(57)【要約】水中油型エマルジョンを製造するための改善された方法であって、マイクロフルイダイゼーションデバイスを使用するステップを含み、このマイクロフルイダイゼーションデバイスの相互作用チャンバが、背圧チャンバの上流において、複数のＺ型チャネルを備えている、方法。本発明は、水中油型エマルジョンの製造のための方法であって、第１の平均油滴サイズを有する第１のエマルジョンを、マイクロフルイダイゼーションデバイスに通して、該第１の平均油滴サイズよりも小さい第２の平均油滴サイズを有する第２のエマルジョンを形成するステップを含み、該マイクロフルイダイゼーションデバイスは、複数のＺ型チャネルを備える相互作用チャンバ、および少なくとも１つのチャネルを備える背圧チャンバを備えており、該背圧チャンバは、該相互作用チャンバの下流に配置されている、方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
水中油型エマルジョンの製造のための方法であって、該方法は、
第１の平均油滴サイズを有する第１のエマルジョンを、マイクロフルイダイゼーションデバイスに通して、該第１の平均油滴サイズよりも小さい第２の平均油滴サイズを有する第２のエマルジョンを形成するステップを含み、
該マイクロフルイダイゼーションデバイスは、複数のＺ型チャネルを備える相互作用チャンバ、および少なくとも１つのチャネルを備える背圧チャンバを備えており、
該背圧チャンバは、該相互作用チャンバの下流に配置されている、
方法。
【請求項２】
前記第１のエマルジョンが、第１の圧力で前記相互作用チャンバに導入され、前記第２のエマルジョンが、該第１の圧力よりも低い第２の圧力で前記背圧チャンバから出ていき、
ここで、該相互作用チャンバの中で、該第１の圧力と該第２の圧力との間の圧力差のうちの８０〜９５％の低下があり、該背圧チャンバの中で、該第１の圧力と該第２の圧力との間の圧力差のうちの５〜２０％の低下がある、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記背圧チャンバが、複数のチャネルを備えている、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
水中油型エマルジョンの製造のための方法であって、該方法は、
第１の平均油滴サイズを有する第１のエマルジョンを、マイクロフルイダイゼーションデバイスに通して、該第１の平均油滴サイズよりも小さい第２の平均油滴サイズを有する第２のエマルジョンを形成するステップを含み、
該マイクロフルイダイゼーションデバイスは、複数のチャネルを備える相互作用チャンバ、および複数のチャネルを備える背圧チャンバを備えている、
方法。
【請求項５】
前記第１のエマルジョンが：
（ｉ）第１の圧力で前記相互作用チャンバに導入され、前記第２のエマルジョンが、該第１の圧力よりも低い第２の圧力で前記背圧チャンバから出ていくか；または
（ｉｉ）第１の圧力で前記背圧チャンバに導入され、前記第２のエマルジョンが、該第１の圧力よりも低い第２の圧力で前記相互作用チャンバから出ていき；
ここで、該相互作用チャンバの中で、該第１の圧力と該第２の圧力との間の圧力差のうちの８０〜９５％の低下があり、該背圧チャンバの中で、該第１の圧力と該第２の圧力との間の圧力差のうちの５〜２０％の低下がある、
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記背圧チャンバの前記チャネルまたは前記複数のチャネルが、Ｚ型チャネルである、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記第２のエマルジョンのろ過を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ホモジナイザを用いて前記第１のエマルジョンを形成するステップを含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の平均油滴サイズが５０００ｎｍ以下である、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１のエマルジョン中のサイズが１．２μｍを超える油滴の数が、５×１０１１／ｍｌ以下である、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２の平均油滴サイズが５００ｎｍ以下である、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２のエマルジョン中のサイズが１．２μｍを超える油滴の数が、５×１０１０／ｍｌ以下である、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ワクチン組成物を調製するための方法であって、
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のエマルジョンを調製するステップと、
該エマルジョンを抗原と組み合わせるステップと、
を含む、方法。
【請求項１４】
ワクチンキットを調製するための方法であって、
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のエマルジョンを調製するステップと、
該エマルジョンを、抗原成分と共にキットの成分としてキット内にパッケージングするステップと、
を含む、方法。
【請求項１５】
前記キットの成分が、別個のバイアルに入れられている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記バイアルが、ホウケイ酸ガラスから作製されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、
アジュバントが、バルクアジュバントであり、
該方法が、キットの成分としてパッケージングするために該バルクアジュバントから単位用量を取り出すステップを含む、
方法。
【請求項１８】
前記抗原が、インフルエンザウイルス抗原である、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記エマルジョンと前記抗原との組み合わせが、ワクチン組成物を形成し、該ワクチン組成物が、インフルエンザウイルス１株当たり約１５μｇ、約１０μｇ、約７．５μｇ、約５μｇ、約３．８μｇ、約１．９μｇ、約１．５μｇの血球凝集素を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記エマルジョンと前記抗原との組み合わせが、ワクチン組成物を形成し、該ワクチン組成物が、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノール保存薬を含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記相互作用チャンバが、複数の固定形状チャネルであって、前記エマルジョンが通る、チャネルを有し、該チャネルにおいて、該エマルジョンが、加圧下で加速させられて、該エマルジョンの油滴サイズが減少し、かつサイズが１．２μｍを超える油滴の数が減少し；該相互作用チャンバのチャネルが、複数の実質的に直角の角を備えており；前記背圧チャンバが、少なくとも１つの固定形状チャネルであって、該エマルジョンが通る、チャネルを有している、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００９年１２月３日に出願された米国仮特許出願第６１／２８３，５４８号の利益を主張し、上記米国仮特許出願の全容は、全ての目的のために、参考として本明細書に援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、マイクロフルイダイゼーションによるワクチン用の水中油型エマルジョンアジュバントの製造の分野内にある。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
「ＭＦ５９」［特許文献１、非特許文献１、非特許文献２（参考文献１〜３）］として知られるワクチンアジュバントは、スクアレン、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０としても知られている）、およびトリオレイン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ８５としても知られている）のサブミクロン水中油型エマルジョンである。このワクチンアジュバントはまた、クエン酸イオン、例えば、１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液を含み得る。このエマルジョンの容積組成は、約５％のスクアレン、約０．５％のＴｗｅｅｎ８０、および約０．５％のＳｐａｎ８５とすることができる。このアジュバントおよびその生産は、非特許文献３（参考文献４）の第１０章、非特許文献４（参考文献５）の第１２章、および非特許文献５（参考文献６）の第１９章により詳細に記載されている。
【０００４】
非特許文献６（参考文献７）に記載されているように、ＭＦ５９は、Ｓｐａｎ８５をスクアレン相に分散させ、Ｔｗｅｅｎ８０を水相に分散させてから、高速で混合して粗エマルジョンを形成することによって工業規模で製造される。次いで、この粗エマルジョンを、マイクロフルイダイザに繰り返し通し、均一な油滴サイズを有するエマルジョンを生産する。次いで、非特許文献５（参考文献６）に記載されているように、任意の大きい油滴を除去して、得られるエマルジョンの平均油滴サイズが、少なくとも３年間、４℃で変化しないようにするために、マイクロフルイダイズされたエマルジョンを０．２２μｍの膜に通してろ過する。最終エマルジョンのスクアレン含量を、特許文献２（参考文献８）に記載されているように測定することができる。
【０００５】
水中油型エマルジョンは、油滴を含む。これらのエマルジョンに含まれる大きい油滴は、凝集のための核形成部位の役割を果たして、保管中にエマルジョンの劣化をもたらし得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第９０／１４８３７号
【特許文献２】欧州特許第２０２９１７０号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｐｏｄｄａ  ＆  Ｄｅｌ  Ｇｉｕｄｉｃｅ，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  （２００３）  ２：  １９７−２０３
【非特許文献２】Ｐｏｄｄａ，  Ｖａｃｃｉｎｅ  （２００１）  １９：  ２６７３−２６８０
【非特許文献３】Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （ｅｄｓ．  Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ）  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５  （ＩＳＢＮ  ０−３０６−４４８６７−Ｘ）
【非特許文献４】Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ：  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ｖｏｌｕｍｅ  ４２  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｓｅｒｉｅｓ）．  ＩＳＢＮ：  １−５９２５９−０８３−７．  Ｅｄ．  Ｏ’Ｈａｇａｎ
【非特許文献５】Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  （ｅｄｓ．  Ｌｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．）．  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２００４．  ＩＳＢＮ  ０−８２４７−４０７１−８
【非特許文献６】Ｏ’Ｈａｇａｎ，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  （２００７）  ６（５）：６９９−７１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、マイクロフルイダイズされた水中油型エマルジョン（例えば、ＭＦ５９）のさらなる改善された製造方法、特に、工業規模での使用に適し、かつ大きい粒子が少ないエマルジョンを提供する改善されたマイクロフルイダイゼーションを提供する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の開示）
本発明は、水中油型エマルジョンの製造方法であって：第１の平均油滴サイズを有する第１のエマルジョンを、マイクロフルイダイゼーションデバイスに通し、第１の平均油滴サイズよりも小さい第２の平均油滴サイズを有する第２のエマルジョンを形成するステップを含む、方法を提供する。このマイクロフルイダイゼーションデバイスは、複数のＺ型チャネルを備える相互作用チャンバ、および少なくとも１つのチャネルを備える補助処理モジュールを備えており、この補助処理モジュールは、相互作用チャンバの下流に配置されている。
【００１０】
第１のエマルジョンは、第１の圧力で相互作用チャンバに導入することができ、第２のエマルジョンは、第１の圧力よりも低い第２の圧力で補助処理モジュールから出ていくことができる。一実施形態では、相互作用チャンバの中で、第１の圧力と第２の圧力との間の圧力差のうちの８０〜９５％の低下があり、補助処理モジュールの中で、第１の圧力と第２の圧力との間の圧力差のうちの５〜２０％の低下がある。
【００１１】
本発明はまた、水中油型エマルジョンの製造方法であって、第１の平均油滴サイズを有する第１のエマルジョンを、マイクロフルイダイゼーションデバイスに通し、第１の平均油滴サイズよりも小さい第２の平均油滴サイズを有する第２のエマルジョンを形成するステップを含む、方法も提供する。マイクロフルイダイゼーションデバイスは、複数のチャネルを備える相互作用チャンバ、および複数のチャネルを備える補助処理モジュールを備えている。
【００１２】
第１のエマルジョンを、（ｉ）第１の圧力で相互作用チャンバに導入して、第２のエマルジョンを、第１の圧力よりも低い第２の圧力で補助処理モジュールから出すことができるかまたは；第１のエマルジョンを、（ｉｉ）第１の圧力で補助処理モジュールに導入して、第２のエマルジョンを、第１の圧力よりも低い第２の圧力で相互作用チャンバから出すことができる。一実施形態では、相互作用チャンバの中で、第１の圧力と第２の圧力との間の圧力差のうちの８０〜９５％の低下があり、補助処理モジュールの中で、第１の圧力と第２の圧力との間の圧力差のうちの５〜２０％の低下がある。
【００１３】
詳細は後述するが、第１のエマルジョンは、５０００ｎｍ以下の平均油滴サイズ、例えば、３００ｎｍ〜８００ｎｍの平均サイズを有し得る。サイズが１．２μｍを超える第１のエマルジョン中の油滴の数は、後述するように５×１０１１／ｍｌ以下であり得る。サイズが１．２μｍを超える油滴は、油滴の凝集および合体によってエマルジョンを不安定にし得るため不利である［１４］。
【００１４】
形成後、第１のエマルジョンを、少なくとも１回、マイクロフルイダイゼーションの通過に供し、平均油滴サイズが減少された第２のエマルジョンを形成することができる。後述するように、第２のエマルジョンの平均油滴サイズは、５００ｎｍ以下である。サイズが１．２μｍを超える第２のエマルジョン中の油滴の数は、後述するように５×１０１０／ｍｌ以下であり得る。これらの特質を達成するために、エマルジョン成分を、複数回、例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、マイクロフルイダイゼーションデバイスに通す必要があろう。
【００１５】
次いで、第２のエマルジョンを、例えば、親水性ポリエーテルスルホン膜に通してろ過して、ワクチンアジュバントとして使用するのに適し得る水中油型エマルジョンを得ることができる。ろ過後に得られる水中油型エマルジョンの平均油滴サイズは、２２０ｎｍ以下、例えば、１３５〜１７５ｎｍ、１４５〜１６５ｎｍ、または約１５５ｎｍであり得る。ろ過後に得られる水中油型エマルジョン中に存在する、サイズが１．２μｍを超える油滴の数は、５×１０８／ｍｌ以下、例えば、５×１０７／ｍｌ以下、５×１０６／ｍｌ以下、２×１０６／ｍｌ以下、または５×１０５／ｍｌ以下であり得る。
【００１６】
ろ過後に得られる最終水中油型エマルジョンは、第１のエマルジョンと比較して、サイズが１．２μｍを超える油滴が少なくとも１／１０２の少なさであり得、理想的には１／１０３の少なさである（例えば、１／１０４の少なさ）。
【００１７】
一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）の前に、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）が２サイクル以上用いられる。同様に、個々のステップ（ｉ）および（ｉｉ）の複数回の繰り返しを用いてもよい。
【００１８】
一般に、この方法は、２０〜６０℃、理想的には４０±５℃で行われる。第１および第２のエマルジョン成分は、高温でも比較的安定し得るが、一部の成分の熱分解が、なお起こり得るため、低温が好ましい。
【００１９】
（エマルジョン成分）
平均油滴サイズ（すなわち、エマルジョンの油滴の数平均直径）は、参考文献１３に記載されているように動的光散乱技術を用いて測定することができる。動的光散乱測定機械の例は、Ｎｉｃｏｍｐ３８０サブミクロン粒子サイズ分析器（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）である。
【００２０】
サイズが１．２μｍを超える粒子の数は、粒子カウンタ、例えば、ＡｃｃｕｓｉｚｅｒＴＭ７７０（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定することができる。
【００２１】
本発明の方法は、水中油型エマルジョンの製造に使用される。これらのエマルジョンは、３つの主な構成要素：油；水性成分；および界面活性剤を含む。
【００２２】
エマルジョンは、薬学的用途が意図されるため、油は、典型的には、生体分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。
【００２３】
使用される油は、スクアレン、すなわち、分岐不飽和テルペノイド（Ｃ３０Ｈ５０；［（ＣＨ３）２Ｃ［＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）］２＝ＣＨＣＨ２−］２；２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン；ＣＡＳ  ＲＮ  ７６８３−６４−９）であるサメ肝油を含み得る。スクアレンは、本発明に使用するのに特に好ましい。
【００２４】
本発明の油は、例えば、スクアレンおよび少なくとも１つのさらなる油を含む、油の混合物（または組み合わせ）を含み得る。
【００２５】
スクアレンを用いるのではなく（またはスクアレンの使用に加えて）、エマルジョンは、例えば、動物供給源（例えば、魚）由来または植物供給源由来の油を含む油（複数可）を含み得る。植物油の供給源には、堅果、種子、および穀物が含まれる。ピーナッツ油、大豆油、ヤシ油、およびオリーブ油は、最も一般に入手しやすく、堅果油の例である。例えば、ホホバ豆から得られたホホバ油を使用することができる。種子油には、サフラワー油、綿実油、ヒマワリ種子油、およびゴマ種子油などが含まれる。穀物群では、コーン油が最も容易に入手しやすいが、他の穀類、例えば、コムギ、オートムギ、ライムギ、コメ、テフ、およびライコムギなどの油も使用しても良い。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素脂肪酸エステルは、種子油では自然には発生しないが、堅果油および種子油に由来する適切な物質の加水分解、分離、およびエステル化によって調製することができる。哺乳動物乳汁由来の脂肪および油は、代謝可能であるため、使用しても良い。哺乳動物供給源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、鹸化、および他の方法の手順は、当技術分野で周知である。
【００２６】
殆どの魚は、容易に収集できる代謝可能な油を含んでいる。例えば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨油、例えば、鯨ろうは、本発明に使用できるいくつかの魚油の例である。多数の分岐鎖油は、５炭素イソプレン単位で生化学的に合成され、一般にテルペノイドと呼ばれている。スクアラン、すなわちスクアレンの飽和類似体も使用しても良い。スクアレンおよびスクアランを含む魚油は、商業的供給源から容易に入手可能であるが、当技術分野で公知の方法によって得ても良い。
【００２７】
他の有用な油は、特にスクアレンと組み合わせられたトコフェロールである。エマルジョンの油相が、トコフェロールを含む場合、α、β、γ、δ、ε、またはζトコフェロールのいずれも使用できるが、α−トコフェロールが好ましい。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールの両方を使用することができる。好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールである。トコフェロールは、いくつかの形態、例えば、様々な塩および／または異性体の形態をとり得る。塩には、有機塩、例えば、コハク酸塩、酢酸塩、ニコチン酸塩などが含まれる。このトコフェロールの塩が使用される場合は、好ましい塩は、コハク酸塩である。スクアレンおよびトコフェロール（例えば、ＤＬ−α−トコフェロール）を含む油の組み合わせを使用することができる。
【００２８】
水性成分は、純粋な水（例えば、ｗ．ｆ．ｉ．）であり得、またはさらなる成分、例えば、溶質を含み得る。例えば、水性成分は、緩衝液を形成する塩、例えば、クエン酸塩またはリン酸塩、例えば、ナトリウム塩を含み得る。典型的な緩衝液には：リン酸緩衝液；トリス緩衝液；ホウ酸緩衝液；コハク酸緩衝液；ヒスチジン緩衝液；またはクエン酸緩衝液が含まれる。緩衝液は、典型的には、５〜２０ｍＭの範囲で含められる。
【００２９】
界面活性剤は、好ましくは生体分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）によって分類することができ、１〜１０の範囲のＨＬＢは、一般的に、界面活性剤が水中よりも油中において可溶性であることを意味し、１０〜２０の範囲のＨＬＢは、油中よりも水中において可溶性であることを意味する。エマルジョンは、好ましくは、少なくとも１０、例えば、少なくとも１５、または好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する少なくとも１つの界面活性剤を含む。
【００３０】
本発明は、限定されるものではないが、以下を含む界面活性剤と共に使用することができる：ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般に、Ｔｗｅｅｎと呼ばれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；ＤＯＷＦＡＸＴＭ商品名として販売されている、エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー、例えば、直鎖状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；反復エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が変化し得、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深い、オクトキシノール；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン（レシチン）；ラウリル、セチル、ステアリル、およびオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として知られている）、例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３０）；ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル；およびソルビタンエステル（一般に、ＳＰＡＮとして知られている）、例えば、トリオレイン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ８５）、およびソルビタンモノラウレート。エマルジョンに含めるのに好ましい界面活性剤は、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０；モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）、Ｓｐａｎ８５（トリオレイン酸ソルビタン）、レシチン、およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【００３１】
界面活性剤の混合物、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０／Ｓｐａｎ８５混合物またはＴｗｅｅｎ８０／Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００混合物を、エマルジョンに含めることができる。ポリオキシエチレンソルビタンエステル、例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ８０）とオクトキシノール、例えば、ｔ−オクチルフェノキシ−ポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）の組み合わせも適している。別の有用な組み合わせは、ラウレス９とポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。有用な混合物は、ＨＬＢ値が１０〜２０の範囲の界面活性剤（例えば、ＨＬＢが１５．０のＴｗｅｅｎ８０）およびＨＬＢ値が１〜１０の範囲の界面活性剤（例えば、ＨＬＢが１．８のＳｐａｎ８５）を含み得る。
【００３２】
（第１のエマルジョンの形成）
マイクロフルイダイゼーションステップの前に、エマルジョン成分を混合して第１のエマルジョンを形成することができる。
【００３３】
第１のエマルジョン中の油滴は、５０００ｎｍ以下、例えば、４０００ｎｍ以下、３０００ｎｍ以下、２０００ｎｍ以下、１２００ｎｍ以下、１０００ｎｍ以下、例えば、８００〜１２００ｎｍまたは３００ｎｍ〜８００ｎｍの平均サイズを有し得る。
【００３４】
第１のエマルジョンでは、サイズが１．２μｍを超える油滴の数は、５×１０１１／ｍｌ以下、例えば、５×１０１０／ｍｌ以下または５×１０９／ｍｌ以下であり得る。
【００３５】
次いで、第１のエマルジョンをマイクロフルイダイズして、第１のエマルジョンよりも小さい平均油滴サイズを有し、かつ／または１．２μｍを超えるサイズを有する油滴がより少ない第２のエマルジョンを形成することができる。
【００３６】
第１のエマルジョンの平均油滴サイズは、ホモジナイザで第１のエマルジョン成分を混合することによって達成することができる。例えば、図１に示されているように、第１のエマルジョン成分を混合容器（１２）内で組み合わせ、次いで組み合わせた成分を、機械式ホモジナイザ、例えば、ロータ−ステータホモジナイザ（１）に導入することができる（１３）。
【００３７】
ホモジナイザは、垂直式および／または水平式で作動することができる。工業的設定に便利なように、インラインホモジナイザが好ましい。
【００３８】
上記成分は、ロータ−ステータホモジナイザに導入され、スロットまたは孔を備えた高速回転しているロータに接する。上記成分は、ポンプ様の様式において遠心力によって外側に移動し、スロット／孔を通る。一部の実施形態では、ホモジナイザは、ロータとステータとの複数の組み合わせ、例えば、図１の特徴（３）と（４）；（５）と（６）、および（７）と（８）によって、ならびに図２によって示されているように、同心円配列の櫛−歯リングを備えている。有用な大型ホモジナイザのロータは、水平方向の複数のブレードがついたインペラ（例えば、図１の特徴（９））のエッジに櫛−歯リングを有し得、これは、静止ライナの適合歯に精密許容差において整合している。第１のエマルジョンは、乱流、キャビテーション、およびロータとステータとの間の間隙内で起こる機械的せん断の組み合わせによって形成される。上記成分は、通常、ロータの軸に対して平行な方向に導入される。
【００３９】
ロータ−ステータホモジナイザにおける重要な性能パラメータは、ロータのチップ速度（周速度）である。このパラメータは、ロータの速度およびロータの直径の両方の関数である。少なくとも１０ｍｓ−１のチップ速度が有用であり、理想的には、より高速、例えば、≧２０ｍｓ−１、≧３０ｍｓ−１、≧４０ｍｓ−１などである。４０ｍｓ−１のチップ速度は、小型ホモジナイザを用いて１０，０００ｒｐｍで、または大型ホモジナイザを用いて低速回転（例えば、２，０００ｒｐｍ）で容易に達成することができる。適切な高せん断ホモジナイザは、市販されている。
【００４０】
工業規模の製造では、ホモジナイザは、理想的には、少なくとも３００Ｌ／時間、例えば、≧４００Ｌ／時間、≧５００Ｌ／時間、≧６００Ｌ／時間、≧７００Ｌ／時間、≧８００Ｌ／時間、≧９００Ｌ／時間、≧１０００Ｌ／時間、≧２０００Ｌ／時間、≧５０００Ｌ／時間、またはさらに≧１００００Ｌ／時間の流量を有すべきである。適切な高容量ホモジナイザが市販されている。
【００４１】
好ましいホモジナイザは、３×１０５〜１×１０６ｓ−１、例えば、３×１０５〜７×１０５ｓ−１、４×１０５〜６×１０５ｓ−１、例えば、約５×１０５ｓ−１のせん断速度を可能にする。
【００４２】
ロータ−ステータホモジナイザは、運転中に熱を比較的発生しないが、使用中に冷却しても良い。理想的には、第１のエマルジョンの温度は、均質化中は６０℃未満、例えば、４５℃未満に維持される。
【００４３】
一部の実施形態では、第１のエマルジョン成分は、複数回（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、２０回、３０回、４０回、５０回、またはそれ以上）均質化することができる。容器とホモジナイザを長く連続させなくても良いように、代わりに、エマルジョン成分を循環させることができる（例えば、図１の特徴（１１）に示されているように）。具体的には、第１のエマルジョンは、第１のエマルジョン成分をホモジナイザに複数回（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、２０回、３０回、４０回、５０回、１００回など）通して循環させることによって形成することができる。しかしながら、多過ぎるサイクルは、参考文献１４に記載されているように再合体をもたらし得るため、望ましくないであろう。したがって、ホモジナイザ循環を用いる場合は、望ましい油滴サイズに達したこと、および／または再合体が起きていないことをチェックするために、油滴のサイズをモニタリングすることができる。
【００４４】
ホモジナイザに通す循環は、第１のエマルジョン中の油滴の平均サイズを減少できるため有利である。循環はまた、第１のエマルジョン中のサイズが１．２μｍを超える油滴の数を減少させることができるため有利である。第１のエマルジョン中の平均油滴サイズおよび１．２μｍを超える油滴の数におけるこれらの減少は、下流のプロセス（複数可）に利点をもたらし得る。具体的には、第１のエマルジョン成分のホモジナイザを通る循環は、マイクロフルイダイゼーションプロセスの改善をもたらし得、このことは、第２のエマルジョン中（すなわちマイクロフルイダイゼーション後）のサイズが１．２μｍを超える油滴の数を減少させることができる。第２のエマルジョンパラメータのこの改善は、ろ過成績の改善をもたらし得る。改善されたろ過成績は、ろ過中の内容物のロス、例えば、水中油型エマルジョンがＭＦ５９の場合は、スクアレン、Ｔｗｅｅｎ８０、およびＳｐａｎ８５のロスを減らすことにつながり得る。
【００４５】
２つの特定の型の循環は、本明細書では「Ｉ型」および「ＩＩ型」と呼ばれる。Ｉ型循環は、図５に例示され、ＩＩ型循環は、図６に例示されている。
【００４６】
第１のエマルジョン成分の循環は、第１のプレミックス容器とホモジナイザとの間で第１のエマルジョン成分を移動させるＩ型循環を含み得る。第１のプレミックス容器は、サイズを５０〜５００Ｌ、例えば、１００〜４００Ｌ、１００〜３００Ｌ、２００〜３００Ｌ、２５０Ｌ、または２８０Ｌとすることができる。第１のプレミックス容器は、ステンレス鋼から製造することができる。Ｉ型循環は、１０〜６０分間、例えば、１０〜４０分間または２０分間続けることができる。
【００４７】
第１のエマルジョン成分の循環は、第１のエマルジョン成分を第１のプレミックス容器から第１のホモジナイザを経て第２のプレミックス容器（任意選択で、第１のプレミックス容器と同じ特性を有する）へ、そして第２のホモジナイザに移動させるＩＩ型循環を含み得る。第２のホモジナイザは、通常は、第１のホモジナイザと同じであるが、一部の構成（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）では、第１のホモジナイザと第２のホモジナイザは異なる。第１のエマルジョン成分の第２のホモジナイザの通過後、例えば、ＩＩ型循環プロセスが繰り返される場合は、第１のエマルジョン成分を、第１のプレミックス容器に戻すことができる。したがって、エマルジョン成分は、単一ホモジナイザを通って第１のプレミックス容器と第２のプレミックス容器との間の８の字経路を移動することができる（図６を参照）。ＩＩ型循環は、単回または複数回、例えば、２回、３回、４回、５回行うことができる。
【００４８】
ＩＩ型循環は、第１のエマルジョンの全ての成分がホモジナイザを確実に通ることを助け得るため、Ｉ型循環と比べて有利である。第１のプレミックス容器が空になることは、エマルジョンの全内容物が、ホモジナイザを通って第２のプレミックス容器内に移動したことを意味する。同様に、第２のプレミックス容器の内容物も空にすることができ、同様に、これらの全内容物がホモジナイザを通ったことが確実になる。したがって、ＩＩ型の構成は、好都合に、エマルジョン成分のすべてを少なくとも２回、確実に均質化することができ、これにより、第１のエマルジョン中の油滴の平均サイズを減少させ、サイズが１．２μｍを超える油滴の数を減少させることができる。したがって、理想的なＩＩ型循環では、第１のプレミックス容器を空にし、実質的にその内容物のすべてをホモジナイザに通して第２のプレミックス容器に送り、次いで第２のプレミックス容器を空にし、実質的にその内容物のすべてを、ホモジナイザに再び通して第１のプレミックス容器に戻す。したがって、すべての粒子がホモジナイザを少なくとも２回通過することになるが、これを、Ｉ型循環で達成するのは困難である。
【００４９】
一部の実施形態では、Ｉ型循環とＩＩ型循環の組み合わせが使用され、この組み合わせは、良好な特質の第１のエマルジョンを提供することができる。具体的には、この組み合わせは、第１のエマルジョン中のサイズが１．２μｍを超える油滴の数を大幅に減少させることができる。この組み合わせには、任意の順序のＩ型循環とＩＩ型循環、例えば、Ｉ型の後にＩＩ型、ＩＩ型の後にＩ型、Ｉ型の後にＩＩ型そして再びＩ型などが含まれ得る。一実施形態では、この組み合わせは、２０分間のＩ型循環の後に１回のＩＩ型循環、すなわち循環した第１のエマルジョン成分を第１のプレミックス容器から第１のホモジナイザに通して第２のプレミックス容器へ、そして第２のホモジナイザに１回通すことを含む。
【００５０】
第１のプレミックス容器および第２のプレミックス容器は、不活性ガス、例えば、窒素下で、例えば、最大０．５バールに維持することができる。これにより、エマルジョン成分の酸化を防止することができ、エマルジョン成分の１つがスクアレンである場合に特に有利である。これは、エマルジョンの安定性を高めることができる。
【００５１】
上述のように、ホモジナイザへの最初の入力は、第１のエマルジョン成分の均質化されていない混合物とすることができる。この混合物は、個々の第１のエマルジョン成分を別個に混合することにより調製することができるが、一部の実施形態では、この混合の前に複数の成分を組み合わせても良い。例えば、このエマルジョンが、ＨＬＢが１０未満の界面活性剤を含む場合は、混合の前にこの界面活性剤を油と組み合わせても良い。同様に、エマルジョンが、ＨＬＢが１０を超える界面活性剤を含む場合は、混合の前にこの界面活性剤を水性成分と組み合わせても良い。緩衝塩を、混合の前に水性成分と組み合わせても良いし、または別個に添加しても良い。
【００５２】
本発明の方法は、大規模で使用することができる。したがって、ある方法は、１リットルを超える容積、例えば、≧５リットル、≧１０リットル、≧２０リットル、≧５０リットル、≧１００リットル、≧２５０リットルなどの第１のエマルジョンを調製することを含み得る。
【００５３】
第１のエマルジョンの形成後、第１のエマルジョンをマイクロフルイダイズしても良いし、または保管してマイクロフルイダイゼーションを待っても良い。
【００５４】
一部の実施形態では、具体的には、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）のサイクルが複数回使用される場合は、ホモジナイザへの入力は、マイクロフルイダイザの出力であるため、第１のエマルジョンは、マイクロフルイダイズされてから再び均質化に供される。
【００５５】
（マイクロフルイダイゼーション）
第１のエマルジョンの形成後、第１のエマルジョンの平均油滴サイズを減少させ、かつ／またはサイズが１．２μｍを超える油滴の数を減少させるために、第１のエマルジョンをマイクロフルイダイズする。
【００５６】
マイクロフルイダイゼーション器械は、入力成分のストリームを、形状が固定されたチャネル内を高圧高速で前進させることによって平均油滴サイズを減少する。相互作用チャンバの入口の圧力（「第１の圧力」とも呼ばれる）は、成分がマイクロフルイダイザに供給されている期間の少なくとも８５％の間、例えば、エマルジョンがマイクロフルイダイザに供給されている期間の少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％の間、実質的に一定（すなわち、±１５％；例えば、±１０％、±５％、±２％）であり得る。
【００５７】
一実施形態では、第１の圧力は、エマルジョンがマイクロフルイダイザに供給されている期間の８５％の間、１３００バール±１５％（１８ｋＳＰＩ±１５％）、すなわち１１００バール〜１５００バール（１５ｋＳＰＩ〜２１ｋＳＰＩ）である。２つの適切な圧力プロフィールが図３に示されている。図３Ａでは、圧力は、上記期間の少なくとも８５％の間、実質的に一定であるが、図３Ｂでは、圧力は、連続して実質的に一定に維持される。
【００５８】
マイクロフルイダイゼーション器具は、典型的には、少なくとも１つの増強ポンプ（ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｅｒ  ｐｕｍｐ）（好ましくは、同期させることができる２つのポンプ）および相互作用チャンバを備えている。増強ポンプは、理想的には電気油圧駆動式であり、高圧（すなわち、第１の圧力）をかけてエマルジョンを、相互作用チャンバに通す。増強ポンプの同期性を利用して、上記のエマルジョンを実質的に一定の圧力で供給し得る。すなわち、マイクロフルイダイゼーション中に、エマルジョン滴がすべて、実質的に同レベルのせん断力に曝露される。
【００５９】
実質的に一定の圧力を使用することの１つの利点は、マイクロフルイダイゼーションデバイスの疲労破壊を低減することができ、これにより、デバイスの寿命が延び得ることである。実質的に一定の圧力を使用することのさらなる利点は、第２のエマルジョンのパラメータが改善され得ることである。具体的には、第２のエマルジョン中に存在するサイズが１．２μｍを超える油滴の数を減少させることができる。さらに、実質的に一定の圧力が使用される場合は、第２のエマルジョンの平均油滴サイズが減少し得る。第２のエマルジョン中の平均油滴サイズの減少およびサイズが１．２μｍを超える油滴の数の減少により、ろ過成績の改善が提供され得る。ろ過成績の改善は、ろ過中の内容物のロス、例えば、エマルジョンがＭＦ５９の場合はスクアレン、Ｔｗｅｅｎ８０、およびＳｐａｎ８５のロスの低減をもたらし得る。
【００６０】
相互作用チャンバは、複数、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０などの固定形状のチャネルを備えことができ、これらのチャネル内をエマルジョンが通る。エマルジョンは、２００〜２５０μｍの直径を有し得る入力ラインから相互作用チャンバに入る。エマルジョンは、相互作用チャンバに入ると複数のストリームに分かれ、高圧下で高速に加速される。エマルジョンがチャネルを通ると、高圧によって生じる力が、エマルジョンの油滴サイズを減少させ、かつサイズが１．２μｍを超える油滴の数を減少させるように作用し得る。これらの力には、以下が含まれ得る：チャネル壁との接触により生じるエマルジョンストリームの変形によるせん断力；高速のエマルジョンストリームが互いに衝突したときに起こる衝突による衝撃力；およびストリーム内でのキャビティの形成および崩壊によるキャビテーション力。相互作用チャンバは、通常は、可動部品を備えていない。相互作用チャンバは、セラミック（例えば、アルミナ）またはダイヤモンド（例えば、多結晶ダイヤモンド）のチャネル表面を備えることができる。他の表面は、ステンレス鋼から形成しても良い。
【００６１】
相互作用チャンバの固定形状の複数のチャネルは、「Ｙ」型形状または「Ｚ」型形状とすることができる。
【００６２】
Ｙ型形状の相互作用チャンバでは、１つの入力エマルジョンストリームが、第１のエマルジョンストリームと第２のエマルジョンストリームに分割され、次いでこれらのストリームが再結合して１つの出力エマルジョンストリームになる。再結合の前に、第１のエマルジョンストリームおよび第２のエマルジョンストリームは、それぞれ別個に、第１および第２の複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０など）のサブストリームに分割され得る。エマルジョンストリームが再結合される場合、第１および第２のエマルジョンストリーム（またはそれらのサブストリーム）は、理想的には、実質的に反対方向に流れる（例えば、第１および第２のエマルジョンストリームまたはそれらのサブストリームは、実質的に同じ平面（±２０度）を流れ、第１のエマルジョンストリームの流れる方向は、第２のエマルジョンストリームの流れる方向とは１８０±２０度異なる）。エマルジョンストリームが再結合するときに生じる力が、エマルジョンの油滴サイズを減少させ、かつサイズが１．２μｍを超える油滴の数を減少させるように作用し得る。
【００６３】
Ｚ型形状の相互作用チャンバでは、エマルジョンストリームは、実質的に直角の角（すなわち、９０±２０度）を複数回（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回など）通る。図４は、Ｚ型形状の相互作用チャンバ、および流れの方向における２つの直角な角を例示している。入力エマルジョンストリームが直角の角を通る際に、この入力エマルジョンストリームは、複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０など）のサブストリームに分割され、次いで１つの出力エマルジョンストリームに再結合され得る（例えば、サブストリーム（３２）が４つの図４に示されているように）。分割およびそれに続く再結合（３１）は、入力と出力との間のどの位置でも起こり得る。エマルジョンが角を通るときにチャネル壁と接触して生じる力は、エマルジョンの油滴サイズを減少させ、かつサイズが１．２μｍを超える油滴の数を減少させるように作用し得る。Ｚ型相互作用チャンバの例として、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社のＥ２３０Ｚ相互作用チャンバが挙げられる。
【００６４】
一実施形態では、エマルジョンストリームは、２つの実質的に直角な角を通る。入力エマルジョンストリームが、第１の実質的に直角な角を通る時点で、この入力エマルジョンストリームは、５つのサブストリームに分割される。これらのサブストリームが、第２の実質的に直角な角を通る時点で、これらのサブストリームは、１つの出力エマルジョンストリームに再結合される。
【００６５】
従来技術では、本発明のような水中油型エマルジョンにＹ型相互作用チャンバを使用することが普通であった。しかしながら、Ｚ型チャネル形状の相互作用チャンバは、Ｙ型形状の相互作用チャンバと比較して、第２のエマルジョン中に存在するサイズが１．２μｍを超える油滴の数を大幅に減少させ得るため、Ｚ型チャネル形状の相互作用チャンバを水中油型エマルジョンに使用することが有利であることを見出した。第２のエマルジョン中のサイズが１．２μｍを超える油滴の数の減少により、ろ過成績の改善が提供され得る。ろ過成績の改善は、ろ過中の内容物のロス、例えば、エマルジョンがＭＦ５９の場合はスクアレン、Ｔｗｅｅｎ８０、およびＳｐａｎ８５のロスの低減をもたらし得る。
【００６６】
好ましいマイクロフルイダイゼーション器具は、１７０バール〜２７５０バール（約２５００ｐｓｉ〜４００００ｐｓｉ）、例えば、約３４５バール、約６９０バール、約１３８０バール、約２０７０バールなどの圧力で作動する。
【００６７】
好ましいマイクロフルイダイゼーション器具は、最大２０Ｌ／分、例えば、最大１４Ｌ／分、最大７Ｌ／分、最大３．５Ｌ／分などの流量で作動する。
【００６８】
好ましいマイクロフルイダイゼーション器具は、１×１０６ｓ−１を超える、例えば、≧２．５×１０６ｓ−１、≧５×１０６ｓ−１、≧１０７ｓ−１などのせん断速度をもたらす相互作用チャンバを有する。
【００６９】
マイクロフルイダイゼーション器具は、例えば、２つ、３つ、４つ、または５つ以上の並列で使用される複数の相互作用チャンバを備えても良いが、１つの相互作用チャンバを備えることがより有用である。
【００７０】
マイクロフルイダイゼーションデバイスは、少なくとも１つのチャネルを備える補助処理モジュール（ＡＰＭ：マイクロフルイダイザにおいて背圧チャンバとしても知られている−これらの用語は本明細書では同義的に使用される）を備えることができる。ＡＰＭは、マイクロフルイダイゼーションデバイスを通るエマルジョンの油滴の平均サイズの減少に寄与するが、この減少の殆どは、相互作用チャンバで起こる。上記のように、エマルジョン成分は、第１の圧力下で増強ポンプ（複数可）によって相互作用チャンバに導入される。エマルジョン成分は、一般に、第１の圧力よりも低い第２の圧力（例えば、大気圧）でＡＰＭから出る。一般に、相互作用チャンバの中（例えば、図４のＰ１からＰ２）で、第１の圧力と第２の圧力との間の圧力差のうちの８０〜９５％の低下があり、補助処理モジュールの中で、第１の圧力と第２の圧力との間の圧力差のうちの５〜２０％の低下があり、例えば、相互作用チャンバで、約９０％の圧力低下が起こり得、ＡＰＭで、約１０％の圧力低下が起こり得る。相互作用チャンバの中での圧力低下および補助処理モジュールの中での圧力低下が、第１の圧力と第２の圧力との間の全圧力差に一致しない場合、これは、相互作用チャンバと補助処理モジュールと間にあるコネクタの中での有限の圧力低下によるものであり得る。
【００７１】
ＡＰＭは、通常は、可動部品を備えていない。ＡＰＭは、セラミック（例えば、アルミナ）またはダイヤモンド（例えば、多結晶ダイヤモンド）のチャネル表面を備えることができる。他の表面は、ステンレス鋼から形成することができる。
【００７２】
ＡＰＭは、一般に、相互作用チャンバの下流に配置され、さらに、この相互作用チャンバに連続して配置され得る。従来技術では、ＡＰＭは、一般に、キャビテーションを抑制してＹ型チャンバの流量を最大３０％増加させるためにＹ型チャネルを備えた相互作用チャンバの下流に配置される。さらに、従来技術では、ＡＰＭは、一般に、大きい凝集塊のサイズを減少させるためにＺ型チャネルを備えた相互作用チャンバの上流に配置される。後者の場合、ＡＰＭは、Ｚ型チャンバの流量を最大３％減少させるだけである。しかしながら、複数のＺ型チャネルを備えた相互作用チャンバの下流にＡＰＭを配置することにより、第２のエマルジョン中の平均油滴サイズの大幅な減少、および第２のエマルジョン中に存在するサイズが１．２μｍを超える油滴の数の大幅な減少をもたらし得るため、この配置が、本発明において有利であることが見出された。上述のように、第２のエマルジョン中のサイズが１．２μｍを超える油滴の数の減少により、ろ過成績が改善され得る。ろ過成績の改善は、ろ過中の内容物のロス、例えば、水中油型エマルジョンがＭＦ５９の場合はスクアレン、Ｔｗｅｅｎ８０、およびＳｐａｎ８５のロスの低減をもたらし得る。Ｚ型相互作用チャンバおよび下流のＡＰＭのこの配置のさらなる利点は、上記相互作用チャンバの後、圧力をゆっくりと低下させることができることである。この圧力のゆっくりとした低下は、エマルジョン中に含まれるガスが少なくなるため、生産安定性の向上をもたらし得る。
【００７３】
ＡＰＭは、内部をエマルジョンが通る少なくとも１つの固定形状のチャネルを備えている。ＡＰＭは、複数、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０などの固定形状のチャネルを備えることができ、これらのチャネル内をエマルジョンが通る。ＡＰＭのチャネルまたは複数のチャネルは、線形であっても、非線形であっても良い。適切な非線形チャネルは、「Ｚ」型形状または「Ｙ」型形状のチャネルであり、これらのチャネルは、相互作用チャンバに関して上に記載されたチャネルと同じである。一実施形態では、ＡＰＭのチャネルまたは複数のチャネルは、Ｚ型形状である。複数のＺ型チャネルは、エマルジョンがＡＰＭに入るときにこのエマルジョンを複数のストリームに分割する。
【００７４】
製造者の推奨とは対照的に、複数の固定形状のチャネルを備えたＡＰＭの使用は、第２のエマルジョン中に存在するサイズが１．２μｍを超える油滴の数の大幅な減少をもたらし得るため、このＡＰＭの使用は、１つの固定形状のチャネルのＡＰＭと比較して有利である。上述のように、第２のエマルジョン中のサイズが１．２μｍを超える油滴の数の減少により、ろ過成績が改善され得る。ろ過成績の改善は、ろ過中の内容物のロス、例えば、水中油型エマルジョンがＭＦ５９の場合はスクアレン、Ｔｗｅｅｎ８０、およびＳｐａｎ８５のロスの低減をもたらし得る。
【００７５】
マイクロフルイダイゼーション器具は、作動中に熱を発生し、この熱が、第１のエマルジョンに対してエマルジョンの温度を１５〜２０℃上昇させ得る。したがって、マイクロフルイダイズされたエマルジョンが、可能な限り迅速に冷却されることが有利である。第２のエマルジョンの温度は、６０℃未満、例えば、４５℃未満に維持することができる。したがって、相互作用チャンバの出力および／またはＡＰＭの出力を、冷却機構、例えば、熱交換器または冷却コイルに供給することができる。出力と冷却機構との間の距離は、冷却の遅延を減少させることによって全体の時間を短くするために、可能限り短く維持するべきである。一実施形態では、マイクロフルイダイザの出力と冷却機構との間の距離は、２０〜３０ｃｍである。冷却機構は、エマルジョンの過熱を防止するために、エマルジョンに対して複数のマイクロフルイダイゼーションステップが行われる場合に特に有用である。
【００７６】
マイクロフルイダイゼーションの結果、水中油型エマルジョン、すなわち油滴の平均サイズが５００ｎｍ以下の第２のエマルジョンとなる。この平均サイズは、エマルジョンのろ過滅菌を容易にするため特に有用である。油滴の数の少なくとも８０％が、５００ｎｍ以下、例えば、４００ｎｍ以下、３００ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、または１６５ｎｍ以下の平均サイズを有するエマルジョンが特に有用である。さらに、第２のエマルジョン中のサイズが１．２μｍを超える油滴の数は、５×１０１０／ｍｌ以下、例えば、５×１０９／ｍｌ以下、５×１０８／ｍｌ以下、または２×１０８／ｍｌ以下である。
【００７７】
マイクロフルイダイゼーションの最初の入力を、第１のエマルジョンとすることができる。しかしながら、一部の実施形態では、マイクロフルイダイズされたエマルジョンを再びマイクロフルイダイゼーションに供して、複数回のマイクロフルイダイゼーションが起きるようにする。具体的には、第２のエマルジョンは、第２のエマルジョン成分を複数回、例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、マイクロフルイダイゼーションデバイスを介して循環させることによって形成することができる。第２のエマルジョンは、第２のエマルジョン成分を４〜７回、マイクロフルイダイゼーションデバイスを介して循環させることによって形成することができる。
【００７８】
第２のエマルジョン成分の循環は、第２のエマルジョン成分を第１のエマルジョン容器（任意選択で、第１のプレミックス容器と同じ特性を有する）とマイクロフルイダイゼーションデバイスとの間を移動させるＩ型循環を含み得る。
【００７９】
第２のエマルジョン成分の循環は、第２のエマルジョン成分を第１のエマルジョン容器から第１のマイクロフルイダイゼーションデバイスを経て第２のエマルジョン容器（任意選択で、第１のプレミックス容器と同じ特性を有する）へ、そして第２のマイクロフルイダイゼーションデバイスに移動させるＩＩ型循環を含み得る。
【００８０】
第２のマイクロフルイダイゼーションデバイスは、第１のマイクロフルイダイゼーションデバイスと同じであっても良い。あるいは、第２のマイクロフルイダイゼーションデバイスは、第１のマイクロフルイダイゼーションデバイスと異なっていても良い。
【００８１】
第１のエマルジョン容器は、第１のプレミックス容器と同じであっても良い。あるいは、第１のエマルジョン容器は、第２のプレミックス容器と同じであっても良い。
【００８２】
第２のエマルジョン容器は、第１のプレミックス容器と同じであっても良い。あるいは、第２のエマルジョン容器は、第２のプレミックス容器と同じであっても良い。
【００８３】
第１のエマルジョン容器は、第１のプレミックス容器と同じであっても良く、第２のエマルジョン容器は、第２のプレミックス容器と同じであっても良い。あるいは、第１のエマルジョン容器は、第２のプレミックス容器と同じであっても良く、第２のエマルジョン容器は、第１のプレミックス容器と同じであっても良い。
【００８４】
代替として、第１のエマルジョン容器および第２のエマルジョン容器は、第１のプレミックス容器および第２のプレミックス容器と異なっても良い。
【００８５】
例えば、ＩＩ型循環プロセスが繰り返される場合は、第２のエマルジョン成分が第２のマイクロフルイダイゼーションデバイスを通った後、第２のエマルジョン成分を第１のエマルジョン容器に戻しても良い。ＩＩ型循環は、１回または複数回、例えば、２回、３回、４回、５回、行っても良い。
【００８６】
ＩＩ型循環は、すべての第２のエマルジョン成分を、確実に、マイクロフルイダイゼーションデバイスに少なくとも２回通して、第２のエマルジョン中の油滴の平均サイズを減少させ、かつサイズが１．２μｍを超える油滴の数を減少させるため、有利である。
【００８７】
マイクロフルイダイゼーション中に、Ｉ型循環とＩＩ型循環の組み合わせを使用しても良い。この組み合わせには、任意の順序のＩ型循環とＩＩ型循環、例えば、Ｉ型の後にＩＩ型、ＩＩ型の後にＩ型、Ｉ型の後にＩＩ型そして再びＩ型などが含まれ得る。
【００８８】
第１のエマルジョン容器および第２のエマルジョン容器は、不活性ガス下、例えば、最大０．５バールの窒素下で維持することができる。こうすることにより、エマルジョン成分の酸化が防止され、これは、エマルジョン成分の１つがスクアレンの場合は特に有利である。このことは、エマルジョンの安定性を向上させる。
【００８９】
本発明の方法は、大規模に使用することができる。したがって、ある方法では、１リットルを超える容積、例えば、≧５リットル、≧１０リットル、≧２０リットル、≧５０リットル、≧１００リットル、≧２５０リットルなどの容積をマイクロフルイダイズすることを含み得る。
【００９０】
（ろ過）
マイクロフルイダイゼーション後、第２のエマルジョンがろ過される。このろ過は、均質化およびマイクロフルイダイゼーションで残存した任意の大きい油滴を除去する。これらの油滴は、数は少ないが、体積が大きいことがあり、凝集の核形成部位として機能して、保管中にエマルジョンの劣化をもたらし得る。さらに、このろ過ステップは、ろ過滅菌を達成することができる。
【００９１】
ろ過滅菌に適した特定のろ過膜は、第２のエマルジョンの流体特性および必要なろ過の程度によって異なる。フィルタの特性は、マイクロフルイダイズされたエマルジョンのろ過の安定性に影響を与え得る。例えば、ろ過膜の孔サイズおよび表面特性は、特に、スクアレンベースのエマルジョンをろ過する際に重要であり得る。
【００９２】
本発明に使用される膜の孔サイズは、望ましい液滴は通過させるが、望ましくない液滴は留めるサイズであるべきである。例えば、この孔サイズは、サイズが１μｍ以上の液滴は留めるが、２００ｎｍ未満の液滴は通過させるサイズであるべきである。０．２μｍまたは０．２２μｍフィルタが理想的であり、ろ過滅菌を達成することもできる。
【００９３】
エマルジョンは、例えば、０．４５μｍフィルタに通して前ろ過（ｐｒｅｆｉｌｔｅｒ）しても良い。前ろ過およびろ過は、孔が大きい第１の膜層および孔が小さい第２の膜層を備えた既知の二重層フィルタの使用によって１つのステップで達成することができる。二重層フィルタは、特に本発明に有用である。第１の層は、理想的には、０．３μｍよりも大きい、例えば、０．３〜２μｍ、０．３〜１μｍ、０．４〜０．８μｍ、または０．５〜０．７μｍの孔サイズを有する。孔サイズが０．７５μｍ以下の第１の層が好ましい。したがって、第１の層は、例えば、０．６μｍまたは０．４５μｍの孔サイズを有しても良い。第２の層は、理想的には、第１の層の孔サイズの７５％未満（理想的には半分未満）、例えば、第１の層の孔サイズの２５〜７０％または２５〜４９％、例えば、３０〜４５％、例えば、第１の層の孔サイズの１／３または４／９である孔サイズを有する。したがって、第２の層は、０．３μｍ未満、例えば、０．１５〜０．２８μｍまたは０．１８〜０．２４μｍ、例えば、０．２μｍまたは０．２２μｍの孔サイズを有する。一例では、大きい孔を有する第１の膜層は、０．４５μｍフィルタを提供し、小さい孔を有する第２の膜層は、０．２２μｍフィルタを提供する。
【００９４】
ろ過膜および／または前ろ過膜は、非対称であっても良い。非対称膜は、膜の一つの側から他の側にかけて孔サイズが異なる膜、例えば、出口面よりも入口面で孔サイズが大きい膜である。非対称膜の一つの側は、「粗孔面」と呼ぶことができ、非対称膜の他の側は、「細孔面」と呼ぶことができる。二重層フィルタでは、一方の層を非対称としても良いし、または両方の層を非対称としても良い（理想的）。
【００９５】
ろ過膜は、多孔質または均質であり得る。均質膜は、通常は、１０〜２００μｍの範囲の高密度フィルムである。多孔質膜は、多孔質構造を有する。一実施形態では、ろ過膜は多孔質である。二重層フィルタでは、両方の層が多孔質であっても良いし、両方の層が均質であっても良いし、または一つが多孔質層で一つが均質層であっても良い。好ましい二重層フィルタは、両方の層が多孔質のフィルタである。
【００９６】
一実施形態では、第２のエマルジョンは、非対称の親水性多孔質膜に通して前ろ過され、次いで前ろ過膜よりも孔が小さい別の非対称の親水性多孔質膜に通してろ過される。これには、二重層フィルタを使用することができる。
【００９７】
ろ過膜（複数可）は、無菌であることを確実にするために、使用前にオートクレーブすることができる。
【００９８】
ろ過膜は、典型的には、ポリマー支持物質、例えば、ＰＴＦＥ（ポリ−テトラ−フルオロ−エチレン）、ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）、ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）、ナイロン（ポリアミド）、ＰＰ（ポリプロピレン）、セルロース（セルロースエステルを含む）、ＰＥＥＫ（ポリエーテルエーテルケトン）、ニトロセルロースなどから形成される。これらは、様々な性質を有し、一部の支持物質が本質的に疎水性であり（例えば、ＰＴＦＥ）、他が本質的に親水性である（例えば、酢酸セルロース）。しかしながら、これらの本質的な性質は、膜表面を処理することによって変更することができる。例えば、膜表面を他の物質（例えば、他のポリマー、グラファイト、シリコーンなど）で処理して膜表面をコーティングすることによって親水性化膜または疎水性化膜を調製することが知られている。例えば、参考文献１５のセクション２．１を参照されたい。二重層フィルタでは、２つの膜を、異なる物質から形成しても良いし、または同じ物質から形成しても良い（理想的）。
【００９９】
本発明に使用するのに理想的なフィルタは、親水性表面を有しており、疎水性（ポリスルホン）フィルタを使用するべきである参考文献９〜１２の教示とは対照的である。親水性表面を有するフィルタは、親水性物質から、または疎水性物質の親水性化によって形成することができ、本発明に使用するのに好ましいフィルタは、親水性ポリエーテルスルホン膜である。疎水性ＰＥＳ膜を親水性ＰＥＳ膜に変換するいくつかの異なる方法が知られている。多くの場合、これは、膜を親水性ポリマーでコーティングすることによって達成される。親水性ポリマーをＰＥＳへ永続的に付着させるために、親水性コーティング層を、通常は、架橋反応またはグラフティングに供する。参考文献１５は、官能化鎖末端を有する疎水性ポリマーの表面特性を変更するプロセスであって、このポリマーをリンカー部分の溶液に接触させて共有結合を形成させ、次いで反応した疎水性ポリマーを改変剤の溶液に接触させるステップを含む、プロセスを開示している。参考文献１６は、膜の直接コーティングによるＰＥＳ膜の親水性化の方法であって、アルコールで予め湿らせるステップ、次いで親水性モノマー、多官能性モノマー（架橋剤）、および重合開始剤を含む水性溶液中に浸漬するステップを含む方法を開示している。次いで、このモノマーおよび架橋剤を、熱またはＵＶ開始重合を用いて重合させて、膜表面に架橋親水性ポリマーのコーティングを形成する。同様に、参考文献１７および１８は、ＰＥＳ膜を、親水性ポリマー（ポリアルキレンオキシド）および少なくとも１つの多官能性モノマー（架橋剤）の水性溶液に浸漬し、次いでモノマーを重合させて抽出可能ではない親水性コーティングを提供することによるＰＥＳ膜のコーティングを開示している。参考文献１９は、ＰＥＳ膜を低温ヘリウムプラズマ処理し、次いでこの膜表面に親水性モノマーＮ−ビニル−２−ピロリドン（ＮＶＰ）をグラフトするグラフト反応によるＰＥＳ膜の親水性化を記載している。さらなるこのようなプロセスが、参考文献２０〜２６に開示されている。
【０１００】
コーティングに依存しない方法では、ＰＥＳを溶媒に溶解し、可溶性の親水性添加物とブレンドし、次いでブレンドした溶液を使用して、例えば、沈殿または共重合の開始によって親水性膜をキャスティングすることができる。このような方法は、参考文献２７〜３３に開示されている。例えば、参考文献３３は、１つの方法を開示しており、この方法では、膜抽出可能性が低く、かつ超純水抵抗性の迅速な回復を可能にする親水性の電荷変更膜を調製し、これは、架橋内部進入ポリマーネットワーク構造を有し、これは、ＰＥＳ、ＰＶＰ、ポリエチレンイミン、および脂肪族ジグリシジルエーテルのブレンドのポリマー溶液を形成し、溶液の薄フィルムを形成し、次いで膜として薄フィルムを沈降させることで形成される。同様のプロセスが、参考文献３４に開示されている。
【０１０１】
ハイブリッドアプローチを使用することもでき、このアプローチでは、親水性添加物が膜形成中に存在する。親水性添加物はまた、後でコーティング物として添加される。例えば、参考文献３５を参照されたい。
【０１０２】
ＰＥＳ膜の親水性化は、低温プラズマでの処理によっても達成することができる。参考文献３６は、低温ＣＯ２プラズマでの処理によるＰＥＳ膜の親水性への変更を記載している。
【０１０３】
ＰＥＳ膜の親水性化は、参考文献３７に記載されているように酸化によっても達成することができる。この方法は、表面張力が低い液体で疎水性ＰＥＳ膜を予め湿らせ、この湿らせたＰＥＳ膜を酸化剤の水性溶液に曝露し、次いで加熱することを含む。
【０１０４】
参考文献３８に記載されているように、相反転も使用することができる。
【０１０５】
理想的な親水性ＰＥＳ膜は、ＰＥＳ（疎水性）のＰＶＰ（親水性）での処理によって得ることができる。ＰＶＰではなくＰＥＧ（親水性）での処理では、詰まりやすく（特に、スクアレン含有エマルジョンを使用する場合）、かつ不都合にもオートクレーブ中にホルムアルデヒドを放出する親水性化ＰＥＳ膜となることが分かった。
【０１０６】
好ましい二重層フィルタは、第１の親水性ＰＥＳ膜および第２の親水性ＰＥＳ膜を有する。
【０１０７】
既知の親水性膜には、Ｂｉｏａｓｓｕｒｅ（Ｃｕｎｏ）；ＥｖｅｒＬＵＸＴＭポリエーテルスルホン；ＳＴｙＬＵＸＴＭポリエーテルスルホン（共に、Ｍｅｉｓｓｎｅｒ）；Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＶ、Ｍｉｌｌｅｘ  ＨＰ、Ｍｉｌｌｉｐａｋ６０、Ｍｉｌｌｉｐａｋ２００、およびＤｕｒａｐｏｒｅ  ＣＶＧＬ０１ＴＰ３膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）；ＦｌｕｏｒｏｄｙｎｅＴＭＥＸ  ＥＤＦ膜、ＳｕｐｏｒＴＭＥＡＶ；ＳｕｐｏｒＴＭＥＢＶ、ＳｕｐｏｒＴＭＥＫＶ（すべて、Ｐａｌｌ）；ＳａｒｔｏｐｏｒｅＴＭ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）；Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈの親水性ＰＥＳ膜；ならびにＷｏｌｆｔｅｃｈｎｉｋのＷＦＰＥＳ  ＰＥＳ膜が含まれる。
【０１０８】
ろ過中、エマルジョンを、４０℃以下、例えば、３０℃以下の温度に維持して、滅菌ろ過を容易に成功させることができる。一部のエマルジョンは、その温度が４０℃を超えると、滅菌フィルタを通過できないことがある。
【０１０９】
参考文献３９に記載されているように、ろ過ステップは、第２のエマルジョンの形成の２４時間以内、例えば、１８時間以内、１２時間以内、６時間以内、２時間以内、３０分以内に行うと有利である。なぜなら、この時間の後では、第２のエマルジョンを、フィルタを詰まらせずに滅菌フィルタに通すことが不可能になる場合があるからである。
【０１１０】
本発明の方法は、大規模に使用することができる。したがって、ある方法では、１リットルを超える容積、例えば、≧５リットル、≧１０リットル、≧２０リットル、≧５０リットル、≧１００リットル、≧２５０リットルなどの容積をろ過することを含み得る。
【０１１１】
（最終エマルジョン）
マイクロフルイダイゼーションおよびろ過の結果は、水中油型エマルジョンであり、このエマルジョンの油滴の平均サイズは、２２０ｎｍ未満、例えば、１５５±２０ｎｍ、１５５±１０ｎｍ、または１５５±５ｎｍであり得、サイズが１．２μｍを超える油滴の数は、５×１０８／ｍｌ以下、例えば、５×１０７／ｍｌ以下、５×１０６／ｍｌ以下、２×１０６／ｍｌ以下、または５×１０５／ｍｌ以下であり得る。
【０１１２】
本明細書に記載されるエマルジョン（第１のエマルジョンおよび第２のエマルジョンを含む）の平均油滴サイズは、一般に、５０ｎｍ以上である。
【０１１３】
本発明の方法は、大規模に使用することができる。したがって、ある方法は、１リットルを超える容積、例えば、≧５リットル、≧１０リットル、≧２０リットル、≧５０リットル、≧１００リットル、≧２５０リットルなどの最終エマルジョンを形成することを含み得る。
【０１１４】
水中油型エマルジョンを形成したら、滅菌ガラス瓶に移すことができる。ガラス瓶は、５Ｌ、８Ｌ、または１０Ｌのサイズとすることができる。あるいは、水中油型エマルジョンを、滅菌した柔軟性のバッグ（柔軟性バッグ）に移しても良い。柔軟性バッグは、５０Ｌ、１００Ｌ、または２５０Ｌのサイズとすることができる。加えて、柔軟性バッグをシステムに接続するために、この柔軟性バッグに１つ以上の滅菌コネクタを取り付けても良い。柔軟性バッグは、ガラス瓶よりも大きく、１つのバッチで製造されるすべてのエマルジョンを保管するために柔軟性バッグを交換する必要がない場合があることを意味するので、滅菌コネクタが取り付けられた柔軟性バッグの使用は、ガラス瓶と比べると有利である。これにより、エマルジョン製造用の滅菌された閉じた系を得ることができ、これは、最終エマルジョン中に不純物が存在する可能性を低減し得る。これは、最終エマルジョンが薬学的目的で使用される場合、例えば、最終エマルジョンがＭＦ５９アジュバントである場合に特に重要であり得る。
【０１１５】
最終エマルジョン中の油の好ましい量（容積％）は、２〜２０％、例えば、約１０％である。約５％または約１０％のスクアレン含有量が、特に有用である。３０〜５０ｍｇ／ｍｌ、例えば、３５〜４５ｍｇ／ｍｌ、３６〜４２ｍｇ／ｍｌ、３８〜４０ｍｇ／ｍｌなどのスクアレン含有量（ｗ／ｖ）が有用である。
【０１１６】
最終エマルジョン中の界面活性剤の好ましい量（重量％）は：ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０）が０．０２〜２％、特に約０．５％または約１％；ソルビタンエステル（例えば、Ｓｐａｎ８５）が０．０２〜２％、特に約０．５％または約１％；オクチルフェノキシポリオキシエタノールまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）が０．００１〜０．１％、特に０．００５〜０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ラウレス９）が０．１〜２０％、好ましくは０．１〜１０％、特に０．１〜１％または約０．５％である。４〜６ｍｇ／ｍｌ、例えば、４．１〜５．３ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０の含有量（ｗ／ｖ）が有用である。４〜６ｍｇ／ｍｌ、例えば、４．１〜５．３ｍｇ／ｍｌのトリオレイン酸ソルビタンの含有量（ｗ／ｖ）が有用である。
【０１１７】
このプロセスは、以下のいずれの水中油型エマルジョンの調製にも特に有用である。
【０１１８】
・スクアレン、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、およびトリオレイン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ８５）を含むエマルジョン。このエマルジョンの容積組成は、約５％スクアレン、約０．５％ポリソルベート８０、および約０．５％トリオレイン酸ソルビタンとすることができる。重量では、これらの量は、４．３％スクアレン、０．５％ポリソルベート８０、および０．４８％トリオレイン酸ソルビタンとなる。このアジュバントは、「ＭＦ５９」として知られている。ＭＦ５９エマルジョンは、有利なことに、クエン酸イオン、例えば、１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム緩衝液を含んでいる。
【０１１９】
・スクアレン、α−トコフェロール（理想的には、ＤＬ−α−トコフェロール）、およびポリソルベート８０を含むエマルジョン。これらのエマルジョンは、重量で、２〜１０％スクアレン、２〜１０％α−トコフェロール、および０．３〜３％ポリソルベート８０、例えば、４．３％スクアレン、４．７％α−トコフェロール、１．９％ポリソルベート８０を含み得る。スクアレン：トコフェロールの重量比は、より安定なエマルジョンを提供するため、好ましくは、１以下（例えば、０．９０）である。スクアレンとポリソルベート８０は、約５：２の容積比、または約１１：５の重量比で存在し得る。このような１つのエマルジョンは、ポリソルベート８０をＰＢＳに溶解して２％溶液にし、次いでこの溶液９０ｍｌを（ＤＬ−α−トコフェロール５ｇとスクアレン５ｍｌ）の混合物と混合し、次いでこの混合物をマイクロフルイダイズすることによって作製することができる。得られるエマルジョンは、サブミクロン、例えば、１００〜２５０ｎｍ、好ましくは約１８０ｎｍの油滴を有し得る。
【０１２０】
・スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）のエマルジョン。このエマルジョンは、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（「３ｄ−ＭＰＬ」）も含み得る。このエマルジョンは、リン酸緩衝液も含み得る。
【０１２１】
・スクアレン、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、およびトコフェロール（例えば、α−トコフェロールスクシナート）を含むエマルジョン。このエマルジョンは、これらの３つの成分を約７５：１１：１０の質量比（例えば、７５０μｇ／ｍｌ  ポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および１００μｇ／ｍｌ  α−トコフェロールスクシナート）で含み得、これらの濃度は、抗原由来のこれらの成分のあらゆる寄与を含むべきである。このエマルジョンは、３ｄ−ＭＰＬも含み得る。このエマルジョンは、サポニン、例えば、ＱＳ２１も含み得る。水相は、リン酸緩衝液を含み得る。
【０１２２】
・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）および疎水性非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステルまたはマンニドエステル、例えば、モノオレイン酸ソルビタンまたは「Ｓｐａｎ８０」）を含むエマルジョン。このエマルジョンは、好ましくは、熱可逆性であり、かつ／またはサイズが２００ｎｍ未満の油滴を少なくとも９０％（容積で）含む［４０］。このエマルジョンはまた、アルジトール；凍結防止剤（例えば、糖、例えば、ドデシルマルトシドおよび／またはスクロース）；および／またはアルキルポリグリコシドの１つ以上も含み得る。このエマルジョンはまた、ＴＬＲ４アゴニスト、例えば、化学構造が糖環を含まないものも含み得る［４１］。このようなエマルジョンは、凍結乾燥しても良い。
【０１２３】
百分率で上に明示したこれらのエマルジョン組成は、それらの割合が変わらないように希釈または濃縮（例えば、整数倍、例えば、２倍もしくは３倍、または分数、例えば、２／３もしくは３／４）によって変更しても良い。例えば、２倍濃縮のＭＦ５９は、約１０％スクアレン、約１％ポリソルベート８０、および約１％トリオレイン酸ソルビタンを含む。濃縮された形態は、希釈して（例えば、抗原溶液で）望ましい最終濃度のエマルジョンを得ることができる。
【０１２４】
本発明のエマルジョンは、理想的には、２℃〜８℃で保管される。本発明のエマルジョンは、凍結するべきではない。本発明のエマルジョンは、理想的には、直射日光に当てないようにすべきである。具体的には、本発明のスクアレン含有エマルジョンおよびワクチンは、スクアレンの光化学的分解を防止するために保護されるべきである。本発明のエマルジョンを保管する場合は、不活性雰囲気、例えば、Ｎ２またはアルゴン中で保管するのが好ましい。
【０１２５】
（ワクチン）
患者に水中油型エマルジョンアジュバントそれだけを投与することも可能であるが（例えば、患者に別個に投与された抗原に対してアジュバント効果を与えるために）、投与の前にアジュバントを抗原と混合して、免疫原性組成物、例えば、ワクチンを形成するのがより有用である。エマルジョンと抗原の混合は、使用時に即席で行っても良いし、または充填前にワクチンの製造中に行っても良い。本発明の方法は、双方の場合に適用することができる。
【０１２６】
したがって、本発明の方法は、エマルジョンを抗原成分と混合するさらなるプロセスステップを含み得る。代替として、本発明の方法は、抗原成分と共に、アジュバントをキットの成分としてキット内にパッケージングするさらなるステップを含み得る。
【０１２７】
したがって、概して、本発明は、混合ワクチンを調製する場合、または混合の準備ができている抗原とアジュバントを含むキットを調製する場合に使用することができる。製造中に混合が行われる場合、混合されるバルク抗原およびエマルジョンの容積は、典型的には、１リットルを超える容積、例えば、≧５リットル、≧１０リットル、≧２０リットル、≧５０リットル、≧１００リットル、≧２５０リットルなどである。使用時に混合が行われる場合、混合される容積は、典型的には、１ミリリットル未満、例えば、≦０．６ｍｌ、≦０．５ｍｌ、≦０．４ｍｌ、≦０．３ｍｌ、≦０．２ｍｌなどである。いずれの場合も、実質的に等容積、すなわち実質的に１：１（例えば、１．１：１〜１：１．１、好ましくは１．０５：１〜１：１．０５、より好ましくは１．０２５：１〜１：１．０２５）のエマルジョンと抗原溶液が混合されるのが有用である。しかしながら、一部の実施形態では、過剰なエマルジョンまたは過剰な抗原を使用しても良い［４２］。過剰な容積の１つの成分が使用される場合、この過剰とは、一般に、少なくとも１．５：１、例えば、≧２：１、≧２．５：１、≧３：１、≧４：１、≧５：１などである。
【０１２８】
抗原とアジュバントがキット内で別個の成分として存在する場合は、これらの成分は、キット内で互いに物理的に分離されており、この分離は、様々な方法で達成することができる。例えば、成分は、別個の容器、例えば、バイアルに入れることができる。２つのバイアルの内容物を、例えば、１つのバイアルの内容物を出して他のバイアルに添加することによって、または両方のバイアルの内容物を別個に出して第３の容器内で混合することによって、必要なときに混合することができる。
【０１２９】
別の構成では、キットの１つの成分がシリンジに入れられ、他方の成分が、容器、例えば、バイアルに入れられている。シリンジを使用して（例えば、針で）その内容物をバイアルに入れて混合し、次いでこの混合物をシリンジ内に回収することができる。次いで、シリンジの混合内容物を、典型的には、新しい滅菌針によって患者に投与することができる。シリンジ内に１つの成分をパッキングしておくことにより、患者への投与のために別個のシリンジを使用する必要がなくなる。
【０１３０】
別の好ましい構成では、２つのキットの成分を、同じシリンジ、例えば、２チャンバシリンジ、例えば、参考文献４３〜５０などに開示されているようなシリンジ内に共に、しかし別個に維持する。シリンジを動作させると（例えば、患者に投与する際）、２チャンバの内容物が混合される。この構成では、使用時に別個の混合ステップが必要ない。
【０１３１】
様々なキットの成分の内容物は、一般に全て液体形態である。一部の構成では、成分（典型的には、エマルジョン成分ではなく抗原成分）は、乾燥形態（例えば、凍結乾燥形態）であり、他の成分は、液体形態である。乾燥成分を再活性化させて、患者に投与する液体組成物にするために２つの成分を混合することができる。凍結乾燥成分は、典型的には、シリンジではなくバイアル内に入れられる。乾燥成分は、安定剤、例えば、ラクトース、スクロース、またはマンニトール、およびそれらの混合物、例えば、ラクトース／スクロース混合物、スクロース／マンニトール混合物などを含み得る。１つの可能な構成では、シリンジに予め充填された液体エマルジョン成分およびバイアル内の凍結乾燥抗原成分を使用する。
【０１３２】
ワクチンが、エマルジョンおよび抗原の他に成分を含む場合は、これらのさらなる成分は、これらの２つのキットの成分の１つに含めても良いし、または第３のキットの成分の一部としても良い。
【０１３３】
本発明の混合ワクチンおよび個々のキットの成分に適した容器には、バイアルおよび使い捨てシリンジが含まれる。これらの容器は、無菌であるべきである。
【０１３４】
組成物／成分がバイアル内にある場合、バイアルは、好ましくは、ガラスまたはプラスチック物質から形成される。バイアルは、好ましくは、組成物が添加される前に滅菌される。ラテックス感受性患者の問題を回避するために、バイアルは、好ましくは、ラテックスを含まないストッパーでシールされ、ラテックスがいずれのパッケージング物質にも含まれないのが好ましい。一実施形態では、バイアルは、ブチルゴムストッパーを有する。バイアルは、単一用量のワクチン／成分を含んでも良いし、または２以上の用量（「複数用量」バイアル）、例えば、１０用量を含んでも良い。一実施形態では、バイアルは、１０×０．２５ｍｌ用量のエマルジョンを含む。好ましいバイアルは、無色のガラスから形成される。
【０１３５】
バイアルは、予め充填されたシリンジをキャップ内に挿入して、シリンジの内容物をバイアルに排出し（例えば、内部の凍結乾燥物質を再構成するため）、次いでバイアルの内容物をシリンジ内に戻すことができるように適合されたキャップ（例えば、ルアーロック）を備えることができる。シリンジをバイアルから取り外したら、針を取り付けて、組成物を患者に投与することができる。キャップは、好ましくは、シールまたはカバーの内部に配置され、キャップにアクセスできるようになる前には、このシールまたはカバーを除去しなければならない。
【０１３６】
組成物／成分がシリンジ内にパッケージングされている場合は、シリンジには、通常は針が取り付けられていないが、組み合わせて使用するために別個の針がシリンジと共に供給され得る。安全針が好ましい。１インチ２３ゲージ、１インチ２５ゲージ、および５／８インチ２５ゲージ針が典型的である。シリンジは、記録管理を容易にするために表面にロット番号、インフルエンザシーズン、および内容物の有効期限を印刷することができる剥離ラベルを備えても良い。シリンジ内のプランジャは、好ましくは、このプランジャが吸引中に誤ってはずれてしまうことを防止するストッパーを有する。シリンジは、ラテックスゴムキャップおよび／またはプランジャを備えても良い。使い捨てシリンジは、単一用量のワクチンを含む。シリンジは、一般に、針の取り付け前に先端部をシールする先端部キャップを備え、この先端部キャップは、ブチルゴムから形成されるのが好ましい。シリンジと針が別個にパッケージングされる場合は、針に、ブチルゴムシールドを取り付けるのが好ましい。
【０１３７】
エマルジョンは、バイアルまたはシリンジにパッケージングする前に緩衝液で希釈しても良い。典型的な緩衝液には：リン酸緩衝液；Ｔｒｉｓ緩衝液；ホウ酸緩衝液；コハク酸緩衝液；ヒスチジン緩衝液；またはクエン酸緩衝液が含まれる。希釈は、例えば、「強度が半分の」アジュバントを提供するために、アジュバントの成分の相対的な割合を維持したまま、アジュバントの成分の濃度を低下させることができる。
【０１３８】
容器は、例えば、小児への送達を容易にするために、半分の用量を示すためにマークを付けることができる。例えば、０．５ｍｌの用量を含むシリンジは、０．２５ｍｌの容積を示すマークを有することができる。
【０１３９】
ガラス容器（例えば、シリンジまたはバイアル）が使用される場合は、ソーダ石灰ガラスではなくホウケイ酸ガラスから作製された容器を使用するのが好ましい。
【０１４０】
限定されるものではないが：ウイルス抗原、例えば、ウイルス表面タンパク質；細菌抗原、例えば、タンパク質および／またはサッカリド抗原；真菌抗原；寄生虫抗原；および腫瘍抗原を含む様々な抗原を水中油型エマルジョンと共に使用することができる。本発明は、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、鉤虫、Ｂ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、狂犬病、ＲＳウイルス、サイトメガロウイルス、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、クラミジア、ＳＡＲＳコロナウイルス、水痘‐帯状疱疹ウイルス、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、エプスタイン‐バーウイルス、ヒトパピローマウイルスなどに対するワクチンに特に有用である。以下に例を挙げる。
【０１４１】
・インフルエンザウイルス抗原。これらは、生のウイルスまたは不活化ウイルスの形態をとり得る。不活化ウイルスが使用される場合、ワクチンは、ビリオン全体、スプリットビリオン、または精製された表面抗原（血球凝集素を含み、通常は、ノイラミニダーゼも含む）を含み得る。インフルエンザ抗原は、ビロゾームの形態でも提供することができる。上記抗原は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈｌｌ、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、および／またはＨ１６から選択される、任意の血球凝集素サブタイプを有し得る。ワクチンは、インフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスを含む、１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、または４つ以上）のインフルエンザウイルス株に由来する抗原（複数可）を含み得、例えば、単価Ａ／Ｈ５Ｎ１もしくはＡ／Ｈ１Ｎ１ワクチン、または３価Ａ／Ｈ１Ｎ１＋Ａ／Ｈ３Ｎ２＋Ｂワクチンを含む。インフルエンザウイルスは、再集合体株であり得、逆遺伝学技術によって得ることができる［例えば、５１〜５５］。したがって、ウイルスは、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルス由来の１つ以上のＲＮＡセグメントを含み得る（典型的には、６つのセグメントがＡ／ＰＲ／８／３４に由来し、ＨＡおよびＮセグメントが、ワクチン株に由来する。すなわち、６：２の再集合体である）。抗原の供給源として使用されるウイルスは、卵（例えば、孵化鶏卵）または細胞培養物で増殖することができる。細胞培養が使用される場合、細胞基材（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）は、典型的には、哺乳動物細胞系、例えば、ＭＤＣＫ；ＣＨＯ；２９３Ｔ；ＢＨＫ；Ｖｅｒｏ；ＭＲＣ−５；ＰＥＲ．Ｃ６；ＷＩ−３８などである。インフルエンザウイルスの増殖に好ましい哺乳動物細胞系には：Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙイヌ腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞［５６〜５９］；アフリカミドリザル腎臓に由来するＶｅｒｏ細胞［６０〜６２］；またはヒト胚性網膜芽細胞に由来するＰＥＲ．Ｃ６細胞［６３］が含まれる。ウイルスが哺乳動物細胞系で増殖した場合、この組成物は、有利なことに、卵タンパク質（例えば、オボアルブミンおよびオボムコイド）およびニワトリＤＮＡを含まないため、アレルゲン性が低下する。単位用量のワクチンは、典型的にはＳＲＩＤによって測定される血球凝集素（ＨＡ）含量を参考にして、典型的には標準化される。既存のワクチンは、典型的には、１株当たり１５μｇのＨＡを含むが、特にアジュバントを使用する場合は、これよりも低い用量を使用することができる。分数の用量、例えば、１／２（すなわち、１株当たり７．５μｇのＨＡ）、１／４、および１／８が、高い用量（例えば、３倍または９倍の用量［６６、６７］）と同様に使用されている［６４、６５］。したがって、ワクチンは、インフルエンザ１株当たり０．１〜１５０μｇ、好ましくは、０．１〜５０μｇ、例えば、０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇなどのＨＡを含み得る。特定の用量には、例えば、１株当たり約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約３．７５、約１．９、約１．５などが含まれる。
【０１４２】
・ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２を含むヒト免疫不全ウイルス。この抗原は、典型的には、エンベロープ抗原である。
【０１４３】
・Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原。この抗原は、好ましくは、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母での発現後に、組換えＤＮＡ法によって得られる。天然ウイルスＨＢｓＡｇとは異なり、組換え酵母発現抗原は、グリコシル化されていない。この抗原は、リン脂質を含有する脂質マトリックスを含む実質的に球形の粒子（約２０ｎｍの平均直径）の形態とすることができる。天然ＨＢｓＡｇ粒子とは異なり、酵母発現粒子は、ホスファチジルイノシトールを含み得る。このＨＢｓＡｇは、任意のサブタイプａｙｗｌ、ａｙｗ２、ａｙｗ３、ａｙｗ４、ａｙｒ、ａｄｗ２、ａｄｗ４、ａｄｒｑ−、およびａｄｒｑ＋由来であり得る。
【０１４４】
・特にイヌに見られる鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｃａｎｉｎｕｍ）。この抗原は、組換えＡｃ−ＭＴＰ−１（アスタシン様メタロプロテアーゼ）および／またはアスパラギン酸ヘモグロビナーゼ（Ａｃ−ＡＰＲ−１）であり得、分泌タンパク質としてバキュロウイルス／昆虫細胞系で発現され得る［６８、６９］。
【０１４５】
・単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）抗原。本発明に使用するのに好ましいＨＳＶ抗原は、膜糖タンパク質ｇＤである。ＨＳＶ−２株由来のｇＤ（「ｇＤ２」抗原）を使用するのが好ましい。この組成物は、Ｃ末端膜アンカー領域が欠失した形態のｇＤ［７０］、例えば、アスパラギン（ａｐａｒａｇｉｎｅ）およびグルタミンがＣ末端に付加された天然タンパク質のアミノ酸１〜３０６を含む切断型ｇＤを使用することができる。この形態のタンパク質には、切断されると２８３アミノ酸の成熟タンパク質を生じる単一ペプチドが含まれる。アンカーの除去により、タンパク質を可溶型において調製することができる。
【０１４６】
・ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原。本発明に使用するのに好ましいＨＰＶ抗原は、Ｌ１カプシドタンパク質であり、組み合わせて、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）として知られている構造を形成することができる。ＶＬＰは、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または昆虫細胞（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ細胞、例えば、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、またはショウジョウバエ細胞）でのＬ１の組換え発現によって生産することができる。酵母細胞の場合は、プラスミドベクターが、Ｌ１遺伝子（複数可）を有することができる；昆虫細胞の場合は、バキュロウイルスベクターが、Ｌ１遺伝子（複数可）を有することができる。より好ましくは、この組成物は、ＨＰＶ−１６株およびＨＰＶ−１８株の両方に由来するＬ１  ＶＬＰを含む。この２価の組み合わせは、非常に有効であることが示された［７１］。ＨＰＶ−１６株およびＨＰＶ−１８株に加えて、ＨＰＶ−６株およびＨＰＶ−１１株に由来するＬ１  ＶＬＰを含むことも可能である。腫瘍形成性ＨＰＶ株の使用も可能である。ワクチンは、ＨＰＶ１株当たり２０〜６０μｇ／ｍｌ（例えば、約４０μｇ／ｍｌ）のＬ１を含み得る。
【０１４７】
・炭疽抗原。炭疽は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓによって引き起こされる。適切なＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ抗原は、Ａ成分（致死因子（ＬＦ）および浮腫因子（ＥＦ））を含み、これらの両方は、防御抗原（ＰＡ）として知られている共通のＢ成分を共有することができる。この抗原は、任意選択で解毒化することができる。さらなる詳細は、参考文献［７２〜７４］で見ることができる。
【０１４８】
・Ｓ．ａｕｒｅｕｓ抗原。様々なＳ．ａｕｒｅｕｓ抗原が知られている。適切な抗原には、莢膜サッカリド（例えば、５型株および／または８型株由来）およびタンパク質（例えば、ＩｓｄＢ、Ｈｌａなど）が含まれる。莢膜サッカリド抗原は、理想的には、キャリアタンパク質に結合体化している。
【０１４９】
・Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原。様々なＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原が知られている。適切な抗原には、莢膜サッカリド（例えば、血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および／または２３Ｆの１つ以上に由来）およびタンパク質（例えば、ニューモリシン、解毒化ニューモリシン、ポリヒスチジン三つ組タンパク質Ｄ（ＰｈｔＤ）など）が含まれる。莢膜サッカリド抗原は、理想的には、キャリアタンパク質に結合体化している。
【０１５０】
・がん抗原。様々な腫瘍特異的抗原が知られている。本発明は、肺がん、メラノーマ、乳がん、前立腺がんなどに対する免疫治療応答を誘発する抗原と共に使用することができる。
【０１５１】
抗原の溶液は、通常は、例えば、１：１の容積比でエマルジョンと混合される。この混合は、充填の前にワクチン製造業者が行うこともできるし、または使用時に医療従事者が行うこともできる。
【０１５２】
（薬学的組成物）
本発明の方法を用いて形成される組成物は、薬学的に許容され得る。これらの組成物は、エマルジョンおよび任意選択の抗原に加えて成分を含み得る。
【０１５３】
この組成物は、保存薬、例えば、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールを含み得る。しかしながら、好ましくは、ワクチンは、水銀物質を実質的に含まない（すなわち、５μｇ／ｍｌ未満）、例えば、チオメルサールを含まないようにするべきである［７５、７６］。水銀を含まないワクチンおよび成分がより好ましい。
【０１５４】
組成物のｐＨは、一般に５．０〜８．１、より典型的には６．０〜８．０、例えば、６．５〜７．５である。したがって、本発明のプロセスは、パッケージングの前にワクチンのｐＨを調整するステップを含み得る。
【０１５５】
この組成物は、好ましくは、無菌である。この組成物は、好ましくは、非発熱性であり、例えば、用量当たり＜１  ＥＵ（エンドトキシン単位、一般的な基準）、好ましくは用量当たり＜０．１  ＥＵを含む。この組成物は、好ましくは、グルテンを含まない。
【０１５６】
この組成物は、単回免疫化用の物質を含んでも良いし、または複数回免疫化用の物質（すなわち、「複数用量」キット）を含んでも良い。複数用量構成の場合には、保存薬を含めるのが好ましい。
【０１５７】
ワクチンは、典型的には、約０．５ｍｌの投与量容積で投与されるが、半分の用量（すなわち、約０．２５ｍｌ）を小児に投与しても良い。
【０１５８】
（処置の方法およびワクチンの投与）
本発明は、本発明の方法を用いて調製されるキットおよび組成物を提供する。本発明の方法によって調製される組成物は、ヒト患者に投与するのに適しており、本発明は、このような組成物を患者に投与するステップを含む、患者において免疫応答を惹起する方法を提供する。
【０１５９】
本発明はまた、薬剤として使用されるこれらのキットおよび組成物も提供する。
【０１６０】
本発明はまた、患者において免疫応答を惹起するための薬剤の製造における、（ｉ）抗原の水性調製物；および（ｉｉ）本発明によって調製される水中油型エマルジョンの使用も提供する。
【０１６１】
これらの方法および使用によって惹起される免疫応答は、一般に、抗体応答、好ましくは、防御抗体反応を含む。
【０１６２】
組成物は、様々な方法で投与することができる。最も好ましい免疫化経路は、筋肉内注射（例えば、腕または脚に）によるものであるが、他の利用可能な経路には、皮下注射、鼻腔内［７７〜７９］、経口［８０］、皮内［８１、８２］、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）［８３］などが含まれる。
【０１６３】
本発明によって調製されるワクチンを使用して、小児と成人の両方を処置することができる。患者は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳であり得る。患者は、高齢者（例えば、≧５０歳、好ましくは≧６５歳）、幼若者（例えば、≦５歳）、入院患者、医療従事者、軍人および兵士、妊婦、慢性疾患免疫不全患者、および海外旅行者であり得る。ワクチンは、これらの群だけに適しているのではなく、集団でより一般的に使用できる。
【０１６４】
本発明のワクチンは、他のワクチンと実質的に同時（例えば、同じ診療中、または同じ医療専門家への訪問時）に患者に投与することができる。
【０１６５】
（中間プロセス）
本発明はまた、第２のエマルジョンを形成するための第１のエマルジョンのマイクロフルイダイゼーション、およびこれに続く第２のエマルジョンのろ過を含む、水中油型エマルジョンの製造方法も提供する。第１のエマルジョンは、上記の特質を有する。
【０１６６】
本発明はまた、第２のエマルジョン、すなわちマイクロフルイダイズされたエマルジョンのろ過を含む水中油型エマルジョンの製造方法も提供する。マイクロフルイダイズされたエマルジョンは、上記の特質を有する。
【０１６７】
本発明はまた、エマルジョンと抗原を組み合わせるステップを含み、このエマルジョンは上記の特質を有する、ワクチンの製造方法も提供する。
【０１６８】
（特定の実施形態）
本発明の特定の実施形態には、以下が含まれる。
【０１６９】
・スクアレンを含む水中油型エマルジョンの製造方法であって、（ｉ）第１の平均油滴サイズを有する第１のエマルジョンを形成するステップ；（ｉｉ）第１のエマルジョンをマイクロフルイダイズして、第１の平均油滴サイズよりも小さい第２の平均油滴サイズを有する第２のエマルジョンを形成するステップ；および（ｉｉｉ）親水性膜を用いて第２のエマルジョンをろ過するステップを含む、方法。
【０１７０】
・水中油型エマルジョンの製造方法であって、（ｉ）５０００ｎｍ以下の第１の平均油滴サイズを有する第１のエマルジョンを形成するステップ；（ｉｉ）第１のエマルジョンをマイクロフルイダイズして、第１の平均油滴サイズよりも小さい第２の平均油滴サイズを有する第２のエマルジョンを形成するステップ；および（ｉｉｉ）親水性膜を用いて第２のエマルジョンをろ過するステップを含む、方法。
【０１７１】
・水中油型エマルジョンの製造方法であって、（ｉ）第１の平均油滴サイズを有する第１のエマルジョンを形成するステップ；（ｉｉ）第１のエマルジョンをマイクロフルイダイズして、第１の平均油滴サイズよりも小さい第２の平均油滴サイズを有する第２のエマルジョンを形成するステップ；および（ｉｉｉ）親水性ポリエーテルスルホン膜を用いて第２のエマルジョンをろ過するステップを含む、方法。
【０１７２】
・スクアレンを含む水中油型エマルジョンの製造方法であって、（ｉ）ホモジナイザを用いて、第１の平均油滴サイズを有する第１のエマルジョンを形成するステップを含み、第１のエマルジョンが、第１のエマルジョン成分をホモジナイザに複数回通して循環させることによって形成される、方法。
【０１７３】
・スクアレンを含む水中油型エマルジョンの製造方法であって、（ｂ）第１の平均油滴サイズを有する第１のエマルジョンをマイクロフルイダイズして、第１の平均油滴サイズよりも小さい第２の平均油滴サイズを有する第２のエマルジョンを形成するステップを含み、第２のエマルジョンが、第２のエマルジョン成分を第１のエマルジョン容器から第１のマイクロフルイダイゼーションデバイスを介して第２のエマルジョン容器に移動させ、次いで第２のマイクロフルイダイゼーションデバイスに通して第２のエマルジョン成分を循環させることによって形成され、第１のマイクロフルイダイゼーションデバイスと第２のマイクロフルイダイゼーションデバイスが同じである、方法。
【０１７４】
・水中油型エマルジョンの製造方法であって：第１の平均油滴サイズを有する第１のエマルジョンをマイクロフルイダイゼーションデバイスに通して、第１の平均油滴サイズよりも小さい第２の平均油滴サイズを有する第２のエマルジョンを形成するステップを含み；このマイクロフルイダイゼーションデバイスが、複数のＺ型チャネルを備える相互作用チャンバ、および少なくとも１つのチャネルを備えた補助処理モジュールを備えており；この補助処理モジュールが、相互作用チャンバの下流に配置されている、方法。
【０１７５】
・水中油型エマルジョンの製造方法であって、第１の平均油滴サイズを有する第１のエマルジョンをマイクロフルイダイゼーションデバイスに通して、第１の平均油滴サイズよりも小さい第２の平均油滴サイズを有する第２のエマルジョンを形成するステップを含み；このマイクロフルイダイゼーションデバイスが、複数のチャネルを備える相互作用チャンバおよび補助処理モジュールを備えている、方法。
【０１７６】
・水中油型エマルジョンの製造方法であって、第１の平均油滴サイズを有する第１のエマルジョンをマイクロフルイダイゼーションデバイスに通して、第１の平均油滴サイズよりも小さい第２の平均油滴サイズを有する第２のエマルジョンを形成するステップを含み、このマイクロフルイダイゼーションデバイスが、相互作用チャンバを備えており、この相互作用チャンバの入口におけるエマルジョン成分の圧力が、エマルジョンがマイクロフルイダイザに供給されている期間の少なくとも８５％の間、実質的に一定である、方法。
【０１７７】
・水中油型エマルジョンの製造方法であって、第１の平均油滴サイズを有する第１のエマルジョンを形成するステップを含み、この第１のエマルジョンの形成が、不活性ガス、例えば、窒素下で、例えば、最大０．５バールの圧力で行われる、方法。
【０１７８】
・水中油型エマルジョンの製造方法であって、第１の平均油滴サイズを有する第１のエマルジョンをマイクロフルイダイゼーションデバイスに通して、第１の平均油滴サイズよりも小さい第２の平均油滴サイズを有する第２のエマルジョンを形成するステップを含み、この第２のエマルジョンの形成が、不活性ガス、例えば、窒素下で、例えば、最大０．５バールの圧力で行われる、方法。
【０１７９】
・水中油型エマルジョンの製造方法であって、（ｉ）第１の平均油滴サイズを有する第１のエマルジョンを形成するステップ；（ｉｉ）第１のエマルジョンをマイクロフルイダイズして、第１の平均油滴サイズよりも小さい第２の平均油滴サイズを有する第２のエマルジョンを形成するステップ；（ｉｉｉ）第２のエマルジョンをろ過するステップ；（ｉｖ）水中油型エマルジョンを滅菌柔軟性バッグに移すステップを含む、方法。
【０１８０】
（一般）
用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘ「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘのみからなっても良いし、または何か追加のもの、例えば、Ｘ＋Ｙを含んでも良い。
【０１８１】
用語「実質的に」は、「完全に」を排除するものではなく、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくても良い。必要に応じて、用語「実質的に」は、本発明の定義から除外しても良い。
【０１８２】
数値ｘに関する用語「約」は、任意選択であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１８３】
特段の記載がない限り、２つ以上の成分を混合するステップを含むプロセスは、混合のいかなる特定の順序も必要としない。したがって、成分は、任意の順序で混合することができる。３つの成分が存在する場合は、例えば、２つの成分を互いに組み合わせてから、この組み合わせを第３の成分と組み合わせることができる。
【０１８４】
動物性（特にウシ）の物質が細胞の培養に使用される場合、このような物質は、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）を含まない、特にウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない供給源から得るべきである。全体として、動物由来物質が全く存在しない状態で細胞を培養することが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【０１８５】
【図１】図１は、第１のエマルジョンの形成に使用できるホモジナイザの特定の例を示している。
【図２】図２は、このようなホモジナイザに使用できるロータおよびステータの詳細を示している。
【図３】図３は、同期増強ポンプモードの２つの圧力プロフィールを示している。
【図４】図４は、Ｚ型チャネル相互作用チャンバを示している。
【図５】図５は、Ｉ型循環を示している。容器は、「Ｃ」で示され、ホモジナイザは、「Ｈ」で示されている。流体の運動の方向および順序が示されている。
【図６】図６は、ＩＩ型循環を示している。容器は、「Ｃ」で示され、ホモジナイザは、「Ｈ」で示されている。流体の運動の方向および順序が示されている。ホモジナイザは、２つの入力の矢印と２つの出力の矢印を有するが、実際には、ホモジナイザは、１つの入力チャネルと１つの出力チャネルを有する。
【発明を実施するための形態】
【０１８６】
（本発明を実施するための様式）
スクアレン、ポリソルベート８０、トリオレイン酸ソルビタン、およびクエン酸ナトリウム緩衝液を含む第１のエマルジョンを均質化によって調製した。第１のエマルジョンを、平均油滴サイズが１２００ｎｍ以下になり、サイズが１．２μｍを超える油滴の数が５×１０９／ｍｌ以下となるまで均質化した。
【０１８７】
次いで、第１のエマルジョンをマイクロフルイダイゼーションに供し第２のエマルジョンを形成した。マイクロフルイダイゼーションデバイスは、約７００バール（すなわち、約１００００ｐｓｉ）の実質的に一定の圧力を提供する２つの同期増強ポンプを備えていた。エマルジョンを、マイクロフルイダイゼーションデバイスに５回通した。エマルジョンは、冷却機構の使用によってマイクロフルイダイゼーション中は４０±５℃の温度に維持した。
【０１８８】
４回の試験運転を行った。第１の一組の試験運転では、単一チャネル補助処理モジュール（ＡＰＭ）を、製造業者によって推奨されるように８チャネルのＺ型相互作用チャンバ（ＩＸＣ）の上流に配置し、マイクロフルイダイゼーションデバイス内のエマルジョンの流量を１０．２Ｌ／分とした。第２の一組の試験運転では、多チャネルのＡＰＭを、８チャネルのＺ型ＩＸＣの下流に配置し、マイクロフルイダイゼーションデバイス内のエマルジョンの流量を１１．６Ｌ／分とした。両方の運転を、大規模（２５０リットル）で行った。４つの試験運転の結果が表１に示されている。
【０１８９】
【表１−１】
2013512891.tif 000002
【０１９０】
【表１−２】
2013512891.tif 000003
表１に示されているように、ＡＰＭがＩＸＣの下流に配置された試験運転は、平均粒子サイズがより小さく、かつサイズが１．２μｍを超える粒子がより少ないエマルジョンを生産した。さらに、ＩＸＣ−ＡＰＭの順序では、１回通過後の粒子直径が≦２００ｎｍに達したが、ＡＰＭ−ＩＸＣの順序では、４回通過後でもこのサイズに達しなかった。したがって、Ｚ型ＩＸＣの下流へのＡＰＭの配置が、大規模製造で有利であることが示された。
【０１９１】
本発明は、ほんの一例として記載されており、本発明の範囲および精神の範囲内で変更形態が可能であることを理解されたい。
【０１９２】
【数１】
2013512891.tif 000004
【０１９３】
【数２】
2013512891.tif 000005
【０１９４】
【数３】
2013512891.tif 000006
【図１】
2013512891.tif 000007
【図２】
2013512891.tif 000008
【図３】
2013512891.tif 000009
【図４】
2013512891.tif 000010
【図５】
2013512891.tif 000011
【図６】
2013512891.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成24年8月1日(2012.8.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水中油型エマルジョンの製造のための方法であって、該方法は、
第１の平均油滴サイズを有する第１のエマルジョンを、マイクロフルイダイゼーションデバイスに通して、該第１の平均油滴サイズよりも小さい第２の平均油滴サイズを有する第２のエマルジョンを形成するステップ、および
該第２のエマルジョンをろ過するステップ
を含み、
該マイクロフルイダイゼーションデバイスは、複数のＺ型チャネルを備える相互作用チャンバ、および少なくとも１つのチャネルを備える背圧チャンバを備えており、
該背圧チャンバは、該相互作用チャンバの下流に配置されている、
方法。
【請求項２】
前記第１のエマルジョンが、第１の圧力で前記相互作用チャンバに導入され、前記第２のエマルジョンが、該第１の圧力よりも低い第２の圧力で前記背圧チャンバから出ており、
ここで、該相互作用チャンバの中で、該第１の圧力と該第２の圧力との間の圧力差のうちの８０〜９５％の低下があり、該背圧チャンバの中で、該第１の圧力と該第２の圧力との間の圧力差のうちの５〜２０％の低下がある、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記背圧チャンバが、複数のチャネルを備えている、請求項１および２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
水中油型エマルジョンの製造のための方法であって、該方法は、
第１の平均油滴サイズを有する第１のエマルジョンを、マイクロフルイダイゼーションデバイスに通して、該第１の平均油滴サイズよりも小さい第２の平均油滴サイズを有する第２のエマルジョンを形成するステップ、および
該第２のエマルジョンをろ過するステップ
を含み、
該マイクロフルイダイゼーションデバイスは、複数のチャネルを備える相互作用チャンバ、および複数のチャネルを備える背圧チャンバを備えている、
方法。
【請求項５】
前記第１のエマルジョンが：
（ｉ）第１の圧力で前記相互作用チャンバに導入され、前記第２のエマルジョンが、該第１の圧力よりも低い第２の圧力で前記背圧チャンバから出ているか；または
（ｉｉ）第１の圧力で前記背圧チャンバに導入され、前記第２のエマルジョンが、該第１の圧力よりも低い第２の圧力で前記相互作用チャンバから出ており；
ここで、該相互作用チャンバの中で、該第１の圧力と該第２の圧力との間の圧力差のうちの８０〜９５％の低下があり、該背圧チャンバの中で、該第１の圧力と該第２の圧力との間の圧力差のうちの５〜２０％の低下がある、
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記背圧チャンバの前記チャネルまたは前記複数のチャネルが、Ｚ型チャネルである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ホモジナイザを用いて前記第１のエマルジョンを形成するステップを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の平均油滴サイズが５０００ｎｍ以下である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１のエマルジョン中のサイズが１．２μｍを超える油滴の数が、５×１０１１／ｍｌ以下である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２の平均油滴サイズが５００ｎｍ以下である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２のエマルジョン中のサイズが１．２μｍを超える油滴の数が、５×１０１０／ｍｌ以下である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ワクチン組成物を調製するための方法であって、
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のエマルジョンを調製するステップと、
該エマルジョンを抗原と組み合わせるステップと、
を含む、方法。
【請求項１３】
ワクチンキットを調製するための方法であって、
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のエマルジョンを調製するステップと、
該エマルジョンを、抗原成分と共にキットの成分としてキット内にパッケージングするステップと、
を含む、方法。
【請求項１４】
前記キットの成分が、別個のバイアルに入れられている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記バイアルが、ホウケイ酸ガラスから作製されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法であって、
該エマルジョンが、バルクアジュバントであり、
該方法が、キットの成分としてパッケージングするために該バルクアジュバントから単位用量を取り出すステップを含む、
方法。
【請求項１７】
前記抗原が、インフルエンザウイルス抗原である、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記エマルジョンと前記抗原との組み合わせが、ワクチン組成物を形成し、該ワクチン組成物が、インフルエンザウイルス１株当たり約１５μｇ、約１０μｇ、約７．５μｇ、約５μｇ、約３．８μｇ、約１．９μｇ、約１．５μｇの血球凝集素を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記エマルジョンと前記抗原との組み合わせが、ワクチン組成物を形成し、該ワクチン組成物が、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノール保存薬を含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記相互作用チャンバが、複数の固定形状チャネルであって、前記エマルジョンが通る、チャネルを有し、該チャネルにおいて、該エマルジョンが、加圧下で加速させられて、該エマルジョンの油滴サイズが減少し、かつサイズが１．２μｍを超える油滴の数が減少し；該相互作用チャンバのチャネルが、複数の実質的に直角の角を備えており；前記背圧チャンバが、少なくとも１つの固定形状チャネルであって、該エマルジョンが通る、チャネルを有している、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８４】
動物性（特にウシ）の物質が細胞の培養に使用される場合、このような物質は、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）を含まない、特にウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない供給源から得るべきである。全体として、動物由来物質が全く存在しない状態で細胞を培養することが好ましい。
したがって本発明は以下の項目を提供する：
（項目１）
水中油型エマルジョンの製造のための方法であって、該方法は、
第１の平均油滴サイズを有する第１のエマルジョンを、マイクロフルイダイゼーションデバイスに通して、該第１の平均油滴サイズよりも小さい第２の平均油滴サイズを有する第２のエマルジョンを形成するステップを含み、
該マイクロフルイダイゼーションデバイスは、複数のＺ型チャネルを備える相互作用チャンバ、および少なくとも１つのチャネルを備える背圧チャンバを備えており、
該背圧チャンバは、該相互作用チャンバの下流に配置されている、
方法。
（項目２）
上記第１のエマルジョンが、第１の圧力で上記相互作用チャンバに導入され、上記第２のエマルジョンが、該第１の圧力よりも低い第２の圧力で上記背圧チャンバから出ており、
ここで、該相互作用チャンバの中で、該第１の圧力と該第２の圧力との間の圧力差のうちの８０〜９５％の低下があり、該背圧チャンバの中で、該第１の圧力と該第２の圧力との間の圧力差のうちの５〜２０％の低下がある、
項目１に記載の方法。
（項目３）
上記背圧チャンバが、複数のチャネルを備えている、前述の項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目４）
水中油型エマルジョンの製造のための方法であって、該方法は、
第１の平均油滴サイズを有する第１のエマルジョンを、マイクロフルイダイゼーションデバイスに通して、該第１の平均油滴サイズよりも小さい第２の平均油滴サイズを有する第２のエマルジョンを形成するステップを含み、
該マイクロフルイダイゼーションデバイスは、複数のチャネルを備える相互作用チャンバ、および複数のチャネルを備える背圧チャンバを備えている、
方法。
（項目５）
上記第１のエマルジョンが：
（ｉ）第１の圧力で上記相互作用チャンバに導入され、上記第２のエマルジョンが、該第１の圧力よりも低い第２の圧力で上記背圧チャンバから出ているか；または
（ｉｉ）第１の圧力で上記背圧チャンバに導入され、上記第２のエマルジョンが、該第１の圧力よりも低い第２の圧力で上記相互作用チャンバから出ており；
ここで、該相互作用チャンバの中で、該第１の圧力と該第２の圧力との間の圧力差のうちの８０〜９５％の低下があり、該背圧チャンバの中で、該第１の圧力と該第２の圧力との間の圧力差のうちの５〜２０％の低下がある、
項目４に記載の方法。
（項目６）
上記背圧チャンバの上記チャネルまたは上記複数のチャネルが、Ｚ型チャネルである、前述の項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
上記第２のエマルジョンのろ過を含む、前述の項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
ホモジナイザを用いて上記第１のエマルジョンを形成するステップを含む、前述の項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
上記第１の平均油滴サイズが５０００ｎｍ以下である、前述の項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
上記第１のエマルジョン中のサイズが１．２μｍを超える油滴の数が、５×１０１１／ｍｌ以下である、前述の項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
上記第２の平均油滴サイズが５００ｎｍ以下である、前述の項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
上記第２のエマルジョン中のサイズが１．２μｍを超える油滴の数が、５×１０１０／ｍｌ以下である、前述の項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
ワクチン組成物を調製するための方法であって、
項目１〜１２のいずれか１項に記載のエマルジョンを調製するステップと、
該エマルジョンを抗原と組み合わせるステップと、
を含む、方法。
（項目１４）
ワクチンキットを調製するための方法であって、
項目１〜１２のいずれか１項に記載のエマルジョンを調製するステップと、
該エマルジョンを、抗原成分と共にキットの成分としてキット内にパッケージングするステップと、
を含む、方法。
（項目１５）
上記キットの成分が、別個のバイアルに入れられている、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
上記バイアルが、ホウケイ酸ガラスから作製されている、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
項目１４〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、
アジュバントが、バルクアジュバントであり、
該方法が、キットの成分としてパッケージングするために該バルクアジュバントから単位用量を取り出すステップを含む、
方法。
（項目１８）
上記抗原が、インフルエンザウイルス抗原である、項目１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
上記エマルジョンと上記抗原との組み合わせが、ワクチン組成物を形成し、該ワクチン組成物が、インフルエンザウイルス１株当たり約１５μｇ、約１０μｇ、約７．５μｇ、約５μｇ、約３．８μｇ、約１．９μｇ、約１．５μｇの血球凝集素を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
上記エマルジョンと上記抗原との組み合わせが、ワクチン組成物を形成し、該ワクチン組成物が、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノール保存薬を含む、項目１８または１９に記載の方法。
（項目２１）
上記相互作用チャンバが、複数の固定形状チャネルであって、上記エマルジョンが通る、チャネルを有し、該チャネルにおいて、該エマルジョンが、加圧下で加速させられて、該エマルジョンの油滴サイズが減少し、かつサイズが１．２μｍを超える油滴の数が減少し；該相互作用チャンバのチャネルが、複数の実質的に直角の角を備えており；上記背圧チャンバが、少なくとも１つの固定形状チャネルであって、該エマルジョンが通る、チャネルを有している、前述の項目のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
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