(57)【要約】  本発明は、バイオマーカー・プレクチン-1を検出し局在化するための診断技法およびイメージング技法に役立つ組成物および方法を提供する。本発明は、プレクチン-1をターゲティングするための多量体型ペプチドリガンド複合体、例えば式(βAKTLLPTPGGS(PEG5000))4KKKKDOTAβA-NH2を有する多量体型ペプチドリガンド複合体を提供し、これには、イメージング剤および/または治療剤をコンジュゲートすることができる。
2013510094.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プレクチン-1またはそのホモログもしくはフラグメントに結合させるための多量体型ペプチドリガンド複合体であって、
プレクチン-1またはそのホモログもしくはフラグメントに独立して結合する少なくとも2つのペプチド
を含み、
プレクチン-1またはそのホモログもしくはフラグメントに結合する該ペプチドのそれぞれは、独立して、少なくとも1つの非標準アミノ酸置換または保存的アミノ酸置換を含んでもよく、
該ペプチドのそれぞれは、独立して、少なくとも1つの追加アミノ酸を付加することによって修飾されていてもよく、
該ペプチドのそれぞれは、ポリエチレングリコールにカップリングされていてもよく；
該ペプチドまたはポリエチレングリコールにカップリングされていてもよいペプチドのそれぞれは、さらにキレート剤にカップリングされており、該キレート剤は、少なくとも1つのリンカーによって、該ペプチドまたはポリエチレングリコールにカップリングされていてもよいペプチドに、カップリングされていてもよく、
少なくとも1つのイメージング剤が、該キレート剤にカップリングされていてもよく、そして
少なくとも1つの治療剤が、該キレート剤にカップリングされていてもよい、
多量体型ペプチドリガンド複合体。
【請求項２】
該多量体がホモ多量体またはヘテロ多量体である、請求項1に記載の多量体型ペプチドリガンド複合体。
【請求項３】
該多量体が四量体である、請求項2に記載の多量体型ペプチドリガンド複合体。
【請求項４】
該多量体型ペプチドリガンド複合体のペプチドが、配列番号1〜4および9〜22からなる群より選択される配列を独立して有する、請求項3に記載の多量体型ペプチドリガンド複合体。
【請求項５】
該配列が配列番号1〜4からなる群より選択される、請求項4に記載の多量体型ペプチドリガンド複合体。
【請求項６】
該四量体型複合体が約8.3×10-7MのKiを有する、請求項5に記載の多量体型ペプチドリガンド複合体。
【請求項７】
該複合体が式(βAKTLLPTPGGS(PEG5000))4KKKKDOTAβA-NH2を有する、請求項6に記載の四量体型ペプチドリガンド複合体。
【請求項８】
該キレーターが、DTPA、DO3A、DOTA、EDTA、TETA、EHPG、HBED、NOTA、DOTMA、TETMA、PDTA、TTHA、LICAM、HYNIC、およびMECAMからなる群より選択される、請求項1に記載の多量体型ペプチドリガンド複合体。
【請求項９】
該イメージング剤が、放射性核種、放射線造影剤、常磁性イオン、金属、生物学的タグ、蛍光ラベル、化学発光ラベル、超音波造影剤および光活性剤からなる群より選択される、請求項1に記載の多量体型ペプチドリガンド複合体。
【請求項１０】
該イメージング剤が放射性核種である、請求項9に記載の多量体型ペプチドリガンド複合体。
【請求項１１】
該放射性核種が、110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr、および他のガンマ放射体、ベータ放射体、または陽電子放射体からなる群より選択される、請求項10に記載の多量体型ペプチドリガンド複合体。
【請求項１２】
該放射性核種が111Inである、請求項11に記載の多量体型ペプチドリガンド複合体。
【請求項１３】
該ポリエチレングリコールがポリエチレングリコール5000である、請求項1に記載の多量体型ペプチドリガンド複合体。
【請求項１４】
対象におけるプレクチン-1またはそのホモログもしくはフラグメントを検出するための方法であって、イメージング剤を含む請求項1に記載の多量体型ペプチドリガンド複合体を対象に投与すること、およびプレクチン-1を含む細胞の場所を検出することを含む方法。
【請求項１５】
該多量体型ペプチドリガンド複合体が式(βAKTLLPTPGGS(PEG5000))4KKKKDOTAβA-NH2を有し、イメージング剤が111Inである、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
該イメージング剤が、コンピュータに接続されていてプログラムを使って画像データを解析するSPECT/CTスキャナで検出される、請求項14に記載の方法。
【請求項１７】
該多量体型ペプチドリガンドを構成するペプチドがそれぞれに、配列番号1〜4および9〜22からなる群より独立して選択される配列を有する、請求項14に記載の方法。
【請求項１８】
該イメージング剤が、放射性核種、放射線造影剤、常磁性イオン、金属、生物学的タグ、蛍光ラベル、化学発光ラベル、超音波造影剤および光活性剤からなる群より選択される、請求項14に記載の方法。
【請求項１９】
該プレクチン-1またはそのホモログもしくはフラグメントが、細胞表面プレクチン-1またはそのホモログもしくはフラグメントである、請求項14に記載の方法。
【請求項２０】
がんを検出し、がんを診断し、がんの進行を監視し、またはがんの処置を監視する方法であって、ここで、該がんの細胞はプレクチン-1またはそのホモログもしくはフラグメントを発現するものであり、該方法が、請求項1に記載の多量体型ペプチドリガンド複合体を含む医薬組成物を試験対象に投与すること、該イメージング剤を検出すること、該試験対象における該イメージング剤のレベルおよび場所を決定すること、ならびに該レベルおよび場所を、非罹患対象からの、他の点では同一な場所からの該イメージング剤のレベルおよび場所と比較するか、または該試験対象の非罹患区域と比較することを含み、ここで該複合体はイメージング剤を含み、さらにここで、非罹患対象または該試験対象の非罹患区域からの該試料における該イメージング剤のレベルまたは場所と比較して、該試験対象における該イメージング剤のより高いレベルまたは異なる場所は、該試験対象がプレクチン-1またはそのホモログもしくはフラグメントを発現するがんを有することの指標であり、それによって、がんを検出し、がんを診断し、がんの進行を監視し、またはがんの処置を監視する方法であって、ここで、該がん細胞はプレクチン-1またはそのホモログもしくはフラグメントを発現するものである、方法。
【請求項２１】
該がんが、頭頚部がん、肝がん、膵がん、食道がん、胃がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、前立腺がん、副腎がん、リンパ腫、唾液腺がん、骨がん、脳がん、小脳がん、結腸がん、直腸がん、直腸結腸がん、口鼻咽頭がん、NPC、腎がん、膀胱がん、皮膚がん、黒色腫、基底細胞癌、硬口蓋癌、舌扁平上皮細胞癌、髄膜腫、多形性腺腫、星状細胞腫、軟骨肉腫、皮質腺腫、肝細胞癌、膵がん、扁平上皮細胞癌、および腺癌からなる群より選択される、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
該がんが膵がんである、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
該膵がんが、膵管腺癌、膵上皮内新生物、腺腫、異形成を伴う腺腫、および上皮内癌からなる群より選択される、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
該がんが転移がんである、請求項20に記載の方法。
【請求項２５】
該多量体型ペプチドリガンド複合体を構成するペプチドがそれぞれに、配列番号1〜4および9〜22からなる群より独立して選択される配列を有する、請求項20に記載の方法。
【請求項２６】
該多量体型ペプチドリガンド複合体が式(βAKTLLPTPGGS(PEG5000))4KKKKDOTAβA-NH2を有し、イメージング剤が111Inである、請求項20に記載の方法。
【請求項２７】
該イメージング剤が、放射性核種、放射線造影剤、常磁性イオン、金属、生物学的タグ、蛍光ラベル、化学発光ラベル、超音波造影剤および光活性剤からなる群より選択される、請求項20に記載の方法。
【請求項２８】
該プレクチン-1またはそのホモログもしくはフラグメントが細胞表面プレクチン-1またはそのホモログもしくはフラグメントである、請求項20に記載の方法。
【請求項２９】
対象におけるがんを診断するための方法であって、該がんの細胞はプレクチン-1またはそのホモログもしくはフラグメントを発現するものであり、該方法は、該対象から生物学的試料を得ること、該試料を、請求項1に記載の多量体型ペプチドリガンド複合体を含む組成物と接触させること、該試験対象からの該試料における該プレクチン-1のレベルまたは場所を、非罹患対象から得られた他の点では同一な試料からのプレクチン-1のレベルまたは場所と比較するか、または既知量のプレクチン-1を含む標準試料と比較することを含み、ここで該複合体はイメージング剤を含むものであり、さらにここで、該試験対象からの該試料におけるプレクチン-1のより高いレベルは、該試験対象ががんを有することの指標である方法。
【請求項３０】
該多量体型ペプチドリガンド複合体が式(βAKTLLPTPGGS(PEG5000))4KKKKDOTAβA-NH2を有する、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
該イメージング剤が、放射性核種、放射線造影剤、常磁性イオン、金属、生物学的タグ、蛍光ラベル、化学発光ラベル、超音波造影剤および光活性剤からなる群より選択される請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
医薬上許容される担体と請求項1に記載の多量体型ペプチドリガンド複合体とを含む医薬組成物。
【請求項３３】
医薬上許容される担体と請求項1に記載の多量体型ペプチドリガンド複合体とを含む医薬組成物、適用具、およびそれを使用するための指示書を含み、イメージング剤および治療剤を含んでいてもよいキット。
【請求項３４】
該複合体が、以下の構造を有する、イメージング剤を含む請求項1に記載の多量体型ペプチドリガンド複合体：
【化１】
2013510094.tif 000009
。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、2009年11月5日に出願された米国仮特許出願第61/258242号に基づく米国特許法第119条（e）項による優先権を主張する権利を有する。
【０００２】
［連邦政府の後援による研究または開発に関する陳述]
本発明は、米国国立衛生研究所によって給付された助成金番号NIH-P50-CA86355およびPO1-CA117969-01による米国政府の支援をうけてなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
［背景技術］
【０００３】
［背景］
膵がん（pancreatic cancer）（PDAC）は、米国および他の工業国では、4番目に多いがん関連死の原因である[1]。多大な努力にもかかわらず、膵がんは今なお破壊的な疾患であり、その5年生存率は5％未満、平均生存期間中央値は1年未満である[1]。この厳しい予後は、主として、その初期診断（initial diagnosis）が治療不可能な進行期になってからと遅くなりがちであり、しばしば転移後であることによる。
【０００４】
PDACは、他の悪性疾患に観察される腺腫-癌シークエンス（adenoma-carcinoma sequence）と同様に、膵上皮内新生物（pancreatic intraepithelial neoplasia）（PanIN）と呼ばれる前駆病変を経由して浸潤がんに進行すると考えられている。病変は、腺腫（PanIN I）から異形成を伴う腺腫（adenoma with dysplasia）（PanIN II）に進行し、さらに上皮内癌（PanIN III）に進行し、最終的に浸潤がんに進行する[2，3，4]。前駆病変を経由する発癌過程（carcinogenesis）がこうして明確に特徴づけられているにも関わらず、PDACに関する有効な早期検出およびスクリーニングは、未だに利用できない。これは、主として、早期がんに関する診断ツールとバイオマーカーが存在しないことによる。したがって、理想的には、PADCのバイオマーカーは、浸潤がんを検出するだけでなく、その前駆病変であるPanIN IIをも、そしてさらに重要なことには、前浸潤性（pre-invasive）悪性PanIN III病変をも検出すべきである。現在のところ、CA19.9が、PDACに関して唯一臨床的に使用されている血清バイオマーカーである。しかしこのマーカーは、特異性および感度が、とりわけ、小さながんの検出および悪性膵疾患と良性膵疾患の弁別（differentiation）に関して、不足している[5]。それゆえに、CA19.9は、PDACのスクリーニングまたは早期検出には適していない。侵襲的内視鏡手技（EUSおよびERCP）は一部の早期病変を検出することができるが、膵臓を傷つける可能性、高い偽陰性率という欠点があり、オペレーター（operator）依存性も高い[6，7]。また、これらの手技は、悪性病変を良性または前悪性病変と識別（distinguish）できないことも多い[8，9]。腹部断層イメージングも、初期（early stage）PDACの（とりわけ高リスク患者における）検出に関して、信頼できないことが判明している[10，11]。これは、術前にPDACを有する患者の最高30％までにおける転移を検出することができず[12，13]、慢性膵炎（CP）とPDACとを安全には弁別（differentiate）しない[14，15]。PDACと慢性膵炎の信頼できる区別（distinction）は重要であるが、その区別はしばしば困難である。どちらの疾患にも共通する臨床的徴候（sign）および症状（symptom）は多いが、それぞれに使用される処置戦略は大いに異なる。PDACの場合は、唯一利用できる治療的処置が全摘術であるのに対し、慢性膵炎の処置は症状改善に焦点が合わされ、それはほとんどの場合、手術なしで達成することができる[14，15]。
【０００５】
現在使用されている診断ツールの短所を克服する新規バイオマーカーおよび非侵襲的イメージング戦略により、PDACと慢性膵炎との信頼できる区別が可能になるであろう。それらは、より早期の診断を可能にし、その結果として、転移が発生（onset）する前のPDACの処置も可能になるであろう。それゆえに、それらは大いに必要とされており、最終的には生存率（survival）の改善を助けることになるだろう[16]。最近、プレクチン-1（Plec1）は、インビトロでの知見および遺伝子操作（genetically engineered）マウスモデルでの知見に基づいて、PDACの新規イメージングバイオマーカーになる可能性があることが示唆された[17]。Plec1の検出に使用するためのペプチドリガンドが同定された[17]。しかし、ヒトPDACとその前駆病変のバイオマーカーとしてのPlec1の適性は、まだ評価されていない。Plec1は、悪性膵「管内乳頭粘液性新生物」（intraductal papillary mucinous neoplasm；IPMN）のバイオマーカーであると同定され、IPMNにおいて生じる癌（carcinoma）を早期検出するためのマーカーであるという仮説が立てられており（Bauschら, 2009, J. Gastrointest. Surg., 13:1948）、また、非小細胞肺がん（Harris, 2009, J. Clin. Oncology, 27, No.15S (May 20 Supplement):e22118）ならびにヒト直腸結腸腺腫および直腸結腸腺癌（Lee, 2004, J. Med., 35:(1-6):141-149）のバイオマーカーであると同定されている。Plec1のペプチドリガンドの一つはペプチドKTLLPTP（配列番号1）である［Kellyら (2008)「Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma」PLoS Med 5:4:e85；国際特許出願公開番号WO2009/129220（Kellyら、2009年10月22日公開）］。
【０００６】
当技術分野では、がんの診断、監視、および局在を助けるために、より良いがんバイオマーカー、バイオマーカーを認識する新しい、より良い試薬が、長年にわたって求められている。本発明はこれらの要求を満たすものである。
【発明の概要】
【０００７】
［発明の概要］
本発明は、プレクチン-1(Plectin-1)を標的とする本明細書に記載の新規分岐（branched）多量体型（multimeric）ペプチドイメージング複合体に基づき、その複合体を使って得られた驚くべき結果にも基づいている。
【０００８】
プレクチン-1（GenBankアクセッション番号AAR95677）は、早期前浸潤性、原発性および転移性ヒトPDACにおいて特異的にアップレギュレートされる。前臨床モデルでは、プレクチン-1は、非侵襲的イメージングに使用することができる初めてのPDACバイオマーカーの一つである。総合すると、これらのデータは、Plec1が、PDACの高感度かつ特異的なバイオマーカーであり、その検出および病期分類（staging）を改善するために、Plec1を利用しうることを示唆している。
【０００９】
本発明は、プレクチン-1またはそのホモログもしくはフラグメントに結合（bind）させるための多量体型ペプチドリガンド複合体であって、プレクチン-1またはそのホモログもしくはフラグメントに独立して結合する少なくとも2つのペプチドを含む複合体を提供する。ある態様において、プレクチン-1またはそのホモログもしくはフラグメントに結合するペプチドのそれぞれは、独立して、少なくとも1つの非標準アミノ酸（non-standard amino acid）置換または保存的アミノ酸置換または付加を含んでもよい。ある態様において、多量体（multimer）のペプチドのそれぞれは、独立して、少なくとも1つの追加アミノ酸を付加することによって修飾されていてもよい。ある態様において、多量体のペプチドのそれぞれは、独立して、ポリエチレングリコールにカップリング（couple）されていてもよい。ある態様において、多量体のペプチドまたはポリエチレングリコールにカップリングされていてもよいペプチドのそれぞれは、さらにキレート剤（chelating agent）にカップリングされていてもよい。キレート剤は、少なくとも1つのリンカーによって、ペプチドまたはポリエチレングリコールにカップリングされていてもよいペプチドに、カップリングされていてもよい。少なくとも1つのイメージング剤（imaging agent）が該キレート剤にカップリングされていてもよく、少なくとも1つの治療剤が該キレート剤にカップリングされていてもよい。
【００１０】
ある態様では、多量体が、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、および八量体からなる群より選択される。
【００１１】
ある態様では、多量体型ペプチドリガンド複合体が、ホモ多量体またはヘテロ多量体である。ある態様では、ホモ多量体が四量体である。
【００１２】
ある実施形態では、多量体型ペプチドリガンド複合体が、DTPA、DO3A、DOTA、EDTA、TETA、EHPG、HBED、NOTA、DOTMA、TETMA、PDTA、TTHA、LICAM、HYNIC、およびMECAMからなる群より選択されるキレーターを含む。
【００１３】
ある態様では、ポリエチレングリコールがポリエチレングリコール5000である。
【００１４】
ある実施形態では、多量体型ペプチドリガンド複合体が、放射性核種、放射線造影剤、常磁性イオン、金属、生物学的タグ（biological tag）、蛍光ラベル、化学発光ラベル、超音波造影剤、および光活性剤（photoactive agent）からなる群より選択されるイメージング剤を含む。ある態様では、イメージング剤が放射性核種である。ある態様では、放射性核種が、110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr、および他のガンマ放射体、ベータ放射体、または陽電子放射体からなる群より選択される。ある態様では、放射性核種が111Inである。
【００１５】
ある態様では、多量体型ペプチドリガンド複合体が、配列番号1〜4および9〜22からなる群より選択される配列を独立して有するペプチドを含む。ある態様では、配列が配列番号1〜4からなる群より選択される。配列番号1（KTLLPTP）は基本（base）ペプチドリガンドであり、他の配列はその修飾体（modification）である（実施例および図9参照）：
配列番号2−βAKTLLPTP
配列番号3−βAKTLLPTPGGS
配列番号4−KTLLPTPGGS
配列番号9−ATLLPTP
配列番号10−KALLPTP
配列番号11−KTALPTP
配列番号12−KTLAPTP
配列番号13−KTLLATP
配列番号14−KTLLPAP
配列番号15−KTLLPTA
配列番号16−βAATLLPTPGGS
配列番号17−βAKALLPTPGGS
配列番号18−βAKTALPTPGGS
配列番号19−βAKTLAPTPGGS
配列番号20−βAKTLLATPGGS
配列番号21−βAKTLLPAPGGS
配列番号22−βAKTLLPTAGGS（配列番号22）。
【００１６】
本明細書と共に提出される配列表ではβアラニンがXaaと記載されることに注意されたい。配列は、プレクチン-1またはそのホモログもしくはフラグメントへのこれらのペプチドの結合に実質的に影響を及ぼさないアミノ酸の置換および付加を含む修飾を受けていてもよい。アラニン置換を上に示したが、他のアミノ酸を使った置換も本発明に包含される。さらに、本明細書に開示するデータは、配列中のスレオニンが重要であること、そしてまたプロリンも重要であることを示唆している。
【００１７】
本発明のペプチドは多量体として有用である。さらに、多量体は、安定性を増加させ、血流中および組織内での半減期を増加させ、分解を減少させることなどを目的として、ベータアラニン（βA）などのアミノ酸およびポリエチレングリコールの付加によって修飾することができる。複合体における配列の配向（orientation）は変えることができる場合があること、および多量体がヘテロ多量体またはホモ多量体でありうることは、当業者には理解されるであろう。
【００１８】
ある実施形態では、多量体型複合体が四量体であり、式(βAKTLLPTPGGS(PEG5000))4KKKKDOTAβA-NH2を有する。これを、その化学構造により、図8に図示する。図8は、さらに、DOTAにカップリングされたイメージング剤を示している。ある態様では、四量体型複合体が約8.3×10-7MのKiを有する。ある実施形態では、イメージング剤が111Inである。ある態様では、コンピュータに接続されていてプログラムを使って画像データ（imaging data）を解析するSPECT/CTスキャナで、イメージング剤が検出される。
【００１９】
本発明はさらに、対象におけるプレクチン-1またはそのホモログもしくはフラグメントを検出するための方法を提供する。本方法は、イメージング剤を含む多量体型ペプチドリガンド複合体を対象に投与すること、およびプレクチン-1を含む細胞の場所（location）を検出することを含む。
【００２０】
ある態様において、本方法は、各ペプチドリガンドが配列番号1〜4および9〜22からなる群より独立して選択される配列を有する多量体ペプチドリガンドイメージング複合体におけるペプチドリガンドの使用を含む。
【００２１】
ある態様において、本方法では、放射性核種、放射線造影剤、常磁性イオン、金属、生物学的タグ、蛍光ラベル、化学発光ラベル、超音波造影剤および光活性剤からなる群より選択されるイメージング剤を使用することが可能である。当業者には、使用される検出方法が使用されるそのイメージング剤に依存することは、理解されるであろう。
【００２２】
本方法の一態様では、プレクチン-1またはそのホモログもしくはフラグメントが、細胞表面プレクチン-1またはそのホモログもしくはフラグメントである。
【００２３】
本発明は、さらに、がんを検出し、がんを診断し、がんの進行を監視し、またはがんの処置を監視するための方法（ここで、がん細胞はプレクチン-1またはそのホモログもしくはフラグメントを発現または提示する）を提供する。本方法は、多量体型ペプチドリガンド複合体を含む医薬組成物であって複合体がイメージング剤を含むものを、試験対象に投与し、次に、イメージング剤を検出し、試験対象におけるイメージング剤のレベルおよび場所を決定することを含む。試験対象におけるレベルおよび場所は、非罹患対象の、他の点では同一な場所からのイメージング剤のレベルおよび場所と比較されるか、または試験対象の非罹患区域（area）と比較される。非罹患対象または試験対象の非罹患区域からの該試料におけるイメージング剤のレベルまたは場所と比較して、試験対象におけるイメージング剤のより高いレベルまたは異なる場所は、その試験対象がプレクチン-1またはそのホモログもしくはフラグメントを発現または提示するがんを有することの指標（indication）である。検出されたイメージング剤のレベルまたは場所は、バイオマーカー・プレクチン-1の場所および量の指標（indicator）である。
【００２４】
ある実施形態では、がんが、頭頚部がん、肝がん、膵がん、食道がん、胃がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、前立腺がん、副腎がん、リンパ腫、唾液腺がん、骨がん、脳がん、小脳がん、結腸がん、直腸がん、直腸結腸がん、口鼻咽頭（oronasopharyngeal）がん、NPC、腎がん、膀胱がん、皮膚がん、黒色腫、基底細胞癌、硬口蓋癌、舌扁平上皮細胞癌、髄膜腫、多形性腺腫、星状細胞腫、軟骨肉腫、皮質腺腫、肝細胞癌、膵がん、扁平上皮細胞癌、および腺癌からなる群より選択される。
【００２５】
ある態様では、がんが膵がんである。ある態様では、膵がんが、膵管腺癌、膵上皮内新生物、腺腫、異形成を伴う腺腫、および上皮内癌からなる群より選択される。
【００２６】
ある実施形態では、がんが転移がんである。
【００２７】
本発明は、がんが良性であるか悪性であるかを、検出されたイメージング剤のレベル（プレクチン-1の量の尺度）に基づいて決定するのを助けるために、イメージングされたプレクチン-1のレベルを比較するのにも役立つ。
【００２８】
本発明は、がんの発癌過程のステージ（stage）を決定し、その進行を早期がんから後期（late stage）がんまで監視するのにも役立つ。この方法は、使用すべき治療のタイプおよび量を決定するのに役立つ。
【００２９】
本発明の方法の一実施形態では、多量体型ペプチドリガンド複合体のペプチドが、それぞれ、配列番号1〜4および9〜22からなる群より独立して選択される配列を有する。
【００３０】
本発明の方法の一実施形態では、多量体型ペプチドリガンド複合体が式(βAKTLLPTPGGS(PEG5000))4KKKKDOTAβA-NH2を有し、イメージング剤が111Inである。
【００３１】
本方法の一実施形態では、イメージング剤が、放射性核種、放射線造影剤、常磁性イオン、金属、生物学的タグ、蛍光ラベル、化学発光ラベル、超音波造影剤および光活性剤からなる群より選択される。
【００３２】
本発明の一実施形態では、プレクチン-1またはそのホモログもしくはフラグメントが、細胞表面プレクチン-1またはそのホモログもしくはフラグメントである。
【００３３】
本発明はさらに、対象におけるがんを診断するための組成物および方法（ここで、がんの細胞はプレクチン-1またはそのホモログもしくはフラグメントを発現する）を提供する。本方法は、対象から生物学的試料を得て、その試料を、請求項1の多量体型ペプチドリガンド複合体を含む組成物であって複合体がイメージング剤を含むものと接触させることを含む。本方法ではさらに、試験対象からの試料におけるプレクチン-1のレベルまたは場所を、非罹患対象から得られた他の点では同一な試料からのプレクチン-1のレベルまたは場所と比較するか、既知量のプレクチン-1を含む標準試料と比較することが可能であり、ここで、該試験対象からの該試料におけるプレクチン-1のより高いレベルは、該試験対象ががんを有することの指標である。
【００３４】
本方法の一実施形態では、多量体型ペプチドリガンド複合体が式(βAKTLLPTPGGS(PEG5000))4KKKKDOTAβA-NH2を有する。ある態様では、イメージング剤が、放射性核種、放射線造影剤、常磁性イオン、金属、生物学的タグ、蛍光ラベル、化学発光ラベル、超音波造影剤および光活性剤からなる群より選択される。
【００３５】
ある実施形態において、本発明は、医薬上許容される担体と、プレクチン-1と結合する多量体型ペプチドリガンド複合体とを含む医薬組成物を提供する。
【００３６】
本発明はさらに、医薬上許容される担体と請求項1の多量体型ペプチドリガンド複合体とを含む医薬組成物、適用具（applicator）、およびそれを使用するための指示書（instructional material）を含み、さらにイメージング剤および治療剤を含んでもよいキットを包含する。
【００３７】
インビボイメージングに関するプレクチン-1標的ペプチド（plectin-1 targeted peptide）（PTP）の有用性を評価するために、本発明は、一例として、ペプチドを、GMPグレード施設（GMP grade facility）において、イメージング剤用のキレーターとしてのDOTAを伴う四量体型構造として、合成したことを開示する。ある態様では、イメージング剤が111Inである。ある態様では、本願において使用されるプレクチン-1のペプチドリガンドが、ペプチドKTLLPTP（配列番号1）である（Kellyら, 2008, PLoS Medicine, 5:4:0657-0668；国際特許出願公開WO2009/129220（Kellyら、2009年10月22日公開））。ある態様では、多量体型ペプチドリガンドイメージング複合体を製造する前に、ペプチドリガンドが本明細書に記載するように修飾される。ある態様では、修飾ペプチドリガンドが＿である。ある態様では、本発明の新規四量体型ペプチドイメージング複合体が、式：(βAKTLLPTPGGS(PEG5000))4KKKKDOTAβA-NH2（本明細書では[(βAla-Lys-Thr-Leu-Leu-Pro-Thr-Pro-Gly-Gly-Ser-PEG5K)2-Lys]2-Lys-Lys(DOTA)-βAla-NH2ともいう）を有し、すなわちそれは、プレクチン-1のリガンドである4つのペプチドを含む複合体である。ある態様では、この複合体がさらに、プレクチン-1発現細胞の場所を可視化するのを助けるために、イメージング剤を含む。ある態様では、イメージング剤が111INである。
【００３８】
所望により、治療剤を取り付ける（attach）か、またはイメージング複合体を含む医薬組成物中に治療剤を含めることができる。
【００３９】
基本ペプチドリガンド（すなわち配列番号1）を複合体中で反対の向き（direction）に配向させうることは、当業者には理解されるであろう。
【００４０】
ある態様では、プレクチン-1のペプチドリガンドとして、他にも、配列番号1〜4および9〜22、ならびにその機能的ホモログ、誘導体、およびフラグメントが挙げられるが、これらに限るわけではない。
【００４１】
ある態様では、本発明の四量体型複合体が、約8.3×10-7MのKi（阻害解離定数）を有する。ある態様において、それは、対象に投与された場合に約4.29分の血中半減期を有する。
【００４２】
さらに本発明は、さらなる活性四量体型複合体を提供する。例えば本発明は、3つの追加アミノ酸（Gly、Gly、およびSer）を伴う修飾された配列番号1、すなわちKTLLPTPGGS（配列番号4）を含む複合体を包含する。この四量体型複合体は、式[Lys-Thr-Leu-Leu-Pro-Thr-Pro-Gly-Gly-Ser]4-Lys4-βAla-DOTAを有し、[KTLLPTPGGS]4-K4-βA-DOTAとも呼ばれて、図7の構造を持つ。
【００４３】
リジン（K）は構造：
【化１】
2013510094.tif 000003
を有する。
【００４４】
ここで使用される臨床的に適切な（clinically relevant）SPECTトレーサーは、小さなPDACおよび転移の検出を可能にする。
【００４５】
ある態様では、イメージング剤または検出可能部分（detectable moiety）が、放射性核種、放射線造影剤、常磁性イオン、金属、生物学的タグ、蛍光ラベル、化学発光ラベル、超音波造影剤および光活性剤を含む。
【００４６】
本発明の四量体型ペプチドイメージング複合体は、従来知られていた薬剤と比較して驚くほど高感度である。さらに、本発明の四量体型ペプチドイメージング複合体は、既知の薬剤と比較して、驚くほど迅速に機能する。
【００４７】
さらに本願は、多くのがんタイプにおけるプレクチン-1の発現を開示する（図2）。したがって本発明は、膵がん以外のがんを検出、診断、および局在するための、本発明の多量体型ペプチドイメージング複合体の使用を包含する。さらに、本発明では、プレクチン-1のレベルを定量することが可能であり、したがって本発明は、正常組織、良性組織、および悪性組織を識別する能力を包含する。ある態様では、多量体ペプチドイメージング複合体が四量体型ペプチドを含む。
【００４８】
本発明はさらに、少なくとも1つの本発明の多量体型ペプチドリガンド複合体、指示書を含み、少なくとも1つのイメージング剤を含んでもよく、少なくとも1つの治療剤を含んでもよいキットを提供する。
【００４９】
本発明のさまざまな態様および実施形態を以下に詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】プレクチン-1免疫組織化学およびウェスタンブロット。A）評価した正常膵臓、慢性膵炎、PanIN、PDAC、異種移植PDACおよびPDAC転移部位（肝臓、リンパ節および腹膜）の代表的な像。全体像（上図）および黒い枠の拡大図（下図）。慢性膵炎はプレクチン-1について弱く染色され、一方、正常膵臓はプレクチン-1を発現しない。PanINは、弱〜中度の膜染色パターンを示す。PDACおよびPDAC異種移植片組織は、プレクチン-1について、細胞質および膜が、中〜強度に染色される。一般的なPDAC転移部位は有意なプレクチン-1発現を示さず、一方、腫瘍細胞は、Plec1について強く染色される。B）標本における染色強度の分布。全てのPDAC症例が中〜強度の染色パターンを示したのに対し、正常膵臓および慢性膵炎の大半はプレクチン-1を発現しなかった。対照的に、PanIN II病変の半分以上がPlec1を弱〜中度に発現し、一方、PanIN III病変の大部分はPlec1陽性だった。C）Plec1の細胞局在も発癌過程において変化する。全てのPanIN I病変と大半のPanIN II病変では膜内にしか同定されないのに対して、一部のPanIN III病変では細胞質中にも存在し、PDACでは常にそこに同定される。D）膵臓組織（急速凍結外科標本）50mgからのPlec1に関する定量的ウェスタンブロット。正常膵臓およびCPにはPlec1は検出されなかったが、各PDACには存在した。
【図２】正常ヒト組織および悪性ヒト組織におけるプレクチン-1発現：プレクチン-1発現に関して評価した組織マイクロアレイの免疫組織化学：正常組織は膀胱および雄性生殖器系（reproductive tract）を除いて弱〜中度のプレクチン-1発現しか示さない。正常と悪性疾患とを識別するプレクチン-1発現の明確な相違は、膵臓、食道、胃および肺だけに観察される。一般的なPDAC転移部位（リンパ節、肝臓）はPlec1を発現しない。
【図３】同所性（orthotopic）PDACにおけるPlec1のインビボイメージング。（A）tPTPのインビトロ検証（validation）。L3.6細胞を96ウェルプレートにプレーティングし、111In-tPTPおよびさまざまな対数濃度のtPTPまたはスクランブル型（scrambled）四量体と共にインキュベートした。（B）同所性に移植したL3.6細胞由来の腫瘍を保持する無胸腺ヌードマウスに111In-tPTPを注射し、注射の4時間後にSPECT/CTでイメージングした。PDACにおけるtPTPの蓄積が膵臓および腹膜転移における腫瘍のインビボイメージングを可能にしていることに注目されたい。T−腫瘍、L−肝臓、rK−右腎臓、lK−左腎臓、M−腹膜転移。（C）SPECT/CTイメージング（図3）後に、動物（n＝5）を屠殺し、臓器を収穫し、ガンマカウント数を評価した。（D）組織像。同所性に移植された腫瘍を有する動物を屠殺し、膵臓および目に見える腹膜転移の領域（region）を摘除し、OCTに包埋し、薄切し、H&Eで染色した。A．膵臓における腫瘍の10×像。挿入図、2つの腫瘍を示す膵臓の2×像。B．腹膜転移の10×像。挿入図、転移および周囲の腹膜の2×像。
【図４】tPTPはPDACを標的とし、非侵襲的インビボイメージングを可能にする。同所性に移植されたL3.6細胞からの腫瘍を保持する無胸腺ヌードマウスに111IN-tPTPを注射し、注射の4時間後にSPECT/CTでイメージングした。SPECT/CTイメージングは、tPTPがPDACに蓄積して、膵臓および腹膜転移における腫瘍のインビボイメージングを可能にすることを実証している。T−腫瘍、L−肝臓、rK−右腎臓、lK−左腎臓、M−腹膜転移。上図−矢状面図；下図-冠状面図。左端の2画像−CT；左から2列目−SPECT；左から3列目−SPECT/CT；右端の2画像-MIP（図3も参照のこと）。
【図５】プレクチン-1標的ペプチドの模式図。多価性を高めるために4コピーの配列番号1を含む多量体型ペプチドリガンド複合体を高度に図式化したものであって、薬剤の循環時間を増加させ、免疫原性を低下させ、ペプチドがインビボで意図したターゲットに到達する前に除去されてしまうことを防ぐために付加することができる4つの5000Da PEG鎖が描かれている。他の潜在的修飾は示されていない。
【図６】tPTPのインビボ特徴づけ−6A．同所性に置かれたL3.6細胞からの腫瘍を保持する無胸腺ヌードマウスに注射された111IN-tPTPの血中半減期。血液を注射の0、15、30、45、60、および120分後に採取した。tPTPの血中半減期は4.29分だった。6B．SPECT/CTイメージング（図4参照）後に、動物（n＝5）を屠殺し、臓器を収穫し、ガンマカウント数を評価した。膵臓は3％注射量/グラムを示し、腹膜腔に見いだされる転移は1.5％注射量/グラムを示した。111IN-tPTPの排泄の主要経路は尿によるものである。
【図７】[Lys-Thr-Leu-Leu-Pro-Thr-Pro-Gly-Gly-Ser]4-Lys4-βAla-DOTA。式[Lys-Thr-Leu-Leu-Pro-Thr-Pro-Gly-Gly-Ser]4-Lys4-βAla-DOTAを有し、[KTLLPTPGGS]4-K4-βA-DOTAとも呼ばれる、四量体型複合体の化学構造。
【図８】tPTP−4(βAKTLLPTPGGS(PEG5000))KKKKDOTAβA-NH2の化学構造。111In分子を含む多量体型ペプチド複合体の化学構造を記載する。
【図９】KTLLPTP（配列番号1）のアミノ酸置換：アラニン突然変異体。この研究に使用したペプチドは、Panc27ペプチドとも呼ばれるファージ由来配列KTLLPTP（配列番号1；対照）および突然変異型（mutated）配列からなる。7つの位置のそれぞれを個別にアラニンに突然変異させた。アラニン突然変異体ATLLPTP、KALLPTP、KTALPTP、KTLAPTP、KTLLATP、KTLLPAP、およびKTLLPTA（それぞれ配列番号9〜15）を作製し、アフィニティについて調べた。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
［詳細な説明］
略号および頭字語
βA−ベータアラニン
CP−慢性膵炎
DOTA−1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸
ncPTP−陰性対照PTP
NIR−近赤外
NIRF−近赤外蛍光色素
Panc27ペプチド−KTLLPTP（配列番号1）
PanIN−膵上皮内新生物
PanIN I−腺腫
PanIN II−異形成を伴う腺腫
PanIN III−上皮内癌
PDAC−膵管腺癌
Plec1−プレクチン-1
PTP−プレクチン-1標的ペプチド
SPECT−単光子放射型コンピュータ断層撮影
tPTP−四量体型プレクチン-1標的ペプチド、四量体型合成ペプチドともいう（これはプレクチン-1を標的とする）
【００５２】
定義
本発明の説明と特許請求の範囲では、以下に述べる定義に従って次の術語を使用する。
【００５３】
「ある」（冠詞「a」および「an」）は、本明細書では、1つまたはそれ以上（すなわち少なくとも1つ）の、その冠詞の文法上の目的語を指すために使用される。例えば「ある要素」とは、1つの要素または1つより多くの要素を意味する。
【００５４】
本明細書において使用する用語「約（about）」は、だいたい（approximately）、の領域（in the region of）、およそ（roughly）、または付近（around）を意味する。「約」という用語を数値範囲と一緒に使用する場合、これは、その範囲を修飾して、その境界を、記載した数値の上下に拡げる。一般に、「約」という用語は、本明細書では、数値を、明記した値の上下に差分にして10％変更するために使用される。ある態様では、「約」という用語が、その用語と一緒に使用される数字の数値の±20％を意味する。したがって約50％は45％〜55％の範囲を意味する。本明細書において端点によって説明する数値範囲は、その範囲内に含まれる全ての数字および端数（fraction）を包含する（例えば1〜5は、1、1.5、2、2.75、3、3.90、4、および5を包含する）。また、全ての数字およびその端数が用語「約」によって修飾されると見なされることを理解すべきである。
【００５５】
本明細書にいう「腺癌」は、腺（空隙を取り囲む細胞の集合体）を形成する細胞で構成される良性（非がん性）腫瘍を指す「腺腫」との対比で、がん性の腫瘍を指す。
【００５６】
本明細書に関して使用する用語「追加の治療活性化合物」または「追加の治療剤」は、処置される特定の傷害、疾患または障害に対する追加の治療的使用のための化合物の使用または投与を指す。そのような化合物には、例えば、無関係な疾患もしくは障害、または処置される傷害、疾患または障害の一次処置には応答しないかもしれない疾患もしくは障害を処置するために使用されるものが含まれうる。
【００５７】
本明細書において使用する用語「アジュバント」は、特異的抗原と組み合わせて使用した場合に、増進した免疫応答を惹起する物質を指す。
【００５８】
本明細書において使用する用語「（化合物）の投与」および/または「（化合物を）投与する」は、処置を必要とする対象に、本発明の化合物または本発明の化合物のプロドラッグを与えることを意味すると理解すべきである。
【００５９】
本明細書において使用する用語「エアロゾル」は、空気中のサスペンション（suspension）を指す。特にエアロゾルは、本発明の製剤の粒子化（particlization）または微粒化（atomization）および空気中のそのサスペンションを指す。
【００６０】
本明細書にいう「アゴニスト」は、ヒトなどの哺乳動物に投与した場合に、その哺乳動物において、目的のターゲット化合物または分子のレベルまたは存在に起因すると考えられる生物学的活性を、増進または拡張（extend）する組成物である。
【００６１】
本明細書において使用する用語「ペプチド構造中の改変（alteration）」は、配列の変化（change）および翻訳後修飾などといった（ただしこれらに限るわけではない）変化を指す。
【００６２】
「アンタゴニスト」は、ヒトなどの哺乳動物に投与した場合に、その哺乳動物において、目的の化合物または分子のレベルまたは存在に起因すると考えられる生物学的活性を、阻害する組成物である。
【００６３】
本明細書にいう「疾患または障害症状を軽減（alleviate）する」とは、症状の重症度、もしくは患者がそのような症状を経験する頻度、またはその両方を低下させることを意味する。
【００６４】
本明細書にいうアミノ酸は、次の表に示すように、そのフルネームで表されるか、それに対応する三文字記号で表されるか、またはそれに対応する一文字記号で表される。
【表１】
2013510094.tif 000004
【００６５】
用語「アミノ酸」は「アミノ酸残基」と互換的に（interchangeably）使用され、遊離のアミノ酸とペプチドのアミノ酸残基とを指しうる。遊離のアミノ酸を指すか、ペプチドの残基を指すかは、文脈から明白であるだろう。
【００６６】
本明細書において使用する「アミノ酸」という表現は、天然アミノ酸と合成アミノ酸の両方、そしてDアミノ酸とLアミノ酸の両方を包含するものとする。「標準アミノ酸」とは、天然ペプチド中に普通に見いだされる20個の標準的なL-アミノ酸のいずれかを意味する。「非標準アミノ酸残基」は、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸を意味し、それが合成的に製造されたか、天然源に由来するかは問わない。本明細書にいう「合成アミノ酸」は、塩、アミノ酸誘導体（アミドなど）、および置換体（substitution）などといった（ただしこれらに限るわけではない）化学修飾アミノ酸も包含する。本発明のペプチド内に含有されるアミノ酸、特にカルボキシ末端またはアミノ末端にあるアミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化によって、またはペプチドの活性に悪影響を及ぼすことなくペプチドの循環半減期を変化させることができる他の化学基による置換によって、修飾することができる。さらに、本発明のペプチドにはジスルフィド結合が存在しても存在しなくてもよい。
【００６７】
アミノ酸は次の一般構造を有する。
【化２】
2013510094.tif 000005
【００６８】
アミノ酸は側鎖Rに基づいて7つのグループに分類することができる：（1）脂肪族側鎖、（2）ヒドロキシル（OH）基を含有する側鎖、（3）硫黄原子を含有する側鎖、（4）酸性基またはアミド基を含有する側鎖、（5）塩基性基を含有する側鎖、（6）芳香環を含有する側鎖、および（7）側鎖がアミノ基に融合されたイミノ酸であるプロリン。
【００６９】
本発明のペプチド化合物を説明するために使用する命名法は、各アミノ酸残基の左にアミノ基を示し、右にカルボキシ基を示すという従来の慣例に従う。本発明の選ばれた具体的実施形態を表す式において、アミノ末端基およびカルボキシ末端基は、明示されているわけではないものの、別段の明記がない限り、生理的pH値においてそれらがとるであろう形態にあると理解されるであろう。
【００７０】
本明細書において使用する「塩基性」または「正電荷」アミノ酸という用語は、R基がpH7.0において正味の正電荷を有するアミノ酸を指し、例えば標準アミノ酸リジン、アルギニン、およびヒスチジンなどが含まれるが、これらに限るわけではない。
【００７１】
本明細書にいう化学化合物（chemical compound）の「類似体（analog）」は、例えば、もう一つの化合物と構造は似ているが必ずしも異性体ではない化合物である（例えば5-フルオロウラシルはチミンの類似体である）。
【００７２】
本明細書において使用する用語「抗体」は、抗原上の特異的エピトープに特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を指す。抗体は、天然源または組換え源（recombinant source）に由来するインタクトな免疫グロブリンであることができ、インタクトな免疫グロブリンの免疫反応性部分であることもできる。抗体は典型的には免疫グロブリン分子の四量体である。本発明における抗体は、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fv、FabおよびF(ab)2、ならびに単鎖抗体およびヒト化抗体などを含む（ただしこれらに限るわけではない）さまざまな形態で存在しうる。
【００７３】
本明細書にいう「抗体重鎖」は、全ての抗体分子に存在する2タイプのポリペプチド鎖のうち、大きい方を指す。
【００７４】
本明細書にいう「抗体軽鎖」は、全ての抗体分子に存在する2タイプのポリペプチド鎖のうち、小さい方を指す。
【００７５】
本明細書において使用する用語「合成抗体」は、組換えDNA技術を使って作製される抗体、例えば本明細書で説明するようにバクテリオファージによって発現される抗体などを意味する。この用語は、抗体をコードしていて抗体タンパク質を発現するDNA分子の合成によって作製された抗体、または抗体を特定するアミノ酸配列であって、前記DNAまたはアミノ酸配列が、当技術分野において利用可能な周知の合成DNAまたはアミノ酸配列技術を使って得られたものを意味するとも解釈されるべきである。
【００７６】
本明細書において使用する用語「抗原」は、免疫応答を引き出す分子と定義される。この免疫応答は、抗体産生もしくは特異的免疫適格細胞の活性化、またはその両方を伴いうる。抗原は、生物、タンパク質/抗原のサブユニット、死滅させたまたは不活化した全細胞、または溶解物に由来することができる。
【００７７】
本明細書において使用する用語「抗原性決定基」は、抗原のうち、特定の抗体と接触する部分（すなわちハプテン）を指す。タンパク質もしくはタンパク質のフラグメント、または化学的部分（chemical moiety）を使ってホスト動物を免疫した場合、その抗原の数多くの領域が、タンパク質上の所与の領域または三次元構造に特異的に結合する抗体の産生を誘導するだろう；これらの領域または構造を抗原性決定基という。抗原性決定基は、抗体への結合に関して、インタクトな抗原（すなわち免疫応答を惹起するために使用した「免疫原」）と競合しうる。
【００７８】
本明細書において使用する用語「抗微生物剤」は、本発明の方法において実施されるヒトまたは動物での使用に関して安全であり、微生物を殺すかその成長を実質的に阻害するのに有効である、任意の天然、合成、または半合成化合物または組成物またはそれらの混合物を指す。本明細書にいう「抗微生物」は、抗細菌、抗真菌、および抗ウイルス剤を包含する。
【００７９】
本明細書において使用する用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」またはアンチセンス核酸は、少なくともその一部分が正常細胞または罹患細胞中に存在する核酸に対して相補的である核酸ポリマーを意味する。「アンチセンス」は、特に、タンパク質をコードする二本鎖DNA分子の非コード（non-coding）鎖の核酸配列、または非コード鎖に実質的に相同な配列を指す。本明細書に定義するアンチセンス配列は、タンパク質をコードする二本鎖DNA分子の配列に対して相補的である。アンチセンス配列が、DNA分子のコード鎖のもっぱらコード部分（coding portion）に相補的である必要はない。アンチセンス配列は、タンパク質をコードするDNA分子のコード鎖上に特定される調節配列であって、コード配列の発現を制御するものに相補的であってもよい。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドには、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの他の修飾体が含まれるが、これらに限るわけではない。
【００８０】
「アプタマー」は、もう一つの化合物（例えばここで同定されるタンパク質）に優先的に結合するようにインビトロで選択された化合物である。多くの場合、アプタマーは核酸またはペプチドである。なぜなら、ヌクレオチドまたはアミノ酸（天然物または合成物の両方）からは、ランダムな配列を容易に数多く生成させることができるからであるが、もちろんアプタマーがこれらに限定される必要はない。
【００８１】
本明細書において使用する用語「取り付ける（attach）」または「取り付け（attachement）」または「取り付けられた（attached）」または「取り付けること（attaching）」は、本明細書においては、「結合（bind）」または「結合すること（binding）」または「結合する（binds）」または「結合された（bound）」と互換的に使用され、安定な複合体の形成をもたらすような分子間の任意の物理的関係、例えばペプチドまたは小分子などのリガンドと「結合パートナー（binding partner）」または「受容体分子」との間の物理的関係などを指す。この関係は、例えば選択的な非共有結合的会合、イオン引力、水素結合、共有結合、ファンデルワールス力または疎水性引力などといった（ただしこれらに限るわけではない）物理化学的相互作用によって媒介されうる。
【００８２】
本明細書において使用する用語「アビディティ」は、リガンドの、受容体分子との総合的な結合の強さ（total binding strength）を指し、この場合、相互作用の強さはパートナー間の複数の独立した結合相互作用を含み、それは複数の低アフィニティ相互作用または小数の高アフィニティ相互作用に由来しうる。
【００８３】
用語「結合（binding）」は、分子同士の、例えば限定するわけではないが、酵素と基質、リガンドと受容体、抗体と抗原、タンパク質のDNA結合ドメインとDNA、およびDNA鎖またはRNA鎖と相補鎖の付着（adherence）を指す。
【００８４】
本明細書にいう「結合パートナー」は、もう一つの分子に結合する能力を有する分子を指す。
【００８５】
本明細書において使用する用語「生体適合性」は、宿主（host）において実質的に有害な応答を惹起しない材料を指す。
【００８６】
本明細書において使用するポリペプチドの「生物学的活性（biologically active）フラグメント」または「生物活性（bioactive）フラグメント」という用語は、完全長タンパク質のうち、その天然リガンドに特異的に結合する能力またはそのタンパク質の機能を果たす能力を有する、天然または合成部分を包含する。
【００８７】
本明細書において使用する用語「生体試料（biological sample）」は、対象から得られる試料を指し、皮膚、毛髪、組織、血液、血漿、細胞、汗および尿を含むが、これらに限るわけではない。
【００８８】
本明細書において使用する用語「生検組織」は、試料ががん性組織を含有するかどうかを決定する目的で対象から摘除された組織の試料を指す。ある実施形態では、対象ががんを有すると疑われるので、生検組織が取得される。その場合は、がんの有無について生検組織を調べる。
【００８９】
本明細書において使用する用語「がん」は、調節されない成長、分化の欠如、限局的組織浸潤、および転移をもたらすユニークな形質−正常な制御の喪失−を有する細胞の増殖と定義される。黒色腫、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵がん、直腸結腸がん、腎がんおよび肺がんなどがその例であるが、これらに限るわけではない。
【００９０】
本明細書において使用する用語「担体分子」は、目的の分子に化学的にコンジュゲート（conjugate）される任意の分子を指す。
【００９１】
本明細書において使用する「細胞」、「細胞株」および「細胞培養」は、互換的に使用される。これらの用語はいずれも、ありとあらゆる後続の世代であるそれらの子孫も包含する。意図的なまたは偶発的な突然変異により全ての子孫が同一でない場合もあると理解される。
【００９２】
本明細書において使用する用語「対象におけるがんを特徴づける」は、良性組織、前がん組織またはがん性組織の存在、がんのステージ、および対象の予後などといった（ただしこれらに限るわけではない）、対象におけるがん試料の1つまたはそれ以上の性質の同定を指す。がんは、1つまたはそれ以上のがんマーカー遺伝子（例えば限定するわけではないが、本明細書に開示するがんマーカー）の発現を同定することによって特徴づけることができる。
【００９３】
本明細書において使用する「化学的にコンジュゲートされた」または「化学的にコンジュゲートする」という用語は、抗原を担体分子に連結（link）することを指す。この連結は、組み換え技術を使って遺伝子レベルで行うことができ、その場合、抗原と担体分子の両方のアミノ酸配列またはその一部を含有するハイブリッドタンパク質を生産することができる。このハイブリッドタンパク質は、抗原と担体分子の両方をコードするオリゴヌクレオチド配列またはその一部によって生産される。この連結には、抗原と担体タンパク質との間に、他の化学反応、例えば限定するわけではないが、グルタルアルデヒド反応を使って作られた共有結合も包含される。共有結合は、抗原を担体分子に架橋する第3の分子を使って作ることもできる。これらの架橋剤（cross-linker）は、抗原上および担体分子上の、1級アミン、スルフヒドリル、カルボニル、糖質、またはカルボン酸など（ただしこれらに限定されるわけではない）の基と反応することができる。化学的コンジュゲーション（chemical conjugation）には、抗原と担体分子との間の非共有結合的結合も包含される。
【００９４】
遺伝子の「コード領域（coding region）」は、その遺伝子のコード鎖のヌクレオチド残基とその遺伝子の非コード鎖のヌクレオチド（これらは、その遺伝子の転写によって生成するmRNA分子のコード領域と、それぞれ相同または相補的である）からなる。
【００９５】
用語「競合配列（competitive sequence）」は、もう一つのペプチドとそのコグネイト結合部位に関して競合する、ペプチドまたはその修飾体、フラグメント、誘導体、もしくはホモログを指す。
【００９６】
本明細書にいう「相補的」は、2つの核酸（例えば2つのDNA分子）の間のサブユニット配列相補性の幅広い概念を指す。両分子中のあるヌクレオチド位置が、互いに塩基対合し合うことが通常は可能であるヌクレオチドによって占められている場合、その核酸はその位置において互いに相補的であると見なされる。したがって、2つの核酸は、各分子中の対応する位置のかなりの数（少なくとも50％）が、通常は互いに塩基対合するヌクレオチド（例えばA：TおよびG：Cヌクレオチド対）で占められているのであれば、互いに相補的である。例えば、第1核酸領域のアデニン残基は、第1領域に対して逆平行である第2核酸領域の残基と、その残基がチミンまたはウラシルであるならば、特異的水素結合を形成する（「塩基対合する」）能力を有することが知られている。また、第1核酸鎖のシトシン残基は、第1鎖に対して逆平行である第2核酸鎖の残基と、その残基がグアニンであるならば、塩基対合する能力を有することが知られている。核酸の第1領域は、同じ核酸または異なる核酸の第2領域に対して、それら2つの領域が逆平行に配置されていて、第1領域の少なくとも1つのヌクレオチド残基が第2領域の残基と塩基対合する能力を有するのであれば、相補的である。好ましくは、第1領域が第1部分を含み、第2領域が第2部分を含み、その第1部分と第2部分とが逆平行に配置された時に、第1部分のヌクレオチド残基の少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約75％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％は、第2部分中のヌクレオチド残基と塩基対合する能力を有する。より好ましくは、第1部分の全てのヌクレオチド残基が第2部分中のヌクレオチド残基と塩基対合する能力を有する。
【００９７】
本明細書にいう「化合物」は、一般に薬物と見なされる、または薬物として使用するための候補である、任意のタイプの物質または薬剤、ならびにそれらの組合せおよび混合物を指す。
【００９８】
本明細書において使用する用語「保存的アミノ酸置換」は、本明細書においては、以下の5つのグループの1つ内でのアミノ酸交換と定義される。
I．小さい脂肪族非極性または弱極性残基：
Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；
II．極性負電荷残基およびそれらのアミド：
Asp、Asn、Glu、Gln；
III．極性正電荷残基：
His、Arg、Lys；
IV．大きい脂肪族非極性残基：
Met Leu、Ile、Val、Cys
V．大きい芳香族残基：
Phe、Tyr、Trp
【００９９】
「対照」細胞は、試験細胞（test cell）と同じ細胞タイプを有する細胞である。対照細胞は、例えば、試験細胞を検査（examine）する時に、まさに同時に、またはほぼ同時に、検査することができる。対照細胞は、例えば試験細胞を検査する時とは異なる時に検査してもよく、対照細胞の検査の結果を記録して、記録された結果を試験細胞の検査によって得られる結果と比較できるようにすることができる。
【０１００】
「試験」細胞は検査される細胞である。
【０１０１】
本明細書にいう「サイトカイン」は、細胞間シグナリング分子を指し、最も良く知られているものは、哺乳動物体細胞の調節に関与する。例えばインターロイキン、インターフェロン、およびトランスフォーミング増殖因子など、効果が成長促進性であるものも、成長阻害性であるものも、数多くのサイトカインファミリーが特徴づけられている。当業者には他のサイトカインも数多く知られている。これらのサイトカインの供給源、特徴、ターゲットおよびエフェクター活性は記載されている。
【０１０２】
本明細書にいう化合物の「誘導体」は、例えばアルキル、アシル、またはアミノ基によるHの置き換えのように、類似の構造を持つ別の化合物から、1段階またはそれ以上の段階で製造することができる化学化合物を指す。
【０１０３】
単語「検出する（detect）」およびその文法上の異形（grammatical variant）の使用が、定量を伴わないその種（species）の測定を指すのに対して、用語「決定する（determine）」または「測定する（measure）」の使用は、それらの文法上の異形の使用と共に、定量を伴うその種の測定を指すものとする。用語「検出する」と「同定する」は、本明細書では、互換的に使用される。
【０１０４】
本明細書にいう「検出可能マーカー」または「レポーター分子」は、マーカーを伴わない類似の化合物の存在下で、そのマーカーを含む化合物の特異的検出を可能にする原子または分子である。検出可能マーカーまたはレポーター分子には、例えば放射性同位元素、抗原性決定基、酵素、ハイブリダイゼーションに利用できる核酸、発色団、発蛍光団、化学発光分子、電気化学的に検出可能な分子、および蛍光偏光の変化または光散乱の変化をもたらす分子などが含まれる。
【０１０５】
「疾患」は、動物がホメオスタシスを維持することができないような動物の健康状態であり、この場合、その疾患が寛解（ameliorate）しなければ、その動物の健康は悪化し続ける。
【０１０６】
これに対して、動物における「障害」は、動物はホメオスタシスを維持することができるが、その動物の健康状態は、その障害が存在しない場合ほどには好ましくないような、動物の健康状態である。無処置のまま放置しても、障害は、その動物の健康状態のさらなる低下を必ずしも引き起こさない。
【０１０７】
本明細書において使用する用語「ドメイン」は、共通する物理化学的特徴（例えば限定するわけではないが、疎水性、極性、球状およびらせん状ドメイン）または性質（例えばリガンド結合、シグナル伝達、細胞浸透（cell penetration））などを共有する分子または構造の一部を指す。結合ドメインの具体例には、DNA結合ドメインおよびATP結合ドメインが含まれるが、これらに限るわけではない。
【０１０８】
膵臓に関連して本明細書にいう「導管細胞（ductal cell）」は、膵臓内の導管および膵臓から出る導管の被覆層（lining）を形成するか、形成する能力を有するか、そこから派生した任意の細胞を指す。
【０１０９】
本明細書にいう「有効量」または「治療有効量」は、選択した効果（例えば疾患または障害の症状を軽減することなど）を生み出すのに十分な量を意味する。組合せの形態にある化合物、例えば複数の化合物が投与される場合、別の化合物と組み合わせて投与される時の各化合物の量は、その化合物が単独で投与される時とは異なりうる。したがって、化合物の組合せの有効量は、その組合せ全体をまとめて指すものであるが、各化合物の実際の量はさまざまでありうる。「より有効な（more effective）」という用語は、ある処置によって、それと比較されているもう一つの処置と比べて、選択した効果が、より大きく軽減（alleviate）されることを意味する。
【０１１０】
本明細書において使用する用語「エフェクタードメイン」は、生化学経路を調節する能力を有する細胞質中のエフェクター分子、化学物質（chemical）、または構造と、直接的に相互作用する能力を有するドメインを指す。
【０１１１】
本明細書において使用する用語「エリキシル剤」は、矯味矯臭物質（flavoring substance）と、時には活性医薬剤（active medicinal agent）とを含有する、透明で、甘味をつけたアルコール含有（通常は水性アルコール）液である。
【０１１２】
「コードする（encoding）」は、所定のヌクレオチド配列（すなわちrRNA、tRNAおよびmRNA）または所定のアミノ酸配列とそこから得られる生物学的性質とを有する他のポリマーおよび高分子を生物学的プロセスにおいて合成するためのテンプレートとして役立つという、遺伝子、cDNA、またはmRNAなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特異的配列の固有の性質を指す。したがって、ある遺伝子は、その遺伝子に対応するmRNAの転写と翻訳とが、細胞または他の生物系においてタンパク質を産生するのであれば、そのタンパク質をコードする。mRNA配列と同一のヌクレオチド配列を有し、通常、配列表に記載されるコード鎖、および遺伝子またはcDNAの転写にテンプレートとして使用される非コード鎖は、その遺伝子またはcDNAのタンパク質その他の産物をコードするということができる。
【０１１３】
「エンハンサー」は、転写の開始部位に対するエンハンサーの距離または配向とはかかわりなく、転写の効率を増加させることができるDNA調節要素である。
【０１１４】
本明細書において使用する用語「エピトープ」は、抗体を惹起し抗体と反応することができる抗原分子上の小さな化学基と定義される。抗原は1つ以上のエピトープを有することができる。大半の抗原は多くのエピトープを有する。すなわち大半の抗原は多価である。通例、エピトープはサイズがおよそ5アミノ酸または5糖である。一般に、分子の特異的一次配列よりはむしろ全体としての三次元構造が、抗原特異性の主たる基準であることは、当業者には理解されている。
【０１１５】
本明細書にいう、ある特定タンパク質またはペプチドの「本質的に純粋な」調製物とは、その調製物中のタンパク質またはペプチドの少なくとも約95重量％、好ましくは少なくとも約99重量％が、その特定タンパク質またはペプチドであるような調製物である。
【０１１６】
「フラグメント」または「セグメント」は、少なくとも1つのアミノ酸を含むアミノ酸配列の一部分、または少なくとも1つのヌクレオチドを含む核酸配列の一部分である。「フラグメント」および「セグメント」という用語は、本明細書においては、互換的に使用される。
【０１１７】
タンパク質またはペプチドに適用される場合、本明細書において使用する用語「フラグメント」は、通常は少なくとも約3〜15アミノ酸長、少なくとも約15〜25アミノ酸長、少なくとも約25〜50アミノ酸長、少なくとも約50〜75アミノ酸長、少なくとも約75〜100アミノ酸長であることができ、100アミノ酸長以上であることもできる。
【０１１８】
核酸に適用される場合、本明細書において使用する用語「フラグメント」は、通常は少なくとも約20ヌクレオチド長、典型的には少なくとも約50ヌクレオチド長、より典型的には約50〜約100ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約100〜約200ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも約200ヌクレオチド〜約300ヌクレオチド、より一層好ましくは少なくとも約300〜約350、より好ましくは少なくとも約350ヌクレオチド〜約500ヌクレオチド、より一層好ましくは少なくとも約500〜約600、さらに好ましくは少なくとも約600ヌクレオチド〜約620ヌクレオチド、より一層好ましくは少なくとも約620〜約650であることができ、最も好ましくは、核酸フラグメントは、約650ヌクレオチド長より大きいであろう。
【０１１９】
本明細書にいう「機能的」生物学的分子は、それを特徴づける性質を示す形態にある生物学的分子である。例えば、機能的酵素とは、その酵素を特徴づける特徴的な触媒活性を示す酵素である。
【０１２０】
本明細書にいう「相同（homologous）」は、2つのポリマー分子間、例えば2つの核酸分子、例えば2つのDNA分子または2つのRNA分子間、または2つのポリペプチド分子間のサブユニット配列類似性を指す。2つの分子の両方におけるサブユニット位置が同じモノマーサブユニットで占められている場合、例えば2つのDNA分子のそれぞれにおけるある位置がアデニンで占められているのであれば、それらはその位置において相同である。2つの配列間の相同性は、一致する位置または相同な位置の数の直接関数（direct function）である。例えば、2つの化合物配列中の位置の半分（例えば10サブユニット長のポリマー中の5つの位置）が相同であるならば、それら２つの配列は50％相同であり、位置の90％、例えば10個中9個が、一致しているか相同であるならば、それら2つの配列は90％相同である。例えば、DNA配列3'ATTGCC5'と3'TATGGCは互いに50％の相同性を有する。
【０１２１】
本明細書にいう「相同性」は「同一性（identity）」と同義語的に使用される。
【０１２２】
2つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間の同一性百分率の決定は、数学的アルゴリズムを使って達成することができる。例えば、2つの配列を比較するのに役立つ数学的アルゴリズムは、KarlinおよびAltschul（1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877）に記載されているように部分修正されたKarlinおよびAltschulのアルゴリズム（1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268）である。このアルゴリズムは、Altschulら（1990, J. Mol. Biol. 215:403-410）のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み込まれており、例えば統一資源位置指定子（universal resource locator）を有する米国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）のワールド・ワイド・ウェブサイトにおいて、NCBIウェブサイトのBLASTツールを使ってアクセスすることができる。本明細書に記載する核酸に相同なヌクレオチド配列を得るために、BLASTヌクレオチド検索を、NBLASTプログラム（NCBIウェブサイトでは「blastn」と呼ばれている）で、次のパラメータを使って行うことができる：ギャップ・ペナルティ（gap penalty）＝5；ギャップ・エクステンション・ペナルティ（gap extension penalty）＝2；ミスマッチ・ペナルティ（mismatch penalty）＝3；マッチ・リワード（match reward）＝1；期待値（expectation value）10.0；およびワード・サイズ（word size）＝11。本明細書に記載するタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、BLASTタンパク質検索を、XBLASTプログラム（NCBIウェブサイトでは「blastn」と呼ばれている）またはNCBI「blastp」プログラムで、次のパラメータを使って行うことができる：期待値10.0、BLOSUM62スコアリング行列（scoring matrix）。比較のためにギャップ付きアラインメントを得るには、Altschulら（1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402）に記載されているように、Gapped BLASTを利用することができる。あるいは、PSI-BlastまたはPHI-Blastを使って、分子間の遠い関係（同上書）および共通のパターンを有する分子間の関係を検出する繰り返し検索（iterated search）を行うこともできる。BLAST、Gapped BLAST、PSI-Blast、およびPHI-Blastプログラムを利用する場合は、各プログラム（例えばXBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメータを使用することができる。
【０１２３】
2つの配列間の同一性百分率は、上述の技法と同様の技法を使って、ギャップを許可してまたはギャップを許可しないで、決定することができる。同一性百分率を算出する場合、典型的には、完全一致（exact match）を計数する。
【０１２４】
本明細書において使用する用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的核酸の対合（pairing）に関して使用される。ハイブリダイゼーションとハイブリダイゼーションの強さ（すなわち核酸間の会合の強さ）は、核酸間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドの長さ、および核酸内のG:C比などといった要因の影響を受ける。
【０１２５】
本明細書において使用する用語「吸入器」は、例えば溶液、粉末などの薬物を経鼻投与するための装置と肺投与するための装置の両方を指す。例えば、用語「吸入器」は、急性喘息発作用の抗ヒスタミン薬の投与に使用されるような噴射剤方式（propellant driven）の吸入器、およびうっ血除去薬の投与に使用されるようなプラスチック製スプレーボトルを包含するものとする。
【０１２６】
本明細書において使用する用語「阻害する（inhibit）」は、用語「阻害する」が使用されている文脈に応じて、記載の機能、レベル、活性、速度などを低下させまたは妨害する化合物、薬剤、または方法の能力を指す。好ましくは、阻害は、少なくとも10％の阻害である。用語「阻害する」は、「低下させる（reduce）」または「ブロックする（block）」と互換的に使用される。
【０１２７】
本明細書において使用する「複合体を阻害する」という用語は、2つ以上のタンパク質の複合体の形成または相互作用を阻害すること、ならびにその複合体の機能または活性を阻害することを指す。この用語は形成された複合体を破壊することも包含する。ただし、この用語は、これらの機能の全てが同時に阻害されなければならないことを含意しない。
【０１２８】
本明細書において使用する「タンパク質を阻害する」という用語は、タンパク質の合成、レベル、または機能を阻害する任意の方法または技法、ならびに目的のタンパク質の合成、レベル、活性、または機能の誘導または刺激を阻害する方法を指す。この用語は、目的のタンパク質の合成、レベル、活性、または機能を調節することができる任意の代謝経路または調節経路も指す。この用語は、他の分子との結合および複合体形成も包含する。それゆえに、用語「タンパク質阻害剤」は、その適用によってタンパク質機能またはタンパク質経路機能の阻害が起こる任意の薬剤または化合物を指す。ただし、この用語は、これらの機能の全てが同時に阻害されなければならないことを含意しない。
【０１２９】
本明細書にいう「注射（inject）または適用（apply）する」は、多くの経路および手段、例えば限定するわけではないが、局所外用（topical）、経口、口腔粘膜（buccal）、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内（intramedullary）、髄腔内（intrathecal）、脳室内（intraventricular）、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸（enteral）、局所外用、舌下、膣、眼、肺、または直腸手段などによる、本発明の化合物の投与を包含する。
【０１３０】
本明細書にいう「指示書」には、本明細書において列挙するさまざまな疾患または障害の軽減を達成するためのキットにおける本発明のペプチドの有用性を伝えるために使用することができる刊行物、記録（recording）、図表（diagram）、または他の任意の表現媒体が包含される。場合によっては、または上記に代えて、指示書は、哺乳動物の細胞または組織における疾患または障害を軽減する1つ以上の方法を説明してもよい。本発明のキットの指示書は、例えば、同定された本発明の化合物が入っている容器に添付されるか、同定された化合物が入っている容器と一緒に出荷することができる。あるいは、指示書と化合物は受取人（recipient）によって協同的に使用されるものとして、指示書を容器とは別に出荷してもよい。
【０１３１】
本明細書において使用する用語「浸潤性（invasive）」、または本明細書にいう「転移（metastasis）」は、細胞の任意の遊走（migration）を指し、特に浸潤性のがん細胞または腫瘍細胞を指す。この用語は、正常に浸潤性である細胞、例えば創傷を治癒する線維芽細胞にも、異常に遊走する細胞にも適用される。この用語が何らかの機序原理による限定を受けることはないが、そのような細胞は、それらを十分に「所定の位置（in place）」に維持して正常に機能させるための身体の手段を打破することによって、遊走すると考えられている。そのような細胞は、それらが、組織または腫瘍内を異常に遊走するか、組織を脱出するか、他の組織に浸潤（invade）するのであれば、「浸潤性」である。
【０１３２】
「単離された核酸」は、自然状態においてそれに隣接している配列から分離された核酸セグメントまたは核酸フラグメント、例えばそのフラグメントに通常は隣接している配列（例えばそのフラグメントを天然に含んでいるゲノムにおいてそのフラグメントに隣接している配列）から取り出されたDNAフラグメントを指す。この用語は、その核酸に天然に付随する他の構成要素から、例えば細胞内でそれに天然に付随するRNAまたはDNAまたはタンパク質から、実質的に精製された核酸にも適用される。それゆえに、この用語は、例えば、ベクター中、自律的に複製するプラスミドまたはウイルス中、または原核生物または真核生物のゲノムDNA中に組み込まれた組換えDNA、または他の配列とは依存せずに独立した分子として（例えばcDNA、またはPCRもしくは制限酵素消化によって生成するゲノムフラグメントもしくはcDNAフラグメントとして）存在する組換えDNAを包含する。これは、追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAも包含する。
【０１３３】
「リガンド」は、ターゲット受容体またはターゲット分子に特異的に結合する化合物である。
【０１３４】
「受容体」またはターゲット分子は、リガンドに特異的に結合する化合物である。
【０１３５】
リガンドまたは受容体が、不均一な化合物の試料における、ある化合物の存在を決定づける結合反応において機能する場合、そのリガンドまたは受容体は、その化合物「に特異的に結合する」。したがって、指定されたアッセイ（例えばイムノアッセイ）条件下で、リガンドまたは受容体は、特定の化合物に優先的に結合し、試料中に存在する他の化合物には有意な量では結合しない。例えばポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション条件下で、相補的な配列を含む化合物ポリヌクレオチドに特異的に結合し、抗体は、イムノアッセイ条件下で、その抗体を産生させたエピトープを保持する抗原に特異的に結合する。
【０１３６】
本明細書において使用する用語「結合（linkage）」は、2つの基の間の結びつき（connection）を指す。この結びつきは、共有結合的であっても非共有結合的であってもよく、限定するわけではないが、イオン結合、水素結合、および疎水性/親水性相互作用が含まれる。
【０１３７】
本明細書において使用する用語「リンカー（linker）」は、他の2つの分子を、共有結合的または非共有結合的に、例えばイオン結合もしくは水素結合またはファンデルワールス相互作用などによって接合（join）する分子、例えば5'端で一つの相補配列にハイブリダイズし、3'端でもう一つの相補配列にハイブリダイズすることで、2つの非相補配列を接合する核酸分子などを指す。
【０１３８】
遺伝子の「異常発現（malexpression）」は、疾患または障害に冒されている患者の細胞における遺伝子の発現であって、発現のレベル（非発現を含む）、発現される遺伝子の部分、または細胞周期に対する遺伝子の発現のタイミングが、その疾患または障害に冒されていない患者の細胞における同じ遺伝子の発現とは異なっている発現を意味する。異常発現は、疾患または障害の原因または一因となるか、疾患または障害の症状であるか、またはその両方であることができると理解される。
【０１３９】
本明細書において使用する用語「悪性」は、退形成、例えば近隣区域または脈管構造への浸透（penetrance）、および転移の性質を有することを指す。
【０１４０】
本明細書において使用する用語「質量タグ（mass tag）」は、分子の化学修飾、より典型的には、ペプチドなどの分子の2つのそのような修飾であって、化学的には同一であるにも関わらず、分子質量に基づいてもう一つの修飾から識別することができるものを指す。
【０１４１】
本明細書において使用する用語「試料中のペプチドを同定する方法」は、タンパク質を含む小さいおよび大きいペプチドを同定することを指す。
【０１４２】
本明細書において使用する用語「発現のレベルを測定すること」または「発現のレベルを決定すること」は、アッセイの結果を目的の遺伝子またはタンパク質の発現のレベルと相関させるために使用することができる任意の測定またはアッセイを指す。そのようなアッセイは、mRNAのレベル、タンパク質レベルなどの測定を含み、ノーザンブロット分析、ウェスタンブロット分析、結合アッセイ、イムノブロットなどのアッセイによって行うことができる。発現のレベルは発現率（rate of expression）を含むことができ、存在するmRNAまたはタンパク質の実際の量によって測定することもできる。
【０１４３】
「核酸」という用語は、典型的には、大きなポリヌクレオチドを指す。「核酸」は、任意の核酸を意味するものとし、デオキシリボヌクレオシドで構成されるか、リボヌクレオシドで構成されるかを問わず、またホスホジエステル結合で構成されるか、修飾された結合、例えばホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホルアミデート、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、架橋ホスホロチオエートまたはスルホン結合、およびそのような結合の組合せなどで構成されるかを問わない。具体的にいえば、核酸という用語は、生物学的に見いだされる5つの塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）以外の塩基で構成される核酸も包含する。
【０１４４】
本明細書において使用する用語「核酸」は、RNAならびに一本鎖DNA、二本鎖DNA、およびcDNAを包含する。さらにまた、「核酸」、「DNA」、「RNA」およびそれに類する用語は、核酸類似体、すなわちホスホジエステルバックボーン以外を有する類似体も包含する。例えば、当技術分野で知られている、バックボーン中にホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有する、いわゆる「ペプチド核酸」は、本発明の範囲に包含されるとみなされる。「核酸」は、任意の核酸を意味するものとし、デオキシリボヌクレオシドで構成されるか、リボヌクレオシドで構成されるかを問わず、またホスホジエステル結合で構成されるか、修飾された結合、例えばホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホルアミデート、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、架橋ホスホロチオエートまたはスルホン結合、およびそのような結合の組合せなどで構成されるかを問わない。具体的にいえば、核酸という用語は、生物学的に見いだされる5つの塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）以外の塩基で構成される核酸も包含する。本明細書では従来の表記法を使ってポリヌクレオチド配列を記述する。すなわち、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は5'端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側の方向を5'方向という。新生RNA転写産物へのヌクレオチドの5'→3'付加の方向を転写方向という。mRNAと同じ配列を有するDNA鎖を「コード鎖」といい、DNA上の基準点に対して5'側に位置するDNA鎖上の配列を「上流配列」といい、DNA上の基準点に対して3'側にあるDNA鎖上の配列を「下流配列」という。
【０１４５】
本明細書において使用する用語「核酸コンストラクト」は、所望する特定の遺伝子または遺伝子フラグメントをコードするDNAおよびRNA配列を包含し、ゲノム法で得られたものか、合成法で得られたものかを問わない。
【０１４６】
別段の明記がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重型であって、同じアミノ酸配列をコードする、全てのヌクレオチド配列を包含する。タンパク質およびRNAをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含んでもよい。
【０１４７】
用語「オリゴヌクレオチド」は、典型的には、短いポリヌクレオチド、一般的には約50ヌクレオチドより大きくないものを指す。ヌクレオチド配列をDNA配列（すなわちA、T、G、C）で表した場合、これは、「T」を「U」で置き換えたRNA配列（すなわちA、U、G、C）も包含することは理解されるであろう。
【０１４８】
本明細書において使用する用語「他の点では同一な試料（otherwise identical sample）」は、第1の試料に類似する試料を指す。すなわち、これは、同じ対象の同じ組織または体液から同じ方法で得られるか、または異なる対象から得られる類似の試料を指す。「非罹患対象からの他の点では同一な試料」という用語は、検査対象である疾患または障害を有することが知られていない対象から得られた試料を指す。試料は、もちろん、標準試料であってもよい。同様に、「他の点では同一な」という用語を、対象または非罹患対象における領域または組織に関して使用することもできる。
【０１４９】
2つのポリヌクレオチドが「作動的に連結されている」という説明は、一本鎖または二本鎖核酸部分が、その核酸部分内に配置された2つのポリヌクレオチドを、それら2つのポリヌクレオチドの少なくとも一方が、それを特徴づける生理的効果を、他方に対して発揮できるような形で、含むことを意味する。例えば、遺伝子のコード領域に作動的に連結されたプロモーターは、そのコード領域の転写を促進することができる。
【０１５０】
臓器に関して本明細書にいう「膵臓」は、結合組織によって一つにまとめられた複数の細胞タイプの集合体を指し、それら複数の細胞には、腺房細胞（acini calls）、導管細胞および島細胞が含まれるが、これらに限るわけではない。「腺房」は、十二指腸において食品を消化するのに必要な数多くの酵素、例えばリパーゼなどを産生する。腺房によって産生された酵素は、導管（duct）と呼ばれる小さな通路によって十二指腸に運ばれる。典型的には、導管細胞は、結合組織により、血管細胞および神経細胞に近接する所定の位置に保たれている。ランゲルハンス島は典型的には膵臓の外分泌腺房単位の間に埋め込まれている。島内分泌細胞の例は、インスリンの作用に対抗するグルカゴンを分泌するアルファ細胞であり、一方、ベータ細胞はインスリンを分泌して、糖質代謝の制御を助ける。
【０１５１】
本明細書にいう「膵がん」は、膵臓を構成する組織、例えば膵管腺癌細胞に起源を有するがんを指す。
【０１５２】
本明細書にいう「膵管腺癌細胞」は、膵臓の導管被覆層から形成または派生する能力を有していたがん性細胞を指す。膵管腺癌細胞は、膵臓内に腺を形成している状態で見いだされるか、任意の臓器内に転移細胞として見いだされるか、リンパ系の血流（blood stream of lymphatic system）内に見いだすことができる。
【０１５３】
本明細書にいう医薬組成物の「非経口投与」は、対象の組織の物理的突破（physical breaching）を特徴とする任意の投与経路、および組織中の裂け目（breach）を通した医薬組成物の投与を包含する。したがって非経口投与は、限定するわけではないが、組成物の注射、外科的切開による組成物の適用、組織貫通非外科的創傷（tissue-penetrating non-surgical wound）による組成物の適用などによる医薬組成物の投与を包含する。特に、非経口投与は、限定するわけではないが、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内注射、および腎臓透析注入（kidney dialytic infusion）技法を包含すると考えられる。
【０１５４】
用語「ペプチド」は、典型的には、短いポリペプチドを指す。
【０１５５】
本明細書において使用する用語「ペプチドリガンド」（またはペプチドに関して「リガンド」という単語）は、例えばタンパク質、糖質などの分子に特異的に結合するペプチドまたはタンパク質のフラグメントを指す。ペプチドリガンドの受容体または結合パートナーは、ポリペプチド、核酸、糖質、脂質、または任意の有機体由来（organic derived）化合物など、本質的に任意のタイプの分子であることができる。リガンドの具体例は、本発明のペプチドリガンドである。
【０１５６】
用語「多量体型ペプチドリガンド複合体」は、プレクチン-1またはそのフラグメントもしくはホモログに結合させてそれを検出するための複合体であって、プレクチン-1に結合するペプチドリガンドを少なくとも2つは含む複合体を指す。場合によっては、ペプチドリガンドは、保存的アミノ酸置換で修飾されているか、分布を増進しまたは分解までの時間を増やすために、追加の標準物または非標準物（additional standard or non-standards）が付加され、場合によっては、ポリエチレンなどの部分がペプチドに付加され、次に、これらのそれぞれが、キレート剤に、場合によってはフレキシブルなアミノ酸鎖などのリンカーを介して、取り付けられて、多量体型ペプチドリガンド複合体を形成する。キレート剤はイメージング剤の取り付けに役立つ。「多量体型ペプチドリガンド複合体」という用語は、イメージング剤を伴う複合体またはイメージング剤を伴わない複合体を指すことができ、用語「多量体型ペプチドリガンドイメージング複合体」も同様であって、これらの用語は、文脈に応じて使用され、解釈されるものとする。これらの用語は、イメージング剤を伴うという表現、もしくはイメージング剤を伴わないという表現、またはそれに類する表現によって、限定されうる。
【０１５７】
本明細書において使用する用語「ペプチド質量ラベリング（peptide mass labeling）」は、化学的には同一であるが弁別的な質量を相違点とする2つの質量タグ試薬で、ペプチドを標識する戦略を意味する。
【０１５８】
「適用（per application）」と言う用語は、薬物または化合物の投与を指す。
【０１５９】
「医薬組成物」という用語は、少なくとも1つの活性成分を含む組成物を意味するものとし、したがってこの組成物は、哺乳動物（例えば限定するわけではないがヒト）における指定された有効な結果（efficacious outcome）について調べることができる。活性成分が、当業者のニーズに基づいて所望する有効な結果を有するかどうかを決定するのに適した技法は、当業者には理解され、正しく認識されるであろう。
【０１６０】
本明細書において使用する用語「医薬上許容される担体」は、化学組成物であって、適当な化合物または誘導体をそれと組合せ、その組合せ後に、その適当な化合物を対象に投与するために使用することができるものを意味する。
【０１６１】
本明細書において使用する用語「生理学的に許容される」エステルまたは塩は、医薬組成物の他のどの成分とも適合する活性成分のエステル型または塩型であって、その組成物を投与しようとする対象にとって有害でないものを意味する。
【０１６２】
「医薬上許容される」とは、ヒトまたは動物への応用に関して、生理学的に認容できることを意味する。
【０１６３】
本明細書において「医薬組成物」は、ヒトおよび動物用の製剤を包含する。
【０１６４】
「複数」は少なくとも2を意味する。
【０１６５】
「ポリヌクレオチド」は、核酸の一本鎖または平行もしくは逆平行鎖を意味する。したがってポリヌクレオチドは一本鎖核酸または二本鎖核酸のどちらであってもよい。
【０１６６】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合、その関連天然構造変異体、および合成非天然類似体によって連結されたアミノ酸残基、その関連天然構造変異体、および合成非天然類似体から構成されるポリマーを指す。
【０１６７】
「合成ペプチドまたはポリペプチド」は、非天然ペプチドまたはポリペプチドを意味する。合成ペプチドまたはポリペプチドは、例えば自動ポリペプチド合成装置を使って合成することができる。さまざまな固相ペプチド合成法が、当業者には知られている。
【０１６８】
本明細書において使用する用語「手術後（post surgical）腫瘍組織」は、対象から（例えば外科手術中に）取り出されたがん性組織（例えば生検組織）を指す。
【０１６９】
「前感作」とは、薬剤のチャレンジ（challenge）に先だつ、少なくとも1つの先天免疫系刺激物質の前投与を意味する。これを寛容の誘導と呼ぶこともある。
【０１７０】
本明細書において使用する用語「防止する」は、何かが起こるのを止めること、または起こるかもしれない何かまたはほぼ確実に起こる何かに対して前もって措置を講じることを意味する。医薬に関して「防止」とは、一般に、疾患または状態に陥る可能性を低下させるためにとられる行動を意味する。
【０１７１】
「防止的（preventive）」または「予防的（prophylactic）」処置は、疾患または障害の徴候を示していないか、早期徴候しか示していない対象に施される処置である。予防的または防止的処置は、その疾患または状態の発生に関連する病理（pathology）が発生するリスクを低下させる目的で施される。
【０１７２】
「プライマー」は、指定されたポリヌクレオチドテンプレートに特異的にハイブリダイズして、相補的ポリヌクレオチドを合成するための開始点を提供する能力を有するポリヌクレオチドを指す。そのような合成は、ポリヌクレオチドプライマーを、合成が誘導される条件下に置いた時に、すなわちヌクレオチド、相補的ポリヌクレオチドテンプレート、および重合のための薬剤、例えばDNAポリメラーゼの存在下に置いた時に起こる。プライマーは典型的には一本鎖であるが、二本鎖であってもよい。プライマーは典型的にはデオキシリボ核酸であるが、広範囲にわたるさまざまな合成および天然プライマーが、多くの応用に役立つ。プライマーは、それがハイブリダイズすることで合成を開始するための部位として役立つように設計されたテンプレートに対して相補的であるが、テンプレートの厳密な配列を反映する必要はない。そのような場合、テンプレートに対するプライマーの特異的ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。プライマーは、例えば発色性部分、放射性部分、または蛍光部分で標識して、検出可能部分として使用することができる。本明細書において使用する用語「プロモーター/調節（regulatory）配列」は、そのプロモーター/調節因子（regulator）配列に作動的に連結された遺伝子産物の発現にとって必要な核酸配列を意味する。ある場合には、この配列はコアプロモーター配列であることができ、また別の場合には、この配列が、遺伝子産物の発現に必要なエンハンサー配列および他の調節要素も含みうる。プロモーター/調節配列は、例えば、遺伝子産物を組織特異的に発現させるものであってもよい。
【０１７３】
「構成的」プロモーターは、それが作動的に連結されている遺伝子の発現を、細胞内で不変的に駆動するプロモーターである。例えば、細胞のハウスキーピング遺伝子の発現を駆動するプロモーターは構成的プロモーターであると考えられる。
【０１７４】
「誘導性」プロモーターは、ある遺伝子産物をコードするまたは特定するポリヌクレオチドに作動的に連結された時に、実質的に、そのプロモーターに対応する誘導物質がその細胞内に存在する場合にのみ、その遺伝子産物を生細胞内で生産させるヌクレオチド配列である。
【０１７５】
「組織特異的」プロモーターは、ある遺伝子産物をコードするまたは特定するポリヌクレオチドに作動的に連結された時に、実質的に、細胞がそのプロモーターに対応する組織タイプの細胞である場合にのみ、その遺伝子産物を生細胞内で生産させるヌクレオチド配列である。
【０１７６】
「予防的」処置は、疾患の徴候を示していないか、疾患の早期徴候しか示していない対象に、その疾患に関連する病理が発生するリスクを低下させる目的で施される処置である。
【０１７７】
末端アミノ基に関して本明細書にいう「保護基」は、ペプチド合成において伝統的に使用されるさまざまなアミノ末端保護基のいずれかとカップリングされているペプチドの末端アミノ基を指す。そのような保護基には、例えば、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、トリフルオロアセチル、スクシニル、およびメトキシスクシニルなどのアシル保護基；ベンジルオキシカルボニルなどの芳香族ウレタン保護基；および脂肪族ウレタン保護基、例えばtert-ブトキシカルボニルまたはアダマンチルオキシカルボニルなどがある。適切な保護基については、GrossおよびMienhofer編「The Peptides」第3巻の3〜88頁（Academic Press、ニューヨーク、1981）を参照されたい。
【０１７８】
末端カルボキシ基に関して本明細書にいう「保護基」は、さまざまなカルボキシル末端保護基のいずれかとカップリングされているペプチドの末端カルボキシル基を指す。そのような保護基には、例えば、エステル結合またはエーテル結合を介して末端カルボキシル基に連結されたtert-ブチル、ベンジルまたは他の許容される基が含まれる。
【０１７９】
「タンパク質」という用語は、典型的には、大きなポリペプチドを指す。本明細書では従来の表記法を使ってポリペプチド配列を描写する。すなわち、ポリペプチド配列の左端はアミノ末端であり、ポリペプチド配列の右端はカルボキシル末端である。
【０１８０】
本明細書において使用する用語「タンパク質調節経路」は、タンパク質を調節する上流調節経路と、そのタンパク質が調節する下流事象の両方を指す。そのような調節には、目的のタンパク質の転写、翻訳、レベル、活性、翻訳後修飾、および機能、ならびにそのタンパク質が調節する下流事象が含まれるが、これらに限るわけではない。
【０１８１】
用語「タンパク質経路」および「タンパク質調節経路」は、本明細書では互換的に使用される。
【０１８２】
本明細書において使用する用語「予後を判定する（providing a prognosis）」は、（例えば本発明の診断方法によって決定される）がんの存在が対象の将来の健康に及ぼす影響（例えば予想される罹病率または死亡率、がんになる可能性、および転移のリスク）に関する情報を与えることを指す。
【０１８３】
本明細書において使用する「精製された」などの用語は、ネイティブ環境においてある分子または化合物に通常付随している他の構成要素に対するその分子または化合物の濃縮に関係する。「精製された」という用語は、そのプロセスにおいてその特定分子が完全に純粋になったことを必ずしも示さない。本明細書にいう「高度に精製された」化合物は、純度90％を上回る化合物を指す。特に、精製精細胞DNAとは、精製精細胞DNAのPCR増幅に続いてその増幅されたDNAの分析を行った場合に、有意な検出可能レベルの非精細胞DNAを産生しないDNAを指す。「有意な検出可能レベル」とは、提示されたデータにおいて明白であって、法医学的証拠（forensic evidence）の分析に際して対処/説明することが必要になるであろう夾雑物（contaminants）の量である。
【０１８４】
「組換えポリヌクレオチド」とは、天然には一つに接合されていない配列を有するポリヌクレオチドを指す。増幅されたまたは組み立てられた組換えポリヌクレオチドを適切なベクターに含め、そのベクターを使って適切な宿主細胞を形質転換することができる。
【０１８５】
組換えポリヌクレオチドは非コード機能（例えばプロモーター、複製起点、リボソーム結合部位など）を果たすこともできる。
【０１８６】
組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞を「組換え宿主細胞」という。組換え宿主細胞中で発現する遺伝子は、その遺伝子が組換えポリヌクレオチドを含む場合には、「組換えポリペプチド」を産生する。
【０１８７】
「組換えポリペプチド」は、組換えポリヌクレオチドの発現時に生成するポリペプチドである。
【０１８８】
「組換え細胞」は導入遺伝子（transgene）を含む細胞である。そのような細胞は真核細胞または原核細胞であることができる。また、トランスジェニック細胞は、限定するわけではないが、導入遺伝子を含む胚性幹細胞、トランスジェニック胚性幹細胞から派生したキメラ哺乳動物から得られる細胞であって導入遺伝子を含むもの、トランスジェニック哺乳動物またはその胎児もしくは胎盤組織から得られる細胞、および導入遺伝子を含む原核細胞も包含する。
【０１８９】
用語「調節する」は、目的の機能または活性を刺激することまたは阻害することを指す。
【０１９０】
本明細書において使用する用語「レポーター遺伝子」は、既知の方法を使ってその発現を検出することができる遺伝子を意味する。例えば、大腸菌（Escherichia coli）lacZ遺伝子を培地中のレポーター遺伝子として使用することができる。なぜなら、lacZ遺伝子の発現は、既知の方法を使って、発色性基質o-ニトロフェニル-β-ガラクトシドを培地に加えることによって検出することができるからである（Gerhardtら編（1994）「Methods for General and Molecular Bacteriology」アメリカ微生物学会、Washington, DC、574頁）。
【０１９１】
本明細書にいう「試料」は、好ましくは、対象からの生物学的試料、例えば限定するわけではないが、正常組織試料、罹患組織試料、生検試料、血液、唾液、糞便、精液、涙、および尿などを指す。試料は、目的の細胞、組織、または体液を含有する、対象から得られる他の任意の材料源であることもできる。試料は、細胞または組織培養から得ることもできる。
【０１９２】
本明細書において使用する用語「二次抗体」は、もう一つの抗体（一次抗体）の定常領域に結合する抗体を指す。
【０１９３】
用語「シグナル配列」は、ポリペプチドが細胞内でとる道筋（path）を指示するペプチド（すなわち、これは、細胞におけるポリペプチドの細胞プロセシング、例えば限定するわけではないが細胞からのポリペプチドの最終的な分泌などを指示する）をコードするポリヌクレオチド配列を意味するものとする。シグナル配列は、例外がないわけではないが典型的にはポリペプチドのアミノ末端に見いだされるアミノ酸の配列であり、ポリペプチドの合成を小胞体に向かわせる。ある場合には、シグナルペプチドは、ポリペプチドからタンパク質分解的に除去されるので、成熟タンパク質には存在しない。
【０１９４】
「低分子干渉RNA（siRNA）」は、なかんずく、センス鎖とアンチセンス鎖の両方から構成される単離されたdsRNA分子を意味する。ある態様では、これは10ヌクレオチド長より大きい。siRNAは、ターゲット遺伝子からのセンス配列と相補的アンチセンス配列をどちらも有する単一の転写産物、例えばヘアピンも指す。siRNAはさらに、任意の形態のdsRNA（より大きなRNAのタンパク質分解的切断産物（proteolytically cleaved product）、部分精製RNA、本質的に純粋なRNA、合成RNA、組換え生産されたRNA）、ならびに1つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換、および/または改変を天然RNAとの相違点とする改変されたRNAを包含する。
【０１９５】
本明細書において使用する用語「固形支持体」は、さまざまな化合物との結合（好ましくは共有結合）を形成する能力を有する溶媒不溶性の基材に関係する。支持体は、生物学的性質を有するもの、例えば限定するわけではないが、細胞またはバクテリオファージ粒子などであるか、合成物、例えば限定するわけではないが、アクリルアミド誘導体、アガロース、セルロース、ナイロン、シリカ、または磁化粒子などであることができる。
【０１９６】
本明細書において使用する「に特異的に結合する」という用語は、ある化合物またはリガンドが、不均一な化合物の試料におけるその化合物の存在を決定づける結合反応条件下またはアッセイ条件下で機能する場合を意味するか、ある分子、例えば結合部分、例えばオリゴヌクレオチドまたは抗体が、もう一つの分子、例えばターゲット分子、例えば核酸もしくはタンパク質に、試料中の他の分子の存在下で、優先的に結合することを意味する。
【０１９７】
ペプチド（リガンド）と受容体（分子）の相互作用に関して使用される場合、「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語は、特定構造（すなわち、リガンドのアミノ酸配列またはタンパク質内のリガンド結合ドメイン）の存在に依存する相互作用も指す。言い換えると、ペプチドは、分子全体への結合ではなく、結合パートナー内の特異的タンパク質構造の認識とそれへの結合を可能にする構造を含む。例えば、標識ペプチドリガンド「A」（例えば単離されたファージディスプレイ（phage displayed）ペプチドまたは単離された合成ペプチド）と非標識「A」とを含有する反応において、リガンドが結合ポケット「A」に対して特異的である場合、結合ポケットAを含むタンパク質の存在下で、非標識ペプチドリガンドは、結合パートナーに結合する標識ペプチドリガンドの量を減少させるであろう。言い換えれば、競合結合アッセイである。
【０１９８】
本明細書において使用する用語「標準（standard）」は、比較に使用するものを指す。例えば、これは、試験化合物を投与する際に投与されて結果を比較するために使用される既知の標準薬剤または標準化合物であるか、ある薬剤または化合物があるパラメータまたは機能に及ぼす効果を測定する場合に対照値を得るために測定される標準パラメータまたは標準機能であることができる。標準は、例えば目的のマーカーを測定する前に試料を加工しまたは精製もしくは抽出手法に供する際に、試料に既知量で加えられ、精製率や回収率などを決定するのに役立つ薬剤または化合物などの「内部標準」も指すことができる。内部標準は、多くの場合、内在性のマーカーと識別することができるように放射性同位元素などで標識された、精製された目的のマーカーである。
【０１９９】
分析、診断、または処置の「対象」は動物である。そのような動物には、哺乳動物、好ましくはヒトが含まれる。
【０２００】
本明細書において使用する用語「がんと診断された対象」は、検査を受けてがん性細胞を有することが見いだされた対象を指す。がんは任意の適切な方法を使って、例えば限定するわけではないが、生検、x線、血液検査、および本発明の診断方法などを使って、診断することができる。本明細書において、膵臓細胞に関連して使用する用語「非がん性」は、その発生段階および活性に関して、調節可能な細胞成長および機能的な生理機能を示す細胞を指す。
【０２０１】
本明細書にいう「その必要がある対象（subject in need thereof）」は、本発明の方法から利益を得るであろう患者、動物、哺乳動物、またはヒトである。
【０２０２】
本明細書において使用する用語「がんを有すると疑われる対象」は、がんを示す1つ以上の症状を示す対象（例えば目に見えるしこり（lump）または腫瘤（mass））またはがんのスクリーニング（例えば定期健診）を受けている対象を指す。がんを有すると疑われる対象は、1つ以上のリスクファクター（risk factor）も有しうる。がんを有すると疑われる対象は一般的にはがんに関する検査をまだ受けていない。しかし、「がんを有すると疑われる対象」には、初期診断を受けたが、がんのステージがわかっていない個体も包含される。この用語はさらに、かつてがんを有していた（例えば寛解中の個体）を包含する。
【０２０３】
本明細書において使用する用語「がんのリスクがある対象」は、特定のがんを発生するリスクファクターを1つ以上有する対象を指す。リスクファクターには、性別、年齢、遺伝的素因、環境ばく露（environmental expose）、およびがんの既往歴（previous incident）、既存の非がん疾患、および生活様式などがあるが、これらに限るわけではない。
【０２０４】
本明細書にいう「実質的に相同なアミノ酸配列」は、基準抗体鎖のアミノ酸配列に対して少なくとも約95％の相同性、好ましくは少なくとも約96％の相同性、より好ましくは少なくとも約97％の相同性、さらに好ましくは少なくとも約98％の相同性、最も好ましくは少なくとも約99％またはそれ以上の相同性を有するアミノ酸配列を包含する。アミノ酸配列類似性または同一性は、BLAST（basic local alignment search tool）2.0.14アルゴリズムを使用するBLASTPおよびTBLASTNプログラムを使って算出することができる。これらのプログラムで使用されるデフォルト設定は、本発明の目的のために、実質的に類似するアミノ酸配列を同定するのに適している。
【０２０５】
「実質的に相同な核酸配列」は、基準核酸配列に対応する核酸配列を意味し、ここで、前記対応する配列は、基準核酸配列がコードするペプチドと実質的に同じ構造および機能を有するペプチド（例えば、ペプチド機能に有意な影響を及ぼさないアミノ酸の変化だけが存在するもの）をコードする。好ましくは、実質的に同一な核酸配列は、基準核酸配列がコードするペプチドをコードする。実質的に類似する核酸配列と基準核酸配列の間の同一性の百分率は、少なくとも約50％、65％、75％、85％、95％、99％またはそれ以上である。核酸の実質的同一性は、2つの配列の配列同一性を、例えば物理的/化学的方法（すなわちハイブリダイゼーション）で、またはコンピュータアルゴリズムによる配列アラインメントで、比較することによって決定することができる。ヌクレオチド配列が基準ヌクレオチド配列に対して実質的に同一であるかどうかを決定するための適切な核酸ハイブリダイゼーション条件は：7％ドデシル硫酸ナトリウムSDS、0.5M NaPO4、1mM EDTA 、50℃、洗浄は2×標準クエン酸添加生理食塩水（standard saline citrate）（SSC）、0.1％SDS中、50℃；好ましくは7％（SDS）、0.5M NaPO4、1mM EDTA、50℃、洗浄は1×SSC、0.1％SDS、50℃；好ましくは7％SDS、0.5M NaPO4、1mM EDTA、50℃、洗浄は0.5×SSC、0.1％SDS、50℃；より好ましくは7％SDS、0.5M NaPO4、1mM EDTA、50℃、洗浄は0.1×SSC、0.1％SDS、65℃である。2つの核酸配列間の実質的類似性を決定するための適切なコンピュータアルゴリズムには、GCSプログラムパッケージ（Devereuxら, 1984 Nucl. Acids Res. 12:387）、およびBLASTNまたはFASTAプログラム（Altschulら, 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990 87:14:5509-13；Altschulら, J. Mol. Biol. 1990 215:3:403-10；Altschulら, 1997 Nucleic Acids Res. 25:3389-3402）などがある。これらのプログラムと共に提供されるデフォルト設定は、本発明の目的のために、核酸配列の実質的類似性を決定するのに適している。
【０２０６】
「実質的に純粋」という用語は、それに天然に付随している構成要素から分離された化合物、例えばタンパク質またはポリペプチドをいう。典型的には、試料中の全物質（total material）の（体積、湿重量もしくは乾燥重量、またはモルパーセントもしくはモル分率で）少なくとも10％、より好ましくは少なくとも20％、より好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも90％、そして最も好ましくは少なくとも99％が目的の化合物である場合に、その化合物は実質的に純粋である。純度は、任意の適当な方法で、例えばポリペプチドの場合であれば、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、またはHPLC分析によって、測定することができる。化合物、例えばタンパク質は、天然に付随する構成要素を本質的に含まない場合、またはその天然状態ではそれに付随している自然の夾雑物から分離されている場合にも、実質的に精製されている。
【０２０７】
本明細書において使用する用語「症状」は、任意の病的現象（morbid phenomenon）、または構造、機能、もしくは感覚における正常からの逸脱であって患者が経験し、疾患を示すものを指す。これに対して「徴候」は疾患の他覚的証拠である。例えば鼻血は徴候である。これは患者、医師、看護師および他の観察者にとって明白である。
【０２０８】
「治療的」処置は、病理の徴候を示す対象に、それらの徴候を減少させまたは排除する目的で施される処置である。
【０２０９】
化合物の「治療有効量」は、その化合物を投与される対象に有益な効果を与えるのに十分であるような化合物の量である。
【０２１０】
本明細書において使用する用語「導入遺伝子（transgene）」は、アミノ酸配列をコードする核酸に作動的に連結されたプロモーター/調節配列をコードする核酸を含む外因性核酸配列を意味し、その外因性核酸はトランスジェニック哺乳動物によってコードされる。
【０２１１】
本明細書において使用する用語「トランスジェニック哺乳動物」とは、その生殖細胞が外因性核酸を含んでいる哺乳動物を意味する。
【０２１２】
本明細書にいう「トランスジェニック細胞」は、導入された核酸配列によってコードされる遺伝子の発現が可能になるような形で細胞中に導入された核酸配列を含む任意の細胞である。
【０２１３】
本明細書において使用する「処置する」ことという用語は、患者または対象が症状を経験する頻度を低下させること、または症状を経験する頻度を低下させるために薬剤または化合物を投与することを意味する。
【０２１４】
「予防的」処置は、疾患の徴候を示していないか、疾患の早期徴候しか示していない対象対象に、その疾患に関連する病理が発生するリスクを低下させる目的で施される処置である。
【０２１５】
本明細書において使用する用語「腫瘍」は、制御されない進行性の過剰な細胞分裂に起因する組織の異常な腫瘤を指す。これは新生物とも呼ばれる。腫瘍は、良性である（がん性でない）場合も、悪性である場合もある。
【０２１６】
本明細書において使用する用語「腫瘍細胞」は、任意の制御されない成長パターンまたは改変された生理機能を示す任意の細胞塊を指す。腫瘍細胞は、ある生物内の任意の組織に由来しうる（例えば膵管腫瘍細胞）。本明細書において使用する用語「がん」は、細胞の制御されない異常な成長を特徴とする、100を上回る疾患の一般名である。がん細胞は、限局的に拡がるか、血管内に侵入し、血流およびリンパ系を通して身体の他のパーツへと拡がり、転移を形成することができる。拡がったがん細胞を「悪性」と呼ぶ。哺乳動物における生理的条件に関して、本明細書において使用する用語「がん」および「がん性」は、典型的には、制御されない細胞成長を特徴とする。がんの例には、癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病があるが、これらに限るわけではない。そのようながんのさらに具体的な例には、扁平上皮細胞がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜のがん、肝細胞がん、胃腸がん、膵がん、膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝がん、膀胱がん、ヘパトーマ、乳がん、結腸がん、直腸結腸がん、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎がん、肝がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌およびさまざまなタイプの頭頚部がんなどがある。
【０２１７】
本明細書において使用する用語「ワクチン」は、対象に接種された時に、その対象において、ある状態、疾患またはその症状から対象を完全にまたは部分的に保護するのに役立つ免疫応答を刺激する効果を有する組成物を意味する。ある態様では、前記状態が受胎である。ワクチンという用語は、予防用ワクチンおよび治療用ワクチンを包含する。混合ワクチンは、2つ以上のワクチンまたは2つ以上の化合物もしくは薬剤を併せ持つワクチンである。
【０２１８】
「ベクター」は、単離された核酸を含み、その単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる組成物である。例えば線状（linear）ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスなど（ただしこれらに限るわけではない）といった、数多くのベクターが当技術分野では知られている。したがって「ベクター」という用語は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを包含する。この用語は、例えばポリリジン化合物、リポソームなどといった、細胞への核酸の導入または送達を容易にする非プラスミドおよび非ウイルス化合物を包含すると解釈されるべきでもある。ウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、組換えウイルスベクターなどがあるが、これらに限るわけではない。非ウイルスベクターの例には、リポソーム、DNAのポリアミン誘導体などがあるが、これらに限るわけではない。
【０２１９】
「発現ベクター」は、発現させようとするヌクレオチド配列に作動的に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用要素を含み、発現のための他の要素は、宿主細胞によって供給されるか、インビトロ発現系中に供給することができる。発現ベクターは、コスミド、プラスミド（例えば、裸のプラスミドまたはリポソームに含まれるもの）、および組換えポリヌクレオチドを組み込んだウイルスなど、当技術分野で知られているものが全て包含される。
【０２２０】
［本発明の配列］
配列番号1−KTLLPTP（配列番号1）（Lys-Thr-Leu-Leu-Pro-Thr-Proともいう）
配列番号2−βAKTLLPTP（配列番号2）
配列番号3−βAKTLLPTPGGS（配列番号3）
配列番号4−KTLLPTPGGS（配列番号4）
配列番号5−KHVMSKQ（配列番号5）
配列番号6−KHVMSKQGGS（配列番号6）
配列番号7−βAKHVMSKQ（配列番号7）
配列番号8−βAKHVMSKQGGS（配列番号8）
配列番号9−ATLLPTP（配列番号9）
配列番号10−KALLPTP（配列番号10）
配列番号11−KTALPTP（配列番号11）
配列番号12−KTLAPTP（配列番号12）
配列番号13−KTLLATP（配列番号13）
配列番号14−KTLLPAP（配列番号14）
配列番号15−KTLLPTA（配列番号15）
配列番号16−βAATLLPTPGGS（配列番号16）
配列番号17−βAKALLPTPGGS（配列番号17）
配列番号18−βAKTALPTPGGS（配列番号18）
配列番号19−βAKTLAPTPGGS（配列番号19）
配列番号20−βAKTLLATPGGS（配列番号20）
配列番号21−βAKTLLPAPGGS（配列番号21）
配列番号22−βAKTLLPTAGGS（配列番号22）
配列番号23−KKKK（配列番号23）
βAはベータアラニンであり、配列表ではXaaとして特定される。
【０２２１】
［実施形態］
本発明は、プレクチン-1を発現するがんまたは任意の細胞を診断、検出、監視、およびイメージングするのに役立つ多量体型ペプチドリガンド複合体を提供する。これらのペプチドは、イメージング、診断、腫瘍局在などに役立つ複合体の形で使用される。多量体型ペプチドを製造するための方法、およびそれらの活性を、対応する単量体型ペプチドと比較するための方法は、PEG化（pegylation）を含めて、本明細書に記載されているか、当技術分野において見いだすことができる（Li, 2007, J. Nuc. Med., 48:7:1162-1171「64Cu-labeled tetrameric and octameric RGD peptides for small-animal PET of tumor αvβ3 integrin expression」；総説がChoeおよびLee, 2007, Current Pharmaceutical Design, 13:17-31にある；Chenら, 2004, Mol. Imaging Biol. 6:350-9「MicroPET imaging of breast cancer alphav-integrin expression with 64Cu-labeled dimeric RGD peptides」；Janssen, 2002, Cancer Biother. Radiopharm., 17:641-6「Comparison of monomeric and dimeric radiolabeled RGD-peptide for tumor targeting」；Poethko, 2004, J. Nucl. Med. 45:892-902；Chen, 2004, Bioconjugate Chem., 15:41-9；Chen, 2004, Nucl. Med. Biol., 31:11-19「Pharmacokinetics and tumor retention of 125I-labeled RGD peptide are improved by PEGylation」；Li et al., 2009, Mol. Cancer Ther., 8:5:1239-1249；米国特許第7,666,979号（米国特許出願第10/661,032号からの発行）；米国特許出願第12/012,011号（米国特許出願第10/792,582号の継続出願）；Nahrendorf, 2010, JACC: Cardiovascular Imaging, 2:10:1213-1222；Krajewski et al., 2005「Effect of Dimerization and Tetramerization on the Potency of HIV-Integrase Inhibitory Peptides」、S. Blondelle編「Understanding Biology Using Peptides」アメリカペプチド学会の411〜412頁）。
【０２２２】
本発明の有用な基本ペプチドは、本明細書またはKellyら（2008「Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma」PLoS Med 5:4:e85）および国際特許出願公開WO2009/129220（Kellyら、2009年10月22日公開）に記載されており、これには配列番号1−KTLLPTP（配列番号1）が含まれる。他の有用なペプチドは本明細書に記載されており、プレクチン-1に結合させるための配列番号2〜4および9〜15が含まれる。
【０２２３】
本発明はさらに、本発明のペプチドをコードする配列を含む単離された核酸を包含する。
【０２２４】
ある実施形態では、本発明の有用なペプチドを使って、多量体型ペプチドリガンド複合体が製造され、それらのペプチドは、合成プロセス中に追加のアミノ酸を付加するか、アミノ酸を置換することによって修飾される。例えば、本明細書では、プレクチン-1に結合する既知のリガンドKTLLPTP（配列番号1）を使って多量体型複合体を形成させ、その基本配列を修飾して配列βAKTLLPTPGGS（配列番号3）を導き出し、そこにPEG5000などのポリエチレングリコール部分を付加した後、複数のペプチドをDOTAなどのキレーターに結びつけるために使用される連結/スペーシング（linking/spacing）リジンを付加した。キレーターは、そこに111Inなどのイメージング剤を付加することができる部分として役立つ。その結果得られる、これらの配列に基づく本発明の多量体型ペプチドリガンドは、この場合は、四量体であり、式(βAKTLLPTPGGS(PEG5000))4KKKKDOTAβA-NH2を有する。
【０２２５】
ChemDrawによって演繹された、プレクチン-1のペプチドリガンド（配列番号1）を4つ含む式(βAKTLLPTPGGS(PEG5000))4KKKKDOTAβA-NH2（本明細書では[(βAla-Lys-Thr-Leu-Leu-Pro-Thr-Pro-Gly-Gly-Ser-PEG5K)2-Lys]2-Lys-Lys(DOTA)-βAla-NH2ともいう）を有する構造の化学名は、2,2',2''-(10-(1-(1-(2-(1-(15-アミノ-11-(4-アミノブチル)-8-(1-ヒドロキシエチル)-2,5-ジイソブチル-4,7,10,13-テトラオキソ-3,6,9,12-テトラアザペンタデカン)ピロリジン-2-カルボキサミド)-3-ヒドロキシブタノイル)ピロリジン-2-イル)-32-(1-(1-(2-(1-(15-アミノ-11-(4-アミノブチル)-8-(1-ヒドロキシエチル)-2,5-ジイソブチル-4,7,10,13-テトラオキソ-3,6,9,12-テトラアザペンタデカン)ピロリジン-2-カルボキサミド)-3-ヒドロキシブタノイル)ピロリジン-2-イル)-25-(1-(1-(2-(1-(15-アミノ-11-(4-アミノブチル)-8-(1-ヒドロキシエチル)-2,5-ジイソブチル-4,7,10,13-テトラオキソ-3,6,9,12-テトラアザペンタデカン)ピロリジン-2-カルボキサミド)-3-ヒドロキシブタノイル)ピロリジン-2-イル)-9-(ヒドロキシメチル)-1,4,7,10-テトラオキソ-14,17-ジオキサ-2,5,8,11-テトラアザノナデカンアミド)-9-(ヒドロキシメチル)-1,4,7,10,19-ペンタオキソ-14,17-ジオキサ-2,5,8,11,20-ペンタアザヘキサコサンアミド)-25-(1-(1-(2-(1-(15-アミノ-11-(4-アミノブチル)-8-(1-ヒドロキシエチル)-2,5-ジイソブチル-4,7,10,13-テトラオキソ-3,6,9,12-テトラアザペンタデカン)ピロリジン-2-カルボキサミド)-3-ヒドロキシブタノイル)ピロリジン-2-イル)-9-(ヒドロキシメチル)-1,4,7,10-テトラオキソ-14,17-ジオキサ-2,5,8,11-テトラアザノナデカンアミド)-35-(3-アミノ-3-オキソプロピルカルバモイル)-9-(ヒドロキシメチル)-1,4,7,10,19,26,33,41-オクタオキソ-14,17-ジオキサ-2,5,8,11,20,27,34,40-オクタアザドテラコンタン-42-イル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7-トリイル)三酢酸インジウム塩である。
【０２２６】
上に特定した四量体型式の化学構造は
【化３】
2013510094.tif 000006
である（図8も参照されたい）。
【０２２７】
本発明はさらに、例えば配列番号1またはβAKTLLPTPGGS（配列番号3）を修飾することなどによる、他の多量体型ペプチドリガンド複合体の製造を開示する。例えば、これらの配列は、配列番号9〜22のいずれかで置き換えることができる。したがって、上述した本発明の四量体(βAKTLLPTPGGS(PEG5000))4KKKKDOTAβA-NH2は、配列番号3の全部または一部を、類似の性質をもたらすことができる他の配列で置き換えるか修飾することによって修飾される。本明細書に記載するとおり、配列番号1の残基のそれぞれについてアラニン突然変異/置換を行ったので、本発明の他の四量体には、これらの置換体のそれぞれが含まれる。これら7つの変化は、それぞれ配列番号16〜22による配列番号3の置き換えに基づくさらに7つの本発明の四量体、すなわち
(βAATLLPTPGGS(PEG5000))4KKKKDOTAβA-NH2、
(βAKALLPTPGGS(PEG5000))4KKKKDOTAβA-NH2、
(βAKTALPTPGGS(PEG5000))4KKKKDOTAβA-NH2、
(βAKTLAPTPGGS(PEG5000))4KKKKDOTAβA-NH2、
(βAKTLLATPGGS(PEG5000))4KKKKDOTAβA-NH2、
(βAKTLLPAPGGS(PEG5000))4KKKKDOTAβA-NH2、および
(βAKTLLPTAGGS(PEG5000))4KKKKDOTAβA-NH2
を包含する。
【０２２８】
これらは本発明が包含する唯一のアミノ酸置換体ではない。他のアミノ酸を使った類似する置換体も本発明に包含される。さらに、本明細書に開示するデータは、スレオニンの存在が特に重要であるらしいことと、プロリンも重要であるらしいことを示唆している。これは、アラニンによるそれらの置換がアフィニティの減少を少なくともわずかには引き起こしたという事実によって証明される。それゆえに、本発明はさらに、例えば、より多くのスレオニン残基を含むか、異なる位置にスレオニン残基を含むような、配列の付加および置換も提供する。
【０２２９】
本発明は、それゆえに、ペプチドリガンドの多量体と、少なくとも1つのイメージング剤（例えば金属、放射性核種など）とを含み、典型的にはイメージング剤を錯化（complex）するためにキレーターにコンジュゲートされている複合体の製造を包含する。
【０２３０】
一定の実施形態では、イメージング剤が、キレーターによって複合体に取り付けられる。ある態様では、キレーターがDOTAである。
【０２３１】
いくつかの三価金属放射性核種は、放射性同位体イメージング（例えばインジウム-111（111In）、ガリウム-67/68（67/68Ga）およびイットリウム-86（86Y））または標的放射性核種治療（targeted radionuclide therapy）（例えば90Yおよびルテチウム-177（177Lu））に適した物理的性質を有する。これらの金属放射性核種は、疾患を診断し、監視し、または処置するために、ターゲティング（targeting）生体分子（ペプチドまたは抗体など）と組み合わせることができる。要求される安定性を有する放射標識（radiolabelled）生体分子を得るには、金属を錯化するために、ペプチドまたはタンパク質をまず適切なキレーターにコンジュゲートしなければならない。ペプチドを標識するための三価金属（例えばIn、Y、GaおよびLu）用のキレーターの要件は、タンパク質を標識するためのものと、概して同じである。錯体（complex）は生物系において安定であるべきであり、それらのキレート力は、ペプチドとの反応によって損なわれてはならない。ほとんどの場合、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）および/または1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸（DOTA；CAS60239-18-1）が使用される（ChoeおよびLee, 2007, Current Pharmaceutical Design, 13:17-31；Liら, 2007, J. Nuclear Medicine「64Cu-Labeled Tetrameric and Octameric RGD Peptides for Small-Animal PET of Tumor avb3 Integrin Expression」48:1162-1171；Nahrendorfら, 2009, JACC Cardiovasc. Imaging, 2:10:1213-1222；Liら, 2009, Mol. Cancer Ther., 8:5:1239-1249；Yimら, 2010, J. Med. Chem., 53:3944-3953；Dijkgraafら, 2010, Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 2010年9月21日オンライン発行；米国特許出願第10/792,582号；Dransfieldら, 米国特許公開番号US2010/0261875；米国特許第7,666,979号参照）。上述した金属の場合、DOTA錯体の方が、DTPA錯体より熱力学的にも速度論的にも安定である（Sosabowskiら, Nature Protocols 1, -972 -976 (2006)およびLeon-Rodriguezら, Bioconjugate chemistry, 01/03/2008；19(2):391-402参照）。
【０２３２】
キレート剤
いくつかの実施形態では、キレート剤をペプチドに直接または間接的に取り付けて、放射性核種などの治療剤または診断剤をキレートするために使用することができる。典型的なキレーターには、DTPA（例えばMx-DTPA）、DOTA、TETA、NETAまたはNOTAなどがあるが、これらに限るわけではない。金属または他のリガンドをタンパク質に取り付けるためのキレート剤のコンジュゲーション方法または使用方法は、当技術分野ではよく知られている（例えば引用によりそのまま本明細書に組み込まれる米国特許出願第12/112,289号を参照されたい）。
【０２３３】
本発明によって包含される有用なキレーターには、DTPA、DO3A、DOTA、EDTA、TETA、EHPG、HBED、NOTA、DOTMA、TETMA、PDTA、TTHA、LICAM、HYNIC、およびMECAMなどがあるが、これらに限るわけではない。HYNICは、本発明のもう一つのイメージング剤であるTc99をキレートするのにとりわけ有用である。
【０２３４】
修飾
本発明では、さらに、複合体の一部としてポリエチレングリコール（「PEG」）分子などの分子を使用することができる。ある態様では、PEGが約20,000m.w.であるか、約20,000m.w.未満である。もう一つの態様では、PEGが約18,000m.w.未満である。さらにもう一つの態様では、PEGが約16,000m.w.未満である。さらにもう一つの態様では、PEGが約14,000m.w.未満である。さらにもう一つの態様では、PEGが約12,000m.w.未満である。さらにもう一つの態様では、PEGが約10,000m.w.未満である。さらにもう一つの態様では、PEGが約8,000m.w.未満である。さらにもう一つの態様では、PEGが約7,000m.w.未満である。さらにもう一つの態様では、PEGが約6,000m.w.未満である。さらにもう一つの態様では、PEGが約5,000m.w.未満である。さらにもう一つの態様では、PEGが約4,000m.w.未満である。さらにもう一つの態様では、PEGが約3,000m.w.未満である。さらにもう一つの態様では、PEGが約2,000m.w.未満である。さらにもう一つの態様では、PEGが約1,000m.w.未満である。さらにもう一つの態様では、PEGが約500m.w.未満である。
【０２３５】
ある態様では、PEGがPEG5000である。
【０２３６】
ペプチドの修飾と製造
ペプチドの製造は実施例で説明する。修飾されたアミノ酸残基を活性に影響を及ぼすことなく組み込みうることは、もちろん理解されるであろう。例えば、末端はブロッキング基（blocking group）、すなわちN末端およびC末端を「望ましくない分解」（この用語は、化合物の機能に影響を及ぼす可能性が高い、その末端におけるあらゆるタイプの酵素的、化学的または生化学的分解、すなわちその末端における化合物の逐次的分解を包含するものとする）から保護および/または安定化するのに適した化学置換基を含むように誘導体化することができる。
【０２３７】
ブロッキング基には、ペプチド化学の分野において従来から使用されている保護基が含まれ、それらはペプチドのインビボ活性に悪影響を及ぼさないであろう。適切なN末端ブロッキング基は、N末端のアルキル化またはアシル化によって導入することができる。適切なN末端ブロッキング基の例には、C1-C5分岐または非分岐アルキル基、ホルミル基およびアセチル基などのアシル基、ならびにそれらの置換型、例えばアセトアミドメチル（Acm）基が含まれる。アミノ酸のデスアミノ類似体も有用なN末端ブロッキング基であり、ペプチドのN末端にカップリングするか、N末端残基（N-terminal reside）の代わりに使用することができる。C末端のカルボキシル基が組み込まれているまたは組み込まれていない適切なC末端ブロッキング基には、エステル、ケトンまたはアミドが含まれる。エステルまたはケトンを形成するアルキル基、特にメチル、エチルおよびプロピルなどの低級アルキル、ならびにアミドを形成するアミノ基、例えば1級アミン（-NH2）、ならびにモノおよびジアルキルアミノ基、例えばメチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、メチルエチルアミノなどは、C末端ブロッキング基の例である。アグマチンなどのデスカルボキシル化アミノ酸類似体も有用なC末端ブロッキング基であり、ペプチドのC末端残基にカップリングするか、C末端残基の代わりに使用することができる。さらに、末端にある遊離のアミノ基およびカルボキシル基をペプチドから全部取り除いて、ペプチド活性に影響（affect）を及ぼさずにそのデスアミノおよびデスカルボキシル化型を得ることができることも理解されるだろう。
【０２３８】
本発明の酸付加塩も機能的等価物として考えられる。したがって、ペプチドの水溶性塩が得られるように、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、または酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸（tataric acid）、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸（cinnamie acid）、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、サリチル酸などの有機酸で処理された本発明のペプチドは、本発明における使用に適している。
【０２３９】
修飾（通常は一次配列を変化させないもの）には、ポリペプチドのインビボまたはインビトロ化学誘導体化、例えばアセチル化、またはカルボキシル化が含まれる。グリコシル化の修飾、例えばポリペプチドのグリコシル化パターンをその合成およびプロセシング中に修飾することによってなされるもの、またはさらなるプロセシングステップにおいて、例えばポリペプチドをグリコシル化に影響を及ぼす酵素（例えば哺乳動物グリコシル化または脱グリコシル化酵素）にばく露することなどによってなされるものも含まれる。ホスホリル化アミノ酸残基、例えばホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホスレオニンを有する配列も包含される。
【０２４０】
タンパク質分解（proteolytic degradation）に対する耐性が改善されるように、または溶解特性を最適化するために、または治療剤としてより適したものになるように、通常の分子生物学的技法を使って修飾されたポリペプチドも包含される。そのようなポリペプチドの類似体には、天然L-アミノ酸以外の残基、例えばD-アミノ酸または非天然もしくは非標準合成アミノ酸を含有するものが含まれる。本発明のペプチドは、本明細書に列挙する具体的な例示的プロセスのいずれかの生成物に限定されない。
【０２４１】
本発明は、構造：
【化４】
2013510094.tif 000007
を有するベータ-アラニン（β-アラニン、β-Ala、bA、およびβAともいう）の使用を包含する。
【０２４２】
本明細書では、記号「βA」を使った配列を記載するが、本明細書と共に提出される配列表では、「βA」を「Xaa」と記載し、配列表のテキストにおける言及が、Xaaはベータアラニンであることを示す。
【０２４３】
本発明において有用なペプチド、例えば分析用の標準または修飾体は、標準的な確立された技法、例えばStewartらが「Solid Phase Peptide Synthesis」第2版（1984，Pierce Chemical Company，イリノイ州ロックフォード）に記述している、またBodanszkyおよびBodanszkyが「The Practice of Peptide Synthesis」（1984，Springer-Verlag， ニューヨーク）に記述している、固相ペプチド合成（SPPS）などによって、容易に製造することができる。最初に、適切に保護されたアミノ酸残基を、そのカルボキシル基を介して、誘導体化された不溶性ポリマー支持体、例えば架橋ポリスチレンまたはポリアミドレジンに取り付ける。「適切に保護された」とは、アミノ酸のα-アミノ基上と、任意の側鎖官能基上の両方に、保護基が存在することを指す。側鎖保護基は、合成の間じゅう、使用する溶媒、試薬および反応条件に対して一般に安定であり、最終ペプチド生成物に影響を及ぼさない条件下で除去することができる。オリゴペプチドの逐次合成は、最初のアミノ酸からN保護基を除去し、そこに所望するペプチドの配列における次のアミノ酸のカルボキシル末端をカップリングすることによって行われる。このアミノ酸も適切に保護されている。新たに付加される（incoming）アミノ酸のカルボキシルは、支持体に結合されたアミノ酸のN末端と反応するように、反応性基の形成によって、例えばカルボジイミドの形成、対称酸無水物の形成、またはヒドロキシベンゾトリアゾールもしくはペンタフルオロフェニル（pentafluorophenly）エステルなどの「活性エステル」基の形成によって、活性化することができる。
【０２４４】
固相ペプチド合成法の例には、α-アミノ保護基としてtert-ブチルオキシカルボニル（butyloxcarbonyl）を利用するBOC法と、アミノ酸残基のα-アミノを保護するために9-フルオレニルメチルオキシカルボニル（fluorenylmetyloxcarbonyl）を利用するFMOC法が含まれ、これらの方法はどちらも当業者にはよく知られている。
【０２４５】
N-および/またはC-ブロッキング基の組込みは、固相ペプチド合成法で通常使用されるプロトコールを使って達成することができる。例えばC末端ブロッキング基を組み込むには、典型的には、レジンからの切断が所望のC末端ブロッキング基を有するペプチドをもたらすように化学修飾された支持レジン（supporting resin）を固相として使用することによって、所望するペプチドの合成が行われる。例えば、C末端が1級アミノブロッキング基を保持するペプチドを得るには、ペプチド合成が完了した時にフッ化水素酸で処理すれば所望のC末端アミド化ペプチドが放出されるように、p-メチルベンズヒドリルアミン（MBHA）レジンを使って合成が行われる。また、C末端におけるN-メチルアミンブロッキング基の組込みは、HF処理するとN-メチルアミド化C末端を保持するペプチドを放出するN-メチルアミノエチル誘導体化DVBレジンを使って行われる。エステル化によるC末端のブロッキングも従来の手法を使って達成することができる。これは、レジンから側鎖ペプチド（side-chain peptide）を放出させ、引き続いて行われる所望のアルコールとの反応によってエステル官能基を形成させることが可能になるような、レジン/ブロッキング基の組合せの使用を必要とする。メトキシアルコキシベンジルアルコールまたは等価なリンカーで誘導体化されたDVBレジンと組み合わされたFMOC保護基は、この目的に使用することができ、支持体からの切断は、ジクロロメタン中のTFAで達成される。次に、所望のアルコールを添加することにより、DCCなどで適切に活性化されたカルボキシル官能基のエステル化を進行させることができ、その後に、エステル化されたペプチド生成物の脱保護および単離を行う。
【０２４６】
N末端ブロッキング基の組込みは、合成されたペプチドがまだレジンに取り付けられている間に、例えば適切な無水物およびニトリルによる処理などによって達成することができる。例えば、N末端にアセチルブロッキング基を組み込むには、レジンにカップリングされたペプチドを、アセトニトリル中の20％無水酢酸で処理することができる。次に、N-ブロック（N-blocked）ペプチド生成物をレジンから切り離し、脱保護してから、単離することができる。
【０２４７】
化学的または生物学的合成技法から得られたペプチドが所望のペプチドであることを保証するために、ペプチド組成の分析を行うべきである。そのようなアミノ酸組成分析は、高分解能質量分析を使ってペプチドの分子量を決定することによって行うことができる。上記に代えて、または上記に加えて、ペプチドを酸水溶液中で加水分解し、HPLCまたはアミノ酸分析計を使ってその混合物の構成要素を分離し、同定し、定量することによって、ペプチドのアミノ酸内容物を確認することもできる。ペプチドの配列を明確に決定するために、ペプチドを逐次的に分解してアミノ酸を順に同定するタンパク質配列決定装置を使用することもできる。
【０２４８】
ペプチドは、その使用に先だって、夾雑物を除去するために精製してもよい。これに関連して、ペプチドが、適当な規制当局によって設定された規格に合致するように精製されることは理解されるであろう。要求される純度レベルを達成するには、例えば、C4-シリカ、C8-シリカまたはC18-シリカなどのアルキル化シリカカラムを用いる逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）などを含む、数多くの従来の精製手法のどれを使用してもよい。精製を達成するために、一般的には、有機分含有量が増加する勾配移動相、例えば水性バッファー中のアセトニトリル（通常は少量のトリフルオロ酢酸を含有するもの）などが使用される。ペプチドをその電荷に基づいて分離するために、イオン交換クロマトグラフィーを使用することもできる。
【０２４９】
本明細書に記載するようにして得られた実質的に純粋なタンパク質は、既知のタンパク質精製手法に従って精製することができ、ここでは、免疫学的アッセイ、酵素アッセイまたは他のアッセイを使って、その手法の各段階における精製が監視される。タンパク質精製法は当技術分野ではよく知られており、例えばDeutscherら（編，1990「Guide to Protein Purification」Harcourt Brace Jovanovich、サンディエゴ）などに記述されている。
【０２５０】
上述のように、本発明のペプチドリガンドの修飾または最適化は、本願の範囲内にある。修飾されたペプチドまたは最適化されたペプチドは、ペプチド結合リガンドの定義に包含される。具体的に述べると、同定されたペプチド配列は、その力価（potency）、薬物動態挙動、安定性および/または他の生物学的、物理的および化学的性質が最適化されるように修飾することができる。
【０２５１】
アミノ酸置換
一定の実施形態では、ここに開示する方法および組成物が、1つ以上の置換アミノ酸残基を有するペプチドの製造を伴いうる。
【０２５２】
さまざまな実施形態において、1つ以上のアミノ酸残基を置き換えることによって、ペプチド配列の構造的、物理的および/または治療的特徴を最適化することができる。
【０２５３】
他の修飾も活性に有害な影響を与えることなく組み込むことができ、それらには、天然L-異性体型にあるアミノ酸の1つ以上をD-異性体型にあるアミノ酸で置換することが含まれるが、これらに限るわけではない。したがって、ペプチドは、1つ以上のD-アミノ酸残基を含むか、全てがD-型であるアミノ酸を含むことができる。本発明のペプチドのレトロインベルソ（retro-inverso）型、例えば、全てのアミノ酸がD-アミノ酸型で置換されている逆（inverted）ペプチドも考えられる。
【０２５４】
一般に、ペプチド中のアミノ酸置換が、典型的には、性質が比較的類似している別のアミノ酸によるアミノ酸の置き換え（すなわち保存的アミノ酸置換）を伴うことは、当業者にはわかるであろう。さまざまなアミノ酸の性質と、アミノ酸置換がタンパク質の構造および機能に及ぼす効果は、当技術分野における広範な研究と知識の対象になってきた。例えば、結果として生じるポリペプチドが、上述した性質の類似するプロファイルまたは改善されたプロファイルを有するであろうという予測の下に、以下に挙げる等配電子的（isosteric）および/または保存的アミノ酸変化を、親ポリペプチド配列に加えることができる。
【０２５５】
アルキル置換疎水性アミノ酸の置換：アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、ノルロイシン、S-2-アミノ酪酸、S-シクロヘキシルアラニン、または分岐鎖、環状鎖および直鎖アルキル、アルケニルもしくはアルキニル置換を含むC1-10炭素の脂肪族側鎖で置換された他の類似するαアミノ酸を含む。
【０２５６】
芳香族置換疎水性アミノ酸の置換：フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ビフェニルアラニン、1-ナフチルアラニン、2-ナフチルアラニン、2-ベンゾチエニルアラニン、3-ベンゾチエニルアラニン、ヒスチジン、先に挙げた芳香族アミノ酸のアミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アザ、ハロゲン化（フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード）またはアルコキシ置換型を含み、その実例（illustrative example）は2-、3-または4-アミノフェニルアラニン、2-、3-または4-クロロフェニルアラニン、2-、3-または4-メチルフェニルアラニン、2-、3-または4-メトキシフェニルアラニン、5-アミノ-、5-クロロ-、5-メチル-または5-メトキシトリプトファン、2'-、3'-、または4'-アミノ-、2'-、3'-、または4'-クロロ-、2、3、または4-ビフェニルアラニン、2'、-3'、-または4'-メチル-2、3または4-ビフェニルアラニン、または4'-メチル-2、3または4-ビフェニルアラニン、および2-または3-ピリジルアラニンである。
【０２５７】
塩基性官能基を含有するアミノ酸の置換：アルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン、2,3-ジアミノプロピオン酸、ホモアルギニン、前記アミノ酸のアルキル、アルケニル、またはアリール置換（C1-C10分岐、線状、または環状）誘導体を含み、置換基がヘテロ原子（例えばアルファ窒素、または1もしくは複数の遠位窒素）上にあるか、アルファ炭素上の例えばプロR（pro-R）位にあるかは問わない。実例として役立つ化合物には次に挙げるものがある：N-ε-イソプロピル-リジン、3-(4-テトラヒドロピリジル)-グリシン、3-(4-テトラヒドロピリジル)-アラニン、N,N-γ,γ'-ジエチル-ホモアルギニン。アルキル基がアルファ炭素のプロR位を占めているα-メチルアルギニン、α-メチル-2,3-ジアミノプロピオン酸、α-メチルヒスチジン、α-メチルオルニチンなどの化合物も包含される。アルキル、芳香族、複素芳香族（ここで複素芳香族基は1つ以上の窒素、酸素または硫黄原子を単独でまたは組み合わせて有する）カルボン酸または数多くの周知の活性化誘導体（例えば酸塩化物、活性エステル、活性アゾライド（azolide）および関連誘導体）のいずれかと、リジン、オルニチン、または2,3-ジアミノプロピオン酸とから形成されるアミドも包含される。
【０２５８】
酸性アミノ酸の置換：アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、チロシン、2,4-ジアミノプロピオン酸（2,4-diaminopriopionic acid）、オルニチンまたはリジンのアルキル、アリール、アリールアルキル、およびヘテロアリールスルホンアミド、ならびにテトラゾール置換アルキルアミノ酸を含む。
【０２５９】
側鎖アミド残基の置換：アスパラギン、グルタミン、およびアスパラギンまたはグルタミンのアルキルまたは芳香族置換誘導体を含む。
【０２６０】
ヒドロキシル含有アミノ酸の置換：
セリン、スレオニン、ホモセリン、2,3-ジアミノプロピオン酸、およびセリンまたはスレオニンのアルキルまたは芳香族置換誘導体を含む。上に列挙した各カテゴリー内のアミノ酸で、同じグループの別のアミノ酸を置換できることも理解される。
【０２６１】
例えば、アミノ酸のハイドロパシーインデックス（hydropathic index）を考慮することができる（Kyte & Doolittle, 1982, J. Mol. Biol., 157:105-132）。アミノ酸の相対的ハイドロパシー特性（hydropathic character）は、結果として生じるタンパク質の二次構造に寄与し、その二次構造が、結果として、そのタンパク質と他の分子との相互作用を規定する。各アミノ酸には、その疎水性および電荷特徴に基づいて、ハイドロパシーインデックスが割り当てられており（Kyte & Doolittle, 1982）、それらは次のとおりである：イソロイシン（＋4.5）；バリン（＋4.2）；ロイシン（＋3.8）；フェニルアラニン（＋2.8）；システイン/シスチン（＋2.5）；メチオニン（＋1.9）；アラニン（＋1.8）；グリシン（−0.4）；スレオニン（−0.7）；セリン（−0.8）；トリプトファン（−0.9）；チロシン（−1.3）；プロリン（−1.6）；ヒスチジン（−3.2）；グルタミン酸（−3.5）；グルタミン（−3.5）；アスパラギン酸（−3.5）；アスパラギン（−3.5）；リジン（−3.9）；およびアルギニン（−4.5）。保存的置換を行う際には、ハイドロパシーインデックスが±2以内のアミノ酸を使用することが好ましく、±1以内はより好ましく、±0.5以内はさらに好ましい。
【０２６２】
アミノ酸置換はアミノ酸残基の親水性を考慮してもよい（例えば米国特許第4,554,101号）。アミノ酸残基には親水性値が割り当てられている：アルギニン（＋3.0）；リジン（＋3.0）；アスパラギン酸（＋3.0）；グルタミン酸（＋3.0）；セリン（＋0.3）；アスパラギン（＋0.2）；グルタミン（＋0.2）；グリシン（0）；スレオニン（−0.4）；プロリン（−0.5.＋−0.1）；アラニン（−0.5）；ヒスチジン（−0.5）；システイン（−1.0）；メチオニン（−1.3）；バリン（−1.5）；ロイシン（−1.8）；イソロイシン（−1.8）；チロシン（−2.3）；フェニルアラニン（−2.5）；トリプトファン（−3.4）。類似する親水性を有する他のアミノ酸によるアミノ酸の置き換えが好ましい。
【０２６３】
他の考慮事項にはアミノ酸側鎖のサイズが含まれる。例えば、コンパクトな側鎖を有するアミノ酸、例えばグリシンまたはセリンを、嵩高い側鎖を有するアミノ酸、例えばトリプトファンまたはチロシンで置き換えることは、一般に好ましくないだろう。さまざまなアミノ酸残基がタンパク質二次構造に及ぼす効果も考慮事項である。実験的研究により、タンパク質ドメインがαヘリックス、βシートまたは逆ターン二次構造をとる傾向に、異なるアミノ酸残基が及ぼす効果は決定されており、当技術分野では知られている（例えばChou & Fasman, 1974, Biochemistry, 13:222-245；1978, Ann. Rev. Biochem., 47: 251-276；1979, Biophys. J., 26:367-384を参照されたい）。
【０２６４】
そのような考慮と広範な実験的研究に基づいて、保存的アミノ酸置換の表が構築されており、当技術分野では知られている。例えば：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシン。あるいは、Ala（A）leu、ile、val；Arg（R）gln、asn、lys；Asn（N）his、asp、lys、arg、gln；Asp（D）asn、glu；Cys（C）ala、ser；Gln（Q）glu、asn；Glu（E）gln、asp；Gly（G）ala；His（H）asn、gln、lys、arg；Ile（I）val、met、ala、phe、leu；Leu（L）val、met、ala、phe、ile；Lys（K）gln、asn、arg；Met（M）phe、ile、leu；Phe（F）leu、val、ile、ala、tyr；Pro（P）ala；Ser（S）、thr；Thr（T）ser；Trp（W）phe、tyr；Tyr（Y）trp、phe、thr、ser；Val（V）ile、leu、met、phe、ala。
【０２６５】
アミノ酸置換に関する他の考慮事項には、残基がタンパク質の内部に位置するかどうか、または溶媒露出しているかどうかが含まれる。内部残基の場合、保存的置換には次の置換が含まれるであろう：AspおよびAsn；SerおよびThr；SerおよびAla；ThrおよびAla；AlaおよびGly；IleおよびVal；ValおよびLeu；LeuおよびIle；LeuおよびMet；PheおよびTyr；TyrおよびTrp（例えばPROWL Rockefeller Universityウェブサイトを参照されたい）。溶媒露出残基の場合、保存的置換には次の置換が含まれるであろう：AspおよびAsn；AspおよびGlu；GluおよびGln；GluおよびAla；GlyおよびAsn；AlaおよびPro；AlaおよびGly；AlaおよびSer；AlaおよびLys；SerおよびThr；LysおよびArg；ValおよびLeu；LeuおよびIle；IleおよびVal；PheおよびTyr（同上書）。アミノ酸置換の選択を補助するために、PAM250スコアリングマトリックス、Dayhoffマトリックス、Granthamマトリックス、McLachlanマトリックス、Doolittleマトリックス、Henikoffマトリックス、Miyataマトリックス、Fitchマトリックス、Jonesマトリックス、Raoマトリックス、LevinマトリックスおよびRislerマトリックスなど、さまざまなマトリックスが構築されている（同上書）。
【０２６６】
アミノ酸置換を決定する際には、正電荷残基（例えばHis、Arg、Lys）と負電荷残基（例えばAsp, Glu）の間のイオン結合（塩橋（salt bridges））または近接するシステイン残基間のジスルフィド結合の形成など、分子間結合または分子内結合の存在も考慮することができる。
【０２６７】
任意のアミノ酸を使って、コードされているペプチド配列中の他の任意のアミノ酸を置換する方法はよく知られており、例えば部位特異的突然変異誘発の技法によるか、アミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドの合成およびアセンブリならびに発現ベクターコンストラクトへの接合によるなど、当業者にとっては日常的実験に過ぎない。
【０２６８】
リンカー
さらに、本発明が包含する修飾には、結合部分または結合ポリペプチドのターゲティング配列と検出可能ラベルまたは治療剤との間にリンカーまたはスペーサーを導入することが含まれる。例えば、そのようなリンカー/スペーサーの使用は、結合ペプチドの関連する性質を改善すること（例えば血清中安定性を増加させることなど）ができる。これらのリンカーとして、当技術分野においてよく見られる置換または無置換アルキル鎖、ポリエチレングリコール誘導体、アミノ酸スペーサー、糖類、または脂肪族もしくは芳香族スペーサーなどを挙げることができるが、これらに制約されるわけではない。
【０２６９】
例えば適切なリンカーには、ホモ二官能性およびヘテロ二官能性架橋分子が含まれる。ホモ二官能性分子は、少なくとも2つの反応性官能基を有し、それらが同じである。ホモ二官能性分子上の反応性官能基には、例えば、アルデヒド基および活性エステル基が含まれる。アルデヒド基を有するホモ二官能性分子には、例えばグルタルアルデヒドおよびスバルアルデヒド（subaraldehyde）などがある。
【０２７０】
少なくとも2つの活性エステル単位を有するホモ二官能性リンカー分子には、ジカルボン酸とN-ヒドロキシスクシンイミドのエステルが含まれる。そのようなN-スクシンイミジルエステルの例をいくつか挙げると、スベリン酸ジスクシンイミジルおよびジチオ-ビス-(プロピオン酸スクシンイミジル）、ならびにそれらの可溶性ビス-スルホン酸およびビス-スルホン酸塩、例えばそれらのナトリウム塩およびカリウム塩などがある。
【０２７１】
ヘテロ二官能性リンカー分子は、少なくとも2つの異なる反応性基を有する。反応性ジスルフィド結合を含有するヘテロ二官能性試薬の例をいくつか挙げると、3-(2-ピリジル-ジチオ)プロピオン酸N-スクシンイミジル（Carlssonら, 1978. Biochem. J., 173:723-737）、S-4-スクシンイミジルオキシカルボニル-アルファ-メチルベンジルチオ硫酸ナトリウム、および4-スクシンイミジルオキシカルボニル-アルファ-メチル-(2-ピリジルジチオ)トルエンなどがある。3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸N-スクシンイミジルが好ましい。チオール基と反応する二重結合を有する反応性基を含むヘテロ二官能性試薬の例をいくつか挙げると、4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸スクシンイミジル（succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexahe-1-carboxylate）およびm-マレイミド安息香酸スクシンイミジルなどがある。他のヘテロ二官能性分子には、3-(マレイミド)プロピオン酸スクシンイミジル、4-(p-マレイミド-フェニル)酪酸スルホスクシンイミジル、4-(N-マレイミドメチル-シクロヘキサン)-1-カルボン酸スルホスクシンイミジル 、マレイミドベンゾイル-5N-ヒドロキシ-スクシンイミドエステルなどがある。
【０２７２】
さらにまた、上述した分子および/または部分の組合せであるリンカーを使用して、ペプチドの性質に特別な利点を付与することもできる。超音波バブル（ultrasound bubble）、リポソームまたは他の凝集に基づくコンストラクトの製剤が可能になるように、リンカー付きの脂質分子を取り付けることができる。そのようなコンストラクトは、診断用レポーター、治療剤（例えば治療用の化学「弾頭（warhead）」）またはそれらの組合せをターゲティングし送達するための薬剤として使用することができるだろう。
【０２７３】
1つ以上の本発明のペプチドリガンドの二量体、多量体、またはポリマーを使用するコンストラクトも考えられる。実際、二量体および多量体の形成によって、低力価ペプチドまたは小分子の結合を実質的に増加させうることを示す文献証拠は豊富に存在する。したがって、二量体型および多量体型コンストラクト（均一および不均一の両方）は、本発明の範囲に包含される。二量体型コンストラクト中のポリペプチド配列は、そのN末端もしくはC末端または適切に配置されたリジン部分のN-イプシロン窒素（または選択的に誘導体化することができる基を保持する他の官能基、例えばペンダントオキシアミノ基または他の求核基）において取り付けるか、または適当な取りつけ化学（attachment chemistry）を使用する1つ以上のリンカー（例えば本明細書に記載するもの）によって、一つに接合することができる。このカップリング化学としては、アミド、尿素、チオ尿素、オキシム、またはアミノアセチルアミド（限定するわけではないが、例えばクロロ-またはブロモ-アセトアミド誘導体から）などを挙げることができる。例えば、本発明のPlec1結合ポリペプチドの二量体型または多量体型コンストラクトを製造するための方法として、少なくとも後述するものが挙げられる。
【０２７４】
リンカーはキレート剤への取り付けにも使用することができる。
【０２７５】
治療剤
別の態様では、本明細書に記載する多量体型ペプチドリガンド複合体を使用する時に、治療剤、例えば限定するわけではないが、細胞毒性剤、抗血管新生剤、アポトーシス促進剤、抗生物質、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、ケモカイン、薬物、プロドラッグ、毒素、酵素または他の薬剤を、補助治療として使用してもよい。本発明において有用な薬物は、例えば、抗有糸分裂剤、抗キナーゼ剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質、アルカロイド、抗血管新生剤、アポトーシス促進剤およびそれらの組合せからなる群より選択される医薬特性を保有しうる。
【０２７６】
がんの診断、監視、および処置
もう一つの態様において、本発明は、対象におけるがんを診断するための組成物および方法を提供する。本方法は、患者からの試料、例えば生検試料と、検出可能部分にコンジュゲートされていてもよい多量体型ペプチドリガンド複合体（ここで、ペプチドリガンド配列は、ある態様では、配列番号1〜4および9〜22の一つから選択される）を含む診断組成物とを用意すること、ペプチドを試料に加えること、および診断組成物を、例えば試料中の検出可能部分を検出することによって検出することを含む。いくつかの実施形態において、イメージングは、レーザー走査顕微鏡法、免疫組織化学、蛍光顕微鏡法、放射線イメージングなどを包含するが、これらに限るわけではない。
【０２７７】
さらなる一態様において、本発明は、がんを診断するためのインビボ法および組成物を提供する。本方法は、膵臓細胞がんのリスクがあるまたは膵臓細胞がんを有すると疑われる対象を同定すること、イメージング分子にコンジュゲートされた本発明の多量体型ペプチドリガンド複合体を含む診断組成物を対象に投与すること、およびインビボイメージングを使って対象内のイメージング分子をイメージングすることを含む。いくつかの実施形態では、膵臓細胞がんが膵管腺癌である。いくつかの実施形態では、イメージング分子が磁気蛍光（magnetofluorescent）粒子である。いくつかの実施形態では、磁気蛍光粒子が近赤外（NIR）蛍光色素（NIRF）を含む。いくつかの実施形態では、組成物が、皮内、皮下、腹腔内、静脈内、動脈内、経口、および胃経路からなる群より選択される経路によって投与される。いくつかの実施形態では、インビボイメージングが、磁気共鳴映像法（MRI）、生体内（intravital）レーザー走査顕微鏡法、内視鏡法、SPECT/CT、および放射線（radiographic）イメージングを含むが、これらに限るわけではない。
【０２７８】
本発明はさらに、発癌過程中を含めて、がんの進行を監視することにも対応する。本願は、プレクチン-1の発現と細胞局在が膵臓癌発生過程（pancreatic carcinogenesis）において変化することを開示する。本発明は、これらの変化を監視するための組成物および方法を提供する。
【０２７９】
ある実施形態において、本発明はさらに、がんの進行または処置を監視するための組成物および方法を提供する。
【０２８０】
もう一つの実施形態において、本発明は、膵がん細胞を外科的に除去するための方法を提供する。この方法は、a）i）膵がん細胞を膵臓非がん細胞と識別するための本発明の多量体型ペプチドリガンド複合体を含む組成物；ii）膵がんを有することがわかっている対象；iii）インビボイメージング装置を用意すること；b）対象に組成物を投与すること；c）インビボの膵がん細胞をイメージング装置でイメージングすること；およびd）膵がん細胞を、その場所の検出後に、対象から除去することを含む。
【０２８１】
本発明は、がんを有する患者を処置する方法であって、i）処置を必要とする対象；ii）本発明の多量体型ペプチドリガンド複合体を含む医薬組成物（リガンドが本発明のバイオマーカーに結合するもの）を用意すること；およびb）処置組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物がさらに治療剤を含む。いくつかの実施形態では、治療剤が、少なくとも1つの融合タンパク質、毒素、および薬物、またはそれらの組合せからなる群より選択される。
【０２８２】
本発明は、プレクチン-1またはそのフラグメントもしくはホモログを発現するがんまたは細胞表面プレクチン-1を示すがんのタイプに限定されない。実際、本発明の検出方法を、さまざまなタイプのがん、例えば限定するわけではないが、肺がん、膀胱がん、頭部および/または頚部がん、乳がん、食道がん、口腔がん、舌がん、歯肉がん、皮膚がん（例えば黒色腫、基底細胞癌、カポジ肉腫など）、筋がん（muscle cancer）、心臓がん、肝がん、気管支がん、軟骨がん、骨がん、胃がん（stomach cancer）、前立腺がん、精巣がん、卵巣がん；子宮頸がん、子宮内膜がん、子宮がん、膵がん、結腸がん、結腸直腸がん、胃がん（gastric cancer）、腎がん、膀胱がん、リンパ腫がん（lymphoma cancer）、脾臓がん、胸腺がん、甲状腺がん、脳がん、神経がん（neuronal cancer）、中皮腫、胆嚢がん、眼がん（ocular cancer）（例えば角膜のがん、ぶどう膜のがん、脈絡膜のがん、黄斑のがん、硝子体液がんなど）、関節がん（joint cancer）（滑膜がんなど）、膠芽腫、白血球がん（white blood cell cancer）（例えばリンパ腫、白血病など）、遺伝性非ポリポーシス大腸がん（HNPC）、大腸炎合併がん（colitis-associated cancer）などに使用することが考えられる。がんとして、さらに、肉腫（骨肉腫およびカポジ肉腫など）が例示される。
【０２８３】
本発明は、膵がんを有する患者を処置する方法であって、a）i）処置を必要とするがん患者、ii）プレクチン-1またはそのフラグメントに結合するリガンドを含む医薬組成物を用意すること、b）その処置組成物を患者に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物がさらに治療剤を含む。いくつかの実施形態では、治療剤が、融合タンパク質、毒素、および薬物からなる群より選択される。さらにもう一つの態様において、本発明は、膵がんを有する対象を処置する方法を提供する。この方法は、処置を必要とする対象を、例えば彼らが膵がんを有することなどに基づいて、同定すること、および細胞毒性剤、例えば毒素または薬物に連結された多量体型ペプチドリガンド複合体（例えば限定するわけではないが、配列番号1〜4および9〜22の配列を有するペプチド）を含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。
【０２８４】
もう一つの態様において、本発明は、ペプチドリガンドに対して選択的アフィニティーを有するがん細胞結合パートナー（受容体）を同定するための方法を提供する。この方法は、結合分子の多様な集団を固形支持体に選択的に固定化すること、固形支持体上に固定化された多様な集団を1つ以上のペプチドリガンドと接触（例えば同時に接触）させること、および前記ペプチドリガンドの1つ以上に選択的に結合する少なくとも1つの結合分子（バクテリオファージによって発現されたものを含む）を決定することを含む。腫瘍抗原（結合分子）に対する選択的アフィニティを有するペプチドリガンドを同定するための方法も提供する。この方法は、腫瘍抗原を固形支持体に選択的に固定化すること、固形支持体上の固定化腫瘍抗原を1つ以上のペプチドリガンドと接触（例えば同時に接触）させること、および前記腫瘍抗原の1つ以上に選択的に結合する少なくとも1つのペプチドリガンドを同定することを含む。ある腫瘍バイオマーカーに対して選択的な単離された結合ペプチド（「ペプチドリガンド」）、特にプレクチン-1に対するペプチドリガンドも提供する。本明細書には、1つ以上の目的のペプチドリガンドに対して選択的なアフィニティーを示す結合分子を同定するための迅速かつ高効率な方法も記載する。これらの方法は、複数の目的ペプチドリガンドに対する複数の結合分子を同時にスクリーニングすることが可能になる点で、有利である。その上、本発明において使用するための結合分子またはリガンドの実体または機能に関して要求される情報は極めてわずかである。例えば、結合分子の多様な集団を、ペプチドリガンドの多様な集団に対して同時にスクリーニングすることにより、所望の結合特異性を示す数多くの分子を迅速に同定することができる。それゆえに、本明細書に記載する方法は、ヒト疾患の診断および処置のための特異的試薬、例えばペプチドリガンドおよびバイオマーカーの発見に、有利に応用することができる。
【０２８５】
本発明において有用な核酸には、例えば、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、例えばアンチセンスDNAおよび/またはRNA；リボザイム；遺伝子治療のためのDNA；ウイルスDNAおよび/またはRNAを含むウイルスフラグメント；DNAおよび/またはRNAキメラ；mRNA；プラスミド；コスミド；ゲノムDNA；cDNA；遺伝子フラグメント；さまざまな構造形態のDNA、例えば一本鎖DNA、二本鎖DNA、スーパーコイルDNAおよび/または三重らせんDNA；Z-DNAなどがあるが、これらに限るわけではない。核酸は、核酸を大量に製造するために典型的に使用される任意の常法によって製造することができる。例えばDNAおよびRNAは、当技術分野において周知の方法により、市販の試薬と合成装置を使って化学合成することができる（例えばGait, 1985, OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS: A PRACTICAL APPROACH（IRL Press、英国オックスフォード）を参照されたい）。RNAは、SP65（Promega Corporation、ウィスコンシン州マディソン）などのプラスミドを使ったインビトロ転写により、高い収率で生産することができる。
【０２８６】
イメージング剤および診断剤
診断剤は、例えば、放射性核種、放射線造影剤、常磁性イオン、金属、蛍光ラベル、化学発光ラベル、超音波造影剤および光活性剤からなる群より選択される。そのような診断剤はよく知られており、そのような既知の診断剤はどれでも使用することができる。診断剤の限定でない例として、110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Srなどの放射性核種、または他のガンマ放射体、ベータ放射体、もしくは陽電子放射体を挙げることができる。有用な常磁性イオンとして、クロム(III)、マンガン(II)、鉄(III)、鉄(II)、コバルト(II)、ニッケル(II)、銅(II)、ネオジム(III)、サマリウム(III)、イッテルビウム(III)、ガドリニウム(III)、バナジウム(II)、テルビウム(III)、ジスプロシウム(III)、ホルミウム(III)またはエルビウム(III)を挙げることができる。金属造影剤として、ランタン(III)、金(III)、鉛(II)またはビスマス(III)を挙げることができる。超音波造影剤は、気体充填（gas-filled）リポソームなどのリポソームを含みうる。放射線不透過性の診断剤は、化合物、バリウム化合物、ガリウム化合物、およびタリウム化合物から選択することができる。当技術分野では、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルアルデヒド（o-phthaldehyde）およびフルオレサミンなど（ただしこれらに限るわけではない）、多種多様な蛍光ラベルが知られている。有用な化学発光ラベルとして、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩またはシュウ酸エステルを挙げることができる。
【０２８７】
これらの薬剤を検出し測定するための技法は、当技術分野において提供されているか、本明細書に記載する。
【０２８８】
抗体およびそれらの製造
本発明のタンパク質、ポリペプチド、またはそのペプチドフラグメントに対する抗体は、当技術分野において周知の方法を使って生成させることができる。例えば、引用によりそのまま本明細書に組み込まれる米国特許出願第07/481,491号には、ペプチドに対する抗体を産生させる方法が開示されている。抗体を生産するために、例えばウサギ、マウス、およびラットなど（ただしこれらに限るわけではない）といった、さまざまな宿主動物を、ポリペプチドまたはそのペプチドフラグメントの注射によって免疫することができる。免疫学的応答を増加させるために、例えば限定するわけではないが、フロイントの（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル（mineral gel）、界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばBCG（カルメット・ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルバム（corynebacterium parvum）など、宿主の種に応じてさまざまなアジュバントを使用することができる。
【０２８９】
モノクローナル抗体の製造には、培養連続継代性細胞株による抗体分子の生産に対応できる任意の技法を利用することができる。例えば、KohlerおよびMilsteinによって最初に開発されたハイブリドーマ技法（1975, Nature 256:495-497）、トリオーマ技法、ヒトB細胞ハイブリドーマ技法（Kozborら, 1983, Immunology Today 4:72）、およびEBV-ハイブリドーマ技法（Coleら, 1985,「Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy」（Alan R. Liss, Inc.）の77〜96頁）を使って、ヒトモノクローナル抗体を生産することができる。もう一つの実施形態では、モノクローナル抗体が無菌動物において生産される。
【０２９０】
本発明によれば、ヒト抗体を使用することができ、ヒト抗体は、ヒトハイブリドーマを利用することによって得るか（Coteら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030）、またはインビトロでヒトB細胞をEBVウイルスで形質転換することによって得ることができる（Coleら, 1985,「Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy」（Alan R. Liss, Inc.）の77〜96頁）。さらにまた、SLLPポリペプチドのエピトープに特異的なマウス抗体分子からの遺伝子を適当な生物学的活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子と接合することによって「キメラ抗体」を生産するために開発された技法（Morrisonら, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851-6855；Neubergerら, 1984, Nature 312:604-608；Takedaら, 1985, Nature 314:452-454）も使用することができ、そのような抗体は本発明の範囲に包含される。特異的モノクローナル抗体がひとたび開発されたら、従来の技法によるその突然変異体（mutant）および変異体（variant）の製造も利用することができる。
【０２９１】
ある実施形態では、単鎖抗体を生産するために記述された技法（引用により本明細書にそのまま組み込まれる米国特許第4,946,778号）に転用してタンパク質特異的単鎖抗体を生産する。もう一つの実施形態では、本発明の特異的抗原、タンパク質、誘導体または類似体に対して所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの迅速かつ簡単な同定が可能になるように、Fab発現ライブラリーを構築するために記述された技法（Huseら, 1989, Science 246:1275-1281）を利用する。
【０２９２】
抗体分子のイディオタイプを含有する抗体フラグメントは既知の技法によって生成させることができる。例えばそのようなフラグメントには、次に挙げるものが含まれるが、これらに限るわけではない：F(ab')2フラグメント、これは抗体分子のペプシン消化によって生産することができる；Fab'フラグメント、これはF(ab')2フラグメントのジスルフィド橋を還元することによって生成させることができる；Fabフラグメント、これは、抗体分子をパパインと還元剤で処理することによって生成させることができる；およびFvフラグメント。
【０２９３】
ポリクローナル抗体の生成は、所望の動物に抗原を接種し、そこからその抗原に特異的に結合する抗体を単離することによって達成される。
【０２９４】
完全長のタンパク質もしくはペプチドまたはそのペプチドフラグメントに対するモノクローナル抗体は、例えばHarlowら（1988,「Antibodies, A Laboratory Manual」Cold Spring Harbor、ニューヨーク）やTuszynskiら（1988, Blood, 72:109-115）に記載されているような任意の周知のモノクローナル抗体製造手法を使って製造することができる。化学合成技術を使って大量の所望のペプチドを合成することもできる。あるいは、所望のペプチドをコードするDNAをクローニングし、大量のペプチドを生成させるのに適した細胞中で、適当なプロモーター配列から発現させてもよい。ペプチドに対するモノクローナル抗体は、本明細書において言及する標準的手法を使って、ペプチドで免疫したマウスから生成させる。
【０２９５】
本明細書に記載する手法を使って得られたモノクローナル抗体をコードする核酸は、当技術分野において利用可能であって例えばWrightら（1992, Critical Rev. in Immunol. 12(3,4):125-168）とその引用文献などに記載されている技術を使って、クローニングし、配列決定することができる。さらに、本発明の抗体は、Wrightら（前掲書）とその引用文献およびGuら（1997, Thrombosis and Hematocyst 77(4):755-759）に記載されている技術を使って、「ヒト化」することもできる。
【０２９６】
ファージ抗体ライブラリーを作成するには、ファージ表面に発現させようとする所望のタンパク質（例えば所望の抗体）を発現する細胞（例えばハイブリドーマ）から単離されたmRNAから、まず最初にcDNAライブラリーを得る。mRNAのcDNAコピーは逆転写酵素を使って作られる。免疫グロブリンフラグメントを特定するcDNAをPCRで取得し、その結果得られたDNAを適切なバクテリオファージベクター中にクローニングして、免疫グロブリン遺伝子を特定するDNAを含むバクテリオファージDNAライブラリーを作成する。異種DNAを含むバクテリオファージライブラリーを作成するための手法は、当技術分野ではよく知られており、例えばSambrookら（1989「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」Cold Spring Harbor、ニューヨーク）に記載されている。
【０２９７】
所望の抗体をコードするバクテリオファージは、その表面上にタンパク質が、それがそれに対応する結合タンパク質（例えばその抗体にとっての抗原）への結合に利用されうるような形でディスプレイされるように、工学的に操作することができる。したがって、特異的抗体を発現するバクテリオファージを、対応する抗原を発現する細胞の存在下でインキュベートすると、バクテリオファージはその細胞に結合するであろう。抗体を発現しないバクテリオファージは細胞に結合しないであろう。そのようなパンニング（panning）技法は当技術分野ではよく知られている。
【０２９８】
上述したようなプロセスが、M13バクテリオファージディスプレイを使ってヒト抗体を生産するために開発されている（Burtonら, 1994, Adv. Immunol. 57:191-280）。基本的には、抗体産生細胞の集団から得たmRNAからcDNAライブラリーを作成する。そのmRNAは、再編成された免疫グロブリン遺伝子をコードしているので、cDNAもそれをコードする。増幅されたcDNAをM13発現ベクターにクローニングして、ヒトFabフラグメントをその表面上に発現するファージのライブラリーを作成する。目的の抗体をディスプレイするファージを抗原結合によって選択し、細菌内で増殖させることにより、可溶性ヒトFab免疫グロブリンを生産する。こうして、従来のモノクローナル抗体合成とは対照的に、この手法では、ヒト免疫グロブリンを発現する細胞ではなく、ヒト免疫グロブリンをコードするDNAを不死化する。
【０２９９】
上述の手法は抗体分子のFab部分をコードするファージの作成を説明している。しかし、本発明がFab抗体をコードするファージの作成だけに限定されるとみなしてはならない。そうではなくて、単鎖抗体をコードするファージ（scFv/ファージ抗体ライブラリー）も本発明に包含される。Fab分子はIg軽鎖全体を含む（すなわち、軽鎖の可変領域と定常領域の両方を含む）が、重鎖は可変領域と第1定常領域ドメイン（CH1）しか含まない。単鎖抗体分子は、Ig Fvフラグメントを含む単一のタンパク質鎖を含む。Ig Fvフラグメントは、抗体の重鎖と軽鎖の可変領域しか含まず、定常領域はそこには含まれていない。scFv DNAを含むファージライブラリーは、Marksら, 1991, J. Mol. Biol. 222:581-597に記載の手法に従って作成することができる。そうして作成されたファージのパンニングによる所望の抗体の単離は、Fab DNAを含むファージライブラリーについて説明したものと同様の方法で行われる。
【０３００】
また本発明は、考えうる特異性をほとんど全て含むように重鎖および軽鎖可変領域を合成することができる合成ファージディスプレイライブラリーを包含すると解釈すべきである（Barbas, 1995, Nature Medicine 1:837-839；de Kruifら. 1995, J. Mol. Biol.248:97-105）。
【０３０１】
抗体の作製において、所望する抗体のスクリーニングは、例えばELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）など、当技術分野において知られる技法によって達成することができる。本発明に従って作製される抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ（すなわち「ヒト化」）および単鎖（組換え）抗体、Fabフラグメント、およびFab発現ライブラリーによって生産されるフラグメントを含めることができる。
【０３０２】
アプタマー
本発明は有用なアプタマーにも向けられる。ある実施形態において、アプタマーは、もう一つの化合物（この場合は同定されたタンパク質）に優先的に結合するようにインビトロで選択された化合物である。ある態様では、アプタマーが核酸またはペプチドである。なぜなら、ヌクレオチドまたはアミノ酸（どちらも天然物または合成物）からランダムな配列を容易に数多く生成させることができるからであるが、当然のことながら、アプタマーをこれらに限定する必要はない。もう一つの態様では、核酸アプタマーが、タンパク質ターゲットに結合する短いDNA鎖である。ある態様では、アプタマーがオリゴヌクレオチドアプタマーである。オリゴヌクレオチドアプタマーは、目的の特異的タンパク質配列に結合することができるオリゴヌクレオチドである。一般的なアプタマー同定方法は、部分的に縮重したオリゴヌクレオチドから開始し、次に何千ものオリゴヌクレオチドを、所望のタンパク質に結合する能力について同時にスクリーニングすることである。結合したオリゴヌクレオチドをタンパク質から溶離させ、配列決定して、特異的認識配列を同定することができる。化学的に安定化したアプタマーを細胞中に大量に導入すると、目的のポリペプチドへの特異的結合が起こり、それによってその機能の阻止が起こりうる。［例えば、アプタマーのインビトロ選択について記述している以下の刊行物を参照されたい：Klugら, Mol. Biol. Reports 20:97-107 (1994)；Wallisら, Chem. Biol. 2:543-552 (1995)；Ellington, Curr. Biol. 4:427-429 (1994)；Latoら, Chem. Biol. 2:291-303 (1995)；Conradら, Mol. Div. 1:69-78 (1995)；およびUphoffら, Curr. Opin. Struct. Biol. 6:281-287 (1996)］。
【０３０３】
アプタマーは、ターゲット遺伝子機能を人工的に妨害する他のオリゴヌクレオチドベースのアプローチと比較して、これらの遺伝子のタンパク質産物に高いアフィニティーおよび特異性で結合するというその能力ゆえに、有利である。しかし、RNAアプタマーは、細胞内タンパク質をターゲティングするその能力に限界がありうる。というのも、ヌクレアーゼ耐性アプタマーでさえ細胞内コンパートメントには効率よく進入できないからである。そのうえ、ベクターベースのアプローチによって哺乳動物細胞内でRNAアプタマーを発現させる試みは、発現するRNAアプタマー中の余分な隣接配列（これらは、アプタマーの機能的コンフォメーションを変化させうる）の存在によって阻まれてきた。
【０３０４】
一本鎖核酸（DNAおよびRNAアプタマー）を使ってタンパク質分子をターゲティングするという考えは、短い配列が標的タンパク質に高いアフィニティーおよび特異性で結合することを可能にするユニークな3Dコンフォメーションに折りたたまれるという、短い配列（20マー〜80マー）の能力に基づいている。酵母や多細胞生物などの真核細胞の内部におけるRNAアプタマーの発現は成功しており、RNAアプタマーは、細胞環境においてその標的タンパク質に対して阻害効果を有することが示されている。
【０３０５】
結合アッセイでは、相互作用が結合であり、形成される複合体は単離するか、反応混合物中で検出することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載する複合体のペプチドの一つ、または試験化合物もしくは薬物候補が、共有結合的または非共有結合的な取り付けによって、固相（例えばマイクロタイタープレート）上に固定化される。非共有結合的取り付けは、一般に、固体表面にペプチドの溶液をコーティングし、乾燥させることによって達成される。あるいは、固定しようとするペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を使って、それを固体表面に係留（anchor）することもできる。アッセイは、検出可能なラベルで標識されていてもよい非固定化構成要素を、固定化構成要素（例えば係留された構成要素を含有する被覆表面）に添加することによって行われる。反応が完了したら、反応しなかった構成要素を、例えば洗浄などによって取り除き、固体表面上に係留されている複合体を検出する。元々は固定化されていない構成要素が検出可能なラベルを担持している場合、表面上に固定化されたラベルの検出は、複合体形成が起こったことを示す。元々は固定化されていない構成要素がラベルを担持していない場合、複合体形成は、例えば固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体を使うことなどによって検出することができる。
【０３０６】
本発明は、本発明の多量体型ペプチドリガンド複合体を含む医薬組成物および治療組成物も包含する。特に、そのような化合物は、当業者に知られる標準的な医薬上許容される担体、充填剤、可溶化剤および安定剤を使って、医薬組成物として製剤化することができる。
【０３０７】
本発明はさらに、本発明の多量体型ペプチドリガンドまたは複合体の1つ以上を含む医薬調製物を提供する。医薬組成物中の該ポリペプチドの濃度は、すなわち約0.1重量％未満（通常は少なくとも約1重量％である）から、20重量％にも達する濃度またはそれ以上まで、広範囲にわたって変動しうる。
【０３０８】
本組成物は、活性成分に加えて、医薬上許容される担体を含みうる。医薬担体は、患者にペプチドを送達する（deliver the peptides o to the patient）のに適した任意の適合性無毒性物質であることができる。ポリペプチドの場合、滅菌水、アルコール、脂肪、ロウ、および不活性固形物を担体として使用することができる。医薬上許容されるアジュバント、緩衝剤、分散剤なども、医薬組成物中に組み入れることができる。
【０３０９】
ポリペプチドを含む医薬組成物を製造する方法は、米国特許第5,789,543号および同第6,207,718号に記載されている。好ましい形態は、意図する投与様式および治療的応用に依存する。
【０３１０】
ある実施形態では多量体型ペプチドを含む本組成物が注射によって投与される。ポリペプチドを投与するための非経口経路は、例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、皮下、または病巣内経路による注射または注入など、既知の方法に従う。タンパク質またはポリペプチドは、注入によって持続的に投与するか、ボーラス注射によって投与することができる。静脈内注入用の典型的組成物は、20％アルブミン溶液が補足されていてもよい10〜50mlの滅菌0.9％NaClまたは5％グルコースと、10μg〜50mg、好ましくは50μg〜10mgのポリペプチドとを含有するように構成させることができるだろう。筋肉内注射用の典型的医薬組成物は、例えば1〜10mlの滅菌緩衝水と、10μg〜50mg、好ましくは50μg〜10mgの本発明のポリペプチドとを含有するように構成されるだろう。非経口投与可能な組成物を製造するための方法は当技術分野ではよく知られており、例えば「Remington's Pharmaceutical Science」（第15版, Mack Publishing, ペンシルバニア州イーストン, 1980）（この文献は、あらゆる目的で、引用によりそのまま本明細書に組み込まれる）などを含むさまざまな情報源に詳述されている。
【０３１１】
医薬組成物および投与
本発明は、本発明の化合物を対象に投与する方法にも向けられる。ある実施形態において、本発明は、本明細書の方法（the method of the invention description）を使って同定された化合物を投与することによって、がんを診断し、Plec-1を検出し、Plec-1発現細胞を局在し、または対象を処置する方法を提供する。本化合物を含む医薬組成物は、それを必要とする対象に、例えば局所外用、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所外用、舌下、または直腸手段など（ただしこれらに限るわけではない）といった、いくつもの経路によって投与される。
【０３１２】
ある実施形態によれば、処置を必要とする対象に処置を施す方法が提供される。この方法は、少なくとも一つの本発明の化合物を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。本発明の方法によって同定された化合物は、既知の化合物または他の薬物と共に投与することもできる。
【０３１３】
本発明を実施するのに有用な医薬組成物は、1ng/kg/日〜100mg/kg/日の用量で送達されるように投与することができる。
【０３１４】
本発明は、本明細書に開示する疾患の処置に有用な化合物を活性成分として含む医薬組成物の製造および使用を包含する。そのような医薬組成物は、対象への投与に適した形態の活性成分のみからなってもよいし、医薬組成物は活性成分と、1つ以上の医薬上許容される担体、1つ以上の追加成分、またはこれらの何らかの組合せとを含んでもよい。活性成分は、当技術分野においてよく知られているとおり、医薬組成物中に、生理学的に許容されるエステルまたは塩の形態で、例えば生理学的に許容されるカチオンまたはアニオンと組み合わされて存在しうる。
【０３１５】
本明細書において使用する用語「生理学的に許容される」エステルまたは塩とは、医薬組成物の他の任意の成分と適合し、その組成物が投与されるべき対象にとって有害でない、活性成分のエステルまたは塩を意味する。
【０３１６】
本明細書に記載する医薬組成物の製剤は、薬理学の分野において知られているまたは今後開発される任意の方法によって製造することができる。一般に、そのような製造法（preparatory method）は、活性成分を担体または1つ以上の他の補助成分と結びつけ、次に必要であれば、またはそれが望ましいのであれば、造形（shape）し、または生成物を所望の単用量または多用量単位に梱包するステップを含む。
【０３１７】
そのような医薬組成物が、一般に、あらゆる種類の動物への投与に適していることは、当業者には理解されるだろう。本発明の医薬組成物を投与することが想定される対象には、ヒトおよび他の霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコおよびイヌなどの商業的に重要な哺乳動物を含む哺乳動物、鶏、アヒル、ガチョウ、および七面鳥などの商業的に重要な鳥を含む鳥などが含まれるが、これらに限定されるわけではない。本発明は、齧歯類動物などの有害動物の避妊に使用することも考えられる。
【０３１８】
本発明の医薬組成物は、ばらで（in bulk）、単一投薬単位（single unit dose）として、または複数の単一投薬単位として、製造し、梱包し、または販売することができる。本明細書にいう「投薬単位（unit dose）」とは、前もって決定された量の活性成分を含む医薬組成物の不連続な量（discrete amount）である。活性成分の量は一般に、対象に投与されるであろう活性成分の投薬量に等しいか、またはそのような投薬量の好都合な端数、例えばそのような投薬量の2分の1または3分の1に等しい。
【０３１９】
本発明の医薬組成物における活性成分、医薬上許容される担体、および任意の追加成分の相対量は、処置される対象の実体、サイズ、および状態に依存し、さらにその組成物を投与しようとする経路にも依存して、変動するであろう。例えば、本組成物は0.1％〜100％（w/w）の活性成分を含みうる。
【０３２０】
活性成分に加えて、本発明の医薬組成物は1つ以上の医薬活性剤を、さらに含みうる。特に考えられる追加の薬剤には、制吐剤、ならびにシアニド（cyanide）およびシアネート（cyanate）スカベンジャー（scavenger）などのスカベンジャーが含まれる。
【０３２１】
本発明の医薬組成物の放出制御（controlled-release）製剤または徐放性（sustained-release）製剤は、従来の技術を使って作製することができる。
【０３２２】
本明細書にいう「追加成分」には、以下に挙げるものの1つ以上が含まれるが、それらに限定されるわけではない：賦形剤；界面活性剤；分散剤；不活性希釈剤；造粒剤および崩壊剤；結合剤；滑沢剤；甘味剤；矯味矯臭剤；着色剤；保存剤；生理学的に分解可能な組成物、例えばゼラチン；水性の媒体および溶剤；油性の媒体および溶剤；懸濁剤；分散剤または湿潤剤；乳化剤、粘滑剤（demulcent）；バッファー；塩；増粘剤；充填剤；乳化剤；酸化防止剤；抗生物質；抗真菌剤；安定剤；および医薬上許容されるポリマー材料または疎水性材料。本発明の医薬組成物に含めることができる他の「追加成分」は、当技術分野において知られており、例えば引用により本明細書に組み込まれるGenaro編, 1985「Remington's Pharmaceutical Sciences」（Mack Publishing Co.、ペンシルバニア州イーストン）などに記述されている。
【０３２３】
典型的には、動物（好ましくはヒト）に投与される本発明の化合物の投薬量は、その動物の体重1キログラムあたり1μg〜約100gの範囲の量である。投与される正確な投薬量は、例えば動物のタイプおよび処置される疾患状態のタイプ、動物の年齢および投与経路などを含む（ただしこれらに限るわけではない）多くの要因に依存して変動するであろうが、好ましくは、化合物の投薬量は動物の体重1キログラムあたり約1mgから約10gまで変動するであろう。より好ましくは、投薬量は、動物の体重1キログラムあたり約10mgから約1gまで変動するであろう。
【０３２４】
化合物は毎日数回程度頻繁に動物に投与してもよいし、それより低い頻度で、例えば1日1回、1週間に1回、2週間ごとに1回、1ヶ月に1回、またはさらに低頻度に、例えば数ヶ月ごとに1回、もしくは1年に1回またはそれ未満の頻度で投与してもよい。投与の頻度は、当業者には明白であり、例えば限定するわけではないが、診断されるがんのタイプ、処置される状態または疾患のタイプおよび重症度、動物のタイプおよび年齢など数多くの要因に依存するであろう。
【０３２５】
適切な調製物には、溶液または懸濁液としての注射剤（injectable）が含まれるが、注射前に液体に溶解または懸濁するのに適した固形物も製造することができる。調製物を乳化するか、ポリペプチドをリポソーム中に封入することもできる。活性成分は、しばしば、医薬上許容され活性成分と適合する賦形剤と混合される。適切な賦形剤は、例えば水（water）食塩水（saline）、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組合せである。また、所望であれば、ワクチン調製物は、少量の補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤および/またはアジュバントなども含みうる。
【０３２６】
本発明は、本発明の組成物と、その組成物を対象の細胞または組織に血管外膜投与すること（adventitially administering）を説明する指示書とを含むキットも包含する。もう一つの実施形態では、このキットが、対象への化合物の投与に先だって本発明の組成物を溶解または懸濁するのに適した（好ましくは滅菌）溶剤を含む。
【０３２７】
本明細書にいう「指示書」には、本明細書において列挙するさまざまな疾患または障害の軽減を達成するためのキットにおける本発明のペプチドの有用性を伝えるために使用することができる刊行物、記録、図表、または他の任意の表現媒体が包含される。場合によっては、または上記に代えて、指示書は、診断または同定のために本組成物を使用する1つ以上の方法、または哺乳動物の細胞もしくは組織における疾患もしくは障害を軽減する1つ以上の方法を説明してもよい。本発明のキットの指示書は、例えば、本発明の多量体型ペプチドが入っている容器に添付されるか、前記ペプチドが入っている容器と一緒に出荷することができる。あるいは、指示書と化合物は受取人によって協同的に使用されるものとして、指示書を容器とは別に出荷してもよい。
【０３２８】
本発明を実施する際には、当技術分野において知られる他の技法も使用することができる。
【０３２９】
以下では、次に挙げる実施例および実施形態に関して本発明を説明する。これ以上の説明がなくても、当業者は、上記の説明と以下の例示的実施例を使って、本発明をなし、それを利用して、クレームされた方法を実施することができると考えられる。それゆえに、以下の実施例は単に例示を目的として提供され、本発明の好ましい実施形態を具体的に指摘するものであって、決して本明細書の他の部分を限定するものであると解釈してはならない。それゆえに、実施例は、本明細書において提供する教示内容の結果として明白になるありとあらゆる変形（variation）を包含すると解釈されるべきである。
【実施例】
【０３３０】
以下に記述する実験は、プレクチン-1（PLEC-1）が、がん、特に前浸潤性、浸潤性および転移性PDACのバイオマーカーであるかどうかを決定すると共に、プレクチン-1を検出するためのより良いリガンド複合体を開発するために計画した。さらにまた、これが良性膵炎を、何より重要なのは慢性膵炎を、悪性膵臓疾患と識別するかどうか、そしてその過剰発現をPDACの非侵襲的イメージングに利用できるかどうかを決定しようと試みた。さらに、ここでは、Plec1が他の非膵臓ヒトがんでもバイオマーカーであるかどうかを評価した。
【０３３１】
方法：
組織試料
組織試料および生体試料は、施設内審査委員会（Institutional Review Board）の承認を得て、その要件に従って収集した。
【０３３２】
パラフィン包埋組織試料を病院資料（hospital file）から得た。全ての標本は評価の時点で確定された診断を受けていた。合計4例の正常膵臓、15例の慢性膵炎、14例のPanIN I、26例のPanIN II、15例のPanIN IIIおよび31例のPDAC、8例の肝臓転移、1例のリンパ節転移および1例の腹膜転移を入手した。膵臓外ヒトがんにおけるPlec1発現を評価するために、市販の腫瘍組織マイクロアレイ（MTU951、US Biomax、メリーランド州ロックビル）を使用した。
【０３３３】
マウス
動物実験は全て承認された。無胸腺雌マウス（nu/nu）を学内飼育施設（in-house breeding facility）から入手した。マウスは無菌環境で維持し、食物と水を自由に摂取させた。
【０３３４】
ウェスタンブロット分析
急速凍結外科標本として入手した膵臓組織50mgを、プロテアーゼインヒビターカクテル（0.001mg/mlアプロチニン、ベスタチン、ペプスタチン、ロイペプチンおよび0.005mg/ml 20mM PMSF、Sigma-Aldrich、米国セントルイス）と組み合わせたRIPAバッファー（50mM Trizma塩基、pH7.4、1％Triton X-100、0.25％デオキシコール酸ナトリウム、100mM EDTA、150mM NaCl）中でホモジナイズした。溶解物を遠心分離によって清澄化し、極めて精密なアッセイ（2-D Quant Kit、Amersham Biosciences、ニュージャージー州）を使ってタンパク質濃度を決定した。20μgタンパク質/レーンをSDS-PAGEで分離し、ニトロセルロースメンブレンに転写した。抗原検出はヒトPlec1に対するウサギモノクローナル抗体（Abcam、マサチューセッツ州ケンブリッジ）を使って行った。二次抗体はHRP結合（coupled）ヤギ抗ウサギポリクローナル抗体（Sigma-Aldrich、米国セントルイス）とした。バンドをECLで可視化した（対照：ラット脳溶解物、Santa Cruz Biotechnology、カリフォルニア州ラホーヤ）。
【０３３５】
免疫染色
パラフィン包埋切片を脱パラフィン化し、TBSで水和し、H2O2でブロッキングした。抗原回復は、Retrievit（BioGenex、カリフォルニア州サンラモン）中で組織を煮沸することによって達成した。TBS中、アビジン/ビオチン（Vector Laboratories、カリフォルニア州バーリンゲーム）および5％ヤギ血清でブロッキングした後、スライドを、1：250 Plec1抗体（Abcam）と共に4℃で終夜インキュベートした。切片をTBST中で3回洗浄した後、ビオチン化抗ウサギ・ヤギ二次抗体（Vector Laboratories、カリフォルニア州バーリンゲーム）と共にインキュベートし、次にDAB（Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド）を使って呈色させ、ヘマトキシリンで対比染色した。Y-FL顕微鏡（ニコン、日本）を使ってスライドを評価した。画像はDP-25カメラおよび収集ソフトウェア（オリンパス、日本）を使って収集した。
【０３３６】
組織学的評価
神経は、Plec1に関して中等度の染色強度を有することがわかり、全てのスライドに存在していた。そこで、各スライド内での神経におけるPlec1の発現を、染色対照および染色強度の基準として使用した。染色強度は、2人の独立した観察者によって記録され、結果が矛盾した場合は、3人目の観察者が評価した。異常な上皮細胞の染色を、神経に見られる中等度の染色との比較で、陰性、弱、中または強と分類した。
【０３３７】
インビトロ競合アッセイ
四量体型プレクチン-1標的ペプチド（tPTP）複合体(βAKTLLPTP-GGS(PEG5000))4KKKKDOTAβA-NH2（本明細書では[(βAla-Lys-Thr-Leu-Leu-Pro-Thr-Pro-Gly-Gly-Ser-PEG5K)2-Lys]2-Lys-Lys(DOTA)-βAla-NH2ともいう）は、プレクチン-1ターゲティングペプチドKTLLPTP（配列番号1）（Kellyら, 2008, PLoS Medicine, 5:4:e85:0657-0668）に基づいて、GMPグレード施設（CS Bio Company、カリフォルニア州メンローパーク）で合成された。
【０３３８】
tPTP分岐PEGペプチド複合体の製造の概要：
ペプチド配列（例）−
[(βAla-Lys-Thr-Leu-Leu-Pro-Thr-Pro-Gly-Gly-Ser-PEG5K)2-Lys]2-Lys-Lys(DOTA)-βAla-NH2
MW：25648
PEG5K：これは、Fmoc-PEG5000-NHSエステル（JenKem Tech）に由来する。
【０３３９】
材料−
1）レジン：
Fmoc-Rink-アミドレジン（置換量（Sub）：0.34mmol/g）；
2）次のとおり特別な側鎖保護AAを使用した：
Lys-15：Lys(Mmt）、Lys-14、13：Fmoc-Lys(Fmoc)；
3）カップリング試薬：Rx/AA/DIC/HOBt（1/3/3/3）;
4）切断試薬：TFA/TIS/H2O;
5）精製：ACN/H2O/TFA
【０３４０】
合成-
1）Rinkアミドレジンにβ-Alaを取り付け、Rx上のβ-Alaの脱Fmoc後に、Fmoc-Lys(Mmt)を取り付けた。
2）Fmoc基がついた状態で、脱Mmtし、Lys-15側鎖にTri-tBu-DOTAをカップリングした。カップリング：Rx/DOTA/DIC/HOBt（1/2/2/2）、カップリング1回（single coupling）。
3）脱Fmoc後に、Rx上の伸長したペプチドにFmoc-Lys(Fmoc)を取り付けた。Lys-14の脱Fmocを実施した。これにより、2つの遊離NH2基が（一方は主鎖上に、他方は側鎖上に）残るだろう。
4）Rx上の2つのNH2基にFmoc-Lys(Fmoc）を取り付けるために二倍量のカップリング試薬を使用した。脱Fmoc後に、Rx上の4つのNH2基が、次のカップリングに利用できるようになった。
5）次に、Fmoc-PEG5000-NHSを、促進剤としてDIPEAを使って、前記4つのNH2基に取り付けた（Rx/PEG 1/8）。Kaiserテスト陰性を確認した後、PEGを脱Fmocし、4つの分岐N末端へのAAカップリングをβ-Ala-1に達するまで1つずつ続けた。
6）最後の脱Fmoc後、Rxは切断できる状態になった。
【０３４１】
切断−
試薬：95％TFA、2.5％H2O、2.5％TIS。室温で240分間撹拌した。
反応から減圧を使って溶媒を除去し、水/ACNの添加後に、その混合物を凍結乾燥した。
【０３４２】
精製−
粗ペプチド（シロップ状）を水で希釈してからHPLCカラム（4.1×25cm×cm）にローディングし、60分で20−60％バッファーBの勾配で精製した。流速、TFAバッファー系中で25mL/分。0.1mmol合成で200mgの最終生成物が得られた（最適化はしていない）。
【０３４３】
DOTA（1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸）は次の構造を有する。
【化５】
2013510094.tif 000008
【０３４４】
対照として、非結合性四量体（ncPTP-4(βAKHVMSKQGGS(PEG5000))KKKDOTAβA-NH2)も合成した。対照ペプチドの配列にはKHVMSKQ（配列番号5）と、配列番号5に2つのグリシンと1つのセリンが付加されてKHVMSKQGGS（配列番号6）になっているものが含まれる。配列番号5または配列番号6に付加されたベータアラニン（βA）はそれぞれβAKHVMSKQ（配列番号7）とβAKHVMSKQGGS（配列番号8）を与える。
【０３４５】
tPTPは、多価性を高めるために四量体として、GMP施設で化学合成され、薬剤の循環時間を増加させるため、免疫原性を低下させるため、およびペプチドが意図したターゲットに到達するためにインビボで切断されてしまうのを防ぐために、4つの5000Da PEG鎖（4つのペプチドの各ペプチドに1つ）が付加された。
【０３４６】
イメージング剤の付加
インジウム標識のために、ペプチド（100μg、nmol）を20μLのPBSに溶解してから100μLの酢酸アンモニウムバッファー（0.1M、pH4.5）で希釈した。塩化インジウム（水中5mCi）（Cardinal Health、バージニア州）をペプチドと混合し、40℃で15分間撹拌しながら平衡化した。DPBSとプレ平衡化しておいたPD10脱塩カラムを使ったサイズ排除によって、反応混合物を精製した。インビトロペプチド検証実験のために、細胞を、濃度が10-3〜10-9の範囲にあるtPTPまたはncPTPおよび5μCi tPTP-In111と共に、3つ一組にして、室温で1時間インキュベートした。1時間後に細胞を洗浄し、100μLの1M NaOHで5分間溶解した。次に、その混合物をチューブに移し、ガンマカウンターでカウント数を分析した。
【０３４７】
イメージング
同所性に注射されたL3.6pl膵がん腫瘍細胞を保持するマウス（n＝4）に、1mCiの111In標識tPTPを注射し、次に注射の4時間後に、UVaにおいて設計され組み立てられたマイクロSPECT/CTスキャナでイメージングした。イメージング中は常に麻酔（酸素中1％〜2％イソフルラン）を送達した。CT収集（CT acquisition）には、約5分間にわたって200度にまたがる200の等間隔な投影を使用した。ピンホールSPECTスキャニングのためにマウスを軸方向に再位置決めし（repositioned axially）、2台のガンマカメラを同時に使って60の等間隔な投影像を180度にわたって得た。収集時間は約30分だった。2台のカメラに直径1mmのタングステンピンホールを装着した。復元したCTボクセルサイズは512×512×640画像マトリックス上に0.082×0.082×0.082mmだった。復元したSPECTボクセルサイズは、60×60×60イメージマトリックス上に0.65×0.65×0.65mmだった。全てのSPECT画像を放射能崩壊（radioactivity decay）について補正したが、ガンマ線減衰（gamma ray attenuation）については補正しなかった。
【０３４８】
体内分布および血中半減期
マウスをSPECT/CTでイメージングした後、動物を屠殺し、その臓器を収穫し、事前に計量しておいたエッペンドルフチューブに入れた。次に各チューブを再計量して、臓器の重量を決定し、放射線を測定した。プローブの血漿中寿命を決定するために、tPTP-Peg-111Inを注射したマウスから、注射後0、15、30、45、60、および120分に採血し、ウェルカウンターで放射能を測定した。
【０３４９】
組織学
膵臓および腹膜転移からのPDAC標本を4％PFAで固定し、OCT中で凍結した。次に組織試料を薄切し、H&Eで染色した。
【０３５０】
Panc27ペプチド（KTLLPTP（配列番号1））のアラニン突然変異
配列番号1のアミノ酸残基のそれぞれのアラニン置換の効果を決定した。この研究に使用したペプチドは、ファージ由来配列KTLLPTP（配列番号1）と、各残基を逐次アラニンに突然変異させたアラニン突然変異体ATLLPTP、KALLPTP、KTALPTP、KTLAPTP、KTLLATP、KTLLPAP、およびKTLLPTA（それぞれ配列番号9〜15）とからなる。2mgの各ペプチドを200μLのPBSに溶解し、1mgのFITCと混合し、終夜反応させた。ペプチドをC18逆相レジンでのフラッシュクロマトグラフィーにより、アセトニトリル/水混合物を使って精製し、分光法によって定量した。
【０３５１】
L3.6細胞を24ウェルプレートにプレーティングし、約90〜95％コンフルエントになった時に使用した。ペプチドを30μMに希釈してから、3倍ずつ希釈することで濃度系列を作成し、最低濃度を約14nMにした（8濃度）。これらをL3.6細胞の上に置き（200μL/ウェル、3つ一組）、氷上で2時間インキュベートした。それらをPBS＋1％ツイーン20で3回洗浄し、200μLの溶解バッファー（50mL PBS、0.5mL Triton X-100、15mg ANSA（アミノナフタレノスルホン酸））およびHPRで標識した抗FITC抗体20μL中で溶解した。残存するペプチドの量を定量するために、溶解物を、FITC-BSAで標識されたイムノアッセイプレート上、標準曲線用のペプチド希釈液と共に、37℃で1時間インキュベートした。プレートを、PBS中の0.1％BSAおよび0.1％Tween-20の溶液で4〜5回洗浄し、テトラメチルベンジジンで呈色させた。
【０３５２】
これらの研究からの吸光度対濃度曲線を、Graphpad prismを使って、シグモイド用量応答（可変スロープ）曲線として解析することで、ペプチドの見掛けのアフィニティを計算した。各突然変異のアフィニティーを確証するために、全ての手順を少なくとも1回は繰り返し、予想されるシグモイド用量応答曲線に当てはまらなかった実験はやり直した。
【０３５３】
結果
Plec1はPADCでは発現するが、慢性膵炎および正常膵臓では発現しない
悪性膵臓疾患と良性膵臓疾患はPlec1発現によって明確に識別される（図1）。100％のPDAC（31/31）がPlec1に関して染色され、そのうち、77％（24/31）が強く染色され、23％は中等度に染色された（7/31）。PDACとは対照的に、正常膵臓にも（4/4）、大部分の慢性膵炎にも（10/15）、Plec1は同定されなかった。残りの慢性膵炎（5/15）は導管上皮においてPlec1に関して弱く染色された（図1B）。膵臓組織溶解物のウェスタンブロッティングによってIHC所見が裏付けられた。正常膵臓（2/2）および慢性膵炎（3/3）にはPlec1が検出されなかったのに対し、各PDACには存在した（3/3；図1D）。
【０３５４】
膵臓癌発生過程におけるPlec1発現および細胞局在の変化
Plec1発現強度は膵癌発生過程において増加する（図1）。病変がPanIN IからIIIへと進行するにつれて、Plec1に関するそれらの染色強度は増加し、Plec1陽性になる病変のパーセンテージが増加する。初期PDAC前駆病変であるPanIN Iは、大半がPlec1陰性である（11/14）。対照的に、PanIN II病変の過半数がPlec1を弱く（13/26）または中等度に（1/26）発現し、一方、PanIN III病変の87％がPlec1陽性だった（13/15；図1A、B）。注目すべきことに、Plec1の細胞局在も発癌過程において変化する。Plec1が早期PanIN病変において同定された場合、その局在は細胞膜に限定されていたが、悪性病変におけるPlec1発現は細胞質および膜局在を有していた。Plec1は、前浸潤性悪性PanIN IIIの27％（4/15）および浸潤性PCAC病変の100％（31/31）において、膜および細胞質に局在した（図1C）。
【０３５５】
Plec1発現はPDAC転移でも保持される
PDACは、通常はPlec1を発現しない腹膜、リンパ節および肝臓に、早期に転移する傾向（propensity）を有する。アッセイした転移巣（metastatic focus）は全て、そのPlec1発現を保持しており（8/8肝臓転移、1/1リンパ節転移および1/1腹膜転移）、これらの組織における転移沈着物（metastatic deposit）を明確に同定し、際立たせていた（図1A）。
【０３５６】
Plec1は非膵臓ヒトがんにおいて過剰発現する
ヒト腫瘍組織マイクロアレイのIHCにより、Plec1の有用性は膵がんに限定されないであろうことが明らかになった。食道、胃、および肺の標本においても、Plec1は、良性組織と悪性組織とを識別するために使用できる可能性がある差次的発現パターンを有していた（図2）。
【０３５７】
Plec1ターゲティングプローブはPDACの非侵襲的イメージングに使用することができる
Plec1が、ヒトPDACのインビボ検出を容易にするためのイメージングバイオマーカーとして機能しうるかどうかを決定するために、本発明者らは、ファージディスプレイスクリーン由来のPlec1標的ペプチドを使って、単光子放射型コンピュータ断層撮影（SPECT）用の臨床的に適切なイメージング剤として機能する四量体型合成ペプチド（tPTP）複合体（図8参照）を合成した。tPTPの特異性のインビトロ検証を、標識tPTPおよび非標識tPTPまたは陰性対照PTP（ncPTP）を使った競合アッセイによって行った。tPTPのKi（阻害解離定数）は、ncPTPの2.86×10-6Mに対して8.3×10-7Mだった（図3A）。膵がん細胞を同所性に注射した動物に、tPTPを投与し、4時間後にSPECT/CTでイメージングした。イメージングは、膵臓中の腫瘍だけでなく、それら動物の腹膜中に存在する転移も明らかにした（図3Bおよび図4）。イメージング後に行った体内分布研究により、膵腫瘍は3％注射量（injected dose）/g（id/g）組織を有し、一方、脾臓、肝臓、および心臓は1％id/g未満を有することが実証された（図3C）。プローブは腎臓にも蓄積し、実際、このペプチドの主要排除経路は、腎臓（図3C）および尿によるものであった。薄切した膵臓および腹膜のH&E染色により、膵臓および腹膜の転移における腫瘍の存在が実証された（図3D）。これらのデータは、tPTPがプレクチン-1の高度に特異的なイメージングツールとして機能することを示している。
【０３５８】
tPTPはPDACを標的とし、非侵襲的インビボイメージングを可能にする
同所性に移植されたL3.6細胞からの腫瘍を保持する無胸腺ヌードマウスに111IN-tPTPを注射し、注射の4時間後にSPECT/CTでイメージングした。SPECT/CTイメージングにより、tPTPはPDAC中に蓄積して、膵臓中および腹膜転移中の腫瘍のインビボイメージングを可能にすることが実証される。図4参照。
【０３５９】
図5は四量体型プレクチン-1標的ペプチドの模式図である。図7はもう一つの四量体型プレクチン-1四量体型ペプチド（tetrameric plectin-1 tetrameric peptide）である。
【０３６０】
tPTPのインビボ特徴づけ
図6は、同所性に置かれたL3.6細胞からの腫瘍を保持する無胸腺ヌードマウスに注射された111IN-tPTPの血中半減期研究の結果を示している（図6A参照）。血液を注射の0、15、30、45、60、および120分後に採取した。tPTPの血中半減期は4.29分だった。SPECT/CTイメージング後（図4も参照されたい）に動物（n＝5）を屠殺し、臓器を収穫し、ガンマカウント数を評価した。膵臓は3％注射量/グラムを示し、腹膜腔に見いだされた転移は1.5％注射量/グラムを示し、最も高い値は腎臓にあった（図6B参照）。111IN-tPTPの主要排泄経路は尿によるものである。
【０３６１】
単量体型ペプチドと比較した四量体型ペプチドの結合および寿命
四量体型プレクチン-1標的ペプチド4(βAKTLLPTP-GGS(PEG5000))-KKKKDOTAβA-NH2（図8の化学構造参照）は、以前に記述された単量体型ペプチドよりも増加した感度を有することがわかった（すなわち、tPTPにおける600pmolというアフィニティに対して単量体型ペプチドによるアフィニティーは160nmolである）。さらに、β-アラニンおよびPEGが付加されているので、四量体型は単量体型ペプチドよりも良好な寿命および体内分布を有する。なぜなら、PETは毒性を低下させ、β-アラニンは分解を減少させるからである。さらにまた、標識四量体型ペプチド複合体が迅速に（すなわち1〜4時間で）可視化されうるのに対し、既知の単量体型ペプチドは可視化までにはるかに長い時間（すなわち48時間）を要する。
【０３６２】
KTLLPTP（配列番号1）のアミノ酸置換：アラニン突然変異
この研究に使用したペプチドは、Panc27ペプチドとも呼ばれるファージ由来配列KTLLPTP（配列番号1）からなる。7つの位置のそれぞれを個別にアラニンに突然変異させた。アラニン突然変異体ATLLPTP、KALLPTP、KTALPTP、KTLAPTP、KTLLATP、KTLLPAP、およびKTLLPTA（それぞれ配列番号9〜15）を作製し、アフィニティについて調べた。その結果を図9に記載する。アラニンによるスレオニンの置換はアフィニティを低下させたので、このデータは、スレオニンの重要性を示唆しているが、本発明の配列の他の位置のいずれかに1つ以上のスレオニンを付加することが、置換にとって有用である可能性を排除するものではない。同じことがプロリンについてもいえるが、データが示唆するとおり、その程度はスレオニンほどではない。しかし、置換を分析するための主たる基準は、得られた置換体がアフィニティーに対して実質的な効果を有するかどうかである。
【０３６３】
考察
現在のところ、早期PDACの検出を、または前浸潤性PDACの検出でさえ、補助するために利用できるバイオマーカーはない。利用可能なバイオマーカーはいずれも、PDACと良性膵臓疾患（最も注目すべきは慢性膵炎）とを、確実には識別しない。ここに本発明者らは、Plec1が、早期前浸潤性の原発および転移ヒトPDACにおいて特異的に発現される初めての新規バイオマーカーであり、一方、正常導管上皮および慢性膵炎における導管上皮細胞はこのタンパク質を発現しないことを確認した。さらにまた、本発明者らは、食道、胃、および肺におけるがん（転移を含む）を検出するためにPlec1発現を利用しうることを示す。これらの知見に加えて、本発明者らは、インビボ前臨床モデルにおいて、Plec1ターゲティングイメージング剤をPDACの非侵襲的イメージングに使用できることを実証する。これにより、PDACに関するルーチン臨床診断およびスクリーニング手段へのPlec1標的イメージングの組込みを考えることが可能になる。
【０３６４】
Plec1そのものは、プラキンファミリーの典型的サイトリンカー（cytolinker）タンパク質である。プラキン類は、中間径フィラメントをデスモソームおよびヘミデスモソームに結びつけ、細胞を機械的に安定化し、細胞骨格動態を調節し、シグナリング分子にとっての足場プラットフォーム（scaffolding platform）として役立つ。さらにまた、プラキン類は、皮膚および骨格筋の完全性にとって不可欠である[18]。その結果として、Plec1遺伝子突然変異は、表皮水泡症などの皮膚疾患に最初に見いだされた[19，20]。最近になってPlec1は乳がん感受性遺伝子2（BRCA2）と相互作用することがわかった[21]。BRCA2突然変異は膵がんリスクの増加と関連する[22，23]。BRCA2そのものは、DNA損傷修復に重要な役割を果たし、主として細胞核内に見いだされるが、中心体にも同定されている。Plec1/BRCA2相互作用は、中心体局在の調節において重要な役割を果たす。それゆえに、Plec1の誤発現（misexpression）は、中心体の移動（displacement）につながり、ゲノム不安定性およびがん発生をもたらしうる[21]。
【０３６５】
PDACは、PanIN IおよびII病変のPanIN III（上皮内癌）への進行および最終的には浸潤癌への進行を経由して生じると考えられる[2，3，4]。この研究で得られたデータによれば、Plec1過剰発現はPanIN IからPanIN IIへの遷移中に獲得される。PanIN Iがごく一部（21％）しかPlec1を発現しなかったのに対し、PanIN IIの半分（54％）および大半のPanIN III（87％）がPlec1陽性だった。このように、Plec1過剰発現は、PanIN Iのステージにおいて、PanIN IIへの組織学的進行前でさえ始まり、病変がPDACへと進行するにつれてさらに増加するようである。興味深いことに、病変が進行するにつれて、Plec1は細胞膜に保持されるのではなく、がん細胞中で遍在的に発現するようになる。Plec1は早期PanIN IおよびII病変では細胞膜上にのみ位置するが、PanIN IIIの27％と31例のPDACの全てが、膜および細胞質でのPlec1発現を示す。このように、Plec1発現は、がんに進行することが運命づけられた早期PanIN病変を潜在的に同定する。これはとりわけ重要である。というのも、PDACはその臨床経過において早期に転移するからである。それゆえに、Plec1は、発癌過程の早期に存在しかつその発現が浸潤癌において保持される、初めてのPDACのバイオマーカーである。これは、前浸潤性PDAC病変を、それらが転移する前に早期検出するために、バイオマーカーを使用することを、潜在的に初めて可能にするものである。Plec1に基づくPDACのスクリーニングおよび診断は、現在利用できる診断ツールの短所の多くを克服する潜在能力を有している。感度と特異性を欠くCA19-9とは異なり[5]、これはPDACの高感度かつ特異的なバイオマーカーである。Plec1に基づく腹部断層イメージングは、原理的に（in principal）、初期PDAC（とりわけ高リスク患者におけるもの）を確実に検出することができるだろう。さらに、Plec1過剰発現は、潜在的に、現時点では同定できない小さな転移巣を際立たせ、それによって、術前の病期分類を改善するために利用することができる。さらにまた、Plec1に基づく腹部断層イメージングは、慢性膵炎とPDACとを安全に弁別するはずである。
【０３６６】
総合すると、これらのデータは、Plec1が、原発および転移ヒトPDACならびに早期前浸潤がんの高感度で特異的なバイオマーカーであることを示唆している。Plec1標的イメージングは診断ルーチンに容易に組み入れることができ、PDACの検出に関する診断制度を、とりわけ転移の発生前にその初期において、改善するのに実質的に寄与すると期待できる。
【０３６７】
本明細書において言及した特許、特許出願および刊行物はいずれも、引用によりそのまま本明細書に組み込まれる。
【０３６８】
参考までに、また一定の項を見つけ出す助けになるように、本明細書には、見出しを記載している。これらの見出しは、その見出しの下に記載されている概念の範囲を限定しようとするものではなく、それらの概念は明細書全体を通して他の項にも適用される。
【０３６９】
本発明を具体的実施形態に関して開示したが、他の当業者が本発明の真の主旨および範囲から逸脱することなく本発明の他の実施形態および変形を考案しうることは、明白である。
【０３７０】
［参考文献］
1．Jemal A, Siegel R, Ward E, Murray T, Xu J, et al. (2007) Cancer statistics, 2007. CA Cancer J Clin 57: 43-66.
2．Hruban RH, Goggins M, Parsons J, Kern SE (2000) Progression model for pancreatic cancer. Clin Cancer Res 6: 2969-2972.
3．Maitra A, Fukushima N, Takaori K, Hruban RH (2005) Precursors to invasive pancreatic cancer. Adv Anat Pathol 12: 81-91.
4．Hruban RH, Takaori K, Klimstra DS, Adsay NV, Albores-Saavedra J, et al. (2004) An illustrated consensus on the classification of pancreatic intraepithelial neoplasia and intraductal papillary mucinous neoplasms. Am J Surg Pathol 28: 977-987.
5．Goggins M (2007) Identifying molecular markers for the early detection of pancreatic neoplasia. Semin Oncol 34: 303-310.
6．Ahmad NA, Kochman ML, Brensinger C, Brugge WR, Faigel DO, et al. (2003) Interobserver agreement among endosonographers for the diagnosis of neoplastic versus non-neoplastic pancreatic cystic lesions. Gastrointest Endosc 58: 59-64.
7．Meining A, Rosch T, Wolf A, Lorenz R, Allescher HD, et al. (2003) High interobserver variability in endosonographic staging of upper gastrointestinal cancers. Z Gastroenterol 41: 391-394.
8．Krishna NB, Mehra M, Reddy AV, Agarwal B (2009) EUS/EUS-FNA for suspected pancreatic cancer: influence of chronic pancreatitis and clinical presentation with or without obstructive jaundice on performance characteristics. Gastrointest Endosc 70: 70-79.
9．Varadarajulu S, Tamhane A, Eloubeidi MA (2005) Yield of EUS-guided FNA of pancreatic masses in the presence or the absence of chronic pancreatitis. Gastrointest Endosc 62: 728-736; quiz 751, 753.
10．Chari ST (2007) Detecting early pancreatic cancer: problems and prospects. Semin Oncol 34: 284-294.
11．Pelaez-Luna M, Takahashi N, Fletcher JG, Chari ST (2007) Resectability of presymptomatic pancreatic cancer and its relationship to onset of diabetes: a retrospective review of CT scans and fasting glucose values prior to diagnosis. Am J Gastroenterol 102: 2157-2163.
12．Fernandez-del Castillo C, Rattner DW, Warshaw AL (1995) Further experience with laparoscopy and peritoneal cytology in the staging of pancreatic cancer. Br J Surg 82: 1127-1129.
13．John TG, Greig JD, Carter DC, Garden OJ (1995) Carcinoma of the pancreatic head and periampullary region. Tumor staging with laparoscopy and laparoscopic ultrasonography. Ann Surg 221: 156-164.
14．Boll DT, Merkle EM (2003) Differentiating a chronic hyperplastic mass from pancreatic cancer: a challenge remaining in multidetector CT of the pancreas. Eur Radiol 13 Suppl 5: M42-49.
15．Oto A, Eltorky MA, Dave A, Ernst RD, Chen K, et al. (2006) Mimicks of pancreatic malignancy in patients with chronic pancreatitis: correlation of computed tomography imaging features with histopathologic findings. Curr Probl Diagn Radiol 35: 199-205.
16．Furukawa H, Okada S, Saisho H, Ariyama J, Karasawa E, et al. (1996) Clinicopathologic features of small pancreatic adenocarcinoma. A collective study. Cancer 78: 986-990.
17．Kelly KA, Bardeesy N, Anbazhagan R, Gurumurthy S, Berger J, et al. (2008) Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma. PLoS Med 5: e85.
18．Sonnenberg A, Liem RK (2007) Plakins in development and disease. Exp Cell Res 313: 2189-2203.
19．Pfendner E, Uitto J (2005) Plectin gene mutations can cause epidermolysis bullosa with pyloric atresia. J Invest Dermatol 124: 111-115.
20．Pulkkinen L, Smith FJ, Shimizu H, Murata S, Yaoita H, et al. (1996) Homozygous deletion mutations in the plectin gene (PLEC1) in patients with epidermolysis bullosa simplex associated with late-onset muscular dystrophy. Hum Mol Genet 5: 1539-1546.
21．Niwa T, Saito H, Imajoh-Ohmi S, Kaminishi M, Seto Y, et al. (2009) BRCA2 interacts with the cytoskeletal linker protein plectin to form a complex controlling centrosome localization. Cancer Sci.
22．Bausch et al., 2009, J. Gastrointest. Surg., 13:1948.
23．Harris, 2009, J. Clin. Oncology, 27, No. 15S (May 20 Supplement): e22118.
24．Lee, 2004, J. Med., 35:(1-6):141-149.
25．国際特許出願公開WO 2009/129220, Kelly, et al., 2009年10月22日公開.
26．Karlin and Altschul (1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268.
27．Karlin and Altschul (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877.
28．Altschul, et al. (1990, J. Mol. Biol. 215:403-410.
29．Altschul et al. (1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.
30．Gross and Mienhofer, eds., The Peptides, vol. 3, pp. 3-88 (Academic Press, New York, 1981.
31．Gerhardt et al., eds., 1994, Methods for General and Molecular Bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, DC, p. 574.
32．Devereux et al., 1984 Nucl. Acids Res. 12:387.
33．Altschul et al., 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990 87:14:5509-13.
34．Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990 215:3:403-10; Altschul et al., 1997 Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.
35．Li, 2007, J. Nuc. Med., 48:7:1162-1171「64Cu-labeled tetrameric and octameric RGD peptides for small-animal PET of tumor αvβ3 integrin expression」.
36．Choe and Lee, 2007, Current Pharmaceutical Design, 13:17-31に総説.
37．Chen et al., 2004, Mol. Imaging Biol. 6:350-9「MicroPET imaging of breast cancer alphav-integrin expression with 64Cu-labeled dimeric RGD peptides」.
38．Janssen, 2002, Cancer Biother. Radiophamr., 17:641-6「Comparison of monomeric and dimeric radiolabeled RGD-peptide for tumor targeting」.
39．Poethko, 2004, J. Nucl. Med. 45:892-902.
40．Chen, 2004, Bioconjugate Chem., 15:41-9.
41．Chen, 2004, Nucl. Med. Biol., 31:11-19「Pharmacokinetics and tumor retention of 125I-labeled RGD peptide are improved by PEGylation」.
42．Li et al., 2009, Mol. Cancer Ther., 8:5:1239-1249.
43．米国特許第7,666,979号（米国特許出願第10/661,032号から発行）, Fan, et al.「Methods for Preparing Multivalent Constructs for Therapeutic and Diagnostic Applications and Methods of Preparing the Same」2010年2月23日
44．米国特許出願第12/012,011号（米国特許出願第10/792,582号の継続出願）
45．Nahrendorf, 2010, JACC: Cardiovascular Imaging, 2:10:1213-1222.
46．Krajewski et al., 2005「Effect of Dimerization and Tetramerization on the Potency of HIV-Integrase Inhibitory Peptides」、S. Blondelle編「Understanding Biology Using Peptides」（American Peptide Society）の411〜412頁.
47．Yim et al., 2010, J. Med. Chem., 53:3944-3953.
48．Dijkgraaf et al., 2010, Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 2010年9月21日オンライン発行.
49． 米国特許出願第10/792,582号；Dransfield et al., 米国特許公開番号US2010/0261875；米国特許第7,666,979号).
50．Sosabowski et al., Nature Protocols 1, -972-976 (2006)およびLeon-Rodriguez et al., Bioconjugate chemistry, 01/03/2008; 19(2):391-402）参照。
51．米国特許出願第12/112,289号
52．Kyte & Doolittle, 1982, J. Mol. Biol., 157:105-132.
53．Chou & Fasman, 1974, Biochemistry, 13:222-245;
54．1978, Ann. Rev. Biochem., 47: 251-276; 1979, Biophys. J., 26:367-384).
55．PROWLロックフェラー大学ウェブサイト
56．Stewart et al.  in Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, 1984, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois.
57． Bodanszky and Bodanszky in The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag, New York.
58．Deutscher et al. (ed., 1990, Guide to Protein Purification, Harcourt Brace Jovanovich, San Diego).
60．Gait, 1985, OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS: A PRACTICAL APPROACH (IRL Press, Oxford, England.
61．Kohler and Milstein (1975, Nature 256:495-497.
62．Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72).
63．Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96.
64．Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030.
65．Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851-6855;
66．Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608;
67．Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454.
68．米国特許第4,946,778号
69．Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281.
70．Harlow et al. (1988, In: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY.
71．Tuszynski et al. (1988, Blood, 72:109-115).
72．Wright et al. (1992, Critical Rev. in Immunol. 12(3,4):125-168.
73．Gu et al. (1997, Thrombosis and Hematocyst 77(4):755-759.
74．Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY).
75．Burton et al., 1994, Adv. Immunol. 57:191-280.
76．Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581-597.
77．Barbas, 1995, Nature Medicine 1:837-839; de Kruif et al. 1995, J. Mol. Biol.248:97-105.
78． Klug et al., Mol. Biol. Reports 20:97-107 (1994).
79．Wallis et al., Chem. Biol. 2:543-552 (1995).
80．Ellington, Curr. Biol. 4:427-429 (1994); Lato et al., Chem. Biol. 2:291-303 (1995).
81．Conrad et al., Mol. Div. 1:69-78 (1995).
82．Uphoff et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 6:281-287 (1996).
83．Fields and Song, Nature (London), 340:245-246 (1989).
84．Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991).
85．Chevray and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991).
86．Watt, 2006, Nature Biotechnology, 24:177;
87．Watt, 米国特許第6,994,982号；
88．Watt, 米国特許出願公開第2005/0287580号；
89．Watt, 米国特許第6,510,495号
90．米国特許第5,789,543号
91．米国特許第6,207,718号
92．Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing, Easton, Pa., 1980).
93．Genaro, ed., 1985, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA.
94．Burrows, et al.「Peptide-MHC Class I Tetrameric Complexes Display Exquisite Ligand Specificity」J of Immunology, 2000; 6229-6234.
95．Chakraborty, et al.「Evaluation of 111In-Labeled Cyclic RGD Peptides: Tetrameric not Tetravalent」Biconjugate Chem., 2010, 21, 969-978.
96．Ponticelli, et al.「Modulation of Angiogenesis by a Tetrameric Tripeptide That Antagonizes Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 1」J of Biological Chemistry, 2008, Vol. 283, No. 49, 34250-34259.
97．Choe, et al.「Targeted In Vivo of Angiogenesis: Present Status and Perspectives」Current Pharmaceutical Design, 2007, 13, 17-31.
98．Chang, et al.「Tetrameric Cytokines with Improved Biological Activity」July 29, 2010.
【図５】
2013510094.tif 000010
【図６】
2013510094.tif 000011
【図７】
2013510094.tif 000012
【図８】
2013510094.tif 000013
【図９】
2013510094.tif 000014
【図１−１】
2013510094.tif 000015
【図１−２】
2013510094.tif 000016
【図１−３】
2013510094.tif 000017
【図１−４】
2013510094.tif 000018
【図２】
2013510094.tif 000019
【図３−１】
2013510094.tif 000020
【図３−２】
2013510094.tif 000021
【図４】
2013510094.tif 000022
【配列表】
2013510094000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年6月26日(2012.6.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2013510094000001.app
【国際調査報告】
2013510094.tif 000023
2013510094.tif 000024
2013510094.tif 000025
2013510094.tif 000026