(57)【要約】  本発明は、リン脂質、コレステロール、イオン性脂質及びトリサイクリック誘導体からなる脂質ナノ粒子を含む、トリサイクリック誘導体の溶解度が向上した薬学的組成物に関するものである。本発明によると、前記脂質ナノ粒子を製造することにより、難溶性のトリサイクリック誘導体を、人体に有害な溶解補助剤を使用することなく高濃度で可溶化させることが可能であり、後で注射剤として使用するために水を加えても、向上された溶解度を維持して、長期間保管時も安定性を示す。したがって、本発明の脂質ナノ粒子は、難溶性トリサイクリック誘導体を有効成分とする薬学的製剤の製造に有用である。【選択図】図２
2013534523.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン脂質、コレステロール及びイオン性脂質からなる群から選択された２種以上で構成される脂質混合物と、下記構造式（１）で表される難溶性トリサイクリック誘導体と、からなる脂質ナノ粒子を含むことを特徴とするトリサイクリック誘導体の溶解度が向上した薬学的組成物。
【化１】
2013534523.tif 000014
【請求項２】
リン脂質が、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、大豆ホスファチジルコリン（Ｓｏｙ  ＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（Ｅｇｇ  ＰＣ）、水素化卵ホスファチジルコリン（ＨＥＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）及びジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）からなる群から選択される１種、又はこれら２種以上の混合物である請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
リン脂質が水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）である請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
イオン性脂質が、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジラウロイルホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）、ジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、ジラウロイルホスファチジン酸（ＤＬＰＡ）及びジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）からなる陰イオン性脂質群から選択される１種、又はこれら２種以上の混合物である請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
イオン性脂質がジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）である請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
イオン性脂質が、ジオレイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、ジメチルオクタデシアンモニウム（ＤＭＯＡ）、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジアルキルジメチルアンモニウムブロマイド（ＤＸＤＡＢ）及びジアルキルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＸＴＡＰ）からなる陽イオン性脂質群から選択される１種、又はこれら２種以上の混合物である請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
脂質混合物におけるリン脂質：コレステロール：イオン性脂質の重量比が０〜１００：０〜２０：０〜１０である請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
脂質混合物におけるリン脂質：コレステロール：イオン性脂質の重量比が０〜２０：０〜７：１〜３である請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
脂質混合物におけるリン脂質：コレステロール：イオン性脂質の重量比が７：３：１である請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
脂質混合物とトリサイクリック誘導体の重量比が１〜２０：１である請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
脂質混合物とトリサイクリック誘導体の重量比が３：１である請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
脂質ナノ粒子の大きさが１ｎｍ〜１，０００ｎｍである請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
脂質ナノ粒子の大きさが２０ｎｍ〜２００ｎｍである請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
薬学的組成物が溶解補助剤を含んでいない請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
リン脂質、コレステロール及びイオン性脂質からなる群から選択された２種以上で構成される脂質混合物を有機溶媒に溶解させて脂質混合物溶液を製造する工程(工程１)と、
前記工程１で製造された脂質混合物溶液に、請求項１の構造式（１）で表されるトリサイクリック誘導体を溶解させる工程(工程２)と、
前記工程２で製造されたトリサイクリック誘導体を含む脂質混合物溶液と水を混合しながら超音波を照射することで、分散された脂質ナノ粒子溶液を製造する工程(工程３)と、
前記工程３で製造された脂質ナノ粒子溶液を減圧蒸留し、有機溶媒を除去する工程(工程４)と、
前記工程４で製造された脂質ナノ粒子溶液を凍結乾燥する工程(工程５)と、を含むことを特徴とする脂質ナノ粒子の製造方法。
【請求項１６】
工程１で使用される有機溶媒が、クロロホルム、ジクロロメタン、メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、イソプロピルアルコール及びテトラヒドロフランからなる群から選択される１種、又はこれら２種以上の混合物である請求項１５に記載の脂質ナノ粒子の製造方法。
【請求項１７】
工程１の脂質混合物は、コレステロール：リン脂質：イオン性脂質の重量比が０〜１００：０〜２０：０〜１０である請求項１５に記載の脂質ナノ粒子の製造方法。
【請求項１８】
工程１の脂質混合物は、コレステロール：リン脂質：イオン性脂質の重量比が０〜２０：０〜７：１〜３である請求項１５に記載の脂質ナノ粒子の製造方法。
【請求項１９】
工程１の脂質混合物は、コレステロール：リン脂質：イオン性脂質の重量比が７：３：１である請求項１５に記載の脂質ナノ粒子の製造方法。
【請求項２０】
工程２の脂質混合物溶液内の脂質混合物とトリサイクリック誘導体の重量比が１〜２０：１である請求項１５に記載の脂質ナノ粒子の製造方法。
【請求項２１】
工程２の脂質混合物溶液内の脂質混合物とトリサイクリック誘導体の重量比が３：１である請求項１５に記載の脂質ナノ粒子の製造方法。
【請求項２２】
工程３において、脂質ナノ粒子の分散は、１）トリサイクリック誘導体を含む脂質混合物溶液に水を添加する方法、２）水にトリサイクリック誘導体を含む脂質混合物溶液を添加する方法、又は３）トリサイクリック誘導体を含む脂質混合物溶液と水を同時に添加する方法で行われる請求項１５に記載の脂質ナノ粒子の製造方法。
【請求項２３】
請求項１に記載のトリサイクリック誘導体の溶解度が向上した薬学的組成物、及び薬学的に許容可能な添加剤を含むことを特徴とする薬学的製剤。
【請求項２４】
請求項１に記載のトリサイクリック誘導体の溶解度が向上した薬学的組成物、及び薬学的に許容可能な賦形剤又は補助剤を含むことを特徴とする薬学的製剤。
【請求項２５】
請求項１に記載のトリサイクリック誘導体の溶解度が向上した薬学的組成物、及び薬学的に許容可能な賦形剤又は補助剤を含むことを特徴とする注射剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リン脂質、コレステロール及びイオン性脂質を含む脂質混合物と、トリサイクリック誘導体とからなる脂質ナノ粒子を含む、溶解度が向上した薬学的組成物及び前記脂質ナノ粒子の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１は、下記構造式（１）のトリサイクリック誘導体を開示している。構造式（１）の化合物は、コルヒチンの誘導体であって、癌細胞株に対しては非常に強い細胞毒性を示し、動物毒性試験では、コルヒチン又はタキソールの注射剤に比べて、毒性が著しく減少しており、腫瘍の大きさ及び腫瘍の重量を顕著に減少させて、ＨＵＶＥＣ細胞で強力な血管新生抑制作用を示す。そのため、構造式（１）の化合物は、臨床的に有用な抗癌剤、抗増殖抑制剤、及び血管新生抑制剤として使用できる。しかし、構造式（１）のトリサイクリック誘導体は、水相に対する溶解度が小さく、滅菌水、注射用水、脱イオン水及び緩衝液のような医薬品製造用水相では、生物学的な利用可能性が低い。そして、可溶化された薬学的組成物として投与しても、体内投与直後、体液及び組織から析出するなど、安定した薬学的製剤の開発に限界があった。
このような下記構造式（１）のトリサイクリック誘導体を水性媒質に可溶化するために、ジメチルスルホキシド、ツイン８０、クレモホールなどの溶解補助剤を使用しなければならない。しかし、これらの溶解補助剤、特にクレモホールは、人体に及ぼす副作用により深刻なアレルギー反応を示すことが知られている。
【０００３】
【化１】
2013534523.tif 000003
【０００４】
このような溶解性の低い薬物を可溶化させるための多様な技術、即ち、ナノ粒子、固体分散体及びミセルなどが知られている。
【０００５】
化合物をリポソーム又はミセルのような脂質凝集体に包装することにより、不溶性、加水分解性化合物を臨床的条件で投与することもできる。リポソームは、広範囲な薬物に対して生理学的に利用可能であり、生分解性の運搬システムとして知られている。また、水相における可溶化が要求されない。そこで、不溶性化合物が、単独で遊離された状態より濃縮されてリポソーム中に製剤化されることで、リポソームは薬物を作用部位に高濃度で運搬することができる。
【０００６】
特許文献２及び３には、アルブミン微細粒子を利用して、パクリタキセルが安定した形態で分散されている製剤の製造技術が示されている。しかし、界面活性剤を使用した公知の製剤に比べ、パクリタキセル−アルブミン粒子が血清アルブミンに吸着することにより、パクリタキセルの薬効が減少する問題点がある。
【０００７】
また、特許文献４には、生分解性でありながら疎水性である高分子としてポリラクチド、ポリグリコリドなどを有し、親水性高分子としてはポリエチレングリコールを有する両親媒性ブロック共重合体を用いて、ジテルペノイドアルカロイド系薬物を可溶化する技術が示されている。しかし、この技術は、薬物の可溶化と可溶化された剤形の毒性低下には効果的であるが、体内投与時、ミセルの構造が不安定であるため、ミセルのコア−シェル構造がたやすく破壊され、封入された薬物が析出される欠点をもつ。
【０００８】
また、特許文献５には、リポソームにカプセル化されたカンプトテシンを含む製剤及びその製造方法が記載されている。製剤は、一つ以上のリン脂質及びカンプトテシンを含むリポソームを内包して、このリポソーム製剤は、遊離された薬物に比べ、改善された薬物動態及び安定性を有する。しかし、カプセル化されたリポソームに薬物を封入する技術は、単位リポソームに封入される薬物の量が少なくて、高濃度溶液の製剤技術に適していない。
【０００９】
上述のように、水相への溶解度の低い構造式（１）のトリサイクリック誘導体が高濃度で可溶化された薬学的製剤の開発のためには、トリサイクリック誘導体がその構造体内に安定的に含有されて、化合物を含有した構造体が水相で安定的に分散されることにより、最終的に水相に難溶性薬物を高濃度で可溶化できる技術が切実に求められている。また、体内投与時、構造体に含有された薬物が体液やタンパク質、塩などの体内成分により容易に破壊されず、体内投与後、薬物が可溶化された構造体から遊離あるいは析出されないなど、体内安定性に優れるトリサイクリック誘導体の可溶化のためのナノ構造体の開発が求められている。
【００１０】
本発明者らは、難溶性トリサイクリック誘導体に脂質混合物を導入した脂質ナノ粒子を利用し、人体に有害な溶解補助剤を使用することなく、トリサイクリック誘導体の溶解度を向上させて、後で注射剤として使用するために水を加えても、向上された溶解度を維持することを確認し、製造された固体状態の脂質ナノ粒子の長期間保管時の安定性を確認して、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】大韓民国特許登録第１０−０６６７４６４−００００号明細書
【特許文献２】米国特許第５４３９６８６号明細書
【特許文献３】米国特許第５５６０９３３号明細書
【特許文献４】大韓民国公開特許第１９９９−００６９０３３号明細書
【特許文献５】大韓民国公開特許第２００１−００３０５９９号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、難溶性トリサイクリック誘導体及び脂質混合物からなる脂質ナノ粒子を含む、溶解度の向上した薬学的組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、前記薬学的組成物に含まれる脂質ナノ粒子の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的を達成するために、本発明は、リン脂質、コレステロール及びイオン性脂質からなる群から選択された２種以上で構成される脂質混合物と、下記構造式（１）で表される難溶性トリサイクリック誘導体とからなる脂質ナノ粒子を含む、トリサイクリック誘導体の溶解度が向上した薬学的組成物を提供する。
【００１４】
【化２】
2013534523.tif 000004
【００１５】
また、本発明は、リン脂質、コレステロール及びイオン性脂質からなる群から選択された２種以上で構成される脂質混合物を有機溶媒に溶解させて脂質混合物溶液を製造する工程（工程１）と、前記工程１で製造された脂質混合物溶液に、前記構造式（１）で表されるトリサイクリック誘導体を溶解させる工程（工程２）と、前記工程２で製造されたトリサイクリック誘導体を含む脂質混合物溶液と水を混合しながら超音波を照射することで、分散された脂質ナノ粒子溶液を製造する工程（工程３）と、前記工程３で製造された脂質ナノ粒子溶液を減圧蒸留し、有機溶媒を除去する工程（工程４）と、前記工程４で製造された脂質ナノ粒子溶液を凍結乾燥する工程（工程５）と、を含む、前記薬学的組成物の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によると、上記構造式（１）の難溶性トリサイクリック誘導体に脂質混合物を導入し、超音波を照射して脂質ナノ粒子を製造することにより、人体に有害な溶解補助剤を使用することなくトリサイクリック誘導体の溶解度を向上させて、後で注射剤として使用するために水を加えても、向上された溶解度を維持する効果を有する。また、製造された固体状態の脂質ナノ粒子は、長期間保管時も安定性を示す。したがって、本発明は、トリサイクリック誘導体を使用する薬学的製剤の製造に普遍的に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、有機溶媒中のトリサイクリック誘導体の溶解度を測定するための、ＨＰＬＣ測定用の標準曲線を示す図である。
【図２】図２は、本発明の一実施例における、脂質ナノ粒子の大きさを粒子分析器で測定した結果を示す図である。
【図３】図３は、本発明の一実施例における、脂質ナノ粒子のＣｒｙｏ−ＴＥＭ像を示す図である。
【図４】図４は、本発明の一実施例における、トリサイクリック誘導体が含まれていない脂質ナノ粒子のＣｒｙｏ−ＴＥＭ像を示す図である。
【図５】図５は、本発明の一実施例における、イオン性脂質が含まれていない脂質ナノ粒子のＣｒｙｏ−ＴＥＭ像を示す図である。
【図６】図６は、本発明の一実施例における、イオン性脂質が含まれていない脂質ナノ粒子から遊離された状態にあるトリサイクリック誘導体のＣｒｙｏ−ＴＥＭ像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書において、用語‘脂質ナノ粒子’は、リン脂質、コレステロール、イオン性脂質と、下記構造式（１）で表されるトリサイクリック誘導体と、からなるナノ粒子を意味する。
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
本発明は、リン脂質、コレステロール及びイオン性脂質からなる群から選択された２種以上で構成される脂質混合物と、下記構造式（１）で表される難溶性トリサイクリック誘導体と、からなる脂質ナノ粒子を含むトリサイクリック誘導体の溶解度が向上した薬学的組成物を提供する。
【００２１】
【化３】
2013534523.tif 000005
【００２２】
前記脂質混合物において、リン脂質は、任意のリン脂質、又はリポソームを形成できるリン脂質の組合せを使用することができる。例えば、ホスファチジルコリン（例えば卵や、大豆又はその他の植物から得られた天然リン脂質、半合成リン脂質又は合成リン脂質等）、脂質鎖の長さが多様なリン脂質、不飽和リン脂質などを適宜選択して使用することができる。具体的には、例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、大豆ホスファチジルコリン（Ｓｏｙ  ＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（Ｅｇｇ  ＰＣ）、水素化卵ホスファチジルコリン（ＨＥＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）から選択される１種又は２種以上の混合物を使用することができる。これらの中でも、水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）を使用することが好ましい。
【００２３】
また、前記脂質混合物において、イオン性脂質は、陰イオン性脂質又は陽イオン性脂質を使用することができる。
【００２４】
前記陰イオン性脂質としては、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジラウロイルホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）、ジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、ジラウロイルホスファチジン酸（ＤＬＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）から選択される１種、又はこれらの２種以上の混合物を使用することができる。これらの中でも、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）を使用することが好ましい。
【００２５】
前記陽イオン性脂質としては、ジオレイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、ジメチルオクタデシアンモニウム（ＤＭＯＡ）、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジアルキルジメチルアンモニウムブロマイド（ＤＸＤＡＢ）、ジアルキルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＸＴＡＰ）から選択される１種、又はこれらの２種以上の混合物を選択して使用することができる。
【００２６】
本発明による前記脂質混合物の構成成分において、リン脂質は、前記脂質ナノ粒子の構造を形成して、コレステロールは、形成された前記脂質ナノ粒子の構造を安定化して、イオン性脂質は、形成された前記脂質ナノ粒子が互いに凝集することを防止する。
【００２７】
本発明による前記脂質混合物において、リン脂質：コレステロール：イオン性脂質の比は、重量部の比（以下「重量比」）で０〜１００：０〜２０：０〜１０であることが好ましく、０〜２０：０〜７：１〜３であることがより好ましくて、７：３：１であることが更に好ましい。
【００２８】
もし、リン脂質の重量比が１００を超過する場合、コレステロールの重量比が２０を超過する場合、又はイオン性リン脂質の重量比が１０を超過する場合は、粒子が大きくなりすぎる問題がある。
【００２９】
また、本発明によるリン脂質、コレステロール及びイオン性脂質を含む脂質混合物とトリサイクリック誘導体の重量比は、１〜２０：１であることが好ましく、３：１であることがより好ましい。もし、トリサイクリック誘導体１重量部に対して脂質混合物が１重量部未満であると、脂質ナノ粒子の大きさが大きくなって、脂質ナノ粒子から遊離されるトリサイクリック誘導体が発生し、トリサイクリック誘導体の溶解度改善効果が弱くなる。一方、トリサイクリック誘導体１重量部に対して脂質混合物が２０重量部を超過すると、それ以上の粒子の大きさの改善効果がないばかりか、脂質混合物を溶解させる溶媒の量が大きく増加し、工程上の問題が発生して、経済性も低下する。
【００３０】
更に、本発明による前記脂質ナノ粒子は、大きさが１ｎｍ〜１，０００ｎｍであることが好ましく、２０ｎｍ〜２００ｎｍであることがより好ましい。もし、前記脂質ナノ粒子の大きさが１ｎｍ未満であると、薬物封入率が低下する場合があり、脂質ナノ粒子の大きさが１，０００ｎｍを超過すると、注射剤に使用し難い場合がある。
【００３１】
また、本発明による薬学的組成物に、エチレンジアミン四酢酸、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、没食子酸プロピル、アスコルビン酸、α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、δ−トコフェロールなどの通常的に使用される抗酸化剤から一つ又は二つ以上を選択して添加することができる。
【００３２】
更に、本発明による薬学的組成物は、スクロース、マンニトール、クレアチニンなどの通常的に使用される凍結乾燥用充填剤を含むことができる。これらの凍結乾燥用充填剤は、下記脂質ナノ粒子の製造方法の工程５における凍結乾燥時、脂質ナノ粒子間の凝集を防止することができる。その結果、製造された固体状態の脂質ナノ粒子を注射用水に加える場合、再凝集されることなく迅速に分散され、当初の脂質ナノ粒子の大きさを維持する。
【００３３】
また、本発明は、前記構造式（１）のトリサイクリック誘導体を含む脂質ナノ粒子の製造方法を提供する。
【００３４】
本発明による脂質ナノ粒子の製造方法は、具体的には、リン脂質、コレステロール及びイオン性脂質からなる群から選択された２種以上で構成される脂質混合物を有機溶媒に溶解させて脂質混合物溶液を製造する工程（工程１）と、前記工程１で製造された脂質混合物溶液に、前記構造式（１）で表されるトリサイクリック誘導体を溶解させる工程（工程２）と、前記工程２で製造されたトリサイクリック誘導体を含む脂質混合物溶液と水を混合しながら超音波を照射することで、分散された脂質ナノ粒子溶液を製造する工程（工程３）と、前記工程３で製造された脂質ナノ粒子溶液を減圧蒸留し、有機溶媒を除去する工程（工程４）と、前記工程４で製造された脂質ナノ粒子溶液を凍結乾燥する工程（工程５）と、を含む、トリサイクリック誘導体の溶解度が向上した、薬学的組成物に含まれる脂質ナノ粒子の製造方法を提供する。
【００３５】
以下、本発明を工程別に更に具体的に説明する。
【００３６】
本発明の前記脂質ナノ粒子の製造方法において、前記工程１は、前記脂質混合物を有機溶媒に溶解させて脂質混合物溶液を製造する工程である。前記脂質混合物を溶解させる有機溶媒としては、クロロホルム、ジクロロメタン、メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、イソプロピルアルコール、テトラヒドロフランなどを使用することができる。
【００３７】
ここで、前記リン脂質：コレステロール：イオン性脂質は、重量比で０〜１００：０〜２０：０〜１０であることが好ましく、０〜２０：０〜７：１〜３であることがより好ましく、７：３：１であることが更に好ましい。前記リン脂質：コレステロール：イオン性脂質の比とする理由は、上述のとおりである。
【００３８】
一方、前記脂質混合物溶液中の前記脂質混合物の濃度は、２０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬの範囲になるように調節することが好ましい。
【００３９】
本発明の前記脂質ナノ粒子の製造方法において、前記工程２は、前記工程１で得られた脂質混合物溶液に、トリサイクリック誘導体を溶解させる工程である。
【００４０】
ここで、脂質混合物：トリサイクリック誘導体の比としては、重量比で１〜２０：１が挙げられるが、３：１が好ましい。
【００４１】
一方、前記脂質混合物溶液中のトリサイクリック誘導体の濃度は、２０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬの範囲になるように調節することが好ましい。
【００４２】
本発明の前記脂質ナノ粒子の製造方法において、前記工程３は、前記工程２で得られた脂質混合物溶液から脂質ナノ粒子溶液を得る工程である。具体的には、前記工程２で得られたトリサイクリック誘導体を含む脂質混合物溶液と水を混合しながら超音波を照射することで、脂質混合物が分散された脂質ナノ粒子溶液を製造する工程である。
【００４３】
前記分散された脂質ナノ粒子溶液を得る方法は、１）トリサイクリック誘導体を含む脂質混合物溶液に水を添加する方法、２）水にトリサイクリック誘導体を含む脂質混合物溶液を添加する方法、及び３）トリサイクリック誘導体を含む脂質混合物溶液と水を同時に添加する方法のいずれも使用できるが、生成される脂質ナノ粒子の安定性を向上させることができるという点で、前記１）の方法を使用することが好ましい。
【００４４】
一方、前記超音波の照射装置としては、特に制限はないが、チップソニケーターを使用することが好ましい。
【００４５】
本発明の前記脂質ナノ粒子の製造方法において、前記工程４は、前記工程３で得られた脂質ナノ粒子溶液を減圧蒸留する工程である。具体的には、前記工程３で得られた分散された脂質ナノ粒子の溶液を減圧蒸留し、有機溶媒を除去して脂質ナノ粒子溶液を得る工程である。
【００４６】
前記工程４では、必要に応じて、ポアサイズが０．１μｍ〜０．５μｍであるメンブレイン、好ましくはポアサイズが０．２μｍであるメンブレインを利用してろ過滅菌を行うことができる。前記メンブレインのポアサイズが０．１μｍ未満であると、脂質ナノ粒子が通過できない場合があり、０．５μｍを超過すると、注射剤に適しない大きさの粒子が含有される場合がある。
【００４７】
追加的に、前記工程４において、減圧蒸留後、必要に応じて、エチレンジアミン四酢酸、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、没食子酸プロピル、アスコルビン酸、α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、δ−トコフェロールなどの通常使用される抗酸化剤、又はスクロース、マンニトール、クレアチニンなどの通常使用される凍結乾燥用充填剤を添加することができる。
【００４８】
本発明の前記脂質ナノ粒子の製造方法において、前記工程５は、前記工程４で得られた脂質ナノ粒子溶液を凍結乾燥して、目的物質である固体状態の脂質ナノ粒子を得る工程である。
【００４９】
本発明による固体状態の脂質ナノ粒子は、人体に有害な溶解補助剤を使用することなくトリサイクリック誘導体の溶解度を向上させて、後で注射剤として使用するために水を加えても、向上された溶解度を維持する効果を有する。
【００５０】
また、製造された固体状態の脂質ナノ粒子は、長期間保管時も、形状及び純度を維持されるため、トリサイクリック誘導体を有効成分とする薬学的製剤の製造に有用である。
【００５１】
本発明の、前記脂質ナノ粒子を含む溶解度の向上した薬学的組成物は、薬学的に下記の多様な経口又は非経口投与形態に剤形化することができる。
【００５２】
経口投与用剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、硬／軟質カプセル剤、液剤、シロップ剤、顆粒剤、エリキシル剤などが挙げられる。これらの剤形において、前記有効成分の他に、通常使用される充填剤、増量剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤などの希釈剤、又は賦形剤を１種以上使用することができる。
【００５３】
前記崩壊剤としては、寒天、デンプン、アルギン酸又はそのナトリウム塩、無水リン酸一水素カルシウム塩などが挙げられる。
前記滑沢剤としては、シリカ、タルク、ステアリン酸又はそのマグネシウム塩、カルシウム塩、ポリエチレングリコールなど挙げられる。
前記結合剤としては、マグネシウムアルミニウムシリケート、デンプンペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリビニールピロリジン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロースなどが挙げられる。
【００５４】
その他にも、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース、グリシンなどを希釈剤として使用でき、場合によっては、一般に知られた共沸混合物、吸収剤、着色剤、香味剤、甘味剤などを一緒に使用することができる。
【００５５】
また、本発明による前記薬学的組成物は、非経口投与することができる。前記非経口投与剤としては、皮下注射剤、静脈注射剤、筋肉内注射剤、胸部内注射剤、経皮吸収剤が挙げられる。
【００５６】
ここで、注射剤として製剤化するためには、前記構造式（１）で示される誘導体又は薬学的に許容されるその塩を安定剤又は緩衝剤と共に水で混合して溶液又は懸濁液に製造して、それをアンプル又はバイアルの投与単位として調製することができる。
【００５７】
また、経皮吸収剤として製剤化するためには、薬物保護層、薬物貯蔵層、放出速度調節膜、粘着剤などで構成されるパッチ型の薬物貯蔵層に貯蔵して製剤化することができる。
【００５８】
前記薬学的組成物は、滅菌されるか、あるいは防腐剤、安定化剤又は浸透圧調節のための塩、緩衝剤などの補助剤、及びその他治療的に有用な物質を含有することができる。前記薬学的組成物は、通常の混合、顆粒化又はコーティング方法により製剤化することができる。本発明による前記薬学的組成物は、更に必要に応じて、その他の薬剤、例えば、他の癌治療剤と併用投与することもできる。
【００５９】
本発明の前記薬学的組成物を単位容量形態で剤形化する場合、有効成分として前記構造式１の誘導体又はその薬学的に許容可能な塩を、約０．１ｍｇ〜１，５００ｍｇの単位容量で含有することが好ましい。投与量は、患者の体重、年齢及び疾病の深刻度のような要因によって、医者の処方で決まるが、成人の治療に必要な投与量としては、投与の頻度と強度にもよるが、一日約１ｍｇ〜５００ｍｇが好ましい。成人への筋肉内又は静脈内投与時、一回投与するとして、一日約５ｍｇ〜３００ｍｇであれば十分であるが、一部患者の場合、更に高い一日投与量が好ましい場合もある。
【実施例】
【００６０】
以下、実施例を通じて本発明を更に詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の内容がこれに限定されるものではない。
【００６１】
（実施例１）本発明に基づくトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子の製造１
水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）４．５８２ｇ、コレステロール１．９６４ｇ、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）０．６５５ｇ及びα−トコフェロール１４．４ｍｇ（リン脂質：コレステロール：イオン性脂質の重量比７：３：１）を、メタノール６０ｍＬ及びジクロロメタン４０ｍＬの有機溶媒に溶解させて製造した脂質混合物溶液に、構造式（１）のトリサイクリック誘導体２．４ｇを加えて溶解した（脂質混合物：トリサイクリック誘導体の重量比３：１）。
【００６２】
前記トリサイクリック誘導体を含む脂質混合物溶液を０℃に冷却した後、２５ｍＬ／ｍｉｎの速度で蒸留水２００ｍＬを添加しつつ、チップソニケーター（モデル：ＶＣＸ７５０、製造会社：Ｓｏｎｉｃｓ社）を用いて超音波を照射することで脂質ナノ粒子を分散させた後、減圧蒸留を行って有機溶媒を除去し、０．２μｍメンブレインろ過により滅菌した。
【００６３】
滅菌された脂質ナノ粒子にスクロース２８．８ｇを加えて、凍結乾燥過程を行い、トリサイクリック誘導体を含む固体状態の脂質ナノ粒子を製造した。
【００６４】
（実施例２）本発明に基づくトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子の製造２
実施例１において、蒸留水２００ｍＬにトリサイクリック誘導体を含む脂質混合物溶液を添加することを除いては、実施例１と同様の方法でトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子を製造した。
【００６５】
（実施例３）本発明に基づくトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子の製造３
トリサイクリック誘導体を含む脂質混合物溶液と蒸留水２００ｍＬを同時に添加することを除いては、実施例１と同様の方法でトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子を製造した。
【００６６】
（実施例４）本発明に基づくトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子の製造４
水素化大豆ホスファチジルコリン３．０５５ｇ、コレステロール１．３０９ｇ、ジパルミトイルホスファチジン酸０．４３６ｇ（リン脂質：コレステロール：イオン性脂質の重量比７：３：１）を使用したことを除いては、実施例１と同様の方法でトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子を製造した（脂質混合物溶液：トリサイクリック誘導体の重量比２：１）。
【００６７】
（実施例５）本発明に基づくトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子の製造５
水素化大豆ホスファチジルコリン１．５２７ｇ、コレステロール０．６５５ｇ、ジパルミトイルホスファチジン酸０．２１８ｇ（リン脂質：コレステロール：イオン性脂質の重量比７：３：１）を使用したことを除いては、実施例１と同様の方法でトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子を製造した（脂質混合物溶液：トリサイクリック誘導体の重量比１：１）。
【００６８】
（実施例６）本発明に基づくトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子の製造６
構造式（１）のトリサイクリック誘導体を１８０ｍｇ、及び水素化大豆ホスファチジルコリン４５８ｍｇ、コレステロール１９６ｍｇ、ジパルミトイルホスファチジン酸６５ｍｇ（リン脂質：コレステロール：イオン性脂質の重量比７：３：１）を使用したことを除いては、実施例１と同様の方法でトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子を製造した（脂質混合物溶液：トリサイクリック誘導体の重量比４：１）。
【００６９】
（実施例７）本発明に基づくトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子の製造７
構造式（１）のトリサイクリック誘導体１２０ｍｇ、及び水素化大豆ホスファチジルコリン４５８ｍｇ、コレステロール１９６ｍｇ、ジパルミトイルホスファチジン酸６５ｍｇ（リン脂質：コレステロール：イオン性脂質の重量比７：３：１）を使用したことを除いては、実施例１と同様の方法でトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子を製造した（脂質混合物溶液：トリサイクリック誘導体の重量比６：１）。
【００７０】
（実施例８）本発明に基づくトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子の製造８
構造式（１）のトリサイクリック誘導体７２ｍｇ、及び水素化大豆ホスファチジルコリン４５８ｍｇ、コレステロール１９６ｍｇ、ジパルミトイルホスファチジン酸６５ｍｇ（リン脂質：コレステロール：イオン性脂質の重量比７：３：１）を使用したことを除いては、実施例１と同様の方法でトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子を製造した（脂質混合物溶液：トリサイクリック誘導体の重量比１０：１）。
【００７１】
（実施例９）本発明に基づくトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子の製造９
構造式（１）のトリサイクリック誘導体３６ｍｇ、及び水素化大豆ホスファチジルコリン４５８ｍｇ、コレステロール１９６ｍｇ、ジパルミトイルホスファチジン酸６５ｍｇ（リン脂質：コレステロール：イオン性脂質の重量比７：３：１）を使用したことを除いては、実施例１と同様の方法でトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子を製造した（脂質混合物溶液：トリサイクリック誘導体の重量比２０：１）。
【００７２】
（実施例１０）本発明に基づくトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子の製造１０
構造式（１）のトリサイクリック誘導体２４０ｍｇ、及び水素化大豆ホスファチジルコリン５０４ｍｇ、コレステロール２１６ｍｇ（リン脂質：コレステロール：イオン性脂質の重量比７：３：０）を使用したことを除いては、実施例１と同様の方法でトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子を製造した（脂質混合物溶液：トリサイクリック誘導体の重量比３：１）。
【００７３】
（実施例１１）本発明に基づくトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子の製造１１
構造式（１）のトリサイクリック誘導体７２ｍｇ、及びコレステロール１６２ｍｇ、ジパルミトイルホスファチジン酸５４ｍｇ（リン脂質：コレステロール：イオン性脂質の重量比０：３：１）を使用したことを除いては、実施例１と同様の方法でトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子を製造した（脂質混合物溶液：トリサイクリック誘導体の重量比３：１）。
【００７４】
（実施例１２）本発明に基づくトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子の製造１２
構造式（１）のトリサイクリック誘導体１６８ｍｇ、及び水素化大豆ホスファチジルコリン４４１ｍｇ、ジパルミトイルホスファチジン酸６３ｍｇ（リン脂質：コレステロール：イオン性脂質の重量比７：０：１）を使用したことを除いては、実施例１と同様の方法でトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子を製造した（脂質混合物溶液：トリサイクリック誘導体の重量比３：１）。
【００７５】
（実施例１３）本発明に基づくトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子の製造１３
構造式（１）のトリサイクリック誘導体８０ｍｇ、及び水素化大豆ホスファチジルコリン１２９ｍｇ、コレステロール５５ｍｇ、ジパルミトイルホスファチジン酸５５ｍｇ（リン脂質：コレステロール：イオン性脂質の重量比７：３：３）を使用したことを除いては、実施例１と同様の方法でトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子を製造した（脂質混合物溶液：トリサイクリック誘導体の重量比３：１）。
【００７６】
（実施例１４）本発明に基づくトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子の製造１４
構造式（１）のトリサイクリック誘導体４８ｍｇ、及び水素化大豆ホスファチジルコリン６７ｍｇ、コレステロール２９ｍｇ、ジパルミトイルホスファチジン酸４８ｍｇ（リン脂質：コレステロール：イオン性脂質の重量比７：３：５）を使用したことを除いては、実施例１と同様の方法でトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子を製造した（脂質混合物溶液：トリサイクリック誘導体の重量比３：１）。
【００７７】
（実施例１５）本発明に基づくトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子の製造１５
構造式（１）のトリサイクリック誘導体４１ｍｇ、及び水素化大豆ホスファチジルコリン４３ｍｇ、コレステロール１８ｍｇ、ジパルミトイルホスファチジン酸６１ｍｇ（リン脂質：コレステロール：イオン性脂質の重量比７：３：１０）を使用したことを除いては、実施例１と同様の方法でトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子を製造した（脂質混合物溶液：トリサイクリック誘導体の重量比３：１）。
【００７８】
（実施例１６）本発明に基づくトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子の製造１６
構造式（１）のトリサイクリック誘導体９６ｍｇ、及び水素化大豆ホスファチジルコリン５８ｍｇ、コレステロール１７３ｍｇ、ジパルミトイルホスファチジン酸５８ｍｇ（リン脂質：コレステロール：イオン性脂質の重量比１：３：１）を使用したことを除いては、実施例１と同様の方法でトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子を製造した（脂質混合物溶液：トリサイクリック誘導体の重量比３：１）。
【００７９】
（実施例１７）本発明に基づくトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子の製造１７
構造式（１）のトリサイクリック誘導体１４４ｍｇ、及び水素化大豆ホスファチジルコリン１８５ｍｇ、コレステロール１８５ｍｇ、ジパルミトイルホスファチジン酸６２ｍｇ（リン脂質：コレステロール：イオン性脂質の重量比３：３：１）を使用したことを除いては、実施例１と同様の方法でトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子を製造した（脂質混合物溶液：トリサイクリック誘導体の重量比３：１）。
【００８０】
（実施例１８）本発明に基づくトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子の製造１８
構造式（１）のトリサイクリック誘導体３１２ｍｇ、及び水素化大豆ホスファチジルコリン６６９ｍｇ、コレステロール２００ｍｇ、ジパルミトイルホスファチジン酸６７ｍｇ（リン脂質：コレステロール：イオン性脂質の重量比１０：３：１）を使用したことを除いては、実施例１と同様の方法でトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子を製造した（脂質混合物溶液：トリサイクリック誘導体の重量比３：１）。
【００８１】
（実施例１９）本発明に基づくトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子の製造１９
構造式（１）のトリサイクリック誘導体１８４ｍｇ、及び水素化大豆ホスファチジルコリン４６０ｍｇ、コレステロール６９ｍｇ、ジパルミトイルホスファチジン酸２３ｍｇ（リン脂質：コレステロール：イオン性脂質の重量比２０：３：１）を使用したことを除いては、実施例１と同様の方法でトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子を製造した（脂質混合物溶液：トリサイクリック誘導体の重量比３：１）。
【００８２】
（実施例２０）本発明に基づくトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子の製造２０
構造式（１）のトリサイクリック誘導体１７６ｍｇ、及び水素化大豆ホスファチジルコリン４６６ｍｇ、コレステロール４６ｍｇ、ジパルミトイルホスファチジン酸１６ｍｇ（リン脂質：コレステロール：イオン性脂質の重量比３０：３：１）を使用したことを除いては、実施例１と同様の方法でトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子を製造した（脂質混合物溶液：トリサイクリック誘導体の重量比３：１）。
【００８３】
（実施例２１）本発明に基づくトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子の製造２１
構造式（１）のトリサイクリック誘導体１８２ｍｇ、及び水素化大豆ホスファチジルコリン５０５ｍｇ、コレステロール３０ｍｇ、ジパルミトイルホスファチジン酸１０ｍｇ（リン脂質：コレステロール：イオン性脂質の重量比５０：３：１）を使用したことを除いては、実施例１と同様の方法でトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子を製造した（脂質混合物溶液：トリサイクリック誘導体の重量比３：１）。
【００８４】
（実施例２２）本発明に基づくトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子の製造２２
構造式（１）のトリサイクリック誘導体１６５ｍｇ、及び水素化大豆ホスファチジルコリン４７５ｍｇ、コレステロール１４ｍｇ、ジパルミトイルホスファチジン酸５ｍｇ（リン脂質：コレステロール：イオン性脂質の重量比１００：３：１）を使用したことを除いては、実施例１と同様の方法でトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子を製造した（脂質混合物溶液：トリサイクリック誘導体の重量比３：１）。
【００８５】
（実施例２３）本発明に基づくトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子の製造２３
構造式（１）のトリサイクリック誘導体１９２ｍｇ、及び水素化大豆ホスファチジルコリン４４８ｍｇ、コレステロール６４ｍｇ、ジパルミトイルホスファチジン酸６４ｍｇ（リン脂質：コレステロール：イオン性脂質の重量比７：１：１）を使用したことを除いては、実施例１と同様の方法でトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子を製造した（脂質混合物溶液：トリサイクリック誘導体の重量比３：１）。
【００８６】
（実施例２４）本発明に基づくトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子の製造２４
構造式（１）のトリサイクリック誘導体２８８ｍｇ、及び水素化大豆ホスファチジルコリン４６５ｍｇ、コレステロール３３２ｍｇ、ジパルミトイルホスファチジン酸６６ｍｇ（リン脂質：コレステロール：イオン性脂質の重量比７：５：１）を使用したことを除いては、実施例１と同様の方法でトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子を製造した（脂質混合物溶液：トリサイクリック誘導体の重量比３：１）。
【００８７】
（実施例２５）本発明に基づくトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子の製造２５
構造式（１）のトリサイクリック誘導体３３６ｍｇ、及び水素化大豆ホスファチジルコリン４７０ｍｇ、コレステロール４７０ｍｇ、ジパルミトイルホスファチジン酸６７ｍｇ（リン脂質：コレステロール：イオン性脂質の重量比７：７：１）を使用したことを除いては、実施例１と同様の方法でトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子を製造した（脂質混合物溶液：トリサイクリック誘導体の重量比３：１）。
【００８８】
（実施例２６）本発明に基づくトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子の製造２６
構造式（１）のトリサイクリック誘導体１３６ｍｇ、及び水素化大豆ホスファチジルコリン１５９ｍｇ、コレステロール２２７ｍｇ、ジパルミトイルホスファチジン酸２３ｍｇ（リン脂質：コレステロール：イオン性脂質の重量比７：１０：１）を使用したことを除いては、実施例１と同様の方法でトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子を製造した（脂質混合物溶液：トリサイクリック誘導体の重量比３：１）。
【００８９】
（実施例２７）本発明に基づくトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子の製造２７
構造式（１）のトリサイクリック誘導体１１８ｍｇ、及び水素化大豆ホスファチジルコリン８８ｍｇ、コレステロール２５３ｍｇ、ジパルミトイルホスファチジン酸１３ｍｇ（リン脂質：コレステロール：イオン性脂質の重量比７：２０：１）を使用したことを除いては、実施例１と同様の方法でトリサイクリック誘導体が含まれた脂質ナノ粒子を製造した（脂質混合物溶液：トリサイクリック誘導体の重量比３：１）。
【００９０】
（比較例１）トリサイクリック誘導体が含まれていない脂質ナノ粒子の製造
実施例１においてトリサイクリック誘導体を添加しなかったことを除いては、実施例１と同様の方法で脂質ナノ粒子を製造した。
【００９１】
（参照例１）トリサイクリック誘導体の水に対する溶解度測定
構造式（１）のトリサイクリック誘導体の水に対する溶解度を以下のように測定した。
まず、前記トリサイクリック誘導体１．４２ｍｇをアセトニトリルに溶解して１００μｇ／ｍＬ溶液を製造した後、順次希釈して、５０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ及び１０μｇ／ｍＬの標準溶液を製造した。この各標準溶液に３−エトキシチオコルヒチンを内部標準物質として添加して、ＨＰＬＣで分析し、トリサイクリック誘導体の面積比を解析して、その標準曲線を作成した。図１にトリサイクリック誘導体の面積比に関する標準曲線を示す。
【００９２】
次に、トリサイクリック誘導体１ｇを蒸留水１０ｍＬに加えて混濁液を作り、２４時間常温で攪拌して十分溶かした後、不溶物質を除くために０．２μｍメンブレインでろ過して、ろ液中に残ったトリサイクリック誘導体を、３−エトキシチオコルヒチンを内部標準物質として添加して、ＨＰＬＣで測定した。図１に示す面積比に関する標準曲線と比較して、水に溶けているトリサイクリック誘導体の濃度を計算した。
【００９３】
この結果から、トリサイクリック誘導体の水に対する溶解度は、０．００μｇ／ｍＬであって、水相には殆ど溶けないことが分かった。
【００９４】
（参照例２）トリサイクリック誘導体の溶解補助剤に対する溶解度測定
構造式（１）のトリサイクリック誘導体の溶解補助剤に対する溶解度を以下のように測定した。
注射剤に使用される一般的な溶解補助剤を使用した場合のトリサイクリック誘導体の溶解度を、上記参照例１で使用した方法で測定した結果を下記表１に示す。
【００９５】
【表１】
2013534523.tif 000006
【００９６】
表１に示すように、トリサイクリック誘導体を水性溶媒に溶解させた場合は、ｐＨを変化させても溶解度は改善されず、有機溶媒のうち、グリセリン、プロピレングリコール、エタノールなどを使用した場合も、溶解度改善の効果がほとんどないことが分かる。
【００９７】
トリサイクリック誘導体をＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ポリエチレングリコール４００、ベンジルアルコールなどの有機溶媒に溶解させた場合は、溶解度改善の効果があったが、注射剤に使用するために水を混合すると、トリサイクリック誘導体の溶解度が急激に減少することを確認した。その結果を下記表２に示す。
【００９８】
【表２】
2013534523.tif 000007
【００９９】
表１及び表２に示されたように、人体に有害ではあるが、溶解度に改善効果のある溶媒を過剰量、溶解補助剤として使用すれば、トリサイクリック誘導体の溶解度を改善することはできる。しかしながら、溶解補助剤の使用は、人体に有害であり好ましいものではない。
【０１００】
（実験例１）トリサイクリック誘導体を含む脂質ナノ粒子の溶解度測定
実施例１で製造した脂質ナノ粒子の溶解度を測定するために、下記のように実験を行った。
実施例１で製造されたトリサイクリック誘導体を含む固体状態の脂質ナノ粒子６６０ｍｇに蒸留水４．０ｍＬを加えて溶解した。その後、溶液中に溶解されたトリサイクリック誘導体の濃度を、参照例１と同様の方法を利用して測定した結果、１０．８０ｍｇ／ｍＬであった。
参照例１で測定したトリサイクリック誘導体の水に対する溶解度（０．００ｍｇ／ｍＬ）に比べ、溶解度が向上したことを確認した。
【０１０１】
参照例２において、溶解補助剤を使用してトリサイクリック誘導体を溶解させた後、水を追加的に加えた場合は、溶解度が急激に減少した。これに対して、実験例１に示されたように、本発明のトリサイクリック誘導体を含む脂質ナノ粒子の溶解度は、更に水が加えられても維持されると考えられる。
【０１０２】
（実験例２）トリサイクリック誘導体を含む脂質混合物溶液を分散させる方法による脂質ナノ粒子大きさの違いの測定
トリサイクリック誘導体を含む脂質混合物溶液の分散方法を変えて製造された実施例１〜３の脂質ナノ粒子大きさを、粒子分析器（モデル：ＺＥＴＡ  ＳＩＺＥＲ−３０００、製造会社：マルバーン社）を利用して測定した結果を下記表３に示す。また、実施例１の脂質ナノ粒子のサイズ（粒子大きさ）を前記粒子分析器で測定した結果を図２に示した。
【０１０３】
【表３】
2013534523.tif 000008
【０１０４】
表３に示されたように、トリサイクリック誘導体を含む脂質混合物溶液の分散方法によって、生成される脂質ナノ粒子の大きさが２０ｎｍ以上の差を示した。したがって、分散方法によって脂質ナノ粒子の大きさを調節することができることが分かる。
【０１０５】
（実験例３）脂質混合物溶液中の脂質混合物とトリサイクリック誘導体の重量比変化による粒子大きさの違いの測定
脂質混合物溶液中の脂質混合物とトリサイクリック誘導体の重量比の変化による脂質ナノの粒子大きさの差を調べるために、実施例１及び４〜９で製造された脂質ナノ粒子の大きさを、実験例２で使用した粒子分析器を利用して測定した。その結果を下記表４に示す。
【０１０６】
【表４】
2013534523.tif 000009
【０１０７】
表４に示されたように、脂質混合物溶液中の脂質ナノ粒子の粒子大きさは、約９０ｎｍ〜１５０ｎｍであり、前記脂質混合物とトリサイクリック誘導体の重量比によって脂質ナノ粒子の大きさを調節可能なことが分かる。また、脂質混合物と構造式（１）の化合物の重量比が３：１未満である場合は、粒子大きさが大きくなり、３：１を超過してからは粒子大きさに変化がないため、脂質混合物と構造式（１）の化合物の最適比率が３：１であることが分かる。
【０１０８】
（実験例４）脂質混合物溶液中のイオン性脂質の重量比変化による粒子大きさの違いの測定
脂質混合物溶液中のイオン性脂質の重量比の変化による脂質ナノ粒子の粒子大きさの差異を調べるために、実施例１、１０、１３、１４及び１５で製造された脂質ナノ粒子の大きさを、実験例２で使用した粒子分析器を利用して測定した。その結果を下記表５に示す。
【０１０９】
【表５】
2013534523.tif 000010
【０１１０】
表５に示されたように、脂質混合物溶液中のイオン性脂質の重量比によって脂質ナノ粒子の大きさを調節することが可能である。イオン性脂質を含んでいない場合は、粒子大きさが３５５．５ｎｍと最も大きかった。これは、イオン性脂質の不在により、形成された脂質ナノ粒子同士が再凝集したからであると考えられる。また、イオン性脂質を１重量部〜１０重量部含有した場合、１０３．７ｎｍ〜２７３．９ｎｍの大きさの脂質ナノ粒子が形成された。
【０１１１】
（実験例５）脂質混合物溶液中のリン脂質の重量比変化による粒子大きさの違いの測定
脂質混合物溶液中のリン脂質の重量比の変化による脂質ナノ粒子の粒子大きさの差異を調べるために、実施例１、１１及び１６〜２２で製造された脂質ナノ粒子の大きさを、実験例２で使用した粒子分析器を利用して測定した。その結果を下記表６に示す。
【０１１２】
【表６】
2013534523.tif 000011
【０１１３】
表６に示されたように、脂質混合物溶液中のリン脂質の重量比によって脂質ナノ粒子の大きさを調節することが可能である。リン脂質を含んでいない場合は、粒子大きさ１３０．６ｎｍの脂質ナノ粒子が形成された。リン脂質を１重量部〜１００重量部含有した場合、１０３．７ｎｍ〜２２０．７ｎｍの大きさの脂質ナノ粒子が形成された。
【０１１４】
（実験例６）脂質混合物溶液中のコレステロールの重量比変化による粒子大きさの違いの測定
脂質混合物溶液中のコレステロールの重量比の変化による脂質ナノ粒子の粒子大きさの差異を調べるために、実施例１、１２及び２３〜２７で製造された脂質ナノ粒子の大きさを、実験例２で使用した粒子分析器を利用して測定した。その結果を下記表７に示す。
【０１１５】
【表７】
2013534523.tif 000012
【０１１６】
表７に示されたように、脂質混合物溶液中のコレステロールの重量比によって脂質ナノ粒子の大きさを調節すること可能である。コレステロールを含んでいない場合は、粒子大きさ１６９ｎｍの脂質ナノ粒子が形成された。コレステロールを１重量部〜２０重量部含有した場合、１０３．７ｎｍ〜２３２．１ｎｍの大きさの脂質ナノ粒子が形成された。
【０１１７】
前記実験例４〜６の結果から、リン脂質：コレステロール：イオン性脂質の最適重量比は、７：３：１であることが分かった。
【０１１８】
（実験例７）脂質ナノ粒子の安定性評価
前記実施例１で製造された脂質ナノ粒子を冷蔵保管における安定性を評価した結果を、下記表８に示す。
【０１１９】
【表８】
2013534523.tif 000013
【０１２０】
表８に示されたように、固体状態の脂質ナノ粒子は、２４ヶ月間冷蔵保管した後も、形状及び純度を維持する安定性を示すことが分かった。
【０１２１】
（実験例８）脂質ナノ粒子の構造確認
本発明の実施例において製造された脂質ナノ粒子の構造を確認するために、Ｃｒｙｏ−ＴＥＭを利用した。
【０１２２】
具体的には、実施例１で製造された脂質ナノ粒子をＣｒｙｏ−ＴＥＭ（モデル：Ｃｒｙｏ  Ｔｅｃｎａｉ  Ｆ２０Ｇ２、製造会社：ＦＥＩ  ＣＯＭＰＡＮＹ社）を利用して構造を解析した結果を図３に示した。また、比較例１で製造した、トリサイクリック誘導体が含まれていない脂質ナノ粒子の構造を図４に示した。実施例１０で製造した、イオン性脂質が含まれていない脂質ナノ粒子の構造を図５に示した。実施例１０で製造した脂質ナノ粒子から遊離されているトリサイクリック誘導体を図６に示した。
【０１２３】
図３〜６に示されたように、実施例１と比較例１を比較してみると、トリサイクリック誘導体の有無に関係なく、脂質ナノ粒子の構造は同一であることを確認した。これは、本発明の脂質ナノ粒子がトリサイクリック誘導体を安定的に含むことができることを示す。また、実施例１０で製造した、イオン性脂質が含まれていない脂質ナノ粒子の場合、安定性が低下し、再凝集する。再凝集される過程で脂質ナノ粒子から遊離されたトリサイクリック誘導体を確認した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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