(57)【要約】  霊長類におけるコカイン暴露の生物学的影響を軽減する方法。前記方法は、霊長類に対して、ある量のアミノ酸置換Ａ２２７Ｓ、Ｓ３１５Ｇ、Ａ３５６ＷおよびＹ３６０Ｇを含むＢＣｈＥ−アルブミン融合タンパク質を投与することを含み、前記融合タンパク質の量は、霊長類におけるコカイン暴露の生物学的影響の軽減を引き起こすために有効である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
霊長類におけるコカイン暴露の生物学的影響を軽減するための方法であって、
（ａ）配列：
ＥＤＤＩＩＩＡＴＫＮＧＫＶＲＧＭＮＬＴＶＦＧＧＴＶＴＡＦＬＧＩＰＹＡＱＰＰＬＧＲＬＲＦＫＫＰＱＳＬＴＫＷＳＤＩＷＮＡＴＫＹＡＮＳＣＣＱＮＩＤＱＳＦＰＧＦＨＧＳＥＭＷＮＰＮＴＤＬＳＥＤＣＬＹＬＮＶＷＩＰＡＰＫＰＫＮＡＴＶＬＩＷＩＹＧＧＧＦＱＴＧＴＳＳＬＨＶＹＤＧＫＦＬＡＲＶＥＲＶＩＶＶＳＭＮＹＲＶＧＡＬＧＦＬＡＬＰＧＮＰＥＡＰＧＮＭＧＬＦＤＱＱＬＡＬＱＷＶＱＫＮＩＡＡＦＧＧＮＰＫＳＶＴＬＦＧＥＳＳＧＡＡＳＶＳＬＨＬＬＳＰＧＳＨＳＬＦＴＲＡＩＬＱＳＧＳＦＮＡＰＷＡＶＴＳＬＹＥＡＲＮＲＴＬＮＬＡＫＬＴＧＣＳＲＥＮＥＴＥＩＩＫＣＬＲＮＫＤＰＱＥＩＬＬＮＥＡＦＶＶＰＹＧＴＰＬＧＶＮＦＧＰＴＶＤＧＤＦＬＴＤＭＰＤＩＬＬＥＬＧＱＦＫＫＴＱＩＬＶＧＶＮＫＤＥＧＴＷＦＬＶＧＧＡＰＧＦＳＫＤＮＮＳＩＩＴＲＫＥＦＱＥＧＬＫＩＦＦＰＧＶＳＥＦＧＫＥＳＩＬＦＨＹＴＤＷＶＤＤＱＲＰＥＮＹＲＥＡＬＧＤＶＶＧＤＹＮＦＩＣＰＡＬＥＦＴＫＫＦＳＥＷＧＮＮＡＦＦＹＹＦＥＨＲＳＳＫＬＰＷＰＥＷＭＧＶＭＨＧＹＥＩＥＦＶＦＧＬＰＬＥＲＲＤＮＹＴＫＡＥＥＩＬＳＲＳＩＶＫＲＷＡＮＦＡＫＹＧＮＰＮＥＴＱＮＮＳＴＳＷＰＶＦＫＳＴＥＱＫＹＬＴＬＮＴＥＳＴＲＩＭＴＫＬＲＡＱＱＣＲＦＷＴＳＦＦＰＫＶ（配列番号１）、
を含む突然変異ブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）ポリペプチドと、
（ｂ）配列：
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ（配列番号２）
を含むヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ポリペプチドと、
（ｃ）配列ＭＲＰＴＷＡＷＷＬＦＬＶＬＬＬＡＬＷＡＰＡＲＧ（配列番号３）を含むシグナルペプチドと
を含むある量の融合タンパク質を霊長類に投与することを含み、
前記融合タンパク質の量は、霊長類におけるコカイン暴露の生物学的影響の軽減を引き起こすために有効である方法。
【請求項２】
前記融合タンパク質が、配列：
ＭＲＰＴＷＡＷＷＬＦＬＶＬＬＬＡＬＷＡＰＡＲＧＥＤＤＩＩＩＡＴＫＮＧＫＶＲＧＭＮＬＴＶＦＧＧＴＶＴＡＦＬＧＩＰＹＡＱＰＰＬＧＲＬＲＦＫＫＰＱＳＬＴＫＷＳＤＩＷＮＡＴＫＹＡＮＳＣＣＱＮＩＤＱＳＦＰＧＦＨＧＳＥＭＷＮＰＮＴＤＬＳＥＤＣＬＹＬＮＶＷＩＰＡＰＫＰＫＮＡＴＶＬＩＷＩＹＧＧＧＦＱＴＧＴＳＳＬＨＶＹＤＧＫＦＬＡＲＶＥＲＶＩＶＶＳＭＮＹＲＶＧＡＬＧＦＬＡＬＰＧＮＰＥＡＰＧＮＭＧＬＦＤＱＱＬＡＬＱＷＶＱＫＮＩＡＡＦＧＧＮＰＫＳＶＴＬＦＧＥＳＳＧＡＡＳＶＳＬＨＬＬＳＰＧＳＨＳＬＦＴＲＡＩＬＱＳＧＳＦＮＡＰＷＡＶＴＳＬＹＥＡＲＮＲＴＬＮＬＡＫＬＴＧＣＳＲＥＮＥＴＥＩＩＫＣＬＲＮＫＤＰＱＥＩＬＬＮＥＡＦＶＶＰＹＧＴＰＬＧＶＮＦＧＰＴＶＤＧＤＦＬＴＤＭＰＤＩＬＬＥＬＧＱＦＫＫＴＱＩＬＶＧＶＮＫＤＥＧＴＷＦＬＶＧＧＡＰＧＦＳＫＤＮＮＳＩＩＴＲＫＥＦＱＥＧＬＫＩＦＦＰＧＶＳＥＦＧＫＥＳＩＬＦＨＹＴＤＷＶＤＤＱＲＰＥＮＹＲＥＡＬＧＤＶＶＧＤＹＮＦＩＣＰＡＬＥＦＴＫＫＦＳＥＷＧＮＮＡＦＦＹＹＦＥＨＲＳＳＫＬＰＷＰＥＷＭＧＶＭＨＧＹＥＩＥＦＶＦＧＬＰＬＥＲＲＤＮＹＴＫＡＥＥＩＬＳＲＳＩＶＫＲＷＡＮＦＡＫＹＧＮＰＮＥＴＱＮＮＳＴＳＷＰＶＦＫＳＴＥＱＫＹＬＴＬＮＴＥＳＴＲＩＭＴＫＬＲＡＱＱＣＲＦＷＴＳＦＦＰＫＶＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ（配列番号４）
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記融合タンパク質がコカイン暴露前に投与される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記融合タンパク質がコカイン暴露前の１日以内に投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記融合タンパク質がコカイン暴露前の２１６時間以内に投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記融合タンパク質がコカイン暴露後に投与される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記融合タンパク質がコカイン暴露後の１時間以内に投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記コカイン暴露が単回コカイン暴露である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記コカイン暴露が反復コカイン暴露である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記反復コカイン暴露がコカイン乱用またはコカイン依存である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記反復コカイン暴露が、１２カ月の期間において少なくとも６回の単回コカイン暴露を含む、請求項９〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記反復コカイン暴露が、霊長類の生涯において少なくとも２０回の単回コカイン暴露を含む、請求項９〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記生物学的影響が霊長類におけるコカイン過剰投与によって引き起こされ、前記軽減が生物学的影響を治療または予防する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記生物学的影響が血圧上昇である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記血圧上昇の持続時間が６０〜９０％低減する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記血圧上昇の持続時間が約７８％低減する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記生物学的影響が心拍数または体温の上昇である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記軽減の程度が４５％〜７０％である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記軽減の程度が５７％である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記生物学的影響が霊長類におけるコカイン要求行動である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記コカイン要求行動がコカイン暴露後のコカイン自制期間中に起こる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記コカイン要求行動が再発後に起こる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記再発の２時間前の融合タンパク質の投与が、再発直後の霊長類によるコカイン要求行動を軽減する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記コカイン暴露の２時間前の融合タンパク質の投与が、霊長類によるコカイン要求行動の５０％〜１００％の低減をもたらす、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記コカイン要求行動の軽減が、融合タンパク質の投与後の４日以内に観察される、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記融合タンパク質の投与が、投与しない場合よりも霊長類における総コカイン暴露の低下をもたらす、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記コカイン要求行動の軽減が、２週〜３週のコカイン自制期間をもたらす、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記コカイン要求行動の軽減が、投与しない場合よりも、霊長類がコカインに暴露されない日数の割合を大きくする、請求項２０〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記コカイン要求行動の軽減が、投与しない場合よりも、霊長類がコカインに暴露されない連続日数を大きくする、請求項２０〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記コカイン要求行動の軽減が、コカイン選択的重度評価（ＣＳＳＡ）または精神障害の診断と統計の手引ＩＶ（ＤＳＭ−ＩＶ）によって評価される、コカイン依存または乱用の重度の低下をもたらす、請求項２０〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記融合タンパク質の有効量は、霊長類の血清コカインレベルを１ｍｇ／ｋｇ静脈内コカイン投与の約３０分以内に約０ｍｇ／ｍｌまで減少させる量である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記融合タンパク質の投与が、霊長類の血清コカインレベルを、１ｍｇ／ｋｇ静脈内コカイン投与の約５分以内に、投与しない場合の血清コカインレベルの１２％未満まで減少させる、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記融合タンパク質の投与が、霊長類の血清コカインレベルを、１ｍｇ／ｋｇ静脈内コカイン投与の約５分以内に、投与しない場合の血清コカインレベルの７％まで減少させる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記融合タンパク質が週１回または週２回投与される、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記融合タンパク質が筋内注射または皮下注射によって投与される、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記融合タンパク質が、１０ｍＭリン酸ナトリウムと、２００ｍＭマンニトールと、６０ｍＭトレハロースと、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を含むｐＨ７．２の製剤緩衝液中にある、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記融合タンパク質が少なくとも３０ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤に存在する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記生物学的影響の軽減が、前記融合タンパク質の投与後の７２時間以内に観察される、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記霊長類がヒトである、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記コカイン暴露が、１０ｍｇ〜６０ｍｇの単回コカイン暴露であるかまたは反復コカイン暴露であり、前記反復コカイン暴露の各単回コカイン暴露が１０ｍｇ〜６０ｍｇである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記融合タンパク質の有効量は、ヒト血清コカインレベルを４０ｍｇの静脈内コカイン投与の約３０分以内に約０ｎｇ／ｍｌまで減少させる量である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
融合タンパク質の有効量が０．０６ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇである、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記融合タンパク質の有効量が０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、または４．８ｍｇ／ｋｇである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記融合タンパク質の有効量が５０ｍｇ〜３００ｍｇである、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記融合タンパク質の有効量が５０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、または３００ｍｇである、請求項４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１０年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／４１２，２０５号と、２００９年１２月８日に出願された米国仮特許出願第６１／２８３，７９１号との優先権を主張し、これらの内容は全体として参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本出願を通して、種々の刊行物と、公開された特許出願と、特許とが参照される。全体としてこれらの書面の開示は、本発明が関係する最先端技術をより十分に記載するために、参照により本出願に援用される。
【背景技術】
【０００３】
コカイン乱用および依存は、悲惨な医学的および社会的結果を有し、これは効果的な利用の開発を最優先にしている（Ｐａｎ，Ｙ．，Ｇａｏ，Ｄ．，Ｙａｎｇ，Ｗ．，Ｃｈｏ，Ｈ．，Ｙａｈｇ，Ｇ．，Ｔａｉ，Ｈ．，Ｚｈａｎ，Ｃ．，“Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｕｔｙｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｃｏｃａｉｎｅ  ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ，”ＰＮＡＳ，１０２（４６）：１６６５６−６１，２００５）。しかしながら、Ｂｒｉｍｉｊｏｉｎらが述べるように、「自制に達している使用者において、コカインの過剰投与を治療する、または再発の可能性を減らす確実な方法はない。ヒト血漿ブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）は、正常なコカイン代謝に貢献し、コカイン毒性の治療において使用することが考慮されている。」（Ｂｒｉｍｉｊｏｉｎ，Ｓ．，Ｇａｏ，Ｙ．，Ａｎｋｅｒ，Ｊ．，Ｇｌｉｄｄｏｎ，Ｌ．，ＬａＦｌｅｕｒ，Ｄ．，Ｓｈａｈ，Ｒ．，Ｚｈａｏ，Ｑ．，Ｓｉｎｇｈ，Ｍ．，Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｍ．，“Ａ  Ｃｏｃａｉｎｅ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  ｂｕｔｙｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  Ｂｌｏｃｋｓ  Ｃｏｃａｉｎｅ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｉｎｓｔａｔｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｓｅｅｋｉｎｇ  ｉｎ  Ｒａｔｓ，”Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，３３：２７１５−２５，２００８）。
【０００４】
野生型ＢＣｈＥは、生体におけるコカイン代謝に重要であるが、コカインに対しては触媒効率が低い。野生型ＢＣｈＥの低いコカインヒドロラーゼ活性は、コカイン乱用または過剰投与を治療するために非常に大量の精製酵素の使用を必要とする。コカインヒドロラーゼ活性を増大させるという目的でヒトＢＣｈＥにおいて行われた突然変異生成は、野生型ＢＣｈＥに比べて４０倍高いｋｃａｔを有する二重突然変異Ａ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ａ（全長ＢＣｈＥと比較して残基３５６と３６０）の開発に至り、これはＫＭをほんの僅かに上昇させた（Ｓｕｎ  Ｈ．，Ｓｈｅｎ  Ｍ．，Ｐａｎｇ  Ｙ．，Ｌｏｃｋｒｉｄｇｅ  Ｏ．，Ｂｒｉｍｉｊｏｉｎ  Ｓ．，“Ｃｏｃａｉｎｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  Ｒｅ−Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｈｕｍａｎ  ｂｕｔｙｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，３０２（２）：７１０−７１６，２００２）。
【０００５】
コカインのＢＣｈＥ触媒加水分解の第１化学反応ステップについての遷移状態を刺激する分子動力学を利用する更なる実験は、野生型ＢＣｈＥよりも５００倍大きく、他に従前設計されたＢＣｈＥ突然変異体よりも大きい触媒効率を有するＢＣｈＥ突然変異体であるＡ２２７Ｓ／Ｓ３１５Ｇ／Ａ３５６Ｗ／Ｙ３６０Ｇをもたらした（Ｐａｎ，Ｙ．，Ｇａｏ，Ｄ．，Ｙａｎｇ，Ｗ．，Ｃｈｏ，Ｈ．，Ｙａｎｇ，Ｇ．，Ｔａｉ，Ｈ．，Ｚｈａｎ，Ｃ．，“Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｕｔｙｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｃｏｃａｉｎｅ  ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ，”ＰＮＡＳ，１０２（４６）：１６６５６−６１，２００５）。
【０００６】
治療的使用に適している可能性があるＡ２２７Ｓ／Ｓ３１５Ｇ／Ａ３５６Ｗ／Ｙ３６０ＧのＢＣｈＥ突然変異体の形態を得るために、Ｐａｎらによって設計されたＢＣｈＥ突然変異体は、そのＣ末端でヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に融合され、これは、類似の融合体は、高い安定性と増大した血漿半減期を有する有益な薬物速度論的特性を示すことが観察されたためである。上記突然変異を含むＢＣｈＥ−アルブミン融合体は、コカインと高い触媒効率を維持し、ラットへの静脈注射後８時間の血漿半減期を示すことが観察された（Ｂｒｉｍｉｊｏｉｎ  Ｓ．，Ｇａｏ，Ｙ．，Ａｎｋｅｒ  Ｊ．，Ｇｌｉｄｄｏｎ  Ｌ．，ＬａＦｌｅｕｒ  Ｄ．，Ｓｈａｈ  Ｒ．，Ｚｈａｏ，Ｑ．，“Ａ  Ｃｏｃａｉｎｅ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｕｔｙｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  Ｂｌｏｃｋｓ  Ｃｏｃａｉｎｅ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｉｎｓｔａｔｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｓｅｅｋｉｎｇ  ｉｎ  Ｒａｔｓ”Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，３３：２７１５−２５，２００８）。
【０００７】
これまで、突然変異であるＡ２２７Ｓと、Ｓ３１５Ｇと、Ａ３５６Ｗと、Ｙ３６０Ｇとを含むＢＣｈＥ−アルブミン融合体を利用する、開発された霊長類におけるコカイン乱用または過剰投与を治療するための効率的な方法はなかった。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、霊長類におけるコカイン暴露の生物学的影響を軽減するための方法であって、
（ａ）配列：
ＥＤＤＩＩＩＡＴＫＮＧＫＶＲＧＭＮＬＴＶＦＧＧＴＶＴＡＦＬＧＩＰＹＡＱＰＰＬＧＲＬＲＦＫＫＰＱＳＬＴＫＷＳＤＩＷＮＡＴＫＹＡＮＳＣＣＱＮＩＤＱＳＦＰＧＦＨＧＳＥＭＷＮＰＮＴＤＬＳＥＤＣＬＹＬＮＶＷＩＰＡＰＫＰＫＮＡＴＶＬＩＷＩＹＧＧＧＦＱＴＧＴＳＳＬＨＶＹＤＧＫＦＬＡＲＶＥＲＶＩＶＶＳＭＮＹＲＶＧＡＬＧＦＬＡＬＰＧＮＰＥＡＰＧＮＭＧＬＦＤＱＱＬＡＬＱＷＶＱＫＮＩＡＡＦＧＧＮＰＫＳＶＴＬＦＧＥＳＳＧＡＡＳＶＳＬＨＬＬＳＰＧＳＨＳＬＦＴＲＡＩＬＱＳＧＳＦＮＡＰＷＡＶＴＳＬＹＥＡＲＮＲＴＬＮＬＡＫＬＴＧＣＳＲＥＮＥＴＥＩＩＫＣＬＲＮＫＤＰＱＥＩＬＬＮＥＡＦＶＶＰＹＧＴＰＬＧＶＮＦＧＰＴＶＤＧＤＦＬＴＤＭＰＤＩＬＬＥＬＧＱＦＫＫＴＱＩＬＶＧＶＮＫＤＥＧＴＷＦＬＶＧＧＡＰＧＦＳＫＤＮＮＳＩＩＴＲＫＥＦＱＥＧＬＫＩＦＦＰＧＶＳＥＦＧＫＥＳＩＬＦＨＹＴＤＷＶＤＤＱＲＰＥＮＹＲＥＡＬＧＤＶＶＧＤＹＮＦＩＣＰＡＬＥＦＴＫＫＦＳＥＷＧＮＮＡＦＦＹＹＦＥＨＲＳＳＫＬＰＷＰＥＷＭＧＶＭＨＧＹＥＩＥＦＶＦＧＬＰＬＥＲＲＤＮＹＴＫＡＥＥＩＬＳＲＳＩＶＫＲＷＡＮＦＡＫＹＧＮＰＮＥＴＱＮＮＳＴＳＷＰＶＦＫＳＴＥＱＫＹＬＴＬＮＴＥＳＴＲＩＭＴＫＬＲＡＱＱＣＲＦＷＴＳＦＦＰＫＶ（配列番号１）、
を含む突然変異ブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）ポリペプチドと、
（ｂ）配列：
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ（配列番号２）
を含むヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ポリペプチドと、
（ｃ）配列ＭＲＰＴＷＡＷＷＬＦＬＶＬＬＬＡＬＷＡＰＡＲＧ（配列番号３）を含むシグナルペプチドと
を含むある量の融合タンパク質を霊長類に投与することを含み、
前記融合タンパク質の量は、霊長類におけるコカイン暴露の生物学的影響の軽減を引き起こすために有効である方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１（配列番号４）は、ＡｌｂｕＢＣｈＥ、突然変異であるＡ２２７Ｓと、Ｓ３１５Ｇと、Ａ３５６Ｗと、Ｙ３６０Ｇとを含むＢＣｈＥ−アルブミン融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図。
【図２】図２は、０．２、１または５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与量（上部パネル直線目盛、下部パネル片対数目盛）の単回ＩＭ投与後の個々のカニクイザルにおけるＡｌｂｕＢＣｈＥ血清濃度−時間プロフィールを示す図。
【図３】図３は、０．２、１または５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与量（上部パネル直線目盛、下部パネル片対数目盛）の単回ＩＭ投与後の個々のカニクイザルにおける平均ＡｌｂｕＢＣｈＥ血清濃度−時間プロフィールを示す図。
【図４Ａ】図４は、対照動物（ｎ＝２）における平均コカイン濃度対時間をＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後の時間（ｎ＝３）の関数として示す図。
【図４Ｂ】図４は、対照動物（ｎ＝２）における平均コカイン濃度対時間をＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後の時間（ｎ＝３）の関数として示す図。
【図５Ａ】図５は、対照動物（ｎ＝２）における平均ベンゾイルエクゴニン濃度対時間をＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後の時間（ｎ＝３）の関数として示す図。
【図５Ｂ】図５は、対照動物（ｎ＝２）における平均ベンゾイルエクゴニン濃度対時間をＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後の時間（ｎ＝３）の関数として示す図。
【図６Ａ】図６は、対照動物（ｎ＝２）における平均エクゴニンメチルエステル濃度対時間をＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後の時間（ｎ＝３）の関数として示す図。
【図６Ｂ】図６は、対照動物（ｎ＝２）における平均エクゴニンメチルエステル濃度対時間をＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後の時間（ｎ＝３）の関数として示す図。
【図７】図７は、第１日のコカイン対照群についての平均コカイン濃度−時間プロフィールと、０．２、１または５ｍｇ／ｋｇでのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後の第１１日（２４０時間）との比較を示す図。
【図８】図８は、０．２、１または５ｍｇ／ｋｇでのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与量の単回ＩＭ投与後のカニクイザルにおけるＡｌｂｕＢＣｈＥ  ＰＫ／ＰＤ分析を示す図。コカインは、対照動物において１ｍｇ／ｋｇの投与量で、またはＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の２、４８、９６、１２０および２４０時間後にＩＶ投与された。
【図９】図９は、コカイン代謝経路を示す図。
【図１０】図１０は、対照動物（ｎ＝２）における１ｍｇ／ｋｇのＩＶコカイン投与後の平均コカインＡＵＣ（０−ｔ）をＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後の時間（ｎ＝３）の関数として示す図。
【図１１】図１１は、対照動物（ｎ＝２）における１ｍｇ／ｋｇのＩＶコカイン投与後の平均ベンゾイルエクゴニンＡＵＣ（０−ｔ）をＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後の時間（ｎ＝３）の関数として示す図。
【図１２】図１２は、５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後の個々のリスザルにおけるＡｌｂｕＢＣｈＥ血清濃度−時間プロフィールを示す図（片対数目盛）。
【図１３】図１３は、対照動物（ｎ＝２）における平均コカイン濃度対時間をＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後の時間（ｎ＝３）の関数として示す図。
【図１４】図１４は、対照動物（ｎ＝２）における１ｍｇ／ｋｇのＩＶコカイン投与の５分後の平均エクゴニンメチルエステル濃度をＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後の時間（ｎ＝３）の関数として示す図。
【図１５】図１５は、対照動物（ｎ＝２）における１ｍｇ／ｋｇのＩＶコカイン投与の５分後の平均ベンゾイルエクゴニン濃度をＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後の時間（ｎ＝３）の関数として示す図。
【図１６】図１６は、コカイン注射の５分後（上部パネル）および３０分後（下側パネル）のコカイン、ならびにコカイン代謝物エクゴニンメチルエステル（ＥＭＥ）およびベンゾイルエクゴニン（ＢＺ）のリスザルの血液レベルの概要を示す図。
【図１７】図１７は、５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の単回ＩＭ投与後のリスザルにおけるＡｌｂｕＢＣｈＥ  ＰＫ／ＰＤ分析を示す図。コカインは、対照動物（ｎ＝２）において１ｍｇ／ｋｇの投与量で、またはＡｌｂｕＢＣｈＥ投与（ｎ＝３）の２、７２、および９６時間後にＩＶ投与された。
【図１８】図１８は、１５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与または製剤緩衝液の単回ＩＭ投与前およびその後のカニクイザルにおける平均心拍数数対時間を示す図。
【図１９】図１９は、１５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与または製剤緩衝液の単回ＩＭ投与前およびその後のカニクイザルにおける平均心拍数圧力生成対時間を示す図。
【図２０】図２０は、１５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与または製剤緩衝液の単回ＩＭ投与前およびその後のカニクイザルにおける平均動脈圧対時間を示す図。
【図２１】図２１は、１５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与または製剤緩衝液の単回ＩＭ投与前およびその後のカニクイザルにおける平均拡張期血圧対時間を示す図。
【図２２】図２２は、１５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与または製剤緩衝液の単回ＩＭ投与前およびその後のカニクイザルにおける平均収縮期血圧対時間を示す図。
【図２３】図２３は、１５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与または製剤緩衝液の単回ＩＭ投与前およびその後のカニクイザルにおける平均体温対時間を示す図。
【図２４Ａ】図２４Ａは、１５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与または製剤緩衝液の単回ＩＭ投与前およびその後のカニクイザルにおける平均呼吸数対時間を示す図。雄性カニクイザルについてのデータを図２４Ｂの上段パネルに示し、雌性カニクイザルについてのデータを図２４Ｂの下段パネルに示す。
【図２４Ｂ】図２４Ａは、１５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与または製剤緩衝液の単回ＩＭ投与前およびその後のカニクイザルにおける平均呼吸数対時間を示す図。雄性カニクイザルについてのデータを図２４Ｂの上段パネルに示し、雌性カニクイザルについてのデータを図２４Ｂの下段パネルに示す。
【図２５Ａ】図２５Ａは、１５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与または製剤緩衝液の単回ＩＭ投与前およびその後のカニクイザルにおける平均ＳＰＯ２レベル対時間を示す図。雄性カニクイザルについてのデータを図２５Ｂの上段パネルに示し、雌性カニクイザルについてのデータを図２５Ｂの下段パネルに示す。
【図２５Ｂ】図２５Ａは、１５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与または製剤緩衝液の単回ＩＭ投与前およびその後のカニクイザルにおける平均ＳＰＯ２レベル対時間を示す図。雄性カニクイザルについてのデータを図２５Ｂの上段パネルに示し、雌性カニクイザルについてのデータを図２５Ｂの下段パネルに示す。
【図２６Ａ】図２６は、１５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与または製剤緩衝液の単回ＩＭ投与前およびその後のカニクイザルにおける平均ＥＴＣＯ２レベル対時間を示す図。雄性カニクイザルについてのデータを図２６Ｂの上段パネルに示し、雌性カニクイザルについてのデータを図２６Ｂの下段パネルに示す。
【図２６Ｂ】図２６は、１５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与または製剤緩衝液の単回ＩＭ投与前およびその後のカニクイザルにおける平均ＥＴＣＯ２レベル対時間を示す図。雄性カニクイザルについてのデータを図２６Ｂの上段パネルに示し、雌性カニクイザルについてのデータを図２６Ｂの下段パネルに示す。
【図２７】図２７は、１５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の３時間後に１ｍｇ／ｋｇのコカイン投与量でＩＶ投与された後のカニクイザルにおける平均動脈圧対時間を示す図。コカイン投与はｔ＝０で投与された。
【図２８】図２８は、１５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の３時間後に１ｍｇ／ｋｇのコカイン投与量でＩＶ投与された後のカニクイザルにおける平均最低血圧対時間を示す図。コカイン投与はｔ＝０で投与された。
【図２９】図２９は、１５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の３時間後に１ｍｇ／ｋｇのコカイン投与量でＩＶ投与された後のカニクイザルにおける平均最高血圧対時間を示す図。コカイン投与はｔ＝０で投与された。
【図３０】図３０は、１５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の３時間後に１ｍｇ／ｋｇのコカイン投与量でＩＶ投与された後のカニクイザルにおける平均心拍数対時間を示す図。コカイン投与はｔ＝０で投与された。
【図３１】図３１は、１５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の３時間後に１ｍｇ／ｋｇのコカイン投与量でＩＶ投与された後のカニクイザルにおける平均心筋仕事量対時間を示す図。コカイン投与はｔ＝０で投与された。
【図３２】図３２は、１５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の３時間後に１ｍｇ／ｋｇのコカイン投与量でＩＶ投与された後のカニクイザルにおける平均体温対時間を示す図。コカイン投与はｔ＝０で投与された。
【図３３】図３３は、コカインまたは生理食塩水のいずれかが自己投与に利用され得た連続日数全体での自己投与期間中のリスザル反応速度（上段パネル）と注射回数（下段パネル）を示す図。応答は、ビヒクルまたはＡｌｂｕＢＣｈＥ投与（５ｍｇ／ｋｇ）後の５日間追跡された。
【図３４】図３４は、ＡｌｂｕＢＣｈＥまたはＡｌｂｕＢＣｈＥビヒクルの投与後のコカイン自己投与の回復のレベルを示す図。ＡｌｂｕＢＣｈＥまたはビヒクルはｉ．ｍ．で与えられた。２、４８および９６時間後、０．３ｍｇ／ｋｇコカインｉ．ｖ．（左パネル）または０．１ｍｇ／ｋｇのコカインｉ．ｖ．（右パネル）は、生理食塩水の置換期間前の５分間に与えられた。
【図３５】図３５は、ＡｌｂｕＢＣｈＥによってメタンフェタミンで訓練された対象におけるコカインの弁別刺激効果の調節を示す図。
【図３６】図３６は、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後のメタンフェタミンで訓練された対象におけるメタンフェタミンの弁別刺激効果を示す図。
【図３７】図３７は、アルブミン融合体が週１回服用され、非融合ペプチドが１日１回服用される場合、非融合ペプチドと比較したアルブミン融合体の相対的血清濃度を示す図。
【図３８】図３８は、ＣＨＯ細胞から精製されたＡｌｂｕＢＣｈＥのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図。レーン１は分子量マーカーであり、レーン２と４は、それぞれ還元および非還元条件下で精製されたＡｌｂｕＢＣｈＥを示す。
【図３９】図３９は、コカイン投与前の野生型ＢＣｈＥまたはＡｌｂｕ−ＣｏｃＨで処理されたラット、コカイン服用単独で与えられたラット、およびコカインおよびＢＣｈＥが与えられていないラットにおける、ビーム横断数対時間を示す図。運動活性は、Ｂｒｉｍｉｊｏｉｎらにおいて報告されるように、赤外線ビーム切断を検出することによって評価された。
【図４０】図４０は、ＡｌｂｕＢＣｈＥの投与後のマウスにおけるＡｌｂｕＢＣｈＥ濃度対時間を示し、同時に、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後のコカイン加水分解（コカイン投与の６０分以内にコカインが安息香酸に変換された割合（％ＢＡ）として表される）対時間を示す図。
【図４１】図４１は、尾静脈を介してＡｌｂｕＢＣｈＥ（３ｍｇ／ｋｇ）投与量または生理食塩水を与えられ、続いて１０分後、また尾静脈を介して３０μＣｉの３Ｈ−コカイン（３．５ｍｇ／ｋｇ）が与えられたラット（ｎ＝６）から回収された脳および心臓におけるコカイン含有量を示す図。脳および心臓は、３Ｈ−コカイン投与の１０分後に回収された。左から右へ、対照データはバー１と３であり、一方、ＡｌｂｕＢＣｈＥデータはバー２と４である。
【図４２】図４２は、３０μＣｉの３Ｈ−コカイン投与（３．５ｍｇ／ｋｇ）前の１０分間で、３ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与または生理食塩水が与えられたラットから回収された脳、心臓および血漿におけるコカイン（左プロット）および安息香酸レベル（右プロット）を示す図。脳、心臓および血漿は、コカイン投与の１０分後に回収された。
【図４３】図４３は、致死量から保護するＡｌｂｕＢＣｈＥの能力を調べる研究の実験的設計を示す図。
【図４４】図４４は、０、１、３、または１０ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥを投与の１０分後に与えられた１００ｍｇ／ｋｇコカインの投与に応答して、多動、発作、および死を示すラットの割合を示す図。
【図４５】図４５は、０、２、および１０ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥのＩＶ投与が与えられ、続いてその５分後、６０または１００ｍｇ／ｋｇのコカインのＩＰ投与が与えられたＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットにおけるコカイン濃度対時間を示す図。
【図４６】図４６は、中毒および再発の行動モデルを示す図。「Ｓ」および「Ｄ」は、それぞれ生理食塩水および薬物コカインを表す。動物をコカイン注入のためにレバー押しを自発するように訓練される。安定化（維持）後、コカインを生理食塩水に置換し、鎮静させる。その後の回復時期では、コカインのプライミング注射を行い、生理食塩水に代える。
【図４７】図４７は、ＡｌｂｕＢＣｈＥ処理に起因した薬物要求行動のコカイン刺激回復の選択的妨害を示す図。以前にコカインを自己投与したラットであって、コカインが生理食塩水で置換されたときに鎮静されるラットは、生理食塩水（Ｓ）、コカイン（Ｃ、１０ｍｇ／ｋｇ）、またはアンフェタミン（Ａ、２ｍｇ／ｋｇ）のＩＶ注射で刺激された。ＡｌｂｕＢＣｈＥは、行動期間の２時間前にＩＶ投与された（Ｅ、２ｍｇ／ｋｇ）。
【図４８】図４８は、生理食塩水注射、コカイン注射（１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）、またはＡｌｂｕＢＣｈＥ（２ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）後にコカイン（１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）注射されたラットにおいて、中毒段階および強制自制後の時期あたりのレバー押しの数を示す図。
【図４９】図４９は、単回の静脈内（ＩＶ）、皮下（ＳＣ）、または筋内（ＩＭ）注射後のカニクイザルにおけるＡｌｂｕＢＣｈＥ生物学的利用能、半減期、最大濃度に対する時間Ｔｍａｘを示す図。投与のＩＭおよびＳＣ経路についてのＡｌｂｕＢＣｈＥ絶対生物学的利用能は、３ｍｇ／ｋｇ投与レベルでのＩＶと比較して計算された。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、霊長類におけるコカイン暴露の生物学的影響を軽減するための方法であって、
（ａ）配列：
ＥＤＤＩＩＩＡＴＫＮＧＫＶＲＧＭＮＬＴＶＦＧＧＴＶＴＡＦＬＧＩＰＹＡＱＰＰＬＧＲＬＲＦＫＫＰＱＳＬＴＫＷＳＤＩＷＮＡＴＫＹＡＮＳＣＣＱＮＩＤＱＳＦＰＧＦＨＧＳＥＭＷＮＰＮＴＤＬＳＥＤＣＬＹＬＮＶＷＩＰＡＰＫＰＫＮＡＴＶＬＩＷＩＹＧＧＧＦＱＴＧＴＳＳＬＨＶＹＤＧＫＦＬＡＲＶＥＲＶＩＶＶＳＭＮＹＲＶＧＡＬＧＦＬＡＬＰＧＮＰＥＡＰＧＮＭＧＬＦＤＱＱＬＡＬＱＷＶＱＫＮＩＡＡＦＧＧＮＰＫＳＶＴＬＦＧＥＳＳＧＡＡＳＶＳＬＨＬＬＳＰＧＳＨＳＬＦＴＲＡＩＬＱＳＧＳＦＮＡＰＷＡＶＴＳＬＹＥＡＲＮＲＴＬＮＬＡＫＬＴＧＣＳＲＥＮＥＴＥＩＩＫＣＬＲＮＫＤＰＱＥＩＬＬＮＥＡＦＶＶＰＹＧＴＰＬＧＶＮＦＧＰＴＶＤＧＤＦＬＴＤＭＰＤＩＬＬＥＬＧＱＦＫＫＴＱＩＬＶＧＶＮＫＤＥＧＴＷＦＬＶＧＧＡＰＧＦＳＫＤＮＮＳＩＩＴＲＫＥＦＱＥＧＬＫＩＦＦＰＧＶＳＥＦＧＫＥＳＩＬＦＨＹＴＤＷＶＤＤＱＲＰＥＮＹＲＥＡＬＧＤＶＶＧＤＹＮＦＩＣＰＡＬＥＦＴＫＫＦＳＥＷＧＮＮＡＦＦＹＹＦＥＨＲＳＳＫＬＰＷＰＥＷＭＧＶＭＨＧＹＥＩＥＦＶＦＧＬＰＬＥＲＲＤＮＹＴＫＡＥＥＩＬＳＲＳＩＶＫＲＷＡＮＦＡＫＹＧＮＰＮＥＴＱＮＮＳＴＳＷＰＶＦＫＳＴＥＱＫＹＬＴＬＮＴＥＳＴＲＩＭＴＫＬＲＡＱＱＣＲＦＷＴＳＦＦＰＫＶ（配列番号１）、
を含む突然変異ブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）ポリペプチドと、
（ｂ）配列：
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ（配列番号２）
を含むヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ポリペプチドと、
（ｃ）配列ＭＲＰＴＷＡＷＷＬＦＬＶＬＬＬＡＬＷＡＰＡＲＧ（配列番号３）を含むシグナルペプチドと
を含む融合タンパク質のある量を霊長類に投与することを含み、
前記融合タンパク質の量は、霊長類におけるコカイン暴露の生物学的影響の軽減を引き起こすために有効である方法を提供する。
【００１１】
本方法の実施形態では、融合タンパク質は、配列：
ＭＲＰＴＷＡＷＷＬＦＬＶＬＬＬＡＬＷＡＰＡＲＧＥＤＤＩＩＩＡＴＫＮＧＫＶＲＧＭＮＬＴＶＦＧＧＴＶＴＡＦＬＧＩＰＹＡＱＰＰＬＧＲＬＲＦＫＫＰＱＳＬＴＫＷＳＤＩＷＮＡＴＫＹＡＮＳＣＣＱＮＩＤＱＳＦＰＧＦＨＧＳＥＭＷＮＰＮＴＤＬＳＥＤＣＬＹＬＮＶＷＩＰＡＰＫＰＫＮＡＴＶＬＩＷＩＹＧＧＧＦＱＴＧＴＳＳＬＨＶＹＤＧＫＦＬＡＲＶＥＲＶＩＶＶＳＭＮＹＲＶＧＡＬＧＦＬＡＬＰＧＮＰＥＡＰＧＮＭＧＬＦＤＱＱＬＡＬＱＷＶＱＫＮＩＡＡＦＧＧＮＰＫＳＶＴＬＦＧＥＳＳＧＡＡＳＶＳＬＨＬＬＳＰＧＳＨＳＬＦＴＲＡＩＬＱＳＧＳＦＮＡＰＷＡＶＴＳＬＹＥＡＲＮＲＴＬＮＬＡＫＬＴＧＣＳＲＥＮＥＴＥＩＩＫＣＬＲＮＫＤＰＱＥＩＬＬＮＥＡＦＶＶＰＹＧＴＰＬＧＶＮＦＧＰＴＶＤＧＤＦＬＴＤＭＰＤＩＬＬＥＬＧＱＦＫＫＴＱＩＬＶＧＶＮＫＤＥＧＴＷＦＬＶＧＧＡＰＧＦＳＫＤＮＮＳＩＩＴＲＫＥＦＱＥＧＬＫＩＦＦＰＧＶＳＥＦＧＫＥＳＩＬＦＨＹＴＤＷＶＤＤＱＲＰＥＮＹＲＥＡＬＧＤＶＶＧＤＹＮＦＩＣＰＡＬＥＦＴＫＫＦＳＥＷＧＮＮＡＦＦＹＹＦＥＨＲＳＳＫＬＰＷＰＥＷＭＧＶＭＨＧＹＥＩＥＦＶＦＧＬＰＬＥＲＲＤＮＹＴＫＡＥＥＩＬＳＲＳＩＶＫＲＷＡＮＦＡＫＹＧＮＰＮＥＴＱＮＮＳＴＳＷＰＶＦＫＳＴＥＱＫＹＬＴＬＮＴＥＳＴＲＩＭＴＫＬＲＡＱＱＣＲＦＷＴＳＦＦＰＫＶＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ（配列番号４）
を含む。
【００１２】
本方法の別の実施形態では、融合タンパク質はコカイン暴露前に投与される。
【００１３】
別の実施形態では、融合タンパク質は、コカイン暴露前の１日以内に投与される。
【００１４】
別の実施形態では、融合タンパク質は、コカイン暴露前の２１６時間以内に投与される。融合タンパク質は、コカイン暴露の１、２、３、４、５、６、７、８、または９日前に投与されてもよい。
【００１５】
本方法のなお別の実施形態では、融合タンパク質はコカイン暴露後に投与される。更なる実施形態では、融合タンパク質は、コカイン暴露後の６時間以内に投与される。別の実施形態では、融合タンパク質は、コカイン暴露後の１時間以内に投与される。
【００１６】
本方法のなお別の実施形態では、コカイン暴露は単回コカイン暴露である。
【００１７】
本方法のなお別の実施形態では、コカイン暴露は反復コカイン暴露である。本方法の更なる実施形態では、反復コカイン暴露はコカイン乱用またはコカイン依存である。
【００１８】
本方法のなお別の実施形態では、反復コカイン暴露は、１２カ月の期間において少なくとも６回の単回コカイン暴露を含む。
【００１９】
本方法のなお別の実施形態では、反復コカイン暴露は、霊長類の生涯において少なくとも２０回の単回コカイン暴露を含む。
【００２０】
本方法のなお別の実施形態では、生物学的影響は霊長類におけるコカイン過剰投与によって引き起こされ、軽減が生物学的影響を治療または予防する。
【００２１】
本方法のなお別の実施形態では、生物学的影響は血圧上昇である。
【００２２】
本方法の更なる実施形態では、血圧上昇の持続時間は６０〜９０％低減する。
【００２３】
本方法の更なる実施形態では、血圧上昇の持続時間は約７８％低減する。
【００２４】
本方法のなお別の実施形態では、生物学的影響は心拍数または体温の上昇である。本方法の更なる実施形態では軽減の程度は４５％〜７０％である。本方法の更なる実施形態では、軽減の程度は５７％である。
【００２５】
本方法のなお別の実施形態では、生物学的影響は霊長類におけるコカイン要求行動である。
【００２６】
本方法の別の実施形態では、コカイン要求行動はコカイン暴露後のコカイン自制期間中に起こる。
【００２７】
本方法のなお別の実施形態では、コカイン要求行動は再発後に起こる。
【００２８】
本方法のなお別の実施形態では、再発の２時間前の融合タンパク質の投与は、再発直後の霊長類によるコカイン要求行動を軽減する。
【００２９】
本方法のなお別の実施形態では、コカイン暴露の２時間前の融合タンパク質の投与は、霊長類によるコカイン要求行動の５０％〜１００％の減少をもたらす。
【００３０】
本方法のなお別の実施形態では、コカイン要求行動の軽減は、融合タンパク質の投与後の４日以内に観察される。
【００３１】
本方法のなお別の実施形態では、融合タンパク質の投与は、投与しない場合よりも霊長類における総コカイン暴露の低下をもたらす。
【００３２】
本方法のなお別の実施形態では、コカイン要求行動の軽減は、霊長類におけるコカイン自制期間をもたらす。本方法の更なる実施形態では、自制期間は２週〜３週である。
【００３３】
本方法のなお別の実施形態では、コカイン要求行動の軽減は、投与しない場合よりも、霊長類がコカインに暴露されない日数の割合を大きくする。
【００３４】
本方法のなお別の実施形態では、コカイン要求行動の軽減は、投与しない場合よりも、霊長類がコカインに暴露されない連続日数を大きくする。
【００３５】
本方法のなお別の実施形態では、コカイン要求行動の軽減は、コカイン選択的重度評価（ＣＳＳＡ）または精神障害の診断と統計の手引ＩＶ（ＤＳＭ−ＩＶ）によって評価されるように、コカイン依存または乱用の重度の低下をもたらす。
【００３６】
本方法のなお別の実施形態では、融合タンパク質の有効量は、霊長類の血清コカインレベルを１ｍｇ／ｋｇ静脈内コカイン投与の約３０分以内に約０ｍｇ／ｍｌまで減少させる量である。
【００３７】
本方法のなお別の実施形態では、融合タンパク質の投与は、霊長類の血清コカインレベルを、１ｍｇ／ｋｇ静脈内コカイン投与の約５分以内に、投与しない場合の血清コカインレベルの１２％未満まで減少させる。
【００３８】
本方法のなお別の実施形態では、融合タンパク質の投与は、霊長類の血清コカインレベルを、１ｍｇ／ｋｇ静脈内コカイン投与の約５分以内に、投与しない場合の血清コカインレベルの７％まで減少させる。
【００３９】
本方法のなお別の実施形態では、融合タンパク質は、１回だけ、１日１回、週２回、週１回、月２回、または月１回投与される。
【００４０】
別の実施形態では、融合タンパク質は週１回または週２回投与される。
【００４１】
別の実施形態では、融合タンパク質は、コカイン暴露後の単回投与として投与される。
【００４２】
別の実施形態では、融合タンパク質は、コカイン過剰投与後に単回投与として投与される。
【００４３】
本方法のなお別の実施形態では、融合タンパク質は、筋内注射または皮下注射によって投与される。
【００４４】
本方法のなお別の実施形態では、融合タンパク質は、１０ｍＭリン酸ナトリウムと、２００ｍＭマンニトールと、６０ｍＭトレハロースと、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０とを含むｐＨ７．２の製剤緩衝液中にある。
【００４５】
本方法のなお別の実施形態では、融合タンパク質が少なくとも３０ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤に存在する。
【００４６】
本方法のなお別の実施形態では、生物学的影響の軽減は、融合タンパク質の投与後の７２時間以内に観察される。
【００４７】
本方法のなお別の実施形態では、霊長類はヒトである。
【００４８】
本方法の更なる実施形態では、コカイン暴露は、１０ｍｇ〜６０ｍｇの単回コカイン暴露であるかまたは反復コカイン暴露であり、反復コカイン暴露の各単回コカイン暴露は１０ｍｇ〜６０ｍｇである。
【００４９】
本方法のなお別の実施形態では、融合タンパク質の有効量は、４０ｍｇの静脈内コカイン投与の約３０分以内に、約０ｎｇ／ｍｌまでヒト血清コカインレベルを低減させる量である。
【００５０】
本方法のなお別の実施形態では、融合タンパク質の有効量は０．０６ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇである。本方法の別の実施形態では、融合タンパク質の有効量は０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、または４．８ｍｇ／ｋｇである。
【００５１】
本方法のなお別の実施形態では、融合タンパク質の有効量は５０ｍｇ〜３００ｍｇである。本方法の別の実施形態では、融合タンパク質の有効量は５０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、または３００ｍｇである。
【００５２】
アミノ酸置換Ａ２２７Ｓと、Ｓ３１５Ｇと、Ａ３５６Ｗと、Ｙ３６０Ｇとを含むＢＣｈＥ−アルブミン融合タンパク質の実施形態を図１に示す（配列番号４）。図１に示されるアミノ酸配列は、下線によって示される異種シグナルペプチドと、ヒトＢＣｈＥのアミノ酸Ｅ２９〜Ｖ５２９を含むＢＣｈＥドメインと、イタリック体で示されるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とを含む。アミノ酸置換Ａ２２７Ｓと、Ｓ３１５Ｇと、Ａ３５６Ｗと、Ｙ３６０Ｇとをボールド体で示し、図１では下線が付されている。置換の番号は、全長ＢＣｈＥの番号に相対する。図１のアミノ酸配列によってコードされるタンパク質は、本明細書全体で「ＡｌｂｕＢＣｈＥ」と呼ばれる。
【００５３】
本発明の上述された実施形態の全ての組み合わせは本発明の範囲内であることが理解される。
【００５４】
本明細書で使用するとき、「霊長類」とは、特に、両眼視力の高度な発達、握るための手足の構造の特殊化、および大脳半球の拡大によって特徴付けられ、ヒト、類人猿、サル、および関連形態を含む哺乳動物のいずれの目を指す。
【００５５】
本明細書で使用するとき、「軽減の程度」とは、ＢＣｈＥ−アルブミン融合タンパク質において観察されたコカイン暴露の生物学的影響と比較して、ＢＣｈＥ−アルブミン融合タンパク質の投与後に観察されるコカイン暴露の生物学的影響の減少を指す。軽減の程度は、以下の式：
【数１】
2013512959.tif 000002
【００５６】
によって計算される。
【００５７】
例えば、コカイン暴露がＢＣｈＥ−アルブミン融合タンパク質の不存在下で３８℃〜３８．７℃の基準温度を上昇させ、コカイン暴露がＢＣｈＥ−融合タンパク質の存在下で３８℃〜３８．３℃の基準温度を上昇させる場合、軽減の程度は５７．１％（（０．７℃−０．３℃）／０．７℃）である。
【００５８】
本明細書で使用するとき、「単回コカイン暴露」とは、任意の他のコカイン暴露から分離された１つのコカイン暴露を指す。「反復コカイン暴露」とは、１回を超える単回コカイン暴露を指す。反復コカイン暴露は、対象における第２または続く単回コカイン暴露で開始する単回コカイン暴露の規則的または不規則的パターンであってもよい。コカイン暴露の反復を経験する個体は、精神障害の診断と統計の手引ＩＶ（ＤＳＭ−ＩＶ）のコカイン依存またはコカイン乱用についての基準を満たしている可能性がある。
【００５９】
本明細書で使用するとき、用語「総コカイン暴露」とは、所定の時間間隔中の総計のコカイン暴露を指す。総コカイン暴露は、コカイン要求行動またはコカイン暴露の他の生物学的影響を軽減するように設計された治療期間中または治療期間後に測定されてもよい。
【００６０】
本明細書で使用するとき、用語「コカイン自制の期間」とは、霊長類が新たなコカイン暴露を経験しないコカイン暴露後の期間を指す。
【００６１】
本明細書で使用するとき、用語「再発」とは、コカイン自制の期間後のコカイン暴露を指す。
【００６２】
パラメータ範囲が与えられる場合、その範囲内の整数の全ての１０分の１は本発明によって与えられる。例えば、「０．２ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ」は、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇなど、最大１５．０ｍｇ／ｋｇ（これを含む）を含む。
【００６３】
動物の投与量は、刊行物「Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ：  Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｄｏｓｅ  ｉｎ  Ｉｎｉｔｉａｌ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ」（米国保健福祉省食品医薬品局医薬品評価研究センター（ＣＤＥＲ）、２００５年７月）に見出される変換表を用いることによってヒト等価線量（ＨＥＤ）に変換されてもよい。カニクイザルに対する投与量（ｍｇ／ｋｇ）は、カニクイザル投与量を３．１で割ることによってＨＥＤ（ｍｇ／ｋｇ）に変換され得る。リスザルに対する投与量（ｍｇ／ｋｇ）は、リスザル投与量を５．３で割ることによってＨＥＤ（ｍｇ／ｋｇ）に変換され得る。
【００６４】
略語のリスト
ＡＵＣ（０−ｔ）  時間ゼロから最後の検出可能な濃度までの血漿濃度−時間曲線下の面積（ｔｚ）
ＡＵＣ（０−∞）  時間ゼロから無限までの血漿濃度−時間曲線下の面積
％ＡＵＣｅｘ  ｔｚから無限までの外挿によるＡＵＣの割合
ＢＣｈＥ  ブチルコリンエステラーゼ
ＢＱＬ  定量限界以下
ＣＬ  クリアランス
Ｃｍａｘ  最大濃度
ＣｏｃＨ  コカイン加水分解酵素
ＥＬＩＳＡ  酵素免疫測定法
ＧＦＲ  糸球体ろ過量
ｈｒ  時間（時）
ＨＲＰ  西洋ワサビペルオキシダーゼ
ＩＭ  筋内
ＩＶ  静脈内
ＬＬＯＱ  定量化の下限
ｍｉｎ  分（ｓ）
ＮＣＡ  非コンパートメント分析
ＮＩＤＡ  国立薬物乱用研究所
ＰＢＳ  リン酸緩衝生理食塩水
ＰＤ  薬力学
ＰＫ  薬物動態
ＲＴ  室温
Ｒｓｑ  決定係数
％ＲＳＤ  相対的標準偏差率
ＳＤ  標準偏差
ＳＣ  皮下
ＳＯＰ  標準操作プロトコール
ｔ１／２  終末段階の半減期
ｔｍａｘ  最大濃度の時間
Ｖｚ  終末段階からの分布量
図１に示されるＢＣｈＥ−アルブミン融合タンパク質（ＡｌｂｕＢＣｈＥ）は、下記の実験に記載されるように試験に適用された。
【００６５】
例１
カニクイザルへのＡｌｂｕＢＣｈＥの単回筋内投与および複数の静脈投与後の薬物動態および薬力学研究
目的
この試験の目的は、０．２、１または５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与レベルで単回筋内投与後の雄性カニクイザルにおけるＡｌｂｕＢＣｈＥの薬物動態（ＰＫ）プロフィールを決定し、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の投与後の２、４８、９６、１２０、および２４０時間でのコカインの１ｍｇ／ｋｇ投与量の静脈投与による時間の関数としてＡｌｂｕＢＣｈＥ活性を決定することであった。
【００６６】
論理的根拠
ＡｌｂｕＢＣｈＥはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の融合タンパク質であり、コカインを安息香酸に加水分解する高い触媒効率を示すヒトブチルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）の一般的な修飾形態である。ＡｌｂｕＢＣｈＥは、薬物要求行動の再発を妨げる潜在的な介入として開発中である。タンパク質のアルブミンへの融合は、クリアランスを減らし、半減期を増加させることによって、タンパク質の薬物動態特性を改善することが示されている。より長期の半減期は、薬物処方とともに、より長期の投与間隔とより良好なコンプライアンスになるように期待される。
【００６７】
種選択に関する論理的根拠
カニクイザル（アカゲザル）は、ヒトに対する解剖学的、生理学的、および生化学的類似性に基づいて本研究のために選択され、これは、観察された薬物動態および薬理学特性のヒトへの外挿を促進し得る。サルは、ブチリルコリンエステラーゼを発現することが知られ、これは本薬物の成分である。また、サルは、生理学的にはコカインに反応性である。
【００６８】
投与レベルおよび経路に関する論理的根拠
従前の研究では、ＡｌｂｕＢＣｈＥ薬物動態プロフィールはカニクイザルにおいて評価された。その研究では、被験物質は、ＳＣ（７．８、２．４および０．７８ｍｇ／ｋｇ）、ＩＭ（２．４ｍｇ／ｋｇ）、ＩＭ（２．４ｍｇ／ｋｇ）投与された。ＡｌｂｕＢＣｈＥの薬物動態プロフィールは、測定されたＳＣ投与全体で直線的であった。本研究についてＩＭの選択は、従前の研究において観察されたＳＣ（それぞれ７９％と３５〜３９％）と比較して、ＩＭにおけるより大きな生物学的利用能に基づいていた。さらに、０．２、１および５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥのＩＭ投与レベルは、カニクイザルにおけるＡｌｂｕＢＣｈＥの薬力学範囲を画定するために選択された。
【００６９】
１ｍｇ／ｋｇでのコカインＩＶ投与は、生理学的関連応答を得て、血中のコカインの測定可能な濃度を達成するのに十分に高い投与量として選択され、これは、動物を過剰に反応させない。
【００７０】
各群の動物の数は、動物間の変動の評価のために必要な群あたりの動物の最小数である。これはプロット研究であるため、ただ１つの性（雄）が評価された。
【００７１】
試験溶液
被験物質であるＡｌｂｕＢＣｈＥは、−７０±１５℃で２９．９ｍｇ／ｍＬを含む凍結液剤として保存溶液中で保存された。投与前に、被験物質製剤を室温で融解した。被験物質製剤を完全に融解したとき、容器を緩やかに反転させることによって混合し、濃度が２０ｍｇ／ｍＬに達するように被験物質の希釈物の適切な溶液を用いて希釈した。この製剤は、４および０．８ｍｇ／ｍＬの濃度に達するように被験物質の希釈物を用いて連続的に希釈された。
【００７２】
薬力学被験物質として塩酸コカインをＳｉｇｍａから購入した。投与レベルは、塩酸塩として表された。
【００７３】
実験設計
本研究は、４つの投与群に分けられた１１匹の実験に使われていない成熟雄性カニクイザルを含んだ：
コカインの単回ＩＶ投与だけを受けた２匹のカニクイザルの対照群；
０．２、１または５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥの単回ＩＭ投与を用いて処理された３つの投与群。３匹の実験に使用されていない雄性カニクイザルを各投与群において使用した。ＡｌｂｕＢＣｈＥ処理後、１ｍｇ／ｋｇのＩＶ投与のコカインは、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の２、４８、９６、１２０、および２４０時間後に投与された。
【００７４】
投与記号および投与レベルの概要を表１に見出すことができる。個々の投与量は、投与の日に記録される体重に基づいて計算された。動物は、投与の投与前に絶食された。
【表１】
2013512959.tif 000003
【００７５】
ＡｌｂｕＢＣｈＥに関する試料回収
ＡｌｂｕＢＣｈＥの単回筋内（ＩＭ）投与は、試験第１日に投与され、血液は表２に概要される時間点で回収された。約０．５ｍＬの全血が大腿静脈から血清分離管（ＳＳＴ）に回収された。
【表２】
2013512959.tif 000004
【００７６】
コカインに関する試料回収
全血の約０．５ｍＬは、コカインの各投与の５、１０、１５、２０、３０、４０および６０分後に大腿静脈から回収された（対照群の試験第１日、およびＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の投与後の試験第１日（２時間）、第３日（４８時間）、第５日（９６時間）、第６日（１２０時間）、および第１１日（２４０時間））。血液は、エステラーゼ阻害剤であるジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）を含むＫ２ＥＤＴＡ血液回収管に入れた。これらの管を数回反転し、回収時に氷水上に置いた。試料は、回収の４５分以内に２〜８℃で遠心分離された。得られた血漿を回収し、血漿の単一の２００μＬの分割量をポリプロピレンチューブに入れた。血漿試料をドライアイス上で凍結し、−７５±１５℃で保存した。
【００７７】
アッセイ法
下記の概要は、投与前、および投与後の異なる時間で得られたサル血清試料におけるＡｌｂｕＢＣｈＥ濃度の測定に使用されたＥＬＩＳＡに基づくアッセイを記述する。
【００７８】
Ｉｍｍｕｌｏｎ  ４  ＨＢＸプレートは、ＰＢＳ中１ｕｇ／ｍＬである１００μＬの抗ＢＣｈＥ  ｍＡｂ００２−０１（Ａｂｃａｍ  ａｂ  １７２４６）を用いて、一晩４℃にて被覆される。ブロッキングは、１×ＰＢＳ中の２％カゼイン、２００μＬ／ウェル、２時間室温にて行われる。洗浄後、１００μＬの希釈血清試料を標準とともにプレートに添加される。標準は、２０００から３．１ｎｇ／ｍＬまでＡｌｂｕＢＣｈＥの３．６４倍の連続希釈を通じて生じさせた。血清試料および標準は、貯蔵されたカニクイザル血清を含む緩衝液を用いた希釈によって、１０％血清で維持される。洗浄ステップは、０．０４μｇ／ｍＬの１００μＬの抗ＨＳＡ  ｍＡｂ−６５０２−ＨＲＰを用いて１時間、検出に先立って行われる。１００μｌのＴＭＢ基質を用いた発色前に再度ウェルを洗浄する。１５分後、反応を１００μＬ／ウェルの１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止させ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー上で４５０／５７０ｎｍにて読み込んだ。未知の血清試料の値は、ＡｌｂｕＢＣｈＥ標準の４パラメータフィットによって生じさせた標準曲線の内挿によって計算される。カニクイザル血清における定量限界は２１．１ｎｇ／ｍＬであった。
【００７９】
血清中のコカインのＬＣ−ＭＳ定量化
以下の概要は、血清試料中のコカインを測定するために使用されたＬＣ−ＭＳに基づくアッセイを記述する。ＭＳ分析前に、血漿試料、較正標準および対照は、支持された液体抽出（ＳＬＥ−ＩＳＯＬＵＴＥ，Ｂｉｏｔａｇｅ）を用いて抽出された。２５マイクロリットルの試料（２５μＬ）は、１５０μＬの５％水酸化アンモニウムと２５μｌの内部標準溶液（コカイン−ｄ３）を受け入れた。混合し、ＳＬＥプレートに移した後、塩化メチレンを用いて試料を抽出し、乾燥するまで蒸発させた。５０μｌの再構成溶液−水中の１０ｍＭ酢酸アンモニウムにおける５％ＡＣＮ中の再懸濁後、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカラムに０．５ｍｌ／分で１０μｌを注入した。移動相を二相にした。質量分析検出は、Ａｐｉ４０００、ＡＰＣＩ陽性インターフェイス、および多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を用いて行われた。コカイン、ベンゾイルエクゴニンおよびエクゴニンメチルエステルの血漿濃度は、このアッセイを用いて決定された。
【００８０】
ＡｌｂｕＢＣｈＥのＰＫ分析
ＡｌｂｕＢＣｈＥ薬物動態パラメータ値は、個々の動物について、血清濃度−時間プロフィールを用いて決定された。コンピュータソフトウェアＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（バージョン４．０．１  Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）を用いた。具体的には、血管外インプットを用いる非コンパートメント分析用モデルを適用した。血清濃度曲線の最終段階において３データ点よりも少ない場合、最終段階の半減期および半減期から由来するＰＫパラメータはそのプロフィールについて計算されなかった。分析されたパラメータは、ｔｍａｘ、Ｃｍａｘ、ｔ１／２、ＡＵＣ（０−ｔ）およびＡＵＣ（０−∞）を含み、これらが計算された。
【００８１】
コカインのＰＫ分析
データが許容される場合、コカインとその代謝物に関する薬物動態パラメータは、コカイン投与の全ての研究日で個々の動物について血清濃度−時間プロフィールを用いて決定された。コンピュータソフトウェアＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（バージョン４．０．１  Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）を用いた。具体的には、非コンパートメント分析のためのモデルは、コカインについてはＩＶボーラスインプット、その代謝物については血管外インプットとともに用いられる。血漿濃度曲線の最終段階における３データ点より少ない場合、最終段階半減期とその半減期に由来するＰＫパラメータは、そのプロフィールについて計算されなかった。
【００８２】
ＰＫ／ＰＤ分析
ＡｌｂｕＢＣｈＥ  ＰＫ／ＰＤ関係は、コンピュータソフトウェアＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（バージョン４．０．１  Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）を用いて定義された。具体的には、直接的なＳ字阻害効果Ｅｍａｘモデルは、コカインＡＵＣによって測定される最大効果（Ｅｍａｘ）が、ＡｌｂｕＢＣｈＥ濃度がゼロとして推定される使用であった。このモデル方程式は、以下の通りに記載することができる：
阻害効果Ｓ字Ｅｍａｘ、Ｃ＝Ｅｍａｘで０、Ｃ＝Ｅ０で∞
Ｅ＝Ｅｍａｘ−（Ｅｍａｘ−Ｅ０）＊（Ｃ＊＊Ｇａｍｍａ／（Ｃ＊＊Ｇａｍｍａ＋ＥＣ５０＊＊Ｇａｍｍａ））
Ｓ字モデルは、２時間の時間点と比較して、４８時間の時間点で観察された高い活性により選択された。
【００８３】
この分析に使用されるＰＤパラメータはコカインＡＵＣであった。このモデルで使用されるＰＫパラメータは、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の２、４８、９６、１２０、および２４０時間後のＡｌｂｕＢＣｈＥ血漿濃度であった。ＡｌｂｕＢＣｈＥ濃度がＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の２時間後に測定されなかったという事実に起因して、投与の３時間後の濃度がこの分析で用いられ、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の３時間後のＡｌｂｕＢＣｈＥ濃度が、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の２時間後のＡｌｂｕＢＣｈＥ濃度を反映し得ると想定される。
【００８４】
統計的方法
実験群による濃度プロフィールとＰＫパラメータ値の簡易統計データは、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎにおける記述的統計関数を用いて計算された。報告されている統計パラメータは、Ｎ、平均、ＳＤおよび変動係数率（％ＣＶ）である。
【００８５】
結果
ＡｌｂｕＢＣｈＥ濃度プロフィール
ＡｌｂｕＢＣｈＥ濃度−時間データおよび簡易統計データを表３および４に列挙する。０．２、１または５ｍｇ／ｋｇの単回ＡｌｂｕＢＣｈＥ  ＩＭ注射後の個々の動物ＡｌｂｕＢＣｈＥ血清濃度−時間プロフィールを図２に示す。３つのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与群についての平均血清濃度−時間プロフィールを図３に示す。
【００８６】
ＩＭ注射後、全ての動物は、測定可能なＡｌｂｕＢＣｈＥ濃度を有した。投与群あたりの動物間変動性は、全ての時間点について８．２〜７８．４の範囲にある％ＣＶによって示されるように妥当であると考えられる。ＡｌｂｕＢＣｈＥ血清濃度は投与量の増加に伴って増加した。
【表３−１】
2013512959.tif 000005
【表３−２】
2013512959.tif 000006
【表４】
2013512959.tif 000007
【００８７】
コカイン、ベンゾイルエクゴニンおよびエクゴニンメチルエステルの濃度プロフィール
ＬＣ／ＭＳ分析は、サル血漿におけるコカイン、ベンゾイルエクゴニンおよびエクゴニンメチルエステルレベルを分析するために全ての試料について行われた。対照動物において、および０．２、１、または５ｍｇ／ｋｇ後の平均血漿濃度−時間プロフィールは、それぞれコカイン、ベンゾイルエクゴニンおよびエクゴニンメチルエステルについて、表５、６、および７、ならびに図４、５、および６に見出すことができる。
【００８８】
一般に、コカイン血漿濃度は、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の関数として減少し、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後の時間の関数として増加するようである。ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の２４０時間後のコカイン濃度は、第１日のコカイン対照群と同じ範囲にあるようである（図７）。これは、ＡｌｂｕＢＣｈＥが、０．２、１または５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の２４０時間後に活性でなかったことを示唆する。また、これは、コカイン動力学が、第１日の単回ＩＶ投与のコカインと、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後の複数回投与のコカインプロフィールとの比較を実施可能にする、カニクイザルにおける時間依存的な動力学を示さないことを指示する。
【００８９】
コカイン代謝経路に基づいて期待され得るように（図９）、ベンゾイルエクゴニン血漿濃度は、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の関数として減少し、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後の時間の関数として増加するようである。
【００９０】
理論的には、エクゴニンメチルエステルの血漿濃度は、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後に増加しなければならない（図９）。この増加は、３つ全てのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与レベルについてのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の２時間後に投与されるコカイン投与でのみ明らかであった。エクゴニンメチルエステル血漿濃度は、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の４８、９６、１２０または２４０時間後のコカイン投与後に、対照と容易に区別することができなかった。
【表５】
2013512959.tif 000008
【表６】
2013512959.tif 000009
【表７】
2013512959.tif 000010
【００９１】
ＡｌｂｕＢＣｈＥの薬物動態分析
個々の動物の０．２、１または５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の単回ＩＭ投与後のＡｌｂｕＢＣｈＥ薬物動態パラメータ値および群あたりの記述統計データを表８に見出すことができる。０．２、１または５ｍｇ／ｋｇのＩＭ投与後のＡｌｂｕＢＣｈＥについての平均ＰＫパラメータ値を表９に要約する。
【００９２】
一般に、投与のＩＭ部位からの吸収は迅速であり、測定可能な濃度が回収された第１の試料（投与の１時間後）で観察された。最大濃度は、０．２および１ｍｇ／ｋｇ投与レベルについて３時間にて観察された。Ｔｍａｘ値は、５ｍｇ／ｋｇ投与について僅かに長かった（６時間）。
【００９３】
投与量増加に伴って増加させたＡｌｂｕＢＣｈＥ暴露
投与量を標準化させてＣｍａｘおよびＡＵＣ値は、投与量の関数としての暴露における比例増加よりも多くを示唆する投与量の関数として増加するようである。また、これは、特に１と５ｍｇ／ｋｇ投与レベル間の投与量の関数として最終排除ｔ１／２の増加を伴われた。この場合、ｔ１／２値はほぼ２倍であった。
【表８】
2013512959.tif 000011
【表９】
2013512959.tif 000012
【００９４】
コカインおよび代謝物の薬物動態分析
投与群あたりの平均コカイン薬物動態値の概要表を表１０に示す。
【００９５】
コカイン薬物動態プロフィールは、全ての投与群と時間点について十分に特徴付けられたが、１つの例外は、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の２時間後に投与されたコカイン投与についての血漿濃度−時間プロフィールは全ての投与群に対して変動的であった。このようにして、最終排除ｔ１／２は、このコカイン投与の場合、大部分の動物において正確に特徴付けることができなかった。
【００９６】
コカインＡＵＣ（０−ｔ）は、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の関数として減少し、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後の時間の関数として増加するようである。同様に、コカイン全身血漿クリアランスは、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の関数として増加し、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後の時間の関数として対照値に戻るようである。ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の２４０時間後に、コカインＡＵＣおよびクリアランスは、第１日のコカイン対照群と同じ範囲になるようである。
【００９７】
３つ全てのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与レベルについて、コカインクリアランスまたはＡＵＣにおける最大ＡｌｂｕＢＣｈＥ効果は、投与の４８時間後に観察された。効果の持続時間は、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与レベルに関連付けられた。５ｍｇ／ｋｇ投与後、コカインＡＵＣとクリアランスにおけるＡｌｂｕＢＣｈＥ効果は、投与後の１２０時間以内は明らかであった。１ｍｇ／ｋｇ投与で、コカインＡＵＣまたはクリアランスにおけるＡｌｂｕＢＣｈＥ効果は、対照または２４０時間の値と比較して、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の９６〜１２０時間後でなおも明らかであり得る。ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与が０．２ｍｇ／ｋｇに減少したので、それにより、４８時間という効果の持続時間はコカインクリアランスが増加した最後の時間点であった。このデータに基づいて、ＡｌｂｕＢＣｈＥの週１回または週２回の投与処方が可能である。
【００９８】
図５に観察され得るように、ベンゾイルエクゴニンの濃度−時間プロフィールは、最終排除段階を含まなかった。このようにして、ベンゾイルエクゴニンの薬物動態特徴付けは、ＡＵＣ（０−ｔ）の特徴付けに限定された。コカイン対照群と比較したＡｌｂｕＢＣｈＥ投与量とＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後の時間の関数としての平均ＡＵＣ値の概要表を表１１に見出すことができる。コカイン代謝経路（図９）と一致して、図１１に示されるように、ベンゾイルエクゴニンＡＵＣはＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の関数として減少したが、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後の時間の関数として増加する。
【００９９】
図６において観察され得るように、エクゴニンメチルエステルの濃度−時間プロフィールは平らであり、最終排除段階を含まなかった。このようにエクゴニンメチルエステルの薬物動態特徴付けは行われなかった。理論的には、エクゴニンメチルエステルＡＵＣは、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後に増加するべきである（図９）。この増加は、３つ全てのＡｌｂｕＢＣｈＥレベルについてのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の２時間後に投与されたコカイン投与でのみ明らかであった。エクゴニンメチルエステルにおけるＡｌｂｕＢＣｈＥ効果は、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の４８、９６、１２０または２４０時間後のコカイン投与後に対照と容易に区別することができなかった。
【表１０】
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【表１１】
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【０１００】
ＰＫ／ＰＤ分析
ＡｌｂｕＢＣｈＥの作用機構に基づいて、直接的効果阻害ＥｍａｘモデルはＡｌｂｕＢＣｈＥとコカインのＰＫ／ＰＤ関係を特徴付けることができることが予測された。
【０１０１】
この分析に使用されるＰＫおよびＰＤデータを表１２に示す。直接的なＳ字阻害効果Ｅｍａｘモデルから得られた適合を図８に示す。
【０１０２】
データは、明らかに、ＡｌｂｕＢＣｈＥ血清濃度とコカイン暴露との間の逆関係を示す。コカイン濃度の５０％減少をもたらし得るＡｌｂｕＢＣｈＥ血清濃度（ＥＣ５０）は、約６００ｎｇ／ｍＬとなるモデルによって推定された。Ｅｍａｘ、Ｅ０、およびガンマ値は、それぞれ１２９０９（分＊ｎｇ／ｍＬ）、１０９６（分＊ｎｇ／ｍＬ）、および０．７０８であった。
【表１２】
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【０１０３】
動物観察
試験全体で動物を観察した。この試験中に死亡はなく、いずれかの投与量でＡｌｂｕＢＣｈＥの投与と関連した臨床またはケージサイズ観察はなかった。被験物質による前処理なしの１ｍｇ／ｋｇの投与量でのコカイン投与は、活動過剰をもたらし、腹式呼吸を含む呼吸数を増加させた。コカインに関連した観察は、０．２〜５ｍｇ／ｋｇの範囲のＡｌｂｕＢＣｈＥ投与量で被験物質を用いて前処理した後の５日間は観察せず、試験第６日と第１１日に戻した。
【０１０４】
結論
ＡｌｂｕＢＣｈＥは、０．２、１または５ｍｇ／ｋｇの単回ＩＭ投与後のカニクイザルにおいて十分に容認された。
【０１０５】
投与のＩＭ部位からのＡｌｂｕＢＣｈＥ吸収は迅速であった。Ｔｍａｘは、０．２と１ｍｇ／ｋｇについて３時間、５ｍｇ／ｋｇ投与について６時間で観察された。ＡｌｂｕＢＣｈＥ暴露は、投与量の関数として、増幅幅が大きくなるように増加するようである。最終排除ｔ１／２は、１と５ｍｇ／ｋｇ投与レベル間で３１〜６２時間増加した。
【０１０６】
コカインは、第１日の対照動物に、ならびにＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の２、４８、９６、１２０および２４０時間後に投与された。各コカイン投与後、ＡｌｂｕＢＣｈＥの血清レベルの減少に応答して、薬物動態プロフィールを決定するという目的で複数の試料を採取した。コカインＡＵＣ（０−ｔ）はＡｌｂｕＢＣｈＥ投与量の関数として減少し、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後の時間の関数として増加した。
【０１０７】
効果の持続期間はＡｌｂｕＢＣｈＥ投与レベルに関連していた。コカインＡＵＣおよびクリアランスにおけるＡｌｂｕＢＣｈＥ効果は、５ｍｇ／ｋｇ投与量について１２０時間、１ｍｇ／ｋｇ投与量について９６〜１２０時間、０．２ｍｇ／ｋｇ投与量について４８時間まで明らかであった。このデータに基づくと、ＡｌｂｕＢＣｈＥの週に１回または２回の投与処方が可能である。
【０１０８】
カニクイザルにおけるＰＫ／ＰＤ関係は、ＡｌｂｕＢＣｈＥ血清濃度とコカイン暴露との間の逆関係を示すようである。コカイン濃度の５０％減少をもたらし得るＡｌｂｕＢＣｈＥ血清濃度（ＥＣ５０）は、約６００ｎｇ／ｍＬとなる直接的なＳ字阻害効果Ｅｍａｘモデルモデルによって推定された。
【０１０９】
例２
リスザルにおけるＡｌｂｕＢＣｈＥ薬物動態薬力学（ＰＫ／ＰＤ）試験
目的
リスザルに対してＡｌｂｕＢＣｈＥの１回の５ｍｇ／ｋｇ筋内注射後のＡｌｂｕＢＣｈＥ薬物動態と薬力学を評価すること。ＡｌｂｕＢＣｈＥ薬力学的効果は、対照動物における１ｍｇ／ｋｇの投与量、またはＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の２、７２および９６時間後のコカインＩＶ投与後に測定された。
【０１１０】
試験設計
投与レベル：５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与レベルは、この投与レベルがコカイン暴露の減少に有効であることが見出されたカニクイザルにおける以前の試験に基づいて選択された。１ｍｇ／ｋｇのコカインＩＶ投与量は、このような投与が極端な活動過剰を引き起こすことなく、サルにおいて効果をもたらすのに十分であるという文献報告に基づいていた。ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与についての投与のＩＭ経路は、これがヒトへの意図された投与経路であるために選択された。
【表１３】
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【表１４】
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【０１１１】
ＡｌｂｕＢＣｈＥ薬物動態試料
血液試料（０．４ｍＬ）は大腿静脈から回収され、投与前、投与の２４、７２、９６および３３６時間後に血清分離管（ＳＳＴ）に置かれた（投与の３３６時間後（１４日目）に回収された試料は、免疫原性を評価することが意図された。また、試料はＡｌｂｕＢＣｈＥ濃度について分析された。）。室温にて少なくとも１時間、これらの管を維持したが、遠心分離前に４時間を超えることはなかった。試料を遠心分離し、少なくとも２００μＬの血清を回収し、ドライアイス上に維持し、その後、約−７０℃にて保存した。
【０１１２】
コカイン薬物動態試料
コカイン投与後の毎回、投与の５分と３０分で大腿静脈から約０．４ｍＬの全血を回収した。エステラーゼ阻害剤（ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ））を含むＫ２ＥＤＴＡ血液回収管に血液を入れた。これらの管を数回反転し、回収時に氷水上に置いた。回収から４５分以内に試料を２〜８℃で遠心分離した。得られた血漿を回収し、血漿の単一の２００μＬ分割量をポリプロピレン管に入れた。血漿試料をドライアイス上で凍結し、約−７０℃で保存した。
【０１１３】
ＡｌｂｕＢＣｈＥ試料分析
以下の段落は、血清試料におけるＡｌｂｕＢＣｈＥ濃度の測定に使用されたＥＬＩＳＡに基づくアッセイを簡単に説明する。
【０１１４】
Ｉｍｍｕｌｏｎ  ４  ＨＢＸプレートは、ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬにて１００ｕｌの抗ヒトＢＣｈＥ  ｍＡＢ  ００２−０１（Ａｂｃａｍ  ａｂ１７２４６）を用いて、一晩４℃で被覆される。ブロッキングは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の２％カゼイン、２００μＬ／ウェル、２時間室温にて行われる。洗浄後、１００μＬの希釈された血清試料は、標準とともにプレートに添加される。標準は、４２０〜５．２ｎｇ／ｍＬにＡｌｂｕＢＣｈＥの２．６倍の連続希釈により生成した。血清試料および標準は、貯蔵されたカニクイザル血清を含む緩衝液を用いた希釈によって、１０％血清で維持される。洗浄ステップは、０．０４μｇ／ｍＬにて１００μｌの抗ＨＳＡ  ｍＡｂ−６５０２−ＨＲＰを用いて１時間、検出に先立って行う。１００μＬのテトラメチルベンジジン基質を用いた発色前にウェルを再度洗浄する。１５分後、１００μＬ／ウェルの１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を用いて反応を停止させ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー上で４５０／５７０ｎｍにて読み込んだ。未知の血清試料についての値は、ＡｌｂｕＢＣｈＥ標準の５パラメータ適合によって生じさせた標準曲線の内挿により計算される。また、投与前および投与後の第１４日に回収された血清試料を免疫原性について分析した。
【０１１５】
ＡｌｂｕＢＣｈＥ薬物動態およびＰＫ／ＰＤ分析
ＡｌｂｕＢＣｈＥ薬物動態パラメータ値は、個々の動物についての血清濃度−時間プロフィールを用いて決定された。コンピュータソフトウェアＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（バージョン４．０．１  Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）を用いた。具体的には、血管外インプットを用いた非コンパートメント分析のためのモデルが適用された。
【０１１６】
データの限定された量に関わらず、ＰＫ／ＰＤ関係を特徴付ける試みがなされた。コンピュータソフトウェアＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（バージョン４．０．１  Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）を用いた。具体的には、直接的な阻害効果Ｅｍａｘモデルが用いられ、そこでは、ＡｌｂｕＢＣｈＥ濃度が０であるときのＥｍａｘが想定された。モデル方程式は以下のように記述することができる。
【０１１７】
Ｅ＝Ｅｍａｘ＊（１−（Ｃ／（Ｃ＋ＥＣ５０）））
この分析に使用されるＰＤパラメータは、コカイン投与の５分後のコカイン血漿濃度であった。このモデルで使用されるＰＫパラメータは、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の２、７２および９６時間後のＡｌｂｕＢＣｈＥ血漿濃度であった。ＡｌｂｕＢＣｈＥ濃度がＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の２時間後に測定されなかったという事実に起因して、回収された１回目の試料がこの分析（ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の２４時間後）に用いられ、これは、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の２４時間後のＡｌｂｕＢＣｈＥ濃度がＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の２時間後のＡｌｂｕＢＣｈＥ濃度を反映し得ると想定された。この分析に用いられた限定されたデータおよび想定に起因して、このＰＫ／ＰＤ分析からのパラメータ値は、概算として眺められる必要がある。
【０１１８】
結果
ＡｌｂｕＢＣｈＥ
表１５および図１２は、５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与量の単回筋内投与後の３匹の雄性リスザルにおけるＡｌｂｕＢＣｈＥ血清濃度−時間プロフィールを与える。表１６は、ＡｌｂｕＢＣｈＥのリスザル薬物動態パラメータ値を要約する。
【０１１９】
ＡｌｂｕＢＣｈＥ最終排除勾配は、０．９より高いＲｓｑ値によって示されるように十分に特徴付けられた。また、曲線下面積は、２０％未満である外挿された％ＡＵＣによって示されるように十分に特徴付けられた。ＡｌｂｕＢＣｈＥ濃度−時間プロフィールの初期吸収段階は、最初の試料が投与の２４時間後に回収されたため、特徴付けられなかった。このようにして、実際のＴｍａｘが３〜６時間で生じるように期待され得るため、報告されたＴｍａｘおよびＣｍａｘは適切である。ＡｌｂｕＢＣｈＥ暴露は３匹の動物について一致し、レベルの差だけが２週間後に明確に現れた。例えば、３匹の動物についてのＡＵＣ値は、％ＣＶが約７％である狭い範囲にあった。ＡｌｂｕＢＣｈＥ最終排除ｔ１／２は、４５．５〜６５．５時間の範囲であると推定された（平均半減期５６．６時間）。
【表１５】
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【表１６】
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【０１２０】
コカインおよび代謝物
コカインは、対照動物（ｎ＝２）における、またはＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の２、７２および９６時間（ｎ＝３）後の１ｍｇ／ｋｇの投与量でＩＶ投与された。生物分析法は、コカイン、ならびにその代謝物の２つ：エクゴニンメチルエステルおよびベンゾイルエクゴニンの血漿濃度を測定した。コカイン代謝経路を図９に示す、エクゴニンメチルエステル代謝物は、ブチリルコリンエステラーゼ酵素を介してコカインから直接形成される。このようにして、この代謝物は、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後に増加することが予測され得る。
【０１２１】
対照およびＡｌｂｕＢＣｈＥ処理されたリスザルにおける個々の平均コカイン濃度（ｎｇ／ｍＬ）対時間（時）データを表１７に示す。平均コカイン濃度対時間の概要を図１３に示す。コカインの最高濃度が対照動物において観察された。コカインの最低レベルは、対照の約７％である値に達するＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の２時間後に観察された。コカイン濃度はＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後の時間の関数として増加し、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の９６時間後でさえもコカイン濃度はなおも対照動物の６０％であった。
【０１２２】
対照およびＡｌｂｕＢＣｈＥ処理されたリスザルにおける個体の平均エクゴニンメチルエステル血漿濃度（ｎｇ／ｍＬ）対時間（時）データを表１８に示す。平均エクゴニンメチルエステル濃度の概要を図１４に示す。期待されたように、コカイン投与の５分後のエクゴニンメチルエステル濃度は、対照動物において低かった。その値は、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の２時間後に観察された最高濃度で動物を処理したＡｌｂｕＢＣｈＥにおいて約４０倍高かった。エクゴニンメチルエステル濃度はＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後の時間の関数として減少し、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の９６時間後でさえ、エクゴニンメチルエステル濃度は対照動物におけるよりもなおも高かった。
【０１２３】
対照およびＡｌｂｕＢＣｈＥ処理されたリスザルにおける個々の平均ベンゾイルエクゴニン血漿濃度（ｎｇ／ｍＬ）対時間（時）データを表１９に示す。平均ベンゾイルエクゴニン濃度の概要を図１５に示す。例示されるように、コカイン代謝物であるベンゾイルエクゴニンにおけるＡｌｂｕＢＣｈＥ効果はあまり顕著ではなかった。
【０１２４】
図１６は、コカイン注射の５分後と３０分後に、コカインと、コカイン代謝物であるエクゴニンメチルエステル（ＥＭＥ）およびベンゾイルエクゴニン（ＢＺ）の血液レベルの概要を示す。ビヒクルの投与後の対照コカイン注射と比較して、ＡｌｂｕＢＣｈＥコカイン血液レベルの投与の２時間後は、５分と３０分の時間点（それぞれＦ３，７＝７．３４、ｐ＜０．０５とＦ３，７＝１４．４、ｐ＜０．００５）の両方で有意に減少した。ＡｌｂｕＢＣｈＥコカインレベルの７２時間後は、コカインの３０分後で対照レベルをなおも有意に下回った。ＡｌｂｕＢＣｈＥの効果は、投与９６時間後、５分と３０分の時間点のいずれも有意でなかった。ＥＭＥレベルにおけるＡｌｂｕＢＣｈＥの効果は同じであるが、コカインの効果とは反対方向であった。ＥＭＥの血液レベルは、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の２時間後で５分と３０分の時間の両方で上昇した（Ｆ３，７＝５．６、ｐ＜０．０５とＦ３，７＝３３．３、ｐ＜０．００１）。ＥＭＥの血液レベルは、３０分の時間点について、ＡｌｂｕＢＣｈＥの７２時間後に有意に上昇したままであった。ＢＺ血液レベルはＡｌｂｕＢＣｈＥの２時間後に僅かに減少しているようであるが、これらの効果は有意でなかった。
【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【０１２５】
ＡｌｂｕＢＣｈＥ  ＰＫ／ＰＤ関係
限定された数の時間点および動物にも関わらず、雄性リスザルにおけるＡｌｂｕＢＣｈＥ  ＰＫ／ＰＤ関係を特徴付ける試みがなされた。本分析に用いられたＰＫおよびＰＤデータを表２０に示す。個々のデータおよび直接的な阻害効果Ｅｍａｘモデルから得られた適合を図１７に示す。データは、ＡｌｂｕＢＣｈＥ血清濃度とコカインレベルとの間の逆関係を明確に示す。コカイン濃度における５０％減少をもたらす可能性があるＡｌｂｕＢＣｈＥ血清濃度（ＥＣ５０）は、約４００ｎｇ／ｍＬであるモデルによって推定された。Ｅｍａｘは２１３ｎｇ／ｍＬであった。この分析に用いられる限定されたデータおよび想定に起因して、このＰＫ／ＰＤ分析からのパラメータ値は、およその見積もりとして眺められる必要がある。
【表２０】
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【０１２６】
＃  ＡｌｂｕＢＣｈＥ濃度がＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の２時間後に測定されなかったという事実に起因して、回収された第１回の試料が分析（ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の２４時間後）において用いられ、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の２４時間後のＡｌｂｕＢＣｈＥ濃度が、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の２時間後のＡｌｂｕＢＣｈＥ濃度を反映する可能性があるとを想定された。
【０１２７】
結論
ＡｌｂｕＢＣｈＥ薬物動態プロフィールは、単回ＩＭの５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後の３匹の雄性リスザルにおいて特徴付けられた。暴露における変動の程度は最小であった（約７％）。ＡｌｂｕＢＣｈＥ最終排除ｔ１／２は、４５．５から６５．５時間の範囲であると推定された。
【０１２８】
コカインは、対照動物において（ｎ＝２）、またはＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の２、７２および９６時間（ｎ＝３）後の１ｍｇ／ｋｇの投与量でＩＶ投与された。ＡｌｂｕＢＣｈＥはコカイン暴露の減少を引き起こした。この効果はＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の２時間後に最も顕著であった（対照の７％未満）。コカイン暴露は、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の９６時間後に対照の約６０％であった。
【０１２９】
ＡｌｂｕＢＣｈＥの作用機序と一致して、コカインの代謝物であるエクゴニンメチルエステルへの暴露は、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の２時間後に約４０倍増加し、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後の時間の関数として減少した。
【０１３０】
ＡｌｂｕＢＣｈＥ効果は、コカイン代謝物のベンゾイルエクゴニンにおいてあまり顕著ではなかった。
【０１３１】
リスザルにおけるＰＫ／ＰＤ関係は、ＡｌｂｕＢＣｈＥ血清濃度とコカインレベルとの間の逆関係を示すようである。コカイン濃度における５０％減少をもたらし得るＡｌｂｕＢＣｈＥ血清濃度（ＥＣ５０）は、約４００ｎｇ／ｍＬである直接的な阻害効果Ｅｍａｘモデルによって見積もられた。限定されたデータおよびこの分析において用いられる想定に起因して、このＰＫ／ＰＤ分析からのパラメータ値はおよその見積もりとして眺められる必要がある。
【０１３２】
例３
ＡｌｂｕＢＣｈＥ：コカイン投与の有無におけるカニクイザルにおける心血管安全性薬理学的試験
目的
３匹の雄性および３匹の雌性カニクイザルにおける筋内（ＩＭ）経路によって投与されたＡｌｂｕＢＣｈＥの心血管および呼吸安全性を評価すること。さらに、心血管安全性におけるコカイン（静脈（ＩＶ）経路により投与される）、ＡｌｂｕＢＣｈＥおよびそれらの組み合わせの効果は、３匹の雄性および３匹の雌性カニクイザルの別の群において評価された。
【０１３３】
試験設計
試験の開始前に、サルは、テレメトリ送信機および血管アクセスポートを外科的に装着された。以下のＣＶパラメータを監視した：収縮期圧、拡張期圧、平均動脈圧、平均心拍数および平均心拍数−収縮期圧の積。また、体温変化を監視した。
【０１３４】
試験群１（３匹の雄と３匹の雌）は、ＡｌｂｕＢＣｈＥ単独の効果をそのビヒクルと比較して試験するための対照群として使用された。試験第１日目と第４日目（ＳＤ）に対照物質のＡｌｂｕＢＣｈＥ製剤緩衝液がサルに投与された。製剤緩衝液投与の３時間後、呼吸および心血管（ＣＶ）パラメータをそれぞれ記録した。
【０１３５】
被験物質（１５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥ）の単回ＩＭ投与がＳＤ８および１１に投与された。ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の３時間後（ＡｌｂｕＢＣｈＥのＴｍａｘに対応する）、ＣＶおよび呼吸パラメータをそれぞれ監視した。
【０１３６】
ＣＶパラメータにおけるコカイン投与前のＡｌｂｕＢＣｈＥによる前処理の効果が、動物の第２の群（群２）（３匹の雄および３匹の雌）において試験された。第１の基準ＣＶパラメータは、ＡｌｂｕＢＣｈＥ製剤緩衝液のＩＭ投与、続く３時間後の生理食塩水（コカインビヒクル）の単回ＩＶ投与後のＳＤ１５において記録された。ＣＶパラメータにおけるコカインの効果はＳＤ１８において測定され、その日に、動物は、ＡｌｂｕＢＣｈＥ製剤緩衝液の単回ＩＭ注射、続く３時間後のコカイン（１ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）の単回ＩＶ投与を受けた。
【０１３７】
ＣＶパラメータにおけるコカイン誘導の変化におけるＡｌｂｕＢＣｈＥを用いた前処理の効果をＳＤ２２に監視した。ＣＶパラメータは、ＡｌｂｕＢＣｈＥ（１５ｍｇ／ｋｇ）の単回ＩＭ投与、続く３時間後のコカイン（１ｍｇ／ｋｇ）の単回ＩＶ投与の後に記録された（表２１参照）。
【０１３８】
全ての動物は、疾病率、死亡率、損傷、ならびに食物および水の利用可能性について少なくとも１日２回観察された。血圧、心拍数、体温、および心電図（ＥＣＧ）を含む、被験物質投与に対する生理学的応答を監視した。
【表２１】
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【０１３９】
結果
試験終了まで全ての動物が生存していた。
【０１４０】
試験群１
図１８〜２６に示されるように、１５ｍｇ／ｋｇ（ＩＭ）のＡｌｂｕＢＣｈＥは、記録されたＣＶパラメータ、およびＡｌｂｕＢＣｈＥ製剤緩衝液を用いて決定された基準値と比較して体温のいずれの有意な変化を生じさせなかった。
【０１４１】
試験群２
コカイン（１．０ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）投与後の２分以内に、平均動脈圧（ＭＡＰ）は、１０５ｍｍＨｇの基準値を上回って約３５ｍｍＨｇ上昇させた。図２７に示されるように、コカイン投与前の１５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥを用いた前処理は、最高血圧がＡｌｂｕＢＣｈＥによって減少されただけでなく、この効果の逆転への時間もまた４．５倍（コカインを単独で与えた場合の７７分と比較して、コカイン投与前のＡｌｂｕＢＣｈＥによる前処理における１７分）に切り詰められたことを示した。
【０１４２】
コカインの投与は、約３分以内に１４０の脈拍／分の基準値から２４０の脈拍／分（７０％増加）のピーク値に達する心拍数の急激な増加を引き起こした。この心拍数におけるコカイン誘導の上昇は、約１５分間持続し、徐々に消え、コカイン投与の２時間後に基準値に戻った。ＡｌｂｕＢＣｈＥによる前処理は、約３分以内に１８２の脈拍／分のピーク値まで、迅速であるが中程度の３０％増加を示す心拍数のコカイン誘導上昇を鈍らせた。図３０に示されるように、この心拍数の軽度の増加は、完全に逆転され、コカイン投与のすでに３０分後に基準値に戻った。
【０１４３】
コカイン投与（１．０ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）は、３８℃の基準温度と比較して、投与の４５分後に３８．７℃のピーク値である体温の軽度の段階的な増加をもたらした。図３２に示されるように、コカイン投与前のＡｌｂｕＢＣｈＥ（１５ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ）による前処理は、３８．３℃の値まで体温をほんの僅かな上昇を引き起こした。
【０１４４】
例４
ＡｌｂｕＢＣｈＥ：リスザルにおけるコカイン自己投与試験のコカイン自己投与および回復
方法
対象
体重が０．８〜１．２ｋｇである成熟雄性リスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ  ｓｃｉｕｒｅｕｓ）を対象として用いた。全てのサルは、湿度と温度の調節された室内で個別に収容され、自由に水を利用できるようにした。サルは、任意の実験手法後に、安定した体重を維持するように決定されたある量の食物（Ｌａｂ  Ｄｉｅｔ  ５０４５，ＰＭＩ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＩＮ；Ｂａｎａｎａ  Ｓｏｆｔｉｅｓ，Ｂｉｏ−Ｓｅｒｖ，Ｆｒｅｎｃｈｔｏｗｎ，ＮＪ）を与えられた。新鮮な果実、野菜および環境強化もまた毎日与えられた。動物ケア施設は、ＡＡＡＬＡＣによって完全に公認され、全ての実験は、ＮＩＤＡ国際試験プログラム動物ケアおよび使用委員会によって承認された。
【０１４５】
コカイン自己投与
３匹のサルは、３０μｇ／ｋｇ／ｉｎｊ  ｉ．ｖ．コカインを自己投与するように訓練された。自己投与訓練法の詳細は、他に見出すことができる（Ｊｕｓｔｉｎｏｖａら、２００３）。要約すると、サルは、Ｐｌｅｘｉｇｌａｓ拘束イスに座位で置かれた。このイスを大きな音響室に入れた。拘束イスの前壁には、応答レバーと刺激ライトがあった。緑色のライトは、セッションの始まりを合図した。サルは、コカインのｉ．ｖ．注射を受けるために、１０回の反応（固定比率、ＦＲ、１０）を行うように訓練された。コカインの注射は、緑色の光を消灯することによって達成され、黄色の刺激ライトが２秒間示される。各々のコカイン注射後、さらに６０秒中断された。中断の終わりに、緑色のライトが点灯した。セッションは１時間続いた。時々、コカインに代えて生理食塩水に置換した。安定なコカイン自己投与、および生理食塩水置換後の応答の確実な消滅が達成された後、ＡｌｂｕＢＣｈＥ（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｍ．）またはそのビヒクル（ｉ．ｍ．）は、自己投与セッション前の２時間に与えられた。次に、自己投与応答は連続して５日間測定された。各薬物試験または生理食塩水の置換後、３０μｇ／ｋｇ／ｉｎｊのコカインに対する応答は、少なくとも５日間、再度達成された。回復試験後（以下参照）、自己投与に利用可能なコカインの投与量を１０μｇ／ｋｇ／ｉｎｊに低下し、ＡｌｂｕＢＣｈＥ（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｍ．）の効果を再度決定した。
【０１４６】
コカイン自己投与の回復
生理食塩水は、３０μｇ／ｋｇ／ｉｎｊ  ｉ．ｖ．コカインを確実に自己投与しているサルにおいて、コカインに代えて置換された。応答は迅速に減少し、日数全体でその低レベルで維持された。次に、ＡｌｂｕＢＣｈＥのビヒクルは、コカイン（０．３ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）前の２時間に与えられ、それは、セッションの５分前に与えられ、この場合、生理食塩水は、コカインが自己投与応答を回復するかどうかを決定するために自己投与について利用可能であった。また、同じ投与量のコカインは、４８時間および９６時間後の自己投与セッション前に与えられた。続いて、ＡｌｂｕＢＣｈＥ（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｍ．）は、０．３ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．コカインを用いた３回の回復試験の第２順の前の２時間に与えられた。これらの試験後、サルを基準に戻し、この場合、３０μｇ／ｋｇ／ｉｎｊコカインが自己投与に利用可能であった。次に、生理食塩水は、再度、コカインに代えて置換され、第２シリーズの回復試験は、０．１ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．コカインが回復セッション前に与えられることを除いて、同じようにして行われた。
【０１４７】
薬物
ＡｌｂｕＢＣｈＥは、３０ｍｇ／ｍｌの濃度で凍結溶液中のＴＥＶＡ  Ｐｈａｒｍａｃｕｔｉｃａｌ（Ｎｅｔａｎｙａ，Ｉｓｒａｅｌ）によって供給された。一度融解し、この溶液をビヒクルを用いて１５ｍｇ／ｍｌに希釈し、次に、０．３３ｍｌ／ｋｇの溶液でサルに与えた。コカイン（ＮＩＤＡ、メリーランド州ボルティモア）は滅菌生理食塩水中に調製され、自己投与用に０．２ｍｌの体積で与えられた。回復試験用の前処理として与える場合、コカインは０．３ｍｌ／ｋｇの体積で与えられた。
【０１４８】
データ分析
血液レベルデータは、各代謝物と時間点（５分または３０分）について別々に分析された。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）は、対照としてビヒクルで処理されたサルの結果を用いて、フォローアップＤｕｎｎｅｔｔ検定により行われた。自己投与データは、ビヒクル処理またはＡｌｂｕＢＣｈＥ処理のいずれかの後に、反応率または注射について別々について分析された。対照データは、直前の基準条件について最後の３日の平均をとることによって分析に含められた。次に、被験者内ＡＮＯＶＡは、ビヒクルまたはＡｌｂｕＢＣｈＥ後の日数を対照と対比させるフォローアップ試験を用いて行われた。回復試験について、二元ＡＮＯＶＡは、対象内因子としてビヒクルまたはＡｌｂｕＢＣｈＥ後の時間、および対象間因子としての前処理（ビヒクルまたはＡｌｂｕＢＣｈＥ）を用いて、反応率と注射の両方について行われた。フォローアップ対比は、各時間点でビヒクルとＡｌｂｕＢＣｈＥを比較した。
【０１４９】
結果
３０μｇ／ｋｇ／ｉｎｊコカインを自己投与するサルにおいて、ＡｌｂｕＢＣｈＥは自己投与を減少させた。図３３のパネルは、連続した日数全体での反応率（上段パネル）と注射（下段パネル）を示す。最初の５日は基準応答を示す。次に、生理食塩水は、コカインに代えて置換され、比率（Ｆ５，１０＝３．７０、ｐ＜０．００１）と注射（Ｆ５，１０＝１８８．７、ｐ＜０．００１）の両方は、先の基準期間の最後の３日間の平均と比較した場合、置換５日間で有意に減少した。基準までの５日の回復後、サルをビヒクルで処理し、５日間の自己投与訓練を与えた。先行する基準期間の最後の３日の平均と比較すると、ビヒクル処理は注射に効果がなかった（Ｆ５，１０＝２．６、ｐ＝０．１０）。日数の全体効果は反応率（Ｆ５，１０＝４．６、ｐ＜０．０５）について観察されたが、フォローアップ対比は、ビヒクル処理後の５日間のいずれにおいても対照からの応答に何らかの有意な変化を示さなかった。ビヒクル処理後、サルは、５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥを与えられ、コカイン自己投与は５日間追跡された。先行する基準の最後の３日間の平均からの有意な変化は、反応率（Ｆ５，１０＝４．６、ｐ＜０．０５）および注射（Ｆ５，１０＝１４．１、ｐ＜０．００１）について観察された。フォローアップ対比は、反応率が処理の１〜４日後に対照とは異なり、注射が処理の１日後と４日後に対照とは有意に異なっていたことを示した。
【０１５０】
回復試験後（下記参照）、サルは、より低いコカイン投与量（１０μｇ／ｋｇ／ｉｎｊ）での自己投与に戻された。維持投与量の減少は、応答率および注射回数を減少させた（図３３、右パネル）。基準安定後、サルは、ビヒクル注射を与えられ、自己投与が５日間継続した。反応率および注射は、基準における最後の３日の平均と比較して、ビヒクル注射後に有意に変化しなかった。次に、ＡｌｂｕＢＣｈＥ（５ｍｇ／ｋｇ）が与えられ、追加の５日間にコカインの自己投与が継続した。反応率と注射の両方は、ＡｌｂｕＢＣｈＥ注射後の２時間減少したが、これらの効果は有意に至らなかった。
【０１５１】
３０μｇ／ｋｇ／ｉｎｊコカインに応答しているサルにおいて、コカインから生理食塩水への置換は応答の迅速な減少をもたらした。次に、ＡｌｂｕＢＣｈＥビヒクルをｉ．ｍ．で与えた。２、４８および９６時間後、０．３ｍｇ／ｋｇコカインｉ．ｖ．を生理食塩水の置換セッション前の５分に与えた。コカインの投与は、図３４の左パネルにおける黒色のバーに示されるように、コカイン自己投与応答の回復をもたらした。５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥをｉ．ｍ．で与え、２時間、４８時間および９６時間後に、０．３ｍｇ／ｋｇコカインｉ．ｖ．を生理食塩水の置換セッション直前に与えたとき、応答の回復は、反応率（Ｆ１，４＝１６．９、ｐ＜０．０５）と注射（Ｆ１，４＝３４．９、ｐ＜０．００１）の両方について２時間の時間点で有意にブロックされた。続いて、回復投与として０．１ｍｇ／ｋｇコカインと同じようにしてサルを試験した。低コカイン投与量への回復はより変動的である一方で、結果の類似パターンが観察され、５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥの効果が再度、反応（Ｆ１，４＝１５．２、ｐ＜０．０５）と注射（Ｆ１，４＝１２９．７、ｐ＜０．００１）の両方について２時間で有意であった。
【０１５２】
０．６ｍｇ／ｋｇメタンフェタミンと生理食塩水とを区別するように訓練された４匹のサルにおいて、コカインは、０．３ｍｇ／ｋｇの投与量でメタンフェタミンと十分に置換した（図３５、上段パネル）。５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥをコカイン投与−効果機能の決定前の２時間に与えた場合、０．３ｍｇ／ｋｇのコカインは、メタンフェタミンのきっかけに一般化できなかった。部分置換（約７０％）は、より高いコカイン投与量（１．０ｍｇ／ｋｇ）で観察された。ＡｌｂｕＢＣｈＥの２４時間後、コカインの０．３ｍｇ／ｋｇの投与量は、なおも、メタンフェタミンきっかけ（約７０％）に完全には一般化できなかったが、ここで、１．０ｍｇ／ｋｇはメタンフェタミンに十分に一般化された。ＡｌｂｕＢＣｈＥ後の４８時間以内、０．３ｍｇ／ｋｇの投与量は、メタンフェタミンきっかけに十分に一般化された。メタンフェタミン投与量−効果機能の決定前の２時間でのＡｌｂｕＢＣｈＥを用いた前処理は、メタンフェタミンきっかけに対してメタンフェタミンの一般化に影響を及ぼさなかった（図３６、上段パネル）。ＡｌｂｕＢＣｈＥを用いた前処理は、いずれかの処理条件下で応答率に影響を及ぼさなかった（図３５と３６、下段パネル）。
【０１５３】
サルは、コカインを自己投与するように訓練され、また、全４回のＡｌｂｕＢＣｈＥ注射を受けた回復手法において試験された。血液は、第１、第２および第４のＡｌｂｕＢＣｈＥ注射後のＡｌｂｕＢＣｈＥ抗体の決定のために採取された。最初の２回の注射後、抗体レベルは、検出レベルを下回った（力価レベルは２０であった）。しかしながら、４回目の注射後、抗体レベルは上昇するように見えた。２匹のサルにおいて、抗体力価は、検出限界を上回って僅かに上昇した（２１と４３）。３番目のサルについて、抗体レベルは明らかに上昇した（６４３）。また、このサルについて血液中のＡｌｂｕＢＣｈＥの濃度は、ＡｌｂｕＢＣｈＥ注射の１週間後に減少した（２７ｎｇ／ｍｌ対他の２匹のサルについては５５と５３ｎｇ／ｍｌ）。
【０１５４】
検討
これらの試験の結果は、明らかに、ＢＣｈＥの修飾形態を用いた前処理が、非ヒト霊長類におけるコカインの行動的効果を遮断することにおいて有効であることを示す。この試験は、げっ歯類においてこの化合物を用いた以前の試験を広げ、この場合、ＡｌｂｕＢＣｈＥは、ラットにおけるコカインの毒性効果を遮断し、またコカイン自己投与のコカイン誘導回復をブロックすることができた（Ｂｒｉｍｉｊｏｉｎら、２００８）。ここで、５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥを用いた前処理は、３０μｇ／ｋｇ／ｉｎｊコカインを自己投与するサルにおける反応率と注射の両方を減少させた。自己投与消滅後のコカイン自己投与の回復について試験されたこれらの同じサルにおいて、５ｍｇ／ｋｇのＡｌｂｕＢＣｈＥは、０．３ｍｇ／ｋｇまたは０．１ｍｇ／ｋｇコカインのいずれかによる応答の回復をブロックすることができる。自己投与に利用可能な投与量を１０μｇ／ｋｇ／ｉｎｊに減少した場合、ＡｌｂｕＢＣｈＥは再び、受け入れた反応率と注射数を減少するように見えたが、１０μｇ／ｋｇ／ｉｎｊコカインを用いたこれらの効果は、より変動しやすく、有意性に至らなかった。最後に、ＡｌｂｕＢＣｈＥの５ｍｇ／ｋｇ投与量は、メタンフェタミン弁別刺激へのコカインの一般化を遮断することができたが、この効果はコカインに特異的であり、それは、ＡｌｂｕＢＣｈＥがメタンフェタミンの弁別刺激効果を遮断することができなかったためである。
【０１５５】
３０μｇ／ｋｇ／ｉｎｊコカイン自己投与に対して試験した場合、ＡｌｂｕＢＣｈＥの効果は、３日後でもなお明らかであったが、有効性は減少していた。しかしながら、回復および区別に関して、ＡｌｂｕＢＣｈＥの効果は、処理の４８時間後に明らかではなかった。ＡｌｂｕＢＣｈＥの半減期は約５６時間であることが示されたが、コカイン代謝における効果は、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の７２時間後でなおも明らかであり、そのため、これらの手法におけるある効果は７２時間で明らかであることが期待され得た。多数の因子は、７２時間で回復またはコカイン一般化における減少を見るためにこの失敗に貢献し得た。自己投与中に、少ないコカインの投与量は、長期間中で与えられた。他の手法では、相対的に大きなコカイン投与量は、ボーラス注射として投与された。他の条件下よりも自己投与条件下で脳に到達する前に、ＡｌｂｕＢＣｈＥがコカインを代謝することは容易であり得る。ＡｌｂｕＢＣｈＥは自己投与下でコカインを代謝する場合、その効果は、消滅条件を設定することである。また、消滅からの行動回復は、自己投与におけるＡｌｂｕＢＣｈＥ処理の効果を引き延ばす場合がある。回復試験では、応答は、以前に回復と関連付けられた生理食塩水と刺激を生じさせた。コカイン注射後にサルが応答を回復した場合、それらのサルはなおも応答のために生理食塩水を受け入れがたが、それらは、以前にコカインと関連付けられた刺激を受け入れた。また、この刺激の提示は、回復条件（Ｓｐｅａｌｍａら、１９９９）下での連続した応答を促進した可能性があり、ＡｌｂｕＢＣｈＥの効果のいくつかをマスクしている。
【０１５６】
ＡｌｂｕＢＣｈＥの効果は、ほぼ確実に、コカインの代謝におけるその効果に関連した。ＡｌｂｕＢＣｈＥの投与は、少なくとも７２時間、血液中のコカイン量を減少させた。ＥＭＥラベルがまたＡｌｂｕＢＣｈＥの少なくとも７２時間後に増加したという事実は、ＡｌｂｕＢＣｈＥが天然のＢＣｈＥ（Ｊｏｎｅｓ、１９８４）に類似してコカインを代謝していたことを示唆する。コカイン代謝のこの時間経過は、サルが３０μｇ／ｋｇ／ｉｎｊコカインを用いて強化された自己投与実験について観察されたものと類似している。さらに、ＡｌｂｕＢＣｈＥは、弁別試験における反応率において効果がなく、これは、血液中のコカインの存在とは独立した自発的反応における非特異的な効果を生じさせないことを示唆する。
【０１５７】
４回目の注射後の１匹のサルにおけるＡｌｂｕＢＣｈＥ抗体の相対的に高いレベルの観察は、ＡｌｂｕＢＣｈＥが複数回の注射を通じてその有効性のいくつかを失った可能性があることを示す。その１匹の特定のサルの結果は、試験された他の２匹のサルとは異なっているようには見えなかったが、抗体の観察は、ＡｌｂｕＢＣｈＥのいくつかがコカインを代謝するその能力を減少し得た抗体によって結合されたことを示唆する。更なる試験は、抗体産生が霊長類においてどのように広まるか、および観察された抗体のレベルがコカインの代謝におけるＡｌｂｕＢＣｈＥの有効性を減少させるのに十分であるか否かを決定するために必要となる。
【０１５８】
コカインは、ＤＡＷＮ検査における救急外来言及と監察医報告書の両方に示され続ける。このようにして、コカインの毒性効果を妨げることができた薬物は、コカインを乱用している患者の救急外来処置に付属して有用であり得る。コカインを代謝する薬物を用いる利点は、コカインに特異的であり、最小の副作用を有するべきであるということである。しかしながら、患者がコカインを用いていることを確認することが必要であり、それは、ＡｌｂｕＢＣｈＥが、毒性効果の類似の薬効範囲を生じ得る、アンフェタミンなどの他の乱用薬物によって生じる毒性に対して有効ではないためである。
【０１５９】
コカインの毒性効果の処置に加えて、ＡｌｂｕＢＣｈＥはまた、コカイン乱用のための他の処置の付属物として有用であり得た。コカインを摂取する、ＡｌｂｕＢＣｈＥが十分な血液レベルであるヒトは、コカインの主観的効果の減少を経験することが期待された。現在の試験に照らして、これは、より少ないコカイン自己投与、コカイン自己投与の回復の減少、コカインによるメタンフェタミン弁別刺激に一般化する障害に翻訳する。コカイン乱用への再発は治療における課題を残しているため、コカインの主観的効果の減少は、再発を減少させるように期待された。使用を再発する処置を受けている者について、血液中のＡｌｂｕＢＣｈＥの存在は、コカインの大部分を代謝し、連続したコカイン使用の可能性を潜在的に減少させる。これは、再発が期待される期間全体でＡｌｂｕＢＣｈＥを摂取し続けるように個体に要求する。したがって、ＡｌｂｕＢＣｈＥに対する抗体の発生をどのように妨げるか、およびコカインを代謝するその能力にどのようにした達成し得るかを決定することは重要である。
【０１６０】
結論として、ＡｌｂｕＢＣｈＥを用いたリスザルの前処理は、コカインボーラス処置後の血液中のコカイン量を減少させることができた。ＡｌｂｕＢＣｈＥを用いた前処理は、１０および３０μｇ／ｋｇ／ｉｎｊコカインを自己投与するように訓練されたサルにおいて、コカイン自己投与を減少させることができた。ＡｌｂｕＢＣｈＥは、２つの異なる投与量のコカインについて、コカイン自己投与のコカイン誘導回復をブロックすることができた。最後に、ＡｌｂｕＢＣｈＥはまた、リスザルにおけるコカインの弁別効果を遮断することができた。ＡｌｂｕＢＣｈＥが、コカインの行動的効果の３つの異なるモデルにおけるコカインの行動的影響を遮断し得たという見解は、コカイン乱用の潜在的な治療として有効であるべきであることを示唆する。
【０１６１】
例５
コカインレクリエーションボランティアにおけるＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後のコカインの薬物動態および薬力学パラメータを評価するためのコカインの複数回投与後のＡｌｂｕＢＣｈＥの二重盲検、プラセボ対照、単回漸増投与量
目的
ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与に続く複数回投与後のコカイン血液レベルを決定すること、およびＡｌｂｕＢＣｈＥ投与に続く複数回投与後のコカインの行動、心理的、および安全性効果を決定すること。ＡｌｂｕＢＣｈＥの薬物動態、安全性、および忍容性を評価すること。
【０１６２】
試験設計
これは、ＡｌｂｕＢＣｈＥによる処理と負の対照としてのプラセボを比較するための５つの治療並列群である活性およびプラセボ調節された二重盲検無作為試験である。
【０１６３】
コカインを用いていた４０人の治療を求めない健常成人は、５つの処置群に無作為に割り当てられる。各群は８人の対象を含む。
【０１６４】
Ａ群（低投与量）：対象は５０ｍｇのＡｌｂｕＢＣｈＥの単回筋内注射を受ける。
【０１６５】
Ｂ群（中投与量）：対象は１００ｍｇのＡｌｂｕＢＣｈＥの単回筋内注射を受ける。
【０１６６】
Ｃ群（高中投与量）：対象は１５０ｍｇのＡｌｂｕＢＣｈＥの単回筋内注射を受ける。
【０１６７】
Ｄ群（高投与量）：対象は３００ｍｇのＡｌｂｕＢＣｈＥの単回筋内注射を受ける。
【０１６８】
Ｅ群（負の対象）：対象は、プラセボの単回筋内注射を受ける。
【０１６９】
試験は、２〜３日空けて、集団あたり８対象の５集団に分けられる。
【０１７０】
入院段階
対象は、第１１日の朝まで、第１日の前の晩（チェックイン；第−１日）から入院したままである。対象は、第１８±２日にフォローアップ外来のための病院に戻る。第−１日：−１日の朝、４０ｍｇのコカイン静脈投与が投与される。
【０１７１】
第１日：ＡｌｂｕＢＣｈＥまたはプラセボの単回筋内投与が投与される。
【０１７２】
第１、４、８および１０日：第１日に、ＡｌｂｕＢＣｈＥのＣｍａｘ（投与の３時間後）、ＡｌｂｕＢＣｈＥ／プラセボ投与の対応する時間で第４日（７２時間後）、第８日（１６８時間後）、および第１０日（２１６時間後）の朝に、４０ｍｇのコカインの筋内チャレンジ投与を投与する。
【０１７３】
生理食塩水注入は、コカイン投与の各日に含まれ（コカイン注入を用いて無作為化され、別々に２時間で投与される）、単盲検された注入タイプ順を有する。
【０１７４】
試験薬物投与
計画されたＡｌｂｕＢＣｈＥ投与はＡ〜Ｅ群について上記される通りである。各対象は、筋内（ＩＭ）注射によってＡｌｂｕＢＣｈＥまたはプラセボの単回投与を受け入れる。４０ｍｇの塩酸コカインは、１ｍｇ／ｍｌの生理食塩水溶液として調製され、一定速度の注入ポンプを用いて、１ｍｇ／秒の速度で前腕静脈内に注射された。
【０１７５】
試験持続時間
各対象についての試験期間（スクリーニングから治験終了（ＥＯＳ）来院）は約１１〜１２週である。
【０１７６】
試験集団
娯楽コカイン使用者である１８〜５５歳の合計４０人の男性対象。投与後、任意の理由で試験を中止する対象を置き換えない。
【０１７７】
主な包含／排除基準
包含基準
１．１８〜５５歳（両端を含む）の男性ボランティア；
２．体格指数（ＢＭＩ）１８〜３３ｋｇ／ｍ２、少なくとも５０ｋｇの体重；
３．健常、臨床的に重大な病歴なし、身体検査、心電図（ＥＣＧ）、バイタルサインおよびスクリーニングの実験結果によって決定される；
４．喫煙、鼻腔内またはｉ．ｖ．経路によるコカインの現在の使用；スクリーニング前の少なくとも月１回、過去１年に６回、生涯にわたって２０回として定義される。現在の使用は、入院期間前（すなわち、スクリーニングまたはスクリーニングと第１日の間）の陽性尿薬物試験（ＵＤＳ）を通じて確認される；
５．試験の性質と、それに参加することのいずれかの危険を理解することができる；
６．調査員と十分にやりとりすることができ、全試験に参加し、その要求に従うことができる；および
７．情報と同意書を読み、調査員またはその代理人と試験について検討し、インフォームドコンセントにサインする機会をもった後、参加するための承諾書を与えようとする意欲。
【０１７８】
排除基準
１．ＤＳＭ−ＩＶ−ＴＲ（精神障害の診断と統計の手引−最新バージョン）基準に従ったアルコールもしくは薬物依存の現在または過去、あるいはリハビリテーションプログラムへの参加（禁煙を除く）；
２．重度のアレルギーまたはアナフィラキシ−反応の病歴；
３．天然もしくは組み換えブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、または製剤の任意の他の成分に対する既知のアレルギーまたは過剰な感受性；
４．任意の臨床的に重要な（主任調査員によって決定される）心臓病、内分泌疾患、血液病、肝臓病、免疫疾患、代謝病、泌尿器疾患、肺疾患、神経疾患、皮膚病、精神疾患、腎疾患、または他の主な疾患の病歴；
５．任意の悪性疾患の病歴；
６．スクリーニング前の２カ月以内、またはスクリーニングとチェックインとの間の任意の時間における大外傷または外科手術；
７．スクリーニング前の２週間以内、またはスクリーニングとチェックインとの間の任意の時間における急性感染；
８．主任調査員によって決定される、スクリーニングまたはチェックイン外来での臨床的に重要な異常ＥＣＧ所見；
９．スクリーニングまたはチェックイン時の収縮期９０〜１４０ｍｍＨｇまたは拡張期４５〜９０ｍｍＨｇ（少なくとも５分の休息後に測定される）の範囲外の血圧。血圧は、５〜１０分の間隔で仰臥位において再試験されてもよい。血圧上昇は、収縮期または拡張期圧のいずれかが３つの評価後に規定の制限を超えている場合に維持されると考えられ、したがって、患者は無作為化されなくてもよい；
１０．スクリーニングまたはチェックイン時の心拍数＜４０拍／分（少なくとも５分の休息後に測定される）；
１１．ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１型または２型の既知の病歴、またはスクリーニング時のそれについての陽性試験結果；
１２．Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の既知の病歴、またはそれについてのスクリーニング時の陽性試験結果；
１３．投与前の２週間以内または投与前の５半減期以内の、いずれか長いほうの、処方薬または市販（ＯＴＣ）薬（パラセタモール（アセトアミノフェン）、≦２ｇ／日またはイブプロフェン、≦６５０ｍｇ／日）、試験薬、ビタミン、または植物性生薬の使用；
１４．投与前の３カ月以内または投与前の５半減期以内の、いずれか長いほうの、新規化学物質または処方薬の別の臨床試験における参加；
１５．投与前の２カ月以内の４００ｍＬを超える血液の喪失（例えば、血液ドナーとして）、またはチェックイン前の３カ月以内に任意の血液、血漿、または血小板輸血を受け、または試験中もしくは試験後の３カ月以内に寄贈を計画している；
１６．対象は、スクリーニング前の１カ月に１日平均２０本を超えるたばこを消費するか、または少なくとも６時間、喫煙（任意のニコチン含有物質の使用）を控えることができない（それにより、全ての投与前と投与後／注入に関連した評価は中断なしに完了し得る）；
１７．アンフェタミン、コカイン（第１日のみ）、オピオイド、カンナビノイド、およびベンゾジアゼピンについて陽性ＵＤＳ。長期半減期により、一定または減少する限り受け入れることができるベンゾジアゼピンおよびカンナビノイドについて陽性結果。他の薬物について陽性ＵＤＳは、調査員／被験者の裁量でスケジュール変更をもたらす；陽性呼気アルコール検査もまた調査員／被験者の裁量でスケジュール変更をもたらす；
１８．農薬または任意の他の有機リン酸エステル類への暴露（例えば、農業労働者）；
１９．一般開業医または調査員の意見において、本試験に参加できない、または首尾よく完了できない。これは、ボランティアが
ａ．精神的にもしくは法律的に無能力であるか、または任意の理由で同意を与えることができない；
ｂ．行政上もしくは法律上の決定による保護にある、または管理下の仮釈放、またはサニタリウムもしくは社会的機関に認められている；
ｃ．緊急の場合接触できない；
ｄ．臨床試験プロトコールに協調もしくは適合できないか、または任意の他の理由で適切でない、ためである。
【０１７９】
安全性、忍容性、および免疫原性分析
安全性
血圧、心拍数（ＰＤパラメータの部分）および体温を含むバイタルサインを測定する。身体検査、臨床検査、および１２リードＥＣＧを行い、１２リードＥＣＧは、各コカイン注射後、注射前、注射の３０分後と２時間後、および最初の注射の８時間後に行った。遠隔測定は、各コカイン注射直後の４時間行った。
【０１８０】
ＢＣｈＥおよびアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）活性についての試料を回収するが、必ずしも全てをアッセイするということではない。ＢＣｈＥおよびＡＣｈＥの活性は、内因性酵素についての中和アッセイとして機能する、Ｅｌｌｍａｎアッセイに基づく比色法を用いて決定される。サンプリングの時間点は、スクリーニング時、投与前、ならびに投与の１６８時間後（第８日）、２４０時間後（第１１日）およびフォローアップ（第１８±２日）である。Ｅｌｌｍａｎアッセイについての血液試験は、（関連する場合）コカインの投与前に行われる。
【０１８１】
コカインの静脈内注射は以下のいずれか：
１．収縮期ＢＰが１８０ｍｍＨｇもしくはそれを超える；
２．拡張期ＢＰが１００ｍｍＨＧもしくはそれを超える；
３．ＨＲが１３０ｂｐｍもしくはそれを超える；または
４．神経刺激薬毒性の行動的発現（動揺、精神病、または試験手順に協力することができない）
が起こる場合に即座に終了される。
【０１８２】
対象は、以下のいずれか：
１．急性胸痛もしくは息切れ；
２．収縮期ＢＰが１８０ｍｍＨｇもしくはそれを超える；
３．拡張期ＢＰが１２０ｍｍＨｇもしくはそれを超える；
４．ＨＲが［２２０−年齢×０．８５］ｂｐｍもしくはそれを超える（すなわち、２０歳の対象について１７０ｂｐｍを超える）；
５．神経学的または精神医学的事象（例えば、パニックもしくは精神病）；
６．臨床的に重大なＥＣＧ異常（心臓ブロック、３以上の持続的異所性心室拍動、もしくは頻脈性不整脈）；
７．更なるコカイン注入についての停止基準は、適切な時間枠内で許容される制限に戻らない（例えば３０分）；
８．更なるコカイン注入についての停止基準は、プロトコール内で２回目について満たされる；または
９．対象に危険性を提示するのに十分な頻度であるＰＩの臨床的判断における任意の条件
が起こる場合にＩＶコカイン注射を忍容しなかったと考えられる。
【０１８３】
ＡｌｂｕＢＣｈＥのＩＭ注射の忍容性
注射部位での局所的忍容性と疼痛（視覚的アナログスケール（ＶＡＳ）によって評価される）は、投与後の最初２４時間以内に評価される。時間点は、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の２０分後、１、２、４、８および２４時間後である。
【０１８４】
有害事象（ＡＥ）は本試験を通じて監視される。
【０１８５】
免疫原性（ＩＧ）
免疫原性レベルの試料を回収するが、必ずしも全てをアッセイしなくてもよい。ＨＳＡ、ヒトブチリルコリンエステラーゼ（ｈＢＣｈＥ）とＡｌｂｕＢＣｈＥに対する抗体の力価を評価する。サンプリング時間点は、投与前、ならびに投与の１６８時間後（第８日）、２４０時間後（第１１日）、およびフォローアップ（第１８±２日）である。ＩＧアッセイについて血液試験は、（関連する場合）コカインの投与前に行われる。
【０１８６】
薬物動態変数とサンプリング
ＡｌｂｕＢＣｈＥの血清濃度を決定するために、血液試料は、投与前と投与後のいくつかの時間点で回収される。データが容認する場合、以下の薬物動態（ＰＫ）パラメータを計算する：
Ｃｍａｘ  観察される最高血清濃度
ｔｍａｘ  Ｃｍａｘに到達する時間
ＡＵＣ（０−ｔ）  ０時間から最後の定量化できる濃度の時間までの血清濃度−時間曲線下面積
ＡＵＣ（０−∞）無限大まで外挿された血清濃度−時間曲線下面積
ＡＵＣｅｘｔ  ｔｌａｓｔから無限大までの外挿によるＡＵＣ（０−∞）の割合
Ｖｄ／ｆ  最終段階中の分布の見掛けの体積
ＣＬ／ｆ  見掛けの全生体クリアランス
λｚ  片対数濃度対時間曲線の最終段階における線形回帰によって推定される最終排除速度定数
ｔ１／２  見掛けの時間排除半減期
ＭＲＴ  平均滞留時間
更なるパラメータは、必要と判断する場合に計算されてもよい。血清におけるＡｌｂｕＢＣｈＥのＰＫについてのサンプリング時間点は以下の通りである：投与前、ならびに投与の２０分後、４０分後、１時間後、１．５時間後、２時間後、３時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１２時間後、１８時間後、２４時間後（第２日）、３６時間後（第２日）、４８時間後（第３日）、７２時間後（第４日）、９６時間後（第５日）、１２０時間後（第６日）、１４４時間後（第７日）、１６８時間後（第８日）、１９２時間後（第９日）、および２１６時間後（第１０日）。適切な場合、ＡｌｂｕＢＣｈＥのＰＫについてのサンプリング時間点は、コカイン注入直前に取られる。
【０１８７】
薬力学変数およびサンプリング
血液試料は、コカインの投与前、およびコカインの各投与後のいくつかの時間点で回収された。インビボにおけるコカインレベル（ならびにその代謝物であるベンゾイルエクゴニンおよびエクゴニンメチルエステル）は、有効なＬＣ／ＭＳ−ＭＳ法によって決定され、ＡｌｂｕＢＣｈＥの血液レベルに相関する。コカイン暴露（Ｃｍａｘ、ｔｍａｘ、ＡＵＣ（０−ｔ）、ＡＵＣ（０−∞）およびＶｄ）およびクリアランス（ＣＬ、λｚ、ｔ１／２）を決定する。各コカイン投与後の血清のコカインレベルのＰＤサンプリング時間点は以下の通りである：投与前、投与の２、５、１０、１５、３０、４５、６０、９０、および１２０分後。
【０１８８】
血圧と心拍数は、注入前、ならびに注入の２、５、１０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１８０、２４０、および３００分後に測定される。
【０１８９】
行動的効果および心理的効果（主観的効果）
主観的効果は、コンピュータ計算された（２１ＣＦＲ１１有効）視覚的アナログスケール（ＶＡＳ）を用いて測定される。主観的効果の回収についての時間点は、コカイン血液試料についての時間点と合致する。以下のセットのＶＡＳは、薬物嗜好性、再度の薬物摂取、全薬物嗜好性、ハイ、良い効果、悪い効果、焦りを感じること、コカインへの願望、不安感、過剰な刺激、および任意の薬物効果である。
【０１９０】
各コカイン投与後のＶＡＳパラメータのＰＤサンプリング時間点は以下の通りである：投与前、投与の２、５、１０、１５、３０、４５、６０、および１２０分後。
【０１９１】
採尿
尿は、第１日、第４日および第８日におけるコカイン投与後の５２時間の間隔で代謝調査のために回収される。回収範囲は、（ｉ）コカイン投与直後、続いて（ｉｉ）３時間の２つの間隔、および（ｉｉｉ）６時間の９つの間隔の回収間隔である。
【０１９２】
統計学的分析
薬物動態
ＰＫパラメータは、各投与レベル（対象数、平均、ＳＤ、幾何平均（ＡＵＣおよびＣｍａｘについて）、変動係数、最小、中央値、および最大）について血清濃度から誘導される。パワーモデルを用いた投与比率性（ＡｌｂｕＢＣｈＥのみについて）は、Ｃｍａｘ、ＡＵＣ０−ｔ、およびＡＵＣ０−∞について評価される。
【０１９３】
薬力学
ＰＤ効果の時間的経過（主観的および客観的）を決定する。ＰＤパラメータは、Ｅｍａｘ（最大効果）、ＴＥｍａｘ（Ｅｍａｘまでの時間）、効果曲線下の時間平均領域（ＴＡ＿ＡＵＥ）、初期時間点についての部分ＡＵＥ、および累積ＡＵＥを含む。
【０１９４】
安全性
安全性データは、必要に応じて、各処理群について、記述統計学および基準からの変化を用いて決定される。ＡＥは、国際医薬用語集（ＭｅｄＤＲＡ）の最新版を用いて符号化され、器官別分類および好ましい用語によって要約される。
【０１９５】
生物分析
ＡｌｂｕＢＣｈＥ濃度および抗体を決定するための凍結血清試料は、分析のためにドライアイスで搬送される。コカインおよび代謝レベルの分析は、有効な方法を用いて行われる。
【０１９６】
結果
安全性、認容性および免疫原性
ＡｌｂｕＢＣｈＥはヒトに投与するのには安全である。５０ｍｇ〜３００ｍｇの筋内（ＩＭ）ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与量を用いた場合、有意な安全性の問題は観察されない。ＡｌｂｕＢＣｈＥは十分に認容的であり、受け入れられない副作用はない。ＩＭ注射部位での局所的認容性および疼痛は受け入れることができ、有意な有害事象はない。単回投与としての５０ｍｇ〜３００ｍｇのＡｌｂｕＢＣｈＥの投与は、有意な免疫反応を引き起こさない。ＨＳＡ、ヒトブチリルコリンエステラーゼ（ｈＢＣｈＥ）およびＡｌｂｕＢＣｈＥに対する抗体の力価は全て、許容限度内である。
【０１９７】
薬物動態変数
ＡｌｂｕＢＣｈＥの観察された最大血清濃度、ＣｍａｘはＡｌｂｕＢＣｈＥの投与量の増加に伴って増加する。投与のＩＭ部位からのＡｌｂｕＢＣｈＥ吸収は急速であり、Ｃｍａｘに到達する時間が短い。ＡＵＣ（０−ｔ）とＡＵＣ（０−∞）は、ＡｌｂｕＢＣｈＥレベルが有意であり、臨床的に有用な時間量で持続することを示す。Ｖｄ／ｆ値は、大部分のＡｌｂｕＢＣｈＥが最終段階の循環血液中に存在することを示す。ＣＬ／ｆ値は、許容速度で生体から消え去ることを示す。適切な最終排除半減期値は、治療レベル維持するためにＡｌｂｕＢＣｈＥの週１回または週２回の投与を示す。ＡｌｂｕＢＣｈＥの平均滞留時間は、臨床的に許容制限内である。
【０１９８】
薬力学変数
コカインの観察された最大血清濃度であるＣｍａｘは、ＡｌｂｕＢＣｈＥの投与量の増加に伴って減少した。Ｃｍａｘレベルは、コカインの４０ｍｇの静脈内投与後に非常に急速に達成し、ｔｍａｘは短い。コカイン、ならびにその代謝物であるベンゾイルエクゴニンおよびエクゴニンメチルエステルのＡＵＣ（０−ｔ）およびＡＵＣ（０−∞）は、コカインが、プラセボを受けている対象よりも、コカイン暴露前にＡｌｂｕＢＣｈＥの投与を受けている対象においてより迅速に代謝されることを示す。コカインＡＵＣ（０−ｔ）は、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与量の関数として減少し、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後の時間の関数として増加する。Ｖｄ値は、大部分のコカインは最終段階の循環血液中に存在することを示す。ＣＬ値は、プラセボと比較して、ＡｌｂｕＢＣｈＥの投与後のより急速なコカインクリアランスを示し、クリアランス速度は、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後の時間が増すのにつれて減少する。同様に、見掛けの最終排除半減期値は、プラセボと比較して、ＡｌｂｕＢＣｈＥの投与後により迅速なコカインクリアランスを示し、クリアランス速度は、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後の時間が増すのにつれて減少する。
【０１９９】
行動効果および心理効果
ＡｌｂｕＢＣｈＥを投与された対象は、プラセボを投与された対象と比較して、視覚的アナログスケール（ＶＡＳ）に関する有意に異なる結果を報告する。ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与はコカイン連鎖を減少させる。ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与は、再度、コカインを摂取したいという願望を減少させる。ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与は全薬物連鎖を減少させる。ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与は、コカイン暴露と関連した「ハイ」を減少させる。ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与は、コカイン暴露後の「良い影響」の主観的感情を減少させる。ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与は、コカイン暴露に関連した「ラッシュ」の主観的感情を減少させる。ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与は、コカインへの願望を減少させる。ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与は、コカイン暴露後の不安の感情を減少させる。ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与は、コカイン暴露後の過度に刺激されるという主観的感情を減少させる。ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与は、「任意の薬物効果」の報告を減少させる。
【０２００】
コカイン暴露前のＡｌｂｕＢＣｈＥ投与された対象は、プラセボ投与された対象と比較して、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後の有意に異なる「悪い影響」を報告しない。ＡｌｂｕＢＣｈＥは、コカイン暴露後の「悪い影響」の感情を減少させる。
【０２０１】
考察
本例は、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の後でのコカインの複数回投与後のコカインの血液レベルを決定し、入院設定におけるＡｌｂｕＢＣｈＥ投与の後での複数回投与後のコカインの行動効果、心理効果および安全効果を決定する。
【０２０２】
外来設定におけるコカイン乱用および依存の成功した処置の一番の目安は、治療中および治療後の自制期間である。自制期間、例えば、自制の２または３週間の促進は、成功した治療を示す。第２の結果判定法は、コカインレベルまたはコカイン摂取量の減少、コカインの非使用日数の全比率、成功した対象の比率、連続したコカインの非使用日数の最大数、例えば、コカイン選択的重症度評価（ＣＣＳＡ）によって評価されるコカイン依存の重症度を含む。
【０２０３】
以前の試験は、ＡｌｂｕＢＣｈＥがラットにおいて約８時間の半減期を有することを見出し、ＡｌｂｕＢＣｈＥの潜在的な半減期がヒトにおいて１日から数日の範囲であると推測されている（Ｂｒｉｍｉｊｏｉｎら、２００８；Ｇａｏら  ２００９）。Ｇａｏらは、ラットにおける単量体ＡｌｂｕＢＣｈＥの観察された半減期は、天然の四量体ＢＣｈＥのものよりも短いことに気付き、ＡｌｂｕＢＣｈＥの半減期はポリエチレングリコシル化などの翻訳後修飾によって増加し得ることを推測した。
【０２０４】
本例は、筋内注射によって投与された場合のＡｌｂｕＢＣｈＥの半減期が投与量に依存し、半減期値が投与量の増加に伴って増加することを決定する。特定の用量での半減期値は、ポリエチレングリコシル化などの翻訳後修飾の必要なく、週１回または週２回の投与スケジュールを可能にする。
【０２０５】
また、以前の試験は、ラットへのＡｌｂｕＢＣｈＥの静脈内投与が、血圧の小幅な上昇および軽度の昏睡を引き起こし得ることを報告している（Ｂｒｉｍｉｊｏｉｎら  ２００８）。対照的に、血圧の有意な増加は、筋内注射によって、ＡｌｂｕＢＣｈＥがヒトに投与された場合に観察されず、昏睡もかなりの数の対象において報告されない。
【０２０６】
ＡｌｂｕＢＣｈＥを投与されたヒト対象は、コカイン禁断症状の有意な増加を報告しない。対照的に、コカインを使用したいという願望は、ＡｌｂｕＢＣｈＥ投与後に有意に減少し、ＡｌｂｕＢＣｈＥの単回投与後の１週間以内は有意に低下したままである。
【０２０７】
本例の所見は、特定の用量でのヒトへのＡｌｂｕＢＣｈＥの筋内投与が、いずれの受け入れられない副作用をもたらさず、特定の投与が、コカイン暴露の生物学的影響の成功した治療を可能にすることを示す。
【０２０８】
参考文献
Brimijoin, S., Gao, Y., Anker, J. J., Gliddon, L. A., LaFleur, D., Shah, R., Zhao, Q., Singh, M., and Carroll, M. E., “A Cocaine Hydrolase Engineered from Human Butyrylcholinesterase Selectively Blocks Cocaine Toxicity and Reinstatement of Drug Seeking in Rats”. Neuropsychopharmacology, 33: 2715-2725, 2008.
Brogan, W.C. 3rd, Kemp, P.M., Bost, R.O., Glamann, D.B., Lange, R.A., Hillis, L.D., “Collection and handling of clinical blood samples to assure the accurate measurement of cocaine concentration,” J. Anal. Toxicol. 1992 May-Jun;16(3):152-4.
Davies, B. and Morris, T., “Physiological parameters in laboratory animals and humans,” Pharm. Res., 10: 1093-1095, 1993.
Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, American Psychiatric Publishing, Inc.; 4th edition (June 2000)
“Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers,” U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER), July 2005.
Pan, Y., Gao, D., Yang, W., Cho, H., Yahg, G., Tai, H., Zhan, C., “Computational redesign of human butyrylcholinesterase for anticocaine medication,” PNAS, 102(46):16656-61, 2005.
Sun, H., Shen, M., Pang, Y., Lockridge, O., Brimijoin, S., “Cocaine Metabolism Accelerated by a Re-Engineered Human Butyrylcholinesterase,” Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 302(2): 710-16, 2002.
US Patent Application Publication No. 2008/0194481, published August 14, 2008 (U.S. Serial No. 11/932,823, filed October 31, 2007).
Gao, et al. (2009) “An Albumin-Bytyrylcholinesterase for Cocaine Toxicity and Addiction: Catalytic and Pharmacokinetic Properties,” NIH Public Access Author Manuscript, published in final edited form as Chem. Biol. Interact. 2008 September 25; 175(1-3): 83-87.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2013512959.tif 000081
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