(57)【要約】  本発明は、新規なポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体、その合成法、組成物、および使用に関する。本発明は特に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のようなレトロウイルスにより顕著に引き起こされる状態である、ウイルス感染症の治療に有用なポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2013544241.tif 000006
（式中、ｎは１および２から選択される整数を表す）
で表されるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体、いずれかの薬学的に許容されるその誘導体、いずれかの薬学的に許容されるその塩、またはプロドラッグを含んでなる混合物であって、前記混合物の分子量が１モルあたり１０００グラム以下であることを特徴とする、混合物。
【請求項２】
式（ＩＩ）：
【化２】
2013544241.tif 000007
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、それぞれ独立して、ＨおよびＯＨから選択され、ｍは０および１から選択される整数を表す）
で表されるポリマーを含んでなる、請求項１に記載の混合物。
【請求項３】
以下の工程：
ａ）ＮａＯＨペレット、再結晶ハイドロキノン、および１，４ベンゾキノンを、ナノピュアトリプル蒸留水またはアルコールに、ＮａＯＨ、ハイドロキノン、ベンゾキノンのモル比３；１；１で、暗所にて撹拌しながらゆっくりと連続的に加えること；
ｂ）工程ａ）で得た混合物を、室温で暗所にて、または近紫外線照射下に、撹拌を続けながら約２４時間置くこと；
ｃ）溶液のｐＨを約１．５に調整し、紫外線照射下で行っていた場合には紫外線照射を止め、該溶液を少なくとも４時間、室温にて静置すること；
ｄ）工程ｃ）で形成されたポリマーの大きな分子量画分を含む固体を、典型的には濾過および氷冷した水で洗浄することによって回収し、ポリマーの小さな分子量画分を含む濾過物を回収および乾燥すること
を含んでなる、ポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の合成方法。
【請求項４】
工程ａ）において、１％以下の化学量論量のフェノールを反応物に加える、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
以下の工程：
ｅ）請求項３に記載の方法の工程ｄ）で得られた産物を、エタノールのような溶媒中に溶解すること；
ｆ）当該混合物から無機塩を濾過除去すること；
ｇ）溶出産物から溶媒を蒸発させること
を含んでなる、ポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の合成方法。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体混合物およびいずれかの薬学的に許容されるその塩またはプロドラッグ。
【請求項７】
薬剤として使用するための、請求項１または２または６に記載のポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物。
【請求項８】
請求項１または２または６に記載のポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物の少なくとも一つ、および少なくとも一つの薬学的に許容される担体を含んでなる、医薬製剤。
【請求項９】
該製剤が経口用製剤である、請求項８に記載の医薬製剤。
【請求項１０】
該製剤が外用製剤である、請求項８に記載の医薬製剤。
【請求項１１】
該製剤がクリーム、フォーム、またはゲルの形態である、請求項１０に記載の医薬製剤。
【請求項１２】
ウイルス感染により引き起こされる疾病または疾患を、予防および／または治療もしくは抑制するための、請求項１または２または５に記載のポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物または請求項８〜１１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１３】
該疾病または疾患が、レトロウイルス感染により引き起こされる、請求項１２に記載のポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物または製剤。
【請求項１４】
該レトロウイルスがＨＩＶ−１である、請求項１３に記載のポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物または製剤。
【請求項１５】
該ポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体が経口的に投与される、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物。
【請求項１６】
該ポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体が局所的に投与される、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物。
【請求項１７】
細菌感染により引き起こされる疾病または疾患を、予防および／または治療もしくは抑制するための、請求項１または２または５に記載のポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物または請求項８〜１１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１８】
有効量の請求項１または２または５に記載のポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物または請求項８〜１１のいずれか一項に記載の製剤がコートされてなることを特徴とする、物品。
【請求項１９】
請求項１または２または５に記載のポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物または請求項８〜１１のいずれか一項に記載の製剤を含んでなる、多機能性抗菌組成物。
【請求項２０】
請求項１または２または５に記載のポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物または請求項８〜１１のいずれか一項に記載の製剤を含んでなる、染色用組成物。
【請求項２１】
血液製剤のウイルス感染性を除去する方法であって、前記血液製剤と有効量の請求項１または２または５に記載のポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体または請求項８〜１１のいずれか一項に記載の製剤とを接触させることを特徴とする、方法。
【請求項２２】
細菌感染により引き起こされる疾病を予防する方法であって、有効量の請求項１または２または５に記載のポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物または請求項８〜１１のいずれか一項に記載の製剤を、医療において用いられる材料の表面に塗布することを特徴とする、方法。
【請求項２３】
ウイルス感染により引き起こされる疾病または疾患を予防および／または治療もしくは抑制する方法であって、被験体に、その必要に応じて治療上有効な量の請求項１または２または５に記載のポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物または請求項８〜１１のいずれか一項に記載の製剤を投与することを特徴とする、方法。
【請求項２４】
レトロウイルスに感染したホストにおいて逆転写酵素を阻害する方法であって、ホストに、その必要に応じて治療上有効な量の請求項１または２または５に記載のポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物または請求項８〜１１のいずれか一項に記載の製剤を投与することを特徴とする、方法。
【請求項２５】
細菌感染により引き起こされる疾病または疾患を予防および／または治療もしくは抑制する方法であって、被験体に、その必要に応じて治療上有効な量の請求項１または２または５に記載のポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物または請求項８〜１１のいずれか一項に記載の製剤を投与することを特徴とする、方法。
【請求項２６】
組織サンプルを染色する方法であって、顕微鏡または蛍光光度法による観察前に、前記組織サンプルと請求項１または２または５に記載のポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物または請求項８〜１１のいずれか一項に記載の製剤とを接触させる工程を含むことを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体およびその合成法に関する。特に本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のようなレトロウイルスにより顕著に引き起こされる状態である、レトロウイルス感染症の治療に有用なポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体に関する。特に本発明は、多機能性抗菌剤、特に抗菌性色素または染料として有用なポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ４＋Ｔ細胞の減少を伴う高濃度のウイルス負荷は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）−１感染症から高頻度のウイルス複製と標的細胞への継続的な感染によって持続する後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）への進行と相関する。現在ＨＩＶの治療は、生活の質を維持し、かつ薬物による毒性を最少化しながら、平均余命を最長化することを目的とする、高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）によって達成されている。しかしながら、現在利用可能な薬剤による治癒は不可能であることから、ＨＡＡＲＴによる生涯にわたる治療では、ウイルス量を５０コピー／ｍｌ未満へ抑制することの維持が必要となる（Ｌｕｃａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，５５，４１３−６）。さらに、治療法に供されるＨＩＶ／ＡＩＤＳ患者に見られる薬剤耐性の増大と、新たにもたらされたＨＩＶ−１感染症が、新規な抗レトロウイルス剤および既存の治療法のさらなる強化の必要性を浮き彫りにしている。
【０００３】
レトロウイルス感染を抑制するための合理的な薬物設計では、ウイルス複製サイクルの異なる段階が標的とされてきた（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ，６，１４８−５４）。これらの段階にはウイルス侵入、脱殻および／またはそれらの細胞内受容体へのウイルスの吸着、ウイルスＲＮＡゲノムからプロウイルスＤＮＡへの転写（逆転写）、ウイルス性ｍＲＮＡの転写および翻訳のトランス活性化、集合過程およびウイルス放出が含まれるが（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５、上記）、今日までには、逆転写酵素（ＲＴ）阻害剤が最も有効な薬剤であることが証明されてきた（Ｗａｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｔｈｅｒ．，１０，１３−２８）。しかしながら、逆転写酵素阻害剤によって治療された患者への薬剤耐性の出現は抗ウイルス療法における主要な制限となっている（Ｓａｌａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｏｒｄ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ，６，１０７−１９）．
【０００４】
抗ＨＩＶ−１特性を有する天然産物のうち、藻類およびシアノバクテリア（Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｅｃｏｔｏｘｉｃｏｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓａｆ．，４５，２０８−２７）、蛇毒（Ｓｏａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｔｏｘｉｃｏｎ，４２，８５５−６８）、ならびに腐植質（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２１８，３８９−９５）から幾つかの薬剤が分離されてきた。腐植質は土壌および水に由来する、分子量範囲が数百から数万である多分散ポリマーの不均一な混合物であり、その抗レトロウイルス特性について研究されてきた（Ｌｅｅｎｈｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，３７，１８Ａ−２６Ａ；Ｌａｕｒｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ，１９，１４５−５３）。
【０００５】
腐植質ポリフェノールおよびキノノイドは、複合体結合による相互作用、自己組織化の相互作用、還元／酸化による相互作用、およびフリーラジカル消去による抗酸化性質を示す腐植質物質の画分を表す。（Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，カルガリー大学博士論文，９２〜１１３頁；Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍｉｃ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ，Ｇｈａｂｂｏｕｒ，Ｅ．Ａ．ａｎｄ  Ｄａｖｉｅｓ，Ｇｅｏｆｆｒｅｙ，ｅｄｓ．，Ｈｕｍｉｃ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，ｍｏｄｅｌｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９３〜２０８頁；Ｇａｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｌｅｖｅｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｓ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｆｏｒ  ｆｕｔｕｒｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．，ｅｄｓ．Ｉ．Ｖ．Ｐｅｒｍｉｎｏｖａ，Ｎ．Ｈｅｒｋｏｒｎ，ａｎｄ  Ｐ．Ｂａｖｅｙｅ．Ｕｓｅ  ｏｆ  ｈｕｍｉｃ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  ｔｏ  ｒｅｍｅｄｉａｔｅ  ｐｏｌｌｕｔｅｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ：Ｆｒｏｍ  ｔｈｅｏｒｙ  ｔｏ  ｐｒａｃｔｉｃｅ．ＮＡＴＯ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔの第６章）。
【０００６】
紅藻類であるイワノカワ属の種の、２つのセスキテルペンハイドロキノンであるペイソノールＡおよびペイソノールＢが、ＲＴの非競合的な阻害物質として作用することから、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２  ＲＴの強力な阻害物質であること、およびＨＩＶ−１複製の抑制因子であることが示されてきた（Ｌｏｙａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３１６，７８９−９６）。
【０００７】
高いｐＨでのハイドロキノンの酸化によって合成される、毒性および変異原性の低い安定した合成ポリマーであるＨＳ−１５００が、推定的にはＨＳ−１５００とＨＩＶ−１  ｇｐ１２０エンベロープタンパク質のＶ３ループとの疎水性／イオン性相互作用を通し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにてＨＩＶ−１を抑制することが見出された（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、上記）。ハイドロキノンは、骨髄における微少核が報告されているものの、細胞傷害性および発癌性は限られている。さらに、ハイドロキノンについての疫学調査によって、ハイドロキノン製造に従事する個人の間では低い死亡率と癌発生率の減少が示された。
【０００８】
突然変異により抵抗性を示すウイルスの高い能力、およびウイルスの薬物抵抗性株の出現のために、特にＲＴ活性を阻害する新たな抗ＨＩＶ剤の発見および開発が決定的に必要とされている。
【０００９】
スーパーバグ蔓延に対する関心の高まりにより、医療関係者はますます新たな抗菌剤を探索している。繊維材料および布地は、微生物の増殖に必要である大きな表面積と吸湿を提供することにより、微生物による攻撃を受けやすいことが知られている。従って、公共の場および病院での疾病による相互汚染に対する関心の高まりから、近年、繊維またはその他の材料に着色もしくは染色可能な抗菌剤が著しく注目されてきた（Ｓｕｎ，２００５，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄｕｃ．，８２，６０−６４）。病院内での疾病の伝染率および感染を減少させるため、医療従事者および患者が用いる繊維に使用され取りこまれる色素特性を有する新規な抗菌剤および／または医療現場で用いられる表面に塗布する顔料を見出すことへの関心が高まっている。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、初代細胞および不死化細胞による培養ならびに確立されたｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて抗ＨＩＶ−１および抗ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）の両方の特性を示す、新規な自己組織化ポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体およびそれらの混合物が見出されたことに関連する。これらの抗ウイルス特性は、低いＩＣ５０値において観察され、ウイルス性逆転写酵素濃度の低下によって特徴付けられるが、ＨＩＶにより誘導される合胞体の形成もまた抑制する。ポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物は、ＲＴ活性の阻害を通したＨＩＶ−１およびＦＩＶの複製ならびに感染性の抑制活性を示す一方、最少の細胞傷害性を示す。本発明は、本発明による新規な自己組織化ポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体が抗菌特性を示すとの知見に関連する。
【００１１】
本発明はさらに、ポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体を、特に単一の自己触媒的フリーラジカル反応によって合成する新規な方法を見出したことに関連する。本発明はさらに、本発明による少なくとも１のポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体を含む医薬組成物、ならびにその使用および使用方法に関する。特に、本発明による方法、使用、製剤、および組成物は、レトロウイルスにより引き起こされる状態もしくは疾患の予防および治療に有用である。加えて、本発明による方法、使用、製剤、および組成物は、細菌感染の予防および治療に有用である。
【００１２】
本発明の第１の態様は、式（Ｉ）によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物を提供する。
【００１３】
本発明の第２の態様は、薬剤として使用するための、本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物を提供する。
【００１４】
本発明の第３の態様は、本発明による少なくとも１のポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物および少なくとも１の薬学的に許容される担体を含む医薬製剤を提供する。
【００１５】
本発明の第４の態様は、薬剤として使用するための、本発明による製剤を提供する。
【００１６】
本発明の第５の態様は、ポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体またはその混合物の調製方法を提供する。
【００１７】
本発明の第６の態様は、本発明の方法によって得ることができるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体またはその混合物を提供する。
【００１８】
本発明の第７の態様は、ウイルス感染により引き起こされる疾病または疾患、特にレトロウイルスにより引き起こされる状態または疾患の、予防および／または治療もしくは抑制のための、本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物またはその製剤を提供する。
【００１９】
本発明の第８の態様は、細菌感染により引き起こされる疾病または疾患の、予防および／または治療もしくは抑制のための、本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物またはその製剤を提供する。
【００２０】
本発明の第９の態様は、ウイルス状態により引き起こされる疾病もしくは疾患、またはレトロウイルスにより引き起こされる疾患を、予防および／または治療もしくは抑制する医薬組成物の調製のための、本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物の使用またはその製剤を提供する。
【００２１】
本発明の第１０の態様は、細菌感染により引き起こされる疾病または疾患を予防および／または治療もしくは抑制する医薬組成物の調製のための、本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物の使用またはその製剤を提供する。
【００２２】
本発明の第１１の態様は、ウイルス状態により引き起こされる疾病もしくは疾患、またはレトロウイルスにより引き起こされる疾患を予防および／または治療もしくは抑制する方法を提供し、前記方法は、被験体に、その必要に応じて治療上有効な量の本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物またはその製剤を投与することを特徴とする。
【００２３】
本発明の第１２の態様は、ホストに、その必要に応じて治療上有効な量の本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物またはその製剤を投与することを特徴とする、レトロウイルス、特にＨＩＶ−１に感染したホストにおいて逆転写酵素を阻害する方法を提供する。
【００２４】
本発明の第１３の態様は、血液製剤のウイルス感染性を除去する方法を提供し、この方法は、前記血液製剤と有効量の本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物またはその製剤とを接触させることを特徴とする。
【００２５】
本発明の第１４の態様は、有効量の本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物またはその製剤がコートされた物品を提供する。
【００２６】
本発明の第１５の態様は、細菌感染により引き起こされる疾病または疾患を予防および／または治療もしくは抑制する方法を提供し、前記方法は、被験体に、その必要に応じて治療上有効な量の本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物またはその製剤を投与することを特徴とする。
【００２７】
本発明の第１６の態様は、有効量の本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物を外科手術または集中治療のような医療において用いられる材料（例えば医療用繊維、医療現場における医療用塗装、管類など）の表面に塗布することを特徴とする、細菌感染により引き起こされる疾病を予防する方法を提供する。
【００２８】
本発明の第１７の態様は、多機能性抗菌剤としての、または多機能性抗菌組成物の調製のための、本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物の使用を提供する。
【００２９】
本発明の第１８の態様は、染色剤としての、本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物の使用を提供する。
【００３０】
本発明の第１９の態様は、本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物を含む染色用組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１ＡＢ】本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマーの性質決定および細胞傷害性を示した図である。Ａ：実施例１の記載によって得た「ポリマー１」混合物の全ての画分について、１４９ｐｐｍ（１）および１１７ｐｐｍ（２）の近傍に集中する比較的狭い２つのバンドを示す、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル；Ｂ：実施例１に記載するように、処理後６および２４時間目にトリパンブルー色素排除によって測定した、濃度を漸増させた本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマーの、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における細胞傷害性のパーセンテージ；
【図１Ｃ】Ｃ：実施例１に記載するように、処理後２４時間目にトリパンブルー色素排除によって測定した、ポリマーの濃度を漸増させた本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー（ポリマー１）対コントロールポリマー（ポリマー２）、およびコントロールの、ＰＢＭＣにおける細胞傷害性のパーセンテージ。
【図２Ａ】実施例３に記載するように測定した、ウイルス性逆転写酵素濃度の抑制活性および本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマーの活性を示した図である。ＡおよびＣ：様々な濃度の本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー対コントロール（無処理）によって処理した、ＨＩＶ−ＳＦ１６２を感染させたヒトＰＢＭＣにおけるウイルス接種材料の上清中のＲＴ濃度；ＢおよびＤ：様々な濃度の本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー対コントロール（無処理）によって処理した、ＦＩＶ−Ｃｈを感染させたＭＹＡ−１細胞におけるウイルス接種材料の上清中のＲＴ濃度；ＥおよびＦ：様々な濃度のコントロール「ポリマー２」によって処理した、ＨＩＶ−ＳＦ１６２を感染させたヒトＰＢＭＣにおけるウイルス接種材料の上清中（Ｅ）、またはＦＩＶ−Ｃｈを感染させたＭＹＡ−１細胞におけるウイルス接種材料の上清中（Ｆ）のＲＴ濃度。
【図２ＢＣＤ】図２Ａの欄参照。
【図２ＥＦ】図２Ａの欄参照。
【図３】実施例４に記載するように、ＨＩＶ−ＮＬ４−３株を感染させ、続いて様々な用量の「ポリマー１」で処理した細胞において、ｐ２４抗体で標識した蛍光をフローサイトメトリーによって評価したウイルス性ｐ２４のレベル（ＡおよびＢ）、および実施例４に記載するようなｐ２４の免疫反応性による測定（Ｃ）における、本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマーの効果を示した図である。Ａ：ＨＩＶ−ＮＬ４−３株を感染させたＣＥＭ−ＧＦＰ細胞のＦＡＣＳプロット；Ｂ：ＨＩＶ−１を感染させた８Ｅ５細胞のＦＡＣＳプロット。平均蛍光強度（ＭＦＩ）の相違比はアイソタイプ抗体コントロールによって標準化した；Ｃ：２種の異なるＨＩＶ−１株（ＮＬ４−３およびＳＦ−１６２）を感染させたＨｅＬａ−ＣＤ４／ＣＣＲ５細胞における、従来のレトロウイルス用薬剤であるジダノシン（ＤＤＩ）に比較した、様々な用量のポリマー１（Ｐ−１）によるｐ２４の陽性度。
【図４】実施例４に記載するように、ＨｅＬａ−ＣＤ４／ＣＣＲ５発現細胞に対する様々な用量の本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマーの処理効果を示した図である。Ａ：偽型ウイルスによる形質導入に先立ち、細胞を「ポリマー１」または「ポリマー２」（コントロール）で前処理した際の、ＨＩＶ−１−ＳＦ１６２を感染させた細胞の単層細胞に形成された合胞体の数；Ｂ：ＨＩＶ−１−ＳＦ１６２エンベロープタンパク質を発現する偽型ウイルスを形質導入したＨｅＬａ−ＣＤ４／ＣＣＲ５発現細胞を、「ポリマー１」または「ポリマー２」（コントロール）で処理した際のルシフェラーゼ活性。
【図５】実施例５に記載するように、ＦＩＶ−１によって誘導されたｉｎ  ｖｉｖｏにおけるウイルス病原性に対する、本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマーの処理効果を示した図である。Ａ：８週間まで「ポリマー１」によって処置したＦＩＶ感染動物（ＦＩＶ（＋））（ｎ＝４）のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞数を、非感染、無処置の健常動物（ＦＩＶ（−））に比較してフローサイトメトリーにより算出した；Ｂ：「ポリマー１」によって処置したＦＩＶ感染動物における体重増加の比を、ＦＩＶに感染しているが無処置である動物（コントロール）に比較して、数週間にわたる試験によって示した；Ｃ：ＦＩＶ感染動物の血漿ウイルス量およびポリマー処置したそれらのカウンターパート。ＮＤ：不検出。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本明細書で用いられる用語「ポリマー」には、当該技術分野での通常の意味、すなわち共有結合した１以上の反復単位（複数の単量体）を含む分子構造という意味が与えられる。用語「ポリマー」には、異なる数の反復単位を含むポリマーの混合物が含まれる。
【００３３】
本明細書で用いられる「治療」および「治療する」などは一般に、望ましい薬理学的および生理的効果を得ることを意味する。本明細書で用いられる用語「治療」は、哺乳類、特にヒトの疾病に対するいずれの治療も網羅し、かつ疾病を抑制すること、すなわちその進行を抑止すること、または疾病を軽減すること、すなわちウイルス量を低下させ、ウイルス複製を減少させ、かつ疾病の進行を遅延させることのような、疾病および／またはその症状もしくは状態の退行を引き起こすことを含む。特定の実施形態によれば、本発明による治療はレトロウイルス、特にＨＩＶ感染の蔓延を阻止するために有用である。特定の実施形態によれば、本発明による治療は合胞体形成（感染細胞の融合に続いて形成され、細胞から細胞への直接感染に関与する多核巨細胞）の抑制を含む。用語「ヒト免疫不全ウイルス」または「ＨＩＶ」は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）を表するために用いられ得る。
【００３４】
本明細書で用いられる用語「被験体」は、哺乳類、例えばヒト、霊長類、ネコなどのような家畜を含む、本発明が意図する哺乳類を指す。
【００３５】
本明細書で用いられる用語「有効量」は、組織、系統、想定される動物またはヒトにおいて生物学的もしくは薬学的な応答を誘発する、本発明による少なくとも一つのポリフェノール−キノノイドポリマーまたはその医薬製剤の量を指す。一つの実施形態によれば、有効量は治療される疾病または状態の症状を緩和するための「治療上有効な量」である。典型的には、有効量はＨＩＶ逆転写酵素、またはＨＩＶ複製もしくは感染に必要なその他の酵素を阻害するため、ＨＩＶによる感染の治療または予防のため、またはＡＩＤＳおよび／またはそれに起因するかもしくは付随する疾病または状態の発生もしくは進行を治療し、予防し、または遅延させるために用いることができる。
【００３６】
典型的には、有効量はグラム陽性菌およびグラム陰性菌の増殖を抑制するために用いるられる。
【００３７】
用語「細菌感染により引き起こされる疾病」は、間質性肺炎、結核、肺炎、嚢胞性線維症、心内膜炎、髄膜炎、外耳炎、眼、骨、関節、胃腸、泌尿器、および皮膚の疾病ならびに疾患、例えば尿路感染（例えば膀胱炎）のような院内感染を含む。
【００３８】
本発明による治療に対する用語「有効性」は、本発明による使用または方法に応答した疾病の経過の変化に基づいて評価できる。
【００３９】
本発明による用語「多機能性抗菌」は、抗菌機能および幾らかの色素様または染料様の性質、例えば染色、可視および蛍光色素の性質を示す薬剤を指す。
【００４０】
用語「染色」剤または組成物は、感染の可能性がある組織サンプルを、顕微鏡または蛍光光度法によって観察するための染色に有用な薬剤または組成物を指す。
【００４１】
用語「組織サンプル」は、医療従事者または研究者が、蛍光透視法または顕微鏡によって試験する感染した生組織を指す。
【００４２】
用語「薬学的に許容されるプロドラッグ」は、ホスト内で代謝される、例えば有効成分を形成するための酵素作用または一般的な酸もしくは塩基加溶媒分解のいずれかによって加水分解または酸化される化合物を指す。
【００４３】
用語「薬学的に許容される塩」は、本発明によるポリマー誘導体の塩を指す。
【００４４】
本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー
本発明によるポリマーは、式（Ｉ）：
【化１】
2013544241.tif 000002
（式中、ｎは１および２から選択される整数を表す）
で表されるポリフェノール−キノノイドポリマーである。一つの態様によれば、本発明によるポリマーの薬学的に許容される誘導体は、場合により置換されていてもよい式（Ｉ）のポリマー、特に式（ＩＩ）：
【化２】
2013544241.tif 000003
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、それぞれ独立して、ＨおよびＯＨから選択され、ｍは０および１から選択される整数を表す）
で表されるポリマーを含んでなる。一つの実施態様において、ｍが０である場合にＲ１はＨを表す。
【００４５】
本発明による組成物は、式（Ｉ）で表されるポリフェノール−キノノイドポリマーの混合物、いずれかの薬学的に許容されるその誘導体、いずれかの薬学的に許容されるその塩、またはそのプロドラッグを含み、これらは異なるｎ値を表し、前記混合物の分子量は１モルあたり１０００グラム以下である。
【００４６】
本発明による組成物は、式（Ｉ）で表されるポリフェノール−キノノイドポリマーの混合物、いずれかの薬学的に許容されるその塩、またはそのプロドラッグを含み、これらは異なるｎ値を表し、前記混合物の分子量は１モルあたり１０００グラム以下である。
【００４７】
本発明の一つの態様によれば、本発明によるポリマー組成物において、前記混合物の分子量は１モルあたり１０００グラム以下であるが、２６６ｇ／ｍｏｌを超える。
【００４８】
本発明の別の態様によれば、本発明によるポリマー組成物において、前記混合物の分子量は１モルあたり２６６ｇ／ｍｏｌ以下である。
【００４９】
本発明の一つの態様によれば、本発明によるポリマー組成物は、本発明による方法から得ることのできるポリマー組成物である。
【００５０】
組成物
本発明は、医学的疾患、特にウイルスおよび／または細菌感染により引き起こされる疾患、特にレトロウイルスによって引き起こされる状態または疾患を患う被験体、好ましくは哺乳類被験体、最も好ましくはヒト患者を治療するための、組成物としての医薬品または治療薬および方法を提供する。
【００５１】
本発明は、ウイルスおよび／または細菌感染により引き起こされる医学的疾患、特にレトロウイルスによって引き起こされる状態または疾患の恐れがある（または感受性のある）被験体、好ましくは哺乳類被験体、最も好ましくはヒト患者を予防的に治療するための、組成物としての医薬品または治療薬および方法を提供する。本発明は特に、ウイルスおよび／または細菌感染により引き起こされる疾病、例えばＨＩＶまたはその他のレトロウイルス感染症の伝染を実質的に減少させるために有用な薬剤、組成物、方法、およびそれらの使用を提供する。感染の恐れがある被験体は、例えば感染に対するいずれかの既知の危険因子、例えばＨＩＶによって同定できる。
【００５２】
本発明は、ウイルスおよび／または細菌感染により引き起こされる医学的疾患の恐れがある（または感受性のある）被験体、好ましくは哺乳類被験体、最も好ましくはヒト患者を予防的に治療するための、組成物としての医薬品または治療薬および方法を提供する。
【００５３】
本発明の医薬組成物は、本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物を、本明細書に記載するいずれかの形で含有できる。
【００５４】
本発明のポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物と、従来用いられる補助剤、担体、希釈剤または賦形剤とは、医薬組成物の形態およびその単位調剤内へ別々に加えられてよく、このような形態は、錠剤または充填したカプセルのような固体、または溶液、懸濁液、エマルション、エリキシル剤、もしくはこれらを充填したカプセルのような液体として、全て経口用であるかまたは非経口用の無菌注射用溶液の形態として用いられてよい。このような医薬組成物およびその単位剤形は、成分を従来の比率で、追加の有効化合物または成分と共に、またはそれらなしで含んでよく、これらの単位剤形は、用いることが意図された一日投与量の範囲内の、いずれかの適した有効量である有効成分を含有してよい。本組成物はまた、徐放組成物の形態であってもよい。
【００５５】
本発明のポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体は、経口投与に適した液体製剤（例えば懸濁液、シロップ、エリキシル剤、口腔洗浄薬または含嗽薬など）として処方されてよく、当該技術分野において公知の技術によって調製でき、水、グリコ―ル、油、アルコールなどのような通常の溶媒のいずれかを用いることができる。本発明のポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体は、経口投与に適した固体製剤（例えば散剤、丸剤、カプセル、および錠剤）として処方されてよく、当該技術分野において公知の技術によって調製でき、デンプン、糖、カオリン、潤滑剤、結合剤、崩壊剤などのような固体賦形剤を用いることができる。本発明のポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体は、当該技術分野において公知の技術によって得られる非経口組成物として処方されてよく、典型的には無菌水が担体として用いられ、任意に溶解補助剤のようなその他の成分が用いられる。注射用溶液の形態である本発明のポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体は当該技術分野において公知の方法によって調製でき、ここで担体は、生理食塩水溶液、グルコース溶液、または生理食塩水およびグルコースの混合物を含有する溶液を含む。
【００５６】
直腸投与のための製剤は、例えばココアバターを含む適切な基剤によって坐薬の形態としてよい。膣投与に適した製剤は、錠剤、膣坐薬用タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、またはスプレー剤の形態としてよい。
【００５７】
本発明のポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体は、クリーム、フォーム、またはゲルの形態のような外用組成物として処方されてよい。
【００５８】
本発明のポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物は、医療に用いられることが明らかである表面、特に織物の表面における、細菌感染を防止するための、蛍光抗菌染料のような多機能性抗菌剤として用いられてよい。本発明のポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物は特に、繊維または塗布基質内に取り込まれてよい。Ｓｕｎ，２００５，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄｕｃ．，８２，６０−６４に記載されるように、化合物は繊維に共有結合させてよく、またはその他の色素に共有結合させるてよい。
【００５９】
本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物は、細胞生存率に影響することなく、その分析のため、組織サンプルの染色に用いてよい。
【００６０】
本発明における使用のための医薬組成物の調製に用いられる適切な方法、および前記組成物における使用に適した成分についてのさらなる記述は、参照によって本明細書に取り込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００５，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓの第５部に提供されている。
【００６１】
投与様式
本発明のポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物およびその組成物は、これらに限定されるものではないが、経口的、非経口的、舌下、局所的、特に局所的に上皮へ、経皮的、直腸性、経粘膜的、経膣的、吸入を通して、頬を通して、もしくは鼻腔内投与、またはそれらの組み合わせを含む、いずれの様式によっても投与されてよい。
【００６２】
特定の実施形態によれば、本発明のポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物およびその組成物は経口投与される。
【００６３】
特定の実施形態によれば、本発明のポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物およびその組成物は局所投与される。
【００６４】
本発明のポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物およびその組成物は、疾病の原因となるウイルスおよび／または細菌への曝露前および／または曝露後の期間に単独で、または有効量の１以上のさらなる治療薬と併用して投与してよい。
【００６５】
特に局所投与される予防薬としての、予防目的での本発明のポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物およびその組成物の投与は、感染に特徴的な症状が現れる前に感染症もしくは疾患を予防するか、または代わりにその進行が遅延するように行うことができる。
【００６６】
本発明の一つの態様によれば、本発明による製剤は、特に組成物の徐放および／または機械的放出の達成において、物品が適切な体の一部かまたは適切な体腔内に配置される際に、子宮内装置、膣ダイアフラム、膣スポンジ、コンドームなどのような物品内に付随させるかまたは組み込まれてよい。
【００６７】
別の態様によれば、グラム陽性菌およびグラム陰性菌に関連する感染症または疾患を予防するための本発明による使用および方法は、医療、特に集中治療および外科手術において用いられる器具および材料（例えば繊維、外科用材料、管類、人工呼吸器など）に、本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物を含む組成物を塗布する工程を含む。典型的には、本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物を含む組成物は、医療、特に集中治療および外科手術において用いられる前記器具および材料の表面に取り込まれるか、または表面にスプレーされる。
【００６８】
併用
本発明の一つの実施形態によれば、本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物およびその医薬製剤は、単独で、または抗ＨＩＶ−１療法において有用な共薬剤（ｃｏ−ａｇｅｎｔ）、または免疫系の修飾因子、またはヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、もしくはＨＩＶプロテアーゼ阻害剤のような、抗感染性または抗ウイルス性化合物と併用して投与することができる。
【００６９】
本発明の別の実施形態によれば、本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物およびその医薬製剤は、単独で、または抗菌性の共薬剤（ｃｏ−ａｇｅｎｔ）、またはグラム陽性菌および／またはグラム陰性菌に関連する感染症もしくは疾患の予防および／または治療に有用な、または免疫抑制された患者の治療に有用な共薬剤と併用して投与することができる。
【００７０】
患者
一つの実施形態によれば、本発明による患者は、ウイルスおよび／または細菌感染により引き起こされる疾病または疾患、特にレトロウイルスによって引き起こされる状態または疾患を患う患者である。
【００７１】
さらなる実施形態によれば、本発明による患者は、ＨＩＶ、典型的にはＨＩＶ−１により引き起こされる疾病または疾患を患う患者である。
【００７２】
別のさらなる実施形態によれば、本発明による患者は、ヌクレオシド剤に抵抗性ではないＨＩＶ変異体により引き起こされる疾病または疾患を患う患者である。
【００７３】
別のさらなる実施形態によれば、本発明による患者は、ヌクレオシド剤に抵抗性のＨＩＶ変異体により引き起こされる疾病または疾患を患う患者である。
【００７４】
別のさらなる実施形態によれば、本発明による患者は、細菌感染により引き起こされる疾病または疾患を患う患者である。
【００７５】
本発明による使用
別の実施形態によれば、本発明は、ウイルスおよび／または細菌感染により引き起こされる疾病または疾患、特にレトロウイルスによって引き起こされる状態または疾患の予防および／または治療のための医薬製剤を調製するための、本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物またはその医薬組成物の使用を提供する。
【００７６】
別の実施形態によれば、本発明は、疾病または疾患を予防および／または治療もしくは抑制する方法を提供し、前記方法は、被験体に、その必要に応じて治療上有効な量の本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物またはその製剤を投与することを含む。
【００７７】
さらなる実施形態によれば、本発明は、本発明による疾病または疾患を予防および／または治療もしくは抑制する方法を提供し、ここで該疾病または疾患は、レトロウイルスにより引き起こされるウイルス状態である。
【００７８】
さらなる実施形態によれば、本発明は、本発明による使用または方法を提供し、ここで本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物またはその製剤は経口的に投与される。
【００７９】
別のさらなる実施形態によれば、本発明は、本発明による使用または方法を提供し、ここで本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物またはその製剤は局所的に投与される。
【００８０】
さらなる実施形態によれば、本発明は本発明による使用または方法を提供し、ここで疾病または疾患はＨＩＶ−１によって引き起こされる。
【００８１】
別のさらなる実施形態によれば、本発明は、Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，５８（１），２７〜３５頁；Ｇａｏ，２００８，Ｔｅｘｔｉｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ，７８（１），６０−７２、およびＷａｉｎｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃ  ＆  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７８（３−４）：１４７−１５５に記載されるように、本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物が色素および顔料としての特性を有することから（茶色および黄色の色合いを有し、かつ自家蛍光を発することから蛍光染料として作用する）、これらの多機能性抗菌剤としての、または多機能性抗菌組成物の調製のための使用を提供する。
【００８２】
別のさらなる実施形態によれば、本発明は、本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物の、細菌染色剤としての、または例えば汚染された細胞および組織サンプルの顕微鏡による画像法において用いられる、細菌染色用組成物の調製のための使用を提供する。
【００８３】
本発明の化合物の合成：
本発明はさらに、ポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体、特に本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物の新規な調製方法を提供する。一つの実施態様によれば、本発明は、以下の工程を含むポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の合成方法を提供する：
ａ）（全ての反応物を添加した後で）、再結晶ハイドロキノン、１，４ベンゾキノン、およびフェノールを、予めｐＨを約１２に調整したナノピュアトリプル蒸留水へ、（ハイドロキノン、ベンゾキノン、フェノールの）モル比２．７３；０．９３；０．１３で、暗所にて撹拌しながらゆっくりと連続的に加えること；
ｂ）工程ａ）で得た混合物を、室温で暗所にて撹拌を続けながら約２４時間置くこと；
ｃ）典型的にはＨＣｌの添加によって、溶液のｐＨを約１．５に調整すること；
ｄ）沈殿物を濾過し、氷冷した水で洗浄した後、工程ｃ）で得た固体を乾燥させること。
【００８４】
工程ｄ）で分離した画分は、分子量の大きなポリマー画分（例えば＞２６６ｇ／モル、かつ＜１０００ｇ／モル）を含む、本発明によるポリマーの混合物である。
【００８５】
本発明はさらに、ポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の新規な調製方法を提供し、この本発明の方法は、上記の濾過による濾過物を回収し、乾燥させ、無水エタノールに溶解し（無機塩を沈殿させるために、濃縮後に溶液を冷却する）、塩を濾過除去した後、残りの固体を乾燥させる、工程ｅ）をさらに含んでなる。工程ｅ）で分離した画分は、分子量の小さなポリマー画分（おおよそ２６６グラム／モル以下）を含む、本発明によるポリマーの混合物である。
【００８６】
あるいは、工程ａ）においてフェノールを除去し、ＮａＯＨを加えてもよいことが見出されており、ここでＮａＯＨ、ハイドロキノン、および１，４ベンゾキノンのモル比は約３：１：１である。この場合、反応は水中、またはプロパノール、メタノール、もしくはエタノール、またはそれらの混合液のようなアルコール溶媒中のいずれかで行うことができる。アルコール溶媒中で行うと反応工程ａ）の反応速度は増大することから、反応工程は約２時間から約１０分間へと有利に短くなる。この場合に、大きな分子量のポリマー画分の形成を促進するため、工程ａ）は暗所または近紫外線を照射して行ってよいことも、また見出された。長時間にわたるＵＶ照射下（例えば＞２４時間）での反応の安定化は、工程ａ）の反応物に少量のフェノール（例えば１％以下）を加え、開環反応を避けることにより、達成され得る。このような方法によって容易かつ迅速な合成が可能となり、特に小さな分子量画分の収率が増大して（典型的には、小さな分子量画分の収率は上記方法に比較しておおよそ５５％増大する）、必要なフェノールの量が減少する。この方法はまた、ｐＨを約１．０に調整して約１０分後に反応を停止させ、固体を濾過除去した後に、本発明のポリマー混合物の大きな分子量画分（例えば典型的には、約２６６ｇ／モルよりも大きく、かつ１’０００ｇ／モルよりも小さい分子量のポリマー）の回収も可能にする。この方法はさらに、得られた濾過物由来の固体を精製することで、本発明のポリマー混合物の小さな分子量画分（例えば約２６６グラム／モルよりも小さい）の非常に簡易化された精製工程も可能にし、これは、Ｐｉｎｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｄａｔａ，５０，２９−３２に記載されるように、無機塩を沈殿させて濾過除去するために濾過物を無水エタノール中に溶解することによって、簡単に行うことができる。塩を一旦濾過除去した後、アルコールを蒸発させ、本発明によるポリマーの混合物を含む、精製された固体を回収する。
【００８７】
別の特定の実施形態によれば、ポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の混合物の合成方法は以下の工程を含む：
ａ）ＮａＯＨペレット、再結晶ハイドロキノン、および１，４ベンゾキノンを、ナノピュアトリプル蒸留水またはアルコール（例えばプロパノール、メタノール、もしくはエタノール、またはそれらの混合液）へ、ＮａＯＨ、ハイドロキノン、ベンゾキノンのモル比３；１；１で、暗所にて撹拌しながらゆっくりと連続的に加えること；
ｂ）工程ａ）で得た混合物を、室温で暗所にて、または近紫外線を照射して、撹拌を続けながら約２４時間置くこと；
ｃ）典型的にはＨＣｌの添加によって溶液のｐＨを約１．０に調整し、紫外線照射下で行った場合には紫外線照射を止め、該溶液を少なくとも４時間、室温にて静置すること；
ｄ）工程ｃ）で形成されたポリマーの大きな分子量画分を含む固体を、典型的には濾過および氷冷した水で洗浄することによって回収し、ポリマーの小さな分子量画分を含む濾過物を回収および乾燥させること。小さな分子量画分は、最初に濾過物を乾燥させ、次に無水エタノール中に溶解し、溶液を冷却した後に沈殿した無機塩を濾過除去することによって精製される。最後にエタノールを蒸発させ、小さな分子量ポリマーを回収する。
【００８８】
さらなる特定の実施形態によれば、特に工程ｂ）がＵＶ照射下および／または非常に長時間（＞２４時間）行われる場合、反応を安定化させるため、工程ａ）での反応物に非常に少ない化学量論量のフェノール（例えば約１％）を加える。反応合成を長時間行うことで、大きな分子量画分（＞３００ｇ／モル、かつ＜１０００ｇ／モル）が比較的大量に得られる。
【００８９】
別の特定の実施形態によれば、工程ｄ）で得た未精製産物は保管されてよく（例えばさらなる精製のためか、または単なる保管のため）、保管は例えば、典型的には濃色または琥珀色の容器内で、好ましくは暗く涼しい場所、最も好ましくは涼しく、乾燥した暗い場所で、保管中に産物を暗所に保持することで行われる。
【００９０】
さらなる態様によれば、本発明はポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の合成方法を提供し、該方法は工程ｄ）で得られる産物を精製する工程、例えば無機塩および副産物を除去することを含む。典型的には、前記精製工程は以下の工程を含む：
ｅ）工程ｄ）で得られる産物を、エタノールのような溶媒中に溶解すること；
ｆ）精製カラムにて混合物を溶出すること；
ｇ）溶出産物から溶媒を蒸発させること；
ｈ）工程ｇ）で得た固体から水を除去すること。
【００９１】
典型的には、工程ｆ）は７０％  ２−プロパノールを移動相として調製したシリカゲルカラムにおいて行ってよい。工程ｇ）における蒸発は、溶媒に送風することによって行ってよい。工程ｈ）における水の除去は、連続した蒸発に続く減圧濾過、それに続く長期乾燥（例えば、典型的には約６０分間の継続する吸引過程によって、固体に空気を通すことにより）によって行ってよい。産物はさらに粉砕し、産物の混合物を乾燥させるため、ドライエライトのような乾燥剤の存在下にデシケータージャー内に配置してよい。特定の実施形態によれば、工程ｈ）で得た精製産物は、さらなる濾過のために保管されてよく、保管は例えば、典型的には濃色または琥珀色の容器内で、保管中に産物を暗く、涼しく、乾燥した環境に保持することで行われる。
【００９２】
さらなる態様によれば、本発明はポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の合成方法を提供し、該方法は工程ｈ）で得られる精製産物を濾過する工程を含む。典型的には、前記濾過工程は以下の工程を含む：
ｉ）工程ｈ）で得た産物をナノピュア水に溶解すること；および
ｆ）分子量を１０００ｇ／モル以下に保つため、再溶解した固体を限外濾過すること。
【００９３】
産物は次に、さらに乾燥させてよく、典型的には濃色または琥珀色の容器内で、保管中に産物を暗く、涼しく、乾燥した環境に保持するような条件で保管してよい。
【００９４】
本発明は、本発明の個別の態様についての単一の説明を意図した、本明細書に記載される特定の実施形態および図面による範囲内に限定されるものではなく、機能的に等価な方法および成分は本発明の範囲内である。本発明を説明する実施例は、本発明の範囲をどのようにも限定しようと意図されたものではない。
【実施例】
【００９５】
全般的な手順および条件
以下の研究は、本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の高い抗ウイルス活性と低い毒性を裏付けるために実施するものである。
【００９６】
次の略語はそれぞれ以下の定義を指す：
ｐｐｍ（百万分率）、ＣＣＲ５（ケモカイン共受容体５）、ＤＤＩ（ジダノシン）、ＥＰＲ（電子常磁性共鳴）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＦＩＶ（ネコ免疫不全ウイルス）、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＭＦＩ（平均蛍光強度）、ＮＭＲ（核磁気共鳴）、ＰＢＳ（リン酸緩衝液硫酸塩）、ＲＴ（逆転写酵素）、ＳＤ（標準偏差）、ＵＶ（紫外線）。
【００９７】
実施例１：本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の合成および性質決定
本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体を、以下に述べるように、本発明による新規な自己触媒的フリーラジカル反応を通して形成する。
【００９８】
試薬の調製、出発物質の秤量、および合成反応は、暗所で室温にて、追加の酸化剤なしで行わなければならない（外気による酸化は十分である）。出発物質は、使用準備が整うまで別々に保存しなければならない。これらの実験パラメータのいずれか一つの偏差が無制御で複雑なフリーラジカル分解、濃縮、開環、および断片化反応を導くこととなる。
【００９９】
最初に、ナノピュア水のｐＨを、ＮａＯＨペレットを攪拌しながら加えることによって、ｐＨ１２に調整する。酸化、還元、もしくは緩衝剤または化合物を、手順のこの時点、またはその他の時点で加えないことが重要である。次に再結晶ハイドロキノン、１，４  ベンゾキノン、およびフェノールを、暗所で攪拌しながらゆっくりとナノピュア水に加える。溶液への添加の順番が大切である。
【０１００】
本ポリフェノール−キノノイドポリマー混合物（「ポリマー１混合物」）調製に用いる反応物の正確なモル比は、ハイドロキノン、ベンゾキノン、フェノールが２．７３：０．９３：０．５３である。異なるモル比は、最終的なポリマー反応産物において異なった成分比をもたらし得ることから、モル比は重要である。
【０１０１】
溶液を暗所で、室温にて撹拌を続けながら２４時間置く。全ての出発物質は反応の最初の数時間内に使い切るが、重合反応は継続し、約２４時間以内に完了する。反応が完了すると、濃ＨＣｌを滴下して加えることによりｐＨを６．５に調整する。次に溶液を蒸発させ、残りの固体を琥珀色の試料瓶内に保管する。
【０１０２】
精製（無機塩および副産物の除去）は、上記のようにして得た産物を１回に３５ｇ用い、１００ｍＬの無水エタノールに溶解して行った。この混合物を、７０％  ２−プロパノールを移動相として調製したシリカゲルカラム（５．０ｃｍ｛Ｄ｝×１００ｃｍに配置した。エタノール混合物をカラム上で一旦溶出させた後、７０％  ２−プロパノールによって産物の混合物をカラムから溶出した。溶媒に送風することによって、溶出混合物から溶媒を蒸発させた。産物の混合物は多量の水を保持していることから、固体産物は、連続した蒸発に続く減圧濾過、それに続く、６０分間の継続する吸引過程によって、固体に空気を通すことによる長期乾燥によって回収した。そのようにして得た産物を粉砕し、産物の混合物を乾燥させるため、ドライエライトの存在下にデシケータージャー内に配置した。次に最終産物を、涼しく／乾燥した／暗所で、琥珀色の瓶内に保管した。
【０１０３】
抗菌試験での使用準備が整ったとき、材料を必用に応じて単にナノピュア水に溶解し、得られた溶液を分子量カットオフ膜によって限外濾過する。分子量が１０００ｇ／ｍｏｌ未満であるポリマーの乾燥を保持し、必要時まで琥珀色の瓶内に保管する。これらは、本研究で「ポリマー１」と称されるポリマーである。ウイルスの複製および細胞傷害性の分析のため、本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマーを培地中に懸濁した。
【０１０４】
最初の３つの反応物のうちいずれか１つのモル比を単に変化させることで、これらのポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の様々な成分の濃度を制御することにより、同様な抗ウイルスおよび抗菌特性を有する異なったポリフェノール−キノノイドポリマー産物を形成できる。異なったポリマー混合物は、異なった化学的、物理的、分光的、および抗菌的特性を有し得る。比較目的で、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６（または欧州特許第０５３７  ４３０  Ｂ１号）に記載されるＨＳ−１５００に類似の構造を有する、合成ハイドロキノンフミン酸塩由来の類似体（「ポリマー２」）をコントロールとして用いた（１モルあたり１５００グラムまで、かつそれを超える分子量を保持し（ＨＳ−１５００）、ｐＨ１０におけるハイドロキノンの強力な化学的酸化後に得られる、カルボキシル官能基と脂肪族結合した芳香族環からなる）。
【０１０５】
化学的性質の決定
産物の性質決定および確認は、以前に記載された同様の化合物に対する標準的な分光技術を用いて行う（Ｐａｔａｉ，１９８９，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｑｕｉｎｏｎｏｉｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），Ａｒｉｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ａｑｕａｔｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，６６（１），８６−９４；  Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００、上記）。同様の化合物におけるこれらの分析技術に対する手順およびプロトコルは当業者に公知であり、文献に詳細に記載されている（Ｐａｔａｉ，１９８９、上記）。炭素−１３核磁気共鳴（１３Ｃ  ＮＭＲ）、マススペクトロメトリー、および元素分析のような標準的技術を用いた。また、ＵＶ−可視分光法、蛍光およびＥＰＲも用いた。
【０１０６】
上で得た、本発明によるポリフェノール−キノノイド化合物（「ポリマー１」）の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、１４９ｐｐｍおよび１１７ｐｐｍの近傍に集中する比較的狭い２つのバンドを示した（図１Ａ）。第１の１４９ｐｐｍ近傍のバンドは酸素に結合した芳香族炭素であると決定され（これらの分子には２タイプの芳香族炭素酸素結合が起こる：１）芳香族炭素中心におけるヒドロキシル（ＯＨ）置換、および２）芳香族環を共に結合させた酸素橋）、一方で第２の１１７ｐｐｍ近傍のバンドは非置換炭素中心における芳香族炭素であると決定された。マススペクトロメトリーでは、５４２および４３４ｇ／ｍｏｌに著しいピークが認められた。これらの所見は、同様の分子について文献に報告されている１３Ｃ−ＮＭＲによる決定およびコンピュータによる化学計算と完全に一致していた（Ｐａｔａｉ，１９８９，上記；Ｒａｌｐｈ，２００４，Ｌ．Ｌ．ａ．Ｒ．Ｊ．，ＵＳ  Ｆｏｒｅｓｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＵＳ  Ｄａｉｒｙ  Ｆｏｒａｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  ａｎｄ  ＵＳＤＡ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，１〜１８頁）。ポリマー混合物の画分（２５０ｇ／モル）の元素分析によると、おおよそ５８％はＣ原子、４％はＨ原子、残りは酸素原子であった。同様な分子ポリマーについて、紫外線−可視光スペクトルにより、電荷移動の特徴的な典型である２００〜４００ｎｍの広範で特徴のない吸光度、ドナー−アクセプター複合体の形成が示された（Ａｒｉｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ａｑｕａｔｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，８６−９４；Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２７，８８９−８９４；Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｅ．Ａ．Ｇｈａｂｂｏｕｒ  ａｎｄ  Ｇ．Ｄａｖｉｅｓ（Ｅｄｓ．），Ｈｕｍｉｃ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，ｍｏｄｅｌｓ，ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，Ｌｏｎｄｏｎ：Ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９３−２０８）。
【０１０７】
ポリマーは粉末の形態で、暗い琥珀色の瓶内で、涼しく乾燥した場所で保管すると、１２か月後でも安定であることが見出された（それらの化学的評価は変化しなかった）。
【０１０８】
上記の性質決定によって確認されたように、上で得た、本発明によるポリフェノール−キノノイド化合物は、一般式（Ｉ）で表される、少数のヒドロキシ置換を有する酸素架橋された芳香族環の混合物から構成され、式中、ｎ＝１−ｘ；分子量画分＜１’０００ｇ／ｍｏｌを分離した場合、ｘ＝２−１０である（ｎ＝１−２に固定される）。
【０１０９】
ポリマー蛍光の測定
星状膠細胞（Ｕ３７３細胞）を既述のとおりに培養し（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７７，６８９９−９１２；Ｂｏｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７０，２６３８−４６）、０．０１ｍＭから１ｍＭの範囲の濃度の、上で得た本発明によるポリフェノール−キノノイド化合物によって処理した。３７℃にて２４時間のインキュベーション後、倒立蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を用い、４００ｎｍの波長にて細胞の蛍光を試験した。実験により、処理した細胞では、無処理の細胞に比較して、細胞質に濃度依存性の蛍光の蓄積が示された。１０００μＭでは、細胞生存率においていずれの有害作用も示さず、明るい蛍光が観察された。
【０１１０】
ポリマーの細胞傷害性
ＨｅＬａ−ＣＤ４／ＣＣＲ５細胞を既述のとおりに（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３４，１７８−１９３）５０，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、上で得た本発明によるポリフェノール−キノノイド化合物を濃度依存性の様式で培養細胞に加えた。化合物への曝露後６ないし２４時間後に、トリパンブルー色素排除によって細胞死を評価した。実験により、１０μＭでのＨｅＬａ−ＣＤ４／ＣＣＲ５における細胞傷害性は最大でおおよそ５％であることが明らかとなったが、その構造がポリマー２に類似する、合成ハイドロキノンフミン酸塩由来の類似体であるＨＳ−１５００による５０％細胞傷害性（ＴＣ５０）は約６００μｇ／ｍｌ（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、上記）であった（図７）。
【０１１１】
ポリマーの投与およびｉｎ  ｖｉｖｏ毒性試験
ポリマーの安全性を決定するため、マウスを「ポリマー１」により用量依存性の様式（経口で１日あたり２、２０、２００ｍｇ／Ｋｇ）で１週間処置した後、動物を安楽死させ、腸、脾臓、肝臓、および心臓の評価を含む細胞傷害の形跡について、組織学的方法によって評価した。ポリマーによって処置した動物由来の肝臓、腸、および脾臓の組織学的分析により、コントロール群からの偏差は示されなかった。「ポリマー１」（２００ｍｇ／ｋｇ）によって経口的に処置したマウス由来の腸、肝臓、および脾臓の切片の組織学的分析によって、動物の１週間の処置に関連する毒性、またはいずれの明らかな病的状態もしくは死亡率についての証拠は示されなかった。
【０１１２】
これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの結果は、既知の抗レトロウイルスヌクレオシド逆転写酵素阻害剤であり、高濃度（１’０００μＭ）でＨｅＬａ−ＣＤ４／ＣＣＲ５の生存率を低下させるジダノシンに比較した、「ポリマー１」の明らかな安全特性を示唆している。
【０１１３】
別の合成法および性質決定
別の合成手順を用いて、同じポリマー混合物が誘導されることを明らかにした。本発明による別の方法に従ってポリマー混合物を合成した。ここではＮａＯＨを再結晶ハイドロキノンに加え、１，４  ベンゾキノンをナノピュア水または化学量論量のアルコールに加えるが、ＮａＯＨ、ハイドロキノン、ベンゾキノンのモル比は３：１：１であった。溶液は、室温で暗所にて撹拌を続けながら２４時間置いた。全ての出発物質は反応の最初の数分内に使い切るが、重合反応は継続し、長時間置くこと、および／またはさらに濃縮した条件下、および／または紫外光付近を用いた場合、大きなポリマー画分がもたらされる。濃ＨＣｌを滴下して加え、ｐＨを１．０に調整することによって反応を停止させる。次に上記のようにポリマーを回収する。抗菌試験での使用準備が整ったとき、材料を必用に応じて単にナノピュア水に溶解する。大きく、より不溶性の画分は、さらに効率よく溶解させるため、生物学的に有意なｐＨ（例えばｐＨ７．４）に調整する必要がある。得られた溶液は使用準備が整っている。あるいは、化合物は、最初に水中でのｐＨを調整することなく経口投与されてもよい。紫外線スペクトル、元素分析、およびマススペクトロメトリーの結果は、上記の予想される分子構造に一致する。例えばマススペクトロメトリーでは、５４２、３９０、および２６６ｇ／ｍｏｌにおいて予想される分子量画分を表すピークが見出された。
【０１１４】
実施例２：インシリコでのモデル化
ＨＩＶ−１  ＲＴ活性部位と相互作用するこれらの化合物の分子モデル化予想を行う。分子モデル化研究によって、本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマーがＨＩＶ−１  ＲＴ酵素の幾つかの決定的な構成要素に結合し得ることが示されている。分子量が４３４ｇ／ｍｏｌである、本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー（ｎ＝２）の代表的構造の、半経験的な幾何学的最適化ＰＭ３レベルの計算は、高電子密度（「ホット」）および低電子密度（「コールド」）の領域によって電子密度表面における静電ポテンシャルマッピングを示すことを可能にする。これらのホットおよびコールド交互領域の電子密度は、自己会合性、自己組織化の分子に典型的であり、相補的な相互作用の発生を可能にする（例えば「ホット」領域は「コールド」領域と共に二量体を形成する）。Ｓｙｂｙｌ力場下での０．５時間の反復後、モデル化の結果は、アミノ酸残基Ｔｙｒ４４１に近いＨＩＶ−１  ＲＴ  ＲＮａｓｅ  Ｈ活性部位における結合相互作用による構造変化を示している。金属イオン補助因子であるＭｇ２＋原子は、Ｔｙｒ４４１の直上に出現する。
【０１１５】
分子モデル化によって、金属イオン補助因子（Ｍｇ２＋）と協調した２つの主要な相互作用および保存された重要な芳香族アミノ酸残基Ｔｙｒ５０１との芳香族π−πスタッキング相互作用を通した、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性部位における強力な結合相互作用が明らかとなった。その他の結合相互作用は、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮａｓｅ  Ｈドメインに重要な、Ｔｒｐ２２９、Ｍｅｔ２３０、Ｇｌｙ２３１、およびＴｙｒ２３２の４分子の近傍に存在することが予想された。さらに、結合相互作用は副溝結合トラック内のＴｒｐ２６６の近傍にもまた起こった。ＲＮａｓｅ  Ｈ活性部位には、触媒的に重要な酸性残基であるＡｓｐ４４３ならびに芳香族残基であるＴｙｒ４５７およびＴｙｒ４４１の近傍にもまた、幾つかのＭｇ２＋との協調による置換がみられる。ＨＩＶ−１  ＲＴ酵素におけるこのような重要な金属イオンの置換および構造変化によって、本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマーが酵素へ、すなわちウイルスへ向かう抑制力を有することが予想される。
【０１１６】
モデル化によって、比較的平坦で非常に柔軟であり（単結合の酸素により架橋された芳香族環）、かつ自己集合構造を形成できる、本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマーの構造がさらに明らかとなる。高度な構造的自由度（活性部位に結合している際であっても）のために、これらはＨＩＶ−１  ＲＴ阻害剤の優れた候補となり、活性部位におけるこれらの構造的自由度の程度（分子「ウィグリング」）は制限されておりかつ活性部位に局在するにもかかわらず、ポリマーが活性部位の変異形におけるわずかな構造変化を調節し、かつそれに適合して結合することが可能となることで、ウイルスの変異による抵抗性の克服に役立ち得る。
【０１１７】
分子量が２６６ｇ／ｍｏｌである、本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー（ｎ＝１）の代表的構造に対するさらなる半経験的な幾何学的最適化ＰＭ３レベルの計算は、比較的高い構造的自由度を有し、かつ非常な低温（１０Ｋ）においても広がる低温蛍光線をもたらし得る、電荷移動様の二量体形成の可能性と完全に一致する、Ａｒｉｅｓｅ，ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ａｑｕａｔｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，８６−９４の記載と同様の結果を導いた。
【０１１８】
実施例３：本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の、逆転写酵素活性における効果
本発明によるポリフェノール−キノノイド混合物の抗ウイルス活性を評価するため、以下のアッセイを行ってＲＴ活性に対するその効果を試験した。
【０１１９】
ウイルス感染を判定するため、健常ヒト（上記のＪｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５に記載）およびネコ由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、最初にＣｏｎ−Ａで刺激し、続いて３日後にレンチウイルスを感染させると共に、以前に記載したように（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３、上記）異なった間隔で回収した組織培養上清中のＩＬ−２を導入した。
【０１２０】
培養上清中の逆転写酵素活性を、以前に記載されたように（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４，７２１１−２０）測定した。簡単に述べると、１０μｌの上清から遠心分離によって細胞片を除去し、［３２Ｐ］ｄＴＴＰを含有する４０μｌの反応カクテルと共に２時間３７℃にてインキュベートした。サンプルをＤＥ８１イオン交換クロマトグラフィー用濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、メードストーン、英国）にブロットし、２×ＳＳＣで５分間３回、および９５％エタノールで５分間２回洗浄した。液体シンチレーション計数で逆転写酵素濃度を測定した。全てのアッセイは三重に行い、最低２回反復した。
【０１２１】
別に、ＨＩＶの野生型、および薬剤抵抗性に関連する、ＨＩＶの薬剤抵抗性変異体（ヌクレオシド剤抵抗性ウイルス（Ｋ６５Ｒ）株ならびに非ヌクレオシド抵抗性株であるＫ１０３ＮおよびＤ３０Ｎ（Ｗｉｎｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：５７−６３）を感染させたＭＴ−２細胞の細胞増殖アッセイにおいて、Ｗａｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＡＡＣ．０１７９５−０９に記載されるように、ＭＴ−２細胞の増殖アッセイにおけるＩＣ５０の測定を通して同様な実験を行った（ＲＴ活性アッセイ）。本発明の混合物の、分子量（ＭＷ）の小さな画分（さらに水溶性の画分）および分子量の大きな画分のＩＣ５０値は以下の表１に示されるとおりであった。
【０１２２】
【表１】
2013544241.tif 000004
【０１２３】
これらの結果は、本発明による混合物が、野生型ウイルスのみならず、非ヌクレオシド剤抵抗性のＨＩＶ変異体に対しても、ＨＩＶ複製を阻害できることを示す。
【０１２４】
ＦＩＶの複製もまた、ＰＢＭＣおよびネコリンパ球細胞株（ＭＹＡ−１）の上清中の逆転写酵素活性によって評価した。
【０１２５】
ＨＩＶ−１を感染させたヒトＰＢＭＣ（図２Ａおよび２Ｃ）およびＦＩＶを感染させたＭＹＡ−１細胞（図２Ｂおよび２Ｄ）におけるＲＴ濃度の分析によって、「ポリマー１」による濃度に依存したＲＴ活性の阻害が明らかとなり、このアッセイで有効ではなかったコントロール「ポリマー２」（図２ＥおよびＦ）に比較すると、ＨＩＶ−１を感染させたＰＢＭＣ（図２Ｃ）では１０日目（図２Ａ）（Ｐ＜０．００１）に最も有効であり、ＦＩＶを感染させたＭＹＡ−１細胞（図２Ｄ）では８日目（図２Ｂ）（Ｐ＜０．０１）に有効であった。２つの異なるＦＩＶ株に対するポリマー１のＩＣ５０値は１２６ｎＭ（ＦＩＶ−Ｐｅｔ）および１５１ｎＭ（ＦＩＶ−Ｃｈ）であったが、コントロール「ポリマー２」のＩＣ５０値は１０９６ｎＭ（ＦＩＶ−Ｐｅｔ）および５０ｎＭ（ＦＩＶ−Ｃｈ）であった。最大の細胞傷害性は１０μＭで達成され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるウイルス複製の阻害に対するポリマー１のＩＣ５０は４０ｎＭ（ＨＩＶ−１に対し）および１０ｎＭ（ＦＩＶに対し）であったが、コントロール「ポリマー２」ではＩＣ５０値は２４５ｎＭ（ＨＩＶ−１に対し）および９ｎＭ（ＦＩＶに対し）であった。
【０１２６】
感染細胞由来の上清における、ポリマーの濃度に依存したＲＴ活性の有意な減少が明らかとなった。１’０００μＭおよび１００μＭの「ポリマー１」で処理した上清中のＨＩＶ−１  ＲＴ活性（図２Ｃ）および１’０００μＭ、１００μＭ、および１０μＭの「ポリマー１」で処理した上清中のＦＩＶ  ＲＴ活性（図２Ｄ）には有意な減少がみられた。
【０１２７】
従って本発明によるポリフェノール−キノノイド化合物は、感染培養中でＨＩＶ−１およびＦＩＶ逆転写酵素（ＲＴａｓｅ）活性の両方を濃度依存性に減少させる（ｐ＜０．０５）。さらにこれらの結果によって、本発明のポリマーの作用はＲＴを直接阻害する機構によるものである可能性が示唆される。
【０１２８】
実施例４：本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の、ＨＩＶ−１  ｐ２４タンパク質発現における効果
ＨＩＶ−１  ｐ２４タンパク質発現における本発明によるポリフェノール−キノノイド化合物による処理の効果を決定するため、様々なアッセイを行った。以下に述べるように、フローサイトメトリーのアプローチを用いて、「ポリマー１」（２０μＭ）で処理したＨＩＶ−１感染ＣＥＭ−ＧＦＰ細胞におけるｐ２４のレベルを調べた。
【０１２９】
ＣＥＭ−ＧＦＰ細胞においては、ウイルス感染の増大によってＨＩＶ−１  ＬＴＲが活性化されるが、これはＧＦＰの発現が高くなることによって示される。「ポリマー１」による処理はＧＦＰ発現の減少をもたらしたが、これはトランスでのＬＴＲ活性化が減少したこと、すなわちポリマーが逆転写酵素を抑制し、続いてｐ２４の発現を抑制したことを示している（図３Ａ）。しかしながら、ＨＩＶ−１を感染させた８Ｅ５細胞（すなわち内在性のＨＩＶ−１タンパク質を産生する細胞）を用いた同様のアプローチでｐ２４のレベルは減少しなかった（図３Ｂ）。ここでのｐ２４のレベルの減少は、組み込み後のＨＩＶ−１の伝播の抑制を示し得ることから、ポリマーはウイルスの転写に先立って効果を発揮することが示唆される。
【０１３０】
これらの所見を確認するため、以下に記載するようにＨｅＬａ−ＣＤ４／ＣＣＲ５におけるｐ２４の免疫反応性を決定した。２つのＨＩＶ−１株（ＮＬ４−３およびＳＦ−１６２）を感染させ、続いて「ポリマー１」により用量依存性に処理したＨｅＬａ−ＣＤ４／ＣＣＲ５細胞において、ｐ２４の免疫陽性度の有意な減少が観察された（図３Ｃ）。ｐ２４レベルの抑制は、従来の抗ウイルス化合物であるジダノシン（ＤＤＩ）に匹敵した。
【０１３１】
ＨｅＬａ−ＣＤ４／ＣＣＲ５細胞における合胞体形成を、以下に記載するように定量した。ＨＩＶ−１による感染前に「ポリマー１」によって処理したＨｅＬａ−ＣＤ４／ＣＣＲ５細胞において、合胞体形成の有意な減少が観察された（図３Ｃ）。これらの試験に加え、以下に述べるように、ＨＩＶ−１偽型ウイルスによる感染前に「ポリマー１」で処理したＨｅＬａ−ＣＤ４／ＣＣＲ５細胞では、同様に濃度に依存性したルシフェラーゼ活性の抑制が明らかとなった。
【０１３２】
従ってこれらの結果により、「ポリマー１」は感染細胞においてＨＩＶ−ＲＴを阻害してｐ２４抗原のレベルを低下させることが示され、これは上で得たＲＴのデータを支持するものである。
【０１３３】
フローサイトメトリー分析
培養ＰＢＬ（１×１０４）を、抗ネコＣＤ４および抗ネコＣＤ８モノクローナル抗体によって標識した。一次抗体による標識後、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ  ＡｂおよびＰＥ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１抗体を加えた。一次抗体を加えていないものを、コントロールとした。ｐ２４の発現における「ポリマー１」の効果を試験するため、ＨＩＶ−１を感染させた８Ｅ５細胞（Ａｃｈｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ａｃｑｕｉｒ．Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃ．Ｓｙｎｄｒ．，２４，２０３−１０）またはＨＩＶ−１  ＬＴＲプロモーターの下にあるＧＦＰを安定的に形質移入したＣＥＭ−ＧＦＰ細胞（Ｇｅｒｖａｉｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，９４，４６５３−８）をフローサイトメトリーアッセイに用いた。
【０１３４】
ＬＡＶを感染させたＡ３．０１細胞のサブクローンであるＣＤ４欠損Ｔ細胞株８Ｅ５は、欠損粒子の合成を導くプロウイルスＤＮＡの、単一の組み込まれたコピーを含有する。これらの細胞はｐ２４タンパク質を産生するが、逆転写酵素は産生しない（ＮＩＨ  ＡＩＤＳデポジトリー）。ＣＤ４欠損Ｔ細胞を培養し、以前に記載されたようにＦＩＶまたはＨＩＶ−１を感染させた（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３、上記；Ｐｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２，９１０９−１５）。続いて８Ｅ５細胞を異なった用量の「ポリマー１」で前処理し、固定後にＢＤ  ｃｙｔｏｆｉｘ／ｃｙｔｏｐｅｒｍキットで透過処理して、ＦＩＴＣ標識ｐ２４抗体ＫＣ５７で免疫染色した。ＣＥＭ−ＧＦＰ細胞（２×１０６）にＨＩＶ−１のＮＬ４−３株を感染させ（４×１０６ｃｐｍ）、直ちに「ポリマー１」で処理した。７日後に細胞を洗浄し、ＧＦＰ蛍光について試験した。分析は、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、マウンテンビュー、カリフォルニア州）フローサイトメーターを用いて、以前に記載されたように行った（Ｐｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、上記）。
【０１３５】
合胞体形成
ＨｅＬａ−ＣＤ４／ＣＣＲ５細胞における合胞体形成を、以前に報告されたように（Ｇａｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０，４２４−３６）、合胞体形成ウイルス（ＮＬ４−３）の感染後に定量した。ＨｅＬａ−ＣＤ４／ＣＣＲ５細胞は、以前に記載されたように培養した（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３、上記；Ｂｏｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３、上記）。おおよそ２×１０５の標的細胞（ＨｅＬａ−ＣＤ４／ＣＣＲ５）にＨＩＶウイルスを感染させると共に「ポリマー１」および「ポリマー２」で処理し、２４時間後に接着細胞をＰＢＳ中の０．５％グルタルアルデヒドで固定した。合胞体形成は、倒立Ｚｅｉｓｓ（オーバーコッヘン、独国）Ａｘｉｏｓｋｏｐ２光学顕微鏡を用いた観察により、×２０の倍率下でスコア化した。
【０１３６】
偽型ウイルスの感染
ｅｎｖ−不活性化ＨＩＶ−１クローン内にホタルルシフェラーゼを発現するプラスミド（ｐＮＬ−Ｌｕｃ−Ｅ−Ｒ−）およびＨＩＶ−１  ＪＲＦＬ  ｅｎｖ配列を含む発現ベクター（ｐＣＭＶ）（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５、上記）を２９３Ｔ細胞に共形質移入し、形質移入後２日目に得られた上清中のＨＩＶ−ＪＲＦＬ−ｅｎｖ偽型ウイルスを回収し、低速遠心分離によって細胞片を除去し、ＨｅＬａ−ＣＤ４／ＣＣＲ５細胞を感染させるために用いた。偽型ウイルスによる標的細胞の感染はルシフェラーゼの発現を誘導するため、これをウイルス添加後２日目の細胞ライセートを用いてルシフェラーゼアッセイキット（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）により定量し、感染性を相対発光量で表した（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３、上記）。
【０１３７】
実施例５：本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の、ＦＩＶ感染ネコに対する効果
ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）は、イエネコに、ウイルスの特性および病原作用の点からＨＩＶ−１−ＡＩＤＳに対して明らかな類似性を有するＡＩＤＳ様症候群を引き起こす。ネコにおけるＦＩＶの血清転換は、典型的には熱性エピソード、リンパ節腫脹、好中球減少、および体重減少により特徴付けられる、一過性の急性期症候群として現れる（ｄｅ  Ｒｏｚｉｅｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８，８９７１−８２）。この初期症状の後に、ＣＤ４＋Ｔリンパ球が次第に減少する長期の無症状期間、および日和見感染への屈服により特徴付けられるＡＩＤＳの末期が続く。それ故このモデルは、特定の抗ＨＩＶ−１剤をｉｎ  ｖｉｖｏで試験するために受け入れられる動物モデルに相当する。従って、本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の抗ＨＩＶ活性を支持するため、以下のように、このようなモデルにおいて「ポリマー１」を試験した。
【０１３８】
組み換えＦＩＶ株であるＦＩＶ−Ｃｈを感染させた３か月齢のネコを、ＣＣＡＣの指針に従い、以前に報告されたように維持した（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ａｉｄｓ，１８，１２４１−５０）。「ポリマー１」による経口処置（胃管により１日２回）をＦＩＶ−Ｃｈに慢性感染した１２週齢のネコ４匹に対して開始し、１００ｍｇ／ｋｇ、１日２回を１週間、続いて２００ｍｇ／ｋｇ、１日２回行った。
【０１３９】
以下に述べるように、ウイルス量の評価のために血漿濃度を連続的に調べると共に、ＰＢＭＣを採取して血中のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞数の分析を行った。このモデルについて以前に報告されたように（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、上記）、ＦＩＶ感染動物では、対応する非感染の健常ネコに比較して平均的なＣＤ４＋Ｔ細胞数が減少していたが、ＣＤ８＋Ｔ細胞数は、ＦＩＶ感染と非感染動物とで同様であった（図４Ａ）。対照的に、「ポリマー１」処置動物におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞数は、１２週以降に増加した（図５Ａ）。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞数の改善は、「ポリマー１」による処置の停止後もなお持続した。「ポリマー１」で処置した動物は全て、処置期間（４週間）および休薬期間（９週間）中に一貫した体重増加を示した（図５Ｂ）。
【０１４０】
感染後１２週間目、「ポリマー１」による処置開始前の平均血漿ウイルス量は、７．０±０．４ｌｏｇ１０  コピー／ｍｌであった。「ポリマー１」処置後２週間目の、ＦＩＶに感染したネコの平均ウイルス量は、５．３±１．３ｌｏｇ１０コピー／ｍｌを示した。「ポリマー１」で処置した動物では、４週間目までにウイルスＲＮＡは検出されなくなった。このウイルス抑制傾向は、いずれの処置も行わなかった次の４週間維持された（図５Ｃ）。６週間目に、幾つかの動物ではウイルスＲＮＡが検出されたが、ウイルス量は休薬期間前の動物に観察された量に至らなかった（図５Ｃ）。
【０１４１】
これらの試験により、ウイルス量は、検出されなくなる処置後４週間まで、時間と共に著しく減少することが明らかとなった。
【０１４２】
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の定量化
フローサイトメトリーによって定量化を行った。
【０１４３】
ＲＮＡの分離および逆転写
疾病の様々な段階においてもなお、血漿ウイルスＲＮＡ量はＨＩＶ−１に感染した個体の転帰を予測する最も強力なものであるが、ウイルスＲＮＡの抑制はどのような治療上のアプローチにおいても必要とされる。従って以下のように、実験期間を通して一定の間隔で血漿ウイルスＲＮＡ量を測定することにより、「ポリマー１」によって処置したかまたはしていないネコにおけるウイルス量の変化を評価した。０、１、２、３、４週間処置した（「ポリマー１」処置）動物および５、６、７週間（休薬期間）の動物の全血から遠心分離によって血漿を分離し、−８０℃に保管した。Ｔｒｉｚｏｌ  ＬＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示に従って用いることで、ウイルスＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡを分光光度分析によって定量し、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の調製に供した。全量５０μｌの反応に、５μｇのＲＮＡを用いた。以前に記載されたように（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、上記）、複数の株からＦＩＶ  ｐｏｌ遺伝子を検出するプライマーを用い、リアルタイム逆転写酵素（ＲＴ−ＰＣＲ）プロトコルによって血漿中のウイルスＲＮＡのコピー数／ｍｌを決定した。
【０１４４】
統計解析
グループ間でのリンパ球数およびウイルス量の比較は、ウェルチの独立ｔ検定を用いて行った。統計解析はインスタットグラフパッド３．０１（サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を用いて行い、０．０５未満のＰ値を有意であるとみなした。
【０１４５】
従ってこれらのデータは、「ポリマー１」で処置したＦＩＶ感染動物では血中のＣＤ４＋Ｔ細胞数の一貫した増加が示されると共に、血漿中のウイルスコピー数が検出できないレベルまで明らかに減少し（ｐ＜０．０５）、この減少はポリマー１による処置の停止後４週間まで維持されたことを示す。上記の分子モデル化研究で予測されたように、本発明によるポリフェノール−キノノイド誘導体を介したｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのウイルス複製の抑制によって、本発明によるポリフェノール−キノノイド誘導体のＨＩＶ−１感染症の治療用としての使用が支持される。
【０１４６】
まとめるとこれらの結果は、本発明によるポリフェノール−キノノイド誘導体が、ＲＴの阻害を通してＨＩＶ−１およびＦＩＶの複製ならびに感染性を抑制する一方で、感染動物のＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球数を改善すると共に血漿中のウイルス量を減少させ、かつ実質的な体重増加を導くことを支持する。さらに、ウイルスＲＴの阻害および複製の阻止を達成するためのＩＣ５０値は、少なくとも４ｌｏｇ用量の規模で低く、これによりポリフェノール−キノノイドポリマーの相対的安全性、およびそれらに対する臨床的評価の可能性が強調される。さらに、これらのポリマーの合成および保管に対するかなりの低価格は、抗ＨＩＶ−１療法におけるこれらの使用のさらなる利点である。
【０１４７】
実施例６：本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体の、細菌に対する効果
実施例１の記載に従って得た本発明によるポリマー混合物の、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の範囲、すなわち大腸菌、枯草菌、緑膿菌、およびプチダ菌に対する抗菌力について試験した。最初に、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）アッセイ（Ｍｏｕｔｏｎ，Ｊ．Ｗ．ａｎｄ  Ｖｉｎｋｓ，Ａ．Ａ．，（２００５）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ４４，Ｎｕｍｂｅｒ  ２，２０１−２１０頁の記載に従った）を、可能性のある抗菌活性を試験するために用いた。ポリマー混合物は、１０ｍｇ／ｍｌから０．１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で試験した。ＭＩＣ値は以下の表２に示されるとおりであった。
【０１４８】
【表２】
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【０１４９】
これらの結果により、本発明によるポリマー混合物は、試験した最も低い濃度においても、全ての微生物に対して抑制性であることが示される。
【０１５０】
本発明によるポリマー混合物の抑制作用が殺菌性であるかまたは静菌性であるかについてさらに調べた。試験微生物として緑膿菌を選択し、実施例１の記載に従って得た本発明によるポリマー混合物を２．５ｍｇ／ｍｌから０．１ｍｇ／ｍｌの試験濃度で用いた。緑膿菌の増殖は２．５ｍｇ／ｍｌにおいて阻止されたが、０．５ｍｇ／ｍｌでは生存細胞の回収が可能であった。このことから、本発明によるポリマー混合物は、２．５ｍｇ／ｍｌ付近の濃度において殺菌性であると考えられる。
【０１５１】
実施例７：本発明によるポリフェノール−キノノイドポリマー誘導体を用いた繊維および生体組織についての説明
繊維における抗菌作用は、Ｈｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｔｅｘｔｉｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ，７１（４），３１８−３２３およびＳｕｎ，２００５，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄｕｃ．，８２，６０−６４に記載されるように、アメリカ繊維化学技術・染色技術協会（ＡＡＴＣＣ）のプロトコルに従ってよい。
【図１ＡＢ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２ＢＣＤ】
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【図２ＥＦ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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