(57)【要約】  双性イオン架橋剤、双性イオンモノマーと双性イオン架橋剤との共重合から合成された架橋した双性イオンヒドロゲル、架橋した双性イオンヒドロゲルの製造方法、および架橋した双性イオンヒドロゲルを含む装置ならびにそれを使用する方法である。【選択図】    図２
2013510179.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式を有する化合物。
【化１】
2013510179.tif 000021
ここで
Ｒ1およびＲ2は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、およびＣ６〜Ｃ１２アリール基からなる群から独立して選択され；
Ｒ3は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１２アリール、ＣＨ2＝Ｃ(Ｒ1)−Ｌ1−、およびＣＨ2＝Ｃ(Ｒ2）−Ｌ2−からなる群から選択され；
Ｌ1およびＬ2は、−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ−(ＣＨ2)n−および−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ−(ＣＨ2)n−からなる群から独立して選択され、ここでｎは１〜２０の整数であり；
Ｌ3は、−(ＣＨ2)n−であり、ここでｎは１〜２０の整数であり；
Ａ1は、Ｃ，Ｓ，ＳＯ，Ｐ，またはＰＯであり；
Ｘ-は、Ｎ+カチオン中心に結合する対イオンであり；および
Ｍ+は、(Ａ1＝Ｏ)Ｏ-アニオン中心に結合する対イオンである。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物であって、Ｒ1，Ｒ2，およびＲ3は、Ｃ１〜Ｃ３アルキルからなる群から独立して選択される化合物。
【請求項３】
請求項１に記載の化合物であって、Ｌ1およびＬ2は、それぞれの出現において、−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ−(ＣＨ2)n−からなる群から独立して選択され、ここでｎは１〜６である化合物。
【請求項４】
請求項１に記載の化合物あって、Ｌ3は−(ＣＨ2)n−であり、ここでｎは１〜６の整数である化合物。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物であって、Ｍ+は金属または有機イオンである化合物。
【請求項６】
請求項１に記載の化合物であって、Ｘ-は、ハライド、カルボキシレート、アルキルスルホネート、スルホネート；ナイトレート、パークロレート、テトラフルオロボレート、ヘキサフルオロホスフェート、トリフルオロメチルスルフォネート、ビス（トリフルオロメチルスルホニル）アミド、ラクテート、およびサリシレートからなる群から選択される化合物。
【請求項７】
請求項１に記載の化合物であって、Ａ1はＣまたはＳＯである化合物。
【請求項８】
請求項１に記載の化合物であって、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3はメチルであり、Ｌ1およびＬ2は、−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ−(ＣＨ2)2−であり、Ｌ3は−(ＣＨ2)−であり、およびＡ1はＣまたはＳＯである化合物。
【請求項９】
繰り返し単位と複数の架橋結合とを有する架橋したポリマーを含む架橋ヒドロゲルであって、
それぞれの繰り返し単位は下記式を有する架橋ヒドロゲル。
【化２】
2013510179.tif 000022
ここで
Ｒ4は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、およびＣ６〜Ｃ１２アリール基からなる群から選択され；
Ｒ5およびＲ6は、アルキルおよびアリールからなる群から独立して選択され、または、それらが結びついた窒素とともにカチオン中心を形成し；
Ｌ4は、カチオン中心［Ｎ+(Ｒ5)(Ｒ6)］をポリマー主鎖［−(ＣＨ2−ＣＲ4)n−］に共有的に結合するリンカーであり；
Ｌ5は、アニオン中心［Ａ2(＝Ｏ)−Ｏ-］をカチオン中心に共有的に結合するリンカーであり；
Ａ2は、Ｃ，Ｓ，ＳＯ，Ｐ，またはＰＯであり；
Ｍ+は、(Ａ2＝Ｏ)Ｏ-アニオン中心に結合する対イオンであり；
Ｘ-は、カチオン中心に結合する対イオンであり；
ｎは、５〜約１０，０００の整数であり；および
ここで、それぞれの架橋結合は下記式を有し：
【化３】
2013510179.tif 000023
ここで
Ｒ1およびＲ2は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、およびＣ６〜Ｃ１２アリール基からなる群から独立して選択され；
Ｒ3は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１２アリール、ＣＨ2＝Ｃ(Ｒ1)−Ｌ1−、ＣＨ2＝Ｃ(Ｒ2)−Ｌ2−からなる群から独立して選択され、またはＲ3は、第３の架橋結合、−Ｌ1−ＣＲ1−ＣＨ2−または−Ｌ2−ＣＲ2−ＣＨ2−）の残部であり；
Ｌ1およびＬ2は、−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ−(ＣＨ2)n−および−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ−(ＣＨ2)n−からなる群から独立して選択され、ここでｎは１〜２０の整数であり；
Ｌ3は、−(ＣＨ2)n−であり、ここでｎは１〜２０の整数であり；
Ａ1は、Ｃ，Ｓ，ＳＯ，Ｐ，またはＰＯであり；
ｘは、約５〜約１０，０００の整数であり；
Ｘ-は、Ｎ+カチオン中心に結合する対イオンであり；および
Ｍ+は、(Ａ＝Ｏ)Ｏ-アニオン中心に結合する対イオンである。
【請求項１０】
請求項９に記載のヒドロゲルであって、Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6は、Ｃ１〜Ｃ３アルキルからなる群から独立して選択されるヒドロゲル。
【請求項１１】
請求項９に記載のヒドロゲルであって、Ｌ1およびＬ2は、−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ−(ＣＨ2)n−であり、ここでｎは１〜６であるヒドロゲル。
【請求項１２】
請求項９に記載のヒドロゲルであって、Ｌ3は−(ＣＨ2)n−であり、ここでｎは１〜６の整数であるヒドロゲル。
【請求項１３】
請求項９に記載のヒドロゲルであって、Ａ1はＣまたはＳＯであるヒドロゲル。
【請求項１４】
請求項９に記載のヒドロゲルであって、Ｌ4は、−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ−(ＣＨ2)n−および−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ−(ＣＨ2)n−からなる群から選択され、ここでｎは１〜２０の整数であるヒドロゲル。
【請求項１５】
請求項９に記載のヒドロゲルであって、Ｌ5は−(ＣＨ2)n−であり、ここでｎは１〜２０の整数であるヒドロゲル。
【請求項１６】
請求項９に記載のヒドロゲルであって、Ａ2は、ＣまたはＳＯであるヒドロゲル。
【請求項１７】
請求項９に記載のヒドロゲルであって、ｎは１０〜約１，０００の整数であるヒドロゲル。
【請求項１８】
請求項９に記載のヒドロゲルであって、Ｍ+は、それぞれの出現において金属または有機イオンであるヒドロゲル。
【請求項１９】
請求項９に記載のヒドロゲルであって、Ｘ-は、それぞれの出現において、ハライド、カルボキシレート、アルキルスルホネート、スルホネート；ナイトレート、パークロレート、テトラフルオロボレート、ヘキサフルオロホスフェート、トリフルオロメチルスルフォネート、ビス（トリフルオロメチルスルホニル）アミド、ラクテート、またはサリシレートであるヒドロゲル。
【請求項２０】
請求項９に記載のヒドロゲルであって、ｘは約１０〜約１，０００の整数であるヒドロゲル。
【請求項２１】
請求項９に記載のヒドロゲルであって、Ｒ1，Ｒ2，およびＲ3は、メチルであり、Ｌ1およびＬ2は、−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ−(ＣＨ2)2−であり、Ｌ3は−(ＣＨ2)−であり、Ａ1はＣまたはＳＯであり、Ｒ4，Ｒ5，およびＲ6は、メチルであり、Ｌ4は−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ−(ＣＨ2)2−であり、Ｌ5は−(ＣＨ2)−であり、Ａ2はＣまたはＳＯであるヒドロゲル。
【請求項２２】
請求項９に記載のヒドロゲルであって、前記架橋ポリマーは下記式を有する繰り返し単位を有するヒドロゲル。
【化４】
2013510179.tif 000024
ここで
Ｒ7およびＲ8は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、およびＣ６−Ｃ１２アリール基から独立して選択され；
Ｒ9，Ｒ10、およびＲ11は、アルキルおよびアリールから独立して選択され、またはそれらが結びついた窒素とともにカチオン中心を形成し；
Ａ3(＝Ｏ)−ＯＭ)はアニオン中心であり、ここでＡ3はＣ，Ｓ，ＳＯ，Ｐ，またはＰＯであり、Ｍは金属または有機対イオンであり；
Ｌ6は、カチオン中心［Ｎ+(Ｒ9)(Ｒ10)(Ｒ11)］をポリマー主鎖に共有的に結合するリンカーであり；
Ｌ7は、アニオン中心［Ａ(＝Ｏ)−ＯＭ］をポリマー主鎖に共有的に結合するリンカーであり；
Ｘ-は、カチオン中心に結合する対イオンであり；
ｎは、５から約１０，０００の整数であり；および
ｐは、５から約１０，０００の整数である。
【請求項２３】
基材の表面であって、請求項９乃至２２のいずれか１項に記載のポリマーを含む表面。
【請求項２４】
請求項２３に記載の表面であって、前記基材は、粒子、ドラッグキャリアー、非ウィルス性遺伝子送達システム、バイオセンサー、メンブラン、移植可能なセンサー、皮下センサー、インプラント、およびコンタクトレンズからなる群から選択される表面。
【請求項２５】
請求項２３に記載の表面であって、前記基材は、イヤードレイナージ管、栄養管、グラウコーマドレナージ管、脳水腫シャント、人工角膜、神経ガイダンス管、導尿カテーテル、組織接着剤、Ｘ線ガイド、人工関節、人工心臓弁、人工血管、ペースメーカー、左心補助人工心臓（ＬＶＡＤ）、動脈移植片、組織足場材、およびステントからなる群から選択される移植可能な医療装置である表面。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、２００９年１１月６日に出願された米国出願第６１／２５９，０７４の優先権を主張するものであり、その全体の内容を本明細書の一部として援用する。
【連邦政府の許諾権の陳述】
【０００２】
本発明は、海軍研究事務所により認められ契約番号Ｎ０００１４０９１０１３７およびＮ０００１４０７１１０３６のもとでの政府の助成を受けてなされたものである。政府は、本発明において正当な権利を有する。
【発明の背景】
【０００３】
ヒドロゲルは、進入型の組織環境を模倣し、高い拡散浸透性を保証し、生物模倣型の機械的強度を与えることに起因して、長い間、生物学的および医用材料用途に関心を抱かせてきた。ヒドロゲルの一般的な特性に加えて、欠陥が少なく生体不活性であって多用途であると通常考えられているので、特別な関心は、ＰＥＧヒドロゲルおよびポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（ｐＨＥＭＡ）ヒドロゲルに与えられる。
【０００４】
ｐＨＥＭＡヒドロゲルは、とりわけコンタクトレンズ、人工角膜、薬剤送達媒体、軟骨代替物、および組織骨格のような用途に用いられて、研究されてきた。しかしながら、ｐＨＥＭＡの水和は天然組織のそれより低く、その欠陥は低いものの他の非ファウリング材料より高い。さらに、ヒドロキシル基を介するｐＨＥＭＡの機能付与は、一般に困難である。
【０００５】
ＰＥＧヒドロゲルはルーチン的に用いられ、付加的な官能基がＰＥＧヒドロゲルに導入される際に、制御されたインビトロおよびインビボの使用のための特異的に付加された生理活性官能基を伴なう生物学的不活性な基礎環境を必要とする用途のためにのみ修飾することができた。しかしながら、ＰＥＧは酸化を受けやすいことが見出された。酸化ダメージへのＰＥＧの感受性は、長期の材料安定性を必要とする用途について、その有用性を減少させる。しかしながら、最大の生物学的安定性および非ファウリングが要求される用途のためには、ＰＥＧベースの材料は不十分である。
【０００６】
近年、双性イオン化合物は、これはポリ（カルボキシベタインメタクリレート）（ｐＣＢＭＡ、スキーム１、構造１）を含むものであるが、極低いファウリングが実証され、５ｎｇ／ｃｍ2未満のタンパク質吸着を許すポリマーで被覆された表面を意味する。双性イオンポリ（カルボキシベタインメタクリレート）で被覆された表面は、たとえ未希釈の血漿および血清からの非特異性タンパク質吸着に対しても大きな耐性を有し、また、生物緑膿菌による長期の細菌性コロニー形成を室温で１０日まで禁止する。双性イオン材料の極低ファウリングは、逆の電荷の周りの高い水和、および水和層を除去するために必要とされる高いエネルギーに起因する。さらに、ＣＢＭＡ（カルボキシベタインメタクリレート）は、通常のＥＤＣ／ＮＨＳケミストリーによって機能付与される。
【０００７】
双性イオン材料の高い水和および極低いファウリング特性のために、双性イオンヒドロゲルは医用用途のために優れた適合性を有するヒドロゲルとして興味の対象である。スルホベタインメタクリレート（ＳＢＭＡ）および混合電荷ヒドロゲルへの低いタンパク質付着、およびカルボキシベタインメタクリレートゲルへの低い細胞接着が立証されてきた。しかしながら、これまでに研究された双性イオンヒドロゲルは低い機械的強度を示し、このことは、その潜在的な生体利用を制限する。それゆえ、改善された機械的特性を有するヒドロゲルについての必要性が存在する。
【０００８】
これらの双性イオンヒドロゲルのもう１つの基本的に制限する特徴は、親水性の架橋剤の欠乏である。最も通常に用いられている市販の“親水性”架橋剤は、Ｎ，Ｎ’−メチレンビス（アクリルアミド）（ＭＢＡＡ，スキーム１，構造２）である。非常に低い濃度において水溶性であるこの架橋剤は、約１０％の架橋剤濃度、特に双性イオンヒドロゲルの形成に理想的な塩溶液中においてのみ、適度に可溶性である。ｐＳＢＭＡおよびｐＣＢＭＡとの重合のための付加的な問題は、重合性部分の固有の不適合である。すなわち、架橋剤の大きく異なる化学構造は、成長するメタクリレートポリマー鎖への乏しい取り込みをもたらす。おそらく、双性イオンヒドロゲル中の架橋剤としてＭＢＡＡの最も受け入れられない特徴は、双性イオンモノマーが行なうようには、水を形成しないことである。双性イオン材料中に逆の電荷の周りで形成された水は、非ファウリングメカニズムを与える。すなわち、ＭＢＡＡは整った水を分解して、タンパク質、細菌、および細胞さえも結合する部分を示し、ヒドロゲルをファウルする。さらに、ＭＢＡＡ架橋剤は、機能性をもたせることができない。
【０００９】
非架橋の双性イオンヒドロゲルの有利な性質を維持した架橋双性イオンヒドロゲルについての要求が存在する。本発明は、この要求を満たして、関連する利点を提供する。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、双性イオン架橋剤、双性イオンモノマーと双性イオン架橋剤との共重合から合成された架橋した双性イオンヒドロゲル、架橋した双性イオンヒドロゲルの合成方法、および架橋した双性イオンヒドロゲルを含む装置、および架橋した双性イオンヒドロゲルを用いる方法を提供する。
【００１１】
一態様において、本発明は下記式を有する架橋剤を提供する。
【化１】
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【００１２】
ここで
Ｒ1およびＲ2は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、および、Ｃ６〜Ｃ１２アリール基からなる群から独立して選択され；
Ｒ3は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１２アリール、ＣＨ2＝Ｃ(Ｒ1)−Ｌ1−、およびＣＨ2＝Ｃ(Ｒ2)−Ｌ2−からなる群から選択され；
Ｌ1およびＬ2は、−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ−(ＣＨ2)n−および−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ−(ＣＨ2)n−からなる群から独立して選択され、ここでｎは１〜２０の整数であり；
Ｌ3は、−(ＣＨ2)n−であり、ここでｎは１〜２０の整数であり；
Ａ1は、Ｃ，Ｓ，ＳＯ，Ｐ，またはＰＯであり；
Ｘ-は、Ｎ+カチオン中心に結合する対イオンであり；および
Ｍ+は、(Ａ1＝Ｏ)Ｏ-アニオン中心に結合する対イオンである。
【００１３】
一実施形態において、Ａ1はＣまたはＳＯである。
【００１４】
他の態様において、本発明は、本発明の架橋剤で架橋した架橋ヒドロゲルを提供する。一実施形態においては、架橋したヒドロゲルは、繰り返し単位と複数の架橋結合とを有する架橋したポリマーを含み、それぞれの繰り返し単位は下記式を有する。
【化２】
2013510179.tif 000004
【００１５】
ここで
Ｒ4は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、およびＣ６−Ｃ１２アリール基からなる群から選択され；
Ｒ5およびＲ6は、アルキルおよびアリールからなる群から独立して選択され、またはそれらが結びついた窒素とともにカチオン中心を形成し；
Ｌ4は、カチオン中心［Ｎ+(Ｒ5)(Ｒ6)］をポリマー主鎖［−(ＣＨ2−ＣＲ4)n−］に共有的に結合するリンカーであり；
Ｌ5は、アニオン中心［Ａ2(＝Ｏ)−Ｏ-］をカチオン中心に共有的に結合するリンカーであり；
Ａ2は、Ｃ，Ｓ，ＳＯ，Ｐ，またはＰＯであり；
Ｍ+は、(Ａ2＝Ｏ)Ｏ-アニオン中心に結合する対イオンであり；
Ｘ-は、カチオン中心に結合する対イオンであり；
ｎは、５〜約１０，０００の整数であり；および
それぞれの架橋結合は下記式を有する。
【化３】
2013510179.tif 000005
【００１６】
ここで
Ｒ1およびＲ2は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基，およびＣ６−Ｃ１２アリール基からなる群から独立して選択され；
Ｒ3は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１２アリール、ＣＨ2＝Ｃ(Ｒ1)−Ｌ1−，ＣＨ2＝Ｃ(Ｒ2)−Ｌ2−からなる群から選択され、またはＲ3は、第３の架橋結合、−Ｌ1−ＣＲ1−ＣＨ2−または−Ｌ2−ＣＲ2−ＣＨ2−）の残部であり；
Ｌ1およびＬ2は、−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ−(ＣＨ2)n−および−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ−(ＣＨ2)n−からなる群から独立して選択され、ここでｎは１〜２０の整数であり；
Ｌ3は−(ＣＨ2)n−であり、ここでｎは１〜２０の整数であり；
Ａ1は、Ｃ，Ｓ，ＳＯ，Ｐ，またはＰＯであり；
ｘは、約５〜約１０，０００の整数であり；
Ｘ-は、Ｎ+カチオン中心に結合する対イオンであり；および
Ｍ+は、(Ａ＝Ｏ)Ｏ-アニオン中心に結合する対イオンである。
【００１７】
他の実施形態において、架橋したヒドロゲルは、繰り返しを有する架橋したポリマーを含み、ここでそれぞれの繰り返し単位は下記式を有する。
【化４】
2013510179.tif 000006
【００１８】
ここで
Ｒ7およびＲ8は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、およびＣ６〜Ｃ１２アリール基からなる群から独立して選択され；
Ｒ9，Ｒ10，およびＲ11は、アルキルおよびアリールから独立して選択され、またはそれらが結びついた窒素とともにカチオン中心を形成し；
Ａ3(＝Ｏ)−ＯＭ)はアニオン中心であり、ここでＡ3は、Ｃ，Ｓ，ＳＯ，Ｐ，またはＰＯであり、Ｍは金属または有機対イオンであり；
Ｌ6は、カチオン中心［Ｎ+(Ｒ9)(Ｒ10)(Ｒ11)］をポリマー主鎖に共有的に結合するリンカーであり；
Ｌ7は、アニオン中心［Ａ(＝Ｏ)−ＯＭ］をポリマー主鎖に共有的に結合するリンカーであり；
Ｘ-は、アニオン中心に結合する対イオンであり；
ｎは、約５〜約１０，０００の整数であり；および
ｐは、５〜約１０，０００の整数である。
【００１９】
他の態様において、本発明は基材の表面を提供し、ここで表面は本発明の架橋ヒドロゲルを含む。
【００２０】
以上の態様および本発明に付随する特徴の多くは、添付した図面に関連した以下の詳細な説明を参照することによって、よりよく理解されるのと同様に、より容易に認識されるようになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、カルボキシベタインモノマーである、カルボキシベタインメタクリレート（ＣＢＭＡ）（１）、Ｎ，Ｎ’−メチレンビス（アクリルアミド）（ＭＢＡＡ）（２），およびカルボキシベタインジメタクリレート（ＣＢＭＡＸ）（３）の化学構造を示す。
【図２】図２は、本発明の代表的な双性イオン架橋剤である、カルボキシベタインジメタクリレート（ＣＢＭＡＸ）（３）、およびカルボキシベタインジメタクリレート（ＣＢＭＡ３Ｘ）（４）の合成を模式的に示す。
【図３Ａ】図３Ａは、本発明の代表的な双性イオン架橋ヒドロゲル、ＣＢＭＡＸ架橋したＣＢＭＡヒドロゲル（ＣＢＭＡＸ）と、ＭＢＡＡ架橋したＣＢＭＡヒドロゲル（ＭＢＡＡ）との、水和特性についての比較である。体積分率は、膨潤したヒドロゲル中でのポリマーの体積による量であり、架橋剤含有量（％）の関数としている。ふさがれた棒は、ＣＢＭＡＸ架橋したＣＢＭＡヒドロゲルを表わし、一方、あいている棒は、ＭＢＡＡ架橋したＣＢＭＡヒドロゲルを表わす。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明の代表的な双性イオン架橋ヒドロゲル、ＣＢＭＡＸ架橋したＣＢＭＡヒドロゲル（ＣＢＭＡＸ）と、ＭＢＡＡ架橋したＣＢＭＡヒドロゲル（ＭＢＡＡ）との、水和特性についての比較である。平衡含水量は、膨潤したヒドロゲル中の水の重量による量であり、架橋剤含有量（％）の関数としている。ふさがれた棒は、ＣＢＭＡＸ架橋したＣＢＭＡヒドロゲルを表わし、一方、あいている棒は、ＭＢＡＡ架橋したＣＢＭＡヒドロゲルを表わす。
【図４】図４は、ＣＢＭＡＸ−およびＭＢＡＡ−架橋したＣＢＭＡヒドロゲルについて、架橋剤の量（％）の関数として相対的な細胞接着を比較する。ＣＢＭＡヒドロゲルの細胞接着は、ｐＨＥＭＡヒドロゲルの細胞接着に規格化した。
【図５】図５は、ＣＢＭＡＸ−およびＭＢＡＡ−架橋したＣＢＭＡヒドロゲルの圧縮弾性率（ＭＰａ）を架橋剤含有量（％）の関数として比較する。ヒドロゲルは圧縮できず、報告された弾性率は、最初の１０％歪みから得られた。ふさがれた菱形は、ＣＢＭＡＸ−架橋したＣＢＭＡヒドロゲルを表わし、一方、あいている四角形はＭＢＡＡ−架橋したＣＢＭＡヒドロゲルを表わす。
【図６Ａ】図６Ａは、ＣＢＭＡＸ−およびＭＢＡＡ−架橋したＣＢＭＡヒドロゲルの物理的特性、架橋密度（μｍｏｌ／ｍｍ3）の比較であり、架橋剤濃度（％）の関数として機械的および膨潤特性から算出した。ふさがれた菱形は、ＣＢＭＡＸ−架橋したＣＢＭＡヒドロゲルを表わし、一方、あいている四角形はＭＢＡＡ−架橋したＣＢＭＡヒドロゲルを表わす。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＣＢＭＡＸ−およびＭＢＡＡ−架橋したＣＢＭＡヒドロゲルの物理的特性、メッシュサイズ（ｎｍ）の比較であり、架橋剤濃度（％）の関数として機械的および膨潤特性から算出した。ふさがれた菱形は、ＣＢＭＡＸ−架橋したＣＢＭＡヒドロゲルを表わし、一方、あいている四角形はＭＢＡＡ−架橋したＣＢＭＡヒドロゲルを表わす。
【図７】図７は、本発明の代表的な双性イオン架橋ポリマー、光重合により得られたＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸの、架橋剤含有量（ｍｏｌ％）の関数としての水和特性（ＥＷＣ）の比較である。
【図８】図８は、本発明の代表的な双性イオン架橋ポリマー、光重合により得られたＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸの、架橋剤含有量（％）の関数としての圧縮強度（ＭＰａ）の比較である。
【図９】図９は、本発明の代表的な双性イオン架橋ポリマー、光重合により得られたＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸの、架橋剤含有量（％）の関数としての圧縮弾性率（ＭＰａ）の比較である。
【図１０】図１０は、架橋剤勾配を有する本発明の代表的な双性イオン架橋ヒドロゲルＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸの合成の模式図である。
【図１１】図１１は、架橋剤勾配を有する本発明の双性イオンポリマーＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸの、架橋剤濃度（％）の関数としての水和特性の比較である。
【図１２】図１２は、架橋剤勾配を有する本発明の双性イオンポリマーＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸの、架橋剤濃度（％）の関数としての架橋剤密度（μｍｏｌ／ｍｍ3）の比較である。
【図１３】図１３は、架橋剤勾配を有する本発明の双性イオンポリマーＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸの、架橋剤濃度（％）の関数としての圧縮弾性率（ＭＰａ）の比較である。
【図１４】図１４は、架橋剤勾配を有する本発明の双性イオンポリマーＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸの、架橋剤濃度（％）の関数としてのメッシュサイズ（ｎｍ）の比較である。
【図１５】図１５は、代表的なＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸ勾配ヒドロゲルの写真である。４％のＣＢＭＡ−Ｘ  ＣＢＭＡヒドロゲルの直径５ｍｍの円盤（Ａ）、および７５％のＣＢＭＡＸ−ヒドロゲルの四角形（Ｂ）が、代表的な勾配を有するヒドロゲル（Ｃ）と比較して示され、ＣＢＭＡＸの架橋に付随した色の勾配を示している。
【図１６】図１６は、代表的な勾配を有するヒドロゲルに沿った長さ（ｃｍ）の関数として架橋剤含有量（％）を示すグラフである。
【図１７】図１７は、ＣＢＭＡＸ含有量（０．１，１，１０，および２０％）の関数として、代表的なＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸヒドロゲルの含水量（ＥＷＣ）の比較である。
【図１８Ａ】図１８Ａは、３日培養後の代表的なＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸヒドロゲルへのＣＯＳ−７細胞付着性の比較を比較する画像であり、ヒドロゲルＣＢＭＡＸ含有量が０．１％のＧＯｘ固定化前である。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、３日培養後の代表的なＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸヒドロゲルへのＣＯＳ−７細胞付着性の比較を比較する画像であり、ヒドロゲルＣＢＭＡＸ含有量が０．１％のＧＯｘ固定化後である。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、３日培養後の代表的なＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸヒドロゲルへのＣＯＳ−７細胞付着性の比較を比較する画像であり、ヒドロゲルＣＢＭＡＸ含有量が１％のＧＯｘ固定化前である。
【図１８Ｄ】図１８Ｃは、３日培養後の代表的なＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸヒドロゲルへのＣＯＳ−７細胞付着性の比較を比較する画像であり、ヒドロゲルＣＢＭＡＸ含有量が１％のＧＯｘ固定化後である。
【図１８Ｅ】図１８Ｅは、３日培養後の代表的なＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸヒドロゲルへのＣＯＳ−７細胞付着性の比較を比較する画像であり、ヒドロゲルＣＢＭＡＸ含有量が１０％のＧＯｘ固定化前である。
【図１８Ｆ】図１８Ｆは、３日培養後の代表的なＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸヒドロゲルへのＣＯＳ−７細胞付着性の比較を比較する画像であり、ヒドロゲルＣＢＭＡＸ含有量が１０％のＧＯｘ固定化後である。
【図１８Ｇ】図１８Ｇは、３日培養後の代表的なＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸヒドロゲルへのＣＯＳ−７細胞付着性の比較を比較する画像であり、ヒドロゲルＣＢＭＡＸ含有量が２０％のＧＯｘ固定化前である。
【図１８Ｈ】図１８Ｇは、３日培養後の代表的なＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸヒドロゲルへのＣＯＳ−７細胞付着性の比較を比較する画像であり、ヒドロゲルＣＢＭＡＸ含有量が２０％のＧＯｘ固定化後である。
【図１９Ａ】図１９Ａは、ＰＢＳ中で１，１０，２５、および４０日のグルコース濃度（ｍＭ）の関数としての、代表的なＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸヒドロゲルで被覆されたグルコースセンサーの電流応答（ｎＡ）の比較である。ヒドロゲルＣＢＭＡＸ含有量０．１％、作動電位：＋０．７５Ｖ  ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、ＰＢＳ中で１，１０，２５、および４０日のグルコース濃度（ｍＭ）の関数としての、代表的なＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸヒドロゲルで被覆されたグルコースセンサーの電流応答（ｎＡ）の比較である。ヒドロゲルＣＢＭＡＸ含有量１％、作動電位：＋０．７５Ｖ  ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極。
【図１９Ｃ】図１９Ｃは、ＰＢＳ中で１，１０，２５、および４０日のグルコース濃度（ｍＭ）の関数としての、代表的なＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸヒドロゲルで被覆されたグルコースセンサーの電流応答（ｎＡ）の比較である。ヒドロゲルＣＢＭＡＸ含有量１０％、作動電位：＋０．７５Ｖ  ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極。
【図１９Ｄ】図１９Ｄは、ＰＢＳ中で１，１０，２５、および４０日のグルコース濃度（ｍＭ）の関数としての、代表的なＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸヒドロゲルで被覆されたグルコースセンサーの電流応答（ｎＡ）の比較である。ヒドロゲルＣＢＭＡＸ含有量２０％、作動電位：＋０．７５Ｖ  ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極。
【図２０Ａ】図２０Ａは、１００％血清中で１，１０，２５、および４０日のグルコース濃度（ｍＭ）の関数としての、代表的なＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸヒドロゲルで被覆されたグルコースセンサーの電流応答（ｎＡ）の比較である。ヒドロゲルＣＢＭＡＸ含有量０．１％、作動電位：＋０．７５Ｖ  ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、１００％血清中で１，１０，２５、および４０日のグルコース濃度（ｍＭ）の関数としての、代表的なＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸヒドロゲルで被覆されたグルコースセンサーの電流応答（ｎＡ）の比較である。ヒドロゲルＣＢＭＡＸ含有量１％、作動電位：＋０．７５Ｖ  ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極。
【図２０Ｃ】図２０Ｃは、１００％血清中で１，１０，２５、および４０日のグルコース濃度（ｍＭ）の関数としての、代表的なＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸヒドロゲルで被覆されたグルコースセンサーの電流応答（ｎＡ）の比較である。ヒドロゲルＣＢＭＡＸ含有量１０％、作動電位：＋０．７５Ｖ  ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極。
【図２０Ｄ】図２０Ｄは、１００％血清中で１，１０，２５、および４０日のグルコース濃度（ｍＭ）の関数としての、代表的なＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸヒドロゲルで被覆されたグルコースセンサーの電流応答（ｎＡ）の比較である。ヒドロゲルＣＢＭＡＸ含有量２０％、作動電位：＋０．７５Ｖ  ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極。
【図２１】図２１は、未希釈の血清中でのＯＡ−ＧＮＰｓ，ＯＣ−ＧＮＰｓ，ＣＡ−ＧＮＰｓ，およびＣＣ−ＧＮＰｓの流体力学的サイズの比較である。血清タンパク質は、遠心分離により除去し、測定前にＰＢＳ中に再分散させた。
【図２２】図２２は、未希釈の血清と混合されたＯＡ−ＧＮＰｓ，ＯＣ−ＧＮＰｓ，ＣＡ−ＧＮＰｓ，およびＣＣ−ＧＮＰｓの流体力学的サイズの比較である。
【発明の詳細な説明】
【００２２】
本発明は、双性イオン架橋剤、双性イオンモノマーと双性イオン架橋剤との共重合から合成された架橋双性イオンヒドロゲル、架橋双性イオンヒドロゲルの製造方法、および架橋双性イオンヒドロゲルを含む装置、および架橋双性イオンヒドロゲルを用いる方法を提供する。
【００２３】
＜双性イオン架橋剤＞
一態様において、本発明は双性イオン架橋剤を提供する。双性イオン架橋剤は、適切な重合性のモノマーおよびコモノマーと共重合して、架橋したポリマーおよび架橋したコポリマーを提供することができる。
【００２４】
双性イオン架橋剤は、１またはこれを超える双性イオンモノマーと共重合させることによって、または１またはこれを超えるイオン対コモノマーなどの電荷を有するコモノマーを共重合させることによって、架橋したヒドロゲルのような架橋したポリマーおよび架橋したコポリマーの合成に有利に用いられる。
【００２５】
本発明の双性イオン架橋剤は、式（Ｉ）を有する。
【化５】
2013510179.tif 000007
【００２６】
ここで
Ｒ1およびＲ2は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、およびＣ６〜Ｃ１２アリール基から独立して選択され；
Ｒ3は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１２アリール、ＣＨ2＝Ｃ(Ｒ1)−Ｌ1−、またはＣＨ2＝Ｃ(Ｒ2)−Ｌ2−から選択され；
Ｌ1およびＬ2は、−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ−(ＣＨ2)n−および−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ−(ＣＨ2)n−からなる群から独立して選択され、ここでｎは１〜２０の整数であり；
Ｌ3は、−(ＣＨ2)n−であり、ここでｎは１〜２０の整数であり；および
Ａ1は、Ｃ，Ｓ，ＳＯ，Ｐ，またはＰＯであり；
Ｘ-は、Ｎ+カチオン中心に結合する対イオンであり；および
Ｍ+は、(Ａ＝Ｏ)Ｏ-アニオン中心に結合する金属または有機対イオンである。
【００２７】
一実施形態において、Ｒ1，Ｒ2，およびＲ3は、Ｃ１〜Ｃ３アルキルである。一実施形態において、Ｒ1，Ｒ2，およびＲ3は、メチルである。
【００２８】
実施形態において、Ｌ1およびＬ2は、−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ−(ＣＨ2)n−であり、ここでｎは１〜６である。実施形態において、Ｌ1およびＬ2は、−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ−(ＣＨ2)2−である。
【００２９】
一実施形態において、Ｌ3は−(ＣＨ2)n−であり、ここでｎは１〜６である。一実施形態において、Ｌ3は−(ＣＨ2)−である。
【００３０】
一実施形態において、Ａ1はＣである。一実施形態において、Ａ1はＳＯである。
【００３１】
図１は、本発明の代表的な双性イオン架橋剤の化学構造を示し、化合物３をここでＣＢＭＡＸと称する。本発明の代表的な双性イオン架橋剤ＣＢＭＡＸの合成は、例１で述べられ、図２に模式的に示す。
【００３２】
＜架橋した双性イオンヒドロゲル＞
他の態様において、本発明は、双性イオン架橋剤との双性イオンモノマーの共重合から合成された架橋した双性イオンヒドロゲルを提供する。双性イオン架橋剤は、適切な重合性のモノマーおよびコモノマーと共重合することができ、架橋したポリマーおよび架橋したコポリマーを提供する。
【００３３】
本発明の架橋したヒドロゲルは、繰り返し基と、双性イオン架橋剤から誘導された架橋結合とを有する架橋したポリマーである。
【００３４】
＜双性イオンモノマー＞  一実施形態において、本発明の架橋したヒドロゲルは、双性イオン架橋剤と適切な重合性双性イオンモノマーとの共重合から合成された架橋したポリマーである。この実施形態においては、架橋したポリマー（例えば、ヒドロゲル）は、式（II）を有する繰り返し単位を有する。
【化６】
2013510179.tif 000008
【００３５】
ここで
Ｒ4は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、およびＣ６〜Ｃ１２アリール基から選択され；
Ｒ5およびＲ6は、アルキルおよびアリールから独立して選択され、またはそれらが結びついた窒素とともにカチオン中心を形成し；
Ｌ4は、カチオン中心［Ｎ+(Ｒ5)(Ｒ6)］をポリマー主鎖［−(ＣＨ2−ＣＲ4)n−］に共有的に結合するリンカーであり；
Ｌ5は、アニオン中心［Ａ2(＝Ｏ)Ｏ-］をカチオン中心に共有的に結合するリンカーであり；
Ａ2は、Ｃ，Ｓ，ＳＯ，Ｐ，またはＰＯであり；
Ｍ+は、(Ａ2＝Ｏ)Ｏ-アニオン中心に結合する金属または有機対イオンであり；
Ｘ-は、カチオン中心に結合する対イオンであり；
ｎは、５〜約１０，０００の整数であり；および
＊は、繰り返し単位が、隣接する繰り返し単位または双性イオン架橋結合のいずれかに共有的に連結する点を表わす。
【００３６】
一実施形態においては、Ｒ4はＣ１〜Ｃ３アルキルである。
【００３７】
Ｒ5およびＲ6は、アルキルおよびアリールから独立して選択され、またはそれら結びついた窒素とともにカチオン中心を形成する。一実施形態において、Ｒ5およびＲ6は、Ｃ１〜Ｃ３アルキルである。
【００３８】
ある実施形態においては、Ｌ4は、−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ−(ＣＨ2)n−および−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ−(ＣＨ2)n−からなる群から選択され、ここでｎは１〜２０の整数である。ある実施形態において、Ｌ4は−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ−(ＣＨ2)n−であり、ここでｎは１〜６である。
【００３９】
ある実施形態において、Ｌ5は−(ＣＨ2)n−であり、ここでｎは１〜２０の整数である。
【００４０】
ある実施形態において、Ａ2はＣまたはＳＯである。
【００４１】
ある実施形態において、ｎは５〜約５，０００の整数である。
【００４２】
一実施形態において、Ｒ4，Ｒ5，およびＲ6はメチルであり、Ｌ4は−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ−(ＣＨ2)2−であり、Ｌ５は−(ＣＨ2)−であり、Ａ1はＣであり、ｎは１０〜約１，０００の整数である。
【００４３】
上述の式（II）を有する繰り返し単位を有する架橋したポリマー（例えばヒドロゲル）に加えて、架橋したポリマーは、式（III）の双性イオン架橋結合を含む。
【化７】
2013510179.tif 000009
【００４４】
ここで、Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｌ1，Ｌ2，Ｌ3，Ａ1，Ｘ-，およびＭ+は、双性イオン架橋剤（式（Ｉ）について上述したようなものであり、ｘは約５〜約１０，０００の整数である。Ｒ3が重合性基を含む架橋したヒドロゲルについて、ヒドロゲルは、上記（−Ｌ1−ＣＲ1−ＣＨ2−および−Ｌ2−ＣＲ2−ＣＨ2−）に示されるようにＲ3を介してさらに架橋する。
【００４５】
本発明の架橋した双性イオンヒドロゲルは、双性イオン架橋剤と式（IV）を有するモノマーとの共重合によって合成することができる。
【化８】
2013510179.tif 000010
【００４６】
ここで、Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6，Ｌ4，Ｌ5，Ａ2，Ｘ-，およびＭ+は、式（II）の繰り返し単位について上述したようなものである。
【００４７】
本発明の代表的な架橋した双性イオンポリマーは、式（Ｖ）を有する。
【化９】
2013510179.tif 000011
【００４８】
ここで、Ｒ5，Ｒ6，Ｌ4，Ｌ5，Ａ2，Ｘ-，Ｍ+およびｎは、式（II）について上述したようなものであり、ＰＢは、繰り返し単位［式（II）］および架橋結合［式（III）］を含むポリマー主鎖である。
【００４９】
本発明の代表的な双性イオンヒドロゲルＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸの合成および特性評価は、例２で述べる。
【００５０】
＜架橋した混合電荷ヒドロゲル＞
他の態様において、本発明は、双性イオン架橋剤とのイオン対コモノマーの共重合から合成された架橋した混合電荷コポリマー（またはヒドロゲル）を提供する。
【００５１】
本明細書において用いられる際、用語「混合電荷コポリマー（またはヒドロゲル）」は、ポリマー主鎖、正の電荷を有する複数の繰り返し単位、および負の電荷を有する複数の繰り返し単位を有するコポリマーをさす。本発明の実施において、これらのコポリマーは、イオン対コモノマーの重合により合成することができる。
【００５２】
混合電荷コポリマーは、正の電荷を有する複数の繰り返し単位と、負の電荷を有する複数の繰り返し単位とを含む。一実施形態において、混合電荷コポリマーは、実質的に電気的に中性である。ここで用いられる際、用語「実質的に電気的に中性」は、有利な非ファウリング特性をコポリマーに与えるコポリマーをさす。一実施形態において、実質的に電気的に中性なコポリマーは、実質的にゼロの正味の電荷を有するコポリマー（すなわち、正の電荷を有する繰り返し単位と負の電荷を有する繰り返し単位とがほぼ同数のコポリマー）である。一実施形態において、負の電荷を有する繰り返し単位の数に対する正の電荷を有する繰り返し単位の数の比は、約１：１．１〜約１：０．５である。一実施形態において、負の電荷を有する繰り返し単位の数に対する正の電荷を有する繰り返し単位の数の比は、約１：１．１〜約１：０．７である。一実施形態において、負の電荷を有する繰り返し単位の数に対する正の電荷を有する繰り返し単位の数の比は、約１：１．１〜約１：０．９である。
【００５３】
＜イオン対コモノマー＞  一実施形態において、本発明の架橋したヒドロゲルは、双性イオン架橋剤と適切な重合性イオン対コノモマーとの共重合により合成される架橋したポリマーである。
【００５４】
本発明に有用な代表的なイオン対コモノマーは、式（VI）および（VII）を有する。
【化１０】
2013510179.tif 000012
【００５５】
本実施形態において、架橋したポリマー（例えば、ヒドロゲル）は、式（VIII）を有する繰り返し単位を有する。
【化１１】
2013510179.tif 000013
【００５６】
ここで
Ｒ7およびＲ8は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、およびＣ６〜Ｃ１２アリール基から独立して選択され；
Ｒ9，Ｒ10，およびＲ11は、アルキルおよびアリールから独立して選択され、またはそれらが結びついた窒素とともにカチオン中心を形成し；
Ａ3(＝Ｏ)−ＯＭ)はアニオン中心であり、ここでＡ3は、Ｃ，Ｓ，ＳＯ，ＰまたはＰＯであり、Ｍは金属または有機対イオンであり；
Ｌ6は、カチオン中心［Ｎ+(Ｒ9)(Ｒ10)(Ｒ11)］をポリマー主鎖に共有的に結合するリンカーであり；
Ｌ7は、アニオン中心［Ａ(＝Ｏ)−ＯＭ］をポリマー主鎖に共有的に結合するリンカーであり；
Ｘ-は、カチオン中心に結合する対イオンであり；
ｎは、５から約１０，０００の整数であり；
ｐは、５から約１０，０００の整数であり；および
＊は、繰り返し単位が、隣接する繰り返し単位または双性イオン架橋結合のいずれかに共有的に結合する点を表わす。
【００５７】
一実施形態において、Ｒ7およびＲ8はＣ１〜Ｃ３アルキルである。
【００５８】
Ｒ9，Ｒ10，およびＲ11は、アルキルおよびアリールから独立して選択され、またはそれらが結びついた窒素とともにカチオン中心を形成する。一実施形態においては、Ｒ9，Ｒ10，およびＲ11はＣ１〜Ｃ３アルキルである。
【００５９】
ある実施形態において、Ｌ6は、−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ−(ＣＨ2)n−および−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ−(ＣＨ2)n−からなる群から選択され、ここでｎは１〜２０の整数である。ある実施形態において、Ｌ6は−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ−(ＣＨ2)n−であり、ここでｎは１〜６である。
【００６０】
ある実施形態においては、Ｌ7はＣ１〜Ｃ２０アルキレン鎖である。代表的なＬ7は、−(ＣＨ2)n−を含み、ここでｎは１〜２０（例えば、１，３，または５）である。
【００６１】
ある実施形態において、Ａ3は、Ｃ，Ｓ，ＳＯ，Ｐ，またはＰＯである。
【００６２】
ある実施形態において、ｎは５〜約５，０００の整数である。
【００６３】
一実施形態において、Ｒ7，Ｒ8，Ｒ9，Ｒ10，およびＲ11は、メチルであり、Ｌ6およびＬ7は−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ−(ＣＨ2)2−であり、ＡはＣであり、ｎは１０〜約１，０００の整数である。
【００６４】
上述の式（VIII）を有する繰り返し単位を有する架橋したコポリマー（例えば、ヒドロゲル）に加えて、架橋したポリマーは式（III）を有する双性イオン架橋結合を有する。
【００６５】
本発明の代表的な架橋した双性イオンポリマーは、式（IX）を有する。
【化１２】
2013510179.tif 000014
【００６６】
ここで、Ｌ6，Ｎ+(Ｒ9)(Ｒ10)(Ｒ11)，Ｌ7，Ａ3(＝Ｏ)ＯＭ，Ｘ-，ｎ，およびｐは、上述したようなものであり、ＰＢは、繰り返し単位［式（VIII）］と［式（III）］とを含むポリマー主鎖である。
【００６７】
以下は、上述した架橋剤、モノマー、コモノマー、ポリマー、コポリマー、および式（Ｉ）〜（IX）の架橋結合の説明である。
【００６８】
上記式において、ＰＢはポリマー主鎖である。代表的なポリマー主鎖は、ビニルモノマー（例えば、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、スチレン）から誘導されたビニル主鎖（例えば、−Ｃ(Ｒ’)(Ｒ”)−Ｃ(Ｒ''')(Ｒ'''')−、ここでＲ’，Ｒ”，Ｒ'''，およびＲ'''は、水素、アルキル、およびアリールから独立して選択される）を含む。他の代表的な主鎖は、ペンダント基を与えるためのポリマー主鎖を含む。他の代表的なポリマー主鎖は、ペプチド（ポリペプチド）、ウレタン（ポリウレタン）、およびエポキシ主鎖を含む。
【００６９】
同様に、上記式において、ＣＨ2＝Ｃ(Ｒ)−は重合性基である。上で言及したものを含む他の重合性基は、本発明のモノマーおよびポリマーを提供するために用い得ることが理解されるであろう。
【００７０】
上記式において、Ｎ+はカチオン中心である。ある実施形態において、カチオン中心は、四級アンモニウム（例えば、Ｌ4，Ｒ5，Ｒ6，およびＬ5に結合したＮ）である。アンモニウムに加えて、他の有用なカチオン中心（Ｒ5およびＲ6を伴なうＮ）は、イミダゾリウム、トリアゾリウム、ピリジニウム、モルホリニウム、オキサゾリジニウム、ピラジニウム、ピリダジニウム、ピリミジニウム、ピペラジニウム、およびピロリジニウムを含む。
【００７１】
Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6，Ｒ9，Ｒ10，およびＲ11は、水素、アルキル基、およびアリール基から独立して選択される。代表的なアルキル基は、Ｃ１〜Ｃ１０の直鎖および分岐したアルキル基を含む。ある実施形態において、アルキル基は、例えばアリール基（例えば、−ＣＨ2Ｃ6Ｈ5，ベンジル）を含む１またはこれを超える置換基でさらに置換される。代表的なアリール基は、Ｃ６〜Ｃ１２アリール基を含み、例えばフェニルを含む。上述の式のある実施形態について、Ｒ5およびＲ6，またはＲ9，Ｒ10，およびＲ11は、Ｎ+とともにカチオン中心を形成する。
【００７２】
Ｌ4（またはＬ6）は、カチオン中心をポリマー主鎖に共有的に結合するリンカーである。ある実施形態においては、Ｌ4は、Ｌ4の残部をポリマー主鎖（またはモノマーのための重合性部分）に結合する官能基（例えば、エステルまたはアミド）を含む。官能基に加えて、Ｌ4はＣ１〜Ｃ２０アルキレン鎖を含むことができる。代表的なＬ4の群は、−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ−(ＣＨ2)n−および−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ−(ＣＨ2)n−を含み、ここでｎは１〜２０（例えば、３）である。
【００７３】
Ｌ5は、カチオン中心をアニオン中心（すなわち、(Ａ＝Ｏ)Ｏ-）に共有的に結合するリンカーである。Ｌ5は、Ｃ１〜Ｃ２０アルキレン基とすることができる。代表的なＬ5の群は、−(ＣＨ2)n−であり、ここでｎは１〜２０（例えば、１，３，または５）である。
【００７４】
Ｌ7は、ポリマー主鎖をアニオン基に共有的に結合するリンカーである。Ｌ7は、Ｃ１〜Ｃ２０アルキレン鎖とすることができる。代表的なＬ7は、−(ＣＨ2)n−を含み、ここでｎは１〜２０（例えば、１，３，または５）である。
【００７５】
Ａ(＝Ｏ)−Ｏ-はアニオン中心である。アニオン中心は、カルボン酸エステル（ＡはＣ）、スルフィン酸（ＡはＳ）、スルホン酸（ＡはＳＯ）、ホスフィン酸（ＡはＰ）、またはホスホン酸（ＡはＰＯ）とすることができる。
【００７６】
上記式において、代表的なアルキル基は、Ｃ１〜Ｃ３０の直鎖および分岐したアルキル基を含む。ある実施形態において、アルキル基は、例えばアリール基（例えば、−ＣＨ2Ｃ6Ｈ5，ベンジル）を含む１またはこれを超える置換基でさらに置換される。
【００７７】
代表的なアリール基は、Ｃ６〜Ｃ１２アリール基を含み、例えば、置換されたフェニル基（例えば安息香酸）を含むフェニルを含む。
【００７８】
Ｘ-は、カチオン中心に結合する対イオンである。対イオンは、カチオン性のポリマーまたはモノマーの合成に起因した対イオン（例えば、Ｃｌ-，Ｂｒ-，Ｉ-）とすることができる。カチオン中心の合成から初期に得られる対イオンは、他の適切な対イオンと交換することができ、制御可能な加水分解特性および他の生物学的特性を有するポリマーを与える。代表的な疎水性の対イオンは、カルボキシレートを含み、例えば、安息香酸および脂肪酸アニオン（例えば、ＣＨ3(ＣＨ2)nＣＯ2-、ここでｎ＝１〜１９）；アルキルスルホネート（例えば、ＣＨ3(ＣＨ2)nＳＯ3-、ここでｎ＝１〜１９）；サリシレート；ラクテート；ビス（トリフルオロメチルスルホニル）アミドアニオン（Ｎ-(ＳＯ2ＣＦ3)2）；およびそれらの誘導体などである。他の適切な対イオンもまた、クロライド、ブロマイド、アイオダイド、サルフェート；ナイトレート；パークロレート（ＣｌＯ4）；テトラフルオロボレート（ＢＦ4）；ヘキサフルオロホスフェート（ＰＦ6）；トリフルオロメチルスルフォネート（ＳＯ3ＣＦ3）；およびそれらの誘導体から選択することができる。他の適切な対イオンは、疎水性の対イオン、および治療的な活性を有する対イオンを含み、（例えば、抗菌剤、サリシル酸（２−ヒドロキシ安息香酸）、ベンゾエート、およびラクテートなどである。
【００７９】
モノマーについて、Ｒ1およびＲ2［式（Ｉ）］およびＲ4［式（IV）］は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、およびＣ１〜Ｃ６アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル）から選択される。一実施形態において、Ｒ1，Ｒ2，およびＲ4は水素である。一実施形態において、Ｒ1，Ｒ2，およびＲ4はメチルである。
【００８０】
＜架橋した双性イオンヒドロゲルで処理された表面＞
他の態様において、本発明は、架橋された双性イオンヒドロゲルで処理された表面を提供する。本発明の架橋された双性イオンヒドロゲルは、双性イオンポリマーに加水分解性を有し、例えば医療装置を含む種々の装置の表面のためのコーティングとして有利である。
【００８１】
本発明のヒドロゲルは、表面を被覆して生体適合性、抗菌性、および非ファウリング表面を提供するために有利に用いられる。したがって、他の態様においては、本発明は、１またはこれを超える本発明の架橋した双性イオンヒドロゲルが適用された（例えば、被覆された、共有的に結合した、イオン的に結合した、疎水的に結合した）表面（例えば、１またはこれを超える表面）を有する装置または材料を提供する。本発明のヒドロゲルで有利に処理することができる、修飾されて本発明のヒドロゲルを含むことができる、または本発明のヒドロゲルを取り込むことができる代表的な装置およびキャリアは、以下を含む：
本発明のヒドロゲルで、処理された、修飾されて含んだ、または取り込んだ表面を有する粒子（例えば、ナノ粒子）；
本発明の材料で、処理された、修飾されて含んだ、または取り込んだ表面を有するドラッグキャリアー；
本発明のヒドロゲルで、処理された、修飾されて含んだ、または取り込んだ表面を有する非ウィルス性遺伝子送達系；
本発明のヒドロゲルで、処理された、修飾されて含んだ、または取り込んだ表面を有するバイオセンサー；
本発明のヒドロゲルで、処理された、修飾されてヒドロゲルを含んだ、または取り込んだ表面を有する、微生物懸濁液のためのメンブラン、ホルモン分離、タンパク質分画、細胞分離、廃水処理、オリゴ糖バイオリアクター、タンパク質限外濾過、およびダイアリープロセシング（ｄｉａｒｙ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）のようなバイオプロセスまたはバイオ分離法のための装置；
本発明のヒドロゲルで、処理された、修飾されて含んだ、または取り込んだ表面を有する移植可能なセンサー；
本発明のヒドロゲルで、処理された、修飾されて含んだ、または取り込んだ表面を有する皮下センサー；
本発明のヒドロゲルで、処理された、修飾されて含んだ、または取り込んだ表面を有する乳房インプラント、人工内耳、および人工歯根のようなインプラント；
本発明のヒドロゲルで、処理された、修飾されて含んだ、または取り込んだ表面を有するコンタクトレンズ；
本発明のヒドロゲルで、処理された、修飾されて含んだ、または取り込んだ表面を有する組織足場材（tissue scaffold）；
本発明のヒドロゲルで処理された、修飾されて含んだ、または取り込んだ表面を有する人工関節、人工心臓弁、人工血管、ペースメーカー、左心補助人工心臓（ＬＶＡＤ）、動脈移植片、およびステントのような移植可能な医療装置；および
本発明のヒドロゲルで修飾された、修飾されて含んだ、または取り込んだ表面を有するイヤードレイナージ（ear drainage）管、栄養管、グラウコーマドレナージ管、脳水腫シャント、人工角膜、神経ガイダンス管、導尿カテーテル、組織接着剤、およびＸ線ガイドのような医療装置。
【００８２】
本発明のヒドロゲルで有利に処理することができる他の代表的な基材および物質は、修飾されて本発明のヒドロゲルを含む、または本発明のヒドロゲルを取り込んだものであり、織物を含み、例えば、衣料品（例えば、コート、シャツ、ズボン、肌着、病院および軍の職員に着用されるものを含む）、寝具類（例えば、毛布、シーツ、枕カバー、マットレス、および枕）、タオル地、およびワイプを含む。
【００８３】
本発明のヒドロゲルで有利に処理することができる他の代表的な基材および物質は、修飾されて本発明のヒドロゲルを含む、または本発明のヒドロゲルを取り込んだものであり、テーブルの上面板、机、カウンターの上面板のような作業表面を含む。
【００８４】
以下は、本発明の代表的な双性イオン架橋したヒドロゲル（ＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸ）の説明である。
【００８５】
上述したように、本発明はファウリング架橋剤の使用なしに非ファウリングｐＣＢＭＡヒドロゲルの機械的特性を改善するために、双性イオン架橋剤を提供する。代表的な双性イオン架橋剤であるＣＢＭＡベースのジメタクリレート架橋剤（ＣＢＭＡＸ）の構造は、図１に構造３で示される。架橋したものは、カチオン性の第四級アミンとアニオン性のカルボキシル基との間に、２つではなく１つのカーボンスペーサーが存在し、第四級アミンの２つのメチル基が第２のメタクリレート基で置き換えられた以外はＣＢＭＡモノマーと同じ化学構造を有する。架橋剤は、１Ｍの塩溶液に優れた溶解性を示し、その双性イオン基はＭＢＡＡとは異なって、ｐＣＢＭＡヒドロゲル中の架橋結合の全域で構造化された水の連続性を与えるであろう。特別に用意したコリンリン酸ベースの架橋剤で合成された双性イオンコリンリン酸（ＰＣ）ベースのヒドロゲルの水の構造が研究され、ＭＢＡＡ架橋した双性イオンヒドロゲルと比較して、ＰＣ架橋した双性イオンヒドロゲル中の水に定性的な違いが観察された(Goda T, Watanabe J, Takai M, Ishihara K.  Water structure and improved mechanical properties of phospholipid polymer hydrogel with phosphorylcholine centered intermolecular cross-linker.  Polymer 2006;47:1390-1396; and Goda T, Matsuno R, Konno T, Takai M, Ishihara K.  Protein adsorption resistance and oxygen permeability of chemically crosslinked phospholipid polymer hydrogel for ophthalmologic biomaterials.  J Biomed Mater Res B Appl Biomater 2009;89:184-190)。双性イオンモノマーと双性イオン架橋剤とから得られたヒドロゲルは、双性イオンモノマーとＭＢＡＡとから得られたヒドロゲルよりも、氷のように結合した水を有し、双性イオン的に架橋した双性イオンヒドロゲルの改善された機械的特性は、水の高められたオーダーに起因する。
【００８６】
本発明の代表的な双性イオン架橋剤である１−カルボキシ−Ｎ−メチル−Ｎ−ジ（２−メタクリロイルオキシ−エチル）メタンアミニウム分子内塩（ＣＢＭＸ）の合成は、例１で述べる。合成は図２に示す。
【００８７】
本発明の代表的な双性イオン架橋ヒドロゲル（ＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸ）の合成は、例２で述べる。
【００８８】
光重合により合成された本発明の代表的な双性イオン架橋ヒドロゲルＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸの合成および特性は、例３で述べる。
【００８９】
光重合により合成され、架橋剤勾配を有する本発明の代表的な双性イオン架橋ヒドロゲルＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸの合成および特性は、例４で述べる。
【００９０】
本発明の代表的な双性イオン架橋ヒドロゲルＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸのグルコースバイオセンサーにおける使用は、例５で述べる。
【００９１】
＜ＣＢＭＡＸでのＣＢＭＡヒドロゲルの水和特性＞
ヒドロゲルの高い含水量は、生物組織の含水量をしばしば反映するので、ヒドロゲルは生物学的応用に魅力的である。ＣＢＭＡヒドロゲルの膨潤特性は、数式（１）および（２）を用いて計算した。すなわち、脱水の前後におけるヒドロゲル円盤の質量および大きさを用いて、平衡含水量およびゲルの体積分率をそれぞれ計算した。図３Ａおよび３Ｂは、平衡含水量（図３Ａ）および体積分率（図３Ｂ）を示しており、ＭＢＡＡ架橋されたヒドロゲルについては、１７％架橋剤における溶解度限界までであり、ＣＢＭＡ架橋されたヒドロゲルについては２％ＣＢＭＡＸから１００％ＣＢＭＡＸまでである（それぞれ、あいている、およびふさがれた棒）。予測されるように、架橋剤含有量における増加は、水和および膨潤の減少を引き起こす。１００％ＣＢＭＡＸにおいて、水和は約６０％の平衡含水量まで低下し、そのように多量の架橋のためには著しく大きな値である。
【００９２】
これらの図面が示すように、ＣＢＭＡがＣＢＭＡＸまたはＭＢＡＡで架橋した際には、含水量における違いは全く現れない。
【００９３】
＜ＣＢＭＡＸを伴なうＣＢＭＡヒドロゲルの非ファウリング特性＞
４％のＣＢＭＡＸ，４％のＭＢＡＡ，１７％のＣＢＭＡＸ，および１７％のＭＢＡＡを有するＣＢＭＡヒドロゲル、およびＣＢＭＡＸヒドロゲルを、非ファウリングについて試験した。実際に取り扱われるのが最も低い値であるので低架橋剤含有量を選択し、一方、１７％はＭＢＡＡ取り込みの上限であるので、１７％架橋剤ヒドロゲルを選択した。この組成は、これら２つのヒドロゲルのファウリング特性の間の任意の違いを最も明確に示すことが予測された。線維芽細胞（ＣＯＳ−７）細胞は、抗菌性の滅菌されたヒドロゲルの上にまいて、補充した成長培地中で３日間成長させた。３日目、細胞接着を視覚的に定量化した。すなわち、それぞれのヒドロゲル処方の顕微鏡観察の１５画像を収集し、ゲルに接着した細胞の絶対数を数えた。
【００９４】
それぞれの処方のヒドロゲルに接着した細胞の数は、架橋剤含有量の関数として、ｐＨＥＭＡヒドロゲルに接着した細胞の数で規格化して図４に定量的に比較する。塗りつぶした棒は、ＣＢＭＡＸで架橋したヒドロゲルを表わし、一方、あいている棒はＭＢＡＡで架橋したヒドロゲルを表わす。右端の棒は、参照のｐＨＥＭＡヒドロゲルを表わす。全てのＣＢＭＡヒドロゲルは、低ファウリングのｐＨＥＭＡに関連して、特に補充した成長培地中で細胞接着において有意な低下（約８０〜９０％）を示す。ｐＨＥＭＡそれ自体は、ＴＣＰＳ上の細胞接着の小さなパーセンテージのみを示す。
【００９５】
低い架橋剤含有量において、ＣＢＭＡＸ−およびＭＢＡＡ−架橋されたヒドロゲルのいずれも非常に小さなファウリングを有し、ｐＨＥＭＡヒドロゲルの場合の約１０〜１５％（誤差範囲内と同等）である。より高い架橋剤含有量においては、顕著な相違が存在する。すなわち、ＣＢＭＡＸで架橋されたヒドロゲルは、非常に非ファウリングのままで残り（ｐＨＥＭＡの場合の約１０％）、一方、ＭＢＡＡで架橋されたヒドロゲルのファウリングは、より悪化した（ｐＨＥＭＡの場合の約２０％）。さらに、１００％ＣＢＭＡＸヒドロゲルでさえ、軽く架橋したＣＢＭＡヒドロゲルの同等の低いファウリングレベル（ｐＨＥＭＡヒドロゲルの場合の約１０％）を示す。このように、ＭＢＡＡの取り込みはＣＢＭＡヒドロゲルの非ファウリング特性を損ない、おそらく、双性イオンポリマー鎖の周りの規則正しい水を乱し、一方で、ＣＢＭＡ架橋剤は、分子レベルの化学的性質および水和作用の連続性を与え、それによって、ＣＢＭＡヒドロゲル内の非ファウリング特性を保存することによる。これらの結果は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）による非特異的なタンパク質吸着の測定によって支持された。
【００９６】
＜ＣＢＭＡヒドロゲルのＲＧＣ−機能付与＞
上述の非ファウリング研究と同様、１７％ＣＢＭＡＸと１７％ＭＢＡＡとを用いて得られたＣＢＭＡヒドロゲルは、機能付与のためのその能力を示す。ヒドロゲルは、ｃＲＧＤ、これは全インテグリン上に見られる細胞結合モチーフである、により従来のＥＤＣ／スルホＮＨＳケミストリーを用いてポスト機能付与した。ＥＤＣなしの同様のケミストリーは、対照のヒドロゲルに行なった。ＣＯＳ−７細胞は、その後、ＥＤＣ／スルホＮＨＳ−ｃＲＧＤ処理されたヒドロゲル上、およびスルホＮＨＳ−ｃＲＧＤ処理された対照ヒドロゲル上にまいた。細胞培養液は３日間培養させ、その後、細胞増殖を光学顕微鏡検査法で定量化した。それぞれのヒドロゲル処方の１５写真を撮影し、ゲルに吸着した細胞の絶対数を数えた。結果を表１にまとめる。
【００９７】
表１  ｃＲＧＤで機能付与された１７％ＣＢＭＡＸ−およびＭＢＡＡ−架橋されたヒドロゲル上の細胞接着。ＥＬＩＳＡからの非特異タンパク質接着は、事前機能付与されたヒドロゲル上への非特異的な細胞吸着を反映する。
【表１】
2013510179.tif 000015
【００９８】
表１に示されるように、機能付与されたＣＢＭＡＸ−およびＭＢＡＡ−架橋したヒドロゲルは、いずれも細胞接着における増加を示す。補充された培地からの非特異的に接着したタンパク質は、表面を汚損し、非特異的細胞接着を促進するであろう。ＥＬＩＳＡによって示されるように、ＣＢＭＡＸ架橋したヒドロゲルは、ＭＢＡＡ架橋したヒドロゲルの場合より効果的に非特異タンパク質吸着に抵抗し、これは、ＣＢＭＡＸ架橋したヒドロゲルへ接着した細胞のより低い総数に反映される。１７％ＭＢＡＡ架橋したヒドロゲル上に接着した細胞のより高い絶対数は、より高い非特異的細胞接着、すなわちファウリングを反映し、これはＭＢＡＡの存在に由来する。いずれのヒドロゲルも、ｃＲＧＤで機能付与されて、特異的細胞接着を誘発し、制御された生体適合性を示す。しかしながら、ＣＢＭＡＸ架橋したヒドロゲルは、バックグラウンド非特異的細胞接着の低いレベルを示す。
【００９９】
＜ＣＢＭＡヒドロゲルの機械的特性＞
機械的特性は、高度に水和したヒドロゲルのための大きな課題である。一般的に、ヒドロゲル中の水が多くなると構造は弱くなる。生体組織のための模倣体として効果的に作用し、細胞成長のための助けとなる環境を与えるために、ヒドロゲルは“柔軟である”べきである。また一方、実際には、機械的強度は取り扱いのために要求される。さらに、基質の堅さは、細胞の運命および幹細胞の分化に重要な役割を果たす。
【０１００】
円盤状のヒドロゲルは、破壊まで圧縮し、抽出したヤング率を、架橋剤組成（ＣＢＭＡＸ対ＭＢＡＡ、それぞれふさがれた菱形およびあいている四角形で表わす）および含有量（架橋剤の％）の関数として図５に示す。これらの値は、表２にもまとめる。
【０１０１】
表２  ＣＢＭＡＸ−およびＭＢＡＡ−架橋したＣＢＭＡヒドロゲルの機械的特性。弾性率、破断歪み、および破壊ストレスは、圧縮下のＣＢＭＡヒドロゲルの応力−歪み曲線から抽出した。
【表２】
2013510179.tif 000016
【０１０２】
ＣＢＭＡＸ−およびＭＢＡＡ−架橋したヒドロゲルについて直接比較できる架橋剤濃度（４％，９％，および１７％）において、ＣＢＭＡＸ架橋したヒドロゲルは、改善された機械的特性を示した。ＣＢＭＡＸ架橋したヒドロゲルの圧縮弾性率は、いずれの架橋剤でも達成できる全濃度においてＭＢＡＡ架橋したヒドロゲルの場合より大きく、破壊ストレスも同様に全濃度においてより大きい。より高い架橋剤含有量は、ＣＢＭＡＸで達成可能である。１００％ＣＢＭＡＸにおいて、圧縮弾性率は８ＭＰａに達し、比較的高い含水量（６０％）を有するヒドロゲルについての印象的な数値であり、この材料は十分に関節軟骨の範囲内であると認識するものである。これは、ｐＨＥＭＡヒドロゲル（０．６ＭＰａの圧縮弾性率）、およびＰＥＧヒドロゲル（５０％の架橋剤含水量で約３ＭＰａまでの圧縮弾性率）とも都合よく比較される。
【０１０３】
ＭＢＡＡ架橋剤を有するＣＢＭＡヒドロゲルに対して、ＣＢＭＡＸを有するＣＢＭＡヒドロゲルの平衡含水量の間に差異が全く見られないので、これらの改善された機械的特性は、低下した水和作用に起因しないが、むしろ水構造の質の違いに起因する。
【０１０４】
圧縮データは、架橋剤の量とＣＢＭＡ−ＣＢＭＡＸヒドロゲルの圧縮弾性率との間の関係の線形性を示す。架橋剤含有量の関数として、４％架橋剤から１００％ＣＢＭＡＸまで圧縮弾性率をプロットすると（図５）、関係は直線的で０．９６１６の回帰である。これは、ゲル系の適合性を明確に示す。すなわち、架橋剤は、伸びる直鎖状のポリマー鎖中に低い架橋剤組成で取り込まれ、かつ、目盛りの他端においては、モノマーは高度に架橋したネットワーク中に高い架橋剤組成で均一に取り込まれる。こうして、ヒドロゲル構造はより均質になる。一方、ＭＢＡＡ架橋剤は、架橋剤組成と圧縮弾性率との間における、より低い線形性（Ｒ2＝０．８５６２）の関係により証明されるように、伸びるポリマー鎖中により乏しい取り込みを示す。架橋剤含有量が９％から１７％に増加すると、ゲルの機械的特性は僅かに高められる。これは、この低い濃度においても制限された溶解性、および伸びる直鎖状のＣＢＭＡポリマー中への溶解した架橋剤の乏しい取り込みに起因する。不均質なヒドロゲルネットワーク中に現れる微視的な構造欠陥は、巨視的なヒドロゲルの機械的完全性を損なう。
【０１０５】
＜ＣＢＭＡヒドロゲルの物理的特性＞
上で集めた水和データおよび応力−歪み曲線を用いて、式３および４により、ＭＢＡＡまたはＣＢＭＡＸで架橋した際のＣＢＭＡヒドロゲルのいくつかの物理的特性を計算した。具体的には、応力−歪み曲線は、応力対（α−α-2）曲線、ここでαは本来の長さに対する変形した長さの比である、に操作した。低い歪みにおいて、この関係は線形であり、架橋剤密度は、この直線の傾きから抽出される（式３参照）。次に、体積当たりの架橋結合の数を一架橋剤当たりの体積に変換して、２つの架橋結合の間の距離を得る。架橋剤密度およびメッシュサイズの計算値は、架橋組成および含有量の関数として、図６Ａおよび６Ｂにそれぞれ示す。同一の名目上の架橋剤含有量において、ＭＢＡＡ架橋したヒドロゲルの架橋密度は、ＣＢＭＡ架橋したヒドロゲルのそれより低く、ＭＢＡＡはＣＢＭＡモノマーとの相溶性がより小さく、ＭＢＡＡのアクリルアミドは伸びるメタクリレートポリマー鎖中に不十分に取り込むという仮説を強化する。一方、ＣＢＭＡＸで架橋したヒドロゲルの高い架橋剤密度は、伸びるメタクリレートポリマー中へのＣＢＭＡＸメタクリレートのより良好な相溶性、およびより均一な取り込みを示唆する。架橋剤密度の値から算出されたメッシュサイズは、同様の筋をもたらし、モノマー−架橋剤の相溶性における差異は、ＣＢＭＡ−ＣＢＭＡＸおよびＣＢＭＡ−ＭＢＡＡ系の機械的特性における差異に主要な役割を担うという考えをさらに支持する。
【０１０６】
さらに、その優れた溶解性およびＣＢＭＡモノマーとの共重合に起因して、ＣＢＭＡＸ架橋されたヒドロゲルは、処方のより広い範囲を利用でき、これは物理的特性のより大きな多様性を与える。異なる架橋剤密度、および異なる細孔サイズは、ＣＢＭＡＸ架橋されたヒドロゲルに制御された形態を生じるものであり、生物学的操作のさらに別の手段を与える。ヒドロゲルは、その生体模倣構造、すなわち、高い含水量および生体分子の移動を許す細孔のために評価される。糖類および成長因子のような小さな分子のための２ｎｍ未満から、大きなタンパク質および抗体のような生体マクロ分子のための１０ｎｍを超える範囲の細孔サイズは、ヒドロゲル中への取り込みを全て行ないやすくする。架橋剤含有量を制御することによって、非ファウリング特性を損なうことなく、ヒドロゲルの細孔サイズを制御することができる。
【０１０７】
本発明の双性イオン架橋剤は、双性イオンヒドロゲル系との優れた相溶性を有する。代表的な架橋剤ＣＢＭＡＸは、有用な双性イオンモノマーＣＢＭＡに対応する構造を有し、それは２つの有利な効果を与える。まず、架橋剤の双性イオンの性質は、改善された溶解性に加えて、架橋剤は双性イオンモノマー側鎖の回りに生じる水の再構築を妨害しないことを意味する。ＭＢＡＡで架橋したヒドロゲルと比較して、ＣＢＭＡＸで架橋したヒドロゲルは、ＭＢＡＡ架橋したヒドロゲルに近づく全ての組成において改善された非ファウリングを示し、ｐＨＥＭＡヒドロゲルの非特異タンパク質吸着の約１０％のみを最終的に示した。第２に、ＣＢＭＡモノマーとＣＢＭＡＸ架橋剤との間の化学的な類似性は、大きな重合適合性を与える。ＣＢＭＡＸ架橋したヒドロゲルは、モノマーおよび架橋剤の明確な化学量論的な取り込みを示した。一方、ＭＢＡＡ架橋したヒドロゲルはＭＢＡＡの溶解限界に達したので、架橋剤含有量と圧縮弾性率との間の関係は低下し始めた。このように、ＣＢＭＡＸ架橋したヒドロゲルは、同等の名目上の架橋剤含有量において、ＭＢＡＡ架橋したヒドロゲルと比較して非常に高められた機械的特性を示した。ＣＢＭＡＸ架橋剤の水溶性は、さらに、以前に可能であったよりも、広い処方範囲に到達するのを可能にする。架橋剤のみ（モノマーなし）の重合により得られたヒドロゲルは、より高い含水量（６０％）、優れた非ファウリング特性（非ファウリングｐＨＥＭＥ参照ヒドロゲルより約９０％低い非特異的細胞接着）、および高い機械的強度（約８ＭＰａの圧縮弾性率）を有することが示された。さらに、ＣＢＭＡモノマーで得られたようなＣＢＭＡＸ架橋剤で構成されるこれらのヒドロゲルは、単純なＥＤＣ／スルホＮＨＳケミストリーによって機能付与することができる。
【０１０８】
以下の例は例示の目的で与えられ、本発明を限定するものではない。
【０１０９】
例
＜材料＞  NＮ，Ｎ’−メチレンビス（アクリルアミド）、過硫酸アンモニウム、ビス亜硫酸水素ナトリウム、２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、メタクリル酸、イオン交換樹脂（ＩＲＡ  ４００ＯＨ型）、およびリン酸緩衝食塩水は、シグマアルドリッチ（セントルイス，ＭＯ）から購入した。エタノールはデーコンラブス（Ｄｅｃｏｎ  Ｌａｂｓ）（キングオブプロシア，ＰＡ）から、アセトニトリルおよびジエチルエーテルは、イーエムディーバイオサイエンシズ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（ギブスタウン，ＮＪ）から、エチレングリコールはヴィーダブリュ−アール（ＶＷＲ）（ウェストチェスター，ＰＡ）から、テトラメチレングリコールジメタクリレートはポリサイエンシズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）（ウォリントン，ＰＡ）から、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ｔ−ブチルブロモアセテート、およびＮ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）はティーシーアイアメリカ（ＴＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａ）（ポートランド，ＯＲ）から、および、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）はバイオ−ラドラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ハーキュリーズ，ＣＡ）から購入した。Ｎ−メチルジエタノ−ルアミン、トリエタノールアミン、メタンスルホン酸、およびトリフルオロ酢酸は、アクロスオーガニクス（Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ）（モリスプレーンズ，ＮＪ）から購入した。ダルベッコ変法イーグル培地、ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、およびペニシリン−ストレプトマイシンは、インヴィトロゲンコープ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ）（カールズバッド，ＣＡ）から購入した。シクロ(アルギニン−グリシン−アスパラギニン−Ｄ−チロンシン−リジン)ペプチド（ｃＲＧＤ）は、ペプチドインターナショナル（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）（ルーイビル，ＫＹ）から購入した。過酸化水素および塩化ナトリウムは、ジェイティーベイカー（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）（フィリップスバーグ，ＮＪ）から、およびイムノピュアー（ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ）（登録商標）ｏ−フェニレンジアミンジハイドロクロライドはピース（Ｐｉｅｒｃｅ）（ロックフォード，ＩＬ）から購入した。西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−接合した抗フィブリノーゲンは、ユーエスバイオロジカル（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）（スウォンプスコット，ＭＡ）から購入した。ＣＯＳ−７細胞(アフリカミドリザル線維芽細胞細胞)は、アメリカンティッシューカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（マナッサス，ＶＡ）から購入した。ここで用いた全ての水は、ミリポア簡易水精製システムで１８．２ｍΩまで精製した。
【０１１０】
＜例１＞
＜代表的な双性イオン架橋剤：１−カルボキシ−Ｎ−メチル−Ｎ−ジ（２−メタクリロイルオキシ−エチル）メタンアミニウム分子内塩（ＣＢＭＸ）および１−カルボキシ−Ｎ−トリ（２−メタクリロイルオキシ−エチル）メタンアミニウム分子内塩（ＣＢＭＡ３Ｘ）の合成＞
この例においては、本発明の代表的な双性イオン架橋剤１−カルボキシ−Ｎ−メチル−Ｎ−ジ（２−メタクリロイルオキシ−エチル）メタンアミニウム分子内塩（ＣＢＭＸ）および１−カルボキシ−Ｎ−トリ（２−メタクリロイルオキシ−エチル）メタンアミニウム分子内塩（ＣＢＭＡ３Ｘ）の合成を説明する。合成は、図２に示す。
【０１１１】
＜Ｎ−メチル−Ｎ−ジ（エタノールアミンメタクリレート）（１）＞  Ｎ−メチルジエタノールアミン（１１．９ｇ，０．１ｍｏｌ），トルエン（１００ｍｌ），ヒドロキノン（２．０ｇ），およびメタクリル酸（２１．５ｇ，０．２５ｍｏｌ）を、スターラー、コンデンサーおよびディーンスター（Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒ）トラップを有する５００ｍＬの反応フラスコに加えた。メタンスルホン酸（１４．４ｇ，０．１５ｍｏｌ）をゆっくりと加え、混合物を加熱して還流した。反応の理論水を共沸的に捕集した後、溶液を室温に冷却した。混合物は、その後、２５ｗｔ％の水酸化ナトリウム水溶液で中和し、有機相を１０％のブライン溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶液をろ過し、ろ液を活性炭および塩基性アルミナでさらに処理した。得られた溶液を真空下で除去して、無色の油が７３％の収率で得られた。1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ：６．１０（ｓ，２Ｈ），５．５６（ｓ，２Ｈ），４．２５（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，４Ｈ），２．７８（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，４Ｈ），２．３９（ｓ，３Ｈ），１．９４（ｓ，６Ｈ）。
【０１１２】
＜Ｎ−メチル−Ｎ−ジ（２−メタクリロイルオキシ−エチル）−Ｎ−１−（ｔ−ブチロイルオキシカルボニルメチル）アンモニウムブロマイド（２）＞  化合物（１）（１２．７５ｇ，５０ｍｍｏｌ），ｔ−ブチルブロモアセテート（１１．７０ｇ，６０ｍｍｏｌ），アセトニトリル（１００ｍｌ）を、窒素充填されたフラスコ内で混合した。混合物は、６０℃で２日間攪拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣をエーテルで洗浄し、乾燥して白色固体を９０％の収率で得た。1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ：６．１５（ｓ，２Ｈ），５．６７（ｓ，２Ｈ），４．８０（ｓ，２Ｈ），４．７３（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，４Ｈ），４．４７（ｍ，４Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），１．９５（ｓ，６Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ）。
【０１１３】
＜１−カルボキシ−Ｎ−メチル−Ｎ−ジ（２−メタクリロイルオキシ−エチル）メタンアミニウム分子内塩（３）（ＣＢＭＡＸ）＞  トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ，３０ｍｌ）を含むジクロロメタン（１２０ｍｌ）中で２日間、室温で処理して、化合物（２）のｔ−ブチルエステル部分（１３．５ｇ，３０ｍｍｏｌ）を除去した。溶媒を真空下で除去し、アセトニトリル（１２０ｍｌ）で置換した。イオン交換樹脂（ＩＲＡ４００  ＯＨ型）の上で溶媒を中和し、次いで、濃縮し、エタノール中で沈殿させ、最後に真空乾燥して、定量的収率で白色固体を得た。1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ：６．０５（ｓ，２Ｈ），５．６６（ｓ，２Ｈ），４．５６（ｔ，４Ｈ），４．２０（ｍ，２Ｈ），３．９５（ｍ，４Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），１．８３（ｓ，６Ｈ）。
【０１１４】
＜１−カルボキシ−Ｎ−トリ（２−メタクリロイルオキシ−エチル）メタンアミニウム分子内塩（４）（ＣＢＭＡ３Ｘ）＞  化合物４は、ＣＢＭＡＸの場合と同様の方法を用いて、トリエタノールアミンとメタクリル酸とからＮ−トリ（エタノールアミンメタクリレート）を得、次いで、ｔ−ブチルブロモアセテートと反応させて、Ｎ−トリ（２−メタクリロイルオキシ−エチル）−Ｎ−１−（ｔ−ブチルオキシカルボニルメチル）アンモニウムブロマイドを得た。ｔ−ブチルエステル部分の除去後、白色固体として化合物４を得た。1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ：６．０７（ｓ，３Ｈ），５．７０（ｓ，３Ｈ），４．６０（ｔ，６Ｈ），４．２０（ｔ，６Ｈ），４．０４（ｓ，２Ｈ），１．８５（ｓ，９Ｈ）。
【０１１５】
＜例２＞
＜代表的な双性イオン架橋ヒドロゲル：ＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸの合成および特性＞
この例においては、本発明の代表的な双性イオン架橋ヒドロゲルＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸの合成を説明する。双性イオンＣＢＭＡＸ架橋したヒドロゲル（ＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸ）の特性は、双性イオンＭＢＡＡ架橋したヒドロゲル（ＣＢＭＡ／ＭＢＡＡ）と比較した。
【０１１６】
２−カルボキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２’−（メタクリロイルオキシ）エチル）エタンアミニウム分子内塩（カルボキシベタインメタクリレート、ＣＢＭＡ）は、Ｚｈａｎｇ  Ｚ，Ｃｈａｏ  Ｔ，Ｃｈｅｎ  Ｓ，Ｊｉａｎｇ  Ｓに述べられているように合成した。ガラススライド上に、超低のファウリングスルホベタインおよびカルボキシベタインポリマー。Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２００６；２２（２４）：１００７２−１００７７。
【０１１７】
＜ヒドロゲル合成＞
モノマー溶液は、１ＭのＮａＣｌ中で６５重量％のモノマーの濃度に調製した。これらの溶液に、架橋剤（Ｎ’，Ｎ’−メチレンビス（アクリルアミド）（ＭＢＡＡ）またはＣＢＭＡＸ（例１で述べたように調製された）を、２〜２３％（モノマーのモルパーセント）の範囲の量で加えた。上述のＣＢＭＡＸ処方は、モノマーと架橋剤との一定の総量を維持し、それらの相対モル量を調整することによって７５％まで調製した。１００％のＣＢＭＡＸは、１ＭのＮａＣｌに所望量のＣＢＭＡＸを溶解することによって単純に調製した。溶液は、超音波処理により混合した。いくつかの場合（上述の約１０％ＭＢＡＡ）において、架橋剤は、完全には溶解しなかった。過硫酸アンモニウムの４０％溶液および１５％のメタ亜硫酸水素ナトリウムを溶液に加えて、重合を開始した。溶液は、０．５または２ｍｍ厚のポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）スペーサーで隔てられたガラス製の顕微鏡スライドの間で６０℃で重合させた。ゲルは、その後、スライドから取り除き、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に浸漬して水和させた。この水和水は５日間絶えず取り換えて、未反応の化学物質および過剰の塩を除去した。バイオプシーパンチを用いて、水和されたヒドロゲルを直径５ｍｍの薄い円盤状に抜いた。１部のエタノール、１．５部のエチレングリコール、および１．５部の水を含有する１．５ｍｌ中の混合溶媒に、０．７８ｍｌのＨＥＭＡモノマーを混合することによって、ＨＥＭＡヒドロゲルを調製した。架橋剤テトラエチレングリコールジメタクリレート（ＴＥＧＤＭＡ）を、次いで加え（６０μｌ）、得られた溶液を超音波処理してよく混合した。最後に、２４μｌの４０％過硫酸アンモニウムおよび７．５μｌのＴＥＭＥＤを加えた。このヒドロゲルは、上述したように形成された。
【０１１８】
＜ヒドロゲルの膨潤特性＞
ヒドロゲルは、ＰＢＳ中で５日間、平衡状態まで膨潤させた。直径０．５ｃｍの円盤は、０．５ｍｍ厚さの膨潤したゲルキャストから切り出した。円盤は、秤量した後、５０℃、３０インチＨｇの真空下で３日間脱水した。乾燥したヒドロゲルの円盤は、ノギスを用いて測定し秤量した。膨潤したヒドロゲルにおけるポリマーの体積分率（Φ）は下記式で与えられる。
【数１】
2013510179.tif 000017
【０１１９】
ここで、Ｄ0およびＤは、それぞれ、乾燥および膨潤した円盤の直径である。緩和された（非膨潤）ヒドロゲルにおけるポリマーの体積分率φ0は、モノマー／架橋剤溶液から決定される。溶液の体積を、加えられた水の体積と比較する。体積における違いは、モノマーの体積として受け止められ、これは、重合後のポリマーの体積に相当する。
【０１２０】
平衡含水量の値は、以下のように定義される。
【数２】
2013510179.tif 000018
【０１２１】
ここで、ｍwは湿潤ヒドロゲルの質量であり、ｍdは乾燥ヒドロゲルの質量である。全てのサンプルは３回測定した。
【０１２２】
＜酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により評価されたタンパク質吸着＞
フィブリノーゲン吸着を測定するために、直径０．５ｃｍのヒドロゲル円盤（キャストした際に０．５ｍｍ厚）を、ウェルプレート中の１ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲンで室温で１５分間培養し、次いで、ＰＢＳ緩衝液で４時間かけて洗浄した。ヒドロゲルは、その後、最後のＰＢＳ洗浄液から取り出し、新しいウェルに移した。それらは、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）接合した抗フィブリノーゲンを含むＰＢＳの１：５００希釈で１０分間、次いで培養した後、同様の緩衝液でさらに５回洗浄した。ヒドロゲルは、その後、ＰＢＳ緩衝液で４時間、繰り返し洗浄し、最後の洗浄液から取り出して新しいウェルに移した。最後に、１ｍｇ／ｍｌのｏ−フェニレンジアミンハイドロクロライド（ＯＰＤ）を含む０．１Ｍのリン酸クエン酸塩緩衝液、これはｐＨ５．０で０．０３％の過酸化水素を含有する、を５００μｌ、それぞれのヒドロゲルに３０秒間隔で加えた。サンプルは、ＯＰＤ溶液中で光を避けて３０分間培養した。上澄みは、それぞれのヒドロゲル円盤から取り出してキュベットに移し、４９２ｎｍにおけるその吸光度を測定した。全てのサンプルは、３回測定した。
【０１２３】
＜ヒドロゲルへの細胞吸着＞
直径０．５ｃｍ（キャスト時に０．５ｍｍ厚）の３つのヒドロゲル円盤を、５００μｌのＰＢＳ溶液とともに４８−ウェルプレートのウェル内にそれぞれ配置した。ヒドロゲルを滅菌するために、それらは、ＵＶ光を３０分間照射し、１ｘペニシリン−ストレプトマイシンを含むＰＢＳ中で一晩冷凍した。ＣＯＳ−７細胞（ｐ＝７）は、補充されたダルベッコ変法イーグル培地中１０4ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で、ヒドロゲルの上にまいた。細胞は、３７℃、５％ＣＯ2、１００％湿度で７２時間成長させ、その後、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００−Ｕ顕微鏡により倍率１０Ｘでヒドロゲルを撮影した。ヒドロゲルの表面における５つの所定の領域で写真撮影し、ヒドロゲルの処方当たり合計で１５画像について、それぞれの画像からの付着細胞の数を合計して、ｐＨＥＭＡヒドロゲルに吸着した細胞の数で規格化した。
【０１２４】
＜ＥＤＣ／スルホＮＨＳケミストリーによって機能付与されたＲＧＤ＞
ＣＢＭＡ／ＭＢＡＡおよびＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸのゲルは、ｃＲＧＤで機能付与した。直径０．５ｃｍ（キャスト時０．５ｍｍ厚）の３つの薄い円盤状のヒドロゲルを、２４−ウェルプレートのウェル内に配置した。それぞれの処方の全てのゲルは、２つのグループに分けた。それぞれのグループのゲルは同じウェル内に配置し、それぞれのヒドロゲルの表面が覆われないことを確保するよう配慮した。ヒドロゲルは、５００μｌのＭＥＳ緩衝溶液（ｐＨ＝５．５，１０ｍＭ  ＭＥＳ，１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中で一晩培養した。ＭＥＳは、その後、各処方の１つのグループから取り出し、５ｍＭのスルホＮＨＳおよび１００ｍＭのＥＤＣを含有するＭＥＳベースの緩衝溶液５００μｌで、室温で２時間置換して、表面を活性化した。対照として、それぞれの処方の第２のグループは、５ｍＭのスルホＮＨＳのＭＥＳベースの緩衝溶液で、同じ時間培養した。ＥＤＣ／スルホＮＨＳ溶液およびスルホＮＨＳ溶液は、その後、ウェルから取り出し、ヒドロゲル円盤をＭＥＳ緩衝液で３回洗浄した。全てのウェルに、１．４ｍＭのｃＲＧＤを含有するＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ＝９，５０ｍＭ  ＣＨＥＳ，１００ｍＭ  ＮａＣｌ）をさらに５００μｌ加え、室温で反応を進行させた。３時間後、ヒドロゲルをＰＢＥで３回洗浄した。洗浄１回当たり１０分とした。最後に、機能付与された表面が上向きでとどまるよう留意して、ヒドロゲルを４８ウェルポリスチレン組織培養プレートの個々のウェルに移した。ヒドロゲルは、ペニシリン−ストレプトマイシンで上述のように滅菌し、細胞接着も、上述したように翌日行なった。
【０１２５】
＜ヒドロゲルの機械的強度＞
各処方の少なくとも５つの直径０．５ｃｍの円盤（キャスト時２ｍｍ厚）は、１０Ｎロードセルを有するＩｎｓｔｒｏｎ  ５５４３Ａメカニカル試験機（Ｉｎｓｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．，ノーウッド，ＭＡ）を用いて１ｍｍ／ｍｉｎの速度で破壊まで圧縮した。ヤング率は、初期の１０％歪みから算出した。
【０１２６】
＜ＣＢＭＡヒドロゲルの物理的特性の計算＞
ヒドロゲルの水和特性（膨潤および緩和した体積分率）および応力−歪み曲線は、異なる２−ａｒｍ  ＣＢＭＡＸ−およびＭＢＡＡ−架橋したヒドロゲル処方の架橋剤密度およびメッシュサイズを計算するために用いることができる。ヒドロゲルの架橋剤密度（νe／Ｖ）を計算するために、以下の式を用いた。
【数３】
2013510179.tif 000019
【０１２７】
ここで、τsは、Ｐａのユニット内の特定の歪みにおける応力であり、αは変形率、または圧縮下での架橋したヒドロゲルの初期長さに対する変形した長さの比である。Ｒは、一般的な気体定数であり、Ｔは絶対温度、φ2は、平衡（完全に膨潤したヒドロゲル）におけるポリマーの体積分率であり、φ0は、緩和状態（非膨潤であるが、水和していないヒドロゲル）の状態のポリマーの体積分率である。（α−α-2）に対するτsのプロットは、低い歪みにおいて直線状であり、架橋剤密度（νe／Ｖ）は、傾き（νe／Ｖ）（ＲＴ）（φ2／φ0）-2から抽出される。
【０１２８】
モルにおける架橋結合密度／単位体積は、等式（４）を用いて、架橋結合の間の距離またはメッシュサイズに変換することができる。
【数４】
2013510179.tif 000020
【０１２９】
ここで、ＮAはアボガドロ数である。等式（４）は、モル／体積をモル当たりの体積に逆にし、モルを架橋結合の数に変換し、立方根をとって架橋結合当たりの距離を得る。この値は、事実上、ヒドロゲルの細孔サイズである。
【０１３０】
＜例３＞
<光重合により合成された代表的な双性イオン架橋ヒドロゲル：ＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸの合成および特性>
この例においては、光重合により合成された、本発明の代表的な双性イオン架橋ヒドロゲルＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸの合成を説明する。
【０１３１】
＜ＣＢベースヒドロゲルの合成＞
モノマーおよび架橋剤の溶液を、４７重量％の重合性材料を用いて、１ＭのＮａＣｌ中に調製した。架橋剤（ＣＢＭＡＸ）は、モノマー（ＣＢＭＡ）の２〜８０モル％の範囲の量で含有させた。１００％ＣＢＭＡＸのための溶液は、４７ｗｔ％ＣＢＭＡＸを用いて、１ＭのＮａＣｌに所望の量のＣＢＭＡＸを溶解させることにより調製した。全ての溶液は、氷水中で超音波処理することによって混合した。１％（ｗｔ／ｗｔ）の光開始剤、２−ヒドロキシ−２−メチル−１−フェニル−１−プロパンをそれぞれの溶液に加え、氷水中での超音波処理を用いて溶液を完全に混合した。溶液は、１ｍｍ厚のポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）スペーサーで隔てられたガラス製の顕微鏡スライドの間で、両側から３０分間の３６５ｎｍのＵＶ照射によって重合させた。ゲルは、その後、スライドから取り出してＰＢＳ中に浸漬して水和させた。この水和水は、５日間絶えず取り換えて、未反応の化学物質および過剰の塩を除去した。バイオプシーパンチを用いて、水和したヒドロゲルを直径５ｍｍの円盤に抜いた。
【０１３２】
＜ヒドロゲルの水和特性＞
膨潤したヒドロゲルは、ＰＢＳ中で５日間平衡にした。０．５ｃｍ円盤は、完全に水和したヒドロゲルスラブから切り取って秤量した。円盤は、その後、真空オーブン中、４５℃、３０インチＨｇ真空で３日間脱水した。膨潤比は、乾燥ヒドロゲル重量に対する膨潤ヒドロゲル重量の比から決定し、各円盤の平衡含水量（ＥＷＣ）は、ＷＣ＝１００（％）＊（ｍw−ｍd）／ｍw、ここでｍwは湿潤ヒドロゲルの質量であり、ｍdは乾燥ヒドロゲルの質量である、として決定した。全てのサンプルは３回測定した。異なるＣＢＭＡＸ含有量のＣＢＭＡ−ＣＢＭＡＸヒドロゲルについて、ＥＷＣ値を図７に示す。ゲルの架橋が進むと、ＥＷＣは、５０モル％を超えるＣＢＭＡＸを含有するゲルについて約５１％の定常値に達するまで減少する。
【０１３３】
＜ヒドロゲルの圧縮特性＞
０．５ｃｍ直径（キャスト時に１ｍｍ厚）の少なくとも３つの円盤は、１０Ｎロードセルを有するＩｎｓｔｒｏｎ  ５５４３Ａメカニカル試験機（Ｉｎｓｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．，ノーウッド，ＭＡ）を用いて１ｍｍ／ｍｉｎの速度で破壊まで圧縮した。ヤング率は、初期の１０％歪みから算出した。図８および９は、異なるＣＢＭＡＸ取り込みを有するＣＢＭＡ−ＣＢＭＡＸヒドロゲルの、圧縮強度および圧縮弾性率をそれぞれ示す。ゲルの圧縮の強度および弾性率は、架橋剤含有量が増加するにつれて上昇する。弾性率における傾向は、熱的な開始によって合成されたヒドロゲルの場合と同じであるが、値には１０倍の増加がある。熱的に重合したヒドロゲルについての減少した弾性率の値は、ゲル全域の不均質性が原因であるとすることができ、これはイニシエーションの間の熱移動の制限の結果である。一部の不均質性は、機械的特性に逆の影響を及ぼすであろう。光重合したゲルについての弾性率における増加のための別の説明は、光開始剤の溶解性が原因であるとすることができる。光開始剤は、熱開始剤より水溶性が低く、より少ないポリマー鎖がイニシエートされるであろう。これは、より長いポリマー鎖に翻訳し、ヒドロゲル中のより多くの架橋結合を有するものと同じである。
【０１３４】
＜ヒドロゲルの細胞毒性および内毒素性の試験＞
光重合したＣＢＭＡＸ架橋のＣＢＭＡヒドロゲルは試験して、細胞毒性の化学物質またはエンドトキシン汚染物のいずれも含まないことを保証した。生体内の移植のために調製された材料はエンドトキシンを含まないべきであり、これは、グラム陰性菌の細胞壁からの細菌の残留物である。体外の細菌の残留物は重要でないものであるが、材料に対する異物応答を高め得る免疫応答を体外で誘発可能であり、体外試験の結果を複雑にする。
【０１３５】
細胞毒性について試験するために、完全に水和したヒドロゲルの円盤を、補充された成長培地（８９％のダルベッコ変法イーグル培地、１０％のウシ胎児血清、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、および１ｘの非必須アミノ酸）中に２４時間浸漬し、すぐに培地をヒドロゲルから取り出して、ＣＯＳ−７細胞の培養に用いた。これは、新鮮な補充された培地中で事前に２４時間、平板培地で成長したものである。細胞は、その後、ヒドロゲル注入で補充された培地で、さらに４８時間培養し、細胞の増殖および健康状態の指標として、そのモルフォルジーを分析した。ヒドロゲル注入で補充された培地で、または新鮮な培地参照のいずれで培養されても、全ての細胞集団は、同等の増殖および健康状態の程度を示した。
【０１３６】
エンドトキシン汚染について試験するために、カブトガニ血球抽出成分（ＬＡＬ）エンドトキシン試験を、標準手順にしたがって行なった。サンプルは、ＬＡＬを含まない水で数日間抽出し、水は、次いで、約０．０６ＥＵ／ｍｌ（Ｌｏｎｚａ）を超えるエンドトキシンを検出する感度を有する酵素測定法を用いて、エンドトキシンの存在下で試験した。この検出限界の濃度のエンドトキシンの存在において、酵素測定法溶液は、それ自体が架橋してゲルを形成したが、この濃度より低いエンドトキシンレベルにおいては、ゲル化は生じないであろう。標準は、サンプルと一緒に試験して結果を確認した。ゲル化測定法は、試験された全てのヒドロゲルがエンドトキシンを含まないことを明らかにした。
【０１３７】
＜例４＞
＜光重合により合成され、架橋剤勾配を有する代表的な双性イオン架橋ヒドロゲル：ＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸの合成および性質＞
この例においては、光重合により合成され、架橋剤勾配を有する本発明の代表的な双性イオン架橋ヒドロゲルＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸの合成および性質を説明する。
【０１３８】
＜ヒドロゲル合成＞
モノマー（ＣＢＭＡ）溶液は、１ＭのＮａＣｌ中に６５ｗｔ％の濃度で調製した。この溶液は、超音波処理して混合し、冷凍した。上述で用いられたものと同様の光開始剤をモノマー溶液に加え、モノマー−開始剤溶液を、２ｍｍ厚のポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）スペーサーで隔てられた２枚の顕微鏡スライドの間にそのままで仕込んだ。次に、架橋剤（ＣＢＡＭＸ）の６５ｗｔ％溶液を同様に調製し、同様に超音波処理して冷凍した。この溶液をモノマー溶液に注意深く加えて、その後、顕微鏡スライド器具の中に仕込んだ。異なる溶液密度に起因して、拡散が架橋剤勾配を作り出す前に、架橋剤溶液は器具の底へ沈むように見えた。この現象の目視観察は、架橋剤中の微量の着色物質により可能とされた。このプロセスは、図１０に示した。最後に、拡散が溶液を均質にする前であるが、長波長ＵＶ光により３０分間重合を開始し、その後、ガラススライドからヒドロゲルを取り除き、ＰＢＳ中で５日間水和させた。
【０１３９】
＜勾配分析＞
勾配を有するヒドロゲルの架橋剤プロファイルは、ヒドロゲルスラブの長さに沿った平衡含水量の測定から定量した。５ｍｍ円盤は、ゲルの縁に沿った近接する部分から切り出し、架橋剤濃度のより高い領域（より濃く着色された、図１０参照）から、架橋剤濃度のより低い領域である。円盤は秤量し、５０℃、３０インチＨｇ真空で３日間徹底的に脱水し、再度秤量した。各円盤の平衡含水量は、ＥＷＣ＝１００（％）＊（ｍw−ｍd）／ｍw、ここでｍwは、湿潤ヒドロゲルの質量であり、ｍdは乾燥ヒドロゲルの質量である、として決定した。
【０１４０】
＜ヒドロゲル特性評価＞
異なるＣＢＭＡＳ濃度、２％ＣＢＭＡＸから１００％ＣＢＭＡＸの範囲、を有するＣＢＭＡヒドロゲルについて平衡含水量を、前もって測定した。この実証された関係を用いると、同じＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸヒドロゲル上の異なる位置で測定された平衡含水量を、それぞれの特定の位置におけるＣＢＭＡＸ含有量に換算することができる。さらに、前述の章において行なわれた物理的および機械的特性の広範な特性評価からの結果を用いると、架橋剤含有量プロファイルは、その対応する機械的（圧縮）弾性率、メッシュサイズ、および架橋剤密度（図１１〜１４）と相関がある。
【０１４１】
＜勾配を有するヒドロゲル形成および分析＞
勾配を有するゲルは、上述したように形成された。架橋剤中に含まれる着色トレーサーに起因して、勾配は肉眼で見ることができる（図１５）。平衡含水量は、図１１に示される関係を用いて架橋剤含有量に換算した。最も高い架橋剤エッジで始まるゲルに沿った距離の関数として、架橋剤含有量を図１６に示す。約１００％〜３０％の範囲の架橋剤含有量は、中間の領域内で極めて均一な勾配を有し、一方の端においてより高い架橋剤濃度を有する単一物質の成功した構造を示す。
【０１４２】
ヒドロゲルは、多種多様で空間的に制御された特性を伴なって形成される。架橋剤含有量は、約１００％〜３０％の範囲であり、中間の領域内で極めて均一な勾配を有する。用いられる材料、ＣＢＭＡモノマーおよびＣＢＭＡ架橋剤、は同じ主鎖および側鎖を有するので、ヒドロゲル全体としては実質的に単一物質で構成される。このように、含水量、架橋剤密度、およびメッシュサイズにおける勾配は、非ファウリングおよび機能付与性のようなある種の所望の特性の連続性を損なわなかった。
【０１４３】
ヒドロゲルは単一物質から作製され、架橋結合の均一な勾配と、対応する物理的、機械的および水和特性とを示す。モノマーと架橋剤とは、１または２のメタクリレート基によってのみ互いに異なり、こうして、全体の構造は単に双性イオンカルボキシベタインおよびメタクリレートからなる。すなわち、勾配は、メタクリレート対双性イオン比の漸進的な増加によって形成される。１００％架橋剤（２：１のメタクリレート対双性イオン）においてさえ、ヒドロゲルは、非ファウリングｐＨＥＭＡヒドロゲルより９０％低い非特異的な細胞接着、および優れた機能付与を示す。このように、全体の勾配に沿って、機械的強度ならびに架橋剤密度の減少、および細孔サイズならびに水和作用の増加にもかかわらず、材料は、双性イオン性および機能付与性を維持して、ゲル制御可能な生理活性を与える。
【０１４４】
＜例５＞
＜グルコースバイオセンサーのための双性イオンポリ(カルボキシベタイン)ヒドロゲル＞
この例においては、グルコースイオンセンサーにおける本発明の代表的な双性イオン架橋ヒドロゲルＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸの使用を述べる。
【０１４５】
＜ポリＣＢＭＡヒドロゲルの合成＞  ＣＢＭＡモノマーは、まず水と混合し、溶液を１分間超音波処理してモノマーを溶解した。ＣＢＭＡＸを上述の溶液に加え、０℃で１分間、混合物を超音波処理して溶解を完結させた。ＣＢＭＡとＣＢＭＡＸとのモル比は、１０００：１，１００：１，１０：１，および５：１であり、ＣＢＭＡの最終的な濃度は１０Ｍであった。１％（ｗ／ｗ）光開始剤（Ｂｅｎａｃｕｒｅ  １１７３）を加え、溶液を０℃で混合した。溶液を、０．４ｍｍのＰＴＦＥスペーサーで隔てられた一対のガラス板の中に移した。３６５ｎｍＵＶ光のもと、室温で３０分間光重合反応を行なって、ヒドロゲルを重合させた。その後、ヒドロゲルをプレートから取り除き、大量のＰＢＳ中に浸漬した。ＰＢＳは、５日間絶えず取り換えて、さらなる使用前に残留する化学物質を除去した。
【０１４６】
＜ヒドロゲルの機械的および細胞接着特性の分析＞  ヒドロゲルは、ＰＢＳ緩衝液中で５日間、平衡状態になるまで膨潤させた。平衡になったヒドロゲルは、次いで、５ｍｍの直径を有する円盤に抜いた。円盤を秤量した後、５０℃、３０インチＨｇ真空における真空のもとで３日間脱水した。膨潤比は、乾燥ヒドロゲルの重量に対する膨潤ヒドロゲルの重量の比によって決定し、平衡含水量の値は上述したように決定した。全てのサンプルは、３回測定した。図１７に示されるように、最も高い含水量は、０．１％ＣＢＭＡＸヒドロゲルについて得られ、これは９４．１９±０．２６％である。ＣＢＭＡＸモル比が大きくなると、含水量は減少する。
【０１４７】
５ｍｍ直径の３つのヒドロゲル円盤（キャスト時０．５ｍｍ）を、５００μＬのＰＢＳ溶液とともに４８ウェルプレートのウェル内にそれぞれ配置した。ヒドロゲルを滅菌するために、１ｘペニシリン−ストレプトマイシンを含むＰＢＳ中で、それらを一晩冷凍した。ＣＯＳ−７細胞（ｐ＝７）は、補充されたＤＭＥＭ中１ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度でヒドロゲルの上にまいた。細胞は、３７℃、５％ＣＯ2、および１００％湿度で７２時間成長させ、その後、ヒドロゲルは１０×倍率のＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００−Ｕ顕微鏡で写真撮影した。ヒドロゲルの表面の５つの所定の領域で、ヒドロゲル処方当たり合計１５の写真撮影を行なった。ＧＯx固定化の前後において、異なるＣＢＭＡＸモル比ポリＣＢＭＡヒドロゲルの表面への細胞結合の違いを、図１８Ａ〜図１８Ｈに定量的に示す。１０％ＣＢＭＡＸを除く全てのポリＣＢＭＡヒドロゲルは、ＧＯｘ固定化の前後の細胞吸着に高い抵抗を有する。すなわち、非常に低い量の表面への細胞接着があった。
【０１４８】
＜ポリＣＢＭＡヒドロゲル被覆されたグルコースセンサーの合成＞  グルコースセンサーは、コイル型の移植可能なセンサーに基づく。コイル型の移植可能なセンサーは、４０〜５０ｍｍの長さの白金ワイヤの上部１０ｍｍを、２５ゲージのニードルに沿って巻き付け、コイル状のシリンダーを形成した。ポリｐＣＢＭＡヒドロゲルの接着を改善するために、１０％（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレートおよび０．５％の水をトルエン中に含む溶液を用いて、８０℃でコイルの表面に機能付与した。グルコースセンサー先端へのヒドロゲルコーティングの形成のために、１．２μＬの混合溶液（ＣＢＭＡ、ＣＢＭＡＸ、および開始剤とともに水）をセンサーの先端にピペットで加えた。溶液は、先端の表面にわたって均一に広がった。２５４ｎｍのＵＶ光への３０分間の露出の後、センサー（Ｐｔ／ＣＢＭＡ／ＧＯｘと称される）は、さらなる使用までＰＢＳ中に保管した。
【０１４９】
＜ＮＨＳ／ＥＤＣケミストリーによる酵素固定化＞  ポリｐＣＢＡＡヒドロゲルのカルボキシル基は、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム（５ｍＭ）およびＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）（１００ｍＭ）を含有する１０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ  ５．５，１００ｍＭ  ＮａＣｌ）の新たに調製された溶液の導入により、２５℃で２時間活性化した。その後、センサーを取り除いて、大量の上述のＭＥＳ緩衝液中に２時間浸漬した。ＭＥＳ緩衝液は、数回交換して、残留する化学物質を除去した。センサーは、ＭＥＳ緩衝液中グルコースオキシダーゼ（ＧＯx）（１０ｍｇ／ｍＬ）を含む新たに調製された溶液中に４℃で４時間、次いで、ＰＢＳ緩衝液にグルコースオキシダーゼ（ＧＯx）（１ｍｇ／ｍＬ）を含む新たに調製された溶液中に４℃で２時間、浸漬した。さらなるグルコース試験の前、センサーは、大量のＰＢＳ中に浸漬して、全ての不安定な結合を除去した。
【０１５０】
＜生体外のセンサー評価＞  センサーの生体外性能をグルコースＰＢＳ溶液中で観察して、センサーの感度および線形範囲を決定した。Ｐｔ／ＣＢＭＡ／ＧＯｘセンサーの感度は、まず、４および２ｍＭのグルコースＰＢＳ溶液を用いて測定した。ＰＢＳの基本電流とサンプル中のグルコースの定常安定電流との間の差を用いて、検定グラフを得た。その後、１００％のヒト血清中に分散されたグルコース溶液で、センサーを試験した。長期間にわたるセンサー評価のために、センサーは、異なる培養日数での次の試験の前に、４℃の１００％ヒト血清中に浸漬した。血清サンプル中でのグルコースを測定するとき、基本電流は血清中でとられ、次いで、センサーをサンプル内に移して定常安定電流を得る。全ての実験は室温で行ない、全ての溶液は測定の間、攪拌した。電流測定は、＋０．７５Ｖｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌおよび白金ワイヤカウンター電極で、室温で行なった。異なるＣＢＭＡＸモル比のポリＣＢＭＡヒドロゲルで被覆されたグルコースセンサーの電流応答を、ＰＢＳ中におけるグルコース濃度の関数として、図１９Ａ〜図１９Ｄに比較する。全てのセンサーは、非常に高い安定性、およびＰＢＳ中における電流応答を示す。さらに、それらの応答は遅延せず、４〜２０ｍＭの範囲にわたって優れた線形性を有する。異なるＣＢＭＡＸモル比のポリＣＢＭＡヒドロゲルで被覆されたグルコースセンサーの電流応答を、１００％血清中におけるグルコース濃度の関数として、図２０Ａ〜２０Ｄに比較する。０．１％ＣＢＭＡＸモル比のポリＣＢＭＡヒドロゲルで被覆されたセンサーは、１０日を越えて血清に曝した後においても感度および線形性に低下はみられないが、一方、他のセンサーは良好に行なうことができない。結果は、ポリＣＢＭＡヒドロゲルコーティングの添加が、移植されたグルコースセンサーの長期間にわたる性能を改善することを示唆する。
【０１５１】
＜例６＞
＜金ナノ粒子のための双性イオンポリ（カルボキシベタイン）ヒドロゲル＞
この例においては、グルコースバイオセンサーにおける本発明の代表的な双性イオン架橋ヒドロゲルＣＢＭＡ／ＣＢＭＡＸの使用を述べる。
【０１５２】
＜イニシエーター修飾された金ナノ粒子の合成（ＧＮＰｓ）＞  アイザー（ｅｉｔｈｅｒ）ＨＡｕＣｌ4（３０ｍＬ）の５ｍＭ水溶液を、トルエン（８０ｍＬ）中に４ｍＭのテトラオクチルブロマイド（ＴＯＡＢ）を含有する溶液に、１０分間攪拌しつつ加えた。その後、ＮａＢＨ4（０．４Ｍ，２５ｍＬ）水溶液を激しく攪拌しつつ、この溶液に滴下して加えた。暗橙溶液は、数分の間に赤色に変わり、攪拌を３時間続けて、反応が完了したことを確かめた。その後、２つの相を分離し、有機相を０．１ＭのＨ2ＳＯ4、０．１ＭのＮａＯＨ、および水で引き続いて洗浄した（それぞれ３回）。その後、イニシエーター、２７４．２ｍｇの１１−メルカプトウンデシル２−ブロモイソブチレート（Ｂｒ(ＣＨ3)2ＣＯＯ(ＣＨ2)11ＳＨ）（０．８０８ｍｍｏｌ，１ｍＬのトルエンに溶解させた）を、滴下の方法により１５分間で溶液に加えた。反応は、一晩、進行させた。メタノール（６０ｍＬ）を系に加えて、Ａｕ−ＮＰｓを沈殿させた。沈殿物を回収し、トルエン中で再分散させ、エタノール中に再沈させた。この沈殿および再分散のサイクルは、純粋なＡｕ−ＮＰｓ（すなわち、反応副生成物を含まない）が得られる前に２回繰り返した。ＮＰｓは、凝集することなくアセトン中によく分散して、Ａｕ−ＮＰｓの平均直径は約５ｎｍであった。
【０１５３】
＜ＡＴＲＰ（ＣＡ−ＧＮＰｓ）を介したＣＢＭＡ被覆されたＧＮＰｓの製造＞  ３００ｍｇのＣＢＭＡモノマー、６１．７０ｍｇの２，２−ビピリジン、および２８．５３ｍｇの臭化銅（Ｉ）を、窒素雰囲気下、３ｍｌの脱泡したアセトンおよび０．５ｍｌのメタノールに加えた。１ｍＬのイニシエーター修飾されたＧＮＰｓ溶液は、上述の溶液と混合する前に窒素でバブリングすることによって脱酸素化した。最終混合物は、室温で２時間攪拌した（１００ｒｐｍ）。重合後、ＣＡ−ＧＮＰｓは、水中で遠心分離／再分散させることによって数回洗浄した。ＣＡ−ＮＰｓの平均直径は、水中で６９．８ｎｍであった。
【０１５４】
＜ＡＴＲＰ（ＯＡ−ＧＮＰｓ）を介したＯＥＧＭＡ被覆されたＧＮＰｓの製造＞  ４７．７ｍｇの臭化銅（Ｉ）、７．４３ｍｇの臭化銅（II）、および１０４ｍｇの２，２−ビピリジンを、窒素のもと、４ｍｌの脱泡したアセトンに溶解した。１ｍＬのイニシエーター修飾されたＧＮＰｓ溶液を、上述の溶液に加える前に、窒素でバブリングすることによって脱酸素化した。２ｇのマイクロモノマーＯＥＧＭＡが得られ、最終混合物は室温で６時間攪拌した。重合後、ＯＡ−ＧＮＰｓは、逆浸透水中で遠心分離／再分散させることによって数回洗浄した。ＰＡ−ＮＰｓの平均直径は、水中で７２．４ｎｍであった。
【０１５５】
＜ＥＧＤＭＡ架橋剤（ＯＣ−ＧＮＰｓ）を伴なったＡＴＲＰを介したＯＥＧＭＡ被覆されたＧＮＰｓの製造＞  ４７．７ｍｇの臭化銅（Ｉ）、７．４３ｍｇの臭化銅（II）、および１０４ｍｇの２，２−ビピリジンを、窒素下で４ｍｌの脱泡したアセトンに溶解させた。１ｍＬのイニシエーター修飾されたＧＮＰｓ溶液を、上述の溶液と直接混合する前に、窒素でバブリングすることによって脱酸素化した。２ｇのマイクロモノマーＯＥＧＭＡおよび１２６．４μＬのＥＧＤＭＡを加え、最終混合物を５０℃で６時間攪拌した。重合後、ＯＣ−ＧＮＰｓを逆浸透水中で遠心分離／再分散させることによって数回洗浄した。ＯＣ−ＮＰｓの平均直径は、水中で７１．９ｎｍであった。
【０１５６】
＜ＣＢＭＡＸ架橋剤（ＣＣ−ＧＮＰｓ）を伴なったＡＴＲＰを介したＣＢＭＡ被覆されたＧＮＰｓの製造＞  ３００ｍｇのＣＢＭＡモノマー、３．０ｍｇのＣＢＭＡＸ、６１．７ｍｇの２，２−ビピリジン、４．４ｍｇの臭化銅（II）、および２８．５３３ｍｇの臭化銅（Ｉ）を、窒素雰囲気下、３ｍｌの脱泡したアセトンおよび０．５ｍｌのメタノール中に溶解した。１ｍＬのイニシエーター修飾されたＧＮＰｓ溶液を、上述の溶液と直接混合する前に、窒素でバブリングすることによって脱酸素化した。最終混合物は、５０℃で６時間攪拌した。重合後、ＣＣＥ−ＧＮＰｓは、逆浸透水中で遠心分離／再分散させることによって数回洗浄した。ＣＣ−ＮＰｓの平均直径は、水中で８０ｎｍであった。
【０１５７】
＜ポリマー被覆されたＧＮＰｓの安定性試験＞  ポリマー被覆されたＧＮＰｓの安定性は、３７℃の１００％のヒトの血清中でさらに評価した。高いタンパク質濃度に起因して、これらのナノ粒子は、遠心分離によりヒト血清タンパク質から分離され、ＰＢＳ緩衝液中に再分散させた。ナノ粒子の平均直径は、その後、ＤＬＳにより３７℃で評価した。全ての溶液は、異なる培養時間における次の試験前に、３７℃の１００％のヒト血清と混合した。図２１に示されるように、ＯＡ−ＧＮＰｓは、非常に短い期間に約５０ｎｍのサイズ増加を示した。７２時間の最終時点において、直径は約１４０ｎｍに増加し、これは著しいタンパク質吸着および微粒子の凝集を示す。ＯＣ−ＧＮＰｓは、そのような極端な状況下では安定でないものの、ＥＧＤＭＡの添加は安定性の向上を助けた。直径の増加量は、６時間および７２時間の培養期間後、それぞれ６ｎｍおよび３０ｎｍであった。沈殿物は、上述の溶液中に観察することができた。しかしながら、ポリＣＢＡＡコーティングでの保護を伴なう３種類のＧＮＰｓ（ＣＡ−ＧＮＰｓ，ＣＣＥ−ＧＮＰｓ，およびＣＣＣ−ＧＮＰｓ）は、タンパク質とナノ粒子との間の相互作用は、凝集を全く引き起こさず、ヒト血清タンパク質からの分離後の粒子サイズは、血清のない場合とほぼ同等（７０ｎｍ，５０ｎｍおよび１０５．９ｎｍ）であり、その優れた安定性を示している。
【０１５８】
次に、ポリマー被覆されたナノ粒子を、非常に高い濃度でヒト血清と混合し、３７℃で培養した。ナノ粒子の平均直径は、その後、３７℃のＤＬＳにより評価した。図２２に示されるように、ＯＡ−ＧＮＰｓは、サイズにおける約２０ｎｍの増加を６時間後に示した。この値は、約７２時間後には２００ｎｍに増加し、これは、培養血清培地中でのタンパク質とのナノ粒子の相互作用に起因する。ここでも、ＥＧＤＭＡの添加は安定性を高めた。７２時間の培養期間後、直径の増加は７０ｎｍであった。しかしながら、ポリＣＢＭＡ被覆を伴なうと、全く凝集せず、３つのサンプルは全て、７２時間の試験期間の間に明らかなサイズ増加なしに優れた安定性を示した。
【０１５９】
説明的な実施形態を示して述べたが、種々の変更は、本発明の意図や範囲から逸脱しない中で行ない得ることが理解されるであろう。
【０１６０】
独占的属性または特権である本発明の実施形態は、以下に限定するように主張される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１８Ｇ】
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【図１８Ｈ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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