(57)【要約】【要約書】  本開示は、アルブミンに対する結合親和性を有する一種の改変ポリペプチドに関する。また、本発明は、異なる状況でこれらの及び他の化合物によるアルブミンへの結合を活用する新たな方法及び使用に関し、そのいくつかは、ヒトを含む哺乳動物における疾患の治療又は診断にとって重要である。
2013534421.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）ＬＡＸ3ＡＫＸ6Ｘ7ＡＮＸ10  ＥＬＤＸ14ＹＧＶＳＤＦ  ＹＫＲＬＩＸ26ＫＡＫＴ
ＶＥＧＶＥＡＬＫＸ39Ｘ40  ＩＬＸ43Ｘ44ＬＰ
（式中、互いに独立して
Ｘ3は、Ｅ、Ｓ、Ｑ及びＣから選ばれ；
Ｘ6は、Ｅ、Ｓ及びＣから選ばれ；
Ｘ7は、Ａ及びＳから選ばれ；
Ｘ10は、Ａ、Ｓ及びＲから選ばれ；
Ｘ14は、Ａ、Ｓ、Ｃ及びＫから選ばれ；
Ｘ26は、Ｄ及びＥから選ばれ；
Ｘ39は、Ｄ及びＥから選ばれ；
Ｘ40は、Ａ及びＥから選ばれ；
Ｘ43は、Ａ及びＫから選ばれ；
Ｘ44は、Ａ、Ｓ及びＥから選ばれ；
位置４５のＬは、存在するか又は存在せず；そして
位置４６のＰは、存在するか又は存在しない）
及び
ｉｉ）ｉ）に定義された配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含むアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項２】
Ｘ6がＥである、請求項１に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項３】
Ｘ3がＳである、請求項１又は２に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項４】
Ｘ3がＥである、請求項１又は２に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項５】
Ｘ7がＡである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項６】
Ｘ14がＳである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項７】
Ｘ14がＣである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項８】
Ｘ10がＡである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項９】
Ｘ10がＳである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項１０】
Ｘ26がＤである、請求項１〜９のいずれか１項に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項１１】
Ｘ26がＥである、請求項１〜９のいずれか１項に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項１２】
Ｘ39がＤである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項１３】
Ｘ39がＥである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項１４】
Ｘ40がＡである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項１５】
Ｘ43がＡである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項１６】
Ｘ44がＡである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項１７】
Ｘ44がＳである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項１８】
位置４５のＬが存在する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項１９】
位置４６のＰが存在する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項２０】
相互作用のｋoff値が、多くとも５×１０-5秒-1になるようにアルブミンに結合する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項２１】
相互作用のｋoff値が、多くとも５×１０-6秒-1になるようにアルブミンに結合する、請求項２０に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項２２】
アミノ酸配列が、配列番号：１−１４４及び配列番号：１６４−２０３のいずれか１つから選ばれる、請求項１に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項２３】
アミノ酸配列が、配列番号：４−５、配列番号：７−８、配列番号：１０−１１、配列番号：１３−１４、配列番号：１６−１７、配列番号：１９−２０、配列番号：２２−２３、配列番号：２５−２６、配列番号：２８−２９、配列番号：３１−３２、配列番号：３４−３５、配列番号：３７−３８、配列番号：４１−４２、配列番号：４９−５０、配列番号：１６４−１７０及び配列番号：１９２−２０３のいずれか１つから選ばれる、請求項２２に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項２４】
アミノ酸配列が、配列番号：１−１４４のいずれか１つから選ばれる、請求項２２に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項２５】
アミノ酸配列が、配列番号：４−５、配列番号：７−８、配列番号：１０−１１、配列番号：１３−１４、配列番号：１６−１７、配列番号：１９−２０、配列番号：２２−２３、配列番号：２５−２６、配列番号：２８−２９、配列番号：３１−３２、配列番号：３４−３５、配列番号：３７−３８、配列番号：４１−４２及び配列番号：４９−５０のいずれか１つから選ばれる、請求項２４に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項２６】
ｉ）に定義された配列のＮ末端及び／又はＣ末端に位置する１つ又はそれ以上のさらなるアミノ酸残基をさらに含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項２７】
さらなるアミノ酸が、ポリペプチドのＮ末端で少なくとも１つのセリン残基を含む、請求項２６に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項２８】
さらなるアミノ酸が、ポリペプチドのＮ末端でグリシン残基を含む、請求項２６又は２７に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項２９】
さらなるアミノ酸が、ポリペプチドのＮ末端でシステイン残基を含む、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項３０】
さらなるアミノ酸が、ポリペプチドのＣ末端でリシン残基を含む、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項３１】
さらなるアミノ酸が、ポリペプチドのＣ末端でグリシン残基を含む、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項３２】
さらなるアミノ酸が、ポリペプチドのＣ末端でシステイン残基を含む、請求項２６〜３１のいずれか１項に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項３３】
アミノ酸配列が、配列番号：１４５−１５０及び配列番号：１６２−１６３のいずれか１つから選ばれる、請求項２６〜３２のいずれか１項に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項３４】
２つを超えないシステイン残基を含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項３５】
１つを超えないシステイン残基を含む、請求項３４に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項３６】
ヒト血清アルブミンに結合する、請求項１〜３５のいずれか１項に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
【請求項３７】
ｉ）前記請求項のいずれか１項に記載のアルブミン結合ポリペプチドからなる第１の部分；及び
ｉｉ）所望の生物活性を有するポリペプチドからなる第２の部分；
を含む融合タンパク質又はコンジュゲート。
【請求項３８】
所望の生物活性を有する第２の部分が、治療活性なポリペプチドである、請求項３７に記載の融合タンパク質又はコンジュゲート。
【請求項３９】
所望の生物活性を有する第２の部分が、ヒト内生酵素、ホルモン、成長因子、ケモカイン、サイトカイン及びリンホカインからなる群より選ばれる、請求項３８に記載の融合タンパク質又はコンジュゲート。
【請求項４０】
第２の部分が、ＩＬ−２、ＧＬＰ−１、ＢＮＰ、ＩＬ−１−ＲＡ、ＫＧＦ、ステムジェン(R)（Stemgen（R））、ＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＴＬＡ−４、ミオスタチン、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子からなる群より選ばれる、請求項３９に記載の融合タンパク質又はコンジュゲート。
【請求項４１】
所望の生物活性を有する第２の部分が、細菌毒素、酵素及び活性化プロテインからなる群より選ばれる非ヒト生物活性タンパク質である、請求項３８に記載の融合タンパク質又はコンジュゲート。
【請求項４２】
所望の生物活性を有する第２の部分が、標的分子と選択的相互作用が可能である結合ポリペプチドである、請求項３７に記載の融合タンパク質又はコンジュゲート。
【請求項４３】
結合ポリペプチドが、抗体、及び抗体結合活性を実質的に保持しているそのフラグメント及びドメイン；マイクロボディ、マキシボディ、アビマー及び他の低分子量ジスルフィド結合タンパク質；並びにブドウ球菌プロテインＡ及びそのドメイン、他の３ヘリックスドメイン、リポカリン、アンキリンリピートドメイン、セルロース結合ドメイン、γクリスタリン、緑色蛍光タンパク質、ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４、クニッツ（Kunitz）ドメインのようなプロテアーゼ阻害剤、ＰＤＺドメイン、ＳＨ３ドメイン、ペプチドアプタマー、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、テンダミスタット、フィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン、トランスフェリン、ジンクフィンガー及びコノトキシンからなる群より選ばれるスカフォールド由来の結合タンパク質；からなる群より選ばれる、請求項４２に記載の融合タンパク質又はコンジュゲート。
【請求項４４】
前記標的分子が、アルツハイマー病のＡβペプチド；他の疾患関連のアミロイドペプチド；細菌毒素及びヘビ毒のような毒素；フォンビルブランド因子のような血液凝固因子；ＩＬ−１３のようなインターロイキン；ミオスタチン；ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−α受容体、ＩＬ−１、ＩＬ−２３及びＩＬ−８のような炎症誘発性因子；Ｃ３及びＣ５のような補体因子；ヒスタミン及びＩｇＥのような過敏症メディエーター；ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ｃＭｅｔ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＣＡＩＸ、ＣＥＡ、ＩＬ−２受容体、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２のような腫瘍関連抗原、並びにＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＨ、インスリン及びソマトスタチンのような他の生体分子からなる群より選ばれる、請求項４３に記載の融合タンパク質又はコンジュゲート。
【請求項４５】
第２の部分のものと同じか又は異なってもよい、さらなる所望の生物活性を有するポリペプチドからなるさらなる部分を含む、請求項３７〜４４のいずれか１項に記載の融合タンパク質又はコンジュゲート。
【請求項４６】
第２の部分が、請求項３８〜４１のいずれか１項に定義された通りであり、そしてさらなる部分が、請求項４２〜４４のいずれか１項に定義された通りである、請求項４５に記載の融合タンパク質又はコンジュゲート。
【請求項４７】
第２の部分が、ポリペプチドの位置Ｘ１４に存在する任意のシステイン残基のチオール基を介して、請求項１〜３６のいずれか１項に記載のアルブミン結合ポリペプチドにコンジュゲートされる、請求項３７〜４６のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項４８】
細胞傷害性薬剤をさらに含む、請求項１〜４７のいずれか１項に記載のアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲート。
【請求項４９】
細胞傷害性薬剤が、カリケアマイシン、オーリスタチン、ドキソルビシン、マイタンシノイド、タキソール、エクテイナシジン、ゲルダナマイシン、メトトレキセート及びそれらの誘導体、並びにそれらの組み合わせから選ばれる、請求項４８に記載のアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲート。
【請求項５０】
標識をさらに含む、請求項１〜４９のいずれか１項に記載のアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲート。
【請求項５１】
前記標識が、蛍光色素及び金属、発色性色素、化学発光化合物及び生物発光タンパク質、酵素、放射性核種及び粒子からなる群より選ばれる、請求項５０に記載のアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲート。
【請求項５２】
システイン残基のチオール基又はリシン残基のアミン基を介してアルブミン結合ポリペプチドにコンジュゲートされたポリアミノポリカルボキシレートキレート剤によって提供されたキレート環境を含む、請求項５１に記載のアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲート。
【請求項５３】
ポリアミノポリカルボキシレートキレート剤が、１,４,７,１０−テトラアザシクロドデカン−１,４,７,１０−四酢酸又はその誘導体である、請求項５２に記載のアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲート。
【請求項５４】
１,４,７,１０−テトラアザシクロドデカン−１,４,７,１０−四酢酸誘導体が、１,４,７,１０−テトラアザシクロドデカン−１,４,７−トリス−酢酸−１０−マレイミドエチルアセトアミドである、請求項５３に記載のアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲート。
【請求項５５】
ポリアミノポリカルボキシレートキレート剤は、ジエチレントリアミン五酢酸又はその誘導体である、請求項５２に記載のアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲート。
【請求項５６】
請求項１〜４６のいずれか１項に記載のアルブミン結合ポリペプチド又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５７】
請求項５６に記載のポリヌクレオチドを発現させることを含む、請求項１〜４５のいずれか１項に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項５８】
請求項５６に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項５９】
請求項５８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項６０】
保護された反応性側鎖を有するアミノ酸及び／又はアミノ酸誘導体を用いた非生物学的ペプチド合成による、請求項１〜３６のいずれか１項に記載のポリペプチドを製造方法であって、非生物学的ペプチド合成が、
アミノ酸及び／又はアミノ酸誘導体の段階的カップリングを行なって保護された反応性側鎖を有する請求項１〜３６のいずれか１項に記載のポリペプチドを形成する工程；
ポリペプチドの反応性側鎖から保護基を除去する工程；及び
水溶液中でポリペプチドを折り畳む工程；
を含む、上記方法。
【請求項６１】
請求項３７〜４８のいずれか１項に記載のコンジュゲートの製造方法であって、
請求項６０に記載の方法に従ってアルブミン結合ポリペプチドを製造する工程；及び
製造されたアルブミン結合ポリペプチドを、請求項３８〜４８のいずれか１項に定義されたような第２の及び／又はさらなる部分とコンジュゲートする工程；
を含む、上記方法。
【請求項６２】
薬剤として使用するための、請求項３７〜５５のいずれか１項に記載の融合タンパク質又はコンジュゲート。
【請求項６３】
それ自体で所望の生物活性を有するポリペプチドを哺乳動物に投与して誘発される免疫応答と比較して、哺乳動物に投与すると免疫応答が誘発されないか又は低減される、請求項６２に記載の融合タンパク質又はコンジュゲート。
【請求項６４】
診断に使用するための、請求項３７〜５５のいずれか１項に記載の融合タンパク質又はコンジュゲート。
【請求項６５】
請求項１〜４７のいずれか１項に記載のアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートに結合された、
それ自体で１００μｇ／ｍｌを超えない水に対する溶解度を有する化合物を含む組成物であって；
ここにおいて、化合物及びアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートが共有結合されている、上記組成物。
【請求項６６】
前記溶解度が、１０μｇ／ｍｌを超えない、請求項６５に記載の組成物。
【請求項６７】
前記溶解度が、１μｇ／ｍｌを超えない、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
前記化合物が薬学的に活性な化合物である、請求項６５〜６７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６９】
前記薬学的に活性な化合物が、細胞傷害性薬剤である、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７０】
前記細胞傷害性薬剤が、請求項４９に定義された通りである、請求項６９に記載の組成物。
【請求項７１】
前記細胞傷害性薬剤が、天然産生化合物由来でない合成ケモトキシンである、請求項６９に記載の組成物。
【請求項７２】
臨床関連の標的に対して結合親和性を有する結合ポリペプチドをさらに含む、請求項６５〜７１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７３】
前記結合ポリペプチドが、請求項４３に定義された通りである、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７４】
ヒト血清アルブミンをさらに含む、請求項６５〜７３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７５】
薬剤として使用するための、請求項６５〜７４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７６】
診断に使用するための請求項６５〜７４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７７】
ａ）それ自体で１００μｇ／ｍｌを超えない水に対する溶解度を有する化合物を備える工程；及び
ｂ）化合物を、請求項１〜４７のいずれか１項に記載のアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートに共有結合させ、このようにして化合物及びアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートの共有結合性複合体を含む組成物を形成する工程；
を含む、請求項６５〜７６のいずれか１項に記載の組成物の製造方法。
【請求項７８】
ｃ）化合物及びアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートの前記複合体をアルブミンと混合し、こうしてｉ）化合物及びアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートの共有結合性複合体、並びにｉｉ）アルブミンの非共有結合性複合体を含む組成物を形成する工程；
をさらに含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
非共有結合性複合体を含む前記組成物を凍結乾燥させて凍結乾燥組成物を得る工程をさらに含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
化合物の水溶解度を高める方法であって、それ自体で１００μｇ／ｍｌを超えない水への溶解度を有する化合物を備える工程；
化合物を、請求項１〜４７のいずれか１項に記載のアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートに共有結合させ、こうして化合物及びアルブミン結合ポリペプチドの共有結合性複合体を形成する工程；並びに
アルブミン結合ポリペプチドとヒト血清アルブミンとの非共有結合性結合を促進する条件下で、化合物及びアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートの前記複合体をアルブミンと共に混合する工程；
を含み、それによって、該複合体中の化合物の水への溶解度が、化合物それ自体の水への溶解度より大きくなる、上記方法。
【請求項８１】
前記溶解度が、請求項６６又は６７に定義された通りである、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記化合物が、請求項６８〜７１のいずれか１項に定義された通りである、請求項８０〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記複合体が、臨床関連の標的に対して結合親和性を有するポリペプチドをさらに含む、請求項８０〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記結合ポリペプチドが、請求項４３に定義された通りである、請求項８３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、アルブミンに対する結合親和性を有するある種の改変ポリペプチド（engineered polypeptides）に関する。また、本発明は、異なる状況でのこれらの及び他の化合物によるアルブミンへの結合を活用する新たな方法及び使用に関し、そのうちの幾つかは、ヒトを含む哺乳動物における疾患の治療にとって重要である。
【背景技術】
【０００２】
血清アルブミン
血清アルブミンは、哺乳動物血清中で最も豊富なタンパク質（４０ｇ／ｌ；ヒト中約０．７ｍＭ）であり、そしてその機能の１つは、脂質及びビリルビンのような分子を結合することである（非特許文献１）。血清アルブミンには、酵素的又は免疫学的機能が全くない。さらにまた、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、多くの天然及び治療分子の内因性輸送及び送達に関与する天然の担体（natural carrier）である（非特許文献２）。血清アルブミンの半減期は、動物の大きさに正比例しており、ここで、例えばヒト血清アルブミンは、１９日の半減期を有し、そしてウサギ血清アルブミンは、約５日の半減期を有する（非特許文献３）。ＨＳＡは、体中に、特に間質及び血液区分に広く分布しており、そこで主に浸透圧（osmolarity）の維持に関与している。構造的に、アルブミンは、３つの相同ドメイン及び全体で５８４個又は５８５個のアミノ酸を含む単鎖タンパク質である（非特許文献４）。アルブミンは、１７個のジスルフィド架橋及び１個の反応性チオール、３４位にシステインを含むが、Ｎ結合された及びＯ結合された炭水化物部分がない（前出Petersの非特許文献５）。
【０００３】
ＨＳＡとの融合又は結合は、タンパク質のin vivo半減期を延長することになる。
タンパク質を直接血清アルブミンに又は血清アルブミンに生体内で結合が可能となるペプチド若しくはタンパク質に共有結合する、いくつかの戦略が報告されている。後者のアプローチの例は、例えば、特許文献１中、特許文献２中及び非特許文献６中に記載されている。最初の文献は、とりわけ、他のタンパク質の半減期を延長するために、レンサ球菌Ｇタンパク質（ＳｐＧ）に由来するアルブミン結合ペプチド又はタンパク質の使用を記載している。その着想は、細菌に由来するアルブミン結合ペプチド／タンパク質を、血液から迅速に排泄されることがわかっている治療上興味深いペプチド／タンパク質に融合させることである。このようにして生成された融合タンパク質は、生体内で血清アルブミンに結合し、そしてそのより長い半減期から便益をもたらし、それにより融合された治療上興味深いペプチド／タンパク質の正味の半減期が延長される。特許文献２及びDennis 等（非特許文献６）は、同じ概念に関するが、ここで、執筆者らは、血清アルブミンを結合するために比較的短いペプチドを用いている。ペプチドは、ファージディスプレイペプチドライブラリー（phage displayed peptide library）から選択された。Dennis等は、初期の研究において、ヒト補体受容体タイプ１へのレンサ球菌Ｇタンパク質のアルブミン結合ドメインの組換え融合に対する免疫応答の強化が見出されたことを記載している。また、特許文献３（Dennis）として公開された米国特許出願は、ここでもファージディスプレイ技術によって同定されたペプチドリガンドを含む構築物の使用を開示しており、それは血清アルブミンに結合し、そして腫瘍標的化のため生物活性化合物にコンジュゲート（conjugated）されている。
【０００４】
細菌受容体タンパク質のアルブミン結合ドメイン
レンサ球菌Ｇタンパク質（ＳｐＧ）は、レンサ球菌の特定菌株の表面上に存在する二機能性受容体であり、そしてＩｇＧ及び血清アルブミンの両方に結合が可能である（非特許文献７）。構造は、いくつかの構造的及び機能的に異なるドメイン（非特許文献８）、より正確には３つのＩｇ−結合ドメイン及び３つの血清アルブミン結合ドメイン（非特許文献９）による高度な反復性がある。ＳｐＧ中の３つの血清アルブミン結合ドメインの１つの構造は、決定されており、３へリックスバンドル折り畳み構造（three-helix bundle fold）を示している（非特許文献１０）。４６個のアミノ酸モチーフは、ＡＢＤ（アルブミン結合ドメイン）として定義されており、そしてまた、後にＧ１４８−ＧＡ３（Ｇタンパク質関連のアルブミン結合のためのＧＡ）と指定されている。例えば特許文献４には、４６個のアミノ酸モチーフＡＢＤのアルブミン結合変異体が、開示されている。
【０００５】
また、Ｇタンパク質中のものとは異なるドメインを結合する細菌アルブミンも同定されており、そのうちの幾つかは、Ｇタンパク質のものと構造的に類似している。このようなアルブミン結合ドメインを含むタンパク質の例は、ＰＡＢ、ＰＰＬ、ＭＡＧ及びＺＡＧタンパク質である（非特許文献１１）。このようなアルブミン結合ドメインの構造及び機能の研究は行われており、そして、例えばJohansson及び共同研究者等によって報告されている（非特許文献１２）。さらにまた、Rozak等は、異なる種特異性及び安定性に関して選択及び研究されたＧ１４８−ＧＡ３の人工変異体の生成を報告しているのに対して（非特許文献１３）、Jonsson等は、ヒト血清アルブミンに対して非常に改善された親和性を有するＧ１４８−ＧＡ３の人工変異体を開発した（非特許文献１４）。いくつかの変異体では、熱安定性の低下を犠牲にしてより高親和性が達成された。
上記の３ヘリックス含有タンパク質に加えて、アルブミンを結合する他の無関係な細菌タンパク質もある。
【０００６】
ＡＢＤ及び免疫感作
近年では、レンサ球菌Ｇタンパク質菌株１４８（Ｇ１４８）のアルブミン結合領域内で、いくつかのＴ細胞及びＢ細胞エピトープが実験的に同定された（非特許文献１５）。研究を支持する執筆者らは、ワクチン中のＧ１４８のＴ細胞エピトープの使用、すなわち、アルブミン結合領域に固有の免疫刺激性を用いることに興味があった。Goetsch等は、Ｇ１４８の配列中に、Ｂ細胞エピトープ、すなわち、免疫感作（immunization）後に抗体によって結合された領域をさらに見出した。ヒトに投与するための医薬組成物では、免疫応答がないことが望ましい。
従って、アルブミン結合ドメインＧ１４８は、それ自体、上述のその免疫刺激性のためこのような組成物における使用には適していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ９１／０１７４３
【特許文献２】ＷＯ０１／４５７４６
【特許文献３】ＵＳ２００４／０００１８２７
【特許文献４】ＷＯ０９／０１６０４３
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Peters, Advances in Protein Chemistry 37:161, 1985
【非特許文献２】Sellers and Koch-Weser, Albumin Structure, Function and Uses, eds Rosenoer et al, Pergamon, Oxford, p 159, 1977
【非特許文献３】McCurdy et al, J Lab Clin Med 143:115, 2004
【非特許文献４】Dugaiczyk et al, Proc Natl Acad Sci USA 79:71, 1982
【非特許文献５】Peters, 1985, Nicholson et al, Br J Anaesth 85:599, 2000
【非特許文献６】Dennis et al, J Biol Chem 277:35035-43, 2002
【非特許文献７】Bjoerck et al, Mol Immunol 24:1113, 1987
【非特許文献８】Guss et al, EMBO J 5:1567, 1986
【非特許文献９】Olsson et al, Eur J Biochem 168:319, 1987
【非特許文献１０】Kraulis et al, FEBS Lett 378:190, 1996, Johansson et al, J. Biol. Chem. 277:8114-20, 2002
【非特許文献１１】Rozak et al, Biochemistry 45:3263-3271, 2006
【非特許文献１２】Johansson et al, J Mol Biol 266:859-865, 1997
【非特許文献１３】Rozak et al, Biochemistry 45:3263-3271, 2006
【非特許文献１４】Jonsson et al, Prot Eng Des Sel 21:515-27, 2008
【非特許文献１５】Goetsch et al, Clin Diagn Lab Immunol 10:125-32, 2003
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
先行技術の上の欠点及び欠陥は、第１の態様において、
ｉ）ＬＡＸ3ＡＫＸ6Ｘ7ＡＮＸ10  ＥＬＤＸ14ＹＧＶＳＤＦ  ＹＫＲＬＩＸ26ＫＡＫＴ
ＶＥＧＶＥＡＬＫＸ39Ｘ40  ＩＬＸ43Ｘ44ＬＰ
（式中、互いに独立して
Ｘ3は、Ｅ、Ｓ、Ｑ及びＣから選ばれ；
Ｘ6は、Ｅ、Ｓ及びＣから選ばれ；
Ｘ7は、Ａ及びＳから選ばれ；
Ｘ10は、Ａ、Ｓ及びＲから選ばれ；
Ｘ14は、Ａ、Ｓ、Ｃ及びＫから選ばれ；
Ｘ26は、Ｄ及びＥから選ばれ；
Ｘ39は、Ｄ及びＥから選ばれ；
Ｘ40は、Ａ及びＥから選ばれ；
Ｘ43は、Ａ及びＫから選ばれ；
Ｘ44は、Ａ、Ｓ及びＥから選ばれ；
位置４５のＬは、存在するか又は存在せず；そして
位置４６のＰは、存在するか又は存在しない）
及び
ｉｉ）ｉ）に定義された配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含むアルブミン結合ポリペプチドによって克服又は緩和される。
【００１０】
アルブミンに対する結合親和性を有する、上に定義された種類の配列関連のポリペプチドは、３アルファヘリックスバンドルドメインに折り畳まれている一般的な親ポリペプチド配列から誘導される。より詳しくは、上記のポリペプチドは、血清アルブミンとアルブミン結合ドメインＧ１４８−ＧＡ３との間の複合体（complex）の構造に基づくモデル構築（Lejon et al, J Biol Chem 279:42924-8, 2004）、並びに一般的な親ポリペプチド配列の多くの突然変異体の結合及び構造特性の分析から誘導される。上に定義されたアミノ酸配列ｉ）は、親ポリペプチド配列と比較してほとんど同一の３ヘリックスバンドルドメインに折り畳まれていることが予想されるある種のポリペプチドを生じるアミノ酸置換を含む。親ポリペプチド配列は、アルブミンと相互作用するための結合表面をすでに含んでいるが、その結合表面は、上の定義によるいくつかの置換によって修飾される。上の定義による置換は、親ポリペプチド配列と比較して改善されたアルブミン結合能力をもたらす。
【００１１】
本開示の第１の態様によるアルブミン結合ポリペプチドは、一連の特徴を示し、それは、例えば、ヒトに投与するための治療分子の融合又はコンジュゲートパートナー（conjugate partners）としてそれらを適したものにしている。本開示によるアルブミン結合ポリペプチドは、例えばアルブミン結合ドメインＧ１４８−ＧＡ３のような関連したアルブミン結合ポリペプチド及びＷＯ０９／０１６０４３に開示されたアルブミン結合ポリペプチドと比較して、以下の６つの特徴のうちの少なくとも５つを示す：
・ポリペプチドは、例えば、Ｇ１４８−ＧＡ３、そして他の細菌由来のアルブミン結合ドメインと比較して異なる表面を示す。違いは、このような細菌タンパク質に以前に暴露されたヒトのような被験者における抗体反応のなんらかのリスクを低下又は排除しうることである。
・ポリペプチドは、例えば、Ｇ１４８−ＧＡ３及び共通の親ポリペプチド配列の他の関連しているが異なる突然変異体よりも少ない潜在的Ｔ細胞エピトープを含み、そのため、ヒトのような被験者に投与されたときに低い免疫原性を示す。
・ポリペプチドは、ヒトのような被験者に投与されたときに、循環抗体とのより低い反応性を示す。従って、例えば、ヒト血清の試験セットで測定されたＧ１４８−ＧＡ３によって生じる抗体交差反応性と比較して、循環抗体に暴露されたポリペプチドの表面、すなわち、アルブミンとの結合相互作用に関与しないポリペプチド表面におけるアミノ酸置換によって抗体交差反応性が低下する。
・ポリペプチドは、ＫＤ値によって定義されるような、より高い結合親和性に関して、そしてｋｏｆｆ値によって定義されるような、より遅い速度（slower off-rate）に関していずれも、例えば、細菌タンパク質由来のアルブミン結合ドメインのような知られた天然に存在する（naturally occurring）アルブミン結合ポリペプチドよりも高いアルブミン結合能力を有する。
・ポリペプチドは、例えば、細菌タンパク質に由来するアルブミン結合ドメインのような知られた天然に存在するアルブミン結合ポリペプチドよりも少ない、ポリペプチドの安定性問題に関連するアミノ酸残基を含む。従って、ポリペプチドは、例えば、酸化しやすいメチオニン又はトリプトファンを含まず、そして１つしかアスパラギンを含まない。
・ポリペプチドは、５５℃より上の融点によって定義されるように、以前のアルブミン結合ポリペプチド、例えばＷＯ０９／０１６０４３に開示されたものよりもより高い構造安定性を有する。
【００１２】
一実施態様において、第１の態様によるアルブミン結合ポリペプチドは、上の記載された６つ特徴のすべてを示す。別の実施態様において、第１の態様によるアルブミン結合ポリペプチドは、アルブミンに結合されたときに、例えば、以前のアルブミン結合ポリペプチド、例えばＷＯ０９／０１６０４３に開示されたものよりもより親水性のプロファイルを示す。ポリペプチドがアルブミンと相互作用するときに、環境にさらされたアルブミン結合ポリペプチドの表面は、表面疎水性をもたらすアミノ酸残基を少ししか含んでいない。
【００１３】
当業者に明らかなように、任意のポリペプチドの機能、例えば第１の態様によるポリペプチドのアルブミン結合能力は、ポリペプチドの第三級構造に左右される。しかしながら、その構造に影響を及ぼすことなく、アルファ−へリックスポリペプチド中のアミノ酸の配列を変化させることは可能である（Taverna and Goldstein, J Mol Biol 315(3):479-84, 2002; He et al, Proc Natl Acad Sci USA 105(38):14412-17, 2008）。従って、生成した配列が、ｉ）によって定義された種類に属する配列に対して少なくとも９５％同一であるようなｉ）の改質変異体も、第１の態様によって包含される。例えば、アミノ酸残基のある種の機能群（functional grouping）に属するアミノ酸残基（例えば疎水性、親水性、極性など）は、同じ機能群からの別のアミノ酸残基に交換することができる。
【００１４】
明細書及び特許請求の範囲に用いられる「％同一」又は「％同一性」という用語は、以下のように算出される。CLUSTAL Wアルゴリズム（Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J., Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680 (1994)）を用いて、問い合わせ配列（query sequence）を標的配列に対して整列させる。整列された配列の最も短いものに対応するウィンドウ上で比較を行う。場合によっては、整列された配列の最も短いものが、本明細書に開示されたアルブミン結合ポリペプチドのような標的配列でありうる。他の場合、問い合わせ配列が整列された配列の最も短いものを構成しうる。問い合わせ配列は、例えば、少なくとも１０個のアミノ酸残基、例えば少なくとも２０個のアミノ酸残基、例えば少なくとも３０個のアミノ酸残基、例えば少なくとも４０個のアミノ酸残基、例えば４５個のアミノ酸残基からなりうる。各位置のアミノ酸残基を比較し、そして標的配列において同一の相関関係を有する問い合わせ配列中の位置のパーセンテージを％同一性として報告する。
【００１５】
第１の態様によるアルブミン結合ポリペプチドの一実施態様において、Ｘ6は、Ｅである。
【００１６】
この態様によるアルブミン結合ポリペプチドの別の実施態様において、Ｘ3は、Ｓである。
【００１７】
この態様によるアルブミン結合ポリペプチドの別の実施態様において、Ｘ3は、Ｅである。
【００１８】
この態様によるアルブミン結合ポリペプチドの別の実施態様において、Ｘ7は、Ａである。
【００１９】
この態様によるアルブミン結合ポリペプチドの別の実施態様において、Ｘ14は、Ｓである。
【００２０】
この態様によるアルブミン結合ポリペプチドの別の実施態様において、Ｘ14は、Ｃである。
【００２１】
この態様によるアルブミン結合ポリペプチドの別の実施態様において、Ｘ10は、Ａである。
【００２２】
この態様によるアルブミン結合ポリペプチドの別の実施態様において、Ｘ10は、Ｓである。
【００２３】
この態様によるアルブミン結合ポリペプチドの別の実施態様において、Ｘ26は、Ｄである。
【００２４】
この態様によるアルブミン結合ポリペプチドの別の実施態様において、Ｘ26は、Ｅである。
【００２５】
この態様によるアルブミン結合ポリペプチドの別の実施態様において、Ｘ39は、Ｄである。
【００２６】
この態様によるアルブミン結合ポリペプチドの別の実施態様において、Ｘ39は、Ｅである。
【００２７】
この態様によるアルブミン結合ポリペプチドの別の実施態様において、Ｘ40は、Ａである。
【００２８】
この態様によるアルブミン結合ポリペプチドの別の実施態様において、Ｘ43は、Ａである。
【００２９】
この態様によるアルブミン結合ポリペプチドの別の実施態様において、Ｘ44は、Ａである。
【００３０】
この態様によるアルブミン結合ポリペプチドの別の実施態様において、Ｘ44は、Ｓである。
【００３１】
この態様によるアルブミン結合ポリペプチドの別の実施態様において、位置４５のＬ残基は、存在する。
【００３２】
この態様によるアルブミン結合ポリペプチドの別の実施態様において、位置４６のＰ残基は、存在する。
【００３３】
この態様によるアルブミン結合ポリペプチドの別の実施態様において、位置４６のＰ残基は、存在しない。
【００３４】
別の実施態様においてこの態様によるアルブミン結合ポリペプチドは、Ｘ7がＬ、Ｅ又はＤのいずれでもないという条件の対象となる。
【００３５】
第１の態様によるアルブミン結合ポリペプチドは、表面に露出されたアミノ酸残基を、例えばシステイン又はリシンのいずれかと置換することによって、適したコンジュゲートパートナーとのコンジュゲーション（conjugation）のために製造されうる。これらの置換は、アルブミン結合ポリペプチドが血清アルブミンに結合したときに血清アルブミンから最も遠くに位置するヘリックスである、Ｎ末端ヘリックス、すなわちポリペプチドのヘリックスの１つに導入してもよい。従って、ｉ）で定義された配列のＸ14位のリシン残基は、部位特異的コンジュゲーションを可能にするために用いてもよい。さらにまた、これは、前記リシンのイプシロン−アミノ基の直交性保護（orthogonal protection）を用いることができるため、分子が化学ペプチド合成によって作られるときに好都合でありうる。
【００３６】
さらにまた、システイン残基をアミノ酸配列に導入して部位特異的コンジュゲーションを可能にしてもよい。例えば、上の定義に従ってシステイン残基をＸ3、Ｘ6及び／又は位置Ｘ14のいずれか１つに導入してもよい。
【００３７】
リシンのイプシロン−アミン又はシステインのチオール基へのコンジュゲーションパートナーのカップリングはアミノ酸配列ｉ）内のアミノ酸残基を用いた部位特異的コンジュゲションを得るための２つの化学的に異なる代替法を表す。当業者に理解されるように、コンジュゲーション用にアミノ酸配列を作成する他の化学的代替法が存在し、そしてそれ自体は、本開示の範囲内にある。このような化学の１つの例は、Ban等（J Am Chem Soc 132:1523-5, 2009）によって示されたようなチロシンの導入によって可能となるクリック様ケミストリー（click-like chemistry）である。
【００３８】
本明細書に用いられる「アルブミン結合」及び「アルブミンに対する結合親和性」という用語は、例えばBiacore機器におけるような表面プラスモン共鳴技術を用いて試験されうるポリペプチドの性質のことである。例えば、下の例に記載されたように、アルブミン結合親和性は、アルブミン又はそのフラグメントを機器のセンサチップ上に固定し、そして被検ポリペプチドを含むサンプルをチップ上に通過させる実験において試験することができる。別法として、被検ポリペプチドを機器のセンサチップ上に固定し、そしてアルブミン又はそのフラグメントを含むサンプルを、チップ上に通過させる。これに関して、アルブミンは、ヒト血清アルブのような哺乳動物からの血清アルブミンであってもよい。次いで、当業者は、アルブミンに対するポリペプチドの結合親和性の少なくとも定性的測定を行うこのような実験によって得られた結果を解釈することができる。定量的測定が望しい場合、例えば、相互作用のＫＤ値を測定するため、表面プラスモン共鳴法を用いてもよい。結合値は、例えばBiacore2000機器（GE Healthcare）において定義されうる。アルブミンを測定センサチップ上に適当に固定化し、そして親和性を測定するポリペプチドのサンプルを系列希釈によって調製し、そして注入する。次いで、例えば機器製造業者（GE Healthcare）によって提供されたBIAevaluation 4.1ソフトウェアの1:1 Langmuir結合モデルを用いて結果からＫＤ値を算出してもよい。
【００３９】
一実施態様において、この態様によるアルブミン結合ポリペプチドは、相互作用のｋｏｆｆ値が最大で５×１０-5秒-1、例えば最大で５×１０-6秒-1となるようにアルブミンに結合する。
【００４０】
上記のように、アミノ酸配列ｉ）によって定義されたアルブミン結合ポリペプチドは、３アルファヘリックスバンドルドメインに折り畳まれている共通の親ポリペプチド配列から誘導される。一実施態様において、この親ポリペプチド配列の３ヘリックスドメインは、レンサ球菌菌株Ｇ１４８からタンパク質Ｇの部分、特にドメインＧＡ３を形成する。
【００４１】
別の実施態様において、アルブミン結合ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：１−１４４及び配列番号：１６４−２０３、例えば配列番号：１−１４４のいずれか１つから選ばれる。より詳しくは、アミノ酸配列は、配列番号：４−５、配列番号：７−８、配列番号：１０−１１、配列番号：１３−１４、配列番号：１６−１７、配列番号：１９−２０、配列番号：２２−２３、配列番号：２５−２６、配列番号：２８−２９、配列番号：３１−３２、配列番号：３４−３５、配列番号：３７−３８、配列番号：４１−４２、配列番号：４９−５０、配列番号：１６４−１７０及び配列番号：１９２−２０３から選ばれる。従って、アミノ酸配列は、配列番号：４−５、配列番号：７−８、配列番号：１０−１１、配列番号：１３−１４、配列番号：１６−１７、配列番号：１９−２０、配列番号：２２−２３、配列番号：２５−２６、配列番号：２８−２９、配列番号：３１−３２、配列番号：３４−３５、配列番号：３７−３８、配列番号：４１−４２及び配列番号：４９−５０から選ばれうる。
【００４２】
一実施態様において、この態様によるアルブミン結合ポリペプチドは、ｉ）に定義された配列のＮ末端及び／又はＣ末端に位置する１つ又はそれ以上のさらなるアミノ酸残基をさらに含む。これらのさらなるアミノ酸残基は、ポリペプチドによるアルブミンの結合の強化、及び折り畳まれたアルブミン結合ドメインの立体配置的安定性の改善において役割を果たしうるが、例えば製造、精製、in vivo若しくはin vitvo安定化、ポリペプチドのカップリング、標識化又は検出、並びにそれらの任意の組み合わせの１つ又はそれ以上に関連する他の目的にも同様に十分に役立ちうる。このようなさらなるアミノ酸残基は、化学的カップリング（chemical coupling）のために、例えばアフィニティマトリックス（affinity matrix）を得るためのクロマトグラフィー樹脂に又は放射性金属と錯化するためのキレート部分に加えられた１つ又はそれ以上のアミノ酸残基を含んでもよい。
【００４３】
従って、アミノ酸配列ｉ）のＮ末端又はＣ末端におけるアルファヘリックスにすぐ前又は後にあるアミノ酸は、一実施態様において、立体配置的安定性を影響を及ぼすことがありうる。改善された立体配置的安定性に寄与しうるアミノ酸残基の１つの例は、上に定義されたアミノ酸配列ｉ）のＮ末端に位置するセリン残基である。Ｎ末端セリン残基は、場合によっては、セリン側鎖のガンマ酸素とグルタミン酸残基のポリペプチド主鎖ＮＨとの間に水素結合を含むことによって、標準的なＳ−Ｘ−Ｘ−Ｅキャッピングボックス（capping box）を形成しうる。このＮ末端キャッピングは、開示の第１の態様によるアルブミン結合ポリペプチドを構成する３ヘリックスドメインの第１のアルファヘリックスの安定化に寄与しうる。
【００４４】
従って、一実施態様において、さらなるアミノ酸は、ポリペプチドのＮ末端で少なくとも１つのセリン残基を含む。換言すれば、アミノ酸配列は、１つ又はそれ以上のセリン残基により始まる。アルブミン結合ポリペプチドの別の実施態様において、さらなるアミノ酸は、ポリペプチドのＮ末端でグリシン残基を含む。アミノ酸配列ｉ）は、１、２、３、４又は任意の適した数のアミノ酸残基によって始まりうることが理解される。従って、アミノ酸配列は、単一セリン残基、単一グリシン残基又は２つの組み合わせ、例えばグリシン−セリン（ＧＳ）の組み合わせ又はグリシン−セリン−セリン（ＧＳＳ）の組み合わせにより始まりうる。Ｎ末端でさらなるアミノ残基を含むアルブミン結合ポリペプチドの例は、配列番号：１４５−１６３中、例えば配列番号：１４５−１４８及び配列番号：１６２−１６３中に提示される。さらに別の実施態様において、さらなるアミノ酸残基は、配列ｉ）によって定義されたようなポリペプチドのＮ末端でグルタミン酸を含む。
【００４５】
同様に、Ｃ末端キャッピングは、アルブミン結合ポリペプチドを構成する３ヘリックスドメインの第３のアルファヘリックスの安定性を改善するために利用してもよい。プロリン残基は、ｉ）に定義されたアミノ酸配列のＣ末端に存在するとき、キャッピング残基として少なくとも部分的に機能することがある。このような場合、Ｃ末端でプロリン残基の後のリシン残基は、リシン残基のイプシロンアミノ基とポリペプチド主鎖中のリシンの２つ及び３つ前の残基に位置するアミノ酸のカルボニル基、例えば、Ｌ４５及びＰ４６の両方が存在するとき、ｉ）に定義されたアミノ酸配列のロイシン及びアラニン残基のカルボニル基との間の水素結合によって、アルブミン結合ポリペプチドの第３のヘリックスのさらなる安定化に寄与しうる。従って、一実施態様において、さらなるアミノ酸は、ポリペプチドのＣ末端でリシン残基を含む。
【００４６】
上に議論したように、さらなるアミノ酸は、アルブミン結合ポリペプチドの製造に関連しうる。特に、Ｐ４６が存在する実施態様によるアルブミン結合ポリペプチドが、化学的ペプチド合成によって製造されるとき、Ｃ末端プロリンの後の１つ又はそれ以上の場合によるアミノ酸残基は、利点をもたらすことがある。このようなさらなるアミノ酸残基は、例えば、合成のジペプチド段階でジケトピペラジンのような望ましくない物質の形成を防止することがある。このようなアミノ酸残基の１つの例は、グリシンである。従って、一実施態様において、さらなるアミノ酸は、上に説明したようにプロリン残基のすぐ後に又はさらなるリシン及び／又はグリシン残基の後に、ポリペプチドのＣ末端でグリシン残基を含む。別法として、ポリペプチド製造は、存在する場合、アミノ酸配列ｉ）のＣ末端プロリン残基のアミド化から利益を得てもよい。この場合、Ｃ末端プロリンは、カルボキシル炭素においてさらなるアミン基を含む。本明細書に記載されたポリペプチド、特にそのＣ末端がプロリン又はペプチド合成中にラセミ化することが知られている他のアミノ酸で終結するものの一実施態様において、上記のＣ末端へのグリシンの付加又は存在する場合、プロリンのアミド化は、Ｃ末端アミノ酸残基のラセミ化に伴う潜在的な問題に対処することもできる。このようにアミド化されたポリペプチドを、化学合成よりもむしろ組換え法により製造しようとする場合、Ｃ末端アミノ酸のアミド化は、当分野で知られたいくつかの方法によって、例えば、ＰＡＭ酵素のアミド化を用いることにより実施することができる。
【００４７】
Ｃ末端でさらなるアミノ酸残基を含むアルブミン結合ポリペプチドの例は、配列番号：１４５−１５２、例えば配列番号：１４８−１５０に提示される。当業者は、ペプチド合成用に予め作成された異なるタイプのマトリックスによるようなＣ末端修飾を実施する方法を知っている。
【００４８】
別の実施態様において、さらなるアミノ酸残基は、ポリペプチドのＮ及び／又はＣ末端でシステイン残基を含む。このようなシステイン残基は、ｉ）に定義されたアミノ酸配列のすぐ前及び／又は後にありうるか、又は上記の任意の他のさらなるアミノ酸残基の前及び／又は後にありうる。ポリペプチド鎖のＮ及び／又はＣ末端でシステイン残基を含むアルブミン結合ポリペプチドの例は、配列番号：１４９−１５０（Ｃ末端）及び配列番号：１５１−１５２（Ｎ末端）に提示される。ポリペプチド鎖へのシステイン残基の付加によって、アルブミン結合ポリペプチドのコンジュゲーションのための部位のチオール基を得ることができる。別法として、システイン残基の導入と類似のやり方でセレノシステイン残基をポリペプチド鎖のＣ末端に導入して部位特異的コンジュゲーションを促進することができる（Cheng et al, Nat Prot 1:2, 2006）。
【００４９】
一実施態様において、アルブミン結合ポリペプチドは、２つを超えないシステイン残基を含む。別の実施態様において、アルブミン結合ポリペプチドは、１つを超えないシステイン残基を含む。
【００５０】
別の実施態様において、アルブミン結合ポリペプチドのさらなるアミノ酸残基は、ポリペプチドの精製若しくは検出のための「タグ」、例えばヘキサヒスチジル（Ｈｉｓ6）タグ、又はタグに特異的な抗体と相互作用するための及び／又は精製に用いるための「ｍｙｃ」（「ｃ−Ｍｙｃ」）タグ若しくは「ＦＬＡＧ」タグを含む。他の代替物は、当業者に知られている。
【００５１】
さらに別の実施態様において、この態様によるアルブミン結合ポリペプチドは、ヒト血清アルブミンに結合する。別の実施態様において、アルブミン結合ポリペプチドは、マウス、ラット、イヌ及びカニクイザルマカク（cynomolgus macaques）からのアルブミンのようなヒト種とは別の種からのアルブミンに結合する。
【００５２】
また、上で議論された「さらなるアミノ酸残基」は、なんらかの所望の機能、例えば、第１のアルブミン結合ドメインと同じ結合機能、又は別の結合機能、又は治療機能、又は酵素機能、又は蛍光機能、又はそれらを混合したものを有する１つ又はそれ以上のポリペプチドドメインを構成してもよい。
【００５３】
結果的に、別の関連した態様において、
ｉ）本明細書に記載された第１の態様によるアルブミン結合ポリペプチドからなる第１の部分；及び
ｉｉ）所望の生物活性を有するポリペプチドからなる第２の部分；
を含む融合タンパク質又はコンジュゲート（conjugate）が提供される。
【００５４】
開示の第１の態様によるアルブミン結合ポリペプチド及び第２の部分を含む融合タンパク質又はコンジュゲートは、第２の部分それ自体のin vivo半減期と比較して第２の部分のin vitvo及び／又はin vivo半減期を延長しうる。結果として、この態様による融合タンパク質又はコンジュゲートが、ヒト被験者のような被験者に投与されるとき、第２の部分に対する生体内暴露を延長することができ、それによりそれ自体で投与されたときの第２の部分の生体内暴露の効力と比較して、第２の部分の生物活性の改善された効力をもたらすことができる。
【００５５】
所望の生物活性は、例えば、治療活性、結合活性又は酵素活性であってもよい。所望の生物活性が治療活性であるとき、この活性を示す第２の部分は、治療活性なポリペプチドでありうる。治療活性なポリペプチドの非限定的な例は、生体分子、例えばヒト内生酵素、ホルモン、成長因子、ケモカイン、サイトカイン及びリンホカインからなる群より選ばれる分子、並びにヒト以外の生物学的に活性なタンパク質、例えば細菌毒素（例えば緑濃菌外毒素並びにブドウ球菌及びレンサ球菌超抗原）、酵素（例えばＲＮａｓｅ及びベータ−ラクタマーゼ）及び活性化プロテイン（例えばストレプトキナーゼ）からなる群より選ばれるタンパク質である。アルブミン結合ポリペプチドとの融合体又はコンジュゲートに役立ちうる治療活性な生体分子の非限定的な例は、ＩＬ−２、ＧＬＰ−１、ＢＮＰ（Ａｌｂ−ベータ−ナトリウム利尿ペプチド）、ＩＬ−１−ＲＡ（インターロイキン−１受容体拮抗物質）、ＫＧＦ（ケラチノサイト増殖因子）、ステムジェン（R)（Stemgen(R)）、成長ホルモン（ＧＨ）、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＴＬＡ−４、ミオスタチン、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子からなる群より選ばれる。
【００５６】
腫瘍組織の漏出欠陥のある血管は、その脈管系（内皮障壁）を巨大分子に対して透過性にするのに対して、健全な組織の血管では、小さな分子しか内皮障壁を通過することができない。同様に、関節リウマチ患者の炎症を起こした関節におけるアルブミンに対する血液−関節障壁の透過性は、著しく高められる。従って、この態様による融合タンパク質又はコンジュゲートは、腫瘍組織中の血管及び炎症を起こした関節の血液−関節障壁を透過する可能性がある。
【００５７】
第２の部分の前記所望の生物活性が結合活性であるとき、前記第２の部分は、標的分子と選択的相互作用が可能な結合ポリペプチドであってもよい。このような結合ポリペプチドは、例えば、抗体並びに抗体結合活性を実質的に保持しているそのフラグメント及びドメイン；マイクロボディ、マキシボディ（maxybodies）、アビマー（avimers）及び他の小さなジスルフィド結合タンパク質；並びにブドウ球菌プロテインＡ及びそのドメイン、他の３ヘリックスドメイン、リポカリン（lipocalins）、アンキリンリピートドメイン、セルロース結合ドメイン、γクリスタリン、緑色蛍光タンパク質、ヒト細胞傷害性Tリンパ球関連抗原４、クニッツ（Kunitz）ドメインのようなプロテアーゼ阻害剤、ＰＤＺドメイン、ＳＨ３ドメイン、ペプチドアプタマー、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、テンダミスタット、フィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン、トランスフェリン、ジンクフィンガー及びコノトキシンからなる群より選ばれるスカフォールド由来の結合タンパク質からなる群より選ばれうる。
【００５８】
いくつかの実施態様において、前記標的結合ポリペプチドの結合のための標的分子は、アルツハイマー病のアミロイドβ（Ａβ）ペプチド；他の疾患関連のアミロイドペプチド；細菌毒素及びヘビ毒のような毒素；フォンビルブランド（von Willebrand）因子のような血液凝固因子；ＩＬ−１３のようなインターロイキン；ミオスタチン；ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−α受容体、ＩＬ−１、ＩＬ−８及びＩＬ−２３のような炎症誘発性因子；Ｃ３及びＣ５のような補体因子；ヒスタミン及びＩｇＥのような過敏症メディエーター（hypersensitivity mediators）；ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ｃＭｅｔ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＣＡＩＸ（炭酸脱水酵素ＩＸ）、ＣＥＡ、ＩＬ−２受容体、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２のような腫瘍関連抗原；並びにＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、成長ホルモン（ＧＨ）、インスリン及びソマトスタチンのような他の生体分子からなる群より選ばれうる。
【００５９】
当業者に理解されるように、第１の態様によるアルブミン結合ポリペプチドは、融合タンパク質において又は任意の他の部分のコンジュゲートパートナーとして有用でありうる。従って、治療活性ポリペプチド、結合ポリペプチド及び標的分子の上のリストは、なんら限定されるものとして解釈すべきではない。
【００６０】
本開示による融合タンパク質又はコンジュゲートの一実施態様において、第２の部分は、アルブミン結合ポリペプチドのＮ若しくはＣ末端に加えられたリシン若しくはシステイン残基を介して又はアルブミン結合ポリペプチド内の位置で、例えばＸ3、Ｘ6及びＸ14から選ばれる位置でリシン若しくはシステイン残基を介してアルブミン結合ポリペプチドにコンジュゲートされる。コンジュゲーション部位が、位置Ｘ14のシステインのように、アルブミン結合ポリペプチドのアミノ酸配列ｉ）内に１つである場合、第２の部分へのコンジュゲーションを可能にするために、さらなるアミノ酸を、アルブミン結合ポリペプチドに加える必要はない。ｉ）によって定義されたポリペプチド鎖内のコンジュゲーション部位は、ポリペプチド、特にコンジュゲーション部位に近いポリペプチドの部分を交差反応抗体からさらに保護してもよい。理論によって拘束されることを望むわけではないが、アルブミン結合ポリペプチドを介したコンジュゲートが、生体内で血清アルブミンに結合するとき、すなわち、血清アルブミンの結合ポケット中に位置するとき、例えばアルブミン結合ポリペプチドを構成する３ヘリックスドメインのヘリックスの１つの中の位置にコンジュゲートされた第２の部分は、アルブミン結合ポリペプチドが結合する血清アルブミンから離れた向きにある可能性がある。さらに、アルブミン結合ポリペプチド内のコンジュゲーション部位は、例えば、抗原提示細胞中の処理における効果、ＭＣＨクラスII分子のペプチド結合溝中の潜在的ペプチド（potential peptides）の損なわれた適合、及びＴ細胞受容体に対して利用可能な改造されたペプチド表面（コンジュゲートされた部分が突き出ているため）のため、別途、ポリペプチドのこの部分からＴ細胞に誘導されたペプチド部分の提示を損うことがありうる。従って、結合部位近くのコンジュゲートの部分の免疫原性は、コンジュゲーション後にさらに低下することが予想される。
【００６１】
本開示のアルブミン結合ポリペプチドと血清アルブミンとの間の高い親和性のため、このようなアルブミン結合ポリペプチドを含むコンジュゲート又は融合タンパク質は、血清アルブミンとの間接的な複合体（complex）とみなされうる。従って、本開示によるコンジュゲート又は融合タンパク質は、血清アルブミンとの直接コンジュゲート又は融合を活用する頻繁に用いられる方法の代替物を提供する。このような血清アルブミンとの直接コンジュゲートは、カップリングにどんな方法を用いるかにかかわらず、不均質であることが多い。特定の分子がリシン残基のアミノ基を介して血清アルブミンに結合されるとき、血清アルブミン分子の表面上の多数のリシンのいずれか１つが標的となることができ、それによりランダムコンジュゲーション部位及びランダム生成物が得られる。ヒト血清アルブミン中の１つの不対システインを介したチオールカップリング（３４位において、Peters, 1985、前出）は、直接コンジュゲートを得るための代替方法を提供していると考えられるが、このような方法論は、しばしば均一な生成物をもたらさない。商業的に入手可能な（ヒト）血清アルブミン中の分子のうち２０〜６０％しか遊離チオール基を示さず、残りは、システイン、ホモシステイン又はグルタチオンのようなチオール化合物によってブロックされている。これに対して、本開示によるアルブミン結合ポリペプチドの３ヘリックスドメインへのコンジュゲーションは、部位特異的に実施してもよい。これは、上に議論されたように、１つ若しくはそれ以上のシステイン、セレノシステイン、又は明記されたリシンのいずれかへのカップリングによって実施してもよい（合成中に直交的に保護される（orthogonally protected））。
【００６２】
本開示のこの態様によれば、所望の生物活性を有する第２の部分は、アルブミン結合ポリペプチドの３ヘリックスドメインとコンジュゲートさせるか又はそれとの融合タンパク質として製造されうる。本開示によるコンジュゲートの非限定的な例を下に示す。グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）又はその誘導体は、アルブミン結合ポリペプチドとのコンジュゲート中で第２の部分として適切に存在しうる小さなポリペプチドである。アルブミン結合ポリペプチドへのＧＬＰ−１のコンジュゲ−ションは、上記のポリペプチド配列の位置のいずれか１つで実施されうる。コンジュゲートは、それ自体、非生物学的方法で製造してもよく、そしてＧＬＰ−１それ自体の効力と比較して有意に強化された効力を示すことが期待される。コンジュゲーションは、小さなポリペプチド若しくはタンパク質、例えばＧＬＰ−１、又はより大きなポリペプチド若しくはタンパク質の両方を用いてもよい。本開示によるコンジュゲートは、典型的に非アミノ酸スペーサー部分、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含んでもよい。
【００６３】
他のポリペプチド又はタンパク質を融合タンパク質の形態でアルブミン結合ポリペプチドのアミノ酸配列と合わせてもよい。さらに、このような融合タンパク質は、第１及び第２部分の間に１つ又はそれ以上のスペーサーアミノ酸残基を含んでもよい。
【００６４】
上記のように、第１の態様によるアルブミン結合ポリペプチドは、マウス、ラット、イヌ及びカニクイザルマカクを含むいくつかの種からの血清アルブミンを結合する。従って、本開示による融合タンパク質又はコンジュゲートは、ヒト被験者だけでなく、動物モデルにおいても第２部分の生物学的効果の強化に寄与しうる。多くの内因性タンパク質は、ヒト血清アルブミンとの直接融合体として製造されてきており、このようなタンパク質の例としては、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＨ、インターフェロン、ＣＤ４、ＩＬ−２、インスリン、グルカゴン、ＧＬＰ−１、抗体Ｆａｂフラグメント及びクニッツ（Kunitz）ドメイン由来タンパク質のようなプロテアーゼ阻害剤が含まれる。しかしながら、このような直接融合体は、動物モデルにおいて十分に評価されないことがありうる。これは、例えば一般的に用いられる動物モデルマウス及びラットにおいて、ヒト血清アルブミンが内因性Ｆｃ新生児受容体（ＦｃＲｎ）と適切に相互作用せず、そしてこの相互作用が、血清アルブミンの長い循環時間に寄与する重要な要因であるという事実のためである。上記のように、本開示によるコンジュゲート又は融合タンパク質は、血清アルブミンの存在下で、アルブミンと結合し、そしてアルブミンとの間接的融合体として機能しうる。これは、第１の態様によるアルブミン結合ポリペプチドを含むコンジュゲート又は融合タンパク質を、前臨床モデル種において有用にしているが、但し、第２の部分が選ばれた種において生物学的に活性である場合に限る。
【００６５】
一実施態様において、第２の部分のそれと同じか又は異なってもよい、さらなる所望の生物活性を有するポリペプチドを構成するさらなる部分を含む融合タンパク質又はコンジュゲートが提供される。このような融合タンパク質又はコンジュゲートの１つの具体例としては、第２の部分として上に定義された治療活性なポリペプチド及びさらなる部分として上に定義された結合ポリペプチドが含まれる。
【００６６】
第１の態様によるアルブミン結合ポリペプチドを組み込んでいる融合タンパク質又はコンジュゲートの上の説明に関して、留意すべきである。第１の、第２の及びさらなる部分の呼称は、一方において本開示によるアルブミン結合ポリペプチド又はポリペプチドと、もう一方において他の機能を示す部分との区別を明確にするために行った。これらの呼称は、融合タンパク質又はコンジュゲートのポリペプチド鎖中の異なるドメインの実際の順序を指すものではない。従って、例えば、前記第１の部分は、制限なしに、融合タンパク質又はコンジュゲートのＮ末端、中央、又はＣ末端に現れうる。
【００６７】
関連した態様において、細胞傷害性薬剤のような有機分子をさらに含む、本開示において定義されたアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートが提供される。第１の態様によるアルブミン結合ポリペプチドに融合若しくはコンジュゲートされうるか、又は第２の態様による融合タンパク質若しくはコンジュゲートと合わせることができる細胞傷害性薬剤の非限定的な例は、カリケアマイシン、オーリスタチン（auristatin）、ドキソルビシン、マイタンシノイド（maytansinoid）、タキソール、エクテイナシジン、ゲルダナマイシン、メトトレキセート及びそれらの誘導体、並びにそれらの組み合わせから選ばれる。以前に、直接アルブミンコンジュゲートを用いてさまざまな障害を治療する試みが行われた。このような直接アルブミンコンジュゲートが、例えば、癌においてドキソルビシンと共に（Kratz et al, J Med Chem 45: 5523-33, 2002）、そして関節リウマチにおいてメトトレキサートと共に（Wunder et al, J Immunol 170:4793-4801, 2003）活用された。アルブミン結合ポリペプチドは、それ自体で又は融合タンパク質若しくはコンジュゲートの一部として、その高いアルブミン結合能力によってアルブミン複合体を構成する間接的な手段を提供し、従って、上に記載された試みと比較して、代替治療法を提供しうることを理解すべきである。
【００６８】
さらに、上の態様は、例えば、ポリペプチドの検出のために、第１の態様によるアルブミン結合ポリペプチド、又は第２の態様による融合タンパク質又はコンジュゲート中に含まれるアルブミン結合ポリペプチドに、標識基、例えば蛍光色素及び金属、発色性色素、化学発光化合物及び生物発光タンパク質、酵素、放射性核種及び粒子からなる群より選ばれる標識が付与されたポリペプチドを包含する。特に、本開示は、本明細書に記載されたアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートの放射性キレート（radiochelate）、及び放射性金属のような放射性核種からなる放射性標識ポリペプチドを包含する。
【００６９】
標識アルブミン結合ポリペプチドが、本開示の第１の態様によるアルブミン結合ポリペプチド及び標識を含む実施態様において、標識ポリペプチドは、例えば、間接的に血清アルブミンを標識化するために用いてもよい。標識ポリペプチドと血清アルブミンとの間の強い結合のため、標識ポリペプチドは、例えば血管透過性及び血液プールの研究に用いてもよい。
【００７０】
別の実施態様において、標識アルブミン結合ポリペプチドは、所望の生物活性を有する第２の部分も含む融合タンパク質又はコンジュゲート中の一部として存在する。標識は、場合によっては、アルブミン結合ポリペプチドにしか結合されず、そして場合によっては、アルブミン結合ポリペプチド及びコンジュゲート又は融合タンパク質の第２の部分の両方に結合される。標識ポリペプチドについて言及する場合、これは、アルブミン結合ポリペプチド並びに第２の及び場合によりさらなる部分を含む融合タンパク質及びコンジュゲートを包含する、本明細書に記載されたポリペプチドのすべての態様への言及と理解しなければならない。従って、標識ポリペプチドは、アルブミン結合ポリペプチド及び、例えば、キレート化されるか若しくはアルブミン結合ポリペプチドに共有結合されうる治療的な放射性核種しか含まないか、又はアルブミン結合ポリペプチド、治療的な放射性核種及び第２の部分、例えば治療有効性のような所望の生物活性を有する小分子を含むことができる。
【００７１】
アルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートが放射性標識化される実施態様において、このような放射性標識ポリペプチドは、放射性核種を含んでもよい。大多数の放射性核種は、金属性を有し、そして金属は、典型的にタンパク質及びペプチド中に存在する元素と安定な共有結合を形成することができない。このため、放射性金属によるタンパク質及びペプチドの標識化は、キレート剤、すなわち、キレートと称する、金属イオンと非共有結合性化合物を形成する多座配位子を用いて実施される。アルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートの実施態様において、放射性核種の取り込みは、キレート環境の提供を通して可能となり、それにより放射性核種は、ポリペプチドに配位結合、キレート化又は錯体形成されうる。
【００７２】
キレート剤の一例は、ポリアミノポリカルボキシレートタイプのキレート剤である。このようなポリアミノポリカルボキシレートキレート剤は、２種類：大環状及び非環状キレート剤に分けることができる。一実施態様において、アルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートは、システイン残基のチオール基又はリシン残基のイプシロンアミン基を介してアルブミン結合ポリペプチドにコンジュゲートされたポリアミノポリカルボキシレートキレート剤によって提供されたキレート化環境を含む。
【００７３】
インジウム、ガリウム、イットリウム、ビスマス、放射性アクチニド及び放射性ランタニドの放射性同位体について最も一般的に用いられる大環状キレート剤は、ＤＯＴＡ（１,４,７,１０−テトラアザシクロドデカン−１,４,７,１０−四酢酸）の種々の誘導体である。一実施態様において、アルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートのキレート環境は、ＤＯＴＡ又はその誘導体によって提供される。より詳しくは、本開示によって包含されるキレート化ポリペプチドの一群は、例えば実施例５に記載されたように、ＤＯＴＡ誘導体１,４,７,１０−テトラアザシクロドデカン−１,４,７−トリス−酢酸−１０−マレイミドエチルアセトアミド（マレイミドモノアミド−ＤＯＴＡ）を、例えば、アルブミン結合ポリペプチドのチオール基と反応させることによって製造される。
【００７４】
高い動的不活性（kinetic inertness）、すなわちＤＯＴＡからの金属の遅い解離速度は、放射性核種の安定な結合にとって好ましい。しかし、遅い結合速度のため、標識化には、高められた温度が必要である。このため、ＤＯＴＡ誘導体は、本開示のアルブミン結合ポリペプチドのような短いペプチドの標識化のために広く用いられ、これは、標識化反応に必要な温度でインキュベーションした後に結合機能を示す。
【００７５】
最も一般的に用いられる非環式ポリアミノポリカルボキシレートキレート剤は、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸）の種々の誘導体である。したがって、また、ジエチレントリアミン五酢酸又はその誘導体によって提供されるキレート環境を有するポリペプチドは、本開示によって包含される。
【００７６】
ＤＴＰＡの主鎖が修飾された半硬質変異体は、例えばZevalin(R)の90Ｙによる標識化に妥当な安定性をもたらすことがわかっている。非環状キレート剤は、あまり不活性でなく、そして、結果的に、大環状のものよりも安定性が低く、その標識化は、周囲温度でも十分に迅速である。このため、それは、本開示による融合タンパク質又はコンジュゲートの標識化に用いられると考えられる。タンパク質及びペプチドを標的設定するためののポリアミノポリカルボキシレートキレート剤のカップリングについての詳細なプロトコールは、Cooper等（Nat Prot 1: 314-7, 2006）によってそしてSosabowski及びMather（Nat Prot 1:972-6, 2006）によって公開されている。
【００７７】
ポリアミノポリカルボキシレートキレート剤に結合された、本明細書に記載された態様によるアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートを用いて、キレート剤及び医用画像に適した放射性核種に結合されたアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートの放射性キレートからなる放射性標識ポリペプチドを提供してもよく、放射性核種は、61Ｃｕ、64Ｃｕ、66Ｇａ、67Ｇａ、68Ｇａ、110mＩｎ、111Ｉｎ、44Ｓｃ及び86Ｙからなる群より選ばれ、又は治療に適した放射性核種では、放射性核種は、225Ａｃ、212Ｂｉ、213Ｂｉ、67Ｃｕ、166Ｈｏ、177Ｌｕ、212Ｐｂ、149Ｐｍ、153Ｓｍ、227Ｔｈ及び90Ｙからなる群より選ばれ、ここにおいて、放射性核種はキレート剤を介してアルブミン結合ポリペプチドと複合体形成される。
【００７８】
また、その実施態様において、いわゆる間接標識化を用いて非金属放射性同位体によりポリペプチドを放射性標識化してもよい。従って、例えば18Ｆ、76Ｂｒで標識化するために、異なるヨウ素同位体及び211Ａｔ、中間体「リンカー分子」が標識化に用いられる。このようなリンカー分子は、２つの機能的部分を含んでいなければならず、１つは迅速かつ効率的な放射性標識化をもたらし、そしてもう１つは、タンパク質への、例えばアミン基への、又は好ましくは、アルブミン結合ポリペプチドの位置Ｘ14におけるような、唯一の（unique）システインのチオール基への迅速かつ効率的なカップリングを可能にする。例えばマレミド基は、チオール基と反応して安定なチオエーテル結合を形成する。「リンカー分子」は、最初に放射性標識と、そしてその後、タンパク質のチオール又はセレノチオール基と反応させてもよい。
【００７９】
別の態様において、本明細書に記載されたアルブミン結合ポリペプチド又は融合タンパク質をコード化するポリヌクレオチドが提供される。また、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、そして発現ベクターを含む宿主細胞を発現することを含む、上記のアルブミン結合ポリペプチド又は融合タンパク質の製造方法が包含される。
【００８０】
別法として、本開示のアルブミン結合ポリペプチドは、保護された反応性側鎖を有するアミノ酸及び／又はアミノ酸誘導体を用いる非生物学的ペプチド合成によって製造してもよく、非生物学的ペプチド合成は、アミノ酸及び／又はアミノ酸性誘導体を段階的にカップリングして、保護された反応性側鎖を有する第１の態様によるポリペプチドを形成し、ポリペプチドの反応性側鎖から保護基を除去し、そして水溶液中でポリペプチドを折り畳むことを含む。
【００８１】
従って、通常のアミノ酸（例えばグリシン、アラニン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン及びバリン）及び予め保護されたアミノ酸誘導体を用いて溶液中又は有機溶媒中の固体支持体上で順にポリペプチド配列を構築する。固体支持体上のペプチド合成の１つの具体例を実施例５に記載する。完全なポリペプチド配列が構築されたときに、保護基を除去し、そしてポリペプチドを水溶液中で折り畳ませる。本開示による各ポリペプチドは、付加的要因なしで３ヘリックスバンドルドメインに可逆的に折り畳まれ、従って、自発的に折り畳まれる。
【００８２】
第２の態様によるコンジュゲートは、非生物学的ペプチド合成によるような、上記の方法のいずれかによるアルブミン結合ポリペプチドを製造し、そして製造されたアルブミン結合ポリペプチドを第２の態様と関連して定義された第２の及び／又はさらなる部分とコンジュゲートすることを含む方法によって製造されうる。
【００８３】
融合タンパク質又はコンジュゲートの一実施態様において、治療に使用するための、例えば薬剤として使用するための、本明細書に定義された融合タンパク質又はコンジュゲートがさらに提供される。このような融合タンパク質又はコンジュゲートは、それ自体で所望の生物活性を有するポリペプチドのin vivo半減期より長いin vivo半減期を示しうる。さらに、融合タンパク質又はコンジュゲートは、それ自体で所望の生物活性を有するポリペプチドについて、哺乳動物に投与すると誘発される免疫応答と比較して、ヒトのような哺乳動物に投与にすると、免疫応答が誘発されないか又は低下される。別の言い方をすれば、これにより、このようなポリペプチドの、本明細書に開示された態様によるアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートへの融合又はコンジュゲーションを通して、所望の生物活性を有するポリペプチドの免疫原性を低下させる方法が提供される。さらに、これは、第２の部分の生物活性の強化を可能にすることができる。
【００８４】
別の実施態様において診断に使用するため、例えば診断剤として使用するための、本開示による融合タンパク質又はコンジュゲートが提供される。
【００８５】
また、本開示は、上記のアルブミン結合ポリペプチドを用いた異なる態様、並びにポリペプチドが、その結合及び他の特性のため有用である、治療、診断及び検出のためのさまざまな方法に関する。これらの使用及び方法の以下の説明において「アルブミン結合ポリペプチド」に言及する場合、この用語は、アルブミン結合ポリペプチドだけでなく、例えば、融合タンパク質又はコンジュゲート中の一部としてアルブミン結合ポリペプチドが組み込まれた、及び／又は標識、キレート剤、治療及び／又は診断剤にコンジュゲートされた、及び／又はタグとして又は他の目的でさらなるアミノ酸残基が付与された上記のこのポリペプチドに基づくすべてのそれらの分子を包含するものとする。上で説明されたように、このような融合タンパク質、誘導体などは、本開示の一部を構成する。
【００８６】
別の一連の態様は、難溶性化合物の水溶液中での溶解性を、アルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートへのそのコンジュゲーションを通して高めるための新たな手段の提供に関する。難溶性化合物及び単独の又は融合タンパク質若しくはコンジュゲート中の一部として組み込まれたアルブミン結合ポリペプチドのその後の複合体（ensuing complex）は、in vivo又はin vitvoでアルブミンと結合することができ、その結合は、水溶液中の溶解度を高める。
【００８７】
従って、このさらなる態様の実施態様において、本明細書に記載されたアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートに結合された、それ自体で１００μｇ／ｍｌを超えない水への溶解度を有する化合物；を含み、ここにおいて化合物とアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートと共有結合された組成物が提供される。
【００８８】
一実施態様において、化合物は、それ自体で１０μｇ／ｍｌを超えない溶解度を有する。さらに別の実施態様において、前記溶解度は、１μｇ／ｍｌを超えない。
【００８９】
いくつかの実施態様において、化合物は、薬学的に活性な化合物、例えば細胞傷害性薬剤であってもよい。細胞傷害性薬剤の非限定的な例としては、カリケアマイシン、オーリスタチン、ドキソルビシン、マイタンシノイド、タキソール、エクテイナシジン、ゲルダナマイシン及びそれらの誘導体、並びにそれらの組み合わせから選ばれるものである。あるいは、細胞傷害性薬剤は、有機合成によって作られ、そして天然産生化合物由来でない合成ケモトキシン（chemotoxin）であってもよい。
【００９０】
難溶性化合物及びアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートに加えて、本開示のこの態様による組成物は、いくつかの実施態様において、また、臨床関連の標的に対して親和性を有する結合ポリペプチドを含む。この結合ポリペプチドは、アルブミン結合ポリペプチドとは適当に異なり、そして本発明の組成物の他の成分に非共有結合的に結合するか又は共有結合してもよい。非限定的な例として、臨床関連の標的に対して親和性を有する結合ポリペプチドは、抗体並びに抗体結合活性を実質的に保持しているそのフラグメント及びドメイン；マイクロボディ、マキシボディ、アビマー、及び他の小さなジスルフィド結合タンパク質；並びに、ブドウ球菌プロンテインＡ及びそのドメイン、他の３ヘリックスドメイン、リポカリン、アンキリンリピートドメイン、セルロース結合ドメイン、γクリスタリン、緑色蛍光タンパク質、ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４、プロテアーゼ阻害剤、例えばクニッツ（Kunitz）ドメイン、ＰＤＺドメイン、ＳＨ３ドメイン、ペプチドアプタマー、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、テンダミスタット、フィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン、トランスフェリン、ジンクフィンガー及びコノトキシンからなる群より選ばれるスカフォールド由来の結合タンパク質からなる群より選ばれうる。
【００９１】
本開示の上の態様による組成物は、それ自体で又は融合タンパク質若しくはコンジュゲート中の存在として、アルブミン結合ポリペプチドの組成物で提供することにより、in vivo又はin vitvoでアルブミンと結合する能力を有する。ある種の場合、生体外にアルブミンと組成物の複合体を形成すること、すなわち外因性アルブミンを組成物に加えることは有益でありうる。このような組成物は、凍結乾燥してもよく、周囲温度での貯蔵に適した製剤が提供される。従って、また、本開示は、ヒト血清アルブミンのようなアルブミンをさらに含む上に定義された組成物を提供する。
【００９２】
また、本開示は、化合物が治療活性化合物である場合、薬剤として使用するための、すなわち治療に使用するための、上の態様による組成物を提供する。適切なことに、アルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲート及び場合によりアルブミンの提供は、活性化合物の治療有効性に有害な影響を及ぼすことがないので、本発明の組成物は、化合物それ自体が指示されるその治療又は予防設定において有用である。
【００９３】
別の実施態様において、診断剤として使用するための、すなわち診断に使用するための上の態様による組成物が提供される。
【００９４】
本開示の関連した態様は、すぐ上に記載された組成物の製造方法を提供する。
方法は、
それ自体で１００μｇ／ｍｌを超えない水に対する溶解度を有する化合物を備える工程；そして
化合物を、本明細書に記載された態様によるアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートに共有結合させ、こうして化合物及びアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートの共有結合性複合体を含む組成物を形成する工程；
を含む。
【００９５】
アルブミンが組成物中に含まれる本開示の実施態様において、方法は、化合物及びアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートの前記複合体をアルブミンと混合し、こうしてｉ）化合物及びアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートの共有結合性複合体、及びｉｉ）アルブミンの非共有結合性複合体を含む組成物を形成するさらなる工程を含んでもよい。この非共有結合性複合体の２つの成分の相対的比率は、難溶性化合物及びアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートの複合体の１つのユニットが、アルブミンの１分子と結合するように、例えば１：１であってもよい。一実施態様において、方法は、非共有結合性複合体を凍結乾燥して凍結乾燥された組成物を得ることをさらに含む。
【００９６】
別の密接に関連した態様において、本開示は、それ自体で１００μｇ／ｍｌを超えない水への溶解度を有する化合物を備える工程；
化合物を、本明細書に記載された態様によるアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートに共有結合させ、こうして化合物及びアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートの共有結合性複合体を形成する工程；並びに
アルブミン結合ポリペプチドとアルブミンとの非共有結合性結合を促進する条件下で化合物及びアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートの前記複合体をアルブミンと混合する工程；
を含み、
それによって、前記複合体中の化合物の水への溶解度が、化合物それ自体の水への溶解度より大きくなる、化合物の水溶解度を高める方法を提供する。
【００９７】
難溶性化合物の溶解度に関するこれらの方法の態様において、さまざまな成分の任意の特徴は、直ぐ前の組成物の態様に関連して記載されたとおりである。
【００９８】
本発明を、さまざまな例となる実施態様に関して記載してきたが、本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更を行うことができ、そしてそれらの要素を同等のものと置き換えることができることは、当業者によって理解される。さらに、その必須の範囲を逸脱することなく、多くの改変を行って特定の状況又は分子を本発明の教示に適合させることができる。従って、本発明は、本発明を実施するために考えられた任意の特定の実施態様に限定されることなく、本発明は、添付の特許請求の範囲内にあるすべての実施態様を包含するものとする。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１−１】本開示のアルブミン結合ポリペプチド（配列番号：１−１５２、配列番号：１５５−２０３）、Ｎ末端グリシン残基によって延長されたレンサ球菌菌株Ｇ１４８のＧタンパク質からのＧＡ３ドメイン（配列番号：１５３）、そして、以前にJonsson等によって記載されたＧ１４８−ＧＡ３から誘導されたアルブミン結合ポリペプチド（前出、配列番号：１５４）の例となるアミノ酸配列のリストである。
【図１−２】図１−１の続きである。
【図１−３】図１−２の続きである。
【図１−４】図１−３の続きである。
【図１−５】図１−４の続きである。
【図１−６】図１−５の続きである。
【図２】ヒト血清アルブミンへのアルブミン結合ポリペプチドＰＥＰ０７９１２（配列番号：１５７）の結合を研究するため、Biacore機器において実施された結合分析の結果を示す。３種の異なる濃度の精製タンパク質（４０ｎＭ、太い灰色の線；１０ｎＭ、黒色の線；そして２．５ｎＭ、灰白の線）を９５５ＲＵの固定化ヒト血清アルブミンを有する表面上に注入した。
【図３】１２６人の正常なヒト血清中に存在するＩｇＧ分子に対する、アルブミン結合ポリペプチドＰＥＰ０７９１３（配列番号：１５３）、ＰＥＰ０６９２３（配列番号：１５４）、ＰＥＰ０７２７１（配列番号：１５５）、ＰＥＰ０７９１２（配列番号：１５７）、ＰＥＰ０７５５４（配列番号：１５６）、ＰＥＰ０７９１４（配列番号：１５８）、ＰＥＰ０７９６８（ＤＯＴＡコンジュゲート化ＰＥＰ０７９１１、配列番号：１５９）及びＰＥＰ０７８４４（配列番号：１６１）の結合を調べるため、ＥＬＩＳＡによって実施された結合分析の結果を示し、ここでＡ）は、平均ＯＤ値を示し、Ｂ）は、陰性血清（ＯＤ＜０．１５として定義される）のパーセンテージを示し、そしてＣ）は、陽性血清（ＯＤ＞１．０として定義される）のパーセンテージを示す。
【図４】化学的に製造して精製されたアルブミン結合ポリペプチドＰＥＰ０７８３４（配列番号：１６０）の分析を示すクロマトグラムであり、ここで、Ａ）は、ブランクを減算された、２２０ｎｍでの吸光度シグナルを示し、そしてＢ）は、ブランクを減算された、２８０ｎｍでの吸光度シグナルを示す。いずれの波長でも２つのピークが現れた。
【図５】図４Ａ）及びＢ）で特定された２つのピークの質量分光分析を示すスペクトログラムである。Ａ）は、第１のピーク、すなわちＰＥＰ０７８３４（配列番号：１６０）の単量体のスペクトログラムであり、そしてＢ）は、ＰＥＰ０７８３４の二量体のスペクトログラムである。
【図６】ＣＤ３+ＣＤ４+Ｔ細胞増殖アッセイにおけるアルブミン結合ポリペプチドＰＥＰ０７９１３（配列番号：１５３）、ＰＥＰ０７９１２（配列番号：１５７）、ＰＥＰ０７９１４（配列番号：１５８）及びＰＥＰ０７９６８（ＤＯＴＡコンジュゲート化ＰＥＰ０７９１１、配列番号：１５９）の免疫原性評価を示す図である。Ａ）は、５２人の白色人種のドナーのコホート中、組換え型ヒトアルブミンと比較してアルブミン結合ポリペプチドに反応する人の数を示す。Ｂ）は、組換え型ヒトアルブミンを含む陰性対照と比較したＰＥＰ０７９１３、ＰＥＰ０７９１２、ＰＥＰ０７９１４及びＰＥＰ０７９６８についての平均刺激指数（ＳＩ）を示す。Ｃ）は、緩衝液対照と比較した、本研究におけるすべてのタンパク質に対して反応する人の数を示す。
【図７】異なる種からのアルブミンに対するアルブミン結合ポリペプチドＡ）ＰＥＰ０７９８６（配列番号：１６３）、Ｂ）ＰＥＰ０８２９６（ＤＯＴＡコンジュゲート化ＰＥＰ０８１８５、配列番号：１４８）及びＣ）ＰＥＰ０６９２３（配列番号：１５４）の結合を調べるため、Biacore機器において実施された結合分析の結果を示す。示されたセンサーグラムは、ヒト（１１３０ＲＵ）、細い灰色の線；カニクイザル（１０４６ＲＵ）、太い灰色の線；ラット（８３１ＲＵ）、太く薄い灰色の線；イヌ（１０５３ＲＵ）、細い黒色の線；そしてマウス（８５８ＲＵ）、太い黒色の線からのアルブミンで固定化された表面上に４０ｎＭの濃度で注入されたタンパク質に相当する。
【図８】５倍モル過剰のＨＳＡの存在下でサイトカインによって誘発されたＴＦ−１細胞増殖における、ＺＸ−ＰＰ０１３（白丸）、ＺＹ−ＰＰ０１３（白四角）及びＺｎｅｇ−ＰＰ０１３（黒三角）の抑制効果を示す。
【図９】１０ｎＭの濃度で固定化されたＨＳＡ（７０４ＲＵ）上に注入され、２ｍｇ／ｍｌの濃度で、４、２５又は４０℃で、指示通り１週間、２週間、１ヵ月及び３ヵ月貯蔵された、ＰＥＰ０７９８６（配列番号：１６３）のBiacore分析によって得られた最大結合反応を示す。時間＝０からの無処置サンプルを参照として示す。
【図１０】熱処理の前及び後のヒト血清アルブミンに対するアルブミン結合ポリペプチドＰＥＰ０８２９６（ＤＯＴＡコンジュゲート化ＰＥＰ０８１８５、配列番号：１４８）の結合を調べるために、Biacore機器で実施された結合分析の結果を示す。２種の濃度のＰＥＰ０８２９６（０．８ｎＭ、灰色の線；４ｎＭ、黒い線）を７２４ＲＵの固定化ヒト血清アルブミンを有する表面に注入した。実線は、熱処理前であり、そして斜線は、９０℃で１０分間の熱処理後である。
【図１１】９０℃で１２分間の熱処理の前及び後のＰＥＰ０８２９６（ＤＯＴＡコンジュゲート化ＰＥＰ０８１８５、配列番号：１４８）の２つのＣＤスペクトルのオーバレイを示す。Ａ）ＰＢＳ ｐＨ７．２中でインキュベートされたサンプル。Ｂ）ＰＢＳ ｐＨ４．０中でインキュベートされたサンプル。
【図１２】静脈内注射（尾静脈）直後１．５時間のデータ収集中にまとめられた、健常ラットにおける68Ｇａ−ＰＥＰ０８２９６の全身分布の最大値投影法（ＭＩＰ）画像を示す。主要血管（例えば頸静脈（長い矢印）及び大腿（短い矢印））、心臓（Ｈ）、肝臓（Ｌ）、脾臓（Ｓ）、腎臓（Ｋ）及び膀胱（Ｂ）における循環放射能が、直ちに描写された。
【図１３】４２ｍｇ／ｍｌの濃度で注入されたＰＥＰ０７９８６（配列番号：１６３）のゲル濾過クロマトグラム、黒色の実線を示す。５ｍｇ／ｍｌの濃度で注入されたオボアルブミン（Ｍｗ４３ｋＤａ）のクロマトグラム、灰色の破線は、比較のために含まれており、ＰＥＰ０７９８６についてのピークは、オボアルブミンより早い時点で溶離された空隙容量において予想された凝集物ではないことが確認された。
【０１００】
ここで、本発明により実施された実験の非限定的な説明を通してさらに本発明を説明する。特に明記しない限り、従来の化学及び分子生物学の方法を一貫して用いた。
【０１０１】
実施例
実施例１：
アルブミン結合ポリペプチドのクローニング、発現、精製及び特性評価
この実施例では、アミノ酸配列が図１及び添付の配列リストに提示された１０種の異なるアルブミン結合ポリペプチド、ＰＥＰ０７９１３（配列番号：１５３）、ＰＥＰ０７９１２（配列番号：１５６）、ＰＥＰ０７９１４（配列番号：１５８）、ＰＥＰ０７９６８（ＤＯＴＡコンジュゲート化ＰＥＰ０７９１１、配列番号：１５９）、ＰＥＰ０６９２３（配列番号：１５４）、ＰＥＰ０７２７１（配列番号：１５５）、ＰＥＰ０７５５４（配列番号：１５６）、ＰＥＰ０７８４４（配列番号：１６１）、ＰＥＰ０７９８６（配列番号：１６３）及びＰＥＰ０８２９６（ＤＯＴＡコンジュゲート化ＰＥＰ０８１８５、配列番号：１４８）を、クローニングし、精製し、そして特徴付けた。
【０１０２】
物質及び方法
アルブミン結合ポリペプチド変異体のクローニング
適当なオリゴヌクレオチドで部位特異的突然変異誘発法を用いてＧ１４８−ＧＡ３中に突然変異を生じさせて所望のアルブミン結合ポリペプチド変異体を得た。アルブミン結合ポリペプチド変異体の前に特定のエンドヌクレアーゼ部位及びＮ末端ＭＧＳＳ配列を加えるプライマーを用いて遺伝子フラグメントをＰＣＲによって増幅した。フラグメントをＮｄｅＩ及びＮｏｔＩで切断し、精製し、そしてクローニングベクター、プラスミドｐＡＹ０２５５６（興味の遺伝子を発現するためにｐＢＲ３２２からの複製起点、カナマイシン耐性遺伝子及びＴ７プロモーターを含む）に連結し、同じ酵素で制限した。ライゲーションをエレクトロコンピテントE. coli TOP10セルに形質転換した。形質転換細胞を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンで補充されたＴＢＡＢプレート（３０ｇ／ｌトリプトース血液寒天培地ベース）上に広げ、続いて３７℃で一夜インキュベーションした。ＰＣＲを用いてコロニーをスクリーニングし、そしてビオチン化オリゴヌクレオチド及びBigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)を用いて製造者のプロトコールに従って、増幅されたフラグメントのシークエンシングを行った。Magnatrix 8000（NorDiag AB）を用いて、磁性ストレプトアビジンコーティングビーズへの結合によってシークエンシング反応物を精製し、そしてABI PRISM(R) 3100 Genetic Analyzer（PE Applied Biosystems）で分析した。すべてのアルブミン結合ポリペプチド変異体を、単量体としてサブクローニングし、そして発現ベクターによってコードされた構築物は、ＭＧＳＳ［ＰＰ＃＃＃］であり、ここでＰＰ＃＃＃は、アルブミン結合ポリペプチドの配列を構成するアミノ酸残基に対応する。
【０１０３】
さらに、アルブミン結合ポリペプチドの配列を構成するアミノ酸残基の前に特定のエンドヌクレアーゼ部位並びにヘキサヒスチジン配列、ＴＥＶプロテアーゼ部位及びグリシン残基を加えるプライマーを用いてＧ１４８−ＧＡ３、ＰＰ００７（配列番号：７）、ＰＰ０１３（配列番号：１３）及びＰＰ０３７（配列番号：３７）の遺伝子フラグメントをＰＣＲによって増幅した。ポリペプチドＰＥＰ０７９１３（配列番号：１５３）、ＰＥＰ０７９１２（配列番号：１５７）、ＰＥＰ０７９１４（配列番号：１５８）及びＰＥＰ０７９６８（配列番号：１５９）は、グリシン残基を加えられたアルブミン結合ポリペプチドＧ１４８−ＧＡ３、ＰＰ００７（配列番号：７）、ＰＰ０１３（配列番号：１３）及びＰＰ０３７（配列番号：３７）に対応する。フラグメントをＸｂａＩ及びＮｏｔＩで切断し、精製し、そしてクローニングベクター、プラスミドｐＡＹ０２５１２（興味の遺伝子を発現するためにｐＢＲ３２２から複製起点、カナマイシン耐性遺伝子及びＴ７プロモーターを含む。クローニング部位は、ヘキサヒスチジンタグを含むペプチドをコードする配列の前、ＴＥＶプロテアーゼのための切断部位の後にある）に連結し、同じ酵素で制限した。ライゲーション、形質転換及び配列検証は、上記の通り実施した。４つのアルブミン結合ポリペプチド変異体Ｇ１４８−ＧＡ３、ＰＰ００７、ＰＰ０１３及びＰＰ０３７を単量体としてサブクローニングし、そして発現ベクターによってコードされた構築物は、ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＬＱＳＳＧＶＤＬＧＴＥＮＬＹＦＱＧ［ＰＰ＃＃＃］であった。
【０１０４】
ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＬＱＳＳＧＶＤＬＧＴＥＮＬＹＦＱＧ［ＰＰ０１３］をコードする発現ベクターを、部位特異的突然変異誘発法によってさらに修飾し、オリゴヌクレオチドを用いて、アルブミン結合ポリペプチドの配列を構成するアミノ酸残基の前にセリン残基を挿入して、構築物ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＬＱＳＳＧＶＤＬＧＴＥＮＬＹＦＱＧＳ−［ＰＰ０１３］を得た。この構築物を、１）部位特異的突然変異誘発法によってさらに修飾して、１４位（ＰＰ０１３内）でセリン残基をシステイン残基により置換し、ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＬＱＳＳＧＶＤＬＧＴＥＮＬＹＦＱＧＳ−［ＰＰ０４９］を生成し、そして２）Ｃ末端へのグリシン残基の付加によってさらに修飾して、ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＬＱＳＳＧＶＤＬＧＴＥＮＬＹＦＱＧＳ［ＰＰ０４９］−Ｇを生成した。Ｃ末端へのグリシンの付加は、グリシン残基及び特定のエンドヌクレアーゼ部位をコードするヌクレオチドを含むプライマーを用いてＰＣＲ増幅によって実施した。フラグメントをＸｂａＩ及びＮｏｔＩで切断し、精製し、そしてクローニングベクター、プラスミドｐＡＹ０２６４１（興味の遺伝子を発現するためにｐＢＲ３２２からの複製起点、カナマイシン耐性遺伝子及びＴ７プロモーターを含む）に連結し、同じ酵素で制限した。ライゲーション、形質転換及び配列検証は、上記の通り実施した。
【０１０５】
タンパク質発現
Ｎ末端ＭＧＳＳ伸張又はＮ末端Ｈｉｓ6−タグのいずれか、続いてＴＥＶ−プロテアーゼ認識部位及びグリシン残基を用いて、アルブミン結合ポリペプチド変異体を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中で発現させた。各アルブミン結合ポリペプチド変異体のコロニーを用いて５０μｇ／ｍｌの濃度にカナマイシンで補充されたＴＳＢ＋ＹＥ培地４ｍｌに接種した。培養物を３７℃で約５時間増殖させた。それぞれの培養物から３ｍｌを用いて、パラレルバイオリアクター（Greta system, Belach Bioteknik AB）中で、５０μｇ／ｍｌの濃度にカナマイシンで補充されたＴＳＢ＋ＹＥ８００ｍｌに接種した。８００ｍｌ／分での通気、そして溶存酸素レベルを３０％より上に保つ撹拌プロファイルにより、３７℃でＯＤ６００ ２まで培養を実施し、続いて最終濃度０．５ｍＭまでＩＰＴＧを添加した。培養を５時間続け、その後、培養物を１０℃に冷却し、通気を止め、そして撹拌を３００ｒｐｍに下げた。細胞沈殿物を遠心分離（１５６００×ｇ、４℃、２０分）によって集め、そして精製まで−２０℃で貯蔵した。
【０１０６】
Ｈｉｓ6−タグ及びＴＥＶ−プロテアーゼ部位を有するアルブミン結合ポリペプチド変異体の精製
1000 U Benzonase(R)（1.01654.001, Merck）を添加された結合バッファー（２０ｍＭナトリウムリン酸、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）３５ｍｌ中で、可溶性ヘキサヒスチジンタグ付きのポリペプチドＰＥＰ０７９１３（配列番号：１５３）、ＰＥＰ０７９１２（配列番号：１５６）、ＰＥＰ０７９１４（配列番号：１５８）、ＰＥＰ０７９６８（配列番号：１５９）、ＰＥＰ０７９８６（配列番号：１６３）及びＰＥＰ０８１８５（配列番号：１４８）を含む凍結された細胞沈殿物を懸濁し、そして超音波処理によって破壊した。ポリペプチドのそれぞれについて、超音波処理した懸濁液を遠心分離（１時間、３７０００×ｇ、４℃）によって清澄化（clarified）し、そして上澄みをHis GraviTrapTMカラム（11-0033-99, GE Healthcare）上に装填した。カラムを洗浄バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、６０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）１０ｍｌで洗浄した後、溶離バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍイミダゾール、ｐＨ７．４）３ｍｌでポリペプチドを溶離した。ＰＤ−１０脱塩カラム（17-0851-01, GE Healthcare）を用いてバッファーを切断バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８）に交換した。２８０ｎｍで吸光度を測定することによってポリペプチド生成物の量を決定した後、ＤＴＴを最終濃度５ｍＭまで加えた。Ｈｉｓ6タグ付きのＴＥＶプロテアーゼを、ポリペプチド生成物に対して１：１０の質量比率で切断バッファーに加えた。緩速混合下、４℃で切断を一夜実施した。切断混合物にイミダゾールを２０ｍＭの濃度まで加えた後、切断されたＨｉｓ6−タグ、Ｈｉｓ6−タグ付きのＴＥＶプロテアーゼ及びＨｉｓ6−タグ付きの非切断生成物を除去するため、混合物をHis GraviTrapTMカラム（11-0033-99, GE Healthcare）に装填した。
【０１０７】
各変異体について、アルブミン結合ポリペプチド変異体を含むフロースルー（flow-through）を、以下のように逆相クロマトグラフィ（ＲＰＣ）によってさらに精製した。予めＲＰＣ Ａバッファー（水中の０．１％ＴＦＡ）で平衡にした１ml Resource 15 RPCカラム（GE Healthcare）にフロースルー画分を装填した。カラムを１０カラム体積（ＣＶ）のＲＰＣ Ａバッファーで洗浄した後、結合したポリペプチドを、１０ＣＶ中に０〜５０％ＲＰＣ Ｂバッファー（アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ）の線状勾配で溶離した。流速は２ｍｌ／分であり、そして２８０ｎｍで吸光度をモニターした。アルブミン結合ポリペプチド変異体を含む画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって特定し、そして貯めた。
【０１０８】
ＲＰＣで精製されたアルブミン結合ポリペプチド変異体を、XK16カラム（GE Healthcare）中に充填された120 ml Superdex 75（GE Healthcare）上のゲル濾過によってさらに精製した。ランニングバッファー（running buffer）は、１×ＰＢＳ、そして流速２ｍｌ／分であった。純粋なアルブミン結合ポリペプチド変異体を含む画分を貯め、そして約１．３ｍｇ／ｍｌに濃縮した。最後に、製造者の勧告に従ってAffinityPak Detoxi-Gel Endotoxin除去ゲル（Pierce、ｐｒｏｄ＃２０３４４）の１ｍｌカラムを用いて、残っている微量のエンドトキシンのから濃縮物を精製した。
【０１０９】
以下のようにＲＰＣ精製工程の前にアルブミン結合ポリペプチド変異体ＰＥＰ０７９１１及びＰＥＰ０８１８５をＭａｌ−ＤＯＴＡにコンジュゲートした。使い捨てのＰＤ−１０脱塩カラム（GE Healthcare）を用いて、ＩＭＡＣ−ＦＴ精製工程からのフロースルー画分のバッファーを０．２Ｍ ＮａＡｃ（ｐＨ５．５）に交換した。マレイミド−モノ−アミド−ＤＯＴＡ（大環状化合物、カタログ番号Ｂ−２７２）を５倍モル過剰で加え、そして連続振盪下、３０℃で６０分間インキュベートした。生成したポリペプチドを、それぞれＰＥＰ０７９６８及びＰＥＰ０８２９６と表した。
【０１１０】
Ｈｉｓ6−タグなしのアルブミン結合ポリペプチド−変異体の精製
可溶性アルブミン結合ポリペプチド変異体ＰＥＰ０６９２３（配列番号：１５４）、ＰＥＰ０７２７１（配列番号：１５５）、ＰＥＰ０７５５４（配列番号：１５６）及びＰＥＰ０７８４４（配列番号：１６１）を含む凍結された細胞沈殿物を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）中に懸濁し、そして超音波処理によって破壊した。ポリペプチド変異体のそれぞれについて、超音波処理された懸濁液を遠心分離（３０分、３２０００×ｇ、４℃）によって清澄化し、そして上澄みをHSA-Sepharoseカラム（GE Healthcare）上に装填した。ＴＳＴ−バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ８．０）、続いて５ｍＭ ＮＨ４Ａｃ、ｐＨ５．５で洗浄した後、結合したアルブミン結合ポリペプチド変異体を０．５Ｍ ＨＡｃ（ｐＨ３．２）で溶離した。
【０１１１】
以下のようにアルブミン結合ポリペプチド変異体を逆相クロマトグラフィ（ＲＰＣ）によってさらに精製した。変異体のそれぞれについて、ＨＳＡ−親和性精製工程からの溶出液を、予めＲＰＣ Ａバッファー（水中の０．１％ＴＦＡ）で平衡にした１ｍｌ Resource
15 RPCカラム（GE Healthcare）上に装填した。カラムを１０ＣＶのＲＰＣ Ａバッファーで洗浄し、結合したポリペプチドを１０ＣＶ中の０〜５０％ＲＰＣ Ｂバッファー（アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ）の線状勾配で溶離した。流速は２ｍｌ／分であり、そして２８０ｎｍで吸光度をモニターした。純粋なアルブミン結合ポリペプチド変異体を含む画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって特定し、そして貯めた。最後に、使い捨てのＰＤ−１０脱塩カラム（GE Healthcare）を用いてバッファーを１ｘＰＢＳ（２．６８ｍＭ ＫＣｌ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１．４７ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、８．１ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．４）に交換した。
【０１１２】
精製されたアルブミン結合ポリペプチド−変異体の特性評価
NanoDrop(R) ND-1000分光光度計を用いて２８０ｎｍで吸光度を測定することによって濃度を評価した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＬＣ−ＭＳでさらに分析した。
【０１１３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のため、それぞれアルブミン結合ポリペプチド変異体約１０μｇをＮｕＰＡＧＥ ＬＤサンプルバッファー（Invitrogen）と混合し、７０℃で１５分間インキュベートし、そしてＮｕＰＡＧＥ ４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌｓ（Invitrogen）上に装填した。分子量マーカーとしてSharp Prestained Standard（Invitrogen）を用い、そして染色のためPhastGel BlueR（GE Healthcare）を用いて、XCell II SureLock Electrophoresis Cell（Novex）中で、NuPAGE MES SDS Running Buffer（Invitrogen）によりゲルを動かした。
【０１１４】
アルブミン結合ポリペプチド変異体の同一性をチェックするため、ＡＰＩ−ＥＳＩ及び単一四重極型（single quadruple）質量分析器を備えたAgilent 1100 LC/MSDシステムを用いてＬＣ／ＭＳ分析を実施した。精製されたアルブミン結合ポリペプチド変異体のそれぞれ約１０μｇを、０．５ｍｌ／分の流速でZorbax 300SB-C8 Narrow-Boreカラム（２．１×１５０ｍｍ、３．５μｍ、Agilent Technologies）上に装填した。０．５ｍｌ／分で１５分間、１０〜７０％の溶液Ｂの線状勾配を用いてポリペプチドを溶離した。分離を３０℃で実施した。２８０及び２２０ｎｍでイオンシグナル及び吸光度をモニターした。精製されたアルブミン結合ポリペプチド変異体の分子量をＭＳによって確認した。
【０１１５】
結果
アルブミン結合ポリペプチド変異体の発現レベルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から推定して生成物１０〜３０ｍｇ／ｇ細胞沈殿物であった。
【０１１６】
すべての変異体について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により決定された純度は、９５％を超え、そしてＬＣ／ＭＳ分析により正確な分子量を確認した。精製後、１０種のアルブミン結合ポリペプチド変異体のそれぞれについて純粋なポリペプチド１〜８ｍｇを得た。
【０１１７】
実施例２：
アルブミン結合ポリペプチドについての親和性測定
この実施例では、Biacore機器を用いてヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対する親和性について、実施例１で合成又は発現し、そして精製されたＰＥＰ０６９２３（配列番号：１５４）、ＰＥＰ０７２７１（配列番号：１５５）、ＰＥＰ０７８４４（配列番号：１６１）、ＰＥＰ０７９１２（配列番号：１５７）、ＰＥＰ０７９１３（配列番号：１５３）、ＰＥＰ０７９１４（配列番号：１５８）及びＰＥＰ０７９６８（ＤＯＴＡコンジュゲート化ＰＥＰ０７９１１、配列番号：１５９）を特徴付けた。ＰＥＰ０７９１３は、Ｎ末端グリシン残基が付加されたＧ１４８−ＧＡ３のアミノ酸配列に相当するのに対して、ＰＥＰ０７２７１、ＰＥＰ０７８４４、ＰＥＰ０７９１２、ＰＥＰ０７９１４及びＰＥＰ０７９６８は、異なるＮ末端アミノ酸付加によるＰＰ００１（配列番号：１）、ＰＰ０４３（配列番号：４３）、ＰＰ００７（配列番号：７）、ＰＰ０１３（配列番号：１３）及びＰＰ０３７（配列番号：３７）のアルブミン結合ポリペプチドに相当する。
【０１１８】
物質及び方法
Biacore2000機器（GE Healthcare）におけるBiosensor分析をＨＳＡ（Albucult(R), Novozymes）で実施し、製造者の勧告に従ってＣＭ−５チップ（研究グレード；GE Healthcare）表面のカルボキシル化されたデキストラン層上へのアミンカップリングによって固定化した。チップの表面１を活性化し、そして不活性化し、そして注入中に参照細胞（ブランク表面）として用いたのに対して、表面２は、７３１レゾナンスユニット（ＲＵ）に固定化されたＨＳＡを含み、そして表面４は、９５５ＲＵに固定化されたＨＳＡを含んだ。精製されたアルブミン結合ポリペプチド変異体をランニングバッファーＨＢＳ−ＥＰ（GE Healthcare)中で２．５ｎＭ、１０ｎＭ及び４０ｎＭに希釈し、そして５０μｌ／分の一定流速で５分間注入し、続いて６０分間ＨＢＳ−ＥＰを注入した。１０ｍＭ、ＨＣｌ ２５μｌの１回注入により表面を再生した。親和性測定は、２セットで実施し；第１セットでは、ＨＢＳ−ＥＰ、ＰＥＰ０６９２３、ＰＥＰ０７２７１、ＰＥＰ０７９１２、ＰＥＰ０７９１３、ＰＥＰ０７９１４及びＰＥＰ０７９６８を注入し（チップ表面２）、そして第２セットでは、ＨＢＳ−ＥＰ、ＰＥＰ０６９２３、ＰＥＰ０７８４４、ＰＥＰ０７９１２及びＰＥＰ０７９１４を注入した（チップ表面４）。対照としてそれぞれのランでＰＥＰ０６９２３を２回注入した。BiaEvaluationソフトウェア（GE Healthcare）を用いて結果を分析した。リガンド表面の曲線からブランク表面の曲線を減算した。
【０１１９】
結果
Biacore 2000機器は、技術的な制限があり、非常に高い親和性の測定が妨げられた。したがって、Biacore研究の目的は、ＨＳＡに対するアルブミン結合ポリペプチド変異体の親和性の正確な動態パラメータを決定することではなかった。しかし、結果からアルブミンに対するこれらのポリペプチドの相対的親和性の定量的評価を得た。参照表面及びバッファー注入の減算後、BIAevaluationソフトウェアを用い、物質移動について補正し、そして局所的パラメーターとしてＲＵｍａｘを設定して曲線を１：１（Langmuir）結合モデルに適合させた。曲線を図２に示す。相対的ＫD、ｋａ（ｋon）、及びｋd（ｋoff）値を評価し、そして下の表に示した。
【０１２０】
【表１】
2013534421.tif 000003
【０１２１】
【表２】
2013534421.tif 000004
【０１２２】
表１及び２に示すように、ＰＥＰ０７２７１（配列番号：１５５）、ＰＥＰ０７８４４
（配列番号：１６１）、ＰＥＰ０７９１２（配列番号：１５７）、ＰＥＰ０７９１４（配列番号：１５８）及びＰＥＰ０７９６８（ＤＯＴＡコンジュゲート化ＰＥＰ０７９１１、配列番号：１５９）は、すべて、ＨＳＡに対してほぼ同じ親和性を有するようであり、親Ｇ１４８−ＧＡ３（ＰＥＰ０７９１３；配列番号：１５３）の親和性を大きく超える。これらのポリペプチドのＨＳＡ親和性は、同様のオフレイト（off-rate）にもかかわらず、ＰＥＰ０６９２３（配列番号：１５４）と比較してわずかに低い。
【０１２３】
実施例３：
アルブミン結合ポリペプチドについての融解温度（Ｔｍ）の測定
この実施例では、実施例１に記載したように発現し、そして精製されたアルブミン結合ポリペプチド変異体ＰＥＰ０７９１３（配列番号：１５３）、ＰＥＰ０６９２３（配列番号：１５４）、ＰＥＰ０７２７１（配列番号：１５５）、ＰＥＰ０７５５４（配列番号：１５６）、ＰＥＰ０７９１２（配列番号：１５７）、ＰＥＰ０７９１４（配列番号：１５８）、ＰＥＰ０７９６８（ＤＯＴＡコンジュゲート化ＰＥＰ０７９１１、配列番号：１５９）、ＰＥＰ０７８４４（配列番号：１６１）及びＰＥＰ０７９８６（配列番号：１６３）、並びに実施例５に記載したように製造されたアルブミンポリペプチド変異体ＰＥＰ０７９７５（ＤＯＴＡコンジュゲート化ＰＥＰ０７８３４、配列番号：１６０）を、ＣＤ分析によって分析した。ＰＥＰ０７９１３は、Ｎ末端グリシン残基を有するＧ１４８−ＧＡ３の配列に相当し、ＰＥＰ０６９２３は、前出、Jonsson等によって以前に記載される改変高親和性誘導体であるのに対して、ＰＥＰ０７２７１、ＰＥＰ０７５５４、ＰＥＰ０７９１２、ＰＥＰ０７９１４、ＰＥＰ０７９６８、ＰＥＰ０７８４４及びＰＥＰ０７９７５は、本開示による異なるＮ末端アミノ酸付加を有するＰＰ００１（配列番号：１）、ＰＰ００７（配列番号：７）、ＰＰ０１３（配列番号：１３）、ＰＰ０３７（配列番号：３７）及びＰＰ０４３（配列番号：４３）アルブミン結合ポリペプチドの例である。
【０１２４】
物質及び方法
精製されたアルブミン結合ポリペプチド変異体を１ｘＰＢＳ中で０．４〜０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度に希釈した。円偏光二色性（ＣＤ）分析を、光路長１ｍｍのセル中、Jasco J-810分光偏光計において実施した。可変温度測定において、温度勾配５℃／分で、２０℃から９０℃まで２２１ｎｍで吸光度を測定した。
【０１２５】
結果
温度プロットに対するＣＤにおける転移の中間点を決定することによって、種々のアルブミン結合ポリペプチド変異体の融解温度（Ｔｍ）を算出した。それらの結果を下の表３にまとめた。
【０１２６】
【表３】
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【０１２７】
ポリペプチドＰＥＰ０７９６８とＰＥＰ０７９１２とは、前者が１４位でマレイミドＤＯＴＡとコンジュゲートされたシステイン残基を有し、そして後者がセリン残基を有することを除いて、同一である。従って、ＤＯＴＡ修飾は、融解温度に影響を及ぼさなかったはずである。また、ＰＥＰ０７９７５は、Ｃ１４を用いてＤＯＴＡとコンジュゲートされ、そしてＣ末端アミド（実施例５でペプチド合成から生じた）、そしてグリシンの代わりにＮ末端アラニンを有することを除いてＰＥＰ０７９６８と同一である。さらにまた、ＰＥＰ０７９１２とＰＥＰ０７５５４との比較は、Ｎ末端セリンが、同じ位置のグリシンより高い融解温度（Ｔｍにおいて５℃の差）になることを示している。従って、本開示によるすべてのアルブミン結合ポリペプチド変異体は、ＰＥＰ０７９１２及びＤＯＴＡコンジュゲート化変異体を除いて、５５℃より上のＴｍを示す。Ｎ末端部分の重要性を考慮すると、試験されたすべてのアルブミン結合ポリペプチドは、Jonsson等、すなわちＰＥＰ０６９２３の先行技術の誘導体よりも優れている。
【０１２８】
実施例４：
血清反応分析
本明細書に開示されたアルブミン結合ポリペプチドのセットに結合可能な、ＩｇＧを含むヒト血清のパーセンテージを、ＥＬＩＳＡによって分析した。全体で１２７人に相当する１４９個の血清サンプルをスクリーニングした。
【０１２９】
物質及び方法
コーティングバッファー（Sigma、カタログ番号３０４１）中で８μｇ／ｍｌに希釈されたAlbucult(R)（Novozymes）５０μｌ／ウェルでＥＬＩＳＡプレート（９６ウェル、ハーフエリアプレート（Costar、カタログ番号３６９０））をコートした。プレートを、４℃で３日間夜通しコートした。分析日に、プレートを水道水で２回洗浄し、そして０．０５％カゼイン（ＰＢＳＣ）を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）１００μｌで２時間ブロックした。プレートを空にし、そしてＰＢＳＣ中で２μｇ／ｍｌに希釈されたアルブミン結合ポリペプチドＰＥＰ０７９１３（配列番号：１５３）、ＰＥＰ０６９２３（配列番号：１５４）、ＰＥＰ０７２７１（配列番号：１５５）、ＰＥＰ０７９１２（配列番号：１５７）、ＰＥＰ０７５５４（配列番号：１５６）、ＰＥＰ０７９１４（配列番号：１５８）、ＰＥＰ０７９６８（ＤＯＴＡコンジュゲート化ＰＥＰ０７９１１、配列番号：１５９）及びＰＥＰ０７８４４（配列番号：１６１）５０μｌ／ウェルを、予め作成されたプレートレイアウトに従って加えた。室温（ＲＴ）で２時間インキュベーション後、自動化ＥＬＩＳＡ洗浄器を用いてプレートをＰＢＳＣ中で４回洗浄した。血清２４μｌをＰＢＳＣ １１７４μｌに加えることによって、１２９人からの１４９個の血清サンプルをＰＢＳＣ中で５０倍希釈した。希釈された血清５０μｌを、予め作成されたプレートレイアウトに従ってウェルごとに加えた。各血清サンプルを、シングレット（singlet）として試験した。各プレート上には、各アルブミン結合ポリペプチドに対する陽性及び陰性対照が含まれていた。
【０１３０】
アルブミン結合性抗体
（ＰＥＰ０６９２３で免疫化された霊長類の血清から社内調製された５０μｌ、０．５μｌ／ｍｌの免疫グロブリン溶液）を陽性対照として加え、そしてＰＢＳＣ５０μｌを陰性対照として用いた。プレートを室温で１時間インキュベートし、その後、自動化ＥＬＩＳＡ洗浄器を用いてＰＢＳＣ中で４回洗浄した。ＰＢＳＣ中で１０ ０００倍希釈された抗ヒトＩｇＧ（Southern Biotech、カタログ番号２０４０−０５）５０μｌ／ウェルを用いて、結合されたＩｇＧを検出した。自動化ＥＬＩＳＡ洗浄器を用いてＰＢＳＣ中で４回洗浄した後、基質５０μｌ／ウェルを加えた（Pierceカタログ番号３４０２１）。１０〜１５分後、各ウェルにＨ2ＳＯ4 ５０μｌを添加することにより反応を停止した後、マルチウェルプレートリーダー（Victor3, Perkin Elmer）を用いて吸光度を測定した。
【０１３１】
結果
アルブミン結合ポリペプチドへのＩｇＧ結合についてスクリーニングした１４９個の血清のうち、２３個は、全８つのポリペプチドに対して陰性（ＯＤ値＜０．１）であり、すなわち、ポリペプチドに結合したＩｇＧを示さなかった。１つ又はそれ以上のアルブミン結合ポリペプチドに対して陽性であった１２６個の血清を用いて分析を実施した。平均吸光度を算出し（図３Ａ）、そしてＯＤ値による血清のパーセンテージを、＜０．１５（図３Ｂ）又は＞１．０（図３Ｃ）のいずれかと評価した。ＰＥＰ０７９１３（配列番号：１５３）、ＰＥＰ０６９２３（配列番号：１５４）及びＰＥＰ０７８４４（配列番号：１６１）では、最も高い平均ＯＤ値及びＩｇＧ結合を有する血清の最も高いパーセンテージが得られたのに対して、ＰＥＰ０７９６８（ＤＯＴＡコンジュゲート化ＰＥＰ０７９１１、配列番号：１５９）、ＰＥＰ０７９１４（配列番号：１５８）及びＰＥＰ０７９５４（配列番号：１５６）に対しては、最小の反応性が見出された。
【０１３２】
従って、最も反応性のアルブミン結合ポリペプチドは、親のＧ１４８−ＧＡ３（ＰＥＰ０７９１３、配列番号：１５３）、そしてＧ１４８−ＧＡ３から保持されたヘリックス１を有する以前に親和性が改善された誘導体（ＰＥＰ０６９２３、配列番号：１５４）であった。３番目に反応性の高いポリペプチド（ＰＥＰ０７８４４、配列番号：１６１）は、ヘリックス１の１４位に当初のリシンを含む。この残基は、コンジュゲーションを目的としており、従って最終的な状況では露出していない。１４位にアラニンを有することを除いて同一のアルブミン結合ポリペプチド変異体（ＰＥＰ０７５５４、配列番号：１５６）は、最小反応性のものである。
【０１３３】
実施例５：
ＤＯＴＡコンジュゲート化アルブミン結合ポリペプチドの化学合成
物質及び方法
標準Ｆｍｏｃ化学を用いて、固層ペプチド合成（Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis-A Practical Approach, W.C. Chan, P.D. White Eds, Oxford University Press 2000, 115-135中、Quibell, M. & Johnson, T.によって記載されたＳＰＰＳ）によって433 A Peptide Synthesizer反応器（Applied Biosystems, Foster City, CA）中、０．１ｍｍｏｌスケールで、すなわち０．１ｍｍｏｌペプチドの理論的な可能な収量で、アルブミン結合ポリペプチドＰＥＰ０７８３４（配列番号：１６０）を合成した。酸に不安定なＦｍｏｃアミド樹脂を、合成を通して固体支持体（Rink Amide MBHA Resin LL（１００−２００メッシュ）、０．３９ｍｍｏｌアミド／ｇ樹脂（Novabiochem）を装填する）として用いた。
【０１３４】
反応器中、室温（ＲＴ）で１０分間混合してアシル化反応により、下の配列による４７個のアミノ酸残基をアミド樹脂に結合した。アシル化反応は、ＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン、Merck）中、１０倍モル過剰のＦｍｏｃ保護アミノ酸を用いて実施し、１当量の２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１,１,３,３−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ、IRIS Biotech）、１当量の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、IRIS Biotech）及び２当量のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、Applied Biosystems）で活性化した。さらに、活性化及びカップリングの前に、すべての反応性アミノ酸側鎖を標準側鎖保護基（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｙｒにはｔｅｒｔ−ブチル（ｔＢｕ）、Ｌｙｓにはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、Ａｒｇには２,２,４,６,７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）、そしてＡｓｎ及びＣｙｓにはトリチル（Ｔｒｔ））で保護した。切断されたペプチドに至る不完全なカップリングの量を減らすために、少量の選ばれたアミノ酸残基を２回のアシル化によってカップリングにかけ、１回目と２回目のカップリングの間で下記のようなＦｍｏｃ脱保護をしなかった。合成されたアルブミン結合ポリペプチドＰＥＰ０７８３４のアミノ酸配列は、以下の通りであった。
ＡＬＡＳＡＫＥＡＡＮ  ＡＥＬＤＣＹＧＶＳＤ  ＦＹＫＲＬＩＤＫＡＫ  ＴＶＥＧＶＥＡＬＫＤ  ＡＩＬＡＡＬＰＮＨ2
（配列番号：１６０−ＮＨ2）
下線を引かれたアミノ酸残基は、二重に結合された。樹脂結合ペプチド上の残っている任意の未反応アミノ基に、無水酢酸（０．５Ｍ無水酢酸（AlfaAesar）、０．１２５Ｍ ＤＩＥＡ、ＮＭＰ中の０．０１５Ｍ ＨＯＢｔ）で５分間キャップした。すべてのカップリングの後、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン（Sigma-Aldrich）で１０分間処理することによって樹脂結合ペプチド上のＮ末端Ｆｍｏｃ基の脱保護を実施した。
【０１３５】
合成完了後、ペプチドを固体支持体から切断し、そして同時に、ＴＦＡ／ＥＤＴ／Ｈ2Ｏ／ＴＩＳ（９４：２．５：２．５：１）（ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸（Apollo）、ＥＤＴ：１,２−エタンジチオール（Aldrich）、ＴＩＳ：トリイソプロピルシラン（Aldrich））を用いて、室温で２時間、随時混合して処理することによって側鎖保護基を切断した。ＴＦＡ処理後、水中の２０％アセトニトリル（Merck）及びｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（Merck）を用いてペプチドを３回抽出した。水相を合わせ、濾過し、そして凍結乾燥させた。
【０１３６】
粗ペプチドを半分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（Reprosil GOLD C18 300、２５０*１０ｍｍ、粒径５μｍ）及び２．５ｍｌ分-1の流速で２５分中に３２〜５５％Ｂ（Ａ：０．１％ＴＦＡ−Ｈ2Ｏ；Ｂ：０．１％ＴＦＡ−ＣＨ3ＣＮ）の勾配によって分析及び精製し、続いて凍結乾燥させた。
【０１３７】
ＲＰ−ＨＰＬＣにおける粗分析からの２２０ｎｍシグナルのピーク下の積分面積を算出することにより合成収率を決定した。6520 Accurate Mass Q-TOF LC/MS（Agilent Technologies）において液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ）を用いて正確な分子量を確認した。１．０ｍｌ分-1の流速で２５分かけて３５〜５５％Ｂの勾配を用いるＲＰ−ＨＰＬＣ（Reprosil GOLD C18 300、２５０*４.６ｍｍ、３μｍ粒径）を用いて生成物の純度を確認した。
【０１３８】
ＤＯＴＡコンジュゲーション
ＰＥＰ０７８３４−アミド（配列番号：１６０−アミド）３ｍｇを４０℃で３０分間２０ｍＭ ＤＴＴにより還元した。ＰＤ−１０カラム（GE Healthcare）上で０．２Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ５．５へのバッファー交換によって過剰ＤＴＴの除去した。カップリングは、５倍モル過剰のキレート剤、水中のマレイミド−モノ−アミド−ＤＯＴＡ（Macrocyclics、カタログ番号Ｂ−２７２）溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を用いて実施した。混合物を連続振盪下、３０℃で１時間インキュベートした。非コンジュゲート化キレート剤からの精製は、半分取ＲＰＣカラム（Zorbax 300SB C18、９．４×２５０ｍｍ、５μｍ）上で行った。精製された物質の結合度を、Zorbax 300SB C8 １５０×２．１ｍｍ、３．５μｍ分析カラム上のＨＰＬＣ−ＭＳによって分析した。方法によって、ＰＥＰ０７９７５を表すマレイミド−ＤＯＴＡコンジュゲート化ＰＥＰ０７８３４のみが検出された。
【０１３９】
結果
粗物質の溶離プロファイルに基づいて、アルブミン結合ポリペプチドＰＥＰ０７８３４−アミド（配列番号：１６０−アミド）の合成収率は、８％であると決定された。測定された分子量は、４９５２．９Ｄａであり、それは算出された理論分子量４９５２．６Ｄａと十分に一致した。精製された生成物を分析したときに、タンパク質の約１０〜１５％は、ジスルフィド結合したホモ二量体であることがわかった（図４及び５）。ＤＯＴＡコンジュゲート化ペプチド（ＰＥＰ０７９７５）の結合活性は、実施例２に記載されたように確認し（データは示さず）、そして融解温度は、実施例３に記載されたように決定した。
【０１４０】
実施例６：
アルブミン結合ポリペプチドの免疫原性試験
ヒト白色人種５２人からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（CRI-Labo Medische Analyse,
Gent, Belgiumから入手した）においてＴ細胞増殖を誘発する能力についてＰＥＰ０７９１３（配列番号：１５３）、ＰＥＰ０７９１２（配列番号：１５７）、ＰＥＰ０７９１４（配列番号：１５８）及びＰＥＰ０７９６８（ＤＯＴＡコンジュゲート化ＰＥＰ０７９１１、配列番号：１５９）を、スクリーニングした。ＰＥＰ０７９１３は、Ｎ末端グリシン残基を有するＧ１４８−ＧＡ３の配列に相当するのに対して、ＰＥＰ０７９１２、ＰＥＰ０７９１４及びＰＥＰ０７９６８は、本開示による種々のＮ末端アミノ酸付加を伴うＰＰ００７（配列番号：７）、ＰＰ０１３（配列番号：１３）及びＰＰ０３７（配列番号：３７）のアルブミン結合ポリペプチドの例である。
【０１４１】
物質及び方法
標準細胞生物学的方法に従って製造されたＰＢＭＣを、組織培養（ＴＣ）処理した９６ウェル丸底プレート（Falcon）に３０００００ＰＢＭＣ／ウェルの量で加えた。９００μｇ／ｍｌ（３倍モル過剰）の組換え型ヒトアルブミン（Albucult(R), Novozymes）をさらに含むＡＩＭＶ培地（Invitrogen）中で１００μｌ／ウェルのアルブミン結合ポリペプチドＰＥＰ０７９１３、ＰＥＰ０７９１２、ＰＥＰ０７９１４及びＰＥＰ０７９６８を添加することにより細胞を刺激した。これは、３０μｇ／ｍｌのアルブミン結合ポリペプチドの最終濃度に相当した。刺激は、八つ組で（eight-plicates）行い、すなわち同じアルブミン結合ポリペプチドを、同一量で、そして同じ条件下で８個のウェルに加えた。陽性対照ウェルでは、３０μｇ／ｍｌのキーホールリンペットヘモシアニン（Keyhole Limpet Hemocyanin）（ＫＬＨ、Calbiochem）又は３０μｇ／ｍｌの破傷風トキソイド（ＴＴ、Statens Serum Institut）のいずれかで細胞を刺激した。陰性対照ウェルでは、９００μｇ／ｍｌのアルブミン入りの又はなしのＡＩＭＶ培地のみを加えた。
【０１４２】
Alexa Fluor 488 Click-iT EdUフローサイトメトリーアッセイキット（Invitrogen）を用いて、培養７日後に細胞増殖を評価した。１μＭ／ウェルのＥｄＵ取り込みマーカー（incorporation marker）を日６に加えた。日７に、細胞を洗浄し、プレートから解離し、再び洗浄し、そしてanti-CD3-PerCP試薬（Becton Dickinson）及びanti-CD4-Alexa647試薬（Becton Dickinson）で３０分間染色した。染色後、細胞を洗浄し、固定化し（ＢＤセルフィクス、BD biosciences）、透過処理し（サポニンを使用）そして製造者のプロトコール（Invitrogen）に従ってClick-iT試薬の添加によりＥｄＵを染色した。染色完了後、細胞を再び洗浄し、そしてフローサイトメトリー（FACSCantoII, BD Biosciences）を用いて分析した。増殖細胞の数を評価するため、一定数のフルオロスフェア（fluospheres）（Invitrogen）を分析前に各ウェルに加えた。すべての染色処置及び洗浄は、９６ウエルプレート中で直接実施した。
【０１４３】
FACSCantoIIの生データを、ＣＤ３+ＣＤ４+Ｔ細胞において階層的にゲート制御し（gated）、そしてゲート制御された細胞（gated cells）の数及びEdU-Alexa Flour 488取り込みマーカーのそれらの蛍光強度を記録した。増殖細胞数／８個１組のタンパク質処理されたウェルの平均値を陽性及び陰性対照と比較し、そして結果として得られる比率を算出し、刺激指数（ＳＩ）として記載した。反復試験間のＳＩ及び変動に基づいて、限界ＳＩ値を、刺激及び抑制についてそれぞれ２．０及び０．５に設定した。
【０１４４】
結果
in vitvoＰＢＭＣ増殖アッセイを用いて、標的ヒト個体群において３倍過剰の組換え型ヒトアルブミンの存在下でのそれらの免疫原性の可能性についてアルブミン結合ポリペプチドＰＥＰ０７９１３、ＰＥＰ０７９１２、ＰＥＰ０７９１４及びＰＥＰ０７９６８を評価した。アルブミン対照と比較して、ＰＥＰ０７９１３では、ドナー５２人のうち６人、ＰＥＰ０７９１２では、ドナー５２人のうち５人、そしてＰＥＰ０７９１４及びＰＥＰ０７９６８では、ドナー５２人のうちの１人でＣＤ３+ＣＤ４+Ｔ細胞増殖が誘発された（図６Ａ）。
【０１４５】
全５２人のドナーの平均刺激指数（ＳＩ）は、組換え型ヒトアルブミンを含む陰性対照と比較してＰＥＰ０７９１４及びＰＥＰ０７９６８について有意な違いはなかった（それぞれｐ＝０．７９及び０．４８、図６Ｂ）。ＰＥＰ０７９１３のＳＩは、有意に高かったのに対して（ｐ＝０．００２）、ＰＥＰ０７９１２のＳＩは、高かったが、有意ではなかった（ｐ＝０．０３、図６Ｂ）。
【０１４６】
バッファーのみと比較して、反応人数は、ＰＥＰ０７９１２では１０人、ＰＥＰ０７９１２では７人、ＰＥＰ０７９１４では２人、ＰＥＰ０７９６８では１人、組換え型ヒトアルブミンでは２人、そして２つの陽性対照ＴＴ及びＫＬＨではそれぞれ４９人及び５１人であった（図６Ｃ）。アルブミン結合ポリペプチドを、以下の順序でそれらの免疫原性に従ってランク付けした：ＰＥＰ０７９１３＞ＰＥＰ０７９１２＞ＰＥＰ０７９１４＞ＰＥＰ０７９６８。ＰＥＰ０７９１４及びＰＥＰ０７９６８は、いずれも非免疫原性であると確定された。従って、上の結果は、陽性対照と比較して、本開示のアルブミン結合ポリペプチドの免疫原性の可能性が低いことを示している。
【０１４７】
実施例７：
異なる種からのアルブミンに対するアルブミン結合ポリペプチドの親和性
この実施例では、Biacore機器を用いてヒト（ＨＳＡ）、カニクイザル（ＣＳＡ）、ラット（ＲＳＡ）、マウス（ＭＳＡ）及びイヌ（ＤＳＡ）からのアルブミンに対する親和性について、実施例１に記載された通り発現し、そして精製されたＰＥＰ０６９２３（配列番号：１５４）、ＰＥＰ０７９８６（配列番号：１６３）及びＰＥＰ０８２９６（ＤＯＴＡコンジュゲート化ＰＥＰ０８１８５、配列番号：１４８）を特徴付けた。
【０１４８】
物質及び方法
Biacore2000機器（GE Healthcare）におけるBiosensor分析は、ＣＭ−５チップ（研究グレード；GE Healthcare）表面のカルボキシル化デキストラン層上にアミンカップリングによって固定化されたＨＳＡ（Albucult(R), Novozymes）、ＣＳＡ（カニクイザル血清から社内精製した）、ＲＳＡ（Sigma-Aldrich、カタログ番号Ａ６２７２）、ＭＳＡ（Sigma-Aldrich、カタログ番号Ａ３５５９）及びＤＳＡ（MP Biomedicals、カタログ番号５５９２５）を用いて、製造者の勧告に従って実施した。
【０１４９】
チップ１において、表面１を活性化し、そして不活性化し、そして注入中に参照細胞（ブランク表面）として用いたのに対して、表面２は、１１３０レゾナンスユニット（ＲＵ）に固定化されたＨＳＡを含み、表面３は、１０４６ＲＵに固定化されたＣＳＡを含み、表面４は、８３１ＲＵに固定化されたＲＳＡを含んだ。チップ２において、表面１を、ブランク表面として用いたのに対して、表面３は、８５８ＲＵに固定化されたＭＳＡを含んだ。チップ３において、表面１をブランク表面として用いたのに対して、表面２は、１０５３ＲＵに固定化されたＤＳＡを含んだ。
【０１５０】
ＨＳＡ、ＣＳＡ及びＲＳＡ（チップ１）に対する親和性の分析では、精製されたアルブミン結合ポリペプチド変異体をランニングバッファーＨＢＳ−ＥＰ（GE Healthcare）中で４０ｎＭ、１０ｎＭ及び２．５ｎＭに希釈し；ＭＳＡ（チップ２）に対する親和性の分析では、アルブミン結合ポリペプチド変異体を１２８０ｎＭ、６４０ｎＭ、１６０ｎＭ及び４０ｎＭに希釈し、そしてＤＳＡ（チップ３）に対する親和性の分析では、アルブミン結合ポリペプチド変異体を１２８０ｎＭ、６４０ｎＭ、１６０ｎＭ、４０ｎＭ及び１０ｎＭに希釈した。アルブミン結合ポリペプチドを５０μｌ／分の一定流速で５分間注入し、続いてＨＢＳ−ＥＰを６０分間注入した。２５μｌ ＨＣｌ（１０ｍＭ）の１回注入により表面を再生した。すべてのサンプルは、二つ組で（in duplicates）行った。
【０１５１】
結果は、BIAevaluationソフトウェア（GE Healthcare）で分析した。リガンド表面の曲線からブランク表面の曲線を減算した。
【０１５２】
結果
Biacore 2000機器は、技術的制限があり、非常に高い親和性の測定が妨げられた。したがって、Biacore研究の目的は、それぞれＨＳＡ、ＣＳＡ、ＲＳＡ、ＭＳＡ及びＤＳＡに対するアルブミン結合ポリペプチド変異体の親和性の正確な動態パラメータを測定することではなかった。しかし、結果から、これらの異なる種からのアルブミンに対する閉鎖性ポリペプチド（enclosed polypeptides）の相対的な親和性の定量的評価を得た。参照表面及びバッファー注入の減算後、BIAevaluationソフトウェアを用い、物質移動について補正し、そして局所的パラメーターとしてＲＵｍａｘを設定して、曲線を１：１（Langmuir）結合モデルに適合させた。代表的な結合曲線を、図７に示す。
【０１５３】
ＰＥＰ０７９８６及びＰＥＰ０８２９６（ＤＯＴＡコンジュゲート化ＰＥＰ０８１８５）は、高い親和性（ピコモルより下からナノモルより下までの範囲のＫＤ）でヒト血清アルブミン並びによくある前臨床モデル種ラット、カニクイザル、マウス及びイヌからのアルブミンに結合する。異なる種に対する相対的親和性は、ＲＳＡ≧ＨＳＡ／ＣＳＡ＞ＭＳＡ／ＤＳＡとランク付けすることができ、すなわちＫD値は、ＫD-RSA≦ＫD-HSA／ＫD-CSA＜ＫD-MSA／ＫD-DSAとランク付けすることができる。ＫD値に関する親和性は、ＰＥＰ０６９２３（本発明ではないポリペプチド）に対して得られた親和性と同じか又はわずかに低かった（しかし、同程度の規模）。
【０１５４】
実施例８：
アルブミン結合ポリペプチドに融合されたタンパク質Ｚ変異体のin vitvo活性
この実施例では、ヒト血清アルブミンの存在下でＴＦ−１細胞のサイトカイン誘発性増殖をブロックするその機能性について、アルブミン結合ポリペプチド変異体ＰＰ０１３（配列番号：１３）に遺伝子的に融合された変異体、サイトカイン特異的タンパク質Ｚ（ブドウ球菌プロンテインＡのドメインＢの誘導体）を含むポリペプチドを試験した。ＴＦ−１細胞の増殖は、いくつかの異なるタイプのサイトカインのいずれかの存在に依存しており、そして増殖反応は、対応するサイトカイン特異的タンパク質Ｚ変異体のようなブロッキング試薬によって阻害することができる。無関連タンパク質に対して特異性を有するタンパク質Ｚ変異体に融合されたＰＰ０１３を陰性対照として用いた。
【０１５５】
物質及び方法
Ｚ−ＰＰ０１３融合タンパク質のクローニング
それぞれサイトカインＸ若しくはＹに対して、又は無関連タンパク質（陰性対照）に対して特異性を有するタンパク質Ｚ変異体の遺伝子フラグメントを、ＰｓｔＩ及びＡｃｃＩ特異的エンドヌクレアーゼ部位を加えるプライマーを用いたＰＣＲによって増幅した。フラグメントをＰｓｔＩ及びＡｃｃＩで切断し、精製し、そして発現ベクター、プラスミドｐＡＹ０２７４７に連結し、同じ酵素で制限した。ｐＡＹ０２７４７は、興味の遺伝子を発現するためにｐＢＲ３２２からの複製起点、カナマイシン耐性遺伝子及びＴ７プロモーターを含む。クローニング部位は、アミノ酸ＭＧＳＳＬＱをコードする配列によって始まり、そしてＶＤＳＳＰＰ０１３をコードする配列が続き、ここでＰＰ０１３は、配列番号：１３を有する開示されたアルブミン結合ポリペプチドである。ライゲーション、形質転換及び配列検証は、上記のように実施した。コードされたタンパク質は以下の通りであった：
１）ＭＧＳＳＬＱ−ＺX−ＶＤＳＳ−ＰＰ０１３（ＺX−ＰＰ０１３と表す）
２）ＭＧＳＳＬＱ−ＺY−ＶＤＳＳ−ＰＰ０１３（ＺY−ＰＰ０１３と表す）
３）ＭＧＳＳＬＱ−Ｚneg−ＶＤＳＳ−ＰＰ０１３（Ｚneg−ＰＰ０１３と表す）
【０１５６】
タンパク質発現
ＺX−ＰＰ０１３、ＺY−ＰＰ０１３及びＺneg−ＰＰ０１３を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中で発現させた。各融合変異体の形質転換からのコロニーを用いて、カナマイシンで５０μｇ／ｍｌの濃度に補充されたＴＳＢ＋ＹＥ培地のスターター培養液（starter cultures）５０ｍｌを接種した。１００ｒｐｍで撹拌しながら、培養物を３７℃で一夜増殖させた。次いで、スターター培養液を用いてカナマイシンで５０μｇ／ｍｌの濃度に補充されたＴＳＢ＋ＹＥ培地９００ｍｌに接種した。培養物を、ＯＤ６００ ＞１．１まで約１．５時間増殖させ、そこへＩＰＴＧを最終濃度０．２ｍＭまで加えた。培養を５時間続けた。細胞沈殿物を遠心分離（１５６００ｇ、４℃、２０分）によって集め、そして精製まで−２０℃で貯蔵した。
【０１５７】
タンパク質精製
可溶性の融合タンパク質変異体ＺX−ＰＰ０１３、ＺY−ＰＰ０１３及びＺneg−ＰＰ０１３を含む凍結された細胞沈殿物を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８中で再懸濁し、そして1000 U Benzonase(R)（Merckカタログ番号1.01654.0001）を加えた。細胞を超音波処理によって破壊し、そして融合タンパク質変異体のそれぞれについて、超音波処理された懸濁液を、遠心分離（１５分、３７０００  ｇ、４℃）によって清澄化した。２０ｘＴＳＴ−バッファー（２０ｘ［２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ８．０］）を、清澄化された懸濁液中に１×ＴＳＴバッファーが生成する体積で加えた。融合タンパク質変異体の各サンプルをＨＳＡ−セファロースカラム（GE Healthcare）上に装填した。ＴＳＴ−バッファー、続いて５ｍＭ ＮＨ４Ａｃ、ｐＨ５．５で洗浄した後、結合した融合タンパク質変異体を０．５Ｍ ＨＡｃ（ｐＨ２．５）で溶離した。
【０１５８】
融合タンパク質変異体を、以下のように、逆相クロマトグラフィ（ＲＰＣ）によってさらに精製した。変異体のそれぞれについて、ＨＳＡ−親和性精製工程からの溶出液を、予めＲＰＣ Ａバッファー（水中の０．１％ＴＦＡ）で平衡にした１ｍｌResource 15 RPCカラム（GE Healthcare）上に装填した。１０ＣＶのＲＰＣ Ａバッファー、そして５ＣＶのＲＰＣ Ｂバッファー（アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ）でカラムを洗浄した後、２０ＣＶにわたる１０〜５０％ＲＰＣ Ｂバッファーの線状勾配により、結合した融合タンパク質を溶離した。流速は２ｍｌ／分であり、そして２８０ｎｍで吸光度をモニターした。純粋な融合タンパク質変異体を含む画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって確定し、そして貯めた。最後に、使い捨てのＰＤ−１０脱塩カラム（GE Healthcare）を用いてバッファーを１ｘＰＢＳ（２．６８ｍＭ ＫＣｌ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１．４７ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、８．１ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．４）に交換した。融合タンパク質変異体の同一性を確認するため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＬＣ／ＭＳ分析を、実施例１に記載されたように実施した。
【０１５９】
Ｚ−ＰＰ０１３融合タンパク質のin vitvo細胞アッセイ
細胞株ＴＦ−１（Ｃｌカタログ番号３００４３４）を、２ｎｇ／ｍｌのｒｈＧＭ−ＣＳＦ （Miltenyi）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地＋１０％ウシ胎児血清（Gibco）中で供給元によって推奨された通り増殖させた。実験日に、細胞を、ＲＰＭＩ １６４０培地＋１０％ウシ胎児血清中で洗浄してＧＭ−ＣＳＦを除去した。
【０１６０】
分子ＺX−ＰＰ０１３、ＺY−ＰＰ０１３及びＺneg−ＰＰ０１３を、それぞれサイトカインＸ及びＹと、そして５倍モル過剰のＨＳＡ（Albucult(R), Novozymes）と混合することによって、サイトカイン誘発性増殖を阻止する、ＺX−ＰＰ０１３及びＺY−ＰＰ０１３の能力を分析した。一定濃度のサイトカイン（４．９ｐｍ）及び５倍モル過剰のＨＳＡを用いて２倍希釈系列で分子を滴定した。容積１００μｌの９６−ウエルプレート中で滴定を実施した。ウェル（１００μｌ）当たり２５０００個の細胞を加え、そしてプレートを３７℃、５％ＣＯ2で３日間インキュベートした。増殖を測定するため、ＲＰＭＩ １６４０培地＋１０％ウシ胎児血清中で２倍希釈されたＣＣＫ−８細胞増殖試薬（Sigma）１９μｌをウェルごとに加えた。４時間後、９６−ウエルプレートリーダー（Victor3; PerkinElmer）を用いて着色反応をモニターした。
【０１６１】
結果
図８に示すように、ＺX−ＰＰ０１３及びＺY−ＰＰ０１３は、ＨＳＡの存在下でそれぞれのサイトカイン誘発性増殖を阻害したのに対して、陰性対照、Ｚneg−ＰＰ０１３は、ＴＦ−１の増殖に影響を及ぼさなかった。従って、実験は、アルブミン結合ポリペプチドを含む融合タンパク質に組み込まれたとき、そしてまた、融合タンパク質がアルブミンに結合したときに、Ｚ分子の機能が保持されたことを示している。
【０１６２】
実施例９：
アルブミン結合ポリペプチドの長期安定性
この実施例では、実施例１に記載されたように発現し、そして精製されたＰＥＰ０７９８６（配列番号：１６３）の安定性を、最長３ヵ月間、４、２５及び４０℃で貯蔵した後、調べた。貯蔵後のポリペプチドの状態は、Biacore機器を用いてＨＳＡに対するその結合を測定することによって調べた。
【０１６３】
物質及び方法
凍結乾燥されたＰＥＰ０７９８６を、２ｍｇ／ｍｌの濃度で滅菌ＮａＰｉバッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）中に溶解した。参照サンプル（時間＝０）を除去し、そして−８０℃で貯蔵した。アリコート１０５μｌを、滅菌スクリューキャップ型エッペンドルフチューブ中にパラフィルムで封入して４、２５及び４０℃で貯蔵した。１週間、２週間、１ヵ月及び３ヵ月後、各温度で貯蔵されたサンプルを、４℃に冷却し、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、次いでBiosensor分析まで−８０℃で貯蔵した。
【０１６４】
バイオセンサー分析は、本質的に実施例２に記載されたように実施したが、７０４レゾナンスユニット（ＲＵ）に固定化されたＨＳＡ（Albucult(R), Novozymes）を用い、そしてアルブミン結合ポリペプチド変異体を１０ｎＭに希釈し、そして２０μｌ／分の一定流速で１０分間注入し、続いてＨＢＳ−ＥＰを１０分間注入した。
【０１６５】
結果
ＰＥＰ０７９８６（配列番号：１６３）のＨＳＡへの結合は、４、２５及び４０℃で少なくとも３ヵ月間貯蔵した後、保持された。さまざまな条件で貯蔵されたＰＥＰ０７９８６について得られたＨＳＡへの最大結合反応を図９に示す。
【０１６６】
実施例１０：
過酷条件下でのアルブミン結合ポリペプチドの安定性
この実施例では、低ｐＨ（約４.０）バッファー中で熱処理（９０℃）した後のアルブミン結合ポリペプチドＰＥＰ０８２９６（ＤＯＴＡコンジュゲート化ＰＥＰ０８１８５、配列番号：１４８）のバイオセンサー及び円偏光二色性（ＣＤ）分析を説明する。例えばＤＯＴＡ修飾タンパク質の68Ｇａ標識化には、このような過酷な反応条件を用いなければならないため、ポリペプチドの構造的同一性及びＨＳＡに結合するその能力における高熱及び低ｐＨ処理の影響を、融解温度（Ｔｍ）、リフォールディング性及びＨＳＡへの結合の測定によって調べた。
【０１６７】
物質及び方法
熱安定性のBiosensor分析
Biacore 2000機器（GE Healthcare）におけるBiosensor分析は、ＣＭ−５チップ（研究グレード；GE Healthcare）表面のカルボキシル化されたデキストラン層上へアミンカップリングによって固定化されたＨＳＡ（Albucult(R), Novozymes）を用いて、製造者の勧告に従って実施した。チップの表面１を活性化し、そして不活性化し、そして注入中に参照細胞（ブランク表面）として用いたのに対して、表面２は、７２４レゾナンスユニット（ＲＵ）に固定化されたＨＳＡを含んだ。１５ｍｌファルコンチューブ中のＰＥＰ０８２９６（５０μｌ、１００μｇ）を、０．２Ｍ酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）４５０μｌ ｐＨ５．５により最終ペプチド濃度０．２ｍｇ／ｍｌに希釈した。０．０５Ｍ ＨＣｌ １．５ｍｌを添加した後（68Ｇｅ／68Ｇａジェネレータ（generator）の溶離に用いた条件及び容積と類似している）、サンプルを９０℃又は室温（対照）で１０分間インキュベートし、次いで室温に移した。０．１Ｍクエン酸ナトリウム６ｍｌを加えてｐＨを中和した。熱処理されたＰＥＰ０８２９６（０．８及び４ｎＭ）を５０μｌ／分の一定流速で５分間注入し、続いてＨＢＳ−ＥＰ中で１５分間解離させた。１０ｍＭ ＨＣｌ ２５μｌを１回注入して表面を再生した。結果を、BIAevaluationソフトウェア（GE Healthcare）で分析した。リガンド表面の曲線からブランク表面の曲線を減算した。
【０１６８】
融解温度（Ｔｍ）の測定
ＰＥＰ０８２９６を、ＰＢＳ中で最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌに溶解した。１００ｍＭ ＨＣｌ ９．５μｌをＰＢＳ １００μｌに加えることによってｐＨ約４．０のＰＢＳを調製した。円偏光二色性（ＣＤ）分析は、実施例３に記載された通り実施した。
【０１６９】
熱安定性のＣＤ分析
熱処理後のＰＥＰ０８２９６の構造的可逆性を調べるため、１９５と２５０の間の２つのＣＤスペクトルを、サンプルごとに２０℃で記録した。第１のスペクトル後、９０℃への加熱によるＶＴＭサイクルを上記のように実施し、続いて１９５と２５０ｎｍの間の第２のＣＤスペクトルを２０℃で集めた。さらに、サーモミキサー（５００ｒｐｍ、１０秒作動、３０秒停止のインターバル混合）において９０℃で１２分間、ＰＢＳ ｐＨ４．０バッファー又はＰＢＳ ｐＨ７．２バッファー中でＰＥＰ０８２９６をインキュベートした。インキュベーション後、サンプルを氷上で冷却し、続いて１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、そして１９５と２５０ｎｍの間のＣＤスペクトルを２０℃で記録した。
【０１７０】
結果
Biosensor分析を用いて、低ｐＨと組み合わせた熱処理、すなわち、ポリペプチドの６８Ｇａ標識化に必要な一般的条件が、ＨＳＡに結合するＰＥＰ０８２９６の能力に影響を及ぼすかどうかを調べた。図１０は、Biacore 2000機器で実施されたこの結合分析の結果を示す。固定化ヒト血清アルブミン７２４ＲＵを有する表面上に、０．８ｎＭ及び４ｎＭの２種の異なる濃度のＰＥＰ０８２９６を、注入した。９０℃、ｐＨ４．０での１０分間の熱処理により、ＨＳＡに対するＰＥＰ０８２９６の結合能力がわずかに低下し、分子の潜在的構造変化を示している。
【０１７１】
ＣＤを用いて分子の潜在的構造変化をさらに調べた。加熱の前及び後の同様のＣＤスペクトルから、サンプルは構造的に可逆性であることが立証された。第１の実験では、２０℃から９０℃までの温度勾配によりサンプルを加熱した。熱処理の前及び後のＣＤスペクトルは、Ｔｍ測定実験において類似しており、２０７及び２２１ｎｍの典型的な極小点はα−ヘリシティを示し、すなわち、ｐＨ４又はｐＨ７．２バッファー中で９０℃への短時間の加熱は、ＰＥＰ０８２９６の構造に影響がなかった。
【０１７２】
しかし、９０℃で１２分間のＰＥＰ０８２９６の前処理では、ｐＨ４．０でインキュベートした場合、ＰＥＰ０８２９６のアルファヘリックス含量の低下をわずかに示したが、ｐＨ７．２でインキュベートした場合、アルファヘリックス含量の変化はなかった。加熱の前及び後の２つのＣＤスペクトルの典型的なオーバレイを図１１に示す。
【０１７３】
融解温度（Ｔｍ）測定からの結果は、表４にまとめた。
【０１７４】
【表４】
2013534421.tif 000006
【０１７５】
実施例１１：
68Ｇａ標識アルブミン結合ポリペプチドを用いた血液プールイメージング
この実施例を構成する実験では、ラットにおける68Ｇａ標識ＰＥＰ０８２９６（ＤＯＴＡコンジュゲート化ＰＥＰ０８１８５、配列番号：１４８）の全身分布を、１．５時間にわたる動的イメージングにより追跡した。標識化ポリペプチドと血清アルブミンの間の強い結合のため、標識ポリペプチドを用いて、例えば血液プール及び組織透過性を研究することができる。
【０１７６】
物質及び方法
ＰＥＰ０８２９６の６８Ｇａ標識化
以前に記載されたように（Velikyan et al (2008), Nucl Med Biol 35:529-536）、
０．１Ｍ ＨＣｌを用いて、68Ｇｅ／68Ｇａジェネレータ（Obninsk, Russia）から68Ｇａを68ＧａＣｌ3として溶離し、濃ＨＣｌにより68ＧａＣｌ4-に変換し、陰イオン交換カラム（Chromafix-HCO3）上で捕捉し、続いて１８ＭΩの水で溶離した。
【０１７７】
標識化は、本質的にTolmachev等（EJNMMI 37:1356-1367, 2010）に記載された通り実施した。濃縮された68Ｇａ−溶出液（１５０〜２００μｌ）を、ＰＥＰ０８２９６（ｐＨ５．５の０．２Ｍ酢酸ナトリウムバッファー中で≧１００μｇ）に加え、そして酢酸ナトリウム（１．２５Ｍ）又はＨＣｌ（０．１μＭ）を用いてｐＨを３．５〜４に調整した。標識混合物を９０℃で１５分間インキュベートした後、冷却し、そして生理緩衝食塩液で溶離するＮＡＰ−５カラム上のサイズ排除精製により標識タンパク質を単離した。
【０１７８】
68Ｇａ標識タンパク質の放射化学的純度及び同一性は、直列のＵＶ（２１０ｎｍ）及び放射能検出器並びに生理緩衝食塩液で溶離するSuperdex Peptide 10/300 GLカラム（GE Healthcare）を用いて、ラジオＨＰＬＣ（radio-HPLC）によって評価した。
【０１７９】
小動物ＰＥＴ
イソフルラン（最初に５％、そして７：３の空気／Ｏ2と２％ブレンドした）を用いてラット（２７７ｇ）に麻酔し、Euthanex CorporationからのMicroflexノンブリーザーマスク（non-rebreather masks）を用いてＥ−Ｚ吸入器によって管理し、そしてmicroPET Focus120システム（Siemens, CTI Concorde Microsystems）内に横たえたまま、加熱パッド（３７℃）上に保持した。68Ｇａ−ＰＥＰ０８２９６、３３ＭＢｑをシリンジ中に投入し、生理食塩水で０．５ｍｌに希釈し、そして尾静脈から注射した。一定の床移動プロトコールで１．５時間床を移動させることによって全身からデータを入手した。データをMicroPET Managerで処理し、そしてランダム（randoms）、不感時間（dead time）及び減衰（decay）について補正した。ランプフィルターを用いる標準２Ｄフィルター逆投影によって画像を再構成し、そしてInveon Research Workplace（Siemens Medical Solutions）ソフトウェアを用いて評価した。
【０１８０】
結果
ＰＥＰ０８２９６についての基本的な分布パターン（図１２）は、68Ｇａ−ＤＯＴＡ、64Ｃｕ−ＤＯＴＡ及び11Ｃのような放射性同位体で標識化されたアルブミンのそれと非常に類似していた（例えばHoffend et al (2005), Nucl Med Biol 32:287-292 and Lu et al (2008), “[1-11C]Butanol and [Methyl-11C]Albumin for Blood Flow and Blood Pool
Imaging”, poster at the XIth Turku PET Symposium, 24-27 May 2008を参照のこと）。要するに、スキャンを通して主要血管において高い放射能濃度が観察された。また、大血液容量の臓器（肝臓、脾臓及び腎臓）も、心血液プール放射能として明確に描写されていた。膀胱中の放射能は、観察期間中に高められ、この腎排出の観察は、標識アルブミンベースのトレーサーによる以前の観察、そしてアルブミン自体の代謝のそれと一致した。
【０１８１】
放射能の一般的な分散パターン及び68Ｇａ−ＰＥＰ０８２９６の静脈内注射後の非常に遅い血漿クリアランスは、アルブミンに対するその予想された非常に迅速かつ強力な結合と一致した。従って、これらの結果は、疾患発現及び治療的介入の両方における組織透過性の陽電子断層撮影研究に使用するためのin vivo血液プール造影剤として放射性トレーサーのさらなる適用を支持する。
【０１８２】
実施例１２：
アルブミン結合ポリペプチドの溶解度
限外濾過を用いたサンプルの連続的濃縮、続いて濃度測定及び凝集状態の調査によって生理学的バッファー中のＰＥＰ０７９８６（配列番号：１６３）の溶解度を調べた。２８０ｎｍでの吸光度の直接読取りによって決定された濃度は、ゲル濾過によって測定された濃度と一致しており、凝集物が検出されない４２ｍｇ／ｍｌを超える溶解度を示した。
【０１８３】
物質及び方法
凍結乾燥されたＰＥＰ０７９８６を、ＮａＰｉバッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）中に３ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。Amicon Ultra遠心式フィルターユニット、３ｋＤａのカットオフ（cut off）（Millipore、カタログ番号ＵＦＣ８００３２４）を、スインギンググバケットローター（swinging bucket rotor）遠心分離機（Multifuge, Heraeus）中、４０００ｇで２０分間の遠心分離によってＮａＰｉバッファー２ｍｌで予めすすいだ。３ｍｇ／ｍｌのＰＥＰ０７９８６ １６２０μｌを、第１の遠心式フィルターユニットに適用し、そして遠心分離を４０００ｇ、２０℃で７分間実施した。さらなる分析のため２５μｌのサンプルを取出し（ＵＦサンプル１）、そして残りのサンプルを第２の遠心濾過機ユニットへ移した。遠心分離及びサンプル取出しを、それぞれ８、９及び２０分の回転時間で３回繰り返した（それぞれＵＦサンプル２、３及び４）。NanoDrop(R) ND-1000分光光度計を用い、そしてＵＦサンプル１〜４を、ＮａＰｉバッファー中でそれぞれ２、４、６及び１２回希釈することによって吸光度の読取りを行った。吸光係数１を用いて濃度を算出したＡｂｓ ２８０＝１．９５５ｍｇ／ｍｌ。ＮａＰｉバッファー中で平衡にされたSuperdex75 10/300 GLカラム（GE Healthcare）を用いて、1100 HPLCシステム（Agilent Technologies）においてゲル濾過を実施した。各ＵＦサンプル１０μｌをカラムに適用した；ＮａＰｉバッファーをランニングバッファーとして用い、そして流速は０．５ｍｌ／分であった。５ｍｇ／ｍｌの濃度で注射された分子量標準オボアルブミンのクロマトグラム（GE Healthcare）を同様に集めた。曲線下面積を積分することによって濃度を決定した。
【０１８４】
結果
２８０ｎｍでの吸光度の直接読取りによって決定された濃度、及びゲル濾過によって決定された濃度を表５に示す。ＰＥＰ０７９８６（配列番号：１６３）の溶解度は、生理学的バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）中で少なくとも４２ｍｇ／ｍｌであった。図１３に示すようにゲル濾過によって凝集物は検出されなかった。
【０１８５】
【表５】
2013534421.tif 000007
【図１−１】
2013534421.tif 000008
【図１−２】
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【図１−３】
2013534421.tif 000010
【図１−４】
2013534421.tif 000011
【図１−５】
2013534421.tif 000012
【図１−６】
2013534421.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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