(57)【要約】  多様な疾患の検出、治療、特性化、及び診断についてのマウスモデル及びその使用が記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍｉＲ−２９をコードする核酸配列に作動可能に連結された、Ｂ細胞に対して発現を方向付けることのできる少なくとも一つの転写制御配列を含む核酸コンストラクト：をゲノムが含む、トランスジェニック動物。
【請求項２】
少なくとも一つの転写制御配列がＶＨプロモーターを含む、請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３】
少なくとも一つの転写制御配列がＩｇＨ−Ｅμエンハンサーをさらに含む、請求項２に記載のトランスジェニック動物。
【請求項４】
ｍｉＲ−２９をコードする核酸配列が、ヒトｍｉＲ−２９をコードするＤＮＡ配列を含む、請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項５】
ＶＨプロモーターがマウスに由来する、請求項２に記載のトランスジェニック動物。
【請求項６】
ＩｇＨ−Ｅμエンハンサーがマウスに由来する、請求項３に記載のトランスジェニック動物。
【請求項７】
動物がマウスである、請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項８】
動物がＣＤ５＋Ｂ細胞の増殖された集団を示す、請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項９】
動物がリンパ増殖性症状を示す、請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１０】
リンパ増殖性症状が前白血病症状を含む、請求項９に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１１】
リンパ増殖性症状が白血病を含む、請求項９に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１２】
白血病がヒトＢ−ＣＬＬの特性を示す、請求項１１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１３】
ゲノムがｍｉＲ−２９をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを含むトランスジェニック動物であって、該配列がＶＨプロモーター及びＩｇＨ−Ｅμエンハンサーに作動可能に連結され、ｍｉＲ−２９が該動物の未成熟Ｂ細胞及び成熟Ｂ細胞において発現する、トランスジェニック動物。
【請求項１４】
ａ）ｍｉＲ−２９をコードする核酸配列に作動可能に連結された、Ｂ細胞に対して発現を方向付けることのできる少なくとも一つの転写制御配列を含む核酸コンストラクト：をゲノムが含むトランスジェニック動物から白血球を得ること；
ｂ）細胞を数えること；及び
ｃ）多数の細胞をトランスジェニック動物と同系のレシピエント動物の中に注入すること、ここで、そのように注入された多数の細胞が、該レシピエント動物においてリンパ増殖性疾患を引き起こすのに効果的である：
の工程を含む、リンパ増殖性疾患を有する動物を作製する方法。
【請求項１５】
リンパ増殖性疾患に影響を及ぼす治療法の能力を決定する方法であって、
ａ）ｍｉＲ−２９をコードする核酸配列に作動可能に連結された、Ｂ細胞に対して発現を方向付けることのできる少なくとも一つの転写制御配列を含む核酸コンストラクト：をゲノムが含む第一のトランスジェニック動物を提供すること；
ｂ）第一のトランスジェニック動物に治療法を施すこと；
ｃ）このトランスジェニック動物におけるＢ細胞の集団の分析を実施すること；
ｄ）対照動物を提供すること、ここで、該対照動物は、ｍｉＲ−２９をコードする核酸配列に作動可能に連結された、Ｂ細胞に対して発現を方向付けることのできる少なくとも一つの転写制御配列を含む核酸コンストラクト：をゲノムが含む第二のトランスジェニック動物であり、該対照動物は治療法を受けない；
ｅ）対照動物におけるＢ細胞の集団の分析を実施すること；及び
ｆ）工程ｃ）の分析を工程ｅ）の分析と比較すること、ここで、リンパ増殖性疾患に影響を及ぼす治療法の能力が、第一のトランスジェニック動物と対照動物との間のＢ細胞集団における差によって証明される：
の工程を含む、方法。
【請求項１６】
リンパ増殖性疾患がＢ細胞性新生組織形成を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ｂ細胞性新生組織形成がＢ−ＣＬＬである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
第一のトランスジェニック動物及び対照動物がマウスである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
分析がＣＤ５＋Ｂ細胞の数及び／又は相対比の計測を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ゲノムがヒトＢ−ＣＬＬをコードする核酸配列を含むトランスジェニックマウスであって、該配列がＶＨプロモーター及びＩｇＨ−Ｅμエンハンサーに作動可能に連結され、該トランスジェニックマウスが対照マウスと比較してＣＤ５＋Ｂ細胞の増殖された集団を発生させる、前記トランスジェニックマウス。
【請求項２１】
ＶＨプロモーターがマウスＶＨプロモーターを含む、請求項２０に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２２】
ＩｇＨ−ＥμエンハンサーがマウスＩｇＨ−Ｅμエンハンサーを含む、請求項２０に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２３】
マウスがヒトＢ−ＣＬＬの特性を示すリンパ性白血病を発症させる、請求項２０に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２４】
ゲノムがヒトｍｉＲ−２９をコードする核酸配列を含むトランスジェニックマウスであって、該配列がＶＨプロモーター及びＩｇＨ−Ｅμエンハンサーに作動可能に連結され、そして該トランスジェニックマウスがヒトＢ−ＣＬＬの特性を示すリンパ性白血病を発症させる、前記トランスジェニックマウス。
【請求項２５】
ＶＨプロモーターがマウスＶＨプロモーターを含む、請求項２４に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２６】
ＩｇＨ−ＥμエンハンサーがマウスＩｇＨ−Ｅμエンハンサーを含む、請求項２４に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２７】
Ｂ細胞においてｍｉＲ−２９を過剰発現するトランスジェニックマウス。
【請求項２８】
請求項２７に記載のトランスジェニックマウスの使用。
【請求項２９】
マウスｍｉＲ−２９ａ／ｂクラスターの発現が、ヒト化ウミシイタケ緑色蛍光タンパク質（ｈｒＧＦＰ）及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ポリ（Ａ）部位とともにＶＨプロモーター−ＩｇＨ−Ｅμエンハンサーによって調節される、トランスジェニックマウス。
【請求項３０】
ｍｉＲ−２９ａが上方制御されるかどうかを決定することを含む、慢性リンパ性白血病の治療に使用される治療剤の有効性を評価する方法であって、ｍｉＲ−２９の上方制御が、進行性Ｂ−ＣＬＬ及び正常ＣＤ１９＋Ｂ細胞と比べて緩徐進行性ヒトＢ−ＣＬＬの指標となる、前記方法。
【請求項３１】
ゲノムが、マウスのＢ細胞内での発現を方向付けることのできる少なくとも一つの転写制御配列を含む核酸コンストラクトを含む、トランスジェニックマウスであって、該転写制御配列が、ｍｉＲ−２９と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むｍｉＲ−２９遺伝子産物をコードする核酸に作動可能に連結され、該マウスがＢ細胞性悪性腫瘍を示す、前記トランスジェニックマウス。
【請求項３２】
少なくとも一つの転写制御配列がＶＨプロモーターを含む、請求項３１に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項３３】
少なくとも一つの転写制御配列がＩｇＨ−Ｅμエンハンサーを含む、請求項３１に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項３４】
核酸が［ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１］を含むｍｉＲ−２９遺伝子産物をコードする、請求項３１に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項３５】
ＶＨプロモーターがマウスに由来する、請求項３２に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項３６】
ＩｇＨ−Ｅμエンハンサーがマウスに由来する、請求項３３に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項３７】
Ｂ細胞性悪性腫瘍が、白血病、リンパ腫又は新生物である、請求項３１に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項３８】
Ｂ細胞性悪性腫瘍が、ヒト急性リンパ性白血病、ヒトリンパ芽球性リンパ腫又はそれらの組み合わせの特性を示す、請求項３１に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項３９】
ａ）ｍｉＲ−２９遺伝子産物をコードする核酸に作動可能に連結された、マウスのＢ細胞内での発現を方向付けることのできる少なくとも一つの転写制御配列を含む核酸コンストラクトをゲノムが含むトランスジェニックマウスに剤を投与すること、ここで、該マウスがＢ細胞性悪性腫瘍を示し、；及び
ｂ）剤をトランスジェニックマウスに投与した後、該マウスにおけるＢ細胞性悪性腫瘍の一以上の症状及び／又は兆候を同一の遺伝子型の対照マウスのＢ細胞性悪性腫瘍の一以上の症状及び／又は兆候と比較すること、ここで、該対照マウスは剤を投与されておらず、トランスジェニックマウスにおけるＢ細胞性悪性腫瘍の一以上の症状及び／又は兆候の検出性及び／又は出現割合の対照マウスに対する差がＢ細胞性悪性腫瘍に影響を及ぼす剤の指標となる：
を含む、剤がＢ細胞性悪性腫瘍に影響を及ぼすかどうかを決定する方法。
【請求項４０】
ａ）ｍｉＲ−２９遺伝子産物をコードする核酸に作動可能に連結された、マウスのＢ細胞内での発現を方向付けることのできる少なくとも一つの転写制御配列を含む核酸コンストラクトをゲノムが含むトランスジェニックマウスに剤を投与すること、ここで、該マウスがＢ細胞性悪性腫瘍を示し、；及び
ｂ）剤をトランスジェニックマウスに投与した後、該マウスにおけるＢ細胞性悪性腫瘍の一以上の症状及び／又は兆候を同一の遺伝子型の対照マウスのＢ細胞性悪性腫瘍の一以上の症状及び／又は兆候と比較すること、ここで、該対照マウスは剤を投与されておらず、剤が該マウスにおけるＢ細胞性悪性腫瘍の一以上の症状及び／又は兆候を対照マウスと比較して阻害、防止及び／又は低減する場合に、剤がＢ細胞性悪性腫瘍の治療又は予防に治療効果を有すると考えられる：
を含む、Ｂ細胞性悪性腫瘍の治療における剤の治療効果を試験する方法。
【請求項４１】
少なくとも一つの転写制御配列が、ＶＨプロモーター、ＩｇＨ−Ｅμエンハンサー又はそれらの組み合わせを含む、請求項４０又は４１に記載の方法。
【請求項４２】
転写制御配列がマウスに由来する、請求項４０又は４１に記載の方法。
【請求項４３】
Ｂ細胞性悪性腫瘍が、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞性リンパ腫、Ｂ細胞性新生物及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４０又は４１に記載の方法。
【請求項４４】
Ｂ細胞性悪性腫瘍が、ヒト急性リンパ芽球性白血病、ヒトリンパ芽球性リンパ腫又はそれらの組み合わせの特性を示す、請求項４１又は４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
[0001]これは、ｘｘｘ，ｘｘ，ｘｘｘｘ出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０ｘｘ／ｘｘｘｘｘｘの３７ＣＦＲ１．３７１の規定に下に提出された国際段階出願であり、２０１０年６月２４日出願の米国仮出願第６１／３５８，３８３号の優先権を請求し、その全ての開示は参照により本明細書に明確に援用される。
【０００２】
連邦政府に支援された研究に関する言及
[0002]本発明は、米国国立衛生研究所により授与された助成金第ＰＯ１−ＣＡ８１５３４号のもとに政府の援助で行われた。米国政府は、本発明における特定の権利を有する。
【０００３】
配列表
[0003]本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを通じてＡＳＣＩＩ形式で提出され、そしてその全体が参照により本明細書に援用される配列表を含有する。２０１１年６月１７日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、６０４＿５２０２０＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔ＿ＯＳＵ−１０１６２．ｔｘｔと名付けられ、そしてそのサイズは１，３９９バイトである。
【０００４】
本発明の技術分野及び産業上の利用可能性
[0004]本発明は、種々の疾患の検出、治療、特性化、及び診断のためのマウスモデル及びその使用に関する。
【０００５】
背景技術
[0005]慢性リンパ性白血病（Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ（ＣＬＬ））は最も一般的なヒトの白血病であり、全症例の〜３０％の割合を占め、米国では毎年１０，０００の新しい症例が観察されている。特徴として、ＣＬＬは高齢者の疾患であり、その発症は、４０歳を超えて１０年ごとに直線的に増加している。この疾患はＣＤ５＋Ｂ細胞のクローン性増殖により特徴付けられることが知られている。
【０００６】
[0006]全ての真核生物遺伝子の１％〜３％の間を示すマイクロＲＮＡは、内在性の非コーディングＲＮＡの１種で、１９〜２５ｎｔの大きさであり、遺伝子発現を転写レベル又は翻訳レベルで制御する。ヒトマイクロＲＮＡのおよそ半分は、癌での変化に関与する染色体不安定部及びゲノム領域に位置し、そしてマイクロＲＮＡ発現プロファイルの変化はほとんどの癌で発生しており、このことは個々のマイクロＲＮＡが腫瘍抑制因子又は腫瘍遺伝子として機能できることを示唆している。
【０００７】
[0007]１３ｑ１４欠失は最も一般的なＣＬＬ異常であり、およそ半分の症例において細胞遺伝学的解析により検出される。１３ｑ１４．３での欠失の解析は、これらの欠失の標的として、２つの物理的に連結されたマイクロＲＮＡ、ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１、の発見をもたらした。結果的に、ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１発現は多数のＣＬＬ症例において低減され、更なる研究によって、ｍｉＲ−１５ａ／ｍｉＲ−１６−１がＢｃｌ２発現を負に制御することが示された。これらの知見は、マイクロＲＮＡがＣＬＬにおいて重要な役割を果たすこと、並びにｍｉＲ−１５／１６の下方制御及びその後のＢｃｌ２の上方制御がＣＬＬの発症に寄与することを示した。ｍｉＲ−１５／１６は緩徐進行性（ｉｎｄｏｌｅｎｔ）ＣＬＬにおいて腫瘍抑制因子として同定されたことから、ＣＬＬでのマイクロＲＮＡ発現プロファイルは広範囲にわたって研究が行われており、そして特徴的なプロファイルが、進行性（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）ＣＬＬと緩徐進行性ＣＬＬとを区別する１３個のマイクロＲＮＡを表すものとして報告された。
【０００８】
[0008]ｍｉＲＮＡ−２９発現は、緩徐進行性ＣＬＬと比べて進行性ＣＬＬにおいて下方制御され、そしてｍｉＲ−２９は、ＴＣＬ１、ＭＣＬ１、及びＣＤＫ６を含むいくつかの腫瘍遺伝子を標的とすることにより腫瘍抑制因子として機能する可能性があることが考えられている。一方、ある報告では、ｍｉＲ−２９発現は転移性乳癌では上方制御されることが示され、ごく最近の研究からは、ｍｉＲ−２９過剰発現はマウスにおいて急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ（ＡＭＬ））を引き起こし得ることが報告された。
【０００９】
[0009]Ｂ細胞性白血病におけるｍｉＲ−２９の役割を明らかにするため、我々は、Ｂ細胞内でｍｉＲ−２９を過剰発現するトランスジェニックマウスを作製し、このマウスモデルの表現型をここに報告する。
【００１０】
[0010]効果的なモデルを有することは、Ｂ細胞性白血病におけるｍｉＲ−２９の役割の明確化を可能にするために役立つであろう。
【発明の概要】
【００１１】
[0011]概要
[0012]一つの側面において、ｍｉＲ−２９をコードする核酸配列に作動可能に連結された、Ｂ細胞に対して発現を方向付けることのできる少なくとも一つの転写制御配列を含む核酸コンストラクト：をゲノムが含むトランスジェニック動物が、本明細書において提供される。
【００１２】
[0013]別の側面において、リンパ増殖性疾患を有する動物を作製する方法が本明細書において提供される。
[0014]別の側面において、リンパ増殖性疾患に影響を及ぼす治療法の能力を決定する方法が本明細書において提供される。
【００１３】
[0015]別の側面において、ゲノムがヒトＢ−ＣＬＬをコードする核酸配列を含むトランスジェニックマウスであって、該配列がＶＨプロモーター及びＩｇＨ−Ｅμエンハンサーに作動可能に連結され、該トランスジェニックマウスが対照マウスと比べてＣＤ５＋Ｂ細胞の増殖された集団を発生させる、トランスジェニックマウスが、本明細書において提供される。
【００１４】
[0016]別の側面において、ゲノムがヒトｍｉＲ−２９をコードする核酸配列を含むトランスジェニックマウスであって、該配列がＶＨプロモーター及びＩｇＨ−Ｅμエンハンサーに作動可能に連結され、該トランスジェニックマウスがヒトＢ−ＣＬＬの特徴を示すリンパ性白血病を発症させる、トランスジェニックマウスが、本明細書において提供される。
【００１５】
[0017]別の側面において、Ｂ細胞内でｍｉＲ−２９を過剰発現するトランスジェニックマウス及びそのようなマウスの使用が本明細書において提供される。
[0018]別の側面において、ヒト化ウミシイタケ緑色蛍光タンパク質（ｈｒＧＦＰ）及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ポリ（Ａ）部位とともにマウスｍｉＲ−２９ａ／ｂクラスターの発現がＶＨプロモーター−ＩｇＨ−Ｅμエンハンサーによって調節されるトランスジェニックマウスが本明細書において提供される。
【００１６】
[0019]別の側面において、ｍｉＲ−２９ａが上方制御されるかどうかを決定することを含む、慢性リンパ性白血病の治療に使用される治療剤の有効性を評価する方法であって、ｍｉＲ−２９ａの上方制御が、進行性Ｂ−ＣＬＬ及び正常ＣＤ１９＋Ｂ細胞と比べて緩徐進行性ヒトＢ−ＣＬＬの指標となる、前記方法が、本明細書において提供される。
【００１７】
[0020]別の側面において、ゲノムが、マウスのＢ細胞内での発現を方向付けることのできる少なくとも一つの転写制御配列を含む核酸コンストラクトを含むトランスジェニックマウスであって、該転写制御配列が、ｍｉＲ−２９と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むｍｉＲ−２９遺伝子産物をコードする核酸配列に作動可能に連結され、該マウスがＢ細胞性悪性腫瘍を示す、トランスジェニックマウスが、本明細書において提供される。
【００１８】
[0021]別の側面において、剤がＢ細胞性悪性腫瘍に影響を及ぼすかどうかを決定する方法が本明細書において提供される。
[0022]別の側面において、Ｂ細胞性悪性腫瘍の治療における剤の治療効果を試験する方法が本明細書において提供される。
【００１９】
[0023]本発明の他の系、方法、特徴、及び利点は、以下の図面及び詳細な説明を検討すれば当業者に明らかであろうし、或いは明らかとなるであろう。そのような更なる系、方法、特徴、及び利点は全て、この説明の中に含まれ、本発明の範囲内であり、そして付随の請求項によって保護されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
[0024]特許又は出願ファイルは、カラーで作成された１以上の図面及び／又は１以上の写真を含有してもよい。カラーの図面（単数又は複数）及び／又は写真（単数又は複数）を伴うこの特許又は特許出願刊行物のコピーは、依頼、そして必要な料金の支払いに応じて特許庁より提供されるであろう。
【図１−１】[0025]図１Ａ−１Ｆ：ＣＬＬにおけるｍｉＲ−２９発現及びＥｐ−ｍｉＲ−２９トランスジェニックファウンダーマウスの作製。  [0026]進行性ＣＬＬ及び緩徐進行性ＣＬＬにおける、図１Ａ−ｍｉＲ−２９ａ及び図１Ｂ−ｍｉＲ−２９ｂの発現。  [0027]図１Ｃ：Ｅｐ−ｍｉＲ−２９コンストラクト。
【図１−２】[0028]図１Ｄ−図１Ｅ：Ｅｐ−ｍｉＲ−２９ファウンダーの脾臓リンパ球におけるｍｉＲ２９ａ（図１Ｄ）及びｍｉＲ−２９ｂ（図１Ｅ）の発現。  [0029]図１Ｆ：Ｅｐ−ｍｉＲ−２９ファウンダーの脾臓リンパ球におけるＧＦＰの発現。
【図２−１】[0030]図２Ａ−２Ｈ：Ｅμ−ｍｉＲ−２９マウスはＣＬＬを発症させる。  [0031]図２Ａ−２Ｃ：ｍｉＲ−２９トランスジェニック（Ｔｇ）及び対照の脾臓（図２Ａ）、末梢血（図２Ｂ）、及び骨髄（図２Ｃ）から単離されたリンパ球のフローサイトメトリー分析。
【図２−２】[0032]図２Ｄ−２Ｆ：ｍｉＲ−２９トランスジェニックマウス及びＷＴ対照におけるＣＤ５＋Ｂ細胞集団の分析。
【図２−３】[0033]図２Ｇ：進行性ＣＬＬを示す代表的なＥμ−ｍｉＲ−２９トランスジェニックマウス及び同年齢のＷＴ対照の肉眼的病理学（ｇｒｏｓｓ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）。  [0034]図２Ｈ：サザンブロットによるＩｇＨ遺伝子構造の分析：少なくとも５０％のＣＤ５＋ＣＤ１９Ｂ細胞を示す代表的な５つの症例から単離された脾臓リンパ球ＤＮＡ。クローン性再構成はアステリスクにより示される。
【図３】[0035]図３Ａ−３Ｌ：Ｅμ−ｍｉＲ−２９マウスの組織病理学的分析。スマッジ細胞は矢頭により示される。非定型リンパ球細胞は黒色の矢印により示される。正常なリンパ濾胞は緑色の矢印により示される。
【図４−１】[0036]図４Ａ−４Ｌ：Ｅμ−ｍｉＲ−２９トランスジェニックマウス由来の白血病細胞の細胞周期分析。  [0037]図４Ａ−４Ｄ：ＷＴ  Ｂ２２０＋＋  Ｂ細胞のＤＮＡへのＢｒｄＵの組み込み。
【図４−２】[0038]図４Ｅ−４Ｊ：トランスジェニックＢ２２０＋ＣＤ５＋Ｂ細胞ＤＮＡ及びＢ２２０＋ＣＤ５−Ｂ細胞ＤＮＡへのＢｒｄＵの組み込み。
【図４−３】[0039]図４Ｋ：ＷＴ動物及びトランスジェニック動物の血清中のＩｇレベル。  [0040]図４Ｌ：ＳＲＢＣ注入後７日のＷＴ動物及びトランスジェニック動物の血清中の抗ＳＲＢＣ特異的抗体のレベル。
【図５−１】[0041]図５Ａ−５Ｃ：ｍｉＲ−２９導入遺伝子発現はＥμ−ＴＣＬ１マウスにおけるＣＬＬを加速させる。  [0042]図５Ａ：脾臓由来のＥμ−ＴＣＬ１／Ｅμ−ｍｉＲ−２９トランスジェニックリンパ球及びＥμ−ＴＣＬ１トランスジェニックリンパ球のフローサイトメトリー分析。
【図５−２】[0043]図５Ｂ：Ｅμ−ＴＣＬ１／Ｅμ−ｍｉＲ−２９及びＥμ−ＴＣＬ１トランスジェニックの脾臓リンパ球におけるＣＤ５Ｂ細胞の割合。  [0044]図５Ｃ：Ｅμ−ＴＣＬ１／Ｅμ−ｍｉＲ−２９及びＥμ−ＴＣＬ１トランスジェニックマウス由来の脾臓の重量。
【図６−１】[0045]図６Ａ−６Ｆ：Ｅμ−ｍｉＲ−２９トランスジェニックマウスにおけるｍｉＲ−２９標的の分析。  [0046]図６Ａ：ｍｉＲ−２９トランスジェニックマウス及びＷＴマウスのＣＤ１９＋Ｂ細胞におけるＣｄｋ６、ＤＮＭＴ３Ａ、ＰＴＥＮ、及びＭｃｌ１の発現のウェスタンブロット分析。  [0047]図６Ｂ：ｍｉＲ−２９トランスジェニックマウス及びＷＴマウスのＣＤ１９＋Ｂ細胞におけるＰＸＤＮ、ＢＣＬ７Ａ、及びＩＴＩＨ５についてのマイクロアレイ発現データ。
【図６−２】[0048]図６Ｃ：ｍｉＲ−２９ａ［ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１］及びＰＸＤＮの３’ＵＴＲ［ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２］、ＢＣＬ７Ａ［ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３］、及びＩＴＩＨ５［ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４］の配列アラインメント。  [0049]図６Ｄ：ｍｉＲ−２９はルシフェラーゼアッセイにおいてＰＸＤＮ発現を標的とするが、ＢＣＬ７Ａ及びＩＴＩＨ５発現は標的としない。
【図６−３】[0050]図６Ｅ：Ｐｘｄｎタンパク質発現に対するｍｉＲ−２９の効果。  [0051]図６Ｆ：ＣＬＬにおけるＰＤＸＮ発現。
【図７】[0052]図７Ａ−７Ｌ：Ｅμ−ｍｉＲ−２９マウスの肝臓及び腎臓における慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）浸潤の組織病理学的分析。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
詳細な説明
[0053]本開示を通じて、様々な刊行物、特許及び公開特許明細書が、同定する引用によって参照とされる。これらの刊行物、特許及び公開特許明細書の開示は、本発明が属する技術分野の技術水準をより十分に記載するために、参照により本開示に援用される。
【００２２】
[0054]本発明は、少なくとも部分的には、Ｂ細胞性白血病におけるｍｉＲ−２９の役割を明確にするという本発明者らの知見に基づく。
[0055]第一の側面において、Ｂ細胞内でｍｉＲ−２９を過剰発現するトランスジェニックマウスが本明細書において提供され；そしてこのマウスモデルの表現型が、目下、本明細書において報告される。ｍｉＲ−２９ａは、進行性Ｂ−ＣＬＬ及び正常ＣＤ１９＋Ｂ細胞と比べて、緩徐進行性ヒトＢ−ＣＬＬにおいて上方制御される。
【００２３】
[0056]Ｂ−ＣＬＬにおけるｍｉＲ−２９の役割を研究するため、本発明者らは本明細書において、マウスＢ細胞内でｍｉＲ−２９を過剰発現するＥμ−ｍｉＲ−２９トランスジェニックマウスを作製した。フローサイトメトリー分析は、２ヶ月齢で開始したこれらのマウスの脾臓におけるＣＤ５＋集団が顕著に増殖することを示し、この場合、ｍｉＲ−２９トランスジェニックマウスの８５％（３４／４０）が、Ｂ−ＣＬＬの特徴であるＣＤ５＋Ｂ細胞集団の増殖を示した。平均して、これらのトランスジェニックマウスにおけるＢ細胞の５０％がＣＤ５陽性であった。
【００２４】
[0057]２年齢で、マウスは、著しく肥大化した脾臓とＣＤ５＋Ｂ細胞集団の〜１００％への増加とを示した。２４〜２６月齢となった２０匹のＥμ−ｍｉＲ−２９トランスジェニックマウスのうち、４匹（２０％）が真正白血病を発症させ、そしてその疾患によって死亡した。これらの結果は、ｍｉＲ−２９の制御異常が緩徐進行性Ｂ−ＣＬＬの発症に寄与し得ることを示す。
【実施例】
【００２５】
[0058]実施例
[0059]本発明は、以下の実施例においてさらに定義され、この中で、別に言及しない限り、全ての部分及び割合は重量によるものであり、そして温度は摂氏度である。これらの実施例は、本発明の好ましい態様を示すが、例示目的のみのために提供されることが理解されるべきである。上記考察及びこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特性を解明することができ、そしてその精神及び範囲から逸脱することなく、多様な用法及び条件に適応させるために、本発明の多様な改変及び修飾を行うことが可能である。特許及び非特許文献を含む、本明細書において参照される全ての刊行物は、参照により明確に援用される。以下の実施例は、本発明の特定の好ましい態様を例示することが意図されるのであって、特に規定のない限り、特許請求の範囲において定義されるような本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【００２６】
[0060]従って、本発明の価値は、本明細書における実施例を参考することによって見ることができる。
[0061]材料及び方法
[0062]Ｅμ−ｍｉＲ−２９トランスジェニックマウス及びヒトのＣＬＬ試料。マウスｍｉＲ−２９ａｂクラスターを含有する１．０−ｋｂフラグメントを、ｈｒＧＦＰ及びＳＶ４０ポリ（Ａ）部位と共にマウスＶＨプロモーター（Ｖ１８６．２）及びＩｇＨ−Ｅμエンハンサーを含有するプラスミドのＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ部位の中にクローニングした。ｍｉＲ−２９ａ／ｂクラスター配列は、このコンストラクトのイントロン内に挿入した。トランスジェニックマウスを、オハイオ州立大学トランスジェニックマウス施設において作製した。遺伝子型の判定を、尾のＤＮＡについてプライマー：ｍｉＲ−２９ｄ：ｇｃｔ  ｇａｃ  ｇｔｔ  ｇｇａ  ｇｃｃ  ａｃａ  ｇｇｔ  ａａｇ［ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５］；ｍｉＲ−２９ｒ：ａｃａ  ａａｔ  ｔｃｃ  ａａａ  ａａｔ  ｇａｃ  ｔｔｃ  ｃａｇ［ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：６］を用いたＰＣＲにより行った。
【００２７】
[0063]ヒトＣＬＬ試料は、ＣＬＬと診断された患者からインフォームドコンセントを得た後、Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍより入手した。研究は、オハイオ州立大学の施設内倫理委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ）の承認に基づいて実施した。ＲＮＡ抽出を実施した。リアルタイムＰＣＲは、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、及びリアルタイムＰＣＲ用ＰＸＤＮアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて製造者のプロトコールに従って実施した。対照ヒト臍帯血ＣＤ１９＋Ｂ細胞は、Ａｌｌｃｅｌｌｓ及びＬｏｎｚａより購入した。
【００２８】
[0064]ｍｉＲ−２９トランスジェニックリンパ球の特性
[0065]脾臓及び骨髄由来のリンパ球を単離した。ＳＲＢＣ免疫応答、Ｉｇレベル、及びＢ細胞集団の増殖のフローサイトメトリー測定を実施した。ＩｇＨ遺伝子の再構成を分析するために、ＥｃｏＲＩ消化及びマウスＪＨ４プローブを用いて脾臓リンパ球ＤＮＡのサザンブロット分析を行った。
【００２９】
[0066]組織学及び免疫組織化学のため、マウスを剖検して、脾臓、肝臓、及び腎臓を１０％緩衝化ホルマリン内で固定し、パラフィンの中に含ませ、次いで４μｍ切片に切断した。標準的なプロトコールに従って切片をＨ＆Ｅで染色した。
【００３０】
[0067]ｍｉＲ−２９標的の分析
[0068]Ｂ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、製造者の指示書に従ってＢ細胞を単離した。脾臓由来のタンパク質を抽出した。Ｃｄｋ６（Ｈ−９６；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＤＮＭＴ３Ａ（２１６０；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｐｔｅｎ（ｍｍａｃ１；Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ）、Ｍｃｌ１（Ｓ−１９；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｐｄｘｎ（Ｎｏｖｕｓ）、及びＧＡＰＤＨ（２１１８；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った。ルシフェラーゼアッセイについては、ｍｉＲ−２９に相補的な領域を含むＰＸＤＮ、ＢＣＬ７Ａ、及びＩＴＩＨ５のｃＤＮＡのフラグメントを、ルシフェラーゼのストップコドンからすぐ下流にあるＸｂａＩ部位を用いてｐＧＬ３ベクター内に挿入した。ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、及びスクランブル対照ＲＮＡ二量体はＡｍｂｉｏｎより購入した。全長ヒトＰＸＤＮを含有する発現コンストラクトはＯｒｉＧｅｎｅより購入した。トランスフェクションを実施した。
【００３１】
[0069]結果
[0070]ＣＬＬにおけるｍｉＲ−２９発現及びＥμ−ｍｉＲ−２９トランスジェニックマウスモデルの作製
[0071]ＣＬＬ及び正常ＣＤ１９＋Ｂ細胞におけるｍｉＲ−２９の発現レベルを決定するため、本発明者らは本明細書において、２９の進行性ＣＬＬ試料、３３の緩徐進行性ＣＬＬ試料、及び２つの正常ＣＤ１９＋Ｂ細胞対照におけるｍｉＲ−２９ａ及びｍｉＲ−２９ｂの発現を研究した。
【００３２】
[0072]図１Ａ及び図１Ｂは、これらの試料におけるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。ｍｉＲ−２９ａ発現は、正常ＣＤ１９＋Ｂ細胞におけるよりも緩徐進行性ＣＬＬにおいての方が４．５倍高かったのに対して、進行性ＣＬＬ試料は３．２倍の増加を示した。同様に、ｍｉＲ−２９ｂ発現は、正常ＣＤ１９＋Ｂ細胞と比較して緩徐進行性ＣＬＬにおいて４倍、進行性ＣＬＬにおいて３．５倍増加した。ｍｉＲ−２９ａ及びｍｉＲ−２９ｂの両方共が、緩徐進行性ＣＬＬと対比して進行性ＣＬＬの方で下方制御されたが、ｍｉＲ−２９ｂの場合ではこの差は統計学的に有意なものではなかった（図１Ｂ）。
【００３３】
[0073]興味深いことに、全ての試料においてｍｉＲ−２９ａ発現レベルはｍｉＲ−２９ｂのそれよりも２０倍を超えて高かった（図１Ａ及び図１Ｂ）。
[0074]ｍｉＲ−２９ａ及びｍｉＲ−２９ｂの発現レベルが正常ＣＤ１９＋Ｂ細胞におけるよりも緩徐進行性ＣＬＬにおいての方が著しく高かったことから、本発明者らは本明細書において、ｍｉＲ−２９はＣＬＬの発症に寄与している可能性があると目下のところ考える。
【００３４】
[0075]調査すべく、本発明者らは本明細書において、ヒト化ウミシイタケ緑色蛍光タンパク質（ｈｒＧＦＰ）及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ポリ（Ａ）部位とともにマウスｍｉＲ−２９ａ／ｂクラスターの発現がＶＨプロモーター−ＩｇＨ−Ｅμエンハンサーによって調節されたトランスジェニックマウスを開発した。
【００３５】
[0076]このプロモーター／エンハンサーの組み合わせは、未成熟及び成熟Ｂ細胞内でのｍｉＲ−２９ａ／ｂの発現を駆動する（図１Ｃ）。ｍｉＲ−２９ａ／ｂクラスター配列は、このコンストラクトのイントロン内に挿入した（図１Ｃ）。「Ｆ１」及び「Ｆ２」と指定されたＦＶＢ／Ｎ背景の２つの創始個体を作製し、繁殖させてトランスジェニック系統を樹立した。ｍｉＲ−２９ａ及びｍｉＲ−２９ｂの発現を、トランスジェニック動物の脾臓から単離したＲＮＡを用いてノーザンブロット分析により調べた。
【００３６】
[0077]図１Ｄ及び図１Ｅは、非トランスジェニックの（ＷＴ）同胞種と比較した、両トランスジェニック系統（Ｆ１及びＦ２）におけるｍｉＲ−２９ａ及びｍｉＲ−２９ｂの過剰発現を示す。導入遺伝子がＢ細胞内で発現することを確認するため、本発明者らは、ＣＤ１９をＢ細胞マーカーとして用いてフローサイトメトリーを実施した。
【００３７】
[0078]図１Ｆは、両トランスジェニック系統における全てのＣＤ１９＋細胞がＧＦＰも発現したのに対して（Ｆ１及びＦ２）、ＷＴ同腹子ではＧＦＰ発現が検出されなかったことを示す。
【００３８】
[0079]Ｅμ−ｍｉＲ−２９トランスジェニックマウスはＣＬＬ表現型を示す
[0080]フローサイトメトリーを使用して、ｍｉＲ−２９トランスジェニックマウス由来の脾臓リンパ球の免疫表現型プロファイルを決定した。１２〜２４月齢では、フローサイトメトリー解析は、４０匹のｍｉＲ−２９トランスジェニックマウスのうちの３４匹（８５％）の脾臓においてＣＤ５＋Ｂ細胞集団が著しく増殖すること（ＣＬＬの特徴）を明らかにし；これらのトランスジェニックマウスにおけるＢ細胞の〜５０％はＣＤ５＋であった。図２Ａ（左）は代表的な例を示す。この動物由来のほとんど全ての脾臓Ｂ細胞がＣＤ５＋ＣＤ１９＋ＩｇＭ＋であったが、これらの細胞は全脾臓リンパ球の２５〜３０％しか表さなかった。より進行性のＣＬＬの症例が図２Ａ（中央）に示されている。この動物の脾臓におけるほぼ全ての正常リンパ球が、悪性のＣＤ５＋ＣＤ１９＋ＩｇＭ＋Ｂ細胞に置き換わった。ＷＴ同腹子の脾臓では、ＣＤ５＋ＣＤ１９＋ＩｇＭ＋Ｂ細胞はほとんど検出されなかった（図２Ａ、右）。
【００３９】
[0081]増殖したＣＤ５＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞の集団は、ｍｉＲ−２９トランスジェニックマウス由来の末梢血及び骨髄でも検出されたが、ＷＴ同腹子からは検出されなかった（図２Ｂ及び図２Ｃ）。
【００４０】
[0082]図２Ｄ−２Ｆは、脾臓におけるＣＤ５＋ＣＤ１９＋ＩｇＭ＋集団が増加した動物の数を示す。４０匹のｍｉＲ−２９トランスジェニックマウスのうち７匹のみ（１７％）が０〜２０％のＣＤ５＋Ｂ細胞を示したが、４０匹のうちの１６匹（４０％）が、６０％又はそれを超えるＣＤ５＋ＣＤ１９＋ＩｇＭ＋細胞を示した。さらに、ｍｉＲ−２９トランスジェニックマウスは、年齢に伴ってＣＤ５＋脾臓Ｂ細胞の割合が著しく増加することを示した（図２Ｆ）。１５月齢よりも若い動物では、ＣＤ５＋Ｂ細胞は総Ｂ細胞のわずか〜２０％を示し；１５〜２０月齢になるとその割合は〜４０％に増加した（図２Ｆ）。
【００４１】
[0083]２０〜２６月齢では、平均すると、全てのＢ細胞の＞６５％がＣＤ５＋であった（図２Ｆ）。これらのデータは、ｍｉＲ−２９トランスジェニックマウスにおいて緩徐進行性ＣＬＬが徐々に進行することを示す。２０匹のＥμ−ｍｉＲ−２９トランスジェニックマウスは、２４〜２６月齢となるまで追跡した。これらのマウスのほぼ全てが著しく肥大化した脾臓を示し、２０匹のうち４匹（２０％）が真正白血病を発症し、そして疾患により死亡した。図２Ｇは、肥大化した脾臓及び肝臓並びに進行したリンパ節腫脹を表す真正白血病の代表的な症例を示す。
【００４２】
[0084]クローン性ＩｇＨ遺伝子再構成は、ヒトＣＬＬ症例において典型的である。これらの再構成は、ＣＬＬのＴｃｌ１駆動性のマウスモデルでも観察された。Ｅμ−ｍｉＲ−２９トランスジェニックマウス由来のＣＤ５＋Ｂ細胞がクローン性を示すかどうかを決定するため、少なくとも５０％のＣＤ５＋ＣＤ１９＋ＩｇＭ＋Ｂ細胞を示す症例から単離された脾臓リンパ球ＤＮＡを用いてサザンブロットハイブリダイゼーションを行った。図２Ｈは、分析した５症例のうちの３つにおけるＩｇＨ遺伝子のクローン性再構築を示す。これらの結果はさらに、Ｅｐ−ｍｉＲ−２９マウスにおけるＣＤ５＋Ｂ細胞の増殖がヒトＣＬＬに似ていることを示す。
【００４３】
[0085]Ｅｐ−ｍｉＲ−２９マウスがＣＬＬ様疾患を発症させることをさらに確認するため、組織学的及び免疫組織学的分析を実施した。図３Ａ−３Ｃは、Ｅｐ−ｍｉＲ−２９トランスジェニックマウス及びＷＴ対照の血液からの代表的な塗沫標本を示す。ＷＴマウスからの塗沫標本は、正常な外観を有する希少なリンパ単球を示した（図３Ａ）。対照的に、軽度のＣＬＬを伴ったＥμ−ｍｉＲ−２９マウスからの塗沫標本は非定型リンパ球細胞の数の増加を示し（図３Ｂ、黒色の矢印）、そして進行したＣＬＬを伴ったｍｉＲ−２９トランスジェニックマウスからの塗沫標本は、ＣＬＬの典型であるスマッジ細胞（図３Ｃ、差し込み図；スマッジ細胞は矢頭により示される）を含む多数の悪性のリンパ球細胞を示した。
【００４４】
[0086]図３Ｄ−３Ｌは、Ｅｐ−ｍｉＲ−２９トランスジェニックマウス及びＷＴ対照の代表的な組織学的画像を示す。ＷＴマウスの脾臓は、保存された構造と正常に見えるいくつかのリンパ濾胞とを示す（図３Ｄ、緑色の矢印）。対照的に、ＣＬＬを伴う病的なｍｉＲ−２９トランスジェニックマウスの脾臓は構造が変形されていることを示し（図３Ｅ）、そして進行したＣＬＬを伴うｍｉＲ−２９マウスの脾臓は、悪性リンパ球の増殖により正常な構造が全て消失していることを示す（図３Ｆ）。
【００４５】
[0087]同一切片のＢ２２０染色は、正常なＢ細胞性質を示すＷＴマウスのリンパ濾胞を示す（図３Ｇ）。対照的に、トランスジェニックの脾臓は、軽度悪性リンパ球の増殖のために乱れたリンパ濾胞を示し（図３Ｈ）、或いはＢ細胞悪性集団の広範囲に及ぶ分布を伴うＣＬＬを示す（図３Ｉ）。
【００４６】
[0088]図３Ｊ−３Ｌは、ＷＴ脾臓におけるサイクリンＤ１の低い発現（図３Ｊ）並びに軽度ＣＬＬ（図３Ｋ）及び進行したＣＬＬ（図３Ｌ）における中程度から高いサイクリンＤ１発現を示す。従って、組織学的及び免疫組織学的試験は、Ｅｐ−ｍｉＲ−２９マウスがＣＬＬ様疾患を発症することを確認した。
【００４７】
[0089]上述したように、Ｅｐ−ｍｉＲ−２９トランスジェニックマウスの２０％のみが進行した白血病を発症し、そして該疾患により死亡した。図７Ａ−７Ｌは、肝臓及び腎臓に浸潤したＣＬＬの進行した代表的な症例を示す。組織学的試験は、Ｂ２２０、サイクリンＤ１、及びＫｉ６７の高発現を伴う、正常な脾臓構造の全般的な消失を示した（図７Ａ−７Ｄ）。
【００４８】
[0090]これらのＢ２２０＋悪性Ｂ細胞は、肝臓（図７Ｅ−７Ｈ）及び腎臓（図７Ｉ−７Ｌ）に浸潤した。
[0091]ＣＬＬリンパ球の集積は、生存期間の延長のみならず、骨髄、リンパ節、又は脾臓に由来するＣＤ５＋Ｂ２２０＋細胞の増殖によっても生じることができる。従って、Ｅｐ−ｍｉＲ−２９マウス由来のＣＬＬ細胞が増殖するかどうかを決定するため、本発明者らは本明細書において、ＢｒｄＵ組み込みに基づく細胞周期分析を使用した。本発明者らは、ＷＴ  Ｂ２２０＋脾臓リンパ球との比較において、Ｂ２２０＋ＣＤ５＋並びにＢ２２０＋ＣＤ５−トランスジェニックの脾臓リンパ球の増殖能力を評価した。図４Ａ−４Ｊは、Ｅμ−ｍｉＲ−２９マウス由来のＢ２２０＋ＣＤ５＋Ｂ細胞が増殖するのに対して、Ｂ２２０＋ＷＴリンパ球についての増殖は検出されなかったことを示す（トランスジェニックのＢ細胞についてＳ期の細胞は２．７％及び５．６％、対してＷＴ  Ｂ細胞については０．３％及び０．５％（図４Ｉ−４Ｊ対図４Ｃ−４Ｄ））。興味深いことに、Ｂ２２０＋ＣＤ５−トランスジェニックのリンパ球でさえ、Ｂ２２０＋ＷＴ  Ｂ細胞と比べてさらに増殖することを、Ｓ期の細胞が１．０％及び０．９５％、対してＷＴ  Ｂ細胞については０．３％及び０．５％であることと共に示した（図４Ｇ−４Ｈ対図４Ｃ−４Ｄ）。
【００４９】
[0092]これらのデータは、ｍｉＲ−２９過剰発現が、ＣＤ５−細胞においてでさえも、Ｂ細胞増殖を促進することを示す。ヒトＣＬＬは、免疫不全、及び最終的にほとんど全ての患者において発症する進行性の重度低ガンマグロブリン血症によって特徴付けられる。従って、Ｅμ−ｍｉＲ−２９マウスが低ガンマグロブリン血症を発症させるかどうかを決定するため、本発明者らは本明細書において、１８月齢でのトランスジェニックマウス及びＷＴ同腹子における血清Ｉｇのレベルを比較した。
【００５０】
[0093]図４Ｋは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、及びＩｇＧ２ｂのレベルが、Ｅμ−ｍｉＲ−２９トランスジェニックマウスにおいてＷＴ対照と比較して２から４倍減少したことを示す。Ｅμ−ｍｉＲ−２９マウスが免疫応答障害を示すかどうかを決定するため、本発明者らは、抗ヒツジＲＢＣ（ＳＲＢＣ）抗体のレベルを、ｍｉＲ−２９トランスジェニックマウス及びＷＴ同法種にＳＲＢＣを注入した後で比較した。図４Ｌは、抗ＳＲＢＣ抗体の血清レベルが、ｍｉＲ−２９トランスジェニックマウスの血清において同年齢のＷＴマウスと比較して〜４倍減少したことを示す。これらのデータは、ヒトＣＬＬにおけるように、Ｅμ−ｍｉＲ−２９マウスにおけるＣＬＬ様疾患が低ガンマグロブリン血症及び免疫不全によって特徴付けられることを明らかに示す。
【００５１】
[0094]本明細書に記載された本発明のマウスモデルでは、ＴＣＬ１  ＯＲＦ（３’ＵＴＲが欠如している）がＶＨプロモーター−ＩｇＨ−Ｅμエンハンサーの調節下にあった。トランスジェニックコンストラクト内の３’ＵＴＲ不存在のため、ｍｉＲ−２９はこれらのマウスにおけるＴＣＬ１発現を阻害することができなかった。Ｅμ−ＴＣＬ１トランスジェニックマウスは進行性ＣＬＬを発症し、そして全てのマウスが疾患のために１２〜１５月齢で死亡した。トランスジェニックｍｉＲ−２９発現がＥＲＴＣＬ１マウスにおいてＣＬＬを加速させることが可能かどうかを決定するため、本発明者らは本明細書において、Ｅμ−ｍｉＲ−２９及びＥμ−ＴＣＬ１のトランスジェニックマウスを交配させた。Ｅμ−ｍｉＲ−２９／Ｅμ−ＴＣＬ１同腹子を約８月齢で屠殺し、そして分析した。
【００５２】
[0095]図５Ａは、これらの遺伝子型の脾臓リンパ球の代表的なＦＡＣＳ分析を示す。ＴＣＬ１／ｍｉＲ−２９ダブルトランスジェニックマウスは、Ｅμ−ＴＣＬ１マウスと比較してＣＤ５＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞集団及びＣＤ５＋ＩｇＭ＋Ｂ細胞集団の著しい増加を示した（９３．９％及び９３．３％対４８．３％及び５０％）。平均すると、Ｅμ−ｍｉＲ−２９／Ｅμ−ＴＣＬ１マウスは、Ｅμ−ＴＣＬ１マウスと比較して４０％多くのＣＤ５＋ＣＤ１９＋脾臓Ｂ細胞を有し、脾臓重量は３倍増加した（図５Ｂ−５Ｃ）。これらのデータは、ｍｉＲ−２９が、Ｔｃｌ１とは独立してＣＬＬの病因に寄与することが可能であることを示す。
【００５３】
[0096]ｍｉＲ−２９標的の分析
[0097]マウスＢ細胞内でのｍｉＲ−２９過剰発現がその標的の発現に影響を及ぼすかどうかを決定するため、ｍｉＲ−２９トランスジェニックマウス及びＷＴ対照由来の選別されたＢ２２０＋Ｂ細胞において、以前に報告されているいくつかのｍｉＲ−２９標的である、Ｃｄｋ６、Ｍｃｌ１、及びＤＮＭＴ３Ａの発現レベルを分析した。その結果、Ｃｄｋ６及びＤＮＭＴ３Ａの２つの標的はｍｉＲ−２９トランスジェニックマウスにおいて下方制御されるのに対して、Ｍｃｌ１及びＰｔｅｎでは差が検出されないことが明らかとなった（図６Ａ）［Ｐｔｅｎは証明されたｍｉＲ−２９標的ではないが、それは潜在的な標的であると以前より予測されている］。
【００５４】
[0098]Ｃｄｋ６及びＤＮＭＴ３Ａは腫瘍抑制因子であるとは知られていないことから、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子発現アレイを用いて、その発癌活性に寄与する潜在的なｍｉＲ−２９標的を決定した。マイクロアレイ分析を使用して、ｍｉＲ−２９トランスジェニックマウス及びＷＴ対照由来の選別されたＢ２２０＋Ｂ細胞において遺伝子発現を比較した。次いで、本発明者らは、Ｔａｒｇｅｔｓｃａｎソフトウェアより得られた潜在的なｍｉＲ−２９標的のリストと共に公知の又は潜在的な腫瘍抑制因子の機能を有したｍｉＲ−２９トランスジェニックマウスにおいて下方制御される遺伝子を相互参照した。３つの潜在的な標的が同定された：ＡＭＬにおいて下方制御されるｐ５３反応性遺伝子である、ペルオキシダシン（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｉｎ）（ＰＸＤＮ）；Ｔ細胞リンパ腫において下方制御されるアポトーシス促進性遺伝子である、Ｂｃｌ７Ａ；及び乳癌において下方制御されるインターαトリプシンインヒビターファミリーのメンバーである、ＩＴＩＨ５。
【００５５】
[0099]図６Ｂ−６Ｃは、ｍｉＲ−２９トランスジェニックマウス対ＷＴ同腹子のＣＤ１９＋Ｂ細胞におけるこれらの３つの遺伝子の発現の下方制御、並びにｍｉＲ−２９ａ及び対応する３’ＵＴＲのアラインメントを示す。ｍｉＲ−２９が実際にＰＸＤＮ、Ｂｃｌ７Ａ、及びＩＴＩＨ５の発現を標的とするかどうかを確認するため、これらのｃＤＮＡの３’ＵＴＲフラグメント（ｍｉＲ−２９相同性領域を含む）をｐＧＬ３ベクターの中のルシフェラーゼＯＲＦの下流に挿入した。ＨＥＫ２９３細胞を、示されたように、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、又はスクランブル陰性コントロールと、ｍｉＲ−２９に相同な領域を含むＰＸＤＮ、Ｂｃｌ７Ａ、及びＩＴＩＨ５  ｃＤＮＡのフラグメントを含有するｐＧＬ３コンストラクトとを同時トランスフェクションした（図６Ｄ）。
【００５６】
[00100]ｍｉＲ−２９ａ又はｍｉＲ−２９ｂの発現は、ＰＸＤＮの３’ＵＴＲを含有するコンストラクトのルシフェラーゼ発現を著しく（〜３倍）減少したのに対して、Ｂｃｌ７Ａ及びＩＴＩＨ５については顕著な効果は観察されなかった（図６Ｄ）。従って、理論により拘束されることを望むものではないが、本発明者らは本明細書において、ＰＸＤＮ発現はｍｉＲ−２９によって標的化される可能性があると目下のところ考える。確認すべく、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲを含む全長ＰＸＤＮ  ｃＤＮＡをサイトメガロウイルス哺乳動物発現ベクター内で使用して、ｍｉＲ−２９発現がＰｄｘｎタンパク質発現レベルに影響を及ぼすかどうかを調査した。
【００５７】
[00101]このコンストラクトを、図６Ｅに示されるように、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、又はプレｍｉＲ陰性コントロール（スクランブル化）とともにＨＥＫ２９３細胞内に同時トランスフェクションした。これらの実験は、ＰＸＤＮのｍｉＲ−２９ａ又はｍｉＲ−２９ｂとの同時発現がほぼ完全にＰｘｄｎ発現を阻害したことを明らかにした（図６Ｅ）。本発明者らは本明細書において、ｍｉＲ−２９ａ及びｍｉＲ−２９ｂはｍＲＮＡ及びタンパク質レベルでＰｘｄｎ発現を標的とすると目下のところ考える。ＰｄｘｎがヒトＣＬＬの病因に重要な役割を果たすかどうかを確認するため、２５のヒトＣＬＬ試料及び正常ＣＤ１９＋Ｂ細胞対照におけるＰＸＤＮの発現を研究した。
【００５８】
[00102]図６Ｆは、これらの試料におけるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。ＰＸＤＮ発現は、ＣＬＬ試料において正常ＣＤ１９Ｂ細胞と比較して劇的に下方制御された（５０倍又はそれを超える）。これらの結果は、Ｂ細胞におけるｍｉＲ−２９の発癌的な役割が、少なくとも部分的には、ペルオキシダシンを標的とすることに依存している可能性があることを示す。
【００５９】
[00103]考察
[00104]本発明は、Ｂ細胞内でのｍｉＲ−２９過剰発現がＣＬＬをもたらすこと、及びｍｉＲ−２９が正常Ｂ細胞と比べて緩徐進行性ＣＬＬにおいて過剰発現することを示す。
【００６０】
[00105]Ｅμ−ｍｉＲ−２９トランスジェニックマウスの２０％のみが老齢期に白血病で死亡したが、ほとんど全てのマウスは増殖したＣＤ５＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞集団を示したことから、Ｅμ−ｍｉＲ−２９の表現型は緩徐進行性ＣＬＬのそれと類似している。従って、ｍｉＲ−２９の上方制御は緩徐進行性ＣＬＬの病因を開始させ、或いは少なくとも著しくそれに寄与する。一方、ＴＣＬ１は緩徐進行性ＣＬＬにおいてほとんど発現せず、おそらく緩徐進行性ＣＬＬにおいて重要な役割は果たさない。
【００６１】
[00106]理論により拘束されることを望むものではないが、本発明者らは本明細書において、ｍｉＲ−２９過剰発現は進行性ＣＬＬを惹起するのには十分ではないと目下のところ考える。対照的に、Ｔｃｌ１の上方制御はＣＬＬの進行性形態の病因において重大な事象である。ｍｉＲ−２９はＴＣＬ１を標的とすることから、（緩徐進行性の形態と比較した場合）進行性ＣＬＬにおけるその下方制御は、Ｔｃｌ１の上方制御及び進行性の表現型の発症に寄与する。
【００６２】
[00107]本発明は多様な及び好ましい態様に言及して記載されているが、多様な改変が実施されてもよく、そして本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、均等物がその要素に対して代用されてもよいことが、当業者によって理解されるべきである。さらに、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、特定の状況又は材料を本発明の教示に適合させるように、多くの修飾が行われてもよい。
【００６３】
[00108]従って、本発明は、本発明を実行するために予期される本明細書に開示された特定の態様に限定されるものでなく、本発明は、特許請求の範囲内に属する全ての態様を含むであろうことが意図される。
【図１−１】
2013534824.tif 000002
【図１−２】
2013534824.tif 000003
【図２−１】
2013534824.tif 000004
【図２−２】
2013534824.tif 000005
【図２−３】
2013534824.tif 000006
【図３】
2013534824.tif 000007
【図４−１】
2013534824.tif 000008
【図４−２】
2013534824.tif 000009
【図４−３】
2013534824.tif 000010
【図５−１】
2013534824.tif 000011
【図５−２】
2013534824.tif 000012
【図６−１】
2013534824.tif 000013
【図６−２】
2013534824.tif 000014
【図６−３】
2013534824.tif 000015
【図７】
2013534824.tif 000016
【配列表】
2013534824000001.app
【国際調査報告】
2013534824.tif 000017
2013534824.tif 000018
2013534824.tif 000019
2013534824.tif 000020