(57)【要約】標的遺伝子座のコピー数を分析し、標的遺伝子の異常なコピー数に関連する疾患またはそのキャリアを検出するためのシステムおよび方法。一態様では、本発明は、標的遺伝子座のコピー数を分析する方法を提供し、この方法は、（ａ）複数の生物学的検体を提供するステップであって、各個別の生物学的検体が標的遺伝子座および既知のコピー数を有する１つまたは複数の参照遺伝子座を含む、ステップ；（ｂ）複数の生物学的アッセイを実施するステップであって、各個別の生物学的アッセイにより各個別の生物学的検体中の標的遺伝子座および１つまたは複数の参照遺伝子座を分析し、標的遺伝子座および１つまたは複数の参照遺伝子座に関する検出可能なシグナルのレベルがそれらのそれぞれのコピー数と相関するような検出可能なシグナルが得られる、複数の生物学的アッセイを実施するステップ等を含む。
2013510580.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子座のコピー数を分析する方法であって、
（ａ）複数の生物学的検体を提供するステップであって、各個別の生物学的検体が標的遺伝子座および既知のコピー数を有する１つまたは複数の参照遺伝子座を含む、ステップ；
（ｂ）複数の生物学的アッセイを実施するステップであって、各個別の生物学的アッセイにより前記各個別の生物学的検体中の前記標的遺伝子座および前記１つまたは複数の参照遺伝子座を分析し、前記標的遺伝子座および前記１つまたは複数の参照遺伝子座に関する検出可能なシグナルのレベルがそれらのそれぞれのコピー数と相関するような検出可能なシグナルが得られる、ステップ；
（ｃ）前記複数の生物学的アッセイに基づいて、前記１つまたは複数の参照遺伝子座に対して正規化した前記標的遺伝子座の複数のコピー数の推定値を決定するステップ；ならびに
（ｄ）前記コピー数の推定値の質および／または前記コピー数の確定の統計的信頼度を評価し、それにより、前記標的遺伝子座のコピー数の確定を行うことができるか否かを決定するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記標的遺伝子座が遺伝子またはその一部を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子またはその一部が生存運動ニューロン１（ＳＭＮ１）のエクソンを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記１つまたは複数の参照遺伝子座が、ＳＭＡＲＣＣ１およびＳＵＰＴ５Ｈからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＳＭＮ１のエクソンがエクソン７である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｂ）における前記生物学的アッセイが、前記標的遺伝子座および前記１つまたは複数の参照遺伝子座を増幅するリアルタイムＰＣＲアッセイである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記検出可能なシグナルが蛍光シグナルであり、前記標的遺伝子座または前記１つもしくは複数の参照遺伝子座の蛍光シグナルのレベルが各増幅サイクルにおいて検出される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｃ）が
（ｉ）各個別の生物学的検体における前記蛍光シグナルの所定のレベルに達する前記標的遺伝子座と前記１つまたは複数の参照遺伝子座との間のサイクル数の差（ΔＣｔｉ）を決定するステップ；
（ｉｉ）正常標的遺伝子座と前記１つまたは複数の参照遺伝子座との間の差を反映するキャリブレータ
【化３１】
2013510580.tif 000043
を得るステップ；および
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）で決定された前記サイクル数の差ΔＣｔｉを前記キャリブレータ
【化３２】
2013510580.tif 000044
に対して正規化することによって各個別の生物学的検体における前記標的遺伝子座のコピー数の推定値を決定するステップ
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｉ）が、前記蛍光シグナルの前記所定のレベルに達する前記標的遺伝子座および前記１つまたは複数の参照遺伝子座のそれぞれのサイクル数（Ｃｔｉ）を最初に測定するステップを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記キャリブレータ
【化３３】
2013510580.tif 000045
が、前記複数の生物学的検体における前記標的遺伝子座と前記１つまたは複数の参照遺伝子座との間の前記ΔＣｔｉの刈り込み平均により定義される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
各個別の生物学的検体における前記標的遺伝子座の前記コピー数の推定値を線形目盛上で決定する、請求項８から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
各個別の生物学的検体における前記標的遺伝子座の前記コピー数の推定値を対数目盛上で決定する、請求項８から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記標的遺伝子座の前記コピー数の推定値の質を、前記１つまたは複数の参照遺伝子座について得られたデータの質に基づいて評価する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記統計的信頼度を、測定の信頼度および／または確定の信頼度を決定することにより評価する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ｂ）で実施する前記生物学的アッセイを反復する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記コピー数の確定の前記統計的信頼度を、反復生物学的アッセイの測定の信頼度および前記複数のコピー数の推定値に基づく確定の信頼度の計算により決定する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｄ）が、前記確定の信頼度が所定の閾値より低い場合に前記標的遺伝子座の前記コピー数の確定を行うことができないことを決定するステップを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
標的遺伝子の異常なコピー数に関連する疾患またはそのキャリアを検出する方法であって、
（ａ）対象の個体から得られた少なくとも１つの生物学的検体を含む複数の生物学的検体を提供するステップ；
（ｂ）多数の反復生物学的アッセイを前記複数の生物学的検体のそれぞれについて実施して、前記標的遺伝子および既知のコピー数を有する１つまたは複数の参照遺伝子を分析するステップであって、前記多数の反復生物学的アッセイのそれぞれにより、前記標的遺伝子および前記１つまたは複数の参照遺伝子の検出可能なシグナルのレベルがそれらのそれぞれのコピー数と相関するような前記検出可能なシグナルが得られる、ステップ；
（ｃ）前記１つまたは複数の参照遺伝子に対して正規化した前記標的遺伝子のコピー数の推定値を決定するステップ；ならびに
（ｄ）前記コピー数の推定値の質および／または対象の前記個体のコピー数の確定の統計的信頼度を評価し、それにより、前記個体における前記標的遺伝子座のコピー数の確定を行うことができるか否かを決定するステップ
を含む方法。
【請求項１９】
前記個体が前記疾患を有するもしくはその危険性があるか否か、または前記個体が前記疾患のキャリアであるか否かを決定するステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記疾患が脊髄性筋萎縮（ＳＭＡ）である、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的遺伝子が生存運動ニューロン１（ＳＭＮ１）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ｂ）で実施する前記生物学的アッセイがリアルタイムＰＣＲアッセイである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ｂ）が、ＳＭＮ１のエクソン７の少なくとも一部を増幅するリアルタイムＰＣＲアッセイを実施するステップを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記検出可能なシグナルが蛍光シグナルであり、前記標的遺伝子または前記１つもしくは複数の参照遺伝子の前記蛍光シグナルのレベルを各増幅サイクルにおいて検出する、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（ｃ）が
（ｉ）各個別の反復アッセイにおける前記蛍光シグナルの所定のレベルに達する前記標的遺伝子と前記１つまたは複数の参照遺伝子との間のサイクル数の差（ΔＣｔｉ）を決定するステップ；
（ｉｉ）正常標的遺伝子と前記１つまたは複数の参照遺伝子との間のバックグラウンドの差を反映するキャリブレータ
【化３４】
2013510580.tif 000046
を得るステップ；および
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）で決定された前記サイクル数の差ΔＣｔｉを前記キャリブレータ
【化３５】
2013510580.tif 000047
に対して正規化することによって各個別の反復アッセイに基づくコピー数の推定値を得るステップ
を含む、請求項１８から２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
各個別の反復アッセイに基づく前記標的遺伝子の前記コピー数の推定値を線形目盛上で決定する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
各個別の反復アッセイに基づく前記標的遺伝子の前記コピー数の推定値を対数目盛上で決定する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記コピー数の推定値の質を評価するステップが、前記１つまたは複数の参照遺伝子について得られたサイクル数の測定およびその増幅曲線の勾配に基づいて品質管理メトリクスを得るステップを含む、請求項２２から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記コピー数の推定値の質を評価するステップが、前記多数の反復生物学的アッセイ間の変動係数を求めるステップを含む、請求項１８から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記コピー数の確定の前記統計的信頼度を評価するステップが、測定の信頼度および／または確定の信頼度を決定するステップを含む、請求項１８から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記コピー数の確定の前記統計的信頼度を、前記多数の反復生物学的アッセイの測定の信頼度および複数のコピー数の推定値に基づく確定の信頼度の計算により決定する、請求項１８に記載の方法。
【請求項３２】
前記測定の信頼度を、前記複数の反復アッセイにわたる前記コピー数の推定値の平均値および所定のコピー数の限界内に適合する前記平均値の標準誤差により定義される前記コピー数の推定値の周りの最大正規信頼区間として決定する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ステップ（ｄ）が、前記測定の信頼度が所定の信頼度閾値を超えない場合に前記コピー数の確定を行うことができないことを決定するステップを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記確定の信頼度が、隣接コピー数分布からのものである前記コピー数の推定値のｔ検定のｐ値を決定する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
ステップ（ｄ）が、前記確定の信頼度が所定の信頼度閾値より低い場合に前記コピー数の確定を行うことができないことを決定するステップを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記標的遺伝子の所定のコピー数を有する１つまたは複数の対照試料を並行して分析するステップをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記生物学的アッセイをマルチウェルプレートで実施する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記１つまたは複数の対照試料の品質管理および統計分析に基づいてプレート品質管理メトリクスを決定するステップをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記１つまたは複数の対照試料のいずれかが前記品質管理もしくは統計的信頼度評価の１つに不合格である場合、またはいずれかの個別の対照試料の推定値が前記所定のコピー数に等しくない場合には、前記プレートは不合格である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
対象の前記個体から得られる前記少なくとも１つの生物学的検体が、細胞、組織、全血、血漿、血清、尿、便、唾液、臍帯血、絨毛膜絨毛試料、絨毛膜絨毛試料培養物、羊水、羊水培養物または経頸部洗浄液からの核酸を含む、請求項１８から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
対象の前記個体から得られる前記少なくとも１つの生物学的検体が出生前試料である、請求項１８から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
標的遺伝子座のコピー数を分析するためのシステムであって、
ａ）複数の生物学的検体を受容するための手段であって、各個別の生物学的検体が標的遺伝子座および既知のコピー数を有する１つまたは複数の参照遺伝子座を含む、手段；
ｂ）複数の生物学的アッセイを実施するための手段であって、各個別の生物学的アッセイにより各個別の生物学的検体における前記標的遺伝子座および前記１つまたは複数の参照遺伝子座を分析し、前記標的遺伝子座および前記１つまたは複数の参照遺伝子座の検出可能なシグナルのレベルがそれらのそれぞれのコピー数と相関するような検出可能なシグナルが得られる、手段；
ｃ）各個別の生物学的検体からの前記検出可能なシグナルを検出し、前記検出可能なシグナルのレベルを測定するように構成された測定モジュール；
ｄ）前記測定モジュールからのシグナル情報を保存するように構成された記憶装置；
ｅ）（ｉ）前記記憶装置に保存された前記シグナル情報に基づいて前記１つまたは複数の参照遺伝子座に対して正規化した前記標的遺伝子座のコピー数の推定値を計算し、（ｉｉ）前記コピー数の推定値の質および／または前記コピー数の確定の統計的信頼度を決定するように適合された計算モジュール；ならびに
ｆ）使用者のための前記計算およびデータ分析結果に一部基づき、前記標的遺伝子座のコピー数の確定および／または品質管理もしくは統計的信頼度分析のいずれかが失敗であるか否かを示すシグナルを含む内容を表示するためのディスプレイモジュール
を含むシステム。
【請求項４３】
前記生物学的アッセイがリアルタイムＰＣＲアッセイである、請求項４２に記載のシステム。
【請求項４４】
前記生物学的アッセイがアレイに基づく比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）である、請求項４２に記載のシステム。
【請求項４５】
前記生物学的アッセイが高スループット配列決定法である、請求項４２に記載のシステム。
【請求項４６】
前記測定モジュールが、各増幅サイクルにおける前記検出可能なシグナルのレベルを測定するように構成されており、前記検出可能なシグナルが蛍光シグナルである、請求項４３に記載のシステム。
【請求項４７】
前記計算モジュールが、以下：
（ｉ）各個別の検体における前記蛍光シグナルの所定のレベルに達する前記標的遺伝子座と前記１つまたは複数の参照遺伝子座との間のサイクル数の差（ΔＣｔｉ）を決定するステップ；
（ｉｉ）正常標的遺伝子座と前記１つまたは複数の参照遺伝子座との間のバックグラウンド差を反映するキャリブレータ
【化３６】
2013510580.tif 000048
を得るステップ；および
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）で測定された前記サイクル数の差ΔＣｔｉを前記キャリブレータ
【化３７】
2013510580.tif 000049
に対して正規化することによって各個別の生物学的検体における前記標的遺伝子座のコピー数の推定値を決定するステップ
に従って、前記標的遺伝子座のコピー数の推定値を計算するように適合されている、請求項４５または４６に記載のシステム。
【請求項４８】
前記計算モジュールが、前記１つまたは複数の参照遺伝子について得られたサイクル数の測定およびその増幅曲線の勾配に基づいて、品質管理メトリクスを少なくとも得ることにより前記コピー数の推定値の質を決定するように適合されている、請求項４３から４７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４９】
前記計算モジュールが、試料の変動係数を少なくとも決定することにより前記コピー数の推定値の質を決定するように適合されている、請求項４３から４８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５０】
前記計算モジュールが、測定の信頼度を少なくとも決定し、決定された前記測定の信頼度を所定の閾値限界と比較することにより前記コピー数の確定の統計的信頼度を決定するように適合されている、請求項４３から４９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５１】
前記計算モジュールが、確定の信頼度を少なくとも決定し、決定された前記確定の信頼度を所定の閾値限界と比較することにより前記コピー数の確定の統計的信頼度を決定するように適合されている、請求項４３から５０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５２】
前記計算モジュールが、任意の対照試料が不合格であるか否かを決定するようにさらに適合されている、請求項４３から５１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５３】
前記標的遺伝子座が生存運動ニューロン１（ＳＭＮ１）のエクソンを含む、請求項４２から５２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５４】
コンピュータ上で方法を実施するための計算モジュールおよびディスプレイモジュールを含むソフトウエアモジュールを規定するための記録されたコンピュータ可読の命令を有するコンピュータ可読媒体であって、前記方法が、
ａ）前記計算モジュールにより、（ｉ）記憶装置に保存されたリアルタイムＰＣＲデータに基づく１つまたは複数の参照遺伝子座に対して正規化した標的遺伝子座のコピー数の推定値ならびに（ｉｉ）前記コピー数の推定値の質および／または前記コピー数の確定の統計的信頼度を計算するステップ；ならびに
ｂ）使用者のための前記計算およびデータ分析結果に一部基づき、前記標的遺伝子座のコピー数の確定および／または品質管理もしくは統計的信頼度分析のいずれかが失敗であるか否かを示すシグナルを含む内容を表示するステップ
を含む、コンピュータ可読媒体。
【請求項５５】
前記標的遺伝子座がＳＭＮ１のエクソン７またはその一部を含む、請求項５４に記載のコンピュータ可読媒体。
【請求項５６】
脊髄性筋萎縮（ＳＭＡ）またはそのキャリアの診断のためのキットであって、
（ａ）ＳＭＮ１のエクソン７またはその一部を増幅するための１つもしくは複数の試薬；
（ｂ）既知のコピー数を有する１つもしくは複数の参照遺伝子座を増幅するための１つもしくは複数の試薬；および
（ｃ）請求項５５に記載のコンピュータ可読媒体
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２００９年１１月１２日に出願された米国仮出願第６１／２６０，８０４号（この完全な内容は、参考として本明細書に援用される）の利益およびそれへの優先権を主張する。
【０００２】
配列表
本明細書は、配列表（２０１０年１１月１２日に「ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名称の．ｔｘｔファイルとして電子的に提出された）に言及する。この．ｔｘｔファイルは、２０１０年１１月１２日に作成され、６ｋｂの大きさである。配列表の全体の内容は、参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
個体の各細胞に存在する遺伝子のコピーの数は、重要な臨床的意味を持ち得る。例えば、常染色体遺伝子の２つ未満の正常コピーを有する個体は、疾患を発症し、かつ／または疾患のキャリアである危険性が高い可能性がある。したがって、遺伝子コピー数の推定値は、人生を左右するような影響を有し得る。例えば、疾患のキャリア状態を決定するための遺伝子コピー数の推定値は、子供をもうける夫婦の意思決定に影響を及ぼし得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、遺伝子座のコピー数を決定するための診断ツールが、生物学的アッセイ測定の質および／またはコピー数の確定の統計的信頼度の包括的評価と生物学的アッセイを組み合せることにより改善することができるという認識を含む。したがって、本発明は、とりわけ、著しく低い偽陽性率を有する、遺伝子座の異常なコピー数に関連する疾患、障害もしくは状態、またはそのキャリアのより正確かつ信頼できる診断方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
したがって、一態様では、本発明は、標的遺伝子座のコピー数を分析する方法であって、（ａ）複数の生物学的検体を提供するステップであって、各個別の生物学的検体が標的遺伝子座および既知のコピー数を有する１つまたは複数の参照遺伝子座を含む、ステップ；（ｂ）複数の生物学的アッセイを実施するステップであって、各個別の生物学的アッセイにより各個別の生物学的検体中の標的遺伝子座および１つまたは複数の参照遺伝子座を分析し、標的遺伝子座および１つまたは複数の参照遺伝子座に関する検出可能なシグナルのレベルがそれらのそれぞれのコピー数と相関するような検出可能なシグナルが得られる、複数の生物学的アッセイを実施するステップ；（ｃ）複数の生物学的アッセイに基づいて、１つまたは複数の参照遺伝子座に対して正規化した標的遺伝子座の複数のコピー数の推定値を決定するステップ；ならびに（ｄ）コピー数の推定値の質および／またはコピー数の確定（ｃａｌｌ）の統計的信頼度を評価し、それにより、標的遺伝子座のコピー数の確定を行うことができるか否かを決定するステップを含む方法を提供する。
【０００６】
いくつかの実施形態では、標的遺伝子座は、遺伝子またはその一部を含む。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座は、生存運動ニューロン１（ＳＭＮ１）のエクソンまたはその一部を含む。いくつかの実施形態では、ＳＭＮ１エクソンは、エクソン７である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の参照遺伝子座は、ＳＭＡＲＣＣ１およびＳＵＰＴ５Ｈからなる群から選択される。
【０００７】
いくつかの実施形態では、上述のステップ（ｂ）における生物学的アッセイは、標的遺伝子座および１つまたは複数の参照遺伝子座を増幅するリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイである。いくつかの実施形態では、検出可能なシグナルは蛍光シグナルであり、標的遺伝子座または１つもしくは複数の参照遺伝子座の蛍光シグナルのレベルはＲＴ−ＰＣＲの各増幅サイクルにおいて検出される。
【０００８】
いくつかの実施形態では、上述のステップ（ｃ）は、（ｉ）各個別の生物学的検体における蛍光シグナルの所定のレベルに達する標的遺伝子座と１つまたは複数の参照遺伝子座との間のサイクル数の差（ΔＣｔｉ）を決定するステップ；（ｉｉ）正常標的遺伝子座と１つまたは複数の参照遺伝子座との間の差を反映するキャリブレータ
【０００９】
【化１】
2013510580.tif 000003
を得るステップ；および（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）で決定されたサイクル数の差ΔＣｔｉをキャリブレータ
【００１０】
【化２】
2013510580.tif 000004
に対して正規化することによって各個別の生物学的検体における標的遺伝子座のコピー数の推定値を決定するステップを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）は、蛍光シグナルの所定のレベルに達する標的遺伝子座および１つまたは複数の参照遺伝子座のそれぞれのサイクル数（Ｃｔｉ）を最初に測定するステップを含む。いくつかの実施形態では、キャリブレータ
【００１１】
【化３】
2013510580.tif 000005
は、複数の生物学的検体における標的遺伝子座と１つまたは複数の参照遺伝子座との間のΔＣｔｉの刈り込み平均（例えば、８０％刈り込み平均）により定義される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、各個別の生物学的検体における標的遺伝子座のコピー数の推定値を線形目盛上で求める。いくつかの実施形態では、各個別の生物学的検体における標的遺伝子座のコピー数の推定値を対数目盛上で求める。
【００１３】
いくつかの実施形態では、標的遺伝子座のコピー数の推定値の質を、１つまたは複数の参照遺伝子座について得られたデータの質に基づいて評価する。いくつかの実施形態では、統計的信頼度を、測定の信頼度および／または確定の信頼度を決定することにより評価する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、上述のステップ（ｂ）で実施する生物学的アッセイを反復する。いくつかの実施形態では、コピー数の確定の統計的信頼度を、反復生物学的アッセイの測定の信頼度および複数のコピー数の推定値に基づく確定の信頼度の計算により決定する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、上述のステップ（ｄ）は、確定の信頼度が所定の閾値より低い場合に標的遺伝子座のコピー数の確定を行うことができないことを決定するステップを含む。
【００１６】
他の態様では、本発明は、標的遺伝子の異常なコピー数に関連する疾患またはそのキャリアを検出する方法であって、（ａ）対象の個体から得られた少なくとも１つの生物学的検体を含む複数の生物学的検体を提供するステップ；（ｂ）多数の反復生物学的アッセイを複数の生物学的検体のそれぞれについて実施して、標的遺伝子および既知のコピー数を有する１つまたは複数の参照遺伝子を分析するステップであって、多数の反復生物学的アッセイのそれぞれにより、標的遺伝子および１つまたは複数の参照遺伝子の検出可能なシグナルのレベルがそれらのそれぞれのコピー数と相関するような検出可能なシグナルが得られる、ステップ；（ｃ）１つまたは複数の参照遺伝子に対して正規化した標的遺伝子のコピー数の推定値を決定するステップ；ならびに（ｄ）コピー数の推定値の質および／または対象の個体のコピー数の確定の統計的信頼度を評価し、それにより、個体における標的遺伝子のコピー数の確定を行うことができるか否かを決定するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、個体が疾患を有するもしくはその危険性があるか否か、または個体が疾患のキャリアであるか否かを決定するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、疾患は、脊髄性筋萎縮（ＳＭＡ）である。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、生存運動ニューロン１（ＳＭＮ１）である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、上述のステップ（ｂ）で実施する生物学的アッセイは、リアルタイムＰＣＲアッセイである。いくつかの実施形態では、上述のステップ（ｂ）は、ＳＭＮ１のエクソン７の少なくとも一部を増幅するリアルタイムＰＣＲアッセイを実施するステップを含む。いくつかの実施形態では、生物学的アッセイにより得られる検出可能なシグナルは、蛍光シグナルであり、標的遺伝子または１つもしくは複数の参照遺伝子の蛍光シグナルのレベルをＲＴ−ＰＣＲの各増幅サイクルにおいて検出する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、上述のステップ（ｃ）は、（ｉ）各個別の反復アッセイにおける蛍光シグナルの所定のレベルに達する標的遺伝子と１つまたは複数の参照遺伝子との間のサイクル数の差（ΔＣｔｉ）を決定するステップ；（ｉｉ）正常標的遺伝子と１つまたは複数の参照遺伝子との間のバックグラウンドの差を反映するキャリブレータ
【００１９】
【化４】
2013510580.tif 000006
を得るステップ；および（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）で決定されたサイクル数の差ΔＣｔｉをキャリブレータ
【００２０】
【化５】
2013510580.tif 000007
に対して正規化することによって各個別の反復アッセイに基づくコピー数の推定値を得るステップを含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、各個別の反復アッセイに基づく標的遺伝子のコピー数の推定値を線形目盛上で求める。いくつかの実施形態では、各個別の反復アッセイに基づく標的遺伝子のコピー数の推定値を対数目盛上で求める。
【００２２】
いくつかの実施形態では、コピー数の推定値の質を評価するステップは、１つまたは複数の参照遺伝子について得られたサイクル数の測定およびその増幅曲線の勾配に基づいて品質管理メトリクス（ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｍｅｔｒｉｃｓ）を得るステップを含む。いくつかの実施形態では、コピー数の推定値の質を評価するステップは、多数の反復生物学的アッセイ間の変動係数を求めるステップを含む。いくつかの実施形態では、コピー数の確定の統計的信頼度を評価するステップは、測定の信頼度および／または確定の信頼度を決定するステップを含む。いくつかの実施形態では、コピー数の確定の統計的信頼度を、多数の反復生物学的アッセイの測定の信頼度および複数のコピー数の推定値に基づく確定の信頼度の計算により決定する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、測定の信頼度を、複数の反復アッセイにわたるコピー数の推定値の平均値および所定のコピー数の限界内に適合する平均値の標準誤差により定義されるコピー数の推定値の周りの最大正規信頼区間として決定する。いくつかの実施形態では、上述のステップ（ｄ）は、測定の信頼度が所定の信頼度閾値を超えない場合にコピー数の確定を行うことができないことを決定するステップを含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、確定の信頼度は、隣接コピー数分布からのものであるコピー数の推定値のｔ検定のｐ値を決定する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、確定の信頼度が所定の信頼度閾値より低い場合にコピー数の確定を行うことができないことを決定するステップを含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、標的遺伝子の所定のコピー数を有する１つまたは複数の対照試料を並行して分析するステップをさらに含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、複数の生物学的検体および１つまたは複数の対照試料における生物学的アッセイは、マルチウェルプレート（例えば、９６ウェルまたは３８４ウェルプレート）で実施する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、１つまたは複数の対照試料の品質管理および統計分析に基づいてプレート品質管理メトリクスを決定するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の対照試料のいずれかが品質管理もしくは統計的信頼度評価の１つに不合格である場合、またはいずれかの個別の対照試料の推定値が所定のコピー数に等しくない場合には、プレートは不合格である。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本発明に適する生物学的検体は、細胞、組織、全血、血漿、血清、尿、便、唾液、臍帯血、絨毛膜絨毛試料、絨毛膜絨毛試料培養物、羊水、羊水培養物または経頸部洗浄液（ｔｒａｎｓｃｅｒｖｉｃａｌ  ｌａｖａｇｅ  ｆｌｕｉｄ）からの核酸を含む。いくつかの実施形態では、本発明に適する生物学的検体は、出生前試料である。
【００２８】
さらに他の態様では、本発明は、本明細書で述べる標的遺伝子座のコピー数を分析するためのシステムを提供する。いくつかの実施形態では、本発明によるシステムは、ａ）複数の生物学的検体を受容するための手段であって、各個別の生物学的検体が標的遺伝子座および既知のコピー数を有する１つまたは複数の参照遺伝子座を含む、手段；ｂ）複数の生物学的アッセイを実施するための手段であって、各個別の生物学的アッセイにより各個別の生物学的検体における標的遺伝子座および１つまたは複数の参照遺伝子座を分析し、標的遺伝子座および１つまたは複数の参照遺伝子座の検出可能なシグナルのレベルがそれらのそれぞれのコピー数と相関するような検出可能なシグナルが得られる、手段；ｃ）各個別の生物学的検体からの検出可能なシグナルを検出し、検出可能なシグナルのレベルを測定するように構成された測定モジュール；ｄ）測定モジュールからのシグナル情報を保存するように構成された記憶装置；ｅ）（ｉ）記憶装置に保存されたシグナル情報に基づいて１つまたは複数の参照遺伝子座に対して正規化した標的遺伝子座のコピー数の推定値を計算し、（ｉｉ）コピー数の推定値の質および／またはコピー数の確定の信頼度を決定するように適合された計算モジュール；ならびにｆ）使用者のための計算およびデータ分析結果に一部基づき、標的遺伝子座のコピー数の確定および／または品質管理もしくは統計的信頼度分析のいずれかが失敗であるか否かを示すシグナルを含む内容を表示するためのディスプレイモジュールを含む。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座は、生存運動ニューロン１（ＳＭＮ１）のエクソンまたはその一部を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、生物学的アッセイは、リアルタイムＰＣＲアッセイである。いくつかの実施形態では、測定モジュールは、各増幅サイクルにおける検出可能なシグナルのレベルを測定するように構成されており、検出可能なシグナルは、蛍光シグナルである。
【００３０】
いくつかの実施形態では、計算モジュールは、（ｉ）各個別の検体における蛍光シグナルの所定のレベルに達する標的遺伝子座と１つまたは複数の参照遺伝子座との間のサイクル数の差（ΔＣｔｉ）を決定するステップ；（ｉｉ）正常標的遺伝子座と１つまたは複数の参照遺伝子座との間のバックグラウンドでの差を反映するキャリブレータ
【００３１】
【化６】
2013510580.tif 000008
を得るステップ；および（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）で測定されたサイクル数の差ΔＣｔｉをキャリブレータ
【００３２】
【化７】
2013510580.tif 000009
に対して正規化することによって各個別の生物学的検体における標的遺伝子座のコピー数の推定値を決定するステップに従って、標的遺伝子座のコピー数の推定値を計算するように適合されている。
【００３３】
いくつかの実施形態では、計算モジュールは、１つまたは複数の参照遺伝子について得られたサイクル数の測定およびその増幅曲線の勾配に基づいて、品質管理メトリクスを少なくとも得ることによりコピー数の推定値の質を決定するように適合されている。いくつかの実施形態では、計算モジュールは、試料の変動係数を少なくとも決定することによりコピー数の推定値の質を適合するように構成されている。いくつかの実施形態では、計算モジュールは、測定の信頼度を少なくとも決定し、決定された測定の信頼度を所定の閾値限界と比較することによりコピー数の確定の統計的信頼度を決定するように適合されている。いくつかの実施形態では、計算モジュールは、確定の信頼度を少なくとも決定し、決定された確定の信頼度を所定の閾値限界と比較することによりコピー数の確定の統計的信頼度を決定するように適合されている。いくつかの実施形態では、計算モジュールは、任意の対照試料が不合格であるか否かを決定するようにさらに適合されている。
【００３４】
さらに他の態様では、本発明は、本明細書で述べるようにコンピュータ上で方法を実施するための計算モジュールおよびディスプレイモジュールを含むソフトウエアモジュールを規定するための記録されたコンピュータ可読の命令を有するコンピュータ可読媒体を提供する。いくつかの実施形態では、前記方法は、ａ）計算モジュールにより、（ｉ）記憶装置に保存されたリアルタイムＰＣＲデータに基づく１つまたは複数の参照遺伝子座に対して正規化した標的遺伝子座のコピー数の推定値ならびに（ｉｉ）コピー数の推定値の質および／またはコピー数の確定の統計的信頼度を計算するステップ；ならびにｂ）使用者のための計算およびデータ分析結果に一部基づき、標的遺伝子座のコピー数の確定および／または品質管理もしくは統計的信頼度分析のいずれかが失敗であるか否かを示すシグナルを含む内容を表示するステップを含む。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座は、ＳＭＮ１のエクソン７またはその一部を含む。
【００３５】
他の関連する態様では、本発明は、本明細書で述べる組成物および方法を用いて遺伝子座の異常なコピー数または対立遺伝子変異型に関連する疾患、障害または状態を検出するための診断キットを提供する。いくつかの実施形態では、本発明による発明のキットは、脊髄性筋萎縮（ＳＭＡ）またはそのキャリアの診断に適する。いくつかの実施形態では、本発明によるキットは、（ａ）ＳＭＮ１のエクソン７またはその一部を増幅するための１つもしくは複数の試薬；（ｂ）既知のコピー数を有する１つもしくは複数の参照遺伝子座を増幅するための１つもしくは複数の試薬；および（ｃ）本明細書で述べたコンピュータ可読媒体を含む。
【００３６】
本明細書において、「または」の使用は、特に明記しない限り、「および／または」を意味する。本明細書で用いているように、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの該用語の変形形態は、他の添加物、成分、整数またはステップを除外することを意図するものでない。本明細書で用いているように、「約」および「おおよそ」という用語は、同等のものとして用いる。約／おおよそを付してまたは付さずに本明細書で用いる数表示は、当業者により認識される通常の変動を含むものとする。特定の実施形態では、「おおよそ」または「約」という用語は、特に明記しない限りまたは文脈から特に明らかでない限り（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除き）、記載される参照値のいずれかの方向の（それより大きいまたは小さい）２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはより小さい範囲内に入る値の範囲を指す。
【００３７】
本発明の他の特徴、目的および利点は、以下の詳細な説明、図面および特許請求の範囲において明らかである。しかし、詳細な説明、図面および特許請求の範囲は、本発明の実施形態を示すが、例示のみの目的で示すものであって、限定の目的で示すものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内の様々な変更および修正は、当業者に明らかになる。
【００３８】
図面は、例示の目的のみのためであって、限定のためではない。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、エクソン７を含むＳＭＮ１遺伝子の一部のゲノム配列を示す図である。エクソン７をコードする配列は、太字である。ＴＡＱＭＡＮ（商標）分析に用いることができた具体例としてのプライマーおよびプローブを示す（陰影付き）。具体例としての配列決定プライマー（ＳＭＮＦＵＰ１およびＳＭＮＲＩＰ１）も示す（陰影付き）。小文字は、単一ヌクレオチド多形を示す。
【図２】図２は、ウェルが２コピー対照、カクテル（例えば、試薬および緩衝液の）ブランクおよび複製の試料を含む、具体例としてのプレートの構成を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、分析システムに含めることができる計算デバイスの実施形態を説明するブロック図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、分析システムに含めることができる計算デバイスの実施形態を説明するブロック図である。
【図４】図４は、分析システムの実施形態を説明するブロック図である。
【図５Ａ】図５Ａは、３８４ウェルプレート上で複製物（９６検体について各４つの複製物）について実施したＴＡＱＭＡＮ（商標）リアルタイムＰＣＲ実験からのＣｔデータから一連の検体におけるコピー数の推定値を得る方法の特定の実施形態の概要を説明する流れ図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、プレートの品質管理を実施する方法の実施形態を説明する流れ図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、検体の品質管理を実施する方法の実施形態を説明する流れ図である。
【図６Ａ】図６Ａは、検体およびプレートの統計値を表示するためのレイアウトの実施形態を示す画面コピーである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、プレートおよび検体の品質管理の結果の実施形態を示す画面コピーである。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
定義
本発明がより容易に理解されるために、特定の用語を最初に下文で定義する。以下の用語および他の用語のさらなる定義は、本明細書を通して示す。
【００４１】
本明細書で用いているように、「対立遺伝子」という語句は、「対立遺伝子変異型」と同義で用いられ、遺伝子座または遺伝子の変異型を指す。いくつかの実施形態では、遺伝子座または遺伝子の特定の対立遺伝子は、特定の表現型、例えば、疾患または状態を発現する危険性の変化、特定の疾患または状態の段階への進行の可能性、特定の療法の適用可能性、感染に対する感受性、免疫機能等に関連する。
【００４２】
本明細書で用いているように、「生物学的検体」という語句は、「生物学的試料」と同義で用いられ、「検体」または「試料」と呼ぶことができる。「生物学的検体」という語句は、本明細書で用いているように生存細胞または生物体から得られた、それにより排泄もしくは分泌された固体または流体（またはそれらの組合せ）試料を指す。特定の実施形態では、生物学的検体は、核酸を含む。生物学的検体の非限定的な例は、血液、血漿、血清、尿、便、唾液、臍帯血、絨毛膜絨毛試料、羊水および経頸部洗浄液などである。生物学的検体の細胞培養、例えば、絨毛膜絨毛試料の培養および／または羊膜細胞培養のような羊水培養物も生物学的検体として用いることができる。生物学的検体は、例えば、臓器または組織から得られた試料（生検または剖検検体を含む）でもあり得、細胞（初代細胞であるかまたは培養細胞であるかを問わず）、細胞により条件づけられた培地、組織または臓器、組織培養を含み得る。いくつかの実施形態では、同じ検体の複製物をアッセイにかけることができる。（下の「反復」を参照のこと）。
【００４３】
本明細書で用いているように、「キャリア」という語句は、遺伝子突然変異または対立遺伝子変異型を有するが、遺伝子突然変異または対立遺伝子変異型に関連する疾患の症状を示さない個体を指す。しかし、キャリアは、一般的に遺伝子突然変異または対立遺伝子変異型をそれらの子孫に伝えることができ、それらの子孫はその後、突然変異遺伝子または対立遺伝子変異型を発現する可能性がある。一般的に、この現象は、多くの遺伝子の劣性の結果である。特定の実施形態では、キャリアが有する突然変異または対立遺伝子変異型は、特定の表現型、例えば、疾患または状態を発現する危険性の変化、特定の疾患または状態の段階への進行の可能性、特定の療法の適用可能性、感染に対する感受性、免疫機能等の素因となるまたはそれに関連する。制限なしに、キャリアは、遺伝子または遺伝子の一部のコピー数の減少または増加を有する可能性がある。キャリアはまた、遺伝子内の突然変異（例えば、点突然変異、多形、欠失、挿入または転座等）を有する可能性がある。「キャリア」はまた、本明細書で「遺伝キャリア」と呼ぶ。
【００４４】
本明細書で用いているように、「コピー数」という語句は、遺伝子座に関して用いる場合、ゲノムまたはゲノム同等物当たりの存在するそのような遺伝子座のコピーの数を指す。「正常コピー数」は、遺伝子座に関して用いる場合、正常個体に存在する正常または野生型対立遺伝子のコピー数を指す。特定の実施形態では、コピー数は、ゼロから３、ゼロから４、ゼロから６、ゼロから７コピーに及ぶ（両端を含む）、またはゼロから７を超えるコピー数である。遺伝子座のコピー数が集団中の個体にわたって著しく異なる実施形態では、推定されたコピー数の中央値を計算および／または比較の目的のための「正常コピー数」と解釈することができる。
【００４５】
本明細書で用いているように、「遺伝子」という用語は、個別の細胞（例えば、細胞内または細胞外）産物および／または機能に関与する個別の核酸配列を指す。より具体的には、「遺伝子」という用語は、タンパク質をコードする部分を含み、かつ、対象の遺伝子によりコードされるタンパク質の発現の調節に関与するプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどの調節配列を場合によって含む核酸を指す。本明細書で用いているように、「遺伝子」という用語は、タンパク質をコードせずに、ｔＲＮＡｓ、ｒＲＮＡｓ等のような機能的ＲＮＡ分子の転写の鋳型となる核酸も含み得る。あるいは、遺伝子は、タンパク質および／または核酸結合部位などの特定の事象／機能のためのゲノム位置を定義し得る。
【００４６】
「個体」および「対象」という用語は、本明細書において同義で用いる。本明細書で用いているように、それらは、疾患もしくは障害（例えば、脊髄性筋萎縮）に苦しみ得るまたは罹りやすいが、疾患もしくは障害の症状を示し得るまたは示し得ないヒトまたは他の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマもしくは霊長類の動物）を指す。多くの実施形態では、対象は、人間である。多くの実施形態では、対象は、患者である。特に明記しない限り、「個体」および「対象」という用語は、特定の年齢を意味せず、したがって、成人、小児（例えば、幼児または新生児）および胎児を含む。
【００４７】
本明細書で用いているように、「遺伝子座」という用語は、染色体上の特定のＤＮＡ配列の特定の位置を指す。本明細書で用いているように、特定のＤＮＡ配列は、任意の長さであり得る（例えば、１、２、３、１０、５０またはそれ以上のヌクレオチド）。いくつかの実施形態では、遺伝子座は、遺伝子もしくは遺伝子の一部であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子座は、遺伝子のエクソンもしくはエクソンの一部であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子座は、遺伝子のイントロンもしくはイントロンの一部であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子座は、遺伝子の調節エレメントもしくは調節エレメントの一部であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子座は、疾患、障害および／または状態に関連する。例えば、遺伝子座における突然変異（例えば、欠失、挿入、スプライシング突然変異、点突然変異等）は、疾患、障害および／または状態と相関させることができる。
【００４８】
本明細書で用いているように、「正常」という用語は、「コピー数」または「遺伝子座」または「遺伝子」または「対立遺伝子」という用語を修飾するために用いる場合、集団に最高の百分率で存在するコピー数または遺伝子座、遺伝子もしくは対立遺伝子、例えば、野生型の数または対立遺伝子を指す。「個体」または「対象」という用語を修飾するために用いる場合、それらは、集団に最高の百分率で存在するコピー数または遺伝子座、遺伝子もしくは対立遺伝子を有する個体または個体の群、例えば、野生型個体または対象を指す。一般的に、正常「個体」または「対象」は、特定の疾患または状態を有さず、疾患または状態のキャリアでもない。「正常」という用語は、正常もしくは野生型個体または対象から分離された生物学的検体または試料を修飾する（例えば、「正常生物学的試料」）ためにも本明細書において用いる。
【００４９】
本明細書で用いているように、「プローブ」という用語は、核酸のプローブに関して用いる場合、対象の核酸と結合またはハイブリダイズすることができる特定のヌクレオチド配列を有する核酸分子（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）を指す。一般的に、プローブは、１つまたは複数の種類の化学結合により、通常水素結合の形成により、相補的または実質的に相補的配列の核酸と特異的に結合する（または特異的にハイブリダイズする）。いくつかの実施形態では、プローブは、リアルタイムＰＣＲ反応においてＤＮＡアンプリコンの核酸に結合することができる。
【００５０】
本明細書で用いているように、「反復」という用語は、生物学的アッセイに関して用いる場合、信頼度、耐障害性を改善するためまたは統計分析を容易にするために実施される繰返しアッセイまたは反復アッセイを指す。いくつかの実施形態では、「反復」という用語は、「反復アッセイ」または「反復生物学的アッセイ」という語句と同義で用いる。一般的に、反復アッセイは、同じ個体から採取された同じまたは類似の生物学的検体からの材料を用いて行われる。すなわち、複数の検体を特定の個体から得ることができ、および／または特定の個体からの単一の検体を部分に分割することができる（各部分が反復アッセイに用いられるか、または後の使用のために保存される）。いくつかの実施形態では、用いられる反復アッセイの数は、所定の統計的閾値によって、または経験的に選択される。いくつかの実施形態では、２反復、３反復、４反復、５反復、６反復、７反復、８反復、９反復、１０反復または１０を超える反復を用いる。いくつかの実施形態では、４反復を用いる。
【００５１】
本明細書で用いているように、「シグナル」という用語は、検出可能および／または測定可能な実体を指す。特定の実施形態では、シグナルは、ヒト眼により検出できる、例えば、目に見える。例えば、シグナルは、可視スペクトルにおける色の強度および／または波長であるか、またはそれに関連し得る。そのようなシグナルの非限定的な例は、酵素反応などの化学反応に起因する着色沈殿物および着色可溶性生成物などである。特定の実施形態では、シグナルは、装置を用いて検出できる。いくつかの実施形態では、シグナルは、励起したとき蛍光を放射する発蛍光団から発生し、光は、蛍光検出器で検出できる。いくつかの実施形態では、シグナルは、分光光度計により検出できる光（例えば、可視光および／または紫外光）であるか、またはそれに関連する。例えば、化学発光反応により発生する光は、シグナルとして用いることができよう。いくつかの実施形態では、シグナルは、放射線、例えば、放射性同位体により放射される放射線、赤外線等であるか、またはそれに関連する。特定の実施形態では、シグナルは、物理的実体の特性の直接的または間接的インジケータである。例えば、シグナルは、生物学的試料中および／または反応容器中の核酸の量および／または濃度の指標として用いることができよう。
【００５２】
詳細な説明
本発明は、遺伝子座を分析するより正確かつ信頼できる方法を提供する。とりわけ、本発明は、生物学的アッセイを包括的な品質管理および統計的信頼度評価と組み合せることにより遺伝子座（特に、正常遺伝子座）のコピー数を分析する方法を提供する。実施例の項で述べるように、本出願の発明者らは、生物学的および統計的分析を効果的かつ効率的に組み合せるシステムおよび方法を開発することに成功した。いくつかの実施形態では、本発明は、例えば、生物学的アッセイの測定の信頼度およびコピー数の確定の統計的信頼度を決定することによりコピー数の推定値の質を評価する、コンピュータシステムにより実行可能なアルゴリズムを利用する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示する発明の方法は、品質管理および／または統計的信頼度評価を容易にするために、標的遺伝子座並びに既知のコピー数を有する１つまたは複数の参照遺伝子座を同じ生物学的アッセイ（例えば、リアルタイムＰＣＲ）を用いて分析する。
【００５３】
多くの遺伝子座が遺伝病に関与しており、そのような遺伝子座は、本明細書で開示する方法を用いて分析することができる。したがって、本明細書で開示する方法は、キャリアの検出、患者の診断、出生前診断および／または着床のための胚の遺伝子型決定等を促進し得る。当業者により認識されているように、標的遺伝子座が関連する遺伝病は、例えば、常染色体劣性、常染色体優性、伴性優性および伴性劣性を含む多くの遺伝パターンのいずれかに従い得る。
【００５４】
いくつかの実施形態では、コピー数の分析は、遺伝子座の一部またはすべての欠失が疾患に関与する遺伝子座について実施する。標的遺伝子座における欠失は、２０塩基対（ｂｐ）未満、２０ｂｐから１００ｂｐまで、１００ｂｐから２００ｂｐまで、２００ｂｐから５００ｂｐまで、５００ｂｐから１ｋｂまで、１ｋｂから２ｋｂまで、２ｋｂから５ｋｂまで、５ｋｂから１０ｋｂまで、１０ｋｂから２０ｋｂまで、２０ｋｂから３０ｋｂまで、および３０ｋｂを超えるサイズの欠失を含むが、これらに限定されない。
【００５５】
いくつかの実施形態では、コピー数の分析は、１つまたは複数の点突然変異および／または挿入突然変異が疾患に関与する標的遺伝子座について実施する。これらの場合、生物学的アッセイは、標的遺伝子座に存在する正常な配列または対立遺伝子のコピー数を検出するように設計することができる。例えば、リアルタイムＰＣＲのような方法は、増幅が正常な配列が存在する場合にのみ起こるように突然変異と正常なヌクレオチド配列とを識別するプライマーを用いて適応することができる。
【００５６】
本発明の様々な態様を以下の項で詳細に述べる。項を用いることは、本発明を限定することを意味しない。各項は、本発明のあらゆる態様に適用され得る。本出願において、特に明記しない限り、「または」の使用は、「および／または」を意味する。
【００５７】
Ｉ．標的遺伝子座ならびに関連する遺伝的疾患、障害および状態
本発明による発明の方法は、標的遺伝子座のコピー数を分析するのに適している。特定の実施形態では、標的遺伝子座は、疾患、障害または状態に関連する。例えば、標的遺伝子座におけるまたは標的遺伝子座内の突然変異または対立遺伝子変異は、疾患、障害もしくは状態および／またはそのキャリアとしての状態を発現する危険性の変化（例えば、増大または低下）と相関し得る。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座におけるまたは標的遺伝子座内の突然変異または対立遺伝子変異と疾患、障害もしくは状態またはキャリア状態との間に因果関係がある。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座におけるまたは標的遺伝子座内の突然変異または対立遺伝子変異は、疾患、障害または状態と一緒に分離するが、疾患、障害または状態の発現に直接的に寄与しない。
【００５８】
いくつかの実施形態では、本発明により分析することができる標的遺伝子座は、遺伝子またはその一部（例えば、エクソン、イントロン、プロモーターもしくは他の調節領域）を含む。表１にそのような遺伝子および関連する遺伝的疾患、障害または状態の非限定的な例を示す。当業者により理解されるように、遺伝子は、複数の名称により公知であり得る。表１における列挙は、特定の疾患に関連し得るその他の遺伝子の存在を排除するものでない。本発明は、将来発見される各個別の疾患に関連するものを含むそれらのその他の遺伝子を含む。
【００５９】
【表１−１】
2013510580.tif 000010
【００６０】
【表１−２】
2013510580.tif 000011
【００６１】
【表１−３】
2013510580.tif 000012
したがって、本発明の方法を用いて分析することができる標的遺伝子座は、表１で識別される遺伝子またはその一部（例えば、エクソン、イントロンまたは調節領域）を含むが、これらに限定されない。表１に明らかにした遺伝子の配列は、当技術分野で公知であり、遺伝子名を用いたＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベースにおける検索により容易にアクセス可能であり、そのような配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６２】
大部分の遺伝子は通常ゲノム等価体当たり２コピーで存在するが、個体間にコピー数の変動が存在する多数の遺伝子が見いだされている。コピー数の差は、遺伝子重複事象、遺伝子欠失事象、遺伝子変換事象、遺伝子再配列、染色体転移等を含むが、これらに限定されない多数の機構により生じ得る。特定の遺伝子のコピー数の差は、疾患または状態を発現する危険性、特定の疾患または状態の段階への進行の可能性、特定の療法への適合性（ａｍｅｎａｂｉｌｉｔｙ）、感染に対する感受性、免疫機能等を含むが、これらに限定されない意味を持ち得る。表１に示した遺伝子に加えて、本明細書で開示する方法は、そのようなコピー数変異を有する遺伝子座におけるコピー数を分析するのに適している。アドレスが「ｈｔｔｐ：／／」の直後が「ｐｒｏｊｅｃｔｓ．ｔｃａｇ．ｃａ／ｖａｒｉａｔｉｏｎ」であるウエブサイトで維持されているゲノム変異体のデータベース（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｖａｒｉａｎｔｓ）（その全内容がそれらの全体として参照により本明細書に組み込まれる）は、少なくとも３８，４０６を超えるコピー数変異を収載している（２００９年３月１１日現在）（例えば、それぞれの全内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｉａｆｒａｔｅら（２００４年）「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３６巻（９号）、９４９〜５１頁；Ｚｈａｎｇら（２００６年）「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｉｓｐｌａｙ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ」、１１５巻（３〜４号）、２０５〜１４頁；Ｚｈａｎｇら（２００９年）「Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１０巻、４５１〜４８１頁；およびＷａｉｎら（２００９年）「Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ，  ｈｕｍａｎ  ｈｅａｌｔｈ，  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｌａｎｃｅｔ、３７４巻、３４０〜３５０頁を参照）。
【００６３】
ＳＭＮ１、ＳＭＮ２および脊髄性筋萎縮（ＳＭＡ）
いくつかの実施形態では、標的遺伝子座は、生存運動ニューロン１（ＳＭＮ１）遺伝子またはＳＭＮ１の一部（例えば、エクソン）である。ＳＭＮ１の部分ヒトゲノム配列を図１に示す（ヒトＳＭＮ１に関する情報については、例えば、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、アドレスが「ｈｔｔｐ」の直後が「ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ？Ｄｂ＝ｇｅｎｅ＆Ｃｍｄ＝ｒｅｔｒｉｅｖｅ＆ｄｏｐｔ＝ｆｕｌｌ＿ｒｅｐｏｒｔ＆ｌｉｓｔ＿ｕｉｄｓ＝６６０６＆ｌｏｇ＄＝ｄａｔａｂａｓｅａｄ＆ｌｏｇｄｂｆｒｏｍ＝ｎｕｃｃｏｒｅ」であるウエブサイトにおけるＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅデータベースにおけるＧｅｎｅＩＤ＃６６０６を参照のこと。ヒトＳＭＮ１の具体例としての部分または全ゲノム配列は、受託番号ＮＧ＿００８６９１．１、ＮＣ＿０００００５．９、ＮＴ＿００６７１３．１５、ＡＣ＿００００４８．１、ＮＷ＿９２２７０７．１、ＡＣ＿０００１３７．１、ＮＷ＿００１８３８９４６．１およびＮＷ＿００１８４１２２９．１のもとでＮＣＢＩヌクレオチドデータベースに見いだすことができる）。
【００６４】
ＳＭＮ１は、染色体５ｑ１３上の重複領域の一部であり、ＳＭＮ１における突然変異は、脊髄の前角における運動ニューロンを侵す治療不可能な常染色体劣性障害である、脊髄性筋萎縮（ＳＭＡ）に関連する。１：５０から１：３０までのキャリア頻度を有する、ＳＭＡは、嚢胞性線維症後の西半球における第２の最も一般的な致命的常染色体劣性疾患である。
【００６５】
全ＳＭＡ患者の約９５パーセントが両遺伝子座におけるＳＭＮ１のエクソン７を欠いている。遺伝子欠失および遺伝子変換事象の両方がＳＭＡ患者におけるＳＭＮ１のエクソン７の欠如に起因していた可能性があると考えられた。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＳＭＮ１のエクソン７の一部またはすべてのコピー数を分析する。ＳＭＮ１のエクソン７のゲノム配列については図１を参照のこと。
【００６６】
関連遺伝子である生存運動ニューロン２（ＳＭＮ２）は、染色体５ｑ１３上のＳＭＮ１の近くに位置し、ＳＭＮ１の相同体をコードする。ＳＭＮ２のコーディング配列はエクソン７における単一ヌクレオチド（８４０Ｃ→Ｔ）異なるが、ＳＭＮ２遺伝子産物は、ＳＭＮ１の喪失を完全には補償することはできない。理論に拘束されるものでないが、ＳＭＮ２における８４０位における転写的にサイレントなＣ→Ｔトランジションは、短縮型転写物が発生するようにエクソンスプライシングエンハンサーの活性を低下させると考えられる。短縮型転写物は、不安定であり、細胞中で速やかに分解すると考えられる。ＳＭＮ２遺伝子産物はＳＭＮ１の喪失を完全には補償することはできないが、いくつかの最近の研究でＳＭＮ２がＳＭＮ１の変更因子である可能性があることが示唆されている。いくつかの実施形態では、本発明は、ＳＭＮ２またはＳＭＮ２の一部（例えば、エクソン）遺伝子を分析するのに用いることができる。
【００６７】
腫瘍抑制遺伝子および／または癌遺伝子
いくつかの実施形態では、標的遺伝子座は、腫瘍抑制遺伝子および／または癌遺伝子などの癌に関与する遺伝子または遺伝子の一部（例えば、エクソン）である。例えば、表皮成長因子１（ＥＧＦＲ）は、コピー数が個体間で異なる癌遺伝子である。ＥＧＦＲコピー数は、非小細胞肺癌などの癌において正常より高いことがあり得、癌療法への適合性に密接な関係を有し得る。コピー数変異に加えて、ＥＧＦＲのエクソン２〜７の欠失などのＥＧＦＲの多数の突然変異体が存在する。本発明の方法を用いてコピー数を推定することができる他のまたはさらなる癌遺伝子の例は、Ｂ−ｒａｆ癌遺伝子（ＢＲＡＦ）；Ｋ−ｒａｓ癌遺伝子（ＫＲＡＳ）；およびホスファチジルイノシトール３キナーゼ、触媒作用、アルファ（ＰＩＫ３ＣＡ）を含むが、これらに限定されない。本発明の方法を用いて数を推定することができる腫瘍抑制遺伝子の例は、ホスファターゼおよびテンシン相同体（ＰＴＥＮ）を含むが、これらに限定されない。（例えば、それぞれの全内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｒｏｎｉら（２００５年）、「Ｇｅｎｅ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｆｏｒ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （ＥＧＦＲ）  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａｎｔｉＥＧＦＲ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ：  ａ  ｃｏｈｏｒｔ  ｓｔｕｄｙ」、Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．、６巻（５号）、２７９〜８６頁；およびＳｏｈら（２００９年）、「Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｇａｉｎｓ  ａｎｄ  ｍｕｔａｎｔ  ａｌｌｅｌｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｂａｌａｎｃｅ  （ＭＳＡＳＩ）  ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ  ｏｃｃｕｒ  ｔｏｇｅｔｈｅｒ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ」、４巻（１０号）、ｅ７４６４頁を参照のこと）。
【００６８】
感染に対する感受性に関与する遺伝子
いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、感染に対する感受性に関与する遺伝子または遺伝子の一部（例えば、エクソン）である。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座は、ＣＣＬ３Ｌ１の遺伝子または遺伝子の一部（例えば、エクソン）である。ＣＣＬ３Ｌ１は、第１７染色体のｑアーム上に位置し、そのコピー数は、個体間で異なる。大部分の個体は、二倍体ゲノム当たり１〜６コピーを有し、一部の個体は、コピーを有さないか、または６コピーを超えるコピーを有する。ＣＣＬ３Ｌ１コピー数の増加は、ヒトＨＩＶ感染に対するより低い感受性に関連づけられた。ＣＣＬ３Ｌ１は、ケモカイン結合タンパク質２およびケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）を含むいくつかのケモカイン受容体に結合するサイトカインをコードする。ＣＣＲ５は、ＨＩＶに対する共受容体であり、ＣＣＲ５へのＣＣＬ３Ｌ１の結合は、ＨＩＶの侵入を阻害する。
【００６９】
免疫機能の調節に関与する遺伝子
いくつかの実施形態では、標的遺伝子座は、免疫機能の調節に関与する遺伝子または遺伝子の一部（例えば、エクソン）である。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座は、ＣＤ１６表面免疫グロブリン受容体をコードするＦＣＧＲ３Ｂである。ＦＣＧＲ３Ｂの低いコピー数は、全身性紅斑性狼瘡および類似の炎症性自己免疫疾患に対する感受性の増大と相関する。ＦＣＧＲ３Ｂのコピー数の変異は、自閉症、統合失調症および特発性学習障害に関連することも見いだされた。
【００７０】
ＩＩ．参照遺伝子座
本発明によれば、１つまたは複数の参照遺伝子座を一般的に同じ生物学的アッセイを用いて標的遺伝子座とともに分析する。参照遺伝子座のコピー数は、既知であるか、または同じ生物学的アッセイを用いてあらかじめ決定する。一般的に、適切な参照遺伝子座は、安定したコピー数を有し、異なる生物学的検体間で変化する可能性が少ない。参照遺伝子座について得られるデータは、標的遺伝子座のコピー数の推定値を正規化し、かつ／またはコピー数の推定値の質および／またはアッセイ測定に関する統計的信頼度の評価を容易にするために用いることができる。
【００７１】
いくつかの実施形態では、参照遺伝子座のコピー数は、標的遺伝子座の正常コピー数と同じである。いくつかの実施形態では、参照遺伝子座のコピー数は、標的遺伝子座の正常コピー数より大きい。いくつかの実施形態では、参照遺伝子座のコピー数は、標的遺伝子座の正常コピー数より小さい。いくつかの実施形態では、参照遺伝子座と標的遺伝子座が同じ染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、参照遺伝子座と標的遺伝子座が異なる染色体上に存在する。
【００７２】
既知のコピー数を有する様々な遺伝子座のいずれかを参照遺伝子座として用いることができる。いくつかの実施形態では、１つの参照遺伝子座は、ＳＭＡＲＣＣ１（ＳＷＩ／ＳＮＦ関連、マトリックス関連、クロマチンのアクチン依存性調節因子、サブファミリーｃ、メンバー１）またはＴｙ５相同体のサプレッサー（ＳＵＰＴ５Ｈ）またはその一部であり得る。
【００７３】
いくつかの実施形態では、１つの参照遺伝子座を標的遺伝子座と一緒に分析する。いくつかの実施形態では、２つの参照遺伝子座を標的遺伝子座と一緒に分析する。いくつかの実施形態では、２つを超える参照遺伝子座（例えば、３つ、４つ、５つ、６つまたは６つを超える参照遺伝子座）を標的遺伝子座と一緒に分析する。
【００７４】
ＩＩＩ．コピー数の決定
標的遺伝子座のコピー数の決定は、一般的に、本明細書で述べるように複数の検体において複数の生物学的アッセイを実施することを必要とする。
【００７５】
１．生物学的検体
様々な生物学的検体のいずれかは、本明細書で開示する方法による使用に適し得る。一般的に、核酸を含む生物学的検体（例えば、細胞、組織等）を用いることができる。特定の実施形態では、生物学的検体は、少なくとも１つの標的遺伝子座および少なくとも１つの参照遺伝子座を含む。生物学的検体の種類は、細胞、組織、全血、血漿、血清、尿、便、唾液、臍帯血、絨毛膜絨毛試料、羊水および経頸部洗浄液を含むが、これらに限定されない。どのような種類の組織生検試料も用いることができる。前述の検体のいずれかの細胞培養、例えば、絨毛膜培養、羊水および／または羊膜細胞培養、血球培養（例えば、リンパ球培養）等も発明の方法により用いることができる。いくつかの実施形態では、生物学的検体は、癌細胞を含む。
【００７６】
いくつかの実施形態では、生物学的検体は、出生前試料である。例えば、生物学的検体は、胎児細胞または無細胞核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、生物学的検体は、無細胞胎児核酸および無細胞母体核酸、例えば、妊娠女性から採取された母体血液、血清または血漿の両方を含み得る。例えば、羊水および／または母体血液などの試料は、妊娠女性から採取することができ、標的遺伝子座のコピー数についてアッセイすることができる。そのような試料からのコピー数の推定値は、とりわけ出生前診断応用において有用である胎児の疾患状態に関する情報を提供し得る。
【００７７】
個体または患者から直接採取された生物学的検体は、生物学的アッセイに用いることができる。場合によって、検体を生物学的アッセイに供する前に１つまたは複数の手順を生物学的検体において実施することができる。例えば、生物学的検体が組織の固体および／または半固体塊を含む場合、生物学的検体を最初に単一細胞懸濁液に処理することができる。いくつかの実施形態では、生物学的検体が体液および細胞を含む場合、細胞を最初に体液から分離することができる。いくつかの実施形態では、生物学的検体が体液を含む場合、体液を分画することができる。例えば、血液試料は、血液成分（例えば、血漿および血清）に分画することができ、成分の１つまたは複数のものをアッセイすることができる。
【００７８】
いくつかの実施形態では、生物学的検体を適切な保存条件下で特定の期間保存する。検体は、検体中の核酸の質を維持するのに適する温度または温度範囲内で保存することができる。そのような範囲は、いくつかの実施形態では、検体の種類に依存し得る。いくつかの実施形態では、適切な保存条件は、約３７℃から−２２０℃までの範囲の温度を含む。いくつかの実施形態では、試料を約４℃、約０℃、約−１０℃、約−２０℃、約−７０℃または約−８０℃で保存する。いくつかの実施形態では、試料を約２４時間を超える、２日を超える、３日を超える、４日を超える、５日を超える、６日を超える、１週間を超える、２週間を超える、３週間を超える、４週間を超える、１カ月を超えるまたは２カ月を超える期間保存する。以前に保存した生物学的検体の一部（例えば、一定分量）またはすべてを生物学的アッセイ時に用いることができる。
【００７９】
いくつかの実施形態では、そのような生物学的検体に対して１つまたは複数の分子生物学的操作を実施することができる。そのような操作は、保存する前および／または後に実施することができ、組織均質化、核酸抽出、タンパク質抽出、リボ核酸を除去するための処理（例えば、リボヌクレアーゼを用いる）、タンパク質を除去し、かつ／または分解するための処理（例えば、プロテアーゼを用いる）、細胞膜を破壊するための処理（例えば、洗剤による）、核酸の単離等を含むが、これらに限定されない。そのような操作は、当技術分野で公知であり、例えば、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。
【００８０】
いくつかの実施形態では、生物学的検体中の細胞を数える（すなわち、試料中の細胞の総数の推定値を得る）。細胞の計数により、例えば、分析に適する生物学的検体中のゲノム等価体の特定の推定数を得るための試料の量を決定することが容易になり得る。いくつかの実施形態では、各生物学的検体は、ほぼ同じ数の細胞からの核酸を含む。
【００８１】
いくつかの実施形態では、生物学的検体をアッセイする前に生物学的検体中の核酸の総量を定量する。いくつかの実施形態では、生物学的検体をアッセイする前に生物学的検体中の核酸のサブセットの量（例えば、胎児および母体核酸の混合物を含む試料中の胎児核酸の量）を定量する。いくつかの実施形態では、生物学的検体をアッセイする前に生物学的検体中のデオキシリボ核酸の総量を定量する。いくつかの実施形態では、各生物学的検体は、ほぼ同じ量の総デオキシリボ核酸を含む。いくつかの実施形態では、各生物学的検体は、分析される複数の他の生物学的検体とほぼ同じ数のゲノム等価体を含む。
【００８２】
２．生物学的アッセイ
一般的に、各生物学的検体中の標的遺伝子座および参照遺伝子座／遺伝子座（複数）のコピー数を分析するために１つまたは複数のアッセイを実施する。一般的に、この目的に適する生物学的アッセイは、レベルが生物学的検体または試料中の遺伝子座（例えば、標的遺伝子座または参照遺伝子座）のコピー数と直接的または間接的に相関する検出可能なシグナルを発生するアッセイを含む。
【００８３】
検出可能なシグナルは、様々な方法のいずれかで、例えば、励起可能な発蛍光団、酵素産物（その量を分光光度計を用いて測定することができる沈殿物など）等を用いて発生させることができる。
【００８４】
特定の実施形態では、検出可能なシグナルのレベルは、試料中の核酸の量と相関し、試料中の核酸の量は、遺伝子座（例えば、標的遺伝子座または参照遺伝子座）のコピー数と関連する。いくつかの実施形態では、生物学的アッセイ（複数可）で発生する検出可能なシグナルは、試料または生物学的検体中のデオキシリボ核酸と相関する。いくつかの実施形態では、生物学的アッセイ（複数可）で発生する検出可能なシグナルは、適切な線形目盛上で生物学的検体または試料中の核酸（例えば、デオキシリボ核酸）の量と相関する。いくつかの実施形態では、生物学的アッセイ（複数可）で発生する検出可能なシグナルは、適切な対数目盛上で生物学的検体または試料中の核酸（例えば、デオキシリボ核酸）の量と相関する。いくつかの実施形態では、生物学的アッセイ（複数可）で発生する検出可能なシグナルは、試料または生物学的検体中の核酸（例えば、デオキシリボ核酸）の量と指数関数的に相関する。いくつかの実施形態では、検出可能なシグナル間の相関関係の性質は、経験的に確定することができる。
【００８５】
特定の実施形態では、例えば、生物学的検体または試料に関する検出可能なシグナルの時間に対する曲線を作製することが可能であるように、発生する検出可能なシグナルをリアルタイムで読み、および／または記録する。
【００８６】
例えば、いくつかの実施形態では、本発明に適する生物学的アッセイは、核酸の増幅およびそれがリアルタイムで増幅されるときの核酸の量の定量を含むリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｒｔＰＣＲ）法である。特定の標的または参照遺伝子座の増幅は、標的または参照遺伝子座に隣接する、および／または標的または参照遺伝子座内の核酸配列とハイブリダイズさせるように設計された適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて促進することができる。いくつかの実施形態では、生物学的アッセイは、各増幅サイクルにおける標的遺伝子座または参照遺伝子座からのアンプリコンに関連するシグナルを検出するステップを含む。
【００８７】
例えば、ＴＡＱＭＡＮ（商標）（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓの商標）リアルタイムＰＣＲアッセイにおいて、消光蛍光プローブにより、増幅された核酸のリアルタイムでの定量が可能である。（例えば、両方の全内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｅｉｄら（１９９６年）、「Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ」、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６巻、９８６〜９９４頁およびＧｉｂｓｏｎら（１９９６年）、「Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ」、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６巻、９９５〜１００１頁を参照のこと。）消光蛍光プローブは、核酸、一般的に発蛍光団および蛍光消光剤にコンジュゲートさせた対象のＰＣＲ増幅産物（例えば、標的遺伝子座または参照遺伝子座からのアンプリコン）とハイブリダイズさせるように設計されたオリゴヌクレオチドを一般的に含む。蛍光消光剤は、所与のＴＡＱＭＡＮ（商標）における発蛍光団に通常近接しており、したがって、発蛍光団からのシグナルを検出することはできない。ＴＡＱＭＡＮ（商標）プローブ分子を増幅されている核酸とハイブリダイズさせるとき、増幅サイクルの伸長部分におけるポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により、発蛍光団をプローブから放出させることができる。プローブから（したがって、消光剤から）放出されたならば、発蛍光団を検出することができる。適切な波長により励起させるとき、発蛍光団は、当該発蛍光団に特有の特定の波長スペクトルの光を放射する。したがって、発蛍光団からの検出可能なシグナルは、増幅産物を示し得る。試料または生物学的検体における蛍光シグナルをリアルタイムで測定することができるので、ＴＡＱＭＡＮ（商標）リアルタイムＰＣＲにより、例えば、各増幅サイクルにおけるリアルタイムでの増幅産物（例えば、標的遺伝子座または参照遺伝子座からのアンプリコン）の定量が可能となる。
【００８８】
発蛍光団をプローブとコンジュゲートさせる方法と同様に、様々な発蛍光団のいずれかを用いることができる。（例えば、Ｒ．  Ｐ．  Ｈａｕｇｌａｎｄ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ：  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  １９９２−１９９４」、５版、１９９４年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．を参照のこと。）適切な発蛍光団の非限定的な例は、フルオレセイン、ローダミン、フィコビリンタンパク質、シアニン、クマリン、ピレン、緑色蛍光タンパク質、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）およびそれらの誘導体などである。発蛍光団の天然および合成誘導体の両方を用いることができる。フルオレセイン誘導体の例は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、オレゴングリーン、トウキョウグリーン、セミナフトフルオレセイン（ｓｅｍｉｎａｐｔｈｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）（ＳＮＡＦＬ）およびカルボキシナフトフルオレセインなどである。ローダミン誘導体の例は、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミン１２３、テトラメチルローダミン誘導体ＴＲＩＴＣおよびＴＡＭＲＡ、スルホローダミン１０１（およびそのスルホニルクロリド形テキサスレッド）ならびにローダミンレッドなどである。フィコビリンタンパク質は、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、フィコエリスロシアニンおよびペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）などである。フィコエリスリンの種類には、Ｒ−フィコエリスリン、Ｂ−フィコエリスリンおよびＹ−フィコエリスリンなどがある。シアニン色素およびそれらの誘導体の例は、Ｃｙ２（シアニン）、Ｃｙ３（インドカルボシアニン）、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５（インドジカルボシアニン）、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＢＣｙ７およびＤＢＣｙ７などである。緑色蛍光タンパク質誘導体の例は、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）などである。ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、それらが置換し得る共通発蛍光団またはそれらの吸収／発光波長にちなんで命名される。ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）色素は、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０およびＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５などである。
【００８９】
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）も本発明のいくつかの実施形態による使用に適している。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素は、発光波長にちなんで命名され、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘ  Ｆｌｕｏｒ  ５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０などである。
【００９０】
ＶＩＣ（商標）、ＪＯＥ（商標）およびＨＥＸ（商標）（それぞれがＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能である）などの市販の発蛍光団も用いることができる。
【００９１】
いくつかの実施形態では、ＴＡＭＲＡ分子をＦＡＭ発蛍光団の消光剤として用いる。
【００９２】
いくつかの実施形態では、１つは標的遺伝子座用、もう１つは１つまたは複数の参照遺伝子座／遺伝子座（複数）用の２つの異なるプローブを用いる。例えば、１つの種類の発蛍光団を有するプローブを標的遺伝子座に用いることができ、発光スペクトルが他のプローブと区別できる他の種類の発蛍光団を有するプローブを参照遺伝子座に用いる。いくつかの実施形態では、ＦＡＭ発蛍光団を有するプローブをＶＩＣ発蛍光団を有するプローブとともに用いる。
【００９３】
ＰＣＲ増幅において、増幅産物は、指数関数的段階、続いて直線的段階、次に静止段階というパターンに一般的に従って数段階の間に増加する。指数関数的段階の間に、産物（例えば、標的遺伝子座または参照遺伝子座からのアンプリコン）は、試薬が新鮮で、利用可能であるため、一般的にＰＣＲのすべてのサイクル中に２倍になる。試薬が消費され、激減するとき、反応は「直線的段階」中に速度が遅くなり始め、アンプリコンの量は各サイクルでもはや２倍にならない。最後に、反応がさらに遅くなり、一斉に停止するとき、「静止」に達する。したがって、時間に対してプロットした検体または試料からの検出可能なシグナル（例えば、蛍光シグナル）の曲線は、一般的に指数関数的段階、直線的段階および静止段階をその順序で示す。特定の実施形態では、実施するＰＣＲ増幅サイクルの数は、反応が少なくとも指数関数的段階を経て、少なくとも直線的段階に、かつ／または少なくとも静止段階に進むように選択する。例えば、一般的に少なくとも２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１または４２増幅サイクルを実施する。
【００９４】
経過時間に対する検出可能なシグナルの曲線は、本明細書で述べるようにコピー数を推定するのに用いることができる。シグナルのあらかじめ定める閾値を選択し、所与の生物学的検体または試料における閾値に達するのに必要なＰＣＲ増幅サイクルの数をサイクル閾（Ｃｔ）値と呼ぶ。対象の所与の生物学的検体（「試験試料」とも呼ぶ）における標的遺伝子座のＣｔ値は、既知のコピー数に一般的に関連するＣｔ参照値と比較することができる。いくつかの実施形態では、Ｃｔ参照値は、既知のコピー数（「Ｚ」と表す）を有する参照遺伝子座を分析することにより得られ、いくつかのそのような実施形態では、標的遺伝子座と同じ生物学的試料中の参照遺伝子座を分析し、それぞれについて得られた値を下で述べるように互いに比較する。
【００９５】
特定の実施形態では、シグナルのあらかじめ定める閾値は、すべてまたは大部分の試料がＰＣＲ増幅反応の指数関数部分において閾値に達すると予測されるように選択する。特定の実施形態では、コピー数の推定値を決定するステップは、以下に示すように標的遺伝子のサイクル閾値と１つまたは複数の参照遺伝子のサイクル閾値との差として定義される値ΔＣｔを決定するステップを含む。
【００９６】
【化８】
2013510580.tif 000013
式中、ＣｔＴは、所与の試験試料中の標的遺伝子座のＣｔ値であり、ＣｔＲは、上述のようなＣｔ参照値である。
【００９７】
一般的に、ΔＣｔは、所与の生物学的検体における標的遺伝子座のコピー数（Ｔ）と参照遺伝子座（そのコピー数が既知である）のコピー数（Ｚ）との比に関連する。例えば、ゲノム当たり１コピーで存在する標的遺伝子座のアンプリコンを示すシグナルは、２コピーで存在する参照遺伝子座のアンプリコンを示すシグナルと比べて増幅の１サイクル遅れる。したがって、ΔＣｔと、標的遺伝子座のコピー数（Ｔ）と参照遺伝子座のコピー数（Ｚ）との比との間の関係は、以下の式により定義することができる。
【００９８】
【化９】
2013510580.tif 000014
式中、ΔＣｔおよびＺは、上述のように定義され、Ｔは、分析する生物学的検体における標的遺伝子座のコピー数である。したがって、Ｔは、以下の式によりＺおよびΔＣｔから決定することができる。
【００９９】
【化１０】
2013510580.tif 000015
例えば、Ｚ＝２およびΔＣｔ＝−１である場合、Ｔ＝１で、これは、ゲノム当たり１コピーを有する標的遺伝子座のアンプリコンを示すシグナルはゲノム当たり２コピーを有する参照遺伝子座のアンプリコンを示すシグナルと比べて１サイクル遅れるという理解と一致する。
【０１００】
他の例として、Ｚ＝４およびΔＣｔ＝−１である場合、Ｔ＝２である。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、Ｔは、整数値と推定される。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、Ｔは、非整数値と推定される。例えば、不均一な生物学的試料からＴの非整数推定値を得ることが可能であり得る。非整数のＴの推定値を生じさせ得る不均一な生物学的検体の例は、標的遺伝子座の不均一なコピー数を有するポリクローナル癌細胞の集団ならびに母体および胎児核酸を含む試料を含むが、これらに限定されない。
【０１０３】
リアルタイムＰＣＲ法を例示の目的で用いたが、遺伝子のコピー数を定量する（直接的または間接的に）のに用いられる他の生物学的方法を、本明細書における発明の方法での使用に適応させることができる。そのような方法は、ＰＣＲ−ＥＬＯＳＡ（ＰＣＲ−酵素結合オリゴソルベントアッセイ；「ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡ」としても公知）、アレイに基づく比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（ａＣＧＨ）および高スループット配列決定法（例えば、定量的次世代配列決定法）を含むが、これらに限定されない。ＰＣＲ−ＥＬＯＳＡアッセイでは、増幅が進行するときＰＣＲ産物を固定化捕捉プローブとハイブリダイズさせる。ＰＣＲ−ＥＬＯＳＡは、時として、リアルタイムＰＣＲの代替として用いられる。ａＣＧＨ（マトリックスＣＧＨとしても公知）では、アレイ上の各スポットがゲノム標的を含む、ｃＤＮＡマイクロアレイが用いられる。高スループット配列決定法では、複数の鋳型および複数のプライマーを用いた並行配列決定反応により、ゲノムまたはゲノムの大部分の迅速な配列決定が可能になる。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、コピー数を決定するための生物学的アッセイを実施することに加えて、追加の有用な情報を提供し得る他のアッセイを実施する。例えば、生物学的検体における標的遺伝子座について配列決定を行って、標的遺伝子座のより低いコピー数の一因となった突然変異が存在するかどうかを決定することができる。
【０１０５】
３．アッセイの方式および対照
特定の実施形態では、より信頼できかつ正確なコピー数の推定および統計分析を促進するために、複数の生物学的アッセイを並行して実施する。一般的に、複数の個体から得られた複数の生物学的検体または試料を並行してアッセイする。いくつかの実施形態では、複数の生物学的アッセイ（特定の実施形態では異なる個体からの検体におけるアッセイを含む）は、特定の個体について、または特定の生物学的検体もしくは試料において実施される反復アッセイも含む。例えば、複数の検体を特定の個体から得ることができ、かつ／または特定の個体からの単一検体をサブユニットに分割することができる（各サブユニットは、反復として用いるか、または後の使用のために保存する）。用いる反復の数は、所定の統計的閾値によって、または経験的に選択することができる。いくつかの実施形態では、２反復、３反復、４反復、５反復、６反復、７反復、８反復、９反復、１０反復または１０を超える反復を用いる。いくつかの実施形態では、４反復を用いる。
【０１０６】
下でさらに説明するように、反復を用いることにより、特定の統計的判断を行うことが容易になる。例えば、いくつかの実施形態では、コピー数の確定の統計的信頼度は、反復生物学的アッセイの測定信頼度および複数のコピー数の推定値に基づく確定の信頼度の計算により判断する。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、対照試料を個体または患者から得られた生物学的検体（試験試料）と並行して分析する。対照試料は、無鋳型対照（ｎｏ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ）（例えば、増幅に基づく方法における）、標的遺伝子座の既知の（例えば、あらかじめ測定された）コピー数を有する生物学的試料、検出可能なシグナルを較正するために用いられる他の参照試料およびそれらの任意の組合せを含むが、これらに限定されない。既知のコピー数を有する対照試料は、正常個体または標的遺伝子座の異常なコピー数に関連する疾患を有することが確認された患者（例えば、ＳＭＮ１のエクソン７の欠失を有することが確認されたＳＭＡ患者）からの検証済み細胞系および／または生物学的検体を含むが、これらに限定されない多くの源から得ることができる。一般的に、反復アッセイは、試験試料について上述したように対照において実施する。いくつかの実施形態では、対照の複製物を用いる。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、複数の生物学的アッセイ（例えば、異なる個体からの）をアレイ方式で行うことができる。様々なアレイ方式を用いて、複数の生物学的検体をアッセイすることを促進することができる。いくつかの実施形態では、複数の生物学的アッセイをマルチウェルプレートで行うことができる。本発明に適する具体例としてのマルチウェルプレートは、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェルおよび３８４ウェルプレートを含むが、これらに限定されない。そのようなプレートは、シグナルを検出するステップを含む方法での使用に適する場合によって透明材料製であってよい。複数のそのようなプレートが使用され得る。一般的に、各生物学的試料またはその一部もしくはサブユニットをそのようなプレートの個々のウェルに入れ、プレートは、１つもしくは複数の空のウェルまたは溶液（例えば、緩衝液）のみで満たされたウェルを含んでいてよい。いくつかの実施形態では、各プレートは、上で説明したような特定の数および種類の対照を含む。例えば、無鋳型対照および既知のコピー数を有する対照を各プレートに含めることができる。非限定的な例として、３８４ウェルプレートは、９６種の生物学的検体または対照の４複製物を含んでいてよい。
【０１０９】
図２に対照および試料複製物を保持するウェルを含む具体例としてのマルチウェルプレートを示す。
【０１１０】
さらにまたはあるいは、適切なアッセイ方式は、少なくとも５０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０、６００、６２０、６４０、６６０、６８０、７００、７２０、７４０、７６０、７８０、８００、８２０、８４０、８６０、８８０、９００、９２０、９４０、９６０、９８０または１０００の生物学的アッセイを同時に実施することを促進する。
【０１１１】
一般的に、マルチウェルプレート（または他の形のアレイ）上に存在する複数の生物学的検体の大多数は、正常なコピー数の標的遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、マルチウェルプレート上に存在する試料の７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を超えるものが正常なコピー数の標的遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、マルチウェルプレート上に存在する試料の９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％を超えるものが正常なコピー数の標的遺伝子座を含む。
【０１１２】
ＩＶ．コピー数の推定値の質および統計的信頼度の評価
本発明による発明の方法は、コピー数の推定値の質および／またはコピー数の確定の統計的信頼度を評価し、それにより、生物学的検体における標的遺伝子座についてコピー数の確定を行うことができるか否かを決定するステップを含む。いくつかの実施形態では、コピー数の推定値の質および／または統計的信頼度を評価するステップは、本明細書における「システム」の項で述べたように、アルゴリズムを実行する計算モジュールで行う。
【０１１３】
マルチウェルプレートを必要とするいくつかの実施形態では、アルゴリズムは、特定の品質管理メトリクスが不合格であり、メトリクスが不合格であったウェルを記録する。いくつかの実施形態では、アルゴリズムは、統計的検定の結果および／または当検定に関する試料の状態（例えば、所定の閾値または範囲による合格または不合格）を記録する。
【０１１４】
１．較正コピー数推定値
複数の生物学的アッセイを複数の生物学的検体（例えば、異なる個体からの）において並行して実施する実施形態では、ΔＣｔ値（式１参照）を各検体について計算することができる。例示の目的のみのために、マルチウェルプレートを例として用いる。しかし、本明細書で述べる方法は、あらゆるアッセイ方式に用いることができる。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、正常なコピー数を有する標的遺伝子座と１つまたは複数の参照遺伝子座との間のバックグラウンドでのサイクル数の差を求めるために、プレート上のすべての試料の「キャリブレータ」値
【０１１６】
【化１１】
2013510580.tif 000016
を計算する。一般的に、キャリブレータは、プレート上のすべての生物学的アッセイからのΔＣｔ値の刈り込み平均に基づいて計算する。いくつかの実施形態では、以下のように８０％刈り込み平均を用いる。
【０１１７】
【化１２】
2013510580.tif 000017
キャリブレータに基づいて、標的遺伝子座のコピー数の推定値（ＴＣｉ）をプレート上の各試料について得ることができる（例えば、較正または正規化コピー数推定値）。いくつかの実施形態では、正規化ＴＣｉは、以下に従って線形目盛上で得ることができる。
【０１１８】
【化１３】
2013510580.tif 000018
いくつかの実施形態では、正規化ＴＣｉは、以下に従って対数目盛上で得ることができる。
【０１１９】
【化１４】
2013510580.tif 000019
同じ個体または同じ生物学的検体の反復アッセイに基づくコピー数の推定値は、平均することができる。いくつかの実施形態では、コピー数の確定は、平均のコピー数の推定値を四捨五入することによって行うことができる。
【０１２０】
２．品質管理メトリクス
特定の実施形態では、各生物学的検体における標的遺伝子座についてコピー数の確定を行うことができるか否かを評価するために、一連の品質管理メトリクスを実施する。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座のコピー数の推定値の質は、本明細書で述べたように、１つまたは複数の参照遺伝子座について得られるデータの質に少なくとも一部基づいて評価する。
【０１２１】
サイクル数の検査
いくつかの実施形態では、一連の品質管理メトリクスは、サイクル数のチェックを含む。所与の生物学的検体の１つまたは複数の参照遺伝子座のＣｔ値が所定の範囲外にある場合、検体は、サイクル数の検査に不合格である。いくつかの実施形態では、所定の範囲は、所定の上限Ｃｔ値を含む。そのような実施形態では、特定の生物学的検体の１つまたは複数の参照遺伝子座のＣｔ値が所定の上限Ｃｔ値を超える場合、Ｃｔの測定は、サイクル数の検査に不合格である。いくつかの実施形態では、所定の上限Ｃｔ値は、構成ファイルで指定されている。いくつかの実施形態では、所定の上限Ｃｔ値は、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０サイクルより大きい。
【０１２２】
シグナルレベル曲線の勾配
いくつかの実施形態では、一連の品質管理メトリクスは、勾配の検査−各生物学的検体における１つまたは複数の参照遺伝子座のシグナルレベル（例えば、増幅反応の曲線からの蛍光レベル）の勾配が所定の範囲内にあるという確認を含む。特定の生物学的検体の勾配が所定の範囲内に入らない場合、検体は、勾配の検査に不合格である。いくつかの実施形態では、勾配Ｓは、Ｃｔ測定に最も近い３つのサイクル測定について計算する。例えば、Ｙ２は、Ｃｔ値に最も近いサイクルの対数変換シグナルレベル（バックグラウンドに対して正規化された）とすることができる。Ｙ１およびＹ３（それらの両方ともバックグラウンドに対して正規化されている）は、Ｃｔ値に最も近いサイクルのそれぞれ直前および直後のサイクルの対数変換シグナルレベルとすることができる。いくつかの実施形態では、蛍光値は、ｌｏｇ１０目盛に基づいている。したがって、いくつかの実施形態では、勾配は、以下により計算する。
【０１２３】
【化１５】
2013510580.tif 000020
いくつかの実施形態では、Ｓの許容される値の所定の範囲を構成ファイルで指定する。いくつかの実施形態では、Ｓの許容される範囲は、約０．１５から０．５５までである。
【０１２４】
試料変動係数
検体複製物を用いる（「アッセイ方式」で上述したように）いくつかの実施形態では、複製物間の試料変動係数（試料ＣＶ）を計算する。生物学的検体の試料ＣＶは、当該検体について合格すべきＣＶ検査のための所定の閾値より低くなければならない。試料ＣＶは、線形目盛上で計算し、生物学的検体のすべての複製物間の試料標準偏差と試料平均値との比である。ゼロコピー数試料の試料ＣＶは、標準偏差と平均値プラス１との比として計算する。試料ＣＶが所定の閾値を超える場合、当該生物学的検体についてはコピー数の確定を行わない。いくつかの実施形態では、試料ＣＶの所定の閾値を構成ファイルで指定する。いくつかの実施形態では、試料ＣＶの所定の閾値は、０．１５である。
【０１２５】
３．統計分析
特定の実施形態では、生物学的検体についてコピー数の確定を行うことができるか否かを決定する助けとするために１つまたは複数の統計分析を実施する。いくつかの実施形態では、統計的信頼度は、下で述べるように、測定の信頼度および／または確定の信頼度を決定することにより評価する。
【０１２６】
測定の信頼度
試料複製物を用いるいくつかの実施形態では、測定の信頼度の値を決定する。測定の信頼度が所定の閾値を下回る場合、検体について得られた値（例えば、コピー数の推定値）は、測定の信頼度の検査に不合格であり、コピー数の確定を行うことができない。測定の信頼度は、試料内変動の指標であり、平均値および平均値のまわりの変動を検討するものである。測定の信頼度は、特定のコピー数に関する所定のコピー数の限界内に適合するような検体または試料に関する平均コピー数推定値（複製物にわたり平均した）のまわりの最大正規信頼区間として計算される。いくつかの実施形態では、試料のすべての複製物にわたる平均値の正規性の仮定をおく。正規分布については、平均値は、線形目盛上のすべての複製物にわたる平均コピー数推定値であり、標準偏差は、平均値の標準誤差（複製物の数の平方根で割った標準偏差）である。いくつかの実施形態では、コピー数限界を構成ファイルで指定する。コピー数の確定限界の例を表２に示す。
【０１２７】
【表２−１】
2013510580.tif 000021
確定の信頼度
いくつかの実施形態では、確定の信頼度を各検体について計算する。いくつかの実施形態では、所与の検体に関する確定の信頼度が所定の閾値より低い場合、標的遺伝子座のコピー数の確定を行うことができないという判断をくだす。いくつかの実施形態では、所定の閾値を構成ファイルで指定する。
【０１２８】
バックグラウンド変動
確定の信頼度を計算するために、バックグラウンド変動を、Ｚコピーの標的遺伝子座を有する試料の確定推定値の分散として最初に計算する（ここでＺは参照遺伝子座の既知の正常コピー数である）。このバックグラウンド変動を計算するためにＺコピーの標的遺伝子座を有する検体（Ｚコピー検体）の所定の臨界数が必要であり、所定の数を構成ファイルで指定することができる。いくつかの実施形態では、所定の臨界数は、２０である。
【０１２９】
特定の実施形態では、検体は、バックグラウンド変動の計算に含められるためには、特定の必要条件に適合しなければならない。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、必要条件は、ａ）品質管理メトリクスに合格すること（所定の範囲内の参照遺伝子座のＣｔ値、所定の範囲内の参照遺伝子座のシグナルレベルの勾配、所定の閾値に適合する測定の信頼度および所定の閾値より低い試料ＣＶ）；ｂ）対照検体でないこと；ｃ）ほぼＺコピーの標的遺伝子座を有すると推定されること；ならびにｄ）特定の所定の試料の種類（例えば、血液）であることの少なくとも１つまたはいずれかの組合せを含む。いくつかの実施形態では、必要条件ｄ）（特定の所定の試料の種類であることという必要条件）は、所定の試料の種類の試料の数がＺコピー検体の所定の臨界数を下回る場合には割愛される。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、必要条件は、上のａ）に略述した品質管理および統計的信頼性メトリクスに合格することならびに標的遺伝子座のＺに等しいコピー数の推定値を有することの両方を含む。
【０１３２】
試料の種類の調節
いくつかの実施形態では、試料の種類に関連する異なる変動を補償するためにバックグラウンド変動を調整する。一般的に、必要条件ｄ）が除外される場合には、試料の調整を行わない。調整は、各試料の種類ごとに行うことができる。すなわち、調整値を差し引くか、または加えることができる。いくつかの実施形態では、大部分の試料について試料の調整を行わない。いくつかの実施形態では、羊水および／または羊膜細胞培養試料のバックグラウンド変動を０．０３単位調整する。いくつかの実施形態では、絨毛膜絨毛試料のバックグラウンド変動を０．０３単位調整する。
【０１３３】
確定の信頼度
試料について調整することができる、またはできないバックグラウンド変動を得たならば、確定の信頼度の値を決定することができる。確定の信頼度は、複数のコピー数の推定値に基づくものであり得る。確定の信頼度を決定するためにＺコピーの標的遺伝子座を有する検体（Ｚコピー検体）の所定の臨界数が必要であり、所定の数を構成ファイルで指定することができる。いくつかの実施形態では、所定の臨界数は、２０である。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、確定の信頼度を決定するために用いるアルゴリズムは、コピー数の推定値が正規分布しており、コピー数にわたり等しい分散を有することを仮定する。正規分布を仮定する統計的検定を用いることができる。いくつかの実施形態では、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いて各検体に関するｐ値を求める。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、統計的検定で検定される仮説は、検体についての観測されるコピー数の推定値が隣接コピー数分布から実際に得られるということである。すなわち、コピー数の推定値が２である場合、アルゴリズムは、試料が実際に１または３コピーを有する確率を求める。アルゴリズムは、２つの検定（この例では、１コピー仮説および３コピー仮説に関する）のそれぞれからのｐ値を合計する。信頼度は、ｐ値の合計を１から差し引くことにより計算される。
【０１３６】
コピー数の推定値が０（または１つ存在する場合、最大の可能なコピー数）である場合、１コピー（または最大値マイナス１）の分布である、唯一の隣接コピー数分布が存在する。そのような場合、アルゴリズムは、コピー数の推定値が隣接コピー数分布から得られるという仮説を検定することから得られる単一のｐ値を用いる。確定の信頼度は、当ｐ値を１から差し引くことにより計算される。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、確定の信頼度統計量は、コピー数の推定値の対数目盛上で計算する。コピー数のｔ分布平均値は、個々のコピー数のコピー数の推定値のすべてを平均することにより決定する。特定の遺伝子コピーカテゴリーについて推定値が存在しない場合、平均値を−２、１、２および２．５８５と仮定する。
【０１３８】
各試料について確定信頼度のＱＣ試験を実施する。確定信頼度が構成ファイルに指定されている閾値より低い場合、試料は、確定信頼度ＱＣメトリクスに不合格である。
【０１３９】
４．プレート品質管理メトリクス
プレートにおける複数の生物学的検体を分析する特定の実施形態では、プレートの特定の品質管理メトリクスが不合格である場合、プレート警報が発信される。例えば、いくつかの実施形態では、ブランク対照を除くプレートにおけるすべての対照試料を品質管理メトリクスについて検査し、かつ／または上述のように統計的に分析する（例えば、Ｃｔ値の検査、勾配の検査、測定の信頼度、確定の信頼度および試料ＣＶ）。これらの品質管理メトリクスのいずれかがプレート上の対照試料について不合格である場合、プレート警報がプレート内の不合格ウェルおよび不合格メトリクスのリストとともに発信される。コピー数に関する対照としての役割を果たす試料も予測されるコピー数との一致について確認する。例えば、いくつかの実施形態では、１つもしくは複数の対照試料のいずれかが品質管理もしくは統計的信頼度評価に不合格である場合、またはいずれかの個別対照試料の推定値が所定のもしくは予測されるコピー数と等しくない場合、プレートは不合格である。いくつかの実施形態では、Ｚコピー（Ｚは参照遺伝子座のコピーの数、例えば、いくつかの実施形態において２）試料の数が、所定の閾値より小さく、かつ／または確定の信頼度統計量に関するｔ分布パラメーターの推定に不十分である場合、プレートは不合格である。いくつかの実施形態では、Ｚコピー試料の平均値のまわりの信頼区間が所定の限界の外側である場合、プレートは不合格である。いくつかの実施形態では、Ｚコピー試料のコピー数の推定値の標準偏差が所定の閾値を上回る場合、プレートは不合格である。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、計算モジュールは、所定のプレートレイアウトに基づいてウェル位置により対照を発見する。
【０１４１】
Ｖ．システムおよびコンピュータ可読媒体
いくつかの実施形態では、本明細書で述べる発明の方法は、本明細書で述べるシステムおよびコンピュータ可読媒体のようなシステムまたはコンピュータ可読媒体上で実施することができる。本明細書で述べるシステムおよび媒体による発明の方法の実施により、標的遺伝子座のコピー数の推定値が確定され、コピー数の推定値の質および／またはコピー数の確定の統計的信頼度が評価され、標的遺伝子座についてコピー数の確定を行うことができるか否かを使用者に警報され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で述べるシステムおよび媒体は、個体が標的遺伝子座の異常なコピー数に関連する疾患、障害もしくは状態を有するか、またはそのキャリアであるかも示し得る。
【０１４２】
本明細書に記載するシステムは、いくつかの実施形態では、プロセッサが命令を実行して方法または処置（例えば、コピー数の推定値の計算および／または統計分析）を実施し得るようなコンピュータ可読媒体上に含められる機能モジュール、クライアント、媒介物、プログラム、実行可能な命令または命令と述べることができる。本明細書で述べる機能モジュールは、コードの個別のブロックに対応する必要はない。むしろ、機能モジュールの機能部分は、様々な媒体上に保存され、様々な時に実行される様々なコード部分の実行により行うことができる。さらに、モジュールは他の機能を果たすことができ、したがって、モジュールは、特定の機能または一連の機能を有することに限定されないことを理解すべきである。いくつかの実施形態では、これらの機能モジュールは、計算デバイスにより実行することができる。機能モジュールは、計算デバイスに保存することができ、またはいくつかの実施形態では、外部ストレージリポジトリもしくは遠隔計算機に保存することができる。
【０１４３】
図３Ａに上述の機能モジュールを保存し、かつ／または実行し得る計算デバイス４００の１つの実施形態を示す。計算デバイスは、いくつかの実施形態では、コンピュータ、計算機またはプロセッサおよびメモリを有する任意の他のデバイスであり得る。いくつかの実施形態では、計算デバイスは、実体計算機にインストールされたハイパバイザにより管理される仮想計算機であり得る。計算デバイス４００内には次の構成要素と交信するシステムバス４５０が含められている：中央演算処理ユニット４２１；メインメモリ４２２；ストレージメモリ４２８；入出力（Ｉ／Ｏ）コントローラ４２３；ディスプレイデバイス４２４Ａ〜４２４Ｎ；およびネットワークインターフェース４１８。１つの実施形態では、ストレージメモリ４２８は、両方がプロセッサ４２１により実行され得るオペレーティングシステムおよびソフトウエアルーチンを含む。Ｉ／Ｏコントローラ４２３は、いくつかの実施形態では、キーボード４２６、ポインティングデバイス４２７および他の入力デバイスにさらに接続されている。他の実施形態は、複数の入出力デバイス４３０Ａ〜４３０Ｎに接続されたＩ／Ｏコントローラ４２３を含み得る。
【０１４４】
図３Ｂに本明細書で述べた機能モジュールを保存し、かつ／または実行することができる計算デバイス４００の他の実施形態を示す。いくつかの実施形態では、計算デバイス４００は、次の構成要素と交信し得るシステムバス４５０を含む。ブリッジ４７０および第１のＩ／Ｏデバイス４３０Ａ。他の実施形態では、ブリッジ４７０は、第２のＩ／Ｏデバイス４３０Ｂ、メインメモリ４２２およびキャッシュメモリ４４０と交信するメイン中央演算処理ユニット４２１とさらに交信する。いくつかの実施形態では、中央演算処理ユニット４２１は、Ｉ／Ｏポートおよびメモリポート４０３にさらに連結されている。
【０１４５】
計算機４００の実施形態は、次の構成要素構成のいずれか１つにより特徴づけられる中央演算処理ユニット４２１を含み得る：メインメモリ４２２からフェッチされる命令に応答し、処理する論理回路。中央演算処理ユニット４２１は、いくつかの実施形態では、Ｉｎｅｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより製造されたもの；Ｍｏｔｏｒｏｌａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより製造されたもの；カリフォルニア州Ｓａｎｔａ  ＣｌａｒａのＴｒａｎｓｍｅｔａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより製造されたものなどのマイクロプロセッサユニット；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍａｃｈｉｎｅｓにより製造されたものなどのＲＳ／６０００プロセッサ；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏ  Ｄｅｖｉｃｅｓにより製造されたものなどのプロセッサ；または論理回路の他の組合せを含み得る。さらに他の実施形態では、中央演算処理ユニット４２１は、次のもののいずれかの組合せを含む：マイクロプロセッサ、マイクロコントローラ、単一プロセッシングコアを有する中央演算処理ユニット、２つのプロセッシングコアを有する中央演算処理ユニットまたは複数のプロセッシングコアを有する中央演算処理ユニット。
【０１４６】
１つの実施形態では、中央演算処理ユニット４２１は、バックサイドバスとしても公知の第２のバスを介してキャッシュメモリ４４０と交信するが、他の実施形態では、プロセッサ４２１は、システムバス４５０を介してキャッシュメモリと交信する。ローカルシステムバス４５０は、いくつかの実施形態では、複数の種類のＩ／Ｏデバイス４３０Ａ〜４３０Ｎと交信するためにも中央演算処理ユニット４２１により使用され得る。
【０１４７】
計算デバイス４００は、いくつかの実施形態では、メインメモリ４２２およびキャッシュメモリ４４０を含む。キャッシュメモリ４４０およびメインメモリ４２２は、いくつかの実施形態では、次のタイプのメモリのいずれか１つであり得る：スタティックランダムアクセスメモリ（ＳＲＡＭ）、バーストＳＲＡＭまたはＳｙｎｃｈＢｕｒｓｔ  ＳＲＡＭ（ＢＳＲＡＭ）；ダイナミックランダムアクセスメモリ（ＤＲＡＭ）；高速ページモードＤＲＡＭ（ＦＰＭ  ＤＲＡＭ）；エンハンストＤＲＡＭ（ＥＤＲＡＭ）、拡張データ出力ＲＡＭ（ＥＤＯ  ＲＡＭ）；拡張データ出力ＤＲＡＭ（ＥＤＯ  ＤＲＡＭ）；バースト拡張データ出力ＤＲＡＭ（ＢＥＤＯ  ＤＲＡＭ）；エンハンストＤＲＡＭ（ＥＤＲＡＭ）；シンクロナスＤＲＡＭ（ＳＤＲＡＭ）；ＪＥＤＥＣ  ＳＲＡＭ；ＰＣ１００  ＳＤＲＡＭ；ダブルデータレートＳＤＲＡＭ（ＤＤＲ  ＳＤＲＡＭ）；エンハンストＳＤＲＡＭ（ＥＳＤＲＡＭ）；ＳｙｎｃＬｉｎｋ  ＤＲＡＭ（ＳＬＤＲＡＭ）；ダイレクトラムバスＤＲＡＭ（ＤＲＤＲＡＭ）；強誘電ＲＡＭ（ＦＲＡＭ（登録商標））；または他のタイプのメモリ。さらなる実施形態は、システムバス４５０；メモリポート４０３；またはプロセッサ４２１がメモリ４２２にアクセスすることを可能にする他の接続、バスもしくはポートを介してメインメモリ４２２にアクセスし得る中央演算処理ユニット４２１を含む。
【０１４８】
コンピュータ可読媒体は、メインメモリ４２２に保存され、プロセッサ４２１により実行され得る。このコンピュータ可読媒体は、いくつかの実施形態では、ソフトウエアプログラムおよび実行されたときにコンピュータが１つまたは複数の機能を果たすことを命令する他の実行可能な一連の命令を含み得る。このコンピュータ可読媒体は、何らかの言語で、またいくつかの実施形態では、次の言語のいずれか１つで書かれた命令を含み得る：Ｊａｖａ（登録商標）、Ｊ＃；ビジュアルベーシック；Ｃ；Ｃ＃；Ｃ＋＋；フォートラン；パスカル；Ｅｉｆｆｅｌ、ベーシック；ＣＯＢＯＬ；およびアセンブリ言語。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、コンピュータ可読媒体は、当業者に公知の基礎計算生物学の方法（ｂａｓｉｃ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｍｅｔｈｏｄ）を実施するための命令を含み得る。特に、コンピュータ可読媒体は、次の情報資源に記載されている方法を実施するための命令を含み得る：ＳｅｔｕｂａｌおよびＭｅｉｄａｎｉｓら、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（ＰＷＳ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｂｏｓｔｏｎ、１９９７年）；Ｓａｌｚｂｅｒｇ、Ｓｅａｒｌｅｓ、Ｋａｓｉｆ（編）、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９９８年）；ＲａｓｈｉｄｉおよびＢｕｅｈｌｅｒ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｂａｓｉｃｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、２０００年）；ならびにＯｕｅｌｅｔｔｅおよびＢｚｅｖａｎｉｓ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、２版、２００１年）。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、計算デバイス４００は、１つもしくは複数のハードディスクドライブであり得る記憶装置４２８、独立ディスクの１つもしくは複数の冗長アレイ、またはＵＳＢもしくはシリアルポートを介して計算デバイス４００と交信し得る外部ストレージもしくは媒体デバイスを含む。さらに他の実施形態では、記憶装置４２８は、次の接続および／またはプロトコルのいずれかを用いてアクセスすることができる遠隔記憶装置であり得る：ＵＳＢ；シリアル；パラレル；イーサネット（登録商標）（Ｅｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標））；ブルートゥース（Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標））；ＷｉＦｉ；ジグビー（Ｚｉｇｂｅｅ（登録商標））；無線ＵＳＢ；ＩＥＥＥ８０２．１５；ＲＳ−２３２；ＲＳ−４８４；ＩＥＥＥ８０２．３およびＩＥＥＥ８０２．１１．
計算デバイス４００は、次の接続のいずれかを介して地域ネットワーク（ＬＡＮ）または広域ネットワーク（ＷＡＮ）などのネットワークに接続するためのネットワークインターフェース４１８をさらに含む：標準電話線；ＬＡＮもしくはＷＡＮリンク（例えば、８０２．１１、Ｔ１、Ｔ３、５６ｋｂ、Ｘ．２５、ＳＮＡ、ＤＥＣＮＥＴ）、ブロードバンド接続（例えば、ＩＳＤＮ、フレームリレー（Ｆｒａｍｅ  Ｒｅｌａｙ）、ＡＴＭ、ギガビットイーサネット（登録商標）、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）−ｏｖｅｒ−ＳＯＮＥＴ）、無線接続または上に列挙した接続のいずれかの組合せ。接続は、種々の通信プロトコル（例えば、ＴＣＰ／ＩＰ、ＩＰＸ、ＳＰＸ、ＮｅｔＢＩＯＳ、イーサネット（登録商標）、ＡＲＣＮＥＴ、ＳＯＮＥＴ、ＳＤＨ、光ファイバー分散データインターフェース（ＦＤＤＩ）、ＲＳ２３２、ＲＳ４８５、ＩＥＥＥ８０２．１１、ＩＥＥＥ８０２．１１ａ、ＩＥＥＥ８０２．１１ｂ、ＩＥＥＥ８０２．１１ｇ、ＣＤＭＡ、ＧＳＭ（登録商標）、ＷｉＭａｘおよび直接非同期接続）を用いて達成することもできる。いくつかの実施形態では、計算デバイス４００は、ネットワークインターフェース４１８を介してその他の計算デバイス、アプライアンス、入力デバイス、記憶装置または機械と交信する。この交信は、いくつかの実施形態では、Ｓｅｃｕｒｅ  Ｓｏｃｋｅｔ  Ｌａｙｅｒ（ＳＳＬ）もしくはＴｒａｎｓｐｏｒｔ  Ｌａｙｅｒ  Ｓｅｃｕｒｉｔｙ（ＴＬＳ）、Ｒｅｍｏｔｅ  Ｄｅｓｋｔｏｐ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（ＲＤＰ）またはＩＣＡプロトコルなどのゲートウエイまたはトンネリングプロトコルのいずれかの種類および／または形態で達成され得る。ネットワークインターフェース４１８のバージョンは、ビルトインネットワークアダプタ；ネットワークインターフェースカード；ＰＣＭＣＩＡネットワークカード；カードバスネットワークアダプタ；無線ネットワークアダプタ；ＵＳＢネットワークアダプタ；モデム；マルチプルネットワークカード；または計算デバイス４００をネットワークに接続するのに適する任意の他のデバイスのいずれか１つを含み得る。
【０１５１】
Ｉ／Ｏデバイス４３０Ａ〜４３０Ｎは、いくつかの実施形態では、次のデバイスのいずれかであり得る：キーボード４２６；ポインティングデバイス４２７；マウス；トラックパッド；オプティカルペン；トラックボール；マイクロフォン；ドローイングタブレット；ビデオディスプレイ；スピーカー；インクジェットプリンタ；レーザープリンタ；および昇華型プリンタ；ＵＳＢフラッシュドライブ；または本明細書で述べる方法およびシステムを実施することができる他の入力／出力デバイス。Ｉ／Ｏコントローラ４２３は、いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＩ／Ｏデバイスを制御するための複数のＩ／Ｏデバイス４３０Ａ〜４３０Ｎに接続し得る。他の実施形態では、Ｉ／Ｏデバイス４３０Ａ〜４３０Ｎは、結果を保存し、結果を表示し、またはシステムバス４５０と次のような外部通信バスとのブリッジとしての役割を果たす：ＵＳＢバス；Ａｐｐｌｅ  Ｄｅｓｋｔｏｐ  Ｂｕｓ；ＲＳ−２３２シリアルコネクション；ＳＣＳＩバス；ＦｉｒｅＷｉｒｅバス；ＦｉｒｅＷｉｒｅ８００バス；イーサネット（登録商標）バス；ＡｐｐｌｅＴａｌｋバス；ギガビットイーサネット（登録商標）バス；非同期伝送モード（Ａｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｍｏｄｅ）バス；ＨＩＰＰＩバス；Ｓｕｐｅｒ  ＨＩＰＰＩバス；ＳｅｒｉａｌＰｌｕｓバス；ＳＣＩ／ＬＡＭＰバス；ＦｉｂｒｅＣｈａｎｎｅｌバス；またはシリアルアタッチド（Ｓｅｒｉａｌ  Ａｔｔａｃｈｅｄ）スモールコンピュータシステムインターフェースバス。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、計算機４００は、複数のディスプレイデバイス４２４Ａ〜４２４Ｎに接続し得る。他の実施形態では、計算デバイス４００は、単一ディスプレイデバイス４２４に接続し得るが、さらに他の実施形態では、計算デバイス４００は、同じ種類もしくは形態のディスプレイであるディスプレイデバイス４２４Ａ〜４２４Ｎに、または異なる種類もしくは形態であるディスプレイデバイスに接続する。ディスプレイデバイス４２４Ａ〜４２４Ｎの実施形態は、次のものによりサポートし、有効にすることができる：１つまたは複数のＩ／Ｏデバイス４３０Ａ〜４３０Ｎ；Ｉ／Ｏコントローラ４２３；Ｉ／Ｏデバイス４３０Ａ〜４３０ＮとＩ／Ｏコントローラ４２３との組合せ；ディスプレイデバイス４２４Ａ〜４２４Ｎをサポートすることができるハードウエアとソフトウエアの組合せ；ディスプレイデバイス４２４Ａ〜４２４Ｎにインターフェースで接続する、交信する、接続するまたは別の方法で使用するためのあらゆる種類および／または形態のビデオアダプタ、ビデオカード、ドライバーおよび／またはライブラリ。計算デバイス４００は、いくつかの実施形態では、１つまたは複数のディスプレイデバイス４２４Ａ〜４２４Ｎを使用するように構成することができ、これらの構成は、複数のディスプレイデバイス４２４Ａ〜４２４Ｎにインターフェースで接続するための複数のコネクタを有すること；各ビデオアダプタが１つまたは複数のディスプレイデバイス４２４Ａ〜４２４Ｎに接続された、複数のビデオアダプタを有すること；複数のディスプレイ４２４Ａ〜４２４Ｎをサポートするように構成されたオペレーティングシステムを有すること；複数のディスプレイデバイス４２４Ａ〜４２４Ｎに接続し、使用するために計算デバイス４００内に含まれている回路およびソフトウエアを使用すること；ならびにメイン計算デバイス４００がメイン計算デバイス４００用のディスプレイデバイス４２４Ａ〜４２４Ｎとして二次計算デバイスのディスプレイを使用することを可能にするためにメイン計算デバイス４００および二次計算デバイス上のソフトウエアを実行することを含みうる。計算デバイス４００のさらに他の実施形態は、複数の二次計算デバイスにより備えられ、ネットワークを介してメイン計算デバイス４００に接続された複数のディスプレイ４２４Ａ〜４２４Ｎを含み得る。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、計算機４００は、あらゆるオペレーティングシステムを実行し得るが、他の実施形態では、計算機４００は、次のオペレーティングシステムのいずれかを実行し得る：ＭＩＣＲＯＳＯＦＴ  ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）オペレーティングシステムのバージョン；Ｕｎｉｘ（登録商標）およびＬｉｎｕｘ（登録商標）オペレーティングシステムの各種リリース；Ａｐｐｌｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒにより製造されたＭＡＣ  ＯＳのあらゆるバージョン；あらゆる組込みオペレーティングシステム。さらに他の実施形態では、計算機４００は、複数のオペレーティングシステムを実行し得る。
【０１５４】
計算機４００は、次の計算デバイスのいずれか１つに組み込むことができる：計算ワークステーション；デスクトップコンピュータ；ラップトップまたはノートコンピュータ；サーバー；手持ちサイズコンピュータ；携帯電話；携帯遠隔通信デバイス；媒体再生デバイス；ゲームシステム；携帯計算デバイス；ノートブック；Ａｐｐｌｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒにより製造されたデバイスのＩＰＯＤファミリーのデバイス；あるいは通信能力があり、本明細書で述べる方法およびシステムを実施するのに十分なプロセッサ能力およびメモリ容量を有する他の種類および／または形態の計算、遠隔通信または媒体デバイス。
【０１５５】
本明細書で述べる機能モジュールは、コードの個別のブロックに対応する必要はない。むしろ、機能モジュールの機能部分は、様々な媒体上に保存され、様々な時に実行される様々なコード部分の実行により行うことができる。さらに、モジュールは他の機能を果たすことができ、したがって、モジュールは、特定の機能または一連の機能を有することに限定されないことを理解すべきである。
【０１５６】
図４に生物学的アッセイから得られたデータ、１つもしくは複数の構成ファイル、および／または保存参照データ（例えば、所定の閾値限界、対照および参照コピー数等）を入力し、本明細書で述べるいずれかの機能モジュールを用いてデータを分析するためのシステム５１０の１つの実施形態を示す。１つの実施形態では、入力デバイス５５０は、分析システム５１０と、より具体的には、分析システム５１０内のプロセッサ上で動作する計算モジュール５４０と交信し得る。計算モジュール５４０は、入力デバイス５５０から得られる出力データに関連する情報を入手し、発信するためにかなり多くの機能または方法を遂行し得る。いくつかの実施形態では、計算モジュール５４０は、発信した情報を保存または分析システム５１０内に含まれているストレージリポジトリ５３０に保存されているデータを入手し得る。いくつかの実施形態では、計算モジュール５４０は、報告データおよび他の値を分析システム５１０内のディスプレイモジュール５６０に転送し得る。他の実施形態では、ディスプレイモジュール５６０は、ストレージリポジトリ５３０から報告データの内容を読み出すことができる。ディスプレイモジュール５６０は、両方がディスプレイモジュール５６０により受信された報告データおよび他の情報を表示し得る、出力デバイス５５５およびディスプレイデバイス５７０と交信する。
【０１５７】
図４にまたより詳細にさらに言及すると、１つの実施形態では、分析システム５１０は、計算モジュール５４０およびディスプレイモジュール５６０のような機能モジュールを含み得る。他の実施形態では、分析システム５１０は、基礎計算生物学の方法を実施するモジュールを含み得る。分析システム５１０は、いくつかの実施形態では、単一計算デバイス１００で実行され得る。他の実施形態では、分析システム５１０は、１つまたは複数の計算デバイス１００を含み得る。分析システム５１０内に含まれる各計算デバイス１００は、システム５１０内に含まれる他の計算デバイス１００と交信し得る。例えば、計算モジュール５４０は、第１のコンピュータにより実行され得るが、ストレージリポジトリ５３０およびディスプレイモジュール５６０は、第２のコンピュータにより実行され得る。他の例では、ストレージリポジトリ５３０は、第１のコンピュータに存在し得るが、機能モジュールのそれぞれは、第２のコンピュータにより実行され得る。
【０１５８】
システム５１０内に含まれる複数のコンピュータ１００の間の交信は、いくつかの実施形態では、ネットワークまたは直接接続により促進され得る。他の実施形態では、直接接続は、イーサネット（登録商標）接続、シリアル接続またはパラレル接続を含み得る。ネットワークは、かなり多くのサブネットワークを含む得、地域ネットワーク（ＬＡＮ）または広域ネットワーク（ＷＡＮ）であり得る。さらに、ネットワークは、私的および公的ネットワークの組合せを含み得る。１つの実施形態では、ネットワークは、本明細書で述べたネットワークのいずれかであり得、分析システム５１０内に含まれるモジュールおよびコンピュータならびに分析システムと交信するデバイスは、本明細書で述べたネットワークのいずれかを介し、本明細書で述べたネットワークプロトコルのいずれかを用いて交信し得る。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、入力デバイス５５０は、分析システム５１０と交信し得る。他の実施形態では、入力デバイス５５０は、計算モジュール５４０または分析システム５１０内の他のモジュールと交信し得る。図４に分析システム５１０の外部にある入力デバイス５５０を例示するが、いくつかの実施形態では、分析システム５１０は、入力デバイス５５０を含み得る。
【０１６０】
入力デバイス５５０は、いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイ（特に、リアルタイムＰＣＲ）から得られるデータを出力することができるデバイス、機械またはコンピュータであり得る。他の実施形態では、入力デバイス５５０は、本明細書で述べたアッセイのいずれかから得られるデータを出力することができるデバイス、機械またはコンピュータであり得る。入力デバイス５５０は、他の実施形態では、１つまたは複数の生物学的検体における標的遺伝子座および１つまたは複数の参照遺伝子座を分析する適切な生物学的アッセイを実施するために構成された機械またはデバイスであり得る。いくつかの実施形態では、入力デバイス５５０は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより開発されたＴＡＱＭＡＮプローブからのシグナルを読み込む。入力デバイス５５０は、いくつかの実施形態では、ＴＡＱプローブの分解時に発蛍光団により放射される蛍光の量を測定する。蛍光量は、ＤＮＡの量を測定するのに用いることができ、いくつかの実施形態では、蛍光の特定のレベルに達するのに必要なサイクルの数を測定しうる。いくつかの実施形態では、標的および参照遺伝子座の蛍光のレベルまたは蛍光シグナルのレベルは、各増幅サイクルで検出することができる。入力デバイス５５０は、アッセイ時に発生し、分析された蛍光シグナルを表す出力データを発信し得る。
【０１６１】
１つの実施形態では、入力デバイス５５０は、アッセイからの出力を表すデータ値のファイル、配列または文字列を出力し得る。この出力ファイルは、次のいずれかを表し得る１つまたは複数の字（ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ）、数または文字（ｌｅｔｔｅｒｓ）を含み得る：蛍光シグナルのレベル；プレート上のウェルを識別する識別子；プレート上の試料または検体を識別する識別子；患者；試料または検体を得た方法；および出力に関連する他の識別子または情報。１つの実施形態では、入力デバイス５５０は、各試料または検体の蛍光シグナルデータが、シグナルの数値表現、患者を識別する識別子、試料を得るために用いた方法、試料または検体を入れたウェル、および他の同様な情報を含むデータの群に反映されているフラットファイルを出力する。データの各群は、この実施形態では、平行線（「｜」）、コンマ、スペースまたは他の字などの区切り字により分離することができる。ファイルの字により区切られた各部分は、プレートに含められた検体の蛍光測定値を含み得る。いくつかの実施形態では、字により区切られた各部分は、各サイクルにおけるマルチウェルプレート（例えば、３８４ウェルプレート）における少なくとも２つのチャンネルにおける蛍光測定値を含み得る。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、分析システム５１０は、入力デバイスからデータを得るために入力デバイス５５０と連動するドライバーまたは他のプログラム（図示せず）を含み得る。いくつかの実施形態では、ドライバーまたはプログラムは、入力デバイスまたは機械５５０から生データを受信し、生データを、分析システム５１０内で動作するプログラムおよびモジュールにより処理することができるフォーマットに変換する。入力デバイス５５０から得られた情報をフォーマットするステップは、データの種類を変更し、関係のない字を除去し、または入力デバイス５５０により出力された情報の図表、グラフもしくは他の視覚表示を作成するステップを含み得る。
【０１６３】
１つの実施形態では、計算モジュール５４０は、入力デバイス５５０から出力データを受信するために入力デバイス５５０と直接交信し得る。計算モジュール５４０は、いくつかの実施形態では、分析システム５１０に含まれるモジュール、機械またはデバイスのいずれかと交信し得る。他の実施形態では、計算モジュール５４０は、入力デバイス５５０により得られた情報を保存するためにストレージリポジトリ５３０と交信し得る。他の実施形態では、計算モジュール５４０は、計算モジュール５４０により発信された情報を保存するためにストレージリポジトリ５３０と交信し得る。さらに他の実施形態では、計算モジュール５４０は、入力デバイス５５０により出力された情報の図表、グラフもしくは他の視覚表示を作成するために、計算モジュール５４０により使用され得る較正情報、閾値情報および対照試料情報などの情報をストレージリポジトリ５３０から読み出し得る。
【０１６４】
１つの実施形態では、計算モジュール５４０は、本明細書で述べた推定計算および／または統計もしくは品質管理分析のいずれかを実施するためにコンピュータ上で動作し得る。これらの統計および／または推定計算は、次のいずれかを含み得る：参照遺伝子サイクル数の決定、プレート上の２コピー試料の数の決定、測定の信頼度の計算；同じ患者から採取された複製試料または検体間の変動係数の計算；同じ患者から採取された複製試料または検体間の標準偏差の計算；確定の信頼度の計算；参照遺伝子勾配の計算；各試料または検体ごとのコピー数の推定値；プレートのデルタサイクル数の計算；較正値；および本明細書で述べた他の計算または決定。いくつかの実施形態では、計算モジュール５４０は、これらの計算および決定をストレージリポジトリ５３０に保存し得る。他の実施形態では、計算モジュール５４０は、これらの計算および決定をディスプレイモジュール５６０に転送し得る。これらの計算および決定値は、一連の品質管理メトリクスに含めることができる。したがって、各値は、アレイ、データベース、リストまたは他のデータ保存構造に保存することができる。
【０１６５】
１つの実施形態では計算モジュール５４０は、単一モジュールであり得るが、他の実施形態では計算モジュール５４０は、１つまたは複数のサブモジュール、サブルーチンまたはプログラムを含み得る。１つの実施形態では、計算モジュール５４０は、コンピュータ上で起動するスクリプトであり得る。スクリプトは、いくつかの実施形態では、主または親プログラム内で起動し得る。例えば、計算モジュール５４０は、いくつかの実施形態では、ＭＡＴＬＡＢ内で起動するスクリプトであり得る。この例では、計算モジュール５４０は、本明細書で述べた統計分析を行うための１つまたは複数の定義済みプログラムまたはルーチンを含む統計ライブラリにアクセスし得る。
【０１６６】
計算モジュール５４０は、いくつかの実施形態では、キャリブレータまたは他の調整値を用いて計算または決定のいずれかを調整し得る。したがって、いくつかの実施形態では、次の環境問題のいずれかを補償するために較正または調整値を計算または決定値に加えまたはそれから差し引くことができる：検体または試料を得るのに用いられる方法に起因する変動；プレートアーチファクト；入力デバイス５５０の他の分野に存在するアーチファクト；アッセイの有効性に影響を及ぼす温度変動；およびアッセイの結果として得られたデータの完全性に影響を及ぼし得る他の環境条件。いくつかの実施形態では、計算標準偏差は、検体または試料を得るのに用いられる方法の種類について調整することができる。例えば、試料を、患者から血液スポットを得ること；患者の口腔を綿棒で拭い取ること；臍帯血を得ること；絨毛膜絨毛試料培養物を得ること；および羊水培養物を得ることにより得る場合、標準偏差は調整しなくてもよい。他方で、試料を羊水または絨毛膜絨毛試料から得る場合、いくつかの実施形態では、０．３調整しなければならない。これらの調整値は、いくつかの実施形態では、ストレージリポジトリ５３０に保存される構成ファイルに含められ、プレートおよび／または検体が品質管理チェックに合格するかどうかを判定するために計算モジュール５４０により使用され得る。
【０１６７】
１つの実施形態では、計算モジュール５４０は、本明細書で述べた１つまたは複数の計算および／または決定を行った後に、得られた結果を１つまたは複数の参照値と比較し得る。これらの参照値は、いくつかの実施形態では、閾値または所定の範囲であり得る。１つの実施形態では、これらの閾値または所定の範囲は、ストレージリポジトリ５３０に保存され得る。値は、いくつかの実施形態では、次のいずれか１つに保存することができる：フラットファイル；データベース；リスト；配列；部分文字列値の連なりを含む文字列；または他のデータ構造。さらに他の実施形態では、値は、計算モジュール５４０により要求されるまで、一時メモリエレメントに保存することができる。
【０１６８】
他の１つの例では、構成ファイルは、次の閾値のいずれかを含み得る：
【０１６９】
【表２−２】
2013510580.tif 000022
上の例では、閾値、値の範囲および調整値を用いて、１つまたは複数の品質管理メトリクスを得ることができる。これらの品質管理メトリクスを用いて、１つまたは複数の推定コピー数値の統計的信頼度を求めることができる。
【０１７０】
計算モジュール５４０は、いくつかの実施形態では、品質管理方針を１つまたは複数の計算または決定値に適用して、プレートが所定の品質管理チェックに合格するかどうか、かつ／または検体もしくは試料が所定の品質管理チェックに合格するかどうかを判定し得る。いくつかの実施形態では、計算モジュール５４０は、計算または決定値を１つまたは複数の所定の閾値および／または値の範囲と比較することにより、プレートおよび／または検体が所定の品質チェックに合格するかどうかを判定する。いくつかの実施形態では、品質管理方針は、プレートまたは検体に関する閾値および値の範囲の必要条件のそれぞれを含み得、他の実施形態では、各品質管理方針は、特定の閾値および値の範囲の必要条件を含み得る。例えば、品質管理方針は、４複製検体間の変動係数が所定の閾値を下回ることを要求し得る。この閾値は、いくつかの実施形態では、０．１５であり得る。他の実施形態では、品質管理方針は、プレートが、所定の値を上回る２コピー試料の数；所定の値を下回る４複製検体間の標準偏差；所定の値を上回るまたはそれに等しい平均確定信頼度値を有し；かつ各対照試料が特定のコピー数の確定を有することを要求し得る。
【０１７１】
ストレージリポジトリ５３０は、いくつかの実施形態では、記憶装置、計算デバイスまたはコンピュータ可読媒体であり得る。１つの実施形態では、ストレージリポジトリ５３０は、メモリリポジトリ、計算デバイスまたは本明細書で述べたコンピュータ可読媒体であり得る。ストレージリポジトリ５３０と分析５１０システムに含まれるモジュールのいずれかとの交信は、ネットワーク、通信バスまたは結線により行われ得る。いくつかの実施形態では、ストレージリポジトリ５３０は、計算モジュール５４０により得られ、計算または決定された情報をメモリに読み込み得る。このデータは、遠隔計算機、分析システム５１０内のコンピュータ、分析システム５１０内のモジュール、または分析システム５１０内のモジュールもしくはコンピュータと交信する外部媒体デバイスによりアクセスされ得る。
【０１７２】
１つの実施形態では、計算モジュール５４０は、参照データ、較正データ、レポートテンプレートおよび他の情報にアクセスするためにストレージリポジトリ５３０と交信し得る。計算モジュール５４０は、読み出された情報を用いて、本明細書で述べた方法およびシステムをさらに実施し、かつ／または計算モジュール５４０により得られ、計算または決定された情報のいずれかを示すディスプレイ出力を発信する。計算モジュール５４０は、報告内容を発信し、いくつかの実施形態では、当報告内容をストレージリポジトリ５３０に保存する。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、分析システム５１０内で動作するエンコーダーは、当情報をストレージリポジトリ５３０に保存する前に受信情報を暗号化し、符号化または圧縮し得る。さらに他の実施形態では、サイクル数および関連情報は、ストレージリポジトリ５３０上の表、データベースまたはリストに保存され得る。
【０１７４】
分析システム５１０内で動作するディスプレイモジュール５６０は、ストレージリポジトリ５３０および／または計算モジュール５４０から報告データもしくは他の出力データを得ることができる。１つの実施形態では、ディスプレイモジュール５６０は、得られた報告データおよび出力データをディスプレイするために報告、ユーザインターフェースおよび他のディスプレイテンプレートを発生し得る。出力データは、いくつかの実施形態では、入力デバイス５５０から得られたあらゆる情報および計算モジュール５４０により計算または決定されたあらゆる情報を含み得る。ディスプレイモジュール５６０は、いくつかの実施形態では、ブラウザー、フォームジェネレーター（ｆｏｒｍ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒｓ）またはユーザへのディスプレイのためにデータを得、フォーマットすることができる他のプログラムを含み得る。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、ディスプレイモジュール５６０は、ディスプレイデバイス５７０および／または他の出力デバイス５５５と連動し得る。ディスプレイモジュール５６０は、受信報告および出力データをディスプレイデバイス５７０でのディスプレイのためにフォーマットし得る。１つの実施形態では、ディスプレイモジュール５６０は、出力デバイス５５５が出力シグナルを発信するために用いることができるフォーマットに出力データおよび報告データをフォーマットすることができる。
【０１７６】
ディスプレイデバイス５７０は、いくつかの実施形態では、あらゆるディスプレイデバイスであり得る。他の実施形態では、ディスプレイデバイス５７０は、本明細書で述べたあらゆるディスプレイデバイスであり得る。例えば、ディスプレイデバイス５７０は、ディスプレイ画面を有し、ディスプレイモジュール５６０により発信されたディスプレイを描画し、描画された画像をユーザに示すことができるモニター、手持ちサイズコンピュータまたは他の機械もしくはデバイスであり得る。図４に分析システム５１０と連通しているディスプレイデバイス５７０を示すが、いくつかの実施形態では、ディスプレイデバイス５７０は、分析システム５１０に含まれ得る。さらなる実施形態は、ディスプレイデバイス５７０を含むディスプレイモジュール５６０を含む。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、出力デバイス５５５は、音声、視覚またはユーザの知覚可能な他のシグナルをユーザに出力するために用いることができる。出力デバイス５５５がディスプレイモジュール５６０からデータを受信する場合、いくつかの実施形態では、出力デバイス５５５は、プレートおよび／または検体が品質管理メトリクスのそれぞれに合格したかどうかを示すために警報を鳴らすか、または１つもしくは複数の発光ダイオードもしくは他の光源を発光させ得る。例えば、出力値がプレートが品質管理メトリクスの１つに不合格であることを示すものである場合、出力デバイス５５５は、不合格を示すＬＥＤを点灯させ得る。他の実施形態では、出力デバイス５５５は、プレートが品質管理メトリクスの１つに不合格である場合、デジタルメッセージを出力するか、または警報を鳴らし得る。
【０１７８】
図５Ｂにプレート品質管理方針を１つまたは複数の品質管理メトリクスに適用する方法６３０の１つの実施形態を示す。いくつかの実施形態では、分析システム５１０内で動作する計算モジュール５４０またはデータ分析モジュール（図示せず）は、一連の品質管理メトリクスを得（ステップ６３２）、プレート上のＺコピー試料の数（Ｚは参照遺伝子座のコピーの数で、いくつかの実施形態では２である）が所定の閾値を下回るかどうかを決定する（ステップ６３６）。Ｚコピー（例えば、２コピー）試料の数が閾値を下回る場合、計算モジュール５４０または他のモジュールは、プレートが不合格であったことを示すフラッグを出力する（ステップ６４４）。Ｚコピー試料の数が所定の閾値を下回らない場合、モジュールは、Ｚコピー試料の標準偏差が所定の閾値を上回るかどうかを決定する（ステップ６３８）。標準偏差が閾値より大きい場合、モジュールは、プレートが不合格であったことを示すフラッグを出力する（ステップ６４４）。標準偏差が閾値を超えない場合、モジュールは、Ｚコピー試料の平均確定が所定の閾値を超えるかどうかを決定する（ステップ６４０）。平均確定が所定の閾値を超える場合、モジュールは、プレートが不合格であったことを示すフラッグを出力する（ステップ６４４）。平均確定が所定の閾値を超えない場合、モジュールは、対照試料が正しいコピー数の確定を有するかどうかを決定する（ステップ６３４）。モジュールが対照試料のコピー数の確定が所定の閾値を下回っていると判断した場合、モジュールは、プレートが不合格であったことを示すフラッグを出力する（ステップ６４４）。さもなければ、モジュールは、プレートが合格であったことを示すフラッグを出力する（ステップ６４２）。
【０１７９】
図５Ｂにまたより詳細にさらに言及すると、１つの実施形態では、方法６３０は、計算モジュール５４０により行われ得る。他の実施形態では、方法６３０は、次のモジュールのいずれかの組合せにより行われ得る：分析システム５１０内で動作する計算モジュール５４０；分析システム５１０内で動作するデータ分析モジュール（図示せず）；または分析システム５１０内のプロセッサにより動作させられる他のモジュール。
【０１８０】
図５Ｂに後の各ステップが、プレートが前のステップの品質管理試験に合格することを要求するような、各ステップが連続的である方法６３０の１つの実施形態を示す。他の実施形態では、各ステップは、当該ステップの実行が、プレートが前のステップにおける品質管理試験に合格したという判断に依存しないような独立であり得る。さらに他の実施形態では、方法６３０内のステップの群は、互いに依存し得るが、ステップの第２の群は、それらの実行が方法に含まれる他のステップの結果に依存しないような完全に独立であり得る。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、分析システム５１０内で動作するモジュールは、一連の品質管理メトリクスを読み出す（ステップ６３２）。モジュールは、いくつかの実施形態では、計算モジュール５４０であり得る。いくつかの実施形態では、モジュールは、品質管理メトリクスを計算し得るが、他の実施形態では、モジュールは、ストレージリポジトリ５３０から品質管理メトリクスを入手し得る。いくつかの実施形態では、モジュールは、品質管理メトリクスの一部を計算し、品質管理メトリクスの一部をストレージリポジトリ５３０から入手し得る。
【０１８２】
プレートが特定の品質管理試験に合格したかどうかについて判断をくだす実施形態は、プレートが特定の品質管理試験に不合格である場合にフラッグまたは他の表示を出力するステップ（ステップ６４４）を含み得る。いくつかの実施形態では、フラッグは、試験不合格を示すデータベース入力、フラッグ、シグナル、構成設定または他の変数を含み得る。このフラッグは、いくつかの実施形態では、さらなる品質管理メトリクスを試験することを続けるかどうかを決定するために計算モジュール５４０により使用され得る。他の実施形態では、計算モジュール５４０は、計算モジュール５４０により発信される報告データの内容にフラッグを示し得る。ディスプレイモジュール５６０が、プレートが分析システム５１０により行われる品質管理試験に合格したかどうかを示す出力ディスプレイを発信する場合、プレートが関連する方針に含まれる各実施試験に合格したかどうかを示すユーザが知覚できるディスプレイを発生させるためにフラッグを用いることができる。
【０１８３】
不合格のプレートは、いくつかの実施形態では、不良な質のコピー数推定値を示す品質管理メトリクスを有するプレートである。したがって、不合格プレートは、プレート上の検体に関する計算コピー数推定値がひずんでおり、したがって、コピー数推定を行うことができないことを示し得る。
【０１８４】
計算モジュール５４０は、いくつかの実施形態では、２コピーを有するプレート上の試料の数が所定の値を下回っているかどうかを決定し得る（ステップ６３６）。いくつかの実施形態では、計算モジュール５４０は、プレート上の各試料ごとのコピー数の推定値を得ることができる。このリストを用いて、モジュールは、いくつの試料がコピー数２を有するかを決定し得る。２コピーを有する試料の数が所定の閾値を下回る場合、プレートは、不合格とみなされる（ステップ６４４）。いくつかの実施形態では、計算モジュール５４０により行われる判断は、２コピー数試料または検体の数を決定する本明細書で述べた決定であり得る。１つの実施形態では、所定の閾値は、システム５１０にハードコーディングされた経験的に定められた値であり得る。さらに他の実施形態では、所定の閾値は、歴史的データに基づいて動的に定められた値であり得る。
【０１８５】
１つの実施形態では、計算モジュール５４０は、２コピー試料の平均値の標準偏差を得ることができる。標準偏差は、いくつかの実施形態では、本明細書で述べた標準偏差であり得る。モジュールが、標準偏差が所定の閾値を上回っていると判断する（ステップ６３８）場合、モジュール５４０は、プレートを不合格にし得る（ステップ６４４）。
【０１８６】
他の実施形態では、計算モジュール５４０は、２コピー試料の平均コピー推定値の測定信頼度が所定の閾値を下回るかどうかを決定し得る。測定信頼度が所定の閾値を下回る場合、モジュール５４０は、プレートを不合格にし得る（ステップ６４４）。
【０１８７】
さらに他の実施形態では、計算モジュール５４０は、対照試料または検体が正しいコピー数の確定を有するどうかを決定し得る（ステップ６３４）。この判断は、本明細書で述べた計算または決定のいずれかを用いてくだされ得る。１つの実施形態では、対照試料が正しいコピー数の確定を有するどうかを決定するステップは、コピー数の確定が所定の閾値を下回るかどうかを決定するステップを含み得る。確定が閾値を下回る場合、モジュール５４０は、プレートを不合格にし得る（ステップ６４４）。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、計算モジュール５４０または他のモジュールは、プレートが品質管理試験のそれぞれに合格したことを示すフラッグを出力し得る（ステップ６４２）。品質管理方針のそれぞれを適用することにより、そしてプレートが要求される基準のそれぞれを満たしていたと判断することにより、モジュールは、プレートが合格したことを示すフラッグ、シグナルまたは他の表示を出力し得る。図５Ｂにプレート合格フラッグを出力する方法６３０を示すが、いくつかの実施形態では、方法６３０は、モジュールがプレート合格フラッグを出力するステップを含まないことがあり得る。
【０１８９】
図５Ｃに検体の品質管理を実施する方法６６０の１つの実施形態を示す。いくつかの実施形態では、計算モジュール５４０は、記述したステップのいずれかを実施し得る。方法６６０を実施するモジュールは、一般的にモジュールと呼ばれる。いくつかの実施形態では、モジュールは、一連の品質管理メトリクスを得て（ステップ６６２）、参照遺伝子または遺伝子座に関するサイクル数が所定の閾値を超えているかどうかを決定する（ステップ６６４）。モジュールは、次に参照遺伝子または遺伝子座に関する勾配が所定の範囲外にあるか否かを決定する（ステップ６６８）。次に計算された変動係数が所定の閾値より大きいかまたは等しいかどうかに関する判断をくだす（ステップ６７０）。モジュールは、計算された測定の信頼度が所定の閾値を下回るかどうか（ステップ６７２）および計算された確定の信頼度が所定の閾値を下回るかどうか（ステップ６７８）をさらに判断する。モジュールが上述の条件のいずれかが当該検体について真である場合、モジュールは、検体が不合格であったことを示すフラッグを出力し（ステップ６７６）、さもなければ、モジュールは、検体が合格したことを示すフラッグを出力し得る（ステップ６７４）。
【０１９０】
図５Ｃにまたより詳細にさらに言及すると、１つの実施形態では、方法６６０は、計算モジュール５４０により実施され得る。他の実施形態では、方法６６０は、次のモジュールのいずれかの組合せにより行われ得る：分析システム５１０内で動作する計算モジュール５４０；分析システム５１０内で動作するデータ分析モジュール（図示せず）；または分析システム５１０内のプロセッサにより動作させられる他のモジュール。
【０１９１】
図５Ｃに後の各ステップが、検体が前のステップの品質管理試験に合格することを要求するような、各ステップが連続的である方法６６０の１つの実施形態を示す。他の実施形態では、各ステップは、当該ステップの実行が、検体が前のステップにおける品質管理試験に合格したという判断に依存しないような独立であり得る。さらに他の実施形態では、方法６６０内のステップの群は、互いに依存し得るが、ステップの第２の群は、それらの実行が方法に含まれる他のステップの結果に依存しないような完全に独立であり得る。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、分析システム５１０内で動作するモジュールは、一連の品質管理メトリクスを読み出す（ステップ６６２）。モジュールは、いくつかの実施形態では、計算モジュール５４０であり得る。いくつかの実施形態では、モジュールは、品質管理メトリクスを計算し得るが、他の実施形態では、モジュールは、ストレージリポジトリ５３０から品質管理メトリクスを入手し得る。いくつかの実施形態では、モジュールは、品質管理メトリクスの一部を計算し、品質管理メトリクスの一部をストレージリポジトリ５３０から入手し得る。
【０１９３】
検体が特定の品質管理試験に合格したかどうかについて判断をくだす実施形態は、検体が特定の品質管理試験に不合格である場合にフラッグまたは他の表示を出力するステップ（ステップ６７６）を含み得る。いくつかの実施形態では、フラッグは、試験不合格を示すデータベース入力、フラッグ、シグナル、構成設定または他の変数を含み得る。このフラッグは、いくつかの実施形態では、さらなる品質管理メトリクスを試験することを続けるかどうかを決定するために計算モジュール５４０により使用され得る。他の実施形態では、計算モジュール５４０は、計算モジュール５４０により発信される報告データの内容にフラッグを示し得る。ディスプレイモジュール５６０が、検体が分析システム５１０により行われる品質管理試験に合格したかどうかを示す出力ディスプレイを発信する場合、検体が各実施試験に合格したかどうかを示すユーザが知覚できるディスプレイを発生させるためにフラッグを用いることができる。
【０１９４】
不合格の検体は、いくつかの実施形態では、不良な質のコピー数推定値を示す品質管理メトリクスを有する検体である。したがって、不合格検体は、当検体に関する計算コピー数推定値がひずんでおり、したがって、当検体についてコピー数の確定を行うことができないことを示し得る。
【０１９５】
１つの実施形態では、モジュールは、各参照遺伝子または遺伝子座ごとのサイクル数値を得て、サイクル数が所定の閾値を下回るかどうかを決定し得る（ステップ６６４）。モジュールは、いくつかの実施形態では、モジュールが対照遺伝子座のサイクル数が所定の閾値を下回り、かつ／またはサイクル数値の所定の範囲内に入るかどうかを決定するという方針を適用することによってこの判断をくだし得る。対照遺伝子座のサイクル数が閾値を下回る場合、モジュールは、検体が不合格であったことを決定し得る（ステップ６７６）。さらに他の実施形態では、モジュールは、対照遺伝子座のサイクル数値が所定の上限値を超えると判断することにより、または対照遺伝子座のサイクル数が所定の下限値を下回っている場合に、検体が不合格であったことを決定し得る。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、モジュールは、参照遺伝子勾配が所定の範囲内にあるか否かを決定し得る（ステップ６６８）。参照遺伝子勾配は、本明細書で述べた勾配であり得る。いくつかの実施形態では、参照遺伝子勾配は、本明細書で述べた式または方法のいずれかを用いて計算しかつ／または決定することができる。参照遺伝子勾配を計算しかつ／または得ることにより、モジュールは、勾配が所定の下限値を下回るかどうかまたは勾配が所定の上限値を超えるかどうかを決定し得る。参照遺伝子勾配が所定の範囲外にある場合、モジュールは、検体が不合格であったことを示すフラッグを出力し得る（ステップ６７６）。
【０１９７】
１つの実施形態では、モジュールは、標的または対照遺伝子座の４つの複製検体の変動係数が所定の値を超えるかどうかを決定する（ステップ６７０）。変動係数は、いくつかの実施形態では、本明細書で述べた方法および式を用いて決定することができる。いくつかの実施形態では、モジュールは、変動係数が所定の閾値より大きくかつ／または等しいことを決定した場合、モジュールは、検体が不合格であったことを示すフラッグを出力し得る（ステップ６７６）。
【０１９８】
モジュールは、さらに他の実施形態では、計算された測定信頼度を得て、計算された測定信頼度の値が所定の閾値を下回るかどうかを決定し得る（ステップ６７２）。測定信頼度は、本明細書で述べた測定信頼度の値であり得、本明細書で述べた方法および式のいずれかを用いて計算することができる。いくつかの実施形態では、モジュールが測定信頼度の値が所定の閾値を下回ると判断した場合、モジュールは、検体が不合格であったことを示すフラッグを出力し得る（ステップ６７６）。
【０１９９】
さらに他の実施形態では、モジュールは、計算された確定信頼度の値を得て、値が所定の閾値を下回るかどうかを決定し得る（ステップ６７８）。いくつかの実施形態では、確定信頼度の値は、本明細書で述べた確定信頼度の値であり得、本明細書で述べた方法および式のいずれかを用いて計算することができる。いくつかの実施形態では、モジュールは、確定信頼度の値が所定の閾値を下回ると判断した場合、モジュールは、検体が不合格であったことを示すフラッグを出力し得る（ステップ６７６）。
【０２００】
いくつかの実施形態では、計算モジュール５４０または他のモジュールは、検体が品質管理試験のそれぞれに合格したことを示すフラッグを出力し得る（ステップ６７４）。品質管理方針のそれぞれを適用することにより、そして検体が要求される基準のそれぞれを満たしていたと判断することにより、モジュールは、検体が合格したことを示すフラッグ、シグナルまたは他の表示を出力し得る。図５Ｃに検体合格フラッグを出力する方法６６０を示すが、いくつかの実施形態では、方法６６０は、モジュールが検体合格フラッグを出力するステップを含まないことがあり得る。
【０２０１】
図７Ａ〜７Ｂに品質管理メトリクスならびに品質管理メトリクスへのプレートおよび検体管理方針の適用の結果ならびに計算モジュール５４０により得られ、確定または計算された他の情報のディスプレイを示す画面コピーを示す。いくつかの実施形態では、図７Ａ〜７Ｂに例示したディスプレイは、ブラウザーまたはアプリケーションウインドウにディスプレイすることができる。他の実施形態は、スマートフォン、ＰＤＡまたは他の携帯端末などの携帯計算デバイスの画面に適合するように描画されたディスプレイを含む。
【０２０２】
図６Ａにプレートが品質管理試験に合格したかどうかを決定するために再検討された品質管理情報をディスプレイするディスプレイ画面を示す。いくつかの実施形態では、次の値を画面上にディスプレイすることができる：参照遺伝子のサイクル数；参照遺伝子のサイクル数が上述の品質管理試験に合格したかどうか；参照遺伝子勾配；参照遺伝子勾配が上述の品質管理試験に合格したかどうか；対照試料およびそれらの状態；プレートにおける２コピー試料の平均値；プレートにおける２コピー標準偏差。いくつかの実施形態では、ディスプレイは、プレート品質管理試験の結果をユーザに効果的に知らせるのに用いることができる。
【０２０３】
図６Ｂにプレートが品質管理試験に合格したかどうかを決定するために分析した品質管理情報をディスプレイするディスプレイ画面を示す。いくつかの実施形態では、次の値を画面上にディスプレイすることができる：コピー数推定値；確定信頼水準；確定信頼度が合格であるか、または不合格であるか；測定信頼水準；測定信頼度が合格であるか、または不合格であるか；試料変動係数レベルおよび変動係数が合格か不合格か。これらの値は、ユーザが、コピー数の推定値が標的患者が特定の疾患を有するか、または有さないかを有効に示すかどうかを決定するのに用いることができる。
【０２０４】
ＶＩ．診断応用
特定の実施形態では、本明細書で開示する方法を診断応用に用いる。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、本発明の方法および／またはシステムは、疾患、障害または状態のキャリアとしての状態に関する診断を得るために用いる。例えば、個体は、遺伝病のキャリアとしてスクリーニングすることができる。いくつかの実施形態では、正常個体は、標的遺伝子座の２コピーを有する。いくつかのそのような実施形態では、標的遺伝子座の１コピーのみ有する個体は、キャリアと診断される。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、本発明の方法および／またはシステムは、出生前診断応用に用いる。例えば、出生前核酸を含む検体（例えば、羊水、羊水／羊膜細胞細胞培養物、絨毛膜絨毛試料、絨毛膜培養物、母体血液等）は、標的遺伝子座のコピー数についてアッセイすることができる。いくつかの実施形態では、正常個体が標的遺伝子座の２コピーを有するいくつかの実施形態では、検体のゼロのコピー推定値は、胎児が特定の疾患、障害または状態を有するまたは発現する可能性がある兆候として用いることができる。本発明のコピー数の推定方法は、試料の起こりうる不均一性を補償するために変更することができる。例えば、母体血液は、胎児核酸と母体核酸の混合物を含むと予測でき、したがって、母体血液の標的対立遺伝子または標的染色体のみかけのコピー数推定値は、母体のコピー数と胎児のコピー数との中間であり得る。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、コピー数推定値は、親になると予定される個体から得られ、予定される親の遺伝子コピー数推定値によって、推定値は、それらの子供（生まれなかった胎児を含む）についても得られる。例えば、コピー数推定値が１人または複数人の親が遺伝病のキャリアである場合、疾患の優性または劣性の性質によって、胎児のコピー数推定値も得られる。
【０２０８】
診断は、キャリアおよび疾患状態がほんの数例である種々の態様に関してくだすことができる。上で説明したように、本発明の方法およびシステムにより得られる遺伝子コピー数推定値は、例えば、疾患もしくは状態を発現する危険性の変化、特定の疾患もしくは状態の段階に進行する可能性、特定の療法の適用可能性、感染の感受性、免疫機能等を決定するのにもう１つの方法としてまたはさらに有用であり得る。
【０２０９】
特定の実施形態では、診断を得るために本発明の方法およびシステムを他の診断方法および／またはシステムと組み合わせる、あるいは他の方法は、コピー数推定値に基づく診断を確認するのに用いることができる。例えば、遺伝子コピー数推定値は、配列決定（例えば、点突然変異などの突然変異を特定するため）、核型分析および／または生物学的マーカーの検出および／または定量などの１つまたは複数の手法と組み合せることができる。
【実施例】
【０２１０】
（実施例１）
患者のＳＭＮ１コピー数を決定するためのＴＡＱＭＡＮ（商標）リアルタイムＰＣＲ
この実施例では、ＴＡＱＭＡＮ（商標）リアルタイムＰＣＲシステムを用いて患者のＳＭＮ１コピー数を決定する。
【０２１１】
実験計画
ＳＭＮ１エクソン７遺伝子座に隣接する２つのプライマーをＰＣＲ増幅に用いる。２つのプライマーの間のＳＭＮ１配列を認識するプローブを用いてＳＭＮのエクソン７からのアンプリコンを検出する。プローブは、ＦＡＭ発蛍光団で標識されており、ＴＡＭＲＡ消光剤を含む。このＳＭＮ１特異的ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡプローブは、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によりＰＣＲ増幅の各ラウンドの伸長部分においてＳＭＮ１プローブから放出される。プローブのＴＡＭＲＡ消光剤からのＦＡＭ発蛍光団の遊離により、熱サイクル内のレーザーが、特定の波長の光を放射するようにＦＡＭ発蛍光団を励起することが可能になる。放射される光量は、得られるＰＣＲ産物の量に比例する。
【０２１２】
この同じ反応物内にＶＩＣ−ＴＡＭＲＡプローブおよびゲノム当たり２コピーで常に存在することが既知である参照遺伝子に特異的な適切なプライマーが存在する。ＶＩＣ発蛍光団は、ＦＡＭ発蛍光団と同じエキソヌクレアーゼ放出およびレーザー励起を受けるが、その発光スペクトルは、ＦＡＭの発光スペクトルと区別できる。
【０２１３】
温度サイクル機器と組み合されたソフトウエアを用いて、ＰＣＲサイクル数の関数としての累積ＦＡＭおよびＶＩＣ蛍光データのリアルタイムプロットを行うことができる。蛍光閾値を越えるのに必要なサイクルの数は、Ｃｔ（サイクル閾値）と呼ばれる。この実施例では、ＦＡＭのＣｔ（本明細書で述べたＣｔＴに相当する）とＶＩＣのＣｔ（本明細書で述べたＣｔＲに相当する）との間の差は、ΔＣｔである。ΔＣｔは、２コピーのＳＭＮ１を有するすべての試料についてほぼ同じであるはずである。ＰＣＲの各サイクルは鋳型を複製するため、１コピーのＳＭＮ１を有するＤＮＡ試料は、２コピーのＳＭＮ１を有する試料より１サイクル大きいΔＣｔを有する（すなわち、１サイクル遅れる）。したがって、１遺伝子コピーのキャリアについてスクリーニングするために個々の試料のΔＣｔ値をすべての試料の平均デルタ
【０２１４】
【化１６】
2013510580.tif 000023
と比較することは可能である。
【０２１５】
対照
無鋳型対照および４つの追加アッセイ対照を各プレート上で用いる。各対照は、プレート上に２回示される。これらの対照は、確認済み細胞系および／または既知のコピー数のＳＭＮ１を有する匿名ゲノム検体から得ることができる。具体的には、これらの対照は、次のＳＭＮ１遺伝子型を有する：０コピーのＳＭＮ１（ヌル）、１コピーのＳＭＮ１（キャリア）、２コピーのＳＭＮ１（推定１＋１正常）、３コピーのＳＭＮ１（推定２＋１正常）。
【０２１６】
無鋳型対照／カクテルブランクは、患者試料を希釈するために用いる１０ｍＭトリスｐＨ９．０緩衝液である。
【０２１７】
材料および方法
【０２１８】
【表２−３】
2013510580.tif 000024
リアルタイムＰＣＲ用試薬
１００μＭ保存ＰＣＲプライマー
１００μＭ保存ＦＡＭおよびＶＩＣ二重標識（ＤＬ）プローブ（ＡＢＩ、光を避けて−２０℃で保存）
１００μＭ保存競合的プローブ
２ｘＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（例えば、ＡＢＩＰ／Ｎ４３６４３４０）
０．２μｍろ過水  。
【０２１９】
ＴＡＱＭＡＮ（商標）リアルタイムＰＣＲ条件
ステップ１：５０℃２分間
ステップ２：９５℃１０分間
ステップ３：９５℃１５秒間
ステップ４：６０℃１分間
ステップ５：ステップ２に進む、３９回繰り返す
終了  。
【０２２０】
（実施例２）
ＴＡＱＭＡＮ（商標）ＰＣＲデータに基づくＳＭＮ１のコピー数の決定
Ｃｔ値は、例えば、実施例１に従って実施されたリアルタイムＰＣＲ実験から得られるシグナル対時間の曲線から得ることができる。プレート上の各複製物について、ＣｔＲ（参照遺伝子座のサイクル数）およびＣｔＴ（標的遺伝子座のサイクル数；この実施例では、ＳＭＮ１）が所定の閾蛍光値に達するのに必要なサイクル数として得られ、ΔＣｔが式１に従って計算される。
【０２２１】
【化１７】
2013510580.tif 000025
表３に同じプレート上の多数の複製物のΔＣｔの具体例としての計算を示す。一般的に、表３に示すより多くの複製物が各プレートに用いられる。
【０２２２】
【表３−１】
2013510580.tif 000026
次にキャリブレータ値
【０２２３】
【化１８】
2013510580.tif 000027
を式４に従ってΔＣｔ値の８０％刈り込み平均として計算する。表３におけるΔＣｔ値について、
【０２２４】
【化１９】
2013510580.tif 000028
は、値の中間２０％（例えば、−０．１および−０．２）を有するウェルの平均ΔＣｔ値となる。言い換えれば、プレートの
【０２２５】
【化２０】
2013510580.tif 000029
は、約−０．１５となる。
【０２２６】
次にコピー数を次の線形目盛により各ウェルについて推定する：
【０２２７】
【化２１】
2013510580.tif 000030
例えば、ウェル１について、ＳＭＮ１のコピー数（ＴＣ）は、
【０２２８】
【化２２】
2013510580.tif 000031
と推定される。
【０２２９】
ウェル８について、ＳＭＮ１のコピー数（ＴＣ）は、
【０２３０】
【化２３】
2013510580.tif 000032
と推定される。
【０２３１】
（実施例３）
ＳＭＮ１遺伝子のコピー数の推定値の質の評価
この実施例では、ＳＭＮ１遺伝子のコピー数の推定値の質をアルゴリズムおよび品質管理メトリクスを用いて評価する。
【０２３２】
この実施例で述べるアルゴリズム計算の概要を図５Ａに示す。図５Ａに示すように、９６検体のそれぞれ４複製物を含む１つまたは複数の３８４ウェルプレートにおけるＴＡＱＭＡＮ（商標）実験からのＣｔデータを用いて、９６検体のコピー推定値を得ることができる。各試料について遺伝子コピー数の推定を行う。アルゴリズムは、プレート上のすべてのウェルについてΔＣｔ値（ＳＭＮ１プローブと参照遺伝子プローブとのＣｔの差）を計算する。コピー数の推定値は、その後、参照遺伝子キャリブレータに依存するＰＣＲ増幅の指数関数モデルに基づいて得られる。キャリブレータは、２つのＳＭＮ１コピーを有する試料のＳＭＮ１と参照遺伝子との平均Ｃｔの差であり、プレートΔＣｔ値の８０％刈り込み平均として計算される。計算の最終のステップにおいて、各試料についてのコピー数の推定値を４つの反応にわたる平均値として計算する。
【０２３３】
図５Ｂにコピー数の推定値の質を評価するために用いたプレート品質管理の概要を示す。プレートの全般的な質を２つの方法で評価する。第一に、対照試料におけるコピー数の値をそれらの既知の値と照査する。対照試料のデータの質または計算されたコピー数が既知の値と一致しない場合、プレートは不合格である。第二に、２遺伝子コピー試料の数がバリデートされた閾値より少ない、または２遺伝子コピー試料の標準偏差がバリデートされた閾値を上回る場合、または２コピー試料の平均コピー数推定値の測定信頼度がバリデートされた閾値を下回る場合、プレートは不合格である。
【０２３４】
図５Ｃにコピー数の推定値の質を評価するために用いた検体品質管理（ＱＣ）の概要を示す。５つのＱＣメトリクスを各検体について得る。最初の３つのメトリクスは、分析するデータの質を評価するものである。複製反応から得られる参照遺伝子Ｃｔ値、参照遺伝子増幅曲線勾配および確定の変動係数（ＣＶ）をバリデートされた閾値と対照して評価する。これらのいずれか１つの結果がバリデートされた閾値外にある場合、試料は不合格である。各試料の結果の信頼度は、２つの統計メトリクス、すなわち確定信頼度および測定信頼度により測定する。これらのメトリクスは、プレート上の試料間および試料内変動に基づいて、得られるコピー数の推定値の信頼度を与える。
【０２３５】
ＳＭＮ１試験データ分析モジュールの記述ならびにモジュールにおける確定推定値（ｃａｌｌ  ｅｓｔｉｍａｔｅｓ）の計算の詳細な説明書を下に示す。
【０２３６】
Ｉ．ＳＭＮ１試験データ分析モジュール
内容の要約
Ａ．データ分析品質管理メトリクス
１．プレート品質管理
２．試料品質管理
Ｂ．データ分析アルゴリズム
１．エラーの取扱い
２．データ入力
３．試料名処理
４．勾配計算
５．勾配ＱＣおよびＣｔＱＣ
６．デルタＣｔの計算、ウェル複製の平均および中央値洗練法
７．測定信頼度
８．試料変動係数
９．２コピー数平均値および標準偏差
１０．試料の種類の調整
１１．確定信頼度
１２．対照のＱＣ試験
１３．モジュール出力
Ｃ．データ分析モジュール出力フォーマット
１．プレートＱＣ
２．試料ＱＣ
Ｄ．運営ＱＣに関する勧告
Ｅ．データ分析モジュール出力フォーマット
Ｆ．データ分析実行可能ファイル
１．実行時要件
２．コマンドラインフォーマット
３．入力
４．出力
Ｇ．構成ファイル
Ｈ．コピー数限界の計算
Ｉ．Ｍａｔｌａｂコンパイル要件  。
【０２３７】
Ａ．データ分析品質管理メトリクス
１．プレート品質管理
プレート品質管理は、対照試料が指定のとおりに機能することを保証し、データ分析モジュールに必要な情報がプレートに存在することを検証するものである。
【０２３８】
対照試料ＱＣ：
ａ．参照遺伝子Ｃｔ検査：プレートＱＣは、対照試料の各反応における参照遺伝子Ｃｔが指定の閾値（構成ファイルにおける３０）より低いことを検証する。対照試料ウェルが閾値を上回るまたは等しい参照遺伝子Ｃｔを有する場合、プレート警報が不合格対照試料ウェルのリストとともに発信される。ブランク対照は除外される。
【０２３９】
ｂ．参照遺伝子勾配検査：プレートＱＣは、対照試料の参照遺伝子蛍光曲線の勾配が４反応のそれぞれの指定の限界（構成ファイルにおける［０．１５、０．５５］）内にあることを検証する。対照試料ウェルが指定の限界外の参照遺伝子勾配を有する場合、プレート警報が不合格対照試料ウェルのリストとともに発信される。ブランク対照は除外される。
【０２４０】
ｃ．対照試料確定検査：プレートＱＣは、対照試料のコピー数の推定値が、正しいコピー数値の測定信頼性試験（信頼度９９．９９％）、確定信頼性試験（信頼度９９．９９％）および試料ＣＶ試験（０．１５）に合格することを検証する。対照試料のいずれかが測定信頼性試験に合格しない場合、プレート警報が不合格対照試料のウェルのリストとともに発信される。ブランク対照は除外される。
【０２４１】
統計的手法を適用する前に用いるプレート全体のＱＣ検査：
ｄ．２コピー試料の数：プレートＱＣは、参照遺伝子Ｃｔ、参照遺伝子勾配、測定信頼性、確定信頼性および試料ＣＶ試験に合格した２コピー試料（良質試料）の数が統計分析に十分であることを確認する（２０試料）。２コピー試料の数は、データ分析モジュールによりエクスポートされる。２コピー試料の数が閾値より少ない場合、プレート警報が発信される。
【０２４２】
ｅ．２コピー試料の平均値：プレートＱＣは、良質２コピー試料の平均値が測定信頼性試験に合格することを検証する。そうでない場合、プレート警報が発信される。平均値は、データ分析モジュールによりエクスポートされる。
【０２４３】
ｆ．２コピー試料の標準偏差：プレートＱＣは、良質２コピー試料の標準偏差が指定の閾値（０．１）より小さいかどうかを確認する。それが閾値より大きいか、または等しい場合、プレート警報が発信される。標準偏差は、データ分析モジュールによりエクスポートされる。
【０２４４】
２．試料品質管理
以下のＱＣ検査は、対照試料を含むプレート上の各試料について実施する。
【０２４５】
ａ．参照遺伝子Ｃｔ検査：試料ＱＣは、４ウェルのそれぞれの参照遺伝子Ｃｔが指定の閾値（３０）より小さいことを検証する。試料ウェルが閾値を上回るか、または等しい参照遺伝子Ｃｔを有する場合、試料警報が不合格ウェルのリストとともに発信される。
【０２４６】
ｂ．参照遺伝子勾配検査：試料ＱＣは、参照遺伝子蛍光曲線の勾配が４ウェルのそれぞれについて指定の限界（［０．１５、０．５５］）内にあることを検証する。試料ウェルが指定の限界外の参照遺伝子勾配を有する場合、試料警報が不合格ウェルのリストとともに発信される。
【０２４７】
ｃ．試料ＣＶ検査：試料ＱＣは、コピー数の推定値の４反復測定間の試料ＣＶを計算する。試料ＣＶが指定の閾値（０．１５）より大きいか、または等しい場合、試料警報が発信される。
【０２４８】
ｄ．測定信頼度：試料ＱＣは、測定信頼度推定値を計算する。測定信頼度は、試料コピー数推定値がコピー数限界内にある統計的信頼レベルである。信頼度が指定の閾値（９９％）より低い場合、試料警報が発信される。
【０２４９】
ｅ．確定信頼度：試料ＱＣは、確定信頼度を計算する。確定信頼度は、試料が出力で報告されたＳＭＮ１遺伝子コピーの数を有する統計的信頼レベルである。確定信頼度が指定の閾値（９９．９９％）より低い場合、試料警報が発信される。
【０２５０】
Ｂ．データ分析アルゴリズム
データ分析の作業の流れのこの記述は、ＳＭＡデータ分析モジュールにおいて実行されるアルゴリズムのステップに従う。アルゴリズムには生データの処理、統計分析およびＱＣ分析という３つの基本的な部分が存在する。
【０２５１】
１．エラーの取扱い
データ分析モジュールは、エラーメッセージをログファイルにエクスポートする。ログファイルの名称は、次の命名法に従い、「ＳＭＡＤＡＬｏｇ」接頭辞で始め、Ｃｔデータファイル名を続ける。Ｃｔデータファイル名がアルゴリズム引数に指定されていない場合、モジュールは、ログファイル「ＳＭＡＤＡＬｏｇ＿Ｄｅｆａｕｌｔ．ｔｘｔ」を作る。モジュールがデータの処理に成功した場合、ログファイルは空である。アルゴリズムがエラーまたは予期しない中間結果に遭遇した場合、アルゴリズムは、計算を停止し、ログファイルにエラーメッセージを書き込む。
【０２５２】
２．データ入力
ＳＭＡデータ分析モジュールは、２つの入力データファイル、ＴａｑＭａｎからのＣｔデータおよびＴａｑＭａｎからのクリップデータを必要とする。ファイルは、標準ＡＢＩフォーマットであるべきである。モジュールは、データ入力をＣｔデータファイルから始める。モジュールは、「Ｗｅｌｌ」キーワードから始めてラインを検索し、「Ｗｅｌｌ」ラインの後に３８４ラインを入力する。これらは、ＦＡＭ  Ｃｔ測定である。モジュールは、ＦＡＭを処理した後、「Ｗｅｌｌ」キーワードを再び検索し、当キーワードの後に他の３８４テキストラインをインポートする。これらは、ＶＩＣ  Ｃｔ測定である。Ｃｔデータファイルにおけるラインが３つの変数、すなわち、試料名、リポーターおよびＣｔについて分析される。すべての非数値Ｃｔが４０に変換される。
【０２５３】
クリップデータファイルは、タブ区切りファイルとして読み取られる。モジュールは、ブロックＡＳ３．．．ＣＦ７７０を読み取る。このブロックは、４０サイクルにわたる３８４ウェルにおける２チャンネルのデルタ蛍光測定を含む。ブロックにおけるセルは、数値を含まなければならない。
【０２５４】
モジュールが２つのデータファイルのいずれかを開けることができない場合、モジュールはエラーメッセージを発信し、データ処理を停止する。アルゴリズム処理の前にウェルを省略することはできない。
【０２５５】
３．試料名の処理
Ｃｔデータファイルから試料名を読み取った後、アルゴリズムは、名称を試料ＩＤ、試料の種類およびウェル位置について分析する。アルゴリズムは、試料名を垂直バー「Ｉ」により分割する。第１の垂直バーの前の文字列が試料ＩＤとして割り当てられ、第１の垂直バーと第２の垂直バーとの間の文字列が試料の種類として割り当てられ、第２の垂直バーの後の文字列が捨てられる。空のウェルは、Ｃｔデータファイルにおける空の試料名“”を有するべきである。試料の種類の識別子は、次の試料の種類の表記規則に従うべきである：ＢＬＤＰＥＲ、ＢＬＯＯＤＳＰＯＴ、ＭＯＵＴＨＷＡＳＨ、ＡＭＮＩＯ、ＣＵＬＴＡＦＣＥＬ、ＣＶＳ、ＣＶＳＣＵＬＴ、ＣＯＲＤＢＬＯＯＤ。空の試料の種類は、ＳＵＲＥＲとする。認識できない試料の種類は、ＢＬＤＰＥＲとするが、含めない。
【０２５６】
４．勾配の計算
ＶＩＣチャンネルについての勾配の計算は、Ｃｔデータファイルに報告されたＣｔ測定に最も近い３つのサイクル測定に基づいて行う。計算のための式は次のとおりである。
【０２５７】
【化２４】
2013510580.tif 000033
ここでＹ１、Ｙ２、Ｙ３は、３つ（対数変換、バックグラウンド正規化）のデルタ蛍光測定値である。
【０２５８】
５．勾配ＱＣおよびＣｔＱＣ
アルゴリズムは、参照遺伝子チャンネル（ＶＩＣ）における勾配およびＣｔ測定をチェックする。勾配またはＣｔ値がＱＣメトリクスに合格しない場合、モジュールは、対照試料を含む各試料に関する試験結果を発信する。このＱＣ試験に不合格であった試料について、アルゴリズムは、ＱＣメトリクス不合格のウェルを記録する。
【０２５９】
６．デルタＣｔの計算、ウェル複製の平均および中央値洗練法
アルゴリズムは、ＶＩＣ  Ｃｔ値からＦＡＭ  Ｃｔ値を差し引くことによりデルタＣｔを計算する。対照アンプリコンのそれぞれについて、アルゴリズムは、経験的分布のテイルにおける観測値の８０％を刈り込むまたは計算から除外する、検体試料のＶＩＣチャンネルとＦＡＭチャンネルとの間の刈り込み平均デルタＣｔを計算する（対照および空ウェルはこの計算から除外される）。刈り込み平均値に基づいて、アルゴリズムは、式５（線形目盛）および式６（ｌｏｇ目盛）に従ってｌｏｇおよび線形目盛上でコピー数の推定値を得る。
【０２６０】
【化２５】
2013510580.tif 000034
プレートが完全である場合、アルゴリズムは、ｌｏｇ目盛上でコピー数の推定値の中央値洗練を行う。完了後、モジュールは、行または列のいずれかが０．２単位超調整されたかをチェックする。それらの複製行または列が中央値洗練カットオフにも適合しない場合、これらの行および列についての調整が取り消される。列１および２は、洗練から常に除外される。行および列数は、プレートＱＣ出力に報告される。
【０２６１】
線形目盛上のコピー数推定値は、調整を含めるために中央値洗練の後に再生される。
【０２６２】
各試料の４つのウェルについてのコピー数の推定値をこの時点に平均する。コピー数の確定は、２つの適用除外を設けて平均コピー数推定値を四捨五入することにより計算する。ブランク対照のコピー数の確定は、“−”に既定値として設定される。コピー数の確定は、３に制限され、３より大きい確定は、３コピーで置き換えられる。プレート上の各試料に関する平均値および標準偏差は、ｌｏｇおよび線形目盛で保存される。
【０２６３】
７．測定信頼度
この計算のために、４複製ウェルにわたる試料平均の正規性の仮定を設ける。測定信頼度は、個々の試料のコピー数限界内に適合するようなコピー数推定値（４ウェルにわたり平均した）の周りの最大の正規信頼区間として決定する。言い換えると、測定信頼度は、各標本または対照についての４つの複製の測定値の間の変動および平均値に注目する。それは、試料内変動の尺度である。正規分布のパラメーターは、次のとおりである：平均値は、線形目盛上の４つのウェルにわたる平均コピー数推定値である。標準偏差は、平均値の標準誤差である。限界は、構成ファイルに指定されているコピー数限界である。試料ＱＣ手順は、測定信頼度が試料が良質であるのに十分に高いかどうかを確認するものである。測定信頼度がカットオフより低い場合、この試料の測定信頼度ＱＣメトリクスは、不合格である。
【０２６４】
測定信頼度および測定信頼度ＱＣ試験の状態が出力ファイルにエクスポートされる。
【０２６５】
８．試料変動係数
試料ＣＶは、線形目盛で計算され、４複製物間の試料標準偏差と試料平均値との比である。ゼロコピー試料の試料ＣＶは、ゼロで割ることが起こり得るため、別に計算する。ゼロコピー数試料の試料ＣＶは、試料標準偏差と平均値プラス１との比として計算する。試料ＱＣ手順は、試料ＣＶが構成ファイルに指定されている閾値より低いかどうかをチェックする。ＣＶが試料ＣＶ  ＱＣメトリクスより大きいか、または等しい場合、試料ＣＶ  ＱＣメトリクスは、この試料について不合格である。
【０２６６】
試料ＣＶおよびＣＶ  ＱＣ試験の状態は、出力ファイルにエクスポートされる。
【０２６７】
９．２コピー数平均値および標準偏差
確定の信頼度の値を得るために、アルゴリズムは、バックグラウンド変動を計算する。バックグラウンド変動は、２コピー試料の確定推定値の分散である。特定の実施形態では、アルゴリズムにより要求される２コピー試料の特定の数が存在し、この数は、構成ファイルに指定されている。標準偏差および平均値の推定のために、モジュールは、良質の試料のみ、すなわち、以下の要件を満たす試料のみをプールする。
【０２６８】
（ａ）ＶＩＣ  Ｃｔ、ＶＩＣ勾配、測定信頼性および試料ＣＶ  ＱＣ試験に合格した
（ｂ）対照でない
（ｃ）２コピーのＳＭＮ１遺伝子を有すると推定された
（ｄ）試料の種類がＢＬＤＰＥＲ
そのような試料の数が閾値を下回る場合、要件（ｄ）を削除し、すべての試料の種類を一緒にプールする。良質の２コピー試料の数がそれらの平均値および標準偏差とともに出力ファイルに報告される。
【０２６９】
測定信頼度と同様なメトリックが平均値の標準誤差に基づいてこれらの試料の平均について得られる。２コピー試料の平均の周りの信頼度が構成ファイルにおける閾値設定を下回る場合、プレートＱＣは、２コピー平均試験に不合格である。
【０２７０】
１０．試料の種類の調整
２コピー試料の標準偏差は、確定信頼度の値を得るためにＷｅｓｔにおいて用いられる標準偏差である。異なる試料の種類は試験で異なる変動を示す可能性があるので、標準偏差の調整を構成ファイルに指定することができる。各試料の種類が調整を受け得る。試料の種類に固有の標準偏差を計算するために、調整が推定２コピー試料標準偏差に加えられる。ステップ９で要件（ｄ）が削除される場合、調整は行われない。現在、ＡＭＮＩＯおよびＣＶＳ標準偏差のみが０．０３単位調整される。
【０２７１】
１１．確定信頼度
確定信頼度は、ｔ検定のｐ値から計算する。アルゴリズムは、次の仮定を設ける。すなわち、確定推定値が正規分布し、コピー数にわたって等分散を有する。この計算を行うことができる前に、対照を除く２コピー試料の臨界数（２０）が必要とされる。各試料について、アルゴリズムは、隣接コピー数分布の試料のｔ検定のｐ値を求める。例えば、２コピー数を有する試料について、アルゴリズムは、１コピー数分布または３コピー数分布のコピー数推定値のｐ値を計算する。２つのｔ検定ｐ値を合計し、２つのｐ値の合計またはゼロもしくは３コピー数の場合には１つのｐ値を、低信頼度に相当する、１−大ｐ値から差し引くことにより、信頼度を計算する。
【０２７２】
コピー数ｔ分布平均値は、遺伝子コピーの個々の数についてコピー数の推定値のすべてを平均することにより求める。特定の遺伝子コピー数の推定値が存在しない場合、平均値は−２、１、２および２．５８５と仮定される。コピー数ｔ分布標準偏差は、試料の種類について調整された標準偏差であり、異なる試料の種類で異なる。
【０２７３】
確定信頼度を各試料について計算するとき、確定信頼度ＱＣ試験を実施する。確定信頼度が構成ファイルに指定されている閾値より低い場合、確定信頼度試験は、当該試料について不合格である。確定信頼度試験の状態および確定信頼度の値が出力ファイルにエクスポートされる。
【０２７４】
１２．対照のＱＣ試験
ブランク対照は、ＱＣプロセスのこの部分から除外される。すべての対照試料を参照遺伝子（ＶＩＣチャンネル）Ｃｔ、参照遺伝子勾配、測定信頼度、確定信頼度および試料ＣＶの質について検査する。これらの試料ＱＣメトリクスのいずれかが不合格である場合、プレート警報が不合格ウェルおよび不合格メトリクスのリストとともに発信される。対照試料のコピー数の推定値も予測されるコピー数の値とのそれらの一致について検査する。モジュールは、最終的なＳＭＮ１プレートレイアウトに基づいてウェル位置により対照を発見する。
【０２７５】
１３．モジュール出力
データ分析モジュールは、プレートＱＣメトリクスから出力を開始し、試料ＱＣメトリクスおよびデータ分析結果について続ける。対照試料が最初にファイルに書き込まれるように、試料がカラムによりエクスポートされる。空のウェルに関する情報は、出力ファイルにエクスポートされない。
【０２７６】
Ｃ．運営ＱＣに関する勧告
特定のＱＣメトリクスの不合格は、機器、自動化スクリプトまたはアッセイ試薬の最適状態に満たない性能を示し得るものである。下に運営ＱＣグループの緊急対応を必要とし得る不合格のリストを示す。
【０２７７】
１．プレートＱＣにおける閾値を超える２コピー試料の標準偏差。このプレートＱＣメトリックの散発的な不合格は、アッセイ試薬または試薬分注に関連する問題を示す可能性がある。このプレートＱＣメトリックの一貫性のある不合格は、試薬および器具類の性能品質の再評価のきっかけとなるものである。不合格は、ＤＮＡ抽出に関連する問題も示し得る。
【０２７８】
２．非確定（繰返し）試料の百分率。プレート上の繰返し試料の率の２５％を超えるスパイク増加は、試薬の性能の最適状態に満たない状態または液体分注／混合に関連する問題を示し得る。プレートバッチの２０％を超える一貫した繰返し率は、重要であり、運営ＱＣの緊急対応を必要とし得る。それは、不良な試薬の質または計測ハードウエアもしくはソフトウエアに関連する問題を示す可能性がある。
【０２７９】
３．対照の不合格。プレートバッチにおける２つを超える対照試料の一貫した不合格は、重要であり、運営ＱＣの緊急対応を必要とする。全体的なプレート繰返し率が１０％未満である場合、それは、対照試料の不合格を示すものである可能性がある。
【０２８０】
４．位置不合格。プレート上の特定の位置の試料の一貫した不合格は、運営ＱＣの緊急対応を必要とする。それは、当位置における計測ハードウエアの最適状態に満たない性能を示し得るものである。
【０２８１】
Ｄ．データ分析モジュール出力フォーマット
ＳＭＡデータ分析出力は、ＸＭＬフォーマットである。それは、プレートＱＣと試料ＱＣの２つの部分からなる。ＸＭＬファイルは、以下の標準フォーマッティングラインから始める：
＜？ｘｍｌ  ｖｅｒｓｉｏｎ＝“１．０”ｅｎｃｏｄｉｎｇ＝“ＵＴＦ−８”？＞
続いて以下のプレート、試験番号およびモジュールバージョンを有する全体的ＳｍａＲｅｓｕｌｔｓ構造：
＜ＳｍａＲｅｓｕｌｔｓ  ｐｌａｔｅＮｕｍｂｅｒ＝“３２００８”ｒｕｎＮｕｍｂｅｒ＝“１２３４５６”ｍｏｄｕｌｅＶｅｒｓｉｏｎ＝“０．２”＞＜／ＳｍａＲｅｓｕｌｔｓ＞
プレートＱＣ構造は以下に含まれる：
＜ＰｌａｔｅＱｃ＞＜／ＰｌａｔｅＱｃ＞
試料ＱＣ構造は以下に含まれる：
＜ＳａｍｐｌｅＱｃ＞＜／ＳａｍｐｌｅＱｃ＞
１．プレートＱＣ
（ａ）＜ＶｉｃＣｔ＞オブジェクトは、対照試料の参照ＣＴ測定試験の状態を表示し、さらに試験が不合格である場合、不合格ウェルをリストする。
（ｂ）＜ＶｉｃＳｌｏｐｅｓ＞は、対照試料の参照勾配測定の状態を表示し、試験が不合格である場合、不合格ウェルをリストする。
（ｃ）＜ＣｏｎｔｒｏｌＣａｌｌｓ＞オブジェクトは、対照の状態を表示する。対照確定のいずれかが遺伝子コピーの指定された数と一致せず、試料ＱＣメトリクスのすべてに合格しない場合、不合格対照のウェルが構造の内側に示される。
（ｄ）＜ＭｅｄｉａｎＰｏｌｉｓｈ＞オブジェクトは、中央値洗練法の状態を表示する。非洗練行および列は、あるならば、構造の内側に示される。
（ｅ）＜ＥｍｐｉｒｉｃａｌＮｅｇａｔｉｖｅ＞オブジェクトは、ＲＪプレート上の２コピー試料の数を表示する。数が閾値を下回る場合、試験は不合格である。
（ｆ）＜ＮｅｇａｔｉｖｅＡｖｅｒａｇｅ＞オブジェクトは、２コピー試料の平均確定を表示する。平均値とその信頼区間が許容限界外にある場合、試験は不合格である。
（ｇ）＜ＮｅｇａｔｉｖｅＳｔｄｉｖ＞オブジェクトは、２コピー試料の標準偏差を示す。標準偏差が閾値を上回る場合、試験は不合格である。
【０２８２】
２．試料ＱＣ
ａ．＜Ｓａｍｐｌｅ＞オブジェクトは、プレート上のすべての対照および試験試料をリストする。
ｂ．＜Ｓａｍｐｌｅ＞オブジェクトは、個々の試料を含み、以下の情報を表示する。
【０２８３】
ｉ．ｓａｍｐｌｅＩＤにおける試料ＩＤ｜試料の種類
ｉｉ．ｔｙｐｅにおける試料の種類（対照、検体）
ｉｉｉ．ｃｏｐｙＥｓｔｉｍａｔｅにおけるコピー数の値
ｉｖ．ｃａｌｌにおける試料コピー数確定。ブランク対照は、“−−”に既定値として設定されたそれらのコピー数の確定を有する。
【０２８４】
ｖ．ｃａｌｌＣｏｎｆｉｄｅｎｃｅＣｒｉｔｅｒｉｏｎにおける確定信頼度試験の状態（合格または不合格）
ｖｉ．ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔＣｏｎｆｉｄｅｎｃｅにおける測定信頼度
ｖｉｉ．ｓａｍｐｌｅＣｖＣｒｉｔｅｒｉｏｎにおける試料ＣＶ試験の状態（合格または不合格）
ｖｉｉｉ．ｓａｍｐｌｅＣｖにおける試料ＣＶ
ｉｘ．ＶｉｃＣｔにおけるこの試料のＶＩＣ  ＣＴ試験状態と不合格ウェルのリスト
ｘ．ＶｉｃＳｌｏｐｅｓにおけるこの試料のＶＩＣ勾配試験状態と不合格ウェルのリスト
ｘｉ．ＦＡＭにおける４ウェルのｌｏｇ１０目盛上の試料ＦＡＭ  ＤｅｌｔａＲｎデータ：ウェルにおけるウェル位置およびサイクル１からサイクル４０までのｌｏｇｉ０ＤｅｌｔａＲｎ数
ｘｉｉ．ＶＩＣにおける４ウェルのｌｏｇ１０目盛上の試料ＶＩＣ  ＤｅｌｔａＲｎデータ：ウェルにおけるウェル位置およびサイクル１からサイクル４０までのｌｏｇｉ０ＤｅｌｔａＲｎ数
Ｅ．データ分析実行可能ファイル（ＳＭＡＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ．ｅｘｅ）
ＳＭＡＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ．ｅｘｅは、Ｗｉｎ３２環境においてコンパイルされるＭａｔｌａｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，Ｉｎｃ）スクリプトである。ＳＭＡＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓは、ＳＭＮ１  ＴａｑＭａｎデータについてデータ正規化、確定割り当て（ｃａｌｌ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）および確定信頼度の計算を行う。
【０２８５】
１．実行時コンポーネント
ａ．Ｍａｔｌａｂ実行時ライブラリ。Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ワークステーションでスクリプトを実行するためにＭＣＲＩｎｓｔａｌｌｅｒ．ｅｘｅが必要である。ＭＣＲＩｎｓｔａｌｌｅｒ．ｅｘｅファイルのバージョンは、スクリプトをコンパイルするために用いられるＭａｔｌａｂのバージョンに適合すべきである。
【０２８６】
ｂ．ＳＭＡＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ．ｃｔｆ。当ファイルは、スクリプトの実行中に用いられる一連のＭａｔｌａｂ機能を含む。このファイルは、ＳＭＡＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ．ｅｘｅホルダーに存在する必要がある。スクリプトの最初の実行時にｃｔｆファイルをＳＭＡＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ＿ｍｅｒサブホルダーに解凍する。一度サブホルダーが作られる。
【０２８７】
ｃ．ＳＭＡＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ．ｃｆｇ。当ファイルは、構成ファイルである。それは、プレーンテキスト形式であり、ＱＣメトリクスに関する種々の調整可能な閾値を含む。
【０２８８】
２．コマンドラインフォーマット
ＳＭＡＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ［ＣＤ  Ｄａｔａ  Ｆｉｌｅ］［Ｃｌｉｐｐｅｄ  Ｄａｔａ  Ｆｉｌｅ］［Ｏｕｔｐｕｔ  Ｆｉｌｅ］［Ｐｌａｔｅ＃］［Ｒｕｎ＃］
ａ．ＣＤ  Ｄａｔａ  Ｆｉｌｅは、標準テキスト形式のＡＢＩ  ＣＴデータ出力ファイルである。
【０２８９】
ｂ．短縮データファイルは、標準テキスト形式のＲｎおよびＤｅｌｔａＲｎ測定を含むＡＢＩ短縮（ｃｌｉｐｐｅｄ）データファイルに相当するものである。
【０２９０】
ｃ．Ｏｕｔｐｕｔ  Ｆｉｌｅは、出力ファイル名である。
【０２９１】
ｄ．Ｐｌａｔｅ  ＃は、プレート番号である。
【０２９２】
ｅ．Ｒｕｎ  ＃は、試験番号である。
【０２９３】
３．入力
ａ．ＣＴデータファイル
ｂ．短縮データファイル
ｃ．出力ファイル名
ｄ．プレート番号
ｅ．試験番号
ｆ．構成ファイルからの構成パラメーター  。
【０２９４】
４．出力
ＳＭＡＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ．ｅｘｅは、以下の２つのファイルに出力を書き込む：
ａ．コマンドラインに指定された出力ファイル（ＳＭＡ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｏｕｔｐｕｔ  ｆｉｌｅ  ｆｏｒｍａｔ．ｄｏｃにおけるフォーマットの記述を参照）
ｂ．ログファイル「ＳＭＡＤＡＬｏｇ＿［ＣＴＤａｔａ  Ｆｉｌｅ］」。ログファイルは、計算中の異常な中間結果および一般的コード実行エラーを登録する。成功裏の実行後にログファイルは空になるべきである。
【０２９５】
Ｆ．構成ファイル
構成ファイルＳＭＡＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ．ｃｆｇは、ＱＣメトリック閾値および他のパラメーターが指定されているテキストファイルである。当ファイルは、以下のラインを有するべきである：
ＶＩＣチャンネルＣｔ閾値：３０
ＶＩＣチャンネル勾配範囲：［０．１５  ０．５５］
０コピー数確定限界：「−０．０１  ０．０１」  
１コピー数確定限界：「０．６  １．４」
２コピー数確定限界：「１．６  ２．４」
３コピー数確定限界：「２．４３  ５」
２コピー数経験対照の最小数：２０
２コピー数標準偏差閾値：０．１
試料ＣＶ閾値：０．１５
測定信頼度閾値：０．９９
確定信頼度閾値：０．９９９９
ＢＬＯＯＤＳＰＯＴに関する標準偏差調整：０
ＭＯＵＴＨＷＡＳＨに関する標準偏差調整：０
ＡＭＮＩＯに関する標準偏差調整：０．０３
ＣＵＬＴＡＦＣＥＬに関する標準偏差調整：０
ＣＶＳに関する標準偏差調整：０．０３
ＣＶＳＣＵＬＴに関する標準偏差調整：０
ＣＯＲＤＢＬＯＯＤに関する標準偏差調整：０
ＶＩＣ  Ｃｔ３０は、参照遺伝子チャンネルの現在のＣｔ閾値である。
【０２９６】
ＶＩＣチャンネル勾配範囲の括弧内の範囲は、ｌｏｇ１０目盛上の参照遺伝子勾配の許容変動範囲である。
【０２９７】
コピー数確定限界は、各種コピー数推定値について括弧内に示す。
【０２９８】
上に示すように、構成パラメーターは、確定信頼度の計算における分散の推定に用いる２コピー試料の最小数、２コピー試料の最大許容標準偏差、最大許容試料ＣＶ、許容信頼レベルおよび各種試料の種類についての変動の調整も含む。
【０２９９】
Ｇ．コピー数限界の計算
コピー数限界の再計算は、推奨されないが、新たな試薬ロット、新たな機器または実験条件の他の変更について実施することができる。いくつかの実施形態において、０、１、２および３の４つのコピー数のそれぞれについて１つの生物学的検体の３０＋の個別反応確定推定値が得られる。
【０３００】
コピー数限界の計算の手順は、以下のとおりである。
【０３０１】
１．個々の反応の確定推定測定値を標準ベータ分布に適合するように以下のように変換する。
【０３０２】
０から０．５までの０コピー確定推定値に２を乗ずる。［０、０．５］間隔外の測定値は捨てる。
【０３０３】
０．５から１．５までの１コピー確定推定値を０．５減じる。［０．５、１．５］間隔外の測定値は捨てる。
【０３０４】
１．５から２．５までの２コピー確定推定値を１．５減じる。［１．５、２．５］間隔外の測定値は捨てる。
【０３０５】
２．４から３．４までの３コピー確定推定値を２．４減じる。［２．４、３．４］間隔外の測定値は捨てる。
【０３０６】
２．変換されたコピー数データセットのそれぞれについて平均値および分散を計算する。
【０３０７】
３．以下のアルファおよびベータの推定により、個別のベータ分布をコピー数変換データに適合させる。
【０３０８】
【化２６】
2013510580.tif 000035
非対称および有界サポートのため、ベータ分布ファミリーをこの手順に選択した。
【０３０９】
４．４つの分布について０．００００５および０．９９９９５百分位数を計算し、百分位数を最初のスケールに逆変換することにより、分布の限界を得る。例えば、２コピー数分布の０．００００５および０．９９９９５百分位数に１．５を加える。
【０３１０】
５．以下のように分布限界を限界境界値と対照してチェックする。
【０３１１】
０コピー
・上限は［０．０１、０．１］の範囲内
・下限は負の上限として設定する
１コピー
・上限は［１．４、１．４５］の範囲内
・下限は［０．５、０．６］の範囲内
２コピー
・上限は［２．３５、２．４］の範囲内
・下限は［１．６、１．６５］の範囲内
３コピー
・下限は［２．４、２．５］の範囲内
・上限は５に設定する  。
【０３１２】
限界境界値は、適切な確定推定値範囲が限界により捕捉され、連続したコピー数領域の間に十分に広い未確定の範囲が存在するように設定する。境界値の配置は、試験の開発における確認済みの試料の確定推定値の変動およびＶｅＶａに基づいている。
【０３１３】
Ｉ．Ｍａｔｌａｂコンパイル要件
モジュールは、Ｍａｔｌａｂ  ｖ．  Ｒ２００７ａで成功裏にコンパイルされる。モジュールのコンパイルは、Ｍａｔｌａｂ、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｔｏｏｌｂｏｘ、Ｍａｔｌａｂ  Ｃｏｍｐｉｌｅｒを必要とする。以下は、モジュールソースコードを含むＭａｔｌａｂファイルのリストである。
【０３１４】
１．ＳＭＡＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ．ｍ−コマンドラインから呼び出される主スクリプト。
【０３１５】
２．ＳＭＡＡｎａｌｙｓｉｓＭｏｄｕｌｅ．ｍ−主計算スクリプト。これは、ＳＭＡＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ．ｍから呼び出される。
【０３１６】
３．ｍｅｄｉａｎｐｏｌｉｓｈ．ｍ−中央値洗練関数
４．ａｌｉｇｎＲｅｐｌｉｃａｔｅｓ．ｍ−複製処理関数（ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）
５．ＲｅａｄＣｏｎｆｉｇ．ｍ−構成ファイルからパラメーター値を読み出すための関数
ＩＩ．ＳＭＡデータ分析モジュールにおける確定推定値の計算の詳細な説明書
デルタＣｔは、式１に従ってプレート上の各ウェル（ｉ，ｊ）について計算する。この場合、参照遺伝子座のＴＡＱＭＡＮ（商標）プローブをＶＩＣ発蛍光団で標識し、標的遺伝子座のＴＡＱＭＡＮ（商標）プローブをＦＡＭ発蛍光団で標識する。したがって、各ウェルについての式１は以下のようになる。
【０３１７】
【化２７】
2013510580.tif 000036
１．各参照遺伝子についてプレートデルタＣＴｓ（対照ウェルを除く）の８０％刈り込み平均をとることにより、２つの参照遺伝子について以下の較正デルタＣＴｓを計算する：
ΔＣｔＳＭＡＲＣＣ１＝刈り込み平均（ΔＣｔｉｊ、８０）；ｉはＳＭＡＲＣＣ１ウェルである
ΔＣｔＳＵＰＴ５＝刈り込み平均（ΔＣｔｉｊ、８０）；ｉはＳＵＰＴ５ウェルである
各参照遺伝子の刈り込み平均を、当該参照遺伝子に対応するプレート上のウェルにわたって計算する。
【０３１８】
２．各ウェルのｌｏｇ確定推定値の計算：
ｌｏｇＣＥｉｊ＝２＋Ｃｔｉｊ−ΔＣｔＳＭＡＲＣＣ１；ｉはＳＭＡＲＣＣ１ウェルである
ｌｏｇＣＥｉｊ＝２＋Ｃｔｉｊ−ΔＣｔＳＵＰＴ５；ｉはＳＵＰＴ５ウェルである
３．各ウェルの確定推定値の計算：
【０３１９】
【化２８】
2013510580.tif 000037
４．４つの試料ウェルの確定推定値を平均することにより、各試料についての確定推定値を計算する：
【０３２０】
【化２９】
2013510580.tif 000038
；ｉ、ｊは４つの試料ウェルである
５．試料確定推定値を四捨五入することにより、試料確定を計算する：
【０３２１】
【化３０】
2013510580.tif 000039
（実施例４）
ＳＭＮ１遺伝子座における突然変異を確定するためのアッセイ
本実施例では、ＳＭＮ１遺伝子座における突然変異を確定するために追加のアッセイを実施する。この実施例における実験は、実施例１で述べたようなリアルタイムＰＣＲ実験と併せて実施する（例えば、同じ組の生物学的検体について実施前、実施中または実施後に）。単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）または他の突然変異が「１」または「０」のＳＭＮ１コピー数確定の原因であるか否かを決定するために、リアルタイムＰＣＲ実験におけるＳＭＮ１アンプリコンに隣接するプライマーを用いてＳＭＮ１に固有の配列決定を実施する。
【０３２２】
最初のＰＣＲ増幅の後、ＰＣＲ反応物をＥｘｏ−ＳＡＰ（エキソヌクレアーゼＩ−エビアルカリホスファターゼ）で処理する。双方向配列情報を得るために各Ｅｘｏ−ＳＡＰ精製ＰＣＲ反応物をフォワードおよびリバースユニバーサルプライマーＵＰ１およびＵＰ２を用いて配列決定する。配列決定産物をゲルを通して電気泳動し、ＡＢＩ３１３０配列決定マシンで３６ｃｍアレイおよびＰＯＰ６ポリマーを用いて分析する。配列の分析は、ＳＥＱＳＣＡＰＥ（商標）ソフトウエア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施する。
【０３２３】
材料および方法
【０３２４】
【表３−２】
2013510580.tif 000040
配列決定ＰＣＲ条件
ステップ１：９５℃で５分間（酵素変性）
ステップ２：９５℃で３０秒間（ｄｓＤＮＡの変性）
ステップ３：６３℃で２０秒間（アニーリング）
ステップ４：７２℃で１分間（伸長）
ステップ５：ステップ２に進む、さらに３７回
ステップ６：７２℃で１０分間（最終伸長）
ステップ７：常時８℃
終了  。
【０３２５】
（実施例５）
北アメリカにおける主要民族集団におけるＳＭＮ１対立遺伝子頻度の推定
本明細書で開示した方法およびシステムにより行われるコピー数の確定は、さらなる分析、例えば、集団における対立遺伝子頻度の推定に適用することができる。
【０３２６】
脊髄性筋萎縮（ＳＭＡ）は、小児の最も一般的な遺伝性の致命的疾患である。ＳＭＮ１エクソン７の喪失に関係する様々な遺伝子欠失が、この劣性形質を運ぶ突然変異対立遺伝子の９４％を占めると報告されている。公表文献は、一般集団における２５例中１例から５０例中１例までのＳＭＮ１突然変異のキャリア頻度を記載している。ＳＭＡは汎民族疾患であると考えられるが、特定の民族のキャリア頻度は不明である。
【０３２７】
この実施例では、コピー数の推定値を実施例１〜３に記載したように得て、北アメリカにおける主要な民族集団における対立遺伝子頻度を推定するのに用いる。アフリカ系アメリカ人、アシュケナージ系ユダヤ人、アジア人、白人およびヒスパニック集団におけるＳＭＮ１突然変異キャリア頻度の正確な評価を行うために、各民族集団における１０００を超える匿名検体を、エクソンコピー数（ＳＭＮ１のエクソン７）を測定した臨床的にバリデートされた定量的リアルタイムＰＣＲアッセイを用いて試験した。試料は、ＳＭＡの家族歴を有さないと推測され、承認済みプロトコルに従って完全に匿名とされた個体のルーチン臨床試験の後の残存物質から収集した。民族性は、自己報告させた。
【０３２８】
表４に示すように有意なコピー数の差がいくつかの民族間で認められた。１コピーキャリアについては、白人またはアシュケナージ系ユダヤ人血統の個体からの検体は、アフリカ系アメリカ人およびヒスパニック背景からのものと統計的に異なる頻度を有していた。アフリカ系アメリカ人を除くすべての民族集団について、２コピー遺伝子型が３コピーより５倍以上優勢であった。アフリカ系アメリカ人では、２および３コピー遺伝子型がほぼ同等の頻度を有していた。アフリカ系アメリカ人集団におけるこれらの予期しない結果は、代替法であるマルチプレックスライゲーション依存性プローブ増幅（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＭＬＰＡ）により３コピー試料のサブセット（ｎ＝５０）を試験することにより確認された。すべてのＭＬＰＡ試料の結果は、リアルタイムＰＣＲ結果と一致していた。
【０３２９】
【表４】
2013510580.tif 000041
各民族集団における対立遺伝子当たりのＳＭＮ１コピー数の頻度も表４における観測遺伝子型から計算した。計算頻度は、Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡を前提としており、表５に示す。
【０３３０】
【表５】
2013510580.tif 000042
１Ｄ＝疾患対立遺伝子（ＳＭＮ１エクソン７欠失／変換、例えば、点突然変異により引き起こされない）
１＝ＳＭＮ１の１コピーを有する対立遺伝子
２＝ＳＭＮ１の２またはそれ以上のコピーを有する対立遺伝子  。
【０３３１】
すべての民族集団における１Ｄ対立遺伝子の罹患率は、内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｉｒｔｈら（１９９９年）「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ  ｃｏｐｉｅｓ：  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｂｔｌｅ  ＳＭＮ１  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ、ｇｅｎｏｔｙｐｅ−ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｕｎｓｅｌｉｎｇ」、Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．（６４巻、１３４０〜１３５６頁）によりＳＭＡ患者について記載された頻度に基づくものであった。
【０３３２】
結論として、５民族集団からの１０００を超える検体の試験により、多くの対立遺伝子頻度の有意な差が明らかになった。
【０３３３】
材料および方法
ＳＭＮ１遺伝子のエクソン７のコピー数推定値の計算、品質管理チェックおよび統計的チェックは、上の実施例１〜３で述べたように実施した。
【０３３４】
遺伝子型頻度の推定値の周りの信頼区間の計算
表４に示した遺伝子型頻度の推定値の周りの９５％信頼区間（９５％ＣＩ）は、厳密ベータ分布モデルに基づいて計算した。表５に示した対立遺伝子頻度は、Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡の仮定のもとで観測遺伝子型データから計算した最尤推定値である。ＥＭアルゴリズムを用いて、スクリーニング集団における０ＳＭＮ１コピー遺伝子型の欠測値を明らかにする。アルゴリズムは、２回の繰返し後に対立遺伝子頻度の推定値の６有効数字に収束する。対立遺伝子頻度の推定値の周りの９５％ＣＩおよび事前危険度推定値（表５）は、対立遺伝子頻度および危険度推定値の模擬母集団の対応する百分位数として計算する。これらのモンテカルロシミュレーションは、事後ベータ分布と続くＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇの仮定のもとでの対立遺伝子頻度の最尤推定から得られる１００００ランダム遺伝子型観測結果に基づいている。
【０３３５】
他の実施形態
本発明の他の実施形態は、本明細書で開示した本発明の明細事項または実施の考慮により当業者には明らかであろう。本明細事項および実施例は例示的なものにすぎないとみなし、本発明の真の範囲は、以下の特許請求の範囲により示すものとする。
【図３Ａ】
2013510580.tif 000050
【図３Ｂ】
2013510580.tif 000051
【図４】
2013510580.tif 000052
【図５Ａ】
2013510580.tif 000053
【図５Ｂ】
2013510580.tif 000054
【図５Ｃ】
2013510580.tif 000055
【図６Ａ】
2013510580.tif 000056
【図６Ｂ】
2013510580.tif 000057
【図１】
2013510580.tif 000058
【図２】
2013510580.tif 000059
【配列表】
2013510580000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年5月15日(2012.5.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
本発明の他の特徴、目的および利点は、以下の詳細な説明、図面および特許請求の範囲において明らかである。しかし、詳細な説明、図面および特許請求の範囲は、本発明の実施形態を示すが、例示のみの目的で示すものであって、限定の目的で示すものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内の様々な変更および修正は、当業者に明らかになる。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
標的遺伝子座のコピー数を分析する方法であって、
（ａ）複数の生物学的検体を提供するステップであって、各個別の生物学的検体が標的遺伝子座および既知のコピー数を有する１つまたは複数の参照遺伝子座を含む、ステップ；
（ｂ）複数の生物学的アッセイを実施するステップであって、各個別の生物学的アッセイにより上記各個別の生物学的検体中の上記標的遺伝子座および上記１つまたは複数の参照遺伝子座を分析し、上記標的遺伝子座および上記１つまたは複数の参照遺伝子座に関する検出可能なシグナルのレベルがそれらのそれぞれのコピー数と相関するような検出可能なシグナルが得られる、ステップ；
（ｃ）上記複数の生物学的アッセイに基づいて、上記１つまたは複数の参照遺伝子座に対して正規化した上記標的遺伝子座の複数のコピー数の推定値を決定するステップ；ならびに
（ｄ）上記コピー数の推定値の質および／または上記コピー数の確定の統計的信頼度を評価し、それにより、上記標的遺伝子座のコピー数の確定を行うことができるか否かを決定するステップ
を含む、方法。
（項目２）
上記標的遺伝子座が遺伝子またはその一部を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記遺伝子またはその一部が生存運動ニューロン１（ＳＭＮ１）のエクソンを含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
上記１つまたは複数の参照遺伝子座が、ＳＭＡＲＣＣ１およびＳＵＰＴ５Ｈからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目５）
上記ＳＭＮ１のエクソンがエクソン７である、項目３に記載の方法。
（項目６）
ステップ（ｂ）における上記生物学的アッセイが、上記標的遺伝子座および上記１つまたは複数の参照遺伝子座を増幅するリアルタイムＰＣＲアッセイである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
上記検出可能なシグナルが蛍光シグナルであり、上記標的遺伝子座または上記１つもしくは複数の参照遺伝子座の蛍光シグナルのレベルが各増幅サイクルにおいて検出される、項目６に記載の方法。
（項目８）
ステップ（ｃ）が
（ｉ）各個別の生物学的検体における上記蛍光シグナルの所定のレベルに達する上記標的遺伝子座と上記１つまたは複数の参照遺伝子座との間のサイクル数の差（ΔＣｔｉ）を決定するステップ；
（ｉｉ）正常標的遺伝子座と上記１つまたは複数の参照遺伝子座との間の差を反映するキャリブレータ
【化３１】
2013510580.tif 000060
を得るステップ；および
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）で決定された上記サイクル数の差ΔＣｔｉを上記キャリブレータ
【化３２】
2013510580.tif 000061
に対して正規化することによって各個別の生物学的検体における上記標的遺伝子座のコピー数の推定値を決定するステップ
を含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
ステップ（ｉ）が、上記蛍光シグナルの上記所定のレベルに達する上記標的遺伝子座および上記１つまたは複数の参照遺伝子座のそれぞれのサイクル数（Ｃｔｉ）を最初に測定するステップを含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
上記キャリブレータ
【化３３】
2013510580.tif 000062
が、上記複数の生物学的検体における上記標的遺伝子座と上記１つまたは複数の参照遺伝子座との間の上記ΔＣｔｉの刈り込み平均により定義される、項目８に記載の方法。
（項目１１）
各個別の生物学的検体における上記標的遺伝子座の上記コピー数の推定値を線形目盛上で決定する、項目８から１０のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
各個別の生物学的検体における上記標的遺伝子座の上記コピー数の推定値を対数目盛上で決定する、項目８から１０のいずれかに記載の方法。
（項目１３）
上記標的遺伝子座の上記コピー数の推定値の質を、上記１つまたは複数の参照遺伝子座について得られたデータの質に基づいて評価する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
上記統計的信頼度を、測定の信頼度および／または確定の信頼度を決定することにより評価する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
ステップ（ｂ）で実施する上記生物学的アッセイを反復する、項目１に記載の方法。
（項目１６）
上記コピー数の確定の上記統計的信頼度を、反復生物学的アッセイの測定の信頼度および上記複数のコピー数の推定値に基づく確定の信頼度の計算により決定する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
ステップ（ｄ）が、上記確定の信頼度が所定の閾値より低い場合に上記標的遺伝子座の上記コピー数の確定を行うことができないことを決定するステップを含む、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
標的遺伝子の異常なコピー数に関連する疾患またはそのキャリアを検出する方法であって、
（ａ）対象の個体から得られた少なくとも１つの生物学的検体を含む複数の生物学的検体を提供するステップ；
（ｂ）多数の反復生物学的アッセイを上記複数の生物学的検体のそれぞれについて実施して、上記標的遺伝子および既知のコピー数を有する１つまたは複数の参照遺伝子を分析するステップであって、上記多数の反復生物学的アッセイのそれぞれにより、上記標的遺伝子および上記１つまたは複数の参照遺伝子の検出可能なシグナルのレベルがそれらのそれぞれのコピー数と相関するような上記検出可能なシグナルが得られる、ステップ；
（ｃ）上記１つまたは複数の参照遺伝子に対して正規化した上記標的遺伝子のコピー数の推定値を決定するステップ；ならびに
（ｄ）上記コピー数の推定値の質および／または対象の上記個体のコピー数の確定の統計的信頼度を評価し、それにより、上記個体における上記標的遺伝子座のコピー数の確定を行うことができるか否かを決定するステップ
を含む方法。
（項目１９）
上記個体が上記疾患を有するもしくはその危険性があるか否か、または上記個体が上記疾患のキャリアであるか否かを決定するステップをさらに含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
上記疾患が脊髄性筋萎縮（ＳＭＡ）である、項目１８または１９に記載の方法。
（項目２１）
上記標的遺伝子が生存運動ニューロン１（ＳＭＮ１）である、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
ステップ（ｂ）で実施する上記生物学的アッセイがリアルタイムＰＣＲアッセイである、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
ステップ（ｂ）が、ＳＭＮ１のエクソン７の少なくとも一部を増幅するリアルタイムＰＣＲアッセイを実施するステップを含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
上記検出可能なシグナルが蛍光シグナルであり、上記標的遺伝子または上記１つもしくは複数の参照遺伝子の上記蛍光シグナルのレベルを各増幅サイクルにおいて検出する、項目２２または２３に記載の方法。
（項目２５）
ステップ（ｃ）が
（ｉ）各個別の反復アッセイにおける上記蛍光シグナルの所定のレベルに達する上記標的遺伝子と上記１つまたは複数の参照遺伝子との間のサイクル数の差（ΔＣｔｉ）を決定するステップ；
（ｉｉ）正常標的遺伝子と上記１つまたは複数の参照遺伝子との間のバックグラウンドの差を反映するキャリブレータ
【化３４】
2013510580.tif 000063
を得るステップ；および
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）で決定された上記サイクル数の差ΔＣｔｉを上記キャリブレータ
【化３５】
2013510580.tif 000064
に対して正規化することによって各個別の反復アッセイに基づくコピー数の推定値を得るステップ
を含む、項目１８から２４のいずれかに記載の方法。
（項目２６）
各個別の反復アッセイに基づく上記標的遺伝子の上記コピー数の推定値を線形目盛上で決定する、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
各個別の反復アッセイに基づく上記標的遺伝子の上記コピー数の推定値を対数目盛上で決定する、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
上記コピー数の推定値の質を評価するステップが、上記１つまたは複数の参照遺伝子について得られたサイクル数の測定およびその増幅曲線の勾配に基づいて品質管理メトリクスを得るステップを含む、項目２２から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
上記コピー数の推定値の質を評価するステップが、上記多数の反復生物学的アッセイ間の変動係数を求めるステップを含む、項目１８から２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
上記コピー数の確定の上記統計的信頼度を評価するステップが、測定の信頼度および／または確定の信頼度を決定するステップを含む、項目１８から２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
上記コピー数の確定の上記統計的信頼度を、上記多数の反復生物学的アッセイの測定の信頼度および複数のコピー数の推定値に基づく確定の信頼度の計算により決定する、項目１８に記載の方法。
（項目３２）
上記測定の信頼度を、上記複数の反復アッセイにわたる上記コピー数の推定値の平均値および所定のコピー数の限界内に適合する上記平均値の標準誤差により定義される上記コピー数の推定値の周りの最大正規信頼区間として決定する、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
ステップ（ｄ）が、上記測定の信頼度が所定の信頼度閾値を超えない場合に上記コピー数の確定を行うことができないことを決定するステップを含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
上記確定の信頼度が、隣接コピー数分布からのものである上記コピー数の推定値のｔ検定のｐ値を決定する、項目３０に記載の方法。
（項目３５）
ステップ（ｄ）が、上記確定の信頼度が所定の信頼度閾値より低い場合に上記コピー数の確定を行うことができないことを決定するステップを含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
上記標的遺伝子の所定のコピー数を有する１つまたは複数の対照試料を並行して分析するステップをさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
上記生物学的アッセイをマルチウェルプレートで実施する、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
上記１つまたは複数の対照試料の品質管理および統計分析に基づいてプレート品質管理メトリクスを決定するステップをさらに含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
上記１つまたは複数の対照試料のいずれかが上記品質管理もしくは統計的信頼度評価の１つに不合格である場合、またはいずれかの個別の対照試料の推定値が上記所定のコピー数に等しくない場合には、上記プレートは不合格である、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
対象の上記個体から得られる上記少なくとも１つの生物学的検体が、細胞、組織、全血、血漿、血清、尿、便、唾液、臍帯血、絨毛膜絨毛試料、絨毛膜絨毛試料培養物、羊水、羊水培養物または経頸部洗浄液からの核酸を含む、項目１８から３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
対象の上記個体から得られる上記少なくとも１つの生物学的検体が出生前試料である、項目１８から４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
標的遺伝子座のコピー数を分析するためのシステムであって、
ａ）複数の生物学的検体を受容するための手段であって、各個別の生物学的検体が標的遺伝子座および既知のコピー数を有する１つまたは複数の参照遺伝子座を含む、手段；
ｂ）複数の生物学的アッセイを実施するための手段であって、各個別の生物学的アッセイにより各個別の生物学的検体における上記標的遺伝子座および上記１つまたは複数の参照遺伝子座を分析し、上記標的遺伝子座および上記１つまたは複数の参照遺伝子座の検出可能なシグナルのレベルがそれらのそれぞれのコピー数と相関するような検出可能なシグナルが得られる、手段；
ｃ）各個別の生物学的検体からの上記検出可能なシグナルを検出し、上記検出可能なシグナルのレベルを測定するように構成された測定モジュール；
ｄ）上記測定モジュールからのシグナル情報を保存するように構成された記憶装置；
ｅ）（ｉ）上記記憶装置に保存された上記シグナル情報に基づいて上記１つまたは複数の参照遺伝子座に対して正規化した上記標的遺伝子座のコピー数の推定値を計算し、（ｉｉ）上記コピー数の推定値の質および／または上記コピー数の確定の統計的信頼度を決定するように適合された計算モジュール；ならびに
ｆ）使用者のための上記計算およびデータ分析結果に一部基づき、上記標的遺伝子座のコピー数の確定および／または品質管理もしくは統計的信頼度分析のいずれかが失敗であるか否かを示すシグナルを含む内容を表示するためのディスプレイモジュール
を含むシステム。
（項目４３）
上記生物学的アッセイがリアルタイムＰＣＲアッセイである、項目４２に記載のシステム。
（項目４４）
上記生物学的アッセイがアレイに基づく比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）である、項目４２に記載のシステム。
（項目４５）
上記生物学的アッセイが高スループット配列決定法である、項目４２に記載のシステム。
（項目４６）
上記測定モジュールが、各増幅サイクルにおける上記検出可能なシグナルのレベルを測定するように構成されており、上記検出可能なシグナルが蛍光シグナルである、項目４３に記載のシステム。
（項目４７）
上記計算モジュールが、以下：
（ｉ）各個別の検体における上記蛍光シグナルの所定のレベルに達する上記標的遺伝子座と上記１つまたは複数の参照遺伝子座との間のサイクル数の差（ΔＣｔｉ）を決定するステップ；
（ｉｉ）正常標的遺伝子座と上記１つまたは複数の参照遺伝子座との間のバックグラウンド差を反映するキャリブレータ
【化３６】
2013510580.tif 000065
を得るステップ；および
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）で測定された上記サイクル数の差ΔＣｔｉを上記キャリブレータ
【化３７】
2013510580.tif 000066
に対して正規化することによって各個別の生物学的検体における上記標的遺伝子座のコピー数の推定値を決定するステップ
に従って、上記標的遺伝子座のコピー数の推定値を計算するように適合されている、項目４５または４６に記載のシステム。
（項目４８）
上記計算モジュールが、上記１つまたは複数の参照遺伝子について得られたサイクル数の測定およびその増幅曲線の勾配に基づいて、品質管理メトリクスを少なくとも得ることにより上記コピー数の推定値の質を決定するように適合されている、項目４３から４７のいずれか一項に記載のシステム。
（項目４９）
上記計算モジュールが、試料の変動係数を少なくとも決定することにより上記コピー数の推定値の質を決定するように適合されている、項目４３から４８のいずれか一項に記載のシステム。
（項目５０）
上記計算モジュールが、測定の信頼度を少なくとも決定し、決定された上記測定の信頼度を所定の閾値限界と比較することにより上記コピー数の確定の統計的信頼度を決定するように適合されている、項目４３から４９のいずれか一項に記載のシステム。
（項目５１）
上記計算モジュールが、確定の信頼度を少なくとも決定し、決定された上記確定の信頼度を所定の閾値限界と比較することにより上記コピー数の確定の統計的信頼度を決定するように適合されている、項目４３から５０のいずれか一項に記載のシステム。
（項目５２）
上記計算モジュールが、任意の対照試料が不合格であるか否かを決定するようにさらに適合されている、項目４３から５１のいずれか一項に記載のシステム。
（項目５３）
上記標的遺伝子座が生存運動ニューロン１（ＳＭＮ１）のエクソンを含む、項目４２から５２のいずれか一項に記載のシステム。
（項目５４）
コンピュータ上で方法を実施するための計算モジュールおよびディスプレイモジュールを含むソフトウエアモジュールを規定するための記録されたコンピュータ可読の命令を有するコンピュータ可読媒体であって、上記方法が、
ａ）上記計算モジュールにより、（ｉ）記憶装置に保存されたリアルタイムＰＣＲデータに基づく１つまたは複数の参照遺伝子座に対して正規化した標的遺伝子座のコピー数の推定値ならびに（ｉｉ）上記コピー数の推定値の質および／または上記コピー数の確定の統計的信頼度を計算するステップ；ならびに
ｂ）使用者のための上記計算およびデータ分析結果に一部基づき、上記標的遺伝子座のコピー数の確定および／または品質管理もしくは統計的信頼度分析のいずれかが失敗であるか否かを示すシグナルを含む内容を表示するステップ
を含む、コンピュータ可読媒体。
（項目５５）
上記標的遺伝子座がＳＭＮ１のエクソン７またはその一部を含む、項目５４に記載のコンピュータ可読媒体。
（項目５６）
脊髄性筋萎縮（ＳＭＡ）またはそのキャリアの診断のためのキットであって、
（ａ）ＳＭＮ１のエクソン７またはその一部を増幅するための１つもしくは複数の試薬；
（ｂ）既知のコピー数を有する１つもしくは複数の参照遺伝子座を増幅するための１つもしくは複数の試薬；および
（ｃ）項目５５に記載のコンピュータ可読媒体
を含むキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子座のコピー数を分析する方法であって、
（ａ）複数の生物学的検体を提供するステップであって、各個別の生物学的検体が標的遺伝子座および既知のコピー数を有する１つまたは複数の参照遺伝子座を含む、ステップ；
（ｂ）複数の生物学的アッセイを実施するステップであって、各個別の生物学的アッセイにより前記各個別の生物学的検体中の前記標的遺伝子座および前記１つまたは複数の参照遺伝子座を分析し、前記標的遺伝子座および前記１つまたは複数の参照遺伝子座に関する検出可能なシグナルのレベルがそれらのそれぞれのコピー数と相関するような検出可能なシグナルが得られる、ステップ；
（ｃ）前記複数の生物学的アッセイに基づいて、前記１つまたは複数の参照遺伝子座に対して正規化した前記標的遺伝子座の複数のコピー数の推定値を決定するステップ；ならびに
（ｄ）前記コピー数の推定値の質および／または前記コピー数の確定の統計的信頼度を評価し、それにより、前記標的遺伝子座のコピー数の確定を行うことができるか否かを決定するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記標的遺伝子座が遺伝子またはその一部を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子またはその一部が生存運動ニューロン１（ＳＭＮ１）のエクソンを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記１つまたは複数の参照遺伝子座が、ＳＭＡＲＣＣ１およびＳＵＰＴ５Ｈからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＳＭＮ１のエクソンがエクソン７である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｂ）における前記生物学的アッセイが、前記標的遺伝子座および前記１つまたは複数の参照遺伝子座を増幅するリアルタイムＰＣＲアッセイである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記検出可能なシグナルが蛍光シグナルであり、前記標的遺伝子座または前記１つもしくは複数の参照遺伝子座の蛍光シグナルのレベルが各増幅サイクルにおいて検出される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｃ）が
（ｉ）各個別の生物学的検体における前記蛍光シグナルの所定のレベルに達する前記標的遺伝子座と前記１つまたは複数の参照遺伝子座との間のサイクル数の差（ΔＣｔｉ）を決定するステップ；
（ｉｉ）正常標的遺伝子座と前記１つまたは複数の参照遺伝子座との間の差を反映するキャリブレータ
【化３１】
2013510580.tif 000067
を得るステップ；および
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）で決定された前記サイクル数の差ΔＣｔｉを前記キャリブレータ
【化３２】
2013510580.tif 000068
に対して正規化することによって各個別の生物学的検体における前記標的遺伝子座のコピー数の推定値を決定するステップ
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｉ）が、前記蛍光シグナルの前記所定のレベルに達する前記標的遺伝子座および前記１つまたは複数の参照遺伝子座のそれぞれのサイクル数（Ｃｔｉ）を最初に測定するステップを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記キャリブレータ
【化３３】
2013510580.tif 000069
が、前記複数の生物学的検体における前記標的遺伝子座と前記１つまたは複数の参照遺伝子座との間の前記ΔＣｔｉの刈り込み平均により定義される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
各個別の生物学的検体における前記標的遺伝子座の前記コピー数の推定値を線形目盛上で決定する、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
各個別の生物学的検体における前記標的遺伝子座の前記コピー数の推定値を対数目盛上で決定する、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的遺伝子座の前記コピー数の推定値の質を、前記１つまたは複数の参照遺伝子座について得られたデータの質に基づいて評価する、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記統計的信頼度を、測定の信頼度および／または確定の信頼度を決定することにより評価する、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ｂ）で実施する前記生物学的アッセイを反復する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記コピー数の確定の前記統計的信頼度を、反復生物学的アッセイの測定の信頼度および前記複数のコピー数の推定値に基づく確定の信頼度の計算により決定する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｄ）が、前記確定の信頼度が所定の閾値より低い場合に前記標的遺伝子座の前記コピー数の確定を行うことができないことを決定するステップを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
標的遺伝子の異常なコピー数に関連する疾患またはそのキャリアを検出する方法であって、
（ａ）対象の個体から得られた少なくとも１つの生物学的検体を含む複数の生物学的検体を提供するステップ；
（ｂ）多数の反復生物学的アッセイを前記複数の生物学的検体のそれぞれについて実施して、前記標的遺伝子および既知のコピー数を有する１つまたは複数の参照遺伝子を分析するステップであって、前記多数の反復生物学的アッセイのそれぞれにより、前記標的遺伝子および前記１つまたは複数の参照遺伝子の検出可能なシグナルのレベルがそれらのそれぞれのコピー数と相関するような前記検出可能なシグナルが得られる、ステップ；
（ｃ）前記１つまたは複数の参照遺伝子に対して正規化した前記標的遺伝子のコピー数の推定値を決定するステップ；ならびに
（ｄ）前記コピー数の推定値の質および／または対象の前記個体のコピー数の確定の統計的信頼度を評価し、それにより、前記個体における前記標的遺伝子座のコピー数の確定を行うことができるか否かを決定するステップ
を含む方法。
【請求項１９】
前記個体が前記疾患を有するもしくはその危険性があるか否か、または前記個体が前記疾患のキャリアであるか否かを決定するステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記疾患が脊髄性筋萎縮（ＳＭＡ）である、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的遺伝子が生存運動ニューロン１（ＳＭＮ１）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ｂ）で実施する前記生物学的アッセイがリアルタイムＰＣＲアッセイである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ｂ）が、ＳＭＮ１のエクソン７の少なくとも一部を増幅するリアルタイムＰＣＲアッセイを実施するステップを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記検出可能なシグナルが蛍光シグナルであり、前記標的遺伝子または前記１つもしくは複数の参照遺伝子の前記蛍光シグナルのレベルを各増幅サイクルにおいて検出する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（ｃ）が
（ｉ）各個別の反復アッセイにおける前記蛍光シグナルの所定のレベルに達する前記標的遺伝子と前記１つまたは複数の参照遺伝子との間のサイクル数の差（ΔＣｔｉ）を決定するステップ；
（ｉｉ）正常標的遺伝子と前記１つまたは複数の参照遺伝子との間のバックグラウンドの差を反映するキャリブレータ
【化３４】
2013510580.tif 000070
を得るステップ；および
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）で決定された前記サイクル数の差ΔＣｔｉを前記キャリブレータ
【化３５】
2013510580.tif 000071
に対して正規化することによって各個別の反復アッセイに基づくコピー数の推定値を得るステップ
を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
各個別の反復アッセイに基づく前記標的遺伝子の前記コピー数の推定値を線形目盛上で決定する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
各個別の反復アッセイに基づく前記標的遺伝子の前記コピー数の推定値を対数目盛上で決定する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記コピー数の推定値の質を評価するステップが、前記１つまたは複数の参照遺伝子について得られたサイクル数の測定およびその増幅曲線の勾配に基づいて品質管理メトリクスを得るステップを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記コピー数の推定値の質を評価するステップが、前記多数の反復生物学的アッセイ間の変動係数を求めるステップを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項３０】
前記コピー数の確定の前記統計的信頼度を評価するステップが、測定の信頼度および／または確定の信頼度を決定するステップを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項３１】
前記コピー数の確定の前記統計的信頼度を、前記多数の反復生物学的アッセイの測定の信頼度および複数のコピー数の推定値に基づく確定の信頼度の計算により決定する、請求項１８に記載の方法。
【請求項３２】
前記測定の信頼度を、前記複数の反復アッセイにわたる前記コピー数の推定値の平均値および所定のコピー数の限界内に適合する前記平均値の標準誤差により定義される前記コピー数の推定値の周りの最大正規信頼区間として決定する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ステップ（ｄ）が、前記測定の信頼度が所定の信頼度閾値を超えない場合に前記コピー数の確定を行うことができないことを決定するステップを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記確定の信頼度が、隣接コピー数分布からのものである前記コピー数の推定値のｔ検定のｐ値を決定する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
ステップ（ｄ）が、前記確定の信頼度が所定の信頼度閾値より低い場合に前記コピー数の確定を行うことができないことを決定するステップを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記標的遺伝子の所定のコピー数を有する１つまたは複数の対照試料を並行して分析するステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項３７】
前記生物学的アッセイをマルチウェルプレートで実施する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記１つまたは複数の対照試料の品質管理および統計分析に基づいてプレート品質管理メトリクスを決定するステップをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記１つまたは複数の対照試料のいずれかが前記品質管理もしくは統計的信頼度評価の１つに不合格である場合、またはいずれかの個別の対照試料の推定値が前記所定のコピー数に等しくない場合には、前記プレートは不合格である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
対象の前記個体から得られる前記少なくとも１つの生物学的検体が、細胞、組織、全血、血漿、血清、尿、便、唾液、臍帯血、絨毛膜絨毛試料、絨毛膜絨毛試料培養物、羊水、羊水培養物または経頸部洗浄液からの核酸を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項４１】
対象の前記個体から得られる前記少なくとも１つの生物学的検体が出生前試料である、請求項１８に記載の方法。
【請求項４２】
標的遺伝子座のコピー数を分析するためのシステムであって、
ａ）複数の生物学的検体を受容するための手段であって、各個別の生物学的検体が標的遺伝子座および既知のコピー数を有する１つまたは複数の参照遺伝子座を含む、手段；
ｂ）複数の生物学的アッセイを実施するための手段であって、各個別の生物学的アッセイにより各個別の生物学的検体における前記標的遺伝子座および前記１つまたは複数の参照遺伝子座を分析し、前記標的遺伝子座および前記１つまたは複数の参照遺伝子座の検出可能なシグナルのレベルがそれらのそれぞれのコピー数と相関するような検出可能なシグナルが得られる、手段；
ｃ）各個別の生物学的検体からの前記検出可能なシグナルを検出し、前記検出可能なシグナルのレベルを測定するように構成された測定モジュール；
ｄ）前記測定モジュールからのシグナル情報を保存するように構成された記憶装置；
ｅ）（ｉ）前記記憶装置に保存された前記シグナル情報に基づいて前記１つまたは複数の参照遺伝子座に対して正規化した前記標的遺伝子座のコピー数の推定値を計算し、（ｉｉ）前記コピー数の推定値の質および／または前記コピー数の確定の統計的信頼度を決定するように適合された計算モジュール；ならびに
ｆ）使用者のための前記計算およびデータ分析結果に一部基づき、前記標的遺伝子座のコピー数の確定および／または品質管理もしくは統計的信頼度分析のいずれかが失敗であるか否かを示すシグナルを含む内容を表示するためのディスプレイモジュール
を含むシステム。
【請求項４３】
前記生物学的アッセイがリアルタイムＰＣＲアッセイである、請求項４２に記載のシステム。
【請求項４４】
前記生物学的アッセイがアレイに基づく比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）である、請求項４２に記載のシステム。
【請求項４５】
前記生物学的アッセイが高スループット配列決定法である、請求項４２に記載のシステム。
【請求項４６】
前記測定モジュールが、各増幅サイクルにおける前記検出可能なシグナルのレベルを測定するように構成されており、前記検出可能なシグナルが蛍光シグナルである、請求項４３に記載のシステム。
【請求項４７】
前記計算モジュールが、以下：
（ｉ）各個別の検体における前記蛍光シグナルの所定のレベルに達する前記標的遺伝子座と前記１つまたは複数の参照遺伝子座との間のサイクル数の差（ΔＣｔｉ）を決定するステップ；
（ｉｉ）正常標的遺伝子座と前記１つまたは複数の参照遺伝子座との間のバックグラウンド差を反映するキャリブレータ
【化３６】
2013510580.tif 000072
を得るステップ；および
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）で測定された前記サイクル数の差ΔＣｔｉを前記キャリブレータ
【化３７】
2013510580.tif 000073
に対して正規化することによって各個別の生物学的検体における前記標的遺伝子座のコピー数の推定値を決定するステップ
に従って、前記標的遺伝子座のコピー数の推定値を計算するように適合されている、請求項４５または４６に記載のシステム。
【請求項４８】
前記計算モジュールが、前記１つまたは複数の参照遺伝子について得られたサイクル数の測定およびその増幅曲線の勾配に基づいて、品質管理メトリクスを少なくとも得ることにより前記コピー数の推定値の質を決定するように適合されている、請求項４３に記載のシステム。
【請求項４９】
前記計算モジュールが、試料の変動係数を少なくとも決定することにより前記コピー数の推定値の質を決定するように適合されている、請求項４３に記載のシステム。
【請求項５０】
前記計算モジュールが、測定の信頼度を少なくとも決定し、決定された前記測定の信頼度を所定の閾値限界と比較することにより前記コピー数の確定の統計的信頼度を決定するように適合されている、請求項４３に記載のシステム。
【請求項５１】
前記計算モジュールが、確定の信頼度を少なくとも決定し、決定された前記確定の信頼度を所定の閾値限界と比較することにより前記コピー数の確定の統計的信頼度を決定するように適合されている、請求項４３に記載のシステム。
【請求項５２】
前記計算モジュールが、任意の対照試料が不合格であるか否かを決定するようにさらに適合されている、請求項４３に記載のシステム。
【請求項５３】
前記標的遺伝子座が生存運動ニューロン１（ＳＭＮ１）のエクソンを含む、請求項４２に記載のシステム。
【請求項５４】
コンピュータ上で方法を実施するための計算モジュールおよびディスプレイモジュールを含むソフトウエアモジュールを規定するための記録されたコンピュータ可読の命令を有するコンピュータ可読媒体であって、前記方法が、
ａ）前記計算モジュールにより、（ｉ）記憶装置に保存されたリアルタイムＰＣＲデータに基づく１つまたは複数の参照遺伝子座に対して正規化した標的遺伝子座のコピー数の推定値ならびに（ｉｉ）前記コピー数の推定値の質および／または前記コピー数の確定の統計的信頼度を計算するステップ；ならびに
ｂ）使用者のための前記計算およびデータ分析結果に一部基づき、前記標的遺伝子座のコピー数の確定および／または品質管理もしくは統計的信頼度分析のいずれかが失敗であるか否かを示すシグナルを含む内容を表示するステップ
を含む、コンピュータ可読媒体。
【請求項５５】
前記標的遺伝子座がＳＭＮ１のエクソン７またはその一部を含む、請求項５４に記載のコンピュータ可読媒体。
【請求項５６】
脊髄性筋萎縮（ＳＭＡ）またはそのキャリアの診断のためのキットであって、
（ａ）ＳＭＮ１のエクソン７またはその一部を増幅するための１つもしくは複数の試薬；
（ｂ）既知のコピー数を有する１つもしくは複数の参照遺伝子座を増幅するための１つもしくは複数の試薬；および
（ｃ）請求項５５に記載のコンピュータ可読媒体
を含むキット。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2013510580000001.app
【国際調査報告】
2013510580.tif 000074
2013510580.tif 000075