(57)【要約】本発明は、1つまたは2つの一本鎖オーバーハングを有する二本鎖標的増幅産物の構築と、そのような標的増幅産物の改善された産生とを組み合わせる方法を提供する。一本鎖オーバーハングは、増幅後の捕捉およびその後の検出／操作のために使用することができる。一本鎖オーバーハングにより、二本鎖標的増幅産物の相補鎖からの干渉を受けない、捕捉／検出／操作が可能になる。2013524841.tif 000014
2013524841.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a. 鋳型核酸を提供する段階
b. 3'端にプライマー／鋳型（pt）領域（該鋳型核酸の一部に相補的である）を含み、かつ捕捉領域（cr）を含む、二官能性オリゴヌクレオチド（bfo）を提供する段階であって、該pt領域および該cr領域がポリメラーゼブロック（B）により分離されている、段階
c. 段階a〜bの成分を混合する段階、ならびに、該bfoの該pt領域が該鋳型核酸にアニールすることおよび増幅される鋳型核酸の産生を該Bが改善することを可能にする条件を提供する段階
d. プライマー伸長を可能にする条件の下で、該bfoの該pt領域を伸長させる段階
e. それにより、該bfoの該cr領域に対応する一本鎖オーバーハングを有する二本鎖核酸（dso）を生成する段階
を含む方法であって、該ポリメラーゼブロック（B）が、インターカレーターを含みかつ以下の一般式
X - L - I
により記載され得る、方法：
式中、Xは、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体、またはPNA、またはPNA類似体の主鎖中に組み入れられ得る主鎖モノマー単位であり、Lはリンカーであり、Iは、DNA、RNA、またはそれらの類似体の核酸塩基とコスタッキングする（co-stack）ことができる少なくとも一つの本質的に平坦な共役系を含むインターカレーターである。
【請求項２】
前記インターカレーターがピレンである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記インターカレーターが、以下の一般構造Z
X - L - I1 - C - I2
により記載されるTINAモノマー中に存在する、前記請求項のいずれか一項記載の方法：
式中、Xは、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体、またはPNA、またはPNA類似体の主鎖中に組み入れられ得る主鎖モノマー単位であり、Lはリンカーであり、I1は、DNA、RNA、またはそれらの類似体の核酸塩基とコスタッキングすることができる少なくとも一つの本質的に平坦な共役系を含む第1のインターカレーターであり、Cは、任意の共役部（conjugator）であり、かつI2は、DNA、RNA、またはそれらの類似体の核酸塩基とコスタッキングすることができる少なくとも一つの本質的に平坦な共役系を含む第2のインターカレーターである。
【請求項４】
Xがアルキレンジオールを含み、Lが、アルキル鎖、オキサアルキル鎖、アザアルキル鎖、チアアルキル鎖、カルボキサミド基、チオカルボキサミド基、スルホンアミド基、またはそれらの組み合わせを含む、リンカーであり、かつ0〜60を含み、I1が、ベンゼン、ナフタレン、アズレン、および二環式ヘテロ芳香環系からなる群より選択される単環式または多環式の芳香族環系であり、I2が、二環式芳香族環系、三環式芳香族環系、四環式芳香族環系、五環式芳香族環系、およびそれらのヘテロ芳香族類似体、ならびにそれらの置換体の群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項５】
Cが、炭素1〜12個のアルキル、炭素2〜12個のアルケニル、炭素2〜25個のアルキニル、もしくはジアゾ、または、炭素もしくは／および窒素原子25個以下の長さを有するそれらの組み合わせの群より選択される共役部である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
I1およびI2が、共役系を介して直接連結される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
Zが、以下の式
2013524841.tif 000013
により記載され得る、前記請求項のいずれか一項記載の方法：
式中、Rは、アリールエチニル、ピレンエチニル、および1H-フェナントロ[9,10-d]イミダゾール-2-イルからなる群より選択される。
【請求項８】
以下の段階をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法：
f. 段階dの第1の伸長産物に相補的である第2のプライマーを提供する段階
g. 段階dの産物を変性させる段階
h. プライマー伸長を可能にする条件の下で、第1の伸長産物にアニールさせた第2のプライマーを伸長させる段階。
【請求項９】
マルチプレックスPCR用の第2のプライマーセットを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記dsoの前記捕捉領域（cr）を捕捉プローブにアニールさせる捕捉段階をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
前記捕捉プローブが、固体支持体上に固定化されているか、あるいは固体支持体への固定化に適合している、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
アニールした分子をアニールしていない分子から分離するための分画段階をさらに含む、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
前記捕捉プローブが、前記請求項のいずれか一項に記載されるようなTINAモノマーを含む、請求項10〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
以下をさらに含む、請求項10〜13のいずれか一項記載の方法：
a. 固定化された標的増幅産物が可視化される、検出期、および／または
b. 該固定化された標的増幅産物が精製される、精製期、および／または
c. 該固定化された標的増幅産物がさらに操作される、操作期。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
分子生物学および関連分野において、PCR産物などの二本鎖核酸をオリゴヌクレオチド、例えば捕捉プローブとの相互作用に利用できるようにすることが、しばしば望ましい。これは、例えば、二本鎖核酸が変性するまで温度を上昇させるかまたはpHを上昇させることにより核酸の二本の鎖を分離することによって実施され得る。変性後、捕捉プローブを添加して、捕捉プローブのアニーリングが起こり得るように条件を逆転させてもよい。しかしながら、両方の鎖が試料中に存在し続けている場合、これらが復元されて、明らかに捕捉プローブと競合する可能性がある。これは当然、捕捉過程の効率を低下させる。
【０００２】
一つの解決法は、捕捉プローブで鎖の一方を捕捉する前に核酸の二本の鎖を物理的に分離することである。しかしながら、これにはさらなる操作が必要であり、これは時間を要し、かつ材料の損失ももたらす可能性がある。
【０００３】
従って、PCRにおいて、DNAポリメラーゼが鋳型の3'端まで完全に複製することを阻止し、それにより一本鎖の5'オーバーハングを残すことが有利であると考えられる（1996年6月11日付の米国特許第5525494号（特許文献1）（Zeneca Limited）に記載）。
【０００４】
DNAポリメラーゼを遮断し、従って一本鎖オーバーハングを作製する（しかし、本発明により得られる、PCRの有効性およびその後の捕捉に対する恩恵は無い）一般的な方法は、PCRプライマーとナンセンスオリゴヌクレオチド配列との間に炭素リンカーを挿入することである。本発明と比較した短所は、炭素リンカーの非剛性構造のためにナンセンスオリゴヌクレオチド配列がめくれて標的ヌクレオチド配列に接する（従ってPCRポリメラーゼを干渉する）可能性である。炭素リンカーはまた輪状になる可能性もあり、ナンセンスオリゴヌクレオチド配列およびプライマー配列を非常に近接させることにより、PCRポリメラーゼがリンカーを読み過ごすようにさせ得る。リンカーのこのような干渉は、後にマルチプレックスPCRアッセイのアッセイ間の均一性を低下させ、そのような干渉は、使用されるポリメラーゼブロックの剛性構造のために、本発明においては見られない。
【０００５】
国際公開公報第9421820号（特許文献2）は、一本鎖オーバーハング（尾部）を有するPCR産物を生成するために、複製不可能な領域を有するプライマーを使用するPCR法を記載している。発明者らは、プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドの核酸塩基のすべてをポリメラーゼが複製することを阻止するために、PCRプライマー中で塩基でない類似体（1,3プロパンジオールおよび1,4-アンヒドロ-2-デオキシ-D-リビトール）を2個使用し、それにより、塩基でない類似体の5'側に位置する核酸塩基に対応する一本鎖オーバーハングを残した。
【０００６】
しかしながら、国際公開公報第9421820号（特許文献2）および米国特許第5525494号（特許文献1）は、特異性および感度の点でPCR反応に恩恵をもたらすか、またはPCR産物のその後の捕捉を促進するポリメラーゼブロックを開示していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第5525494号
【特許文献２】国際公開公報第9421820号
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、1つまたは2つの一本鎖オーバーハングを有する二本鎖標的増幅産物の構築と、そのような標的増幅産物の改善された産生とを組み合わせる方法を提供する。一本鎖オーバーハングは、増幅後の捕捉およびその後の検出／操作のために使用することができる。一本鎖オーバーハングにより、二本鎖標的増幅産物の相補鎖からの干渉を受けない、改善された捕捉／検出／操作が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】PCR産物の量の関数としての、変性PCR産物またはBFO修飾PCR産物の検出。両方の検出系について、DNA捕捉オリゴヌクレオチドおよびパラ-TINA修飾DNA捕捉オリゴヌクレオチドによる検出を示す。より多くの情報については実施例1を参照されたい。
【図２】本発明において使用される例示的な二官能性オリゴヌクレオチドの模式図。
【図３】1個（上のパネル）および2個の二官能性オリゴヌクレオチドのプライマーセットを用いたマルチプレックスPCRの模式図。
【図４】図4Aは、アニーリング勾配における50 nMでのオルト-TINA（横列1）およびC3スペーサー（横列2）のPCR産物を示す。詳細については実施例2を参照されたい。図4Bは、アニーリング勾配における100 nMでのオルト-TINA（横列1）およびC3スペーサー（横列2）のPCR産物を示す。詳細については実施例2を参照されたい。
【図５】図5Aは、アニーリング勾配における200 nMでのオルト-TINA（横列1）およびC3スペーサー（横列2）のPCR産物を示す。詳細については実施例2を参照されたい。図5Bは、アニーリング勾配における400 nMでのオルト-TINA（横列1）およびC3スペーサー（横列2）のPCR産物を示す。詳細については実施例2を参照されたい。
【図６】オルト-TINAおよびC3スペーサーで修飾された二官能性オリゴヌクレオチドのLuminex捕捉解析の結果を示す。詳細については実施例2を参照されたい。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
発明の開示
本発明は、以下の段階を含む方法を提供する：
a. 鋳型核酸を提供する段階
b. 3'端にプライマー／鋳型（pt）領域（該鋳型核酸の一部に相補的である）を含み、かつ捕捉領域（cr）を含む、二官能性オリゴヌクレオチド（bfo）を提供する段階であって、該pt領域および該cr領域がポリメラーゼブロック（B）により分離されている、段階
c. 段階a〜bの成分を混合する段階、および、該bfoの該pt領域が該鋳型核酸にアニールすることを可能にする条件を提供する段階
d. プライマー伸長を可能にする条件の下で、該bfoの該pt領域を伸長させる段階
e. それにより、該bfoの該cr領域に対応する一本鎖オーバーハングを有する二本鎖核酸（dso）を生成する段階。
【００１１】
好ましい態様において、段階bのbfoは、
5'cr - B - pt 3'
として構築される。
【００１２】
別の態様において、段階bのbfoは、
X - B - pt 3'
として構築され、式中、「X」は、「cr」、「B」、および「pt」の任意の組み合わせであり得る。例えば、X＝3'pt - B - cr 5' - B - 5'crである（この場合、この特定のbfoの式は
3'pt - B - cr 5' - B - 5'cr - B - pt 3'
となる）。
【００１３】
好ましくは、段階dにおける伸長は、以下からなる群より選択される反応の一部としてなされる：指数関数的標的増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、ローリングサークル増幅）、等温指数関数的標的増幅（例えば、核酸配列ベース増幅（NASBA）、鎖置換増幅（SDA）、転写媒介増幅（TMA））、線形標的増幅（例えば、逆転写、ジデオキシ塩基配列決定法）。
【００１４】
一つの態様において、鋳型核酸はRNAであり、そのためポリメラーゼは逆転写酵素である。
【００１５】
PCR
方法がPCRである時、方法が以下の段階をさらに含むことが、認識されるであろう：
f. 段階dの第1の伸長産物に相補的である第2のプライマーを提供する段階
g. 段階dの産物を変性させる段階
h. プライマー伸長を可能にする条件の下で、第1の伸長産物にアニールさせた第2のプライマーを伸長させる段階。
【００１６】
段階f〜hは、第2の鎖合成と呼ばれてもよい。
【００１７】
一つの態様において、第2のプライマーもまたbfoである。従って、第2のbfoのpt領域は、第2の鎖合成のプライマーとして働く。第2のbfoは、典型的に、pt領域の配列および／またはcr領域の配列が第1のbfoとは異なる。長さ、ヌクレオチド類似体の含量、および修飾されたヌクレオチド、ならびにポリメラーゼブロックの特徴もまた、異なってもよいことを理解されたい。第1および第2のプライマーの両方がbfoである時、本方法の二本鎖産物（単位複製配列）は、両端に一本鎖オーバーハング（捕捉領域）を有する。
【００１８】
ポリメラーゼは、典型的に、変性、アニーリング、および伸長の複数回反復できるように、熱安定性である。さもなければ、ポリメラーゼを各変性段階後に添加しなければならないであろう。通常、2〜45回、より好ましくは5〜35回、および最も好ましくは10〜30回の反復が実施される。反復の回数は、典型的に、第1のサイクルにおける鋳型核酸の量、最終産物の望ましい量、および過程の効率に依存することを理解されたい。
【００１９】
マルチプレックス
PCRに関連する上述の態様において、2個のプライマーが使用される。プライマー1はbfoであり、プライマー2はbfoであってもよいし、または典型的なPCRプライマーであってもよい。いずれにしても、2個のプライマーは、共にある特定の配列の増幅を可能にしてPCR産物（単位複製配列）を生成する、プライマーセットまたはプライマー対と呼ばれてもよい。
【００２０】
単に1組のプライマー対を使用する代わりに、方法は、PCR反応がマルチプレックスPCRであるように複数のプライマー対を使用してもよい。プライマーセット2については、1個または両方のプライマーがbfoであってもよく、追加的なプライマーセットについても同様である。
【００２１】
各プライマーセットにおけるプライマーの1個のみがbfoである態様において、プライマーセット1のbfoの捕捉領域は、プライマーセット2のbfoの捕捉領域と同一であってもよい。すなわち、2個の単位複製配列が、同一の配列／部分で捕捉プローブにより捕捉されてもよい。
【００２２】
より好ましい態様において、プライマーセット1のbfoの捕捉領域は、プライマーセット2のbfoの捕捉領域と同一ではない。すなわち、2個の単位複製配列が、異なる配列／部分、すなわち固体表面上の2個の別々の領域（例えば、別々のビーズまたはアレイ上の別々の位置へ）で捕捉プローブにより捕捉されてもよく、追加的なプライマーセットについても同様である。
【００２３】
各プライマーセットにおける両方のプライマーがbfoである別の態様において、プライマーセット1のその後の捕捉のために使用されるbfoの捕捉領域は、プライマーセット2のその後の捕捉のために使用されるbfoの捕捉領域と同一であってもよい。すなわち、2個の単位複製配列が、同一の配列／部分で捕捉プローブにより捕捉されてもよい。
【００２４】
より好ましい態様において、プライマーセット1のその後の捕捉のために使用されるbfoの捕捉領域は、プライマーセット2のその後の捕捉のために使用されるbfoの捕捉領域と同一ではない。すなわち、2個の単位複製配列が、異なる配列／部分、すなわち固体表面上の2個の別々の領域（例えば、別々のビーズまたはアレイ上の別々の位置へ）で捕捉プローブにより捕捉されてもよく、追加的なプライマーセットについても同様である。
【００２５】
各プライマーセットにおける両方のプライマーがbfoであるこの態様において、プライマーセット1のその後の検出／操作のために使用されるbfoの捕捉領域は、プライマーセット2のその後の検出／操作のために使用されるbfoの捕捉領域と同一であってもよい。すなわち、2個の単位複製配列が、同一の配列／部分でプローブにより検出／操作されてもよい。
【００２６】
より好ましい態様において、プライマーセット1のその後の検出／操作のために使用されるbfoの捕捉領域は、プライマーセット2のその後の検出／操作のために使用されるbfoの捕捉領域と同一ではない。すなわち、2個の単位複製配列が、異なる配列／部分でプローブにより検出／操作されてもよく、追加的なプライマーセットについても同様である。
【００２７】
方法における使用のための二官能性オリゴヌクレオチド（bfo）
プライマー／鋳型領域
通常、二官能性オリゴヌクレオチドのプライマー／鋳型領域は、完全に天然のヌクレオチドからなる。従って、最も多くの場合、排他的にDNAモノマーからなると考えられる。ある特定の態様において、DNAおよびRNAモノマーの混合物を含んでもよく、または、排他的にRNAからなってもよい。他の態様において、bfoのプライマー／鋳型領域は、依然としてpt領域がポリメラーゼにより伸長されることが可能である限り、1個または複数の修飾されたモノマー／核酸類似体／主鎖修飾体を含んでもよい。従って、一つの態様において、pt領域の3'端から数えて最初の2、3、4、6、8、または10ヌクレオチドは、非修飾DNAモノマーまたは非修飾RNAモノマーのいずれかであることが好ましい。
【００２８】
二官能性オリゴヌクレオチドの鋳型／プライマー領域の長さは、典型的に、5〜40ヌクレオチド長であり、より好ましくは8〜30ヌクレオチド長であり、最も好ましくは10〜25ヌクレオチド長である。
【００２９】
鋳型／プライマーは、必ずしもその全長にわたって鋳型核酸に相補的である必要はないことが、認識されるべきである。例えば、ポリメラーゼブロックと、鋳型核酸に相補的である領域との間に追加的な配列を有してもよい。そのような追加的な配列は、例えば制限酵素部位を含んでもよい。
【００３０】
捕捉領域
捕捉領域は、5〜40ヌクレオチド長であることが好ましく、より好ましくは8〜30ヌクレオチド長であり、最も好ましくは10〜25ヌクレオチド長である。
【００３１】
捕捉領域は、天然のヌクレオチド両方（非修飾DNAモノマーおよび非修飾RNAモノマー）を含んでもよく、かつまた、修飾されたモノマーおよび／またはヌクレオチド類似体を含んでもよい。モノマーは、例えば、糖で、および／またはヌクレオチド間結合で、および／または塩基で修飾されてもよい。特に好ましいモノマーは、2-O-アルキル、2-O-フルオロなどの2-O-修飾ヌクレオチド、LNA（ロックド核酸）およびBNAなどの二環式ヌクレオチド、モルフォリノ、FANAなどである。
【００３２】
一つの態様において、捕捉領域は、PNA（ペプチド核酸）を含むか、またはそれからなってもよい。別の態様において、捕捉領域は、標準的なオリゴヌクレオチド（ホスホロアミダート）化学を用いて組み入れられ得るヌクレオチド類似体および修飾されたヌクレオチドのみからなってもよい。この態様において、PNAは使用されない。
【００３３】
捕捉領域は、典型的に、アプタマーおよび一本鎖捕捉配列からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドである。本明細書において使用されるアプタマーという用語は、三次元構造をとり、かつこの構造を介してリガンドに結合する（ハイブリダイゼーションによる結合とは対照的に）オリゴヌクレオチドを指す。従って、アプタマーを、ある特定のタンパク質に結合するようにSELEXにより進化させていてもよい。アプタマーはまた、抗体に結合してもよく、その場合アプタマーは、エピトープ（抗体結合部位）と呼ばれうる。
【００３４】
これらの場合のいずれにおいても、捕捉領域は、リガンド、例えば、抗体などのタンパク質と、または、捕捉領域にアニールすることが可能である一本鎖オリゴヌクレオチドの形態のリガンドと、相互作用することができる。
【００３５】
bfoの他の官能性
本発明の方法における使用のためのbfoは、追加的な官能性を含んでもよい。bfoは例えば、開裂可能なリンカー、例えば、ジスルフィド架橋または光開裂性部分などの放出基を含んでもよい。bfoはまた、例えばビオチンなどの捕捉基を含んでもよい。一つの態様において、bfoは、捕捉基および放出基の両方を含む。また、一つまたは複数のプライマーセットの他方のプライマーが、他の官能性を含んでもよい。
【００３６】
ポリメラーゼブロック（B）
二官能性領域のどれがプライマー／鋳型領域であり、どれが捕捉領域であるかに関して、プライマー／鋳型領域は、容易に捕捉領域から区別される。なぜなら、プライマー／鋳型領域は、例えばPCRの際の伸長反応においてbfoが鋳型として使用される場合には、bfoの3'端から、それ以降のプライマー伸長が不可能な最初のヌクレオチドまたは他の部分まで伸長するからである。従って、それ以降のプライマー伸長が不可能な最初のヌクレオチドまたは他の部分が、ポリメラーゼブロックであり、該ブロックは、上記の修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の一つであってもよい。
【００３７】
ポリメラーゼブロックは、プライマー／鋳型領域の鋳型領域の3'端から少なくとも5、6、10、12、15、18、21、24または27ヌクレオチドに位置することが好ましい。従って、対応する態様において、プライマー／鋳型領域は、そのため少なくとも5、6、10、12、または15、18、21、24、または27ヌクレオチドの長さである。
【００３８】
該ブロック（B）は、核酸の主鎖構造に組み入れられた場合には、ポリメラーゼに遭遇するとDNAまたはRNAポリメラーゼのさらなる伸長を阻止すると考えられる、任意の成分であり得る。該ブロックは、典型的に、ヌクレオチド類似体、修飾されたヌクレオチド、連結部分、およびインターカレーターからなる群より選択される。
【００３９】
核類似体は、例えば、LNA、モルフォリノ、FANA、HNAであってもよい。
【００４０】
好ましい連結部分は、ポリエチレングリコールリンカー（PEG）などのポリアルキレングリコールリンカーである。他のリンカーを使用してもよい。
【００４１】
インターカレーター
一つの態様において、ポリメラーゼブロックは、インターカレーター、すなわち、DNAまたはRNAの塩基間にインターカレートすることができる部分を含むことが好ましい。インターカレーターは、典型的に、芳香族環系を含む。
【００４２】
bfoにおいて使用されるインターカレーターは原則的に、インターカレーションを可能にするリンカーによりbfoのモノマーへ付加されてもよく、またはインターカレーターは、追加的なモノマーとして含まれてもよい。
【００４３】
最も広範な態様において、そのようなモノマーは、
X - L - I
と記載されてもよく、式中、Xは、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体、またはPNA、またはPNA類似体の主鎖中に組み入れられ得る主鎖モノマー単位であり、Lはリンカーであり、I1は、DNA、RNA、またはそれらの類似体の核酸塩基とコスタッキングする（co-stack）ことができる、少なくとも一つの本質的に平坦な共役系を含む第1のインターカレーターである。
【００４４】
好ましくは、主鎖モノマー単位Xは、例えばグリコン（glycon）などの環系に部分的に含まれるアルキレンジオールを任意で有する、エチレングリコールまたは1-O-メチレングリセロールなどのアルキレンジオールを含む。例えば、主鎖モノマーXは、窒素、硫黄、リン、および酸素より選択されるヘテロ原子を最終的に有する、四員環、五員環、または六員環の一部であってもよい。好ましくは、アルキレンジオールは、オリゴヌクレオチドの隣接するモノマー単位を直接連結し、かつ、この態様において、アルキレンジオールが例えばグリコンなどの環系の一部であり続けてもよいことが、理解されるべきである。
【００４５】
一つの態様において、モノマーのリンカーLは、0〜60個の原子を含む。
【００４６】
別の態様において、Lは、鎖もしくは環、またはそれらの組み合わせ、および／あるいはそれらの置換体を含む。
【００４７】
また別の態様において、Lは、アルキル鎖、またはオキサアルキル鎖、またはアザアルキル鎖、またはチアアルキル鎖、またはカルボキサミド基、またはチオカルボキサミド基、またはスルホンアミド基、またはそれらの組み合わせを含む。
【００４８】
好ましい態様において、リン原子を含む主鎖モノマー単位Xの単位長は原子6個未満であり、ここで、主鎖単位長とは、1個のモノマーから隣までの最短距離である。
【００４９】
追加的なモノマーとして添加される、ブロックとしての使用のために好ましいインターカレーターは、国際公開公報第2006/125447号（参照により本明細書に組み入れられる）に記載されているTINAモノマー、国際公開公報第2003/052134号および国際公開公報第2003/052133号、国際公開公報第2003/051901号（参照により本明細書に組み入れられる）に記載されているINAモノマー、Narayanan S et al, NAR 2004, 32: 2901-2911（参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている5'付加アシルアミドキャップからなる群より選択することができる。
【００５０】
TINA
TINA（ねじれたインターカレーティング核酸）は、捕捉領域をプライマー／鋳型領域モノマーから離れさせるようであるため、bfoのある特定の用途に特に好ましいことが分かっている。従って、TINAモノマーがブロックとして使用される時、捕捉領域は、プライマー／鋳型領域と相互作用する傾向がほとんどないであろう。
【００５１】
TINAモノマーは、一般構造Z
X - L - I1 - C - I2
により記載されてもよく、式中、Xは、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体、またはPNA、またはPNA類似体の主鎖中に組み入れられ得る主鎖モノマー単位であり、Lはリンカーであり、I1は、DNA、RNA、またはそれらの類似体の核酸塩基とコスタッキングすることができる少なくとも一つの本質的に平坦な共役系を含む第1のインターカレーターであり、Cは、任意の共役部（conjugator）であり、かつI2は、DNA、RNA、またはそれらの類似体の核酸塩基とコスタッキングすることができる少なくとも一つの本質的に平坦な共役系を含む第2のインターカレーターである。
【００５２】
好ましい態様において、主鎖Xは、DNA、RNA、HNA、MNA、ANA、LNA、CAN、INA、CeNA、TNA、(2'-NH)-TNA、(3'-NH)-TNA、α-L-リボ-LNA、α-L-キシロ-LNA、β-D-リボ-LNA、β-D-キシロ-LNA、[3.2.1]-LNA、ビシクロ-DNA、6-アミノ-ビシクロ-DNA、5-エピ-ビシクロ-DNA、α-ビシクロ-DNA、トリシクロ-DNA、ビシクロ[4.3.0]-DNA、ビシクロ[3.2.1]-DNA、ビシクロ[4.3.0]アミド-DNA、β-D-リボピラノシル-NA、α-L-リキソピラノシル-NA、2'-R-RNA、2'-OR-RNA、2'-AE-RNA、α-L-RNA、β-D-RNA、およびそれらの組み合わせならびにそれらの修飾体のオリゴヌクレオチド中に組み入れることができる。
【００５３】
別の態様において、主鎖モノマー単位Xは、グリコンなどの環系に部分的に含まれるアルキレンジオールを任意で有する、エチレングリコールまたは1-O-メチレングリセロールなどのアルキレンジオールを含む。例えば、主鎖モノマーXは、窒素、硫黄、リン、および酸素より選択されるヘテロ原子を最終的に有する、四員環、五員環、または六員環の一部であってもよい。好ましくは、アルキレンジオールは、オリゴヌクレオチドの隣接しているモノマー単位を直接連結させる。この態様において、アルキレンジオールが依然として例えばグリコンなどの環系の一部であってもよいことが、理解されるべきである。
【００５４】
一つの態様において、柔軟な塩基スタッキングモノマーのリンカーLは、0〜60個の原子を含む。
【００５５】
別の態様において、Lは、鎖もしくは環、またはそれらの組み合わせ、および／またはそれらの置換体を含む。
【００５６】
また別の態様において、Lは、アルキル鎖、またはオキサアルキル鎖、またはアザアルキル鎖、またはチアアルキル鎖、またはカルボキサミド基、またはチオカルボキサミド基、またはスルホンアミド基、またはそれらの組み合わせを含む。
【００５７】
好ましい態様において、I1は、ベンゼン、ナフタレン、アズレン、二環式ヘテロ芳香環系、およびそれらの置換体の群より任意で選択される、単環式または多環式の芳香族環系である。
【００５８】
好ましい態様において、I1は、単環式または多環式の芳香族環系の1、2位にLおよびCを有して配置される。
【００５９】
さらに別の態様において、I1は、単環式または多環式の芳香族環系の1、3位にLおよびCを有して配置される。
【００６０】
別の態様において、I1は、単環式または多環式の芳香族環系の1、4位にLおよびCを有して配置される。
【００６１】
より好ましい態様において、I1は、オルト位にLおよびCを有する（1、2位にLおよびC）またはパラ位にLおよびCを有する（1、4位にLおよびC）ベンゼン環である。
【００６２】
柔軟な塩基スタッキングモノマーのCは、任意の共役部である。Cが任意でない好ましい態様において、Cは、炭素1〜12個のアルキル、炭素2〜12個のアルケニル、炭素2〜25個のアルキニル、もしくはジアゾ、または、炭素原子もしくは／および窒素原子25個以下の長さを有するそれらの組み合わせの群より選択される。
【００６３】
代替的な態様において、柔軟な塩基スタッキングモノマーは、共役部を全く含有しない。従って、I1およびI2は、例えば共役系を介して直接連結されてもよい。
【００６４】
別の態様において、Cは、直鎖または分岐鎖または単環式芳香族環、および、窒素、硫黄、リン、および酸素より選択されるヘテロ原子を最終的に有するそれらの置換体からなる群より選択される。
【００６５】
また別の態様において、Cのアルケニルは、アセチレンまたは反復アセチレンである。
【００６６】
好ましい態様において、リン原子を含む主鎖モノマー単位Xの単位長は、原子6個未満であり、ここで、主鎖単位長とは、1個のモノマーから隣までの最短距離である。
【００６７】
好ましい態様において、連結部分Lは、少なくとも原子2個の長さを有し、かつ、窒素、硫黄、リン、および酸素より選択されるヘテロ原子を最終的に有する。好ましくは、連結部分Lは、原子2〜10個の長さ、より好ましくは原子2〜5個の長さを有する。最も好ましい態様において、連結部分は、XとI1との間の5結合に対応する原子3個の長さを有する。
【００６８】
柔軟な塩基スタッキングモノマーのI2は、DNA、RNA、またはそれらの類似体の核酸塩基とコスタッキングすることができる少なくとも一つの本質的に平坦な共役系を含む第2のインターカレーターである。
【００６９】
好ましい態様において、I2は、二環式芳香族環系、三環式芳香族環系、四環式芳香族環系、五環式芳香族環系、およびそれらのヘテロ芳香族類似体、ならびにそれらの置換体の群より選択される。最も好ましいのは、四環式環系、特にピレンである。
【００７０】
特定の態様において、I2は、1H-フェナントロ[9,10-d]イミダゾール-2-イル基またはピレンである。
【００７１】
最も好ましい態様において、Zは、以下の式
2013524841.tif 000003
により記載され得、式中、Rは、アリールエチニル、ピレンエチニル、および1H-フェナントロ[9,10-d]イミダゾール-2-イルの群より選択され、かつR基は、ベンゼンのオルト、メタ、またはパラ位で置換されてもよい。より好ましいのは、オルトおよびパラ位である。
【００７２】
INA
INA（インターカレーティング核酸）は、以下の一般式
X - Y - Q
により記載されてもよく、式中、Xは、核酸または核酸類似体の主鎖中に組み入れることができる主鎖モノマー単位であり、好ましくは、Xは、アルキレンジオールを含む。
【００７３】
Qは、DNAの核酸塩基とコスタッキングすることができる少なくとも一つの本質的に平坦な共役系を含むインターカレーターであり、好ましくは、Qは、ベンゼン、ナフタレン、アズレン、および二環式ヘテロ芳香環系、三環式芳香族環系、四環式芳香族環系、五環式芳香族環系、およびそれらのヘテロ芳香族類似体、ならびにそれらの置換体からなる群より選択される、単環式または多環式の芳香族環系由来である。最も好ましいのは、四環式環系、特にピレンである。
【００７４】
Yは、前記主鎖モノマー単位および前記インターカレーターを連結するリンカー部分である。
【００７５】
QおよびYの全長は、典型的に、5〜25Å、より好ましくは、7〜20Åである。
【００７６】
好ましい態様において、リン原子を含む主鎖モノマー単位Xの単位長は、原子6個未満であり、ここで、主鎖単位長とは、1個のモノマーから隣までの最短距離である。
【００７７】
捕捉領域−リガンドの相互作用
1つまたは2つの一本鎖オーバーハング（捕捉領域）を含む二本鎖核酸は典型的に、さらなる操作に供され、好ましくは、dsoの捕捉領域（cr）は、リガンド、例えばオリゴヌクレオチドまたはタンパク質と相互作用する。
【００７８】
ナノ構造
従って、二本鎖核酸は、例えば、核酸ベースのナノ構造を生成するためのナノ技術において使用されてもよい。そのような態様において、一本鎖オーバーハングを有する二本鎖核酸を典型的に、第2の二本鎖核酸と、好ましくは同じく一本鎖オーバーハングを有する二本鎖核酸と接触させる。両方の一本鎖オーバーハングは典型的に、相補領域を有するように、すなわち互いにアニールできるように設計される。一方の一本鎖オーバーハングが、1つより多い、例えば2つまたは3つの他方の一本鎖オーバーハングへのアニーリングを可能にする長さを有してもよい。このように、剛性二本鎖核酸は、種々の方法で結合されて、ナノ構造を構築することができる。
【００７９】
捕捉
別の態様において、方法は、dsoの捕捉領域（cr）を捕捉プローブにアニールさせる捕捉段階をさらに含む。本発明において使用されるポリメラーゼブロックB、例えば上述のTINAは、実施例1に示すように捕捉を改善する。理論に束縛されるものではないが、捕捉の改善は剛性のTINA構造に基づくものであり、これが、捕捉領域を二本鎖領域から離れさせ、かつしたがって捕捉領域の接触性を増加させると考えられる。
【００８０】
捕捉プローブは通常、固体支持体に固定化されているか、あるいは、捕捉プローブは、固体支持体への固定化に適合している。
【００８１】
固体支持体は、例えば、ビーズ、ブロット、またはアレイであってもよい。
【００８２】
dsoが捕捉プローブと接触して、捕捉プローブがcrにアニールした後、アニールした分子（PCR産物）をアニールしていない分子から分離するための分画段階が、典型的に実施される。
【００８３】
好ましい態様において、捕捉プローブは、インターカレーター、例えば、上述のようなTINAモノマーまたはINAモノマーを含む。捕捉プローブはまた、2個またはそれより多いインターカレーターを含んでもよい。実施例の節に示すように、インターカレーターを含む捕捉プローブは、捕捉反応の効率を改善する。
【００８４】
標的増幅産物が固体表面上に捕捉されている時、その次の段階は典型的に、以下の一つまたは複数となる：
a. 固定化された標的増幅産物が可視化される、検出期
b. 該固定化された標的増幅産物が精製される、精製期
c. 該固定化された標的増幅産物がさらに操作される、操作期。
【実施例】
【００８５】
序文
本発明の方法において、例えばTINA分子などのポリメラーゼブロックが、二官能性オリゴヌクレオチド中に配置される。TINA分子に対して3'側のオリゴヌクレオチドの部分が、従来のPCRプライマーとして機能するのに対して、TINA分子に対して5'側のオリゴヌクレオチドの部分は、ナンセンスオリゴヌクレオチド尾部である。このアプローチは、以下に要約することができる複数の利点を有する：i）マルチプレックスPCRの有効性の増加、ii）マルチプレックスPCR反応の検出時の解析感度の改善、iii）マルチプレックスPCR産物の検出のためのマイクロアレイおよびバイオセンサーアプローチにおける非特異的交差反応性の減少、ならびにiv）より容易な設計およびより均一なPCR反応。二官能性オリゴヌクレオチドにおけるTINA分子は、依然としてPCR反応の有効性を改善するが、TINA分子はまた、PCRポリメラーゼによる読み過ごしを解消し、これによりナンセンスオリゴヌクレオチド配列を一本鎖オーバーハングとして残す。一本鎖PCRオーバーハングは、PCR産物の変性先行させることなくマルチプレックスPCR反応の検出を可能にし、これにより、PCR単位複製配列の検出の解析感度を増加させる。ナンセンスオリゴヌクレオチドのタグ配列は自由に設計することができるため、複数のPCR単位複製配列間の交差反応性の危険性が減少する。PCR単位複製配列は、ナンセンスオリゴヌクレオチドのタグ配列により識別されるため、類似の長さを有するPCR単位複製配列を設計することができる。PCR単位複製配列の長さを同等にすることにより、マルチプレックスPCRの有効性の均一化を達成することができ、これによりマルチプレックスPCRアッセイの最適化が単純になる。本発明の方法の最終的な恩恵とは、マルチプレックスPCRアッセイのアッセイ間の均一性が比較的高いことである。
【００８６】
実施例1：
実験の目的は、変性PCR産物の固相検出を、BFO修飾PCR産物の検出と比較することである。
【００８７】
PCR反応：
大腸菌（E. coli）由来のeltA遺伝子を標的とするプライマーセットを従来のPCR用に選択したのに対して、rrs遺伝子を標的とするプライマーセットをBFO修飾PCR用に使用した。両方のプライマーセットの配列は、Brandal LT et al, J Microbiol Methods. 2007 Feb;68(2):331-41に基づく。実施例におけるすべてのオリゴヌクレオチドは、HPLC精製および品質管理を伴い、0.2 μmol合成スケールで、IBA GmbHまたはDNA Technology A/Sから購入した。
【００８８】
臨床上のETECである大腸菌株D2262（estA、eltA、およびrrs陽性）を、SOSプレート上、37℃で一晩増殖させた。コロニーの半分を100μLの水に溶かし、95℃で15分間、細胞を溶解させた。細胞片を2300 gで1分間の遠心分離により除去し、上清をPCRに使用した。
【００８９】
eltA遺伝子に対する従来のPCR用のプライマー対は以下とした。
2013524841.tif 000004
PCR断片長：322 bp。
【００９０】
rrs遺伝子に対する二官能性オリゴヌクレオチドPCR用のプライマー対は以下とした。
2013524841.tif 000005
PCR断片長  401bp。
Xは、パラ-TINA（13ページに記載されるようなZであり、式中、Rは、ピレンエチニルであり、ベンゼンのパラ位で置換されている）であり、かつビオチンは、標準的なビオチンである。
【００９１】
PCRは、1×PCR緩衝液（1.61 g/L Tris-HCl、6.88 g/L Trizma塩基、2.12 g/L (NH4)2SO4、100μL/L Tween 80、5 g/L Ficoll 400）、0.2 mMの各dNTP、0.2 μMの各プライマー、2.5 mM MgCl2、0.08％ BSA、1μL鋳型DNA、および1 U KAPA2GO Robust HS DNAポリメラーゼを含む25μLの反応容積で実施した。PCRは、以下からなるPCRプログラムを用いて、SensoQuest Labcycler上で行った：段階1：95℃で4分間；段階2：段階3〜5を30サイクル；段階3：95.0℃で15秒間；段階4：Y℃で30秒間；5：72.0℃で30秒間、および段階6：72℃で1分間。Yは、eltA PCRについて59.5℃であり、rrs PCRについて53.1℃であった。PCR産物を、Macherey-Nagel由来のMN Nucleospin Extract II kitを用いて精製した。DNA濃度をNanodrop（商標）上で測定し、eltA PCR反応については18.3 ng/μL、およびrrs PCR反応については42.4 ng/μLであった。
【００９２】
BFO修飾PCR産物のLuminex検出：
BFO修飾rrs PCR産物を、各ウェルにおいてeltA、estA、およびrrsを標的とする一連の3種類の磁気ビーズ（MagPlex（商標））に結合させた捕捉オリゴヌクレオチドを用いて、Luminex200（商標）上で検出した。estA用の捕捉オリゴヌクレオチドはビーズ15に、rrsはビーズ29に、およびeltAはビーズ61に結合させた。BFO修飾PCR産物の一本鎖オーバーハングは、従来のDNAオリゴヌクレオチドまたはパラ-TINA修飾DNAオリゴヌクレオチドに対するワトソン-クリックベースの逆平行二重鎖形成により捕捉された。
【００９３】
2013524841.tif 000006
Xは、パラ-TINAであり、NH2-CXは、アミノ修飾シクロヘキサンスペーサーであり、HEGLは、C18ヘキサエチレングリコールスペーサーである。
【００９４】
従来のDNA捕捉オリゴヌクレオチドは、Luminexにより推奨されるEDCベースの結合手法を用いて結合させたのに対して、パラ-TINA修飾オリゴヌクレオチドは、ビーズへの同程度のオリゴヌクレオチドコーティングを保証するためにNHS-EDCベースの社内の結合手法を用いて結合させた。
【００９５】
Luminexアッセイは、V型マイクロタイタープレート（NUNCカタログ番号249952）を用いて行った。3種類のビーズ各々の0.2μLを、PCR産物、ハイブリダイゼーション緩衝液、および滅菌水と混合し、100μLの最終容積にした。0.5μLのPCR産物から開始して、PCR産物を3倍希釈系列で希釈した。最終的な緩衝液は、20 mM NaH2PO4/Na2HPO4、400 mM NaCl、0.03％ Triton X-100、pH 6.5からなった。プレートを、35℃で30分間、900 rpmの混合速度でインキュベーションした（ThermoScientific由来のiEMS Incubator/shaker（商標））。プレートを、5 mM NaH2PO4/Na2HPO4、100 mM NaCl、0.03％ Triton X-100、pH 6.5で3回洗浄し、検出緩衝液を添加した。検出緩衝液は、5μg/mLストレプトアビジン-R-PE（Prem. Grade S-21388, Invitrogen）、100μg/mLアルブミンフラクションV（K39619718921, Merck）、20 mM NaH2PO4/Na2HPO4、400 mM NaCl、0.03％ Triton X-100、pH 6.5 からなった。プレートを、35℃で15分間、900 rpmの混合速度でインキュベーションし、5 mM NaH2PO4/Na2HPO4、100 mM NaCl、0.03％ Triton X-100、pH 6.5で3回洗浄し、Luminex200（商標）システム上で少なくとも300個の各ビーズを計数して解析した。
【００９６】
従来のPCR産物のLuminex検出：
eltA PCR産物を、各ウェルにおいてeltA、estA、およびrrsを標的とする三重の磁気ビーズ（MagPlex（商標））を用いて、Luminex200（商標）システム上で検出した。rrs用の捕捉オリゴヌクレオチドはビーズ13に、estAはビーズ15に、およびeltAはビーズ81に結合させた。BFO修飾PCR産物のLuminex検出と同一のプロトコルを用いて、オリゴヌクレオチドをMagPlex（商標）に結合させた。
【００９７】
2013524841.tif 000007
Xは、パラ-TINAであり、NH2-CXは、アミノ修飾シクロヘキサンスペーサーであり、HEGLは、C18ヘキサエチレングリコールスペーサーである。
【００９８】
Luminexアッセイは、V型マイクロタイタープレート（NUNCカタログ番号249952）を用いて行った。3種類のビーズ各々の0.2μLを、PCR産物、Triton X-100（100μLの反応容積において0.03％の最終濃度）、および滅菌水と混合し、80μLの最終容積にした。1.0μLのPCR産物から開始して、PCR産物を2倍希釈系列で希釈した。プレートを、95℃で5分間、AccuBlock（商標）上でインキュベーションし、直ちに氷に移して2分間放置した。冷ハイブリダイゼーション緩衝液を添加して、100μLの全容積にし、最終緩衝液は、10 mM NaH2PO4/Na2HPO4、200 mM NaCl、および0.03％ Triton X-100、pH 6.5からなった。プレートを、45℃で15分間、900 rpmの混合速度でインキュベーションした（ThermoScientific由来のiEMS Incubator/shaker（商標））。プレートを、10 mM NaH2PO4/Na2HPO4、200 mM NaCl、0.03％ Triton X-100、pH 6.5で3回洗浄し、検出緩衝液を添加した。検出緩衝液は、5μg/mLストレプトアビジン-R-PE（Prem. Grade S-21388, Invitrogen）、100μg/mLアルブミンフラクションV（K39619718921, Merck）、10 mM NaH2PO4/Na2HPO4、200 mM NaCl、0.03％ Triton X-100、pH 6.5からなった。プレートを、45℃で10分間、900 rpmの混合速度でインキュベーションし、10 mM NaH2PO4/Na2HPO4、200 mM NaCl、0.03％ Triton X-100、pH 6.5で3回洗浄し、Luminex200（商標）システム上で少なくとも300個の各ビーズを計数して解析した。
【００９９】
結果：
図1は、DNAオリゴヌクレオチドおよびパラ-TINA修飾DNAオリゴヌクレオチドの捕捉による、eltAおよびrrs PCR産物の検出を比較する。両方のPCRについて、パラ-TINA修飾捕捉オリゴヌクレオチドは、Luminex検出法の感度を増加させた。変性eltA PCR産物の捕捉は、BFO修飾rrs PCR産物の捕捉よりも感度が低かった。多数の要素が、2種類のアッセイ間で異なっていた。本発明者らは、rrs PCR産物の検出については、14merの捕捉オリゴヌクレオチドを35℃で30分間、および420 mMの一価陽イオン濃度で使用したのに対して、eltA PCR産物は、27merの捕捉オリゴヌクレオチドを、210 mMの一価陽イオン濃度、ならびに95℃で5分間の変性、2分間の氷への移行（リアニーリングを阻害するため）、および45℃で15分間のインキュベーション（リアニーリングが15分後に完了する可能性があるため）と共に用いて検出した。両方のアッセイについて、2個の他の捕捉オリゴヌクレオチドに対する交差反応性を検定し、かつ両方のアッセイについて、交差反応性は検出されなかった。
【０１００】
結論：
本実験において、BFO修飾PCR産物の検出には、（Nanodrop（商標）DNA測定およびPCR断片長を考慮に入れると）比較的低ストリンジェントの検出条件（比較的高い一価陽イオン濃度および比較的低い温度）および比較的高い標的濃度が好都合であるが、他方で、変性PCR産物の検出には、BFO修飾PCR産物の検出用の捕捉オリゴヌクレオチドのほぼ2倍の長さの捕捉オリゴヌクレオチドが非常に好都合である。本発明者らは、これらの要素を踏まえて、BFO修飾PCR産物の検出のための感度は、変性PCR産物の検出と比較して有意に増加していると結論付ける。
【０１０１】
実施例2
本発明者らは、オルト-TINAが、実施例1のパラ-TINAと同様にDNAポリメラーゼを停止させること、およびオルト-TINAがPCR反応を改善することを示す。本発明者らは、PCR反応においてオルト-TINAを含有するプライマーを、DNAポリメラーゼを停止させるC3スペーサーを含有するプライマー対と比較する。使用したプライマー対を、下記に示す。
【０１０２】
プライマー：ipaH oT mix v2oT
2013524841.tif 000008
プライマー：ipaH C3 mix
2013524841.tif 000009
Zは、13ページに記載したとおりであり、式中、Rは、ピレンエチニルであり、ベンゼンのオルト位で置換されている。
【０１０３】
DEC082FおよびDEC083RプライマーはDNA Technologyで作製され、DEC066FはEuroFins MWG Operonで作製される。オリゴをddH2Oに溶かし、100μMの濃度にする。PCR反応を、細菌溶解物に対して実施する（鋳型遺伝子を含有する細菌のコロニーを水中で15分間煮沸し、1μlの煮沸溶解物を各PCR反応において鋳型として使用する）。本実験において使用した細菌株は、ipaH遺伝子を含有する大腸菌fr1368である。PCR反応を、25μlの全容積においてSensoQuest Labcyclerで実施する。PCR反応の成分の最終濃度は以下である：1×Euro-Optima緩衝液（10.4 mM Tris-HCl、56.8 mM Trizma塩基、16.1 mM (NH)4SO4、0.01％ Tween 80、30 mM NaCl）、2 mM dATP、dGTP、dCTP、および0.66 mM dTTP、および1.33 mM dUTP、2.5 mM MgCl2、0.08％ BSA、1×SYBR green I、0.25 UウラシルDNAグリコシラーゼ（Fermantas）、ならびに1 U KAPA2G Robust HS DNAポリメラーゼ（KAPA-Biosystems）。50 nM、100 nM、200 nM、および400 nMの4種類の異なるプライマー濃度を使用する。PCR反応を、60〜80℃のアニーリング勾配で検定する。PCRプログラムを、下記に示す。
【０１０４】
PCRプログラムEuro Optima Mastermix：
2013524841.tif 000010
【０１０５】
プレート設定および正確なアニーリング勾配を下記に示す。
2013524841.tif 000011
【０１０６】
PCR産物を、比較のためにアガロースゲル上で検定する。5μlの各PCR産物を、ゲル上で検定する。Gel Redを含む2,5％アガロースゲルに130ボルト（一定）を20分間印加する。レーン1は、1μlの分子マーカー（GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder（Fermentas, SM0323））を含有する。レーン2〜12は、縦列2〜12由来のPCR産物を含有する。各ゲルは、同一濃度での2タイプのPCR反応物を含有する。オルト-TINAを含有するPCR反応物を常に最初にロードし（横列1）、続いてC3スペーサーPCR反応物をロードする（横列2）。
【０１０７】
結果：
図4Aは、アニーリング勾配における50 nMでのオルト-TINA（横列1）およびC3スペーサー（横列2）のPCR産物を示す。オルト-TINA PCR反応およびC3スペーサーPCR反応は両方とも、61.8℃から、それぞれ70.9℃および67.3℃までで機能し、50 nMのプライマー濃度では、オルト-TINA PCR反応がC3スペーサー反応より良好に機能することを示す。
【０１０８】
図4Bは、アニーリング勾配における100 nMでのオルト-TINA（横列1）およびC3スペーサー（横列2）のPCR産物を示す。オルト-TINA PCR反応およびC3スペーサーPCR反応は両方とも、61.8℃から、それぞれ72.7℃および69.1℃までで機能し、100 nMのプライマー濃度では、オルト-TINA PCR反応がC3スペーサー反応より良好に機能することを示す。
【０１０９】
図5Aは、アニーリング勾配における200 nMでのオルト-TINA（横列1）およびC3スペーサー（横列2）のPCR産物を示す。オルト-TINA PCR反応およびC3スペーサーPCR反応は両方とも、61.8℃から、それぞれ80.0℃および70.9℃までで機能し、200 nMのプライマー濃度では、オルト-TINA PCR反応がC3スペーサー反応より良好に機能することを示す。しかし、オルト-TINAについての最後のPCR反応は、弱いバンドしか生成しない。
【０１１０】
図5Bは、アニーリング勾配における400 nMでのオルト-TINA（横列1）およびC3スペーサー（横列2）のPCR産物を示す。オルト-TINA PCR反応およびC3スペーサーPCR反応は両方とも、61.8℃から、それぞれ80.0℃および72.7℃までで機能し、400 nMのプライマー濃度では、オルト-TINA PCR反応がC3スペーサー反応より良好に機能することを示す。
【０１１１】
オルト-TINAおよびC3スペーサープライマーを含むPCR結果の総合的な結論。オルト-TINAプライマーは概して、C3スペーサーを含有するプライマーより良好に機能する。オルト-TINAプライマーは、すべての検定した濃度で、C3スペーサープライマーより高いアニーリング温度で機能する。このことは、オルト-TINAプライマーがより低い濃度で使用可能であり、かつC3スペーサーを含有するプライマーと同様に機能できること、または、オルト-TINAを含有するプライマーがより高いアニーリング温度で使用可能であり、かつC3スペーサープライマーと同様に機能できることを意味する。これはマルチプレックスPCRにおける大きな利点につながる。なぜなら、より良好な結果が得られる一方で、プライマー濃度を減少させることができ、アニーリング温度を上昇させることができるためである。
【０１１２】
その次の段階は、CliffHangerプライマーにおけるオルト-TINAがDNAポリメラーゼを停止でき、それにより一本鎖オーバーハングを生成できることを示すことである。オルト-TINAがDNAポリメラーゼを停止させる能力を検定するために、本発明者らは、一本鎖オリゴでコーティングしたLuminexビーズへのPCR産物の捕捉試験を行う。オルト-TINAがDNAポリメラーゼを停止させて一本鎖オーバーハングを生成する能力を有するならば、少なくともC3スペーサー断片と同じくらい良好に、Luminexビーズ上にオルト-TINA断片を捕捉することが可能であると考えられる。
【０１１３】
本発明者らは、5μlのPCR産物を使用したアガロースゲル解析と比較して、Luminex捕捉検定のために、1μlの精製したPCR断片を使用する。本発明者らは、400 nMの実験から4種類のアニーリング温度を選択し、それらからPCR産物を精製する（下記参照）。
2013524841.tif 000012
【０１１４】
PCR断片を、プロトコルに従って、MN Nucleospin Extract II kit（Macherey-Nagel）で精製する。実験における状況および影響を把握するために、精製したPCR産物を、開始容積と同じ容積中に溶出させる。
【０１１５】
Luminex捕捉解析を、以下のように実施する：1μlの精製PCR産物を6回にわたり3倍希釈し、希釈系列（1；0.3333；0.1111；0.0370；0.0123；0.0041；0.0014μl）を生成する。PCR産物を、20 mM NaH2PO4/Na2HPO4＋400 mM NaCl＋0.03％ Triton x-100、pH 6,94の最終濃度を有するHB緩衝液中、かつ捕捉オリゴを伴うluminexビーズの存在下で（ウェル当たり0.2μl）、解析する。捕捉混合物を、51℃および900 rpmで30分間インキュベーションする。インキュベーション後、反応物を3回、洗浄緩衝液（4倍希釈したHB緩衝液）で洗浄する。最後の洗浄の後、検出混合物を反応物に添加する。これは、洗浄緩衝液中の100μg/mlアルブミンフラクションV（Merck）および5μg/mlストレプトアビジン-R-フィコエリスリン（Sigma）からなっている。検出混合物を、51℃および900 rpmで15分間インキュベーションし、その後洗浄緩衝液で3回洗浄する。Luminex機器は、90秒間にわたってウェル当たり300個のビーズを計数するようにプログラミングされる。
【０１１６】
結果
捕捉解析（図6）からの結果は、オルト-TINA PCR産物が捕捉され得ることを示し、従ってこのことは、オルト-TINAがDNAポリメラーゼを停止させて、一本鎖オーバーハングを生成できることを意味している。Luminexの結果は、アガロースゲル解析からの結果を反映している。オルト-TINA PCR産物は、アガロースゲル上でC3スペーサー産物よりも高い濃度を有するようであり、かつLuminex解析においてもオルト-TINAは、C3スペーサー産物より高いMFIを生じる。これは、オルト-TINAが、少なくともC3スペーサーと同程度に良好にDNAポリメラーゼを停止させることを示す。MFIは、アガロースゲル上のPCR産物のバンドの強度と相関する。最少で0.0014μlのPCR産物を検出できる（希釈曲線は良好な直線性を有する）ので、Luminexアッセイもまた、アガロースゲルより高感度であるようである。アガロースゲルでは2種類のプライマー間の差異がおよそ3℃であるのに対して、Luminex解析においてはおよそ6℃であり、このことは、Luminex機器がアガロースゲルよりも高感度でありかつより良好に識別できることを示す。
【０１１７】
最終結論
本発明者らは、オルト-TINAが、C3スペーサーと比較してPCR反応を改善すること、およびまた、少なくともC3スペーサーと同程度に良好にDNAポリメラーゼを停止できることを示している。
【図１】
2013524841.tif 000015
【図２】
2013524841.tif 000016
【図３】
2013524841.tif 000017
【図４】
2013524841.tif 000018
【図５】
2013524841.tif 000019
【図６】
2013524841.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成25年1月8日(2013.1.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a. 鋳型核酸を提供する段階
b. 3'端にプライマー／鋳型（pt）領域（該鋳型核酸の一部に相補的である）を含み、かつ捕捉領域（cr）を含む、二官能性オリゴヌクレオチド（bfo）を提供する段階であって、該pt領域および該cr領域がポリメラーゼブロック（B）により分離されている、段階
c. 段階a〜bの成分を混合する段階、ならびに、該bfoの該pt領域が該鋳型核酸にアニールすることおよび増幅される鋳型核酸の産生を該Bが改善することを可能にする条件を提供する段階
d. プライマー伸長を可能にする条件の下で、該bfoの該pt領域を伸長させる段階
e. それにより、該bfoの該cr領域に対応する一本鎖オーバーハングを有する二本鎖核酸（dso）を生成する段階
を含む方法であって、該ポリメラーゼブロック（B）が、以下の式
2013524841.tif 000021
により記載され得るTINAモノマーである、方法：
式中、Rは、アリールエチニル、ピレンエチニル、および1H-フェナントロ[9,10-d]イミダゾール-2-イルからなる群より選択される。
【請求項２】
以下の段階をさらに含む、請求項1記載の方法：
f. 段階dの第1の伸長産物に相補的である第2のプライマーを提供する段階
g. 段階dの産物を変性させる段階
h. プライマー伸長を可能にする条件の下で、第1の伸長産物にアニールさせた第2のプライマーを伸長させる段階。
【請求項３】
マルチプレックスPCR用の第2のプライマーセットを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項４】
前記dsoの前記捕捉領域（cr）を捕捉プローブにアニールさせる捕捉段階をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記捕捉プローブが、固体支持体上に固定化されているか、あるいは固体支持体への固定化に適合している、請求項4記載の方法。
【請求項６】
アニールした分子をアニールしていない分子から分離するための分画段階をさらに含む、請求項5記載の方法。
【請求項７】
前記捕捉プローブがインターカレーターを含む、請求項4〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記インターカレーターが、請求項1に記載されるようなTINAモノマーである、請求項7記載の方法。
【請求項９】
以下をさらに含む、請求項4〜8のいずれか一項記載の方法：
a. 固定化された標的増幅産物が可視化される、検出期、および／または
b. 該固定化された標的増幅産物が精製される、精製期、および／または
c. 該固定化された標的増幅産物がさらに操作される、操作期。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
本発明は、1つまたは2つの一本鎖オーバーハングを有する二本鎖標的増幅産物の構築と、そのような標的増幅産物の改善された産生とを組み合わせる方法を提供する。一本鎖オーバーハングは、増幅後の捕捉およびその後の検出／操作のために使用することができる。一本鎖オーバーハングにより、二本鎖標的増幅産物の相補鎖からの干渉を受けない、改善された捕捉／検出／操作が可能になる。
[本発明1001]
a. 鋳型核酸を提供する段階
b. 3'端にプライマー／鋳型（pt）領域（該鋳型核酸の一部に相補的である）を含み、かつ捕捉領域（cr）を含む、二官能性オリゴヌクレオチド（bfo）を提供する段階であって、該pt領域および該cr領域がポリメラーゼブロック（B）により分離されている、段階
c. 段階a〜bの成分を混合する段階、ならびに、該bfoの該pt領域が該鋳型核酸にアニールすることおよび増幅される鋳型核酸の産生を該Bが改善することを可能にする条件を提供する段階
d. プライマー伸長を可能にする条件の下で、該bfoの該pt領域を伸長させる段階
e. それにより、該bfoの該cr領域に対応する一本鎖オーバーハングを有する二本鎖核酸（dso）を生成する段階
を含む方法であって、該ポリメラーゼブロック（B）が、インターカレーターを含みかつ以下の一般式
X - L - I
により記載され得る、方法：
式中、Xは、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体、またはPNA、またはPNA類似体の主鎖中に組み入れられ得る主鎖モノマー単位であり、Lはリンカーであり、Iは、DNA、RNA、またはそれらの類似体の核酸塩基とコスタッキングする（co-stack）ことができる少なくとも一つの本質的に平坦な共役系を含むインターカレーターである。
[本発明1002]
前記インターカレーターがピレンである、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記インターカレーターが、以下の一般構造Z
X - L - I1 - C - I2
により記載されるTINAモノマー中に存在する、前記本発明のいずれかの方法：
式中、Xは、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体、またはPNA、またはPNA類似体の主鎖中に組み入れられ得る主鎖モノマー単位であり、Lはリンカーであり、I1は、DNA、RNA、またはそれらの類似体の核酸塩基とコスタッキングすることができる少なくとも一つの本質的に平坦な共役系を含む第1のインターカレーターであり、Cは、任意の共役部（conjugator）であり、かつI2は、DNA、RNA、またはそれらの類似体の核酸塩基とコスタッキングすることができる少なくとも一つの本質的に平坦な共役系を含む第2のインターカレーターである。
[本発明1004]
Xがアルキレンジオールを含み、Lが、アルキル鎖、オキサアルキル鎖、アザアルキル鎖、チアアルキル鎖、カルボキサミド基、チオカルボキサミド基、スルホンアミド基、またはそれらの組み合わせを含む、リンカーであり、かつ0〜60を含み、I1が、ベンゼン、ナフタレン、アズレン、および二環式ヘテロ芳香環系からなる群より選択される単環式または多環式の芳香族環系であり、I2が、二環式芳香族環系、三環式芳香族環系、四環式芳香族環系、五環式芳香族環系、およびそれらのヘテロ芳香族類似体、ならびにそれらの置換体の群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1005]
Cが、炭素1〜12個のアルキル、炭素2〜12個のアルケニル、炭素2〜25個のアルキニル、もしくはジアゾ、または、炭素もしくは／および窒素原子25個以下の長さを有するそれらの組み合わせの群より選択される共役部である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1006]
I1およびI2が、共役系を介して直接連結される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1007]
Zが、以下の式
2013524841.tif 000022
により記載され得る、前記本発明のいずれかの方法：
式中、Rは、アリールエチニル、ピレンエチニル、および1H-フェナントロ[9,10-d]イミダゾール-2-イルからなる群より選択される。
[本発明1008]
以下の段階をさらに含む、前記本発明のいずれかの方法：
f. 段階dの第1の伸長産物に相補的である第2のプライマーを提供する段階
g. 段階dの産物を変性させる段階
h. プライマー伸長を可能にする条件の下で、第1の伸長産物にアニールさせた第2のプライマーを伸長させる段階。
[本発明1009]
マルチプレックスPCR用の第2のプライマーセットを含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記dsoの前記捕捉領域（cr）を捕捉プローブにアニールさせる捕捉段階をさらに含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記捕捉プローブが、固体支持体上に固定化されているか、あるいは固体支持体への固定化に適合している、本発明1010の方法。
[本発明1012]
アニールした分子をアニールしていない分子から分離するための分画段階をさらに含む、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記捕捉プローブが、前記本発明のいずれかに記載されるようなTINAモノマーを含む、本発明1010〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
以下をさらに含む、本発明1010〜1013のいずれかの方法：
a. 固定化された標的増幅産物が可視化される、検出期、および／または
b. 該固定化された標的増幅産物が精製される、精製期、および／または
c. 該固定化された標的増幅産物がさらに操作される、操作期。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2013524841000001.app
【国際調査報告】
2013524841.tif 000023
2013524841.tif 000024
2013524841.tif 000025