(57)【要約】  本発明は、プロテアーゼ及びプロテアーゼ阻害剤を同定するためのシステムを提供する。本システムは、少なくとも２つの構成要素を有する。第１の構成要素は、少なくとも１つの結合部位、転写プロモーター、誘導性プロモーター領域、及び少なくとも１つのレポーター遺伝子を含むレポーターコンストラクトであり、これらはすべて該レポーター遺伝子の発現のために機能的に連結し、転写活性化剤と機能的に連携している。第２の構成要素は、核酸結合ドメイン、少なくとも１つのプロテアーゼ基質ドメイン、及び、誘導性プロモーターのための少なくとも１つの転写活性化ドメインを含む転写活性化剤である。本システムは、プロテアーゼ基質ドメインに対するプロテアーゼ活性に影響を及ぼす薬剤の検出と評価を可能にする。また、本システムは、環境試料中におけるプロテアーゼの存在の検出を可能にする。【選択図】図４ｂ
2013512692.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼ及びプロテアーゼ阻害剤を同定するためのシステムであって：
少なくとも１つの結合部位、誘導性プロモーター領域、及び少なくとも１つのレポーター遺伝子を含み、これらがすべて該レポーター遺伝子の発現のために機能的に連結し、転写活性化剤と機能的に連携している、レポーターコンストラクト；
核酸結合ドメイン、少なくとも１つのプロテアーゼ基質ドメイン、及び、誘導性プロモーターのための少なくとも１つの転写活性化ドメインを含む、転写活性化剤
を含むシステム。
【請求項２】
さらに少なくとも１つのプロテアーゼ又はプロテアーゼ候補を含み、該プロテアーゼ又はプロテアーゼ候補が、プロテアーゼ基質ドメインを特異的に標的とする、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
転写活性化剤又はプロテアーゼ／プロテアーゼ候補の少なくとも１つが、核酸コンストラクトの産物としてシステムに提供される、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
転写活性化剤又はプロテアーゼ／プロテアーゼ候補の少なくとも１つが、タンパク質としてシステムに提供される、請求項２に記載のシステム。
【請求項５】
さらに以下からなる群より選択される少なくとも１つのレポーター遺伝子を含む、請求項１に記載のシステム：
Ｖｅｎｕｓ黄色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）；青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、これらの蛍光変異体、生物発光タンパク質、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ、ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、コメツキムシルシフェラーゼ、及びホタルルシフェラーゼ、これらもレポーターベクターの活性の定量化に用いることができる。
【請求項６】
１つの誘導性プロモーターから転写された少なくとも２つのレポーター遺伝子を含む、請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
レポーター遺伝子コンストラクトが１〜８個の結合部位配列の反復を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
レポーター遺伝子コンストラクトが５個の結合部位配列の反復を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
結合部位が、Ｇａｌ４及びＬｅｘＡからなる群より選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
誘導性レポーター領域が、ＴＡＴＡプロモーター領域を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
プロテアーゼ基質が、ＢｏＮＴプロテアーゼ基質、炭疽菌プロテアーゼ、カスパーゼ、アルファウイルスＮＳＰ２プロテアーゼ、ＨＩＶプロセシングプロテアーゼ、低分子ユビキチン様修飾因子プロセシングプロテアーゼ、ユビキチンプロセシングプロテアーゼ、ＩＳＧ１５プロセシングプロテアーゼ、自食作用関連ＡＴＧ４様プロセシングプロテアーゼ、及び、肝炎ウイルスプロセシングプロテアーゼ、又はこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
プロテアーゼ基質が、ＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰ−２、及びシンタキシン１ａ、又はこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１３】
プロテアーゼ基質が、ＳＮＡＰ−２５及びＶＡＭＰ−２プロテアーゼ基質ドメインを含む、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１４】
プロテアーゼがＢｏＮＴプロテアーゼである、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１５】
プロテアーゼ基質が、結合ドメインと転写活性化ドメインの間の転写活性化剤上に位置し、転写活性化剤が、転写が起こる細胞内区画にある、請求項１に記載のシステム。
【請求項１６】
プロテアーゼ基質ドメインが分子の一端にあり、結合ドメインと転写活性化ドメインが互いに機能的に近接して、かつプロテアーゼ基質ドメインから逆となる転写活性化剤の末端に位置し、プロテアーゼ基質ドメインの切断によって結合ドメインと転写活性化因子が遊離し、機能性転写活性化剤フラグメントを与える、請求項１に記載のシステム。
【請求項１７】
転写活性化剤が細胞核の外に隔離されるが、プロテアーゼによる切断が、結合ドメイン及び転写活性化ドメインを含み、転写活性が起きている細胞内区画に到達することができる機能的に活性な転写活性化剤を遊離するように設計された、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１８】
ｔＴＳ細胞における、請求項２に記載のシステム。
【請求項１９】
以下を含むシステムに、少なくとも１つの試験分子又は化合物を導入すること：
少なくとも１つの結合部位、転写プロモーター、誘導性プロモーター領域、及び、少なくとも１つのレポーター遺伝子を含むレポーター遺伝子コンストラクトであって、これらはすべて該レポーター遺伝子の発現のために機能的に連結し、転写活性化剤と機能的に連携している；
核酸結合ドメイン、少なくとも１つのプロテアーゼ基質ドメイン、及び、誘導性プロモーターのための少なくとも１つの転写活性化ドメインを含む転写活性化剤；及び
該プロテアーゼ基質ドメインに特異的なプロテアーゼ；
並びに、レポーター分子の発現レベルへの影響を測定すること
を含む、プロテアーゼ阻害剤を同定する方法。
【請求項２０】
以下を含むシステムに、少なくとも１つの試験分子又は化合物を導入すること：
少なくとも１つの結合部位、転写プロモーター、誘導性プロモーター領域、及び、少なくとも１つのレポーター遺伝子を含むレポーター遺伝子コンストラクトであって、これらはすべて該レポーター遺伝子の発現のために機能的に連結し、転写活性化剤と機能的に連携している；及び
核酸結合ドメイン、少なくとも１つのプロテアーゼ基質ドメイン、及び、誘導性プロモーターのための少なくとも１つの転写活性化ドメインを含む転写活性化剤；
並びに、レポーター分子の発現レベルへの影響を測定すること
を含む、プロテアーゼを同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、プロテアーゼ阻害剤同定検定の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテアーゼは生物学的プロセスに重要な役割を果たす。しかしながら、プロテアーゼはまた生物学的システム、特にウィルス、毒素、及び、病原微生物により配達されたシステムに重大な害を及ぼす。プロテアーゼ阻害剤を開発し、特に細胞でのプロテアーゼ活性を検定する方法はバイオテクノロジーの重要な分野である。例えば、ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴｓ）は最も効力がある既知の毒素である（S.S. Arnon, R. Schechter, et al. Jama 285:1059-70. (2001)、及び、B.M. Paddle. J Appl Toxicol 23:139-70. (2003)）。ボツリヌス中毒症は、細菌クロストリジウム・ボツリナム（Clostridium botulinum）で汚染された食物の摂取、開放創での該細菌のコロニー形成、又は、該毒素の摂取、若しくは、呼吸が原因となって引き起こされうる。これらの毒素は軍人、及び、文民の両方の集団に対する深刻な脅威である（S.C. Clarke. Br J Biomed Sci 62:40-6 (2005)、R.P. Hicks, M.G. Hartell, et al. Curr Med Chem 12:667-90 (2005)、D. Josko. Clin Lab Sci 17:30-4 (2004)）。ヒトにおけるボツリヌス毒素の致死量は体重１ｋｇ当たり１ｎｇ以下である（J.C. Burnett, E.A. Henchal, et al. Nat Rev Drug Discov 4:281-97 (2005)、J.C. Burnett, J. J. Schmidt, et al. Bioorg Med Chem 13:333-41 (2005)、B.M. Paddle J Appl Toxicol 23:139-70 (2003)）。疾病管理防止センター（Ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）はこれらの毒素をＡ分類（最優先）のバイオ脅威剤（ｂｉｏ−ｔｈｒｅａｔ  ａｇｅｎｔｓ）として記載してきた。ＢｏＮＴｓは危険ではあるが、有益な医療化合物として認識されてきた。ＢｏＮＴｓは、今では、ある範囲の病気、及び、美容で用いられる確立したバイオ治療薬であり、国内、及び、海外でますます大量に生産されている（R. Bhidayasiri, and D.D. Truong, J Neurol. Sci.235:1-9 (2005)、C.L. Comellaand and S.L. Pullman. Muscle Nerve 29:628-44 (2004)、K.A. Foster. Drug Discov Today 10:563-9 (2005)、R.G. Glogau. Clin J Pain 18:S191-7 (2002)、J.D. Marks. Anesthesiol Clin North America 22:509-32, vii. (2004)、C. Montecucco and J. Molgo. Curr Opin Pharmacol 5:274-9 (2005)）。それらの有益性の良くないの結果は、該神経毒が悪用の為にますます入手しやすくなったことである。同様に、使用の増加は、治療中の意図せぬ有害作用発生の可能性を上昇させる（T.R. Cote, A.K. Mohan, et al. J Am Acad Dermatol 53:407-15 (2005)）。
【０００３】
いったん、肺に吸入されると、又は、胃腸管に摂取されると、ＢｏＮＴｓは呼吸上皮、又は、粘膜を越えて血流に経細胞輸送され、それらは、末梢コリン茶道性シナプス前神経終末に結合して入り込む前に、細胞間隙に入り込むことができる。いったん、神経細胞が冒され横隔膜の筋肉が機能を停止すると、救命医療機械的人工呼吸が、現在のところ、唯一の治療上の選択肢である。しかしながら、内部移行したＢｏＮＴｓの効果は数カ月にわたることができる（R. Eleopra, V. Tugnoli, et al. Neurosci Lett 256:135-8 (1998)、F.A. Meunier, G. Lisk, et al. Mol Cell Neurosci 22:454-66 (2003)）。それ故、限られた数の個体が同時に冒されても、長期にわたる人工呼吸は非現実的であろう。
【０００４】
異なる三次構造とかなりの配列の相違を所有する七種のＢｏＮＴ血清型（Ａ−Ｇ）が存在する。構造的に、各血清型は１００ＫＤａの重鎖（ＨＣ）と５０ＫＤａの軽鎖（ＬＣ）から成る。それらは、最初、一本のポリペプチド鎖として合成され、それは、細菌の、又は、宿主のプロテアーゼによって切断される。前記のポリペプチド鎖は、神経標的細胞の還元的な細胞質環境に到達するまで、ジスルフィド結合によって連結されたままである（D.B. Lacy, W. Tepp, et al. Nat Struct Biol 5:898-902 (1998). L.L. Simpson. Annu Rev Pharmacol Toxicol 44:167-93 (2004)）。軽鎖は亜鉛依存性エンドペプチダーゼである。
【０００５】
いったん、肺に吸入されると、又は、胃腸管に摂取されると、ＢｏＮＴｓは呼吸上皮、又は、粘膜を越えて血流に経細胞輸送され、それらは、末梢コリン茶道性シナプス前神経終末に結合して入り込む前に、細胞間隙に入り込むことができる。重鎖は、神経細胞に結合し、軽鎖を重鎖のカルボキシ末端半分（ＨＣC）を介して細胞質へ輸送し、重鎖のアミノ末端半分（ＨＣN）により形成された孔を通ってエンドソームから細胞質へ軽鎖を輸送することによるタンパク質分解性軽鎖の輸送システムとして働く。各ＢｏＮＴ血清型は、神経筋接合部でのアセチルコリン含有小胞の融合と放出に責任があるＳＮＡＲＥタンパク質の構成要素を切断するプロテアーゼである（B.R. Singh. Nat Struct Biol 7:617-9 (2000)、K.J. Turton, A. Chaddock, and K.R. Acharya, Trends Biochem. Sci. 27:552-8 (2002)）。ＢｏＮＴ血清型Ａ及びＢｏＮＴ血清型ＥはＳＮＡＰ−２５（シナプトソーム結合タンパク質（２５ＫＤａ））を切断する（T. Binz, J. Blasi, et al. J Biol Chem 269:1617-20 (1994)）。血清型Ｂ、Ｄ、Ｆ、及び、ＧはＶＡＭＰ（小胞結合膜タンパク質、シナプトブレビンおよびＶＡＭＰ‐２とも称される）を切断する（G. Schiavo, F. Benfenati, et al. Nature 359:832-5 (1992)、G. Schiavo, C. Malizio, et al. J. Biol. Chem. 269:20213-6 (1994)、G. Schiavo, O. Rossetto, et al. J Biol Chem 268:23784-7 (1993)、G. Schiavo, C. C. Shone, et al. J Biol Chem 268:11516-9 (1993)、J.J. Schmidt, and R. G. Stafford. Biochemistry 44:4067-73 (2005)）。血清型ＣはＳＮＡＰ−２５とシンタキシン１Ａの両方を切断する（J. Blasi, E.R. Chapman, et al. Embo J 12:4821-8 (1993)）。ＳＮＡＲＥのＢｏＮＴ介在性切断は、運動ニューロンが神経筋接合部でのアセチルコリンを放出するのを妨害すること、および、同様にアセチルコリン放出の抑制を介して自律神経の機能をさえぎることによる弛緩麻痺という結果になる。いったん、横隔膜の筋肉が冒されると、呼吸が損なわれ、究極的には窒息することになる。
【０００６】
７種類のＢｏＮＴ血清型のアミノ酸配列はかなり異なる。しかしながら、前記の異なる血清型は全体的に類似した折り畳み方をとり、触媒中心の局面は保存されている（M.A. Breidenbachand A.T. Brunger. Trends Mol Med 11:377-81 (2005)）。ＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｂ  のX線結晶構造は、これら二種類の血清型の亜鉛結合部位の８オングストローム内の領域は、２２残基の内１７残基同一であるほど高度に相同である（S. Swaminathan & S. Eswaramoorthy, Nature Structural Biology 7:693-699 (2000)）。しかしながら、ＢｏＮＴ／ＢよりもＢｏＮＴ／Ａでよりかなり深く埋め込まれている亜鉛結合ポケットを含む１５オングストローム内ではかなりの変化が観察される。それ故、広範囲の潜在的阻害剤ではありえないほど、前記の血清型の間で活性部位は十分に異なる。さらに、結合すると、基質は、ＢｏＮＴ軽鎖の外周を包み込み、異常に大きい基質酵素境界面を作り出す（M.A. Breidenbachand A.T. Brunger. Nature 432:925-9 (2004)）。ＢｏＮＴの基質特異性はまた、「非活性部位」結合と呼ばれる、活性サイト遠位部位を渡る長い基質／軽鎖プロテアーゼ境界面上のＢｏＮＴの基質との結合によって決定される（M.A. Breidenbachand A.T. Brunger. Trends Mol Med 11:377-81 (2005)）。
【０００７】
ワクチン法がＢｏＮＴに対する生物テロ防御で役割を果たすであろう（M.P. Byrne and L.A. Smith. Biochimie 82:955-66 (2000)、J.B. Park and L.L. Simpson. Expert Rev Vaccines 3:477-87 (2004)）。しかしながら、ＢｏＮＴへの曝露の前に、ＢｏＮＴの同定と危険にさらされている大集団の人間へのワクチン接種は問題である。有効な曝露後処置である治療法の開発が必須である。低分子量非ペプチド阻害剤は、曝露後治療薬の開発にとり最善の機会を提供する。前記の経路の後の段階、及び、特定のタンパク質分解段階をさえぎることは曝露後の治療にとり望ましい。そのような化合物は中毒になっているニューロンの細胞質に入り込むことができねばならないであろうし、特異的に作用しなくてはならないであろう。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、プロテアーゼ及びプロテアーゼ阻害剤を同定するためのシステムを提供する。本システムは、少なくとも２つの成分を有する。第１の成分は、少なくとも１つの結合部位、転写プロモーター、誘導性プロモーター領域、及び少なくとも１つのレポーター遺伝子を有するレポーターコンストラクトであり、これらはすべて、転写活性化剤と機能的に連携してレポーター遺伝子を発現するために、機能的に連結している。第２の成分は、核酸結合ドメイン、少なくとも１つのプロテアーゼ基質ドメイン、及び誘導性プロモーターのための少なくとも１つの転写活性化ドメインを含む転写活性化剤である。本システムは、プロテアーゼ基質ドメインに対するプロテアーゼ活性に作用する作用物質の発見と評価を行うことができる。また、本システムは、転写活性化剤のプロテアーゼ基質ドメインを特異的に切断する少なくとも１つのプロテアーゼ又はプロテアーゼ候補を含んでいてもよい。
【０００９】
本発明の別の好適な実施形態は、上述のシステムを用いてプロテアーゼ阻害剤を同定する方法である。本発明のさらに別の実施形態では、上述のシステムを用いて環境サンプル中のプロテアーゼの存在を確認する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
本発明の多くの利点は、下記図面を参照することで、当業者にとってより理解しやすいものとなる：
【図１】図１Ａ及び１Ｂは、本発明の１つの実施形態に従って作製された３つのコンストラクトと、それらの他の分子との相互作用を示す模式図であり、プロテアーゼ存在下でのレポーターの転写シグナルの変化を評価するためのものである。１つのコンストラクトは、転写活性化剤（「ＴＡ」）を提供する。ＴＡ剤は、結合ドメイン（「ＢＤ」）、プロテアーゼ基質（「ＰＳ」）ドメイン、及び転写活性化ドメイン（「ＡＤ」）を含む。第２のコンストラクトは、プロテアーゼコンストラクト（「ＰＣ」）である。ＰＣは、プロモーター、ＴｅｔＯなどのレギュレーター配列、及び、ＴＡのＰＣをタンパク質分解活性で切断するプロテアーゼの配列を含む。第３のコンストラクトは、レポーターコンストラクト（「ＲＣ」）である。１つの好適な実施形態のＲＣは、転写プロモーター領域とレポーター遺伝子を含む。転写プロモーター領域は、少なくとも２つの構成要素を含む：ＴＡ剤のＢＤドメインに機能的に対応する少なくとも１つの結合部位（「ＢＳ」）配列、及び、少なくとも１つのＴＡＴＡボックス配列を有する最小プロモーター領域。この図に示すシステムは、ＰＣのプロテアーゼがＰＳを切断した場合、転写が停止し、シグナルが減少することから、「切断オフ」システムと呼ばれる。
【図２】図２Ａ及び２Ｂは、図１Ａ及び１Ｂで概略を説明した３つのコンストラクトの概略図であり、説明／典型例として、ＴＡ剤の一部として示されているドメインは：Ｇａｌ４オペロンの転写因子に由来するＢＤ、ＰＳはＶＡＭＰ２（アミノ酸２５〜９４）又はＳＮＡＰ２５（アミノ酸１０４〜２０６）のいずれか、そして、ＡＤは核内因子κＢ（「ＮＦκＢ／ＡＤ」）である。図１ＢにおいてＲＣの一部として示されている構成要素は：ＴＡ剤のＧａｌ４  ＢＤに対応する少なくとも１つのＢＳからなるプロモーター、及び、ＴＡＴＡボックスを含む最小アデノウイルスプロモーター領域である（E.D. Lewis, J.L. Manley, Mol.Cell Biol. 5: 2433-2442 (1985)）。ＰＣは、発現を調節するためのＴｅｔＯ配列を有するＣＭＶプロモーターと、ＢｏＮＴ／Ａの軽鎖を発現するためのＳＢＰ−ＣＦＰ−ＢｏＮＴ／ＬＣ−Ａ配列とを含む。他のコンストラクトは、任意のボツリヌス毒素の軽鎖、又はＴＡ剤のＰＳを切断するプロテアーゼを含んでいてもよい。
【図３】図３Ａ及び３Ｂは、ＴＡ剤のＢＤ及びＡＤがＰＳの末端に結合している、本発明の１つの実施形態によるシステムの概略図である。ＰＳは、膜に局在しているか、又は細胞の核の外側にとどまる。このシステムにプロテアーゼが加えられると、ＰＳを切断し、ＢＤ−ＡＤ対が遊離され、レポーター遺伝子（「ＲＧ」）の転写が促進される。このシステムは、「切断オン」システムと呼ばれる。
【図４ａ】図４ａは、ＰＳがＶＡＭＰ−２である「切断オン」システムの概略図である。
【図４ｂ】図４ｂは、ＰＳがＳＮＡＰ−２５である「切断オン」システムの概略図である。
【図５】図５は、最小プロモーターの漏出を制御する追加構成要素を有する、ＴＡ剤及びＲＣの概略図である。追加構成要素は、転写調節因子の少なくとも１つのコピーであり、好適な実施形態の１つでは、転写調節因子はＴｅｔＯプロモーター領域（５’−ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａｔｃ−３’）である。具体的には、図示する実施形態では、コンストラクトはＴｅｔＯプロモーター配列の４つのコピーを使用している。
【図６】図６は、安定に組み込まれたＲＣについて、テトラサイクリンの存在及び非存在での生物発光率を示す実験結果の棒グラフである。図中のクローンは、ＴＡ剤コンストラクトを含まない。
【図７】図７は、ＴＡ剤の存在下における安定なレポーターについて、テトラサイクリンの存在及び非存在での生物発光率を示す実験結果の棒グラフである。
【図８】図８は、テトラサイクリンの存在及び非存在における、レポーターコンストラクト及び記載するＢＤ−ＶＡＭＰ−ＮＦκＢ  ＴＡ剤を含む細胞のマイクロプレート細胞機能性試験の結果を示す。
【図９】図９は、本発明の１つの好適な実施形態による生物発光分析であり、記載するＴＡ剤のＹＦＰ（Ｖｅｎｕｓ）及びＧＬｕｃの発現に対する効果を示す。
【図１０】図１０は、安定なＢｏＮＴ／ＬＣ−Ｂ指標細胞株の評価を示す実験結果の棒グラフである。
【図１１】図１１は、ＴＡ剤コンストラクトの機能性試験における生物発光分析の結果を示す棒グラフと画像である。
【図１２】図１２は、切断オフ指標システムの検証を示す棒グラフである。
【図１３】図１３は、安定な細胞株における切断オンシステムの検証を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
上記のように要約される本発明は、以下の説明を参照することでより良く理解でき、また、付属する特許請求の範囲及び図面も合わせて読まれるものとする。当業者が本発明を作製、使用できるように以下に記載した実施形態の説明は、本発明を限定するものではなく、本発明の個別の例である。当業者においては、本発明を実施するための代替のもの、要素、方法、及びシステムを改変又は設計する基礎として、開示された概念や具体的な実施形態を容易に利用することができる。
【００１２】
本発明の１つの実施形態は、プロテアーゼ阻害剤の同定及びプロテアーゼ活性の評価のための、新規の細胞ベースのシステムを提供する。システムの構成要素には、複数のコンストラクトが含まれる。図１〜５に示すように、３つのコンストラクトがシステムの一部を形成している：転写活性化剤（「ＴＡ」、本明細書において「トランス活性化因子」コンストラクトと呼ばれる場合もある）、レポーターコンストラクト（「ＲＣ」）、及びプロテアーゼコンストラクト（「ＰＣ」）。３つのコンストラクトは、２種類のプロテアーゼ評価システムに利用することができる。図１及び２に示す「切断オフ」システムでは、ＰＣの産物がＴＡを不活性化し、その結果、ＲＣの産物の転写が減少する。図３及び４に示す「切断オン」システムでは、ＰＣの産物がＴＡ剤の活性部分を遊離させ、転写が活性化され、ＲＣのレポーターからのシグナルが増強される。
【００１３】
ＴＡ剤は、以下の３つの要素を含むキメラタンパク質分子を発現するように作られている：ＤＮＡ結合ドメイン（「ＢＤ」）、少なくとも１つのプロテアーゼのための切断部位を含むプロテアーゼ基質ドメイン（「ＰＳ」）、及び転写活性化ドメイン（「ＡＤ」）。本発明の１つの好適な実施形態では、図１及び２に示すように、ＴＡ剤は、ＢＤと転写活性化ドメインＡＤがＰＳのそれぞれ反対側に位置するように設計されている。本発明のその他の実施形態では、図３及び４に示すように、ＰＳは、ＴＡ剤のＢＤ−ＡＤエレメントの一端に位置する。システムが「切断オン」システムであるか又は「切断オフ」システムであるかは、ＴＡ剤におけるＰＳの位置によって決定される。
【００１４】
１つの好適な実施形態によるＴＡ剤は、ＳＮＡＰ−２５又はＶＡＭＰ−２などのボツリヌス毒基質を用いる。これらのコンストラクトにおけるＳＮＡＰ−２５及びＶＡＭＰ−２の選択されたドメインは、切断活性の発現に十分である。したがって、通常それぞれの基質を切断するＢｏＮＴプロテアーゼに関して、任意のタンパク質のプロテアーゼ基質ドメインを包含するのに十分なドメインを提供する。より好ましくは、提供するＰＳドメインは、少なくともさらに外毒素ＰＳ部位を包含するのに十分な大きさを有する。M.A. Breidenbach and A.T.B. TRENDS in Molecular Medicine 11: 376-381(2005)。ＶＡＭＰ−２に関しては、ＰＳドメインはＶＡＭＰ−２のアミノ酸２５〜９４を含むと考えられる。Cornille F, Martin L, et al. J Biol Chem. 272:3459-64 (1997)；Sikorra S, Henke T, et al. J Biol Chem. 283:21145-52 (2008)。ＳＮＡＰ−２５に関しては、該ドメインはＳＮＡＰ−２５のアミノ酸１０４〜２０６を含むと考えられる。S. Chen and J.T. Barbieri, Journal of Biological Chemistry 281: 10906-10911 (2006)。１つの好適な実施形態では、ＡＤコンストラクトの配列は、ＢＤ−ＳＮＡＰ−２５−ＮＦκＢ又はＢＤ−ＶＡＭＰ−ＮＦκＢである。用いられるＳＮＡＰ−２５及びＶＡＭＰ−２フラグメントは、パルミトイル化残基が欠失しており、そのため、それぞれ細胞膜又は細胞内小胞へのＴＡ剤の局在化を妨げる。
【００１５】
ＰＣは、ＴＡ剤中のプロテアーゼ基質（「ＰＳ」）を認識するプロテアーゼを含む。ＰＣは、プロテアーゼを発現し、またＴＡ及びＲＣを含む宿主細胞中で発現することができるベクターであってもよい（図１〜５）。本発明の１つの実施形態では、下記例３に示すように、プロテアーゼはベクター中に発現する。別の実施形態では、ＰＣは、ＴＡ及びＲＣを発現する細胞に導入されたプロテアーゼ又はプロテアーゼ様分子であり得る。ＰＣのプロテアーゼは、ＴＡ剤のＰＳドメインを切断する。１つの実施形態によると、ＴＡ剤のＡＤは、ＢＤによってＲＣ上のプロモーターに近接し、ＲＣのＢＳから転写下流に位置するレポーターの転写を促進する（図１及び２）。ＰＣが活性化される又は宿主系に存在すると、プロテアーゼのタンパク質分解活性が作用し、ＡＤからＢＤを分離することで、ＴＡ剤を不活性化し、転写促進因子として作用できなくする（図１Ｂ及び２Ｂ）。ある好適な実施形態では、プロテアーゼはＢｏＮＴ  Ａ、Ｃ、及びＥから選択され、ＰＳはＳＮＡＰ−２５である。別の好適な実施形態では、プロテアーゼはＢｏＮＴ  Ｂ、Ｄ、Ｆ、及びＧから選択され、ＰＳはＶＡＭＰ−２である。さらに別の好適な実施形態では、ＢｏＮＴはセロタイプＣであり、ＰＳはシンタキシン１ａ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＫ５４５０７．２）である。１つの実施形態では、ＴＡは、Ｃ末端膜貫通ドメインが欠失したシンタキシン１ａのドメインを含む場合がある（ＢＤ−シンタキシン１ａ（１〜２６５）−ＡＤ）。プロテアーゼ基質は、任意の既知のプロテアーゼ基質であってよい。同様に、様々なプロテアーゼが使用できると考えられる。例としては、炭疽菌プロテアーゼ、カスパーゼ、アルファウイルスＮＳＰ２プロテアーゼ、ＨＩＶプロセシングプロテアーゼ、低分子ユビキチン様修飾因子プロセシングプロテアーゼ、ユビキチンプロセシングプロテアーゼ、ＩＳＧ１５プロセシングプロテアーゼ、自食作用関連ＡＴＧ４様プロセシングプロテアーゼ、及び、Ｃ型肝炎プロセシングプロテアーゼなどが挙げられる。
【００１６】
その他の実施形態によると、ＰＳドメインの切断は、レポーター遺伝子発現の促進（「切断オン」効果）をもたらす（図３Ｂ及び４Ｂ）。切断によって、機能的に連結したＢＤ及びＡＤエレメントの双方を含むユニットが遊離されれば、転写は促進される。図３Ｂ及び４Ｂに示すように、ＢＤ及びＡＤからなるＴＡ剤は、プロテアーゼ基質（ＰＳ）ドメイン上のパルミトイル化残基によって、細胞核の外部にとどめることができる。さらなる実施形態では、ＢＤ−ＡＤ対は、ＰＣからのプロテアーゼによってＢＤ−ＡＤコンストラクトが遊離されるまでＢＤ−ＡＤコンストラクトを細胞核の外部にとどめるような他の分子に結合されていてもよく、遊離したＢＤ−ＡＤコンストラクトは核の内部に輸送され、その後レポーター遺伝子の転写を促進する。このような機構では、プロテアーゼ基質ドメインは、細胞内で、細胞膜や他の小胞膜と結合していてもよい。プロテアーゼの切断部位は、ＢＤ−ＡＤからなるＴＡと、ＰＳの核外アンカー部位との間に位置する。そのため、ＰＳがプロテアーゼによって切断されると、ＢＤ−ＡＤが遊離して核に入り、指標物質の転写を促進することで、プロテアーゼの存在を示す。本発明の１つの実施形態では、ＰＣにおけるプロテアーゼの発現が調節されている。例えば、ＴｅｔＯ制御エレメントがプロテアーゼ遺伝子の上流に含まれる場合があり、適切な条件が存在しない限り、プロテアーゼの発現を妨げる。１つの好適な実施形態では、テトラサイクリンが存在しない場合にプロテアーゼの発現を妨げるＴｅｔＯオペレーターが用いられている。当業者に知られている他の制御機構も、宿主細胞中のプロテアーゼ発現の制御に対して妥当であると考えられる。
【００１７】
ＲＣは、核酸ベースのコンストラクトである。好ましくは、ＴＡ剤及び／又はＰＣも、それぞれトランス活性化因子分子及びプロテアーゼを発現する核酸ベースのコンストラクトである。しかし、当業者においては、ＴＡ及び／又はＰＣは、あらかじめ作られたタンパク質として、哺乳類の機能細胞に与えられる場合があることも理解される。同様に、当業者においては、この３つのコンストラクトのシステムによる他の環境への適用も理解でき、それは例えば、ＴＡ剤とＰＣのいずれか又は両方が核酸又はタンパク質で提供され、３つのコンストラクトが膜上に固定されているものなどの無細胞系が挙げられる。以下の説明では、コンストラクトのそれぞれが遺伝子導入による遺伝子コンストラクトとして哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞に導入された、好適な実施形態に焦点を当てる。
【００１８】
ＲＣは、ＴＡ剤のＢＤによって認識される１つ以上のＢＳを有し、好ましくはプロモーター配列がＴＡＴＡボックス及び少なくとも１つのレポーター遺伝子を含む（図１〜４）。ＴＡ剤のＢＤエレメントは、該１つ以上のＢＳエレメントに結合する。本発明の１つの実施形態では、ＴＡ剤にＧａｌ４  ＢＤが用いられ、対応するＧａｌ４  ＢＳがＲＣに用いられる。別の好適な実施形態では、ＬｅｘＡ  ＢＤと対応するＢＳ配列が用いられる。同様に、Ｂ４２酸性小球ドメイン、ＶＰ１６酸性活性、及びｐ５３酸性活性化ドメインなど、トランス活性化因子からもたらされるその他の活性化ドメインも用いることができる。J Estojak, R. Brent, E.A. Golemis Molecular and Cellular Biology 15:5820-5829 (1995)；及び、H. Lee, K Hun Mok et al. JBC 275: 29426-29423 (2000)。１つの好適な実施形態では、ＩＰＲは、１〜１４８番目のアミノ酸の位置に、Ｇａｌ４同系ＤＮＡ結合配列の５つのコピーを有する。その他の結合ドメイン認識配列の複数のコピーも用いることができると考えられる。例えば、ＬｅｘＡに対する結合ドメイン配列（ＢＤ）などが挙げられる。結合部位は、通常、ＴＡＴＡボックスの１０〜５００ｂｐ上流に位置している。
【００１９】
１つの好適な実施形態では、ＢＳ及びプロモーター配列は、本質的に２つの部分からなるコンストラクトである誘導性プロモーター領域（「ＩＰＲ」）を構成する。第１の構成要素は最小プロモーターＴＡＴＡボックスであり、これは最小限では単独で、最小プロモーターの上流で機能する。第２の構成要素は少なくとも１つのＢＳであり、該ＢＳに結合した無損傷のＴＡ剤の存在下で、２つの部分からなるプロモーターからの転写を顕著に増加させる。１つの好適な実施形態では、ＩＰＲは最小アデノウイルスプロモーター領域を有する（E.D. Lewis, J.L. Manley, Mol Cell Biol 5: 2433-2442 (1985)）。ＴＡ剤のＢＤによって認識されるＢＳの数個のコピーを用いることで、ＴＡ剤のＲＣへの結合をより強くすることができる。用いるＢＳの数は１つから８つ程度で、好ましくは５つである。上述の好ましいＢＤエレメントによると、対応するＢＳは、ＢＤによって認識されるＤＮＡ配列である。K.H. Young, Biol. Reprod. 58: 302-311 (1998)。この構成においては、最小ＴＡＴＡボックスプロモーター領域は、追加の転写活性化因子（この場合ではＢＤ−ＡＤキメラタンパク質によってもたらされる）によるＢＤ領域への結合がない状態では、ごく最小限の転写のみを促進することができる。
【００２０】
場合によっては、ＴＡＴＡボックスなどの最小プロモーターからなる２部分の転写調節領域の第１の構成要素は、ＢＤ−ＡＤを含む転写活性化因子によるＢＳ配列への結合がない状態では、好ましくない高いレベルの転写活性をもたらす可能性がある。転写活性化因子によるＢＳへの結合がない状態での最小プロモーターＴＡＴＡボックスからの転写を抑制することによる調節のレベルを高めるには、さらにテトラサイクリン制御型リプレッサー、又は好ましくはテトラサイクリン制御型サプレッサーエレメントを、最小プロモーターの下流に配置する（図５）。ＴｅｔＯと呼ばれるこのＤＮＡ配列エレメントは、テトラサイクリンの非存在下で、テトラサイクリン・リプレッサータンパク質、又はテトラサイクリン・サプレッサータンパク質に結合する（図５）。テトラサイクリンの存在下では、テトラサイクリン応答型リプレッサー又はサプレッサータンパク質は、ＴｅｔＯエレメントから遊離され、ＢＳ及び最小ＴＡＴＡ領域を含む２部分の転写調節領域からの転写の抑制を解放する。その他の調節エレメントも用いることができると考えられる。
【００２１】
１つの例示的実施形態では、転写調節領域は、ＢＳ及びプロモーター領域の下流に位置する（プロモーター領域はＴＡＴＡボックスを含んでもよい）。好適な実施形態によると、レポーターコンストラクト上のプロモーター領域の下流にあるエレメントは、２１個のヌクレオチドからなるＴｅｔＯプロモーター領域の少なくとも１つのコピーである。N.F.J. van Poppel, J. Welagen, et al. International Journal for Parasitology 36: 443-452 (2006)。好ましくは、ＲＣは、少なくとも１つからおよそ６つのＴｅｔＯプロモーターの反復、より好ましくは、およそ４つのＴｅｔＯプロモーターの反復を含む。ＲＣが、ｔＴＳ遺伝子産物を含むＴｅｔＳ細胞中にある場合、ＴｅｔＯプロモーター領域を介した転写はブロックされる。好ましいこのようなＴｅｔＳ／ｔＴＳ細胞株は、ＨｅＬａ細胞株の派生株で、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のＨＥＫ２９３ｔＴＳ、Ｃａｔａｌｏｇ＃６３１１４６；又はＨｅＬａ２９３ｔＴＳ、Ｃａｔａｌｏｇ＃６３１１４７などの細胞株がある。テトラサイクリンを加えると、ＴｅｔＯプロモーターはｔＴＳに結合されない。本発明の１つの好適な実施形態では、レポーターコンストラクトは、プロテアーゼ活性の評価方法の効率を高める付加的な構成要素を含む。そのような構成要素の１つは、適切な条件が存在しない限りレポーター産物の転写を妨げるために用いられる、転写サイレンシング又は阻害配列からなる。例えば、図５に示すように、Ｔｅｔオペロン（ＴｅｔＯ）のいくつかのコピーを、プロモーターの下流に配置してもよい。N.F.J. van Poppel, J. Welagen, et al. International Journal for Parasitology. 36:443-452 (2006)。ＲＣが、転写サイレンサーｔＴＳを発現する細胞株に導入された場合、レポーターの転写が抑制される。テトラサイクリンを加えることで、ｔＴＳがＴｅｔＯへの結合から取り除かれ、プロモーターが高度に活性化される。当業者においては、その他の類似の転写阻害剤も利用できることが理解されよう。また、ＴｅｔＯのコピーの数の増加がレポーターの転写レベルに直接関係し、阻害剤のコピーが多いほど、該領域への結合が強くなることがわかる。
【００２２】
ＴＡ剤のＡＤエレメント（上述の好適な実施形態によると、ＡＤはＮＦκＢである）は、その後遊離して、転写を促進する。このさらなる調節レベルは、システムの厳密な調節を可能にする。例えば、テトラサイクリンが存在しない場合、レポーター遺伝子産物は存在せず、発現が特に「漏れやすい」ことはない。ＴＡの発現又はＢＤ−ＮＦκＢキメラの遊離がない場合のバックグラウンドの転写レベルは、測定することができる。
【００２３】
上記のエレメントを含むＩＰＲは、１つ以上のレポーター遺伝子の上流にあり、転写を調節する。本発明のある好適な実施形態では、プロテアーゼ活性の評価に２つ以上のレポーターを用いることができる。例えば、２つの異なる蛍光分子配列が含まれる。その他のレポーター対、例えば蛍光レポーター及び抗生物質耐性配列なども用いることができる。２つの配列は、別々の分子として翻訳されてもよく、又はキメラ産物を生産してもよい。１つの好適な実施形態では、２つのレポーターは、単一の翻訳産物の一部である。さらに好適なある実施形態では、２つのレポーター分子は、切断可能なリンカーによって分離されている。ある例では、図２及び４に示すように、Ｖｅｎｕｓ遺伝子産物がＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）遺伝子産物に融合し、２つのレポータータンパク質は口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）の「自己切断」ペプチド２Ａ配列によって連結されている。M.D. Ryan and J. Drew, Foot-and-mouth disease virus 2A oligopeptide mediated cleavage of an artificial polyprotein, The EMBO Journal 13:928-933 (1994)。当業者においては、他の自己切断ペプチドを２つのレポーターの連結に用いることができること、又は、２つのレポーターは融合タンパク質産物の一部として活性があり、２つのタンパク質産物に分離する必要がないことが理解されよう。２Ａ切断部位により、培養液に分泌されたＧＬｕｃの活性、及びＶｅｎｕｓ発現による細胞蛍光が生じる。両方のレポーター遺伝子を包含することで、細胞のＶｅｎｕｓ  ＹＦＰの生産を顕微鏡で即座に調べることができ、同様に、プレートリーダーで生物発光を検出することができる。ＧＬｕｃ産物は細胞の増殖が行われている培養液中に放出されるため、ＧＬｕｃレポーターの過剰発現は、当業者において既知の方法により、容易に測定することができる。１つの転写（１つのプロモーターから発現された１つのＲＮＡ）から２つのタンパク質を発現する別の方法としては、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を２つの遺伝子の間に挿入する方法がある。Yury A. Bochkov and Ann C. Palmenberg BioTechniques 41:283-292 (2006)。
【００２４】
本システムは、インビボでＴＡ剤のＰＳを特異的に認識するプロテアーゼの活性の評価に用いることができる。例えば、ＲＣを含む細胞内でコンストラクトが発現された場合、レポーター産物の発現レベルは、同細胞内でのプロテアーゼの活性の作用の１つであるキメラＢＤ−ＡＤ産物の存在を示す。
【００２５】
プロテアーゼ基質が膜貫通成分を含む場合、ＢＤ−ＡＤ成分の作用は無効化される。例えば、天然型のボツリヌス神経毒素プロテアーゼ基質は、タンパク質を小胞膜に局在化させるパルミトイル化残基を含む。Lane, S. R. and Y. C. Liu. Journal of Neurochemistry 69: 1864-1869 (1997)。その結果、上述のＢＤ−ＰＳ−ＡＤコンストラクトに用いられるＰＳには、基質のパルミトイル化残基は除外される。細胞膜への局在化は、単純に、パルミトイル化残基をコンストラクトから除去することで回避することができる。当業者においては、実施形態の一部では、パルミトイル化残基をコンストラクトから除外する代わりに、これらの残基のパルミトイル化を防ぎ、コンストラクトの小胞膜への局在化を阻害するようにコンストラクトを設計することが可能であることも理解されよう。
【００２６】
一方で、パルミトイル化とそれによる細胞膜への局在化は、本発明の別の好適な実施形態で利用することもできる。そのような実施形態では、パルミトイル化プロテアーゼ基質は転写エンハンサードメインに結合される（図３及び４）。この構成は、以下にＢＤ−ＡＤ−ＰＳ又はＡＤ−ＢＤ−ＰＳとして記載されており、ＢＤ−ＡＤとＡＤ−ＢＤの順番は置き換え可能である。あるいは、プロテアーゼ基質が転写エンハンサーエレメントに結合し、ＰＳ−ＢＤ−ＡＤの構成となってもよい。これらの好適な実施形態の例においては、ボツリヌス神経毒素基質は、図４ａ（ＢＤ−ＮＦκＢ−ＶＡＭＰ）及び図４ｂ（ＳＮＡＰ−２５−ＢＤ−ＮＦκＢ）に示すように提供され、この好適な実施形態におけるＢＤは、Ｇａｌ４結合ドメインである。別の好適な実施形態では、ＢＤ−ＡＤドメインを有する全長シンタキシン１ａは、シンタキシン１ａのＮ末端に融合している。シンタキシン１ａのＣ末端膜貫通ドメインは、ＢＤ−ＡＤ−シンタキシン１ａの全長分子を、シナプス前終末の膜に固定している。
【００２７】
本発明の別の実施形態を表す１つの可能性のある解決法である切断オンＢｏＮＴ／Ａ切断試験の潜在的限界のため、ＢＤ−ＡＤドメインは、プロテアーゼ基質ＰＳ、この場合ではＳＮＡＰ２５のアミノ酸１０４〜２０６（ＳＮＡＰ２５に存在するパルミトイル化システイン残基、アミノ酸９５〜１０３は欠如する）と融合されてもよく、これはさらに、任意のシンタキシン１ａ全長分子と融合し、融合分子全体ＢＤ−ＡＤ−ＳＮＡＰ２５（１０４〜２０６）−シンタキシン１ａ全長（１〜２８８）を固定する。この配列は、ＢｏＮＴ／Ａに対するＳＮＡＰ２５全長（１〜２０６）−ＢＤ−ＡＤ切断オンシステムの潜在的限界に対応するだけでなく、ＢＤ−ＡＤ−ＳＮＡＰ２５（１０４〜２０６）−シンタキシン１ａ全長（１〜２８８）は、ＳＮＡＰ−２５及びシンタキシン１ａ分子の両方の切断によりＢｏＮＴ／Ｃ１の切断オン指標として機能し、また、ＳＮＡＰ２５においてＢｏＮＴ／Ｅの切断オン指標として機能する。シンタキシン１ａを用いてＢＤ−ＡＤ−ＳＮＡＰ２５分子をシナプス前膜に固定することには、潜在的利点がある。原則的な利点としては、ＳＮＡＰ２５の場合と本質的に同一であるシンタキシン１ａの標的化及びシナプス前膜への局在化は、ＳＮＡＰ２５基質を正しく局在化することができる。また、ＢｏＮＴ／Ａ  ＬＣは、シンタキシン１ａの輸送と同じように、シナプス前膜に輸送され、プロテアーゼ基質及びＢＤ−ＡＤ−ＳＮＡＰ２５（１０４〜２０６）−シンタキシン１ａ全長（１〜３２８）の局在化が可能となる。本発明の別の実施形態では、ＴＡ剤はＢＤ−ＡＤ−ＳＮＡＰ２５（１０４〜２０６）−ＶＡＭＰ−２コンストラクトである。ＢＤ−ＡＤ−ＳＮＡＰ２５（１０４〜２０６）−ＶＡＭＰ−２コンストラクトは、本質的にすべてのＢｏＮＴセロタイプの試験に用いることができる広範囲なボツリヌスプロテアーゼシステムである（ＢｏＮＴ／Ａ、Ｃ１、及びＥはＳＮＡＰ−２５を切断し、ＢｏＮＴ／Ｂ、Ｄ、Ｆ、及びＧはＶＡＭＰ−２を切断する）。
【００２８】
ＲＣのレポーター配列は、蛍光タンパク質、生物発光タンパク質、又は、遺伝子の発現によるシグナルの定量化が可能なその他のタンパク質の配列と対応させることができる。黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）；青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、及びこれらの蛍光変異体も用いることができると考えられる。Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ、ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、コメツキムシルシフェラーゼ、及びホタルルシフェラーゼなどの生物発光タンパク質も、レポーターベクターの活性の定量化に用いることができる。１つの好適な実施形態では、レポーター配列は、Ｖｅｎｕｓ黄色蛍光タンパク質からなり得る。Nagai T., Ibata K., Park E.S., et al. Nature Biotechnol 20: 87-90 (2002)。
【００２９】
本システムは、上述のコンストラクトの１つ以上を含む遺伝子組み換え細胞株の作製に用いることができる。コンストラクトは、特定のタイプの細胞における発現のために、１つ以上のベクターに組み入れることができる。コンストラクトは、細胞内に安定に組み込まれるか、又は形質転換ベクター上に存在してもよい。その方法とベクターは、当技術分野において公知である。細胞への形質移入及び形質導入に用いる方法論は、当技術分野において公知である。Laura Bonetta, The Inside Scoop−Evaluating Gene Delivery Methods, Nature Methods 2:875-883 (2005)。ある好適な実施形態では、コンストラクトの１つ以上は、レンチウイルスベクターを介して組み込まれる。さらに好適なある実施形態では、レンチウイルスベクターは、自己不活性化（「ＳＩＮ」）レンチウイルスベクターである。当業者においては、コンストラクトを含む細胞と含まない細胞を区別するために、ベクターに抗生物質耐性マーカーなどのその他の選択マーカーを含ませ得ることが理解されよう。
【００３０】
本発明の別の好適な実施形態は、遺伝子組み換え細胞株の作製方法を提供する。該方法の第１の工程では、２９３−ｔＴＳ細胞などの真核細胞に、Ｇａｌ４  ＢＳの５つのコピーによって制御される最小プロモーターから発現される調節レポーター遺伝子を含むＲＣを含有するベクターを用いて、形質導入を行う。他の好適な実施形態では、上述のように、合成テトラサイクリンオペレーターの４つのコピーがさらに含まれる（「Ｇ５ＴＯ４プロモーター」）。
【００３１】
本システムは、ボツリヌス神経毒素などの特定のプロテアーゼの活性の評価に用いることができる。第１の工程として、Ｇａｌ５／ＴＯ４プロモーター及びＶｅｎｕｓ遺伝子、ＧＬｕｃ遺伝子を有するＲＣを含むレンチウイルスベクターを哺乳類２９３−Ｔｓ細胞にトランスフェクトする。その後、細胞は、ＢＤ−ＳＮＡＰ−２５−ＡＤコンストラクト又はＢＤ−ＶＡＭＰ−２−ＡＤコンストラクトのいずれかを含むレンチウイルスベクターでトランスフェクトする。コンストラクトは、安定に導入される。細胞株は、ＢｏＮＴ／ＬＣ−Ｂをコードする遺伝子コンストラクトをさらに含むよう操作され、種々のボツリヌス神経毒素プロテアーゼの活性を評価するための最終的なレポーター細胞株を作り出す。これらの最終的な細胞株では、ＢｏＮＴ／ＬＣの発現がＳＮＡＰ−２５又はＶＡＭＰベースのトランス活性化因子融合タンパク質を切断し、ＤＮＡ結合ドメインを活性化ドメインから分離し、その結果、細胞はＶｅｎｕｓ及びルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現できない。あるいは、プロテアーゼが細胞内に形質導入される。上述のように、同様の方法が、他のプロテアーゼ−基質又は結合ドメイン−結合部位の対の活性を確認するために用いることができる。
【００３２】
ＲＣ、ＴＡ剤、及びＰＣを含むレポーター細胞株は、プロテアーゼ阻害剤の同定に用いられる。１つの好適な実施形態では、細胞株は、ボツリヌス神経毒素阻害剤などのプロテアーゼ阻害剤のハイスループットスクリーニングに用いられる。キメラ転写因子は、無損傷の場合、Ｇ５又はＧ５ＴＯ４プロモーターを活性化し、その結果、Ｖｅｎｕｓ及びＧＬｕｃレポーター遺伝子の発現につながるが、ボツリヌス神経毒素の軽鎖によって切断されると、レポーター遺伝子の発現が停止する。前述のように、このシステムは、「切断オフ」システムと呼ばれ、低分子ＢｏＮＴ／ＬＣ阻害剤のスクリーニングに適しているが、これは、ＢｏＮＴの阻害がレポーターシグナルの増加を引き起こし（「シグナル増大」試験）、偽陽性の検出頻度が低下するためである。ＢｏＮＴ／ＬＣ阻害剤の存在下では、転写因子は切断されず、その結果、Ｖｅｎｕｓ及びＧＬｕｃ指標物質の発現が回復する。
【００３３】
細胞株は、システムが潜在的な阻害剤にさらされるハイスループットスクリーニング試験に用いられる。本発明の１つの実施形態では、システムは、利用可能な化合物ライブラリーに存在する阻害剤の同定、又は所望の特定の分子の試験に用いることができる。ライブラリーを用いたそのような方法の１つは、例４〜６に記載されている。
【００３４】
本発明の１つの実施形態は、細胞によるシグナル増大型の生物発光レポータースクリーニングを提供する。ある好適な実施形態では、本発明は、ＢｏＮＴ／Ａ  ＬＣやＢｏＮＴ／Ｂ  ＬＣなどの神経毒のエンドペプチダーゼ阻害剤を、細胞ベースのレポーターＨＴＳによって同定する。これらのエンドペプチダーゼ阻害剤は小分子で、ＢｏＮＴ／ＡやＢｏＮＴ／Ｂなどの神経毒を阻害する。１つの好適な実施形態によって用いられた遺伝子組み換え細胞株は、低基底レポーターシグナルを有するが、小分子がＢｏＮＴ／ＬＣのペプチダーゼ活性を阻害すると、非常に高く増幅された光シグナル（＞１０Ｘ）を生み出す。この手法により、ＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰ−２、シンタキシン１ａ、及び他の神経毒と相互作用するＢｏＮＴ／ＬＣに対して細胞内で活性な阻害剤の同定手段が提供される。細胞ベースのＢｏＮＴ／ＬＣ又はＨＴＳスクリーニング試験は、それぞれ、他の試験に対する簡便なカウンタースクリーニングを提供する。同様に、切断オン及び切断オフ試験を連続して用いることで、カウンタースクリーニング試験となり得る。これらのカウンタースクリーニング試験の目的は、例えば、他の一般的な毒性現象ではなく本発明による作用機序などを確認することである。本システムのそのような試験には、切断された転写活性化分子の細胞毒性の分析又は判定が含まれ、迅速に偽陽性を排除し、最も選択性が高く毒性のない神経毒阻害剤を素早く同定する。偽陽性のスクリーニングの方法の１つとしては、レポーター分子の発現に影響を及ぼしていると考えられるシステム内の転写活性化分子の分析がある。偽陽性（例えば、ＴＡ分子の遊離又は分解に関係のない何らかの機構によって働く阻害剤）のスクリーニングは、例えば、分離カラムによるＴＡ分子の大きさの分析や、ＴＡ分子を認識する抗体などを利用する。したがって、本発明の１つの実施形態は、細胞ベースのＨＴＳにより、神経細胞内のＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰ−２、シンタキシン１ａなどの基質の神経毒切断を阻害する「薬剤様」小分子を同定する方法を提供する。
【００３５】
本明細書に記載する細胞ベースのスクリーニング手法は、あらゆるインビトロの酵素的スクリーニングに対して顕著な利点があるが、それは、化合物が細胞内環境にたどり着き、細胞質ゾル中ののＢｏＮＴ／Ａ又はＢｏＮＴ／Ｂなどの神経毒による、ＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰ−２、シンタキシン１ａなどのそれらの基質の切断を阻害する必要があるためである。そのため、毒素及びその基質の両方が、臨床的なインビボ環境にある。毒素の作用は、無細胞での酵素活性とは対照的に、細胞内では異なる可能性が高い。７０〜１００アミノ酸残基の大きな基質フラグメントを用いることが、これらの細胞ベースの試験の主要な優位点の一つである。活性部位がエキソサイトよりも大きいタンパク質を包含できることから、通常エキソサイトと考えられていない部位での切断が検出可能である。
【００３６】
本明細書に開示する方法及びシステムは、ボツリヌス神経毒素Ａ及びＢなどの種々の神経毒の阻害剤を治療法として最適化するために、同定及び優先順位の決定に用いることができる。該方法は、さらに、多様な化合物のライブラリーに対して、ＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｂなどの神経毒の阻害剤のための哺乳類細胞ベースの主要レポータースクリーニングの構築、検証、及び適用に用いることができる。スクリーニングのヒットは、三重の再分析で確認することができ、偽陽性は、複数のＢｏＮＴベースの試験又は非毒素試験を互いのカウンター試験として用い、また上述の他の方法を用いることで、排除することができる。本出願に開示する方法は、さらに、細胞によるシグナル増大型のレポータースクリーニングを提供する。これらのスクリーニングは、化合物ライブラリーに適用され、潜在的な阻害剤を同定するために、二次検証として生化学的試験による追加検討を行う。検証されたヒットは、その特徴を完全に調べ、インビトロ及び神経細胞モデル系の両方でボツリヌス神経毒素に対して特異的に作用するか、そして細胞毒性が最小限であるかを確認する。
【００３７】
１つの実施形態では、本明細書に記載するシステム及び方法は、ＢｏＮＴが引き起こす中毒の治療のための極めて強力な小分子阻害剤の同定及び開発を提供する。小分子ＢｏＮＴ  ＬＣ阻害剤は、神経細胞に侵入し、毒素への前暴露及び後暴露の両方に対する防護をもたらすことができる。その他の実施形態では、本明細書に記載するシステム及び方法は、発病において重要となりうる他のプロテアーゼ基質対に対する小分子阻害剤の同定に用いることができる。そのようなプロテアーゼ基質対としては、炭疽菌致死因子、カスパーゼ、ユビキチンプロテアーゼ、低分子ユビキチン様修飾因子プロテアーゼ、ユビキチン様分子プロセシングプロテアーゼ、ＡＴＧ４などの自食作用関連プロセシングプロテアーゼ、アルファウイルスＮＳＰ２プロテアーゼ及びＨＩＶプロテアーゼなどのウイルスにコードされたプロテアーゼなどがある。
【００３８】
しかしながら、ＢｏＮＴは、プロテアーゼ阻害剤を同定するシステムを利用可能な多くの方法の一例である。当業者においては、本明細書に記載するコンストラクト及び方法は、他のプロテアーゼ、及びそれらの活性や阻害剤の評価に利用できることが理解されよう。可能性の範囲には、ほぼすべての基質とプロテアーゼの組み合わせが含まれるが、いくつかの具体的な例としては、炭疽菌致死因子亜鉛金属プロテアーゼ（ＬＦ）とその関連する基質ＭＡＰＫＫ、アルファウイルスのＮＳＰ２プロテアーゼなどのウイルスプロセシングプロテアーゼとその関連する基質ＮＳＰ１−４、ユビキチン及びユビキチン様分子プロセシングプロテアーゼ、カスパーゼ、ユビキチンプロテアーゼ、低分子ユビキチン様修potency飾因子プロテアーゼ、ユビキチン様分子プロセシングプロテアーゼ、ＡＴＧ４などの自食作用関連プロセシングプロテアーゼ、アルファウイルスＮＳＰ２プロテアーゼ及びＨＩＶプロテアーゼなどのウイルスにコードされたプロテアーゼなどがある。小分子阻害剤のスクリーニングにおいて、小分子阻害剤の高速でハイスループットのスクリーニングには、細胞内でプロテアーゼが活性化されているときはシグナルが抑えられ、細胞内で小分子によってプロテアーゼが阻害されているときはシグナルが増加するような細胞ベースのシステムが好ましい。これは、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）では、一般的に、「陽性のヒット」が存在している、すなわち、活性なプロテアーゼ阻害化合物が存在している場合にシグナルが増加する方が、より効率的なためである。
【００３９】
細胞内のプロテアーゼ活性の存在を検出する手段は重要となり得る。例えば、ＢｏＮＴへの集団暴露が起きた場合、限られたリソースで直ちに治療を必要とする人と、実際には暴露していない可能性もあるが体調の悪い人（いわゆる歩ける人（walking well））とを、素早く分別する必要が生じる場合がある。同様に、ＢｏＮＴ薬剤の効果と効能を試験する手段の現在のゴールドスタンダード、すなわち主要なものは、毒素をマウスに注射し、マウスのＬＤ５０の基準を定める方法を用いている。この方法では、生きた動物を致死検定に大量に使用する必要がある。そのような生きた動物での検定は、制限又は排除することが望ましい。ＢｏＮＴの活性の存在を確実に検出し、定量化することができるような、細胞ベースの試験法が必要である。ＢｏＮＴ  ＬＣプロテアーゼなど、細胞内のプロテアーゼの存在を検出する細胞ベースの試験法は、細胞内にプロテアーゼが存在することで１つまたは複数の指標シグナルが活性化されるシステムによって構成するのが最適である。本発明の１つの実施形態では、「切断オン」の構成（ＢＤ−ＡＤ−ＰＳ）においてＴＡ剤とＲＣを発現する細胞が、試料中の既知のプロテアーゼの存在を確認するために用いられている。そのような実施形態では、環境試料はＴＡ及びＲＣコンストラクトを含む細胞に提示される。もし標的プロテアーゼ、例えばＢｏＮＴ／ＬＣ  Ａが存在すれば、それが細胞内に入り、ＴＡをＰＳで切断し、ＡＤ−ＢＤフラグメントを遊離させ、次にそれがＲＣ内のレポーター遺伝子の転写を促進する。
【実施例】
【００４０】
実施例１
哺乳動物細胞におけるｐＢＤ−ＮＦκＢの発現
合成プロモーターＧ５／ＴＯ４を含む、本発明の一実施形態にしたがったレポーターコンストラクト（ＲＣ）はレンチウィルスベクターにより細胞に形質移入された。前記レポーターコンストラクトは、ＮＦκＢ転写活性化因子に連結したＧａｌ４結合ドメイン融合体（転写活性化剤）を発現するプラスミド（ｐＢＤ−ＮＦκＢ）とともにＨｅＬａ−ｔＴＳ細胞へ共形質移入された。前記の形質移入された細胞はテトラサイクリン転写サイレンサーｔＴＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を恒常的に発現する。前記の細胞は６穴プレートで、約８０％の集密（コンフルエンス）になるまで培養された。形質移入の６時間後、１μｇ／ｍｌのテトラサイクリンが、前記の試験細胞の培地に加えられた。テトラサイクリンは対照として用いられる試験細胞の培地には加えられなかった。コペポーダ（Gaussia princeps）ルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）アッセイ（Monique Verhaegen and Theodore K. Christopoulos Anal. Chem., 74:4378-4385 (2002)）のため、形質移入の２日後に、培養液が回収された。１μｇ／ｍｌの濃度でテトラサイクリンを含む培地で培養された前記の細胞の相対的光単位（ＲＬＵ）はテトラサイクリンを含まない培地で培養された細胞よりもルミノメーターで測定すると１６倍高い。さらに、テトラサイクリンを含む培地で培養された細胞ではビーナスの発現があり、テトラサイクリンを含まない培地で培養された細胞ではビーナスの発現が無い。したがって、（１）合成プロモーターＧ５／ＴＯ４は機能的である。それは、Ｇａｌ４結合部位に結合するＢＤ−ＮＦκＢのような転写活性化因子により大いに活性化されうる。テトラサイクリンの存在下でＧＬｕｃとＹＦＰの両方の発現が大いに活性化される。（２）ＧＬｕｃ遺伝子は大変敏感で便利なレポーターである。これらの実験で、コペポーダルシフェラーゼの９５％が培養液中に分泌される。したがって、ＧＬｕｃ活性は培養液より直接、ルミノメーターによって測定されうる。この制御されたレポーター遺伝子発現、レポーター遺伝子発現の低くて測定可能なバックグラウンド、及び、簡便な使用に照らし、この応用例で述べられるプロモーターレポーターシステムはハイスループットスクリーニングに有効である。
【００４１】
前記の新規レポーターコンストラクトはレンチウィルスベクターにより２９３−ｔＴＳ細胞へ形質導入された。前記のレポーターコンストラクトを持つレンチウィルスベクター粒子は７．１μｇのＨＩＶ−１  ｇａｇ−ｐｏｌヘルパーコンストラクト（Synaptic Research）、及び、２．８μｇのＶＳＶ−Ｇ発現プラスミド（Synaptic Research）との３．５μｇの形質導入プラスミドの１００  ｍｍプレートに培養された８０％から９０％の集密の２９３ＦＴ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）への共形質移入により作成された。発芽したウィルスベクターを含む培養液から形質移入の４８時間後に回収され、４℃、２，０００  ｒｐｍで１０分間の遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＴ  ６００Ｄ）により細胞破砕物が取り除かれた。破砕物を取り除かれたウィルス上清はさらに、４℃、２５，０００  ｒｐｍで９０分間の超遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＯｐｔｉｍａTM  ＸＬ１００Ｋ）により濃縮された。最後に、ウィルスベクターペレットは５０μｌ（元の容積の１／２００）の培養液に一晩浸され、再懸濁され、そして、形質導入で必要になるまで−８５℃で保存された。結果、生じたウィルスベクター粒子は、恒常的にテトラサイクリン転写サイレンサーｔＴＳを発現する２９３−ｔＴＳ細胞（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を形質導入するために使用された。クローニング用リングにより、単細胞コロニーがクローン化され、増幅した細胞をＢＤ−ＮＦκＢキメラ転写活性化因子を発現するｐＢＤ−ＮＦκＢで一時的に形質移入することにより機能性について試験された。１μｇ／ｍｌのテトラサイクリンの存在下、及び、非存在下、前記の形質移入された細胞が培養された。テトラサイクリンによる誘導の２日後、YFP蛍光（ビーナス遺伝子発現）が蛍光顕微鏡で観察され、コペポーダルシフェラーゼ遺伝子発現はルミノメーターにより測定された。
【００４２】
我々は２５クローンを解析した。６クローンの結果を図６で示される。我々は、大変低い基礎活性を示し、テトラサイクリンの添加により１４倍に活性化されうるクローン１７番を選択した。これにより、前記のレポーター分子は活性化剤によって誘導された。そして、前記のシステムはハイスループットスクリーニングに必要な属性を持つ。
【００４３】
実施例２
レポーターコンストラクトと転写活性化剤を含むｔＴＳ細胞
制御要素の遺伝子、すなわち、Ｇａｌ４  ＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸１からアミノ酸１４８まで）（Ｇａｌ４／ＢＤ、又は、ＢＤ）とＮＦκＢ転写活性化ドメイン（ＮＦκＢ／ＡＤ、又は、ＡＤ）の間に挟み込まれた適切なＢｏＮＴ基質（ＢｏＮＴ／ＡにはＳＮＡＰ−２５、及び、ＢｏＮＴ／ＢにはＶＡＭＰ−２）から成る転写活性化因子キメラ融合タンパク質は実施例１で述べられる新規レポーターコンストラクトを持つ細胞に導入された。
【００４４】
実施例２Ａ
タンパク質性基質がパルミトイル化された残基を含まないＢＤ−ＰＳ−ＡＤコンストラクトは合成で構築され、前記のレポーターコンストラクトを含む細胞に導入された。Ｇａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインとＮＦκＢ転写活性化ドメインの間に融合されたＳＮＡＰ−２５の切断部位の周囲１０３アミノ酸残基（残基１０４から残基２０６まで）、あるいは、ＶＡＭＰ−２の切断部位の周囲７０アミノ酸残基（残基２５から残基９４まで）のどちらかをコードする転写活性化剤が使用された。実施例１由来のレポーター細胞系列クローン１７番はさらに、ＢＤ−ＶＡＭＰ−ＮＦκＢ遺伝子コンストラクトを持つレンチウィルスベクターで形質導入された。６個の単細胞クローンが選択され、テトラサイクリンの存在下、及び、非存在下で生物発光の割合について解析された。図７を参照のこと。形質導入された細胞は適切な選択（Ｇ４１８、ブラストサイジン、ピューロマイシン）にかけられ、および、レポーターとＶＡＭＰ−２転写活性化因子融合体の両方を安定した挿入で保持する単細胞クローンが得られた。１μｇ／ｍｌのテトラサイクリンが培地に添加されると、クローン３２番レポーター遺伝子は常に／反復的に２００倍以上活性化された。
【００４５】
同様の過程はその他のキメラ転写活性化因子コンストラクトを含む細胞系列を創出するために用いられる。例えば、前記のレポーターベクターを含む細胞系列はさらに、ＢＤ−ＳＮＡＰ２５−ＮＦκＢ遺伝子コンストラクト、又は、ＢＤ−シンタキシン１ａ−ＮＦκＢ遺伝子コンストラクトで形質移入される。または、各々別のＢｏＮＴ基質を含む一つ以上の転写活性化因子コンストラクトが作成される。さらに、結合ドメイン（ＢＤ）及び転写活性化ドメイン（ＮＦκＢ）は、前記のレポーターコンストラクトの結合サイトが対応して変更される限り、どんなＤＮＡ結合ドメイン及び転写活性化ドメインによって置換されうる。前記のレポーターコンストラクトと転写活性化剤を持つ単細胞クローンは、クローン３２番で述べたように評価される。
【００４６】
クローン３２番の機能性は、シグナル強度とシグナルバックグラウンドの割合がハイスループットスクリーニングでの使用に充分であることを示すために、９６穴マイクロプレートで解析された。低密度の細胞（グループ１）、中密度の細胞（グループ２）、及び、高密度の細胞（グループ）の３グループについて３穴ずつの複製がなされた。１μｇ／ｍｌのテトラサイクリンの存在下、及び、非存在下での細胞培養の１日後、５倍に希釈された培養液の５μｌが第二のプレートに移され、生物発光がプレートリーダーで測定された。テトラサイクリンで処理した細胞の培養液のルシフェラーゼ活性はテトラサイクリンで処理されなかった細胞の培養液で観察されたそれの２００倍高かった。図８を参照のこと。その結果は前記の３つのグループそれぞれの各メンバーについて一貫していた。さらに、テトラサイクリンで処理されなかった細胞での基礎活性は極めて低かった。生物発光が測定された。生物発光はテトラサイクリンと完全なＤＢ−ＰＳ−ＴＡコンストラクトの存在下、テイン者活性化により２００倍に増加した。図８を参照のこと。
【００４７】
実施例２Ｂ
「切断オン」法は、図３、及び、図４で示されるように、それぞれキメラ転写活性化因子ＢＤ−ＮＦκＢ／ＡＤの上流、又は、下流に融合したＳＮＡＰ−２５の切断部位の周辺１０３アミノ酸残基（残基１０４から２０６まで）、あるいは、ＶＡＭＰ−２の切断部位の周辺７０アミノ酸残基（残基２５から９４まで）のどちらかをコードする転写活性化因子コンストラクトによって評価された。ボツリヌスの基質のパルミトイル化の結果、ＳＮＡＰ２５とＶＡＭＰ−２の部分が、ＢＤ−ＮＦκＢ／ＡＤを繋ぎとめる細胞性シナプス前原形質膜上に発現する。図９は両方の構成を用いて行われた実験の結果の例を示す。
【００４８】
実施例３
安定な細胞系列でのコンストラクトの更なる検証
ＶＡＭＰ２ベースの転写活性化因子コンストラクトとプロテアーゼコンストラクトとしてＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖、及び、ＴｅｔＯ含有レポーターコンストラクトを利用する「切断オフ」システムの検証が安定的細胞系列で果たされた。前記レポーターと前記ＶＡＭＰ２転写活性化因子の両方の安定的組み込むクローン３２番は、ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖プロテアーゼコンストラクトのレンチウィルスを用いた形質導入による最終的な誘導可能指標細胞系列の創出のために使用された。この完成した細胞系列（クローン１２番）に安定的に組み込まれた指標システムの三つの構成要素（レポーターコンストラクト、転写活性化因子、及び、プロテアーゼコンストラクト）のすべてを用い、テトラサイクリンでの誘導から直ぐに４８時間にわたりＧＬｕｃ発現を評価することにより、前記のシステムが試験された。２４時間ごとに前の培地を新しい培地で置換する前にＧＬｕｃアッセイが行われた。ＲＬＵで表現されるＧＬｕｃ活性はルミノメーターを用いて測定され、テトラサイクリン制御プロテアーゼコンストラクトからのＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖の誘導４８時間後では約１５倍のＧＬｕｃシグナルの低下を示した（図１０）。この結果は、レポーターコンストラクト、切断オフ転写活性化因子、及び、プロテアーゼコンストラクトで完全に組み立てられたシステムはＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖阻害剤のハイスループットスクリーニングに適しているということを示す。この構成のシステムは軽鎖プロテアーゼの阻害によりシグナルの増強を示すであろう。
【００４９】
ＶＡＭＰ２ベースの転写活性化因子コンストラクトとプロテアーゼコンストラクトとしてＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖、及び、ＴｅｔＯ含有レポーターコンストラクトを利用する切断オンシステムの検証も又、上述したのと同じ方法を用いて果たされた。結果は、４８時間後にＧＬｕｃシグナルの４０倍近い増強を示す（図１０）。この構成のシステムは、ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖プロテアーゼの存在を検出するのにより適していないとしたら、軽鎖プロテアーゼの阻害によりシグナルの減少を示すであろう。
【００５０】
実施例４
切断オフシステムは遺伝子発現を低下させる。
ＳＮＡＰ−２５、及び、ＶＡＭＰ−２キメラ転写活性化因子の機能性を示すために、それらは自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウィルスベクターにクローン化され、様々なＢｏＮＴ／軽鎖遺伝子コンストラクト（野生型Ａ軽鎖、変異型Ａ軽鎖、及び、野生型Ｂ軽鎖）と共に前記のレポーターコンストラクトと２９３ＴｔＴＳ細胞に共形質移入された。細胞は１μｇ／ｍｌのテトラサイクリンで処理された。コペポーダルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）活性はルミノメーターを用いて測定され、ビーナスＹＦＰ発現は蛍光顕微鏡によって観察された。結果は図９に示される。前記の結果は、レポーターは転写活性化因子の切断によってオフにされることを確証した。変異型ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖（ｍＬＣ−Ａ）とＧａｌ４／ＢＤ−ＳＮＡＰ２５−ＮＦκＢ／ＡＤで共形質移入されると、それらが使用されると有効なＢｏＮＴ／Ａ軽鎖阻害剤が存在するのと同様になるのだが、キメラＢＤ−ＳＮＡＰ２５−ＮＦκＢ転写活性化因子はＧ５ＴＯ４プロモーターを大いに活性化するが、野生型ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖（ＬＣ−Ａ）とＧａｌ４／ＢＤ−ＳＮＡＰ２５−ＮＦκＢ／ＡＤで共形質移入されると、ＢＤ−ＳＮＡＰ２５−ＮＦκＢ転写活性化因子はＧ５ＴＯ４プロモーターをあまり活性化しない。キメラＧａｌ４／ＢＤ−ＶＡＭＰ−ＮＦκＢ転写活性化因子／ＡＤは、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖発現プラスミドで形質移入されると、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖によって切断されないので、Ｇ５ＴＯ４プロモーターを活性化する。キメラ転写活性化因子コンストラクトＧａｌ４／ＢＤ−ＶＡＭＰ−ＮＦκＢ／ＡＤは、野生型ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖（ＬＣ−Ｂ）とＧａｌ４／ＢＤ−ＶＡＭＰ−ＮＦκＢ／ＡＤで共形質移入されると、前記転写因子が切断されるので、前記レポーターを活性化しない。ＲＬＵ値で表現されるコペポーダルシフェラーゼ活性は可視化されたＹＦＰ蛍光の結果と一致しており、そして、該レポーター反応の定量測定を提供する。切断されない転写活性化因子対切断される転写活性化因子で、ＳＮＡＰ−２５転写活性化システム、及び、ＶＡＭＰ転写活性化でそれぞれ２０倍と２３倍である。
【００５１】
ストレプトアビジン結合タンパク質（ＳＢＰ）、サイアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、及び、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖、又はＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖がフレームを揃えて順番に融合した、これらのタンパク質から成る二つのＢｏＮＴコンストラクトがある。これらの二つのコンストラクト、ＳＢＰ−ＣＦＰ−ＢｏＮＴ／Ａ−ＬＣ及びＳＢＰ−ＣＦＰ−ＢｏＮＴ／Ｂ−ＬＣ、はレンチウィルスベクターｐＬｅｎｔｉ４／ＴＯ／Ｖ５−ＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ．，Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．  Ｋ４９６５−００）にクローンされた。前記融合遺伝子はＴＡＴＡボックスの直ぐ上流に挿入された２コピーのＴｅｔオペレーターを持つ改変サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターから発現される。Ｔｅｔ反応性リプレッサー（ＴＲｅｘ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又は転写サイレンサーｔＴＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が前記プロモーターの機能を停止させる。しかしながら、テトラサイクリンの存在下では、ＴＲｅｘ、又は、ｔＴＳはＴｅｔオペレーターへの結合に失敗し、ＣＭＶプロモーターは充分に活性的である。前記コンストラクトは６穴プレートに蒔かれた２９３−ｔＴＳ細胞に形質移入された。
【００５２】
ＢｏＮＴ／ＬＣの発現は蛍光顕微鏡法によるＣＦＰ発現の観察によって検出された。これらのＢｏＮＴ／Ａ−ＬＣ、及び、ＢｏＮＴ／Ｂ−ＬＣのレンチウィルコンストラクトはレポーター細胞系列の構築を完成させるために使用されることができる。
【００５３】
実施例５
転写活性化因子及びプロテアーゼコンストラクトを有する相補的安定レポーター細胞系列
Ａ）ＶＡＭＰ切断オフ
ＴｅｔＯのない前記レポーターコンストラクトの生物学的機能性を評価する為に、このレポーターコンストラクトは前述したようにレンチウィルベクターを用いてＨＥＫ２９３細胞に安定的に組み入れられた。この安定的レポーター細胞系列を構築基盤として使用して、ＶＡＭＰ切断オフシステムが、一時的形質移入を用いる対応するプロテアーゼコンストラクト（ＢｏＮＴ／ＬＣ−Ｂ）及び転写活性化因子（ＢＤ−ＶＡＭＰ２−ＡＤ）での相補により試験された。形質移入後すぐに前記レポーターコンストラクトからのビーナス（ＹＦＰ）とＧＬｕｃの両方の経時的発現がアッセイされた。具体的には、レポーター細胞は、２ｍｌの完全成長培地中、６穴滅菌ポリリシンコートプレートに約７０％の集密になるまで培養された。転写活性化因子ＢＤ−ＶＡＭＰ２（２５−９４）−ＮＦκＢプラスミド単独での形質移入の為に、４μｇのプラスミドＤＮＡがＣａｌＰｈｏｓ  Ｋｉｔ  （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を用いて形質移入された。ＢＤ−ＶＡＭＰ２−ＡＤとＢｏＮＴ／ＬＣ−Ｂで共形質移入される細胞には、１対３の転写活性化因子：プロテアーゼコンストラクトプラスミドＤＮＡの比率が用いられた。プレートは二酸化炭素恒温器に一晩３７℃で保温された。１２時間後、培地は２ｍｌの新しい完全成長培地と置換され、５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンがＢｏＮＴ−ＬＣ−Ｂの発現を開始する為に培地に加えられた。ＢｏＮＴ−ＬＣ−Ｂのみで形質移入された細胞はＬＣ−Ｂ発現のポジティブ対照として用いられた。ＢＤ−ＶＡＭＰ２−ＡＤ単独で形質移入された細胞の培地にテトラサイクリンは添加されず、対照として用いられた。培地のアリコットが、２４時間ごとに新しい培地と置換される前にコペポーダルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）アッセイのため、２４時間、４８時間、及び、７２時間で回収された。ＲＬＵで表わされるＧＬｕｃ活性はルミノメーターを用いて測定され、ビーナスＹＦＰの蛍光は蛍光顕微鏡でモニターされた。２４時間、４８時間、及び、７２時間の間隔で異なる穴のプレート表面からかき集められた細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄され、４℃、１０，０００  ｒｐｍで１０分間遠心分離され、ゲル添加液で融解された。試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動され、それから、ウサギ抗ＧＦＰ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を一次抗体として、及び、アルカリフォスファターゼ結合抗ウサギＩｇＧ抗体を二次抗体として用いるウェスタンブロットのためＰＶＤＦ膜に転写された（図１１）。ＴｅｔＯを欠くレポーターコンストラクト、切断オフＶＡＭＰ転写活性化因子、及び、ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖プロテアーゼコンストラクトを含む細胞システムのＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖によるＶＡＭＰ転写活性化因子の切断によるシグナルの減少を示すことに成功したことは、このシステムはまたＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖阻害剤のハイスループットスクリーニングに適していることを示す。
【００５４】
Ｂ）ＳＮＡＰ２５切断オフ
前述の同じ安定的なレポーター細胞系列を用い、一時的形質移入を用いる対応するプロテアーゼコンストラクト及び転写活性化因子での相補によりＳＮＡＰ２５切断オフシステムが試験された。再述すると、形質移入後すぐに前記レポーターコンストラクトからのビーナス（ＹＦＰ）とＧＬｕｃの両方の経時的発現がアッセイされた。具体的には、レポーター細胞は、２ｍｌの抗生物質を欠き血清を含む完全成長培地中、６穴滅菌ポリリシンコートプレートに約７０％の集密になるまで培養される。転写活性化因子ＢＤ−ＳＮＡＰ２５（１０４−２０６）−ＮＦκＢプラスミド単独での形質移入の為に、４μｇのプラスミドＤＮＡがリポフェクタミンTM２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて形質移入された。ＢＤ−ＳＮＡＰ２５ＮＦκＢとＢｏＮＴ／ＬｃＡで共形質移入される細胞には、４μｇずつのプラスミドＤＮＡが１穴ごとに用いられる。形質移入の６時間後、５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンがＢｏＮＴ−ＬＣ−Ａの発現を開始する為に培地に加えられた。ＢｏＮＴ−ＬＣ−Ａのみで形質移入された細胞はＬＣ−Ｂ発現のポジティブ対照として用いられた。ＢＤ−ＳＮＡＰ２５−ＮＦκＢ単独で形質移入された細胞の培地にテトラサイクリンは添加されず、対照として用いられた。培地のアリコットが、２４時間ごとに新しい培地と置換される前にコペポーダルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）アッセイのため、２４時間、４８時間、及び、７２時間で回収された。ＲＬＵで表わされるＧＬｕｃ活性はルミノメーターを用いて測定され、ビーナスの蛍光は蛍光顕微鏡でモニターされた。２４時間、４８時間、及び、７２時間の間隔で異なる穴のプレート表面からかき集められた細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄され、４℃、１０，０００  ｒｐｍで１０分間遠心分離され、ゲル添加液で融解された。試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動され、それから、ウサギ抗ＧＦＰ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を一次抗体として、及び、アルカリフォスファターゼ結合抗ウサギＩｇＧ抗体を二次抗体として用いるウェスタンブロットのためＰＶＤＦ膜に転写された（図１１）。
【００５５】
Ｃ）（テトラサイクリン制御）レポーターコンストラクトを有するＳＮＡＰ２５切断オフ安定細胞系列
ＴｅｔＯにより制御される安定なレポーター細胞系列（クローン１７番）を検証するために同様の実験法がとられた。この場合、クローン１７番は、ＢＤ−ＳＮＡＰ２５−ＡＤを有するレンチウィルスにより形質導入され、引き続いて一時的形質移入によるＢｏＮＴ／ＬＣ−Ａテトラサイクリン誘導プロテアーゼコンストラクトで相補された。テトラサイクリンへ曝露され、ＧＬｕｃシグナルは最初の４８時間の間に劇的に減少した。ＢｏＮＴ／ＬＣ−Ａの誘導に伴うこの大幅なシグナルの減少は、前記システムが前記薬剤スクリーニング法とＢｏＮＴ／ＬＣ−Ａの衰微のアッセイに機能するであろうことを示す。
【００５６】
実施例６
テトラサイクリン有、又は、テトラサイクリン無の発現
ＴｅｔＯを欠くレポーターコンストラクト、転写活性化剤としてのＳＮＡＰ２５  （１２０６）−ＢＤ−ＡＤ、プロテアーゼコンストラクトとしてのＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖の一時的な形質移入、及び、安定的形質導入において、ルシフェラーゼシグナルは、図１３で示されるように、高い基礎シグナルレベルにかかわらず、ＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖によるＳＮＡＰ２５（１−２０６）−ＢＤ−ＡＤの切断後、少なくとも２倍に増加する。ＢｏＮＴ／Ｅ軽鎖による切断の後、カルボキシ末端ＳＮＡＰ２５切断産物は安定である。したがって、ＢｏＮＴ／Ａ切断であるようには、切断後のＢＤ−ＡＤの分解はない。ＳＮＡＰ２５（１−２０６）−ＢＤ−ＡＤの高い基礎シグナル、及び、Ｃ末端ＳＮＡＰ２５（１−２０６）−ＢＤ−ＡＤの急速な分解のため、異なるＳＮＡＰ２３切断オンシステムが使用される。このシステムは、ＢＤ−ＡＤ−ＳＮＡＰ２５（１０４−２０６）−ＶＡＭＰ全長、又は、ＢＤ−ＡＤ−ＳＮＡＰ２５（１０４−２０６）−シンタキシン１ａ全長から成る。
【００５７】
実施例７
ＳＮＡＰ２５切断オンアッセイを行うための別の指標システム
短縮型のＳＮＡＰ２５（１０４−２０６）を含むどんな転写活性化因子コンストラクトもパルミトイル化を欠き、結果として、膜局在が本質的にできない。この転写活性化因子のＶＡＭＰ２、又は、シンタキシン１ａのような膜アンカーへの融合により、切断オン調査を行うための別の方法が可能になる。ありうる転写活性化因子の構成は、ＢＤ−ＡＤ−ＳＮＡＰ２５（１０４−２０６）−ＶＡＭＰ２、又は、ＢＤ−ＡＤ−ＳＮＡＰ２５（１０４−２０６）−シンタキシン１ａである。
【００５８】
これらの融合コンストラクトは前述したのと同様に、（ＴｅｔＯを欠く）安定レポーター細胞系列の前記融合転写活性化因子、及び、ＢｏＮＴ／ＬＣ−Ａ、あるいは、ＢｏＮＴ／ＬＣ−Ｂのどちらかとの両方での一時的形質移入により、試験される。全ての切断オンシステムを使用した場合と同様に、前記レポーターのシグナルはテトラサイクリンがないと基線で低く、転写活性化因子のタンパク質分解性切断でシグナルが増加するであろう。テトラサイクリン添加後、培地のアリコットが新しい培地と置換される前にコペポーダルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）アッセイのため、２４時間、４８時間、及び、７２時間で回収された。ＲＬＵで表わされるＧＬｕｃ活性はルミノメーターを用いて測定され、ビーナスの蛍光は蛍光顕微鏡でモニターされた。これらの融合転写活性化因子コンストラクトの主要な利点は、それらが多数のＢｏＮＴ／ＬＣ血清型の普遍的な検出器として作用する能力である。従って、単一の指標細胞系列がどの軽鎖でもその存在を検出する能力が認識される。もし、前記システムがＢｏＮＴ毒素のレセプターを持ち、前記毒素を効率よく内部に取り入れることができる細胞で創出されるなら、この細胞系列は、完全に活性のあるＢｏＮＴの存在に対する高親和性敏感細胞ベースのバイオ検出器として機能することができる。もし、前記毒素を鋭敏に検出するために環境中から毒素を取り込む十分な能力を持つ適切な細胞系列を見つけることができないのなら、前記細胞系列の毒素に対する親和性と感受性は、必要なタンパク質レセプターとＢｏＮＴ毒素細胞性レセプターのガングリオシド成分を過剰発現する安定な細胞系列を創ることで高められうる。
【００５９】
実施例８
炭疽菌プロテアーゼ阻害剤を検出する指標システム
ある実施例において、転写活性化因子は、プロテアーゼ基質ドメインがＢＳ−ＭＥＫ１−ＡＤの形状の中のマイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ（ＭＥＫ１）全長（ＮＣＢＩ基準配列：ＮＰ＿００２７４６）であるように構築される（A.P. Chopra, S.A. Boone, et al. JBC 278:9402-9406 (2003)）。この転写活性化因子コンストラクトは、非テトラサイクリン制御レポーターコンストラクトを有する安定な細胞系列の実施例で用いられたように、同様にＴｅｔＯを欠く安定なレポーター細胞系列に移入される。したがって、この場合、Ｔｅｔ誘導性プロテアーゼコンストラクトは、ＭＥＫ１を切断する炭疽菌致死因子（ＬＦ）プロテアーゼ（ＮＣＢＩ基準配列：  ＡＡＹ１５２３７）である。レポーター細胞に存在する全てのコンストラクトを用い、炭疽菌致死因子プロテアーゼの阻害剤が、ビーナスとＧＬｕｃからのレポーターシグナルの増加に基づいて選択される。
【００６０】
実施例９
ユビキチン関連プロテアーゼ阻害剤を検出するための指標システム
別の実施例において、転写活性化因子は、プロテアーゼ基質ドメインがカルボキシ末端５−ＡＡを有するヒトｓｍａｌｌ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｒｅｌａｔｅｄ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ１  （ＳＵＭＯ１）タンパク質（ＮＣＢＩ基準配列：ＡＢＭ８７１５５）であるように構築される。５−ＡＡカルボキシ末端ペプチドは（ユビキチン様）特異的プロテアーゼ（ＵＬＰ１）により切断され、したがって、プロテアーゼコンストラクトはプロテアーゼとしてのＵＬＰ１（ＮＣＢＩ基準配列：ＡＡＧ３３２５２）で構築される。プロテアーゼコンストラクトと転写活性化因子コンストラクトの両方が一時的形質移入によりＴｅｔＯを欠く安定な細胞系列に同様に移入される。全ての３要素、レポーターコンストラクト、転写活性化因子切断オフＳｕｍｏコンストラクト、及び、ＵＬＰ１プロテアーゼコンストラクトが発現されると、ルシフェラーゼシグナルが消える。このシステムはＳＵＭＯプロテアーゼ阻害剤のハイスループットスクリーニングに適当である。
【００６１】
実施例１０
プロテアーゼ阻害剤のスクリーニング
前記の最終的なレポーター細胞系列はｓｉＲＮＡノックダウンという小分子阻害剤によって機能解析される。ＢｏＮＴ／Ａ−ＬＣスクリーニングアッセイで、確立された阻害剤（例えば、ヒドロキサム酸化合物のどれか）が使用される。ＢｏＮＴ／Ｂ−ＬＣには既知の小分子阻害剤がないので、ＢｏＮＴ／Ｂ−ＬＣを標的とするＤａｈｒｍａｃｏｎ／Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ社由来のｓｉＲＮＡが使用される。本発明のある実施形態において、標的につき３種のｓｉＲＮＡが開発されうる。さらに、ノックダウンは本当で、特異的であり、そして、非特異的な効果がないことを確認する対照として、ごちゃ混ぜの（スクランブル）ｓｉＲＮＡが使用される。２９３Ｔ細胞は前記ｓｉＲＮＡとＢｏＮＴ／Ａ軽鎖プラスミド、又は、ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖プラスミドで共形質移入され、最終的なレポーター細胞系列の確認のため、最も有効なｓｉＲＮＡを選択するのに使用される。次に、前記有効なｓｉＲＮＡとスクランブルｓｉＲＮＡの両方が前記最終的レポーター細胞を形質移入するために使用される。ＢｏＮＴ／ＬＣの発現を形質移入直後に開始するため、１μｇ／ｍｌのテトラサイクリンが培地に添加される。ルシフェラーゼアッセイのため、１日目から４日目まで培地のアリコットが回収される。ビーナスの蛍光は蛍光顕微鏡でモニターされうる。前記レポーター（ルシフェラーゼとビーナス蛍光の両方）の最終的レポーター細胞での発現は有効なｓｉＲＮＡにより回復される。
【００６２】
レポータースクリーニングは半陽性（ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖阻害剤、又は、ＢｏＮＴ／Ｂ  軽鎖のｓｉＲＮＡ）、及び、半陰性（ＤＭＳＯのみ）対照でマイクロプレートを運用し、Ｚ値を測定することにより適正化される。各レポーター株の効率性を決定するために用いられる条件はマイクロプレート（９６穴、又は、３８４穴）の密度、試験される化合物の濃度、ＤＭＳＯ濃度への寛容性、温度、試験化合物の添加前のレポーター株の集密の程度、生物発光を読みとる前のマイクロプレートの保温時間、及び、ルシフェラーゼアッセイのため分取される培地の量を含む。適切な０．５より大きいＺ因子を達成するために実験ごとに条件は変更されうる（J.H. Zhang, T. D. Chung, and K. R. Oldenburg, J Biomol. Screen 4:67-73 (1999)）。本発明のより好ましい実施形態において、スクリーニングは３８４穴ディッシュでなされる。十分なＺ因子を維持するために必要ならば、９６穴ディッシュが使用されてよい。
【００６３】
レポーター株は培養され、９６穴、又は、３８４穴乳白色スクリーニングプレートへ滅菌Ｗｅｌｌｍａｔｅマイクロプレート試薬分注器（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，  Ｉｎｃ．）を用いて蒔かれる。阻害剤のスクリーニングのために、化合物のマスタープレートがスクリーニングの日に室温で溶かされ、予め決定されていた量の化合物がＳｃｉｃｌｏｎｅ  ＡＬＨ  ３０００液体操作ロボット（Ｃａｌｉｐｅｒ，  Ｉｎｃ．）とＴｗｉｓｔｅｒ  ＩＩマイクロプレート操作器Ｃａｌｉｐｅｒ，  Ｉｎｃ．）を用いて加えられる。プレートはそれから確定された適切な時間と温度の条件で保温される。それから、予め決定されていた量の細胞培養液がＳｃｉｃｌｏｎｅロボットで適切に希釈するように新しいマイクロプレートに移される。Ｗｅｌｌｍａｔｅ試薬分注器を用いてルシフェラーゼの基質が加えられ、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌマイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で生物発光が測定される。
【００６４】
実施例１１
阻害剤の最適化されたスクリーニング
阻害剤をスクリーニングするために用いられる該方法が、スクリーニング条件を査定するために試験的スクリーニングにかけられる。最適化されたアッセイの構成が２、３の異なる濃度での約２，０００化合物の試験的スクリーニングにおいて試験される。各プレートに対照、８穴について０％阻害（ＤＭＳＯのみ）、そして、８穴についてほぼ完全な阻害（ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖阻害剤、又は、ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖のｓｉＲＮＡ）、が含まれる。上述した方法にしたがい、アッセイプレートは適切なレポーター細胞と試験される化合物を受ける。このスクリーニングから得られるデータは変動（％変動係数）、様々なＺスコアカットオフ値でのヒット率を決定するのに使用され、ハイスループットスクリーニングが始まる前に解決が必要なアッセイに関するどんな問題をも同定することができる。前記試験スクリーニングからのデータはそれから、０．１％から１％のヒット率を確定するためにスクリーニングでの化合物の濃度（おそらく、２５μＭから４０μＭまでの範囲）を決定するために使用される。ある化合物をヒットであると示す判定基準は前記試験スクリーニングで決定される。しかしながら、３より大きい、又は、５より大きいＺスコアが適切であるようである。各試料についてのＺスコアは、負の対照の平均相対光単位から試料の相対光単位を引き算し、その差を負の対象の標準偏差で割り算することによって得られる。
【００６５】
実施例１２
阻害剤のスクリーニング
本発明のある実施形態にしたがう方法はまた１０μＭ以下の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を有するプロテアーゼ阻害剤を同定し、確認するために様々な化合物ライブラリーを選別するのに使用される。
【００６６】
上述したハイスループット細胞性ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖、及び、ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖スクリーニングが、これらのボツリヌス神経毒素のどちらかに対して効力がある阻害活性を持つ化合物を同定するために独立した小分子と自然産物のライブラリーに適用される。前記スクリーニングからのヒットは再アッセイにより、それらはＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖、又は、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖のどちらかを阻害するが両方を阻害することはないことを確認され、及び、濃度依存的阻害調査（ＩＣ５０）におけるそれらの効力を示すことにより確認される。
【００６７】
Ａ．化合物ライブラリーと試料操作
ＮＥＲＣＥライブラリー。ハーバード大学医学部ニューイングランド地方生物防御、及び、新興感染症総合教育拠点（ＮＥＲＣＥ／ＢＥＩＤ）の国立スクリーニング研究室（ＮＳＲＢ）の化合物コレクションが切断オフ細胞ベースＢｏＮＴスクリーニングシステムにおいて選別される小分子ライブラリーの一例として使用される。このライブラリーは、難溶性、潜在的な界面活性剤様の活性、水性溶液での安定性の欠如、及び、化学反応性のような望ましくない性質を有する化合物を選別したＮＥＲＣＥの化学顧問達のグループによって集められてきた。現在のところ、我々の自家製のコレクションと重複しているものを含むが、約１６５，０００種の化合物が利用可能である。その二つのライブラリーの重複は１０％未満である。それ故、組み合わせたライブラリーの資源は約３００，０００の個別の化合物に相当する。
【００６８】
Ｂ．一次ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖スクリーニングおよび一次ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖スクリーニングの応用
候補化学物質ライブラリーの化合物が９６穴フォーマット、又は、３８４穴フォーマットで、上述した細胞ベースＢｏＮＴ／Ａ軽鎖ハイスループットスクリーニング、及び、ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖細胞ベースハイスループットスクリーニングに対して検討される。スクリーニングライブラリーの化合物は９６穴のマスタープレート中に１００％ＤＭＳＯ中に２．５ｍＭの濃度で−２０℃で保存される。マスタープレートが溶かされ、上述した試験スクリーニングで決定された量の化合物がＳｃｉｃｌｏｎｅ  ＡＬＨ  ３０００液体操作ロボット（Ｃａｌｉｐｅｒ，  Ｉｎｃ．）とＴｗｉｓｔｅｒ  ＩＩマイクロプレート操作器Ｃａｌｉｐｅｒ，  Ｉｎｃ．）を用いて、一度に４枚の９６穴元プレートを一枚の３８４穴プレートに組み合わせて加えられる。前記スクリーニングプレートは、上述した試験スクリーニングで述べたように最初と最後の列に正の対照と負の対照を含む。
【００６９】
プレートリーダーによって作られた生データは次のように加工される。相対的発光単位（ＲＬＵ）データが取得され、プレートのシリアル番号をデータベースエントリーに関連付けることで、半自動的方法で解析される。各化合物のエントリに数値の情報を関連付け、％阻害とＺスコアを計算する。さらに、Ｚ因子計算は正の対照と負の対照に基づきプレートごとに行われ、０．６より大きいＺ値は十分であるとみなされ、そのプレート中の化合物からのデータがデータベースに受け入れられる。％阻害、Ｚスコア、及び、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）及び逆スクリーニングの結果のような確認／査定データを含む全てのスクリーニングデータが一つの中央データベース（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＳｏｆｔのＣｈｅｍＢｉｏＯｆｆｉｃｅ）に保存される。調査された一連の化学物質の構造と活性の関係が短時間で解析される。さらに、商業上のデータベースから類似化合物が短時間で同定され、取得され、データベースに登録され、生物学的試験のために提出される。
【００７０】
Ｃ．ヒット確認と立証
一次ヒットとして示すための判定基準を満たす化合物は、前述した３段階からなる確認プロセスを受ける。第一に、一次ヒットはストックプレートから確認ストックプレートへ選択され、４枚の確認アッセイプレートのセットを作成するために複製される。その４枚の確認アッセイプレートは、各化合物について４つの新しいデータポイントを作成するための一次スクリーニングアッセイで使用される。４回反復されたアッセイで少なくとも３回、５０％より大きい阻害と３より大きいＺスコアを示すものが確認されたヒットである。第二に、その他のボツリヌス神経毒素の阻害について複製物において逆スクリーニングされるものが確認されたヒットである。第三に、確認されたヒットは、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖、及び、ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖の阻害についてのＦＲＥＴアッセイで濃度依存的活性について検討されうる。ＩＣ５０はそれぞれの効力を位置づけるために決定される。
【００７１】
シグナル増大細胞ベースアッセイの信頼性のため、スクリーニングプロセスを通してＺスコアが０．５よりも大きければ、スクリーニングにおいて偽陽性に出会うことはほとんどない。ボツリヌス神経毒素と生物発光の誘発に必要なプロセスの両方を阻害することによって偽陰性が生じうる。しかしながら、これらのヒットは検出可能であっても、追求するには偶然でで十分な質をもたないであろう。別のボツリヌス神経毒素での逆スクリーニングを通り抜けたヒットは乱雑ではないようであろう。一次ヒットを査定し、順位をつけるために、いくつかの二次アッセイが以下に述べるように適用され、前記スクリーニングからのヒットをさらに限定する。もし、先に確定した判定基準でヒット率が０．１％の下であれば、そのスクリーニングプレートのＺ値が約０．６よりも上である限り、ヒットについてより低い阻害レベルを許容することにより、そのヒット率が上昇しうる。それは、負の対照と正の対照の間に広い分離帯をしめし、各ヒットは完全に活性のある対照より少なくとも３標準偏差分下である。
【００７２】
本発明のある実施形態にしたがう方法の次の段階で、同定された各阻害剤が査定され、多数のヒットに効力と選択性で順位が付けられる。ＢｏＮＴ／Ａ、及び、ＢｏＮＴ／Ｂの評価された阻害剤は１０μＭ以下のＩＣ５０を持つことができ、１０以上の選択性インデックスＣＣ５０／ＩＣ５０を持つことができ、重大な細胞毒性をもたないことがありえ、そして、一次神経細胞モデルにおいて確認された活性をもつことができる。
【００７３】
本発明のある実施におけるこの段階は、上述したハイスループットスクリーニングにおいて発見されたスクリーニングヒット、又は、化学型に順位をつけるために必要な効力と特異性についての情報を引き出す。ある望ましい実施形態において、４種の活性が査定されうる。（ａ）インビトロ効力（ＢｏＮＴ／Ａエンドペプチダーゼ、及び、ＢｏＮＴ／Ｂエンドペプチダーゼのインビトロでの阻害に対するＩＣ５０）、（ｂ）特異性（その他のエンドペプチダーゼ、ＢｏＮＴ／Ｆ、炭疽菌致死因子（ＡＴ−ＬＦ）、及び、一連のヒトマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）のインビトロでの阻害効力に対するＩＣ５０、及び、キレート化性質の試験）（ｃ）細胞毒性（すなわち、前記化合物の培養哺乳類細胞でのＣＣ５０）、及び、（ｄ）インビボ効力（すなわち、一次ラットニューロンでのＢｏＮＴ／Ａ  ＳＮＡＰ−２５切断の阻害、又は、ＶＡＭＰ切断活性のＢｏＮＴ／Ｂ阻害に対するＩＣ５０，および、神経軸索の成長阻害の救助）。合格した化合物は細胞毒性、及び、その他の非関連エンドペプチダーゼに対する活性をほとんど、又は、まったく示さないが、インビトロで、及び、単離されたニューロンでＢｏＮＴ／Ａ、及び／又は、ＢｏＮＴ／Ｂ作用の強力で特異的な救出をもたらす。
【００７４】
ラットニューロン細胞ＳＮＡＰ−２５切断アッセイ
前述したように、細胞が７日から８日齢のラット小脳から回収され、洗浄され、６穴プレートで培養され、培地交換をしながら一週間培養される。いったん、前記の細胞が中立的にネットワーク状になると、それらは化合物、又は、希釈剤（ＤＭＳＯ）と１５分間、前保温される。細胞はそれからＢｏＮＴ／Ａで接種され、採取前に３７℃、５％二酸化炭素で３時間保温される。細胞は１Ｍ水酸化ナトリウム溶液でＢｏＮＴを不活性化するために処理され、遠心分離前にプレート表面からこそぎ落とされ、ゲル添加液で溶解される。試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動され、ウサギ抗ＳＮＡＰ−２５抗体とＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を用いる免疫ブロットのために膜に転写される。走査デンシトメトリーでバンドの強度が読まれ、補正される。
【００７５】
本発明は望ましい実施形態に関して述べられてきた。特定の値、関係、物質、及び、工程が本発明の構想を述べることを目的として表明されてきたが、一方、様々な改変、及び／又は、修飾が、広く述べられた本発明の基本的な構想、及び、動作原理の精神、又は、範囲から離れることなく、具体的な実施形態でしめされた本発明に対してなされうることが当業者によって理解されるであろう。上の教示の観点から、当業者は、本明細書で教示された発明から離れることなくそれらの細目を修飾することができると認識されるであろう。本発明の基礎となる構想の望ましい実施形態、および、ある修飾を十分に明らかにしたので、当業者がその基礎となる構想に精通すると、さまざまなその他の実施形態、並びに、本明細書で示し、述べた実施形態のある改変、及び、修飾は明らかに彼らによって起こされるであろう。そのような修飾、変法、及び、その他の実施形態が添付される請求項、又は、その同等物の範囲にある限り、それらすべてを含むことが意図される。それ故、本発明は、本明細書で具体的に明らかにされた以外の態様で実行されうることが理解されるべきであろう。結果として、本実施形態は、例示的なものであり制限的ではないとあらゆる点でみなされうる。
【図１】
2013512692.tif 000003
【図２】
2013512692.tif 000004
【図３】
2013512692.tif 000005
【図４ａ】
2013512692.tif 000006
【図４ｂ】
2013512692.tif 000007
【図５】
2013512692.tif 000008
【図６】
2013512692.tif 000009
【図７】
2013512692.tif 000010
【図１０】
2013512692.tif 000011
【図１２】
2013512692.tif 000012
【図１３】
2013512692.tif 000013
【図８】
2013512692.tif 000014
【図９】
2013512692.tif 000015
【図１１】
2013512692.tif 000016
【国際調査報告】
2013512692.tif 000017
2013512692.tif 000018
2013512692.tif 000019