(57)【要約】Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドを含有する融合タンパク質が開示される。上記Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質は、全長Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドを含む場合もあり、全長Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドの細胞外ドメインの一部または全部を含めた、全長Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドの断片を含有する場合もある。また、上記融合タンパク質を用いてＴ細胞の活性化を下方制御するための方法、ならびに炎症性疾患および炎症性障害ならびに自己免疫疾患および自己免疫障害を処置するための方法も開示される。
2013503204.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第２のポリペプチドに直接的に融合するか、または該第２のポリペプチドに融合するリンカーペプチド配列またはリンカーポリペプチド配列を介して該第２のポリペプチドに間接的に融合するＢ７−Ｈ４ポリペプチドまたはその断片を含む第１の融合パートナーを含む融合タンパク質であって、該Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドまたはその断片が、配列番号６３のＩｇＶまたは配列番号６４のＩｇＶを含むか、または該Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質が、配列番号５７のＫＲＲＳ配列を欠く、融合タンパク質。
【請求項２】
前記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドが、ヒトＢ７−Ｈ４ポリペプチドまたはマウスＢ７−Ｈ４ポリペプチドである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドが、ヒトＢ７−Ｈ４の細胞外ドメイン、またはＢ７−Ｈ４結合活性を有するその断片を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドが、
配列番号４９もしくは配列番号５２の、３２−２４９、３２−２４８、３２−２４７、３２−２４６、３２−２４５、３２−２４４、３２−２４３、３２−２４２、３２−２４１、３１−２４９、３１−２４８、３１−２４７、３１−２４６、３１−２４５、３１−２４４、３１−２４３、３１−２４２、３１−２４１、３０−２４９、３０−２４８、３０−２４７、３０−２４６、３０−２４５、３０−２４４、３０−２４３、３０−２４２、３０−２４１、２９−２４９、２９−２４８、２９−２４７、２９−２４６、２９−２４５、２９−２４４、２９−２４３、２９−２４２、２９−２４１、２８−２４９、２８−２４８、２８−２４７、２８−２４６、２８−２４５、２８−２４４、２８−２４３、２８−２４２、２８−２４１、２７−２４９、２７−２４８、２７−２４７、２７−２４６、２７−２４５、２７−２４４、２７−２４３、２７−２４２、２７−２４１、２６−２４９、２６−２４８、２６−２４７、２６−２４６、２６−２４５、２６−２４４、２６−２４３、２６−２４２、２６−２４１、２５−２４９、２５−２４８、２５−２４７、２５−２４６、２５−２４５、２５−２４４、２５−２４３、２５−２４２、２５−２４１、２４−２４９、２４−２４８、２４−２４７、２４−２４６、２４−２４５、２４−２４４、２４−２４３、２４−２４２、２４−２４１、または
配列番号５０もしくは配列番号５３の、３２−２４５、３２−２４４、３２−２４３、３２−２４２、３２−２４１、３２−２４０、３２−２３９、３２−２３８、３２−２３７、３１−２４５、３１−２４４、３１−２４３、３１−２４２、３１−２４１、３１−２４０、３１−２３９、３１−２３８、３１−２３７、３０−２４５、３０−２４４、３０−２４３、３０−２４２、３０−２４１、３０−２４０、３０−２３９、３０−２３８、３０−２３７、２９−２４５、２９−２４４、２９−２４３、２９−２４２、２９−２４１、２９−２４０、２９−２３９、２９−２３８、２９−２３７、２８−２４５、２８−２４４、２８−２４３、２８−２４２、２８−２４１、２８−２４０、２８−２３９、２８−２３８、２８−２３７、２７−２４５、２７−２４４、２７−２４３、２７−２４２、２７−２４１、２７−２４０、２７−２３９、２７−２３８、２７−２３７、２６−２４５、２６−２４４、２６−２４３、２６−２４２、２６−２４１、２６−２４０、２６−２３９、２６−２３８、２６−２３７、２５−２４５、２５−２４４、２５−２４３、２５−２４２、２５−２４１、２５−２４０、２５−２３９、２５−２３８、２５−２３７、２４−２４５、２４−２４４、２４−２４３、２４−２４２、２４−２４１、２４−２４０、２４−２３９、２４−２３８、２４−２３７、または
配列番号５１もしくは配列番号５４の、３２−２５９、３２−２５８、３２−２５７、３２−２５６、３２−２５５、３２−２５４、３２−２５３、３２−２５２、３２−２５１、３１−２５９、３１−２５８、３１−２５７、３１−２５６、３１−２５５、３１−２５４、３１−２５３、３１−２５２、３１−２５１、３０−２５９、３０−２５８、３０−２５７、３０−２５６、３０−２５５、３０−２５４、３０−２５３、３０−２５２、３０−２５１、２９−２５９、２９−２５８、２９−２５７、２９−２５６、２９−２５５、２９−２５４、２９−２５３、２９−２５２、２９−２５１、２８−２５９、２８−２５８、２８−２５７、２８−２５６、２８−２５５、２８−２５４、２８−２５３、２８−２５２、２８−２５１、２７−２５９、２７−２５８、２７−２５７、２７−２５６、２７−２５５、２７−２５４、２７−２５３、２７−２５２、２７−２５１、２６−２５９、２６−２５８、２６−２５７、２６−２５６、２６−２５５、２６−２５４、２６−２５３、２６−２５２、２６−２５１、２５−２５９、２５−２５８、２５−２５７、２５−２５６、２５−２５５、２５−２５４、２５−２５３、２５−２５２、２５−２５１、２４−２５９、２４−２５８、２４−２５７、２４−２５６、２４−２５５、２４−２５４、２４−２５３、２４−２５２、２４−２５１、または
配列番号４３もしくは配列番号４６の、２４−２４１、２４−２４０、２４−２３９、２４−２３８、２４−２３７、２４−２３６、２４−２３５、２４−２３４、２４−２３３、２３−２４１、２３−２４０、２３−２３９、２３−２３８、２３−２３７、２３−２３６、２３−２３５、２３−２３４、２３−２３３、２２−２４１、２２−２４０、２２−２３９、２２−２３８、２２−２３７、２２−２３６、２２−２３５、２２−２３４、２２−２３３、２１−２４１、２１−２４０、２１−２３９、２１−２３８、２１−２３７、２１−２３６、２１−２３５、２１−２３４、２１−２３３、２０−２４１、２０−２４０、２０−２３９、２０−２３８、２０−２３７、２０−２３６、２０−２３５、２０−２３４、２０−２３３、１９−２４１、１９−２４０、１９−２３９、１９−２３８、１９−２３７、１９−２３６、１９−２３５、１９−２３４、１９−２３３、１８−２４１、１８−２４０、１８−２３９、１８−２３８、１８−２３７、１８−２３６、１８−２３５、１８−２３４、１８−２３３、１７−２４１、１７−２４０、１７−２３９、１７−２３８、１７−２３７、１７−２３６、１７−２３５、１７−２３４、１７−２３３、１６−２４１、１６−２４０、１６−２３９、１６−２３８、１６−２３７、１６−２３６、１６−２３５、１６−２３４、１６−２３３、または
配列番号４４もしくは配列番号４７の、２４−２３７、２４−２３６、２４−２３５、２４−２３４、２４−２３３、２４−２３２、２４−２３１、２４−２３０、２４−２２９、２３−２３７、２３−２３６、２３−２３５、２３−２３４、２３−２３３、２３−２３２、２３−２３１、２３−２３０、２３−２２９、２２−２３７、２２−２３６、２２−２３５、２２−２３４、２２−２３３、２２−２３２、２２−２３１、２２−２３０、２２−２２９、２１−２３７、２１−２３６、２１−２３５、２１−２３４、２１−２３３、２１−２３２、２１−２３１、２１−２３０、２１−２２９、２０−２３７、２０−２３６、２０−２３５、２０−２３４、２０−２３３、２０−２３２、２０−２３１、２０−２３０、２０−２２９、１９−２３７、１９−２３６、１９−２３５、１９−２３４、１９−２３３、１９−２３２、１９−２３１、１９−２３０、１９−２２９、１８−２３７、１８−２３６、１８−２３５、１８−２３４、１８−２３３、１８−２３２、１８−２３１、１８−２３０、１８−２２９、１７−２３７、１７−２３６、１７−２３５、１７−２３４、１７−２３３、１７−２３２、１７−２３１、１７−２３０、１７−２２９、１６−２３７、１６−２３６、１６−２３５、１６−２３４、１６−２３３、１６−２３２、１６−２３１、１６−２３０、１６−２２９、または
配列番号４５もしくは配列番号４８の、２４−２５１、２４−２５０、２４−２４９、２４−２４８、２４−２４７、２４−２４６、２４−２４５、２４−２４４、２４−２４３、２３−２５１、２３−２５０、２３−２４９、２３−２４８、２３−２４７、２３−２４６、２３−２４５、２３−２４４、２３−２４３、２２−２５１、２２−２５０、２２−２４９、２２−２４８、２２−２４７、２２−２４６、２２−２４５、２２−２４４、２２−２４３、２１−２５１、２１−２５０、２１−２４９、２１−２４８、２１−２４７、２１−２４６、２１−２４５、２１−２４４、２１−２４３、２０−２５１、２０−２５０、２０−２４９、２０−２４８、２０−２４７、２０−２４６、２０−２４５、２０−２４４、２０−２４３、１９−２５１、１９−２５０、１９−２４９、１９−２４８、１９−２４７、１９−２４６、１９−２４５、１９−２４４、１９−２４３、１８−２５１、１８−２５０、１８−２４９、１８−２４８、１８−２４７、１８−２４６、１８−２４５、１８−２４４、１８−２４３、１７−２５１、１７−２５０、１７−２４９、１７−２４８、１７−２４７、１７−２４６、１７−２４５、１７−２４４、１７−２４３、１６−２５１、１６−２５０、１６−２４９、１６−２４８、１６−２４７、１６−２４６、１６−２４５、１６−２４４、１６−２４３
からなる群から選択される、ヒトＢ７−Ｈ４の細胞外ドメインのうちの少なくとも５０アミノ酸の断片である、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドが、配列番号６３、配列番号６４、配列番号８３、配列番号８４、または配列番号８５に示される、ＩｇＶドメインのうちの少なくとも２５アミノ酸を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドが、
必要に応じて、シグナルペプチドのうちの１〜５アミノ酸をＮ末端に結合させた、
配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、もしくは配列番号４８のうちのいずれかの、１６−１４４、１６−１４５、１６−１４６、１６−１４７、１６−１４８、１６−１４９、１６−１５０、１６−１５１、１６−１５２、１７−１４４、１７−１４５、１７−１４６、１７−１４７、１７−１４８、１７−１４９、１７−１５０、１７−１５１、１７−１５２、１８−１４４、１８−１４５、１８−１４６、１８−１４７、１８−１４８、１８−１４９、１８−１５０、１８−１５１、１８−１５２、１９−１４４、１９−１４５、１９−１４６、１９−１４７、１９−１４８、１９−１４９、１９−１５０、１９−１５１、１９−１５２、２０−１４４、２０−１４５、２０−１４６、２０−１４７、２０−１４８、２０−１４９、２０−１５０、２０−１５１、２０−１５２、２１−１４４、２１−１４５、２１−１４６、２１−１４７、２１−１４８、２１−１４９、２１−１５０、２１−１５１、２１−１５２、２２−１４４、２２−１４５、２２−１４６、２２−１４７、２２−１４８、２２−１４９、２２−１５０、２２−１５１、２２−１５２、２３−１４４、２３−１４５、２３−１４６、２３−１４７、２３−１４８、２３−１４９、２３−１５０、２３−１５１、２３−１５２、２４−１４４、２４−１４５、２４−１４６、２４−１４７、２４−１４８、２４−１４９、２４−１５０、２４−１５１、２４−１５２、または
配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、もしくは配列番号５４のうちのいずれかの、２４−１５２、２４−１５３、２４−１５４、２４−１５５、２４−１５６、２４−１５７、２４−１５８、２４−１５９、２４−１６０、２５−１５２、２５−１５３、２５−１５４、２５−１５５、２５−１５６、２５−１５７、２５−１５８、２５−１５９、２５−１６０、２６−１５２、２６−１５３、２６−１５４、２６−１５５、２６−１５６、２６−１５７、２６−１５８、２６−１５９、２６−１６０、２７−１５２、２７−１５３、２７−１５４、２７−１５５、２７−１５６、２７−１５７、２７−１５８、２７−１５９、２７−１６０、２８−１５２、２８−１５３、２８−１５４、２８−１５５、２８−１５６、２８−１５７、２８−１５８、２８−１５９、２８−１６０、２９−１５２、２９−１５３、２９−１５４、２９−１５５、２９−１５６、２９−１５７、２９−１５８、２９−１５９、２９−１６０、３０−１５２、３０−１５３、３０−１５４、３０−１５５、３０−１５６、３０−１５７、３０−１５８、３０−１５９、３０−１６０、３１−１５２、３１−１５３、３１−１５４、３１−１５５、３１−１５６、３１−１５７、３１−１５８、３１−１５９、３１−１６０、３２−１５２、３２−１５３、３２−１５４、３２−１５５、３２−１５６、３２−１５７、３２−１５８、３２−１５９、３２−１６０、
配列番号６５、配列番号６６、もしくは配列番号６７のうちのいずれかの、２０−１４８、２０−１４９、２０−１５０、２０−１５１、２０−１５２、２０−１５３、２０−１５４、２０−１５５、２０−１５６、２１−１４８、２１−１４９、２１−１５０、２１−１５１、２１−１５２、２１−１５３、２１−１５４、２１−１５５、２１−１５６、２２−１４８、２２−１４９、２２−１５０、２２−１５１、２２−１５２、２２−１５３、２２−１５４、２２−１５５、２２−１５６、２３−１４８、２３−１４９、２３−１５０、２３−１５１、２３−１５２、２３−１５３、２３−１５４、２３−１５５、２３−１５６、２４−１４８、２４−１４９、２４−１５０、２４−１５１、２４−１５２、２４−１５３、２４−１５４、２４−１５５、２０−１５６、２５−１４８、２５−１４９、２５−１５０、２５−１５１、２５−１５２、２５−１５３、２５−１５４、２５−１５５、２５−１５６、２６−１４８、２６−１４９、２６−１５０、２６−１５１、２６−１５２、２６−１５３、２６−１５４、２６−１５５、２６−１５６、２７−１４８、２７−１４９、２７−１５０、２７−１５１、２７−１５２、２７−１５３、２７−１５４、２７−１５５、２７−１５６、２８−１４８、２８−１４９、２８−１５０、２８−１５１、２８−１５２、２８−１５３、２８−１５４、２８−１５５、２８−１５６、または
配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７７、配列番号７８、もしくは配列番号７９のうちのいずれかの、２４−１５２、２４−１５３、２４−１５４、２４−１５５、２４−１５６、２４−１５７、２４−１５８、２４−１５９、２４−１６０、２５−１５２、２５−１５３、２５−１５４、２５−１５５、２５−１５６、２５−１５７、２５−１５８、２５−１５９、２５−１６０、２６−１５２、２６−１５３、２６−１５４、２６−１５５、２６−１５６、２６−１５７、２６−１５８、２６−１５９、２６−１６０、２７−１５２、２７−１５３、２７−１５４、２７−１５５、２７−１５６、２７−１５７、２７−１５８、２７−１５９、２７−１６０、２８−１５２、２８−１５３、２８−１５４、２８−１５５、２８−１５６、２８−１５７、２８−１５８、２８−１５９、２８−１６０、２９−１５２、２９−１５３、２９−１５４、２９−１５５、２９−１５６、２９−１５７、２９−１５８、２９−１５９、２９−１６０、３０−１５２、３０−１５３、３０−１５４、３０−１５５、３０−１５６、３０−１５７、３０−１５８、３０−１５９、３０−１６０、３１−１５２、３１−１５３、３１−１５４、３１−１５５、３１−１５６、３１−１５７、３１−１５８、３１−１５９、３１−１６０、３２−１５２、３２−１５３、３２−１５４、３２−１５５、３２−１５６、３２−１５７、３２−１５８、３２−１５９、３２−１６０
からなる群から選択される、ヒトＢ７−Ｈ４のＩｇＶドメインのうちの少なくとも５０アミノ酸の断片である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記第２のポリペプチドが、免疫グロブリン定常ドメインを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記免疫グロブリン定常ドメインが、マウス免疫グロブリンＣγ２ａ鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含む、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記免疫グロブリン定常ドメインが、配列番号８６、配列番号８７、または配列番号９０に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされる、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記免疫グロブリン定常ドメインが、ヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記融合タンパク質の二量体化または多量体化を媒介してホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体、またはヘテロ多量体を形成するドメインをさらに含む、請求項１から１０のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
二量体化または多量体化を媒介する前記ドメインが、前記パートナーの融合タンパク質上のシステインと分子間ジスルフィド結合を形成することが可能な１つ以上のシステイン、コイルドコイルドメイン、酸性残基のパッチ、亜鉛フィンガードメイン、カルシウムハンドドメイン、ＣＨ１領域、ＣＬ領域、ロイシンジッパードメイン、ＳＨ２（ｓｒｃ相同性２）ドメイン、ＳＨ３（ｓｒｃ相同性３）ドメイン、ＰＴＢ（ホスホチロシン結合）ドメイン、ＷＷドメイン、ＰＤＺドメイン、１４−３−３ドメイン、ＷＤ４０ドメイン、ＥＨドメイン、Ｌｉｍドメイン、イソロイシンジッパードメイン、ならびに受容体二量体対の二量体化ドメインからなる群から選択される、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、または配列番号１３３のポリペプチドを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、または配列番号１３７のポリペプチドを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
第１および第２の融合タンパク質を含む二量体タンパク質であって、該第１の融合タンパク質および該第２の融合タンパク質が、請求項１から１４のいずれかに記載の融合タンパク質を含み、該第１の融合タンパク質および該第２の融合タンパク質が、共有結合または非共有結合により互いと結合して二量体を形成する二量体タンパク質。
【請求項１６】
前記融合タンパク質が、ジスルフィド結合によって結合している、請求項１から１５のいずれかに記載の二量体タンパク質または多量体タンパク質。
【請求項１７】
請求項１から１６のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む単離核酸分子。
【請求項１８】
請求項１７に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２０】
炎症反応の１つ以上の症状の処置または阻害を必要とする個体における炎症反応の１つ以上の症状を処置または阻害する方法であって、
該個体における該炎症反応の該１つ以上の症状を軽減または阻害するのに有効な量で、請求項１から１６のいずれかに記載のＢ７−Ｈ４融合タンパク質を該個体に投与する工程を含む方法。
【請求項２１】
前記炎症反応が、自己免疫疾患または自己免疫障害と関連する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記個体が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円形脱毛症、強直性脊椎炎（ａｎｋｌｏｓｉｎｇ  ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖性症候群（ａｌｐｓ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック病−皮膚炎、慢性疲労性症候群免疫不全症候群（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｆａｔｉｇｕｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、瘢痕性類天疱瘡、寒冷血球凝集素病、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、ドゴー病（Ｄｅｇｏ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症−線維筋炎、グレーブス病（ｇｒａｖｅ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ギラン−バレー症候群（ｇｕｉｌｌａｉｎ−ｂａｒｒｅ）、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、インスリン依存性糖尿病（Ｉ型）、若年性関節炎、メニエール病（Ｍｅｎｉｅｒｅ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、混合結合組織病、多発性硬化症、再発寛解型多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、ならびにウェゲナー肉芽腫症からなる群から選択される自己免疫疾患を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
被験体における炎症を処置する方法であって、有効な量の、請求項１から１６のいずれかに記載のＢ７−Ｈ４融合タンパク質を該被験体に投与して、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、炎症性分子を分泌する他の細胞、または他の細胞に炎症性分子を分泌させるようにする細胞からなる群から選択される免疫細胞の分化、増殖、活性、ならびに／または該免疫細胞によるサイトカインの生成および／または分泌を阻害するかまたは低減する工程を含む方法。
【請求項２４】
有効な量の、請求項１から１８のいずれかに記載のＢ７−Ｈ４融合タンパク質を投与して、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、またはＴｈ２２細胞の分化、増殖、活性、ならびに／または該Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、またはＴｈ２２細胞によるサイトカインの生成および／または分泌を阻害するかまたは低減する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
被験体における炎症を処置するための方法であって、有効な量の、請求項１から１６のいずれかに記載のＢ７−Ｈ４融合タンパク質を該被験体に投与して、Ｔｈ１細胞またはＴｈ１７細胞に対するそれらの抑制効果を増強する工程を含む方法。
【請求項２６】
被験体における炎症を処置するための方法であって、有効な量の、請求項１から１６のいずれかに記載のＢ７−Ｈ４融合タンパク質を該被験体に投与して、ＴｒｅｇによるＩＬ−１０の生成を促進または増強する工程を含む方法。
【請求項２７】
被験体における炎症を処置するための方法であって、有効な量の、請求項１から１６のいずれかに記載のＢ７−Ｈ４融合タンパク質を該被験体に投与して、Ｔｒｅｇの細胞数を増加させるか、またはＴｒｅｇの集団を増大させる工程を含む方法。
【請求項２８】
被験体における炎症を処置するための方法であって、有効な量の、請求項１から１６のいずれかに記載のＢ７−Ｈ４融合タンパク質を該被験体に投与して、Ｔｈ１経路およびＴｈ１７経路を阻害し、かつ、Ｔｈ１７経路に対するＴｒｅｇの抑制活性を増強するか、またはＴｒｅｇによるＩＬ−１０の分泌を促進もしくは増強する工程を含む方法。
【請求項２９】
被験体における炎症促進性分子の生成を低減するための方法であって、有効な量の、請求項１から１８のいずれかに記載のＢ７−Ｈ４融合タンパク質、またはその断片を投与して、該被験体における１つ以上のサイトカインの生成を阻害する工程を含む方法。
【請求項３０】
第２の治療剤を投与する工程をさらに含む、請求項２０から２９に記載の方法のうちのいずれか１つの方法。
【請求項３１】
Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質により処置される被験体を選択するための方法であって、
ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、およびＩＬ−２１からなる群から選択される１つ以上のサイトカインまたはＭＭＰのレベルについて被験体をスクリーニングする工程と、
該サイトカインのレベルを、炎症性障害を有さないコントロール被験体におけるサイトカインまたはＭＭＰのレベルと比較する工程と、
該被験体における該１つ以上のサイトカインのレベルが、炎症性障害を有さない該コントロール被験体におけるレベルと比較して高い場合は、有効な量の、請求項１から１６のいずれかに記載のＢ７−Ｈ４融合タンパク質を該被験体に投与して、炎症性障害の１つ以上の症状を阻害するかまたは軽減する工程と
を含む方法。
【請求項３２】
Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質により処置される被験体を選択するための方法であって、
ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、およびＩＬ−２１からなる群から選択される１つ以上のサイトカインまたはＭＭＰをコードするｍＲＮＡのレベルについて被験体をスクリーニングする工程と、
該サイトカインまたはＭＭＰをコードするｍＲＮＡのレベルを、炎症性障害を有さないコントロール被験体における、該サイトカインまたはＭＭＰをコードするｍＲＮＡのレベルと比較する工程と、
該被験体における該サイトカインをコードする１つ以上のｍＲＮＡのレベルが、炎症性障害を有さない該コントロール被験体におけるレベルと比較して高い場合は、有効な量の、請求項１から１６のいずれかに記載のＢ７−Ｈ４融合タンパク質を該被験体に投与して、炎症性障害の１つ以上の症状を阻害するかまたは軽減する工程と
を含む方法。
【請求項３３】
Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質により処置される被験体を選択するための方法であって、
ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、およびＩＬ−２１からなる群から選択される１つ以上のサイトカインまたはＭＭＰをコードする遺伝子における多型について被験体をスクリーニングする工程と、
該サイトカインまたはＭＭＰをコードする遺伝子のうちの１つ以上が、多型を有する場合は、有効な量の、請求項１から１６のいずれかに記載のＢ７−Ｈ４融合タンパク質を該被験体に投与して、炎症性障害の１つ以上の症状を阻害するかまたは軽減する工程と
を含む方法。
【請求項３４】
前記被験体が、以前に、ＴＮＦ遮断剤による処置に不応であった、請求項２０から３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記被験体が、慢性かつ遷延性の炎症を有する、請求項２０から３４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質およびＢ７−Ｈ４融合タンパク質を使用して被験体における免疫応答を調節するための方法に関する。
【０００２】
関連出願への相互参照
この出願は、２００９年８月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／２３８，６０５号、２００９年１２月４日に出願された米国仮特許出願第６１／２６６，８５４号、２００９年１０月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／２５４，９３０号、２００９年１２月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／２８６，５３７号、および２０１０年８月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／３７８，３６１号に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
抗原特異的Ｔ細胞反応は、２つのシグナル：第１に、ＭＨＣとの関係において提示される抗原ペプチドとのＴＣＲの関与によるシグナル（シグナル１）、ならびに第２に、異なる受容体／リガンド対間の接触により送達される、抗原に依存しない第２のシグナル（シグナル２）により媒介される。この「第２のシグナル」は、Ｔ細胞反応（活性化  対  寛容）の他、この反応の強度および持続を決定するのに極めて重要であり、Ｂ７ファミリーのタンパク質など、共刺激分子からの正負両方のシグナルにより制御される。最も広範にわたり特徴づけられているＴ細胞共刺激経路は、Ｂ７−ＣＤ２８経路であり、ここでは、Ｂ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）の各々が、刺激性のＣＤ２８受容体および阻害性のＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）受容体と関与しうる。Ｔ細胞受容体を介するシグナル伝達と共に、ＣＤ２８によるライゲーションは、抗原特異的なＴ細胞増殖を増大させ、サイトカインの生成を増強し、Ｔ細胞の分化およびエフェクター機能を刺激し、かつＴ細胞の生存を促進する（非特許文献１；非特許文献２；ならびに非特許文献３）。これに対し、ＣＴＬＡ−４を介するシグナル伝達は、Ｔ細胞の増殖、ＩＬ−２の生成、ならびに細胞周期の進行を阻害する、負のシグナルを送達すると考えられている（非特許文献４；ならびに非特許文献５）。Ｂ７ファミリーの他のメンバーには、Ｂ７−Ｈ１（Ｄｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、５巻：１３６５〜１３６９頁（１９９９年）；ならびにＦｒｅｅｍａｎら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１９２巻：１〜９頁（２０００年））、Ｂ７−ＤＣ（Ｔｓｅｎｇら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１９３巻：８３９〜８４６頁（２００１年）；ならびにＬａｔｃｈｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２巻：２６１〜２６８頁（２００１年））、Ｂ７−Ｈ２（Ｗａｎｇら、Ｂｌｏｏｄ、９６巻：２８０８〜２８１３頁（２０００年）；  Ｓｗａｌｌｏｗら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１１巻：４２３〜４３２頁（１９９９年）；ならびにＹｏｓｈｉｎａｇａら、Ｎａｔｕｒｅ、４０２巻：８２７〜８３２頁（１９９９年））、Ｂ７−Ｈ３（Ｃｈａｐｏｖａｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２巻：２６９〜２７４頁（２００１年））、およびＢ７−Ｈ４（Ｃｈｏｉら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７１巻：４６５０〜４６５４頁（２００３年）；  Ｓｉｃａら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１８巻：８４９〜８６１頁（２００３年）；  Ｐｒａｓａｄら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１８巻：８６３〜８７３頁（２００３年）；ならびにＺａｎｇら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、１００巻：１０３８８〜１０３９２頁（２００３年））が含まれる。Ｂ７−Ｈ１およびＢ７−ＤＣは、ＰＤ−１のリガンドであり、Ｂ７−Ｈ２はＩＣＯＳのリガンドであり、Ｂ７−Ｈ３は、現時点では、オーファンリガンドである（Ｄｏｎｇら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｓ．、２８巻：３９〜４８頁（２００３年））。
【０００４】
Ｂ７−Ｈ４は、Ｔ細胞反応に対する負の制御因子である、Ｂ７ファミリーのメンバーである。ヒトＢ７−Ｈ４とマウスＢ７−Ｈ４とが８７％のアミノ酸同一性を共有することから、進化において保存された重要な機能が示唆される。ヒトおよびマウスのＢ７−Ｈ４  ｍＲＮＡは、リンパ器官（脾臓および胸腺）および非リンパ器官（肺、肝臓、精巣、卵巣、胎盤、骨格筋、膵臓、および小腸を含めた）のいずれにおいても、広範に発現している。Ｂ７−Ｈ４タンパク質の発現についての限られた研究は、Ｂ７−Ｈ４が、単離されたばかりのヒトＴ細胞、Ｂ細胞、ＤＣ、および単球上では発現せず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて刺激された後のこれらの細胞型において誘導されうることを示す。免疫組織化学染色は、Ｂ７−Ｈ４が、乳房腫瘍、腎臓腫瘍、肺腫瘍、および卵巣腫瘍で高度に発現することを示し、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による解析はまた、マウスＢ７−Ｈ４も、前立腺癌、肺癌、および結腸癌を含めた多数の腫瘍細胞系において高度に発現することを示す。Ｂ７−Ｈ４は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）により高度に発現され、それは腫瘍血管系に存在する。制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、ＩＬ−６およびＩＬ−１０を介して、ＴＡＭにおけるＢ７−Ｈ４の上方制御を誘導するが、これは、Ｔｒｅｇが免疫の抑制に寄与する機構のうちの１つであると考えられている（Ｋｒｙｃｚｅｋ，  Ｊ．Ｉ．、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７７巻（１号）：４０〜４４頁（２００６年））。Ｂ７−Ｈ４の発現はまた、罹患した腎臓の尿細管上皮細胞においても観察されている（Ｃｈｅｎ，  Ｙ．、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．、７０巻（１２号）：２０９２〜９頁（２００６年）、電子版、２００６年１０月１８日）。
【０００５】
Ｂ７−Ｈ４の受容体は、クローニングされていない。Ｂ７−Ｈ４は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、およびＰＤ−１など、公知のＣＤ２８ファミリーメンバーには結合しないことが示されており（Ｓｉｃａら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１８巻：８４９〜８６１頁（２００３年））、したがって、これらは、Ｂ７−Ｈ４の潜在的な受容体ではない。Ｂ７−Ｈ４のトランスフェクト細胞ならびにＢ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質を用いる機能研究は、Ｂ７−Ｈ４が、ＴＣＲを介するＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖、これらの細胞周期の進行、ならびにこれらによるＩＬ−２の生成を阻害するシグナルを送達することを証明している。Ｂ７−１による共刺激は、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇにより誘導される阻害を凌駕することができない。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける活性と一致して、Ｂ７−Ｈ４ノックアウトマウスが自己免疫を発達させる。Ｂ７−Ｈ４の広範かつ誘導性の発現は、機能研究と併せて、Ｂ７−Ｈ４が、末梢組織における免疫反応を下方制御するように働くことを示唆する。
【０００６】
より近年の結果はまた、Ｂ７−Ｈ４が、好中球の反応に対する負の制御因子としても作用することを証明する。好中球は、自然免疫系の重要な構成要素であり、病原体に対する第１の宿主防御線である。しかし、好中球はまた、慢性炎症および自己免疫疾患にも寄与し得る。Ｂ７−Ｈ４ノックアウトマウスは、Ｔｈ１細胞反応の増大を示し、好中球依存性である免疫反応の増進に起因して、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによる感染に対する抵抗性を増大させる（Ｓｕｈ．  Ｗ．Ｋ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、２６巻（１７号）：６４０３〜１１頁（２００６年）；ならびにＺｈｕ，  Ｇ．ら、Ｂｌｏｏｄ、１１３巻（８号）：１７５９〜６７頁（２００９年）、電子版、２００８年１２月２４日）。単量体のＢ７−Ｈ４のＩｇＶドメインまたは細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を流体力学的にトランスフェクトされたマウスは、リポ多糖（ＬＰＳ）およびＬｉｓｔｅｒｉａ属感染に対する好中球反応を増大させたが、二量体のＢ７−Ｈ４−Ｉｇでは、骨髄由来の好中球前駆体の増殖を低減する（Ｚｈｕ，  Ｇ．ら、Ｂｌｏｏｄ、１１３巻（８号）：１７５９〜６７頁（２００９年）電子版、２００８年１２月２４日）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｌｅｎｓｈｏｗら、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９６年）１４巻：２３３〜２５８頁
【非特許文献２】ＣｈａｍｂｅｒｓおよびＡｌｌｉｓｏｎ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７年）９巻：３９６〜４０４頁
【非特許文献３】ＲａｔｈｍｅｌｌおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９年）１７巻：７８１〜８２８頁
【非特許文献４】ＫｒｕｍｍｅｌおよびＡｌｌｉｓｏｎ、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．（１９９６年）１８３巻：２５３３〜２５４０頁
【非特許文献５】Ｗａｌｕｎａｓら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．（１９９６年）１８３巻：２５４１〜２５５０頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ある特定の免疫細胞、ならびに免疫細胞のシグナル伝達経路は、免疫障害を処置するための新規の薬剤の有望な標的である。例えば、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、自己免疫および炎症を媒介するのに重要な役割を果たす。多数の研究による膨大な証拠は、関節リウマチ、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、エリテマトーデス、およびブドウ膜炎などの障害におけるこれらの免疫細胞の重要性を示している。既存の療法の大半では、一度に標的とする経路が１つに限られる。したがって、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、Ｔｒｅｇ細胞、またはＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１０、およびＭＭＰが含まれるがこれらに限定されない、サイトカイン、メタロプロテアーゼ、ケモカイン、ならびに他の分子などの炎症性分子を分泌するか、もしくは他の細胞にこれらを分泌させる他の細胞など、自己免疫および炎症に関与する複数の細胞および経路を標的とする療法が必要とされている。
【０００９】
したがって、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、またはＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２１、およびＭＭＰが含まれるがこれらに限定されない炎症性分子を分泌するか、もしくは他の細胞にこれらを分泌させる他の細胞を調節するための組成物および方法を提供することが、本発明の目的である。
【００１０】
好ましくは、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、またはＴｈ２２細胞による、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２１、およびＭＭＰが含まれるがこれらに限定されない１つ以上の炎症性分子の分泌を結果としてもたらす、少なくとも２つの免疫経路を調節するための組成物および方法を提供することが、本発明の別の目的である。
【００１１】
Ｔｒｅｇ細胞、ならびにＩＬ−１０分泌およびＴＧＦ−ベータ分泌などの経路を調節するための組成物および方法を提供することが、本発明の別の目的である。
【００１２】
Ｔｈ１  Ｔ細胞、Ｔｈ１７  Ｔ細胞、またはＴｈ２２  Ｔ細胞の炎症促進活性を調節しながら、同時に、Ｔｒｅｇの活性を増大させるかまたは促進するための組成物および方法を提供することが、本発明の別の目的である。
【００１３】
Ｔ細胞の抗原特異的増殖を低下させるかまたは阻害し、Ｔ細胞による炎症促進性分子の生成を減少させるかまたは阻害し、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、またはＴｈ２２細胞の分化およびエフェクター機能を低下させるかまたは阻害し、かつ、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、またはＴｈ２２細胞の生存を短縮させるかまたは阻害するように機能する、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドを含有する組成物を提供することが、本発明の目的である。
【００１４】
Ｔｒｅｇの活性を増大させるかもしくは促進するか、ＴｒｅｇからのＩＬ−１０などの炎症性分子の生成を増大させるか、ナイーブＴ細胞のＴｒｅｇへの分化を増大させるか、Ｔｒｅｇの数を増加させるか、またはＴｒｅｇの生存を延長させるように機能する、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドを含有する組成物を提供することが、本発明の別の目的である。
【００１５】
Ｔｈ１  Ｔ細胞、Ｔｈ１７  Ｔ細胞、またはＴｈ２２  Ｔ細胞の炎症促進活性を阻害するかまたは減少させながら、同時に、Ｔｒｅｇの活性を増大させるかまたは促進するように機能する、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドを含有する組成物を提供することが、本発明の別の目的である。
【００１６】
Ｂ７−Ｈ４組成物をコードする単離核酸分子を提供することが、本発明の別の目的である。
【００１７】
Ｂ７−Ｈ４組成物をコードする核酸分子を発現させるベクターを含有する細胞を提供することが、本発明の別の目的である。
【００１８】
それらをＢ７−Ｈ４組成物と接触させることにより、炎症促進性Ｔ細胞の活性化を低減させるかまたは阻害する方法を提供することが、本発明のなおさらなる目的である。
【００１９】
炎症性疾患および炎症性障害ならびに自己免疫疾患および自己免疫障害を処置するための方法を提供することが、本発明のなおさらなる目的である。
【００２０】
Ｂ７−Ｈ４組成物、Ｂ７−Ｈ４組成物をコードする核酸、またはＢ７−Ｈ４組成物をコードする核酸でトランスフェクトまたは形質導入した細胞を、それを必要とする哺乳動物に投与するための方法を提供することが、本発明のなおさらなる目的である。
【００２１】
Ｔｒｅｇの生物学的活性を増大させるための組成物および方法を提供することが、別の目的である。
【００２２】
エピトープ拡大を阻害するかまたは低減するための組成物および方法を提供することが、また別の目的である。
【００２３】
ナイーブＴ細胞が、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、またはＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２１、およびＭＭＰが含まれるがこれらに限定されない炎症促進性分子を分泌するか、もしくは他の細胞にこれらを分泌させる他の細胞へと分化することを阻害するための組成物および方法を提供することが、別の目的である。
【００２４】
未成熟の抗原提示細胞の分化および成熟を阻害するための組成物および方法を提供することが、別の目的である。
【００２５】
患者における、炎症性ケモカイン、サイトカイン、もしくは他の分子などのバイオマーカーのレベル、またはバイオマーカーの遺伝子発現を測定することにより、開示される組成物および方法による処置から利益を得る上記患者をモニタリングすることが、本発明の別の目的である。
【００２６】
患者における、炎症性ケモカイン、サイトカイン、または他の分子などのバイオマーカーのレベルを測定することにより、開示される組成物および方法による処置から利益を得る上記患者を同定することが、本発明の別の目的である。
【００２７】
炎症性ケモカイン、サイトカイン、または他の分子などのバイオマーカーをコードする遺伝子において多型を有する患者を同定することにより、開示される組成物および方法による処置から利益を得る患者を同定することが、本発明の別の目的である。
【００２８】
炎症性疾患および炎症性障害ならびに自己免疫疾患および自己免疫障害を有する患者を処置するための組合せ療法を提供することが、本発明の別の目的である。
【００２９】
ＴＮＦ遮断剤が奏効しない患者を処置するための組成物を提供することが、本発明の別の目的である。
【００３０】
慢性炎症および遷延性炎症を処置するための組成物を提供することが、本発明の別の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドを含有する融合タンパク質が開示される。上記Ｂ７−Ｈ４融合ポリペプチドは、第２のポリペプチドに直接的に融合するか、または第２のポリペプチドに融合するリンカーペプチド配列を介して間接的に上記第２のポリペプチドに融合するＢ７−Ｈ４タンパク質のうちの全部または一部を含む、第１の融合パートナーを有する。上記Ｂ７−Ｈ４融合ポリペプチドは、任意の起源の種に由来しうる。好ましい実施形態では、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドが、マウス起源のもの、非ヒト霊長動物起源のもの、またはヒト起源のものに由来する。一実施形態では、上記Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質が、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、またはＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２１、およびＭＭＰが含まれるがこれらに限定されない炎症性分子を分泌するか、もしくは他の細胞にこれらを分泌させる他の細胞の炎症活性を阻害する。上記Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質はまた、サイトカインであるＩＬ−１０などの分子の生成を増大させることにより、Ｔｒｅｇの抑制能を増大させることも可能である。
【００３２】
上記Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質は、全長Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドまたはその断片を含みうる。一実施形態では、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドが、全長Ｂ７−Ｈ４の可溶性断片である。断片には、その天然の受容体に結合する能力を保持し、かつ、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドの細胞外ドメインのうちの一部または全部を組み込み、かつ、その細胞内ドメインおよび／または膜貫通ドメインのうちの一部または全部を欠く断片が含まれる。一実施形態では、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド断片が、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドの細胞外ドメインの全体を含む。他の実施形態では、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドの可溶性断片が、Ｂ７−Ｈ４の生物学的活性を保持する上記細胞外ドメインの断片を含む。Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドの細胞外ドメインは、膜貫通ドメインに由来する１、２、３、４、５以上の連続するアミノ酸、ならびに／またはそのシグナル配列に由来する１、２、３、４、５以上の連続するアミノ酸を含みうる。代替的に、上記細胞外ドメインは、Ｃ末端、Ｎ末端、またはこれらの両方から取り出された、１、２、３、４、５以上の連続するアミノ酸を有しうる。また、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドならびにこれらの断片の改変体も、用いることができる。
【００３３】
一実施形態では、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドを、ヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域に対応するか、またはマウス免疫グロブリンＣγ２ａ鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域に対応するアミノ酸配列を有することが好ましい、Ｉｇ重鎖定常領域のうちの１つ以上のドメインに融合させることができる。
【００３４】
その融合タンパク質を二量体化または多量体化させて、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体、またはヘテロ多量体を形成することができる。二量体化／多量体化のパートナーは、パラレルまたはアンチパラレルの配向性で配置することができる。
【００３５】
また、上記融合タンパク質をコードする単離核酸分子、上記核酸を組み込むベクターおよび宿主細胞、ならびに上記融合タンパク質を含有する薬学的組成物および免疫原性組成物も提供される。免疫原性組成物は、抗原、融合タンパク質の供給源、ならびに、必要に応じて、アジュバントを含有する。
【００３６】
上記融合タンパク質を用いて、炎症促進性Ｔ細胞の活性化を減少させるかまたは阻害するための方法が開示される。上記開示される組成物の治療的な使用には、炎症性疾患および炎症性障害ならびに自己免疫疾患および自己免疫障害の１つ以上の症状を処置または緩和することが含まれる。上記Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質は、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、ならびに／または炎症性分子を分泌するか、もしくは他の細胞に炎症性分子を分泌させる他の細胞の分化を阻害するかまたは低減すること；Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、ならびに／または炎症性分子を分泌するか、もしくは他の細胞に炎症性分子を分泌させる他の細胞の活性を阻害するかまたは低減すること；上記Ｔｈ１の経路および／または上記Ｔｈ１７の経路を阻害するかまたは弱めること；Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、ならびに／または炎症性分子を分泌するか、もしくは他の細胞に炎症性分子を分泌させる他の細胞による炎症性分子の生成および／または分泌を阻害するかまたは低減すること；Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、ならびに／または炎症性分子を分泌するか、もしくは他の細胞に炎症性分子を分泌させる他の細胞の増殖を阻害するかまたは低減すること；Ｔｒｅｇと相互作用すること；Ｔｒｅｇの活性を増強すること；ＴｒｅｇによるＩＬ−１０の分泌を増強すること；Ｔｒｅｇの数を増加させること；Ｔｒｅｇの抑制能を増大させること；あるいはこれらの組合せのうちのいずれかまたはすべてにより、炎症を処置するのに有用である。
【００３７】
一実施形態では、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドまたはＢ７−Ｈ４融合タンパク質が、免疫系におけるＴｒｅｇの抑制活性を増強する。Ｔｒｅｇは、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、ならびに／または炎症性分子を分泌するか、もしくは他の細胞にこれらを分泌させる他の細胞の分化、増殖、活性、ならびに／またはその細胞によるサイトカインの生成および／または分泌を抑制しうる。好ましい実施形態では、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドまたはＢ７−Ｈ４融合タンパク質が、ナイーブＴ細胞に対するＴｒｅｇの抑制活性を増強して、ナイーブＴ細胞が、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、またはＴｈ２２細胞へと分化することを阻害するかまたは低減し、これにより、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、ならびに／または被験体におけるＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２１、およびＭＭＰが含まれるがこれらに限定されない炎症性分子を分泌するか、もしくは他の細胞にこれらを分泌させる他の細胞の数を低減する。
【００３８】
一実施形態は、有効量のＢ７−Ｈ４ポリペプチドまたはその融合タンパク質を被験体に投与することにより、上記被験体におけるエピトープ拡大を阻害するかまたは低減する方法を提供する。好ましい実施形態は、有効量のＢ７−Ｈ４ポリペプチドまたはその融合タンパク質を投与して、多発性硬化症（ＭＳ）または全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を有する患者におけるエピトープ拡大を阻害するかまたは低減する方法を提供する。
【００３９】
Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、それらの断片、またはそれらの融合物は、他のリンパ球表面マーカー（例えば、ＣＤ４０、アルファ−４インテグリン）に対する抗体もしくはサイトカインに対する抗体；他の融合タンパク質、例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（Ｏｒｅｎｃｉａ（登録商標）、ベラタセプト）、ＴＮＦＲ−Ｉｇ（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））；Ｒｅｍｉｃａｄｅ、Ｃｉｍｚｉａ、およびＨｕｍｉｒａなどのＴＮＦ−α遮断剤；ＣＤ７３−Ｉｇ；シクロホスファミド（ＣＴＸ）（すなわち、Ｅｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（商標））；メトトレキサート（ＭＴＸ）（すなわち、Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ（登録商標）、Ｔｒｅｘａｌｌ（登録商標））；ベリムマブ（すなわち、Ｂｅｎｌｙｓｔａ（登録商標））；Ｔｙｓａｂｒｉもしくは他の免疫抑制薬；抗増殖剤；細胞傷害剤；または免疫抑制を補助し得る他の化合物が含まれるがこれらに限定されない、１つ以上のさらなる治療剤と組み合わせて投与することができる。
【００４０】
一実施形態では、さらなる治療剤が、免疫の活性化に関与する種々の経路を標的とする。好ましい実施形態では、上記さらなる治療剤が、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（アバタセプト）など、ＣＴＬＡ−４融合タンパク質である。好ましい実施形態では、上記さらなる治療剤が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＣＤ８６に対するそのアビディティーを顕著に増大させる、２つのアミノ酸置換（Ｌ１０４ＥおよびＡ２９Ｙ）を含有する、ベラタセプトとして公知のＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質である。
【００４１】
別の実施形態では、第２の治療剤が、シクロホスファミド（ＣＴＸ）である。好ましい実施形態では、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などの慢性自己免疫疾患または慢性自己免疫障害を処置するのに有効な量で、Ｂ７−Ｈ４−ＩｇおよびＣＴＸを共投与する。
【００４２】
別の実施形態では、上記第２の治療剤が、血清中のアデノシン量を増加させる。好ましい実施形態では、上記第２の治療剤が、ＣＤ７３−Ｉｇ、組換えＣＤ７３、またはＣＤ７３の発現を増大させる別の薬剤（例えば、サイトカインまたはモノクローナル抗体または低分子）である。別の実施形態では、上記第２の治療剤が、インターフェロン−ベータである。
【００４３】
別の実施形態では、上記第２の治療剤が、Ｔｙｓａｂｒｉまたは別のＭＳ治療剤である。好ましい実施形態では、Ｂ７−Ｈ４−ＩｇをＴｙｓａｂｒｉと反復して使用する（ｃｙｃｌｅｄ）か、またはＢ７−Ｈ４−Ｉｇを休薬期間に用い、それにより上記第２の治療剤の投与を低頻度とし、ＰＭＬなどの副作用の危険性を低減し、かつ、上記第２の治療剤に対する耐性を防止することができる。
【００４４】
別の実施形態では、上記第２の治療剤が、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、ならびに／または炎症性分子を分泌するか、もしくは他の細胞に炎症性分子を分泌させる他の細胞の分化、増殖、活性、ならびに／またはその細胞によるサイトカインの生成および／または分泌を阻害するかまたは低減する低分子である。別の実施形態では、上記第２の治療剤が、Ｔｒｅｇと相互作用する低分子であるか、Ｔｒｅｇの活性を増強する低分子であるか、ＴｒｅｇによるＩＬ−１０の分泌を促進もしくは増強する低分子であるか、Ｔｒｅｇの数を増加させる低分子であるか、Ｔｒｅｇの抑制能を増大させる低分子であるか、またはこれらの組合せである。一実施形態では、上記低分子が、レチノイン酸またはその誘導体である。
【００４５】
別の実施形態では、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質、またはそれらの断片を用いて、ＴＮＦ遮断剤に不応の患者を処置することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１Ａ】図１Ａは、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇを用いて炎症を阻害するための作用モードを例示する図である。図１Ａでは、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇが、Ｔ細胞を標的とする。図１Ｂでは、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇが、樹状細胞（ＤＣ）の成熟を遮断する。
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇを用いて炎症を阻害するための作用モードを例示する図である。図１Ａでは、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇが、Ｔ細胞を標的とする。図１Ｂでは、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇが、樹状細胞（ＤＣ）の成熟を遮断する。
【図２】図２は、コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）予防モデルのための、関節炎の誘発および処置を例示する図である。
【図３】図３は、ＣＩＡ予防モデルにおいて、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処置したマウス（黒丸）、ならびにビヒクルで処置したマウス（白丸）における、コラーゲンＩＩ（ＣＩＩ）による誘発後の時間に対する関節炎スコアに関する折れ線グラフである。
【図４】図４は、ＣＩＡ治療モデルについての、関節炎の誘発および処置を例示する図である。
【図５】図５は、ＣＩＡ治療モデルにおいて、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処置したマウス（黒丸）、ならびにビヒクルで処置したマウス（白丸）における、コラーゲンＩＩ（ＣＩＩ）による誘発後の時間に対する関節炎スコアに関する折れ線グラフである。
【図６】図６は、ＣＩＡ治療モデルについての、代表的な疾患の誘発ならびに投与レジメンを例示する図である。
【図７】図７は、雌マウス（ＡＡ＃７９）における関節炎スコアを、ＣＩＩによる免疫後の時間（日数）の関数として示す折れ線グラフである。ビヒクル、マウスＩｇＧ、マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇ、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ、およびＲＰＡ１１００１０による処置を示す。
【図８】図８は、雄マウス（ＡＡ＃８０）における関節炎スコアを、ＣＩＩによる免疫後の時間（日数）の関数として示す折れ線グラフである。ビヒクル、マウスＩｇＧ、マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇ、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ、およびＲＲＰＡ１１００１０による処置を示す。
【図９】図９は、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処置したマウス、またはＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）で処置したマウスに由来する血清試料についての定量イムノアッセイによる多検体プロファイリング（ｍｕｌｔｉ−ａｎａｌｙｔｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）解析に従い、疾患の増悪ならびにＢ７−Ｈ４−Ｉｇによる処置の奏効をモニタリングするのに用いうるバイオマーカーを同定するための、完全なデータセットのうちの前半部分を示すチャートである。
【図１０】図１０は、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処置したマウス、またはＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）で処置したマウスに由来する血清試料についての定量イムノアッセイによる多検体プロファイリング解析に従い、疾患の増悪ならびにＢ７−Ｈ４−Ｉｇによる処置の奏効をモニタリングするのに用いうるバイオマーカーを同定するための、完全なデータセットのうちの後半部分を示すチャートである。
【図１１】図１１は、図７および８の完全なデータセットについての、定量イムノアッセイによる多検体プロファイリングデータ解析の概要を示すチャートである。２７日目、３４日目、４１日目、または全体で、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）処置群と、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ処置群との間に有意差（０．０５未満のｐ値）が存在する場合は、分析物に影を付す。また、分析物と臨床スコアとの間の相関係数が０．３未満の場合にも、分析物に影を付す。
【図１２】図１２は、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の血清レベル（μｇ／ｍｌ）を、臨床スコアと対比して示す折れ線グラフである。
【図１３】図１３は、ＣＩＩによる免疫後２７日目、３４日目、および４１日目の、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処置したマウス（−■−）またはＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）で処置したマウス（−●−）におけるエンドセリン１（ＥＴ−１）の血清レベル（ｐｇ／ｍｌ）を示すプロットである。
【図１４】図１４は、ＩＬ−６の血清レベル（ｐｇ／ｍｌ）を、臨床スコアと対比して示す折れ線グラフである。
【図１５】図１５は、ＣＩＩによる免疫後２７日目、３４日目、および４１日目の、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処置したマウス（−■−）またはＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）で処置したマウス（−●−）における単球走化性タンパク質１（ＭＰＣ−１）の血清レベル（ｐｇ／ｍｌ）を示すプロットである。
【図１６】図１６は、単球走化性タンパク質３（ＭＰＣ−３）の血清レベル（ｐｇ／ｍｌ）を、臨床スコアと対比して示す折れ線グラフである。
【図１７】図１７は、ＣＩＩによる免疫後２７日目、３４日目、および４１日目の、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処置したマウス（−■−）またはＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）で処置したマウス（−●−）における単球走化性タンパク質３（ＭＰＣ−３）の血清レベル（ｐｇ／ｍｌ）を示すプロットである。
【図１８】図１８は、ＣＩＩによる免疫後２７日目、３４日目、および４１日目の、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処置したマウス（−■−）またはＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）で処置したマウス（−●−）におけるマクロファージ（ｐｈａｇｅ）炎症性タンパク質２（ＭＩＰ−２）の血清レベル（ｐｇ／ｍｌ）を示すプロットである。
【図１９】図１９である。
【図２０】図２０Ａ、２０Ｂ、および２０Ｃは、表示される炎症促進性サイトカイン／ケモカインについての、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処置したマウス（黒色バー）またはビヒクルコントロールで処置したマウス（白色バー）の血漿炎症促進性サイトカインおよび炎症促進性ケモカインのレベルを示す棒グラフである。ＴＮＦα（図６ａ）、ＩＬ−６（図６ｂ）、およびＭＣＰ−１（図６ｃ）。
【図２１】図２１は、ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞促進条件下で、培養プレートに結合させたかまたは溶液中のコントロールＩｇＧ（白色バー）またはＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（黒色バー）と共に培養し、かつ、ビーズに結合させた抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体により、またはオボアルブミンペプチドでパルスした抗原提示細胞により活性化させたナイーブＴ細胞についての、マウスＴ細胞増殖（［３Ｈ］チミジンの取込み）を示す棒グラフである。
【図２２】図２２は、Ｔｈ１細胞促進条件下で、培養プレートに結合させたかまたは溶液中のコントロールＩｇＧ（白色バー）またはＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（黒色バー）と共に培養し、かつ、ビーズに結合させた抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体により、またはオボアルブミンペプチドでパルスした抗原提示細胞により活性化させたマウスＣＤ４＋ナイーブＴ細胞により生成されるＩＦＮ−γ（ｎｇ／ｍｌ）を示す棒グラフである。
【図２３】図２３は、Ｔｈ１７細胞促進条件下で、培養プレートに結合させたかまたは溶液中のコントロールＩｇＧ（白色バー）またはＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（黒色バー）と共に培養し、かつ、ビーズに結合させた抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体により、またはオボアルブミンペプチドでパルスした抗原提示細胞により活性化させたＣＤ４＋ナイーブＴ細胞についての、マウスＴ細胞増殖（［３Ｈ］チミジンの取込み）を示す棒グラフである。
【図２４】図２４は、Ｔｈ１７細胞促進条件下で、培養プレートに結合させたかまたは溶液中のコントロールＩｇＧ（白色バー）またはＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（黒色バー）と共に培養し、かつ、ビーズに結合させた抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体により、またはオボアルブミンペプチドでパルスした抗原提示細胞により活性化させたマウスナイーブＴ細胞により生成されるＩＬ１７（ｎｇ／ｍｌ）を示す棒グラフである。
【図２５】図２５は、Ｔｈ１７細胞促進条件下で、培養プレートに結合させたかまたは溶液中のコントロールＩｇＧ（白色バー）またはＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（黒色バー）と共に培養し、かつ、ビーズに結合させた抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体により、またはオボアルブミンペプチドでパルスした抗原提示細胞により活性化させたマウスナイーブＴ細胞により生成されるＴＮＦ−α（ｎｇ／ｍｌ）を示す棒グラフである。
【図２６】図２６は、Ｔｈ２細胞促進条件下で、培養プレートに結合させたかまたは溶液中のコントロールＩｇＧ（白色バー）またはＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（黒色バー）と共に培養し、かつ、ビーズに結合させた抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体により、またはオボアルブミンペプチドでパルスした抗原提示細胞により活性化させたＣＤ４＋ナイーブＴ細胞についての、マウスＴ細胞増殖（［３Ｈ］チミジンの取込み）を示す棒グラフである。
【図２７】図２７は、Ｔｈ１細胞促進条件下で培養し、オボアルブミンペプチドで刺激したマウスナイーブＴ細胞により生成されるＩＮＦ−γ（ｎｇ／ｍｌ）を、コントロールＩｇＧ（−○−）またはロット番号２２のＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（−●−）もしくはロット番号２３のＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（−▲−）の濃度（μｇ／ｍｌ）の関数として示す折れ線グラフである。
【図２８】図２８は、Ｔｈ１７細胞促進条件下で培養し、オボアルブミンペプチドで刺激したマウスナイーブＴ細胞により生成されるＩＬ−１７（ｎｇ／ｍｌ）を、コントロールＩｇＧ（−○−）またはロット番号２２のＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（−●−）もしくはロット番号２３のＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（−▲−）の濃度（μｇ／ｍｌ）の関数として示す折れ線グラフである。
【図２９】図２９は、Ｔｈ１細胞促進条件（−●−）下またはＴｈ１７細胞促進条件（−▲−）下で培養し、ビーズに結合させた抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で刺激し、かつ、その培養物（溶液）に漸増濃度のヒトＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（μｇ／ｍｌ）を直接添加することによって処理したＣＤ４＋ナイーブＴ細胞についての、マウスＴ細胞増殖（［３Ｈ］チミジンの取込み）を示す折れ線グラフである。
【図３０】図３０は、Ｔｈ１細胞促進条件（−●−）下またはＴｈ１７細胞促進条件（−▲−）下で培養し、ビーズに結合させた抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で刺激し、かつ、その培養物（溶液）に漸増濃度のヒトＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（μｇ／ｍｌ）を直接添加することによって処理したマウスＣＤ４＋ナイーブＴ細胞により生成されるＩＮＦ−γ（ｎｇ／ｍｌ）を示す折れ線グラフである。
【図３１】図３１は、Ｔｈ１細胞促進条件（−●−）下またはＴｈ１７細胞促進条件（−▲−）下で培養し、ビーズに結合させた抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で刺激し、かつ、その培養物（溶液）に漸増濃度のヒトＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（μｇ／ｍｌ）を直接添加することによって処理したマウスＣＤ４＋ナイーブＴ細胞により生成されるＩＬ１７（ｎｇ／ｍｌ）を示す折れ線グラフである。
【図３２】図３２Ａおよび３２Ｂは、Ｔｈ１細胞促進条件下で培養し、オボアルブミンペプチドでパルスした抗原提示細胞により刺激し、かつ、種々の濃度（μｇ／ｍｌ）のコントロールＩｇＧまたはＢ７−Ｈ４−Ｉｇで処理した、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の存在下または非存在下におけるマウスＣＤ４＋ＣＤ６２＋ナイーブＴ細胞により生成される、（Ａ）ではＩＮＦ−γ（ｎｇ／ｍｌ）ならびに（Ｂ）ではＩＬ−１０（ｎｇ／ｍｌ）を示す折れ線グラフである。コントロールＩｇＧで処理したＣＤ２５＋Ｔ細胞を含有するＴ細胞を●として示し、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処理したＣＤ２５＋Ｔ細胞を含有するＴ細胞を▲として示す。ＣＤ２５＋Ｔ細胞を枯渇させ、コントロールＩｇＧで処理したＴ細胞を○として示し、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処理したＴ細胞を△として示す。
【図３３】図３３Ａおよび３３Ｂは、Ｔｈ１７細胞促進条件下で培養し、オボアルブミンペプチドでパルスした抗原提示細胞により刺激し、かつ、種々の濃度（μｇ／ｍｌ）の異なるコントロールＩｇＧまたはＢ７−Ｈ４−Ｉｇで処理した、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の存在下または非存在下におけるマウスＣＤ４＋ＣＤ６２＋ナイーブＴ細胞により生成される、（Ａ）ではＩＬ−１７Ａ（ｎｇ／ｍｌ）ならびに（Ｂ）ではＩＬ−１０（ｎｇ／ｍｌ）を示す折れ線グラフである。コントロールＩｇＧで処理したＣＤ２５＋Ｔ細胞を含有するＴ細胞を●として示し、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処理したＣＤ２５＋Ｔ細胞を含有するＴ細胞を▲として示す。ＣＤ２５＋Ｔ細胞を枯渇させ、コントロールＩｇＧで処理したＴ細胞を○として示し、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処理したＴ細胞を△として示す。
【図３４】図３４は、ｎＴｒｅｇによる抑制アッセイを例示するフローチャートである。
【図３５】図３５は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）としての放射線照射した非精製脾細胞、抗ＣＤ３抗体、ならびに様々な量のマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（０（−●−）、１（−■−）、５（−▲−）、または１０（−▼−）μｇ／ｍＬ）を加えた、比１：０、１：０．１２、１：０．２５、１：０．５、１：１、および１：２のＣＤ４＋／ＧＦＰ−レスポンダーナイーブＴ細胞およびＣＤ４＋／ＧＦＰ＋ｎＴｒｅｇ細胞についての、Ｔ細胞増殖（［３Ｈ］チミジンの取込み）を示す折れ線グラフである。
【図３６】図３６は、多発性硬化症（ＭＳ）についてのマウス自己免疫性Ｒ−ＥＡＥモデルを使用するｉｎ  ｖｉｖｏ研究における、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の誘発および処置レジメンを概略的に例示する図である。
【図３７】図３７は、０日目に６０μｇ（３ｍｇ／ｋｇ）のコントロールＩｇＧ（○）、または６０μｇ（３ｍｇ／ｋｇ）のＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（●）で治療したＥＡＥ誘発ＳＪＬマウスにおける平均臨床スコアを、疾患誘発後の日数と対比させる折れ線グラフである。
【図３８】図３８は、２１日目に６０μｇ（３ｍｇ／ｋｇ）のコントロールＩｇＧ（○）、または６０μｇ（３ｍｇ／ｋｇ）のＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（●）で処置したＥＡＥ誘発ＳＪＬマウスにおける平均臨床スコアを、疾患誘発後の日数と対比させる折れ線グラフである。
【図３９】図３９は、０日目または２１日目にコントロールＩｇＧまたはマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇで処置したＥＡＥマウスにおいて、５０日目にＰＬＰ１３９〜１５１またはＰＬＰ１７８〜１９１で耳感作した後、５５日目に平均耳腫脹（×１０−４インチ）により測定したときの遅延型過敏（ＤＴＨ）反応を示す棒グラフである。白四角は、ｔ＝０において投与されたコントロールＩｇＧであり、黒四角は、ｔ＝０において投与されたＢ７−Ｈ４−Ｉｇであり、右上がりの斜線を付した四角は、ｔ＝２１において投与したコントロールＩｇＧであり、左上がりの斜線を付した四角は、ｔ＝２１において投与したＢ７−Ｈ４−Ｉｇである。＊コントロールＩｇＧ注射マウスを有意に下回るＤＴＨ反応（ｐ＜０．０１）。
【図４０】図４０は、０日目または２１日目にＢ７−Ｈ４−ＩｇおよびコントロールＩｇＧで処置したＥＡＥマウスのリンパ節から単離したＴ細胞についての、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、疾患誘発性の優性エピトープであるＰＬＰ１３９〜１５１、ならびに拡大エピトープに特異的なペプチドであるＰＬＰ１７８〜１９１で処理した後のＴ細胞増殖（ΔＣＰＵ（１分間当たりのカウント））を示す棒グラフである。白四角は、ｔ＝０において投与されたコントロールＩｇＧであり、黒四角は、ｔ＝０において投与されたＢ７−Ｈ４−Ｉｇであり、右上がりの斜線を付した四角は、ｔ＝２１において投与したコントロールＩｇＧであり、左上がりの斜線を付した四角は、ｔ＝２１において投与したＢ７−Ｈ４−Ｉｇである。＊コントロールＩｇＧ注射マウスを有意に下回る［３Ｈ］−チミジンの取込み（ｐ＜０．０１）。
【図４１】図４１は、０日目または２１日目にＢ７−Ｈ４−ＩｇおよびコントロールＩｇＧで処置したＥＡＥマウスのリンパ節から単離し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、疾患誘発性の優性エピトープであるＰＬＰ１３９〜１５１、ならびに拡大エピトープに特異的なペプチドであるＰＬＰ１７８〜１９１で処理した後のＴ細胞により生成されるＩＦＮ−γ（ｐｇ／ｍｌ）を示す棒グラフである。白四角は、ｔ＝０において投与されたコントロールＩｇＧであり、黒四角は、ｔ＝０において投与されたＢ７−Ｈ４−Ｉｇであり、右上がりの斜線を付した四角は、ｔ＝２１において投与したコントロールＩｇＧであり、左上がりの斜線を付した四角は、ｔ＝２１において投与したＢ７−Ｈ４−Ｉｇである。＊コントロールＩｇＧ注射マウスを有意に下回るＩＦＮ−γの生成（ｐ＜０．０１）。
【図４２】図４２は、疾患誘発後の０日目〜１０日目の間に、５回にわたり、６０μｇのＢ７−Ｈ４−Ｉｇ、３００μｇのＢ７−Ｈ４−Ｉｇ、またはコントロールＩｇＧを注射して処置したＥＡＥマウスにおいて、１０日目にＰＬＰ１３９〜１５１ペプチドまたはＯＶＡ３２３〜３３９ペプチドで耳感作した後の、ＯＶＡ反応を差し引いたΔ平均耳腫脹（×１０−４インチ）を示す棒グラフである。＊コントロールＩｇＧ注射マウスを有意に下回るＤＴＨ反。
【図４３】図４３は、図４２で説明したＥＡＥマウスのリンパ節から単離し、抗ＣＤ３抗体（０．１〜１０μｇ／ｍＬ）、ＰＬＰ１３９〜１５１（１〜２０μｇ／ｍＬ）、またはＯＶＡ３２３〜３３９（１〜２０μｇ／ｍＬ）の存在下で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて再活性化させたＴ細胞増殖（ΔＣＰＵ（１分間当たりのカウント））を示す折れ線グラフである。
【図４４】図４４は、多発性硬化症（ＭＳ）についてのマウス自己免疫性Ｒ−ＥＡＥモデルを使用するｉｎ  ｖｉｖｏ研究における、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の誘発および処置レジメンを概略的に例示する図である。
【図４５】図４５Ａ、４５Ｂ、および４５Ｃは、ＣＦＡ中で乳化させた５０μｇのＰＬＰペプチドにより免疫したＳＪＬマウスから５０日目に単離した、脾臓（Ａ）、排出リンパ節（Ｂ）、およびＣＮＳにおける全リンパ球数（×１０６個）を示す棒グラフである。寛解期において、コントロールＩｇＧまたはＢ７−Ｈ４−Ｉｇでマウスを処置した：投与１回当たり６０または３００μｇ、１週間当たり３回投与で２週間にわたり（６回の投与により）処置した。
【図４６】図４６Ａ、４６Ｂ、および４６Ｃは、図４５で説明した脾臓（Ａ）、排出リンパ節（Ｂ）、またはＣＮＳから単離したＴ細胞サブセットの数（×１０６個）を示す棒グラフであり、Ｔ細胞サブセットとは、ＣＤ４＋細胞（Ｔ細胞）、ＣＤ４＋／ＦｏｘＰ３＋（Ｔｒｅｇ）、およびＣＤ４＋／ＣＤ４４＋細胞（エフェクター／メモリーＴ細胞）であった。個々のマウスに由来する各表現型についての平均細胞数として、データを示す。
【図４７】図４７は、コントロールＩｇＧ、６０μｇのＢ７−Ｈ４−Ｉｇ、または３００μｇのＢ７−Ｈ４−Ｉｇによる処置についての、図４６からのＣＤ４＋Ｔ細胞中のＴｒｅｇの百分率を示す棒グラフである。
【図４８】図４８Ａおよび４８Ｂは、ＣＦＡ中で乳化させた５０μｇのＰＬＰペプチドにより免疫したＳＪＬマウスから３５日目に単離し、抗ＣＤ３抗体（１ｕｇ／ｍＬ）、ＰＬＰ１３９〜１５１（２０μｇ／ｍＬ）、またはＰＬＰ１７８〜１９１（２０μｇ／ｍＬ）の存在下で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて活性化させた総脾細胞（Ａ）およびリンパ節細胞（Ｂ）の増殖（ＣＰＵ（１分間当たりのカウント））を示す棒グラフである。寛解期において、コントロールＩｇＧまたはＢ７−Ｈ４−Ｉｇでマウスを処置した：投与１回当たり６０または３００μｇ、１週間当たり３回投与で２週間にわたり（６回の投与により）処置した。
【図４９】図４９は、疾患の誘発後５０日の期間（日数）にわたる、ＳＪＬマウスの平均臨床スコアを示す折れ線グラフである。疾患誘発後の２３日目から、１週間当たり３回、６０μｇのＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（−●−）、３００μｇのＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（−▲−）、またはコントロールＩｇＧ（−△−）でマウスを処置した。
【図５０】図５０は、多発性硬化症（ＭＳ）についてのマウス自己免疫性Ｒ−ＥＡＥモデルを使用するｉｎ  ｖｉｖｏ研究における、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の誘発およびヒトＢ７−Ｈ４−Ｉｇの処置レジメンを概略的に例示する図である。
【図５１】図５１Ａおよび５１Ｂは、疾患の誘発後５５日の期間（日数）にわたる、ＳＪＬマウスの平均臨床スコア（Ａ）および長期再発率（Ｂ）を示す折れ線グラフである。疾患誘発後の２３日目から、１週間当たり３回で４週間にわたり、１００μｇのヒトＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（５ｍｇ／ｋｇ）、５００μｇのヒトＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（２５ｍｇ／ｋｇ）、または１００μｇのコントロールＩｇＧ、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）（５ｍｇ／ｋｇ）でマウスを処置した。
【図５２】図５２は、糖尿病を有するＣＴＬＡ４ＫＤ／ＮＯＤマウスの百分率を、１週間当たり３回で４週間にわたる（１５ｍｇ／ｋｇ；腹腔内（ｉ．ｐ．）注射による）Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ処置後の週数と対比して示す折れ線グラフである。マウスは、２週齢とした。
【図５３】図５３は、糖尿病を有するＣＴＬＡ４ＫＤ／ＢＤＣ２．５／ＮＯＤマウスの百分率を、１週間当たり３回で４週間にわたる（１５ｍｇ／ｋｇ；腹腔内（ｉ．ｐ．）注射による）Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ処置後の週数と対比して示す折れ線グラフである。マウスは、１１週齢とした。
【図５４】図５４は、コントロールマウスならびに種々の用量のＢ７−Ｈ４−Ｉｇで処置したマウスに由来するＴｒｅｇ細胞の増殖百分率を示す棒グラフである。５日間にわたる腸内抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞増殖アッセイにおいて、Ｔｒｅｇ細胞を滴定した。各カラムは、Ｔｒｅｇに曝露しなかった培養物に対する百分率で表わされる、４連の培養物の平均ｃｐｍ値を表わし、バーは、ＳＤを表わす。グラフ内の左から右への３つのカラムの各群は、コントロール、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ（６０μｇ）、またはＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（３００μｇ）で処置したマウスに由来するＴｒｅｇを表わす。
【図５５】図５５は、コントロールマウスまたはＢ７−Ｈ４−Ｉｇで処置したマウスから回収され、かつ、５日間にわたり、腸内抗原でパルスした脾細胞であるＡＰＣへと曝露されたＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞の増殖（ｃｐｍ）を示す棒グラフである。各カラムは、４連の培養物の平均ｃｐｍ値を表わし、バーは、ＳＤを表わす。グラフ内の左から右への３つのカラムの各群は、コントロール、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ（６０μｇ）、またはＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（３００μｇ）で処置したマウスに由来するＴｒｅｇを表わす。
【図５６】図５６は、Ｔｈ１７分化カクテルの存在下で抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体により活性化し、かつ、４日間にわたる培養の９日目、１日目、または２日目にマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇ、マウスアイソタイプＩｇＧ２ａコントロール、またはレチノイン酸（ＲＡ）をその培養物に添加した、Ｂａｌｂ／ＣマウスのナイーブＴ細胞により分泌されたＩＬ−１７Ａの量（ｎｇ／ｍｌ）を示す棒グラフである。
【図５７】図５７は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体およびマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇにより活性化させたマウスナイーブＴ細胞におけるｍＲＮＡの上方制御または下方制御の倍数を、マウスアイソタイプコントロールと対比して示す棒グラフである。すべての細胞を、Ｔｈ１７分化カクテルの存在下で培養した。定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、Ｔｈ１７細胞、Ｔｒｅｇ細胞、自己免疫性障害、および／または炎症に関与するｍＲＮＡの発現について調べた。
【図５８】図５８は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体、ならびに融合タンパク質の４６位においてＱまたはＬを伴うヒトＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（１μｇ／ｍＬ）により活性化するか、またはアイソタイプコントロールとしての、呼吸器系合胞体ウイルスのＦタンパク質のＡ抗原部位におけるエピトープに対して得られたヒト化モノクローナルＩｇＧ抗体（Ｓｙｎａｇｉｓ）により活性化させたヒトＴ細胞におけるｍＲＮＡの上方制御または下方制御の倍数を示す棒グラフである。すべての細胞を、Ｔｈ１７分化カクテルの存在下で培養した。定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、Ｔｈ１７細胞、Ｔｒｅｇ細胞、自己免疫性障害、および／または炎症に関与するｍＲＮＡの発現について調べた。
【図５９】図５９は、表示される濃度のマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇ、マウスＩｇＧコントロール、またはレチノイン酸で処理したＴＨ１７細胞により生成されるＩＬ−１７Ａの濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す棒グラフである。
【図６０】図６０は、マウスＴｈ１７細胞における、Ｂ７−Ｈ４−ＩｇＱの活性（■）、Ｂ７−Ｈ４−ＩｇＬの活性（▲）をＳｙｎａｇｉｓの活性（◆）（無関係のヒトＩｇＧ１抗体）と対比して示す、ＩＬ−１７Ａ濃度（ｎｇ／ｍｌ）対タンパク質濃度（μｇ／ｍｌ）の折れ線グラフである。
【図６１】図６１は、マウスＴｈ１７細胞における、マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇの活性（ロット２２（■）およびロット２３（▲））を、マウスＩｇＧコントロールの活性（◆）およびレチノイン酸コントロールの活性（×）と対比して示す、ＩＬ−１７Ａ濃度（ｎｇ／ｍｌ）対タンパク質濃度（μｇ／ｍｌ）の折れ線グラフである。
【図６２】図６２は、ＭＲＬ／ｌｐｒループスマウスモデルを使用するｉｎ  ｖｉｖｏ研究の処置スケジュールを概略的に例示する図である。
【図６３】図６３は、コントロールによる処置群、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇおよびシクロホスファミド（ＣＴＸ）による組合せ処置群、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ単独処置群、ならびにＣＴＸ単独処置群で、処置前（４週齢）および２１週齢まで定期的に、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスから回収した血漿に検出される抗ｄｓＤＮＡ自己抗体（単位）を示す棒グラフである。各処置群についての、左から右へのバーは、４、７、８、９、１０、１１、１５、１９、および２１週間における抗ｄｓＤＮＡ自己抗体を示す。
【図６４】図６４は、２１週間におけるコントロールによる処置群、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇおよびシクロホスファミド（ＣＴＸ）による組合せ処置群、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ単独処置群、ならびにＣＴＸ単独処置群におけるタンパク質指標（単位）を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
Ｉ．定義
本明細書で用いられる「単離」という用語は、その化合物が天然で存在する環境とは異なる環境内にある対象の化合物（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）、例えば、ペプチドを、それが天然では見出されない濃度へと濃縮することなどにより、その天然の環境から分離した化合物を指す。「単離」には、対象の化合物について実質的に富化された試料内にある化合物、ならびに／またはその中において対象の化合物が部分的もしくは実質的に精製された試料内にある化合物が包含される。
【００４８】
「免疫細胞」とは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、樹状細胞、およびマクロファージが含まれるがこれらに限定されない、造血細胞系統に由来する任意の細胞を指す。
【００４９】
本明細書で用いられる「ポリペプチド」という用語は、修飾（例えば、リン酸化またはグリコシル化）に関わらず、任意の長さのアミノ酸鎖を指す。
【００５０】
本明細書で用いられる「共刺激ポリペプチド」または「共刺激分子」とは、Ｔ細胞の細胞表面分子と相互作用すると、Ｔ細胞反応を調節するポリペプチドである。
【００５１】
本明細書で用いられる「共刺激シグナル伝達」とは、抗原提示細胞上における共刺激ポリペプチドと、Ｔ細胞上におけるその受容体とが、抗原特異的Ｔ細胞反応の間に相互作用することから生じるシグナル伝達活性である。抗原特異的Ｔ細胞反応は、２つのシグナル：１）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が、ＭＨＣとの関係で提示される抗原ペプチドと会合することによるシグナル（シグナル１）、ならびに２）異なる共刺激受容体／リガンド対間の接触により送達される、抗原に依存しない第２のシグナル（シグナル２）を介する。この「第２のシグナル」は、Ｔ細胞反応（活性化対阻害）の他、この反応の強度および持続時間を決定するのに極めて重要であり、Ｂ７ファミリーのタンパク質など、共刺激分子からの正負両方のシグナルにより制御される。
【００５２】
本明細書で用いられる「Ｂ７ポリペプチド」という用語は、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−ＤＣ、Ｂ７−Ｈ５、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ならびにこれらの生物学的に活性な断片および／または改変体が含まれるがこれらに限定されない、Ｔ細胞を共刺激するＢ７ファミリーのタンパク質のメンバーを意味する。代表的な、生物学的に活性な断片には、Ｔ細胞を共刺激する細胞外ドメイン、またはＴ細胞を共刺激する細胞外ドメインの断片が含まれる。
【００５３】
本明細書で用いられる「可溶性Ｂ７−Ｈ４」または「ｓＨ４」とは、Ｂ７−Ｈ４を発現する細胞から漏出するか、分泌されるか、または他の方法で抽出されうる、Ｂ７−Ｈ４の断片を指す。Ｂ７−Ｈ４の可溶性断片は、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドの細胞外ドメインのうちの一部または全部を含み、その細胞内ドメインおよび／または膜貫通ドメインのうちの一部または全部を欠く。一実施形態では、可溶性Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド断片が、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドの細胞外ドメインの全体を含む。他の実施形態では、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドの可溶性断片が、上記細胞外ドメインの断片を含む。Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドの細胞外ドメインは、ハイドロパシープロットなどの標準的な方法を用いて、当業者が容易に決定することが可能である。
【００５４】
本明細書で用いられる「炎症性分子」とは、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２１、およびＭＭＰなどを含むがそれに限定されないサイトカインおよびメタロプロテアーゼを含むがそれに限定されない、炎症反応を結果としてもたらす分子を指す。
【００５５】
本明細書で用いられる「ベクター」とは、挿入されたセグメントの複製をもたらすように、その中に別のＤＮＡセグメントを挿入しうる、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどのレプリコンである。本明細書で説明されるベクターは、発現ベクターでありうる。
【００５６】
本明細書で用いられる「発現ベクター」とは、１つ以上の発現調節配列を含むベクターである。
【００５７】
本明細書で用いられる「発現調節配列」とは、別のＤＮＡ配列の転写および／または翻訳を調節する（ｃｏｎｔｒｏｌ）および制御する（ｒｅｇｕｌａｔｅ）ＤＮＡ配列である。
【００５８】
「作動可能に連結された」とは、このように説明される構成要素が、それらの通常の機能または意図される機能を果たすように構成される、エレメントの配置を指す。したがって、併せて作動可能に連結された２つの異なるポリペプチドは、併せて物理的に連結されたものではあるが、それら各々の生物学的機能を保持する。
【００５９】
本明細書で用いられる「価数」とは、分子１個当たりの利用可能な結合部位の数を指す。
【００６０】
本明細書で用いられる「改変体」のポリペプチドは、対応する野生型ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸配列の変化を含有する。
【００６１】
本明細書で用いられる「保存的」アミノ酸置換とは、置換されたアミノ酸が、類似の構造的特性または化学的特性を有する置換である。
【００６２】
本明細書で用いられる「宿主細胞」とは、その中に組換えベクターを導入しうる原核生物細胞および真核生物細胞を指す。
【００６３】
本明細書で用いられる「形質転換」および「トランスフェクト」とは、当技術分野で公知の多数の技法により、核酸（例えば、ベクター）を細胞へと導入することを包含する。
【００６４】
本明細書で用いられる通り、分子が標的に「特異的に結合する」または標的に対する「特異的な結合を示す」という語句は、他の生物学的物質（ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）の異種集団の存在下においてその分子の存在を決定する結合反応を指す。規定されたイムノアッセイ条件下において、指定の分子は、特定の標的に優先的に結合するが、試料中に存在する他の生物学的物質に対して相当量で結合することはない。このような条件下における、標的に対する抗体の特異的な結合は、上記抗体が、上記標的に対するその特異性について選択されることを必要とする。各種のイムノアッセイフォーマットを用いて、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体を選択するのに日常的に用いられる。特異的な免疫反応性を決定するのに用いうるイムノアッセイのフォーマットおよび条件の説明については、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８年）、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。
【００６５】
本明細書で用いられる「免疫学的」（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ）、「免疫学的な」（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ）、または「免疫」（ｉｍｍｕｎｅ）反応という用語は、レシピエントである患者におけるペプチドに対して得られた、有益な体液性（抗体媒介性）反応および／または細胞性（抗原特異的なＴ細胞またはそれらの分泌生成物により媒介される）反応の発達である。このような反応は、免疫原を投与することにより誘導される能動反応の場合もあり、抗体またはプライミングされたＴ細胞を投与することにより誘導される受動反応の場合もある。細胞性免疫反応は、クラスＩ  ＭＨＣ分子またはクラスＩＩ  ＭＨＣ分子と会合したポリペプチドエピトープの提示により誘発されて、抗原特異的なＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞および／またはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を活性化する。細胞性免疫反応はまた、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、好塩基球、樹状細胞、星状細胞、神経小膠細胞、好酸球の活性化、好中球または自然免疫の他の構成要素の活性化または動員も伴いうる。細胞媒介性免疫学的反応の存在は、増殖アッセイ（ＣＤ４＋Ｔ細胞）またはＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）アッセイにより決定することができる。免疫原による防御効果または治療効果への、体液性反応および細胞性反応の相対的な寄与は、免疫された同系動物から抗体およびＴ細胞を個別に単離し、第２の被験体における防御効果または治療効果を測定することにより識別することができる。
【００６６】
「免疫原性薬剤」または「免疫原」とは、必要に応じてアジュバントと共に、哺乳動物へと投与されたときに、それ自身に対する免疫学的反応を誘導することが可能である。
【００６７】
本明細書では、「個体」、「宿主」、「被験体」、および「患者」という用語が互換的に用いられ、ヒト、マウスおよびラットなどのげっ歯動物、ならびに他の実験動物が含まれるがこれらに限定されない哺乳動物を指す。
【００６８】
ＩＩ．融合タンパク質
Ｂ７−Ｈ４融合ポリペプチドは、第２のポリペプチドに直接的に融合するか、または上記第２のポリペプチドに融合するリンカーペプチド配列を介して第２のポリペプチドに融合するＢ７−Ｈ４タンパク質のうちの全部または一部を含む、第１の融合パートナーを有する。その融合タンパク質は、必要に応じて、２つ以上の融合タンパク質を二量体化または多量体化するように機能するドメインを含有する。そのペプチド／ポリペプチドリンカードメインは、別個のドメインの場合もあり、代替的に、上記融合タンパク質の他のドメインのうちの１つ（Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドまたは第２のポリペプチド）の内部に含有される場合もある。同様に、上記融合タンパク質を二量体化または多量体化するように機能するドメインは、別個のドメインの場合もあり、代替的に、上記融合タンパク質の他のドメイン（Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、第２のポリペプチド、またはペプチド／ポリペプチドリンカードメイン）のうちの１つ内に含有される場合もある。一実施形態では、上記二量体化／多量体化ドメインと、上記ペプチド／ポリペプチドリンカードメインとが同じである。
【００６９】
本明細書で開示される融合タンパク質は、式Ｉ：
Ｎ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｃ
［式中、「Ｎ」は、融合タンパク質のＮ末端を表わし、「Ｃ」は、融合タンパク質のＣ末端を表わす］の融合タンパク質である。好ましい実施形態では、「Ｒ１」が、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドであり、「Ｒ２」が、任意選択のペプチド／ポリペプチドリンカードメインであり、「Ｒ３」が、第２のポリペプチドである。代替的に、Ｒ３は、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドであることが可能であり、Ｒ１は、第２のポリペプチドでありうる。
【００７０】
二量体化または多量体化は、二量体化ドメインまたは多量体化ドメインを介して、２つ以上の融合タンパク質間で生じうる。代替的に、融合タンパク質の二量体化または多量体化は、化学的な架橋形成によっても生じうる。形成される二量体または多量体は、ホモ二量体／ホモ多量体の場合もあり、ヘテロ二量体／ヘテロ多量体の場合もある。
【００７１】
Ａ．Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド
好ましい実施形態では、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドが、哺乳動物種に由来する。最も好ましい実施形態では、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドが、マウス、非ヒト霊長動物（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ、およびＭａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、またはヒト起源のものである。有用なマウスＢ７−Ｈ４ポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１７８５９４またはＡＹ２８０９７３である核酸によりコードされるＢ７−Ｈ４ポリペプチドに対して、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列同一性を有する。有用なマウスＢ７−Ｈ４ポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号がＡＡＨ３２９２５．１またはＮＰ＿８４８７０９．２によるＢ７−Ｈ４ポリペプチドに対して、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列同一性を有する。有用なヒトＢ７−Ｈ４ポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号がＡＫ０２６０７１である核酸によりコードされるＢ７−Ｈ４ポリペプチドに対して、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列同一性を有する。有用なヒトＢ７−Ｈ４ポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０７８９０２．２またはＢＡＢ１５３４９．１によるＢ７−Ｈ４ポリペプチドに対して、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列同一性を有する。
【００７２】
マウスＢ７−Ｈ４ポリペプチドは、
【００７３】
【化１】
2013503204.tif 000003
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされうる。
【００７４】
マウスＢ７−Ｈ４ポリペプチドは、
【００７５】
【化２】
2013503204.tif 000004
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有しうる。
【００７６】
ヒトＢ７−Ｈ４ポリペプチドは、
【００７７】
【化３】
2013503204.tif 000005
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされうる。
【００７８】
ヒトＢ７−Ｈ４ポリペプチドは、
【００７９】
【化４】
2013503204.tif 000006
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有しうる。
【００８０】
非ヒト霊長動物Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドは、
【００８１】
【化５】
2013503204.tif 000007
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有しうる（配列番号１５および１６は、チンパンジー（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）のポリペプチド配列であり、配列番号１７および１８は、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）のポリペプチド配列であり、配列番号１９および２０は、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）のポリペプチド配列である）。
【００８２】
Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドをコードする核酸は、好まれる発現宿主における発現について最適化することができる。コドンは、Ｂ７−Ｈ４核酸配列が由来する哺乳動物と上記発現宿主の間でのコドン使用の違いを考慮して、同じアミノ酸をコードする代替のコドンで置換することができる。このようにして、発現宿主に好ましいコドンを用いて、核酸を合成することができる。
【００８３】
１．Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドの断片
上記Ｂ７−Ｈ４タンパク質は、抗体の可変ドメインおよび定常ドメインと類縁の、２つの免疫グロブリンドメインである、ＩｇＶドメイン（またはＶドメイン）およびＩｇＣドメイン（またはＣドメイン）を、その細胞外ドメイン内に含有する。当業者は、ファミリーデータベースおよびドメインデータベースを検索することにより、上記ドメインを同定することができる。単離ＩｇＶドメインに由来する機能的データに基づき、ならびに他のＢ７ファミリーメンバーとの類比により、上記ＩｇＶドメインが、受容体との結合に関与すると考えられる。細胞外ドメインの各Ｉｇドメインは、このフォールドに典型的であり、かつ、構造−機能にとって重要でありうる通り、ドメイン内のシステイン残基間で形成される１つのジスルフィド結合を含む。配列番号２、５、９、および１２では、これらのシステインが、ＩｇＶドメインでは残基５６および１３０に位置し、ＩｇＣドメインでは残基１６８および２２５に位置する。加えて、ＩｇＶドメインでは、１つのＮ連結されたグリコシル化部位の存在が予測され、上記ＩｇＣドメインでは、６つのグリコシル化部位の存在が予測されており、これらは、マウスＢ７−Ｈ４配列と、ヒトＢ７−Ｈ４配列とで保存されている。
【００８４】
一実施形態では、上記第１の融合パートナーが、Ｂ７−Ｈ４の断片である。本明細書で用いられるＢ７−Ｈ４断片とは、全長タンパク質より少なくとも１アミノ酸短いポリペプチドの任意のサブセットを指す。有用な断片は、それらの１つ以上の天然の受容体に結合する能力を保持する断片である。全長Ｂ７−Ｈ４の断片であるＢ７−Ｈ４ポリペプチドは、全長Ｂ７−Ｈ４と比較して、その天然の受容体（複数可）に結合する能力が、典型的には少なくとも２０パーセント、３０パーセント、４０パーセント、５０パーセント、６０パーセント、７０パーセント、８０パーセント、９０パーセント、９５パーセント、９８パーセント、９９パーセント、１００パーセント、なおまたは１００パーセント超である。
【００８５】
Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドの断片には、可溶性断片が含まれる。可溶性のＢ７−Ｈ４ポリペプチド断片とは、それらを生成させる細胞から漏出するか、分泌されるか、または他の方法で抽出されうる、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドの断片である。Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドの可溶性断片は、上記受容体ポリペプチドの細胞外ドメインの一部または全部を含み、かつ、細胞内ドメインおよび／または膜貫通ドメインの一部または全部を欠く。一実施形態では、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド断片が、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドの細胞外ドメインの全体を含む。他の実施形態では、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドの可溶性断片が、Ｂ７−Ｈ４の生物学的活性を保持する細胞外ドメインの断片を含む。上記細胞外ドメインは、上記膜貫通ドメインに由来する１、２、３、４、もしくは５の連続するアミノ酸、ならびに／またはそのシグナル配列に由来する１、２、３、４、もしくは５の連続するアミノ酸を含みうる。代替的に、上記細胞外ドメインは、Ｃ末端、Ｎ末端、またはこれらの両方から取り出された、１、２、３、４、５以上のアミノ酸を有しうる。一部の実施形態では、上記細胞外ドメインが、ＩｇＶドメインのみであるか、または全長タンパク質の残基５６および１３０に位置するＩｇＶドメインの保存システイン間の領域である。
【００８６】
一般に、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドまたはそれらの断片は、シグナル配列をコードする配列を含む核酸から発現される。一般に、そのシグナル配列が未成熟ポリペプチドから切断されて、上記シグナル配列を欠く成熟ポリペプチドが生成される。配列番号４、７、１１、１４、１６、１８、および２０は、各々が、シグナルペプチドを欠く。標準的な分子生物学の技法を用いて、Ｂ７−Ｈ４のシグナル配列を、別のポリペプチドのシグナル配列で置換して、そのポリペプチドの発現レベル、分泌、可溶性、または他の特性に影響を及ぼすことができる。上記Ｂ７−Ｈ４のシグナル配列を置換するのに用いられるシグナル配列は、当技術分野で公知の任意のシグナル配列でありうる。配列番号２、３、５、６、９、１０、１２、１３、１５、１７、および１９は、各々が、シグナルペプチドを含有する。
【００８７】
好ましい実施形態では、上記融合タンパク質が、Ｉｇ  Ｆｃ領域に融合した、Ｂ７−Ｈ４またはその断片の細胞外ドメインを含む。組換えＢ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質は、既に説明されている通り（Ｃｈａｐｏｖａｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．、４５巻：２４７〜２５５頁（２０００年））、Ｂ７−Ｈ４またはその断片の細胞外ドメインのコード領域を、ヒトＩｇＧ１またはマウスＩｇＧ２ａのＦｃ領域と融合させることにより、調製することができる。
【００８８】
ａ．マウスＢ７−ＤＣ細胞外ドメイン融合パートナー
一実施形態では、上記融合タンパク質の第１の融合パートナーが、マウスＢ７−Ｈ４またはその断片の細胞外ドメインを含む。上記第１の融合パートナーは、
【００８９】
【化６】
2013503204.tif 000008
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされうる。
【００９０】
別の実施形態では、上記第１の融合パートナーが、マウスアミノ酸配列：
【００９１】
【化７】
2013503204.tif 000009
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有しうる。
【００９２】
成熟タンパク質では、シグナル配列が除去される。加えて、他のポリペプチドまたは他の生物に由来するシグナルペプチドを用いて、作製時における宿主からの融合タンパク質の分泌を増強することができる。配列番号２８は、上記シグナル配列を伴わない、配列番号２４および配列番号２６のマウスアミノ酸配列：
【００９３】
【化８】
2013503204.tif 000010
を示す。
【００９４】
配列番号２９は、上記シグナル配列を伴わない、配列番号２５および配列番号２７のマウスアミノ酸配列：
【００９５】
【化９】
2013503204.tif 000011
を示す。
【００９６】
別の実施形態では、上記融合タンパク質の第１の融合パートナーが、マウスＢ７−Ｈ４のＩｇＶドメインを含む。一実施形態では、上記ＩｇＶドメインが、少なくとも、配列番号２または配列番号５の５６位におけるシステイン〜配列番号２または配列番号５の１３０位におけるシステインを含む。別の実施形態では、上記ＩｇＶドメインが、このアミノ酸範囲により定められるポリペプチドの少なくとも２５または５０アミノ酸の断片を含有する。
【００９７】
上記第１の融合パートナーは、例示的なＩｇＶドメインをコードする以下のヌクレオチド配列：
【００９８】
【化１０】
2013503204.tif 000012
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされうる。
【００９９】
上記第１の融合パートナーは、マウスアミノ酸配列：
【０１００】
【化１１】
2013503204.tif 000013
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有しうる。
【０１０１】
ｂ．ヒト細胞外ドメイン融合パートナー
別の実施形態では、上記融合タンパク質の第１の融合パートナーが、ヒトＢ７−Ｈ４またはその断片の細胞外ドメインを含む。上記第１の融合パートナーは、
【０１０２】
【化１２】
2013503204.tif 000014
【０１０３】
【化１３】
2013503204.tif 000015
【０１０４】
【化１４】
2013503204.tif 000016
【０１０５】
【化１５】
2013503204.tif 000017
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされうる。
【０１０６】
別の実施形態では、上記第１の融合パートナーが、ヒトアミノ酸配列：
【０１０７】
【化１６】
2013503204.tif 000018
【０１０８】
【化１７】
2013503204.tif 000019
【０１０９】
【化１８】
2013503204.tif 000020
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有しうる。
【０１１０】
成熟タンパク質では、シグナル配列が除去される。加えて、他のポリペプチドまたは他の生物に由来するシグナルペプチドを用いて、作製時における宿主からの融合タンパク質の分泌を増強することができる。配列番号５５は、上記シグナル配列を伴わない、配列番号４３および配列番号４９のヒトアミノ酸配列：
【０１１１】
【化１９】
2013503204.tif 000021
を示す。
【０１１２】
配列番号５６は、上記シグナル配列を伴わない、配列番号４６および配列番号５２のヒトアミノ酸配列：
【０１１３】
【化２０】
2013503204.tif 000022
を示す。
【０１１４】
配列番号５７は、上記シグナル配列を伴わない、配列番号４４および配列番号５０のヒトアミノ酸配列：
【０１１５】
【化２１】
2013503204.tif 000023
を示す。
【０１１６】
配列番号５８は、上記シグナル配列を伴わない、配列番号４７および配列番号５３のヒトアミノ酸配列：
【０１１７】
【化２２】
2013503204.tif 000024
を示す。
【０１１８】
配列番号５９は、上記シグナル配列を伴わない、配列番号４５および配列番号５１のヒトアミノ酸配列：
【０１１９】
【化２３】
2013503204.tif 000025
を示す。
【０１２０】
配列番号６０は、上記シグナル配列を伴わない、配列番号４８および配列番号５４のヒトアミノ酸配列：
【０１２１】
【化２４】
2013503204.tif 000026
を示す。
【０１２２】
他の実施形態では、配列番号４５、４８、５１、５４、５９、および６０から、最後のアラニン残基およびセリン残基が除去される。
【０１２３】
別の実施形態では、上記融合タンパク質の第１の融合パートナーが、ヒトＢ７−Ｈ４のＩｇＶドメインを含む。一実施形態では、上記ＩｇＶドメインが、少なくとも、配列番号９または配列番号１２の５６位におけるシステイン〜配列番号９または配列番号１２の１３０位におけるシステインを含む。別の実施形態では、上記ＩｇＶドメインが、このアミノ酸範囲により定められるポリペプチドの少なくとも２５または５０アミノ酸の断片を含有する。
【０１２４】
上記第１の融合パートナーは、例示的なＩｇＶドメインをコードする以下のヌクレオチド配列：
【０１２５】
【化２５】
2013503204.tif 000027
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされうる。
【０１２６】
上記第１の融合パートナーは、ヒトアミノ酸配列：
【０１２７】
【化２６】
2013503204.tif 000028
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有しうる。
【０１２８】
ｃ．非ヒト霊長動物細胞外ドメイン融合パートナー
別の実施形態では、上記融合タンパク質の第１の融合パートナーが、非ヒト霊長動物Ｂ７−Ｈ４またはその断片の細胞外ドメインを含む。例示的な非ヒト霊長動物には、チンパンジー（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）、およびカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）が含まれるがこれらに限定されない。
【０１２９】
上記第１の融合パートナーは、チンパンジー（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）アミノ酸配列：
【０１３０】
【化２７】
2013503204.tif 000029
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有しうる。
【０１３１】
成熟タンパク質では、シグナル配列が除去される。加えて、他のポリペプチドまたは他の生物に由来するシグナルペプチドを用いて、作製時における宿主からの融合タンパク質の分泌を増強することができる。
【０１３２】
配列番号６８は、上記シグナル配列を伴わない、配列番号６５のチンパンジーアミノ酸配列：
【０１３３】
【化２８】
2013503204.tif 000030
を示す。
【０１３４】
配列番号６９は、上記シグナル配列を伴わない、配列番号６６のチンパンジーアミノ酸配列：
【０１３５】
【化２９】
2013503204.tif 000031
を示す。
【０１３６】
配列番号７０は、上記シグナル配列を伴わない、配列番号６７のチンパンジーアミノ酸配列：
【０１３７】
【化３０】
2013503204.tif 000032
を示す。
【０１３８】
上記第１の融合パートナーは、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）アミノ酸配列：
【０１３９】
【化３１】
2013503204.tif 000033
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有しうる。
【０１４０】
成熟タンパク質では、シグナル配列が除去される。加えて、他のポリペプチドまたは他の生物に由来するシグナルペプチドを用いて、作製時における宿主からの融合タンパク質の分泌を増強することができる。
【０１４１】
配列番号７４は、上記シグナル配列を伴わない、配列番号７１のアカゲザルアミノ酸配列：
【０１４２】
【化３２】
2013503204.tif 000034
を示す。
【０１４３】
配列番号７５は、上記シグナル配列を伴わない、配列番号７２のアカゲザルアミノ酸配列：
【０１４４】
【化３３】
2013503204.tif 000035
を示す。
【０１４５】
配列番号７６は、上記シグナル配列を伴わない、配列番号７３のアカゲザルアミノ酸配列：
【０１４６】
【化３４】
2013503204.tif 000036
を示す。
【０１４７】
上記第１の融合パートナーは、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）アミノ酸配列：
【０１４８】
【化３５】
2013503204.tif 000037
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有しうる。
【０１４９】
成熟タンパク質では、シグナル配列が除去される。加えて、他のポリペプチドまたは他の生物に由来するシグナルペプチドを用いて、作製時における宿主からの融合タンパク質の分泌を増強することができる。
【０１５０】
配列番号８０は、上記シグナル配列を伴わない、配列番号７７のカニクイザルアミノ酸配列：
【０１５１】
【化３６】
2013503204.tif 000038
を示す。
【０１５２】
配列番号８１は、上記シグナル配列を伴わない、配列番号７８のカニクイザルアミノ酸配列：
【０１５３】
【化３７】
2013503204.tif 000039
を示す。
【０１５４】
配列番号８２は、上記シグナル配列を伴わない、配列番号７９のカニクイザルアミノ酸配列：
【０１５５】
【化３８】
2013503204.tif 000040
を示す。
【０１５６】
他の実施形態では、配列番号６７、７０、７３、７６、７９、および８２から、最後のアラニン残基およびセリン残基が除去される。
【０１５７】
別の実施形態では、上記融合タンパク質の第１の融合パートナーが、チンパンジーＢ７−Ｈ４のＩｇＶドメインを含む。一実施形態では、上記ＩｇＶドメインが、少なくとも、配列番号１５の５２位におけるシステイン〜配列番号１５の１２６位におけるシステインを含む。別の実施形態では、上記ＩｇＶドメインが、このアミノ酸範囲により定められるポリペプチドの少なくとも２５または５０アミノ酸の断片を含有する。
【０１５８】
上記第１の融合パートナーは、以下の例示的なＩｇＶドメインの以下のチンパンジーアミノ酸配列：
【０１５９】
【化３９】
2013503204.tif 000041
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有しうる。
【０１６０】
別の実施形態では、上記融合タンパク質の第１の融合パートナーが、アカゲザルＢ７−Ｈ４のＩｇＶドメインを含む。一実施形態では、上記ＩｇＶドメインが、少なくとも、配列番号１７の５６位におけるシステイン〜配列番号１７の１３０位におけるシステインを含む。別の実施形態では、上記ＩｇＶドメインが、このアミノ酸範囲により定められるポリペプチドの少なくとも２５または５０アミノ酸の断片を含有する。
【０１６１】
上記第１の融合パートナーは、以下の例示的なＩｇＶドメインのアカゲザルアミノ酸配列：
【０１６２】
【化４０】
2013503204.tif 000042
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有しうる。
【０１６３】
別の実施形態では、上記融合タンパク質の第１の融合パートナーが、カニクイザルＢ７−Ｈ４のＩｇＶドメインを含む。一実施形態では、上記ＩｇＶドメインが、少なくとも、配列番号１９の５６位におけるシステイン〜配列番号１９の１３０位におけるシステインを含む。別の実施形態では、上記ＩｇＶドメインが、このアミノ酸範囲により定められるポリペプチドの少なくとも２５または５０アミノ酸の断片を含有する。
【０１６４】
上記第１の融合パートナーは、以下の例示的なＩｇＶドメインのカニクイザルアミノ酸配列：
【０１６５】
【化４１】
2013503204.tif 000043
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有しうる。
【０１６６】
ｄ．Ｂ７−Ｈ４細胞外ドメイン断片
Ｂ７−Ｈ４細胞外ドメインは、Ｂ７−Ｈ４のシグナルペプチドまたは推定膜貫通ドメインに由来する、１つ以上のアミノ酸を含有しうる。分泌時において、切断される上記シグナルペプチドのアミノ酸数は、発現系および宿主に応じて変化しうる。加えて、Ｃ末端またはＮ末端に由来する１つ以上のアミノ酸を逸失しながら、Ｂ７−Ｈ４受容体に対する結合能を保持するＢ７−Ｈ４細胞外ドメインの断片も、本開示される融合タンパク質の融合パートナーとして用いることができる。
【０１６７】
例えば、第１の融合パートナーとして用いうる、適切なマウスＢ７−Ｈ４断片には、
配列番号２６もしくは配列番号２７の、
３２−２５７、３２−２５６、３２−２５５、３２−２５４、３２−２５３、３２−２５２、３２−２５１、３２−２５０、３２−２４９、
３１−２５７、３１−２５６、３１−２５５、３１−２５４、３１−２５３、３１−２５２、３１−２５１、３１−２５０、３１−２４９、
３０−２５７、３０−２５６、３０−２５５、３０−２５４、３０−２５３、３０−２５２、３０−２５１、３０−２５０、３０−２４９、
２９−２５７、２９−２５６、２９−２５５、２９−２５４、２９−２５３、２９−２５２、２９−２５１、２９−２５０、２９−２４９、
２８−２５７、２８−２５６、２８−２５５、２８−２５４、２８−２５３、２８−２５２、２８−２５１、２８−２５０、２８−２４９、
２７−２５７、２７−２５６、２７−２５５、２７−２５４、２７−２５３、２７−２５２、２７−２５１、２７−２５０、２７−２４９、
２６−２５７、２６−２５６、２６−２５５、２６−２５４、２６−２５３、２６−２５２、２６−２５１、２６−２５０、２６−２４９、
２５−２５７、２５−２５６、２５−２５５、２５−２５４、２５−２５３、２５−２５２、２５−２５１、２５−２５０、２５−２４９、
２４−２５７、２４−２５６、２４−２５５、２４−２５４、２４−２５３、２４−２５２、２４−２５１、２４−２５０、２４−２４９、または
配列番号２４もしくは配列番号２５の、
２４−２４９、２４−２４８、２４−２４７、２４−２４６、２４−２４５、２４−２４４、２４−２４３、２４−２４２、２４−２４１、
２３−２４９、２３−２４８、２３−２４７、２３−２４６、２３−２４５、２３−２４４、２３−２４３、２３−２４２、２３−２４１、
２２−２４９、２２−２４８、２２−２４７、２２−２４６、２２−２４５、２２−２４４、２２−２４３、２２−２４２、２２−２４１、
２１−２４９、２１−２４８、２１−２４７、２１−２４６、２１−２４５、２１−２４４、２１−２４３、２１−２４２、２１−２４１、
２０−２４９、２０−２４８、２０−２４７、２０−２４６、２０−２４５、２０−２４４、２０−２４３、２０−２４２、２０−２４１、
１９−２４９、１９−２４８、１９−２４７、１９−２４６、１９−２４５、１９−２４４、１９−２４３、１９−２４２、１９−２４１、
１８−２４９、１８−２４８、１８−２４７、１８−２４６、１８−２４５、１８−２４４、１８−２４３、１８−２４２、１８−２４１、
１７−２４９、１７−２４８、１７−２４７、１７−２４６、１７−２４５、１７−２４４、１７−２４３、１７−２４２、１７−２４１、
１６−２４９、１６−２４８、１６−２４７、１６−２４６、１６−２４５、１６−２４４、１６−２４３、１６−２４２、１６−２４１
が含まれるがこれらに限定されない。
【０１６８】
さらなる適切なマウスＢ７−Ｈ４断片には、
必要に応じて、シグナルペプチドのうちの１〜５アミノ酸をそのＮ末端に結合させた、
配列番号２または配列番号５の、
２８−２５７、２８−２５８、２８−２５９、２８−２６０、２８−２６１、２８−２６２、２８−２６３、
２９−２５７、２９−２５８、２９−２５９、２９−２６０、２９−２６１、２９−２６２、２９−２６３、
３０−２５７、３０−２５８、３０−２５９、３０−２６０、３０−２６１、３０−２６２、３０−２６３、
３１−２５７、３１−２５８、３１−２５９、３１−２６０、３１−２６１、３１−２６２、３１−２６３、
３２−２５７、３２−２５８、３２−２５９、３２−２６０、３２−２６１、３２−２６２、３２−２６３
が含まれるがこれらに限定されない。上記シグナルペプチドは、配列番号２、３、５、６、９、１０、１２、１３、１５、１７、および１９内に含有されるシグナルペプチドを含め、本明細書で開示される任意のシグナルペプチドの場合もあり、当技術分野において公知である任意のシグナルペプチドの場合もある。
【０１６９】
さらなる適切なマウスＢ７−Ｈ４断片には、配列番号３２または配列番号３３に示されるＩｇＶドメインのうちの、少なくとも２５、２０、７５、１００、または１２５アミノ酸を含有する断片が含まれるがこれらに限定されない。
【０１７０】
例示的な断片には、必要に応じて、シグナルペプチドのうちの１〜５アミノ酸をそのＮ末端に結合させた、
配列番号２４もしくは配列番号２５の、
１６−１４４、１６−１４５、１６−１４６、１６−１４７、１６−１４８、１６−１４９、１６−１５０、１６−１５１、１６−１５２、
１７−１４４、１７−１４５、１７−１４６、１７−１４７、１７−１４８、１７−１４９、１７−１５０、１７−１５１、１７−１５２、
１８−１４４、１８−１４５、１８−１４６、１８−１４７、１８−１４８、１８−１４９、１８−１５０、１８−１５１、１８−１５２、
１９−１４４、１９−１４５、１９−１４６、１９−１４７、１９−１４８、１９−１４９、１９−１５０、１９−１５１、１９−１５２、
２０−１４４、２０−１４５、２０−１４６、２０−１４７、２０−１４８、２０−１４９、２０−１５０、２０−１５１、２０−１５２、
２１−１４４、２１−１４５、２１−１４６、２１−１４７、２１−１４８、２１−１４９、２１−１５０、２１−１５１、２１−１５２、
２２−１４４、２２−１４５、２２−１４６、２２−１４７、２２−１４８、２２−１４９、２２−１５０、２２−１５１、２２−１５２、
２３−１４４、２３−１４５、２３−１４６、２３−１４７、２３−１４８、２３−１４９、２３−１５０、２３−１５１、２３−１５２、
２４−１４４、２４−１４５、２４−１４６、２４−１４７、２４−１４８、２４−１４９、２４−１５０、２４−１５１、２４−１５２、または
配列番号２６もしくは配列番号２７の、
２４−１５２、２４−１５３、２４−１５４、２４−１５５、２４−１５６、２４−１５７、２４−１５８、２４−１５９、２４−１６０、
２５−１５２、２５−１５３、２５−１５４、２５−１５５、２５−１５６、２５−１５７、２５−１５８、２５−１５９、２５−１６０、
２６−１５２、２６−１５３、２６−１５４、２６−１５５、２６−１５６、２６−１５７、２６−１５８、２６−１５９、２６−１６０、
２７−１５２、２７−１５３、２７−１５４、２７−１５５、２７−１５６、２７−１５７、２７−１５８、２７−１５９、２７−１６０、
２８−１５２、２８−１５３、２８−１５４、２８−１５５、２８−１５６、２８−１５７、２８−１５８、２８−１５９、２８−１６０、
２９−１５２、２９−１５３、２９−１５４、２９−１５５、２９−１５６、２９−１５７、２９−１５８、２９−１５９、２９−１６０、
３０−１５２、３０−１５３、３０−１５４、３０−１５５、３０−１５６、３０−１５７、３０−１５８、３０−１５９、３０−１６０、
３１−１５２、３１−１５３、３１−１５４、３１−１５５、３１−１５６、３１−１５７、３１−１５８、３１−１５９、３１−１６０、
３２−１５２、３２−１５３、３２−１５４、３２−１５５、３２−１５６、３２−１５７、３２−１５８、３２−１５９、３２−１６０
が含まれるがこれらに限定されない。上記シグナルペプチドは、配列番号２、３、５、６、９、１０、１２、１３、１５、１７、および１９内に含有されるシグナルペプチドを含め、本明細書で開示される任意のシグナルペプチドの場合もあり、当技術分野において公知である任意のシグナルペプチドの場合もある。
【０１７１】
第１の融合パートナーとして用いうる、例示的である適切なヒトＢ７−Ｈ４断片には、
配列番号４９もしくは配列番号５２の、
３２−２４９、３２−２４８、３２−２４７、３２−２４６、３２−２４５、３２−２４４、３２−２４３、３２−２４２、３２−２４１、
３１−２４９、３１−２４８、３１−２４７、３１−２４６、３１−２４５、３１−２４４、３１−２４３、３１−２４２、３１−２４１、
３０−２４９、３０−２４８、３０−２４７、３０−２４６、３０−２４５、３０−２４４、３０−２４３、３０−２４２、３０−２４１、
２９−２４９、２９−２４８、２９−２４７、２９−２４６、２９−２４５、２９−２４４、２９−２４３、２９−２４２、２９−２４１、
２８−２４９、２８−２４８、２８−２４７、２８−２４６、２８−２４５、２８−２４４、２８−２４３、２８−２４２、２８−２４１、
２７−２４９、２７−２４８、２７−２４７、２７−２４６、２７−２４５、２７−２４４、２７−２４３、２７−２４２、２７−２４１、
２６−２４９、２６−２４８、２６−２４７、２６−２４６、２６−２４５、２６−２４４、２６−２４３、２６−２４２、２６−２４１、
２５−２４９、２５−２４８、２５−２４７、２５−２４６、２５−２４５、２５−２４４、２５−２４３、２５−２４２、２５−２４１、
２４−２４９、２４−２４８、２４−２４７、２４−２４６、２４−２４５、２４−２４４、２４−２４３、２４−２４２、２４−２４１、または
配列番号５０もしくは配列番号５３の、
３２−２４５、３２−２４４、３２−２４３、３２−２４２、３２−２４１、３２−２４０、３２−２３９、３２−２３８、３２−２３７、
３１−２４５、３１−２４４、３１−２４３、３１−２４２、３１−２４１、３１−２４０、３１−２３９、３１−２３８、３１−２３７、
３０−２４５、３０−２４４、３０−２４３、３０−２４２、３０−２４１、３０−２４０、３０−２３９、３０−２３８、３０−２３７、
２９−２４５、２９−２４４、２９−２４３、２９−２４２、２９−２４１、２９−２４０、２９−２３９、２９−２３８、２９−２３７、
２８−２４５、２８−２４４、２８−２４３、２８−２４２、２８−２４１、２８−２４０、２８−２３９、２８−２３８、２８−２３７、
２７−２４５、２７−２４４、２７−２４３、２７−２４２、２７−２４１、２７−２４０、２７−２３９、２７−２３８、２７−２３７、
２６−２４５、２６−２４４、２６−２４３、２６−２４２、２６−２４１、２６−２４０、２６−２３９、２６−２３８、２６−２３７、
２５−２４５、２５−２４４、２５−２４３、２５−２４２、２５−２４１、２５−２４０、２５−２３９、２５−２３８、２５−２３７、
２４−２４５、２４−２４４、２４−２４３、２４−２４２、２４−２４１、２４−２４０、２４−２３９、２４−２３８、２４−２３７、または
配列番号５１もしくは配列番号５４の、
３２−２５９、３２−２５８、３２−２５７、３２−２５６、３２−２５５、３２−２５４、３２−２５３、３２−２５２、３２−２５１、
３１−２５９、３１−２５８、３１−２５７、３１−２５６、３１−２５５、３１−２５４、３１−２５３、３１−２５２、３１−２５１、
３０−２５９、３０−２５８、３０−２５７、３０−２５６、３０−２５５、３０−２５４、３０−２５３、３０−２５２、３０−２５１、
２９−２５９、２９−２５８、２９−２５７、２９−２５６、２９−２５５、２９−２５４、２９−２５３、２９−２５２、２９−２５１、
２８−２５９、２８−２５８、２８−２５７、２８−２５６、２８−２５５、２８−２５４、２８−２５３、２８−２５２、２８−２５１、
２７−２５９、２７−２５８、２７−２５７、２７−２５６、２７−２５５、２７−２５４、２７−２５３、２７−２５２、２７−２５１、
２６−２５９、２６−２５８、２６−２５７、２６−２５６、２６−２５５、２６−２５４、２６−２５３、２６−２５２、２６−２５１、
２５−２５９、２５−２５８、２５−２５７、２５−２５６、２５−２５５、２５−２５４、２５−２５３、２５−２５２、２５−２５１、
２４−２５９、２４−２５８、２４−２５７、２４−２５６、２４−２５５、２４−２５４、２４−２５３、２４−２５２、２４−２５１、または
配列番号４３もしくは配列番号４６の、
２４−２４１、２４−２４０、２４−２３９、２４−２３８、２４−２３７、２４−２３６、２４−２３５、２４−２３４、２４−２３３、
２３−２４１、２３−２４０、２３−２３９、２３−２３８、２３−２３７、２３−２３６、２３−２３５、２３−２３４、２３−２３３、
２２−２４１、２２−２４０、２２−２３９、２２−２３８、２２−２３７、２２−２３６、２２−２３５、２２−２３４、２２−２３３、
２１−２４１、２１−２４０、２１−２３９、２１−２３８、２１−２３７、２１−２３６、２１−２３５、２１−２３４、２１−２３３、
２０−２４１、２０−２４０、２０−２３９、２０−２３８、２０−２３７、２０−２３６、２０−２３５、２０−２３４、２０−２３３、
１９−２４１、１９−２４０、１９−２３９、１９−２３８、１９−２３７、１９−２３６、１９−２３５、１９−２３４、１９−２３３、
１８−２４１、１８−２４０、１８−２３９、１８−２３８、１８−２３７、１８−２３６、１８−２３５、１８−２３４、１８−２３３、
１７−２４１、１７−２４０、１７−２３９、１７−２３８、１７−２３７、１７−２３６、１７−２３５、１７−２３４、１７−２３３、
１６−２４１、１６−２４０、１６−２３９、１６−２３８、１６−２３７、１６−２３６、１６−２３５、１６−２３４、１６−２３３、または
配列番号４４もしくは配列番号４７の、
２４−２３７、２４−２３６、２４−２３５、２４−２３４、２４−２３３、２４−２３２、２４−２３１、２４−２３０、２４−２２９、
２３−２３７、２３−２３６、２３−２３５、２３−２３４、２３−２３３、２３−２３２、２３−２３１、２３−２３０、２３−２２９、
２２−２３７、２２−２３６、２２−２３５、２２−２３４、２２−２３３、２２−２３２、２２−２３１、２２−２３０、２２−２２９、
２１−２３７、２１−２３６、２１−２３５、２１−２３４、２１−２３３、２１−２３２、２１−２３１、２１−２３０、２１−２２９、
２０−２３７、２０−２３６、２０−２３５、２０−２３４、２０−２３３、２０−２３２、２０−２３１、２０−２３０、２０−２２９、
１９−２３７、１９−２３６、１９−２３５、１９−２３４、１９−２３３、１９−２３２、１９−２３１、１９−２３０、１９−２２９、
１８−２３７、１８−２３６、１８−２３５、１８−２３４、１８−２３３、１８−２３２、１８−２３１、１８−２３０、１８−２２９、
１７−２３７、１７−２３６、１７−２３５、１７−２３４、１７−２３３、１７−２３２、１７−２３１、１７−２３０、１７−２２９、
１６−２３７、１６−２３６、１６−２３５、１６−２３４、１６−２３３、１６−２３２、１６−２３１、１６−２３０、１６−２２９、または
配列番号４５もしくは配列番号４８の、
２４−２５１、２４−２５０、２４−２４９、２４−２４８、２４−２４７、２４−２４６、２４−２４５、２４−２４４、２４−２４３、
２３−２５１、２３−２５０、２３−２４９、２３−２４８、２３−２４７、２３−２４６、２３−２４５、２３−２４４、２３−２４３、
２２−２５１、２２−２５０、２２−２４９、２２−２４８、２２−２４７、２２−２４６、２２−２４５、２２−２４４、２２−２４３、
２１−２５１、２１−２５０、２１−２４９、２１−２４８、２１−２４７、２１−２４６、２１−２４５、２１−２４４、２１−２４３、
２０−２５１、２０−２５０、２０−２４９、２０−２４８、２０−２４７、２０−２４６、２０−２４５、２０−２４４、２０−２４３、
１９−２５１、１９−２５０、１９−２４９、１９−２４８、１９−２４７、１９−２４６、１９−２４５、１９−２４４、１９−２４３、
１８−２５１、１８−２５０、１８−２４９、１８−２４８、１８−２４７、１８−２４６、１８−２４５、１８−２４４、１８−２４３、
１７−２５１、１７−２５０、１７−２４９、１７−２４８、１７−２４７、１７−２４６、１７−２４５、１７−２４４、１７−２４３、
１６−２５１、１６−２５０、１６−２４９、１６−２４８、１６−２４７、１６−２４６、１６−２４５、１６−２４４、１６−２４３
が含まれるがこれらに限定されない。
【０１７２】
さらなる適切なヒトＢ７−Ｈ４断片には、
必要に応じて、シグナルペプチドのうちの１〜５アミノ酸をそのＮ末端に結合させた、
配列番号９または配列番号１２の、
２７−２４９、２７−２５０、２７−２５１、２７−２５２、２７−２５３、２７−２５４、２７−２５５、２７−２５６、２７−２５７、２７−２５９、２７−２６０、
２８−２４９、２８−２５０、２８−２５１、２８−２５２、２８−２５３、２８−２５４、２８−２５５、２８−２５６、２８−２５７、２８−２５９、２８−２６０、
２９−２４９、２９−２５０、２９−２５１、２９−２５２、２９−２５３、２９−２５４、２９−２５５、２９−２５６、２９−２５７、２９−２５９、２９−２６０、
３０−２４９、３０−２５０、３０−２５１、３０−２５２、３０−２５３、３０−２５４、３０−２５５、３０−２５６、３０−２５７、３０−２５９、３０−２６０、
３１−２４９、３１−２５０、３１−２５１、３１−２５２、３１−２５３、３１−２５４、３１−２５５、３１−２５６、３１−２５７、３１−２５９、３１−２６０、
３２−２４９、３２−２５０、３２−２５１、３２−２５２、３２−２５３、３２−２５４、３２−２５５、３２−２５６、３２−２５７、３２−２５９、３２−２６０
が含まれるがこれらに限定されない。上記シグナルペプチドは、配列番号２、３、５、６、９、１０、１２、１３、１５、１７、および１９内に含有されるシグナルペプチドを含め、本明細書で開示される任意のシグナルペプチドの場合もあり、当技術分野において公知である任意のシグナルペプチドの場合もある。
【０１７３】
さらなる適切なヒトＢ７−Ｈ４断片には、配列番号６３または配列番号６４に示されるＩｇＶドメインのうちの、少なくとも２５、２０、７５、１００、または１２５アミノ酸を含有する断片が含まれるがこれらに限定されない。例示的な断片には、必要に応じて、シグナルペプチドのうちの１〜５アミノ酸をそのＮ末端に結合させた、
配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、もしくは配列番号４８のうちのいずれかの、
１６−１４４、１６−１４５、１６−１４６、１６−１４７、１６−１４８、１６−１４９、１６−１５０、１６−１５１、１６−１５２、
１７−１４４、１７−１４５、１７−１４６、１７−１４７、１７−１４８、１７−１４９、１７−１５０、１７−１５１、１７−１５２、
１８−１４４、１８−１４５、１８−１４６、１８−１４７、１８−１４８、１８−１４９、１８−１５０、１８−１５１、１８−１５２、
１９−１４４、１９−１４５、１９−１４６、１９−１４７、１９−１４８、１９−１４９、１９−１５０、１９−１５１、１９−１５２、
２０−１４４、２０−１４５、２０−１４６、２０−１４７、２０−１４８、２０−１４９、２０−１５０、２０−１５１、２０−１５２、
２１−１４４、２１−１４５、２１−１４６、２１−１４７、２１−１４８、２１−１４９、２１−１５０、２１−１５１、２１−１５２、
２２−１４４、２２−１４５、２２−１４６、２２−１４７、２２−１４８、２２−１４９、２２−１５０、２２−１５１、２２−１５２、
２３−１４４、２３−１４５、２３−１４６、２３−１４７、２３−１４８、２３−１４９、２３−１５０、２３−１５１、２３−１５２、
２４−１４４、２４−１４５、２４−１４６、２４−１４７、２４−１４８、２４−１４９、２４−１５０、２４−１５１、２４−１５２
または
配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、もしくは配列番号５４のうちのいずれかの、
２４−１５２、２４−１５３、２４−１５４、２４−１５５、２４−１５６、２４−１５７、２４−１５８、２４−１５９、２４−１６０、
２５−１５２、２５−１５３、２５−１５４、２５−１５５、２５−１５６、２５−１５７、２５−１５８、２５−１５９、２５−１６０、
２６−１５２、２６−１５３、２６−１５４、２６−１５５、２６−１５６、２６−１５７、２６−１５８、２６−１５９、２６−１６０、
２７−１５２、２７−１５３、２７−１５４、２７−１５５、２７−１５６、２７−１５７、２７−１５８、２７−１５９、２７−１６０、
２８−１５２、２８−１５３、２８−１５４、２８−１５５、２８−１５６、２８−１５７、２８−１５８、２８−１５９、２８−１６０、
２９−１５２、２９−１５３、２９−１５４、２９−１５５、２９−１５６、２９−１５７、２９−１５８、２９−１５９、２９−１６０、
３０−１５２、３０−１５３、３０−１５４、３０−１５５、３０−１５６、３０−１５７、３０−１５８、３０−１５９、３０−１６０、
３１−１５２、３１−１５３、３１−１５４、３１−１５５、３１−１５６、３１−１５７、３１−１５８、３１−１５９、３１−１６０、
３２−１５２、３２−１５３、３２−１５４、３２−１５５、３２−１５６、３２−１５７、３２−１５８、３２−１５９、３２−１６０
が含まれるがこれらに限定されない。上記シグナルペプチドは、配列番号２、３、５、６、９、１０、１２、１３、１５、１７、および１９内に含有されるシグナルペプチドを含め、本明細書で開示される任意のシグナルペプチドの場合もあり、当技術分野において公知である任意のシグナルペプチドの場合もある。
【０１７４】
第１の融合パートナーとして用いうる、例示的である適切な非ヒト霊長動物Ｂ７−Ｈ４断片には、
配列番号７１もしくは配列番号７７の、
３２−２４９、３２−２４８、３２−２４７、３２−２４６、３２−２４５、３２−２４４、３２−２４３、３２−２４２、３２−２４１、
３１−２４９、３１−２４８、３１−２４７、３１−２４６、３１−２４５、３１−２４４、３１−２４３、３１−２４２、３１−２４１、
３０−２４９、３０−２４８、３０−２４７、３０−２４６、３０−２４５、３０−２４４、３０−２４３、３０−２４２、３０−２４１、
２９−２４９、２９−２４８、２９−２４７、２９−２４６、２９−２４５、２９−２４４、２９−２４３、２９−２４２、２９−２４１、
２８−２４９、２８−２４８、２８−２４７、２８−２４６、２８−２４５、２８−２４４、２８−２４３、２８−２４２、２８−２４１、
２７−２４９、２７−２４８、２７−２４７、２７−２４６、２７−２４５、２７−２４４、２７−２４３、２７−２４２、２７−２４１、
２６−２４９、２６−２４８、２６−２４７、２６−２４６、２６−２４５、２６−２４４、２６−２４３、２６−２４２、２６−２４１、
２５−２４９、２５−２４８、２５−２４７、２５−２４６、２５−２４５、２５−２４４、２５−２４３、２５−２４２、２５−２４１、
２４−２４９、２４−２４８、２４−２４７、２４−２４６、２４−２４５、２４−２４４、２４−２４３、２４−２４２、２４−２４１、または
配列番号７２もしくは配列番号７８の、
３２−２４５、３２−２４４、３２−２４３、３２−２４２、３２−２４１、３２−２４０、３２−２３９、３２−２３８、３２−２３７、
３１−２４５、３１−２４４、３１−２４３、３１−２４２、３１−２４１、３１−２４０、３１−２３９、３１−２３８、３１−２３７、
３０−２４５、３０−２４４、３０−２４３、３０−２４２、３０−２４１、３０−２４０、３０−２３９、３０−２３８、３０−２３７、
２９−２４５、２９−２４４、２９−２４３、２９−２４２、２９−２４１、２９−２４０、２９−２３９、２９−２３８、２９−２３７、
２８−２４５、２８−２４４、２８−２４３、２８−２４２、２８−２４１、２８−２４０、２８−２３９、２８−２３８、２８−２３７、
２７−２４５、２７−２４４、２７−２４３、２７−２４２、２７−２４１、２７−２４０、２７−２３９、２７−２３８、２７−２３７、
２６−２４５、２６−２４４、２６−２４３、２６−２４２、２６−２４１、２６−２４０、２６−２３９、２６−２３８、２６−２３７、
２５−２４５、２５−２４４、２５−２４３、２５−２４２、２５−２４１、２５−２４０、２５−２３９、２５−２３８、２５−２３７、
２４−２４５、２４−２４４、２４−２４３、２４−２４２、２４−２４１、２４−２４０、２４−２３９、２４−２３８、２４−２３７、または
配列番号７３もしくは配列番号７９の、
３２−２５９、３２−２５８、３２−２５７、３２−２５６、３２−２５５、３２−２５４、３２−２５３、３２−２５２、３２−２５１、
３１−２５９、３１−２５８、３１−２５７、３１−２５６、３１−２５５、３１−２５４、３１−２５３、３１−２５２、３１−２５１、
３０−２５９、３０−２５８、３０−２５７、３０−２５６、３０−２５５、３０−２５４、３０−２５３、３０−２５２、３０−２５１、
２９−２５９、２９−２５８、２９−２５７、２９−２５６、２９−２５５、２９−２５４、２９−２５３、２９−２５２、２９−２５１、
２８−２５９、２８−２５８、２８−２５７、２８−２５６、２８−２５５、２８−２５４、２８−２５３、２８−２５２、２８−２５１、
２７−２５９、２７−２５８、２７−２５７、２７−２５６、２７−２５５、２７−２５４、２７−２５３、２７−２５２、２７−２５１、
２６−２５９、２６−２５８、２６−２５７、２６−２５６、２６−２５５、２６−２５４、２６−２５３、２６−２５２、２６−２５１、
２５−２５９、２５−２５８、２５−２５７、２５−２５６、２５−２５５、２５−２５４、２５−２５３、２５−２５２、２５−２５１、
２４−２５９、２４−２５８、２４−２５７、２４−２５６、２４−２５５、２４−２５４、２４−２５３、２４−２５２、２４−２５１、または
配列番号６５の、
２８−２４５、２８−２４４、２８−２４３、２８−２４２、２８−２４１、２８−２４０、２８−２３９、２８−２３８、２８−２３７、
２７−２４５、２７−２４４、２７−２４３、２７−２４２、２７−２４１、２７−２４０、２７−２３９、２７−２３８、２７−２３７、
２６−２４５、２６−２４４、２６−２４３、２６−２４２、２６−２４１、２６−２４０、２６−２３９、２６−２３８、２６−２３７、
２５−２４５、２５−２４４、２５−２４３、２５−２４２、２５−２４１、２５−２４０、２５−２３９、２５−２３８、２５−２３７、
２４−２４５、２４−２４４、２４−２４３、２４−２４２、２４−２４１、２４−２４０、２４−２３９、２４−２３８、２４−２３７、
２３−２４５、２３−２４４、２３−２４３、２３−２４２、２３−２４１、２３−２４０、２３−２３９、２３−２３８、２３−２３７、
２２−２４５、２２−２４４、２２−２４３、２２−２４２、２２−２４１、２２−２４０、２２−２３９、２２−２３８、２２−２３７、
２１−２４５、２１−２４４、２１−２４３、２１−２４２、２１−２４１、２１−２４０、２１−２３９、２１−２３８、２１−２３７、
２０−２４５、２０−２４４、２０−２４３、２０−２４２、２０−２４１、２０−２４０、２０−２３９、２０−２３８、２０−２３７、または
配列番号６６の、
２８−２４１、２８−２４０、２８−２３９、２８−２３８、２８−２３７、２８−２３６、２８−２３５、２８−２３４、２８−２３３、
２７−２４１、２７−２４０、２７−２３９、２７−２３８、２７−２３７、２７−２３６、２７−２３５、２７−２３４、２７−２３３、
２６−２４１、２６−２４０、２６−２３９、２６−２３８、２６−２３７、２６−２３６、２６−２３５、２６−２３４、２６−２３３、
２５−２４１、２５−２４０、２５−２３９、２５−２３８、２５−２３７、２５−２３６、２５−２３５、２５−２３４、２５−２３３、
２４−２４１、２４−２４０、２４−２３９、２４−２３８、２４−２３７、２４−２３６、２４−２３５、２４−２３４、２４−２３３、
２３−２４１、２３−２４０、２３−２３９、２３−２３８、２３−２３７、２３−２３６、２３−２３５、２３−２３４、２３−２３３、
２２−２４１、２２−２４０、２２−２３９、２２−２３８、２２−２３７、２２−２３６、２２−２３５、２２−２３４、２２−２３３、
２１−２４１、２１−２４０、２１−２３９、２１−２３８、２１−２３７、２１−２３６、２１−２３５、２１−２３４、２１−２３３、
２０−２４１、２０−２４０、２０−２３９、２０−２３８、２０−２３７、２０−２３６、２０−２３５、２０−２３４、２０−２３３、または
配列番号６７の、
２８−２５５、２８−２５４、２８−２５３、２８−２５２、２８−２５１、２８−２５０、２８−２４９、２８−２４８、２８−２４７、
２７−２５５、２７−２５４、２７−２５３、２７−２５２、２７−２５１、２７−２５０、２７−２４９、２７−２４８、２７−２４７、
２６−２５５、２６−２５４、２６−２５３、２６−２５２、２６−２５１、２６−２５０、２６−２４９、２６−２４８、２６−２４７、
２５−２５５、２５−２５４、２５−２５３、２５−２５２、２５−２５１、２５−２５０、２５−２４９、２５−２４８、２５−２４７、
２４−２５５、２４−２５４、２４−２５３、２４−２５２、２４−２５１、２４−２５０、２４−２４９、２４−２４８、２４−２４７、
２３−２５５、２３−２５４、２３−２５３、２３−２５２、２３−２５１、２３−２５０、２３−２４９、２３−２４８、２３−２４７、
２２−２５５、２２−２５４、２２−２５３、２２−２５２、２２−２５１、２２−２５０、２２−２４９、２２−２４８、２２−２４７、
２１−２５５、２１−２５４、２１−２５３、２１−２５２、２１−２５１、２１−２５０、２１−２４９、２１−２４８、２１−２４７、
２０−２５５、２０−２５４、２０−２５３、２０−２５２、２０−２５１、２０−２５０、２０−２４９、２０−２４８、２０−２４７
が含まれるがこれらに限定されない。
【０１７５】
さらなる適切な非ヒト霊長動物Ｂ７−Ｈ４断片には、
必要に応じて、シグナルペプチドのうちの１〜５アミノ酸をそのＮ末端に結合させた、
配列番号１７または配列番号１９の、
２７−２４９、２７−２５０、２７−２５１、２７−２５２、２７−２５３、２７−２５４、２７−２５５、２７−２５６、２７−２５７、２７−２５９、２７−２６０、
２８−２４９、２８−２５０、２８−２５１、２８−２５２、２８−２５３、２８−２５４、２８−２５５、２８−２５６、２８−２５７、２８−２５９、２８−２６０、
２９−２４９、２９−２５０、２９−２５１、２９−２５２、２９−２５３、２９−２５４、２９−２５５、２９−２５６、２９−２５７、２９−２５９、２９−２６０、
３０−２４９、３０−２５０、３０−２５１、３０−２５２、３０−２５３、３０−２５４、３０−２５５、３０−２５６、３０−２５７、３０−２５９、３０−２６０、
３１−２４９、３１−２５０、３１−２５１、３１−２５２、３１−２５３、３１−２５４、３１−２５５、３１−２５６、３１−２５７、３１−２５９、３１−２６０、
３２−２４９、３２−２５０、３２−２５１、３２−２５２、３２−２５３、３２−２５４、３２−２５５、３２−２５６、３２−２５７、３２−２５９、３２−２６０
が含まれるがこれらに限定されない。上記シグナルペプチドは、配列番号２、３、５、６、９、１０、１２、１３、１５、１７、および１９内に含有されるシグナルペプチドを含め、本明細書で開示される任意のシグナルペプチドの場合もあり、当技術分野において公知である任意のシグナルペプチドの場合もある。
【０１７６】
さらなる適切な非ヒト霊長動物Ｂ７−Ｈ４断片には、
必要に応じて、シグナルペプチドのうちの１〜５アミノ酸をそのＮ末端に結合させた、
配列番号１５の、
２３−２４５、２３−２４６、２３−２４７、２３−２４８、２３−２４９、２３−２５０、２３−２５１、２３−２５２、２３−２５３、２３−２５４、２３−２５５、
２４−２４５、２４−２４６、２４−２４７、２４−２４８、２４−２４９、２４−２５０、２４−２５１、２４−２５２、２４−２５３、２４−２５４、２４−２５５、
２５−２４５、２５−２４６、２５−２４７、２５−２４８、２５−２４９、２５−２５０、２５−２５１、２５−２５２、２５−２５３、２５−２５４、２５−２５５、
２６−２４５、２６−２４６、２６−２４７、２６−２４８、２６−２４９、２６−２５０、２６−２５１、２６−２５２、２６−２５３、２６−２５４、２６−２５５、
２７−２４５、２７−２４６、２７−２４７、２７−２４８、２７−２４９、２７−２５０、２７−２５１、２７−２５２、２７−２５３、２７−２５４、２７−２５５、
２８−２４５、２８−２４６、２８−２４７、２８−２４８、２８−２４９、２８−２５０、２８−２５１、２８−２５２、２８−２５３、２８−２５４、２８−２５５
が含まれるがこれらに限定されない。上記シグナルペプチドは、配列番号２、３、５、６、９、１０、１２、１３、１５、１７、および１９内に含有されるシグナルペプチドを含め、本明細書で開示される任意のシグナルペプチドの場合もあり、当技術分野において公知である任意のシグナルペプチドの場合もある。
【０１７７】
さらなる適切な非ヒト霊長動物Ｂ７−Ｈ４断片には、配列番号８３、配列番号８４、または配列番号８５に示されるＩｇＶドメインのうちの、少なくとも２５、２０、７５、１００、または１２５アミノ酸を含有する断片が含まれるがこれらに限定されない。例示的な断片には、必要に応じて、シグナルペプチドのうちの１〜５アミノ酸をそのＮ末端に結合させた、配列番号６５、配列番号６６、もしくは配列番号６７のうちのいずれかの、
２０−１４８、２０−１４９、２０−１５０、２０−１５１、２０−１５２、２０−１５３、２０−１５４、２０−１５５、２０−１５６、
２１−１４８、２１−１４９、２１−１５０、２１−１５１、２１−１５２、２１−１５３、２１−１５４、２１−１５５、２１−１５６、
２２−１４８、２２−１４９、２２−１５０、２２−１５１、２２−１５２、２２−１５３、２２−１５４、２２−１５５、２２−１５６、
２３−１４８、２３−１４９、２３−１５０、２３−１５１、２３−１５２、２３−１５３、２３−１５４、２３−１５５、２３−１５６、
２４−１４８、２４−１４９、２４−１５０、２４−１５１、２４−１５２、２４−１５３、２４−１５４、２４−１５５、２０−１５６、
２５−１４８、２５−１４９、２５−１５０、２５−１５１、２５−１５２、２５−１５３、２５−１５４、２５−１５５、２５−１５６、
２６−１４８、２６−１４９、２６−１５０、２６−１５１、２６−１５２、２６−１５３、２６−１５４、２６−１５５、２６−１５６、
２７−１４８、２７−１４９、２７−１５０、２７−１５１、２７−１５２、２７−１５３、２７−１５４、２７−１５５、２７−１５６、
２８−１４８、２８−１４９、２８−１５０、２８−１５１、２８−１５２、２８−１５３、２８−１５４、２８−１５５、２８−１５６、または
配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７７、配列番号７８、もしくは配列番号７９のうちのいずれかの、
２４−１５２、２４−１５３、２４−１５４、２４−１５５、２４−１５６、２４−１５７、２４−１５８、２４−１５９、２４−１６０、
２５−１５２、２５−１５３、２５−１５４、２５−１５５、２５−１５６、２５−１５７、２５−１５８、２５−１５９、２５−１６０、
２６−１５２、２６−１５３、２６−１５４、２６−１５５、２６−１５６、２６−１５７、２６−１５８、２６−１５９、２６−１６０、
２７−１５２、２７−１５３、２７−１５４、２７−１５５、２７−１５６、２７−１５７、２７−１５８、２７−１５９、２７−１６０、
２８−１５２、２８−１５３、２８−１５４、２８−１５５、２８−１５６、２８−１５７、２８−１５８、２８−１５９、２８−１６０、
２９−１５２、２９−１５３、２９−１５４、２９−１５５、２９−１５６、２９−１５７、２９−１５８、２９−１５９、２９−１６０、
３０−１５２、３０−１５３、３０−１５４、３０−１５５、３０−１５６、３０−１５７、３０−１５８、３０−１５９、３０−１６０、
３１−１５２、３１−１５３、３１−１５４、３１−１５５、３１−１５６、３１−１５７、３１−１５８、３１−１５９、３１−１６０、
３２−１５２、３２−１５３、３２−１５４、３２−１５５、３２−１５６、３２−１５７、３２−１５８、３２−１５９、３２−１６０
が含まれるがこれらに限定されない。上記シグナルペプチドは、配列番号２、３、５、６、９、１０、１２、１３、１５、１７、および１９内に含有されるシグナルペプチドを含め、本明細書で開示される任意のシグナルペプチドの場合もあり、当技術分野において公知である任意のシグナルペプチドの場合もある。
【０１７８】
２．Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド改変体
有用な改変体には、本明細書で説明されるアッセイのうちのいずれかにより示されるような、生物学的活性を増大させるか、またはそのタンパク質の半減期もしくは安定性を増大させる改変体が含まれる。Ｂ７−Ｈ４の活性を有する、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドおよびＢ７−Ｈ４断片、またはこれらの融合物を操作して、生物学的活性を増大させることができる。好ましい実施形態では、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドまたはＢ７−Ｈ４融合タンパク質が、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞に対するその分子の結合を増大させ、上記Ｔ細胞に阻害シグナルを伝達する、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失、または挿入により改変されている。
【０１７９】
他の好ましい改変体は、他の免疫細胞と対比して、１つのＴ細胞型に選択的に結合するように操作されたＢ７−Ｈ４ポリペプチドである。例えば、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドを操作して、Ｔｒｅｇ、Ｔｈ０細胞、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、またはＴｈ２２細胞に優先的に結合させることができる。優先的結合とは、１つの細胞型について、別の細胞型を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上上回る結合を指す。
【０１８０】
Ｂ７−Ｈ４のさらに他の改変体を操作して、免疫細胞に対する結合性を野生型Ｂ７−Ｈ４と比べて低減することができる。これらの改変体を、より強力な結合特性を有する改変体と組合わせて用いて、影響が中程度であるように免疫反応を調節することができる。
【０１８１】
最後に、改変体のＢ７−Ｈ４ポリペプチドを操作して、半減期を野生型と比べて延長することができる。これらの改変体は、酵素的分解に耐性であるように改変することが典型的である。例示的な改変には、酵素的分解に耐性である、改変アミノ酸残基および改変ペプチド結合が含まれる。当技術分野では、これを達成するための各種の修飾が公知である。例えば、Ｂ７−Ｈ４の膜近傍領域は、例えば、プロテアーゼのプロタンパク質コンベルターゼファミリーのメンバーによるならば、認識および切断される可能性がありうる二塩基性のモチーフである、ＫＲＲＳモチーフを含む。このモチーフ（ＫＲＲＳ）を除去して、半減期を延長することができる。上記改変体を改変して、受容体に対する親和性が、血清のｐＨならびにエンドソームのｐＨにおいて、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４断片、またはこれらの融合物の半減期に対して及ぼす影響について調整することもできる。
【０１８２】
Ｂ．第２のポリペプチド
上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドは、第２のポリペプチドに融合させることができる。上記第２のポリペプチドの存在は、上記Ｂ７−Ｈ４融合ポリペプチドの可溶性、安定性、親和性、および／または価数を変化させうる。本明細書で用いられる「価数」とは、分子１個当たりで利用可能な結合部位の数を指す。一実施形態では、上記第２のポリペプチドが、異なる供給源または異なるタンパク質に由来するポリペプチドである。
【０１８３】
一実施形態では、上記第２のポリペプチドが、ヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域に対応するか、またはマウス免疫グロブリンＣγ２ａ鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域に対応するアミノ酸配列を有することが好ましい、免疫グロブリン重鎖定常領域のうちの１つ以上のドメインを含有する。配列番号８８および８９は、ヒト免疫グロブリンＣγ１のヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の例示的な配列を示す。
【０１８４】
好ましい二量体融合タンパク質では、その二量体は、二量体化した通常のＩｇ重鎖内でジスルフィド結合するＣｙｓ残基と同じＣｙｓ残基である、上記Ｉｇ重鎖の２つからのヒンジ領域内のシステイン残基が共有結合することから生じる。このようなタンパク質を、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇと称する。
【０１８５】
一実施形態では、上記免疫グロブリン定常ドメインが、特定の細胞型への結合性を増強するか、バイオアベイラビリティーを増大させるか、またはＢ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質、またはこれらの断片の安定性を増大させる、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を含有しうる。上記で説明した通り、適切なアミノ酸置換には、保存的置換および非保存的置換が含まれる。
【０１８６】
別の実施形態では、上記第２のポリペプチドが、それを介してさらなる分子が、上記Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質に結合されうる、コンジュゲーションドメインを有しうる。このような一実施形態では、そのコンジュゲートされる分子が、特定の器官または組織を上記融合タンパク質の標的とすることが可能である。このような別の実施形態では、上記コンジュゲートされる分子が、上記Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質の効果を増強するかまたは増進させることができる別の免疫調節剤である。別の実施形態では、上記コンジュゲートされる分子が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
【０１８７】
上記融合タンパク質のＦｃ部分は、アイソタイプもしくはサブクラスにより異なる場合があり、キメラ体もしくはハイブリッド体とすることが可能であり、かつ／または、例えば、エフェクター機能、半減期の調節、組織への結合可能性を改善し、安定性などの生物物理的な特徴を増強し、生産の効率を改善する（ならびにより廉価とする）ように改変することができる。当技術分野では、開示される融合タンパク質を構築するのに有用な多くの改変、ならびにそれらを行う方法が当該分野で公知であり、例えば、Ｍｕｅｌｌｅｒら、Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎ．、３４巻（６号）：４４１〜４５２頁（１９９７年）；  Ｓｗａｎｎら、Ｃｕｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎ．、２０巻：４９３〜４９９頁（２００８年）；ならびにＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎ．、２０巻：４６０〜４７０頁（２００８年）を参照されたい。一部の実施形態では、上記Ｆｃ領域が、天然のＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ２  Ｆｃ領域、またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、上記Ｆｃ領域が、ハイブリッド体、例えば、ＩｇＧ２  Ｆｃ定常領域／ＩｇＧ４  Ｆｃ定常領域からなるキメラ体である。上記Ｆｃ領域に対する改変には、Ｆｃガンマ受容体および補体への結合を防止するようにＩｇＧ４を修飾すること；１つ以上のＦｃガンマ受容体への結合を改善するようにＩｇＧ１を改変すること；エフェクター機能を最小化するようにＩｇＧ１を改変すること（アミノ酸の変化）；ＩｇＧ１のグリカンを変化させる／取り除くこと（典型的には、発現宿主を変更することによる）；ならびにＦｃＲｎに対するＩｇＧ１のｐＨ依存性結合を変化させることが含まれるがこれらに限定されない。上記Ｆｃ領域は、ヒンジ領域の全体を含む場合もあり、全体には満たないヒンジ領域を含む場合もある。
【０１８８】
非ホジキンリンパ腫またはワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症に対し、リツキシマブ（ＣＤ２０に対するマウス／ヒトキメラＩｇＧ１モノクローナル抗体）で処置された患者における治療結果は、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに対し固有の親和性を有するＦｃγ受容体の対立遺伝子改変体を上記個体が発現することと相関した。特に、低親和性の活性化Ｆｃ受容体であるＣＤ１６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）について、高親和性の対立遺伝子を有する患者は、高い奏効率を示し、非ホジキンリンパ腫の場合には、無増悪生存が改善された。別の実施形態では、上記Ｆｃドメインが、低親和性の阻害性Ｆｃ受容体であるＣＤ３２Ｂ（ＦｃγＲＩＩＢ）への結合性を低減する、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を含有することが可能であり、かつ、低親和性の活性化Ｆｃ受容体であるＣＤ１６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）に対する野生型の結合レベルを保持するか、またはこれに対する結合性を増強しうる。
【０１８９】
別の実施形態は、ＦｃＲへの結合性が低度であるＩｇＧ２−４ハイブリッド体およびＩｇＧ４変異体を含み、これにより、その半減期が延長される。代表的なＩｇＧ２−４ハイブリッド体およびＩｇＧ４変異体は、Ａｎｇａｌ，  Ｓ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３０巻（１号）：１０５〜１０８頁（１９９３年）；  Ｍｕｅｌｌｅｒ，  Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｏｎｏｌｏｇｙ、３４巻（６号）：４４１〜４５２頁（１９９７年）；ならびにＷａｎｇらに対する米国特許第６，９８２，３２３号において記載されている。一部の実施形態では、上記ＩｇＧ１ドメインおよび／またはＩｇＧ２ドメインが欠失しており、例えば、Ａｎｇａｌらは、セリン２４１がプロリンで置換されたＩｇＧ１およびＩｇＧ２について記載している。
【０１９０】
好ましい実施形態では、上記Ｆｃドメインが、ＣＤ１６Ａに対する結合性を増強する、アミノ酸の挿入、欠失、または置換を含有する。当技術分野では、ＣＤ１６Ａに対する結合を増大させ、かつ、ＣＤ３２Ｂに対する結合性を低減する、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインにおける多数の置換が公知であり、Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５７巻（１８号）：８８８２〜９０頁（２００７年）において記載されている。ＣＤ３２Ｂに対する結合性を低減し、かつ／またはＣＤ１６Ａに対する結合性を増大させる、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインの例示的な改変体は、Ｆ２４３Ｌ置換、Ｒ９２９Ｐ置換、Ｙ３００Ｌ置換、Ｖ３０５Ｉ置換、またはＰ２９６Ｌ置換を含有する。これらのアミノ酸置換は、任意の組合せで、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン内に存在しうる。一実施形態では、上記ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインの改変体が、Ｆ２４３Ｌ置換、Ｒ９２９Ｐ置換、およびＹ３００Ｌ置換を含有する。別の実施形態では、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインの改変体が、Ｆ２４３Ｌ置換、Ｒ９２９Ｐ置換、Ｙ３００Ｌ置換、Ｖ３０５Ｉ置換、およびＰ２９６Ｌ置換を含有する。別の実施形態では、Ｎ２９７Ｑ置換によってＦｃＲへの結合性が消失するので、上記ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインの改変体が、この変異を含有する。
【０１９１】
Ｃ．ペプチドリンカードメインまたはポリペプチドリンカードメイン
本開示されるＢ７−Ｈ４融合タンパク質は、必要に応じて、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドを、第２のポリペプチドから隔てる、ペプチドリンカードメインまたはポリペプチドリンカードメインを含有する。
【０１９２】
１．抗体のヒンジ領域
一実施形態では、上記リンカードメインが、免疫グロブリンのヒンジ領域を含有する。好ましい実施形態では、上記ヒンジ領域が、ヒト免疫グロブリンに由来する。上記ヒンジが由来しうる、適切なヒト免疫グロブリンには、ＩｇＧ、ＩｇＤ、およびＩｇＡが含まれる。好ましい実施形態では、上記ヒンジ領域が、ヒトＩｇＧに由来する。当技術分野では、免疫グロブリンのヒンジ領域ならびに他のドメインのアミノ酸配列が周知である。
【０１９３】
一実施形態では、Ｂ７−Ｈ４融合ポリペプチドが、
【０１９４】
【化４２】
2013503204.tif 000044
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸によりコードされる、ヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含有する。
【０１９５】
配列番号８６によりコードされるヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域は、以下のアミノ酸配列：
【０１９６】
【化４３】
2013503204.tif 000045
を有する。
【０１９７】
配列番号８７によりコードされるヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域は、以下のアミノ酸配列：
【０１９８】
【化４４】
2013503204.tif 000046
を有する。
【０１９９】
上記ヒンジをさらに短縮して、配列番号８９のアミノ酸１、２、３、４、５、またはこれらの組合せを除去することができる。一実施形態では、配列番号８９のアミノ酸１および２を欠失させる。
【０２００】
別の実施形態では、上記Ｂ７−Ｈ４融合ポリペプチドが、
【０２０１】
【化４５】
2013503204.tif 000047
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸によりコードされる、マウス免疫グロブリンＣγ２ａ鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含有する。
【０２０２】
配列番号９０によりコードされるマウス免疫グロブリンＣγ２ａ鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域は、以下のアミノ酸配列：
【０２０３】
【化４６】
2013503204.tif 000048
を有する。
【０２０４】
別の実施形態では、上記リンカードメインが、上記で説明した免疫グロブリンのヒンジ領域を含有し、かつ、１つ以上のさらなる免疫グロブリンドメインをさらに含む。
【０２０５】
２．他のペプチド／ポリペプチドリンカードメイン
他の適切なペプチド／ポリペプチドリンカードメインは、天然または非天然のペプチドまたはポリペプチドを含む。ペプチドリンカーの配列は、少なくとも２アミノ酸の長さである。上記ペプチドまたはポリペプチドドメインは、可撓性のペプチドまたはポリペプチドである。本明細書における「可撓性リンカー」とは、ペプチド結合（複数可）によって連結された２つ以上のアミノ酸残基を含有するペプチドまたはポリペプチドであって、上記結合によって連結した２つのポリペプチドにその結合が与える回転自由度が、上記可撓性リンカーが存在しない２つの連結したポリペプチドが有する回転自由度より大きい、ペプチドまたはポリペプチドを指す。このような回転自由度により、可撓性リンカーにより連結した２つ以上の抗原結合部位の各々が、より効率的に標的抗原（複数可）に接近することが可能となる。例示的な可撓性ペプチド／ポリペプチドには、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号９２）、Ａｌａ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号９３）、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３（配列番号９４）、および（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）４（配列番号９５）が含まれるがこれらに限定されない。当技術分野では、さらなる可撓性ペプチド／ポリペプチド配列が周知である。
【０２０６】
Ｄ．二量体化ドメイン、多量体化ドメイン、および標的化ドメイン
本明細書で開示される融合タンパク質は、必要に応じて、２つ以上の融合タンパク質を二量体化または多量体化するように機能する、二量体化ドメインまたは多量体化ドメインを含有する。上記融合タンパク質を二量体化または多量体化するように機能するドメインは、上記融合タンパク質の別個のドメインの場合もあり、代替的に、上記融合タンパク質の他のドメイン（Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、第２のポリペプチド、またはペプチド／ポリペプチドリンカードメイン）のうちの１つの内部に含有される場合もある。
【０２０７】
１．二量体化ドメイン
「二量体化ドメイン」は、少なくとも２つのアミノ酸残基、または少なくとも２つのペプチドもしくはポリペプチド（アミノ酸配列が同じ場合もあり、アミノ酸配列が異なる場合もある）が会合することにより形成される。上記ペプチドまたはポリペプチドは、共有結合および／または非共有結合による会合（複数可）を介して、互いと相互作用しうる。好ましい二量体化ドメインは、そのパートナーの融合タンパク質におけるシステインと分子間ジスルフィド結合を形成することが可能な、少なくとも１つのシステインを含有する。上記二量体化ドメインは、そのパートナーの融合タンパク質間でジスルフィド結合（複数可）が形成されうるように、１つ以上のシステイン残基を含有しうる。一実施形態では、二量体化ドメインが、１、２、または３〜約１０のシステイン残基を含有する。好ましい実施形態では、上記二量体化ドメインが、免疫グロブリンのヒンジ領域である。
【０２０８】
さらなる例示的な二量体化ドメインは、当技術分野において公知である任意の二量体化ドメインであることが可能であり、これらには、コイルドコイルドメイン；酸性残基のパッチ（ａｃｉｄ  ｐａｔｃｈ）；亜鉛フィンガードメイン；カルシウムハンドドメイン；ＣＨ１−ＣＬ対ドメイン；米国特許第５，８２１，３３３号に記載される、操作された「ノブ」および／または「隆起」を伴う「インターフェース」ドメイン；ロイシンジッパードメイン（例えば、ｊｕｎおよび／またはｆｏｓ由来）（米国特許第５，９３２，４４８号）；ＳＨ２（ｓｒｃ相同体２）ドメイン；ＳＨ３（ｓｒｃ相同体３）ドメイン（Ｖｉｄａｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４３巻、７３３６〜４４頁（２００４年））；ホスホチロシン結合（ＰＴＢ）ドメイン（Ｚｈｏｕら、Ｎａｔｕｒｅ、３７８巻：５８４〜５９２頁（１９９５年））；ＷＷドメイン（Ｓｕｄｏｌ、Ｐｒｏｇ．  Ｂｉｏｃｈｙｓ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．、６５巻：１１３〜１３２頁（１９９６年））；ＰＤＺドメイン（Ｋｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ、３７８巻：８５〜８８頁（１９９５年）；  Ｋｏｍａｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６９巻：１７３７〜１７４０頁（１９９５年））；１４−３−３ドメイン；ＷＤ４０ドメイン（Ｈｕら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２７３巻、３３４８９〜３３４９４頁（１９９８年））；ＥＨドメイン；Ｌｉｍドメイン；イソロイシンジッパードメイン；受容体の二量体対（例えば、インターロイキン８受容体（ＩＬ−８Ｒ）；ならびにＬＦＡ−１およびＧＰＩＩＩｂ／ＩＩＩａなどのインテグリンヘテロ二量体）、またはそれらの二量体化領域（複数可）によるドメイン；二量体のリガンドポリペプチド（例えば、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＤＧＦのメンバー、および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（Ａｒａｋａｗａら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６９巻（４５号）：２７８３３〜２７８３９頁（１９９４年）；ならびにＲａｄｚｉｅｊｅｗｓｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３２巻（４８号）：１３５０頁（１９９３年））によるドメインが含まれるがこれらに限定されず、また、その親和性を変化させるこれらのドメインの改変体でもありうる。上記ポリペプチド対は、酵母ツーハイブリッド法によるスクリーニングを含め、当技術分野において公知の方法により同定することができる。酵母ツーハイブリッド法によるスクリーニングは、米国特許第５，２８３，１７３号および同第６，５６２，５７６号において説明されている。相互作用するドメイン対間の親和性は、Ｋａｔａｈｉｒａら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７７巻、９２４２〜９２４６頁（２００２年）において記載される方法を含め、当技術分野において公知の方法を用いて決定することができる。代替的に、例えば、ＷＯ０１／００８１４において記載される方法を用いて、ペプチド配列のライブラリーを、ヘテロ二量体化についてスクリーニングすることもできる。タンパク質間相互作用に有用な方法はまた、例えば、米国特許第６，７９０，６２４号においても記載されている。
【０２０９】
２．多量体化ドメイン
「多量体化ドメイン」とは、３つ以上のペプチドまたはポリペプチドを、共有結合および／または非共有結合による会合（複数可）を介して互いと相互作用させるドメインである。適切な多量体化ドメインには、コイルドコイルドメインが含まれるがこれに限定されない。コイルドコイルとは、通常、７アミノ酸（ヘプタッドリピート）または１１アミノ酸（ウンデカドリピート）の配列内において、３および４残基の間隔を置いた、主に疎水性の残基が連続するパターンを伴うペプチド配列であり、多量体によるヘリックスバンドルを形成するように構築される（フォールドする）。配列が、一部不規則に分布する３および４残基の間隔を含む、コイルドコイルもまた意図される。疎水性残基とは、特に、疎水性アミノ酸のＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、およびＴｒｐである。「主に疎水性」とは、上記残基のうちの少なくとも５０％が、言及された疎水性アミノ酸から選択されなければならないことを意味する。
【０２１０】
コイルドコイルドメインは、ラミニンに由来しうる。細胞外腔では、ヘテロ三量体のコイルドコイルタンパク質であるラミニンが、基底膜の形成において重要な役割を果たす。ラミニンの機能に、多機能性のオリゴマー構造が要求されることは、明らかである。コイルドコイルドメインはまた、３本の鎖が連結されるトロンボスポンジン（ＴＳＰ−１およびＴＳＰ−２）または５本鎖の鎖が連結されるトロンボスポンジン（ＴＳＰ−３、ＴＳＰ−４、およびＴＳＰ−５）に由来する場合もあり、パラレルな５本鎖のコイルドコイル（Ｍａｌａｓｈｋｅｖｉｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４巻：７６１〜７６５頁（１９９６年））へとフォールドするＣＯＭＰ（ＣＯＭＰｃｃ）（Ｇｕｏら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９９８年、１７巻：５２６５〜５２７２頁）に由来する場合もある。
【０２１１】
当技術分野では、他のタンパク質に由来するさらなるコイルドコイルドメイン、ならびにポリペプチドの多量体化を媒介する他のドメインが公知であり、本開示される融合タンパク質において用いるのに適している。
【０２１２】
別の実施形態では、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質、またはこれらの断片を、抗体などの第２の多価ポリペプチドに結合させることにより、多量体を形成するように誘導することができる。Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質、またはこれらの断片を多量体化する目的で用いるのに適する抗体には、ＩｇＭ抗体、ならびに架橋多価ＩｇＧ複合体、架橋多価ＩｇＡ複合体、架橋多価ＩｇＤ複合体、または架橋多価ＩｇＥ複合体が含まれるがこれらに限定されない。
【０２１３】
３．標的化ドメイン
上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドおよびＢ７−Ｈ４融合タンパク質は、体内の特定の部位を上記分子の標的とするための標的化ドメインを含有しうる。好ましい標的化ドメインは、炎症領域を上記分子の標的とする。例示的な標的化ドメインは、炎症組織またはＩＬ１７、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、およびＩＬ−２３が含まれるがこれらに限定されない炎症促進性サイトカインに特異的な抗体またはそれらの抗原結合断片である。多発性硬化症などの神経学的障害の場合において、上記標的化ドメインは、ＣＮＳを上記分子の標的とする場合もあり、血管内皮（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）のＶＣＡＭ−１に結合する場合もある。さらなる標的化ドメインは、炎症促進性分子に特異的なペプチドアプタマーでありうる。他の実施形態では、上記Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質が、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の表面上に提示されるポリペプチドに特異的な結合パートナーを含みうる。さらに他の実施形態では、上記標的化ドメインが、活性化免疫細胞を特異的に標的とする。標的とするのに好ましい免疫細胞には、Ｔｈ０  Ｔ細胞、Ｔｈ１  Ｔ細胞、Ｔｈ１７  Ｔ細胞、およびＴｈ２２  Ｔ細胞、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２１、およびＭＭＰが含まれるがこれらに限定されない炎症性分子を分泌するか、もしくは他の細胞にこれらを分泌させる他の細胞、ならびにＴｒｅｇが含まれる。例えば、Ｔｒｅｇの標的化ドメインは、ＣＤ２５に特異的に結合しうる。
【０２１４】
Ｅ．例示的な融合タンパク質
代表的なマウスＢ７−Ｈ４融合タンパク質は、
【０２１５】
【化４７】
2013503204.tif 000049
【０２１６】
【化４８】
2013503204.tif 000050
【０２１７】
【化４９】
2013503204.tif 000051
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸によりコードされる。
【０２１８】
別の実施形態では、代表的なマウスＢ７−Ｈ４融合タンパク質が、
【０２１９】
【化５０】
2013503204.tif 000052
【０２２０】
【化５１】
2013503204.tif 000053
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。
【０２２１】
シグナル配列を伴わない、配列番号９９および配列番号１０１のマウスＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は、
【０２２２】
【化５２】
2013503204.tif 000054
である。
【０２２３】
シグナル配列を伴わない、配列番号１００および配列番号１０２のマウスＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は、
【０２２４】
【化５３】
2013503204.tif 000055
である。
【０２２５】
代表的なヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質は、
【０２２６】
【化５４】
2013503204.tif 000056
【０２２７】
【化５５】
2013503204.tif 000057
【０２２８】
【化５６】
2013503204.tif 000058
【０２２９】
【化５７】
2013503204.tif 000059
【０２３０】
【化５８】
2013503204.tif 000060
【０２３１】
【化５９】
2013503204.tif 000061
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸によりコードされる。
【０２３２】
別の実施形態では、代表的なヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質が、
【０２３３】
【化６０】
2013503204.tif 000062
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。
【０２３４】
別の実施形態では、代表的なヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質が、
【０２３５】
【化６１】
2013503204.tif 000063
【０２３６】
【化６２】
2013503204.tif 000064
【０２３７】
【化６３】
2013503204.tif 000065
【０２３８】
【化６４】
2013503204.tif 000066
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。
【０２３９】
シグナル配列を伴わない、配列番号１１４および配列番号１２２のヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は、
【０２４０】
【化６５】
2013503204.tif 000067
である。
【０２４１】
シグナル配列を伴わない、配列番号１１５および配列番号１２３のヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は、
【０２４２】
【化６６】
2013503204.tif 000068
である。
【０２４３】
シグナル配列を伴わない、配列番号１１６および配列番号１２４のヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は、
【０２４４】
【化６７】
2013503204.tif 000069
である。
【０２４５】
シグナル配列を伴わない、配列番号１１７および配列番号１２５のヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は、
【０２４６】
【化６８】
2013503204.tif 000070
である。
【０２４７】
シグナル配列を伴わない、配列番号１１８および配列番号１２６のヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は、
【０２４８】
【化６９】
2013503204.tif 000071
である。
【０２４９】
シグナル配列を伴わない、配列番号１１９および配列番号１２７のヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は、
【０２５０】
【化７０】
2013503204.tif 000072
である。
【０２５１】
シグナル配列を伴わない、配列番号１２０および配列番号１２８のヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は、
【０２５２】
【化７１】
2013503204.tif 000073
である。
【０２５３】
シグナル配列を伴わない、配列番号１２１および配列番号１２９のヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は、
【０２５４】
【化７２】
2013503204.tif 000074
である。
【０２５５】
上記の例示的な融合タンパク質は、本明細書に記載される改変体の任意の組合せを組み込みうる。別の実施形態では、上記の例示的な融合タンパク質の末端のリシンを欠失させる。
【０２５６】
本開示される融合タンパク質は、標準的な分子生物学の技法を用いて単離することができる。例えば、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有する発現ベクターを、リン酸カルシウム沈殿により２９３細胞へとトランスフェクトし、無血清ＤＭＥＭ中で培養する。７２時間後にその上清を回収し、プロテインＧまたは好ましくはプロテインＡ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）により、上記融合タンパク質を精製する。
【０２５７】
Ｆ．融合タンパク質の二量体および多量体
Ｂ７−Ｈ４融合ポリペプチドは、二量体化することもでき、多量体化することもできる。二量体化または多量体化は、上記で説明した二量体化ドメインまたは多量体化ドメインを含め、二量体化ドメインまたは多量体化ドメインを介した２つ以上の融合タンパク質間で生じうる。代替的に、融合タンパク質の二量体化または多量体化は、化学的な架橋形成によっても生じうる。融合タンパク質の二量体は、ホモ二量体の場合もあり、ヘテロ二量体の場合もある。融合タンパク質の多量体は、ホモ多量体の場合もあり、ヘテロ多量体の場合もある。
【０２５８】
本明細書で開示される融合タンパク質の二量体は、式ＩＩ：
Ｎ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｃ
Ｎ−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｃ
または、代替的に、式ＩＩＩ：
Ｎ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｃ
Ｃ−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｎ
の二量体である［式中、式ＩＩにより示される二量体の融合タンパク質を、パラレルな配向性にあると定義し、式ＩＩＩにより示される二量体の融合タンパク質を、アンチパラレルな配向性にあると定義する。また、パラレルな二量体およびアンチパラレルな二量体を、それぞれ、シス二量体およびトランス二量体とも称する。「Ｎ」および「Ｃ」は、それぞれ、上記融合タンパク質のＮ末端およびＣ末端を表わす。融合タンパク質の構成要素である「Ｒ１」、「Ｒ２」、および「Ｒ３」は、式Ｉに関して上記で定義された通りである。式ＩＩおよび式ＩＩＩの両方に関して、「Ｒ４」は、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドまたは第２のポリペプチドであり、「Ｒ５」は、任意選択のペプチド／ポリペプチドリンカードメインであり、「Ｒ６」は、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドまたは第２のポリペプチドであり、ここで、「Ｒ４」が第２のポリペプチドである場合は、「Ｒ６」がＢ７−Ｈ４ポリペプチドであり、「Ｒ４」がＢ７−Ｈ４ポリペプチドである場合は、「Ｒ６」が第２のポリペプチドである。一実施形態では、「Ｒ１」がＢ７−Ｈ４ポリペプチドであり、「Ｒ４」もまたＢ７−Ｈ４ポリペプチドであり、「Ｒ３」および「Ｒ６」のいずれもが第２のポリペプチドである］。
【０２５９】
「Ｒ１」＝「Ｒ４」、「Ｒ２」＝「Ｒ５」、ならびに「Ｒ３」＝「Ｒ６」であるときの式ＩＩの融合タンパク質二量体を、ホモ二量体と定義する。同様に、「Ｒ１」＝「Ｒ６」、「Ｒ２」＝「Ｒ５」、ならびに「Ｒ３」＝「Ｒ４」であるときの式ＩＩＩの融合タンパク質二量体を、ホモ二量体と定義する。任意の理由でこれらの条件が満たされないときの融合タンパク質二量体を、ヘテロ二量体と定義する。例えば、ヘテロ二量体は、これらの条件を満たすドメイン配向性を含有しうる（すなわち、式ＩＩによる二量体では、「Ｒ１」および「Ｒ４」が両方ともＢ７−Ｈ４ポリペプチドであり、「Ｒ２」および「Ｒ５」が両方ともペプチド／ポリペプチドリンカー（ｌｉｋｅｒ）ドメインであり、「Ｒ３」および「Ｒ６」が両方とも第２のポリペプチドである）が、これらのドメインのうちの１つ以上の種が同一ではない。例えば、「Ｒ３」および「Ｒ６」のいずれもがＢ７−Ｈ４ポリペプチドでありうるが、一方のポリペプチドは野生型のＢ７−Ｈ４アミノ酸配列を含有しうるのに対し、他方のポリペプチドは改変体のＢ７−Ｈ４ポリペプチドでありうる。例示的な改変体のＢ７−Ｈ４ポリペプチドは、標的細胞に対する結合性が増大または減少し、免疫細胞に対する活性が増大し、半減期が延長または短縮されるか、または安定性が増大または減少するように修飾したＢ７−Ｈ４ポリペプチドである。免疫グロブリンのＣＨ１領域またはＣＬ領域を、ポリペプチドリンカードメインの一部として含有する融合タンパク質の二量体は、その二量体の一方の融合タンパク質がＣＨ１領域を含有し、その二量体の他方の融合タンパク質がＣＬ領域を含有する、ヘテロ二量体を形成することが好ましい。
【０２６０】
また、融合タンパク質を用いて、多量体を形成することもできる。二量体と同様に、多量体も、上記多量体うちのすべての融合タンパク質が、それらのＮ末端およびＣ末端に関して同じ配向性で整列する、パラレルな多量体でありうる。多量体は、上記多量体うちの融合タンパク質が、代替的に、それらのＮ末端およびＣ末端に関して反対の配向性で整列する、アンチパラレルな多量体でもありうる。多量体（パラレルな多量体またはアンチパラレルな多量体）は、ホモ多量体の場合もあり、ヘテロ多量体の場合もある。
【０２６１】
Ｇ．ペプチドおよびポリペプチドの修飾
上記融合タンパク質は、通常の細胞環境においてポリペプチドに存在しうる化学的部分により、例えば、リン酸化、メチル化、アミド化、硫酸化、アシル化、グリコシル化、ＳＵＭＯ化、およびユビキチン化により修飾することができる。融合タンパク質はまた、放射性同位体および蛍光化合物が含まれるがこれらに限定されない、検出可能なシグナルを直接的または間接的に与えることが可能な標識により修飾することもできる。
【０２６２】
融合タンパク質はまた、細胞環境においては通常ポリペプチドに付加されない化学的部分によっても修飾することができる。例えば、本開示される融合タンパク質はまた、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧ）鎖が含まれるがこれらに限定されないポリマー鎖を共有結合させること（すなわち、ＰＥＧ化）が含まれるがこれらに限定されないポリマー鎖の共有結合によっても修飾することができる。ＰＥＧへの高分子のコンジュゲーションは、近年、各種の薬物の薬物動態（ＰＫ）プロファイルを変化させ、これにより、それらの治療剤としての能力を改善するのに有効な戦略として行われている。ＰＥＧコンジュゲーションは、酵素による消化に対して保護し、腎臓による濾過を遅延させ、かつ、中和抗体の生成を低減することにより、その循環における薬物の貯留を増大させる。加えて、ＰＥＧコンジュゲーションはまた、上記融合タンパク質の多量体化を可能とするためにも用いることができる。
【０２６３】
上記ポリペプチドのうちで標的とされるアミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応することが可能な有機誘導剤と反応させることにより、分子内に修飾を導入することができる。別の修飾は、上記タンパク質の環化である。
【０２６４】
上記ポリペプチドの化学的誘導体の例には、コハク酸無水物または他のカルボン酸無水物で誘導体化されたリシニル残基およびアミノ末端残基が含まれる。環状カルボン酸無水物（ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）による誘導体化には、上記リシニル残基の電荷を逆転させる効果がある。アミノ含有残基を誘導体化するのに適する他の試薬には、メチルピコリンイミデートなどのイミドエステル；ピリドキサールリン酸；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソウレア；２，４ペンタンジオン；ならびにグリオキシル酸塩とのトランスアミナーゼ触媒反応物が含まれる。カルボキシル側鎖基であるアスパルチルまたはグルタミルは、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどのカルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応により選択的に修飾することができる。さらに、アスパルチル残基およびグルタミル残基は、アンモニアとの反応により、アスパラギニル残基およびグルタミニル残基へと転換することもできる。融合タンパク質はまた、１つ以上のＬ−アミノ酸を置換する、１つ以上のＤ−アミノ酸も含みうる。
【０２６５】
Ｈ．結合特性の修飾
Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、それらの断片、ならびにそれらの融合物（集合的に、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドと称する）の結合特性は、投与される用量および投与レジメンに関連する。一実施形態では、本開示されるＢ７−Ｈ４ポリペプチドが、免疫細胞の受容体分子の他のリガンドと比べ、上記受容体分子をより長期にわたり、またはより高い百分率で占有することを証明する結合特性を、Ｔ細胞上の少なくとも１つの受容体に対して有する。他の実施形態では、本開示されるＢ７−Ｈ４ポリペプチドが示すＴ細胞上の受容体に対する結合親和性が、野生型のＢ７−Ｈ４と比べて低く、上記タンパク質が、投与後３カ月、２カ月、１カ月、３週間、２週間、１週間、または数日間未満の期間で解離することを可能とする。
【０２６６】
一部の実施形態では、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、もしくはそれらの断片、またはそれらの融合物の、その受容体に対する親和性が比較的高く、したがって、解離速度が比較的遅い。他の実施形態では、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドを、数日間、数週間、または数カ月の期間にわたり間欠的に投与し、次回の投与前の回復を可能とする程度に免疫反応を弱めるが、これを用いて、免疫反応を完全に止めることなしに免疫反応を軽減することができ、かつ、長期間にわたる副作用を回避することができる。
【０２６７】
ＩＩＩ．単離核酸分子
本明細書では、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、それらの断片、ならびにそれらの融合物をコードする単離核酸配列が開示される。有用なマウスＢ７−Ｈ４核酸は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号がＮＭ＿１７８５９４またはＡＹ２８０９７３であるＢ７−Ｈ４核酸に対して、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列同一性を有する。有用なヒトＢ７−Ｈ４核酸は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号がＡＫ０２６０７１であるＢ７−Ｈ４核酸に対して、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列同一性を有する。本明細書で用いられる「単離核酸」とは、哺乳動物のゲノム内に存在する他の核酸分子から分離される核酸を指し、これには、通常、哺乳動物ゲノム内の上記核酸の片側または両側に隣接する核酸（例えば、Ｂ７−Ｈ４以外のタンパク質をコードする核酸）が含まれる。任意の非天然核酸配列は、天然では見出されず、天然のゲノム内では直接隣接する配列を有さないので、核酸に関して本明細書で用いられる「単離」という用語はまた、このような非天然核酸配列との組合せも包含する。
【０２６８】
単離核酸は、例えば、天然のゲノム内において、通常、あるＤＮＡ分子に直接隣接して見出される核酸配列のうちの１つが除去されるかまたは存在しないと仮定した場合のＤＮＡ分子でありうる。したがって、限定なしに述べると、単離核酸には、他の配列とは独立した個別の分子（例えば、化学的に合成された核酸、またはＰＣＲもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理により作製されたｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ断片）の他、自律複製プラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）であるベクター内、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ内に組み込まれた組換えＤＮＡとして存在するＤＮＡ分子が含まれる。加えて、単離核酸には、ハイブリッド核酸または融合核酸の一部である組換えＤＮＡ分子など、操作された核酸も含まれうる。例えば、ｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムライブラリー、またはゲノムＤＮＡの制限酵素消化物を含有するゲルスライス内の数百〜数百万の他の核酸中に存在する核酸は、単離核酸と考えるべきでない。
【０２６９】
Ｂ７−Ｈ４融合ポリペプチドをコードする核酸は、好まれる発現宿主における発現について最適化することができる。コドンは、Ｂ７−Ｈ４核酸配列が由来する哺乳動物と上記発現宿主の間でのコドン使用の違いを考慮して、同じアミノ酸をコードする代替のコドンで置換することができる。このようにして、発現宿主に好ましいコドンを用いて、核酸を合成することができる。
【０２７０】
核酸は、センス配向性の場合もあり、アンチセンス配向性の場合もあり、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドをコードする基準配列に相補的な場合もある。核酸は、ＤＮＡの場合もあり、ＲＮＡの場合もあり、核酸類似体の場合もある。核酸類似体は、塩基部分で修飾される場合もあり、糖部分で修飾される場合もあり、リン酸塩骨格で修飾される場合もある。このような修飾は、例えば、上記核酸の安定性、ハイブリダイゼーション、または可溶性を改善しうる。上記塩基部分における修飾には、デオキシチミジンに対するデオキシウリジン、ならびにデオキシシチジンに対する５−メチル−２’−デオキシシチジンまたは５−ブロモ−２’−デオキシシチジンが含まれうる。上記糖部分に対する修飾には、２’−Ｏ−メチル糖または２’−Ｏ−アリル糖を形成する、リボース糖の２’ヒドロキシルに対する修飾が含まれうる。リン酸デオキシリボース骨格を修飾して、各塩基部分がモルホリノ６員環に連結されるモルホリノ核酸、またはデオキシリン酸塩骨格が偽ペプチド骨格で置換されるが４つの塩基は保持されるペプチド核酸を作製することができる。例えば、ＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒ（１９９７年）、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．、７巻：１８７〜１９５頁；ならびにＨｙｒｕｐら（１９９６年）、Ｂｉｏｏｒｇａｎ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．、４巻：５〜２３頁を参照されたい。加えて、上記デオキシリン酸塩骨格を、例えば、ホスホロチオエート骨格もしくはホスホロジチオエート骨格、ホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄｉｔｅ）骨格、またはアルキルホスホトリエステル骨格で置換することもできる。
【０２７１】
ポリペプチドをコードする核酸は、それらを必要とする被験体に投与することができる。核酸の送達は、細胞内に「外来」核酸を導入すること、ならびに、最終的には、生きた動物に「外来」核酸を導入することを伴う。当技術分野では、被験体に核酸を送達するための組成物および方法が公知である（「Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｌｅｍｏｉｎｅ，  Ｎ．Ｒ．編、ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、２００８年を参照されたい）。
【０２７２】
ＩＶ．ベクターおよび宿主細胞
Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、それらの断片、ならびにそれらの融合物をコードするベクターもまた提供される。上記で説明した核酸などの核酸は、ベクターへと挿入して、細胞内で発現させることができる。本明細書で用いられる「ベクター」とは、挿入されたセグメントの複製をもたらすように、その中に別のＤＮＡセグメントを挿入しうる、プラスミド、ファージ、ウイルスまたはコスミドなどのレプリコンである。ベクターは、発現ベクターでありうる。「発現ベクター」とは、１つ以上の発現調節配列を含むベクターであり、「発現調節配列」とは、別のＤＮＡ配列の転写および／または翻訳を調節するかつ制御するＤＮＡ配列である。
【０２７３】
ベクター内の核酸は、１つ以上の発現調節配列に作動可能に連結されうる。本明細書で用いられる「作動可能に連結される」とは、発現調節配列が、対象のコード配列の発現を効果的に調節するように、遺伝子構築物内に組み込まれることを意味する。発現調節配列の例には、プロモーター、エンハンサー、および転写終結領域が含まれる。プロモーターとは、転写が開始される地点（一般には、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始部位近傍）の１００ヌクレオチド以内上流であることが典型的なＤＮＡ分子の領域からなる。コード配列をプロモーターの調節下に置くには、上記ポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位を、上記プロモーターの１〜約５０ヌクレオチド下流に配置することが必要である。エンハンサーは、時間、位置、およびレベルに関して発現特異性をもたらす。プロモーターとは異なり、エンハンサーは、転写部位から種々の距離に配置されても機能しうる。エンハンサーはまた、転写開始部位の下流に配置することもできる。ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡへと転写することが可能であり、次いで、ｍＲＮＡを、そのコード配列によりコードされるタンパク質へと翻訳しうる場合、このコード配列は、「作動可能に連結されて」おり、細胞内の発現調節配列の「調節下」にある。
【０２７４】
限定なしに述べると、適切な発現ベクターには、例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルス、タバコモザイクウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスに由来するプラスミドおよびウイルスベクターが含まれる。Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）などの企業から、多数のベクターおよび発現系が市販されている。
【０２７５】
発現ベクターは、タグ配列を含みうる。タグ配列は、コードされるポリペプチドとの融合物として発現させることが典型的である。このようなタグは、カルボキシル末端またはアミノ末端を含めた、上記ポリペプチド内の任意の部位に挿入することができる。有用なタグの例には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン、ｃ−ｍｙｃ、ヘマグルチニン、Ｆｌａｇ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、およびプロテインＡが含まれるがこれらに限定されない。一実施形態では、Ｂ７−Ｈ４融合ポリペプチドをコードする核酸分子が、好ましくは、ヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域に対応するアミノ酸配列を有するＩｇ重鎖定常領域のうちの１つ以上のドメインをコードする核酸を含有するベクター内に存在する。
【０２７６】
発現させる核酸を含有するベクターは、宿主細胞内に移入することができる。「宿主細胞」という用語は、その中に組換え発現ベクターを導入しうる、原核生物細胞および真核生物細胞を含むことを意図する。本明細書で用いられる「形質転換」および「トランスフェクト」とは、多数の技法のうちの１つにより、核酸分子（例えば、ベクター）を細胞内に導入することを包含する。特定の技法に限定されないが、当技術分野では、これらの技法のうちの多くが十分に確立されている。例えば、電気穿孔法または塩化カルシウムを介する形質転換により、原核生物細胞を核酸で形質転換することができる。例えば、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストランを介するトランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔法、またはマイクロインジェクションを含めた技法により、核酸を哺乳動物細胞へとトランスフェクトすることができる。例えば、本明細書に記載されるＢ７−Ｈ４融合ポリペプチドを作製するには、宿主細胞（例えば、原核生物細胞、またはＣＨＯ細胞などの真核生物細胞）を用いることができる。
【０２７７】
記載したベクターを用いて、細胞内、例えば、膵島細胞など、移植される細胞内でＢ７−Ｈ４を発現させることができる。例示的なベクターには、アデノウイルスベクターが含まれるがこれに限定されない。１つの手法は、培養物中の初代細胞内に核酸を導入した後、これらのｅｘ  ｖｉｖｏで形質転換された細胞を、宿主の全身に、または宿主の特定の器官もしくは組織内に自家移植することを含む。ｅｘ  ｖｉｖｏ法は、例えば、被験体から細胞を採取する工程と、その細胞を培養する工程と、その細胞に発現ベクターを形質導入する工程と、コードされるポリペプチドの発現に適する条件下に細胞を維持する工程とを含みうる。分子生物学の技術分野では、これらの方法が公知である。例えば、リン酸カルシウムによる遺伝子移入、リポフェクションによる遺伝子移入、電気穿孔法による遺伝子移入、ウイルス感染による遺伝子移入、ならびに遺伝子銃による遺伝子移入を含めた、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける遺伝子治療に用いられる任意の標準的な手段により、上記形質導入工程を達成することができる。代替的に、リポソームまたはポリマー製マイクロ粒子を用いることもできる。次いで、形質導入に成功した細胞は、例えば、コード配列の発現、または薬剤耐性遺伝子の発現について選択することができる。次いで、上記細胞を致死線量で放射線照射し（所望の場合）、被験体内に注射するかまたは植え込むことができる。一実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸を含有する発現ベクターを、それを必要とする被験体へと投与される細胞内にトランスフェクトする。
【０２７８】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける核酸療法は、機能的に活性なＤＮＡを、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、哺乳動物の体細胞組織または器官へと直接移入することにより達成することができる。例えば、本明細書で開示されるポリペプチドをコードする核酸は、リンパ系組織または腫瘍へと直接投与することができる。代替的に、Ｂリンパ球特異的転写制御エレメント（ＴＲＥ）、Ｔリンパ球特異的ＴＲＥ、または樹状細胞特異的ＴＲＥなどのリンパ系組織特異的ＴＲＥを用いて、リンパ系組織特異的な標的化を達成することもできる。当技術分野では、リンパ組織特異的ＴＲＥが公知である。
【０２７９】
核酸はまた、ウイルス性の手段によって、ｉｎ  ｖｉｖｏで投与することもできる。融合タンパク質をコードする核酸分子は、当技術分野において周知の、複製欠損レトロウイルスを生成させるパッケージング細胞系を用いて、レトロウイルスベクターへとパッケージングすることができる。また、非複製性とされうる、組換えアデノウイルスおよび組換えワクシニアウイルスを含めた他のウイルスベクターも用いることができる。裸のＤＮＡもしくは裸のＲＮＡ、またはウイルスベクターに加えて、操作された細菌も、ベクターとして用いることができる。
【０２８０】
核酸はまた、リポソーム、ポリマー製マイクロ粒子およびポリマー製ナノ粒子、ならびにアシアロ糖タンパク質／ポリリシンなどのポリカチオンを含めた他のキャリアにより送達することもできる。
【０２８１】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、ウイルス媒介の遺伝子移入、ならびにキャリア媒介の遺伝子移入に加えて、プラスミドＤＮＡの投与ならびに粒子ボンバードメント媒介の遺伝子移入を含め、当技術分野において周知の物理的手段も、ＤＮＡの直接的導入に用いることができる。
【０２８２】
Ｖ．薬学的組成物
本明細書で開示されるＢ７−Ｈ４ポリペプチド、断片、融合ポリペプチド、核酸、ならびにベクターを含めた薬学的組成物が提供される。ペプチドまたはポリペプチドを含有する薬学的組成物は、非経口投与経路（筋肉内注射、腹腔内注射、静脈内（ＩＶ）注射、または皮下注射）、経皮投与経路（受動的に、またはイオン導入法もしくは電気穿孔法を用いる）、または経粘膜投与経路（鼻腔内投与経路、膣内投与経路、直腸内投与経路、または舌下投与経路）により投与することもでき、生体崩壊性挿入物を用いて投与することもでき、かつ、各投与経路に適切な剤形で処方することができる。
【０２８３】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける一部の手法では、本明細書で開示される組成物を、治療有効量で被験体に投与する。本明細書で用いられる「有効量」または「治療有効量」という用語は、処置される障害の１つ以上の症状を処置、阻害、もしくは緩和するか、または他の方法で所望の薬理学的効果および／または生理学的効果をもたらすのに十分な投与量を意味する。正確な投与量は、被験体に依存する変数（例えば、年齢、免疫系の健康など）、疾患、ならびに行われる処置など、種々の因子により異なる。
【０２８４】
本明細書で開示されるポリペプチド組成物、ならびに上記ポリペプチドをコードする核酸については、さらなる研究が行われるにつれて、種々の患者における種々の状態を処置するのに適切な投与量のレベルについての情報が明らかになり、当業者は、レシピエントの治療的状況、年齢、ならびに全般的な健康を考慮して、適正な投薬について確実にすることができる。選択される投与量は、所望の治療効果、投与経路、ならびに所望の処置期間に依存する。一般に、ポリペプチド組成物の場合、哺乳動物には、毎日体重１ｋｇ当たり０．００１〜２０ｍｇのレベルの投与量を投与する。一般に、静脈内注射または静脈内注入の場合、投与量は低量でありうる。
【０２８５】
ある特定の実施形態では、例えば、処置される部位に直接注射することにより、上記ポリペプチド組成物を局所に投与する。その注射は、全身投与により達成されうるものより高い上記ポリペプチド組成物の局所濃度の増加をもたらすことが典型的である。例えば、多発性硬化症などの神経障害の場合は、そのタンパク質をＣＮＳ近傍の部位へと局所投与することができる。上記ポリペプチド組成物を、上記で説明したマトリックスと組み合わせて、処置される部位の外部への上記ポリペプチドの受動拡散を低減することにより、そのポリペプチド組成物の局所濃度の増大を補助することができる。
【０２８６】
Ａ．非経口投与のための製剤
好ましい実施形態では、ペプチドおよびポリペプチドを含有する組成物を含めた、本明細書で開示される組成物を、水溶液中で非経口注射により投与する。製剤はまた、懸濁液またはエマルジョンの形態でもありうる。一般に、薬学的組成物は、有効量のペプチドまたはポリペプチドを含めて提供され、必要に応じて、薬学的に許容される希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、および／またはキャリアを含む。このような組成物は、必要に応じて、希釈剤、滅菌水、各種の緩衝剤内容物（例えば、トリス−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ、およびイオン強度による緩衝食塩液；洗浄剤および可溶化剤（例えば、ＴＷＥＥＮ  ２０（ポリソルベート−２０）、ＴＷＥＥＮ  ８０（ポリソルベート−８０））、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、ならびに防腐剤（例えば、Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ、ベンジルアルコール）および増量剤（例えば、ラクトース、マンニトール）などの添加剤のうちの１つ以上を含む。非水性溶媒または非水性ビヒクルの例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油およびトウモロコシ油などの植物油、ゼラチン、ならびにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。上記製剤は、凍結乾燥させ、かつ、使用直前に再溶解／再懸濁させることができる。上記製剤は、例えば、細菌保持（ｂａｃｔｅｒｉａ  ｒｅｔａｉｎｉｎｇ）フィルターを介する濾過により、滅菌剤を組成物中に組み込むことにより、上記組成物に照射することにより、または組成物を加熱することにより滅菌することができる。
【０２８７】
Ｂ．局所投与のための製剤
本明細書で開示される融合タンパク質は、局所適用することができる。局所投与は、とりわけ、肺粘膜、鼻腔粘膜、口腔（舌下、頬）粘膜、膣粘膜、または直腸粘膜に適用される場合に有効でありうるが、大半のペプチド製剤については良好に作用しない。
【０２８８】
組成物を吸入しながら肺へと送達することができ、空気動力学的直径が約５ミクロン未満である、エアゾールまたは噴霧乾燥粒子として送達される場合、肺上皮層に浸透して血流へと達しうる。
【０２８９】
それらのすべてが当業者にはよく知られている、噴霧器、定量吸入器、および粉末吸入器が含まれるがこれらに限定されない、治療用生成物を肺送達するためにデザインされた広範にわたる機械的デバイスを用いることができる。市販されるデバイスの一部の具体例は、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ噴霧器（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）；Ａｃｏｒｎ  ＩＩ噴霧器（Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ、Ｃｏｌｏ．）；Ｖｅｎｔｏｌｉｎ定量吸入器（Ｇｌａｘｏ  Ｉｎｃ．、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、Ｎ．Ｃ．）；およびＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器（Ｆｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．）である。Ｎｅｋｔａｒ、Ａｌｋｅｒｍｅｓ、およびＭａｎｎｋｉｎｄはいずれも、吸入用インスリン粉末調製物の承認を受けているか、またはそれらを臨床試験中であり、これらの技術は、本明細書に記載される製剤に適用されうる。
【０２９０】
上記粘膜に投与するための製剤は、噴霧乾燥薬物粒子であることが典型的ではあるが、錠剤、ゲル、カプセル、懸濁液、またはエマルジョンに組み込むこともできる。標準的な薬学的賦形剤が任意の処方者（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒ）から入手可能である。経口製剤は、チューインガム、ゲルストリップ、錠剤、またはロゼンジの形態でありうる。
【０２９１】
経皮製剤もまた、調製しうる。これらは、軟膏、ローション、スプレー、またはパッチであることが典型的であり、それらのすべては、標準的な技法を用いて調製することができる。経皮製剤は、浸透増強剤の含有が求められる。
【０２９２】
Ｃ．制御送達用ポリマーマトリックス
本明細書で開示される融合タンパク質はまた、放出制御製剤で投与することもできる。放出制御用ポリマーデバイスは、ポリマーデバイスの植込み（ロッド、シリンダー、フィルム、ディスク）後または注射（マイクロ粒子）後の長期間にわたり、全身に放出されるように作製することができる。マトリックスは、マイクロスフェアなどのマイクロ粒子の形態であることが可能であり、この場合、固体のポリマー製マトリックス中またはマイクロカプセル内にペプチドを分散させるが、そこでは、コアがポリマー殻とは異なる材料であり、その性状が液体の場合もあり固体の場合もあるこのコア内に上記ペプチドを分散または懸濁させる。本明細書で別段に定義しない限り、マイクロ粒子、マイクロスフェア、およびマイクロカプセルは、互換的に用いられる。代替的に、上記ポリマーは、数ナノメートル〜４センチメートルの薄型のスラブまたはフィルムとして成形することもでき、粉砕または他の標準的な技法により作製される粉末の場合もあり、ハイドロゲルなどのゲルの場合さえもある。
【０２９３】
融合ポリペプチドまたはその融合ポリペプチドをコードする核酸を送達するには、非生体分解性マトリックスを用いることもでき、生体分解性マトリックスを用いることもできるが、生体分解性マトリックスが好ましい。生体分解性マトリックスは、天然ポリマーの場合もあり、合成ポリマーの場合もあるが、分解プロファイルおよび放出プロファイルの特徴がより良好であるため、合成ポリマーが好ましい。上記ポリマーは、放出が所望される期間に基づいて選択される。いくつかの場合には、直線的放出が最も有用でありうるが、他の場合には、パルス放出または「バルク放出」がより有効な結果をもたらしうる。上記ポリマーは、ハイドロゲルの形態であることが可能であり（水の重量で約９０％まで吸収することが典型的である）、必要に応じて、多価イオンまたはポリマーで架橋することができる。
【０２９４】
上記マトリックスは、溶媒を蒸発させることにより、噴霧乾燥させることにより、溶媒で抽出することにより、かつ、当業者に公知の他の方法より形成することができる。例えば、ＭａｔｈｉｏｗｉｔｚおよびＬａｎｇｅｒ、Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、５巻：１３〜２２頁（１９８７年）；  Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、６巻：２７５〜２８３頁（１９８７年）；ならびにＭａｔｈｉｏｗｉｔｚら、Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉ．、３５巻：７５５〜７７４頁（１９８８年）により記載される通り、薬物送達のためのマイクロスフェアを作製するために開発された方法のうちのいずれかを用いて、生体崩壊性マイクロスフェアを調製することができる。
【０２９５】
上記デバイスは、植込み領域または注射領域を処置する局所放出用（これらは、全身を処置するための投与量よりはるかに少ない投与量を送達することが典型的である）に処方することもでき、全身送達用に処方することもできる。これらは、皮下に植え込むかまたは注射することもでき、筋肉内、脂肪内に植え込むかまたは注射することもでき、嚥下させることもできる。
【０２９６】
ＶＩ．製造方法
Ａ．融合タンパク質を作製するための方法
当技術分野において公知である従来の技法を用いて、本開示される融合タンパク質を製造することができる。単離融合タンパク質は、例えば、化学合成により得ることもでき、宿主細胞における組換えによる産生によって得ることもできる。組換えにより融合タンパク質を生産するためには、上記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸を用いて、細菌宿主細胞または真核生物宿主細胞（例えば、昆虫細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞）を形質転換することもでき、これに形質導入することもでき、これにトランスフェクトすることもできる。一般に、核酸構築物は、上記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された制御配列を含む。制御配列（本明細書ではまた、発現調節配列とも称する）は、遺伝子産物をコードしないが、代わりに、それらが作動可能に連結された核酸配列の発現に影響を及ぼすことが典型的である。
【０２９７】
当技術分野では、ポリペプチドを発現させ、かつ産生させるのに有用な原核生物細胞系および真核生物細胞系が周知であり、これらには、例えば、ＢＬ−２１株などのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ菌株、ならびにＣＨＯ細胞などの培養哺乳動物細胞が含まれる。
【０２９８】
真核生物宿主細胞では、多数のウイルスベースの発現系を用いて、融合タンパク質を発現させることができる。当技術分野では、ウイルスベースの発現系が周知であり、これらには、バキュロウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター、レトロウイルスベクター、またはワクシニアベースのウイルスベクターが含まれるがこれらに限定されない。
【０２９９】
適切な調節エレメントおよび選択マーカーを伴う発現ベクターを用いて、改変体の融合タンパク質を安定的に発現する哺乳動物細胞系を作製することができる。例えば、真核生物発現ベクターであるｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびｐ９１０２３（Ｂ）（Ｗｏｎｇら（１９８５年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２８巻：８１０〜８１５頁を参照されたい）は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ−１細胞、ヒト胚性腎臓２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＭＤＣＫ細胞、およびヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）における改変体ポリペプチドの発現に適する。さらなる適切な発現系には、Ｌｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．を介して入手可能なＧＳ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）が含まれる。
【０３００】
電気穿孔法、リポフェクション、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウムによる共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、または他の適切なトランスフェクション法により発現ベクターを導入した後、安定的な細胞系を選択することができる（例えば、代謝的選択による場合もあり、Ｇ４１８、カナマイシン、またはハイグロマイシンに対する抗生剤耐性による場合もある）。対象のポリペプチドを発現させ、例えば、細胞培養物上清または溶解させた細胞から上記ポリペプチドを回収しうるように、トランスフェクトされた細胞を培養することができる。代替的に、（ａ）増幅された配列を、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの哺乳動物発現ベクターへとライゲーションし、かつ、（ｂ）小麦胚芽抽出物またはウサギ網状赤血球溶解物を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて転写および翻訳することにより、融合タンパク質を作製することもできる。
【０３０１】
融合タンパク質は、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、およびヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法を用いて単離することができる。一部の実施形態では、上記ポリペプチドを、アフィニティーマトリックスへと捕捉させるアミノ酸配列を含有するさらなるドメインを含有するように、融合タンパク質を操作することができる。例えば、プロテインＡカラムを用いて、細胞培養上清中または細胞質抽出物中のＦｃ融合ポリペプチドを単離することができる。加えて、ｃ−ｍｙｃ、ヘマグルチニン、ポリヒスチジン、またはＦｌａｇ（商標）（Ｋｏｄａｋ）などのタグを用いて、ポリペプチドの精製を補助することもできる。このようなタグは、カルボキシル末端またはアミノ末端を含め、上記ポリペプチド内の任意の位置に挿入することができる。有用でありうる他の融合物には、アルカリホスファターゼなど、上記ポリペプチドの検出を促進する酵素が含まれる。また、イムノアフィニティークロマトグラフィーも、ポリペプチドを精製するのに用いることができる。加えて、その中でそれが生成する細胞に融合タンパク質を分泌させる分泌シグナルを含有する（予め分泌シグナルが存在するのではない場合）ように、その融合タンパク質を操作することもできる。次いで、分泌された融合タンパク質を細胞培地から慣習的に単離することができる。
【０３０２】
Ｂ．単離核酸分子を作製するための方法
一般的な分子クローニング法ならびに化学的な核酸合成法が含まれるがこれらに限定されない標準的な技法により、単離核酸分子を作製することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、改変体ポリペプチドをコードする単離核酸を得ることができる。ＰＣＲとは、標的核酸を酵素的に増幅する技法である。対象領域またはこれを超える領域の末端に由来する配列情報を使用して、増幅される鋳型の対向鎖と配列が同一であるオリゴヌクレオチドプライマーをデザインすることができる。ＰＣＲを用いて、全ゲノムＤＮＡまたは全細胞ＲＮＡに由来する配列を含め、ＤＮＡならびにＲＮＡに由来する特定の配列を増幅することができる。プライマーは、１４〜４０ヌクレオチドの長さであることが典型的であるが、１０ヌクレオチド〜数百ヌクレオチドの範囲の長さでありうる。一般的なＰＣＲ法については、例えば、「ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５年において記載されている。ＲＮＡを鋳型の供給源として用いる場合は、逆転写酵素を用いて、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鎖を合成することができる。また、リガーゼ鎖反応、鎖置換増幅、自家持続配列複製、または核酸配列ベースの増幅を用いて、単離核酸を得ることもできる。例えば、Ｌｅｗｉｓ（１９９２年）、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ、１２巻：１頁；  Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８７巻：１８７４〜１８７８頁；ならびにＷｅｉｓｓ（１９９１年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４巻：１２９２〜１２９３頁を参照されたい。
【０３０３】
単離核酸は、単一の核酸分子として化学合成することもでき、オリゴヌクレオチドの配列として（例えば、３’から５’方向における自動ＤＮＡ合成のためのホスホルアミダイト法を用いて）化学合成することもできる。例えば、所望の配列を含有し、オリゴヌクレオチド対がアニーリングしたときに二重鎖が形成されるように、各対が、短鎖の相補性セグメント（たとえば、約１５ヌクレオチド）を含有する長鎖オリゴヌクレオチド（例えば、＞１００ヌクレオチド）の１つ以上の対を合成することができる。ＤＮＡポリメラーゼを用いて上記オリゴヌクレオチドを伸長させ、その結果として、１つのオリゴヌクレオチド対当たり単一の二本鎖核酸分子を得、次いで、これをベクターへとライゲーションすることができる。単離核酸はまた、変異誘発により得ることもできる。ＰＣＲを介するオリゴヌクレオチド特異的変異誘発および／または部位特異的変異誘発を含めた標準的な技法を用いて、融合タンパク質をコードする核酸を変異させることができる。「Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、８章、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９２年を参照されたい。修飾されうるアミノ酸位置の例には、本明細書で説明される位置が含まれる。
【０３０４】
ＶＩＩ．治療的使用の方法
本明細書で開示されるＢ７−Ｈ４ポリペプチド、もしくはそれらの断片、またはそれらの融合物は、治療剤として有用である。ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、免疫細胞、好ましくはＴ細胞を、Ｂ７−Ｈ４融合ポリペプチドと接触させて、炎症が含まれるがこれに限定されない免疫反応を軽減または阻害することができる。Ｂ７−Ｈ４融合ポリペプチドと接触させるＴ細胞は、α／β型Ｔ細胞受容体およびγ／δ型Ｔ細胞受容体を含めたＴ細胞受容体を発現する任意の細胞でありうる。Ｔ細胞は、ＣＤ４を発現するＴ細胞のサブセット、ならびにＣＤ８を発現するＴ細胞のサブセットを含め、ＣＤ３を発現するすべての細胞を含む。Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞の両方を含み、かつ、ＣＴＬなどのエフェクター細胞も含む。Ｔ細胞はまた、Ｔｈ１細胞、Ｔｃ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｃ２細胞、Ｔｈ３細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、Ｔｒｅｇ細胞、およびＴｒ１細胞などの制御性細胞も含む。Ｔ細胞はまた、ＮＫＴ細胞ならびに、類似のＴ細胞系列の固有のクラスも含む。例えば、上記組成物を用いて、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、またはＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２１、およびＭＭＰが含まれるがこれらに限定されない炎症性分子を分泌するか、もしくは他の細胞にこれらを分泌させる他の細胞を調節することができる。上記組成物はまた、Ｔｒｅｇの活性を増大させるかもしくは促進するか、ＴｒｅｇからのＩＬ−１０などのサイトカインの生成を増大させるか、Ｔｒｅｇの分化を増大させるか、Ｔｒｅｇの数を増加させるか、またはＴｒｅｇの生存を延長させるのにも用いることができる。
【０３０５】
一部の実施形態では、本開示されるＢ７−Ｈ４ポリペプチド、もしくはそれらの断片、またはそれらの融合物を、第２の治療剤と組み合わせて投与する。免疫を調節するには、組合せ療法が有用でありうる。一部の実施形態では、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、もしくはそれらの断片、またはそれらの融合物を用いて、炎症促進性薬物の活性を減弱または逆転し、かつ／またはこのような薬物の有害作用を制限することができる。
【０３０６】
本開示されるＢ７−Ｈ４ポリペプチド、それらの断片、またはそれらの融合物により処置されうる他の免疫細胞には、Ｔ細胞の前駆体、樹状細胞および単球などの抗原提示細胞もしくはそれらの前駆体、Ｂ細胞、またはこれらの組合せが含まれる。上記Ｂ７−Ｈ４組成物を用いてＢ細胞による抗体の生成を調節することができるが、それは、上記Ｂ細胞を有効量の上記Ｂ７−Ｈ４組成物と接触させることにより、コントロールと比べて、上記Ｂ細胞による抗体の生成を阻害するかまたは低減することができるというものである。上記Ｂ７−Ｈ４組成物はまた、上記Ｂ細胞によるサイトカインの生成も調節しうる。
【０３０７】
Ａ．炎症反応を処置する方法
好ましい実施形態は、炎症の１つ以上の症状を処置または緩和するための方法を提供する。より好ましい実施形態では、本開示される組成物および方法が、慢性炎症および遷延性炎症を処置するのに有用である。本開示されるＢ７−Ｈ４ポリペプチド、もしくはそれらの断片、またはそれらの融合物を用いて、炎症一般を処置することができる。
【０３０８】
免疫細胞の生物学的活性を阻害もしくは低減するか、または炎症部位における炎症促進性分子の量を低減するのに有効な量のＢ７−Ｈ４ポリペプチド、もしくはそれらの断片、またはそれらの融合物を投与することにより、被験体、好ましくはヒトにおける、炎症を含めた免疫反応を阻害するかまたは軽減することができる。例示的な炎症促進性分子には、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２１、およびＭＭＰが含まれるがこれらに限定されない。
【０３０９】
Ｔｈ１およびＴｈ１７は、炎症を阻害するかまたは軽減するためにＢ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質、またはそれらの断片による阻害の標的となりうる、例示的なＴ細胞である。上記Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質は、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、ならびに／またはＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２１、およびＭＭＰが含まれるがこれらに限定されない炎症性分子を分泌するか、もしくは他の細胞にこれらを分泌させる他の細胞の分化を阻害するかまたは低減すること；Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、ならびに／またはＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２１、およびＭＭＰが含まれるがこれらに限定されない炎症性分子を分泌するか、もしくは他の細胞にこれらを分泌させる他の細胞の活性を阻害するかまたは低減すること；Ｔｈ１経路および／またはＴｈ１７経路を阻害するかまたは弱めること；Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、ならびに／またはＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２１、およびＭＭＰが含まれるがこれらに限定されない炎症性分子を分泌するか、もしくは他の細胞にこれらを分泌させる他の細胞によるサイトカインの生成および／または分泌を阻害するかまたは低減すること；Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、ならびに／またはＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２１、およびＭＭＰが含まれるがこれらに限定されない炎症性分子を分泌するか、もしくは他の細胞にこれらを分泌させる他の細胞の増殖を阻害するかまたは低減することのうちのいずれかまたはすべてにより、炎症を処置するのに有用である。
【０３１０】
加えて、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇは、Ｔｒｅｇに、免疫反応に対する抑制作用を増強させることができる。Ｔｒｅｇは、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、ならびに／またはＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２１、およびＭＭＰが含まれるがこれらに限定されない炎症性分子を分泌するか、もしくは他の細胞にこれらを分泌させる他の細胞の分化、増殖、活性、ならびに／またはそれらによるサイトカインの生成および／または分泌を抑制しうる。例えば、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇは、Ｔｒｅｇに、Ｔｈ１細胞および／またはＴｈ１７細胞に対する抑制作用を増強させて、それぞれ生成されるＩＦＮ−γおよびＩＬ−１７のレベルを低減することを可能にする。Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇはまた、Ｔｒｅｇに対して直接的に作用して、ＩＬ−１０の生成を促進または増強し、Ｔｈ１経路およびＴｈ１７経路を抑制するか、またはＴｒｅｇの数を増加させることもできる。
【０３１１】
図１Ａおよび１Ｂは、炎症を阻害するためのＢ７−Ｈ４融合タンパク質について提起される２つの作用モードを示す。図１Ａは、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇが、複数のＴ細胞経路内の複数の地点で作用することを示す。例えば、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇは、ナイーブＴ細胞が、Ｔｈ１細胞またはＴｈ１７細胞へと分化することを阻害しうる。代替的に、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇは、Ｔｈ１細胞もしくはＴｈ１７細胞、またはこれらの両方と相互作用して、炎症促進性分子の生成を阻害するかまたは低減することも可能である。加えて、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇは、Ｔｒｅｇの分化を増大させ、かつ／またはＴｒｅｇに、Ｔｈ１経路およびＴｈ１７経路に対する抑制作用を増強させて、生成されるＩＮＦ−γおよび／またはＩＬ−１７のレベルを低減することも可能である。Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇは、ＴｒｅｇからのＩＬ−１０の生成を増強し、これにより、Ｔｈ１細胞およびＴｈ１７細胞の活性を阻害する。
【０３１２】
図１Ｂは、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇが、未成熟樹状細胞（ＤＣ）など、未成熟抗原提示細胞を標的とし、細胞の成熟を阻害する、第２のモデルを示す。抗原を捕捉する未成熟樹状細胞は、抗原提示細胞、Ｔ細胞プライミング細胞へと成熟する能力を有し；抗原を免疫原へと転換し、かつ、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、およびプロテアーゼなどの分子を発現させて、免疫反応を開始する。ＤＣが免疫を制御する能力は、ＤＣの成熟に依存する。ＤＣ内における抗原の取込みおよびプロセシングの後、細菌全体または細菌由来抗原（例えば、リポ多糖；ＬＰＳ）、炎症性分子、最適の細胞表面受容体（例えば、ＣＤ４０）のライゲーション、およびウイルス生成物（例えば、二本鎖ＲＮＡ）を含めた各種の因子が、成熟を誘導しうる。その成熟プロセスは、表面におけるＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子の発現、ならびに共刺激分子の生成を増大させる、ＤＣへのシグナルを伴う。
【０３１３】
図１Ｂに提示されるモデルでは、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇが、ＤＣの成熟を遮断し、これにより、ナイーブＴ細胞のＴｈ１細胞またはＴｈ１７細胞への発生が阻止され、炎症促進性分子の生成が低減される。加えて、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇは、未成熟ＤＣのプールを増大させることができるが、これは、Ｔｒｅｇの分化に好ましく、かつ／またはＴｒｅｇに、Ｔｈ１経路およびＴｈ１７経路に対する抑制作用を増強させて、生成されるＩＮＦ−γおよび／またはＩＬ−１７のレベルを低減することができる。このようにして、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇは、ＴｒｅｇからのＩＬ−１０の生成を増強し、これにより、Ｔｈ１細胞およびＴｈ１７細胞の活性を阻害する。
【０３１４】
１．Ｔｈ１経路の阻害
ａ．Ｔｈ１の発生の阻害
炎症を阻害するかまたは軽減するための一つの方法は、それを必要とする被験体におけるＴｈ１の発生を阻害するのに有効な量のＢ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質、それらの改変体を投与する工程を含む。Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質、それらの断片、またはそれらの改変体を投与することによって、ナイーブＴ細胞のＴｈ１細胞への分化を遮断することにより、炎症を阻害するかまたは軽減しうることが発見されている。一実施形態では、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドまたはそれらの融合タンパク質が、ナイーブＴ細胞に対するＴｒｅｇの抑制能を増大させて、ナイーブＴ細胞がＴｈ１細胞へと分化することを阻害するかまたは低減し、これにより、被験体におけるＴｈ１細胞の数を低減する。代替的に、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドまたはそれらの融合タンパク質は、ＴＨ１細胞の増殖を阻害するかまたは低減する。Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、それらの断片、またはそれらの融合タンパク質はまた、抗原提示細胞の成熟を遮断することにより、ナイーブＴ細胞のＴｈ１細胞への分化を低減することもできる。上記被験体において発生しうるＴｈ１細胞の数を制限することにより、ＩＮＦ−γなどの炎症促進性分子の量を低減するかまたは抑えることができる。ＩＮＦ−γは、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、およびＭＭＰを含めた、他の炎症促進性分子の生成または放出を刺激する。したがって、被験体におけるＴｈ１細胞の数を調節することにより、これらの他の炎症促進性分子のレベルを調節することができ、これにより、炎症反応を軽減することができる。
【０３１５】
ｂ．炎症促進性分子の阻害
別の実施形態は、被験体に、Ｔｈ１細胞による炎症促進性分子の生成を阻害するかまたは低減するのに有効な量のＢ７−Ｈ４ポリペプチド、その融合タンパク質、またはその断片を投与することにより、上記被験体における炎症を阻害するかまたは軽減する方法を提供する。Ｔｈ１細胞により生成される、例示的な炎症促進性分子には、ＩＦＮ−γが含まれる。この実施形態では、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、その融合タンパク質、またはその断片が、上記Ｔｈ１細胞と直接的に相互作用し、そのＴｈ１細胞によるＩＦＮ−γの生成を阻害するかまたは低減することができる。この実施形態では、Ｔｈ１細胞集団ではなくて、炎症促進性分子の量を制御する。
【０３１６】
２．Ｔｈ１７経路の阻害
ａ．Ｔｈ１７の発生の阻害
また、ナイーブＴ細胞がＴｈ１７細胞へと発生することを阻害するかまたは遮断するのに有効な量のＢ７−Ｈ４ポリペプチド、その断片、またはその融合物を投与することにより、被験体における炎症を阻害するかまたは軽減することもできる。一実施形態では、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドまたはＢ７−Ｈ４融合タンパク質が、被験体におけるＴｈ１７細胞の数を低減するのに十分な量だけ、ナイーブＴ細胞のＴｈ１７細胞への分化に対するＴｒｅｇの抑制活性を増大させる。代替的に、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドまたはその融合タンパク質は、ＴＨ１７細胞の増殖を阻害するかまたは低減する。Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドまたはその融合タンパク質はまた、抗原提示細胞の成熟を遮断することにより、ナイーブＴ細胞のＴｈ１７細胞への分化を低減し得る。被験体におけるＴｈ１７細胞の集団を低減することにより、ＩＬ−１７の他、ＩＬ−２２およびＩＬ−２１の量も低減することができる。ＩＬ−１７とは、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、およびＭＭＰなど、他の炎症促進性分子を増加させる炎症促進性サイトカインである。したがって、ＩＬ−１７の量を低減することにより、これらの他の炎症促進性分子も低減することができ、これにより、炎症を軽減または阻害することができる。
【０３１７】
ｂ．ＩＬ−１７の生成の阻害
さらに別の実施形態は、Ｔｈ１７細胞によるＩＬ−１７の生成の他、ＩＬ−２２およびＩＬ−２１の生成も阻害するのに有効な量のＢ７−Ｈ４ポリペプチド、その融合タンパク質、またはその断片を投与することにより、被験体における炎症を処置するための方法を提供する。この実施形態では、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドまたはＢ７−Ｈ４融合タンパク質が、例えば、Ｔｈ１７細胞に結合し、その結果として、これらのＴｈ１７細胞によるＩＬ−１７（またはＩＬ−２２およびＩＬ−２１）の産生を阻害することにより、Ｔｈ１７細胞に直接的に作用することができる。上記の通り、ＩＬ−１７（およびＩＬ−２２またはＩＬ−２１）を阻害するかまたは低減すると、他の炎症促進性分子が低減され、これにより、炎症が軽減または阻害される。
【０３１８】
３．Ｔｈ１経路およびＴｈ１７経路の阻害
本開示されるＢ７−Ｈ４ポリペプチド、それらの融合タンパク質、ならびにそれらの断片を用いて、Ｔｈ１経路およびＴｈ１７経路の両方を同時に阻害することができる。１つの抗炎症剤を用いて２つの個別の経路を阻害することにより、免疫反応に対するより頑健な阻害または低減がもたらされる。
【０３１９】
４．Ｔｒｅｇ
炎症はまた、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、それらの融合タンパク質、またはそれらの断片を、ＩＬ−１０を生成させるＴｒｅｇの抑制活性を増強して、Ｔｈ１経路および／またはＴｈ１７経路に対する抑制活性を増強するのに有効な量で被験体に投与することにより処置することもできる。この実施形態では、本開示されるＢ７−Ｈ４ポリペプチドおよびＢ７−Ｈ４融合タンパク質が、Ｔｒｅｇ単独と比べて、ＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−１７の生成に対する抑制効果を増大させる。
【０３２０】
別の実施形態は、ＴｒｅｇによるＩＬ−１０の生成を増大させるのに有効な量のＢ７−Ｈ４ポリペプチド、その融合タンパク質、またはその断片を投与することにより、炎症を処置するための方法を提供する。ＩＬ−１０の生成が増大すると、その結果として、Ｔｈ１７細胞によるＩＬ−１７の生成が減少し、かつ、Ｔｈ１細胞によるＩＦＮ−αの生成が減少する。この実施形態では、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質、ならびにこれらの断片が、Ｔｒｅｇと直接的に相互作用して、上記ＴｒｅｇによるＩＬ−１０の生成を増大させることができる。
【０３２１】
さらに別の実施形態は、Ｔｈ１経路、Ｔｈ１７経路を阻害するか、またはこれらに干渉して、Ｔｒｅｇによる上記Ｔｈ１経路およびＴｈ１７経路に対する抑制効果を増強するのに有効な量のＢ７−Ｈ４ポリペプチド、それらの融合タンパク質、ならびにそれらの断片を投与することにより、炎症を処置するための方法を提供する（図１Ａを参照されたい）。Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドまたはそれらの融合タンパク質はまた、抗原提示細胞の成熟を遮断することにより、Ｔｒｅｇのプールを増大させることも可能である（図１Ｂを参照されたい）。
【０３２２】
上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、それらの融合タンパク質、ならびにそれらの断片はまた、Ｔｒｅｇ細胞の集団または数を増加させるのに十分な量で被験体に投与することもできる。
【０３２３】
Ｔｒｅｇを、Ｂ７−Ｈ４活性を有する、有効量のＢ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質、またはこれらの断片と接触させることにより、ＴｒｅｇによるＩＬ−１０およびＴＧＦ−βの生成を、コントロールと比べて増大させることができる。その増大は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生じる場合もあり、ｉｎ  ｖｉｖｏで生じる場合もある。
【０３２４】
５．可溶性Ｂ７−Ｈ４
可溶性Ｂ７−Ｈ４（ｓＨ４）は、Ｂ７−Ｈ４受容体への結合について細胞表面Ｂ７−Ｈ４と競合し、Ｔ細胞への阻害性シグナルを結果としてもたらさないデコイ分子として作用する。Ｂ７−Ｈ４は、抗原刺激の存在下において、Ｔ細胞の細胞周期の進行を阻害する。Ｂ７−Ｈ４は、好中球の前駆体の増殖を抑制することにより、自然免疫を阻害しうる。ｓＨ４レベルの上昇は、内因性Ｂ７−Ｈ４の阻害効果を遮断すると考えられている。
【０３２５】
したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｓＨ４の生物学的活性に干渉することにより、例えば、それを必要とする個体に、ｓＨ４が上記Ｂ７−Ｈ４受容体に結合する能力を阻害もしくは減少させるか、または内因性の阻害性Ｂ７−Ｈ４分子の活性を増進させる薬剤の有効量を投与することにより、炎症反応を処置することができる。ｓＨ４の生物学的活性に対する干渉は、本明細書で開示されるＢ７−Ｈ４融合ポリペプチドを投与することにより達成することができる。
【０３２６】
投与は、既存の状態、疾患、または障害（すなわち、既存の炎症性疾患もしくは炎症性障害、または自己免疫疾患もしくは自己免疫障害）に対する処置に限定されず、また、個体においてこのような疾患が発生する危険性を防止または低下させるのにも、すなわち、予防的使用にも用いることができる。予防的ワクチン接種への潜在的な候補には、炎症性疾患もしくは炎症性障害、または自己免疫疾患もしくは自己免疫障害を発症する危険性が高い個体、すなわち、ある特定の自己免疫障害の個人歴または家族歴を有する個体が含まれる。
【０３２７】
Ｂ．処置される炎症性疾患
Ｂ７−Ｈ４融合ポリペプチドを用いて処置されうる、代表的な炎症性疾患および炎症性障害、または自己免疫疾患および自己免疫障害には、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円形脱毛症、強直性脊椎炎（ａｎｋｌｏｓｉｎｇ  ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖性症候群（ａｌｐｓ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック病−皮膚炎、慢性疲労性症候群免疫不全症候群（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｆａｔｉｇｕｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、瘢痕性類天疱瘡、寒冷血球凝集素病、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、ドゴー病（Ｄｅｇｏ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症−線維筋炎、グレーブス病（ｇｒａｖｅ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ギラン−バレー症候群（ｇｕｉｌｌａｉｎ−ｂａｒｒｅ）、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、インスリン依存性糖尿病（Ｉ型）、若年性関節炎、メニエール病（Ｍｅｎｉｅｒｅ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、混合結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群（ｐｏｌｙｇｌａｎｃｕｌａｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、ならびにウェゲナー肉芽腫症が含まれるがこれらに限定されない。
【０３２８】
Ｂ７−Ｈ４は、炎症経路の複数の地点において、かつ、高レベルで作用し、これによりＢ７−Ｈ４は、ＴＮＦ−αなどのエフェクター性サイトカインの発現および／または活性に影響を与えるように調節する主要な制御因子として作用する。したがって、本明細書に記載されるＢ７−Ｈ４組成物は、Ｅｎｂｒｅｌ、Ｒｅｍｉｃａｄｅ、Ｃｉｍｚｉａ、およびＨｕｍｉｒａなどのＴＮＦ−α遮断剤が奏効しない患者、またはＴＮＦ−α遮断剤が安全ではないかまたは有効でない患者を処置するのに特に有用である。加えて、炎症経路における主要な制御因子としてのその活性のために、本開示されるＢ７−Ｈ４組成物は、慢性炎症および遷延性炎症を処置するのに特に有用である。好ましい実施形態では、本明細書に記載されるＢ７−Ｈ４組成物を用いて、再発および／または寛解型多発性硬化症を処置する。
【０３２９】
Ｃ．エピトープ拡大の阻害
エピトープ拡大とは、Ｂ細胞およびＴ細胞の免疫反応が、単一の決定基から自己抗原における多くの部位までの特異性のレベル、ならびにＶ遺伝子使用のレベルの両方での多様化する能力を指す（Ｍｏｎｎｅａｕｘ，  Ｆ．ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＆  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、４６巻（６号）：１４３０〜１４３８頁（２００２年））。エピトープ拡大は、全身性自己免疫疾患に制限されない。エピトープ拡大は、ヒトならびに各種のミエリンタンパク質によるＥＡＥ誘発実験動物におけるＩＤＤＭおよび多発性硬化症など、Ｔ細胞依存性の器官特異的疾患において説明されている。
【０３３０】
エピトープ拡大は、同じ自己分子における新たなエピトープに対する認識の獲得の他、同じ高分子複合体において会合するタンパク質に存在するエピトープに対する認識の獲得も包含する。エピトープ拡大は、当技術分野ではその方法が公知である、遅延型過敏（ＤＴＨ）反応を測定することにより評価することができる。
【０３３１】
一実施形態は、被験体に、有効量のＢ７−Ｈ４ポリペプチド、その断片、またはその融合タンパク質を投与することにより、上記被験体におけるエピトープ拡大を阻害するかまたは低減する方法を提供する。好ましい実施形態では、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、その断片、またはその融合タンパク質が、多発性硬化症を有する個体におけるエピトープ拡大を阻害する。上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドまたはその融合物は、その炎症経路の複数の地点を阻害するかまたは遮断することが好ましい。
【０３３２】
さらに別の実施形態は、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、ならびに／またはＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２１、およびＭＭＰが含まれるがこれらに限定されない炎症促進性分子を分泌するか、もしくは他の細胞にこれらを分泌させる他の細胞の分化、増殖、活性、ならびに／またはそれらによるサイトカインの生成および／または分泌を阻害するかまたは低減するのに有効な量のＢ７−Ｈ４ポリペプチド、その断片、またはその融合タンパク質を被験体に投与することにより、多発性硬化症を有する被験体におけるエピトープ拡大を阻害するかまたは低減するための方法を提供する。別の実施形態は、被験体に、Ｔｒｅｇと相互作用するか、Ｔｒｅｇの活性を増強するか、ＴｒｅｇによるＩＬ−１０の分泌を促進もしくは増強するか、Ｔｒｅｇの数を増加させるか、Ｔｒｅｇによる抑制能を増大させるか、またはこれらの組合せをもたらすのに有効な量のＢ７−Ｈ４ポリペプチド、その断片、またはその融合タンパク質を被験体に投与することにより、多発性硬化症を処置するための方法を提供する。
【０３３３】
Ｄ．組合せ療法
Ｂ７−Ｈ４融合ポリペプチドは、単独で用いることもでき、さらなる治療剤と組み合わせて用いることもできる。上記さらなる治療剤には、免疫抑制剤（例えば、他のリンパ球表面マーカー（例えば、ＣＤ４０、アルファ−４インテグリン）またはサイトカインに対する抗体）；他の融合タンパク質（例えば、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ（Ｏｒｅｎｃｉａ（登録商標））、ＴＮＦＲ−Ｉｇ（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）））；Ｅｎｂｒｅｌ、Ｒｅｍｉｃａｄｅ、Ｃｉｍｚｉａ、およびＨｕｍｉｒａなどのＴＮＦ−α遮断剤；シクロホスファミド（ＣＴＸ）（すなわち、Ｅｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（商標））；メトトレキサート（ＭＴＸ）（すなわち、Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ（登録商標）、Ｔｒｅｘａｌｌ（登録商標））；ベリムマブ（すなわち、Ｂｅｎｌｙｓｔａ（登録商標））；もしくは他の免疫抑制薬（例えば、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６様化合物、ラパマイシン化合物、またはステロイド類）；抗増殖剤；細胞傷害剤；または免疫抑制を補助し得る他の化合物が含まれるがこれらに限定されない。
【０３３４】
好ましい実施形態では、上記さらなる治療剤が、別個の経路を介して、Ｔ細胞の活性化を阻害するかまたは低減するように機能する。このような一実施形態では、上記さらなる治療剤が、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（アバタセプト）などのＣＴＬＡ−４融合タンパク質である。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質は、抗原提示細胞上におけるＣＤ８０／ＣＤ８６（Ｂ７−１／Ｂ７−２）への結合について、Ｔ細胞上の共刺激受容体であるＣＤ２８と競合し、このために、Ｔ細胞の活性化を阻害するように機能する。別の実施形態では、上記さらなる治療剤が、ベラタセプトとして公知のＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質である。ベラタセプトは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣＤ８６に対するそのアビディティーを顕著に増大させる２つのアミノ酸置換（Ｌ１０４ＥおよびＡ２９Ｙ）を含有する。別の実施形態では、上記さらなる治療剤が、Ｍａｘｙ−４である。
【０３３５】
別の実施形態では、上記第２の治療剤が、シクロホスファミド（ＣＴＸ）である。また、サイトホスファンとしても公知のシクロホスファミド（Ｅｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（商標）の一般名）は、オキサゾホリン基に由来する窒素マスタードによるアルキル化剤である。シクロホスファミドは、各種の癌ならびに一部の自己免疫障害を処置するのに用いられている。好ましい実施形態では、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などの慢性自己免疫疾患または慢性自己免疫障害を予防または処置するのに有効な量で、Ｂ７−Ｈ４−ＩｇおよびＣＴＸを共投与する。シクロホスファミド（ＣＴＸ）は、腎ループスを有する患者におけるびまん性増殖性糸球体腎炎に用いられる第一選択薬である。下記の実施例１８において詳述される通り、ヒトにおける現行の処置様式である、低用量のシクロホスファミド（隔週１回、５０ｍｇ／ｋｇ）に加えてＢ７−Ｈ４−Ｉｇを伴う組合せ処置は、ＭＲＬ／ｌｐｒ狼瘡モデルにおける狼瘡疾患の増悪を結果として防止することが発見されている。一部の実施形態では、それを必要とする患者において、抗二本鎖ＤＮＡ（抗ｄｓ  ＤＮＡ）自己抗体の血中レベルもしくは血清レベルを低減し、かつ／またはタンパク尿を軽減するのに有効な量で、上記組合せ療法を投与する。
【０３３６】
別の実施形態では、上記第２の治療剤が、血清中におけるアデノシン量を増加させる（例えば、ＷＯ０８／１４７４８２を参照されたい）。好ましい実施形態では、上記第２の治療剤が、ＣＤ７３−Ｉｇ、組換えＣＤ７３、またはＣＤ７３の発現を増大させる他の薬剤（例えば、サイトカインまたはモノクローナル抗体または低分子）である（例えば、ＷＯ０４／０８４９３３を参照されたい）。別の実施形態では、上記第２の治療剤が、インターフェロン−ベータである。
【０３３７】
別の実施形態では、上記第２の治療剤が、Ｔｙｓａｂｒｉまたは別のＭＳ治療剤である。好ましい実施形態では、Ｂ７−Ｈ４−ＩｇをＴｙｓａｂｒｉと反復して使用するか、またはＢ７−Ｈ４−Ｉｇを休薬期間に用い、それにより上記第２の治療剤の投与を低頻度とし、ＰＭＬなどの副作用の危険性を低減し、かつ、上記第２の治療剤に対する耐性を防止することができる。
【０３３８】
別の実施形態では、上記第２の治療剤が、慢性炎症を優先的に処置し、これにより、その処置レジメンが、急性炎症および慢性炎症の両方を標的とする。好ましい実施形態では、上記第２の治療剤が、ＴＮＦ−α遮断剤である。
【０３３９】
別の実施形態では、上記第２の治療剤が、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、ならびに／またはＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２１、およびＭＭＰが含まれるがこれらに限定されない炎症性分子を分泌するか、もしくは他の細胞にこれらを分泌させる他の細胞の分化、増殖、活性、ならびに／またはそれらによるサイトカインの生成および／または分泌を阻害するかまたは低減する低分子である。別の実施形態では、上記第２の治療剤が、Ｔｒｅｇと相互作用するか、Ｔｒｅｇの活性を増強するか、ＴｒｅｇによるＩＬ−１０の分泌を促進もしくは増強するか、Ｔｒｅｇの数を増加させるか、Ｔｒｅｇによる抑制能を増大させるか、またはこれらの組合せをもたらす低分子である。
【０３４０】
典型的に有用な低分子は、有機分子であり、分子量が、１００ドルトンを超え、かつ、約２，５００ドルトン未満；より好ましくは１００〜２０００；より好ましくは約１００〜約１２５０；より好ましくは約１００〜約１０００；より好ましくは約１００〜約７５０；より好ましくは約２００〜約５００ドルトンである低分子有機化合物であることが好ましい。低分子は、タンパク質との構造的相互作用、特に、水素結合に必要な官能基を含み、少なくとも、アミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基、好ましくは、これらの官能化学基のうちの少なくとも２つを含むことが典型的である。上記低分子は、上記の官能基のうちの１つ以上で置換された、炭素環式（ｃｙｃｌｉｃａｌ  ｃａｒｂｏｎ）構造物もしくは複素環式構造物、および／または芳香族構造物もしくはポリ芳香族構造物を含むことが多い。低分子にはまた、ペプチド、糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、これらの誘導体、構造類似体、またはこれらの組合せを含めた生体分子も含まれる。一実施形態では、上記低分子が、レチノイン酸またはその誘導体である。下記の実施例は、レチノイン酸が、Ｔｈ１７細胞の分化および／または活性を阻害するかまたは低減することを証明する。
【０３４１】
好ましい実施形態では、上記組成物は、Ｔｒｅｇの活性または生成を増大させる化合物と組み合わせて、またはこれらの化合物と逐次的に用いられる。例示的なＴｒｅｇ増強剤には、グルココルチコイドであるフルチカゾン、サルメテロール（ｓａｌｍｅｔｅｒｏａｌ）、ＩＬ−１２に対する抗体、ＩＦＮ−γに対する抗体、およびＩＬ−４に対する抗体；ビタミンＤ３、およびデキサメタゾン、ならびにこれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない。他の炎症促進性分子に対する抗体もまた、本開示されるＢ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質、またはこれらの断片と組み合わせて、またはこれらと交互に用いることができる。ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、またはＩＬ−２１に結合する抗体が好ましい。
【０３４２】
本明細書で用いられる「ラパマイシン化合物」という用語は、中性の三環系化合物であるラパマイシン、ラパマイシン誘導体、ラパマイシン類似体、ならびにラパマイシンと同じ作用機構（例えば、サイトカイン機能の阻害）を有すると考えられる他のマクロライド化合物を含む。「ラパマイシン化合物」という表現は、ラパマイシンと構造的類似性を有する化合物、例えば、それらの治療有効性を増強するように改変された類似の大環状構造物を有する化合物を含む。当技術分野では、例示的なラパマイシン化合物が公知である（例えば、ＷＯ９５１２２９７２；ＷＯ９５１１６６９１；ＷＯ９５１０４７３８；米国特許第６，０１５，８０９号；同第５，９８９，５９１号；米国特許第５，５６７，７０９号；同第５，５５９，１１２号；同第５，５３０，００６号；同第５，４８４，７９０号；同第５，３８５，９０８号；同第５，２０２，３３２号；同第５，１６２，３３３号；同第５，７８０，４６２号；同第５，１２０，７２７号を参照されたい）。
【０３４３】
「ＦＫ５０６様化合物」という表現は、ＦＫ５０６、およびＦＫ５０６誘導体およびＦＫ５０６類似体、例えば、ＦＫ５０６と構造的類似性を有する化合物、例えば、それらの治療有効性を増強するように改変された類似の大環状構造物を有する化合物を含む。ＦＫ５０６様化合物の例には、例えば、ＷＯ００１０１３８５に記載されている化合物が含まれる。本明細書で用いられる「ラパマイシン化合物」という表現は、ＦＫ５０６様化合物を含めないことが好ましい。
【０３４４】
他の適切な治療剤には、抗炎症剤が含まれるがこれらに限定されない。上記抗炎症剤は、非ステロイド系の場合もあり、ステロイド系の場合もあり、これらの組合せの場合もある。一実施形態は、約１％（ｗ／ｗ）〜約５％（ｗ／ｗ）、典型的には約２．５％（ｗ／ｗ）の抗炎症剤を含有する経口組成物を提供する。限定なしに述べると、非ステロイド系抗炎症剤の代表例には、ピロキシカム、イソキシカム、テノキシカム、スドキシカムなどのオキシカム；アスピリン、ジサルシド、ベノリレート、トリリセート、サファプリン、ソルプリン、ジフルニサル、およびフェンドサルなどのサリチル酸塩およびエステル；ジクロフェナク、フェンクロフェナク、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、イソキセパック、フロフェナク、チオピナク、ジドメタシン、アセマタシン、フェンチアザク、ゾメピラク、クリンダナク、オキセピナク、フェルビナク、およびケトロラクなどの酢酸誘導体；メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、ニフルミン酸、およびトルフェナム酸などのフェナム酸塩およびエステル；イブプロフェン、ナプロキセン、ベノキサプロフェン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、フェノプロフェン、フェンブフェン、インドプロフェン、ピルプロフェン、カルプロフェン、オキサプロジン、プラノプロフェン、ミロプロフェン、チオキサプロフェン、スプロフェン、アルミノプロフェン、およびチアプロフェン酸（ｔｉａｐｒｏｆｅｎｉｃ）などのプロピオン酸誘導体；フェニルブタゾン、オキシフェンブタゾン、フェプラゾン、アザプロパゾン、およびトリメタゾンなどのピラゾールが含まれる。また、これらの非ステロイド系抗炎症剤の混合物も使用することができる。
【０３４５】
限定なしに述べると、ステロイド系抗炎症薬の代表例には、ヒドロコルチゾン、ヒドロキシルトリアムシノロン、アルファ−メチルデキサメタゾン、リン酸デキサメタゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、吉草酸クロベタゾール、デソニド、デソキシメタゾン、酢酸デソキシコルチコステロン、デキサメタゾン、ジクロリゾン、二酢酸ジフロラゾン、吉草酸ジフルコルトロン、フルアドレノロン、フルクロロロンアセトニド、フルドロコルチゾン、フルメタゾンピバレート、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルコルチンブチルエステル、フルオコルトロン、酢酸フルプレドニデン（フルプレドニリデン）、フルランドレノロン、ハルシノニド、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロンアセトニド、コルチゾン、コルトドキソン、フルセトニド、フルドロコルチゾン、二酢酸ジフルオロオゾン、フルラドレノロン、フルドロコルチゾン、二酢酸ジフルロゾン、フルラドレノロンアセトニド、メドリゾン、アムシナフェル、アムシナフィド、ベタメタゾンおよびそのエステルの残りのもの（ｔｈｅ  ｂａｌａｎｃｅ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｅｓｔｅｒｓ）、クロロプレドニゾン、酢酸クロロプレドニゾン（ｃｈｌｏｒｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ  ａｃｅｔａｔｅ）、クロコルテロン、クレシノロン、ジクロリゾン、ジフルルプレドネート、フルクロロニド、フルニゾリド、フルオロメタロン、フルペロロン、フルプレドニゾロン、吉草酸ヒドロコルチゾン、シクロペンチルプロピオン酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルタメート、メプレドニゾン、パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、トリアムシノロン、ならびにこれらの混合物などのコルチコステロイドが含まれる。
【０３４６】
別の実施形態では、さらなる治療剤に、ｓＨ４活性を阻害するかまたはこれに干渉して、被験体における炎症性障害を処置する組成物が含まれる。一実施形態では、炎症性疾患を処置するために、ｓＨ４を微量有するかまたはそれが検出不能である被験体にＢ７−Ｈ４融合ポリペプチドを投与する。別の実施形態では、Ｂ７−Ｈ４融合ポリペプチドを投与して、ｓＨ４レベルが高い被験体における炎症性疾患の１つ以上の症状を処置する。ｓＨ４レベルの上昇は、炎症性障害を有することが公知の被験体におけるｓＨ４レベルを、炎症性障害を有さない被験体におけるｓＨ４レベルと比較することにより決定することができる。
【０３４７】
Ｅ．薬力学マーカー
上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、もしくはそれらの断片、またはそれらの融合タンパク質を用いる処置の有効性は、血清タンパク質などのバイオマーカー、好ましくは炎症促進性サイトカイン、炎症促進性ケモカイン、急性期のマーカー、ならびに／または全ＩｇＧ、もしくは特異的な疾患関連ＩｇＧなどの抗体、あるいは他の血清タンパク質、例えば、ｓＨ４のレベルの変化について、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドまたはそれらの融合タンパク質による処置を受ける被験体から得られる試料をアッセイすることにより決定することができる。例えば、被験体から得られる血清試料におけるバイオマーカーのベースラインレベルは、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドまたは融合タンパク質による処置より前に決定することができる。Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドまたはそれらの融合タンパク質による処置後または処置の間に、上記被験体に由来する血液試料におけるバイオマーカーレベルをモニタリングすることができる。ベースラインレベルと比べたバイオマーカーレベルの変化、例えば、サイトカインレベルの低下は、その処置が、炎症性障害の１つ以上の症状を軽減するのに有効であることを示す。代替的に、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドまたはそれらの融合タンパク質による処置を受ける被験体に由来する血液試料におけるサイトカインレベルを、炎症性障害を有さない被験体から決定された、所定のバイオマーカーレベルと比較することができる。一部の実施形態では、１つのバイオマーカーだけのレベルをモニタリングする。他の実施形態では、２、３、４、５以上のバイオマーカーのレベルをモニタリングする。
【０３４８】
上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、それらの断片、または融合タンパク質を用いる処置の有効性は、対照と比較したＴｒｅｇ数の増加、または活性化Ｔｈ１細胞数もしくは活性化Ｔｈ１７細胞数の減少など、リンパ球集団のレベルの変化について、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドまたはそれらの融合タンパク質による処置を受ける被験体から得られる試料をアッセイすることにより決定することができる。
【０３４９】
一部の実施形態では、当技術分野において公知の方法を用いて、疾患特異的なマーカーまたは症状をモニタリングすることにより、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、それらの断片、または融合タンパク質を用いる処置の有効性を決定する。例えば、造影を使用して、多発性硬化症の処置の有効性を評価することもでき、遅延型過敏（ＤＴＨ）をモニタリングして、狼瘡処置の有効性を評価することもできる。
【０３５０】
上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、それらの断片、またはそれらの融合タンパク質を用いる処置の有効性は、血清タンパク質、好ましくは炎症促進性サイトカインおよび／または炎症促進性ケモカインの他、分泌因子、細胞表面受容体、ならびにＴｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、およびＴｒｅｇ細胞に特徴的な転写因子をコードする遺伝子が含まれるがこれらに限定されない遺伝子の発現レベルの変化について、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドまたはそれらの融合タンパク質による処置を受ける被験体から得られる試料をアッセイすることにより決定することができる。当技術分野では、遺伝子の発現を測定する方法が周知であり、これらには、定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびマイクロアレイ解析が含まれるがこれらに限定されない。
【０３５１】
Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、それらの断片、ならびにそれらの融合タンパク質を用いる処置の有効性を決定するためにモニタリングされうる例示的なマーカーは、下記の実施例全体、特に、図７、８、９、５７、および５８において見出すことができ、これらにはＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２１、およびＭＭＰのうちの１つ以上が含まれるがこれらに限定されない。関節炎をモニタリングするのに特に有用なバイオマーカーは、下記の実施例３ならびに図７、８、および９で説明されており、これらには、ＣＲＰ、ＥＴ−１、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ−２、およびＴＮＦ−αが含まれることが好ましいがこれらに限定されない。Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、それらの断片、ならびにそれらの融合物、ならびにこれらのタンパク質を組み込む組合せ治療による処置の有効性をモニタリングするのに有用な別のマーカーは、患者の組織液中のＣＤ７３レベルである（例えば、ＷＯ０９／０５３５２を参照されたい）。
【０３５２】
Ｆ．患者の選択
本明細書に記載されたＢ７−Ｈ４ポリペプチド、それらの断片、ならびにそれらの融合タンパク質の有効性は、上記で説明したバイオマーカーもしくは遺伝子発現のレベル、または下流のエフェクター遺伝子をコードする遺伝子内の多型について、標的となる患者を予めスクリーニングすることにより予測することができる。
【０３５３】
非限定的な例では、炎症性障害を有さない被験体と比べて、１つ以上の炎症性サイトカインまたは炎症性ケモカインのレベルが高い患者を、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４断片、またはＢ７−Ｈ４融合タンパク質による処置について選択することができる。代替的に、１つ以上の炎症性サイトカイン遺伝子または炎症性ケモカイン遺伝子において多型を有する患者を、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドまたはＢ７−Ｈ４融合タンパク質による処置について選択することもできる。例えば、ＩＬ−１０遺伝子に特定の多型を有する患者は、上記多型の性質に応じて、Ｂ７−Ｈ４組成物による処置が、多少とも良好に奏効すると予測されうる。Ｂ７−Ｈ４組成物による処置が有効であるかどうかを決定する目的でスクリーニングされうる、例示的な分子ならびにそれら各々の遺伝子には、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２１、およびＭＭＰのうちの１つ以上が含まれるがこれらに限定されない。Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、それらの断片、ならびにそれらの融合物、ならびにこれらのタンパク質を組み込む組合せ治療による処置について患者を選択するのに有用な別のマーカーは、患者の組織液中のＣＤ７３レベルである。炎症性分子のレベルは、定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびＥＬＩＳＡが含まれるがこれらに限定されない公知の方法により測定することができる。当技術分野では、遺伝子多型を同定する方法が周知であり、これらには、ＤＮＡ配列決定およびＤＮＡマイクロアレイが含まれるがこれらに限定されない。
【０３５４】
また、処置期間における１つ以上の炎症性分子のレベルについて患者をスクリーニングし、かつ、被験体における１つ以上のサイトカインレベルが、炎症性障害を有さないコントロール被験体におけるレベルと比較して高ければ、その被験体に投与するＢ７−Ｈ４の量を増やすか、または上記被験体における１つ以上のサイトカインレベルが、炎症性障害を有さないコントロール被験体におけるレベルと比較して低ければ、その被験体に投与するＢ７−Ｈ４の量を減らすことにより、炎症性障害のための、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドまたはＢ７−Ｈ４融合タンパク質による処置の有効性について、患者をモニタリングすることもできる。
【実施例】
【０３５５】
（実施例１）
コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）予防モデルにおけるＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（マウス）
方法および材料
ＣＩＡは、ヒトＲＡについて十分に特徴づけられたマウスモデルであり、ＤＢＡ／１ＪマウスにコラーゲンＩＩ（ＣＩＩ）を注射することにより、関節において腫脹および進行性炎症を誘発し、その結果として関節炎をもたらす。図２に示す通り、ＣＩＩによる免疫と同じ日に、ＤＢＡ／１Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）に、０．５ｍｇのＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（２０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内（ＩＰ）投与した。毎週２回で６週間にわたり、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ処置を継続した。２１日目に、ＩＦＡ中で乳化させたＣＩＩを用いて、マウスを再感作した。図２は、実験デザインの概要を概説する。４０日目が、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ処置の最終日であった。表１に提示される関節炎スコア付けシステムを用いて、２６日目から、毎週２回、マウスの足／関節をモニタリングした。
【０３５６】
【表１】
2013503204.tif 000075
結果
図３に示す通り、３３日目以降、上記Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処置したＣＩＡマウスの全関節炎スコアは、ビヒクルを注射したＣＩＡマウスについてのスコアより著しく低かった。
【０３５７】
（実施例２）
ＣＩＡ治療モデル
方法および材料
図４は、ＣＩＡ治療研究の実験デザインの概要を概説する。まず、ＣＦＡ中で乳化させたニワトリＣＩＩにより、ＤＢＡ／１Ｊマウスを免疫した。２１日後に、ＩＦＡ中で乳化させたＣＩＩによりマウスを再感作し、２つの群に無作為化した。第１群（ｎ＝１０）には、毎週３回で４週間にわたり、３００μｇのＢ７−Ｈ４−ＩｇをＩＰ注射した。第２群（ｎ＝１０）には、ビヒクルを注射した。毎週３回、マウスの足／関節をモニタリングし、スコアを記録した。
【０３５８】
結果
図５に示す通り、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇは、関節炎の発達を有意に抑制することができた。３８日目以降、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処置したＣＩＡマウスの全関節炎スコアは、ビヒクルを注射したＣＩＡマウスの全関節炎スコアより有意に低かった。
【０３５９】
（実施例３）
ヒトＢ７−Ｈ４−Ｉｇを用いるＣＩＡの処置
材料および方法
動物
ＤＢＡ／１マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ，Ｉｎｃ．；ＤＢＡ１Ｂ０）
耳タグ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂａｎｄ；１００５−１）
電気バリカン（Ｏｓｔｅｒ）  。
【０３６０】
ＣＩＡの誘発
Ｈｏｏｋｅ  Ｋｉｔ（商標）Ｃｈｉｃｋｅｎ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ／ＣＦＡ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎ（Ｈｏｏｋｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；ＥＫ−０２１０）
Ｈｏｏｋｅ  Ｋｉｔ（商標）Ｃｈｉｃｋｅｎ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ／ＩＦＡ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎ（Ｈｏｏｋｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；ＥＫ−０２１１）  。
【０３６１】
処置
Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ
ＲＰＡ１１００１０
Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）（パリビズマブ；ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ；ＮＤＣ＃６０５７４−４１１２−１）；ヒトＩｇＧ１アイソタイプコントロールとして用いる
マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇ
マウスＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール（ＢｉｏＸＣｅｌｌ；Ｃｌ．１８）
Ｌｕｅｒ−Ｌｏｋチップを伴う３ｍＬのシリンジ（ＢＤ；３０９５８５）
２７ゲージの注射針（ＢＤ；３０５１０９）
Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ製剤用緩衝液（１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５；８％ｗ／ｗのスクロース；０．０１％のポリソルベート８０）
血清の回収
ランセット（Ｍｅｄｉｐｏｉｎｔ  Ｇｏｌｄｅｎｒｏｄ；４ｍｍ）
Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ（登録商標）Ｓｅｒｕｍ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ  Ｔｕｂｅｓ（ＢＤ；３６５９５６）  。
【０３６２】
関節炎の誘発
７〜９週齢のＤＢＡ／１マウス（１群当たり１０匹）を、ＣＩＡモデルに用いた。複数の販売元（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、およびＴａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ）によるマウスについて調べたところ、Ｔａｃｏｎｉｃによるマウスが、本ＣＩＡ研究に最適であると判定された。Ｔａｃｏｎｉｃによるマウスが、より一貫し、かつ、より重度の疾患症状を発症し、ならびに疾患増悪の持続を示すのに対し、他の販売元によるマウスは、処置を施さない場合であっても、安定した重度が低い疾患を示すことが多い。ＡＡ＃７９における雌（Ｆ）マウス、ならびにＡＡ＃８０の雄（Ｍ）マウスを調べ、その後の実験においていずれの性別を用いるかを決定した。
【０３６３】
研究を開始する前日、電気バリカンを用いて各マウスの右側腹部の毛を刈り取った。各マウスの右耳に、金属製の識別タグを取り付けた。０日目に、右側腹部へのニワトリＩＩ型コラーゲン／フロイント完全アジュバント（ＣＩＩ／ＣＦＡ）エマルジョン１００μＬで、マウスを免疫した。２０日目に、電気バリカンを用いて各マウスの左側腹部の毛を刈り取り、２１日目に、左側腹部へのニワトリＩＩ型コラーゲン／フロイント不完全アジュバント（ＣＩＩ／ＩＦＡ）エマルジョン１００μＬで、マウスを免疫した。ＣＩＩ／ＣＦＡエマルジョンおよびＣＩＩ／ＩＦＡエマルジョンを予め充填したシリンジをＨｏｏｋｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、これらを用いて、一貫した免疫原の投与および免疫原の効力を確保した。
【０３６４】
疾患のモニタリング
紅斑ならびに軽度の腫脹など、初期関節炎症状は、通常２１日目に現れ、２８日目には、多くの足指における腫脹ならびに炎症の足根関節への拡大など、より重度の症状が現れるのが典型的であった。表２に示す、広く受容されている関節炎の重症度スコアシステムを用いて、毎週３回、関節炎症状の重症度について、各肢を評価した。四肢の各々によるスコアをまとめて、各マウスの疾患スコアを得る。
【０３６５】
【表２】
2013503204.tif 000076
処置
マウスＣＩＡ治療モデルにおける疾患の誘発および処置を表わす代表的な時間の流れを、図６に示す。この処置レジメンは、概念実証研究に用いる。また、より少ない投与回数、より低頻度の投与、ならびに／またはより少ない投与量を用いるレジメンも有効でありうる。研究動物の平均疾患スコアが４を超えたときに、処置を開始した。これは、ＡＡ＃７９では２９日目に対応し、ＡＡ＃８０では２４日目に対応した。動物が症状を帯びるまで待つことにより、上記モデルを、予防モードではなく、治療モードで実施することを確保した。表３に処置群を示す。
【０３６６】
【表３】
2013503204.tif 000077
毎週３回で合計８回にわたる腹腔内（ＩＰ）注射により、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ、ＲＰＡ１１００１０、およびマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇタンパク質を投与した。ＲＰＡ１１００１０とは、配列番号１２６の、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇの細胞外ドメイン改変体である。１週間に１回で合計３回にわたり、コントロールのマウスＩｇＧタンパク質およびヒトＩｇＧタンパク質を施した。Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇは、コントロールのＩｇＧより急速に循環から除去されるので、この差違を補完するため、異なる投与スケジュールを用いる。注射の直前に、すべてのタンパク質を、滅菌ＰＢＳにより、所望の濃度（５００μＬ中に５００μｇ、または１ｍｇ／ｍＬ）まで希釈した。ビヒクルコントロールのマウスには、ＰＢＳ中で１：１０に希釈して５００μＬの注射容量とした、Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ製剤用緩衝液を施した。
【０３６７】
血清中バイオマーカーの解析
ＡＡ＃８０では、２７日目、３４日目、４１日目、および５５日目に、下顎静脈（ｓｕｂｍａｎｄｉｂｕｌａｒ  ｖｅｉｎ）から血清試料を回収した。マウス１匹当たり約２００μＬの血液を、Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ（登録商標）Ｓｅｒｕｍ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ  Ｔｕｂｅｓ内に回収した。遠心分離後、血清を取り出し、解析を行うまで、＜−６５℃で保存した。
【０３６８】
選択した血清試料を、Ｒｕｌｅｓ−Ｂａｓｅｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）に送付して、定量イムノアッセイによる血清試料の多重分析物プロファイリングを行い、疾患の増悪ならびにＢ７−Ｈ４−Ｉｇ処置の奏効をモニタリングするのに用いうるバイオマーカーを同定することを目標とした。２７日目、３４日目、および４１日目に、ＲｏｄｅｎｔＭＡＰ  ｖ２．９  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｓｅｒｖｉｃｅを用いて、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ群内の代表的なマウス３匹（タグ番号３３３２、３３３４、および３３３８）、ならびにＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）群内の代表的なマウス３匹（タグ番号３３２４、３３２９、および３３３０）に由来する血清を、５８の分析物のレベルについて解析した。
【０３６９】
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌおよびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、Ｒｕｌｅｓ−Ｂａｓｅｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅによる解析に由来するデータを解析した。Ｔ検定を実施して、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処置した試料中の各分析物のレベルを、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）で処置した試料中の各分析物のレベルと比較した。多重比較のための補正は行わなかった。加えて、各分析物対疾患スコアについての相関係数を計算した。
【０３７０】
結果
ＣＩＡモデルにおけるＢ７−Ｈ４−Ｉｇの有効性
図７および８、ならびに表４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、６、および７に示す通り、ＡＡ＃７９およびＡＡ＃８０のいずれにおいても、Ｂ７−Ｈ４−ＩｇおよびマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇで処置したマウスは、コントロール群におけるマウスより疾患スコアが低かったが、これは、初期研究の結果と符合した。いずれの研究においても、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇはより優れた有効性を示し、ＡＡ＃７９では、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ群における疾患の安定化が、処置停止後においても持続される。ＲＰＡ１１００１０改変体は、いずれの研究でも有効でなかった。
【０３７１】
【表４Ａ】
2013503204.tif 000078
【０３７２】
【表４Ｂ】
2013503204.tif 000079
【０３７３】
【表５Ａ】
2013503204.tif 000080
【０３７４】
【表５Ｂ】
2013503204.tif 000081
【０３７５】
【表６】
2013503204.tif 000082
【０３７６】
【表７】
2013503204.tif 000083
ＣＩＩによる免疫後、２１日目までに、大半の動物は、炎症症状を発症し始め、疾患の重症度は、４５日目まで増悪し続けた。Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処置したマウスは、長期間にわてって疾患スコアが安定しており、ＡＡ＃７９では、この効果が、処置を停止した後においても維持される。マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇで処置した動物では、処置期間（ＡＡ＃７９では２９日目〜４６日目、ならびにＡＡ＃８０では２４日目〜４１日目）中は疾患スコアが一過性で安定するが、すぐに反跳した。コントロール処置群ならびにＲＰＡ１１００１０群における疾患の増悪は、すべて、同様のプロファイルを示した。
【０３７７】
血清中バイオマーカーの解析
図９、１０、および１１に示し、かつ、以下に記載する通り、複数のタンパク質の血清レベルは、疾患の増悪と相関し、かつ／またはＢ７−Ｈ４−Ｉｇ処置マウスとＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）処置マウスとで異なった。図９および１０は、Ｒｕｌｅｓ  Ｂａｓｅｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅによる完全なデータセットを示す。図１１は、Ｒｕｌｅｓ  Ｂａｓｅｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅによるデータ解析の概要を示す。２７日目、３４日目、４１日目、または全体で、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）処置群と、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ処置群との間に潜在的な有意差（０．０５未満のｐ値）が見られる場合は、分析物に影を付す。また、分析物と臨床スコアとの相関係数が０．３未満の場合にも、分析物に影を付す。これらのマーカーは、疾患重症度についての客観的な指標、ならびに／またはＢ７−Ｈ４−Ｉｇによる処置の奏効についてのバイオマーカーとして用いられうる。
【０３７８】
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）
図１２に示す通り、ＣＲＰタンパク質レベルは、臨床スコアと相関するが、２つの群間では有意差を示さない。ＣＲＰは、炎症について一般的に用いられる臨床バイオマーカーであり、ＲＡの疾患活性についてのマーカーとして十分に受容されている。ＣＲＰ濃度が高ければ、関節の侵食が予測される。ＣＲＰは、アカゲザルＣＩＡモデルではバイオマーカーとして用いられているが、マウスにおけるバイオマーカーとしては一般的に用いられていない。ＣＲＰではなく、以下に記載されるＳＡＰが、マウスにおける主要な急性期タンパク質であると考えられる。
【０３７９】
エンドセリン１（ＥＴ−１）
図１３に示す通り、４１日目には、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ処置マウスにおいて、ＥＴ−１レベルが著しく低下する。エンドセリンは、強力な血管収縮因子として作用する。ＲＡ患者では、血漿レベルの上昇が報告されている。ＥＴ−１もまた、好中球を滑膜へと動員するのに役割を果たしうる。
【０３８０】
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼアルファ（ＧＳＴ−α）
Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）処置マウスに由来する血清試料９例中７例では、ＧＳＴ−αレベルが検出不能であるが、３４日目の試料３例中２例、ならびに４１日目の試料３例中３例を含めた、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ処置マウスに由来する血清試料９例中５例では、ＧＳＴ−αレベルが検出可能である。ＧＳＴ−αは、低分子の解毒に関与し、レベルの上昇は、肝毒性を示しうる。いずれの症例でも、検出されるレベルは、検出限界をわずかに上回るに過ぎなかった。
【０３８１】
インターロイキン６（ＩＬ−６）
図１４に示す通り、ＩＬ−６レベルは、疾患スコアと共に増大する。最高レベルはすべて、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）処置群で見られるが、この研究では、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）群とＢ７−Ｈ４−Ｉｇ群との差が、統計的有意に到達しなかった。初期の研究は、マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇにより処置すると、上記ＣＩＡモデルにおけるＩＬ−６レベルが低下することを示した。
【０３８２】
増殖関連アルファタンパク質（Ｇｒｏ−α）
Ｇｒｏ−α（また、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１；ＣＸＣＬ１とも呼ばれる）レベルは、疾患スコアと共に増大する。最高レベルはすべて、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）処置群で見られるが、この研究では、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）群とＢ７−Ｈ４−Ｉｇ群との差が、統計的有意に到達しない。Ｇｒｏ−αは、好中球の走化性および活性化に関与する。
【０３８３】
単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）
図１５に示す通り、４１日目および全体では、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ処置マウスにおいて、ＭＣＰ−１（また、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２；ＣＣＬ２とも呼ばれる）レベルが著しく低い。ＭＣＰ−１は、単球、メモリーＴ細胞、および樹状細胞を、傷害部位または炎症部位へと動員する。ＭＣＰ−１は、ＲＡにおける関節部へのマクロファージの動員を促進し、炎症を持続させる。初期の研究は、マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇもまた、上記ＣＩＡモデルにおいてＭＣＰ−１レベルを低下させることを示した。
【０３８４】
単球走化性タンパク質３（ＭＣＰ−３）
図１６および１７に示す通り、ＭＣＰ−３（また、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド７；ＣＣＬ７とも呼ばれる）レベルが疾患スコアと共に増大し、４１日目および全体では、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ処置マウスにおいて、それは著しく低い。ＭＣＰ−３は、ＭＣＰ−１と７４％同一である。ＭＣＰ−３は、単球およびＴ細胞の化学誘引物質である。
【０３８５】
マクロファージ炎症性タンパク質２（ＭＩＰ−２）
ＭＩＰ−２（また、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１４；ＣＸＣＬ１４とも呼ばれる）レベルは、疾患スコアと共に増大する。図１８に示す通り、４１日目では、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）処置マウスより、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ処置マウスにおけるレベルが著しく低い。ＭＩＰ−２は、好中球の強力な化学誘引物質である。
【０３８６】
血清アミロイドタンパク質（ＳＡＰ）
ＳＡＰレベルは、疾患スコアと共に上昇するが、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ処置群と、Ｓｙｎａｇｉｓ処置群とで顕著な差を示さない。ＳＡＰは、マウスにおける主要な急性期タンパク質であり、かつ、一般的な炎症マーカーであると考えられる。
【０３８７】
腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）
図１９に示す通り、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）処置マウスに由来する血清試料９例中５例では、レベルが検出限界を上回るが、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ処置マウスに由来する血清のうちで、レベルが検出限界を上回る血清は見られなかった。ＴＮＦ−αは、ＲＡの疾患活性についての重要なメディエーターである。初期の研究は、マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇで処置すると、ＣＩＡモデルにおけるＴＮＦ−αレベルが低下することを示した。
【０３８８】
実施例３において提示されるデータでは、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇが、マウスＣＩＡモデルで強力な有効性を示し、ビヒクルで処置した動物ならびにコントロールのＩｇＧで処置した動物と比較して、疾患スコアを安定化させることができる。Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇは、雌ＤＢＡ／１マウスおよび雄ＤＢＡ／１マウスのいずれにおいても、マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇより強力であると考えられ、雌マウスでは、長期間にわたる保護効果を誘導した。雄マウスと雌マウスとでは、疾患の経過が若干異なる。ＣＩＡモデルでは、ヒトＢ７−Ｈ４−Ｉｇが、それのマウス類似体より強力である一方、ＲＰＡ１１００１０は、ＡＡ＃７９およびＡＡ＃８０のいずれにおいても活性でなかった。マウスＴＨ１７分化アッセイとの関係では、Ｂ７−Ｈ４−ＩｇおよびＲＰＡ１１００１０の活性が同様であり、マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇがより強力である。これら３つの分子の薬物動態特性が異なる可能性がある。さらなる研究を実施して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるこれらの分子の相対的活性を評価する。
【０３８９】
Ｒｕｌｅｓ−Ｂａｓｅｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅにより実施された血清中タンパク質の解析は、初期の研究を確認し、かつ、ＣＩＡモデルによる疾患の増悪ならびにＢ７−Ｈ４−Ｉｇによる処置の奏効について、新たなリードアウトをもたらした。最も有望なマーカーには、ＣＲＰ、ＥＴ−１、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ−２、およびＴＮＦ−αが含まれる。血清中バイオマーカーについての研究結果、ならびに既に公表された結果は、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇが、好中球の成熟ならびに滑膜への遊走に影響を及ぼしうることを示唆する（Ｚｈｕ，  Ｇ．ら、Ｂｌｏｏｄ、１１３巻：１７５９〜１７６７頁（２００９年）；  Ａｚｕｍａ，Ｔ．ら、ＰＬｏＳ．  Ｍｅｄ．、６巻、ｅ１０００１６６頁（２００９年））。
【０３９０】
（実施例４）
Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇは炎症促進性分子を低減する
方法および材料
実施例３に記載した通りに処置したマウスから、３３日目に血漿を回収し、ＢＤ（商標）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）Ｆｌｅｘ  Ｓｅｔｓを用いて、炎症促進性分子、例えば、ＴＮＦα、ＩＬ６、およびケモカイン（ＭＣＰ−１）について解析した。
【０３９１】
結果
図２０Ａ、２０Ｂ、および２０Ｃのそれぞれに提示するデータは、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇが、処置されたＣＩＡマウスにおけるＴＮＦα、ＩＬ６、およびＭＣＰ−１を著しく低減したことを証明する。
【０３９２】
（実施例５）
Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇはサイトカインの生成ならびにＴ細胞の分化に影響を及ぼす
材料および方法
マウス
ＢＡＬＢ／ｃマウスであるＤＯ１１．１０ならびにＣ５７ＢＬ／６マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。ＳＪＬマウスは、Ｈａｒｌａｎから購入した。ＮＩＨガイドラインに従って、すべてのマウスを維持した。本研究で用いたマウスは、６〜９週齢であった。
【０３９３】
他の試薬
マウスコントロールＩｇＧ：Ｒｏｃｋｌａｎｄ、＃０１０−０１０２；ＣＤ４＋Ｔ細胞陰性単離キット：Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、＃１３０−０９０−８６０；ＣＤ６２Ｌ＋陽性選択用磁気ビーズ：Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、＃１３０−０４９−７０１；ＣＤ２５＋Ｔ細胞枯渇：抗ｍＣＤ２５抗体−ＰＥ：Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、＃１２０−０００−９００；ならびに抗ＰＥ磁気ビーズ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ：＃１２０−０００−２９４；Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍｏｕｓｅ  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｄｅｒビーズ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１１４５２Ｄ；Ｍｏｕｓｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｋｉｔ：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＰＸＭＣＹＴＯ−７０Ｋ；９６ウェル平底プレート：Ｃｏｓｔａｒ、＃３５９６；β−メルカプトエタノール：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃２１９８５−０２３；ＨＬ−１培地：Ｌｏｎｚａ  ＃３４４０１７；ＯＶＡ３２３〜３３９：ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ（配列番号１３８）；ＰＬＰ１３０〜１５１：ＨＳＬＧＫＷＬＧＨＰＤＫＦ（配列番号１３９）；ＰＬＰ１３０〜１５１：ＮＴＷＴＴＣＱＳＩＡＦＰＳＫ（配列番号１４０）；ＭＯＧ３５〜５５：ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ（配列番号１４１）は合成した；ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（商標）ＭＡＰ：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  。
【０３９４】
サイトカインおよび抗体
表８は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるヘルパーＴ細胞を極性化させるのに用いられるサイトカインおよび抗体についての詳細な情報を列挙する。
【０３９５】
【表８】
2013503204.tif 000084
ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞の単離
ＤＯ１１．１０マウスから、マウス脾細胞をまず摘出し、ＯＶＡ３２３〜３３９に特異的な、ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞受容体を発現する脾細胞を単離した。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＣＤ４＋Ｔ細胞陰性単離キット（カタログ番号１３０−０９０−８６０）を用いて、マウスＣＤ４＋Ｔ細胞を精製した。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ抗ＣＤ６２Ｌ陽性選択用磁気ビーズ（カタログ番号１３０−０４９−７０１）を用いて、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をさらに精製した。
【０３９６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＴｈ１細胞の極性化
ｒＩＬ−２（１ｎｇ／ｍＬ）、ｒＩＬ−１２（４ｎｇ／ｍＬ）、および抗ＩＬ−４抗体（１μｇ／ｍＬ）の存在下、無血清ＨＬ−１培地中で、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を伴うかまたは伴わないＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞を培養した。多数のフォーマット（可溶性Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇならびに不溶性Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇの提示）において、マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇの活性を調べた。また、非特異的に活性化されるか、または抗原特異的刺激により活性化されたＴ細胞に対する活性についても、マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇを評価した。マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇを固定化フォーマットで供給するには、まず、１μｇ／ｍＬのマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇを１ウェル当たり１００μｌ用いて９６ウェル平底プレートをコーティングし、３７℃で２時間にわたりインキュベートした。マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇを可溶性形態で供給するには、マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇを、１μｇ／ｍＬで、または、用量依存研究についての「図面の簡単な説明」および図で示される通りに、組織培養物へと添加した。非特異的な抗原による活性化では、マウス  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｄｅｒビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１４５２Ｄ）を、１：１の細胞対ビーズ比で各ウェルに添加した。ＯＶＡ特異的活性化については、まず、脾細胞を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスから、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として単離し、その後、３０００ｒａｄで４５分間にわたり放射線照射し、次いで、１：１のＡＰＣ対レスポンダー細胞比で各ウェルに添加した。ＯＶＡ３２３〜３３９ペプチドを２０μｇ／ｍＬでその培養物に添加した。
【０３９７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＴｈ１７細胞の極性化
ｒＴＧＦ−β（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−２３（４ｎｇ／ｍＬ）、抗ＩＬ−４抗体（１μｇ／ｍＬ）、抗ＩＦＮ−γ抗体（１μｇ／ｍＬ）、および抗ＩＬ−２抗体（１μｇ／ｍＬ）が存在する無血清ＨＬ−１培地中で、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を伴うかまたは伴わないＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞を培養した。マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇを固定化フォーマットで供給するには、まず、１μｇ／ｍＬのマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇを１ウェル当たり１００μｌ用いて９６ウェル平底プレートをコーティングし、３７℃で２時間にわたりインキュベートした。マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇを可溶性形態で供給するには、マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇを、１μｇ／ｍＬで、または、用量依存研究についての「図面の簡単な説明」および図で示される通りに、組織培養物へと添加した。非特異的な抗原による活性化では、マウス  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｄｅｒビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１４５２Ｄ）を、１：１の細胞対ビーズ比で各ウェルに添加した。ＯＶＡ特異的な活性化では、まず、脾細胞を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスから、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として単離し、その後、３０００ｒａｄで４５分間にわたり放射線照射し、次いで、１：１のＡＰＣ対レスポンダー細胞比で各ウェルに添加した。ＯＶＡ３２３〜３３９ペプチドを２０μｇ／ｍＬでその培養物に添加した。
【０３９８】
増殖解析
共インキュベーションの２４時間後において、各ウェルに［３Ｈ］−チミジン（１ウェル当たり１μＣｉ）を添加した。Ｔｏｐｃｏｕｎｔ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｅｒｉｄａｎ、ＣＴ）を用いて、［３Ｈ］−チミジンを添加した４８時間後における［３Ｈ］−チミジンの取込みにより、増殖を決定した。三連培養物の平均値±ＳＥＭとして、結果を表わす。
【０３９９】
サイトカイン解析
７２時間後において、［３Ｈ］−チミジンを伴わないプレートから上清を回収し、サイトカインについて解析した。マウス  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １０−Ｐｌｅｘシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびＬｕｍｉｎｅｘ  Ｌｉｑｕｉｄｃｈｉｐ解析装置（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）またはＥＬＩＳＡを用いて、サイトカインの測定を実施した。
【０４００】
結果
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇの生物活性を証明するため、Ｔ細胞極性化培養物にＢ７−Ｈ４−Ｉｇを添加した。ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（商標）ＭＡＰを介する、［３Ｈ］−チミジンの取込みならびにサイトカインの生成により、Ｂ７−Ｈ４−ＩｇがＴ細胞の増殖を阻害する能力を決定した。加えて、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の存在下または非存在下におけるＴ細胞の極性化培養結果を比較することにより、Ｂ７−Ｈ４−ＩｇとＴｒｅｇ細胞との相互作用を評価した。
【０４０１】
Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇによる処理は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＴｈ１細胞極性化培養条件下およびＴｈ１７細胞極性化培養条件下における、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化および分化を変化させる。まず、Ｍｉｌｔｅｎｙｉキットを用いて、ＤＯ１１．１０マウスから、マウスＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞を単離した。図２１に示す通り、マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇの存在下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＴｈ１細胞促進条件（ＩＬ２、ＩＬ−１２、および抗ＩＬ４抗体を伴う）の存在下で活性化されるＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞は、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍｏｕｓｅ  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｄｅｒビーズ（抗ＣＤ３抗体＋抗ＣＤ２８抗体によるビーズ）で非特異的に刺激しても、ＯＶＡ３２３〜３３９でパルスしたＡＰＣ（ＡＰＣ／ＯＶＡ）の存在下で活性化させても、マウスＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞の増殖は著しく阻害された。上記ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ビーズおよびＡＰＣによる活性化条件の両方で活性化させても、同様の結果が得られた。加えて、図２２は、マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇが、同じ条件下にあるマウスＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞から生成されるＩＦＮ−γのレベルを著しく低下させたことを示す。Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇを、溶液（Ｓｏｌ）中に添加しても、プレート（Ｐｌａｔｅ）に結合させても、すべての場合において同様の結果が見られた。
【０４０２】
ＭＳおよびＥＡＥのいずれもが、Ｔｈ１細胞／Ｔｈ１７細胞媒介性であると考えられ、したがって、次に、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＴｈ１７細胞促進培養条件の存在下で活性化させたときの、ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞の分化を阻害しうるかどうかを決定した。図２３に示す通り、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＴｈ１７細胞促進培養条件（ｒＴＧＦ−β、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、抗ＩＬ−４抗体、抗ＩＦＮ−γ抗体、および抗ＩＬ−２抗体を伴う）の存在下において、ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞は活性化された。マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇは、マウスＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞をＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍｏｕｓｅ  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｄｅｒビーズ（抗ＣＤ３抗体＋抗ＣＤ２８抗体によるビーズ）で非特異的に刺激しても、ＯＶＡ３２３〜３３９でパルスしたＡＰＣ（ＡＰＣ／ＯＶＡ）の存在下で活性化させても、マウスＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞の増殖を著しく阻害した。上記ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ビーズおよびＡＰＣによる活性化条件の両方で活性化させても、同様の結果が得られた。加えて、図２４および２５は、マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇが、これらの同じ条件下で誘導されたマウスＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞から生成されるＩＬ−１７およびＩＦＮ−αのレベルを、それぞれ、著しく低下させたことを示す。Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇを、溶液（Ｓｏｌ）中に添加しても、プレート（Ｐｌａｔｅ）に結合させても、同様の結果が認められた。
【０４０３】
同じバッチに由来するＢ７−Ｈ４−Ｉｇを用いて、上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＴｈ１／Ｔｈ１７細胞アッセイを３回にわたり繰り返したところ、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇが、Ｔｈ１細胞／Ｔｈ１７細胞の増殖、ならびにＩＦＮ−γおよびＩＬ１７の生成を阻害することが一貫して証明された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＴｈ２細胞極性化条件下：ＩＬ−２、ＩＬ−４、抗ＩＬ１２抗体、および抗ＩＦＮ−γ抗体の存在下において、同じ標的であるＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞を用いたところ、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇは、Ｔｈ２細胞に影響を及ぼさなかった（図２６）。
【０４０４】
異なるバッチに由来するマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇについても、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける同一の生物活性が証明されている。図２７および２８に示す通り、ロット番号２２に由来するＢ７−Ｈ４−Ｉｇも、ロット番号２３に由来するＢ７−Ｈ４−Ｉｇも同様に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＴｈ１細胞極性条件下およびＴｈ１７細胞極性化条件下において、それぞれ、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１７の生成を、用量依存的な形で阻害した。このデータは、Ｔｈ１／Ｔｈ１７細胞アッセイの一貫性だけでなく、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇの生産プロセスの一貫性も実証する。
【０４０５】
（実施例６）
ヒトＢ７−Ｈ４−ＩｇはマウスＴｈ１７細胞を阻害する
材料および方法
ヒトＢ７−Ｈ４タンパク質と、マウスＢ７−Ｈ４タンパク質とは、９５％相同である。ヒトＢ７−Ｈ４−Ｉｇを、マウスＴ細胞との交差反応性について調べた。上記で説明した通りに、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を単離した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇの生物活性について実施例５で説明した通り、精製したマウスＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を、Ｔｈ１細胞促進条件である、ＩＬ２、ＩＬ−１２、および抗ＩＬ４抗体の存在下、またはＴｈ１７細胞促進条件である、ＴＧＦ−β、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、抗ＩＬ−４抗体、抗ＩＦＮ−γ、および抗ＩＬ−２抗体の存在下において極性化させた。ヒトＢ７−Ｈ４−Ｉｇを、０、０．１、または１０μｇ／ｍＬで、その培養物に直接添加した。コントロールのヒトＩｇＧ１（Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標））をその培養物に添加して、タンパク質の最終濃度を１０μｇ／ｍＬとした。
【０４０６】
結果
図２９、３０、および３１に提示されるデータは、ヒトＢ７−Ｈ４−Ｉｇが、マウスＣＤ４＋ナイーブＴ細胞と交差反応し、マウスＴｈ１細胞／Ｔｈ１７細胞の増殖を用量依存的な形で遮断し（図２９）、これが、Ｔｈ１細胞におけるＩＦＮ−γ生成の低減（図３０）、ならびにＴｈ１７細胞におけるＩＬ−１７生成の低減（図３１）と相関したことを示す。異なるバッチに由来するヒトＢ７−Ｈ４−Ｉｇを用いても、同じ結果が得られた。
【０４０７】
（実施例７）
Ｂ７−Ｈ４−ＩｇはＴｒｅｇに影響を及ぼす
方法および材料
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の枯渇
ＣＤ６２Ｌを陽性選択する前に、抗ｍＣＤ２５−ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ；カタログ番号１２０−０００−９００）および抗ＰＥ磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ；カタログ番号１２０−０００−２９４）を用いて、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を枯渇させた。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を枯渇させた後では、ＣＤ２５＋／Ｐ３＋細胞が、約５％から１％にまで減少した。
【０４０８】
結果
必要に応じて、ＤＯ１１．１０マウスのＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞集団から、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を枯渇させた（−ＣＤ２５＋Ｔ細胞）のち、ＯＶＡ３２３〜３３９ペプチドでパルスしたＡＰＣならびにＢ７−Ｈ４−Ｉｇの存在下においてｉｎ  ｖｉｔｒｏのＴｈ１細胞極性化を行なった。
【０４０９】
ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞をＴｈ１細胞促進条件またはＴｈ１７細胞促進条件のいずれかの存在下で活性化させたときの、ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞の増殖レベルならびにサイトカインの生成レベルをＢ７−Ｈ４−Ｉｇが低下させる程度は、そのＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞が単離されたマウスの齢数と相関することが分かった。ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞の初期選択は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を陰性選択した後、ＡｕｔｏＭａｘを用いることを介してＣＤ６２Ｌ＋細胞を陽性選択することに基づいた。マウス体内に存在するＴｒｅｇ細胞の数は齢数と共に増加し、Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ２５＋であるので、次に、ＣＤ４＋Ｔ細胞を陰性選択するときに、ＣＤ２５＋細胞、すなわち、Ｔｒｅｇ細胞、ならびに活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞を枯渇させたとすれば、Ｔｈ１細胞促進条件の存在下で活性化させたときの、ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞によるＩＦＮ−γの生成を阻害するＢ７−Ｈ４−Ｉｇの能力が変化するかどうかを決定した。
【０４１０】
まず、ＤＯ１１．１０マウスからＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞を単離し、ｒＩＬ−２（１ｎｇ／ｍＬ）、ｒＩＬ−１２（４ｎｇ／ｍＬ）、およびＩＬ−４（１μｇ／ｍＬ）抗体の存在下でＴｈ１細胞へと極性化させ、ＯＶＡ３２３〜３３９でパルスしたＡＰＣ（ＡＰＣ／ＯＶＡ）により刺激した。マウスＢ７−Ｈ４−ＩｇまたはコントロールＩｇＧを、種々の用量で、その培養物に直接添加した。図３２Ａに示す通り、Ｔｒｅｇを枯渇させること（白丸）の結果として、Ｔｒｅｇ細胞が存在した場合のＩＦＮ−γレベル（黒丸）と比較して、ＩＦＮ−γの生成が増大した。Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇを介するＩＦＮ−γ生成の減少は用量依存的であり（白三角）、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の存在下（黒三角）では、その阻害がより深甚であった。逆に、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇは、ＩＬ−１０の生成を用量依存的な形で増大させた（黒三角；図３２Ｂ）。
【０４１１】
また、ＯＶＡ３２３〜３３９ペプチドでパルスしたＡＰＣならびに種々の量のマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇの存在下においてｉｎ  ｖｉｔｒｏのＴｈ１７細胞極性化を行う前に、ＤＯ１１．１０マウスのＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞から、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を枯渇させること（−ＣＤ２５＋Ｔ細胞）の効果も調べた。まず、ＤＯ１１．１０マウスからＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞を単離した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を含む細胞またはＣＤ４＋ＣＤ２５＋を枯渇させた細胞（−ＣＤ２５＋Ｔ細胞）を、ｒＴＧＦ−β（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−２３（４ｎｇ／ｍＬ）、抗ＩＬ−４（１μｇ／ｍＬ）抗体、抗ＩＦＮ−γ（１μｇ／ｍＬ）抗体、および抗ＩＬ−２抗体（１μｇ／ｍＬ）の存在下でＴｈ１７細胞へと極性化させ、ＯＶＡ３２３〜３３９でパルスしたＡＰＣ（ＡＰＣ／ＯＶＡ）により刺激した。マウスＢ７−Ｈ４−ＩｇまたはコントロールＩｇＧを、種々の用量で、その培養物に直接添加した。図３３Ａに示す通り、Ｔｒｅｇを枯渇させること（白丸）の結果として、Ｔｒｅｇ細胞が存在した場合のＩＬ−１７レベル（黒丸）と比較して、ＩＬ−１７の生成が増大した。ＩＬ−１７生成の減少は用量依存的であることが分かった（白三角）。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞が存在する場合（黒三角）は、その阻害が一貫して大きかった。これに対し、図３３Ｂは、マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇが、ＩＬ−１０の生成を用量依存的な形で増大させ（白三角）、ＩＬ−１０の増大が、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞が存在する場合より大きかった（黒三角）ことを示す。
【０４１２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＢ７−Ｈ４−Ｉｇは、ＯＶＡ３２３〜３３９でパルスされた同系ＡＰＣまたは抗原非特異的な抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体でコーティングされたビーズのいずれかにより刺激されたときの、ＯＶＡ３２３〜３３９特異的トランスジェニックナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖、ならびにこれらのＴｈ１細胞またはＴｈ１７細胞のいずれかへの分化を阻害する。さらに、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇは、Ｔｈ１細胞およびＴｈ１７細胞のそれぞれにより生成されるＩＦＮ−γおよびＩＬ−１７／ＴＮＦαのレベルを低減する。精製ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞からＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を枯渇させたところ、ＩＦＮ−γ生成およびＩＬ−１７生成の低減が、それほど顕著ではなくなった。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞が存在すると、Ｔｈ１細胞／Ｔｈ１７細胞の極性化の間にＩＬ−１０生成をＢ７−Ｈ４−Ｉｇが用量依存的に増大させることが極めて重要である。これらのデータは、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇが、一部、Ｔｒｅｇ細胞に対して、ＩＬ−１０の発現を上方制御し、かつ、Ｔｈ１エフェクター細胞およびＴｈ１７エフェクター細胞の分化および機能を阻害するように作用しうることを示す。
【０４１３】
（実施例８）
Ｂ７−Ｈ４−ＩｇはｉＴｒｅｇの誘導を促進する
材料および方法
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるｉＴｒｅｇ細胞の誘導
まず、ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞を、室温で１０分間にわたり、ＣＦＳＥ（５μＭ）で標識した。０．５倍容量の氷冷ウシ胎仔血清を添加することにより、上記色素をクエンチした。氷上で５分間にわたり上記細胞をインキュベートした後、遠心分離を行い、細胞ペレットを回収した。ＨＬ−１培地中でさらに２回にわたり、その細胞を洗浄した。次いで、ＴＧＦ−β（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−２（１０、５０、１００Ｕ／ｍＬ）の存在下で３日間にわたりその細胞を培養してから、抗ＦｏｘＰ３  ＡＰＣ抗体で細胞内染色した。ＦＡＣＳ解析を行い、ＦｏｘＰ３＋細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖したｉＴｒｅｇ細胞を検出した。
【０４１４】
結果
上記の知見は、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇが、ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞を、Ｔｒｅｇ細胞の表現型へと分化するように誘導し、かつ／またはＴｒｅｇ細胞の機能を直接的に増強することを示唆する。したがって、次に、誘導性Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）細胞促進条件の存在下で、ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞をＢ７−Ｈ４−Ｉｇで処理したとすれば、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋ｉＴｒｅｇ細胞の数が結果として増加するかどうかを試験した。まず、ｉＴｒｅｇの誘導に対してＢ７−Ｈ４−Ｉｇが及ぼすさらなる効果（もし存在するとして）を評価するための実験条件を考量して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるｉＴｒｅｇ誘導培養条件を最適化した。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、雌ＳＪＬマウスから単離した。まず、精製マウスＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞をＣＳＦＥで標識し、これらを、ＴＧＦ−β（１０ｎｇ／ｍＬ）ならびに濃度０、５０、または１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２の存在下で、ｉＴｒｅｇ細胞へと誘導した。３日後にＦＡＣＳ解析を実施し、ＦｏｘＰ３の発現ならびにＣＦＳＥの含量を検出した。ｉＴｒｅｇの分化に１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を用いたところ、ＦｏｘＰ３陽性であり、かつ、ＣＦＳＥが希釈された細胞集団を検出した。より少量のＩＬ−２を用いたところ、この細胞集団のサイズが縮小した。
【０４１５】
ｉＴｒｅｇの分化におけるＢ７−Ｈ４−Ｉｇの役割を評価するために、最適未満のｉＴｒｅｇ条件（１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−βならびに５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２）を用いた。Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇが、実際に、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞の百分率の増大を誘導したとすれば、そのＢ７−Ｈ４−Ｉｇにより誘導される増大が、ＴＧＦ−β／ＩＬ−２の効果により遮蔽されないことが明らかとなるように、最適未満のｉＴｒｅｇ条件を用いた。染色された細胞についてのＦＡＣＳ解析は、最適未満のｉＴｒｅｇ細胞促進条件である、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−βならびに５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２の存在下でＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞を活性化させたところ、ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＦｏｘＰ３およびＣＤ２５を発現するように、すなわちｉＴｒｅｇに誘導されることを明らかにした。異なる量のマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（０、１、５、または１０μｇ／ｍＬ）を添加した。Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇは、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋ｉＴｒｅｇの百分率を用量依存的な形で増大させ、最高百分率のＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞が誘導されたのは、ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞を１０μｇ／ｍｌのＢ７−Ｈ４−Ｉｇの存在下で活性化させたときであった。これに対し、ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞を１０μｇ／ｍｌのコントロールＩｇＧの存在下で活性化させたところ、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋ｉＴｒｅｇの増大は認められなかった。
【０４１６】
（実施例９）
Ｂ７−Ｈ４−ＩｇはＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化ならびにｎＴｒｅｇによる抑制機能を調節する
材料および方法
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける抑制アッセイ
Ｂ６バックグラウンドのＦｏｘＰ３−ＧＦＰマウス１０匹から、脾臓およびリンパ節を摘出した。細胞を、単細胞懸濁物とし、合計１．７６×１０９個の細胞を回収した。１×１０８個の細胞を取り置き、放射線照射して、本アッセイにおけるＡＰＣとした。上記で説明した通り、残りの細胞から、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を精製した。合計６．２×１０８個のＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を回収した。５×１０７個の細胞を取り置き、本実験におけるエフェクターＴ細胞とした。上記細胞の残余（５．７×１０８個）を、抗ＣＤ４  ＰＥ−Ｃｙ７抗体で染色し、ＭｏＦｌｏによりＰＥ−Ｃｙ７＋／ＧＦＰ＋細胞を分取した。ＭｏＦｌｏから、９９％の純度で、合計４×１０６個のｎＴｒｅｇ（ＣＤ４＋／ＦｏｘＰ３＋）細胞を回収した。丸底プレート内に最終容量２００μｌで、１×１０５個のエフェクターＴ細胞＋放射線照射された１×１０５個のＡＰＣ＋αＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）を伴う抑制アッセイ用培養物を準備した。その培養物ウェルにはまた、種々の比率のｎＴｒｅｇ細胞：Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇも施した。
結果
Ｔｒｅｇ細胞の機能に対するＢ７−Ｈ４−Ｉｇの効果をさらに決定するために、Ｂ６／ＦｏｘＰ３−ＧＦＰマウスの脾臓およびリンパ節から精製した天然Ｔｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ）細胞を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＴｒｅｇ抑制アッセイを行った。このトランスジェニックマウスでは、ＧＦＰトランス遺伝子が、ＦｏｘＰ３特異的プロモーターの制御下にあり、内因性ＦｏｘＰ３を発現するｎＴｒｅｇ細胞を緑色蛍光により検出することが可能となる。
【０４１７】
ＭｏＦＬｏ分取により、Ｂ６／ＦｏｘＰ３−ＧＦＰマウスから、ｎＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋／ＣＤ６２Ｌ＋／ＦｏｘＰ３−ＧＦＰ＋）を単離した。ＧＦＰ−ナイーブＴ細胞（ＣＤ４＋／ＣＤ６２Ｌ＋／ＦｏｘＰ３−ＧＦＰ−）を、レスポンダー細胞として用いた。一定数のＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞、放射線照射した脾細胞性ＡＰＣ、ならびに抗ＣＤ３抗体に、漸増数のｎＴｒｅｇ細胞を添加した（図３４）。図３５に示す通り、固定した数のレスポンダー細胞（１×１０５個）を、漸増数のＴｒｅｇ細胞（０、１．２５×１０４、２．５×１０４、５×１０４、１×１０５、２×１０５）と共に用いる、種々のレスポンダー：ｎＴｒｅｇ比を使用することによって、１：０、１：０．１２、１：０．２５、１：０．５、１：１、および１：２という固定レスポンダー／ｎＴｒｅｇ比がもたらされた。抑制アッセイ物に種々の量のＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（０、１、５、または１０ｍｇ／ｍＬ）を添加し、３日後に、［３Ｈ］−チミジンによりレスポンダー細胞の増殖を評価した。
【０４１８】
図３５に示す通り、ｎＴｒｅｇ細胞の非存在下（比が１：０のとき）において、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇは、用量依存的な形で、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化および増殖を抑制した。Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇの非存在下（黒丸）において、ｎＴｒｅｇは、やはり用量依存的な様式でＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を阻止した。比を１：２（ｎＴｒｅｇが２に対してレスポンダーが１）としたところ、ｎＴｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化をほぼ消失させた。ｎＴｒｅｇおよびマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇの両方を存在させたところ、顕著な抑制が観察された。マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇの非存在下において、１：０．１２および１：０．２５のＴ細胞レスポンダー：ｎＴｒｅｇ比では、抑制が検出されなかった。しかし、５または１０μｇ／ｍＬのＢ７−Ｈ４−Ｉｇは、抗ＣＤ３抗体により誘導されるＴ細胞の活性化を完全に遮断した。Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇの非存在下において、抑制が増大したのは、１：０．５、１：０、１：１、および１：２のレスポンダー／ｎＴｒｅｇ比が、より多くのｎＴｒｅｇが存在する場合に限られた。
【０４１９】
（実施例１０）
Ｂ７−Ｈ４−ＩｇはＰＬＰ１３９〜１５１ペプチドにより誘発される再発型ＥＡＥ（Ｒ−ＥＡＥ）における疾患の誘発および増悪を調節する
方法および材料
ＰＬＰ誘発Ｒ−ＥＡＥモデル
ＰＬＰ１３９〜１５１によりＲ−ＥＡＥを誘発するため、６〜７週齢の雌ＳＪＬマウスを、２００μｇのＭ．  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒａ、ならびに５０μｇのＰＬＰ１３０〜１５１（ＨＳＬＧＫＷＬＧＨＰＤＫＦ）（配列番号１３９）を含有する１００μＬのエマルジョンを、側腹部の３つの部位に分布させることにより皮下（ｓ．ｃ．）免疫した。個々の動物を毎日観察し、表８に示すような（Ｍｉｌｌｅｒら、「Ｃｕｒｒ．  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｍｍｕｌｏ．」、１２章、１５．１単元）０〜５段階で、盲検化方式により、臨床スコアを評価した。別段に言及されない限り、すべての実験について、すべてのマウスの齢数および性別を一致させた。
【０４２０】
図３６は、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇによる典型的な処置レジメンを示す。マウスを無作為に４群に群分けした。疾患予防モデルでは、ＰＬＰ１３０〜１５１によるプライミングと同じ日に、Ｂ７−Ｈ４−ＩｇまたはコントロールＩｇＧを、３ｍｇ／ｋｇで腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。治療モデルでは、ＰＬＰ１３０〜１５１によるプライミング後の約２１日目から、Ｂ７−Ｈ４−ＩｇまたはコントロールＩｇＧを、３ｍｇ／ｋｇでｉ．ｐ．により施した。いずれの場合にも、毎週３回で２〜４週間にわたり、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇを投与した。
【０４２１】
遅延型過敏（ＤＴＨ）反応
ＤＴＨ反応は、既に記載した通り、２４時間にわたる耳腫脹アッセイを用いて定量した。Ｍｉｔｕｔｏｙｏ  ７３２６型工学用マイクロメーター（Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ’ｓ  Ｔｏｏｌｓ、Ｂｒｏｏｋｌｙｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を用いて、感作前の耳の厚さを決定した。その直後、３０ゲージの注射針を装着した１００μＬのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを用いて、耳の背面に、１０μＬのＰＢＳ中に１０μｇのペプチドを注射することにより、ＤＴＨ反応を誘発した。耳感作の２４時間後において、感作前の測定値に対する耳の厚さの増大を決定した。１０−４インチ±ＳＥＭの単位で、結果を表わす。１０−４インチ±ＳＥＭの単位による、耳の厚さの変化として結果を表わす。その測定は、本実験群の内容を知らされていない２名の実験者により独立に行われた。スチューデントのｔ検定により、コントロールＩｇＧ注射マウスに対するマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇ処置マウスにおける耳の腫脹の有意性を評価した。
【０４２２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける抗原特異的リコール反応
排出リンパ節（腋窩リンパ節、上腕リンパ節、および鼠径リンパ節）を摘出し、滅菌６０メッシュワイヤースクリーンを通して、マッシングすることにより、単細胞懸濁物を得た。９６ウェルマイクロ滴定プレートにおいて、１ウェル当たり５×１０５個の、赤血球を含まない（トリス−ＮＨ４Ｃｌで処理した）リンパ節細胞を、抗原を伴うかまたは伴わない補充培地中、３７℃の７％ＣＯ２中で２４時間にわたりインキュベートし、次いで、培養最後の４８時間にわたり、１ウェル当たり１μＣｉの［３Ｈ］−チミジンでパルスした。Ｔｏｐｃｏｕｎｔ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｅｒｉｄａｎ、ＣＴ）を用いて検出される［３Ｈ］−チミジンの取込みにより、増殖を決定した。個々の動物に由来する３連の培養物による平均値±ＳＥＭとして、結果を表わす。７２時間後に上清を回収して、サイトカイン解析を行った。マウス  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １０−ＰｌｅｘシステムおよびＬｕｍｉｎｅｘ  Ｌｉｑｕｉｄｃｈｉｐ解析装置（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）またはＥＬＩＳＡを用いて、サイトカインの測定を実施した。
【０４２３】
結果
ＰＬＰ  Ｒ−ＥＡＥ動物モデルにおける誘導性エピトープ（ＰＬＰ１３９〜１５１ペプチド）に特異的なＴ細胞は、急性ＣＮＳ損傷を引き起こし、この初期の急性損傷の結果として免疫系に曝露される、内因性脳炎誘発性のミエリンエピトープに対するＴ細胞反応を結果として誘導する。Ｒ−ＥＡＥにおいて、再発寛解型の疾患経過がこのように増悪することは、エピトープ拡大として公知のプロセスである、ＰＬＰ１７８〜１９１ペプチドに特異的なナイーブＴ細胞の新規の活性化を介することが示されている。Ｒ−ＥＡＥの疾患経過において、マウスは、再発寛解型の臨床経過を特徴とする、上行性麻痺性脱髄性疾患を発症するが、これが、ＭＳについて検証されたモデルである（Ｍｉｌｌｅｒら、「Ｃｕｒｒ．  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、１５章：１５．１単元（２０１０年））。
【０４２４】
Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇの治療的利益を決定するために、ＰＬＰ１３９〜１５１誘導Ｒ−ＥＡＥマウスモデルにおいて、疾患予防（疾患の誘発と同じ日に処置を開始する）、ならびに治療的介入（疾患の寛解時において処置を開始する）の両方について、マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇを調べた（図３６）。いずれの場合にも、約２カ月間にわたり、その疾患経過を追跡し、表９に示す等級付けシステムに従い、臨床疾患を評価した。
【０４２５】
【表９】
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ａ尾の引きずり：マウスを取り上げたときに、尾が完全に弛緩し、尾の先端の巻上げが見られない。
ｂ後肢の脱力：あひる歩行として観察されるが、客観的な徴候は、歩行時に、マウスの後肢が、ワイヤー製ケージの上から落下することである。
ｃ後肢の部分的な麻痺：マウスはもはや、後肢を用いて臀部の姿勢を維持したり歩行したりすることができないが、なお一方または両方の後肢をある程度は動かすことができる。
ｄ後肢の完全な麻痺：後肢の運動が完全に失われる；マウスは、その前肢だけで体を引きずる。この段階のマウスには、ケージの床面、啜り飲み用の長型チューブにより餌を施し、脱水による死亡を防止するため、生理食塩液を毎日皮下注射する。
【０４２６】
ｅｘ  ｖｉｖｏにおいてペプチドによりＴ細胞を刺激した後に、サイトカインの分泌についてアッセイすることにより、ＤＴＨ反応、ならびにエピトープを拡大させる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるリコール反応をモニタリングしながらこれを行った。
Ｂ７−Ｈ４−ＩｇはＲ−ＥＡＥモデルにおける再発型疾患を防止する
まず、ＣＦＡ中で乳化させたＰＬＰ１３９〜１５１ペプチドにより雌ＳＪＬマウスを免疫し、次いで、予防的処置または治療的処置のための２群に無作為化した。各処置レジメンについて、１つの部分群にはコントロールのＩｇＧを施し、他の部分群にはマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇを施す、２つの部分群を存在させた。コントロールのＩｇＧならびにマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇのいずれも、３ｍｇ／ｋｇで毎週３回、４週間にわたりこれらを施した。予防的処置（図３７）とは、マウスＢ７−Ｈ４−ＩｇまたはコントロールＩｇＧを、ＰＬＰによる免疫の当日（ｔ＝０）から投与を開始したことを意味する。治療的処置（図３８）とは、マウスＢ７−Ｈ４−ＩｇまたはコントロールＩｇＧを、２１日目（ｔ＝２１）から投与を開始したことを意味する。そのデータは、１群当たりマウス５匹で、５５日間にわたる平均臨床スコアとして提示され、その臨床スコアおよび注射は、二重盲検で行われた。
【０４２７】
図３７および３８に提示されるデータは、予防的処置のレジメンならびに治療的処置のレジメンの両方において、コントロールＩｇＧと対比したマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇについての臨床スコアを示す。そのデータは、マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇが、両方の処置レジメンによっても、Ｒ−ＥＡＥの疾患再発を減少させ、かつ／または防止したことを示す。上記コントロールＩｇＧを注射したＲ−ＥＡＥマウスにおける臨床スコアの平均が１．５〜２．５であったのに対し、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ処置動物では０〜０．５であった。上記マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇ処置マウスとコントロールＩｇＧ注射マウスとの差は有意であった。
【０４２８】
Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇはエピトープ拡大を阻止する
ミエリンに由来する一次エピトープであるＰＬＰ１３９〜１５１に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞媒介活性およびエピトープ拡大の遮断に対するＢ７−Ｈ４−Ｉｇの効果を決定するために、４つの処置群すべてにおいて、ＤＴＨを介するｉｎ  ｖｉｖｏのペプチド特異的反応を解析した。５０日目に、表示されるペプチド１０μｇでマウスを耳感作し、２４時間後に腫脹を測定した。耳の腫脹を評価し、図３９に示した（＊コントロールＩｇＧ注射マウスを有意に下回るＤＴＨ反応；ｐ＜０．０１）。本データは、０日目にマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇによる処置を開始したところ、優性エピトープであるＰＬＰ１３９〜１５１に対する反応が有意に低減されたが、２１日目にマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇによる処置を開始したところ、ＰＬＰ１３９〜１５１反応が阻害されなかったことを示す。これに対し、０日目および２１日目の両方でマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇによる処置を開始したところ、拡大エピトープに対する反応である、ＰＬＰ１７８〜１９１特異的反応が有意に低減された。
【０４２９】
Ｂ７−Ｈ４−ＩｇはＰＬＰ１７８〜１９１特異的なＴ細胞の増殖を低減した
上記で説明した通り、マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇを注射したＥＡＥマウス、ならびにコントロールＩｇＧを注射したＥＡＥマウスからリンパ節を単離した。Ｔ細胞を採取し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、疾患誘発性の優性エピトープであるＰＬＰ１３９〜１５１、ならびに拡大エピトープに特異的なペプチドであるＰＬＰ１７８〜１９１でこれらを誘発した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの刺激アッセイ物に［３Ｈ］−チミジンを添加し、Ｔ細胞の増殖を解析した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏのペプチドリコール刺激アッセイは、両方のマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇによる誘発レジメンも、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＰＬＰ１７８〜１９１（拡大エピトープ）特異的なＴ細胞の増殖を低減したことを示す（図４０：＊コントロールＩｇＧ注射マウスを有意に下回る［３Ｈ］−チミジンの取込み；ｐ＜０．０１）。ＰＬＰ１３９〜１５１（一次ペプチド）特異的Ｔ細胞の増殖では有意差がなかった。
【０４３０】
Ｂ７−Ｈ４−ＩｇはＰＬＰ１３９〜１５１特異的Ｔ細胞反応ならびにＰＬＰ１７８〜１９１特異的Ｔ細胞反応を下方制御した
上記で説明した通り、コントロールＩｇＧ処置マウスおよびＢ７−Ｈ４−Ｉｇ処置マウスからリンパ節を単離した。Ｔ細胞を採取し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、疾患誘発性の優性ペプチドであるＰＬＰ１３９〜１５１、ならびに拡大エピトープペプチドであるＰＬＰ１７８〜１９１で免疫反応を誘発した。上清を回収し、市販のＥＬＩＳＡキットによりＩＦＮ−γについて解析した。
【０４３１】
上記の実験は、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇが、再発型疾患に影響を与えたことを明確に示す。ＤＴＨ解析（図３９）、ならびにＰＬＰ１３９〜１５１ペプチドを用いてｅｘ  ｖｉｖｏのＴ細胞リコール研究において測定したＩＦＮ−γの生成（図４１：＊コントロールＩｇＧ注射マウスを有意に下回るＩＦＮ−γの生成；ｐ＜０．０１）は、０日目にＢ７−Ｈ４−Ｉｇを投与したところ、ＰＬＰ１３９〜１５１ペプチドに対する免疫反応が、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ特異的に阻害されたことを証明し、このことはＢ７−Ｈ４−Ｉｇが、疾患の急性期に影響を及ぼしうることを示唆する。
【０４３２】
Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇはエピトープ拡大を阻止する
ＥＡＥの急性期に対するＢ７−Ｈ４−Ｉｇの効果を明らかにするために、ＰＬＰ１３９〜１５１誘発Ｒ−ＥＡＥモデルにおいて第２のｉｎ  ｖｉｖｏ実験を行った。上記で説明した通りに、マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇを注射したＥＡＥマウスおよびコントロールＩｇＧを注射したＥＡＥマウスにおけるＤＴＨ反応をアッセイした。１０日目に、１０μｇのＰＬＰ１３９〜１５１でマウスを耳感作し、２４時間後に腫脹を測定した。この研究では、０日目に、６０μｇ（３ｍｇ／ｋｇ）または３００μｇ（１５ｍｇ／ｋｇ）の２つの異なる用量のＢ７−Ｈ４−Ｉｇを、ＳＪＬマウス（１つの処置群当たりｎ＝１０）に施した。５回にわたりＢ７−Ｈ４−Ｉｇを注射した後、疾患誘発後の１０日目において、５匹のマウスを用いてＤＴＨ解析を行い、その後、ｅｘ  ｖｉｖｏにおけるＴ細胞抗原リコール解析を行った。図４２（＊コントロールＩｇＧ注射マウスを有意に下回るＤＴＨ反応）に示す通り、０日目にＢ７−Ｈ４−Ｉｇを施したところ、３ｍｇ／ｋｇ（６０μｇ）および１５ｍｇ／ｋｇ（３００μｇ）のいずれの用量も、ＯＶＡ３２３〜３３９ペプチド（陰性コントロール）と対比したＰＬＰ１３９〜１５１ペプチドに対するＤＴＨ反応により測定される、誘発性ＰＬＰ１３９〜１５１ペプチドに対する免疫反応を有意に阻害した。
【０４３３】
上記で説明した通りに、動物から排出リンパ節を摘出し、単細胞懸濁物を調製し、抗ＣＤ３抗体（０．１〜１０μｇ／ｍＬ）、ＰＬＰ１３９〜１５１（１〜２０μｇ／ｍＬ）、またはＯＶＡ３２３〜３３９（１〜２０μｇ／ｍＬ）の存在下で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて再活性化させた。［３Ｈ］−チミジンの取込みにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＴ細胞の増殖を解析した。図４３（＊コントロールＩｇＧ注射マウスを有意に下回る［３Ｈ］−チミジンの取込み；ｐ＜０．０１）は、抗ＣＤ３抗体で刺激したところ、コントロールＩｇＧ注射マウス群ならびにＢ７−Ｈ４−Ｉｇ注射マウス群の両方に由来する細胞についても、頑健なＴ細胞増殖が見られる一方、陰性コントロールペプチドであるＯＶＡ３２３〜３３９はいかなる反応も誘発しなかったことを示す。これに対し、３ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇのいずれの用量のＢ７−Ｈ４−Ｉｇ注射群に由来するＴ細胞も、ＰＬＰ１３９〜１５１ペプチドによる刺激に対してほとんどからまったく反応を示さなかった。ＤＴＨ反応、ならびにｅｘ  ｖｉｖｏにおいてＰＬＰ１３９〜１５１一次ペプチドでリコールしたときのＴ細胞増殖の両方とも、再発型疾患に対するその明白な効果に加えて、Ｂ７−Ｈ４−ＩｇによるＥＡＥ急性期に対する防御を証明する。
【０４３４】
（実施例１１）
Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇは病原性ＣＤ４＋Ｔ細胞の浸潤を遮断し、Ｔｒｅｇの蓄積を促進する
材料および方法
免疫組織化学染色
ネンブタールでマウスに麻酔をかけ、リン酸塩緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で還流した。各マウスに由来する脳および脊髄を、液体窒素中のＯＣＴ（Ｍｉｌｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｅｌｋｈａｒｔ、ＩＮ）中で凍結させた。下部腰椎領域に由来する脊髄の組織を、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ  １８００  ｃｒｙｏｔｏｍｅ上で６μｍに切片化し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓ静電荷電スライド（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃａｌｌｙ  ｃｈａｒｇｅｄ  ｓｌｉｄｅ）上に固定した。脳および脊髄の縦断切片から、横断切片（脳については１０μｍの厚さとし、脊髄については６μｍの厚さとする）を調製した。マウスＣＤ４、マウスＰＬＰ、およびマウスＦｏｘＰ３に対するビオチンコンジュゲート抗体で組織を染色した。製造業者の指示書に従うＴｙｒａｍｉｄｅ  Ｓｉｇｎａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＴＳＡ）Ｄｉｒｅｃｔキット（ＮＥＮ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）、ならびにフルオレセイン−抗マウスＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により、ビオチニル化抗体の陽性染色を可視化した。切片を４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で対比染色し、次いで、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄｍｏｕｎｔｉｎｇ媒体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でカバースリップ処理した。スライドを精査し、ＳＰＯＴ  ＲＴカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＭＩ）を用いる落射蛍光顕微鏡法により画像を収集した。４０または１００倍の倍率で、各群による切片を解析した。
【０４３５】
結果
Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉＴｒｅｇ誘導研究は、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇが、ｉＴｒｅｇの分化を促進する証拠を提供する（実施例８）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抑制アッセイにおいてＦｏｘＰ３−ＧＦＰトランスジェニックマウスから精製したｎＴｒｅｇ細胞を用いたところ、Ｂ７−Ｈ４−ＩｇによるＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の活性化および増殖の低下が証明された（実施例９、図３５）。少数のｎＴｒｅｇ細胞の存在下において、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇを抑制アッセイ物に添加したところ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるエフェクターＴ細胞の活性化および増殖の遮断に対して顕著な効果がもたらされている。
【０４３６】
この研究では、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴｒｅｇ細胞の数に対するＢ７−Ｈ４−Ｉｇによる処置効果を解析した。Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇによる処置後において、ＣＮＳへと浸潤するＣＤ４＋Ｔ細胞の数および表現型に対するＢ７−Ｈ４−Ｉｇの効果、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける活性に関与性である部位を決定した。図４４に示す通り、Ｒ−ＥＡＥ疾患を誘発するための標準的なプロトコールに従い、ＳＬＪマウス（１群当たり１０匹のマウス）を、ＰＬＰ１３９〜１５１で免疫した。まず、ＳＪＬマウスを、ＰＬＰ１３９〜１５１ペプチドで免疫した。寛解期（２３日目）に、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇによる処置を開始した。マウスには、毎週３回で２週間または４週間にわたり、１００μｇのマウスコントロールＩｇＧ、または６０もしくは３００μｇのＢ７−Ｈ４−Ｉｇを施した。６回にわたりＢ７−Ｈ４−Ｉｇを投与した後である３５日目に、動物の半数（各群から５匹ずつのマウス）を安楽死させた。残りの動物（各群から５匹ずつのマウス）は、１２回にわたりＢ７−Ｈ４−Ｉｇを投与した後である５０日目に安楽死させた。マウスの脾臓、排出リンパ節、脊髄、および脳を回収し、組織を単細胞懸濁物とし、血球計を用いてカウントし、ＣＤ４＋エフェクター／メモリーＴ細胞（ＣＤ４＋／ＣＤ４４＋）ならびにＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）の存在について解析した。小脳ならびに腰髄（ｌｕｍｂａｒ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ）の組織試料全体を瞬間凍結させ、上記で説明した通りに処理して、組織学検査により、ＣＮＳ内に存在するＣＤ４＋細胞およびＦｏｘＰ３＋細胞の数を解析した。
【０４３７】
図４５Ａ、４５Ｂ、および４５Ｃで証明される通り、マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇによる処置は、６回にわたる処置の後に、脾臓（４５Ａ）および排出リンパ節（４５Ｂ）におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の数を増加させ、かつ、これに対し、ＣＮＳ（４５Ｃ）内における浸潤性ＣＤ４＋Ｔ細胞の総数を減少させる傾向を示した。
【０４３８】
脾臓、排出リンパ節から、ならびにまた、腰髄からも単離された細胞を、ＣＤ４、ＣＤ４４、およびＦｏｘＰ３について染色した後に、ＦＡＣＳ解析を行って、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋／ＦｏｘＰ３＋）、およびＣＤ４＋エフェクター／メモリーＴ細胞（ＣＤ４＋／ＣＤ４４＋）の数を得た。データを、個々のマウスに由来する各表現型についての平均細胞数として、図４６Ａ、４６Ｂ、および４６Ｃに示す。Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋／ＦｏｘＰ３＋）細胞の数を計算したところ、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇによる処置が、脾臓（４６Ａ）およびリンパ節（４６Ｂ）内のＴｒｅｇ細胞数を顕著に増加させたことは、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団の増大が、一部は、Ｔｒｅｇ細胞の増加に起因したことを示唆する。コントロールのＩｇＧ処置マウスと比較したところ、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇによる処置はまた、ＣＮＳ内のエフェクター／メモリーＴ細胞（ＣＤ４＋／ＣＤ４４＋）も減少させた（４６Ｃ）。１２回にわたる処置全体を経過した後にも、同様のデータが得られた。図４６Ａ、４６Ｂ、および４６Ｃはまた、ＣＮＳ内に浸潤するＣＤ４＋Ｔ細胞がより少ないその一方で、ＣＮＳにおけるＴｒｅｇ細胞の量は一定であると考えられた（４６Ｃ）ことも明らかにし、このことは、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇが、ＣＮＳ内の全ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＴｒｅｇ細胞の比を変化させたことを示す。実際、図４７に示す通り、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ処置マウスに由来するＣＮＳでは、コントロールＩｇＧ注射マウスに由来するＣＮＳと比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＴｒｅｇ細胞の百分率が顕著に高かった。
【０４３９】
また、コントロールＩｇＧ処置マウスおよびＢ７−Ｈ４−Ｉｇ処置マウスにおける抗ＰＬＰ抗体染色により、脱髄レベルも解析した。その結果は、群間でＰＬＰ染色レベルの著明で検出可能な差が認められないこと、すなわち、脱髄レベルの顕著な差が認められないことを示す。しかし、また、腰髄から採取した横断切片試料における全ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＦｏｘＰ３＋細胞を染色し、かつこれらの総数をカウントすることにより、組織学的にもＣＮＳへのＴ細胞の浸潤を精査した。組織学によるデータは、存在するＣＤ４＋Ｔ細胞の総数ならびにＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞の数についてのフローサイトメトリーによる解析と相関する。組織学によるデータは、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇによる処置が、ＣＮＳ内のＦｏｘＰ３＋細胞の数を増加させることを証明する点で、ＦＡＣＳによるデータと符合する。それはまた、ＦｏｘＰ３＋細胞が、ＣＮＳ内でＣＤ４＋エフェクターＴ細胞と共に共局在化し、それらが、病原性Ｔ細胞に対して抑制効果を及ぼすことを可能としていることも示す。
【０４４０】
全体において、そのデータは、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇによる処置が、ＣＮＳ内の全ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＴｒｅｇ細胞の比を好ましい形で変化させることを明確に証明しており、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇによる処置が、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を阻害し、かつ、Ｔｒｅｇ細胞の機能および／または数を増加させることを示唆する、提起される作用機構と符合する。１２回にわたるすべての投与後（疾患誘発後の５０日目）において、同様の所見が達成された。
【０４４１】
また、エピトープ拡大に対するＢ７−Ｈ４−Ｉｇによる処置の影響についても試験した。そのために、同じマウスから、脾臓および排出リンパ節を回収し、これらを、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数および表現型について解析した。ＣＦＡ中で乳化させた５０μｇのＰＬＰ１３９〜１５１ペプチドにより、ＳＪＬマウスを免疫した。寛解期において、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇでマウスを処置した：投与１回当たり６０または１００ｕｇ、毎週３回で２週間にわたり（６回の投与により）処置した。３５日目に、抗ＣＤ３抗体（１ｕｇ／ｍｌ）、ＰＬＰ１３９〜１５１（２０μｇ／ｍＬ）、またはＰＬＰ１７８〜１９１（２０μｇ／ｍＬ）が存在する個別のウェル内で、マウス１匹当たりの全脾細胞および全リンパ節細胞（培養物２００ｕｌ当たり５×１０５個ずつの細胞）を活性化させた。培養を開始した２４時間後に、１μＣｉの［３Ｈ］−チミジン（ｔｒｉｔｉａｔｅ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）を各ウェルに添加し、培養を開始した７２時間後に、ウェルを解析した。これを、平均ＣＰＭとして提示した。図４８Ａおよび４８Ｂに示す通り、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇによりマウスを処置したところ、ＰＬＰ１３９〜１５１およびＰＬＰ１７８〜１９１のいずれに対する増殖反応も減少した。したがって、ＳＪＬマウスで進行するＲ−ＥＡＥの寛解期におけるＢ７−Ｈ４−Ｉｇによる処置は、Ｔｒｅｇ細胞数を増加させることにより、エピトープ拡大を減少させると考えられる。図４９に提示されるこの研究の平均臨床スコアは、３ｍｇ／ｋｇ（投与１回当たり６０μｇ）および１５ｍｇ／ｋｇ（投与１回当たり３００μｇ）のいずれの用量におけるＢ７−Ｈ４−Ｉｇも、最初の再発を著しく阻止したことを示す。用量を増大させると、その後の時点（疾患誘発後の４２日目より後）における疾患スコアを低下させるのにより有効であると考えられる。
【０４４２】
（実施例１２）
ＰＬＰ誘発Ｒ−ＥＡＥモデルにおけるヒトＢ７−Ｈ４−Ｉｇのｉｎ  ｖｉｖｏ生物活性
また、ＰＬＰ１３９〜１５１誘発Ｒ−ＥＡＥマウスモデルにおいて、ヒトＢ７−Ｈ４−Ｉｇも、その治療的有効性について調べた。まず、ＰＬＰ１３９〜１５１ペプチドで、ＳＪＬマウスを免疫した。まず、ＣＦＡ中で乳化させたＰＬＰ１３９〜１５１ペプチドにより、雌のＳＪＬマウスを免疫し、２３日目に３つの群に無作為化した。１つの群には、５ｍｇ／ｋｇ（１００μｇ）、毎週３回で４週間にわたり、コントロールのヒトＩｇＧ１（Ｓｙｎａｇｉｓ）を施した。他の２つの群には、５または２５ｍｇ／ｋｇ、毎週３回で４週間にわたり、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇを施した（図５０）。約２カ月間にわたり疾患の経過を追跡し、表９に示す等級付けシステム、ならびに上記で説明した長期再発率に従い、臨床疾患を評価した。
【０４４３】
図５１Ａおよび５１Ｂに示す通り、２つの異なる投与レベルである５または２５ｍｇ／ｋｇにおいて、ヒトＢ７−Ｈ４−Ｉｇは、平均臨床スコアの低減（５１Ａ）ならびに長期再発率の低減（５１Ｂ）により決定される通り、一次性の疾患再発を阻害した。高用量（２５ｍｇ／ｋｇ）は、平均臨床スコアの低下（５１Ａ）を結果としてもたらすと考えられるが、低用量群と高用量群とで再発頻度の差違は存在せず（５１Ｂ）、いずれの用量も、再発エピソードを防止するのに同等に有効であった。
【０４４４】
実施例５〜１２で提示されるデータは、ＰＬＰ１３９〜１５１誘発再発寛解型ＥＡＥ（Ｒ−ＥＡＥ）におけるＢ７−Ｈ４−Ｉｇによる処置の、高度に有効でありかつ再現可能な治療有効性を示す。加えて、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれにおいても、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇの生物活性が決定された。そのデータは、マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＴｈ１細胞系列駆動条件下およびＴｈ１７細胞系列駆動条件下で、刺激された、ＯＶＡ３２３〜３３９特異的トランスジェニックＣＤ４＋ナイーブＴ細胞の増殖および分化を阻害したことを示す。Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇはまた、Ｔｈ１細胞およびＴｈ１７細胞のそれぞれにより生成されるＩＦＮ−γおよびＩＬ−１７のレベルも低下させた。ＡｕｔｏＭａｘで精製したＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞から、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を枯渇させたところ、ＩＬ−１７の抑制はそれほど顕著ではなくなったが、これはまた、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇが、Ｔｒｅｇに直接的に作用して、Ｔｈ１７エフェクター細胞の分化および機能を阻害させることも示唆していた。また、誘導性制御性Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）の分化を誘導するための、最適化未満濃度のＴＧＦ−βおよびＩＬ−２の存在下で増殖させたＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるｉＴｒｅｇの誘導に対するマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇの効果も調べた。そのデータは、ＦｏｘＰ３＋／ＣＤ２５＋細胞集団についてのＦＡＣＳ解析により決定される通り、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇが、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞の、ｉＴｒｅｇ表現型への分化を、用量依存的な形で増強することを示した。したがって、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇは、ＭＳならびに他の自己免疫疾患に関与する、複数の重要な病原性の炎症経路を同時に標的とし、Ｔｒｅｇを誘導することによりさらに炎症を抑制する。これは、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇが、ｉＴｒｅｇの誘導を促進することの最初の直接的な証拠である。Ｔｈ１細胞およびＴｈ１７細胞の分化に対するその効果と結びつけて考えると、このことは、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇを、ＭＳのために開発されている他のすべての薬物から区別する。
【０４４５】
Ｔｒｅｇの抑制機能を調節するＢ７−Ｈ４−Ｉｇの能力についてｉｎ  ｖｉｔｒｏの抑制アッセイでさらに調べた。ＭｏＦｌｏ細胞分取装置を用いて、ＦｏｘＰ３−ＧＦＰトランスジェニックマウスから天然Ｔｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ）細胞を精製し、ＣＤ４＋／ＦｏｘＰ３−ＧＦＰ＋ｎＴｒｅｇ細胞を得た。ＣＤ４＋／ＧＦＰ＋ｎＴｒｅｇ細胞およびマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇの存在下または非存在下において、抗ＣＤ３抗体でＣＤ４＋ＧＦＰ−レスポンダーＴ細胞を刺激した。ｎＴｒｅｇ細胞の非存在下では、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇが、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化および増殖を用量依存的な様式で阻害したことから、既出の知見が確認された。マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇの非存在下では、ｎＴｒｅｇが、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化および増殖を細胞数依存的な形で阻止した。しかし、ｎＴｒｅｇおよびＢ７−Ｈ４−Ｉｇの両方を存在させたところ、ＣＤ４＋ＧＦＰ−レスポンダーＴ細胞に対する免疫抑制レベルの顕著な増大が観察された。Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇについての上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける解析は、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇが、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞の活性化を遮断し、かつ、ナイーブヘルパーＴ細胞の、炎症促進性Ｔｈ１細胞および炎症促進性Ｔｈ１７細胞のサブセットへの分化を阻害するだけでなく、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞のｉＴｒｅｇへの分化も増強するというモデルを支持する。
【０４４６】
また、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、Ｒ−ＥＡＥの誘発および増悪を調節するＢ７−Ｈ４−Ｉｇの能力についても調べた。第１のｉｎ  ｖｉｖｏ研究では、ＰＬＰ１３９〜１５１／ＣＦＡペプチドによるプライミングの当日にＢ７−Ｈ４−Ｉｇによる処置を開始したところ、それは、Ｒ−ＥＡＥの急性期における疾患の症状には影響を及ぼさなかったが、平均臨床スコアならびにＰＬＰ１７８〜１９１拡大エピトープに対するＤＴＨ反応の顕著な低減により決定される通り、一次性の疾患再発を阻害した。同様に、疾患寛解期（疾患誘発後の２１日目）においてＢ７−Ｈ４−Ｉｇによる処置を開始したところ、それは、ＰＬＰ１７８〜１９１拡大エピトープに対するＴ細胞反応を阻害すると共に、疾患再発の重症度も著しく軽減した。第１のｉｎ  ｖｉｖｏ研究とは対照的に、Ｒ−ＥＡＥについての再研究では、ＰＬＰ１３９〜１５１／ＣＦＡペプチドによるプライミングの当日にＢ７−Ｈ４−Ｉｇによる処置を開始したところ、それは、Ｒ−ＥＡＥの急性期における疾患症状に影響を与えたことが示された。その後、マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇが、処置されたマウスの末梢におけるＴｒｅｇ細胞数を増加させることが証明された。Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇは、病原性ＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＮＳへの浸潤を遮断し、Ｒ−ＥＡＥマウスのＣＮＳにおける防御性Ｔｒｅｇの百分率を増大させた。これは、疾患の一次性の状態および再発状態の両方に対するＢ７−Ｈ４−Ｉｇの効果を説明しうる。
【０４４７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方において、ヒトＢ７−Ｈ４−Ｉｇを調べた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるバイオアナリシスによる結果は、ヒトＢ７−Ｈ４−Ｉｇが、マウスＣＤ４＋ナイーブＴ細胞と交差反応し、マウスＴｈ１細胞／Ｔｈ１７細胞の増殖および分化を遮断したことを示す。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＲ−ＥＡＥ実験による結果は、ヒトＢ７−Ｈ４−Ｉｇが、平均臨床スコアおよび長期再発率の両方の低減によって決定される通り、疾患を阻害することを明らかにした。さらに、異なるバッチ（ロット）に由来するＢ７−Ｈ４−Ｉｇについて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける同一の生物活性が示されたことから、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇの生産プロセスの一貫性が証明された。まとめると、本知見は、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇが、Ｔｒｅｇ細胞の数および／または機能を増大させ、かつ、Ｔｈ１細胞反応／Ｔｈ１７細胞反応を減少させることを示唆する。
【０４４８】
（実施例１３）
糖尿病マウスモデル
ＣＴＬＡ４ＫＤ／ＮＯＤマウス
材料および方法
雌雄両方の２週齢ＣＴＬＡ４ＫＤ／ＮＯＤマウス（Ｃｈｅｎら、ＰＮＡＳ、１０３巻（４４号）：１６４００〜１６４０５頁（２００６年））を、実験群：ビヒクル群（１１匹のマウス）およびＢ７−Ｈ４−Ｉｇ群（１２匹のマウス）へと無作為に割り当てた。毎週３回で４週間にわたり（１５ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｐ．注射による）、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇでマウスを処置し、Ｄｉａｓｔｉｘにより、初尿中におけるグルコース含量について、毎週３回モニタリングした。Ｄｉａｓｔｉｘが陽性を示した場合は、血漿を回収して血中グルコースレベルを調べた。血中グルコースが≧６００ｍｇ／ｄＬに達した場合は、糖尿病と判定した。
【０４４９】
結果
図５２は、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇが、ＣＴＬＡ４ＫＤ／ＮＯＤマウスにおける自己免疫性糖尿病の発生を防止することを示す。２週齢のＣＴＬＡ４ＫＤ／ＮＯＤマウスに、毎週３回で４週間にわたり（１５ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｐ．注射による）、ビヒクルまたはＢ７−Ｈ４−Ｉｇを注射した。マウスが５週齢になったとき（ビヒクル注射の３週間後）、ビヒクル注射マウスのうちの３０〜４０％が糖尿病を発症したことは、公表されたデータ（Ｃｈｅｎら、ＰＮＡＳ、「Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ＣＴＬＡ４−ｌｉｎｋｅｄ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｗｉｔｈ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ」、２００６年）と符合する。マウスが２４週齢となっても（Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ処置の２２週間後）、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処置したＣＴＬＡ４ＫＤ／ＮＯＤマウスは、糖尿病を発症しなかった。
【０４５０】
ＣＴＬＡ４ＫＤ／ＢＤＣ２．５／ＮＯＤマウス
方法および材料
ＣＴＬＡ４ＫＤ／ＮＯＤマウス（Ｃｈｅｎら、ＰＮＡＳ（２００６年））を、ＢＤＣ２．５  ＴＣＲトランスジェニックマウス（Ｋａｔｚら、Ｃｅｌｌ、７４巻（６号）：１０８９〜１００頁（１９９３年））と交配させた。雌雄両方の１１週齢マウスを、実験群：ビヒクル群（３匹のマウス）およびＢ７−Ｈ４−Ｉｇ群（５匹のマウス）へと無作為に割り当てた。毎週３回で４週間にわたり（１５ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｐ．注射による）、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇでマウスを処置し、Ｄｉａｓｔｉｘにより、初尿中におけるグルコース含量について、毎週３回モニタリングした。Ｄｉａｓｔｉｘが陽性を示した場合は、血漿を回収して血中グルコースレベルを調べた。血中グルコースが≧６００ｍｇ／ｄＬに達した場合は、糖尿病と判定した。
【０４５１】
結果
図５３は、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇが、ＣＴＬＡ４ＫＤ／ＢＤＣ２．５／ＮＯＤマウスにおける自己免疫性糖尿病の発症を遅延させたことを示す。１１週齢のＣＴＬＡ４ＫＤ／ＢＤＣ２．５／ＮＯＤマウスに、毎週３回で４週間にわたり（１５ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｐ．注射による）、ビヒクルまたはＢ７−Ｈ４−Ｉｇを注射した。マウスが１６週齢になったとき（ビヒクル注射の５週間後）、ビヒクル注射マウスのうちの１００％が糖尿病を発症したことは、根拠のあるデータ（Ｃｈｅｎ博士との私信による）と符合する。マウスが２１週齢となる（Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ処置の１０週間後）まで、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処置したＣＴＬＡ４ＫＤ／ＢＤＣ２．５／ＮＯＤマウスは、糖尿病を発症しなかった。
【０４５２】
（実施例１４）
Ｂ７−Ｈ４−ＩｇはＴｒｅｇ活性を増強する
方法および材料
糞便抽出物からの腸内抗原の調製
マウスから結腸および盲腸を摘出し、その内容物をＰＢＳ中に入れることにより、抽出物を調製した。これを氷上で３０秒間ずつ３回にわたり超音波処理した後、１０，０００ｇで１０分間にわたり遠心分離にかけて、不溶性物質を除去した。その上清を回収し、滅菌濾過し、−６０℃で保存した。ビシンコニン酸（ＢＣＡ）法により決定される通り、上清中のタンパク質濃度は、１〜１．５ｍｇ／ｍＬであることが典型的であった。
【０４５３】
Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇによる処置
７〜９週齢の野生型雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに、毎週３回で２週間にわたり、６０μｇまたは３００μｇのＢ７−Ｈ４−Ｉｇを腹腔内（ＩＰ）注射した。各群のマウスは５匹ずつとした。処置の２週間後、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ処置マウス、ならびにまたコントロールのナイーブマウスも安楽死させて、Ｔ細胞を単離した。
【０４５４】
ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の調製
ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞は以下の通りに得た：製造業者の指示書に従い、マウス抗ＣＤ４モノクローナル抗体でコーティングしたＤＹＮＡＢＥＡＤ（登録商標）およびＤＥＴＡＣＨＡＢＥＡＤ（登録商標）システム（Ｄｙｎａｌ  ＡＳ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）を用いて、脾臓の単細胞懸濁物から、ＣＤ４＋Ｔ細胞を陽性選択した。次いで、製造業者の指示書に従い、ＰＥ標識した抗ＣＤ２５モノクローナル抗体を用いるＭｉｌｔｅｎｙｉの磁気ビーズ法（ＭＡＣＳ（登録商標）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｌｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の後、抗ＰＥ抗体マイクロビーズを添加し、かつこれらを枯渇させることにより、ＣＤ４＋Ｔ細胞（フローサイトメトリーにより９８％超の純度であると評価される）を、ＣＤ２５＋Ｔ細胞集団と、ＣＤ２５−Ｔ細胞集団とに分離した。
【０４５５】
抗原提示細胞の調製およびパルス
ＢＡＬＢ／ｃマウスに由来する正常脾臓細胞を、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として用いた。その脾臓細胞を８×１０６細胞／ｍＬへと調整し、２４ウェルプレート内での２ｍＬの最終容量中に４００μｇの腸内抗原抽出物を混合し、抗原提示させた。１８時間にわたるインキュベーション後、培地中で細胞を３回にわたり洗浄し、放射線照射（３０００ｒａｄ）して、ＡＰＣの増殖を消失させた。
【０４５６】
増殖アッセイ
ＡＰＣを１．０×１０６細胞／ｍＬへと調整し、９６ウェルの丸底培養プレートの各ウェルに１００μＬを添加した。Ｂａｌｂ／Ｃマウスから単離されたＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を、１×１０６細胞／ｍＬへと調整し、そのＡＰＣに１００μＬを添加した。培養の４日後、各ウェルに０．５μＣｉの［３Ｈ］−チミジンを添加し、１８時間にわたりインキュベートし、細胞を採取して、取り込まれたチミジンをカウントすることにより、増殖を測定した。
【０４５７】
結果
標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏの腸内抗原プライミング増殖アッセイでは、まず、正常なマウスＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を９６ウェルプレートに添加し、腸内抗原でパルスしたＡＰＣと混合した。コントロール処置マウスまたはＢ７−Ｈ４−Ｉｇ処置マウスからＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を単離し、これらを上記の培養物に、１ウェル当たり０、６２５０、１２５００、および２５０００Ｔｒｅｇ細胞を添加した。図５４は、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ処置マウスに由来するＴｒｅｇが、コントロールマウスに由来するＴｒｅｇと比較して、腸内抗原によるプライミング、ならびにＴ細胞の増殖を遮断することにおいてより強力であることを示す。加えて、高用量のＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（３００μｇ）で処置されたマウスが、低用量のＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（６０μｇ）で処置されたマウスと比較してより有効なＴｒｅｇを生ずることから、用量依存的な効果が示された。
【０４５８】
また、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ処置マウスに由来するＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞についてはまた、腸内抗原によるプライミングおよび増殖に対するそれらの反応性を評価した。図５５は、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ処置マウスに由来するＣＤ４＋ＣＤ２５−エフェクターＴ細胞が、腸内抗原でパルスされたＡＰＣに対して良好に反応し、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇによる処置が、腸内抗原特異的なＣＤ４＋ＣＤ２５−エフェクターＴ細胞の反応にほとんど影響を及ぼさなかったことを示す。
【０４５９】
そのデータは、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ処置動物のリンパ節から回収されたＴｒｅｇ細胞が、コントロールマウスから得られるＴｒｅｇ細胞と比較して、抗原によるプライミングならびにＴ細胞の増殖を遮断することにおいて、活性の増大を示すことを示唆する。Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇによる処置は、腸内抗原特異的なＣＤ４＋ＣＤ２５−エフェクターＴ細胞にほとんど影響を及ぼさない。
【０４６０】
（実施例１５）
Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇはナイーブ細胞が活性化し、Ｔｈ１７細胞へと分化する間の初期に機能して、ＩＬ−１７Ａの生成を阻害する
方法および材料
上記の実施例における通り、ＢＡＬＢ／ｃマウスからＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞を単離し、Ｔｈ１７細胞分化カクテル（ＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−２３（４ｎｇ／ｍＬ）、抗ＩＬ−４抗体（１０μｇ／ｍＬ）、抗ＩＦＮ−γ抗体（５μｇ／ｍＬ）、および抗ＩＬ−２抗体（５μｇ／ｍＬ））の存在下において、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を結合させたビーズにより活性化させた。４日間にわたる培養の０日目、１日目、または２日目に、マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（１０μｇ／ｍＬ）またはレチノイン酸（ＲＡ）（１０μＭ）を、培養物に添加した。４日間にわたる培養の終了時において、ＥＬＩＳＡにより、ＩＬ−１７Ａレベルを測定した。
【０４６１】
結果
Ｔｈ１７アッセイの期間は、４日間である。Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇが作用するのはいつかを決定するために、０日目、１日目、または２日目に、１０μｇ／ｍＬのマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇ、１０μｇ／ｍＬのマウスＩｇＧコントロール、または１０ｍＭのレチノイン酸を添加することにより、Ｔｈ１７アッセイを実施した。
【０４６２】
マウスＢ７−Ｈ４−ＩｇおよびＲＡのいずれもが、アッセイの開始時（０日目）に添加されたときに最も強力にＩＬ−１７Ａを阻害したことから、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇは、ナイーブＴ細胞がＴｈ１７細胞へと分化する間の初期に機能して、ＩＬ−１７Ａの生成および／または分泌を阻害することが示された（図５６）。
【０４６３】
（実施例１６）
Ｂ７−Ｈ４−ＩｇはＴｈ１７細胞の分化と関連する遺伝子の発現を下方制御する
方法および材料
上記の実施例における通り、ＢＡＬＢ／ｃマウスからＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞を単離し、Ｔｈ１７細胞分化カクテル（ＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−２３（４ｎｇ／ｍＬ）、抗ＩＬ−４抗体（１０μｇ／ｍＬ）、抗ＩＦＮ−γ抗体（５μｇ／ｍＬ）、および抗ＩＬ−２抗体（５μｇ／ｍＬ））の存在下において、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を結合させたビーズにより活性化させた。Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ（１μｇ／ｍＬで、２つの異なるロット（＃２２および＃２３）による）またはアイソタイプコントロールのいずれかと共に、細胞をインキュベートした。細胞からＲＮＡを単離し、定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて、Ｔｈ１７細胞、Ｔｒｅｇ細胞、自己免疫性障害、および炎症と関連する多数のｍＲＮＡ（ＳＡ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのマウスＴｈ１７パネル）の発現レベルについて調べた。
【０４６４】
ヒトＴ細胞を、Ｔｈ１７細胞分化カクテル（ＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−２３（４ｎｇ／ｍＬ）、抗ＩＬ−４抗体（１０μｇ／ｍＬ）、抗ＩＦＮ−γ抗体（５μｇ／ｍＬ）、および抗ＩＬ−２抗体（５μｇ／ｍＬ））の存在下において、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を結合させたビーズにより活性化させた。細胞を、ＱまたはＬとして同定されるＢ７−Ｈ４−Ｉｇの２つの異なる改変体（１μｇ／ｍＬ）、またはアイソタイプコントロールとしての、呼吸器系合胞体ウイルスのＦタンパク質のＡ抗原部位におけるエピトープに対するヒト化モノクローナルＩｇＧ抗体（Ｓｙｎａｇｉｓ）と共にインキュベートした。
【０４６５】
結果
定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果は、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇが、Ｔｈ１７細胞の主たる転写因子であるＲＯＲｃ、ならびにＴｈ１７細胞のエフェクター分子である、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−２１、およびＩＬ−２２など、Ｔｈ１７細胞の分化に関与するｍＲＮＡの発現を下方制御することを示す（表１０、ならびに図５７および５８）。
【０４６６】
【表１０−１】
2013503204.tif 000086
【０４６７】
【表１０−２】
2013503204.tif 000087
【０４６８】
【表１０−３】
2013503204.tif 000088
【０４６９】
【表１０−４】
2013503204.tif 000089
（実施例１７）
マウスＴＨ１７アッセイにおけるマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇの活性
方法および材料
動物
５〜７週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ）を用いた。
【０４７０】
ＣＤ４ナイーブ細胞の単離
細胞ろ過器（Ｃｅｌｌ  ｓｔｒａｉｎｅｒ）
ＡＣＫ溶解緩衝液
１０倍濃度のＨａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ；Ｈ１６４１）
ＣＤ４陰性選択キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；１３０−０９０−８６０）
抗マウスＣＤ２５抗体−ビオチン（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；１３０−０９２−５６９）
ＣＤ６２Ｌビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；１３０−０４９−７０１）
９６  Ｗｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ（Ｃｏｓｔａｒ；３５９５）  。
【０４７１】
培地
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍｏｕｓｅ  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｄｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１１４５２Ｄ）
ＨＬ−１培地（Ｌｏｎｚａ；３４４０１７）
１０００倍濃度のβ−メルカプトエタノール（２−Ｍｅ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；２１９８５−０２３）
ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１５０７０−０６３）
非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１１１４０−０５０）
Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；２５０３０−０８１）  。
【０４７２】
ＴＨ１７分化カクテル
組換えヒトＴＧＦ−β１  （Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ２４０−Ｂ−０１０）
組換えマウスＩＬ−６（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；４−８０６１）
組換えマウスＩＬ−２３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；１４−８２３１）
抗マウスＩＬ−２抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；１６−７０２１）
抗マウスＩＬ−４抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；１６−７０４１）
抗マウスＩＦＮ−γ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；１６−７３１１）  。
【０４７３】
Ｂ７−Ｈ４−ＩｇおよびマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇ
ロット２２のマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇ
ロット２３のマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇ
ヒトＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（Ｑ）
ヒトＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（Ｌ）  。
【０４７４】
陽性コントロールおよび陰性コントロール
オールトランス−レチノイン酸（ＡＴＲＡ；Ｓｉｇｍａ；Ｒ２６２５）
ＣｈｒｏｍｏＰｕｒｅマウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ；０１５−０００−００３）
Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）  。
【０４７５】
解析
マウスＩＬ−１７Ａ  ＥＬＩＳＡキット
６〜９週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓および鼠径リンパ節から、細胞ろ過器を介する機械的破壊の後、赤血球（ＲＢＣ）溶解を行うことにより、末梢Ｔ細胞を得た。
【０４７６】
Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃマイクロビーズシステムを用いて、ナイーブヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋）を得た。陰性選択によりＣＤ４＋細胞を富化した後、ＣＤ６２Ｌ＋を陽性選択した。一部の実験ではまた、ＣＤ２５＋細胞を枯渇させもした。
【０４７７】
選択後、ＴＨ１７細胞分化カクテル（ＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−２３（４ｎｇ／ｍＬ）、抗ＩＬ−２抗体（５μｇ／ｍＬ）、抗ＩＬ−４抗体（１０μｇ／ｍＬ）、および抗ＩＦＮ−γ抗体（５μｇ／ｍＬ））の存在下において、細胞：ビーズ比１：１の抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体ビーズにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞を活性化する。１．２５〜２０μｇ／ｍｌの最終濃度で、マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇを添加する。レチノイン酸（ＲＡ）を陽性コントロールとして用い、マウスＩｇＧを陰性コントロールとして用いる。
【０４７８】
４日間にわたる培養後、培養物をスピンダウンし、上清を採取し、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−１７Ａレベルについて解析するまで、＜−６５℃で保存する。
【０４７９】
フローサイトメトリーおよび細胞内染色（ＩＣＳ）を用いて、出発細胞集団の純度、ならびに分化プロトコールの成功について評価した。
【０４８０】
結果
マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇが、マウスＴｈ１７細胞によるＩＬ−１７Ａの発現を低減するように作用することを証明するために、最初の実験を実施した。マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇ、コントロールのマウスＩｇＧ、またはレチノイン酸（ＲＡ）の存在下、Ｔｈ１７促進条件下で、４日間にわたり、ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞を刺激および培養する。
【０４８１】
４日目に上清を採取し、ＩＬ−１７Ａ  ＥＬＩＳＡにより解析した。図５９に示す通り、マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇによる処置およびＲＡによる処置のいずれもが、コントロールのマウスＩｇＧと比べて、ＩＬ−１７Ａの発現を低減させた。
【０４８２】
このアッセイにおいて、ヒトＢ７−Ｈ４−Ｉｇが活性であるかどうかを確かめるために、実験を実施した。ヒトＢ７−Ｈ４と、そのマウス類似体とでは、Ｂ７−Ｈ４の細胞外ドメインが９５％同一であるため、種の交差反応が可能なはずである。２０、１０、５、２．５、および１．２５μｇ／ｍＬのタンパク質濃度について調べた。ヒトＢ７−Ｈ４−Ｉｇの２つの改変体を、関連性のないヒトＩｇＧ１抗体治療剤であるＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）と比較し、２つのロットのマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇを、マウスＩｇＧコントロールと比較した。
【０４８３】
図６０および６１に示す通り、ヒトＢ７−Ｈ４−Ｉｇならびにそのマウス類似体は、Ｔｈ１７アッセイにおいてマウス細胞に対して活性である。
【０４８４】
（実施例１８）
ＭＲＬ／ｌｐｒループスマウスモデル
材料および方法
処置レジメン
この実験では、４週齢のＭＲＬ／ｌｐｒマウスを用いた。識別のために、動物の右耳に金属製のタグを付した。シクロホスファミド（ＣＴＸ）は、腎ループスを有する患者におけるびまん性増殖性糸球体腎炎に用いられる第一選択薬であり、ＤａｉｋｈおよびＷｏｆｓｙは、ＣＴＸおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇによる組合せ処置が、進行性腎炎を有するＮＺＢ／ＮＺＷ  Ｆ１ループスマウスの腎疾患を軽減し、かつ生存を延長させるのに、いずれかの薬剤単独より有効であることを報告した（ＤａｉｋｈおよびＷｏｆｓｙ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６６巻（５号）：２９１３〜６頁（２００１年））。概念実証試験では、組換えマウスＢ７−Ｈ４−ＩｇおよびＣＴＸによる組合せ処置について調べた。マウスには、隔週１回で５０ｍｇ／ｋｇのＩＰ注射によるＣＴＸを伴うかまたは伴わない、５ｍｇ／ｋｇのマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（ロット番号ＤＥＶ−１１０−５−００６）による単剤処置または組合せ処置を施した（図６２）。モノクローナル抗体および融合タンパク質についてのｉｎ  ｖｉｖｏ研究に基づき、毎週２回で５ｍｇ／ｋｇ（マウス１匹当たりの注射１回当たり１００μｇ）のマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇ投与レジメンを選択した。単剤処置および組合せ処置のいずれも、ＰＢＳで希釈して、同様の５００μＬ注射用試料を作製し、これを、ゲージ２７の注射針を伴う３ｍｌのシリンジを用いて投与した。そのタンパク質による処置の３日前、ならびに処置中および処置後において隔週で、下顎静脈から血液試料（約２００μＬ）を採取した（ＡＲＣ  ＳＯＰ  ８０５０．０２．０８）。Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ（登録商標）採血管内に血液試料を回収し、遠心分離後における血液試料の上清から血漿を採取し、使用まで、−８０℃の冷凍庫で保存した。
【０４８５】
抗ｄｓＤＮＡ自己抗体の解析
約８カ月齢の老齢ＭＲＬ／ｌｐｒマウス５匹から血漿をプールすることにより、陽性コントロールの抗ｄｓＤＮＡ自己抗体を生成させた。その陽性コントロール血漿をアリコート分割し、使用前に−８０℃の冷凍庫で保存した。
【０４８６】
まず、サケ精巣ＤＮＡを、水浴中３７℃のＰＢＳ中に溶解させ、その後、０．４５μｍの膜フィルターに通して濾過することにより、ｄｓＤＮＡ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を作製した。そのｄｓＤＮＡ溶液をアリコート分割し、使用前に−８０℃で保存した。
【０４８７】
自己抗体ＥＬＩＳＡの前日、まず、１００μＬのｄｓＤＮＡ原液を、１０ｍＬのＰＢＳに添加し、１００μｇ／ｍｌの最終濃度にした。次いで、その希釈ｄｓＤＮＡ１００μｌを、Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２ＨＢ  ９６ウェル平底マイクロ滴定プレートの各ウェルに添加した。プレートを、覆いなしで、３７℃の加湿インキュベーター内に入れ、一晩にわたりコーティングした。マイクロ滴定プレート洗浄機（ｈｙｄｒｏＦＬＥＸ、ＴＥＣＡＮ；Ｓｏｆｔｗａｒｅ：ＨｙｄｒｏＣｏｎｔｒｏｌ）を用いて、３００μＬのＰＢＳ／Ｔ［ＰＢＳ中に０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０（ポリソルベート２０）］により、４回にわたりプレートを洗浄し、次いで、室温で少なくとも１時間にわたり、２００μＬのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中に１０％のウシ胎仔血清）によりブロッキングした後、３００μＬのＰＢＳ／Ｔにより４回にわたり洗浄した。ブロッキング緩衝液により、陰性コントロール（正常Ｂａｌｂ／Ｃマウスの血漿、１：２０００の希釈率）、陽性コントロール（１：５０００、１：１００００，１：２００００の希釈率）、および試料（１：２０００の希釈率）を希釈した。次に、１００μＬの各希釈コントロールおよび希釈試料を、対応するウェル（２連ウェル）に添加し、室温で２時間にわたり、または４℃で一晩にわたりインキュベートした後、３００μＬのＰＢＳ／Ｔで４回にわたり洗浄した。検出では、１００μＬの抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ、Ａ９３０９；ブロッキング緩衝液中で１：１００００に希釈する）を各ウェルに添加し、プレートを室温で１時間にわたりインキュベートした後、４００μＬのＰＢＳ／Ｔで４回にわたり洗浄した。
【０４８８】
その後、室温で予め加温した１００μＬのＴＭＢ基質試薬を各ウェルに添加した。最適に発色させたら（約１０分間にわたる）、１００μＬの停止溶液（１％の硫酸）を添加した。次いで、マイクロプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ；Ｓｏｆｔｗａｒｅ：ＳｏｔｆＭａｘ  Ｐｒｏ５．２）を用いて、４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４５０）についてプレートを読み取った。
【０４８９】
研究の終了時において、すべての血液試料を解析した。希釈率１：１００００の内部陽性コントロールとの対比により、被験試料のＯＤ４５０値を標準化した。絶対値ではなく、相対値によるＡｂ濃度を用いて比較した。
【０４９０】
組織学検査
糸球体腎炎を評価するため、マウス腎臓を摘出し、１０％ホルマリン（ＳＡＦＥＦＩＸ  ＩＩ）中で固定し、ＡＭＬ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｏｓｅｄａｌｅ、ＭＤ）へと送付した。ＡＭＬ  Ｌａｂｓでは、７ｍｍの切片が得られ、標準的なＨ＆Ｅ染色により染色された。低倍率および高倍率の光学顕微鏡下で、画像を収集した。
【０４９１】
タンパク尿の解析
尿検査用ディップスティック（Ｇｅｒｍａｉｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号５２１００）を用いて、新鮮尿試料を調べることにより、タンパク尿を測定した。新鮮尿の液滴を、ディップ試薬パッド上に回収した。約１〜２分後、パッドの色を、色チャートと比較して、０〜＋４のスケール（０／微量＝陰性、１＋＝３０、２＋＝１００、３＋＝３００、および４＋≧２，０００ｍｇ／ｄｌ）でタンパク尿レベルを決定した。
【０４９２】
結果
４週齢の雌ＭＲＬ／ｌｐｒマウスを、４つの群：ビヒクル、ＣＴＸ単独、マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇ単独、ならびにＣＴＸとマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇとの組合せ処置（Ｃｏｍｂｏ）に分割した（図６２）。ＣＴＸは、隔週１回、５０ｍｇ／ｋｇのＩＰで施した。マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇは、毎週２回、１００μｇ（５ｍｇ／ｋｇ）をＩＰ投与した。Ｃｏｍｂｏ群では、隔週にＣＴＸ注射を施し、かつ、マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇの５ｍｇ／ｋｇを毎週２回施した。７週間にわたり、マウスを処置した。
【０４９３】
【表１１】
2013503204.tif 000090
2013503204.tif 000091
処置前（４週齢）において、ならびに２１週齢まで定期的に、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスから血漿を回収した。抗ｄｓＤＮＡ自己抗体を、老齢のＭＲＬ／ｌｐｒマウスから回収された血漿のプールである内部コントロールに対して評価および標準化した（表１１）。
【０４９４】
マウスＢ７−Ｈ４−ＩｇとＣＴＸとの組合せは、上記ＭＲＬ／ｌｐｒループスマウスモデルにおける抗ｄｓＤＮＡ自己抗体の発生を著しく低減した。図６３は、抗ｄｓＤＮＡ自己抗体の相対測定値を示し、これは、マウスＢ７−Ｈ４−ＩｇおよびＣＴＸによる組合せ処置が、処置されたＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける自己抗体の発生を防止し、上記組合せ処置が、ＣＴＸ単独による処置またはマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇ単独による処置より有効であったことを証明する。後の時点である１９週目および２１週目ではまた、マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇ単独による処置においても、著しく低い自己抗体レベルであることが明らかになったことから、投与レジメンを最適化すれば、マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇ単独も有効でありうることが示唆される。
【０４９５】
マウスが２１週齢となった時点で、この実験は終了とした。コントロールビヒクル注射マウスおよび処置マウスからリンパ系器官を回収した。マウスＢ７−Ｈ４−ＩｇとＣＴＸとの組合せは、上記ＭＲＬ／ｌｐｒループスマウスモデルにおけるリンパ増殖を著しく低減した。マウスＢ７−Ｈ４−ＩｇおよびＣＴＸによる組合せ処置は、脾臓およびリンパ節の肥大を防止した。動物を安楽死させる前に、ＡｉｍＳｔｒｉｐタンパク質用ペーパーストリップを用いて、タンパク尿について解析した。図６４は、マウスＢ７−Ｈ４−ＩｇおよびＣＴＸによる組合せ処置を受けたマウスでは、残りの群におけるマウスと比較して、タンパク尿が著しく低減されたことを明らかにする。
【０４９６】
腎臓を摘出して、組織学検査を行った。腎臓切片についてのＨ＆Ｅ染色は、マウスＢ７−Ｈ４−ＩｇおよびＣＴＸによる組合せ処置が、血管炎を減少させ、かつ、糸球体の損傷を防止することを示した。ビヒクル注射マウスの腎臓では、血管の周囲に大規模なリンパ球浸潤が観察され、糸球体の内部に赤血球が認められた。
【０４９７】
上記ＭＲＬ／ｌｐｒマウスでは、組換えマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇタンパク質およびＣＴＸによる組合せ処置が、ループス疾患の増悪を顕著に防止したが、それは、抗ｄｓＤＮＡ抗体が少ないこと、リンパ系器官の肥大が見られないこと、タンパク尿が少ないこと、腎臓へのリンパ球の浸潤が少ないこと、ならびに糸球体が無傷である証拠が見られることにより証明された。
【０４９８】
（実施例１９）
未成熟樹状細胞の生成
約５０ｍＬの全血液（ドナーの例数：ｎ＝３〜５）からの小スケールにおけるＤＣの生成
・新鮮ＧＭ−ＣＳＦおよび隔日のＩＬ−４＋１０％ヒトＡＢ血清
・７日間にわたる培養
無血清法と比較する
・分化の開始時にＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を添加する
・５〜６日間にわたる培養
ｉｍＤＣの採取
・マーカー解析：ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１１Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ
・ＡＰＣ−Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ間の結合、抗Ｂ７−Ｈ４との競合
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおけるＢ７−Ｈ４−Ｉｇ
・ＬＰＳ＋１０、５０、２５０μｇ／ｍＬのＢ７−Ｈ４−ＩｇまたはコントロールのＩｇＧ１を用いる
・上清を回収して、サイトカイン解析を行う（まず、ＴＮＦａおよびＩＬ−６について解析する）；上清を保存して、その後の他のサイトカイン解析に用いる
・細胞を採取して、ＤＣ成熟についてのマーカー解析を行う：例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＣＲ７
ＤＣの成熟におけるＢ７−Ｈ４−Ｉｇの役割の決定
・ＤＣ成熟カクテルを用い、ＤＣの成熟におけるＢ７−Ｈ４の役割について研究する
・ＬＰＳ単独；ＴＮＦａ＋ＰＧＥ２；ＩＬ−１ｂ＋ＩＬ６＋ＴＮＦａ＋ＰＧＥ２・・・
・２日間にわたる成熟を１日間の成熟と対比する；通常のディッシュまたは超低付着度ディッシュ；アッセイ１回当たりにおける各ウェルの細胞数を最小化する
・上清を回収して、サイトカイン解析を行う
・細胞を採取して、ＤＣ成熟についてのマーカー解析を行う：例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＣＲ７
・３〜５例のドナーからの細胞について調べる
・ｉｍＤＣについての放出基準、例えば、細胞マーカーおよびＢ７−Ｈ４−Ｉｇの結合を決定する
・成熟カクテル、成熟のタイミング、ならびにサイトカインおよび／または成熟マーカーの阻害についての基準を決定する
小スケールにおける再現性
・上記規定されたｉｍＤＣのパラメータを用いて、３例のドナーからの細胞を処理する
・規定されたＤＣの成熟カクテルおよびＢ７−Ｈ４−Ｉｇを適用する
・サイトカインおよびｍＤＣマーカーについて解析する
大スケールにおけるｉｍＤＣの生成
・小スケールから規定されたｉｍＤＣの条件を用いて、２〜３個のｌｅｕｋｏｐａｋの処理を開始する
・１個のｌｅｕｋｏｐａｋは一般に、５×１０８〜１×１０９個のｉｍＤＣをもたらす
・ｉｍＤＣを極低温保存する
・細胞を融解させて、ＤＣの成熟、ならびにＢ７−Ｈ４−Ｉｇの機能解析を行う
・小スケールにより規定された成熟条件を用いる
・１ウェル当たりの細胞数を最小化する試験を行う
・上記アッセイの頑健性および再現性を試験する：サイトカインおよびｍＤＣマーカーについて調べる
・ｉｍＤＣを受容体の発見に供する（受容体の発見に少量の細胞が必要である場合は、確認研究の後、小スケールの細胞処理によりｉｍＤＣを得ることができる）
別段に定義されない限り、本明細書で用いられるすべての技術用語および科学用語は、本開示される発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
【０４９９】
当業者は、日常的な実験だけを用いて、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの同等物を認識するか、または確認することになる。このような同等物は、以下の特許請求の範囲により包含されることを意図する。
【図１Ｂ】
2013503204.tif 000092
【図２】
2013503204.tif 000093
【図３】
2013503204.tif 000094
【図４】
2013503204.tif 000095
【図５】
2013503204.tif 000096
【図６】
2013503204.tif 000097
【図７】
2013503204.tif 000098
【図８】
2013503204.tif 000099
【図１２】
2013503204.tif 000100
【図１３】
2013503204.tif 000101
【図１４】
2013503204.tif 000102
【図１５】
2013503204.tif 000103
【図１６】
2013503204.tif 000104
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2013503204.tif 000108
【図２１】
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【図２２】
2013503204.tif 000110
【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
2013503204.tif 000118
【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
2013503204.tif 000127
【図４１】
2013503204.tif 000128
【図４２】
2013503204.tif 000129
【図４３】
2013503204.tif 000130
【図４５】
2013503204.tif 000131
【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
2013503204.tif 000135
【図５０】
2013503204.tif 000136
【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
2013503204.tif 000141
【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
2013503204.tif 000147
【図６２】
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【図６３】
2013503204.tif 000149
【図６４】
2013503204.tif 000150
【図１Ａ】
2013503204.tif 000151
【図９】
2013503204.tif 000152
【図１０】
2013503204.tif 000153
【図１１】
2013503204.tif 000154
【図３４】
2013503204.tif 000155
【図４４】
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【配列表】
2013503204000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年5月2日(2012.5.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
別の実施形態では、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質、またはそれらの断片を用いて、ＴＮＦ遮断剤に不応の患者を処置することができる。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
第２のポリペプチドに直接的に融合するか、または該第２のポリペプチドに融合するリンカーペプチド配列またはリンカーポリペプチド配列を介して該第２のポリペプチドに間接的に融合するＢ７−Ｈ４ポリペプチドまたはその断片を含む第１の融合パートナーを含む融合タンパク質であって、該Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドまたはその断片が、配列番号６３のＩｇＶまたは配列番号６４のＩｇＶを含むか、または該Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質が、配列番号５７のＫＲＲＳ配列を欠く、融合タンパク質。
（項目２）
上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドが、ヒトＢ７−Ｈ４ポリペプチドまたはマウスＢ７−Ｈ４ポリペプチドである、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目３）
上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドが、ヒトＢ７−Ｈ４の細胞外ドメイン、またはＢ７−Ｈ４結合活性を有するその断片を含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目４）
上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドが、
配列番号４９もしくは配列番号５２の、３２−２４９、３２−２４８、３２−２４７、３２−２４６、３２−２４５、３２−２４４、３２−２４３、３２−２４２、３２−２４１、３１−２４９、３１−２４８、３１−２４７、３１−２４６、３１−２４５、３１−２４４、３１−２４３、３１−２４２、３１−２４１、３０−２４９、３０−２４８、３０−２４７、３０−２４６、３０−２４５、３０−２４４、３０−２４３、３０−２４２、３０−２４１、２９−２４９、２９−２４８、２９−２４７、２９−２４６、２９−２４５、２９−２４４、２９−２４３、２９−２４２、２９−２４１、２８−２４９、２８−２４８、２８−２４７、２８−２４６、２８−２４５、２８−２４４、２８−２４３、２８−２４２、２８−２４１、２７−２４９、２７−２４８、２７−２４７、２７−２４６、２７−２４５、２７−２４４、２７−２４３、２７−２４２、２７−２４１、２６−２４９、２６−２４８、２６−２４７、２６−２４６、２６−２４５、２６−２４４、２６−２４３、２６−２４２、２６−２４１、２５−２４９、２５−２４８、２５−２４７、２５−２４６、２５−２４５、２５−２４４、２５−２４３、２５−２４２、２５−２４１、２４−２４９、２４−２４８、２４−２４７、２４−２４６、２４−２４５、２４−２４４、２４−２４３、２４−２４２、２４−２４１、または
配列番号５０もしくは配列番号５３の、３２−２４５、３２−２４４、３２−２４３、３２−２４２、３２−２４１、３２−２４０、３２−２３９、３２−２３８、３２−２３７、３１−２４５、３１−２４４、３１−２４３、３１−２４２、３１−２４１、３１−２４０、３１−２３９、３１−２３８、３１−２３７、３０−２４５、３０−２４４、３０−２４３、３０−２４２、３０−２４１、３０−２４０、３０−２３９、３０−２３８、３０−２３７、２９−２４５、２９−２４４、２９−２４３、２９−２４２、２９−２４１、２９−２４０、２９−２３９、２９−２３８、２９−２３７、２８−２４５、２８−２４４、２８−２４３、２８−２４２、２８−２４１、２８−２４０、２８−２３９、２８−２３８、２８−２３７、２７−２４５、２７−２４４、２７−２４３、２７−２４２、２７−２４１、２７−２４０、２７−２３９、２７−２３８、２７−２３７、２６−２４５、２６−２４４、２６−２４３、２６−２４２、２６−２４１、２６−２４０、２６−２３９、２６−２３８、２６−２３７、２５−２４５、２５−２４４、２５−２４３、２５−２４２、２５−２４１、２５−２４０、２５−２３９、２５−２３８、２５−２３７、２４−２４５、２４−２４４、２４−２４３、２４−２４２、２４−２４１、２４−２４０、２４−２３９、２４−２３８、２４−２３７、または
配列番号５１もしくは配列番号５４の、３２−２５９、３２−２５８、３２−２５７、３２−２５６、３２−２５５、３２−２５４、３２−２５３、３２−２５２、３２−２５１、３１−２５９、３１−２５８、３１−２５７、３１−２５６、３１−２５５、３１−２５４、３１−２５３、３１−２５２、３１−２５１、３０−２５９、３０−２５８、３０−２５７、３０−２５６、３０−２５５、３０−２５４、３０−２５３、３０−２５２、３０−２５１、２９−２５９、２９−２５８、２９−２５７、２９−２５６、２９−２５５、２９−２５４、２９−２５３、２９−２５２、２９−２５１、２８−２５９、２８−２５８、２８−２５７、２８−２５６、２８−２５５、２８−２５４、２８−２５３、２８−２５２、２８−２５１、２７−２５９、２７−２５８、２７−２５７、２７−２５６、２７−２５５、２７−２５４、２７−２５３、２７−２５２、２７−２５１、２６−２５９、２６−２５８、２６−２５７、２６−２５６、２６−２５５、２６−２５４、２６−２５３、２６−２５２、２６−２５１、２５−２５９、２５−２５８、２５−２５７、２５−２５６、２５−２５５、２５−２５４、２５−２５３、２５−２５２、２５−２５１、２４−２５９、２４−２５８、２４−２５７、２４−２５６、２４−２５５、２４−２５４、２４−２５３、２４−２５２、２４−２５１、または
配列番号４３もしくは配列番号４６の、２４−２４１、２４−２４０、２４−２３９、２４−２３８、２４−２３７、２４−２３６、２４−２３５、２４−２３４、２４−２３３、２３−２４１、２３−２４０、２３−２３９、２３−２３８、２３−２３７、２３−２３６、２３−２３５、２３−２３４、２３−２３３、２２−２４１、２２−２４０、２２−２３９、２２−２３８、２２−２３７、２２−２３６、２２−２３５、２２−２３４、２２−２３３、２１−２４１、２１−２４０、２１−２３９、２１−２３８、２１−２３７、２１−２３６、２１−２３５、２１−２３４、２１−２３３、２０−２４１、２０−２４０、２０−２３９、２０−２３８、２０−２３７、２０−２３６、２０−２３５、２０−２３４、２０−２３３、１９−２４１、１９−２４０、１９−２３９、１９−２３８、１９−２３７、１９−２３６、１９−２３５、１９−２３４、１９−２３３、１８−２４１、１８−２４０、１８−２３９、１８−２３８、１８−２３７、１８−２３６、１８−２３５、１８−２３４、１８−２３３、１７−２４１、１７−２４０、１７−２３９、１７−２３８、１７−２３７、１７−２３６、１７−２３５、１７−２３４、１７−２３３、１６−２４１、１６−２４０、１６−２３９、１６−２３８、１６−２３７、１６−２３６、１６−２３５、１６−２３４、１６−２３３、または
配列番号４４もしくは配列番号４７の、２４−２３７、２４−２３６、２４−２３５、２４−２３４、２４−２３３、２４−２３２、２４−２３１、２４−２３０、２４−２２９、２３−２３７、２３−２３６、２３−２３５、２３−２３４、２３−２３３、２３−２３２、２３−２３１、２３−２３０、２３−２２９、２２−２３７、２２−２３６、２２−２３５、２２−２３４、２２−２３３、２２−２３２、２２−２３１、２２−２３０、２２−２２９、２１−２３７、２１−２３６、２１−２３５、２１−２３４、２１−２３３、２１−２３２、２１−２３１、２１−２３０、２１−２２９、２０−２３７、２０−２３６、２０−２３５、２０−２３４、２０−２３３、２０−２３２、２０−２３１、２０−２３０、２０−２２９、１９−２３７、１９−２３６、１９−２３５、１９−２３４、１９−２３３、１９−２３２、１９−２３１、１９−２３０、１９−２２９、１８−２３７、１８−２３６、１８−２３５、１８−２３４、１８−２３３、１８−２３２、１８−２３１、１８−２３０、１８−２２９、１７−２３７、１７−２３６、１７−２３５、１７−２３４、１７−２３３、１７−２３２、１７−２３１、１７−２３０、１７−２２９、１６−２３７、１６−２３６、１６−２３５、１６−２３４、１６−２３３、１６−２３２、１６−２３１、１６−２３０、１６−２２９、または
配列番号４５もしくは配列番号４８の、２４−２５１、２４−２５０、２４−２４９、２４−２４８、２４−２４７、２４−２４６、２４−２４５、２４−２４４、２４−２４３、２３−２５１、２３−２５０、２３−２４９、２３−２４８、２３−２４７、２３−２４６、２３−２４５、２３−２４４、２３−２４３、２２−２５１、２２−２５０、２２−２４９、２２−２４８、２２−２４７、２２−２４６、２２−２４５、２２−２４４、２２−２４３、２１−２５１、２１−２５０、２１−２４９、２１−２４８、２１−２４７、２１−２４６、２１−２４５、２１−２４４、２１−２４３、２０−２５１、２０−２５０、２０−２４９、２０−２４８、２０−２４７、２０−２４６、２０−２４５、２０−２４４、２０−２４３、１９−２５１、１９−２５０、１９−２４９、１９−２４８、１９−２４７、１９−２４６、１９−２４５、１９−２４４、１９−２４３、１８−２５１、１８−２５０、１８−２４９、１８−２４８、１８−２４７、１８−２４６、１８−２４５、１８−２４４、１８−２４３、１７−２５１、１７−２５０、１７−２４９、１７−２４８、１７−２４７、１７−２４６、１７−２４５、１７−２４４、１７−２４３、１６−２５１、１６−２５０、１６−２４９、１６−２４８、１６−２４７、１６−２４６、１６−２４５、１６−２４４、１６−２４３
からなる群から選択される、ヒトＢ７−Ｈ４の細胞外ドメインのうちの少なくとも５０アミノ酸の断片である、項目３に記載の融合タンパク質。
（項目５）
上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドが、配列番号６３、配列番号６４、配列番号８３、配列番号８４、または配列番号８５に示される、ＩｇＶドメインのうちの少なくとも２５アミノ酸を含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目６）
上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドが、
必要に応じて、シグナルペプチドのうちの１〜５アミノ酸をＮ末端に結合させた、
配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、もしくは配列番号４８のうちのいずれかの、１６−１４４、１６−１４５、１６−１４６、１６−１４７、１６−１４８、１６−１４９、１６−１５０、１６−１５１、１６−１５２、１７−１４４、１７−１４５、１７−１４６、１７−１４７、１７−１４８、１７−１４９、１７−１５０、１７−１５１、１７−１５２、１８−１４４、１８−１４５、１８−１４６、１８−１４７、１８−１４８、１８−１４９、１８−１５０、１８−１５１、１８−１５２、１９−１４４、１９−１４５、１９−１４６、１９−１４７、１９−１４８、１９−１４９、１９−１５０、１９−１５１、１９−１５２、２０−１４４、２０−１４５、２０−１４６、２０−１４７、２０−１４８、２０−１４９、２０−１５０、２０−１５１、２０−１５２、２１−１４４、２１−１４５、２１−１４６、２１−１４７、２１−１４８、２１−１４９、２１−１５０、２１−１５１、２１−１５２、２２−１４４、２２−１４５、２２−１４６、２２−１４７、２２−１４８、２２−１４９、２２−１５０、２２−１５１、２２−１５２、２３−１４４、２３−１４５、２３−１４６、２３−１４７、２３−１４８、２３−１４９、２３−１５０、２３−１５１、２３−１５２、２４−１４４、２４−１４５、２４−１４６、２４−１４７、２４−１４８、２４−１４９、２４−１５０、２４−１５１、２４−１５２、または
配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、もしくは配列番号５４のうちのいずれかの、２４−１５２、２４−１５３、２４−１５４、２４−１５５、２４−１５６、２４−１５７、２４−１５８、２４−１５９、２４−１６０、２５−１５２、２５−１５３、２５−１５４、２５−１５５、２５−１５６、２５−１５７、２５−１５８、２５−１５９、２５−１６０、２６−１５２、２６−１５３、２６−１５４、２６−１５５、２６−１５６、２６−１５７、２６−１５８、２６−１５９、２６−１６０、２７−１５２、２７−１５３、２７−１５４、２７−１５５、２７−１５６、２７−１５７、２７−１５８、２７−１５９、２７−１６０、２８−１５２、２８−１５３、２８−１５４、２８−１５５、２８−１５６、２８−１５７、２８−１５８、２８−１５９、２８−１６０、２９−１５２、２９−１５３、２９−１５４、２９−１５５、２９−１５６、２９−１５７、２９−１５８、２９−１５９、２９−１６０、３０−１５２、３０−１５３、３０−１５４、３０−１５５、３０−１５６、３０−１５７、３０−１５８、３０−１５９、３０−１６０、３１−１５２、３１−１５３、３１−１５４、３１−１５５、３１−１５６、３１−１５７、３１−１５８、３１−１５９、３１−１６０、３２−１５２、３２−１５３、３２−１５４、３２−１５５、３２−１５６、３２−１５７、３２−１５８、３２−１５９、３２−１６０、
配列番号６５、配列番号６６、もしくは配列番号６７のうちのいずれかの、２０−１４８、２０−１４９、２０−１５０、２０−１５１、２０−１５２、２０−１５３、２０−１５４、２０−１５５、２０−１５６、２１−１４８、２１−１４９、２１−１５０、２１−１５１、２１−１５２、２１−１５３、２１−１５４、２１−１５５、２１−１５６、２２−１４８、２２−１４９、２２−１５０、２２−１５１、２２−１５２、２２−１５３、２２−１５４、２２−１５５、２２−１５６、２３−１４８、２３−１４９、２３−１５０、２３−１５１、２３−１５２、２３−１５３、２３−１５４、２３−１５５、２３−１５６、２４−１４８、２４−１４９、２４−１５０、２４−１５１、２４−１５２、２４−１５３、２４−１５４、２４−１５５、２０−１５６、２５−１４８、２５−１４９、２５−１５０、２５−１５１、２５−１５２、２５−１５３、２５−１５４、２５−１５５、２５−１５６、２６−１４８、２６−１４９、２６−１５０、２６−１５１、２６−１５２、２６−１５３、２６−１５４、２６−１５５、２６−１５６、２７−１４８、２７−１４９、２７−１５０、２７−１５１、２７−１５２、２７−１５３、２７−１５４、２７−１５５、２７−１５６、２８−１４８、２８−１４９、２８−１５０、２８−１５１、２８−１５２、２８−１５３、２８−１５４、２８−１５５、２８−１５６、または
配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７７、配列番号７８、もしくは配列番号７９のうちのいずれかの、２４−１５２、２４−１５３、２４−１５４、２４−１５５、２４−１５６、２４−１５７、２４−１５８、２４−１５９、２４−１６０、２５−１５２、２５−１５３、２５−１５４、２５−１５５、２５−１５６、２５−１５７、２５−１５８、２５−１５９、２５−１６０、２６−１５２、２６−１５３、２６−１５４、２６−１５５、２６−１５６、２６−１５７、２６−１５８、２６−１５９、２６−１６０、２７−１５２、２７−１５３、２７−１５４、２７−１５５、２７−１５６、２７−１５７、２７−１５８、２７−１５９、２７−１６０、２８−１５２、２８−１５３、２８−１５４、２８−１５５、２８−１５６、２８−１５７、２８−１５８、２８−１５９、２８−１６０、２９−１５２、２９−１５３、２９−１５４、２９−１５５、２９−１５６、２９−１５７、２９−１５８、２９−１５９、２９−１６０、３０−１５２、３０−１５３、３０−１５４、３０−１５５、３０−１５６、３０−１５７、３０−１５８、３０−１５９、３０−１６０、３１−１５２、３１−１５３、３１−１５４、３１−１５５、３１−１５６、３１−１５７、３１−１５８、３１−１５９、３１−１６０、３２−１５２、３２−１５３、３２−１５４、３２−１５５、３２−１５６、３２−１５７、３２−１５８、３２−１５９、３２−１６０
からなる群から選択される、ヒトＢ７−Ｈ４のＩｇＶドメインのうちの少なくとも５０アミノ酸の断片である、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目７）
上記第２のポリペプチドが、免疫グロブリン定常ドメインを含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目８）
上記免疫グロブリン定常ドメインが、マウス免疫グロブリンＣγ２ａ鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含む、項目７に記載の融合タンパク質。
（項目９）
上記免疫グロブリン定常ドメインが、配列番号８６、配列番号８７、または配列番号９０に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされる、項目８に記載の融合タンパク質。
（項目１０）
上記免疫グロブリン定常ドメインが、ヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目１１）
上記融合タンパク質の二量体化または多量体化を媒介してホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体、またはヘテロ多量体を形成するドメインをさらに含む、項目１から１０のいずれかに記載の融合タンパク質。
（項目１２）
二量体化または多量体化を媒介する上記ドメインが、上記パートナーの融合タンパク質上のシステインと分子間ジスルフィド結合を形成することが可能な１つ以上のシステイン、コイルドコイルドメイン、酸性残基のパッチ、亜鉛フィンガードメイン、カルシウムハンドドメイン、ＣＨ１領域、ＣＬ領域、ロイシンジッパードメイン、ＳＨ２（ｓｒｃ相同性２）ドメイン、ＳＨ３（ｓｒｃ相同性３）ドメイン、ＰＴＢ（ホスホチロシン結合）ドメイン、ＷＷドメイン、ＰＤＺドメイン、１４−３−３ドメイン、ＷＤ４０ドメイン、ＥＨドメイン、Ｌｉｍドメイン、イソロイシンジッパードメイン、ならびに受容体二量体対の二量体化ドメインからなる群から選択される、項目１１に記載の融合タンパク質。
（項目１３）
配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、または配列番号１３３のポリペプチドを含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目１４）
配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、または配列番号１３７のポリペプチドを含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目１５）
第１および第２の融合タンパク質を含む二量体タンパク質であって、該第１の融合タンパク質および該第２の融合タンパク質が、項目１から１４のいずれかに記載の融合タンパク質を含み、該第１の融合タンパク質および該第２の融合タンパク質が、共有結合または非共有結合により互いと結合して二量体を形成する二量体タンパク質。
（項目１６）
上記融合タンパク質が、ジスルフィド結合によって結合している、項目１から１５のいずれかに記載の二量体タンパク質または多量体タンパク質。
（項目１７）
項目１から１６のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む単離核酸分子。
（項目１８）
項目１７に記載の核酸を含むベクター。
（項目１９）
項目１８に記載のベクターを含む宿主細胞。
（項目２０）
炎症反応の１つ以上の症状の処置または阻害を必要とする個体における炎症反応の１つ以上の症状を処置または阻害する方法であって、
該個体における該炎症反応の該１つ以上の症状を軽減または阻害するのに有効な量で、項目１から１６のいずれかに記載のＢ７−Ｈ４融合タンパク質を該個体に投与する工程を含む方法。
（項目２１）
上記炎症反応が、自己免疫疾患または自己免疫障害と関連する、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
上記個体が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円形脱毛症、強直性脊椎炎（ａｎｋｌｏｓｉｎｇ  ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖性症候群（ａｌｐｓ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック病−皮膚炎、慢性疲労性症候群免疫不全症候群（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｆａｔｉｇｕｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、瘢痕性類天疱瘡、寒冷血球凝集素病、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、ドゴー病（Ｄｅｇｏ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症−線維筋炎、グレーブス病（ｇｒａｖｅ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ギラン−バレー症候群（ｇｕｉｌｌａｉｎ−ｂａｒｒｅ）、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、インスリン依存性糖尿病（Ｉ型）、若年性関節炎、メニエール病（Ｍｅｎｉｅｒｅ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、混合結合組織病、多発性硬化症、再発寛解型多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、ならびにウェゲナー肉芽腫症からなる群から選択される自己免疫疾患を有する、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
被験体における炎症を処置する方法であって、有効な量の、項目１から１６のいずれかに記載のＢ７−Ｈ４融合タンパク質を該被験体に投与して、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、炎症性分子を分泌する他の細胞、または他の細胞に炎症性分子を分泌させるようにする細胞からなる群から選択される免疫細胞の分化、増殖、活性、ならびに／または該免疫細胞によるサイトカインの生成および／または分泌を阻害するかまたは低減する工程を含む方法。
（項目２４）
有効な量の、項目１から１８のいずれかに記載のＢ７−Ｈ４融合タンパク質を投与して、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、またはＴｈ２２細胞の分化、増殖、活性、ならびに／または該Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、またはＴｈ２２細胞によるサイトカインの生成および／または分泌を阻害するかまたは低減する、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
被験体における炎症を処置するための方法であって、有効な量の、項目１から１６のいずれかに記載のＢ７−Ｈ４融合タンパク質を該被験体に投与して、Ｔｈ１細胞またはＴｈ１７細胞に対するそれらの抑制効果を増強する工程を含む方法。
（項目２６）
被験体における炎症を処置するための方法であって、有効な量の、項目１から１６のいずれかに記載のＢ７−Ｈ４融合タンパク質を該被験体に投与して、ＴｒｅｇによるＩＬ−１０の生成を促進または増強する工程を含む方法。
（項目２７）
被験体における炎症を処置するための方法であって、有効な量の、項目１から１６のいずれかに記載のＢ７−Ｈ４融合タンパク質を該被験体に投与して、Ｔｒｅｇの細胞数を増加させるか、またはＴｒｅｇの集団を増大させる工程を含む方法。
（項目２８）
被験体における炎症を処置するための方法であって、有効な量の、項目１から１６のいずれかに記載のＢ７−Ｈ４融合タンパク質を該被験体に投与して、Ｔｈ１経路およびＴｈ１７経路を阻害し、かつ、Ｔｈ１７経路に対するＴｒｅｇの抑制活性を増強するか、またはＴｒｅｇによるＩＬ−１０の分泌を促進もしくは増強する工程を含む方法。
（項目２９）
被験体における炎症促進性分子の生成を低減するための方法であって、有効な量の、項目１から１８のいずれかに記載のＢ７−Ｈ４融合タンパク質、またはその断片を投与して、該被験体における１つ以上のサイトカインの生成を阻害する工程を含む方法。
（項目３０）
第２の治療剤を投与する工程をさらに含む、項目２０から２９に記載の方法のうちのいずれか１つの方法。
（項目３１）
Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質により処置される被験体を選択するための方法であって、
ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、およびＩＬ−２１からなる群から選択される１つ以上のサイトカインまたはＭＭＰのレベルについて被験体をスクリーニングする工程と、
該サイトカインのレベルを、炎症性障害を有さないコントロール被験体におけるサイトカインまたはＭＭＰのレベルと比較する工程と、
該被験体における該１つ以上のサイトカインのレベルが、炎症性障害を有さない該コントロール被験体におけるレベルと比較して高い場合は、有効な量の、項目１から１６のいずれかに記載のＢ７−Ｈ４融合タンパク質を該被験体に投与して、炎症性障害の１つ以上の症状を阻害するかまたは軽減する工程と
を含む方法。
（項目３２）
Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質により処置される被験体を選択するための方法であって、
ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、およびＩＬ−２１からなる群から選択される１つ以上のサイトカインまたはＭＭＰをコードするｍＲＮＡのレベルについて被験体をスクリーニングする工程と、
該サイトカインまたはＭＭＰをコードするｍＲＮＡのレベルを、炎症性障害を有さないコントロール被験体における、該サイトカインまたはＭＭＰをコードするｍＲＮＡのレベルと比較する工程と、
該被験体における該サイトカインをコードする１つ以上のｍＲＮＡのレベルが、炎症性障害を有さない該コントロール被験体におけるレベルと比較して高い場合は、有効な量の、項目１から１６のいずれかに記載のＢ７−Ｈ４融合タンパク質を該被験体に投与して、炎症性障害の１つ以上の症状を阻害するかまたは軽減する工程と
を含む方法。
（項目３３）
Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質により処置される被験体を選択するための方法であって、
ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、およびＩＬ−２１からなる群から選択される１つ以上のサイトカインまたはＭＭＰをコードする遺伝子における多型について被験体をスクリーニングする工程と、
該サイトカインまたはＭＭＰをコードする遺伝子のうちの１つ以上が、多型を有する場合は、有効な量の、項目１から１６のいずれかに記載のＢ７−Ｈ４融合タンパク質を該被験体に投与して、炎症性障害の１つ以上の症状を阻害するかまたは軽減する工程と
を含む方法。
（項目３４）
上記被験体が、以前に、ＴＮＦ遮断剤による処置に不応であった、項目２０から３１のいずれかに記載の方法。
（項目３５）
上記被験体が、慢性かつ遷延性の炎症を有する、項目２０から３４のいずれかに記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
【図１Ａ】図１Ａは、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇを用いて炎症を阻害するための作用モードを例示する図である。図１Ａでは、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇが、Ｔ細胞を標的とする。図１Ｂでは、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇが、樹状細胞（ＤＣ）の成熟を遮断する。
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇを用いて炎症を阻害するための作用モードを例示する図である。図１Ａでは、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇが、Ｔ細胞を標的とする。図１Ｂでは、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇが、樹状細胞（ＤＣ）の成熟を遮断する。
【図２】図２は、コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）予防モデルのための、関節炎の誘発および処置を例示する図である。
【図３】図３は、ＣＩＡ予防モデルにおいて、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処置したマウス（黒丸）、ならびにビヒクルで処置したマウス（白丸）における、コラーゲンＩＩ（ＣＩＩ）による誘発後の時間に対する関節炎スコアに関する折れ線グラフである。
【図４】図４は、ＣＩＡ治療モデルについての、関節炎の誘発および処置を例示する図である。
【図５】図５は、ＣＩＡ治療モデルにおいて、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処置したマウス（黒丸）、ならびにビヒクルで処置したマウス（白丸）における、コラーゲンＩＩ（ＣＩＩ）による誘発後の時間に対する関節炎スコアに関する折れ線グラフである。
【図６】図６は、ＣＩＡ治療モデルについての、代表的な疾患の誘発ならびに投与レジメンを例示する図である。
【図７】図７は、雌マウス（ＡＡ＃７９）における関節炎スコアを、ＣＩＩによる免疫後の時間（日数）の関数として示す折れ線グラフである。ビヒクル、マウスＩｇＧ、マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇ、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ、およびＲＰＡ１１００１０による処置を示す。
【図８】図８は、雄マウス（ＡＡ＃８０）における関節炎スコアを、ＣＩＩによる免疫後の時間（日数）の関数として示す折れ線グラフである。ビヒクル、マウスＩｇＧ、マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇ、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ、およびＲＲＰＡ１１００１０による処置を示す。
【図９】図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃ、および図９Ｄは、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処置したマウス、またはＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）で処置したマウスに由来する血清試料についての定量イムノアッセイによる多検体プロファイリング（ｍｕｌｔｉ−ａｎａｌｙｔｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）解析に従い、疾患の増悪ならびにＢ７−Ｈ４−Ｉｇによる処置の奏効をモニタリングするのに用いうるバイオマーカーを同定するための、完全なデータセットのうちの前半部分を示すチャートである。
【図１０】図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、および図１０Ｄは、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処置したマウス、またはＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）で処置したマウスに由来する血清試料についての定量イムノアッセイによる多検体プロファイリング解析に従い、疾患の増悪ならびにＢ７−Ｈ４−Ｉｇによる処置の奏効をモニタリングするのに用いうるバイオマーカーを同定するための、完全なデータセットのうちの後半部分を示すチャートである。
【図１１】図１１Ａ、および図１１Ｂは、図７および８の完全なデータセットについての、定量イムノアッセイによる多検体プロファイリングデータ解析の概要を示すチャートである。２７日目、３４日目、４１日目、または全体で、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）処置群と、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ処置群との間に有意差（０．０５未満のｐ値）が存在する場合は、分析物に影を付す。また、分析物と臨床スコアとの間の相関係数が０．３未満の場合にも、分析物にアステリスク（＊）で印をつける。
【図１２】図１２は、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の血清レベル（μｇ／ｍｌ）を、臨床スコアと対比して示す折れ線グラフである。
【図１３】図１３は、ＣＩＩによる免疫後２７日目、３４日目、および４１日目の、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処置したマウス（−■−）またはＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）で処置したマウス（−●−）におけるエンドセリン１（ＥＴ−１）の血清レベル（ｐｇ／ｍｌ）を示すプロットである。
【図１４】図１４は、ＩＬ−６の血清レベル（ｐｇ／ｍｌ）を、臨床スコアと対比して示す折れ線グラフである。
【図１５】図１５は、ＣＩＩによる免疫後２７日目、３４日目、および４１日目の、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処置したマウス（−■−）またはＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）で処置したマウス（−●−）における単球走化性タンパク質１（ＭＰＣ−１）の血清レベル（ｐｇ／ｍｌ）を示すプロットである。
【図１６】図１６は、単球走化性タンパク質３（ＭＰＣ−３）の血清レベル（ｐｇ／ｍｌ）を、臨床スコアと対比して示す折れ線グラフである。
【図１７】図１７は、ＣＩＩによる免疫後２７日目、３４日目、および４１日目の、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処置したマウス（−■−）またはＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）で処置したマウス（−●−）における単球走化性タンパク質３（ＭＰＣ−３）の血清レベル（ｐｇ／ｍｌ）を示すプロットである。
【図１８】図１８は、ＣＩＩによる免疫後２７日目、３４日目、および４１日目の、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処置したマウス（−■−）またはＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）で処置したマウス（−●−）におけるマクロファージ炎症性タンパク質２（ＭＩＰ−２）の血清レベル（ｐｇ／ｍｌ）を示すプロットである。
【図１９】図１９は、ＣＩＩによる免疫後２７日目、３４日目、および４１日目の、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処置したマウス（−■−）またはＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）で処置したマウス（−●−）におけるＴＮＦαの血清レベル（ｎｇ／ｍｌ）を示すプロットである。
【図２０】図２０Ａ、２０Ｂ、および２０Ｃは、表示される炎症促進性サイトカイン／ケモカインについての、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処置したマウス（黒色バー）またはビヒクルコントロールで処置したマウス（白色バー）の血漿炎症促進性サイトカインおよび炎症促進性ケモカインのレベルを示す棒グラフである。ＴＮＦα（Ａ）、ＩＬ−６（Ｂ）、およびＭＣＰ−１（Ｃ）。
【図２１】図２１は、ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞促進条件下で、培養プレートに結合させたかまたは溶液中のコントロールＩｇＧ（白色バー）またはＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（斜線が入ったバー）と共に培養し、かつ、ビーズに結合させた抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体により、またはオボアルブミンペプチドでパルスした抗原提示細胞により活性化させたナイーブＴ細胞についての、マウスＴ細胞増殖（［３Ｈ］チミジンの取込み）を示す棒グラフである。
【図２２】図２２は、Ｔｈ１細胞促進条件下で、培養プレートに結合させたかまたは溶液中のコントロールＩｇＧ（白色バー）またはＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（斜線が入ったバー）と共に培養し、かつ、ビーズに結合させた抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体により、またはオボアルブミンペプチドでパルスした抗原提示細胞により活性化させたマウスＣＤ４＋ナイーブＴ細胞により生成されるＩＦＮ−γ（ｎｇ／ｍｌ）を示す棒グラフである。
【図２３】図２３は、Ｔｈ１７細胞促進条件下で、培養プレートに結合させたかまたは溶液中のコントロールＩｇＧ（白色バー）またはＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（斜線が入ったバー）と共に培養し、かつ、ビーズに結合させた抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体により、またはオボアルブミンペプチドでパルスした抗原提示細胞により活性化させたＣＤ４＋ナイーブＴ細胞についての、マウスＴ細胞増殖（［３Ｈ］チミジンの取込み）を示す棒グラフである。
【図２４】図２４は、Ｔｈ１７細胞促進条件下で、培養プレートに結合させたかまたは溶液中のコントロールＩｇＧ（白色バー）またはＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（斜線が入ったバー）と共に培養し、かつ、ビーズに結合させた抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体により、またはオボアルブミンペプチドでパルスした抗原提示細胞により活性化させたマウスナイーブＴ細胞により生成されるＩＬ−１７（ｎｇ／ｍｌ）を示す棒グラフである。
【図２５】図２５は、Ｔｈ１７細胞促進条件下で、培養プレートに結合させたかまたは溶液中のコントロールＩｇＧ（白色バー）またはＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（斜線が入ったバー）と共に培養し、かつ、ビーズに結合させた抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体により、またはオボアルブミンペプチドでパルスした抗原提示細胞により活性化させたマウスナイーブＴ細胞により生成されるＴＮＦ−α（ｎｇ／ｍｌ）を示す棒グラフである。
【図２６】図２６は、Ｔｈ２細胞促進条件下で、培養プレートに結合させたかまたは溶液中のコントロールＩｇＧ（白色バー）またはＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（斜線が入ったバー）と共に培養し、かつ、ビーズに結合させた抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体により、またはオボアルブミンペプチドでパルスした抗原提示細胞により活性化させたＣＤ４＋ナイーブＴ細胞についての、マウスＴ細胞増殖（［３Ｈ］チミジンの取込み）を示す棒グラフである。
【図２７】図２７は、Ｔｈ１細胞促進条件下で培養し、オボアルブミンペプチドで刺激したマウスナイーブＴ細胞により生成されるＩＮＦ−γ（ｎｇ／ｍｌ）を、コントロールＩｇＧ（−○−）またはロット番号２２のＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（−●−）もしくはロット番号２３のＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（−▲−）の濃度（μｇ／ｍｌ）の関数として示す折れ線グラフである。
【図２８】図２８は、Ｔｈ１７細胞促進条件下で培養し、オボアルブミンペプチドで刺激したマウスナイーブＴ細胞により生成されるＩＬ−１７（ｎｇ／ｍｌ）を、コントロールＩｇＧ（−○−）またはロット番号２２のＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（−●−）もしくはロット番号２３のＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（−▲−）の濃度（μｇ／ｍｌ）の関数として示す折れ線グラフである。
【図２９】図２９は、Ｔｈ１細胞促進条件（−●−）下またはＴｈ１７細胞促進条件（−▲−）下で培養し、ビーズに結合させた抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で刺激し、かつ、その培養物（溶液）に漸増濃度のヒトＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（μｇ／ｍｌ）を直接添加することによって処理したＣＤ４＋ナイーブＴ細胞についての、マウスＴ細胞増殖（［３Ｈ］チミジンの取込み）を示す折れ線グラフである。
【図３０】図３０は、Ｔｈ１細胞促進条件（−●−）下またはＴｈ１７細胞促進条件（−▲−）下で培養し、ビーズに結合させた抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で刺激し、かつ、その培養物（溶液）に漸増濃度のヒトＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（μｇ／ｍｌ）を直接添加することによって処理したマウスＣＤ４＋ナイーブＴ細胞により生成されるＩＮＦ−γ（ｎｇ／ｍｌ）を示す折れ線グラフである。
【図３１】図３１は、Ｔｈ１細胞促進条件（−●−）下またはＴｈ１７細胞促進条件（−▲−）下で培養し、ビーズに結合させた抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で刺激し、かつ、その培養物（溶液）に漸増濃度のヒトＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（μｇ／ｍｌ）を直接添加することによって処理したマウスＣＤ４＋ナイーブＴ細胞により生成されるＩＬ１７（ｎｇ／ｍｌ）を示す折れ線グラフである。
【図３２】図３２Ａおよび３２Ｂは、Ｔｈ１細胞促進条件下で培養し、オボアルブミンペプチドでパルスした抗原提示細胞により刺激し、かつ、種々の濃度（μｇ／ｍｌ）のコントロールＩｇＧまたはＢ７−Ｈ４−Ｉｇで処理した、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の存在下または非存在下におけるマウスＣＤ４＋ＣＤ６２＋ナイーブＴ細胞により生成される、（Ａ）ではＩＮＦ−γ（ｎｇ／ｍｌ）ならびに（Ｂ）ではＩＬ−１０（ｎｇ／ｍｌ）を示す折れ線グラフである。コントロールＩｇＧで処理したＣＤ２５＋Ｔ細胞を含有するＴ細胞を●として示し、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処理したＣＤ２５＋Ｔ細胞を含有するＴ細胞を▲として示す。ＣＤ２５＋Ｔ細胞を枯渇させ、コントロールＩｇＧで処理したＴ細胞を○として示し、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処理したＴ細胞を△として示す。
【図３３】図３３Ａおよび３３Ｂは、Ｔｈ１７細胞促進条件下で培養し、オボアルブミンペプチドでパルスした抗原提示細胞により刺激し、かつ、種々の濃度（μｇ／ｍｌ）の異なるコントロールＩｇＧまたはＢ７−Ｈ４−Ｉｇで処理した、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の存在下または非存在下におけるマウスＣＤ４＋ＣＤ６２＋ナイーブＴ細胞により生成される、（Ａ）ではＩＬ−１７Ａ（ｎｇ／ｍｌ）ならびに（Ｂ）ではＩＬ−１０（ｎｇ／ｍｌ）を示す折れ線グラフである。コントロールＩｇＧで処理したＣＤ２５＋Ｔ細胞を含有するＴ細胞を●として示し、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処理したＣＤ２５＋Ｔ細胞を含有するＴ細胞を▲として示す。ＣＤ２５＋Ｔ細胞を枯渇させ、コントロールＩｇＧで処理したＴ細胞を○として示し、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処理したＴ細胞を△として示す。
【図３４】図３４は、ｎＴｒｅｇによる抑制アッセイを例示するフローチャートである。
【図３５】図３５は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）としての放射線照射した非精製脾細胞、抗ＣＤ３抗体、ならびに様々な量のマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（０（−●−）、１（−■−）、５（−▲−）、または１０（−▼−）μｇ／ｍＬ）を加えた、比１：０、１：０．１２、１：０．２５、１：０．５、１：１、および１：２のＣＤ４＋／ＧＦＰ−レスポンダーナイーブＴ細胞およびＣＤ４＋／ＧＦＰ＋ｎＴｒｅｇ細胞についての、Ｔ細胞増殖（［３Ｈ］チミジンの取込み）を示す折れ線グラフである。
【図３６】図３６は、多発性硬化症（ＭＳ）についてのマウス自己免疫性Ｒ−ＥＡＥモデルを使用するｉｎ  ｖｉｖｏ研究における、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の誘発および処置レジメンを概略的に例示する図である。
【図３７】図３７は、０日目に６０μｇ（３ｍｇ／ｋｇ）のコントロールＩｇＧ（○）、または６０μｇ（３ｍｇ／ｋｇ）のＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（●）で治療したＥＡＥ誘発ＳＪＬマウスにおける平均臨床スコアを、疾患誘発後の日数と対比させる折れ線グラフである。
【図３８】図３８は、２１日目に６０μｇ（３ｍｇ／ｋｇ）のコントロールＩｇＧ（○）、または６０μｇ（３ｍｇ／ｋｇ）のＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（●）で処置したＥＡＥ誘発ＳＪＬマウスにおける平均臨床スコアを、疾患誘発後の日数と対比させる折れ線グラフである。
【図３９】図３９は、０日目または２１日目にコントロールＩｇＧまたはマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇで処置したＥＡＥマウスにおいて、５０日目にＰＬＰ１３９〜１５１またはＰＬＰ１７８〜１９１で耳感作した後、５５日目に平均耳腫脹（×１０−４インチ）により測定したときの遅延型過敏（ＤＴＨ）反応を示す棒グラフである。白四角は、ｔ＝０において投与されたコントロールＩｇＧであり、水平に線の入った四角は、ｔ＝０において投与されたＢ７−Ｈ４−Ｉｇであり、右上がりの斜線を付した四角は、ｔ＝２１において投与したコントロールＩｇＧであり、左上がりの斜線を付した四角は、ｔ＝２１において投与したＢ７−Ｈ４−Ｉｇである。＊コントロールＩｇＧ注射マウスを有意に下回るＤＴＨ反応（ｐ＜０．０１）。
【図４０】図４０は、０日目または２１日目にＢ７−Ｈ４−ＩｇおよびコントロールＩｇＧで処置したＥＡＥマウスのリンパ節から単離したＴ細胞についての、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、疾患誘発性の優性エピトープであるＰＬＰ１３９〜１５１、ならびに拡大エピトープに特異的なペプチドであるＰＬＰ１７８〜１９１で処理した後のＴ細胞増殖（ΔＣＰＵ（１分間当たりのカウント））を示す棒グラフである。白四角は、ｔ＝０において投与されたコントロールＩｇＧであり、水平に線の入った四角は、ｔ＝０において投与されたＢ７−Ｈ４−Ｉｇであり、右上がりの斜線を付した四角は、ｔ＝２１において投与したコントロールＩｇＧであり、左上がりの斜線を付した四角は、ｔ＝２１において投与したＢ７−Ｈ４−Ｉｇである。＊コントロールＩｇＧ注射マウスを有意に下回る［３Ｈ］−チミジンの取込み（ｐ＜０．０１）。
【図４１】図４１は、０日目または２１日目にＢ７−Ｈ４−ＩｇおよびコントロールＩｇＧで処置したＥＡＥマウスのリンパ節から単離し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、疾患誘発性の優性エピトープであるＰＬＰ１３９〜１５１、ならびに拡大エピトープに特異的なペプチドであるＰＬＰ１７８〜１９１で処理した後のＴ細胞により生成されるＩＦＮ−γ（ｐｇ／ｍｌ）を示す棒グラフである。白四角は、ｔ＝０において投与されたコントロールＩｇＧであり、水平に線の入った四角は、ｔ＝０において投与されたＢ７−Ｈ４−Ｉｇであり、右上がりの斜線を付した四角は、ｔ＝２１において投与したコントロールＩｇＧであり、左上がりの斜線を付した四角は、ｔ＝２１において投与したＢ７−Ｈ４−Ｉｇである。＊コントロールＩｇＧ注射マウスを有意に下回るＩＦＮ−γの生成（ｐ＜０．０１）。
【図４２】図４２は、疾患誘発後の０日目〜１０日目の間に、５回にわたり、６０μｇのＢ７−Ｈ４−Ｉｇ、３００μｇのＢ７−Ｈ４−Ｉｇ、またはコントロールＩｇＧを注射して処置したＥＡＥマウスにおいて、１０日目にＰＬＰ１３９〜１５１ペプチドまたはＯＶＡ３２３〜３３９ペプチドで耳感作した後の、ＯＶＡ反応を差し引いたΔ平均耳腫脹（×１０−４インチ）を示す棒グラフである。＊コントロールＩｇＧ注射マウスを有意に下回るＤＴＨ反。
【図４３】図４３は、図４２で説明したＥＡＥマウスのリンパ節から単離し、抗ＣＤ３抗体（０．１〜１０μｇ／ｍＬ）、ＰＬＰ１３９〜１５１（１〜２０μｇ／ｍＬ）、またはＯＶＡ３２３〜３３９（１〜２０μｇ／ｍＬ）の存在下で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて再活性化させたＴ細胞増殖（ΔＣＰＵ（１分間当たりのカウント））を示す折れ線グラフである。
【図４４】図４４は、多発性硬化症（ＭＳ）についてのマウス自己免疫性Ｒ−ＥＡＥモデルを使用するｉｎ  ｖｉｖｏ研究における、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の誘発および処置レジメンを概略的に例示する図である。
【図４５】図４５Ａ、４５Ｂ、および４５Ｃは、ＣＦＡ中で乳化させた５０μｇのＰＬＰペプチドにより免疫したＳＪＬマウスから５０日目に単離した、脾臓（Ａ）、排出リンパ節（Ｂ）、およびＣＮＳ（Ｃ）における全リンパ球数（×１０６個）を示す棒グラフである。寛解期において、コントロールＩｇＧまたはＢ７−Ｈ４−Ｉｇでマウスを処置した：投与１回当たり６０または３００μｇ、１週間当たり３回投与で２週間にわたり（６回の投与により）処置した。
【図４６】図４６Ａ、４６Ｂ、および４６Ｃは、図４５で説明した脾臓（Ａ）、排出リンパ節（Ｂ）、またはＣＮＳ（Ｃ）から単離したＴ細胞サブセットの数（×１０６個）を示す棒グラフであり、Ｔ細胞サブセットとは、ＣＤ４＋細胞（Ｔ細胞）、ＣＤ４＋／ＦｏｘＰ３＋（Ｔｒｅｇ）、およびＣＤ４＋／ＣＤ４４＋細胞（エフェクター／メモリーＴ細胞）であった。個々のマウスに由来する各表現型についての平均細胞数として、データを示す。
【図４７】図４７は、コントロールＩｇＧ、６０μｇのＢ７−Ｈ４−Ｉｇ、または３００μｇのＢ７−Ｈ４−Ｉｇによる処置についての、図４６からのＣＤ４＋Ｔ細胞中のＴｒｅｇの百分率を示す棒グラフである。
【図４８】図４８Ａおよび４８Ｂは、ＣＦＡ中で乳化させた５０μｇのＰＬＰペプチドにより免疫したＳＪＬマウスから３５日目に単離し、抗ＣＤ３抗体（１ｕｇ／ｍＬ）、ＰＬＰ１３９〜１５１（２０μｇ／ｍＬ）、またはＰＬＰ１７８〜１９１（２０μｇ／ｍＬ）の存在下で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて活性化させた総脾細胞（Ａ）およびリンパ節細胞（Ｂ）の増殖（ＣＰＵ（１分間当たりのカウント））を示す棒グラフである。寛解期において、コントロールＩｇＧまたはＢ７−Ｈ４−Ｉｇでマウスを処置した：投与１回当たり６０または３００μｇ、１週間当たり３回投与で２週間にわたり（６回の投与により）処置した。
【図４９】図４９は、疾患の誘発後５０日の期間（日数）にわたる、ＳＪＬマウスの平均臨床スコアを示す折れ線グラフである。疾患誘発後の２３日目から、１週間当たり３回、６０μｇのＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（−●−）、３００μｇのＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（−▲−）、またはコントロールＩｇＧ（−△−）でマウスを処置した。
【図５０】図５０は、多発性硬化症（ＭＳ）についてのマウス自己免疫性Ｒ−ＥＡＥモデルを使用するｉｎ  ｖｉｖｏ研究における、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の誘発およびヒトＢ７−Ｈ４−Ｉｇの処置レジメンを概略的に例示する図である。
【図５１】図５１Ａおよび５１Ｂは、疾患の誘発後５５日の期間（日数）にわたる、ＳＪＬマウスの平均臨床スコア（Ａ）および長期再発率（Ｂ）を示す折れ線グラフである。疾患誘発後の２３日目から、１週間当たり３回で４週間にわたり、１００μｇのヒトＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（５ｍｇ／ｋｇ）、５００μｇのヒトＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（２５ｍｇ／ｋｇ）、または１００μｇのコントロールＩｇＧ、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）（５ｍｇ／ｋｇ）でマウスを処置した。
【図５２】図５２は、糖尿病を有するＣＴＬＡ４ＫＤ／ＮＯＤマウスの百分率を、１週間当たり３回で４週間にわたる（１５ｍｇ／ｋｇ；腹腔内（ｉ．ｐ．）注射による）Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ処置後の週数と対比して示す折れ線グラフである。マウスは、２週齢とした。
【図５３】図５３は、糖尿病を有するＣＴＬＡ４ＫＤ／ＢＤＣ２．５／ＮＯＤマウスの百分率を、１週間当たり３回で４週間にわたる（１５ｍｇ／ｋｇ；腹腔内（ｉ．ｐ．）注射による）Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ処置後の週数と対比して示す折れ線グラフである。マウスは、１１週齢とした。
【図５４】図５４は、コントロールマウスならびに種々の用量のＢ７−Ｈ４−Ｉｇで処置したマウスに由来するＴｒｅｇ細胞の増殖百分率を示す棒グラフである。５日間にわたる腸内抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞増殖アッセイにおいて、Ｔｒｅｇ細胞を滴定した。各カラムは、Ｔｒｅｇに曝露しなかった培養物に対する百分率で表わされる、４連の培養物の平均ｃｐｍ値を表わし、バーは、ＳＤを表わす。グラフ内の左から右への３つのカラムの各群は、コントロール、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ（６０μｇ）、またはＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（３００μｇ）で処置したマウスに由来するＴｒｅｇを表わす。
【図５５】図５５は、コントロールマウスまたはＢ７−Ｈ４−Ｉｇで処置したマウスから回収され、かつ、５日間にわたり、腸内抗原でパルスした脾細胞であるＡＰＣへと曝露されたＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞の増殖（ｃｐｍ）を示す棒グラフである。各カラムは、４連の培養物の平均ｃｐｍ値を表わし、バーは、ＳＤを表わす。グラフ内の左から右への３つのカラムの各群は、コントロール、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ（６０μｇ）、またはＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（３００μｇ）で処置したマウスに由来するＴｒｅｇを表わす。
【図５６】図５６は、Ｔｈ１７分化カクテルの存在下で抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体により活性化し、かつ、４日間にわたる培養の９日目、１日目、または２日目にマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇ、マウスアイソタイプＩｇＧ２ａコントロール、またはレチノイン酸（ＲＡ）をその培養物に添加した、Ｂａｌｂ／ＣマウスのナイーブＴ細胞により分泌されたＩＬ−１７Ａの量（ｎｇ／ｍｌ）を示す棒グラフである。
【図５７】図５７は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体およびマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇにより活性化させたマウスナイーブＴ細胞におけるｍＲＮＡの上方制御または下方制御の倍数を、マウスアイソタイプコントロールと対比して示す棒グラフである。すべての細胞を、Ｔｈ１７分化カクテルの存在下で培養した。定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、Ｔｈ１７細胞、Ｔｒｅｇ細胞、自己免疫性障害、および／または炎症に関与するｍＲＮＡの発現について調べた。
【図５８】図５８は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体、ならびに融合タンパク質の４６位においてＱまたはＬを伴うヒトＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（１μｇ／ｍＬ）により活性化するか、またはアイソタイプコントロールとしての、呼吸器系合胞体ウイルスのＦタンパク質のＡ抗原部位におけるエピトープに対して得られたヒト化モノクローナルＩｇＧ抗体（Ｓｙｎａｇｉｓ）により活性化させたヒトＴ細胞におけるｍＲＮＡの上方制御または下方制御の倍数を示す棒グラフである。すべての細胞を、Ｔｈ１７分化カクテルの存在下で培養した。定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、Ｔｈ１７細胞、Ｔｒｅｇ細胞、自己免疫性障害、および／または炎症に関与するｍＲＮＡの発現について調べた。
【図５９】図５９は、表示される濃度のマウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇ、マウスＩｇＧコントロール、またはレチノイン酸で処理したＴＨ１７細胞により生成されるＩＬ−１７Ａの濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す棒グラフである。
【図６０】図６０は、マウスＴｈ１７細胞における、Ｂ７−Ｈ４−ＩｇＱの活性（■）、Ｂ７−Ｈ４−ＩｇＬの活性（▲）をＳｙｎａｇｉｓの活性（◆）（無関係のヒトＩｇＧ１抗体）と対比して示す、ＩＬ−１７Ａ濃度（ｎｇ／ｍｌ）対タンパク質濃度（μｇ／ｍｌ）の折れ線グラフである。
【図６１】図６１は、マウスＴｈ１７細胞における、マウスＢ７−Ｈ４−Ｉｇの活性（ロット２２（■）およびロット２３（▲））を、マウスＩｇＧコントロールの活性（◆）およびレチノイン酸コントロールの活性（×）と対比して示す、ＩＬ−１７Ａ濃度（ｎｇ／ｍｌ）対タンパク質濃度（μｇ／ｍｌ）の折れ線グラフである。
【図６２】図６２は、ＭＲＬ／ｌｐｒループスマウスモデルを使用するｉｎ  ｖｉｖｏ研究の処置スケジュールを概略的に例示する図である。
【図６３】図６３は、コントロールによる処置群、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇおよびシクロホスファミド（ＣＴＸ）による組合せ処置群、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ単独処置群、ならびにＣＴＸ単独処置群で、処置前（４週齢）および２１週齢まで定期的に、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスから回収した血漿に検出される抗ｄｓＤＮＡ自己抗体（単位）を示す棒グラフである。各処置群についての、左から右へのバーは、４、７、８、９、１０、１１、１５、１９、および２１週間における抗ｄｓＤＮＡ自己抗体を示す。
【図６４】図６４は、２１週間におけるコントロールによる処置群、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇおよびシクロホスファミド（ＣＴＸ）による組合せ処置群、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ単独処置群、ならびにＣＴＸ単独処置群におけるタンパク質指標（単位）を示す棒グラフである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における炎症を軽減するための薬学的な製剤であって、該製剤は、
第２のポリペプチドに融合した、または第２のポリペプチドに融合したリンカーペプチドに融合した、配列番号６３または配列番号６４のＩｇＶドメインを含むＢ７−Ｈ４ポリペプチドを含む融合タンパク質を、コントロールと比較して、該被験体における総ＣＤ４＋細胞に対する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の比率を増大させるのに有効な量で含む、
薬学的な製剤。
【請求項２】
被験体における炎症を軽減するための薬学的な製剤であって、該製剤は、
第２のポリペプチドに融合した、または第２のポリペプチドに融合したリンカーペプチドに融合した、配列番号６３または配列番号６４のＩｇＶドメインを含むＢ７−Ｈ４ポリペプチドを含む融合タンパク質を、コントロールと比較して、該被験体における総ＣＤ４＋細胞に対する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の比率を増大させるのに有効な量で含み、
該第２のポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む、
薬学的な製剤。
【請求項３】
被験体における自己免疫性障害を処置するための薬学的な製剤であって、該製剤は、
第２のポリペプチドに融合した、または第２のポリペプチドに融合したリンカーペプチドに融合した、配列番号６３または配列番号６４のＩｇＶドメインを含むＢ７−Ｈ４ポリペプチドを含む融合タンパク質を、コントロールと比較して、該被験体における総ＣＤ４＋細胞に対する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の比率を増大させるのに有効な量で含む、
薬学的な製剤。
【請求項４】
被験体における自己免疫性障害を処置するための薬学的な製剤であって、該製剤は、
第２のポリペプチドに融合した、または第２のポリペプチドに融合したリンカーペプチドに融合した、配列番号６３または配列番号６４のＩｇＶドメインを含むＢ７−Ｈ４ポリペプチドを含む融合タンパク質を、コントロールと比較して、該被験体における総ＣＤ４＋細胞に対する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の比率を増大させるのに有効な量で含み、
該第２のポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む、
薬学的な製剤。
【請求項５】
炎症部位、排出リンパ節、脾臓、中枢神経系、またはそれらの組み合わせにおいて、総ＣＤ４＋細胞に対するＴｒｅｇの比率を増大させる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の薬学的な製剤。
【請求項６】
前記被験体において、総ＣＤ４＋細胞に対するエフェクターＴ細胞またはメモリーＴ細胞の比率を低減させる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の薬学的な製剤。
【請求項７】
前記被験体の前記炎症部位において総ＣＤ４＋細胞に対するエフェクターＴ細胞またはメモリーＴ細胞の比率を低減させる、請求項５に記載の薬学的な製剤。
【請求項８】
被験体における炎症を軽減するための薬学的な製剤であって、該製剤は、
第２のポリペプチドに融合した、または第２のポリペプチドに融合したリンカーペプチドに融合した、配列番号６３または配列番号６４のＩｇＶドメインを含むＢ７−Ｈ４ポリペプチドを含む融合タンパク質を、コントロールと比較して、該被験体におけるＩＬ−１０のレベルを増大させるのに有効な量で含む、
薬学的な製剤。
【請求項９】
被験体における炎症を軽減するための薬学的な製剤であって、該製剤は、
第２のポリペプチドに融合した、または第２のポリペプチドに融合したリンカーペプチドに融合した、配列番号６３または配列番号６４のＩｇＶドメインを含むＢ７−Ｈ４ポリペプチドを含む融合タンパク質を、コントロールと比較して、該被験体におけるＩＬ−１０のレベルを増大させるのに有効な量で含み、
該第２のポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む、
薬学的な製剤。
【請求項１０】
被験体における自己免疫性障害を処置するための薬学的な製剤であって、該製剤は、
第２のポリペプチドに融合した、または第２のポリペプチドに融合したリンカーペプチドに融合した、配列番号６３または配列番号６４のＩｇＶドメインを含むＢ７−Ｈ４ポリペプチドを含む融合タンパク質を、コントロールと比較して、該被験体におけるＩＬ−１０のレベルを増大させるのに有効な量で含む、
薬学的な製剤。
【請求項１１】
被験体における自己免疫性障害を処置するための薬学的な製剤であって、該製剤は、
第２のポリペプチドに融合した、または第２のポリペプチドに融合したリンカーペプチドに融合した、配列番号６３または配列番号６４のＩｇＶドメインを含むＢ７−Ｈ４ポリペプチドを含む融合タンパク質を、コントロールと比較して、該被験体におけるＩＬ−１０のレベルを増大させるのに有効な量で含み、
該第２のポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む、
薬学的な製剤。
【請求項１２】
コントロールと比較して、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）からのＩＬ−１０の分泌を増大させる、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の薬学的な製剤。
【請求項１３】
被験体における炎症を処置するための薬学的な製剤であって、該製剤は、
第２のポリペプチドに融合した、または第２のポリペプチドに融合したリンカーペプチドに融合した、配列番号６３または配列番号６４のＩｇＶドメインを含むＢ７−Ｈ４ポリペプチドを含む融合タンパク質を、コントロールと比較して、該被験体においてＴｈ１経路またはＴｈ１７経路を阻害するのに有効な量で含む、
薬学的な製剤。
【請求項１４】
被験体における炎症を処置するための薬学的な製剤であって、該製剤は、
第２のポリペプチドに融合した、または第２のポリペプチドに融合したリンカーペプチドに融合した、配列番号６３または配列番号６４のＩｇＶドメインを含むＢ７−Ｈ４ポリペプチドを含む融合タンパク質を、コントロールと比較して、該被験体においてＴｈ１経路またはＴｈ１７経路を阻害するのに有効な量で含み、
該第２のポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む、
薬学的な製剤。
【請求項１５】
コントロールと比較して、前記被験体において前記Ｔｈ１７経路を阻害する、請求項１３または１４に記載の薬学的な製剤。
【請求項１６】
コントロールと比較して、前記被験体においてＴｈ１７細胞の数を低減させる、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の薬学的な製剤。
【請求項１７】
コントロールと比較して、前記被験体においてナイーブＴ細胞のＴｈ１７細胞への分化を低減させる、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の薬学的な製剤。
【請求項１８】
コントロールと比較して、前記被験体においてＩＬ−１７のレベルを低減させる、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の薬学的な製剤。
【請求項１９】
コントロールと比較して前記被験体においてＴｈ１細胞の数を低減させる、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の薬学的な製剤。
【請求項２０】
Ｔｈ１細胞またはＴｈ１７細胞によって媒介される炎症を軽減する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の薬学的な製剤。
【請求項２１】
関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円形脱毛症、強直性脊椎炎（ａｎｋｌｏｓｉｎｇ  ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖性症候群（ａｌｐｓ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック病−皮膚炎、慢性疲労性症候群免疫不全症候群（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｆａｔｉｇｕｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、瘢痕性類天疱瘡、寒冷血球凝集素病、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、ドゴー病（Ｄｅｇｏ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症−線維筋炎、グレーブス病（ｇｒａｖｅ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ギラン−バレー症候群（ｇｕｉｌｌａｉｎ−ｂａｒｒｅ）、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、インスリン依存性糖尿病（Ｉ型）、若年性関節炎、メニエール病（Ｍｅｎｉｅｒｅ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、混合結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、ならびにウェゲナー肉芽腫症からなる群から選択される疾患を有する被験体における炎症を軽減するのに有効である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の薬学的な製剤。
【請求項２２】
前記疾患が、シェーグレン症候群、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病または重症筋無力症である、請求項２１に記載の薬学的な製剤。
【請求項２３】
前記疾患がシェーグレン症候群である、請求項２２に記載の薬学的な製剤。
【請求項２４】
被験体における炎症を軽減するための薬学的な製剤であって、該製剤は、
第２のポリペプチドに融合した、または第２のポリペプチドに融合したリンカーペプチドに融合した、配列番号６３または配列番号６４のＩｇＶドメインを含むＢ７−Ｈ４ポリペプチドを含む融合タンパク質を、コントロールと比較して、該被験体において炎症性Ｔ細胞の分化または活性化を低減するのに有効な量で含む、
薬学的な製剤。
【請求項２５】
被験体における炎症を軽減するための薬学的な製剤であって、該製剤は、
第２のポリペプチドに融合した、または第２のポリペプチドに融合したリンカーペプチドに融合した、配列番号６３または配列番号６４のＩｇＶドメインを含むＢ７−Ｈ４ポリペプチドを含む融合タンパク質を、コントロールと比較して、該被験体において炎症性Ｔ細胞の分化または活性化を低減するのに有効な量で含み、
該第２のポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む、
薬学的な製剤。
【請求項２６】
Ｔｈ１細胞またはＴｈ１７細胞に対する抑制効果を増強することによって、ＴｒｅｇによるＩＬ−１０の生成を促進または増強することによって、Ｔｒｅｇの細胞数を増加させるか、またはＴｒｅｇの集団を増大させることによって、あるいはＴｈ１経路またはＴｈ１７経路を阻害することによって、被験体において炎症を処置する方法において使用するための請求項１〜２５のいずれか一項に記載の製剤。
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【国際調査報告】
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2013503204.tif 000230
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