染色された成人の精巣細胞の発現プロファイルが図４３に示された。ＳＳＣの特徴付けに用いられた表面マーカーの中で、ＳＳＥＡ‐４は成体のアカゲザルの精巣におけるＳＳＣでの発現を示し、ヒトの精巣で十分に発現した。精巣生検および供与された組織の両方から単離されたヒトの精巣細胞が試験され、１３．３±１．４％の細胞が表面にＳＳＥＡ‐４を発現することがわかった。げっ歯類および霊長類の精巣で挙げられたＳＳＣマーカーの他のサブセットは、ＣＤ４９ｆ（α６‐インテグリン）ＣＤ‐９０（Ｔｈｙ‐１）ＣＤ‐１１７（ｃ‐Ｋｉｔ）、およびＣＤ４９ｆ＋ＣＤ‐９０＋／ＣＤ１１７−（３重染色）の組み合わせである。成人の精巣では、２５±２．５％の細胞がＣＤ４９ｆを発現し、１３±５％がＣＤ９０＋である。興味深いことに、サルの精巣と比較して、ヒトの精巣では、３重染色された細胞の集団がなかった（図３９Ｅ‐Ｈ）。
【０２４７】
精巣切片の組織学的および免疫組織化学的な染色：組織学的検討は、ヘマトキシリン‐エオシン染色した場合、供与された組織との比較において精巣生検が類似する形態をしていることが明らかになった（図３９Ａ‐Ｂ）。ヒトの精巣組織が、分布とヒトＳＳＣのマーカーの発現をよく理解するための免疫組織染色試験のために取られた。ＳＳＥＡ‐４およびα６‐インテグリンとしても知られるＣＤ４９ｆが成人の精巣で興味深い発現パターンを有し、それは、サルの精巣で以前観察されたものにとてもよく似ている（図４０）。組織学的な定量によれば、精細管の基底膜の近傍にあるほとんど全ての生殖細胞は、げっ歯類およびサルのＳＳＣおよび他の多分化能の幹細胞の表面に見られたマーカーであるＣＤ４９ｆを発現する（管横断面に対して２８．７±１．２）。また、精細管の基底膜の間にある多くの細胞はＳＳＥＡ‐４を発現し（管横断面に対して１８±１）、多能性マーカーがヒト胚幹（ＥＳ）、胚生殖（ＥＧ）細胞および成体のアカゲザルのＳＳＣで見られた。興味深いことに、ＳＳＥＡ‐４＋細胞の大部分には（８３．３％）、ＣＤ４９ｆが共局在している。特異的な免疫反応は、成人の精巣でＣＤ９０について見られなかった。予想外に、ほとんどの生殖細胞は、幹細胞因子に対する受容体および生殖細胞分化の早期マーカーであるｃ‐Ｋｉｔをその表面よりはむしろ核内にとどめていたことが観察された。約７５％のＳＳＥＡ‐４＋細胞がｃ‐Ｋｉｔと共局在したことは、成人の精巣に２つの異なる集団の存在の可能性を示唆している。また、ＣＤ４９ｆおよびｃ‐Ｋｉｔの共局在は、精細管の基底膜でＣＤ４９ｆ＋細胞のほとんどが（７３．６％）、ｃ‐Ｋｉｔをともに発現しており、これは、ＳＳＥＡ‐４のそれと類似する。全てのＳＳＥＡ‐４＋細胞は、生殖細胞マーカーＶＡＳＡに対して陽性である一方、ＣＤ‐４９ｆ＋細胞の５０％だけがＶＡＳＡの染色を示したことは、ＣＤ‐４９ｆが精巣の体細胞の表面でも発現されることを示唆している。これに対し、黄体形成ホルモン受容体（ＬＨＲ）が精細管のＶＡＳＡ＋細胞で発現しないが、ヒトの精巣においてセルトリおよびライディッヒ細胞の細胞質でのみ発現されることは、ＬＨＲが成人の精巣において生殖細胞ではなく体細胞のみで発現されることを示している（図４４）。Ｏｃｔ‐４を発現するヒトの精巣の基底膜に明らかな細胞の集団があったことは、多能性特性を備えるヒトのＳＳＣの中に細胞の集団があることを示している。
【０２４８】
リアルタイムＰＣＲおよびテロメラーゼ試験：精原幹細胞特異的な発現を調べるために、遺伝子発現解析がＳＳＥＡ‐４＋およびＳＳＥＡ‐４−細胞に対して行われた。ｃ‐Ｋｉｔ、ＧＦＲα‐１、ＰＬＺＦ，Ｃ‐ＲｅｔおよびＧＰＲ‐１２５を含む全ての遺伝子がＳＳＥＡ‐４＋の集団で少なくとも３倍から７倍多く発現した（図４１Ａ）。特に、ＳＳＥＡ‐４＋細胞は、ＦＧＦＲ‐３においてかなり高い（２４倍）発現レベルを示したことは（データを示さず）、ＦＧＦＲ‐３およびそのリガンドＦＧＦ９がヒトＳＳＣの増殖および自己再生に関連があることを示している。さらに、ＳＳＥＡ‐４選別された細胞でのｈ‐ＴＥＲＴのより高い発現レベルは、それらの高いレベルのテロメラーゼ活性およびそれらの再配置能力を示す。ＳＳＥＡ‐４陽性選別された細胞が、テロメラーゼ活性に関して、ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）と対照して精巣由来の非選別の細胞と比較された（図４１Ｂ）。非選別の細胞は、ｈＥＳＣ（１００％）と比較して、平均１０．４％±１０．３２％のテロメラーゼ活性を示したが、ＳＳＥＡ‐４＋細胞は、非選別の細胞の５４．５％（＋／−７．８％）と比較して、約５倍多く発現し、また、ｈＥＳＣのテロメラーゼの発現より約２倍小さかった。このことは、上方調節されたｈ‐ＴＥＲＴの発現の知見を支持し、少なくともＳＳＥＡ‐４陽性の細胞での複製能力の延長を示唆する。
【０２４９】
精原幹細胞移植：共局在研究は、ヒトの精原幹細胞の濃縮された集団を移植されたマウスの精巣で行われ、それらの定着効率を評価し、およびマウスの精巣で再配置したヒトのＳＳＣの表面で発現されるマーカーを明らかにする。これらマーカーの局在のまとめが表１２に示されている。ＳＳＥＡ‐４、ＣＤ４９ｆ、およびｃ‐ＫｉｔとともにＨＮＰを用いて、ヒト核タンパク質に陽性である細胞の２８．１％（±３．６％）がＣＤ４９ｆに陽性であって、９４．９％（±１．３％）がｃ‐Ｋｉｔに陽性であって、１４．２％（±３．６％）がＳＳＥＡ‐４に陽性である。さらに我々はＳＳＥＡ‐４＋細胞の１００％がｃ‐Ｋｉｔにも陽性であることを見出し、さらに、ＳＳＥＡ‐４＋／ｃ‐Ｋｉｔ＋細胞のみが受容個体マウスの精巣に統合され得る可能性を示唆し、従って、これは、ＳＳＥＡ‐４＋の集団の中で自己再生しているＳＳＣである。α６‐インテグリンおよびＳＳＥＡ‐４に関する共局在研究は、９５．６３％（±１．６％）のＳＳＥＡ‐４＋細胞がα６‐インテグリンに対しても陽性であることを示した。これらの結果と、ＨＮＰとのα６‐インテグリンの共局在、ＳＳＥＡ‐４ならびにＨＮＰの２倍を超える発現、α６‐インテグリン＋細胞の２つの集団、α６‐インテグリン＋／ＳＳＥＡ４＋およびα６‐インテグリン＋ＳＳＥＡ‐４−という事実を考慮すると、ＳＳＣは受容個体の精巣に再配置できる。また、α６‐インテグリン＋細胞は一体化された細胞の約４分の１だけの割合を占めることが言及されるべきであって、これは、ＳＳＣの約７５％が一体化されたうえ、フローサイトメトリーによる表面マーカーで特徴付けられたことを意味する。しかし、ほとんど全ての一体化された細胞はｃ‐Ｋｉｔで陽性に染色されるが、それはほとんどの細胞において核に局在し、ｃ‐Ｋｉｔ＋細胞はフローサイトメトリーで検出されなかった（図４３）。他の細胞表面マーカーとＨＮＰの共局在は、マウスの精巣に定着したヒトのＳＳＣがマウスのＳＳＣ表面で発現されるマーカーである、ＣＤ‐２９（β１‐インテグリン）を発現しないことを明らかにした（図４２）。しかし、４２．８％のＨＮＰ細胞がＧＰＲ‐１２５と共局在したことは、このマーカーがヒトのＳＳＣを再配置する集団の表面に発現されることを示している。また、２８．３％のＨＮＰ陽性細胞が多能性マーカーＮａｎｏｇと共局在することは、ヒトＳＳＣを再配置する約３分の１が多能性特性を備えることを示唆している。
【表１２】
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【０２５０】
考察
本研究は、成人の精巣における精原幹細胞が表現型および分子的特性においてマウスと異なり、同一ではないが霊長類のＳＳＣに類似することを明示している。第１に、ヒトの精巣切片および単離された細胞における選択されたマーカーの局在と発現が検討された。免疫染色化学的な検討は、試験されたマーカーの中で、ＳＳＥＡ‐４が特異的にヒトのＳＳＣの表面で発現されることを示した。全てのＳＳＥＡ‐４細胞は、精細管の基底膜に局在し、生殖細胞マーカーＶＡＳＡを共局在していた。これは、成体の霊長類の精巣においてすでに得られた所見に極めて類似する。しかし、成体の精巣におけるＳＳＥＡ‐４＋細胞の割合は、サル（２％）の精巣よりもヒトでかなり高かった（１３％）。また、分子生物学的解析では、ＳＳＥＡ‐４選別された細胞がＳＳＣ特異的な全ての遺伝子のより高い発現レベルと高いレベルのテロメラーゼ活性を有することは、この集団に精原幹細胞が存在することを示す。以前の研究は、マウスおよび成体の霊長類の精巣由来のＳＳＣがＣＤ４９ｆおよびＣＤ９０を発現し、ＣＤ‐１１７に陰性であることを示した。単離されたヒトの精巣細胞におけるＣＤ４９ｆおよびＣＤ９０の発現はすでに報告されている。この免疫組織化学研究が、ヒトの精巣におけるＣＤ４９ｆは精細管の基底膜に局在したことを示したことで、このマーカーがＳＳＣに加えて分化しているＡ型の精原細胞で発現していることを示唆している。また、精細管の外側での一部のＣＤ４９ｆ陽性細胞の発現は、ＣＤ４９ｆがヒトのＳＳＣでは発現しているが、特異的なマーカーではなく、ヒトの精巣由来のＳＳＣの濃縮に単独で用いることができないことを示唆している。フローサイトメトリー解析は、免疫組織化学染色を確認し、ＣＤ４９ｆまたはＣＤ９０に陽性に染色される成人の精巣内における異なる細胞の集団は存在するが、霊長類とは対照的に、ヒトの精巣には、２重陽性の細胞が存在する集団がないことを示した。ＳＳＥＡ‐４と同様に、ＣＤ４９ｆ＋およびＣＤ９０＋細胞の割合も、サルの精巣と比較して成人の精巣においてずいぶん高かった。
【０２５１】
フローサイトメトリー解析が、成人の精巣にＣＤ１１７＋細胞はほとんどないことを示した一方で、免疫組織化学染色は、精細管の基底膜の多くの細胞およびヒトの精巣のルミナー区画の細胞にｃ‐Ｋｉｔの局在を示した。ヒトの精巣でのｃ‐Ｋｉｔタンパク質の類似する局在パターンが他の研究者によって報告された。最近、未分化の精原細胞におけるｃ‐Ｋｉｔの発現が段階特異的であることが示されたことは、ヒトの精子形成の早期段階に対するこのタンパク質の関与を示唆している。ｃ‐Ｋｉｔは、チロシンキナーゼ膜タンパク質であって、造血幹細胞および前駆体細胞、そして生殖腺を含むいくつかの非造血組織で発現される。移動および定着、増殖および分化を含む生殖細胞の成長における様々な機能にｃ‐Ｋｉｔおよびそのリガンドである幹細胞因子（ＳＣＦ）の関与を示す、かなり具体的な証拠がある。成人の精巣における細胞は、その膜ではなく、その核にｃ‐Ｋｉｔタンパク質を発現する。ｃ‐Ｋｉｔの核での局在は、これらの細胞がなぜフローサイトメトリーで検出されないのかを説明する。ｃ‐Ｋｉｔは一般には膜タンパク質であるが、細胞質および核での局在が報告されている。ＳＳＥＡ‐４とｃ‐Ｋｉｔとの重複する局在は、成人の精巣でのＳＳＥＡ‐４＋細胞の２つの集団、つまり一方はｃ‐Ｋｉｔの発現があり、他方はｃ‐Ｋｉｔの発現がないことを示した。マウスでの研究に基づいて、ＳＳＣはｃ‐Ｋｉｔに対して陰性であることが示された。
【０２５２】
成体の霊長類では、ＳＳＥＡ‐４＋細胞は、受容個体マウスの精巣に再配置でき、活発に分裂する精原幹細胞の集団である。ヒトのＳＳＣは、ＳＳＥＡ‐４の磁化選別によって精製され、ＳＳＥＡ‐４＋細胞がブスルファン処理された受容個体マウスの精巣に移植された。ＳＳＥＡ‐４＋細胞が移植後にマウスの精細管の大部分の基底膜で見られたことは、この集団に機能的なＳＳＣが存在することを示唆している。驚くべきことに、受容個体の精巣に定着したヒトの全ての細胞がｃ‐Ｋｉｔ＋であったことは、ＳＳＥＡ‐４で選別された細胞のｃ‐Ｋｉｔ＋分画のみが受容個体の精巣に定着でき、ひいては、これが該細胞ヒトの精巣において活性のあるＳＳＣであることを示唆している。また、ＲＴ‐ＰＣＲ解析は、ＳＳＥＡ‐４で選別された細胞がｃ‐ＫｉｔおよびＦＧＦＲ３のかなり高い発現レベルを有することを明らかにした。ヒトのＳＳＣにおけるｃ‐Ｋｉｔの発現は、この受容体およびそのリガンドＣＳＦの、ヒトＳＳＣの定着および／または再配置への関与を示唆する。ｃ‐ＫｉｔおよびＳＣＦが生殖細胞の移動、接着および増殖の鍵となる因子であることを示すかなり具体的な証拠がある。また、ヒトのＳＳＣにおけるＦＧＦＲ３の高い発現は、ヒトのＳＳＣの増殖および自己再生におけるそのリガンドの関与を示唆するであろう。線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）およびその受容体（ＦＧＦＲ）は、初期の胚および生殖細胞の成長に関する鍵となるシグナル分子である。ＦＧＦは、マウスおよびヒトのＳＳＣの生存と維持を促進することが示された。生体外での研究は、ＦＧＦ９がＦＧＦＲ３に対するかなり可能性のあるリガンドであることを示した。従って、ヒトのＳＳＣの培養培地にＦＧＦ９およびＳＣＦを加えることは、生体外でのそれらの生存と増殖に有利である。
【０２５３】
また、マウスの精巣に一体化されたヒト細胞の分集団がその表面にＧＰＲ‐１２５を発現したことは、このマーカーもヒトのＳＳＣの再配置において発現することを示唆する。マウスおよびヒトの精巣切片におけるＧＰＲ‐１２５の発現が報告された。マウスの精巣にヒトのＳＳＣを再配置する分集団は、多能性マーカーＮａｎｏｇに陽性に染色される。一部のＳＳＣにおける多能性マーカーＮａｎｏｇおよびＳＳＥＡ‐４の発現は、成人の精巣内のＳＳＣの分集団が他の細胞系統に分化するための多能性の能力を有することを示唆する。マウスおよびヒトの精巣由来の多分化能の細胞系統の発生は、ヒトのＳＳＣの多分化性を支持し、生殖能力の回復の他に再生疾患に対するこれらの細胞の臨床的な応用を示唆する。一方、ヒトの精巣における免疫学的局在決定において、Ｎａｎｏｇは未分化のＳＳＣのみに限定されず、精細管の内腔でさえも含む全ての生殖細胞に局在した。この所見は、成体の霊長類の精巣と酷似しており、進化した生殖細胞での転写因子Ｎａｎｏｇの異なる役割を示唆している。Ｎａｎｏｇの役割の特性は、未だに決定されていないが、多能性マーカーＯｃｔ‐４が生殖細胞では生存因子であって、その下方調節は分化よりもむしろアポトーシスおよび細胞死をもたらすことが報告された。
【０２５４】
また、移植研究は、精原幹細胞の定着に関して、ヒトとマウスの精細管の間で特定の適合性を示した。興味深いことに、受容個体マウスの精巣におけるＳＳＥＡ‐４＋細胞（１４％）およびＣＤ４９ｆ＋細胞（２８％）の割合がヒトの精巣のそれと酷似（ＳＳＥＡ‐４に対して１３％およびＣＤ４９ｆに対して２７％）したことは、自然の環境にかなり類似したレベルで、ヒトのＳＳＣが空のマウスの精巣に定着し、かつ再配置する能力を備えることを示唆しており、これは、マウスの精巣がヒトのＳＳＣの定着に適した環境を提供することを意味している。しかし、精原細胞の限られた増殖を超えるさらなる成長は、本研究でもウシ、ブタ、霊長類およびヒトのＳＳＣを用いた従来の研究でもまったく見られなかった。マウスの精巣は、より高度な種由来の完全な精子形成を支持するのに適した環境を提供できないが、精細管のその基底膜は、ヒトの精巣と酷似する形式でヒトの精原幹細胞を選択的に引き付け、保護する能力を有する。
【０２５５】
まとめると、成人の精巣内で再配置する精原幹細胞は、ＳＳＥＡ‐４＋、ＣＤ４９ｆ＋、ＣＤ９０＋、ＧＰＲ‐１２５＋およびｃ‐Ｋｉｔ＋の表現型の特性を有する。約３分の１のＳＳＣがＮａｎｏｇを発現することは、成人の精巣において多能性特性を備える精原幹細胞の集団の存在を示唆している。この結果は、臨床応用、培養の拡大または分化の目的のために、成人の精巣由来の精原幹細胞の単離および精製に直接的に関係する。さらに、ヒトのＳＳＣの分集団での多能性マーカーの発現は、細胞置換療法および組織再生に関するこれらの細胞の可能性のある用途を示唆する。
【０２５６】
実施例１３
マウスの精原細胞の宿主外での成熟
本研究は、未成熟なマウスから単離された精巣の細胞が定着でき、かつ人工の精細管で精子形成を再びできるかを調べることを目的とする。内径２５０μｍ、外径３００μｍの医療仕様のポリエチレンチューブ（タイゴン社）が１０ｃｍ片に切られ、３０ゲージ針に接続され、人工の精細管として用いられた。チューブは、１ｍｌの７０％エタノールで洗浄され、蒸留水と清浄な空気で３回洗浄された。精巣の細胞外基質がＴｒｉｔｏｎ‐Ｘ‐１００とデオキシコール酸の混合物を用いた３７℃、２４時間の脱細胞化によって、２匹の成体マウスから抽出され、往復式振とう培養機上で３７℃、２４時間のトリプシンおよびＥＤＴＡによって分解された。抽出されたＥＣＭは、３７℃で３０分間、コラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）で可溶化され、次に、コラゲナーゼがＥＤＴＡを加えることで不活性化された。可溶化されたＥＣＭは、小さい分割量で−２０℃に保管された。チューブに細胞を入れる前日に、チューブはＥＣＭで被覆され、殺菌のため紫外線下、室温で２時間インキュベートされ、使用するまで４℃で保持された。
【０２５７】
未成熟な（生後３‐４日）ＧＦＰまたはＯＧ２マウス由来の精巣が単離され、１‐２×１０４／μｌの濃度で入れられた。約１０μｌの細胞懸濁液が各チューブを満たすのに必要だった。次に、チューブは、ＧＤＮＦ、ＦＧＦ，ＥＧＦ、およびＬＩＦを含む成長因子を添加した８ｍｌのＰＭ‐１（商標）培地を含む６ｃｍの皿に置かれ、５％二酸化炭素を含む加湿された空気中で、３２℃で培養された。培地は、チューブ内に加え、６ｃｍの皿内で１日おきに交換された。培養は２１日間継続され、チューブが解剖学的な検討のために光学顕微鏡下で毎日観察された。培養から７日後、ＦＳＨ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）およびレチノイン酸（０．５μＭ）を含む成熟誘導因子が添加された。培養から１４日後、ＧＤＮＦ、ＦＧＦ，ＥＧＦ、およびＬＩＦを培地から除去し、一部のチューブの内容物が１ｍｌの注射器で流し出され、試料が組織学的およびＤＮＡ含有量の解析のために採取された。さらに、一部の細胞がＲＮＡ抽出と遺伝子発現解析に用いられた。いくつかの実験では、チューブはＥＣＭで被覆されず、他のいくつかの実験では、成熟誘導因子単独または他の因子（ＧＤＮＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦおよびＬＩＦ）の異なる組み合わせで試験された。培養期間の最後に、精子細胞および精子の形態である細胞が収集され、ＩＣＳＩまたは生体外受精（ＩＶＦ）によって、卵子を受精する能力が評価された。さらに、受精した卵子を胚に成長させる能力が評価された。また、胚はＧＦＰの発現および成長の能力について試験され、胚が母体に移植されてからの期間が評価された。
【０２５８】
生後４日のＯＧ２マウス由来の精巣切片の組織学的検討は、精細管内において、未発達な生殖細胞および未成熟なセルトリ細胞のみが存在し、精巣発生のこの段階で発達した生殖細胞が見られないことを示した。チューブの光学顕微鏡観察は、精巣の細胞がチューブに付着し、培養の最初の１週間でその数が増加したことを明らかにした（図５３Ａ）。ＥＣＭで被覆されたチューブは、被覆されていないチューブよりも多くの細胞を含んでいた。様々な大きさの生殖細胞コロニーがチューブ外に見られた。一部の領域で、コロニーがより豊富で、一部では、細胞が完全にチューブの表面を覆っていた。７日後のチューブの断片のＨ＆ＥおよびＤＡＰＩ染色は、光学顕微鏡での検討を確認し、チューブ内のコロニーおよび細胞の鎖の存在を示した（図５３Ｂ‐Ｄ）。７日および１４日後に集められた細胞の光学顕微鏡での観察は、円形で細長い精子細胞に形態的に類似する小さな細胞の存在を示した。また、核が濃縮され、精子の頭部に類似するいくつかのかなり小さい細胞が見られた。Ｈ＆Ｅ染色は、円形の精子細胞および精子の頭部に類似する細胞の存在を確認した。ピーナッツ凝集素（ＰＮＡ）、アクロソームおよび先体小胞を特異的に染色するレクチンの免疫組織化学的な局在が円形細胞および濃縮された細胞がＰＮＡを発現することを示したことは、これらの細胞における先体構造の存在を示唆している（図５３Ｅ）。培養から１８日後、さらに細長い細胞が見られ、細長い精子細胞に類似していた（図４７）。また、頭部、アクロソーム、中央部分および尾を含む成熟した精子に見える細胞が皿に付着して見られた（図４８）。培養から１０日後、泳ぐ精子が見られ、実験が進むにつれてその数は増加した。
【０２５９】
人工の管で産生された精子の受精能力がＩＶＦの手順で試験された。８週齢の雌のＣＤ‐１マウスがＰＭＳＧ（１０  ＩＵ）の注射に続けてＰＭＳＧ注射の６２時間後のＨＣＧ（２０  ＩＵ）で特別に排卵させられた。ＨＣＧの１２時間後、マウスが安楽死させられ、卵子が回収され、０．１％のヒアルロニダーゼで露出され、鉱油下で１００μＭのＭ２培地に移された。培養２２日後に人工の精細管が１ｍｌ注射器で洗い流され、細胞が回収され、４℃で１０分間、８００×Ｇで遠心分離された。上清が取り除かれ、細胞が２００μｌのヒト管液（ＨＴＦ）に再懸濁され、３２℃に維持された。人工管から集められた３０μｌの細胞懸濁液が卵子に加えられた。３７℃で一晩インキュベーションした後、ほとんどの卵子（６／７）が胚に成長した（図４９）。生体外で産生された胚の確認は、ＧＦＰ  ＰＣＲで行われた。
【０２６０】
成体の精巣のＥＣＭで被覆された人工管は、精原細胞の成熟を促進する。精母細胞の形態および性質を備える細胞が見られたことは、培養５‐７日後に減数分裂に入ったことを示している。また、円形の精子細胞および細長い精子細胞の形態を備える細胞が見られたことは、生殖細胞の一部が精子形成に入ったことを示している。核濃縮がほとんどの細胞で起きたが、伸長は完全ではなく、遅れた。これらの細胞は、明らかに濃縮された頭部、アクロソーム、中間部分および尾を含む完全に成熟した精子の全ての特徴を含んでいた。人工管で産生された精子が生体外での受精で卵子を受精させたことは、これらの細胞が卵子まで泳ぎ、透明帯に結合し、帯に移行し、卵細胞膜に融合する能力を有することを示唆している。
【０２６１】
実施例１４
マウスの卵巣生殖系列細胞の宿主外での成熟
マウスの卵巣由来の卵巣生殖系列細胞（ＯＧＳＣ）は、直径４０‐６０μｍであって、初期の卵母細部に類似する卵母細胞様の細胞を産生できる。これらの細胞は、顆粒膜細胞を用いた卵胞工学、それに続く卵胞の生体外での成長または卵巣切除したマウスへの卵胞の移植‐マウス宿主外／生体内での成熟によってさらに成熟される。
【０２６２】
記載がない限り、本明細書および特許請求の範囲で用いられる構成要素の量、分子量、反応条件、その他のような特性を表す全ての数字は、どの場合においても用語「約」によって修飾されるものとして理解されるべきである。従って、そうでないことが示されない限り、前述の明細書および添付の特許請求の範囲で示される数値パラメータは、本発明で目標とする所望の特性に応じて、変化し得る近似値である。少なくとも特許請求の範囲への均等論の適用の範囲に限らずとも、各数値パラメータは、報告された有効桁の数の知識および通常の周辺技術を適用することによって、少なくとも構成されるべきである。本発明の広い範囲を示す数値範囲およびパラメータは近似値であるにもかかわらず、特定の実施例で示されたその数値は、できるだけ正確に報告される。しかしながら、いずれの数値も、それぞれの試験測定系で見られる標準偏差がもたらすある程度の誤りを、やむを得ず本質的に含む。
【０２６３】
用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および本発明を記載する文脈（特に、添付の特許請求の範囲の文脈）において使用される同様の指示対象は、本明細書中で特に示されないか、または文脈によって明確に否定されない限り、単数形および複数形の両方を網羅すると解釈されるべきである。本明細書中の数値の範囲の記述は、単に、その範囲内に納まるそれぞれ別個の値を個別に参照する略記法として機能することが意図される。本明細書中で特に示されない限り、それぞれ個々の値は、あたかもそれが本明細書に個別に引用されるかのように本明細書中に組み込まれる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中で特に示されないか、そうでなければ文脈によって明確に否定されない限り、任意の適切な順序で行われ得る。本明細書中に提供される任意かつ全ての例、または例示的な言語（例えば、「等の（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用は、単に、本発明を十分に明らかにすることが意図され、そして別に特許請求された本発明の範囲を限定しない。本明細書中の言語は、本発明の実施に必須である任意の特許請求されていない要素を示すと解釈されるべきではない。
【０２６４】
本明細書で開示された本発明の択一的な要素および実施の形態の分類は、限定として解釈されない。グループの各構成要素は、個々にまたはその群の他の構成要素または本明細書に記載された他の構成要素とのあらゆる組み合わせにおいて言及され、特許請求される。利便性および／または特許性を理由に、群の１つまたは複数の構成要素が群に含まれ、または除かれることが見込まれる。任意のこのような包含または削除があるときでも、明細書はここで変更され、そうして添付の特許請求の範囲に用いられた全てのマルークシュ群の記載を満たす群を含むものと見なされる。
【０２６５】
本発明のいくつかの実施形態が明細書中に記載され、それは、本発明を実施するために本発明者らが知り得る最良の形態を含む。当然に、それらの実施形態の変形例は、上述の説明を読む際に当業者にとって明らかとなる。本発明者は、当業者に、適切な場合にこのような変形例を使用することを期待し、そして本発明者は、本発明について、本明細書中に具体的に記載されるものとは異なる方法で実施されることを意図する。したがって、本発明は、適切な原理によって許容されるような、ここに添付された特許請求の範囲において列挙される対象事項の全ての改変および均等なものを含む。さらに、上記の要素のあらゆる組み合わせが、本明細書中で特に示されないか、またはそうでなければ文脈によって明確に否定されない限り、その全ての可能な変形例において本発明に包含される。
【０２６６】
さらに、多くの参照は、本明細書全体を通して特許および出版刊行物に対してなされている。上記の引用された参考文献および出版刊行物の各々は、その全体が本明細書中に参考として個別に援用される。
【０２６７】
本明細書で開示された特定の実施の形態は、言語の含むまたは実質上含むを用いて特許請求の範囲をさらに限定することができる。特許請求の範囲で用いられるとき、出願または補正時に追加されても、移行用語「を含む」は、特許請求の範囲で特定されていないあらゆる要素、ステップまたは成分を排除する。移行用語「を実質上含む」は、特許請求の範囲を、特定された物質またはステップに限定し、かつそれらは基本のおよび新規の特性に実質的に影響しない。主張した本発明の実施の形態は、本質的に、または明確に記載され、本明細書で使用可能である。
【０２６８】
最後に、本明細書中で開示される本発明の実施形態は、本発明の原理の例示であることが理解されるべきである。使用され得る他の改変は、本発明の範囲内である。したがって、限定ではないが例として、本発明の代替的な構成は、本明細書中の教示に従って利用され得る。したがって、本発明は、明確に示されかつ記載されるものに限定されない。
【０２６９】
（関連出願の相互参照）
本願は、２００９年１１月５日に出願された米国仮出願番号第６１／２５８，５３５号に対する利益を、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づいて主張し、その全体が参照することにより組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図４Ｐ】
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【図４Ｑ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図７Ｊ】
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【図７Ｋ】
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【図７Ｌ】
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【図７Ｍ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図８Ｊ】
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【図８Ｋ】
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【図８Ｌ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１０Ｐ】
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【図１０Ｑ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１４Ｇ】
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【図１４Ｈ】
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【図１４Ｉ】
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【図１４Ｊ】
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【図１４Ｋ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図２９Ｄ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図３９Ｃ】
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【図３９Ｄ】
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【図３９Ｅ】
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【図３９Ｆ】
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【図３９Ｇ】
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【図３９Ｈ】
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【図３９Ｉ】
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【図４０】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４４Ｃ】
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【図４４Ｄ】
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【図４４Ｅ】
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【図４４Ｆ】
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【図４４Ｇ】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2013514760.tif 000153
2013514760.tif 000154
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