(57)【要約】本発明は、凝集体を含有する疑いがある試料を、凝集体特異的結合試薬と、前記試薬と存在するならば前記凝集体とが結合することを可能にする条件下で接触させ、試料中の、もしあるならば凝集体の存在を、凝集体と試薬との結合により検出することにより、試料中の凝集体の存在を検出する方法を提供し、ここで、凝集体特異的結合試薬は、典型的に、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。オリゴマーの存在を検出する方法も提供される。これらの方法において用いるための組成物も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の凝集体の存在を検出するための方法であって、前記方法は：
凝集体を含有する疑いがある試料と、凝集体特異的結合試薬とを、前記試薬と、存在するならば前記凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、
前記試料中の、もしあるならば凝集体の存在を、凝集体と前記凝集体特異的結合試薬との結合により検出するステップと
を含み、
前記凝集体特異的結合試薬が、
前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、
１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、
前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、
方法。
【請求項２】
試料中の凝集体の存在を検出するための方法であって、前記方法は：
凝集体を含有する疑いがある試料と、凝集体特異的結合試薬とを、前記試薬と、存在するならば前記凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、
前記複合体と、コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬とを、結合を可能にする条件下で接触させるステップと、
前記試料中の、もしあるならば凝集体の存在を、凝集体と前記コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬との結合により検出するステップと
を含み、
前記凝集体特異的結合試薬が、
前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、
１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、
前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、
方法。
【請求項３】
前記複合体を形成した後に、未結合の試料を除去するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬が、抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記凝集体が、Ａβタンパク質を含み、前記コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬が、抗Ａβ抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
試料中の凝集体の存在を検出する方法であって、前記方法は：
凝集体を含有する疑いがある試料と、凝集体特異的結合試薬とを、前記試薬と、存在するならば前記凝集体とが結合して第１複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、
未結合の試料を除去するステップと、
前記凝集体を、前記第１複合体から解離させて、解離凝集体を提供するステップと、
前記解離凝集体と、第１コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬とを、結合して第２複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、
前記試料中の、もしあるならば凝集体の存在を、前記第２複合体の形成を検出することにより検出するステップと
を含み、
前記凝集体特異的結合試薬が、
前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、
１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、
前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、
方法。
【請求項７】
前記第２複合体の形成が、検出可能に標識された第２コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬を用いて検出される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第１コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬が、固体支持体に連結されている、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記凝集体が、前記第１複合体をチオシアン酸グアニジンに曝露することにより、前記第１複合体から解離される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記凝集体が、前記複合体を高ｐＨまたは低ｐＨに曝露することにより、前記第１複合体から解離される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記凝集体が、Ａβタンパク質を含み、前記コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬が、抗Ａβ抗体である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
試料中の凝集体の存在を検出するための方法であって、前記方法は：
凝集体を含有する疑いがある試料と、コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬とを、前記試薬と、存在するならば前記凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、
未結合の試料を除去するステップと、
前記複合体を、検出可能な標識を含む凝集体特異的結合試薬とを、前記試薬と前記凝集体との結合を可能にする条件下で接触させるステップと、
前記試料中の、もしあるならば凝集体の存在を、凝集体と前記凝集体特異的結合試薬との結合により検出するステップと
を含み、
前記凝集体特異的結合試薬が、
前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、
１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、
前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、
方法。
【請求項１３】
前記コンフォメーションタンパク質特異的タンパク質が、固体支持体と連結されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
試料中の凝集体の存在を検出するための方法であって、前記方法は：
凝集体特異的結合試薬を含む固体支持体を提供するステップと、
前記固体支持体を、検出可能に標識されたリガンドと組み合わせるステップであって、前記凝集体特異的結合試薬が前記検出可能に標識されたリガンドと結合するアビディティが、前記試薬が前記凝集体と結合するアビディティより弱い、ステップと、
凝集体を含有する疑いがある試料と、前記固体支持体とを、前記試料中に存在する場合に前記凝集体が前記試薬と結合して、前記リガンドを置き換えることを可能にする条件下で組み合わせるステップと、
前記凝集体と前記凝集体特異的結合試薬との間で形成された複合体を検出するステップと
を含み、
前記凝集体特異的結合試薬が、
前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、
１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、
前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、
方法。
【請求項１５】
ポリペプチド試料中の凝集体の量を低減するための方法であって、前記方法は：
凝集体を含有する疑いがあるポリペプチド試料と、凝集体特異的結合試薬とを、前記試薬と、存在するならば前記凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、
未結合のポリペプチド試料を収集するステップと
を含み、
前記凝集体特異的結合試薬が、
前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、
１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、
前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、
方法。
【請求項１６】
試料中の凝集体とモノマーとを識別するための方法であって、前記方法は：
凝集体を含有する疑いがある試料と、凝集体特異的結合試薬とを、前記試薬と、存在するならば前記凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、
前記試料中の、もしあるならば凝集体とモノマーとを、凝集体と前記凝集体特異的結合試薬との結合により識別するステップと
を含み、
前記凝集体特異的結合試薬が、
前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、
１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、
前記固体支持体に付着している場合に、前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、
方法。
【請求項１７】
被験体についてコンフォメーション疾患の増大した蓋然性が存在しているか否かを評価するための方法であって、前記方法は：
コンフォメーション疾患を有する疑いがある被験体からの生物学的試料と、凝集体特異的結合試薬とを、前記試薬と、存在するならば病原性凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、
前記生物学的試料中の、もしあるならば病原性凝集体の存在を、凝集体と前記凝集体特異的結合試薬との結合により検出するステップと、
前記生物学的試料中の病原性凝集体の量がコンフォメーション疾患を有さない被験体からの試料中の凝集体の量より高いならば、前記被験体がコンフォメーション疾患を有することの増大した蓋然性が存在していることを決定するステップと
を含み、
前記凝集体特異的結合試薬が、
前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、
１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、
前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、
方法。
【請求項１８】
コンフォメーション疾患についての処置の有効性を評価するための方法であって、前記方法は：
コンフォメーション疾患についての処置を受けた患者からの生物学的試料と、凝集体特異的結合試薬とを、前記試薬と、存在するならば病原性凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、
前記試料中の、もしあるならば病原性凝集体の存在を、凝集体と前記凝集体特異的結合試薬との結合により検出するステップと、
前記生物学的試料中の病原性凝集体の量が対照中の病原性凝集体の量よりも低いならば、前記処置が有効であることを決定するステップであって、前記対照が、コンフォメーション疾患についての処置前の前記患者からの生物学的試料中の病原性凝集体の量である、ステップと
を含み、
前記凝集体特異的結合試薬が、
前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、
１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、
前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、
方法。
【請求項１９】
前記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約９０ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１２０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１０００ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記凝集体または病原性凝集体が、可溶性である、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
試料中のオリゴマーの存在を検出するための方法であって、前記方法は：
オリゴマーを含有する疑いがある試料を提供するステップであって、前記試料が、オリゴマー以外の凝集体を欠く、ステップと、
前記試料と、凝集体特異的結合試薬とを、前記試薬と、存在するならば前記オリゴマーとが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、
前記試料中の、もしあるならばオリゴマーの存在を、オリゴマーと前記凝集体特異的結合試薬との結合により検出するステップと
を含み、
前記凝集体特異的結合試薬が、
前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、
１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、
前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、
方法。
【請求項２３】
試料中のオリゴマーの存在を検出するための方法であって、前記方法は：
オリゴマーを含有する疑いがある試料を提供するステップと、
前記試料からオリゴマー以外の凝集体を除去するステップと、
前記試料と、凝集体特異的結合試薬とを、前記試薬と、存在するならば前記オリゴマーとが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、
前記試料中の、もしあるならばオリゴマーの存在を、オリゴマーと前記凝集体特異的結合試薬との結合により検出するステップと
を含み、
前記凝集体特異的結合試薬が、
前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、
１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、
前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、
方法。
【請求項２４】
前記凝集体の除去が、遠心分離による、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
試料中のオリゴマーの存在を検出するための方法であって、前記方法は：
オリゴマーを含有する疑いがある試料と、凝集体特異的結合試薬とを、前記試薬と、存在するならば前記オリゴマーとが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、
前記複合体を第２試薬と接触させるステップであって、前記試薬が、オリゴマーまたはオリゴマー以外の凝集体のいずれかと優先的に結合する、ステップと、
前記試料中の、もしあるならばオリゴマーの存在を、オリゴマーと前記第２試薬との結合または結合の欠如により検出するステップと
を含み、
前記凝集体特異的結合試薬が、
前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、
１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、
前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、
方法。
【請求項２６】
オリゴマー以外の前記凝集体が、原線維を含む、請求項２２〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記オリゴマーが、可溶性である、請求項２２〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記凝集体特異的結合試薬と前記凝集体またはオリゴマーとの間で形成された前記複合体を、洗浄剤で処理するステップをさらに含む、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記処理するステップが、前記接触させるステップの後に行われる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記洗浄剤が、中性洗浄剤である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記洗浄剤が、正電荷および負電荷の両方を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記洗浄剤が、長い炭素鎖を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記洗浄剤が、モノラウリン酸ポリエチレングリコールソルビタン、ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、アミドスルホベタイン−１４，３−［Ｎ，Ｎ−ジメチル（３−ミリストイルアミノプロピル）アンモニオ］プロパンスルホネート、アミドスルホベタイン−１６，３−［Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（３−パルミトアミドプロピル）アンモニオ］プロパン−１−スルホネート、４−ｎ−オクチルベンゾイルアミド−プロピル−ジメチルアンモニオスルホベタインおよびＮ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ドデシルグリシンベタインからなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記固体支持体が、ニトロセルロース、ポリスチレンラテックス、フッ化ポリビニル、ジアゾ化ペーパー、ナイロンメンブレン、活性化ビーズ、磁気反応性ビーズ、酸化チタン、酸化ケイ素、多糖ビーズ、多糖メンブレン、アガロース、ガラス、ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール−ポリスチレンハイブリッド、孔径制御ガラス、ガラススライド、金ビーズおよびセルロースからなる群より選択される、請求項１〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記凝集体特異的結合試薬が、検出可能に標識されている、請求項１〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記試料が、体組織または体液を含む生物学的試料である、請求項１〜１４または１６〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記生物学的試料が、全血、血液分画物、血液成分、血漿、血小板、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、骨髄、尿、涙、乳汁、リンパ液、器官組織、脳組織、神経系組織、筋肉組織、非神経系組織、生検材料、剖検材料、脂肪生検材料、細胞、大便、胎盤、脾臓組織、リンパ組織、膵臓組織、気管支肺胞洗浄液または滑液を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記試料が、脳脊髄液（ＣＳＦ）を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記試料が、ポリペプチドを含む、請求項１〜１４または１９〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記凝集体特異的結合試薬が、前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約２の正の、少なくとも約３の正の、少なくとも約４の正の、少なくとも約５の正の、少なくとも約６の正のまたは少なくとも約７の正の正味電荷を有する、請求項１〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約３０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約４０００ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している、請求項１〜４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約７０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約８０００ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約９０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している、請求項１〜４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
前記凝集体特異的結合試薬が、モノマーに対する結合親和性および／またはアビディティより少なくとも約２倍高い、凝集体に対する結合親和性および／またはアビディティを有する、請求項１〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記凝集体特異的結合試薬が、前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨより少なくとも約１ｐＨ単位高いｐＫａを有する少なくとも１つの正に荷電した官能基を含む、請求項１〜４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記少なくとも１つの正に荷電した官能基が、前記凝集体特異的結合試薬の全ての官能基のうちで前記固体支持体に最も近い、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記凝集体特異的結合試薬が、疎水性官能基を含む、請求項１〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記疎水性官能基が、芳香族疎水性官能基である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記疎水性官能基が、脂肪族疎水性官能基である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記凝集体特異的結合試薬が、１つだけの正に荷電した官能基と、少なくとも１つの疎水性官能基とを含む、請求項１〜４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
前記凝集体特異的結合試薬が、少なくとも１つの正に荷電した官能基と、１つだけの疎水性官能基とを含む、請求項１〜４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
前記凝集体特異的結合試薬が、１つだけの正に荷電した官能基と、１つだけの疎水性官能基とを含む、請求項１〜４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
前記凝集体特異的結合試薬が、Ｌ−異性体である少なくとも１つのアミノ酸を含む、請求項１〜５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
前記凝集体特異的結合試薬が、Ｄ−異性体である少なくとも１つのアミノ酸を含む、請求項１〜５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
前記凝集体が、非病原性である、請求項１〜１６または１９〜５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
前記非病原性凝集体が、酵母プリオンタンパク質ｓｕｐ３５またはホルモンである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記非病原性凝集体が、ポリペプチドの凝集体である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記凝集体が、病原性である、請求項１〜４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
前記病原性凝集体が、子かん前症、タウオパチー、ＴＤＰ−４３タンパク質症またはセルピン病と関連する凝集体である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記病原性凝集体が、アミロイド疾患と関連する凝集体である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記アミロイド疾患が、全身性アミロイドーシス、ＡＡアミロイドーシス、シヌクレイン病、アルツハイマー病、プリオン病、ＡＬＳ、免疫グロブリン関連疾患、血清アミロイドＡ関連疾患、ハンチントン病、パーキンソン病、ＩＩ型糖尿病、透析アミロイドーシスおよび脳のアミロイドアンギオパチーからなる群より選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記病原性凝集体が、アルツハイマー病と関連する凝集体である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
前記病原性凝集体が、脳のアミロイドアンギオパチーと関連する凝集体である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
アルツハイマー病または脳のアミロイドアンギオパチーと関連する前記凝集体が、アミロイド−ベータ（Ａβ）タンパク質を含む、請求項６１または６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記Ａβタンパク質が、Ａβ４０である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記Ａβタンパク質が、Ａβ４２である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
アルツハイマー病と関連する前記凝集体が、タウタンパク質を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６７】
前記病原性凝集体が、アミリンを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６８】
前記病原性凝集体が、アミロイドＡタンパク質を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６９】
前記病原性凝集体が、アルファ−シヌクレインを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項７０】
前記凝集体特異的結合試薬が、前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて少なくとも１の正味正電荷を有する少なくとも１つのアミノ酸を含む、請求項１〜６７のいずれかに記載の方法。
【請求項７１】
前記少なくとも１つのアミノ酸が、生理的ｐＨにて正に荷電されている、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記少なくとも１つのアミノ酸が、リシンおよびアルギニンからなる群より選択される天然アミノ酸である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記少なくとも１つのアミノ酸が、オルニチン、メチルリシン、ジアミノ酪酸、ホモアルギニンおよび４−アミノメチルフェニルアラニンからなる群より選択される非天然アミノ酸である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記凝集体特異的結合試薬が、疎水性アミノ酸を含む、請求項１〜７３のいずれかに記載の方法。
【請求項７５】
前記疎水性アミノ酸が、芳香族疎水性アミノ酸である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記疎水性アミノ酸が、脂肪族疎水性アミノ酸である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記疎水性アミノ酸が、トリプトファン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、チロシン、ホモフェニルアラニン、フェニルグリシン、４−クロロフェニルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、チエニルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、４−アミノフェニルアラニン、ペンタフルオロフェニルアラニン、２−ナフチルアラニン、ｐ−ビフェニルアラニン、スチリルアラニン、置換フェニルアラニン、ハロゲン化フェニルアラニン、アミノイソ酪酸、アリルグリシン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、１−ナフチルアラニン、ピリジルアラニンおよび１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸からなる群より選択される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７８】
前記凝集体特異的結合試薬が、
【化４１】
2013510297.tif 000076
からなる群より選択されるペプチドを含む、請求項１〜７７のいずれかに記載の方法。
【請求項７９】
前記凝集体特異的結合試薬が、Ｆ−ｆｄｂ−Ｆ−ｆｄｂ−ｆｄｂ−ｆｄｂ（配列番号５３）、ＦｏＦｏｏｏ（配列番号５４）、モノＢｏｃ−エチレンジアミン＋ＢｒＣＨ２ＣＯ−ＫＫＦＫＦ（配列番号５５）、トリエチルアミン＋ＢｒＣＨ２ＣＯ−ＫＫＦＫＦ（配列番号５６）、テトラメチルエチレンジアミン＋ＢｒＣＨ２ＣＯ−ＫＫＦＫＦ（配列番号５７）および配列番号５８〜６６からなる群より選択されるペプチドを含む、請求項１〜７７のいずれかに記載の方法。
【請求項８０】
前記凝集体特異的結合試薬が、
【化４２】
2013510297.tif 000077
からなる群より選択されるペプチドを含む、請求項１〜７７のいずれかに記載の方法。
【請求項８１】
前記凝集体特異的結合試薬が、
【化４３】
2013510297.tif 000078
【化４４】
2013510297.tif 000079
【化４５】
2013510297.tif 000080
【化４６】
2013510297.tif 000081
からなる群より選択されるペプトイドを含み、ここで、式中、ＲおよびＲ’は任意の基である、請求項１〜７７のいずれかに記載の方法。
【請求項８２】
前記凝集体特異的結合試薬が、配列番号９〜１４および９１〜９６からなる群より選択されるペプトイドを含む、請求項１〜７７のいずれかに記載の方法。
【請求項８３】
前記凝集体特異的結合試薬が、
【化４７】
2013510297.tif 000082
を含み、ここで、式中、ＲおよびＲ’は、任意の基である、請求項１〜７７のいずれかに記載の方法。
【請求項８４】
前記凝集体特異的結合試薬が、
【化４８】
2013510297.tif 000083
のデンドロンを含む、請求項１〜８３のいずれかに記載の方法。
【請求項８５】
前記凝集体特異的結合試薬が、アミン、アルキル基、複素環、シクロアルカン、グアニジン、エーテル、アリルおよび芳香族からなる群より選択される官能基を含む、請求項１〜８４のいずれかに記載の方法。
【請求項８６】
前記凝集体特異的結合試薬が、ナフチル、フェノール、アニリン、フェニル、置換フェニル、ニトロフェニル、ハロゲン化フェニル、ビフェニル、スチリル、ジフェニル、ベンジルスルホンアミド、アミノメチルフェニル、チオフェン、インドリル、ナフチル、フランおよびイミダゾールからなる群より選択される芳香族官能基を含む、請求項１〜８５のいずれかに記載の方法。
【請求項８７】
前記ハロゲン化フェニルが、クロロフェニルまたはフルオロフェニルである、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記凝集体特異的結合試薬が、第１級アミン、第２級アミン、第３級アミンおよび第４級アミンからなる群より選択されるアミン官能基を含む、請求項１〜８５のいずれかに記載の方法。
【請求項８９】
前記凝集体特異的結合試薬が、イソブチル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチルおよびメチルならびにオクチルからなる群より選択されるアルキル官能基を含む、請求項１〜８５のいずれかに記載の方法。
【請求項９０】
前記凝集体特異的結合試薬が、テトラヒドロフラン、ピロリジンおよびピペリジンからなる群より選択される複素環官能基を含む、請求項１〜８５のいずれかに記載の方法。
【請求項９１】
前記凝集体特異的結合試薬が、シクロプロピルおよびシクロヘキシルからなる群より選択されるシクロアルカン官能基を含む、請求項１〜８５のいずれかに記載の方法。
【請求項９２】
前記凝集体特異的結合試薬が、反復モチーフを含む、請求項１〜９１のいずれかに記載の方法。
【請求項９３】
前記凝集体特異的結合試薬が、前記凝集体の負に荷電した基のものと同じ間隔で正に荷電した基を含む、請求項１〜９２のいずれかに記載の方法。
【請求項９４】
前記凝集体特異的結合試薬が、配列番号１または配列番号１５を含む、請求項１〜９３のいずれかに記載の方法。
【請求項９５】
前記凝集体が、アミリンを含み、前記凝集体特異的結合試薬が、配列番号１５を含み、前記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約８０００ｎｍｏｌ〜約１５０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している、請求項１、６、１２、１４および１６のいずれかに記載の方法。
【請求項９６】
前記凝集体が、アルファ−シヌクレインを含み、前記凝集体特異的結合試薬が、配列番号１５を含み、前記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約８０００ｎｍｏｌ〜約１５０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している、請求項１、６、１２、１４および１６のいずれかに記載の方法。
【請求項９７】
前記凝集体が、アミロイドＡタンパク質を含み、前記凝集体特異的結合試薬が、配列番号１５を含み、前記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約８０００ｎｍｏｌ〜約１５０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している、請求項１、６、１２、１４および１６のいずれかに記載の方法。
【請求項９８】
前記洗浄剤が、ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートであり、前記凝集体が、Ａβ４０タンパク質を含む病原性凝集体であり、前記凝集体特異的結合試薬が、配列番号１５を含み、前記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約８０００ｎｍｏｌ〜約１５０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している、請求項３３に記載の方法。
【請求項９９】
前記試料が、脳脊髄液（ＣＳＦ）を含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
以下：
【化４９】
2013510297.tif 000084
らなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド凝集体特異的結合試薬。
【請求項１０１】
ＫＫＫＫＫＫ（配列番号４）のアミノ酸配列からなるペプチドを含む、ペプチド凝集体特異的結合試薬。
【請求項１０２】
Ｆ−ｆｄｂ−Ｆ−ｆｄｂ−ｆｄｂ−ｆｄｂ（配列番号５３）、ＦｏＦｏｏｏ（配列番号５４）、モノＢｏｃ−エチレンジアミン＋ＢｒＣＨ２ＣＯ−ＫＫＦＫＦ（配列番号５５）、トリエチルアミン＋ＢｒＣＨ２ＣＯ−ＫＫＦＫＦ（配列番号５６）、テトラメチルエチレンジアミン＋ＢｒＣＨ２ＣＯ−ＫＫＦＫＦ（配列番号５７）および配列番号５８〜６６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド凝集体特異的結合試薬。
【請求項１０３】
以下：
【化５０】
2013510297.tif 000085
【化５１】
2013510297.tif 000086
【化５２】
2013510297.tif 000087
からなる群より選択されるペプトイドを含む、ペプトイド凝集体特異的結合試薬であって、式中、ＲおよびＲ’は、任意の基である、ペプトイド凝集体特異的結合試薬。
【請求項１０４】
配列番号９〜１４および９１〜９５からなる群より選択されるペプトイドを含む、ペプトイド凝集体特異的結合試薬。
【請求項１０５】
疎水性官能基を含む、請求項１００〜１０４のいずれかに記載の凝集体特異的結合試薬。
【請求項１０６】
前記疎水性官能基が、芳香族疎水性官能基である、請求項１０５に記載の凝集体特異的結合試薬。
【請求項１０７】
前記疎水性官能基が、脂肪族疎水性官能基である、請求項１０５に記載の凝集体特異的結合試薬。
【請求項１０８】
アミン、アルキル基、複素環、シクロアルカン、グアニジン、エーテル、アリルおよび芳香族からなる群より選択される官能基を含む、請求項１００〜１０７のいずれかに記載の凝集体特異的結合試薬。
【請求項１０９】
ナフチル、フェノール、アニリン、フェニル、置換フェニル、ニトロフェニル、ハロゲン化フェニル、ビフェニル、スチリル、ジフェニル、ベンジルスルホンアミド、アミノメチルフェニル、チオフェン、インドリル、ナフチル、フランおよびイミダゾールからなる群より選択される芳香族官能基を含む、請求項１００〜１０８のいずれかに記載の凝集体特異的結合試薬。
【請求項１１０】
前記ハロゲン化フェニルが、クロロフェニルまたはフルオロフェニルである、請求項１０９に記載の凝集体特異的結合試薬。
【請求項１１１】
第１級アミン、第２級アミン、第３級アミンおよび第４級アミンからなる群より選択されるアミン官能基を含む、請求項１００〜１０８のいずれかに記載の凝集体特異的結合試薬。
【請求項１１２】
イソブチル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチルおよびメチルならびにオクチルからなる群より選択されるアルキル官能基を含む、請求項１００〜１０８のいずれかに記載の凝集体特異的結合試薬。
【請求項１１３】
テトラヒドロフラン、ピロリジンおよびピペリジンからなる群より選択される複素環官能基を含む、請求項１００〜１０８のいずれかに記載の凝集体特異的結合試薬。
【請求項１１４】
シクロプロピルおよびシクロヘキシルからなる群より選択されるシクロアルカン官能基を含む、請求項１００〜１０８のいずれかに記載の凝集体特異的結合試薬。
【請求項１１５】
検出可能に標識されている、請求項１００〜１１４のいずれかに記載の凝集体特異的結合試薬。
【請求項１１６】
固体支持体と、請求項１００〜１１５に記載の凝集体特異的結合試薬とを含む組成物。
【請求項１１７】
固体支持体と凝集体特異的結合試薬とを含む組成物であって、前記凝集体特異的結合試薬が、
【化５３】
2013510297.tif 000088
を含み、さらに、前記固体支持体がビーズを含む、組成物。
【請求項１１８】
固体支持体と、ペプチド凝集体特異的結合試薬とを含む組成物であって、前記試薬が、
【化５４】
2013510297.tif 000089
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、さらに、前記固体支持体がビーズを含む、組成物。
【請求項１１９】
前記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて前記固体支持体に付着しており、前記組成物が、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、請求項１１６〜１１８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２０】
前記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約９０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１２０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５００ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１０００ｎｍｏｌの電荷密度にて前記固体支持体に付着しており、前記組成物が、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、請求項１１６〜１１８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２１】
前記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約３０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約４０００ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５０００ｎｍｏｌの電荷密度にて前記固体支持体に付着しており、前記組成物が、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、請求項１１６〜１１８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２２】
前記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約７０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約８０００ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約９０００ｎｍｏｌの電荷密度にて前記固体支持体に付着しており、前記組成物が、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、請求項１１６〜１１８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２３】
前記固体支持体が、ニトロセルロース、ポリスチレンラテックス、フッ化ポリビニル、ジアゾ化ペーパー、ナイロンメンブレン、活性化ビーズ、磁気反応性ビーズ、酸化チタン、酸化ケイ素、多糖ビーズ、多糖メンブレン、アガロース、ガラス、ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール−ポリスチレンハイブリッド、孔径制御ガラス、ガラススライド、金ビーズおよびセルロースからなる群より選択される、請求項１１６〜１２２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２４】
請求項１１６〜１２３のいずれかに記載の組成物を含むキット。
【請求項１２５】
凝集体を検出するための、前記キットの使用についての使用説明書をさらに含む、請求項１２４に記載のキット。
【請求項１２６】
固体支持体と、
凝集体特異的結合試薬と、
凝集体を検出するための、キットの使用についての使用説明書と
を含むキットであって、前記凝集体特異的結合試薬が、
【化５５】
2013510297.tif 000090
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、前記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて前記固体支持体に付着しており、前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、キット。
【請求項１２７】
固体支持体と、
凝集体特異的結合試薬と、
凝集体を検出するための、キットの使用についての使用説明書と
を含むキットであって、前記凝集体特異的結合試薬が、
【化５６】
2013510297.tif 000091
を含み、前記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて前記固体支持体に付着しており、前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、キット。
【請求項１２８】
前記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約９０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１２０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５００ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１０００ｎｍｏｌの電荷密度にて前記固体支持体に付着している、請求項１２６または１２７に記載のキット。
【請求項１２９】
前記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約３０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約４０００ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５０００ｎｍｏｌの電荷密度にて前記固体支持体に付着している、請求項１２６または１２７に記載のキット。
【請求項１３０】
前記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約７０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約８０００ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約９０００ｎｍｏｌの電荷密度にて前記固体支持体に付着している、請求項１２６または１２７に記載のキット。
【請求項１３１】
試料中のＡβを含む凝集体の存在を検出するための方法であって、前記方法は：
Ａβを含む凝集体を含有する疑いがある試料と、凝集体特異的結合試薬とを、前記試薬と、存在するならば前記凝集体とが結合して第１複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、
未結合の試料を除去するステップと、
前記凝集体を、前記第１複合体から解離させて、解離凝集体を提供するステップと、
前記解離凝集体と、固体支持体と連結された第１抗Ａβ抗体とを、結合して第２複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、
前記試料中の、もしあるならば凝集体の存在を、検出可能に標識された第２抗Ａβ抗体を用いて前記第２複合体の形成を検出することにより検出するステップと
を含み、
前記凝集体特異的結合試薬が、
前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、
１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、
前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、
方法。
【請求項１３２】
前記凝集体特異的結合試薬が、
【化５７】
2013510297.tif 000092
【化５８】
2013510297.tif 000093
【化５９】
2013510297.tif 000094
からなる群より選択されるペプトイドを含み、ここで式中、ＲおよびＲ’は、任意の基である、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記凝集体特異的結合試薬が、
【化６０】
2013510297.tif 000095
および配列番号５３、５５、５６および５８〜６６からなる群より選択されるペプチドを含む、請求項１３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
タンパク質のミスフォールディングは、細胞において通常発生することである。しかし、ミスフォールディングされたタンパク質は自己会合する傾向にあり、これは、様々なサイズおよび構造のタンパク質凝集体をもたらす。ミスフォールディングされたタンパク質の存続は毒性の凝集体を導き得るので、細胞は、細胞におけるミスフォールディングされたタンパク質の量を低減するための経路および機構を有する。ミスフォールディングされたタンパク質中間体は、中間体の正しいフォールディングを支援する分子シャペロンにより認識される。ミスフォールディングされたタンパク質がシャペロンによる修正を逃れた場合、ユビキチン−プロテオソーム経路が、通常、これらを分解する。
【０００２】
ミスフォールディングされたタンパク質の蓄積は、多様な疾患と関連する。タンパク質コンフォメーション疾患は、正常タンパク質から病原性配座異性体への異常なコンフォメーション転換から生じる伝染性海綿状脳症、アルツハイマー病、ＡＬＳおよび糖尿病のような多様な臨床的に無関係の疾患を含む。この転換は、次いで、病原性配座異性体から、オリゴマーのような小さい凝集体または組織沈着をもたらす原線維のような大きい凝集体への自己会合を導くことができ、周囲の組織の損傷を導くと仮定されている。
【０００３】
生体被験体および生体被験体から得られた試料におけるコンフォメーション疾患タンパク質の凝集体の検出は、困難であることが示されている。生体患者における凝集体の存在を確認するための現在の技術は、洗練されておらず、侵襲性である。例えば、病理組織学的検査は、被験体にとって危険性がある生検を要求する。病理組織学は、本質的に、試料採取の誤りを生じやすい。なぜなら、病変および凝集した病原性配座異性体の沈着は、生検材料が採取される領域によっては見逃されることがあるからである。つまり、被験体の死亡前でのこれらの状態に対する確定診断および対症療法は、実質的にまだ対処されていない難題である。
【０００４】
アミロイド−ベータタンパク質（Ａβ）凝集体、主にＡβ１−４０（Ａβ４０）および１−４２（Ａβ４２）の沈着は、アルツハイマー病（ＡＤ）と徹底的に関連付けられており、この疾患の優れた標準マーカーであるとみなされている。しかし、ＡＤについての唯一の確定的試験は、死後の脳試料からの原線維状Ａβ凝集体のプラークの免疫組織化学的染色である。現在、ＡＤについてのＦＤＡ承認済み死亡前診断試験は存在しない。血漿またはＣＳＦ試料を、死亡前試験に用いることができる。いくつかの死亡前ＡＤ試験は、脳脊髄液（ＣＳＦ）に焦点を当てており、可溶性のモノマーＡβ４２を定量化することを試みている。しかし、このバイオマーカーは、ＡＤの間接的な測定値として働くだけである。
【０００５】
最近の文献は、Ａβの小さく可溶性で非原線維状オリゴマーの種が、アルツハイマー病表現型に直接寄与する神経毒性因子であるようであることを示唆している（非特許文献１；非特許文献２）。さらに、Ａβ４２に対して産生された抗体を用いて、Ａβオリゴマー種のレベルの上昇が、アルツハイマー病の患者から採取された脳脊髄液（ＣＳＦ）において、健常な対照の被験体から採取されたＣＳＦと比較して見出された（非特許文献３）。しかし、現在まで、オリゴマーと結合できる小分子は報告されていない。
【０００６】
つまり、ＣＳＦまたは血漿のようなその他の体液から直接、凝集したＡβを特異的に検出できる試験は、大きな利点を有する。可溶性Ａβオリゴマーのような凝集体の早期の検出は、アルツハイマー病についてのより迅速で、より効率的な診断と、潜在的な療法の評価とを可能にする。
【０００７】
体液の試料から直接、その他のコンフォメーション疾患タンパク質の病原性凝集体を検出できる試験も望まれている。なぜなら、これらも、これらのコンフォメーション疾患についてのより迅速でより早い診断と、潜在的な療法の評価とを可能にするからである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈｏｓｈｉら、ＰＮＡＳ、２００３年、１００巻、６３７０頁
【非特許文献２】Ｌａｍｂｅｒｔら、ＰＮＡＳ、１９９８年、９５巻、６４４８頁
【非特許文献３】Ｇｅｏｒｇａｎｏｐｏｕｌｏｕら、ＰＮＡＳ、２００５年、１０２巻、２２７３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
さらに、製造されたポリペプチドの品質管理も、凝集体と特異的に結合する試薬を用いることで利益を受ける。組換えインスリンまたは治療上の抗体のようなポリペプチドは、通常、高レベルで生成されるので、凝集体を形成する傾向にある。つまり、所望のポリペプチドの調製物から凝集体を除くために凝集体と特異的に結合できる試薬に対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書に記載される発明は、凝集体特異的結合試薬を用いて試料中の凝集体の存在を検出する方法を提供することにより、これらの必要性を満たす。好ましい実施形態では、この方法は、オリゴマーの存在を検出する。
【００１１】
つまり、一態様は、凝集体を含有する疑いがある試料を、凝集体特異的結合試薬と接触させるステップであって、前記試薬と、存在するならば前記凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、前記試料中の、もしあるならば凝集体の存在を、凝集体と前記凝集体特異的結合試薬との結合により検出するステップとを含み、前記凝集体特異的結合試薬が、前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、試料中の凝集体の存在を検出する方法を含む。
【００１２】
別の態様は、凝集体を含有する疑いがある試料を、凝集体特異的結合試薬と接触させるステップであって、前記試薬と、存在するならば前記凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、前記複合体を、コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬と接触させるステップであって、結合を可能にする条件下で接触させるステップと、前記試料中の、もしあるならば凝集体の存在を、凝集体と前記コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬との結合により検出するステップとを含み、前記凝集体特異的結合試薬が、前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、試料中の凝集体の存在を検出する方法を含む。あるいくつかの実施形態では、方法は、前記複合体を形成した後に、未結合の試料を除去するステップをさらに含む。あるいくつかの実施形態では、コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬は、抗体である。好ましい実施形態では、凝集体は、Ａβタンパク質を含有し、前記コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬が、抗Ａβ抗体である。
【００１３】
さらに別の態様は、凝集体を含有する疑いがある試料を、凝集体特異的結合試薬と接触させるステップであって、前記試薬と、存在するならば前記凝集体とが結合して第１複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、未結合の試料を除去するステップと、前記凝集体を、前記第１複合体から解離させて、解離凝集体を提供するステップと、前記解離凝集体を、第１コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬と接触させるステップであって、結合して第２複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、前記試料中の、もしあるならば凝集体の存在を、前記第２複合体の形成を検出することにより検出するステップとを含み、前記凝集体特異的結合試薬が、前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、試料中の凝集体の存在を検出する方法を含む。あるいくつかの実施形態では、前記第２複合体の形成は、検出可能に標識された第２コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬を用いて検出される。あるいくつかの実施形態では、第１コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬は、固体支持体に連結されている。あるいくつかの実施形態では、凝集体は、前記第１複合体をチオシアン酸グアニジンに曝露すること、または前記複合体を高ｐＨまたは低ｐＨに曝露することにより、前記第１複合体から解離される。好ましい実施形態では、凝集体は、Ａβタンパク質を含み、前記コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬が、抗Ａβ抗体である。
【００１４】
別の態様は、凝集体を含有する疑いがある試料を、コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬と接触させるステップであって、前記試薬と、存在するならば前記凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、未結合の試料を除去するステップと、前記複合体を、検出可能な標識を含む凝集体特異的結合試薬と接触させるステップであって、前記試薬と前記凝集体との結合を可能にする条件下で接触させるステップと、前記試料中の、もしあるならば凝集体の存在を、凝集体と前記凝集体特異的結合試薬との結合により検出するステップとを含み、前記凝集体特異的結合試薬が、前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、試料中の凝集体の存在を検出する方法を提供する。あるいくつかの実施形態では、コンフォメーションタンパク質特異的タンパク質は、固体支持体と連結されている。
【００１５】
さらに別の態様は、凝集体特異的結合試薬を含有する固体支持体を提供するステップと、前記固体支持体を、検出可能に標識されたリガンドと組み合わせるステップであって、前記凝集体特異的結合試薬の前記検出可能に標識されたリガンドと結合するアビディティが、前記試薬の前記凝集体と結合するアビディティより弱いステップと、凝集体を含有する疑いがある試料を、前記固体支持体と組み合わせるステップであって、前記試料中に存在する場合に前記凝集体が前記試薬と結合して、前記リガンドを置き換えることを可能にする条件下で組み合わせるステップと、前記凝集体と前記凝集体特異的結合試薬との間で形成された複合体を検出するステップとを含み、前記凝集体特異的結合試薬が、前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、試料中の凝集体の存在を検出する方法を提供する。
【００１６】
別の態様は、凝集体を含有する疑いがあるポリペプチド試料を、凝集体特異的結合試薬と接触させるステップであって、前記試薬と、存在するならば前記凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、未結合のポリペプチド試料を収集するステップとを含み、前記凝集体特異的結合試薬が、前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、ポリペプチド試料中の凝集体の量を低減する方法を提供する。
【００１７】
さらに別の態様は、凝集体を含有する疑いがある試料を、凝集体特異的結合試薬と接触させるステップであって、前記試薬と、存在するならば前記凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、前記試料中で、凝集体ともしあるならばモノマーとを、凝集体と前記凝集体特異的結合試薬との結合により識別するステップとを含み、前記凝集体特異的結合試薬が、前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、試料中の凝集体とモノマーとを識別する方法を提供する。
【００１８】
別の態様は、コンフォメーション疾患を有する疑いがある被験体からの生物学的試料を、凝集体特異的結合試薬と接触させるステップであって、前記試薬と、存在するならば病原性凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、前記生物学的試料中の、もしあるならば病原性凝集体の存在を、凝集体と前記凝集体特異的結合試薬との結合により検出するステップと、前記被験体が、前記生物学的試料中の病原性凝集体の量がコンフォメーション疾患を有さない被験体からの試料中の凝集体の量より高い場合、コンフォメーション疾患を有することの増大した蓋然性が存在していることを決定するステップとを含み、前記凝集体特異的結合試薬が、前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、被験体についてコンフォメーション疾患の増大した蓋然性が存在しているか否かを評価する方法を提供する。
【００１９】
別の態様は、コンフォメーション疾患についての処置を受けた患者からの生物学的試料を、凝集体特異的結合試薬と接触させるステップであって、前記試薬と、存在するならば病原性凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、前記試料中の、もしあるならば病原性凝集体の存在を、凝集体と前記凝集体特異的結合試薬との結合により検出するステップと、前記生物学的試料中の病原性凝集体の量が対照中の病原性凝集体の量よりも低い場合、前記処置が有効であることを決定するステップであって、前記対照が、コンフォメーション疾患についての処置前の前記患者からの生物学的試料中の病原性凝集体の量であるステップとを含み、前記凝集体特異的結合試薬が、前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、コンフォメーション疾患についての処置の有効性を評価する方法を提供する。
【００２０】
さらに別の態様は、オリゴマーを含有する疑いがある試料を準備するステップであって、前記試料が、オリゴマー以外の凝集体を欠くステップと、前記試料を、凝集体特異的結合試薬と接触させるステップであって、前記試薬と、存在するならば前記オリゴマーとが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、前記試料中の、もしあるならばオリゴマーの存在を、オリゴマーと前記凝集体特異的結合試薬との結合により検出するステップとを含み、前記凝集体特異的結合試薬が、前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、試料中のオリゴマーの存在を検出する方法を含む。
【００２１】
別の態様は、オリゴマーを含有する疑いがある試料を準備するステップと、前記試料からオリゴマー以外の凝集体を除去するステップと、前記試料を、凝集体特異的結合試薬と接触させるステップであって、前記試薬と、存在するならば前記オリゴマーとが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、前記試料中の、もしあるならばオリゴマーの存在を、オリゴマーと前記凝集体特異的結合試薬との結合により検出するステップとを含み、前記凝集体特異的結合試薬が、前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、試料中のオリゴマーの存在を検出する方法を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体の除去は、遠心分離による。
【００２２】
さらに別の態様は、オリゴマーを含有する疑いがある試料を、凝集体特異的結合試薬と接触させるステップであって、前記試薬と、存在するならば前記オリゴマーとが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、前記複合体を第２試薬と接触させるステップであって、前記試薬が、オリゴマーまたはオリゴマー以外の凝集体のいずれかと優先的に結合するステップと、前記試料中の、もしあるならばオリゴマーの存在を、オリゴマーと前記第２試薬との結合または結合の欠如により検出するステップとを含み、前記凝集体特異的結合試薬が、前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、試料中のオリゴマーの存在を検出する方法を提供する。オリゴマーの存在を検出するステップを含む態様のあるいくつかの実施形態では、オリゴマー以外の凝集体は、原線維を含む。
【００２３】
上記の態様のあるいくつかの実施形態では、（例えば、検出、低減または識別される）目的の凝集体、病原性凝集体またはオリゴマーは、可溶性である。
【００２４】
上記の態様のあるいくつかの実施形態では、方法は、前記凝集体特異的結合試薬と前記凝集体またはオリゴマーとの間で形成された複合体を、洗浄剤で処理するステップをさらに含む。あるいくつかの実施形態では、処理するステップは、接触させるステップの後に行われる。あるいくつかの実施形態では、洗浄剤は、中性洗浄剤である。あるいくつかの実施形態では、正電荷および負電荷の両方を含む。あるいくつかの好ましい実施形態では、洗浄剤は、長い炭素鎖を含む。いくつかの好ましい実施形態では、洗浄剤は、モノラウリン酸ポリエチレングリコールソルビタン、ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、アミドスルホベタイン−１４，３−［Ｎ，Ｎ−ジメチル（３−ミリストイルアミノプロピル）アンモニオ］プロパンスルホネート、アミドスルホベタイン−１６，３−［Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（３−パルミトアミドプロピル）アンモニオ］プロパン−１−スルホネート、４−ｎ−オクチルベンゾイルアミド−プロピル−ジメチルアンモニオスルホベタインおよびＮ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ドデシルグリシンベタインからなる群より選択される。
【００２５】
上記の態様のあるいくつかの実施形態では、固体支持体は、ニトロセルロース、ポリスチレンラテックス、フッ化ポリビニル、ジアゾ化ペーパー、ナイロンメンブレン、活性化ビーズ、磁気反応性ビーズ、酸化チタン、酸化ケイ素、多糖ビーズ、多糖メンブレン、アガロース、ガラス、ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール−ポリスチレンハイブリッド、孔径制御ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）、ガラススライド、金ビーズおよびセルロースからなる群より選択される。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、検出可能に標識されている。あるいくつかの実施形態では、試料は、体組織または体液を含む生物学的試料である。あるいくつかの実施形態では、生物学的試料は、全血、血液分画物、血液成分、血漿、血小板、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、骨髄、尿、涙、乳汁、リンパ液、器官組織、脳組織、神経系組織、筋肉組織、非神経系組織、生検材料、剖検材料、脂肪生検材料、細胞、大便、胎盤、脾臓組織、リンパ組織、膵臓組織、気管支肺胞洗浄液または滑液を含む。好ましい実施形態では、試料は、脳脊髄液（ＣＳＦ）を含む。あるいくつかの実施形態では、試料は、ポリペプチドを含む。
【００２６】
あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約２の正の、少なくとも約３の正の、少なくとも約４の正の、少なくとも約５の正の、少なくとも約６の正のまたは少なくとも約７の正の正味電荷を有する。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約９０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１２０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約３０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約４０００ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している。好ましい実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、モノマーについての結合の親和性および／またはアビディティより少なくとも約２倍高い凝集体についての結合の親和性および／またはアビディティを有する。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨより少なくとも約１ｐＨ単位高いｐＫａを有する、少なくとも１つの正に荷電した官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬における少なくとも１つの正に荷電した官能基は、凝集体特異的結合試薬の全ての官能基のうちで固体支持体に最も近い。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、疎水性官能基を含む。いくつかの実施形態では、疎水性官能基は、芳香族疎水性官能基である。他の実施形態では、疎水性官能基は、脂肪族疎水性官能基である。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、１つだけの正に荷電した官能基と、少なくとも１つの疎水性官能基とを含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、少なくとも１つの正に荷電した官能基と、１つだけの疎水性官能基とを含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、１つだけの正に荷電した官能基と、１つだけの疎水性官能基とを含む。いくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、Ｌ−異性体である少なくとも１つのアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、Ｄ−異性体である少なくとも１つのアミノ酸を含む。
【００２７】
あるいくつかの実施形態では、凝集体は、非病原性である。あるいくつかの実施形態では、非病原性凝集体は、酵母プリオンタンパク質ｓｕｐ３５またはホルモンである。あるいくつかの実施形態では、非病原性凝集体は、ポリペプチドの凝集体である。他の実施形態では、凝集体は、病原性である。あるいくつかの実施形態では、病原性凝集体は、子かん前症、タウオパチー、ＴＤＰ−４３タンパク質症またはセルピン病と関連する凝集体である。あるいくつかの実施形態では、病原性凝集体は、アミロイド疾患と関連する凝集体である。あるいくつかの実施形態では、アミロイド疾患は、全身性アミロイドーシス、ＡＡアミロイドーシス、シヌクレイン病、アルツハイマー病、プリオン病、ＡＬＳ、免疫グロブリン関連疾患、血清アミロイドＡ関連疾患、ハンチントン病、パーキンソン病、ＩＩ型糖尿病、透析アミロイドーシスおよび脳のアミロイドアンギオパチーからなる群より選択される。好ましい実施形態では、病原性凝集体は、アルツハイマー病と関連する凝集体である。あるいくつかの他の好ましい実施形態では、病原性凝集体は、脳のアミロイドアンギオパチーと関連する凝集体である。あるいくつかの実施形態では、アルツハイマー病または脳のアミロイドアンギオパチーと関連する凝集体は、アミロイド−ベータ（Ａβ）タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、Ａβタンパク質は、Ａβ４０である。他の実施形態では、Ａβタンパク質は、Ａβ４２である。あるいくつかの実施形態では、アルツハイマー病と関連する凝集体は、タウタンパク質を含む。あるいくつかの実施形態では、病原性凝集体は、アミリンを含む。あるいくつかの実施形態では、病原性凝集体は、アミロイドＡタンパク質を含む。あるいくつかの実施形態では、病原性凝集体は、アルファ−シヌクレインを含む。
【００２８】
あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて少なくとも１の正味正電荷を有する少なくとも１つのアミノ酸を含む。あるいくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸は、生理的ｐＨにて正に荷電されている。あるいくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸は、リシンおよびアルギニンからなる群より選択される天然アミノ酸である。あるいくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸は、オルニチン、メチルリシン、ジアミノ酪酸、ホモアルギニンおよび４−アミノメチルフェニルアラニンからなる群より選択される非天然アミノ酸である。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、疎水性アミノ酸を含む。あるいくつかの実施形態では、疎水性アミノ酸は、芳香族疎水性アミノ酸である。あるいくつかの実施形態では、疎水性アミノ酸は、脂肪族疎水性アミノ酸である。あるいくつかの実施形態では、疎水性アミノ酸は、トリプトファン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、チロシン、ホモフェニルアラニン、フェニルグリシン、４−クロロフェニルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、チエニルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、４−アミノフェニルアラニン、ペンタフルオロフェニルアラニン、２−ナフチルアラニン、ｐ−ビフェニルアラニン、スチリルアラニン、置換フェニルアラニン、ハロゲン化フェニルアラニン、アミノイソ酪酸、アリルグリシン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、１−ナフチルアラニン、ピリジルアラニンおよび１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸からなる群より選択される。好ましい実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、
【００２９】
【化１】
2013510297.tif 000002
からなる群より選択されるペプチドを含む。いくつかの好ましい実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、Ｆ−ｆｄｂ−Ｆ−ｆｄｂ−ｆｄｂ−ｆｄｂ（配列番号５３）、ＦｏＦｏｏｏ（配列番号５４）、モノＢｏｃ−エチレンジアミン＋ＢｒＣＨ２ＣＯ−ＫＫＦＫＦ（配列番号５５）、トリエチルアミン＋ＢｒＣＨ２ＣＯ−ＫＫＦＫＦ（配列番号５６）、テトラメチルエチレンジアミン＋ＢｒＣＨ２ＣＯ−ＫＫＦＫＦ（配列番号５７）および配列番号５８〜６６からなる群より選択されるペプチドを含む。いくつかの好ましい実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、
【００３０】
【化２】
2013510297.tif 000003
からなる群より選択されるペプチドを含む。いくつかの好ましい実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、配列番号９〜１４および９１〜９６からなる群より選択されるペプトイドを含む。好ましい実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、
【００３１】
【化３】
2013510297.tif 000004
【００３２】
【化４】
2013510297.tif 000005
【００３３】
【化５】
2013510297.tif 000006
（式中、ＲおよびＲ’は任意の基である）からなる群より選択されるペプトイドを含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、
【００３４】
【化６】
2013510297.tif 000007
（式中、ＲおよびＲ’は、任意の基である）を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、
【００３５】
【化７】
2013510297.tif 000008
のデンドロンを含む。
【００３６】
あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、アミン、アルキル基、複素環、シクロアルカン、グアニジン、エーテル、アリルおよび芳香族からなる群より選択される官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、ナフチル、フェノール、アニリン、フェニル、置換フェニル、ニトロフェニル、ハロゲン化フェニル、ビフェニル、スチリル、ジフェニル、ベンジルスルホンアミド、アミノメチルフェニル、チオフェン、インドリル、ナフチル、フランおよびイミダゾールからなる群より選択される芳香族官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、ハロゲン化フェニルは、クロロフェニルまたはフルオロフェニルである。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、第１級アミン、第２級アミン、第３級アミンおよび第４級アミンからなる群より選択されるアミン官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、イソブチル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチルおよびメチルならびにオクチルからなる群より選択されるアルキル官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、テトラヒドロフラン（ｔｅｔｒｏｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）、ピロリジンおよびピペリジンからなる群より選択される複素環官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、シクロプロピルおよびシクロヘキシルからなる群より選択されるシクロアルカン官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、反復モチーフを含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、凝集体の負に荷電した基のものと同じ間隔で正に荷電した基を含む。
【００３７】
あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、配列番号１または配列番号１５を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体は、アミリンを含み、前記凝集体特異的結合試薬は、配列番号１５を含み、前記凝集体特異的結合試薬は、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約８０００ｎｍｏｌ〜約１５０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している。あるいくつかの実施形態では、凝集体は、アルファ−シヌクレインを含み、前記凝集体特異的結合試薬は、配列番号１５を含み、前記凝集体特異的結合試薬は、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約８０００ｎｍｏｌ〜約１５０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している。あるいくつかの実施形態では、凝集体は、アミロイドＡタンパク質を含み、前記凝集体特異的結合試薬は、配列番号１５を含み、前記凝集体特異的結合試薬は、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約８０００ｎｍｏｌ〜約１５０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している。あるいくつかの実施形態では、洗浄剤処理のさらなるステップが含まれ、洗浄剤は、ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートであり、前記凝集体は、Ａβ４０タンパク質を含む病原性凝集体であり、前記凝集体特異的結合試薬は、配列番号１５を含み、前記凝集体特異的結合試薬は、１平方メートルあたりの正味電荷が約８０００ｎｍｏｌ〜約１５０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している。あるいくつかの実施形態では、試料は、脳脊髄液（ＣＳＦ）を含む。
【００３８】
別の態様は、
【００３９】
【化８】
2013510297.tif 000009
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド凝集体特異的結合試薬を含む。さらに別の態様は、ＫＫＫＫＫＫのアミノ酸配列からなるペプチドを含む、ペプチド凝集体特異的結合試薬を含む。別の態様は、Ｆ−ｆｄｂ−Ｆ−ｆｄｂ−ｆｄｂ−ｆｄｂ（配列番号５３）、ＦｏＦｏｏｏ（配列番号５４）、モノＢｏｃ−エチレンジアミン＋ＢｒＣＨ２ＣＯ−ＫＫＦＫＦ（配列番号５５）、トリエチルアミン＋ＢｒＣＨ２ＣＯ−ＫＫＦＫＦ（配列番号５６）、テトラメチルエチレンジアミン＋ＢｒＣＨ２ＣＯ−ＫＫＦＫＦ（配列番号５７）および配列番号５８〜６６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド凝集体特異的結合試薬を含む。別の態様は、配列番号９〜１４および９１〜９５からなる群より選択されるペプトイドを含む、ペプトイド凝集体特異的結合試薬を含む。別の態様は、
【００４０】
【化９】
2013510297.tif 000010
【００４１】
【化１０】
2013510297.tif 000011
【００４２】
【化１１】
2013510297.tif 000012
（式中、ＲおよびＲ’は、任意の基である）からなる群より選択されるペプトイドを含む、ペプトイド凝集体特異的結合試薬を含む。別の態様は、
【００４３】
【化１２】
2013510297.tif 000013
を含むデンドロン凝集体特異的結合試薬を含む。あるいくつかの実施形態では、試薬は、疎水性官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、疎水性官能基は、芳香族疎水性官能基である。あるいくつかの実施形態では、疎水性官能基は、脂肪族疎水性官能基である。あるいくつかの実施形態では、試薬は、アミン、アルキル基、複素環、シクロアルカン、グアニジン、エーテル、アリルおよび芳香族からなる群より選択される官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、ナフチル、フェノール、アニリン、フェニル、置換フェニル、ニトロフェニル、ハロゲン化フェニル、ビフェニル、スチリル、ジフェニル、ベンジルスルホンアミド、アミノメチルフェニル、チオフェン、インドリル、ナフチル、フランおよびイミダゾールからなる群より選択される芳香族官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、ハロゲン化フェニルは、クロロフェニルまたはフルオロフェニルである。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、第１級アミン、第２級アミン、第３級アミンおよび第４級アミンからなる群より選択されるアミン官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、イソブチル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチルならびにメチルおよびオクチルからなる群より選択されるアルキル官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、テトラヒドロフラン、ピロリジンおよびピペリジンからなる群より選択される複素環官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、シクロプロピルおよびシクロヘキシルからなる群より選択されるシクロアルカン官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、試薬は、検出可能に標識されている。
【００４４】
別の態様は、固体支持体と上記の態様の凝集体特異的結合試薬とを含む組成物を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて付着しており、前記組成物は、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約９０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１２０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約３０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約４０００ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、前記組成物は、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約７０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約８０００ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約９０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、前記組成物は、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。あるいくつかの実施形態では、固体支持体は、ニトロセルロース、ポリスチレンラテックス、フッ化ポリビニル、ジアゾ化ペーパー、ナイロンメンブレン、活性化ビーズ、磁気反応性ビーズ、酸化チタン、酸化ケイ素、多糖ビーズ、多糖メンブレン、アガロース、ガラス、ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール−ポリスチレンハイブリッド、孔径制御ガラス、ガラススライド、金ビーズおよびセルロースからなる群より選択される。
【００４５】
別の態様は、固体支持体と凝集体特異的結合試薬とを含む組成物であって、前記凝集体特異的結合試薬が、
【００４６】
【化１３】
2013510297.tif 000014
を含み、さらに、前記固体支持体が、ビーズを含む組成物を含む。
【００４７】
別の態様は、固体支持体と、ペプチド凝集体特異的結合試薬とを含む組成物であって、前記試薬が、
【００４８】
【化１４】
2013510297.tif 000015
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、さらに、前記固体支持体が、ビーズを含む組成物を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて付着しており、前記組成物は、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約９０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１２０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約３０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約４０００ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、前記組成物は、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。
【００４９】
別の態様は、上記の組成物を含有するキットを含む。あるいくつかの実施形態では、キットは、凝集体を検出するためのキットの使用についての使用説明書をさらに含む。
【００５０】
別の態様は、キットを含み、該キットは、固体支持体と、
【００５１】
【化１５】
2013510297.tif 000016
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて前記固体支持体に付着しており、前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する凝集体特異的結合試薬と、凝集体を検出するためのキットの使用についての使用説明書とを含む。
【００５２】
別の態様は、キットを含み、該キットは、固体支持体と、
【００５３】
【化１６】
2013510297.tif 000017
を含み、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて前記固体支持体に付着しており、前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する凝集体特異的結合試薬と、凝集体を検出するためのキットの使用についての使用説明書とを含む。
【００５４】
組成物またはキットのあるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて付着しており、前記組成物は、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約９０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１２０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約３０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約４０００ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、前記組成物は、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。
【００５５】
好ましい態様は、Ａβを含む凝集体を含む疑いがある試料を、凝集体特異的結合試薬と接触させるステップであって、前記試薬と、存在するならば前記凝集体とが結合して第１複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、未結合の試料を除去するステップと、前記凝集体を、前記第１複合体から解離させて、解離凝集体を提供するステップと、前記解離凝集体を、固体支持体と連結された第１抗Ａβ抗体と接触させるステップであって、結合して第２複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、前記試料中の、もしあるならば凝集体の存在を、検出可能に標識された第２抗Ａβ抗体を用いて前記第２複合体の形成を検出することにより検出するステップとを含み、前記凝集体特異的結合試薬が、前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、試料中のＡβを含む凝集体の存在を検出する方法を提供する。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、
【００５６】
【化１７】
2013510297.tif 000018
【００５７】
【化１８】
2013510297.tif 000019
【００５８】
【化１９】
2013510297.tif 000020
（式中、ＲおよびＲ’は、任意の基である）からなる群より選択されるペプトイドを含む。
【００５９】
あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、
【００６０】
【化２０】
2013510297.tif 000021
ならびに配列番号５３、５５、５６および５８〜６６からなる群より選択されるペプチドを含む。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１−１】図１は、試験した潜在的な凝集体特異的結合試薬を示す。各凝集体特異的結合試薬の配列／名称は、各分子の推定正味電荷とともに示す（ｐＨ７での官能基のｐＫａに基づいて）。「Ｒ」基の構造は、図２で見ることができる。
【図１−２】図１は、試験した潜在的な凝集体特異的結合試薬を示す。各凝集体特異的結合試薬の配列／名称は、各分子の推定正味電荷とともに示す（ｐＨ７での官能基のｐＫａに基づいて）。「Ｒ」基の構造は、図２で見ることができる。
【図２】図２は、マレイミド提示ビーズをＭｉｃｈａｅｌ付加反応によりチオール化ペプチドとコンジュゲートさせる反応を示す。
【図３】図３は、ミスフォールディングタンパク質アッセイ（Ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（ＭＰＡ））のステップを示す。
【図４】図４は、様々な電荷、骨格および疎水性の凝集体特異的結合試薬が、オリゴマーを捕捉する能力を試験した結果を示す。パートＡは、完全に負、完全に正および中性のペプチド、ならびに疎水性または脂肪族残基を含有するペプチド、ならびにペプトイドおよびデンドロンを示す。パートＢは、電荷および疎水性の様々な組み合わせを有するペプチド、ならびにペプトイドを示す。ｙ軸は、ＡベータＥＬＩＳＡからの相対的ライトユニットを示す。
【図５】図５は、オリゴマーの捕捉が、リガンド密度とともに非線形的に増加することを証明する。パートＡは、各試料に３マイクロリットルのビーズを加えた場合の負荷密度対捕捉効率を示し、パートＢは、各試料に１５マイクロリットルのビーズを加えた場合の負荷密度対捕捉効率を示す。
【図６】図６は、オリゴマー捕捉アッセイにおける２つの正に荷電したペプチドＫＫＫＫＫＫおよびＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫの比較を示す。
【図７】図７は、Ｅ２２Ｇグロブロマー構造の分析を示す。パートＡは、Ｅ２２Ｇおよび野生型グロブロマーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。パートＢは、２つのグロブロマーのサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図８】図８は、ＰＳＲ１およびグルタチオン陰性対照によるＥ２２Ｇおよび野生型グロブロマーの捕捉を試験する結合アッセイを示す。
【図９】図９は、Ｅ２２ＫグロブロマーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。パートＡは、架橋なしのＥ２２Ｋおよび野生型グロブロマーの分析を示す。パートＢは、架橋されたグロブロマーを用いた分析を示す。
【図１０】図１０は、ＰＳＲ１およびグルタチオン陰性対照によるＥ２２Ｋ、Ｅ２２Ｇおよび野生型グロブロマーの捕捉を試験する結合アッセイを示す。
【図１１】図１１は、オリゴマーを捕捉する能力について試験した追加のペプトイド凝集体特異的結合試薬を示す。
【図１２】図１２は、様々なペプトイド凝集体特異的結合試薬によるグロブロマーの捕捉を示す。
【図１３】図１３は、ビーズに直接コンジュゲートしたＰＳＲ１（パートＡ）およびストレプトアビジン被覆ビーズと結合したビオチン−ＰＳＲ１（パートＢ）を用いたグロブロマーの捕捉を示す。
【図１４】図１４は、ビオチン化誘導体をストレプトアビジン誘導体化磁性ビーズに結合する反応を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、本研究で調製した対照ペプトイドであるバッチ１を示す（ＰＳＲ１類似体、負に荷電したＰＳＲ１類似体、全て正の対照）。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、電荷および電荷のパターンの要件を検査するために調製したペプトイドであるバッチ２を示す。
【図１６】図１６は、バッチ１ペプトイドによるプリオン凝集体捕捉を示す。データは３連で示す。
【図１７】図１７は、バッチ２ペプトイドによるプリオン凝集体捕捉を示す。データは３連で示す。
【図１８Ａ】図１８Ａは、図１５に示すペプトイドにより捕捉されたアルツハイマーの脳ホモジネート（ＡＤＢＨ）からのＡベータ（１−４２）凝集体を示す。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、図１５に示す正に荷電したペプトイドにより捕捉されたＡＤＢＨからのＡベータ（１−４２）凝集体を示す。
【図１９】図１９は、ＡＤＢＨからＡベータ凝集体を捕捉するＰＳＲ１および全て正に荷電された種についての検出限界分析を示す。
【図２０】図２０は、ＰＳＲ１ビーズ、グルタチオン対照ビーズ、７＋および７−ペプトイドビーズにより捕捉される全タウシグナルを示す。
【図２１】図２１は、ＭＰＡシグナルの倍数変化が、ＰＳＲ１被覆濃度とともに線形的に変化しないことを示す。
【図２２】図２２Ａは、図１５に示すペプトイドにより捕捉されたＡＤＢＨからのＡベータ（１−４０）凝集体を示す。図２２Ｂは、図１５に示す正に荷電したペプトイドにより捕捉されたＡＤＢＨからのＡベータ（１−４０）凝集体を示す。
【図２３−１】図２３は、ペプチド凝集体特異的結合試薬ＫＫＫＦＫＦおよびＫＫＫＬＫＬならびにペプトイド凝集体特異的結合試薬ＰＳＲ１についての電荷密度実験を示す。ＰＳＲ１についての結果は、ビーズとコンジュゲートしたＰＳＲ１およびセルロースとコンジュゲートしたＰＳＲ１について示す。
【図２３−２】図２３は、ペプチド凝集体特異的結合試薬ＫＫＫＦＫＦおよびＫＫＫＬＫＬならびにペプトイド凝集体特異的結合試薬ＰＳＲ１についての電荷密度実験を示す。ＰＳＲ１についての結果は、ビーズとコンジュゲートしたＰＳＲ１およびセルロースとコンジュゲートしたＰＳＲ１について示す。
【図２４】図２４は、ミスフォールディングタンパク質アッセイ（ＭＰＡ）が、対照および疾患患者からの脳ホモジネートを区別する能力を示す。パートＡは、５の正常（Ｎ）試料および１１のｖＣＪＤ患者試料におけるプリオン凝集体捕捉を示す。ＡＮＯＶＡは、これらの１６の試料が、単一の集団に由来しないことを示す。パートＢは、４の正常（Ｎ）試料および１０のＡＤ患者試料におけるタウおよびＡベータ１−４２凝集体捕捉を示す。ＡＮＯＶＡは、これらの１４の試料が、単一の集団に由来しないことを示す。両方のグラフにおけるｙ軸は、標的マーカーＥＬＩＳＡアッセイにおいて検出される相対的ライトユニットである。
【図２５】図２５は、オリゴマー捕捉に対する電荷の影響力を見る研究の結果を示す。０または１ｎｇ／ｍＬのＡベータ４２オリゴマーを、ＣＳＦに添加し、潜在的なヘキサペプチド凝集体特異的結合試薬を有するビーズで捕捉した。オリゴマーの捕捉は、黒色のバーで示し、ＣＳＦからのモノマーＡベータ４０および４２のバックグラウンド捕捉は、縞および白色のバーで示す。ｘ軸は、ヘキサペプチド配列を示す（ＰＳＲ１、配列番号１５、参照のために示す）。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。
【図２６】図２６は、図２５におけるヘキサペプチド試薬についての電荷対オリゴマー捕捉シグナルの比較を示す。電荷は、アッセイ緩衝液のｐＨに対する個別の官能基のｐＫａに基づいて計算する。
【図２７】図２７は、異なる配向およびモノマーキラリティーを有する潜在的な凝集体特異的結合試薬を示す。
【図２８】図２８は、図２７に示す試薬についての配向およびキラリティー研究の結果を示す。Ａベータ４２オリゴマーをＣＳＦに添加し、図２７からの潜在的な凝集体特異的結合試薬を有するビーズで捕捉した。オリゴマーの捕捉は、黒色のバーで示し、ＣＳＦからのモノマーＡベータ４０および４２のバックグラウンド捕捉は、縞および白色のバーで示す。ｘ軸は、試薬配列を示す。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。
【図２９】図２９は、オリゴマー捕捉に対する疎水性残基の影響力を見る研究の結果を示す。Ａベータ４２オリゴマーをＣＳＦに添加し、潜在的なヘキサペプチド凝集体特異的結合試薬を有するビーズで捕捉した。オリゴマーの捕捉は、淡いバーで示し、ＣＳＦからのモノマーＡベータ４２のバックグラウンド捕捉は、より濃いバーで示す。ｘ軸は、ヘキサペプチド配列を示す。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。
【図３０Ａ】図３０Ａ〜Ｃは、オリゴマー捕捉に対する芳香族残基の影響力を見る研究の結果を示す。Ａベータ４２オリゴマーをＣＳＦに添加し、潜在的なヘキサペプチド凝集体特異的結合試薬を有するビーズで補足した。図３０Ａは、フォーマットＸＫＸＫＫＫのペプチドを示し、Ｘは、ｘ軸上に示す残基である（ＰＳＲ１は参照のために示す）。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。オリゴマーの捕捉は、黒色のバーで示し、ＣＳＦからのモノマーＡベータ４２のバックグラウンド捕捉は、白色のバーで示す。図３０Ｂは、フォーマットＫＫＫＸＫＸのペプチドを示し、Ｘは、ｘ軸上に示す残基である（ＰＳＲ１は参照のために示す）。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。オリゴマーの捕捉は、水平の縞のバーで示し、ＣＳＦからのモノマーＡベータ４２および４０のバックグラウンド捕捉は、黒色、白色および点描のバーで示す。図３０Ｃは、フォーマットＸＫＸＫＫＫのペプチドを示し、Ｘは、ｘ軸上に示す残基である。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。オリゴマーの捕捉は、淡いバーで示し、ＣＳＦからのモノマーＡベータ４２のバックグラウンド捕捉は、濃いバーで示す。
【図３０Ｂ】図３０Ａ〜Ｃは、オリゴマー捕捉に対する芳香族残基の影響力を見る研究の結果を示す。Ａベータ４２オリゴマーをＣＳＦに添加し、潜在的なヘキサペプチド凝集体特異的結合試薬を有するビーズで補足した。図３０Ａは、フォーマットＸＫＸＫＫＫのペプチドを示し、Ｘは、ｘ軸上に示す残基である（ＰＳＲ１は参照のために示す）。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。オリゴマーの捕捉は、黒色のバーで示し、ＣＳＦからのモノマーＡベータ４２のバックグラウンド捕捉は、白色のバーで示す。図３０Ｂは、フォーマットＫＫＫＸＫＸのペプチドを示し、Ｘは、ｘ軸上に示す残基である（ＰＳＲ１は参照のために示す）。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。オリゴマーの捕捉は、水平の縞のバーで示し、ＣＳＦからのモノマーＡベータ４２および４０のバックグラウンド捕捉は、黒色、白色および点描のバーで示す。図３０Ｃは、フォーマットＸＫＸＫＫＫのペプチドを示し、Ｘは、ｘ軸上に示す残基である。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。オリゴマーの捕捉は、淡いバーで示し、ＣＳＦからのモノマーＡベータ４２のバックグラウンド捕捉は、濃いバーで示す。
【図３０Ｃ】図３０Ａ〜Ｃは、オリゴマー捕捉に対する芳香族残基の影響力を見る研究の結果を示す。Ａベータ４２オリゴマーをＣＳＦに添加し、潜在的なヘキサペプチド凝集体特異的結合試薬を有するビーズで補足した。図３０Ａは、フォーマットＸＫＸＫＫＫのペプチドを示し、Ｘは、ｘ軸上に示す残基である（ＰＳＲ１は参照のために示す）。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。オリゴマーの捕捉は、黒色のバーで示し、ＣＳＦからのモノマーＡベータ４２のバックグラウンド捕捉は、白色のバーで示す。図３０Ｂは、フォーマットＫＫＫＸＫＸのペプチドを示し、Ｘは、ｘ軸上に示す残基である（ＰＳＲ１は参照のために示す）。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。オリゴマーの捕捉は、水平の縞のバーで示し、ＣＳＦからのモノマーＡベータ４２および４０のバックグラウンド捕捉は、黒色、白色および点描のバーで示す。図３０Ｃは、フォーマットＸＫＸＫＫＫのペプチドを示し、Ｘは、ｘ軸上に示す残基である。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。オリゴマーの捕捉は、淡いバーで示し、ＣＳＦからのモノマーＡベータ４２のバックグラウンド捕捉は、濃いバーで示す。
【図３１】図３１は、オリゴマー捕捉に対する異なるタイプの芳香族残基の影響力を見る研究の結果を示す。Ａベータ４２オリゴマーをＣＳＦに添加し、チオフェン環、荷電芳香族を有する潜在的な凝集体特異的結合試薬およびＰＳＲ１を有するビーズで捕捉した。オリゴマーの捕捉は、水平の縞のバーで示し、ＣＳＦからのモノマーＡベータ４２および４０のバックグラウンド捕捉は、黒色、白色および点描のバーで示す。ｘ軸は、結合試薬を示す。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。
【図３２】図３２は、オリゴマー捕捉における荷電残基の性質を見る研究の結果を示す。Ａベータ４２オリゴマーをＣＳＦに添加し、ジアミノブタン酸（ｆｄｂ）、オルニチン（（ｏｒｎｉｔｈａｎｅ）Ｏｒｎ、側鎖はペプチド主鎖に組み込まれている）を有する潜在的な凝集体特異的結合試薬およびＰＳＲ１を有するビーズで捕捉した。オリゴマーの捕捉は、最初のバーで示し、ＣＳＦからのモノマーＡベータ４２および４０のバックグラウンド捕捉は、２番目〜４番目のバーで示す。ｘ軸は、試薬を示す。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。
【図３３Ａ】図３３Ａ〜Ｃは、追加の正に荷電した凝集体特異的結合試薬を試験した結果を示す。Ａベータ４２オリゴマーをＣＳＦに添加し、潜在的な凝集体特異的結合試薬を有するビーズで捕捉した。図３３Ａおよび３３Ｂについて、オリゴマーの捕捉は、斜線の縞のバーで示し、ＣＳＦからのモノマーＡベータ４２のバックグラウンド捕捉は、塗りつぶしたバーで示す。ｘ軸は、試薬を示す。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。図３３Ｃについて、ＣＳＦに添加した０．５ｎｇ／ｍＬオリゴマー（最初のバー）、０．０５ｎｇ／ｍＬオリゴマー（２番目のバー）および０ｎｇ／ｍＬオリゴマー（３番目のバー）の捕捉を試験した。ｘ軸は、試薬を示す（コードおよび構造について表１３および１４を参照されたい）。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。
【図３３Ｂ】図３３Ａ〜Ｃは、追加の正に荷電した凝集体特異的結合試薬を試験した結果を示す。Ａベータ４２オリゴマーをＣＳＦに添加し、潜在的な凝集体特異的結合試薬を有するビーズで捕捉した。図３３Ａおよび３３Ｂについて、オリゴマーの捕捉は、斜線の縞のバーで示し、ＣＳＦからのモノマーＡベータ４２のバックグラウンド捕捉は、塗りつぶしたバーで示す。ｘ軸は、試薬を示す。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。図３３Ｃについて、ＣＳＦに添加した０．５ｎｇ／ｍＬオリゴマー（最初のバー）、０．０５ｎｇ／ｍＬオリゴマー（２番目のバー）および０ｎｇ／ｍＬオリゴマー（３番目のバー）の捕捉を試験した。ｘ軸は、試薬を示す（コードおよび構造について表１３および１４を参照されたい）。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。
【図３３Ｃ】図３３Ａ〜Ｃは、追加の正に荷電した凝集体特異的結合試薬を試験した結果を示す。Ａベータ４２オリゴマーをＣＳＦに添加し、潜在的な凝集体特異的結合試薬を有するビーズで捕捉した。図３３Ａおよび３３Ｂについて、オリゴマーの捕捉は、斜線の縞のバーで示し、ＣＳＦからのモノマーＡベータ４２のバックグラウンド捕捉は、塗りつぶしたバーで示す。ｘ軸は、試薬を示す。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。図３３Ｃについて、ＣＳＦに添加した０．５ｎｇ／ｍＬオリゴマー（最初のバー）、０．０５ｎｇ／ｍＬオリゴマー（２番目のバー）および０ｎｇ／ｍＬオリゴマー（３番目のバー）の捕捉を試験した。ｘ軸は、試薬を示す（コードおよび構造について表１３および１４を参照されたい）。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。
【図３４】図３４は、２つの同一のペプチドアレイ（それぞれに約１１２０の１２マーペプチドが入っている）を示し、これらは、オリゴマーＡベータ１−４２と優先的に結合するペプチドを同定する目的のために、３ｎｇ／ｍＬのモノマーまたはオリゴマーＡベータ１−４２とインキュベートした。結合したＡベータ１−４２は、ペプチドのＮ末端を認識する抗Ａベータ抗体（６Ｅ１０）を用いるウェスタンブロットにより検出した。モノマーではなくオリゴマーと結合する著しい数のペプチドが検出された。いくつかのペプチド（丸で囲む）だけがモノマーとオリゴマーの両方のＡベータを、大きな選択性なしで認識した。Ａベータペプチド捕捉に伴うシグナルを、Ｋｏｄａｋイメージステーションソフトウェアを用いて定量化し、ペプチドを、最高から最低までの正味の強度で並べた。上位５〜１０％のペプチドを、上位の結合体とみなした。
【図３５】図３５は、ＮＭＰＡにおける１％ＴＷ２０または１％ＺＷ３−１４洗浄によるＮＭＰＡバックグラウンド低減を示す。異なるマトリクス（ＴＢＳＴＴおよびＣＳＦ）を、ＡＳＲ１とインキュベートした。１％ＴＷ２０もしくは１％ＺＷ３−１４を用いて、または用いずに、インキュベーション後のプルダウンビーズを洗浄した。ｘ軸は、ＮＭＰＡにおけるプルダウンマトリクスおよびプルダウン洗浄後に用いた洗浄剤を示す。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。
【図３６】図３６は、洗浄剤洗浄を用いてのＮＭＰＡバックグラウンド低減および感度改善を示す。Ａベータ４２オリゴマーをＴＢＳＴＴまたはＣＳＦに添加し、ＡＳＲ１とインキュベートした。プルダウンビーズを、インキュベーションの後に１％洗浄剤を用いて、または用いずに洗浄した。上および下のグラフのｘ軸は、添加したオリゴマーレベルを示す。上のグラフのｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。下のグラフのｙ軸は、ＡベータイムノアッセイからのＡベータ４２のＳ／Ｎ比を示す。
【図３７】図３７は、洗浄剤の構造および名称を示す。
【図３８】図３８は、様々なＡβ４２凝集体の未変性ゲル（ｎａｔｉｖｅ  ｇｅｌ）分析を示す。
【図３９】図３９は、ＰＳＲ１およびＡｃ−ＦＫＦＫＫＫによるＡＤ  ＣＳＦ中のＡβ４０凝集体の捕捉を示す。
【図４０】図４０は、１６，０００ｇで１０分間または１３４，０００ｇで１時間遠心分離したアルツハイマー病ＣＳＦおよび正常ＣＳＦの上清およびペレット中の、ミスフォールディングタンパク質アッセイにより検出されたＡβ４０オリゴマーの量を示す。凡例：小さいチェック：全量Ａβ４０；大きいチェック：１６，０００ｇ上清；水平の線：１６，０００ペレット；垂直の線：１３４，０００ｇ上清、斜線：１３４，０００ｇペレット。
【図４１】図４１は、脾臓におけるＡＡアミロイドーシスの組織学的評価を示す。コンゴレッド色素で染色された異なる度合いの脾臓アミロイド沈着の典型的な例を示す。アミロイドは、偏光の下で研究すると、緑色の複屈折を示す。１＋、濾胞での非常に薄い限局的な沈着（Ａ）、２＋、脾臓の限定された領域におけるよりはっきりした濾胞周囲のアミロイド沈着（ＢおよびＣ）、３＋、ほとんどまたは全ての濾胞の周辺の中程度のアミロイド沈着（Ｄ）、４＋、濾胞の周辺に局在するが、連続的な浸潤を頻繁に形成している大規模なアミロイド沈着（ＥおよびＦ）。（×２５）
【図４２】図４２は、ＰＳＲ１被覆ビーズが、ＡＡ関連部分を捕捉できることを証明する。（Ａ〜Ｃ）ＰＳＲ１で枯渇させた投入物（Ａ）、溶出物（Ｂ）およびビーズ（Ｃ）画分に対してモノクローナル抗マウスＳＡＡ抗体を用いるイムノブロッティング。このミスフォールディングタンパク質アッセイ（ＭＰＡ）は、３または９ｕＬのＰＳＲ１被覆ビーズを用い、脾臓ＡＡのマウス（ＡＡ）および対照未処置マウス（Ｃｔｒｌ）からの１、４または８ｕＬの１０％ｗ／ｖ脾臓ホモジネートを投入物として用いて行った。（Ｄ）サンドイッチＥＬＩＳＡによるＳＡＡ関連種の検出。検出限界未満の値は、０ｕｇ／ｍＬとして表す。
【図４３】図４３は、ＡＡ  ＭＰＡアッセイの最適化を示す。投入物、ＰＳＲ１で枯渇させた投入物、ビーズおよび溶出画分に対してポリクローナル抗マウスＳＡＡ／ＡＡ抗体（「ＡＡ１３８」）を用いるイムノブロットを示す。ＭＰＡは、６ｕｌのＰＳＲ１被覆ビーズと、投入物としての脾臓ＡＡのマウス（ＡＡ＋）、単一のＡｇＮＯ３注射でチャレンジした対照マウス（ＡｇＮＯ３抗原刺激（ｐｒｉｍｅｄ））および対照未処置マウス（未処置）からの５０ｕｇの全タンパク質に相当する１０％ｗ／ｖ脾臓ホモジネートとを用いて行った。アクチンは、ローディング対照として用いた。
【図４４】図４４は、ＡＡ凝集体の変性が、ＡＡ関連部分の検出を妨げることを証明する。溶出画分に対するサンドイッチＥＬＩＳＡによるＳＡＡ関連種の検出を示す。変性は、脾臓ＡＡのマウスからの９ｕＬの１０％ｗ／ｖ脾臓ホモジネートを、１３．５ｕＬの変性緩衝液と混合し、１０または３０分間、室温または３７℃にて、７５０ｒｐｍでインキュベートすることにより達成し、その後に、５．４ｕＬの中和緩衝液で中和した（ｄｅｎａｔ−ＡＡ）。緩衝対照（ｂｕｆｆ−ＡＡ）は、脾臓ＡＡのマウスからの９ｕＬの１０％ｗ／ｖ脾臓ホモジネートを、予め混合した１３．５ｕＬの変性緩衝液および５．４ｕＬの中和緩衝液と混合することにより調製した。ＭＰＡは、上記の４つの変性試料、ならびに緩衝ＡＡ試料、非変性ＡＡ含有試料（ｕｎｄｅｎａｔ−ＡＡ）、対照ＡｇＮＯ３処置マウスからの非変性脾臓ホモジネート試料（ｕｎｄｅｎａｔ−ＡｇＮＯ３）および対照未処置マウスからの非変性脾臓ホモジネート試料（ｕｎｄｅｎａｔ−ＢＬ６）を用いて行った。
【図４５】図４５は、ＰＳＲ１ビーズが、緩衝液（Ａ）および血漿（Ｂ）の両方において、アミリンモノマーよりもｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成アミリン原線維と優先的に結合することを示す。
【図４６】図４６は、ＩＩ型糖尿病患者からの膵臓組織におけるアミリン凝集体を、変性剤（変性）で処理しない限り、ＥＬＩＳＡ（未変性）により検出できないことを示す。アミリンは、正常な非疾患患者からの膵臓組織において低レベルでしか見出されない。凡例：丸：正常、未変性；四角：ＩＩ型糖尿病、未変性；三角；正常、変性；逆三角：ＩＩ型糖尿病、変性。
【図４７】図４７は、ＰＳＲ１が、膵臓組織からのモノマーよりもアミリン原線維を優先的に検出することを証明する。凡例：丸：正常、未変性；四角：ＩＩ型糖尿病、未変性；三角；正常、変性；逆三角：ＩＩ型糖尿病、変性。
【図４８】図４８は、ＩＩ型糖尿病膵臓組織におけるアミリン原線維が、血漿中で、ＰＳＲ−１と結合するが、グルタチオンまたは５Ｌ（ＰＳＲ１の負バージョン）対照ビーズと結合しないことを証明する。凡例：丸：５Ｌビーズ；四角：グルタチオンビーズ；三角：ＰＳＲ１ビーズ。
【図４９】図４９は、アルファ−シヌクレイン（ａＳｙｎ）原線維が、ＥＬＩＳＡにより検出されないことを示す。凡例：塗りつぶした丸、変性原線維；塗りつぶしていない丸、未変性。
【図５０】図５０は、対照ビーズではなくＰＳＲ１ビーズは、ＣＳＦまたは血漿に添加したアルファシヌクレイン原線維を捕捉できることを示す。凡例：塗りつぶした四角：ＰＳＲ１−ＣＳＦ中のａＳｙｎ原線維；塗りつぶしていない四角：ＣＴＲＬ−ＣＳＦ中のａＳｙｎ原線維；塗りつぶした三角：ＰＳＲ１−血漿中のａＳｙｎ原線維；塗りつぶしていない逆三角：血漿中のａＳｙｎ原線維。
【図５１】図５１は、ＰＳＲ１が、ＣＳＦおよび血漿において、モノマーよりもアルファ−シヌクレイン原線維と優先的に結合することを示す。凡例：塗りつぶした四角：ＣＳＦ中のａＳｙｎ原線維；塗りつぶしていない四角：ＣＳＦ中の変性ａＳｙｎ；塗りつぶした三角：血漿中の未変性ａＳｙｎ原線維；塗りつぶしていない三角：血漿中の変性ａＳｙｎ。
【図５２】図５２は、異なる条件下でＰＳＲ１ビーズから溶出したアルファシヌクレインの量を示す。凡例：淡いバー：ＧｄｎＳＣＮ；濃いバー：ＮａＯＨ。
【図５３Ａ】図５３は、Ｔｇ（ＳＨａＰｒＰ）マウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存プロットを示す。（Ａ）Ｔｇ（ＳＨａＰｒＰ）マウスに、プリオン力価を見積もるために、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）２６３Ｋハムスター脳ホモジネートの１０−２〜１０−１２の範囲の１０倍系列希釈を接種した。（Ｂ）２６３Ｋプリオン症状性ハムスターからのプールした感染性プリオン血漿とインキュベートしたＰＳＲ１ビーズをｉ．ｃ．接種したＴｇ（ＳＨａＰｒＰ）マウスのバイオアッセイ。ハムスターから採血し、２６３Ｋプリオンの接種の示した日数後に屠殺にした。マウスに、図に示すように、ＰＢＳまたはＴＢＳＴＴ中の５．２５または１０．５μｌビーズのいずれかを接種した。
【図５３Ｂ】図５３は、Ｔｇ（ＳＨａＰｒＰ）マウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存プロットを示す。（Ａ）Ｔｇ（ＳＨａＰｒＰ）マウスに、プリオン力価を見積もるために、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）２６３Ｋハムスター脳ホモジネートの１０−２〜１０−１２の範囲の１０倍系列希釈を接種した。（Ｂ）２６３Ｋプリオン症状性ハムスターからのプールした感染性プリオン血漿とインキュベートしたＰＳＲ１ビーズをｉ．ｃ．接種したＴｇ（ＳＨａＰｒＰ）マウスのバイオアッセイ。ハムスターから採血し、２６３Ｋプリオンの接種の示した日数後に屠殺にした。マウスに、図に示すように、ＰＢＳまたはＴＢＳＴＴ中の５．２５または１０．５μｌビーズのいずれかを接種した。
【図５４】図５４は、Ｔｇ（ＳＨａＰｒＰ）マウスからの脳切片の病理を示す。２６３Ｋプリオン感染ハムスター脳ホモジネート（Ｂ）を接種したマウス、プール２（１１７〜１１８ｄｐｉ）（Ｃ）およびプール１（１４３〜１５４ｄｐｉ）（Ｄ）からの血漿とインキュベートしたＰＳＲ１ビーズを接種したマウスは、ヘマトキシリンおよびエオシン染色により示される空胞、ＰｒＰ抗体ＳＡＦ８４により視覚化されるＰｒＰＳｃ沈着、およびＧＦＡＰに対する抗体により明示される星状細胞グリオーシスを示す。非接種マウス（Ａ）は、空胞形成、ＰｒＰＳｃ沈着またはグリオーシスの徴候を示さない。ヒストブロット分析を用いて、プロテイナーゼＫ消化およびＰＯＭ１での染色後のＰｒＰＳｃ沈着を示した。
【図５５】図５５は、Ｔｇ（ＳＨａＰｒＰ）マウスからのプロテイナーゼＫで消化した脳ホモジネートのウェスタンブロット分析を示す。（Ａ〜Ｃ）プロテイナーゼＫ耐性物質が、プール１（１４３〜１５４ｄｐｉ；マウス♯１〜９）および２（１１７〜１１８ｄｐｉ；マウス♯１〜３）からの血漿とインキュベートしたＰＳＲ１ビーズをｉ．ｃ．接種したＴｇ（ＳＨａＰｒＰ）に存在する。対照試料は、なし：健常マウスからの脳ホモジネート、および２６３：２６３Ｋプリオンを接種したマウスからの脳ホモジネートと表示する。分子量標準物質は、キロダルトンで示す。マウス♯１には、ＰＢＳ中の１０．５μｌビーズを、マウス♯２〜４には、ＰＢＳ中の５．２５μｌビーズを、マウス♯５および６には、ＴＢＳＴＴ中の１０．５μｌビーズを、マウス♯７および８には、ＴＢＳＴＴ中の５．２５μｌビーズを、そしてマウス♯１〜３（１１７〜１１８ｄｐｉ）には、ＴＢＳＴＴ中の１０．５μｌビーズを接種した。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
表の簡単な説明
表１は、例示的なコンフォメーション疾患および関連するコンフォメーションタンパク質を列挙する。
【００６３】
表２は、ＡＳＢ試薬を作製するための例示的なペプチド配列を列挙する。
【００６４】
表３は、ＡＳＢ試薬を作製するために適切な例示的なペプトイド領域を列挙する。
【００６５】
表４は、表３で用いた略語についての一覧を提供する。
【００６６】
表５は、表３に列挙したペプトイド配列についての関係する構造を提供する。
【００６７】
表６は、実施例３で試験したペプトイドについての特徴決定情報を提供する。
【００６８】
表７は、漸増密度のＰＳＲ１（＋＋＋Ａ＋Ａ）とコンジュゲートしたストレプトアビジン磁性ビーズにより捕捉される全プリオンシグナルを示す。
【００６９】
配列表の簡単な説明
配列番号１〜８は、ＡＳＢ試薬の作製において用いる例示的なペプチドのアミノ酸配列を提供する。
【００７０】
配列番号９〜２９は、ＡＳＢ試薬の作製において用いる例示的なペプトイドの改変アミノ酸配列を提供する。
【００７１】
発明の詳細な説明
本発明は、ある電荷密度にて固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する試薬の発見と関連付けられる。これらの凝集体は、アルツハイマー病、糖尿病、全身性アミロイドーシスなどのようなコンフォメーション疾患と関連することがある。
【００７２】
モノマーよりも凝集体と優先的に結合する試薬の発見により、コンフォメーション疾患またはその他の使用のためにこれらの試薬を利用する検出アッセイ、診断アッセイおよび精製または単離方法の開発が可能になる。
【００７３】
いずれの理論にも拘束されることを望まないが、これらのＡＳＢ試薬が凝集体と優先的に結合し、それを検出する能力は、凝集体内のモノマー単位の反復の性質によると考えられる。
【００７４】
多くの凝集体は、類似の物理的特性を共有する。例えば、プリオンタンパク質の凝集体であるＰｒＰＳｃは、以下の特徴を示す：β−シート含量の増加（ＰｒＰＣにおいて約３％に対してＰｒＰＳｃにおいて＞４０％）、およびＰｒＰＳｃ線維は、線維軸に沿って垂直に配向されたβ−シートで構成される。Ａβペプチドの凝集体は、類似のβ−シート構造を共有する（Ｌｕｈｒｓら、２００５年、ＰＮＡＳ１０２巻：１７３４２頁）。本出願人は、これらの反復タンパク質表面との結合は、発明の凝集体特異的試薬が、固体支持体に付着している場合にモノマーよりも凝集体と優先的に結合することの機序であると考える。
【００７５】
本発明のＡＳＢ試薬は、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している。いずれの特定の理論にも拘束されることを望まないが、本出願人は、ＡＳＢ試薬の正電荷により、それらが、ＡＳＢ試薬の正電荷と凝集体の負電荷との間のイオン性相互作用により、凝集体と結合することが可能になると考えている。これらの負電荷は、凝集体中のミスフォールディングされた配座異性体の露出した負に荷電した残基、または凝集体に含有される塩、脂質もしくはその他の種の負電荷によりもたらされることがある。イオン性相互作用は重要であるが、凝集体の構造およびサイズも、結合において役割を有する。なぜなら、ＡＳＢ試薬は、露出した正電荷を有する凝集体と優先的に結合できるからである。
【００７６】
さらに、ＡＳＢ試薬は、固体支持体上においてＡＳＢ試薬の電荷密度が増加するので、モノマーよりも凝集体に対する優先性の増加を示す。いずれの特定の理論にも拘束されることを望まないが、本出願人は、電荷密度の増加により、ＡＳＢ試薬が、より大きいアビディティで、露出した負電荷の反復パターンを有する規則正しい構造を含有する凝集体と結合することが可能になると考える。
【００７７】
これらのＡＳＢ試薬は、凝集体とのこの優先的な結合を示すために、より大きい構造またはその他のタイプの骨格分子の一部である必要はない。例示するＡＳＢ試薬は本発明の方法において有用なＡＳＢ試薬についての出発点（例えばサイズまたは配列の特徴の点で）を提供する一方で、より望ましい特質（例えばより高い親和性、より大きい安定性、より大きい溶解度、より小さいプロテアーゼ感受性、より大きい特異性、合成がより容易であることなど）を有するＡＳＢ試薬を生成するために多くの改変を行うことができることが、当業者に明らかである。
【００７８】
全般的に、本明細書で記載するＡＳＢ試薬は、ある電荷密度にて固体支持体に付着している場合にモノマーよりも凝集体と優先的に結合できる。つまり、これらの試薬は、生体のまたは死後の脳、脊髄、脳脊髄液またはその他の神経系組織ならびに血液および脾臓を含む生物学的または非生物学的な実質上いずれの試料においても凝集体の存在の迅速な検出を可能にする。ＡＳＢ試薬は、よって、広範囲の単離、精製、検出、診断および治療上の用途において有用である。
【００７９】
本発明の実施は、そうでないと示さない限り、当該分野の範囲内の化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来の方法を採用する。このような技術は、文献に詳細に説明されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０年）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．  ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．  Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．  ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６年、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９年）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｂｉｒｄｉ，  Ｋ．Ｓ．編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７年）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９９年、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：  Ａｎ  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ、（Ｒｅａｍら編、１９９８年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）；ＰＣＲ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ）、第２版（ＮｅｗｔｏｎおよびＧｒａｈａｍ編、１９９７年、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）；ＰｅｔｅｒｓおよびＤａｌｒｙｍｐｌｅ、Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（第２版）、Ｆｉｅｌｄｓら（編）、Ｂ．Ｎ．  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹを参照されたい。
【００８０】
本発明の試薬および方法は、もちろん変動し得るので、特定の処方またはプロセスパラメータに限定されないことが理解される。本明細書で用いる用語は、本発明の特定の実施形態を記載する目的のためのものであり、限定することを意図しないことも理解される。
【００８１】
Ｉ．定義
本発明の理解を容易にするために、本願において用いる選択された用語について以下に論じる。
【００８２】
タンパク質は、タンパク質ミスフォールディングの結果として、１より多いコンフォメーションで存在し得る。本明細書で用いる場合、用語「配座異性体」は、あるコンフォメーションのタンパク質モノマーのことをいう。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、タンパク質の大多数が正しくフォールディングされた配座異性体として存在する。配座異性体に関して本開示において用いる場合、用語「天然の／未変性の（ｎａｔｉｖｅ）」または「細胞性の」は、タンパク質の正しくフォールディングされた配座異性体のことをいう。タンパク質は、ミスフォールディングされた配座異性体としても存在することがある。多くの場合、これらのミスフォールディングされた配座異性体は、病原性である。本明細書で用いる場合、用語「病原性」は、タンパク質もしくは配座異性体が実際に疾患を引き起こすことを意味することがあり、またはこれは、タンパク質もしくは配座異性体が疾患と関連し、よって、疾患が存在する場合に存在することを単に意味することがある。病原性配座異性体が存在するタンパク質の例は、表１の右の列に列挙する。つまり、本開示と関連して用いられる病原性タンパク質または配座異性体は、必ずしも疾患の具体的な原因因子であるタンパク質である必要はなく、よって、感染性であってもなくてもよい。配座異性体と関連して用いる場合の用語「非病原性」は、その存在が疾患と関連しないタンパク質の未変性の配座異性体のことをいう。特定の疾患、例えばアルツハイマー病と関連する病原性配座異性体は、「病原性アルツハイマー病配座異性体」と記載することがある。
【００８３】
いくつかの場合では、タンパク質の天然ではない配座異性体は、疾患と関連しない。例えばＳｕｐ３５ｐのような酵母プリオンは、酵母細胞において天然ではない配座異性体として存在し得るが、酵母細胞の生長または生存性に対して影響を有さない。疾患と関連しない天然ではない配座異性体を形成するタンパク質の他の例は、カーリン（Ｅ．ｃｏｌｉ）、シャプリン（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、プリオンＨｅｔ−ｓ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ  ａｎｓｅｒｉｎａ）、マラリアコートタンパク質、いくつかのクモにおけるクモの糸、メラニン細胞タンパク質Ｐｍｅｌ１７、組織型プラスミノゲンアクチベータ（ｔＰＡ）ならびにＡＣＴＨ、ベータエンドルフィン、プロラクチンおよび成長ホルモンのようなホルモンである。
【００８４】
上で論じた天然ではない配座異性体とは対照的に、いくつかのタンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏでは天然ではない配座異性体として存在しないが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて天然ではない配座異性体を形成する能力がある場合がある。天然ではない配座異性体を形成する能力があるこれらのタンパク質のいくつかの例は、ミオグロビン、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼのｐ８５αサブユニットのＳＨ３ドメイン、アシルホスファターゼおよびＨｙｐＦ−Ｎ（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
【００８５】
本明細書で用いる場合、用語「凝集体」は、タンパク質の天然ではない配座異性体を１コピーより多く含有する複合体のことをいい、配座異性体間の天然ではない相互作用から生じる。凝集体は、同じタンパク質の複数コピー、１より多いタンパク質の複数コピーおよび限定されないが、糖タンパク質、リポタンパク質、脂質、グリカン、核酸および塩を含む追加の成分を含有することがある。凝集体は、封入体、プラークまたはアグリソームのような構造で存在することがある。凝集体のいくつかの例は、無定形凝集体、オリゴマーおよび原線維である。無定形凝集体は、典型的には、不規則で不溶性である。「オリゴマー」は、本明細書で用いる場合、タンパク質の天然ではない配座異性体を１コピーより多く含有する。典型的には、これらは、少なくとも２モノマーで、１０００モノマー以下、またはいくつかの場合においては１０６モノマー以下を含有する。オリゴマーは、小ミセル凝集体および前原線維（ｐｒｏｔｏｆｉｂｒｉｌ）を含む。小ミセル凝集体は、典型的に、可溶性で規則正しく、球状の構造である。前原線維も、典型的に、ベータ−シート構造を有する可溶性で規則正しい凝集体である。前原線維は、典型的に、曲線をなす構造であり、少なくとも１０、またはいくつかの場合では少なくとも２０のモノマーを含有する。原線維は、典型的に不溶性で、高度に規則正しい凝集体である。原線維は、典型的に、数百〜数千のモノマーを含有する。原線維は、例えば、交差ベータシート構造を示すアミロイドを含み、コンゴレッドで染色し、偏光の下で見た場合に、澄んだ黄緑色の複屈折により同定できる。単一試料中に含有される場合に、無定形凝集体、オリゴマーおよび原線維のような凝集体は、遠心分離により分離されることがある。例えば、１４，０００×ｇにて１０分間の遠心分離は、典型的に、大きい原線維および無定形凝集体のような非常に大きい凝集体（１０〜１０００ＭＤａ）だけを取り出し、１００，０００×ｇにて１時間の遠心分離は、典型的に、より小さい原線維および無定形凝集体のような１ＭＤａより大きい凝集体を取り出す。凝集体のサイズおよび溶解度は、分離のために要求される沈降速度に影響する。
【００８６】
本発明の凝集体は、天然ではない配座異性体として存在するかまたは存在する能力がある上で論じたいずれのタンパク質も含有してよい。多くの場合、凝集体は、疾患と関連する。このような疾患およびそれらの関連するコンフォメーションタンパク質の例を、表１に列挙する。他の場合では、凝集体は、製薬またはその他の工業的な使用のためのタンパク質の高い製造収率と関連する。例えば、組換えインスリンまたは治療上の抗体のようなタンパク質は、高レベルで生成される場合に凝集する傾向にある。凝集体は、分泌顆粒における天然の貯蔵物の形で見出すこともできる（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００９年、３２５巻：３２８頁）。
【００８７】
用語「凝集体特異的結合試薬」または「ＡＳＢ試薬」は、ある電荷密度にて固体支持体に付着している場合に、モノマーと比較して凝集体と優先的に結合する、それらに限定されないがペプチドおよびペプトイドを含む任意のタイプの試薬のことをいう。結合は、親和性、アビディティまたは特異性の増加によることがある。例えば、あるいくつかの実施形態では、本明細書で記載する凝集体特異的結合試薬は、凝集体と優先的に結合するが、それでもなお、弱いが検出可能なレベルにてモノマーと結合する能力があってよい。典型的には、弱い結合またはバックグラウンドの結合は、例えば適当な対照の使用により、目的の凝集体との優先的な相互作用から容易に見分けられる。全般的に、本発明の方法で用いる凝集体特異的結合試薬は、過剰のモノマーの存在下で凝集体と結合する。好ましくは、ＡＳＢ試薬は、モノマーについての結合親和性／アビディティよりも少なくとも約２倍高い結合親和性／アビディティで凝集体と結合する。
【００８８】
「ＰＳＲ１」は、ＡＳＢ試薬の一例である。ＰＳＲ１は、配列番号１５の配列を含有する。配列番号１５の構造を、表５に示す。
【００８９】
凝集体特異的結合試薬は、それが特異的、非特異的または特異的結合と非特異的結合のいくらかの組み合わせで結合する場合、別のペプチドまたはタンパク質と「結合する」という。試薬は、それが、モノマーよりも凝集体とより大きい親和性、アビディティおよび／またはより大きい特異性で結合する場合、凝集体と「優先的に結合する」という。用語「優先的に結合する（ｂｉｎｄ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）」、「優先的に結合する（ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｂｉｎｄ）」、「選択的に結合する（ｂｉｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ）」、「選択的に結合する（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｂｉｎｄ）」および「選択的に捕捉する」は、本明細書において交換可能に用いられる。
【００９０】
「コンフォメーションタンパク質」は、タンパク質の天然およびミスフォールディングされた配座異性体のことをいう。
【００９１】
多くのコンフォメーションタンパク質は、コンフォメーション疾患タンパク質である。「コンフォメーション疾患タンパク質」は、コンフォメーション疾患と関連するタンパク質の天然および病原性のミスフォールディングされた配座異性体のことをいい、該タンパク質の構造は、望ましくない可溶性のオリゴマーまたはアミロイド原線維のような凝集体の形成をもたらすように変化されている（例えばミスフォールディングされている）。コンフォメーション疾患タンパク質の例は、限定することなく、Ａβおよびタウのようなアルツハイマー病タンパク質；ＰｒＰＳｃおよびＰｒＰＣのようなプリオンタンパク質；アルファ−シヌクレインのようなパーキンソン病タンパク質；アミロイドＡタンパク質のようなＡＡアミロイドーシスタンパク質ならびに糖尿病タンパク質アミリンを含む。疾患と、それに関連するタンパク質（２以上の異なるコンフォメーションが仮定される）の非限定的なリストを、以下に示す。
【００９２】
表１．
【００９３】
【表１−１】
2013510297.tif 000022
【００９４】
【表１−２】
2013510297.tif 000023
「コンフォメーション疾患タンパク質」は、本明細書で用いる場合、本明細書で記載する配列と全く同じ配列を有するポリペプチドに限定されない。この用語が、任意の同定されたかまたは同定されていない種または疾患（例えばアルツハイマー病、パーキンソン病など）からのコンフォメーション疾患タンパク質を包含することが、容易に明らかである。
【００９５】
「コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬」または「ＣＰＳＢ試薬」は、特定のタンパク質の１より多い配座異性体と相互作用する任意のタイプの試薬のことをいう。好ましくは、コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬は、コンフォメーションタンパク質の天然の配座異性体およびミスフォールディングされた配座異性体の両方と結合する。いくつかの場合では、コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬は、タンパク質のモノマーおよび凝集体の両方と結合することがある。あるいくつかの場合では、ＣＰＳＢ試薬は、タンパク質配列にかかわらず、凝集体構造を認識する。このようなＣＰＳＢ試薬の例は、Ａ１１抗体であり、これは、Ａベータ、ＰｒＰおよびアルファ−シヌクレインの凝集体を認識する（Ｋａｙｅｄら、２００３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００巻：４８６頁）。その他の場合では、ＣＰＳＢ試薬は、Ａベータ凝集体だけを認識する。しかし、多くの場合では、ＣＰＳＢ試薬は、タンパク質のモノマーだけと結合する。ＣＰＳＢ試薬が捕捉試薬として用いられる本発明の方法では、ＣＰＳＢは、凝集体と結合しなければならない。ＣＰＳＢ試薬が凝集体を検出するために用いられる本発明の方法では、ＣＰＳＢは、凝集体と結合することは要求されない。ＣＰＳＢが凝集体と結合しない場合、凝集体検出のために、凝集体を変性することが必要である。典型的に、ＣＰＳＢ試薬は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体である。
【００９６】
用語「プリオン」、「プリオンタンパク質」、「ＰｒＰタンパク質」および「ＰｒＰ」は、病原性コンフォメーションまたは正常細胞性コンフォメーションのいずれも有さないことがあるプリオンタンパク質の凝集体（スクラピータンパク質、病原性タンパク質形、病原性アイソフォーム、病原性プリオンおよびＰｒＰＳｃと様々によぶ）および非凝集体（細胞性タンパク質形、細胞性アイソフォーム、非病原性アイソフォーム、非病原性プリオンタンパク質およびＰｒＰＣと様々によぶ）の両方、ならびに変性形および様々な組換え形のことをいうために本明細書において交換可能に用いる。凝集体は、ヒトおよび動物における疾患状態（海綿状脳症）と関連する。非凝集体は、動物細胞に通常存在し、適当な条件下で、病原性ＰｒＰＳｃコンフォメーションに変換されることがある。プリオンは、ヒト、ヒツジ、ウシおよびマウスを含む広く多様な哺乳類の種で天然に生成される。
【００９７】
用語「アルツハイマー病（ＡＤ）タンパク質」または「ＡＤタンパク質」は、病原性コンフォメーションまたは正常細胞性コンフォメーションのいずれも有さないことがあるアルツハイマー病タンパク質の凝集体（病原性タンパク質形、病原性アイソフォーム、病原性アルツハイマー病タンパク質およびアルツハイマー病配座異性体と様々によぶ）および非凝集体（正常細胞性形、非病原性アイソフォーム、非病原性アルツハイマー病タンパク質と様々によぶ）の両方、ならびに変性した形および様々な組換え形のことをいうために本明細書において交換可能に用いる。例示的なアルツハイマー病タンパク質は、Ａβおよびタウタンパク質を含む。
【００９８】
用語「アミロイド−ベータ」、「アミロイド−β」、「Ａベータ」、「Ａβ」、「Ａβ４２」、「Ａβ４０」、「Ａβｘ−４２」、「Ａβｘ−４０」および「Ａβ４０／４２」は、本明細書で用いる場合、全て、アミロイド−βペプチドのことをいい、これらは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の切断後に細胞外で見出される４３アミノ酸長までのファミリーである。用語Ａβは、任意の形のアミロイド−βペプチドのことを全般的にいうために用いる。用語「Ａβ４０」は、「Ａβｘ−４０」のことをいう。用語「Ａβ４２」は、「Ａβｘ−４２」のことをいう。用語「Ａβ１−４２」は、ＡＰＰのアミノ酸１〜４２に相当する断片のことをいう。用語「Ａβ１−４０」は、ＡＰＰのアミノ酸１〜４０に相当する断片のことをいう。用語Ａβ４０／４２は、Ａβ４０アイソフォームおよびＡβ４２アイソフォームの両方のことをいうために用いる。「グロブロマー」は、Ａβ４２により形成される可溶性のオリゴマーのことをいう（Ｂａｒｇｈｏｒｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００５年）。
【００９９】
用語「糖尿病タンパク質」は、病原性コンフォメーションまたは正常細胞性コンフォメーションのいずれも有さないことがある糖尿病疾患タンパク質の凝集体（病原性タンパク質形、病原性アイソフォーム、病原性糖尿病疾患タンパク質と様々によぶ）および非凝集体（正常細胞性形、非病原性アイソフォーム、非病原性糖尿病疾患タンパク質と様々によぶ）の両方、ならびに変性形および様々な組換え形のことをいうために本明細書において用いる。例示的なＩＩ型糖尿病タンパク質はアミリンであり、これは、膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）としても公知である。
【０１００】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに言及する場合の「単離された」により、示される分子が、該分子が天然で見出される生物全体から分離され、離されていることを意味するか、あるいは該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが天然で見出されない場合は、該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドをその意図する目的のために用いることができるようにその他の生物学的巨大分子から十分に離れていることを意味する。
【０１０１】
「ペプトイド」は、全般的に、少なくとも１つ、好ましくは２以上のアミノ酸置換、好ましくはＮ−置換グリシンを含有するペプチド模倣物のことをいうために使用される。ペプトイドは、なかでも、米国特許第５，８１１，３８７号に記載される。本明細書で用いる場合、「ペプトイド試薬」は、アミノ末端領域、カルボキシ末端領域および該アミノ末端領域と該カルボキシ末端領域との間の少なくとも１つの「ペプトイド領域」を有する分子である。アミノ末端領域は、典型的には任意のＮ−置換グリシンを含有しない、試薬のアミノ末端側の領域のことをいう。アミノ末端領域は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アシル、アミノ保護基、アミノ酸、ペプチドなどであり得る。カルボキシ末端領域は、任意のＮ−置換グリシンを含有しないペプトイドのカルボキシ末端の端の領域のことをいう。カルボキシ末端領域は、Ｈ、アルキル、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ保護基、アミノ酸、ペプチドなどを含み得る。
【０１０２】
「ペプトイド領域」は、アミノ末端に最も近いＮ−置換グリシンを含んでこのＮ−置換グリシンから開始し、カルボキシ末端に最も近いＮ−置換グリシンを含んでこのＮ−置換グリシンで終わる領域である。ペプトイド領域は、その中のアミノ酸の少なくとも３つがＮ−置換グリシンで置き換えられている試薬の部分のことを全般的にいう。
【０１０３】
「生理的ｐＨ」は、約５．５〜約８．５または約６．０〜約８．０または通常約６．５〜約７．５のｐＨのことをいう。
【０１０４】
「脂肪族」は、直鎖状または分岐鎖状の炭化水素部分のことをいう。脂肪族基は、ヘテロ原子およびカルボニル部分を含むことができる。
【０１０５】
「アミノ酸」は、２０の天然に存在し、遺伝子によりコードされるα−アミノ酸、またはその保護誘導体、および任意の非天然または非アルファアミノ酸のいずれかのことをいう。アミノ酸の保護誘導体は、アミノ部分、カルボキシ部分または側鎖部分上の１または複数の保護基を含有できる。アミノ保護基の例は、ベンジルオキシカルボニル、４−フェニルベンジルオキシカルボニル、２−メチルベンジルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、４−フルオロベンジルオキシカルボニル、４−クロロベンジルオキシカルボニル、３−クロロベンジルオキシカルボニル、２−クロロベンジルオキシカルボニル、２，４−ジクロロベンジルオキシカルボニル、４−ブロモベンジルオキシカルボニル、３−ブロモベンジルオキシカルボニル、４−ニトロベンジルオキシカルボニル、４−シアノベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、２−（４−キセニル）−イソプロポキシカルボニル、１，１−ジフェニルエタ−１−イルオキシカルボニル、１，１−ジフェニルプロパ−１−イルオキシカルボニル、２−フェニルプロパ−２−イルオキシカルボニル、２−（ｐ−トルイル）−プロパ−２−イルオキシカルボニル、シクロペンタニルオキシ−カルボニル、１−メチルシクロペンタニルオキシカルボニル、シクロヘキサニルオキシカルボニル、１−メチルシクロヘキサニルオキシカルボニル、２−メチルシクロヘキサニルオキシカルボニル、２−（４−トルイルスルホニル）−エトキシカルボニル、２−（メチルスルホニル）エトキシカルボニル、２−（トリフェニルホスフィノ）−エトキシカルボニル、フルオレニルメトキシカルボニル（「ＦＭＯＣ」）、２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、１−（トリメチルシリルメチル）プロパ−１−エニルオキシカルボニル、５−ベンゾイソキサリルメトキシカルボニル、４−アセトキシベンジルオキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル、２−エチニル−２−プロポキシカルボニル、シクロプロピルメトキシカルボニル、４−（デシクロキシ）ベンジルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、１−ピペリジルオキシカルボニル（１−ｐｉｐｅｒｉｄｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｌｙｌ）などのようなホルミル、トリチル、フタルイミド、トリクロロアセチル、クロロアセチル、ブロモアセチル、ヨードアセチルおよびウレタン型の遮蔽基；ベンゾイルメチルスルホニル基、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィンオキシドのようなアミノ保護基を含む。カルボキシ保護基の例は、メチル、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−メチルベンジル、ｐ−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、２，４−ジメトキシベンジル、２，４，６−トリメトキシベンジル、２，４，６−トリメチルベンジル、ペンタメチルベンジル、３，４−メチレンジオキシベンジル、ベンズヒドリル、４，４’−ジメトキシベンズヒドリル、２，２’，４，４’−テトラメトキシベンズヒドリル、ｔ−ブチル、ｔ−アミル、トリチル、４−メトキシトリチル、４，４’−ジメトキシトリチル、４，４’，４”−トリメトキシトリチル、２−フェニルプロパ−２−イル、トリメチルシリル、ｔ−ブチルジ���チルシリル、フェナシル、２，２，２−トリクロロエチル、β−（ジ（ｎ−ブチル）メチルシリル）エチル、ｐ−トルエンスルホニルエチル、４−ニトロベンジルスルホニルエチル、アリル、シンナミル、１−（トリメチルシリルメチル）プロパ−１−エン−３−イルなどの部分を含む。採用する保護基の種は、誘導体化された保護基が、適当な点にて、分子の残りの部分を破壊することなく選択的に除去できる限り、重要でない。保護基のさらなる例は、Ｅ．  Ｈａｓｌａｍ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、（Ｊ．  Ｇ．  Ｗ．  ＭｃＯｍｉｅ編、１９７３年）、第２章；ならびにＴ．  Ｗ．  ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．  Ｇ．  Ｍ．  Ｗｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、（１９９１年）、第７章（これらのそれぞれの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている）で見出される。
【０１０６】
「Ｎ−置換グリシン」は、式−（ＮＲ−ＣＨ２−ＣＯ）−（式中、各Ｒは、非水素部分である）の残基のことをいう。
【０１０７】
Ｎ−置換グリシンの塩、エステルおよび保護形（例えばＦｍｏｃまたはＢｏｃでのＮ−保護など）も含まれる。
【０１０８】
Ｎ−置換グリシンを含むアミノ酸置換を作製する方法は、なかでも、米国特許第５，８１１，３８７号（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている）に開示される。
【０１０９】
「サブユニット」は、他のサブユニットと連結して鎖、例えばペプチドを形成できる分子のことをいう。アミノ酸およびＮ−置換グリシンは、サブユニットの例である。他のサブユニットと連結している場合、サブユニットは「残基」とよぶことができる。
【０１１０】
ＩＩ．本発明の方法で用いる試薬
本発明で用いる凝集体特異的結合試薬（「ＡＳＢ試薬」）は、ある電荷密度にて固体支持体に付着している場合にモノマーよりも凝集体と優先的に結合する試薬である。
【０１１１】
典型的には、ＡＳＢ試薬は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している。好ましくは、このようなＡＳＢ試薬は、ペプチドまたは改変ペプチド（ペプトイドとして一般的に公知のものを含む）のいずれかである。
【０１１２】
あるいくつかの実施形態では、このようなＡＳＢ試薬は、ポリカチオン性である。最も好ましくは、ＡＳＢ試薬は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約２の正の、少なくとも約３の正の、少なくとも約４の正の、少なくとも約５の正の、少なくとも約６の正の、少なくとも約７の正の、少なくとも約８の正の、少なくとも約９の正の、少なくとも約１０の正の、少なくとも約１１の正のまたは少なくとも約１２の正の正味電荷を有する。ＡＳＢ試薬は、約１を超える任意の正の正味電荷を有してよい。全般的に、ＡＳＢ試薬の正味電荷が増加すると、試薬は、増加した優先性でモノマーよりも凝集体と結合する。
【０１１３】
好ましくは、ＡＳＢ試薬は、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約９０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１２０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約３０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約４０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約７０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約８０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約９０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１００００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１２０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１３０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１４０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１５０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１６０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１８０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２００００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約４００００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６００００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約８００００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１０００００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５０００００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１００００００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２００００００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２４０００００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２８０００００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約３００００００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約４００００００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５００００００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５４０００００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６００００００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６６０００００ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約７００００００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している。
【０１１４】
あるいくつかの実施形態では、ＡＳＢ試薬は、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１２ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約３０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約４０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約７０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約８０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約９０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１１０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１２０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１５０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２５０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約３００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約３５０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約４００ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約４５０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している。出願人は、このより低い範囲の電荷密度で固体支持体に付着しているＡＳＢ試薬は、モノマーよりも、小さい凝集体と結合するのではなく、モノマーよりも原線維とだけ優先的に結合しやすいと考えている。
【０１１５】
好ましい実施形態では、ＡＳＢ試薬は、モノマーについての結合親和性および／またはアビディティよりも少なくとも約２倍高い、少なくとも約２．５倍高い、少なくとも約３倍高い、少なくとも約３．５倍高い、少なくとも約４倍高い、少なくとも約４．５倍高い、少なくとも約５倍高い、少なくとも約５．５倍高い、少なくとも約６倍高い、少なくとも約６．５倍高い、少なくとも約７倍高い、少なくとも約７．５倍高い、少なくとも約８倍高い、少なくとも約８．５倍高い、少なくとも約９倍高い、少なくとも約９．５倍高い、少なくとも約１０倍高いまたは少なくとも約２０倍高い、凝集体についての結合親和性および／またはアビディティを有する。
【０１１６】
好ましい実施形態では、ＡＳＢ試薬は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨよりも少なくとも１ｐＨ単位、少なくとも約２ｐＨ単位、少なくとも約３ｐＨ単位または少なくとも約４ｐＨ単位高いｐＫａを有する少なくとも１つの正に荷電した官能基を含有する。典型的に、試料は、ＡＳＢ試薬と、生理的ｐＨにて接触する。あるいくつかの実施形態では、しかし、ｐＨは、試料に対して不利益にならずに、生理的ｐＨよりも低いかまたは高いことがある。このような実施形態では、試料は、ＡＳＢ試薬と、約１のｐＨ、約２のｐＨ、約３のｐＨ、約４のｐＨ、約５のｐＨ、約６のｐＨ、約７のｐＨ、約８のｐＨ、約９のｐＨまたは約１０のｐＨで接触してよい。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、ＡＳＢ試薬は、疎水性官能基も含有する。疎水性官能基は、例えば、芳香族または脂肪族疎水性官能基であってよい。
【０１１８】
あるいくつかの実施形態では、ＡＳＢ試薬は、アミン、アルキル基、複素環、シクロアルカン、グアニジン、エーテル、アリルおよび芳香族のような官能基を含有することがある。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、ナフチル、フェノール、アニリン、フェニル、置換フェニル、ニトロフェニル、ハロゲン化フェニル、ビフェニル、スチリル、ジフェニル、ベンジルスルホンアミド、アミノメチルフェニル、チオフェン、インドリル、ナフチル、フランおよびイミダゾールからなる群より選択される芳香族官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、ハロゲン化フェニルは、クロロフェニルまたはフルオロフェニルである。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、第１級アミン、第２級アミン、第３級アミンおよび第４級アミンからなる群より選択されるアミン官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、イソブチル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチルならびにメチルおよびオクチルからなる群より選択されるアルキル官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、テトラヒドロフラン、ピロリジンおよびピペリジンからなる群より選択される複素環官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、シクロプロピルおよびシクロヘキシルからなる群より選択されるシクロアルカン官能基を含む。このような芳香族官能基は、ナフチル、フェノールおよびアニリンを含む。さらなる実施形態では、ＡＳＢ試薬は、反復モチーフを含有する。他の実施形態では、ＡＳＢ試薬は、凝集体の負に荷電した基と同じ間隔で正に荷電した基を含有する。
【０１１９】
Ａ．ＡＳＢペプチド試薬
好ましい実施形態では、ＡＳＢ試薬は、ペプチドである。典型的に、ＡＳＢペプチド試薬は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて少なくとも１の正味正電荷、少なくとも２の正味正電荷、少なくとも３の正味正電荷、少なくとも４の正味正電荷、少なくとも５の正味正電荷、少なくとも６の正味正電荷、少なくとも７の正味正電荷、少なくとも８の正味正電荷、少なくとも９の正味正電荷、少なくとも１０の正味正電荷、少なくとも１１の正味正電荷または少なくとも１２の正味正電荷を含有する。好ましい実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸はまた、生理的ｐＨで正に荷電されている。好ましい実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸は、リシンまたはアルギニンのような天然アミノ酸である。他の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸は、オルニチン、メチルリシン、ジアミノ酪酸、ホモアルギニンまたは４−アミノメチルフェニルアラニンのような非天然アミノ酸である。好ましい実施形態では、ＡＳＢ試薬は、疎水性アミノ酸を含有する。疎水性アミノ酸は、脂肪族疎水性アミノ酸であってよい。好ましい実施形態では、疎水性アミノ酸は、トリプトファン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、チロシン、ホモフェニルアラニン、フェニルグリシン、４−クロロフェニルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、チエニルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、４−アミノフェニルアラニン、ペンタフルオロフェニルアラニン、２−ナフチルアラニン、ｐ−ビフェニルアラニン、スチリルアラニン、置換フェニルアラニン、ハロゲン化フェニルアラニン、アミノイソ酪酸、アリルグリシン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、１−ナフチルアラニン、ピリジルアラニンまたは１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸である。
【０１２０】
ＡＳＢペプチド試薬は、ペプチドが所望の特徴を維持する限り、欠失、付加および置換（一般的に保存的な性質）のような本明細書で列挙する特定のＡＳＢペプチド試薬に対する改変を含むことができる。あるいくつかの実施形態では、保存的なアミノ酸の置き換えが好ましい。保存的なアミノ酸の置き換えは、それらの側鎖で関連付けられるアミノ酸のファミリー内で生じるものである。遺伝子によりコードされるアミノ酸は、４つのファミリーに全般的に分けられる：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電で極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、時に、芳香族アミノ酸として一緒に分類される。例えば、ロイシンからイソロイシンまたはバリン、アスパラギン酸からグルタミン酸、トレオニンからセリン、またはあるアミノ酸から構造的に関連付けられるアミノ酸への同様の保存的置き換えの散発的な置き換えは、生物学的活性に対して大きな影響を有さないことが、当然予測可能である。これらの改変は、部位特異的変異誘発によるように計画的であってよく、タンパク質を生成する宿主の変異またはＰＣＲ増幅による誤りによるように偶発であってもよい。さらに、以下の１または複数の効果を有する改変を行ってよい：凝集体についての親和性、アビディティおよび／または特異性の増加；ならびにプロテアーゼに対する安定性および耐性の増加。
【０１２１】
ＡＳＢペプチド試薬は、アミノ酸の１または複数の類似体（例えば非天然アミノ酸などを含む）、置換された結合を有するペプチド、ならびに天然に存在するものおよび天然に存在しないもの（例えば合成）の両方の当該技術において公知のその他の改変を含有してよい。つまり、合成ペプチド、ダイマー、マルチマー（例えばタンデムリピート、多重抗原性ペプチド（ＭＡＰ）形、直鎖状連結ペプチド）、環化、分岐状分子などは、ペプチドとみなす。これは、１または複数のＮ−置換グリシン残基（「ペプトイド」）およびその他の合成アミノ酸またはペプチドを含有する分子も含む（例えばペプトイドの記載について米国特許第５，８３１，００５号；同第５，８７７，２７８号；および同第５，９７７，３０１号；Ｎｇｕｙｅｎら（２０００年）Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．７巻（７号）：４６３〜４７３頁；およびＳｉｍｏｎら（１９９２年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９巻（２０号）：９３６７〜９３７１頁を参照されたい）。
【０１２２】
これらおよびその他のアミノ酸類似体およびペプチド模倣物の全般的な概説について、Ｎｇｕｙｅｎら（２０００年）Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．７巻（７号）：４６３〜４７３頁；Ｓｐａｔｏｌａ，  Ａ．Ｆ．、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ．  Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２６７頁（１９８３年）を参照されたい。Ｓｐａｔｏｌａ，  Ａ．  Ｆ．，  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ（全般的な概説）、Ｖｅｇａ  Ｄａｔａ、１巻、３号、（１９８３年３月）；Ｍｏｒｌｅｙ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ（全般的な概説）、４６３〜４６８頁（１９８０年）；Ｈｕｄｓｏｎ，  Ｄ．ら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔ  Ｒｅｓ、１４巻：１７７〜１８５頁（１９７９年）（−−ＣＨ２ＮＨ−−、ＣＨ２ＣＨ２−−）；Ｓｐａｔｏｌａら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ、３８巻：１２４３〜１２４９頁（１９８６年）（−−ＣＨ２−−Ｓ）；Ｈａｎｎ  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．  Ｉ、３０７〜３１４頁（１９８２年）（−−ＣＨ−−ＣＨ−−、ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ）；Ａｌｍｑｕｉｓｔら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ、２３巻：１３９２〜１３９８頁（１９８０年）（−−ＣＯＣＨ２−−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ、２３巻：２５３３頁（１９８２年）（−−ＣＯＣＨ２−−）；Ｓｚｅｌｋｅら、欧州特許出願ＥＰ４５６６５号ＣＡ：９７巻：３９４０５頁（１９８２年）（−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；Ｈｏｌｌａｄａｙら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ、２４巻：４４０１〜４４０４頁（１９８３年）（−−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；およびＨｒｕｂｙ、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ、３１巻：１８９〜１９９頁（１９８２年）（−−ＣＨ２−−Ｓ−−）も参照されたい。
【０１２３】
天然アミノ酸と非天然アミノ酸類似体との任意の組み合わせを用いて、本明細書で記載するＡＳＢ試薬を作製できることも明らかである。遺伝子によりコードされない、通常見られるアミノ酸類似体は、それらに限定されないが、オルニチン（Ｏｒｎ）；アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ベンゾチオフェニルアラニン（ＢｔＰｈｅ）；アルビジイン（Ａｂｚ）；ｔ−ブチルグリシン（Ｔｌｅ）；フェニルグリシン（ＰｈＧ）；シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；２−ナフチルアラニン（２−Ｎａｌ）；１−ナフチルアラニン（１−Ｎａｌ）；２−チエニルアラニン（２−Ｔｈｉ）；１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）；Ｎ−メチルイソロイシン（Ｎ−ＭｅＩｌｅ）；ホモアルギニン（Ｈａｒ）；Ｎα−メチルアルギニン（Ｎ−ＭｅＡｒｇ）；ホスホチロシン（ｐＴｙｒまたはｐＹ）；ピペコリン酸（Ｐｉｐ）；４−クロロフェニルアラニン（４−ＣｌＰｈｅ）；４−フルオロフェニルアラニン（４−ＦＰｈｅ）；１−アミノシクロプロパンカルボン酸（１−ＮＣＰＣ）；４−アミノメチルフェニルアラニン（ＡｍＦ）；およびサルコシン（Ｓａｒ）を含む。ＡＳＢ試薬で用いるアミノ酸のいずれも、Ｄ−異性体またはより典型的にはＬ−異性体のいずれであってもよい。
【０１２４】
本明細書で記載するＡＳＢ試薬を形成するために用い得るアミノ酸のその他の天然に存在しない類似体は、ペプトイドを含み、かつ／または生物学的機能等価物であるアミノ酸のスルホン酸およびホウ酸類似体のようなペプチド模倣化合物も、本発明の化合物において有用であり、これは、アイソスターで場合によって置き換えられている１または複数のアミド結合を有する化合物を含む。本発明の状況では、例えば、−−ＣＯＮＨ−−は、−−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＮＨＣＯ−−、−−ＳＯ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｏ−−、−−ＣＨ２ＣＨ２−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２ＳＯ−−、−−ＣＨ−−ＣＨ−−（ｃｉｓまたはｔｒａｎｓ）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−および１，５−ジ置換テトラゾールにより、これらのアイソスターが連結するラジカルが、−−ＣＯＮＨ−−が連結するラジカルと同様の配向を保持するように置き換えてよい。本明細書で記載するＡＳＢ試薬における１または複数の残基は、Ｎ−置換グリシン残基を含んでよい。
【０１２５】
つまり、試薬はまた、１または複数のＮ−置換グリシン残基を含んでよい（１または複数のＮ−置換グリシン残基を有するペプチドは、「ペプトイド」とよぶことがある）。例えば、あるいくつかの実施形態では、本明細書で記載する任意のＡＳＢ試薬の１または複数のプロリン残基は、Ｎ−置換グリシン残基で置き換えられる。この関係において適切な具体的なＮ−置換グリシンは、それらに限定されないが、Ｎ−（Ｓ）−（１−フェニルエチル）グリシン；Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）グリシン；Ｎ−（シクロプロピルメチル）グリシン；Ｎ−（イソプロピル）グリシン；Ｎ−（３，５−ジメトキシベンジル）グリシン；およびＮ−ブチルグリシンを含む。その他のＮ−置換グリシンも、本明細書で記載するＡＳＢ試薬配列中の１または複数のアミノ酸残基を置き換えるのに適切であり得る。
【０１２６】
本明細書で記載するＡＳＢ試薬は、モノマー、マルチマー、環化分子、分岐鎖状分子、リンカーなどであってよい。本明細書で記載する配列のいずれかのマルチマー（すなわち、ダイマー、トリマーなど）またはその生物学的機能等価物も企図する。マルチマーは、ホモマルチマーであり得（すなわち同一のモノマーで構成される）、例えば各モノマーが同じペプチド配列である。代わりに、マルチマーは、ヘテロマルチマーであり得、これは、マルチマーを構成するモノマーの全てが同一ではないことを意味する。
【０１２７】
マルチマーは、モノマーを互いに、あるいは担体に直接付着させることにより形成できる（例えば、多重抗原性ペプチド（ＭＡＰＳ）（例えば対称性ＭＡＰＳ）、ポリマー骨格、例えばＰＥＧ骨格に付着したペプチドおよび／またはスペーサ単位ありもしくはなしでタンデムに連結したペプチドを含む）。
【０１２８】
代わりに、連結基をモノマー配列に付加して、モノマーを一緒につなぎ合わせて、マルチマーを形成できる。連結基を用いるマルチマーの非限定的な例は、グリシンリンカーを用いるタンデムリピート；リンカーを介して担体に付着しているＭＡＰＳおよび／またはリンカーを介して骨格に付着している直鎖状連結ペプチドを含む。連結基は、当業者に公知の二官能性スペーサ単位（ホモ二官能性またはヘテロ二官能性のいずれか）を用いることを含み得る。例として、そして限定ではなく、このようなスペーサ単位を、４−（ｐ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジル（ＳＭＣＣ）、４−（ｐ−マレイミドフェニル）酪酸スクシンイミジルなどのような試薬を用いて連結ペプチドに一緒に組み込むための多くの方法が、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、現在のＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｉｌｌ．）に記載されているか、またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）およびＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓ．）（現在のＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）からも入手可能であり、「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ」、ＶＣＫ−Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ／Ｇｅｒｍａｎｙ（１９８９年）に記載されている。モノマー配列を一緒に連結するために用い得る連結基の一例は、−−Ｙ１−−Ｆ−−Ｙ２（式中、Ｙ１およびＹ２は同一または異なり、０〜２０、好ましくは０〜８、より好ましくは０〜３炭素原子のアルキレン基であり、Ｆは、−−Ｏ−−、−−Ｓ−−、−−Ｓ−−Ｓ−−、−−Ｃ（Ｏ）−−Ｏ−−、−−ＮＲ−−、−−Ｃ（Ｏ）−−ＮＲ−−、−−ＮＲ−−Ｃ（Ｏ）−−Ｏ−−、−−ＮＲ−−Ｃ（Ｏ）−−ＮＲ−−、−−ＮＲ−−Ｃ（Ｓ）−−ＮＲ−−、−−ＮＲ−−Ｃ（Ｓ）−−Ｏ−−のような１または複数の官能基である）である。Ｙ１およびＹ２は、ヒドロキシ、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノ、カルボキシル、カルボキシアルキルなどで場合によって置換されていてよい。モノマーの任意の適当な原子が、連結基に付着できることが理解される。
【０１２９】
さらに、本明細書で記載するＡＳＢ試薬は、直鎖状、分岐鎖状または環化されていてよい。モノマー単位は、環化でき、あるいは一緒に連結されて、直鎖状もしくは分岐鎖状の様式、環の形（例えばマクロ環）、星の形（デンドリマー）またはボールの形（例えばフラーレン）のマルチマーを提供してよい。当業者は、本明細書で開示するモノマー配列から形成できる多数のポリマーを容易に認識する。あるいくつかの実施形態では、マルチマーは、環状ダイマーである。上記と同じ用語を用いて、ダイマーは、ホモダイマーまたはヘテロダイマーであり得る。
【０１３０】
モノマーまたはマルチマーのいずれであっても環状の形は、それらに限定されないが、例えば（１）Ｎ末端アミンをＣ末端カルボン酸と、窒素とＣ末端カルボニルとの間の直接アミド結合形成によりもしくは例えばイプシロン−アミノカルボン酸との縮合によるようなスペーサ基の仲介により環化すること；（２）２つの残基の側鎖間の結合の形成により、例えばアスパラギン酸もしくはグルタミン酸側鎖とリシン側鎖との間にアミド結合を形成することによりまたは２つのシステイン側鎖間もしくはペニシラミン側鎖とシステイン側鎖との間もしくは２つのペニシラミン側鎖間にジスルフィド結合を形成することにより環化すること；（３）側鎖（例えばアスパラギン酸またはリシン）とそれぞれＮ末端アミンもしくはＣ末端カルボキシルのいずれかとの間のアミド結合の形成により環化すること；および／あるいは（４）２つの側鎖を、短い炭素スペーサ基の仲介により連結することのような上記の任意の結合により作製できる。
【０１３１】
さらに、本明細書で記載するＡＳＢ試薬は、追加のペプチドまたは非ペプチド成分も含んでよい。追加のペプチド成分の非限定的な例は、スペーサ残基、例えば２以上のグリシン（天然または誘導体化された）残基、または一方もしくは両方の端のアミノヘキサン酸リンカー、またはペプチド試薬の可溶化を助け得る残基、例えばアスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）のような酸性残基を含む。あるいくつかの実施形態では、例えば、ペプチド試薬は、多重抗原性ペプチド（ＭＡＰ）として合成される。典型的には、ペプチド試薬の複数コピー（例えば２〜１０コピー）は、分岐鎖状リシンのようなＭＡＰキャリアまたはその他のＭＡＰキャリアコア上に直接合成される。例えば、Ｗｕら（２００１年）Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２００１年１２３巻（２８号）：６７７８〜８４頁；Ｓｐｅｔｚｌｅｒら（１９９５年）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４５巻（１号）：７８〜８５頁を参照されたい。
【０１３２】
本明細書で記載するＡＳＢ試薬に含むことができる非ペプチド成分（例えば化学部分）の非限定的な例は、ペプチド試薬のいずれかの末端または内部での１または複数の検出可能な標識、タグ（例えばビオチン、Ｈｉｓ−Ｔａｇ、オリゴヌクレオチド）、色素、結合対のメンバーなどを含む。非ペプチド成分は、直接もしくはスペーサ（例えばアミド基）を介して、干渉しないように、定量構造活性データおよび／または分子モデリングにより予測される化合物の位置（複数可）に付着することもできる（例えば１または複数の標識の共有的付着により）。本明細書で記載するＡＳＢ試薬は、アミロイド特異的色素（例えばコンゴレッド、チオフラビンなど）のような化学部分も含み得る。化合物の誘導体化（例えば標識化、環化、化学部分の付着など）は、試薬の結合特性、生物学的機能および／または薬理活性に実質的に干渉すべきではない（それらをさらに増進してよい）。
【０１３３】
上記のペプチドは、それらに限定されないが、組換え構築物からの発現およびペプチド合成を含む当業者に公知の標準的な方法を用いて調製できる。
【０１３４】
Ｂ．ＡＳＢ試薬の基本として用いられる好ましいペプチドの例
本発明の凝集体特異的結合試薬を作製するために有用なペプチドの非限定的な例は、好ましくは、表２に示す配列に由来する。この表におけるペプチドは、従来の１文字アミノ酸コードで表され、アミノ末端を左に、そしてカルボキシ末端を右にして示す。
【０１３５】
この表における配列のいずれも、Ｇｌｙリンカー（Ｇｎ、ここでｎ＝１、２、３または４）を、アミノおよび／またはカルボキシ末端に場合によって含んでよい。典型的には、アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）をリンカーとして用いる。表における配列のいずれも、キャッピング基を、アミノおよび／またはカルボキシ末端に場合によって含んでよい。このようなキャッピング基の一例は、アセチル基である。キャッピング基は、負に荷電していないことが好ましい。
【０１３６】
表２：ＡＳＢ試薬を作製するためのペプチド配列
【０１３７】
【表２−１】
2013510297.tif 000024
【０１３８】
【表２−２】
2013510297.tif 000025
【０１３９】
【表２−３】
2013510297.tif 000026
【０１４０】
【表２−４】
2013510297.tif 000027
Ｃ．ペプトイドＡＳＢ試薬
特に好ましい実施形態では、ＡＳＢ試薬はペプトイドである。ペプトイドを作製する方法は、米国特許第５，８１１，３８７号および同第５，８３１，００５号、ならびに本明細書で開示する方法に開示される。好ましいペプトイドを以下に記載する。ＡＳＢペプトイド試薬は、ペプトイドが所望の特徴を維持する限り、欠失、付加および置換（一般的に保存的な性質）のような本明細書で列挙する特定のＡＳＢペプトイド試薬に対する改変を含むことができる。
【０１４１】
好ましいペプトイド配列
表３は、本発明で用いられるＡＳＢ試薬を調製するために適切なペプトイド領域（アミノからカルボキシへの向き）の例を列挙する。表４は、表３で用いた略語についての一覧を提供する。表５は、配列のそれぞれの関係する構造を提供する。特定のＡＳＢ試薬の調製は、本明細書において以下に記載する。
【０１４２】
表３：ＡＳＢ試薬のための代表的なペプトイド試薬
【０１４３】
【表３】
2013510297.tif 000028
表４：表３への略語の一覧
【０１４４】
【表４−１】
2013510297.tif 000029
【０１４５】
【表４−２】
2013510297.tif 000030
表５：表３のペプトイド領域の関係する構造
【０１４６】
【表５−１】
2013510297.tif 000031
【０１４７】
【表５−２】
2013510297.tif 000032
【０１４８】
【表５−３】
2013510297.tif 000033
【０１４９】
【表５−４】
2013510297.tif 000034
【０１５０】
【表５−５】
2013510297.tif 000035
特に好ましい実施形態では、ＡＳＢ試薬は、ＰＳＲ１の構造：
【０１５１】
【化２１】
2013510297.tif 000036
（式中、ＲおよびＲ’は任意の基であり得る）
を含有する。
【０１５２】
Ｄ．その他の骨格からのＡＳＢ試薬
本発明のあるいくつかの実施形態では、ＡＳＢ試薬は、ペプチドおよびペプトイド以外の正に荷電した有機分子骨格を含む。好ましい実施形態では、ＡＳＢ試薬は、デンドロンである。特に好ましい実施形態では、ＡＳＢ試薬は、
【０１５３】
【化２２】
2013510297.tif 000037
の構造を含む。
【０１５４】
Ｅ．本発明の方法で用いられるＡＳＢ試薬の同定
本発明の方法で用いられるＡＳＢ試薬は、ある電荷密度にて固体支持体に付着している場合にモノマーよりも凝集体と優先的に結合する。この特性は、任意の公知の結合アッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットなどのような標準的なイムノアッセイ；標識ペプチド；ＥＬＩＳＡ様アッセイ；および／または細胞ベースのアッセイ、特に「凝集体とＡＳＢ試薬との結合による凝集体の検出」に関する以下の項で記載するアッセイを用いて試験できる。
【０１５５】
本発明の方法で用いるＡＳＢ試薬の特異性を試験するある簡便な方法は、凝集体とモノマーの両方を含有する試料を選択することである。典型的には、このような試料は、疾患動物からの組織を含む。凝集体と特異的に結合することがわかっている本明細書で記載するＡＳＢ試薬は、固体支持体に付着しており（当該技術において周知であり、以下にさらに記載する方法により）、凝集体を他の試料成分から分離して（「プルダウン」）、固体支持体上の試薬−タンパク質結合相互作用の数と直接的に関連付けられる定量的な値を得るために用いられる。この結果を、未知の結合特異性を有するＡＳＢ試薬のものと比較して、このような試薬が凝集体と優先的に結合できるか否かを決定できる。
【０１５６】
ＩＩＩ．凝集体とＡＳＢ試薬との結合による凝集体の検出
記載するＡＳＢ試薬は、試料（例えば血液、脳、脊髄、ＣＳＦまたは器官試料のような生物学的試料）をスクリーニングするため、例えば、これらの試料中の凝集体の存在または非存在を検出するための多様なアッセイにおいて用いることができる。多くの現在の試薬とは異なって、本明細書で記載するＡＳＢ試薬は、血液試料、血液生成物、ＣＳＦもしくは生検試料を含む実質上いずれのタイプの生物学的または非生物学的試料における検出も可能にする。
【０１５７】
例えば、凝集体と関連する疾患の診断のための方法、および凝集体の存在または非存在について知ることが重要である任意のその他の状況において、上記検出方法を用いることができる。
【０１５８】
捕捉試薬または検出試薬のいずれかとしての凝集体特異的結合試薬の使用
本発明の方法で用いられるＡＳＢ試薬は、典型的に、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。１より多いコンフォメーションタンパク質の凝集体を含有することが期待される試料について、またはその方法の目的のためにどのタイプの凝集体が存在するかを決定することが重要である場合には、凝集体特異的結合試薬は、異なるタイプのコンフォメーションタンパク質についての異なる結合特異性および／または親和性を有するＣＰＳＢ試薬と組み合わせて検出のために用いるべきである。例えば、凝集体特異的結合試薬を捕捉試薬として用いる場合、コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬を検出試薬として用いるか、またはその逆であるべきである。しかし、アッセイされる特定の試料が、単一のタイプの凝集体だけを含有すると期待されるか、またはその方法の目的のためにどの凝集体が存在するかを決定することが重要でない場合、ＡＳＢ試薬は、捕捉および検出の両方の試薬として用いることができる。
【０１５９】
凝集体特異的結合試薬を捕捉剤として用いる方法
好ましい実施形態では、本発明は、凝集体を含有する疑いがある試料を、凝集体特異的結合試薬と、試薬と存在するならば凝集体との結合を可能にする条件下で接触させ、試料中の、もしあるならば凝集体の存在を、凝集体と試薬との結合により検出することにより、試料中の凝集体の存在を検出する方法を提供し、ここで、凝集体特異的結合試薬は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。
【０１６０】
本発明の方法で用いるために、試料は、凝集体を含有するとわかっているかまたは疑いがあるものであれば何でも可能である。試料は、生物学的試料（つまり、生体または以前は生きていた生物から調製された試料）または非生物学的試料であり得る。典型的に、生物学的試料は、体組織または体液を含有する。適切な生物学的試料は、それらに限定されないが、全血、血液分画物、血液成分、血漿、血小板、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、骨髄、尿、涙、乳汁、リンパ液、器官組織、脳組織、神経系組織、筋肉組織、非神経系組織、生検材料、剖検材料、脂肪生検材料、細胞、大便、胎盤、脾臓組織、リンパ組織、膵臓組織、気管支肺胞洗浄液または滑液を含む。好ましい生物学的試料は、血漿およびＣＳＦを含む。あるいくつかの実施形態では、試料は、ポリペプチドを含有する。
【０１６１】
試料は、本明細書で記載する１または複数のＡＳＢ試薬と、ＡＳＢ試薬（複数可）と試料中に存在するならば凝集体との結合を可能にする条件下で、接触させる。本明細書の開示に基づいて、特定の条件を決定することは、当業者の力量の十分に範囲内である。典型的には、試料とＡＳＢ試薬（複数可）とを一緒に、適切な緩衝液中で生理的ｐＨにて適切な温度（例えば約４〜３７℃）にて、適切な期間（例えば約１時間〜１晩）インキュベートして、結合の発生を可能にする。
【０１６２】
本方法のこれらの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は捕捉試薬であり、試料中の凝集体の存在は、凝集体と凝集体特異的結合試薬との結合により検出される。捕捉の後に、凝集体の存在は、同時に捕捉および検出試薬として働くまさに同じ凝集体特異的結合試薬により検出され得る。代わりに、別個の検出試薬が存在でき、これは、異なる凝集体特異的結合試薬、または好ましくは１もしくは複数のコンフォメーションタンパク質特異的結合試薬のいずれかであり得る。好ましい実施形態では、ＣＰＳＢ試薬は、標識抗体である。好ましい実施形態では、捕捉ステップの後に、未結合の試料を除去し、凝集体を、ＡＳＢ試薬と形成した複合体から解離させて、解離凝集体を得る。解離凝集体を、第１ＣＰＳＢ試薬と接触させて第２複合体の形成を可能にし、試料中の凝集体の存在を、第２複合体の形成を検出することにより検出する。好ましい実施形態では、第２複合体の形成は、検出可能に標識された第２ＣＰＳＢ試薬を用いて検出する。第１ＣＰＳＢ試薬は、好ましくは、固体支持体に連結している。特に好ましい実施形態では、凝集体は、Ａベータタンパク質を含有し、ＣＰＳＢ試薬は、抗Ａベータ抗体である。
【０１６３】
凝集体特異的結合試薬を検出剤として用いる方法
他の実施形態では、本発明は、凝集体を含有する疑いがある試料を、コンフォメーションタンパク質のモノマーおよび凝集体の両方と結合するコンフォメーションタンパク質特異的結合試薬と、ＣＰＳＢ試薬と存在するならば凝集体とが結合して第１複合体が形成することを可能にする条件下で、接触させ、結合を可能にする条件下で第１複合体をＡＳＢ試薬と接触させ、試料中の、もしあるならば凝集体の存在を、凝集体とＡＳＢ試薬との結合により検出することにより、試料中の凝集体の存在を検出する方法を提供し、ここで、ＡＳＢ試薬は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。典型的には、捕捉ステップの後に、未結合の試料を除去する。ＣＰＳＢ試薬は、好ましくは、固体支持体と連結している。
【０１６４】
Ａ．凝集体を捕捉するための試薬
好ましい実施形態では、捕捉試薬は、凝集体特異的結合試薬であり、これは、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。他の実施形態では、捕捉試薬は、コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬であり、これは、コンフォメーションタンパク質のモノマーおよび凝集体の両方と結合する。
【０１６５】
捕捉試薬は、試料と、試料中の任意の凝集体が試薬と結合して複合体を形成することを可能にする条件下で、接触させる。このような結合条件は、当業者により容易に決定され、本明細書でさらに記載される。典型的に、上記方法は、マイクロタイタープレートのウェルまたは小容量プラスチックチューブで行われるが、任意の使いやすい容器が適切である。試料は、全般的に、液体試料または懸濁物であり、捕捉試薬の前または後に反応容器に加えることができる。
【０１６６】
捕捉試薬が上記の凝集体特異的結合試薬である場合、これは、好ましくは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌで固体支持体と連結する。
【０１６７】
捕捉試薬が、代わりに、ＣＰＳＢ試薬である場合、これは、好ましくは固体支持体と連結し、これは、以下の項においてさらに詳細に記載する。いくつかの実施形態では、固体支持体は、試料を加える前に付着している。固体支持体（例えば磁性ビーズ）は、まず、本明細書で記載する捕捉試薬が支持体に十分に固定化されるように、該捕捉試薬と反応させる。捕捉試薬が付着した固体支持体は、次いで、凝集体を含有する疑いがある試料と、捕捉試薬が凝集体と結合することを可能にする条件下で、接触させる。
【０１６８】
代わりに、捕捉試薬がＣＰＳＢ試薬である場合、これは、まず、固体支持体に付着させる前に凝集体を含有する疑いがある試料と接触させ、その後、捕捉試薬を固体支持体に付着させることができる（例えば、試薬は、ビオチン化されることができ、固体支持体は、固体支持体と連結されたアビジンまたはストレプトアビジンを含む）。
【０１６９】
あるいくつかの実施形態では、捕捉試薬と凝集体との間の複合体が確立された後に、未結合の試料物質（つまり、任意の未結合の凝集体を含む、捕捉試薬と結合しなかった試料の任意の成分）を除去できる。例えば、捕捉試薬が固体支持体に連結している場合、未結合の物質は、固体支持体を反応溶液（未結合の試料物質を含有する）から、例えば遠心分離、沈殿、ろ過、磁力などにより分離することにより、低減できる。複合体を有する固体支持体は、上記方法の次のステップを行う前に任意の残存試料物質を除去するために、場合によって１または複数の洗浄ステップに供してよい。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、未結合の試料物質の除去および任意の場合によっての洗浄の後に、結合した凝集体は、複合体から解離され、任意の公知の検出方法を用いて検出される。代わりに、複合体中の結合した凝集体は、捕捉試薬から解離することなく検出される。
【０１７１】
Ｂ．凝集体の解離および変性
捕捉試薬と結合して複合体を形成した後に、凝集体を、凝集体の検出を容易にするために処理してよい。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、未結合の物質を除去し、凝集体を、次いで、複合体から解離させる。「解離」とは、捕捉試薬から分離して凝集体を検出できるような、捕捉試薬からの凝集体の物理的分離のことをいう。複合体からの凝集体の解離は、例えば、低濃度（例えば０．４〜１．０Ｍ）のグアニジン塩酸塩またはグアニジンイソチオシアン酸塩を用いて遂行できる。
【０１７３】
その方法で用いるＣＰＳＢ試薬が、変性タンパク質を検出できるだけである場合、解離凝集体も変性される。「変性」は、ポリペプチドの天然のコンフォメーションを破壊することをいう。試薬から解離せずに変性することは、例えば、試薬が、試薬と凝集体とを共有的に連結する活性化可能な反応性基（例えば光反応性基）を含有する場合、遂行できる。
【０１７４】
好ましい実施形態では、凝集体は、同時に解離および変性される。
【０１７５】
凝集体は、高濃度の塩またはカオトロピック剤、例えば約３Ｍから約６Ｍのチオシアン酸グアニジン（ＧｄｎＳＣＮ）またはグアニジンＨＣｌ（ＧｄｎＨＣｌ）のようなグアニジウム塩を用いて同時に解離および変性してよい。好ましくは、カオトロピック剤は、検出を行う前に除去するかまたは希釈する。なぜなら、これらは、検出試薬の結合に干渉し得るからである。
【０１７６】
他の実施形態では、凝集体は、ｐＨを変更することにより、例えばｐＨを１２以上（「高ｐＨ」）に上げるかもしくはｐＨを２以下（「低ｐＨ」）に下げることにより、捕捉試薬との複合体から解離され、同時に、変性される。複合体を高ｐＨに曝露することが好ましい。１２．０から１３．０までのｐＨが、通常、十分である。好ましくは、１２．５から１３．０まで、１２．７から１２．９まで、または１２．９のｐＨを用いる。代わりに、複合体を低ｐＨに曝露することを用いて、病原性タンパク質を試薬から解離および変性させることができる。この代替について、１．０から２．０までのｐＨが十分である。いくつかの実施形態では、凝集体は、ｐＨ１２．５〜１３．２で、適切な時間量、例えば９０℃にて１０分間処理される。
【０１７７】
第１複合体を、高ｐＨまたは低ｐＨのいずれかに曝露することは、一般的に、短時間だけ、例えば６０分間、好ましくは１５分以下、より好ましくは１０分以下で行われる。いくつかの実施形態では、曝露は、室温より上、例えば約６０℃、７０℃、８０℃または９０℃にて行われる。凝集体を解離するのに十分な時間の曝露の後に、ｐＨを、酸性試薬（高ｐＨ解離条件を用いる場合）または塩基性試薬（低ｐＨ解離条件を用いる場合）のいずれかを加えることにより、中性（つまり、約７．０から７．５までのｐＨ）に容易に再調整できる。当業者は、適当なプロトコールを容易に決定でき、実施例を本明細書で記載する。
【０１７８】
全般的に、高ｐＨ解離条件に影響するために、ＮａＯＨを約０．０５Ｎ〜約０．２Ｎの濃度まで加えることが十分である。好ましくは、ＮａＯＨを約０．０５Ｎから約０．１５Ｎまでの濃度まで加え、より好ましくは約０．１ＮのＮａＯＨを用いる。解離が一旦遂行されると、ｐＨを、適切な量の酸性溶液、例えばリン酸、第１リン酸ナトリウムを加えることにより、中性（つまり、約７．０から７．５まで）に再調整できる。
【０１７９】
全般的に、低ｐＨ解離条件に影響するために、Ｈ３ＰＯ４を約０．２Ｍ〜約０．７Ｍの濃度まで加えることが十分である。好ましくは、Ｈ３ＰＯ４を、０．３Ｍから０．６Ｍまでの濃度まで加え、より好ましくは０．５ＭのＨ３ＰＯ４を用いる。解離が一旦遂行されると、ｐＨを、適切な量の塩基性溶液、例えばＮａＯＨまたはＫＯＨを加えることにより、中性（つまり、約７．０から７．５まで）に再調整できる。
【０１８０】
所望により、複合体からの凝集体の解離は、例えば低濃度（例えば０．４〜１．０Ｍ）のグアニジン塩酸塩またはグアニジンイソチオシアン酸塩を用いてタンパク質を変性させることなく遂行することもできる。ＷＯ２００６０７６４９７（国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００１０９０号）を、タンパク質を変性させることなく複合体から凝集体を解離させる追加の条件について参照されたい。代わりに、捕捉された凝集体はまた、例えば試薬を、試薬と凝集体とを共有的に連結するために用いることができる活性化可能な反応性基（例えば光反応性基）を含有するように改変する場合、試薬から解離することなく変性させることができる。
【０１８１】
解離の後に、凝集体を、次いで、捕捉試薬から分離する。この分離は、未結合の物質（今では解離凝集体）を含有する部分を取り出し、捕捉試薬を含有する部分を廃棄する以外は、上記の未結合の試料物質の除去と類似の様式で遂行できる。
【０１８２】
Ｃ．捕捉された凝集体の検出
凝集体の検出は、コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬を用いて遂行してよい。好ましい実施形態では、ＣＰＳＢ試薬は、コンフォメーションタンパク質上のエピトープを認識する抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）である。
【０１８３】
試料中の捕捉された凝集体の検出は、ＡＳＢ試薬を用いることにより遂行してもよい。このような試薬は、捕捉試薬が同じかもしくは異なる凝集体特異的結合試薬、またはコンフォメーションタンパク質特異的結合試薬のいずれかである実施形態において、用いてよい。
【０１８４】
その方法が、第１凝集体特異的結合試薬および第２凝集体特異的結合試薬を利用する場合、第１および第２の試薬は、同じかまたは異なることができる。「同じ」により、第１および第２の試薬が、第２試薬が検出可能な標識を含むことにおいてだけ異なることを意味する。第１および第２の試薬は、例えばこれらが異なる構造を有するか、またはプリオンタンパク質の異なる領域からの断片に由来する場合、「異なる」。
【０１８５】
全般的な検出方法
任意の適切な検出手段を、次いで用いて、捕捉試薬と凝集体との間の結合を同定できる。
【０１８６】
結合を検出するために用いるために適切な分析方法は、蛍光、電子顕微鏡観察、原子間力顕微鏡観察、ＵＶ／可視分光法、ＦＴＩＲ、核磁気共鳴分光法、ラマン分光法、質量分析、ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動、表面プラズモン共鳴分光法、微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）または当該技術において公知の任意のその他の方法のような方法を含む。
【０１８７】
結合は、しばしばＥＬＩＳＡの形で、標識された試薬または抗体を用いることにより検出してもよい。本発明で用いるために適切な検出可能な標識は、それらに限定されないが、放射活性同位体、蛍光剤（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）、化学発光剤（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）、発色団、蛍光半導体ナノ結晶、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、発色団、色素、金属イオン、金属ゾル、リガンド（例えばビオチン、ストレプトアビジンまたはハプテン）などを含む、検出の能力がある任意の分子を含む。追加の標識は、それらに限定されないが、検出可能範囲の蛍光を示す能力がある材料またはその部分を含む、蛍光を用いるものを含む。本発明で用い得る標識の具体例は、それらに限定されないが、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、ジメチルアクリジニウムエステル（ＤＭＡＥ）、テキサスレッド、ルミノール、ＮＡＤＰＨおよびβ−ガラクトシダーゼを含む。さらに、検出可能な標識は、オリゴヌクレオチドタグを含んでよく、これは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、分岐鎖状ＤＮＡ（ｂ−ＤＮＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）などを含む核酸検出方法により検出できる。好ましい検出可能な標識は、酵素、特にアルカリホスファターゼ（ＡＰ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）および蛍光化合物を含む。当該技術において周知のように、酵素は、検出可能な基質、例えば色素形成性基質または蛍光形成性基質と組み合わせて利用して、検出可能なシグナルを生じる。
【０１８８】
標識された検出試薬（上記）を用いることに加えて、免疫沈降を用いて、凝集体と結合した試薬を分離して取り出してよい。好ましくは、免疫沈降は、沈殿増進剤を加えることにより容易になる。沈殿増進剤は、タンパク質と結合した試薬の沈殿を増進または増加できる部分を含む。このような沈殿増進剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、プロテインＧ、プロテインＡなどを含む。プロテインＧまたはプロテインＡを沈殿増進剤として用いる場合、これらのタンパク質は、ビーズ、好ましくは磁性ビーズに場合によって付着できる。沈殿は、遠心分離の使用または磁力の使用によりさらに増進できる。このような沈殿増進剤の使用は、当該技術において公知である。
【０１８９】
ウェスタンブロットは、例えば、典型的に、タグ付加１次抗体を採用し、これが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからの変性タンパク質を、ニトロセルロースまたはＰＶＤＦ上にエレクトロブロットされた「プルダウン」アッセイ（上記のような）から得られる試料において検出する。１次抗体を、次いで、タグについてのプローブ（例えばストレプトアビジンコンジュゲートアルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、ＥＣＬ試薬および／または増幅可能なオリゴヌクレオチド）を用いて検出する（および／または増幅する）。結合は、標識され、親和性タグについてのプローブ（例えばストレプトアビジンコンジュゲートアルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、ＥＣＬ試薬または増幅可能なオリゴヌクレオチド）を用いて増幅される親和性タグ（例えばビオチン）を有するペプチドのような検出試薬を用いて評価することもできる。
【０１９０】
細胞ベースのアッセイも採用でき、例えば、ここでは、凝集体を、個別の細胞上で直接検出する（例えば、蛍光ベースの細胞選別、計数または特異的に標識された細胞の検出を可能にする蛍光標識された試薬を用いて）。
【０１９１】
検出試薬からのシグナルを増幅するアッセイも公知である。この例は、ビオチンおよびアビジンを用いるアッセイ、ならびに酵素標識および酵素媒介イムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡアッセイである。さらなる例は、シグナル増幅のための分岐鎖状ＤＮＡの使用（例えば米国特許第５，６８１，６９７号；同第５，４２４，４１３号；同第５，４５１，５０３号；同第５，４５４７，０２５号；および同第６，２３５，４８３号）；ＰＣＲ、ローリングサークル増幅、Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅのインベーダ（Ａｒｒｕｄａら２００２年Ｅｘｐｅｒｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．  Ｄｉａｇｎ．２巻：４８７頁；米国特許第６０９０６０６号、同第５８４３６６９号、同第５９８５５５７号、同第６０９０５４３号、同第５８４６７１７号）、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ（米国特許第６，５１１，８０９号；ＥＰ第０５４４２１２Ａ１号）などのような標的増幅技術を用いること；および／またはイムノ−ＰＣＲ技術（例えば米国特許第５，６６５，５３９号；国際公開ＷＯ９８／２３９６２；ＷＯ００／７５６６３；およびＷＯ０１／３１０５６を参照されたい）を含む。
【０１９２】
さらに、サンドイッチＥＬＩＳＡと同様のマイクロタイタープレートでの手順を用いてよく、例えば、本明細書で記載する凝集体特異的結合試薬またはコンフォメーションタンパク質特異的結合試薬を用いてタンパク質（複数可）を固体支持体（例えばマイクロタイタープレートのウェル、ビーズなど）に固定化し、それらに限定されないが、コンジュゲートアルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、ＥＣＬ試薬または増幅可能なオリゴヌクレオチドのような親和性および／もしくは検出標識を有する別の凝集体特異的結合試薬またはコンフォメーションタンパク質特異的結合試薬を含み得る追加の検出試薬を用いて、凝集体を検出する。
【０１９３】
捕捉された解離凝集体を検出するための好ましい方法
捕捉試薬および結合した凝集体が検出の前に解離される場合、解離凝集体は、以下により詳細に記載される直接ＥＬＩＳＡまたは抗体サンドイッチＥＬＩＳＡタイプのアッセイのいずれかでのＥＬＩＳＡタイプのアッセイで検出できる。用語「ＥＬＩＳＡ」は、抗体を用いる検出を記載するために用いるが、アッセイは、抗体が「酵素連結」しているものに限定されない。検出抗体は、本明細書で記載し、イムノアッセイの技術において周知の検出可能な標識のいずれを用いても標識できる。Ｌａｕら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １０４巻（２８号）：１１５５１〜１１５５６頁（２００７年）に記載されるようなＥＬＩＳＡを行って、捕捉試薬から解離された凝集体の量を定量化できる。
【０１９４】
解離凝集体は、標準的なＥＬＩＳＡのために、それで固体支持体の表面を受動的に被覆することにより調製できる。このような受動的被覆の方法は周知であり、典型的に、１００ｍＭのＮａＨＣＯ３中でｐＨ８にて、約３７℃にて数時間または４℃にて１晩行われる。その他の被覆緩衝液は周知である（例えば５０ｍＭ炭酸塩ｐＨ９．６、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８または１０ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ７．２）。固体支持体は、本明細書で記載するかまたは当該技術において周知の任意の固体支持体であり得るが、好ましくは、固体支持体は、マイクロタイタープレート、例えば９６ウェルポリスチレンプレートである。高濃度のカオトロピック剤を用いて解離を行った場合、カオトロピック剤の濃度は、希釈により、固体支持体を被覆する前に少なくとも約２倍に低減する。高または低ｐＨと、その後の中和を用いて解離を行った場合、解離凝集体は、さらなる希釈なしで被覆のために用いることができる。プレート（複数可）を洗浄して、未結合の物質を除去できる。
【０１９５】
標準的なＥＬＩＳＡを行う場合、固体支持体に付着しているコンフォメーションタンパク質特異的結合試薬または凝集体特異的結合試薬（捕捉のために用いたのと同じものかまたは異なるもののいずれか）のような検出可能に標識された結合分子を加える。この検出可能に標識された結合分子を、任意の捕捉された凝集体と反応させ、プレートを洗浄し、標識された分子の存在を当該技術において周知の方法を用いて検出することができる。検出分子は、捕捉試薬が凝集体に特異的である限り、凝集体に特異的である必要はなく、凝集体とモノマーとの両方と結合できる。好ましい実施形態では、検出可能に標識された結合分子は、抗体である。このような抗体は、コンフォメーションタンパク質の天然の配座異性体およびミスフォールディングされた配座異性体の両方に特異的な周知のもの、および周知の方法により産生された抗体を含む。
【０１９６】
代わりの実施形態では、解離凝集体は、抗体サンドイッチタイプＥＬＩＳＡを用いて検出される。この実施形態では、解離凝集体は、凝集体またはコンフォメーションタンパク質に特異的な第１抗体を有する固体支持体上に「再捕捉」される。再捕捉された凝集体を有する固体支持体は、場合によって洗浄して、任意の未結合の物質を除去し、次いで、コンフォメーションタンパク質または凝集体に特異的な第２抗体と、第２抗体と再捕捉された凝集体との結合を可能にする条件下で、接触させる。
【０１９７】
第１および第２抗体は、典型的には異なる抗体であり、好ましくは、コンフォメーションタンパク質上の異なるエピトープを認識する。例えば、第１抗体は、コンフォメーションタンパク質のＮ末端の端のエピトープを認識し、第２抗体は、Ｎ末端以外にあるエピトープを認識するか、またはその逆である。第１および第２抗体のその他の組み合わせを、容易に選択できる。この実施形態では、第１抗体ではなく第２抗体が検出可能に標識される。
【０１９８】
試薬からの凝集体の解離を、カオトロピック剤を用いて行う場合、カオトロピック剤は、検出アッセイを行う前に除去されるか、または少なくとも１５倍に希釈されるべきである。解離を、高または低ｐＨおよび中和により行う場合、解離凝集体は、さらなる希釈なしで用いることができる。解離凝集体を、検出を行う前に変性させる場合、第１および第２抗体はともに、変性配座異性体と結合する。
【０１９９】
捕捉された非解離凝集体の検出のための好ましい方法
その他の例示的なアッセイでは、捕捉試薬および結合した凝集体は、検出の前に解離されない。捕捉試薬が、固体支持体に連結したＡＳＢである場合、凝集体を含有するかまたは含有する疑いがある試料を、固体支持体に加えることができる。任意の凝集体が試薬と結合することを可能にするのに十分なインキュベーション期間の後に、固体支持体を洗浄して未結合の部分を除去し、固体支持体に付着しているコンフォメーションタンパク質特異的結合試薬または同じかもしくは異なる第２凝集体特異的結合試薬のような、上記のような検出可能に標識された２次結合分子を加える。代わりに、固体支持体に連結している（例えばマイクロタイタープレートのウェルを被覆している）コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬を捕捉試薬として用い、検出を、固体支持体に付着している凝集体特異的結合試薬を用いて遂行できる。
【０２００】
Ｄ．アッセイで用いる固体支持体
ＡＳＢ試薬が、固体支持体上に提供される。あるいくつかの実施形態では、ＣＰＳＢ試薬が、固体支持体上に提供される。ＡＳＢ試薬またはＣＰＳＢ試薬は、試料と接触する前に固体支持体上に提供されるか、またはＣＰＳＢ試薬の場合、試薬は、試料と接触し、その中の任意の凝集体と結合した後に、固体支持体と結合するように適合できる（例えばビオチン化試薬と、アビジンまたはストレプトアビジンを含む固体支持体とを用いることにより）。
【０２０１】
本発明の目的のための固体支持体は、不溶性マトリクスであり、目的の分子（例えば本発明の試薬、コンフォメーションタンパク質、抗体など）が連結または付着できる硬質または半硬質の表面を有することができる任意の材料であり得る。例示的な固体支持体は、それらに限定されないが、ニトロセルロース、塩化ポリビニル；ポリプロピレン、ポリスチレン、ラテックス、ポリカーボネート、ナイロン、デキストラン、キチン、砂、シリカ、軽石、アガロース、セルロース、ガラス、金属、ポリアクリルアミド、ケイ素、ゴム、多糖、フッ化ポリビニル、ジアゾ化ペーパー、活性化ビーズ、磁気反応性ビーズならびに固相合成、親和性分離、精製、ハイブリダイゼーション反応、イムノアッセイおよびその他のそのような用途に通常用いられる任意の材料のような担体を含む。支持体は、粒子状であり得るか、または連続表面の形であり得、メンブレン、メッシュ、プレート、ペレット、スライド、ディスク、キャピラリー、中空繊維、針、ピン、チップ、固体繊維、ゲル（例えばシリカゲル）およびビーズ（例えばポア−ガラスビーズ、シリカゲル、場合によってジビニルベンゼンで架橋されているポリスチレンビーズ、グラフト化ｃｏ−ポリビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、ラテックスビーズ、場合によってＮ−Ｎ’−ビス−アクリロイルエチレンジアミンで架橋されているジメチルアクリルアミドビーズ、酸化鉄磁性ビーズおよび疎水性ポリマーで被覆されたガラス粒子）を含む。
【０２０２】
本明細書で記載するＡＳＢ試薬またはＣＰＳＢ試薬は、ＡＳＢ試薬またはＣＰＳＢ試薬を、例えば共有的に、吸着（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）により、カップリングによりまたは結合対を用いることにより付着させる標準的な技術を用いて、固体支持体に容易に連結させることができる。
【０２０３】
支持体への固定化は、ＡＳＢ試薬またはＣＰＳＢ試薬を、最初に、タンパク質に連結することにより増進できる（例えば、該タンパク質がよりよい固相結合特性を有する場合）。適切な連結タンパク質は、それらに限定されないが、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミンおよび当業者に周知のその他のタンパク質のような巨大分子を含む。分子を支持体と結合させるために用いることができるその他の試薬は、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマーなどを含む。このような分子およびこれらの分子をタンパク質と連結させる方法は、当業者に周知である。例えばＢｒｉｎｋｌｅｙ，  Ｍ．Ａ．、（１９９２年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、３巻：２〜１３号；Ｈａｓｈｉｄａら（１９８４年）Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６巻：５６〜６３頁；ならびにＡｎｊａｎｅｙｕｌｕおよびＳｔａｒｏｓ（１９８７年）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．  ３０巻：１１７〜１２４頁を参照されたい。
【０２０４】
所望により、固体支持体に加えられるＡＳＢ試薬またはＣＰＳＢ試薬を、容易に官能化して、スチレンまたはアクリル酸部分を作製でき、よって、分子をポリスチレン、ポリアクリル酸またはポリイミド、ポリアクリルアミド、ポリエチレン、ポリビニル、ポリジアセチレン、ポリフェニレン−ビニレン、ポリペプチド、多糖、ポリスルホン、ポリピロール、ポリイミダゾール、ポリチオフェン、ポリエーテル、エポキシ、石英ガラス、シリカゲル、シロキサン、ポリホスフェート、ヒドロゲル、アガロース、セルロースなどのようなその他のポリマーに組み込むことができる。好ましい実施形態では、固体支持体は、磁性ビーズ、より好ましくはポリスチレン／酸化鉄ビーズである。
【０２０５】
ＡＳＢ試薬またはＣＰＳＢ試薬は、分子の結合対の相互作用により固体支持体に付着できる。このような結合対は周知であり、その例は、本明細書の他の場所で記載する。結合対の一方のメンバーを、上記の技術により固体支持体に連結し、結合対の他方のメンバーを試薬に付着させる（合成前、合成中または合成後）。このようにして改変されたＡＳＢ試薬またはＣＰＳＢ試薬を、試料と接触させ、存在するならば凝集体との相互作用が溶液において発生し、その後に固体支持体を試薬（または試薬−タンパク質複合体）と接触させることができる。この実施形態のための好ましい結合対は、ビオチンとアビジン、およびビオチンとストレプトアビジンを含む。ビオチン−アビジンおよびビオチン−ストレプトアビジンに加えて、この実施形態のためのその他の適切な結合対は、例えば、抗原−抗体、ハプテン−抗体、ミメトープ−抗体、受容体−ホルモン、受容体−リガンド、アゴニスト−アンタゴニスト、レクチン−炭水化物、プロテインＡ−抗体Ｆｃを含む。このような結合対は、周知であり（例えば米国特許第６，５５１，８４３号および同第６，５８６，１９３号を参照されたい）、当業者は、適切な結合対を選択し、本発明で用いるためにそれらを適合させることができる。捕捉試薬を、上記のように支持体に付着させるために適合させる場合、試料を、捕捉試薬が支持体に付着する前または付着した後に、捕捉試薬と接触させることができる。
【０２０６】
代わりに、ＡＳＢ試薬またはＣＰＳＢ試薬は、当該技術において周知のコンジュゲーション化学を用いて固体支持体に共有的に付着できる。例えば、チオール含有ＡＳＢまたはＣＰＳＢ試薬を、固体支持体、例えばカルボキシル化磁性ビーズに直接、当該技術において公知の標準的な方法を用いて付着できる（例えばＣｈｒｉｓｅｙ，  Ｌ．Ａ．、Ｌｅｅ，  Ｇ．Ｕ．およびＯ’Ｆｅｒｒａｌｌ，  Ｃ．Ｅ．（１９９６年）、Ｃｏｖａｌｅｎｔ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＤＮＡ  ｔｏ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒ  ｆｉｌｍｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２４巻（１５号）、３０３１〜３０３９頁；Ｋｉｔａｇａｗａ，  Ｔ．、Ｓｈｉｍｏｚｏｎｏ，  Ｔ．、Ａｉｋａｗａ，  Ｔ．、Ｙｏｓｈｉｄａ，  Ｔ．およびＮｉｓｈｉｍｕｒａ，  Ｈ．（１９８０年）、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏ−ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．  ２９巻（４号）、１１３０〜１１３５頁を参照されたい）。カルボキシル化磁性ビーズを、まず、マレイミド官能性を含有するヘテロ二官能性架橋リンカー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．からのＢＭＰＨ）に、カルボジイミド化学を用いて連結する。チオール化ＡＳＢまたはＣＰＳＢ試薬を、次いで、ＢＭＰＨ被覆ビーズのマレイミド官能基に共有的に連結する。本発明の検出方法の実施形態で用いる場合、固体支持体は、試薬および凝集体を含む複合体を、未結合の試料から分離することを助ける。チオールカップリングのために特に使いやすい磁性ビーズは、Ｄｙｎａｌ（現在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）からのＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｍ−２７０カルボン酸である。ＡＳＢまたはＣＰＳＢ試薬はまた、リンカー、例えば１または複数のアミノヘキサン酸部分を含んでもよい。
【０２０７】
Ｅ．凝集体の好ましい検出方法
好ましい実施形態を以下に記載する。
【０２０８】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合するＡＳＢ試薬を用いて凝集体を捕捉および検出し、該方法は、凝集体を含有する疑いがある試料を、ＡＳＢ試薬と接触させるステップであって、ＡＳＢ試薬と、存在するならば凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、試料中の、もしあるならば凝集体を、凝集体とＡＳＢ試薬との結合により検出するステップとを含む。凝集体の結合は、例えば、複合体を解離させ、凝集体をＣＰＳＢ試薬で検出することにより検出できる。
【０２０９】
一実施形態では、捕捉される凝集体は、Ａβ４０、Ａβ４２またはタウのようなアルツハイマー病に関連する凝集体である。このような場合では、試料は、好ましくは血漿または脳脊髄液である。ＡＳＢ試薬は、好ましくは配列番号１〜８に由来し、
【０２１０】
【化２３】
2013510297.tif 000038
【０２１１】
【化２４】
2013510297.tif 000039
【０２１２】
【化２５】
2013510297.tif 000040
（式中、ＲおよびＲ’は、任意の基であり得る）
のようなペプトイド試薬を含む。
【０２１３】
他の好ましい実施形態では、本発明の方法は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合するＡＳＢ試薬を用いて凝集体を捕捉し、ＣＰＳＢ試薬を用いて凝集体を検出する。該方法は、凝集体を含有する疑いがある試料を、ＡＳＢ試薬と接触させるステップであって、試薬と、存在するならば凝集体とが結合して第１複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、第１複合体を、ＣＰＳＢ試薬と接触させるステップであって、結合を可能にする条件下で接触させるステップと、試料中の、もしあるならば凝集体の存在を、凝集体とＣＰＳＢ結合試薬との結合により検出するステップとを含む。典型的には、未結合の試料は、第１複合体を形成した後で、かつ第１複合体をＣＰＳＢ試薬と接触させる前に除去する。ＣＰＳＢ結合試薬は、標識された抗コンフォメーションタンパク質抗体であり得る。
【０２１４】
まださらに別の好ましい実施形態では、本発明の方法は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合するＡＳＢ試薬を用いて凝集体の存在を捕捉および検出する。該方法は、凝集体を含有する疑いがある試料を、ＡＳＢ試薬と接触させるステップであって、ＡＳＢ試薬と、存在するならば凝集体とが結合して第１複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、未結合の試料物質を除去するステップと、凝集体を、第１複合体から解離させて、解離凝集体を提供するステップと、解離凝集体を、第１ＣＰＳＢ試薬と接触させるステップであって、結合して第２複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、試料中の、もしあるならば凝集体の存在を、第２複合体の形成を検出することにより検出するステップとを含む。第２複合体の形成は、好ましくは、検出可能に標識された第２ＣＰＳＢ試薬を用いて検出され、第１ＣＰＳＢ試薬は、好ましくは、固体支持体に連結されている。
【０２１５】
代わりに、本発明は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合するＡＳＢ試薬を用いて凝集体を捕捉し、本明細書で記載する第２ＡＳＢ試薬を用いて凝集体を検出する方法を提供する。該方法は、凝集体を含有する疑いがある試料を、第１ＡＳＢ試薬と接触させるステップであって、第１試薬と、存在するならば凝集体とが結合して第１複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、凝集体を含有する疑いがある試料を、検出可能な標識を有する第２ＡＳＢ試薬と接触させるステップであって、第２試薬と第１複合体中の凝集体との結合を可能にする条件下で接触させるステップと、試料中の、もしあるならば凝集体を、凝集体と第２試薬との結合により検出するステップとを含む。
【０２１６】
さらに別の代替では、本発明は、ＣＰＳＢ試薬を用いて凝集体を捕捉し、ＡＳＢ試薬であって、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合するＡＳＢ試薬を用いて凝集体を検出する方法を提供する。該方法は、（ａ）凝集体を含有する疑いがある試料を、ＣＰＳＢ試薬と接触させるステップであって、試薬と、存在するならば凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、（ｂ）未結合の試料物質を除去するステップと、（ｃ）複合体を、検出可能な標識を有するＡＳＢ試薬と接触させるステップであって、ＡＳＢ試薬と凝集体との結合を可能にする条件下で接触させるステップと、試料中の、もしあるならば凝集体を、凝集体とＡＳＢ試薬との結合により検出するステップとを含み、ＡＳＢ試薬は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。
【０２１７】
上記の全ての方法において、「未結合の試料」は、接触させるステップで捕捉されなかった試料中の成分のことをいう。未結合の試料は、当該技術において周知の方法、例えば洗浄、遠心分離、ろ過、磁性分離およびこれらの技術の組み合わせにより除去できる。好ましくは、本発明の方法では、未結合の試料は、複合体を緩衝液で洗浄することによりおよび／または磁性分離により除去される。
【０２１８】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、全身性アミロイドーシス、タウオパチー、シヌクレイン病および子かん前症を含むコンフォメーション疾患の検出のために用いる。
【０２１９】
Ｆ．オリゴマーを検出する方法
本明細書で記載する発明は、オリゴマーを検出する方法を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、オリゴマーを含有する疑いがある、オリゴマー以外の凝集体を欠く試料を準備し、試料を、ＡＳＢ試薬と、試薬と存在するならばオリゴマーとが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させ、試料中の、もしあるならばオリゴマーの存在を、オリゴマーとＡＳＢ試薬との結合により検出することにより、試料中のオリゴマーの存在を検出する方法を提供し、ここで、ＡＳＢ試薬は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。
【０２２０】
オリゴマーを検出する方法で用いるために、試料は、凝集体を含有するとわかっているかまたは疑いがあるものであれば何でも可能である。試料は、生物学的試料（つまり、生体または以前は生きていた生物から調製された試料）または非生物学的試料であり得る。典型的に、生物学的試料は、体組織または体液を含有する。適切な生物学的試料は、それらに限定されないが、全血、血液分画物、血液成分、血漿、血小板、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、骨髄、尿、涙、乳汁、リンパ液、器官組織、脳組織、神経系組織、筋肉組織、非神経系組織、生検材料、剖検材料、脂肪生検材料、細胞、大便、胎盤、脾臓組織、リンパ組織、膵臓組織、気管支肺胞洗浄液または滑液を含む。好ましい生物学的試料は、血漿およびＣＳＦを含む。あるいくつかの実施形態では、試料は、ポリペプチドを含有する。
【０２２１】
代わりの実施形態では、本発明は、オリゴマーを含有する疑いがある試料を準備し、試料からオリゴマー以外の凝集体を除去し、試料を、ＡＳＢ試薬と、試薬と存在するならばオリゴマーとが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させ、試料中の、もしあるならばオリゴマーの存在を、オリゴマーとＡＳＢ試薬との結合により検出することにより、試料中のオリゴマーの存在を検出する方法を提供し、ここで、ＡＳＢ試薬は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。好ましい実施形態では、オリゴマー以外の凝集体は、遠心分離により試料から除去される。
【０２２２】
さらに別の実施形態では、本発明は、オリゴマーを含有する疑いがある試料を、ＡＳＢ試薬と、試薬と存在するならばオリゴマーとが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させ、複合体を第２試薬と接触させ（ここで、該試薬は、オリゴマーまたはオリゴマー以外の凝集体と優先的に結合する）、試料中の、もしあるならばオリゴマーの存在を、オリゴマーと第２試薬との結合または結合の欠如により検出することにより、試料中のオリゴマーの存在を検出する方法を提供し、ここで、ＡＳＢ試薬は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。好ましい実施形態では、第２試薬は、オリゴマーを認識するが原線維を認識しないＡ１１抗体である。
【０２２３】
オリゴマーの存在を検出する方法の好ましい実施形態では、オリゴマー以外の凝集体は、原線維を含む。
【０２２４】
非オリゴマー凝集体を試料から除去するための方法
非オリゴマー凝集体は、当該技術において公知の任意の方法により試料から除去できる。典型的には、無定形凝集体および原線維のような非オリゴマー凝集体は、遠心分離により試料から除去できる。当業者により用いられる好ましい遠心分離条件は、多様である（Ｐｈｉｌｏ、ＡＡＰＳ  Ｊ、２００６年、８巻（３号）Ａｒｔ．６５）。しかし、１４，０００×ｇにて１０分間の遠心分離は、典型的に、大きい原線維およびいくらかの無定形凝集体を含む非常に大きい凝集体（１０〜１０００ＭＤａ）だけを取り出し、１００，０００×ｇにて１時間の遠心分離は、典型的に、より小さい原線維および無定形凝集体を含む１ＭＤａより大きい凝集体を取り出す。凝集体のサイズ、溶解度およびイオン強度ならびに試料の濃度、温度およびｐＨは全て、分離のために要求される遠心分離の加速度および速度に影響する（Ｓｉｐｅ，  Ｊ．（編）、２００５年、Ａｍｙｌｏｉｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｔｈｅ  Ｂｅｔａ  Ｓｈｅｅｔ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ、４１０〜４２５頁、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ；Ｓｔｉｎｅら、ＪＢＣ、２００３年、２７８巻、１１６１２〜２２頁）。
【０２２５】
Ｇ．コンフォメーション疾患の検出方法
コンフォメーション疾患
本発明は、天然ではない配座異性体の凝集体を、凝集体特異的結合試薬を用いて検出し、凝集体媒介疾患の増大した蓋然性が存在しているか否かを評価し、凝集体媒介疾患についての処置の有効性を評価する方法に関する。コンフォメーション疾患タンパク質およびそれらの対応する疾患は、表１に列挙するものを含む。
【０２２６】
本発明のコンフォメーション疾患は、２以上の異なるコンフォメーションを形成するタンパク質と関連する任意の疾患を含む。本明細書で特に興味があるものは、アルツハイマー病、全身性アミロイドーシス、タウオパチーおよびシヌクレイン病のようなアミロイド疾患を含み、これらは全て交差ベータシートのシグネチャーを提示する。対象のその他の疾患は、糖尿病およびポリグルタミン病、ならびにセルピン病のような非アミロイドタンパク質症である。
【０２２７】
あるいくつかの実施形態では、本発明の方法は、モノマーおよび凝集体の両方を捕捉または検出するためのコンフォメーションタンパク質特異的結合試薬（「ＣＰＳＢ試薬」）の使用も含む。用いる具体的なＣＰＳＢ試薬は、検出されるタンパク質に依存する。例えば、診断されるコンフォメーション疾患がアルツハイマー病であるならば、ＣＰＳＢ試薬は、アルツハイマー病タンパク質Ａβのモノマーおよび凝集体の両方を認識する抗体であり得る。
【０２２８】
病原性アルツハイマー病凝集体を検出するための方法
Ａβ４０、Ａβ４２またはタウのようなミスフォールディングされた配座異性体を含有する病原性アルツハイマー病凝集体を検出するための方法が提供される。
【０２２９】
特に好ましい実施形態では、これらの方法は、病原性アルツハイマー病凝集体を、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合するＡＳＢ試薬で捕捉し、捕捉された凝集体をＣＰＳＢ試薬で検出する。
【０２３０】
特に、方法は、病原性アルツハイマー病凝集体を含有する疑いがある試料を、ＡＳＢ試薬と接触させるステップであって、この接触は、ＡＳＢ試薬と、存在するならば病原性アルツハイマー病凝集体とが結合して第１複合体を形成することを可能にする条件下で行われる、ステップと、未結合の試料物質を除去するステップと、病原性アルツハイマー病凝集体を、第１複合体から解離させて、解離病原性アルツハイマー病凝集体を提供するステップと、解離病原性アルツハイマー病凝集体を、ＣＰＳＢ試薬と接触させるステップであって、この接触は、結合して第２複合体を形成することを可能にする条件下で行われる、ステップと、試料中の、もしあるならば病原性アルツハイマー病凝集体の存在を、第２複合体の形成を検出することにより検出するステップとを含む。第１複合体中の病原性アルツハイマー病凝集体は、好ましくは、約０．０５ＮのＮａＯＨまたは約０．１ＮのＮａＯＨで、約９０℃または約８０℃にて、ＣＰＳＢ試薬と接触させる前に解離および変性させる。病原性アルツハイマー病凝集体がＡβ４０またはＡβ４２を含有する場合、これは、好ましくは、約０．１ＮのＮａＯＨで、約８０℃にて約３０分間解離および変性される。好ましくは、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いる。
【０２３１】
解離および／または変性は、ＩＶ（Ｂ）項に記載する方法を用いて遂行できる。典型的には、病原性アルツハイマー病凝集体は、ｐＨを低ｐＨから高ｐＨまたは高ｐＨから低ｐＨに変更することにより、同時に解離および変性させる。
【０２３２】
好ましい実施形態では、ＡＳＢ試薬は、配列番号１〜８または
【０２３３】
【化２６】
2013510297.tif 000041
【０２３４】
【化２７】
2013510297.tif 000042
【０２３５】
【化２８】
2013510297.tif 000043
（式中、ＲおよびＲ’は、任意の基であり得る）
を含むペプトイドに由来し、試薬は、磁性ビーズのような固体支持体に連結される。
【０２３６】
ＣＰＳＢ試薬は、好ましくは、マイクロタイタープレートのような固体支持体に連結された抗アルツハイマー病タンパク質抗体であり、第２複合体の形成は、好ましくは、検出可能に標識された第２ＣＰＳＢ試薬を用いて検出される。病原性アルツハイマー病凝集体がＡβ４０またはＡβ４２を含有する場合、好ましい抗アルツハイマー病タンパク質抗体は、Ａβ４０のＣ末端に特異的な抗体である１１Ａ５０−Ｂ１０（Ｃｏｖａｎｃｅ）；Ａβ４２のＣ末端に特異的な抗体である１２Ｆ４（Ｃｏｖａｎｃｅ）；Ａβアミノ酸１８〜２２に特異的な４Ｇ８；Ａβアミノ酸１〜１０に特異的な２０．１；およびＡβアミノ酸３〜８に特異的な６Ｅ１０を含む。特に好ましい実施形態では、１２Ｆ４または１１Ａ５０−Ｂ１０がＥＬＩＳＡプレート上の捕捉抗体であり、１４Ｇ８が検出可能に標識された第２ＣＰＳＢ試薬として用いられる。試料は、好ましくは、血漿または脳脊髄液（ＣＳＦ）である。
【０２３７】
したがって、特に好ましい実施形態では、病原性アルツハイマー病凝集体の存在を検出するための方法は、それらに限定されないが、病原性アルツハイマー病凝集体を含有する疑いがある血漿またはＣＳＦの試料を、磁性ビーズに連結されたＰＳＲ１と接触させるステップであって、この接触は、ＰＳＲ１と、存在するならば病原性アルツハイマー病凝集体とが結合して第１複合体を形成することを可能にする条件下で行われる、ステップと、未結合の試料物質を除去するステップと、病原性アルツハイマー病凝集体を、ｐＨを変更することにより第１複合体から解離および／または変性させて、解離病原性アルツハイマー病凝集体を提供するステップと、解離病原性アルツハイマー病凝集体を、固体支持体と結合した抗アルツハイマー病タンパク質抗体と接触させるステップであって、この接触は、結合して第２複合体の形成を可能にする条件下で行われる、ステップと、第２複合体の形成を、標識された第２抗アルツハイマー病タンパク質抗体とインキュベートすることにより検出するステップとを含む。
【０２３８】
Ｈ．競合アッセイ
いくつかの態様では、本発明の方法は、競合的結合により凝集体を検出する。いつＡＳＢ結合試薬と弱く結合するリガンドが凝集体により置き換えられるかを決定するのに、検出の手段を用いることができる。固体支持体上に吸着されるＡＳＢ試薬は、凝集体がＡＳＢ試薬と結合するアビディティよりも弱い結合のアビディティでＡＳＢ試薬と結合する検出可能に標識されたリガンドと組み合わされる。リガンド−ＡＳＢ試薬複合体が検出される。次いで、試料を加える。検出可能に標識されたリガンドの結合のアビディティは、ＡＳＢ試薬に対する凝集体の結合のアビディティより弱いので、凝集体は、標識されたリガンドを置き換え、ＡＳＢ試薬と結合した標識されたリガンドの検出量の減少が、ＡＳＢ試薬と試料中の凝集体との間で形成された複合体を示す。
【０２３９】
したがって、特定の実施形態では、凝集体の存在は、ＡＳＢ試薬を含む固体支持体を提供するステップ、固体支持体を、検出可能に標識されたリガンドと組み合わせるステップ（ここで、検出可能に標識されたリガンドに対するＡＳＢ試薬の結合のアビディティは、凝集体に対するＡＳＢ試薬の結合のアビディティより弱い）、凝集体を含有する疑いがある試料を、固体支持体と、試料中に存在する場合に凝集体がＡＳＢ試薬と結合して、リガンドを置き換えることを可能にする条件下で組み合わせるステップ、そしてＡＳＢ試薬と試料からの凝集体との間で形成された複合体を検出するステップにより検出され、ここで、ＡＳＢ試薬は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。
【０２４０】
ＩＶ．その他の方法
全般的に、本明細書で記載するＡＳＢ試薬は、ＡＳＢ試薬がある電荷密度にて固体支持体に付着している場合に、コンフォメーションタンパク質の凝集体と優先的に結合できる。したがって、これらの試薬は、生存もしくは死後の脳、脊髄またはその他の神経系組織および血液を含む生物学的もしくは非生物学的の実質上いずれの試料においても凝集体の存在の容易な検出を可能にする。試料は、組換えまたは合成のポリペプチドを含有してよい。試薬は、よって、広範囲の単離、精製、検出、診断および治療上の用途において有用である。
【０２４１】
例えば、親和性支持体に付着しているＡＳＢ試薬は、凝集体を単離するために用いてよい。ＡＳＢ試薬は、固体支持体に、例えば、吸着、共有結合などにより貼付することができ、よって、試薬は、それらの凝集体選択的結合活性を保持する。場合によって、スペーサ基を含めてよく、それにより、例えば、ＡＳＢ試薬の結合部位が接近可能なままになる。固定化されたＡＳＢ試薬は、次いで、血液、血漿、脳、脊髄およびその他の組織のような生物学的試料からの凝集体を結合するために用いることができる。結合した試薬または複合体は、例えばｐＨの変化により支持体から収集するか、または凝集体は、複合体から解離させてよい。
【０２４２】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、凝集体を含有する疑いがあるポリペプチド試料を、ＡＳＢ試薬と、試薬と存在するならば凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させ、未結合のポリペプチド試料を回収することにより、ポリペプチド試料からの凝集体の量を低減するための方法を提供し、ここで、ＡＳＢ試薬は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。あるいくつかの実施形態では、該方法は、複合体の存在を検出して、試料が凝集体を含有するか否かを決定するステップをさらに含む。複合体の検出は、検出可能な標識を有する第２凝集体特異的結合試薬または検出可能な標識を有するコンフォメーションタンパク質特異的結合試薬が凝集体と結合することを可能にすることにより達成できる。組換えまたは合成のタンパク質の生成は、製薬、生物燃料および医療ならびにその他の生命科学研究のような多くの産業のために重要である。このようなポリペプチド試料は、例えば、組換えインスリンおよび治療用抗体のような製薬用に製造されたタンパク質を含有し得る。これらのポリペプチドは、高レベルで生成されることがあり、ポリペプチドの凝集体は、比較的高い速度で形成される傾向にある。ポリペプチド試料からの凝集体の量を低減するための本発明により提供される方法は、製薬用に産出されるこれらのタンパク質の品質管理、およびその他の産業のために生成されるタンパク質の品質管理において有用である。
【０２４３】
他の実施形態では、本発明は、凝集体を含有する疑いがある試料を、ＡＳＢ試薬と、試薬と存在するならば凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させ、凝集体とモノマーとを、凝集体と試薬との結合により識別することにより、試料中の凝集体とモノマーとを識別するための方法を提供し、ここで、ＡＳＢ試薬は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。好ましい実施形態では、凝集体と試薬との結合は、検出可能な標識を有する第２凝集体特異的結合試薬または検出可能な標識を有するコンフォメーションタンパク質特異的結合試薬が凝集体と結合することを可能にすることにより検出される。未結合の試料は、複合体の形成の後に、標識された試薬で凝集体を検出する前に除去してよい。代わりに、複合体を解離させて解離凝集体を提供し、この解離凝集体を、第１ＣＰＢＳ試薬と結合させて、第２複合体を形成することを可能にし、第２複合体の形成を検出してよい。あるいくつかの実施形態では、第２複合体は、検出可能に標識された第２ＣＰＳＢ試薬を用いて検出してよい。あるいくつかの実施形態では、第１ＣＰＳＢは、固体支持体に連結される。
【０２４４】
あるいくつかの実施形態では、本発明は、コンフォメーション疾患を有する疑いがある生物学的試料を、ＡＳＢ試薬と、試薬と存在するならば病原性凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップ、試料中の、もしあるならば病原性凝集体の存在を、凝集体と試薬との結合により検出するステップ、そして生物学的試料中の病原性凝集体の量がコンフォメーション疾患を有さない被験体からの試料中の凝集体の量より高いならば、被験体がコンフォメーション疾患を有することの増大した蓋然性が存在していることを決定するステップにより、被験体についてコンフォメーション疾患の増大した蓋然性が存在しているか否かを評価するための方法を提供し、ここで、ＡＳＢ試薬は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。好ましい実施形態では、凝集体と試薬との結合は、検出可能な標識を有する第２凝集体特異的結合試薬または検出可能な標識を有するコンフォメーションタンパク質特異的結合試薬が凝集体と結合することを可能にすることにより検出される。未結合の試料は、複合体の形成の後に、標識された試薬で凝集体を検出する前に除去してよい。代わりに、複合体を解離させて解離凝集体を提供し、次いで、この解離凝集体を、第１ＣＰＢＳ試薬と結合させて、第２複合体を形成することを可能にし、第２複合体の形成を検出してよい。あるいくつかの実施形態では、第２複合体は、検出可能に標識された第２ＣＰＳＢ試薬を用いて検出してよい。あるいくつかの実施形態では、第１ＣＰＳＢは、固体支持体に連結される。
【０２４５】
他の実施形態では、本発明は、コンフォメーション疾患についての処置を受けた患者からの生物学的試料を、ＡＳＢ試薬と、試薬と存在するならば病原性凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップ、試料中の、もしあるならば病原性凝集体の存在を、凝集体と試薬との結合により検出するステップ、生物学的試料中の病原性凝集体の量がコンフォメーション疾患についての処置前の患者から採取された生物学的試料中の病原性凝集体の量よりも低いならば、前記処置が有効であることを決定するステップにより、コンフォメーション疾患についての処置の有効性を評価するための方法を提供し、ここで、ＡＳＢ試薬は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。好ましい実施形態では、凝集体と試薬との結合は、検出可能な標識を有する第２凝集体特異的結合試薬または検出可能な標識を有するコンフォメーションタンパク質特異的結合試薬が凝集体と結合することを可能にすることにより検出される。未結合の試料は、複合体の形成の後に、標識された試薬で凝集体を検出する前に除去してよい。代わりに、複合体を解離させて解離凝集体を提供し、次いで、この解離凝集体を、第１ＣＰＢＳ試薬と結合させて、第２複合体を形成することを可能にし、第２複合体の形成を検出してよい。あるいくつかの実施形態では、第２複合体は、検出可能に標識された第２ＣＰＳＢ試薬を用いて検出してよい。あるいくつかの実施形態では、第１ＣＰＳＢは、固体支持体に連結される。
【０２４６】
本明細書で記載する試薬を用いるいくつかの変形および組み合わせを、本発明の方法に用いてよい。
【０２４７】
Ｖ．組成物およびキット
本発明は、凝集体特異的結合試薬と固体支持体とを含む組成物を提供する。したがって、好ましい実施形態では、本発明は、アミノ酸配列ＫＫＫＦＫＦ、ＫＫＫＷＫＷ、ＫＫＫＬＫＬまたはＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫを含有するペプチド凝集体特異的結合試薬を提供する。あるいくつかの実施形態では、本発明は、ＫＫＫＫＫＫからなるペプチドを含有するペプチド凝集体特異的結合試薬を提供する。
【０２４８】
好ましい実施形態では、本発明は、
【０２４９】
【化２９】
2013510297.tif 000044
【０２５０】
【化３０】
2013510297.tif 000045
（式中、ＲおよびＲ’は、任意の基である）
を含むペプトイド凝集体特異的結合試薬を提供する。
【０２５１】
あるいくつかの実施形態では、本発明は、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合するデンドロン凝集体特異的結合試薬であって、
【０２５２】
【化３１】
2013510297.tif 000046
を含む試薬を提供する。
【０２５３】
本発明の組成物の凝集体特異的結合試薬は、疎水性官能基も含有してよい。疎水性官能基は、例えば、芳香族または脂肪族疎水性官能基であってよい。あるいくつかの実施形態では、ＡＳＢ試薬は、アミン、アルキル基、複素環、シクロアルカン、グアニジン、エーテル、アリルおよび芳香族のような官能基を含有することがある。このような芳香族官能基は、ナフチル、フェノール、アニリン、フェニル、置換フェニル、ニトロフェニル、ハロゲン化フェニル、ビフェニル、スチリル、ジフェニル、ベンジルスルホンアミド、アミノメチルフェニル、チオフェン、インドリル、ナフチル、フランおよびイミダゾールを含む。さらなる実施形態では、ＡＳＢ試薬は、反復モチーフを含有する。他の実施形態では、ＡＳＢ試薬は、検出可能に標識されている。
【０２５４】
本発明は、固体支持体と、上記の凝集体特異的結合試薬とを含む組成物も提供する。好ましい実施形態では、ペプチド、ペプトイドまたはデンドロン凝集体特異的結合試薬は、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約９０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１２０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約３０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約４０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５０００ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着し、組成物は、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。
【０２５５】
固体支持体は、不溶性マトリクスであり、対象の分子（例えば本発明の試薬、コンフォメーションタンパク質、抗体など）が連結または付着できる硬質または半硬質の表面を有することができる任意の材料であり得る。例示的な固体支持体は、それらに限定されないが、ニトロセルロース、塩化ポリビニル；ポリプロピレン、ポリスチレン、ラテックス、ポリカーボネート、ナイロン、デキストラン、キチン、砂、シリカ、軽石、アガロース、セルロース、ガラス、金属、ポリアクリルアミド、ケイ素、ゴム、多糖、フッ化ポリビニル、ジアゾ化ペーパー、活性化ビーズ、磁気反応性ビーズならびに固相合成、親和性分離、精製、ハイブリダイゼーション反応、イムノアッセイおよびその他の用途に通常用いられる任意の材料のような担体を含む。支持体は、粒子状であり得るか、または連続表面の形態であり得、これとしては、メンブレン、メッシュ、プレート、ペレット、スライド、ディスク、キャピラリー、中空繊維、針、ピン、チップ、固体繊維、ゲル（例えばシリカゲル）およびビーズ（例えばポア−ガラスビーズ、シリカゲル、場合によってジビニルベンゼンで架橋されているポリスチレンビーズ、グラフト化ｃｏ−ポリビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、ラテックスビーズ、場合によってＮ−Ｎ’−ビス−アクリロイルエチレンジアミンで架橋されているジメチルアクリルアミドビーズ、酸化鉄磁性ビーズならびに疎水性ポリマーで被覆されたガラス粒子が挙げられる。
【０２５６】
本発明は、本発明の方法を行うためのキットをさらに提供する。典型的には、キットは、前の２つの段落に記載する組成物を含有する。
【実施例】
【０２５７】
以下の非限定的な実施例を、説明のために記載する。
【０２５８】
（実施例１）
試薬が凝集体を捕捉する能力を試験するためのアッセイ
本実施例は、試薬が凝集体と結合する能力を試験するために設計されたアッセイを記載する。
【０２５９】
これらの試薬がタンパク質凝集体を捕捉する能力を評価するために、以前に記載されたミスフォールディングタンパク質アッセイ、すなわちＭＰＡ（Ｌａｕら、２００７年、ＰＮＡＳ、１０４巻：１１５５１頁）を用いた（図３）。このアッセイでは、対象の捕捉試薬をビーズに付着させ、これらを、正常なモノマーのタンパク質と凝集したタンパク質との混合物を含有する対象の試料とともにインキュベートして捕捉を可能にし、次いで洗浄して未結合の物質を除去する。この富化ステップの後に、溶出緩衝液を用いてビーズから捕捉された物質を解離するとともに、あらゆる凝集体を変性させる。溶出された物質は、次いで、対象のタンパク質に特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡに付す。有効な捕捉試薬として作用する強い凝集体結合試薬は、モノマーおよび凝集体の混合物を含有する試料から高いシグナルを示すが、生理的レベルのモノマータンパク質だけを含有する対照試料からは示さない。
【０２６０】
実施例２は、様々な特性を有する試薬が、モノマーベータアミロイド１−４２よりもオリゴマーベータアミロイド１−４２（Ｂａｒｇｈｏｒｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００５年により「グロブロマー」と命名された）と、グロブロマーを添加したＣＳＦにおいて優先的に結合する能力を試験するためのこのアッセイの使用について記載する。実施例３は、様々なペプトイド試薬が、疾患関連凝集体と、り患した脳のホモジネートを添加した緩衝液、ＣＳＦまたは血漿において優先的に結合する能力を試験するためのこのアッセイの使用について記載する。実施例４は、ペプトイド試薬が、正常な対応するモノマーよりも様々な疾患関連凝集体と、疾患を有する患者からの脳ホモジネートにおいて優先的に結合する能力を試験するためのこのアッセイの使用について記載する。
【０２６１】
（実施例２）
試薬の結合能力の評価
本実施例は、モノマーよりもオリゴマーと優先的に結合する能力に対する異なる捕捉試薬特性の影響を実証する。固体支持体上で全体的な正電荷および高い電荷密度を有する試薬は、オリゴマーと優先的に結合する能力の増加を示した。さらに、試薬に疎水性残基を付加することは、優先的な結合を改善したが、試薬の具体的な骨格は、それが正に荷電されている限り、重要でなかった。
【０２６２】
タンパク質凝集体は、イオン結合、水素結合および疎水性相互作用のような多様な機序により捕捉試薬と結合できる。広く多様な電荷、疎水性および骨格（デンドリマー、ペプチド、ペプトイド）を有する一連の潜在的な凝集体特異的結合試薬を設計して、これらの可能性のある結合様式を試験した（図１）。試薬を、以下の方法により磁性Ｄｙｎａｌ  Ｍ２７０ビーズ（図２）にコンジュゲートした。
【０２６３】
カルボン酸を提示するビーズを、ＥＤＣおよびＢＭＰＨで処理してマレイミド提示ビーズを創出し、これにチオール化ペプチド（またはその他のチオール化有機分子）を、Ｍｉｃｈａｅｌ付加反応により付加した。カルボン酸を提示するＤｙｎａｌ  Ｍ２７０磁化ビーズ（３０ｍｇ／ｍＬビーズ）をボルテックスし、１５ｍｌファルコンチューブに入れた。チューブを磁石内に置き、上清を除去した。ビーズを、０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ５で２回洗浄し、次いで、洗浄緩衝液を除去した。カップリング溶液（ＭＥＳ緩衝液中の３３ｍＭ  ＢＭＰＨ、１３０ｍＭ  ＥＤＣ）を加え、チューブを室温にて３０分間揺り動かした。１×ＭＥＳ、１×Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５中で洗浄した後に、ビーズをＴｒｉｓ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．５）で１５分間クエンチした。ビーズを、次いで、リン酸塩緩衝液中で２回洗浄し、脱気したリン酸塩中の５ｍＭチオール化リガンドに加えた。ビーズを２１時間回転させ、次いで、０．１Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ７、１×ＰＢＳ中で洗浄して、貯蔵した。
【０２６４】
グロブロマーを調製するために、ベータアミロイド（１−４２）を、ヘキサフルオロイソプロパノール中でのインキュベーションでモノマー化した。ヘキサフルオロイソプロパノールを、真空遠心分離により除去した。ＤＭＳＯ、ＰＢＳおよび２％  ＳＤＳを、次いで、試料に加えた。試料をボルテックスし、超音波処理し、次いで、３７℃にてインキュベートした。６時間後に、試料を水で希釈し、ボルテックスし、３７℃にてさらに１９時間インキュベートした。試料を１３５０００×ｇにて１時間、４℃にて超遠心分離し、上清を保持した。グロブロマーを、アッセイのためにＣＳＦに添加した。
【０２６５】
様々な試薬とコンジュゲートしたビーズのアリコートを、９６ウェルプレートのウェルに加えた。Ｔｒｉｓ緩衝液中のグロブロマー添加ＣＳＦを各ウェルに加え、プレートを３７℃にて１時間、振とうしながらインキュベートした。陰性対照のために、正常ＣＳＦを用いたが、これは、ベータアミロイドのモノマーのみを含有するとみなす。ビーズをＴＢＳＴ洗浄緩衝液で洗浄し、結合した物質を、変性溶液（典型的に０．１〜０．１５Ｎ  ＮａＯＨ）で溶出した。溶出物にリコンディショニング緩衝液（ｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を加えた後に、ベータアミロイド（１−４２）特異的サンドイッチＥＬＩＳＡによりベータアミロイドを検出した。
【０２６６】
電荷
まず、電荷ベースの相互作用がオリゴマー捕捉を可能にするか否かを決定した。負に荷電した残基（例えばアスパラギン酸、Ｄ）を含有するペプチド、正に荷電した残基（例えばリシン、Ｋ）を含有するペプチドおよび中性残基（例えばヒスチジン、Ｈ）を含有するペプチドを試験した。代表的な結果を図４Ａに示す。負に荷電した（ＤＤＤＤＤＤ）ペプチドおよび中性（ＨＨＨＨＨＨ）ペプチドは、オリゴマー種の富化をほとんどもたらさなかったが、正に荷電した（ＫＫＫＫＫＫ）ペプチドは、著しい捕捉をもたらした。オリゴマー上の負に荷電した残基（またはオリゴマーと結合した塩、脂質もしくはその他の種）が、正に荷電した捕捉ペプチドと相互作用すると仮定した。
【０２６７】
疎水性相互作用
正電荷単独でオリゴマーの富化に十分であったが、疎水性相互作用が追加の捕捉効率をもたらすか否かを決定するために、疎水性相互作用を試験した。全て正に荷電されたペプチドＫＫＫＫＫＫを、芳香族疎水性残基（例えばトリプトファン、Ｗまたはフェニルアラニン、Ｆ）および脂肪族残基（例えばロイシン、Ｌ）を含有するペプチドと比較した。ペプチドＫＫＫＦＫＦおよびＫＫＫＷＫＷは、脂肪族疎水性残基を有するかまたは疎水性残基を有さない対応するペプチドに対して、捕捉効率の増加をもたらし（図４Ｂ）、このことは、芳香族疎水性残基の付加が捕捉を改善したことを証明した。
【０２６８】
代替骨格
富化方法がペプチド骨格に限定されるか否か、または他の正に荷電した有機分子骨格もオリゴマーを富化できるか否かを評価するために、２つの追加の骨格であるペプトイドおよびデンドロンを試験した。ペプトイドは、Ｎ−置換グリシンの直鎖状ポリマーであり、よって、ペプチドのものと類似の間隔を保持するが、アキラルであり、溶液においてペプチドとは異なるコンフォメーションを有する傾向にある。デンドロンは、ペプチドと構造的類似性がほとんどない分岐鎖状ポリマーである。ＮＭＰＡアッセイにおいて、図１に示す正に荷電したペプトイドおよびデンドロンはともに、オリゴマーを富化する能力があり（図４Ａ）、このことは、ペプチド骨格が捕捉にとって重要でないことを証明した。
【０２６９】
ペプトイド骨格がオリゴマーを捕捉する能力に対する異なる疎水性および電荷の影響を調査するために、追加のセットのペプトイドを、グロブロマー添加ＣＳＦとともに試験した。図１１は、試験した追加のペプトイドの構造および電荷を示す。スチルベンおよびオクチルペプトイドは、元のＰＳＲ１ペプトイドとは異なる疎水性モノマーを有する（ベンジル基からより大きい芳香族スチルベンまたは脂肪族オクチル鎖への置き換え）。短い鎖およびグアニジンペプトイドは、元のペプトイドとは異なるカチオン基を有する。短い鎖のペプトイドは、側鎖アミンとペプトイド主鎖との間にブチルスペーサではなくエチルを有し、グアニジンは、元のペプトイドよりもより塩基性の側鎖を有する。２重および３重ペプトイドは、ＰＳＲ１と比べて長さが増加しており、よって、リガンドあたりより多い電荷を有する。図１２は、これらのペプトイド試薬を用いるＭＰＡアッセイの結果を示す。全ての追加のペプトイドは、ＰＳＲ１と同様にグロブロマーを捕捉した。
【０２７０】
アビディティ
上記の結果は、正味正電荷が効果のある捕捉のために重要であり、具体的な骨格は重要性がより低いことを示した。よって、ある主要な結合様式はイオン相互作用によると仮定した。個別のイオン相互作用は比較的弱く、よって、オリゴマーと捕捉試薬との間の相互作用は、アビディティ成分を有し、ここでは、捕捉効率は複数のリガンドの組み合わせた強度に基づくと考えられる。このような場合、表面上のリガンドの密度が重要である。
【０２７１】
この可能性を評価するために、異なる量の正に荷電したペプトイドが付着した一連のビーズを調製して、各ビーズが異なる電荷密度を提示するようにした。リガンド負荷の量を決定するために、アミン定量化を用いた。ビーズのアリコートを磁石中に置き、上清を除去した。エタノール中の８０％フェノール、ピリジン／水中の０．２ｍＭ  ＫＣＮおよびエタノール中の６％ニンヒドリンを各チューブに加えた。アリコートをボルテックスし、１００℃にて７分間加熱した。室温まで冷却した後に、６０％エタノールを加えた。チューブを磁石中に置き、５７０ｎｍでの上清の吸光度を決定した。ビーズの負荷は、ベールの法則に従って、１５０００Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を用いて決定した。
【０２７２】
ビーズ（３ｕｌまたは１５ｕｌ）を、ＣＳＦを添加した０．５ｎｇ／ｍＬグロブロマーを含有する試料に加えた。図５からわかるように、捕捉は、リガンド密度とともに非線形的に増加し、オリゴマー捕捉に要求される最小密度が存在した。ＰＳＲ１について、この限界は、グロブロマーとの優先的な結合について約５ｎｍｏｌリガンド／ｍｇビーズであった。ビーズ１グラムあたりおよそ２〜５ｍ２の表面積に鑑みて、この値は、およそ１５００ｎｍｏｌリガンド／ｍ２、または全てのアミンがｐＨ７．４のアッセイ条件にてプロトン化されていると仮定して、大まかに６０００ｎｍｏｌ正電荷／ｍ２であった。
【０２７３】
追加の実験を行って、捕捉試薬の結合効率とオリゴマーの特異的捕捉に要求される最小限の電荷との間の関係を評価した。捕捉試薬（ペプチドＫＫＫＦＫＦ、ペプチドＫＫＫＬＫＬまたはペプトイドＰＳＲ１）を有する一連のビーズを、約６０００ｎｍｏｌ／ｍ２〜約１５０００ｎｍｏｌ／ｍ２の範囲の負荷密度で調製した。方法は、上記の２つの段落に記載したのと同じであったが、１ｎｇ／ｍＬのグロブロマーを用い、３μｌのビーズを加えた。上記の電荷密度についての初期の実験と同様に、オリゴマーの捕捉は、電荷密度とともに指数関数的に増加した（図２３）。試験した最低の負荷密度（約６０００ｎｍｏｌ／ｍ２）にて、バックグラウンドと捕捉されたオリゴマーとの間を依然として見分けることが可能であった。ペプチドＫＫＫＦＫＦのような高効率の試薬については、５００ｎｍｏｌ／ｍ２リガンドまたは２０００ｎｍｏｌ正電荷／ｍ２もの低さで、オリゴマーの選択的捕捉のために十分であると見積もられた。
【０２７４】
その他の固体支持体とコンジュゲートした試薬を用いて、アビディティベースの捕捉を観察することが可能である。ＰＳＲ１を、セルロースメンブレンに、以下の段落に示すプロトコールを用いてコンジュゲートした（このセルロースメンブレン上では、はるかにより高いレベルの負荷を達成できる）。ビーズ上に負荷させたものよりおよそ１００倍高いＰＳＲ１負荷の増加は、ＰＳＲ１が溶液におけるオリゴマーと優先的に結合する能力を継続的に増加させた（図２３）。
【０２７５】
ペプトイド／ペプチドをメンブレン上に直接コンジュゲートするために、セルロースメンブレン（Ｗｈａｔｍａｎ５０）を、エピブロモヒドリン：過塩素酸：ジオキサンの１０：１：９０溶液に浸して１〜３時間ｒｔにてインキュベートした。メタノールで洗浄して乾燥した後に、メンブレンを、そのままのトリオキサデカンジアミン中で７０℃にて１時間インキュベーションすることによりアミノ化した。洗浄の後に、メンブレンをクエンチし（３Ｍ  ＮａＯＭｅ中で）、洗浄して再び乾燥した。スポットを、ＮＭＰ中のＨＯＢＴおよびＤＩＣで予め活性化したＦｍｏｃＧｌｙの０．４Ｍ溶液１ｕｌをスポットし、２０分間インキュベートすることにより境界を定めた。カップリングを反復し、メンブレンを、ＤＭＦ中の２％無水酢酸、その後ＤＭＦ中の２％無水酢酸／２％ＤＩＥＡでキャッピングした。メンブレンをＤＭＦで洗浄し、ＤＭＦ中の４％ＤＢＵで脱保護し（２×１０〜２０分）、ＤＭＦおよびメタノールで洗浄し、次いで乾燥した。活性化マレイミドプロピオン酸（０．４Ｍ、ＨＯＢｔおよびＤＩＣとともに）を、メンブレンのスポットに加え、カップリングを反復し、メンブレンをＮＭＰ、水およびメタノールで洗浄した。ＤＭＦ／リン酸塩緩衝液中の１０ｍＭチオール化ペプトイドのアリコート（２ｕｌ）を、メンブレンに加えた。チオール化ペプトイドの添加を反復し、メンブレンをクエンチし（ＢＭＥで）、洗浄し（水、メタノール、ＤＭＦおよびメタノール）、最後に乾燥した後に使用した。
【０２７６】
この電荷密度の効果をさらに調べるために、単一リガンド上の電荷を増加して、電荷／リガンドの増加が、表面密度の減少を補償できるか否かを決定した。２つの正に荷電したペプチドＫＫＫＫＫＫ（負荷レベル：３．１ｎｍｏｌ／ｍｇビーズ）およびＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫ（負荷レベル：１．６ｎｍｏｌ／ｍｇビーズ）を比較した（図６）。リガンドあたりの電荷の数の倍加（６から１２まで）は、ビーズ上へのリガンドの負荷が付随して減少したならば、捕捉効率を必ずしも倍加しなかった。
【０２７７】
固体支持体のアビディティおよび選択
オリゴマーの捕捉におけるアビディティの役割も、ＰＳＲ１ペプトイド試薬について２つの異なる固体支持体を比較することにより検査した。ＰＳＲ１が磁性ビーズに直接コンジュゲートしている場合は、ペプトイドリガンドの密度は約３．５μｍｏｌ／ｍ２であるので、電荷密度は約１４μｍｏｌ電荷／ｍ２である。これとは対照的に、ストレプトアビジン被覆磁性ビーズと結合しているビオチン−ＰＳＲ１の密度は約０．０３３μｍｏｌ／ｍ２であるので、電荷密度は約０．１２μｍｏｌ電荷／ｍ２である。これらの２つのＰＳＲ１ビーズのオリゴマー捕捉能力を比較して、異なるレベルの電荷密度を有するビーズの効果を評価した。
【０２７８】
等量のＰＳＲ１および２つの異なる投入物レベル、すなわちＰＳＲ１と直接コンジュゲートしている３もしくは３０μｌのビーズ（３０ｍｇ／ｍｌ、「ＰＳＲ１ビーズ」）またはビオチン−ＰＳＲ１と結合している１０もしくは１００μｌのストレプトアビジンビーズ（１０ｍｇ／ｍｌ、「ｂ−ＰＳＲ１ビーズ」）を、ＭＰＡアッセイにおいて、８０μｌのグロブロマー添加ＣＳＦと２０μｌの５×ＴＢＳＴＴとの混合物とともに用いた。グロブロマーは、それらの未変性のコンフォメーション（「未変性ｇｌｏｂ」）でまたはモノマー（「変性ｇｌｏｂ」）として、陰性対照のために加えた。グロブロマーを、５Ｍ  ＧｄｎＳＣＮ中で室温にて３０分間変性させた。等量のビーズを用いたが、ＰＳＲ１ビーズの電荷密度は、ｂ−ＰＳＲ１ビーズのものよりおよそ１００倍大きかった。
【０２７９】
ＰＳＲ１ビーズは、グロブロマーについてより高い感度および特異性を示したが、低密度ｂ−ＰＳＲ１ビーズは、制限された特異性および感度を示し（図１３ＡおよびＢ）、このことは、電荷密度がオリゴマーの捕捉のために重要であることをさらに示した。
【０２８０】
（実施例３）
様々な電荷を有し様々な電荷密度での多様なペプトイド凝集体特異的結合試薬を用いる原線維の検出
本実施例は、ペプトイド試薬を用いる原線維凝集体の捕捉について記載する。実施例２で得られた結論と同様に、固体支持体上の全体的な正電荷および高い電荷密度は、モノマーよりも原線維凝集体とのペプトイド試薬の優先的な結合が増加するために重要であった。
【０２８１】
ストレプトアビジン誘導体化磁性ビーズと結合できるビオチン化誘導体としての化合物を試験のために調製した（図１４を参照されたい）。ペプトイドを、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．（１９９２年）１１４巻：１０６４６〜１０６４７頁；Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．（２００３年）１２５巻：８８４１〜８８４５頁；Ｊ．  Ｐｅｐｔ．  Ｐｒｏｔ．  Ｒｅｓ．（１９９２年）４０巻：４９８頁）により以前に本質的に記載されたサブモノマー法を用いて調製し、ＨＰＬＣにより精製した（図１５、表６）。
【０２８２】
ペプトイドは、それらのサブモノマーの順序およびアイデンティティーを記載するために略記する。ペプトイドサブモノマーは、次のように表す：ｐＨ７にて正に荷電されるサブモノマーを示す「＋」；ｐＨ７にて負に荷電されるサブモノマーを示す「−」；芳香族サブモノマーを示す「Ａ」；および極性非荷電サブモノマーを示す「Ｐ」。配列は、Ｎ→Ｃに示し、ビオチン−（アミノヘキサン酸）２リンカーが含意される。「正に荷電した」の「＋」は、本実施例で採用した条件下で正に荷電されることが期待される塩基性官能基を示す。
【０２８３】
表６．ペプトイドについての特徴決定情報
【０２８４】
【表６】
2013510297.tif 000047
分析ＨＰＬＣ−ＭＳ：Ａｇｉｌｅｎｔ１１００、流速０．８ｍｌ／分、３．５分間で５〜９５％ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ、１００×２．１ｍｍ  ５μｍ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＯＤＳカラム、２１４ｎｍにて６分間のＵＶ検出、記載されるＭＳモード。
【０２８５】
分取ＨＰＬＣ：流速３０ｍｌ／分、１６分間で以下に記載する勾配のＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ、３０×５０ｍｍ  ＳＦ  Ｃ１８カラム、Ｗａｔｅｒｓ検出器、２１４ｎｍにて１６分間のＵＶ検出。
【０２８６】
プリオン凝集体のプルダウン
図１５ａに示す３つのビオチン化ペプトイド類似体を、ストレプトアビジン誘導体化磁性ビーズ上にコンジュゲートした。２つの公知のビーズコンジュゲート、すなわちＰＳＲ１（陽性対照）またはグルタチオン（陰性対照）で直接被覆したＤｙｎａｌ  Ｍ２７０ビーズも、比較のために試験した。５つのビーズコンジュゲートを、ミスフォールディングタンパク質アッセイを用いてアッセイした（図３）。５つのビーズコンジュゲートを、９６ウェルプレートのウェルに加えた。プリオンタンパク質のミスフォールディングされた形の大きい凝集体ＰｒｐＳｃの豊富な供給源であることが公知のプリオン感染ハムスターからの１０％脳ホモジネート（ｗ／ｖ）を試料として用いた。脳ホモジネートを、緩衝液、脳脊髄液（ＣＳＦ）および血漿に、それぞれ３つのレベル３００、１００および０ｎＬ／ｍＬで添加した。脳ホモジネート溶液をビーズに加え、ある期間、典型的には３７℃にて１時間、回転させながらインキュベートした。磁石を試料に用いて、上清からビーズ結合物質を分離した。上清を除去した後に、溶出緩衝液を用いて凝集体を変性させ、溶出された物質をビーズから解離した。溶出された物質を、次いで、対象のタンパク質に特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイに付した。
【０２８７】
ＰｒｐＳｃ捕捉実験の結果を図１６に示す。グルタチオンビーズまたは非荷電ビーズ（ＰＡＰＡＰＡ）からはシグナルは観察されなかった。シグナルは、１００または３００ｎｇ／ｍＬの添加レベルにて、ＰＳＲ１被覆ビーズ、ＰＳＲ１のビオチン化類似体（＋＋＋Ａ＋Ａ）および６の正電荷を含有するペプトイド（＋＋＋＋＋＋）を用いた場合に観察された。シグナルは、緩衝液中で行ったアッセイについて、これらの３つのペプトイド−ビーズコンジュゲート間で著しく異ならなかったが、ＰＳＲ１被覆ビーズおよび＋＋＋＋＋＋は、ＰＳＲ１のビオチン化類似体（＋＋＋Ａ＋Ａ）に比べて、他の２つのマトリクスにおけるシグナルを中程度に増加させた。添加なし試料では、シグナルは観察されなかった。捕捉されたＰｒｐＳｃと同様のシグナル／ノイズレベルが、ビオチン化ＰＳＲ１（＋＋＋Ａ＋Ａ）および以前に記載したＰＳＲ１で直接被覆したビーズについて観察され、図１４に示すライブラリーフォーマットの有効性を示した。６の正電荷を帯びたペプトイドは、ＰｒｐＳｃも効率的に捕捉した。
【０２８８】
図１５ｂに示すビオチン化ペプトイド類似体を、ストレプトアビジン誘導体化磁性ビーズ上にコンジュゲートした。プリオン感染ハムスターの脳からのホモジネートを、０および３００ｎｇ／ｍＬの添加レベルだけを探究した以外は上記のようにして試験した。これらの実験の結果を、図１７に示す（データは３連で示す）。データは、緩衝液中のＰＳＲ１で被覆したビーズ（陽性対照、＋＋＋Ａ＋Ａ）に対して示す。最高の全体的な正電荷を有する４つのペプトイドが、緩衝液中でＰＳＲ１に匹敵するシグナルをもたらしたが、負に荷電したペプトイドまたは中性の電荷、双性イオンペプトイドは、著しくより低いシグナルを示した。シグナルの減少は、緩衝液アッセイに比べてＣＳＦまたは血漿に添加した試料から観察されたが、正に荷電したペプトイドは、まだ著しい捕捉を示した。＋４および＋７の全体的な正電荷を帯びたペプトイドは、ＰｒｐＳｃを効率的に捕捉した。３つの芳香族サブモノマーおよび４つの正のサブモノマーを帯びたペプトイドについて、サブモノマーの順序は、シグナルに劇的に影響しなかった。
【０２８９】
Ａβ凝集体のプルダウン
上記のプリオンアッセイと類似のアプローチを用いて、ペプトイド−ビーズコンジュゲートによるＡβ凝集体捕捉を評価した。アルツハイマー病患者の脳からの１０％脳ホモジネート（ｗ／ｖ）を陽性対照として用いた。なぜなら、これらの試料は、Ａβ（１−４０）、Ａβ（１−４２）およびタウの大きい凝集体が豊富であることが公知であるからである。
【０２９０】
Ａβ（１−４２）について、１０ｎＬの１０％脳ホモジネートを各ウェルに加え、２重のアッセイからのシグナルを検出した（図１８Ａ）。これらの実験からの全体的な傾向は、上記のプリオン捕捉実験と類似の傾向を示した。全体的な正電荷が低いペプトイドについて、低いシグナルが観察され、捕捉効率は、緩衝液中で最強であった。Ａβ（１−４２）を捕捉するための正に荷電したペプトイドの有用性をさらに調査するために、全体的に正に荷電されたペプトイドに焦点を当てた第２の実験を行った（図１８Ｂ）。様々な順序の３つの芳香族および４つの正電荷を含有するペプトイド間で配列特異性はほとんど観察されなかったが、７つの正電荷を有するペプトイドは、血漿およびＣＳＦの両方において、４つの正電荷を有するものよりもシグナルの増加をもたらした。
【０２９１】
ＣＳＦおよび血漿中でのＡβ（１−４２）捕捉について、＋＋＋Ａ＋Ａ（ビオチン化ＰＳＲ１）と＋＋＋＋＋＋＋との間で同様の検出限界が観察された（図１９）（ＣＳＦ中で１．３対１．６ｎＬ／アッセイおよび血漿中で３．８対２．５ｎＬ／アッセイ）。
【０２９２】
＋４〜＋７の全体的な正電荷を帯びたペプトイドは、緩衝液中のＡβ（１−４２）を効率的に、そしてより少ない程度でＣＳＦおよび血漿中で捕捉した。３つの芳香族サブモノマーおよび４つの正のサブモノマーを有するペプトイドについて、サブモノマーの順序はシグナルに劇的に影響しなかった。同様の検出限界が、＋＋＋Ａ＋Ａ（ビオチン化ＰＳＲ１）および＋＋＋＋＋＋＋について見出された。
【０２９３】
Ａβ（１−４０）について、１μＬの１０％脳ホモジネートを各ウェルに加え、２重のアッセイからのシグナルを検出した（図２２Ａ）。このデータにおいてシグナルのより大きい変動が観察されたが、これらの実験からの全体的な傾向は、プリオンの研究についての傾向と同様であった。全般的に、緩衝液およびＣＳＦについて、より高く正に荷電されたペプトイドを用いるアッセイにおいて、より高いシグナルが観察された。
【０２９４】
−Ａ−Ａ−Ａ−および−−−ＡＡＡ−についての結果は、正電荷が凝集体との優先的な結合に要求されることを示した以前の知見とは一致しなかった。しかし、反復内での再現性が乏しいことに鑑みて、この結果は決定的でなく、さらなる確認が要求される。
【０２９５】
Ａβ（１−４０）を捕捉するための正に荷電したペプトイドの有用性をさらに調査するために、全体的に正に荷電されたペプトイドに焦点を当てた第２の実験を行った（図２２Ｂ）。７つの正電荷を有するペプトイドを用いるアッセイからのシグナルは、４つの正電荷を含有するものと同じ程度にまたはそれよりも高かった。＋４〜＋７の全体的な正電荷を帯びたペプトイドは、緩衝液中のＡβ（１−４０）を効率的に、そしてより少ない程度でＣＳＦおよび血漿中で捕捉した。３つの芳香族サブモノマーおよび４つの正のサブモノマーを有するペプトイドについて、サブモノマーの順序はシグナルに劇的に影響しなかった。
【０２９６】
タウ凝集体のプルダウン
上記のプリオンアッセイと類似のアプローチを用いて、ペプトイド−ビーズコンジュゲートによるタウ捕捉を評価した。アルツハイマー病（ＡＤ）患者の脳からの１６０ｎＬの脳ホモジネートを陽性対照として用いた。なぜなら、これらの試料は、Ａβ（１−４０）、Ａβ（１−４２）およびタウの大きい凝集体が豊富であることが公知であるからである。対照として、結果を、最小限のタウ凝集体を有するはずである正常な脳ホモジネートと比較した。ＰＳＲ１（＋＋＋Ａ＋Ａ）で被覆したビーズおよびグルタチオンで被覆したビーズを、ビオチン化＋＋＋＋＋＋＋および−−−−−−−と比較すると、ＰＳＲ１（＋＋＋Ａ＋Ａ）および（＋＋＋＋＋＋＋）がともにＡＤ試料において、正常な脳ホモジネート（ＮＢＨ）と比較してより高いシグナルを有したが、グルタチオン対照および−−−−−−−ペプトイドは、両方の試料で同様のシグナルを有したことが示された。ＰＳＲ１（＋＋＋Ａ＋Ａ）は、最高のシグナルを有した（図２０）。
【０２９７】
病原性プリオン凝集体の結合におけるビーズ上のＰＳＲ１密度の影響の測定
上記のアッセイの分析物はタンパク質凝集体であると推定されるので、ビーズ表面上の密度の関数としてのＰＳＲ１の捕捉効率を調査した。ストレプトアビジン磁性ビーズを、異なる比率のビオチン化ＰＳＲ１（＋＋＋Ａ＋Ａ）および中性電荷の対照ペプトイド（ＰＡＰＡＰＡ）を含有する溶液で処理した。ビーズから未結合のペプトイドを洗い流した後に、ビーズを、病原性プリオン凝集体を含有するシリアンハムスターの脳ホモジネートを添加したヒト血漿と混合した。過剰のタンパク質を洗い流し、プリオン凝集体をビーズから溶出し、プリオンタンパク質に特異的なＥＬＩＳＡを用いて検出した（図３）。期待されたように、中性電荷の対照ペプトイド（ＰＡＰＡＰＡ）とコンジュゲートしたビーズはＥＬＩＳＡにおいて最小限のシグナルを導いたが、ＰＳＲ１（＋＋＋Ａ＋Ａ）とだけコンジュゲートしたビーズは、約３５倍高いシグナルを産生した。オリゴマーアッセイにおいてみられた電荷密度の要件と一致して、Ｂｉｏ−ＰＳＲ１（＋＋＋Ａ＋Ａ）電荷密度とシグナルとの間に線形の相関関係は観察されなかった（表７および図２１）。ＰＳＲ１コンジュゲート濃度を０から５０％（約６０ｎｍｏｌ電荷／ｍ２）に増加することにより、４倍のＳ／Ｎの増加が産生されたが、２５％（約３０ｎｍｏｌ電荷／ｍ２）から７５％（約９０ｎｍｏｌ電荷／ｍ２）へのさらなる増加は、ほぼ２７倍のＳ／Ｎの増加を産生した。ＰＳＲ１（＋＋＋Ａ＋Ａ）コンジュゲート濃度を１００％（約１２０ｎｍｏｌ電荷／ｍ２）までさらに増加することにより、７５％読出しを超える中程度のＳ／Ｎの増加が産生された。
【０２９８】
表７．漸増密度のＰＳＲ１（＋＋＋Ａ＋Ａ）とコンジュゲートしたストレプトアビジン
磁性ビーズにより捕捉された全プリオンシグナル
【０２９９】
【表７】
2013510297.tif 000048
（実施例４）
患者試料中での凝集体タンパク質の検出
本実施例は、図１に描くペプトイド捕捉試薬、すなわちＰＳＲ１が、ミスフォールディングされたタンパク質凝集体と関連するいくつかの疾患において、モノマーと凝集体とを見分けることができることを実証する。
【０３００】
実験は、実施例１に記載する方法に従って行った。７５ｎＬの１０％ＡＤ脳ホモジネートを１×ＴＢＳＴＴに添加し、３ｕｌのＰＳＲ１ビーズと１時間インキュベートした。ＰＳＲ１ビーズを、その後、洗浄し、結合したＡβ４２またはタウ凝集体を溶出し、それぞれＡβ４２およびタウ特異的サンドイッチＥＬＩＳＡにより検出した。
【０３０１】
脳ホモジネート中での凝集体の捕捉
ＮＭＰＡを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｚｕｅｒｉｃｈ  ＨｏｓｐｉｔａｌのＡｄｒｉａｎｏ  Ａｇｕｚｚｉ博士からの対照、異型クロイツフェルト−ヤコブ病（ｖＣＪＤ）またはアルツハイマー病（ＡＤ）患者からの脳ホモジネートに対して行った。ｖＣＪＤについて、プリオンタンパク質が検出された。ＡＤについて、Ａベータ（１−４２）およびタウの両方が検出された。結果は、ＰＳＲ１が、対照とｖＣＪＤまたはＡＤ試料のいずれかとを明らかに見分けたことを示した（図２４）。
【０３０２】
（実施例５）
グロブロマー捕捉におけるＥ２２の役割の決定
本実施例は、凝集体の電荷、構造およびサイズが、ビーズに付着したペプトイド凝集体特異的結合試薬によるその認識に寄与することを示す。
【０３０３】
上記のように、凝集体特異的結合試薬と凝集体との間の電荷相互作用は、結合機序の重要な成分である。実施例２は、正に荷電した試薬が、オリゴマーの著しい捕捉をもたらしたことを実証した。よって、オリゴマー上の表面に露出された負に荷電した残基は、これらの試薬との結合に関与しやすい。ベータアミロイド原線維およびＮ−Ｍｅｔプレグロブロマーの構造研究は、負に荷電されたＥ２２残基が表面に露出されていることを示唆した（Ｌｕｈｒｓら、ＰＮＡＳ、２００５年；Ｙｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００９年）。よって、露出されたＥ２２が、ＰＳＲ１、すなわち正に荷電した捕捉試薬によるベータアミロイドの捕捉に重要であるか否かを決定するための研究を行った。
【０３０４】
３つのベータアミロイド１−４２ペプチドを作製して、Ｅ２２の役割を試験した：野生型ペプチド、中性電荷を有する北極型変異Ｅ２２Ｇを含有する変異体ペプチド、および正電荷を有するイタリア型変異Ｅ２２Ｋを含有する変異体ペプチド。合成ペプチドは、Ａｎａｓｐｅｃから商業的に入手可能であった。
【０３０５】
変異体ペプチドを、実施例３に記載する方法に従ってオリゴマー化した。
【０３０６】
Ｅ２２ＧグロブロマーのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィー分析は、その構造が、野生型グロブロマーのものと類似することを実証した（図７）。オリゴマーを、１２０Ｖにて１．５〜２時間の４〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により分離し、ゲルをクーマシーブルーで染色した。オリゴマーを、１ｍＬ／分の流速で流す（ｒｕｎ）ＰＢＳ中でのＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムでのＳＥＣにより分離した。１ｍＬの画分を収集し、Ａβ４２特異的ＥＬＩＳＡにより分析した。
【０３０７】
ＮＭＰＡを、ＰＳＲ１がＥ２２Ｇグロブロマーを捕捉する能力を評価するために用いた。用いた方法は、実施例２に記載する。中性に荷電されたＥ２２Ｇグロブロマーは、ＰＳＲ１により捕捉されず（図８）、電荷相互作用が、ミスフォールディングされたタンパク質の認識における鍵となる因子であることを示した。
【０３０８】
Ｅ２２Ｋグロブロマーを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価し、野生型と比較した。Ｅ２２Ｋグロブロマーは、およそ５５キロダルトンでの野生型のバンドの喪失により示されるように、ＳＤＳ不安定性オリゴマーを形成した（図９Ａ）。グルタルアルデヒドを用いてオリゴマーを架橋することにより、Ｅ２２Ｋグロブロマーが野生型よりも高い分子量を有することが示された（図９Ｂ）。
【０３０９】
中性荷電Ｅ２２Ｇ変異体グロブロマーとは対照的に、正に荷電したＥ２２Ｋグロブロマーは、ＰＳＲ１により効率的に捕捉された（図１０）。この結果は、構造およびサイズも、ミスフォールディングされたタンパク質のＰＳＲ１認識に寄与し、タンパク質構造上の荷電された表面が、正味電荷よりもＰＳＲ１結合に寄与することを実証する。
【０３１０】
（実施例６）
追加の試薬の結合能力の評価
本実施例は、荷電試薬および疎水性試薬の追加の種の結合能力を示し、異なる捕捉試薬の特性の、モノマーよりもオリゴマーと優先的に結合するそれらの能力に対する影響をさらに実証する。オリゴマー捕捉は、カチオン残基の増加とともに指数関数的に増加し、捕捉は、キラリティーおよび配向に依存するよりも、ビーズ表面についての電荷分布に依存し、これらのことは一緒に、結合が多モードの相互作用であることを示唆する。試薬の芳香族性／疎水性を増加することによりオリゴマー捕捉が改善されるが、電荷と疎水性との間の均衡は、特異性を維持するために維持する必要がある。
【０３１１】
材料および方法
一連の新しい潜在的な凝集体特異的結合試薬を、以下に示すようにして設計して、実施例２に記載するようにして磁性Ｄｙｎａｌ  Ｍ２７０ビーズにコンジュゲートした。典型的に、７〜１２ｎｍｏｌのリガンド（各候補凝集体特異的結合試薬）で、１ｍｇのビーズを被覆した。
【０３１２】
ビーズのアリコート（典型的に３ｕｌ）を、９６ウェルプレートのウェルに加え、その後に試料（８０：２０のＣＳＦ：ＴＢＳＴＴに添加したＡベータ１−４２グロブロマー（Ａベータ４２オリゴマーモデル）ありまたはなしで、典型的に１２５ｕｌ）を加えた。プレートを密閉し、３７℃にて１時間、振とうしながらインキュベートした。プレートを、洗浄剤の水溶液（典型的にモノラウリン酸ポリエチレングリコールソルビタンおよびｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）で洗浄して、未結合の物質および残存緩衝液を除去した。変性溶液（典型的に０．１〜０．１５Ｎ  ＮａＯＨ）を各ウェルに加え、プレートを８０℃まで３０分間、振とうしながら加熱した。プレートを室温に冷却した後に、中和緩衝液（典型的に０．４％ＴＷＥＥＮ２０中の０．１２〜０．１８Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ３）を加え、プレートを室温にて軽く振とうした。ビーズ溶出物を、Ａβ４２特異的ＥＬＩＳＡまたはＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）からのＭＳＤ（登録商標）９６ウェルＭＵＬＴＩ−ＳＰＯＴ（登録商標）Ｈｕｍａｎ／Ｒｏｄｅｎｔ  ［４Ｇ８］  Ａｂｅｔａ  Ｔｒｉｐｌｅｘ  Ｕｌｔｒａ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ａｓｓａｙのいずれかを用いて分析した。Ａβ４２特異的アッセイについて、試料をビーズから溶出し、検出抗体（４Ｇ８  ＨＲＰ）を、Ａβ４２特異的抗体１２Ｆ４を帯びたプレートに加えた。プレートを１時間インキュベートし、洗浄し、基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤからのＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を加え、発光を測定した。ＭＳＤプレートアッセイを、製造者のプロトコールに従って、同様の様式で行った。
【０３１３】
結果
オリゴマー捕捉に対する正電荷数の影響力
本実験では、所定の骨格内の電荷の好ましい数を同定した。Ａｌａ／Ｌｙｓペプチドフレームワークを利用し、ここでは、各Ｌｙｓ残基を含めることにより、ペプチドの正味電荷が＋１増加する。漸増電荷（＋１→＋６）を有する６つのヘキサペプチド、すなわちＡＡＡＫＡＡ、ＡＡＫＫＡＡ、ＡＡＫＫＫＡ、ＡＫＫＫＫＡ、ＡＫＫＫＫＫおよびＫＫＫＫＫＫを調製して、ビーズにコンジュゲートした。これらのビーズが、１ｎｇ／ｍＬでＣＳＦに添加されたＡベータ１−４２グロブロマーを捕捉する能力を試験し、結果を図２５に示す。グロブロマー捕捉レベル（「４２  １ｎｇ／ｍｌ」または塗りつぶしたバー）を、添加なしのＣＳＦにおいて検出されたＡベータ１−４２のバックグラウンドシグナル（「４２  ０ｎｇ／ｍｌ」）および添加なしのＣＳＦにおいて検出されたＡベータ１−４０のバックグラウンドシグナル（「４０  ０ｎｇ／ｍｌ」）またはＡＢ４２オリゴマーを添加したＣＳＦ「４０  １ｎｇ／ｍｌ」と比較した。本実験において評価した各試薬の、磁性ビーズにコンジュゲートした電荷密度を、以下の表８に示す。
【０３１４】
表８．正に荷電したペプチド試薬の電荷密度
【０３１５】
【表８】
2013510297.tif 000049
本実験の結果は、グロブロマー捕捉が、カチオン残基とともに増加する（塗りつぶしたバー）が、ＣＳＦに由来するバックグラウンドＡベータ１−４２または１−４０シグナルは、相対的に低いままであることを示す。これらの研究は、このフレームワークにおけるペプチドは、オリゴマーを捕捉するために少なくとも＋２の電荷、および約２〜３μｍｏｌ電荷／ｍ２の電荷密度が必要であることを示唆する。
【０３１６】
この結果に基づいて、電荷がどのように捕捉に影響するかも調査できる。ｐＨ７での理論的ペプチド正味電荷を捕捉に対してプロットすることにより（図２６に示すように）、電荷と捕捉との間に指数関数的な関係があることが明らかになり、このことは、電荷を増加することにより捕捉が劇的に改善されることを示唆する。「シグナル」（Ａベータ１−４２グロブロマー捕捉レベル）および「ノイズ」（Ａベータ１−４０モノマー捕捉レベル）の両方が電荷の増加とともに増加するが、シグナル：ノイズの比は電荷の増加とともに改善されることも明らかになる（以下の表９の「４２：４０」の列を参照されたい）。
【０３１７】
表９．Ａｌａ／Ｌｙｓ骨格の正に荷電したペプチド試薬により捕捉されたシグナル対ノイズのレベル
【０３１８】
【表９】
2013510297.tif 000050
「４２」の列における数字は、各ペプチド試薬により捕捉されたＡベータ１−４２グロブロマー添加ＣＳＦ試料から得られた平均ＲＬＵを表す。「４０」の列における数字は、各ペプチド試薬により捕捉されたＡベータ１−４０モノマー添加ＣＳＦ試料から得られた平均ＲＬＵを表す。「４２：４０」の列は、「４０」に対する「４２」の比を示す。
【０３１９】
Ａｌａ／Ｌｙｓ骨格の他に、＋２の正味電荷を有するが芳香族残基を有さない別の試薬であるＫＩＧＶＶＲを試験した。Ａｌａ／Ｌｙｓ骨格に対する上記と同様の実験を、ＰＳＲ１と並べてこの試薬に対して行った。結果は、ＫＩＧＶＶＲが、Ａベータ１−４２グロブロマーを、ＰＳＲ１のグロブロマー捕捉レベルと同様の高いレベルで捕捉し、Ａベータ１−４０添加ＣＳＦ中でＰＳＲ１と同様の低レベルのモノマーＡベータ１−４０ノイズを、そして非添加試料中で低いバックグラウンドを有したことを示した。
【０３２０】
オリゴマー捕捉に対するキラリティー、ビーズに対する電荷の配向および主鎖の配向の影響力
上記の実験から、Ａｌａ／Ｌｙｓペプチドが、ＰＳＲ１より少ないグロブロマーを捕捉したことが明らかになった。ＰＳＲ１もカチオン性であり、６残基を有するが、Ａｌａ／Ｌｙｓフレームワークペプチドからそれを分ける２つの特徴、すなわち２つの芳香族残基および異なる主鎖を有する。これらの特徴のどちらが捕捉効率において役割を演じているかをよりよく理解するために、本発明者らは、これらの特性のそれぞれを別々に調査した。
【０３２１】
好ましい骨格を同定するために、ＰＳＲ１とそのペプチド類似体であるＫＫＫＦＫＦを研究し、ＫＫＫＦＫＦの誘導体を作製した。ＫＫＫＦＫＦと同じ全体的な電荷パターンを有する５つの異なるペプチド試薬を設計して、キラリティー、ビーズに対する電荷の配向および主鎖の配向の影響力を研究した（図２７）。１つのペプチドｋｋｋｆｋｆは、通常のＬ−アイソフォームの代わりにＤ−アイソフォームアミノ酸を有する。グロブロマー捕捉アッセイは、Ａｌａ／Ｌｙｓ骨格を有する試薬について上記したのと同様の方法で、これらの試薬に対して行った。ペプチドを、磁性ビーズに、約４〜５ｎｍｏｌ／ｍｇビーズまたは約４．８〜６μｍｏｌ／ｍ２電荷でコンジュゲートした。ＰＳＲ１は、約１２ｎｍｏｌ／ｍｇビーズまたは約１４μｍｏｌ／ｍ２電荷でコンジュゲートした。アッセイの結果を図２８に示し、シグナル対ノイズの比較を以下の表１０に示す。
【０３２２】
表１０．ＫＫＫＦＫＦ骨格において正に荷電したペプチド試薬により捕捉されたシグナル対ノイズのレベル
【０３２３】
【表１０】
2013510297.tif 000051
アッセイの結果は、これらの試薬の全てがグロブロマーを捕捉できたが、ビーズに最も近い電荷を有する試薬（連結−ＫＫＫＦＫＦ、ＦＫＦＫＫＫ−連結および連結−ｋｋｋｆｋｆ）が、これらのビーズの残り、すなわちＫＫＫＦＫＦ−連結および連結−ＦＫＦＫＫＫよりも著しくよりよいことを示す（図２８）。捕捉の改善は、キラリティー（連結−ｋｋｋｆｋｆと連結−ＫＫＫＦＫＦを比較されたい）および主鎖の配向（連結−ＫＫＫＦＫＦとＦＫＦＫＫＫ−連結を比較されたい）に、全般的に依存しなかった。全体的に、このように配向およびキラリティーへの依存性が欠如しているが、ビーズに対する電荷密度に依存性であることは、グロブロマーが試薬と、伝統的な小分子−タンパク質の「錠と鍵」相互作用よりもむしろ、多モードの様式で相互作用していることを示唆する。
【０３２４】
疎水性／芳香族残基の影響力
主鎖への変化が捕捉に対して中程度の影響力しか有さなかったことに鑑みて、本発明者らは、次に、上に示すような２つの異なる骨格の＋４ヘキサペプチド／ヘキサペプトイド試薬をまず比較することにより、芳香族残基の有用性を探求した。これらの試薬のＲＬＵレベルおよびシグナル：ノイズ比の比較を、以下の表１１に示す。
【０３２５】
表１１．疎水性／芳香族残基ありまたはなしの骨格の＋４ヘキサペプチド／ヘキサペプトイド試薬の比較
【０３２６】
【表１１】
2013510297.tif 000052
この比較から、＋４Ａｌａ／Ｌｙｓペプチド（ＡＫＫＫＫＡ）が、芳香族残基を含有するその他の試薬よりも著しくより低いグロブロマー捕捉効率と、より低いシグナル：ノイズ比を有することが明らかになる（表１１）。このことは、芳香族残基および／または疎水性残基が、捕捉効率にとって有益であることを示唆する。
【０３２７】
凝集体結合についての芳香族残基  対  非芳香族残基の利点を比較するために、追加のペプチドを設計して、グロブロマー捕捉アッセイにおいて比較した。試薬およびアッセイの結果を、図２９に示す。各試薬についての右のバーは、４ｎｇ／ｍＬグロブロマーを添加した試料から捕捉され、検出されたＡベータ１−４２グロブロマーレベルを表す。結果は、芳香族残基（ＡＫＦＫＫＫおよびＦＫＦＫＫＫにおいてＰｈｅで表される）が、非芳香族残基と比べてグロブロマー捕捉の改善をもたらしたが、脂肪族残基のような非芳香族疎水性残基を含有する試薬もグロブロマーを捕捉したことを示す（図２９）。ＡＫＦＫＫＫにおいて実証されるように、ペプチド中に１つの芳香族残基だけが存在しても、グロブロマー捕捉を著しく増加できたことは注目に値する。
【０３２８】
疎水性／芳香族残基についての要件をさらに探究するために、本発明者らは、より少ない荷電残基とより高い疎水性含量とを特徴とする一連のペプチドについて研究した。結果を以下の表１２に示す。ここでは、最も疎水性でかつ電荷が最小のペプチドが、グロブロマーの捕捉に効率的であった（ＦＫＦＳＬＦＳＧ、ＦＫＦＮＬＦＳＧおよびＩＲＹＶＴＨＱＹＩＬＷＰ）が、これらは、バックグラウンドモノマー種も著しい量で捕捉したことが観察でき、このことは、相互作用の特異性が、より均衡がとれた荷電／疎水性の性質を有するペプチドを用いるよりも低いことを示唆する。
【０３２９】
表１２．高い疎水性／芳香族含量を有する試薬の分析
【０３３０】
【表１２】
2013510297.tif 000053
全体的に、これらの結果は、ビーズ結合試薬とオリゴマーとの間の結合機序が、アビディティに依存することを示唆する。最適捕捉効率は、荷電されたコアと疎水性の外部とをもたらすコンジュゲートを用いて達成されるが、これらの試薬の正確な配列／構造は、重要性がより低い。骨格の変化（例えばペプチド対ペプトイド）およびキラリティーは、電荷分布よりも結合に関して重要性がより低く、Ｄ、Ｌ、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、ペプチド模倣物または類似の荷電および疎水性の特徴を有する有機分子を含む骨格は、オリゴマーを捕捉する類似の能力を示しやすい。最後に、疎水性含量を増加させることにより、捕捉効率が増加するが、オリゴマー形についての特異性を低減するので、電荷と特異性との間の均衡を維持することは、効率的なオリゴマー選択試薬のために重要である。
【０３３１】
試験した多様な芳香族残基
天然または非天然の多様な代わりの芳香族残基をペプチド骨格に導入して、追加の凝集体結合試薬を作製し、新しい試薬を上記のようにしてグロブロマー結合についてアッセイした。
【０３３２】
本研究について用いたペプチド骨格は、Ａｃ−ＦＫＦＫＫＫ−連結（より具体的にはＡｃ−ＦＫＦＫＫＫ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ｃｙｓ−ＮＨ２）であり、その構造を以下に示す。
【０３３３】
【化３２】
2013510297.tif 000054
フェニルアラニンを、異なる試薬において、以下の天然または非天然残基のそれぞれで表される異なるタイプの芳香族残基で置き換えた。
【０３３４】
【化３３】
2013510297.tif 000055
ペプチド骨格Ａｃ−ＫＫＫＦＫＦ−連結（より具体的にはＡｃ−ＦＫＦＫＫＫ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ｃｙｓ−ＮＨ２）も研究した。フェニルアラニンを、異なる試薬において、以下の非天然残基のそれぞれで表される異なるタイプの芳香族残基で置き換えた。
【０３３５】
【化３４】
2013510297.tif 000056
置換芳香族残基を有する試薬についてのグロブロマー結合アッセイの結果を、図３０Ａ、３０Ｂおよび３０Ｃに示す。結果は、全てのタイプの置換芳香族残基が、特異的グロブロマー捕捉のために働いたことを示す。本実験における様々な試薬での同様の範囲の捕捉および検出のレベルにより反映される比較的均一な構造−活性の関係により、このペプチド骨格が、全般的に、グロブロマー捕捉を改善することが確認される。
【０３３６】
別のペプチド試薬を設計して、正電荷および芳香族の特徴を同じ残基に組み込んだ（荷電芳香族）。この非天然ペプチドの配列は、Ａｌａ−ＡｍＦ−ＡｍＦ−Ｐｈｅ−ＡｍＦ−Ａｌａ（ＡｍＦ＝４−メチルアミノフェニルアラニン、荷電芳香族残基）である。このペプチドの構造を以下に示す。
【０３３７】
【化３５】
2013510297.tif 000057
グロブロマー結合アッセイを、この上記の「荷電芳香族」試薬について行い、結果を図３１に示す。この実験は、ここでもまた、正に荷電しかつ芳香族の残基ならびにそれらの構造の柔軟性の重要性を示す。
【０３３８】
芳香族の間隔の影響力
異なる間隔の芳香族を有する一連のペプチド試薬を作製し、凝集体結合能力についてグロブロマー捕捉アッセイで試験した。これらの試薬の配列は、それぞれＫＫＫＦＫＦ、ＫＫＦＫＫＦ、ＫＦＫＫＫＦおよびＦＫＦＫＫＫを含む。同様のレベルの検出結果は、芳香族の間隔が、凝集体捕捉において最小限の役割しか演じないことを示す（データは示さないが、これらの試薬は全て、グロブロマーを特異的に捕捉した）。
【０３３９】
第１級アミンの間隔の影響力
第１級アミンの間隔も、凝集体捕捉に対するその影響力について研究した。一方がより短い鎖のＬｙｓ類似体Ｆｍｏｃ−２，４−ジアミノブタン酸（α第１級アミンを有する「ｆｄｂ」）を含み、他方がδ第１級アミン（デルタアミノ酸２，５−ジアミノペンタン酸、「ｏ」と略記する）を含む２つのペプチドを作製した。ペプチドは、磁性ビーズに、Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ｃｙｓ−ＮＨ２リンカーを用いてコンジュゲートし、グロブロマー捕捉アッセイにおける凝集体結合能力について試験した。２つのペプチドの構造を以下に示す。
【０３４０】
Ｆ−ｆｄｂ−Ｆ−Ｆｄｂ−Ｆｄｂ−ｆｄｂ：
【０３４１】
【化３６】
2013510297.tif 000058
ＦｏＦｏｏｏ：
【０３４２】
【化３７】
2013510297.tif 000059
第１級アミンの間隔が異なる試薬についてのグロブロマー捕捉アッセイの結果を図３２に示す。この結果から、凝集体の捕捉において、より短い鎖のＬｙｓ類似体、すなわち間隔がより狭い第１級アミンを有するペプチドが、間隔がより広い第１級アミンを有するδペプチドよりも有効であることが明らかになる（但し、これらはともにグロブロマーを特異的に捕捉した）。
【０３４３】
第４級アミンの付加
骨格への第４級アミンの付加を、Ａｃ−ＫＫＫＦＫＦおよび以下に示す構造の３つ（第２級アミンを有する１つの対照および２つの異なる第４級アミン）を含む４つのペプチドを用いて研究した。ペプチドを、磁性ビーズに、Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ｃｙｓ−ＮＨ２リンカーを用いてコンジュゲートし、上記のようにしてグロブロマー捕捉についてアッセイした。同様のレベルの検出結果は、単一の第４級アミンを含めることが、凝集体捕捉において最小限の役割しか演じないことを示す（データは示さないが、これらの試薬は全て、グロブロマーを特異的に捕捉した）。
【０３４４】
モノＢｏｅ−エチレンジアミン＋ＢｒＣＨ２ＣＯ−ＫＫＦＫＦ
【０３４５】
【化３８】
2013510297.tif 000060
トリエチルアミン＋ＢｒＣＨ２ＣＯ−ＫＫＦＫＦ
【０３４６】
【化３９】
2013510297.tif 000061
テトラメチルエチレンジアミン＋ＢｒＣＨ２ＣＯ−ＫＫＦＫＦ
【０３４７】
【化４０】
2013510297.tif 000062
試験した追加の凝集体結合試薬
表１３および表１４に示すようないくつかの追加のペプチド試薬およびペプトイド試薬を作製し、上記のようなグロブロマー捕捉アッセイにおいて試験した。中性であるＮｂｎ−Ｎｈｙｅ−Ｎｄｐｃ−Ｎｇａｂ−Ｎｔｈｆ−Ｎｃｐｍ（１１８−６）を除いて、２つの表に列挙する全てのその他のペプチド試薬およびペプトイド試薬は、グロブロマーを特異的に捕捉した（図３３Ａ、３３Ｂおよび３３Ｃを参照されたい）。
【０３４８】
表１３：ＡＳＢ試薬を作製するための追加のペプチドおよびペプトイド配列
【０３４９】
【表１３】
2013510297.tif 000063
表１４：ＡＳＢ試薬を作製するための追加のペプトイド配列の構造および正味電荷
【０３５０】
【表１４−１】
2013510297.tif 000064
【０３５１】
【表１４−２】
2013510297.tif 000065
【０３５２】
【表１４−３】
2013510297.tif 000066
（実施例７）
メンブレンアレイ上での新しい潜在的な凝集体特異的結合試薬のスクリーニング
候補凝集体特異的結合試薬についてのペプチドまたはペプトイド配列の設計に加えて、セルロースメンブレン上にスポットしたランダムペプチド配列も、モノマーを超える凝集体との特異的結合について試験した。多くのペプチドが、本研究において、凝集体と特異的に結合することが見出された。
【０３５３】
１１２０のランダム１２マーペプチドを提示するように調製されたセルロースメンブレンアレイは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａのペプチドセンターから購入した（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ、このサービスは、現在、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｉｎｅｘｕｓ．ｃａ／を通じて利用可能である）。このメンブレン上のペプチドの負荷密度は、容易に入手可能でない。しかし、製造者により記載されたものと同様であると考えられるメンブレンアレイ合成方法を用いて、本発明者は、ペプチド負荷密度が約２〜４ｍｍｏｌリガンド／ｍ２であると測定し、このことは、最少数の正電荷である＋１を有するペプチドが、おそらく、同じ電荷密度である２〜４ｍｍｏｌ正味電荷／ｍ２にてメンブレンアレイを被覆していることを意味する。ランダムペプチドを被覆するために本発明者が用いたアレイ合成方法を以下に記載する。
【０３５４】
セルロースメンブレン（Ｗｈａｔｍａｎ５０）を、エピブロモヒドリン：過塩素酸：ジオキサンの１０：１：９０溶液に浸して１〜３時間室温にてインキュベートした。メタノールで洗浄して乾燥した後に、メンブレンを、そのままのトリオキサデカンジアミン中で７０℃にて１時間インキュベーションすることによりアミノ化した。洗浄の後に、メンブレンをクエンチし（３Ｍ  ＮａＯＭｅ中で）、洗浄して再び乾燥した。スポットを、ＮＭＰ中のＨＯＢＴおよびＤＩＣで予め活性化したＦｍｏｃＧｌｙの０．４Ｍ溶液１ｕｌをスポットし、２０分間インキュベートすることにより境界を定めた。カップリングを反復し、メンブレンを、ＤＭＦ中の２％無水酢酸、その後ＤＭＦ中の２％無水酢酸／２％ＤＩＥＡでキャッピングした。メンブレンをＤＭＦで洗浄し、ＤＭＦ中の４％ＤＢＵで脱保護し（２×１０〜２０分）、ＤＭＦおよびメタノールで洗浄し、次いで乾燥した。後続のアミノ酸は、次いで、１）活性化Ｆｍｏｃアミノ酸溶液をメンブレンにスポットし、２）無水酢酸でキャッピングし、３）ＤＢＵで脱保護するサイクルを用いる標準的な固相合成方法を用いて付着させることができた。最終的なメンブレンをキャッピングし、ＤＭＦおよびメタノールで洗浄し、乾燥した後に使用した。
【０３５５】
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａから購入したメンブレンを、１％乳溶液で６０分間インキュベートし、各１０分間、４回洗浄し、ＴＢＳＴ中の３ｎｇ／ｍＬのＡベータ１−４２グロブロマー（「オリゴマー」試料）または３ｎｇ／ｍＬのＡベータ１−４２モノマー（実施例２において上記するようにして調製した「モノマー」試料）の溶液に６０分間供した。洗浄した後に、メンブレンを、１％乳で希釈した抗Ａベータ抗体（６Ｅ１０）の溶液中で６０分間インキュベートした。洗浄した後に、メンブレンを、１％乳で希釈した２次抗体（ヤギ−抗マウス−ＨＲＰ）に６０分間供した。洗浄ステップの後に、化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤからのＤＵＲＡ  ＷＥＳＴ）をアレイに加え、画像をＫｏｄａｋイメージャーで撮影した。得られた画像を図３４に示し、メンブレン上での上位の特異的結合体のうちのグロブロマーと特異的に結合した正に荷電したペプチドを、以下の表１５に示す。上位の特異的結合体のうちではないが、メンブレン上でグロブロマーと特異的に結合したいくつかのペプチドも表１５に含めた。なぜなら、これらは、後で磁性ビーズ上で確認したからである。
【０３５６】
表１５：セルロースメンブレン上でＡベータ４２グロブロマーと特異的に結合した、正に荷電したペプチド
【０３５７】
【表１５】
2013510297.tif 000067
表１５から選択したペプチドを、ＤＹＮＡＬビーズに、ペプチドのアミノ末端にてリンカーＡｃ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｈｘ−Ａｈｘを用い、上記と同じプロトコールに従ってコンジュゲートした。ビーズ上でのこれらの試薬の電荷密度は、正に荷電した残基を１つだけ有するペプチドについて約４０００ｎｍｏｌ／ｍ２の低さであり、正に荷電した残基を１より多く有するペプチドについて正比例してより高かった。ペプチドがコンジュゲートしたビーズを、生理的レベルのＡベータ４０および４２を含有するＣＳＦ中で、Ａベータ４２グロブロマー結合能力についてアッセイした。ビーズ上で試験した表１５に列挙する配列の全ては、ビーズを被覆する場合に、Ａベータ４２グロブロマーと特異的に結合することが確認された（表１５およびデータは示さず）。
【０３５８】
（実施例８）
洗浄剤処理を用いるＣＳＦにおける結合バックグラウンドの低減
本実施例では、ＣＳＦのような生物学的試料からの凝集体検出の可能性のある干渉について研究し、そのような干渉を低減するための解決法を、捕捉後洗浄ステップにおいて様々な洗浄剤を試験することにより見出した。
【０３５９】
まず、正常ＣＳＦ（健常な人々からのプールしたＣＳＦ試料）に添加したＡベータ４２グロブロマーの検出限界（ＬｏＤ）を、緩衝液（ＴＢＳＴＴ）に添加したグロブロマーと、ＰＳＲ１とコンジュゲートしたビーズを用いて比較した。結果は、グロブロマーのＬｏＤが、ＣＳＦに添加した場合に約１０ｐＭ、または緩衝液に添加した場合に約５ｐＭであったことを示し、このことは、ＣＳＦ試料が結合の高いバックグラウンドを有することを示した（データは示さず）。
【０３６０】
次に、２つの中性洗浄剤であるモノラウリン酸ポリエチレングリコールソルビタン（ＴＷＥＥＮ２０としてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手可能）およびｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−１４としてＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪから入手可能）を用いて、ＰＳＲ１ビーズと接触させたグロブロマー添加ＣＳＦ試料を処理した。各アッセイについて、３０μｌのＰＳＲ１ビーズ（約７〜１２ｎｍｏｌ  ＰＳＲ１リガンド／ｍｇ  ＤＹＮＡＬビーズで被覆、これを本実施例およびそうでないと記載しない限り以下の実施例で用いた）と７０μｌの１×ＴＢＳＴＴとの混合物を、プルダウンプレートの各ウェルにすぐにピペットで入れた。液体を磁性分離器で除去した。５０マイクロリットルの５×ＴＢＳＴＴを各ウェルに加えた。ビーズを、７５０ｒｐｍにて軽く振とうすることにより懸濁した。次に、グロブロマーなしの２００μｌのＴＢＳＴＴまたはＣＳＦ試料を各ウェルに加えた。プルダウンプレートを密閉し、３７℃にて１時間、５００ｒｐｍで振とうしながらインキュベートした。インキュベーションの後に、ビーズを８回、ＴＢＳＴで、プレート洗浄器で洗浄した。プレート洗浄の後に、ビーズから残存ＴＢＳＴ緩衝液を磁性分離器で除去した。ビーズを、次いで、１００μｌのＴＢＳ、１％Ｔｗｅｅｎ２０または１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４のいずれかと室温にて３０分間、７５０ｒｐｍでインキュベートした（その後、ＴＢＳＴを用いてプレート洗浄器で追加の洗浄を８回行った）。残存ＴＢＳＴを磁性分離器で除去した後に、２０μｌの変性溶液、典型的には０．１〜０．１５Ｎ  ＮａＯＨをビーズに加えた。プレートをアルミホイルプレートシーラーで覆い、８０℃にて３０分間、７５０ｒｐｍで振とうしながらインキュベートした。インキュベーションの後に、プレートを室温まで冷却し、２０マイクロリットルの中和溶液、典型的には０．１２〜０．１８Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４＋０．４％Ｔｗｅｅｎ２０を各ウェルに加え、プレートを室温にて５分間、７５０ｒｐｍで振とうしながらインキュベートした。ビーズを溶出物から磁気的に分離した後に、上清を、予めブロッキングしたＭＳＤ  ＥＬＩＳＡプレートに移した。ＭＳＤ  Ａベータ３重アッセイを、製造者の使用説明書に従って行った。ＣＳＦ試料から検出されたＡベータ４２およびＡベータ４０のバックグラウンドレベルを図３５に示す。結果は、ＴＷＥＥＮ２０またはＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−１４のいずれかでの洗浄が、正常ＣＳＦのＡβ４２の検出を、ＰＳＲ１をＴＢＳＴＴ緩衝液単独とインキュベートした場合に観察されたバックグラウンドレベルまで低減したことを示す。これらは、正常ＣＳＦのＡβ４０の検出も著しく低減し、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−１４は、正常ＣＳＦのＡβ４０検出レベルの低減についてＴＷＥＥＮ２０よりもよく働くことが明らかになった。
【０３６１】
次に、洗浄剤処理の効果を、グロブロマーを添加した試料において研究した。様々な濃度のＡベータ４２グロブロマー（０〜２５ｐｇ／ｍＬ）を、２００ｕｌのＴＢＳＴＴまたはＣＳＦのいずれかに添加した。ＣＳＦ試料を、５０ｕｌの５×ＴＢＳＴＴと混合した後に、試料を３０μｌのＰＳＲ１ビーズと接触させた。捕捉、洗浄および検出ステップを、上記のようにして行った。異なるマトリクスに添加し、異なる洗浄緩衝液で処理し、シグナル／ノイズ（ここで、シグナルは、試料のＲＬＵであり、ノイズは、グロブロマーを添加していない、同等に処理された試料からのシグナルである）を計算したグロブロマーのＡベータ４２検出レベルの結果を図３６に示す。結果は、ＰＳＲ１プルダウンの後にグロブロマー添加ＣＳＦ試料をＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−１４またはＴＷＥＥＮ２０で処理することは、グロブロマー検出のシグナル／ノイズを改善したことを示す。
【０３６２】
Ｓ／Ｎ＝２に基づくＭＰＡグロブロマー検出のＬｏＤ、および２５．３ｐｇ／ｍＬのグロブロマー添加レベルでのシグナル／ノイズ比を計算し、以下の表１６に示す。計算した結果は、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−１４およびＴＷＥＥＮ２０は、ＣＳＦ中のグロブロマーのＬｏＤも、緩衝液中のグロブロマーのＬｏＤまで著しく低減したことを示す。
【０３６３】
表１６：捕捉後に異なる洗浄緩衝液で処理した試料のグロブロマー検出ＲＬＵならびに計算したＬｏＤおよびＳ／Ｎ
【０３６４】
【表１６】
2013510297.tif 000068
最後に、ある範囲の洗浄剤を、本実施例で記載する方法に従って試験し、いくつかが、ＣＳＦ試料のバックグラウンドＡベータ凝集体結合を低減することが見出された。試験した洗浄剤およびそれらの構造を図３７に示す。アッセイ結果および計算したシグナル／ノイズのまとめを以下の表１７に示す。
【０３６５】
表１７：捕捉後に異なる洗浄剤で処理した試料のグロブロマー検出ＲＬＵおよび計算したＳ／Ｎ
【０３６６】
【表１７】
2013510297.tif 000069
ａ：Ａベータ４２グロブロマー添加／非添加のＳ／Ｎ＝（０．５ｎｇ／ｍＬグロブロマーを有する試料のＡベータ４２  ＲＬＵ）／（０ｎｇ／ｍＬグロブロマーを有する試料のＡベータ４２  ＲＬＵ）
ｂ：Ａベータ４２グロブロマー添加／Ａベータ４０のＳ／Ｎ＝（０．５ｎｇ／ｍＬグロブロマーのＡベータ４２  ＲＬＵ）／（０ｎｇ／ｍＬグロブロマーを有する試料および０．５ｎｇ／ｍＬグロブロマーを有する試料の平均Ａベータ４０  ＲＬＵ）  。
【０３６７】
結果は、より長い炭素鎖を有するＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ洗浄剤（ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−１４および３−１６）が、Ａベータ４２グロブロマー検出についてのシグナル／ノイズ比をより著しく改善したことを示す。別の実験では、より長い炭素鎖を有するＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ洗浄剤、特にＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−１６が、Ａベータ４０凝集体捕捉Ｓ／Ｎを、ＡＤ  ＣＳＦにおいてさらにより著しく改善した（データは示さず）。
【０３６８】
ＣＳＦ試料のバックグラウンドＡベータ凝集体結合を低減し、１．０より大きいＡベータ４２グロブロマー添加／Ａベータ４０のＳ／Ｎをもたらした洗浄剤は、以下のものである。
【０３６９】
ＴＷＥＥＮ２０（モノラウリン酸ポリエチレングリコールソルビタン）、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−１４（ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−１６（ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−１２（ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）、ＡＳＢ−１４（アミドスルホベタイン−１４，３−［Ｎ，Ｎ−ジメチル（３−ミリストイルアミノプロピル）アンモニオ］プロパンスルホネート）、ＡＳＢ−１６（アミドスルホベタイン−１６，３−［Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（３−パルミトアミドプロピル）アンモニオ］プロパン−１−スルホネート）、ＡＳＢ−Ｃ８フェノール（４−ｎ−オクチルベンゾイルアミド−プロピル−ジメチルアンモニオスルホベタイン）およびＥＭＰＩＧＥＮ  ＢＢ（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ドデシルグリシンベタイン）。これらは全て、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈおよび／またはＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手可能である。
【０３７０】
（実施例９）
凝集体特異的結合試薬のコンフォメーション特異性
本実施例は、ＰＳＲ１およびＰＳＲ１のペプチド類似体であるＡｃ−ＦＫＦＫＫＫのコンフォメーション特異性の特徴決定をする。
【０３７１】
材料および方法
Ａｂ４２凝集体を、以前に記載したようにして調製した。原線維を、Ｓｔｉｎｅら（ＪＢＣ２００３年、２７８巻、１１６１２頁）に従って調製し、グロブロマーを、Ｂａｒｇｈｏｒｎら（Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２００５年９５巻８３４頁）に従って調製し、ＡＤＤＬを、Ｌａｍｂｅｒｔら（ＰＮＡＳ  １９９８年、９５巻６４４８頁）に従って調製し、ＡＳＰＤを、Ｎｏｇｕｃｈｉら（ＪＢＣ  ２００９年２８４巻３２８９５頁）に従って調製した。正常ＣＳＦは、臨床的に特徴決定された認知障害のない患者のＣＳＦ試料からプールした。ＡＤ  ＣＳＦは、臨床的に特徴決定されたＡＤ患者の試料からプールした。アルツハイマー病脳ホモジネート（ＡＤＢＨ）は、臨床的に診断されたＡＤ患者の脳試料を０．２Ｍスクロース（１：１０ｗ／ｖ）中で超音波処理することにより調製した。
【０３７２】
未変性ゲルについて、各試料を４〜２０％勾配ゲルにローディングし、未変性条件下で５時間泳動（ｒｕｎ）し、クーマシー染色（簡単なＢｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎ）で処理した。
【０３７３】
捕捉アッセイ（ミスフォールディングタンパク質アッセイ）のために、アリコートのビーズ（３０ｕｌ）を、９６ウェルプレートのウェルに加えた後に、８０：２０  ＣＳＦ：ＴＢＳＴＴ中の１２５ｕｌの試料を加えた。プレートを密閉し、３７℃にて１時間、振とうしながらインキュベートした。プレートをＴＢＳＴで洗浄し、残存緩衝液を除去した。変性溶液（０．１Ｎ  ＮａＯＨ）を各ウェルに加え、プレートを８０℃まで３０分間、振とうしながら加熱した。プレートをＲＴまで冷却した後に、中和緩衝液（０．１２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ３−０．４％ＴＷ２０）を加え、プレートをＲＴにて軽く振とうした。アッセイは、Ａβについての３重Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＥＬＩＳＡキットを用いて分析した。ビーズから溶出された試料中のＡβを、製造者のプロトコールに従って検出した。
【０３７４】
検出限界（ＬｏＤ）研究について、各凝集体の系列希釈物をＣＳＦに添加し、上記のプロトコールに従ってアッセイした。ＬｏＤは、バックグラウンドレベルの２倍超と定義した。
【０３７５】
ＡＤと正常ＣＳＦとを識別するために、プールした正常ＣＳＦまたはプールしたアルツハイマー病患者ＣＳＦを、上記のプロトコールに従ってアッセイした。
【０３７６】
結果
異なるサイズおよび形状の７つのＡβ種を、結合研究のために選択した。
【０３７７】
表１８  Ａβ種
【０３７８】
【表１８】
2013510297.tif 000070
未変性ゲル分析
未変性ゲル分析を、異なるＡβ種の特徴決定をするために行った（図３８）。試験した凝集体は全て、中程度の均質性を有した。全て、いくらかの量のモノマーを含有した。グロブロマー以外は全て、ゲルに入りこまない大きい物質を有した。グロブロマーは、試験したモデルのうちで最小であることが明らかである。ＡＳＰＤおよびＡＤＤＬは、類似の特性を示した。
【０３７９】
試薬の捕捉特性
ミスフォールディングタンパク質アッセイを用いる捕捉研究は、ＰＳＲ１が、多様な凝集体のコンフォメーションおよびサイズを捕捉できることを示した。全ての凝集体種は、ｆｍｏｌ以下のレベルでＰＳＲ１により捕捉された。
【０３８０】
表１９  凝集体についてのＰＳＲ１のＬｏＤ
【０３８１】
【表１９】
2013510297.tif 000071
ＡＳＲ１およびＡｃ−ＦＫＦＫＫＫは、試験した全ての異なる凝集体種と、類似の結合優先性で普遍的に結合する。ＬｏＤについての正確な数は、ＣＳＦおよび凝集体ロットに依存する。
【０３８２】
表２０  凝集体についての試薬のＬｏＤ
【０３８３】
【表２０】
2013510297.tif 000072
ＬｏＤは、より大きい原線維状物質＞より小さいオリゴマー種＞＞モノマーを捕捉する優先性を示す。このパターンは、これらの種を３ｕｌのＰＳＲ１ビーズおよび１ｎｇ／ｍＬの凝集体を用いて試験した場合に観察される捕捉選択性を反映する。
【０３８４】
表２１  凝集体についての試薬のＬｏＤ
【０３８５】
【表２１】
2013510297.tif 000073
ＡＤと正常ＣＳＦとの識別
ＡＤと正常ＣＳＦとを識別するために有用なものを同定するために、試薬を試験した。図３９を参照されたい。ＰＳＲ１およびＡｃ−ＦＫＦＫＫＫはともに、対応しない正常のプールと比べて陽性のプールしたＡＤ  ＣＳＦにおいて、より高いＡβ４０シグナルを有することが示され、このことは、試薬が、ｉｎ  ｖｉｖｏで、ＡＤ  ＣＳＦに存在するＡβ４０凝集体を捕捉していることを示唆した。Ａｃ−ＦＫＦＫＫＫは、シグナルの最大の変化をもたらす。
【０３８６】
（実施例１０）
分画遠心分離によるＡＤ  ＣＳＦからのＡβ４０オリゴマーの分粒
本実施例では、ＰＳＲ１によりアルツハイマー病ＣＳＦから捕捉された凝集体の物理的特性を特徴決定する。
【０３８７】
材料および方法
ＡＤ  ＣＳＦまたは正常のプールしたＣＳＦ（何も添加していないか、５ｎｇ／ｍＬグロブロマーを添加、または２００ｎＬ／ｍＬ  ＡＤＢＨ（超音波処理ありもしくはなし）を添加）を、１６，０００×ｇにて１０分間または１３４，０００×ｇにて１時間、４℃にて遠心分離した。上清画分およびペレット画分を別々のチューブに入れ（ペレットは、元の試料と同じ容量のＣＳＦ中で再構成した）、ミスフォールディングタンパク質アッセイ（ＭＰＡ）に供した。
【０３８８】
ミスフォールディングタンパク質アッセイ：１００ｕｌの試料を、２５ｕｌの５×ＴＢＳＴＴ緩衝液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％Ｔｗｅｅｎ２０、５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ｐＨ７．５）および３０ｕｌのＰＳＲ１ビーズと３７℃にて１時間インキュベートした。ビーズをＴＢＳＴで６回洗浄した後に、１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４と３０分間インキュベーションし、ＴＢＳＴでさらに洗浄した。Ａベータペプチドを０．１５Ｍ  ＮａＯＨで室温にて３０分間溶出した後に、溶出物を０．１８Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４＋０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０で中和し、製造者の使用説明書に従うＭｅｓｏｓｃａｌｅの３重Ａβイムノアッセイにより検出した。
【０３８９】
結果
既知のサイズの様々な凝集体の挙動を決定して、アルツハイマーのＣＳＦで見出される凝集体についての分子量の参照を得た。凝集体の溶解度は、分子量と線形の関係を必ずしも有さないが（そして凝集体のコンフォメーションに依存する変動性の支配下にある）、これらの研究は、凝集体サイズについての参照のいくらかの枠組みをもたらす。超音波処理していないアルツハイマー病脳ホモジネート（ＡＤＢＨ）からのＡベータ原線維は、１６，０００ｇおよび１３４，０００ｇの両方にてペレットを形成した。これらの凝集体は、ＴＳＫ４０００カラムの空隙容量近くで溶出され、１ＭＤａより大きいとみられる。超音波処理したＡＤＢＨからのいくらかの割合のＡベータ凝集体は、１６，０００ｇにて可溶性であったが、１３４，０００ｇにてペレットを形成した。サイズ排除クロマトグラフィーから、これらの凝集体が約０．５〜１ＭＤａであると見積もられた。グロブロマー（およそ５４ＫＤａであると見積もられる）は、１６，０００ｇおよび１３４，０００ｇの両方で可溶性であった。
【０３９０】
ＡＤ  ＣＳＦにおける内因性Ａβ４０オリゴマーは、１３４，０００ｇにて１時間の遠心分離の後に依然として溶液中にあり、このことは、これらが、超音波処理されたＡＤＢＨ試料で見出される０．５〜１ＭＤａの「中間サイズの」凝集体よりも小さいことがあることを示唆する。これらのデータは、ＡＤ  ＣＳＦで見出されるオリゴマーが、組織において沈着した凝集体（ＡＤＢＨ）と比較した場合に、溶解度に関して異なる挙動を有することを示し、これらのサイズがより小さいことを示唆する。
【０３９１】
（実施例１１）
脾臓ＡＡのマウスにおけるＡＡタンパク質の検出
本実施例は、ＰＳＲ１が、ＡＡアミロイドーシスおよび慢性炎症におけるいくつかの症例において発生する血清アミロイドＡ凝集体と優先的に結合することを示す。
【０３９２】
材料および方法
動物
同系交配８〜１０週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを用いた。全てのマウスは、特定の病原体のない条件下で維持した。飼育および実験プロトコールは、Ｓｗｉｓｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ｌａｗに従い、Ｃａｎｔｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｏｆｆｉｃｅ、Ｚｕｅｒｉｃｈの規則を遵守した。
【０３９３】
アミロイドーシスの誘導
アミロイド増進因子（ＡＥＦ）を、前に記載された［１］ようにしてアミロイド含有肝から抽出し、４つの異なる群のマウスにおいてアミロイド誘導のために用いた。各マウスは、２０ｕｇのタンパク質抽出物を、尾静脈の静脈内注射として受け、全身性炎症を、０．２ｍｌの１％硝酸銀（ＡｇＮＯ３）の随伴する皮下注射により刺激した。さらなる炎症刺激は、第７日、第１４日および第２１日に週１回与えた。マウスを、第５日、第９日、第１６日および第２３日のいくつかの時点で屠殺した。対照マウスは、単回の硝酸銀注射だけを受け、１６時間後に屠殺した。
【０３９４】
組織学
脾臓を、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。アミロイドの存在は、厚さ５ｕｍの切片でコンゴレッド染色した後に［２］調査し、アミロイド量を以下の尺度に従って定量化した：０；なし；１＋微量のアミロイド；２＋少量のアミロイド沈着物；３＋中程度のアミロイド沈着物；４＋大量のアミロイド［１］。
【０３９５】
組織調製
１０％脾臓ホモジネートを、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中で、超音波組織ホモジナイザーを用いて調製した。ホモジネートを２００×ｇにて１分間遠心分離し、上清をＰＳＲ１ビーズベースの捕捉アッセイのために用いた。イムノブロッティング分析のために、ＰＢＳ不溶性組織ペレットを８Ｍ尿素中で２４時間、旋回しながら室温にて可溶化した。
【０３９６】
脾臓ホモジネートからのＡＡ種のＰＳＲ−１ビーズベースの捕捉
ＰＳＲ１をコンジュゲートしたビーズを、１ｍｌのＴＢＳ−ＴＴ（ＴＢＳ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ、１％Ｔｗｅｅｎ２０）で２回洗浄した後に、合計容量１００μｌのＴＢＳ−ＴＴ中で１０％脾臓ホモジネートと３７℃にて１時間、７５０ｒｐｍの振とうの下でインキュベートした。未結合の物質をビーズから、１ｍｌのＴＢＳ−Ｔ（ＴＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄することにより除去した。その後に、ビーズを５０ｕｌのＴＢＳ−Ｔに再懸濁し、捕捉されたタンパク質を、７５ｕｌ変性緩衝液（１Ｍ  ＮａＯＨ  ｐＨ１２．３）で３７℃または８０℃にて１０分間、それぞれ７５０ｒｐｍまたは１２００ｒｐｍの振とうの下で溶出した。その後に、試料を３０ｕｌの１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ４．３で３７℃または８０℃にて１０分間、それぞれ７５０ｒｐｍまたは１２００ｒｐｍの振とうの下で中和した。１５０ｕｌの溶出物をビーズから吸引し、ＳＡＡ／ＡＡタンパク質の存在を、Ｔｒｉｄｅｌｔａ  Ｌｔｄ．からのマウスＳＡＡ  ＥＬＩＳＡを用いるかまたはイムノブロッティングにより分析した。３ｕｌ、６ｕｌおよび９ｕｌのＰＳＲ−１ビーズならびに１ｕｌ、４ｕｌおよび８ｕｌの１０％脾臓ホモジネートならびにそれらの比を試験した。
【０３９７】
イムノブロッティング
試料を９５℃まで５分間加熱した後に、１０〜２０％Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅプレキャストゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により電気泳動し、その後、ニトロセルロースメンブレンにウェットブロッティングにより移した。マウスＳＡＡ／ＡＡタンパク質を検出するために、２つの異なる１次抗体：抗マウスＳＡＡ抗体（１：１０００；Ｔｒｉｄｅｌｔａ  Ｌｔｄ．）およびＧｕｎｉｌｌａ  Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ教授（Ｕｐｐｓａｌａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓｗｅｄｅｎ）から快く提供されたポリクローナル抗マウスＳＡＡ／ＡＡ抗体（１：１０００）を用いた。２次抗体は、それぞれヤギ−抗ラット−ＨＲＰ（１：８０００）およびヤギ−抗ウサギ−ＨＲＰ（１：１００００）であった。タンパク質バンドは、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を用い、ブロットをＳｔｅｌｌａ検出器（Ｒａｙｔｅｓｔ）内で露光することにより視覚化した。
【０３９８】
結果：
ＰＳＲ１被覆ビーズは、ＡＡ関連部分を捕捉できる：
ＰＳＲ１被覆ビーズがＡＡ関連部分を捕捉できるか否かを試験するために、ＭＰＡを、３ｕＬまたは９ｕＬのＰＳＲ１被覆ビーズ（３０ｍｇ／ｍＬ）を用い、脾臓ＡＡのマウス（コンゴレッド染色により組織学的に評価して３＋のスコア、図４１）および対照の未処置マウスからの１ｕＬ、４ｕＬまたは８ｕＬの１０％ｗ／ｖ脾臓ホモジネートを投入物として用いて行った。抗マウスＳＡＡ抗体を用いるビーズ画分、溶出画分およびＰＳＲ１で枯渇させた投入物画分に対するウェスタンブロット分析により、ＡＡ含有試料においてのみ、溶出画分およびビーズ画分において、分子量マーカーの７ｋＤａ成分のものと同様の電気泳動移動度を有する短い断片の存在が明らかになった（図４２ａ〜ｃ）。３ｕＬのＰＳＲ１ビーズを用いて行ったＭＰＡの溶出画分も、マウスＳＡＡサンドイッチＥＬＩＳＡにより試験した。ＳＡＡは、ＡＡ含有試料からの溶出物においてのみ検出できた（図４２ｄ）。
【０３９９】
いくつかの試験チューブでは、捕捉されたＡＡ部分の溶出が最適でなく、ビーズ画分においてもイムノブロット上でシグナルが検出できた（図４２ｃ）。よって、溶出のためのよりストリンジェントな条件（８０℃および１２００ｒｐｍ）を試験した。これらの条件は、ＡＡ捕捉部分の完全な溶出をもたらした（図４３）。循環における全長ＳＡＡのレベルが非常に高いアミロイド陰性であるがＡｇＮＯ３で抗原刺激した動物からの脾臓ホモジネート、または未処置動物からの脾臓ホモジネートをＭＰＡアッセイに供した場合、溶出物においてシグナルは検出されなかった（図４３）。重要なことに、このイムノブロットについて、別の抗マウスＳＡＡ抗体を用いて、アミロイド陽性試料からの溶出物においていくつかのより短いＡＡ断片が除去された。
【０４００】
これらの実験は、ＰＳＲ１被覆ビーズがＡＡ関連部分を捕捉できることを示す。
【０４０１】
ＡＡ凝集体の変性は、ＡＡ関連部分の検出を妨げる：
ＡＡ関連部分のＰＳＲ１捕捉が凝集体に限定されるか否かを試験するために、ＭＰＡを、変性、緩衝および非変性ＡＡ含有試料、ならびに対照ＡｇＮＯ３処置マウスおよび対照未処置マウスからの脾臓ホモジネートについて行った。溶出画分をＥＬＩＳＡにより試験した。ＳＡＡは、非変性または緩衝ＡＡ含有試料からの溶出物においてのみ検出できた（図４４）。これらのデータは、投入物物質の変性が、ＰＳＲ１被覆ビーズによるＡＡ関連部分の捕捉および／またはＰＳＲ１被覆ビーズからのＡＡ関連部分の溶出を妨げることによりＭＰＡに干渉し、ＰＳＲ１ビーズによるそのような部分の捕捉は、試験した条件下で凝集体特異的であることを示す。
【０４０２】
参考文献
１．Ｌｕｎｄｍａｒｋ  Ｋ、Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ  ＧＴ、Ｎｙｓｔｒｏｍ  Ｓ、Ｍｕｒｐｈｙ  ＣＬ、Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ａら（２００２年）Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｉｔｙ  ｏｆ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ  ｂｙ  ａ  ｐｒｉｏｎ−ｌｉｋｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９９巻：６９７９〜６９８４頁
２．Ｐｕｃｈｔｌｅｒ  Ｈ、Ｓｗｅａｔ  Ｆ（１９６５年）Ｃｏｎｇｏ  ｒｅｄ  ａｓ  ａ  ｓｔａｉｎ  ｆｏｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｏｆ  ａｍｙｌｏｉｄ．  Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  １３巻：６９３〜６９４頁  。
【０４０３】
（実施例１２）
アミリン凝集体の検出
本実施例は、ＰＳＲ１が、ＩＩ型糖尿病において発生するアミリン凝集体と優先的に結合することを示す。より具体的には、本実施例は、ＰＳＲ１が、どのようにモノマーよりもアミリン原線維と優先的に結合するか（アミリンはｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製したかまたは膵臓組織から抽出されたかのいずれか）について記載する。
【０４０４】
材料および方法
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏアミリン原線維を、モノマーアミリンペプチドを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）中で１００ｕＭにて再構成し、ＲＴにて３日より長くインキュベートすることにより作製した。１０％膵臓組織ホモジネートを、スクロース溶液中で作製した。試料を、１容積の試料を９容積の６Ｍチオシアン酸グアニジンと合わせ、ＲＴにて少なくとも３０分間インキュベートすることにより変性させた。
【０４０５】
試料中のモノマーアミリンを、Ｌｉｎｃｏヒトアミリン（トータル）ＥＬＩＳＡキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃａｔ♯ＥＺＨＡＴ−５１Ｋ）により検出し、凝集したアミリンを、ＰＳＲ１ビーズを用いるＭＰＡ（ミスフォールディングタンパク質アッセイ）により検出した。ＭＰＡを行うために、未変性または変性した試料（ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルまたは組織）を、緩衝液または正常ヒト血漿に添加し、ＰＳＲ１または陰性対照ビーズに供した。インキュベーションの後に、ビーズを洗浄し、ビーズと結合した凝集したアミリンを溶出し、６Ｍチオシアン酸グアニジンで変性させた。溶出物を、次いで、試料緩衝液で希釈し、上記のＬｉｎｃｏヒトアミリン（トータル）ＥＬＩＳＡキットを用いるＥＬＩＳＡにより検出した。
【０４０６】
結果
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成したアミリン
図４５ＡおよびＢは、ＭＰＡが、緩衝液および血漿の両方においてアミリンｉｎ  ｖｉｔｒｏ原線維を検出するが、モノマーは検出しないことを示す。
【０４０７】
膵臓組織からの内因性アミリン
ＩＩ型糖尿病患者からの膵臓組織は、正常膵臓組織と比較して、高濃度の凝集したアミリンを含有する。しかし、この凝集したアミリンは、試料がモノマー形に変性されない限りはＥＬＩＳＡにより直接検出できない（図４６を参照されたい）。
【０４０８】
ＭＰＡアッセイを行った際、これは、ヒト血漿に添加したＩＩ型糖尿病患者からの膵臓組織において凝集したアミリンを検出した。凝集したアミリンをモノマーに変換する試料の変性は、ＭＰＡによる検出を消失させた（図４７を参照されたい）。
【０４０９】
ＩＩ型糖尿病患者からの膵臓組織における凝集したアミリンの検出は、ＰＳＲ１がアミリン原線維と特異的に結合することによる。図４８は、血漿に添加した同じＩＩ型糖尿病膵臓組織がＰＳＲ１と結合したが、中性グルタチオンまたはＰＳＲ１の負に荷電したバージョンであるペプトイド（５Ｌ）のいずれかを有する対照ビーズとは結合しなかったことを示す。
【０４１０】
（実施例１３）
アルファ−シヌクレインの検出
本実施例は、ＰＳＲ１が、パーキンソン病、ならびにゴーシェ病、多系統萎縮症およびレビー小体型認知症のようなその他のシヌクレイン病で発生するアルファ−シヌクレイン凝集体と優先的に結合することを示す。
【０４１１】
材料および方法
ＥＬＩＳＡ
アミリン原線維を、Ｊ．  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．（１９９９年）２７４巻、２８号、１９５０９〜１９５１２頁に報告されるようにして調製した。原線維を変性するために、試料を５．４Ｍチオシアン酸グアニジンで室温にて３０分間処理した。試料を、次いで、示される濃度まで希釈し、アルファシヌクレインをサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ♯ＫＨＢ００６１）により、製造者の使用説明書に従って検出した。
【０４１２】
ミスフォールディングタンパク質アッセイ
凝集したアルファシヌクレインについてのＰＳＲ１ビーズの特異性を、３ｕｌのＰＳＲ１ビーズを原線維状アルファ−シヌクレインと、化学変性剤（室温にて３０分間の５．４Ｍチオシアン酸グアニジン）での前処理ありまたはなしでインキュベーションすることにより試験した。アルファシヌクレインをＴＢＳＴＴ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％Ｔｗｅｅｎ２０）中の８０％ＣＳＦまたは血漿、１２５ｕｌで示される濃度に希釈した。試料を３７℃および５５０ｒｐｍにて１時間インキュベートした後に、ＴＢＳ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０緩衝液で洗浄した。結合したアルファシヌクレインを、ビーズから、４ｕｌの６Ｍチオシアン酸グアニジン（室温にて３０分間）を用いて溶出し、２４６ｕｌのＥＬＩＳＡ希釈緩衝液で希釈し、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ♯ＫＨＢ００６１）により検出した。ビーズへのアルファシヌクレイン原線維の非特異的結合も、対照ビーズ（グルタチオンコンジュゲートＤｙｎａｌビーズ）を用いて試験した。
【０４１３】
結果
ＰＳＲ１ビーズは、アルファシヌクレイン原線維と結合する
アルファシヌクレイン（ａＳｙｎ）原線維は、これらを原線維内でマスクされている抗体エピトープを露出させる変性剤を用いて前処理しない限り、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ♯ＫＨＢ００６１）により検出されなかった。グアニジン処理したアルファシヌクレイン原線維だけを検出でき、このことは、変性が、凝集体の構成要素であるモノマーの最適な検出のために必要であることを示唆した。低濃度の凝集体を含有する大容積の試料の変性は困難であるので、ＰＳＲ１は、これらの凝集体を捕捉して富化するために有用なツールである。図４９を参照されたい。
【０４１４】
ミスフォールディングタンパク質アッセイ（ＭＰＡ）で用いたＰＳＲ１ビーズは、グルタチオン分子とコンジュゲートした対照ビーズ（ＣＴＲＬ）と比較して、ＣＳＦまたは血漿中に希釈したアルファシヌクレイン（ａＳｙｎ）原線維と特異的に結合した。図５０を参照されたい。
【０４１５】
ミスフォールディングタンパク質アッセイで用いたＰＳＲ１ビーズは、ＣＳＦまたは血漿中に希釈したアルファシヌクレイン原線維（未変性ａＳｙｎ原線維）と優先的に結合したが、原線維を化学変性剤で前処理することにより作製されたアルファシヌクレインモノマー（変性ａＳｙｎ）とは優先的に結合しなかった。ＰＳＲ１は、過剰のａＳｙｎモノマータンパク質を含有する生物学的マトリクスからの低レベルのａＳｙｎ原線維を捕捉して富化でき、このことは、凝集したａＳｙｎに対する著しい選択性を示した。図５１を参照されたい。
【０４１６】
アルファ−シヌクレイン原線維のためのＭＰＡアッセイ溶出条件の最適化
ＭＰＡアッセイにおけるアルファ−シヌクレイン原線維の検出のためのＰＳＲ１ビーズの使用についての条件を最適化するために、異なる溶出条件を試験した：１）６Ｍ  ＧｄｎＳＣＮを３０分間、対して２）０．１０Ｎ  ＮａＯＨを１０分間。１０分間の０．１Ｎ  ＮａＯＨ溶出は、チオシアン酸グアニジン溶出よりも良好に機能した。図５２を参照されたい。
【０４１７】
（実施例１４）
ＰＳＲ１−プリオンのマウス感染力
本実施例は、ＰＳＲ１が、プリオンタンパク質の感染性の形と優先的に結合することを示す。
【０４１８】
材料および方法
ハムスター血漿の調製
１ヶ月齢の離乳段階のゴールデンシリアンハムスターに、１０７のＬＤ５０感染単位と見積もられる１００μｌの２６３Ｋ感染１％ハムスター脳ホモジネート（ｗ／ｖ）（ＫｉｍｂｅｒｌｉｎおよびＷａｌｋｅｒ、１９８６年）、または１００μｌの１％非感染ハムスター脳ホモジネートを腹腔内接種した。その後、接種後第０日、３０日、５０日および８０日に、ハムスターを屠殺し、血液を、ＥＤＴＡ抗凝固剤の存在下で、心臓穿刺により、採集した。運動失調、毛づくろいの低下および食欲の喪失の臨床徴候が現れた際にも、動物を屠殺し、症状性の段階での試料を採取した。個別の血液試料を９５０×ｇにて１０分間遠心分離し、上清画分中の血漿を別のチューブに移し、−８０℃にて凍結した。
【０４１９】
ＰｒＰＳｃのビーズベースの捕捉
感度アッセイのために、ＰＢＳ中の２６３Ｋ感染１０％脳ホモジネートの１０倍系列希釈３０μｌを、Ｔｇ（ＳＨａＰｒＰ）マウスに脳内接種した（群＝４〜８）（Ｓｃｏｔｔら、１９８９年）。
【０４２０】
ＰＳＲ１捕捉アッセイのために、１４３ｄｐｉおよび１５４ｄｐｉにて屠殺した１１匹の症状性ハムスターからの血漿をプール１に、１０４から１０６ｄｐｉに屠殺した１４匹の症状性ハムスターからの血漿をプール２に、５０ｄｐｉでの２０匹の症状が出る前のハムスターからの血漿をプール３に、そして１１７〜１１８ｄｐｉでの１５匹の症状性ハムスターからの血漿をプール４に合わせた。２１μｌのＰＳＲ１コンジュゲートビーズ（（Ｌａｕら、２００７年）；Ｇａｏら、２０１０年原稿提出中）を１ｍｌのＰＢＳ（８ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で５回洗浄した後に、５００μｌのプールしたハムスター血漿と４℃にて１晩、振とう器でインキュベートした。
【０４２１】
未結合の物質を、ビーズから、１ｍｌのＰＢＳまたはＴＢＳＴＴで５回洗浄することにより除去した。ビーズを、６０μｌまたは１２０μｌのＰＢＳに再懸濁し、それぞれ３０μｌの再懸濁したビーズを、１群に少なくとも４匹のマウスのＴｇ（ＳＨａＰｒＰ）マウスに脳内接種した。
【０４２２】
マウスを２日おきにモニタリングし、ＴＳＥ（伝染性海綿状脳症）を、運動失調、よろめき、および後肢不全麻痺を含む臨床基準に従って診断した。終末期疾患の開始時に、Ｔｇ（ＳＨａＰｒＰ）マウスを屠殺した。マウスを従来の条件下で維持し、全ての実験は、Ｚｕｅｒｉｃｈの州の動物虐待防止ガイドラインに従って行った。
【０４２３】
病理組織学および免疫組織化学染色
厚さ２μｍの切片を、正に荷電したシラン処理ガラススライド上に切断し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色したか、またはＰｒＰ（ＳＡＦ８４）、星状細胞（ＧＦＡＰ）についての抗体を用いて免疫染色した。ＰｒＰ染色のために、切片を脱パラフィンし、９８％ギ酸中で６分間インキュベートし、次いで蒸留水で５分間洗浄した。
【０４２４】
切片を高圧釜内で１００℃に、クエン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）中で加熱し、室温まで３分間冷却し、蒸留水で５分間洗浄した。免疫組織化学染色を、自動化ＮＥＸＥＳ免疫組織化学染色装置（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）において、ＩＶＩＥＷ  ＤＡＢ検出キット（Ｖｅｎｔａｎａ）を用いて行った。プロテアーゼ１（Ｖｅｎｔａｎａ）と１６分間インキュベートした後に、切片を抗ＰｒＰ  ＳＡＦ−８４（ＳＰＩ  ｂｉｏ；１：２００）と３２分間インキュベートした。切片を、ヘマトキシリンで対比染色した。星状細胞についてのＧＦＡＰ免疫組織化学（ウサギ抗マウスＧＦＡＰポリクローナル抗体１：１０００で２４分間；ＤＡＫＯ）を同様にして行ったが、抗原性賦活化は、ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ＝８．０）中で１００℃に加熱することにより行った。
【０４２５】
ヒストブロット分析を、Ｔａｒａｂｏｕｌｏｓら、１９９２年に従う改変した標準的なプロトコールを用いて行った。厚さ１０μｍの凍結切片をガラススライド上に載せ、直ちにニトロセルロースメンブレン（Ｐｒｏｔｒａｎ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）に押しつけ、溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．８）に浸し、風乾した。タンパク質を移した後に、切片をＴＢＳＴ中で１時間再水和し、その後、１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．１％Ｂｒｉｊ３５を含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．８中の２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬにて、３７℃にて４時間、プロテイナーゼＫで消化した。メンブレンをＴＢＳＴで３回洗浄した後に、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８中の３Ｍチオシアン酸グアニジンでの変性ステップを室温にて１０分間行った。メンブレンを洗浄し、５％脱脂乳（ＴＢＳＴ中）でブロッキングし、抗ＰｒＰ抗体ＰＯＭ−１（球状ドメイン内のエピトープ、ａａ１２１〜２３１）、１：１００００と４℃にて１晩インキュベートした（Ｐｏｌｙｍｅｎｉｄｏｕら、２００８年）。ブロットを、再び洗浄し、アルカリホスファターゼコンジュゲートヤギ抗マウス抗体を加えた（ＤＡＫＯ、１：２０００）。ＴＢＳＴおよびＢ３緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．５）での別の洗浄ステップの後に、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて４５分間の視覚化ステップを行った。発色ステップを蒸留水で停止した。ブロットを風乾し、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＳＺＸ１２双眼顕微鏡およびＯｌｙｍｐｕｓカメラで写真を撮影した。
【０４２６】
ウェスタンブロット
１０％脳ホモジネートを、０．３２Ｍスクロース中で、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ２４（Ｂｅｒｔｉｎ）を用いて調製した。５０〜９０μｇタンパク質の抽出物を、５０μｇ／ｍＬプロテイナーゼ−Ｋで、ＤＯＣ／ＮＰ−４０  ０．５％中で、３７℃にて４５分間消化した。反応を、３μｌのｃｏｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤カクテルおよび８μｌのドデシルラウリル硫酸（ＬＤＳ）ベースの試料緩衝液を加えることにより停止した。試料を９５℃まで５分間加熱した後に、１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプレキャストゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により電気泳動し、その後、ニトロセルロースメンブレンにウェットブロッティングにより移した。タンパク質を、抗ＰｒＰ  ＰＯＭ１抗体（１：１００００）と４℃にて１晩インキュベートすることにより検出した。２次検出のために、ＨＲＰコンジュゲート抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。シグナルを、ＥＣＬ検出キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて視覚化した。
【０４２７】
結果
Ｔｇ（ＳＨａＰｒＰ）における２６３Ｋハムスター株の力価を決定するための感度アッセイ
血漿からＰＳＲ１ビーズにより捕捉されたプリオンの感染力についての標準曲線を作製するために、本発明者は、１０（ｗｔ／ｖｏｌ）％  ２６３Ｋハムスター脳ホモジネートから得られた１０倍系列希釈を、エンドポイントフォーマットで、ハムスタープリオンタンパク質を３２倍過剰発現する（Ｓｃｏｔｔら、１９８９年）Ｔｇ（ＳＨａＰｒＰ）マウスに脳内接種した（図５３、表２２）。１０−２〜１０−８の範囲の希釈物を接種されたマウスは、４０〜９８日間の平均インキュベーション時間の後に、臨床徴候を生じた。エンドポイントにまだ到達していないので、完全な標準曲線を得るためにさらなる希釈を行う。
【０４２８】
表２２：Ｔｇ（ＳＨａＰｒＰ）における２６３Ｋ接種材料のエンドポイント力価決定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）のまとめ
【０４２９】
【表２２】
2013510297.tif 000074
ａ希釈は、１０％脳ホモジネートから開始した。
【０４３０】
Ｔｇ（ＳＨａＰｒＰ）マウスにおけるプリオン感染ハムスターからの血漿被覆ＰＳＲ１ビーズを用いるバイオアッセイ
ＰＳＲ１ビーズを、２６３Ｋプリオン感染ハムスターの症状が出る前の群または症状性群のいずれかからプールした血漿試料とインキュベートし（表２３）、Ｔｇ（ＳＨａＰｒＰ）マウスにｉ．ｃ．接種した。症状性ハムスターからの血漿プールのビーズを接種したマウスは、接種後７４〜９４日間の平均インキュベーション時間の後に疾患を発生した（図５４、表２３）。症状が出る前のハムスターから得られたビーズを接種したマウスは、接種後５６および８５日後に疾患を発生した（図５４、表２３）。観察されたインキュベーション時間は、３０μｌ  ２６３Ｋハムスター脳ホモジネートの１０−７〜１０−８の感染性希釈物と相関する。
【０４３１】
臨床的に疾患を有するマウスにおけるプリオン病の発生は、病理組織学的および免疫組織化学的分析（図５４）、ならびにヒストブロットおよびウェスタンブロット分析におけるプロテイナーゼＫ耐性物質の検出（図５５）により明示された。
【０４３２】
これらのデータは、ＰＳＲ１ビーズが、プリオン感染血液試料から、感染力のあるプリオンを捕捉し、これを高い効率でＴｇ（ＳＨａＰｒＰ）マウスに伝達することを示す。
【０４３３】
表２３：血漿被覆ＰＳＲ１ビーズを接種したＴｇ（ＳＨａＰｒＰ）マウスのバイオアッセイのまとめ
【０４３４】
【表２３】
2013510297.tif 000075
参考文献
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【図４１】
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【図４４】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３Ａ】
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【図５３Ｂ】
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【図５４】
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【図５５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年6月29日(2012.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のオリゴマーの存在を検出するための方法であって、前記方法は：
（ａ）オリゴマーを含有する疑いがある試料を提供するステップであって、前記試料が、オリゴマー以外の凝集体を欠く、ステップ；またはオリゴマーを含有する疑いがある試料を提供し、そして前記試料からオリゴマー以外の凝集体を除去するステップ；
（ｂ）前記試料と、凝集体特異的結合試薬とを、前記試薬と、存在するならば前記オリゴマーとが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップ；ならびに
（ｃ）前記試料中の、もしあるならばオリゴマーの存在を、オリゴマーと前記凝集体特異的結合試薬との結合により検出するステップ
を含み、
前記凝集体特異的結合試薬が、
前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、
１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、
前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、
方法。
【請求項２】
前記方法が：
オリゴマーを含有する疑いがある試料と、凝集体特異的結合試薬とを、前記試薬と、存在するならば前記オリゴマーとが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、
前記複合体を第２試薬と接触させるステップであって、前記試薬が、オリゴマーまたはオリゴマー以外の凝集体のいずれかと優先的に結合する、ステップと、
前記試料中の、もしあるならばオリゴマーの存在を、オリゴマーと前記第２試薬との結合または結合の欠如により検出するステップと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
オリゴマー以外の前記凝集体が、原線維を含むか、または前記オリゴマーが、可溶性である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
試料中の凝集体の存在を検出するための方法であって、前記方法は：
（ａ）凝集体を含有する疑いがある試料と、凝集体特異的結合試薬とを、前記試薬と、存在するならば前記凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、
（ｂ）前記試料中の、もしあるならば凝集体の存在を、凝集体と前記凝集体特異的結合試薬との結合により検出するステップと
を含み、
前記凝集体特異的結合試薬が、
前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、
１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、
前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、
方法。
【請求項５】
前記方法が、ステップ（ａ）の後に、以下の追加のステップ：
（ｉ）未結合の試料を除去するステップと、
（ｉｉ）前記凝集体を、前記複合体から解離させて、解離凝集体を提供するステップと、
（ｉｉｉ）前記解離凝集体と、第１コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬とを、結合して第２複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、
を含み、ここで、
前記試料中の凝集体の存在を検出する前記ステップが、前記第２複合体の形成を検出することによって実行され
場合により、前記凝集体が、Ａβタンパク質を含み、前記コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬が、抗Ａβ抗体である、
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ａ）が：
凝集体を含有する疑いがある試料と、コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬とを、前記コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬と、存在するならば前記凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させることと、
未結合の試料を除去することと、
前記複合体と、検出可能な標識を含む凝集体特異的結合試薬とを、前記凝集体特異的結合試薬と前記凝集体との結合を可能にする条件下で接触させることと、
を含む、
請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記方法が、ステップ（ａ）の前に、以下の追加のステップ：
凝集体特異的結合試薬を含む固体支持体を提供するステップと、
前記固体支持体を、検出可能に標識されたリガンドと組み合わせるステップであって、前記検出可能に標識されたリガンドに対する前記凝集体特異的結合試薬の結合のアビディティが、前記凝集体に対する前記試薬の結合のアビディティよりも弱い、ステップと、
を含み、ここで、
ステップ（ａ）が、凝集体を含有する疑いがある試料と、前記固体支持体とを、前記試料中に存在する場合に前記凝集体が前記試薬と結合して、前記リガンドを置き換えることを可能にする条件下で組み合わせることを含み、そして
ステップ（ｂ）が、前記凝集体と前記凝集体特異的結合試薬との間で形成された複合体を検出することを含む、
請求項４に記載の方法。
【請求項８】
ポリペプチド試料中の凝集体の量を低減するための方法であって、前記方法は：
凝集体を含有する疑いがあるポリペプチド試料と、請求項４に記載の凝集体特異的結合試薬とを、前記試薬と、存在するならば前記凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、
未結合のポリペプチド試料を回収するステップと
を含む、方法。
【請求項９】
前記凝集体特異的結合試薬が、
１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約９０ｎｍｏｌ；
１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１２０ｎｍｏｌ；
１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５００ｎｍｏｌ；
１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１０００ｎｍｏｌ；または
１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌ
の電荷密度にて固体支持体に付着しており、かつ／または
前記凝集体または病原性凝集体が、可溶性である、
請求項４〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記試料が、体組織または体液を含む生物学的試料であり、好ましくは、前記生物学的試料が、全血、血液分画物、血液成分、血漿、血小板、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、骨髄、尿、涙、乳汁、リンパ液、器官組織、脳組織、神経系組織、筋肉組織、非神経系組織、生検材料、剖検材料、脂肪生検材料、細胞、大便、胎盤、脾臓組織、リンパ組織、膵臓組織、気管支肺胞洗浄液または滑液を含み、かつ／または前記試料が、ポリペプチドを含む、請求項１〜７または９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記凝集体特異的結合試薬が、前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約２の正の、少なくとも約３の正の、少なくとも約４の正の、少なくとも約５の正の、少なくとも約６の正のまたは少なくとも約７の正の正味電荷を有する、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記凝集体特異的結合試薬が、
モノマーに対する結合の親和性および／またはアビディティより少なくとも約２倍高い、凝集体に対する結合の親和性および／またはアビディティを有し；かつ／あるいは
前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨより少なくとも約１ｐＨ単位高いｐＫａを有する少なくとも１つの正に荷電した官能基を含み、
好ましくは、前記少なくとも１つの正に荷電した官能基が、前記凝集体特異的結合試薬の全ての官能基のうちで前記固体支持体に最も近い、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記凝集体特異的結合試薬が、疎水性官能基を含み、場合により前記疎水性官能基が、芳香族疎水性官能基または脂肪族疎水性官能基である、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記凝集体特異的結合試薬が、
（ａ）１つだけの正に荷電した官能基および少なくとも１つの疎水性官能基；
（ｂ）少なくとも１つの正に荷電した官能基および１つだけの疎水性官能基；または
（ｃ）１つだけの正に荷電した官能基および１つだけの疎水性官能基
を含み、かつ／あるいは
前記凝集体特異的結合試薬が、Ｌ−異性体である少なくとも１つのアミノ酸またはＤ−異性体である少なくとも１つのアミノ酸を含む、
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記凝集体が、病原性であり、そして好ましくは：
（ａ）前記凝集体が、子かん前症、タウオパチー、ＴＤＰ−４３タンパク質症、セルピン病またはアミロイド疾患と関連する凝集体であり、そしてより好ましくは、子かん前症と関連する前記凝集体が、アンチトリプシンを含む；あるいは
（ｂ）前記凝集体が、アミロイド−ベータ（Ａβ）タンパク質、タウタンパク質、アミリン、アミロイドＡタンパク質およびアルファ−シヌクレインからなる群より選択される凝集体を含み；
ここで、場合により、前記アミロイド疾患が、全身性アミロイドーシス、ＡＡアミロイドーシス、シヌクレイン病、アルツハイマー病、ＡＬＳ、免疫グロブリン関連疾患、血清アミロイドＡ関連疾患、ハンチントン病、パーキンソン病、ＩＩ型糖尿病、透析アミロイドーシスおよび脳のアミロイドアンギオパチーからなる群より選択される、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記凝集体特異的結合試薬が、Ｌ−異性体であるかもしくはＤ−異性体である少なくとも１つのアミノ酸を含み；かつ／あるいは前記凝集体特異的結合試薬が、リシンおよびアルギニンからなる群より選択される天然アミノ酸；ならびに／またはオルニチン、メチルリシン、ジアミノ酪酸、ホモアルギニンおよび４−アミノメチルフェニルアラニンからなる群より選択される非天然アミノ酸を含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記凝集体特異的結合試薬が、以下：
（ａ）以下：
【化４１ａ】
2013510297.tif 000160
からなる群より選択されるペプチド；
（ｂ）Ｆ−ｆｄｂ−Ｆ−ｆｄｂ−ｆｄｂ−ｆｄｂ（配列番号５３）、ＦｏＦｏｏｏ（配列番号５４）、モノＢｏｃ−エチレンジアミン＋ＢｒＣＨ２ＣＯ−ＫＫＦＫＦ（配列番号５５）、トリエチルアミン＋ＢｒＣＨ２ＣＯ−ＫＫＦＫＦ（配列番号５６）、テトラメチルエチレンジアミン＋ＢｒＣＨ２ＣＯ−ＫＫＦＫＦ（配列番号５７）および配列番号５８〜６６からなる群より選択されるペプチド；
（ｃ）以下：
【化４２ａ】
2013510297.tif 000161
からなる群より選択されるペプチド；または
（ｄ）以下：
【化４３ａ】
2013510297.tif 000162
【化４４ａ】
2013510297.tif 000163
【化４５ａ】
2013510297.tif 000164
【化４６ａ】
2013510297.tif 000165
からなる群より選択されるペプトイドであって、ここで、式中、ＲおよびＲ’は任意の基である、ペプトイド；
（ｅ）配列番号９〜１４および９１〜９６からなる群より選択されるペプトイド；または
（ｆ）
【化４７ａ】
2013510297.tif 000166
を含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記凝集体特異的結合試薬が、
【化４８ａ】
2013510297.tif 000167
のデンドロンを含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記凝集体特異的結合試薬が、以下：
（ａ）反復モチーフ
（ｂ）前記凝集体の負に荷電した基の間隔と同じ間隔を有する正に荷電した基；および／または
（ｃ）配列番号１または配列番号１５
を含む、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
（ａ）前記凝集体が、アミリンを含み、前記凝集体特異的結合試薬が、配列番号１５を含み、前記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約８０００ｎｍｏｌ〜約１５０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している；
（ｂ）前記凝集体が、アルファ−シヌクレインを含み、前記凝集体特異的結合試薬が、配列番号１５を含み、前記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約８０００ｎｍｏｌ〜約１５０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している；
（ｃ）前記凝集体が、アミロイドＡタンパク質を含み、前記凝集体特異的結合試薬が、配列番号１５を含み、前記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約８０００ｎｍｏｌ〜約１５０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している、請求項４〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記凝集体がＡβを含み、そして前記第１コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬が固体支持体と連結された第１抗Ａβ抗体であり、そして前記第２複合体の形成を検出することには、検出可能に標識された第２抗Ａβ抗体が使用され、場合により、前記凝集体特異的結合試薬が、以下：
（ａ）以下：
【化５７ａ】
2013510297.tif 000168
【化５８ａ】
2013510297.tif 000169
【化５９ａ】
2013510297.tif 000170
からなる群より選択されるペプトイドであって、ここで式中、ＲおよびＲ’は、任意の基である、ペプトイド；または
（ｂ）以下：
【化６０ａ】
2013510297.tif 000171
および配列番号５３、５５、５６および５８〜６６からなる群より選択されるペプチドを含む、請求項５に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２００９年１１月４日に出願された米国仮出願第６１／２５８，１８８号および２００９年１１月３０日に出願された米国仮出願第６１／２６５，３４０号への優先権を主張する。これらの出願は、それらの全体が参考として本明細書に援用される。
この発明は、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ＆  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．と米国エネルギー省に関連して運営されているＴＨＥ  ＲＥＧＥＮＴＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＯＦ  ＣＡＬＩＦＯＲＮＩＡ  ＥＲＮＥＳＴ  ＯＲＬＡＮＤＯ  ＬＡＷＲＥＮＣＥ  ＢＥＲＫＥＬＥＹ  ＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹとの間で、ＳＴＥＶＥＮＳＯＮ−ＷＹＤＬＥＲ（１５  ＵＳＣ  ３７１０）ＣＯＯＰＥＲＡＴＩＶＥ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＡＮＤ  ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ  ＡＧＲＥＥＭＥＮＴ  （「ＣＲＡＤＡ」）第ＬＢ０７００４１９１号の下でなされた。米国政府は、この発明に一定の権利を有する。
タンパク質のミスフォールディングは、細胞において通常発生することである。しかし、ミスフォールディングされたタンパク質は自己会合する傾向にあり、これは、様々なサイズおよび構造のタンパク質凝集体をもたらす。ミスフォールディングされたタンパク質の存続は毒性の凝集体を導き得るので、細胞は、細胞におけるミスフォールディングされたタンパク質の量を低減するための経路および機構を有する。ミスフォールディングされたタンパク質中間体は、中間体の正しいフォールディングを支援する分子シャペロンにより認識される。ミスフォールディングされたタンパク質がシャペロンによる修正を逃れた場合、ユビキチン−プロテオソーム経路が、通常、これらを分解する。
【０００２】
ミスフォールディングされたタンパク質の蓄積は、多様な疾患と関連する。タンパク質コンフォメーション疾患は、正常タンパク質から病原性配座異性体への異常なコンフォメーション転換から生じる伝染性海綿状脳症、アルツハイマー病、ＡＬＳおよび糖尿病のような多様な臨床的に無関係の疾患を含む。この転換は、次いで、病原性配座異性体から、オリゴマーのような小さい凝集体または組織沈着をもたらす原線維のような大きい凝集体への自己会合を導くことができ、周囲の組織の損傷を導くと仮定されている。
【０００３】
生体被験体および生体被験体から得られた試料におけるコンフォメーション疾患タンパク質の凝集体の検出は、困難であることが示されている。生体患者における凝集体の存在を確認するための現在の技術は、洗練されておらず、侵襲性である。例えば、病理組織学的検査は、被験体にとって危険性がある生検を要求する。病理組織学は、本質的に、試料採取の誤りを生じやすい。なぜなら、病変および凝集した病原性配座異性体の沈着は、生検材料が採取される領域によっては見逃されることがあるからである。つまり、被験体の死亡前でのこれらの状態に対する確定診断および対症療法は、実質的にまだ対処されていない難題である。
【０００４】
アミロイド−ベータタンパク質（Ａβ）凝集体、主にＡβ１−４０（Ａβ４０）および１−４２（Ａβ４２）の沈着は、アルツハイマー病（ＡＤ）と徹底的に関連付けられており、この疾患の優れた標準マーカーであるとみなされている。しかし、ＡＤについての唯一の確定的試験は、死後の脳試料からの原線維状Ａβ凝集体のプラークの免疫組織化学的染色である。現在、ＡＤについてのＦＤＡ承認済み死亡前診断試験は存在しない。血漿またはＣＳＦ試料を、死亡前試験に用いることができる。いくつかの死亡前ＡＤ試験は、脳脊髄液（ＣＳＦ）に焦点を当てており、可溶性のモノマーＡβ４２を定量化することを試みている。しかし、このバイオマーカーは、ＡＤの間接的な測定値として働くだけである。
【０００５】
最近の文献は、Ａβの小さく可溶性で非原線維状オリゴマーの種が、アルツハイマー病表現型に直接寄与する神経毒性因子であるようであることを示唆している（非特許文献１；非特許文献２）。さらに、Ａβ４２に対して産生された抗体を用いて、Ａβオリゴマー種のレベルの上昇が、アルツハイマー病の患者から採取された脳脊髄液（ＣＳＦ）において、健常な対照の被験体から採取されたＣＳＦと比較して見出された（非特許文献３）。しかし、現在まで、オリゴマーと結合できる小分子は報告されていない。
【０００６】
つまり、ＣＳＦまたは血漿のようなその他の体液から直接、凝集したＡβを特異的に検出できる試験は、大きな利点を有する。可溶性Ａβオリゴマーのような凝集体の早期の検出は、アルツハイマー病についてのより迅速で、より効率的な診断と、潜在的な療法の評価とを可能にする。
【０００７】
体液の試料から直接、その他のコンフォメーション疾患タンパク質の病原性凝集体を検出できる試験も望まれている。なぜなら、これらも、これらのコンフォメーション疾患についてのより迅速でより早い診断と、潜在的な療法の評価とを可能にするからである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈｏｓｈｉら、ＰＮＡＳ、２００３年、１００巻、６３７０頁
【非特許文献２】Ｌａｍｂｅｒｔら、ＰＮＡＳ、１９９８年、９５巻、６４４８頁
【非特許文献３】Ｇｅｏｒｇａｎｏｐｏｕｌｏｕら、ＰＮＡＳ、２００５年、１０２巻、２２７３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
さらに、製造されたポリペプチドの品質管理も、凝集体と特異的に結合する試薬を用いることで利益を受ける。組換えインスリンまたは治療上の抗体のようなポリペプチドは、通常、高レベルで生成されるので、凝集体を形成する傾向にある。つまり、所望のポリペプチドの調製物から凝集体を除くために凝集体と特異的に結合できる試薬に対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書に記載される発明は、凝集体特異的結合試薬を用いて試料中の凝集体の存在を検出する方法を提供することにより、これらの必要性を満たす。好ましい実施形態では、この方法は、オリゴマーの存在を検出する。
【００１１】
つまり、一態様は、凝集体を含有する疑いがある試料を、凝集体特異的結合試薬と接触させるステップであって、前記試薬と、存在するならば前記凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、前記試料中の、もしあるならば凝集体の存在を、凝集体と前記凝集体特異的結合試薬との結合により検出するステップとを含み、前記凝集体特異的結合試薬が、前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、試料中の凝集体の存在を検出する方法を含む。
【００１２】
別の態様は、凝集体を含有する疑いがある試料を、凝集体特異的結合試薬と接触させるステップであって、前記試薬と、存在するならば前記凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、前記複合体を、コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬と接触させるステップであって、結合を可能にする条件下で接触させるステップと、前記試料中の、もしあるならば凝集体の存在を、凝集体と前記コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬との結合により検出するステップとを含み、前記凝集体特異的結合試薬が、前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、試料中の凝集体の存在を検出する方法を含む。あるいくつかの実施形態では、方法は、前記複合体を形成した後に、未結合の試料を除去するステップをさらに含む。あるいくつかの実施形態では、コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬は、抗体である。好ましい実施形態では、凝集体は、Ａβタンパク質を含有し、前記コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬が、抗Ａβ抗体である。
【００１３】
さらに別の態様は、凝集体を含有する疑いがある試料を、凝集体特異的結合試薬と接触させるステップであって、前記試薬と、存在するならば前記凝集体とが結合して第１複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、未結合の試料を除去するステップと、前記凝集体を、前記第１複合体から解離させて、解離凝集体を提供するステップと、前記解離凝集体を、第１コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬と接触させるステップであって、結合して第２複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、前記試料中の、もしあるならば凝集体の存在を、前記第２複合体の形成を検出することにより検出するステップとを含み、前記凝集体特異的結合試薬が、前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、試料中の凝集体の存在を検出する方法を含む。あるいくつかの実施形態では、前記第２複合体の形成は、検出可能に標識された第２コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬を用いて検出される。あるいくつかの実施形態では、第１コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬は、固体支持体に連結されている。あるいくつかの実施形態では、凝集体は、前記第１複合体をチオシアン酸グアニジンに曝露すること、または前記複合体を高ｐＨまたは低ｐＨに曝露することにより、前記第１複合体から解離される。好ましい実施形態では、凝集体は、Ａβタンパク質を含み、前記コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬が、抗Ａβ抗体である。
【００１４】
別の態様は、凝集体を含有する疑いがある試料を、コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬と接触させるステップであって、前記試薬と、存在するならば前記凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、未結合の試料を除去するステップと、前記複合体を、検出可能な標識を含む凝集体特異的結合試薬と接触させるステップであって、前記試薬と前記凝集体との結合を可能にする条件下で接触させるステップと、前記試料中の、もしあるならば凝集体の存在を、凝集体と前記凝集体特異的結合試薬との結合により検出するステップとを含み、前記凝集体特異的結合試薬が、前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、試料中の凝集体の存在を検出する方法を提供する。あるいくつかの実施形態では、コンフォメーションタンパク質特異的タンパク質は、固体支持体と連結されている。
【００１５】
さらに別の態様は、凝集体特異的結合試薬を含有する固体支持体を提供するステップと、前記固体支持体を、検出可能に標識されたリガンドと組み合わせるステップであって、前記凝集体特異的結合試薬の前記検出可能に標識されたリガンドと結合するアビディティが、前記試薬の前記凝集体と結合するアビディティより弱いステップと、凝集体を含有する疑いがある試料を、前記固体支持体と組み合わせるステップであって、前記試料中に存在する場合に前記凝集体が前記試薬と結合して、前記リガンドを置き換えることを可能にする条件下で組み合わせるステップと、前記凝集体と前記凝集体特異的結合試薬との間で形成された複合体を検出するステップとを含み、前記凝集体特異的結合試薬が、前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、試料中の凝集体の存在を検出する方法を提供する。
【００１６】
別の態様は、凝集体を含有する疑いがあるポリペプチド試料を、凝集体特異的結合試薬と接触させるステップであって、前記試薬と、存在するならば前記凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、未結合のポリペプチド試料を収集するステップとを含み、前記凝集体特異的結合試薬が、前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、ポリペプチド試料中の凝集体の量を低減する方法を提供する。
【００１７】
さらに別の態様は、凝集体を含有する疑いがある試料を、凝集体特異的結合試薬と接触させるステップであって、前記試薬と、存在するならば前記凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、前記試料中で、凝集体ともしあるならばモノマーとを、凝集体と前記凝集体特異的結合試薬との結合により識別するステップとを含み、前記凝集体特異的結合試薬が、前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、試料中の凝集体とモノマーとを識別する方法を提供する。
【００１８】
別の態様は、コンフォメーション疾患を有する疑いがある被験体からの生物学的試料を、凝集体特異的結合試薬と接触させるステップであって、前記試薬と、存在するならば病原性凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、前記生物学的試料中の、もしあるならば病原性凝集体の存在を、凝集体と前記凝集体特異的結合試薬との結合により検出するステップと、前記被験体が、前記生物学的試料中の病原性凝集体の量がコンフォメーション疾患を有さない被験体からの試料中の凝集体の量より高い場合、コンフォメーション疾患を有することの増大した蓋然性が存在していることを決定するステップとを含み、前記凝集体特異的結合試薬が、前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、被験体についてコンフォメーション疾患の増大した蓋然性が存在しているか否かを評価する方法を提供する。
【００１９】
別の態様は、コンフォメーション疾患についての処置を受けた患者からの生物学的試料を、凝集体特異的結合試薬と接触させるステップであって、前記試薬と、存在するならば病原性凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、前記試料中の、もしあるならば病原性凝集体の存在を、凝集体と前記凝集体特異的結合試薬との結合により検出するステップと、前記生物学的試料中の病原性凝集体の量が対照中の病原性凝集体の量よりも低い場合、前記処置が有効であることを決定するステップであって、前記対照が、コンフォメーション疾患についての処置前の前記患者からの生物学的試料中の病原性凝集体の量であるステップとを含み、前記凝集体特異的結合試薬が、前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、コンフォメーション疾患についての処置の有効性を評価する方法を提供する。
【００２０】
さらに別の態様は、オリゴマーを含有する疑いがある試料を準備するステップであって、前記試料が、オリゴマー以外の凝集体を欠くステップと、前記試料を、凝集体特異的結合試薬と接触させるステップであって、前記試薬と、存在するならば前記オリゴマーとが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、前記試料中の、もしあるならばオリゴマーの存在を、オリゴマーと前記凝集体特異的結合試薬との結合により検出するステップとを含み、前記凝集体特異的結合試薬が、前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、試料中のオリゴマーの存在を検出する方法を含む。
【００２１】
別の態様は、オリゴマーを含有する疑いがある試料を準備するステップと、前記試料からオリゴマー以外の凝集体を除去するステップと、前記試料を、凝集体特異的結合試薬と接触させるステップであって、前記試薬と、存在するならば前記オリゴマーとが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、前記試料中の、もしあるならばオリゴマーの存在を、オリゴマーと前記凝集体特異的結合試薬との結合により検出するステップとを含み、前記凝集体特異的結合試薬が、前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、試料中のオリゴマーの存在を検出する方法を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体の除去は、遠心分離による。
【００２２】
さらに別の態様は、オリゴマーを含有する疑いがある試料を、凝集体特異的結合試薬と接触させるステップであって、前記試薬と、存在するならば前記オリゴマーとが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、前記複合体を第２試薬と接触させるステップであって、前記試薬が、オリゴマーまたはオリゴマー以外の凝集体のいずれかと優先的に結合するステップと、前記試料中の、もしあるならばオリゴマーの存在を、オリゴマーと前記第２試薬との結合または結合の欠如により検出するステップとを含み、前記凝集体特異的結合試薬が、前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、試料中のオリゴマーの存在を検出する方法を提供する。オリゴマーの存在を検出するステップを含む態様のあるいくつかの実施形態では、オリゴマー以外の凝集体は、原線維を含む。
【００２３】
上記の態様のあるいくつかの実施形態では、（例えば、検出、低減または識別される）目的の凝集体、病原性凝集体またはオリゴマーは、可溶性である。
【００２４】
上記の態様のあるいくつかの実施形態では、方法は、前記凝集体特異的結合試薬と前記凝集体またはオリゴマーとの間で形成された複合体を、洗浄剤で処理するステップをさらに含む。あるいくつかの実施形態では、処理するステップは、接触させるステップの後に行われる。あるいくつかの実施形態では、洗浄剤は、中性洗浄剤である。あるいくつかの実施形態では、洗浄剤は、正電荷および負電荷の両方を含む。あるいくつかの好ましい実施形態では、洗浄剤は、長い炭素鎖を含む。いくつかの好ましい実施形態では、洗浄剤は、モノラウリン酸ポリエチレングリコールソルビタン、ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、アミドスルホベタイン−１４，３−［Ｎ，Ｎ−ジメチル（３−ミリストイルアミノプロピル）アンモニオ］プロパンスルホネート、アミドスルホベタイン−１６，３−［Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（３−パルミトアミドプロピル）アンモニオ］プロパン−１−スルホネート、４−ｎ−オクチルベンゾイルアミド−プロピル−ジメチルアンモニオスルホベタインおよびＮ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ドデシルグリシンベタインからなる群より選択される。
【００２５】
上記の態様のあるいくつかの実施形態では、固体支持体は、ニトロセルロース、ポリスチレンラテックス、フッ化ポリビニル、ジアゾ化ペーパー、ナイロンメンブレン、活性化ビーズ、磁気反応性ビーズ、酸化チタン、酸化ケイ素、多糖ビーズ、多糖メンブレン、アガロース、ガラス、ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール−ポリスチレンハイブリッド、孔径制御ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）、ガラススライド、金ビーズおよびセルロースからなる群より選択される。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、検出可能に標識されている。あるいくつかの実施形態では、試料は、体組織または体液を含む生物学的試料である。あるいくつかの実施形態では、生物学的試料は、全血、血液分画物、血液成分、血漿、血小板、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、骨髄、尿、涙、乳汁、リンパ液、器官組織、脳組織、神経系組織、筋肉組織、非神経系組織、生検材料、剖検材料、脂肪生検材料、細胞、大便、胎盤、脾臓組織、リンパ組織、膵臓組織、気管支肺胞洗浄液または滑液を含む。好ましい実施形態では、試料は、脳脊髄液（ＣＳＦ）を含む。あるいくつかの実施形態では、試料は、ポリペプチドを含む。
【００２６】
あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約２の正の、少なくとも約３の正の、少なくとも約４の正の、少なくとも約５の正の、少なくとも約６の正のまたは少なくとも約７の正の正味電荷を有する。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約９０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１２０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約３０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約４０００ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している。好ましい実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、モノマーについての結合の親和性および／またはアビディティより少なくとも約２倍高い凝集体についての結合の親和性および／またはアビディティを有する。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨより少なくとも約１ｐＨ単位高いｐＫａを有する、少なくとも１つの正に荷電した官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬における少なくとも１つの正に荷電した官能基は、凝集体特異的結合試薬の全ての官能基のうちで固体支持体に最も近い。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、疎水性官能基を含む。いくつかの実施形態では、疎水性官能基は、芳香族疎水性官能基である。他の実施形態では、疎水性官能基は、脂肪族疎水性官能基である。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、１つだけの正に荷電した官能基と、少なくとも１つの疎水性官能基とを含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、少なくとも１つの正に荷電した官能基と、１つだけの疎水性官能基とを含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、１つだけの正に荷電した官能基と、１つだけの疎水性官能基とを含む。いくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、Ｌ−異性体である少なくとも１つのアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、Ｄ−異性体である少なくとも１つのアミノ酸を含む。
【００２７】
あるいくつかの実施形態では、凝集体は、非病原性である。あるいくつかの実施形態では、非病原性凝集体は、酵母プリオンタンパク質ｓｕｐ３５またはホルモンである。あるいくつかの実施形態では、非病原性凝集体は、ポリペプチドの凝集体である。他の実施形態では、凝集体は、病原性である。あるいくつかの実施形態では、病原性凝集体は、子かん前症、タウオパチー、ＴＤＰ−４３タンパク質症またはセルピン病と関連する凝集体である。あるいくつかの実施形態では、病原性凝集体は、アミロイド疾患と関連する凝集体である。あるいくつかの実施形態では、アミロイド疾患は、全身性アミロイドーシス、ＡＡアミロイドーシス、シヌクレイン病、アルツハイマー病、プリオン病、ＡＬＳ、免疫グロブリン関連疾患、血清アミロイドＡ関連疾患、ハンチントン病、パーキンソン病、ＩＩ型糖尿病、透析アミロイドーシスおよび脳のアミロイドアンギオパチーからなる群より選択される。好ましい実施形態では、病原性凝集体は、アルツハイマー病と関連する凝集体である。あるいくつかの他の好ましい実施形態では、病原性凝集体は、脳のアミロイドアンギオパチーと関連する凝集体である。あるいくつかの実施形態では、アルツハイマー病または脳のアミロイドアンギオパチーと関連する凝集体は、アミロイド−ベータ（Ａβ）タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、Ａβタンパク質は、Ａβ４０である。他の実施形態では、Ａβタンパク質は、Ａβ４２である。あるいくつかの実施形態では、アルツハイマー病と関連する凝集体は、タウタンパク質を含む。あるいくつかの実施形態では、病原性凝集体は、アミリンを含む。あるいくつかの実施形態では、病原性凝集体は、アミロイドＡタンパク質を含む。あるいくつかの実施形態では、病原性凝集体は、アルファ−シヌクレインを含む。
【００２８】
あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて少なくとも１の正味正電荷を有する少なくとも１つのアミノ酸を含む。あるいくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸は、生理的ｐＨにて正に荷電されている。あるいくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸は、リシンおよびアルギニンからなる群より選択される天然アミノ酸である。あるいくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸は、オルニチン、メチルリシン、ジアミノ酪酸、ホモアルギニンおよび４−アミノメチルフェニルアラニンからなる群より選択される非天然アミノ酸である。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、疎水性アミノ酸を含む。あるいくつかの実施形態では、疎水性アミノ酸は、芳香族疎水性アミノ酸である。あるいくつかの実施形態では、疎水性アミノ酸は、脂肪族疎水性アミノ酸である。あるいくつかの実施形態では、疎水性アミノ酸は、トリプトファン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、チロシン、ホモフェニルアラニン、フェニルグリシン、４−クロロフェニルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、チエニルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、４−アミノフェニルアラニン、ペンタフルオロフェニルアラニン、２−ナフチルアラニン、ｐ−ビフェニルアラニン、スチリルアラニン、置換フェニルアラニン、ハロゲン化フェニルアラニン、アミノイソ酪酸、アリルグリシン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、１−ナフチルアラニン、ピリジルアラニンおよび１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸からなる群より選択される。好ましい実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、
【００２９】
【化１】
2013510297.tif 000172
からなる群より選択されるペプチドを含む。いくつかの好ましい実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、Ｆ−ｆｄｂ−Ｆ−ｆｄｂ−ｆｄｂ−ｆｄｂ（配列番号５３）、ＦｏＦｏｏｏ（配列番号５４）、モノＢｏｃ−エチレンジアミン＋ＢｒＣＨ２ＣＯ−ＫＫＦＫＦ（配列番号５５）、トリエチルアミン＋ＢｒＣＨ２ＣＯ−ＫＫＦＫＦ（配列番号５６）、テトラメチルエチレンジアミン＋ＢｒＣＨ２ＣＯ−ＫＫＦＫＦ（配列番号５７）および配列番号５８〜６６からなる群より選択されるペプチドを含む。いくつかの好ましい実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、
【００３０】
【化２】
2013510297.tif 000173
からなる群より選択されるペプチドを含む。いくつかの好ましい実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、配列番号９〜１４および９１〜９６からなる群より選択されるペプトイドを含む。好ましい実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、
【００３１】
【化３】
2013510297.tif 000174
【００３２】
【化４】
2013510297.tif 000175
【００３３】
【化５】
2013510297.tif 000176
（式中、ＲおよびＲ’は任意の基である）からなる群より選択されるペプトイドを含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、
【００３４】
【化６】
2013510297.tif 000177
（式中、ＲおよびＲ’は、任意の基である）を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、
【００３５】
【化７】
2013510297.tif 000178
のデンドロンを含む。
【００３６】
あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、アミン、アルキル基、複素環、シクロアルカン、グアニジン、エーテル、アリルおよび芳香族からなる群より選択される官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、ナフチル、フェノール、アニリン、フェニル、置換フェニル、ニトロフェニル、ハロゲン化フェニル、ビフェニル、スチリル、ジフェニル、ベンジルスルホンアミド、アミノメチルフェニル、チオフェン、インドリル、ナフチル、フランおよびイミダゾールからなる群より選択される芳香族官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、ハロゲン化フェニルは、クロロフェニルまたはフルオロフェニルである。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、第１級アミン、第２級アミン、第３級アミンおよび第４級アミンからなる群より選択されるアミン官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、イソブチル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチルおよびメチルならびにオクチルからなる群より選択されるアルキル官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、テトラヒドロフラン（ｔｅｔｒｏｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）、ピロリジンおよびピペリジンからなる群より選択される複素環官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、シクロプロピルおよびシクロヘキシルからなる群より選択されるシクロアルカン官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、反復モチーフを含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、凝集体の負に荷電した基のものと同じ間隔で正に荷電した基を含む。
【００３７】
あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、配列番号１または配列番号１５を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体は、アミリンを含み、前記凝集体特異的結合試薬は、配列番号１５を含み、前記凝集体特異的結合試薬は、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約８０００ｎｍｏｌ〜約１５０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している。あるいくつかの実施形態では、凝集体は、アルファ−シヌクレインを含み、前記凝集体特異的結合試薬は、配列番号１５を含み、前記凝集体特異的結合試薬は、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約８０００ｎｍｏｌ〜約１５０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している。あるいくつかの実施形態では、凝集体は、アミロイドＡタンパク質を含み、前記凝集体特異的結合試薬は、配列番号１５を含み、前記凝集体特異的結合試薬は、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約８０００ｎｍｏｌ〜約１５０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している。あるいくつかの実施形態では、洗浄剤処理のさらなるステップが含まれ、洗浄剤は、ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートであり、前記凝集体は、Ａβ４０タンパク質を含む病原性凝集体であり、前記凝集体特異的結合試薬は、配列番号１５を含み、前記凝集体特異的結合試薬は、１平方メートルあたりの正味電荷が約８０００ｎｍｏｌ〜約１５０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している。あるいくつかの実施形態では、試料は、脳脊髄液（ＣＳＦ）を含む。
【００３８】
別の態様は、
【００３９】
【化８】
2013510297.tif 000179
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド凝集体特異的結合試薬を含む。さらに別の態様は、ＫＫＫＫＫＫのアミノ酸配列からなるペプチドを含む、ペプチド凝集体特異的結合試薬を含む。別の態様は、Ｆ−ｆｄｂ−Ｆ−ｆｄｂ−ｆｄｂ−ｆｄｂ（配列番号５３）、ＦｏＦｏｏｏ（配列番号５４）、モノＢｏｃ−エチレンジアミン＋ＢｒＣＨ２ＣＯ−ＫＫＦＫＦ（配列番号５５）、トリエチルアミン＋ＢｒＣＨ２ＣＯ−ＫＫＦＫＦ（配列番号５６）、テトラメチルエチレンジアミン＋ＢｒＣＨ２ＣＯ−ＫＫＦＫＦ（配列番号５７）および配列番号５８〜６６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド凝集体特異的結合試薬を含む。別の態様は、配列番号９〜１４および９１〜９５からなる群より選択されるペプトイドを含む、ペプトイド凝集体特異的結合試薬を含む。別の態様は、
【００４０】
【化９】
2013510297.tif 000180
【００４１】
【化１０】
2013510297.tif 000181
【００４２】
【化１１】
2013510297.tif 000182
（式中、ＲおよびＲ’は、任意の基である）からなる群より選択されるペプトイドを含む、ペプトイド凝集体特異的結合試薬を含む。別の態様は、
【００４３】
【化１２】
2013510297.tif 000183
を含むデンドロン凝集体特異的結合試薬を含む。あるいくつかの実施形態では、試薬は、疎水性官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、疎水性官能基は、芳香族疎水性官能基である。あるいくつかの実施形態では、疎水性官能基は、脂肪族疎水性官能基である。あるいくつかの実施形態では、試薬は、アミン、アルキル基、複素環、シクロアルカン、グアニジン、エーテル、アリルおよび芳香族からなる群より選択される官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、ナフチル、フェノール、アニリン、フェニル、置換フェニル、ニトロフェニル、ハロゲン化フェニル、ビフェニル、スチリル、ジフェニル、ベンジルスルホンアミド、アミノメチルフェニル、チオフェン、インドリル、ナフチル、フランおよびイミダゾールからなる群より選択される芳香族官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、ハロゲン化フェニルは、クロロフェニルまたはフルオロフェニルである。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、第１級アミン、第２級アミン、第３級アミンおよび第４級アミンからなる群より選択されるアミン官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、イソブチル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチルならびにメチルおよびオクチルからなる群より選択されるアルキル官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、テトラヒドロフラン、ピロリジンおよびピペリジンからなる群より選択される複素環官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、シクロプロピルおよびシクロヘキシルからなる群より選択されるシクロアルカン官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、試薬は、検出可能に標識されている。
【００４４】
別の態様は、固体支持体と上記の態様の凝集体特異的結合試薬とを含む組成物を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて付着しており、前記組成物は、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約９０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１２０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約３０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約４０００ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、前記組成物は、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約７０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約８０００ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約９０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、前記組成物は、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。あるいくつかの実施形態では、固体支持体は、ニトロセルロース、ポリスチレンラテックス、フッ化ポリビニル、ジアゾ化ペーパー、ナイロンメンブレン、活性化ビーズ、磁気反応性ビーズ、酸化チタン、酸化ケイ素、多糖ビーズ、多糖メンブレン、アガロース、ガラス、ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール−ポリスチレンハイブリッド、孔径制御ガラス、ガラススライド、金ビーズおよびセルロースからなる群より選択される。
【００４５】
別の態様は、固体支持体と凝集体特異的結合試薬とを含む組成物であって、前記凝集体特異的結合試薬が、
【００４６】
【化１３】
2013510297.tif 000184
を含み、ここで、ＲおよびＲ’は、任意の基であり得、さらに、前記固体支持体が、ビーズを含む組成物を含む。
【００４７】
別の態様は、固体支持体と、ペプチド凝集体特異的結合試薬とを含む組成物であって、前記試薬が、
【００４８】
【化１４】
2013510297.tif 000185
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、さらに、前記固体支持体が、ビーズを含む組成物を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて付着しており、前記組成物は、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約９０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１２０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約３０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約４０００ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、前記組成物は、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。
【００４９】
別の態様は、上記の組成物を含有するキットを含む。あるいくつかの実施形態では、キットは、凝集体を検出するためのキットの使用についての使用説明書をさらに含む。
【００５０】
別の態様は、キットを含み、該キットは、固体支持体と、
【００５１】
【化１５】
2013510297.tif 000186
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて前記固体支持体に付着しており、前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する凝集体特異的結合試薬と、凝集体を検出するためのキットの使用についての使用説明書とを含む。
【００５２】
別の態様は、キットを含み、該キットは、固体支持体と、
【００５３】
【化１６】
2013510297.tif 000187
を含み、ここで、ＲおよびＲ’は、任意の基であり得、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて前記固体支持体に付着しており、前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する凝集体特異的結合試薬と、凝集体を検出するためのキットの使用についての使用説明書とを含む。
【００５４】
組成物またはキットのあるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて付着しており、前記組成物は、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約９０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１２０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約３０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約４０００ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、前記組成物は、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。
【００５５】
好ましい態様は、Ａβを含む凝集体を含む疑いがある試料を、凝集体特異的結合試薬と接触させるステップであって、前記試薬と、存在するならば前記凝集体とが結合して第１複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、未結合の試料を除去するステップと、前記凝集体を、前記第１複合体から解離させて、解離凝集体を提供するステップと、前記解離凝集体を、固体支持体と連結された第１抗Ａβ抗体と接触させるステップであって、結合して第２複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、前記試料中の、もしあるならば凝集体の存在を、検出可能に標識された第２抗Ａβ抗体を用いて前記第２複合体の形成を検出することにより検出するステップとを含み、前記凝集体特異的結合試薬が、前記試料が前記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、前記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、試料中のＡβを含む凝集体の存在を検出する方法を提供する。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、
【００５６】
【化１７】
2013510297.tif 000188
【００５７】
【化１８】
2013510297.tif 000189
【００５８】
【化１９】
2013510297.tif 000190
（式中、ＲおよびＲ’は、任意の基である）からなる群より選択されるペプトイドを含む。
【００５９】
あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、
【００６０】
【化２０】
2013510297.tif 000191
ならびに配列番号５３、５５、５６および５８〜６６からなる群より選択されるペプチドを含む。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
試料中の凝集体の存在を検出するための方法であって、上記方法は：
凝集体を含有する疑いがある試料と、凝集体特異的結合試薬とを、上記試薬と、存在するならば上記凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、
上記試料中の、もしあるならば凝集体の存在を、凝集体と上記凝集体特異的結合試薬との結合により検出するステップと
を含み、
上記凝集体特異的結合試薬が、
上記試料が上記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、
１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、
上記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、
方法。
（項目２）
試料中の凝集体の存在を検出するための方法であって、上記方法は：
凝集体を含有する疑いがある試料と、凝集体特異的結合試薬とを、上記試薬と、存在するならば上記凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、
上記複合体と、コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬とを、結合を可能にする条件下で接触させるステップと、
上記試料中の、もしあるならば凝集体の存在を、凝集体と上記コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬との結合により検出するステップと
を含み、
上記凝集体特異的結合試薬が、
上記試料が上記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、
１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、
上記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、
方法。
（項目３）
上記複合体を形成した後に、未結合の試料を除去するステップをさらに含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
上記コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬が、抗体である、項目２に記載の方法。
（項目５）
上記凝集体が、Ａβタンパク質を含み、上記コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬が、抗Ａβ抗体である、項目２に記載の方法。
（項目６）
試料中の凝集体の存在を検出する方法であって、上記方法は：
凝集体を含有する疑いがある試料と、凝集体特異的結合試薬とを、上記試薬と、存在するならば上記凝集体とが結合して第１複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、
未結合の試料を除去するステップと、
上記凝集体を、上記第１複合体から解離させて、解離凝集体を提供するステップと、
上記解離凝集体と、第１コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬とを、結合して第２複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、
上記試料中の、もしあるならば凝集体の存在を、上記第２複合体の形成を検出することにより検出するステップと
を含み、
上記凝集体特異的結合試薬が、
上記試料が上記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、
１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、
上記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、
方法。
（項目７）
上記第２複合体の形成が、検出可能に標識された第２コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬を用いて検出される、項目６に記載の方法。
（項目８）
上記第１コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬が、固体支持体に連結されている、項目６に記載の方法。
（項目９）
上記凝集体が、上記第１複合体をチオシアン酸グアニジンに曝露することにより、上記第１複合体から解離される、項目６に記載の方法。
（項目１０）
上記凝集体が、上記複合体を高ｐＨまたは低ｐＨに曝露することにより、上記第１複合体から解離される、項目６に記載の方法。
（項目１１）
上記凝集体が、Ａβタンパク質を含み、上記コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬が、抗Ａβ抗体である、項目６に記載の方法。
（項目１２）
試料中の凝集体の存在を検出するための方法であって、上記方法は：
凝集体を含有する疑いがある試料と、コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬とを、上記試薬と、存在するならば上記凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、
未結合の試料を除去するステップと、
上記複合体を、検出可能な標識を含む凝集体特異的結合試薬とを、上記試薬と上記凝集体との結合を可能にする条件下で接触させるステップと、
上記試料中の、もしあるならば凝集体の存在を、凝集体と上記凝集体特異的結合試薬との結合により検出するステップと
を含み、
上記凝集体特異的結合試薬が、
上記試料が上記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、
１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、
上記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、
方法。
（項目１３）
上記コンフォメーションタンパク質特異的タンパク質が、固体支持体と連結されている、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
試料中の凝集体の存在を検出するための方法であって、上記方法は：
凝集体特異的結合試薬を含む固体支持体を提供するステップと、
上記固体支持体を、検出可能に標識されたリガンドと組み合わせるステップであって、上記凝集体特異的結合試薬が上記検出可能に標識されたリガンドと結合するアビディティが、上記試薬が上記凝集体と結合するアビディティより弱い、ステップと、
凝集体を含有する疑いがある試料と、上記固体支持体とを、上記試料中に存在する場合に上記凝集体が上記試薬と結合して、上記リガンドを置き換えることを可能にする条件下で組み合わせるステップと、
上記凝集体と上記凝集体特異的結合試薬との間で形成された複合体を検出するステップと
を含み、
上記凝集体特異的結合試薬が、
上記試料が上記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、
１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、
上記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、
方法。
（項目１５）
ポリペプチド試料中の凝集体の量を低減するための方法であって、上記方法は：
凝集体を含有する疑いがあるポリペプチド試料と、凝集体特異的結合試薬とを、上記試薬と、存在するならば上記凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、
未結合のポリペプチド試料を収集するステップと
を含み、
上記凝集体特異的結合試薬が、
上記試料が上記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、
１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、
上記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、
方法。
（項目１６）
試料中の凝集体とモノマーとを識別するための方法であって、上記方法は：
凝集体を含有する疑いがある試料と、凝集体特異的結合試薬とを、上記試薬と、存在するならば上記凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、
上記試料中の、もしあるならば凝集体とモノマーとを、凝集体と上記凝集体特異的結合試薬との結合により識別するステップと
を含み、
上記凝集体特異的結合試薬が、
上記試料が上記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、
１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、
上記固体支持体に付着している場合に、上記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、
方法。
（項目１７）
被験体についてコンフォメーション疾患の増大した蓋然性が存在しているか否かを評価するための方法であって、上記方法は：
コンフォメーション疾患を有する疑いがある被験体からの生物学的試料と、凝集体特異的結合試薬とを、上記試薬と、存在するならば病原性凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、
上記生物学的試料中の、もしあるならば病原性凝集体の存在を、凝集体と上記凝集体特異的結合試薬との結合により検出するステップと、
上記生物学的試料中の病原性凝集体の量がコンフォメーション疾患を有さない被験体からの試料中の凝集体の量より高いならば、上記被験体がコンフォメーション疾患を有することの増大した蓋然性が存在していることを決定するステップと
を含み、
上記凝集体特異的結合試薬が、
上記試料が上記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、
１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、
上記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、
方法。
（項目１８）
コンフォメーション疾患についての処置の有効性を評価するための方法であって、上記方法は：
コンフォメーション疾患についての処置を受けた患者からの生物学的試料と、凝集体特異的結合試薬とを、上記試薬と、存在するならば病原性凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、
上記試料中の、もしあるならば病原性凝集体の存在を、凝集体と上記凝集体特異的結合試薬との結合により検出するステップと、
上記生物学的試料中の病原性凝集体の量が対照中の病原性凝集体の量よりも低いならば、上記処置が有効であることを決定するステップであって、上記対照が、コンフォメーション疾患についての処置前の上記患者からの生物学的試料中の病原性凝集体の量である、ステップと
を含み、
上記凝集体特異的結合試薬が、
上記試料が上記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、
１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、
上記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、
方法。
（項目１９）
上記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約９０ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１２０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している、項目１〜１８のいずれかに記載の方法。
（項目２０）
上記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１０００ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している、項目１〜１９のいずれかに記載の方法。
（項目２１）
上記凝集体または病原性凝集体が、可溶性である、項目１〜２０のいずれかに記載の方法。
（項目２２）
試料中のオリゴマーの存在を検出するための方法であって、上記方法は：
オリゴマーを含有する疑いがある試料を提供するステップであって、上記試料が、オリゴマー以外の凝集体を欠く、ステップと、
上記試料と、凝集体特異的結合試薬とを、上記試薬と、存在するならば上記オリゴマーとが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、
上記試料中の、もしあるならばオリゴマーの存在を、オリゴマーと上記凝集体特異的結合試薬との結合により検出するステップと
を含み、
上記凝集体特異的結合試薬が、
上記試料が上記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、
１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、
上記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、
方法。
（項目２３）
試料中のオリゴマーの存在を検出するための方法であって、上記方法は：
オリゴマーを含有する疑いがある試料を提供するステップと、
上記試料からオリゴマー以外の凝集体を除去するステップと、
上記試料と、凝集体特異的結合試薬とを、上記試薬と、存在するならば上記オリゴマーとが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、
上記試料中の、もしあるならばオリゴマーの存在を、オリゴマーと上記凝集体特異的結合試薬との結合により検出するステップと
を含み、
上記凝集体特異的結合試薬が、
上記試料が上記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、
１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、
上記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、
方法。
（項目２４）
上記凝集体の除去が、遠心分離による、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
試料中のオリゴマーの存在を検出するための方法であって、上記方法は：
オリゴマーを含有する疑いがある試料と、凝集体特異的結合試薬とを、上記試薬と、存在するならば上記オリゴマーとが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、
上記複合体を第２試薬と接触させるステップであって、上記試薬が、オリゴマーまたはオリゴマー以外の凝集体のいずれかと優先的に結合する、ステップと、
上記試料中の、もしあるならばオリゴマーの存在を、オリゴマーと上記第２試薬との結合または結合の欠如により検出するステップと
を含み、
上記凝集体特異的結合試薬が、
上記試料が上記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、
１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、
上記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、
方法。
（項目２６）
オリゴマー以外の上記凝集体が、原線維を含む、項目２２〜２５のいずれかに記載の方法。
（項目２７）
上記オリゴマーが、可溶性である、項目２２〜２５のいずれかに記載の方法。
（項目２８）
上記凝集体特異的結合試薬と上記凝集体またはオリゴマーとの間で形成された上記複合体を、洗浄剤で処理するステップをさらに含む、項目１〜２７のいずれかに記載の方法。
（項目２９）
上記処理するステップが、上記接触させるステップの後に行われる、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
上記洗浄剤が、中性洗浄剤である、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
上記洗浄剤が、正電荷および負電荷の両方を含む、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
上記洗浄剤が、長い炭素鎖を含む、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
上記洗浄剤が、モノラウリン酸ポリエチレングリコールソルビタン、ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、アミドスルホベタイン−１４，３−［Ｎ，Ｎ−ジメチル（３−ミリストイルアミノプロピル）アンモニオ］プロパンスルホネート、アミドスルホベタイン−１６，３−［Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（３−パルミトアミドプロピル）アンモニオ］プロパン−１−スルホネート、４−ｎ−オクチルベンゾイルアミド−プロピル−ジメチルアンモニオスルホベタインおよびＮ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ドデシルグリシンベタインからなる群より選択される、項目３０に記載の方法。
（項目３４）
上記固体支持体が、ニトロセルロース、ポリスチレンラテックス、フッ化ポリビニル、ジアゾ化ペーパー、ナイロンメンブレン、活性化ビーズ、磁気反応性ビーズ、酸化チタン、酸化ケイ素、多糖ビーズ、多糖メンブレン、アガロース、ガラス、ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール−ポリスチレンハイブリッド、孔径制御ガラス、ガラススライド、金ビーズおよびセルロースからなる群より選択される、項目１〜３３のいずれかに記載の方法。
（項目３５）
上記凝集体特異的結合試薬が、検出可能に標識されている、項目１〜３４のいずれかに記載の方法。
（項目３６）
上記試料が、体組織または体液を含む生物学的試料である、項目１〜１４または１６〜３５のいずれかに記載の方法。
（項目３７）
上記生物学的試料が、全血、血液分画物、血液成分、血漿、血小板、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、骨髄、尿、涙、乳汁、リンパ液、器官組織、脳組織、神経系組織、筋肉組織、非神経系組織、生検材料、剖検材料、脂肪生検材料、細胞、大便、胎盤、脾臓組織、リンパ組織、膵臓組織、気管支肺胞洗浄液または滑液を含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
上記試料が、脳脊髄液（ＣＳＦ）を含む、項目３６に記載の方法。
（項目３９）
上記試料が、ポリペプチドを含む、項目１〜１４または１９〜３５のいずれかに記載の方法。
（項目４０）
上記凝集体特異的結合試薬が、上記試料が上記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約２の正の、少なくとも約３の正の、少なくとも約４の正の、少なくとも約５の正の、少なくとも約６の正のまたは少なくとも約７の正の正味電荷を有する、項目１〜３９のいずれかに記載の方法。
（項目４１）
上記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約３０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約４０００ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している、項目１〜４０のいずれかに記載の方法。
（項目４２）
上記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約７０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約８０００ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約９０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している、項目１〜４０のいずれかに記載の方法。
（項目４３）
上記凝集体特異的結合試薬が、モノマーに対する結合親和性および／またはアビディティより少なくとも約２倍高い、凝集体に対する結合親和性および／またはアビディティを有する、項目１〜４２のいずれかに記載の方法。
（項目４４）
上記凝集体特異的結合試薬が、上記試料が上記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨより少なくとも約１ｐＨ単位高いｐＫａを有する少なくとも１つの正に荷電した官能基を含む、項目１〜４３のいずれかに記載の方法。
（項目４５）
上記少なくとも１つの正に荷電した官能基が、上記凝集体特異的結合試薬の全ての官能基のうちで上記固体支持体に最も近い、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
上記凝集体特異的結合試薬が、疎水性官能基を含む、項目１〜４５のいずれかに記載の方法。
（項目４７）
上記疎水性官能基が、芳香族疎水性官能基である、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
上記疎水性官能基が、脂肪族疎水性官能基である、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
上記凝集体特異的結合試薬が、１つだけの正に荷電した官能基と、少なくとも１つの疎水性官能基とを含む、項目１〜４８のいずれかに記載の方法。
（項目５０）
上記凝集体特異的結合試薬が、少なくとも１つの正に荷電した官能基と、１つだけの疎水性官能基とを含む、項目１〜４８のいずれかに記載の方法。
（項目５１）
上記凝集体特異的結合試薬が、１つだけの正に荷電した官能基と、１つだけの疎水性官能基とを含む、項目１〜４８のいずれかに記載の方法。
（項目５２）
上記凝集体特異的結合試薬が、Ｌ−異性体である少なくとも１つのアミノ酸を含む、項目１〜５１のいずれかに記載の方法。
（項目５３）
上記凝集体特異的結合試薬が、Ｄ−異性体である少なくとも１つのアミノ酸を含む、項目１〜５１のいずれかに記載の方法。
（項目５４）
上記凝集体が、非病原性である、項目１〜１６または１９〜５３のいずれかに記載の方法。
（項目５５）
上記非病原性凝集体が、酵母プリオンタンパク質ｓｕｐ３５またはホルモンである、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
上記非病原性凝集体が、ポリペプチドの凝集体である、項目５４に記載の方法。
（項目５７）
上記凝集体が、病原性である、項目１〜４８のいずれかに記載の方法。
（項目５８）
上記病原性凝集体が、子かん前症、タウオパチー、ＴＤＰ−４３タンパク質症またはセルピン病と関連する凝集体である、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
上記病原性凝集体が、アミロイド疾患と関連する凝集体である、項目５７に記載の方法。
（項目６０）
上記アミロイド疾患が、全身性アミロイドーシス、ＡＡアミロイドーシス、シヌクレイン病、アルツハイマー病、プリオン病、ＡＬＳ、免疫グロブリン関連疾患、血清アミロイドＡ関連疾患、ハンチントン病、パーキンソン病、ＩＩ型糖尿病、透析アミロイドーシスおよび脳のアミロイドアンギオパチーからなる群より選択される、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
上記病原性凝集体が、アルツハイマー病と関連する凝集体である、項目５７に記載の方法。
（項目６２）
上記病原性凝集体が、脳のアミロイドアンギオパチーと関連する凝集体である、項目５７に記載の方法。
（項目６３）
アルツハイマー病または脳のアミロイドアンギオパチーと関連する上記凝集体が、アミロイド−ベータ（Ａβ）タンパク質を含む、項目６１または６２に記載の方法。
（項目６４）
上記Ａβタンパク質が、Ａβ４０である、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
上記Ａβタンパク質が、Ａβ４２である、項目６３に記載の方法。
（項目６６）
アルツハイマー病と関連する上記凝集体が、タウタンパク質を含む、項目６１に記載の方法。
（項目６７）
上記病原性凝集体が、アミリンを含む、項目５７に記載の方法。
（項目６８）
上記病原性凝集体が、アミロイドＡタンパク質を含む、項目５７に記載の方法。
（項目６９）
上記病原性凝集体が、アルファ−シヌクレインを含む、項目５７に記載の方法。
（項目７０）
上記凝集体特異的結合試薬が、上記試料が上記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて少なくとも１の正味正電荷を有する少なくとも１つのアミノ酸を含む、項目１〜６７のいずれかに記載の方法。
（項目７１）
上記少なくとも１つのアミノ酸が、生理的ｐＨにて正に荷電されている、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
上記少なくとも１つのアミノ酸が、リシンおよびアルギニンからなる群より選択される天然アミノ酸である、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
上記少なくとも１つのアミノ酸が、オルニチン、メチルリシン、ジアミノ酪酸、ホモアルギニンおよび４−アミノメチルフェニルアラニンからなる群より選択される非天然アミノ酸である、項目７１に記載の方法。
（項目７４）
上記凝集体特異的結合試薬が、疎水性アミノ酸を含む、項目１〜７３のいずれかに記載の方法。
（項目７５）
上記疎水性アミノ酸が、芳香族疎水性アミノ酸である、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
上記疎水性アミノ酸が、脂肪族疎水性アミノ酸である、項目７４に記載の方法。
（項目７７）
上記疎水性アミノ酸が、トリプトファン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、チロシン、ホモフェニルアラニン、フェニルグリシン、４−クロロフェニルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、チエニルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、４−アミノフェニルアラニン、ペンタフルオロフェニルアラニン、２−ナフチルアラニン、ｐ−ビフェニルアラニン、スチリルアラニン、置換フェニルアラニン、ハロゲン化フェニルアラニン、アミノイソ酪酸、アリルグリシン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、１−ナフチルアラニン、ピリジルアラニンおよび１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸からなる群より選択される、項目７４に記載の方法。
（項目７８）
上記凝集体特異的結合試薬が、
【化４１】
2013510297.tif 000192
からなる群より選択されるペプチドを含む、項目１〜７７のいずれかに記載の方法。
（項目７９）
上記凝集体特異的結合試薬が、Ｆ−ｆｄｂ−Ｆ−ｆｄｂ−ｆｄｂ−ｆｄｂ（配列番号５３）、ＦｏＦｏｏｏ（配列番号５４）、モノＢｏｃ−エチレンジアミン＋ＢｒＣＨ２ＣＯ−ＫＫＦＫＦ（配列番号５５）、トリエチルアミン＋ＢｒＣＨ２ＣＯ−ＫＫＦＫＦ（配列番号５６）、テトラメチルエチレンジアミン＋ＢｒＣＨ２ＣＯ−ＫＫＦＫＦ（配列番号５７）および配列番号５８〜６６からなる群より選択されるペプチドを含む、項目１〜７７のいずれかに記載の方法。
（項目８０）
上記凝集体特異的結合試薬が、
【化４２】
2013510297.tif 000193
からなる群より選択されるペプチドを含む、項目１〜７７のいずれかに記載の方法。
（項目８１）
上記凝集体特異的結合試薬が、
【化４３】
2013510297.tif 000194
【化４４】
2013510297.tif 000195
【化４５】
2013510297.tif 000196
【化４６】
2013510297.tif 000197
からなる群より選択されるペプトイドを含み、ここで、式中、ＲおよびＲ’は任意の基である、項目１〜７７のいずれかに記載の方法。
（項目８２）
上記凝集体特異的結合試薬が、配列番号９〜１４および９１〜９６からなる群より選択されるペプトイドを含む、項目１〜７７のいずれかに記載の方法。
（項目８３）
上記凝集体特異的結合試薬が、
【化４７】
2013510297.tif 000198
を含み、ここで、式中、ＲおよびＲ’は、任意の基である、項目１〜７７のいずれかに記載の方法。
（項目８４）
上記凝集体特異的結合試薬が、
【化４８】
2013510297.tif 000199
のデンドロンを含む、項目１〜８３のいずれかに記載の方法。
（項目８５）
上記凝集体特異的結合試薬が、アミン、アルキル基、複素環、シクロアルカン、グアニジン、エーテル、アリルおよび芳香族からなる群より選択される官能基を含む、項目１〜８４のいずれかに記載の方法。
（項目８６）
上記凝集体特異的結合試薬が、ナフチル、フェノール、アニリン、フェニル、置換フェニル、ニトロフェニル、ハロゲン化フェニル、ビフェニル、スチリル、ジフェニル、ベンジルスルホンアミド、アミノメチルフェニル、チオフェン、インドリル、ナフチル、フランおよびイミダゾールからなる群より選択される芳香族官能基を含む、項目１〜８５のいずれかに記載の方法。
（項目８７）
上記ハロゲン化フェニルが、クロロフェニルまたはフルオロフェニルである、項目８６に記載の方法。
（項目８８）
上記凝集体特異的結合試薬が、第１級アミン、第２級アミン、第３級アミンおよび第４級アミンからなる群より選択されるアミン官能基を含む、項目１〜８５のいずれかに記載の方法。
（項目８９）
上記凝集体特異的結合試薬が、イソブチル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチルおよびメチルならびにオクチルからなる群より選択されるアルキル官能基を含む、項目１〜８５のいずれかに記載の方法。
（項目９０）
上記凝集体特異的結合試薬が、テトラヒドロフラン、ピロリジンおよびピペリジンからなる群より選択される複素環官能基を含む、項目１〜８５のいずれかに記載の方法。
（項目９１）
上記凝集体特異的結合試薬が、シクロプロピルおよびシクロヘキシルからなる群より選択されるシクロアルカン官能基を含む、項目１〜８５のいずれかに記載の方法。
（項目９２）
上記凝集体特異的結合試薬が、反復モチーフを含む、項目１〜９１のいずれかに記載の方法。
（項目９３）
上記凝集体特異的結合試薬が、上記凝集体の負に荷電した基のものと同じ間隔で正に荷電した基を含む、項目１〜９２のいずれかに記載の方法。
（項目９４）
上記凝集体特異的結合試薬が、配列番号１または配列番号１５を含む、項目１〜９３のいずれかに記載の方法。
（項目９５）
上記凝集体が、アミリンを含み、上記凝集体特異的結合試薬が、配列番号１５を含み、上記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約８０００ｎｍｏｌ〜約１５０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している、項目１、６、１２、１４および１６のいずれかに記載の方法。
（項目９６）
上記凝集体が、アルファ−シヌクレインを含み、上記凝集体特異的結合試薬が、配列番号１５を含み、上記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約８０００ｎｍｏｌ〜約１５０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している、項目１、６、１２、１４および１６のいずれかに記載の方法。
（項目９７）
上記凝集体が、アミロイドＡタンパク質を含み、上記凝集体特異的結合試薬が、配列番号１５を含み、上記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約８０００ｎｍｏｌ〜約１５０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している、項目１、６、１２、１４および１６のいずれかに記載の方法。
（項目９８）
上記洗浄剤が、ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートであり、上記凝集体が、Ａβ４０タンパク質を含む病原性凝集体であり、上記凝集体特異的結合試薬が、配列番号１５を含み、上記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約８０００ｎｍｏｌ〜約１５０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している、項目３３に記載の方法。
（項目９９）
上記試料が、脳脊髄液（ＣＳＦ）を含む、項目９８に記載の方法。
（項目１００）
以下：
【化４９】
2013510297.tif 000200
らなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド凝集体特異的結合試薬。
（項目１０１）
ＫＫＫＫＫＫ（配列番号４）のアミノ酸配列からなるペプチドを含む、ペプチド凝集体特異的結合試薬。
（項目１０２）
Ｆ−ｆｄｂ−Ｆ−ｆｄｂ−ｆｄｂ−ｆｄｂ（配列番号５３）、ＦｏＦｏｏｏ（配列番号５４）、モノＢｏｃ−エチレンジアミン＋ＢｒＣＨ２ＣＯ−ＫＫＦＫＦ（配列番号５５）、トリエチルアミン＋ＢｒＣＨ２ＣＯ−ＫＫＦＫＦ（配列番号５６）、テトラメチルエチレンジアミン＋ＢｒＣＨ２ＣＯ−ＫＫＦＫＦ（配列番号５７）および配列番号５８〜６６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド凝集体特異的結合試薬。
（項目１０３）
以下：
【化５０】
2013510297.tif 000201
【化５１】
2013510297.tif 000202
【化５２】
2013510297.tif 000203
からなる群より選択されるペプトイドを含む、ペプトイド凝集体特異的結合試薬であって、式中、ＲおよびＲ’は、任意の基である、ペプトイド凝集体特異的結合試薬。
（項目１０４）
配列番号９〜１４および９１〜９５からなる群より選択されるペプトイドを含む、ペプトイド凝集体特異的結合試薬。
（項目１０５）
疎水性官能基を含む、項目１００〜１０４のいずれかに記載の凝集体特異的結合試薬。
（項目１０６）
上記疎水性官能基が、芳香族疎水性官能基である、項目１０５に記載の凝集体特異的結合試薬。
（項目１０７）
上記疎水性官能基が、脂肪族疎水性官能基である、項目１０５に記載の凝集体特異的結合試薬。
（項目１０８）
アミン、アルキル基、複素環、シクロアルカン、グアニジン、エーテル、アリルおよび芳香族からなる群より選択される官能基を含む、項目１００〜１０７のいずれかに記載の凝集体特異的結合試薬。
（項目１０９）
ナフチル、フェノール、アニリン、フェニル、置換フェニル、ニトロフェニル、ハロゲン化フェニル、ビフェニル、スチリル、ジフェニル、ベンジルスルホンアミド、アミノメチルフェニル、チオフェン、インドリル、ナフチル、フランおよびイミダゾールからなる群より選択される芳香族官能基を含む、項目１００〜１０８のいずれかに記載の凝集体特異的結合試薬。
（項目１１０）
上記ハロゲン化フェニルが、クロロフェニルまたはフルオロフェニルである、項目１０９に記載の凝集体特異的結合試薬。
（項目１１１）
第１級アミン、第２級アミン、第３級アミンおよび第４級アミンからなる群より選択されるアミン官能基を含む、項目１００〜１０８のいずれかに記載の凝集体特異的結合試薬。
（項目１１２）
イソブチル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチルおよびメチルならびにオクチルからなる群より選択されるアルキル官能基を含む、項目１００〜１０８のいずれかに記載の凝集体特異的結合試薬。
（項目１１３）
テトラヒドロフラン、ピロリジンおよびピペリジンからなる群より選択される複素環官能基を含む、項目１００〜１０８のいずれかに記載の凝集体特異的結合試薬。
（項目１１４）
シクロプロピルおよびシクロヘキシルからなる群より選択されるシクロアルカン官能基を含む、項目１００〜１０８のいずれかに記載の凝集体特異的結合試薬。
（項目１１５）
検出可能に標識されている、項目１００〜１１４のいずれかに記載の凝集体特異的結合試薬。
（項目１１６）
固体支持体と、項目１００〜１１５に記載の凝集体特異的結合試薬とを含む組成物。
（項目１１７）
固体支持体と凝集体特異的結合試薬とを含む組成物であって、上記凝集体特異的結合試薬が、
【化５３】
2013510297.tif 000204
を含み、さらに、上記固体支持体がビーズを含む、組成物。
（項目１１８）
固体支持体と、ペプチド凝集体特異的結合試薬とを含む組成物であって、上記試薬が、
【化５４】
2013510297.tif 000205
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、さらに、上記固体支持体がビーズを含む、組成物。
（項目１１９）
上記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて上記固体支持体に付着しており、上記組成物が、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、項目１１６〜１１８のいずれかに記載の組成物。
（項目１２０）
上記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約９０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１２０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５００ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１０００ｎｍｏｌの電荷密度にて上記固体支持体に付着しており、上記組成物が、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、項目１１６〜１１８のいずれかに記載の組成物。
（項目１２１）
上記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約３０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約４０００ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５０００ｎｍｏｌの電荷密度にて上記固体支持体に付着しており、上記組成物が、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、項目１１６〜１１８のいずれかに記載の組成物。
（項目１２２）
上記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約７０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約８０００ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約９０００ｎｍｏｌの電荷密度にて上記固体支持体に付着しており、上記組成物が、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、項目１１６〜１１８のいずれかに記載の組成物。
（項目１２３）
上記固体支持体が、ニトロセルロース、ポリスチレンラテックス、フッ化ポリビニル、ジアゾ化ペーパー、ナイロンメンブレン、活性化ビーズ、磁気反応性ビーズ、酸化チタン、酸化ケイ素、多糖ビーズ、多糖メンブレン、アガロース、ガラス、ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール−ポリスチレンハイブリッド、孔径制御ガラス、ガラススライド、金ビーズおよびセルロースからなる群より選択される、項目１１６〜１２２のいずれかに記載の組成物。
（項目１２４）
項目１１６〜１２３のいずれかに記載の組成物を含むキット。
（項目１２５）
凝集体を検出するための、上記キットの使用についての使用説明書をさらに含む、項目１２４に記載のキット。
（項目１２６）
固体支持体と、
凝集体特異的結合試薬と、
凝集体を検出するための、キットの使用についての使用説明書と
を含むキットであって、上記凝集体特異的結合試薬が、
【化５５】
2013510297.tif 000206
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、上記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて上記固体支持体に付着しており、上記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、キット。
（項目１２７）
固体支持体と、
凝集体特異的結合試薬と、
凝集体を検出するための、キットの使用についての使用説明書と
を含むキットであって、上記凝集体特異的結合試薬が、
【化５６】
2013510297.tif 000207
を含み、上記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて上記固体支持体に付着しており、上記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、キット。
（項目１２８）
上記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約９０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１２０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５００ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１０００ｎｍｏｌの電荷密度にて上記固体支持体に付着している、項目１２６または１２７に記載のキット。
（項目１２９）
上記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約３０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約４０００ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５０００ｎｍｏｌの電荷密度にて上記固体支持体に付着している、項目１２６または１２７に記載のキット。
（項目１３０）
上記凝集体特異的結合試薬が、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約７０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約８０００ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約９０００ｎｍｏｌの電荷密度にて上記固体支持体に付着している、項目１２６または１２７に記載のキット。
（項目１３１）
試料中のＡβを含む凝集体の存在を検出するための方法であって、上記方法は：
Ａβを含む凝集体を含有する疑いがある試料と、凝集体特異的結合試薬とを、上記試薬と、存在するならば上記凝集体とが結合して第１複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、
未結合の試料を除去するステップと、
上記凝集体を、上記第１複合体から解離させて、解離凝集体を提供するステップと、
上記解離凝集体と、固体支持体と連結された第１抗Ａβ抗体とを、結合して第２複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、
上記試料中の、もしあるならば凝集体の存在を、検出可能に標識された第２抗Ａβ抗体を用いて上記第２複合体の形成を検出することにより検出するステップと
を含み、
上記凝集体特異的結合試薬が、
上記試料が上記凝集体特異的結合試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、
１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、
上記固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する、
方法。
（項目１３２）
上記凝集体特異的結合試薬が、
【化５７】
2013510297.tif 000208
【化５８】
2013510297.tif 000209
【化５９】
2013510297.tif 000210
からなる群より選択されるペプトイドを含み、ここで式中、ＲおよびＲ’は、任意の基である、項目１３１に記載の方法。
（項目１３３）
上記凝集体特異的結合試薬が、
【化６０】
2013510297.tif 000211
および配列番号５３、５５、５６および５８〜６６からなる群より選択されるペプチドを含む、項目１３１に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１−１】図１は、試験した潜在的な凝集体特異的結合試薬を示す。各凝集体特異的結合試薬の配列／名称は、各分子の推定正味電荷とともに示す（ｐＨ７での官能基のｐＫａに基づいて）。「Ｒ」基の構造は、図２で見ることができる。
【図１−２】図１は、試験した潜在的な凝集体特異的結合試薬を示す。各凝集体特異的結合試薬の配列／名称は、各分子の推定正味電荷とともに示す（ｐＨ７での官能基のｐＫａに基づいて）。「Ｒ」基の構造は、図２で見ることができる。
【図２】図２は、マレイミド提示ビーズをＭｉｃｈａｅｌ付加反応によりチオール化ペプチドとコンジュゲートさせる反応を示す。
【図３】図３は、ミスフォールディングタンパク質アッセイ（Ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（ＭＰＡ））のステップを示す。
【図４】図４は、様々な電荷、骨格および疎水性の凝集体特異的結合試薬が、オリゴマーを捕捉する能力を試験した結果を示す。パートＡは、完全に負、完全に正および中性のペプチド、ならびに疎水性または脂肪族残基を含有するペプチド、ならびにペプトイドおよびデンドロンを示す。パートＢは、電荷および疎水性の様々な組み合わせを有するペプチド、ならびにペプトイドを示す。ｙ軸は、ＡベータＥＬＩＳＡからの相対的ライトユニットを示す。
【図５】図５は、オリゴマーの捕捉が、リガンド密度とともに非線形的に増加することを証明する。パートＡは、各試料に３マイクロリットルのビーズを加えた場合の負荷密度対捕捉効率を示し、パートＢは、各試料に１５マイクロリットルのビーズを加えた場合の負荷密度対捕捉効率を示す。
【図６】図６は、オリゴマー捕捉アッセイにおける２つの正に荷電したペプチドＫＫＫＫＫＫ（配列番号４）およびＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫ（配列番号５）の比較を示す。
【図７】図７は、Ｅ２２Ｇグロブロマー構造の分析を示す。パートＡは、Ｅ２２Ｇおよび野生型グロブロマーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。パートＢは、２つのグロブロマーのサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図８】図８は、ＰＳＲ１およびグルタチオン陰性対照によるＥ２２Ｇおよび野生型グロブロマーの捕捉を試験する結合アッセイを示す。
【図９】図９は、Ｅ２２ＫグロブロマーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。パートＡは、架橋なしのＥ２２Ｋおよび野生型グロブロマーの分析を示す。パートＢは、架橋されたグロブロマーを用いた分析を示す。
【図１０】図１０は、ＰＳＲ１およびグルタチオン陰性対照によるＥ２２Ｋ、Ｅ２２Ｇおよび野生型グロブロマーの捕捉を試験する結合アッセイを示す。
【図１１】図１１は、オリゴマーを捕捉する能力について試験した追加のペプトイド凝集体特異的結合試薬を示す。
【図１２】図１２は、様々なペプトイド凝集体特異的結合試薬によるグロブロマーの捕捉を示す。
【図１３】図１３は、ビーズに直接コンジュゲートしたＰＳＲ１（パートＡ）およびストレプトアビジン被覆ビーズと結合したビオチン−ＰＳＲ１（パートＢ）を用いたグロブロマーの捕捉を示す。
【図１４】図１４は、ビオチン化誘導体をストレプトアビジン誘導体化磁性ビーズに結合する反応を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、本研究で調製した対照ペプトイドであるバッチ１を示す（ＰＳＲ１類似体、負に荷電したＰＳＲ１類似体、全て正の対照）。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、電荷および電荷のパターンの要件を検査するために調製したペプトイドであるバッチ２を示す。
【図１６】図１６は、バッチ１ペプトイドによるプリオン凝集体捕捉を示す。データは３連で示す。
【図１７】図１７は、バッチ２ペプトイドによるプリオン凝集体捕捉を示す。データは３連で示す。
【図１８Ａ】図１８Ａは、図１５に示すペプトイドにより捕捉されたアルツハイマーの脳ホモジネート（ＡＤＢＨ）からのＡベータ（１−４２）凝集体を示す。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、図１５に示す正に荷電したペプトイドにより捕捉されたＡＤＢＨからのＡベータ（１−４２）凝集体を示す。
【図１９】図１９は、ＡＤＢＨからＡベータ凝集体を捕捉するＰＳＲ１および全て正に荷電された種についての検出限界分析を示す。
【図２０】図２０は、ＰＳＲ１ビーズ、グルタチオン対照ビーズ、７＋および７−ペプトイドビーズにより捕捉される全タウシグナルを示す。
【図２１】図２１は、ＭＰＡシグナルの倍数変化が、ＰＳＲ１被覆濃度とともに線形的に変化しないことを示す。
【図２２】図２２Ａは、図１５に示すペプトイドにより捕捉されたＡＤＢＨからのＡベータ（１−４０）凝集体を示す。図２２Ｂは、図１５に示す正に荷電したペプトイドにより捕捉されたＡＤＢＨからのＡベータ（１−４０）凝集体を示す。
【図２３−１】図２３は、ペプチド凝集体特異的結合試薬ＫＫＫＦＫＦ（配列番号１）およびＫＫＫＬＫＬ（配列番号３）ならびにペプトイド凝集体特異的結合試薬ＰＳＲ１についての電荷密度実験を示す。ＰＳＲ１についての結果は、ビーズとコンジュゲートしたＰＳＲ１およびセルロースとコンジュゲートしたＰＳＲ１について示す。
【図２３−２】図２３は、ペプチド凝集体特異的結合試薬ＫＫＫＦＫＦ（配列番号１）およびＫＫＫＬＫＬ（配列番号３）ならびにペプトイド凝集体特異的結合試薬ＰＳＲ１についての電荷密度実験を示す。ＰＳＲ１についての結果は、ビーズとコンジュゲートしたＰＳＲ１およびセルロースとコンジュゲートしたＰＳＲ１について示す。
【図２４】図２４は、ミスフォールディングタンパク質アッセイ（ＭＰＡ）が、対照および疾患患者からの脳ホモジネートを区別する能力を示す。パートＡは、５の正常（Ｎ）試料および１１のｖＣＪＤ患者試料におけるプリオン凝集体捕捉を示す。ＡＮＯＶＡは、これらの１６の試料が、単一の集団に由来しないことを示す。パートＢは、４の正常（Ｎ）試料および１０のＡＤ患者試料におけるタウおよびＡベータ１−４２凝集体捕捉を示す。ＡＮＯＶＡは、これらの１４の試料が、単一の集団に由来しないことを示す。両方のグラフにおけるｙ軸は、標的マーカーＥＬＩＳＡアッセイにおいて検出される相対的ライトユニットである。
【図２５】図２５は、オリゴマー捕捉に対する電荷の影響力を見る研究の結果を示す。０または１ｎｇ／ｍＬのＡベータ４２オリゴマーを、ＣＳＦに添加し、潜在的なヘキサペプチド凝集体特異的結合試薬を有するビーズで捕捉した。オリゴマーの捕捉は、黒色のバーで示し、ＣＳＦからのモノマーＡベータ４０および４２のバックグラウンド捕捉は、縞および白色のバーで示す。ｘ軸は、ヘキサペプチド配列を示す（ＰＳＲ１、配列番号１５、参照のために示す）。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。
【図２６】図２６は、図２５におけるヘキサペプチド試薬についての電荷対オリゴマー捕捉シグナルの比較を示す。電荷は、アッセイ緩衝液のｐＨに対する個別の官能基のｐＫａに基づいて計算する。
【図２７】図２７は、異なる配向およびモノマーキラリティーを有する潜在的な凝集体特異的結合試薬を示す。
【図２８】図２８は、図２７に示す試薬についての配向およびキラリティー研究の結果を示す。Ａベータ４２オリゴマーをＣＳＦに添加し、図２７からの潜在的な凝集体特異的結合試薬を有するビーズで捕捉した。オリゴマーの捕捉は、黒色のバーで示し、ＣＳＦからのモノマーＡベータ４０および４２のバックグラウンド捕捉は、縞および白色のバーで示す。ｘ軸は、試薬配列を示す。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。
【図２９】図２９は、オリゴマー捕捉に対する疎水性残基の影響力を見る研究の結果を示す。Ａベータ４２オリゴマーをＣＳＦに添加し、潜在的なヘキサペプチド凝集体特異的結合試薬を有するビーズで捕捉した。オリゴマーの捕捉は、淡いバーで示し、ＣＳＦからのモノマーＡベータ４２のバックグラウンド捕捉は、より濃いバーで示す。ｘ軸は、ヘキサペプチド配列を示す。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。
【図３０Ａ】図３０Ａ〜Ｃは、オリゴマー捕捉に対する芳香族残基の影響力を見る研究の結果を示す。Ａベータ４２オリゴマーをＣＳＦに添加し、潜在的なヘキサペプチド凝集体特異的結合試薬を有するビーズで補足した。図３０Ａは、フォーマットＸＫＸＫＫＫ（それぞれ配列番号３６、５９および４１）のペプチドを示し、Ｘは、ｘ軸上に示す残基である（ＰＳＲ１は参照のために示す）。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。オリゴマーの捕捉は、黒色のバーで示し、ＣＳＦからのモノマーＡベータ４２のバックグラウンド捕捉は、白色のバーで示す。図３０Ｂは、フォーマットＫＫＫＸＫＸ（それぞれ配列番号１、６０および６１）のペプチドを示し、Ｘは、ｘ軸上に示す残基である（ＰＳＲ１は参照のために示す）。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。オリゴマーの捕捉は、水平の縞のバーで示し、ＣＳＦからのモノマーＡベータ４２および４０のバックグラウンド捕捉は、黒色、白色および点描のバーで示す。図３０Ｃは、フォーマットＸＫＸＫＫＫ（それぞれ配列番号３６および６２〜６６）のペプチドを示し、Ｘは、ｘ軸上に示す残基である。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。オリゴマーの捕捉は、淡いバーで示し、ＣＳＦからのモノマーＡベータ４２のバックグラウンド捕捉は、濃いバーで示す。
【図３０Ｂ】図３０Ａ〜Ｃは、オリゴマー捕捉に対する芳香族残基の影響力を見る研究の結果を示す。Ａベータ４２オリゴマーをＣＳＦに添加し、潜在的なヘキサペプチド凝集体特異的結合試薬を有するビーズで補足した。図３０Ａは、フォーマットＸＫＸＫＫＫ（それぞれ配列番号３６、５９および４１）のペプチドを示し、Ｘは、ｘ軸上に示す残基である（ＰＳＲ１は参照のために示す）。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。オリゴマーの捕捉は、黒色のバーで示し、ＣＳＦからのモノマーＡベータ４２のバックグラウンド捕捉は、白色のバーで示す。図３０Ｂは、フォーマットＫＫＫＸＫＸ（それぞれ配列番号１、６０および６１）のペプチドを示し、Ｘは、ｘ軸上に示す残基である（ＰＳＲ１は参照のために示す）。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。オリゴマーの捕捉は、水平の縞のバーで示し、ＣＳＦからのモノマーＡベータ４２および４０のバックグラウンド捕捉は、黒色、白色および点描のバーで示す。図３０Ｃは、フォーマットＸＫＸＫＫＫ（それぞれ配列番号３６および６２〜６６）のペプチドを示し、Ｘは、ｘ軸上に示す残基である。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。オリゴマーの捕捉は、淡いバーで示し、ＣＳＦからのモノマーＡベータ４２のバックグラウンド捕捉は、濃いバーで示す。
【図３０Ｃ】図３０Ａ〜Ｃは、オリゴマー捕捉に対する芳香族残基の影響力を見る研究の結果を示す。Ａベータ４２オリゴマーをＣＳＦに添加し、潜在的なヘキサペプチド凝集体特異的結合試薬を有するビーズで補足した。図３０Ａは、フォーマットＸＫＸＫＫＫ（それぞれ配列番号３６、５９および４１）のペプチドを示し、Ｘは、ｘ軸上に示す残基である（ＰＳＲ１は参照のために示す）。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。オリゴマーの捕捉は、黒色のバーで示し、ＣＳＦからのモノマーＡベータ４２のバックグラウンド捕捉は、白色のバーで示す。図３０Ｂは、フォーマットＫＫＫＸＫＸ（それぞれ配列番号１、６０および６１）のペプチドを示し、Ｘは、ｘ軸上に示す残基である（ＰＳＲ１は参照のために示す）。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。オリゴマーの捕捉は、水平の縞のバーで示し、ＣＳＦからのモノマーＡベータ４２および４０のバックグラウンド捕捉は、黒色、白色および点描のバーで示す。図３０Ｃは、フォーマットＸＫＸＫＫＫ（それぞれ配列番号３６および６２〜６６）のペプチドを示し、Ｘは、ｘ軸上に示す残基である。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。オリゴマーの捕捉は、淡いバーで示し、ＣＳＦからのモノマーＡベータ４２のバックグラウンド捕捉は、濃いバーで示す。
【図３１】図３１は、オリゴマー捕捉に対する異なるタイプの芳香族残基の影響力を見る研究の結果を示す。Ａベータ４２オリゴマーをＣＳＦに添加し、チオフェン環、荷電芳香族を有する潜在的な凝集体特異的結合試薬およびＰＳＲ１を有するビーズで捕捉した。オリゴマーの捕捉は、水平の縞のバーで示し、ＣＳＦからのモノマーＡベータ４２および４０のバックグラウンド捕捉は、黒色、白色および点描のバーで示す。ｘ軸は、結合試薬を示す。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。
【図３２】図３２は、オリゴマー捕捉における荷電残基の性質を見る研究の結果を示す。Ａベータ４２オリゴマーをＣＳＦに添加し、ジアミノブタン酸（ｆｄｂ）、オルニチン（（ｏｒｎｉｔｈａｎｅ）Ｏｒｎ、側鎖はペプチド主鎖に組み込まれている）を有する潜在的な凝集体特異的結合試薬およびＰＳＲ１を有するビーズで捕捉した。オリゴマーの捕捉は、最初のバーで示し、ＣＳＦからのモノマーＡベータ４２および４０のバックグラウンド捕捉は、２番目〜４番目のバーで示す。ｘ軸は、試薬を示す。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。
【図３３Ａ】図３３Ａ〜Ｃは、追加の正に荷電した凝集体特異的結合試薬を試験した結果を示す。Ａベータ４２オリゴマーをＣＳＦに添加し、潜在的な凝集体特異的結合試薬を有するビーズで捕捉した。図３３Ａおよび３３Ｂについて、オリゴマーの捕捉は、斜線の縞のバーで示し、ＣＳＦからのモノマーＡベータ４２のバックグラウンド捕捉は、塗りつぶしたバーで示す。ｘ軸は、試薬を示す。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。図３３Ｃについて、ＣＳＦに添加した０．５ｎｇ／ｍＬオリゴマー（最初のバー）、０．０５ｎｇ／ｍＬオリゴマー（２番目のバー）および０ｎｇ／ｍＬオリゴマー（３番目のバー）の捕捉を試験した。ｘ軸は、試薬を示す（コードおよび構造について表１３および１４を参照されたい）。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。
【図３３Ｂ】図３３Ａ〜Ｃは、追加の正に荷電した凝集体特異的結合試薬を試験した結果を示す。Ａベータ４２オリゴマーをＣＳＦに添加し、潜在的な凝集体特異的結合試薬を有するビーズで捕捉した。図３３Ａおよび３３Ｂについて、オリゴマーの捕捉は、斜線の縞のバーで示し、ＣＳＦからのモノマーＡベータ４２のバックグラウンド捕捉は、塗りつぶしたバーで示す。ｘ軸は、試薬を示す。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。図３３Ｃについて、ＣＳＦに添加した０．５ｎｇ／ｍＬオリゴマー（最初のバー）、０．０５ｎｇ／ｍＬオリゴマー（２番目のバー）および０ｎｇ／ｍＬオリゴマー（３番目のバー）の捕捉を試験した。ｘ軸は、試薬を示す（コードおよび構造について表１３および１４を参照されたい）。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。
【図３３Ｃ】図３３Ａ〜Ｃは、追加の正に荷電した凝集体特異的結合試薬を試験した結果を示す。Ａベータ４２オリゴマーをＣＳＦに添加し、潜在的な凝集体特異的結合試薬を有するビーズで捕捉した。図３３Ａおよび３３Ｂについて、オリゴマーの捕捉は、斜線の縞のバーで示し、ＣＳＦからのモノマーＡベータ４２のバックグラウンド捕捉は、塗りつぶしたバーで示す。ｘ軸は、試薬を示す。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。図３３Ｃについて、ＣＳＦに添加した０．５ｎｇ／ｍＬオリゴマー（最初のバー）、０．０５ｎｇ／ｍＬオリゴマー（２番目のバー）および０ｎｇ／ｍＬオリゴマー（３番目のバー）の捕捉を試験した。ｘ軸は、試薬を示す（コードおよび構造について表１３および１４を参照されたい）。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。
【図３４】図３４は、２つの同一のペプチドアレイ（それぞれに約１１２０の１２マーペプチドが入っている）を示し、これらは、オリゴマーＡベータ１−４２と優先的に結合するペプチドを同定する目的のために、３ｎｇ／ｍＬのモノマーまたはオリゴマーＡベータ１−４２とインキュベートした。結合したＡベータ１−４２は、ペプチドのＮ末端を認識する抗Ａベータ抗体（６Ｅ１０）を用いるウェスタンブロットにより検出した。モノマーではなくオリゴマーと結合する著しい数のペプチドが検出された。いくつかのペプチド（丸で囲む）だけがモノマーとオリゴマーの両方のＡベータを、大きな選択性なしで認識した。Ａベータペプチド捕捉に伴うシグナルを、Ｋｏｄａｋイメージステーションソフトウェアを用いて定量化し、ペプチドを、最高から最低までの正味の強度で並べた。上位５〜１０％のペプチドを、上位の結合体とみなした。
【図３５】図３５は、ＮＭＰＡにおける１％ＴＷ２０または１％ＺＷ３−１４洗浄によるＮＭＰＡバックグラウンド低減を示す。異なるマトリクス（ＴＢＳＴＴおよびＣＳＦ）を、ＡＳＲ１とインキュベートした。１％ＴＷ２０もしくは１％ＺＷ３−１４を用いて、または用いずに、インキュベーション後のプルダウンビーズを洗浄した。ｘ軸は、ＮＭＰＡにおけるプルダウンマトリクスおよびプルダウン洗浄後に用いた洗浄剤を示す。ｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。
【図３６】図３６は、洗浄剤洗浄を用いてのＮＭＰＡバックグラウンド低減および感度改善を示す。Ａベータ４２オリゴマーをＴＢＳＴＴまたはＣＳＦに添加し、ＡＳＲ１とインキュベートした。プルダウンビーズを、インキュベーションの後に１％洗浄剤を用いて、または用いずに洗浄した。上および下のグラフのｘ軸は、添加したオリゴマーレベルを示す。上のグラフのｙ軸は、Ａベータイムノアッセイからの相対的ライトユニットを示す。下のグラフのｙ軸は、ＡベータイムノアッセイからのＡベータ４２のＳ／Ｎ比を示す。
【図３７】図３７は、洗浄剤の構造および名称を示す。
【図３８】図３８は、様々なＡβ４２凝集体の未変性ゲル（ｎａｔｉｖｅ  ｇｅｌ）分析を示す。
【図３９】図３９は、ＰＳＲ１およびＡｃ−ＦＫＦＫＫＫ（配列番号９９）によるＡＤ  ＣＳＦ中のＡβ４０凝集体の捕捉を示す。
【図４０】図４０は、１６，０００ｇで１０分間または１３４，０００ｇで１時間遠心分離したアルツハイマー病ＣＳＦおよび正常ＣＳＦの上清およびペレット中の、ミスフォールディングタンパク質アッセイにより検出されたＡβ４０オリゴマーの量を示す。凡例：小さいチェック：全量Ａβ４０；大きいチェック：１６，０００ｇ上清；水平の線：１６，０００ペレット；垂直の線：１３４，０００ｇ上清、斜線：１３４，０００ｇペレット。
【図４１】図４１は、脾臓におけるＡＡアミロイドーシスの組織学的評価を示す。コンゴレッド色素で染色された異なる度合いの脾臓アミロイド沈着の典型的な例を示す。アミロイドは、偏光の下で研究すると、緑色の複屈折を示す。１＋、濾胞での非常に薄い限局的な沈着（Ａ）、２＋、脾臓の限定された領域におけるよりはっきりした濾胞周囲のアミロイド沈着（ＢおよびＣ）、３＋、ほとんどまたは全ての濾胞の周辺の中程度のアミロイド沈着（Ｄ）、４＋、濾胞の周辺に局在するが、連続的な浸潤を頻繁に形成している大規模なアミロイド沈着（ＥおよびＦ）。（×２５）
【図４２】図４２は、ＰＳＲ１被覆ビーズが、ＡＡ関連部分を捕捉できることを証明する。（Ａ〜Ｃ）ＰＳＲ１で枯渇させた投入物（Ａ）、溶出物（Ｂ）およびビーズ（Ｃ）画分に対してモノクローナル抗マウスＳＡＡ抗体を用いるイムノブロッティング。このミスフォールディングタンパク質アッセイ（ＭＰＡ）は、３または９ｕＬのＰＳＲ１被覆ビーズを用い、脾臓ＡＡのマウス（ＡＡ）および対照未処置マウス（Ｃｔｒｌ）からの１、４または８ｕＬの１０％ｗ／ｖ脾臓ホモジネートを投入物として用いて行った。（Ｄ）サンドイッチＥＬＩＳＡによるＳＡＡ関連種の検出。検出限界未満の値は、０ｕｇ／ｍＬとして表す。
【図４３】図４３は、ＡＡ  ＭＰＡアッセイの最適化を示す。投入物、ＰＳＲ１で枯渇させた投入物、ビーズおよび溶出画分に対してポリクローナル抗マウスＳＡＡ／ＡＡ抗体（「ＡＡ１３８」）を用いるイムノブロットを示す。ＭＰＡは、６ｕｌのＰＳＲ１被覆ビーズと、投入物としての脾臓ＡＡのマウス（ＡＡ＋）、単一のＡｇＮＯ３注射でチャレンジした対照マウス（ＡｇＮＯ３抗原刺激（ｐｒｉｍｅｄ））および対照未処置マウス（未処置）からの５０ｕｇの全タンパク質に相当する１０％ｗ／ｖ脾臓ホモジネートとを用いて行った。アクチンは、ローディング対照として用いた。
【図４４】図４４は、ＡＡ凝集体の変性が、ＡＡ関連部分の検出を妨げることを証明する。溶出画分に対するサンドイッチＥＬＩＳＡによるＳＡＡ関連種の検出を示す。変性は、脾臓ＡＡのマウスからの９ｕＬの１０％ｗ／ｖ脾臓ホモジネートを、１３．５ｕＬの変性緩衝液と混合し、１０または３０分間、室温または３７℃にて、７５０ｒｐｍでインキュベートすることにより達成し、その後に、５．４ｕＬの中和緩衝液で中和した（ｄｅｎａｔ−ＡＡ）。緩衝対照（ｂｕｆｆ−ＡＡ）は、脾臓ＡＡのマウスからの９ｕＬの１０％ｗ／ｖ脾臓ホモジネートを、予め混合した１３．５ｕＬの変性緩衝液および５．４ｕＬの中和緩衝液と混合することにより調製した。ＭＰＡは、上記の４つの変性試料、ならびに緩衝ＡＡ試料、非変性ＡＡ含有試料（ｕｎｄｅｎａｔ−ＡＡ）、対照ＡｇＮＯ３処置マウスからの非変性脾臓ホモジネート試料（ｕｎｄｅｎａｔ−ＡｇＮＯ３）および対照未処置マウスからの非変性脾臓ホモジネート試料（ｕｎｄｅｎａｔ−ＢＬ６）を用いて行った。
【図４５】図４５は、ＰＳＲ１ビーズが、緩衝液（Ａ）および血漿（Ｂ）の両方において、アミリンモノマーよりもｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成アミリン原線維と優先的に結合することを示す。
【図４６】図４６は、ＩＩ型糖尿病患者からの膵臓組織におけるアミリン凝集体を、変性剤（変性）で処理しない限り、ＥＬＩＳＡ（未変性）により検出できないことを示す。アミリンは、正常な非疾患患者からの膵臓組織において低レベルでしか見出されない。凡例：丸：正常、未変性；四角：ＩＩ型糖尿病、未変性；三角；正常、変性；逆三角：ＩＩ型糖尿病、変性。
【図４７】図４７は、ＰＳＲ１が、膵臓組織からのモノマーよりもアミリン原線維を優先的に検出することを証明する。凡例：丸：正常、未変性；四角：ＩＩ型糖尿病、未変性；三角；正常、変性；逆三角：ＩＩ型糖尿病、変性。
【図４８】図４８は、ＩＩ型糖尿病膵臓組織におけるアミリン原線維が、血漿中で、ＰＳＲ−１と結合するが、グルタチオンまたは５Ｌ（ＰＳＲ１の負バージョン）対照ビーズと結合しないことを証明する。凡例：丸：５Ｌビーズ；四角：グルタチオンビーズ；三角：ＰＳＲ１ビーズ。
【図４９】図４９は、アルファ−シヌクレイン（ａＳｙｎ）原線維が、ＥＬＩＳＡにより検出されないことを示す。凡例：塗りつぶした丸、変性原線維；塗りつぶしていない丸、未変性。
【図５０】図５０は、対照ビーズではなくＰＳＲ１ビーズは、ＣＳＦまたは血漿に添加したアルファシヌクレイン原線維を捕捉できることを示す。凡例：塗りつぶした四角：ＰＳＲ１−ＣＳＦ中のａＳｙｎ原線維；塗りつぶしていない四角：ＣＴＲＬ−ＣＳＦ中のａＳｙｎ原線維；塗りつぶした三角：ＰＳＲ１−血漿中のａＳｙｎ原線維；塗りつぶしていない逆三角：血漿中のａＳｙｎ原線維。
【図５１】図５１は、ＰＳＲ１が、ＣＳＦおよび血漿において、モノマーよりもアルファ−シヌクレイン原線維と優先的に結合することを示す。凡例：塗りつぶした四角：ＣＳＦ中のａＳｙｎ原線維；塗りつぶしていない四角：ＣＳＦ中の変性ａＳｙｎ；塗りつぶした三角：血漿中の未変性ａＳｙｎ原線維；塗りつぶしていない三角：血漿中の変性ａＳｙｎ。
【図５２】図５２は、異なる条件下でＰＳＲ１ビーズから溶出したアルファシヌクレインの量を示す。凡例：淡いバー：ＧｄｎＳＣＮ；濃いバー：ＮａＯＨ。
【図５３Ａ】図５３は、Ｔｇ（ＳＨａＰｒＰ）マウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存プロットを示す。（Ａ）Ｔｇ（ＳＨａＰｒＰ）マウスに、プリオン力価を見積もるために、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）２６３Ｋハムスター脳ホモジネートの１０−２〜１０−１２の範囲の１０倍系列希釈を接種した。（Ｂ）２６３Ｋプリオン症状性ハムスターからのプールした感染性プリオン血漿とインキュベートしたＰＳＲ１ビーズをｉ．ｃ．接種したＴｇ（ＳＨａＰｒＰ）マウスのバイオアッセイ。ハムスターから採血し、２６３Ｋプリオンの接種の示した日数後に屠殺にした。マウスに、図に示すように、ＰＢＳまたはＴＢＳＴＴ中の５．２５または１０．５μｌビーズのいずれかを接種した。
【図５３Ｂ】図５３は、Ｔｇ（ＳＨａＰｒＰ）マウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存プロットを示す。（Ａ）Ｔｇ（ＳＨａＰｒＰ）マウスに、プリオン力価を見積もるために、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）２６３Ｋハムスター脳ホモジネートの１０−２〜１０−１２の範囲の１０倍系列希釈を接種した。（Ｂ）２６３Ｋプリオン症状性ハムスターからのプールした感染性プリオン血漿とインキュベートしたＰＳＲ１ビーズをｉ．ｃ．接種したＴｇ（ＳＨａＰｒＰ）マウスのバイオアッセイ。ハムスターから採血し、２６３Ｋプリオンの接種の示した日数後に屠殺にした。マウスに、図に示すように、ＰＢＳまたはＴＢＳＴＴ中の５．２５または１０．５μｌビーズのいずれかを接種した。
【図５４】図５４は、Ｔｇ（ＳＨａＰｒＰ）マウスからの脳切片の病理を示す。２６３Ｋプリオン感染ハムスター脳ホモジネート（Ｂ）を接種したマウス、プール２（１１７〜１１８ｄｐｉ）（Ｃ）およびプール１（１４３〜１５４ｄｐｉ）（Ｄ）からの血漿とインキュベートしたＰＳＲ１ビーズを接種したマウスは、ヘマトキシリンおよびエオシン染色により示される空胞、ＰｒＰ抗体ＳＡＦ８４により視覚化されるＰｒＰＳｃ沈着、およびＧＦＡＰに対する抗体により明示される星状細胞グリオーシスを示す。非接種マウス（Ａ）は、空胞形成、ＰｒＰＳｃ沈着またはグリオーシスの徴候を示さない。ヒストブロット分析を用いて、プロテイナーゼＫ消化およびＰＯＭ１での染色後のＰｒＰＳｃ沈着を示した。
【図５５】図５５は、Ｔｇ（ＳＨａＰｒＰ）マウスからのプロテイナーゼＫで消化した脳ホモジネートのウェスタンブロット分析を示す。（Ａ〜Ｃ）プロテイナーゼＫ耐性物質が、プール１（１４３〜１５４ｄｐｉ；マウス♯１〜９）および２（１１７〜１１８ｄｐｉ；マウス♯１〜３）からの血漿とインキュベートしたＰＳＲ１ビーズをｉ．ｃ．接種したＴｇ（ＳＨａＰｒＰ）に存在する。対照試料は、なし：健常マウスからの脳ホモジネート、および２６３：２６３Ｋプリオンを接種したマウスからの脳ホモジネートと表示する。分子量標準物質は、キロダルトンで示す。マウス♯１には、ＰＢＳ中の１０．５μｌビーズを、マウス♯２〜４には、ＰＢＳ中の５．２５μｌビーズを、マウス♯５および６には、ＴＢＳＴＴ中の１０．５μｌビーズを、マウス♯７および８には、ＴＢＳＴＴ中の５．２５μｌビーズを、そしてマウス♯１〜３（１１７〜１１８ｄｐｉ）には、ＴＢＳＴＴ中の１０．５μｌビーズを接種した。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
表の簡単な説明
表１は、例示的なコンフォメーション疾患および関連するコンフォメーションタンパク質を列挙する。
【００６３】
表２は、ＡＳＢ試薬を作製するための例示的なペプチド配列を列挙する。
【００６４】
表３は、ＡＳＢ試薬を作製するために適切な例示的なペプトイド領域を列挙する。
【００６５】
表４は、表３で用いた略語についての一覧を提供する。
【００６６】
表５は、表３に列挙したペプトイド配列についての関係する構造を提供する。
【００６７】
表６は、実施例３で試験したペプトイドについての特徴決定情報を提供する。
【００６８】
表７は、漸増密度のＰＳＲ１（＋＋＋Ａ＋Ａ、配列番号１５）とコンジュゲートしたストレプトアビジン磁性ビーズにより捕捉される全プリオンシグナルを示す。
【００６９】
配列表の簡単な説明
配列番号１〜８は、ＡＳＢ試薬の作製において用いる例示的なペプチドのアミノ酸配列を提供する。
【００７０】
配列番号９〜２９は、ＡＳＢ試薬の作製において用いる例示的なペプトイドの改変アミノ酸配列を提供する。
【００７１】
発明の詳細な説明
本発明は、ある電荷密度にて固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する試薬の発見と関連付けられる。これらの凝集体は、アルツハイマー病、糖尿病、全身性アミロイドーシスなどのようなコンフォメーション疾患と関連することがある。
【００７２】
モノマーよりも凝集体と優先的に結合する試薬の発見により、コンフォメーション疾患またはその他の使用のためにこれらの試薬を利用する検出アッセイ、診断アッセイおよび精製または単離方法の開発が可能になる。
【００７３】
いずれの理論にも拘束されることを望まないが、これらのＡＳＢ試薬が凝集体と優先的に結合し、それを検出する能力は、凝集体内のモノマー単位の反復の性質によると考えられる。
【００７４】
多くの凝集体は、類似の物理的特性を共有する。例えば、プリオンタンパク質の凝集体であるＰｒＰＳｃは、以下の特徴を示す：β−シート含量の増加（ＰｒＰＣにおいて約３％に対してＰｒＰＳｃにおいて＞４０％）、およびＰｒＰＳｃ線維は、線維軸に沿って垂直に配向されたβ−シートで構成される。Ａβペプチドの凝集体は、類似のβ−シート構造を共有する（Ｌｕｈｒｓら、２００５年、ＰＮＡＳ１０２巻：１７３４２頁）。本出願人は、これらの反復タンパク質表面との結合は、発明の凝集体特異的試薬が、固体支持体に付着している場合にモノマーよりも凝集体と優先的に結合することの機序であると考える。
【００７５】
本発明のＡＳＢ試薬は、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している。いずれの特定の理論にも拘束されることを望まないが、本出願人は、ＡＳＢ試薬の正電荷により、それらが、ＡＳＢ試薬の正電荷と凝集体の負電荷との間のイオン性相互作用により、凝集体と結合することが可能になると考えている。これらの負電荷は、凝集体中のミスフォールディングされた配座異性体の露出した負に荷電した残基、または凝集体に含有される塩、脂質もしくはその他の種の負電荷によりもたらされることがある。イオン性相互作用は重要であるが、凝集体の構造およびサイズも、結合において役割を有する。なぜなら、ＡＳＢ試薬は、露出した正電荷を有する凝集体と優先的に結合できるからである。
【００７６】
さらに、ＡＳＢ試薬は、固体支持体上においてＡＳＢ試薬の電荷密度が増加するので、モノマーよりも凝集体に対する優先性の増加を示す。いずれの特定の理論にも拘束されることを望まないが、本出願人は、電荷密度の増加により、ＡＳＢ試薬が、より大きいアビディティで、露出した負電荷の反復パターンを有する規則正しい構造を含有する凝集体と結合することが可能になると考える。
【００７７】
これらのＡＳＢ試薬は、凝集体とのこの優先的な結合を示すために、より大きい構造またはその他のタイプの骨格分子の一部である必要はない。例示するＡＳＢ試薬は本発明の方法において有用なＡＳＢ試薬についての出発点（例えばサイズまたは配列の特徴の点で）を提供する一方で、より望ましい特質（例えばより高い親和性、より大きい安定性、より大きい溶解度、より小さいプロテアーゼ感受性、より大きい特異性、合成がより容易であることなど）を有するＡＳＢ試薬を生成するために多くの改変を行うことができることが、当業者に明らかである。
【００７８】
全般的に、本明細書で記載するＡＳＢ試薬は、ある電荷密度にて固体支持体に付着している場合にモノマーよりも凝集体と優先的に結合できる。つまり、これらの試薬は、生体のまたは死後の脳、脊髄、脳脊髄液またはその他の神経系組織ならびに血液および脾臓を含む生物学的または非生物学的な実質上いずれの試料においても凝集体の存在の迅速な検出を可能にする。ＡＳＢ試薬は、よって、広範囲の単離、精製、検出、診断および治療上の用途において有用である。
【００７９】
本発明の実施は、そうでないと示さない限り、当該分野の範囲内の化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来の方法を採用する。このような技術は、文献に詳細に説明されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０年）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．  ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．  Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．  ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６年、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９年）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｂｉｒｄｉ，  Ｋ．Ｓ．編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７年）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９９年、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：  Ａｎ  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ、（Ｒｅａｍら編、１９９８年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）；ＰＣＲ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ）、第２版（ＮｅｗｔｏｎおよびＧｒａｈａｍ編、１９９７年、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）；ＰｅｔｅｒｓおよびＤａｌｒｙｍｐｌｅ、Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（第２版）、Ｆｉｅｌｄｓら（編）、Ｂ．Ｎ．  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹを参照されたい。
【００８０】
本発明の試薬および方法は、もちろん変動し得るので、特定の処方またはプロセスパラメータに限定されないことが理解される。本明細書で用いる用語は、本発明の特定の実施形態を記載する目的のためのものであり、限定することを意図しないことも理解される。
【００８１】
Ｉ．定義
本発明の理解を容易にするために、本願において用いる選択された用語について以下に論じる。
【００８２】
タンパク質は、タンパク質ミスフォールディングの結果として、１より多いコンフォメーションで存在し得る。本明細書で用いる場合、用語「配座異性体」は、あるコンフォメーションのタンパク質モノマーのことをいう。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、タンパク質の大多数が正しくフォールディングされた配座異性体として存在する。配座異性体に関して本開示において用いる場合、用語「天然の／未変性の（ｎａｔｉｖｅ）」または「細胞性の」は、タンパク質の正しくフォールディングされた配座異性体のことをいう。タンパク質は、ミスフォールディングされた配座異性体としても存在することがある。多くの場合、これらのミスフォールディングされた配座異性体は、病原性である。本明細書で用いる場合、用語「病原性」は、タンパク質もしくは配座異性体が実際に疾患を引き起こすことを意味することがあり、またはこれは、タンパク質もしくは配座異性体が疾患と関連し、よって、疾患が存在する場合に存在することを単に意味することがある。病原性配座異性体が存在するタンパク質の例は、表１の右の列に列挙する。つまり、本開示と関連して用いられる病原性タンパク質または配座異性体は、必ずしも疾患の具体的な原因因子であるタンパク質である必要はなく、よって、感染性であってもなくてもよい。配座異性体と関連して用いる場合の用語「非病原性」は、その存在が疾患と関連しないタンパク質の未変性の配座異性体のことをいう。特定の疾患、例えばアルツハイマー病と関連する病原性配座異性体は、「病原性アルツハイマー病配座異性体」と記載することがある。
【００８３】
いくつかの場合では、タンパク質の天然ではない配座異性体は、疾患と関連しない。例えばＳｕｐ３５ｐのような酵母プリオンは、酵母細胞において天然ではない配座異性体として存在し得るが、酵母細胞の生長または生存性に対して影響を有さない。疾患と関連しない天然ではない配座異性体を形成するタンパク質の他の例は、カーリン（Ｅ．ｃｏｌｉ）、シャプリン（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、プリオンＨｅｔ−ｓ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ  ａｎｓｅｒｉｎａ）、マラリアコートタンパク質、いくつかのクモにおけるクモの糸、メラニン細胞タンパク質Ｐｍｅｌ１７、組織型プラスミノゲンアクチベータ（ｔＰＡ）ならびにＡＣＴＨ、ベータエンドルフィン、プロラクチンおよび成長ホルモンのようなホルモンである。
【００８４】
上で論じた天然ではない配座異性体とは対照的に、いくつかのタンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏでは天然ではない配座異性体として存在しないが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて天然ではない配座異性体を形成する能力がある場合がある。天然ではない配座異性体を形成する能力があるこれらのタンパク質のいくつかの例は、ミオグロビン、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼのｐ８５αサブユニットのＳＨ３ドメイン、アシルホスファターゼおよびＨｙｐＦ−Ｎ（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
【００８５】
本明細書で用いる場合、用語「凝集体」は、タンパク質の天然ではない配座異性体を１コピーより多く含有する複合体のことをいい、配座異性体間の天然ではない相互作用から生じる。凝集体は、同じタンパク質の複数コピー、１より多いタンパク質の複数コピーおよび限定されないが、糖タンパク質、リポタンパク質、脂質、グリカン、核酸および塩を含む追加の成分を含有することがある。凝集体は、封入体、プラークまたはアグリソームのような構造で存在することがある。凝集体のいくつかの例は、無定形凝集体、オリゴマーおよび原線維である。無定形凝集体は、典型的には、不規則で不溶性である。「オリゴマー」は、本明細書で用いる場合、タンパク質の天然ではない配座異性体を１コピーより多く含有する。典型的には、これらは、少なくとも２モノマーで、１０００モノマー以下、またはいくつかの場合においては１０６モノマー以下を含有する。オリゴマーは、小ミセル凝集体および前原線維（ｐｒｏｔｏｆｉｂｒｉｌ）を含む。小ミセル凝集体は、典型的に、可溶性で規則正しく、球状の構造である。前原線維も、典型的に、ベータ−シート構造を有する可溶性で規則正しい凝集体である。前原線維は、典型的に、曲線をなす構造であり、少なくとも１０、またはいくつかの場合では少なくとも２０のモノマーを含有する。原線維は、典型的に不溶性で、高度に規則正しい凝集体である。原線維は、典型的に、数百〜数千のモノマーを含有する。原線維は、例えば、交差ベータシート構造を示すアミロイドを含み、コンゴレッドで染色し、偏光の下で見た場合に、澄んだ黄緑色の複屈折により同定できる。単一試料中に含有される場合に、無定形凝集体、オリゴマーおよび原線維のような凝集体は、遠心分離により分離されることがある。例えば、１４，０００×ｇにて１０分間の遠心分離は、典型的に、大きい原線維および無定形凝集体のような非常に大きい凝集体（１０〜１０００ＭＤａ）だけを取り出し、１００，０００×ｇにて１時間の遠心分離は、典型的に、より小さい原線維および無定形凝集体のような１ＭＤａより大きい凝集体を取り出す。凝集体のサイズおよび溶解度は、分離のために要求される沈降速度に影響する。
【００８６】
本発明の凝集体は、天然ではない配座異性体として存在するかまたは存在する能力がある上で論じたいずれのタンパク質も含有してよい。多くの場合、凝集体は、疾患と関連する。このような疾患およびそれらの関連するコンフォメーションタンパク質の例を、表１に列挙する。他の場合では、凝集体は、製薬またはその他の工業的な使用のためのタンパク質の高い製造収率と関連する。例えば、組換えインスリンまたは治療上の抗体のようなタンパク質は、高レベルで生成される場合に凝集する傾向にある。凝集体は、分泌顆粒における天然の貯蔵物の形で見出すこともできる（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００９年、３２５巻：３２８頁）。
【００８７】
用語「凝集体特異的結合試薬」または「ＡＳＢ試薬」は、ある電荷密度にて固体支持体に付着している場合に、モノマーと比較して凝集体と優先的に結合する、それらに限定されないがペプチドおよびペプトイドを含む任意のタイプの試薬のことをいう。結合は、親和性、アビディティまたは特異性の増加によることがある。例えば、あるいくつかの実施形態では、本明細書で記載する凝集体特異的結合試薬は、凝集体と優先的に結合するが、それでもなお、弱いが検出可能なレベルにてモノマーと結合する能力があってよい。典型的には、弱い結合またはバックグラウンドの結合は、例えば適当な対照の使用により、目的の凝集体との優先的な相互作用から容易に見分けられる。全般的に、本発明の方法で用いる凝集体特異的結合試薬は、過剰のモノマーの存在下で凝集体と結合する。好ましくは、ＡＳＢ試薬は、モノマーについての結合親和性／アビディティよりも少なくとも約２倍高い結合親和性／アビディティで凝集体と結合する。
【００８８】
「ＰＳＲ１」は、ＡＳＢ試薬の一例である。ＰＳＲ１は、配列番号１５の配列を含有する。配列番号１５の構造を、表５に示す。
【００８９】
凝集体特異的結合試薬は、それが特異的、非特異的または特異的結合と非特異的結合のいくらかの組み合わせで結合する場合、別のペプチドまたはタンパク質と「結合する」という。試薬は、それが、モノマーよりも凝集体とより大きい親和性、アビディティおよび／またはより大きい特異性で結合する場合、凝集体と「優先的に結合する」という。用語「優先的に結合する（ｂｉｎｄ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）」、「優先的に結合する（ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｂｉｎｄ）」、「選択的に結合する（ｂｉｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ）」、「選択的に結合する（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｂｉｎｄ）」および「選択的に捕捉する」は、本明細書において交換可能に用いられる。
【００９０】
「コンフォメーションタンパク質」は、タンパク質の天然およびミスフォールディングされた配座異性体のことをいう。
【００９１】
多くのコンフォメーションタンパク質は、コンフォメーション疾患タンパク質である。「コンフォメーション疾患タンパク質」は、コンフォメーション疾患と関連するタンパク質の天然および病原性のミスフォールディングされた配座異性体のことをいい、該タンパク質の構造は、望ましくない可溶性のオリゴマーまたはアミロイド原線維のような凝集体の形成をもたらすように変化されている（例えばミスフォールディングされている）。コンフォメーション疾患タンパク質の例は、限定することなく、Ａβおよびタウのようなアルツハイマー病タンパク質；ＰｒＰＳｃおよびＰｒＰＣのようなプリオンタンパク質；アルファ−シヌクレインのようなパーキンソン病タンパク質；アミロイドＡタンパク質のようなＡＡアミロイドーシスタンパク質ならびに糖尿病タンパク質アミリンを含む。疾患と、それに関連するタンパク質（２以上の異なるコンフォメーションが仮定される）の非限定的なリストを、以下に示す。
【００９２】
表１．
【００９３】
【表１−１】
2013510297.tif 000212
【００９４】
【表１−２】
2013510297.tif 000213
「コンフォメーション疾患タンパク質」は、本明細書で用いる場合、本明細書で記載する配列と全く同じ配列を有するポリペプチドに限定されない。この用語が、任意の同定されたかまたは同定されていない種または疾患（例えばアルツハイマー病、パーキンソン病など）からのコンフォメーション疾患タンパク質を包含することが、容易に明らかである。
【００９５】
「コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬」または「ＣＰＳＢ試薬」は、特定のタンパク質の１より多い配座異性体と相互作用する任意のタイプの試薬のことをいう。好ましくは、コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬は、コンフォメーションタンパク質の天然の配座異性体およびミスフォールディングされた配座異性体の両方と結合する。いくつかの場合では、コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬は、タンパク質のモノマーおよび凝集体の両方と結合することがある。あるいくつかの場合では、ＣＰＳＢ試薬は、タンパク質配列にかかわらず、凝集体構造を認識する。このようなＣＰＳＢ試薬の例は、Ａ１１抗体であり、これは、Ａベータ、ＰｒＰおよびアルファ−シヌクレインの凝集体を認識する（Ｋａｙｅｄら、２００３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００巻：４８６頁）。その他の場合では、ＣＰＳＢ試薬は、Ａベータ凝集体だけを認識する。しかし、多くの場合では、ＣＰＳＢ試薬は、タンパク質のモノマーだけと結合する。ＣＰＳＢ試薬が捕捉試薬として用いられる本発明の方法では、ＣＰＳＢは、凝集体と結合しなければならない。ＣＰＳＢ試薬が凝集体を検出するために用いられる本発明の方法では、ＣＰＳＢは、凝集体と結合することは要求されない。ＣＰＳＢが凝集体と結合しない場合、凝集体検出のために、凝集体を変性することが必要である。典型的に、ＣＰＳＢ試薬は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体である。
【００９６】
用語「プリオン」、「プリオンタンパク質」、「ＰｒＰタンパク質」および「ＰｒＰ」は、病原性コンフォメーションまたは正常細胞性コンフォメーションのいずれも有さないことがあるプリオンタンパク質の凝集体（スクラピータンパク質、病原性タンパク質形、病原性アイソフォーム、病原性プリオンおよびＰｒＰＳｃと様々によぶ）および非凝集体（細胞性タンパク質形、細胞性アイソフォーム、非病原性アイソフォーム、非病原性プリオンタンパク質およびＰｒＰＣと様々によぶ）の両方、ならびに変性形および様々な組換え形のことをいうために本明細書において交換可能に用いる。凝集体は、ヒトおよび動物における疾患状態（海綿状脳症）と関連する。非凝集体は、動物細胞に通常存在し、適当な条件下で、病原性ＰｒＰＳｃコンフォメーションに変換されることがある。プリオンは、ヒト、ヒツジ、ウシおよびマウスを含む広く多様な哺乳類の種で天然に生成される。
【００９７】
用語「アルツハイマー病（ＡＤ）タンパク質」または「ＡＤタンパク質」は、病原性コンフォメーションまたは正常細胞性コンフォメーションのいずれも有さないことがあるアルツハイマー病タンパク質の凝集体（病原性タンパク質形、病原性アイソフォーム、病原性アルツハイマー病タンパク質およびアルツハイマー病配座異性体と様々によぶ）および非凝集体（正常細胞性形、非病原性アイソフォーム、非病原性アルツハイマー病タンパク質と様々によぶ）の両方、ならびに変性した形および様々な組換え形のことをいうために本明細書において交換可能に用いる。例示的なアルツハイマー病タンパク質は、Ａβおよびタウタンパク質を含む。
【００９８】
用語「アミロイド−ベータ」、「アミロイド−β」、「Ａベータ」、「Ａβ」、「Ａβ４２」、「Ａβ４０」、「Ａβｘ−４２」、「Ａβｘ−４０」および「Ａβ４０／４２」は、本明細書で用いる場合、全て、アミロイド−βペプチドのことをいい、これらは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の切断後に細胞外で見出される４３アミノ酸長までのファミリーである。用語Ａβは、任意の形のアミロイド−βペプチドのことを全般的にいうために用いる。用語「Ａβ４０」は、「Ａβｘ−４０」のことをいう。用語「Ａβ４２」は、「Ａβｘ−４２」のことをいう。用語「Ａβ１−４２」は、ＡＰＰのアミノ酸１〜４２に相当する断片のことをいう。用語「Ａβ１−４０」は、ＡＰＰのアミノ酸１〜４０に相当する断片のことをいう。用語Ａβ４０／４２は、Ａβ４０アイソフォームおよびＡβ４２アイソフォームの両方のことをいうために用いる。「グロブロマー」は、Ａβ４２により形成される可溶性のオリゴマーのことをいう（Ｂａｒｇｈｏｒｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００５年）。
【００９９】
用語「糖尿病タンパク質」は、病原性コンフォメーションまたは正常細胞性コンフォメーションのいずれも有さないことがある糖尿病疾患タンパク質の凝集体（病原性タンパク質形、病原性アイソフォーム、病原性糖尿病疾患タンパク質と様々によぶ）および非凝集体（正常細胞性形、非病原性アイソフォーム、非病原性糖尿病疾患タンパク質と様々によぶ）の両方、ならびに変性形および様々な組換え形のことをいうために本明細書において用いる。例示的なＩＩ型糖尿病タンパク質はアミリンであり、これは、膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）としても公知である。
【０１００】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに言及する場合の「単離された」により、示される分子が、該分子が天然で見出される生物全体から分離され、離されていることを意味するか、あるいは該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが天然で見出されない場合は、該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドをその意図する目的のために用いることができるようにその他の生物学的巨大分子から十分に離れていることを意味する。
【０１０１】
「ペプトイド」は、全般的に、少なくとも１つ、好ましくは２以上のアミノ酸置換、好ましくはＮ−置換グリシンを含有するペプチド模倣物のことをいうために使用される。ペプトイドは、なかでも、米国特許第５，８１１，３８７号に記載される。本明細書で用いる場合、「ペプトイド試薬」は、アミノ末端領域、カルボキシ末端領域および該アミノ末端領域と該カルボキシ末端領域との間の少なくとも１つの「ペプトイド領域」を有する分子である。アミノ末端領域は、典型的には任意のＮ−置換グリシンを含有しない、試薬のアミノ末端側の領域のことをいう。アミノ末端領域は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アシル、アミノ保護基、アミノ酸、ペプチドなどであり得る。カルボキシ末端領域は、任意のＮ−置換グリシンを含有しないペプトイドのカルボキシ末端の端の領域のことをいう。カルボキシ末端領域は、Ｈ、アルキル、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ保護基、アミノ酸、ペプチドなどを含み得る。
【０１０２】
「ペプトイド領域」は、アミノ末端に最も近いＮ−置換グリシンを含んでこのＮ−置換グリシンから開始し、カルボキシ末端に最も近いＮ−置換グリシンを含んでこのＮ−置換グリシンで終わる領域である。ペプトイド領域は、その中のアミノ酸の少なくとも３つがＮ−置換グリシンで置き換えられている試薬の部分のことを全般的にいう。
【０１０３】
「生理的ｐＨ」は、約５．５〜約８．５または約６．０〜約８．０または通常約６．５〜約７．５のｐＨのことをいう。
【０１０４】
「脂肪族」は、直鎖状または分岐鎖状の炭化水素部分のことをいう。脂肪族基は、ヘテロ原子およびカルボニル部分を含むことができる。
【０１０５】
「アミノ酸」は、２０の天然に存在し、遺伝子によりコードされるα−アミノ酸、またはその保護誘導体、および任意の非天然または非アルファアミノ酸のいずれかのことをいう。アミノ酸の保護誘導体は、アミノ部分、カルボキシ部分または側鎖部分上の１または複数の保護基を含有できる。アミノ保護基の例は、ベンジルオキシカルボニル、４−フェニルベンジルオキシカルボニル、２−メチルベンジルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、４−フルオロベンジルオキシカルボニル、４−クロロベンジルオキシカルボニル、３−クロロベンジルオキシカルボニル、２−クロロベンジルオキシカルボニル、２，４−ジクロロベンジルオキシカルボニル、４−ブロモベンジルオキシカルボニル、３−ブロモベンジルオキシカルボニル、４−ニトロベンジルオキシカルボニル、４−シアノベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、２−（４−キセニル）−イソプロポキシカルボニル、１，１−ジフェニルエタ−１−イルオキシカルボニル、１，１−ジフェニルプロパ−１−イルオキシカルボニル、２−フェニルプロパ−２−イルオキシカルボニル、２−（ｐ−トルイル）−プロパ−２−イルオキシカルボニル、シクロペンタニルオキシ−カルボニル、１−メチルシクロペンタニルオキシカルボニル、シクロヘキサニルオキシカルボニル、１−メチルシクロヘキサニルオキシカルボニル、２−メチルシクロヘキサニルオキシカルボニル、２−（４−トルイルスルホニル）−エトキシカルボニル、２−（メチルスルホニル）エトキシカルボニル、２−（トリフェニルホスフィノ）−エトキシカルボニル、フルオレニルメトキシカルボニル（「ＦＭＯＣ」）、２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、１−（トリメチルシリルメチル）プロパ−１−エニルオキシカルボニル、５−ベンゾイソキサリルメトキシカルボニル、４−アセトキシベンジルオキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル、２−エチニル−２−プロポキシカルボニル、シクロプロピルメトキシカルボニル、４−（デシクロキシ）ベンジルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、１−ピペリジルオキシカルボニル（１−ｐｉｐｅｒｉｄｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｌｙｌ）などのようなホルミル、トリチル、フタルイミド、トリクロロアセチル、クロロアセチル、ブロモアセチル、ヨードアセチルおよびウレタン型の遮蔽基；ベンゾイルメチルスルホニル基、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィンオキシドのようなアミノ保護基を含む。カルボキシ保護基の例は、メチル、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−メチルベンジル、ｐ−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、２，４−ジメトキシベンジル、２，４，６−トリメトキシベンジル、２，４，６−トリメチルベンジル、ペンタメチルベンジル、３，４−メチレンジオキシベンジル、ベンズヒドリル、４，４’−ジメトキシベンズヒドリル、２，２’，４，４’−テトラメトキシベンズヒドリル、ｔ−ブチル、ｔ−アミル、トリチル、４−メトキシトリチル、４，４’−ジメトキシトリチル、４，４’，４”−トリメトキシトリチル、２−フェニルプロパ−２−イル、トリメチルシリル、ｔ−ブチルジ���チルシリル、フェナシル、２，２，２−トリクロロエチル、β−（ジ（ｎ−ブチル）メチルシリル）エチル、ｐ−トルエンスルホニルエチル、４−ニトロベンジルスルホニルエチル、アリル、シンナミル、１−（トリメチルシリルメチル）プロパ−１−エン−３−イルなどの部分を含む。採用する保護基の種は、誘導体化された保護基が、適当な点にて、分子の残りの部分を破壊することなく選択的に除去できる限り、重要でない。保護基のさらなる例は、Ｅ．  Ｈａｓｌａｍ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、（Ｊ．  Ｇ．  Ｗ．  ＭｃＯｍｉｅ編、１９７３年）、第２章；ならびにＴ．  Ｗ．  ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．  Ｇ．  Ｍ．  Ｗｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、（１９９１年）、第７章（これらのそれぞれの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている）で見出される。
【０１０６】
「Ｎ−置換グリシン」は、式−（ＮＲ−ＣＨ２−ＣＯ）−（式中、各Ｒは、非水素部分である）の残基のことをいう。
【０１０７】
Ｎ−置換グリシンの塩、エステルおよび保護形（例えばＦｍｏｃまたはＢｏｃでのＮ−保護など）も含まれる。
【０１０８】
Ｎ−置換グリシンを含むアミノ酸置換を作製する方法は、なかでも、米国特許第５，８１１，３８７号（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている）に開示される。
【０１０９】
「サブユニット」は、他のサブユニットと連結して鎖、例えばペプチドを形成できる分子のことをいう。アミノ酸およびＮ−置換グリシンは、サブユニットの例である。他のサブユニットと連結している場合、サブユニットは「残基」とよぶことができる。
【０１１０】
ＩＩ．本発明の方法で用いる試薬
本発明で用いる凝集体特異的結合試薬（「ＡＳＢ試薬」）は、ある電荷密度にて固体支持体に付着している場合にモノマーよりも凝集体と優先的に結合する試薬である。
【０１１１】
典型的には、ＡＳＢ試薬は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している。好ましくは、このようなＡＳＢ試薬は、ペプチドまたは改変ペプチド（ペプトイドとして一般的に公知のものを含む）のいずれかである。
【０１１２】
あるいくつかの実施形態では、このようなＡＳＢ試薬は、ポリカチオン性である。最も好ましくは、ＡＳＢ試薬は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約２の正の、少なくとも約３の正の、少なくとも約４の正の、少なくとも約５の正の、少なくとも約６の正の、少なくとも約７の正の、少なくとも約８の正の、少なくとも約９の正の、少なくとも約１０の正の、少なくとも約１１の正のまたは少なくとも約１２の正の正味電荷を有する。ＡＳＢ試薬は、約１を超える任意の正の正味電荷を有してよい。全般的に、ＡＳＢ試薬の正味電荷が増加すると、試薬は、増加した優先性でモノマーよりも凝集体と結合する。
【０１１３】
好ましくは、ＡＳＢ試薬は、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約９０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１２０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約３０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約４０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約７０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約８０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約９０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１００００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１２０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１３０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１４０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１５０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１６０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１８０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２００００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約４００００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６００００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約８００００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１０００００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５０００００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１００００００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２００００００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２４０００００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２８０００００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約３００００００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約４００００００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５００００００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５４０００００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６００００００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６６０００００ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約７００００００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している。
【０１１４】
あるいくつかの実施形態では、ＡＳＢ試薬は、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１２ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約３０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約４０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約７０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約８０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約９０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１１０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１２０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１５０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２５０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約３００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約３５０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約４００ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約４５０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着している。出願人は、このより低い範囲の電荷密度で固体支持体に付着しているＡＳＢ試薬は、モノマーよりも、小さい凝集体と結合するのではなく、モノマーよりも原線維とだけ優先的に結合しやすいと考えている。
【０１１５】
好ましい実施形態では、ＡＳＢ試薬は、モノマーについての結合親和性および／またはアビディティよりも少なくとも約２倍高い、少なくとも約２．５倍高い、少なくとも約３倍高い、少なくとも約３．５倍高い、少なくとも約４倍高い、少なくとも約４．５倍高い、少なくとも約５倍高い、少なくとも約５．５倍高い、少なくとも約６倍高い、少なくとも約６．５倍高い、少なくとも約７倍高い、少なくとも約７．５倍高い、少なくとも約８倍高い、少なくとも約８．５倍高い、少なくとも約９倍高い、少なくとも約９．５倍高い、少なくとも約１０倍高いまたは少なくとも約２０倍高い、凝集体についての結合親和性および／またはアビディティを有する。
【０１１６】
好ましい実施形態では、ＡＳＢ試薬は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨよりも少なくとも１ｐＨ単位、少なくとも約２ｐＨ単位、少なくとも約３ｐＨ単位または少なくとも約４ｐＨ単位高いｐＫａを有する少なくとも１つの正に荷電した官能基を含有する。典型的に、試料は、ＡＳＢ試薬と、生理的ｐＨにて接触する。あるいくつかの実施形態では、しかし、ｐＨは、試料に対して不利益にならずに、生理的ｐＨよりも低いかまたは高いことがある。このような実施形態では、試料は、ＡＳＢ試薬と、約１のｐＨ、約２のｐＨ、約３のｐＨ、約４のｐＨ、約５のｐＨ、約６のｐＨ、約７のｐＨ、約８のｐＨ、約９のｐＨまたは約１０のｐＨで接触してよい。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、ＡＳＢ試薬は、疎水性官能基も含有する。疎水性官能基は、例えば、芳香族または脂肪族疎水性官能基であってよい。
【０１１８】
あるいくつかの実施形態では、ＡＳＢ試薬は、アミン、アルキル基、複素環、シクロアルカン、グアニジン、エーテル、アリルおよび芳香族のような官能基を含有することがある。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、ナフチル、フェノール、アニリン、フェニル、置換フェニル、ニトロフェニル、ハロゲン化フェニル、ビフェニル、スチリル、ジフェニル、ベンジルスルホンアミド、アミノメチルフェニル、チオフェン、インドリル、ナフチル、フランおよびイミダゾールからなる群より選択される芳香族官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、ハロゲン化フェニルは、クロロフェニルまたはフルオロフェニルである。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、第１級アミン、第２級アミン、第３級アミンおよび第４級アミンからなる群より選択されるアミン官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、イソブチル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチルならびにメチルおよびオクチルからなる群より選択されるアルキル官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、テトラヒドロフラン、ピロリジンおよびピペリジンからなる群より選択される複素環官能基を含む。あるいくつかの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は、シクロプロピルおよびシクロヘキシルからなる群より選択されるシクロアルカン官能基を含む。このような芳香族官能基は、ナフチル、フェノールおよびアニリンを含む。さらなる実施形態では、ＡＳＢ試薬は、反復モチーフを含有する。他の実施形態では、ＡＳＢ試薬は、凝集体の負に荷電した基と同じ間隔で正に荷電した基を含有する。
【０１１９】
Ａ．ＡＳＢペプチド試薬
好ましい実施形態では、ＡＳＢ試薬は、ペプチドである。典型的に、ＡＳＢペプチド試薬は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて少なくとも１の正味正電荷、少なくとも２の正味正電荷、少なくとも３の正味正電荷、少なくとも４の正味正電荷、少なくとも５の正味正電荷、少なくとも６の正味正電荷、少なくとも７の正味正電荷、少なくとも８の正味正電荷、少なくとも９の正味正電荷、少なくとも１０の正味正電荷、少なくとも１１の正味正電荷または少なくとも１２の正味正電荷を含有する。好ましい実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸はまた、生理的ｐＨで正に荷電されている。好ましい実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸は、リシンまたはアルギニンのような天然アミノ酸である。他の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸は、オルニチン、メチルリシン、ジアミノ酪酸、ホモアルギニンまたは４−アミノメチルフェニルアラニンのような非天然アミノ酸である。好ましい実施形態では、ＡＳＢ試薬は、疎水性アミノ酸を含有する。疎水性アミノ酸は、脂肪族疎水性アミノ酸であってよい。好ましい実施形態では、疎水性アミノ酸は、トリプトファン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、チロシン、ホモフェニルアラニン、フェニルグリシン、４−クロロフェニルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、チエニルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、４−アミノフェニルアラニン、ペンタフルオロフェニルアラニン、２−ナフチルアラニン、ｐ−ビフェニルアラニン、スチリルアラニン、置換フェニルアラニン、ハロゲン化フェニルアラニン、アミノイソ酪酸、アリルグリシン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、１−ナフチルアラニン、ピリジルアラニンまたは１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸である。
【０１２０】
ＡＳＢペプチド試薬は、ペプチドが所望の特徴を維持する限り、欠失、付加および置換（一般的に保存的な性質）のような本明細書で列挙する特定のＡＳＢペプチド試薬に対する改変を含むことができる。あるいくつかの実施形態では、保存的なアミノ酸の置き換えが好ましい。保存的なアミノ酸の置き換えは、それらの側鎖で関連付けられるアミノ酸のファミリー内で生じるものである。遺伝子によりコードされるアミノ酸は、４つのファミリーに全般的に分けられる：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電で極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、時に、芳香族アミノ酸として一緒に分類される。例えば、ロイシンからイソロイシンまたはバリン、アスパラギン酸からグルタミン酸、トレオニンからセリン、またはあるアミノ酸から構造的に関連付けられるアミノ酸への同様の保存的置き換えの散発的な置き換えは、生物学的活性に対して大きな影響を有さないことが、当然予測可能である。これらの改変は、部位特異的変異誘発によるように計画的であってよく、タンパク質を生成する宿主の変異またはＰＣＲ増幅による誤りによるように偶発であってもよい。さらに、以下の１または複数の効果を有する改変を行ってよい：凝集体についての親和性、アビディティおよび／または特異性の増加；ならびにプロテアーゼに対する安定性および耐性の増加。
【０１２１】
ＡＳＢペプチド試薬は、アミノ酸の１または複数の類似体（例えば非天然アミノ酸などを含む）、置換された結合を有するペプチド、ならびに天然に存在するものおよび天然に存在しないもの（例えば合成）の両方の当該技術において公知のその他の改変を含有してよい。つまり、合成ペプチド、ダイマー、マルチマー（例えばタンデムリピート、多重抗原性ペプチド（ＭＡＰ）形、直鎖状連結ペプチド）、環化、分岐状分子などは、ペプチドとみなす。これは、１または複数のＮ−置換グリシン残基（「ペプトイド」）およびその他の合成アミノ酸またはペプチドを含有する分子も含む（例えばペプトイドの記載について米国特許第５，８３１，００５号；同第５，８７７，２７８号；および同第５，９７７，３０１号；Ｎｇｕｙｅｎら（２０００年）Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．７巻（７号）：４６３〜４７３頁；およびＳｉｍｏｎら（１９９２年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９巻（２０号）：９３６７〜９３７１頁を参照されたい）。
【０１２２】
これらおよびその他のアミノ酸類似体およびペプチド模倣物の全般的な概説について、Ｎｇｕｙｅｎら（２０００年）Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．７巻（７号）：４６３〜４７３頁；Ｓｐａｔｏｌａ，  Ａ．Ｆ．、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ．  Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２６７頁（１９８３年）を参照されたい。Ｓｐａｔｏｌａ，  Ａ．  Ｆ．，  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ（全般的な概説）、Ｖｅｇａ  Ｄａｔａ、１巻、３号、（１９８３年３月）；Ｍｏｒｌｅｙ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ（全般的な概説）、４６３〜４６８頁（１９８０年）；Ｈｕｄｓｏｎ，  Ｄ．ら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔ  Ｒｅｓ、１４巻：１７７〜１８５頁（１９７９年）（−−ＣＨ２ＮＨ−−、ＣＨ２ＣＨ２−−）；Ｓｐａｔｏｌａら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ、３８巻：１２４３〜１２４９頁（１９８６年）（−−ＣＨ２−−Ｓ）；Ｈａｎｎ  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．  Ｉ、３０７〜３１４頁（１９８２年）（−−ＣＨ−−ＣＨ−−、ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ）；Ａｌｍｑｕｉｓｔら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ、２３巻：１３９２〜１３９８頁（１９８０年）（−−ＣＯＣＨ２−−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ、２３巻：２５３３頁（１９８２年）（−−ＣＯＣＨ２−−）；Ｓｚｅｌｋｅら、欧州特許出願ＥＰ４５６６５号ＣＡ：９７巻：３９４０５頁（１９８２年）（−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；Ｈｏｌｌａｄａｙら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ、２４巻：４４０１〜４４０４頁（１９８３年）（−−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；およびＨｒｕｂｙ、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ、３１巻：１８９〜１９９頁（１９８２年）（−−ＣＨ２−−Ｓ−−）も参照されたい。
【０１２３】
天然アミノ酸と非天然アミノ酸類似体との任意の組み合わせを用いて、本明細書で記載するＡＳＢ試薬を作製できることも明らかである。遺伝子によりコードされない、通常見られるアミノ酸類似体は、それらに限定されないが、オルニチン（Ｏｒｎ）；アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ベンゾチオフェニルアラニン（ＢｔＰｈｅ）；アルビジイン（Ａｂｚ）；ｔ−ブチルグリシン（Ｔｌｅ）；フェニルグリシン（ＰｈＧ）；シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；２−ナフチルアラニン（２−Ｎａｌ）；１−ナフチルアラニン（１−Ｎａｌ）；２−チエニルアラニン（２−Ｔｈｉ）；１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）；Ｎ−メチルイソロイシン（Ｎ−ＭｅＩｌｅ）；ホモアルギニン（Ｈａｒ）；Ｎα−メチルアルギニン（Ｎ−ＭｅＡｒｇ）；ホスホチロシン（ｐＴｙｒまたはｐＹ）；ピペコリン酸（Ｐｉｐ）；４−クロロフェニルアラニン（４−ＣｌＰｈｅ）；４−フルオロフェニルアラニン（４−ＦＰｈｅ）；１−アミノシクロプロパンカルボン酸（１−ＮＣＰＣ）；４−アミノメチルフェニルアラニン（ＡｍＦ）；およびサルコシン（Ｓａｒ）を含む。ＡＳＢ試薬で用いるアミノ酸のいずれも、Ｄ−異性体またはより典型的にはＬ−異性体のいずれであってもよい。
【０１２４】
本明細書で記載するＡＳＢ試薬を形成するために用い得るアミノ酸のその他の天然に存在しない類似体は、ペプトイドを含み、かつ／または生物学的機能等価物であるアミノ酸のスルホン酸およびホウ酸類似体のようなペプチド模倣化合物も、本発明の化合物において有用であり、これは、アイソスターで場合によって置き換えられている１または複数のアミド結合を有する化合物を含む。本発明の状況では、例えば、−−ＣＯＮＨ−−は、−−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＮＨＣＯ−−、−−ＳＯ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｏ−−、−−ＣＨ２ＣＨ２−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２ＳＯ−−、−−ＣＨ−−ＣＨ−−（ｃｉｓまたはｔｒａｎｓ）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−および１，５−ジ置換テトラゾールにより、これらのアイソスターが連結するラジカルが、−−ＣＯＮＨ−−が連結するラジカルと同様の配向を保持するように置き換えてよい。本明細書で記載するＡＳＢ試薬における１または複数の残基は、Ｎ−置換グリシン残基を含んでよい。
【０１２５】
つまり、試薬はまた、１または複数のＮ−置換グリシン残基を含んでよい（１または複数のＮ−置換グリシン残基を有するペプチドは、「ペプトイド」とよぶことがある）。例えば、あるいくつかの実施形態では、本明細書で記載する任意のＡＳＢ試薬の１または複数のプロリン残基は、Ｎ−置換グリシン残基で置き換えられる。この関係において適切な具体的なＮ−置換グリシンは、それらに限定されないが、Ｎ−（Ｓ）−（１−フェニルエチル）グリシン；Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）グリシン；Ｎ−（シクロプロピルメチル）グリシン；Ｎ−（イソプロピル）グリシン；Ｎ−（３，５−ジメトキシベンジル）グリシン；およびＮ−ブチルグリシンを含む。その他のＮ−置換グリシンも、本明細書で記載するＡＳＢ試薬配列中の１または複数のアミノ酸残基を置き換えるのに適切であり得る。
【０１２６】
本明細書で記載するＡＳＢ試薬は、モノマー、マルチマー、環化分子、分岐鎖状分子、リンカーなどであってよい。本明細書で記載する配列のいずれかのマルチマー（すなわち、ダイマー、トリマーなど）またはその生物学的機能等価物も企図する。マルチマーは、ホモマルチマーであり得（すなわち同一のモノマーで構成される）、例えば各モノマーが同じペプチド配列である。代わりに、マルチマーは、ヘテロマルチマーであり得、これは、マルチマーを構成するモノマーの全てが同一ではないことを意味する。
【０１２７】
マルチマーは、モノマーを互いに、あるいは担体に直接付着させることにより形成できる（例えば、多重抗原性ペプチド（ＭＡＰＳ）（例えば対称性ＭＡＰＳ）、ポリマー骨格、例えばＰＥＧ骨格に付着したペプチドおよび／またはスペーサ単位ありもしくはなしでタンデムに連結したペプチドを含む）。
【０１２８】
代わりに、連結基をモノマー配列に付加して、モノマーを一緒につなぎ合わせて、マルチマーを形成できる。連結基を用いるマルチマーの非限定的な例は、グリシンリンカーを用いるタンデムリピート；リンカーを介して担体に付着しているＭＡＰＳおよび／またはリンカーを介して骨格に付着している直鎖状連結ペプチドを含む。連結基は、当業者に公知の二官能性スペーサ単位（ホモ二官能性またはヘテロ二官能性のいずれか）を用いることを含み得る。例として、そして限定ではなく、このようなスペーサ単位を、４−（ｐ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジル（ＳＭＣＣ）、４−（ｐ−マレイミドフェニル）酪酸スクシンイミジルなどのような試薬を用いて連結ペプチドに一緒に組み込むための多くの方法が、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、現在のＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｉｌｌ．）に記載されているか、またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）およびＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓ．）（現在のＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）からも入手可能であり、「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ」、ＶＣＫ−Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ／Ｇｅｒｍａｎｙ（１９８９年）に記載されている。モノマー配列を一緒に連結するために用い得る連結基の一例は、−−Ｙ１−−Ｆ−−Ｙ２（式中、Ｙ１およびＹ２は同一または異なり、０〜２０、好ましくは０〜８、より好ましくは０〜３炭素原子のアルキレン基であり、Ｆは、−−Ｏ−−、−−Ｓ−−、−−Ｓ−−Ｓ−−、−−Ｃ（Ｏ）−−Ｏ−−、−−ＮＲ−−、−−Ｃ（Ｏ）−−ＮＲ−−、−−ＮＲ−−Ｃ（Ｏ）−−Ｏ−−、−−ＮＲ−−Ｃ（Ｏ）−−ＮＲ−−、−−ＮＲ−−Ｃ（Ｓ）−−ＮＲ−−、−−ＮＲ−−Ｃ（Ｓ）−−Ｏ−−のような１または複数の官能基である）である。Ｙ１およびＹ２は、ヒドロキシ、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノ、カルボキシル、カルボキシアルキルなどで場合によって置換されていてよい。モノマーの任意の適当な原子が、連結基に付着できることが理解される。
【０１２９】
さらに、本明細書で記載するＡＳＢ試薬は、直鎖状、分岐鎖状または環化されていてよい。モノマー単位は、環化でき、あるいは一緒に連結されて、直鎖状もしくは分岐鎖状の様式、環の形（例えばマクロ環）、星の形（デンドリマー）またはボールの形（例えばフラーレン）のマルチマーを提供してよい。当業者は、本明細書で開示するモノマー配列から形成できる多数のポリマーを容易に認識する。あるいくつかの実施形態では、マルチマーは、環状ダイマーである。上記と同じ用語を用いて、ダイマーは、ホモダイマーまたはヘテロダイマーであり得る。
【０１３０】
モノマーまたはマルチマーのいずれであっても環状の形は、それらに限定されないが、例えば（１）Ｎ末端アミンをＣ末端カルボン酸と、窒素とＣ末端カルボニルとの間の直接アミド結合形成によりもしくは例えばイプシロン−アミノカルボン酸との縮合によるようなスペーサ基の仲介により環化すること；（２）２つの残基の側鎖間の結合の形成により、例えばアスパラギン酸もしくはグルタミン酸側鎖とリシン側鎖との間にアミド結合を形成することによりまたは２つのシステイン側鎖間もしくはペニシラミン側鎖とシステイン側鎖との間もしくは２つのペニシラミン側鎖間にジスルフィド結合を形成することにより環化すること；（３）側鎖（例えばアスパラギン酸またはリシン）とそれぞれＮ末端アミンもしくはＣ末端カルボキシルのいずれかとの間のアミド結合の形成により環化すること；および／あるいは（４）２つの側鎖を、短い炭素スペーサ基の仲介により連結することのような上記の任意の結合により作製できる。
【０１３１】
さらに、本明細書で記載するＡＳＢ試薬は、追加のペプチドまたは非ペプチド成分も含んでよい。追加のペプチド成分の非限定的な例は、スペーサ残基、例えば２以上のグリシン（天然または誘導体化された）残基、または一方もしくは両方の端のアミノヘキサン酸リンカー、またはペプチド試薬の可溶化を助け得る残基、例えばアスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）のような酸性残基を含む。あるいくつかの実施形態では、例えば、ペプチド試薬は、多重抗原性ペプチド（ＭＡＰ）として合成される。典型的には、ペプチド試薬の複数コピー（例えば２〜１０コピー）は、分岐鎖状リシンのようなＭＡＰキャリアまたはその他のＭＡＰキャリアコア上に直接合成される。例えば、Ｗｕら（２００１年）Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２００１年１２３巻（２８号）：６７７８〜８４頁；Ｓｐｅｔｚｌｅｒら（１９９５年）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４５巻（１号）：７８〜８５頁を参照されたい。
【０１３２】
本明細書で記載するＡＳＢ試薬に含むことができる非ペプチド成分（例えば化学部分）の非限定的な例は、ペプチド試薬のいずれかの末端または内部での１または複数の検出可能な標識、タグ（例えばビオチン、Ｈｉｓ−Ｔａｇ、オリゴヌクレオチド）、色素、結合対のメンバーなどを含む。非ペプチド成分は、直接もしくはスペーサ（例えばアミド基）を介して、干渉しないように、定量構造活性データおよび／または分子モデリングにより予測される化合物の位置（複数可）に付着することもできる（例えば１または複数の標識の共有的付着により）。本明細書で記載するＡＳＢ試薬は、アミロイド特異的色素（例えばコンゴレッド、チオフラビンなど）のような化学部分も含み得る。化合物の誘導体化（例えば標識化、環化、化学部分の付着など）は、試薬の結合特性、生物学的機能および／または薬理活性に実質的に干渉すべきではない（それらをさらに増進してよい）。
【０１３３】
上記のペプチドは、それらに限定されないが、組換え構築物からの発現およびペプチド合成を含む当業者に公知の標準的な方法を用いて調製できる。
【０１３４】
Ｂ．ＡＳＢ試薬の基本として用いられる好ましいペプチドの例
本発明の凝集体特異的結合試薬を作製するために有用なペプチドの非限定的な例は、好ましくは、表２に示す配列に由来する。この表におけるペプチドは、従来の１文字アミノ酸コードで表され、アミノ末端を左に、そしてカルボキシ末端を右にして示す。
【０１３５】
この表における配列のいずれも、Ｇｌｙリンカー（Ｇｎ、ここでｎ＝１、２、３または４）を、アミノおよび／またはカルボキシ末端に場合によって含んでよい。典型的には、アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）をリンカーとして用いる。表における配列のいずれも、キャッピング基を、アミノおよび／またはカルボキシ末端に場合によって含んでよい。このようなキャッピング基の一例は、アセチル基である。キャッピング基は、負に荷電していないことが好ましい。
【０１３６】
表２：ＡＳＢ試薬を作製するためのペプチド配列
【０１３７】
【表２−１】
2013510297.tif 000214
【０１３８】
【表２−２】
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【０１３９】
【表２−３】
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【０１４０】
【表２−４】
2013510297.tif 000217
Ｃ．ペプトイドＡＳＢ試薬
特に好ましい実施形態では、ＡＳＢ試薬はペプトイドである。ペプトイドを作製する方法は、米国特許第５，８１１，３８７号および同第５，８３１，００５号、ならびに本明細書で開示する方法に開示される。好ましいペプトイドを以下に記載する。ＡＳＢペプトイド試薬は、ペプトイドが所望の特徴を維持する限り、欠失、付加および置換（一般的に保存的な性質）のような本明細書で列挙する特定のＡＳＢペプトイド試薬に対する改変を含むことができる。
【０１４１】
好ましいペプトイド配列
表３は、本発明で用いられるＡＳＢ試薬を調製するために適切なペプトイド領域（アミノからカルボキシへの向き）の例を列挙する。表４は、表３で用いた略語についての一覧を提供する。表５は、配列のそれぞれの関係する構造を提供する。特定のＡＳＢ試薬の調製は、本明細書において以下に記載する。
【０１４２】
表３：ＡＳＢ試薬のための代表的なペプトイド試薬
【０１４３】
【表３】
2013510297.tif 000218
表４：表３への略語の一覧
【０１４４】
【表４−１】
2013510297.tif 000219
【０１４５】
【表４−２】
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表５：表３のペプトイド領域の関係する構造
【０１４６】
【表５−１】
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【０１４７】
【表５−２】
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【０１４８】
【表５−３】
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【０１４９】
【表５−４】
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【０１５０】
【表５−５】
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特に好ましい実施形態では、ＡＳＢ試薬は、ＰＳＲ１の構造：
【０１５１】
【化２１】
2013510297.tif 000226
（式中、ＲおよびＲ’は任意の基であり得る）
を含有する。
【０１５２】
Ｄ．その他の骨格からのＡＳＢ試薬
本発明のあるいくつかの実施形態では、ＡＳＢ試薬は、ペプチドおよびペプトイド以外の正に荷電した有機分子骨格を含む。好ましい実施形態では、ＡＳＢ試薬は、デンドロンである。特に好ましい実施形態では、ＡＳＢ試薬は、
【０１５３】
【化２２】
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の構造を含む。
【０１５４】
Ｅ．本発明の方法で用いられるＡＳＢ試薬の同定
本発明の方法で用いられるＡＳＢ試薬は、ある電荷密度にて固体支持体に付着している場合にモノマーよりも凝集体と優先的に結合する。この特性は、任意の公知の結合アッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットなどのような標準的なイムノアッセイ；標識ペプチド；ＥＬＩＳＡ様アッセイ；および／または細胞ベースのアッセイ、特に「凝集体とＡＳＢ試薬との結合による凝集体の検出」に関する以下の項で記載するアッセイを用いて試験できる。
【０１５５】
本発明の方法で用いるＡＳＢ試薬の特異性を試験するある簡便な方法は、凝集体とモノマーの両方を含有する試料を選択することである。典型的には、このような試料は、疾患動物からの組織を含む。凝集体と特異的に結合することがわかっている本明細書で記載するＡＳＢ試薬は、固体支持体に付着しており（当該技術において周知であり、以下にさらに記載する方法により）、凝集体を他の試料成分から分離して（「プルダウン」）、固体支持体上の試薬−タンパク質結合相互作用の数と直接的に関連付けられる定量的な値を得るために用いられる。この結果を、未知の結合特異性を有するＡＳＢ試薬のものと比較して、このような試薬が凝集体と優先的に結合できるか否かを決定できる。
【０１５６】
ＩＩＩ．凝集体とＡＳＢ試薬との結合による凝集体の検出
記載するＡＳＢ試薬は、試料（例えば血液、脳、脊髄、ＣＳＦまたは器官試料のような生物学的試料）をスクリーニングするため、例えば、これらの試料中の凝集体の存在または非存在を検出するための多様なアッセイにおいて用いることができる。多くの現在の試薬とは異なって、本明細書で記載するＡＳＢ試薬は、血液試料、血液生成物、ＣＳＦもしくは生検試料を含む実質上いずれのタイプの生物学的または非生物学的試料における検出も可能にする。
【０１５７】
例えば、凝集体と関連する疾患の診断のための方法、および凝集体の存在または非存在について知ることが重要である任意のその他の状況において、上記検出方法を用いることができる。
【０１５８】
捕捉試薬または検出試薬のいずれかとしての凝集体特異的結合試薬の使用
本発明の方法で用いられるＡＳＢ試薬は、典型的に、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。１より多いコンフォメーションタンパク質の凝集体を含有することが期待される試料について、またはその方法の目的のためにどのタイプの凝集体が存在するかを決定することが重要である場合には、凝集体特異的結合試薬は、異なるタイプのコンフォメーションタンパク質についての異なる結合特異性および／または親和性を有するＣＰＳＢ試薬と組み合わせて検出のために用いるべきである。例えば、凝集体特異的結合試薬を捕捉試薬として用いる場合、コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬を検出試薬として用いるか、またはその逆であるべきである。しかし、アッセイされる特定の試料が、単一のタイプの凝集体だけを含有すると期待されるか、またはその方法の目的のためにどの凝集体が存在するかを決定することが重要でない場合、ＡＳＢ試薬は、捕捉および検出の両方の試薬として用いることができる。
【０１５９】
凝集体特異的結合試薬を捕捉剤として用いる方法
好ましい実施形態では、本発明は、凝集体を含有する疑いがある試料を、凝集体特異的結合試薬と、試薬と存在するならば凝集体との結合を可能にする条件下で接触させ、試料中の、もしあるならば凝集体の存在を、凝集体と試薬との結合により検出することにより、試料中の凝集体の存在を検出する方法を提供し、ここで、凝集体特異的結合試薬は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。
【０１６０】
本発明の方法で用いるために、試料は、凝集体を含有するとわかっているかまたは疑いがあるものであれば何でも可能である。試料は、生物学的試料（つまり、生体または以前は生きていた生物から調製された試料）または非生物学的試料であり得る。典型的に、生物学的試料は、体組織または体液を含有する。適切な生物学的試料は、それらに限定されないが、全血、血液分画物、血液成分、血漿、血小板、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、骨髄、尿、涙、乳汁、リンパ液、器官組織、脳組織、神経系組織、筋肉組織、非神経系組織、生検材料、剖検材料、脂肪生検材料、細胞、大便、胎盤、脾臓組織、リンパ組織、膵臓組織、気管支肺胞洗浄液または滑液を含む。好ましい生物学的試料は、血漿およびＣＳＦを含む。あるいくつかの実施形態では、試料は、ポリペプチドを含有する。
【０１６１】
試料は、本明細書で記載する１または複数のＡＳＢ試薬と、ＡＳＢ試薬（複数可）と試料中に存在するならば凝集体との結合を可能にする条件下で、接触させる。本明細書の開示に基づいて、特定の条件を決定することは、当業者の力量の十分に範囲内である。典型的には、試料とＡＳＢ試薬（複数可）とを一緒に、適切な緩衝液中で生理的ｐＨにて適切な温度（例えば約４〜３７℃）にて、適切な期間（例えば約１時間〜１晩）インキュベートして、結合の発生を可能にする。
【０１６２】
本方法のこれらの実施形態では、凝集体特異的結合試薬は捕捉試薬であり、試料中の凝集体の存在は、凝集体と凝集体特異的結合試薬との結合により検出される。捕捉の後に、凝集体の存在は、同時に捕捉および検出試薬として働くまさに同じ凝集体特異的結合試薬により検出され得る。代わりに、別個の検出試薬が存在でき、これは、異なる凝集体特異的結合試薬、または好ましくは１もしくは複数のコンフォメーションタンパク質特異的結合試薬のいずれかであり得る。好ましい実施形態では、ＣＰＳＢ試薬は、標識抗体である。好ましい実施形態では、捕捉ステップの後に、未結合の試料を除去し、凝集体を、ＡＳＢ試薬と形成した複合体から解離させて、解離凝集体を得る。解離凝集体を、第１ＣＰＳＢ試薬と接触させて第２複合体の形成を可能にし、試料中の凝集体の存在を、第２複合体の形成を検出することにより検出する。好ましい実施形態では、第２複合体の形成は、検出可能に標識された第２ＣＰＳＢ試薬を用いて検出する。第１ＣＰＳＢ試薬は、好ましくは、固体支持体に連結している。特に好ましい実施形態では、凝集体は、Ａベータタンパク質を含有し、ＣＰＳＢ試薬は、抗Ａベータ抗体である。
【０１６３】
凝集体特異的結合試薬を検出剤として用いる方法
他の実施形態では、本発明は、凝集体を含有する疑いがある試料を、コンフォメーションタンパク質のモノマーおよび凝集体の両方と結合するコンフォメーションタンパク質特異的結合試薬と、ＣＰＳＢ試薬と存在するならば凝集体とが結合して第１複合体が形成することを可能にする条件下で、接触させ、結合を可能にする条件下で第１複合体をＡＳＢ試薬と接触させ、試料中の、もしあるならば凝集体の存在を、凝集体とＡＳＢ試薬との結合により検出することにより、試料中の凝集体の存在を検出する方法を提供し、ここで、ＡＳＢ試薬は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。典型的には、捕捉ステップの後に、未結合の試料を除去する。ＣＰＳＢ試薬は、好ましくは、固体支持体と連結している。
【０１６４】
Ａ．凝集体を捕捉するための試薬
好ましい実施形態では、捕捉試薬は、凝集体特異的結合試薬であり、これは、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。他の実施形態では、捕捉試薬は、コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬であり、これは、コンフォメーションタンパク質のモノマーおよび凝集体の両方と結合する。
【０１６５】
捕捉試薬は、試料と、試料中の任意の凝集体が試薬と結合して複合体を形成することを可能にする条件下で、接触させる。このような結合条件は、当業者により容易に決定され、本明細書でさらに記載される。典型的に、上記方法は、マイクロタイタープレートのウェルまたは小容量プラスチックチューブで行われるが、任意の使いやすい容器が適切である。試料は、全般的に、液体試料または懸濁物であり、捕捉試薬の前または後に反応容器に加えることができる。
【０１６６】
捕捉試薬が上記の凝集体特異的結合試薬である場合、これは、好ましくは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌで固体支持体と連結する。
【０１６７】
捕捉試薬が、代わりに、ＣＰＳＢ試薬である場合、これは、好ましくは固体支持体と連結し、これは、以下の項においてさらに詳細に記載する。いくつかの実施形態では、固体支持体は、試料を加える前に付着している。固体支持体（例えば磁性ビーズ）は、まず、本明細書で記載する捕捉試薬が支持体に十分に固定化されるように、該捕捉試薬と反応させる。捕捉試薬が付着した固体支持体は、次いで、凝集体を含有する疑いがある試料と、捕捉試薬が凝集体と結合することを可能にする条件下で、接触させる。
【０１６８】
代わりに、捕捉試薬がＣＰＳＢ試薬である場合、これは、まず、固体支持体に付着させる前に凝集体を含有する疑いがある試料と接触させ、その後、捕捉試薬を固体支持体に付着させることができる（例えば、試薬は、ビオチン化されることができ、固体支持体は、固体支持体と連結されたアビジンまたはストレプトアビジンを含む）。
【０１６９】
あるいくつかの実施形態では、捕捉試薬と凝集体との間の複合体が確立された後に、未結合の試料物質（つまり、任意の未結合の凝集体を含む、捕捉試薬と結合しなかった試料の任意の成分）を除去できる。例えば、捕捉試薬が固体支持体に連結している場合、未結合の物質は、固体支持体を反応溶液（未結合の試料物質を含有する）から、例えば遠心分離、沈殿、ろ過、磁力などにより分離することにより、低減できる。複合体を有する固体支持体は、上記方法の次のステップを行う前に任意の残存試料物質を除去するために、場合によって１または複数の洗浄ステップに供してよい。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、未結合の試料物質の除去および任意の場合によっての洗浄の後に、結合した凝集体は、複合体から解離され、任意の公知の検出方法を用いて検出される。代わりに、複合体中の結合した凝集体は、捕捉試薬から解離することなく検出される。
【０１７１】
Ｂ．凝集体の解離および変性
捕捉試薬と結合して複合体を形成した後に、凝集体を、凝集体の検出を容易にするために処理してよい。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、未結合の物質を除去し、凝集体を、次いで、複合体から解離させる。「解離」とは、捕捉試薬から分離して凝集体を検出できるような、捕捉試薬からの凝集体の物理的分離のことをいう。複合体からの凝集体の解離は、例えば、低濃度（例えば０．４〜１．０Ｍ）のグアニジン塩酸塩またはグアニジンイソチオシアン酸塩を用いて遂行できる。
【０１７３】
その方法で用いるＣＰＳＢ試薬が、変性タンパク質を検出できるだけである場合、解離凝集体も変性される。「変性」は、ポリペプチドの天然のコンフォメーションを破壊することをいう。試薬から解離せずに変性することは、例えば、試薬が、試薬と凝集体とを共有的に連結する活性化可能な反応性基（例えば光反応性基）を含有する場合、遂行できる。
【０１７４】
好ましい実施形態では、凝集体は、同時に解離および変性される。
【０１７５】
凝集体は、高濃度の塩またはカオトロピック剤、例えば約３Ｍから約６Ｍのチオシアン酸グアニジン（ＧｄｎＳＣＮ）またはグアニジンＨＣｌ（ＧｄｎＨＣｌ）のようなグアニジウム塩を用いて同時に解離および変性してよい。好ましくは、カオトロピック剤は、検出を行う前に除去するかまたは希釈する。なぜなら、これらは、検出試薬の結合に干渉し得るからである。
【０１７６】
他の実施形態では、凝集体は、ｐＨを変更することにより、例えばｐＨを１２以上（「高ｐＨ」）に上げるかもしくはｐＨを２以下（「低ｐＨ」）に下げることにより、捕捉試薬との複合体から解離され、同時に、変性される。複合体を高ｐＨに曝露することが好ましい。１２．０から１３．０までのｐＨが、通常、十分である。好ましくは、１２．５から１３．０まで、１２．７から１２．９まで、または１２．９のｐＨを用いる。代わりに、複合体を低ｐＨに曝露することを用いて、病原性タンパク質を試薬から解離および変性させることができる。この代替について、１．０から２．０までのｐＨが十分である。いくつかの実施形態では、凝集体は、ｐＨ１２．５〜１３．２で、適切な時間量、例えば９０℃にて１０分間処理される。
【０１７７】
第１複合体を、高ｐＨまたは低ｐＨのいずれかに曝露することは、一般的に、短時間だけ、例えば６０分間、好ましくは１５分以下、より好ましくは１０分以下で行われる。いくつかの実施形態では、曝露は、室温より上、例えば約６０℃、７０℃、８０℃または９０℃にて行われる。凝集体を解離するのに十分な時間の曝露の後に、ｐＨを、酸性試薬（高ｐＨ解離条件を用いる場合）または塩基性試薬（低ｐＨ解離条件を用いる場合）のいずれかを加えることにより、中性（つまり、約７．０から７．５までのｐＨ）に容易に再調整できる。当業者は、適当なプロトコールを容易に決定でき、実施例を本明細書で記載する。
【０１７８】
全般的に、高ｐＨ解離条件に影響するために、ＮａＯＨを約０．０５Ｎ〜約０．２Ｎの濃度まで加えることが十分である。好ましくは、ＮａＯＨを約０．０５Ｎから約０．１５Ｎまでの濃度まで加え、より好ましくは約０．１ＮのＮａＯＨを用いる。解離が一旦遂行されると、ｐＨを、適切な量の酸性溶液、例えばリン酸、第１リン酸ナトリウムを加えることにより、中性（つまり、約７．０から７．５まで）に再調整できる。
【０１７９】
全般的に、低ｐＨ解離条件に影響するために、Ｈ３ＰＯ４を約０．２Ｍ〜約０．７Ｍの濃度まで加えることが十分である。好ましくは、Ｈ３ＰＯ４を、０．３Ｍから０．６Ｍまでの濃度まで加え、より好ましくは０．５ＭのＨ３ＰＯ４を用いる。解離が一旦遂行されると、ｐＨを、適切な量の塩基性溶液、例えばＮａＯＨまたはＫＯＨを加えることにより、中性（つまり、約７．０から７．５まで）に再調整できる。
【０１８０】
所望により、複合体からの凝集体の解離は、例えば低濃度（例えば０．４〜１．０Ｍ）のグアニジン塩酸塩またはグアニジンイソチオシアン酸塩を用いてタンパク質を変性させることなく遂行することもできる。ＷＯ２００６０７６４９７（国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００１０９０号）を、タンパク質を変性させることなく複合体から凝集体を解離させる追加の条件について参照されたい。代わりに、捕捉された凝集体はまた、例えば試薬を、試薬と凝集体とを共有的に連結するために用いることができる活性化可能な反応性基（例えば光反応性基）を含有するように改変する場合、試薬から解離することなく変性させることができる。
【０１８１】
解離の後に、凝集体を、次いで、捕捉試薬から分離する。この分離は、未結合の物質（今では解離凝集体）を含有する部分を取り出し、捕捉試薬を含有する部分を廃棄する以外は、上記の未結合の試料物質の除去と類似の様式で遂行できる。
【０１８２】
Ｃ．捕捉された凝集体の検出
凝集体の検出は、コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬を用いて遂行してよい。好ましい実施形態では、ＣＰＳＢ試薬は、コンフォメーションタンパク質上のエピトープを認識する抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）である。
【０１８３】
試料中の捕捉された凝集体の検出は、ＡＳＢ試薬を用いることにより遂行してもよい。このような試薬は、捕捉試薬が同じかもしくは異なる凝集体特異的結合試薬、またはコンフォメーションタンパク質特異的結合試薬のいずれかである実施形態において、用いてよい。
【０１８４】
その方法が、第１凝集体特異的結合試薬および第２凝集体特異的結合試薬を利用する場合、第１および第２の試薬は、同じかまたは異なることができる。「同じ」により、第１および第２の試薬が、第２試薬が検出可能な標識を含むことにおいてだけ異なることを意味する。第１および第２の試薬は、例えばこれらが異なる構造を有するか、またはプリオンタンパク質の異なる領域からの断片に由来する場合、「異なる」。
【０１８５】
全般的な検出方法
任意の適切な検出手段を、次いで用いて、捕捉試薬と凝集体との間の結合を同定できる。
【０１８６】
結合を検出するために用いるために適切な分析方法は、蛍光、電子顕微鏡観察、原子間力顕微鏡観察、ＵＶ／可視分光法、ＦＴＩＲ、核磁気共鳴分光法、ラマン分光法、質量分析、ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動、表面プラズモン共鳴分光法、微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）または当該技術において公知の任意のその他の方法のような方法を含む。
【０１８７】
結合は、しばしばＥＬＩＳＡの形で、標識された試薬または抗体を用いることにより検出してもよい。本発明で用いるために適切な検出可能な標識は、それらに限定されないが、放射活性同位体、蛍光剤（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）、化学発光剤（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）、発色団、蛍光半導体ナノ結晶、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、発色団、色素、金属イオン、金属ゾル、リガンド（例えばビオチン、ストレプトアビジンまたはハプテン）などを含む、検出の能力がある任意の分子を含む。追加の標識は、それらに限定されないが、検出可能範囲の蛍光を示す能力がある材料またはその部分を含む、蛍光を用いるものを含む。本発明で用い得る標識の具体例は、それらに限定されないが、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、ジメチルアクリジニウムエステル（ＤＭＡＥ）、テキサスレッド、ルミノール、ＮＡＤＰＨおよびβ−ガラクトシダーゼを含む。さらに、検出可能な標識は、オリゴヌクレオチドタグを含んでよく、これは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、分岐鎖状ＤＮＡ（ｂ−ＤＮＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）などを含む核酸検出方法により検出できる。好ましい検出可能な標識は、酵素、特にアルカリホスファターゼ（ＡＰ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）および蛍光化合物を含む。当該技術において周知のように、酵素は、検出可能な基質、例えば色素形成性基質または蛍光形成性基質と組み合わせて利用して、検出可能なシグナルを生じる。
【０１８８】
標識された検出試薬（上記）を用いることに加えて、免疫沈降を用いて、凝集体と結合した試薬を分離して取り出してよい。好ましくは、免疫沈降は、沈殿増進剤を加えることにより容易になる。沈殿増進剤は、タンパク質と結合した試薬の沈殿を増進または増加できる部分を含む。このような沈殿増進剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、プロテインＧ、プロテインＡなどを含む。プロテインＧまたはプロテインＡを沈殿増進剤として用いる場合、これらのタンパク質は、ビーズ、好ましくは磁性ビーズに場合によって付着できる。沈殿は、遠心分離の使用または磁力の使用によりさらに増進できる。このような沈殿増進剤の使用は、当該技術において公知である。
【０１８９】
ウェスタンブロットは、例えば、典型的に、タグ付加１次抗体を採用し、これが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからの変性タンパク質を、ニトロセルロースまたはＰＶＤＦ上にエレクトロブロットされた「プルダウン」アッセイ（上記のような）から得られる試料において検出する。１次抗体を、次いで、タグについてのプローブ（例えばストレプトアビジンコンジュゲートアルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、ＥＣＬ試薬および／または増幅可能なオリゴヌクレオチド）を用いて検出する（および／または増幅する）。結合は、標識され、親和性タグについてのプローブ（例えばストレプトアビジンコンジュゲートアルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、ＥＣＬ試薬または増幅可能なオリゴヌクレオチド）を用いて増幅される親和性タグ（例えばビオチン）を有するペプチドのような検出試薬を用いて評価することもできる。
【０１９０】
細胞ベースのアッセイも採用でき、例えば、ここでは、凝集体を、個別の細胞上で直接検出する（例えば、蛍光ベースの細胞選別、計数または特異的に標識された細胞の検出を可能にする蛍光標識された試薬を用いて）。
【０１９１】
検出試薬からのシグナルを増幅するアッセイも公知である。この例は、ビオチンおよびアビジンを用いるアッセイ、ならびに酵素標識および酵素媒介イムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡアッセイである。さらなる例は、シグナル増幅のための分岐鎖状ＤＮＡの使用（例えば米国特許第５，６８１，６９７号；同第５，４２４，４１３号；同第５，４５１，５０３号；同第５，４５４７，０２５号；および同第６，２３５，４８３号）；ＰＣＲ、ローリングサークル増幅、Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅのインベーダ（Ａｒｒｕｄａら２００２年Ｅｘｐｅｒｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．  Ｄｉａｇｎ．２巻：４８７頁；米国特許第６０９０６０６号、同第５８４３６６９号、同第５９８５５５７号、同第６０９０５４３号、同第５８４６７１７号）、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ（米国特許第６，５１１，８０９号；ＥＰ第０５４４２１２Ａ１号）などのような標的増幅技術を用いること；および／またはイムノ−ＰＣＲ技術（例えば米国特許第５，６６５，５３９号；国際公開ＷＯ９８／２３９６２；ＷＯ００／７５６６３；およびＷＯ０１／３１０５６を参照されたい）を含む。
【０１９２】
さらに、サンドイッチＥＬＩＳＡと同様のマイクロタイタープレートでの手順を用いてよく、例えば、本明細書で記載する凝集体特異的結合試薬またはコンフォメーションタンパク質特異的結合試薬を用いてタンパク質（複数可）を固体支持体（例えばマイクロタイタープレートのウェル、ビーズなど）に固定化し、それらに限定されないが、コンジュゲートアルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、ＥＣＬ試薬または増幅可能なオリゴヌクレオチドのような親和性および／もしくは検出標識を有する別の凝集体特異的結合試薬またはコンフォメーションタンパク質特異的結合試薬を含み得る追加の検出試薬を用いて、凝集体を検出する。
【０１９３】
捕捉された解離凝集体を検出するための好ましい方法
捕捉試薬および結合した凝集体が検出の前に解離される場合、解離凝集体は、以下により詳細に記載される直接ＥＬＩＳＡまたは抗体サンドイッチＥＬＩＳＡタイプのアッセイのいずれかでのＥＬＩＳＡタイプのアッセイで検出できる。用語「ＥＬＩＳＡ」は、抗体を用いる検出を記載するために用いるが、アッセイは、抗体が「酵素連結」しているものに限定されない。検出抗体は、本明細書で記載し、イムノアッセイの技術において周知の検出可能な標識のいずれを用いても標識できる。Ｌａｕら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １０４巻（２８号）：１１５５１〜１１５５６頁（２００７年）に記載されるようなＥＬＩＳＡを行って、捕捉試薬から解離された凝集体の量を定量化できる。
【０１９４】
解離凝集体は、標準的なＥＬＩＳＡのために、それで固体支持体の表面を受動的に被覆することにより調製できる。このような受動的被覆の方法は周知であり、典型的に、１００ｍＭのＮａＨＣＯ３中でｐＨ８にて、約３７℃にて数時間または４℃にて１晩行われる。その他の被覆緩衝液は周知である（例えば５０ｍＭ炭酸塩ｐＨ９．６、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８または１０ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ７．２）。固体支持体は、本明細書で記載するかまたは当該技術において周知の任意の固体支持体であり得るが、好ましくは、固体支持体は、マイクロタイタープレート、例えば９６ウェルポリスチレンプレートである。高濃度のカオトロピック剤を用いて解離を行った場合、カオトロピック剤の濃度は、希釈により、固体支持体を被覆する前に少なくとも約２倍に低減する。高または低ｐＨと、その後の中和を用いて解離を行った場合、解離凝集体は、さらなる希釈なしで被覆のために用いることができる。プレート（複数可）を洗浄して、未結合の物質を除去できる。
【０１９５】
標準的なＥＬＩＳＡを行う場合、固体支持体に付着しているコンフォメーションタンパク質特異的結合試薬または凝集体特異的結合試薬（捕捉のために用いたのと同じものかまたは異なるもののいずれか）のような検出可能に標識された結合分子を加える。この検出可能に標識された結合分子を、任意の捕捉された凝集体と反応させ、プレートを洗浄し、標識された分子の存在を当該技術において周知の方法を用いて検出することができる。検出分子は、捕捉試薬が凝集体に特異的である限り、凝集体に特異的である必要はなく、凝集体とモノマーとの両方と結合できる。好ましい実施形態では、検出可能に標識された結合分子は、抗体である。このような抗体は、コンフォメーションタンパク質の天然の配座異性体およびミスフォールディングされた配座異性体の両方に特異的な周知のもの、および周知の方法により産生された抗体を含む。
【０１９６】
代わりの実施形態では、解離凝集体は、抗体サンドイッチタイプＥＬＩＳＡを用いて検出される。この実施形態では、解離凝集体は、凝集体またはコンフォメーションタンパク質に特異的な第１抗体を有する固体支持体上に「再捕捉」される。再捕捉された凝集体を有する固体支持体は、場合によって洗浄して、任意の未結合の物質を除去し、次いで、コンフォメーションタンパク質または凝集体に特異的な第２抗体と、第２抗体と再捕捉された凝集体との結合を可能にする条件下で、接触させる。
【０１９７】
第１および第２抗体は、典型的には異なる抗体であり、好ましくは、コンフォメーションタンパク質上の異なるエピトープを認識する。例えば、第１抗体は、コンフォメーションタンパク質のＮ末端の端のエピトープを認識し、第２抗体は、Ｎ末端以外にあるエピトープを認識するか、またはその逆である。第１および第２抗体のその他の組み合わせを、容易に選択できる。この実施形態では、第１抗体ではなく第２抗体が検出可能に標識される。
【０１９８】
試薬からの凝集体の解離を、カオトロピック剤を用いて行う場合、カオトロピック剤は、検出アッセイを行う前に除去されるか、または少なくとも１５倍に希釈されるべきである。解離を、高または低ｐＨおよび中和により行う場合、解離凝集体は、さらなる希釈なしで用いることができる。解離凝集体を、検出を行う前に変性させる場合、第１および第２抗体はともに、変性配座異性体と結合する。
【０１９９】
捕捉された非解離凝集体の検出のための好ましい方法
その他の例示的なアッセイでは、捕捉試薬および結合した凝集体は、検出の前に解離されない。捕捉試薬が、固体支持体に連結したＡＳＢである場合、凝集体を含有するかまたは含有する疑いがある試料を、固体支持体に加えることができる。任意の凝集体が試薬と結合することを可能にするのに十分なインキュベーション期間の後に、固体支持体を洗浄して未結合の部分を除去し、固体支持体に付着しているコンフォメーションタンパク質特異的結合試薬または同じかもしくは異なる第２凝集体特異的結合試薬のような、上記のような検出可能に標識された２次結合分子を加える。代わりに、固体支持体に連結している（例えばマイクロタイタープレートのウェルを被覆している）コンフォメーションタンパク質特異的結合試薬を捕捉試薬として用い、検出を、固体支持体に付着している凝集体特異的結合試薬を用いて遂行できる。
【０２００】
Ｄ．アッセイで用いる固体支持体
ＡＳＢ試薬が、固体支持体上に提供される。あるいくつかの実施形態では、ＣＰＳＢ試薬が、固体支持体上に提供される。ＡＳＢ試薬またはＣＰＳＢ試薬は、試料と接触する前に固体支持体上に提供されるか、またはＣＰＳＢ試薬の場合、試薬は、試料と接触し、その中の任意の凝集体と結合した後に、固体支持体と結合するように適合できる（例えばビオチン化試薬と、アビジンまたはストレプトアビジンを含む固体支持体とを用いることにより）。
【０２０１】
本発明の目的のための固体支持体は、不溶性マトリクスであり、目的の分子（例えば本発明の試薬、コンフォメーションタンパク質、抗体など）が連結または付着できる硬質または半硬質の表面を有することができる任意の材料であり得る。例示的な固体支持体は、それらに限定されないが、ニトロセルロース、塩化ポリビニル；ポリプロピレン、ポリスチレン、ラテックス、ポリカーボネート、ナイロン、デキストラン、キチン、砂、シリカ、軽石、アガロース、セルロース、ガラス、金属、ポリアクリルアミド、ケイ素、ゴム、多糖、フッ化ポリビニル、ジアゾ化ペーパー、活性化ビーズ、磁気反応性ビーズならびに固相合成、親和性分離、精製、ハイブリダイゼーション反応、イムノアッセイおよびその他のそのような用途に通常用いられる任意の材料のような担体を含む。支持体は、粒子状であり得るか、または連続表面の形であり得、メンブレン、メッシュ、プレート、ペレット、スライド、ディスク、キャピラリー、中空繊維、針、ピン、チップ、固体繊維、ゲル（例えばシリカゲル）およびビーズ（例えばポア−ガラスビーズ、シリカゲル、場合によってジビニルベンゼンで架橋されているポリスチレンビーズ、グラフト化ｃｏ−ポリビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、ラテックスビーズ、場合によってＮ−Ｎ’−ビス−アクリロイルエチレンジアミンで架橋されているジメチルアクリルアミドビーズ、酸化鉄磁性ビーズおよび疎水性ポリマーで被覆されたガラス粒子）を含む。
【０２０２】
本明細書で記載するＡＳＢ試薬またはＣＰＳＢ試薬は、ＡＳＢ試薬またはＣＰＳＢ試薬を、例えば共有的に、吸着（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）により、カップリングによりまたは結合対を用いることにより付着させる標準的な技術を用いて、固体支持体に容易に連結させることができる。
【０２０３】
支持体への固定化は、ＡＳＢ試薬またはＣＰＳＢ試薬を、最初に、タンパク質に連結することにより増進できる（例えば、該タンパク質がよりよい固相結合特性を有する場合）。適切な連結タンパク質は、それらに限定されないが、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミンおよび当業者に周知のその他のタンパク質のような巨大分子を含む。分子を支持体と結合させるために用いることができるその他の試薬は、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマーなどを含む。このような分子およびこれらの分子をタンパク質と連結させる方法は、当業者に周知である。例えばＢｒｉｎｋｌｅｙ，  Ｍ．Ａ．、（１９９２年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、３巻：２〜１３号；Ｈａｓｈｉｄａら（１９８４年）Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６巻：５６〜６３頁；ならびにＡｎｊａｎｅｙｕｌｕおよびＳｔａｒｏｓ（１９８７年）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．  ３０巻：１１７〜１２４頁を参照されたい。
【０２０４】
所望により、固体支持体に加えられるＡＳＢ試薬またはＣＰＳＢ試薬を、容易に官能化して、スチレンまたはアクリル酸部分を作製でき、よって、分子をポリスチレン、ポリアクリル酸またはポリイミド、ポリアクリルアミド、ポリエチレン、ポリビニル、ポリジアセチレン、ポリフェニレン−ビニレン、ポリペプチド、多糖、ポリスルホン、ポリピロール、ポリイミダゾール、ポリチオフェン、ポリエーテル、エポキシ、石英ガラス、シリカゲル、シロキサン、ポリホスフェート、ヒドロゲル、アガロース、セルロースなどのようなその他のポリマーに組み込むことができる。好ましい実施形態では、固体支持体は、磁性ビーズ、より好ましくはポリスチレン／酸化鉄ビーズである。
【０２０５】
ＡＳＢ試薬またはＣＰＳＢ試薬は、分子の結合対の相互作用により固体支持体に付着できる。このような結合対は周知であり、その例は、本明細書の他の場所で記載する。結合対の一方のメンバーを、上記の技術により固体支持体に連結し、結合対の他方のメンバーを試薬に付着させる（合成前、合成中または合成後）。このようにして改変されたＡＳＢ試薬またはＣＰＳＢ試薬を、試料と接触させ、存在するならば凝集体との相互作用が溶液において発生し、その後に固体支持体を試薬（または試薬−タンパク質複合体）と接触させることができる。この実施形態のための好ましい結合対は、ビオチンとアビジン、およびビオチンとストレプトアビジンを含む。ビオチン−アビジンおよびビオチン−ストレプトアビジンに加えて、この実施形態のためのその他の適切な結合対は、例えば、抗原−抗体、ハプテン−抗体、ミメトープ−抗体、受容体−ホルモン、受容体−リガンド、アゴニスト−アンタゴニスト、レクチン−炭水化物、プロテインＡ−抗体Ｆｃを含む。このような結合対は、周知であり（例えば米国特許第６，５５１，８４３号および同第６，５８６，１９３号を参照されたい）、当業者は、適切な結合対を選択し、本発明で用いるためにそれらを適合させることができる。捕捉試薬を、上記のように支持体に付着させるために適合させる場合、試料を、捕捉試薬が支持体に付着する前または付着した後に、捕捉試薬と接触させることができる。
【０２０６】
代わりに、ＡＳＢ試薬またはＣＰＳＢ試薬は、当該技術において周知のコンジュゲーション化学を用いて固体支持体に共有的に付着できる。例えば、チオール含有ＡＳＢまたはＣＰＳＢ試薬を、固体支持体、例えばカルボキシル化磁性ビーズに直接、当該技術において公知の標準的な方法を用いて付着できる（例えばＣｈｒｉｓｅｙ，  Ｌ．Ａ．、Ｌｅｅ，  Ｇ．Ｕ．およびＯ’Ｆｅｒｒａｌｌ，  Ｃ．Ｅ．（１９９６年）、Ｃｏｖａｌｅｎｔ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＤＮＡ  ｔｏ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒ  ｆｉｌｍｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２４巻（１５号）、３０３１〜３０３９頁；Ｋｉｔａｇａｗａ，  Ｔ．、Ｓｈｉｍｏｚｏｎｏ，  Ｔ．、Ａｉｋａｗａ，  Ｔ．、Ｙｏｓｈｉｄａ，  Ｔ．およびＮｉｓｈｉｍｕｒａ，  Ｈ．（１９８０年）、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏ−ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．  ２９巻（４号）、１１３０〜１１３５頁を参照されたい）。カルボキシル化磁性ビーズを、まず、マレイミド官能性を含有するヘテロ二官能性架橋リンカー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．からのＢＭＰＨ）に、カルボジイミド化学を用いて連結する。チオール化ＡＳＢまたはＣＰＳＢ試薬を、次いで、ＢＭＰＨ被覆ビーズのマレイミド官能基に共有的に連結する。本発明の検出方法の実施形態で用いる場合、固体支持体は、試薬および凝集体を含む複合体を、未結合の試料から分離することを助ける。チオールカップリングのために特に使いやすい磁性ビーズは、Ｄｙｎａｌ（現在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）からのＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｍ−２７０カルボン酸である。ＡＳＢまたはＣＰＳＢ試薬はまた、リンカー、例えば１または複数のアミノヘキサン酸部分を含んでもよい。
【０２０７】
Ｅ．凝集体の好ましい検出方法
好ましい実施形態を以下に記載する。
【０２０８】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合するＡＳＢ試薬を用いて凝集体を捕捉および検出し、該方法は、凝集体を含有する疑いがある試料を、ＡＳＢ試薬と接触させるステップであって、ＡＳＢ試薬と、存在するならば凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、試料中の、もしあるならば凝集体を、凝集体とＡＳＢ試薬との結合により検出するステップとを含む。凝集体の結合は、例えば、複合体を解離させ、凝集体をＣＰＳＢ試薬で検出することにより検出できる。
【０２０９】
一実施形態では、捕捉される凝集体は、Ａβ４０、Ａβ４２またはタウのようなアルツハイマー病に関連する凝集体である。このような場合では、試料は、好ましくは血漿または脳脊髄液である。ＡＳＢ試薬は、好ましくは配列番号１〜８に由来し、
【０２１０】
【化２３】
2013510297.tif 000228
【０２１１】
【化２４】
2013510297.tif 000229
【０２１２】
【化２５】
2013510297.tif 000230
（式中、ＲおよびＲ’は、任意の基であり得る）
のようなペプトイド試薬を含む。
【０２１３】
他の好ましい実施形態では、本発明の方法は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合するＡＳＢ試薬を用いて凝集体を捕捉し、ＣＰＳＢ試薬を用いて凝集体を検出する。該方法は、凝集体を含有する疑いがある試料を、ＡＳＢ試薬と接触させるステップであって、試薬と、存在するならば凝集体とが結合して第１複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、第１複合体を、ＣＰＳＢ試薬と接触させるステップであって、結合を可能にする条件下で接触させるステップと、試料中の、もしあるならば凝集体の存在を、凝集体とＣＰＳＢ結合試薬との結合により検出するステップとを含む。典型的には、未結合の試料は、第１複合体を形成した後で、かつ第１複合体をＣＰＳＢ試薬と接触させる前に除去する。ＣＰＳＢ結合試薬は、標識された抗コンフォメーションタンパク質抗体であり得る。
【０２１４】
まださらに別の好ましい実施形態では、本発明の方法は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合するＡＳＢ試薬を用いて凝集体の存在を捕捉および検出する。該方法は、凝集体を含有する疑いがある試料を、ＡＳＢ試薬と接触させるステップであって、ＡＳＢ試薬と、存在するならば凝集体とが結合して第１複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、未結合の試料物質を除去するステップと、凝集体を、第１複合体から解離させて、解離凝集体を提供するステップと、解離凝集体を、第１ＣＰＳＢ試薬と接触させるステップであって、結合して第２複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、試料中の、もしあるならば凝集体の存在を、第２複合体の形成を検出することにより検出するステップとを含む。第２複合体の形成は、好ましくは、検出可能に標識された第２ＣＰＳＢ試薬を用いて検出され、第１ＣＰＳＢ試薬は、好ましくは、固体支持体に連結されている。
【０２１５】
代わりに、本発明は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合するＡＳＢ試薬を用いて凝集体を捕捉し、本明細書で記載する第２ＡＳＢ試薬を用いて凝集体を検出する方法を提供する。該方法は、凝集体を含有する疑いがある試料を、第１ＡＳＢ試薬と接触させるステップであって、第１試薬と、存在するならば凝集体とが結合して第１複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、凝集体を含有する疑いがある試料を、検出可能な標識を有する第２ＡＳＢ試薬と接触させるステップであって、第２試薬と第１複合体中の凝集体との結合を可能にする条件下で接触させるステップと、試料中の、もしあるならば凝集体を、凝集体と第２試薬との結合により検出するステップとを含む。
【０２１６】
さらに別の代替では、本発明は、ＣＰＳＢ試薬を用いて凝集体を捕捉し、ＡＳＢ試薬であって、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合するＡＳＢ試薬を用いて凝集体を検出する方法を提供する。該方法は、（ａ）凝集体を含有する疑いがある試料を、ＣＰＳＢ試薬と接触させるステップであって、試薬と、存在するならば凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップと、（ｂ）未結合の試料物質を除去するステップと、（ｃ）複合体を、検出可能な標識を有するＡＳＢ試薬と接触させるステップであって、ＡＳＢ試薬と凝集体との結合を可能にする条件下で接触させるステップと、試料中の、もしあるならば凝集体を、凝集体とＡＳＢ試薬との結合により検出するステップとを含み、ＡＳＢ試薬は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。
【０２１７】
上記の全ての方法において、「未結合の試料」は、接触させるステップで捕捉されなかった試料中の成分のことをいう。未結合の試料は、当該技術において周知の方法、例えば洗浄、遠心分離、ろ過、磁性分離およびこれらの技術の組み合わせにより除去できる。好ましくは、本発明の方法では、未結合の試料は、複合体を緩衝液で洗浄することによりおよび／または磁性分離により除去される。
【０２１８】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、全身性アミロイドーシス、タウオパチー、シヌクレイン病および子かん前症を含むコンフォメーション疾患の検出のために用いる。
【０２１９】
Ｆ．オリゴマーを検出する方法
本明細書で記載する発明は、オリゴマーを検出する方法を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、オリゴマーを含有する疑いがある、オリゴマー以外の凝集体を欠く試料を準備し、試料を、ＡＳＢ試薬と、試薬と存在するならばオリゴマーとが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させ、試料中の、もしあるならばオリゴマーの存在を、オリゴマーとＡＳＢ試薬との結合により検出することにより、試料中のオリゴマーの存在を検出する方法を提供し、ここで、ＡＳＢ試薬は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。
【０２２０】
オリゴマーを検出する方法で用いるために、試料は、凝集体を含有するとわかっているかまたは疑いがあるものであれば何でも可能である。試料は、生物学的試料（つまり、生体または以前は生きていた生物から調製された試料）または非生物学的試料であり得る。典型的に、生物学的試料は、体組織または体液を含有する。適切な生物学的試料は、それらに限定されないが、全血、血液分画物、血液成分、血漿、血小板、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、骨髄、尿、涙、乳汁、リンパ液、器官組織、脳組織、神経系組織、筋肉組織、非神経系組織、生検材料、剖検材料、脂肪生検材料、細胞、大便、胎盤、脾臓組織、リンパ組織、膵臓組織、気管支肺胞洗浄液または滑液を含む。好ましい生物学的試料は、血漿およびＣＳＦを含む。あるいくつかの実施形態では、試料は、ポリペプチドを含有する。
【０２２１】
代わりの実施形態では、本発明は、オリゴマーを含有する疑いがある試料を準備し、試料からオリゴマー以外の凝集体を除去し、試料を、ＡＳＢ試薬と、試薬と存在するならばオリゴマーとが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させ、試料中の、もしあるならばオリゴマーの存在を、オリゴマーとＡＳＢ試薬との結合により検出することにより、試料中のオリゴマーの存在を検出する方法を提供し、ここで、ＡＳＢ試薬は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。好ましい実施形態では、オリゴマー以外の凝集体は、遠心分離により試料から除去される。
【０２２２】
さらに別の実施形態では、本発明は、オリゴマーを含有する疑いがある試料を、ＡＳＢ試薬と、試薬と存在するならばオリゴマーとが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させ、複合体を第２試薬と接触させ（ここで、該試薬は、オリゴマーまたはオリゴマー以外の凝集体と優先的に結合する）、試料中の、もしあるならばオリゴマーの存在を、オリゴマーと第２試薬との結合または結合の欠如により検出することにより、試料中のオリゴマーの存在を検出する方法を提供し、ここで、ＡＳＢ試薬は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。好ましい実施形態では、第２試薬は、オリゴマーを認識するが原線維を認識しないＡ１１抗体である。
【０２２３】
オリゴマーの存在を検出する方法の好ましい実施形態では、オリゴマー以外の凝集体は、原線維を含む。
【０２２４】
非オリゴマー凝集体を試料から除去するための方法
非オリゴマー凝集体は、当該技術において公知の任意の方法により試料から除去できる。典型的には、無定形凝集体および原線維のような非オリゴマー凝集体は、遠心分離により試料から除去できる。当業者により用いられる好ましい遠心分離条件は、多様である（Ｐｈｉｌｏ、ＡＡＰＳ  Ｊ、２００６年、８巻（３号）Ａｒｔ．６５）。しかし、１４，０００×ｇにて１０分間の遠心分離は、典型的に、大きい原線維およびいくらかの無定形凝集体を含む非常に大きい凝集体（１０〜１０００ＭＤａ）だけを取り出し、１００，０００×ｇにて１時間の遠心分離は、典型的に、より小さい原線維および無定形凝集体を含む１ＭＤａより大きい凝集体を取り出す。凝集体のサイズ、溶解度およびイオン強度ならびに試料の濃度、温度およびｐＨは全て、分離のために要求される遠心分離の加速度および速度に影響する（Ｓｉｐｅ，  Ｊ．（編）、２００５年、Ａｍｙｌｏｉｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｔｈｅ  Ｂｅｔａ  Ｓｈｅｅｔ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ、４１０〜４２５頁、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ；Ｓｔｉｎｅら、ＪＢＣ、２００３年、２７８巻、１１６１２〜２２頁）。
【０２２５】
Ｇ．コンフォメーション疾患の検出方法
コンフォメーション疾患
本発明は、天然ではない配座異性体の凝集体を、凝集体特異的結合試薬を用いて検出し、凝集体媒介疾患の増大した蓋然性が存在しているか否かを評価し、凝集体媒介疾患についての処置の有効性を評価する方法に関する。コンフォメーション疾患タンパク質およびそれらの対応する疾患は、表１に列挙するものを含む。
【０２２６】
本発明のコンフォメーション疾患は、２以上の異なるコンフォメーションを形成するタンパク質と関連する任意の疾患を含む。本明細書で特に興味があるものは、アルツハイマー病、全身性アミロイドーシス、タウオパチーおよびシヌクレイン病のようなアミロイド疾患を含み、これらは全て交差ベータシートのシグネチャーを提示する。対象のその他の疾患は、糖尿病およびポリグルタミン病、ならびにセルピン病のような非アミロイドタンパク質症である。
【０２２７】
あるいくつかの実施形態では、本発明の方法は、モノマーおよび凝集体の両方を捕捉または検出するためのコンフォメーションタンパク質特異的結合試薬（「ＣＰＳＢ試薬」）の使用も含む。用いる具体的なＣＰＳＢ試薬は、検出されるタンパク質に依存する。例えば、診断されるコンフォメーション疾患がアルツハイマー病であるならば、ＣＰＳＢ試薬は、アルツハイマー病タンパク質Ａβのモノマーおよび凝集体の両方を認識する抗体であり得る。
【０２２８】
病原性アルツハイマー病凝集体を検出するための方法
Ａβ４０、Ａβ４２またはタウのようなミスフォールディングされた配座異性体を含有する病原性アルツハイマー病凝集体を検出するための方法が提供される。
【０２２９】
特に好ましい実施形態では、これらの方法は、病原性アルツハイマー病凝集体を、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合するＡＳＢ試薬で捕捉し、捕捉された凝集体をＣＰＳＢ試薬で検出する。
【０２３０】
特に、方法は、病原性アルツハイマー病凝集体を含有する疑いがある試料を、ＡＳＢ試薬と接触させるステップであって、この接触は、ＡＳＢ試薬と、存在するならば病原性アルツハイマー病凝集体とが結合して第１複合体を形成することを可能にする条件下で行われる、ステップと、未結合の試料物質を除去するステップと、病原性アルツハイマー病凝集体を、第１複合体から解離させて、解離病原性アルツハイマー病凝集体を提供するステップと、解離病原性アルツハイマー病凝集体を、ＣＰＳＢ試薬と接触させるステップであって、この接触は、結合して第２複合体を形成することを可能にする条件下で行われる、ステップと、試料中の、もしあるならば病原性アルツハイマー病凝集体の存在を、第２複合体の形成を検出することにより検出するステップとを含む。第１複合体中の病原性アルツハイマー病凝集体は、好ましくは、約０．０５ＮのＮａＯＨまたは約０．１ＮのＮａＯＨで、約９０℃または約８０℃にて、ＣＰＳＢ試薬と接触させる前に解離および変性させる。病原性アルツハイマー病凝集体がＡβ４０またはＡβ４２を含有する場合、これは、好ましくは、約０．１ＮのＮａＯＨで、約８０℃にて約３０分間解離および変性される。好ましくは、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いる。
【０２３１】
解離および／または変性は、ＩＶ（Ｂ）項に記載する方法を用いて遂行できる。典型的には、病原性アルツハイマー病凝集体は、ｐＨを低ｐＨから高ｐＨまたは高ｐＨから低ｐＨに変更することにより、同時に解離および変性させる。
【０２３２】
好ましい実施形態では、ＡＳＢ試薬は、配列番号１〜８または
【０２３３】
【化２６】
2013510297.tif 000231
【０２３４】
【化２７】
2013510297.tif 000232
【０２３５】
【化２８】
2013510297.tif 000233
（式中、ＲおよびＲ’は、任意の基であり得る）
を含むペプトイドに由来し、試薬は、磁性ビーズのような固体支持体に連結される。
【０２３６】
ＣＰＳＢ試薬は、好ましくは、マイクロタイタープレートのような固体支持体に連結された抗アルツハイマー病タンパク質抗体であり、第２複合体の形成は、好ましくは、検出可能に標識された第２ＣＰＳＢ試薬を用いて検出される。病原性アルツハイマー病凝集体がＡβ４０またはＡβ４２を含有する場合、好ましい抗アルツハイマー病タンパク質抗体は、Ａβ４０のＣ末端に特異的な抗体である１１Ａ５０−Ｂ１０（Ｃｏｖａｎｃｅ）；Ａβ４２のＣ末端に特異的な抗体である１２Ｆ４（Ｃｏｖａｎｃｅ）；Ａβアミノ酸１８〜２２に特異的な４Ｇ８；Ａβアミノ酸１〜１０に特異的な２０．１；およびＡβアミノ酸３〜８に特異的な６Ｅ１０を含む。特に好ましい実施形態では、１２Ｆ４または１１Ａ５０−Ｂ１０がＥＬＩＳＡプレート上の捕捉抗体であり、１４Ｇ８が検出可能に標識された第２ＣＰＳＢ試薬として用いられる。試料は、好ましくは、血漿または脳脊髄液（ＣＳＦ）である。
【０２３７】
したがって、特に好ましい実施形態では、病原性アルツハイマー病凝集体の存在を検出するための方法は、それらに限定されないが、病原性アルツハイマー病凝集体を含有する疑いがある血漿またはＣＳＦの試料を、磁性ビーズに連結されたＰＳＲ１と接触させるステップであって、この接触は、ＰＳＲ１と、存在するならば病原性アルツハイマー病凝集体とが結合して第１複合体を形成することを可能にする条件下で行われる、ステップと、未結合の試料物質を除去するステップと、病原性アルツハイマー病凝集体を、ｐＨを変更することにより第１複合体から解離および／または変性させて、解離病原性アルツハイマー病凝集体を提供するステップと、解離病原性アルツハイマー病凝集体を、固体支持体と結合した抗アルツハイマー病タンパク質抗体と接触させるステップであって、この接触は、結合して第２複合体の形成を可能にする条件下で行われる、ステップと、第２複合体の形成を、標識された第２抗アルツハイマー病タンパク質抗体とインキュベートすることにより検出するステップとを含む。
【０２３８】
Ｈ．競合アッセイ
いくつかの態様では、本発明の方法は、競合的結合により凝集体を検出する。いつＡＳＢ結合試薬と弱く結合するリガンドが凝集体により置き換えられるかを決定するのに、検出の手段を用いることができる。固体支持体上に吸着されるＡＳＢ試薬は、凝集体がＡＳＢ試薬と結合するアビディティよりも弱い結合のアビディティでＡＳＢ試薬と結合する検出可能に標識されたリガンドと組み合わされる。リガンド−ＡＳＢ試薬複合体が検出される。次いで、試料を加える。検出可能に標識されたリガンドの結合のアビディティは、ＡＳＢ試薬に対する凝集体の結合のアビディティより弱いので、凝集体は、標識されたリガンドを置き換え、ＡＳＢ試薬と結合した標識されたリガンドの検出量の減少が、ＡＳＢ試薬と試料中の凝集体との間で形成された複合体を示す。
【０２３９】
したがって、特定の実施形態では、凝集体の存在は、ＡＳＢ試薬を含む固体支持体を提供するステップ、固体支持体を、検出可能に標識されたリガンドと組み合わせるステップ（ここで、検出可能に標識されたリガンドに対するＡＳＢ試薬の結合のアビディティは、凝集体に対するＡＳＢ試薬の結合のアビディティより弱い）、凝集体を含有する疑いがある試料を、固体支持体と、試料中に存在する場合に凝集体がＡＳＢ試薬と結合して、リガンドを置き換えることを可能にする条件下で組み合わせるステップ、そしてＡＳＢ試薬と試料からの凝集体との間で形成された複合体を検出するステップにより検出され、ここで、ＡＳＢ試薬は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。
【０２４０】
ＩＶ．その他の方法
全般的に、本明細書で記載するＡＳＢ試薬は、ＡＳＢ試薬がある電荷密度にて固体支持体に付着している場合に、コンフォメーションタンパク質の凝集体と優先的に結合できる。したがって、これらの試薬は、生存もしくは死後の脳、脊髄またはその他の神経系組織および血液を含む生物学的もしくは非生物学的の実質上いずれの試料においても凝集体の存在の容易な検出を可能にする。試料は、組換えまたは合成のポリペプチドを含有してよい。試薬は、よって、広範囲の単離、精製、検出、診断および治療上の用途において有用である。
【０２４１】
例えば、親和性支持体に付着しているＡＳＢ試薬は、凝集体を単離するために用いてよい。ＡＳＢ試薬は、固体支持体に、例えば、吸着、共有結合などにより貼付することができ、よって、試薬は、それらの凝集体選択的結合活性を保持する。場合によって、スペーサ基を含めてよく、それにより、例えば、ＡＳＢ試薬の結合部位が接近可能なままになる。固定化されたＡＳＢ試薬は、次いで、血液、血漿、脳、脊髄およびその他の組織のような生物学的試料からの凝集体を結合するために用いることができる。結合した試薬または複合体は、例えばｐＨの変化により支持体から収集するか、または凝集体は、複合体から解離させてよい。
【０２４２】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、凝集体を含有する疑いがあるポリペプチド試料を、ＡＳＢ試薬と、試薬と存在するならば凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させ、未結合のポリペプチド試料を回収することにより、ポリペプチド試料からの凝集体の量を低減するための方法を提供し、ここで、ＡＳＢ試薬は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。あるいくつかの実施形態では、該方法は、複合体の存在を検出して、試料が凝集体を含有するか否かを決定するステップをさらに含む。複合体の検出は、検出可能な標識を有する第２凝集体特異的結合試薬または検出可能な標識を有するコンフォメーションタンパク質特異的結合試薬が凝集体と結合することを可能にすることにより達成できる。組換えまたは合成のタンパク質の生成は、製薬、生物燃料および医療ならびにその他の生命科学研究のような多くの産業のために重要である。このようなポリペプチド試料は、例えば、組換えインスリンおよび治療用抗体のような製薬用に製造されたタンパク質を含有し得る。これらのポリペプチドは、高レベルで生成されることがあり、ポリペプチドの凝集体は、比較的高い速度で形成される傾向にある。ポリペプチド試料からの凝集体の量を低減するための本発明により提供される方法は、製薬用に産出されるこれらのタンパク質の品質管理、およびその他の産業のために生成されるタンパク質の品質管理において有用である。
【０２４３】
他の実施形態では、本発明は、凝集体を含有する疑いがある試料を、ＡＳＢ試薬と、試薬と存在するならば凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させ、凝集体とモノマーとを、凝集体と試薬との結合により識別することにより、試料中の凝集体とモノマーとを識別するための方法を提供し、ここで、ＡＳＢ試薬は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。好ましい実施形態では、凝集体と試薬との結合は、検出可能な標識を有する第２凝集体特異的結合試薬または検出可能な標識を有するコンフォメーションタンパク質特異的結合試薬が凝集体と結合することを可能にすることにより検出される。未結合の試料は、複合体の形成の後に、標識された試薬で凝集体を検出する前に除去してよい。代わりに、複合体を解離させて解離凝集体を提供し、この解離凝集体を、第１ＣＰＳＢ試薬と結合させて、第２複合体を形成することを可能にし、第２複合体の形成を検出してよい。あるいくつかの実施形態では、第２複合体は、検出可能に標識された第２ＣＰＳＢ試薬を用いて検出してよい。あるいくつかの実施形態では、第１ＣＰＳＢは、固体支持体に連結される。
【０２４４】
あるいくつかの実施形態では、本発明は、コンフォメーション疾患を有する疑いがある生物学的試料を、ＡＳＢ試薬と、試薬と存在するならば病原性凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップ、試料中の、もしあるならば病原性凝集体の存在を、凝集体と試薬との結合により検出するステップ、そして生物学的試料中の病原性凝集体の量がコンフォメーション疾患を有さない被験体からの試料中の凝集体の量より高いならば、被験体がコンフォメーション疾患を有することの増大した蓋然性が存在していることを決定するステップにより、被験体についてコンフォメーション疾患の増大した蓋然性が存在しているか否かを評価するための方法を提供し、ここで、ＡＳＢ試薬は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。好ましい実施形態では、凝集体と試薬との結合は、検出可能な標識を有する第２凝集体特異的結合試薬または検出可能な標識を有するコンフォメーションタンパク質特異的結合試薬が凝集体と結合することを可能にすることにより検出される。未結合の試料は、複合体の形成の後に、標識された試薬で凝集体を検出する前に除去してよい。代わりに、複合体を解離させて解離凝集体を提供し、次いで、この解離凝集体を、第１ＣＰＳＢ試薬と結合させて、第２複合体を形成することを可能にし、第２複合体の形成を検出してよい。あるいくつかの実施形態では、第２複合体は、検出可能に標識された第２ＣＰＳＢ試薬を用いて検出してよい。あるいくつかの実施形態では、第１ＣＰＳＢは、固体支持体に連結される。
【０２４５】
他の実施形態では、本発明は、コンフォメーション疾患についての処置を受けた患者からの生物学的試料を、ＡＳＢ試薬と、試薬と存在するならば病原性凝集体とが結合して複合体を形成することを可能にする条件下で接触させるステップ、試料中の、もしあるならば病原性凝集体の存在を、凝集体と試薬との結合により検出するステップ、生物学的試料中の病原性凝集体の量がコンフォメーション疾患についての処置前の患者から採取された生物学的試料中の病原性凝集体の量よりも低いならば、前記処置が有効であることを決定するステップにより、コンフォメーション疾患についての処置の有効性を評価するための方法を提供し、ここで、ＡＳＢ試薬は、試料がＡＳＢ試薬と接触するｐＨにて、少なくとも約１の正の正味電荷を有し、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着しており、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。好ましい実施形態では、凝集体と試薬との結合は、検出可能な標識を有する第２凝集体特異的結合試薬または検出可能な標識を有するコンフォメーションタンパク質特異的結合試薬が凝集体と結合することを可能にすることにより検出される。未結合の試料は、複合体の形成の後に、標識された試薬で凝集体を検出する前に除去してよい。代わりに、複合体を解離させて解離凝集体を提供し、次いで、この解離凝集体を、第１ＣＰＳＢ試薬と結合させて、第２複合体を形成することを可能にし、第２複合体の形成を検出してよい。あるいくつかの実施形態では、第２複合体は、検出可能に標識された第２ＣＰＳＢ試薬を用いて検出してよい。あるいくつかの実施形態では、第１ＣＰＳＢは、固体支持体に連結される。
【０２４６】
本明細書で記載する試薬を用いるいくつかの変形および組み合わせを、本発明の方法に用いてよい。
【０２４７】
Ｖ．組成物およびキット
本発明は、凝集体特異的結合試薬と固体支持体とを含む組成物を提供する。したがって、好ましい実施形態では、本発明は、アミノ酸配列ＫＫＫＦＫＦ（配列番号１）、ＫＫＫＷＫＷ（配列番号２）、ＫＫＫＬＫＬ（配列番号３）またはＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫ（配列番号５）を含有するペプチド凝集体特異的結合試薬を提供する。あるいくつかの実施形態では、本発明は、ＫＫＫＫＫＫ（配列番号４）からなるペプチドを含有するペプチド凝集体特異的結合試薬を提供する。
【０２４８】
好ましい実施形態では、本発明は、
【０２４９】
【化２９】
2013510297.tif 000234
【０２５０】
【化３０】
2013510297.tif 000235
（式中、ＲおよびＲ’は、任意の基である）
を含むペプトイド凝集体特異的結合試薬を提供する。
【０２５１】
あるいくつかの実施形態では、本発明は、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合するデンドロン凝集体特異的結合試薬であって、
【０２５２】
【化３１】
2013510297.tif 000236
を含む試薬を提供する。
【０２５３】
本発明の組成物の凝集体特異的結合試薬は、疎水性官能基も含有してよい。疎水性官能基は、例えば、芳香族または脂肪族疎水性官能基であってよい。あるいくつかの実施形態では、ＡＳＢ試薬は、アミン、アルキル基、複素環、シクロアルカン、グアニジン、エーテル、アリルおよび芳香族のような官能基を含有することがある。このような芳香族官能基は、ナフチル、フェノール、アニリン、フェニル、置換フェニル、ニトロフェニル、ハロゲン化フェニル、ビフェニル、スチリル、ジフェニル、ベンジルスルホンアミド、アミノメチルフェニル、チオフェン、インドリル、ナフチル、フランおよびイミダゾールを含む。さらなる実施形態では、ＡＳＢ試薬は、反復モチーフを含有する。他の実施形態では、ＡＳＢ試薬は、検出可能に標識されている。
【０２５４】
本発明は、固体支持体と、上記の凝集体特異的結合試薬とを含む組成物も提供する。好ましい実施形態では、ペプチド、ペプトイドまたはデンドロン凝集体特異的結合試薬は、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約９０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１２０ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約１０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約２０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約３０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約４０００ｎｍｏｌ、１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約５０００ｎｍｏｌまたは１平方メートルあたりの正味電荷が少なくとも約６０００ｎｍｏｌの電荷密度にて固体支持体に付着し、組成物は、固体支持体に付着している場合に、モノマーよりも凝集体と優先的に結合する。
【０２５５】
固体支持体は、不溶性マトリクスであり、対象の分子（例えば本発明の試薬、コンフォメーションタンパク質、抗体など）が連結または付着できる硬質または半硬質の表面を有することができる任意の材料であり得る。例示的な固体支持体は、それらに限定されないが、ニトロセルロース、塩化ポリビニル；ポリプロピレン、ポリスチレン、ラテックス、ポリカーボネート、ナイロン、デキストラン、キチン、砂、シリカ、軽石、アガロース、セルロース、ガラス、金属、ポリアクリルアミド、ケイ素、ゴム、多糖、フッ化ポリビニル、ジアゾ化ペーパー、活性化ビーズ、磁気反応性ビーズならびに固相合成、親和性分離、精製、ハイブリダイゼーション反応、イムノアッセイおよびその他の用途に通常用いられる任意の材料のような担体を含む。支持体は、粒子状であり得るか、または連続表面の形態であり得、これとしては、メンブレン、メッシュ、プレート、ペレット、スライド、ディスク、キャピラリー、中空繊維、針、ピン、チップ、固体繊維、ゲル（例えばシリカゲル）およびビーズ（例えばポア−ガラスビーズ、シリカゲル、場合によってジビニルベンゼンで架橋されているポリスチレンビーズ、グラフト化ｃｏ−ポリビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、ラテックスビーズ、場合によってＮ−Ｎ’−ビス−アクリロイルエチレンジアミンで架橋されているジメチルアクリルアミドビーズ、酸化鉄磁性ビーズならびに疎水性ポリマーで被覆されたガラス粒子が挙げられる。
【０２５６】
本発明は、本発明の方法を行うためのキットをさらに提供する。典型的には、キットは、前の２つの段落に記載する組成物を含有する。
【実施例】
【０２５７】
以下の非限定的な実施例を、説明のために記載する。
【０２５８】
（実施例１）
試薬が凝集体を捕捉する能力を試験するためのアッセイ
本実施例は、試薬が凝集体と結合する能力を試験するために設計されたアッセイを記載する。
【０２５９】
これらの試薬がタンパク質凝集体を捕捉する能力を評価するために、以前に記載されたミスフォールディングタンパク質アッセイ、すなわちＭＰＡ（Ｌａｕら、２００７年、ＰＮＡＳ、１０４巻：１１５５１頁）を用いた（図３）。このアッセイでは、対象の捕捉試薬をビーズに付着させ、これらを、正常なモノマーのタンパク質と凝集したタンパク質との混合物を含有する対象の試料とともにインキュベートして捕捉を可能にし、次いで洗浄して未結合の物質を除去する。この富化ステップの後に、溶出緩衝液を用いてビーズから捕捉された物質を解離するとともに、あらゆる凝集体を変性させる。溶出された物質は、次いで、対象のタンパク質に特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡに付す。有効な捕捉試薬として作用する強い凝集体結合試薬は、モノマーおよび凝集体の混合物を含有する試料から高いシグナルを示すが、生理的レベルのモノマータンパク質だけを含有する対照試料からは示さない。
【０２６０】
実施例２は、様々な特性を有する試薬が、モノマーベータアミロイド１−４２よりもオリゴマーベータアミロイド１−４２（Ｂａｒｇｈｏｒｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００５年により「グロブロマー」と命名された）と、グロブロマーを添加したＣＳＦにおいて優先的に結合する能力を試験するためのこのアッセイの使用について記載する。実施例３は、様々なペプトイド試薬が、疾患関連凝集体と、り患した脳のホモジネートを添加した緩衝液、ＣＳＦまたは血漿において優先的に結合する能力を試験するためのこのアッセイの使用について記載する。実施例４は、ペプトイド試薬が、正常な対応するモノマーよりも様々な疾患関連凝集体と、疾患を有する患者からの脳ホモジネートにおいて優先的に結合する能力を試験するためのこのアッセイの使用について記載する。
【０２６１】
（実施例２）
試薬の結合能力の評価
本実施例は、モノマーよりもオリゴマーと優先的に結合する能力に対する異なる捕捉試薬特性の影響を実証する。固体支持体上で全体的な正電荷および高い電荷密度を有する試薬は、オリゴマーと優先的に結合する能力の増加を示した。さらに、試薬に疎水性残基を付加することは、優先的な結合を改善したが、試薬の具体的な骨格は、それが正に荷電されている限り、重要でなかった。
【０２６２】
タンパク質凝集体は、イオン結合、水素結合および疎水性相互作用のような多様な機序により捕捉試薬と結合できる。広く多様な電荷、疎水性および骨格（デンドリマー、ペプチド、ペプトイド）を有する一連の潜在的な凝集体特異的結合試薬を設計して、これらの可能性のある結合様式を試験した（図１）。試薬を、以下の方法により磁性Ｄｙｎａｌ  Ｍ２７０ビーズ（図２）にコンジュゲートした。
【０２６３】
カルボン酸を提示するビーズを、ＥＤＣおよびＢＭＰＨで処理してマレイミド提示ビーズを創出し、これにチオール化ペプチド（またはその他のチオール化有機分子）を、Ｍｉｃｈａｅｌ付加反応により付加した。カルボン酸を提示するＤｙｎａｌ  Ｍ２７０磁化ビーズ（３０ｍｇ／ｍＬビーズ）をボルテックスし、１５ｍｌファルコンチューブに入れた。チューブを磁石内に置き、上清を除去した。ビーズを、０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ５で２回洗浄し、次いで、洗浄緩衝液を除去した。カップリング溶液（ＭＥＳ緩衝液中の３３ｍＭ  ＢＭＰＨ、１３０ｍＭ  ＥＤＣ）を加え、チューブを室温にて３０分間揺り動かした。１×ＭＥＳ、１×Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５中で洗浄した後に、ビーズをＴｒｉｓ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．５）で１５分間クエンチした。ビーズを、次いで、リン酸塩緩衝液中で２回洗浄し、脱気したリン酸塩中の５ｍＭチオール化リガンドに加えた。ビーズを２１時間回転させ、次いで、０．１Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ７、１×ＰＢＳ中で洗浄して、貯蔵した。
【０２６４】
グロブロマーを調製するために、ベータアミロイド（１−４２）を、ヘキサフルオロイソプロパノール中でのインキュベーションでモノマー化した。ヘキサフルオロイソプロパノールを、真空遠心分離により除去した。ＤＭＳＯ、ＰＢＳおよび２％  ＳＤＳを、次いで、試料に加えた。試料をボルテックスし、超音波処理し、次いで、３７℃にてインキュベートした。６時間後に、試料を水で希釈し、ボルテックスし、３７℃にてさらに１９時間インキュベートした。試料を１３５０００×ｇにて１時間、４℃にて超遠心分離し、上清を保持した。グロブロマーを、アッセイのためにＣＳＦに添加した。
【０２６５】
様々な試薬とコンジュゲートしたビーズのアリコートを、９６ウェルプレートのウェルに加えた。Ｔｒｉｓ緩衝液中のグロブロマー添加ＣＳＦを各ウェルに加え、プレートを３７℃にて１時間、振とうしながらインキュベートした。陰性対照のために、正常ＣＳＦを用いたが、これは、ベータアミロイドのモノマーのみを含有するとみなす。ビーズをＴＢＳＴ洗浄緩衝液で洗浄し、結合した物質を、変性溶液（典型的に０．１〜０．１５Ｎ  ＮａＯＨ）で溶出した。溶出物にリコンディショニング緩衝液（ｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を加えた後に、ベータアミロイド（１−４２）特異的サンドイッチＥＬＩＳＡによりベータアミロイドを検出した。
【０２６６】
電荷
まず、電荷ベースの相互作用がオリゴマー捕捉を可能にするか否かを決定した。負に荷電した残基（例えばアスパラギン酸、Ｄ）を含有するペプチド、正に荷電した残基（例えばリシン、Ｋ）を含有するペプチドおよび中性残基（例えばヒスチジン、Ｈ）を含有するペプチドを試験した。代表的な結果を図４Ａに示す。負に荷電した（ＤＤＤＤＤＤ（配列番号１００））ペプチドおよび中性（ＨＨＨＨＨＨ（配列番号１０１））ペプチドは、オリゴマー種の富化をほとんどもたらさなかったが、正に荷電した（ＫＫＫＫＫＫ（配列番号４））ペプチドは、著しい捕捉をもたらした。オリゴマー上の負に荷電した残基（またはオリゴマーと結合した塩、脂質もしくはその他の種）が、正に荷電した捕捉ペプチドと相互作用すると仮定した。
【０２６７】
疎水性相互作用
正電荷単独でオリゴマーの富化に十分であったが、疎水性相互作用が追加の捕捉効率をもたらすか否かを決定するために、疎水性相互作用を試験した。全て正に荷電されたペプチドＫＫＫＫＫＫ（配列番号４）を、芳香族疎水性残基（例えばトリプトファン、Ｗまたはフェニルアラニン、Ｆ）および脂肪族残基（例えばロイシン、Ｌ）を含有するペプチドと比較した。ペプチドＫＫＫＦＫＦ（配列番号１）およびＫＫＫＷＫＷ（配列番号２）は、脂肪族疎水性残基を有するかまたは疎水性残基を有さない対応するペプチドに対して、捕捉効率の増加をもたらし（図４Ｂ）、このことは、芳香族疎水性残基の付加が捕捉を改善したことを証明した。
【０２６８】
代替骨格
富化方法がペプチド骨格に限定されるか否か、または他の正に荷電した有機分子骨格もオリゴマーを富化できるか否かを評価するために、２つの追加の骨格であるペプトイドおよびデンドロンを試験した。ペプトイドは、Ｎ−置換グリシンの直鎖状ポリマーであり、よって、ペプチドのものと類似の間隔を保持するが、アキラルであり、溶液においてペプチドとは異なるコンフォメーションを有する傾向にある。デンドロンは、ペプチドと構造的類似性がほとんどない分岐鎖状ポリマーである。ＮＭＰＡアッセイにおいて、図１に示す正に荷電したペプトイドおよびデンドロンはともに、オリゴマーを富化する能力があり（図４Ａ）、このことは、ペプチド骨格が捕捉にとって重要でないことを証明した。
【０２６９】
ペプトイド骨格がオリゴマーを捕捉する能力に対する異なる疎水性および電荷の影響を調査するために、追加のセットのペプトイドを、グロブロマー添加ＣＳＦとともに試験した。図１１は、試験した追加のペプトイドの構造および電荷を示す。スチルベンおよびオクチルペプトイドは、元のＰＳＲ１ペプトイドとは異なる疎水性モノマーを有する（ベンジル基からより大きい芳香族スチルベンまたは脂肪族オクチル鎖への置き換え）。短い鎖およびグアニジンペプトイドは、元のペプトイドとは異なるカチオン基を有する。短い鎖のペプトイドは、側鎖アミンとペプトイド主鎖との間にブチルスペーサではなくエチルを有し、グアニジンは、元のペプトイドよりもより塩基性の側鎖を有する。２重および３重ペプトイドは、ＰＳＲ１と比べて長さが増加しており、よって、リガンドあたりより多い電荷を有する。図１２は、これらのペプトイド試薬を用いるＭＰＡアッセイの結果を示す。全ての追加のペプトイドは、ＰＳＲ１と同様にグロブロマーを捕捉した。
【０２７０】
アビディティ
上記の結果は、正味正電荷が効果のある捕捉のために重要であり、具体的な骨格は重要性がより低いことを示した。よって、ある主要な結合様式はイオン相互作用によると仮定した。個別のイオン相互作用は比較的弱く、よって、オリゴマーと捕捉試薬との間の相互作用は、アビディティ成分を有し、ここでは、捕捉効率は複数のリガンドの組み合わせた強度に基づくと考えられる。このような場合、表面上のリガンドの密度が重要である。
【０２７１】
この可能性を評価するために、異なる量の正に荷電したペプトイドが付着した一連のビーズを調製して、各ビーズが異なる電荷密度を提示するようにした。リガンド負荷の量を決定するために、アミン定量化を用いた。ビーズのアリコートを磁石中に置き、上清を除去した。エタノール中の８０％フェノール、ピリジン／水中の０．２ｍＭ  ＫＣＮおよびエタノール中の６％ニンヒドリンを各チューブに加えた。アリコートをボルテックスし、１００℃にて７分間加熱した。室温まで冷却した後に、６０％エタノールを加えた。チューブを磁石中に置き、５７０ｎｍでの上清の吸光度を決定した。ビーズの負荷は、ベールの法則に従って、１５０００Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を用いて決定した。
【０２７２】
ビーズ（３ｕｌまたは１５ｕｌ）を、ＣＳＦを添加した０．５ｎｇ／ｍＬグロブロマーを含有する試料に加えた。図５からわかるように、捕捉は、リガンド密度とともに非線形的に増加し、オリゴマー捕捉に要求される最小密度が存在した。ＰＳＲ１について、この限界は、グロブロマーとの優先的な結合について約５ｎｍｏｌリガンド／ｍｇビーズであった。ビーズ１グラムあたりおよそ２〜５ｍ２の表面積に鑑みて、この値は、およそ１５００ｎｍｏｌリガンド／ｍ２、または全てのアミンがｐＨ７．４のアッセイ条件にてプロトン化されていると仮定して、大まかに６０００ｎｍｏｌ正電荷／ｍ２であった。
【０２７３】
追加の実験を行って、捕捉試薬の結合効率とオリゴマーの特異的捕捉に要求される最小限の電荷との間の関係を評価した。捕捉試薬（ペプチドＫＫＫＦＫＦ（配列番号１）、ペプチドＫＫＫＬＫＬ（配列番号３）またはペプトイドＰＳＲ１）を有する一連のビーズを、約６０００ｎｍｏｌ／ｍ２〜約１５０００ｎｍｏｌ／ｍ２の範囲の負荷密度で調製した。方法は、上記の２つの段落に記載したのと同じであったが、１ｎｇ／ｍＬのグロブロマーを用い、３μｌのビーズを加えた。上記の電荷密度についての初期の実験と同様に、オリゴマーの捕捉は、電荷密度とともに指数関数的に増加した（図２３）。試験した最低の負荷密度（約６０００ｎｍｏｌ／ｍ２）にて、バックグラウンドと捕捉されたオリゴマーとの間を依然として見分けることが可能であった。ペプチドＫＫＫＦＫＦ（配列番号１）のような高効率の試薬については、５００ｎｍｏｌ／ｍ２リガンドまたは２０００ｎｍｏｌ正電荷／ｍ２もの低さで、オリゴマーの選択的捕捉のために十分であると見積もられた。
【０２７４】
その他の固体支持体とコンジュゲートした試薬を用いて、アビディティベースの捕捉を観察することが可能である。ＰＳＲ１を、セルロースメンブレンに、以下の段落に示すプロトコールを用いてコンジュゲートした（このセルロースメンブレン上では、はるかにより高いレベルの負荷を達成できる）。ビーズ上に負荷させたものよりおよそ１００倍高いＰＳＲ１負荷の増加は、ＰＳＲ１が溶液におけるオリゴマーと優先的に結合する能力を継続的に増加させた（図２３）。
【０２７５】
ペプトイド／ペプチドをメンブレン上に直接コンジュゲートするために、セルロースメンブレン（Ｗｈａｔｍａｎ５０）を、エピブロモヒドリン：過塩素酸：ジオキサンの１０：１：９０溶液に浸して１〜３時間ｒｔにてインキュベートした。メタノールで洗浄して乾燥した後に、メンブレンを、そのままのトリオキサデカンジアミン中で７０℃にて１時間インキュベーションすることによりアミノ化した。洗浄の後に、メンブレンをクエンチし（３Ｍ  ＮａＯＭｅ中で）、洗浄して再び乾燥した。スポットを、ＮＭＰ中のＨＯＢＴおよびＤＩＣで予め活性化したＦｍｏｃＧｌｙの０．４Ｍ溶液１ｕｌをスポットし、２０分間インキュベートすることにより境界を定めた。カップリングを反復し、メンブレンを、ＤＭＦ中の２％無水酢酸、その後ＤＭＦ中の２％無水酢酸／２％ＤＩＥＡでキャッピングした。メンブレンをＤＭＦで洗浄し、ＤＭＦ中の４％ＤＢＵで脱保護し（２×１０〜２０分）、ＤＭＦおよびメタノールで洗浄し、次いで乾燥した。活性化マレイミドプロピオン酸（０．４Ｍ、ＨＯＢｔおよびＤＩＣとともに）を、メンブレンのスポットに加え、カップリングを反復し、メンブレンをＮＭＰ、水およびメタノールで洗浄した。ＤＭＦ／リン酸塩緩衝液中の１０ｍＭチオール化ペプトイドのアリコート（２ｕｌ）を、メンブレンに加えた。チオール化ペプトイドの添加を反復し、メンブレンをクエンチし（ＢＭＥで）、洗浄し（水、メタノール、ＤＭＦおよびメタノール）、最後に乾燥した後に使用した。
【０２７６】
この電荷密度の効果をさらに調べるために、単一リガンド上の電荷を増加して、電荷／リガンドの増加が、表面密度の減少を補償できるか否かを決定した。２つの正に荷電したペプチドＫＫＫＫＫＫ（配列番号４；負荷レベル：３．１ｎｍｏｌ／ｍｇビーズ）およびＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫ（配列番号５；負荷レベル：１．６ｎｍｏｌ／ｍｇビーズ）を比較した（図６）。リガンドあたりの電荷の数の倍加（６から１２まで）は、ビーズ上へのリガンドの負荷が付随して減少したならば、捕捉効率を必ずしも倍加しなかった。
【０２７７】
固体支持体のアビディティおよび選択
オリゴマーの捕捉におけるアビディティの役割も、ＰＳＲ１ペプトイド試薬について２つの異なる固体支持体を比較することにより検査した。ＰＳＲ１が磁性ビーズに直接コンジュゲートしている場合は、ペプトイドリガンドの密度は約３．５μｍｏｌ／ｍ２であるので、電荷密度は約１４μｍｏｌ電荷／ｍ２である。これとは対照的に、ストレプトアビジン被覆磁性ビーズと結合しているビオチン−ＰＳＲ１の密度は約０．０３３μｍｏｌ／ｍ２であるので、電荷密度は約０．１２μｍｏｌ電荷／ｍ２である。これらの２つのＰＳＲ１ビーズのオリゴマー捕捉能力を比較して、異なるレベルの電荷密度を有するビーズの効果を評価した。
【０２７８】
等量のＰＳＲ１および２つの異なる投入物レベル、すなわちＰＳＲ１と直接コンジュゲートしている３もしくは３０μｌのビーズ（３０ｍｇ／ｍｌ、「ＰＳＲ１ビーズ」）またはビオチン−ＰＳＲ１と結合している１０もしくは１００μｌのストレプトアビジンビーズ（１０ｍｇ／ｍｌ、「ｂ−ＰＳＲ１ビーズ」）を、ＭＰＡアッセイにおいて、８０μｌのグロブロマー添加ＣＳＦと２０μｌの５×ＴＢＳＴＴとの混合物とともに用いた。グロブロマーは、それらの未変性のコンフォメーション（「未変性ｇｌｏｂ」）でまたはモノマー（「変性ｇｌｏｂ」）として、陰性対照のために加えた。グロブロマーを、５Ｍ  ＧｄｎＳＣＮ中で室温にて３０分間変性させた。等量のビーズを用いたが、ＰＳＲ１ビーズの電荷密度は、ｂ−ＰＳＲ１ビーズのものよりおよそ１００倍大きかった。
【０２７９】
ＰＳＲ１ビーズは、グロブロマーについてより高い感度および特異性を示したが、低密度ｂ−ＰＳＲ１ビーズは、制限された特異性および感度を示し（図１３ＡおよびＢ）、このことは、電荷密度がオリゴマーの捕捉のために重要であることをさらに示した。
【０２８０】
（実施例３）
様々な電荷を有し様々な電荷密度での多様なペプトイド凝集体特異的結合試薬を用いる原線維の検出
本実施例は、ペプトイド試薬を用いる原線維凝集体の捕捉について記載する。実施例２で得られた結論と同様に、固体支持体上の全体的な正電荷および高い電荷密度は、モノマーよりも原線維凝集体とのペプトイド試薬の優先的な結合が増加するために重要であった。
【０２８１】
ストレプトアビジン誘導体化磁性ビーズと結合できるビオチン化誘導体としての化合物を試験のために調製した（図１４を参照されたい）。ペプトイドを、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．（１９９２年）１１４巻：１０６４６〜１０６４７頁；Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．（２００３年）１２５巻：８８４１〜８８４５頁；Ｊ．  Ｐｅｐｔ．  Ｐｒｏｔ．  Ｒｅｓ．（１９９２年）４０巻：４９８頁）により以前に本質的に記載されたサブモノマー法を用いて調製し、ＨＰＬＣにより精製した（図１５、表６）。
【０２８２】
ペプトイドは、それらのサブモノマーの順序およびアイデンティティーを記載するために略記する。ペプトイドサブモノマーは、次のように表す：ｐＨ７にて正に荷電されるサブモノマーを示す「＋」；ｐＨ７にて負に荷電されるサブモノマーを示す「−」；芳香族サブモノマーを示す「Ａ」；および極性非荷電サブモノマーを示す「Ｐ」。配列は、Ｎ→Ｃに示し、ビオチン−（アミノヘキサン酸）２リンカーが含意される。「正に荷電した」の「＋」は、本実施例で採用した条件下で正に荷電されることが期待される塩基性官能基を示す。
【０２８３】
表６．ペプトイドについての特徴決定情報
【０２８４】
【表６】
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分析ＨＰＬＣ−ＭＳ：Ａｇｉｌｅｎｔ１１００、流速０．８ｍｌ／分、３．５分間で５〜９５％ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ、１００×２．１ｍｍ  ５μｍ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＯＤＳカラム、２１４ｎｍにて６分間のＵＶ検出、記載されるＭＳモード。
【０２８５】
分取ＨＰＬＣ：流速３０ｍｌ／分、１６分間で以下に記載する勾配のＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ、３０×５０ｍｍ  ＳＦ  Ｃ１８カラム、Ｗａｔｅｒｓ検出器、２１４ｎｍにて１６分間のＵＶ検出。
【０２８６】
プリオン凝集体のプルダウン
図１５ａに示す３つのビオチン化ペプトイド類似体を、ストレプトアビジン誘導体化磁性ビーズ上にコンジュゲートした。２つの公知のビーズコンジュゲート、すなわちＰＳＲ１（陽性対照）またはグルタチオン（陰性対照）で直接被覆したＤｙｎａｌ  Ｍ２７０ビーズも、比較のために試験した。５つのビーズコンジュゲートを、ミスフォールディングタンパク質アッセイを用いてアッセイした（図３）。５つのビーズコンジュゲートを、９６ウェルプレートのウェルに加えた。プリオンタンパク質のミスフォールディングされた形の大きい凝集体ＰｒｐＳｃの豊富な供給源であることが公知のプリオン感染ハムスターからの１０％脳ホモジネート（ｗ／ｖ）を試料として用いた。脳ホモジネートを、緩衝液、脳脊髄液（ＣＳＦ）および血漿に、それぞれ３つのレベル３００、１００および０ｎＬ／ｍＬで添加した。脳ホモジネート溶液をビーズに加え、ある期間、典型的には３７℃にて１時間、回転させながらインキュベートした。磁石を試料に用いて、上清からビーズ結合物質を分離した。上清を除去した後に、溶出緩衝液を用いて凝集体を変性させ、溶出された物質をビーズから解離した。溶出された物質を、次いで、対象のタンパク質に特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイに付した。
【０２８７】
ＰｒｐＳｃ捕捉実験の結果を図１６に示す。グルタチオンビーズまたは非荷電ビーズ（ＰＡＰＡＰＡ、配列番号２１）からはシグナルは観察されなかった。シグナルは、１００または３００ｎｇ／ｍＬの添加レベルにて、ＰＳＲ１被覆ビーズ、ＰＳＲ１のビオチン化類似体（＋＋＋Ａ＋Ａ、配列番号１５）および６の正電荷を含有するペプトイド（＋＋＋＋＋＋、配列番号１６）を用いた場合に観察された。シグナルは、緩衝液中で行ったアッセイについて、これらの３つのペプトイド−ビーズコンジュゲート間で著しく異ならなかったが、ＰＳＲ１被覆ビーズおよび＋＋＋＋＋＋（配列番号１６）は、ＰＳＲ１のビオチン化類似体（＋＋＋Ａ＋Ａ、配列番号１５）に比べて、他の２つのマトリクスにおけるシグナルを中程度に増加させた。添加なし試料では、シグナルは観察されなかった。捕捉されたＰｒｐＳｃと同様のシグナル／ノイズレベルが、ビオチン化ＰＳＲ１（＋＋＋Ａ＋Ａ、配列番号１５）および以前に記載したＰＳＲ１で直接被覆したビーズについて観察され、図１４に示すライブラリーフォーマットの有効性を示した。６の正電荷を帯びたペプトイドは、ＰｒｐＳｃも効率的に捕捉した。
【０２８８】
図１５ｂに示すビオチン化ペプトイド類似体を、ストレプトアビジン誘導体化磁性ビーズ上にコンジュゲートした。プリオン感染ハムスターの脳からのホモジネートを、０および３００ｎｇ／ｍＬの添加レベルだけを探究した以外は上記のようにして試験した。これらの実験の結果を、図１７に示す（データは３連で示す）。データは、緩衝液中のＰＳＲ１で被覆したビーズ（陽性対照、＋＋＋Ａ＋Ａ、配列番号１５）に対して示す。最高の全体的な正電荷を有する４つのペプトイドが、緩衝液中でＰＳＲ１に匹敵するシグナルをもたらしたが、負に荷電したペプトイドまたは中性の電荷、双性イオンペプトイドは、著しくより低いシグナルを示した。シグナルの減少は、緩衝液アッセイに比べてＣＳＦまたは血漿に添加した試料から観察されたが、正に荷電したペプトイドは、まだ著しい捕捉を示した。＋４および＋７の全体的な正電荷を帯びたペプトイドは、ＰｒｐＳｃを効率的に捕捉した。３つの芳香族サブモノマーおよび４つの正のサブモノマーを帯びたペプトイドについて、サブモノマーの順序は、シグナルに劇的に影響しなかった。
【０２８９】
Ａβ凝集体のプルダウン
上記のプリオンアッセイと類似のアプローチを用いて、ペプトイド−ビーズコンジュゲートによるＡβ凝集体捕捉を評価した。アルツハイマー病患者の脳からの１０％脳ホモジネート（ｗ／ｖ）を陽性対照として用いた。なぜなら、これらの試料は、Ａβ（１−４０）、Ａβ（１−４２）およびタウの大きい凝集体が豊富であることが公知であるからである。
【０２９０】
Ａβ（１−４２）について、１０ｎＬの１０％脳ホモジネートを各ウェルに加え、２重のアッセイからのシグナルを検出した（図１８Ａ）。これらの実験からの全体的な傾向は、上記のプリオン捕捉実験と類似の傾向を示した。全体的な正電荷が低いペプトイドについて、低いシグナルが観察され、捕捉効率は、緩衝液中で最強であった。Ａβ（１−４２）を捕捉するための正に荷電したペプトイドの有用性をさらに調査するために、全体的に正に荷電されたペプトイドに焦点を当てた第２の実験を行った（図１８Ｂ）。様々な順序の３つの芳香族および４つの正電荷を含有するペプトイド間で配列特異性はほとんど観察されなかったが、７つの正電荷を有するペプトイドは、血漿およびＣＳＦの両方において、４つの正電荷を有するものよりもシグナルの増加をもたらした。
【０２９１】
ＣＳＦおよび血漿中でのＡβ（１−４２）捕捉について、＋＋＋Ａ＋Ａ（ビオチン化ＰＳＲ１、配列番号１５）と＋＋＋＋＋＋＋（配列番号１７）との間で同様の検出限界が観察された（図１９）（ＣＳＦ中で１．３対１．６ｎＬ／アッセイおよび血漿中で３．８対２．５ｎＬ／アッセイ）。
【０２９２】
＋４〜＋７の全体的な正電荷を帯びたペプトイドは、緩衝液中のＡβ（１−４２）を効率的に、そしてより少ない程度でＣＳＦおよび血漿中で捕捉した。３つの芳香族サブモノマーおよび４つの正のサブモノマーを有するペプトイドについて、サブモノマーの順序はシグナルに劇的に影響しなかった。同様の検出限界が、＋＋＋Ａ＋Ａ（ビオチン化ＰＳＲ１、配列番号１５）および＋＋＋＋＋＋＋（配列番号１７）について見出された。
【０２９３】
Ａβ（１−４０）について、１μＬの１０％脳ホモジネートを各ウェルに加え、２重のアッセイからのシグナルを検出した（図２２Ａ）。このデータにおいてシグナルのより大きい変動が観察されたが、これらの実験からの全体的な傾向は、プリオンの研究についての傾向と同様であった。全般的に、緩衝液およびＣＳＦについて、より高く正に荷電されたペプトイドを用いるアッセイにおいて、より高いシグナルが観察された。
【０２９４】
−Ａ−Ａ−Ａ−（配列番号２４）および−−−ＡＡＡ−（配列番号２５）についての結果は、正電荷が凝集体との優先的な結合に要求されることを示した以前の知見とは一致しなかった。しかし、反復内での再現性が乏しいことに鑑みて、この結果は決定的でなく、さらなる確認が要求される。
【０２９５】
Ａβ（１−４０）を捕捉するための正に荷電したペプトイドの有用性をさらに調査するために、全体的に正に荷電されたペプトイドに焦点を当てた第２の実験を行った（図２２Ｂ）。７つの正電荷を有するペプトイドを用いるアッセイからのシグナルは、４つの正電荷を含有するものと同じ程度にまたはそれよりも高かった。＋４〜＋７の全体的な正電荷を帯びたペプトイドは、緩衝液中のＡβ（１−４０）を効率的に、そしてより少ない程度でＣＳＦおよび血漿中で捕捉した。３つの芳香族サブモノマーおよび４つの正のサブモノマーを有するペプトイドについて、サブモノマーの順序はシグナルに劇的に影響しなかった。
【０２９６】
タウ凝集体のプルダウン
上記のプリオンアッセイと類似のアプローチを用いて、ペプトイド−ビーズコンジュゲートによるタウ捕捉を評価した。アルツハイマー病（ＡＤ）患者の脳からの１６０ｎＬの脳ホモジネートを陽性対照として用いた。なぜなら、これらの試料は、Ａβ（１−４０）、Ａβ（１−４２）およびタウの大きい凝集体が豊富であることが公知であるからである。対照として、結果を、最小限のタウ凝集体を有するはずである正常な脳ホモジネートと比較した。ＰＳＲ１（＋＋＋Ａ＋Ａ、配列番号１５）で被覆したビーズおよびグルタチオンで被覆したビーズを、ビオチン化＋＋＋＋＋＋＋（配列番号１７）および−−−−−−−（配列番号２２）と比較すると、ＰＳＲ１（＋＋＋Ａ＋Ａ、配列番号１５）および（＋＋＋＋＋＋＋、配列番号１７）がともにＡＤ試料において、正常な脳ホモジネート（ＮＢＨ）と比較してより高いシグナルを有したが、グルタチオン対照および−−−−−−−（配列番号２２）ペプトイドは、両方の試料で同様のシグナルを有したことが示された。ＰＳＲ１（＋＋＋Ａ＋Ａ、配列番号１５）は、最高のシグナルを有した（図２０）。
【０２９７】
病原性プリオン凝集体の結合におけるビーズ上のＰＳＲ１密度の影響の測定
上記のアッセイの分析物はタンパク質凝集体であると推定されるので、ビーズ表面上の密度の関数としてのＰＳＲ１の捕捉効率を調査した。ストレプトアビジン磁性ビーズを、異なる比率のビオチン化ＰＳＲ１（＋＋＋Ａ＋Ａ、配列番号１５）および中性電荷の対照ペプトイド（ＰＡＰＡＰＡ、配列番号２１）を含有する溶液で処理した。ビーズから未結合のペプトイドを洗い流した後に、ビーズを、病原性プリオン凝集体を含有するシリアンハムスターの脳ホモジネートを添加したヒト血漿と混合した。過剰のタンパク質を洗い流し、プリオン凝集体をビーズから溶出し、プリオンタンパク質に特異的なＥＬＩＳＡを用いて検出した（図３）。期待されたように、中性電荷の対照ペプトイド（ＰＡＰＡＰＡ、配列番号２１）とコンジュゲートしたビーズはＥＬＩＳＡにおいて最小限のシグナルを導いたが、ＰＳＲ１（＋＋＋Ａ＋Ａ、配列番号１５）とだけコンジュゲートしたビーズは、約３５倍高いシグナルを産生した。オリゴマーアッセイにおいてみられた電荷密度の要件と一致して、Ｂｉｏ−ＰＳＲ１（＋＋＋Ａ＋Ａ、配列番号１５）電荷密度とシグナルとの間に線形の相関関係は観察されなかった（表７および図２１）。ＰＳＲ１コンジュゲート濃度を０から５０％（約６０ｎｍｏｌ電荷／ｍ２）に増加することにより、４倍のＳ／Ｎの増加が産生されたが、２５％（約３０ｎｍｏｌ電荷／ｍ２）から７５％（約９０ｎｍｏｌ電荷／ｍ２）へのさらなる増加は、ほぼ２７倍のＳ／Ｎの増加を産生した。ＰＳＲ１（＋＋＋Ａ＋Ａ、配列番号１５）コンジュゲート濃度を１００％（約１２０ｎｍｏｌ電荷／ｍ２）までさらに増加することにより、７５％読出しを超える中程度のＳ／Ｎの増加が産生された。
【０２９８】
表７．漸増密度のＰＳＲ１（＋＋＋Ａ＋Ａ、配列番号１５）とコンジュゲートしたストレプトアビジン磁性ビーズにより捕捉された全プリオンシグナル
【０２９９】
【表７】
2013510297.tif 000238
（実施例４）
患者試料中での凝集体タンパク質の検出
本実施例は、図１に描くペプトイド捕捉試薬、すなわちＰＳＲ１が、ミスフォールディングされたタンパク質凝集体と関連するいくつかの疾患において、モノマーと凝集体とを見分けることができることを実証する。
【０３００】
実験は、実施例１に記載する方法に従って行った。７５ｎＬの１０％ＡＤ脳ホモジネートを１×ＴＢＳＴＴに添加し、３ｕｌのＰＳＲ１ビーズと１時間インキュベートした。ＰＳＲ１ビーズを、その後、洗浄し、結合したＡβ４２またはタウ凝集体を溶出し、それぞれＡβ４２およびタウ特異的サンドイッチＥＬＩＳＡにより検出した。
【０３０１】
脳ホモジネート中での凝集体の捕捉
ＮＭＰＡを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｚｕｅｒｉｃｈ  ＨｏｓｐｉｔａｌのＡｄｒｉａｎｏ  Ａｇｕｚｚｉ博士からの対照、異型クロイツフェルト−ヤコブ病（ｖＣＪＤ）またはアルツハイマー病（ＡＤ）患者からの脳ホモジネートに対して行った。ｖＣＪＤについて、プリオンタンパク質が検出された。ＡＤについて、Ａベータ（１−４２）およびタウの両方が検出された。結果は、ＰＳＲ１が、対照とｖＣＪＤまたはＡＤ試料のいずれかとを明らかに見分けたことを示した（図２４）。
【０３０２】
（実施例５）
グロブロマー捕捉におけるＥ２２の役割の決定
本実施例は、凝集体の電荷、構造およびサイズが、ビーズに付着したペプトイド凝集体特異的結合試薬によるその認識に寄与することを示す。
【０３０３】
上記のように、凝集体特異的結合試薬と凝集体との間の電荷相互作用は、結合機序の重要な成分である。実施例２は、正に荷電した試薬が、オリゴマーの著しい捕捉をもたらしたことを実証した。よって、オリゴマー上の表面に露出された負に荷電した残基は、これらの試薬との結合に関与しやすい。ベータアミロイド原線維およびＮ−Ｍｅｔプレグロブロマーの構造研究は、負に荷電されたＥ２２残基が表面に露出されていることを示唆した（Ｌｕｈｒｓら、ＰＮＡＳ、２００５年；Ｙｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００９年）。よって、露出されたＥ２２が、ＰＳＲ１、すなわち正に荷電した捕捉試薬によるベータアミロイドの捕捉に重要であるか否かを決定するための研究を行った。
【０３０４】
３つのベータアミロイド１−４２ペプチドを作製して、Ｅ２２の役割を試験した：野生型ペプチド、中性電荷を有する北極型変異Ｅ２２Ｇを含有する変異体ペプチド、および正電荷を有するイタリア型変異Ｅ２２Ｋを含有する変異体ペプチド。合成ペプチドは、Ａｎａｓｐｅｃから商業的に入手可能であった。
【０３０５】
変異体ペプチドを、実施例３に記載する方法に従ってオリゴマー化した。
【０３０６】
Ｅ２２ＧグロブロマーのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィー分析は、その構造が、野生型グロブロマーのものと類似することを実証した（図７）。オリゴマーを、１２０Ｖにて１．５〜２時間の４〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により分離し、ゲルをクーマシーブルーで染色した。オリゴマーを、１ｍＬ／分の流速で流す（ｒｕｎ）ＰＢＳ中でのＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムでのＳＥＣにより分離した。１ｍＬの画分を収集し、Ａβ４２特異的ＥＬＩＳＡにより分析した。
【０３０７】
ＮＭＰＡを、ＰＳＲ１がＥ２２Ｇグロブロマーを捕捉する能力を評価するために用いた。用いた方法は、実施例２に記載する。中性に荷電されたＥ２２Ｇグロブロマーは、ＰＳＲ１により捕捉されず（図８）、電荷相互作用が、ミスフォールディングされたタンパク質の認識における鍵となる因子であることを示した。
【０３０８】
Ｅ２２Ｋグロブロマーを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価し、野生型と比較した。Ｅ２２Ｋグロブロマーは、およそ５５キロダルトンでの野生型のバンドの喪失により示されるように、ＳＤＳ不安定性オリゴマーを形成した（図９Ａ）。グルタルアルデヒドを用いてオリゴマーを架橋することにより、Ｅ２２Ｋグロブロマーが野生型よりも高い分子量を有することが示された（図９Ｂ）。
【０３０９】
中性荷電Ｅ２２Ｇ変異体グロブロマーとは対照的に、正に荷電したＥ２２Ｋグロブロマーは、ＰＳＲ１により効率的に捕捉された（図１０）。この結果は、構造およびサイズも、ミスフォールディングされたタンパク質のＰＳＲ１認識に寄与し、タンパク質構造上の荷電された表面が、正味電荷よりもＰＳＲ１結合に寄与することを実証する。
【０３１０】
（実施例６）
追加の試薬の結合能力の評価
本実施例は、荷電試薬および疎水性試薬の追加の種の結合能力を示し、異なる捕捉試薬の特性の、モノマーよりもオリゴマーと優先的に結合するそれらの能力に対する影響をさらに実証する。オリゴマー捕捉は、カチオン残基の増加とともに指数関数的に増加し、捕捉は、キラリティーおよび配向に依存するよりも、ビーズ表面についての電荷分布に依存し、これらのことは一緒に、結合が多モードの相互作用であることを示唆する。試薬の芳香族性／疎水性を増加することによりオリゴマー捕捉が改善されるが、電荷と疎水性との間の均衡は、特異性を維持するために維持する必要がある。
【０３１１】
材料および方法
一連の新しい潜在的な凝集体特異的結合試薬を、以下に示すようにして設計して、実施例２に記載するようにして磁性Ｄｙｎａｌ  Ｍ２７０ビーズにコンジュゲートした。典型的に、７〜１２ｎｍｏｌのリガンド（各候補凝集体特異的結合試薬）で、１ｍｇのビーズを被覆した。
【０３１２】
ビーズのアリコート（典型的に３ｕｌ）を、９６ウェルプレートのウェルに加え、その後に試料（８０：２０のＣＳＦ：ＴＢＳＴＴに添加したＡベータ１−４２グロブロマー（Ａベータ４２オリゴマーモデル）ありまたはなしで、典型的に１２５ｕｌ）を加えた。プレートを密閉し、３７℃にて１時間、振とうしながらインキュベートした。プレートを、洗浄剤の水溶液（典型的にモノラウリン酸ポリエチレングリコールソルビタンおよびｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）で洗浄して、未結合の物質および残存緩衝液を除去した。変性溶液（典型的に０．１〜０．１５Ｎ  ＮａＯＨ）を各ウェルに加え、プレートを８０℃まで３０分間、振とうしながら加熱した。プレートを室温に冷却した後に、中和緩衝液（典型的に０．４％ＴＷＥＥＮ２０中の０．１２〜０．１８Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ３）を加え、プレートを室温にて軽く振とうした。ビーズ溶出物を、Ａβ４２特異的ＥＬＩＳＡまたはＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）からのＭＳＤ（登録商標）９６ウェルＭＵＬＴＩ−ＳＰＯＴ（登録商標）Ｈｕｍａｎ／Ｒｏｄｅｎｔ  ［４Ｇ８］  Ａｂｅｔａ  Ｔｒｉｐｌｅｘ  Ｕｌｔｒａ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ａｓｓａｙのいずれかを用いて分析した。Ａβ４２特異的アッセイについて、試料をビーズから溶出し、検出抗体（４Ｇ８  ＨＲＰ）を、Ａβ４２特異的抗体１２Ｆ４を帯びたプレートに加えた。プレートを１時間インキュベートし、洗浄し、基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤからのＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を加え、発光を測定した。ＭＳＤプレートアッセイを、製造者のプロトコールに従って、同様の様式で行った。
【０３１３】
結果
オリゴマー捕捉に対する正電荷数の影響力
本実験では、所定の骨格内の電荷の好ましい数を同定した。Ａｌａ／Ｌｙｓペプチドフレームワークを利用し、ここでは、各Ｌｙｓ残基を含めることにより、ペプチドの正味電荷が＋１増加する。漸増電荷（＋１→＋６）を有する６つのヘキサペプチド、すなわちＡＡＡＫＡＡ（配列番号１０２）、ＡＡＫＫＡＡ（配列番号３２）、ＡＡＫＫＫＡ（配列番号３３）、ＡＫＫＫＫＡ（配列番号３４）、ＡＫＫＫＫＫ（配列番号３５）およびＫＫＫＫＫＫ（配列番号４）を調製して、ビーズにコンジュゲートした。これらのビーズが、１ｎｇ／ｍＬでＣＳＦに添加されたＡベータ１−４２グロブロマーを捕捉する能力を試験し、結果を図２５に示す。グロブロマー捕捉レベル（「４２  １ｎｇ／ｍｌ」または塗りつぶしたバー）を、添加なしのＣＳＦにおいて検出されたＡベータ１−４２のバックグラウンドシグナル（「４２  ０ｎｇ／ｍｌ」）および添加なしのＣＳＦにおいて検出されたＡベータ１−４０のバックグラウンドシグナル（「４０  ０ｎｇ／ｍｌ」）またはＡＢ４２オリゴマーを添加したＣＳＦ「４０  １ｎｇ／ｍｌ」と比較した。本実験において評価した各試薬の、磁性ビーズにコンジュゲートした電荷密度を、以下の表８に示す。
【０３１４】
表８．正に荷電したペプチド試薬の電荷密度
【０３１５】
【表８】
2013510297.tif 000239
本実験の結果は、グロブロマー捕捉が、カチオン残基とともに増加する（塗りつぶしたバー）が、ＣＳＦに由来するバックグラウンドＡベータ１−４２または１−４０シグナルは、相対的に低いままであることを示す。これらの研究は、このフレームワークにおけるペプチドは、オリゴマーを捕捉するために少なくとも＋２の電荷、および約２〜３μｍｏｌ電荷／ｍ２の電荷密度が必要であることを示唆する。
【０３１６】
この結果に基づいて、電荷がどのように捕捉に影響するかも調査できる。ｐＨ７での理論的ペプチド正味電荷を捕捉に対してプロットすることにより（図２６に示すように）、電荷と捕捉との間に指数関数的な関係があることが明らかになり、このことは、電荷を増加することにより捕捉が劇的に改善されることを示唆する。「シグナル」（Ａベータ１−４２グロブロマー捕捉レベル）および「ノイズ」（Ａベータ１−４０モノマー捕捉レベル）の両方が電荷の増加とともに増加するが、シグナル：ノイズの比は電荷の増加とともに改善されることも明らかになる（以下の表９の「４２：４０」の列を参照されたい）。
【０３１７】
表９．Ａｌａ／Ｌｙｓ骨格の正に荷電したペプチド試薬により捕捉されたシグナル対ノイズのレベル
【０３１８】
【表９】
2013510297.tif 000240
「４２」の列における数字は、各ペプチド試薬により捕捉されたＡベータ１−４２グロブロマー添加ＣＳＦ試料から得られた平均ＲＬＵを表す。「４０」の列における数字は、各ペプチド試薬により捕捉されたＡベータ１−４０モノマー添加ＣＳＦ試料から得られた平均ＲＬＵを表す。「４２：４０」の列は、「４０」に対する「４２」の比を示す。
【０３１９】
Ａｌａ／Ｌｙｓ骨格の他に、＋２の正味電荷を有するが芳香族残基を有さない別の試薬であるＫＩＧＶＶＲ（配列番号４４）を試験した。Ａｌａ／Ｌｙｓ骨格に対する上記と同様の実験を、ＰＳＲ１と並べてこの試薬に対して行った。結果は、ＫＩＧＶＶＲ（配列番号４４）が、Ａベータ１−４２グロブロマーを、ＰＳＲ１のグロブロマー捕捉レベルと同様の高いレベルで捕捉し、Ａベータ１−４０添加ＣＳＦ中でＰＳＲ１と同様の低レベルのモノマーＡベータ１−４０ノイズを、そして非添加試料中で低いバックグラウンドを有したことを示した。
【０３２０】
オリゴマー捕捉に対するキラリティー、ビーズに対する電荷の配向および主鎖の配向の影響力
上記の実験から、Ａｌａ／Ｌｙｓペプチドが、ＰＳＲ１より少ないグロブロマーを捕捉したことが明らかになった。ＰＳＲ１もカチオン性であり、６残基を有するが、Ａｌａ／Ｌｙｓフレームワークペプチドからそれを分ける２つの特徴、すなわち２つの芳香族残基および異なる主鎖を有する。これらの特徴のどちらが捕捉効率において役割を演じているかをよりよく理解するために、本発明者らは、これらの特性のそれぞれを別々に調査した。
【０３２１】
好ましい骨格を同定するために、ＰＳＲ１とそのペプチド類似体であるＫＫＫＦＫＦ（配列番号１）を研究し、ＫＫＫＦＫＦ（配列番号１）の誘導体を作製した。ＫＫＫＦＫＦ（配列番号１）と同じ全体的な電荷パターンを有する５つの異なるペプチド試薬を設計して、キラリティー、ビーズに対する電荷の配向および主鎖の配向の影響力を研究した（図２７）。１つのペプチドｋｋｋｆｋｆ（配列番号３７）は、通常のＬ−アイソフォームの代わりにＤ−アイソフォームアミノ酸を有する。グロブロマー捕捉アッセイは、Ａｌａ／Ｌｙｓ骨格を有する試薬について上記したのと同様の方法で、これらの試薬に対して行った。ペプチドを、磁性ビーズに、約４〜５ｎｍｏｌ／ｍｇビーズまたは約４．８〜６μｍｏｌ／ｍ２電荷でコンジュゲートした。ＰＳＲ１は、約１２ｎｍｏｌ／ｍｇビーズまたは約１４μｍｏｌ／ｍ２電荷でコンジュゲートした。アッセイの結果を図２８に示し、シグナル対ノイズの比較を以下の表１０に示す。
【０３２２】
表１０．ＫＫＫＦＫＦ（配列番号１）骨格において正に荷電したペプチド試薬により捕捉されたシグナル対ノイズのレベル
【０３２３】
【表１０】
2013510297.tif 000241
アッセイの結果は、これらの試薬の全てがグロブロマーを捕捉できたが、ビーズに最も近い電荷を有する試薬（連結−ＫＫＫＦＫＦ（配列番号１０３）、ＦＫＦＫＫＫ−連結（配列番号９８）および連結−ｋｋｋｆｋｆ（配列番号１０６））が、これらのビーズの残り、すなわちＫＫＫＦＫＦ−連結（配列番号１０５）および連結−ＦＫＦＫＫＫ（配列番号１０４）よりも著しくよりよいことを示す（図２８）。捕捉の改善は、キラリティー（連結−ｋｋｋｆｋｆと連結−ＫＫＫＦＫＦを比較されたい（配列番号１０６と配列番号１０３））および主鎖の配向（連結−ＫＫＫＦＫＦとＦＫＦＫＫＫ−連結を比較されたい（配列番号１０３と配列番号９８））に、全般的に依存しなかった。全体的に、このように配向およびキラリティーへの依存性が欠如しているが、ビーズに対する電荷密度に依存性であることは、グロブロマーが試薬と、伝統的な小分子−タンパク質の「錠と鍵」相互作用よりもむしろ、多モードの様式で相互作用していることを示唆する。
【０３２４】
疎水性／芳香族残基の影響力
主鎖への変化が捕捉に対して中程度の影響力しか有さなかったことに鑑みて、本発明者らは、次に、上に示すような２つの異なる骨格の＋４ヘキサペプチド／ヘキサペプトイド試薬をまず比較することにより、芳香族残基の有用性を探求した。これらの試薬のＲＬＵレベルおよびシグナル：ノイズ比の比較を、以下の表１１に示す。
【０３２５】
表１１．疎水性／芳香族残基ありまたはなしの骨格の＋４ヘキサペプチド／ヘキサペプトイド試薬の比較
【０３２６】
【表１１】
2013510297.tif 000242
この比較から、＋４Ａｌａ／Ｌｙｓペプチド（ＡＫＫＫＫＡ（配列番号３４））が、芳香族残基を含有するその他の試薬よりも著しくより低いグロブロマー捕捉効率と、より低いシグナル：ノイズ比を有することが明らかになる（表１１）。このことは、芳香族残基および／または疎水性残基が、捕捉効率にとって有益であることを示唆する。
【０３２７】
凝集体結合についての芳香族残基  対  非芳香族残基の利点を比較するために、追加のペプチドを設計して、グロブロマー捕捉アッセイにおいて比較した。試薬およびアッセイの結果を、図２９に示す。各試薬についての右のバーは、４ｎｇ／ｍＬグロブロマーを添加した試料から捕捉され、検出されたＡベータ１−４２グロブロマーレベルを表す。結果は、芳香族残基（ＡＫＦＫＫＫ（配列番号４６）およびＦＫＦＫＫＫ（配列番号３６）においてＰｈｅで表される）が、非芳香族残基と比べてグロブロマー捕捉の改善をもたらしたが、脂肪族残基のような非芳香族疎水性残基を含有する試薬もグロブロマーを捕捉したことを示す（図２９）。ＡＫＦＫＫＫ（配列番号４６）において実証されるように、ペプチド中に１つの芳香族残基だけが存在しても、グロブロマー捕捉を著しく増加できたことは注目に値する。
【０３２８】
疎水性／芳香族残基についての要件をさらに探究するために、本発明者らは、より少ない荷電残基とより高い疎水性含量とを特徴とする一連のペプチドについて研究した。結果を以下の表１２に示す。ここでは、最も疎水性でかつ電荷が最小のペプチドが、グロブロマーの捕捉に効率的であった（ＦＫＦＳＬＦＳＧ（配列番号３８）、ＦＫＦＮＬＦＳＧ（配列番号４０）およびＩＲＹＶＴＨＱＹＩＬＷＰ（配列番号７１））が、これらは、バックグラウンドモノマー種も著しい量で捕捉したことが観察でき、このことは、相互作用の特異性が、より均衡がとれた荷電／疎水性の性質を有するペプチドを用いるよりも低いことを示唆する。
【０３２９】
表１２．高い疎水性／芳香族含量を有する試薬の分析
【０３３０】
【表１２】
2013510297.tif 000243
全体的に、これらの結果は、ビーズ結合試薬とオリゴマーとの間の結合機序が、アビディティに依存することを示唆する。最適捕捉効率は、荷電されたコアと疎水性の外部とをもたらすコンジュゲートを用いて達成されるが、これらの試薬の正確な配列／構造は、重要性がより低い。骨格の変化（例えばペプチド対ペプトイド）およびキラリティーは、電荷分布よりも結合に関して重要性がより低く、Ｄ、Ｌ、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、ペプチド模倣物または類似の荷電および疎水性の特徴を有する有機分子を含む骨格は、オリゴマーを捕捉する類似の能力を示しやすい。最後に、疎水性含量を増加させることにより、捕捉効率が増加するが、オリゴマー形についての特異性を低減するので、電荷と特異性との間の均衡を維持することは、効率的なオリゴマー選択試薬のために重要である。
【０３３１】
試験した多様な芳香族残基
天然または非天然の多様な代わりの芳香族残基をペプチド骨格に導入して、追加の凝集体結合試薬を作製し、新しい試薬を上記のようにしてグロブロマー結合についてアッセイした。
【０３３２】
本研究について用いたペプチド骨格は、Ａｃ−ＦＫＦＫＫＫ−連結（より具体的にはＡｃ−ＦＫＦＫＫＫ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ｃｙｓ−ＮＨ２（配列番号９８））であり、その構造を以下に示す。
【０３３３】
【化３２】
2013510297.tif 000244
フェニルアラニンを、異なる試薬において、以下の天然または非天然残基のそれぞれで表される異なるタイプの芳香族残基で置き換えた。
【０３３４】
【化３３】
2013510297.tif 000245
ペプチド骨格Ａｃ−ＫＫＫＦＫＦ−連結（より具体的にはＡｃ−ＦＫＦＫＫＫ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ｃｙｓ−ＮＨ２（配列番号１０５））も研究した。フェニルアラニンを、異なる試薬において、以下の非天然残基のそれぞれで表される異なるタイプの芳香族残基で置き換えた。
【０３３５】
【化３４】
2013510297.tif 000246
置換芳香族残基を有する試薬についてのグロブロマー結合アッセイの結果を、図３０Ａ、３０Ｂおよび３０Ｃに示す。結果は、全てのタイプの置換芳香族残基が、特異的グロブロマー捕捉のために働いたことを示す。本実験における様々な試薬での同様の範囲の捕捉および検出のレベルにより反映される比較的均一な構造−活性の関係により、このペプチド骨格が、全般的に、グロブロマー捕捉を改善することが確認される。
【０３３６】
別のペプチド試薬を設計して、正電荷および芳香族の特徴を同じ残基に組み込んだ（荷電芳香族）。この非天然ペプチドの配列は、Ａｌａ−ＡｍＦ−ＡｍＦ−Ｐｈｅ−ＡｍＦ−Ａｌａ（ＡｍＦ＝４−メチルアミノフェニルアラニン、荷電芳香族残基、配列番号５８）である。このペプチドの構造を以下に示す。
【０３３７】
【化３５】
2013510297.tif 000247
グロブロマー結合アッセイを、この上記の「荷電芳香族」試薬について行い、結果を図３１に示す。この実験は、ここでもまた、正に荷電しかつ芳香族の残基ならびにそれらの構造の柔軟性の重要性を示す。
【０３３８】
芳香族の間隔の影響力
異なる間隔の芳香族を有する一連のペプチド試薬を作製し、凝集体結合能力についてグロブロマー捕捉アッセイで試験した。これらの試薬の配列は、それぞれＫＫＫＦＫＦ（配列番号１）、ＫＫＦＫＫＦ（配列番号４２）、ＫＦＫＫＫＦ（配列番号４３）およびＦＫＦＫＫＫ（配列番号３６）を含む。同様のレベルの検出結果は、芳香族の間隔が、凝集体捕捉において最小限の役割しか演じないことを示す（データは示さないが、これらの試薬は全て、グロブロマーを特異的に捕捉した）。
【０３３９】
第１級アミンの間隔の影響力
第１級アミンの間隔も、凝集体捕捉に対するその影響力について研究した。一方がより短い鎖のＬｙｓ類似体Ｆｍｏｃ−２，４−ジアミノブタン酸（α第１級アミンを有する「ｆｄｂ」）を含み、他方がδ第１級アミン（デルタアミノ酸２，５−ジアミノペンタン酸、「ｏ」と略記する）を含む２つのペプチドを作製した。ペプチドは、磁性ビーズに、Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ｃｙｓ−ＮＨ２リンカーを用いてコンジュゲートし、グロブロマー捕捉アッセイにおける凝集体結合能力について試験した。２つのペプチドの構造を以下に示す。
【０３４０】
Ｆ−ｆｄｂ−Ｆ−Ｆｄｂ−Ｆｄｂ−ｆｄｂ（配列番号５３）：
【０３４１】
【化３６】
2013510297.tif 000248
ＦｏＦｏｏｏ（配列番号５４）：
【０３４２】
【化３７】
2013510297.tif 000249
第１級アミンの間隔が異なる試薬についてのグロブロマー捕捉アッセイの結果を図３２に示す。この結果から、凝集体の捕捉において、より短い鎖のＬｙｓ類似体、すなわち間隔がより狭い第１級アミンを有するペプチドが、間隔がより広い第１級アミンを有するδペプチドよりも有効であることが明らかになる（但し、これらはともにグロブロマーを特異的に捕捉した）。
【０３４３】
第４級アミンの付加
骨格への第４級アミンの付加を、Ａｃ−ＫＫＫＦＫＦ（配列番号１０８）および以下に示す構造の３つ（第２級アミンを有する１つの対照および２つの異なる第４級アミン）を含む４つのペプチドを用いて研究した。ペプチドを、磁性ビーズに、Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ｃｙｓ−ＮＨ２リンカーを用いてコンジュゲートし、上記のようにしてグロブロマー捕捉についてアッセイした。同様のレベルの検出結果は、単一の第４級アミンを含めることが、凝集体捕捉において最小限の役割しか演じないことを示す（データは示さないが、これらの試薬は全て、グロブロマーを特異的に捕捉した）。
【０３４４】
モノＢｏｅ−エチレンジアミン＋ＢｒＣＨ２ＣＯ−ＫＫＦＫＦ（配列番号５５）
【０３４５】
【化３８】
2013510297.tif 000250
トリエチルアミン＋ＢｒＣＨ２ＣＯ−ＫＫＦＫＦ（配列番号５６）
【０３４６】
【化３９】
2013510297.tif 000251
テトラメチルエチレンジアミン＋ＢｒＣＨ２ＣＯ−ＫＫＦＫＦ（配列番号５７）
【０３４７】
【化４０】
2013510297.tif 000252
試験した追加の凝集体結合試薬
表１３および表１４に示すようないくつかの追加のペプチド試薬およびペプトイド試薬を作製し、上記のようなグロブロマー捕捉アッセイにおいて試験した。中性であるＮｂｎ−Ｎｈｙｅ−Ｎｄｐｃ−Ｎｇａｂ−Ｎｔｈｆ−Ｎｃｐｍ（１１８−６、配列番号９７）を除いて、２つの表に列挙する全てのその他のペプチド試薬およびペプトイド試薬は、グロブロマーを特異的に捕捉した（図３３Ａ、３３Ｂおよび３３Ｃを参照されたい）。
【０３４８】
表１３：ＡＳＢ試薬を作製するための追加のペプチドおよびペプトイド配列
【０３４９】
【表１３】
2013510297.tif 000253
表１４：ＡＳＢ試薬を作製するための追加のペプトイド配列の構造および正味電荷
【０３５０】
【表１４−１】
2013510297.tif 000254
【０３５１】
【表１４−２】
2013510297.tif 000255
【０３５２】
【表１４−３】
2013510297.tif 000256
（実施例７）
メンブレンアレイ上での新しい潜在的な凝集体特異的結合試薬のスクリーニング
候補凝集体特異的結合試薬についてのペプチドまたはペプトイド配列の設計に加えて、セルロースメンブレン上にスポットしたランダムペプチド配列も、モノマーを超える凝集体との特異的結合について試験した。多くのペプチドが、本研究において、凝集体と特異的に結合することが見出された。
【０３５３】
１１２０のランダム１２マーペプチドを提示するように調製されたセルロースメンブレンアレイは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａのペプチドセンターから購入した（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ、このサービスは、現在、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｉｎｅｘｕｓ．ｃａ／を通じて利用可能である）。このメンブレン上のペプチドの負荷密度は、容易に入手可能でない。しかし、製造者により記載されたものと同様であると考えられるメンブレンアレイ合成方法を用いて、本発明者は、ペプチド負荷密度が約２〜４ｍｍｏｌリガンド／ｍ２であると測定し、このことは、最少数の正電荷である＋１を有するペプチドが、おそらく、同じ電荷密度である２〜４ｍｍｏｌ正味電荷／ｍ２にてメンブレンアレイを被覆していることを意味する。ランダムペプチドを被覆するために本発明者が用いたアレイ合成方法を以下に記載する。
【０３５４】
セルロースメンブレン（Ｗｈａｔｍａｎ５０）を、エピブロモヒドリン：過塩素酸：ジオキサンの１０：１：９０溶液に浸して１〜３時間室温にてインキュベートした。メタノールで洗浄して乾燥した後に、メンブレンを、そのままのトリオキサデカンジアミン中で７０℃にて１時間インキュベーションすることによりアミノ化した。洗浄の後に、メンブレンをクエンチし（３Ｍ  ＮａＯＭｅ中で）、洗浄して再び乾燥した。スポットを、ＮＭＰ中のＨＯＢＴおよびＤＩＣで予め活性化したＦｍｏｃＧｌｙの０．４Ｍ溶液１ｕｌをスポットし、２０分間インキュベートすることにより境界を定めた。カップリングを反復し、メンブレンを、ＤＭＦ中の２％無水酢酸、その後ＤＭＦ中の２％無水酢酸／２％ＤＩＥＡでキャッピングした。メンブレンをＤＭＦで洗浄し、ＤＭＦ中の４％ＤＢＵで脱保護し（２×１０〜２０分）、ＤＭＦおよびメタノールで洗浄し、次いで乾燥した。後続のアミノ酸は、次いで、１）活性化Ｆｍｏｃアミノ酸溶液をメンブレンにスポットし、２）無水酢酸でキャッピングし、３）ＤＢＵで脱保護するサイクルを用いる標準的な固相合成方法を用いて付着させることができた。最終的なメンブレンをキャッピングし、ＤＭＦおよびメタノールで洗浄し、乾燥した後に使用した。
【０３５５】
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａから購入したメンブレンを、１％乳溶液で６０分間インキュベートし、各１０分間、４回洗浄し、ＴＢＳＴ中の３ｎｇ／ｍＬのＡベータ１−４２グロブロマー（「オリゴマー」試料）または３ｎｇ／ｍＬのＡベータ１−４２モノマー（実施例２において上記するようにして調製した「モノマー」試料）の溶液に６０分間供した。洗浄した後に、メンブレンを、１％乳で希釈した抗Ａベータ抗体（６Ｅ１０）の溶液中で６０分間インキュベートした。洗浄した後に、メンブレンを、１％乳で希釈した２次抗体（ヤギ−抗マウス−ＨＲＰ）に６０分間供した。洗浄ステップの後に、化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤからのＤＵＲＡ  ＷＥＳＴ）をアレイに加え、画像をＫｏｄａｋイメージャーで撮影した。得られた画像を図３４に示し、メンブレン上での上位の特異的結合体のうちのグロブロマーと特異的に結合した正に荷電したペプチドを、以下の表１５に示す。上位の特異的結合体のうちではないが、メンブレン上でグロブロマーと特異的に結合したいくつかのペプチドも表１５に含めた。なぜなら、これらは、後で磁性ビーズ上で確認したからである。
【０３５６】
表１５：セルロースメンブレン上でＡベータ４２グロブロマーと特異的に結合した、正に荷電したペプチド
【０３５７】
【表１５】
2013510297.tif 000257
表１５から選択したペプチドを、ＤＹＮＡＬビーズに、ペプチドのアミノ末端にてリンカーＡｃ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｈｘ−Ａｈｘ（配列番号１０９）を用い、上記と同じプロトコールに従ってコンジュゲートした。ビーズ上でのこれらの試薬の電荷密度は、正に荷電した残基を１つだけ有するペプチドについて約４０００ｎｍｏｌ／ｍ２の低さであり、正に荷電した残基を１より多く有するペプチドについて正比例してより高かった。ペプチドがコンジュゲートしたビーズを、生理的レベルのＡベータ４０および４２を含有するＣＳＦ中で、Ａベータ４２グロブロマー結合能力についてアッセイした。ビーズ上で試験した表１５に列挙する配列の全ては、ビーズを被覆する場合に、Ａベータ４２グロブロマーと特異的に結合することが確認された（表１５およびデータは示さず）。
【０３５８】
（実施例８）
洗浄剤処理を用いるＣＳＦにおける結合バックグラウンドの低減
本実施例では、ＣＳＦのような生物学的試料からの凝集体検出の可能性のある干渉について研究し、そのような干渉を低減するための解決法を、捕捉後洗浄ステップにおいて様々な洗浄剤を試験することにより見出した。
【０３５９】
まず、正常ＣＳＦ（健常な人々からのプールしたＣＳＦ試料）に添加したＡベータ４２グロブロマーの検出限界（ＬｏＤ）を、緩衝液（ＴＢＳＴＴ）に添加したグロブロマーと、ＰＳＲ１とコンジュゲートしたビーズを用いて比較した。結果は、グロブロマーのＬｏＤが、ＣＳＦに添加した場合に約１０ｐＭ、または緩衝液に添加した場合に約５ｐＭであったことを示し、このことは、ＣＳＦ試料が結合の高いバックグラウンドを有することを示した（データは示さず）。
【０３６０】
次に、２つの中性洗浄剤であるモノラウリン酸ポリエチレングリコールソルビタン（ＴＷＥＥＮ２０としてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手可能）およびｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−１４としてＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪから入手可能）を用いて、ＰＳＲ１ビーズと接触させたグロブロマー添加ＣＳＦ試料を処理した。各アッセイについて、３０μｌのＰＳＲ１ビーズ（約７〜１２ｎｍｏｌ  ＰＳＲ１リガンド／ｍｇ  ＤＹＮＡＬビーズで被覆、これを本実施例およびそうでないと記載しない限り以下の実施例で用いた）と７０μｌの１×ＴＢＳＴＴとの混合物を、プルダウンプレートの各ウェルにすぐにピペットで入れた。液体を磁性分離器で除去した。５０マイクロリットルの５×ＴＢＳＴＴを各ウェルに加えた。ビーズを、７５０ｒｐｍにて軽く振とうすることにより懸濁した。次に、グロブロマーなしの２００μｌのＴＢＳＴＴまたはＣＳＦ試料を各ウェルに加えた。プルダウンプレートを密閉し、３７℃にて１時間、５００ｒｐｍで振とうしながらインキュベートした。インキュベーションの後に、ビーズを８回、ＴＢＳＴで、プレート洗浄器で洗浄した。プレート洗浄の後に、ビーズから残存ＴＢＳＴ緩衝液を磁性分離器で除去した。ビーズを、次いで、１００μｌのＴＢＳ、１％Ｔｗｅｅｎ２０または１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４のいずれかと室温にて３０分間、７５０ｒｐｍでインキュベートした（その後、ＴＢＳＴを用いてプレート洗浄器で追加の洗浄を８回行った）。残存ＴＢＳＴを磁性分離器で除去した後に、２０μｌの変性溶液、典型的には０．１〜０．１５Ｎ  ＮａＯＨをビーズに加えた。プレートをアルミホイルプレートシーラーで覆い、８０℃にて３０分間、７５０ｒｐｍで振とうしながらインキュベートした。インキュベーションの後に、プレートを直ちに氷上に１分間置き、２０マイクロリットルの中和溶液、典型的には０．１２〜０．１８Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４＋０．４％Ｔｗｅｅｎ２０を各ウェルに加え、プレートを室温にて５分間、７５０ｒｐｍで振とうしながらインキュベートした。ビーズを溶出物から磁気的に分離した後に、上清を、予めブロッキングしたＭＳＤ  ＥＬＩＳＡプレートに移した。ＭＳＤ  Ａベータ３重アッセイを、製造者の使用説明書に従って行った。ＣＳＦ試料から検出されたＡベータ４２およびＡベータ４０のバックグラウンドレベルを図３５に示す。結果は、ＴＷＥＥＮ２０またはＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−１４のいずれかでの洗浄が、正常ＣＳＦのＡβ４２の検出を、ＰＳＲ１をＴＢＳＴＴ緩衝液単独とインキュベートした場合に観察されたバックグラウンドレベルまで低減したことを示す。これらは、正常ＣＳＦのＡβ４０の検出も著しく低減し、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−１４は、正常ＣＳＦのＡβ４０検出レベルの低減についてＴＷＥＥＮ２０よりもよく働くことが明らかになった。
【０３６１】
次に、洗浄剤処理の効果を、グロブロマーを添加した試料において研究した。様々な濃度のＡベータ４２グロブロマー（０〜２５ｐｇ／ｍＬ）を、２００ｕｌのＴＢＳＴＴまたはＣＳＦのいずれかに添加した。ＣＳＦ試料を、５０ｕｌの５×ＴＢＳＴＴと混合した後に、試料を３０μｌのＰＳＲ１ビーズと接触させた。捕捉、洗浄および検出ステップを、上記のようにして行った。異なるマトリクスに添加し、異なる洗浄緩衝液で処理し、シグナル／ノイズ（ここで、シグナルは、試料のＲＬＵであり、ノイズは、グロブロマーを添加していない、同等に処理された試料からのシグナルである）を計算したグロブロマーのＡベータ４２検出レベルの結果を図３６に示す。結果は、ＰＳＲ１プルダウンの後にグロブロマー添加ＣＳＦ試料をＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−１４またはＴＷＥＥＮ２０で処理することは、グロブロマー検出のシグナル／ノイズを改善したことを示す。
【０３６２】
Ｓ／Ｎ＝２に基づくＭＰＡグロブロマー検出のＬｏＤ、および２５．３ｐｇ／ｍＬのグロブロマー添加レベルでのシグナル／ノイズ比を計算し、以下の表１６に示す。計算した結果は、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−１４およびＴＷＥＥＮ２０は、ＣＳＦ中のグロブロマーのＬｏＤも、緩衝液中のグロブロマーのＬｏＤまで著しく低減したことを示す。
【０３６３】
表１６：捕捉後に異なる洗浄緩衝液で処理した試料のグロブロマー検出ＲＬＵならびに計算したＬｏＤおよびＳ／Ｎ
【０３６４】
【表１６】
2013510297.tif 000258
最後に、ある範囲の洗浄剤を、本実施例で記載する方法に従って試験し、いくつかが、ＣＳＦ試料のバックグラウンドＡベータ凝集体結合を低減することが見出された。試験した洗浄剤およびそれらの構造を図３７に示す。アッセイ結果および計算したシグナル／ノイズのまとめを以下の表１７に示す。
【０３６５】
表１７：捕捉後に異なる洗浄剤で処理した試料のグロブロマー検出ＲＬＵおよび計算したＳ／Ｎ
【０３６６】
【表１７】
2013510297.tif 000259
ａ：Ａベータ４２グロブロマー添加／非添加のＳ／Ｎ＝（０．５ｎｇ／ｍＬグロブロマーを有する試料のＡベータ４２  ＲＬＵ）／（０ｎｇ／ｍＬグロブロマーを有する試料のＡベータ４２  ＲＬＵ）
ｂ：Ａベータ４２グロブロマー添加／Ａベータ４０のＳ／Ｎ＝（０．５ｎｇ／ｍＬグロブロマーのＡベータ４２  ＲＬＵ）／（０ｎｇ／ｍＬグロブロマーを有する試料および０．５ｎｇ／ｍＬグロブロマーを有する試料の平均Ａベータ４０  ＲＬＵ）  。
【０３６７】
結果は、より長い炭素鎖を有するＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ洗浄剤（ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−１４および３−１６）が、Ａベータ４２グロブロマー検出についてのシグナル／ノイズ比をより著しく改善したことを示す。別の実験では、より長い炭素鎖を有するＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ洗浄剤、特にＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−１６が、Ａベータ４０凝集体捕捉Ｓ／Ｎを、ＡＤ  ＣＳＦにおいてさらにより著しく改善した（データは示さず）。
【０３６８】
ＣＳＦ試料のバックグラウンドＡベータ凝集体結合を低減し、１．０より大きいＡベータ４２グロブロマー添加／Ａベータ４０のＳ／Ｎをもたらした洗浄剤は、以下のものである。
【０３６９】
ＴＷＥＥＮ２０（モノラウリン酸ポリエチレングリコールソルビタン）、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−１４（ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−１６（ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−１２（ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）、ＡＳＢ−１４（アミドスルホベタイン−１４，３−［Ｎ，Ｎ−ジメチル（３−ミリストイルアミノプロピル）アンモニオ］プロパンスルホネート）、ＡＳＢ−１６（アミドスルホベタイン−１６，３−［Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（３−パルミトアミドプロピル）アンモニオ］プロパン−１−スルホネート）、ＡＳＢ−Ｃ８フェノール（４−ｎ−オクチルベンゾイルアミド−プロピル−ジメチルアンモニオスルホベタイン）およびＥＭＰＩＧＥＮ  ＢＢ（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ドデシルグリシンベタイン）。これらは全て、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈおよび／またはＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手可能である。
【０３７０】
（実施例９）
凝集体特異的結合試薬のコンフォメーション特異性
本実施例は、ＰＳＲ１およびＰＳＲ１のペプチド類似体であるＡｃ−ＦＫＦＫＫＫ（配列番号９９）のコンフォメーション特異性の特徴決定をする。
【０３７１】
材料および方法
Ａｂ４２凝集体を、以前に記載したようにして調製した。原線維を、Ｓｔｉｎｅら（ＪＢＣ２００３年、２７８巻、１１６１２頁）に従って調製し、グロブロマーを、Ｂａｒｇｈｏｒｎら（Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２００５年９５巻８３４頁）に従って調製し、ＡＤＤＬを、Ｌａｍｂｅｒｔら（ＰＮＡＳ  １９９８年、９５巻６４４８頁）に従って調製し、ＡＳＰＤを、Ｎｏｇｕｃｈｉら（ＪＢＣ  ２００９年２８４巻３２８９５頁）に従って調製した。正常ＣＳＦは、臨床的に特徴決定された認知障害のない患者のＣＳＦ試料からプールした。ＡＤ  ＣＳＦは、臨床的に特徴決定されたＡＤ患者の試料からプールした。アルツハイマー病脳ホモジネート（ＡＤＢＨ）は、臨床的に診断されたＡＤ患者の脳試料を０．２Ｍスクロース（１：１０ｗ／ｖ）中で超音波処理することにより調製した。
【０３７２】
未変性ゲルについて、各試料を４〜２０％勾配ゲルにローディングし、未変性条件下で５時間泳動（ｒｕｎ）し、クーマシー染色（簡単なＢｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎ）で処理した。
【０３７３】
捕捉アッセイ（ミスフォールディングタンパク質アッセイ）のために、アリコートのビーズ（３０ｕｌ）を、９６ウェルプレートのウェルに加えた後に、８０：２０  ＣＳＦ：ＴＢＳＴＴ中の１２５ｕｌの試料を加えた。プレートを密閉し、３７℃にて１時間、振とうしながらインキュベートした。プレートをＴＢＳＴで洗浄し、残存緩衝液を除去した。変性溶液（０．１Ｎ  ＮａＯＨ）を各ウェルに加え、プレートを８０℃まで３０分間、振とうしながら加熱した。プレートをＲＴまで冷却した後に、中和緩衝液（０．１２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ３−０．４％ＴＷ２０）を加え、プレートをＲＴにて軽く振とうした。アッセイは、Ａβについての３重Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＥＬＩＳＡキットを用いて分析した。ビーズから溶出された試料中のＡβを、製造者のプロトコールに従って検出した。
【０３７４】
検出限界（ＬｏＤ）研究について、各凝集体の系列希釈物をＣＳＦに添加し、上記のプロトコールに従ってアッセイした。ＬｏＤは、バックグラウンドレベルの２倍超と定義した。
【０３７５】
ＡＤと正常ＣＳＦとを識別するために、プールした正常ＣＳＦまたはプールしたアルツハイマー病患者ＣＳＦを、上記のプロトコールに従ってアッセイした。
【０３７６】
結果
異なるサイズおよび形状の７つのＡβ種を、結合研究のために選択した。
【０３７７】
表１８  Ａβ種
【０３７８】
【表１８】
2013510297.tif 000260
未変性ゲル分析
未変性ゲル分析を、異なるＡβ種の特徴決定をするために行った（図３８）。試験した凝集体は全て、中程度の均質性を有した。全て、いくらかの量のモノマーを含有した。グロブロマー以外は全て、ゲルに入りこまない大きい物質を有した。グロブロマーは、試験したモデルのうちで最小であることが明らかである。ＡＳＰＤおよびＡＤＤＬは、類似の特性を示した。
【０３７９】
試薬の捕捉特性
ミスフォールディングタンパク質アッセイを用いる捕捉研究は、ＰＳＲ１が、多様な凝集体のコンフォメーションおよびサイズを捕捉できることを示した。全ての凝集体種は、ｆｍｏｌ以下のレベルでＰＳＲ１により捕捉された。
【０３８０】
表１９  凝集体についてのＰＳＲ１のＬｏＤ
【０３８１】
【表１９】
2013510297.tif 000261
ＡＳＲ１およびＡｃ−ＦＫＦＫＫＫ（配列番号９９）は、試験した全ての異なる凝集体種と、類似の結合優先性で普遍的に結合する。ＬｏＤについての正確な数は、ＣＳＦおよび凝集体ロットに依存する。
【０３８２】
表２０  凝集体についての試薬のＬｏＤ
【０３８３】
【表２０】
2013510297.tif 000262
ＬｏＤは、より大きい原線維状物質＞より小さいオリゴマー種＞＞モノマーを捕捉する優先性を示す。このパターンは、これらの種を３ｕｌのＰＳＲ１ビーズおよび１ｎｇ／ｍＬの凝集体を用いて試験した場合に観察される捕捉選択性を反映する。
【０３８４】
表２１  凝集体についての試薬のＬｏＤ
【０３８５】
【表２１】
2013510297.tif 000263
ＡＤと正常ＣＳＦとの識別
ＡＤと正常ＣＳＦとを識別するために有用なものを同定するために、試薬を試験した。図３９を参照されたい。ＰＳＲ１およびＡｃ−ＦＫＦＫＫＫ（配列番号９９）はともに、対応しない正常のプールと比べて陽性のプールしたＡＤ  ＣＳＦにおいて、より高いＡβ４０シグナルを有することが示され、このことは、試薬が、ｉｎ  ｖｉｖｏで、ＡＤ  ＣＳＦに存在するＡβ４０凝集体を捕捉していることを示唆した。Ａｃ−ＦＫＦＫＫＫ（配列番号９９）は、シグナルの最大の変化をもたらす。
【０３８６】
（実施例１０）
分画遠心分離によるＡＤ  ＣＳＦからのＡβ４０オリゴマーの分粒
本実施例では、ＰＳＲ１によりアルツハイマー病ＣＳＦから捕捉された凝集体の物理的特性を特徴決定する。
【０３８７】
材料および方法
ＡＤ  ＣＳＦまたは正常のプールしたＣＳＦ（何も添加していないか、５ｎｇ／ｍＬグロブロマーを添加、または２００ｎＬ／ｍＬ  ＡＤＢＨ（超音波処理ありもしくはなし）を添加）を、１６，０００×ｇにて１０分間または１３４，０００×ｇにて１時間、４℃にて遠心分離した。上清画分およびペレット画分を別々のチューブに入れ（ペレットは、元の試料と同じ容量のＣＳＦ中で再構成した）、ミスフォールディングタンパク質アッセイ（ＭＰＡ）に供した。
【０３８８】
ミスフォールディングタンパク質アッセイ：１００ｕｌの試料を、２５ｕｌの５×ＴＢＳＴＴ緩衝液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％Ｔｗｅｅｎ２０、５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ｐＨ７．５）および３０ｕｌのＰＳＲ１ビーズと３７℃にて１時間インキュベートした。ビーズをＴＢＳＴで６回洗浄した後に、１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４と３０分間インキュベーションし、ＴＢＳＴでさらに洗浄した。Ａベータペプチドを０．１５Ｍ  ＮａＯＨで室温にて３０分間溶出した後に、溶出物を０．１８Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４＋０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０で中和し、製造者の使用説明書に従うＭｅｓｏｓｃａｌｅの３重Ａβイムノアッセイにより検出した。
【０３８９】
結果
既知のサイズの様々な凝集体の挙動を決定して、アルツハイマーのＣＳＦで見出される凝集体についての分子量の参照を得た。凝集体の溶解度は、分子量と線形の関係を必ずしも有さないが（そして凝集体のコンフォメーションに依存する変動性の支配下にある）、これらの研究は、凝集体サイズについての参照のいくらかの枠組みをもたらす。超音波処理していないアルツハイマー病脳ホモジネート（ＡＤＢＨ）からのＡベータ原線維は、１６，０００ｇおよび１３４，０００ｇの両方にてペレットを形成した。これらの凝集体は、ＴＳＫ４０００カラムの空隙容量近くで溶出され、１ＭＤａより大きいとみられる。超音波処理したＡＤＢＨからのいくらかの割合のＡベータ凝集体は、１６，０００ｇにて可溶性であったが、１３４，０００ｇにてペレットを形成した。サイズ排除クロマトグラフィーから、これらの凝集体が約０．５〜１ＭＤａであると見積もられた。グロブロマー（およそ５４ＫＤａであると見積もられる）は、１６，０００ｇおよび１３４，０００ｇの両方で可溶性であった。
【０３９０】
ＡＤ  ＣＳＦにおける内因性Ａβ４０オリゴマーは、１３４，０００ｇにて１時間の遠心分離の後に依然として溶液中にあり、このことは、これらが、超音波処理されたＡＤＢＨ試料で見出される０．５〜１ＭＤａの「中間サイズの」凝集体よりも小さいことがあることを示唆する。これらのデータは、ＡＤ  ＣＳＦで見出されるオリゴマーが、組織において沈着した凝集体（ＡＤＢＨ）と比較した場合に、溶解度に関して異なる挙動を有することを示し、これらのサイズがより小さいことを示唆する。
【０３９１】
（実施例１１）
脾臓ＡＡのマウスにおけるＡＡタンパク質の検出
本実施例は、ＰＳＲ１が、ＡＡアミロイドーシスおよび慢性炎症におけるいくつかの症例において発生する血清アミロイドＡ凝集体と優先的に結合することを示す。
【０３９２】
材料および方法
動物
同系交配８〜１０週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを用いた。全てのマウスは、特定の病原体のない条件下で維持した。飼育および実験プロトコールは、Ｓｗｉｓｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ｌａｗに従い、Ｃａｎｔｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｏｆｆｉｃｅ、Ｚｕｅｒｉｃｈの規則を遵守した。
【０３９３】
アミロイドーシスの誘導
アミロイド増進因子（ＡＥＦ）を、前に記載された［１］ようにしてアミロイド含有肝から抽出し、４つの異なる群のマウスにおいてアミロイド誘導のために用いた。各マウスは、２０ｕｇのタンパク質抽出物を、尾静脈の静脈内注射として受け、全身性炎症を、０．２ｍｌの１％硝酸銀（ＡｇＮＯ３）の随伴する皮下注射により刺激した。さらなる炎症刺激は、第７日、第１４日および第２１日に週１回与えた。マウスを、第５日、第９日、第１６日および第２３日のいくつかの時点で屠殺した。対照マウスは、単回の硝酸銀注射だけを受け、１６時間後に屠殺した。
【０３９４】
組織学
脾臓を、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。アミロイドの存在は、厚さ５ｕｍの切片でコンゴレッド染色した後に［２］調査し、アミロイド量を以下の尺度に従って定量化した：０；なし；１＋微量のアミロイド；２＋少量のアミロイド沈着物；３＋中程度のアミロイド沈着物；４＋大量のアミロイド［１］。
【０３９５】
組織調製
１０％脾臓ホモジネートを、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中で、超音波組織ホモジナイザーを用いて調製した。ホモジネートを２００×ｇにて１分間遠心分離し、上清をＰＳＲ１ビーズベースの捕捉アッセイのために用いた。イムノブロッティング分析のために、ＰＢＳ不溶性組織ペレットを８Ｍ尿素中で２４時間、旋回しながら室温にて可溶化した。
【０３９６】
脾臓ホモジネートからのＡＡ種のＰＳＲ−１ビーズベースの捕捉
ＰＳＲ１をコンジュゲートしたビーズを、１ｍｌのＴＢＳ−ＴＴ（ＴＢＳ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ、１％Ｔｗｅｅｎ２０）で２回洗浄した後に、合計容量１００μｌのＴＢＳ−ＴＴ中で１０％脾臓ホモジネートと３７℃にて１時間、７５０ｒｐｍの振とうの下でインキュベートした。未結合の物質をビーズから、１ｍｌのＴＢＳ−Ｔ（ＴＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄することにより除去した。その後に、ビーズを５０ｕｌのＴＢＳ−Ｔに再懸濁し、捕捉されたタンパク質を、７５ｕｌ変性緩衝液（１Ｍ  ＮａＯＨ  ｐＨ１２．３）で３７℃または８０℃にて１０分間、それぞれ７５０ｒｐｍまたは１２００ｒｐｍの振とうの下で溶出した。その後に、試料を３０ｕｌの１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ４．３で３７℃または８０℃にて１０分間、それぞれ７５０ｒｐｍまたは１２００ｒｐｍの振とうの下で中和した。１５０ｕｌの溶出物をビーズから吸引し、ＳＡＡ／ＡＡタンパク質の存在を、Ｔｒｉｄｅｌｔａ  Ｌｔｄ．からのマウスＳＡＡ  ＥＬＩＳＡを用いるかまたはイムノブロッティングにより分析した。３ｕｌ、６ｕｌおよび９ｕｌのＰＳＲ−１ビーズならびに１ｕｌ、４ｕｌおよび８ｕｌの１０％脾臓ホモジネートならびにそれらの比を試験した。
【０３９７】
イムノブロッティング
試料を９５℃まで５分間加熱した後に、１０〜２０％Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅプレキャストゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により電気泳動し、その後、ニトロセルロースメンブレンにウェットブロッティングにより移した。マウスＳＡＡ／ＡＡタンパク質を検出するために、２つの異なる１次抗体：抗マウスＳＡＡ抗体（１：１０００；Ｔｒｉｄｅｌｔａ  Ｌｔｄ．）およびＧｕｎｉｌｌａ  Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ教授（Ｕｐｐｓａｌａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓｗｅｄｅｎ）から快く提供されたポリクローナル抗マウスＳＡＡ／ＡＡ抗体（１：１０００）を用いた。２次抗体は、それぞれヤギ−抗ラット−ＨＲＰ（１：８０００）およびヤギ−抗ウサギ−ＨＲＰ（１：１００００）であった。タンパク質バンドは、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を用い、ブロットをＳｔｅｌｌａ検出器（Ｒａｙｔｅｓｔ）内で露光することにより視覚化した。
【０３９８】
結果：
ＰＳＲ１被覆ビーズは、ＡＡ関連部分を捕捉できる：
ＰＳＲ１被覆ビーズがＡＡ関連部分を捕捉できるか否かを試験するために、ＭＰＡを、３ｕＬまたは９ｕＬのＰＳＲ１被覆ビーズ（３０ｍｇ／ｍＬ）を用い、脾臓ＡＡのマウス（コンゴレッド染色により組織学的に評価して３＋のスコア、図４１）および対照の未処置マウスからの１ｕＬ、４ｕＬまたは８ｕＬの１０％ｗ／ｖ脾臓ホモジネートを投入物として用いて行った。抗マウスＳＡＡ抗体を用いるビーズ画分、溶出画分およびＰＳＲ１で枯渇させた投入物画分に対するウェスタンブロット分析により、ＡＡ含有試料においてのみ、溶出画分およびビーズ画分において、分子量マーカーの７ｋＤａ成分のものと同様の電気泳動移動度を有する短い断片の存在が明らかになった（図４２ａ〜ｃ）。３ｕＬのＰＳＲ１ビーズを用いて行ったＭＰＡの溶出画分も、マウスＳＡＡサンドイッチＥＬＩＳＡにより試験した。ＳＡＡは、ＡＡ含有試料からの溶出物においてのみ検出できた（図４２ｄ）。
【０３９９】
いくつかの試験チューブでは、捕捉されたＡＡ部分の溶出が最適でなく、ビーズ画分においてもイムノブロット上でシグナルが検出できた（図４２ｃ）。よって、溶出のためのよりストリンジェントな条件（８０℃および１２００ｒｐｍ）を試験した。これらの条件は、ＡＡ捕捉部分の完全な溶出をもたらした（図４３）。循環における全長ＳＡＡのレベルが非常に高いアミロイド陰性であるがＡｇＮＯ３で抗原刺激した動物からの脾臓ホモジネート、または未処置動物からの脾臓ホモジネートをＭＰＡアッセイに供した場合、溶出物においてシグナルは検出されなかった（図４３）。重要なことに、このイムノブロットについて、別の抗マウスＳＡＡ抗体を用いて、アミロイド陽性試料からの溶出物においていくつかのより短いＡＡ断片が除去された。
【０４００】
これらの実験は、ＰＳＲ１被覆ビーズがＡＡ関連部分を捕捉できることを示す。
【０４０１】
ＡＡ凝集体の変性は、ＡＡ関連部分の検出を妨げる：
ＡＡ関連部分のＰＳＲ１捕捉が凝集体に限定されるか否かを試験するために、ＭＰＡを、変性、緩衝および非変性ＡＡ含有試料、ならびに対照ＡｇＮＯ３処置マウスおよび対照未処置マウスからの脾臓ホモジネートについて行った。溶出画分をＥＬＩＳＡにより試験した。ＳＡＡは、非変性または緩衝ＡＡ含有試料からの溶出物においてのみ検出できた（図４４）。これらのデータは、投入物物質の変性が、ＰＳＲ１被覆ビーズによるＡＡ関連部分の捕捉および／またはＰＳＲ１被覆ビーズからのＡＡ関連部分の溶出を妨げることによりＭＰＡに干渉し、ＰＳＲ１ビーズによるそのような部分の捕捉は、試験した条件下で凝集体特異的であることを示す。
【０４０２】
参考文献
１．Ｌｕｎｄｍａｒｋ  Ｋ、Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ  ＧＴ、Ｎｙｓｔｒｏｍ  Ｓ、Ｍｕｒｐｈｙ  ＣＬ、Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ａら（２００２年）Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｉｔｙ  ｏｆ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ  ｂｙ  ａ  ｐｒｉｏｎ−ｌｉｋｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９９巻：６９７９〜６９８４頁
２．Ｐｕｃｈｔｌｅｒ  Ｈ、Ｓｗｅａｔ  Ｆ（１９６５年）Ｃｏｎｇｏ  ｒｅｄ  ａｓ  ａ  ｓｔａｉｎ  ｆｏｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｏｆ  ａｍｙｌｏｉｄ．  Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  １３巻：６９３〜６９４頁  。
【０４０３】
（実施例１２）
アミリン凝集体の検出
本実施例は、ＰＳＲ１が、ＩＩ型糖尿病において発生するアミリン凝集体と優先的に結合することを示す。より具体的には、本実施例は、ＰＳＲ１が、どのようにモノマーよりもアミリン原線維と優先的に結合するか（アミリンはｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製したかまたは膵臓組織から抽出されたかのいずれか）について記載する。
【０４０４】
材料および方法
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏアミリン原線維を、モノマーアミリンペプチドを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）中で１００ｕＭにて再構成し、ＲＴにて３日より長くインキュベートすることにより作製した。１０％膵臓組織ホモジネートを、スクロース溶液中で作製した。試料を、１容積の試料を９容積の６Ｍチオシアン酸グアニジンと合わせ、ＲＴにて少なくとも３０分間インキュベートすることにより変性させた。
【０４０５】
試料中のモノマーアミリンを、Ｌｉｎｃｏヒトアミリン（トータル）ＥＬＩＳＡキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃａｔ♯ＥＺＨＡＴ−５１Ｋ）により検出し、凝集したアミリンを、ＰＳＲ１ビーズを用いるＭＰＡ（ミスフォールディングタンパク質アッセイ）により検出した。ＭＰＡを行うために、未変性または変性した試料（ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルまたは組織）を、緩衝液または正常ヒト血漿に添加し、ＰＳＲ１または陰性対照ビーズに供した。インキュベーションの後に、ビーズを洗浄し、ビーズと結合した凝集したアミリンを溶出し、６Ｍチオシアン酸グアニジンで変性させた。溶出物を、次いで、試料緩衝液で希釈し、上記のＬｉｎｃｏヒトアミリン（トータル）ＥＬＩＳＡキットを用いるＥＬＩＳＡにより検出した。
【０４０６】
結果
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成したアミリン
図４５ＡおよびＢは、ＭＰＡが、緩衝液および血漿の両方においてアミリンｉｎ  ｖｉｔｒｏ原線維を検出するが、モノマーは検出しないことを示す。
【０４０７】
膵臓組織からの内因性アミリン
ＩＩ型糖尿病患者からの膵臓組織は、正常膵臓組織と比較して、高濃度の凝集したアミリンを含有する。しかし、この凝集したアミリンは、試料がモノマー形に変性されない限りはＥＬＩＳＡにより直接検出できない（図４６を参照されたい）。
【０４０８】
ＭＰＡアッセイを行った際、これは、ヒト血漿に添加したＩＩ型糖尿病患者からの膵臓組織において凝集したアミリンを検出した。凝集したアミリンをモノマーに変換する試料の変性は、ＭＰＡによる検出を消失させた（図４７を参照されたい）。
【０４０９】
ＩＩ型糖尿病患者からの膵臓組織における凝集したアミリンの検出は、ＰＳＲ１がアミリン原線維と特異的に結合することによる。図４８は、血漿に添加した同じＩＩ型糖尿病膵臓組織がＰＳＲ１と結合したが、中性グルタチオンまたはＰＳＲ１の負に荷電したバージョンであるペプトイド（５Ｌ）のいずれかを有する対照ビーズとは結合しなかったことを示す。
【０４１０】
（実施例１３）
アルファ−シヌクレインの検出
本実施例は、ＰＳＲ１が、パーキンソン病、ならびにゴーシェ病、多系統萎縮症およびレビー小体型認知症のようなその他のシヌクレイン病で発生するアルファ−シヌクレイン凝集体と優先的に結合することを示す。
【０４１１】
材料および方法
ＥＬＩＳＡ
アミリン原線維を、Ｊ．  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．（１９９９年）２７４巻、２８号、１９５０９〜１９５１２頁に報告されるようにして調製した。原線維を変性するために、試料を５．４Ｍチオシアン酸グアニジンで室温にて３０分間処理した。試料を、次いで、示される濃度まで希釈し、アルファシヌクレインをサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ♯ＫＨＢ００６１）により、製造者の使用説明書に従って検出した。
【０４１２】
ミスフォールディングタンパク質アッセイ
凝集したアルファシヌクレインについてのＰＳＲ１ビーズの特異性を、３ｕｌのＰＳＲ１ビーズを原線維状アルファ−シヌクレインと、化学変性剤（室温にて３０分間の５．４Ｍチオシアン酸グアニジン）での前処理ありまたはなしでインキュベーションすることにより試験した。アルファシヌクレインをＴＢＳＴＴ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％Ｔｗｅｅｎ２０）中の８０％ＣＳＦまたは血漿、１２５ｕｌで示される濃度に希釈した。試料を３７℃および５５０ｒｐｍにて１時間インキュベートした後に、ＴＢＳ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０緩衝液で洗浄した。結合したアルファシヌクレインを、ビーズから、４ｕｌの６Ｍチオシアン酸グアニジン（室温にて３０分間）を用いて溶出し、２４６ｕｌのＥＬＩＳＡ希釈緩衝液で希釈し、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ♯ＫＨＢ００６１）により検出した。ビーズへのアルファシヌクレイン原線維の非特異的結合も、対照ビーズ（グルタチオンコンジュゲートＤｙｎａｌビーズ）を用いて試験した。
【０４１３】
結果
ＰＳＲ１ビーズは、アルファシヌクレイン原線維と結合する
アルファシヌクレイン（ａＳｙｎ）原線維は、これらを原線維内でマスクされている抗体エピトープを露出させる変性剤を用いて前処理しない限り、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ♯ＫＨＢ００６１）により検出されなかった。グアニジン処理したアルファシヌクレイン原線維だけを検出でき、このことは、変性が、凝集体の構成要素であるモノマーの最適な検出のために必要であることを示唆した。低濃度の凝集体を含有する大容積の試料の変性は困難であるので、ＰＳＲ１は、これらの凝集体を捕捉して富化するために有用なツールである。図４９を参照されたい。
【０４１４】
ミスフォールディングタンパク質アッセイ（ＭＰＡ）で用いたＰＳＲ１ビーズは、グルタチオン分子とコンジュゲートした対照ビーズ（ＣＴＲＬ）と比較して、ＣＳＦまたは血漿中に希釈したアルファシヌクレイン（ａＳｙｎ）原線維と特異的に結合した。図５０を参照されたい。
【０４１５】
ミスフォールディングタンパク質アッセイで用いたＰＳＲ１ビーズは、ＣＳＦまたは血漿中に希釈したアルファシヌクレイン原線維（未変性ａＳｙｎ原線維）と優先的に結合したが、原線維を化学変性剤で前処理することにより作製されたアルファシヌクレインモノマー（変性ａＳｙｎ）とは優先的に結合しなかった。ＰＳＲ１は、過剰のａＳｙｎモノマータンパク質を含有する生物学的マトリクスからの低レベルのａＳｙｎ原線維を捕捉して富化でき、このことは、凝集したａＳｙｎに対する著しい選択性を示した。図５１を参照されたい。
【０４１６】
アルファ−シヌクレイン原線維のためのＭＰＡアッセイ溶出条件の最適化
ＭＰＡアッセイにおけるアルファ−シヌクレイン原線維の検出のためのＰＳＲ１ビーズの使用についての条件を最適化するために、異なる溶出条件を試験した：１）６Ｍ  ＧｄｎＳＣＮを３０分間、対して２）０．１０Ｎ  ＮａＯＨを１０分間。１０分間の０．１Ｎ  ＮａＯＨ溶出は、チオシアン酸グアニジン溶出よりも良好に機能した。図５２を参照されたい。
【０４１７】
（実施例１４）
ＰＳＲ１−プリオンのマウス感染力
本実施例は、ＰＳＲ１が、プリオンタンパク質の感染性の形と優先的に結合することを示す。
【０４１８】
材料および方法
ハムスター血漿の調製
１ヶ月齢の離乳段階のゴールデンシリアンハムスターに、１０７のＬＤ５０感染単位と見積もられる１００μｌの２６３Ｋ感染１％ハムスター脳ホモジネート（ｗ／ｖ）（ＫｉｍｂｅｒｌｉｎおよびＷａｌｋｅｒ、１９８６年）、または１００μｌの１％非感染ハムスター脳ホモジネートを腹腔内接種した。その後、接種後第０日、３０日、５０日および８０日に、ハムスターを屠殺し、血液を、ＥＤＴＡ抗凝固剤の存在下で、心臓穿刺により、採集した。運動失調、毛づくろいの低下および食欲の喪失の臨床徴候が現れた際にも、動物を屠殺し、症状性の段階での試料を採取した。個別の血液試料を９５０×ｇにて１０分間遠心分離し、上清画分中の血漿を別のチューブに移し、−８０℃にて凍結した。
【０４１９】
ＰｒＰＳｃのビーズベースの捕捉
感度アッセイのために、ＰＢＳ中の２６３Ｋ感染１０％脳ホモジネートの１０倍系列希釈３０μｌを、Ｔｇ（ＳＨａＰｒＰ）マウスに脳内接種した（群＝４〜８）（Ｓｃｏｔｔら、１９８９年）。
【０４２０】
ＰＳＲ１捕捉アッセイのために、１４３ｄｐｉおよび１５４ｄｐｉにて屠殺した１１匹の症状性ハムスターからの血漿をプール１に、１０４から１０６ｄｐｉに屠殺した１４匹の症状性ハムスターからの血漿をプール２に、５０ｄｐｉでの２０匹の症状が出る前のハムスターからの血漿をプール３に、そして１１７〜１１８ｄｐｉでの１５匹の症状性ハムスターからの血漿をプール４に合わせた。２１μｌのＰＳＲ１コンジュゲートビーズ（（Ｌａｕら、２００７年）；Ｇａｏら、２０１０年原稿提出中）を１ｍｌのＰＢＳ（８ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で５回洗浄した後に、５００μｌのプールしたハムスター血漿と４℃にて１晩、振とう器でインキュベートした。
【０４２１】
未結合の物質を、ビーズから、１ｍｌのＰＢＳまたはＴＢＳＴＴで５回洗浄することにより除去した。ビーズを、６０μｌまたは１２０μｌのＰＢＳに再懸濁し、それぞれ３０μｌの再懸濁したビーズを、１群に少なくとも４匹のマウスのＴｇ（ＳＨａＰｒＰ）マウスに脳内接種した。
【０４２２】
マウスを２日おきにモニタリングし、ＴＳＥ（伝染性海綿状脳症）を、運動失調、よろめき、および後肢不全麻痺を含む臨床基準に従って診断した。終末期疾患の開始時に、Ｔｇ（ＳＨａＰｒＰ）マウスを屠殺した。マウスを従来の条件下で維持し、全ての実験は、Ｚｕｅｒｉｃｈの州の動物虐待防止ガイドラインに従って行った。
【０４２３】
病理組織学および免疫組織化学染色
厚さ２μｍの切片を、正に荷電したシラン処理ガラススライド上に切断し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色したか、またはＰｒＰ（ＳＡＦ８４）、星状細胞（ＧＦＡＰ）についての抗体を用いて免疫染色した。ＰｒＰ染色のために、切片を脱パラフィンし、９８％ギ酸中で６分間インキュベートし、次いで蒸留水で５分間洗浄した。
【０４２４】
切片を高圧釜内で１００℃に、クエン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）中で加熱し、室温まで３分間冷却し、蒸留水で５分間洗浄した。免疫組織化学染色を、自動化ＮＥＸＥＳ免疫組織化学染色装置（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）において、ＩＶＩＥＷ  ＤＡＢ検出キット（Ｖｅｎｔａｎａ）を用いて行った。プロテアーゼ１（Ｖｅｎｔａｎａ）と１６分間インキュベートした後に、切片を抗ＰｒＰ  ＳＡＦ−８４（ＳＰＩ  ｂｉｏ；１：２００）と３２分間インキュベートした。切片を、ヘマトキシリンで対比染色した。星状細胞についてのＧＦＡＰ免疫組織化学（ウサギ抗マウスＧＦＡＰポリクローナル抗体１：１０００で２４分間；ＤＡＫＯ）を同様にして行ったが、抗原性賦活化は、ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ＝８．０）中で１００℃に加熱することにより行った。
【０４２５】
ヒストブロット分析を、Ｔａｒａｂｏｕｌｏｓら、１９９２年に従う改変した標準的なプロトコールを用いて行った。厚さ１０μｍの凍結切片をガラススライド上に載せ、直ちにニトロセルロースメンブレン（Ｐｒｏｔｒａｎ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）に押しつけ、溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．８）に浸し、風乾した。タンパク質を移した後に、切片をＴＢＳＴ中で１時間再水和し、その後、１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．１％Ｂｒｉｊ３５を含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．８中の２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬにて、３７℃にて４時間、プロテイナーゼＫで消化した。メンブレンをＴＢＳＴで３回洗浄した後に、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８中の３Ｍチオシアン酸グアニジンでの変性ステップを室温にて１０分間行った。メンブレンを洗浄し、５％脱脂乳（ＴＢＳＴ中）でブロッキングし、抗ＰｒＰ抗体ＰＯＭ−１（球状ドメイン内のエピトープ、ａａ１２１〜２３１）、１：１００００と４℃にて１晩インキュベートした（Ｐｏｌｙｍｅｎｉｄｏｕら、２００８年）。ブロットを、再び洗浄し、アルカリホスファターゼコンジュゲートヤギ抗マウス抗体を加えた（ＤＡＫＯ、１：２０００）。ＴＢＳＴおよびＢ３緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．５）での別の洗浄ステップの後に、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて４５分間の視覚化ステップを行った。発色ステップを蒸留水で停止した。ブロットを風乾し、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＳＺＸ１２双眼顕微鏡およびＯｌｙｍｐｕｓカメラで写真を撮影した。
【０４２６】
ウェスタンブロット
１０％脳ホモジネートを、０．３２Ｍスクロース中で、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ２４（Ｂｅｒｔｉｎ）を用いて調製した。５０〜９０μｇタンパク質の抽出物を、５０μｇ／ｍＬプロテイナーゼ−Ｋで、ＤＯＣ／ＮＰ−４０  ０．５％中で、３７℃にて４５分間消化した。反応を、３μｌのｃｏｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤カクテルおよび８μｌのドデシルラウリル硫酸（ＬＤＳ）ベースの試料緩衝液を加えることにより停止した。試料を９５℃まで５分間加熱した後に、１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプレキャストゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により電気泳動し、その後、ニトロセルロースメンブレンにウェットブロッティングにより移した。タンパク質を、抗ＰｒＰ  ＰＯＭ１抗体（１：１００００）と４℃にて１晩インキュベートすることにより検出した。２次検出のために、ＨＲＰコンジュゲート抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。シグナルを、ＥＣＬ検出キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて視覚化した。
【０４２７】
結果
Ｔｇ（ＳＨａＰｒＰ）における２６３Ｋハムスター株の力価を決定するための感度アッセイ
血漿からＰＳＲ１ビーズにより捕捉されたプリオンの感染力についての標準曲線を作製するために、本発明者は、１０（ｗｔ／ｖｏｌ）％  ２６３Ｋハムスター脳ホモジネートから得られた１０倍系列希釈を、エンドポイントフォーマットで、ハムスタープリオンタンパク質を３２倍過剰発現する（Ｓｃｏｔｔら、１９８９年）Ｔｇ（ＳＨａＰｒＰ）マウスに脳内接種した（図５３、表２２）。１０−２〜１０−８の範囲の希釈物を接種されたマウスは、４０〜９８日間の平均インキュベーション時間の後に、臨床徴候を生じた。エンドポイントにまだ到達していないので、完全な標準曲線を得るためにさらなる希釈を行う。
【０４２８】
表２２：Ｔｇ（ＳＨａＰｒＰ）における２６３Ｋ接種材料のエンドポイント力価決定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）のまとめ
【０４２９】
【表２２】
2013510297.tif 000264
ａ希釈は、１０％脳ホモジネートから開始した。
【０４３０】
Ｔｇ（ＳＨａＰｒＰ）マウスにおけるプリオン感染ハムスターからの血漿被覆ＰＳＲ１ビーズを用いるバイオアッセイ
ＰＳＲ１ビーズを、２６３Ｋプリオン感染ハムスターの症状が出る前の群または症状性群のいずれかからプールした血漿試料とインキュベートし（表２３）、Ｔｇ（ＳＨａＰｒＰ）マウスにｉ．ｃ．接種した。症状性ハムスターからの血漿プールのビーズを接種したマウスは、接種後７４〜９４日間の平均インキュベーション時間の後に疾患を発生した（図５４、表２３）。症状が出る前のハムスターから得られたビーズを接種したマウスは、接種後５６および８５日後に疾患を発生した（図５４、表２３）。観察されたインキュベーション時間は、３０μｌ  ２６３Ｋハムスター脳ホモジネートの１０−７〜１０−８の感染性希釈物と相関する。
【０４３１】
臨床的に疾患を有するマウスにおけるプリオン病の発生は、病理組織学的および免疫組織化学的分析（図５４）、ならびにヒストブロットおよびウェスタンブロット分析におけるプロテイナーゼＫ耐性物質の検出（図５５）により明示された。
【０４３２】
これらのデータは、ＰＳＲ１ビーズが、プリオン感染血液試料から、感染力のあるプリオンを捕捉し、これを高い効率でＴｇ（ＳＨａＰｒＰ）マウスに伝達することを示す。
【０４３３】
表２３：血漿被覆ＰＳＲ１ビーズを接種したＴｇ（ＳＨａＰｒＰ）マウスのバイオアッセイのまとめ
【０４３４】
【表２３】
2013510297.tif 000265
参考文献
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【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１−１】
2013510297.tif 000266
【図１−２】
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【図１０】
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【図１１】
2013510297.tif 000269
【図１２】
2013510297.tif 000270
【図１３】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２６】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
2013510297.tif 000295
【図５０】
2013510297.tif 000296
【図５１】
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【図５２】
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【図５３Ａ】
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【図５３Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2013510297.tif 000306
【図８】
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【図９】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図２０】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３４】
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【図３７】
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【図３８】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図５４】
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【図５５】
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【国際調査報告】
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