(57)【要約】  ＫＡＴＰチャネルの調節に関連する組成物及び方法並びにＫＡＴＰとｍｉｔｏＫＡＴＰチャネルの調節によって肝障害を治療する方法が開示される。
2013527754.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子をアッセイする方法であって、
ａ．無標識バイオセンサーの分析に使用されるバイオセンサー表面上でＫＡＴＰ細胞株を培養するステップと、
ｂ．分子で前記細胞株をインキュベートして分子処理した細胞株を産生するステップと、
ｃ．無標識バイオセンサーで前記分子処理した細胞株を分析して分子データ出力を産生するステップと、
ｄ．同一の前記細胞株における前記分子データ出力と既知のＫＡＴＰモジュレーターデータ出力とを比較して分子−ＫＡＴＰモジュレーターの比較を産生するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
分子をアッセイする方法であって、
ａ．無標識バイオセンサーの分析に使用されるバイオセンサー表面上でＫＡＴＰ細胞株を培養するステップと、
ｂ．マーカー及び分子で前記細胞株をインキュベートしてインキュベートしている細胞株を産生するステップと、
ｃ．無標識バイオセンサーで前記インキュベートしている細胞株を分析してマーカー−分子データ出力を産生するステップと、
ｄ．同一の前記細胞株における前記マーカー−分子データ出力とマーカー−ＫＡＴＰモジュレーターデータ出力とを比較してマーカー−分子／マーカー−ＫＡＴＰモジュレーターの比較を産生するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
ＫＡＴＰ細胞株はミトコンドリアＡＴＰ感受性カリウムイオンチャネル（ｍｉｔｏＫＡＴＰ）を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
細胞株は肝細胞を含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
肝細胞は肝細胞を含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
肝細胞は肝ウイルスに感染されたことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
肝ウイルスは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅの型肝炎、単純ヘルペス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、黄熱病ウイルス、又はアデノウイルスであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
細胞は、非ウイルス性感染症に感染された源から得ることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項９】
非ウイルス性感染症は、トキソプラズマ、レプトスピラ、Ｑ熱、又はロッキー山紅斑熱を含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
細胞は、化学物質、毒素、又は薬物であるか又はそれらの影響を受ける源から得ることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
化学物質又は毒素は、アルコール、パラセタモール、アモキシシリン、抗結核薬、ミノサイクリン、メチルドパ、ニトロフラントイン、イソニアジド又はケトコナゾールを含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
既知ＫＡＴＰモジュレーターデータ出力は、培養した前記ＫＡＴＰ細胞株で前記ＫＡＴＰモジュレーターをインキュベートしてＫＡＴＰモジュレーターデータ出力を生成する無標識バイオセンサーで、前記インキュベートした細胞株を解析することにより、産生されたことを特徴とする請求項１ないし１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
前記比較において分子データ出力及びＫＡＴＰモジュレーターデータ出力が類似していることを示すとき、潜在的ＫＡＴＰモジュレーターを識別するステッップを更に含むことを特徴とする請求項１ないし１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４】
ＫＡＴＰ細胞株は、ＨｅｐＧ２細胞又はＨｅｐＧ２Ｃ３Ａ細胞株から選択されることを特徴とする請求項１ないし１３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５】
既知ＫＡＴＰモジュレーターは、カリウムチャネルオープナー（ＫＣＯ）を含むことを特徴とする請求項１ないし１４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１６】
ＫＣＯは、ジアゾキシド、ピナシジル、クロマカリム又はニコランジルを含むことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＫＡＴＰモジュレーターは、ＫＡＴＰ抑制物質を含むことを特徴とする請求項１ないし１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１８】
ＫＡＴＰ抑制物質は、スルホニルウレア又はＵ−３７８８３Ａを含むことを特徴とする請求項１ないし１７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１９】
スルホニル尿素は、トルブタミド、トラザミド又はグリピジドを含むことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
マーカー−ＫＡＴＰモジュレーターデータ出力は、培養した前記ＫＡＴＰ細胞株で前記マーカー及び前記ＫＡＴＰモジュレーターをインキュベートして、マーカー−ＫＡＴＰモジュレーターデータ出力を生成する無標識バイオセンサーで、前記インキュベートした細胞株を解析することにより、産生されたことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２１】
前記比較においてマーカー−分子データ出力及びマーカー−ＫＡＴＰモジュレーターデータ出力が類似していることを示すとき、潜在的ＫＡＴＰモジュレーターを識別するステッップを更に含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２２】
マーカーはＲＯＣＫ１抑制物質又はＲＯＣＫ２抑制物質を含むことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＲＯＣＫ１抑制物質又はＲＯＣＫ２抑制物質はＹ−２７６３２、Ｈ−８９、Ｈ−８を含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
マーカーはＪＡＫモジュレーターを含むことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
ＪＡＫモジュレーターは、ＪＡＫ抑制物質を含むことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＪＡＫ抑制物質は、ＡＧ４９０を含むことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
マーカーは、チトクロムＰ４５０酵素モジュレーターを含むことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
チトクロムＰ４５０酵素モジュレーターは、チトクロムＰ４５０活性化物質を含むことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
チトクロムＰ４５０酵素は、ＣＹＰ２Ｄ６又はＣＹＰ３Ａ４を含むことを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
チトクロムＰ４５０活性化物質は、リファンピシンを含むことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＲＯＣＫ経路の活性化に対する分子をアッセイするステップを更に含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項３２】
前記アッセイのステップは、
ａ．無標識バイオセンサーの分析に使用される表面上でＲＯＣＫ抑制物質応答性細胞株を培養するステップと、
ｂ．分子で前記細胞株をインキュベートしてインキュベートする細胞株を産生するステップと、
ｃ．無標識バイオセンサーで前記インキュベートする細胞株を分析して分子データ出力を産生するステップと、
ｄ．同一の前記細胞株における前記分子データ出力と既知のＲＯＣＫ抑制物データ出力とを比較して分子−ＲＯＣＫ抑制物の比較を産生するステップと、を含むことを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ＲＯＣＫ抑制物質応答性細胞株は、既知のＲＯＣＫ抑制物質によるＲＯＣＫの基礎活性を阻害することが豊富なバイオセンサーシグナルを生成するような細胞株を含むことを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
細胞株は、Ａ４３１、Ａ５４９、又はＨＴ２９から選択されることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記方法は、少なくとも２つのマーカーを使用して独立して実行されることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項３６】
マーカーは少なくともＥＣ７０、ＥＣ８０、ＥＣ９０、ＥＣ９５、及びＥＣ１００の濃度で添加されることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
分子をアッセイする方法であって、
ａ．無標識バイオセンサーの分析に使用されるバイオセンサー表面上でＡ４３１、ＨＴ２９、Ａ５４９、及びＨｅｐＧ２の４つの異なる細胞株を培養するステップと、
ｂ．分子で前記細胞株の各々をインキュベートして４つのインキュベートしている細胞株を産生するステップと、
ｃ．無標識バイオセンサーで前記インキュベートしている細胞株の各々を分析して各インキュベートしている細胞株に対する分子データ出力を産生するステップと、
ｄ．同一の前記細胞株における前記分子データ出力とＲＯＣＫ抑制物質のデータ出力とを比較して各細胞株に対する分子−ＲＯＣＫ抑制物質の比較を産生するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項３８】
ＲＯＣＫ抑制物質のデータ出力は、各細胞株とＲＯＣＫ抑制物質をインキュベートし、各細胞株に対するＲＯＣＫ抑制物質のデータ出力を生成する無標識バイオセンサーで各培養細胞株を解析することにより産生することを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ＫＡＴＰモジュレーターデータ出力を生成するステップと、各細胞株について分子−ＫＡＴＰ抑制物質の比較を生成するステップと、を更に含むことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
追加のイオンチャネルアッセイを行うステップを更に含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４１】
追加のイオンチャネルアッセイは、従来の又は自動化されたパッチクランプするステップを含むことを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
対象物を処理する方法であって、肝疾患の治療の必要性である対象物にｍｉｔｏＫＡＴＰモジュレーターを投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項４３】
肝疾患はＪＡＫ又はｍｉｔｏＫＡＴＰから下流のＲｈｏキナーゼシグナルに関与することを特徴とする請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ｍｉｔｏＫＡＴＰチャネルはＫｉｒ６．２及びＳＵＲ２チャネルであることを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
対象物における肝毒性を減少させる方法であって、ＫＣＯの機能が対象物に与えられた薬物の肝臓毒性を減少させる前記ＫＣＯを対象物に投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項４６】
ＫＣＯがピナシジルであることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（先に出願された米国特許出願の利益の主張）
本願は、２０１０年３月３０日に出願された米国仮出願第６１／３１９，０６１号に基づく優先権の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
アデノシン三リン酸感受性カリウムチャネル（ＫＡＴＰチャネル）は、細胞の代謝レベルを細胞膜興奮性にリンクする分子センサーとしての役割を果たす。現在まで、ＫＡＴＰチャネルを調節する能力に対する迅速かつ効率的に評価するための分子メカニズムは面倒な電気タイプのアッセイに限定されている。本明細書で提供されるものは、肝細胞等の細胞におけるＫＡＴＰチャネルアッセイ、特に、ミトコンドリアＫＡＴＰチャネルアッセイを実行できる方法、組成物、及び機器である。また、肝細胞のＫＡＴＰチャネルを調節することによって肝疾患を治療する方法も開示される。
【発明の概要】
【０００３】
薬物標的としてミトコンドリアＡＴＰ感受性カリウムイオンチャネル（ｍｉｔｏＫＡＴＰ）を使用する方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、本方法は、肝疾患を予防又は治療できる化合物を同定することができる。いくつかの実施形態では、化合物は、ｍｉｔｏＫＡＴＰチャネルのモジュレーターである。また、肝細胞におけるｍｉｔｏＫＡＴＰチャネルモジュレーターを選別するために無標識バイオセンサーの細胞アッセイを使用する方法も本明細書で開示される。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】図１は、肝細胞株のＨｅｐＧ２Ｃ３Ａにおける内因性ＫＡＴＰチャネルの発現を示す。
【図２】図２は、Ｋｉｒ６．２サブユニットのウェスタンブロッティング法によって証明された内因性ＫＡＴＰイオンチャネルがＨｅｐＧ２Ｃ３Ａ細胞内のミトコンドリアに存在することを示す。
【図３】図３は、本発明の一実施形態に係るリアルタイムで記録されたＨｅｐＧ２Ｃ３Ａ細胞におけるＫＡＴＰオープナーのピナシジル誘起ＤＭＲシグナルを示す。（Ａ）は異なる用量でピナシジルによる刺激に応答したＨｅｐＧ２Ｃ３Ａのリアルタイム運動ＤＭＲシグナルを示す。（Ｂ）はピナシジル用量の関数としての刺激後３０分でのピナシジルＤＭＲシグナルの振幅だけでなく、ピナシジルＤＭＲシグナルの動態（Ｔ１／２）を示す。
【図４】図４は、ｈｅｐＧ２Ｃ３Ａ細胞におけるピナシジル誘起ＤＭＲシグナル上のｓｉＲＮＡによるＳＵＲノックダウンの影響を示す。（Ａ）はＳＵＲ２又はＳＵＲ１のＲＮＡｉノックダウンがある場合とない場合ピナシジルＤＭＲシグナルのリアルタイム動態を示す。（Ｂ）は異なるＲＮＡｉノックダウン前処理の関数としてピナシジルに対する細胞応答（刺激後３０分）の振幅を示す。負のコントロール（すなわち、媒体バッファへの細胞応答）も含まれる。
【図５】図５は、ｈｅｐＧ２Ｃ３Ａ細胞におけるピナシジル誘起ＤＭＲシグナル上のｓｉＲＮＡによるノックダウンＫｉｒ６．ｘの影響を示す。（Ａ）はＫｉｒ６．１又はＫｉｒ６．２のＲＮＡｉノックダウンがある場合とない場合ピナシジルＤＭＲシグナルのリアルタイム動態を示す。（Ｂ）は異なるＲＮＡｉノックダウン前処理の関数としてピナシジルに対する細胞応答（刺激後３０分）の振幅を示す。負のコントロール（すなわち、媒体バッファへの細胞応答）も含まれる。
【図６】図６は、ＨｅｐＧ２Ｃ３Ａ細胞におけるｍｉｔｏＫＡＴＰチャネルの薬理学的特性を示す。（Ａ）は既知ＫＡＴＰブロッカートラザミドによってピナシジルＤＭＲシグナルの用量依存的阻害を示す。（Ｂ）は既知のＫＡＴＰブロッカーのパネルによるピナシジルのＤＭＲシグナルの用量依存性の調節を示し、それらの用量の関数としてピナシジルＤＭＲシグナルの振幅としてプロットされている。（Ｃ）はピナシジルＤＭＲシグナル上の異なるブロッカー各３２μＭでの影響を示す。すべての実験においてピナシジル濃度は４０μＭであった。
【図７】図７は、ｍｉｔｏＫＡＴＰシグナル伝達がＲｈｏキナーゼ活性にリンクされていることを示す。ＲＯＣＫ抑制物質Ｙ−２７６３２はＨｅｐＧ２Ｃ３Ａ細胞において用量依存的にピナシジルＤＭＲシグナルを減衰させた。（Ａ）は、異なる用量でのＹ−２７６３２の存在下でリアルタイム運動ピナシジルのＤＭＲシグナルを示す。（Ｂ）はＹ２７６３２用量の関数としてピナシジルＤＭＲシグナルの振幅を示す。すべての実験においてピナシジル濃度は４０μＭであった。
【図８Ａ−Ｂ】図８Ａ−Ｂは、ｍｉｔｏＫＡＴＰシグナル伝達がＲｈｏキナーゼ活性にリンクされていることを示す。ＲＯＣＫ１又はＲＯＣＫ２どちらかのＲＮＡｉノックダウンは著しくピナシジルＤＭＲシグナルを減衰させた。（Ａ）リアルタイムピナシジルのＤＭＲシグナルを示し、（Ｂ）は別のＲＮＡｉノックダウンの関数としてピナシジルＤＭＲの振幅を示す。また、ＲＮＡｉノックダウンは著しくＨｅｐＧ２Ｃ３Ａ細胞内で対応するタンパク質を減少させた。すべての実験において、ピナシジル濃度は４０μＭであった。
【図８Ｃ−Ｄ】図８Ｃ−Ｄは、ｍｉｔｏＫＡＴＰシグナル伝達がＲｈｏキナーゼ活性にリンクされていることを示す。ＲＯＣＫ１又はＲＯＣＫ２どちらかのＲＮＡｉノックダウンは著しくピナシジルＤＭＲシグナルを減衰させた。また、ＲＮＡｉノックダウンは著しくＨｅｐＧ２Ｃ３Ａ細胞内で対応するタンパク質を減少させた。（Ｃ）はＲＯＣＫ１ノックダウンを示し、（Ｄ）はＲＯＣＫ２ノックダウンを示す。すべての実験において、ピナシジル濃度は４０μＭであった。
【図９】図９は、ｍｉｔｏＫＡＴＰシグナル伝達がアクチンの再造形にリンクされていることを示す。２つのよく知られたアクチン分裂剤によるピナシジルＤＭＲシグナルの依存性の阻害は、（Ａ）でサイトカラシンＢを示し、（Ｂ）でラトランクリンＡを示す。すべての実験においてピナシジル濃度は４０μＭであった。
【図１０】図１０は、ｍｉｔｏＫＡＴＰシグナル伝達がＪＡＫキナーゼの活性にリンクされていることを示す。ＪＡＫ抑制物質ＡＧ４９０は、用量依存的に細胞内でＨｅｐＧ２Ｃ３ＡピナシジルＤＭＲシグナルを阻害した。（Ａ）はリアルタイム動態を示し、（Ｂ）はＡＧ４９０用量の関数としてピナシジルＤＭＲの振幅を示す。すべての実験において、ピナシジル濃度は４０μＭであった。
【図１１】図１１は、ｍｉｔｏＫＡＴＰチャネルシグナル伝達がＪＡＫの活性にリンクされていることを示す。ＪＡＫ１ではなく、ＲＮＡｉのＪＡＫ２又はＪＡＫ３のどちらかがノックダウン、ピナシジルＤＭＲシグナルを著しく減衰させた。（Ａ）はリアルタイムピナシジルのＤＭＲシグナルを示し、（Ｂ）は異なるＲＮＡｉノックダウンの関数としてのピナシジルＤＭＲの振幅を示す。
【図１２Ａ−Ｂ】図１２Ａ−Ｂは、ｍｉｔｏＫＡＴＰチャネル調節が原発性肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ４活性のリファンピン起因誘導を抑制することを示す。（Ａ）はＣＹＰ３Ａ４活性のピナシジルの影響を示す。（Ｂ）は、ＣＹＰ３Ａ４活性のリファンピシン誘導のピナシジルの影響を示す。原発性肝細胞は、ＣＹＰ前の３日間まで酵素活性測定のための特定の用量での化合物でプレインキュベート（ｐｒｅ−ｉｎｃｕｂａｔｅｄ）された。
【図１２Ｃ−Ｄ】図１２Ｃ−Ｄは、ｍｉｔｏＫＡＴＰチャネル調節が原発性肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ４活性のリファンピン起因誘導を抑制することを示す。（Ｃ）はＣＹＰ３Ａ４活性のグリピジドの影響を示す。（Ｄ）はＣＹＰ３Ａ４活性のリファンピシン誘導のグリピジドの影響を示す。原発性肝細胞は、ＣＹＰ前の３日間まで酵素活性測定のための特定の用量での化合物でプレインキュベート（ｐｒｅ−ｉｎｃｕｂａｔｅｄ）された。
【図１２Ｅ−Ｆ】図１２Ｅ−Ｆは、ｍｉｔｏＫＡＴＰチャネル調節が原発性肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ４活性のリファンピン起因誘導を抑制することを示す。（Ｅ）はＣＹＰ１Ａ２活性にピナシジルの影響を示す。（Ｆ）はＣＹＰ１Ａ２活性のグリピジドの影響を示す。原発性肝細胞は、ＣＹＰ前の３日間まで酵素活性測定のための特定の用量での化合物でプレインキュベート（ｐｒｅ−ｉｎｃｕｂａｔｅｄ）された。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
Ａ．材料、組成物及びアッセイ：
１．イオンチャネル：
イオンチャネルは、細胞膜を通過するイオンの動きを制御する内在性膜タンパク質である。人間において、約４００の遺伝子がタンパク質を符号化して、数千以上のいくつかの異なるイオンチャネルサブタイプを組み立てて形成して、通常、チャネルポアを形成し付属サブユニットを伴うヘテロ多量体複合体である。これらのサブタイプは、それらのイオン選択、配列相同性、四次構造やゲート開閉機構に応じて分類することができる。イオンチャネルは、刺激の広い配列に対応してゲーティングによる細胞の電気的特性を制御する。現在までに、イオンチャネルは、小さな分子やイオン等の配位子の濃度変化、膜電位の変化、温度変化、膜張力の変化、及び、可視光への曝露に敏感であることが最近確認されている。
【０００６】
イオンチャネルタンパク質は、細胞内又は細胞外のリガンド又はイオンは、電圧、温度やストレッチによってゲート開閉され得る。細胞膜のチャネルを通るイオン流動は、次の３つの要因、機能的なチャネルの数と、イオンの電気化学勾配を下げるイオンのために存在する原動力と、開口のイオン伝導状態におけるチャネルの割合とによって決定される。この開口確率は、Ｇ−タンパク質、脂質キナーゼ等のシグナル伝達分子や、他のシグナル伝達分子の大きな変動で調節され得る。
【０００７】
イオンチャネルは人間の病気状態へ導く分子経路において重要な役割を果たし、病気と先天性イオンチャネル機能障害（いわゆるチャネル病）との間の既知リンク数の増加に反映されている。更に、イオンチャネルは、Ｇタンパク質共役受容体、キナーゼ、トランスポーター及び酵素の５つの主要な薬物標的のファミリーの１つである。高血圧治療ためのＬ型Ｃａ２＋チャネルブロッカー、糖尿病治療ための細胞膜ＫＡＴＰチャネルオープナー、不安治療ためのＧＡＢＡＡ受容体モジュレーター、及び、てんかんや不整脈患者に与える使用依存性Ｎａ＋チャネルブロッカーは、ブロックバスター売上高を示す薬物の例である。このように、イオンチャネルは非常に魅力的な薬物標的である。
【０００８】
しかし、ほとんどの市販のイオンチャネル薬は運よく見つけたものであり、数百万の化合物ライブラリが使用されていたイオンチャネル創薬は、ハイスループット技術の影響を受けやすい機能アッセイの欠如によって妨げられてきた。
【０００９】
２．肝臓と肝疾患：
肝臓は、人間が日常的にさらされている化学物質の膨大な数と種類の代謝の主要な器官である。肝臓での代謝酵素中で最も重要なクラスは、積極的に薬や他の化学物質の排除に関与するチトクロムＰ４５０である。Ｐ４５０は、それらを排泄できるように化学物質を分解するプロセスを開始するが、代謝の過程で、所望の薬理学的効果を有するいくつかの活性代謝物は、作成することができる。しかし、逆もまた真であり、代謝は共通の鎮痛剤アセトアミノフェンの分解のように有毒な代謝産物を生成することができる。
【００１０】
肝臓は血液から多くの有毒物質の解毒だけでなく、多くの化合物の合成と分泌の主な器官トである。肝細胞、肝臓の細胞質質量の７０−８０％を占める最も豊富な細胞は、肝臓での代謝と生合成プロセスのほとんどを行っている。したがって、in vitroで培養された肝細胞は薬物代謝と毒性試験用に好まれている。
【００１１】
肝炎（複数の肝炎）は、臓器の組織における炎症性細胞の存在によって特徴付けられる肝臓への損傷を意味する。条件は、自分自身で癒し、自己制限することも、肝臓の瘢痕化に進行することができる。それが長く持続するとき、それが六箇月以上と慢性持続するときには、急性肝炎と考えられている。肝炎は肝臓の損傷、世界中のほとんどの症例の原因となる肝炎ウイルスによって引き起こされる場合がある。肝炎は毒素（特にアルコール）、他の感染症や自己免疫プロセスから引き起こされる場合もある。
【００１２】
肝炎にはＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ型肝炎並びに虚血性肝炎等の多くの種類がある。肝炎はウイルス（例えば、肝炎Ａ−Ｅのほとんどがウイルス感染によって引き起こされる）によって誘発される。肝炎はまた毒素、化学物質、薬物分子（例えば、アルコール、毒素、パラセタモール、アモキシシリン、抗結核薬、ミノサイクリン）に起因することもある。肝炎はまた、循環不全（すなわち、虚血性肝炎）、自己免疫状態、代謝性疾患、又はウィルソン病等の遺伝性疾患に起因され得る。
【００１３】
急性肝炎は、肝炎Ａ−Ｅ型（ウイルス原因の９５％以上）、単純ヘルペス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、黄熱病ウイルス、及びアデノウイルスの感染によって引き起こされ得る。急性肝炎はまた、トキソプラズマ、レプトスピラ症、Ｑ熱、及びロッキー山紅斑熱等の非ウイルス性感染症による原因で、同様に化学物質やアルコール等の毒素、毒素及び薬物（例えば、パラセタモール、アモキシシリン、抗結核薬、ミノサイクリン及び多くの他のもの）による原因で発生し得る。慢性肝炎は、通常、ウイルス性肝炎（すなわち、Ｄ型肝炎の有無にかかわらないＢ型肝炎、Ｃ型肝炎）、自己免疫性、アルコール、ある種の薬剤（例えば、メチルドパ、ニトロフラントイン、イソニアジド、ケトコナゾール）によって引き起こされ、また、ウィルソン病等の遺伝性疾患や、アルファ１アンチトリプシン欠損症によって引き起こされ得る。
【００１４】
人間の体は、ほぼすべての薬を異物として識別して、それらを種々の化学プロセス（すなわち代謝）により適宜排除する。これは化学変換を必要とし、（ａ）脂肪溶解性を減らし、（ｂ）生物学的活性を変化させる。体内のほぼすべての組織は、化学物質を代謝するためにいくつかの機能を有するが、肝臓における滑面小胞体は、内因性化学物質（例えば、コレステロール、ステロイドホルモン、脂肪酸、タンパク質）及び外因性物質（例えば、薬物又は他の非ネイティブの化学物質）の両方の主な”メタボリッククリアリングハウス”である。
【００１５】
化学物質の排除及び変換で肝臓が演じる中心的な役割はまた、肝毒性と称される薬剤誘発性傷害にそれが受けやすくなる。特定の薬剤は、過量投与で撮影するときや治療の範囲内で導入された場合でも、いつか、肝臓を傷つけ得る。研究所や産業、自然の化学物質（例えばミクロシスチン）と薬草療法で使用されているもの等の他の化学薬剤はまた、肝毒性を誘発し得る。
【００１６】
９００以上の薬は肝障害の誘発に関与しているので、それが市場から撤退すべき薬物の最も一般的な理由とされている。化学物質は、異常な肝酵素のテストとしてのみ現れる肝臓への不顕性傷害をしばしば引き起こす。薬剤性肝障害は、すべての入院患者の５％、すべての急性肝障害の５０％に該当している。いくつかのメカニズムには誘発肝傷害又は損傷過程の悪化に原因がある。多くの化学物質は、エネルギーを作り出すミトコンドリア、細胞内小器官を損傷することがある。その機能不全は、順番に肝細胞を傷つけ得る酸化剤の過剰な量を解放する。ＣＹＰ２Ｅ１等のチトクロムＰ−４５０システム内の一部の酵素の活性化はまた、酸化ストレスを導き得る。肝細胞と胆管細胞への損傷は、肝臓内部の胆汁酸の蓄積を導く。これは、更に肝臓の損傷を促進することができる。クッパー細胞、脂肪貯蔵星状細胞及び白血球（すなわち好中球及び単球）等の非実質細胞はまた、機構の役割を有することができる。
【００１７】
フェーズ１とフェーズ２：薬物代謝は通常、２つのフェーズに分けられる。フェーズ１の反応はフェーズ２に薬剤を準備していると考えられている。しかし、多くの化合物が直接、フェーズ２で代謝されることができる。フェーズ１の反応は、酸化、還元、加水分解、水和及び他の多くの希少な化学反応を伴う。これらのプロセスは、薬物の水への溶解度を増加させる傾向があると、より化学的に活性な、潜在的に有毒である代謝物を生成することができる。位相のほとんどは、２の反応は細胞質で行われ、トランスフェラーゼ酵素を介した内因性化合物との結合を含む。化学的に活性なフェーズ１の製品は、比較的不活性であり、このステップによって除去するのに適したレンダリングされる。
【００１８】
チトクロムＰ−４５０として知られている小胞体内に位置する酵素群は、肝臓での代謝酵素中で最も重要なファミリーである。チトクロムＰ−４５０は、電子輸送鎖の末端オキシダーゼ成分である。それは単一の酵素ではなく、むしろ密接に関連した５０個のアイソフォームからファミリーで構成され、それらの６個が薬物の９０％を代謝する。個々のＰ−４５０遺伝子産物には途方もない多様性があり、この不均一性は、肝臓がフェーズ１での化学物質の広大な配列（ほぼすべての薬物を含む）で酸化を行うことを可能としている。Ｐ４５０系の３つの重要な特性、遺伝的多様性、酵素活性変化及び競争的阻害は、薬剤誘発性毒性の役割を担っている。多くの物質は、Ｐ−４５０酵素のメカニズムに影響を与えることができる。薬はいくつかの方法で酵素ファミリーと相互作用する。チトクロムＰ−４５０酵素を修飾する薬は抑制物質又は誘導物質としてと呼ばれている。ＣＹＰ抑制物質は、１つ又は複数のＰ−４５０酵素の代謝活性をブロックする。この効果は、通常すぐに発生する。一方、誘導物質はその合成を増加させることにより、Ｐ−４５０活性を増加させる。薬物の半減期を誘導することに応じて、酵素活性前の遅延が増加することは通常である。
【００１９】
薬物副作用は、タイプＡ（内因性又は薬理学的）又はタイプＢ（特有）として分類されている。タイプＡ薬物反応は、すべての毒性の８０％の原因になる。薬理学的（タイプＡ）肝毒性を有する薬物や毒素は、予測可能な用量反応曲線を有するもの（高濃度が肝臓の損傷をより引き起こす）や、肝組織を直接損傷する又は代謝プロセスをブロックする等の毒性の十分に特徴付けられたメカニズムを有するものである。アセトアミノフェン過量摂取の場合と同様に、傷害のこのタイプは毒性のための或るしきい値に達した直後に発生する。特有な損傷は、影響を受けやすい個人において、薬剤が用量に関連せずに変りやすい潜伏期間を有する非予測肝毒性を引き起こすときに、警告なしに発生する。傷害のこのタイプは明確な用量反応又は時間的な関係を有しておらず、最も、予測モデルを有していない。ＦＤＡの承認プロセスの一環として厳密な臨床試験の後に、特有な肝毒性は市場からのいくつかの薬物、の撤退に導く事になり、トログリタゾン（Ｒｅｚｕｌｉｎ（登録商標））及びトロバフロキサシン（Ｔｒｏｖａｎ（登録商標））が特有な肝毒性の２つの典型的な例である。抗凝固キシメラガトラン（Ｅｘａｎｔａ（登録商標））の開発は、肝臓損傷の懸念のために中止された。
【００２０】
３．ＡＴＰ感受性カリウムイオンチャネル及びｍｉｔｏＫＡＴＰチャネル：
アデノシン三リン酸感受性カリウムチャネル（ＫＡＴＰチャネル）は、細胞の代謝レベルを細胞膜興奮性にリンクする分子センサーとしての役割を果たす。ＫＡＴＰチャネルは細胞内ＭｇＡＤＰとの相互作用によって活性化され、ＡＴＰの高いレベルによって阻害される。１つのＫＡＴＰチャネルタンパク質複合体は、４つのポア形成内向き整流カリウムチャネルサブユニット（Ｋｉｒ６．１又はＫｉｒ６．２）と、スルホニル尿素受容体と呼ばれる４つの規制βサブユニット（ＳＵＲ１又はＳＵＲ２Ａ、２Ｂ）から構成されており、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）スーパーファミリーのメンバーである。ＫＡＴＰチャネルは、心筋細胞、膵β細胞、平滑筋細胞、及び神経細胞を含む異なる分子組成物を伴う様々な組織で発現している（Seino S. Annu. Rev. Physiol. 1999. 61:337-62）。細胞原形質膜上での発現に加えて、ＫＡＴＰチャネルは、ミトコンドリアの内膜に（Inoue I., et al. Nature 1991; 352:244-7）及び核膜に（I. Quesada, et al. PNAS 2002; 99: 9544-9549）おいても発見されている。
【００２１】
ｉ．ＫＡＴＰチャネルの構造、機能及び関連疾患：
他の内向き整流Ｋ＋チャネルと同様に、Ｋｉｒ６．１及びＫｉｒ６．２の各サブユニットは、２つの膜貫通セグメント（Ｍ１とＭ２）と細胞内のＮ末端及びＣ末端を伴うポア形成領域とを有するものであり、いくつかの潜在的なプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）又はプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の依存性のリン酸化部位が含まれている（Seino S. Annu. Rev. Physiol. 1999. 61:337-62）。各ＳＵＲサブユニットは、３つの膜貫通ドメイン（ＴＭＤ  ０、１、２）と２つの細胞内ヌクレオチド結合ドメイン（ＮＢＤ１と２）を含んでいる。ＳＵＲ１及びＳＵＲ２は、それらの結合スルホニル尿素への親和性と組織分布に違いがあり、ＳＵＲ２の２つのバリエーションは最後の４２個のアミノ酸でお互いに異なっている。ＫｉｒとＳＵＲサブユニット間の相互作用は、細胞表面上のＫＡＴＰチャネルの発現を決定するだけでなく、ＡＴＰ結合及び加水分解上のチャネル活性化を調節する。
【００２２】
膵β細胞では、ＫＡＴＰチャネルはＫｉｒ６．２とＳＵＲ１とで構成され、それらはインスリン分泌の調節に重要な役割を果たしている。血流中の高グルコースレベルはβ細胞における細胞質ＡＴＰ濃度の上昇を誘導して、ＫＡＴＰチャネルの閉鎖をもたらし、これがβ細胞膜の脱分極と電位依存性Ｃａ２＋チャネルと次のインスリン分泌の開放を導く。スルホニル尿素（例えばトルブタミド及びグリピジド等）と高い親和性でＳＵＲ１に結合し、ＫＡＴＰチャネル活性を刺激することによりインスリン分泌を抑制することができる。インスリン過剰分泌になるＳＵＲ１又はＫｉｒ６．２の機能変異の損失は、乳児期の永続的な高インスリン血性低血糖（ＰＨＨＩ）を引き起こすことが分かっている。逆に、ＫＡＴＰチャネルの連続的な開口につながる変異が一過性又は永続性新生児糖尿病を引き起こし得る。
【００２３】
長年にわたり様々な組織におけるＫＡＴＰチャネルの分子組成物は、組換えＫｉｒ６．ｘとＳＵＲｘサブユニットの異なる組み合わせたものとして表現し、ネイティブのＡＴＰ感受性カリウム電流と比較することによって決定した。ＫＡＴＰチャネルは、主に心筋細胞、Ｋｉｒ６．２をＳＵＲ２Ｂと平滑筋細胞や血管平滑筋細胞におけるＫｉｒ６．１とＫｉｒ６．２をＳＵＲ２ＢにおけるＳＵＲ２Ａとで構成されている。心臓では、両方の筋細胞膜やミトコンドリアＫＡＴＰチャネルは虚血性プレコンディショニング（ＩＰＣ）の保護効果を有することが示唆されている。ＫＡＴＰチャネルは、膀胱、結腸、気道の平滑筋の収縮性の調節における強力な役割を果たしている。ＫＡＴＰチャネルはまた、サイクリックＡＭＰ依存ＰＫＡシグナル伝達経路や血管拡張薬によって開始サイクリックＧＭＰ依存ＰＫＧ経路の調節を介して血管拡張に貢献している。
【００２４】
ｉｉ．ＫＡＴＰチャネルオープナー、ブロッカー及びそれらの治療法としての潜在性：
細胞内ＡＴＰ／ＭｇＡＤＰ濃度による調節に加え、ＫＡＴＰチャネルは、カリウムチャネルオープナー（ＫＣＯ）と呼ばれる構造多様化合物群並びにスルホニル尿素及びその他の非スルホニル尿素化学物質等の被ブロック化合物によっても、活性化され得る（Babenko, A.P.et al.J. Biol. Chem. 2000; 275:717-720）。異なるＫＣＯｓへのチャネル応答は、ＫＡＴＰチャネルの分子組成物に依存する。ジアゾキシドはＫｉｒ６．２／ＳＵＲ１チャネルを効果的に活性化するがＫｉｒ６．２／ＳＵＲ２Ａチャンネルにほとんど影響を与えない一方で、ピナシジル、クロマカリム、及びニコランジルは優先的にＫｉｒ６．２／ＳＵＲ２チャネルを活性化する。キメラチャネルを使用した放射性結合のアッセイ及び研究は、ＫＣＯｓがＳＵＲサブユニットに結合すること、特に、ジアゾキシドがＴＭＤ１及びピナシジルに結合し、又はその類似体がＴＭＤ２に結合すること、それらのＫＡＴＰチャネルに及ぼす影響がＮＢＤＳとのヌクレオチド相互作用によって調節されていること、を示唆している。スルホニル尿素薬は、ＩＩ型糖尿病の治療に用いられているが、それらがＳＵＲ１サブユニットに結合し、ＫＡＴＰチャネルを閉じて、インスリン分泌を導くからである。これらの薬剤はまたＳＵＲ２ベースＫＡＴＰチャネルで同様の阻害を示す。また、選択的にＫｉｒ６．１含有ＫＡＴＰチャネルを阻害することが報告されているＵ−３７８８３Ａ等の非スルホニル尿素ブロッカーもある。
【００２５】
ＫＡＴＰチャネルのオープナーとブロッカーの両方は治療的可能性を有する。例えば、スルホニル尿素薬は、ＩＩ型糖尿病の治療のために使用されている。また、選択的ＫＡＴＰチャネルブロッカーは活性電位持続時間を減らすことによって、不整脈を防止するために使用することができる。ＫＡＴＰチャネルオープナーは、高血圧、高インスリン血症、冠状動脈疾患の治療に用いられている。
【００２６】
ｉｉｉ．肝細胞のＫＡＴＰチャネル：
ＫＡＴＰチャネルに関するほとんどの研究は、膵β細胞や心筋細胞で行われてきた。Ｍａｌｈｉらは、ラット肝細胞における及びヒト肝癌細胞株における細胞増殖へのＫＡＴＰチャネルとそれらの効果の発現を報告した（Malhi, H. et al. J. Biol. Chem. 2000, 275: 26050-26057）。しかし、他の研究では、ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２の細胞表面上の現在少しＫＡＴＰチャネルを有するが、ＫＡＴＰチャネルの発現がインスリンとグルコース輸送体ＧＬＵＴ２の形質移入によって誘導されることがあることを示している（Liu, G.J. et al. FASEB J. 2003; 17: 1682-1684）。
【００２７】
無気力ミトコンドリアＫＡＴＰチャネルはラット肝ミトコンドリアから単離されたミトプラストを使用する単一チャネル記録によって１９９１年に最初に報告された（Inoue I, et al. Nature 1991, 352: 244-247）。技術的な難しさとミトコンドリアの複雑さの故に、ミトコンドリアＫＡＴＰチャネルの分子組成はまだ明確ではない（Rodrigo, G.C. and Standen, N.B. Current Pharmaceutical Design, 2005, 11: 1915-1940）。ミトコンドリアＫＡＴＰチャネルが心臓組織におけるＩＰＣの保護の役割を果たしており、活性酸素種（ＲＯＳ）の生成の調節を含むいくつかの可能なメカニズムを介して細胞のアポトーシスを抑制し、ミトコンドリア基質体積を維持し、ミトコンドリアＣａ２＋のレベルを調節していることが提案されている（Ardehali, H. J. Bioenergetics and Biomembranes, 2005, 37: 171-177）。
【００２８】
４．無標識アッセイを用いたミトコンドリアＡＴＰ感受性カリウムイオンチャネルのスクリーニング：
イオンチャネルは依然として標的の目立った被搾取クラスのままである。１つの制限要因は、生理学的に関連するスクリーニングツールの欠如である。従来及び自動化されたパッチクランプを含むパッチクランプ法は中規模のスループットへの低位性があり、人工的なシステム（すなわち、操作された細胞、及び／又は人工的な測定環境）の使用を伴う。最も重要なことは、これらのアッセイが単一細胞アッセイである。しかし、細胞応答は、単一細胞レベルで非常に不均一である。同様に重要なのは、これらのアッセイは、侵襲的であるということであり、必要な密封はイオンチャネル複合体の細胞構造を混乱させ得る。侵襲的であり、人工的なシステム（すなわち、操作された細胞及び／又は色素標識分子）の使用に加えて、イオン流動／蛍光アッセイは、細胞の背景を変更し得る染料又はイオンを予め充填する必要がある故、一般的に合致品質が低く、正の陽性及び負の陰性を誤ることが高くなる。これらの欠点を克服するために、本方法は無標識細胞アッセイを使用して、ネイティブ細胞における内因性イオンチャネルのためにここで選別モジュレーターを開示した。いくつかの実施形態では、開示された方法は、内因性ｍｉｔｏＫＡＴＰイオンチャンネル等の選別モジュレーターに無標識細胞アッセイを使用している。いくつかの実施形態では、スクリーニングは、非従来型の細胞株で実行される。いくつかの実施形態では、ｍｉｔｏＫＡＴＰチャネルの機能的役割は不明であるが、その活性化はバイオセンサー細胞アッセイにより強力に検出することができる。無標識バイオセンサー、特にＳＰＲとＲＷＧ含む光学バイオセンサーは、非侵襲的であり、イオンチャネル、イオンチャネルを介して媒介された検知ゾーン内の細胞事項のリガンド誘導の動的再配分のリアルタイム検出を有効にする。結果のＤＭＲシグナルは統合された細胞応答であり、イオンチャネル活性の全体の進化に従っている。リアルタイムの動態は、イオンチャネルとそれらの調節タンパク質に作用するモジュレーターの動作のモードの分類を可能にする。バイオセンサーのイオンチャネル細胞アッセイのさらなる利点は、これらに限定されるものではないが、バイオセンサーのイオンチャネルアッセイは、イオンチャネル活性を細胞生理学へのつなげるイオンチャネル調節するための新たな洞察を提供することができることを含んでいる。
【００２９】
５．肝疾患を予防又は治療するための治療標的としての内因性ｍｉｔｏＫＡＴＰ：
肝細胞又は肝組織における内因性ｍｉｔｏＫＡＴＰチャネルの生物学的、生理学的及び病態生理学的役割は不明である。しかし、ＫＡＴＰチャネルは内生的に形質転換された肝細胞腫瘍細胞株（ＨｅｐＧ２細胞）で発現していることを示すいくつかの証拠がある。開示された方法も、原発性肝細胞内での形質転換におけるｍｉｔｏＫＡＴＰチャネルの発現や、細胞生物学及び生理学の下流への内因性ｍｉｔｏＫＡＴＰチャネル活性化や、原発性肝細胞内での薬物代謝におけるｍｉｔｏＫＡＴＰチャネル活性化の役割を、示す証拠を提供することがでる。開示された方法はまた、肝臓疾患を治療するための潜在的な治療標的として下流ｍｉｔｏＫＡＴＰ活性化標的（例えば、ＪＡＫ及びＲｈｏキナーゼ）を識別することができる。
【００３０】
ｉ．Ｒｈｏキナーゼ：
ＲＯＣＫとも呼ばれるＲｈｏキナーゼは、ＲｈｏＡの主要なエフェクターである。ＲＯＣＫは遺伝子産物、ＲＯＣＫＩ及びＲＯＣＫＩＩ（キナーゼ−１及び−２を含むＲｈｏ関連のコイルドコイル、それぞれＲｏｋｂ／ｐ１６０ＲＯＣＫとＲｏｋａとして知られている）に対応する約１６０ｋＤａのセリン／スレオニンプロテインキナーゼである。２つのキナーゼは、触媒キナーゼドメインにおける８９％の同一性を有するヒトでは６４％の全体的同一性を有する。両方のキナーゼは、Ｃ１保存領域によって分割されたコイルドコイル領域と）プレクストリン相同領域（ＰＨ）を含む。２つのＲＯＣＫは空間的に特異な発現を有する。ＲｈｏキナーゼはそのＣＯＯＨ末端ドメインによって自動調節され、そのキナーゼ活性を阻害する活性部位に折り返されている。ＲｈｏＡの活性ＧＴＰ結合形態だけはＲＯＣＫに結合し、タンパク質の不活性化をブロックする。Ｒｈｏの活性形態がＲＯＣＫに結合される限りは、キナーゼは活性化のままである。Ｒｈｏキナーゼはまた、アラキドン酸及びスフィンゴによって活性化され得る。カスパーゼによるＣＯＯＨ末端抑制の切断は、アポトーシス中ＲＯＣＫ活性の増加をもたらすことができる。
【００３１】
セリン／トレオニンキナーゼＲＯＣＫ１及びＲＯＣＫ２は活性化されたＲｈｏ  ＧＴＰアーゼの直接の標的であり、異常なρ／  ＲＯＣＫシグナル伝達はヒト疾患の数に関与している。ＲＯＣＫ１及びＲＯＣＫ２は、成長因子、インテグリンの活性化、細胞のストレスを含む細胞外刺激の数に応じて活性化Ｒｈｏの下流にて活性化された酵素のＡＧＣサブファミリーのメンバーに密接に関連している。ＲＯＣＫの活性化は、力発生と形態学的変化を促進する事象の協調の一連を導く。これらの事象には、細胞の運動性、接着性、平滑筋収縮、神経突起退縮、及び食作用等のアクチン−ミオシン媒介プロセスの多くに直接貢献している。これらの応答は、細胞の種類に依存している場合もあるが、加えて、ＲＯＣＫのキナーゼは、増殖、分化、アポトーシス、発癌性形質転換における役割を果たしている。
【００３２】
ＲＯＣＫの活性化は、多くの異なる下流標的の後続のリン酸化をもたらす。Ｒｈｏキナーゼ中で最もよく知られている標的は、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）である。ミオシンホスファターゼもＲｈｏキナーゼによってリン酸化され、この相互作用がリン酸化ＭＬＣの増加を引き起こす。また、ＲＯＣＫはそれらの活性化ループ中の保存されたスレオニンでＬＩＭキナーゼ１及びキナーゼ−２（ＬＩＭＫ１とＬＩＭＫ２）をリン酸化し、ＬＩＭＫ活性及びコフィリンタンパク質のその後のリン酸化を増加して、それらのＦアクチン切断活性をブロックする。アクチン細胞骨格の再構成に関与する他の多くのタンパク質は、ＲＯＣＫによってリン酸化される。
【００３３】
ＲＯＣＫ酵素は、細胞形態、ストレスファイバーの形成と機能、細胞接着、細胞遊走及び浸潤、上皮間葉移行、変換、食作用、アポトーシス、神経突起退縮、細胞質分裂、及び細胞分化を含む複数の細胞プロセスにおいて重要な役割を果たしている。このように、ＲＯＣＫキナーゼは、癌、高血圧、痙攣、喘息、切迫早産、勃起不全、緑内障、アテローム性動脈硬化症、心筋肥大、神経疾患を含む様々な疾患を治療するために抑制物質の開発のための潜在的な標的を表す。
【００３４】
喘息は、神経伝達物質と炎症性メディエーターを含む様々な刺激に気道過敏症及び気道に炎症細胞の浸潤及び活性化に関連付けられている初期及び後期喘息様反応を特徴とする慢性炎症性気道疾患である。喘息において、リクルート炎症細胞及び常在性構造細胞によって気道で放出される炎症性メディエーター（ｍｅｄｉａｔｏｒｓ）は、増加気管支収縮に起因する気道過敏症を招くことになる。また、慢性的炎症は慢性喘息における固定気道閉塞及び気道過敏症の進展に寄与する気道の再造形を駆り立てるように発現する。気道の再造形は、気道壁（線維症）及び気道を取り囲む収縮、気道平滑筋の増加が豊富で細胞外基質タンパク質の過剰な沈着等のいくつかの重要な機能が含まれる。気道過敏症は、筋肉中の固有機能の変化により、又は筋機能の神経性及び非神経性制御の変化のいずれかによって引き起こされる気道平滑筋収縮の増加により、部分的に説明することができる。また、気道過敏症の進展は、上皮層の損傷、粘膜の腫れ、杯細胞の過形成及び気道壁の再造形等の気道の物理的変化によって支えられている。気道再造形は、典型的には、網状薄膜の肥厚、上皮下細胞外基質の沈着（線維化）を増強、及び気道を取り囲む収縮気道平滑筋の割合の増加によって特徴付けられている。現在の喘息治療は、十分にこれらの機能を阻害することができない。現在、アレルギー性喘息の急性及び慢性の機能の治療は、主に、β２−アドレナリン受容体アゴニスト及びコルチコステロイドによってなされている。過度の気道平滑筋の収縮に起因する急性気管支痙攣は、ほとんどの患者において吸入β２−アドレナリン受容体アゴニストにより、それらが気道平滑筋弛緩を引き起こすように、十分に復帰させることができる。しかし、残念なことに、患者はβ２−アドレナリン受容体アゴニストに対する耐性を進展させることができ、これらの薬剤は、それらが、in vitroで気道再造形（例えば気道平滑筋の増殖）の個々の機能を阻害することができるという報告にもかかわらず、in vivoでの気道炎症と気道再造形に対する最小限の効果しかもたらさない。吸入コルチコステロイドは、永続的な、軽度、中等度及び重度の喘息を含むいくつかのアレルギー疾患の制御のために主力を表しており、喘息を特徴づける炎症過程の強度を低減する活性への広域スペクトルのためによく知られている。しかし、残念なことに、気道炎症（例えば好中球）のいくつかの機能は、コルチコステロイド治療の影響を比較的受けすることができる。また、コルチコステロイドは、気道再造形の抑制機能では部分的にのみ効果がある。よって、コルチコステロイドは気道再造形のいくつかの機能（線維症、気道平滑筋の肥厚、粘液腺の肥大）を効果的に防ぐものの、それらは気道壁の再造形の反転に不完全に有効である。β２−アドレナリン受容体アゴニスト及びコルチコステロイド治療に関連した制限は、代替薬物標的の調査と同定を推進させてきた。それらの中でも、Ｒｈｏキナーゼは、喘息における気道過敏症の治療のための潜在的な標的として浮上している。ＲｈｏキナーゼはＲｈｏＡのエフェクター分子、単量体ＧＴＰ結合タンパク質であり、ミオシンホスファターゼの不活性化を介したＣａ２＋の鋭敏化を引き起こす。Ｒｈｏキナーゼの主要な生���機能は収縮、移行、及び細胞の増殖を含む。これらの作用は、喘息の病態生理学的特徴、すなわち、気流制限、気道過敏症、β−アドレナリン作動性脱鋭敏化、好酸球動員及び気道再造形に関連すると考えられている。
【００３５】
６．ＪＡＫ：
ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）ファミリーは、免疫応答に関与する細胞の増殖や機能のサイトカイン依存性調節の役割を果たしている。現在、４つの既知の哺乳類ＪＡＫファミリー・メンバー、ＪＡＫ１（ヤヌスキナーゼ−１としても知られている）、ＪＡＫ２（ヤヌスキナーゼ−２として知られている、ＪＡＫ３（また、ヤヌスキナーゼ、白血球、ＪＡＫＬ、Ｌ−ＪＡＫ、ヤヌスキナーゼ−３としても知られている）及び、ＴＹＫ２（また、タンパク質−チロシンキナーゼＴとして知られている）がある。ＪＡＫタンパク質は１２０ないし１４０ｋＤａの大きさの範囲で変動し、７つの保存ＪＡＫホモロジー（ＪＨ）ドメインを含み、これらの１つが機能触媒キナーゼドメインであり、他は、調節機能を潜在的に提供し、及び／又はＳＴＡＴのためのドッキングサイトとして機能する偽性キナーゼドメインである。
【００３６】
ＪＡＫキナーゼのレベルでのシグナル伝達をブロックすることは、いくつか例を挙げれば炎症性疾患、自己免疫疾患や骨髄増殖性疾患、人間の癌を含む多くの疾患の治療法を開発するための可能性を秘めている。ＪＡＫキナーゼのモジュレーター又は阻害は、乾癬及び皮膚過敏症等の皮膚免疫疾患を患っている患者の治療上の利点を有する。したがって、ヤヌスキナーゼ又は関連するキナーゼの抑制物質が広く求められ、いくつかの出版物は化合物の効果的な知見を報告する。ＪＡＫ−関連疾患のさらなる例としては、多発性硬化症等の自己免疫疾患、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、タイプＩ型糖尿病、狼瘡、乾癬、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、重症筋無力症、免疫グロブリン腎症、自己免疫性甲状腺障害、等が挙げられる。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、尋常性天疱瘡（ＰＶ）又は水疱性類天疱瘡（ＢＰ）等の自己免疫性水疱性皮膚疾患である。ＪＡＫ−関連疾患のさらなる例は、喘息、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎や鼻炎等のアレルギー症状がある。ＪＡＫ−関連疾患のさらなる例は、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ１、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）とヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）等のウイルスによる疾患が含まれる。
【００３７】
更に、ＪＡＫ−関連疾患は、炎症及び炎症性疾患を含む。例えば炎症性疾患は、眼の炎症性疾患（例えば、虹彩炎、ぶどう膜炎、強膜炎、結膜炎、又は関連疾患）、気道の炎症性疾患（例えば、アレルギー性鼻炎又は副鼻腔炎や鼻や副鼻腔等を含む上気道又は気管支炎、慢性閉塞性肺疾患等を含む下気道）、心筋炎等の炎症性筋疾患、及び他の炎症性疾患を含む。
【００３８】
７．アコースティックバイオセンサー：
水晶振動子等の音響バイオセンサーは、細胞応答を特徴付けるための音波を利用している。音響波は、一般的に圧電使用して生成され、受信される。音響バイオセンサーは、多くの場合、共振型センサ構成で動作するように設計されている。典型的なセットアップにおいて、薄い石英ディスクは２つの金電極間に挟まれている。電極間の交流信号の印加は、励起と敏感な発振回路として動作する水晶発振を導く。出力センサ信号は共振周波数と動抵抗がある。バイオセンサー表面が硬質である場合、共振周波数は主に吸着した物質の総質量の線形関数である。液体環境下での音響センサ応答は、結合した分子の質量だけではなく、形成されたる分子複合体又は生細胞の粘弾性特性の変化と電荷に、敏感である。共振周波数と結晶に関連する細胞の運動抵抗を測定することにより、細胞接着や細胞毒性を含む細胞プロセスをリアルタイムで調べることができる。
【００３９】
８．電気バイオセンサー：
電気バイオセンサーは、細胞接着を含む細胞応答を特徴づけるインピーダンスを採用している。典型的なセットアップでは、生きている細胞は、統合された電極アレイを埋め込んだことを特徴とするバイオセンサー表面に接触されている。定電圧かつ高周波の小ＡＣパルスは、細胞の存在によって妨害された電極間に電界を生成するために使用されている。電気パルスは、統合された電気回路を使用して現場で生成され、回路を流れる電流が時間とともに続く。得られたインピーダンスは細胞層の電気伝導度の変化の尺度である。細胞の形質膜は、細胞間や下に流れる電流を強制的に絶縁材として作用し、インピーダンスの非常に豊富な変化をもたらす。インピーダンスベースの測定は、細胞接着や拡散、細胞微動、細胞の形態学的変化、及び細胞死、細胞シグナル伝達を含む細胞の事象の広い範囲を研究するために適用されている。
【００４０】
９．光バイオセンサー：
光バイオセンサーは、細胞応答を特徴付けるために表面に結合した電磁波を主に採用している。表面に結合した波は、光励起された表面プラズモン（表面プラズモン共鳴、ＳＰＲ）のいずれかを使用して、金基板上又は導波モード共鳴（共振導波路格子、ＲＷＧ）結合された回折格子を用いた誘電体基板上にて達成することができる。中赤外ＳＰＲを含むＳＰＲの場合、読み出しは、反射光の強度の最小のものが発生する共鳴角である。同様に、フォトニック結晶バイオセンサー等、バイオセンサーをＲＷＧに、読み出しは最大内部結合効率が達成される共鳴角又は波長である。共鳴角又は波長はセンサ表面又はその近くで局所的な屈折率の関数である。アッセイ実行のための流路の少数に限定されているＳＰＲとは異なり、ＲＷＧバイオセンサーは、計測及びアッセイにおける最近の進歩の故に、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）と細胞アッセイに適している。典型的なＲＷＧでは、細胞を直接、高屈折率材料から成るバイオセンサーが埋め込まれたマイクロタイタープレートのウェルに配置される。屈折率の局所的な変化は、刺激による生細胞の動的質量再分配（ＤＭＲ）シグナルを導く。これらのバイオセンサーは、受容体生物学、リガンドの薬理学、細胞接着を含む多様な細胞プロセスを研究するために使用されてきている。
【００４１】
本発明は、コーニングのエピック（登録商標）システムなどの共振導波路回折格子バイオセンサーを好ましくは使用している。エピック（登録商標）システムは、市販の波長統合システム又は角度インターロゲーションシステム（angular interrogation system）又は掃引波長イメージングシステム（swept wavelength imaging system）（コーニング社、コーニング、ニューヨーク州）を含む。商用システムでは、ロボット工学とオンボードの液体ハンドリングユニット、又はロボットを使用した外部液体アクセサリーシステムで温度制御ユニット、光学検出部と、から構成されている。検出部は、統合された光ファイバを中心に配置され、約７又は１５秒の時間間隔で、細胞応答の運動測定を可能にする。化合物溶液は、オンボードの液体ハンドリングユニット又は外部液体アクセサリーシステム（両者は従来の液体ハンドリングシステムを使用している）を使用して導入された。高分解能イメージングシステムだけでなく高い取得光バイオセンサーシステムを含むさまざまなＲＷＧバイオセンサーシステムを使用することもできる。
【００４２】
１０．バイオセンサー及びバイオセンサー細胞アッセイ：
無標識の細胞ベースアッセイは、一般的にバイオセンサーを用いて生細胞における分子誘発性の応答を監視する。当該分子は天然のもの又は人工のものであることができ、精製されている又は浄化されていない混合物であることができる。典型的な場合、バイオセンサーは、光学的トランスデューサ、電気的トランスデューサ、熱量的トランスデューサ、音響的トランスデューサ、磁気的トランスデューサなどのトランスデューサを用いて、バイオセンサーに接触した細胞における分子認識事象又は分子誘発性の変化を定量化可能なシグナルに変換する。これら無標識のバイオセンサーは分子相互作用の分析に使用されることができ、当該分析は、どのように分子錯体が形成及び分離するかを経時的に特性化すること、又は細胞応答についてはどのように細胞が刺激に対して応答するかを特性化することを含む。本方法に適用可能なバイオセンサーは、例えば、フォトニック結晶バイオセンサー、共振ミラー、エリプソメータを含む表面プラズモン共振型（ＳＰＲ）バイオセンサー及び共振導波路回折格子型（ＲＷＧ）バイオセンサーなどの光学バイオセンサーシステム、並びに生体インピーダンスシステムなどの電気バイオセンサーシステムを含む。
【００４３】
ｉ．ＳＰＲバイオセンサーとそのシステム：
ＳＰＲは入射光の範囲をカバーするプリズムに依存しており、プリズムは、くさび状の偏光された光を、導電性金属フィルム（例えば金）を含む平面ガラス基板に導き、これによって表面プラズモンを励起する。発生するエバネセント波は金層内の自由電子雲と相互作用して吸収され、電子電荷密度波（すなわち表面プラズモン）を生成し、反射光の強度を低下させる。この発生する強度が最小の共振角度は、センサ表面の反対の面にある金層に近接した溶液の屈折率の関数である。
【００４４】
ｉｉ．ＲＷＧバイオセンサーとシステム：
ＲＷＧバイオセンサーは、例えば、基板（例えばガラス）、回折格子又は周期構造が組み込まれた導波路薄膜、及び細胞層を含み得る。ＲＷＧバイオセンサーは、回折格子による光の導波路への共振結合を使用して溶液と表面との接触面における全反射を導き、これによって当該接触面において電磁場を生成する。この電磁場の性質は一過性のものであり、これは当該電磁場がセンサ表面から急激に減衰することを意味し、当該電磁場が初期値の１／ｅに減衰する距離は侵入深さとして知られており、侵入深さは特定のＲＷＧバイオセンサー構成の関数であるが、典型的な場合約２００ｎｍである。このタイプのバイオセンサーはエバネセント波を利用してバイオセンサー表面又はその近傍における細胞層のリガンド誘発性変化を特性化する。
【００４５】
ＲＷＧ機器は角度シフト又は波長シフトの測定に基づいたシステムへさらに分割されることができる。波長シフトの測定において、一定の角度の入射波長の範囲をカバーする偏光された光が使用されて導波路を照射し、特定の波長の光は当該導波路に結合されかつ当該導波路に沿って伝播する。一方、角度シフトの機器において、センサは単色光を用いて投射され、当該光が共振的に結合される角度が測定される。
【００４６】
共振条件はバイオセンサーの表面に直接接触している細胞層（例えば、細胞密度、細胞付着、及び細胞状態）の影響を受ける。リガンド又は検体が生細胞における細胞標的（例えば、ＧＰＣＲ、イオンチャネル、キナーゼ）と相互作用した場合、細胞層内の局所的な屈折率の変化は共振角度（又は波長）のシフトとして検出されることができる。
【００４７】
コーニング（登録商標）Ｅｐｉｃ（登録商標）システムは、無標識の生物化学的すなわち細胞ベースのアッセイのためにＲＷＧバイオセンサーを使用する（コーニング社、コーニング、ＮＹ）。Ｅｐｉｃ（登録商標）システムは、ＲＷＧプレートリーダ及びＳＢＳ（生体分子スクリーニング協会）標準のマイクロタイタープレートで構成されている。当該プレートリーダにおける検出システムは、細胞のリガンド誘発性変化を受けると、統合されたファイバ光学系を用いて入射光の波長シフトを測定する。一組の照射−検出ヘッドは直線的に設けられ、これによって反射スペクトルは３８４ウェルのマイクロプレートのコラム内のウェルの各々から同時に収集される。プレート全体が走査され、センサの各々が複数回アドレス指定され、コラムの各々が順次アドレス指定される。入射光の波長は分析用に収集されかつ使用される。温度管理ユニットが機器に含まれることができ、これによって温度変化による入射波長の擬似シフトが最小限にする。測定された応答は細胞の集団の平均的な応答を表している。当該システムの様々な機能が自動化されることができ（例えばサンプルローディング）、また、多重化されることができる（例えば９６ウェル又は３８６ウェルのマイクロタイタープレート）。液体操作はオンボードの液体操作部又は外部の付属液体操作部によって行われる。特に、分子溶液は、下部に培養された細胞を含んでいる細胞アッセイプレートのウェルへ直接付加又はピペッティングされる。当該細胞アッセイプレートは細胞を覆う特定のアッセイバッファ溶液の領域を含む。さらに、特定の回数のピペッティングによる単純な混合ステップは分子付加ステップに組み込まれることができる。
【００４８】
ｉｉｉ．電気バイオセンサーとそのシステム：
電気バイオセンサーは、基板（例えばプラスチック）、電極、及び細胞層で構成されている。この電気的検出方法において、細胞は基板上に設けられた小さな金電極上において培養され、システムの電気インピーダンスは時間に従う。当該インピーダンスは細胞層の導電性の変化の尺度である。典型的な場合、固定又は変更された周波数における小さな一定の電圧が電極又は電極アレイに加えられ、回路の電流が経時的に監視される。電流のリガンド誘発性変化は細胞応答の尺度を提供する。全ての細胞検知に対するインピーダンス測定は１９８４年に初めて実現された。それ以降、インピーダンスベースの測定は、細胞付着、細胞拡散、細胞の微細動作、細胞の形態変化、及び細胞死を含む幅広い細胞事象の研究に用いられている。従来のインピーダンスシステムは、小さな検出電極及び大きな基準電極を使用したため、大きなアッセイのばらつきに悩まされている。このばらつきを克服するために、ＣｅｌｌＫｅｙシステム（MDS Sciex社、南サンフランシスコ、ＣＡ）、ＲＴ−ＣＥＳ（ACEA Biosciences社、サンディエゴ、ＣＡ）などの最新世代のシステムは、微小電極アレイを有する集積回路を使用する。
【００４９】
ｉｖ．高い空間分解能のバイオセンサー画像化システム：
ＳＰＲ画像化システム、エリプソメトリ画像化システム、及びＲＷＧ画像化システムを含む光学バイオセンサー画像化システムは、高い空間分解能を提供し、本開示の実施例に使用されることができる。例えば、ＳＰＲイメージャ（登録商標）ＩＩ（GWC Technologies社）は、プリズムに結合したＳＰＲを使用し、固定入射角度にてＳＰＲ測定を行い、ＣＣＤカメラを用いて反射光を収集する。表面の変化は反射率変化として記録される。従って、ＳＰＲ画像化は、すべてのアレイの要素に対する測定結果を同時に収集する。
【００５０】
画像化ベースの用途にはＲＷＧバイオセンサーに基づいた波長走査型光学インターロゲーションシステム（swept wavelength optical interrogation system）が用いられることができる。このシステムにおいて、センサすなわちマイクロプレート型のＲＷＧバイオセンサーのアレイに投射するのに高速の調節可能レーザ源が使用される。当該センサのスペクトルは、当該センサから反射された光学パワーをレーザ波長が走査する際の時間の関数として検出することによって解釈されることができ、コンピュータ化された共振波長インターロゲーションモデリングを用いた測定データの分析は、固定化受容体又は細胞層を有するバイオセンサーの空間分解された画像の説明を与える。画像センサの使用は、画像化ベースのインターロゲーション構成につながる。二次元の無標識画像は部品を移動することなく得られることができる。
【００５１】
一方、横磁場モードすなわちｐ−偏光されたＴＭ０モードの角度インターロゲーションシステムが使用されることもできる。このシステムは、約２００μｍｘ３０００μｍ又は２００μｍｘ２０００μｍの大きさのＲＷＧセンサに照射するような各光ビームアレイを生成する投光システムと、これらセンサから反射された光ビームの角度の変化を記録するＣＣＤカメラベースの受光システムと、で構成されている。アレイ化された光ビームは、回折光学レンズと組み合わせたビームスプリッタを用いて得られることができる。このシステムは、最大４９センサ（７ｘ７ウェルセンサアレイ内）が３秒ごとに同時にサンプリングされること又は全３８４ウェルのマイクロプレートが１０秒毎に同時にサンプリングされることを可能にする。
【００５２】
さらに、波長走査型インターロゲーションシステムが使用されることもできる。このシステムにおいて、一定の角度の入射波長の範囲をカバーする偏光された光が導波路回折格子型バイオセンサーに亘って照射及び走査されるのに使用され、各位置における反射光が同時に記録されることができる。走査中にバイオセンサーにおける高分解能画像が得られることもできる。
【００５３】
ｖ．バイオセンサーパラメータ：
ＲＷＧバイオセンサー又は生体インピーダンスバイオセンサーなどの無標識バイオセンサーはリガンド誘発性の細胞応答をリアルタイムで追跡することができる。非侵襲的かつ操作不要のバイオセンサーの細胞アッセイは細胞シグナル伝達の予備知識を必要としない。得られるバイオセンサーシグナルはリガンド薬理及び受容体シグナル伝達に関する高度な情報を含む。多重パラメータは刺激された細胞の動的バイオセンサー応答から抽出されることができる。これらパラメータは動態全体、段階、シグナル振幅、を含み、さらに１の段階から他の段階への遷移時間を含む動態パラメータ、及び各段階の動態を含むが、これらに限定されない（Fang, Y., and Ferrie, A.M.(2008) “label-free optical biosensor for ligand-directed functional selectivity acting on β2 adrenoceptor in living cells”.FEBS Lett.582, 558-564; Fang, Y., et al.,(2005) “Characteristics of dynamic mass redistribution of EGF receptor signaling in living cells measured with label free optical biosensors”.Anal.Chem., 77, 5720-5725; Fang, Y., et al.,(2006) “Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing”.Biophys.J., 91, 1925-1940、参照）。
【００５４】
クラスタリング又は類似の分析では、各ノード（すなわち、分子）に対してエッジの属性（すなわち、バイオセンサー、細胞応答データ）が異なることがある。例えば、細胞内の分子プロファイル（一次的、二次的）では、エッジの属性は、特定の運動パラメータ（例えば、ＤＭＲシグナルのＤＭＲ事象の振幅や速度）、又は所定時間の刺激後のバイオセンサーシグナルの実際の値、又は複数又はすべての時間ポイントの刺激後のバイオセンサーシグナルの実際の値であることがある。分子バイオセンサーの二次的プロファイルに対するエッジの属性はまた、それぞれのマーカーの一次的プロファイルに正規化した後の特定のマーカーに対するバイオセンサーシグナルの出力パラメータの変調率とすることができる。その結果、集団のエッジの属性はノード分子の無標識薬理学を表示するための効果的な意味を表し、開示された方法に基づいて分子の既知の分子との類似性が比較でき、分子を決定することができるようになる。
【００５５】
ａ．バイオセンサー出力パラメータ：
多くの異なるバイオセンサーの出力パラメータが本明細書で説明されている。例えば、細胞内の刺激で誘発される指向質量再分配の動態を規定する６つのパラメータとして、全体の動態（すなわち、形状）、応答の位相（休止Ａ４３１細胞におけるＥＧＦ誘導ＤＭＲシグナルの特定の例では、ポジティブな動的質量再分配（Ｐ−ＤＭＲ）、ネガティブな動的質量再分配（Ｎ−ＤＭＲ）、及び回復したポジティブな動的質量再分配（ＲＰ−ＤＭＲ）の細胞応答に関連する３つの主要な位相がある。）、動態、各相の合計持続時間、各ＤＭＲの事象の合計振幅、並びにＰ−ＤＭＲ相からＮ−ＤＭＲ相へ若しくはＮ−ＤＭＲ相からＲＰ−ＤＭＲ相への遷移時間であり得る。動的質量再分配は、しばしば、動的な細胞物質の再配布又は方向性質量の再分配と呼ばれている。他のバイオセンサーの出力パラメータは、共振ピークから入手することができる。例えば、ピークの位置、強度、ピーク形状及びピーク半値幅（ＰＷＨＭ）を使用することができる。バイオセンサーの出力パラメータはまた、バイオセンサーの共振バンド画像から取得することもできる。バンドの形状、位置、強度、分布及び幅の５つの追加特徴のこれらのパラメータはすべて、本明細書に開示されるようなバイオセンサーを使用して、任意の細胞アッセイの任意のアプリケーションのために独立して、又は一緒に使用することができる。任意のサブセット又は組み合わせでパラメータを使用すると、細胞受容体アッセイのためのシグネチャやＥＧＦ受容体ベースのアッセイのために特定のシグネチャなどの所定のアッセイ又は特定のアッセイの所定のバリエーションのためのシグネチャを生成することができる。
【００５６】
（Ａ）刺激誘発指向質量再分配の動態に関連するパラメータ：
刺激誘発ＤＭＲの動態に関連する多くのバイオセンサーの出力パラメータがある。これらのパラメータは変化率を見ており、変化率は細胞へ発生している刺激の事象としてバイオセンサーデータ出力に発生している。刺激事象は、例えば、培地への分子の添加、培養培地から分子の除去、温度の変化やｐＨの変化、又は、細胞への放射線の導入などの細胞の状態を変化させ得る任意の事象である。刺激事象は、刺激事象によって生成された細胞上の方向性の質量再分配など何らかの効果で刺激効果を産生され得る。刺激事象は、分子、化学物質、生化学物質、生物学物質、ポリマーである可能性がある。生化学物質又は生物学物質は、ペプチド、合成ペプチド又は天然に存在するペプチドであり得る。例えば、多くの異なるペプチドはブラジキニン炎症性ペプチド、プロテアーゼ酵素トロンビン、及び血圧調節アンジオテンシンペプチドを含むシグナル伝達分子として機能する。これら３つのタンパク質は、それらの配列と生理学で区別され、別の細胞表面受容体を介して作用する一方で、それらは細胞表面受容体のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）と呼ばれる共通の分類に分けられている。ＧＰＣＲの他のポリペプチドリガンドは、バソプレッシン、オキシトシン、ソマトスタチン、ニューロペプチドＹ、ＧｎＲＨ、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺ホルモン、オレキシン、ウロテンシンＩＩ、エンドルフィン、エンケファリン、及び多くの他のものが含まれている。ＧＰＣＲは、ペプチドリガンドに応答するだけでなく小分子神経伝達物質（アセチルコリン、ドーパミン、セロトニン、アドレナリン）、光、臭気物質、味、脂質、ヌクレオチド、イオンにも応答する広範かつ多様な遺伝子ファミリーに属している。ＧＰＣＲにより使用されるメインのシグナル伝達機構は、細胞内カルシウム放出及びｃＡＭＰ産生を含む下流側の第２メッセンジャーシステムに結合したＧタンパク質とＧＴＰａｓｅタンパク質とが相互作用することである。ペプチドＧＰＣＲによって使用される細胞内シグナル伝達システムは、すべてのＧＰＣＲで使用されるものに類似しており、それらが相互作用するＧタンパク質及び活性化されるセカンドメッセンジャーシステムに応じて一般的に分類される。Ｇｓ共役ＧＰＣＲのために、受容体によるＧタンパク質Ｇｓの活性化は、アデニル酸シクラーゼの活性化と下流のサイクリックＡＭＰの産生を刺激しつつ、Ｇｉ共役受容体はｃＡＭＰの産生を阻害する。ｃＡＭＰ産生の主要な結果の一つは、プロテインキナーゼＡの活性化である。Ｇｑ共役受容体は、ホスホリパーゼＣ、放出ＩＰ３及びジアシルグリセロールを刺激する。ＩＰ３はＥＲ内の受容体に結合し、細胞内のカルシウムの放出、及びプロテインキナーゼＣのその後の活性化、カルモジュリン依存性経路を引き起こす。ＧＰＣＲのためのこれらのセカンドメッセンジャーシグナリングシステムに加えて、ＧＰＣＲの経路は、チロシンキナーゼ成長因子受容体及びＭａｐキナーゼ経路を含む他のシグナル伝達経路とのクロストークを示す。ＥＧＦ受容体のような受容体チロシンキナーゼ又は接着斑複合体のいずれかのトランス活性化は、アダプタータンパク質Ｓｈｅ、Ｇｒｂ２及びＳｏｓ、並びにＥｒｋ１とＥｒｋ２を活性化する下流のＭａｐキナーゼを介してｒａｓ活性化を刺激することができる。Ｓｒｃキナーゼはまた、ＧＰＣＲによるｒａｓ及びＭａｐキナーゼ経路の活性化に不可欠な媒介の役割を果たす可能性がある。
【００５７】
いくつかの刺激事象が発生する可能性があることは可能であるが、データ出力に変更はない。この状況はまだ刺激事象であり、なぜならば、細胞の条件が指向性質量再配布又は細胞又は細胞培養液中で変化を引き起こし得る何らかの方法で変化するからである。
【００５８】
本明細書に開示されるように特定のシグネチャが任意のアッセイ又は任意の細胞の状態のために決定され得ることができる、ことが理解される。多数の”シグネチャ”が異なるアッセイのため本明細書に開示されているが、任意のアッセイのために本明細書中では実行され、そのアッセイの”シグネチャ”を決定することができる。任意の所定のアッセイのために複数の”シグネチャ”が存在し得ることも可能であり、そして各々は本明細書に記載のように決定されることができる。バイオセンサーの出力データを収集した後、１つ以上のパラメータを見る、すなわち、所定のアッセイのためのシグネチャが取得され得る。最適なシグネチャを識別するために複数の実験を実行する必要があり、そして最適なシグネチャを見つけるために異なる条件下で実験を行う必要があり得るが、これを行うことができる。これは、本明細書に開示の方法のいずれかが”識別”又は”決定”又は”提供”する工程を有することができることを理解され、例えば、シグネチャはそれらの上に追加される。
【００５９】
（１）全体の動態：
見られ得るパラメータの１つは、データ出力の全体的な動態であり、この全体的な動態パラメータは、データ収集の完全な運動像を観察する。観察することができる総合的な動態の一態様は、時間をかけてデータ出力によって生成される曲線の形状の変化である。したがってデータ出力によって生成される曲線の形状は、変更され、又は刺激事象の発生時の着実な滞在することができる。その変化の方向性は、全体の質量分布を示し、例えば、ポジティブなＤＭＲ（Ｐ−ＤＭＲ）位相では、センサのエバネセントテール（evanescent tail）以内での増加質量を示し、正味ゼロＤＭＲはセンサのエバネセントテール内の質量の正味の変化が殆ど存在しないことを示唆し、一方、ネガティブなＤＭＲはセンサのエバネセントテール内の正味死亡質量（net-deceased mass）を示す。
【００６０】
光バイオセンサーを用いて得られた刺激誘発細胞応答の全体的な動態は、単相（Ｐ−ＤＭＲ、Ｎ−ＤＭＲもしくは正味ゼロ−ＤＭＲのいずれか）、又は２位相（例えば、これらの３相のいずれかの２相の組み合わせが可能）、又は３相、又は多相で構成される（例えば、複数Ｐ−ＤＭＲが時間経過中に発生可能）から構成される。
【００６１】
（２）応答相：
時間の関数として観測することができる別のパラメータは、データ出力内で発生する位相の変化である。無標識バイオセンサーは、曲線を生成するようにグラフ化することができるデータ出力を生成する。この曲線は遷移点を持つことになり、例えば、データは増加状態から減少状態に変わり、又はその逆に変わる。これらの変化は、相転移と呼ぶことができ、そして、それらが発生した時刻とそれらが取る形状とはバイオセンサー出力パラメータとしては、例えば、使用することができる。例えば、Ｐ−ＤＭＲ、正味ゼロＤＭＲ、Ｎ−ＤＭＲ、又はＲＰ−ＤＭＲがある場合がある。Ｐ−ＤＭＲ、Ｎ−ＤＭＲ、及びＲＰ−ＤＭＲの振幅は別個のバイオセンサー出力パラメータとして測定されることができる。
【００６２】
（３）動態：
もう一つのバイオセンサーの出力パラメータは、例えば、相転移が完了した時点で速度などのデータ出力の態様のいずれかの動態であり得る。例えば、どのくらいの速さで相転移が完了するか、又はデータ出力を完了するにはどのくらいの時間がかかるかが、動態であり得る。測定することができる動態のもう一つの例は、データ出力の全体的な位相にかかる時間長さであり得る。もう一つの例は、Ｐ−ＤＭＲ相とＮ−ＤＭＲ相のいずれか又は両方の時間の合計持続時間であり得る。もう一つの例は、Ｐ−ＤＭＲ相とＮ−ＤＭＲ相のいずれか又は両方の合計振幅を取得するのにかかる速さ又は時間であり得る。もう一つの例は、Ｐ−ＤＭＲからＮ−ＤＭＲ相までの遷移時間τであり得る。Ｐ−ＤＭＲ相とＮ−ＤＭＲ相の事象の両方の動態又は相も測定することができる。
【００６３】
（Ｂ）共振ピークに関連するパラメータ：
所定導波モードの共振ピークは、例えば、光強度に対するバイオセンサーへの光のカップリングの角度を、又は、光強度に対するバイオセンサーへのカップリングした光の角度を調べることで発生したデータ出力のタイプである。光導波路光モードスペクトルは、バイオセンサーを照らすために光の角度の広い範囲を使用し、そして角度の関数として結合強度の強度を監視する方法における、光強度に対するバイオセンサーへの光のカップリングの角度を調べることで発生したデータ出力のタイプである。このスペクトルでは、複数の導波モードの複数の共振ピークが共に発生する。共振ピークやＯＷＬＳスペクトル背後原理が同一であるため、所定導波モードの共振ピーク、又は多導波モードのＯＷＬＳスペクトルの共振ピークを、交換可能にバイオセンサーでは使用することができる。光の特定の波長が発生したとき又は光が特定の角度でバイオセンサーに当たるように生成された場合、光源から出射された光は、バイオセンサーの中にて結合され、この結合は、バイオセンサーから生じるシグナルを増加させる。光の角度又は波長を結合の関数として強度内のこの変化は共振ピークと呼ばれている。センサの個別の所定モードは、異なる特性を持つ類似の共振ピークを生じさせることができる。ＤＭＲ又は細胞効果を評価するこのピークに関連して使用できる、所定モードの共振ピーク又は共振スペクトルを定義する異なるパラメータが多数ある。これらのサブセットは以下で議論される。
【００６４】
（１）ピーク位置：
データ出力が共振ピークの発生のピークでグラフ化されている場合、例えば、光の特定の波長で又はでバイオセンサーへの光結合のための特定の入射角において、ピークは発生している。この発生の位置での角度又は波長は、刺激事象に応答して質量再分配又は細胞の事象が原因で変化することがある。例えば、ＥＧＦ受容体などの特定の受容体に対する潜在的な成長因子の存在下では、培養細胞の共振ピークの位置はカップリングの角度又はカップリングの波長を増加又は減少させることができ、結果として、共振ピークの中央位置の変化になる。ピーク強度の位置が測定され、それが測定されるべき良い点とすると、７５％のピーク強度又は５０％のピーク強度又は２５％のピーク強度、又は６６％のピーク強度又は４５％のピーク強度など、例えば（ピーク強度の百分の１から１００％までのすべてのレベルが開示されたと見なされる）共振ピークに沿った任意の点の位置が測定され得ることが理解される。しかし、ピーク強度以外のポイントを使用する場合、ピーク強度の前及びピーク強度の後に、例えば、４５％のピーク強度になる位置が常にあり得る。したがって、ピーク強度以外の強度のために、その強度が発生するピーク内には二つが常にあり得る。これらの非ピーク強度の位置はバイオセンサーの出力パラメータとして利用することができるが、強度の位置が事前ピーク強度又は事後ピーク強度である場合、人は単に知っている必要がある。
【００６５】
（２）強度：
共振ピークの特定の強度の位置はバイオセンサー出力パラメータとして使用できるのと同じように、強度自体の量はまた、バイオセンサー出力パラメータになることができる。１つの特に関連強度は所定モードの共振ピークの最大強度である。この最大強度の大きさは、ちょうど位置のように、細胞又は細胞培養に特に効果があり刺激事象の存在に基づいて変化することがあり、この変化が測定されシグネチャに使用される。ちょうど共振ピーク位置と同様に、共振ピーク強度は、ピーク内の任意の強度や位置で測定することができる。例えば、バイオセンサー出力パラメータとして、最大強度の５０％、又は最大強度の３０％、又は最大強度の７０％、又は１％から１００％の間の任意の割合が強度として使用することができる。同様に、強度の位置と同様に、例えば４５％最大強度のように最大強度以外の強度が使用される場合、非最大強度を使用して、この強度を有する共振ピーク内に常に二箇所があり得る。強度位置パラメータと同様に行うことができるが、強度が事前最大強度又は事後最大強度あるかどうかを考慮する必要がある。
【００６６】
例えば、元の細胞の集密度が５０％前後（５０％集密度にて、センサ表面の細胞が最大ＰＷＨＭ値へ導く傾向がある）であるとき、抑制物質及び活性化物質の両方の存在は、培養後のピーク半値幅（ＰＷＨＭ）の減少結果をもたらす。しかし、合計角度シフト（すなわち、共振ピークの中心位置）のような他のバイオセンサー出力パラメータは、まったく効果を有しない分子からの活性化物質から抑制物質を区別するために用いることができる。図６Ｂに例示するように、ＰＷＨＭはピークの最大強度（高さ）の半分で、ピーク上の点の間に引かれた線の長さである。抑制物質は、例えば、細胞増殖、全く治療なしでの細胞のためのシフトよりも小さい角速シフトを生じさせる傾向がある一方で、活性化物質は、すべてのセンサ上の細胞密度が本質的に同一又はほぼ同じである場合の処理をしていない細胞を有するセンサに比べて、大きな角度シフトを生じさせる傾向がある。細胞増殖を阻害（抑制物質など）する、又は刺激（活性化物質など）する分子の効力又は能力は、すべての分子の濃度が同じである場合、ＰＷＨＭ値に対するそれらの効果によって決定することができる。ＰＷＨＭ変化の所定値は、共振ピークの中心位置の変化との組み合わせで、抑制物質又は活性化物質を除外するために使用することができる。所定モードの共振ピークを検出するために使用されるインターロゲーションシステムに応じて、ＰＷＨＭの単位又は値が変化させられ得る。例えば、角度インターロゲーションシステムでは、単位は度とすることができる。度のＰＷＨＭにおける変化は、例えば、１０００分の１、１０００分の２、１０００分の３、１０００分の５、１０００分の７、又は１０００分の１０であり得る。
【００６７】
（３）ピーク形状：
使用することができるもう一つのバイオセンサーの出力パラメータは、全体的なピーク形状であるか、又はある強度の特定のピーク間の形状がある。例えば、半最大ピーク強度のピーク形状、又は他の任意の強度（３０％、４０％、７０％、又は８８％、又は２０％〜１００％の間のいずれかパーセント）のピーク形状は、バイオセンサーの出力パラメータとして使用することができる。形状は特定の強度の上又は下のピーク面積によって特徴づけることができる。例えば、半最大ピーク強度では、事前ピーク強度である点とポストピーク強度である点とがある。１つのラインはこれらの２点の間に描画することができ、そして、共振ピーク内のこのラインより上の面積、又は、共振ピーク内のこのラインより下の面積が決定され、バイオセンサーの出力パラメータになることができる。所定ピークの積分面積はまた、細胞に作用する分子の影響を分析するために使用することができると理解されている。
【００６８】
もう一つの形状関連バイオセンサーの出力パラメータは、特定のピーク強度の共振ピークの幅があることができる。例えば、ピーク強度の５０％である共振ピーク上の事前ピーク強度の点とピーク強度の５０％である共振ピーク上の事後ピーク強度のライン上の点との間の線の大きさを測定することにより、半最大ピーク強度（ＨＭＰＷ）での共振ピークの幅が、求められることができる。この測定は、次にバイオセンサー出力パラメータとして使用することができる。これは、共振ピークの幅がピーク強度の２０〜１００％の間で任意の強度に対して、このようにして決定され得ることが理解される。（この例は、図６（ｂ）のような数字は、全体を通して見ることができる。）
【００６９】
（Ｃ）バイオセンサーの共振バンド画像に関連したパラメータ：
今では、ほとんどの光学バイオセンサーは、センサ表面に固定化されたプローブ分子への標的分子の結合、又は一度毎のセンサ面上の細胞接着や細胞の生存を監視している。複数のバイオセンサーに結合事象又は細胞接着や細胞の生存のために、研究者は、一般的に、時間順次にこれらの事象を監視する。よって、直接異なるセンサ間の比較が困難な場合がある。さらに、波長又は角度のインターロゲーションであるかどうか、これらの検出システムは、センサを照らすために小さなスポット（約１００から５００μｍ直径）のレーザー光を利用する。応答又は共振ピークは、照射領域から細胞応答の平均を表す。、９６ウェルマイクロプレートバイオセンサー（例えば、コーニングのＥｐｉｃマイクロプレート）については、それぞれのＲＷＧセンサは約３×３ｍｍであり、各ウェルの底にあり、一方、センサは一般的に３８４ウェルマイクロプレートフォーマットのために１×１ｍｍ２の寸法を有している。したがって、現在のセンサ技術を用いて得られた応答は、センサ表面のごく一部だけで現れる。理想的には、検出システムは１つだけを許してはならない同時に複数のバイオセンサーに付着した生細胞の応答を監視するだけでなく、比較的大きな面積又は各センサの複数の領域からのシグナルインターロゲーションを可能とする。
【００７０】
撮像光学インターロゲーションシステム（例えば、ＣＣＤカメラ）を介した共振バンドはデータ出力の１つのタイプであり、該データ出力は物理的な位置と単一センサに亘って定義された場所で反射光（すなわち、外部結合した）の強度を、例えば、見ることによって発生したものである。反射光は、内部結合した光に直接関係している。代わりに、共振バンドは、小型のレーザースポットを使用しセンサを照らし、一次元又は二次元でセンサ全体を横切って走査し、所定の導波モードの共振ピークを収集する方法で、スキャンインターロゲーションシステムを通じて収集することができる。センサ内の位置の関数としての共振ピーク又は光強度は最後に再構成され、センサの共振バンドを形成することができる。バイオセンサーでは、光の特定の波長が発生したとき、又は光が特定の角度でバイオセンサーに当たるように生成されたとき、外部結合した光は、センサ面での又は近くの屈折率変化の関数として変化し、この変化が撮像システムにより収集された各センサの共振帯域の特性のシフトを引き起こす。さらに、培養後のセンサ全体にわたる細胞の平らでない付着を、共振バンドを用いて直接可視化することができる（例えば、図１に共振バンドを丸で囲んだところを参照されたい）。理想のマルチウェルマイクロバイオセンサーでは、各センサの位置は相対的に他のバイオセンサーへ正規化され、すなわち、センサはマイクロプレート内の行又は列に亘って各ウェルの中心を通って整列している。よって、得られた共振バンドの画像が細胞接着又は刺激に応答している細胞の変化に係る内部リファレンスとして使用することができる。従って、所定モードの各センサの共振バンドは、ＤＭＲ又は細胞効果を評価するために、このバンドに関連する使用することができる追加のパラメータを提供する。これらのサブセットは以下で議論される。
【００７１】
（１）バンド形状：
使用することができる他のバイオセンサーの出力パラメータは、所定のモードの各バイオセンサーの共振バンドの形状である。その形状は、各センサの大面積にわたる強度分布によって定義される。その形状は、大面積にわたる刺激に応答した付着細胞の均質性又は細胞の変化のインデックスとして用いることができる（例えば、図１に示すように、各共振バンドは約２００ミリメートル×３０００ミリメートルの寸法でセンサ全体にわたる応答を表す）。
【００７２】
（２）位置：
所定モードの各センサの共振ピークの位置と同様に、各共振バンドの位置はバイオセンサーの出力パラメータとして使用することができる。その強度は、各バンドの最大強度で中心位置を生成するイメージングソフトウェアを用いて定量化することができる。このような位置の強度は、刺激又は分子治療への応答における細胞の変化を調べるために使用することができる。
【００７３】
（３）強度：
ちょうど共振バンドの位置として、外部結合した光の強度は、イメージングシステムを用いて収集したバイオセンサーの出力パラメータとして使用することができる。バンド全体の平均強度又はイメージングバンド内の各画素の絶対強度は、細胞接着の品質を検査し、細胞応答を評価するために使用することができる。
【００７４】
（４）分布：
イメージングシステムを用いて収集された角度又は波長の外部結合した光の分布は、バイオセンサー出力パラメータとして使用され得る。このパラメータは、細胞がなく又はプローブ分子を固定化していない場合、センサ自体の表面特性を評価するために用いることができ、さらに、センサ表面の照射領域を横切って細胞接着の品質を検査するめに用いることができる。
また、このパラメータはまた、領域全体にわたる細胞密度が同一である場合に細胞に分子効果の均一性を調べるために用いることができ、又は、細胞密度が照射領域に亘って他とは区別できる一つの領域である場合に分子誘発細胞応答上の細胞密度の効果を調べるために用いることができる。
【００７５】
（５）幅：
所定モードの共振ピークのＰＷＨＭように、イメージングシステムを使用して得られた共振バンドの幅は、バイオセンサー出力パラメータとして使用することができる。このパラメータは、共振ピークのためにのみ利用可能である唯一のＰＷＨＭの代わりにセンサの照射領域の複数の地域での複数のバンド幅を得ることを除いて、共振ピークのＰＷＨＭ値のものに対してほぼ同一の特徴や、その後の有用な情報コンテンツを共有する。共振バンド画像によって得られた他のパラメータと同様に、幅は上記の用途に使用することができる。
【００７６】
すべてのこれらのパラメータは、本明細書に開示されるバイオセンサーを使用して、任意の細胞アッセイの任意のアプリケーションのために独立して、又は一緒に使用することができる。任意のサブセット又は組み合わせでパラメータを使用することは、細胞受容体アッセイのためのシグネチャや、その後のＥＧＦ受容体ベースアッセイのための特定のシグネチャのような、特定のアッセイ上の所定のアッセイ又は所定のバリエーションのためのシグネチャを生成することができる。
【００７７】
ｖｉ．生細胞内の動的質量再分配（ＤＭＲ）シグナル：
細胞標的を通じた刺激に対する細胞応答は、下流シグナル伝達ネットワークの空間的及び時間的ダイナミクスによって符号化され得る。これにより、リアルタイムの細胞シグナル伝達の一体化の監視は、細胞生物学及び生理学の理解において有用な生理学的に関連のある情報をもたらし得る。
【００７８】
共振導波路回折格子（ＲＷＧ）バイオセンサーを含む光バイオセンサーは、細胞物質の動的再分配に関連する一体化された細胞応答を検出可能であり、細胞シグナル伝達の研究に非侵襲的手段をもたらす。全ての光バイオセンサーは、それらがセンサ表面又はセンサ表面の非常に近傍の局所的な屈折率の変化を測定可能な点で共通している。原理上は、細胞内のリガンド起因の変化を特徴付けるためにエバネッセント波を用いることが可能である故に、ほとんど全ての光バイオセンサーが細胞検知に適用可能である。エバネッセント波は、電磁場であり、溶液表面界面における光の全反射によって生成され、通常は、侵入深さ又は感知体積として知られる深度特性にて溶液内に短い距離（〜数１００ナノメートル）延在する。
【００７９】
最近、理論的及び数学的モデルが開発され、これらはリガンドを用いた刺激に応答する生細胞内で測定される光信号のパラメータ及び性質を記述する。これらのモデルは、既知の細胞生物物理学と組み合わされた３層導波路システムに基づいており、リガンド起因光信号を、受容体を通して媒介された特定の細胞プロセスと関連付ける。
【００８０】
バイオセンサーが入射光によって照明されている領域に配されている細胞の平均応答を測定する故に、細胞の融合層は、最適なアッセイ結果を達成するために用いられ得る。バイオセンサーの短い侵入深さと比較して細胞の寸法が大きい故に、センサ構成は、非従来的な３層システムとして考えられる：基板、回折格子構造を有する導波路フィルム、及び細胞層。従って、有効屈折率（すなわち、検出シグナル）におけるリガンド起因の変化は、一次まで、細胞走の下部の屈折率の変化と直接的に比例し得る。
【００８１】
【数１】
2013527754.tif 000003
【００８２】
ここで、Ｓ（Ｃ）は細胞層に対する感受性であり、Δｎｃはバイオセンサーによって検出された細胞層のリガンド起因の局所的屈折率変化である。細胞内の所定の体積の屈折率がタンパク質等の生体分子の濃度によって主に決まるので、Δｎｃは、検知体積内の細胞標的又は分子集合体の局地的濃度のリガンド起因の変化に直接比例すると仮定され得る。センサ表面から延在するエバネッセント波の指数関数的に減衰する特性を考慮して、リガンド起因光信号は、以下の式によって支配される。
【００８３】
【数２】
2013527754.tif 000004
【００８４】
ここで、ΔＺＣは細胞内への侵入深さであり、αは特異的屈折率増加（タンパク質に関して約０．１８／ｍＬ／ｇ）であり、ｚｉは質量再分配が発生する距離であり、ｄは細胞層内の１つのスライスの仮想的な厚さである。ここで、細胞層は、垂直方向において等間隔のスライスに分割される。上記式は、それぞれが応答全体に対して同等でない寄与を有する、リガンド起因の光信号がセンサ表面から異なった距離において発生する質量再分配の合計である。さらに、波長又は角度変化に関して検出された信号は、センサ表面と垂直に発生する質量再分配に主に感受性を有する。その動的な性質の故に、これは、動的質量再分配（ＤＭＲ）シグナルとも称される。
【００８５】
ｖｉｉ．細胞及びバイオセンサー：
細胞は、複数の細胞経路又は機構に依存して、それらが受診する情報を符号化して統合する。タンパク質標的への検体の結合を特に測定する光バイオセンサーを用いた親和性分析と異なり、生細胞はさらに非常に複雑で動的である。
【００８６】
細胞のシグナル伝達を研究するために、細胞はバイオセンサーの表面に接触させられ得、これは細胞の培養によって達成され得る。これらの培養された細胞は、３つのタイプの接触態様を介してバイオセンサー表面に取り付けられ得る：３つのタイプとは、焦点接着、密接接触（close contact）及び細胞外基質接触であり、それぞれが独自の表面からの離間距離特性を有している。結果として、通常は、基本的な細胞膜は、〜１０−１００ｎｍ程度表面から離れて配される。懸濁細胞（suspension cell）に関して、細胞は、細胞表面受容体の共有結合、もしくは細胞表面受容体の特異的結合によって、又は重力による単純な定着によって、バイオセンサー表面に接触され得る。このため、バイオセンサーは、細胞の下部を検知することが可能である。
【００８７】
多くの場合、細胞は表面依存接着及び増殖を呈す。豊富な細胞アッセイを実現するために、バイオセンサー表面は、細胞接着及び増殖を促進するためのコーティングを必要とし得る。しかし、表面特性は、細胞の生物学的状態への直接的な影響を有し得る。例えば、表面結合リガンドは、細胞によって与えられる力の下でどれくらい変形するかを決定付ける基板材料の機械的適合性のように、細胞の応答に影響を与え得る。培養条件（時間、血清濃度、密集度等）が異なることによって、得られた細胞状態は、１の表面と他の表面との差異、及び１の条件と他の条件との差異であり得る。従って、細胞状態を調節する特別な取り組みは、バイオセンサーベースの細胞アッセイを開発するために必要であり得る。
【００８８】
細胞は、比較的大きな寸法（通常は数十μの範囲）を有する動的な物体である。刺激なしであっても、細胞は常に微動（細胞以下の分解能の低速度撮影の顕微鏡検査によって、及びナノメートルレベルの生体インピーダンス測定によって、組織培養において見られるような動態的変動及び細胞構造の再構築）している。
【００８９】
非刺激条件下において、ＲＷＧバイオセンサーで分析した場合、細胞はほとんど正味０のＤＭＲ応用を普通は生成する。これは、部分的に光バイオセンサーの低い空間的分解能の故であり、レーザ光点の大きなサイズ及び結合光の長い伝播距離によって決まる。レーザ光点のサイズは、観察される領域のサイズを決め、通常は一度に１の分析点のみが観察され得る。従って、バイオセンサーは、通常は、光入射領域に配されている大量の細胞の平均化された応答を測定する。細胞は単一細胞レベルで微動をするが、大量の細胞は、正味０の平均ＤＭＲ応答をもたらす。さらに、細胞間マクロ分子は、高度に組織化されて空間的に束縛され、ほ乳類細胞内の場所を最適化する。細胞上及び細胞内のタンパク質のしっかりと制御された局在化は、特定の細胞機能及び応答を決定する。なぜならば、この局在化は、細胞が適切なパートナーと相互作用するタンパク質の特異性及び効率性を調節することを可能にしかつタンパク質活性化及び不活性化機構を空間的に分離することを可能にする故である。この制御故に、非刺激条件下において、感知体積内の細胞の局地的質量濃度は平衡状態に達し得、正味０の光学的応答をもたらす。一貫性のある光学的応答を達成するために、観察される細胞は、細胞のほとんどが単一の分裂周期を終えたばかりになるような期間、従来の培養条件下で培養され得る。
【００９０】
生細胞は、外因的なシグナルを感知して応答する優れた能力を有する。細胞シグナル伝達は、環境的キュー（環境信号）（environmental cue）が単一の明確に定義された応答をもたらす応答の線状鎖をトリガする直線ルートを介して機能すると考えられていた。しかし、調査は、外部刺激に対する細胞応答がさらに非常に複雑であることを示した。細胞が受信した情報が、処理されて、リン酸化及びシグナル伝達タンパク質の位相的再配置の複雑な時間的及び空間的パターンに符号化され得ることが明らかになった。タンパク質の適切な場所への空間的及び時間的標的付けは、タンパク質−タンパク質間の相互作用の特異性及び効率性を調節すること、ひいては細胞シグナル伝達及び応答のタイミング及び強度を記述することに不可欠である。細胞骨格認識、細胞周期チェック点及びアポトーシス等の重要な細胞判定は、精密な時間的制御及び活性化しているシグナルトランスデューサーの相対的な空間的分布に依存している。従って、Ｇ−タンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）等の細胞標的で媒介された細胞シグナル伝達は、規則的で調節された態様において通常は進行し、一連の空間的及び時間的事象からなり、これらの多くは、細胞の局所細胞物質における局在的質量濃度又は再分配の変化をもたらす。これらの変化及び再分配は、感知体積内で発生した場合、光バイオセンサーを用いてリアルタイムで直接追跡され得る。
【００９１】
ｖｉｉｉ．ＤＭＲシグナルは生細胞の生理学的な応答：
受容体生物学を研究するための従来の薬理学的手法と比較して、リガンドが細胞システム内で発現した受容体に対して特異性を有する場合、リガンド起因ＤＭＲシグナルは受容体特異性を有し、用量依存性を有し、かつ飽和可能性を有することが示されている。多数のＧタンパク質結合受容体（ＣＰＣＲ）リガンドについて、有効性（ＥＣ５０の値によって測定）は、従来の方法を用いて測定されたものとほとんど同一と認められる。さらに、ＤＭＲシグナルは、期待された脱感作パターンを呈し、脱感作及び再感作は、全てのＧＰＣＲと共通である。さらに、ＤＭＲシグナルは、従来の技術で取得されたのと同様のＧＰＣＲリガンドの忠実度を維持する。さらに、バイオセンサーは、完全アゴニスト、部分的アゴニスト、逆アゴニスト、拮抗物質（アンタゴニスト）、及びアロステリック調節因子を区別可能である。これらをもとに、これらの発見は、ＤＭＲが生細胞の生理学的応答を監視可能であることを示す。
【００９２】
ｉｘ．ＤＭＲシグナルは、生細胞内のリガンド−受容体ペアのシステム細胞生物学（ｓｙｓｔｅｍｓ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ）情報を含む。：
リガンドを用いた細胞の刺激は、一連の空間的及び時間的事象をもたらす。これらの非限定的な例は、リガンド結合、受容体活性化、タンパク質補充、受容体内在化及び再利用、第２メッセンジャー代替、細胞骨格再構築、遺伝子発現、並びに細胞付着変化を含む。細胞事象の各々が、それぞれの特性（反応速度（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）、期間、大きさ、質量移動）を有している故に、かつバイオセンサーが感知体積内の質量再分配に関連する細胞事象に主に感受性がある故に、細胞事象はＤＭＲシグナル全体とは異なる寄与をし得る。化学生物学、細胞生物学、及び生物物理学の手法は、リガンド起因ＤＭＲシグナルの細胞機構を解明するために使用され得る。最近は、特定の細胞シグナル伝達コンポーネント内の介入治療（intervention）のために直接化学薬品を使用する化学生物学が、生物学的疑問を解決するために使用されている。このことは、様々な異なったタイプの細胞標的の活性を特に制御する多数のモジュレーターの識別の故に重要である。この手法は、受容体（表皮成長因子（ＥＧＦ）受容体、及びＧｑ−及びＧｓ−結合受容体を含む）によって媒介されたシグナル伝達及びそのネットワークの相互作用をマッピングするのに適している。
【００９３】
ＥＦＧＲは、受容体チロシンキナーゼのファミリーに属している。ＥＧＦは、結合して、ＥＧＦＲの内因性タンパク質チロシンキナーゼ活性を刺激し、主にＭＡＰＫ、Ａｋｔ及びＪＮＫ経路に関与するシグナル伝達カスケードを開始する。ＥＧＦ刺激において、Ａ４３１細胞内の質量再分配をもたらす多くの事象がある（細胞株が内因的にＥＧＦＲを過剰発現する）。ＥＧＦＲシグナル伝達は、細胞の状態に依存することが知られている。結果として、ＥＧＦ起因ＤＭＲシグナルも細胞状態に依存する。０．１％のウシ胎児血清内で２０時間経て得られた休眠細胞において、ＥＧＦ刺激は、３つの異なった順次的なフェーズを伴うＤＭＲシグナルをもたらす：（ｉ）増加するシグナルを伴う増加（ポジティブ）フェーズ（Ｐ−ＤＭＲ）、（ｉｉ）遷移フェーズ、及び（ｉｉｉ）減衰フェーズ（Ｎ−ＤＭＲ）。化学生物学及び細胞生物学の研究は、ＥＧＦ起因ＤＭＲシグナルが主にＲａｓ／ＭＡＰＫ経路に結合されることを示しており、これはＭＥＫを介して進行して、細胞脱離をもたらす。２つの証拠は、Ｐ−ＤＭＲが、主に、細胞表面において活性化された受容体への細胞内標的の補充の故であることを示している。第１に、ダイナミン又はクラスリン活性の遮断は、Ｐ−ＤＭＲ事象の大きさに小さな影響を与える。ダイナミン及びクラスリン、ＥＧＦＲ活性の２つの下流コンポーネント、はＥＧＦＲ内在化及びシグナル伝達の実行において重要な役割を果たす。第２に、ＭＥＫ活性の遮断は、Ｐ−ＤＭＲ事象を部分的に減衰させる。ＭＥＫは、ＭＡＰＫ経路において重要なコンポーネントであり、これは、最初に細胞質から細胞膜に移動し、ＥＧＦ刺激の後に、受容体を伴った内在化が起こる。
【００９４】
他方、Ｎ−ＤＭＲ事象は、細胞脱離及び受容体内在化の故である。蛍光像は、ＥＧＦ刺激が、大量の内在化された受容体及び細胞脱離をもたらすことを示している。受容体内在化又はＭＥＫ活性の遮断が細胞脱離を防止すること、及び受容体内在化がダイナミン及びクラスリンの両方を必要とすることが知られている。このことは、ダイナミン又はクラスリン活性の遮断が、受容体内在化及び細胞脱離の両方を抑制すべきであり、ＭＥＫ活性の遮断が、受容体内在化ではなく細胞脱離のみを抑制すべきであることを示している。予想通り、ダイナミン又はクラスリン抑制物質は、ＥＧＦ起因Ｎ−ＤＭＲを完全に阻害し（〜１００％）、ＭＥＫ抑制物質は、Ｎ−ＤＭＲを部分的にのみ減衰させる（〜８０％）。蛍光像は、ＭＥＫではなくダイナミンの活性の遮断が受容体内在化を減じることを確認する。
【００９５】
ｘ．ＤＭＲシグナルは、生細胞におけるリガンド作用のシステム細胞薬理情報を含む。：
ＤＭＲシグナルが、細胞の底部内の細胞物質の動的再分配を含む多くの細胞事象の寄与からなる一体化した細胞応答であるので、ＤＭＲシグナル等のリガンド起因のバイオセンサーシグナルは、システム細胞薬理情報を含む。ＧＰＣＲは、細胞内においてしばしばリッチな（ｒｉｃｈ）挙動を呈し、多くのリガンドが有効なバイアスをもたらして細胞の機構の特定の部分に有利に作用し得かつ経路的にバイアスされた効果を呈し得ることが知られている。従って、リガンドは、受容体の下流の細胞事象がどのように測定されてリガンド薬理に関する読み出し情報（１又は複数）として使用されるかに基づいて複数の効果を有し得る可能性は十分ある。実際、ほとんど経路的にバイアスされておりかつ単一のシグナル伝達事象のみをアッセイする従来の細胞アッセイにとって、ＧＰＣＲリガンドのシグナル伝達ポテンシャルを系統的に表すことは困難である。しかし、無標識バイオセンサー細胞アッセイが細胞シグナル伝達の事前情報を必要とせず、経路的にバイアスされておらずかつ経路感受性があるので、これらのバイオセンサー細胞アッセイは、リガンド選択性シグナル伝達及び任意のリガンドのシステム細胞薬理の研究に適している。
【００９６】
ｘｉ．イオンチャネルモジュレーターのための無標識バイオセンサー及びバイオセンサー細胞ベースアッセイ：
無標識細胞ベースアッセイは、一般に生きている細胞における化合物によって誘導される応答を監視するためのバイオセンサーを採用している。化合物は、天然又は合成、精製又は未精製の混合物であり得る。バイオセンサーは、一般的に分子認識事象又は定量信号にバイオセンサーと接触した細胞におけるリガンド誘導の変化を変換するために、光学、電気熱量、音響又は磁気トランスデューサ等のトランスデューサを利用している。本発明に適用可能なバイオセンサーは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、共振導波路格子（ＲＷＧ）バイオセンサー、共振ミラー、エリプソメータ、生体インピーダンスシステム等の光バイオセンサーシステムや電気バイオセンサーシステムを含むが、これらに限定されない。
【００９７】
イオンチャネルは重要な薬物標的である。なぜならば、それらが生理的過程の非常に広いスペクトルを制御する上で重要な役割を果たしているためであり、それらの機能不全が病態につながるからである。しかし、歴史的には、このタンパク質のクラスを標的とする薬の開発は困難であった。通常は、小分子ライブラリにおいては豊富ではない扱いやすい案内構造を識別するために開発された新しい、機能、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）戦略は有望な結果が得られている。自動化された細胞ベースのＨＴＳアッセイは、蛍光法を用いて高密度フォーマットプレート読み取り機で膜電位や細胞内カルシウムの変動を監視して、イオンチャネルの多くの異なる種類に設定され得る。新しく自動化されたパッチクランプ技術は第２のクリーニングを提供し、これはチャネルレベルでの活性の合致を確認し、イオンチャネルスーパーファミリー全体で選択性を決定し、作用機序についての洞察を提供する。同じ第１及び第２のアッセイは、効果的に医薬品化学のリード開発を支援している。しかし、これらのアプローチは、イオンチャネル調節が細胞の機能と生理機能にどのように影響を与えることの洞察をほとんど提供しない。
【００９８】
Ｂ．方法：
本明細書に開示される方法、本方法で使用することができる組成物及び化合物は、材料、物質、分子、リガンドなどの異なる多くのクラスから生じ得る。また、開示することはこれらのクラスの特定のサブセットであり、例えば、ＫＡＴＰチャネルの活性化のためのマーカーとしてのピナシジルなどのマーカーと呼ばれる無標識バイオセンサーアッセイに特有のものである。
【００９９】
分子の混合物等のこれらのクラスの混合物も開示され、開示された方法で使用することができることが理解される。
【０１００】
特定の方法では、未知の分子、試験分子、薬剤候補分子と同様に既知の分子を使用することができる。
【０１０１】
特定の方法や状況において、修飾、調節又はモジュレーターは、ＫＡＴＰモジュレーター、ＪＡＫモジュレーター、又はＲＯＣＫモジュレーター等の役割や、同様に、これらのすべての潜在性としての役割を果たす。同様に、既知のモジュレーターを使用することができる。
【０１０２】
特定の方法において、例えば、細胞、組成物は、同様に、細胞株、細胞過程から細胞応答を生成することができる細胞パネル、細胞標的に関与している。本明細書で説明しているように細胞が培養されそして細胞培養が使用され得る。
【０１０３】
本明細書に記載の方法はバイオセンサーを使用するアッセイを含む。特定のアッセイでは、それらはアゴニズム又はアンタゴニズムモードのいずれかで実行される。しばしばアッセイは、材料、物質、又は分子等の１つ以上のクラスでの細胞処理に関与している。また、本明細書で議論し、対象物も同様に扱うことができることが理解される。
【０１０４】
特定の方法では、例えば、分子細胞間で接触させことが行われる。開示された方法は、ＤＭＲの応答のように、バイオセンサーの応答として明示できる細胞応答等の応答が検出される。これら及び他の応答を測定することができる。特定の方法では、バイオセンサーからの信号は、豊富なバイオセンサーシグナルや豊富なＤＭＲシグナルとすることができる。
【０１０５】
無標識バイオセンサーを利用する開示された方法は、一次プロファイル、二次プロファイル、及び調節プロファイルなどのプロファイルを生成することができる。これらのプロファイル等は、本明細書で説明例えば、分子に関する決定を行うために使用することができ、クラスのいずれかを使用することができる。
【０１０６】
また、本明細書に開示されるものは、分子、細胞、材料又は物質等の化合物又は組成物のライブラリ及びパネルである。また、マーカーパネルと細胞パネル等の特定パネルが開示される。
【０１０７】
開示される方法は、例えば、バイオセンサーシグナル、ＤＭＲシグナル、正規化、コントロール、正のコントロール、モジュレーション比較、インデックス、バイオセンサーインデックス、ＤＭＲインデックス、分子バイオセンサーインデックス、分子ＤＭＲインデックス、分子インデックス、モジュレーターバイオセンサーインデックス、モジュレーターＤＭＲインデックス、分子調節インデックス、既知モジュレーターバイオセンサーインデックス、既知モジュレーターＤＭＲインデックス、マーカーバイオセンサーインデックス、マーカーＤＭＲインデックス、マーカーのバイオセンサーシグナルの調節、ＤＭＲシグナルの調節、増強、及びインデックス類似性、等の様々な側面を利用することができる。
【０１０８】
本明細書に開示される任意の組成物、化合物、又はその他は、本方法で特徴づけることができる。
【０１０９】
より高い、阻害等の言葉で特徴付けに依存する方法が開示されている。
【０１１０】
特定の方法では、受容体又は細胞標的が使用される。特定の方法は、シグナル伝達経路に関する情報だけでなく、分子で処理した細胞や他の細胞プロセスを提供することができる。
【０１１１】
特定の実施形態では、特定の効能や効果は、特徴的になり、直接の作用（例えば薬剤候補分子の）はアッセイされ得る。
【０１１２】
１．ＫＡＴＰモジュレーター及び薬物標的としてのｍｉｔｏＫＡＴＰをスクリーニングする方法：
薬物標的としてミトコンドリアＡＴＰ感受性カリウムイオンチャネル（ｍｉｔｏＫＡＴＰ）を使用する方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、本方法は、肝疾患を予防又は治療することができる化合物を同定することができる。いくつかの実施形態では、該化合物は、ｍｉｔｏＫＡＴＰチャネルモジュレーターである。また、肝細胞におけるｍｉｔｏＫＡＴＰチャネルモジュレーターを選別するために無標識バイオセンサーの細胞アッセイを使用する方法も、本明細書で開示される。
【０１１３】
また、肝細胞においてｍｉｔｏＫＡＴＰイオンチャネルモジュレーターをスクリーニングする方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、スクリーニングは、無標識アッセイを使用して実行される。無標識アッセイは基準として既知ＫＡＴＰオープナーの使用に依存させてもよい。いくつかの実施形態では、ＫＡＴＰオープナーはピナシジルである。開示された方法に従って示されているように、ピナシジルは、形質転換された肝細胞株のＨｅｐＧ２Ｃ３Ａ内の豊富な動的質量再分配（ＤＭＲ）シグナルを提供する。肝細胞におけるピナシジルのＤＭＲシグナルはｍｉｔｏＫＡＴＰ経路モジュレーターを含むｍｉｔｏＫＡＴＰモジュレーターを選別するために使用することができる。
【０１１４】
また、肝疾患を治療又は予防するためのｍｉｔｏＫＡＴＰモジュレーターの使用の方法も開示される。開示された方法に従って示されているように、肝細胞株ＨｅｐＧ２Ｃ３Ａ内のピナシジルＤＭＲシグナルがＫｉｒ６．２／ＳＵＲ２のＫＡＴＰイオンチャンネルに関連付けられており、ＫＡＴＰイオンチャネルは主にミトコンドリア内に配置されている。ピナシジルＤＭＲシグナルは、アクチンの再造形、ＲＯＣＫ活性及びＪＡＫの活性にリンクされることができる。ｍｉｔｏＫＡＴＰモジュレーターはまた、よく知られている肝毒性薬物リファンピンにより誘導されるＣＹＰ３Ａ４酵素活性誘導を抑制することができる。したがって、ｍｉｔｏＫＡＴＰチャネルは肝臓疾患を治療又は予防するための新薬の開発につながるような標的にすることができる。
【０１１５】
また、本明細書に開示された分子の抑制物質方法は、分子を抑制物質する方法であって、
ａ．無標識バイオセンサーの分析に使用されるバイオセンサー表面上でＫＡＴＰ細胞株を培養するステップと、
ｂ．分子で前記細胞株をインキュベートして分子処理した細胞株を産生するステップと、
ｃ．無標識バイオセンサーで前記分子処理した細胞株を分析して分子データ出力を産生するステップと、
ｄ．同一の前記細胞株における前記分子データ出力と既知のＫＡＴＰモジュレーターデータ出力とを比較して分子−ＫＡＴＰモジュレーターの比較を産生するステップと、を含むことを特徴とする。
【０１１６】
また、本明細書に開示された分子の抑制物質方法は、分子を抑制物質する方法であって、
ａ．無標識バイオセンサーの分析に使用されるバイオセンサー表面上でＫＡＴＰ細胞株を培養するステップと、
ｂ．マーカー及び分子で前記細胞株をインキュベートしてインキュベートしている細胞株を産生するステップと、
ｃ．無標識バイオセンサーで前記インキュベートしている細胞株を分析してマーカー−分子データ出力を産生するステップと、
ｄ．同一の前記細胞株における前記マーカー−分子データ出力とマーカー−ＫＡＴＰモジュレーターデータ出力とを比較してマーカー−分子／マーカー−ＫＡＴＰモジュレーターの比較を産生するステップと、を含むことを特徴とする。
【０１１７】
また、本明細書に開示された分子のアッセイ法は、分子をアッセイする方法であって、
ａ．無標識バイオセンサーの分析に使用されるバイオセンサー表面上でＡ４３１、ＨＴ２９、Ａ５４９、及びＨｅｐＧ２の４つの異なる細胞株を培養するステップと、
ｂ．分子で前記細胞株の各々をインキュベートして４つのインキュベートしている細胞株を産生するステップと、
ｃ．無標識バイオセンサーで前記インキュベートしている細胞株の各々を分析して各インキュベートしている細胞株に対する分子データ出力を産生するステップと、
ｄ．同一の前記細胞株における前記分子データ出力とＲＯＣＫ抑制物質のデータ出力とを比較して各細胞株に対する分子−ＲＯＣＫ抑制物質の比較を産生するステップと、を含むことを特徴とする。
【０１１８】
また、本明細書に開示された対象物の処理法は、対象物を処理（被験者を治療）する方法であって、肝疾患の治療の必要性である対象物にＫＡＴＰモジュレーターを投与するステップと、を含むことを特徴とする。
【０１１９】
また、本明細書に開示された肝毒性の減少法は、対象物における肝毒性を減少させる方法であって、ＫＣＯの機能が対象物に与えられた薬物の肝臓毒性を減少させる前記ＫＣＯを対象物に投与するステップを含むことを特徴とする。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、ＫＡＴＰ細胞株はミトコンドリアＡＴＰ感受性カリウムイオンチャネル（ｍｉｔｏＫＡＴＰ）を含むことができる。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、細胞株は、肝細胞を含むことができる。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、肝細胞は肝細胞を含むことができる。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、肝細胞は肝ウイルスに感染され得る。いくつかの実施形態において、肝ウイルスは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅの型肝炎、単純ヘルペス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、黄熱病ウイルス、又はアデノウイルスであり得る。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、細胞は、非ウイルス性感染症に感染源から得ることができる。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、非ウイルス性感染症は、トキソプラズマ、レプトスピラ、Ｑ熱、又はロッキー山紅斑熱を含むことができる。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、細胞は、化学物質、毒素、又は薬物であるか又はそれらの影響を受ける源から得ることができる。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、化学物質又は毒素は、アルコール、パラセタモール、アモキシシリン、抗結核薬、ミノサイクリン、メチルドパ、ニトロフラントイン、イソニアジド又はケトコナゾールを含むことができる。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、既知ＫＡＴＰモジュレーターデータ出力は、培養した前記ＫＡＴＰ細胞株で前記ＫＡＴＰモジュレーターをインキュベートしてＫＡＴＰモジュレーターデータ出力を生成する無標識バイオセンサーで、前記インキュベートした細胞株を解析することにより、産生されることができる。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、方法は、前記比較において分子データ出力及びＫＡＴＰモジュレーターデータ出力が類似していることを示すとき、潜在的ＫＡＴＰモジュレーターを識別するステッップを更に含むことができる。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、ＫＡＴＰ細胞株は、ＨｅｐＧ２細胞又はＨｅｐＧ２Ｃ３Ａ細胞株から選択することができる。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、既知ＫＡＴＰモジュレーターは、カリウムチャネルオープナー（ＫＣＯ）を含むことができる。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、ＫＣＯは、ジアゾキシド、ピナシジル、クロマカリム又はニコランジルを含むことができる。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、ＫＡＴＰモジュレーターは、ＫＡＴＰ抑制物質を含むことができる。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、ＫＡＴＰ抑制物質は、スルホニルウレア又はＵ−３７８８３Ａを含むことができる。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、スルホニル尿素は、トルブタミド、トラザミド又はグリピジドを含むことができる。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、マーカー−ＫＡＴＰモジュレーターデータ出力は、培養した前記ＫＡＴＰ細胞株で前記マーカー及び前記ＫＡＴＰモジュレーターをインキュベートして、マーカー−ＫＡＴＰモジュレーターデータ出力を生成する無標識バイオセンサーで、前記インキュベートした細胞株を解析することにより、産生されることができる。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、方法は、前記比較においてマーカー−分子データ出力及びマーカー−ＫＡＴＰモジュレーターデータ出力が類似していることを示すとき、潜在的ＫＡＴＰモジュレーターを識別するステッップを更に含むことができる。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、マーカーはＲＯＣＫ１モジュレーター又はＲＯＣＫ２モジュレーターを含むことができる。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、ＲＯＣＫ１モジュレーター又はＲＯＣＫ２モジュレーターはＲＯＣＫ１抑制物質又はＲＯＣＫ２抑制物質を含むことができる。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、ＲＯＣＫ１抑制物質又はＲＯＣＫ２抑制物質は、Ｙ−２７６３２を含むことができる。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、マーカーはＪＡＫモジュレーターを含むことができる。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、ＪＡＫモジュレーターは、ＪＡＫ抑制物質を含むことができる。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、ＪＡＫ抑制物質は、ＡＧ４９０を含むことができる。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、マーカーは、チトクロムＰ４５０酵素モジュレーターを含むことができる。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、チトクロムＰ４５０酵素モジュレーターは、チトクロムＰ４５０活性化物質を含むことができる。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、チトクロムＰ４５０酵素は、ＣＹＰ２Ｄ６又はＣＹＰ３Ａ４を含むことができる。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、チトクロムＰ４５０活性化物質は、リファンピシンを含むことができる。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、方法は、ＲＯＣＫ経路の活性化に対する分子をアッセイするステップを更に含むことができる。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、アッセイのステップは、
ａ．無標識バイオセンサーの分析に使用される表面上でＲＯＣＫ抑制物質応答性細胞株を培養するステップと、
ｂ．分子で前記細胞株をインキュベートしてインキュベートする細胞株を産生するステップと、
ｃ．無標識バイオセンサーで前記インキュベートする細胞株を分析して分子データ出力を産生するステップと、
ｄ．同一の前記細胞株における前記分子データ出力と既知のＲＯＣＫ抑制物データ出力とを比較して分子−ＲＯＣＫ抑制物の比較を産生するステップと、を含むことができる。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、ＲＯＣＫ抑制物質応答性細胞株は、既知のＲＯＣＫ抑制物質によるＲＯＣＫの基礎活性を阻害することが豊富なバイオセンサーシグナルを生成するような細胞株を含むことができる。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、細胞株は、Ａ４３１、Ａ５４９、又はＨＴ２９から選択されることができる。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、方法は、少なくとも２つのマーカーを使用して独立して実行されることができる。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、マーカーは少なくともＥＣ７０、ＥＣ８０、ＥＣ９０、ＥＣ９５、及びＥＣ１００の濃度で添加されることができる。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、ＲＯＣＫ抑制物質はＹ２７６３２とすることができ、ＫＡＴＰモジュレーターはＬＹ−２９４００２とすることができる。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、ＲＯＣＫ抑制物質のデータ出力は、各細胞株とＲＯＣＫ抑制物質をインキュベートし、各細胞株に対するＲＯＣＫ抑制物質のデータ出力を生成する無標識バイオセンサーで各培養細胞株を解析することにより産生することができる。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、方法は更に、ＫＡＴＰモジュレーターデータ出力を生成するステップと、各細胞株について分子−ＫＡＴＰ抑制物質の比較を生成するステップと、を含むことができる。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、方法は、更に追加のイオンチャネルアッセイを行うステップを含むことができる。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、追加のイオンチャネルアッセイは、従来の又は自動化されたパッチクランプするステップを含むことができる。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、ＫＡＴＰモジュレーターはｍｉｔｏＫＡＴＰモジュレーターを含むことができる。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、肝疾患はＪＡＫ又はＫＡＴＰから下流のＲｈｏキナーゼシグナルに関与し得る。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、ＫＡＴＰチャネルはＫｉｒ６．２及びＳＵＲ２チャネルであることができる。いくつかの実施形態において、ＫＣＯがピナシジルであることができる。
【０１６２】
Ｃ．定義：
本発明の様々な実施例は、図面がある場合は図面を参照して詳細に説明される。様々な実施例への言及は、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。さらに、本明細書で説明されている任意の例は、限定することを意図したものではなく、本発明の多くの可能な実施例のいくつかを単に説明するものである。
【０１６３】
１．”Ａ”
本明細書及び特許請求の範囲に使用されている”ａ”、”ａｎ”、及び”ｔｈｅ”等の単数系の用語は明示されない限り複数の対象を含む。従って、例えば”抑制物質”は２つ以上の抑制物質の混合物等を含む。
【０１６４】
２．”省略形（Ａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎ）”
当業者には広く知られている省略形が使用されることがある（例えば、時間に対する”ｈ”又は”ｈｒ”、グラムに対する”ｇ”又は”ｇｍ”、ミリリットルに対する”ｍＬ”、室温に対する”ｒｔ”、ナノメートルに対する”ｎｍ”、モルに対する”Ｍ”など）。
【０１６５】
３．”約（Ａｂｏｕｔ）”
例えば、組成物内の成分数、濃度、体積、処理温度、処理時間、収率、流速、圧力などの値、及びその範囲であって本開示の実施例に記載されているものに”約”が修飾されている場合、その数量は変化することを示し、当該変化は、例えば、化合物、組成物、濃縮物、又は使用する製剤を作製するのに使用される典型的な測定手順及び取扱手順によって、これら手順における故意でない間違いによって、製品、原料、出発材料の純度、又は本方法を実施するのに使用される成分の差によって、及びこれらと同様の要因によって生じ得る。さらに、用語”約”は特定の初期濃度又は初期混合における組成物又は製剤の老化によって変化する量及び特定の初期濃度又は初期混合における組成物又は製剤の混合又は処理によって変化する量を含む。用語”約”が修飾されているかに関わらず、特許請求の範囲はこれら数量に均等なものを含む。
【０１６６】
４．”細胞のパネルに亘ってとマーカーのパネルに対して”
”細胞のパネルに亘ってとマーカーのパネルに対して”の句は、細胞のパネルにおける各細胞に作用する分子の一次のプロファイルとマーカーパネルを変調する分子の変調プロファイルを審査する体系的なプロセスを言う。マーカー／細胞のペアでは、プロセスは、最初に細胞の各タイプに独立して作用する分子の一次的プロファイルを調べることから始まり、続いて、同一細胞内の分子の存在下でマーカーの二次的プロファイルを調べる。用語の”対して”は、マーカー誘発性バイオセンサー応答を調節する分子の能力を表すために具体的に使用されている。
【０１６７】
５．アゴニスト：
アゴニストは、細胞内であってもよい細胞による応答を生成する細胞における受容体と結合する分子等の作用をもたらす分子又は物質である。
【０１６８】
６．アンタゴニスト：
アンタゴニストは、受容体に結合する分子等のアゴニストの作用等を阻害（遮断等）する分子又は物質であり、アゴニストが結合するのを防止し、アゴニストの作用を阻害する。
【０１６９】
７．活性化物質：
活性化物質は、基本の状態に比べて、状態の増加をもたらす。例えば、ＥＧＦは、ＥＧＦＲの活性化物質であり、ＥＧＦＲへのＥＧＦの結合は、シグナル伝達事象をもたらす。
【０１７０】
８．”アッセイすること（Ａｓｓａｙｉｎｇ）”
アッセイすること、アッセイする等の用語は細胞又は分子などの物質の特性を判定するための分析をいい、当該特性は例えばリガンド又はマーカーなどの１つ以上の外因性刺激により刺激された際の細胞の光学応答又は生体インピーダンス応答の有無、量、範囲、速度、動態、又は種類である。刺激に対する細胞応答のバイオセンサーシグナルを生成することがアッセイであってもよい。
【０１７１】
９．”応答をアッセイする（Assaying the response）”
”応答をアッセイすること”等の用語は、当該応答を特性化する手段を使用することを意味する。例えば、分子が細胞に接触させられる場合、当該分子にさらされた当該細胞の応答をアッセイするのにバイオセンサーが使用されることができる。
【０１７２】
１０．”付着する”
”付着する（Ａｔｔａｃｈ）”、”付着（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）”、”接着（ａｄｈｅｒｅ）”、”付着され（ａｄｈｅｒｅｄ）”、”固定された（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）”等の用語は、例えば、本開示の表面修飾物質、相溶剤、細胞、リガンド候補分子等のエンティティを、物理吸着、化学結合等のプロセス若しくはそれらの組み合わせのプロセスによって、表面に固定若しくは固着せしめることを通常意味する。特に、”細胞の付着（ｃｅｌｌ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）”、”細胞の付着（ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ）”等の用語は、表面との細胞の相互作用若しくは表面への結合を意味する。当該相互作用又は結合は、細胞固定材料、相溶剤（例えば、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミン、ゼラチン、ポリリジン等）若しくはそれら双方を用いて培養し又は相互作用せしめること等によって行われる。”付着性細胞”、”固定された細胞”等の用語は、基板の外部表面に関連付けられ、基板の外部表面上に固定され、又は特定の接触を維持する原核細胞若しくは真核細胞等の細胞、細胞株又は細胞システムを意味する。培養後のかかるタイプの細胞は、洗浄媒質交換処理、すなわち、多くの細胞ベースの分析に必須である処理に対して抵抗力を有し、耐性を有し得る。
【０１７３】
１１．”アゴニニストモード及びアンタゴニストモード”
アゴニストモード等の用語は、例えばＤＭＲシグナルなどのバイオセンサーシグナルのきっかけとなる分子の能力を判定するために細胞が分子にさらされるようなアッセイをいい、一方、アンタゴニストモードは、マーカーに応答する細胞のバイオセンサーシグナルを変調又は調節する分子の能力を判定するために細胞が分子の存在するマーカーにさらされるようなアッセイをいう。
【０１７４】
１２．”バイオセンサー（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）”
バイオセンサー等の用語は、生物学的成分に物理化学的検出成分を組み合わせた検体を検出するデバイスをいう。典型的な場合バイオセンサーは３つの部分からなり、当該部分は、生物学的成分又は要素（例えば、組織、微生物、病原体、細胞、又はこれらの組合せ）、検出要素（光学的、圧電的、電気化学的、温度的、又は磁気的などの物理化学的手法において機能するもの）、及び両成分に関するトランスデューサである。当該生物学的成分又は要素は、例えば、生細胞、病原体、又はこれらの組合せであることができる。実施例において、光学バイオセンサーは、生細胞、病原体、又はこれらの組合せにおける分子認識事象又は分子刺激事象を定量化可能なシグナルへ変換する光学トランスデューサを含み得る。
【０１７５】
１３．”バイオセンサー細胞アッセイを中心とした細胞プロファイル薬理学”
”バイオセンサー細胞アッセイを中心とした細胞プロファイル薬理学”等の用語は、無標識バイオセンサーの細胞アッセイを用いて分子の薬理学を決定する方法である。
【０１７６】
１４．”バイオセンサーインデックス（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｉｎｄｅｘ）”
”バイオセンサーインデックス”等の用語は、バイオセンサーデータの集合からなるインデックスをいう。バイオセンサーインデックスは、一次プロファイル又は二次プロファイルなどのバイオセンサープロファイルの集合であり得る。当該インデックスは任意の種類のデータを含み得る。例えば、プロファイルのインデックスは、Ｎ−ＤＭＲデータ点、Ｐ−ＤＭＲデータ点、その両方、又はインピーダンスデータ点からなることができる。当該インデックスはプロファイル曲線に関する全てのデータ点であってもよい。
【０１７７】
１５．”バイオセンサー応答（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）”
”バイオセンサー応答”、”バイオセンサー出力信号”、”バイオセンサーシグナル”等の用語は、細胞を有するセンサシステムの細胞応答に対する応答をいう。バイオセンサーは細胞応答を定量化可能なセンサ応答へ変換する。バイオセンサー応答は、ＲＷＧ又はＳＰＲなどの光学バイオセンサーによって測定された刺激に対する光学応答又は電気バイオセンサーによって測定された刺激に対する細胞の生体インピーダンス応答である。本開示の実施例において、バイオセンサー応答は刺激に対する細胞応答に直結しているため、当該バイオセンサー及び当該細胞応答は同じ意味で使用され得る。
【０１７８】
１６．”バイオセンサーシグナル（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｓｉｇｎａｌ）”
”バイオセンサーシグナル”等の用語は、バイオセンサーを用いて測定された細胞のシグナルであって、刺激に対する細胞の応答によって生成されたものをいう。
【０１７９】
１７．”バイオセンサー表面”
バイオセンサー表面等は、それに培養される細胞を有することができるバイオセンサーのあらゆる表層でもある。バイオセンサー表面は、組織培養処理され、又は細胞間マトリックス物質（例えばフィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、等）で被覆され、又は合成的材料（例えば、ポリリジン）で被覆され得る。
【０１８０】
１８．”細胞（Ｃｅｌｌ）”
細胞等の用語は、半透膜によって外部を囲まれた原形質の小さく通常は顕微鏡でしか見ることができない原形質のかたまりをいい、細胞は選択的に１つ以上の核及び様々なオルガネラを含み、細胞は生命体の全ての基本的な働きを単独で又は他の同様のかたまりと相互作用して行うことができ、細胞は独立して働くことができる生命体の最小の構造単位を形成し、細胞は人工の細胞構造、細胞モデルシステム、及び同様の人工細胞系を含む。
【０１８１】
細胞は異なる細胞型を含むことができ、当該細胞型は例えば、特定の疾患に関する細胞、特定の起源に由来する細胞型、特定の標的に関する細胞型、又は特定の生理機能に関する細胞型である。さらに、細胞は、天然の細胞、人工の細胞、形質転換細胞、不死化細胞、一次細胞、胚性幹細胞、成体幹細胞、癌幹細胞、又は細胞から派生した幹細胞であってもよい。細胞の少なくとも２種類を含む細胞系を使用することもできる。細胞系は自然に又は共培養を経由して形成することができる。
【０１８２】
ヒトは約２１０の既知の異なる細胞型からなる。どのように細胞が準備されるか（例えば、人工的に作り出された、形質転換された、不死化された、又はヒトの体から新鮮分離されたなど）、及び、どこで（例えば、異なる年齢のヒトの体又は異なる病期のヒトの体など）細胞が得られたかを考慮すると、当該細胞型の数はほぼ無限である。
【０１８３】
１９．細胞株：
”細胞株”等の用語は、少なくとも１つの共通の特性や培養にて継代することができる機能を持っていることによってグループ化することができる細胞を言う。
【０１８４】
２０．”細胞背景”
”細胞背景”等の用語は、特定の状態を有する一種の細胞である。例えば、細胞の異なるタイプは、異なる細胞背景（例えば細胞受容体の差動発現又は組織化）を有する。
また、異なる状態を有するが同じタイプの細胞は、異なる細胞背景を有する。細胞の同じタイプで異なる状態は、培養（例えば止められ又は増殖中又は静止性状態の細胞周期）又は処理（例えば異なる薬理学的試薬で処理された細胞）で達成されることができる。
【０１８５】
２１．”細胞培養する（Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ）”
”細胞培養”又は”細胞培養すること”は、管理された状況下において原核細胞又は真核細胞が培養されるプロセスをいう。”細胞培養する”は、多細胞真核生物、特に動物細胞から派生した細胞を培養することだけでなく、複合組織及び複合器官を培養することもいう。
【０１８６】
２２．”細胞パネル（Ｃｅｌｌ  ｐａｎｅｌ）”
”細胞パネル”等の用語は、少なくとも２つの細胞型を含むパネルをいう。当該細胞はここに開示されたものの任意の組合せであり得る。
【０１８７】
２３．”細胞応答（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）”
”細胞応答”等の用語は、刺激に対する細胞の応答をいう。
【０１８８】
２４．”細胞プロセス（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｃｅｓｓ）”
”細胞プロセス”等の用語は細胞内において又は細胞によって起こる応答をいう。細胞プロセスの例は、増殖、アポトーシス、壊死、分化、細胞シグナル変換、極性変化、移動、又は形質転換を含むが、これらに限定されない。
【０１８９】
２５．”細胞標的（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔ）”
”細胞標的”等の用語はタンパク質又は核酸などのバイオポリマーであって、当該バイオポリマーの活性が外部刺激によって変形されることができるものをいう。細胞標的は、酵素、キナーゼ、イオンチャネル、及び受容体のような最も普及しているタンパク質である。
【０１９０】
２６．”特性化すること（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ）”
”特性化すること”等の用語は、リガンド、分子、マーカー、又は細胞などの物質の特徴に関する情報を収集することをいい、例えばリガンド、分子、又は細胞に対するプロファイルを得ることをいう。
【０１９１】
２７．”含む（Ｃｏｍｐｒｉｓｅ）”
本明細書及び特許請求の範囲を通して、単語”含む”、”含んでいる”、及びその変形は、”含むがこれに限定されない”という意味であり、例えば他の添加物、成分、整数、又はステップを除外するという意味ではない。
【０１９２】
２８．”基本的に構成されている（Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）”
実施例において、”基本的に構成されている”とは、例えば、表面組成、バイオセンサー表面上における表面組成、製剤又は組成物を構成又は使用する方法、及び本開示の物質、デバイス、又は装置について説明するものであり、これらが、特許請求の範囲に記載された成分又はステップに加えて、ここに開示されている組成物、物質、装置、及び方法を作製・構成及び使用することに関する基礎的かつ新規な特徴に大きな影響を与えない他の成分又はステップを含み得ることをいい、当該他の成分又はステップは、例えば、特定の反応剤、特定の添加剤若しくは材料、特定の作用物質、特定の細胞若しくは細胞株、特定の表面改質剤若しくは表面調節剤、特定のリガンド候補、又はこれらと同様の変更可能な構造体、材料、若しくはプロセスである。当該本開示の成分又はステップの基礎的な特徴に大きな影響を与え得る項目又は本開示に望ましくない特性を与え得る項目は、例えば、バイオセンサー表面に対する細胞の親和性低下、細胞表面受容体又は細胞内受容体に対する刺激の親和性異常、リガンド候補又は同様の刺激に対する異常な細胞活性又は逆の細胞活性、及びこれらと同様の特性を含む。
【０１９３】
２９．”成分（Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）”
ここに開示されているのは、開示された組成物を準備するのに使用される成分と、本明細書に開示された方法に使用される組成物自体と、である。これら及び他の材料は本明細書に開示されており、かつ、これら材料の組合せ、サブセット、相互作用、グループ等が開示されている場合において、これら分子の各々、集合的組合せ、及びその置換のうちの特定のものが明確に開示されていなくても、その各々は詳細に検討されて本明細書に記載されているものとする。従って、分子クラスＡ、Ｂ、及びＣと分子クラスＤ、Ｅ、及びＦとが開示され、分子の組合せ例Ａ−Ｄが開示されているならば、各々が個別に記載されていない場合であってもその各々は個別かつ集合的に検討されており、すなわち組合せＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ、及びＣ−Ｆも開示されていることを意味する。同様にこれらのサブセット又は組合せも開示されているものとする。従って、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、及びＣ−Ｅのサブグループも開示されているものとする。このコンセプトは、ここに開示された組成物を作製及び使用する方法におけるステップ（これらに限定されない）を含む本願の全ての特徴に適用される。従って、実行されることができる様々な追加ステップが存在するならば、これら追加ステップの各々は開示された方法の任意の特定の実施例又は実施例の組合せに伴って実行されることができるものとする。
【０１９４】
３０．”接触させること（Ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）”
接触させること等の用語は、少なくとも２つのもの、例えば分子、細胞、マーカー、化合物若しくは組成物、少なくとも２つの組成物、又は製品若しくは機械を含むこれらの任意のものの間に分子相互作用が起こり得る場合において、分子相互作用が起こり得るように近接させることを意味する。例えば、接触させることは、少なくとも２つの組成物、分子、製品、又は物質を、接触させるすなわちこれらが近接して混合又は触れるような状態にさせることをいう。例えば、組成物Ａの溶液と培養された細胞Ｂとを有しており、組成物Ａの溶剤を培養された細胞Ｂ上に注入することは、組成物Ａを細胞培養物Ｂに接触させることである。細胞をリガンドに接触させることは、リガンドを、当該細胞に対して、当該細胞が当該リガンドへのアクセスを有する状態を保証させることである。
【０１９５】
ここに開示されている全てのものは、他のものに接触することができるものとする。例えば、細胞は、マーカーすなわち分子、バイオセンサー等に接触することができる。
【０１９６】
３１．化合物及び組成物：
化合物及び組成物は当該技術分野におけるその標準的な意味を有している。特定の指定物、例えば分子、物質、マーカー、細胞、又は試薬であってこれら指定物を含むもの、これら指定物で構成されているもの、及びこれら指定物で基本的に構成されているものが開示されているものとする。従って、特定の指定マーカーが使用される場合、当該マーカーを含む組成物、当該マーカーで構成されている組成物、又は当該マーカーで基本的に構成されている組成物も開示されているものとする。特定の指定物が作製される場合、当該指定物の化合物も開示されているものとする。例えば、ＥＧＦなどの特定の生物学的材料が開示されているならば、化合物の形態をとったＥＧＦも開示されているものとする。
【０１９７】
３２．”コントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）”
”コントロール”、”コントロールレベル”、又は”コントロール細胞”等の用語は、変化が測定される基準として定義されるものをいい、例えば、コントロールは実験によるものではなく所定のパラメータセットによるものであり、又はコントロールは前処理レベル若しくは後処理レベルに基づくものである。これらは試験の実行と同時、試験の実行前、若しくは試験の実行後に実行されるものであるか、又は予め決められた基準であり得る。例えば、コントロールは、並行試験として主体物、客体物、試薬等が試験手順、試験用の作用物質、試験変数等の不備・不作為を除いて処理される場合の試験結果、及び、試験効果の判断における比較基準として使用される試験結果をいう。従って、コントロールは、手順、作用物質、変数等に関する効果を判定するのに使用されることができる。例えば、細胞上の試験分子の効果が対象であるならば、ａ）当該分子の存在下における当該細胞の特性を記録し、ｂ）ａを実行した後に既知の活性若しくは活性不足を備えたコントロール分子又はコントロール組成物（例えばアッセイバッファ溶液（賦形剤））を追加してその効果を記録し、そして試験分子のコントロールに対する効果を比較することができる。特定の状況においては、一旦コントロールが実行されると当該コントロールは基準として使用されることができ、再度コントロール実験が行われる必要はなく、他の状況においては、コントロール実験は比較が行われる度に毎回実行されなければならない。
【０１９８】
３３．チトクロムＰ４５０酵素モジュレーター：
”チトクロムＰ４５０酵素モジュレーター”は、Ｐ４５０活性を増加又は減少させる、Ｐ４５０を調節する機能を有する任意の分子である。既知Ｐ４５０のモジュレーターとしてはリファンピシンがあるが、これに限定されない。
【０１９９】
３４．チトクロムＰ４５０酵素活性化物質：
”チトクロムＰ４５０酵素活性化物質”は、Ｐ４５０活性を増加させる、Ｐ４５０を調節する機能を有する任意の分子である。既知Ｐ４５０活性化物質としてはリファンピシンがあるが、これに限定されない。
【０２００】
３５．チトクロムＰ４５０酵素抑制物質：
”チトクロムＰ４５０酵素抑制物質”は、Ｐ４５０活性を低下させる、Ｐ４５０を調節する機能を有するが任意の分子である。
【０２０１】
３６．データ出力：
データ出力は、無標識バイオセンサー等の分析マシンを用いたアッセイを実行した後に生じる収集された結果をいう。例えば、無標識バイオセンサーのデータ出力は、ＤＭＲシグナルであり得る。データ出力は、例えば、インデックスへ操作処理され得ることが理解される。データ出力として、アッセイが分子、ＫＡＴＰチャネル、Ｒｈｏキナーゼ、マーカー、抑制物質、ＫＡＴＰ抑制物質、マーカー−分子、マーカー−ＫＡＴＰ抑制物質等を用いて実施される様々な種類のデータ出力が存在し得ることが理解される。分子−ＫＡＴＰ抑制物質の比較を生成する分子データ出力とＫＡＴＰ抑制物質データ出力との比較等、任意の２つの出力の比較がなされ得ることが理解される。通常は、このような比較は、ＤＭＲデータ出力とＤＭＲデータ出力とのように、類似のデータ出力間で実施される。
【０２０２】
３７．”定義済み経路”
”経路を定義された”等の用語は、例えばＧαｑ経路、Ｇαｓ経路、Ｇαｉ経路、Ｇ１２／１３ＥＧＦＲ（上皮細胞増殖因子受容体）経路又はＰＫＣ（プロテインキナーゼＣ）経路などの特定経路である。
【０２０３】
３８．調整解除された（無秩序）ＰＩ３Ｋ経路細胞株：
調整解除された（無秩序）ＰＩ３Ｋ経路細胞株は、経路内の重要なシグナル伝達カスケードタンパク質（１又は複数）の変化の故にＰＩ３Ｋ経路が過反応する細胞株である。これらの変化は、限定するものではないが、刺激されていない細胞内のＲａｓ及びＰＩ３Ｋの構成的活性化をもたらすＫ−Ｒａｓ（ＰＩ３Ｋの上流タンパク質）の変異、又は同様にＰＩ３Ｋの構成的活性化をもたらすＰＴＥＮ（ＰＩ３Ｋの下流のネガティブ調節遺伝子（調節因子））の機能喪失を含む。例えば、調整解除された（無秩序な）ＰＩ３Ｋ経路細胞下部は、刺激されていない細胞内で構成的に活性化されるＫ−Ｒａｓ変異体を含むＡ５４９細胞下部である（Krypuy, M., et al.  "High resolution melting analysis for the rapid and sensitive detection of mutations in clinical samples: KRAS codon 12 and 13 mutations in non-small cell lung cancer".  BMC Cancer 2006, 6, e295）。
【０２０４】
ＰＩ３Ｋ経路に関連しているタンパク質は、限定するわけではないが、
（１）ＡＫＴ及びＰＩ３Ｋファミリーであるもの及びこれらの調節因子である：ＡＫＴ１，ＡＫＴ２，ＡＫＴ３，ＡＰＰＬ，ＢＴＫ，ＣＴＭＰ，ＧＮＢ１，ＧＲＢ１０，ＧＲＢ２，ＨＳＰＢ１，ＨＳＰＣＡ，ＨＳＰＣＢ，ＩＬＫ，ＩＮＰＰ５Ｄ（ＳＨＩＰ），ＩＮＰＰＬ１，ＭＡＰＫ８ＩＰ１（ＪＩＰ１），ＭＴＣＰ１，ＰＤＫ２，ＰＤＰＫ１，ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ１１０ａ），ＰＩＫ３ＣＢ（ｐ１１０ｂ），ＰＩＫ３ＣＧ，ＰＩＫ３Ｒ１（ｐ８５ａ），ＰＩＫ３Ｒ２（ｐ８５ｂ），ＰＩＫ３Ｒ３，ＰＲＫＣＡ，ＰＲＫＣＢ１，ＰＲＫＣＺ，ＰＴＥＮ，ＴＣＬ１Ａ，ＴＣＬ１Ｂ；
（２）ＩＧＦ−１又は他のＲＴＫシグナル伝達経路：ＣＳＮＫ２Ａ１，ＥＬＫ１，ＦＯＳ，ＧＲＢ２，ＨＲＡＳ，ＩＧＦ１，ＩＧＦ１Ｒ，ＩＲＳ１，ＪＵＮ，ＭＡＰ２Ｋ１，ＭＡＰＫ３，ＭＡＰＫ８，ＰＩＫ３ＣＢ，ＰＴＰＮ１１，ＲＡＦ１，ＫＲＡＳ，ＲＡＳＡ１，ＳＨＣ１，ＳＯＳ１，ＳＲＦ；
（３）アクチン組織及び細胞遊走のＰＩ３Ｋサブユニットｐ８５関連調節因子：ＡＩＣＤＡ，ＣＤＣ４２，ＣＵＴＬ１，ＰＡＫ１，ＰＤＧＦＲＡ，ＲＡＣ１，ＲＨＯＡ，ＷＡＳＬ，ＺＦＹＶＥ２１；
（４）ＰＴＥＮ依存細胞サイクル停止因子及びアポトーシス因子：ＡＫＴ１，ＣＤＫＮ１Ｂ（ｐ２７），ＣＵＴＬ１，ＦＡＳＬＧ，ＦＯＸＯ３Ａ，ＧＲＢ２，ＩＬＫ，ＩＴＧＢ１，ＭＡＰＫ１，ＭＡＰＫ３，ＰＤＫ１，ＰＤＫ２，ＰＴＥＮ，ＰＴＫ２，ＲＢＬ２，ＳＨＣ１，ＳＯＳ１，ＺＦＹＶＥ２１；
（５）ＢＡＤリン酸化関連の抗アポトーシス経路：ＡＫＴ１，ＡＳＡＨ１，ＢＡＤ，ＣＵＴＬ１，ＧＲＢ２，ＨＲＡＳ，ＩＧＦ１Ｒ，ＩＲＳ１，ＭＡＰ２Ｋ１，ＭＡＰＫ１，ＭＡＰＫ３，ＰＲＫＡＲ１Ｂ，ＲＡＦ１，ＲＰＳ６ＫＡ１，ＳＨＣ１，ＳＯＳ１，ＹＷＨＡＨ，ＺＦＹＶＥ２１；並びに、
（６）ｍＴＯＲシグナル伝達経路に関連するタンパク質：ＡＫＴ１，ＣＵＴＬ１，ＥＩＦ３Ｓ１０，ＥＩＦ４Ａ１，ＥＩＦ４Ｂ，ＥＩＦ４Ｅ，ＥＩＦ４ＥＢＰ１，ＥＩＦ４Ｇ１，ＦＫＢＰ１Ａ，ＦＲＡＰ１，ＭＫＮＫ１，ＰＤＫ１，ＰＤＫ２，ＰＲ４８，ＰＴＥＮ，ＲＨＥＢ，ＲＰＳ６，ＲＰＳ６ＫＢ１，ＴＳＣ１，ＴＳＣ２，ＺＦＹＶＥ２１、を含む。
【０２０５】
３９．”検出する（Ｄｅｔｅｃｔ）”
検出する等の用語は、本開示の装置及び方法の能力であって、分子又はマーカーに誘発された細胞応答を発見又は検知し、かつ異なる分子に対する当該検知された応答を区別する能力をいう。
【０２０６】
４０．”（薬剤候補分子の）直接作用（Ｄｉｒｅｃｔ  ａｃｔｉｏｎ）”
”直接作用”等の用語は、細胞上において独立して作用する（薬剤候補分子の）結果をいう。
【０２０７】
４１．”ＤＭＲシグナル”
”ＤＭＲシグナル”等の用語は、光学バイオセンサーを用いて測定された細胞のシグナルであって、刺激の際に細胞の応答によって生成されたものをいう。
【０２０８】
４２．”ＤＭＲ応答（ＤＭＲ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）”
”ＤＭＲ応答”等の用語は、光学バイオセンサーを用いたバイオセンサー応答をいう。ＤＭＲは動的質量再分布すなわち動的な細胞物質の再分布をいう。Ｐ−ＤＭＲはポジティブなＤＭＲ応答であり、Ｎ−ＤＭＲはネガティブなＤＭＲ応答であり、ＰＲ−ＤＭＲは回復したＰ−ＤＭＲ応答である。
【０２０９】
４３．”薬剤候補分子（Ｄｒｕｇ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）”
薬剤候補分子等の用語は、薬剤又はファーマコフォアとして機能する能力を試験される試験分子をいう。この分子は鉛分子と考慮されてもよい。
【０２１０】
４４．”効能（Ｅｆｆｉｃａｃｙ）”
効能等の用語は、理想的又は最適な条件下での所望の効果の大きさを生成する能力をいう。効能は、現実の条件下での変化に関するものである有効性（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ）に関する概念とは区別されるものである。効能は、分子レベル、細胞レベル、組織レベル、又は系レベルにおける応答を起こす能力と受容体占有率との間の関係である。
【０２１１】
４５．”より高く（Ｈｉｇｈｅｒ）阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）等の単語”
より高く増大する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）、上昇する（ｅｌｅｖａｔｅ）、上昇（ｅｌｅｖａｔｉｏｎ）等の用語、又はこれらの変形は、例えばコントロールと比較して、基礎レベルよりも大きく（高く）増大（上昇）することをいう。低い（ｌｏｗ）、より低い（ｌｏｗｅｒ）、低下する（ｒｅｄｕｃｅ）、減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）、低下（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）等の用語、又はこれらの変形は、例えばコントロールと比較して、基礎レベルよりも小さく（低く）減少（低下）することをいう。例えば、基礎レベルは、アゴニスト又はアンタゴニストなどの分子を細胞に加える前すなわち当該分子の非存在下における通常の生体内レベルである。阻害する、阻害形態等の用語は低下させる又は抑制することをいう。
４６．ＨｅｐＧ２Ｃ３Ａ細胞株：
”ＨｅｐＧ２Ｃ３Ａ” 用語はＨｅｐＧ２細胞株に関連した腫瘍細胞である細胞株である。
【０２１２】
４７．ＨｅｐＧ２細胞株：
ＨｅｐＧ２細胞株は（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−８０６５）は、ヒト肝細胞癌細胞株及び分化肝細胞癌で１５歳の白人アメリカ人の男性の肝臓組織から派生した永久細胞株である。これらの細胞は形態学的に上皮であり、５５のモデルの染色体数を有しており、ヌードマウスにおける腫瘍形成性ではない。細胞は、様々な主要な血漿タンパク質、例えば、アルブミン、トランスフェリン、急性期タンパク質フィブリノーゲン、α２−マクログロブリン、α１−アンチトリプシン、トランスフェリン、プラスミノゲンを分泌する。細胞はヒト成長ホルモンの刺激に応答する。
【０２１３】
ＨｅｐＧ２細胞は分極ヒト肝細胞の研究のためのin vitroモデルシステムに適している。別のよく特徴付けられた偏肝細胞株は、ラット肝由来のハイブリッド細胞株ＷＩＦ−Ｂを含む。適切な培養条件によって、ＨｅｐＧ２細胞は、in vivoで毛細胆管（ＢＣ）及び類洞ドメインにそれぞれ類似するアピカル及び側底細胞表面ドメインの制御可能形成を伴う豊富な形態学的及び機能的な分化を表す（http://www.ATCC.orgのサマリーを参照）。
【０２１４】
４８．ＪＡＫ（ヤヌスキナーゼ）媒介シグナル伝達： 
ＪＡＫ媒介シグナル伝達は、ＪＡＫと相互作用する分子又は物質の上流へ又は下流へ向かうシグナルを言う。ピナシジル等の内因性ＡＴＰ感受性カリウム（ＫＡＴＰ）イオンチャネルのためのオープナーは、ＪＡＫ（ヤヌスキナーゼ）媒介シグナル伝達の活性化物質であり得る。ＪＡＫ及びＳＴＡＴ（シグナル伝達及び転写タンパク質（Signal transduction and transcpription protein））は、成長、生存、分化及び病原体抵抗を調節する、多くのサイトカイン受容体システムの重要な成分である。例えば、ＩＬ−６（又はｇｐ１３０）ファミリーがあり、Ｂ細胞分化、原形質細胞発生（plasmacytogenesis）及び急性期反応を共同規制する。サイトカイン結合は、受容体の二量体化を誘導し、関連するＪＡＫを活性化し、自体と受容体をリン酸化する。受容体とＪＡＫ上のリン酸化部位は、Ｓｔａｔ３等のＳＨ２含有ＳＴＡＴのための、並びにＳＨ２含有タンパク質のための、並びに、ＭＡＰキナーゼ、ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ及び他の細胞経路へ受容体をリンクするアダプタのためのドッキング部位として機能する。
【０２１５】
ヤヌスキナーゼの変異は、ヒトの血液悪性腫瘍における主要な分子の事象である。Ｊａｋ２偽性キナーゼドメイン内で特有の体細胞突然変異（Ｖ６１７Ｆ）は、真性多血症患者の＞９０％で、そして本態性血小板血症、特発性骨髄線維症の患者の大部分で発生している。この変異は、造血前駆細胞の悪性形質転換を導く病的な活性化Ｊａｋ２キナーゼをもたらす。急性巨核芽球性白血病患者の一部に存在するいくつかのＪＡＫ３偽性キナーゼドメインの変異も、ＪＡＫ３恒常的活性を与える。ＪＡＫ１における体細胞の機能獲得型変異は、成人Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病の約２０％に発見されている。
【０２１６】
４９．ＪＡＫ活性化物質：
”ＪＡＫ活性化物質”は、ＪＡＫを活性化する機能を有する任意の分子である。
【０２１７】
５０．ＪＡＫ抑制物質：
”ＪＡＫ抑制物質”は、ＪＡＫを阻害する機能を有する任意の分子である。既知のＪＡＫ抑制物質としては、ＡＧ４９０があるが、これに限定されない。
【０２１８】
５１．ＪＡＫモジュレーター：
”ＪＡＫモジュレーター”は、ＪＡＫ活性を増加又は減少させる、ＪＡＫを調節する機能を有する任意の分子である。既知のＪＡＫモジュレーターとしては、ＡＧ４９０があるが、これに限定されない。
【０２１９】
５２．”分子の存在下”
”分子の存在下”等の用語は、培養された細胞が分子に接触又はさらされていることをいう。当該接触又はさらすことは刺激が細胞に接触する前又は同時に行われ得る。
【０２２０】
５３．”インデックス（Ｉｎｄｅｘ）”
インデックス等の用語はデータの集合をいう。例えば、インデックスは１つ以上の変調プロファイルを含む一覧、表、ファイル、又はカタログであり得る。インデックスはデータの組合せから生成されることもできる。例えば、ＤＭＲプロファイルは、Ｐ−ＤＭＲ、Ｎ−ＤＭＲ、及びＲＰ−ＤＭＲを含み得る。インデックスは、完成したプロファイルのデータ、Ｐ−ＤＭＲデータ、Ｎ−ＤＭＲデータ、ＲＰ−ＤＭＲデータ、これらの任意のデータ点、又はこれら若しくは他のデータの組合せを用いて生成され得る。インデックスはこのような情報の集合である。典型的な場合、インデックスを比較する際のインデックスは同様のデータ（すなわちＰ−ＤＭＲとＰ−ＤＭＲデータ）である。
【０２２１】
ｉ．”バイオセンサーインデックス（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｉｎｄｅｘ）”
”バイオセンサーインデックス”等の用語は、バイオセンサーデータの集合からなるインデックスをいう。バイオセンサーインデックスは、一次プロファイル又は二次プロファイルなどのバイオセンサープロファイルの集合であり得る。当該インデックスは任意の種類のデータを含み得る。例えば、プロファイルのインデックスは、Ｎ−ＤＭＲデータ点、Ｐ−ＤＭＲデータ点、その両方、又はインピーダンスデータ点からなることができる。当該インデックスはプロファイル曲線に関する全てのデータ点であってもよい。
【０２２２】
ｉｉ．”ＤＭＲインデックス”
”ＤＭＲインデックス”等の用語はＤＭＲデータの集合からなるバイオセンサーインデックスをいう。
【０２２３】
５４．”分子の不在と存在下で細胞／マーカーの動態応答”
”分子運動の不在と存在下で細胞／マーカーの応答”等の句は、分子の不在と存在下でマーカーによって誘導される全体のアッセイ又は一部のアッセイの細胞応答の時系列を指し、例えばパターン認識分析を使用して、薬理学や分子の作用形態を調べるために直接使用することができる。
【０２２４】
５５．”既知の分子（Ｋｎｏｗｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）”
既知の分子等の用語は、既知の薬理学的／生物学的／生理学的／病態生理学的な活性を有する分子をいい、その正確な作用モードは既知の場合未知の場合がある。
【０２２５】
５６．”既知のモジュレーター（Ｋｎｏｗｎ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）”
既知のモジュレーター等の用語は、標的の内の少なくとも１つが既知であり既知の親和性を有するモジュレーターをいう。例えば、既知のモジュレーターはβ２−アドレナリン受容体アゴニストであり得る。既知のモジュレーター又はこれと同様の用語は、標的の少なくとも１つが既知の親和性と共に知られているモジュレーターである。例えば、既知のモジュレーターは、ＰＩ３Ｋ抑制物質、ＰＫＡ抑制物質、ＧＰＣＲアンタゴニスト、ＧＰＣＲアゴニスト、ＲＴＫ抑制物質、表皮成長因子受容体中和抗体、ホスホジエステラーゼ抑制物質、ＰＫＣ抑制物質又は活性剤等であってもよい。
【０２２６】
５７．”既知のモジュレーターのバイオセンサーインデックス（Ｋｎｏｗｎ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｉｎｄｅｘ）”
”既知のモジュレーターのバイオセンサーインデックス”等の用語は、既知のモジュレーターに対して収集されたデータによって生成されたモジュレーターのバイオセンサーインデックスをいう。例えば、既知のモジュレーターのバイオセンサーインデックスは、細胞パネル上において作用する既知のモジュレーターのプロファイル、及びマーカーパネルに対する既知のモジュレーターの変調プロファイルからなることができ、各マーカーパネルは細胞パネル内の細胞用である。
【０２２７】
５８．”既知のモジュレーターのＤＭＲインデックス（Ｋｎｏｗｎ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ  ＤＭＲ  ｉｎｄｅｘ）”
”既知のモジュレーターのＤＭＲインデックス”等の用語は、既知のモジュレーターに対して収集されたデータによって生成されたＤＭＲインデックスをいう。例えば、既知のモジュレーターのＤＭＲインデックスは、細胞パネル上において作用する既知のモジュレーターのプロファイル、及びマーカーパネルに対する既知のモジュレーターの変調プロファイルからなることができ、各マーカーパネルは細胞パネル内の細胞用である。
【０２２８】
５９．”リガンド（Ｌｉｇａｎｄ）”
リガンド等の用語は、物質、組成物、又は分子であって、生物学的目的を果たす生体分子に結合して当該分子との錯体を形成することができるものをいう。リガンドとその標的分子との間の実際の不可逆的な共有結合は生物系においては希少である。受容体に結合するリガンドは化学的配座すなわち受容体タンパク質の立体形状を変化させる。受容体タンパク質の配座状態は受容体の機能状態を決定する。結合傾向すなわち結合強度は親和性と呼ばれている。リガンドは、基質、ブロッカー、抑制物質、活性化物質、及び神経伝達物質を含む。放射性リガンドは放射標識付きリガンドであり、一方、蛍光リガンドは蛍光標識付きリガンドであり、その両方は、受容体生物学及び受容体生物化学の研究用のトレーサとしてしばしば使用されるリガンドと考慮されてもよい。リガンドとモジュレーターはほぼ同じ意味で使用される。
【０２２９】
６０．”ライブラリ（Ｌｉｂｒａｒｙ）”
ライブラリ等の用語は集合をいう。ライブラリはここに開示された全てものの集合であり得る。例えば、インデックスの集合であるインデックスライブラリ、プロファイルの集合であるプロファイルライブラリ、ＤＭＥインデックスの集合であるＤＭＲインデックスライブラリ、分子の集合である分子ライブラリ、細胞の集合である細胞ライブラリ、及びマーカーの集合であるマーカーライブラリであってもよい。ライブラリは、例えば、ランダム又は非ランダムのもの、判定された又は未判定のものであってもよい。例えば、ここに開示されているのは既知のモジュレーターのバイオセンサーインデックス又はＤＭＲインデックスのライブラリである。
【０２３０】
６１．肝細胞：
”肝細胞”等の用語は、肝組織から由来するか又は得られた細胞を言う。肝細胞は、原発性肝細胞、肝細胞等Ｃ３Ａ形質転換された肝細胞、及びＦ２Ｎ４細胞等の不死化肝細胞を含むことができる。実施形態では、肝細胞は、繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３等のヘルパー細胞を含むことができる。ヒト又はラットの肝星細胞とクッパー細胞に適したヘルパー細胞の例としては、ＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞、マウス３Ｔ３−Ｊ２の線維芽細胞やヒトの線維芽細胞等の繊維芽細胞を含む。
【０２３１】
６２．”長期間アッセイ”
”長期間アッセイ”などの用語は、生きた細胞上の特定の分子の長期的な影響を研究するために使用される。１つの長期的アッセイの特定のタイプは、”長期的バイオセンサー細胞アッセイ”である。一実施形態では、細胞の各タイプは、長期間（例えば、８時間、１６時間、２４時間、３２時間、４８時間、及び７２時間）、分子にさらされている。この長期間アッセイは、細胞の健康な状態（例えば、生存率、アポトーシス、細胞周期の調節、細胞接着調節、増殖）上の分子の影響を判断するために使用される。また、この長期間アッセイは、事象又はシグナル伝達経路の分子誘導性の細胞を研究するために直接使用することができる初期の細胞シグナル応答（分子刺激後の例えば、３０分、６０分、１２０分、１８０分）が含まれている。
【０２３２】
別の実施形態において、マーカーの存在下での長期間バイオセンサー細胞アッセイは、分子とマーカーの間に細胞生物学、生理学上の長期的な影響のクロスレギュレーションを試験するために使用される。マーカー（群）は、分子にて、分子の後又は前に追加することができる。例えば、マーカー（例えば、Ｈ２Ｏ２）は細胞パネル内の細胞の少なくとも１種類のアポトーシスをトリガしたときに、１分子が保護であるかどうかを決定するためにそのような長期間アッセイを使用することができる。逆に、このような長期的観点アッセイは分子によって誘発される細胞事象（例えば、アポトーシス、又は壊死）に対するマーカーの保護又は相乗的な役割を決定するために用いることができることも事実である。
【０２３３】
６３．”長期的なバイオセンサーシグナル”
”長期的なバイオセンサーシグナルが”長期間アッセイから生産バイオセンサーシグナルである。
【０２３４】
６４．”長期ＤＭＲシグナル”
長期ＤＭＲシグナル等の用語は、長期的な光バイオセンサー、細胞アッセイから生成された光学バイオセンサーシグナルである。
【０２３５】
６５．”マーカー（Ｍａｒｋｅｒ）”
マーカー等の用語は、バイオセンサーの細胞アッセイにおけるシグナルを生成するリガンドをいう。さらに、当該シグナルは、少なくとも１つの特定の細胞シグナル伝達経路及び／又は少なくとも１つの特定の標的介した少なくとも１つの特定の細胞プロセスの特性でなければならない。当該シグナルは、ポジティブ若しくはネガティブ、又はその組合せ（振動）であり得る。
【０２３６】
６６．”マーカーパネル（Ｍａｒｋｅｒ  ｐａｎｅｌ）”
”マーカーパネル”等の用語は、少なくとも２つのマーカーを含むパネルをいう。当該マーカーは異なる経路、同一の経路、異なる標的、又は同一の標的に対するものであり得る。
【０２３７】
６７．”マーカーバイオセンサーインデックス”
”マーカーバイオセンサーインデックス”等の用語は、マーカーに対して収集されたデータによって生成されたバイオセンサーインデックスをいう。例えば、マーカーバイオセンサーインデックスは、細胞のパネル上で作用するマーカーのプロファイル、及びマーカーパネルに対するマーカーの変調プロファイルからなることができ、各マーカーパネルは細胞パネルにおける細胞用である。
【０２３８】
６８．”マーカーＤＭＲインデックス”
”マーカーＤＭＲインデックス”等の用語は、マーカーに対して収集されたデータによって生成されたバイオセンサーのＤＭＲインデックスをいう。例えば、マーカーＤＭＲインデックスは、細胞パネル上で作用するマーカーのプロファイル、及びマーカーパネルに対するマーカーの変調プロファイルからなることができ、各マーカーパネルは細胞パネルにおける細胞用である。
【０２３９】
６９．”材料”
材料は、物理的な対象の組織に入る何か（化学的なものであるか、生化学的なものであるか、生物学的なものであるか又はそれらを混合したもの）の現実の一部である。
【０２４０】
７０．”媒体”
媒体は、細胞が培養されることができるいかなる混合物でもある。細胞増殖培養液は、微生物又は細胞が培養を経験する対象である。
【０２４１】
７１．”模倣する（Ｍｉｍｉｃ）”
本明細書で使用されている”模倣する”等の用語は、対象となる客体物の１つ以上の機能を実行することをいう。例えば、分子模倣体は分子の１つ以上の機能を実行する。
【０２４２】
７２．”変調する（Ｍｏｄｕｌａｔｅ）”
変調すること又はその変形は、細胞標的を介した細胞活性を増大、減少、又は維持することを意味する。これらの単語の内の１つが使用されている場合、コントロールから１％、５％、１０％、２０％、５０％、１００％、５００％、若しくは１０００％増加する、又はコントロールから１％、５％、１０％、２０％、５０％、若しくは１００％減少し得ることが開示されているものとする。
【０２４３】
７３．”モジュレーター（Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）”
モジュレーター等の用語は、細胞標的の活性を制御するリガンドをいう。モジュレーターは標的タンパク質などの細胞標的に結合するシグナル変調分子である。
【０２４４】
７４．”変調比較（Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）”
”変調比較”等の用語は、一次プロファイル及び二次プロファイルを正規化した結果をいう。
【０２４５】
７５．”変調プロファイル（Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅ）”
”変調プロファイル”等の用語は、分子の存在下におけるマーカーの二次プロファイルと分子の非存在下におけるマーカーの一次プロファイルとの間の比較をするものである。当該比較物は、例えば、二次プロファイルから一次プロファイルを差し引くこと又は一次プロファイルから二次プロファイルを差し引くこと、すなわち一次プロファイルに対して二次プロファイルを正規化することによるものである。
【０２４６】
７６．”モジュレーターのバイオセンサーインデックス（Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｉｎｄｅｘ）”
”モジュレーターのバイオセンサーインデックス”等の用語は、モジュレーターに対して収集されたデータによって生成されたバイオセンサーインデックスをいう。例えば、モジュレーターのバイオセンサーインデックスは、細胞パネル上で作用するモジュレーターのプロファイル、及びマーカーパネルに対するモジュレーターの変調プロファイルからなることができ、各マーカーパネルは細胞パネルにおける細胞用である。
【０２４７】
７７．”モジュレーターのＤＭＲインデックス（Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ  ＤＭＲ  ｉｎｄｅｘ）”
”モジュレーターのＤＭＲインデックス”等の用語は、モジュレーターに対して収集されたデータによって生成されたＤＭＲインデックスをいう。例えば、モジュレーターのＤＭＲインデックスは、細胞パネル上で作用するモジュレーターのプロファイル、及びマーカーパネルに対するモジュレーターの変調プロファイルからなることができ、各マーカーパネルは細胞パネルにおける細胞用である。
【０２４８】
７８．”マーカーのバイオセンサーシグナルを変調する（Ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｓｉｇｎａｌ  ｏｆ  ａ  ｍａｒｋｅｒ）”
”マーカーのバイオセンサーシグナルを変調する”等の用語は、マーカーを用いた刺激に対する細胞のバイオセンサーシグナル又はプロファイルの変化を引き起こすことをいう。
【０２４９】
７９．”ＤＭＲシグナルを変調する（Ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  ＤＭＲ  ｓｉｇｎａｌ）”
”ＤＭＲシグナルを変調する”等の用語は、マーカーを用いた刺激に対する細胞のＤＭＲシグナル又はプロファイルの変化を引き起こすことをいう。
【０２５０】
８０．”分子”
本明細書で使用されている”分子”等の用語は、生物学的、生物化学的、又は化学的存在であって、確定的な分子量を有する分子又は化学分子の形態をとって存在するものをいう。分子等の用語は、化学的、生物化学的、又は生物学的分子をいい、そのサイズは問わない。
【０２５１】
いくつかの分子は炭素を含まない（酸素分子などの単純な気体分子及びいくつかの硫黄ベースのポリマーなどのより複雑な分子を含む）が、多くの分子は有機分子と呼ばれる形態をとるもの（炭素原子を含む分子であり、特に共有結合によって接続されているもの）である。一般用語の”分子”は、タンパク質、核酸、炭水化物、ステロイド、有機薬剤、小さな分子、受容体、抗体、及び脂質などの分子における多数の記述的クラス又はグループを含む。適切な場合は、１つ以上のこれらのより記述的な用語（タンパク質などの多くのものは分子のグループと重複して記載されている）が、分子のサブグループに対する本方法の用途のために、分子がタンパク質などのサブクラスと一般クラスとしての”分子”との両方を示すことなく、本明細書において使用される。明記されない限り、単語”分子”は、特定の分子及びその塩（例えば薬剤学的に許容できる塩）を含む。
【０２５２】
８１．”分子混合物（Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍｉｘｔｕｒｅ）”
分子混合物等の用語は、少なくとも２つの分子を含む混合物をいう。当該２つの分子は、構造的に異なるもの（すなわち光学異性体（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ））、組成的に異なるもの（例えば、プロテインアイソフォーム、グリコフォーム、又は異なるポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）の変形物を有する抗体など）、又は構造的及び組成的に異なるもの（例えば、未浄化の天然抽出物又は未浄化の合成化合物）であり得るが、これらに限定されない。
【０２５３】
８２．”分子のバイオセンサーインデックス（Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｉｎｄｅｘ）”
”分子のバイオセンサーインデックス”等の用語は、分子に対して収集されたデータによって生成されたバイオセンサーインデックスをいう。例えば、分子のバイオセンサーインデックスは、細胞パネル上で作用する分子のプロファイル、及びマーカーパネルに対する分子の変調プロファイルからなることができ、各マーカーパネルは細胞パネルにおける細胞用である。
【０２５４】
８３．”分子のＤＭＲインデックス（Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＤＭＲ  ｉｎｄｅｘ）”
”分子のＤＭＲインデックス”等の用語は、分子に対して収集されたデータによって生成されたＤＭＲインデックスをいう。例えば、分子のＤＭＲインデックスは、細胞パネル上で作用する分子のプロファイル、及びマーカーパネルに対する分子の変調プロファイルからなることができ、各マーカーパネルは細胞パネルにおける細胞用である。
【０２５５】
８４．”分子インデックス（Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｄｅｘ）”
”分子インデックス”等の用語は分子に関するインデックスをいう。
【０２５６】
８５．”分子処理された細胞（Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｃｅｌｌ）”
分子処理された細胞等の用語は、分子にさらされた細胞をいう。
【０２５７】
８６．”分子変調インデックス（Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ）”
”分子変調インデックス”等の用語は、細胞パネル上で作用するマーカーパネルのバイオセンサー出力シグナルを変調する分子の能力を表示するインデックスをいう。当該変調インデックスは、分子の存在下におけるマーカーを用いた刺激の際の細胞応答の特定のバイオセンサー出力シグナルのパラメータを、分子の非存在下におけるものに対して正規化することによって生成される。
【０２５８】
８７．”分子薬理（Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）”
”分子薬理”等の用語は、システム細胞生態（ｓｙｓｔｅｍｓ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ）又はシステム細胞薬理（ｓｙｓｔｅｍｓ  ｃｅｌｌ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）をいい、すなわち細胞上で作用する分子の作用モードである。分子薬理は、毒性、特定の細胞プロセス（例えば、増殖、分化、活性酸素種シグナル伝達）に影響を与える能力、又は特定の細胞標的（例えば、ＫＡＴＰチャネル、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＰＫＧ、ＪＡＫ２、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ２、若しくはアクチン）を修飾する能力（これらに限定されない）によってしばしば特性化される。
【０２５９】
８８．”生来細胞”
天然の細胞は、遺伝子工学によらなかったいかなる細胞でもある。天然の細胞は一次細胞、不滅にされた細胞、形質転換細胞株、幹細胞、又は、幹細胞を誘導した細胞であり得る。
【０２６０】
８９．通常のＫＡＴＰ経路細胞株：
通常のＫＡＴＰ経路細胞株は、ＫＡＴＰ経路が規制緩和されていない、よって、構成的に活性化されていない細胞株である。しかし、かかる細胞株は依然としてＫＡＴＰ経路の恒常的活性化を導くことができない特定のタンパク質変異体を含むことができる。
【０２６１】
９０．”正規化すること（Ｎｏｒｍａｌｉｚｉｎｇ）”
正規化すること等の用語は、例えば少なくとも１つの共通変数を除去するために、データ、プロファイル、又は応答を調節することを意味する。例えば、２つの応答が生成され、その一方が細胞上で作用するマーカーに対するものであり、他方が細胞上で作用するマーカー及び分子に対するものである場合、正規化することとは、分子の非存在下におけるマーカー誘発された応答と分子の存在下における当該応答とを比較してマーカーのみによる応答を除去することをいい、これによって正規化された応答はマーカーに対する分子の変調による応答を示すこととなる。変調比較はマーカーの一次プロファイル及び分子の存在下におけるマーカーの二次プロファイル（変調プロファイル）を正規化することによって得られる。
【０２６２】
９１．非ウイルス性感染症：
”非ウイルス性感染症”等の用語は、細胞が細菌や寄生虫等のウイルスではない生物に感染した状態を言う。これは、細胞がウイルス以外の生物で汚染された状態を意味する。
【０２６３】
９２．”任意の（Ｏｐｔｉｏｎａｌ）”
”任意の”、”任意で”等の用語は、その後に記載されている事象又は状況が発生する場合と発生しない場合があることを意味し、かつ当該記載が当該事象又は状況の発生する例と発生しない例とを含むことを意味する。例えば、”任意で組成物は組合せを含む”との表現は、当該組成物が異なる分子の組合せを含む場合と組合せを含まない場合とがあることを意味し、この表現は当該組合せと当該組合せではないこと（すなわち当該組合せの個別のメンバー）との両方を含む。
【０２６４】
９３．”又は”
本明細書で使用されている”又は”等の用語は、特定の一覧の中の１のメンバー及び当該一覧のメンバーの任意の組合せを含むことを意味する。
【０２６５】
９４．”パネル（Ｐａｎｅｌ）”
パネル等の用語は、所定の組の試料（例えば、マーカー、細胞、又は経路）をいう。パネルはライブラリから試料を選定して作成され得る。
【０２６６】
９５．”パニング”
パニング等の用語は、一つ以上の受容体又は細胞標的の存在のための一つ細胞又は細胞群をスクリーニングすることを意味する。
【０２６７】
９６．経路：
本明細書で使用される経路は、細胞内で起こる化学反応の一連である。経路内において、１つの分子又は物質は修飾されて他の分子又は物質に導かれてなり、そして調節される。しばしば、キナーゼ等の酵素は、これらの修飾に関与している。経路は、細胞内だけでなく、細胞小器官から細胞小器官に、細胞表面から核に発生する、又は細胞質から細胞小器官や細胞小器官への細胞質に生じ得る。修飾や調節は、化学的（例えば、リン酸化）又は物理的（ある場所から別の場所への例えば、転座）なものが含まれる。
【０２６８】
９７．”期間”
”期間”は、時間の経過を表している任意の期間をいう。例えば、１秒、１分、１時間、１日及び１週は、全ての期間である。
【０２６９】
９８．”プロファイル”
プロファイル等の用語は、細胞等の組成物に対して収集されたデータをいう。プロファイルは、本明細書において説明されているように、無標識バイオセンサーから収集され得る。
【０２７０】
ｉ．”一次プロファイル（Ｐｒｉｍａｒｙ  ｐｒｏｆｉｌｅ）”
”一次プロファイル”等の用語は、バイオセンサー応答又はバイオセンサー出力シグナルであり、すなわち分子が細胞に接触した際に得られたプロファイルをいう。典型的な場合、一次プロファイルは、最初の細胞応答を正味ゼロ（すなわち基準線）のバイオセンサーシグナルに対して正規化した後に得られる。
【０２７１】
ｉｉ．”二次プロファイル（Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｐｒｏｆｉｌｅ）”
”二次プロファイル”等の用語は、分子の存在下におけるマーカーに対する細胞のバイオセンサー応答又はバイオセンサー出力シグナルをいう。二次プロファイルは、マーカー誘発された細胞応答すなわちバイオセンサー応答を変調する分子の能力を示すものとして使用されることができる。
【０２７２】
ｉｉｉ．”変調プロファイル（Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅ）”
”変調プロファイル”等の用語は、分子の存在下におけるマーカーの二次プロファイルと分子の非存在下におけるマーカーの一次プロファイルとの間の比較をするものである。当該比較物は、例えば、二次プロファイルから一次プロファイルを差し引くこと又は一次プロファイルから二次プロファイルを差し引くこと、すなわち一次プロファイルに対して二次プロファイルを正規化することによるものである。
【０２７３】
９９．”正のコントロール（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）”
”正のコントロール”等の用語は、データ収集条件がデータ収集を導き得ることを示すコントロールをいう。
【０２７４】
１００．”刺激後”
”刺激後”等の用語、細胞アッセイにおける分子と細胞の刺激後の時間をいう。
【０２７５】
１０１．潜在的ＫＡＴＰ抑制物質：
潜在的ＫＡＴＰ抑制物質は、分子が本明細書で説明として既知ＫＡＴＰ抑制物質に類似していると判定された任意の分子である。既知のＫＡＴＰ抑制物質としてはスルホニル尿素があるが、これに限定されない。既知ＫＡＴＰ抑制物質は、比較のために参照する分子として用いることができる。
【０２７６】
１０２．潜在的ＫＡＴＰモジュレーター：
”潜在的ＫＡＴＰモジュレーター”は、任意の分子、化合物又は同様アッセイにおけるＫＡＴＰ修飾薬に機能が本明細書に開示されている組成物である。
【０２７７】
１０３．潜在的Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）抑制物質
潜在的Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）抑制物質は、分子が本明細書に記載した既知ＲＯＣＫ抑制物質に類似していると判定された任意の分子である。既知のＲＯＣＫ抑制物質Ｙ２７６３２、Ｈ−８９、Ｈ−８が含まれるが、これらに限定されない。
【０２７８】
１０４．ＫＡＴＰ抑制物質及び既知のＫＡＴＰ抑制物質：
ＫＡＴＰ抑制物質は、ＫＡＴＰの抑制物質であることが決定されている任意の分子である。既知のＫＡＴＰ抑制物質としては、スルホニル尿素、これらに限定されない。既知ＫＡＴＰ抑制物質は、比較のために参照する分子として用いることができる。
【０２７９】
１０５．ＫＡＴＰ細胞株：
” ＫＡＴＰ細胞株”等の用語は、少なくとも１つのＫＡＴＰチャネルを発現する細胞の種類をいう。ＫＡＴＰ細胞株の非限定的な例は、ＨｅｐＧ２又はＨｅｐＧ２Ｃ３Ａである。ｍｉｔｏＫＡＴＰ等の用語は、ミトコンドリアにおけるＫＡＴＰを言うとを理解されている。
【０２８０】
１０６．ＫＡＴＰ抑制物質：
”ＫＡＴＰ抑制物質”は、ＫＡＴＰチャネルを開放から抑制する機能を有する任意の分子、化合物、又は組成物である。
【０２８１】
１０７．ＫＡＴＰモジュレーター：
” ＫＡＴＰモジュレーター”は、ＫＡＴＰチャネルを開く又は開口から抑制する、ＫＡＴＰチャネルを調節する機能を有する任意の分子、化合物、又は組成物である。
【０２８２】
１０８．カリウムチャネルオープナー（ＫＣＯ）：
”カリウムチャネルオープナー”は、ＫＡＴＰチャネルを開く機能を有する任意の分子、化合物、又は組成物である。
【０２８３】
１０９．”増強する（Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅ）”
増強する、増強された等の用語は、分子によって引き起こされた細胞内のマーカーのバイオセンサー応答の特定のパラメータを増大することをいう。分子の存在下における同一の細胞内におけるマーカーの二次プロファイルと同一のマーカーの一次プロファイルとを比較することによって、当該分子による細胞のマーカー誘発されたバイオセンサー応答の変調を計算することができる。ポジティブな変調は、マーカーに誘発されたバイオセンサーシグナルを増大させる分子を意味する。
【０２８４】
１１０．”プロファイル”
プロファイル等の用語は、細胞等の組成物に対して収集されたデータをいう。プロファイルは、本明細書において説明されているように、無標識バイオセンサーから収集され得る。
【０２８５】
１１１．”パルス刺激アッセイ”
”パルス刺激アッセイ”等の用語は、細胞が非常に短い時間（例えば、数秒又は数分）だけ分子にさらされている場合に、使用され得る。このパルス刺激アッセイは、細胞／標的に作用する分子の動態を研究するのと同様に、マーカーによって誘発されるバイオセンサーシグナルへの影響を研究するために使用することができる。パルス刺激アッセイは、単に分子を添加した直後、所定の時間で液体ハンドリング装置によって細胞アッセイバッファ溶液で分子溶液を交換することにより行うことができる。
【０２８６】
１１２．”効力（Ｐｏｔｅｎｃｙ）”
効力等の用語は、所定の強度の効果を得るのに必要な量で表された分子活性の測定結果をいう。効力は親和性及び効能に比例する。親和性は受容体に結合する薬物分子の能力である。
【０２８７】
１１３．”刊行物”
本願を通して、様々な刊行物が参照されている。これら刊行物の開示内容は、当該技術分野の状況をより完全に説明するために、その全てにおいて、参照することにより本願に組み込まれているものとする。開示された参照物は、当該参照物の属する文中において記載されている材料においても、個別かつ詳細に参照することにより本明細書に組み込まれているものとする。
【０２８８】
１１４．”パルス刺激アッセイ”
”パルス刺激アッセイ”等の用語は、細胞が非常に短い時間（例えば、数秒又は数分）だけ分子にさらされている場合に、使用され得る。このパルス刺激アッセイは、細胞／標的に作用する分子の動態を研究するのと、同様に、マーカーによって誘発されるバイオセンサーシグナルへの影響を研究するために使用することができる。パルス刺激アッセイは、単に分子を添加した直後、所定の時間で液体ハンドリング装置によって細胞アッセイバッファ溶液で分子溶液を交換することにより行うことができる。
【０２８９】
１１５．”範囲（Ｒａｎｇｅｓ）”
範囲は、１の”約”に修飾された特定の値から、及び／又は他の”約”に修飾された特定の値まで、として本明細書において表現されることができる。このように範囲が表現された場合、他の実施例は、一方の特定の値から他方の特定の値までか、一方の特定の値以上か、又は他方の特定の値以下を含む。同様に、値が、先行詞”約”を使用することによって、近似値として表現された場合、この特定の値は他の実施例を形成する。さらに、当該範囲の終点の各々は、その他の終点に関連してかつ当該他の終点とは独立して重要なものである。さらに、本明細書には多数の値が開示されており、当該値の各々は、その値に加えて”約”に修飾された特定の値として本明細書に開示されているものとする。例えば、値”１０”が開示されているならば、”約１０”も開示されているものとする。さらに、当業者に適切に理解されるように、１の値が当該値”以下”と開示されている場合、”当該値以上”及びその値間の可能な範囲も開示されているものとする。例えば、値”１０”が開示されているならば、”１０以下”及び”１０以上”も開示されているものとする。さらに、本願を通して、データは多数の異なる形式で与えられており、このデータは、終点、始点、及び当該データ点の任意の組合せを表すものであるとする。例えば、特定のデータ点”１０”及び特定のデータ点１５が開示されているならば、１０より大きい、１５より大きい、１０以上、１５以上、１０未満、１５未満、１０以下、１５以下、１０、及び１５が１０と１５との間と同様に考慮され開示されているものとする。さらに、２つの特定の単位間の各単位も開示されているものとする。例えば、１０及び１５が開示されているならば、１１、１２、１３、及び１４も開示されているものとする。
【０２９０】
１１６．”受容体（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）”
受容体等の用語は、細胞の原形質膜又は細胞質に組み込まれているタンパク質分子であって、可動性のシグナル伝達分子（又は”シグナル”分子）が結合し得るものをいう。受容体に結合する分子は”リガンド”と呼ばれ、ペプチド（神経伝達物質など）、ホルモン、調合薬、又は毒素であることができ、さらに受容体は、当該結合が起きた際に、通常は細胞応答を開始する構造変化に進入する。しかし、いくつかのリガンドは応答を誘発することなく受容体を遮断するのみである（例えばアンタゴニスト）。受容体におけるリガンド誘発変化は、当該リガンドの生物学的活性を構成する生理学的変化を引き起こす。
【０２９１】
１１７．”豊富なバイオセンサーシグナル（Ｒｏｂｕｓｔ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｓｉｇｎａｌ）”
”豊富なバイオセンサーシグナル”はバイオセンサーシグナルであって、その振幅がノイズレベル又はネガティブコントロール応答よりも十分に（例えば、３倍、１０倍、２０倍、１００倍、又は１，０００倍）大きいシグナルである。しばしば、当該ネガティブコントロール応答はアッセイバッファ溶液（すなわち賦形剤）を加えた後の細胞のバイオセンサー応答である。当該ノイズレベルは他の溶液を加えない場合の細胞のバイオセンサーシグナルである。細胞が他の溶液を加える前から溶液に浸されているのは影響しない。
【０２９２】
１１８．”豊富なＤＭＲシグナル（Ｒｏｂｕｓｔ  ＤＭＲ  ｓｉｇｎａｌ）”
”豊富なＤＭＲシグナル”等の用語は”豊富なバイオセンサーシグナル”のＤＭＲの形態をとったものをいう。
【０２９３】
１１９．Ｒｈｏ媒介シグナル伝達：
Ｒｈｏ媒介シグナル伝達は、Ｒｈｏキナーゼと相互作用する分子又は物質の上流又は下流の任意のシグナル伝達を言う。ピナシジル等の内因性ＡＴＰ感受性カリウム（ＫＡＴＰ）イオンチャネルのためのオープナーは、Ｒｈｏ媒介シグナル伝達の活性化物質であり得る。
【０２９４】
１２０．Ｒｈｏキナーゼ抑制物質：
Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）抑制物質は、例えば、Ｙ−２７６３２等のＲｈｏキナーゼ、ＲＯＣＫキナーゼ抑制物質ＩＩＩＲＯＣＫｏｕｔ、Ｒｈｏキナーゼ抑制物質、ＩＶ、Ｈ８９、Ｈ８ファミリーを阻害することが決定されている任意の分子又は物質である。
【０２９５】
１２１．ＲＯＣＫ抑制物質応答性細胞株
ＲＯＣＫキナーゼ抑制物質応答性細胞株は、既知のＲＯＣＫ抑制物質によるＲＯＣＫの基礎活性を阻害するが、細胞内で検出可能なバイオセンサーシグナルを導く任意の細胞株である。例えば、Ａ５４９はまた、ＲＯＣＫ抑制物質応答性細胞株である。Ｋ−ＲＡＳ変異体を活性化する存在に起因したＡ５４９、規制緩和ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ活性が含まれて刺激されていない。ＲＯＣＫはＰＩ３Ｋの下流標的である。したがって、Ｙ２７６３２又はＨ８９等の既知ＲＯＣＫ抑制物質によるＲＯＣＫの阻害基礎活性は、Ａ５４９細胞における豊富なＤＭＲシグナルを導き得る。
【０２９６】
１２２．ＲＯＣＫ抑制物質：
”ＲＯＣＫ抑制物質”は、ＲＯＣＫを阻害する機能を有する任意の分子である。既知ＲＯＣＫ抑制物質としては、Ｙ２７６３２、Ｈ−８９、Ｈ−８があるが、これらに限定されない。
【０２９７】
１２３．ＲＯＣＫモジュレーター：
”ＲＯＣＫモジュレーター”は、ＲＯＣＫ活性を増加又は減少させる、ＲＯＣＫを調節する機能を有する任意の分子である。有名なＲＯＣＫモジュレーターとしてはＹ２７６３２、Ｈ−８９、Ｈ−８があるが、これらに限定されない。
【０２９８】
１２４．”応答（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）”
”応答”等の用語は刺激に対する反応をいう。
【０２９９】
１２５．”サンプル（Ｓａｍｐｌｅ）”
サンプル又はこれと同様の用語は動物、植物、真菌などであって、天然物、天然抽出物等、動物由来の組織若しくは器官、細胞（対象物内のもの、対象物から直接取出したもの、又は培養状態を維持している細胞若しくは培養された細胞株由来の細胞）、細胞溶解物（又は溶解物の一部）若しくは細胞抽出物、又は細胞若しくは細胞材料（例えば、ポリペプチド又は核酸）から派生した１つ以上の分子を含む溶液をいい、これらは本明細書に記載されているようにアッセイされる。サンプルは体液又は排出物（例えば、血液、尿、便、唾液、涙、胆汁であるがこれらに限定されない）であって細胞又は細胞成分を含むものであってもよい。
【０３００】
１２６．”媒体を含んでいる血清”
媒体を含んでいる血清などの用語は、血清（例えばウシ胎児血清）を含むあらゆる細胞培地である。Ｆｅｔａｌウシ血清（又はウシ胎仔血清）は、血漿タンパクフィブリノーゲンがフィブリンに変わって、クロットに残るプロセスである血液の凝析の後に残るプラズマの一部であること。ウシ胎児血清はウシの胎児の血液から調製された血清であり、ウシの胚から引き出される血液から由来する。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）は抗体において低くて、より多くの増殖因子を含むことのために最も広く使われている血清であり、そして、多くの異なる応用の可転性を考慮に入れる。ＦＢＳが、真核細胞を培養する際に使われる。
【０３０１】
１２７．”血清枯渇媒体”
血清枯渇媒体は、血清を含まない細胞培地である。
【０３０２】
１２８．”短い期間”
”短い期間”等の用語は、基準培養の下の細胞の重複より概して短い時間である。
【０３０３】
１２９．”短期アッセイ”
”短期アッセイ”などの用語は、生きた細胞上の特定の分子の短期的な影響を研究するために使用される。短期アッセイの特定のタイプは、”短期的なバイオセンサー細胞アッセイ”である。一実施形態では、細胞の各タイプは、時間の短い期間（例えば、５分、１０分、３０分、４５分、６０分、９０分、１８０分、２４０分）の分子にさらされている。この短期的なアッセイは、しばしば分子が誘導する細胞シグナリング事象又は経路を研究し、マーカー誘発細胞応答を調節する分子の能力を研究するために直接使用することができる初期の細胞シグナル応答を検出するために使用される。
【０３０４】
１３０．シグナル伝達：
シグナル伝達は、経路内の他の分子又は物質の他の変性をもたらす、経路内の１の分子又は物質の変性をいう。
【０３０５】
１３１．”シグナル伝達経路”
”定義された経路を”等の用語は、シグナル（例えば外因のリガンド）を受信することから細胞の応答（例えば細胞標的の発現増大）までの細胞の経路である。場合によっては、受容体に結合するリガンドによって生じる受容体活性化は、リガンドに対する細胞応答に直結する。例えば、ＫＣＯ、ピナシジルは、イオンチャネルの部分である細胞表面受容体を活性化することができる。ＫＡＴＰチャネルに結合するピナシジルは、当該受容体の一部であるカリウム選択性イオンチャネルを開く。ＫＡＴＰ活性化は、負の電荷を帯びたカリウムイオンが、細胞へ進入して、チャネルが存在する細胞に応じて様々な作用を促進することを可能にする。しかし、多くの細胞表面受容体において、リガンド−受容体相互作用は細胞の応答に直結していない。活性化された受容体は、細胞の挙動におけるリガンドの最終的な生理学的効果が生成される前に、まず細胞内部の他のタンパク質と相互作用しなければならない。しばしば、いくつかの相互作用する細胞タンパク質の鎖の挙動は受容体の活性化に従って変更される。受容体活性化によって誘発された細胞変化のすべてのセットはシグナル伝達機序すなわちシグナル伝達経路と呼ばれる。当該シグナル伝達経路は比較的単純であるか、又は非常に複雑であるかである。
【０３０６】
１３２．インデックスの類似性：
”インデックスの類似性”又はこれと同様の用語は、２つのインデックス又は少なくとも３つのインデックスの類似性を表す用語であり、１つは分子に関し、インデックスのパターンに基づきかつ／又はスコアのマトリクスに基づいている。スコアのマトリクスは、対応する細胞内の異なった分子の一次プロファイルのシグネチャ（signature）、及びマーカーの各々に対する異なった分子の変化プロファイルの特性及び割合等のそれらの対照部分（counterpart）に強く関連している。例えば、より高いスコアがより類似している特性に与えられ、より低いか又は負のスコアが非類似な特性に与えられる。分子変化インデックスにあるのは、変化の３つのタイプ、ポジティブ（正）、ネガティブ（負）及びニュートラルのみであるので、類似性マトリクスは比較的単純である。例えば、単純なマトリクスは、同一の変化（例えば、ポジティブ変化）に＋１のスコアを付与し、非類似の変化に−１のスコアを付与する。
【０３０７】
代替的に、異なったスコアが異なった基準を用いて変化のタイプに与えられ得る。例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、１００％、２００％等のポジティブ変化に、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋１０、＋２０のスコアが対応して与えられ得る。反対に、ネガティブ変化対しては、同様であるが反対符号のスコアが与えられ得る。
【０３０８】
１３３．”安定した（Ｓｔａｂｌｅ）”
医薬組成物に関して使用される場合、”安定した”等の用語は、当業者の間では、特定の保存条件下での所定期間の活性材料の喪失が特定の量未満、通常は１０％未満であることを意味する。組成物が安定していると考慮されるのに必要な時間は、製品の用途に関係しており、かつ製品の生産、品質管理及び検査のための保管、最終的な使用の前に再度保管される卸売業者への輸送又は消費者への直接の輸送における商業的実用性によって定められる。数ヶ月の安全率を含めると、医薬品の最低製品寿命は通常１年であり、１８ヶ月よりも長いのが好ましい。本明細書で使用されている用語”安定した”は、これら市場の実情と、２度から８度の間の冷蔵状態などの容易に達成可能な環境条件で製品を保管及び輸送する能力と、を考慮している。
【０３０９】
１３４．”物質（Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）”
物質等の用語は任意の物理的客体物をいう。材料は物質である。分子、リガンド、マーカー、細胞、タンパク質、及びＤＮＡは物質と考えられる。機械又は製品は、物質そのものではなく、物質から作られているものと考えられる。
【０３１０】
１３５．”対象物（Ｓｕｂｊｅｃｔ）”
本明細書を通して使用されている対象物等の用語は固体を意味する。従って、”対象物”は、例えば、犬、猫などの家畜化された動物、家畜類（牛、馬、豚、羊、ヤギなど）、実験動物（マウス、ウサギ、ラット、モルモットなど）、哺乳類、ヒト以外の哺乳類、霊長類、ヒト以外の霊長類、齧歯動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、及び他の動物を含むことができる。１つの対象物の態様は、霊長類又はヒトなどの哺乳類である。対象物はヒト以外であってもよい。
【０３１１】
１３６．懸濁細胞：
”懸濁細胞”は、好ましくは細胞が付属しないか又は培養の間、基質の表層に付着しない媒体で培養される細胞又は細胞株を意味する。しかし、懸濁細胞は、一般に、化学的（例えば、共有結合不略又は抗体−細胞表面受容体相互作用）、又は物理的手段（例えば、重力の力によるバイオセンサーが包埋されるウェルの底へ沈降によって、バイオセンサー表面に接触させることができる。このように、懸濁細胞がまた、バイオセンサー細胞の分析のために使われることができる。
【０３１２】
１３７．”試験分子”
試験分子等の用語は、当該試験分子に関するいくつかの情報を得る手法において使用される分子をいう。試験分子は未知の分子又は既知の分子であることができる。
【０３１３】
１３８．”処理・治療すること（Ｔｒｅａｔｉｎｇ）”
処理すること、処理等の用語は少なくとも２つの意味で使用されることができる。第１に、処理すること、処理等の用語は投与すなわち対象物に向けてとられる行為をいう。第２に、処理すること、処理等の用語は２つのものを混合することをいい、当該２つのものは例えば分子及び細胞などの２つ以上の物質である。この混合は、当該少なくとも２つの物質を接触し得る状態にさせる。例えば、”細胞を処理して高い密集度を達成する”は、細胞が密集度に達するように細胞を世話又は操作することを意味する。
【０３１４】
治療、処置等の用語が疾病に関する文脈において使用される場合、これらは例えば治癒又は症状の軽減を暗示するものではない。治療学的用語又はこれと同様の用語が治療すること、治療等の用語に伴って使用される場合、基礎疾患の症状が軽減すること及び／又は基礎的な１つ以上の細胞的原因、生理学的原因、若しくは生物化学的原因、若しくは症状を起こす機序が軽減されることを意味する。この文脈において使用される軽減とは、単に疾病の生理学的状態だけでなく、疾病の分子状態を含む疾病の状態が比較的低減されることを意味すると、理解される。
【０３１５】
１３９．”トリガ（Ｔｒｉｇｇｅｒ）”
トリガ等の用語は応答などの事象を起こす又は開始する動作や作用をいう。
【０３１６】
１４０．”未知分子”
未知の分子等の用語は、未知の生物学的、薬理学的、生理学的、病態生理学的な活性を有する分子である。
【０３１７】
１４１．”値（Ｖａｌｕｅｓ）”
組成物、要素、添加物、細胞型、マーカーなどの態様及びそれらの範囲のために開示された特定かつ好ましい値は、説明のためだけのものであり、それらは、定義された他の値又は定義された範囲中の他の値を除外するものではない。本開示の組成物、装置及び方法は、それらが有するどんな値又は値のどんな組み合わせ、特定の値、さらなる特定の値及びここに開示された好ましい値のものも含む。
【０３１８】
従って、ここに開示された方法、組成物、製品及び機械は、本明細書に記載された様々な成分、ステップ、分子及び組成物等を含み、これらで構成され、又は本質的にこれらで構成されるような態様にて結合され得る。それらは、例えば、ここに定義したようなリガンドを含む分子を特性化する方法、ここに定義したようなインデックスを生成する方法、又は、ここに定義したような創薬の方法において使われることができる。
【０３１９】
１４２．ウイルス感染：
”ウイルス感染”等の用語は、細胞がウイルスに感染した状態をいう。これは、細胞がウイルスに汚染された状態を意味する。
【０３２０】
Ｄ．例：
１．実験手順（例１−５）：
ｉ．試薬：
キナーゼ抑制物質ライブラリ、イオンチャネルモジュレーターライブラリ及びラトランクリンＡはBIOMOL InternationalＬＰ社（プリマスミーティング、ペンシルバニア州）から購入し、これらを除いて、すべての化合物はSigma-Aldrich社から購入した。細胞培養試薬はすべてＧＩＢＣＯ細胞培養製品から購入した。
【０３２１】
ｉｉ．細胞培養：
すべての細胞株はＡＴＣＣから購入し、ＡＴＣＣの指示に従って維持された。細胞は、ＡＴＣＣの指示に従って週１−２回に継代培養した。１５未満の継代細はすべての実験に使用した。
【０３２２】
ｉｉｉ．ＲＴ−ＰＣＲ：
ＨｅｐＧ２Ｃ３Ａ細胞の総ＲＮＡは、Qiagen社からのＲＮｅａｓｙキット（Ｃａｔ＃７５１４４）を用いて、細胞（１５〜３０万個の細胞）の集約的な単層で１つのＴ−７５フラスコから抽出された。全ＲＮＡ抽出の可能なＤＮＡ混入は、ＲＮａｓｅフリーのＤＮａｓｅセット（Ｃａｔ＃７９２５４、Qiagen社）を用いて消化された。ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマー配列はAm. J. Respir. Cell Mol. Biol.(2002) 26:135-143及びFASEB J.(1999)13:1833-1838からのものであった。全てのプライマーは、Sigma-Aldrich社によって合成された。ＲＴ−ＰＣＲは、Qiagen社からのワンステップＲＴ−ＰＣＲキット（Ｃａｔ＃２１０２１２）を用いて行った。ＰＣＲ条件は以下の通りであった。５０℃で３０分間、９５℃で１５分間、続いて、９４℃で１分間の６０サイクル、５７℃で１．５分及び７２℃で２分、７２℃で１０分間の最終延長とした。
【０３２３】
ｉｖ．ＲＮＡｉノックダウン：
全てのｓｉＲＮＡは、予測ノックダウン効率の序列に基づいて、Sigma-Aldrich社から事前に設計されたｓｉＲＮＡデータベースから選択された。ＴｓｉＲＮＡ  ＩＤは、ＳＵＲ１（Ｒｅｆｓｅｑ  ＩＤ：ＮＭ＿０００３５２）に対しＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿０００９２３４７、ＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿０００９２３４８及びＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿０００９２３４９で、  ＳＵＲ２（  Ｒｅｆｓｅｑ  ＩＤ：ＮＭ＿００５６９１）に対しＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿０００６１３０１、ＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿０００６１３０２及びＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿０００６１３０３で、  Ｋｉｒ６．１（Ｒｅｆｓｅｑ  ＩＤ：ＮＭ００４９８２）に対しＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿００１１３３５７、ＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿００１１３３５８及びＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿００１１３３５９で、  Ｋｉｒ６．２（Ｒｅｆｓｅｑ  ＩＤ：ＮＭ０００５２５）に対しＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿００２２０２５６、ＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿００２２０２５７及びＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿００２２０２５８で、ＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿０００６５５７３、ＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿０００６５５７１、ＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿０００６５５７０に対しＲＯＣＫ１（ＲｅｆｓｅｑＩＤ：ＮＭ＿００５４０６）で、ＲＯＣＫ２（ＲｅｆｓｅｑＩＤ：ＮＭ＿００４８５０）に対しＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿００２０４２５３、ＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿００２０４２５２、ＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿００２０４２５１で、ＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿００１７４６１４、ＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿００１７４６１３に対しＪＡＫ１（ＲｅｑＩＤ：ＮＭ＿００２２２７）で、  ＳＡＳＩ＿Ｈｓ０２＿００３３８６７５、ＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿０００４１５４７に対しＪＡＫ２（ＲｅｑＩＤ：ＮＭ＿００４９７２）で、ＡＫ３（ＲｅｑＩＤ：ＮＭ＿０００２１５）に対しＪＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿００１１８１２８、ＳＡＳＩ＿Ｈｓ０２＿００３０２１０３である。
【０３２４】
ｓｉＲＮＡの形質移入は、製造元の指示に従って、Sigma-Aldrich社からＮ−ＴＥＲのナノ粒子ｓｉＲＮＡ形質移入システム（Ｃａｔ＃Ｎ２９１３）を用いて実行された。簡単に説明すると、５０００個の細胞を、Ｅｐｉｃ３８４ウェルプレートの各ウェルに播種した。翌日、細胞を５０ｎＭのｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、新鮮な細胞培養培地と交換する前に、２４時間培地を含むｓｉＲＮＡ中でインキュベートした。エピック細胞アッセイを形質移入の４８時間後に行った。
【０３２５】
ウェスタンブロット実験のために、Ｃ３Ａ細胞を、６ウェル組織培養処理プレートに３ｘ１０５／ウェルで播種した。細胞を、播種後２０時間、ＲＯＣＫ１又はＲＯＣＫ２のｓｉＲＮＡ（ランク１）を用いて最終濃度５０ｎＭでトランスフェクトした。形質移入２４時間後に、培地を含む形質移入試薬を除去し、新鮮な培地に交換した。形質移入４８時間後に、細胞をウェスタンブロットのために細胞を溶解した。
【０３２６】
ｖ．免疫沈降及びウエスタンブロット：
ＲＯＣＫ１及びＲＯＣＫ２のウェスタンブロットのために、各サンプルの１２０μｌの細胞溶解液を４０μｌの４×ＳＤＳサンプルバッファと混合し、そして５分間１００℃で沸騰させた。タンパク質を１０％ＳＤＳゲル上で分離し、各サンプルの１５μｌをゲルに添加した。膜を、１時間、ウサギ抗ＲＯＣＫ１（ｓｃ−５５６０）又はウサギ抗ＲＯＣＫ２（ｓｃ−５５６１）又はヤギ１時間抗アクチン（ｓｃ−１６１６）（１：５００希釈）でブロットし、その後、ヤギ抗ウサギ又はウマ抗ヤギ抗体（１：２０００希釈）で複合化した第２ＨＲＰで１５分間ブロットした。
【０３２７】
Ｋｉｒ６．２のために、１億Ｃ３Ａ細胞を１％ＮＰ４０溶解バッファに溶解し、タンパク質Ａセファロース（シグマ、Ｐ３３９１）とで複合化したヤギ抗Ｋｉｒ６．２を（ｓｃ−１１２２８、Ｇ１６）で免疫沈降した。タンパク質を１０％ＳＤＳゲル上で分離し、全細胞溶解物又はミトコンドリア溶解物の３０μｌをゲルに添加した。膜をヤギ抗Ｋｉｒ６．２を（ｓｃ−１１２２８、１：２００）で１時間ブロットし、その後、ヤギ抗ウサギ又はウマ抗ヤギ抗体（１：２０００希釈）で複合化した第２ＨＲＰで３０分間ブロットした。ミトコンドリアＣ３Ａを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの培養細胞用ミトコンドリア単離キット（Ｃａｔ＃ＫＨＭ３０３１）を使用して１億Ｃ３Ａ細胞から単離した。
【０３２８】
ｖｉ．ヒト肝細胞：
ヒト初代肝細胞がＸｅｎｏＴｅｃｈ（Ｈ１５００．Ｈ１５Ａ＋ロットＮｏ．７７０）から購入された。メーカーの指示に従って、細胞を解凍しＸｅｎｏｔｅｃｈ肝細胞単離キット（Ｃａｔ＃：Ｋ２０００）を用いて精製した。細胞（５０，０００個／ウェル）は、１日目に１０％ＦＢＳを含むガラクトースフリーＭＦＥプレーティングミディアム（コーニング社製）を用いて、コラーゲンＩをコーティングした９６ウェルプレート（BD Bioscience社、Ｃａｔ＃３５４４０７）に播種された。培地は２日目に０．２５ｍｇ／ｍｌマトリゲル（BD Bioscience社、Ｃａｔ＃３５６２３４）を用いて、１０％ＦＢＳを含むＭＦＥ維持培地に変更された。細胞は１日目から８日目まで５％ＣＯ２により３７℃でインキュベートされた。５日目から、細胞は、ＣＹＰ３Ａ４の誘導のために１０μＭのリファンピシン（Ｃａｔ＃Ｒ３５０１、Sigma-Aldrich社製）で、又はＣＹＰ１Ａ２の誘導のために５０μＭのオメプラゾール（Ｃａｔ＃Ｏ１０４、Sigma-Aldrich社）で、又は７２時間ＤＭＳＯの等量で、処理した。８日目には、ＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ１Ａ２のアッセイがＰ４５０−Ｇｌｏ（登録商標）ＣＹＰ３Ａ４アッセイキット又はＰ４５０−Ｇｌｏ（商標）ＣＹＰ１Ａ２アッセイキット（Ｃａｔ＃Ｖ８９０２とＶ８７７２、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して行われた。細胞数はＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｃａｔ＃Ｇ１７８０、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて正規化された。
【０３２９】
ｖｉｉ．ＰＣＲ−アレイ：
ヒト肝細胞を上記のように培養した。５日目に、細胞を採取し、そして全ＲＮＡを、カラムＤＮａｓｅ消化（Ｃａｔ＃７９２５４）上でQiagen社のＲＮｅａｓｙミニキット（Ｃａｔ＃７４１０４）を用いて抽出した。各サンプルのＲＮＡ濃度を、クワント−ＩＴ（商標）ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ＲＮＡアッセイキット（Invitrogen社、Ｃａｔ＃Ｒ１１４９０）を用いて定量し、ＰＣＲ−アレイ実験まで−８０℃で保存した。アレイプレート（ヒト癌の薬剤耐性及び代謝ＰＣＲアレイ、Ｃａｔ＃ＰＡＨＳ−００４、SABioscience社、フレデリック、メリーランド州）を、SABioscience社マニュアル（部品＃１０２２Ａ）に従って調製した。１μｇの総ＲＮＡを９６ウェルアレイプレートごとに使用し、それぞれの全ＲＮＡサンプルを複製でテストした。ＰＣＲ−Ａｒｒａｙを、ソフトウェアＳＤＳ２．３を用いて、９６ウェル標準ブロックでＡＢＩ−７９００ＨＴ上で行った。ＰＣＲ条件を、ユーザマニュアル（部品＃１０２２Ａ）で提案されているように設定した。SABioscience社オンライン分析ツールを用いてデータを分析した。
【０３３０】
ｖｉｉｉ．光バイオセンサーシステム及び細胞アッセイ：
Ｅｐｉｃ（登録商標）の波長インターロゲーションシステム（wavelength interrogation system）（コーニング社、コーニング、ニューヨーク州）を全細胞の検出に使用した。このシステムは、温度制御装置、光学検出部、ロボットによるオンボード液体ハンドリングユニットから構成されている。検出部は、統合された光ファイバを中心とし、約１５秒の時間間隔で、細胞応答の運動測定を可能にする。化合物溶液を、オンボードの液体ハンドリングユニット（すなわち、ピペッティング）を使用して導入した。
【０３３１】
ＲＷＧバイオセンサーは、センサー表面に近い局所屈折率の微細な変化を検出することが可能である。細胞内の局所屈折率はバイオマス（例えば、タンパク質、分子複合体）の密度とその分布の関数であるので、バイオセンサーは、非侵襲的にネイティブ細胞内のリガンド誘導動的質量再分配を検出するために、そのエバネッセント波を利用している。エバネッセント波は細胞内にて約１５０ｎｍの特性検知体積を導く距離に亘って延びて指数関数的に減衰しているので、受容体活性化を通して媒介された任意の光学応答は、バネッセント波がサンプリングされている細胞一部にわたる平均値を表していることを示唆している。受容体活性化下流の多くの細胞事象の集合はリガンド誘導ＤＭＲの動態及び振幅を決定する。
【０３３２】
バイオセンサー細胞アッセイのために、化合物溶液を、ＨＢＳＳ（１×ハンクス平衡塩溶液、プラス２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．１）で保存され濃縮された溶液を希釈することによって作成し、そして、３８４ウェルのポリプロピレンコンパウンド保存プレートに移し複合ソースプレートを調製した。二段階アッセイを行った際には、次の２つの化合物ソースプレートを個別に作成した。並行して、細胞をＨＢＳＳで２回洗浄して、３０μＬのＨＢＳＳ中で維持し、細胞アッセイプレートを調製した。そして、細胞アッセイプレート及び複合ソースプレートの両方を、リーダシステムのホテルでインキュベートした。インキュベーションの後、細胞アッセイマイクロプレート内のすべてのバイオセンサーのベースラインの波長を記録し、ゼロに正規化した。その後、２ないし１０分の連続記録を実行してベースラインを確立し、そして、細胞が定常状態に達していることを確認した。次に、細胞応答は、オンボード液体ハンドラを用いて細胞アッセイプレート中に化合物溶液の１０μｌを転送することによって引き起こされた。
【０３３３】
すべての研究を、制御された温度（２８℃）で行った。それぞれ少なくとも３つの複製した少なくとも２つの独立した実験の組を実施した。変動のアッセイ係数は＜１０％であることが分かった。
【０３３４】
２．例１：肝細胞内のミトコンドリアＫＡＴＰチャネルの存在：
ＫＡＴＰチャネルは細胞の代謝レベルを細胞膜興奮性にリンクする分子センサーとしての役割を果たす。ＫＡＴＰチャネルは細胞内ＭｇＡＤＰとの相互作用によって活性化され、ＡＴＰの高レベルによって阻害される。ＫＡＴＰチャネルは細胞膜とミトコンドリア内膜と核膜に発見されている。ＫＡＴＰチャネルの発現を確認し肝細胞株ＨｅｐＧ２Ｃ３Ａ内の特定のＫＡＴＰチャネルサブユニットを決定するために、ＨｅｐＧ２Ｃ３Ａ細胞から単離された全ＲＮＡでの、Ｋｉｒ６．１、Ｋｉｒ６．２、ＳＵＲ１、ＳＵＲ２Ａ及びＳＵＲ２Ｂに特定なプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを実行した。図１に示されているように、Ｋｉｒ６．１、Ｋｉｒ６．２、ＳＵＲ２Ａ及びＳＵＲ２ＢはＨｅｐＧ２Ｃ３Ａ細胞で発現されたが、ＳＵＲ１サブユニットではなかった。
【０３３５】
全ての細胞パッチクランプ記録はＨｅｐＧ２Ｃ３Ａ細胞内のいかなるＫ＋の選択的な電流を検出することができなかった、ＫＡＴＰチャネルは細胞膜に存在しないかもしれないことを示す。ミトコンドリアＫＡＴＰチャネルは、ラット肝細胞で報告されている。ウェスタンブロットに続くＨｅｐＧ２Ｃ３Ａ細胞からのミトコンドリアの単離は、全細胞溶解液及びミトコンドリア溶解液におけるＫｉｒ６．２の存在を示した（図２）。
【０３３６】
３．例２：無標識細胞アッセイで肝細胞のＫＡＴＰチャネルを検出する。：
無標識ＲＷＧバイオセンサー細胞アッセイは、与えられた細胞集団中の化合物により誘導される質量再分配を測定する。得られたシグナルは、複数の細胞シグナル伝達事象の和であり得る。しかし、ＫＡＴＰチャネルは、内向き整流Ｋ＋チャネルであり、生理的条件下で細胞内ＭｇＡＤＰ及び特定ＫＣＯｓによって活性化され得る。チャンネル組成の特定ＫＣＯｓの可用性及び無標識ＲＷＧバイオセンサーの感度は、ＫＡＴＰチャネルの活性化及びそれに続く細胞内シグナル伝達事象を直接監視する事を可能にするものである。
【０３３７】
肝細胞内の無標識ｍｉｔｏＫＡＴＰチャネルアッセイの実現可能性及び特殊性を実証するためには、我々はピナシジル（図３Ａ）、Ｋｉｒ６．２／ＳＵＲ２特定ＫＣＯによって誘導さＨｅｐＧ２Ｃ３Ａ細胞の用量依存的な応答をまず測定した。図３Ｂは、ピナシジル誘発ＤＭＲシグナルの振幅と動態の両方が濃度依存性であることを示している。ピナシジルによって活性化されたｍｉｔｏＫＡＴＰチャネルは内因的に発現されている故に、我々は、任意の特定ＫＡＴＰチャネルサブユニットのノックダウンがピナシジル誘発ＤＭＲシグナルの減少をもたらすことができると推測した。図４に示すように、ＳＵＲ１特定ｓｉＲＮＡで移入されたＨｅｐＧ２Ｃ３Ａ細胞はピナシジル誘発ＤＭＲシグナルに影響を与えなかったが、一方、ＳＵＲ２特定ｓｉＲＮＡの形質移入ではピナシジル誘発ＤＭＲシグナルの大幅な削減を導いた。同様に、図５は、Ｋｉｒ６．１特定ｓｉＲＮＡではピナシジル誘発ＤＭＲシグナルに影響を与えなかったが、一方、Ｋｉｒ６．２特定ｓｉＲＮＡの形質移入の細胞はコントロールと比較して有意にＤＭＲシグナルを減少させたことを示す。
【０３３８】
ＫＡＴＰチャネルは、トラザミド、トルブタミド、グリピジド等の一般的なスルホニル尿素薬によって遮断され得る。図６は、ＨｅｐＧ２Ｃ３Ａ細胞におけるピナシジル誘発ＤＭＲシグナルがこれらのスルホニル尿素のパネルによって用量依存的に阻害され得ることを示している。特筆すべきは、ＫＡＴＰチャネルを含むＫｉｒ６．１を選択的に阻害することが報告されている非スルホニル尿素ブロッカーＵ−３７８８３Ａは、ピナシジル誘発ＤＭＲシグナルには影響を与えなかった。一緒に、これらの実験は、無標識細胞アッセイが肝細胞におけるｍｉｔｏＫＡＴＰチャネルの活性化を検出することができ、そして原因であるｍｉｔｏＫＡＴＰチャネルの分子組成物がおそらくＫｉｒ６．２とＳＵＲ２であることを示す。
【０３３９】
４．例３：肝細胞におけるｍｉｔｏＫＡＴＰシグナル伝達はＲＯＣＫ活性にリンクされている。：
Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ１及びＲＯＣＫ２）は、小さいＧＴＰアーゼＲｈｏＡの開始シグナル伝達経路に重要な役割を果たしている。Ｒｈｏキナーゼは、細胞骨格の組織、細胞増殖、アポトーシス等の様々な細胞機能に関与することが知られていた。図７に示すように、ＲＯＣＫ抑制物質とのプレインキュベーション（ｐｒｅ−ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）は、Ｙ−２７６３２は、用量依存的に誘導されピナシジルＤＭＲシグナルを減少させた。ＲＯＣＫ１又はＲＯＣＫ２特定ｓｉＲＮＡどちらかの形質移入は、ピナシジル誘発ＤＭＲシグナルを大幅に減少させた（図８Ａ及び８Ｂ）。ＲＯＣＫ１及びＲＯＣＫ２特定抗体を用いたウェスタンブロットは、ＨｅｐＧ２Ｃ３Ａ細胞におけるＲＯＣＫ１及びＲＯＣＫ２タンパク質レベル（図８Ｃ及び８Ｄ）のノックダウンを確認した。２つの異なるアクチンフィラメント分裂剤のカラシンＢ又はラトランクリンＡでのプレインキュベーションはまた、ＨｅｐＧ２Ｃ３Ａ細胞内でピナシジル誘発ＤＭＲシグナルを用量依存的に低減することができる。これらの結果は、ｍｉｔｏＫＡＴＰチャネルが肝細胞におけるシグナル伝達活性をＲＯＣＫにリンクされて開始されたことを示している。
【０３４０】
５．例４：肝細胞におけるｍｉｔｏＫＡＴＰシグナル伝達はＪＡＫの活性にリンクされている。
【０３４１】
ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ１、２、３）はサイトカイン媒介細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質チロシンキナーゼである。それらは細胞の生存、増殖、分化、アポトーシス等細胞機能の様々にとって重要である。図１０は、ＪＡＫ抑制物質でのプレインキュベーションＡＧ４９０がＨｅｐＧ２Ｃ３Ａ細胞においてピナシジル誘発ＤＭＲシグナルを用量依存的に減少させたことを示す。図１１に示すように、ＪＡＫ２又はＪＡＫ３特定ｓｉＲＮＡがピナシジル誘発ＤＭＲシグナルを著しく減衰させた一方で、ＪＡＫ１特定ｓｉＲＮＡの形質移入は、ピナシジル誘発ＤＭＲシグナルに影響を及ぼさなかった。これらの結果は、ｍｉｔｏＫＡＴＰチャネルシグナル伝達の活性化は、ＪＡＫ特にＪＡＫ２及びＪＡＫ３の活性にリンクされていることを示す。
【０３４２】
６．例５：ｍｉｔｏＫＡＴＰモジュレーターはＣＹＰ３Ａ４活性のリファンピシン誘導を抑制する。：
リファンピシンは、ＲＮＡの合成を妨げ、細菌やウイルス性疾患を治療するために使用されているリファマイシンの形態に由来する半合成抗生物質である。リファンピシンは、一般的に結核やハンセン病を含むマイコバクテリウム感染症を治療するために使用され、また、フシジン酸との組み合わせで、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の治療に一定の役割を有する。これは、髄膜炎（髄膜炎菌）感染に対する予防的治療で使用されている。
【０３４３】
リファンピシンは、細菌の細胞内におけるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを、そのβ−サブユニットに結合することにより、阻害し、そしてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の転写とそれに続くタンパク質への翻訳を防止する。その親油性の性質は、中枢神経系への配分及び血液脳関門を介した浸透を必要とする結核性の髄膜炎型を治療するための良い候補になる。
【０３４４】
しかし、リファンピンは主に薬物の肝毒性に関連する有害作用を呈し、リファンピシンを投与された患者は、多くの場合、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を含む肝機能検査を受けている。リファンピシンは肝チトクロムＰ４５０酵素（ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ３Ａ４等）の強力な誘導因子であり、この酵素系を介して肝臓によって排除される多くの薬剤の代謝を増加させる。これは、ホルモン避妊の低減効果等の多数の薬物相互作用をもたらす。例えば、リファンピシンは、副腎ホルモン、甲状腺ホルモン、ビタミンＤを含む内在性基質の代謝を高め得る。
【０３４５】
コラーゲンＩ−マトリゲルサンドイッチ条件下で培養したヒト初代肝細胞を用いて、ＣＹＰ酵素活性に関するｍｉｔｏＫＡＴＰモジュレーターと同様にリファンピンの影響が研究された。図１２Ａに示すように、ピナシジルは約２倍の最大誘導を有するＣＹＰ３Ａ４の誘導を用量依存的に引き起こした。予想されたように、リファンピシンはＣＹＰ３Ａ４の３倍の誘導を導いた。しかし、ピナシジルも用量依存的にリファンピシン誘導を抑制した（図１２Ｂ）。同様の観察がｍｉｔｏＫＡＴＰブロッカーグリピジドで観察された（図１２Ｃと図１２Ｄ）。一方、ピナシジル及びグリピジド両方はＣＹＰ１Ａ２活性にほとんど影響を与えなかった。まとめると、これらのデータは、ｍｉｔｏＫＡＴＰモジュレーターが肝臓毒素リファンピシンのＣＹＰ３Ａ４酵素誘導活性を抑制することができ、ｍｉｔｏＫＡＴＰイオンチャネルが肝臓毒素誘発損傷に対して保護的であることを示す。
【０３４６】
Ｅ．参考文献
1. Fang, Y., Ferrie, A.M., Fontaine, N.H., Mauro, J., and Balakrishnan, J. (2006) Biophys. J. 91, 1925-1940.
2. Fang, Y., Ferrie, A.M., Fontaine, N.H., and Yuen, P.K. (2005) Anal. Chem. 77: 5720-5725.
3. Fang, Y.  (2006) Assays and Drug development Technologies. 4: 583-595.
4.  WO2006108183 A2 Fang, Y., Ferrie, A.M., Fontaine, N.M., Yuen, P.K.  and Lahiri, J.  "Optical biosensors and cells".
【図１】
2013527754.tif 000005
【図２】
2013527754.tif 000006
【図３】
2013527754.tif 000007
【図４】
2013527754.tif 000008
【図５】
2013527754.tif 000009
【図６】
2013527754.tif 000010
【図７】
2013527754.tif 000011
【図８Ａ−Ｂ】
2013527754.tif 000012
【図８Ｃ−Ｄ】
2013527754.tif 000013
【図９】
2013527754.tif 000014
【図１０】
2013527754.tif 000015
【図１１】
2013527754.tif 000016
【図１２Ａ−Ｂ】
2013527754.tif 000017
【図１２Ｃ−Ｄ】
2013527754.tif 000018
【図１２Ｅ−Ｆ】
2013527754.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】平成24年11月28日(2012.11.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子をアッセイする方法であって、
ａ．無標識バイオセンサーの分析に使用され得るバイオセンサー表面上でＫＡＴＰ細胞株を培養するステップと、
ｂ．分子で前記細胞株をインキュベートして分子処理した細胞株を産生するステップと、
ｃ．無標識バイオセンサーで前記分子処理した細胞株を分析して分子データ出力を産生するステップと、
ｄ．同一の前記細胞株における前記分子データ出力と既知のＫＡＴＰモジュレーターデータ出力とを比較して分子−ＫＡＴＰモジュレーターの比較を産生するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
ＫＡＴＰ細胞株はミトコンドリアＡＴＰ感受性カリウムイオンチャネル（ｍｉｔｏＫＡＴＰ）を含むこと、細胞株は肝細胞を任意に含むこと、肝細胞は肝ウイルスに任意に感染されたこと、肝ウイルスは、任意にＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅの型の肝炎、単純ヘルペス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、黄熱病ウイルス、又はアデノウイルスであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞は任意に非ウイルス性感染症又は化学物質又は毒素で感染された源から得ること、非ウイルス性感染症は任意にトキソプラズマ、レプトスピラ、Ｑ熱、又はロッキー山紅斑熱を含むこと、及び／又は、化学物質又は毒素は任意にアルコール、パラセタモール、アモキシシリン、抗結核薬、ミノサイクリン、メチルドパ、ニトロフラントイン、イソニアジド又はケトコナゾールを含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
既知ＫＡＴＰモジュレーターデータ出力は、培養した前記ＫＡＴＰ細胞株で前記ＫＡＴＰモジュレーターをインキュベートしてＫＡＴＰモジュレーターデータ出力を生成する無標識バイオセンサーで、前記インキュベートした細胞株を解析することにより、産生されたこと、前記比較において分子データ出力及びＫＡＴＰモジュレーターデータ出力が類似していることを示すとき、潜在的ＫＡＴＰモジュレーターを識別するステッップを更に含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記アッセイのステップは、
ａ．無標識バイオセンサーの分析に使用され得る表面上でＲＯＣＫ抑制物質応答性細胞株を培養するステップと、
ｂ．分子で前記細胞株をインキュベートしてインキュベートする細胞株を産生するステップと、
ｃ．無標識バイオセンサーで前記インキュベートする細胞株を分析して分子データ出力を産生するステップと、
ｄ．同一の前記細胞株における前記分子データ出力と既知のＲＯＣＫ抑制物データ出力とを比較して分子−ＲＯＣＫ抑制物の比較を産生するステップと、を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
分子をアッセイする方法であって、
ａ．無標識バイオセンサーの分析に使用され得るバイオセンサー表面上でＫＡＴＰ細胞株を培養するステップと、
ｂ．マーカー及び分子で前記細胞株をインキュベートしてインキュベートしている細胞株を産生するステップと、
ｃ．無標識バイオセンサーで前記インキュベートしている細胞株を分析してマーカー−分子データ出力を産生するステップと、
ｄ．同一の前記細胞株における前記マーカー−分子データ出力とマーカー−ＫＡＴＰモジュレーターデータ出力とを比較してマーカー−分子／マーカー−ＫＡＴＰモジュレーターの比較を産生するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
分子をアッセイする方法であって、
ａ．無標識バイオセンサーの分析に使用されるバイオセンサー表面上でＡ４３１、ＨＴ２９、Ａ５４９、及びＨｅｐＧ２の４つの異なる細胞株を培養するステップと、
ｂ．分子で前記細胞株の各々をインキュベートして４つのインキュベートしている細胞株を産生するステップと、
ｃ．無標識バイオセンサーで前記インキュベートしている細胞株の各々を分析して各インキュベートしている細胞株に対する分子データ出力を産生するステップと、
ｄ．同一の前記細胞株における前記分子データ出力とＲＯＣＫ抑制物質のデータ出力とを比較して各細胞株に対する分子−ＲＯＣＫ抑制物質の比較を産生するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
対象物を処理する方法であって、肝疾患の治療の必要性である対象物にｍｉｔｏＫＡＴＰモジュレーターを投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
対象物における肝毒性を減少させる方法であって、ＫＣＯの機能が対象物に与えられた薬物の肝臓毒性を減少させる前記ＫＣＯを対象物に投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
分子をアッセイする方法であって、
ａ．無標識バイオセンサーの分析に使用され得る表面上でＫＡＴＰ細胞株を培養するステップと、
ｂ．分子で前記細胞株をインキュベートして分子処理した細胞株を産生するステップと、
ｃ．無標識バイオセンサーで前記分子処理した細胞株を分析して分子データ出力を産生するステップと、
ｄ．同一の前記細胞株における前記分子データ出力と既知のＫＡＴＰモジュレーターデータ出力とを比較して分子−ＫＡＴＰモジュレーターの比較を産生するステップと、
ｅ．前記比較においてマーカー−分子データ出力及びマーカー−ＫＡＴＰモジュレーターデータ出力が類似していることを示すとき、潜在的ＫＡＴＰモジュレーターを識別するステッップと、を含み、
前記マーカー−ＫＡＴＰモジュレーターデータ出力は、培養した前記ＫＡＴＰ細胞株で前記マーカー及び前記ＫＡＴＰモジュレーターをインキュベートして、マーカー−ＫＡＴＰモジュレーターデータ出力を生成する無標識バイオセンサーで、前記インキュベートした細胞株を解析することにより、産生されたこと、並びに、前記モジュレーターがＹ１７６３１であることを特徴とする方法。
【国際調査報告】
2013527754.tif 000020
2013527754.tif 000021
2013527754.tif 000022
2013527754.tif 000023