(57)【要約】  本発明は、修飾されたN末端を有するGLP-1受容体アゴニスト化合物に関する。該化合物は、式Chem.1:Y-Z-P(式中、Pは、2つのN末端アミノ酸残基を欠いているGLP-1受容体アゴニストペプチドの断片を表し、Y-Zは、新規のHis-Ala模倣体を表す)の化合物である。GLP-1受容体アゴニスト化合物の例は、ヒトGLP-1(7-37)、エキセンジン-4(1-39)またはGLP-1A(1-37)から誘導される。本発明は、これらの化合物、とりわけ、これらの化合物のin vivoでの作用の継続期間を持続化することが可能な1つまたは複数のアルブミン結合側鎖を有する化合物の誘導体にも関する。本発明のペプチドおよび誘導体は、良好な効力、持続型の薬物動態プロファイルを有し、胃腸酵素による分解に対し安定であり、および/または、高い経口バイオアベイラビリティーを有する。これらの特性は、皮下投与、静脈内投与、および/または、とりわけ経口投与のためのGLP-1受容体アゴニスト化合物の開発において重要である。本発明は、本発明のGLP-1受容体アゴニスト化合物の調製において使用するための中間生成物にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Chem.1:
Chem.1:Y-Z-P[式中、
Pは、2つのN末端アミノ酸残基を欠いているGLP-1受容体アゴニストペプチドの断片を表し、
Zは、式Chem.2の基:
Chem.2:
【化１】
2013514322.tif 000047
{式中、
Wは、式Chem.3の基:
Chem.3:
【化２】
2013514322.tif 000048
(式中、
R1およびR2は独立に、
(i)水素、アルキル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ハロゲン、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、シアノ、アミノ、アミノアルキル、カルボキシル、カルボキシルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、カルボキサミド、置換されたカルボキサミド、アルキルエステル、アリールエステル、アルキルスルホニルもしくはアリールスルホニルを表し、または
R1とR2とは一緒になって
(ii)シクロアルキル、ヘテロシクリルもしくはヘテロアリール
を形成し、
但し、
(iii)R1およびR2は両方が水素を表すことはない)
を表す}、
を表し、
Yは、式Chem.4またはChem.5の基:
Chem.4:
【化３】
2013514322.tif 000049
Chem.5:
【化４】
2013514322.tif 000050
{式中、
X1はN、OまたはSであり、X2、X3、X4およびX5は独立にCまたはNを表し、
但し、X2、X3、X4およびX5のうち少なくとも1つはCであり、
R11、R12、R13およびR14は独立に、
水素、アルキル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ハロゲン、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、シアノ、アミノ、アミノアルキル、カルボキシル、カルボキシルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、カルボキサミド、置換されたカルボキサミド、アルキルエステル、アリールエステル、アルキルスルホニルまたはアリールスルホニル
を表し、
Qは、結合または式Chem.6の基:
Chem.6:
*-(C(R15)(R16))q-*
(式中、
qは1〜6であり、
R15およびR16は互いに独立に、且つ、各値のqについて独立に、水素、アルキル、カルボキシルまたはヒドロキシルを表す)
を表し、
Rは水素またはアルキルを表す}
を表す]
を有するGLP-1受容体アゴニストペプチドまたは薬学上許容されるその塩、アミドもしくはエステル。
【請求項２】
(i) N9-[-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)-エチルカルバモイル]-2-メチル-プロピオニル}-[Lys18,Glu22,Gln34]GLP-1(9-37)-ペプチド;
(ii) N9-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)-エチルカルバモイル]-2-メチル-プロピオニル}-[His31,Gln34]GLP-1(9-37)-ペプチド;
(iii) N9-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)-エチルカルバモイル]-2-メチル-プロピオニル}-[Glu30,Lys36]GLP-1(9-37)-Glu38-ペプチドアミド;
(iv) N9-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)プロピルカルバモイル]-2-メチル-プロピオニル}-[Glu30,Lys36]GLP-1(9-37)Glu38-ペプチドアミド;
(v) N9-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)-メチルカルバモイル]-2-メチル-プロピオニル}-[Glu30,Lys36]GLP-1(9-37)-Glu38-ペプチドアミド;
(vi) N3-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)-メチルカルバモイル]-2-メチル-プロピオニル}-[Arg17,Arg20,Arg33,Lys38]GLP-1A(3-37)-ペプチド;
(vii) N9-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)-エチルカルバモイル]-2-メチル-プロピオニル}-[Arg34,Lys37]GLP-1(9-37)-ペプチド;
(iix) N9-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)-エチルカルバモイル]-2-メチル-プロピオニル}[Arg34,Lys37]GLP-1(9-37)Glu38-ペプチド;
(ix) N9-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)-エチルカルバモイル]-2-メチル-プロピオニル}-[Arg34,Lys37]GLP-1(9-37)-ペプチド;
(x) N9-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)-エチルカルバモイル]-2-メチル-プロピオニル}[Arg34]GLP-1(9-37)-ペプチド;および
(xii) N9-[2,2-ジメチル-3-オキソ-3-(ピリジン-2-イルメチルアミノ)プロパノイル]-[Arg34,Lys37]-GLP-1-(9-37)-ペプチド
から選択されるGLP-1受容体アゴニストペプチドまたは薬学上許容されるその塩、アミドもしくはエステル。
【請求項３】
請求項1または2に記載のペプチドの誘導体または薬学上許容されるその塩、アミドもしくはエステル。
【請求項４】
前記ペプチドのリシン残基に結合したアルブミン結合部分を有する、請求項3に記載の誘導体。
【請求項５】
前記アルブミン結合部分が、Chem.8、Chem.9およびChem.10:
Chem.8:HOOC-(CH2)x-CO-*
Chem.9:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
Chem.10:R18-C6H4-(CH2)z-CO-*
(式中、xは6〜18の範囲の整数であり、yは3〜17の範囲の整数であり、zは1〜5の範囲の整数であり、R18は、150Da以下のモル質量を有する基である)
から選択される持続化部分を含む、請求項4に記載の誘導体。
【請求項６】
アルブミン結合部分が、Chem.11、Chem.12、Chem.13およびChem.14:
Chem.11: *-NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)ｋ-O-(CH2)n-CO-*
Chem.12: *-NH-C(COOH)-(CH2)2-CO-*
Chem.13: *-N-C((CH2)2-COOH)-CO-*
Chem.14: *-NC5H8-CO-*
(式中、ｋは1〜5の範囲の整数であり、ｎは1〜5の範囲の整数である)
から選択される、リンカーをさらに含む、請求項5に記載の誘導体。
【請求項７】
Chem.30、Chem.31、Chem.32、Chem.33、Chem.34、Chem.35、Chem.36、Chem.37、Chem.38、Chem.39およびChem.41から選択されるGLP-1受容体アゴニストペプチドの誘導体または薬学上許容されるその塩、アミドもしくはエステル。
【請求項８】
式Chem.50またはChem.51:
Chem.50:
【化５】
2013514322.tif 000051
Chem.51:
【化６】
2013514322.tif 000052
[式中、Qは、結合または式Chem.6の基:
Chem.6:
-(C(R15)(R16))q-
(式中、qは1〜6であり、R15およびR16は互いに独立に、且つ、各値のqについて独立に、水素、アルキル、カルボキシルまたはヒドロキシルを表す)を表し、
Rは水素またはアルキルを表し、
R1およびR2は独立に、(i)水素、アルキル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ハロゲン、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、シアノ、アミノ、アミノアルキル、カルボキシル、カルボキシルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、カルボキサミド、置換されたカルボキサミド、アルキルエステル、アリールエステル、アルキルスルホニルもしくはアリールスルホニルを表し、または(ii)R1とR2とは一緒になってシクロアルキル、ヘテロシクリルもしくはヘテロアリールを形成し、
PG1およびPG2はそれぞれ保護基を表す]
の中間化合物または薬学上許容されるその塩、エステルもしくはアミド。
【請求項９】
Chem.23、Chem.24、Chem.25、Chem.26、Chem.27、Chem.28およびChem.29から選択される中間化合物、または薬学上許容されるその塩、アミドもしくはエステル。
【請求項１０】
Chem.40の化合物、または薬学上許容されるその塩、アミドもしくはエステル。
【請求項１１】
a)GLP-1(9-37)(配列番号1)の以下のアナログ:(i)(18K、22E、34Q)、(ii)(30E、36K、38E)、(iii)(31H、34Q)、(iv)34R、(v)(34R、37K)および(vi)(34R、37K、38E)、および
b)GLP-1A(3-37)(配列番号3)の以下のアナログ:(17R、20R、33R、38K)
から選択されるペプチド中間生成物または薬学上許容されるその塩、アミドもしくはエステル。
【請求項１２】
医薬として使用するための、請求項1から7のいずれか一項に記載のペプチドまたは誘導体。
【請求項１３】
摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重症疾患および/または多嚢胞性卵巣症候群などあらゆる形態の糖尿病および関連疾患の治療および/または予防において使用するための、および/または、脂質パラメーターの改善、β細胞機能の改善のための、および/または、糖尿病性疾患の進行の遅延化もしくは予防のための、請求項1から7のいずれか一項に記載のペプチドまたは誘導体。
【請求項１４】
摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重症疾患および/または多嚢胞性卵巣症候群などあらゆる形態の糖尿病および関連疾患の治療および/または予防のための、および/または、脂質パラメーターの改善、β細胞機能の改善のための、および/または、糖尿病性疾患の進行の遅延化もしくは予防のための医薬の製造における、請求項1から7のいずれか一項に記載のペプチドまたは誘導体の使用。
【請求項１５】
薬学的に活性な量の請求項1から7のいずれか一項に記載のペプチドまたは誘導体を投与することにより、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重症疾患および/または多嚢胞性卵巣症候群などあらゆる形態の糖尿病および関連疾患を治療または予防し、および/または脂質パラメーターを改善し、β細胞機能を改善し、および/または糖尿病性疾患の進行を遅延化もしくは予防する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、GLP-1受容体アゴニストペプチドのアナログおよび誘導体、ならびにその医薬としての使用に関する。本発明のGLP-1受容体アゴニストペプチド(グルカゴン様ペプチド-1(GLP-1)、エキセンジンなど)およびそのアナログにおいては、2つのN末端アミノ酸がN末端模倣体(mimetic)により置き換わっている。
【０００２】
配列表の参照による組込み
「配列表」の題の付いた配列表は、1770バイトであり、2010年12月1日に作り上げたものであり、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
WO2004/067548 A2は、化学修飾された、調節ペプチドの代謝産物ならびにその作製および使用の方法に関する。
【０００４】
リラグルチド(1日1回投与用のGLP-1誘導体であり、Novo Nordisk A/Sにより市販されている)は、WO98/08871の実施例37に開示されている。
【０００５】
セマグルチド(Semaglutide)(週1回投与用のGLP-1誘導体であり、Novo Nordisk A/Sにより開発中である)は、WO06/097537の実施例4に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO2004/067548 A2
【特許文献２】WO98/08871
【特許文献３】WO06/097537
【特許文献４】US2007/0161087
【特許文献５】WO2005/058958
【特許文献６】WO2007/124463 A2
【特許文献７】WO2005/058954
【特許文献８】WO2004/093823
【特許文献９】WO2006/124529
【特許文献１０】WO2005/027978
【特許文献１１】WO2009/030771
【特許文献１２】WO09/030738
【特許文献１３】WO2008/145728
【特許文献１４】WO2009/083549 A1
【特許文献１５】EP511600
【特許文献１６】WO2006/082204
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】UniProt Knowledgebase (UniProtKB)-SwissProtセクション(www.uniprot.org)
【非特許文献２】Needleman, S.B.およびWunsch, C.D.、(1970)、Journal of Molecular Biology、48、443〜453頁
【非特許文献３】MyersおよびW. Millerによるalignのプログラム、収録先:「Optimal Alignments in Linear Space」、CABIOS (computer applications in the biosciences)、(1988)、4、11〜17頁
【非特許文献４】PoulsenおよびJensen、収録先:Journal of Biomolecular Screening、2007、第12巻、240〜247頁
【非特許文献５】M. Bodanszky、「Principles of Peptide Synthesis」、第2版、Springer Verlag、1993
【非特許文献６】GreeneおよびWuts、「Protective Groups in Organic Synthesis」、John Wiley & Sons、1999
【非特許文献７】Florencio Zaragoza Dorwald、「Organic Synthesis on solid Phase」、Wiley-VCH Verlag GmbH、2000
【非特許文献８】「Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis」、W.C. ChanおよびP.D. White編、Oxford University Press、2000
【非特許文献９】Hodgsonら、「The synthesis of peptides and proteins containing non-natural amino acids」、Chemical Society Reviews、第33巻、第7号、(2004)、422〜430頁
【非特許文献１０】Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第19版、(1995)およびそれ以降の一切の版
【非特許文献１１】W.R. Sampson、(1999)、J. Pep. Sci.、5、403頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、修飾されたN末端を含むGLP-1受容体アゴニスト化合物に関する。
【０００９】
好ましい化合物は、式Chem.1:Y-Z-P(式中、Pは、N末端を欠いているGLP-1受容体アゴニストペプチドの断片を表し、Y-Zは、ペプチドのN末端を模倣する基を表す)を有する。この新しいN末端は、好ましくは、His-Ala模倣体、His-Gly模倣体および/またはHis-Ser模倣体である。
【００１０】
より具体的には、本発明は、式Chem.1: Y-Z-P[式中、Pは、2つのN末端アミノ酸残基を欠いているGLP-1受容体作動薬ペプチドの断片を表し、Zは、式Chem.2の基:
【化１】
2013514322.tif 000002
{式中、Wは、式Chem.3の基:
【化２】
2013514322.tif 000003
(式中、R1およびR2は独立に、(i)水素、アルキル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ハロゲン、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、シアノ、アミノ、アミノアルキル、カルボキシル、カルボキシルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、カルボキサミド、置換されたカルボキサミド、アルキルエステル、アリールエステル、アルキルスルホニルもしくはアリールスルホニルを表し、またはR1とR2とは一緒になって(ii)シクロアルキル、ヘテロシクリルもしくはヘテロアリールを形成する)を表す}を表し、Yは、式Chem.4の基:
【化３】
2013514322.tif 000004
またはChem.5の基:
【化４】
2013514322.tif 000005
{式中、X1はN、OまたはSであり、X2、X3、X4およびX5は独立にCまたはNを表し、但し、X2、X3、X4およびX5のうち少なくとも1つはCであり、R11、R12、R13およびR14は独立に、水素、アルキル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ハロゲン、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、シアノ、アミノ、アミノアルキル、カルボキシル、カルボキシルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、カルボキサミド、置換されたカルボキサミド、アルキルエステル、アリールエステル、アルキルスルホニルまたはアリールスルホニルを表し、Qは、結合または式Chem.6の基:*-(C(R15)(R16))q-*(式中、qは1〜6であり、R15およびR16は互いに独立に、且つ、各値のqについて独立に、水素、アルキル、カルボキシルまたはヒドロキシルを表す)を表し、Rは水素またはアルキルを表す}を表す]を有するGLP-1受容体作動薬ペプチドまたは薬学上許容されるその塩、アミドもしくはエステルに関する。
【００１１】
本発明は、このペプチドの誘導体および薬学上許容されるその塩、アミドまたはエステルにも関する。
【００１２】
本発明は、これらの化合物の、好ましくは、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重症疾患および/または多嚢胞性卵巣症候群などあらゆる形態の糖尿病および関連疾患の治療および/または予防のための、および/または、脂質パラメーターの改善、β細胞機能の改善のための、および/または、糖尿病性疾患の進行の遅延化もしくは予防のための医薬としての使用にも関する。
【００１３】
最後に、本発明は、新しいN末端ならびにペプチドの断片に対応する、すなわち、新しいN末端の結合前の段階で、両方とも本発明のペプチドの調製に関係がある、中間生成物に関する。
【００１４】
本発明のペプチドおよび誘導体は、生物学的に活性があり、好ましくは効力が高い。それに加えて、またはその代わりに、該ペプチドおよび誘導体は、持続型の(PRotracted)薬物動態プロファイルを有する。それに加えて、またはその代わりに、該ペプチドおよび誘導体は、胃腸酵素(gastro intestinal enzyme)による分解に対し安定である。それに加えて、またはその代わりに、該ペプチドおよび誘導体は、高い経口バイオアベイラビリティーを有する。これらの特性は、皮下投与、静脈内投与および/またはとりわけ経口投与のための次世代のGLP-1化合物の開発において重要である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、式Chem.1: Y-Z-P[式中、Pは、2つのN末端アミノ酸残基を欠いているGLP-1受容体作動薬ペプチドの断片を表し、Zは、式Chem.2の基:
【化５】
2013514322.tif 000006
{式中、Wは、式Chem.3の基:
【化６】
2013514322.tif 000007
(式中、R1およびR2は独立に、(i)水素、アルキル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ハロゲン、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、シアノ、アミノ、アミノアルキル、カルボキシル、カルボキシルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、カルボキサミド、置換されたカルボキサミド、アルキルエステル、アリールエステル、アルキルスルホニルもしくはアリールスルホニルを表し、またはR1とR2とは一緒になって(ii)シクロアルキル、ヘテロシクリルもしくはヘテロアリールを形成する)を表す}を表し、Yは、式Chem.4の基:
【化７】
2013514322.tif 000008
またはChem.5の基:
【化８】
2013514322.tif 000009
{式中、X1はN、OまたはSであり、X2、X3、X4およびX5は独立にCまたはNを表し、但し、X2、X3、X4およびX5のうち少なくとも1つはCであり、R11、R12、R13およびR14は独立に、水素、アルキル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ハロゲン、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、シアノ、アミノ、アミノアルキル、カルボキシル、カルボキシルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、カルボキサミド、置換されたカルボキサミド、アルキルエステル、アリールエステル、アルキルスルホニルまたはアリールスルホニルを表し、Qは、結合または式Chem.6の基:*-(C(R15)(R16))q-*(式中、qは1〜6であり、R15およびR16は互いに独立に、且つ、各値のqについて独立に、水素、アルキル、カルボキシルまたはヒドロキシルを表す)を表し、Rは水素またはアルキルを表す}を表す]を有するGLP-1受容体作動薬ペプチドまたは薬学上許容されるその塩、アミドもしくはエステルに関する。
【００１６】
第1の態様では、R1およびR2は両方が水素を表すことはなく、したがって、本発明は、式Chem.1: Y-Z-P[式中、Pは、2つのN末端アミノ酸残基を欠いているGLP-1受容体作動薬ペプチドの断片を表し、Zは、式Chem.2の基:
【化９】
2013514322.tif 000010
{式中、Wは、式Chem.3の基:
【化１０】
2013514322.tif 000011
(式中、R1およびR2は独立に、(i)水素、アルキル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ハロゲン、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、シアノ、アミノ、アミノアルキル、カルボキシル、カルボキシルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、カルボキサミド、置換されたカルボキサミド、アルキルエステル、アリールエステル、アルキルスルホニルもしくはアリールスルホニルを表し、またはR1とR2とは一緒になって(ii)シクロアルキル、ヘテロシクリルもしくはヘテロアリールを形成し、但し、(iii)R1およびR2は両方が水素を表すことはない)を表す}を表し、Yは、式Chem.4の基:
【化１１】
2013514322.tif 000012
またはChem.5の基:
【化１２】
2013514322.tif 000013
{式中、X1はN、OまたはSであり、X2、X3、X4およびX5は独立にCまたはNを表し、但し、X2、X3、X4およびX5のうち少なくとも1つはCであり、R11、R12、R13およびR14は独立に、水素、アルキル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ハロゲン、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、シアノ、アミノ、アミノアルキル、カルボキシル、カルボキシルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、カルボキサミド、置換されたカルボキサミド、アルキルエステル、アリールエステル、アルキルスルホニルまたはアリールスルホニルを表し、Qは、結合または式Chem.6の基:*-(C(R15)(R16))q-*(式中、qは1〜6であり、R15およびR16は互いに独立に、且つ、各値のqについて独立に、水素、アルキル、カルボキシルまたはヒドロキシルを表す)を表し、Rは水素またはアルキルを表す}を表す]を有するGLP-1受容体作動薬ペプチドまたは薬学上許容されるその塩、アミドもしくはエステルに関する。
【００１７】
第2の態様では、R1およびR2は両方が水素を表してもよく、Q-NR-*は、Chem.4の窒素原子に結合していない。
【００１８】
第3の態様では、R1およびR2は両方が水素を表してもよく、Q-NR-*は、Chem.4の炭素原子に結合している。
【００１９】
本発明は、これらのペプチドのそれぞれの誘導体およびその薬学上許容される塩、アミドまたはエステルにも関する。
【００２０】
本発明は、これらの化合物の、好ましくは、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重症疾患および/または多嚢胞性卵巣症候群などあらゆる形態の糖尿病および関連疾患の治療および/または予防のための、および/または、脂質パラメーターの改善、β細胞機能の改善のための、および/または、糖尿病性疾患の進行の遅延化もしくは予防のための医薬としての使用にも関する。
【００２１】
最後に、本発明は、該新しいN末端ならびに該ペプチドの断片に対応する、すなわち、該新しいN末端の結合前の段階で、両方とも本発明のペプチドの調製に関係がある、中間生成物に関する。
【００２２】
以下においては、ギリシア文字は、その記号または対応する表記名(written name)、例えば、α=アルファ、β=ベータ、ε=イプシロン、γ=ガンマ、ω=オメガなどにより表すことがある。また、ギリシア文字であるμは、「u」により(例えば、μl=ul、またはμM=uMで)表すことがある。
【００２３】
化学式中の星印(*)は、i)結合の位置、ii)ラジカル、および/またはiii)非共有電子を表す。
【００２４】
GLP-1受容体アゴニスト
本発明のGLP-1受容体アゴニスト化合物は、ヒトGLP-1(7-37)、エキセンジン-4(1-39)および/またはGLP-1A(1-37)から、誘導してもよくまたは誘導できる。これらのペプチドのアミノ酸配列は、UniProt Knowledgebase (UniProtKB)-SwissProtセクション(www.uniprot.org)において、それぞれ、以下の受入番号、配列識別番号(sequence identifier)および配列名で見出すことができる:UNIPROT:P01275_8、GLUC_HUMAN、グルカゴン様ペプチド1(7-37);UNIPROT:P26349_3、EXE4_HELSU、エキセンジン-4またはエキセナチド;およびUNIPROT:O42143_5、GLUC1_XENLA、グルカゴン様ペプチド1A。
【００２５】
2つのN末端アミノ酸を欠いている対応する断片の配列、すなわち、GLP-1(9-37)、エキセンジン-4(3-39)およびGLP-1A(3-37)は、添付の配列表に、それぞれ、配列番号1、配列番号2および配列番号3として含まれている。
【００２６】
本発明の化合物をそこから誘導してもよくまたは誘導できるGLP-1受容体アゴニスト断片の別の例は、配列番号2のD3アナログである、すなわち、3位に第1のアミノ酸残基であるアスパラギン酸(D、Asp)を有する以外は配列番号2と同一である、エキセンジン-3(3-39)と命名されたペプチドである。
【００２７】
GLP-1受容体の配列は、先に述べたUniProtKBデータベースにおいて、以下の受入番号、識別番号および名称で見出すことができる:UNIPROT:P43220、GLP1R_HUMAN、グルカゴン様ペプチド1受容体、GLP-1受容体、GLP-1-RまたはGLP-1R。
【００２８】
用語「GLP-1受容体アゴニスト」は、本明細書中で使用する場合、ヒトGLP-1受容体のアゴニストである化合物、すなわち、ヒトGLP-1受容体を含有する培地においてcAMPの形成を刺激する化合物を指す。GLP-1受容体のアゴニズムまたは効力は、以下に、「効力」と見出しの付いた項において記載するように定量するが、本明細書の実施例13も参照のこと。
【００２９】
アミノ酸およびペプチド
用語「ペプチド」は、例えば、本発明のGLP-1受容体アゴニストペプチドに関して使用する場合、アミド(またはペプチド)結合により相互連結された一連のアミノ酸を含む化合物を指す。
【００３０】
特定の一実施形態では、該ペプチドは、大部分、または主に、アミド結合により相互連結されたアミノ酸から構成される(例えば、モル質量で、少なくとも50%、60%、70%、80%または少なくとも90%)。別の特定の実施形態では、該ペプチドは、ペプチド結合により相互連結されたアミノ酸から成る。
【００３１】
本発明のペプチドは、ペプチド結合により連結され少なくとも5つの構成アミノ酸(constituent amino acid)を含む。特定の実施形態では、該ペプチドは、少なくとも10個、好ましくは少なくとも15個、より好ましくは少なくとも20個、さらにより好ましくは少なくとも25個、または最も好ましくは少なくとも28個のアミノ酸を含む。
【００３２】
特定の実施形態では、該ペプチドは、少なくとも5個の構成アミノ酸から構成され、好ましくは、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個から構成され、または、最も好ましくは、少なくとも28個のアミノ酸から構成される。
【００３３】
追加的な特定の実施形態では、該ペプチドは、i)29個、ii)30個、iii)31個またはiv)32個のアミノ酸から、a)構成される、または、b)成る。
【００３４】
またさらなる特定の実施形態では、該ペプチドは、i)33個、ii)34個、iii)35個またはiv)36個のアミノ酸から、a)構成される、または、b)成る。
【００３５】
またさらなる特定の一実施形態では、該ペプチドは、ペプチド結合により相互連結されたアミノ酸から成る。
【００３６】
アミノ酸は、アミン基およびカルボン酸基、ならびに、場合により1つまたは複数の追加的な基(多くの場合、側鎖と呼ばれる)を含有する分子である。
【００３７】
用語「アミノ酸」は、タンパク新生アミノ酸(PRoteogenic amino acid)(遺伝コードによりコードされ、天然アミノ酸および標準アミノ酸を包含する)、ならびに、非タンパク新生アミノ酸(タンパク質中では見出されず、および/または、標準遺伝コードではコードされない)および合成アミノ酸を包含する。したがって、アミノ酸は、タンパク新生アミノ酸、非タンパク新生アミノ酸および/または合成アミノ酸の群から選択してもよい。
【００３８】
遺伝コードによりコードされないアミノ酸の非限定的な例は、ガンマ-カルボキシグルタミン酸、オルニチンおよびホスホセリンである。合成アミノ酸の非限定的な例は、以下のアミノ酸のD-異性体である:D-アラニンおよびD-ロイシン、Aib(α-アミノイソ酪酸)、β-アラニンおよびdes-アミノヒスチジン(desH、別名イミダゾプロピオン酸、略称Imp)など。
【００３９】
以下においては、光学異性体について述べられていない全てのアミノ酸は、L-異性体(特に明記しない限り)を意味すると理解されたい。
【００４０】
GLP-1受容体アゴニストペプチド、断片、アナログ、残基の番号付け、同一性
「GLP-1受容体アゴニストペプチド」は、先に定義したとおりのペプチド、さらには、先に定義したとおりのGLP-1受容体アゴニストである。
【００４１】
本発明のペプチドは、GLP-1受容体アゴニストペプチドである。
【００４２】
GLP-1受容体アゴニストペプチドの追加的な例は、以下の公知の化合物である:ヒトGLP-1(7-37)、エキセンジン-4(1-39)、エキセンジン-3(1-39)およびGLP-1A(1-37)。
【００４３】
特定の一実施形態では、本発明のGLP-1受容体アゴニスト化合物は、これらの公知のGLP-1受容体アゴニストペプチドのうち任意の1つもしくは複数から、誘導してもよくまたは誘導できる。
【００４４】
用語「断片」は、GLP-1受容体アゴニストペプチドについて言及する場合、言及される該ペプチドより短いペプチドを意味する。
【００４５】
式I中のP基の定義に対応する特定の一実施形態では、該断片には、対応する完全長ペプチド(GLP-1受容体アゴニストである)と比較して2つのN末端アミノ酸が欠けている。
【００４６】
別の特定の実施形態では、この特定の断片は、i)実質的に、ii)好ましくはほぼ完全に、またはiii)より好ましくは実際上完全に、生物活性(すなわち、GLP-1受容体アゴニズム)が欠けていることから、それ自体はGLP-1受容体アゴニストではない。
【００４７】
P(2つのN末端アミノ酸残基を欠いているGLP-1受容体アゴニストペプチドの断片)の特定の例は、以下のとおりである:GLP-1(9-37)、エキセンジン-4(3-39)およびGLP-1A(3-37)、それぞれ、添付の配列表に、配列番号1、配列番号2および配列番号3として含まれている。Pの別の例は、配列番号2の変異型D3であるエキセンジン-3(3-39)である。
【００４８】
配列表では、GLP-1(9-37)(配列番号1)の断片の第1のアミノ酸残基(グルタミン酸である)を1番に割り当てている。しかし、以下においては、当技術分野での慣習に従いこのグルタミン酸残基を9番と呼び、続きのアミノ酸残基をそれに応じて番号付けし、グリシンの37番で終わっている。
【００４９】
同様に、配列表では、エキセンジン-4(3-39)(配列番号2)の第1のアミノ酸残基(これもグルタミン酸である)を1番に割り当てている。しかし、以下においては、当技術分野での慣習に従いこのグルタミン酸残基を3番と呼び、続きのアミノ酸残基をそれに応じて番号付けし、セリンを39番として終わっている。
【００５０】
同様に、配列表では、GLP-1A(3-37)(配列番号3)の第1のアミノ酸残基(アスパラギン酸である)を1番に割り当てている。しかし、以下においては、当技術分野での慣習に従いこのアスパラギン酸残基を3番と呼び、続きのアミノ酸残基をそれに応じて番号付けし、セリンを37番として終わっている。
【００５１】
したがって、一般的に、配列番号1、2もしくは3のペプチドまたはそのアナログに関するアミノ酸残基番号または位置番号について本明細書で言及した場合は、それぞれ、9位のGlu、3位のGluまたは3位のAspで開始し、それぞれ、37位のGly、39位のSerまたは37位のSerで終了する配列について言及している。
【００５２】
Pの追加的な特定の例は、配列番号1、配列番号2および/または配列番号3のアナログである。
【００５３】
「アナログ」は、配列番号1、2または3に関して本明細書中で使用する場合、配列番号1、2または3のうち任意の1つまたは複数の変異型であるペプチドまたは化合物を指す。
【００５４】
特定の一実施形態では、配列番号1のアナログは、配列番号1と比較していくつかのアミノ酸残基が入れ替わっている、配列番号1の修飾体を指す。このような入替えまたは修飾は、独立に、1つまたは複数のアミノ酸の置換、付加および/または欠失を表すことがある。ただし、N末端での付加は、好ましくは除外される。配列番号2および配列番号3のアナログは、同様に、配列番号1のアナログの定義と似た形で定義される。
【００５５】
アナログは、参照配列、修飾されている配列に対応する参照配列中でのアミノ酸残基(すなわちその位置)の番号、および実際の修飾体への言及により、記載することがある。
【００５６】
特定の実施形態では、参照配列は、i)GLP-1(9-37)(配列番号1)、ii)エキセンジン-4(3-39)(配列番号2)、またはiii)GLP-1A(3-37)(配列番号3)である。
【００５７】
以下に記載するのは、本明細書中で使用する場合の、適当なアナログの命名の非限定的、例示的な例である:
N9-[-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)-エチルカルバモイル]-2-メチルプロピオニル}-[Lys18,Glu22,Gln34]GLP-1(9-37)ペプチドは、GLP-1(9-37)(配列番号1)から誘導できる本発明のGLP-1受容体アゴニストペプチドであり、すなわち、Chem.1中のPが、配列番号1のアナログ、すなわち、18位のセリンがリシンで置換されており、22位のグリシンがグルタミン酸で置換されており、34位のリシンがグルタミンで置換されている、アナログであり、
N9-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)プロピルカルバモイル]-2-メチルプロピオニル}-[Glu30,Lys36]GLP-1(9-37)Glu38-ペプチドは、GLP-1(9-37)(配列番号1)から誘導できる本発明のGLP-1受容体アゴニストペプチドであり、すなわち、Chem.1中のPが、配列番号1のアナログ、すなわち、30位のアラニンがグルタミン酸で置換されており、36位のアルギニンがリシンで置換されており、C末端、すなわち38位でグルタミン酸が付加されている、アナログであり、
N3-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)-メチルカルバモイル]-2-メチルプロピオニル}-[Arg17,Arg20,Arg33,Lys38]GLP-1A(3-37)-ペプチドは、GLP-1A(3-37)(配列番号3)から誘導できる本発明のGLP-1受容体アゴニストペプチドであり、すなわち、Chem.1中のPが、配列番号3のアナログ、すなわち、17位、20位および33位のリシンがアルギニンで置換されており、C末端、すなわち38位でリシンが付加されている、アナログである。
【００５８】
ところで、このペプチドは、配列番号1からも誘導できることから、{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)-メチルカルバモイル]-2-メチルプロピオニル}-がN末端のN9に結合した、GLP-1(9-37)(配列番号1)のアナログ(17T、18Q、19Q、21D、22E、23R、26R、30D、33I、34N、36G、37P、38S、39R、40E、41I、42I、43S、44K)として表すこともできる。
【００５９】
別の例として、「GLP-1(9-37)(配列番号1)と比較して、以下の置換:18K;22E;30E;31H;34Q、R;36K;37Kおよび/または38Eのうち少なくとも1つを含む」本発明のGLP-1受容体アゴニストペプチドは、Chem.1のPが配列番号1のアナログとみなされ、該アナログが、18位にリシン、22位にグルタミン酸、30位にグルタミン酸、31位にヒスチジン、34位にグルタミン、36位にリシン、37位にリシン、および/または38位にグルタミン酸を有し、該アナログが、配列番号1と比較してさらなる修飾を含んでもよい、GLP-1受容体アゴニストペプチドを指す。
【００６０】
前述の例から明らかなように、アミノ酸残基は、その正式名称、その1文字のコードおよび/またはその3文字のコードにより識別することがある。これら3つの方式は、完全に同等である。
【００６１】
表現「〜と同等の位置」または「対応する位置」は、配列番号1、2または3のうち任意の1つまたは複数を参照して、修飾されたGLP-1受容体アゴニストペプチド配列における修飾部位を特徴付けるために、使用することがある。同等のまたは対応する位置、ならびに修飾番号は、例えば、手で書き目で追う(handwriting and eyeballing)だけで容易に推定され、および/または、標準的なタンパク質またはペプチドのアラインメントプログラム(Needleman-Wunschのアラインメントである「align」など)を使用してもよい。このアルゴリズムは、以下に説明されている:Needleman, S.B.およびWunsch, C.D.、(1970)、Journal of Molecular Biology、48、443〜453頁、ならびに、MyersおよびW. Millerによるalignのプログラム、収録先「Optimal Alignments in Linear Space」、CABIOS (computer applications in the biosciences)、(1988)、4、11〜17頁。アラインメントについては、デフォルトのスコア行列であるBLOSUM50およびデフォルトの同一性行列(identity matrix)を使用してもよく、ギャップにおける第1の残基についてのペナルティーは-12または好ましくは-10に、また、ギャップにおける追加的な残基についてのペナルティーは-2または好ましくは-0.5に、設定してもよい。
【００６２】
このアルゴリズムは、本発明のGLP-1受容体アゴニストペプチドのP基の、配列番号1、2および3のそれぞれとの同一性の程度を定量するために(例えば、この3つの配列のうちどれが、当該P基との同一性の比率(%)が最も高いかを決定する目的で)、ひいては、配列番号1〜3のうち最も近い関連配列(同一性の比率(%)が最も高いもの)と比較して入れ替わっているアミノ酸残基の番号を決定するためにも、適切に使用できる。本発明のGLP-1受容体アゴニストの所与のP基の、配列番号1、2および3それぞれとの同一性の比率(%)が偶然同じであるような場合には、同じ最大の同一性の比率(%)を有する配列のうちいずれを決定に使用してもよい。
【００６３】
そのようなアラインメントの例を、ここで以下に挿入するが、この中の配列の1番が本発明の配列番号1であり、配列の2番が本発明の配列番号3である:
【表１】
2013514322.tif 000014
【００６４】
前記のアラインメントは例示のためのものにすぎないが、それは、典型的には、本発明の配列番号1、2または3のうち1つのアナログは、これらの参照配列のいずれかと比較されることになるからである。
【００６５】
配列中に含まれているImpおよび/またはAibなどの非天然アミノ酸を含むアナログの場合、こうした非天然アミノ酸は、アラインメントの目的で、Xで置き換えてもよい。必要に応じ、Xは、後から手作業で補正できる。
【００６６】
誘導体
用語「誘導体」は、本発明のGLP-1受容体アゴニストペプチドに関して本明細書中で使用する場合、1つまたは複数の置換基が該ペプチドに共有結合している、化学修飾されたペプチドまたはアナログを意味する。置換基は側鎖と呼ぶ場合もある。特定の一実施形態では、本発明の誘導体は1つの側鎖を有する。別の特定の実施形態では、該誘導体は、2つの側鎖を有する。この定義の適用上、式IのY-Z-基は、好ましくは、置換基/側鎖とは見なされない。
【００６７】
特定の実施形態では、側鎖は、少なくとも10個の炭素原子、または少なくとも15個、20個、25個、30個、35個、40個もしくは少なくとも43個の炭素原子を有する。さらなる特定の実施形態では、側鎖は、少なくとも5個のヘテロ原子、とりわけOおよびN、例えば、少なくとも7個、9個、10個、12個、15個、17個または少なくとも20個のヘテロ原子(少なくとも1個、2個、3個または4個のN原子、および/または少なくとも3個、4個、6個、9個、12個、13個または15個のO原子など)をさらに含んでいてもよい。
【００６８】
GLP-1受容体アゴニスト誘導体の非限定的な例としては、本発明のGLP-1受容体アゴニストペプチドの、例えば、免疫グロブリン(IgGなど)のFc部分との、ヒトアルブミンとの、抗体(グルカゴン結合抗体の重鎖可変領域など)との、またはこれらのうちいずれかの断片またはアナログとの、非相同的な融合タンパク質またはコンジュゲートが挙げられる(例えば、US2007/0161087、WO2005/058958およびWO2007/124463 A2を参照のこと)。追加的な例としては、ペグ化されたペプチド(例えば、WO2005/058954、WO2004/093823およびWO2006/124529を参照のこと)、ならびに、アシル化されたペプチド(例えば、WO98/08871、WO2005/027978、WO2006/097537およびWO2009/030771を参照のこと)が挙げられる。
【００６９】
好ましい一実施形態では、側鎖は、アルブミンと共に非共有結合的な凝集体を形成し、それにより、血流での本誘導体の循環を促進すること、さらには、本誘導体の作用時間を持続化させる効果を有することが可能であるが、これは、本誘導体とアルブミンとの凝集体が、医薬品有効成分を放出するには崩壊が単にゆっくりであるという事実による。したがって、好ましい置換基または側鎖をまとめて、アルブミン結合部分と呼ぶことがある。
【００７０】
別の特定の実施形態では、アルブミン結合部分は、アルブミン結合およびそれによる持続化にとりわけ関連する部分を含むことから、その部分を持続化部分と呼ぶこともある。持続化部分は、持続化部分が本ペプチドへの結合位置に対し、アルブミン結合部分の反対の端または近くであってもよい。
【００７１】
またさらなる特定の一実施形態では、アルブミン結合部分は、持続化部分と、ペプチドへの結合位置との間の部分(この部分を、リンカー、リンカー部分、スペーサーなどと呼ぶことがある)を含む。リンカーの存在は任意選択的なものであることから、リンカーが存在しない場合には、アルブミン結合部分は持続化部分と同一であってもよい。
【００７２】
特定の実施形態では、アルブミン結合部分および/または持続化部分は、親油性であり、および/または、生理学的なpH(7.4)で負に帯電している。
【００７３】
アルブミン結合部分、持続化部分またはリンカーは、アルキル化、アシル化、エステル形成もしくはアミド形成によるなどのコンジュゲーション化学により本GLP-1受容体アゴニストペプチドのリシン残基と、または、マレイミドもしくはハロアセトアミド(ブロモアセトアミド/フルオロアセトアミド/ヨードアセトアミドなど)のカップリングなどによりシステイン残基と、共有結合してもよい。
【００７４】
好ましい一実施形態では、アルブミン結合部分および/または持続化部分の活性エステルは、場合によりリンカーを伴って、リシン残基のアミノ基、好ましくはそのイプシロンアミノ基と、アミド結合の形成下で共有結合性に繋がる(このプロセスをアシル化と呼ぶ)。
【００７５】
特に明記しない限り、リシン残基のアシル化と言えば、そのイプシロンアミノ基のことであると理解される。
【００７６】
一実施形態では、本発明は、18K、26K、36Kおよび/または37K(この場合、GLP-1(9-37)(配列番号1)の配列を参照できる)のうち1つまたは複数に結合しているアルブミン結合部分を含む、好ましくは有する、GLP-1受容体アゴニストペプチドの誘導体に関する。これまでに記載したように、各残基番号は、GLP-1(9-37)(配列番号1)における対応する位置を指す。さらに、同じくこれまでに記載したように、位置番号を示すための上付き文字の代わりに普通の文字を使用することがある。例えば、「K18」は、「18K」と完全に同等である。
【００７７】
対応する位置番号は、これまでに記載したように、好ましくは、手で書き目で追うことにより、または、適当なアラインメントプログラムを用いることにより、同定される。
【００７８】
本件においては、用語「アルブミン結合部分」、「持続化部分」および「リンカー」は、これらの分子の、反応していない形態ならびに反応した形態を包含する。一方または他方の形態を意味しているか否かは、その用語が使用されている文脈から明らかである。
【００７９】
一態様では、アルブミン結合部分は、
Chem.8:HOOC-(CH2)x-CO-*
Chem.9:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
Chem.10:R18-C6H4-(CH2)z-CO-*
(式中、xは6〜18の範囲の整数であり、yは3〜17の範囲の整数であり、zは1〜5の範囲の整数であり、R18は、150Da以下のモル質量を有する基である)
から選択される持続化部分を含む、またはから成る。
【００８０】
第1の実施形態では、*-(CH2)Ｘ-*は、直鎖または分枝状、好ましくは直鎖状のアルキレンを指し、式中、ｘは6〜18の範囲の整数である。
【００８１】
別の実施形態では、*-(CH2)ｙ-*は、直鎖または分枝状、好ましくは直鎖状のアルキレンを指し、式中、ｙは3〜17の範囲の整数である。
【００８２】
第3の実施形態では、*-(CH2)z-*は、直鎖または分枝状、好ましくは直鎖状のアルキレンを指し、式中、zは1〜5の範囲の整数である。
【００８３】
化学物質(R1基など)のモル質量(M)は、当該物質の1モルの質量である。モル質量は、ダルトン(記号Da)で示され、定義は1Da=1g/molである。
【００８４】
モル質量は、標準原子量から計算してもよく、化学カタログに掲載されていることが多い。化合物のモル質量は、その化合物を形成する原子の標準原子量の合計にモル質量定数Mu(1g/molに等しい)を掛けることにより得られる。例として、tert.ブチル(C4H9)の分子量は、M(C4H9)=([4×12.01]+[9×1.008])×1g/mol=57Daである。
【００８５】
標準原子量は、国際純正・応用化学連合(IUPAC、International Union of Pure and Applied Chemistry)により公表されており、多種多様な教科書、商用カタログ、掛け図などにも転載されている。
【００８６】
本GLP-1受容体アゴニストペプチドへの結合ついては、脂肪酸の酸性基、または脂肪二酸(fatty diacid)の酸性基のうち1つが、本GLP-1受容体アゴニストペプチド中のリシン残基のイプシロンアミノ基とアミド結合を形成する。
【００８７】
用語「脂肪酸」は、4〜28個の炭素原子を有する脂肪族のモノカルボン酸を指し、脂肪酸は、好ましくは分枝していない、および/または偶数のものであり、飽和していても不飽和であってもよい。
【００８８】
用語「脂肪二酸」は、先に定義したように脂肪酸を指すが、オメガ位に追加的なカルボン酸基を有している。したがって、脂肪二酸は、ジカルボン酸である。
【００８９】
命名法は、当技術分野における慣例のとおりであり、例えば、*-COOHならびにHOOC-*はカルボキシ、*-C6H4-*はフェニレン、*-CO-*ならびに*-OC-*はカルボニル(O=C<**)、C6H5-O-*はフェノキシを指す。
【００９０】
特定の実施形態では、芳香族(フェノキシ基およびフェニレン基など)は、独立に、オルト、メタまたはパラであってもよい。
【００９１】
好ましい一実施形態では、リンカー部分(存在する場合)は、5〜30個のC原子を有する。追加的な好ましい実施形態では、リンカー部分(存在する場合)は、4〜20個のヘテロ原子を有する。H原子は、ヘテロ原子ではない。
【００９２】
別の実施形態では、リンカーは、少なくとも1つのOEG分子、少なくとも1つのグルタミン酸残基、および/または少なくとも1つのピペリジン分子、場合により置換されている、より正確には対応するラジカルを含む(OEGは、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸を表し、すなわち、このジラジカルは以下のとおりである:*-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*)。
【００９３】
アミノ酸のグルタミン酸は、2つのカルボン酸基を含む。そのガンマ-カルボキシ基は、好ましくは、リシンのイプシロンアミノ基と、またはOEG分子(存在する場合)のアミノ基と、または別のGlu残基(存在する場合)のアミノ基と、アミド結合を形成するために使用される。次いで、Gluのアミノ基は、持続化部分のカルボキシ基と、またはOEG分子(存在する場合)のカルボキシ基と、または別のGlu(存在する場合)のガンマ-カルボキシ基と、アミド結合を形成する。このようにしてGluを含ませることを、簡潔に「ガンマ-Glu」と呼ぶことがある。
【００９４】
本発明の誘導体は、結合される原子と同じ分子式および配列を有するが空間におけるその原子の三次元配向のみが異なっている、異なる立体異性体の形態で存在してもよい。本発明の例示される誘導体の立体異性は、標準的な命名法を用いた名称ならびに構造で、実験の項の中で示す。特に明記しない限り、本発明は、特許請求する誘導体の全ての立体異性体の形態に関する。
【００９５】
本発明のGLP-1受容体アゴニストペプチドおよび誘導体の血漿中濃度は、任意の適当な方法を用いて定量してもよい。例えば、LC-MS(液体クロマトグラフィー質量分析)、または、RIA(Radio Immuno Assay、放射性免疫測定法)、ELISA(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay、酵素結合免疫吸着測定法)およびLOCI(Luminescent oxygen Channeling Immunoassay)などのイムノアッセイを用いてもよい。適当なRIAおよびELISAのアッセイの一般的なプロトコールは、例えば、WO09/030738の116〜118頁に見出される。好ましいアッセイはLOCIアッセイであるが、このアッセイでは、化合物の血漿中濃度を、Luminescent oxygen Channeling Immunoassay(LOCI)を用いて、一般的に、PoulsenおよびJensen、収録先:Journal of Biomolecular Screening、2007、第12巻、240〜247頁によりインスリンの定量について記載されているように、定量する。ドナービーズはストレプトアビジンでコーティングし、アクセプタービーズは、ペプチドの中間/C末端エピトープ(mid-/C-terminal epitope)を認識するモノクローナル抗体とコンジュゲートさせる。N末端に特異的な別のモノクローナル抗体はビオチニル化する。この3つの反応物を、分析物と組み合わせると、2つの部位のある免疫複合体が形成される。この複合体に光を当てると、ドナービーズから一重状態の酸素原子が放出され、これがアクセプタービーズ中に流れて化学発光を誘発し、この光をEnvisionプレートリーダーで測定する。光の量は、化合物の濃度に比例する。
【００９６】
薬学上許容される塩、アミドまたはエステル
本発明のGLP-1受容体アゴニストペプチド、誘導体および中間生成物は、薬学上許容される塩、アミドまたはエステルの形態であってもよい。
【００９７】
塩は、例えば、塩基と酸との間の化学反応(例えば、NH3+H2SO4→(NH4)2SO4)により形成される。
【００９８】
塩は、塩基性塩、酸性塩であってもよく、または、そのいずれでもないもの(すなわち中性塩)であってもよい。水中では、塩基性塩は水酸化物イオンを、酸性塩はヒドロニウムイオンを生じる。
【００９９】
本発明のペプチドおよび誘導体の塩は、それぞれ陰イオン性基または陽イオン性基と反応する陽イオンまたは陰イオンを付加することで形成してもよい。これらの基は、本発明の化合物のペプチド部分中および/または側鎖中に位置してもよい。
【０１００】
本発明の化合物の陰イオン性基の非限定的な例としては、側鎖(存在する場合)中ならびにペプチド部分中の遊離カルボキシル基が挙げられる。ペプチド部分は、C末端に遊離カルボン酸基を含んでいることが多く、内部の酸性アミノ酸残基(AspおよびGluなど)に遊離カルボキシル基を含んでいることもある。
【０１０１】
ペプチド部分中の陽イオン性基の非限定的な例としては、N末端(存在する場合)の遊離アミノ基、ならびに、内部の塩基性アミノ酸残基(His、ArgおよびLysなど)の任意の遊離アミノ基が挙げられる。
【０１０２】
本発明のペプチドおよび誘導体のエステルは、例えば、遊離カルボン酸基をアルコールまたはフェノールと反応させることにより形成してもよく、この結果、アルコキシ基またはアリールオキシ基により少なくとも1つのヒドロキシル基が置き換わる。
【０１０３】
エステル形成には、本ペプチドのC末端の遊離カルボキシル基、および/または、側鎖中の任意の遊離カルボキシル基が関与していてもよい。
【０１０４】
本発明のペプチドおよび誘導体のアミドは、例えば、遊離カルボン酸基をアミンもしくは置換されたアミンと反応させること、または、遊離アミノ基もしくは置換されたアミノ基をカルボン酸と反応させることにより、形成してもよい。
【０１０５】
アミド形成には、ペプチドのC末端の遊離カルボキシル基、側鎖中の任意の遊離カルボキシル基、ペプチドのN末端の遊離アミノ基、および/または、ペプチドおよび/または側鎖中の任意の遊離アミノ基もしくは置換されたアミノ基が関与していてもよい。
【０１０６】
特定の一実施形態では、本ペプチドまたは誘導体は、薬学上許容される塩の形態である。別の特定の実施形態では、本ペプチドまたは誘導体は、好ましくはペプチドのC末端にアミド基を有する薬学上許容されるアミドの形態である。またさらなる特定の一実施形態では、本ペプチドまたは誘導体は、薬学上許容されるエステルの形態である。
【０１０７】
中間化合物
本発明は、式Chem.50またはChem.51:
Chem.50:
【０１０８】
【化１３】
2013514322.tif 000015
【０１０９】
Chem.51:
【０１１０】
【化１４】
2013514322.tif 000016
【０１１１】
(式中、Q、R、R1およびR2は、式Chem.1を有する本発明のGLP-1受容体アゴニストペプチドについて定義するとおりであり、PG1およびPG2はそれぞれ保護基を表す)
の中間生成物にも関する。
【０１１２】
PG1基の非限定的な例は、Boc、Trt、Mtt、MmtおよびFmocである。
【０１１３】
PG2基の非限定的な例は、-OH、または、活性化エステルとして官能性をもたせた基、例えば、限定するものではないが、OPfp、OPnpおよびOSucである。
【０１１４】
他の適当な活性化エステルを、例えば、M. Bodanszky、「Principles of Peptide Synthesis」、第2版、Springer Verlag、1993の教示に従い選択してもよい。
【０１１５】
機能特性
第1の機能的な態様では、本発明のGLP-1受容体アゴニストペプチドおよび/または誘導体は、良好な効力を有する。それに加えて、またはその代わりに、第2の機能的な態様では、該ペプチドおよび/または誘導体は、持続型の薬物動態プロファイルを有する。それに加えて、またはその代わりに、第3の機能的な態様では、該ペプチドおよび/または誘導体は、胃腸酵素による分解に対し安定である。それに加えて、またはその代わりに、第4の機能的な態様では、該ペプチドおよび/または誘導体は、高い経口バイオアベイラビリティーを有する。
【０１１６】
生物活性(効力)
第1の機能的な態様によれば、本GLP-1受容体アゴニスト誘導体は、生物学的に活性がある、または良好な効力を有する。
【０１１７】
驚くべきことに、該誘導体は、本明細書の実施例11の比較化合物(Chem.40)と比較して改善された効力を有するが、この比較化合物は、先行技術のうち最も強力な化合物の1つ、すなわち、WO2004/067548の化合物215に基づくものである。
【０１１８】
さらに、または加えて、本発明の誘導体は、低アルブミン濃度(0.005%)では、GLP-1受容体との結合親和性が高い、すなわちIC50値が低いが、このことについては、受容体結合と見出しの付いた項で、追ってさらに論考する。
【０１１９】
効力に関して、半数有効濃度(half maximal effective concentration)(EC50)という用語は、一般に、用量応答曲線を参照することによる、ベースラインと最大値との中間の応答を誘導する濃度を指す。EC50は、化合物の効力の尺度として使用され、その最大効果の50%が観察される濃度を表す。
【０１２０】
本発明の誘導体のin vitro効力は、本明細書に追って記載のように定量し、当該誘導体のEC50を定量してもよい。EC50が低いほど、効力は良好である。
【０１２１】
特定の一実施形態では、本発明の誘導体は、Chem.40より少なくとも3倍強力、好ましくは少なくとも4倍強力、さらにより好ましくは少なくとも5倍強力、または、最も好ましくはChem.40より少なくとも6倍強力である。
【０１２２】
別の特定の実施形態では、本発明の誘導体は、Chem.40より少なくとも7倍強力、好ましくは少なくとも8倍強力、さらにより好ましくは少なくとも9倍強力、または最も好ましくはChem.40より少なくとも10倍強力である。
【０１２３】
別の特定の実施形態では、本発明の誘導体は、Chem.40より少なくとも20倍強力、好ましくは少なくとも50倍強力、さらにより好ましくは少なくとも100倍強力、またより好ましくは少なくとも200倍強力、または最も好ましくはChem.40より少なくとも400倍強力である。
【０１２４】
効力は、好ましくは、以下に記載するように決定され、例えば、3倍強力な化合物のEC50は3倍低いことに注意する。
【０１２５】
特定の一実施形態では、効力および/または活性は、in vitro効力、すなわち、機能的なGLP-1受容体アッセイの成績、より具体的には、クローン化されたヒトGLP-1受容体を発現する細胞株においてcAMPの形成を刺激する能力を指す。
【０１２６】
ヒトGLP-1受容体を含有する培地におけるcAMPの形成の刺激は、好ましくは、安定なトランスフェクト細胞株(BHK467-12A(tk-ts13)など)を用い、および/または、cAMPの定量に、機能的な受容体アッセイ(例えば、内因性に形成されるcAMPと外因性に加えられるビオチン標識したcAMPとの間の競合に基づくもの)を用いて定量してもよく、そのようなアッセイにおいては、cAMPは、より好ましくは、特異的な抗体を使用して捕捉され、および/または、この場合、さらにより好ましいアッセイは、AlphaScreen cAMP Assay、最も好ましくは、実施例13に記載するアッセイである。
【０１２７】
追加的な特定の一実施形態では、培地は、以下の組成を有する(最終的なアッセイ内濃度(final in-assay concentration)):50mM TRIS-HCl;5mM HEPES;10mM MgCl2、6H2O;150mM NaCl;0.01% Tween;0.1% BSA;0.5mM IBMX;1mM ATP;1uM GTP;pH7.4。
【０１２８】
さらなる特定の一実施形態では、本GLP-1受容体アゴニストのEC50は2000pM未満、好ましくは1800pM未満、より好ましくは1700pM未満、さらにより好ましくは1600pM未満、または最も好ましくは1500pM未満である。
【０１２９】
別の特定の実施形態では、本発明の誘導体はin vivoにおいて強力であり、その値は、任意の適当な動物モデルにおいて、ならびに臨床試験において、当技術分野で公知のように定量してもよい。糖尿病のdb/dbマウスは適当な動物モデルの一例であり、血糖低下効果は、そのようなマウスにおいてin vivoで、例えばWO09/030738の実施例43に記載されているように定量してもよい。
【０１３０】
持続化-受容体結合-高アルブミンおよび低アルブミン
第2の機能的な態様によれば、本発明の誘導体は持続化されている。
【０１３１】
高アルブミン濃度および低アルブミン濃度での本発明のペプチドおよび誘導体の受容体結合を定量するために適当なアッセイは、本明細書の実施例14に開示されている。
【０１３２】
一般に、低アルブミン濃度でGLP-1受容体と結合することが、低いIC50値に相当し、最大限良好であるはずである。
【０１３３】
高アルブミン濃度でのIC50値は、本化合物がGLP-1受容体と結合する際のアルブミンの影響の尺度である。公知のように、本発明のGLP-1受容体アゴニストペプチド誘導体は、アルブミンとも結合する。このことは一般に望ましい効果であり、これにより、血漿中での該誘導体の寿命が延びる。したがって、高アルブミン条件でのIC50値は、一般に、GLP-1受容体との結合と競合するアルブミン結合が原因で生じるGLP-1受容体との結合の減少に対応して、低アルブミン条件でのIC50値より高くなるであろう。
【０１３４】
したがって、高い(IC50値(高アルブミン)/IC50値(低アルブミン))比は、当該誘導体がアルブミンと良好に結合し(長い半減期を有することができる)、それ自体GLP-1受容体とも良好に結合する指標としてとらえることができる(IC50値(高アルブミン)が高く、IC50値(低アルブミン)が低い)。他方、アルブミン結合は、常に望ましいとは限らない場合もあり、または、アルブミンとの結合が強くなりすぎることもある。したがって、IC50(低アルブミン)、IC50(高アルブミン)および高/低比にとって望ましい範囲は、意図される用途およびそのような用途を取り巻く環境に、また、潜在的な関心のある他の化合物特性によっては、化合物毎に異なる場合がある。
【０１３５】
特定の一実施形態では、本発明のペプチドおよび誘導体は、低アルブミン濃度(0.005%)では、GLP-1受容体との結合親和性が高い、すなわちIC50値が低い。
【０１３６】
特定の一実施形態では、0.005% HSA(低アルブミン)の存在下でのGLP-1受容体結合親和性(IC50)は、600.00nM未満、好ましくは500.00nM未満、より好ましくは200.00nM未満、さらにより好ましくは100.00nM未満、または最も好ましくは45.00nM未満である。
【０１３７】
胃腸酵素による分解
第3の機能的な態様によれば、本発明のGLP-1受容体アゴニストペプチドおよび/または誘導体は、1つまたは複数の胃腸酵素による分解に対し、安定であり、または安定化されている。
【０１３８】
胃腸酵素としては、限定するものではないが、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼおよびカルボキシペプチダーゼなどのエキソペプチダーゼおよびエンドペプチダーゼが挙げられる。安定性は、これらの胃腸酵素に対し、精製された酵素の形態、または胃腸系からの抽出物の形態で試験してもよい。
【０１３９】
特定の一実施形態では、本発明の誘導体の、ラット小腸の抽出物におけるin vitroでの半減期(T1/2)を、GLP-1(7-37)の対応する半減期(T1/2)で割った値は、1.0超、好ましくは2.0超、より好ましくは3.0超、さらにより好ましくは4.0超、または最も好ましくは5.0超である。言い換えれば、比率(SI)は、各誘導体について、すなわち、当該誘導体の、ラット小腸の抽出物におけるin vitroでの半減期(T1/2)をGLP-1(7-37)の対応する半減期(T1/2)で割った値として、定義してもよい。
【０１４０】
ラット小腸の抽出物におけるin vitroでの半減期を定量するための適当なアッセイは、Novo Nordisk A/Sにより、受理官庁であるEPOに本出願と同日に出願された、名称「Double-acylated GLP-1 derivatives」のPCT出願の実施例57に開示されている。
【０１４１】
持続化-ラットにおけるin vivo半減期
第2の機能的な態様によれば、本発明の誘導体は持続化されている。特定の一実施形態では、持続性は、i.v.投与後のラットにおけるin vivo半減期(T1/2)として定量してもよい。追加的な実施形態では、該半減期は、少なくとも4時間、好ましくは少なくとも5時間、さらにより好ましくは少なくとも6時間、または最も好ましくは少なくとも8時間である。
【０１４２】
i.v.投与後のラットにおけるin vivo半減期を定量するための適当なアッセイは、Novo Nordisk A/Sにより、受理官庁であるEPOに本出願と同日に出願された、名称「Double-acylated GLP-1 derivatives」のPCT出願の実施例58に開示されている。
【０１４３】
持続化-ミニブタにおけるin vivo半減期
第2の機能的な態様によれば、本発明の誘導体は持続化されている。特定の一実施形態では、持続性は、i.v.投与後のミニブタにおけるin vivo半減期(T1/2)として定量してもよい。追加的な実施形態では、該半減期は、少なくとも12時間、好ましくは少なくとも24時間、より好ましくは少なくとも36時間、さらにより好ましくは少なくとも48時間、または最も好ましくは少なくとも60時間である。
【０１４４】
i.v.投与後のミニブタにおけるin vivo半減期を定量するための適当なアッセイは、本明細書の実施例16に開示されている。
【０１４５】
経口バイオアベイラビリティー
第4の機能的な態様によれば、本発明の誘導体は、高い経口バイオアベイラビリティーを有する。
【０１４６】
市販のGLP-1受容体アゴニストペプチド誘導体の経口バイオアベイラビリティーは非常に低い。i.v.投与またはs.c.投与用に開発中のそのような誘導体の経口バイオアベイラビリティーも低い。
【０１４７】
したがって、当技術分野では、経口バイオアベイラビリティーが改善された誘導体が必要とされている。そのような誘導体があれば、その効力が全般的に満足である限り、および/または、その半減期も全般的に満足である限り、経口投与用に適当な候補であると思われる。
【０１４８】
本発明者らは、新規の種類のGLP-1受容体アゴニストペプチド誘導体を同定したが、この誘導体は、高い経口バイオアベイラビリティーと同時に、満足な効力および/または半減期を有する。
【０１４９】
それに加えて、またはその代わりに、これらの誘導体は、高い経口バイオアベイラビリティーと同時に、低濃度のアルブミン条件でGLP-1受容体に対し高い結合親和性(すなわち、低いIC50値)を有する。
【０１５０】
これらの特徴は、1日の経口用量が低い医薬品有効成分を得るために重要であり、このことは、例えば、作製の経済性、安全問題が生じる可能性の見込み、ならびに、投与の快適性の問題および環境上の懸念など、さまざまな理由から望ましい。
【０１５１】
一般に、本発明のGLP-1受容体アゴニスト化合物のバイオアベイラビリティーという用語は、変化せずに体循環に到達する該化合物の投与用量の割合を指す。定義により、薬物が静脈内投与された場合の当該薬物のバイオアベイラビリティーは100%である。しかし、薬物が他の経路(経口など)経由で投与されると、当該薬物のバイオアベイラビリティーは低下する(不完全な吸収および初回通過代謝による)。バイオアベイラビリティーについての知識は、非静脈内投与経路の場合の投与量を計算する際に必須である。
【０１５２】
絶対経口バイオアベイラビリティー(absolute oral bioavailability)は、経口投与後の体循環中での活性薬物のバイオアベイラビリティー(曲線下面積すなわちAUCとして推定される)を、静脈内投与後の同じ薬物のバイオアベイラビリティーと比較するものである。その値は、非静脈内投与による薬物の吸収量を、それに対応する同じ薬物の静脈内投与と比較した割合である。この比較は、異なる用量を用いた場合には用量正規化しなければならず、結果的に、各AUCは、投与された対応用量で割ることにより補正される。
【０１５３】
経口投与および静脈内投与を両方とも行った後で、血漿中薬物濃度対時間をプロットする。絶対バイオアベイラビリティー(F)は、用量補正されたAUC-経口をAUC-静脈内で割ったものである。
【０１５４】
本発明のGLP-1受容体アゴニスト化合物の絶対経口バイオアベイラビリティーは、a)リラグルチドおよび/またはb)セマグルチドの該値より高く、好ましくは少なくとも10%高く、より好ましくは少なくとも20%高く、さらにより好ましくは少なくとも30%高く、または最も好ましくは少なくとも40%高い。経口バイオアベイラビリティーを調べる前に、本発明のGLP-1受容体アゴニスト化合物を、例えば、WO2008/145728に記載されている製剤のうち任意の1つまたは複数を使用して、インスリン分泌性の化合物の経口製剤の技術分野で公知のように適切に製剤化してもよい。
【０１５５】
ある試験が開発され、実施例15に記載したが、この試験は、経口バイオアベイラビリティーを非常によく予測することが見出された。この試験によれば、GLP-1誘導体をラットの腸管腔中に直接注射した後、血漿中でのその濃度(曝露量)を定量し、血漿中濃度(pmol/l)を投与溶液の濃度(umol/l)で割った比率を、t=30分について計算する。この比率は、腸のバイオアベイラビリティーの尺度であり、実際の経口バイオアベイラビリティーのデータと良好に相関することが示されている。
【０１５６】
本発明の誘導体の追加的な特定の実施形態は、実験の項の前の「特定の実施形態」の見出しの付いた項に記載してある。
【０１５７】
作製方法
例えばGLP-1(7-37)のようなペプチドおよびそのアナログの作製については、当技術分野では周知である。
【０１５８】
本発明の式Iのペプチドの断片Pは、例えば、古典的なペプチド合成、例えば、t-Boc化学またはFmoc化学を用いた固相ペプチド合成、または他の十分確立された手法により作製できる。例えば、以下を参照のこと:GreeneおよびWuts、「Protective Groups in Organic Synthesis」、John Wiley & Sons、1999; Florencio Zaragoza Dorwald、「Organic Synthesis on solid Phase」、Wiley-VCH Verlag GmbH、2000ならびに「Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis」、W.C. ChanおよびP.D. White編、Oxford University Press、2000。
【０１５９】
それに加えて、またはその代わりに、該断片Pは、組換え法、すなわち、該断片をコードするDNA配列を含有し、本ペプチドを発現させる条件下で適当な栄養培地中で本ペプチドを発現することが可能な、宿主細胞を培養することにより、作製してもよい。これらのペプチドの発現に適した宿主細胞の非限定的な例は、以下のとおりである:大腸菌(Escherichia coli)、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、ならびに哺乳動物のBHK細胞株またはCHO細胞株。
【０１６０】
Y-Zを式IのPに組み込んでいる、すなわち付加している、本発明の完全なGLP-1受容体アゴニストペプチドは、例えば、実験の部に記載されているように作製してもよい。あるいは、以下を参照のこと:Hodgsonら、「The synthesis of peptides and proteins containing non-natural amino acids」、Chemical Society Reviews、第33巻、第7号、(2004)、422〜430頁;および、WO2009/083549 A1、名称「Semi-recombinant preparation of GLP-1 analogues」中。
【０１６１】
本発明の誘導体は、当技術分野で公知のように調製でき、本発明のいくつかの誘導体を調製する方法の具体例は、本明細書の実験の部に含まれている。
【０１６２】
医薬組成物
本発明のペプチドもしくは誘導体または薬学上許容されるその塩、アミドもしくはエステルと薬学上許容される添加剤とを含む医薬組成物は、当技術分野で公知のように調製できる。
【０１６３】
用語「添加剤」は、広義には、治療活性成分(active therapeutic ingredient)以外の任意の成分を指す。添加剤は、不活性な物質、活性のない物質、および/または医薬として活性がない物質であってもよい。
【０１６４】
添加剤は、例えば、担体、ビヒクル、賦形剤、錠剤補助物質(tablet aid)としての、および/または、投与および/または活性物質の吸収を改善するための、多様な目的を果たしてもよい。
【０１６５】
多様な添加剤を用いた薬学的に活性な成分の製剤化は、当技術分野で公知である。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy(例えば、第19版、(1995)、およびそれ以降の一切の版)を参照のこと。
【０１６６】
添加剤の非限定的な例は、以下のとおりである:溶媒、賦形剤、緩衝液、保存剤、張性調節剤(tonicity regulating agent)、キレート化剤および安定化剤。
【０１６７】
製剤の例としては、液体製剤、すなわち、水を含む水性製剤が挙げられる。液体製剤は、溶液剤または懸濁剤であってもよい。水性製剤は、典型的には、少なくとも50%w/wの水、または、少なくとも60%、70%、80%もしくはさらには少なくとも90%w/wの水を含む。
【０１６８】
あるいは、医薬組成物は、固形製剤、例えば、フリーズドライもしくはスプレードライされた組成物であってもよく、このような組成物は、そのまま使用してもよく、または、使用に先立ち、これに医師もしくは患者が溶媒および/または賦形剤を加える。
【０１６９】
水性製剤のpHは、pH3〜pH10の間のどのような値(例えば、約7.0〜約9.5、または約3.0〜約7.0)であってもよい。
【０１７０】
医薬組成物は、緩衝液を含んでもよい。緩衝液は、例えば、以下から成る群から選択してもよい:酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、シトレート、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リシン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素ニナトリウム、リン酸ナトリウムおよびトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、スクシネート、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸、ならびにそれらの混合物。医薬組成物は、保存剤を含んでもよい。保存剤は、例えば、以下から成る群から選択してもよい:フェノール、o-クレゾール、m-クレゾール、p-クレゾール、p-ヒドロキシ安息香酸メチル、p-ヒドロキシ安息香酸プロピル、2-フェノキシエタノール、p-ヒドロキシ安息香酸ブチル、2-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノールおよびチオメルサール、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、p-ヒドロキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネシン(chlorphenesine)(3p-クロルフェノキシプロパン(chlorphenoxypropane)-1,2-ジオール)、ならびにそれらの混合物。保存剤は、0.1mg/ml〜20mg/mlの濃度で存在してもよい。医薬組成物は、等張剤(isotonic agent)を含んでもよい。等張剤は、例えば、以下から成る群から選択してもよい:塩(例えば塩化ナトリウム)、糖または糖アルコール、アミノ酸(例えば、グリシン、ヒスチジン、アルギニン、リシン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、トレオニン)、アルジトール(例えば、グリセロール(グリセリン(glycerine))、1,2-プロパンジオール(プロピレングリコール)、1,3-プロパンジオール、1,3-ブタンジオール)、ポリエチレングリコール(例えばPEG400)、およびそれらの混合物。単糖、二糖または多糖または水溶性グルカンなど任意の糖(例えば、フルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、アルファHPCDおよびベータHPCD、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプンおよびカルボキシメチルセルロース-Naなど)を使用してもよい。糖アルコールは、少なくとも1つの-OH基を有するC4〜C8の炭化水素と定義され、例えば、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトールおよびアラビトールを包含する。一実施形態では、糖アルコール添加物はマンニトールである。医薬組成物は、キレート化剤を含んでもよい。キレート化剤は、例えば、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、クエン酸およびアスパラギン酸の塩、ならびにそれらの混合物から選択してもよい。医薬組成物は、安定化剤を含んでもよい。安定化剤は、例えば、1つもしくは複数の酸化阻害剤、凝集阻害剤、界面活性剤、および/または、1つもしくは複数のプロテアーゼ阻害剤であってもよい。これらの多様な種類の安定化剤の非限定的な例は、以下に開示する。
【０１７１】
用語「凝集体形成」は、ペプチド分子間での物理的な相互作用の結果オリゴマーが形成されることを指し、このオリゴマーは、可溶性のままであっても、または、溶液から沈殿する、大きな、目に見える凝集体であってもよい。液体の医薬組成物の保管中の、ペプチドによる凝集体形成は、当該ポリペプチドの生物活性に悪影響を及ぼす場合があり、その結果、該医薬組成物の治療有効性が失われる。さらに、凝集体形成は、ポリペプチドを含有する医薬組成物が注入系を用いて投与された場合には、管組織、膜またはポンプの遮断など、他の問題の原因となる場合がある。
【０１７２】
医薬組成物は、該組成物の保管中にポリペプチドの凝集体形成を低下させるだけ十分な量のアミノ酸ベースを含んでもよい。用語「アミノ酸ベース」は、1つもしくは複数のアミノ酸(メチオニン、ヒスチジン、イミダゾール、アルギニン、リシン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、トレオニンなど)またはそのアナログを指す。いずれのアミノ酸も、遊離塩基形態または塩形態のいずれで存在してもよい。任意の立体異性体(すなわち、L、Dまたはそれらの混合物)のアミノ酸ベースが存在してもよい。
【０１７３】
治療剤として作用するポリペプチドが、メチオニン残基からメチオニンスルホキシドへの酸化を起こしやすい少なくとも1つのメチオニン残基を含むポリペプチドである場合、メチオニン(または、イオウを含む他のアミノ酸またはアミノ酸アナログ)を加えて、そのような酸化を阻害してもよい。メチオニンの任意の立体異性体(LもしくはD)またはそれらの組合せを使用できる。
【０１７４】
医薬組成物は、高分子量のポリマーまたは低分子化合物の群から選択される安定化剤を含んでもよい。安定化剤は、例えば、以下から選択してもよい:ポリエチレングリコール(例えばPEG3350)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリビニルピロリドン、カルボキシセルロース/ヒドロキシセルロースまたはそれらの誘導体(例えば、HPC、HPC-SL、HPC-LおよびHPMC)、シクロデキストリン、イオウ含有物質(モノチオグリセロール、チオグリコール酸および2-メチルチオエタノールとして)、および異なる塩(例えば塩化ナトリウム)。医薬組成物は、以下の追加的な安定化剤を含んでもよい:メチオニンおよびEDTA(ポリペプチドをメチオニン酸化から保護する)、ならびに非イオン性界面活性剤(ポリペプチドを、凍結-解凍または機械的なせん断に伴う凝集から保護する)など、但しこれらに限定されない。
【０１７５】
医薬組成物は、1つまたは複数の界面活性剤、好ましくは、1つの界面活性剤、少なくとも1つの界面活性剤、または2つの異なる界面活性剤を含んでもよい。用語「界面活性剤」は、水溶性(親水性)部分と脂溶性(親油性)部分とから構成される任意の分子またはイオンを指す。界面活性剤は、例えば、以下から成る群から選択してもよい:陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤および/または双性イオン性界面活性剤。
【０１７６】
医薬組成物は、1つまたは複数のプロテアーゼ阻害剤(例えば、EDTA(エチレンジアミン四酢酸)および/またはベンズアミジンHClなど)を含んでもよい。
【０１７７】
医薬組成物の追加的、任意選択的な成分としては、例えば以下が挙げられる:湿潤剤、乳化剤、酸化防止剤、増量剤、金属イオン、油性ビヒクル、タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチン(gelatine))、および/または双性イオン(例えば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リシンおよびヒスチジンなどのアミノ酸)。
【０１７８】
またさらに、医薬組成物は、インスリン分泌性化合物の経口製剤の技術分野で公知のように、例えば、WO2008/145728に記載されている該製剤のうち任意の1つまたは複数を使用して、製剤化してもよい。
【０１７９】
投与用量は、0.01mg〜100mgの本GLP-1受容体アゴニスト誘導体、または0.01〜50mg、または0.01〜20mg、または0.01〜10mgの本GLP-1受容体アゴニスト誘導体を含有してもよい。
【０１８０】
本誘導体は、医薬組成物の形態で投与してもよい。本誘導体は、その必要がある患者に、いくつかの部位、例えば、局所的な部位(皮膚または粘膜の部位など)、吸収を迂回する部位(動脈中、静脈中または心臓内など)、および吸収に関与する部位(皮膚内、皮下、筋肉内または腹部内など)で投与してもよい。
【０１８１】
投与経路は、例えば以下の経路であってもよい:舌、舌下、頬側口腔、口腔内、経口、胃内、腸内、経鼻、経肺(細気管支、肺胞経由、またはそれらの組合せなど)、非経口、上皮、真皮、経皮、結膜、尿道、膣、直腸および/または眼。組成物は、経口組成物であってもよく、その投与経路は、経口である。
【０１８２】
組成物は、例えば、以下のようないくつかの剤形で投与してもよい:溶液剤、懸濁剤、乳剤、微小乳剤(microemulsion)、多相乳剤(multiple emulsion)、フォーム剤、塗擦剤、ペースト剤、プラスター剤、軟膏剤、錠剤、コーティング錠、チューインガム剤、リンス剤、カプセル剤(硬ゼラチンカプセル剤または軟ゼラチンカプセル剤など)、坐剤(suppositorium)、直腸用のカプセル剤、ドロップ剤、ゲル剤、スプレー剤、散剤、エアゾール剤、吸入剤、点眼剤、眼軟膏剤、眼用のリンス剤、膣用のペッサリー剤、膣リング、膣用の軟膏剤、注射液剤、in situ変換溶液剤(in situ transforming solution)(in situでゲル化、凝結、沈殿するもの、および、in situで結晶化するものなど)、注入用の溶液剤として、またはインプラント剤として。組成物は、錠剤、場合により被覆されたカプセル剤またはチューインガム剤であってもよい。
【０１８３】
組成物は、例えば、安定性、バイオアベイラビリティーおよび/または溶解性を改善するために、薬物担体または薬物送達系中でさらに配合してもよい。特定の一実施形態では、組成物は、そのような系に、共有結合性、疎水性および/または静電性の相互作用により結合していてもよい。そのような配合の目的は、例えば、有害作用を減少させる、時間療法を達成する、および/または患者コンプライアンスを高めるためであってもよい。
【０１８４】
組成物は、制御型、徐放型、持続型、遅延型および/または緩徐放出型の薬物送達系の製剤の形態で使用することもできる。
【０１８５】
非経口投与は、注射器、場合によりペン様の注射器を用い、または注入ポンプを用いて、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射または静脈内注射により実施してもよい。
【０１８６】
組成物は、溶液剤、懸濁剤もしくは散剤の形態で経鼻投与してもよく、または、液体もしくは粉末のスプレー剤の形態で経肺投与してもよい。
【０１８７】
経皮投与は、例えば、パッチ剤(イオン浸透型のパッチ剤など)から、または、経粘膜経路を介した(例えば頬側口腔への)、針を用いない注射による、またさらなる一選択肢である。
【０１８８】
組成物は、安定化製剤であってもよい。用語「安定化製剤」は、物理的および/または化学的な安定性を好ましくは両方とも高めた製剤を指す。一般には、製剤は、有効期限に達するまで、(推奨される使用条件および保管条件に従った)使用中および保管中は、安定でなくてはならない。
【０１８９】
用語「物理的安定性」は、熱機械的応力、および/または、不安定化している界面および表面(疎水性表面など)との相互作用にさらされる結果として、ポリペプチドが生物学的に不活性なおよび/または不溶性の凝集体を形成する傾向を指す。水性のポリペプチド製剤の物理的安定性は、異なる温度での機械的/物理的な応力(例えば、激しい振動)に多様な期間にわたり曝露させた後での目視検査および/または濁度測定を用いて評価してもよい。あるいは、物理的安定性は、ポリペプチドの立体配座状態を分光学的に調べる薬剤またはプローブ(例えば、Thioflavin Tまたは「疎水性パッチ」プローブなどを用いて評価してもよい)。
【０１９０】
用語「化学的安定性」は、未切断のポリペプチドと比較して、潜在的に、生物学的な効力が低下し、および/または免疫原性効果が向上している化学分解産物の形成に至る、ポリペプチド構造の化学的な(とりわけ共有結合性の)変化を指す。化学的安定性は、例えば、SEC-HPLCおよび/またはRP-HPLCにより、異なる環境条件にさらした後の多様な時点で化学分解産物の量を測定することにより評価できる。
【０１９１】
本発明による誘導体を用いた治療は、例えば、抗糖尿病剤、抗肥満剤、食欲調節剤、降圧剤、糖尿病が原因のもしくは糖尿病に伴う合併症の治療および/または予防のための薬剤、ならびに、肥満が原因のもしくは肥満に伴う合併症および障害の治療および/または予防のための薬剤から選択される1つまたは複数の追加的な薬理活性物質と組み合わせることもできる。これらの薬理活性物質の例は、インスリン、スルホニル尿素、ビグアニド、メグリチニド、グルコシダーゼ阻害剤、グルカゴンアンタゴニスト、DPP-IV(ジペプチジルペプチダーゼ-IV)阻害剤、糖新生および/またはグリコーゲン分解の刺激に関与する肝臓酵素の阻害剤、グルコース取込みモジュレーター、脂質代謝を改変する化合物(HMG CoA阻害剤(スタチン)としての抗高脂血症剤、胃抑制ポリペプチド(GIPアナログ)など)、食物摂取を低下させる化合物、RXRアゴニスト、および、β細胞のATP依存性カリウムチャネルに作用する薬剤;コレスチラミン、コレスチポール、クロフィブレート、ゲムフィブロジル、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、プロブコール、デキストロチロキシン、ネテグリニド(neteglinide)、レパグリニド;β遮断薬(アルプレノロール、アテノロール、チモロール、ピンドロール、プロプラノロールおよびメトプロロールなど)、ACE(アンギオテンシン変換酵素)阻害剤(ベナゼプリル、カプトプリル、エナラプリル、フォシノプリル、リシノプリル、アラトリオプリル、キナプリルおよびラミプリルなど)、カルシウムチャネル遮断薬(ニフェジピン、フェロジピン、ニカルジピン、イスラジピン、ニモジピン、ジルチアゼムおよびベラパミルなど)、およびα遮断薬(ドキサゾシン、ウラピジル、プラゾシンおよびテラゾシンなど);CART(コカイン・アンフェタミン調節転写産物)アゴニスト、NPY(神経ペプチドY)アンタゴニスト、PYYアゴニスト、Y2受容体アゴニスト、Y4受容体アゴニスト、混合型のY2/Y4受容体アゴニスト、MC4(メラノコルチン4)アゴニスト、オレキシンアンタゴニスト、TNF(腫瘍壊死因子)アゴニスト、CRF(コルチコトロピン放出因子)アゴニスト、CRF BP(コルチコトロピン放出因子結合タンパク質)アンタゴニスト、ウロコルチンアゴニスト、β3アゴニスト、オキシント
モジュリンおよびアナログ、MSH(メラニン形成細胞刺激ホルモン)アゴニスト、MCH(メラニン形成細胞凝集ホルモン)アンタゴニスト、CCK(コレシストキニン)アゴニスト、セロトニン再取込み阻害剤、セロトニンおよびノルアドレナリン再取込み阻害剤、混合型のセロトニンおよびノルアドレナリン作動性化合物、5HT(セロトニン)アゴニスト、ボンベシンアゴニスト、ガラニンアンタゴニスト、成長ホルモン、成長ホルモン放出化合物、TRH(チロトロピン放出ホルモン)アゴニスト、UCP2または3(脱共役タンパク質2または3)モジュレーター、レプチンアゴニスト、DAアゴニスト(ブロモクリプチン、ドプレキシン(doprexin))、リパーゼ/アミラーゼ阻害剤、RXR(レチノイドX受容体)モジュレーター、TRβアゴニスト;ヒスタミンH3アンタゴニスト、胃抑制ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニスト(GIPアナログ)、ガストリンおよびガストリンアナログである。
【０１９２】
本発明による誘導体を用いた治療は、血糖値および/または脂質ホメオスタシスに影響する外科手術(胃バンディング術または胃バイパス術など)と組み合わせることもできる。
【０１９３】
医薬としての適応症
本発明は、医薬として使用するための本発明のGLP-1受容体アゴニストペプチドおよびその誘導体にも関する。
【０１９４】
特定の実施形態では、これらの化合物を、以下の医学的処置のために使用してもよく、こうした処置は全て、好ましくは、何らかの形で糖尿病に関する:
(i)あらゆる形態の糖尿病(高血糖、2型糖尿病、耐糖能障害、1型糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、MODY(若年発症成人型糖尿病)、妊娠糖尿病など)の予防および/または治療、および/または、HbA1Cの低下のため、
(ii)糖尿病性疾患の進行(2型糖尿病の進行など)の遅延化または予防、耐糖能障害(IGT)のインスリン使用2型糖尿病への進行の遅延化、および/または、インスリン非使用2型糖尿病のインスリン使用2型糖尿病への進行の遅延化、
(iii)β細胞機能の改善(β細胞アポトーシスの減少、β細胞機能の向上および/またはβ細胞量の増加など)、および/または、グルコースのβ細胞への感受性の回復のため、
(iv)認知障害の予防および/または治療、
(v)例えば以下による摂食障害(肥満など)の予防および/または治療:食物摂取の減少、減量、食欲の抑制、満腹の誘導;無茶食い障害(binge eating disorder)、神経性過食症、および/または、抗精神病剤またはステロイドの投与により誘導される肥満の治療または予防;胃の運動性の低下;および/または胃内容排出の遅延化、
(vi)糖尿病性合併症(ニューロパチーを含む末梢神経障害、腎症または網膜症など)の予防および/または治療、
(vii)以下の脂質パラメーターの改善:脂質異常症の予防および/または治療、総血清中脂質(total serum lipid)の低下;HDLの低下;LDLの低下;VLDLの低下、すなわちトリグリセリドの低下;コレステロールの低下;HDLの増加;ヒトにおけるリポタンパク質a(Lp(a))の血漿レベルの低下;in vitroおよび/またはin vivoでのアポリポタンパク質a(apo(a))の産生の阻害など、
(iix)以下の心血管疾患の予防および/または治療:症候群X;アテローム性動脈硬化症;心筋梗塞;冠動脈心疾患;脳卒中、脳虚血;初期の心疾患または初期の心血管疾患(左室肥大など);冠動脈疾患;本態性高血圧症;急性の高血圧緊急症;心筋症;心機能不全;運動耐容能;慢性心不全;不整脈;心拍不規則;シンコピー(syncopy);アテローム性動脈硬化症;軽度の慢性心不全;狭心症;心臓バイパス再閉塞;間欠性跛行(アテローム性動脈硬化症オブリテレン(oblitteren));拡張機能不全;および/または収縮機能不全など、
(ix)胃腸疾患(炎症性腸症候群、小腸症候群、またはクローン病、消化不良および/または胃潰瘍など)の予防および/または治療、
(x)重症疾患の予防および/または治療(重症疾患患者、重症ポリネフロパシー(CIPNP)患者および/または潜在的なCIPNP患者の治療など);重症疾患、またはCIPNPの発症の予防;患者における全身性炎症応答症候群(SIRS)の予防、治療および/または治癒;および/または、患者が入院中に菌血症、敗血症および/または敗血症性ショックに罹患する可能性の予防または減少のため;および/または
(xi)多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)の予防および/または治療。
【０１９５】
特定の一実施形態では、適応症は、適応症(i)、(ii)および/または(iii)、または、適応症(v)、適応症(vi)、適応症(vii)および/または適応症(iix)など、(i)〜(iii)および(v)〜(iix)から成る群から選択される。
【０１９６】
別の特定の実施形態では、適応症は(i)である。さらなる特定の一実施形態では、適応症は(v)である。またさらなる特定の実施形態では適応症は(iix)である。
【０１９７】
以下の適応症がとりわけ好ましい:2型糖尿病および/または肥満。
【０１９８】
特定の実施形態
以下に記載するのは、本発明の特定の実施形態である:
【０１９９】
1. 式Chem.1:
Chem.1:Y-Z-P[式中、
Pは、2つのN末端アミノ酸残基を欠いているGLP-1受容体作動薬ペプチドの断片を表し、
Zは、式Chem.2の基:
Chem.2:
【化１５】
2013514322.tif 000017
{式中、
Wは、式Chem.3の基:
Chem.3:
【化１６】
2013514322.tif 000018
(式中、
R1およびR2は独立に、
(i)水素、アルキル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ハロゲン、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、シアノ、アミノ、アミノアルキル、カルボキシル、カルボキシルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、カルボキサミド、置換されたカルボキサミド、アルキルエステル、アリールエステル、アルキルスルホニルもしくはアリールスルホニルを表し、または
R1とR2とは一緒になって
(ii)シクロアルキル、ヘテロシクリルもしくはヘテロアリール
を形成し、
但し、
(iii)R1およびR2は両方が水素を表すことはない)
を表す}、
を表し、
Yは、式Chem.4またはChem.5の基:
Chem.4:
【化１７】
2013514322.tif 000019
Chem.5:
【化１８】
2013514322.tif 000020
{式中、
X1はN、OまたはSであり、X2、X3、X4およびX5は独立にCまたはNを表し、
但し、X2、X3、X4およびX5のうち少なくとも1つはCであり、
R11、R12、R13およびR14は独立に、
水素、アルキル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ハロゲン、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、シアノ、アミノ、アミノアルキル、カルボキシル、カルボキシルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、カルボキサミド、置換されたカルボキサミド、アルキルエステル、アリールエステル、アルキルスルホニルまたはアリールスルホニル
を表し、
Qは、結合または式Chem.6の基:
Chem.6:
*-(C(R15)(R16))q-*
(式中、
qは1〜6であり、
R15およびR16は互いに独立に、且つ、各値のqについて独立に、水素、アルキル、カルボキシルまたはヒドロキシルを表す)
を表し、
Rは水素またはアルキルを表す}
を表す]
を有するGLP-1受容体作動薬ペプチドまたは薬学上許容されるその塩、アミドもしくはエステル。
【０２００】
2. R1およびR2が独立に、水素、アルキル、アリール、ハロゲン、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、アミノ、アミノアルキル、カルボキシル、カルボキシルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、カルボキサミド、アルキルエステルまたはアリールエステルを表し、好ましくは、アルキル、ヒドロキシルアルキル、アミノアルキル、カルボキシルアルキル、アルコキシおよび/またはアルキルエステルが、直鎖または分枝状の、より好ましくは1〜6個のC原子を有する低級アルキルを含有する、実施形態1のペプチド。
【０２０１】
3. R1およびR2が独立に、水素、低級アルキルまたは低級アルコキシを表し、該低級アルキルおよび低級アルコキシが独立に、1〜5個のC原子、好ましくは1〜4個のC原子、または最も好ましくは1〜3個のC原子を有する、実施形態1または2のいずれか1つのペプチド。
【０２０２】
4. R1およびR2が独立に、水素、1〜2個のC原子を有するアルキル(エチルもしくはメチル)、または1〜2個のC原子を有するアルコキシ(エトキシ、メトキシ)を表す、実施形態1〜3のいずれか1つのペプチド。
【０２０３】
5. R1およびR2が、メチルまたはメトキシ、好ましくはメチルである、実施形態1〜4のいずれか1つのペプチド。
【０２０４】
6. R1およびR2が独立に、アルキル、アリール、ハロゲン、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、アミノ、アミノアルキル、カルボキシル、カルボキシルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、カルボキサミド、アルキルエステルまたはアリールエステルを表し、好ましくは、アルキル、ヒドロキシルアルキル、アミノアルキル、カルボキシルアルキル、アルコキシおよび/またはアルキルエステルが、直鎖または分枝状の、より好ましくは1〜6個のC原子を有する低級アルキルを含有する、実施形態1のペプチド。
【０２０５】
7. R1およびR2が独立に、低級アルキルまたは低級アルコキシを表し、該低級アルキルおよび低級アルコキシが独立に、1〜5個のC原子、好ましくは1〜4個のC原子、または最も好ましくは1〜3個のC原子を有する、実施形態1および6のいずれか1つのペプチド。
【０２０６】
8. R1およびR2が独立に、1〜2個のC原子を有するアルキル(エチルもしくはメチル)、または1〜2個のC原子を有するアルコキシ(エトキシ、メトキシ)を表す、実施形態1および6または7のいずれか1つのペプチド。
【０２０７】
9. R1およびR2が、メチルまたはメトキシ、好ましくはメチルである、実施形態1および6〜8のいずれか1つのペプチド。
【０２０８】
10. Zが、式Chem.7:
Chem.7:
【０２０９】
【化１９】
2013514322.tif 000021
の基である、実施形態1〜9のいずれか1つのペプチド。
【０２１０】
11. YがChem.4である、実施形態1〜10のいずれか1つのペプチド。
【０２１１】
12. X1がNである、実施形態1〜11のいずれか1つのペプチド。
【０２１２】
13. X2、X3、X4およびX5のうち1つがNである、実施形態1〜12のいずれか1つのペプチド。
【０２１３】
14. i)X3がNであり、ii)X4がNであり、iii)X5がNであり、またはX2がNである、実施形態1〜13のいずれか1つのペプチド、好ましくは実施形態12のペプチド。
【０２１４】
15 .R11およびR12が独立に、水素、アルキル、アリール、ハロゲン、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、アミノ、アミノアルキル、カルボキシル、カルボキシルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、カルボキサミド、アルキルエステルまたはアリールエステルを表し、好ましくは、アルキル、ヒドロキシルアルキル、アミノアルキル、カルボキシルアルキル、アルコキシおよび/またはアルキルエステルが、直鎖または分枝状の、より好ましくは1〜6個のC原子を有する低級アルキルを含有する、実施形態1〜14のいずれか1つのペプチド。
【０２１５】
16. R11およびR12が独立に、水素、低級アルキルまたは低級アルコキシを表し、該低級アルキルおよび低級アルコキシが独立に、1〜5個のC原子、好ましくは1〜4個のC原子、または最も好ましくは1〜3個のC原子を有する、実施形態1〜15のいずれか1つのペプチド。
【０２１６】
17. R11およびR12が独立に、水素、1〜2個のC原子を有するアルキル(エチルもしくはメチル)、または1〜2個のC原子を有するアルコキシ(エトキシ、メトキシ)を表す、実施形態1〜16のいずれか1つのペプチド。
【０２１７】
18. R11およびR12が、メチルまたは水素、好ましくは水素である、実施形態1〜17のいずれか1つのペプチド。
【０２１８】
19. Yが、2位、3位および/または5位のうち1つまたは2つで場合により置換されている1H-イミダゾールの誘導体、好ましくは1H-イミダゾール-4-イルであり、イミダゾールの位置番号付けが、IUPACに従っており、および/または、2010年12月3日のDK時間18:00にwikipedia上でイミダゾールについて示されているとおりである、実施形態1〜18のいずれか1つのペプチド。
【０２１９】
20. Qが、i)X2、ii)X3、X4またはX5に、好ましくはX2またはX4に、最も好ましくはX4に結合している、実施形態1〜19のいずれか1つのペプチド。
【０２２０】
21. qが、1〜5、好ましくは1〜4、より好ましくは1〜3、さらにより好ましくは1、2または3である、実施形態1〜20のいずれか1つのペプチド。
【０２２１】
22. R15およびR16が、互いに独立に、且つ、各値のqについて独立に、水素を表す、実施形態1〜21のいずれか1つのペプチド。
【０２２２】
23. R15およびR16が両方とも水素を表す、実施形態1〜22のいずれか1つのペプチド。
【０２２３】
24. Rが水素である、実施形態1〜23のいずれか1つのペプチド。
【０２２４】
25. Yが、式Chem.7の基:
Chem.7:
*-(R17)-N-*
(式中、R17は、直鎖または分枝状の、1〜6個のC原子、好ましくは1〜5個のC原子、より好ましくは1〜4個のC原子、または最も好ましくは1〜3個のC原子を有するアルキレンを表す)
で置換されている、1H-イミダゾールなどイミダゾールの誘導体である、実施形態1〜24のいずれか1つのペプチド。
【０２２５】
26. YがChem.5である、実施形態1〜10のいずれか1つのペプチド。
【０２２６】
27. R13およびR14が独立に、水素、アルキル、アリール、ハロゲン、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、アミノ、アミノアルキル、カルボキシル、カルボキシルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、カルボキサミド、アルキルエステルまたはアリールエステルを表し、好ましくは、アルキル、ヒドロキシルアルキル、アミノアルキル、カルボキシルアルキル、アルコキシおよび/またはアルキルエステルが、直鎖または分枝状の、より好ましくは1〜6個のC原子を有する低級アルキルを含有する、実施形態1〜10および26のいずれか1つのペプチド。
【０２２７】
28. R13およびR14が独立に、水素、低級アルキルまたは低級アルコキシを表し、該低級アルキルおよび低級アルコキシが独立に、1〜5個のC原子、好ましくは1〜4個のC原子、または最も好ましくは1〜3個のC原子を有する、実施形態1〜10および26または27のいずれか1つのペプチド。
【０２２８】
29. R13およびR14が独立に、水素、1〜2個のC原子を有するアルキル(エチルもしくはメチル)、または1〜2個のC原子を有するアルコキシ(エトキシ、メトキシ)を表す、実施形態1〜10および26〜28のいずれか1つのペプチド。
【０２２９】
30. R13およびR14が、メチルまたは水素、好ましくは水素である、実施形態1〜10および26〜29のいずれか1つのペプチド。
【０２３０】
31. Yが、3位、4位、5位および/または6位のうち1つまたは2つで場合により置換されているピリジンの誘導体、好ましくはピリジン-2-イルであり、ピリジンの位置番号付けが、IUPACに従っており、および/または、2010年12月3日のDK時間18:00にwikipedia上でピリジンについて示されているとおりである、実施形態1〜10および26〜30のいずれか1つのペプチド。
【０２３１】
32. Qが、ピリジン環の2位、3位、4位、5位または6位に、好ましくは2位に結合しており、ピリジンの位置番号付けが実施形態31において定義するとおりである、実施形態1〜10および26〜31のいずれか1つのペプチド。
【０２３２】
33. qが、実施形態21において定義するとおりである、実施形態1〜32のいずれか1つのペプチド。
【０２３３】
34. R15およびR16が、実施形態22〜23のいずれか1つに定義するとおりである、実施形態1〜33のいずれか1つのペプチド。
【０２３４】
35. Rが水素である、実施形態1〜34のいずれか1つのペプチド。
【０２３５】
36. Pが、2つのN末端アミノ酸残基を欠いている断片である、該GLP-1受容体アゴニストペプチドが、ヒトGLP-1受容体のアゴニストであり、アゴニスト活性が、好ましくは、ヒトGLP-1受容体を含有する培地におけるcAMPの形成の刺激として定量される、実施形態1〜35のいずれか1つのペプチド。
【０２３６】
37. 該培地が、ヒトGLP-1受容体を含有し、以下の組成(最終的なアッセイ内濃度):50mM Tris-HCl、1mM EGTA、1.5mM MgSO4、1.7mM ATP、20mM GTP、2mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)、0.01% Tween-20、pH7.4、より好ましくは以下の組成(最終的なアッセイ内濃度):50mM TRIS-HCl;5mM HEPES;10mM MgCl2、6H2O;150mM NaCl;0.01% Tween;0.1% BSA;0.5mM IBMX;1mM ATP;1uM GTP;pH7.4を有する培地などの適当な培地である、実施形態36のペプチド。
【０２３７】
38. Pが、2つのN末端アミノ酸残基を欠いている断片である、該GLP-1受容体アゴニストペプチドが、1000pM未満、好ましくは500pM未満、より好ましくは250pM未満、さらにより好ましくは125pM未満、または最も好ましくは50pM未満のEC50に相当する効力を有する、実施形態1〜37のいずれか1つのペプチド。
【０２３８】
39. Pが、2つのN末端アミノ酸残基を欠いている断片である、該GLP-1受容体アゴニストペプチドが、His-Ala-「P」、His-Gly-「P」および「His-Ser-P」から選択される、実施形態1〜38のいずれか1つのペプチド。
【０２３９】
40. Pが、2つのN末端アミノ酸残基を欠いている断片である、該GLP-1受容体アゴニストペプチドが、His-Ala-「P」およびHis-Gly-「P」から選択される、実施形態1〜39のいずれか1つのペプチド。
【０２４０】
41. Pが、i)GLP-1(9-37)(配列番号1)、ii)エキセンジン-4(3-39)(配列番号2)、iii)GLP-1A(3-37)(配列番号3)、およびiv)i)、ii)またはiii)のアナログであり、自身との類似性または好ましくは同一性の比率(%)が最も高いそれぞれの配列i)、ii)またはiii)と比較して最大8つのアミノ酸残基が入れ替わっている該アナログから選択される、実施形態1〜40のいずれか1つのペプチド。
【０２４１】
42. Pが、GLP-1(9-37)(配列番号1)、または、配列番号1と比較して最大8つのアミノ酸残基が入れ替わっているそのアナログである、実施形態1〜41のいずれか1つのペプチド。
【０２４２】
43. Pが、自身との類似性が最も高いi)GLP-1(9-37)(配列番号1)、ii)エキセンジン-4(3-39)(配列番号2)およびiii)GLP-1A(3-37)(配列番号3)の配列のうち1つと比較して入れ替わっているアミノ酸残基を、a)最大7つ、6つもしくは5つ、好ましくはb)最大4つ、またはc)最も好ましくは最大3つ有し、好ましくは該比較が、GLP-1(9-37)(配列番号1)と、またはGLP-1A(3-37)と、最も好ましくはGLP-1(9-37)と行われる、実施形態1〜42のいずれか1つのペプチド。
【０２４３】
44. Pが、自身との類似性が最も高いi)GLP-1(9-37)(配列番号1)、ii)エキセンジン-4(3-39)(配列番号2)およびiii)GLP-1A(3-37)(配列番号3)の配列のうち1つと比較して入れ替わっているアミノ酸残基を、最大2つ、好ましくは最大1つ有するか、または最も好ましくは全く有さず、好ましくは該比較が、GLP-1(9-37)(配列番号1)と、またはGLP-1A(3-37)と、最も好ましくはGLP-1(9-37)と行われる、実施形態1〜43のいずれか1つのペプチド。
【０２４４】
45. C末端のアミドを有する、実施形態1〜44のいずれか1つのペプチド。
【０２４５】
46. C末端の-COOH基を有する、実施形態1〜45のいずれか1つのペプチド。
【０２４６】
47. GLP-1(9-37)(配列番号1)と比較して、以下の置換:18K;22E;30E;31H;34Q,R;36K;37Kおよび/または38Eのうち少なくとも1つを含む、実施形態1〜46のいずれか1つのペプチド。
【０２４７】
48. 18Kを含む、実施形態1〜47のいずれか1つのペプチド。
【０２４８】
49. 22Eを含む、実施形態1〜48のいずれか1つのペプチド。
【０２４９】
50. 30Eを含む、実施形態1〜49のいずれか1つのペプチド。
【０２５０】
51. 31Hを含む、実施形態1〜50のいずれか1つのペプチド。
【０２５１】
52. 34Qまたは34R、好ましくは34Rを含む、実施形態1〜51のいずれか1つのペプチド。
【０２５２】
53. 36Kを含む、実施形態1〜52のいずれか1つのペプチド。
【０２５３】
54. 37Kを含む、実施形態1〜53のいずれか1つのペプチド。
【０２５４】
55. 38Eを含む、実施形態1〜54のいずれか1つのペプチド。
【０２５５】
56. 34Rおよび37Kを含む、実施形態1〜55のいずれか1つのペプチド。
【０２５６】
57. 30Eおよび36Kを含む、実施形態1〜56のいずれか1つのペプチド。
【０２５７】
58. 31Hおよび34Qを含む、実施形態1〜57のいずれか1つのペプチド。
【０２５８】
59. 38Eをさらに含む、実施形態56〜57のいずれか1つのペプチド。
【０２５９】
60. 以下の置換:(i)18K、22E、34Q、(ii)31H、34Q、(iii)30E、36K、(iv)30E、36K、38E、(v)34R、(vi)34R、37Kまたは(vii)34R、37K、38Eを含む、実施形態1〜59のいずれか1つのペプチド。
【０２６０】
61. GLP-1(9-37)(配列番号1)と比較して、以下の置換:(i)18K、22E、34Q、(ii)31H、34Q、(iii)30E、36K、(iv)30E、36K、38E、(v)34R、(vi)34R、37Kまたは(vii)34R、37K、38Eを有し、他のアミノ酸残基は全て配列番号1におけるとおりである、実施形態1〜60のいずれか1つのペプチド。
【０２６１】
62. GLP-1A(3-37)(配列番号3)と比較して、以下の置換:17Q,R;20R;33Rおよび/または38Kのうち少なくとも1つを含む、実施形態1〜46のいずれか1つのペプチド。
【０２６２】
63. GLP-1A(3-37)(配列番号3)と比較して、以下の置換:17R、20R、33Rおよび38Kを有し、他のアミノ酸残基は全て配列番号3におけるとおりである、実施形態1〜46および62のいずれか1つのペプチド。
【０２６３】
64. (i) N9-[-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)-エチルカルバモイル]-2-メチル-プロピオニル}-[Lys18,Glu22,Gln34]GLP-1(9-37)-ペプチド;
(ii) N9-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)-エチルカルバモイル]-2-メチル-プロピオニル}-[His31,Gln34]GLP-1(9-37)-ペプチド;
(iii) N9-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)-エチルカルバモイル]-2-メチル-プロピオニル}-[Glu30,Lys36]GLP-1(9-37)-Glu38-ペプチドアミド;
(iv) N9-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)プロピルカルバモイル]-2-メチル-プロピオニル}-[Glu30,Lys36]GLP-1(9-37)Glu38-ペプチドアミド;
(v) N9-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)-メチルカルバモイル]-2-メチル-プロピオニル}-[Glu30,Lys36]GLP-1(9-37)-Glu38-ペプチドアミド;
(vi) N3-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)-メチルカルバモイル]-2-メチル-プロピオニル}-[Arg17,Arg20,Arg33,Lys38]GLP-1A(3-37)-ペプチド;
(vii) N9-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)-エチルカルバモイル]-2-メチル-プロピオニル}-[Arg34,Lys37]GLP-1(9-37)-ペプチド;
(iix) N9-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)-エチルカルバモイル]-2-メチル-プロピオニル}[Arg34,Lys37]GLP-1(9-37)Glu38-ペプチド;
(ix) N9-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)-エチルカルバモイル]-2-メチル-プロピオニル}-[Arg34,Lys37]GLP-1(9-37)-ペプチド;
(x) N9-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)-エチルカルバモイル]-2-メチル-プロピオニル}[Arg34]GLP-1(9-37)-ペプチド;および
(xii) N9-[2,2-ジメチル-3-オキソ-3-(ピリジン-2-イルメチルアミノ)プロパノイル][Arg34,Lys37]-GLP-1-(9-37)-ペプチド
から選択されるGLP-1受容体アゴニストペプチドまたは薬学上許容されるその塩、アミドもしくはエステル。
【０２６４】
64. 最大2つのK残基を有する、実施形態1〜63のいずれか1つのペプチド。
【０２６５】
65. 最大1つのK残基を有する、実施形態1〜64のいずれか1つのペプチド。
【０２６６】
66. a)i)GLP-1(9-37)(配列番号1)、ii)エキセンジン-4(3-39)(配列番号2)およびiii)GLP-1A(3-37)(配列番号3)の指示された位置のいずれかに対応する位置、および/または
b)i)GLP-1(9-37)(配列番号1)、ii)エキセンジン-4(3-39)(配列番号2)およびiii)GLP-1A(3-37)(配列番号3)と比較したアミノ酸修飾の番号
が、手で書き目で追うことにより同定される、実施形態1〜65のいずれか1つのペプチド。
【０２６７】
67. a)i)GLP-1(9-37)(配列番号1)、ii)エキセンジン-4(3-39)(配列番号2)およびiii)GLP-1A(3-37)(配列番号3)の指示された位置のいずれかに対応する位置、および/または
b)i)GLP-1(9-37)(配列番号1)、ii)エキセンジン-4(3-39)(配列番号2)およびiii)GLP-1A(3-37)(配列番号3)と比較したアミノ酸修飾の番号
が、標準的なタンパク質またはペプチドのアラインメントプログラムの使用により同定される、実施形態1〜66のいずれか1つのペプチド。
【０２６８】
68. 該アラインメントプログラムがNeedleman-Wunschアラインメントである、実施形態67のペプチド。
【０２６９】
69. デフォルトのスコア行列およびデフォルトの同一性行列が使用される、実施形態67〜68のいずれか1つのペプチド。
【０２７０】
70. 該スコア行列がBLOSUM62である、実施形態67〜69のいずれか1つのペプチド。
【０２７１】
71. ギャップにおける第1の残基についてのペナルティーが-10(マイナス10)である、実施形態67〜70のいずれか1つのペプチド。
【０２７２】
72. ギャップにおける追加的な残基についてのペナルティーが-0.5(マイナス0.5)である、実施形態67〜71のいずれか1つのペプチド。
【０２７３】
73. 残基番号、好ましくは任意の残基番号(アミノ酸残基の後ろに上付き文字で、または当該アミノ酸残基の前もしくは後ろに普通の文字で書かれる)が、i)GLP-1(9-37)(配列番号1)、ii)エキセンジン-4(3-39)(配列番号2)およびiii)GLP-1A(3-37)(配列番号3)の配列の1つにおける対応する位置を指す、実施形態1〜72のいずれか1つのペプチド。
【０２７４】
74. 実施形態1〜73のいずれか1つのペプチドの誘導体または薬学上許容されるその塩、アミドもしくはエステル。
【０２７５】
75. リシン残基、より好ましくはそのイプシロンアミノ基にアミド結合を介して結合しているアルブミン結合部分を、含む、好ましくは、有する、実施形態74の誘導体。
【０２７６】
76. 18K、26K、36Kおよび/または37Kのうち1つまたは複数に結合しているアルブミン結合部分、好ましくは、18K、26Kまたは36Kに結合している1つのアルブミン結合部分、または26Kおよび37Kに結合している2つのアルブミン結合部分を、含み、好ましくは、有し、GLP-1(9-37)(配列番号1)の配列を参照できる、実施形態75の誘導体。
【０２７７】
77. 17K、20K、33Kおよび/または38Kのうち1つまたは複数に結合しているアルブミン結合部分、好ましくは、38Kに結合している1つのアルブミン結合部分、または20Kおよび33Kに結合している2つのアルブミン結合部分を有し、GLP-1A(3-37)(配列番号3)の配列を参照できる、実施形態75の誘導体。
【０２７８】
78. アルブミン結合部分が、持続化部分を含む、実施形態75〜77のいずれか1つの誘導体。
【０２７９】
79. 持続化部分が、Chem.8、Chem.9およびChem.10:
Chem.8:HOOC-(CH2)x-CO-*
Chem.9:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
Chem.10:R18-C6H4-(CH2)z-CO-*
(式中、xは6〜18の範囲の整数であり、yは3〜17の範囲の整数であり、zは1〜5の範囲の整数であり、R18は、150Da以下のモル質量を有する基である)
から選択される、実施形態78の誘導体。
【０２８０】
80. 持続化部分がChem.8(式中、xは、好ましくは14〜18、より好ましくは16〜18の範囲の偶数であるか、または最も好ましくはxは16である)である、実施形態79の誘導体。
【０２８１】
81. 持続化部分がChem.9(式中、yは、好ましくは7〜15の範囲の奇数である)である、実施形態79の誘導体。
【０２８２】
82. 持続化部分がChem.10(式中、zは、奇数、好ましくは3であり、R18はtert.ブチルである)である、実施形態79の誘導体。
【０２８３】
83. yが9である、実施形態79および81のいずれか1つの誘導体。
【０２８４】
84. -COOH基がパラ位にある、実施形態79、81および83のいずれか1つの誘導体。
【０２８５】
85. R18がパラ位にある、実施形態79および82のいずれか1つの誘導体。
【０２８６】
86. リンカーを含む、実施形態75〜84のいずれか1つの誘導体。
【０２８７】
87. アルブミン結合部分がリンカーを含む、実施形態75〜86のいずれか1つの誘導体。
【０２８８】
88. アルブミン結合部分がリンカーをさらに含む、実施形態75〜87のいずれか1つの誘導体。
【０２８９】
89. リンカーが、NラジカルおよびCOラジカルを含むジラジカルであり、
i)Nラジカルが、場合により置換されている、第1の*-NR19R20基(式中、R19およびR20は独立に、水素、炭素またはイオウを示すことがある)で表され、
ii)COラジカルが第1の*-CO基で表され、
好ましくは、第1の*-NR19R20基は第2の*-CO基とアミド結合を形成することが可能であり、第1の*-CO基は第2の*-NR19R20基とアミド結合を形成することが可能であり、このとき、第2の*-NR19R20基および第2の*-CO基は、それぞれ、第1の*-NR19R20基および第1の*-CO基と定義され、独立に、i)該アナログ、ii)持続化部分および/またはiii)別のリンカーの構造の一部を形成する、実施形態86〜88のいずれか1つの誘導体。
【０２９０】
90. Chem.11、Chem.12、Chem.13およびChem.14:
Chem.11:*-NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)k-O-(CH2)n-CO-*
Chem.12:*-NH-C(COOH)-(CH2)2-CO-*
Chem.13:*-N-C((CH2)2COOH)-CO-*
Chem.14:*-NC5H8-CO-*
(式中、kは、1〜5の範囲の整数であり、nは、1〜5の範囲の整数であり、Chem.12およびChem.13は、Gluのジラジカルである)
から成る群から選択される少なくとも1つのリンカーを含む、実施形態74〜89のいずれか1つの誘導体。
【０２９１】
91. リンカーがChem.11を含み、好ましくはChem.11が第1のリンカーエレメントである、実施形態90の誘導体。
【０２９２】
92. kが1である、実施形態90〜91のいずれか1つの誘導体。
【０２９３】
93. nが1である、実施形態90〜92のいずれか1つの誘導体。
【０２９４】
94. Chem.11がm回含まれ、mが1〜10の範囲の整数である、実施形態90〜93のいずれか1つの誘導体。
【０２９５】
95. mが、1〜6の範囲、好ましくは1〜4の範囲の整数であり、より好ましくはmが1または2であり、さらにより好ましくはmが1であり、または最も好ましくはmが2である、実施形態94の誘導体。
【０２９６】
96. mが1とは異なるとき、Chem.11のエレメントがアミド結合を介して相互連結される、実施形態94〜95のいずれか1つの誘導体。
【０２９７】
97. リンカーが、1つまたは複数のChem.11のエレメントから成る、実施形態90〜96のいずれか1つの誘導体。
【０２９８】
98. Chem.11が、Chem.11a:
【０２９９】
【化２０】
2013514322.tif 000022
【０３００】
(式中、kおよびnは、実施形態90〜97のいずれか1つに定義するとおりである)
で表される、実施形態90〜97のいずれか1つの誘導体。
【０３０１】
99. 該リンカーが、Chem.12およびChem.13などのGluジラジカルを含む、実施形態90〜99のいずれか1つの誘導体。
【０３０２】
100. Chem.12およびChem.13が独立に、それぞれChem.12aおよびChem.13a:
Chem.12a:
【０３０３】
【化２１】
2013514322.tif 000023
【０３０４】
Chem.13a:
【０３０５】
【化２２】
2013514322.tif 000024
【０３０６】
で、最も好ましくはChem.12aで表されてもよい、実施形態90〜99のいずれか1つの誘導体。
【０３０７】
101. Chem.12および/またはChem.13などのGluジラジカルが独立にp回含まれ、pが1〜3の範囲の整数である、実施形態90〜101のいずれか1つの誘導体。
【０３０８】
102. pが、1、2もしくは3、好ましくは1もしくは2、または最も好ましくは1である、実施形態101の誘導体。
【０３０９】
103. Gluジラジカルが、L-GluまたはD-Glu、好ましくはL-Gluのラジカルである、実施形態90〜102のいずれか1つの誘導体。
【０３１０】
104. リンカーが、Gluジラジカル、好ましくはChem.12、より好ましくはChem.12aから成る、実施形態90〜103のいずれか1つの誘導体。
【０３１１】
105. リンカーがChem.14を含む、実施形態90〜104のいずれか1つの誘導体。
【０３１２】
106. Chem.14が、Chem.14a:
【０３１３】
【化２３】
2013514322.tif 000025
【０３１４】
で表される、実施形態90〜105のいずれか1つの誘導体。
【０３１５】
107. リンカーが、自身の*-NH末端で持続化部分の*-CO末端と、且つ、自身の*-CO末端で本ペプチドのリシン残基のイプシロンアミノ基と連結されているChem.11から成る、実施形態90〜106のいずれか1つの誘導体。
【０３１６】
108. リンカーが、アミド結合を介して、指示された配列において相互連結されている1回のChem.12と2回のChem.11とから成り、リンカーが、自身の*-NH末端で持続化部分の*-CO末端と、且つ、自身の*-CO末端で本ペプチドのリシン残基のイプシロンアミノ基と連結されている、実施形態90〜106のいずれか1つの誘導体。
【０３１７】
109. リンカーが、アミド結合を介して、指示された配列において相互連結されている1回のChem.14と1回のChem.12と2回のChem.11とから成り、リンカーが、自身の*-NH末端で持続化部分の*-CO末端と、且つ、自身の*-CO末端で本ペプチドのリシン残基のイプシロンアミノ基と連結されている、実施形態90〜106のいずれか1つの誘導体。
【０３１８】
110. 1つまたは複数のリンカーが、アミド結合を介して相互連結されている、実施形態90〜109のいずれか1つの誘導体。
【０３１９】
111. Chem.30、Chem.31、Chem.32、Chem.33、Chem.34、Chem.35、Chem.36、Chem.37、Chem.38、Chem.39およびChem.41から選択される化合物または薬学上許容されるその塩、アミドもしくはエステル。
【０３２０】
112. その名称により特徴付けられ、本明細書の実施例1〜10および12の化合物の名称のそれぞれのリストから選択される化合物または薬学上許容されるその塩、アミドもしくはエステル。
【０３２１】
113. 実施形態111の化合物である、実施形態112の化合物。
【０３２２】
114. 実施形態74〜110のいずれか1つの誘導体である、実施形態111〜113のいずれか1つの化合物。
【０３２３】
115. GLP-1活性を有する、実施形態1〜114のいずれか1つのペプチドまたは誘導体。
【０３２４】
116. GLP-1活性が、ヒトGLP-1受容体を活性化させる能力を指す、実施形態115のペプチドまたは誘導体。
【０３２５】
117. in vitroアッセイにおいて、ヒトGLP-1受容体の活性化がcAMP産生の効力として測定される、実施形態116のペプチドまたは誘導体。
【０３２６】
118. 4500pM以下、好ましくは4500pM未満、より好ましくは4000pM未満、さらにより好ましくは3500pM未満、または最も好ましくは3000pM未満のEC50に相当する効力を有する、実施形態1〜117のいずれか1つのペプチドまたは誘導体。
【０３２７】
119. 2500pM未満、好ましくは2000pM未満、より好ましくは1500pM未満、さらにより好ましくは1000pM未満、または最も好ましくは800pM未満のEC50に相当する効力を有する、実施形態1〜118のいずれか1つのペプチドまたは誘導体。
【０３２８】
120. 600pM未満、好ましくは500pM未満、より好ましくは400pM未満、さらにより好ましくは300pM未満、または最も好ましくは200pM未満のEC50に相当する効力を有する、実施形態1〜119のいずれか1つのペプチドまたは誘導体。
【０３２９】
121. 180pM未満、好ましくは160pM未満、より好ましくは140pM未満、さらにより好ましくは120pM未満、または最も好ましくは100pM未満のEC50に相当する効力を有する、実施形態1〜120のいずれか1つのペプチドまたは誘導体。
【０３３０】
122. 80pM未満、好ましくは60pM未満、より好ましくは50pM未満、さらにより好ましくは40pM未満、または最も好ましくは30pM未満のEC50に相当する効力を有する、実施形態1〜121のいずれか1つのペプチドまたは誘導体。
【０３３１】
123. 該効力が、好ましくは、安定なトランスフェクト細胞株(BHK467-12A(tk-ts13)など)を用い、および/または、cAMPの定量に、機能的な受容体アッセイ(例えば、内因性に形成されるcAMPと外因性に加えられるビオチン標識したcAMPとの間の競合に基づくもの)を用いて、ヒトGLP-1受容体を含有する培地におけるcAMPの用量依存的な形成を示す用量応答曲線についてのEC50として定量され、そのようなアッセイにおいては、cAMPは、より好ましくは、特異的な抗体を使用して捕捉され、および/または、この場合、さらにより好ましいアッセイは、AlphaScreen cAMP Assay、最も好ましくは、実施例13に記載するアッセイである、実施形態1〜122のいずれか1つのペプチドまたは誘導体。
【０３３２】
124. EC50が、セマグルチドのEC50を10倍未満、好ましくは、セマグルチドのEC50の8倍未満、より好ましくは、セマグルチドのEC50の6倍未満、さらにより好ましくは、セマグルチドのEC50の4倍未満、または最も好ましくは、セマグルチドのEC50の2倍未満である、実施形態1〜123のいずれか1つのペプチドまたは誘導体。
【０３３３】
125. EC50が、セマグルチドのEC50を下回る、好ましくは、セマグルチドのEC50の0.8倍未満、より好ましくは、セマグルチドの効力の0.6倍未満、さらにより好ましくは、セマグルチドのEC50の0.4倍未満、または最も好ましくは、セマグルチドのEC50の0.2倍未満である、実施形態1〜124のいずれか1つのペプチドまたは誘導体。
【０３３４】
126. EC50が、リラグルチドのEC50を10倍未満、好ましくは、リラグルチドのEC50の8倍未満、より好ましくは、リラグルチドのEC50の6倍未満、さらにより好ましくは、リラグルチドのEC50の4倍未満、または最も好ましくは、リラグルチドのEC50の2倍未満である、実施形態1〜125のいずれか1つのペプチドまたは誘導体。
【０３３５】
127. EC50が、リラグルチドのEC50を下回る、好ましくは、リラグルチドのEC50の0.8倍未満、より好ましくは、リラグルチドのEC50の0.6倍未満、さらにより好ましくは、リラグルチドのEC50の0.5倍未満、または最も好ましくは、リラグルチドのEC50の0.4倍以下である、実施形態1〜126のいずれか1つのペプチドまたは誘導体。
【０３３６】
128. [2.0% HSA(高アルブミン)の存在下でのGLP-1受容体結合親和性(IC50)を、0.005% HSA(低アルブミン)の存在下でのGLP-1受容体結合親和性(IC50)で割った]比率が、
a)少なくとも0.5、好ましくは少なくとも1.0、より好ましくは少なくとも10、さらにより好ましくは少なくとも20、もしくは最も好ましくは少なくとも30であるか、
b)少なくとも40、好ましくは少なくとも50、より好ましくは少なくとも60、さらにより好ましくは少なくとも70、もしくは最も好ましくは少なくとも80であるか、
c)少なくとも90、好ましくは少なくとも100、より好ましくは少なくとも110、もしくは最も好ましくは少なくとも120であるか、
d)セマグルチドの該比率の少なくとも20%、好ましくは、セマグルチドの該比率の少なくとも50%、より好ましくは、セマグルチドの該比率の少なくとも75%、さらにより好ましくは、セマグルチドの該比率に少なくとも等しい、もしくは最も好ましくは、セマグルチドの該比率の少なくとも2倍であるか、または
e)リラグルチドの該比率に少なくとも等しい、好ましくは、リラグルチドの該比率の少なくとも2倍、より好ましくは、リラグルチドの該比率の少なくとも3倍、さらにより好ましくは、リラグルチドの該比率の少なくとも5倍、もしくは最も好ましくは、リラグルチドの該比率の少なくとも10倍である、
実施形態74〜127のいずれか1つの誘導体。
【０３３７】
129. 0.005% HSA(低アルブミン)の存在下でのGLP-1受容体結合親和性(IC50)が、
a)600.00nM未満、好ましくは500.00nM未満、より好ましくは200.00nM未満、さらにより好ましくは100.00nM未満、もしくは最も好ましくは45.00nM未満であるか、または
b)20.00nM未満、好ましくは10.00nM未満、より好ましくは5.00nM未満、さらにより好ましくは2.00nM未満、もしくは最も好ましくは1.00nM未満である、
実施形態74〜128のいずれか1つの誘導体。
【０３３８】
130. 2.0% HSA(高アルブミン)の存在下でのGLP-1受容体結合親和性(IC50)が、
a)900nM未満、より好ましくは800nM未満、さらにより好ましくは700nM未満、もしくは最も好ましくは600nM未満であるか、または
b)400.00nM未満、好ましくは300.00nM未満、より好ましくは200.00nM未満、さらにより好ましくは100.00nM未満、もしくは最も好ましくは50.00nM未満である、
実施形態1〜129のいずれか1つの誘導体。
【０３３９】
131. GLP-1受容体との結合親和性が、該受容体からの125I-GLP-1の置換えにより、好ましくはSPA結合アッセイを用いて測定される、実施形態1〜130のいずれか1つの誘導体。
【０３４０】
132. GLP-1受容体が、安定なトランスフェクト細胞株、好ましくはハムスター細胞株、より好ましくはベビーハムスター腎臓細胞株(BHKtk-ts13など)を用いて調製される、実施形態1〜131のいずれか1つの誘導体。
【０３４１】
133. IC50値が、該受容体から125I-GLP-1の50%を置き換える濃度として定量される、実施形態1〜132のいずれか1つのアナログまたは誘導体。
【０３４２】
134. リラグルチドより高く、および/またはセマグルチドより高い経口バイオアベイラビリティー、好ましくは絶対経口バイオアベイラビリティーを有する、実施形態74〜133のいずれか1つの誘導体。
【０３４３】
135. 経口バイオアベイラビリティーが、腸管腔中への直接注射後の血漿中での曝露量として、ラットにおいてin vivoで測定される、実施形態134の誘導体。
【０３４４】
136. ラットの空腸中で、本誘導体の溶液の注射の30分後に定量される本誘導体の血漿中濃度(pM)を、注射した溶液の濃度(μM)で割ったもの(30分時点での用量補正された曝露量)が、少なくとも15、好ましくは少なくとも30、より好ましくは少なくとも48、またより好ましくは少なくとも62、さらにより好ましくは少なくとも80、または最も好ましくは少なくとも100である、実施形態74〜135のいずれか1つの誘導体。
【０３４５】
137. ラットの空腸中で、本誘導体の溶液の注射の30分後に定量される本誘導体の血漿中濃度(pM)を、注射した溶液の濃度(μM)で割ったもの(30分時点での用量補正された曝露量)が、少なくとも30、好ましくは少なくとも40、より好ましくは少なくとも50、またより好ましくは少なくとも60、さらにより好ましくは少なくとも70、または最も好ましくは少なくとも80である、実施形態74〜136のいずれか1つの誘導体。
【０３４６】
138. 55mg/mlのカプリン酸ナトリウムとの混合物中の1000uMの濃度で試験される、実施形態74〜137のいずれか1つの誘導体。
【０３４７】
139. 好ましくは到着時の体重がおよそ240gの、オスのSprague Dawleyラットが使用される、実施形態74〜138のいずれか1つの誘導体。
【０３４８】
140. 該ラットを実験前およそ18時間絶食させる、実施形態74〜139のいずれか1つの誘導体。
【０３４９】
141. 該ラットに、絶食させた後、且つ、空腸中での本誘導体の注射前に、全身麻酔をかける、実施形態74〜140のいずれか1つの誘導体。
【０３５０】
142. 空腸の近位部(十二指腸方向に10cm遠位)中、または中腸(盲腸方向に50cm近位)中に投与される、実施形態74〜141のいずれか1つの誘導体。
【０３５１】
143. 100μlの本誘導体が、1mL注射器を用いて、カテーテルを通して空腸管腔中に注射され、次いで、200μlの空気が、別の注射器で空腸管腔中に送り込まれ、次に該別の注射器を該カテーテルに連結したままにして該カテーテル中への逆流が防止される、実施形態74〜142のいずれか1つの誘導体。
【０３５２】
144. 血液試料(200ul)が、尾静脈からEDTAチューブ中に、0分時点、10分時点、30分時点、60分時点、120分時点および240分時点など所望の間隔で収集され、20分以内に、10000G、4℃で5分遠心分離される、実施形態74〜143のいずれか1つの誘導体。
【０３５３】
145. 血漿(75ul)が、分離され、直ちに凍結され、本誘導体の血漿中濃度を分析するまで-20℃で維持される、実施形態74〜144のいずれか1つの誘導体。
【０３５４】
146. 本誘導体の血漿中濃度の分析にLOCI(Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay)が用いられる、実施形態74〜145のいずれか1つの誘導体。
【０３５５】
147. リラグルチドより高い持続型の作用プロファイルを有する、実施形態74〜145のいずれか1つの誘導体。
【０３５６】
148. 持続が、関連する動物種(db/dbマウス、ラット、ブタおよび/または好ましくはミニブタなど)におけるin vivo半減期を意味し、本誘導体が、i)s.c.投与、および/または好ましくはii)s.c.投与される、実施形態147の誘導体。
【０３５７】
149. ミニブタにおけるi.v.投与後の終末半減期(T1/2)が、
a)少なくとも12時間、好ましくは少なくとも24時間、より好ましくは少なくとも36時間、さらにより好ましくは少なくとも48時間、もしくは最も好ましくは少なくとも60時間、または
b)セマグルチドの該半減期の少なくとも0.2倍、好ましくは、セマグルチドの該半減期の少なくとも0.4倍、より好ましくは、セマグルチドの該半減期の少なくとも0.6倍、さらにより好ましくは、セマグルチドの該半減期の少なくとも0.8倍、もしくは最も好ましくは、セマグルチドの該半減期と少なくとも同じである、実施形態74〜148のいずれか1つの誘導体。
【０３５８】
150. ミニブタが、オスのGottingenミニブタである、実施形態149の誘導体。
【０３５９】
151. ミニブタが、生後7〜14カ月であり、好ましくは体重が16〜35kgである、実施形態149〜150のいずれか1つの誘導体。
【０３６０】
152. ミニブタが個別に収容され、1日1回または2回、好ましくはSDSミニブタ食を給餌される、実施形態149〜151のいずれか1つの誘導体。
【０３６１】
153. 本誘導体が、順化の少なくとも2週間後にi.v.投与される、実施形態149〜152のいずれか1つの誘導体。
【０３６２】
154. 動物が、投与前およそ18時間、および投与後少なくとも4時間絶食させられ、全期間にわたり水は自由に摂れる、実施形態149〜153のいずれか1つの誘導体。
【０３６３】
155. 50mMリン酸ナトリウム、145mM塩化ナトリウム、0.05% tween 80、pH7.4に溶解されて適当な濃度、好ましくは20〜60nmol/mlになる、実施形態149〜154のいずれか1つの誘導体。
【０３６４】
156. 本誘導体の静脈内注射が、1〜2nmol/kgに相当する体積で投与される、実施形態149〜155のいずれか1つの誘導体。
【０３６５】
157. 実施例2の化合物ではない、好ましくはChem.31ではない、実施形態74〜156のいずれか1つの誘導体。
【０３６６】
158. 実施例7、8、9および12の化合物ではない、好ましくは、Chem.36、Chem.37、Chem.38およびChem.41ではない、実施形態74〜157のいずれか1つの誘導体。
【０３６７】
158. 医薬として使用するための、実施形態1〜73および115〜127のいずれか1つのペプチド。
【０３６８】
159. 医薬として使用するための、実施形態74〜157のいずれか1つの誘導体。
【０３６９】
160. 摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重症疾患および/または多嚢胞性卵巣症候群などあらゆる形態の糖尿病および関連疾患の治療および/または予防において使用するための、および/または、脂質パラメーターの改善、β細胞機能の改善のための、および/または、糖尿病性疾患の進行の遅延化もしくは予防のための、実施形態1〜73および115〜127のいずれか1つのペプチド。
【０３７０】
161. 摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重症疾患および/または多嚢胞性卵巣症候群などあらゆる形態の糖尿病および関連疾患の治療および/または予防において使用するための、および/または、脂質パラメーターの改善、β細胞機能の改善のための、および/または、糖尿病性疾患の進行の遅延化もしくは予防のための、実施形態74〜157のいずれか1つの誘導体。
【０３７１】
162. 摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重症疾患および/または多嚢胞性卵巣症候群などあらゆる形態の糖尿病および関連疾患の治療および/または予防のための、および/または、脂質パラメーターの改善、β細胞機能の改善のための、および/または、糖尿病性疾患の進行の遅延化もしくは予防のための医薬の製造における、実施形態1〜73および115〜127のいずれか1つのペプチドの使用。
【０３７２】
163. 摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重症疾患および/または多嚢胞性卵巣症候群などあらゆる形態の糖尿病および関連疾患の治療および/または予防のための、および/または、脂質パラメーターの改善、β細胞機能の改善のための、および/または、糖尿病性疾患の進行の遅延化もしくは予防のための医薬の製造における、実施形態74〜157のいずれか1つの誘導体の使用。
【０３７３】
164. 薬学的に活性な量の実施形態1〜73および115〜127のいずれか1つのペプチドを投与するステップにより、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重症疾患および/または多嚢胞性卵巣症候群などあらゆる形態の糖尿病および関連疾患を治療および/または予防し、および/または、脂質パラメーターを改善し、β細胞機能を改善し、および/または、糖尿病性疾患の進行を遅延化もしくは予防する、方法。
【０３７４】
165. 薬学的に活性な量の実施形態74〜157のいずれか1つの誘導体を投与するステップにより、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重症疾患および/または多嚢胞性卵巣症候群などあらゆる形態の糖尿病および関連疾患を治療または予防し、および/または、脂質パラメーターを改善し、β細胞機能を改善し、および/または、糖尿病性疾患の進行を遅延化もしくは予防する、方法。
【０３７５】
166. 式Chem.50またはChem.51:
Chem.50:
【０３７６】
【化２４】
2013514322.tif 000026
【０３７７】
Chem.51:
【０３７８】
【化２５】
2013514322.tif 000027
【０３７９】
[式中、Qは、結合または式Chem.6の基:
Chem.6:
-(C(R15)(R16))q-
(式中、qは1〜6であり、R15およびR16は互いに独立に、且つ、各値のqについて独立に、水素、アルキル、カルボキシルまたはヒドロキシルを表す)を表し、
Rは水素またはアルキルを表し、
R1およびR2は独立に、(i)水素、アルキル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ハロゲン、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、シアノ、アミノ、アミノアルキル、カルボキシル、カルボキシルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、カルボキサミド、置換されたカルボキサミド、アルキルエステル、アリールエステル、アルキルスルホニルもしくはアリールスルホニルを表し、または(ii)R1とR2とは一緒になってシクロアルキル、ヘテロシクリルもしくはヘテロアリールを形成し、
PG1およびPG2はそれぞれ保護基を表し、
但し場合により、(iii)R1およびR2は両方が水素を表すことはない]
の中間生成物または薬学上許容されるその塩、エステルもしくはアミド。
【０３８０】
167. PG1が、自身が結合しているN原子を可逆的に非反応性にし、選択的に除去されうる基である、実施形態166の中間生成物。
【０３８１】
168. PG1が、Boc、Trt、Mtt、Bzl、Tos、Clt、Mmt、BomおよびFmocから成る群から選択される、実施形態165〜167のいずれか1つの中間生成物。
【０３８２】
169. PG2が、自身が結合している-CO基を可逆的に非反応性にし、選択的に除去されうる基である、実施形態166〜168のいずれか1つの中間生成物。
【０３８３】
170. PG2が、i)-OH、またはii)活性化エステルとして官能性をもたせたものである、実施形態165〜169のいずれか1つの中間生成物。
【０３８４】
171. 活性化エステルが、p-ニトロフェノール、2,4,5-トリクロロフェノール、N-ヒドロキシスクシンイミド、N-ヒドロキシスルホスクシンイミド、3,4-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-1,2,3-ベンゾトリアジン-4-オン、5-クロロ-8-ヒドロキシキノリン、N-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボン酸イミド、ペンタフルオロフェノール、p-スルホテトラフルオロフェノール、N-ヒドロキシフタルイミド、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール、N-ヒドロキシマレイミド、4-ヒドロキシ-3-ニトロベンゼンスルホン酸のエステル、または当技術分野で公知の任意の他の活性化エステルである、実施形態170の中間生成物。
【０３８５】
172. PG2が、OPfp、OPnpおよびOSucから選択される、実施形態165〜171のいずれか1つの中間生成物。
【０３８６】
173. PG1が、Trtである、実施形態166〜172のいずれか1つの中間生成物。
【０３８７】
174. qが、1〜5、好ましくは1〜4、より好ましくは1〜3である、実施形態166〜173のいずれか1つの中間生成物。
【０３８８】
175. R15およびR16が、互いに独立に、且つ、各値のqについて独立に、水素を表す、実施形態166〜174のいずれか1つの中間生成物。
【０３８９】
176. R15およびR16が両方とも水素を表す、実施形態166〜175のいずれか1つの中間生成物。
【０３９０】
177. Qが-(CH2)nである(式中、nは1、2または3である)、実施形態166〜176のいずれか1つの中間生成物。
【０３９１】
178. Rが、水素である、実施形態166〜177のいずれか1つの中間生成物。
【０３９２】
179. R1およびR2が独立に、水素、アルキル、アリール、ハロゲン、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、アミノ、アミノアルキル、カルボキシル、カルボキシルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、カルボキサミド、アルキルエステルまたはアリールエステルを表し、好ましくは、アルキル、ヒドロキシルアルキル、アミノアルキル、カルボキシルアルキル、アルコキシおよび/またはアルキルエステルが、直鎖または分枝状の、より好ましくは1〜6個のC原子を有する低級アルキルを含有する、実施形態166〜178のいずれか1つの中間生成物。
【０３９３】
180. R1およびR2が独立に、水素、低級アルキルまたは低級アルコキシを表し、該低級アルキルおよび低級アルコキシが独立に、1〜5個のC原子、好ましくは1〜4個のC原子、または最も好ましくは1〜3個のC原子を有する、実施形態166〜179のいずれか1つの中間生成物。
【０３９４】
181. R1およびR2が独立に、1〜2個のC原子を有するアルキル(エチルもしくはメチル)、または1〜2個のC原子を有するアルコキシ(エトキシもしくはメトキシ)を表す、実施形態166〜180のいずれか1つの中間生成物。
【０３９５】
182. R1およびR2が、メチルまたはメトキシ、好ましくはメチルである、実施形態166〜181のいずれか1つの中間生成物。
【０３９６】
183. R1およびR2が両方ともメチルである、実施形態166〜182のいずれか1つの中間生成物。
【０３９７】
184. PG2がOHである、実施形態166〜183のいずれか1つの中間生成物。
【０３９８】
185. 式Chem.50またはChem.51:
[式中、Qは、結合または式Chem.6の基:
Chem.6:
-(C(R15)(R16))q-(式中、qは1〜6であり、R15およびR16は互いに独立に、且つ、各値のqについて独立に、水素、アルキル、カルボキシルまたはヒドロキシルを表し、Rは水素またはアルキルを表し、R1およびR2は独立に、(i)アルキル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ハロゲン、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、シアノ、アミノ、アミノアルキル、カルボキシル、カルボキシルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、カルボキサミド、置換されたカルボキサミド、アルキルエステル、アリールエステル、アルキルスルホニルもしくはアリールスルホニルを表し、または(ii)R1とR2とは一緒になってシクロアルキル、ヘテロシクリルもしくはヘテロアリールを形成し、PG1およびPG2はそれぞれ、好ましくは実施形態167〜173のいずれか1つに定義のとおりの、保護基を表す)]
の中間生成物または薬学上許容されるその塩、アミドもしくはエステル。
【０３９９】
186. Chem.23、Chem.24、Chem.25、Chem.26、Chem.27、Chem.28およびChem.29から選択される中間化合物、または薬学上許容されるその塩、アミドもしくはエステル。
【０４００】
187. Chem.40の化合物、または薬学上許容されるその塩、アミドもしくはエステル。
【０４０１】
188. 本明細書の実施例11の化合物の名称により特徴付けられた化合物または薬学上許容されるその塩、アミドもしくはエステル。
【０４０２】
189. 実施形態187の化合物である、実施形態188の化合物。
【０４０３】
190. GLP-1(9-37)(配列番号1)の以下のアナログ:(i)(18K、22E、34Q)、(ii)(30E、36K、38E)、(iii)(31H、34Q)、(iv)34R、(v)(34R、37K)および(vi)(34R、37K、38E)から選択されるペプチド中間生成物または薬学上許容されるその塩、アミドもしくはエステル。
【０４０４】
191. GLP-1A(3-37)(配列番号3)の以下のアナログ:(17R、20R、33R、38K)であるペプチド中間生成物または薬学上許容されるその塩、アミドもしくはエステル。
【０４０５】
(実施例)
この実験の部は、略語のリストから始まり、本発明のペプチドおよび誘導体を合成および特徴付けするための一般的な方法を挙げた項が続く。次に、特定のGLP-1ペプチド誘導体の調製に関するいくつかの例が続き、最後に、これらのペプチドおよび誘導体の活性および特性に関するいくつかの例を挙げてある(薬理学的な方法と見出しの付いた項)。
【０４０６】
本実施例は、本発明の例示に役立つ。
【０４０７】
略語
以下においては、以下の略語を使用する(アルファベット順):
Aib:アミノイソ酪酸(α-アミノイソ酪酸)
API:医薬品有効成分
AUC:曲線下面積
BG:血糖
BHK:ベビーハムスター腎臓
Boc:t-ブチルオキシカルボニル
Bom:ベンジルオキシメチル
BW:体重
Bzl:ベンジル
Clt:2-クロロトリチル
コリジン:2,4,6-トリメチルピリジン
cpm:カウント毎分
DCM:ジクロロメタン
Dde:1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)エチル
DIC:ジイソプロピルカルボジイミド
DIPEA:ジイソプロピルエチルアミン
DMAP:4-ジメチルアミノピリジン
DMEM:ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)
EDTA:エチレンジアミン四酢酸
EGTA:エチレングリコール四酢酸
FCS:ウシ胎仔血清
Fmoc:9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
HATU:(O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)
HBTU:(2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル-)-1,1,3,3テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)
HEPES:4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸
HFIP:1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノールまたはヘキサフルオロイソプロパノール
HOAt:1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール
HOBt:1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
HPLC:高速液体クロマトグラフィー
HSA:ヒト血清アルブミン
IBMX:3-イソブチル-1-メチルキサンチン
Imp:イミダゾプロピオン酸(別名des-アミノヒスチジン、DesH)
i.v.:静脈内に
ivDde:1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)-3-メチルブチル
IVGTT:静脈内耐糖能試験
LCMS:液体クロマトグラフィー質量分析
LYD:Landrace Yorkshire Duroc
MALDI-MS:MALDI-TOF MSを参照
MALDI-TOF MS:マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析法
MeOH:メタノール
Mmt:4-メトキシトリチル
Mtt:4-メチルトリチル
NMP:N-メチルピロリドン
OBz:ベンゾイルエステル
OEG:8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸
OPfp:ペンタフルオロフェノキシ
OPnp:パラニトロフェノキシ
OSu:O-スクシンイミジルエステル(ヒドロキシスクシンイミドエステル)
OSuc:2,5-ジオキソピロリジン-1-イル
OtBu:tertブチルエステル
PBS:リン酸緩衝生理食塩水
PD:薬力学的な
Pen/Strep:ペニシリン/ストレプトマイシン
PK:薬物動態学的な
RP:逆相
RP-HPLC:逆相高速液体クロマトグラフィー
RT:室温
Rt:保持時間
s.c.:皮下に
SD:標準偏差
SEC-HPLC:サイズ排除高速液体クロマトグラフィー
SPPS:固相ペプチド合成
tBu:tert.ブチル
TFA:トリフルオロ酢酸
TIS:トリイソプロピルシラン
TLC:薄層クロマトグラフィー
Tos:トシレート(またはパラトルエンスルホニル)
Tris:トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンまたは2-アミノ-2-ヒドロキシメチルプロパン-1,3-ジオール
Trt:トリフェニルメチルまたはトリチル
Trx:トラネキサム酸
UPLC:超高速液体クロマトグラフィー
【０４０８】
調製の方法
A.一般的な方法
この項は、固相ペプチド合成の方法(SPPS法、これには、アミノ酸の脱保護の方法、樹脂からペプチドを切り出し、それを精製する方法が含まれる)、ならびに、その結果得られるペプチドを検出し特徴付ける方法(LCMS法、MALDI法およびUPLC法)に関する。ペプチドの固相合成は、場合により、ジペプチドアミド結合上の保護されたジペプチドを、酸性条件下で切断できる基(2-Fmoc-オキシ-4-メトキシベンジルまたは2,4,6-トリメトキシベンジルなどであるが、これらに限定されない)と共に使用することにより改良してもよい。セリンまたはトレオニンがペプチド中に存在する場合は、シュードプロリンジペプチドを使用してもよい(例えば、Novabiochemから入手可能。W.R. Sampson、(1999)、J. Pep. Sci.、5、403頁も参照のこと)。使用した保護されたアミノ酸誘導体は、標準的なFmocアミノ酸(例えば、Anaspec、IRISまたはNovabiochemが供給)であった。N末端アミノ酸をアルファアミノ基でBoc保護(例えば、N末端にHisを有するペプチドの場合は、Boc-His(Boc)-OHまたはBoc-His(Trt)-OH)した。配列中のリシンのイプシロンアミノ基は、アルブミン結合部分およびスペーサーの結合手段によっては、Mtt、Mmt、Dde、ivDdeまたはBocのいずれかで保護した。アルブミン結合部分および/またはリンカーは、樹脂結合ペプチド(resin bound peptide)のアシル化、または無保護ペプチドの溶液中でのアシル化のいずれかにより、本ペプチドに結合させることができる。アルブミン結合部分および/またはリンカーを、保護されたペプチジル樹脂に結合させる場合、結合は、SPPSと、適切に保護されたビルディングブロック(building block)とを用いたモジュラーであってもよく、このようなビルディングブロックとしては、Fmoc-OEG-OH(Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸)、Fmoc-Trx-OH(Fmoc-トラネキサム酸)、Fmoc-Glu-OtBu、オクタデカンジオン酸モノ-tert-ブチルエステル、ノナデカンジオン酸モノ-tert-ブチルエステルまたは4-(9-カルボキシノニルオキシ)安息香酸tert-ブチルエステルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４０９】
1. 樹脂結合ペプチドの合成
SPPS法A
SPPS法Aは、Applied Biosystems 433ペプチド合成装置(ABI433A合成装置とも呼ばれる)でFmoc化学を用いる、保護されたペプチジル樹脂の合成を指し、メーカーのFastMoc UVプロトコール(NMP中でのHBTUまたはHATUを介在させたカップリングとFmoc保護基の脱保護のUVモニタリングとを用いる)を使用して0.25mmolまたは1.0mmolスケールで行う。
【０４１０】
ペプチドアミドの合成に使用する出発樹脂(starting resin)は、適当なRink-Amide樹脂(ペプチドアミド用)、または、(カルボキシ(C)末端を有するペプチド用には)適当なWang樹脂もしくは適当なクロロトリチル樹脂のいずれかであった。適当な樹脂は、例えばNovabiochemから市販されている。
【０４１１】
SPPS法B
SPPS法Bは、マイクロ波ベースのLibertyペプチド合成装置(CEM Corp.、North Carolina)でFmoc化学を用いる、保護されたペプチジル樹脂の合成を指す。適当な樹脂は、Novabiochemから入手可能な、予め担持された低担持量のWang樹脂(例えば、低担持量のFmoc-Lys(Mtt)-Wang樹脂、0.35mmol/g)である。Fmoc脱保護は、NMP中の5%ピペリジンを最大70℃または75℃で用いて行った。カップリング化学は、NMP中のDIC/HOAtであった。アミノ酸/HOAt溶液(0.3M、NMP中、3〜10倍モル過剰で)を、次いで、同じモル当量のDIC(0.75M、NMP中)を、樹脂に加えた。例えば、以下のスケールの反応には、1カップリング当たり、以下の量の0.3Mアミノ酸/HOAt溶液を使用した:スケール/ml、0.10mmol/2.5ml、0.25mmol/5ml、1mmol/15ml。カップリングの時間および温度は、一般には、5分、最大70℃または75℃であった。より大きいスケールの反応については、より長いカップリング時間、例えば10分を用いた。元のアミノ酸が立体障害のあるもの(例えばAib)であれば、ヒスチジンというアミノ酸を、50℃で、二重カップリング(double couple)、または四重カップリング(quadruple couple)させた。アルギニンというアミノ酸は、RTで25分間カップリングさせてから、5分間かけて70℃または75℃に加熱した。いくつかのアミノ酸(Aibなど、但しこれに限定されない)は「二重カップリング」させたが、これは、第1のカップリング(例えば、75℃で5分)後、樹脂を排出し、さらなる試薬を加え(アミノ酸、HOAtおよびDIC)、この混合物を再び加熱する(例えば、75℃で5分)ことを意味する。リシン側鎖の化学修飾を所望のときは、リシンをLys(Mtt)として組み込んだ。Mtt基は、樹脂をDCMで洗浄し、何も加えていない(未希釈の)ヘキサフルオロイソプロパノールに樹脂を20分間懸濁させてからDCMおよびNMPで洗浄することにより、取り出した。リシンの化学修飾は、手作業での合成(SPPS法Dを参照のこと)によるか、または、適切に保護されたビルディングブロックを使用した、前述のとおりのLibertyペプチド合成装置での1つもしくは複数の自動化されたステップによるか、そのいずれかで実施し(一般的な方法を参照のこと)、場合により、手作業でのカップリングが含まれた。
【０４１２】
SPPS法D
SPPS法Dは、手作業でのFmoc化学を用いる、保護されたペプチジル樹脂の合成を指す。この方法は、典型的には、リンカーおよび側鎖のペプチド骨格への結合のために用いた。0.25mmolの合成スケールでは、以下の条件を用いた。カップリング化学は、4〜10倍モル過剰での、NMP中のDIC/HOAt/コリジンであった。カップリング条件は、室温で1〜6時間であった。Fmoc脱保護は、NMP中の20〜25%ピペリジンを用いて実施し(3×20ml、各10分)、次いでNMP洗浄を行った(4×20mL)。Dde脱保護またはivDde脱保護は、NMP中の2%ヒドラジンを用いて実施し(2×20ml、各10分)、次いでNMP洗浄を行った(4×20ml)。Mtt脱保護またはMmt脱保護は、DCM中の2%TFAおよび2〜3%TIS(5×20ml、各10分)、次いでDCM(2×20ml)、DCM中の10% MeOHおよび5% DIPEA(2×20ml)ならびにNMP(4×20ml)での洗浄を用い、または、何も加えていないヘキサフルオロイソプロパノールで処理(5×20ml、各10分)してから前述のように洗浄することにより、実施した。アルブミン結合部分および/またはリンカーは、樹脂結合ペプチドのアシル化、または無保護ペプチドの溶液中でのアシル化のいずれかにより、本ペプチドに結合させることができる(以下に記載の手段を参照のこと)。アルブミン結合部分および/またはリンカーを、保護されたペプチジル樹脂に結合する場合、結合は、SPPSおよび適切に保護されたビルディングブロックを用いたモジュラーであってもよい(一般的な方法を参照のこと)。
【０４１３】
樹脂結合ペプチドへの結合-手段I:活性化された(活性エステルまたは対称な無水物)アルブミン結合部分またはリンカー(オクタデカンジオン酸モノ-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)エステルなど)(Ebashiら、EP511600、樹脂結合ペプチドに対し4モル当量)をNMP(25mL)に溶解し、樹脂に加え、一晩室温で振盪した。反応混合物を濾過し、樹脂を、NMP、DCM、2-プロパノール、メタノールおよびジエチルエーテルを用いて徹底的に洗浄した。
【０４１４】
樹脂結合ペプチドへの結合-手段II:アルブミン結合部分をNMP/DCM(1:1、10ml)に溶解した。HOBt(樹脂に対し4モル当量)およびDIC(樹脂に対し4モル当量)などの活性化試薬を加え、この溶液を15分間撹拌した。この溶液を樹脂に加え、DIPEA(樹脂に対し4モル当量)を加えた。樹脂を2〜24時間室温で振盪した。樹脂をNMP(2×20ml)、NMP/DCM(1:1、2×20ml)およびDCM(2×20ml)で洗浄した。
【０４１５】
溶液中のペプチドへの結合-手段III:活性化された(活性エステルまたは対称な無水物)アルブミン結合部分またはリンカー(オクタデカンジオン酸モノ-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)エステルなど)(Ebashiら、EP511600)を本ペプチドに対し1〜1.5モル当量で、有機溶媒(アセトニトリル、THF、DMF、DMSOなど)、または水/有機溶媒の混合物(1〜2ml)に溶解し、本ペプチドの水溶液(10〜20ml)に、10モル当量のDIPEAと共に加えた。アルブミン結合残基(tert-ブチルなど)上の保護基の場合は、反応混合物を一晩凍結乾燥させ、単離された未精製のペプチドを、その後、脱保護した。tert-ブチル保護基の場合は、脱保護は、本ペプチドをトリフルオロ酢酸、水およびトリイソプロピルシランの混合物(90:5:5)に溶解することにより実施した。30分後、この混合物を真空中で蒸発させ、未精製のペプチドを、追って記載のとおりの分取用HPLCにより精製した。
【０４１６】
SPPS法E
SPPS法Eは、Protein Technologies(Tucson、AZ、85714、U.S.A.)製のPrelude固相ペプチド合成装置でのFmoc化学によるペプチド合成を指す。適当な樹脂は、Novabiochemから入手可能な、予め担持された低担持量のWang樹脂(例えば、低担持量のfmoc-Lys(Mtt)-Wang樹脂、0.35mmol/g)である。Fmoc脱保護は、NMP中の25%ピペリジンを用いて2×10分間行った。カップリング化学は、NMP中のDIC/HOAt/コリジンであった。アミノ酸/HOAt溶液(0.3M、NMP中、3〜10倍モル過剰で)を、次いで、同じモル当量のDIC(3M、NMP中)およびコリジン(3M、NMP中)を、樹脂に加えた。例えば、以下のスケールの反応には、1カップリング当たり、以下の量の0.3Mアミノ酸/HOAt溶液を使用した:スケール/ml、0.10mmol/2.5ml、0.25mmol/5ml。カップリング時間は、一般には60分であった。いくつかのアミノ酸(アルギニン、Aibまたはヒスチジンが挙げられるが、これらに限定されない)は「二重カップリング」させたが、これは、第1のカップリング(例えば60分)後、樹脂を排出し、さらなる試薬を加え(アミノ酸、HOAt、DICおよびコリジン)、この混合物を再度反応させる(例えば60分)ことを意味する。いくつかのアミノ酸および脂肪酸の誘導体(Fmoc-Oeg-OH、Fmoc-Trx-OH、Fmoc-Glu-OtBu、オクタデカンジオン酸モノ-tert-ブチルエステル、ノナデカンジオン酸モノ-tert-ブチルエステルまたは4-(9-カルボキシノニルオキシ)安息香酸tert-ブチルエステルが挙げられるが、これらに限定されない)は、長時間、例えば6時間、カップリングさせた。リシン側鎖の化学修飾を所望のときは、リシンをLys(Mtt)として組み込んだ。Mtt基は、樹脂をDCMで洗浄し、ヘキサフルオロイソプロパノール/DCM(75:25)に樹脂を3×10分懸濁させてからDCM、20%ピペリジンおよびNMPで洗浄することにより、取り出した。リシンの化学修飾は、手作業での合成(SPPS法Dを参照のこと)によるか、または、適切に保護されたビルディングブロックを使用した、前述のとおりのPreludeペプチド合成装置での1つもしくは複数の自動化されたステップによるか、そのいずれかで実施した(一般的な方法を参照のこと)。
【０４１７】
2. 樹脂からのペプチドの切り出しおよび精製
合成後、樹脂をDCMで洗浄し、本ペプチドを、TFA/TIS/水(95/2.5/2.5または92.5/5/2.5)で2〜3時間処理し、次いでジエチルエーテルで沈殿させることにより、樹脂から切り出した。このペプチドを、適当な溶媒(例えば30%酢酸など)に溶解し、アセトニトリル/水/TFAを使用する、C18、5μMカラムを用いた標準的なRP-HPLCにより精製した。画分を、UPLC法、MALDI法およびLCMS法の組合せにより分析し、適切な画分をプールし、凍結乾燥させた。
【０４１８】
3. 検出および特徴付けの方法
LCMS法
LCMS法1(LCMS1)
Agilent Technologies LC/MSD TOF(G1969A)質量分析計を使用して、Agilent 1200シリーズのHPLCシステムから溶出後の試料の質量を同定した。タンパク質スペクトルのデコンボリューションを、Agilentのタンパク質確認用ソフトウェアで計算した。
溶出剤:
A:0.1%トリフルオロ酢酸、水中
B:0.1%トリフルオロ酢酸、アセトニトリル中
カラム:Zorbax 5u、300SB-C3、4.8×50mm
グラジエント:25%〜95%アセトニトリル、15分間
【０４１９】
LCMS法2(LCMS2)
Perkin Elmer Sciex API 3000質量分析計を使用して、Perkin Elmer Series 200 HPLCシステムから溶出後の試料の質量を同定した。
溶出剤:
A:0.05%トリフルオロ酢酸、水中
B:0.05%トリフルオロ酢酸、アセトニトリル中
カラム:Waters Xterra MS C-18×3mm、内径5μm
グラジエント:5%〜90%アセトニトリル、7.5分間、1.5ml/min
【０４２０】
LCMS法3(LCMS3)
Waters Micromass ZQ質量分析計を使用して、Waters Alliance HT HPLCシステムから溶出後の試料の質量を同定した。
溶出剤:
A:0.1%トリフルオロ酢酸、水中
B:0.1%トリフルオロ酢酸、アセトニトリル中
カラム:Phenomenex、Jupiter C4 50×4.60mm、内径5μm
グラジエント:10%〜90%B、7.5分間、1.0ml/min
【０４２１】
LCMS法4(LCMS4)
LCMS4は、Waters Acquity UPLCシステムおよびLCT Premier XE質量分析計(Micromass製)から成る装置を用いて実施した。UPLCポンプを、以下を含有する2つの溶出剤貯蔵部に連結させた:
A:0.1%ギ酸、水中
B:0.1%ギ酸、アセトニトリル中
【０４２２】
分析は、適切な体積の試料(好ましくは2〜10μl)をカラム上に注入し、これをAおよびBのグラジエントで溶出させることにより、RTで実施した。
【０４２３】
UPLC条件、検出器の設定および質量分析計の設定は、以下のとおりであった:
カラム:Waters Acquity UPLC BEH、C-18、1.7μm、2.1mm×50mm
グラジエント:直線的な5%〜95%アセトニトリル、4.0分(あるいは8.0分)間、0.4ml/min
検出:214nm(TUV(Tunable UV検出器)からのアナログ出力)
MSイオン化モード:API-ES
スキャン:100〜2000amu(あるいは500〜2000amu)、ステップは0.1amu
【０４２４】
UPLC法およびHPLC法
方法05_B5_1
UPLC(方法05_B5_1):RP分析は、デュアルバンド検出器(dual band detector)付きのWaters UPLCシステムを用いて実施した。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用い、40℃で、214nmおよび254nmでのUV検出値を収集した。
【０４２５】
このUPLCシステムを、以下を含有する2つの溶出剤貯蔵部と連結させた:
A:0.2M Na2SO4、0.04M H3PO4、10%CH3CN(pH=3.5)
B:70%CH3CN、30%H2O
【０４２６】
以下の直線グラジエントを用いた:8分かけて流速0.40ml/minで60% A、40% Bから30% A、70% B。
【０４２７】
方法05_B7_1
UPLC(方法05_B7_1):RP分析は、デュアルバンド検出器付きのWaters UPLCシステムを用いて実施した。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用い、40℃で、214nmおよび254nmでのUV検出値を収集した。
【０４２８】
このUPLCシステムを、以下を含有する2つの溶出剤貯蔵部と連結させた:
A:0.2M Na2SO4、0.04M H3PO4、10%CH3CN(pH=3.5)
B:70%CH3CN、30%H2O
【０４２９】
以下の直線グラジエントを用いた:8分かけて流速0.40ml/minで80% A、20% Bから40% A、60% B。
【０４３０】
方法04_A2_1
UPLC(方法04_A2_1):RP分析は、デュアルバンド検出器(dual band detector)付きのWaters UPLCシステムを用いて実施した。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用い、40℃で、214nmおよび254nmでのUV検出値を収集した。
【０４３１】
このUPLCシステムを、以下を含有する2つの溶出剤貯蔵部と連結させた:
A:90%H2O、10%CH3CN、0.25M炭酸水素アンモニウム
B:70%CH3CN、30%H2O
【０４３２】
以下の直線グラジエントを用いた:16分かけて流速0.40ml/minで90% A、10% Bから60% A、40% B。
【０４３３】
方法04_A3_1
UPLC(方法04_A3_1):RP分析は、デュアルバンド検出器付きのWaters UPLCシステムを用いて実施した。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用い、40℃で、214nmおよび254nmでのUV検出値を収集した。
【０４３４】
このUPLCシステムを、以下を含有する2つの溶出剤貯蔵部と連結させた:
A:90%H2O、10%CH3CN、0.25M炭酸水素アンモニウム
B:70%CH3CN、30%H2O
【０４３５】
以下の直線グラジエントを用いた:16分かけて流速0.40ml/minで75% A、25% Bから45% A、55% B。
【０４３６】
方法04_A4_1
UPLC(方法04_A4_1):RP分析は、デュアルバンド検出器付きのWaters UPLCシステムを用いて実施した。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用い、40℃で、214nmおよび254nmでのUV検出値を収集した。
【０４３７】
このUPLCシステムを、以下を含有する2つの溶出剤貯蔵部と連結させた:
A:90%H2O、10%CH3CN、0.25M炭酸水素アンモニウム
B:70%CH3CN、30%H2O
【０４３８】
以下の直線グラジエントを用いた:16分かけて流速0.40ml/minで65% A、35% Bから25% A、65% B。
【０４３９】
方法08_B2_1
UPLC(方法08_B2_1):RP分析は、デュアルバンド検出器付きのWaters UPLCシステムを用いて実施した。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用い、40℃で、214nmおよび254nmでのUV検出値を収集した。
【０４４０】
このUPLCシステムを、以下を含有する2つの溶出剤貯蔵部と連結させた:
A:99.95%H2O、0.05%TFA
B:99.95%CH3CN、0.05%TFA
【０４４１】
以下の直線グラジエントを用いた:16分かけて流速0.40ml/minで95% A、5% Bから40% A、60% B。
【０４４２】
方法08_B4_1
UPLC(方法08_B4_1):RP分析は、デュアルバンド検出器付きのWaters UPLCシステムを用いて実施した。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用い、40℃で、214nmおよび254nmでのUV検出値を収集した。
【０４４３】
このUPLCシステムを、以下を含有する2つの溶出剤貯蔵部と連結させた:
A:99.95%H2O、0.05%TFA
B:99.95%CH3CN、0.05%TFA
【０４４４】
以下の直線グラジエントを用いた:16分かけて流速0.40ml/minで95% A、5% Bから95% A、5% B。
【０４４５】
方法05_B10_1
UPLC(方法05_B10_1):RP分析は、デュアルバンド検出器付きのWaters UPLCシステムを用いて実施した。ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用い、40℃で、214nmおよび254nmでのUV検出値を収集した。
【０４４６】
このUPLCシステムを、以下を含有する2つの溶出剤貯蔵部と連結させた:
A:0.2M Na2SO4、0.04M H3PO4、10%CH3CN(pH3.5)
B:70%CH3CN、30%H2O
【０４４７】
以下の直線グラジエントを用いた:8分かけて流速0.40ml/minで40% A、60% Bから20% A、80% B。
方法02_B4_4
HPLC(方法02_B4_4):RP分析は、Waters 2487デュアルバンド検出器付きのAlliance Waters 2695システムを用いて実施した。Symmetry300 C18、5um、3.9mm×150mmカラムを用い、42℃で、214nmおよび254nmでのUV検出値を収集した。水中の5〜95%アセトニトリル、90〜0%の水および5%トリフルオロ酢酸(1.0%)の直線グラジエントを用い、15分かけて流速1.0ml/minで溶出させた。
【０４４８】
方法01_B4_1
HPLC(方法01_B4_1):RP分析は、Waters 996ダイオードアレイ検出器付きのWaters 600Sシステムを用いて実施した。Waters 3mm×150mm、3.5um C-18 Symmetryカラムを用いて、UV検出値を収集した。カラムを42℃に加熱し、水中の5〜95%アセトニトリル、90〜0%の水および5%トリフルオロ酢酸(1.0%)の直線グラジエントを用い、15分かけて流速1ml/minで溶出させた。
【０４４９】
MALDI-MS法
分子量は、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析法を用いて決定し、MicroflexまたはAutoflex(Bruker)で記録した。アルファ-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸のマトリックスを使用した。
【０４５０】
NMR法
プロトンNMRスペクトルは、テトラメチルシランを内部標準として用いたBrucker Avance DPX 300(300MHz)を使用して記録した。化学シフト(δ)はppmの単位で得、分裂パターンは次のように示す:sは一重線、dは二重線、ddは二重の二重線、dtは二重の三重線、tは三重線、ttは三重の三重線(triplet of triplet)、qは四重線、quintは五重線、sextは六重線、mは多重線、およびbr=ブロード。
【０４５１】
B.中間体の合成
1. 脂肪二酸のモノエステルの合成
C12、C14、C16およびC18の二酸(diacid)をBoc無水物、DMAP、およびトルエン中のt-ブタノールで一晩還流させると、主にt-ブチルモノエステルが得られる。得られるのは、単酸(mono acid)と二酸とジエステルとの混合の完了後である。精製は、洗浄、ショートプラグ(short plug)のシリカ濾過および結晶化により実施する。
【０４５２】
2. 2-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-エチルアミンの合成
Chem.23:
【０４５３】
【化２６】
2013514322.tif 000028
【０４５４】
絶対メタノール(400mL)中の、二塩酸ヒスタミン(20.47g、0.111mol)およびトリエチルアミン(48mL、0.345mol)を、室温で10分間撹拌した。メタノール(30mL)中のトリフルオロ酢酸エチルエステル(14.6mL、0.122mol)を30分かけて0℃で滴加した。反応混合物を、3.5時間室温で撹拌してから、真空中で蒸発により乾燥させた。残留物をジクロロメタン(450mL)に溶解し、トリエチルアミン(31mL、0.222mol)を加えた。次に、塩化トリチル(34.1g、0.122mol)を少しずつ(piecewise)加え、混合物を一晩室温で撹拌した。クロロホルム(400mL)および水(600mL)を反応混合物中に注いだ。水層を分離し、クロロホルムで抽出した(3×400mL)。有機層を合わせたものを無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を除去し、ベージュ色の固形物をヘキサン(1000mL)で研和した。懸濁液を濾過すると、2,2,2-トリフルオロ-N-[2-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-エチル]-アセトアミドが白色の固形物として得られた。
収量(収率):45.54g(91%)。
1H NMRスペクトル (300MHz, CDCl3, δH): 8.44 (bs, 1H); 7.43 (s, 1H); 7.41〜7.33 (m, 9H); 7.19〜7.10 (m, 6H); 6.65 (s, 1H); 3.66 (q, J=5.9Hz, 2H); 2.79 (t, J=5.9Hz, 2H)。
【０４５５】
前記のアミド(45.54g、0.101mmol)をテトラヒドロフラン(1000mL)およびメタノール(1200mL)に溶解した。水(500mL)中の水酸化ナトリウム(20.26g、0.507mol)溶液を加えた。混合物は、2時間室温で撹拌してから、真空中で濃縮した。残留物を、クロロホルム(1200mL)と水(800mL)との間で分離した。水層をクロロホルムで抽出した(3×400mL)。有機層を合わせ、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を蒸発させると茶色の油が得られ、これを3日間真空中で乾燥させると、標題生成物がベージュ色の固形物として得られた。
収量(収率):32.23g(90%)。
全収率:82%。
M.p.:111〜113℃。
1H NMRスペクトル (300MHz, CDCl3, δH): 7.39 (d, J=1.3, 1H); 7.38〜7.32 (m, 9H); 7.20〜7.12 (m, 6H); 6.61 (s, 1H); 3.00 (t, J=6.6Hz, 2H); 2.70 (t, J=6.5Hz, 2H); 1.93 (bs, 2H)。
【０４５６】
3. 2,2-ジメチル-N-[2-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-エチル]-マロンアミド酸の合成
Chem.24:
【０４５７】
【化２７】
2013514322.tif 000029
【０４５８】
アセトニトリル(75mL)中のメルドラム酸(5.52g、38.3mmol)と炭酸カリウム(26.5g、191mmol)とヨウ化メチル(7.15mL、115mmol)との混合物を、密封したチューブ内で75℃にて7時間加熱した。この混合物を室温に冷却し、ジクロロメタン(300mL)で希釈し、濾過し、真空中で濾液を蒸発により乾燥させた。酢酸エチル(75mL)、ヘキサン(75mL)および水(50mL)を加え、相を分離した。有機層を、チオ硫酸ナトリウムの10%水溶液(50mL)および水(50mL)で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を真空中で除去すると、2,2,5,5-テトラメチル-[1,3]ジオキサン-4,6-ジオンが白色の固形物として得られた。
収量(収率):6.59g(79%)。
RF(SiO2、クロロホルム/酢酸エチル、98:2):0.60。
1H NMRスペクトル (300MHz, CDCl3, δH): 1.76 (s, 6H); 1.65 (s, 6H)。
【０４５９】
トルエン(80mL)中の、前述のように調製した2-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-エチルアミン(5.00g、14.2mmol)およびトリエチルアミン(9.86mL、70.7mmol)の溶液を、50分かけて、トルエン(40mL)中の前述のジオン化合物(3.65g、21.2mmol)の溶液に75℃で滴加した。この混合物を、この温度でさらに3時間(最初のアミンがTLCで検出されるまで)撹拌してから、蒸発により乾燥させた。残留物をクロロホルム(300mL)に再溶解し、10%クエン酸水溶液(200mL)で洗浄した。水相をクロロホルム(2×60mL)で抽出し、クロロホルム相を合わせ、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を真空中で除去した。残留物を高温のクロロホルム(140mL)で研和し、ヘキサン(70mL)を加え、この懸濁液を室温で一晩撹拌した。固形物を濾過により取り出し、クロロホルム/ヘキサン混合物(1:1、2×50mL)で洗浄し、真空中で乾燥させると、標題生成物が得られた。
収量(収率):6.73g(88%)。
M.p.:161〜162℃。
RF(SiO2、クロロホルム/メタノール、85:15):0.40。
1H NMRスペクトル (300MHz, DMSO-d6, δH): 12.45 (bs, 1H); 7.66 (t, J=5.1Hz, 1H); 7.57〜7.31 (m, 9H); 7.26 (s, 1H); 7.20〜7.02 (m, 6H); 6.66 (s, 1H); 3.25 (m, 2H); 2.57 (t, J=7.3Hz, 2H); 1.21 (s, 6H)。
【０４６０】
4. 4-(4-tert-ブチルフェニル)-酪酸の合成
Chem.25:
【０４６１】
【化２８】
2013514322.tif 000030
【０４６２】
塩化アルミニウム粉末(80.0g、600mmol)を、tert-ブチルベンゼン(40.0g、300mmol)と無水コハク酸(26.7g、267mmol)と1,1,2,2-テトラクロロエタン(100mL)との撹拌混合物に少しずつ加えた。塩化アルミニウムを全て加え終わった後、この混合物を、氷(500mL)と濃塩酸(100mL)との混合物中に注いだ。有機層を分離し、水(500mL)で洗浄し、溶媒を蒸留により除去した。固形の残留物を高温の15%炭酸ナトリウム水溶液(1000mL)に溶解し、濾過し、冷却し、塩酸を用いて酸を沈殿させた(pH=1に酸性化した)。この未精製の酸を濾過し、空気で乾燥させ、ベンゼン(500mL)から再結晶化させると、4-(4-tert-ブチルフェニル)-4-オキソ酪酸が無色の結晶として得られた。
収量(収率):36.00g(58%)。
M.p.:117〜120℃。
1H NMRスペクトル (300MHz, CDCl3, δH): 7.93 (dm, J=8.3Hz, 2H); 7.48 (dm, J=8.3Hz, 2H); 3.30 (t, J=6.6Hz, 2H); 2.81 (t, J=6.6Hz, 2H); 1.34 (s, 9H)。
【０４６３】
前述の酸(36.0g、154mmol)と水酸化カリウム(25.8g、462mmol)とヒドラジン水和物(20mL、400mmol)とエチレングリコール(135mL)との混合物を3時間還流させてから、蒸気の温度が196〜198℃に上昇しきるまで、蒸留した。さらなる14時間の還流後、この混合物をわずかに冷却させてから、冷水(200mL)中に注いだ。この混合物を濃塩酸で酸性化(pH=1に)し、ジクロロメタン(2×400mL)で抽出した。有機抽出物を合わせ、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を真空中で除去し、残留物をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル60A、0.060〜0.200mm、溶出剤:ヘキサン/酢酸エチル10:1〜6:1)により精製すると、標題生成物がオフホワイトの固形物として得られた。
収量(収率):16.25g(48%)。
M.p.:59〜60℃。
RF(SiO2、酢酸エチル):0.60。
1H NMRスペクトル (300MHz, CDCl3, δH): 7.31 (dm, J=8.1Hz, 2H); 7.12 (dm, J=8.1Hz, 2H); 2.64 (t, J=7.6Hz, 2H); 2.38 (t, J=7.4Hz, 2H); 1.96 (m, 2H); 1.31 (s, 9H)。
【０４６４】
5. 2,2-ジメチル-N-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イルメチル)-マロンアミド酸の合成
Chem.26:
【０４６５】
【化２９】
2013514322.tif 000031
【０４６６】
塩酸ヒドロキシルアミン(15.9g、229mmol)を、水(400mL)中の4(5)-イミダゾールカルボキシアルデヒド(20.0g、209mmol)および炭酸ナトリウム(12.1g、114mmol)の溶液に加え、その結果得られる溶液を室温で一晩撹拌した。この混合物を蒸発させて100mLとし、氷浴中で冷却した。この固形物を濾過により分離し、濾液を濃縮して40mLとした。0℃に冷却した後、さらなる結晶が得られた。この固形物(23g)を合わせ、エタノール(およそ160mL)から再結晶化させると、イミダゾール-4(5)-カルバルデヒドオキシムが無色の結晶として得られた。
収量(収率):15.98g(69%)。
1H NMRスペクトル (300MHz, アセトン-d3+D2O, δH): 7.78 (bs, 1H); 7.74 (d, J=0.9Hz, 1H); 7.43 (s, 1H)。
【０４６７】
塩化アセチル(51.0mL、718mmol)を、0℃、アルゴン下でメタノール(670mL)に滴加した。30分後、冷却用の浴槽を取り除き、前述のオキシム(16.0g、144mmol)、次いで炭素担持パラジウム(5重量%、6.1g)を加えた。この混合物を、大気圧で17時間水素化してから、Celiteを通して濾過し、溶媒を蒸発させると、純粋な4-(アミノメチル)-イミダゾールジヒドロクロリドが無色の結晶として得られた。
収量(収率):23.92g(98%)。
1H NMRスペクトル (300MHz, D2O, δH): 8.72 (s, 1H); 7.60 (s, 1H); 4.33 (s, 2H)。
【０４６８】
メタノール(1000mL)中の、前述の二塩酸アミン(18.9g、111mmol)およびトリエチルアミン(93mL、667mmol)を室温で10分間撹拌した。メタノール(30mL)中のトリフルオロ酢酸エチルエステル(13.3mL、111mmol)を40分かけて0℃で滴加した。反応混合物は、18時間室温で撹拌してから、真空中で蒸発により乾燥させた。残留物を乾燥ジクロロメタン(2000mL)に溶解し、トリエチルアミン(31mL、222mmol)を加えた。次に、塩化トリチル(31.6g、113mmol)を加え、この混合物を一晩室温で撹拌した。クロロホルム(1000mL)および水(1000mL)を反応混合物中に注いだ。水層を分離し、クロロホルムで抽出した(2×300mL)。有機層を合わせたものを無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を除去し、ベージュ色の固形物をヘキサン(1000mL)で研和した。懸濁液を濾過すると、2,2,2-トリフルオロ-N-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イルメチル)-アセトアミドが白色の固形物として得られた。
収量(収率):46.59g(96%)。
RF(SiO2、ジクロロメタン/メタノール95:5):0.35。
1H NMRスペクトル (300MHz, DMSO-d6, δH): 9.77 (t, J=5.7Hz, 1H); 7.47〜7.34 (m, 9H); 7.33 (d, J=1.5Hz, 1H); 7.13〜7.03 (m, 6H); 6.80 (d, J=0.8Hz, 1H); 4.25 (d, J=5.7Hz, 2H)。
【０４６９】
前述のアミド(46.6g、107mmol)をテトラヒドロフラン(600mL)およびエタノール(310mL)に溶解した。水(85mL)中の水酸化ナトリウム(21.4g、535mmol)の溶液を加えた。混合物を、5時間室温で撹拌してから、真空中で濃縮した。残留物をクロロホルム(1600mL)と水(800mL)との間で分離した。水層をクロロホルム(4×200mL)で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を蒸発させると、(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-メチルアミンがオフホワイトの固形物として得られた。
収量(収率):36.30g(100%)。
1H NMRスペクトル (300MHz, CDCl3, δH): 7.38 (d, J=1.3, 1H); 7.36〜7.30 (m, 9H); 7.18〜7.10 (m, 6H); 6.69 (m, 1H); 3.77 (s, 2H); 1.80 (bs, 2H)。
【０４７０】
トルエン(220mL)中の前述のアミン(10.0g、29.5mmol)およびトリエチルアミン(20.5mL、147mmol)の溶液を、トルエン(80mL)中の2,2,5,5-テトラメチル-[1,3]ジオキサン-4,6-ジオン(3.65g、21.2mmol)の溶液に、45分かけて75℃で滴加した。この混合物を、この温度でさらに3時間(最初のアミンがTLCで検出されるまで)撹拌してから、蒸発により乾燥させた。残留物をクロロホルム(500mL)に再溶解し、10%クエン酸水溶液(300mL)で洗浄した。水相をクロロホルム(100mL)で抽出し、クロロホルム相を合わせ、水(150mL)で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を真空中で除去した。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲルFluka 60、ジクロロメタン/メタノール98:2から9:1)により精製し、クロロホルム/ヘキサン混合物から結晶化させると、標題生成物がベージュ色の結晶として得られた。
収量(収率):9.80g(73%)。
M.p.:174〜175℃。
RF(SiO2、クロロホルム/メタノール、85:15):0.35。
1H NMRスペクトル (300MHz, CDCl3, δH): 8.45 (t, J=5.8Hz, 1H); 7.53 (s, 1H); 7.40〜7.28 (m, 9H); 7.14〜7.01 (m, 6H); 6.84 (s, 1H); 4.39 (d, J=5.8Hz, 2H); 1.44 (s, 6H)。
【０４７１】
6. 3-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-プロピルアミンの合成
Chem.27:
【０４７２】
【化３０】
2013514322.tif 000032
【０４７３】
テトラヒドロフラン/ジエチルエーテル(1:1、100mL)中のエチル3-(1-トリチル-4-イミダゾリル)プロピオネート(93.0g、223mmol)を、水素化アルミニウムリチウム(17.0g、446mmol)の懸濁液に1時間にわたり滴加した。この混合物を3時間還流させてから、氷/水で冷却しながら水(100mL)、20%水酸化ナトリウム(100mL)および水(100mL)で処理し、濾過し、この固形物をテトラヒドロフランで洗浄した。有機相を無水炭酸カリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させると、3-(1-トリチル-4-イミダゾリル)プロパノールが白色の固形物として得られた。
収量(収率):68.0g(82%)。
M.p.:127〜129℃。
1H NMRスペクトル (300MHz, CDCl3, δH): 7.40〜7.24 (m, 10H); 7.17〜7.06 (m, 6H); 6.55 (s, 1H); 3.72 (t, J=5.3Hz, 2H); 2.68 (t, J=6.6Hz, 2H); 1.86 (m, 2H)。
【０４７４】
塩化メタンスルホニル(8mL、104mmol)を、ジクロロメタン(400mL)中の前述のアルコール(32.0g、86.8mmol)とトリエチルアミン(15.5mL)との溶液に、0℃で1時間にわたり滴加した。この混合物を、冷却せずにさらに1時間撹拌してから、5%炭酸水素ナトリウムで洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。ジクロロメタンを真空中で30℃にて蒸発させ、残っている油性のメシレートを次のステップで直接使用した。
収量(収率):31.2g(80%)。
1H NMRスペクトル (300MHz, CDCl3, δH): 7.37〜7.30 (m, 10H); 7.16〜7.09 (m, 6H); 6.58 (s, 1H); 4.24 (t, J=6.3Hz, 2H); 2.96 (s, 3H); 2.67 (m, 2H); 2.10 (m, 2H)。
【０４７５】
前述のメシレート(30.0g、67mmol)とカリウムフタルイミド(18.0g、100mmol)とヨウ化ナトリウム(4.0g、26.7mmol)とジメチルホルムアミド(200mL)との混合物を、一晩周囲温度で撹拌してから水(2L)およびベンゼン(2L)で処理した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を蒸発させると残留物が得られ、これをベンゼンから再結晶化させると、1-トリチル-4-(3-フタルイミドプロピル)イミダゾールが白色の固形物として得られた。
収量(収率):17.2g(52%)。
M.p.:211〜214℃。
1H NMRスペクトル (300MHz, CDCl3, δH): 7.83 (m, 2H); 7.72 (m, 2H); 7.39〜7.27 (m, 10H); 7.18〜7.07 (m, 6H); 6.60 (d, J=0.9Hz, 1H); 3.72 (t, J=7.4Hz, 2H); 2.60 (t, J=7.5Hz, 2H); 1.99 (m, 2H)。
【０４７６】
前述のイミダゾール誘導体(26.6g、53.5mmol)を、エタノール(300mL)およびテトラヒドロフラン(150mL)に60℃で溶解し、ヒドラジン水和物(50g、1mol)を加え、この溶液を6時間還流させてから、70℃で一晩加熱した。固形物を濾過により取り出し、濾液を25%アンモニア水溶液(2.5l)およびジクロロメタン(2.5L)で処理した。有機層を無水炭酸カリウムで乾燥させ、蒸発させると残留物が得られ、これを、シリカゲル(Fluka 60、アンモニア/メタノールで飽和させたクロロホルム)を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製すると、標題化合物が白色の固形物として得られた。
収量(収率):14.2g(72%)。
M.p.:112〜113℃。
RF(SiO2、アンモニア/メタノール9:1で飽和させたクロロホルム):0.30。
1H NMRスペクトル (300MHz, CDCl3, δH): 7.37〜7.28 (m, 10H); 7.18〜7.09 (m, 6H); 6.53 (d, J=1.3Hz, 1H); 2.74 (t, J=6.9Hz, 2H); 2.59 (t, J=7.4Hz, 2H); 1.95 (bs, 2H); 1.78 (m, 2H)。
【０４７７】
7. 2,2-ジメチル-N-[3-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-プロピル]-マロンアミド酸の合成
Chem.28:
【０４７８】
【化３１】
2013514322.tif 000033
【０４７９】
2-クロロトリチルクロリド樹脂(2.3g、3.0mmol)をDCM中で20分間膨張させ、濾過した。ジメチルマロン酸(2当量、6.0mmol、793mg)をDCM:DMF 1:1(10mL)に溶解して樹脂に加え、次いで、DIPEA(6当量、18.0mmol、3.14mL)およびDCM(10mL)を加えた。樹脂を一晩RTで振盪した。樹脂を濾過し、DCM:MeOH:DIPEA(17:2:1)、DCM、NMPおよびDCM(それぞれ2×25mL)で洗浄した。樹脂をDMF中で20分間膨張させ、濾過した。HOAt(3当量、9.0mmol、1.23g)、DIC(3当量、9.0mmol、1.40mL)およびDMF(25mL)を加え、樹脂を90分間RTで振盪した。樹脂を濾過し、3-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-プロピルアミン(1.8当量、5.40mmol、1.84g)、DIPEA(4当量、6.0mmol、2.09mL)およびDMF(10mL)を加えた。樹脂を2日間振盪した。樹脂を濾過し、NMP(5×20mL)およびDCM(10×20mL)で洗浄した。2,2,2-トリフルオロエタノール/ジクロロメタン  1:1(20mL)を樹脂に加え、これを2時間振盪した。樹脂を2,2,2-トリフルオロエタノール/ジクロロメタン  1:1(10mL)で洗浄し、濾液を合わせたものを回収し、真空中で濃縮すると、標題化合物が得られた。
収量(収率):600mg(41%)。
LCMS4:m/z=482(M+1)
UPLC(方法02_B4_4):Rt=8.07分
1H NMRスペクトル (300MHz, DMSO-d6, δH): 7.36〜7.44 (9H, m)、7.07〜7.12 (6H, m)、6.62 (1H, s)、3.02〜3.09 (2H, q)、2.38〜2.43 (2H, t)、1.61〜1.69 (2H, m)、1.26 (6H, s)
【０４８０】
8. 2,2-ジメチル-N-ピリジン-2-イルメチルマロンアミド酸の合成
Chem.29:
【０４８１】
【化３２】
2013514322.tif 000034
【０４８２】
クロロトリチルクロリド樹脂(2.3g、3.0mmol)をDCM中で20分間膨張させ、濾過した。ジメチルマロン酸(2当量、6.0mmol、793mg)をDCM:NMP 1:1(10mL)に溶解して樹脂に加え、次いで、DIPEA(6当量、18.0mmol、3.14mL)およびDCM(10mL)を加えた。樹脂を一晩RTで振盪した。樹脂を濾過し、DCM:MeOH:DIPEA(17:2:1)、DCM、NMPおよびDCM(それぞれ2×25mL)で洗浄した。樹脂をNMP中で20分間膨張させ、濾過した。HOAt(3当量、9.0mmol、1.23g)、DIC(3当量、9.0mmol、1.40mL)およびNMP(25mL)を加え、樹脂を90分間RTで振盪した。樹脂を濾過し、2-(アミノメチル)ピリジン(2当量、6mmol、659mg)、DIPEA(4当量、6.0mmol、2.09mL)およびNMP(10mL)を加えた。樹脂を一晩振盪した。樹脂を濾過し、NMP(5×20mL)およびDCM(10×20mL)で洗浄した。TFA/TIS/水(95:2.5:2.5、30mL)を樹脂に加え、これを1時間振盪し、濾過し、真空中で濃縮すると、標題化合物が得られた。
収量(収率):600mg(41%)。
LCMS4:m/z=223(M+1)
UPLC(方法08_B4_1):Rt=1.79分
【０４８３】
C.本発明の化合物の合成
【０４８４】
(実施例1)
N9-[-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)-エチルカルバモイル]-2-メチル-プロピオニル}-Nε18-[2-(2-[2-(2-[2-(2-((S)-3-[1-(19-カルボキシ-ノナデカノイル)-ピペリジン-4-カルボキシアミノ]-3-カルボキシプロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Lys 18,Glu22,Gln34]GLP-1(9-37)-ペプチド
Chem.30:
【０４８５】
【化３３】
2013514322.tif 000035
【０４８６】
調製方法:SPPS法E。2,2-ジメチル-N-[2-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-エチル]-マロンアミド酸を、Aibアミノ酸と同じカップリング条件を用いてカップリングした。
LCMS4:m/z=1441.63(m/3)、1081.62(m/4)
【０４８７】
(実施例2)
N9-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)-エチルカルバモイル]-2-メチルプロピオニル}-Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][His31,Gln34]GLP-1(9-37)-ペプチド
Chem.31:
【０４８８】
【化３４】
2013514322.tif 000036
【０４８９】
調製方法:SPPS法B。2,2-ジメチル-N-[2-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-エチル]-マロンアミド酸、Fmoc-Oeg-OH、Fmoc-Glu-OtBuおよびオクタデカンジオン酸モノ-tert-ブチルエステルを、Aibアミノ酸と同じカップリング条件を用いてカップリングした。
LCMS4:Rt=2.23分、m/z=1341(m/3)、1006(m/4)
【０４９０】
(実施例3)
N9-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)-エチルカルバモイル]-2-メチル-プロピオニル}-Nε36-(2-{2-[2-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル)(Gln30,Lys 36)GLP-1(9-37)Glu38-ペプチドアミド
Chem.32:
【０４９１】
【化３５】
2013514322.tif 000037
【０４９２】
調製方法:実施例2と同様。
LCMS4:Rt=6.90分、m/z=1319(m/3)、990(m/4)
【０４９３】
(実施例4)
N9-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)プロピルカルバモイル]-2-メチル-プロピオニル}-Nε36-(2-{2-[2-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル)[Glu30,Lys 36]GLP-1(9-37)Glu38-ペプチドアミド
Chem.33:
【０４９４】
【化３６】
2013514322.tif 000038
【０４９５】
調製方法:SPPS法B。2,2-ジメチル-N-[3-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-プロピル]-マロンアミド酸、Fmoc-Oeg-OHおよびオクタデカンジオン酸モノ-tert-ブチルエステルを、Aibアミノ酸と同じカップリング条件を用いてカップリングした。
LCMS4: m/z=1324(m/3)、993(m/4)
UPLC(方法04_A3_1): Rt=12.55分
【０４９６】
(実施例5)
N9-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)メチルカルバモイル]-2-メチル-プロピオニル}-Nε36-(2-{2-[2-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)エトキシ}エトキシ]アセチル)[Glu30,Lys 36]GLP-1(9-37)Glu38-ペプチドアミド
Chem.34:
【０４９７】
【化３７】
2013514322.tif 000039
【０４９８】
調製方法:SPPS法B。2,2-ジメチル-N-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イルメチル)-マロンアミド酸、Fmoc-Oeg-OHおよびオクタデカンジオン酸モノ-tert-ブチルエステルを、Aibアミノ酸と同じカップリング条件を用いてカップリングした。
LCMS4: m/z=1313(m/3)、975(m/4)
UPLC(方法04_A3_1): Rt=12.44分
【０４９９】
(実施例6)
N3-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)-メチルカルバモイル]-2-メチル-プロピオニル}-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)-アセチルアミノ]エトキシ}-エトキシ)アセチル][Arg17,Arg20,Arg33,Lys38]GLP-1A(3-37)-ペプチド
Chem.35:
【０５００】
【化３８】
2013514322.tif 000040
【０５０１】
調製方法:SPPS法B。2,2-ジメチル-N- (1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イルメチル)-マロンアミド酸、Fmoc-Oeg-OH、Fmoc-Glu-OtBuおよびオクタデカンジオン酸モノ-tert-ブチルエステルを、Aibアミノ酸と同じカップリング条件を用いてカップリングした。
LCMS4: m/z=1663(m/3)、1247(m/4)、998(m/5)
UPLC(方法04_A3_1): Rt=11.26分
【０５０２】
(実施例7)
N9-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)-エチルカルバモイル]-2-メチルプロピオニル}-Nε26-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)-デカノイルアミノ]-ブチリルアミノ}-エトキシ)-エトキシ]-アセチルアミノ}-エトキシ)-エトキシ]-アセチル}、Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)-デカノイルアミノ]-ブチリルアミノ}-エトキシ)-エトキシ]-アセチルアミノ}-エトキシ)-エトキシ]-アセチル}[Arg34,Lys37]GLP-1(9-37)-ペプチド
Chem.36:
【０５０３】
【化３９】
2013514322.tif 000041
【０５０４】
調製方法:SPPS法B。2,2-ジメチル-N-[2-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-エチル]-マロンアミド酸を、Aibアミノ酸と同じカップリング条件を用いてカップリングした。8-(9-フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ)-3,6-ジオキサオクタン酸(Iris Biotechから市販されている)、Fmoc-Glu-OtBuおよび4-(9-カルボキシノニルオキシ)-安息香酸tert-ブチルエステル(WO2006/082204の実施例25、ステップ2に記載されているように調製)を、SPPS法Dを用いてカップリングした。
UPLC(方法08_B4_1):Rt=8.81分。
LCMS4:Rt=2.29分、m/z=1625(m/3)、1219(m/4)、975(m/5)
【０５０５】
(実施例8)
N9-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)-エチルカルバモイル]-2-メチル-プロピオニル}Nε26-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシ-フェノキシ)-デカノイルアミノ]-ブチリルアミノ}-エトキシ)-エトキシ]-アセチルアミノ}-エトキシ)-エトキシ]-アセチル}、Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシ-フェノキシ)-デカノイルアミノ]-ブチリルアミノ}-エトキシ)-エトキシ]-アセチルアミノ}-エトキシ)-エトキシ]-アセチル}[Arg34,Lys37]GLP-1(9-37)Glu38-ペプチド
Chem.37:
【０５０６】
【化４０】
2013514322.tif 000042
【０５０７】
調製方法:SPPS法B。2,2-ジメチル-N-[2-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-エチル]-マロンアミド酸を、Aibアミノ酸と同じカップリング条件を用いてカップリングした。8-(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-アミノ)-3,6-ジオキサオクタン酸(Iris Biotechから市販されている)、Fmoc-Glu-OtBuおよび4-(9-カルボキシ-ノニルオキシ)-安息香酸tert-ブチルエステル(WO2006/082204の実施例25、ステップ2に記載されているように調製)を、SPPS法Dを用いてカップリングした。
UPLC(方法04_A3_1):Rt=9.32分。
LCMS4:Rt=2.29分、m/z=1669(m/3)、1252(m/4)、1001(m/5)
【０５０８】
(実施例9)
N9-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)-エチルカルバモイル]-2-メチル-プロピオニル}-Nε26-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-tert-ブチル-フェニル)-ブチリルアミノ]-4-カルボキシ-ブチリルアミノ}-エトキシ)-エトキシ]-アセチルアミノ}-エトキシ)-エトキシ]-アセチル}、Nε37-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-[4-(4-tert-ブチル-フェニル)-ブチリルアミノ]-4-カルボキシ-ブチリルアミノ}-エトキシ)-エトキシ]-アセチルアミノ}-エトキシ)-エトキシ]-アセチル}[Arg34,Lys37]GLP-1(9-37)-ペプチド
Chem.38:
【０５０９】
【化４１】
2013514322.tif 000043
【０５１０】
調製方法:SPPS法B。2,2-ジメチル-N-[2-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-エチル]-マロンアミド酸を、Fmoc-Aibアミノ酸と同じカップリング条件を用いてカップリングした。8-(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-アミノ)-3,6-ジオキサオクタン酸(Iris Biotechから市販されている)、Fmoc-Glu-OtBuおよび4-(4-t-ブチルフェニル)酪酸を、SPPS法Dを用いてカップリングした。
UPLC(方法04_A4_1):Rt=10.56分。
LCMS4:Rt=2.40分、m/z=940(m/5)、1174(m/4)、1565(m/3)
【０５１１】
(実施例10)
N9-{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)-エチルカルバモイル]-2-メチル-プロピオニル}-Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Arg34]GLP-1(9-37)-ペプチド
Chem.39:
【０５１２】
【化４２】
2013514322.tif 000044
【０５１３】
調製方法:SPPS法E。2,2-ジメチル-N-[2-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-エチル]-マロンアミド酸を、Aibアミノ酸と同じカップリング条件を用いてカップリングした。
LCMS4: m/z=1367.30(m/3)、1025.60(m/4)
【０５１４】
(実施例11)(比較化合物)
N9-(5-オキソ-5-フェニルペンタノイル)、Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Arg34]-GLP-1-(9-37)-ペプチド
Chem.40:
【０５１５】
【化４３】
2013514322.tif 000045
【０５１６】
調製方法:SPPS法B。
UPLC(方法01_B4_1):Rt=11.48分。
LCMS2:Rt=5.60 m/z=1356(m/3)
【０５１７】
(実施例12)
N9-[2,2-ジメチル-3-オキソ-3-(ピリジン-2-イルメチルアミノ)プロパノイル]、Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Arg34,Lys37]-GLP-1-(9-37)-ペプチド
Chem.41:
【０５１８】
【化４４】
2013514322.tif 000046
【０５１９】
調製方法:SSPS法B。2,2-ジメチル-N-ピリジン-2-イルメチルマロンアミド酸を、先の実施例における2,2-ジメチル-N-[2-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-エチル]-マロンアミド酸について用いたものと同じカップリング条件を用いてカップリングした。Fmoc-Glu-OtBuおよび4-(9-カルボキシノニルオキシ)-安息香酸tert-ブチルエステル(WO2006/082204の実施例25、ステップ2に記載されているように調製)を、SPPS法Dを用いてカップリングした。
UPLC(方法08_B4_1):Rt=8.98分
LCMS4:Rt=2.23分、m/z=1624(m/3)、1218(m/4)
【０５２０】
薬理学的な方法
(実施例13)
in vitro効力
この実施例の目的は、本GLP-1受容体アゴニスト誘導体のin vitroでの活性または効力を試験することである。
【０５２１】
実施例1〜12のGLP-1受容体アゴニスト誘導体の効力を、以下に記載するように、すなわち、ヒトGLP-1受容体を発現する膜を含有する培地における環状AMP(cAMP)の形成の刺激として、定量した。
【０５２２】
実施例11の化合物(Chem.40)は、WO2004/067548の化合物215(24頁)(このWO刊行物の図1によれば、この刊行物の最も強力な化合物の1つである)に基づく比較化合物であることに留意されたい。
【０５２３】
原理
ヒトGLP-1受容体を発現する安定なトランスフェクト細胞株BHK467-12A(tk-ts13)由来の精製した血漿膜を当該GLP-1受容体アゴニスト誘導体で刺激し、cAMP産生の効力を、AlphaScreenTM cAMP Assay Kit(Perkin Elmer Life Sciences製)を用いて測定した。AlphaScreen Assayの基本原理は、内因性のcAMPと外因性に加えられたビオチン-cAMPとの間の競合である。cAMPの捕捉は、アクセプタービーズとコンジュゲートされた特異的な抗体を用いることにより達成される。
【０５２４】
細胞培養および膜の調製
安定なトランスフェクト細胞株および高発現クローンを、スクリーニングのために選択した。細胞は、DMEM中の5% CO2、5% FCS、1% Pen/Strep(ペニシリン/ストレプトマイシン)および0.5mg/mlの選抜マーカーG418で培養した。
【０５２５】
およそ80%コンフルエントの細胞をPBSで2回洗浄し、ベルセン(エチレンジアミン四酢酸の四ナトリウム塩の水溶液)で回収し、1000rpmで5分遠心分離し、上清を除去した。追加的なステップは、全て、氷の上で行った。細胞ペレットを、Ultrathuraxにより10mlの緩衝液1(20mM Na-HEPES、10mM EDTA、pH=7.4)中で20〜30秒間ホモジナイズし、20.000rpmで15分遠心分離し、ペレットを、10mlの緩衝液2(20mM Na-HEPES、0.1mM EDTA、pH=7.4)に再懸濁させた。この懸濁液を20〜30秒間ホモジナイズし、20.000rpmで15分遠心分離した。緩衝液2中での懸濁、ホモジナイゼーションおよび遠心分離を1回繰り返し、膜を緩衝液2に再懸濁させた。タンパク質濃度を定量し、膜は、使用するまで-80℃で保管した。
【０５２６】
アッセイは、1/2面積の平底の96ウェルプレート(Costarカタログ番号:3693)において実施した。1ウェル当たりの最終体積は50μlであった。
【０５２７】
溶液および試薬
AlphaScreen cAMP Assay Kit(Perkin Elmer Life Sciences製(カタログ番号:6760625M))、内容物:抗cAMPアクセプタービーズ(10U/μl)、ストレプトアビジンドナービーズ(10U/μl)およびビオチニル化されたcAMP(133U/μl)。
【０５２８】
AlphaScreen緩衝液、pH=7.4:50mM TRIS-HCl(Sigma、カタログ番号:T3253);5mM HEPES(Sigma、カタログ番号:H3375);10mM MgCl2、6H2O(Merck、カタログ番号:5833);150mM NaCl(Sigma、カタログ番号:S9625);0.01% Tween(Merck、カタログ番号:822184)。使用に先立ち、以下のものをAlphaScreen緩衝液に加えた(最終濃度を示す):BSA(Sigma、カタログ番号A7906):0.1%;IBMX(Sigma、カタログ番号I5879):0.5mM;ATP(Sigma、カタログ番号A7699):1mM;GTP(Sigma、カタログ番号G8877):1uM。
【０５２９】
cAMP標準(アッセイにおける希釈係数=5):cAMP溶液:5μLの5mM cAMPストック+495μLのAlphaScreen緩衝液。
【０５３０】
AlphaScreen緩衝液中の適当な希釈系列を、cAMP標準、ならびに、試験対象となるGLP-1アナログまたは誘導体、例えば、以下の8つの濃度のGLP-1化合物:10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13Mおよび10-14Mについて、また、例えば10-6から3×10-11までのcAMPの系列を、調製した。
【０５３１】
膜/アクセプタービーズ
hGLP-1/BHK467-12A膜を1ウェル当たり6μg(0.6mg/ml相当)使用する(1ウェル当たりの膜の使用量は変化させてもよい)
「膜なし」:アクセプタービーズ(最終15μg/ml)、AlphaScreen緩衝液中
「1ウェル当たり6μgの膜」:膜+アクセプタービーズ(最終15μg/ml)、AlphaScreen緩衝液中
10μlの「膜なし」を、cAMP標準(1ウェル毎、二重)および陽性対象および陰性対照に加える
10μlの「1ウェル当たり6μgの膜」を、GLP-1およびアナログに加える(1ウェル毎、二重/三重)
陽性対象:10μlの「膜なし」+10μlのAlphaScreen緩衝液
陰性対照:10μlの「膜なし」+10μlのcAMPストック溶液(50μM)
ビーズは直射光に敏感なので、一切の取扱いは、暗所(できるだけ暗い場所)で、または緑色の光の下で行った。全ての希釈は、氷の上で行った。
【０５３２】
手順
1.AlphaScreen緩衝液を作製する。
2.GLP-1/アナログ/cAMP標準をAlphaScreen緩衝液に溶解および希釈する。
3.ドナービーズ溶液を作製し、R.Tで30分インキュベートする。
4.cAMP/GLP-1/アナログをプレートに加える:1ウェル当たり10μl。
5.膜/アクセプタービーズ溶液を調製し、これをプレートに加える:1ウェル当たり10μl。
6.ドナービーズを加える:1ウェル当たり30μl。
7.プレートをアルミニウム箔で覆い、振盪器上で3時間(非常にゆっくり)、RTでインキュベートする。
8.AlphaScreenで計数する-計数前に、各プレートをAlphaScreen中で3分間プレインキュベートする。
【０５３３】
必要に応じ、GLP-1に関する折り畳み構造の変動(fold variation)を、EC50(GLP-1)/EC50(アナログ)として計算してもよい-3693.2。
【０５３４】
結果
Graph-Pad Prismソフトウェア(バージョン5)を用いてEC50[pM]値を計算した。
【０５３５】
試験した本発明の誘導体は全て、2100pM以下のEC50に相当する良好なin vitro効力を有した。8個の誘導体はさらに効力が高く、EC50は1000pM以下であり、5個の誘導体は500pM以下のEC50に相当するまたさらに高い効力を有し、4個の誘導体は非常に効力が高くEC50は300pM以下に相当し、1個の誘導体は100pM以下のEC50に相当する非常に良好な効力を有した。
【０５３６】
実施例11の比較化合物は、はるかに効力が劣り、具体的には、EC50は8000pMを超えた。
【０５３７】
(実施例14)
GLP-1受容体結合
この実験の目的は、本GLP-1アゴニスト誘導体の、GLP-1受容体との結合、および、その結合がアルブミンの存在によりどのように影響を受ける可能性があるかを調べることである。これは、以下に記載するように、in vitro実験で行う。
【０５３８】
実施例1〜12のGLP-1受容体アゴニスト誘導体の、ヒトGLP-1受容体との結合親和性を、該受容体から125I-GLP-1を置き換える能力により測定した。
【０５３９】
実施例11の化合物(Chem.40)は、WO2004/067548の化合物215(24頁)(このWO刊行物の図1によれば、この刊行物の最も強力な化合物の1つである)に基づく比較化合物であることに留意されたい。
【０５４０】
本誘導体の、アルブミンとの結合を試験するため、アッセイは、低濃度のアルブミン(0.005%、トレーサー中でのその残留量に相当する)、ならびに高濃度のアルブミン(2.0%、添加したもの)を用いて実施した。
【０５４１】
結合親和性、IC50の変化は、当該ペプチドがアルブミンと結合し、それにより動物モデルにおける当該ペプチドの潜在的な持続型の薬物動態プロファイルが予測されることを示唆する。
【０５４２】
条件
種(in vitro):ハムスター
生物学的なエンドポイント:受容体結合
アッセイ方法:SPA
受容体:GLP-1受容体
細胞株:BHK tk-ts13
【０５４３】
細胞培養および膜精製
安定なトランスフェクト細胞株および高発現クローンを、スクリーニングのために選択した。細胞は、DMEM中の5% CO2、10% FCS、1% Pen/Strep(ペニシリン/ストレプトマイシン)および1.0mg/mlの選抜マーカーG418で培養した。
【０５４４】
細胞(およそ80%コンフルエント)をPBS中で2回洗浄し、ベルセン(エチレンジアミン四酢酸の四ナトリウム塩の水溶液)で回収し、次いで、1000rpmで5分間の遠心分離により分離した。細胞/細胞ペレットは、後続のステップにおいて、可能な限り氷の上で維持しなければならない。細胞ペレットは、Ultrathurraxを用いて、適当な量の緩衝液1(細胞の量次第であるが、例えば10ml)中で20〜30秒間ホモジナイズした。ホモジネートを20000rpmで15分間遠心分離した。ペレットを10mlの緩衝液2に再懸濁させ(ホモジナイズし)、再度遠心分離した。このステップをもう1回繰り返した。その結果得られるペレットを緩衝液2に再懸濁させ、タンパク質濃度を定量した。膜は、マイナス80℃で保管した。
緩衝液1:20mM Na-HEPES+10mM EDTA、pH7.4
緩衝液2:20mM Na-HEPES+0.1mM EDTA、pH7.4
【０５４５】
結合アッセイ:
SPA:
試験化合物、膜、SPA粒子および[125I]-GLP-1(7-36)NH2をアッセイ緩衝液中で希釈した。25ul(マイクロリットル)の試験化合物をOptiplateに加えた。HSA(2% HSAを含有する「高アルブミン」実験)または緩衝液(0.005% HSAを含有する「低アルブミン」実験)を加えた(50ul)。1試料当たり5〜10ugのタンパク質を加えた(50ul)が、これは、1ml当たりタンパク質0.1〜0.2mgに相当する(各膜調製物について好ましくは最適化した)。SPA粒子(小麦胚芽アグルチニンSPAビーズ、Perkin Elmer、#RPNQ0001)を0.5mg/ウェル(50ul)の量で加えた。インキュベーションは、[125I]-GLP-1]-(7-36)NH2(最終濃度0.06nM。49.880DPM、25ulに相当)で開始した。プレートをPlateSealerで密封し、振盪しながら30℃で120分間インキュベートした。プレートを遠心分離し(1500rpm、10分)、Topcounterで計数した。
【０５４６】
アッセイ緩衝液:
50mM HEPES
5mM EGTA
5mM MgCl2
0.005% Tween 20
pH7.4
HSAはSIGMA A1653であった
【０５４７】
計算
IC50値は、50%の125I-GLP-1を受容体から置き換える濃度として曲線から読み取り、[(IC50/nM)高HSA]/[(IC50/nM)低HSA]の比率を定量した。
【０５４８】
一般に、低アルブミン濃度でのGLP-1受容体との結合は、可能な限り良好であるべきであり、それは、IC50値が低いことに相当する。
【０５４９】
高アルブミン濃度でのIC50値は、該誘導体がGLP-1受容体と結合する際のアルブミンの影響の尺度である。公知のように、本GLP-1受容体アゴニスト誘導体は、アルブミンとも結合する。このことは一般に望ましい効果であり、これにより、血漿中での該誘導体の寿命が延びる。したがって、高アルブミン条件でのIC50値は、一般に、GLP-1受容体との結合と競合するアルブミン結合が原因で生じるGLP-1受容体との結合の減少に対応して、低アルブミン条件でのIC50値より高くなるであろう。
【０５５０】
したがって、高い(IC50値(高アルブミン)/IC50値(低アルブミン))比は、当該誘導体がアルブミンと良好に結合し(長い半減期を有することができる)、それ自体GLP-1受容体とも良好に結合する指標としてとらえることができる(IC50値(高アルブミン)が高く、IC50値(低アルブミン)が低い)。
【０５５１】
結果
以下の結果が得られた(ここで、「比率」は、[(IC50/nM)高HSA]/[(IC50/nM)低HSA]を指す):
【０５５２】
全ての誘導体の比率は10を超えており、10個が20超であり、6個の誘導体が30超であり、4個の誘導体が50超であり、1個の誘導体が100超であった。実施例11の比較化合物の比率は300超であった。
【０５５３】
さらに、IC50(低アルブミン)については、全ての誘導体(実施例11の比較化合物を除く)のIC50(低アルブミン)が40nM未満であり、1個を除く全てが20nM未満、4個を除く全てが10.0nM未満、5個が5.00nM未満、3個の誘導体が1.00nM未満であった。
【０５５４】
最後に、IC50(高アルブミン)については、本発明の全ての誘導体のIC50(高アルブミン)が900.00nM未満であり、9個が500.00nM未満、4個が100.00nM未満、2個の誘導体が50.00nM未満であった。実施例11の比較化合物のIC50(高アルブミン)は、800.00nM超であった。
【０５５５】
(実施例15)
経口バイオアベイラビリティーの推定
この実験の目的は、本GLP-1受容体アゴニスト誘導体の経口バイオアベイラビリティーを推定することである。
【０５５６】
この目的のために、腸管腔中への本化合物の直接注射後の血漿中での曝露量を、以下に記載するように、ラットにおいてin vivoで試験する。
【０５５７】
本化合物は、55mg/mlのカプリン酸ナトリウムの溶液中の1000uMの濃度で試験する。
【０５５８】
到着時の体重がおよそ240gの32匹のオスのSprague DawleyラットをTaconic(デンマーク)から入手し、簡単なランダム化により、異なる処置に、1群当たり4匹のラットを割り付ける。ラットは、実験前およそ18時間絶食させ、全身麻酔(ヒプノルム/ドルミカム)をかける。
【０５５９】
化合物を、空腸の近位部(十二指腸方向に10cm遠位)中、または中腸(盲腸方向に50cm近位)中のいずれかに投与する。PE50カテーテル(長さ10cm)を空腸中に挿入し、少なくとも1.5cm空腸中に進め、投与前に、腸の周囲を結索糸により、カテーテルを3/0縫合糸で、先端の遠位で固定して、漏出またはカテーテルの移動を防止する。カテーテルは、注射器および針を用いずに設置し、2mlの生理食塩水を腹部中に投与してから、創傷クリップで傷口を閉鎖した。
【０５６０】
100μlの各化合物は、1ml注射器を用いて、カテーテルを通して空腸管腔中に注射する。次いで、200μlの空気を別の注射器で空腸管腔中に送り込んでカテーテルを「洗い流す」。この注射器をカテーテルに連結したままにして、カテーテル中への逆流を防止する。
【０５６１】
血液試料(200ul)を、尾静脈からEDTAチューブ中に、所望の間隔(通常、0分時点、10分時点、30分時点、60分時点、120分時点および240分時点)で収集し、20分以内に、10000G、4℃で5分遠心分離する。血漿(75ul)をMicronicチューブに分離し、直ちに凍結し、各GLP-1受容体アゴニスト誘導体の血漿中濃度を分析するまで-20℃で維持する。分析は、LOCI(Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay)を用いて、一般的に、PoulsenおよびJensen、収録先:Journal of Biomolecular Screening、2007、第12巻、240〜247頁によりインスリンの定量について記載されているように行う。ドナービーズはストレプトアビジンでコーティングし、アクセプタービーズは、ペプチドの中間/C末端エピトープを認識するモノクローナル抗体とコンジュゲートさせる。N末端に特異的な別のモノクローナル抗体はビオチニル化する。この3つの反応物を分析物と組み合わせると、2つの部位のある免疫複合体が形成される。この複合体に光を当てると、ドナービーズから一重状態の酸素原子が放出され、これがアクセプタービーズ中に流れて化学発光を誘発し、この光をEnvisionプレートリーダーで測定する。光の量は、化合物の濃度に比例する。
【０５６２】
血液採取後、ラットを麻酔下で屠殺し、開腹して、カテーテルが正しく配置されていることを確認する。
【０５６３】
平均(n=4)の血漿中濃度(pmol/l)を、時間の関数として定量する。血漿中濃度(pmol/l)を投与溶液の濃度(μmol/l)で割った比率を各処置について計算し、t=30分(化合物を空腸中に注射した30分後)についての結果を、腸のバイオアベイラビリティーの代替尺度として評価する(30分時点での用量補正された曝露量)。用量補正された曝露量は、実際のバイオアベイラビリティーと有意に相関することが示されている。
【０５６４】
この結果は、30分時点での用量補正された曝露量として得てもよく、その値は、(化合物を空腸中に注射した30分後の血漿中濃度(pM))を、(投与溶液中の化合物の濃度(μM))で割ったものを指す。
【０５６５】
(実施例16)
ミニブタにおける薬物動態
この試験の目的は、本GLP-1受容体アゴニスト誘導体の、ミニブタへのi.v.投与後のin vivoでの持続、すなわち、その作用時間の延びを定量することである。これは、当該誘導体の終末半減期を定量する、薬物動態学的な(PK)試験において行う。終末半減期とは、一般に、初期分布段階の後に測定される一定の血漿中濃度を半減させるのにかかる期間を意味する。
【０５６６】
Ellegaard Gottingen Minipigs(Dalmose、デンマーク)から入手した、生後およそ7〜14カ月で体重がおよそ16〜35kgのオスのGottingenミニブタを試験で使用する。ミニブタは、個別に収容され、1日1回または2回、SDSミニブタ食(Special Diets Services、Essex、UK)を限定的に給餌される。順化の少なくとも2週間後、2本の長期留置型の(permanent)中心静脈カテーテルを、各動物において、下大動脈(vena cava caudalis)または上大動脈(vena cava cranialis)に埋め込む。動物は、外科手術後1週間回復させてから、投与間に適当なウォッシュアウト期間を設けた反復投与薬物動態試験に使用する。
【０５６７】
動物は、投与前およそ18時間、および投与後少なくとも4時間絶食させられるが、全期間にわたり水は自由に摂れた。
【０５６８】
本化合物は、50mMリン酸ナトリウム、145mM塩化ナトリウム、0.05% tween 80、pH7.4に溶解されて、通常20〜60nmol/mlの濃度になる。本化合物の静脈内注射(通常1〜2nmol/kgに相当する体積、例えば0.033ml/kg)をカテーテル経由で投与し、投与後13日までの間、所定の時点で採血する(好ましくは、他のカテーテル経由で)。血液試料(例えば0.8ml)をEDTA緩衝液(8mM)中に収集してから、4℃、1942Gで10分間、遠心分離する。ドライアイス上で血漿をMicronicチューブ中にピペットで移し、ELISAまたは類似の抗体ベースアッセイまたはLC-MSを用いて各GLP-1化合物の血漿中濃度を分析するまで、-20℃で維持する。個々の血漿中濃度-時間プロファイルは、WinNonlin v.5.0(Pharsight Inc.、Mountain View、CA、USA)の非コンパートメントモデルにより分析し、その結果得られる終末半減期(調和平均)を定量する。
【０５６９】
本明細書では、本発明の一定の特徴を例示および説明してきたが、多くの改変形、代用物、変形および等価物が、今や当業者には想起されよう。したがって、添付の特許請求の範囲は、そのような改変形および変形は全て本発明の真の精神の範囲内にあるものとして包含することを意図していることは理解されたい。
【配列表】
2013514322000001.app
【国際調査報告】
2013514322.tif 000053
2013514322.tif 000054
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