(57)【要約】  ＤＮＡサンプル中のメチル化ヌクレオチドを検出するための、イオン感応型電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）の使用を説明する。ＤＮＡサンプル中のメチル化ヌクレオチドを検出する方法は、メチル化ヌクレオチドと非メチル化ヌクレオチドを識別する試薬を用いてＤＮＡのサンプルを処理して、処理したＤＮＡを提供するステップと、処理したＤＮＡを増幅するステップと、増幅したＤＮＡを任意にシークエンシングするステップとを含む。ＩＳＦＥＴを用いて、増幅および／またはシークエンシングするステップの間に鎖伸長反応における１つ以上のｄＮＴＰの付加を監視する。適切な装置も提供される。
2013524776.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡサンプル中のメチル化ヌクレオチドを検出するための、イオン感応型電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）の使用。
【請求項２】
ＤＮＡサンプル中のメチル化ヌクレオチドを検出する方法であって、
メチル化ヌクレオチドと非メチル化ヌクレオチドを識別する試薬を用いてＤＮＡのサンプルを処理して、処理したＤＮＡを提供するステップと、
処理したＤＮＡを増幅するステップと、
増幅したＤＮＡを任意にシークエンシングするステップとを備え、
ＩＳＦＥＴが、増幅および／またはシークエンシングするステップの鎖伸長反応の間にＤＮＡ鎖への１つ以上のｄＮＴＰの付加を監視する、方法。
【請求項３】
試薬は、ＤＮＡサンプル中のメチル化ヌクレオチドのメチル基と選択的に結合する抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
処理したＤＮＡに対して免疫沈降を行い、それによって非抗体結合ＤＮＡから抗体結合ＤＮＡを分離する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
試薬を用いた処理の前に、ＤＮＡサンプルに対して、ＤＮＡをより小さなフラグメントに分解するプロセスを行う最初のステップをさらに備える、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
プロセスはソニケーションである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
試薬は、ＤＮＡサンプル中の非メチル化シトシンのみをウラシルに変換する重亜硫酸塩を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
処理したＤＮＡの増幅はＰＣＲを用いて行われる、請求項２〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ＰＣＲは、メチル化ＤＮＡから生じる処理したＤＮＡ鎖のみを増幅することができるメチル化特異的プライマーを用いて行われる、請求項７に従属する場合の請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＰＣＲは、非メチル化ＤＮＡから生じる処理したＤＮＡ鎖のみを増幅することができる非メチル化特異的プライマーを用いて行われる、請求項７に従属する場合の請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ＤＮＡサンプル中のメチル化ヌクレオチドを検出する方法であって、
非メチル化シトシンをウラシルに変換する重亜硫酸塩を用いてＤＮＡのサンプルを処理して、処理したＤＮＡを提供するステップと、
メチル化特異的プライマーまたは非メチル化特異的プライマーを用いて、処理したＤＮＡをＰＣＲ増幅するステップとを備え、
ＩＳＦＥＴが、ＰＣＲの間に鎖伸長反応へのｄＮＴＰの付加を監視する、方法。
【請求項１２】
ＤＮＡメチル化を測定するための装置であって、
ＤＮＡを含有する第１のサンプルに露出可能な第１のイオン感応型電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）と、
ＤＮＡを含有する第２のサンプルに露出可能な第２のＩＳＦＥＴと、
出力信号を提供する回路とを備え、出力信号は第１および第２のＩＳＦＥＴの信号に由来する、装置。
【請求項１３】
第１のサンプルはメチル化サンプルであり、非メチル化サンプルである第２のサンプルと比較される、請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
第２のサンプルは、既知量のメチル化を有する基準サンプルである、請求項１２に記載の装置。
【請求項１５】
第２のサンプルは、請求項１２に記載の装置。
【請求項１６】
出力信号は、第１および第２のＩＳＦＥＴの信号の比率である、請求項１２に記載の装置。
【請求項１７】
複数の第１のＩＳＦＥＴをさらに備え、各ＩＳＦＥＴは、異なるメチル化クラスタを見ているサンプルに露出可能である、請求項１２に記載の装置。
【請求項１８】
ＩＳＦＥＴは、弱反転領域で動作するようにバイアスをかけられる、請求項１２〜１７のいずれかに記載の装置。
【請求項１９】
ＩＳＦＥＴおよび回路は基板上に集積され、ＩＳＦＥＴのトランジスタは回路の一部を形成する、請求項１２〜１８のいずれかに記載の装置。
【請求項２０】
ＩＳＦＥＴの信号は電流であり、回路の出力信号は前記電流の比率である、請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
出力信号は閾値信号と比較され、対象部位の比較メチル化値と関連付けられるポテンシャルの診断または診療結果を示す、請求項１２〜２０のいずれかに記載の装置。
【請求項２２】
請求項１において使用するため、または請求項２〜１１のいずれかに記載の方法で使用するための、請求項１２〜２１のいずれかに記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は検知装置および方法に関し、特にメチル化ＤＮＡの検出に好適な検知装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
化学では、メチル化は、基質へのメチル基の付加、またはメチル基による原子もしくは基の置換を意味する。メチル化は、より大きな炭素鎖の代わりに特定的にメチル基を用いて水素原子を置換するアルキル化の形態である。これらの用語は化学、生化学、土壌学および生物化学において一般的に用いられる。
【０００３】
生体系では、メチル化は酵素によって触媒される。そのようなメチル化は重金属の修飾、遺伝子発現の調節、タンパク質機能の調節、およびＲＮＡ代謝に関連し得る。重金属のメチル化は生体系の外部でも起こり得る。組織サンプルの化学的メチル化も、一定の組織学的染色アーテファクトを減少させるための１つの方法である。
【０００４】
脊椎動物におけるＤＮＡメチル化は典型的に、ＣｐＧ部位（シトシン−ホスフェート−グアニン部位、すなわちＤＮＡ配列中のシトシンのすぐ後にグアニンが続く部位）で起こる。このメチル化によって、シトシンが５−メチルシトシンに変換される。Ｍｅ−ＣｐＧの形成は、酵素ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによって触媒される。大部分の哺乳類ＤＮＡのＣｐＧ部位の約４０％はメチル化されているが、全くメチル化されていない、ＧＣリッチな（約６５％のＧＣ残基からなる）ＣｐＧアイランドとして知られている一定の領域がある。これらは、遍在的に発現するすべての遺伝子を含む、哺乳類遺伝子の５６％のプロモータに関連している。ヒトゲノムの１〜２％はＣｐＧクラスタであり、ＣｐＧメチル化と転写活性とは反比例する。
【０００５】
ＤＮＡメチル化は、シトシンのピリミジン環の５位またはアデニンのプリン環の６位窒素へのメチル基の付加を伴う（シトシンおよびアデニンは、ＤＮＡの４種の塩基のうちの２種である）。この修飾は細胞分裂を経て受け継がれ得る。ＤＮＡメチル化は典型的に、接合体形成の間に除去され、発生の際に連続的な細胞分裂によって再建される。ＤＮＡメチル化は、高等生物における正常な生物発生と細胞分化において極めて重要な役割を担っている。ＤＮＡメチル化は、細胞が「自分がどこにいたのかを記憶」できるように細胞内の遺伝子発現パターンを安定的に変化させる。換言すれば、胚発生の際に膵島となるようにプログラムされた細胞は、島であり続ける必要があることを知らせるシグナルを受け続けなくても、生物の一生に渡って膵島であり続ける。さらに、ＤＮＡメチル化は、時間と共に宿主のゲノムに取込まれたウイルス遺伝子や他の有害な要素の発現を抑制する。ＤＮＡメチル化はまた、クロマチン構造の基礎を形成する。これによって、細胞は単一不変のＤＮＡ配列から多細胞生命に必要な無数の特徴を形成することができる。ＤＮＡメチル化はまた、ほとんどすべての種類の癌の発達において極めて重要な役割を果たしている。
【０００６】
ＤＮＡメチル化は、たとえばシトシンのピリミジン環の５位炭素などのＤＮＡへのメチル基の付加を伴い、この場合は、遺伝子発現を減少させるという特異的効果がある。成体の体細胞組織では、ＤＮＡメチル化は典型的にＣｐＧジヌクレオチドの文脈で起こり、非ＣｐＧメチル化は、胚性幹細胞で普及している。
【０００７】
重亜硫酸塩シークエンシングは、ＤＮＡを重亜硫酸塩で処理してそのメチル化パターンを特定する。ＤＮＡメチル化は最初に発見されたエピジェネティックマークであり、現在でも最も研究され続けている。ＤＮＡメチル化は、転写活性の抑制にも関係している。
【０００８】
ＤＮＡを重亜硫酸塩で処理すると、シトシン残基がウラシルに変換されるが、５−メチルシトシン残基は影響を受けない。このように、重亜硫酸塩処理は、個別のシトシン残基のメチル化状態に依存するＤＮＡ配列中の特異的な変化をもたらし、ＤＮＡのセグメントのメチル化状態に関する一塩基分解情報を生成する。この情報を得るために、変更された配列に対してさまざまな解析が行なわれ得る。したがって、この解析の目的は、重亜硫酸塩変換によって生じる一塩基多型（シトシンおよびチミン）同士の間の分化に要約される。
【０００９】
シークエンシングは、サンガーシークエンシングとは異なるパイロシークエンシングによって行なうことができ、ジデオキシヌクレオチドを用いたチェーンターミネーションの代わりに、ヌクレオチドが取込まれるときに放出されるピロリン酸の検出に依存する。
【００１０】
Infinium IIプラットフォームを用いるイルミナ社（Illumina）のメチル化（Methylation）アッセイは、重亜硫酸塩シークエンシングおよびパイロシークエンシングと同様に、ヒトＤＮＡメチル化のゲノムワイドに包括的なプロファイリングを生成するためのBeadChIP技術を用いる。Staaf et al.（２００８）によると、「Infinium IIアッセイは、蛍光検出に用いる２つのチャネル同士の間に染料強度バイアスを有しているように思われた。さらに、このバイアスは、データがBeadStudioソフトウェアで用いる正規化アルゴリズムを経た後でも除去されなかった。」と記載されている。
【００１１】
ＤＮＡメチル化バイオマーカの解析に用いるサンプルは通常、腫瘍からの高濃度のバックグラウンドＤＮＡを含有している。しかし、腫瘍由来ＤＮＡは非常に低濃度で存在していることが多く、かつ健常細胞からのＤＮＡが実質的に混入し得るため、検出が困難である。このため、体液中の異常メチル化された腫瘍由来ＤＮＡを同定するための、多量の非メチル化バックグラウンドＤＮＡ中のメチル化ＤＮＡの単一コピーを高感度に検出する機能を有する方法が必要であることが多い。
【００１２】
サンプルＤＮＡの異なる種類の前処理を組合せた後に、異なる解析工程を実行した結果、ＤＮＡメチル化パターンおよびプロファイルを特定するための多数の技術が得られている。
【００１３】
特に、メチローム解析の方法は３つのグループに分けられる。すなわち、制限酵素に基づくもの、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）またはアフィニティに基づくもの、および重亜硫酸塩変換（遺伝子に基づくもの）である。制限酵素に基づく方法では、メチル化感受性制限酵素を網羅的なメチル化解析用の実験的方法（ＲＬＧＳ、ＤＭＨなど）と組合せることによって、より小さな／大きなスケールのＤＮＡメチル化解析のためにメチル化感受性制限酵素を使用し、ＤＮＡ配列が分からないまま任意の遺伝子に適用される。しかし、多量のゲノムＤＮＡが必要であるため、回復されたＤＮＡが少量である場合には、この方法はサンプルの解析に適さない。他方、ＣｈＩＰに基づく方法は、タンパク質に対する抗体を用いることによって、溶液からのタンパク質抗原の沈降から腫瘍の分化メチル化領域を同定するのに有用である。これらの方法はタンパク質に基づくものであり、癌の研究に広範に適用されている。
【００１４】
いくつかの利点にも拘らず、タンパク質に基づく方法は、規定部位におけるメチル（ＣＨ3）基の検出が限られており、制限酵素認識配列の頻度によって得られるデータが限られているため、抗体の付着後に余分な増幅が必要である場合は方法が複雑になる。
【００１５】
ＭＳＰはその高い解析感度で知られているが、プライマーの設計およびＰＣＲサイクルの数に影響され得る。このため、偽陽性結果が生じる危険性があり、これは癌の早期発見にメチル化技術を用いる際の最も重要な問題の１つであるとされている。したがって、メチル化検出の特異性を高めることは、適切な早期発見試験の発展における重要な一歩である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本願の発明者は、既存の方法では蛍光検出手段に多額のコストがかかり、ＣＭＯＳプロセスなどの標準的な大量生産製造技術に概して対応していないことを認識した。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
発明の要約
本発明の第１の局面によると、ＤＮＡサンプル中のメチル化ヌクレオチドを検出するための、イオン感応型電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）の使用が提供される。
【００１８】
本発明の第２の局面によると、ＤＮＡサンプル中のメチル化ヌクレオチドを検出する方法であって、メチル化ヌクレオチドと非メチル化ヌクレオチドを識別する試薬を用いてＤＮＡのサンプルを処理して、処理したＤＮＡを提供するステップと、処理したＤＮＡを増幅するステップと、増幅したＤＮＡを任意にシークエンシングするステップとを含み、ＩＳＦＥＴが、増幅および／またはシークエンシングするステップの鎖伸長反応の間にＤＮＡ鎖への１つ以上のｄＮＴＰの付加を監視する方法が提供される。
【００１９】
増幅および合成によるシークエンシング（sequencing-by-synthesis）の間、イオンが放出または消費される。たとえば、ヌクレオチドが鎖伸長反応に取込まれると水素イオンが放出される。これらのイオンはＩＳＦＥＴによって検出されて、出力される電気信号を変化させ得る。
【００２０】
試薬は、ＤＮＡサンプル中のメチル化ヌクレオチドのメチル基と選択的に結合する抗体であり得る。次に、サンプルに対して免疫沈降を行い、それによって非抗体結合フラグメント（すなわち非メチル化フラグメント）から抗体結合ＤＮＡフラグメント（すなわちメチル化フラグメント）が分離され得る。
【００２１】
試薬を用いた処理の前に、ＤＮＡサンプルに対して、１つ以上の付加的なプロセスが行われ得る。ＤＮＡ鎖をより小さなフラグメントに分解するために、ＤＮＡは精製または処理され得る。たとえば、ＤＮＡに対してソニケーションまたは制限酵素消化が行われ得る。
【００２２】
試薬は、メチル化または非メチル化ヌクレオチドと選択的に反応し得る。ある実施形態では、試薬は重亜硫酸塩を含み、これはＤＮＡサンプル中の非メチル化シトシンのみをウラシルに変換し、メチル化シトシンは変化しない。特定の実施形態では、試薬は重亜硫酸ナトリウムである。
【００２３】
ＤＮＡの増幅はＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）または等温増幅を用いて行われ得る。メチル化ヌクレオチドは、処理したＤＮＡ鎖に対して定量ＰＣＲを行うことによって検出され得る。
【００２４】
ＤＮＡを重亜硫酸塩（たとえばＨＳＯ3-イオン、重亜硫酸ナトリウム、ＮＡＨＳＯ3）で処理する場合、ＰＣＲはメチル化特異的プライマーを用いて行われ得る。メチル化特異的プライマーは、オリジナルのＤＮＡサンプル中のメチル化シトシンに対応する位置にグアニンを取込む。メチル化シトシンは重亜硫酸塩によってウラシルに変換されないため、グアニンヌクレオチドは非変換シトシンに相補的であり、プライマーを処理したＤＮＡに結合させることができるので、メチル化サンプルから処理したＤＮＡ鎖のみを増幅することができる。
【００２５】
代替的に、非メチル化サンプルから処理したＤＮＡ鎖のみを増幅することができる非メチル化特異的プライマーが用いられ得る。これらのプライマーは、オリジナルのサンプル中の非メチル化シトシンに対応する位置にグアニンの代わりにアデニンを取込む。非メチル化シトシンは重亜硫酸塩によってウラシルに変換されるため、アデニンはウラシルに相補的であり、プライマーを処理したＤＮＡに結合させることができるので、非メチル化サンプルから処理したＤＮＡ鎖のみを増幅することができる。
【００２６】
特定の実施形態では、当該方法は、非メチル化シトシンをウラシルに変換する重亜硫酸塩を用いてＤＮＡのサンプルを処理して、処理したＤＮＡを提供するステップと、メチル化特異的プライマーまたは非メチル化特異的プライマーを用いて、処理したＤＮＡをＰＣＲ増幅するステップとを含み、ＩＳＦＥＴが、ＰＣＲの間に鎖伸長反応へのｄＮＴＰの付加を監視する。
【００２７】
好都合なことに、この方法では、ＰＣＲ生成物のその後の解析（たとえばシークエンシングによる解析）を必要とせずに、ＰＣＲ反応の間に直接的にＤＮＡサンプル中のメチル化を検出することができるが、必要であればシークエンシングも行なってよい。
【００２８】
本発明はさらに、測定対象のサンプルを提供し、当該サンプルを、メチル化ヌクレオチドと非メチル化ヌクレオチドを識別する作業を行うプロセスで処理することによって、ＤＮＡサンプル中のメチル化ヌクレオチドを検出する使用および方法も含む。当該プロセスの直接的または間接的な結果は、イオン感応型電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）を用いて検出される。
【００２９】
当該結果は、化学反応の副生成物であり得る。
反応では典型的に、数千の分子のすべてが同時に同一の反応を経験する。
【００３０】
反応はＤＮＡ合成であり得、イオン電荷の変動は、ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）およびデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の挿入を表わす。
【００３１】
副生成物の種類または量は、１つ以上のヌクレオチドのメチル化に依存する。
検査対象のＤＮＡのサンプルが重亜硫酸塩で処理されて、メチル化シトシンがウラシルに変えられ得る。
【００３２】
処理した鎖に対して、ウラシルが存在する場合はウラシルがチミンによって置換されたＤＮＡ鎖を形成するプロセスが行われ得る。
【００３３】
処理した鎖に対して、たとえばＰＣＲ増幅または等温増幅などの増幅が行われ得る。増幅の間、処理した鎖の多くのコピーが作られる。これらは多くのプロセスによってシークエンシング可能であり、その間、イオンが放出または消費される。たとえば、合成によるシークエンシングの間の鎖へのヌクレオチドの取込みの際に、水素イオンが放出され得る。これらのイオンはＩＳＦＥＴによって検出されて、出力される電気信号を変化させ得る。
【００３４】
メチル化ヌクレオチドは、処理した鎖に定量ＰＣＲを行なうことによって検出され得る。メチル化サンプルから処理した鎖のみを増幅することができるメチル化特異的プライマーが用いられ得る。代替的に、または別個に、非メチル化サンプルから処理した鎖のみを増幅することができる非メチル化特異的プライマーが用いられ得る。
【００３５】
本方法では、生成物のその後の解析を必要とせずに、ＰＣＲの間に直接的に２、３の位置のメチル化状態を検出することができる。
【００３６】
本発明の別の局面によると、ＤＮＡ鎖中の１つ以上のメチル化ヌクレオチドの位置を特定する方法が提供される。
【００３７】
本発明のさらなる局面によると、ＤＮＡサンプル中のメチル化ヌクレオチドの量を特定する方法が提供される。
【００３８】
本発明のさらなる局面によると、メチル化ＤＮＡを検出するための装置であって、第１の基板上のＩＳＦＥＴと、ＤＮＡサンプルをＩＳＦＥＴに接触させるためのマイクロ流体チャンバを有する第２の基板とを含む装置が提供される。当該装置は重亜硫酸塩を含有し得る。
【００３９】
当該装置は、ＰＣＲを行うためのサーモサイクラーをさらに含み得る。
当該装置は、単一の反応チャンバまたは複数の反応チャンバを含み得る。各チャンバがＩＳＦＥＴを含み得る。特定の実施形態では４つのチャンバが提供され、各々がＩＳＦＥＴを含む。各チャンバは、ＰＣＲ反応に用いる、異なるｄＮＴＰまたは異なるプライマーもしくはプローブを含み得る。
【００４０】
本発明のある局面では、ＤＮＡメチル化を測定するための装置であって、ＤＮＡを含有する第１のサンプルに露出可能な第１のイオン感応型電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）と、ＤＮＡを含有する第２のサンプルに露出可能な第２のＩＳＦＥＴと、出力信号を提供する回路とを含み、出力信号は第１および第２のＩＳＦＥＴの信号に由来する装置が提供される。
【００４１】
第２のサンプルは、既知量のメチル化を有する基準サンプルであり得る。
第１のサンプルはメチル化サンプルであり得、非メチル化サンプルであり得る第２のサンプルと比較され得る。
【００４２】
出力信号は、第１および第２のＩＳＦＥＴの信号の比率であり得る。
当該装置は、複数の第１のＩＳＦＥＴをさらに含み得、各ＩＳＦＥＴは、異なるメチル化クラスタを見ているサンプルに露出可能である。
【００４３】
ＩＳＦＥＴは、弱反転領域で動作するようにバイアスをかけられ得る。
ＩＳＦＥＴおよび回路は基板上に集積され得、ＩＳＦＥＴのトランジスタは回路の一部を形成する。
【００４４】
ＩＳＦＥＴの信号は電流であり得、回路の出力信号は電流の比率であり得る。
上記装置の出力信号は閾値信号と比較され、対象部位の比較メチル化値と関連付けられるポテンシャルの診断または診療結果を示し得る。
【００４５】
本発明のいずれの局面においても、鎖伸長および水素イオン放出が起こり、ＩＳＦＥＴの電気出力および信号に離散的な変化が生じ得る。これは、たとえば本明細書に記載されているように制御と比較され得る。たとえば、ＩＳＦＥＴの電気出力および信号は、プローブに相補的な標的配列の欠如と比較され得る。ＩＳＦＥＴの電気出力信号は、ｄＮＴＰの付加後に監視される。
【００４６】
添付の図面を参照して、本発明の特定的な実施形態を例示としてのみ以下に説明する。
詳細な説明
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１ａ】従来のＩＳＦＥＴ構成に露出したサンプル溶液を示す図である。
【図１ｂ】フローティングゲートＩＳＦＥＴに露出したサンプル溶液を示す図である。
【図２ａ】ＩＳＦＥＴマクロモデルを示す図である。
【図２ｂ】ＣＭＯＳ  ＩＳＦＥＴマクロモデルを示す図である。
【図３】商業用ＣＭＯＳ技術における典型的なプロセスフローを示す図である。
【図４】高度メチル化（hypermethylation）の頻度、異なる腫瘍抑制遺伝子、および異なる腫瘍の種類の関係を三次元で表わした図である。
【図５】正常細胞および腫瘍細胞における転写に対するメチル化の影響を示す図である。
【図６】本発明の実施形態に係る、重亜硫酸塩処理の後にＰＣＲを受けたＤＮＡサンプル中のメチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡの変化をそれぞれ例示する図である。
【図７】本発明の実施形態に係る、ＤＮＡのサンプル中のメチル化を定量化するメトリクスを決定する際の一連のステップを示す図である。
【図８ａ】免疫沈降に基づくメチル化検出の方法を概略的に示す図である。
【図８ｂ】重亜硫酸塩変換に基づくメチル化検出の方法を概略的に示す図である。
【図９】重亜硫酸塩処理を用いてＤＮＡ配列を検出するための方法のステップを示す図である。
【図１０】公知の解析法を用いてＤＮＡ配列を検出するための方法のステップを示す図である。
【図１１】本発明の実施形態の方法を概略的に示す図である。
【図１２】本発明の実施形態に係るメチル化細胞を概略的に示す図である。
【図１３】本発明の実施形態に係る出力信号を提供するためのＩＳＦＥＴを組込んだ回路を示す図である。
【図１４】出力信号を提供するための図１３に示すような複数の回路を含むシステム回路を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
ある実施形態では、図１１を参照して、
・試験対象のＤＮＡサンプルを提供し、精製し、マイクロ流体チャンバに入れて、ＩＳＦＥＴと接触させる。
【００４９】
・非メチル化シトシンの位置がウラシルになるように、重亜硫酸塩処理によってＤＮＡサンプルを変化させる。
【００５０】
・処理したサンプルをＰＣＲを用いて増幅する。結果として生じるＤＮＡコピーにおいて、ウラシルの位置はチミンになる。
【００５１】
・コピーを変性させ、プローブを対象区域（たとえば腫瘍プロモータ領域）までハイブリダイズする。
【００５２】
・合成によるシークエンシングを行い、異なるｄＮＴＰをチャンバに１つずつ付加する。特定対象の位置におけるｄＮＴＰの取込みの間、水素イオンが放出される。グアニンはメチル化シトシンと合体（incorporate）し、アデニンは、オリジナルのチミン、および非メチル化シトシンに対応するウラシルに対応するチミンの両方と合体する。各々の公知のｄＮＴＰ付加の間、ＩＳＦＥＴの電気出力信号を監視する。
【００５３】
代替的な実施形態では、
・試験対象のサンプルを提供し、精製し、マイクロ流体チャンバに入れて、ＩＳＦＥＴと接触させる。
【００５４】
・非メチル化シトシンの位置がウラシルになるように、重亜硫酸塩処理によってサンプルを変化させる。
【００５５】
・処理したサンプルをＰＣＲを用いて増幅する。結果として生じるＤＮＡコピーにおいて、ウラシルの位置はチミンになる。
【００５６】
・メチル化シトシンを検出することが目標の位置にグアニン、または非メチル化シトシン（ウラシル）を検出することが目標の位置にアデニンを有するように設計されたプローブをハイブリダイズし、増幅したＤＮＡの一本鎖コピーを変性させる。
【００５７】
・複数のｄＮＴＰをまとめて、または１つずつチャンバに付加する。プローブの３′末端における複数のｄＮＴＰの取込み、または鎖伸長の間に水素イオンが放出される。プローブに相補的な標的配列の存在下で、鎖伸長および水素イオン放出が起こる結果、ＩＳＦＥＴの電気出力信号に離散的な変化が生じる。これは、プローブに相補的な標的配列の欠如と比較され得る。ＩＳＦＥＴの電気出力信号を、ｄＮＴＰの付加後に監視する。
【００５８】
さらに別の実施形態では、
・試験対象のサンプルを提供し、精製し、マイクロ流体チャンバに入れて、ＩＳＦＥＴおよびチャンバのサーモサイクリング用装置と接触させる。
【００５９】
・非メチル化シトシンの位置がウラシルになるように、重亜硫酸塩処理によってサンプルを変化させる。
【００６０】
・メチル化シトシン（ウラシル）を検出することが目標の位置にグアニン、または非メチル化シトシン（ウラシル）を検出することが目標の位置にアデニンを有するように設計された増幅プライマーのセットを、増幅試薬、ポリメラーゼ酵素および過剰なｄＮＴＰと共にチャンバに付加する。
【００６１】
・サンプルに対してサーモサイクリングを行ってＰＣＲを実行し、サーモサイクリングが進行するにつれてＩＳＦＥＴの電気出力信号を監視する。プローブの３′末端における複数のｄＮＴＰの取込み、またはＰＣＲの鎖伸長段階の間に水素イオンが放出される。プローブに相補的な標的配列の存在下で、鎖伸長および水素イオン放出が起こる結果、ＩＳＦＥＴの電気出力信号に離散的な変化が生じる。これは、プローブに相補的な標的配列の欠如と比較され得る。しかし、増幅混合物によって水素イオンの放出が緩衝されるため、標的ＤＮＡの存在下の増幅時に鎖伸長から生じるｐＨの変化に応じて電気出力信号を生成するためには、増幅を、サンプルの緩衝能力を克服するようにサイクルの閾値数を超えて続行する必要がある。
【００６２】
上述の実施形態のいずれも、異なる順序でステップを組合せたり、試薬を導入することができる。
【００６３】
変化が生じる時、および変化の大きさを監視することによってＤＮＡのシークエンシングが可能になり、これによってオリジナルのサンプル中のメチル化または非メチル化シトシンの位置が特定される。電気信号は、基準ＩＳＦＥＴを有する制御チャンバの基準信号、または基準電極と比較され得る。信号の差は、配列中のある位置における公知のヌクレオチドの取込み対非取込みを表わす。
【００６４】
処理したサンプルの配列を制御配列または以前のサンプルと比較して、サンプル中のメチル化シトシンの量および位置を特定することができる。たとえば、シトシンの代わりにチミンが存在すること（それぞれグアニンの代わりにアデニンを取込むことによって）は、オリジナルのサンプルが特定の位置に非メチル化シトシンを含んでいたことを表わし得る。
【００６５】
メッセンジャーＲＮＡのプロモータとして公知の領域に発生するサンプルＤＮＡのメチル化は、ＤＮＡの発現に影響を及ぼし得る。
【００６６】
メチル化されるＤＮＡの量、およびサンプル中のオリジナルのＤＮＡのメチル化のパーセントは、ＩＳＦＥＴから出力される信号の大きさに影響を与える。この信号は、メチル化の量、およびそれが起こっている位置の両方を提供するため、たとえば、存在する腫瘍の可能性の予測を提供する。
【００６７】
本方法は、サーモサイクリングと共に、またはサーモサイクリングなしで用いられ得る。たとえば、サーモサイクリングは、Ｔａｑポリメラーゼまたは組換え型Ｔ７ポリメラーゼなどのシークエンシング酵素を用いて、最適化を促進するのに用いられ得る。Ｔ７ポリメラーゼを用いる場合、ヌクレオチド挿入を監視する速度が上がり、精度が向上し得る。たとえば、試薬混合物のｐＨは調節可能である。ｐＨが減少するとより多くの水素イオンが生成されるが、反応も全滅する傾向にある。試験によって、ｐＨ６．８が有用なｐＨ値であることがわかっている。マグネシウムを試薬混合物に付加して酵素を発動させる。試薬の濃度は変更可能である。
【００６８】
典型的なサーモサイクリングシークエンシングを表１に示す。
【００６９】
【表１】
2013524776.tif 000003
【００７０】
サーマルサイクラーの内部で作業することによって、最小限の操作でシークエンシングプロセスを複数回反復することができる。これによってノイズブースティングに対するシグナルが可能になり、ＧＣリッチ領域または単一ヌクレオチド反復区域などの読取が困難な領域の描写が容易になる。
【００７１】
ＩＳＦＥＴはソース／ドレイン領域のＭＯＳＦＥＴ構造に基づくものであって、下部の装置のチャネルに容量結合された化学的に敏感な絶縁体と接触している電解質溶液に露出した基準電極によって与えられるリモートゲートを有する。このように説明されることもあるが、ＩＳＦＥＴの定義は、図１ａに示されるような金属ゲートを有しない構造に限定されない。より一般的に、ＩＳＦＥＴは、その閾値電圧がイオン濃度の変化によって変調されるイオン感応型ゲート構造を有する任意のＦＥＴと定義される。イオン感応型ゲート構造は、図１ａに示されるような無機または有機絶縁膜のみで、またはイオン感応型絶縁膜に覆われた１つ以上の金属層に接続された電気的に浮遊状態のポリシリコンゲートを含む積層ゲート構造のみで、構成され得る。
【００７２】
好ましい実施形態では、窒化シリコン絶縁層を有するｐＨ感応型ＩＳＦＥＴは、後者の積層ゲート構造に従って標準的なＣＭＯＳプロセスで作製される。これは文献［１−４］において広範に報告されている確立された技術であり、改良したプロセスフロー、さらなるマスク工程または任意のプロセス後工程を必要とせずに、標準的な半導体製造工場で大量生産できるという利点を有する。ＣＭＯＳベースのｐＨ−ＩＳＦＥＴ構造は、そのｐＨが測定対象である電解質溶液と接触している絶縁層として、一般的に窒化シリコンまたは酸窒化シリコンであるパッシベーション層と、下部の電界効果トランジスタのポリシリコンゲートとパッシベーション層との間に接続された所与のＣＭＯＳプロセスで使用可能な１つ以上の金属層のフローティングゲート積層体とを用いる（図１ｂ）。
【００７３】
基準電極に印加される電圧はすべて、電解質を介して絶縁体表面に容量結合されており、この界面上のイオンからのｐＨ依存電荷がチャネル電流を変調する。これによって、ＩＳＦＥＴ  ＩＤ−ＶＧＳの転移特性に目に見える変化が生じ、これはその閾値電圧（Ｖｔｈ）の変調として表わすことができる。ＣＭＯＳ  ＩＳＦＥＴでは、パッシベーション面に蓄積されるｐＨ依存荷電はその下のフローティングゲート構造に容量結合され、フローティングゲート構造は、下部の電界効果トランジスタのソース端子とドレイン端子との間のチャネルにゲート酸化物を横切って容量結合される。このため、基準電極によってＩＳＦＥＴにバイアスをかけると（典型的に異なる用途におけるＡｇ／ＡｇＣｌまたはＰｔ偽電極）、絶縁体表面におけるイオン濃度の変化によってＩＳＦＥＴの電気信号が変調される。ＣＭＯＳ製造工程の標準的な処理ステップ（図３）を用いることができる。
【００７４】
基準電極に印加される電圧はすべて、電解質を介して絶縁体表面に容量結合されており、この界面上のイオンからのｐＨ依存電荷がチャネル電流を変調する。これによって、ＩＳＦＥＴ転移特性に目に見える変化が生じ、これはその閾値電圧Ｖｔｈの変調として表わすことができる。ＩＳＦＥＴの閾値電圧をそのリモートゲート（Ｇ）、つまり基準電極に対して規定すると、それに矛盾する（belies）装置の真性ＭＯＳＦＥＴ閾値電圧と、ポリシリコンゲートと接触している上部金属層と基準電極との電位差との組合せとして表わすことができる（図２ｂ）。
【００７５】
【数１】
2013524776.tif 000004
【００７６】
【数２】
2013524776.tif 000005
【００７７】
式中、ガンマはすべてのｐＨ独立化学ポテンシャルのグルーピングであり、ＵＴは［５］に記載されるように熱電圧ｋＴ／ｑまたはＲＴ／Ｆである。
【００７８】
より詳しくは、
【００７９】
【数３】
2013524776.tif 000006
【００８０】
および
【００８１】
【数４】
2013524776.tif 000007
【００８２】
であり、式中、従来のＭＯＳＦＥＴパラメータは、金属半導体仕事関数φmaの差、半導体のフェルミポテンシャルφf、固定表面状態電荷密度Ｑss、半導体表面電荷密度Ｑsc、および単位面積当たりの絶縁体容量Ｃozである。
【００８３】
Ｖchemはポテンシャルのグルーピングであり、この内、φeoは唯一のｐＨ依存項である。Ｅrefは、真空に対する銀／塩化銀基準電極の絶対電極ポテンシャルであり、標準的な水素電極に正規化された標準的な電極ポテンシャルに４．４４Ｖを加えることによって見つけることができ［９９］、φljは基準溶液と電解質との液体接合部電位差であり、φeoは電解質−絶縁体界面のポテンシャルであり、χeoは電解質−絶縁体双極子ポテンシャルであり、φm／ｑは、ＩＳＦＥＴのゲートには金属がないため、Ｖth(MOSFET)から減算すべきＶchemに含まれる金属仕事関数である。
【００８４】
電解質−絶縁体界面ポテンシャルψeoのｐＨに対する依存は、部位結合理論とGouy-Chapman-Stern二重層モデルとの組合せを用いてモデル化される。
【００８５】
メチル化ＤＮＡは、生物学に基づいた方法を用いて（重亜硫酸塩変換およびメチル化特異的プライマー伸長を用いて）処理され、回路はＩrefを定義し、トランスリニア細胞（translinear cell）を介してＩoutをＩrefと比較する。
【００８６】
本明細書中で「メチル化細胞」と称されるシステム（図１２）は、ＩＳＦＥＴの標準的な回路技術との統合能力のために知能センサ設計を利用して、リアルタイムに連続的に働き得る。より詳細には、システムの化学的フロントエンドは、ａ）１つ以上のＣｐＧジヌクレオチドを含むＤＮＡ配列、または重亜硫酸塩試薬で処理した配列のいずれか一方を参照して、１つ以上のＣｐＧの非メチル化配列からメチル化配列を識別するための手段として、試薬混合物と、ｂ）反応のｐＨに依存して、加水分解反応を通じたＤＮＡサンプルの標的相補的領域でのみハイブリダイゼーション反応が起こるようにプライマー対を用いるメチル化特異的アニーリングのプロセスとを用いる。
【００８７】
さらに、プラットフォームシステムの化学的部分から得られる情報は、ＩＳＦＥＴに基づいたセンサフロントエンドの実行を通じて電気的部分によって解析される。このような相互作用によって、ｐＨ形態で取得され、調製したＤＮＡサンプルから得られる、ＩＳＦＥＴに基づいたセンサの出力としてのレシオメトリック信号が決定され、メチル化／非メチル化情報の比率が得られるため、病原性遺伝子と正常メチル化遺伝子との差異を特定できる。このような比率は、予め定義された閾値を上回って呈示されるメチル化アリコットの割合に基づいて得られる。取得した比率を解析することによって、ＩＳＦＥＴが含まれる場合、知的処理アルゴリズムから得られる向上した精度で癌の早期発見が可能になり得る。
【００８８】
患者のサンプル対基準サンプルの相対的なメチル化を表わす出力信号を提供する２つのＩＳＦＥＴを集積した集積回路を図１３に示す。当該回路は、各ＩＳＦＥＴの上方のウェルと、サンプルおよび／または試薬を送出するチャネルとを提供するマイクロ流体構成で覆われ得る。試薬はサンプルと混合して、サンプル中のメチル化の量に依存して水素イオンを生成する。
【００８９】
サンプルをＩＳＦＥＴセンサＸ１に露出し、特異的遺伝子プロモータ（ＣＤＫＮ２Ａ／ｐ１６−ＩＮＫ４、ＲＡＳＳＦ１、ＤＡＰキナーゼ、Ｈ−カドヘリン、ＡＰＣおよびＯ＾６−ＭＧＭＴなど）の異常メチル化の証拠があるか否かを試験する。回路１は基準電流（Ｉｒｅｆ）を規定し、２つのカレントミラー（Ｍ８−Ｍ９，Ｍ１２−Ｍ１３）およびＣＭＯＳインバータ（Ｍ１０，Ｍ１１）からなる電流比較器によって、出力電流（Ｉｏｕｔ）を基準電流と比較する。第２のＩＳＦＥＴセンサＸ２を、「非メチル化サンプル」とラベル付けした正常メチル化サンプル（健常対照群）に露出する。
【００９０】
当該回路は、メチル化された、重亜硫酸塩変換されたＤＮＡ患者サンプル、および重亜硫酸塩変換された非メチル化サンプルによって与えられるドレイン電流（ＩｍｅｔｈおよびＩｕｎｍｅｔｈ）同士の分割を計算可能なトランスリニア細胞（ＭＯＳＦＥＴ  Ｍ１，Ｍ２，Ｍ３，Ｍ４）をさらに含む。電流分割のため、カレントミラーを用いて（Ｍ５，Ｍ６，Ｍ７）、電流の方向を回転させ、電流の比率をトランジスタをほとんど用いなくても計算できるようにトランスリニアループに適合させる。
【００９１】
出力電流（Iｏｕｔ）と基準電流（Iｒｅｆ）との比較に基づいて、ＣＭＯＳインバータは、電流がＩｒｅｆによって設定された所望の閾値を超える場合はスイッチングに寄与することによって、臨界比率値と特定のＣｐＧから得られる正常比率値を区別する。式（４）から得られるメチル化比率の計算は、遺伝子の全体的なメチル化に対する対象の腫瘍抑制因子内に存在するメチル化の異常レベルを表わすため、メチル化のレベルに相関するそのような遺伝子の機能の正常性の破壊に基づく疫学因子を規定する。
【００９２】
２つのＩＳＦＥＴであるＸ１およびＸ２によって与えられるドレイン電流間の分割を計算可能なトランスリニア細胞を示す。トランスリニア回路は、殆どの場合電流信号に対する乗算および除算を行なうために用いられる弱反転ＭＯＳトランジスタの電流と電圧の指数関数関係を利用する。
【００９３】
誤差によって示されるループに対してキルヒホップの電圧ループを実行することによって、以下の式が与えられる。
【００９４】
【数５】
2013524776.tif 000008
【００９５】
したがって、弱反転ドレイン電流を置換した後は、
【００９６】
【数６】
2013524776.tif 000009
【００９７】
となり、自然対数を加える基本関係を用いることによって、比率について以下の最終的な式が得られる。
【００９８】
【数７】
2013524776.tif 000010
【００９９】
これによって、Ｉｇａｉｎは比率に対する予め定義されたゲインの項であり、Ｉｏｕｔは出力電流であり、ＩｍｅｔｈおよびＩｕｎｍｅｔｈの両方は、弱反転バイアスをかけられた、ＩＳＦＥＴ装置Ｘ１およびＸ２の一般化されたドレイン電流（ＩＤ）であり、以下のように定義される。
【０１００】
【数８】
2013524776.tif 000011
【０１０１】
【数９】
2013524776.tif 000012
【０１０２】
式中の対象値を置換した後、
【０１０３】
【数１０】
2013524776.tif 000013
【０１０４】
となり、これによって、ＶＧＳは装置のゲートソース電圧であり、Ｉｏは固有電流であり、ｎは弱反転傾斜係数であり、Ｕｔは熱電圧であり、Ｋｃｈｅｍは一定の化学ポテンシャルのグルーピングであり、αＸは感度パラメータであり、［ｉｏｎＸ］は溶液中のイオン濃度である。
【０１０５】
上記のメチル化は、複数の遺伝子中のメチル化を検出する無修飾ＣＭＯＳ技術における実現の統合、スケラービリティおよびコストの低さという利点を利用してスケール変更可能である。たとえば、遺伝子１のメチル化を回路１のＸ１に露出しつつ、健常遺伝子１を回路１のＸ２に露出する。Ｎ番目の遺伝子を回路ＮのセンサＸ１およびＸ２に露出するまで、これを反復する。
【０１０６】
増幅したＤＮＡサンプルを、ＩＳＦＥＴであるＸ１のセットの上方のいくつかの別個のウェルに入れる。増幅したＤＮＡ鎖を、ＩＳＦＥＴであるＸ２の第２のセットの上方のいくつかの別個のウェルに入れる。異なる対象ＣｐＧアイランドの前の点でアニールするように設計された異なるプローブを、各ウェルに別個に追加する。これによって、いくつかの対象遺伝子の相対的なメチル化を標準と比較する。各メチル化遺伝子の比率を、どの種類の腫瘍を検査中であるかに応じて重み付けし、出力診断信号を生成する。
【０１０７】
たとえば、研究によれば、肝腫瘍の検出はＰ１５（ｉｎｋ４ｂ）、ＣＤＨ１、ＡＰＣおよびＰ１４（ａｒｆ）腫瘍抑制遺伝子と最も大きく関連していることがわかっている（図４参照）。このため、腫瘍の可能性の複雑な表示は、これらの遺伝子の関連メチル化の重み付け合計に基づき得る。
【０１０８】
１つの実施形態では、たとえば合成電流Ｉｍｅｔｈを提供する複数のセンサＸ１に平行なＩＳＦＥＴセンサを追加することによって、複数の電流を処理可能である。複数の非メチル化サンプルを、合成電流Ｉｕｎｍｅｔｈを提供するＸ２に平行な複数のセンサに露出する。
【０１０９】
図１４に示す代替的な実施形態では、各々が図１３の回路と同様の複数の回路１がプロセッサ２に接続されて、出力信号３を提供する。プロセッサは、各回路１のデジタル出力（すなわちＶｏｕｔ）またはメチル化比率を表わすアナログ信号（すなわちＩｏｕｔ）を使用し得る。プロセッサは、ＣＭＯＳ内でセンサ回路１とさらに一体化したコンピュータまたは回路であり得る。
【０１１０】
本発明を上述のように好ましい実施形態の観点から説明したが、これらの実施形態は例示的なものに過ぎず、請求項はこれらの実施形態に限定されないことを理解すべきである。当業者であれば、開示内容に鑑みて、添付の請求項の範囲内に収まると考えられる変更および代替案を加えることができるであろう。本明細書に開示または図示される各特徴は、単独でも、ここに開示または図示されるいずれかの他の特徴と適切に組合されても、本発明に組込むことができる。
【図１ａ】
2013524776.tif 000014
【図１ｂ】
2013524776.tif 000015
【図２ａ】
2013524776.tif 000016
【図２ｂ】
2013524776.tif 000017
【図３】
2013524776.tif 000018
【図４】
2013524776.tif 000019
【図５】
2013524776.tif 000020
【図６】
2013524776.tif 000021
【図７】
2013524776.tif 000022
【図８ａ】
2013524776.tif 000023
【図８ｂ】
2013524776.tif 000024
【図９】
2013524776.tif 000025
【図１０】
2013524776.tif 000026
【図１１】
2013524776.tif 000027
【図１２】
2013524776.tif 000028
【図１３】
2013524776.tif 000029
【図１４】
2013524776.tif 000030
【手続補正書】
【提出日】平成24年11月13日(2012.11.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡサンプル中のメチル化ヌクレオチドを検出するための、フローティングゲートを有するイオン感応型電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）の使用。
【請求項２】
ＤＮＡサンプル中のメチル化ヌクレオチドを検出する方法であって、
メチル化ヌクレオチドと非メチル化ヌクレオチドを識別する試薬を用いてＤＮＡのサンプルを処理して、処理したＤＮＡを提供するステップと、
処理したＤＮＡを増幅するステップと、
増幅したＤＮＡを任意にシークエンシングするステップとを備え、
フローティングゲートを有するＩＳＦＥＴが、増幅および／またはシークエンシングするステップの鎖伸長反応の間にＤＮＡ鎖への１つ以上のｄＮＴＰの付加を監視する、方法。
【請求項３】
試薬は、ＤＮＡサンプル中のメチル化ヌクレオチドのメチル基と選択的に結合する抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
処理したＤＮＡに対して免疫沈降を行い、それによって非抗体結合ＤＮＡから抗体結合ＤＮＡを分離する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
試薬を用いた処理の前に、ＤＮＡサンプルに対して、ＤＮＡをより小さなフラグメントに分解するプロセスを行う最初のステップをさらに備える、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
プロセスはソニケーションである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
試薬は、ＤＮＡサンプル中の非メチル化シトシンのみをウラシルに変換する重亜硫酸塩を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
処理したＤＮＡの増幅はＰＣＲを用いて行われる、請求項２〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ＰＣＲは、メチル化ＤＮＡから生じる処理したＤＮＡ鎖のみを増幅することができるメチル化特異的プライマーを用いて行われる、請求項７に従属する場合の請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＰＣＲは、非メチル化ＤＮＡから生じる処理したＤＮＡ鎖のみを増幅することができる非メチル化特異的プライマーを用いて行われる、請求項７に従属する場合の請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ＤＮＡサンプル中のメチル化ヌクレオチドを検出する方法であって、
非メチル化シトシンをウラシルに変換する重亜硫酸塩を用いてＤＮＡのサンプルを処理して、処理したＤＮＡを提供するステップと、
メチル化特異的プライマーまたは非メチル化特異的プライマーを用いて、処理したＤＮＡをＰＣＲ増幅するステップとを備え、
フローティングゲートを有するＩＳＦＥＴが、ＰＣＲの間に鎖伸長反応へのｄＮＴＰの付加を監視する、方法。
【請求項１２】
ＤＮＡメチル化を測定するための装置であって、
ＤＮＡを含有する第１のサンプルに露出可能な、フローティングゲートを有する第１のイオン感応型電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）と、
ＤＮＡを含有する第２のサンプルに露出可能な、フローティングゲートを有する第２のＩＳＦＥＴと、
出力信号を提供する回路とを備え、出力信号は第１および第２のＩＳＦＥＴの信号に由来する、装置。
【請求項１３】
第１のサンプルはメチル化サンプルであり、非メチル化サンプルである第２のサンプルと比較される、請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
第２のサンプルは、既知量のメチル化を有する基準サンプルである、請求項１２に記載の装置。
【請求項１５】
出力信号は、第１および第２のＩＳＦＥＴの信号の比率である、請求項１２に記載の装置。
【請求項１６】
複数の第１のＩＳＦＥＴをさらに備え、各ＩＳＦＥＴは、フローティングゲートを有し、異なるメチル化クラスタを見ているサンプルに露出可能である、請求項１２に記載の装置。
【請求項１７】
ＩＳＦＥＴは、弱反転領域で動作するようにバイアスをかけられる、請求項１２〜１６のいずれかに記載の装置。
【請求項１８】
ＩＳＦＥＴおよび回路は基板上に集積され、ＩＳＦＥＴのトランジスタは回路の一部を形成する、請求項１２〜１７のいずれかに記載の装置。。
【請求項１９】
ＩＳＦＥＴの信号は電流であり、回路の出力信号は前記電流の比率である、請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
出力信号は閾値信号と比較され、対象部位の比較メチル化値と関連付けられるポテンシャルの診断または診療結果を示す、請求項１２〜１９のいずれかに記載の装置。
【請求項２１】
請求項１において使用するため、または請求項２〜１１のいずれかに記載の方法で使用するための、請求項１２〜２０のいずれかに記載の装置。
【国際調査報告】
2013524776.tif 000031
2013524776.tif 000032
2013524776.tif 000033