(57)【要約】  無水アンモニアを使用するバイオマス前処理は、アンモニアが蒸気状態でバイオマス粒子または破片を貫通することができる場合、およびバイオマスが連続的に供給され、反応器を通って移動する場合に、静止形反応器において効果的である。この条件を達成するために系全体の含水率を、系中の総質量を基準にして４０質量%未満に維持される。この前処理済みバイオマス生産物は効果的に糖化されて、生産物の生体触媒生産のための発酵可能な糖を生産する。
2013544099.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオマスを処理して前処理済みバイオマスを生産する方法であって、
ａ）少なくとも約６０％の乾物含量を有するバイオマスを提供するステップ、
ｂ）連続的に供給することによって（ａ）の前記バイオマスを静止形前処理槽に装荷し、それによって前記槽中の前記装荷バイオマスが、前記槽を通って移動するステップ、
ｃ）前記槽内の総含水量が４０質量%未満（前記槽内の総質量に対して測定される）残存する条件下で、（ｂ）の前記装荷バイオマスを、それが前記前処理槽を通って移動している最中に、少なくとも約４％（前記槽内の前記バイオマスの乾燥質量に対して測定される）の無水アンモニアと接触させ、それによって前記バイオマスの大部分にアンモニア蒸気を浸透させるステップ、および
ｄ）前記バイオマスを前記前処理槽から排出させるステップ
を含み、
前記槽から排出される前記バイオマスが前処理済みバイオマス生産物である、方法。
【請求項２】
（ｄ）の排出のステップ後に、蒸気が前処理済みバイオマス生産物から分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
蒸気がアンモニア蒸気を含み、それが回収されて前処理槽またはアンモニア蒸気取扱システムに再利用される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｄ）後に、前処理済みバイオマス生産物が回収される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｃ）後に、装荷バイオマスが、約１０分間から約５時間の滞留時間で前処理槽を通って進む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
無水アンモニアをバイオマスと約５時間未満のあいだ接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
槽内のバイオマスの温度が少なくとも約７０℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
槽の温度を、ステップ（ｂ）の前に少なくとも約７０℃まで上昇させる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｂ）前の温度が、約７０℃から約１９０℃である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
温度を、高温ガスを注入することによって直接に、または槽に熱を加えることによって間接的に上昇させる、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｃ）における無水アンモニアの濃度が、約２０％未満（槽内のバイオマスの乾燥質量に対して測定される）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
槽内の圧力が、ステップ（ｂ）〜（ｄ）にわたって約０から２０ゲージ圧である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）の前記バイオマスが、機械的にサイズを小さくしたバイオマスである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
バイオマスが、セルロース、ヘミセルロース、およびリグニンを含むセルロース系バイオマスである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
バイオマスが、トウモロコシの穂軸、トウモロコシの皮、トウモロコシの茎葉、草、小麦わら、大麦わら、カラスムギわら、菜種わら、干し草、稲わら、スイッチグラス、ススキ、コードグラス、クサヨシ、紙くず、サトウキビの絞りかす、モロコシの絞りかすまたはわら、大豆わら、穀物の製粉から得られる成分、樹木、枝、根、葉、木材チップ、おがくず、低木および灌木、野菜、果実、花、および動物厩肥からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる２０１０年１１月２３日出願の米国仮特許出願第６１／４１６４８４号に関する特典を請求するものである。
【０００２】
本発明は、バイオマスを処理して発酵可能な糖を得るための方法に関する。具体的には、容易に糖化可能な材料を生産するために無水アンモニアを用いた充填床反応器中でのバイオマスの連続供給前処理方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
リグノセルロース系原料および廃棄物、例えば農作物残渣、木材、林業廃棄物、製紙汚泥、ならびに都市および産業廃棄物は、化学薬品、プラスチック、燃料、および飼料の生産用の潜在的に大きな再生可能な原料を提供する。炭水化物ポリマー、セルロースとヘミセルロース、およびリグニンを含有するリグノセルロース系原料および廃棄物は、一般に、様々な化学的、機械的、および酵素的手段によって処理されて、主としてヘキソース糖およびペントース糖を放出し、次いで発酵させて有用な製品にすることができる。
【０００４】
前処理法は、リグノセルロース系バイオマスの炭水化物ポリマー、すなわち多糖類を、糖化に使用されるセルロース分解酵素の影響をより容易に受け易くするために使用される。バイオマスのアンモニア前処理法を含めて様々な前処理法が知られている。一般にアンモニアは、バイマオスを糖化に向けて処理しているあいだ水性状態で使用されてきた。
【０００５】
例えば、本出願の所有者が所有する米国特許第７，９３２，０６３号明細書は、高い固形分かつ低いアンモニア水濃度の条件下でバイオマスを前処理する方法を開示している。使用されるアンモニアの濃度は、そのバイオマス−アンモニア水混合物のｐＨをアルカリ性に保つのに十分な最低限の濃度であり、バイオマスの乾燥質量を基準にして最高で約１２質量%未満である。バイオマスの乾燥質量は、バイオマス−アンモニア水混合物の質量の少なくとも約１５％、最大で約８０％までの初期濃度である。
【０００６】
米国特許第４，０６４，２７６号明細書には、麦わらおよび他の植物性材料の処理のために無水アンモニアを使用してその材料の栄養的価値を向上させることが開示されている。少なくとも６０質量%の乾物含量を有する麦わらを、１トンの乾燥麦わらにつき１５〜４０ｋｇの無水アンモニアで、周囲温度、大気圧において少なくとも１０日間処理する。
【０００７】
米国特許第７，９１５，０１７号明細書には、バイオマスを液体または蒸気状態の無水アンモニアで、かつ／または液体または蒸気状態の高濃度アンモニア：水混合物で前処理して、アンモニア対乾燥バイオマスの比が約０．２対１から１．２対１であり、かつ水対乾燥バイオマスの比が約０．２対１．０から１．５対１である混合物を得る工程が開示されている。これら方法は、液相状態にある総アンモニアの分率を高めるために使用される。温度を約５０℃から１４０℃に保ち、槽からアンモニアを放出することによって圧力を急速に開放して処理済みバイオマスを形成する。
【０００８】
バイオマスの前処理のためのアンモニア再利用パーコレーション法では充填床フロースルー反応器が使用される（Ｙｏｏｎらの論文（１９９５年）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５１／５２：５〜１９）。この方法ではアンモニア水をバイオマスの床を通して連続的に再循環させる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
効率的にバイオマスをアンモニアで前処理し、反応器のコストを低減させる容易に糖化可能な材料を生産する方法の必要性が残っている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、静止形槽内で連続的なやり方でバイオマスを無水アンモニアにより前処理して、容易に糖化可能な材料を生産するための方法を提供する。
【００１１】
したがって本発明は、バイオマスを処理して前処理済みバイオマス生産物を生産するための方法を提供し、この方法は、
ａ）少なくとも約６０％の乾物含量を有するバイオマスを提供するステップ、
ｂ）（ａ）のバイオマスを、連続的に供給することによって静止形前処理槽に装荷し、それによって槽内の装荷バイオマスが槽を通って進むステップ、
ｃ）（ｂ）の装荷バイオマスを、槽内の総含水率が４０質量%未満（槽内の総質量を規準に測定される）残存する条件下で、少なくとも約４％（槽内の総質量を規準に測定される）の無水アンモニアと接触させ、それによってバイオマスの大部分にアンモニア蒸気を浸透させるステップ、および
ｄ）前処理槽からバイオマスを退出させるステップ
を含み、
この槽から排出されるバイオマスが前処理済みバイオマス生産物である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】バイオマスを前処理槽中に連続的に供給するための前処理システムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
バイオマスをアンモニアで処理する場合、そのバイオマス全体にわたるアンモニアの接触は、糖化用のバイオマスの効果的な調製にとって重要である。一般には機械的撹拌を用いてアンモニアとバイオマスを混合し、接触を最大にする。本明細書中で述べる条件下では、前処理は、バイオマスを反応器に連続的に供給し、機械的混合を伴わずに反応器を通ってバイオマスを移動させることによって行われ、それによって、アンモニアが反応物である混合反応器に付随するエネルギーコストおよびメンテナンスコストを取り除く。
【００１４】
特許請求の範囲および明細書の解釈のために下記の定義および省略形が使用されることになる。
【００１５】
本明細書中で使用される用語「（本質的に全部として）含む（“ｃｏｍｐｒｉｓｅ”、“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”）」、「含む（“ｉｎｃｌｕｄｅ”、“ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ”）」、「有する（“ｈａｓ”、“ｈａｖｉｎｇ”）」、「含有する（“ｃｏｎｔａｉｎ”、“ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ”）」、またはこれらの任意の他の語尾変化は、非排他的に包含されるものを対象として含む。例えば、構成要素の一覧表を含む組成物、混合物、工程、方法、物品、または装置は、必ずしもこれらの構成要素のみに限定されず、はっきりとは列挙されていない構成要素、あるいはこのような組成物、混合物、工程、方法、物品、または装置に固有な他の構成要素も含むことができる。さらに、相反するものと明記されない限り、「または」は、包含的なまたはを意味し、排他的なまたはを意味しない。例えば、条件ＡまたはＢは、Ａが真であり、（あるいは存在し）かつＢが偽である（あるいは存在しない）、Ａが偽であり（あるいは存在せず）かつＢが真である（あるいは存在する）、およびＡとＢの両方が真である（あるいは存在する）のうちのいずれか一つによって満たされる。
【００１６】
また、本発明の構成要素または成分の前に置かれる不定冠詞「或る（“ａ”、“ａｎ”）」は、構成要素または成分のそれら事例（すなわち出来事）の数に関して非制限的であることを意図している。したがって「或る（“ａ”、“ａｎ”）」は、１つまたは少なくとも１つを含むものと解釈されるべきであり、また構成要素または成分の単数形の単語は、その数がはっきり単数であることを意味しない限り、複数もまた含む。
【００１７】
本明細書中で使用される用語「発明」または「本発明」は、非限定的用語であり、その特定の発明の任意の単一の実施形態を指すことを意図するものではなく、この明細書および特許請求の範囲中で記述されるすべてのあり得る実施形態を包含する。
【００１８】
本明細書中で用いられ、本発明の成分または反応物の使用量を修飾する用語「約」は、例えば、濃縮物または使用液を作製するために現実の世界で使用される一般的な測定手順および液体取扱手順を通じて、またこれらの手順における不注意による誤りを通じて、また組成物を製造するためにまたはそれら方法を実施するために使用される成分の製造、供給源、または純度の違いなどを通じて起こり得る数量の変動を指す。用語「約」はまた、ある特定の初期混合物からもたらされる組成物の異なる平衡条件のせいで相違する量を包含する。用語「約」によって修飾されていてもいなくても特許請求の範囲には、それらの量の等価物が含まれる。一実施形態では用語「約」は、その報告された数値の１０％以内、好ましくはその報告された数値の５％以内を意味する。
【００１９】
用語「発酵可能な糖」とは、発酵過程で微生物が炭素源として使用することができるオリゴ糖類および単糖類を指す。
【００２０】
用語「リグノセルロース系」は、リグニンとセルロースの両方を含む組成物を指す。リグノセルロース系材料はまた、ヘミセルロースを含むことができる。
【００２１】
用語「セルロース系」は、セルロースと、ヘミセルロースを含めた追加の成分とを含む組成物を指す。
【００２２】
用語「糖化」とは、多糖類からの発酵可能な糖の生産を指す。
【００２３】
用語「前処理済みバイオマス」は、糖化に先立って前処理を施されたバイオマスを意味する。
【００２４】
用語「ブタノール」とは、イソブタノール、１−ブタノール、２−ブタノール、またはこれらの組合せを指す。
【００２５】
用語「リグノセルロース系バイオマス」は任意のリグノセルロース系材料を指し、これにはセルロース、ヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖、および／または単糖を含む材料が含まれる。バイオマスはまた、タンパク質および／または脂質などの追加の成分を含むことができる。バイオマスは単一供給源から得ることもでき、またバイオマスは１種類以上の供給源から得られる混合物を含むこともできる。例えばバイオマスは、トウモロコシの穂軸とトウモロコシの茎葉の混合物、または草と葉の混合物を含むことができる。リグノセルロース系バイオマスには、これらに限定されないが、生物燃料エネルギー作物、農作物残渣、都市ごみ、産業廃棄物、製紙汚泥、庭ごみ、木材、および林業廃棄物が挙げられる。バイオマスの例には、これらに限定されないが、トウモロコシの穂軸、トウモロコシの皮等の作物の残留物、トウモロコシの茎葉、草、小麦わら、大麦わら、干し草、稲わら、スイッチグラス、紙くず、サトウキビの絞りかす、モロコシ属植物材料、大豆植物材料、穀物の製粉から得られる成分、樹木、枝、根、葉、木材チップ、おがくず、低木と灌木、野菜、果実、および花が挙げられる。
【００２６】
用語「乾物含量」とは、対象材料の液体内容物を除去した後に存在するその材料の質量単位の量を指す。
【００２７】
用語「バイオマス水解物」とは、バイオマスの糖化により生ずる生産物を指す。このバイオマスもまた、糖化に先立って前処理または予備加工することができる。
【００２８】
用語「バイオマス水解物発酵ブロス」とは、バイオマス水解物を含む培地中での生体触媒の成長および生産の結果生ずる生産物を含有するブロスである。このブロスは、生体触媒によって消費されないバイオマス水解物の成分、ならびにこの生体触媒自体およびその生体触媒によって作られる生産物を含む。
【００２９】
用語「スラリー」とは、不溶性材料と液体の混合物を指す。スラリーはまた、高レベルの溶解性固形物を含有することもできる。スラリーの例には、糖化ブロス、発酵ブロス、および蒸留廃液が挙げられる。
【００３０】
用語「目的生産物」とは、発酵中に微生物生産宿主細胞によって生産される任意の生産物を指す。これら目的生産物は、宿主細胞中での遺伝子操作された酵素経路の結果であってもよく、また内在性経路によって生産されてもよい。典型的な目的生産物には、これらに限定されないが、酸、アルコール、アルカン、アルケン、芳香族化合物、アルデヒド、ケトン、バイオポリマー、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ビタミン類、抗生物質、および医薬品が挙げられる。
【００３１】
用語「静止形の槽」とは、装荷材料の混合のための手段を含まない槽を指す。充填床反応器は静止形の槽を採用する。
【００３２】
用語「静止形前処理槽」とは、前処理のために使用することができる静止形の槽を指す。この槽は、本発明の方法に使用されるアンモニアなどの装荷材料に耐えるように建造される。
【００３３】
用語「ベント」とは、閉じ込められたガスを爆発による影響を伴わずに逃がすことを可能にすることを指す。
【００３４】
用語「ガス」とは、その臨界温度未満の凝縮性低密度相、例えば水蒸気を含めたガスおよび蒸気の両方を指す。
【００３５】
用語「槽内の総質量」とは、槽に加えられた成分の全体を合わせた質量を指す。
【００３６】
用語「大多数」とは５０％超を指す。大多数とは５０％を超す任意の整数を指すことができる。
【００３７】
静止形の槽中でのバイオマスの連続的前処理
本発明の方法では、バイオマスを前処理用の静止形槽中に連続的に供給して前処理済みバイオマス生産物を生産する。連続供給静止形槽前処理方法の一実施形態を図１に示す。下記に述べる方法の態様を図１に例示し、それらは図１に示す下記付番を有する。
【００３８】
バイオマスは、槽の第一の端部すなわち入口（１０）に供給され、槽（１１）を通って槽の第二の反対側の端部すなわち出口（１２）に向かって進む。バイオマスは、連続供給装置（１３）、例えば押出機、工業用ベーラー、またはコンクリートポンプを使用して槽に供給される。バイオマスは、重力流によって、または供給原料を連続供給装置中に追い込むオーガーによるなどのエネルギー入力法によって、連続供給装置に装荷するためのフィードビン中に入る。
【００３９】
静止形前処理槽中に連続的に供給されるバイオマスは、供給装置によって加えられる力の結果として槽の入口から槽の出口へ移動する。槽は、幅の寸法よりも大きい入口−出口軸の寸法を有する。例えば槽は、円筒すなわち管路（図１の場合のように）であることができる。バイオマス原料引込位置の下流で蒸気シールを使用して、アンモニアおよび水蒸気を含めた前処理剤が入口から上流に向かって脱出するのを妨げる。これは、入口からの蒸気の脱出を遮断するために、例えばバイオマス引込位置とアンモニアおよび水蒸気の注入位置の間でバイオマスの十分な膨潤を実現することによって達成することができる。一実施形態では２種類の異なるバイオマス原料、すなわち主としてスイッチグラスまたはトウモロコシの穂軸と、熱水分を受けた時に膨潤し塞ぐ微粉砕トウモロコシ穀粒またはデンプンのゾーンを交互に積み重ねた状態で連続的に加える。
【００４０】
管路槽は、前処理にとって十分な滞留時間を与えると同時に全体の槽の長さを短くするために、入口端部の径を超える管径の拡大を可能にする１個または複数個のすそ広がりに拡がった部分（１４）を含む。径の拡大は、より長い一定の径の管路と比べて全体の摩擦力を減少させることになる。径の拡大はまた、供給されたバイオマスの供給口への逆流を制限することにもなる。
【００４１】
工程の全体寸法を小さくするために槽中に１つまたは複数の方向転換部（１５）を含むことができる。槽は、前処理されたバイオマス生産物が下流の受け槽（１７）（これは糖化装置（１８）であってもよい）の引込位置またはその近くで出て行くように、バイオマスを持ち上げるためにその長さの全体または一部の上方に高所（１６）を有することができる。これは、前処理済みバイオマス生産物を糖化装置または他の受け槽に送るためのバケット、オーガー、エレベーター、または他の装置の必要性を回避する。
【００４２】
無水アンモニアおよび水蒸気を含めた前処理剤を供給するために、槽の長さに沿って１ヶ所または複数ヶ所の場所で入口（１９）が使用される。上記で示したようにこれらの入口は、バイオマス供給口の下流で、かつ前処理剤がバイオマス供給口を通って流出するのを減らす距離にある。前処理剤は、前処理を受けるバイオマスと連通して、下記に述べるように装荷バイオマスを前処理するのに十分な割合で槽中に供給される。さらに、槽に水蒸気を直接注入することによって、あるいは水蒸気または加熱油などの加熱媒体を含有し、槽を取り巻くジャケットを用いて槽を加熱することによってバイオマスに熱が与えられる。
【００４３】
槽の末端部分（２０）は、非絶縁でもよく、また、例えば反応器ジャケットを使用することにより積極的に冷却してバイオマスが槽を出て行く前に温度の低下を可能にしてもよい。滅菌水を工程に直接注入して冷却を早めてもよい。
【００４４】
前処理されたバイオマス生産物は出口で槽を出て行く。出口は、スウィング型逆止弁で使用されるような蝶番式プレート（２１）などの出口弁であることができる。流れに対抗する制御された力を加えることを利用して吐出圧力を調節することができる。
【００４５】
過剰な試薬、例えばアンモニアは、前処理工程中で捕獲し再利用することができる。アンモニアおよび水蒸気の蒸気類は、前処理槽の排気孔から放出することもできるが、一般にはこれらの蒸気は前処理済みバイオマスと一緒に排出され、受け槽（１７）またはホッパーの中へと入る。受け槽中では蒸気は、膨張し蒸発して前処理済みバイオマスから分離するようになり、一般には排気孔（２２）からベントされ、再利用のために前処理工程に導かれる。
【００４６】
別法では、加えられるアンモニアは、過剰な試薬を捕獲し再利用する必要性を回避するために、必須の化学量論量のアンモニア、プラス許容できるアンモニア残留物に限定することもできる。
【００４７】
アンモニア蒸気を使用する前処理法
本発明の方法では、静止形槽に装荷された連続供給バイオマスが、槽を通って進むにつれて無水アンモニアにより比較的乾燥した系中で処理される。系が比較的乾燥している場合、アンモニアは、機械的混合を必要としないような蒸気の状態でバイオマス全体にわたって拡がることができる。蒸気状アンモニアが通過するようなバイオマス粒子間または破片間の開いた隙間空間は、反応器内の含水量を低く保つことによって維持され、その結果、反応器中に存在する水分はバイオマスと結び付き、隙間空間に充満しない。したがって、水分はバイオマス粒子または破片の界面ではより高く、バイオマス粒子間または破片間の隙間空間中ではより低いので、槽内の含水率は一定でない。
【００４８】
槽内の全体的な総含水率は、バイオマスと、無水アンモニアと、水蒸気などの槽に加えられる任意の他の成分とを含めた槽内の総質量に対して測定される４０質量%未満残存する。本発明の方法においては、後続の糖化で生産される糖の収率によって判定される容易に糖化可能なバイオマス生産物を生産するための効果的な前処理に向けて、機械的混合を伴わずにアンモニア蒸気をバイオマスに浸透させることができることを本明細書中で示す。アンモニア装荷点からの様々な距離で採取した試料によれば、糖化の間に高レベルの糖を生産することができた。本明細書の実施例において生産される糖は、キシロースモノマーが理論上の収率の５７〜６８％の範囲、またグルコースモノマーが理論上の収率の８０〜９０％の範囲であった。
【００４９】
本発明の前処理方法に使用される槽では混合機構は必要でなく、それは静止形の槽である。槽は、円筒などの任意の形状であることができ、また水平または垂直の向きに置くことも、水平部分と垂直部分を含むこともできる。槽は、バイオマス、アンモニア、および水蒸気の導入のための１つまたは複数の出入口を有する。槽は、大気圧（０ゲージ圧）から２０ゲージ圧の圧力で稼働するように建造することができる。槽は、その温度を直接に上昇させるための手段、例えば加熱ジャケットを有することができる。槽は、アンモニア蒸気に耐えるように設計された材料のものであり、充填床型の反応器であることができる。
【００５０】
槽に装荷されるバイオマスは、典型的にはリグノセルロース系バイオマスであり、少なくとも約６０％の乾物含量を有する。バイオマスの乾燥質量の割合は、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、またはそれ以上であることができる。例えば、新たに収穫されたトウモロコシの茎葉が、一般には乾燥質量約７０％であるのに対し、バイオマスは、例えば空気乾燥により乾燥してより高い割合の乾物にすることができる。さらにバイオマスは、槽に装荷する前にサイズを小さくすることもできる。一般にはバイオマスを槽に装荷するに先立って機械的に、例えば細断、裁断、または粉砕によってそのサイズを小さくする。
【００５１】
バイオマスの入っている槽に無水アンモニアを装荷し、それをバイオマスに浸透させることによって槽内のバイオマスを無水アンモニアと接触させる。本発明の方法では槽内のバイオマスの大部分が無水アンモニアと接触する。一般には５０％を超えるバイオマスが無水アンモニアと接触する。バイオマスの少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が無水アンモニアと接触する。
【００５２】
無水アンモニアは、槽内のバイオマスの乾燥質量を基準にして少なくとも約４％の量で加えられる。使用される無水アンモニアの濃度範囲は約４％から約２０％である。６％のアンモニアを使用することにより、３％の無水アンモニアの効果と比較して、本明細書中の実施例３に示すようにその得られる無水アンモニア浸透バイオマスの糖化によるキシロースの収率は増大した。無水アンモニアの導入は、その入れられる槽内のバイオマスの温度を上昇させる。
【００５３】
無水アンモニアを加える前に反応器および／またはバイオマスの温度を上げてもよい。温度は、例えば加熱ジャケットまたは加熱コイルを用いて槽に熱を加えることによる方法、あるいは反応器の槽内に高温のガスまたは蒸気、例えば水蒸気を導入することによる方法を含めて任意の方法によって間接的にまたは直接に上昇させることができる。水蒸気は、槽内の総含水量を槽内の総質量の４０質量%未満に保つために過熱蒸気または乾燥蒸気として注入して水分の導入を避けることができる。槽内の水分は、主としてバイオマスおよび加えられるガスから来てもよい。非常に乾燥したバイオマス、例えば約１５％未満の含水率を有するバイオマスを処理する場合、低い４０％の総含水率を維持するためにその水蒸気は乾燥している必要はない。しかしながらバイオマスが、より高い含水率、例えば約３５％を有する場合には乾燥蒸気が使用される。望ましい温度は、一般には約７０℃から１９０℃の範囲である。典型的には温度は、約９０℃から１５０℃の範囲である。
【００５４】
また、槽内部の圧力を増すこともできる。圧力を増すためには水蒸気の注入を使用することができる。前処理の間、その圧力は０ゲージ圧から２０ゲージ圧未満に保たれる。バイオマスが前処理槽を通って移動する際の滞留時間は、約１０分間から５時間である。この滞留時間には、バイオマスが槽に入ってから水蒸気およびアンモニアなどの前処理剤注入用の入口に出会うまでのバイオマス装荷後の第一区分を含めることができる。典型的には滞留時間の第二区分において水蒸気およびアンモニアが注入されてバイオマスと接触し、前処理が起こる。この第二区分は、約５分間から数時間であることができる。この時間の間、アンモニアが蒸気状態でバイオマス粒子間または破片間の隙間空間を通って浸透し続ける条件を与える圧力および温度が槽内に維持される。バイオマスが、前述のように温度が下がる出口に近づく際の滞留時間の第三区分が存在してもよい。
【００５５】
所望の滞留時間の終わりに、前処理されたバイオマスは、前述のような供給装置によって加えられる力により押し出されるに従って出口を通って槽から排出される。この前処理されたバイオマス生産物は乾燥状態である。これを機械的方法によって、または重力によって次の槽に装荷することができる。
【００５６】
関連した前処理剤蒸気は、上記で言及したように再利用することができる。商業的に採算の合う方法でアンモニアを再利用することが好ましい。アンモニア蒸気は、アンモニア蒸気取扱システムを用いた、当業者に知られている方法によって再利用することができる。例えば、アンモニア蒸気を凝縮し、アンモニア水として再利用することができる。別法ではアンモニア蒸気を、主として無水状態で再利用することもできる。
【００５７】
リグノセルロース系バイオマス
本発明の方法で使用されるバイオマスはリグノセルロース系であり、これはセルロースおよびヘミセルロースなどの多糖類と、リグニンとを含有する。バイオマスの多糖類はまた、グルカンおよびキシランと呼ぶこともできる。使用することができるバイオマスの種類には、これらに限定されないが、生物燃料エネルギー作物、農作物残渣、都市ごみ、産業廃棄物、製紙汚泥、庭ごみ、木材、および林業廃棄物が挙げられる。バイオマスの例には、これらに限定されないが、トウモロコシの穂軸、トウモロコシの皮、トウモロコシの茎葉、草、小麦わら、大麦わら、カラスムギわら、菜種わら、干し草、稲わら、スイッチグラス、ススキ、コードグラス、クサヨシ、紙くず、サトウキビの絞りかす、モロコシの絞りかすまたはわら、大豆わら、穀物の製粉から得られる成分、樹木、枝、根、葉、木材チップ、おがくず、低木および灌木、野菜、果実、花、および動物厩肥が挙げられる。バイオマスには、他の穀物残渣、ハコヤナギ材、他の広葉樹材、針葉樹材、およびおがくずなどの林業廃棄物、消費者使用後の古紙製品、トウモロコシ繊維、ビートパルプ、パルプ工場微細繊維および不良品などの繊維プロセス残渣、および他の十分な量で存在するリグノセルロース系材料を挙げることができる。
【００５８】
本発明にとって特に有用なバイオマスには、比較的高い炭水化物含有率を有し、比較的高密度であり、かつ／または収集、運搬、貯蔵、および／または操作が比較的容易なバイオマスが挙げられる。
【００５９】
リグノセルロース系バイオマスは単一供給源から得ることもでき、またバイオマスは１種類以上の供給源から得られる混合物を含むこともできる。例えばバイオマスは、トウモロコシの穂軸とトウモロコシの茎葉の混合物、あるいは茎または柄と葉の混合物を含むことができる。
【００６０】
供給源から得られるバイオマスを直接使用することもでき、またそれを何らかの予備加工にかけることもできる。例えばサイズを小さくするまたは水分を減らすためにバイオマスにエネルギーを加えることができる。粒径減少は、その得られるサイズが０．１ｍｍを超える粒の粗い小型の材料を生産する方法を用いて行うことができる。使用することができる方法には、ナイフミリング、粗砕、細断、チョッピング、ディスク精砕、および粗ハンマーミル粉砕などの機械的方法が挙げられる。この種の粒径減少は、無水アンモニアによる処理の前または後に行うことができるが、一般には前である。乾燥は、任意の通常の手段、例えば乾燥炉、回転乾燥機、フラッシュ乾燥機、または過熱蒸気乾燥機の使用によることができる。さらに、約４０％未満の望ましいバイオマス含水率に到達するには空気乾燥で十分であろう。本発明の方法に使用する場合、バイオマスは、少なくとも約６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９３質量%の乾物含量を有することが望ましい。
【００６１】
前処理済みバイオマス生産物
本発明の方法により得られる前処理済みバイオマス生産物を糖化に使用して、所望の製品を生産するための生体触媒による発酵用の糖を生産する。
【００６２】
糖化
典型的には、酵素による糖化は、グルコース、キシロース、およびアラビノースを含めた糖を含有する水解物を生産するために、少なくとも１種類の糖化酵素と、多くの場合セルロースおよびヘミセルロースを分解するための酵素共同体とを利用する。糖化酵素は、Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．らの論文（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，６６：５０６〜５７７，２００２年）中で概説されている。
【００６３】
この酵素は、一般には１種類または複数種類のグリコシダーゼを含む。グリコシダーゼは、二糖、オリゴ糖、および多糖のエーテル結合を加水分解する。これらグリコシダーゼは、一般群「ヒドラーゼ」（ＥＣ  ３）の酵素分類ＥＣ  ３．２．１ｘ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  １９９２年，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ、補遺１（１９９３年）、補遺２（１９９４年）、補遺３（１９９５年）、補遺４（１９９７年）、および補遺５（それぞれ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２３：１〜５，１９９４年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３２：１〜６，１９９５年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３７：１〜５，１９９６年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５０：１〜６，１９９７年、およびＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６４：６１０〜６５０，１９９９年に記載されている））中に見出される。本発明の方法において有用なグリコシダーゼは、それらが加水分解するバイオマス成分によって分類することができる。本発明の方法において有用なグリコシダーゼには、セルロース加水分解グリコシダーゼ（例えば、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グリコシダーゼ）、ヘミセルロース加水分解グリコシダーゼ（例えば、キシラナーゼ、エンドキシラナーゼ、エキソキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、アラビノキシラナーゼ、マンナーゼ、ガラクターゼ、ペクチナーゼ、グルクロニダーゼ）、およびデンプン加水分解グリコシダーゼ（例えば、アミラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、イソアミラーゼ）が挙げられる。さらに、ペプチダーゼ（ＥＣ  ３．４．ｘ．ｙ）、リパーゼ（ＥＣ  ３．１．１．ｘおよび３．１．４．ｘ）、リグニナーゼ（ＥＣ  １．１１．１．ｘ）、およびフェルロイルエステラーゼ（ＥＣ  ３．１．１．７３）などの糖化酵素共同体に他の活性を加えて、バイオマスの他の成分からの多糖の遊離を促進させることが役立つこともある。多糖加水分解酵素を生産する微生物は、多くの場合、異なる基質特異性を有する数種類の酵素または一群の酵素が触媒する活性、例えばセルロースの分解を示すことが当業界でよく知られている。したがって微生物由来の「セルラーゼ」は、そのすべてがセルロース分解活性に寄与する一群の酵素を含むことができる。市販または非市販の酵素製剤、例えばセルラーゼは、その酵素を得るために利用させる精製スキームに応じて非常に多種類の酵素を含む可能性がある。
【００６４】
糖化酵素、例えばＳｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰセルラーゼ、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ、Ａｃｃｅｌｅｒａｓｅ（登録商標）１５００、およびＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＤＵＥＴ（Ｄａｎｉｓｃｏ  Ｕ．Ｓ．Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ．）を市場で入手することができる。さらに、糖化酵素は未精製であることも、一種類の細胞抽出物またはホールセル製剤として供給することもできる。酵素は、複数種の糖化用酵素を発現させるように遺伝子工学で作られた組換え微生物を用いて生産することもできる。
【００６５】
グリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）の種類は、本発明においては特定の等級のもの、例えばファミリーＧＨ３、ＧＨ３９、ＧＨ４３、ＧＨ５５、ＧＨ１０、およびＧＨ１１である。これらＧＨは、２種類以上の炭水化物間、または炭水化物部分と非炭水化物部分の間のグリコシド結合を加水分解する酵素の一群である。これらＧＨのファミリーは、配列類似性に基づいて分類されており、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ  ｅｎｚｙｍｅ（ＣＡＺｙ）データベース（Ｃａｎｔａｒｅｌら（２００９年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３７（Ｄａｔａｂａｓｅ発行）：Ｄ２３３〜２３８）中で入手できる。これらの酵素は、複数種の基質に対して作用することができ、本発明の糖化方法において有効である。グリコシドヒドロラーゼファミリー３（「ＧＨ３」）酵素は、複数種類の既知の活性、すなわち  −グルコシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．２１）、β−キシロシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．３７）、Ｎ−アセチル  −グルコサミニダーゼ（ＥＣ：３．２．１．５２）、グルカン  β−１，３−グルコシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．５８）、セロデキストリナーゼ（ＥＣ：３．２．１．７４）、エキソ−１，３〜１，４−グルカナーゼ（ＥＣ：３．２．１）、およびβ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．２３）を有する。グリコシドヒドロラーゼファミリー３９（「ＧＨ３９」）酵素は、α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＥＣ：３．２．１．７６）またはβ−キシロシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．３７）活性を有する。グリコシドヒドロラーゼファミリー４３（「ＧＨ４３」）酵素は、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．５５）、  −キシロシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．３７）、エンドアラビナナーゼ（ＥＣ：３．２．１．９９）、およびガラクタン  １，３−  −ガラクトシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．１４５）活性を有する。グリコシドヒドロラーゼファミリー５１（「ＧＨ５１」）酵素は、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．５５）またはエンドグルカナーゼ（ＥＣ：３．２．１．４）活性を有する。グリコシドヒドロラーゼファミリー１０（「ＧＨ１０」）酵素については、Ｓｃｈｍｉｄｔらの論文（１９９９年，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８：２４０３〜２４１２）およびＬｏ  Ｌｅｇｇｉｏらの論文（２００１年，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５０９：３０３〜３０８）中により完全に記載されている。グリコシドヒドロラーゼファミリー１１（「ＧＨ１１」）酵素については、Ｈａｋｏｕｖａｉｎｅｎらの論文（１９９６年，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：９６１７〜２４）中により完全に記載されている。
【００６６】
これらの酵素は、それらの自然宿主生物から単離することも、あるいは生産用に遺伝子工学で作られた宿主生物中で発現させることもできる。例えば、標的発現宿主細胞中で作用するプロモーターと、上記で与えられるＧＨをコードする配列と、終止シグナルとを含有するキメラ遺伝子は、プラスミドベクターから発現させるか、または当業者に知られている標準的な方法を用いて標的発現宿主細胞のゲノム中に組み込まれる。使用されるコード配列は、発現用に使用される特異的宿主に関して最適化されたコドンであることができる。一般に使用される発現宿主細胞には、細菌、例えばエスケリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、およびストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）と、酵母菌、例えばサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、およびファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ）と、糸状菌、例えばアクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ブィエルカンデラ属（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｐｏｒｉｕｍ）、コプリナス属（Ｃｏｐｕｒｉｎｕｓ）、コリオラス属（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、コリナスクス属（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）、ケトミウム属（Ｃｈａｅｒｔｏｍｉｕｍ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィロバシディウム属（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ジベレラ属（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、ヒューミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ネオカリマスティクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロカエテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、フレビア属（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロミセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、プレウロツス属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シタリジウム属（Ｓｃｙｔａｌｄｉｕｍ）、シゾフィラム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、スポロトリクム属（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トラメテス属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、およびトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）とが挙げられる。
【００６７】
当業者であれば、共同体中で使用する各酵素の有効量の決め方、および最適な酵素活性のための条件の調整の仕方を知っているはずである。当業者であれば、選択された条件下で所与の前処理生産物の最適な糖化を得るために共同体内で必要とされる酵素活性の種類の最適化の仕方もまた知っているはずである。糖化の例は、米国特許第７，９３２，０６３号明細書中に記載されている。
【００６８】
糖化は、約数分〜約２００時間、一般には約２４時間〜約７２時間行うことができる。反応の時間は、酵素の濃度および比活性、ならびに使用される基質および環境条件、例えば温度およびｐＨによって決まることになる。当業者は、特定の基質および糖化酵素共同体で使用される温度、ｐＨ、および時間の最適条件を容易に決めることができる。
【００６９】
糖化は、単一バッチで、流加回分式（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）で、または連続工程として行うことができる。糖化はまた、ワンステップで、または複数ステップで行うことができる。例えば、糖化に必要な異なる酵素は、異なるｐＨまたは温度の最適条件を示すことがある。或る温度およびｐＨで酵素（または酵素群）を用いて一次処理を行い、続いて異なる温度および／またはｐＨで異なる酵素（または酵素群）を用いて二次または三次（またはそれ以上の）処理を行うことができる。さらに、逐次ステップにおける異なる酵素による処理は、同一のｐＨおよび／または温度であってもよく、あるいはより高いｐＨおよび温度において安定かつより活性であるヘミセルラーゼを使用し、続いてより低いｐＨおよび温度において活性であるセルラーゼを使用するなどの異なるｐＨおよび温度であってもよい。
【００７０】
発酵に先立って糖化混合物を、例えばそれら発酵可能な糖の濃度を増すために蒸発によって濃縮することができる。任意選択的に、その糖化生産物中の液体をバッチ法または連続法で固体から分離することもできる。任意選択的に、その液体またはその糖化生産物全体を発酵に先立って滅菌することもできる。発酵の間に使用される生体触媒および糖化の間に使用されるｐＨに応じて、ｐＨを発酵に適したものに調整することができる。
【００７１】
発酵可能な糖を含有するバイオマス水解物は、一般に発酵培地の或る割合として培地中に含まれ、生体触媒の成長および生産物の生産用の炭素供給源の全体または一部を形成する。発酵培地中の水解物は、一般には発酵培地の約４０％〜９０％である。発酵培地の４０％または８０％として使用される水解物の例が、米国特許第７，９３２，０６３号明細書の実施例９に示されている。水解物中の発酵可能な糖の濃度によっては追加の糖を培地に加えることができる。例えば、約８０ｇ／Ｌのグルコースと約５０ｇ／Ｌのキシロースを含有する水解物が発酵培地の４０％で含まれる場合、追加のグルコースおよびキシロースを加えて所望の最終糖濃度にすることができる。水解物に加えて、発酵培地は、当業者によく知られている、他の栄養分、塩、ならびに生産物の生産に使用されるその特異的生体触媒が成長および生産のために必要とする要素とを含有することができる。それら栄養補助剤には、例えば酵母抽出物、特異アミノ酸、リン酸塩、窒素源、塩、および微量元素を挙げることができる。特異的生体触媒によって作られる特異的生産物の生産に必要な成分にはまた、例えばプラスミドを維持するための抗生物質、または酵素触媒反応において必要な補因子を挙げることができる。
【００７２】
水解物を調製し、それを発酵培地に加え、次いで発酵を行う代わりとして、同時糖化発酵（ＳＳＦ）法を用いてバイオマス水解物発酵ブロスを生産することもできる。この方法では糖は、それらが生産生体触媒によって代謝されるにつれてバイオマスから生産される。
【００７３】
生体触媒の発酵および目的生産物
発酵培地中の発酵可能な糖を適切な生体触媒によって代謝して目的生産物を生産する。発酵過程で糖を生体触媒と接触させる。そこで生体触媒は、その生体触媒によって作られる目的生産物が生産される条件下で成長する。温度および／または頭隙ガスは、使用中の特定の生体触媒に役立つ条件に応じて発酵に合わせて調整することができる。発酵は、好気性でも嫌気性でもよい。温度およびｐＨを含めたこれらのおよび他の条件は、使用される特定の生体触媒に合わせて調整される。
【００７４】
生体触媒によって生産される目的生産物の例には、１，３−プロパンジオール、ブタノール（イソブタノール、２−ブタノール、および１−ブタノール）、およびエタノールが挙げられる。１，３−プロパンジオールを生産する組換え微生物が、米国特許第７，５０４，２５０号明細書中に開示されている。遺伝子組換え酵母菌によるブタノールの生産は、例えば米国特許第７，８５１，１８８号明細書中に開示されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の遺伝子組換え株もまた、エタノール生産のための生体触媒として使用されてきた（Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄらの論文（２００２年）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：６２６３〜６２７２）。エタノールは、リグノセルロース系バイオマス水解物発酵培地中で遺伝子組換えザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）によって生産されている（米国特許第７，９３２，０６３号明細書）。エタノールの生産を向上させる使用することができるザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）の遺伝子組換え株が、米国特許第７，２２３，５７５号明細書および米国特許第７，９９８，７２２号明細書中に記載されている。
【実施例】
【００７５】
下記実施例において本発明をさらに明確にする。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、例示の目的でのみ与えられることを理解されたい。前述の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的な特徴を突き止めることができ、そして本発明を様々な用途および条件に適合させるために、本発明の精神および範囲から逸脱することなくその様々な変形形態および修正形態を作り出すことができる。
【００７６】
使用される省略形の意味は下記の通りである。「ｓ」は秒であり、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」または「ｈｒ」は時間を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍ」はメートルであり、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「ｃｍ」はセンチメートルを意味し、「μｍ」はマイクロメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「Ｍ」はモルを意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｋｇ」はキログラムであり、「ｒｐｍ」は１分当たり回転数を意味し、「Ｃ」は摂氏であり、「ｐｐｍ」は１００万分の１を意味し、「ｐｓｉ」は平方インチ当たりポンドである。
【００７７】
一般的方法
糖化酵素
Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）１５００（Ａ１５００）を、Ｄａｎｉｓｃｏ  Ｕ．Ｓ．Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）から得た。
【００７８】
充填床反応器
垂直向きステンレス鋼製フィルターハウジング圧力槽からなり、取外し可能な蓋を有する充填床前処理反応器を使用した。この圧力槽は、上部が開いたステンレス鋼製の取出し可能な円筒状バスケット、固体壁、および穴のあいた基底部を収容する。バスケットは、バイオマスを充填床に静的に取り入れることを可能にし、かつバイオマス粒子間の間隙体積全体にわたる、頂部充填または底部充填液体、蒸気、および／またはガスの通過を可能にした。
【００７９】
フィルターハウジングは、８インチ（２０．３ｃｍ）の内径および２９インチ（７３．７ｃｍ）の室内長を有した。円筒状バスケットは、６．５インチ（１６．５ｃｍ）の径、２９インチ（７３．７ｃｍ）の深さ、および約１５．８リットルの容積を有した。
【００８０】
可撓性の銅管が、フィルターハウジングの外面領域の約３０％を取り囲む。槽の外側を加熱するために使用されるこの銅管は、１６４．７ｐｓｉａ（１１３５．６キロパスカル）の水蒸気供給源に連結された。
【００８１】
充填床反応器に合わせて、
・完全または不完全真空を作り出すために空気を排出すること、
・８４．７ｐｓｉａ（５８４キロパスカル）で動作するボイラーからの飽和蒸気を加えること、
・無水アンモニアを加えること、
・反応後、プロセス蒸気を排出すること、
・反応後、真空を破るために空気を加えること
を可能する管接合部が作られた。
【００８２】
実施例１
糖化準備におけるバイオマスの充填床前処理
４．０７ｋｇのトウモロコシ穂軸を細断し分類して、１／４インチ（０．６４ｃｍ）を超え、かつ３／８インチ（０．３７５ｃｍ）未満の粒径を有する穂軸画分を得た。このトウモロコシ穂軸をバスケットに入れ、次いで一般的方法で述べた前処理反応器に入れた。このトウモロコシ穂軸は、８．６％の含水率および２２７．５ｇ／Ｌのかさ密度を有した。予備反応充填床は約２９インチ（７３．７ｃｍ）の深さであった。
【００８３】
空気を反応器から排気し、０．１バール（１０キロパスカル）の不完全真空を達成した。絶乾バイオマスの質量を基準にして８質量%の無水アンモニアが、２９７．６ｇのアンモニアを約６０分の時間をかけて装荷することによって加えられた。次いで、８４．７ｐｓｉａ（５８４キロパスカル）の圧力の飽和蒸気を加えて、反応器の温度を約７０℃に至らせた。この時点で、４０分の保持時間の間に反応器の温度を７０℃から９０℃へ上昇するに任せた。反応器中の圧力は、この保持時間の間ずっと約８５ｐｓｉａ（５８４キロパスカル）であった。この保持時間の後に、その加圧されたガスおよび蒸気を放出し、冷却した外部取り込み槽内に閉じ込めた。反応器が大気圧に達したとき、真空ポンプを用いて反応器を約０．１バール（１０キロパスカル）まで排気し、その圧力で５分間保った。次いで反応器の排気口を開いて真空を解放して大気圧にした。工程が大気圧に達した後に、前処理反応器を開いた。
【００８４】
前処理されたバイオマスを、充填床の頂部から底部までの四分画した各分画、すなわち表１の場合のように第一四半画分（頂部）、第二四半画分、第三四半画分、第四四半画分（底部）から取り出した。これらの画分を含水率および残留アンモニアについて分析し、結果を表２に示す。残留アンモニアは、既知量の前処理済み固体を水中で１時間抽出し、次いで０．１Ｎ  ＨＣｌによる滴定を用いてｐＨ５．３に達するための酸の当量を求めることによって決定した。次いでその当量を正規化して抽出系中の乾物の量にした。さらにその後、等質量の各画分を一緒にし、次いで分析して、前処理済みバイオマスのミキシングカップ組成を決定した。
【００８５】
表１．29インチ(73.7 cm)深さの反応器床中の４つの離れた層から回収した試料
2013544099.tif 000003
【００８６】
表２．前処理された材料の分析
2013544099.tif 000004
*DMは乾物
【００８７】
各前処理済みバイオマス画分の試料を酵素により糖化して、グルカンおよびキシランの単糖およびオリゴ糖の収率を決定した。
【００８８】
糖化手順
各画分の０．５６ｇを計量して、個々の２０ｍＬシンチレーション用バイアルに入れた。適量の５０ｍＭ（ｐＨ５）酢酸緩衝液を加えて、１バイアル当たり１８．６％の固形物を得た。１Ｎ  Ｈ2ＳＯ4を加えることによってｐＨを５に調整した。この酢酸緩衝液は、インキュベーション中の原料内の細菌の成長を抑制するために０．００５％アジ化ナトリウムを含有した。
【００８９】
酵素による糖化は、グルカン＋キシラン７．２ｍｇ／ｇ、またはグルカン＋キシラン２１．７ｍｇ／ｇのいずれかでヘミセルラーゼ（Ｘｙｎ３、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ５１Ａ、およびＦｖ４３Ｄ）の反応混液と組み合わせたＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）１５００を使用して行った。酵素を各バイアルに加え、続いてインキュベーション中の原料の十分な摩砕を実現するために１．１／２インチ（１．３ｃｍ）の鋼球を加えた。
【００９０】
バイアルにしっかり蓋をかぶせ、回転式ふりまぜ機中で１８０ｒｐｍの回転式ふりまぜ機上に７２時間放置して約４８℃において糖化した。
【００９１】
インキュベーション後、試料を水で希釈してから濾過し、ＨＰＬＣによって分析した。これら試料を、移動相として０．０１Ｎ  Ｈ2ＳＯ4を０．６ｍＬ／分の流量で使用する６０℃でのＨＰＸ−８７Ｈカラム（ＢｉｏＲａｄ）流出を用いたＨＰＬＣ分析にかけた。
【００９２】
総糖値を、硫酸の添加による酸加水分解、オートクレーブ処理、濾過、およびＨＰＬＣによる分析によって得た。オリゴマーの値は、各試料について総糖濃度からそのモノマーを引くことによって求めた。結果を表３に示す。
【００９３】
表３．処理済みバイオマスの四分画した各画分の加水分解から生産された糖
2013544099.tif 000005
【００９４】
実施例２
糖化準備における高温度で短時間によるバイオマスの充填床前処理
実施例１の場合と同様に３．７４ｋｇの粉砕トウモロコシ穂軸を、一般的方法で述べた反応器のバスケットに入れた。このバスケットを前処理反応器に入れた。トウモロコシ穂軸は、８．６％の含水率および２２７．５ｇ／Ｌのかさ密度を有した。予備反応の充填床は約２９インチ（７３．７ｃｍ）の深さであった。
【００９５】
１５０ｐｓｉｇ（１０３４．２キロパスカル）の水蒸気を予熱器の銅コイルに当てた。予熱器の蓋が１４５℃に達した時、０．６ｐｓｉａの不完全真空が達成されるまで空気を排気した。水蒸気は工程に直接注入され、１７ｐｓｉａ（４．１４キロパスカル）の圧力に達した。次いで、底弁を開いて系中で形成された凝縮物を放出することによって予熱器をベントした。すべての凝縮物が系からパージされたことを確実にするために、開いた底弁から乾燥蒸気が出るのが観察されるまで水蒸気を予熱器の頂部に注入した。この時点で反応器中の温度は約１００℃であった。水蒸気の流れを止め、次いで排水弁を閉じた。バイオマス中への熱吸収のせいで反応器の温度は８０℃に降下し、８ｐｓｉａの不完全真空を生じさせた。この時点で工程に１９０．３ｇの無水アンモニアを加えて、反応器中に装荷した乾物を基準にして６質量%のアンモニア負荷を達成した。アンモニアの添加後に、工程に１５０℃の反応温度および７０ｐｓｉａ（４８２．６キロパスカル）の圧力に至らせるのに十分な水蒸気を加えた。３０分後、加圧されたガスおよび蒸気を放出し、冷却した外部取り入れ槽内に捕獲した。反応器が大気圧に達したら、次にバイオマスから残留アンモニアをさらに減少させるために、真空ポンプを用いて反応器を約０．１バール（１０キロパスカル）まで排気し、その圧力に５分間保った。次いで反応器の排気口を開いて真空を解放して大気圧にした。工程が大気圧に達した後、前処理反応器を開いた。
【００９６】
表４の場合のように、前処理されたバイオマスを充填床の頂部から底部まで四つに分画した各画分から取り出した。これらの画分を含水率および残留アンモニアについて分析し、結果を表５に示す。さらにその後、等質量の各画分を一緒にし、次いで分析して、前処理済みバイオマスのミキシングカップ組成を決定した。
【００９７】
表４．30-inch深さの反応器床中の反応器床の４つの離れた層から回収した試料
2013544099.tif 000006
【００９８】
表５．前処理された材料の分析
2013544099.tif 000007
*DM は乾物
【００９９】
各前処理済みバイオマス画分の試料を酵素により糖化して、実施例１で述べたと同様にグルカンおよびキシランの単糖およびオリゴ糖の収率を決定した。
【０１００】
表６．処理済みバイオマスの四分画した各画分の加水分解から生産された糖
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【図１】
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【国際調査報告】
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