(57)【要約】本発明は、従来の方法と比べて誘導効率が高い誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞生成方法を提供する。その方法は、体細胞を、その細胞中でマイクロＲＮＡレベルまたは活性を変更する作用物質および／またはｐ２１阻害剤と組み合わせて核初期化因子により処理することを含む。本発明はさらに、そのような方法により生成されたｉＰＳ細胞、ならびにそのようなｉＰＳ細胞の臨床使用および研究使用を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞を生成する方法であって、
ａ）体細胞を核初期化因子と接触させること；および
ｂ）（ａ）の細胞を、該細胞内でＲＮＡレベルまたは活性を変更するマイクロＲＮＡと接触させ、それによってｉＰＳ細胞を生成すること
を含む、前記生成する方法。
【請求項２】
前記マイクロＲＮＡまたはＲＮＡが修飾される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マイクロＲＮＡがベクター中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ  ｌｅｔ−７ファミリーメンバーまたはｍｉＲ−３０２ｂクラスター中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２９ａ、またはそれらの組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記マイクロＲＮＡが、配列番号１を含むポリヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の方法
【請求項７】
前記マイクロＲＮＡが、配列番号２〜１１からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記マイクロＲＮＡが、ｐ２１、Ｔｇｆｂｒ２、ｐ５３、Ａｇｏ２、またはそれらの組合せの発現または活性を調節する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記マイクロＲＮＡが、Ｓｐｒｙ  １／２、ｐ８５、ＣＤＣ４２またはＥＲＫ１／２の経路を調節する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記核初期化因子が、ベクター中に含まれる遺伝子によりコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記核初期化因子が、ＳＯＸファミリー遺伝子、ＫＬＦファミリー遺伝子、ＭＹＣファミリー遺伝子、ＳＡＬＬ４、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、またはそれらの組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記核初期化因子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ−ＭＹＣの１種以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記核初期化因子がｃ−Ｍｙｃを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記マイクロＲＮＡとの接触前に、接触と同時に、または接触後に、前記体細胞に前記初期化因子を接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記体細胞が哺乳類細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法を用いて生産された誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法により生産された誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞の濃縮された集団。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法により生産された多能性幹細胞の分化を誘導することにより得られた分化した細胞。
【請求項１９】
対象を治療する方法であって、
ａ）請求項１に記載の方法により対象の体細胞から誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞を生成すること；
ｂ）工程（ａ）のｉＰＳ細胞の分化を誘導すること；および
ｃ）（ｂ）の細胞を該対象に導入し、それによって症状を治療すること
を含む、前記治療する方法。
【請求項２０】
ｉＰＳ細胞の生成効率を高めるためのマイクロＲＮＡの使用。
【請求項２１】
前記マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−３０２ｂクラスター、ｍｉＲ  ｌｅｔ−７ファミリーメンバー、またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−３０２ｂクラスター、ｍｉＲ  ｌｅｔ−７ファミリーメンバー、またはそれらの組合せの少なくとも２種以上からなる群から選択されるｍｉＲ配列の組合せ。
【請求項２３】
誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞を生成する方法であって、
ａ）体細胞を核初期化因子と接触させること；および
ｂ）（ａ）の細胞を、マイクロＲＮＡの阻害剤と接触させ、それによってｉＰＳ細胞を生成すること
を含む方法。
【請求項２４】
前記マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ  ｌｅｔ−７ファミリーメンバー、またはｍｉＲ−３０２ｂクラスター中に存在する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２９ａ、またはそれらの組合せである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記マイクロＲＮＡが、配列番号１に示されるポリヌクレオチド配列を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記マイクロＲＮＡが、配列番号２〜１１からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記マイクロＲＮＡが、ｐ２１、Ｔｇｆｂｒ２、ｐ５３、Ａｇｏ２、またはそれらの組合せの発現または活性を調節する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記マイクロＲＮＡが、Ｓｐｒｙ  １／２、ｐ８５、ＣＤＣ４２、またはＥＲＫ１／２の経路を調節する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記核初期化因子が、ベクター中に含まれる遺伝子によりコードされる、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
前記核初期化因子が、ＳＯＸファミリー遺伝子、ＫＬＦファミリー遺伝子、ＭＹＣファミリー遺伝子、ＳＡＬＬ４、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、またはそれらの組合せである、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記核初期化因子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ−ＭＹＣの１種以上である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
初期化効率が、前記マイクロＲＮＡ阻害剤を使用しない対照と比べて少なくとも２倍である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
前記体細胞が繊維芽細胞を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３５】
前記マイクロＲＮＡ阻害剤との接触前に、接触と同時に、または接触後に、前記体細胞に前記初期化因子を接触させる、請求項２３に記載の方法。
【請求項３６】
前記体細胞が哺乳類細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３７】
請求項２３に記載の方法を用いて生産された誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞。
【請求項３８】
請求項２３に記載の方法により生産された誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞の濃縮された集団。
【請求項３９】
請求項３８に記載の多能性幹細胞の分化を誘導することにより得られた分化した細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞の分野に関し、より具体的には、そのような細胞を体細胞から生成する方法、ならびにそのような方法により生成されたｉＰＳ細胞の臨床使用および研究使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、胚性幹（ＥＳ）細胞の特性を示し、当初はマウス体細胞における４種の核初期化因子（４Ｆ）：Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃＭｙｃの異所発現により生成された。ヒト細胞では、最初の４種の山中因子の他にも、４種の因子の別のセット、例えば、Ｏｃｔ４  Ｎａｎｏｇ  Ｌｉｎ２８およびＳｏｘ２を用いてｉＰＳＣを生成することもできる。異なる組織由来の多くの細胞種が初期化可能であると確認されているが、典型的に０．０１％〜０．２％という低初期化効率がｉＰＳＣ誘導およびさらなる治療的使用のための主要な障害である。初期化効率を高める小分子についてのスクリーニングだけでなく、ｉＰＳＣ誘導の新しい方法の開発にも多大な努力が注ぎ込まれてきたが、初代繊維芽細胞がＥＳ様状態に初期化される機構はまだ大部分が不明である。
【０００３】
細胞初期化の機構を理解するために、種々のアプローチが用いられてきた。小分子に基づく方法では、Ｄｎｍｔ１阻害剤で細胞を処理することによって、初期化プロセスを加速させることができることが確認された。またＴＧＦβ阻害もより速く、かつ、より効率的なｉＰＳＣ誘導を可能にすることが見出された。これはＳｏｘ２およびｃＭｙｃに取って代わることができる。さらにまたアレイ解析では、部分的に初期化されたｉＰＳＣは、メチルトランスフェラーゼ阻害剤などの因子での処理が行われるとさらに完全に初期化され得ることが示された。４種の初期化因子によるプロモーター結合および発現誘導の網羅的ゲノム解析では、これらの因子はｉＰＳＣおよびｍＥＳ細胞において類似した標的を有し、おそらく類似した遺伝子セットを調節するであろうこと、さらに、部分的ｉＰＳＣでは初期化因子のターゲッティングが変更されることも証明されている。
【０００４】
ごく最近では、いくつかのグループによってｐ５３媒介腫瘍抑制経路がｉＰＳＣ誘導に拮抗し得ることが確認された。ｐ５３およびその下流のエフェクターｐ２１の両方は初期化プロセス中に誘導され、両タンパク質の発現低下によってｉＰＳＣコロニー形成が促進され得る。これらのタンパク質は４種の初期化因子（４Ｆ）を発現する大部分の細胞においてアップレギュレートされ、ｃＭｙｃはｐ２１発現を遮断すると報告されているが、これらの４種の因子（４Ｆ）の異所発現が癌遺伝子／導入遺伝子過剰発現に対する細胞応答をいかにして克服し、なぜ細胞のごく一部の集団だけが完全に初期化されるかについては依然として不明である。
【０００５】
マイクロＲＮＡ(MicoRNA)は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれるタンパク質複合体と関係がある１８〜２４ヌクレオチドの一本鎖低分子ＲＮＡである。これらの低分子ＲＮＡは、通常遺伝子転写物の非コード領域から生成され、翻訳抑制により遺伝子発現を抑制する働きをする。近年、マイクロＲＮＡは多くの異なる重要なプロセス（多数ある中で、ヒトＥＳ細胞の自己複製遺伝子発現、胚性幹（ＥＳ）細胞の細胞周期制御、選択的スプライシング、心臓発生など）への関与が見出された。さらに、ＥＳ細胞特異的マイクロＲＮＡは、マウスｉＰＳＣ誘導を増強し、初期化中にｃＭｙｃの機能に取って代わることができることが最近報告された。またｈＥＳ特異的ｍｉＲ−３０２は、ヒト繊維芽細胞における４種の因子の発現により老化応答軽減することも示唆されている。しかしながら、これらのマイクロＲＮＡは初期化プロセスの極めて終わりに近い段階まで発現されないため、マイクロＲＮＡがｉＰＳＣ誘導において重要な役割を果たすかどうかはこれまで分かっていなかった。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、ｉＰＳＣ誘導中にマイクロＲＮＡが必要とされるという重大な発見に基づくものである。マイクロＲＮＡ生合成機構へ干渉により初期化効率の著しい低下がもたらされる。初期化の初期段階中に高度に誘導されるマイクロＲＮＡクラスターが確認され、機能試験では、そのようなマイクロＲＮＡを体細胞に導入することにより誘導効率が高まることが示されている。加えて、細胞の初期化に使用される重要なレギュレーターも確認されたが、それらのレギュレーターを標的として、初期化効率ならびにｉＰＳ細胞の直接分化を著しく増加させ得ることが有利である。
【０００７】
よって、一実施形態では、本発明は、ｉＰＳ細胞を生成する方法を提供する。その方法は、体細胞を核初期化因子と接触させること、およびその細胞を、その細胞でＲＮＡレベルまたは活性を変更するマイクロＲＮＡと接触させ、それによってｉＰＳ細胞を生成することを含む。一態様では、マイクロＲＮＡまたはＲＮＡが修飾される。別の態様では、マイクロＲＮＡはベクター中に存在する。別の態様では、マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ  ｌｅｔ−７ファミリーメンバー（例えば、ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ  ９８）またはｍｉＲ−３０２ｂクラスター中に存在する。別の態様では、マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２９ａ、またはそれらの組合せである。
【０００８】
一態様では、マイクロＲＮＡは、配列番号１を含むポリヌクレオチド配列を有する。別の態様では、マイクロＲＮＡは、配列番号２〜１１からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を有する。別の態様では、マイクロＲＮＡは、ｐ２１、Ｔｇｆｂｒ２、ｐ５３、またはそれらの組合せの発現または活性を調節する。別の態様では、マイクロＲＮＡは、Ｓｐｒｙ  １／２、ｐ８５、ＣＤＣ４２またはＥＲＫ１／２の経路を調節する。
【０００９】
一態様では、核初期化因子は、ベクター中に含まれる遺伝子によりコードされる。別の態様では、核初期化因子は、ＳＯＸファミリー遺伝子、ＫＬＦファミリー遺伝子、ＭＹＣファミリー遺伝子、ＳＡＬＬ４、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、またはそれらの組合せである。別の態様では、核初期化因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ−ＭＹＣの１種以上である。別の態様では、核初期化因子はｃ−Ｍｙｃを含む。別の態様では、誘導効率は、マイクロＲＮＡを使用しない場合と比べて少なくとも２倍となる。
【００１０】
一態様では、マイクロＲＮＡとの接触前に、接触と同時にまたは接触後に、体細胞に初期化因子を接触させる。別の態様では、体細胞は哺乳類細胞である。さらなる態様では、体細胞はヒト細胞またはマウス細胞である。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、体細胞を核初期化因子と、ｐ２１発現または活性の阻害剤とに接触させることによりｉＰＳ細胞を生成する方法を提供する。
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、体細胞を、その細胞内でＲＮＡレベルまたは活性を変更する作用物質と接触させ（ここで、該作用物質は該体細胞中で多能性を誘導し、ただし、該作用物質は核初期化因子ではない）、それによってｉＰＳ細胞を生成することにより誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞を生成する方法を提供する。様々な実施形態では、ＲＮＡは非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）であり、マイクロＲＮＡが含まれる。
【００１３】
上に記載した方法の一態様では、作用物質はポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは小分子である。さらなる態様では、ポリヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチド、化学修飾されたオリゴヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはＤＮＡである。別の態様では、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。さらなる態様では、ＲＮＡは、マイクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡまたはｓｈＲＮＡからなる群から選択される。別の態様では、体細胞はマウス胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ）である。
【００１４】
様々な態様では、ＲＮＡを変更する作用物質は、ｐ２１、Ｔｇｆｂｒ２、ｐ５３、またはそれらの組合せを、発現または活性について阻害することができる。一態様では、作用物質はポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは小分子であってよい。別の態様では、作用物質またはｐ２１、Ｔｇｆｂｒ２および／またはｐ５３の阻害剤はＲＮＡ分子であり、マイクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。例示的態様では、作用物質またはｐ２１、Ｔｇｆｂｒ２および／またはｐ５３の阻害剤は、マイクロＲＮＡ分子であり、前記細胞に導入された組換えベクター中に含まれるポリヌクレオチドによりコードされる。
【００１５】
様々な態様では、マイクロＲＮＡは、ｉＰＳＣの誘導またはその分化中に活性または発現の増加または減少を示すクラスター中に含まれるマイクロＲＮＡであってよい。一態様では、誘導効率は、作用物質を使用しない場合と比べて少なくとも２倍となる。別の態様では、誘導効率は、作用物質を使用しない場合と比べて少なくとも３倍である。別の態様では、誘導効率は、作用物質を使用しない場合と比べて少なくとも５倍である。一態様では、マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−１０６ａまたはｍｉＲ−３０２ｂクラスター中の１種以上のマイクロＲＮＡであってよく、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−ｌｅｔ−７ファミリーメンバー（例えば、ｌｅｔ−７ａ；ｍｉＲ  ９８）またはそれらの組合せが含まれる。関連態様では、マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−１０６ａおよびｍｉＲ−３０２ｂクラスター中のマイクロＲＮＡ種に対応する様々なマイクロＲＮＡ（例えば、配列番号２〜１１のもの）の間で保存されると判明している、配列番号１を含むポリヌクレオチド配列を有する。一態様では、マイクロＲＮＡは、配列番号２〜１１からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を有する。
【００１６】
様々な態様では、核初期化因子は、前記細胞に導入された組換えベクター中に含まれる遺伝子によりコードされる。別の態様では、作用物質は、ｐ２１、Ｔｇｆｂｒ２、ｐ５３、またはそれらの組合せの発現または活性を阻害する。別の態様では、作用物質は、Ｓｐｒｙ  １／２、ｐ８５、ＣＤＣ４２またはＥＲＫ１／２の経路を調節する。
【００１７】
様々な態様では、核初期化因子は、ＳＯＸファミリー遺伝子、ＫＬＦファミリー遺伝子、ＭＹＣファミリー遺伝子、ＳＡＬＬ４、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、またはそれらの組合せの１種以上によりコードされる。例示的態様では、核初期化因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ−ＭＹＣの１種以上である。別の態様では、少なくとも１種の核初期化因子がｃ−Ｍｙｃを含む。さらなる態様では、ｃ−Ｍｙｃは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡを抑制することにより初期化を少なくともある程度まで促進する。
【００１８】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載した方法を用いて生産されたｉＰＳ細胞またはそのような細胞の集団を提供する。別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載した方法により生産された誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞の濃縮された集団を提供する。
【００１９】
同様に、別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載した方法を用いて生成されたｉＰＳＣの分化を誘導することにより得られた分化した細胞を提供する。一態様では、体細胞はｉＰＳＣをＲＮＡ分子またはアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させることによって分化を誘導することにより得られる。一態様では、ＲＮＡ分子は、マイクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡまたはｓｈＲＮＡからなる群から選択される。
【００２０】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載した方法を用いて生成されたｉＰＳ細胞を用いて対象を治療する方法を提供する。その方法は、本明細書に記載した方法を用いて対象の体細胞を誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞に誘導すること、そのｉＰＳ細胞の分化を誘導すること、およびその分化した細胞をその対象に導入し、それによってその症状を治療することを含む。
【００２１】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載した方法により生成されたｉＰＳ細胞またはそれから得られた体細胞を用いて作用物質の生理学的機能を評価するための方法を提供する。一態様では、その方法は、本明細書に記載した方法を用いて生産された誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞を処理することおよびその作用物質による少なくとも１つの細胞機能の変化を評価することを含む。別の態様では、その方法は、本明細書に記載した多能性幹細胞の分化を誘導することにより得られた分化した細胞を作用物質により処理することおよびその作用物質による細胞機能の変化を評価することを含む。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載した方法により生成されたｉＰＳ細胞またはそれから得られた体細胞を用いて化合物の毒性を評価する方法を提供する。一態様では、その方法は、本明細書に記載した方法を用いて生産された誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞を化合物により処理することおよびその化合物の毒性を評価することを含む。別の態様では、その方法は、本明細書に記載した多能性幹細胞の分化を誘導することにより得られた分化した細胞を化合物により処理することおよびその化合物の毒性を評価することを含む。
【００２３】
別の実施形態では、本発明は、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞を生成する方法を提供する。その方法は、体細胞を少なくとも１種の核初期化因子と接触させること；およびその細胞をｐ２１、Ｔｇｆｂｒ２、ｐ５３、またはそれらの組合せの発現または活性についての阻害剤と接触させることを含む。一態様では、阻害剤はｐ２１の発現および／または活性を阻害する。別の態様では、阻害剤はＴｇｆｂｒ２の発現および／または活性を阻害する。別の態様では、阻害剤はｐ５３の発現および／または活性を阻害する。
【００２４】
別の実施形態では、本発明は、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞を生成する方法を提供する。その方法は、体細胞を、その細胞内でＲＮＡレベルまたは活性を変更する作用物質と接触させ（ここで、該作用物質は該体細胞中で多能性を誘導し、ただし、該作用物質は核初期化因子ではない）、それによってｉＰＳ細胞を生成することを含む。
【００２５】
別の実施形態では、本発明は、対象を治療する方法を提供する。その方法は、本明細書に記載した方法により対象の体細胞から誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞を生成すること；そのｉＰＳ細胞の分化を誘導すること；およびその細胞をその対象に導入し、それによってその症状を治療することを含む。
【００２６】
別の実施形態では、本発明は、ｉＰＳ細胞の生成効率を高めるためのマイクロＲＮＡの使用を提供する。一態様では、マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−３０２ｂクラスター、またはそれらの組合せからなる群から選択される。別の態様では、マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−１０６ａまたはｍｉＲ−３０２ｂクラスター中に存在する。別の態様では、マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２９ａ、またはそれらの組合せである。
【００２７】
別の実施形態では、本発明は、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−３０２ｂクラスター、ｍｉＲ  ｌｅｔ−７ファミリーメンバーまたはそれらの組合せからなる群から選択されるｍｉＲ配列の組合せを提供する。別の態様では、マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−１０６ａまたはｍｉＲ−３０２ｂクラスター中に存在する。別の態様では、マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２９ａ、またはそれらの組合せである。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】マウスｉＰＳＣ誘導へのＲＮＡｉ機構の関与を示す図である。図１ａ、図１ｂおよび図１ｃは、それぞれ、ｓｈＲＮＡによるマウスＲＮＡｉ機構遺伝子Ａｇｏ２、ＤｒｏｓｈａおよびＤｉｃｅｒのノックダウンを示している。標的遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルの両方をＲＴ−ｑＰＣＲにより解析し、ヒストグラムおよび対応するウエスタンブロットに示している。初代マウス胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ）に、４種の因子を、Ｄｒｏｓｈａ、ＤｉｃｅｒおよびＡｇｏ２をターゲッティングするｓｈＲＮＡとともに形質導入する。ＭＥＦにレンチウイルスｓｈＲＮＡを４μｇ／μｌのポリブレンとともに形質導入し、形質導入後３日目にトータルＲＮＡまたはタンパク質を採取する。標的遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルを、それぞれ、ＲＴ−ｑＰＣＲおよびウエスタンブロッティングにより解析する。ｐＬＫＯは、ｓｈＲＮＡレンチウイルスベクターに対する空ベクター対照である。ｐＧＩＰＺは、ターゲッティングしないｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターである。図１ｄは、Ａｇｏ２のノックダウンによりＯＳＫによるｉＰＳＣ誘導が減少するということを示している。形質導入後２１日目にコロニーを染色し、ＡＰについて定量する。エラーバーは、２反復のウェルの標準偏差を表す。図１ｅは、ｓｈＡｇｏ２に関するｉＰＳＣのＧＦＰ＋コロニーの定量を示している。形質導入後２１日目にＧＦＰ＋コロニーを定量する。エラーバーは、２反復のウェルの標準偏差を表す。図１ｆは、Ａｇｏ２のノックダウンにより４ＦによるｉＰＳＣ誘導が劇的に減少するということを示している。初代ＭＥＦに４種の初期化因子（ＯＳＫＭ（４Ｆ））をｓｈＲＮＡ  Ａｇｏ２とともに形質導入する。形質導入後１４日目にコロニーをアルカリ性ホスファターゼについて染色することができる。アルカリ性ホスファターゼはｍＥＳ／ｉＰＳ細胞のマーカーである。ｐＬＫＯベクターおよびｐＧＩＰＺベクターを陰性対照とした。
【図２】初期化の初期段階中のマイクロＲＮＡクラスターｍｉＲ−１７、２５、１０６ａおよび３０２ｂの誘導を示す図である。図２ａは、４種の因子の形質導入後の、初期段階にある１０種のマイクロＲＮＡクラスターの発現誘導を示すグラフを示している。ｍｉＲ  ＲＴ−ｑＰＣＲを用いて、ＥＳ細胞において高度に発現される１０種のクラスターの代表的なマイクロＲＮＡの発現変化を定量する。感染後４日目に開始時のＭＥＦおよび４Ｆを用いたＭＥＦのトータルＲＮＡを解析する。ヒストグラムの色の濃いバーは感染後４日目のＭＥＦを示し、白色のバーは開始時のＭＥＦを示す。アスタリスクは、誘導されたマイクロＲＮＡを示す。図２ｂは、４Ｆ形質導入後４日目に誘導された異なるｍｉＲクラスターのシード領域比較を示している。類似したシード領域に下線を施している。図２ｃは、マイクロＲＮＡの誘導についてのグラフを示している。代表的なマイクロＲＮＡは４種の因子の種々の組合せを用いて誘導され得る。形質導入後４日後にマイクロＲＮＡ発現を定量する。４Ｆ、ＯＳＫ、ＯＳおよび単一因子を用いて、ｍｉＲ発現の変化にどの因子が関与したかを解析する。
【図３】ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂによるｉＰＳＣの誘導増強を示す図である。図３ａは、初期化アッセイの時系列を示す絵画表現である。マイクロＲＮＡミミックを０日目および５日目に終濃度５０ｎＭでトランスフェクトする。４Ｆ誘導については１１日目に、ＯＳＫ  ３因子のｉＰＳＣ誘導については１５〜２０日目にＧＦＰ＋コロニーを定量する。図３ｂは、ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂミミックが４Ｆ誘導に関するｉＰＳＣ誘導を増強することを示すグラフである。Ｏｃｔ４−ＧＦＰ  ＭＥＦを５０ｎＭの表示マイクロＲＮＡでトランスフェクトする。形質導入後１１日目にＧＦＰ＋コロニーを定量する。誘導倍率およびエラーバーは、３反復のウェルを用いた３つの独立した実験から計算した。図３ｃは、ＯＳＫ系を用いたｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂの増強効果の識別を示すグラフである。４Ｆ実験の場合と同様に、マイクロＲＮＡミミックをトランスフェクトする。１５〜２０日目にＧＦＰ＋コロニーを定量する。エラーバーは、３反復のウェルでの３つの独立した実験の標準偏差を表す。図３ｄは、初期化効率に対するマイクロＲＮＡ阻害の影響を示すグラフである。ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂの阻害剤は初期化効率を劇的に低下させる。マイクロＲＮＡ阻害剤もまた終濃度５０ｎＭでトランスフェクトし、ｍｉＲミミックトランスフェクションと同じ実験時系列を維持する。エラーバーは、３反復のウェルでの３つの独立した実験の標準偏差を表す。
【図４】異なる内因性ＥＳマーカーのＲＴ−ＰＣＲによる発現を解析するｍｉＲミミック実験から得られたｉＰＳＣクローンの特性評価を示す図である。継代後３日目にｉＰＳ細胞株からトータルＲＮＡを単離する。ＥＳ細胞特異的マーカー（Ｅｒａｓ、ＥＣａｔ  Ｉ、Ｎａｎｏｇおよび内因性Ｏｃｔ４など）の発現をＲＴ−ＰＣＲにより解析する。
【図５】ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂによるマウスｐ２１およびＴｇｆｂｒ２のターゲッティングを示す図である。図５ａは、ｍｉＲ−９３および１０６ｂトランスフェクションによりｐ２１タンパク質レベルが減少するということを示している。Ｏｃｔ４−ＧＦＰ  ＭＥＦを、５０ｎＭのｍｉＲミミックでトランスフェクトし、ウエスタン解析のためにトランスフェクションの４８時間後に採取する。ローディング対照としてアクチンを用いる。図５ｂは、ｐ２１がｓｉＲＮＡにより効率的にノックダウンされるということを示している。Ｐ２１  ｓｉＲＮＡトランスフェクトＭＥＦおよび対照トランスフェクトＭＥＦを、４８時間およびＲＴ−ｑＰＣＲの時点で採取し、ウエスタンブロッティングを行って、ｐ２１発現を確認する。ｐ２１  ｍＲＮＡをＧＡＰＤＨに対して正規化する。図５ｃは、ｓｉＲＮＡによるｐ２１のノックダウンによりｉＰＳＣ誘導が増強されるということを示している。ＭＥＦを４Ｆウイルスに感染させ、マイクロＲＮＡミミックトランスフェクションと同じ時系列に従ってｓｉＲＮＡをトランスフェクトする。ＧＦＰ＋コロニーを１１日目に定量する。エラーバーは、３反復のウェルを用いた少なくとも２つの独立した実験を表す。図５ｄは、ｍｉＲ−９３および１０６ｂトランスフェクションによりＴｇｆｂｒ２発現が減少するということを示している。ウエスタンブロッティングのためにトランスフェクト細胞を４８時間の時点で採取する。図５ｅは、ｓｉＲＮＡによりＴｇｆｂｒ２がノックダウンされるということを示している。相対的Ｔｇｆｂｒ２  ｍＲＮＡレベルをＧａｐｄｈのものに対して正規化する。図５ｆは、ｓｉＲＮＡによるＴｇｆｂｒ２のノックダウンによりｉＰＳＣ誘導が増強されるということを示している。エラーバーは、３反復のウェルを用いた少なくとも３つの独立した実験を表す。
【図６】マイクロＲＮＡによる初期化の促進を示す図である。図６ａは、ｍｉＲ−１７およびｍｉＲ−１０６ａにより初期化効率を高めることができるが、ｍｉＲ−１６では初期化効率を高めることができないということを示している。ｍｉＲ−１７およびｍｉＲ−１０６ａミミックをＭＥＦに終濃度５０ｎＭでトランスフェクトする。形質導入後１１日目にＧＦＰ＋コロニーを定量する。エラーバーは、３反復のウェルでの２つの独立した実験を表す。図６ｂは、ｍｉＲ−１７および１０６ａがｐ２１をターゲッティングするということを示している。マイクロＲＮＡミミックのＭＥＦへのトランスフェクションの２日後にｐ２１のウエスタンブロッティングを行う。ｍｉＲ−１７およびｍｉＲ−１０６ａはＴｇｆｂｒ２発現をターゲッティングする。マイクロＲＮＡミミックをＭＥＦに５０ｎＭの終濃度でトランスフェクトする。図６ｃは、ｍｉＲ−１７および１０６ａがＴｇｆｂｒ２をターゲッティングするということを示している。トランスフェクションの２日後にウエスタンブロッティングを行う。図６ｄは、ｉＰＳＣ誘導中のマイクロＲＮＡの役割についてのモデルを示している。初期化の初期段階中に、ｍｉＲ−１７、２５および１０６ａクラスターを含むいくつかのマイクロＲＮＡが誘導される。これらのマイクロＲＮＡは、初期化プロセスに拮抗する因子（ｐ２１および他の未同定タンパク質など）をターゲッティングすることにより完全初期化を促進する。上昇および下降は、初期化プロセス中の種々の潜在的な段階および障壁を表し、破線は、初期化された細胞におけるマイクロＲＮＡ誘導により低下した初期化の障壁を示す。
【図７】マウスｉＰＳＣ誘導におけるｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂの用量応答を示すグラフである。Ｏｃｔ４−ＧＦＰ  ＭＥＦを異なる濃度（５ｎＭ、１５ｎＭおよび５０ｎＭ）のマイクロＲＮＡでトランスフェクトする。ミミック対照ｓｉＲＮＡを対照として用いる。形質導入後１１日目にＧＦＰ＋コロニーを定量する。データは、１２ウェルプレートでの３反復のウェルを表す。
【図８】ｉＰＳＣ誘導中に誘導されたｐ２１発現を示す図である。図８ａは、異なるｐ２１発現系（左から右へ：ＯＳＫＭ、ＯＳＫ、ＯＳ、Ｋｌｆ４、ｃＭｙｃおよびＭＥＦ対照）を用いたウエスタンブロット解析を示している。ｐ２１発現はＫｌｆ４およびｃＭｙｃにより誘導される。ウエスタンブロッティング解析のために形質導入後５日目に４Ｆ、ＯＳＫ、ＯＳ、Ｋｌｆ４およびｃＭｙｃに感染させたＭＥＦを採取する。図８ｂは、感染したＭＥＦにおける異なる導入遺伝子の発現の確認を示すグラフを示している。
【図９】ＯＳＫ  ３因子を用いた初期化のｐ２１過剰発現による阻害を示す図である。図９ａは、ＯＳＫ誘導およびｐ２１過剰発現によるｉＰＳＣのＡＰ＋コロニーの定量のグラフである。２１日目に誘導された細胞をアルカリ性ホスファターゼについて染色する。ｐ２１ウイルスは、ＯＳＫと同時に導入する。図９ｂは、ＯＳＫ誘導およびｐ２１過剰発現によるｉＰＳＣのＧＦＰ＋コロニーの定量のグラフである。
【図１０】ｍｉＲＮＡによるｐ２１発現の直接調節を示す図である。図１０ａは、ｐ２１  ｍＲＮＡ  ３'ＵＴＲに見出される２つの潜在的部位を示す絵画表現である。突然変異を第１の部位（保存部位）に導入して、ｍｉＲ−９３および１０６ｂの結合親和性を破壊する。図１０ｂは、Ｈｅｌａ細胞におけるｐＧＬ３−ｐ２１ルシフェラーゼレポーター発現の定量を示すグラフである。Ｈｅｌａ細胞を、ｐＧＬ３−ｐ２１およびｐＲＬ−ＴＫと、マイクロＲＮＡとで４８時間トランスフェクトした後採取する。結果を、トランスフェクト細胞におけるｐＲＬ−ＴＫレベルに対して正規化する。
【図１１】ｍｉＲＮＡによるＴｇｆｂｒ２発現の直接調節を示す図である。図１１ａは、Ｔｇｆｂｒ２  ｍＲＮＡ  ３'ＵＴＲに見出される２つの潜在的部位を示す絵画表現である。図１１ｂは、ｐ２１実験と同様に実施した、Ｈｅｌａ細胞におけるルシフェラーゼレポーター発現の定量を示すグラフである。結果を、トランスフェクト細胞におけるｐＲＬ−ＴＫレベルに対して正規化する。
【図１２】表示した様々なｍｉＲＮＡの存在下での相対的Ｔｇｆｂｒ２  ｍＲＮＡレベルを示す図である。
【図１３】ｓｈＲＮＡがｓｈＡｇｏ２感染ＭＥＦにおいて活発に発現されることを示す図である。図１３ａはｓｈＡｇｏ２レベルを示し、図１３ｂはｓｈＲＮＡレベルを示している。図１３ｃは、Ａｇｏ２感染ＭＥＦにおけるＥＳ特異的マーカーの発現を示している。
【図１４】ＯＳＫＭ因子の形質導入後０日目、４日目、８日目および１２日目の相対的ｍｉＲＮＡ発現を示す図である。
【図１５】ｍｉＲ−９３の相対的レベルに対するｍｉＲ−９３ミミックの影響を示す図である。
【図１６】図１６ａは、ｍｉＲ阻害剤が標的ｍｉＲ発現を減少させることができるということを示している。図１６ｂは、初期化プロセスの種々の段階中のｍｉＲ阻害剤の影響をさらに示している。
【図１７】ｍｉＲ−９３またはｍｉＲ−１０６ｂが導入されるときの内因性Ｎａｎｏｇ遺伝子座のプロモーターメチル化レベルを示す図である。
【図１８】図１８ａおよび図１８ｂは、ｍｉＲ−９３トランスフェクション後に著しく減少する遺伝子がｉＰＳＣにおいて低度に発現される遺伝子の３倍濃縮を示し得る一方で、ｍｉＲ−９３トランスフェクション後に増加する遺伝子がそのような濃縮を示さないということを示している。
【図１９】図１９ａは、ｍＲＮＡアレイ解析またはＲＴ−ｑＰＣＲ解析のいずれかを用いた、ｍｉＲ−９３の導入後の相対的Ｔｇｆｂｒ２  ｍＲＮＡレベルを示している。図１９ｂは、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９３またはｍｉＲ−１０６ｂの導入後の相対的ｍＲＮＡレベルを示している。
【図２０】ＭＥＦで濃縮されたマイクロＲＮＡ、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａの阻害によりｉＰＳ細胞初期化効率が高まることを示す図である。図２０ａは、ＭＥＦにおいてｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２１およびｌｅｔ７ａが高度に発現されるということを示している。トータルＲＮＡをＯｃｔ４−ＥＧＦＰ  ＭＥＦおよびマウスＥＳ細胞から単離し、ゲル電気泳動により分離する。表示ｍｉＲＮＡに対して特異的な放射性標識プローブを用いて、シグナルを検出する。Ｕ６  ｓｎＲＮＡをローディング対照とする。図２０ｂは、ｍｉＲＮＡ阻害により初期化効率が高まるということを示している。Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰ  ＭＥＦにＯＳＫＭを形質導入する。形質導入後１４日目に蛍光顕微鏡検査法によりＧＦＰ陽性コロニーを確認し、計数する。ＧＦＰ＋コロニー数を、ａｎｔｉ  ｍｉＲターゲッティングしない対照処理の数に対して正規化し、変化倍率として報告する。エラーバーは、３つの独立した実験の標準偏差を表す。＊ｐ値＜０．０５。
【図２１】ｃ−Ｍｙｃが初期化中の、ＭＥＦで濃縮されたｍｉＲＮＡの主要なレプレッサーであることを示す図である。図２１ａは、初期化後５日目の選択ｍｉＲＮＡのノーザン解析を示している。Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰ  ＭＥＦに、表示した、単一因子または様々な初期化因子組合せを形質導入する。１Ｆ、１種の因子；２Ｆ、２種の因子；３Ｆ、３種の因子；ＯＳＫＭ：Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃ。Ｕ６をローディング対照ＲＮＡとして用いる。胚幹細胞（ＥＳ）のトータルＲＮＡを、ＭＥＦおよび形質導入細胞に対する陰性対照とする。様々なプローブを用いて、右側に表示した特定ｍｉＲＮＡを検出する。ｍｉＲ−２９１ブロッティングがＥＳ  ＲＮＡの陽性対照である。  図２１ｂは、様々な初期化因子の存在下でのｍｉＲＮＡ発現の定量的表現を示している。シグナル強度をＵ６  ｓｎＲＮＡの強度に対して正規化する。発現比を、ＭＥＦにおける発現（これを１００％に任意設定する）に対する各ｍｉＲＮＡの発現割合として計算する。（パネルＡの）様々なｍｉＲＮＡを定量し、右側に表示する。  図２１ｃは、ＯＳＫまたはＯＳＫＭによる初期化後の様々な時点におけるＯｃｔ４−ＥＧＦＰ  ＭＥＦにおける選択ｍｉＲＮＡのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析を示している。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析のために形質導入後の表示した日（Ｄ）にＲＮＡを単離する。シグナルをＵ６に対して正規化し、ＭＥＦにおいて発現されたｍｉＲＮＡ（これを１００に任意設定する）に対する割合として示す。エラーバーは、２つの独立した実験の標準偏差を表す。
【図２２】図２２は、ｍｉＲ−２１またはｍｉＲ−２９ａの阻害が、ｐ５３タンパク質レベルを低下させｐ８５αおよびＣＤＣ４２の経路をアップレギュレートすることによりｉＰＳ細胞初期化を促進することを示す図である。図２２ａは、様々なｍｉＲＮＡの阻害後のｐ５３、ＣＤＣ４２およびｐ８５αの発現のウエスタン解析を示している。１×１０５  Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰ  ＭＥＦを表示ｍｉＲＮＡ阻害剤でトランスフェクトする。５日後に細胞を採取し、解析する。図２２ｂは、表示ｍｉＲ阻害剤の存在下でのタンパク質発現の定量的表現を示している。シグナル強度を、ＧＡＰＤＨ強度に対して正規化し、対照（ＮＴ）細胞における発現（これを１００に任意設定した）に対する割合として示す。エラーバーは、少なくとも３つの独立した実験の標準偏差を示す。＊ｐ値＜０．０５。  図２２ｃは、様々なｍｉＲＮＡの阻害およびＯＳＫＭ形質導入の後のｐ５３、ＣＤＣ４２およびｐ８５αの発現のイムノブロット解析を示している。１×１０５  Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰ  ＭＥＦを表示ｍｉＲＮＡ阻害剤でトランスフェクトする。５日後に細胞を採取し、イムノブロットにより解析する。（Ｂ）に記載のとおり、シグナル強度を正規化する。エラーバーは、少なくとも３つの独立した実験の標準偏差を示す。＊ｐ値＜０．０５。図２２ｄは、ｍｉＲ−２９ａまたはｐ５３の枯渇により初期化効率が高まるということを示している。４Ｘ１０４  Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰ  ＭＥＦを、表示ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ阻害剤と、ＯＳＫＭ初期化因子とでトランスフェクトする。形質導入後１２日目にＧＦＰ陽性細胞を計数する。エラーバーは、少なくとも３つの独立した実験の標準偏差を示す。＊ｐ値＜０．０５。
【図２３】ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａの枯渇が、ＥＲＫ１／２経路をダウンレギュレートすることにより初期化効率を高めることを示す図である。図２３ａは、ＭＥＦにおける様々なｍｉＲＮＡの阻害後のリン酸化ＥＲＫ１／２およびトータルＥＲＫ１／２のウエスタン解析を示している。１×１０５  Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰ  ＭＥＦを表示ｍｉＲＮＡ阻害剤でトランスフェクトし、５日後に採取し、イムノブロットする。シグナル強度を、アクチンに対して正規化し、ａｎｔｉ  ｍｉＲ  ＮＴ対照の発現に対する割合として示す。エラーバーは、３つの独立した実験の標準偏差を示す。＊ｐ値＜０．０５；＊＊ｐ値＜０．００５。図２３ｂは、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａの枯渇によりＳｐｒｙ１タンパク質レベルが増加するということを示している。Ｓｐｒｙ１発現比のウエスタンブロット解析を示す。ＭＥＦを、表示した様々なｍｉＲＮＡ阻害剤でトランスフェクトする。ウエスタンブロット解析のためにトランスフェクション後５日目に細胞を採取する。シグナル強度を、アクチンに対して正規化し、図２３ａに記載したように示す。エラーバーは、３つの独立した実験の標準偏差を表す。＊ｐ値＜０．０５；＊＊ｐ値＜０．００５。  図２３ｃは、ＥＲＫ１／２またはＧＳＫ３βのノックダウン後の初期化効率における変化倍率を示している。４Ｘ１０４  Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰ  ＭＥＦを表示ｓｉＲＮＡと、ＯＳＫＭとでトランスフェクトする。２週間後にＧＦＰ陽性細胞を計数する。ｓｉＮＴでのトランスフェクションを初期化効率の対照とする。エラーバーは、３つの独立した実験の標準偏差を示す。＊＊ｐ値＜０．００５。図２３ｄは、ＭＥＦにおける様々なｍｉＲＮＡの阻害後のリン酸化ＧＳＫ−３βおよびトータルＧＳＫ−３βのウエスタン解析を示している。１×１０５  Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰ  ＭＥＦを表示ｍｉＲＮＡ阻害剤でトランスフェクトし、５日後に採取し、イムノブロットにより解析する。図２３ａに記載したように、シグナル強度を正規化する。エラーバーは、３つの独立した実験の標準偏差を示す。
【図２４】ｃ−Ｍｙｃが、ＭＥＦで濃縮されたｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａをダウンレギュレートすることにより初期化を促進することを示す模式図を示す図である。ｐ５３およびＥＲＫ１／２の経路は初期化の障壁として働き、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａは、ＣＤＣ４２、ｐ８５αおよびＳｐｒｙ１をダウンレギュレートすることによりそれらの経路を間接的に活性化する。ｍｉＲ−２１／ｐ５３経路とｍｉＲ−２９ａ／ＥＲＫ１／２経路との間のクロストークも示す。ｃ−Ｍｙｃは、これらのｍｉＲＮＡの発現を抑制し、次にはＥＲＫ１／２およびｐ５３の誘導に支障をきたす。点線はｉＰＳ初期化に対するｐ５３およびＥＲＫ１／２の作用を示す。
【図２５】ｍｉＲ−２１の阻害が、ＯＳＫによるｉＰＳ細胞初期化を促進することを示す図である。ｍｉＲＮＡの阻害剤は、ＯＳＫでの初期化中にＯｃｔ４−ＭＥＦに導入される。形質導入後の様々な時点においてＧＦＰ陽性コロニーを計数する。エラーバーは、２つの独立した実験の標準偏差を表す。
【図２６】ｍｉＲＮＡの阻害が、初期化中にアポトーシスまたは増殖速度を変更しないことを示す図である。図２６ａは、ｍｉＲＮＡの阻害剤が、ＯＳＫＭでの初期化中にＯｃｔ４−ＭＥＦに導入されるということを示している。形質導入後８〜９日目に細胞を収集する。ＰＥ  Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｉ（BD Pharmingen；カタログ番号５５９７６３）および７−アミノ−アクチノマイシン（７−ＡＡＤ）を用いてアポトーシスを評価する。シグナルをＦＡＣＳにより検出する。エラーバーは、３つの独立した実験の標準偏差を表す。図２６ｂは、ｍｉＲＮＡ阻害剤が、ＯＳＫＭでの初期化中にＯｃｔ４−ＭＥＦに導入されるということを示している。形質導入後８〜９日目に細胞を収集する。収集の１日前に、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ  Ｅｄｕ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｋｉｔｓ（Invitrogen；カタログ番号Ｃ１０３３７）を用いて５−エチニル−２'−デオキシウリジン（Ｅｄｕ）で細胞を処理する。シグナルをＦＡＣＳにより検出する。エラーバーは、３つの独立した実験の標準偏差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、ｉＰＳＣ誘導に関与する重要な調節機構の発見に基づくものである。重要な態様は、ｉＰＳＣの誘導に関する細胞マイクロＲＮＡ間の関連性の発見である。これは、重要なマイクロＲＮＡ経路タンパク質のノックダウンによるマイクロＲＮＡ生合成機構への干渉により初期化効率の著しい低下がもたらされ得るという観察結果から明らかである。特に、初期化の初期段階中に高度に誘導される、少なくとも３種のマイクロＲＮＡクラスターが明らかとなっている、ｍｉＲ−１７〜９２、１０６ｂ〜２５および１０６ａ〜３６３。非常に類似したシード領域を有するいくつかのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂなど）は、ｐ２１発現をターゲッティングすることによりｉＰＳＣ誘導を大幅に増強し、得られたクローンを完全初期化状態に到達させ得る。
【００３０】
本発明によれば、マイクロＲＮＡはｉＰＳＣ誘導において直接働くことができ、マイクロＲＮＡ生合成機構への干渉により初期化効率が著しく低下することとなる。本発明は、初期化の初期段階中に高度に誘導される３種のマイクロＲＮＡクラスター、ｍｉＲ−１７〜９２、ｍｉＲ−１０６ｂ〜２５およびｍｉＲ−１０６ａ〜３６３を提供する。機能解析では、これらのマイクロＲＮＡをＭＥＦに導入することによりＯｃｔ４−ＧＦＰ＋ｉＰＳＣコロニー形成が促進されることが示された。また、本発明によれば、Ｔｇｆｂｒ２およびｐ２１（これらは両方とも初期化を阻害する）はこれらのマイクロＲＮＡにより直接ターゲッティングされ、それらの活性の遮断により初期化効率が著しく低下することとなる。本発明によれば、ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂは初期化活性の重要なレギュレーターであることが提案される。
【００３１】
本組成物および方法を記載する前に、記載する特定の組成物、方法および実験条件は変化し得ることから本発明はそのような組成物、方法および条件に限定されないことを理解すべきである。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書において用いられる用語は特定の実施形態を記載することを目的とするものにすぎず、限定するものではないことも理解すべきである。
【００３２】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、特に明示されない限り、複数の参照語を包含する。従って、例えば、「方法」について述べる場合は、１以上の方法および／または、この開示内容などを読むことによって当業者には明らかとなるであろう、本明細書に記載した種類の工程も包含する。
【００３３】
特に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の通常の技術を有する人に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本発明の実施または試験において、本明細書に記載したものと類似または同等の方法および材料を使用することができるが、好ましい方法および材料を次に記載する。
【００３４】
本明細書において論じるように、マイクロＲＮＡが初期化プロセスおよびｉＰＳＣ誘導効率に関与するという発見によって、それらの細胞中のこれらのマイクロＲＮＡのレベルを操作することによりｉＰＳＣ誘導効率を大幅に高める能力に至っている。よって、本発明は、既知方法と比べて誘導効率が改善されたｉＰＳ細胞生成方法を提供する。その方法は、体細胞を核初期化因子と、その細胞内でマイクロＲＮＡレベルまたは活性を変更する作用物質とに接触させること（ただし、該作用物質は核初期化因子ではない）、それによってｉＰＳ細胞を生成することを含む。
【００３５】
本発明はまた、初期化プロセスおよびｉＰＳＣ誘導効率に直接関与する調節タンパク質の発見にも基づく。そのような１つのタンパク質はｐ２１（１６５アミノ酸しか含まない低分子タンパク質）であり、このタンパク質は、ｐ５３依存性Ｇ１増殖停止を引き起こし分化および細胞老化を促進することにより癌発生中の腫瘍抑制遺伝子として長年にわたり知られていた。ｉＰＳＣ誘導中のマイクロＲＮＡによるｐ２１発現阻害はこの点で誘導効率を高めることが証明された。よって、１つの実施形態では、本発明は、体細胞を核初期化因子と、ｐ２１発現または活性の阻害剤とに接触させることによるｉＰＳ細胞生成方法を提供する。
【００３６】
ｉＰＳＣ生成へのＲＮＡの調節関与を前提として、核初期化因子以外の、ＲＮＡレベルを調節する作用物質を用いて誘導が起こり得ると考えられる。よって、本発明は、体細胞を、その細胞内でＲＮＡレベルまたは活性を変更する作用物質と接触させ（ここで、該作用物質は該体細胞中で多能性を誘導し、ただし、該作用物質は核初期化因子ではない）、それによってｉＰＳ細胞を生成することにより誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞を生成する方法を提供する。様々な実施形態では、ＲＮＡは非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、例えば、マイクロＲＮＡなどである。
【００３７】
様々な実施形態では、１種以上の核初期化因子を用いて、卵子、胚またはＥＳ細胞を使用せずに分化した細胞の初期化を誘導することができる。誘導プロセスの効率は、誘導プロセス中にその細胞内でマイクロＲＮＡレベルまたは活性を変更する作用物質を利用することにより高められる。その方法を用いて、ＥＳ細胞と類似した多能性と増殖能を有する誘導多能性幹細胞を便宜にかつ高度に再現性良く樹立し得る。例えば、核初期化因子は、ＲＮＡ分子（マイクロＲＮＡなど）をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターとともに、核初期化因子をコードする遺伝子を含む組換えベクターを細胞に形質導入することにより、細胞に導入され得る。よって、その細胞は、組換えベクター中に含まれる遺伝子の産物として発現される核初期化因子を発現することができ、同様に組換えベクター中に含まれるポリヌクレオチドの産物として発現されるマイクロＲＮＡを発現し、それによって核初期化因子だけを使用する場合と比べて高い効率（割合）で分化した細胞の初期化を誘導する。
【００３８】
本明細書において用いられるように、多能性細胞とは、in vitroで長期間（１年より長い期間）分裂する可能性があり、内胚葉、中胚葉および外胚葉を含む３つの胚葉全てから得られる細胞に分化する独特の能力を有する細胞を包含する。
【００３９】
本発明で用いる体細胞は初代細胞または不死化細胞であってよい。そのような細胞は、初代細胞（非不死化細胞）（動物から新たに単離したものなど）であってよく、または細胞株（不死化細胞）から得てもよい。例示的態様では、体細胞は、例えば、ヒト細胞またはマウス細胞などの哺乳類細胞である。体細胞は、周知の方法により、種々の器官（限定されるものではないが、皮膚、肺、膵臓、肝臓、胃、腸、心臓、生殖器、膀胱、腎臓、尿道および他の泌尿器など）から、または一般的には生存体細胞を含有する任意の器官または組織から得てもよい。本発明において有用な哺乳類体細胞には、例として、成体幹細胞、セルトリ細胞、内皮細胞、顆粒膜上皮細胞、ニューロン、膵島細胞、表皮細胞、上皮細胞、肝細胞、毛包細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（Ｂリンパ球およびＴリンパ球）、赤血球、マクロファージ、単球、単核細胞、繊維芽細胞、心筋細胞、他の公知の筋肉細胞、一般的には任意の生存体細胞が挙げられる。特定の実施形態では、繊維芽細胞が用いられる。本明細書において用いられる体細胞という用語はまた、成体幹細胞を含むようにも意図されている。成体幹細胞は、特定組織のあらゆる細胞種を生じさせることが可能な細胞である。成体幹細胞の例としては、造血幹細胞、神経幹細胞および間葉系幹細胞が挙げられる。
【００４０】
本明細書において用いられるように、初期化とは、一部分化したまたは最終分化した体細胞の分化状態を変更するまたは後退させるプロセスを指すよう意図されている。体細胞の初期化は、体細胞の分化状態の一部後退または完全後退であってよい。例示的態様では、初期化は完全なものであり、この場合、体細胞は誘導多能性幹細胞に初期化される。しかしながら、初期化は、一部であってもよい（低分化状態への後退など）。例えば、最終分化した細胞の低分化状態の細胞（多分化性細胞など）への後退。
【００４１】
本発明の様々な態様では、核初期化因子は、多能性を誘導する遺伝子であり、分化した細胞または半分化した細胞を、最初の細胞より原始的な表現型（多能性幹細胞の表現型など）に初期化するために利用される。そのような遺伝子は、細胞中でマイクロＲＮＡレベルまたは活性を変更するおよび／またはｐ２１の発現または活性を阻害して誘導効率を高める作用物質とともに利用される。そのような遺伝子および作用物質は、体細胞のゲノムに組み込まれた１種以上の該遺伝子の発現により、体細胞からの多能性幹細胞の生成が可能である。本明細書において用いられるように、多能性を誘導する遺伝子とは、多能性と関係がある遺伝子であって、該遺伝子の組込みおよび発現により体細胞からの低分化細胞（多能性幹細胞など）の生成が可能である遺伝子を指すよう意図されている。多能性遺伝子の発現は、典型的には多能性幹細胞に限定され、多能性幹細胞の機能的同一性に不可欠である。
【００４２】
細胞中でマイクロＲＮＡのレベルまたは活性を変更するまたはｐ２１の発現または活性を阻害する作用物質には、様々な異なる種類の分子が含まれることは当業者ならば理解するであろう。本発明の方法のいずれかにおいて有用な作用物質は、あらゆる種類の分子、例えば、ポリヌクレオチド、ペプチド、ペプチドミメティック、ペプトイド（ビニローグペプトイド(vinylogous peptoids)など）、化学化合物（有機分子または小有機分子など）などであり得る。よって、一態様では、本発明の方法に用いる作用物質は、ポリヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ分子など）である。様々な態様では、作用物質は、ポリヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ分子（マイクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡおよびｓｈＲＮＡなど）など）であってよい。例示的な態様では、作用物質は、細胞に導入されるマイクロＲＮＡであり、その導入の結果、その細胞中でマイクロＲＮＡのレベルおよび活性が増加しかつ／またはｐ２１が阻害される。
【００４３】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、遺伝子発現を調節する一本鎖ＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、遺伝子によりコードされておりそのＤＮＡから転写されるがｍｉＲＮＡはタンパク質へ翻訳されない；その代わりに一次転写物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）は各々、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと呼ばれる短いステムループ構造にプロセシングされ、最終的には機能性ｍｉＲＮＡにプロセシングされる。成熟したｍｉＲＮＡ分子は１以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子と完全にまたは部分的に相補的であり、それらの主な機能は遺伝子発現をダウンレギュレートすることである。マイクロＲＮＡは、独立した遺伝子によりコードされ得るが、また、様々な異なるＲＮＡ種（イントロン、ｍＲＮＡの３'ＵＴＲ、長い非コードＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡおよびトランスポゾンを含む）から（酵素Ｄｉｃｅｒによって）プロセシングを受け得る。本明細書において用いられるように、マイクロＲＮＡとは、「ミミック」マイクロＲＮＡも包含し、「ミミック」マイクロＲＮＡは、それらの内因性対応物と同じまたは実質的に同じ機能を有する、細胞に外から導入されるマイクロＲＮＡを意味するよう意図されている。よって、当業者ならば作用物質が外から導入されるＲＮＡであってよいことを理解する上で、作用物質はまた、細胞中でマイクロＲＮＡの発現を増加または減少させる化合物なども包含する。
【００４４】
様々な態様では、マイクロＲＮＡは、ｉＰＳＣの誘導またはその分化中に活性または発現の増加または減少を示すクラスター中に含まれるマイクロＲＮＡであってよい。一態様では、マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−１０６ａまたはｍｉＲ−３０２ｂクラスター中の１種以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１０６ｂ、またはそれらの任意の組合せなど）であってよい。ｍｉＲ−１７〜９２、ｍｉＲ−１０６ｂ〜２５およびｍｉＲ−１０６ａ〜３６３クラスターの誘導は、正確な初期化に重要であることが示されている。そのプロセス中にそのようなマイクロＲＮＡは初期化障壁を低くするように思われるため、それらの細胞中のこれらのマイクロＲＮＡのレベルを操作して、初期化効率を改善し得る。マイクロＲＮＡは重要な調節分子であることが示されていることから、また、マイクロＲＮＡを操作して、ｉＰＳＣの分化を指示し得る。
【００４５】
３種のマイクロＲＮＡクラスターは、ｉＰＳＣ誘導中に誘導されることがここで確認され、これらのクラスター内のいくつかのマイクロＲＮＡは、同じヌクレオチドシード領域配列を有すると判明しており、それらは類似したｍＲＮＡをターゲッティングすることが示された。また、同じシード領域のヌクレオチド配列を共有するそのようなマイクロＲＮＡはｉＰＳＣ誘導を増強する一方で、ｐ２１発現を減少させることも判明している。よって、一態様では、マイクロＲＮＡは、様々なマイクロＲＮＡ（例えば、配列番号２〜１１のもの）の間で保存されると判明している、配列番号１を含むポリヌクレオチド配列、５'−ＡＡＧＵＧＣ−３'を有する。よって、関連態様では、マイクロＲＮＡは、配列番号２〜１１のいずれかのヌクレオチド配列を有する。
【００４６】
「低分子干渉ＲＮＡ」および「ｓｉＲＮＡ」という用語はまた、様々な生物学的役割を果たす短鎖二本鎖ＲＮＡ分子の種類である、短鎖干渉ＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡを指すように、本明細書において用いられる。とりわけ、ｓｉＲＮＡはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路に関与し、そこでｓｉＲＮＡは特異的遺伝子の発現に干渉する。ＲＮＡｉ経路におけるそれらの役割に加え、ｓｉＲＮＡはＲＮＡｉ関連経路においても（例えば、抗ウイルス機構としてまたはゲノムのクロマチン構造形成において）作用する。
【００４７】
本発明のポリヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡ分子など）は任意の好適な長さのものであってよい。例えば、遺伝子発現を調節するためにアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ分子を使用するにはどのような長さが好適であるかは当業者ならば理解するであろう。そのような分子は、典型的には、約５〜１００ヌクレオチド長、５〜５０ヌクレオチド長、５〜４５ヌクレオチド長、５〜４０ヌクレオチド長、５〜３５ヌクレオチド長、５〜３０ヌクレオチド長、５〜２５ヌクレオチド長、５〜２０ヌクレオチド長または１０〜２０ヌクレオチド長である。例えば、その分子は、約５ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、２６ヌクレオチド長、２７ヌクレオチド長、２８ヌクレオチド長、２９ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、３１ヌクレオチド長、３２ヌクレオチド長、３３ヌクレオチド長、３４ヌクレオチド長、３５ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、４５ヌクレオチド長または５０ヌクレオチド長であってよい。そのようなポリヌクレオチドは、少なくとも約１５ヌクレオチド〜約１２０を超えるヌクレオチドを含んでよい（少なくとも約１６ヌクレオチド、少なくとも約１７ヌクレオチド、少なくとも約１８ヌクレオチド、少なくとも約１９ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２１ヌクレオチド、少なくとも約２２ヌクレオチド、少なくとも約２３ヌクレオチド、少なくとも約２４ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約２６ヌクレオチド、少なくとも約２７ヌクレオチド、少なくとも約２８ヌクレオチド、少なくとも約２９ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約５５ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約６５ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約８５ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約９５ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約１１０ヌクレオチド、少なくとも約１２０ヌクレオチドまたは１２０を超えるヌクレオチドを含む）。
【００４８】
「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」または「核酸分子」という用語は、ホスホジエステル結合によって相互に連結される２種以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの配列を意味するように、本明細書において広く用いられる。そのようなものとして、それらの用語は、ＲＮＡおよびＤＮＡ（遺伝子またはその部分、ｃＤＮＡ、合成ポリデオキシリボ核酸配列などであってよく、かつ一本鎖または二本鎖であってよい）、ならびにＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを包含する。さらに、本明細書において用いられるそれらの用語は、細胞から単離され得る天然に存在する核酸分子、ならびに例えば、化学合成法によりまたは酵素法により（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるなど）調製され得る合成ポリヌクレオチドを包含する。例えば、組成物の異なる成分を区別するために、議論の便宜上異なる用語を用いているにすぎないことを認識すべきである。
【００４９】
一般的に、ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、天然に存在するデオキシリボヌクレオチド（２'−デオキシリボースと連結されたアデニン、シトシン、グアニンまたはチミンなど）またはリボヌクレオチド（リボースと連結されたアデニン、シトシン、グアニンまたはウラシルなど）である。しかしながら、使用に応じて、ポリヌクレオチドは、天然に存在しない合成ヌクレオチドまたは修飾された天然に存在するヌクレオチドを含むヌクレオチド類似体も含み得る。ヌクレオチド類似体は、当技術分野で周知であり、市販されており、そのようなヌクレオチド類似体を含有するポリヌクレオチドと同様である。ポリヌクレオチドのヌクレオチドを連結している共有結合は、一般的にはホスホジエステル結合である。しかしながら、ポリヌクレオチドを使用する目的に応じて、その共有結合は多数の他の結合のいずれかであってもよく、チオジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ペプチド様結合または合成ポリヌクレオチドを生産するためのヌクレオチドの連結に有用な、当業者に公知の任意の他の結合が含まれる。
【００５０】
天然に存在するヌクレオチドおよびホスホジエステル結合を含むポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、化学合成することができ、または鋳型として適当なポリヌクレオチドを用い、組換えＤＮＡ法を用いて生産することができる。それに対し、ヌクレオチド類似体またはホスホジエステル結合以外の共有結合を含むポリヌクレオチドは、一般的に化学合成されるが、Ｔ７ポリメラーゼなどの酵素によりある特定の種類のヌクレオチド類似体をポリヌクレオチドに組み込むことができるため、そのような酵素を用いて、適当な鋳型から組換えによりそのようなポリヌクレオチドを生産することができる。
【００５１】
様々な実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ分子には、修飾を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。様々な修飾が当技術分野で公知であり、本発明における使用のために考えられる。例えば、修飾主鎖または非天然ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが考えられる。本明細書において用いられるように、修飾主鎖を有するオリゴヌクレオチドとは、主鎖中にリン原子を有するものおよび主鎖中にリン原子がないものを包含する。本明細書の目的において、当技術分野において言及されることがあるように、ヌクレオシド間主鎖中にリン原子がない修飾オリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドであると考えることができる。
【００５２】
様々な態様では、修飾オリゴヌクレオチド主鎖としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネートおよび他のアルキルホスホネート（３'−アルキレンホスホネート、５'−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホルアミダート（３'−アミノホスホルアミダートおよびアミノアルキルホスホルアミダートを含む）、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、通常の３'−５'結合を有するセレノホスフェートおよびボラノホスフェート、これらの２'−５'結合した類似体、および１以上のヌクレオチド間結合が３'−３'結合、５'−５'結合または２'−２'結合である逆の極性を有するものが挙げられる。逆の極性を有するある特定のオリゴヌクレオチドは、最も３'側のヌクレオチド間結合に単一の３'−３'結合、すなわち、脱塩基であってよい（核酸塩基が欠けているかまたはその代わりにヒドロキシル基を有する）単一の逆のヌクレオシド残基を含む。様々な塩、混合塩および遊離酸形も含まれる。
【００５３】
様々な態様では、内部にリン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド主鎖は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１以上の短鎖ヘテロ原子ヌクレオシド間結合または複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される主鎖を有する。これらには、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から一部形成される）；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびメチレンチオホルムアセチル主鎖；リボアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；および混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分を有する他のものを有するものが含まれる。
【００５４】
様々な態様では、オリゴヌクレオチドミメティック、糖およびヌクレオシド間結合の両方、すなわち、ヌクレオチド単位の主鎖は、新規な基に置換されている。塩基単位は、適当な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。そのような１つのオリゴマー化合物、優れたハイブリダイゼーション特性を示すことが示されたオリゴヌクレオチドミメティックは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖−主鎖は、アミド含有主鎖、特に、アミノエチルグリシン主鎖に置換されている。核酸塩基は、保持され、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合している。様々な態様では、オリゴヌクレオチドはホスホロチオエート主鎖およびヘテロ原子主鎖を含むオリゴヌクレオシドを含み得る。修飾オリゴヌクレオチドはまた、１以上の置換された糖部分も含み得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２'位に次のものの１つを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル（ここで、該アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換されているかまたは非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってよい）。特に好ましいのは、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］］２（ここで、ｎおよびｍは１〜約１０である）である。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２'位に次のものの１つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を向上させるための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を向上させるための基、および類似した特性を有する他の置換基。別の修飾としては、２'−メトキシエトキシ（２'ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２'−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２'−ＭＯＥとしても知られる）が挙げられる。
【００５５】
関連態様では、本発明は、標的ポリヌクレオチドに対する親和性および特異性が増強されたアンチセンス核酸を生成するためのロックド核酸（ＬＮＡ）の使用を含む。ＬＮＡは、２'−ヒドロキシル基が糖環の３'または４'炭素原子と結合し、それによって二環式糖部分を形成する核酸である。その結合は、２'酸素原子と４'炭素原子を架橋するメチレン (methelyne)（−ＣＨ２−）ｎ基（ここで、ｎは１または２である）であることが好ましい。
【００５６】
他の修飾としては、２'−メトキシ（２'−Ｏ−ＣＨ３）、２'−アミノプロポキシ（２'−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２'−アリル（２'−ＣＨ−ＣＨ−ＣＨ２）、２'−Ｏ−アリル（２'−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ２）、２'−フルオロ（２'−Ｆ）、２'−アミノ、２'−チオ、２'−Ｏメチル、２'−メトキシメチル、２'−プロピルなどが挙げられる。２'−修飾は、アラビノ（上）位またはリボ（下）位に存在してよい。好ましい２'−アラビノ修飾は２'−Ｆである。また、類似した修飾も、オリゴヌクレオチドの他の位置で、特に、３'末端ヌクレオチド上または２'−５'結合オリゴヌクレオチド中の糖の３'位および５'末端ヌクレオチドの５'位で行ってよい。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖ミメティックも有していてよい。
【００５７】
オリゴヌクレオチドはまた、核酸塩基の修飾または置換も含み得る。本明細書において用いられるように、「非修飾」または「天然」核酸塩基としては、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾された核酸塩基としては、他の合成および天然核酸塩基、例えば、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチル誘導体および他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピル誘導体および他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換のアデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換のウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなどが挙げられる。さらなる修飾核酸塩基としては、三環式ピリミジン、例えば、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）などのＧクランプ、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリミド［３'，２'：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）などが挙げられる。修飾核酸塩基としては、プリン塩基またはピリミジン塩基が他の複素環、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドンで置換されたものも挙げられ得る。さらなる核酸塩基は当技術分野で公知である。これらの核酸塩基のいくつかは、本明細書に記載したオリゴマー化合物の結合親和性を高めるために特に有用である。これらには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを含む）、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンが含まれる。５−メチルシトシン置換は、０．６〜１．２Ｃにより核酸二本鎖安定性を高めることが示され、現在好ましい塩基置換であり、さらに特には、２'−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせられる場合である。
【００５８】
本明細書に記載したアンチセンスオリゴヌクレオチドの別の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取込みを高めるオリゴヌクレオチドの１以上の部分またはコンジュゲートとの化学的結合を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、第一級または第二級ヒドロキシル基などの官能基と共有結合されたコンジュゲート群を含み得る。コンジュゲート群としては、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を増強する群、およびオリゴマーの薬物動態特性を増強する群が挙げられる。典型的なコンジュゲート群としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンおよび色素が挙げられる。薬力学的特性を増強する群とは、本発明の文脈において、オリゴマーの取込みを向上させ、オリゴマーの分解耐性を増強し、および／またはＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する群を包含する。薬物動態特性を増強する群とは、本発明の文脈において、オリゴマーの取込み、分布、代謝または排出を向上させる群を包含する。コンジュゲート部分としては、限定されるものではないが、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル−５−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム  １，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、あるいはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、あるいはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノカルボニルオキシコレステロール部分などの脂質部分が挙げられる。
【００５９】
いくつかの遺伝子は、多能性と関係があり、初期化因子としての本発明での使用に好適であることが見出された。そのような遺伝子は当技術分野で公知であり、それらの例として、ＳＯＸファミリー遺伝子（ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、ＳＯＸ１５、ＳＯＸ１８）、ＫＬＦファミリー遺伝子（ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５）、ＭＹＣファミリー遺伝子（Ｃ−ＭＹＣ、Ｌ−ＭＹＣ、Ｎ−ＭＹＣ）、ＳＡＬＬ４、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ＳＴＥＬＬＡ、ＮＯＢＯＸまたはＳＴＡＴファミリー遺伝子が挙げられる。ＳＴＡＴファミリーメンバーには、例えば、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５（ＳＴＡＴ５ＡおよびＳＴＡＴ５Ｂ）、およびＳＴＡＴ６が含まれ得る。場合によっては、多能性を誘導するために１種の遺伝子だけを使用することも可能であるが、一般的には、多能性を誘導するために２種以上の遺伝子の発現が必要である。例えば、２種、３種、４種またはそれ以上の遺伝子をポリシストロン性構築物として体細胞ゲノムに同時に組み込んで、そのような遺伝子の同時発現を可能にし得る。例示的態様では、多能性を誘導するために、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびＣ−ＭＹＣを含む４種の遺伝子が利用される。本発明での使用に好適な初期化因子として知られるさらなる遺伝子は、米国特許出願第１０／９９７，１４６号および米国特許出願第１２／２８９，８７３号において開示されており、これらの特許出願は引用することにより本明細書の一部とされる。
【００６０】
これらの遺伝子の全ては、ヒトを含む哺乳類に一般に存在するため、任意の哺乳類由来の相同体も本発明において用いてよい（限定されるものではないが、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマおよびサルを含む哺乳類から得られた遺伝子など）。さらに、野生型遺伝子産物に加えて、いくつかの（例えば、１〜１０個、１〜６個、１〜４個、１〜３個および１個または２個）のアミノ酸の置換、挿入および／または欠失を含み野生型遺伝子産物と類似した機能を有する変異遺伝子産物も使用することができる。さらに、因子の組合せは野生型の遺伝子または遺伝子産物の使用に限定されない。例えば、野生型Ｍｙｃの代わりにＭｙｃキメラまたは他のＭｙｃ変異体を使用することができる。
【００６１】
本発明は、任意の特定の核初期化因子組合せに限定されない。本明細書において論じるように、核初期化因子は、１種以上の遺伝子産物を含んでよい。核初期化因子はまた、本明細書において論じるように、遺伝子産物の組合せも含んでよい。本明細書において開示するように、各核初期化因子を単独でまたは他の核初期化因子と組み合わせて用いてよい。さらに、本発明の核初期化因子は、スクリーニング方法により、例えば、米国特許出願第１０／９９７，１４６号において論じられているように、同定することができ、この特許出願は引用することにより本明細書の一部とされる。加えて、本発明の核初期化因子は、分化、発生、増殖などに関連する１種以上の因子および他の生理学的活性を有する因子、ならびに核初期化因子として機能し得る他の遺伝子産物を含み得る。
【００６２】
核初期化因子は、タンパク質またはペプチドを含んでよい。そのタンパク質は、本明細書において論じるように、遺伝子から生産されてよく、あるいは、そのタンパク質と別のタンパク質、ペプチドなどとの融合遺伝子産物の形であってよい。そのタンパク質またはペプチドは、蛍光タンパク質および／または融合タンパク質であってよい。例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）との融合タンパク質またはヒスチジンタグなどのペプチドとの融合遺伝子産物を用いることもできる。さらに、ウイルスＨＩＶから得られたＴＡＴペプチドとの融合タンパク質を調製し使用することによって、細胞膜を通じての核初期化因子の細胞内取込みを促進することができ、それによって、融合タンパク質を培地に加え遺伝子形質導入などの複雑な操作を行わないことから、初期化の誘導だけが可能になる。そのような融合遺伝子産物の調製方法は当業者には周知であるため、当業者ならば、目的に応じて適当な融合遺伝子産物を容易に設計し調製することができる。
【００６３】
本明細書において論じるように、ｉＰＳＣは、体細胞に核初期化因子と、その細胞中でマイクロＲＮＡレベルまたは活性を変更する作用物質および／またはｐ２１阻害剤とを組み合わせて接触させることにより誘導され得る。当業者には理解されるように、体細胞への送達は当技術分野で公知の任意の好適な方法により行われ得る。一態様では、核初期化因子は、核初期化因子をコードする遺伝子を含む組換えベクターを用いて細胞に導入され得る。同様に、マイクロＲＮＡを変更する作用物質は、ＲＮＡ分子（例えば、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドなど）をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを用いて細胞に導入され得る。同様に、ｐ２１の阻害剤は、ペプチド阻害剤またはＲＮＡ分子（例えば、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドなど）をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを用いて細胞に導入され得る。よって、その細胞は、組換えベクター中に含まれる遺伝子の産物として発現される核初期化因子を発現することができ、同様に組換えベクター中に含まれるポリヌクレオチドの産物として作用物質またはｐ２１阻害剤を発現し、それによって核初期化因子だけを使用する場合と比べて高い効率（割合）で分化した細胞の初期化を誘導する。
【００６４】
本発明の核酸構築物（組換えベクターなど）は、様々な周知の技術（細胞の非ウイルス性トランスフェクションなど）を用いて細胞に導入され得る。例示的態様では、構築物は、ベクターに組み込まれ、細胞に導入されて、その構築物の発現が可能になる。細胞への導入は、当技術分野で公知の任意のウイルス性または非ウイルス性トランスフェクション（限定されるものではないが、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、熱ショック、マグネトフェクション、リポソーム法、マイクロインジェクション、微粒子銃法（ナノ粒子）、陽イオン性ポリマー法（ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）または細胞融合など）により行われ得る。他のトランスフェクション方法としては、専売のトランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）、Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｈｉｌｙｍａｘ（商標）、Ｆｕｇｅｎｅ（商標）、ｊｅｔＰＥＩ（商標）、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（商標）およびＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）など）が挙げられる。
【００６５】
他の態様では、体細胞への、核初期化因子と、その細胞中でマイクロＲＮＡレベルまたは活性を変更する作用物質および／またはｐ２１阻害剤とを組み合わせての誘導中の接触は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、細胞膜を介したタンパク質、ＲＮＡ分子などの直接送達により行われ得る。
【００６６】
細胞中でマイクロＲＮＡレベルまたは活性を変更する作用物質および／またはｐ２１阻害剤と組み合わせた核初期化因子の使用では、初期化因子だけを使用する場合と比べて誘導効率は高まる。様々な態様では、誘導効率は、従来の方法と比べて１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％または５００％までも高まり得る。例えば、誘導効率は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％または５０％（例えば、開始時の体細胞総数に対する誘導された細胞の割合）ほどの高さであり得る。
【００６７】
誘導プロセス中、体細胞に、その細胞中でマイクロＲＮＡレベルまたは活性を変更する作用物質および／またはｐ２１阻害剤を接触させると同時にまたはその前に、体細胞に核初期化因子を接触させ得る。様々な態様では、体細胞に任意の他の作用物質または阻害剤を接触させる約１日、２日、３日、４日、５日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日またはそれ以上前に、体細胞に初期化因子を接触させる。例示的態様では、体細胞に任意の他の作用物質または阻害剤を接触させる約１日、２日、３日、４日または５日前に、体細胞に初期化因子を接触させる。
【００６８】
初期化細胞の多能性を評価するためにさらなる解析を行ってよい。細胞を異なる増殖特性および胚幹細胞様形態について解析し得る。例えば、特異的細胞種への分化を推進することが知られているある特定の増殖因子を加えることによって細胞をin vitroで分化させ得る。体の数種の細胞種だけを形成可能な初期化細胞は多分化性であり、一方、体のいかなる細胞種をも形成可能な初期化細胞は多能性である。
【００６９】
多能性を評価するための初期化体細胞の発現プロファイリングも行ってよい。多能性と関係がある個別遺伝子の発現もまた調査し得る。加えて、胚幹細胞表面マーカーの発現も解析し得る。多能性幹細胞と関係があることが当技術分野で公知の様々な遺伝子の検出および解析としては、限定されるものではないが、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＡＬＬ４、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、またはそれらの組合せなどの遺伝子の解析が挙げられ得る。ｉＰＳ細胞はいくつもの多能性細胞マーカーを発現し得、それらには以下が挙げられる：アルカリ性ホスファターゼ(alkaline phosphatase)（ＡＰ）；ＡＢＣＧ２；ステージ特異的胚抗原−１(stage specific embryonic antigen-1)（ＳＳＥＡ−１）；ＳＳＥＡ−３；ＳＳＥＡ−４；ＴＲＡ−１−６０；ＴＲＡ−１−８１；Ｔｒａ−２−４９／６Ｅ；ＥＲａｓ／ＥＣＡＴ５、Ｅ−カドヘリン(E-cadherin)；β−チュブリンＩＩＩ(β-tubulin III)；α−平滑筋アクチン(α-smooth muscle actin)（α−ＳＭＡ）；繊維芽細胞増殖因子４(fibroblast growth factor 4)（ＦＧＦ４）、Ｃｒｉｐｔｏ、Ｄａｘ１；亜鉛フィンガータンパク質２９６(zinc finger protein 296)（Ｚｆｐ２９６）；Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ−１(N-acetyltransferase-1)（Ｎａｔ１）；ＥＳ細胞関連転写物１(ES cell associated transcript 1)（ＥＣＡＴ１）；ＥＳＧ１／ＤＰＰＡ５／ＥＣＡＴ２；ＥＣＡＴ３；ＥＣＡＴ６；ＥＣＡＴ７；ＥＣＡＴ８；ＥＣＡＴ９；ＥＣＡＴ１０；ＥＣＡＴ１５−１；ＥＣＡＴ１５−２；Ｆｔｈｌｌ７；Ｓａｌｌ４；未分化胚細胞転写因子(undifferentiated embryonic cell transcription factor)（Ｕｔｆ１）；Ｒｅｘ１；ｐ５３；Ｇ３ＰＤＨ；テロメラーゼ(telomerase)（ＴＥＲＴを含む）；サイレントＸ染色体遺伝子(silent X chromosome genes)；Ｄｎｍｔ３ａ；Ｄｎｍｔ３ｂ；ＴＲＩＭ２８；F-box containing protein 15（Ｆｂｘ１５）；Ｎａｎｏｇ／ＥＣＡＴ４；Ｏｃｔ３／４；Ｓｏｘ２；Ｋｌｆ４；ｃ−Ｍｙｃ；Ｅｓｒｒｂ；ＴＤＧＦ１；ＧＡＢＲＢ３；Ｚｆｐ４２、ＦｏｘＤ３；ＧＤＦ３；ＣＹＰ２５Ａ１；developmental pluripotency-associated 2（ＤＰＰＡ２）；T-cell lymphoma breakpoint 1（Ｔｃｌ１）；ＤＰＰＡ３／Ｓｔｅｌｌａ；ＤＰＰＡ４；ならびに他の一般的な多能性マーカー、例えば、細胞を初期化するために誘導中に用いられる任意の遺伝子。ｉＰＳ細胞はまた、ｉＰＳ細胞が誘導される分化細胞に特有のマーカーのダウンレギュレーションによっても特徴付けることができる。
【００７０】
本発明はさらに、本明細書に記載した方法を用いて生産されたｉＰＳ細胞、ならびにそのような細胞の集団を提供する。様々な細胞種へ分化可能な、本発明の初期化細胞には、様々な用途および治療的使用がある。幹細胞の基本特性である、無限に自己複製する能力および体のあらゆる細胞種に分化する能力は治療的使用に理想的となる。
【００７１】
よって、一態様では、本発明は、本明細書に記載した方法を用いて生成された誘導多能性幹細胞を用いて対象における障害および／または症状の治療または予防方法をさらに提供する。その方法は、対象から体細胞を得ることおよび本明細書に記載した方法を用いてその体細胞を誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞に初期化することを含む。その細胞は、次いで、症状の治療に好適な所望の細胞種にその細胞を分化させるのに好適な条件下で培養される。分化した細胞は、次いで、症状を治療または予防するために対象に導入され得る。
【００７２】
一態様では、本明細書に記載した方法を用いて生産されたｉＰＳ細胞、ならびにそのような細胞の集団は、それらの細胞を、それらの細胞中でマイクロＲＮＡレベルまたは活性を変更する作用物質により処理するかまたはそのような作用物質と接触させることによりin vitroで分化させ得る。マイクロＲＮＡはｉＰＳＣ誘導において重要なレギュレーターとして確認されているため、そのようなｉＰＳＣの分化を指示するために個別マイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ集団の操作を用い得ると思われる。そのような処理を、増殖因子または当技術分野で一般的に公知の他の作用物質および刺激と組み合わせて用いて、特異的細胞種への分化を推進し得る。
【００７３】
本発明の１つの利点は、移植に好適な同系(isogenic or synegenic)ヒト細胞について本質的に無制限の供給を提供することである。ｉＰＳ細胞は、患者に特異的に合わせられ、免疫拒絶が回避される。従って、現行の移植方法に関する重大な問題（宿主対移植片または移植片対宿主の拒絶によって起こり得る移植組織の拒絶など）がうまく回避される。健常なヒトから得られた体細胞由来のｉＰＳ細胞またはｉＰＳ細胞から調製された完全に分化した細胞のいくつかの種類を、ｉＰＳ細胞バンクに細胞のライブラリーとして保存することができ、幹細胞療法を受ける患者による拒絶が起こらない体細胞、組織または器官の調製に、そのライブラリー中の１種類以上のｉＰＳ細胞を用いることができる。
【００７４】
本発明のｉＰＳ細胞は、当技術分野で公知の方法により様々な障害を治療するための複数の異なる細胞種に分化させ得る。例えば、ｉＰＳ細胞を誘導して、造血幹細胞(hematopoetic stem cells)、筋肉細胞、心筋細胞、肝臓細胞、軟骨細胞、上皮細胞、尿路細胞、神経細胞などに分化させ得る。分化した細胞は、症状を予防または治療するために、次いで、患者の体に移植して戻され得る。よって、本発明の方法は、特定の細胞種／組織の増加もしくは置換または細胞の脱分化が望ましい、心筋梗塞、鬱血性心不全、卒中、虚血、末梢血管疾患、アルコール性肝疾患、硬変、パーキンソン病、アルツハイマー病、糖尿病、癌、関節炎、創傷治癒、免疫不全、再生不良性貧血、貧血、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、リソソーム蓄積症、多発性硬化症、脊髄損傷、遺伝性障害および類似疾患を有する対象を治療するために使用し得る。
【００７５】
様々な実施形態では、その方法によって、組織または器官の細胞数が、対応する未処理の対照組織または器官と比べて少なくとも約５％、１０％、２５％、５０％、７５％またはそれ以上増加する。さらに別の実施形態では、その方法によって、組織または器官の生物活性が、対応する未処理の対照組織または器官と比べて少なくとも約５％、１０％、２５％、５０％、７５％またはそれ以上増加する。さらに別の実施形態では、その方法によって、組織または器官における血管形成が、対応する未処理の対照組織または器官と比べて少なくとも約５％、１０％、２５％、５０％、７５％またはそれ以上増加する。さらに別の実施形態では、前記細胞は対象に対して、細胞数の増加が望まれる部位に直接投与される。
【００７６】
本発明はさらに、本明細書に記載した方法により得られた様々な細胞を用いることにより作用物質、化合物、医薬、毒物などの生理学的機能または毒性を評価するための方法を提供する。
【００７７】
４種の転写因子、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃＭｙｃの異所発現により体細胞をＥＳ様状態に初期化して、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作出することができる。本発明によれば、細胞のマイクロＲＮＡはｉＰＳＣ生成を調節することとなる。重要なマイクロＲＮＡ経路タンパク質のノックダウンにより初期化効率の著しい低下がもたらされ得る。３種のマイクロＲＮＡクラスター、ｍｉＲ−１７〜９２、１０６ｂ〜２５および１０６ａ〜３６３は、初期化の初期段階中に高度に誘導されることが示されている。非常に類似したシード領域を有するいくつかのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂを含む）は、ｉＰＳＣ誘導を大幅に増強し、これらのマイクロＲＮＡの阻害により初期化効率が著しく低下した。さらに、ｍｉＲ−ｉＰＳＣクローンは完全初期化状態に到達し得る。本発明によれば、Ｔｇｆｂｒ２およびｐ２１は、これらのマイクロＲＮＡにより直接ターゲッティングされることとなり、両遺伝子のｓｉＲＮＡノックダウンによりｉＰＳＣ誘導が実際に増強されることとなる。また、本発明によれば、ｍｉＲ−９３およびそのファミリーメンバーはＴＧＦ−β受容体ＩＩを直接ターゲッティングして、ｉＰＳＣ初期化を促進することとなる。本発明によれば、マイクロＲＮＡは初期化プロセスにおいて作用することとなり、細胞中のマイクロＲＮＡレベルをモジュレートすることによりｉＰＳＣ誘導効率は大幅に高められ得ることとなる。
【００７８】
誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）はオーダーメイド再生医療に大いに有望であるが、初期化の分子基盤は大部分が不明である。細胞同一性を維持する障壁を克服することが分化した細胞の初期化における重要な段階である。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は標的遺伝子を組織特異的にモジュレートするため、本発明によれば、異なるマウス胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ）濃縮ｍｉＲＮＡは、初期化障壁として働くタンパク質を転写後にモジュレートすることとなる。これらのｍｉＲＮＡの阻害は、細胞シグナル伝達に影響を及ぼして、それらの障壁を低くするはずである。本発明によれば、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａの枯渇によりＭＥＦにおける初期化効率が高まることとなる。本発明によれば、ｐ５３およびＥＲＫ１／２の経路はｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａによって調節され、初期化において作用することとなる。さらに、本発明によれば、ｃ−Ｍｙｃは、ＭＥＦで濃縮されたｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａなど）を抑制することにより初期化をある程度まで促進することとなる。本発明は、ｉＰＳＣ初期化に関与する複数のシグナル伝達ネットワークの調節におけるｍｉＲＮＡ機能を提供する。
【００７９】
Ｃ−Ｍｙｃは、４種の初期化因子（４Ｆ：Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃ）のうちの１つであり、細胞増殖および腫瘍発生において重要な役割を果たす。Ｃ−Ｍｙｃは、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤ｐ２１Ｃｉｐ１の抑制を通じて細胞性塞栓およびアポトーシスの重要なレギュレーターである。Ｍｉｚ−１機能を無効にし、ｐ１５ＩＮＫ４ｂを抑制することにより、ｃ−Ｍｙｃは、初代細胞の不死化において重要な役割を果たす。ｃ−Ｍｙｃの多くの転写機能はＭａｘまたはＭｉｚ−１との協同作用を必要とする。原癌遺伝子としてのｃ−Ｍｙｃは初期化効率を大幅に高めるが、初期化では重要でない。従って、初期化中のｃ−Ｍｙｃの下流の分子経路を定義することにより初期化効率を損なうことなくｉＰＳ細胞の治療用途を増すことができる。
【００８０】
Ｏｃｔ４−ＧＦＰマウス胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ）は、Ｄ１３．５に、ｐｏｕ５ｆ１の停止コドンの下流にＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ融合カセットを有するマウス（Jackson lab、ストック番号００８２１４）から得られる。これらのＭＥＦは、１０％ＦＢＳ(Invitrogen)とグルタミンおよびＮＥＡＡとを含有するＤＭＥＭ（Invitrogen、１１９９５−０６５）で培養される。ｉＰＳＣ誘導では、０〜４代継代のＭＥＦだけを用いる。
【００８１】
Ｃ−Ｍｙｃは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）発現を調節することによってＥＳ細胞再生を維持するように働く側面があると報告されている。マイクロＲＮＡは、２２−ヌクレオチドの非コード低分子ＲＮＡであり、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に装入され、全体的な遺伝子サイレンシング機能を発揮する。ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−２００およびｍｉＲ−４２９の発現はＥＳ細胞においてｃ−Ｍｙｃにより誘導され、分化に拮抗する。Ｃ−Ｍｙｃはまた、ｍｉＲ−１７〜９２マイクロＲＮＡクラスターをアップレギュレートすることによりまたは既知腫瘍抑制遺伝子（ｌｅｔ−７ファミリー、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１、ｍｉＲ−２９ファミリーおよびｍｉＲ−３４ａなど）を抑制することにより腫瘍形成も促進する。
【００８２】
体細胞同一性を固定する、Ｉｎｋ４−Ａｒｆ、ｐ５３およびｐ２１などの因子により媒介される障壁を克服することは、初期化における律速段階である。ｍｉＲＮＡは標的遺伝子を組織特異的にモジュレートするため、本発明によれば、異なるＭＥＦ  ｍｉＲＮＡは、初期化レギュレーターとして働くタンパク質を転写後にモジュレートすることとなる。これらのｍｉＲＮＡの阻害により、細胞シグナル伝達に影響を及ぼして、それらの障壁を低くすることができる。
【００８３】
本発明によれば、ＭＥＦにおいて豊富なｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａ）の枯渇により初期化効率が約２．１倍〜２．８倍高まることとなる。また、本発明によれば、ｃ−ＭｙｃはｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａ）を抑制して、ＭＥＦの初期化を促進することとなる。さらに、本発明によれば、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａは、初期化プロセス中にｐ５３レベルおよびＥＲＫ１／２リン酸化を間接的にダウンレギュレートすることによりｐ５３およびＥＲＫ１／２の経路を調節することとなる。
【００８４】
次の実施例を示して、本発明の実施形態をさらに説明するが、それらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。それらの実施例は用いられる可能性のある典型的なものであるが、当業者に公知の他の手順、方法論または技術を代わりに用いてもよい。
【実施例】
【００８５】
実施例１
細胞培養物、ベクターおよびウイルス形質導入
Ｏｃｔ４−ＧＦＰマウス胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ）は、Ｄ１３．５に、ｐｏｕ５ｆ１の停止コドンの下流にＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ融合カセットを有するマウス（Jackson lab、ストック番号００８２１４）から得られる。これらのＭＥＦは、１０％ＦＢＳ(Invitrogen)とグルタミンおよびＮＥＡＡとを含有するＤＭＥＭ（Invitrogen、１１９９５−０６５）で培養される。ｉＰＳＣ誘導では、０〜４代継代のＭＥＦだけを用いる。
【００８６】
プラスミドｐＭＸｓ−Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃＭｙｃはAddgeneから購入する。プラスミドｐＭＸ−ＨＡ−ｐ２１は、Ｎ末端タグ付きｐ２１をｐＭＸベクターのＥｃｏＲＩ部位に挿入することにより生成する。ｐＬＫＯ−ｓｈＲＮＡのクローンはOpen-Biosystemsから購入する。
【００８７】
レトロウイルスを生成するために、ＰＬＡＴ−Ｅ細胞を１０ｃｍプレートに播種し、翌日Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Invitrogen、１８３２４−０１２）およびＰＬＵＳ（商標）（Invitrogen、１１５１４−０１５）を用いて各因子９μｇをトランスフェクトする。ウイルスを採取し、２日後に合わせる。ｉＰＳＣ誘導では、ＭＥＦを１２ウェルプレートに播種し、翌日４種の因子ウイルスを４μｇ／ｍｌポリブレンとともに形質導入する。形質導入の１日後、培地を新鮮なＭＥＦ培地に換え、３日後にＬＩＦ（Millipore、ＥＳＧ１１０７）を補給したｍＥＳ培養培地に替える。形質導入後１４日目からＧＦＰ＋コロニーを採取し、拡大に成功したクローンを、１５％ＦＢＳ(Hyclone)とＬＩＦ、チオグリセロール、グルタミンおよびＮＥＡＡとを含有するＤＭＥＭで培養した。照射ＣＦ１  ＭＥＦをｍＥＳおよび得られたｉＰＳＣクローンの培養用のフィーダー細胞層として用いる。
【００８８】
ｓｈＲＮＡレンチウイルスを生成するために、ｓｈＲＮＡレンチウイルスベクターを２９３ＦＴ細胞にｐＰＡＣＫＨ１パッケージングシステム（ＳＢＩ、カタログ番号ＬＶ５００Ａ−１）とともに共トランスフェクトする。トランスフェクション後２日目にレンチウイルスを採取し、室温で４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。ウイルスを生産するために、１０ｃｍ組織培養プレートで４μｇのｐＬＫＯまたはｐＧＩＰＺベクターおよび１０μｇのパッケージングミックスを２９３ＦＴ細胞(Invitrogen)にトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後に、ウイルスを含有する上清を採取し、４μｇ／μｌポリブレンとのさらなる形質導入に用いた。ＳｈＲＮＡウイルスを４種の因子ウイルスとともに体積比１：１：１：１：１で加える。
【００８９】
マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびＭＥＦのトランスフェクションは次のとおり行う：マイクロＲＮＡミミックおよび阻害剤、ｓｉＲＮＡはDharmaconから購入する。ＭＥＦをトランスフェクトするために、マイクロＲＮＡミミックをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Invitrogen、１１０５８−０２１）で所望の終濃度に希釈する。次いで、その混合物にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Invitrogen、１１６６８−０１９）を２μｌ／ウェルで加え、室温で２０分インキュベートする。１２ウェルトランスフェクションでは、８０μｌのｍｉＲ混合物を、３２０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭが入った各ウェルに加える。３時間後に、各ウェルに０．８ｍｌのウイルス混合物（ｉＰＳＣの場合）または新鮮培地を加え、翌日その培地を新鮮なＭＥＦ培地に換える。
【００９０】
ウエスタンブロッティングは次のとおり行う：全細胞溶解物を、ＭＰＥＲバッファー（PIERCE、７８５０３）を氷上で２０分間用いて調製し、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより清澄にする。１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中に同量の溶解物をローディングし、セミドライ式システム(Bio-Rad)を用いてタンパク質をＰＶＤＦ膜（Bio-Rad、１６２０１７７）に転写する。次いで、ＰＶＤＦ膜を、ＴＢＳＴ中５％ミルクにより室温で少なくとも１時間または４℃で一晩ブロッキングする。
【００９１】
使用する抗体には、抗ｐ２１（BD、５５６４３０）、抗ｍＮａｎｏｇ（R&D、ＡＦ２７２９）、抗ｈ／ｍＳＳＥＡ１（R&D、ＭＡＢ２１５６）、抗ＨＡ（Roche、１１８６７４２３００１）、抗ｍＡｇｏ２（Wako、０１４２２０２３）、抗Ｄｉｃｅｒ（Abcam、ａｂ１３５０２）、抗Ｄｒｏｓｈａ（Abcam、ａｂ１２２８６）、抗アクチン（Thermo、ＭＳ１２９５Ｐ０）、抗ＡＦＰ（Abcam、ａｂ７７５１）、抗βチュブリンＩＩＩ（R&D systems、ＭＡＢ１３６８）、抗αアクチニン（Sigma、Ａ７８１１）を含む。
【００９２】
ｍＲＮＡおよびマイクロＲＮＡのＲＴおよび定量ＰＣＲは次のとおり行う：トータルＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ法(Invitrogen)により抽出する。抽出後、１μｇのトータルＲＮＡを、スーパースクリプトＩＩ（商標）(Invitrogen)によるＲＴに用いる。定量ＰＣＲは、Roche  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０  ＩＩ（商標）およびAbgeneのＳｙｂｒｇｒｅｅｎ混合物（Ａｂ−４１６６）を用いることにより行う。マウスＡｇｏ２、Ｄｉｃｅｒ、Ｄｒｏｓｈａ、Ｇｒａｐｈおよびｐ２１のプライマーを下の表１に記載する。他のプライマーは、Takahashi, K. and S. Yamanaka (2006) Cell 126(4): 663-76に記載されている。
【００９３】
マイクロＲＮＡの定量解析では、トータルＲＮＡを、上に記載した方法を用いて抽出する。抽出後、１．５〜３μｇのトータルＲＮＡを、ＱｕａｎｔｉＭｉｒ（商標）キット（ＳＢＩ、ＲＡ４２０Ａ−１）を用い製造業者のプロトコールに従うマイクロＲＮＡ逆転写に用いる。次いで、ＲＴ産物を、正方向プライマーとしての成熟マイクロＲＮＡ配列およびキットで提供されるユニバーサルプライマーを用いる定量ＰＣＲに用いる。
【００９４】
免疫染色は次のとおり行う：細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドにより室温で２０分間固定する。固定した細胞を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００により５分間透過処理する。次いで、それらの細胞を、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳ中５％ＢＳＡにより室温で１時間ブロッキングする。一次抗体を、製造業者の提示に従って、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する２．５％ＢＳＡ  ＰＢＳにより１：１００〜１：４００に希釈する。次いで、一次抗体で細胞を１時間染色し、その後、ＰＢＳで３回洗浄する。二次抗体を１：４００希釈し、室温で４５分間細胞を染色する。
【００９５】
胚様体（ＥＢ）形成および分化のアッセイは次のとおり行う：ｉＰＳ細胞をトリプシン処理して単一の細胞懸濁液にし、懸滴法を用いて胚体を生成する。各液滴には、２０μｌのＥＢ分化培地中４０００個のｉＰＳ細胞を用いる。ＥＢを３日間懸滴培養した後、ゼラチンコーティングプレートに再播種する。再播種後、収縮を繰り返す領域がはっきりと確認される１４日目まで細胞をさらに培養する。
【００９６】
（表１）qPCR解析用プライマー
2013510576.tif 000002
【００９７】
プロモーターメチル化解析は次のとおり行う：ＮａｎｏｇおよびＰｏｕ５ｆ１プロモーターのＣｐＧメチル化を、これまでに記載されている同じ手法に従って解析する(Takahashi, K. and S. Yamanaka (2006) Cell 126(4): 663-76)。簡潔には、得られたクローンのゲノムＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ（商標）キットを用いて抽出する。次いで、１μｇのＤＮＡを、製造業者のプロトコールに従うゲノム修飾解析（ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｄｉｒｅｃｔ  ｋｉｔ、Zymo Research、Ｄ５０２０）に用いる。修飾後、選択した領域のＰＣＲを行い、それらの産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（商標）(Invitrogen)にクローニングする。各遺伝子について１０のクローンを配列決定する。
【００９８】
実施例２
奇形腫形成、キメラ作製およびマイクロアレイ解析
奇形腫形成およびキメラ作製は次のとおり行う：奇形腫を生成するために、ｉＰＳ細胞をトリプシン処理し、濃度１×１０７細胞／ｍｌで再懸濁する。無胸腺ヌードマウスにまずアベルチンで麻酔をかけ、次いで、およそ１５０μｌの細胞懸濁液を各マウスに注射する。３〜４週間、週１回マウスを腫瘍について調べる。腫瘍を採取し、パラフィン包理およびＨ＆Ｅ染色の前に亜鉛ホルマリン溶液により室温で２４時間固定する。得られたｉＰＳＣクローンがキメラに寄与する能力を試験するために、ｉＰＳ細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｙｒ（Ｃ−２Ｊ）／Ｊ（アルビノ）胚盤胞に注射する。一般的に、各胚盤胞は１２〜１８個のｉＰＳ細胞を受ける。胚移植にはＩＣＲレシピエント雌を用いる。ドナーｉＰＳ細胞はアグーチまたは黒色のいずれかである。
【００９９】
ｍＲＮＡ  マイクロアレイ解析を次のとおり行う：ｍｉＲ−９３およびｓｉＣｏｎｔｒｏｌをＭＥＦにトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後にトータルＲＮＡを採取する。ｍＲＮＡマイクロアレイをサンフォード・バーナム研究所(Sanford-Burnham institute)内のマイクロアレイ施設により実施する。潜在的機能標的（変化倍率＞２、ｐ＜０．０５）および全標的（変化倍率＞２５％、ｐ＜０．０５）の両方についての遺伝子一覧表を、ボルカノマップ(volcano maps)でフィルタリングすることにより作成する。次いで、遺伝子一覧表を、ＧｅｎｅＧｏソフトウェアを用いその会社のガイドラインに従うオントロジー解析に用いる。
【０１００】
デュアルルシフェラーゼアッセイは次のとおり行う：ｐ２１およびＴｇｆｂｒ２両方の３'ＵＴＲを、ｐＧＬ３対照ベクターのＸｂａＩ部位にクローニングする。１２ウェルプレートの各ウェルに、２００ｎｇの得られたベクターおよび５０ｎｇのｐＲＬ−ＴＫ（ウミシイタケルシフェラーゼ）を、トランスフェクションの１日前に播種した１×１０５個のＨｅｌａ細胞にトランスフェクトする。各処理に５０ｎＭのマイクロＲＮＡを用い、トランスフェクション後２日目に細胞溶解物を採取する。次いで、２０μｌの溶解物を、製造業者のプロトコール（Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  Promega、Ｅ１９１０）に従うデュアルルシフェラーゼアッセイに用いる。
【０１０１】
細胞増殖アッセイは次のとおり行う：３０００個のＭＥＦを９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、４ＦウイルスおよびｓｈＲＮＡレンチウイルスを形質導入する（またはマイクロＲＮＡ阻害剤でトランスフェクトする）。形質導入／トランスフェクション後１日目から、２日おきに、細胞をＣｅｌｌｔｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Promega、Ｇ３５８０）を含有するｍＥＳ培地とともに組織培養インキュベーター中で１時間インキュベートする。次いで、４９０ｎｍでの吸光度を各ウェルについてプレートリーダーを使用して測定し、収集データを用いて相対的増殖曲線を作成し、形質導入／トランスフェクション後１日目のシグナルを標準として用いる。
【０１０２】
実施例３
転写後調節経路は体細胞の初期化に関与する
転写後調節経路は、ＭＥＦのｉＰＳ細胞への初期化に関与することが確認された。ｉＰＳＣ誘導中の転写後遺伝子調節の役割を調査するために、マウスＤｉｃｅｒ、ＤｒｏｓｈａおよびＡｇｏ２をターゲッティングするレンチウイルスｓｈＲＮＡベクターを、初代Ｏｃｔ４−ＧＦＰ  ＭＥＦにおける安定なノックダウンに用いる。これらのｓｈＲＮＡ構築物のノックダウン効率をウエスタンおよびＲＴ−ｑＰＣＲの両方により検証する（図１ａ、図１ｂおよび図１ｃ）。各ｓｈＲＮＡではおよそ７０％〜８０％のｍＲＮＡレベルノックダウンが常に観察され、タンパク質レベルの著しい低下も観察される。
【０１０３】
次いで、ｓｈＲＮＡを個別に用いて、ＭＥＦを４種の因子ＯＳＫＭ（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃＭｙｃ）を発現するウイルスとともに体積比１：１：１：１：１で形質導入する(tranduce)。１４日後に、コロニーを固定し、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）活性（これは広く用いられているＥＳ細胞マーカーである）について染色する。各処理についてＡＰ＋コロニーを定量し、重要なＲＮＡｉ機構タンパク質Ｄｉｃｅｒ、ＤｒｏｓｈａおよびＡｇｏ２のノックダウンによりＡＰ＋コロニーがｐＬＫＯおよびｐＧＩＰＺ対照と比べて劇的に減少する。ＯＳＫ（３種の因子  ３Ｆ）形質導入を用いることによっても類似した結果が観察される。
【０１０４】
ＧＦＰ＋およびＡＰ＋コロニーの両方の定量では、Ａｇｏ２のノックダウンは初期化効率を劇的に低下させるが、一方、形質導入繊維芽細胞の増殖には影響を及ぼさないことが確認された。（図１ｄ、図１ｅおよび図１ｆ）。Ａｇｏ２ノックダウンにより初期化効率が低下するにもかかわらず、ｓｈＡｇｏ２でのいくつかのＧＦＰ＋コロニーは感染ＭＥＦであり、さらなる特性評価では、これらのコロニーはｓｈＲＮＡ組込みについて陽性でありそこではｓｈＲＮＡが活発に発現されることが判明した（図１３ａおよび図１３ｂ）。これらの細胞はまた、試験したＥＳ特異的マーカー全てを発現するが、内因性Ｏｃｔ４遺伝子座で示した（図１３ｃ）。これらのデータは、転写後調節、とりわけ、マイクロＲＮＡが初期化プロセスにおいて重要な役割を果たすことを強く示唆している。
【０１０５】
実施例４
マイクロＲＮＡクラスターは体細胞の初期化中に誘導される
マイクロＲＮＡ  ｍｉＲ−１７、２５、１０６ａおよび３０２ｂクラスターは初期化の初期段階中に誘導されることが判明している。４種の転写因子はｉＰＳＣ誘導中に多くの遺伝子発現変化を誘導するため、これらの因子によっていくつかのＥＳ特異的マイクロＲＮＡが誘導され、そして、これらの因子がＭＥＦの初期化の成功を手助けし得ると推測される。ｉＰＳＣ誘導を増強するＥＳ特異的マイクロＲＮＡに関する最新の刊行物でも、その仮説が裏付けられているが、報告されているマイクロＲＮＡは初期化の極めて終わりに近い段階まで発現が見出されなかった。公表されている結果を解析することにより、解析には、マウスＥＳ細胞において高度に発現されると判明している９種のマイクロＲＮＡクラスターを選択し、それらを表２に示す。
【０１０６】
各クラスターからの２種の代表的なマイクロＲＮＡを、ｍｉＲ  ｑＰＣＲに基づく方法を用いて評価して、異なる初期化段階（ＯＳＫＭ因子の形質導入後０日目、４日目、８日目および１２日目を含む）における発現変化を定量する。多くのＥＳ特異的マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−２９０クラスターおよびｍｉＲ−２９３クラスターなど）は、８日目まで誘導されず（図１４）、この段階においてＧＦＰ＋コロニーはすでに検出できる。いくつかの他のマイクロＲＮＡクラスター（ｍｉＲ−１７〜９２、２５〜１０６ｂ、１０６ａ〜３６３および３０２ｂ〜３６７を含む）は、４種の因子の形質導入後４日目までに様々な程度に発現される（図２ａ）。これらの４種のマイクロＲＮＡクラスターの間では、ＭＥＦにおけるｍｉＲ−３０２ｂ〜３６７のレベルが最も低い。初期化４日目に高度に誘導される３種のクラスターの間では、一部に非常に類似したシード領域の共有があり（図２ｂ）、それらが初期化において作用し、類似した遺伝子セットをターゲッティングすることができることを示唆している。
【０１０７】
（表２）iPSC実験に用いたマイクロRNAの一覧表
2013510576.tif 000003
【０１０８】
次いで、４種の因子のどの因子がこれらのマイクロＲＮＡの誘導に関与しているかを判定するために解析を行う。同じ用量の４種の因子の種々の組合せをＭＥＦに形質導入することにより、ｍｉＲ  ｑＰＣＲ解析のために感染後４日目にトータルＲＮＡを採取する（図２ｃ）。この解析により、ｃＭｙｃ単独でｍｉＲ−１７〜９２、ｍｉＲ−２５〜１０６ｂおよびｍｉＲ−１０６ａ〜３６３クラスターの発現を誘導することができることが確認される。しかしながら、全ての場合において、４種の初期化因子全ての組合せがマイクロＲＮＡクラスターの最も豊富な発現を誘導し、その強い発現は最大の初期化効率と相関している（図２ｃ）。
【０１０９】
これらの結果により、３種のマイクロＲＮＡクラスター（ｍｉＲ−１７〜９２、２５〜１０６ｂ、１０６ａ〜３６３を含む）は初期化の初期段階中に誘導されること、さらに、これらのマイクロＲＮＡの発現は４種の因子組によって最も高度に誘導されるが、単一因子でも程度は劣るもののそれらの発現を誘導することができることが確認された。
【０１１０】
実施例５
マイクロＲＮＡはｉＰＳＣ誘導を増強する
マイクロＲＮＡ  ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂは、マウスｉＰＳＣ誘導を増強することが判明している。確認されている４種のマイクロＲＮＡクラスターは、類似したシード領域を有するいくつかのマイクロＲＮＡを含むため、ｍｉＲ−１０６ｂ〜２５クラスターが３種のマイクロＲＮＡ（すなわち、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂ）を含むことからこのクラスターをさらに解析する。ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂは同一シード領域を有し、両方とも４種の初期化因子によって高度に誘導される（図２ａ）。これらのマイクロＲＮＡが初期化細胞で機能しているならば、そのプロセス中にこれらのマイクロＲＮＡを導入することによりｉＰＳＣ誘導の効率向上が期待されることとなる。
【０１１１】
これらの誘導されたマイクロＲＮＡの機能試験には、マイクロＲＮＡミミックをＭＥＦに直接トランスフェクトする戦略を用いる（図３ａ）。マイクロＲＮＡを４種の因子（またはＯＳＫ）ウイルスとともに２回、０日目および５日目に導入し、内因性Ｏｃｔ４プロモーターの制御下でＧＦＰ発現するレポーターＭＥＦを用いた。例えば、０日目および５日目に、マイクロＲＮＡミミックを、４種の因子（４Ｆ、ＯＳＫＭ）全てまたは単独のＯｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４（ＯＳＫ）のいずれかを発現するベクターとともに、Ｏｃｔ−４−ＧＦＰを保有しているＭＥＦに直接トランスフェクトし、ＧＦＰ発現に基づいて初期化をアッセイする。これらの細胞がｉＰＳＣへの初期化に成功したら、それらはＧＦＰ陽性（＋）となる。１１日目頃にＧＦＰ＋コロニーを定量して、初期化効率を評価する（図３ｂ；表３）。実際には、ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂミミックのトランスフェクションによって４Ｆ形質導入およびＯＳＫ形質導入の両方でＧＦＰ＋コロニーの約４〜６倍増加となり（図３ｃ）、ｉＰＳＣ誘導中に誘導されるこれらのマイクロＲＮＡはＭＥＦ初期化を促進することが確認された。
【０１１２】
（表３）iPSC誘導に関するmiRによるGFP+コロニー数
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＊  12ウェルプレート(ゼラチンコーティング処理)に4x104個MEF/ウェル
【０１１３】
用量依存実験は、５〜１５ｎＭの範囲ほどの低いｍｉＲで初期化効率の向上が見られることを示している（図７）。コロニーをアルカリ性ホスファターゼ基質で染色すると、ｍｉＲミミックトランスフェクションでのＡＰ＋コロニーの著しい増加はないようであり、ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂはｉＰＳＣコロニーの成熟プロセスを促進することができることが示唆される。このことは、ＯＳＫ系を用いて観察される現象（ｍｉＲミミックトランスフェクト細胞ではＯＳＫ形質導入後１５日目に多くのＧＦＰ＋コロニーが現われるが、一方、対照ウェルではこの段階において成熟したｉＰＳＣコロニーを全く示さなかった）によっても裏付けられる。
【０１１４】
これらのマイクロＲＮＡがｉＰＳＣ誘導において重要であることを確認するために、ｍｉＲ阻害剤を用いて、そのプロセス中に標的とするマイクロＲＮＡのノックダウンも行う。試験したｍｉＲ阻害剤の全ては標的ｍｉＲ発現を効率的に減少させることができ、それらのトランスフェクションは増殖に影響を及ぼさない（図１６ａおよび図１６ｂ）。ｍｉＲミミック実験と一致して、ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂのノックダウンによってＧＦＰ＋コロニーの劇的な減少が促され得る（図３ｄ）。ｍｉＲ−２５ミミックはＭＥＦのｉＰＳＣ誘導を増強しないが、このマイクロＲＮＡのノックダウンにより初期化効率が約４０％低下し（図３ｄ）、ｍｉＲ−２５は初期化プロセス中にも作用し得ることが示唆される。対照として、Ｌｅｔ７ａ阻害剤は、初期化効率に対していかなる影響も及ぼさなかった。これらのデータは、ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂがＭＥＦのｉＰＳＣへの初期化を促進することを強く示している。初期化効率は、ｉＰＳＣ誘導中にこれらのマイクロＲＮＡをモジュレートすることによってさらに高め得る。
【０１１５】
実施例６
マイクロＲＮＡにより誘導されたクローンは完全な多能性を有する
誘導された細胞が完全な多能性状態に達するかどうかを調べるために、各マイクロＲＮＡならびにｍｉＲ対照についていくつかのｉＰＳＣクローンを得、多能性マーカーの発現について解析する。全てのクローンはＧＦＰ＋（再活性化されるＯｃｔ４発現を示す）である。免疫染色により、ＮａｎｏｇおよびＳＳＥＡ１も全てのクローンにおいて活性化されることが確認された。他のｍＥＳマーカー（Ｅｒａｓ、ＥＣａｔ  Ｉおよび内因性(endogeneous)Ｏｃｔ４など）についてのＲＴ−ｑＰＣＲは類似した結果を示す。全ゲノムｍＲＮＡ発現プロファイリングでも、得られたクローンがＭＥＦよりもマウスＥＳ細胞に類似した遺伝子発現パターンを示すことを示す。内因性Ｎａｎｏｇ遺伝子座のプロモーターメチル化を解析し、試験したクローンは全て、マウスＥＳ細胞で観察されるように、脱メチル化プロモーターを示した（図１７）。
【０１１６】
得られたクローンがｍＥＳ細胞の完全分化能を示すかどうかを調査するために、胚様体（ＥＢ）形成を評価する。得られたクローンは全て、効率的なＥＢ形成を示し、ＥＢは系統マーカー（β−チュブリンＩＩＩ（外胚葉）、ＡＦＰ（内胚葉）およびα−アクチニン（中胚葉）など）について陽性染色を示す。これらの細胞から収縮を繰り返すＥＢも得られ、これは、これらのｍｉＲ−ｉＰＳＣクローンから機能的な心筋細胞が誘導され得ることを示す。これらのｍｉＲ−ｉＰＳＣを無胸腺ヌードマウスに注射すると、３〜４週間で奇形腫が容易に誘導される。最後に、より厳しい試験として、ｍｉＲにより誘導されたｉＰＳＣクローンをアルビノ／黒色Ｂ６胚盤胞に注射し、キメラマウスを作製する。さらに、これらの細胞は、得られたＥ１３．５胚の生殖隆起に寄与し得た。これらの結果は、初期化に対するｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂの促進作用は誘導された多能性細胞の分化能を変更しないこと、そして得られたクローンは３種の生殖細胞系全てに分化することができることを示す。
【０１１７】
実施例７
ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂはマウスにおいてＴｇｆｂｒ２およびＰ２１をターゲッティングする
ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂによる初期化効率向上の基礎にある機構をさらに理解するために、これらのマイクロＲＮＡの細胞標的を調査する。ｍｉＲ−９３がｍｉＲ−１０６ｂと同じシード領域を共有することから、まず解析にそれを選択する。ｍｉＲ−９３ミミックをＭＥＦにトランスフェクトし、ｍＲＮＡ発現プロフィール解析のために２日目にトータルＲＮＡを採取する。その解析は、公表されているＭＥＦおよびｉＰＳＣの発現プロフィールと比べてｍｉＲ−９３の潜在的機能標的を同定する。ｍｉＲ−９３トランスフェクションにより著しく減少した遺伝子は、ｉＰＳＣにおいて低度に発現される遺伝子の３倍の濃縮を示し（図１８ａ）、一方、ｍｉＲ−９３トランスフェクションにより増加した遺伝子はそのような濃縮を示さない。加えて、ｍｉＲ−９３トランスフェクトＭＥＦの発現プロフィールについて経路オントロジー解析を行う。興味深いことに、ｉＰＳＣ誘導の２つの重要な経路は、ｍｉＲ−９３：ＴＧＦ−βシグナル伝達経路およびＧ１／Ｓ移行経路により調節される。
【０１１８】
ＴＧＦ−βシグナル伝達では、ｍｉＲ−９３トランスフェクションにより最も著しく減少した遺伝子の１つにＴｇｆｂｒ２がある。Ｔｇｆｂｒ２は、ＴＧＦ−βシグナル伝達において重要な役割を果たす構成的に活性な受容体キナーゼであり、最近の小分子スクリーニングにより、そのヘテロ二量体パートナーであるＴｇｆｂｒ１の阻害剤がｉＰＳＣ誘導を増強することが示されている。マイクロＲＮＡ標的部位予測により、ｍｉＲ−９３およびそのファミリーであるマイクロＲＮＡでは２つの保存されたターゲッティング部位がその３'ＵＴＲに存在することが示されている。そのため、さらなる調査のために、ｍｉＲ−９３が第１の標的候補として選択される。
【０１１９】
Ｇ１／Ｓ移行に関しては、ヒト固形腫瘍サンプル（乳房、結腸、腎臓、胃および肺）および胃癌細胞株における最近の結果により、ｍｉＲ−１０６ｂ〜２５クラスターは細胞周期調節因子（ＣＤＫ阻害剤ｐ２１およびｐ５７など）をターゲッティングすることができること、そしてヒトおよびマウスｐ２１が３'ＵＴＲの保存されたｍｉＲ−９３／１０６ｂ標的部位を共有することが示されているため、潜在的標的としてｐ２１が選択される。
【０１２０】
さらに、マウスＥＳ細胞特異的マイクロＲＮＡクラスター（ｍｉＲ−２９０およびｍｉＲ−２９３クラスターを含む）はまた、いくつかのＧ１−Ｓ期移行負調節因子（ｐ２１を含む）をターゲッティングすることも提示された。加えて、ｍｉＲ−２９０および２９３クラスターマイクロＲＮＡはｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂと非常に類似したシード領域を共有する。そのため、ｐ２１も標的候補として解析する。さらに、ｐ２１は、ｉＰＳＣ誘導の初期段階中に４種の因子ＯＳＫＭにより大幅に誘導される（図８ａ）。詳細な解析により、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２の組合せはｐ２１レベルの著しい変化を示さないため、ｐ２１の誘導が主にＫｌｆ４およびｃＭｙｃの過剰発現によることが明らかになっている（図８ａ）。
【０１２１】
マウスＴｇｆｂｒ２およびｐ２１がｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂによってターゲッティングされるかどうかを確認するために、ｍｉＲミミックをＭＥＦにトランスフェクトし、４８時間後にウエスタンブロッティングにより全細胞溶解物を解析する。実際には、ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂは、Ｔｇｆｂｒ２およびｐ２１両方のタンパク質レベルを効率的に低下させ（図５ａおよび図５ｄ）、さらにｐ２１  ｍＲＮＡレベルを約２５〜３０％低下させ、Ｔｇｆｂｒ２  ｍＲＮＡレベルを約６０〜７０％低下させる（図１９）。ｐ２１がｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂの直接標的であるかどうかをさらに調査するために、ルシフェラーゼアッセイ（ｐ２１  ３'ＵＴＲ配列を有するルシフェラーゼレポーターがホタルルシフェラーゼコード配列の下流に挿入される）を行う。ルシフェラーゼアッセイによって、ｍｉＲミミックをＨｅｌａ細胞にトランスフェクトすることによりルシフェラーゼ活性の一貫した約４０％の抑制が達成され得ることが明らかになっている。また、保存されたｐ２１  ３'ＵＴＲ標的部位のシード領域に突然変異が導入されると、マイクロＲＮＡミミックの抑制が完全に破壊され得ることも判明している（図１０）。Ｔｇｆｂｒ２については、ルシフェラーゼアッセイでＧＬ活性の約５０％減少も示し、一方、ｍｉＲ−９３変異株にはそのような影響はない（図１１）。
【０１２２】
ｐ２１により促進される細胞周期停止によって初期化に必要な後成的修飾が阻害され得るが、増殖中の細胞においてそのような修飾がより起こりやすいためである。ｐ２１発現がｉＰＳＣ誘導に支障をきたすかどうかを判定するために、ＨＡタグ付きｐ２１  ｃＤＮＡをｐＭＸレトロウイルス主鎖にクローニングし、ＭＥＦ細胞で過剰発現させる。ＨＡ−ｐ２１ウイルスを４種のＯＳＫＭ因子とともにＭＥＦに導入すると、アルカリ性ホスファターゼ染色とＯｃｔ４−ＧＦＰ陽性コロニー形成に基づいて、ｉＰＳＣ誘導のほぼ完全な阻害が観察される（図９ａ）。初期化に３種のＯＳＫ因子を用いる場合も類似した結果が得られる（図９ｂ）。
【０１２３】
解析により、ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂがＴｇｆｂｒ２およびｐ２１の発現両方を効率的に抑制することが示されているため、Ｔｇｆｂｒ２およびｐ２１の両方を、それらの活性が初期化に拮抗し得るかどうかをさらに調査する。マイクロＲＮＡミミックで使用した同じ実験時系列を用いて、Ｔｇｆｂｒ２またはｐ２１  ｓｉＲＮＡをＭＥＦにトランスフェクトする。ウエスタンブロッティングおよびＲＴ−ｑＰＣＲでは、ウイルス形質導入を行わずにｓｉＲＮＡによって、それぞれ、タンパク質およびｍＲＮＡレベルの両方が効率的にノックダウンされることが確認される（図５ｂおよび図５ｅ）。次いで、ＯＳＫＭ形質導入によりＭＥＦ初期化を開始し、形質導入後１１日目にＯｃｔ４−ＧＦＰ＋コロニーを定量する。各遺伝子についてコロニー数の約２倍の誘導が観察される（図５ｃおよび図５ｆ）。同時に、我々のデータによって、Ｔｇｆｂｒ２およびｐ２１がｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂの直接標的であり、これらの遺伝子のダウンレギュレーションにより初期化プロセスを促進し得ることが確認される。
【０１２４】
実施例８
ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂトランスフェクションから得られたｉＰＳＣクローンの多能性
ｍｉＲ−９３および１０６ｂは、マウスｉＰＳＣ誘導を増強する能力について確認されたが、誘導された細胞が完全な多能性状態に達するかどうかという問題が残っている。この問題に答えるために、各マイクロＲＮＡならびにｍｉＲ対照についていくつかのｉＰＳＣクローンを得て、多能性マーカーおよび分化能を解析する。これらの得られたクローンは全てＧＦＰ＋（Ｏｃｔ４遺伝子座の再活性化を示す）である。免疫染色により、ＮａｎｏｇおよびＳＳＥＡ１もこれらの細胞において活性化されることも確認された。他のｍＥＳマーカーについてのＲＴ−ｑＰＣＲは類似した結果を示す。全ゲノムｍＲＮＡ発現プロフィールでも、これらの得られたクローンがＭＥＦではなくｍＥＳと非常に類似した遺伝子発現パターンを有することを示す。内因性Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇ遺伝子座のプロモーターメチル化も解析し、試験したクローンは全て、脱メチル化プロモーター有することが観察された。
【０１２５】
得られたクローンがｍＥＳ細胞の完全分化能を有するかどうかを調査するために、胚体形成を最初の試験として用いる。得られたクローンは全て、効率的なＥＢ形成を生じ、それらのＥＢは系統マーカー染色について陽性であると判明している。これらの細胞から収縮を繰り返すＥＢも得られる。
【０１２６】
最後に、より厳しい試験として、これらの得られたクローンを注射して、それらがキメラマウスに寄与するかどうかを調べる。実際には、試験したクローン全てからキメラが得られる。これらの結果は、初期化に対するｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂの促進作用は誘導された細胞の能力を変化させないこと、さらにＥＳ様状態に達した誘導クローンは３種の系統全てに分化することができることを示す。
【０１２７】
実施例９
他のマイクロＲＮＡのアップレギュレーションもｉＰＳＣ誘導を増強する
本明細書において論じるように、３種のマイクロＲＮＡクラスターは、ｉＰＳＣ誘導中に４種の因子により誘導されると確認され、これらのクラスター内のいくつかのマイクロＲＮＡは、同じシード領域を有すると判明しており、それらは類似したｍＲＮＡをターゲッティングすることが示されている（図２）。ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂと同じシード領域を共有する他のマイクロＲＮＡがｉＰＳＣ誘導を同様に増強することができるかどうかを調査するために、ｍｉＲ−１７およびｍｉＲ−１０６ａのマイクロＲＮＡミミックを、ｍｉＲ−９３ミミック処理およびｉＰＳＣ誘導について上に記載したものと類似した試験手法を用いて試験する。実際には、これらのマイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−１０６ｂ〜２５クラスターで見られたものと同様に初期化を促進し（図６ａ）、これらのｍｉＲのトランスフェクション全てで、Ｔｇｆｂｒ２およびｐ２１タンパク質レベルの低下が起こる（図６ｂおよび図６ｃ）。
【０１２８】
同時に、これらの結果は、ｍｉＲ−１７〜９２、ｍｉＲ−１０６ｂ〜２５およびｍｉＲ−１０６ａ〜３６３クラスターの誘導は正確な初期化に重要であること、そしてこれらのマイクロＲＮＡのアップレギュレーションはｉＰＳＣ生成プロセスへの初期化障壁を低くすることを示唆している（図６ｄ）。よって、これらのマイクロＲＮＡの細胞内レベルを操作して、初期化効率を向上させ得る。
【０１２９】
実施例１０
ｉＰＳＣ初期化機構
得られたクローンは、内因性Ｏｃｔ４−ＧＦＰ発現を活性化することは分かっている。マイクロＲＮＡミミックとのＯＳＫＭ形質導入後１２日目からコロニーを採取し、照射ＭＥＦフィーダープレート上で維持する。内因性ｐｏｕ５ｆ１遺伝子座のＧＦＰシグナルとして緑色蛍光を観察することができる。クローンは、ＥＳ特異的マーカーのアルカリ性ホスファターゼ染色および免疫染色（ＮａｎｏｇおよびＳＳＥＡ１染色に基づく）を用いて示すことができる。核染色にはＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を用いることができる。３胚葉全てからの細胞は、誘導ｉＰＳＣクローンを用いる胚様体（ＥＢ）アッセイで得ることができる。ＥＢ形成のためにｉＰＳ細胞を約４０００個の細胞／２０μｌ液滴で３日間培養し、次いで、収縮を繰り返す心筋細胞が観察される１２〜１４日目までさらに培養するために、ＥＢをゼラチンコーティングプレート上に再播種する。異なる系統マーカー（外胚葉マーカーのβ−チュブリンＩＩＩ；内胚葉マーカーのＡＦＰ；および中胚葉マーカーのα−アクチニンを含む）で細胞を免疫染色することができる。奇形腫は、ｉＰＳ細胞の注射により生成することができ、１５０万個の細胞を各マウスに注射し、パラフィン包理およびＨ＆Ｅ染色のために注射の３〜４週間後に腫瘍を採取する。誘導クローンを用いて、キメラマウスを作製することもできる。ｉＰＳ細胞をアルビノまたは黒色Ｃ５７Ｂ６マウス（ＮＣＩ）の胚盤胞に注射し、ｉＰＳＣの寄与はアグーチまたは黒色の毛色により見ることができる。
【０１３０】
１２日目の初期化細胞はアルカリ性ホスファターゼ基質によって染色され得る。本発明によれば、ｍｉＲミミックトランスフェクションによりＡＰ＋コロニーの著しい増加は起こらないが、ｍｉＲ−９３および１０６ｂのノックダウンによってＡＰ＋コロニーだけでなくＧＦＰ＋コロニーの著しい減少が生じることとなる。マイクロＲＮＡミミックはＡＰ＋コロニー形成全体に影響を及ぼさないが、一方、阻害剤は影響を及ぼす。
【０１３１】
ＭＥＦはｉＰＳ細胞に初期化することができるという発見以降、このすばらしいプロセスの基本的機構の理解に多くの努力が傾けられてきた。本明細書に記載した結果によって、転写後遺伝子調節が初期化中に直接関与すること、そしてＲＮＡｉ機構への干渉により初期化効率を著しく変更することができることが初めて確認された。加えて、前の実施例に示されるように、３種のマイクロＲＮＡクラスターは、ｉＰＳ細胞を誘導するために用いられる４種の因子によって著しくアップレギュレートされ、これらのクラスター内のマイクロＲＮＡは少なくとも２つの重要な経路：ＴＧＦ−βシグナル伝達および細胞周期制御をおそらくターゲッティングする。
【０１３２】
この研究は続行されているが、いくつかの最近の報告では数種の下流腫瘍抑制遺伝子（ｐ２１など）を含むｐ５３経路がｉＰＳＣ誘導中の大きな障壁の１つであることも確認された。４種の因子（ＯＳＫＭ）の異所発現によりｐ５３が容易にアップレギュレートされ、細胞防御プログラムの連続反応（細胞周期停止、アポトーシスまたはＤＮＡ損傷応答など）が開始されることを示す多くの証拠もある。これらの防御応答はおそらく低初期化効率（約０．１％前後と考えられる）の根底にある。しかしながら、これらのデータは、初期化に成功した細胞がいかにして細胞障壁を克服してｉＰＳ細胞になるかを説明していない。本明細書に記載した実施例は、初期化の成功に拮抗する経路をターゲッティングするマイクロＲＮＡの発現を誘導することによって、これらの細胞が、全てではないが少なくとも一部において障壁を克服し得ることを示している。初代繊維芽細胞におけるマイクロＲＮＡレベルをモジュレートすることによって、初期化効率の著しい向上が達成され得る。
【０１３３】
ＴＧＦ−βシグナル伝達は、原腸形成、器官特異的形態形成および組織ホメオスタシスのような多様なプロセスにおいて機能する重要な経路である。標準的なＴＧＦ−β形質導入の現行モデルによって、ＴＧＦ−βリガンドはＴＧＦ−β受容体ＩＩ（Ｔｇｆｂｒ２）と結合し、次いで、それが、Ｔｇｆｂｒ１とヘテロ二量体を形成して受容体関連Ｓｍａｄｓによりシグナルを伝達することが示されている。ＴＧＦ−βシグナル伝達は、ヒトおよびマウスＥＳ細胞自己複製、の両方で機能することが報告されており、ＦＧＦ２は、ＥＳ細胞培養に広く用いられている増殖因子であり、ＴＧＦ−βリガンド発現を誘導し、ＢＭＰ様活性を抑制する。化学阻害剤によるＴＧＦ−β受容体Ｉファミリーキナーゼの遮断はＥＳ細胞自己複製に支障をきたす。そのような阻害剤は初期化中に全く異なる役割を果たすと思われるため、これらの発見はｉＰＳＣ誘導に特に重要である。最近の化学スクリーニングでは、ＴＧＦ−β受容体Ｉ（Ｔｇｆｂｒ１）の小分子阻害剤はｉＰＳＣ誘導を実際に増強し、Ｎａｎｏｇ発現を誘導することによってＳｏｘ２の必要条件の代わりとし得ることが示された。さらに、ＴＧＦ−βリガンドによる初期化中の細胞の処理はｉＰＳＣ誘導に対して悪影響を及ぼす。よって、ＴＧＦ−βシグナル伝達はＥＳ細胞自己複製に重要であるが、初期化にとっては障壁である。本発明によれば、Ｔｇｆｂｒ１に加えて、構成的に活性なキナーゼＴｇｆｂｒ２の活性もまた初期化に拮抗することとなる。また、本発明によれば、ｍｉＲ−９３およびそのファミリーメンバーはＴｇｆｂｒ２を直接ターゲッティングして、そのシグナル伝達と初期化をモジュレートすることとなる。
【０１３４】
Ｐ２１（これは１６５アミノ酸しか含まない低分子タンパク質である）は、ｐ５３依存性Ｇ１増殖停止を引き起こし分化および細胞老化を促進することにより癌発生中の腫瘍抑制遺伝子として長年にわたり認められてきた。本発明によれば、４種の因子（ＯＳＫＭ）がＭＥＦ細胞に導入されるとｐ２１発現はアップレギュレートされるが、ｐ２１の過剰発現によりｉＰＳＣ誘導がほぼ完全に遮断される（図９）ため、このアップレギュレーションは初期化プロセスに拮抗することとなる（図８）。Ｋｌｆ４初期化因子がｐ２１プロモーターと結合しｐ２１転写を増加させるため、初期化中の細胞におけるｐ２１の誘導は  ｐ５３に依存することがあるがｐ５３に依存しないこともある。
【０１３５】
同じ転写因子がｉＰＳＣ誘導を促進することがあり、ｉＰＳＣ誘導に拮抗することもあることから、これは４種の初期化因子の機能についての興味深い問題を提起している。実際には、ある特定レベルのｐ２１誘導が初期化プロセスにとって有益であるという可能性を除外することができる証拠は現在ない。ｐ２１は、ｐ５３依存性細胞周期停止における周知の役割の他に、若干の発癌活性を有することも報告されている。例えば、ｐ２１は、アポトーシス（細胞周期制御におけるその通常の機能とは無関係の機能）から細胞を保護することにより発癌活性を有する。
【０１３６】
初期化におけるｐ２１の潜在的利益は、タンパク質−タンパク質相互作用を通じて遺伝子発現を調節する能力に依存し得る。例えば、ｐ２１は、アポトーシスに関与するいくつかのタンパク質（カスパーゼ８、カスパーゼ１０およびプロカスパーゼ３など）と直接結合することができる。別の例では、ｐ２１は、Ｍｙｃ  Ｎ末端と結合してＭｙｃ−Ｍａｘヘテロ二量体形成を遮断することにより、Ｍｙｃのアポトーシス促進作用のサプレッサーでもある。実際には、Ｍｙｃ自体がＭＥＦにおいて過剰発現されると、細胞培養物では細胞死の著しい増加が認められるが、一方、４種の因子を形質導入した細胞では、細胞死はｍｙｃだけのサンプルと比べて最小限にとどまる。従って、ｐ２１の誘導は、初期化プロセスの障壁となり得るが、細胞アポトーシスを減少させるのに必要なある特定レベルのｐ２１を維持し得るため初期化効率を向上させ得る。
【０１３７】
ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂのトランスフェクションはｐ２１  ｓｉＲＮＡトランスフェクションよりも初期化に対する促進効果が高く、その際、ｍｉＲ−９３および１０６ｂはｐ２１  ｓｉＲＮＡほどｐ２１の発現を抑制しなかったため、本明細書において示すデータはこの仮説を裏付ける部分的証拠ともいえる。しかしながら、この効果は、これらのマイクロＲＮＡによる、Ｔｇｆｂｒ２およびｐ２１を含む複数のタンパク質のターゲッティングによるものである可能性もある。
【０１３８】
マイクロＲＮＡは通常複数の細胞タンパク質をターゲッティングするため、ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂの促進効果は、初期化に関与するさらなる遺伝子を見つける機会を与え、そのプロセスがより理解される。実際には、ｐ２１の他に、Ｇ１−Ｓ期移行の負の調節因子であると報告されているいくつかの他の遺伝子もｍＲＮＡ転写物の３'ＵＴＲ領域にｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂ標的部位を有する（Ｒｂ１、Ｒｂｌ１、Ｒｂｌ２およびＬａｔｓ２など）。ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂの、報告されている別の興味深い標的は転写因子Ｅ２Ｆ１であり、この転写因子は多くのヒト腫瘍サンプルにおいて脱制御され過活性化されることがよく見られる。Ｅ２Ｆ１の１つの重大な機能は、ＡＲＦおよびＩＮＫ４ａをコードするＣＤＫＮ２Ａ遺伝子座の発現を活性化することである。Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ遺伝子座もまた初期化効率を阻害し得る。よって、本発明によれば、ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂのトランスフェクションはＥ２Ｆ１をターゲッティングし、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子座を活性化する可能性を低くして初期化の障壁を下げることができることとなる。
【０１３９】
最後に、ｍｉＲ−１７〜９２、ｍｉＲ−１０６ｂ〜２５およびｍｉＲ−１０６ａ〜３６３クラスターはマウスとヒトとの間で完全に保存される。よって、本発明によれば、ｍｉＲ−９３およびｍｉＲ−１０６ｂの促進効果はヒト初期化にも適用し得ることとなる。
【０１４０】
実施例１１
マイクロＲＮＡはｉＰＳ細胞初期化をモジュレートする
マウス胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ）誘導：Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰ  ＭＥＦは、マウス株Ｂ６；１２９Ｓ４−Ｐｏｕ５ｆ１ｔｍ２（ＥＧＦＰ）Ｊａｅ／Ｊ（Jackson laboratory；ストック番号００８２１４）から、ＷｉＣｅｌｌ研究所のウェブサイト(www.wiCell.org/)で提供されているプロトコールを用いて得る。Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰ  ＭＥＦを、ＭＥＦ完全培地（１０％ＦＢＳ、非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミン含有、ピルビン酸ナトリウム不含のＤＭＥＭ）が入った０．１％ゼラチンコーティングプレートで維持する。
【０１４１】
レトロウイルスを用いた初期化：４Ｘ１０４個のＯｃｔ４−ＥＧＦＰ  ＭＥＦにｐＭＸレトロウイルスを形質導入して、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃ(Addgene)を誤発現させる。２日後に、形質導入Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰ  ＭＥＦにＥＳ培地（１５％ＥＳ−ｓｃｒｅｅｎｅｄ  ＦＢＳ、非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミン、モノチオグリセロールおよび１０００Ｕ／ｍｌ  ＬＩＦ含有のＤＭＥＭ）を供給し、１日おきに培地を換える。特に断りのない限り、形質導入の約２週間後に、蛍光顕微鏡検査法によって初期化幹細胞（ＥＧＦＰ＋ｉＰＳＣコロニーと定義される）にスコアをつける。ｉＰＳＣを得るために、実体顕微鏡(Leica)下でＥＧＦＰ＋コロニーを手作業で採取する。
【０１４２】
マイクロＲＮＡ阻害剤またはｓｉＲＮＡトランスフェクション：ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−２１、およびｍｉＲ−２９ａマイクロＲＮＡの阻害剤は、Dharmaconから購入する。４Ｘ１０４個のＯｃｔ４−ＥＧＦＰ  ＭＥＦをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅおよび阻害剤で、製造業者の教示(Invitrogen)に従いトランスフェクトする。３〜５時間後に、培地を捨て、ＭＥＦ完全培地に替える；初期化では、初期化因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃ）をコードするレトロウイルスを加え、翌日培地を完全培地に替える。特に断りのない限り、トランスフェクション／形質導入後５日目に、阻害剤またはｓｉＲＮＡを再度導入する。
【０１４３】
ノーザン解析では、１×１０５個のＯｃｔ４−ＥＧＦＰ  ＭＥＦをトランスフェクトし、５日後に採取する。トータルＲＮＡをＴＲＩＺＯＬ(Invitrogen)により単離し、約９μｇのトータルＲＮＡを１４％変性ポリアクリルアミドゲル(National Diagnostics)上で分離する。ＲＮＡをＨｙｂｏｎｄ−ＸＬ膜(GE healthcare)上に転写し、マイクロＲＮＡを同位体標識した特異的ＤＮＡプローブにより検出する。シグナル強度をホスホイメージャーにより視覚化し、Ｍｕｌｔｉ  Ｇａｕｇｅ  Ｖ３．０(FUJIFILM)を用いて解析する。マイクロＲＮＡシグナル強度を、Ｕ６  ｓｎＲＮＡのものに対して正規化する。実験は３反復で実施する。
【０１４４】
ウエスタン解析では、１×１０５個のＯｃｔ４−ＥＧＦＰ  ＭＥＦをトランスフェクトし、５日後に採取する。トータルタンパク質をＭ−ＰＥＲバッファー(Pierce)で調製し、同量のトータルタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離する。タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、次の抗体を用いてバンドを検出する：ＧＡＰＤＨ（Santa Cruz；カタログ番号ｓｃ−２０３５７）、ｐ５３（Santa Cruz；カタログ番号ｓｃ−５５４７６）、ＰＩ３キナーゼｐ８５（Cell Signaling；カタログ番号４２５７）；Ｃｄｃ４２（Santa Cruz；カタログ番号ｓｃ−８４０１）；ｐ−ＥＲＫ１／２（Cell Signaling；カタログ番号９１０１）；ＥＲＫ１／２（Cell Signaling；カタログ番号９１０２）；ｐ−ＧＳＫ３β（Cell Signaling；カタログ番号９３２３）；ＧＳＫ３β（Cell Signaling；カタログ番号９３１５）；βアクチン（Thermo Scientific；カタログ番号ＭＳ−１２９５）。シグナル強度を、Ｍｕｌｔｉ  Ｇａｕｇｅ  Ｖ３．０(FUJIFILM)により定量し、ＧＡＰＤＨまたはβアクチンに対して正規化する。実験は３〜５回繰り返す。
【０１４５】
in vitro分化および奇形腫形成アッセイ：in vitro分化では、ｉＰＳＣをトリプシン／ＥＤＴＡにより解離し、胚様体（ＥＢ）培地（１５％ＦＢＳ、非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミン含有のＤＭＥＭ）中に終濃度５Ｘ１０４細胞／ｍｌに再懸濁する。ＥＢ形成を誘導するために、逆さにしたペトリ皿の蓋で２０μｌ中１０００個のｉＰＳ細胞を懸滴培養する。３〜５日後に、ＥＢを採取し、ウェル当たり約１０個のＥＢで０．１％ゼラチンコーティングした６ウェルプレートに転写する。ＥＢ形成の２週間後に、収縮を繰り返す心筋細胞（中胚葉）が顕微鏡により確認される。内胚葉および外胚葉から得られた細胞は、それぞれ、α−フェトプロテイン（R&D；カタログ番号ＭＡＢ１３６８）抗体およびニューロン特異的βＩＩＩ−チュブリン（abcam；カタログ番号ａｂ７７５１）抗体によって確認した。
【０１４６】
奇形腫アッセイでは、１．５Ｘ１０６個のｉＳＰＣをトリプシン処理し、１５０μｌに再懸濁し、次いで、アベルチンで麻酔をかけた無胸腺ヌードマウスの後肢背面に皮下注射する。３週間後に、マウスを犠牲にして、奇形腫を採取する。腫瘍塊を固定し、切開し、サンフォード・バーナム研究所にあるＣｅｌｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ−Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ｃｏｒｅ施設内で解析する。
【０１４７】
キメラ解析：採取の２時間前にｉＰＳＣ培地を換える。トリプシン処理したｉＰＳＣを０．１％ゼラチンコーティングプレートで３０分間培養して、フィーダー細胞を除去する。ｉＰＳＣをＥ３．５  Ｃ５７ＢＬ／６−ｃＢｒｄ／ｃＢｒｄ胚盤胞に注射し、次いで、偽妊娠したレシピエント雌へ移す。生後、子の毛色によりｉＰＳＣの寄与を評価する：黒色はｉＰＳＣに由来する。
【０１４８】
免疫蛍光およびアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）染色：ｉＰＳＣを０．１％ゼラチンコーティングした６ウェルプレートに播種し培養する。４日後に、細胞を４％パラホルムアルデヒド（Electron Microscopy Sciences；カタログ番号１５７１０−Ｓ）により固定する。免疫蛍光染色では、固定した細胞をＰＢＳ中０．１％Ｔｒｉｘｔｏｎ  Ｘ−１００により透過処理し、５％ＢＳＡ／ＰＢＳによりブロッキングする。ＳＳＥＡ−１（R&D；カタログ番号ＭＡＢ２１５５）およびＮａｎｏｇ（R&D；カタログ番号ＡＦ２７２９）に対する抗体をＥＳマーカーとする。核をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２染色(Invitrogen)により視覚化する。ＡＰ染色では、アルカリ性ホスファターゼ基質を用い製造業者の教示に従って（Vector Laboratories；カタログ番号ＳＫ−５１００）固定した細胞を処理する。
【０１４９】
実施例１２
ｍｉＲ−２１またはｍｉＲ−２９ａの阻害は初期化効率を高める
マウス胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ）誘導：Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰ  ＭＥＦは、マウス株Ｂ６；１２９Ｓ４−Ｐｏｕ５ｆ１ｔｍ２（ＥＧＦＰ）Ｊａｅ／Ｊ（Jackson laboratory；ストック番号００８２１４）から、ＷｉＣｅｌｌ研究所のウェブサイト(www.wiCell.org/)で提供されているプロトコールを用いて得る。Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰ  ＭＥＦを、ＭＥＦ完全培地（１０％ＦＢＳ、非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミン含有、ピルビン酸ナトリウム不含のＤＭＥＭ）が入った０．１％ゼラチンコーティングプレートで維持する。
【０１５０】
ＭＥＦ特異的ｍｉＲＮＡの阻害が初期化障壁を低くするかどうかを判定するために、ＭＥＦで濃縮されたｍｉＲＮＡを解析し、それらのレベルを、マウスＥＳ（ｍＥＳ）細胞で見られるものと比較する。図２０ａに示されるように、ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａは、ｍＥＳ細胞と比べ、ＭＥＦにおいて高度に発現される。一方、ｍｉＲ  ２９１は、ｍＥＳでは非常に豊富であるがＭＥＦでは存在しない（図２０ａ）。次に、ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−２１、およびｍｉＲ−２９ａに対し、ｍｉＲＮＡ阻害剤を、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃ（ＯＳＫＭ）を発現するレトロウイルスとともにＯｃｔ４−ＥＧＦＰ  ＭＥＦ（Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰレポーターを保有するＭＥＦ）に導入する。形質導入後１４日目に、ｍｉＲ−２１阻害剤で処理した細胞はターゲッティングしない（ＮＴ）対照と比べて初期化効率の約２．１倍向上を示す（図２０ｂ）。同様に、ｍｉＲ−２９ａの阻害後、初期化効率は有意に約２．８倍向上する（図２０ｂ）。ｍｉＲ  ２９ａまたは２１阻害で用いた同様のａｎｔａｇｏｍｉｒ処理に従って、ｌｅｔ−７ａ阻害後にＯＳＫＭ初期化に対して軽度の効果が観察される（図２０ｂ）。ｃ−Ｍｙｃの不在下でｍｉＲＮＡ阻害により３種の因子による初期化が促進されるかどうかをさらに試験するために、ｍｉＲＮＡ阻害剤を、ＯＳＫＭよりずっと低い効率で細胞を初期化するＯＳＫとともに細胞に形質導入する。ＯＳＫにより初期化したｉＰＳ細胞コロニーの数は、ＯＳＫ単独での処理と比べ、ｍｉＲ−２１阻害剤の存在下で増加する（図２５）。これらの結果は、ＭＥＦで濃縮されたｍｉＲＮＡ  ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９の枯渇により４Ｆによる初期化が著しく促進されること、そしてｍｉＲ−２１の遮断により３種の因子（ＯＳＫ）による初期化の効率が中等度に向上することを示す。
【０１５１】
Ｃ−Ｍｙｃは、初期化中にｍｉＲＮＡ  ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２９ａおよびｍｉＲ−１４３の発現を抑制する：最近の研究により、ＯＳＫＭ因子は、後成的機構と転写機構の両方を通じて細胞同一性を変更することが示されている。本発明によれば、ＯＳＫＭ初期化因子は、ＭＥＦで濃縮されたｍｉＲＮＡをダウンレギュレートし得ることとなる。ｍｉＲＮＡ発現に対する各初期化因子の潜在的影響を評価するために、ＭＥＦにＯＳＫＭ因子の様々な組合せを形質導入し、それらに対してノーザンブロット解析を行う（図２１ａ）。興味深いことに、Ｓｏｘ２だけが、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２９ａおよびｌｅｔ−７ａの発現レベルが、ＭＥＦ対照と比べて２倍より高く誘導する（図２１ｂ、左のパネル）。Ｋｌｆ４は、選択したｍｉＲＮＡに対して軽度であるがＳｏｘ２と類似した影響を及ぼす（図２１ｂ、左のパネル）。Ｏｃｔ４過剰発現に関してのみ、ｍｉＲＮＡは発現レベルが変化しない（図２１ｂ、左のパネル）。Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４とは対照的に、単一因子のｃ−ＭｙｃはｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａ（ＭＥＦにおいて最も豊富なｍｉＲＮＡ）の発現をＭＥＦ対照の約７０％ダウンレギュレートする（図２１ａおよび図２１ｂ、左のパネル）。さらに、図２１ｂ（中央のパネル）に示す２種の因子（２Ｆ）の様々な組合せの間では、ｃ−Ｍｙｃを含む組合せは、３種のｍｉＲＮＡ全て（ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２９ａおよびｌｅｔ−７ａを含む）における減少を、約２５〜８０％増大し得る（図２１ｂ、中央のパネル）。Ｓｏｘ２とＯｃｔ４とでは、ｍｉＲＮＡに対する１Ｆの影響と同様に、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａを、ＭＥＦ対照の１．５倍および２．３倍増加させ、ＯＫおよびＳＫではｍｉＲＮＡ発現に対して及ぼす明らかな影響はない。さらに、３種の因子（３Ｆ）の様々な組合せの間では、ｍｉＲＮＡ−２１の発現は、ＳＫＭ細胞およびＯＫＭ細胞において、ＭＥＦにおいて見られる発現と比べて、それぞれ約７０％および７８％減少し、同様に、ｍｉＲ−２９ａ発現は、ｃ−Ｍｙｃを含む３Ｆ組合せで約４８〜７０％減少する（図２１ｂ、右のパネル）。３Ｆ組合せにｃ−Ｍｙｃを含むことによりｌｅｔ−７ａレベルも少し減少する（図２１ｂ、右のパネル）。ｃ−Ｍｙｃを含まないＯＳＫでは、ｍｉＲＮＡ発現に対して及ぼす影響はほとんどなかった（図２１ｂ、右のパネル）。よって、これらの結果は、ｃ−Ｍｙｃが初期化中のｍｉＲＮＡ発現の調節において重要な役割を果たすことを強く示唆している。
【０１５２】
ｃ−ＭｙｃがｍｉＲＮＡ発現に拮抗する第１因子であることをさらに確認するために、ＯＳＫをｃ−Ｍｙｃとともにまたはｃ−Ｍｙｃを含めずに細胞に形質導入し、ｍｉＲＮＡ発現を形質導入後の様々な時点においてリアルタイム定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）により調査する。ＯＳＫに対し、ＯＳＫＭ形質導入により初期化中のｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−１４３の発現は大幅に減少し（図２１ｃ）、ｃ−Ｍｙｃは、ＭＥＦで濃縮されたｍｉＲＮＡ（最も豊富なものである、ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａを含む）の発現の調節において中心的な役割を果たすことが分かる。これらのデータは、ｃ−ＭｙｃはｍｉＲＮＡダウンレギュレーションを通じてある程度初期化を促進することも示唆している。
【０１５３】
実施例１３
ｍｉＲＮＡ枯渇によって誘導されたｉＰＳ細胞は多能性を獲得する
本発明によれば、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａ阻害剤を用いて得られたマウスｉＰＳ細胞は多能性であることとなる。ＯＳＫＭ／ａｎｔｉ  ｍｉＲ−２９ａ  ｉＰＳ細胞についてＥＳ細胞マーカー染色を行うことができる。さらなる解析のために、ＯＳＫＭおよびｍｉＲ−２９ａ阻害剤での処理後に得られたＧＦＰ＋コロニーを採取する。胚幹細胞マーカーＮａｎｏｇおよびＳＳＥＡ１を発現する代表的なコロニーを同定する。内因性Ｏｃｔ４も活性化し、それはＥＧＦＰ染色により示すことができる。強いアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）活性はＥＳマーカーの１つとして観察することができる。
【０１５４】
ＯＳＫＭ／ａｎｔｉ  ｍｉＲ−２９ａ  ｉＰＳ細胞のin vitro分化を行うことができる。胚様体をin vitroで形成し、２週間培養することができる。細胞を固定し、抗αフェトプロテイン（中胚葉について）および抗βチュブリンＩＩＩ（外胚葉について）で染色することができる。核は、Ｈｏｅｓｃｈｔ染色による対比染色として観察することができる。ＯＳＫＭ／ａｎｔｉ  ｍｉＲ−２９ａ  ｉＰＳ細胞の奇形腫形成解析も行うことができる。１．５Ｘ１０６個のｉＰＳＣを無胸腺ヌード雌マウスに皮下注射する。注射の３週間後に腫瘍塊を採取し、組織病理学的解析のために固定する。３胚葉から得られた様々な組織を確認することができ、それらには、腸管様上皮（内胚葉）、脂肪組織、軟骨および筋肉（中胚葉）、ならびに神経組織および表皮（外胚葉）が含まれる。ＯＳＫＭ／ａｎｔｉ  ｍｉＲ−２９ａ  ｉＰＳ細胞およびＯＳＫ／ａｎｔｉ  ｍｉＲ−２１  ｉＰＳ細胞のキメラ解析も行うことができる。８〜１４個のｉＰＳ細胞をＥ３．５マウス胚盤胞に注射することができる。各キメラへのｉＰＳ細胞の寄与は、黒色の毛色を評価することにより推定することができ、割合として観察することができる。
【０１５５】
ｍｉＲ−２１またはｍｉＲ−２９ａの遮断がｉＰＳ細胞の多能性に支障をきたすかどうかを調査するために、ＯＳＫＭ／ａｎｔｉ  ｍｉＲ−２９ａまたはＯＳＫ／ａｎｔｉ  ｍｉＲ−２１を用いたｉＰＳ細胞を多能性について評価する。まず、初期化のおよそ２週間後に細胞を手作業で採取し、拡大して、形態およびＥＳ特異的マーカーの発現を調べる。細胞はＥＳ様形態および高度に発現されたＯｃｔ４−ＥＧＦＰ示す（内因性ＥＳ細胞シグナル伝達の確立を示す。加えて、ＯＳＫＭ／ａｎｔｉ  ｍｉＲ−２９ａ  ｉＰＳ細胞またはＯＳＫ／ａｎｔｉ  ｍｉＲ−２１  ｉＰＳ細胞は、ＮａｎｏｇおよびＳＳＥＡ１を含むＥＳ細胞特異的マーカーを発現し、アルカリ性ホスファターゼ活性を示した。それらのｉＰＳ細胞が、通常誘導されるｉＰＳ細胞と同等の多能性潜在能力を示すかどうかを試験するために、ＯＳＫＭ／ａｎｔｉ  ｍｉＲ−２９ａ  ｉＰＳ細胞およびＯＳＫ／ａｎｔｉ  ｍｉＲ−２１  ｉＰＳ細胞を、誘導して胚様体（ＥＢ）を形成するかまたはヌードマウスに注射し、様々な組織に分化させる。in vitro分化の２週間後に、３胚葉全てから得られた典型的な細胞種が観察される。注射の３週間後に形成された奇形腫腫瘍に対して、組織病理学的解析を行う。３胚葉全てに由来する様々な組織が生成され、ｉＰＳ細胞が多能性を得たことが確認される。多能性についての最も厳しい試験を用いるために、ｉＰＳ細胞をＥ３．５胚盤胞に注射して、キメラマウスを作出する。ｍｉＲ枯渇によるｉＰＳ細胞から得られたマウスは、ｉＰＳ細胞に起因する、有意の約１５％〜２５％黒色毛色を示す。これらのデータは、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａの枯渇が、得られたｉＰＳ細胞の多能性に対して悪影響を及ぼさないことを示している。
【０１５６】
実施例１４
ｍｉＲ−２９ａの阻害はＰ８５αおよびＣＤＣ４２の経路を通じてＰ５３をダウンレギュレートする
初期化に及ぼすｍｉＲ−２９ａの作用の基礎にある機構を理解するために、ｐ８５αおよびＣＤＣ４２の発現を調査する。ｐ８５αおよびＣＤＣ４２はＨｅＬａ細胞においてｍｉＲ−２９の直接標的であると報告されている。その目的で、ｍｉＲＮＡ阻害剤をＭＥＦにトランスフェクトし、トランスフェクション後５日目にｐ８５αおよびＣＤＣ４２タンパク質発現をウエスタンブロットにより評価する。Ｐ８５αおよびＣＤＣ４２タンパク質レベルはｍｉＲ−２９ａ遮断によって少し増加するが、それに対し、ｌｅｔ−７ａ阻害剤ではほとんど影響がない（図２２ａおよび図２２ｂ）。また、形質転換関連タンパク質５３（Ｔｒｐ５３またはｐ５３）はｐ８５αおよびＣＤＣ４の直接標的であると報告されている。よって、ｐ５３についても、ｐ５３がＭＥＦにおいてｍｉＲ−２９ａによって間接的に調節されるかどうかを調査する。それを試験するために、ＭＥＦをｍｉＲＮＡ阻害剤でトランスフェクトし、免疫ブロッティングのために５日採取して、ｐ５３の発現を評価する。Ｐ５３タンパク質レベルはｍｉＲ−２９ａ阻害によって約３０％低下する（図２２ａおよび図２２ｂ）がＮＴ対照やｌｅｔ−７ａ阻害では変化しない。ｍｉＲ−２１の枯渇によってもｐ８５αおよびＣＤＣ４２タンパク質抑制から解放され、それゆえにｐ８５αおよびＣＤＣ４２のレベルが増加し、その結果、ｐ５３発現の約２５％ダウンレギュレーションが起こることは重要である（図２２ａおよび図２２ｂ）。
【０１５７】
初期化中にｍｉＲ−２１またはｍｉＲ−２９ａの阻害によってｐ５３レベルが低下することをさらに確認するために、初期化５日目にｐ５３発現をウエスタンブロット解析により調査する。初期化を開始するために、ｍｉＲＮＡ阻害剤をＯＳＫＭとともに導入する。ＭＥＦ単独での観察と一致して、初期化中に、ｍｉＲ−２１またはｍｉＲ−２９ａの枯渇によって、ｐ５３タンパク質レベルがＯＳＫＭ対照と比べてそれぞれ約２５％または約４０％低下する（図２２ｃ）。要するに、我々のデータによって、初期化中、ｍｉＲ−２９ａの遮断によってｐ８５αおよびＣＤＣ４２の経路を通じてｐ５３タンパク質レベルが約３０〜４０％低下することがわかった。加えて、ｍｉＲ−２１の枯渇はｐ８５αおよびＣＤＣ４２の両方に対して類似した影響を及ぼし、ｐ５３タンパク質レベルを約２５％〜約３０％低下させた。
【０１５８】
ｍｉＲ−２９ａの阻害は、ｐ５３ダウンレギュレーションを通じて初期化効率を向上させる：ｐ５３の欠乏によって初期化効率が大幅に向上し得ることは報告されている。ｍｉＲ−２９ａの枯渇はｐ５３レベルを著しく低下させ、初期化効率を約２．８倍向上させることから、本発明によれば、ｍｉＲ−２９ａノックダウンの効果は主にｐ５３ダウンレギュレーションによって媒介されることとなる。これを受けて、ｐ５３  ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲ−２９ａ阻害剤をＯＳＫＭとともにＯｃｔ４−ＥＧＦＰ  ＭＥＦにトランスフェクトして、初期化を開始する。ｓｉＲＮＡによるｐ５３のダウンレギュレーション（約８０％）は、初期化効率に対して、ｍｉＲ−２９ａ阻害の場合と類似した良い影響を及ぼす（図２２ｄ）。ｐ５３  ｓｉＲＮＡの存在下でｍｉＲ阻害剤を加えた場合には初期化効率の向上は見られない（図２２ｄ）。これらの結果は、ｍｉＲ−２９ａの阻害はｐ５３のダウンレギュレーションを通じて初期化効率を向上させるようにある程度作用することを示唆している。
【０１５９】
実施例１５
ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａの阻害はＧＳＫ３βではなくＥＲＫ１／２のリン酸化を減少させて初期化を促進する
ｍｉＲ２１は、心臓繊維芽細胞においてｓｐｒｏｕｔｙ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  １（Ｓｐｒｙ１）の阻害を通じてＭＡＰＫ／ＥＲＫを活性化することが報告されている。ＭＡＰＫ／ＥＲＫ活性の遮断は、神経幹細胞の初期化を促進し、ＥＳＣ自己複製の基底状態を保証する。よって、本発明によれば、ｍｉＲＮＡ阻害剤導入後にＭＥＦにおけるＥＲＫ１／２リン酸化を評価することによってｍｉＲ−２１は初期化中にＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路を調節することとなる。それを試験するために、ＭＥＦをｍｉＲＮＡ阻害剤でトランスフェクトし、次いで、ウエスタンブロット解析のために採取して、リン酸化ＥＲＫ１／２レベルを決定する。ウエスタンブロット解析は、ｍｉＲ−２１の遮断によってＥＲＫ１／２リン酸化がＮＴ対照と比べて約４５％有意に低下したが、それに対し、ｌｅｔ−７ａ阻害剤ではそのような影響がないことを示している（図２３ａ）。興味深いことに、ｍｉＲ−２９ａ枯渇ＭＥＦでもＥＲＫ１／２リン酸化がＮＴ対照と比べて６０％有意に低下する（図２３ａ）。また、本発明によれば、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａは、Ｓｐｒｙ１レベルを変更することによりＥＲＫ１／２リン酸化に影響を及ぼし得ることとなる。様々なｍｉＲＮＡ阻害剤をトランスフェクトすることによりＭＥＦにおいてｍｉＲ−２１またはｍｉＲ−２９ａを枯渇させ、Ｓｐｒｙ１発現レベルを免疫ブロッティングにより定量し、それらの結果は、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａの阻害によりＳｐｒｙ１発現レベルが高まった（図２３ｂ）ことを示している。ゆえに、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａの枯渇は、Ｓｐｒｙ１タンパク質レベルをモジュレートすることによってＥＲＫ１／２のリン酸化をダウンレギュレートする。
【０１６０】
ＥＲＫ１／２ダウンレギュレーションによって初期化効率が高まるかどうかについて取り組むために、４Ｆ初期化の過程でＥＲＫ１または２をターゲッティングするｓｉＲＮＡをＯｃｔ４−ＥＧＦＰ  ＭＥＦに導入する。いずれの枯渇も成熟したｉＰＳ細胞の生成を促進する（図２３ｃ）。本発明によれば、ｍｉＲ−２１の遮断によってＥＲＫ１／２リン酸化が減少することからｍｉＲ−２１はＭＥＦにおけるＥＲＫ１／２活性化のインデューサーとして働くこととなる。ｍｉＲ−２９ａの枯渇によってもＥＲＫ１／２リン酸化は著しく減少する。これらの結果は、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａがＥＲＫ１／２活性を調節して初期化効率を高めることを強く示唆している（図２３ａ、図２３ｂおよび図２３ｃ）。
【０１６１】
ＧＳＫ３β経路もＥＳ自己複製および神経幹細胞の初期化を抑制する。ＧＳＫ３βの枯渇により成熟ｉＰＳ細胞生成は大幅に増加する（図２３ｃ）。本発明によれば、ｍｉＲＮＡ枯渇がＧＳＫ３β活性化を調節したこととなる。免疫ブロッティングは、Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰ  ＭＥＦにおけるｍｉＲＮＡの遮断がＧＳＫ３β活性化に対して大きな影響を及ぼさないことを示している（図２３ｄ）。本発明によれば、細胞生存率および複製速度を評価するためにフローサイトメトリーを用いることによってｍｉＲＮＡ枯渇が初期化中にアポトーシスまたは細胞増殖を変更することとなる。ＯＳＫＭでの初期化中のｍｉＲＮＡ  ２１、２９ａまたはｌｅｔ−７の遮断ではアポトーシスまたは増殖速度は変更されない（図２６）。全体として、ｍｉＲ−２９ａおよびｍｉＲ−２１はｐ５３およびＥＲＫ１／２の経路をモジュレートして、ｉＰＳ細胞初期化効率を調節する。
【０１６２】
実施例１６
Ｃ−ＭｙｃはｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａのダウンレギュレーションを通じてＰ５３レベルを低下させＥＲＫ１／２活性化に拮抗することにより初期化の閾値を下げる
初期化誘導に現在用いられている導入遺伝子の代替物を開発するために、これらの因子によってシグナル伝達経路がどのように調節されるかを理解することが重要である。本発明によれば、ｃ−Ｍｙｃは初期化中に、ＭＥＦで濃縮されたｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−２１、ｌｅｔ−７ａ、およびｍｉＲ−２９ａなど）を抑制することとなる（図２０）。阻害剤によるｍｉＲ−２９ａの枯渇は、ｐ８５αおよびＣＤＣ４２抑制を解放することによってｐ５３タンパク質レベルを低下させる可能性が高い（図２２）。加えて、ｍｉＲ−２１の枯渇はＥＲＫ１／２リン酸化も減少させる（図２３）。本発明によれば、ｍｉＲ−２１阻害はｐ５３タンパク質レベルを低下させることとなり、そしてｍｉＲ−２９ａの阻害もＥＲＫ１／２リン酸化レベルを低下させることとなる。ｐ５３およびＥＲＫ１／２のシグナル伝達はいずれも初期化に拮抗する。ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａの遮断またはｐ５３およびＥＲＫ１／２のノックダウンにより初期化効率を高めることができる（図２２および図２３）。本発明によれば、ｃ−Ｍｙｃは、ｐ５３タンパク質レベルおよびＥＲＫ１／２活性化の誘導を通じて初期化障壁として働く、ＭＥＦで濃縮されたｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａを抑制することによって、ある程度初期化を促進することとなる（図２４）。
【０１６３】
初期化を促進するために、ｍｉＲ−２９０ファミリーのＥＳ特異的ｍｉＲＮＡの強制発現をｃ−Ｍｙｃの代わりにすることができる。また、Ｃ−ＭｙｃはｍｉＲ−２９０クラスターのプロモーター領域と結合する。しかしながら、ｃ−Ｍｙｃ導入遺伝子の初期発現は、初期化を開始するのに有効であるが、ｍｉＲ−２９０クラスターが発現を開始する成熟ｉＰＳ細胞の移行段階またはそれ以降では重要なものでない。よって、ｃ−ＭｙｃがｍｉＲ−２９０ファミリーの活性化を通じて初期化の初期段階を促進するという可能性は低い。
【０１６４】
本発明によれば、初期化のためにｃ−Ｍｙｃが導入されると、ＭＥＦで濃縮されたｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１４３およびｌｅｔ−７ａを含む）の発現レベルは低下することとなる。Ｃ−Ｍｙｃは、腫瘍形成の促進または多能性基底状態の維持においてｍｉＲＮＡに深刻な転写の影響を及ぼす。よって、ｍｉＲＮＡ発現のｃ−Ｍｙｃ抑制は初期化の基礎にあると考えられる機構である。
【０１６５】
ｍｉＲ−２１は、正のメディエーターとして、ＴＧＦβ１およびＥＲＫ１／２の経路（これらの両経路は初期化およびＥＳ細胞基底状態に影響を及ぼすことがわかっている）を通じて繊維形成活性を増強するように働く。特に、確認したｍｉＲ−２９ａ標的の間では、ｐ５３がｍｉＲ−２９ａによって正に調節される。加えて、最近の研究では、Ｉｎｋ４−Ａｒｆ／ｐ５３／ｐ２１経路が初期化に支障をきたし、ｐ５３の欠乏によって初期化効率が大幅に高まることが示されている。これらのことから、これらのシグナル伝達経路は初期化プロセスに対する第１の障壁であるといえよう。
【０１６６】
ｃ−ＭｙｃをターゲッティングするｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａの枯渇により、初期化効率が約２．１倍〜約２．８倍高まり（図２０）、ＭＥＦで濃縮されたｍｉＲＮＡも初期化障壁として働くことが示唆される。ｌｅｔ−７阻害は初期化を促進することが最近報告されたが、しかしながら、何度かの試みによると、ａｎｔａｇｏｍｉｒによりｌｅｔ−７が阻害された場合、観察される初期化への影響は軽度なものでしかない（図２０）。さらに、本発明によれば、初期化中のｐ５３の誘導はｍｉＲ−２９ａ阻害によって支障をきたし初期化効率が高まることとなる。同様に、初期化は、ｍｉＲ−２１の枯渇またはＥＲＫ１／２のいずれかによって大幅に促進され得る。Ｃ−Ｍｙｃは、初期化の初期段階の大きな要因であり、そのプロセスを移行段階および終わりに近い段階で維持するには必要でなく、これによれば、高効率の初期化を開始するためにｃ−Ｍｙｃを調節するｍｉＲＮＡを使用し得ることとなる。
【０１６７】
Ｃ−Ｍｙｃは、ｍｉＲ−２９ａプロモーターと直接結合し抑制することが報告されている。本発明によれば、ｃ−Ｍｙｃは、ｍｉＲ−２１の枯渇と部分的にしか置き換えることができないこととなり、これはｃ−Ｍｙｃが初期化において他の機能を有することを示唆している。よって、初期化中のｃ−Ｍｙｃ機能に代わる、複数の経路の調節またはＭＥＦで濃縮されたｍｉＲＮＡの広い抑制が必要とされ得る。
【０１６８】
本発明によれば、ｃ−ＭｙｃはｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａのダウンレギュレーションを通じてｐ５３レベルを低下させＥＲＫ１／２活性化に拮抗することにより初期化の閾値を下げることとなる。加えて、ｃ−Ｍｙｃの下流の因子は、初期化を改善するために、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは小分子による操作の対象となり得る。これらのアプローチは、４種の初期化因子全ての代わりとするために広げることができる。
【０１６９】
上記の実施例により本発明を記載してきたが、修飾および変形が本発明の精神および範囲内に含まれることは理解されるであろう。よって、本発明は次の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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