(57)【要約】  本発明は、ブドウ球菌感染を治療及び／または予防するための、ポリグリセロールリン酸（ＰＧＰ）を含む免疫原性組成物を提供する。いくつかの実施態様においては、ＰＧＰは、Ｔ細胞依存性抗原にコンジュゲーションされる。本発明は、ブドウ球菌感染を治療及び／または予防するために、本発明の組成物を使用する方法も提供する。本発明は、ＰＧＰを合成するための方法も提供する。本発明は、ＰＧＰをＴ細胞依存性抗原にコンジュゲーションするための方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞依存性抗原に共有結合したポリ−グリセロールリン酸（ＰＧＰ）を含む免疫原性組成物。
【請求項２】
前記ＰＧＰは、置換ホスホラミダイトモノマーを調製することと、前記モノマーを徐々に伸長させることとによって製造される、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
前記ＰＧＰは、約５〜２０のグリセロールリン酸モノマーを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記ＰＧＰは、約１０のグリセロールリン酸モノマーを含む、請求項３に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記Ｔ細胞依存性抗原は、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、遺伝子的に解毒したジフテリア毒素、百日咳トキソイド（ＰＴ）、組換え細胞外タンパク質Ａ（ｒＥＰＡ）、外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、またはＰａｎ  ＤＲヘルパーＴ細胞エピトープ（ＰＡＤＲＥ）ペプチドである、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記遺伝子的に解毒したジフテリア毒素はＣＲＭ１９７である、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記Ｔ細胞依存性抗原はＰＡＤＲＥペプチドである、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記ＰＡＤＲＥペプチドは、配列ＡＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡを含み、ここで、Ｘはシクロヘキシルアラニンである、請求項７に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
ＰＧＰと前記Ｔ細胞依存性抗原とのモル比は約５：１〜５０：１である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記モル比は１０：１である、請求項９に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記ＰＧＰは、前記Ｔ細胞依存性抗原に直接的に結合する、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記ＰＧＰは、前記Ｔ細胞依存性抗原にリンカーを通じて結合する、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
前記ＰＧＰは、チオール基、チオール−エーテル基、アシル−ヒドラゾン基、ヒドラジド基、ヒドラジン基、ヒドラゾン基、またはアミノオキシ基を用いて前記Ｔ細胞依存性抗原に共有結合する、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
前記ヒドラゾン基はビス−アリールヒドラゾン基である、請求項１３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記チオール求核基は、スクシニミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノアート（ＳＰＤＰ）またはＮ−スクシニミジル−Ｓ−アセチルチオアセタート（ＳＡＴＡ）である、請求項１３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記ヒドラジド求核基は、Ｅ−マレイミドカプロン酸ヒドラジド−ＨＣｌ（ＥＭＣＨ）、またはヒドラジンもしくはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）および１−エチル−３−ジメチルアミノプロピル）カルバジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）を用いて付加され、ならびに前記アリールヒドラジン基は、スクシニミジルヒドラジノニコチナートアセトンヒドラゾンを用いて付加される、請求項１３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
有効量の請求項１に記載の免疫原性組成物を投与することを含む、ＰＧＰを発現する細菌による感染を治療するための方法。
【請求項１８】
前記細菌はブドウ球菌である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細菌は、黄色ブドウ球菌または表皮ブドウ球菌である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記免疫原性組成物は、非経口的に投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記免疫原性組成物は、他の活性剤とともに投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記他の活性剤は、抗生物質、細菌性抗原、または抗細菌抗体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
有効量の請求項１に記載の免疫原性組成物を投与することを含む、ＰＧＰを発現する細菌に対して対象にワクチン接種するための方法。
【請求項２４】
前記細菌はブドウ球菌である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記細菌は、黄色ブドウ球菌または表皮ブドウ球菌である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記免疫原性組成物は、非経口的に投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫原性組成物は、他の活性剤とともに投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記他の活性剤は、抗生物質、細菌性抗原、または抗細菌抗体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
有効量の請求項１に記載の免疫原性組成物を投与することを含む、ＰＧＰを発現する細菌に対して防御性抗体を生成するための方法。
【請求項３０】
前記細菌はブドウ球菌である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記細菌は、黄色ブドウ球菌または表皮ブドウ球菌である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記免疫原性組成物は、非経口的に投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記免疫原性組成物は、他の活性剤とともに投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記他の活性剤は、抗生物質、細菌性抗原、または抗細菌抗体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
保護および活性化されたホスホラミダイトモノマーを調製することと、前記モノマーを徐々に伸長させることとを含む、ポリ−グリセロールリン酸（ＰＧＰ）を合成するための方法。
【請求項３６】
前記伸長は、標準的な固相オリゴヌクレオチド合成技法を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記伸長は、ＤＮＡ合成装置において実施される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
結合基が、前記伸長の間に前記ＰＧＰに組み込まれる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記結合基は、前記伸長の間に固体支持体によって組み込まれる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記結合基はアミノ基である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記モノマーは、結合基または結合基の前駆体を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記結合基はアミノ基である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記モノマーは、
（ａ）１つの末端のヒドロキシル基上の酸不安定保護基、
（ｂ）２−ＯＨ上の塩基不安定基、および／または
（ｃ）他方の末端のヒドロキシル上の活性化型リン基、
を含むグリセロール分子である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４４】
前記グリセロールは、キラル的に純粋である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記活性化型リン基は、結合基または結合基の前駆体を含む、請求項４4に記載の方法。
【請求項４６】
前記結合基はアミノ基である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
（ｂ）の前記塩基不安定基は、酸脱保護条件に対して安定である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記伸長は、固相支持体を用いる標準的な固相オリゴヌクレオチド合成技法を含み、ここで、（ｂ）の前記塩基不安定基は、前記固相支持体からのＰＧＰの切断の間に除去される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記モノマーは、
（ａ）１つの末端のヒドロキシル基上の酸不安定保護基を用いてグリセロール分子を保護すること、
（ｂ）２−ＯＨ上の塩基不安定基を用いてグリセロールを保護すること、および／または
（ｃ）他方の末端のヒドロキシル上の活性化型リン基を用いてグリセロールを保護すること
によって調製される、請求項３５に記載の方法。
【請求項５０】
前記グリセロール分子は、キラル的に純粋である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記活性化型リン基は、結合基または結合基の前駆体を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記結合基はアミノ基である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
（ｂ）の前記塩基不安定基は、酸脱保護条件に対して安定である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記伸長は、固相支持体を用いる標準的な固相オリゴヌクレオチド合成技法を含み、ここで、（ｂ）の前記塩基不安定基は、前記固相支持体からのＰＧＰの切断の間に除去される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記グリセロール分子は、まず、前記酸不安定保護基を用いて保護され、および次に、前記塩基不安定基を用いて保護される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
前記モノマーは、
（ａ）レブリン酸エステルをイソプロピリデングリセロール分子から調製すること、
（ｂ）前記イソプロピリデン保護基を除去すること、
（ｃ）酸不安定基を用いて遊離末端アルコールを保護すること、
（ｄ）塩基不安定基を用いて２−ＯＨ基を保護すること、
（ｅ）前記レブリン酸エステルを脱保護して、遊離末端ヒドロキシを提供すること、および
（ｆ）遊離末端アルコールをホスファイト化すること
によって調製される、請求項３５に記載の方法。
【請求項５７】
前記イソプロピリデングリセロール分子は、キラル的に純粋である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記レブリン酸エステルは、ヒドラジンによって除去される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
請求項３７に記載の方法によって製造される合成ポリ−グリセロールリン酸（ＰＧＰ）分子。
【請求項６０】
前記リンカー基は、チオール、アミン、アミノオキシ、アルデヒド、ヒドラジド、ヒドラジン、マレイミド、カルボキシル、またはハロアシルを含む、請求項５９に記載の合成ＰＧＰ。
【請求項６１】
リンカー基を含む合成ポリ−グリセロールリン酸（ＰＧＰ）分子。
【請求項６２】
前記リンカー基は、チオール、アミン、アミノオキシ、アルデヒド、ヒドラジド、ヒドラジン、マレイミド、カルボキシル、またはハロアシルを含む、請求項６１に記載の合成ＰＧＰ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利に関する記載
本発明は、一部、米国政府からの支援によりなされた。したがって、政府は、本発明において一定の権利を有し得る。
【０００２】
本発明の分野
本発明は、免疫原性組成物およびワクチンの分野、それらの製造、ならびにグラム陽性細菌感染の治療および／または予防のためのそれらの使用に関する。より詳細には、本発明は、ＰＧＰ抗原を含むワクチン組成物に関する。このような組成物を調製および使用するための方法も提供される。
【背景技術】
【０００３】
ヒトにおけるほとんどの病原性細菌は、グラム陽性生物体である。グラム陽性細菌の例には、ブドウ球菌、連鎖球菌、コリネバクテリウム、リステリア、桿菌、およびクロストリジウムが挙げられる。ブドウ球菌は通常、ヒトおよび他の動物の皮膚および粘膜に存在しかつコロニー形成する。細菌を保有する皮膚または粘膜が手術または他の外傷の間に損傷を受けた場合、ブドウ球菌は、感染の原因となる内部組織への接近を獲得し得る。ブドウ球菌が局所的に増殖するかまたはリンパ系もしくは血液系に入ると、重度の感染合併症が結果として生じ得る。ブドウ球菌は、米国において、菌血症、手術創感染、および人工器官材料の感染の主要因であり、他の病院内（院内）感染症の第二の主要因である。ブドウ球菌感染と関連した合併症には、敗血症ショック、心内膜炎、関節炎、骨髄炎、肺炎、および種々の臓器における膿瘍が挙げられる。
【０００４】
ブドウ球菌は、コアグラーゼ陽性（ＣｏＰＳ）またはコアグラーゼ陰性（ＣｏＮＳ）のいずれかとして分類される。黄色ブドウ球菌は、ブドウ球菌の最も一般的なコアグラーゼ陽性型である。黄色ブドウ球菌は、地域病院における手術部位感染（ＳＳＩ）の主要因であり、米国において、毎年３００，０００〜５００，０００のＳＳＩを生じる。全体として、黄色ブドウ球菌誘発性ＳＳＩは、年間医療費の１０億ドル〜１００億ドルを占める。抗生物質メチシリンに対して耐性のある黄色ブドウ球菌株（ＭＲＳＡ株）は、米国における院内ブドウ球菌感染の４０％〜６０％の原因である。ＭＲＳＡ株は、１９９２年〜２００２年の間で９％から４９％に増大した。２００１年から２００３年まで、米国における皮膚および軟組織の感染について、１１６０万の外来治療訪問があり、そのうちの多くまたはほとんどは、ＭＳＲＡ株によるものであると考えられるものであった。地域感染型のＭＲＳＡ感染のこの発生は、微生物についての懸念を高め、ブドウ球菌の蔓延を制御する努力に対する新たな緊急度を与えた。
【０００５】
コアグラーゼ陰性ブドウ球菌は、院内菌血症の最も一般的な要因である（すべての症例の３０〜４０％）。およそ２５０，０００症例のＣｏＮＳ菌血症は毎年、米国においてかなりの罹患率、１〜２％から２５％にまで及ぶ死亡率、エピソードあたり２５，０００ドルの平均追加経費、少なくとも７日間の入院の延長を伴って生じる。表皮ブドウ球菌は、ブドウ球菌の最も一般的に単離されるコアグラーゼ陰性型であり、留置型医用デバイスに用いられる事実上すべての生体材料において増殖するその能力に大きく起因して、臨床的に重要な感染の主要因である。一旦確立されると、これらの感染は、抗菌剤に対して不応となる傾向にあり、しばしば、感染したデバイスの除去を必要とする。
【０００６】
ブドウ球菌感染は、典型的には抗生物質を用いて治療される。しかしながら、抗生物質に対して広いスペクトルの耐性を呈するブドウ球菌株の割合は、ますます広まっており、抗菌剤療法の有効性を低下させる。新たな抗菌剤が研究下にあるが、細菌は究極的には、これらの新たな抗生物質を回避するための耐性機序を工夫することが予期される。したがって、ブドウ球菌感染を予防および／または治療するための非抗菌剤アプローチに対する緊急の必要性がある。
【０００７】
細胞外グラム陽性細菌病原体に対するヒト免疫は主として、表面多糖類に特異的な抗体を介するオプソニン殺作用によって仲介される（Ｓｋｕｒｎｉｋ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  １２０（９）：３２２０−３３  （２０１０））。黄色ブドウ球菌は、２つの以下のような抗原、すなわち莢膜多糖（ＣＰ）およびポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＰＮＡＧ）を発現する。莢膜多糖類は、細菌細胞に対するワクチン誘発性免疫のための最良に確立された標的である（Ｓｋｕｒｎｉｋ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  １２０（９）：３２２０−３３  （２０１０））。しかしながら、ブドウ球菌感染に対する防御性ヒト免疫を構成するものが何であるかについての知識がなかったので、好適なワクチンを開発するための合理的なアプローチを用いることが困難であった。例えば、黄色ブドウ球菌は、外見的には重複した機能を有する種々の分子を産生し、１つが除去される（またはワクチンによって標的にされる）と、他の細菌産物が機能の損失を補償し得る。加えて、ブドウ球菌は、ヒト自然免疫を回避する多くの多様な戦略を発達させた（Ｓｃｈａｆｆｅｒ  Ａ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  Ｃｌｉｎ．，  ２３：１５３−７１  （２００９））。
【０００８】
受動免疫療法におけるブドウ球菌抗原に対する抗体を用いるアプローチは、いくつかの予備的な成功を伴って研究されてきた。例えば、黄色ブドウ球菌莢膜多糖類血清型５（ＣＰ５）および血清型８（ＣＰ８）（すなわち、Ａｌｔａｓｔａｐｈ）、クランピング因子A（ClfA）（すなわち、Aurexis）、ATP結合カセット（ABC）（すなわち、Aurograb）、ならびにリポテイコ酸（ＬＴＡ）（すなわち、パギバキシマブ（Ｐａｇｉｂａｘｉｍａｂ））に対する抗体を用いた第２相および第３相試験が完了した（Ｓｃｈａｆｆｅｒ  Ａ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  Ｃｌｉｎ．，  ２３：１５３−７１  （２００９））。しかしながら、フィブリノーゲンおよびフィブリンを結合するブドウ球菌アドへシン（黄色ブドウ球菌ＣｌｆＡおよび表皮ブドウ球菌ＳｄｒＧ）に対して高い抗体力価を有するドナー由来のプールされたヒト免疫グロブリン調製物（すなわちＶｅｒｏｎａｔｅ）を用いた第３相試験は失敗した。この失敗は、特に失望するものであり、なぜなら、抗体カクテルは、ＣｌｆＡおよびＳｄｒＧに対する抗体について選択したが、多くの他のブドウ球菌抗原に対する抗体を含んでいたようであり、多成分性受動免疫療法における試みの失敗を表すからである（Ｓｃｈａｆｆｅｒ  Ａ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  Ｃｌｉｎ．，  ２３：１５３−７１  （２００９））。
【０００９】
今日まで、ブドウ球菌抗原の投与を包含する２つだけの能動免疫化アプローチが第２相および第３相試験において試験された。結合型（conjugate）ワクチンの形態の黄色ブドウ球菌莢膜多糖類ＣＰ５およびＣＰ８に基づいた１つのアプローチ（すなわち、ＳｔａｐｈＶａｘ）は、第３相段階で失敗した。ワクチンは、血液透析患者に投与されると、有意な保護を与え損ねた。この試験の失敗は、研究者に有効なブドウ球菌ワクチンを開発することが可能かどうかを問いかけさせた（Ｓｃｈａｆｆｅｒ  Ａ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  Ｃｌｉｎ．，  ２３：１５３−７１  （２００９））。実際、黄色ブドウ球菌感染からの回復は、その後の感染に対する免疫を与えるようには見えず、ブドウ球菌感染に対する免疫が生じないかもしれないことを示唆する。それにもかかわらず、鉄を制限する条件下でのみ発現する、黄色ブドウ球菌細胞壁に固定されるタンパク質ＩｓｄＢをベースにした別のワクチン（すなわち、Ｖ７１０）は近年、第２／３相試験に入った。しかしながら、目下、臨床用途における抗ブドウ球菌ワクチンも、ワクチンに含まれる場合にどの細菌成分が保護を与えるかを予想する方法も、存在しない。
【００１０】
リポテイコ酸（ＬＴＡ）は、細菌細胞壁に突出するすべてのグラム陽性細菌細胞膜の主要構成成分であり、細菌機能について必須であるように見える（Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １７０：４１３４−３８  （２００３））。ＬＴＡが免疫刺激性であるという証拠も増加している。例えば、ＬＴＡは、免疫化後の防御性抗菌効果を惹起することが示された（Ｙｏｋｏｙａｍａ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌ，  ６３：２３５−２４１  （２００２）、Ｃａｌｄｗｅｌｌ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  １５：３３９−３５０  （１９８２））。しかしながら、米国特許出願公開第２００５／０１６９９４１号において、発明者らのうちの１名は、天然の精製済みＬＴＡおよび脱アシル化した天然の精製済みＬＴＡ（ｄｅＡｃＬＴＡ）が、マウスにおいて乏しい免疫原性しかないことを示した。免疫原性を改良するために、ｄｅＡｃＬＴＡを、マレイミドにより誘導体化した破傷風トキソイド（ＴＴ）に結合させた。ｄｅＡｃＬＴＡ−ＴＴ結合型ワクチンは、高レベルの抗ＬＴＡ  ＩｇＧ抗体を誘導した。加えて、応答は、追加免疫可能であり、Ｔ細胞非依存性抗原からＴ細胞依存性抗原へのｄｅＡｃＬＴＡの変換を示した。ｄｅＡｃＬＴＡ−ＴＴによって誘導された抗体は、無処置のＬＴＡと交差反応し、血清は、表皮ブドウ球菌細菌に対するオプソニン化貪食作用アッセイにおいて非常に防御性であった。ｄｅＡｃＬＴＡ−ＴＴを用いて免疫化したマウスは、脾臓および腎臓における細菌の顕著な減少によって明らかにされるように、生きた黄色ブドウ球菌による静脈内（ｉ．ｖ．）感染に対しても耐性があった。
【００１１】
本発明者らは、その他の発明者らとともに、黄色ブドウ球菌ＬＴＡに対するマウス／ヒトキメラ型モノクローナル抗体（Ｐａｇｉｂａｘｉｍａｂ）が、表皮ブドウ球菌および黄色ブドウ球菌に対してインビトロでオプソニン性であり（すなわち、食作用を亢進し）、黄色ブドウ球菌に対してインビボで防御性であることも示した。パギバキシマブ抗体は、マウスを全ブドウ球菌で免疫化し、結果として生じるモノクローナル抗体を、ブドウ球菌のオプソニン作用を誘導する能力に基づいて脾臓細胞の融合物から選択することによって開発された。パギバキシマブは、細菌に対する最高の結合活性を有し、高レベルのオプソニン作用を誘導した（Ｗｅｉｓｍａｎ  Ｌ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  ９：６３９−６４４  （２００９）、およびＷｅｉｓｍａｎ  Ｌ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，  ５３：２８７９−２８８６  （２００９））。しかしながら、ＬＴＡの投与は、炎症反応を惹起し、能動型ワクチンにおける使用のための候補としては望ましくない（例えば、Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４（１２）：１６２９−３３  （２００７）、Ｍｏｒａｔｈ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｓ．，  １１（６）：３４８−５６  （２００５）、Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １７０（８）：４１３４−３８  （２００３）、およびＭｏｒａｔｈ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １９５（１２）：１６３５−４０  （２００２）を参照されたい）。
【００１２】
したがって、グラム陽性細菌感染の治療および／または予防のための免疫原性組成物およびワクチンを提供することによって前記分野における需要に取り組むことが、本発明の主要目的である。このような組成物を調製および使用するための方法も提供される。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、ブドウ球菌感染に対する防御性エピトープであることがこれまで公知ではなかった部分であるポリ−グリセロールリン酸（ＰＧＰ）を含む免疫原性組成物を提供する。
【００１４】
一態様において、ＰＧＰは、Ｔ細胞依存性抗原に共有結合する。さらに別の態様において、Ｔ細胞依存性抗原は、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、遺伝子的に解毒したジフテリア毒素、百日咳トキソイド（ＰＴ）、組換え細胞外タンパク質（ｅｘｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ａ（ｒＥＰＡ）、外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、またはＰａｎ  ＤＲヘルパーＴ細胞エピトープ（ＰＡＤＲＥ）ペプチドである。さらに別の態様において、ＰＡＤＲＥペプチドは、配列ＡＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡを含み、この中で、Ｘは、シクロヘキシルアラニンである。さらに別の態様において、遺伝子的に解毒したジフテリア毒素はＣＲＭ１９７である。
【００１５】
別の態様において、ＰＧＰとＴ細胞依存性抗原とのモル比は、約５：１〜５０：１である。さらに別の態様において、モル比は１０：１である。
【００１６】
別の態様において、ＰＧＰは、Ｔ細胞依存性抗原に直接結合する。さらに別の態様において、ＰＧＰは、リンカーを通じて、Ｔ細胞依存性抗原に結合する。
【００１７】
別の態様において、ＰＧＰは、チオール基、チオール−エーテル基、アシル−ヒドラゾン基、ヒドラジド基、ヒドラジン基、ヒドラゾン、特にビス−アリールヒドラゾン基、またはオキシム基を用いて、Ｔ細胞依存性抗原に共有結合する。さらに別の態様において、チオール求核基は、例えば、スクシニミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノアート（ＳＰＤＰ）、またはＮ−スクシニミジル−Ｓ−アセチルチオアセタート（ＳＡＴＡ）を用いて組み込まれる。さらに別の態様において、ヒドラジド求核基は、Ｅ−マレイミドカプロン酸ヒドラジド−ＨＣｌ（ＥＭＣＨ）、またはヒドラジンもしくはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）および１−エチル−３−ジメチルアミノプロピル）カルバジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）を用いて付加され、ならびにアリールヒドラジン基は、スクシニミジルヒドラジノニコチナートアセトンヒドラゾン（Ｓ−ＨｙＮｉｃ，  Ｓｏｌｕｌｉｎｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を用いて付加される。
【００１８】
別の態様において、ＰＧＰは合成物である。さらに別の態様において、ＰＧＰは、置換ホスホラミダイトモノマーを調製することと、標準的な固相核酸技法を用いてモノマーを徐々に伸長させることとによって製造される。
【００１９】
別の態様において、ＰＧＰは、約５〜２０のグリセロールリン酸モノマーを含む。さらに別の態様において、ＰＧＰは、約１０〜１２のグリセロールリン酸モノマーを含む。さらに別の態様において、ＰＧＰは、約１０のグリセロールリン酸モノマーを含む。
【００２０】
本発明は、ＰＧＰ部分を発現する細菌による感染を治療するための方法、ＰＧＰ部分を発現する細菌に対して対象にワクチン接種するための方法、および有効量の本発明の免疫原性組成物を投与することを含む、ＰＧＰ部分を発現する細菌に対して防御性抗体を生成するための方法も提供する。
【００２１】
一態様において、細菌は、ブドウ球菌である。別の態様において、細菌は、黄色ブドウ球菌または表皮ブドウ球菌である。
【００２２】
一態様において、免疫原性組成物は、非経口的に投与される。別の態様において、免疫原性組成物は、別の活性剤とともに投与される。さらに別の態様において、他の活性剤は、抗生物質、細菌性抗原、または抗細菌抗体である。
【００２３】
本発明は、保護および活性化されたホスホラミダイトモノマーを調製することと、モノマーを徐々に伸長させることとによって、ポリ−グリセロールリン酸（ＰＧＰ）を合成するための新規の方法も提供する。一態様において、伸長は、標準的な固相オリゴヌクレオチド合成技法を含む。別の態様において、伸長は、ＤＮＡ合成装置において実施される。さらに別の態様において、結合基は、伸長の間にＰＧＰに組み込まれる。さらに別の態様において、結合基は、伸長の間に固体支持体によって組み込まれる。さらに別の態様において、モノマーは、結合基または結合基の前駆体を含む。さらに別の態様において、結合基はアミノ基である。
【００２４】
一態様において、モノマーは、（ａ）１つの末端のヒドロキシル基上の酸不安定保護基、（ｂ）２−ＯＨ上の塩基不安定基、および／または（ｃ）他方の末端のヒドロキシル上の活性化型リン基、を含むグリセロール分子である。別の態様において、モノマーは、（ａ）１つの末端のヒドロキシル基上の酸不安定保護基を用いてグリセロール分子を保護すること、（ｂ）２−ＯＨ上の塩基不安定基を用いてグリセロールを保護すること、および／または（ｃ）他方の末端のヒドロキシル上の活性化型リン基を用いてグリセロールを保護すること、によって調製される。
【００２５】
さらに別の態様において、グリセロールはキラル的に純粋である。別の態様において、活性化型リン基は、結合基または結合基の前駆体を含む。さらに別の態様において、結合基はアミノ基である。さらに別の態様において、（ｂ）の塩基不安定基は、酸脱保護条件に対して安定である。さらに別の態様において、伸長は、固相支持体を用いる標準的な固相オリゴヌクレオチド合成技法を含み、この中で、（ｂ）の上記塩基不安定基は、固相支持体からのＰＧＰの切断の間に除去される。さらに別の態様において、グリセロール分子は、まず、酸不安定保護基を用いて保護され、および次に、塩基不安定基を用いて保護される。
【００２６】
さらに別の態様において、モノマーは、（ａ）レブリン酸エステルをイソプロピリデングリセロール分子から調製すること、（ｂ）上記イソプロピリデン保護基を除去すること、（ｃ）酸不安定基を用いて遊離末端アルコールを保護すること、（ｄ）塩基不安定基を用いて２−ＯＨを保護すること、（ｅ）上記レブリン酸エステルを脱保護して、遊離末端ヒドロキシルを提供すること、および（ｆ）遊離末端アルコールをホスファイト化すること、によって調製される。一態様において、イソプロピリデングリセロール分子は、キラル的に純粋である。別の態様において、レブリン酸エステルは、ヒドラジンによって除去される。
【００２７】
本発明は、本発明の方法によって製造される合成ポリ−グリセロールリン酸（ＰＧＰ）分子も提供する。本発明は、リンカーを含む合成ポリ−グリセロールリン酸（ＰＧＰ）分子も提供する。一態様において、合成ＰＧＰは、リンカー基を含む。別の態様において、リンカー基は、チオール、アミン、アミノオキシ、アルデヒド、ヒドラジド、ヒドラジン、マレイミド、カルボキシル、またはハロアシルを含む。
【００２８】
本発明の追加的な目的および利点は、以下の説明において一部示され、および一部、説明から明らかであり、または本発明の実施によって学ばれ得る。本発明の目的および利点は、添付の特許請求の範囲に特に指摘された要素および組み合わせによって具現化および達成される。
【００２９】
以上の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方が、例示的かつ説明的であるに過ぎず、主張されるように、本発明を制限するものではない。説明において引用される文書はいずれも、引用により本明細書に組み込まれる。
【００３０】
本明細書に組み込まれおよびその一部を構成する添付の図面は、本発明の例示的な実施態様を例証し、前記説明とともに、本発明の原理を説明するよう機能する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、黄色ブドウ球菌リポテイコ酸（ＬＴＡ）およびそのポリ（グリセロールリン酸）（ＰＧＰ）成分の構造を示す。
【図２】図２は、保護されたグリセロールリン酸ホスホラミダイトを用いてＰＧＰを調製するために使用される合成スキームである。
【図３】図３は、ＴＴとの組み合わせ（ｄｅＡｃＬＴＡ＋ＴＴ）およびＴＴ結合型ｄｅＡｃＬＴＡ（ｄｅＡｃＬＴＡ−ＴＴ）におけるｄｅＡｃＬＴＡの免疫原性を示す。２０個体のＢＡＬＢ／ｃマウスの群を０、１４、および２８日後に、ＴＴと混合した、またはＴＴに結合した５μｇのＬＴＡ、およびＲｉｂｉアジュバントを用いて免疫化した。個々の血清（２８日後）をＥＬＩＳＡによって抗ＬＴＡ  ＩｇＧについてアッセイした。
【図４】図４は、ＰＧＰ−ＴＴを用いて免疫化されたＢＡＬＢ／ｃマウスが、黄色ブドウ球菌による感染に対して特異的に保護されることを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたり５個体）を、２５μｇの刺激性ＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ）と混合した１３ｍｇのミョウバン上に吸着されたＰＧＰ−ＴＴまたはＰＰＳ１４−ＴＴ（１μｇ／個体）を用いて免疫化し、１４日後に同様に追加免疫した。３６日後に、マウスに１．７×１０7ＣＦＵの生きた黄色ブドウ球菌を腹腔内感染させた。血液を尾静脈から１、２、および３日後に、黄色ブドウ球菌コロニー計数の決定のために得た。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明の詳細な説明
本発明は、ブドウ球菌感染についての防御性エピトープであることがこれまで公知ではなかった部分であるＰＧＰ抗原を含む免疫原性組成物およびワクチンに関する。ＰＧＰ部分を発現するグラム陽性細菌による感染の治療および／または予防のためのこのような組成物を調製および使用する方法も提供される。
【００３３】
ＰＧＰ抗原
リポテイコ酸（ＬＴＡ）の構造は、細菌間で異なるが、典型的にはポリ−グリセロールリン酸（ＰＧＰ）（図１）またはポリ−リビトールリン酸（ＰＲＰ）のコア鎖および糖脂質尾部を含む。ＰＧＰ鎖は、グリセロール上にペンダント糖およびＤ−アラニンエステルを有する。ＰＧＰを含むブドウ球菌には、黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌が含まれる。ＰＧＰを欠くブドウ球菌には、Ｓ．シトレウスが含まれる。
【００３４】
本発明者らは、黄色ブドウ球菌ＬＴＡに対するマウス／ヒトキメラ型モノクローナル抗体であるパギバキシマブが、黄色ブドウ球菌由来のＬＴＡおよび合成ＰＧＰに等しく十分に結合することをここに決定し（実施例２を参照のこと）、これらの抗体がＰＧＰに対して特異的であることを示唆した。これらの新たな結果は、ＰＧＰが、ブドウ球菌感染の防御および／または治療のための標的抗原として機能し得ることを示唆する。
【００３５】
したがって、一態様において、本発明は、ＰＧＰを含む免疫原性組成物に関する。別の態様において、ＰＧＰは合成物である。さらに別の態様において、ＰＧＰは、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を動員することのできる免疫原性タンパク質に共有結合する（すなわちコンジュゲーションする）。
【００３６】
多価抗原
ＰＧＰなどの多価抗原は、少価（ｐａｕｃｉｖａｌｅｎｔ）抗原よりもＢ細胞受容体のシグナル伝達およびＢ細胞の活性化のより強力な刺激因子であることが示された。例えば、免疫原性であるために、２型Ｔ細胞非依存性（ＴＩ−２）Ａｇ  ＤＮＰ−ポリアクリルアミドは、１００，０００Ｄａの閾値分子質量および２０の閾値ハプテン結合価を超過すべきであることが発見された（Ｄｉｎｔｚｉｓ  Ｒ．Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３１：２１９６−２０３  （１９８３））。特定の多価抗原の免疫原性とその分子量（すなわち、反復単位数）の間の関連性は、抗原特異的免疫グロブリンの誘導についての釣り鐘形曲線を呈する（Ｄｉｎｔｚｉｓ  Ｒ．Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４３：１２３９−４４  （１９８９））。歴史的に、約１〜２０の反復単位を含む多価抗原は、非常に免疫原性であることが発見されており、有効なワクチン抗原として機能する。
【００３７】
したがって、本発明の一態様において、ＰＧＰは、約１〜２０のグリセロールリン酸モノマーを含む。別の態様において、ＰＧＰは、約５〜１０のグリセロールリン酸モノマーを含む。さらに別の態様において、ＰＧＰは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のグリセロールリン酸モノマーを含む。
【００３８】
ＰＧＰ合成
固相核酸合成による伸長に好適な適切に保護されたグリセロールアミダイトの調製は、活性化型モノマーが、１つの末端上で酸不安定アルコール保護基を、酸脱保護条件に対して安定である２−ＯＨ上で塩基不安定基を、および伸長のために活性型ホスホラミダイトを組み込まなければならないので、困難である。本明細書で使用する場合、用語「活性型」および「活性化型」は、化学的実体上の少なくとも１つの部分が、例えば１つ以上の共有結合を通じて別の分子と相互作用することができるようにされたことを意味する。
【００３９】
一態様において、酸不安定基はジメトキシトリチルである。酸不安定基は、トリクロロ酢酸またはジクロロ酢酸を用いて除去され得る。別の態様において、塩基不安定基はレブリン酸エステル基である。塩基不安定基は、例えばヒドラジンによって除去され得る。さらに別の態様において、活性型ホスホラミダイト基は、３−（（（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ）オキシ）プロパンニトリル基であり得る。
【００４０】
（Ｓ）−（＋）立体配置を保有するキラル的に純粋なグリセロールモノマーは、市販の適切なモノマーへの合成経路を見出す困難さを増大させる。好適な経路を見出す困難さは、（ａ）いかなる他の保護にも影響せずに除去できる３つのヒドロキシル保護基が発見されなければならず、（ｂ）ヒドロキシル基が互いに対してアルファであり、そのことが、一定の条件下で保護基の迅速な移動を可能にするので、好適な保護基の選択が制限されるものとして、当業者によって理解され得る。
【００４１】
このことを踏まえ、本発明者らは、ＰＧＰを合成する複数の経路を評価し、図２および実施例１における一般的な概略において提供されるように、ＰＧＰを多量に合成するための信頼できる方法を開発した。したがって、ホスホラミダイトは、（ａ）そのレブリン酸エステルとしての３−ＯＨ基の保護、（ｂ）イソプロピリデン保護基の酸脱保護、（ｃ）１−ＯＨにおけるジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基の組み込み、（ｄ）ベンゾアートとしての２−ＯＨの保護、（ｅ）３−Ｏ−レブリン酸エステル基の除去、および（ｆ）３−ＯＨのホスファイト化を含む６つの工程において、（Ｓ）−（＋）−１，２−イソプロピリデングリセロールから合成され得る。上記の特異的な保護基は高い収量をもたらし得るのに対し、他の酸および塩基不安定基は、いかなる他の保護にも影響せずに、かつ移動における問題を苦慮せずに除去することができる限り、用いられ得る。
【００４２】
本発明の別の態様において、伸長は、例えば、ＤＮＡ合成装置における標準的な固相核酸合成プロトコールの使用を通じて生じ得る。別の態様において、ホスホラミダイト、例えば、１−Ｏ−ジメトキシトリチル基−２−（Ｓ）−（＋）−ベンザオアート（ｂｅｎｚａｏａｔｅ）−３−ホホスホラミダイト（ｐｈｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）グリセロールは、ＤＮＡ合成装置を用いて伸長される。反応は、例えば、所望のＰＧＰポリマーを生じるための標準的なカップリング条件ならびに標準的な切断および脱保護条件を採用する複数サイクルを用いて実施されることができる。当業者は、アミノ基などの「３’」または「５’」結合基が、３’−アミノ固体支持体または５’−アミノホスホラミダイトを用いることによって、ＰＧＰポリマーに組み込まれることができることも理解する。
【００４３】
結合型ワクチン
ワクチン調製物は、免疫原性であるべきであり、すなわち、調製物は、免疫応答を誘導することができるべきである。しかしながら、外来の薬剤を単に注射することによって、対象における抗体形成を刺激することが必ずしも常に可能であるとは限らない。特定の薬剤は、免疫応答を生得的に惹起することができ、かつ修飾せずにワクチン中で投与され得るのに対し、他の重要な薬剤は、免疫原性ではなく、かつ薬剤が免疫応答を誘導することができる前に免疫原性の分子もしくは構築物へと変換されなければならない。
【００４４】
免疫応答は、以下の通り一般的に説明されることのできる複雑な一連の反応である：（１）抗原は身体に入り、抗原を加工して細胞表面上に抗原の断片を保持する抗原提示細胞と遭遇し、（２）抗原提示細胞上に保持される抗原断片は、Ｂ細胞に対する助力を提供するＴ細胞によって認識され、および（３）Ｂ細胞は刺激されて、増殖し、抗原に対する抗体を分泌する抗体形成細胞へと分裂する。
【００４５】
ほとんどの抗原は、Ｔ細胞からの支援で抗体を誘発するだけであり、それゆえ、Ｔ依存性（ＴＤ）として公知である。タンパク質などのこれらの抗原は、抗原提示細胞によって加工され、したがって、先に説明したプロセスにおいてＴ細胞を活性化することができる。このようなＴ依存性抗原の例には、破傷風トキソイドおよびジフテリアトキソイドが挙げられる。
【００４６】
多糖類などのいくつかの抗原は、抗原提示細胞によって適切に加工されることができず、Ｔ細胞によって認識されない。これらの抗原は、抗体形成を誘発するためにＴ細胞の助力を必要としないが、Ｂ細胞を直接活性化することができ、それゆえ、Ｔ非依存性抗原（ＴＩ）として公知である。ＰＧＰは、Ｔ非依存性抗原である。
【００４７】
Ｔ依存性抗原は、いろいろな意味でＴ非依存性抗原とは相違する。最も顕著なことに、Ｔ依存性抗原は、免疫応答を非特異的に亢進させるアジュバントについての必要性において相違する。大部分の可溶性Ｔ依存性抗原は、アジュバントともに投与されない限り、低レベルの抗体応答しか惹起しない。凝集した形態へのＴＤ抗原の不溶化は、アジュバントの不在下でさえ、抗原の免疫原性を高めることもできる。対照的に、Ｔ非依存性抗原は、アジュバントの不在下で投与される場合、抗体応答を刺激することができるが、応答は一般的に、より低い程度およびより短い持続時間である。
【００４８】
Ｔ非依存性抗原とＴ依存性抗原の間の４つの他の差異は、以下のとおりである：（１）Ｔ依存性抗原は免疫応答を刺激することができ、それにより記憶応答は同じ抗原による二次的攻撃感染の際に惹起されることができるのに対し、Ｔ非依存性抗原は二次応答性について免疫系を刺激することができず、（２）抗原に対する抗体の親和性は、Ｔ依存性抗原を用いた免疫化後の時間とともに増大するが、Ｔ非依存性抗原では増大せず、（３）Ｔ依存性抗原は、Ｔ非依存性抗原よりも効果的に未熟なまたは新生の免疫系を刺激し、（４）Ｔ依存性抗原は通常、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＥ抗体を刺激するのに対し、Ｔ非依存性抗原は主として、ＩｇＭおよびＩｇＧ３抗体を刺激する。
【００４９】
Ｔ非依存性抗原に対する免疫応答を高めるための１つのアプローチは、抗原を１つ以上のＴ依存性抗原とコンジュゲーションさせることを包含する。この方法におけるＴ細胞の助力の動員は、高まった免疫性を提供することが示されている。ＣＤ４＋  Ｔ細胞の助力を動員することのできる免疫原性「担体」タンパク質に共有結合したＴ細胞非依存性抗原を含む結合型ワクチンは、高力価の防御性ＩｇＧ応答を惹起し、かつＴ非依存性抗原に対する免疫記憶を発生させることが示されている。
【００５０】
担体タンパク質は、Ｔ細胞の助力を活性化および動員することのできる任意のウイルス性、細菌性、寄生虫性、動物性、または真菌性タンパク質／トキソイドであり得る。例示的な担体タンパク質には、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、遺伝子的に解毒したジフテリア毒素（例えば、ＣＲＭ１９７）（ＤＴ）、百日咳トキソイド（ＰＴ）、組換え細胞外タンパク質Ａ（ｒＥＰＡ）、組換えブドウ球菌エンテロトキシンＣ１（ｒＳＥＣ）、コレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ）、髄膜炎菌Ｐ６４ｋタンパク質、組換えＰｏｒＢ（髄膜炎菌ポリン）、モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）外膜タンパク質ＣＤおよびＵｓｐＡ、組換えバチルス・アンシラシス（Bacillus anthracis）防御性抗原、組換えニューモリシンＰｌｙ、自己溶菌酵素（Ａｌｙ）、クレブシエラ肺炎桿菌ＯｍｐＡタンパク質、鞭毛、分類不可能なヘモフィルス属インフルエンザ外膜タンパク質Ｐ６、組換えクレブシエラ肺炎桿菌外膜４０−ｋＤａタンパク質（Ｐ４０）、および髄膜炎菌由来の外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、一連のｐａｎＨＬＡ−ＤＲ結合ペプチド（Ｐａｎ  ＤＲヘルパーＴ細胞エピトープ；ＰＡＤＲＥ）も担体タンパク質として用いられており、天然Ｔ細胞エピトープよりもおよそ１，０００倍強力であることが発見された。歴史的に、約１：１〜５０：１のＴＩ：ＴＤモル比を有する結合型ワクチンは、非常に免疫原性でありかつ有効なワクチン抗原として機能することが発見された。
【００５１】
したがって、本発明の一態様において、ＰＧＰは、タンパク質、トキソイド、ペプチド、Ｔ細胞もしくはＢ細胞アジュバント、リポタンパク質、熱ショックタンパク質、Ｔ細胞スーパー抗原、および／または細菌性外膜タンパク質に共有結合する。別の態様において、ＰＧＰは、アルブミン、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、ＣＲＭ１９７、ｒＥＰＡ、百日咳トキソイド（ＰＴ）、ＫＬＨ、外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、および／またはＰａｎ  ＤＲヘルパーＴ細胞エピトープ（ＰＡＤＲＥ）に共有結合する。本発明の一態様において、ＰＧＰと担体タンパク質とのモル比は、約１：１〜５０：１である。本発明の別の態様において、ＰＧＰと担体タンパク質のモル比は、約１：１、５：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、または５０：１である。
【００５２】
Ｔ細胞依存性抗原をＴ細胞非依存性抗原にコンジュゲーションするための方法は、当該技術分野において公知である。担体化合物は、Ｔ細胞非依存性抗原に直接結合し得るか、またはリンカーを通じて結合され得る。一般に、少なくとも１つの部分は、他の分子に共有結合できるようにするよう「活性化され」なければならない。多くのコンジュゲーション法は、当該技術分野において公知である（例えば、Ｄｉｃｋ  Ｗ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｎｔｒｉｂ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １０：４８−１１４  （１９８９）、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  Ｇ．Ｔ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ２nd  Ｅｄ．  （２００８）、ならびに米国特許第５，８４９，３０１号および同第５，９５５，０７９号を参照されたい）。結合体（コンジュゲート）は、例えば、米国特許第４，３６５，１７０号および同第４，６７３，５４７号に記載されるような、直接的な還元的アミノ化法によって調製されることができる。コンジュゲーション法はあるいは、シアン酸エステルを形成するための１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフロオロボラート（ＣＤＡＰ）を用いたＴ細胞非依存性抗原のヒドロキシル基の活性化に依存し得る。次に、活性化型抗原は、担体タンパク質上のアミノ基に直接的にまたは間接的に（リンカー基を介して）結合し得る。例えば、シアン酸エステルは、ヘキサンジアミンまたはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨまたはＡＨ）とカップリングした後に、担体タンパク質上のカルボキシル基を介してカルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣまたはＥＤＣ）化学作用を用いて、担体タンパク質にコンジュゲーションすることができる。このようなコンジュゲートは、国際公開第９３／１５７６０号、国際公開第９５／０８３４８号、および国際公開第９６／２９０９４号に記載される。
【００５３】
一般に、タンパク質担体における以下の種類の化学基は、以下のカップリング／コンジュゲーションに用いられることができる：（１）カルボジイミド化学作用を用いてＴ非依存性部分における天然のまたは誘導体化されたアミノ基にコンジュゲーションし得るカルボキシル（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸を介する）、（２）カルボジイミド化学作用を用いてＴ非依存性部分における天然のまたは誘導体化されたカルボキシル基にコンジュゲーションし得るアミノ基（例えば、リジンを介する）、（３）スルフヒドリル（例えば、システインを介する）、（４）ヒドロキシル基（例えば、チロシンを介する）、（５）イミダゾール基（例えば、ヒスチジンを介する）、（６）グアニドール基（例えば、アルギニンを介する）、および（７）インドリル基（例えば、トリプトファンを介する）。Ｔ細胞非依存性抗原において、以下の基、すなわちＯＨ、ＣＯＯＨ、またはＮＨ2をカップリングに用いることができる。アルデヒド基は、過ヨウ素酸塩、酸加水分解、過酸化水素などを含む、当該技術分野で公知の異なる処理によって発生することができる。
【００５４】
上記のように、ＴＩ部分とＴＤ部分の間のコンジュゲーションは、間接的にまたは直接的にのいずれかで進行し得る。特定の場合において、ＴＩ部分とＴＤ部分を組み合わせるプロセスは、望ましくない副作用をもたらし得る。例えば、直接的なカップリングは、互いに非常に近接してＴＩ部分およびＴＤ部分を配置して、この２つの部分間の過剰な架橋の形成を促進することができる。このような条件の極みにおいて結果として生じるコンジュゲート産物は、（例えば、ゲル化した状態で）不必要に粘度が高くなる可能性がある。
【００５５】
過剰な架橋は、結果として生じるコンジュゲート産物の低下した免疫原性も結果的に生じうる。加えて、架橋は、外来エピトープのコンジュゲートへの導入を結果として生じるか、またはそれに代わるものとして、有用なワクチンの製造に有害である可能性がある。過剰の架橋の導入は、この問題を悪化させる。
【００５６】
ＴＩ部分とＴＤ部分の間の架橋の制御は、各々における活性基の数、基の濃度、反応のｐＨ、緩衝液組成、温度、リンカーの使用、および当業者に周知の他の手段によって制御することができる（例えば、米国特許出願公開第２００５／０１６９９４１号を参照されたい）。
【００５７】
例えば、リンカーは、架橋の程度を制御するために、ＴＩ部分とＴＤ部分の間に提供されてもよい。リンカーは、分子間の物理的分離を維持するのを助け、望ましくない架橋の数を制限するために用いられることができる。追加的な利点として、リンカーは、結果として生じるコンジュゲートの構造を制御するためにも用いられることができる。コンジュゲートが正確な構造を有さない場合、免疫原性に不利に影響を及ぼし得る問題が結果として生じ得る。あまりにも速すぎるかまたはあまりにも遅すぎるかのいずれかのカップリング速度は、結果として生じるコンジュゲート産物の全体的な収量、構造、および免疫原性に影響を及ぼす可能性がある（例えば、Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  １５２：  ３６１  （１９８０）を参照されたい）。
【００５８】
これらの考慮を踏まえて、本発明者らは、実施例３および７に示すように、非常に免疫原性の高いＰＧＰコンジュゲートを製造するコンジュゲーション法を開発した。一態様において、ＰＧＰ分子は、リンカーを通じてＴＤ部分に結合する。さらに別の態様において、リンカーは、ＴＤ部分へのカップリングの前にＰＧＰに結合する。したがって、一態様において、本発明は、ＰＧＰのＴ細胞依存性抗原へのチオ−エーテルカップリングに関する。別の態様において、本発明は、ＰＧＰのＴ細胞依存性抗原へのカルボキシルカップリングに関する。さらに別の態様において、本発明は、ＰＧＰのＴ細胞依存性抗原へのコンジュゲーションのためのオキシム化学作用の使用に関する。
【００５９】
免疫原性組成物
本発明は、本発明のＰＧＰ抗原を含む免疫原性組成物にも関する。本発明の組成物は、多くのインビボおよびインビトロでの目的に有用である。例えば、本発明の組成物は、ブドウ球菌感染およびＰＧＰを含む他の種の細菌によって生じる感染を予防するためのヒトおよび動物の能動免疫化のためのワクチンとして、ＰＧＰ部分を発現するグラム陽性細菌による感染を予防または治療するために他のヒトまたは動物に投与されることのできる抗ＰＧＰ抗体を製造するためのヒトまたは動物の免疫化のためのワクチンとして、このような細菌による感染を予防することのできるモノクローナル抗体、抗体を作製することに関与する遺伝子のライブラリー、またはペプチド模倣薬など、重要な生物製剤についてスクリーニングするための抗原として、ブドウ球菌感染およびＰＧＰを含む他の種の細菌によって生じる感染のための診断試薬として、ならびにブドウ球菌感染およびＰＧＰを含む他の種の細菌によって生じる感染に対するヒトまたは動物の感受性に関して、ヒトまたは動物の免疫学的状態を決定するための診断試薬として、抗体応答を生じるのに有用である。
【００６０】
本発明の組成物は、抗原に対する免疫応答を誘発することのできる任意の対象に投与され得るが、免疫応答を生じることができ、かつブドウ球菌感染症を発症する危険がある対象におけるブドウ球菌により生じる全身感染に対する能動免疫を誘導するのに特に適している。「免疫応答を生じることができかつブドウ球菌感染症を発症する危険がある対象」は、環境中のブドウ球菌またはＰＧＰ部分を発現する他のグラム陽性細菌に曝露される危険がある免疫系を保有する哺乳類である。例えば、入院患者は、病院環境における細菌への曝露の結果として感染症を発症する危険がある。黄色ブドウ球菌による感染症を発症することについての高リスク集団には、例えば、透析中の腎疾患患者、および高リスクの手術を受けている個体が挙げられる。表皮ブドウ球菌による感染症を発症させることについての高リスク集団には、例えば、留置型医用デバイスを有する患者が挙げられる。いくつかの実施態様において、対象は、医用デバイスインプラントを受容したことのある対象であり、他の実施態様において、対象は、医用デバイスインプラントを受容したことがないものである。
【００６１】
本発明の組成物は、抗体応答を誘導するための有効量で対象に投与される。「抗体応答を誘導するための有効量」は、本明細書で使用する場合、例えば、（１）対象における抗ＰＧＰ抗体の産生を誘導すること、記憶細胞の産生を誘導すること、および細胞毒性リンパ球反応をおそらく誘導することなどによって、対象自体の免疫保護を生じる上で対象を支援し、および／または（２）ＰＧＰ部分を発現するグラム陽性細菌に曝露された対象において感染が生じるのを予防するのに十分なＰＧＰの量である。当業者は、当該技術分野で公知の常規の方法によって、ＰＧＰの量が能動免疫を誘導するのに十分であるかどうかを評価することができる。
【００６２】
一般に、治療目的のために投与される場合、本発明の製剤は、医薬として許容し得る溶液において適用される。このような調製物は、医薬として許容し得る濃度の塩、緩衝剤、保存料、適合性のある担体、アジュバント、および／または他の治療成分を常規的に含んでもよい。本発明の組成物を製剤するのに好適な担体媒体には、リン酸ナトリウム緩衝生理食塩水および他の慣用媒体が挙げられる。好適な緩衝剤には、酢酸および塩（１〜２％（ｗ／ｖ））、クエン酸および塩（１〜３％（ｗ／ｖ））、ホウ酸および塩（０．５〜２．５％（ｗ／ｖ））、ならびにリン酸および塩（０．８〜２％（ｗ／ｖ））が挙げられる。好適な保存料には、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％（ｗ／ｖ））、クロロブタノール（０．３〜０．９％（ｗ／ｖ））、パラベン（０．０１〜０．２５％（ｗ／ｖ））、およびチメロサール（０．００４〜０．０２％（ｗ／ｖ））が挙げられる。一般的に、本発明の組成物は、約５〜約１００μｇの抗原を含む。他の実施態様において、本発明の組成物は、約１０〜５０μｇの抗原を含む。
【００６３】
本発明の組成物には、アジュバントも含んでもよい。用語「アジュバント」には、本発明のＰＧＰに組み込まれるかまたはＰＧＰと同時に投与され、対象における免疫応答を増強する任意の物質が含まれる。アジュバントには、アルミニウム化合物（例えば、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム）、およびフロイント完全または不完全アジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。アジュバント特性を有する他の材料には、ＴＬＲリガンド（例えば、ＴＬＲ９アゴニストＣｐＧ−ＯＤＮ）、ＢＣＧ（弱毒化ヒト型結核菌）、リン酸カルシウム、レバミソール、イソプリノシン、多価陰イオン（例えば、ポリＡ：Ｕ）、レンチナン、百日咳毒素、リピドＡ、サポニン、ＱＳ−２１、およびペプチド（例えば、ムラミルジペプチド）が挙げられる。レアアース塩（例えば、ランタン及びセリウム）もアジュバントとして使用されうる。アジュバントの量は、過度の実験をせずに、当業者によって容易に決定されることができる。
【００６４】
本発明は、本発明のＰＧＰを１つ以上の医薬として許容し得る担体および任意に他の治療成分とともに含む、医療用途のための医薬組成物を提供する。用語「医薬として許容し得る担体」は、本明細書で使用する場合、およびより完全に下記に説明されるように、１つ以上の適合性のある固体または液体の充填剤、希釈剤、またはヒトもしくは他の動物への投与に好適な封入物質を意味する。
【００６５】
非経口投与に好適な組成物は簡便に、レシピエントの血液と等張性であることができるＰＧＰの滅菌水性調製物を含む。採用され得る許容し得るビヒクルおよび溶媒には、水、リンゲル液、および等張性塩化ナトリウム溶液がある。加えて、滅菌固定油は、溶媒または懸濁媒として従来どおり採用される。この目的のために、合成モノまたはジ−グリセリドを含む任意の無刺激性固定油が採用され得る。加えて、オレイン酸などの脂肪酸が、注射液の調製において利用される。皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内等の投与に好適な担体製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａにおいて見出され得る。
【００６６】
本発明の調製物は、有効量で投与される。有効量は、先に論議されたように、単独でまたはさらなる用量とともに、能動免疫を誘導するＰＧＰ抗原の量である。投与の様式に応じて、１ナノグラム／キログラム〜１００ミリグラム／キログラムの薬用量範囲が有効であろうと考えられる。一実施態様において、薬用量範囲は、５００ナノグラム〜５００マイクログラム／キログラムである。別の実施態様において、薬用量範囲は、１マイクログラム〜１００マイクログラム／キログラムである。絶対量は、投与が、細菌に感染していない高リスク対象に関して、または感染をすでに有している対象に関して実施されたかどうか、併用治療、投薬回数、ならびに年齢、健康状態、大きさ、および体重を含む個々の患者のパラメータを含む種々の因子によるであろう。これらは、当業者に周知の因子であり、常規の実験のみを用いて取り扱える。一般的に、信頼できる医学的判断に従って最高安全用量である最大用量が用いられるべきである。
【００６７】
複数用量の本発明の医薬組成物が熟慮される。一般的に、複数用量の免疫化スキームは、高用量の抗原に続いて、数週間の待機期間の後、その後のより低用量の抗原の投与を包含する。さらなる用量は、同様に投与されてもよい。細菌感染に対する免疫応答および／または感染からのその後の防御を結果として生じる任意の治療方式を用いてもよい。複数用量の送達のための所望の時間間隔は、常規の実験のみを採用する当業者によって決定されることができる。
【００６８】
種々の投与経路が利用可能である。選択される特定の様式は、治療途中の特定の容態および治療効能に必要な薬用量に依存するであろう。本発明の方法は、一般的にいえば、医学的に許容し得る任意の投与様式を用いて実施され得、有効レベルの免疫応答を、臨床的に許容し得ない有害な効果を生じずに引き起こす任意の様式を意味する。一実施態様において、投与様式は非経口的である。用語「非経口的」には、皮下注射、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内注射、または輸注技術が含まれる。他の経路には、経口、鼻内、皮膚、舌下、および局所が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
組成物は、単位薬用量形態で簡便に提示され得、薬学の分野において周知の方法のいずれかによって調製され得る。他の送達系には、時間放出、遅延放出、または持続放出送達系が含まれることができる。多くの種類の放出送達系が、利用可能であり、および当業者に公知である。放出送達系には、ポリ乳酸およびポリグリコール酸、ポリ無水物、ならびにポリカプロラクトンなどのポリマーベースの系、コレステロール、コレステロールエステルなどのステロールと、ならびに脂肪酸またはモノ−、ジ−、およびトリグリセリドなどの中性脂肪とを含む脂質である非ポリマー系、ヒドロゲル放出系、シラスティック系、ペプチドベースの系、ワックス被膜、従来の結合剤および賦形剤を用いた圧縮錠剤、部分的に融合したインプラントなどが挙げられる。
【００７０】
本発明のＰＧＰ抗原は、他の活性剤とともに送達されてもよい。例えば、ＰＧＰは、１つ以上の抗生物質、細菌抗原などの１つ以上の他の抗原、および／または１つ以上の抗細菌性抗体とともに送達されてもよい。このような薬剤は当業者に公知である。ＰＧＰおよび他の活性剤は、同じ組成物中で併合されてもよく、または別個の組成物において投与されてもよい。別個の組成物において投与される場合、ＰＧＰ組成物は、他の組成物と同時に投与されてもよいかまたは、他の組成物と連続して投与されてもよい。
【００７１】
本発明の他の実施態様は、本明細書に開示される本発明の明細および実施に関する考慮から当業者に明らかであろう。明細および実施例が、例示的としてのみ考慮されるべきであること、それとともに本発明の真の範囲および精神が、以下の特許請求の範囲によって示されるべきであることは意図される。
【実施例】
【００７２】
実施例
実施例１．ＰＧＰの合成
ＰＧＰにおける反復単位がホスホグリセロールであるので、反復するポリマーが、適切な置換ホスホラミダイトモノマーを調製し、それをＤＮＡ合成装置において徐々に伸長させることによって合成され得ることが仮定された。その目的のために、ホスホラミダイトシントンを必要とした。ホスホラミダイトを設計し、この中で、２−ＯＨを、固相合成の間の樹脂からのポリマーの切断の間に、水酸化アンモニウムを用いて脱保護されるであろうベンゾイルエステルとして保護した。２−ＯＨが保護されたホスホラミダイトを製造するための合成スキームを図２に示す。
【００７３】
簡潔には、ホスホラミダイトを合成するために、Ｃ−２で所望のキラリティを維持しながら、直角に切断可能な保護基を、キラル的に純粋なアセトニドから出発するグリセロールのアルコールにおいて調製した。図２のスキームは、多様な保護スキームを試験した後に開発した、成功裏の経路を示す。化合物１のアルコール基をそのレブリン酸エステルとして保護した後、水性酢酸によりアセトニドを脱保護した。レブリン酸エステル３の第一級アルコールを、ＤＮＡ合成装置に必要とされるように、そのジメチオキシトリチルとして保護した。２−ＯＨをそのベンゾイルエステルとして保護し、レブリン酸エステルをピリジン緩衝ヒドラジンにより切断した。アルコール６をホスフィン７と組み合わせて、クロリドを用いる標準的なホスファイト化条件下で、所望のホスホラミダイト８を得た。すべての工程の収率は、７０％超であった。
【００７４】
図２に示される合成スキームに関するさらなる詳細を下記に示す：
【００７５】
（Ｓ）−（＋）−１，２−イソプロピリデン−グリセロ−３−イルレブリン酸エステル２：ジクロロメタン（２００ｍＬ）中の（Ｓ）−（＋）−１，２−イソプロピリデングリセロール１（１５．００ｇ、０．１１４モル、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｓ，  ＭＯ）の溶液に、レブリン酸（１３．２ｇ、１．１１４モル、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）およびＤＭＡＰ（２．７８ｇ、０．０２３モル、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を添加した。撹拌した溶液に、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、２６．１５ｇ、０．１１４モル、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）の溶液を滴下して添加した。反応物を４時間撹拌し、沈殿したＤＣＵを濾過により除去した。反応は、ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル（１／１）、ＰＭＡ発色）によって完了していることが示された。反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム溶液および鹹水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮して、２（２５．７ｇ、９８．２％収率）を無色の油として生じた。
【００７６】
（Ｓ）−（＋）−グリセロ−３−イルレブリン酸エステル３：溶液ＡｃＯＨ／Ｈ2Ｏ（３／１、１２０ｍＬ）にアセトニド２（２５．０ｇ）を添加した。反応混合物を５０℃の油浴において１６時間加熱した。反応混合物を粘性のある油に濃縮し、キシレンから２回共蒸発させた。粗製物の画分（１６ｇ）を、ヘキサン／酢酸エチル（１／２）を溶離剤としてまず用いた後、１００％の酢酸エチルを用いるシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。生成物を含む画分をプールし、濃縮して３（１０．２ｇ）を生じた。
【００７７】
（Ｓ）−（＋）−１−ＤＭＴ−グリセロ−３−イルレブリン酸エステル４：無水ピリジン（２００ｍＬ）中のジオール３（７．３５ｇ、３８．６ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化ジメトキシトリチル（１３．１ｇ、３８．６ｍｍｏｌ、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）の溶液を滴下して添加した。室温で２時間撹拌した後、反応は、ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル（１／２）、紫外線および酸発色）によって完了していることが示された。溶媒をロータリーエバポレータにおいて除去し、ジクロロメタンに溶解し、飽和重炭酸ナトリウムおよび鹹水で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮して、淡黄色を与えた。粗生成物をキシレンから共蒸発させた（２回）。生成物をフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。
【００７８】
（Ｓ）−（＋）−１−ＤＭＴ−２−ベンゾアート−グリセロ−３−イルレブリン酸エステル５：無水ピリジン中の４（１１．６０ｇ、２３．６ｍｍｏｌ）の溶液に、無水ピリジン（６ｍＬ）中の塩化ベンゾイル（４．１５ｇ、２．９５ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応混合物を室温で１．５時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル（１／１））は、生成物への優れた変換を示した。溶媒をロータリーエバポレータにおいて除去し、ジクロロメタンに溶解し、飽和重炭酸ナトリウムおよび鹹水で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮して、淡黄色を与えた。粗生成物をキシレンから共蒸発させた（２回）。生成物をフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、６．５ｇの５を粘性のある油として生じた。
【００７９】
（Ｓ）−（＋）−１−ＤＭＴ−２−ベンゾアート−グリセロール６：ピリジン／ＡｃＯＨ（３／２、２０ｍＬ）中の１Ｍヒドラジン水和物の溶液（１．２１ｍＬ；２．０１ｍｍｏｌ）。ピリジン中の５（６．００ｇ、１０．１ｍｍｏｌ）の溶液に、ヒドラジン／ピリジン／ＡｃＯＨ溶液を添加し、反応混合物を室温で１．５時間撹拌した。ＴＬＣは、出発材料５の完全な消費を示した（出発材料５のＲｆは、生成物よりもわずかに低い）。溶媒をロータリーエバポレータにおいて除去し、残渣をジクロロメタンに溶解し、飽和重炭酸ナトリウム（２回）、５％ＬｉＣｌ、および鹹水で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、および濃縮して、粘性のある油を与えた。生成物を、ヘキサン中の５％トリエチルアミン、ヘキサン、およびヘキサン／酢酸エチル（３／１）で連続してあらかじめ平衡化したシリカゲルカラム上でのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。粗生成物をカラムに適用し、ヘキサン／酢酸エチル（３／１）でまず溶出して、高いＲｆの不純物を除去した後、ヘキサン／酢酸エチル（２／１）で溶出した。生成物を含む画分をプールし、濃縮して、６（４．０ｇ）を粘性のある油として生じた。
【００８０】
アミダイト８：無水条件下で、無水ＤＣＭ（３０ｍＬ）中のアルコール６（３．８０ｇ、７．６２ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．１等価物）の溶液に、３−（（クロロ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ）オキシ）プロパンニトリル（２．２５ｇ、２．０ｍＬ、Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ，  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  ＭＡ）を注射器によって滴下して添加した。反応混合物を室温で３０分間撹拌し、反応は、ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル／ＴＥＡ（６７／３３／２）、紫外線および酸発色）によって完了していることが示された。ＭｅＯＨ（１ｍＬ）を反応混合物に添加し、反応混合物を５分間撹拌した後、ロータリーエバポレータにおいて濃縮乾固させた。残渣をジクロロメタンに溶解し、飽和重炭酸ナトリウム（２回）および鹹水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮して、無色の油を与えた。生成物を、ヘキサン中の５％トリエチルアミン、ヘキサン、およびヘキサン／酢酸エチル（２／１）で連続してあらかじめ平衡化しておいたシリカゲルカラム上でのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。粗生成物をカラムに適用し、ヘキサン／酢酸エチル（３／１）でまず溶出して、高いＲｆの不純物を除去した後、ヘキサン／酢酸エチル（２／１）で溶出した。生成物を含む画分をプールし、濃縮して、８（４．２ｇ、７８．９％）を粘性のある油となるまで濃縮した。
【００８１】
ホスファートＰＧＰ−１２−マー−ヘキシルアミノ合成：１つの末端にアミノ基を、そして、他の末端にホスファートを組み込んだＰＧＰの合成を、ＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅのＰｏｌｙＰｌｅｘ  Ｏｌｉｇｏ合成装置および３’−Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ７  ＣＰＧ支持体（Ａｌｌｅｌｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いるＡｌｌｅｌｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （ｗｗｗ．ａｌｌｅｌｅｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ）における標準的な固体支持体ＤＮＡ合成法を用いて達成した。各サイクルにおいて、アミダイト８（３５〜４０当量）を用いた。１２サイクルの後、ポリマーを脱保護し、標準的な水酸化アンモニウム開裂条件、すなわち、５５℃での水性水酸化アンモニウムを用いて開裂させた。生成物を粘性のある油として単離し、凍結乾燥した。凍結乾燥した生成物を、水中に再懸濁し、コンジュゲーションのために３Ｋ透析カセットを用いて脱塩した。
【００８２】
実施例２．パギバキシマブによるＰＧＰの認識
ＥＬＩＳＡプレート（９６ウェル）を４ｍｇ／ｍＬのパギバキシマブ（抗ＬＴＡ）、Ｚａｎｔｉｂｏｄｙ（抗ペプチドグリカン）、またはシナジス（Ｓｙｎａｇｉｓ）（抗ＲＳＶ）（これらはすべてキメラＩｇＧ１抗体である）を用いて一晩被覆した。ＰＧＰを、実施例１において先に説明した通り調製し、ＬＴＡを黄色ブドウ球菌から抽出した。両分子をビオチン化した後、ＥＬＩＳＡプレートに、表１に示される濃度で１時間添加した。次に、プレートを、セイヨウワサビペルオキシダーゼを用いて３０分間発色させた。表１は、各ウェルから得られた光学密度測定値を表す。これらの実験は、ＰＧＰが、ＬＴＡに特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（パギバキシマブ）によって認識されたことを示し、ＰＧＰが、ＰＧＰを含むグラム陽性細菌のための潜在的なワクチン標的であることを示唆する。
【００８３】
【表１】
2013510882.tif 000002
【００８４】
別個の実験において、ＥＬＩＳＡプレート（９６−ウェル）を４ｍｇ／ｍＬのパギバキシマブを用いて一晩被覆した。ＬＴＡをビオチン−ＰＴＰまたはビオチン−ＬＴＡに２時間添加した後、混合物をパギバキシマブで被覆したウェルに添加した。６０分後、プレートを洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼをさらに３０分間、添加した。表２は、過剰のＬＴＡの存在下でのパギバキシマブ被覆したウェルに対するＬＴＡまたはＰＧＰの結合のパーセント阻害を示す。これらの結果は、ＬＴＡが、パギバキシマブへのＰＧＰ結合を阻害することができることを示す。
【００８５】
【表２】
2013510882.tif 000003
【００８６】
実施例３．ＰＧＰのＴ細胞依存性担体へのコンジュゲーション
アミノリンカーを含むおよそ１．５ｍｇの粗合成ＰＧＰ１０マーを３００μＬの水に可溶化し、２ｋＤａカットオフを有する透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて水に対して透析した。透析した材料をｐＨ７．３にし、過剰のＧＭＢＳを用いて標識した。１時間後、遊離試薬を一晩の透析によって除去した。６ｍｇの破傷風トキソイド（Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａから得た）をｐＨ８にし、およそ５０倍モル過剰量のＳＰＤＰで標識した。一晩の反応後、溶液をｐＨ６．８に調整し、約２５ｍＭ  ＤＴＴにした。約３０分後、溶液を、ＰＢＳ＋５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ６．８で平衡化した１×１５ｃｍのＧ２５カラムで脱塩した。Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ４、３０ｋＤａカットオフデバイスを用いて、タンパク質画分を約６４ｍｇの最終濃度に濃縮した。次に、タンパク質を１０ＰＧＰ／ＴＴのおよその比でマレイミド−ＰＧＰと併合した。４時間後、溶液をＮ−エチルマレイミド中、約１０ｍＭにし、ｐＨを８に調整した。遊離試薬をＡｍｉｃｏｎデバイスを用いて、０．１Ｍホウ酸ナトリウム、ｐＨ９の反復した洗浄により除去した。タンパク質濃度をその吸光度から決定し、溶液をホスファートについてアッセイし、ＰＧＰ含有量を決定した。最終的なコンジュゲートは、およそ１０モルのＰＧＰ／１モルのＴＴを有することが見出された。
【００８７】
実施例４．ＰＧＰ−結合型ワクチンを用いたマウスの免疫化
１０のグリセロールリン酸モノマーを含む合成ＰＧＰ分子（ＰＧＰ10）を、実施例１において先に説明した方法を用いて製造した。次に、実施例３において先に説明したように、ＰＧＰにおけるヘキシルアミンリンカーを用いて、ＴＴ分子あたり約６のＰＧＰの比において、ＰＧＰ10を破傷風トキソイド（ＴＴ）に共有結合させた。マウスを１３μｇのミョウバンおよび７５μｇのＣｐＧ−ＯＤＮ中の１μｇのコンジュゲートで免疫化した（１群あたり７個体）。１４日後、マウスを追加的な１μｇの結合型ワクチンで追加免疫した。アジュバント分子ミョウバンおよびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の存在下でのＰＧＰ−ＴＴを腹腔内で（ｉ．ｐ．）用いたＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化および追加免疫は、ＰＧＰ特異的なＥＬＩＳＡによって測定されるように、高い力価の血清ＩｇＧ抗ＰＧＰ抗体を誘発した（図３）。血液を１、２、および３日後に尾静脈から得、コロニー計数をアガープレートにおいて実施した。この様式で免疫化したマウスは、ＴＴに共有結合した肺炎球菌莢膜多糖１４型（ＰＰＳ１４）（ＰＰＳ１４−ＴＴ）を含む結合型ワクチンを用いて類似の様式で免疫化したマウスと比較して、腹腔内感染後に血液から生きた黄色ブドウ球菌を迅速に除去した（図４）。
【００８８】
これらのデータは、ＰＧＰベースの結合型ワクチンが、複数種のブドウ球菌、およびＰＧＰ含有ＬＴＡを発現する他のグラム陽性細菌による感染に対する能動的な防御を提供することを示唆する。
【００８９】
実施例５．グリセロールリン酸モノマーの数の関数としてのＰＧＰ−コンジュゲートの免疫原性の最適化
本発明のＰＧＰ−コンジュゲートの免疫原性は、グリセロールリン酸モノマーの数の関数として最適化されることができる。この目的のために、例えば、５、１０、１５、および２０のグリセロールリン酸モノマーを含む一連のＰＧＰ分子を、実施例１において先に説明した通り合成することができる。ＰＧＰ分子は、リンカー部分を用いたその後の修飾のために、Ｃ６アミノ基で終止されることができる。生成物は、質量スペクトル分析によって特徴づけられることができる。これらのＰＧＰ分子は次に、実施例３において先に説明した通り、ＧＭＰワクチン等級のＴＴに共有結合することができる。
【００９０】
コンジュゲートを用いて、雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（５週齢）（１群あたり７個体）を免疫化することができる。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、他の株よりも黄色ブドウ球菌による感染に対してより感受性があることが発見され、より若齢のマウスは、より老齢のマウスよりも感受性がある。マウスに、１３μｇのミョウバン（Ａｌｌｈｙｄｒｏｇｅｌ  ２％）に吸着されたＰＧＰ−ＴＴコンジュゲート（０．２、１．０、５．０、または２５μｇ／個体）を腹腔内注射して、１４日後に類似の様式で追加免疫することができる。ＰＧＰ特異的ＩｇＧの力価を、尾静脈を通じて０、７、１４（一次）、２１、および２８（二次）日後に得られた血液から得られた血清試料から、ＥＬＩＳＡアッセイを利用して決定することができる。簡潔には、ＥＬＩＳＡプレートを、アビジンに続いてビオチン−ＰＧＰの添加で被覆することができる。プレートを次に、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡでブロッキングすることができる。次に、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中の１／５０希釈血清で出発する血清試料の３倍希釈物を添加することができる。次に、アルカリホスファターゼ結合型ポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、またはＩｇＧ２ａ抗体を、続いて、発色のために基質（ｐ−ニトロフェニルホスファート、二ナトリウム）を添加することができる。色相をＭｕｌｔｉｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ＥＬＩＳＡ読み取り装置における４０５ｎｍの吸光度で読み取ることができる。
【００９１】
複数の実験由来のデータを直接比較するために、ＰＧＰ特異的マウスＩｇＧ１モノクローナル抗体（クローンＭ１１０）を用いて標準曲線を作成することができる。血清はさらに、地域感染のメチシリン耐性（ＭＲＳＡ）ＮＲＳ１２３黄色ブドウ球菌（ＵＳＡ４００）、莢膜５型メチシリン感受性（ＭＳＳＡ）黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ４９５２１）、および表皮ブドウ球菌（Ｈａｙ株）をいずれも用いて、インビトロでのオプソニン化貪食作用活性について試験することができる。これらの株は、公知の臨床的関連性を有する。黄色ブドウ球菌は、表皮ブドウ球菌よりも強毒であり、そのため、インビボでの感染モデルにおける使用により適しており、なぜなら、後者は、感染性について極度に高い用量を必要とするからである。しかしながら、表皮ブドウ球菌に対するインビボでの防御は、インビトロでのオプソニン化貪食作用アッセイ単独を通じて強く暗示されることができ、特に、これらのパラメータが黄色ブドウ球菌を用いて相関する場合、そうである。血清抗原特異的ＩｇＧ力価およびオプソニン化貪食作用は、インビボでの宿主保護とよく相関することが期待される。
【００９２】
黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌は、標準的な増殖プロトコールを用いて対数増殖期中期まで増殖することができる。細菌数は、血液アガープレートにおけるコロニー計数によって決定されることができる。黄色ブドウ球菌は、非致死量だが感染量である可変量（５×１０6、１×１０7、および２×１０7ＣＦＵ／個体）で静脈内注射することができる。細菌コロニー計数のための血液は、１、２、および３日後に得ることができ、脾臓、肝臓、および腎臓からのコロニー計数は、７日後に決定することができる。
【００９３】
オプソニン化貪食作用アッセイは、すでに説明した通り実施することができる（Ｒｏｍｅｒｏ−Ｓｔｅｉｎｅｒ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ４：４１５−４２２  （１９９７））。簡潔には、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを用いて好中球に分化させたＨＬ−６０細胞（ヒト前骨髄球性白血病）（４０μＬ体積中、４×１０5個の細胞）を用いて、血清を黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌に対するオプソニン化貪食作用活性（力価）について試験することができる。４００／１のエフェクター［好中球］／標的［細菌］比を用いることができる。免疫血清の存在下または不在下でのＨＬ−６０細胞培養物における細菌コロニー計数をスコア化して、抗ＬＴＡ  ｍＡｂ（パギバキシマブ）をポジティブコントロールとして用いて力価を算出することができる。オプソニン化貪食作用力価は、対照ウェルにおける増殖と比較して、５０％超の殺滅を示す血清希釈倍率の逆数である。言い換えれば、免疫化していないマウス由来の血清と比較して、播種した細菌の５０％超の殺滅をもたらす血清希釈を、「血清希釈倍率の逆数」として用いる。したがって、１／１００よりも希釈した血清が５０％超の細胞を殺滅しないのに対し、１／１００の血清希釈が殺滅する場合、用いられる数は１００である（すなわち、１／１００の逆数）。
【００９４】
インビトロでＰＧＰ特異的ＩｇＧおよび／またはオプソニン化貪食作用活性の最高血清力価を生じる各コンジュゲートの最低用量を、最初の３日間の間の菌血症のレベルならびに７日後に脾臓、肝臓、および腎臓から得られる黄色ブドウ球菌のコロニー計測数によって反映される、生きたＭＲＳＡおよびＭＳＳＡ黄色ブドウ球菌による静脈内攻撃感染に対する宿主防御を与えるコンジュゲートの能力を直接比較するために選択することができる。３つの非致死量の細菌（５×１０6、１×１０7、および２×１０7  ＣＦＵ／個体）を、二次免疫化の２週間後に、１群あたり７個体のＢＡＬＢ／ｃマウスへと静脈内注射することができる。細菌に感染していないいくつかの追加的なマウス由来の血液試料を、ネガティブコントロールとして用いることができる。免疫していないかまたは無関係な肺炎球菌ワクチンで免疫化したかのいずれかである感染したマウスを、ポジティブコントロールとして用いることができる。
【００９５】
より長いポリマー長は、ＰＧＰ特異的ＩｇＧのより高い血清力価と相関すると期待される。より高い血清力価は、生細菌を用いた、より高いレベルのインビトロでのオプソニン化貪食作用活性およびより良好な宿主防御を生じるようである。
【００９６】
実施例６．ＰＧＰ：担体タンパク質の比の関数としてのＰＧＰ−コンジュゲートの免疫原性の最適化
本発明のＰＧＰ−コンジュゲートの免疫原性を、ＰＧＰの担体タンパク質に対する比の関数として測定することができる。この目的のために、一連のＰＧＰ−ＴＴコンジュゲートを、実施例５において先に決定した最適なポリマー長のＰＧＰ、および実施例３に示したおよそ１０、２０、および３０のＰＧＰ：ＴＴ比のコンジュゲーションプロトコールを用いて合成することができる。これは、Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スクシニミドエステル（ＧＭＢＳ）のＴＴタンパク質に対するモル比を変動させて、反応部位の数を増加させることによって達成されることができる。免疫化および防御性ＰＧＰ特異的ＩｇＧ応答の分析を、実施例５において先に論議された通り実施することができる。
【００９７】
より高いＰＧＰ：ＴＴモル比は、ＰＧＰ特異的ＩｇＧのより高い血清力価と相関すると期待される。より高い血清力価は、生細菌を用いた、インビトロでのより高いレベルのオプソニン化貪食作用活性およびより良好な宿主防御を生じるようである。
【００９８】
実施例７．代替的なコンジュゲーション化学作用
ＰＧＰは、実施例３において先に説明したヘキシルアミンに加えて、アルデヒドリンカーを用いて、およびカルボキシルリンカーを用いて、合成されることができる。ＴＴは、ヒドラジドまたはアミノ−オキシ基を用いて官能化することができる（例えば、ＷＯ／２００５／０７２７７８およびＬｏｐｅｚ−Ａｃｏｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ，  ２４：７１６  （２００６）を参照されたい）。ＰＧＰおよびＴＴは、下記に示される化学作用のうちの１つを用いてカップリングすることができる。
【００９９】
タンパク質アミンに対するチオ−エーテルカップリング。ＰＧＰ−ＮＨ2を、０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８中で１０ｍｇ／ｍＬで可溶化することができる。２倍モル過剰量のスルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰを固体として、撹拌しながら添加することができる。１時間後、ｐＨをｐＨ５に低下させることができ、溶液を２５ｍＭのＤＴＴにすることができる。３０分後、溶液を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ５で平衡化しておいたＧ１０脱塩カラムにおいて脱塩することができる。ボイド容量をプールし、ＤＴＮＢアッセイ（Ｅｌｌｍａｎ  Ｇ．  Ｌ．  １９５９．  Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ８２：７０−７７）を用いてチオールについて、およびホスファートについてアッセイすることができる。脱気した緩衝液を用いることができ、チオール化ＰＧＰをアルゴン下で維持することができる。タンパク質を０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８中で１０ｍｇ／ｍＬに可溶化することができ、０〜５０モル／モルタンパク質でＮＨＳブロモ酢酸を用いて、可変レベルまでブロモアセチル化することができる。４℃で２時間後、各々を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５デバイス（ＴＴおよびＣＲＭ１９７についてそれぞれ３０  ｋＤａおよび１０  ｋＤａカットオフ）を用いて繰り返し洗浄することによって、同じ緩衝液へと脱塩することができる。残余のアミンを、ＴＮＢＳを用いてアッセイすることができ（Ｖｉｄａｌ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ８６：１５５−１５６  （１９８６））、誘導体化の程度を、天然タンパク質由来の遊離アミンの減少から決定することができる。タンパク質の最終濃度を１０ｍｇ／ｍＬにすることができ、溶液をアルゴンで徐々に脱気することができる。ＰＧＨ−ＳＨおよびブロモアセチル化したタンパク質を、ブロモアセチル基に対して１．５：１のモル過剰量のＰＧＰで併合し、ｐＨを８に調整し、反応混合物をアルゴン下で４℃で撹拌することができる。コンジュゲーション速度を、周期的なサンプリング、メルカプトエタノールによって一定分量をクエンチングすること、およびＳＤＳ  ＰＡＧＥによって評価することによって決定することができる。残余の活性基をメルカプトエタノールでクエンチングし、そして、ＨＥＰＥＳで平衡化しておいたＳ１００ＨＲカラムにおけるサイズ排除クロマトグラフィーによって、コンジュゲーションしていないＰＧＰを除去することができる。ＰＧＰを有さない対照コンジュゲートを、ブロモアセチル化したタンパク質をメルカプトエタノールとともにインキュベートすることによって生成することができる。
【０１００】
タンパク質カルボキシルへのカップリング。ＰＧＰ−ＣＯ2Ｈを以下の通りカップリングすることができる。ヒドラジド−タンパク質（Ｈｚ−タンパク質）を、０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ５中、５ｍｇ／ｍＬおよびアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）中、０．２５ＭのＴＴを併合することによって調製することができる。５ｍｇ／ｍＬのＥＤＣを添加することができ、ｐＨを５．５に２時間維持することができる。溶液を酢酸ナトリウムｐＨ５．５の添加によってクエンチングした後、ＭＥＳ緩衝液で平衡化しておいたＧ２５カラムにおいて脱塩することができ、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５デバイスを用いて１０ｍｇ／ｍＬに濃縮することができる。誘導体化の程度を、ＴＮＢＳを用いて決定することができる。ＰＧＰ−ＣＯ2Ｈをタンパク質−ヒドラジド溶液に、５０：１のモル比で添加することができ、溶液をカルボジイミド中で５ｍＭとすることができる。一晩のインキュベーション後、ｐＨを８に上昇させることができ、コンジュゲーションしていないＰＧＰをサイズ排除クロマトグラフィーによって除去することができる。
【０１０１】
タンパク質アミンへのカップリングのための代替的な化学作用。ＰＧＰ−Ａｌｄを、オキシム化学作用を用いてカップリングさせることができる。アミノ−オキシタンパク質（ＡＯ−タンパク質）をすでに説明した通り調製することができる（Ｌｅｅｓ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ，  ２４：７１６−７２９  （２００６））。簡潔には、タンパク質を先に説明した通りブロモアセチル化した後、２倍過剰量のチオール−アミノオキシ試薬と反応させ、その後、ｐＨ５の酢酸緩衝液へと脱塩し、２０ｍｇ／ｍＬに濃縮することができる。０．１Ｍの酢酸ナトリウム＋５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ５中の１０ｍｇ／ｍＬのＰＧＰ−Ａｌｄを、１．１：１のモル比でＡＯ−タンパク質と併合することができ、５ｍＭのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを生成することができる。４時間後、反応溶液を５ｍＭのアセトアルデヒドとすることができ、コンジュゲーションしていないＰＧＰをサイズ排除クロマトグラフィーによって除去することができる。
【０１０２】
すべての場合において、官能化の程度を、天然タンパク質との差異から決定することができる。ヒドラジドまたはアミノオキシ基を、ＴＮＢＳおよび、ＡＤＨまたはアミノオキシ酢酸のいずれかを標準物質として用いる５５０ｎｍでの吸光度を用いて決定することができる。タンパク質濃度を、２８０ｎｍの吸光度および励起係数から決定することができる。ＰＧＰ濃度を、ホスファートアッセイを用いて決定することができる。ＰＧＰのモルを、ＰＧＰあたりのホスファートモル／反復基数から算出することができ、負荷をＰＧＰモル／タンパク質モルから決定することができる。コンジュゲーションは、検出抗体として抗ＬＴＡ  ｍＡｂを用いるウェスタンブロットを用いて評価することができ、抗ＴＴまたは抗ＣＲＭ１９７を捕捉抗体として、および抗ＬＴＡ  ｍＡｂを検出抗体として用いる二重ＥＬＩＳＡを用いてさらに確認することができる。凝集は免疫原性に影響を及ぼす可能性があるので、コンジュゲートは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  Ｇ４０００カラムを用いるＳＥＣ  ＨＰＬＣによって分析することができる。コンジュゲーションしていないＰＧＰをサイズ排除クロマトグラフィーによって除去することができ、なぜなら、先行研究は、コンジュゲート調製物中の多量のコンジュゲーションしていない多糖が、コンジュゲート自体に対するＰＳ特異的Ｉｇ応答を阻害しうることを示しているからである。
【０１０３】
免疫化および防御性ＰＧＰ特異的ＩｇＧ応答の分析を、実施例５において先に論議される通り実施することができる。
【０１０４】
実施例８．担体タンパク質およびアジュバントの関数としてのＰＧＰ−コンジュゲートの免疫原性の最適化
本発明のＰＧＰ−コンジュゲートの免疫原性を、用いられる担体タンパク質およびアジュバントの関数として測定することができる。ＴＴおよびＣＲＭ１９７の両方は、臨床的用途において現在結合型ワクチンのために使用されている免疫原性タンパク質担体であり、したがって、有効であることが示されている。ＴＴは、結合した標的抗原のための助力を生じるのに決定的なＣＤ４＋  Ｔ細胞の活性化に関して、ＣＲＭ１９７よりも強力である。結合型ワクチンに対するＩｇＧ抗ＰＳ応答とＩｇＧ抗担体応答の間の有意な相関を観察することはできるが、これは必ずしも常にではなく、なぜなら、担体特異的Ｂ細胞に対するＣＤ４＋  Ｔ細胞による助力の過度の集中が、結合した標的抗原に応答するＢ細胞についてのこの同じ助力を低減させ得るからである。さらに、結合した標的抗原の性質は、担体に対するＣＤ４＋  Ｔ細胞応答のペプチド特異性に影響を及ぼすことができる。最後に、結合型ワクチンに対する低減した抗ＰＳ応答は、同じ担体タンパク質が異なるワクチン種類に用いられる場合に観察された。これらの観察は、防御性ＩｇＧ抗ＰＧＰ応答の誘導について異なる担体を試験することが役立つかもしれないことを示唆する。
【０１０５】
加えて、ミョウバンは、比較的最小の副作用を生じる、ヒトでの使用のための現に最も一般的に用いられるアジュバントであるが、比較的制限された免疫刺激特性を有する。この点において、ミョウバンよりもかなり高い抗体応答を誘発するＴＬＲリガンドなどの他のアジュバント、およびより防御性のＩｇＧアイソタイプ（例えば、マウスにおけるＩｇＧ２ａ）は、より顕著な副作用の可能性があるにもかかわらず、研究下にある。種々の臨床治験において有望性を示した１つのこのようなＴＬＲリガンドは、ＴＬＲ９アゴニストであるＣｐＧ−ＯＤＮである。したがって、アジュバント製剤中のミョウバンへのＣｐＧ−ＯＤＮの包含は、臨床有用性の可能性を有するデータを生じるようである。
【０１０６】
この目的のために、ＣＲＭ１９７にまたはＴＴに結合したＰＧＰのコンジュゲートは、実施例５において先に決定した最適なポリマー長のＰＧＰ、実施例６において決定した最適なＰＧＰ：担体比、および実施例７において決定した最適なコンジュゲーション化学作用を用いて合成され得る。マウスを、２５μｇの３０マーＣｐＧ−ＯＤＮの存在下または不在下で、ミョウバン中の可変用量のコンジュゲートを用いて、実施例５において先に論議した通り免疫化することができ、血清を、ＰＧＰ特異的ＩｇＧアイソタイプの力価およびオプソニン化貪食作用活性について試験することができる。加えて、異なる担体タンパク質を含むコンジュゲートの免疫原性も、ＢＡＬＢ／ｃ（ＭＨＣ−ＩＩd）マウスに加えて、Ｃ５７ＢＬ／６［ＭＨＣ−ＩＩb］、Ｃ３Ｈ（ＭＨＣ−ＩＩk）、およびＡ．ＳＷ（ＭＨＣ−ＩＩs）マウスにおいて測定することができる。これらの結果を、ヒトＨＬＡ−ＤＲ４についてトランスジェニックであるＭＨＣ−ＩＩ−／−マウスの繁殖コロニーからの結果と比較することができる。
【０１０７】
防御性ＰＧＰ特異的ＩｇＧの誘導のレベルは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞活性化のためのタンパク質担体の相対強度と直接相関するようであり、ＣｐＧ−ＯＤＮのミョウバンへの添加は、ミョウバンのみを用いてみられるものを上回る防御性のＰＧＰ特異的ＩｇＧ応答を亢進させるようである。
【０１０８】
加えて、ＰＧＰ−ＰＡＤＲＥコンジュゲートも試験することができ、なぜなら、完全に合成の結合型ワクチンが、再現性、安全性、および費用対効果に関して、従来の結合型ワクチンを上回る潜在的な利点を有するからである。先に論議した通り、ＰＡＤＲＥは、天然Ｔ細胞エピトープよりもおよそ１，０００倍強力であることが発見され、アジュバント中のＰＡＤＲＥ−ペプチド構築物は、免疫原性であることが示された。ＰＡＤＲＥの肺炎連鎖球菌莢膜多糖類（ＰＰＳ）への結合は、ＰＡＤＲＥ特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞の動員を通じて、マウスにおけるインビボでの抗ＰＰＳ応答を増強した。したがって、ＰＡＤＲＥは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞依存性ＰＧＰ結合型ワクチンの製剤において、無処置の免疫原性担体タンパク質についてのより効率的な代替物となり得る。
【０１０９】
この目的のために、Ｎ末端システインを有する１３のアミノ酸のＰＡＤＲＥペプチド（ＡＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ、式中、Ｘ＝シクロヘキシルアラニン）を、標準的なペプチド化学作用を用いて合成することができる。実施例５において決定された最適化された鎖長を有するＰＧＰ−ＮＨ2は、ｐＨ８．０で２倍モル過剰量のＮＨＳブロモ酢酸を用いてブロモアセチル化されることができ、Ｇ１０脱塩カラムにおいて５０ｍＭのＨＥＰＥＳ＋５ｍＭ  ＥＤＴＡへと脱塩することができる。チオール−ＰＡＤＲＥペプチドを、１．５：１のモル比のＰＤＲＥ：ＰＧＰで添加することができる。２時間後、コンジュゲートを、Ｐｅｐｄｅｘサイズ排除カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＃１７−５１７６−０１）を用いて精製することができる。反応の進行および精製を、逆相ＨＰＬＣを用いてモニターすることができる。ＰＡＤＲＥ濃度を、ペプチドの励起係数およびホスファートについてアッセイすることによって決定されたＰＧＰ濃度から決定することができる。
【０１１０】
最適な免疫原性を決定するためにＰＡＤＲＥとＰＧＰとのモル比が変動する、いくつかのコンジュゲートを調製することができる。マウスを、ＣｐＧ−ＯＤＮを含むまたは含まないミョウバンの存在下で、先に説明した通り免疫化することができる。ＩｇＧ抗ＰＧＰの一次および二次血清力価をＥＬＩＳＡによって決定することができ、血清オプソニン活性を、オプソニン化貪食作用アッセイ（黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌）によって決定することができ、宿主防御を、黄色ブドウ球菌による感染によって決定することができる。生じたデータを、先に決定した最適化されたＰＧＰ−タンパク質天然担体コンジュゲートを用いて得られるものと比較することができる。最初の比較研究は、ＢＡＬＢ／ｃマウスを利用することができるが、先に説明した通り、追加的なマウスＭＨＣ−ＩＩバックグラウンドのマウス、およびＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスを用いることに拡張されることができる。
【０１１１】
最適化されたＰＧＰ−ＰＡＤＲＥコンジュゲートは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の動員のより高い効率性により、免疫化に用いられるＰＧＰの重量当たりで、対応するＰＧＰ−担体タンパク質コンジュゲートよりも高い防御性ＰＧＰ特異的ＩｇＧ応答（すなわち、血清ＰＧＰ特異的力価、オプソニン化貪食作用、およびインビボでの宿主防御）を示すことが期待される。
【図１】
2013510882.tif 000004
【図２】
2013510882.tif 000005
【図３】
2013510882.tif 000006
【図４】
2013510882.tif 000007
【配列表】
2013510882000001.app
【国際調査報告】
2013510882.tif 000008
2013510882.tif 000009
2013510882.tif 000010