(57)【要約】  本発明は、サンプル細胞の細胞培養性能データの予測のためのプロセス、該細胞の単離のためのプロセス、及びサンプル細胞の細胞培養性能データの予測のための装置に関する。【選択図】  図１a
2013545449.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つのサンプル細胞の細胞培養性能データの予測のためのプロセスであって、以下のステップ：
（a）少なくとも一つのサンプル細胞のサンプル、標準細胞の細胞培養性能データ、及び標準細胞の未加工標準MS（質量分析）データの準備、
（b）前記少なくとも一つのサンプル細胞のサンプルのMS分析への供試による、それらの未加工サンプルMSデータの取得、
（c）前記未加工標準及び前記未加工サンプルMSデータの、少なくとも一つの第一のMSシグナル処理法への供試による前処理標準及びサンプルMSプロフィールの取得、並びに
（d）ステップ（a）の標準細胞の細胞培養性能データ、及びステップ（c）で得られる前処理標準及びサンプルMSプロフィールの、PLS-DA（部分最小二乗判別分析）に基づく比較評価を含む第二のMSシグナル処理法への供試による、前記少なくとも一つのサンプル細胞の細胞培養性能データの予測、
を含む上記プロセス。
【請求項２】
細胞培養性能データが、細胞比生産性、全生存細胞数、又は細胞産物濃度データである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
細胞が、ヒト細胞株、動物細胞株、植物細胞株、真菌の細胞、細菌の細胞、酵母の細胞、及び幹細胞からなる群より選択される、請求項１〜２のいずれか1項に記載のプロセス。
【請求項４】
細胞が、CHO細胞株、CHO-K1細胞株、又は改変CHO-K1細胞株である、請求項１〜３のいずれか1項に記載のプロセス。
【請求項５】
ステップ（b）のMS分析がMALDI-TOFである、請求項１〜４のいずれか1項に記載のプロセス。
【請求項６】
ステップ（b）に供されるサンプル細胞のサンプルが、0.015×106〜0.0625×106の細胞を含む、請求項１〜５のいずれか1項に記載のプロセス。
【請求項７】
ステップ（b）で得られる未加工サンプルMSデータ、及びステップ（a）において準備される未加工標準MSデータが、ベースライン補正、標準化、アライメント、フィルタリング、及びトリミングからなる群より選択される操作によりシグナル処理される、請求項１〜６のいずれか1項に記載のプロセス。
【請求項８】
ステップ（c）で得られる前処理標準及びサンプルMSプロフィールが光学的に分析される、請求項１〜７のいずれか1項に記載のプロセス。
【請求項９】
ステップ（d）において評価される予測された細胞培養性能データを有するサンプル細胞が細胞培養において培養され、それによりその細胞培養性能データを検証する、請求項１〜８のいずれか1項に記載のプロセス。
【請求項１０】
ステップ（b）で得られる未加工サンプルMSプロフィール、及び検証されたサンプル細胞の細胞培養性能データが、ステップ（a）において標準細胞の標準MSデータ及び細胞培養性能データとして用いられる、請求項１〜９のいずれか1項に記載のプロセス。
【請求項１１】
細胞からの細胞産物の生産のためのプロセスであって、以下のステップ：
a）請求項１〜１０に記載の細胞培養性能データの予測、
b）所望の細胞培養性能データを有するサンプル細胞の特定、
c）ステップb）で特定された前記サンプル細胞の培養、及び
d）ステップc）の培養によって生産される細胞産物の取得、
を含む上記プロセス。
【請求項１２】
ステップa）において予測される細胞培養性能データを有するサンプル細胞が小容量の培地において培養される、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか1項に記載のプロセスが行われ、所望の細胞が単離される、所望の細胞培養性能データを有する細胞の単離のためのプロセス。
【請求項１４】
請求項１３に記載のプロセスによって単離される細胞。
【請求項１５】
10g/Lより高いタンパク質生産性によって特徴づけられる、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
少なくとも一つのサンプル細胞の細胞培養性能データの予測のための装置であって、以下の技術的特徴：
（a）少なくとも一つのサンプル細胞の、サンプルのMS（質量分析）分析への供試による、それらの未加工サンプルMSデータの取得に適する手段、
（b）未加工標準及び前記未加工サンプルMSデータの、少なくとも一つの第一のMSシグナル処理法への供試による、前処理標準及びサンプルMSプロフィールの取得に適する手段、並びに
（c）標準細胞の細胞培養性能データ、並びに前記前処理サンプル及び標準MSプロフィールの、PLS-DA（部分最小二乗判別分析）に基づく比較評価を含む第二のMSシグナル処理法への供試による、サンプル細胞の細胞培養性能データの予測に適する手段、
を含む上記装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はサンプル細胞の細胞培養性能データの予測のためのプロセス、該細胞の単離のためのプロセス、及びサンプル細胞の細胞培養性能データの予測のための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
所望の製造特性を有する組み換え哺乳類細胞株の単離のための従来技術による方法は、所望の特徴の特定の組み合わせを単離するための資源及び能力の両方の点で不十分である。
【０００３】
例えば、Adrichemら(Anal. Chem., 1998, 70, 923-930)（非特許文献１）はマトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（MALDI質量分析）による、培養上清におけるタンパク質パターン及び哺乳類細胞ついての研究を開示している。該MALDI質量分析は、培地に分泌されたか又は細胞溶解物中に存在するタンパク質の測定による、タンパク質プロファイリングのために用いられ得る。MALDI質量分析によって検出可能な質量範囲は16000〜数十万、好適には数百〜数千ダルトンである。それにより得られる結果は、標準的なSDS-PAGE電気泳動と相補的である。したがってこれらの方法は、例えばIgGタイプの抗体を発現するハイブリドーマ細胞の大規模な培養の測定のために用いられ得る。
【０００４】
Zhangら(J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2006, 17, 490-499)（非特許文献２）は、MALDI-TOF及びLC-ESI-MS/MS質量分析を用いる哺乳類細胞株の同定を開示している。MALDI-TOF質量分析が単一の細胞からの直接的なペプチドプロファイリングに効果的であることが記載されている。LC-ESI-MS/MS分析はサンプル細胞のトリプシン消化後に有益なシークエンス情報を提供し得る。測定される異なる細胞株を同定及び区別するためのフィンガープリントとして用いられ得る特有かつ再現性のあるMALDI-MSパターンを得られることが見出された。しかしながら、得られたMSスペクトルは三つの異なる哺乳類細胞の種類を区別するための明瞭に可視的なMSピークに基づいて視覚的に比較された。あるいはZhangらは、異なる技術、すなわち、サンプルの消化を必要とする、液体クロマトグラフィー、それに続くエレクトロスプレーイオン化及びタンデム質量分光法の組み合わせ(LC-ESI MS/MS)もまたプロテオームプロフィールの差を明確にするために有用であることを実証している。
【０００５】
Fengら(Rapid Commun. Mass Spectrom., 2010, 24, 1226-1230)（非特許文献３）はマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間法（MALDI-TOF）を用いる高／低生産CHO細胞の迅速な特徴づけを開示している。該文献において開示されたプロセスは二つの統計学的な方法、すなわち主成分分析（principle component analysis（PCA））及び線形部分最小二乗法（linear partial least squares（PLS））を、MALDI-TOFスペクトルを分析するために用いることにより、同じ培養液及び同じ規模で生産するときに高及び低生産細胞を区別することができる。特に、Fengらによる方法は組み換えIFN-ガンマタンパク質を生産する異なる細胞株の生産性データの、同じ規模、すなわち小規模で増殖させた場合における区別を可能とする。Fengらによれば、この手法は細胞生産性を予測するためにおそらくは用いられ得る。用いられる線形PLSは、一定の規模で細胞株亜群を見つけるのに関連する多くの変数を有するデータを分析する事ができるという点にその有用性がある。
【０００６】
前記のように従来技術、特にFengらによる方法は、統計学的なプログラム、すなわちPLS及びPCAによって分析されるMALDI-TOFデータが、低及び高生産細胞を一定の培養規模で区別するために用いられ得ることを単に教示する。
【０００７】
しかしながら、従来技術においては細胞をまだ小容量の培地で培養しているときに、スケールアップ後期、特に大容量バイオリアクターにおける未知細胞の細胞特性を予測する方法は教示されていない。特に、既知の統計学的なプログラムであるPCA及びPLSは、スケールアップ後期における細胞特性の正確かつ信頼性のある予測の基礎として用いるには不十分なデータを生み出す。
【０００８】
特定のバランスでタンパク質を発現する初期の細胞株は、例えばこの時期では高生産性を示し得るが、バイオリアクターへのスケールアップ期の後にはこの生産性は様々な要因、すなわちせん断力、容量の影響、培養槽の種類又は形式の相違、培養パラメータ、例えばpH及びガス制御、並びに細胞密度の差によって悪化させられ得る。
【０００９】
したがって、細胞株作製の初期において、かつ小容量のみで培養される多数の細胞株を迅速に選抜できる方法であって、一定かつ所望の培養規模、特に大容量規模を意味するバイオリアクター規模における、増殖及び特定の生産特性、例えば該細胞株の増加した容量生産性を予測可能である、上記方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Adrichem et al., Anal. Chem., 1998, 70, 923-930
【非特許文献２】Zhang et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2006, 17, 490-499
【非特許文献３】Feng et al., Rapid Commun. Mass Spectrom., 2010, 24, 1226-1230
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、本発明の根本的な技術的課題は前記課題を克服する方法を提供する事、特に未知の細胞特性を有する細胞の細胞培養、特にバイオリアクター性能を、特にスケールアップの初期において既に予測するための方法であって、さらに時間を節約し、かつ費用を削減するが、大容量スケール培養及び／又は高生産性条件下、特にバイオリアクター規模において該性能の高い予測正確性を有するものである、上記方法を提供する事である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
この課題は本発明の独立請求項によって解決される。したがって、本発明は以下のステップ：
a）好適には小容量の培地で培養される少なくとも一つのサンプル細胞のプローブ、標準細胞の細胞培養性能データ、及び標準細胞の未加工標準MS（質量分析）データの準備、
b）少なくとも一つのサンプル細胞のプローブのMS分析への供試による、それらの未加工サンプルMSデータの取得、
c）未加工標準及び未加工サンプルMSデータの、少なくとも一つの第一のMSシグナル処理法への供試による、前処理標準及びサンプルMSプロフィールの取得、並びに、
d）ステップa）の標準細胞の細胞培養性能データ及びステップc）で得られる前処理サンプル及び標準MSプロフィールの、PLS-DA（部分最小二乗判別分析）に基づく比較評価を含む第二のMSシグナル処理法への、好適には該比較評価から成るデータ分析への供試による、少なくとも一つのサンプル細胞の細胞培養性能データの予測、
を含む、少なくとも一つのサンプル細胞の細胞培養性能データの予測のためのプロセス、好適にはin vitroプロセスを提供する。
【００１３】
したがって、本発明は未知の細胞培養、好適にはバイオリアクター性能データを有する少なくとも一つサンプル細胞の細胞培養、好適にはバイオリアクター性能データの、正確かつ信頼性のある予測のための有益なプロセスであって、時間を節約し、かつ費用を削減する、特定の細胞培養、好適にはバイオリアクター性能データ、例えば細胞の生産性の予測を可能とするものである、上記プロセスを提供する。本発明はかかる有益なプロセスを提供するだけでなく前記方法によって調製され、及び特に単離される細胞であって、所望の細胞培養、好適にはバイオリアクター性能データ、例えば高生産性によって特に特徴づけられる上記細胞もまた提供する。さらに、本発明は本発明のプロセスを実施可能な細胞培養性能データ予測のための装置を提供する。
【００１４】
通常96ウェルプレートから初めに24ウェルプレートに、その後振盪フラスコに、及び最後にバイオリアクター規模にスケールアップする従来技術に対して、本発明は24ウェルプレート及び振盪フラスコにおける培養ステップを不要にする。小容量、例えば96ウェルプレートにおいて培養される少なくとも一つのサンプル細胞における細胞培養、好適にはバイオリアクター性能データの予測の後、直接バイオリアクターにおける培養が行われ得る。
【００１５】
本発明によれば、PLS-DAは一つの変数に基づいて非常に具体的な観察クラスの分離を可能とし、それゆえにPLS-DAを用いる事で細胞株の生産性のクラス分けの問題が克服され、異なる規模における該細胞株の細胞培養、好適にはバイオリアクターの性能が予測され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１ａ】図１a及び１bは、1000データ点の再サンプリングの前及び後の典型的なMSプロフィールを示す。
【図１ｂ】図１a及び１bは、1000データ点の再サンプリングの前及び後の典型的なMSプロフィールを示す。
【図２ａ】図２a及び２bは、ベースライン補正の前及び後の典型的なMSプロフィールを示す。
【図２ｂ】図２a及び２bは、ベースライン補正の前及び後の典型的なMSプロフィールを示す。
【図３ａ】図３a及び３bは、標準化の前及び後の典型的なMSプロフィールを示す。
【図３ｂ】図３a及び３bは、標準化の前及び後の典型的なMSプロフィールを示す。
【図４ａ】図４a及び４bは、Savitzky-Golay平滑化の前及び後の典型的なMSプロフィールを示す。
【図４ｂ】図４a及び４bは、Savitzky-Golay平滑化の前及び後の典型的なMSプロフィールを示す。
【図５ａ】図５a及び５bは、ほとんど又は全く情報を含まないスペクトル領域のトリミングの前及び後の典型的なMSプロフィールを示す。
【図５ｂ】図５a及び５bは、ほとんど又は全く情報を含まないスペクトル領域のトリミングの前及び後の典型的なMSプロフィールを示す。
【図６ａ】図６a、６b、及び３８は、未加工MSプロフィールを用いたPC1対PC2のスコアプロット（６a、３８）と、典型的な付随するMSプロフィール（6b）を示す。
【図６ｂ】図６a、６b、及び３８は、未加工MSプロフィールを用いたPC1対PC2のスコアプロット（６a、３８）と、典型的な付随するMSプロフィール（6b）を示す。
【図７ａ】図７a、７b、及び３９は、ベースライン補正に供されたMSプロフィールを用いたPC1対PC2のスコアプロット（７a、３９）と、典型的な付随するMSプロフィール（７b）を示す。
【図７ｂ】図７a、７b、及び３９は、ベースライン補正に供されたMSプロフィールを用いた、PC1対PC2のスコアプロット（７a、３８）と、典型的な付随するMSプロフィール（７b）を示す。
【図８ａ】図８a、８b、及び４０は、ベースライン補正及び標準化に供されたMSプロフィールを用いたPC1対PC2のスコアプロット（８a、４０）と、典型的な付随するMSプロフィール（８b）を示す。
【図８ｂ】図８a、８b、及び４０は、ベースライン補正及び標準化に供されたMSプロフィールを用いたPC1対PC2のスコアプロット（８a、４０）と、典型的な付随するMSプロフィール（８b）を示す。
【図９ａ】図９a、９b、及び４１は、ベースライン補正、標準化、及びトリミングに供されたMSプロフィールを用いたPC1対PC2のスコアプロット（９a、４１）と、典型的な付随するMSプロフィール（９b）を示す。
【図９ｂ】図９a、９b、及び４１は、ベースライン補正、標準化、及びトリミングに供されたMSプロフィールを用いたPC1対PC2のスコアプロット（９a、４１）と、典型的な付随するMSプロフィール（９b）を示す。
【図１０】図１０は、PLSツールボックスにおけるPLSDA分析のフローチャートを示す。
【図１１】図１１a及び１１bは、PLSツールボックスにおけるPLSDA取り込みダイアログボックスを示す。
【図１２】図１２は、PLSツールボックスにおけるPLSDAクラス群の選択ダイアログボックスを示す。
【図１３】図１３は、PLSツールボックスにおけるPLSDAの再処理オプションを示す。
【図１４】図１４は、PLSツールボックスにおけるPLSDA交差検定ダイアログボックスを示す。
【図１５ａ】図１５a〜１５d及び４２〜４５は、様々なPLSDAスコアプロット：（１５a、４２）二変数スコアプロット、（１５b、４３）Hotelling's T2 プロット、（１５c、４４）モデル予測プロット、及び（１５d、４５）モデル予測確率プロットを示す。
【図１５ｂ】図１５a〜１５d及び４２〜４５は、様々なPLSDAスコアプロット：（１５a、４２）二変数スコアプロット、（１５b、４３）Hotelling's T2 プロット、（１５c、４４）モデル予測プロット、及び（１５d、４５）モデル予測確率プロットを示す。
【図１５ｃ】図１５a〜１５d及び４２〜４５は、様々なPLSDAスコアプロット：（１５a、４２）二変数スコアプロット、（１５b、４３）Hotelling's T2 プロット、（１５c、４４）モデル予測プロット、及び（１５d、４５）モデル予測確率プロットを示す。
【図１５ｄ】図１５a〜１５d及び４２〜４５は、様々なPLSDAスコアプロット：（１５a、４２）二変数スコアプロット、（１５b、４３）Hotelling's T2 プロット、（１５c、４４）モデル予測プロット、及び（１５d、４５）モデル予測確率プロットを示す。
【図１６ａ】図１６a、１６b、４６及び４７はPLSDA負荷量プロット（loading plot）：（１６a、４６）潜在変数1及び（１６a、４７）潜在変数2を示す。
【図１６ｂ】図１６a、１６b、４６及び４７はPLSDA負荷量プロット（loading plot）：（１６a、４６）潜在変数1及び（１６a、４７）潜在変数2を示す。
【図１７】図１７及び４８は、Y予測クラス1のためのPLSDA決定境界を示す。
【図１８】図１８及び４９は、Y予測クラス1のためのPLSDA確率プロットを示す。
【図１９ａ】図１９a及び１９bは、抗体生産細胞株CHO2、42、及び52のLC-ESI-MSデータを比較するPLSDA分析を示す。
【図１９ｂ】図１９a及び１９bは、抗体生産細胞株CHO2、42、及び52のLC-ESI-MSデータを比較するPLSDA分析を示す。
【図２０】図２０は、2g/Lより低い群及び2g/Lより高い群に分類されたサンプルを含む、7つの抗体生産CHO細胞株（2、42、52、75、106、144、及び164）のLC-ESI-MSデータを比較するPLSDA分析を示す。
【図２１ａ】図２１a及び図２１bは、ベースライン補正及び標準化を含む（２１a）、並びに再サンプリング、ベースライン補正、フィルタリング、アライメント、視覚分析及び標準化を含む（２１b）、MSシグナル処理法で前処理されたMSプロフィールを示す。
【図２１ｂ】図２１a及び図２１bは、ベースライン補正及び標準化を含む（２１a）、並びに再サンプリング、ベースライン補正、フィルタリング、アライメント、視覚分析及び標準化を含む（２１b）、MSシグナル処理法で前処理されたMSプロフィールを示す。
【図２２】図２２は、未加工MSデータの再サンプリング、ベースライン補正、フィルタリング、アライメント、視覚分析及び標準化、並びにその後のPLS-DAモデリングを含む本発明による未加工MSデータの前処理を用いた、細胞株ラウンド1の予測のためのY予測プロットを示す。
【図２３】図２３は、本発明による前処理を用いた細胞株ラウンド1の予測のためのLV１対LV2を示す。
【図２４】図２４は、未加工MSデータの再サンプリング、ベースライン補正、フィルタリング、アライメント、視覚分析及び標準化、並びにその後のPLS-DAモデリングを含む本発明によるMSデータの前処理を用いた、細胞株ラウンド2の予測のためのY予測プロットを示す。
【図２５】図２５は、本発明による前処理を用いた細胞株ラウンド2の予測のためのLV１対LV2を示す。
【図２６】図２６は、未加工MSデータの再サンプリング、ベースライン補正、フィルタリング、アライメント、視覚分析及び標準化、並びにその後のPLS-DAモデリングを含む本発明による未加工MSデータの前処理を用いた、細胞株ラウンド3の予測のためのY予測プロットを示す。
【図２７】図２７は、本発明による前処理を用いた細胞株ラウンド3の予測のためのLV１対LV2を示す。
【図２８】図２８は、未加工MSデータの再サンプリング、ベースライン補正、フィルタリング、アライメント、視覚分析及び標準化、並びにその後のPLS-DAモデリングを含む本発明による未加工MSデータの前処理を用いた、細胞株ラウンド4の予測のためのY予測プロットを示す。
【図２９】図２９は、本発明による前処理を用いた細胞株ラウンド4の予測のためのLV１対LV2を示す。
【図３０】図３０は、未加工MSデータの再サンプリング、ベースライン補正、フィルタリング、アライメント、視覚分析及び標準化、並びにその後のPLS-DAモデリングを含む本発明による未加工MSデータの前処理を用いた、細胞株ラウンド5の予測のためのY予測プロットを示す。
【図３１】図３１は、本発明による前処理を用いた細胞株ラウンド5の予測のためのLV１対LV2を示す。
【図３２】図３２は、未加工MSデータの再サンプリング、ベースライン補正、フィルタリング、アライメント、視覚分析及び標準化、並びにその後のPLS-DAモデリングを含む本発明による未加工MSデータの前処理を用いた、細胞株ラウンド3の予測のためのIVC Y予測プロットを示す。
【図３３】図３３は、未加工MSデータの再サンプリング、ベースライン補正、フィルタリング、アライメント、視覚分析及び標準化、並びにその後のPLS-DAモデリングを含む本発明による未加工MSデータの前処理を用いた、細胞株ラウンド4の予測のためのIVC Y予測プロットを示す。
【図３４】図３４は、未加工MSデータの再サンプリング、ベースライン補正、フィルタリング、アライメント、視覚分析及び標準化、並びにその後のPLS-DAモデリングを含む本発明による未加工MSデータの前処理を用いた、細胞株ラウンド5の予測のためのIVC Y予測プロットを示す。
【図３５】図３５は、未加工MSデータの再サンプリング、ベースライン補正、フィルタリング、アライメント、視覚分析及び標準化、並びにその後のPLS-DAモデリングを含む本発明による未加工MSデータの前処理を用いた、細胞株ラウンド3の予測のためのqP Y予測プロットを示す。
【図３６】図３６は、未加工MSデータの再サンプリング、ベースライン補正、フィルタリング、アライメント、視覚分析及び標準化、並びにその後のPLS-DAモデリングを含む本発明による未加工MSデータの前処理を用いた、細胞株ラウンド4の予測のためのqP Y予測プロットを示す。
【図３７】図３７は、未加工MSデータの再サンプリング、ベースライン補正、フィルタリング、アライメント、視覚分析及び標準化、並びにその後のPLS-DAモデリングを含む本発明による未加工MSデータの前処理を用いた、細胞株ラウンド5の予測のためのqP Y予測プロットを示す。
【図３８】図６a、６b、及び３８は、未加工MSプロフィールを用いたPC1対PC2のスコアプロット（６a、３８）と、典型的な付随するMSプロフィール（6b）を示す。
【図３９】図７a、７b、及び３９は、ベースライン補正に供されたMSプロフィールを用いたPC1対PC2のスコアプロット（７a、３９）と、典型的な付随するMSプロフィール（７b）を示す。
【図４０】図８a、８b、及び４０は、ベースライン補正及び標準化に供されたMSプロフィールを用いたPC1対PC2のスコアプロット（８a、４０）と、典型的な付随するMSプロフィール（８b）を示す。
【図４１】図９a、９b、及び４１は、ベースライン補正、標準化、及びトリミングに供されたMSプロフィールを用いたPC1対PC2のスコアプロット（９a、４１）と、典型的な付随するMSプロフィール（９b）を示す。
【図４２】図１５a〜１５d及び４２〜４５は、様々なPLSDAスコアプロット：（１５a、４２）二変数スコアプロット、（１５b、４３）Hotelling's T2 プロット、（１５c、４４）モデル予測プロット、及び（１５d、４５）モデル予測確率プロットを示す。
【図４３】図１５a〜１５d及び４２〜４５は、様々なPLSDAスコアプロット：（１５a、４２）二変数スコアプロット、（１５b、４３）Hotelling's T2 プロット、（１５c、４４）モデル予測プロット、及び（１５d、４５）モデル予測確率プロットを示す。
【図４４】図１５a〜１５d及び４２〜４５は、様々なPLSDAスコアプロット：（１５a、４２）二変数スコアプロット、（１５b、４３）Hotelling's T2 プロット、（１５c、４４）モデル予測プロット、及び（１５d、４５）モデル予測確率プロットを示す。
【図４５】図１５a〜１５d及び４２〜４５は、様々なPLSDAスコアプロット：（１５a、４２）二変数スコアプロット、（１５b、４３）Hotelling's T2 プロット、（１５c、４４）モデル予測プロット、及び（１５d、４５）モデル予測確率プロットを示す。
【図４６】図１６a、１６b、４６及び４７はPLSDA負荷量プロット（loading plot）：（１６a、４６）潜在変数1及び（１６a、４７）潜在変数2を示す。
【図４７】図１６a、１６b、４６及び４７はPLSDA負荷量プロット（loading plot）：（１６a、４６）潜在変数1及び（１６a、４７）潜在変数2を示す。
【図４８】図１７及び４８は、Y予測クラス1のための決定境界を示す。
【図４９】図１８及び４９は、Y予測クラス1のためのPLSDA確率プロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の文脈において、細胞培養性能データは好適にはバイオリアクター性能データである。
【００１８】
本発明の文脈において、用語「少なくとも一つのサンプル細胞のプローブ」は用語「少なくとも一つのサンプル細胞のサンプル」と同じ意味を有する。
【００１９】
本発明の文脈において、用語「バイオリアクター性能データ」は、細胞が大容量条件及び／又は高生産性条件下、特にバイオリアクターにおいて培養され又は増殖されるときの、細胞の挙動及び特徴についてのデータを意味すると理解される。バイオリアクター性能データは好適には特定の細胞産物、例えばタンパク質、特に抗体、抗体断片若しくは融合抗体、抗生物質の個々及び特定の細胞の生産性についての、又は該細胞の培養要求性、増殖性若しくは生存期間についてのデータである。好適な実施形態では、細胞産物はタンパク質、特に抗体、ペプチド、プロテオグリカン、糖タンパク質、炭水化物、脂質、抗生物質、又はホルモンである。
【００２０】
用語「標準細胞」は一定の規模において、好適には大容量規模及び／又は高生産性条件下、特にバイオリアクター規模において、既知の細胞培養性能データ、特に既知の特徴及び挙動を有する細胞を意味する。これらの既知の特徴は、従来技術の方法によって測定及び分析された。例えば、細胞の生産性はELISA（酵素結合免疫吸着法（enzyme-linked immuno sorbent assay））によって決定され得る。
【００２１】
本発明の文脈において、用語「サンプル細胞」は少なくとも一つの未知の細胞培養性能データ、特に細胞特性を有する細胞に関する。好適には、該サンプル細胞の少なくとも一つの特徴は既知である。
【００２２】
本発明の文脈において、用語「小容量の培地」は培地が好適には1μL〜100L、好適には1μL〜90L、好適には1μL〜80L、好適には1μL〜70L、好適には1μL〜60L、好適には1μL〜50L、好適には1μL〜40L、好適には1μL〜30L、好適には1μL〜20L、好適には1μL〜10L、好適には1μL〜5L、好適には1μL〜4L、好適には1μL〜3L、好適には1μL〜2L、好適には1μL〜1L、好適には1μL〜0.5L、好適には1μL〜0.4L、好適には1μL〜0.3L、好適には1μL〜0.2L、好適には1μL〜0.1L、好適には1μL〜90mL、好適には1μL〜80mL、好適には1μL〜70mL、好適には1μL〜60mL、好適には1μL〜50mL、好適には1μL〜40mL、好適には1μL〜30mL、好適には1μL〜20mL、好適には1μL〜10mL、好適には1μL〜5mL、好適には1μL〜4mL、好適には1μL〜3mL、好適には1μL〜2mL、好適には1μL〜1mL、好適には1〜999μL、好適には1μL〜0.5mL、好適には1μL〜0.4mL、好適には1μL〜0.3mL、好適には1μL〜0.2mL、好適には1μL〜0.1mL、好適には1μL〜50μL、好適には1μL〜40μL、好適には1μL〜30μL、好適には1μL〜20μL、好適には1μL〜10μL、好適には20〜90μL、好適には20〜80μL、好適には20〜70μL、好適には20〜60μL、好適には20〜50μL、好適には20〜40μL、好適には20〜30μL、好適には30〜70μL、好適には30〜60μL、好適には30〜50μL、好適には30〜40μL、好適には10〜100μL、好適には10〜90μL、好適には10〜80μL、好適には10〜70μL、好適には10〜60μL、好適には10〜50μL、好適には10〜40μL、好適には10〜30μL、好適には10〜20μL、好適には40〜60μL、好適には40〜50μLの容量を有する培地を意味する。
【００２３】
本発明の文脈において用語「スケールアップの初期」は、細胞が前記定義に従う小容量の培地において培養される時点として理解される。
【００２４】
本発明の文脈において用語「バイオリアクター」は、少なくとも一つの所望の細胞産物の生産のための細胞を含むことができ、好適には生産速度及び／又は前記所望の細胞産物の量の点で高生産性を可能とする容器を意味する。特に好適な実施形態では、バイオリアクターは生物学的に活性な環境を支持する装置又は構造である。特に好適な実施形態では、本発明のバイオリアクターは、目的の前記細胞産物の工業的及び商業的生産に好適な容器である。特に好適な実施形態では、かかる容器は目的の該細胞産物を高生産性で生産するのに好適な細胞培養条件を作り出すことができる。特に好適な実施形態では、バイオリアクターは、好適には本明細書で用いる「大容量」又は「大容量の培地」であると記載される、少なくとも10L、少なくとも20L、少なくとも50L、少なくとも100L、少なくとも200L、少なくとも300L、少なくとも400L、少なくとも500L、少なくとも600L、少なくとも700L、少なくとも800L、少なくとも900L、少なくとも1000L、特に少なくとも2000L、少なくとも3000L、又は少なくとも4000Lの容量の培地を含む。
【００２５】
本発明の文脈において、二つの要素の間に用いられる表現「及び／又は」は、該用語によって連結される両方の要素が累積的又は代替的に言及されることを意味する。したがって、表現「A及び／又はB」は「A又はB」並びに「A及びB」を包含し、「A、B、又はその両方のいずれか一つ」を意味する。
【００２６】
したがって、本発明は、当業者が少なくとも一つのサンプル細胞、特に少なくとも一つの細胞株の特徴を予測することを可能とする方法を提供する。この方法では、第一のステップa）において、小容量及び低細胞濃度、好適には104〜108、好適には104〜108生存細胞／培養培地mLを有する培地にいて培養された少なくとも一つのサンプル細胞のプローブ、標準細胞の細胞培養性能データ、並びにそれらの未加工標準MSデータを準備する。次に、第二のステップにおいて、少なくとも一つのサンプル細胞を質量分析法によって分析する。第三のステップにおいて、少なくとも一つのサンプル細胞及び標準細胞の両方の未加工MSデータを、MSシグナル処理法によって処理し、それにより少なくとも一つのサンプル細胞及び標準細胞の前処理MSプロフィールを得る。第四のステップにおいて、標準細胞の細胞培養性能データ並びに前処理サンプル及び標準MSプロフィールを統計学的な方法、すなわち好適にはPCAと組み合わせたPLS-DAに供する。この統計学的なプログラムは、サンプル細胞の前処理MSプロフィールを標準細胞の前処理MSプロフィールと比較し、評価するために用いられる。
【００２７】
本発明の好適な実施形態では、ステップa）において少なくとも一つのサンプル細胞のサンプルは、ステップb）においてMS分析に供し、それらの未加工サンプルMSデータを得るために準備される。
【００２８】
用語「少なくとも一つのサンプル細胞のプローブ」及び用語「少なくとも一つのサンプル細胞のサンプル」は、既定の数のサンプル細胞、すなわち少なくとも一つのサンプル細胞を意味する。
【００２９】
好適には、サンプルはステップa）において小容量の培地において準備されMS分析に供され、それらの未加工サンプルMSデータが得られる。
【００３０】
本発明の好適な実施形態では、培養後の細胞の濃度は好適にはサンプルにおいて、104〜108、105〜107、特に106〜107生存細胞/培養培地mLである。
【００３１】
本発明はスケールアップの初期において培養される少なくとも一つのサンプル細胞の細胞培養、好適にはバイオリアクター性能データ、例えば生産性の予測を可能とする。本発明による方法は、例えば高生産性細胞株の迅速な作製を可能とし、それにより治療的なタンパク質の製造費用を削減し、かつ医薬品の開発を加速させる。
【００３２】
本プロセスは、好適には産物の作製サイクルの初期において、すなわち好適には1〜999μLの容量の培養培地が用いられる時期において、特に大規模なバイオリアクター、特に10リットルより多い容量の培養培地を含むバイオリアクターにおいて所望の特性、例えば高い容量生産性を有する細胞、好適には細胞株を同定するための新規な選抜ツールを提供する。さらに、本発明による方法は例えば、好適には少なくとも1g/L、好適には少なくとも5g/L、及び最も好適には10g/L等の高い産物生産性を含む、特定の細胞特性を有する細胞、特に細胞株の作製の初期における発見確率を改善する。有用な細胞、好適には細胞株の同定に加え本方法は、例えば治療的なタンパク質の製造、特にモノクローナル抗体の製造のための改善された特性を有する新規な宿主細胞、好適には細胞株の単離のためにも、好適に用いられ得る。特に、MS分析とPLS-DAの統計学的な方法の組み合わせによって、好適にはPLS-DAとPCA（主成分分析）の組み合わせによって、本プロセスは異なる産物生産性レベルのパターンを同定し、それにより異なる規模でのそれらの生産性の、迅速かつ可能であれば自動的な方法による予測を可能とする。
【００３３】
本発明の好適な実施形態では細胞の比生産性、好適には細胞の高産物生産性は、少なくとも0.1g/L/h、好適には少なくとも1g/L/h、好適には少なくとも5g/L/h、好適には少なくとも10g/L/h、及び最も好適には10g/L/hである。
【００３４】
高生産細胞、好適には細胞株の発見の確率が高くなれば、製造に好適な細胞（株）の同定前に選抜するのに必要な細胞、好適には細胞株の数が減少する可能性がある。選抜される細胞、好適には細胞株の数の減少によって必要とされる物質が減少する。結果として、より少ない廃棄物の同時生産しか伴わず、かつより少ない資源しか細胞、好適には細胞株の構築の間に必要とされないだろう。高生産細胞、好適には細胞株は産物の市場要求量を供給するために必要なバイオリアクター培養の数を減少させる。本プロセスは、生産プロセスにおける原料の要求量、特に費用、特に原料として、並びに装置の洗浄及び衛生化においての両方で用いられる水を減少させ得る。
【００３５】
本発明の好適な実施形態では細胞培養性能データ、好適にはバイオリアクター性能データは細胞の、好適には大容量におけるサンプル細胞及び／又は標準細胞の性能を反映する。
【００３６】
本発明の好適な実施形態では、細胞培養、好適にはバイオリアクター性能データは、細胞比生産性、全生存細胞数、又は細胞産物濃度、特に細胞比生産性、全生存細胞数、又は細胞産物濃度データである。
【００３７】
特に好適な実施形態では細胞培養、好適にはバイオリアクター性能データは細胞比生産性(qP)である。
【００３８】
特に好適な実施形態では細胞培養、好適にはバイオリアクター性能データは全生存細胞数データ（IVC）である。
【００３９】
特に好適な実施形態では細胞培養、好適にはバイオリアクター性能データは細胞産物濃度データである。
【００４０】
本発明の好適な実施形態では、細胞産物濃度データは細胞産物の力価データである。
【００４１】
用語「力価」は、力価測定によって決定される、好適にはバイオリアクターにおける培地、好適には細胞培養培地の濃度を意味する。
【００４２】
本発明の好適な実施形態では、細胞の生産安定性についてのデータは細胞培養性能データとして理解されない。
【００４３】
本発明の好適な実施形態では、サンプル細胞及び／又は標準細胞は、ヒト細胞株、動物細胞株、植物細胞株、抗体、真菌の細胞、細菌の細胞、酵母の細胞及び幹細胞からなる群より選択される。
【００４４】
本発明の好適な実施形態では、サンプル細胞及び標準細胞の両方は同じ細胞種、特に細胞株又は系統から選択される。
【００４５】
本発明の好適な実施形態では、サンプル細胞はCHO細胞株、好適にはCHO-K1細胞株、好適には改変CHO-K1細胞株である。本発明の好適な実施形態では、標準細胞もCHO細胞株、好適にはCHO-K1細胞株（ATCC Number: CCL-61TM）、好適には改変CHO-K1細胞株である。
【００４６】
CHO-K1細胞株は成体のチャイニーズハムスターの卵巣に由来する親CHO細胞株のサブクローンである。CHO-K1細胞はプロリン合成遺伝子の欠失によりプロリンを必要とし、生合成連鎖のブロックはグルタミン酸をグルタミンγ-セミアルデヒドへ変換するステップで起こる。
【００４７】
本発明の好適な実施形態では、少なくとも一部、好適には全ての標準細胞が少なくとも一つのサンプル細胞と比べて異なる細胞産物、好適にはタンパク質、好適には抗体を発現する。
【００４８】
本発明の好適な実施形態では、少なくとも一部、好適には全ての標準細胞の細胞株構築が少なくとも一つのサンプル細胞のそれとは異なる。
【００４９】
本発明の好適な実施形態では、ステップb）において用いられるMS分析は、MALDI-TOF、LC-ESI-MS（液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化質量分析）及びLC-ESI-MS/MS（液体クロマトグラフィーと組み合わせたエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析）からなる群より選択される。
【００５０】
本発明の好適な実施形態では、ステップb）において用いられるMS分析はMALDI-TOFである。MALDI-TOFに供されるサンプル細胞は、例えばトリプシンによって消化される必要はないが、非常に単純な細胞調製によってそのままの形態でマトリックス中に包埋され得る。
【００５１】
本発明の好適な実施形態では、ステップb）において用いられるMS分析はLC-ESI-MSである。LC-ESI-MS分析は、生産性、増殖性、及び他の所望の特徴の点で、細胞株間の特定の大きな差を提供する。LC-ESI-MS分析は、更なる次元の情報を提供する。
【００５２】
本発明の好適な実施形態では、未加工標準MSデータはMALDI-TOF、LC-ESI-MS及びLC-ESI-MS/MSからなる群より選択されるMS分析、好適にはMALDI-TOFによって得られる。
【００５３】
本発明の好適な実施形態では、MALDI-TOF MS又はLC-ESI-MSのためのイオン化は装置特異的パラメータに従って最適化されている、例えば装置依存的に陰性若しくは陽性反射モード（reflection mode）、又は陽性若しくは陰性リニアモード（linear mode）において、質量抑制及びパルスイオン抽出（pulsed ion extraction）を伴って、又は伴わずに行われる。
【００５４】
本発明の好適な実施形態では、MALDI-TOF質量分析装置の以下の設定が、本発明による方法のために用いられる：
極性:  +ve
抑制:  1000Da（ダルトン）
範囲：1000〜50000Da。
【００５５】
本発明の好適な実施形態では、MALDI-TOF及びLC-ESI-MSのMS分析中の質量抑制は500Da未満、好適には1000Da未満、及び最も好適には1500Da未満である。
【００５６】
本発明の好適な実施形態では、MALDI-TOF及びLC-ESI-MSのMS分析中の質量抑制は500Da超、好適には1000Da超、及び最も好適には1500Da超である。
【００５７】
本発明の好適な実施形態では、MALDI-TOF及びLC-ESI-MSのMS分析中の検出範囲は、200〜100000Da、好適には200〜60000Da、好適には500〜50000Da、好適には1000〜100000Da、1000〜18000Da、好適には500〜10000Da、及び最も好適には200〜8000Daである。
【００５８】
本発明の好適な実施形態では、少なくとも一つのサンプル細胞は、好適にはバッファー溶液により洗浄した後にMS分析、好適にはMALDI-TOFに供される。
【００５９】
本発明の好適な実施形態では、少なくとも一つのサンプル細胞はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)単独又はそれに続く、特に0.2〜0.7M、好適には0.3〜0.5M、好適には0.35Mのショ糖水溶液により洗浄した後にMS分析、好適にはMALDI-TOFに供される。
【００６０】
本発明の好適な実施形態では、MALDI-TOF分析に用いられるマトリックスはシナピン酸（SA）である。本発明によればMALDI-TOF分析のマトリックスとしてのシナピン酸の使用は、好適には70kDaまでの特に広い範囲のピークを有し、特によく分離された有益なスペクトルを提供する。本発明のさらなる実施形態では、2,5-ジヒドロキシ安息香酸（DHB）もまたマトリックスとして用いられ得る。
【００６１】
本発明の好適な実施形態では、ステップb）において供される少なくとも一つのサンプル細胞のプローブは、1×106細胞以下、好適には0.015×106〜0.0625×106細胞、特に0.03×106細胞を含む。
【００６２】
本発明の好適な実施形態では、MSプロフィールは低温、例えば0〜10℃、好適には2〜8℃、特に4℃への順化の1〜5時間後、好適には1〜4時間後、特に1〜3時間後に採取され、それによりもっとも再現性良くかつより小さなシグナル対ノイズを含むマススペクトルが得られる。
【００６３】
本発明の好適な実施形態では、サンプル細胞は増殖の特定の時期にMS分析に供される。好適なサンプリング時期は細胞増殖の中期及び／又は終期である。
【００６４】
本発明の好適な実施形態では、ステップb）において得られる未加工サンプルMSデータ及び／又はステップa）において準備される未加工標準MSデータは、ベースライン補正、標準化、アライメント、フィルタリング及びトリミングからなる群より選択される操作によってシグナル処理される。
【００６５】
好適な実施形態では、ステップc）において用いられる第一のMSシグナル処理法は、ベースライン補正、標準化、アライメント、フィルタリング及びトリミングからなる群より選択される。
【００６６】
MSデータプロフィールは典型的に、MALDIマトリックス中の化学ノイズ及びイオンの過負荷等の問題により、異なるベースラインを示す。これはMSプロフィールを、それらを用いた距離行列として比較するためにデータ分析技術を用い、プロフィール間の類似性を測定する際に望ましくない。したがって、本発明の好適な実施形態では、未加工サンプル及び／又は標準MSデータは、ベースライン補正操作によってシグナル処理される。
【００６７】
MSプロフィール中によく観察されるもう一つの現象は、イオン強度の振幅のばらつきである。これは幾つかの要素、例えばサンプル調製時のばらつき、又は機器の感度の変化によって引き起こされ得る。したがって、本発明の好適な実施形態では、未加工サンプル及び／又は標準MSデータは標準化操作によってシグナル処理される。
【００６８】
ピークアライメントは観察されるM/Z値と真の飛行時間との差異を補正するのに用いられる。これらの誤差は通常誤差較正の結果として生じ、ピーク間の系統的なシフトとして観察され得る。したがって、本発明の好適な実施形態では、未加工サンプル及び／又は標準MSデータはピークアライメント操作によってシグナル処理される。
【００６９】
MSプロフィールのフィルタリングは、好適にはSavitzky-Golayフィルターによってシグナルを滑らかにすることによって行われる。したがって、本発明の好適な実施形態では、未加工サンプル及び／又は標準MSデータはフィルタリング操作によってシグナル処理される。
【００７０】
MSプロフィールのトリミングは、ほとんど又は全く情報を含まないシグナル部分を除去するために行われる。好適には、0〜500m/z値の範囲がMSスペクトルから除去される。したがって、本発明の好適な実施形態では、未加工サンプル及び／又は標準MSデータはトリミング操作によってシグナル処理される。
【００７１】
本発明の好適な実施形態では、少なくとも一つのサンプル細胞のプローブは再サンプリングされる。この特定の好適なプロセスのステップは、スペクトル中に含まれる情報を保存しながら、元のシグナルのアップサンプリング（up-sampling）及びダウンサンプリング（down-sampling）、すなわち測定される様々なデータポイントの測定量（amounts channels）を変更することを可能とする。典型的に、再サンプリングはコンピューターの制約、例えばコンピューターの容量の欠如により元の高解像度のMSシグナルが実施にとって非実用的と考えられる条件で利用される。再サンプリングは多数のスペクトルの整列を容易にする、一貫したm/z範囲を作り出すためにも用いられ得る。
【００７２】
本発明の好適な実施形態では、少なくとも一つのサンプル細胞のサンプルは、少なくとも50,000まで、好適にはm/zベクトルにおいてわずかな差となるまでアップサンプリングされる。
【００７３】
本発明の好適な実施形態では、未加工標準及びサンプルMSデータは視覚的に分析される。
【００７４】
本発明の好適な実施形態では、ステップc）において得られる前処理標準及びサンプルMSプロフィールは、好適には異常値を検出するため及び異常な欠陥のある前処理標準及びサンプルMSプロフィールを除去するために光学的に分析される。
【００７５】
好適な実施形態では、ステップc）において用いられる第一のMSシグナル処理法は、好適には以下の順序で、以下のステップ：未加工標準及び／又はサンプルMSデータの再サンプリング、ベースライン補正、フィルタリング、アライメント、視覚分析及び標準化を含む。
【００７６】
本発明の好適な実施形態では、ステップd）において評価される予測された細胞培養、好適にはバイオリアクター性能データを有するサンプル細胞は、細胞培養、好適にはバイオリアクターにおいて培養され、それによりその細胞培養、好適にはバイオリアクター性能データを検証する。
【００７７】
本発明の好適な実施形態では、ステップb）において得られる未加工サンプルMSプロフィール及びサンプル細胞の検証されたバイオリアクター性能データはステップa）において、標準MSデータ及び標準細胞のバイオリアクター性能データとして用いられる。既知の細胞培養、好適にはバイオリアクター性能データを有する標準細胞の多数のMSプロフィールを準備することによって予測の確率、好適には信頼性は、より正確かつ信頼性のあるものとなる。
【００７８】
本発明の好適な実施形態では、ステップ（d）によるPLS-DAモデルは、二つの異なる情報セット、すなわちx-ブロック及びy-ブロックを必要とする。本発明の好適な実施形態では、x-ブロックはプロセスの96DWP（ディープウェルプレート）期において作られる前処理サンプルMSデータからの情報を含む。本発明の好適な実施形態では、各前処理サンプルMSデータがサンプルとして処理され、特定の範囲のm/z値にわたって記録されたシグナル強度が変数として処理される。本発明の好適な実施形態では、y-ブロックは前処理標準MSデータのそれぞれをクラス変数に割り当てる情報を含む。本発明の好適な実施形態では、y-ブロックは、好適にはバイオリアクター規模における細胞株の生産性の特定の測定、すなわち産物濃度、比生産性又は全生存細胞数に関する情報を含む。
【００７９】
本発明の好適な実施形態では、統計学的なプログラムであるPLS-DAは安定な細胞株と不安定な細胞株を区別するためには用いられない。本発明の好適な実施形態では、統計学的なプログラムであるPLS-DAが本発明によるプロセスにおいて用いられる唯一の統計学的なプログラムである。本発明の好適な実施形態では、統計学的なプログラムであるPLS-DA及びPCAが本発明によるプロセスにおいて用いられる唯一の統計学的なプログラムである。好適には、未加工標準及び未加工サンプルMSデータはステップc）において統計学的な分析、好適にはPLSの使用なしに前処理され、その後ステップd）においてPLS-DAに基づく比較評価を含む第二のMSシグナル処理法に供され、それにより少なくとも一つのサンプル細胞の細胞培養性能データが予測される。
【００８０】
本発明の好適な実施形態では、x-ブロックのデータを用いて元の変数の潜在変数空間（latent variable space）へのPLSマッピングが行われる。これは元のデータのばらつきを最大限説明しながら、問題の次元を低下させる効果を有する。本発明の好適な実施形態では、PLS-DAアルゴリズムはy-ブロックの情報を利用して、y-ブロックに保存されたクラス情報に基づいて、x-ブロックのデータを最もよく分離する直線の判別境界を適合させる。y-ブロックに二つのクラスのみが記載される場合は一つの判別境界で十分である。三つ又はそれ以上のクラスが存在する場合には、クラス中のサンプルは各利用可能なクラスにとって外のクラスのサンプルと比較されるべきである。
【００８１】
本発明の好適な実施形態では、以下のクラスが全生存細胞数データを予測するためのPLS-DAに基づく比較評価において用いられる：
・高＞4500×106細胞×h/mL、
・4500×106細胞×h/mL＞中＞3250×106細胞×h/mL、及び
・低＜3250×106細胞×h/mL。
【００８２】
本発明の好適な実施形態では、以下のクラスが細胞の比生産性データを予測するためのPLS-DAに基づく比較評価において用いられる：
・高＞2.35pg×細胞×h、
・2.35pg×細胞×h＞中＞1.75pg×細胞×h、及び
・低＜1.75pg×細胞×h。
【００８３】
本発明の好適な実施形態では、以下のクラスが細胞産物の濃度データを予測するためのPLS-DAに基づく比較評価において用いられる:
・高＞4g/L、及び
・低＜4g/L。
【００８４】
本発明は、以下のステップ:
a）本発明の方法による細胞培養性能データの予測、
b）所望の細胞培養性能データを有するサンプル細胞の同定、
c）ステップb）において同定される前記サンプル細胞の、好適には大容量の培地における培養、並びに
d）ステップc）における培養によって生産される細胞産物、好適にはタンパク質の取得
を含む、細胞からの細胞産物、好適にはタンパク質の生産のためのプロセスにも関する。
【００８５】
好適には、細胞産物、好適にはタンパク質の生産のためのプロセスにおいて、ステップa）において細胞培養性能データが予測されるサンプル細胞は、小容量の培地で培養される。
【００８６】
さらに、本発明は所望の細胞培養、好適にはバイオリアクター性能データを有する細胞の調製、特に単離のためのプロセスであって、少なくとも一つのサンプル細胞の細胞培養、好適にはバイオリアクター性能データの予測プロセスが行われ、少なくとも一つの所望の細胞が調製、好適には単離される、上記プロセスを提供する。
【００８７】
本発明は本発明によるプロセスによって取得、特に単離される細胞を提供する。
【００８８】
本発明の好適な実施形態では、単離される細胞は少なくとも1g/L、好適には少なくとも5g/L、好適には少なくとも6、7、8、9、又は好適には少なくとも10g/Lのタンパク質生産性によって特徴づけられる。
【００８９】
本発明の好適な実施形態では、単離される細胞は少なくとも0.1g/L/h、好適には少なくとも1g/L/h、好適には少なくとも5g/L/h、好適には少なくとも6、7、8、9又は好適には 少なくとも10g/L/hのタンパク質生産性によって特徴づけられる。
【００９０】
本発明の好適な実施形態では、単離される細胞は少なくとも0.1g/L/h/細胞、好適には少なくとも1g/L/h/細胞、好適には少なくとも5g/L/h/細胞、好適には少なくとも6、7、8、9又は好適には少なくとも10g/L/h/細胞のタンパク質生産性によって特徴づけられる。
【００９１】
本発明は、少なくとも一つのサンプル細胞の細胞培養、好適にはバイオリアクター性能データの予測のための、好適には少なくとも一つのサンプル細胞のプローブと共に提供される際の、好適には細胞培養性能データの予測の提供に適する装置であって、（a）少なくとも一つのサンプル細胞のプローブのMS（質量分析）分析への供試による、それらの未加工サンプルMSデータの取得に適する手段、（b）未加工標準及び未加工サンプルMSデータの少なくとも一つの第一のMSシグナル処理法への供試による前処理標準及びサンプルMSプロフィールの取得に適する手段、並びに（c）標準細胞の細胞培養、好適にはバイオリアクター性能データ、並びに前処理サンプル及び標準MSプロフィールの、PLS-DA（部分最小二乗判別分析）に基づく比較評価を含む第二のMSシグナル処理法への供試によるサンプル細胞のバイオリアクター性能データの予測に適する手段を含むものである、上記装置によっても、その根本的な課題を解決する。
【００９２】
さらに好適な実施形態は下位請求項の対象である。
【００９３】
本発明は以下の実施例及び対応する図を参照してさらに説明される。
【実施例】
【００９４】
実施例１−（従来技術による）細胞株の作製
モデルマウス−ヒトキメラIgG4又はIgG1抗体の発現のための遺伝子最適化された重鎖及び軽鎖遺伝子を含むGS発現ベクター（Lonza）（Kalwy et al., Mol. Biotechnol 2006, 34, 151-156）を、抗体を発現する組み換えGH-CSO細胞株を作製するのに用いた。該ベクターを宿主細胞株CHOK1SV（CHO-K1の派生株：Lonza）に標準的なエレクトロポレーション法を用いて導入し、トランスフェクション混合物を80個の96ウェルプレートに分配した。プレートを加湿した10%CO2を含む大気中37℃でインキュベートした。翌日、新鮮な培地をプレートの細胞懸濁液に加えた。該培地中のMSX（メチオニンスルホキシミン（methionine sulphoxamine）濃度は、各ウェルにおけるMSXの終濃度が50μMとなる濃度であった。プレートを、トランスフェクションの約三週間後に、最初にグルタミン非依存性トランスフェクタントについて選抜した。単離されたトランスフェクタントのコロニー（それぞれ単一のコロニーを含むウェルに由来するものとして同定された）を、典型的な細胞株構築法の全ての評価段階を通して増殖させた。
【００９５】
培養物の細胞濃度をVi-CELLTM自動細胞生存数分析計（Beckman Coulter）を用いて決定した。培養物を目標細胞濃度2.0×105生存細胞/mL及び最終容量を典型的に30mLとし、125mLの振盪フラスコに移した。細胞株を4日ごとに連続的に継代培養した。継代培養において容認できる細胞濃度に達し、かつ継代培養間の生存細胞濃度の全ての大きな変動が止まったら、懸濁培養において行う評価段階を開始した。細胞株を第一の懸濁液評価（バッチ）に続いてランク付けした後、半回分（fed-batch）評価を行った。半回分評価のために、培養物の細胞濃度をVi-CELLTM自動細胞生存数分析計を用いて7日目及び14日目において決定した。供給物Aのボーラス（bolus）添加を3日目に行い、供給物Bのボーラス添加を8日目及び11日目に行った。培養上清のサンプルを抗体濃度決定のために様々な日に採取した。細胞生存分析は、MACSQuant（登録商標）分析計を用いても行い得る。
【００９６】
実施例２−MALDI-TOF分析のためのサンプル細胞の調製
他で特定しない限り、全ての実験を実施例1（第一段落）で概要を述べたのと同じ培養条件下で行った。サンプルプローブ（サンプルを意味する）をMS分析に供する前に細胞を数え、適正な細胞数を提供するために必要な培養物の容量を計算した。細胞を処理の直前にインキュベーター（96ウェルプレート）から取り出した。各サンプルの必要量をエッペンドルフチューブに移し、エッペンドルフ微量遠心管（モデル5417c、ローターF-45-30-11）において960rcf（3000rpm）で5分間遠心し、上清を除去した。その後細胞を1mLのPBS（リン酸緩衝生理食塩水）において穏やかに上下にピペッティングすることによって洗浄し、その後前記のように遠心した。前記の通り、次に細胞を1mLの0.35Mショ糖で洗浄し、前記の通りの遠心後に上清を除去した。その時点で細胞ペレットをその後のさらなる取扱いのために（-80℃で）保管するか、又はMS分析で直ちに処理し得る。保管の場合には、凍結した細胞ペレットは解凍後の使用の前に室温に平衡化する必要がある。
【００９７】
シナピン酸の20mg/mL溶液をマトリックスバッファー（40%アセトニトリル、60% 0.1%TFA）中で調製し、飽和溶液を得た。その後シナピン酸溶液を超音波水浴中に15分間配置し、その後エッペンドルフ微量遠心管（モデル5417c、ローターF-45-30-11）において5分間17900rcf（13000rpm）で遠心した。
【００９８】
その後マトリックス溶液（50μL）を各サンプルに加え、手動で溶液を上下にピペッティングすることにより細胞を再懸濁した。再懸濁後、細胞を数時間以内の間4℃に配置した。4℃から取り出し、細胞を穏やかなタッピングにより再懸濁し、その後各サンプル1μLを384 MTP ground steel MALDI TOFプレート（Bruker）上に配置した。プレートをMALDI TOF機（Bruker Ultraflex）に配置し、サンプルを分析する前にサンプルを空気乾燥させた。
【００９９】
実施例３−Dunn溶解バッファーを用いるLC-ESI-MS分析のためのサンプル細胞の調製
サンプル回収：ある範囲のCHO細胞株を250mL懸濁細胞培養フラスコで増殖させた。細胞をVi-CELLTMを用いて数え、必要な細胞数（1×106〜0.015625×106）を1.5mLのエッペンドルフチューブにピペットで移し、エッペンドルフ微量遠心管（モデル5417c、ローターF-45-30-11)において960rcfで5分間遠心し、上清を除去した。ペレットを使用まで-80℃で保管した。
【０１００】
細胞の溶解：ペレットを解凍し、400μLのDunn溶解バッファー（高純度尿素9.5M、CHAPS 2%、DTT 1%）に再懸濁し、十分にボルテックスし、インキュベート開始の30分後に簡単にボルテックスしつつ、1時間室温（RT）でインキュベートした。その後サンプルを985.6g、好適には1700rcf（相対的遠心力）で1分間遠心して細胞片を除去し、上清を2mLエッペンドルフにピペットで移した。その後サンプル50μLをアセトン沈降に用いた。
【０１０１】
アセトン沈降：100%氷冷アセトンとサンプルの4:1希釈液を1時間-20℃でインキュベートした。その後、希釈サンプルを8870.4g、好適には17900rcf（相対的遠心力）で10分間遠心して上清を除去し、ペレットを短時間（5分未満）空気乾燥させた。
【０１０２】
GEヘルスケアの2Dクリーンアップキット（製品コード80-6484-51）を、溶液のトリプシン消化の前にサンプルを浄化するために用いた。キットと共に提供されるマニュアルの手順Aに従った。
【０１０３】
溶液におけるトリプシン消化：最初にサンプルを上下にピペッティングしてペレットを取り外した後に短時間ボルテックスすることによりペレットを50μLの8M尿素、0.4M重炭酸アンモニウム（NH4HCO3）中に再懸濁した。サンプルを2.5μLの100mMジチオスレイトール（DTT）を含む50mM NH4HCO3の添加により、37℃のインキュベーターにおいて1時間化学的に還元した。その後サンプルを5μLの100mMヨードアセトアミドを含む50mM NH4HCO3の添加により、暗室において室温で15分間アルキル化した。尿素濃度を192.5μLのHPLCグレードの水の添加により＜2Mまで希釈し、その後10μLの0.25μg/μL改変トリプシン（Promega）を添加した。その後トリプシン消化を37℃インキュベーターにおいて一晩進行させた。その後サンプルをSavant speed vac（SC110A）を用いて低設定で乾燥し、20μLの0.1%ギ酸で再懸濁し、8870.4gで1分間遠心し、上清を除去して全てのペレットを再懸濁し、再び8870.4g、好適には17900rcf（相対的遠心力）で1分間遠心し、その後スクリューキャップバイアルに挿入物と共にピペットで移し、LC-ESI-MSで分析するまで-80℃で凍結した。
【０１０４】
実施例４−LC-ESI-MSによる分析
適切なMSスペクトルを生じる、LC-ESI-MS（HPLC（Donex又はAgilent）と組み合わせたESI-MS（Bruker又はWaters））による分析のために使用したHPLC法を表1に示す。
【０１０５】
LC-ESI-MSによって作られたファイルを、その後プロプリエタリファイルフォーマット（proprietary file format）（Bruker又はWaters）から、ユニバーサルスタンダード（mzXML）に（すなわち、CompassExportを用いて）変換し、生じたファイル及びデータをビニング（binning）手順に供した。この種類のMSデータの分析に標準的なビニング手法は、異なる（又は同じ）サンプルからの複数のESI-MSデータセットをそれらの整列によって比較することを可能とし、かつ保持時間（LC系からの溶出時間）及びm/z範囲（ECI-MSにおいて検出されるイオンの質量電荷比）を、例えば保持時間60秒のビン及び質量電荷比1m/z単位のビンを用いてビンごとに均等に間隔をあけた区間に分割することを含む。
【表１】
2013545449.tif 000003
【０１０６】
実施例５−データ分析プロトコル方法1
５．１  データ処理及びソフトウェアの進行
MSに基づく細胞株の選抜及び作製のための本実施例において、細胞株の生産性の迅速かつ規模を超えた予測を可能とする（ウインドウズインターフェースを介して実行する）ソフトウェアツールを用いる。これはMALTABバイオインフォマティクス及び統計学的ツールボックス並びにPLSツールボックス（www.eigenvector.com）を用いるMALTAB（リリース2008b、参考）にコンパイルされている。
【０１０７】
ソフトウェアアプリケーションは、様々な培養条件及び規模で増殖させたサンプル及び標準細胞株のMSプロフィールが入手可能になって初めて用いられ得る。シグナル処理ツールを、様々なレベルの産物を生産する細胞株の指標となる特有のMSデータパターンを抽出するためにMSプロフィールに適用した。
【０１０８】
５．２  MSプロフィールの再サンプリング
MSプロフィールの再サンプリングを、MATLABバイオインフォマティクスツールボックスの「msresample」機能（http://tinyurl.com/msresample）を用いて行う。これはスペクトルに含まれる情報を保存しながら、元のシグナルのアップサンプリング及びダウンサンプリングを可能とする。図１a及び1bは、再サンプリングの適用前及び後の、典型的な96DWPスペクトルを示す。
【０１０９】
典型的に再サンプリングを、元の高解像度のMSシグナルがコンピューターの制約、例えばコンピューターの容量の欠如により実施にとって非実用的と考えられる条件で利用する。再サンプリングは、多数のスペクトルの整列を容易にする一貫したm/z範囲を作り出すためにも用い得る。再サンプリングされる単位の数を低すぎる設定にしないように、MSプロフィールの再サンプリング時には注意を払わなければならない。これはシグナルの解像度の喪失を引き起こすだろうし、特徴の喪失につながり得る。
【０１１０】
５．３  MSプロフィールのベースライン補正
MSデータプロフィールは、典型的にMALDIマトリックス中の化学ノイズ及びイオン過負荷等の問題により、異なるベースラインを示す。これはMSプロフィールを比較するためにデータ分析技術を用いる際には望ましくないものとなり得る。なぜなら該データ分析技術はプロフィール間の類似性を測定するために距離計量（distance metric）を利用するからである。したがって、あらゆる種類のシグナル比較分析の前にこれらの効果を除くことが好ましい。これはMATLABバイオインフォマティクスツールボックスの「msbackadj」機能（http://tinyurl.com/msbackadj）を用いて行う。図２a及び２ｂは、ベースライン補正の適用前及び後の典型的な96DWPのスペクトルの一例を示す。
【０１１１】
存在するノイズが結果に影響を与えるだろうから、幾つかのスペクトル前処理を連続して適用するときは、ベースライン補正をダウンサンプリング後かつ較正の補正前に用いるべきである。
【０１１２】
５．４  標準化
MSプロフィールにおいてよく観察されるもう一つの現象はイオン強度の振幅のばらつきである。これは幾つかの要素、例えばサンプル調製時のばらつき、又は機器の感度の変化によって引き起こされ得る。このばらつきを考慮するための標準的な手順は、MS曲線の下の面積を群平均の該面積（典型的に平均値又は中央値を用いる）に対して標準化することである。これはMATLABバイオインフォマティクスツールボックスの「msnorm」機能（http://tinyurl.com/msnormal）を用いて行う。図３a及び３bは曲線下の面積の標準化の前及び後の典型的な96DWPのスペクトルの一例を示す。
【０１１３】
クリスタライゼーションマトリックス（crystallisation matrix）によって導入されるノイズ要素が結果に影響を与え得るから、幾つかのスペクトル前処理を連続して適用するときはサンプルの標準化をベースラインを差し引いた後に行うべきである。
【０１１４】
５．５  MSアライメント
ピークアライメントを観察されるm/z値と真の飛行時間の間の差異を補正するのに用いる。これらの誤差は通常誤差較正の結果として生じ、ピーク間の系統的なシフトとして観察し得る。これらの不一致の補正はMATLABバイオインフォマティクスツールボックスの「msalign」機能（http://tinyurl.com/msalign）を用いて行い得る。
【０１１５】
スペクトルを整列させるための一つの方法は、既知のスペクトルプロフィールを有する物質をサンプルに添加し、これに基づいてサンプルを整列させることである。しかしながら、サンプルに添加をしなかった場合にはサンプルを平均プロフィール等の参照スペクトルに対して整列し得る。
【０１１６】
５．６  MSプロフィールのフィルタリング
典型的なMSプロフィールはシグナル及びノイズの両方の混合物を含む。Savitzky-Golayフィルターの使用によるシグナルの平滑化は、後の処理におけるシグナルのノイズ成分の影響を減少させるのに役立ち得る。Savitzky-Golayフィルターは曲線を適合させるのに高次の多項式を使用するから、典型的にMSシグナルに適用される。これはピーク高さ等のシグナル中の特徴のより優れた保存をもたらす。このプロセスは、MATLABバイオインフォマティクスツールボックスの「mssgolay」機能（http://tinyurl.com/mssgolay）を用いて行う。図４a及び４bはSavitzky-Golayフィルタリングの適用前及び後の典型的な96DWPスペクトルの一例を示す。
【０１１７】
５．７  MSプロフィールのトリミング
MSプロフィールのトリミングは、ほとんど又は全く情報を含まないシグナル部分を除去するために行う。該トリミングはまた、スペクトルを小区分に分割することを可能とする。これはスペクトル全体というよりもむしろMSプロフィールの特定の領域を分析することを可能とする。図５a及び図５bは、0〜500m/z範囲でのシグナルのトリミングの前及び後の典型的な96DWPスペクトルの一例を示す。
【０１１８】
５．８  前処理の効果の比較
MSデータへのシグナル処理技術の適用の効果を実証するために、（二連で測定した）118の細胞株の群を、主成分分析（PCA）を用いて分析した。図６a、６b、及び３８は、PC1対PC2の主成分スコアプロットを示す。このプロットは、データセット中の変数の二つの主要な源を記載する。
【０１１９】
未加工MSプロフィールに対するベースライン補正の適用は、第一及び第二の主成分において観察されるばらつきの量の減少をもたらす。これは図７a、７b、及び３９において観察し得る。
【０１２０】
ベースライン補正はMALDIマトリックスによるシグナル中のノイズを考慮するのみである。シグナルの振幅におけるばらつきを、標準化を用いて除去することが好適である。図８a、８b、及び４０はスペクトルの群に対する標準化の適用の影響を示す。標準化の適用は、変数の主要な源であるPC1において観察されるばらつきの減少を明確に示す。
【０１２１】
行われる最後のシグナル処理ステップは、有用な情報を含まないとして知られるシグナル部分の除去である。図９a、９b、及び４１は、MALDIを0〜500m/z単位の範囲の強度を記録しないように設定したので、0〜500m/z単位の範囲のMSプロフィール中のデータ点の除去の影響を示す。該スコアプロットが図８a、８b、及び４０で観察されたものと同一であるから、このデータの除去によって何の影響も観察されないことはスコアプロットから明らかである。
【０１２２】
ステップc）において、以下のステップ：未加工標準及び／又はサンプルMSデータの再サンプリング、ベースライン補正、フィルタリング、アライメント、視覚分析、及び標準化を含む第一のシグナル処理法を用いる事で、標準及びサンプルMSプロフィールは、ベースライン補正及び標準化の方法ステップのみで前処理したMSプロフィールと比較してより滑らかに見え、かつピークは細胞株間においてより一貫して整列する（図２１a及び２１b）。かかる方法は2又は3の細胞ペレットを同じサンプルからのMS分析への供試のために調製する、生物学的複製物のためのより一貫したMSプロフィールもまたもたらす。好適には、これらの改良はサンプルの処理に必要な時間の増幅というコストをもたらすが（約400スペクトルに対して約2時間）、好適にはこれは細胞株構築プロセス中の、それらの対象細胞株の予測／選択のために必要なモデリング手法及び時間の点で、法外なものではない。
【０１２３】
実施例６  シグナル処理法2
６．１  生産性計量のPLSDAモデリング
PLSDAは特に予測分類のために考案された多変量最小二乗モデリングのアプリケーションである。実施例において利用する開発されたMSフィンガープリンティング手法は、Eigenvector Research, Inc.（EVRI）（www.eigenvector.com）によって公表されたPLSDAのPLSツールボックス(PLS_Toolbox)実装を使用する。
【０１２４】
６．２  PLSDAモデルのトレーニング
PLSDAモデルをトレーニングするためには、二つの異なる情報セット：x-ブロック及びy-ブロックを必要とする。新しい細胞株の構築を実行するための概略を述べた手法において、x-ブロックはプロセスの96DWP段階で作られるスペクトルプロフィール中の情報を含む。各プロフィールをサンプルとして処理し、特定の範囲のm/z値において記録されるシグナル強度を変数として処理する。y-ブロックは各トレーニングサンプルをクラス変数に割り当てる情報を含む。この実施例において、y-ブロックはバイオリアクター規模における細胞株の特定の細胞培養生産性データ、すなわち産物濃度、比生産性又は全生存細胞数に関する情報を含む。
【０１２５】
x-ブロックのデータを用いて、元の変数の潜在変数空間へのPLSマッピングを行う。これは元のデータのばらつきを最大限記載しながら、問題の次元を低下させる効果を有する。その際、PLSDAアルゴリズムはy-ブロック中の情報を利用して、y-ブロックに保存されたクラス情報に基づいて、x-ブロックのデータを最もよく分離する直線の判別境界に適合させる。y-ブロックに記載されるクラスが二つだけである場合は、単一の判別境界で十分である。三つ又はそれ以上のクラスが存在する場合には、クラス中のサンプルは各利用可能なクラスにとって外のクラスのサンプルと比較されるべきである。
【０１２６】
６．３  分析フローチャート
図１０は、MATLAB PLSツールボックスにおいて見られる画像実行アルゴリズムを用いるPLSDAモデルを構築するのに必要な操作のフローチャートを示す。
【０１２７】
１．  Xデータのロード（Load X data）−このボタンはソフトウェアへのx-ブロックデータの取り込みを促す。フィンガープリンティングソフトウェアms_preprocは、シグナル処理と分析技術の間のインターフェースとしてはたらくように設計され、自動的にMSデータをPLSツールボックスでの取り扱いに必要なフォーマットに変換し、その変数をMATLABワークスペースに変数「xブロック」として保存する（図１１a及び図１１b）。
【０１２８】
２．  クラスのロード（Load Classes）（任意）−このボタンはy-ブロックのデータをソフトウェアへ取り込むのに用いる。しかしながら、クラスの情報は「xブロック」変数にも保管され得る。（より詳しくは、http://wiki.eigenvector.com/index.php?title=DataSet_Object を参照)。ms_preprocソフトウェアはクラスの情報を「xブロック」変数中に包含する；したがってこのステップは任意である。
【０１２９】
３．  クラス群の選択（Select Class Groups）−このボタンはモデルを構築するのに用いるクラス群の選択オプションを使用者に提示する。図１２は三つのクラス（高、中、低）の典型例を示す。該モデルは右欄に加えられるクラスのための決定境界を計算する。
【０１３０】
４．  前処理の選択（Choose Preprocessing）−このボタンはスペクトルファイルに様々な前処理技術を適用するのに用い得る（図１３）。バイオインフォマティクスツールボックス中のスペクトル前処理ツールを用いてこのステップを実行する場合、このステップの大部分は任意である。しかしながら、トレーニング中に割り当てられる事前確率（prior probability）の問題もデータの前処理に関係する。デフォルトにより、該アルゴリズムは各クラスが選択される確率を均等と仮定する。場合によってはこの限りでなく、真の確率を反映するために値を調整しなければならない。これは「Edit」メニューの「Options」セクション中の「Method Options (PLSDA)」を変更することによって行う。
【０１３１】
５．  交差検定の選択（Choose Cross-Validation）−このボタンはトレーニングプロセスにおいて使用者が交差検定することを可能とする。このプロセスは結果の改善された信頼性を提供するのにしばしば用いられ、分類性能のクロスチェックとしてはたらく。標準的な手法はトレーニングデータの一部を準備し、これを分類の性能を試験するのに用いることである。典型的には、その後このプロセスを準備するデータの異なる部分を用いて反復する。図１４はPLSツールボックスを用いるデータの分割に利用可能な方法を示す（http://wiki.eigenvector.com/index.php?title=Using_Cross-Validation）。
【０１３２】
６．  モデル構築（Build Model）−このボタンは、PLS潜在変数を計算し、トレーニングデータセット中の正確な分類の数を最大化するのに最適な位置に決定境界を配置する。
【０１３３】
７．  成分の選択（Choose Components）−このボタンは、PLSDAモデルが計算された時点で利用可能となる。このボタンは使用者がPLSDAモデルに保有される潜在変数の数を選択するのを補助するグラフを作る。これを達成するもう一つの方法は、モデルに過剰に適合しないようにy-ブロックに対して説明される変数をほぼ70〜80％にすべきであるとみなすことである。
【０１３４】
８．  スコアの評価（Review Scores）−このボタンは、潜在変数スコアに関するプロットの数へのアクセスを可能とする。これらはモデルの性能を分析するのに用い得る。図１５a〜１５d及び４２〜４５は最も有用なグラフの幾つか；（a）二変数負荷量プロット、（b）Hotelling’s T2プロット、（c）モデル予測プロット、及び（d）モデル予測プロットに付随する確率を示す。
【０１３５】
９．  負荷量の評価（Review Loadings）−このボタンは、潜在変数負荷量に関するプロットの数へのアクセスを可能とする。これらは各潜在変数に最も重大な影響を与える変数を特定するのに用い得る。これは境界に最も影響を与えると考えられるスペクトルシグナルの領域を特定するために有用であり得る。
【０１３６】
１０．  試験データのロード（Load Test Data）−モデルが構築されたら、次のステップはモデルを利用して未知のデータについての予測を行うことである。このボタンのクリックは使用者に図１１a／bと同じダイアログボックスを提示する。試験データを、クラス変数をサンプルに割り当てることなくステップ１における元のx-ブロックデータと共に取り込み得る。ステップ２において、我々のms_preprocソフトウェアによってクラスに割り当てられない全てのサンプルは、自動的に試験データとみなされる。これらは図１６a、１６b、４６及び４７において未知と分類されるサンプルとして見られ得る。
【０１３７】
１１．  モデルの適用（Apply model）−このボタンは試験データをトレーニングされたPLSDAモデルに適合させる。これは、使用者が未知のサンプルが属するであろう最も確率の高い分類を決定することを可能とする。
【０１３８】
実施例７−MSプロフィールのMALDI-TOFへの供試とそれらの統計的モデリング
例証される段落は、新しい細胞株作製プロセスにおけるMS分析データのモデリングから得られる結果に着目する。図４８、４９、１７及び１８はBNCDモデルのために得られる結果を示す（データは含まれる二連のサンプルにおいてベースライン補正され、標準化され、トリミングされる）。三角形（図１７及び１８）及び星（図４８及び４９）は「高」クラス（＞4000mg/L）のトレーニングデータを示し、星（図１７及び１８）及び三角形（図４８及び４９）は「低」クラス（≦3999mg/L）のトレーニングサンプルを示し、黒い点（図１７及び１８）及び細胞株ID数を有さない十字（図４８及び４９）はクラスデータが未知であるサンプルを表し、細胞株ID数を有する点は分類境界（上部の灰色の点線）より上のサンプルを示す。
【０１３９】
細胞株構築プロセスにおける処理された情報を用いる事で、（i）予測モデルを細胞株作製プロセス中に作られた数百のMSデータを含んで構築し得る。モデルに基づいて、異なる量のMAb（＞4000mg/L；≦3999mg/L）を生産すると予測された細胞株のリストが照合された。表２は、図４８、４９、１７、及び１８において特定され得る幾つかの細胞株を取り上げている。細胞株を、予測法の性能を測定するためにその力価を測定しながら増殖させた。
【表２】
2013545449.tif 000004
【０１４０】
検定の実行結果は、作製初期の個々の細胞株の照合されたMSプロフィールが後期の製造規模における細胞の振る舞いを反映するように、細胞株作製プロセスにおける予測的な細胞株選択の実施の成功を証明した。
【０１４１】
実施例８−LC-ESI-MSに供されたMSプロフィールの統計学的モデリング後の結果
LC-ESI-MSによって得られた未加工MSプロフィールを、シグナル処理法I（実施例５）及びシグナル処理法II（実施例６）によってシグナル処理した。結果を図１９a／b及び２０に示した。
【０１４２】
図１９a／bは、PLSDA分析を用いる三つの異なる組み換えCHO細胞株の分離を示し（図１９a／bはLV1対LV3を示す）、図２０は、サンプルが＜2g/Lと＞2g/Lに分類される際の、PLSDA分析後の七つの異なる組み換えCHO細胞株の分離を示す。該データは各組み換え細胞株群の二つのサンプル、及びPLSDAアルゴリズムが様々な群に属する細胞株を識別できることを示す。この手法は所望の特徴（例えば生産性）に基づく組み換え細胞株のフィンガープリンティングに好適である。
【０１４３】
表３は、24ウェルプレート、バッチ、半回分バッチ及びバイオリアクターで培養したCHO細胞株2、42、52、75、106、144、及び164の産物濃度を示す。特に、バイオリアクター規模の産物濃度は、LC-ESI-MSデータを用いるPLS-DA分析によって正確に予測された（図２０）。
【表３】
2013545449.tif 000005
【０１４４】
実施例９−予測の正確性の改善
９．１  バイオリアクターラウンド１
この第一のラウンドでは、抗インスリン抗体IgG XXXを生産する細胞株を、他で特定しない限り実施例１の第一段落で概略を述べた培養条件で用いた。
【０１４５】
その後、前記細胞株をMS分析に供してそれらの未加工サンプルMSデータを得、次に未加工サンプルMSデータを、アップサンプリング、ベースライン補正、フィルタリング、アライメント及び標準化のステップを含む少なくとも一つの第一のMSシグナル処理法に供して前処理サンプルMSプロフィールを得、その後、前処理サンプルMSプロフィールを、PLS-DAに基づく比較評価を含む第二のデータ分析に供し、それにより細胞株のバイオリアクターにおける力価データを予測した。
【０１４６】
前処理標準MSプロフィールとして、抗体IgG CB72.3を生産する細胞株のMSデータ、並びにベースライン補正、標準化、及びトリミングで前処理した、特に表２（実施例７）の細胞株の前処理したMSプロフィールを用いる。標準細胞の力価データとして、抗体IgG CB72.3を生産する細胞株の力価データ、特に表２（実施例７）に記載されている力価データを用いる。
【０１４７】
かかる方法によって得られるY予測プロットは、バイオリアクターの評価のために考慮され得る細胞株のセットを示す（図２２）。全ての細胞株の力価を正確に予測するための十分な範囲のデータスペースがモデル中に存在しない可能性を示す、潜在変数プロットの検定データの重大な減少も存在する（図２３）。
【０１４８】
その後、力価データが予測された細胞株を、バイオリアクターにおける力価データを検証するために細胞培養において培養する。バイオリアクター培養を通常の方法で行う。
【０１４９】
様々な細胞株のサンプルを、バイオリアクター培養の15日目に採取した。
【０１５０】
表４は、バイオリアクターにおける培養の第一ラウンドにおいて実際に培養した細胞株の力価データの結果を示す。
【表４】
2013545449.tif 000006
【０１５１】
用語「reps」はMS分析に供される一つの細胞株の調製の反復数を意味する。
【０１５２】
xが0、1、2、又は3であり得る用語「x/3reps＞4mg/mL」は、一つの細胞株の3回の調製のうちx回、PLS-DAに基づく比較評価が4mg/mL以上の力価データを予測することを意味する。
【０１５３】
９．２  バイオリアクターラウンド2
バイオリアクターラウンド2を実施例９．１で明記したのと同じ方法で行った。ただし、標準前処理MSプロフィールとして、バイオリアクターラウンド1の前処理標準MSプロフィール及びバイオリアクターの第一ラウンドで力価を測定した細胞株のMSプロフィールを、その測定した力価データとともに統計学的なプログラムに含めた。
【０１５４】
かかる方法によって得られるY予測プロットは、図２２と比べてバイオリアクター培養のために考慮される異なる細胞株のセットを示す（図２４）。検定データの減少も図２３と比べて、潜在変数プロットにおいてあまり明白ではない（図２５）。しかしながら、データの減少は依然として見られ、該方法は高生産細胞となるだろう多数の細胞株を暗示する。
【０１５５】
表５はバイオリアクターの第二ラウンドにおいて実際に培養した細胞株の力価の結果を示す。
【表５】
2013545449.tif 000007
【０１５６】
９．３  バイオリアクターラウンド3
バイオリアクターラウンド3を実施例９．１で明記したのと同じ方法で行った。ただし、標準前処理MSプロフィールとして、バイオリアクターラウンド1の前処理標準MSプロフィール及びバイオリアクターの第一及び第二の実行において力価データを測定した細胞株のMSプロフィールを、その測定した力価データとともに統計学的なプログラムに含めた。
【０１５７】
かかる方法によって得られるY予測プロットは、より少ない細胞株が高生産細胞となるだろうことを予測する（図２６）。潜在変数プロットにおいて見られる検定データの減少は（図２７）、図２５と比べて優位に減少している。予測の正確性は、先の2回のラウンドよりもより信頼性があるように見え、これは該方法が先のものよりデータスペースにより適合することを意味する。
【０１５８】
表６はバイオリアクターの第三ラウンドにおいて実際に培養した細胞株の力価の結果を示す。
【表６】
2013545449.tif 000008
【０１５９】
９．４  バイオリアクターラウンド4
バイオリアクターラウンド4を実施例９．１で明記したのと同じ方法で行った。ただし、標準前処理MSプロフィールとして、バイオリアクターラウンド1の前処理標準MSプロフィール及びバイオリアクターの第一、第二、及び第三の実行において力価データを測定した細胞株のMSプロフィールを、その測定した力価データとともに統計学的なプログラムに含めた。
【０１６０】
かかる方法によって得られるY予測プロットは、図２６と比べてより少ない細胞株が高生産細胞となるだろうことを予測する（図２８）。潜在変数プロットにおける検定データの減少は（図２９）、先に観察されたもの（例えば図２７）よりさらに少ない。
【０１６１】
表７は、バイオリアクターの第四ラウンドにおいて実際に培養した細胞株の力価の結果を示す。
【表７】
2013545449.tif 000009
【０１６２】
９．５  バイオリアクターラウンド5
バイオリアクターラウンド5を実施例９．１で明記したのと同じ方法で行った。ただし、標準前処理MSプロフィールとして、バイオリアクターラウンド1の前処理標準MSプロフィール及びバイオリアクターの第一、第二、第三、及び第四の実行において力価データを測定した細胞株のMSプロフィールを、その測定した力価データとともに統計学的なプログラムに含めた。
【０１６３】
かかる方法によって得られるY予測プロットは、ほんのわずかな細胞株のみが高生産細胞となると予測されることを示す（図３０）。潜在変数プロットにおける検定データの減少は（図３１）、図２９のものから大きな変化を示さなかった。このラウンドにおいて培養した5つの細胞株において、モデルは2つの細胞株を高生産細胞と予測しながら、正確に5つの細胞株を分類した。
【０１６４】
表８はバイオリアクターの第五ラウンドにおいて実際に培養した細胞株の力価の結果を示す。
【表８】
2013545449.tif 000010
【０１６５】
実施例１０
細胞株を実施例９で概略を述べたように調製し、培養した。
【０１６６】
Xが3、4、及び5である用語「バイオリアクターラウンドX」は、実施例９及び１０の両方で同じ培養条件下の、同じバイオリアクターの培養を意味する。
【０１６７】
PLS-DAに基づく比較評価のために、全生存細胞数（IVC）及び細胞比生産性（qP）データの両方を用いて3クラスのPLS-DAモデルを構築した。両方のモデルにおいて、望ましいクラスは中クラスであった。分類の境界は、以下のように定義した：
IVCモデル:
高＞4500×106細胞×h/mL、
4500×106細胞×h/mL＞中＞3250×106細胞×h/mL、及び
低＜3250×106細胞×h/mL。
【０１６８】
qPモデル：
高＞2.35pg×細胞×h、
2.35pg×細胞×h＞中＞1.75pg×細胞×h、及び
低＜1.75pg×細胞×h。
【０１６９】
前記条件及び設定に基づいて、PLS-DAに基づく比較評価を細胞培養性能データ、すなわち全生存細胞数データ（IVC）及び細胞比生産性データ（qP）を予測するために行った。
【０１７０】
さらに、細胞株をバイオリアクターにおいて培養したときの細胞株のIVC及びqPデータを決定した。
【０１７１】
１０．１  全生存細胞数データ（IVC）の予測
バイオリアクターラウンド3〜5の予測のための前処理標準MSプロフィールとして、抗体IgG CB72.3を生産する細胞株のMSデータ、並びにベースライン補正、標準化、及びトリミングによって前処理した、特に表２（実施例７）の細胞株の前処理したMSプロフィール、並びにバイオリアクターラウンド1及び2で培養した細胞株の前処理MSプロフィールを用いる。標準細胞の全生存細胞数データとして、抗体IgG CB72.3を生産する細胞株の、特に表２（実施例７）の細胞株の全生存細胞数データ並びにバイオリアクターラウンド1及び2で培養された細胞株の全生存細胞数データを用いる。
【０１７２】
１０．１．１  バイオリアクターラウンド3
図３２は、本発明による未加工MSデータの前処理及び後のPLS-DAモデリングを用いる、細胞株ラウンド3の予測のためのIVC Y予測プロットを示す。
【０１７３】
表９は、バイオリアクターの第三ラウンドにおいて実際に培養した細胞株の観察されたIVC値を示す。
【表９】
2013545449.tif 000011
【０１７４】
xが0、1、2又は3であり得る用語「4500＞x/3 reps＞3250」は、一つの細胞株の三回の調製のうちx回、PLS-DAに基づく比較評価が4500〜3250のIVCデータを予測することを意味する。
【０１７５】
１０．１．２  バイオリアクターラウンド4
図３３は、本発明による未加工MSデータの前処理及び後のPLS-DAモデリングを用いる、細胞株ラウンド4の予測のためのIVC Y予測プロットを示す。
【０１７６】
表１０は、バイオリアクターの第四ラウンドにおいて実際に培養した細胞株の観察されたIVC値を示す。
【表１０】
2013545449.tif 000012
【０１７７】
１０．１．３  バイオリアクターラウンド5
図３４は、本発明による未加工MSデータの前処理及び後のPLS-DAモデリングを用いる、細胞株ラウンド5の予測のためのIVC Y予測プロットを示す。
【０１７８】
表１１は、バイオリアクターの第五ラウンドにおいて実際に培養した細胞株の観察されたIVC値を示す。
【表１１】
2013545449.tif 000013
【０１７９】
１０．２  細胞の比生産性データ（qP）の予測
バイオリアクターラウンド3〜5の予測のための前処理標準MSプロフィールとして、抗体IgG CB72.3を生産する細胞株のMSデータ、並びにベースライン補正、標準化、及びトリミングによって前処理した、特に表２（実施例７）の細胞株の前処理したMSプロフィール、並びにバイオリアクターラウンド1及び2で培養された細胞株の前処理MSプロフィールを用いる。標準細胞の細胞比生産性データとして、抗体IgG CB72.3を生産する細胞株の、特に表２（実施例７）の細胞株の細胞比生産性データ並びにバイオリアクターラウンド1及び2で培養された細胞株の細胞比生産性データを用いる。
【０１８０】
１０．２．１  バイオリアクターラウンド3
図３５は、本発明による未加工MSデータの前処理及び後のPLS-DAモデリングを用いる、細胞株ラウンド3の予測のためのqP Y予測プロットを示す。
【０１８１】
表１２は、バイオリアクターの第三ラウンドにおいて実際に培養した細胞株の観察されたqP値を示す。
【表１２】
2013545449.tif 000014
【０１８２】
xが0、1、2又は3であり得る用語「2.35＞x/3 reps＞1.75」は、一つの細胞株の三回の調製のうちx回、PLS-DAに基づく比較評価が2.35〜1.75のqPデータを予測することを意味する。
【０１８３】
１０．２．２  バイオリアクターラウンド4
図３６は、本発明による未加工MSデータの前処理及び後のPLS-DAモデリングを用いる、細胞株ラウンド4の予測のためのqP Y予測プロットを示す。
【０１８４】
表１３は、バイオリアクターの第四ラウンドにおいて実際に培養した細胞株の観察されたqP値を示す。
【表１３】
2013545449.tif 000015
【０１８５】
１０．２．３  バイオリアクターラウンド5
図３７は、本発明による未加工MSデータの前処理及び後のPLS-DAモデリングを用いる、細胞株ラウンド5の予測のためのqP Y予測プロットを示す。
【０１８６】
表１４は、バイオリアクターの第五ラウンドにおいて実際に培養した細胞株の観察されたqP値を示す。
【表１４】
2013545449.tif 000016
【０１８７】
１０．３  要約
図３２〜３７及び表９〜１４は、96ディープウェルプレートで培養される細胞株のIVC及びqPバイオリアクター性能データを、本発明による方法によって正確に予測し得ることを示す。
【図１ａ】
2013545449.tif 000017
【図１ｂ】
2013545449.tif 000018
【図２ａ】
2013545449.tif 000019
【図２ｂ】
2013545449.tif 000020
【図３ａ】
2013545449.tif 000021
【図３ｂ】
2013545449.tif 000022
【図４ａ】
2013545449.tif 000023
【図４ｂ】
2013545449.tif 000024
【図５ａ】
2013545449.tif 000025
【図５ｂ】
2013545449.tif 000026
【図６ａ】
2013545449.tif 000027
【図６ｂ】
2013545449.tif 000028
【図７ａ】
2013545449.tif 000029
【図７ｂ】
2013545449.tif 000030
【図８ａ】
2013545449.tif 000031
【図８ｂ】
2013545449.tif 000032
【図９ａ】
2013545449.tif 000033
【図９ｂ】
2013545449.tif 000034
【図１０】
2013545449.tif 000035
【図１１】
2013545449.tif 000036
【図１２】
2013545449.tif 000037
【図１３】
2013545449.tif 000038
【図１４】
2013545449.tif 000039
【図１５ａ】
2013545449.tif 000040
【図１５ｂ】
2013545449.tif 000041
【図１５ｃ】
2013545449.tif 000042
【図１５ｄ】
2013545449.tif 000043
【図１６ａ】
2013545449.tif 000044
【図１６ｂ】
2013545449.tif 000045
【図１７】
2013545449.tif 000046
【図１８】
2013545449.tif 000047
【図１９ａ】
2013545449.tif 000048
【図１９ｂ】
2013545449.tif 000049
【図２０】
2013545449.tif 000050
【図２１ａ】
2013545449.tif 000051
【図２１ｂ】
2013545449.tif 000052
【図２２】
2013545449.tif 000053
【図２３】
2013545449.tif 000054
【図２４】
2013545449.tif 000055
【図２５】
2013545449.tif 000056
【図２６】
2013545449.tif 000057
【図２７】
2013545449.tif 000058
【図２８】
2013545449.tif 000059
【図２９】
2013545449.tif 000060
【図３０】
2013545449.tif 000061
【図３１】
2013545449.tif 000062
【図３２】
2013545449.tif 000063
【図３３】
2013545449.tif 000064
【図３４】
2013545449.tif 000065
【図３５】
2013545449.tif 000066
【図３６】
2013545449.tif 000067
【図３７】
2013545449.tif 000068
【図３８】
2013545449.tif 000069
【図３９】
2013545449.tif 000070
【図４０】
2013545449.tif 000071
【図４１】
2013545449.tif 000072
【図４２】
2013545449.tif 000073
【図４３】
2013545449.tif 000074
【図４４】
2013545449.tif 000075
【図４５】
2013545449.tif 000076
【図４６】
2013545449.tif 000077
【図４７】
2013545449.tif 000078
【図４８】
2013545449.tif 000079
【図４９】
2013545449.tif 000080
【手続補正書】
【提出日】平成24年2月22日(2012.2.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つのサンプル細胞の細胞培養性能データの予測のためのプロセスであって、以下のステップ：
（a）少なくとも一つのサンプル細胞のサンプル、標準細胞の細胞培養性能データ、及び標準細胞の未加工標準MS（質量分析）データの準備、
（b）前記少なくとも一つのサンプル細胞のサンプルのMS分析への供試による、その未加工サンプルMSデータの取得、
（c）前記未加工標準及び未加工サンプルMSデータの、少なくとも一つの第一のMSシグナル処理法への供試による前処理標準及びサンプルMSプロフィールの取得、並びに
（d）ステップ（a）の標準細胞の細胞培養性能データ、及びステップ（c）で得られた前処理標準及びサンプルMSプロフィールの、PLS-DA（部分最小二乗判別分析）に基づく比較評価を含む第二のMSシグナル処理法への供試による、前記少なくとも一つのサンプル細胞の細胞培養性能データの予測、
を含み、前記細胞培養性能データが細胞比生産性、全生存細胞数、又は細胞産物濃度データである、上記プロセス。
【請求項２】
細胞が、ヒト細胞株、動物細胞株、植物細胞株、真菌の細胞、細菌の細胞、酵母の細胞、及び幹細胞からなる群より選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
細胞が、CHO細胞株又はCHO-K1細胞株である、請求項１〜２のいずれか1項に記載のプロセス。
【請求項４】
ステップ（b）のMS分析がMALDI-TOFである、請求項１〜３のいずれか1項に記載のプロセス。
【請求項５】
ステップ（b）に供されるサンプル細胞のサンプルが、0.015×106〜0.0625×106の細胞を含む、請求項１〜４のいずれか1項に記載のプロセス。
【請求項６】
ステップ（b）で得られる未加工サンプルMSデータ、及びステップ（a）において準備される未加工標準MSデータが、ベースライン補正、標準化、アライメント、フィルタリング、及びトリミングからなる群より選択される操作によりシグナル処理される、請求項１〜５のいずれか1項に記載のプロセス。
【請求項７】
ステップ（c）で得られる前処理標準及びサンプルMSプロフィールが光学的に分析される、請求項１〜６のいずれか1項に記載のプロセス。
【請求項８】
ステップ（d）において評価され予測された細胞培養性能データを有するサンプル細胞が細胞培養において培養され、それによりその細胞培養性能データを検証する、請求項１〜７のいずれか1項に記載のプロセス。
【請求項９】
ステップ（b）で得られた未加工サンプルMSプロフィール、及び検証されたサンプル細胞の細胞培養性能データが、ステップ（a）において標準細胞の標準MSデータ及び細胞培養性能データとして用いられる、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか1項に記載のプロセスが行われ、所望の細胞が単離される、所望の細胞培養性能データを有する細胞の単離のためのプロセス。
【請求項１１】
少なくとも10g/L/hのタンパク質生産性によって特徴づけられる、請求項１０に記載のプロセスによって単離される細胞。
【請求項１２】
少なくとも一つのサンプル細胞のサンプルが供給されたときに、細胞培養性能データの予測を提供するのに適した装置であって、以下の技術的特徴：
（a）少なくとも一つのサンプル細胞のサンプルの、MS（質量分析）分析への供試による、その未加工サンプルMSデータの取得に適した手段、
（b）未加工標準及び未加工サンプルMSデータの、少なくとも一つの第一のMSシグナル処理法への供試による、前処理標準及びサンプルMSプロフィールの取得に適した手段、並びに
（c）標準細胞の細胞培養性能データ、並びに前記前処理サンプル及び標準MSプロフィールの、PLS-DA（部分最小二乗判別分析）に基づく比較評価を含む第二のMSシグナル処理法への供試による、サンプル細胞の細胞培養性能データの予測に適した手段、
を含み、前記細胞培養性能データが細胞比生産性、全生存細胞数、又は細胞産物濃度データである、上記装置。
【国際調査報告】
2013545449.tif 000081
2013545449.tif 000082
2013545449.tif 000083
2013545449.tif 000084
2013545449.tif 000085
2013545449.tif 000086