(57)【要約】  本発明は、血清代替処方物、ならびに共役リノール酸およびエイコサペンタエン酸、アクチビンＡおよび／またはステアリン酸を含んでなる、幹細胞の誘導、維持および分化に好適な培養培地に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
共役リノール酸およびエイコサペンタエン酸からなる群から選択される少なくとも１種の脂肪酸を含んでなる、ゼノフリー血清代替物。
【請求項２】
アクチビンＡをさらに含んでなる、請求項１に記載の血清代替物。
【請求項３】
レチノールをさらに含んでなる、請求項１または２に記載の血清代替物。
【請求項４】
ステアリン酸をさらに含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の血清代替物。
【請求項５】
共役リノール酸（ＣＬＡ）の濃度が、前記血清代替物を添加した基本培地である最終培養培地で約０．５ｍｇ／ｌ〜約５ｍｇ／ｌのＣＬＡを含んでなるものであり、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）の濃度が、該最終培養培地で約１ｍｇ／ｌ〜約１０ｍｇ／ｌのＥＰＡを含んでなるものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の血清代替物。
【請求項６】
アクチビンＡの濃度が、前記血清代替物を添加した基本培地である最終培養培地で約０．００１ｍｇ／ｌ〜約０．０２ｍｇ／ｌのアクチビンＡを含んでなるものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の血清代替物。
【請求項７】
レチノールの濃度が、前記血清代替物を添加した基本培地である最終培養培地で約０．２５ｍｇ／ｌ〜約１．０ｍｇ／ｌのレチノールを含んでなるものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の血清代替物。
【請求項８】
ステアリン酸の濃度が、前記血清代替物を添加した基本培地である最終培養培地で約０．５ｍｇ／ｌ〜約５ｍｇ／ｌのステアリン酸を含んでなるものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の血清代替物。
【請求項９】
基本培地と、請求項１〜８のいずれか一項に記載の血清代替物とを含んでなる、ゼノフリー細胞培養培地。
【請求項１０】
幹細胞の維持、増殖または分化のための、請求項９に記載の細胞培養培地の使用。
【請求項１１】
幹細胞の誘導または単離のための、請求項９に記載の細胞培養培地の使用。
【請求項１２】
新規幹細胞株をin vitroで作出するための方法であって、
ａ）望ましい起源の単離された細胞を供給すること、
ｂ）請求項９に記載のゼノフリー培地と該細胞を接触させること、および
ｃ）幹細胞培養に好適な条件下で該細胞を培養すること
を含んでなる、方法。
【請求項１３】
前記単離された細胞が胚起源、成体体細胞起源または間葉起源のものである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
幹細胞を培養するための方法であって、
ａ）請求項９に記載のゼノフリー培地と該幹細胞を接触させること、および
ｂ）幹細胞培養に好適な条件下で該細胞を培養すること
を含んでなる、方法。
【請求項１５】
前記培養がフィーダー細胞層上で行われる、請求項１２または請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
幹細胞を分化させるための方法であって、
ａ）分化誘導剤を添加した請求項９に記載のゼノフリー培地と該幹細胞を接触させること、および
ｂ）幹細胞の分化に好適な条件下で該細胞を培養すること
を含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト胚性幹細胞などの幹細胞の誘導、維持および分化において使用するためのゼノフリー（ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ）処方物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、ヒトの体のあらゆる細胞種に分化する可能性がある多能性細胞である。ヒトＥＳＣは、培養下で無限増殖が可能であり、そのため欠損ヒト組織または欠陥ヒト組織の置換のために細胞および組織を供給することが可能であることから、治療上極めて興味深いものである。将来、ヒトＥＳＣは、治療目的で増殖され、ヒトの体に移植することができる特定の細胞種に分化するように向けられ、または創薬および毒性学の研究において細胞モデルとして使用されると大いに期待されている。
【０００３】
胚性幹細胞は、本来の細胞運命をたどり自発的に分化する傾向があることから、培養下で維持することが難しい。ほとんどの培養条件ではある程度の求められていない分化が起こる。幹細胞は、多くの内因子および外因子（増殖因子、細胞外マトリックス分子および成分、環境的ストレッサーならびに直接的細胞間相互作用を含む）の結果として分化する。長期増殖能、長期培養後の多能性発達可能性および核型安定性は、幹細胞培養物の有用性に関して重要な特徴である。
【０００４】
ｈＥＳＣの未分化段階は、細胞の形態学的特徴を判別することによってモニタリングすることができる。未分化ｈＥＳＣは、特徴的な形態を有し、非常に小さい密集した細胞である。分化した細胞が多少、ｈＥＳＣコロニーの辺縁部に通常現われるが、最適な培養方法により、分化した細胞を最小限の量にする増殖支援を受けられる。転写因子Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇならびに細胞表面マーカーＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ−３／４などのｈＥＳＣの未分化段階の状況を追跡するために使用されるいくつかの生化学的マーカーがある。これらのマーカーは、ｈＥＳＣがいずれかの細胞系統に分化し始めると消失する。
【０００５】
ｈＥＳＣを作出し、培養するための基本技術は記載されている。しかしながら、ｈＥＳＣの培養に現在用いられている手法の多くには限界と欠点がある。胚性幹細胞は、一般には、培養中に所望の増殖を可能にする動物血清（とりわけ、ウシ胎児血清）または他の動物由来製品を含有する培養培地中で誘導され増殖されている。ｈＥＳＣ培養培地中に動物由来製品が存在することにはいくつかの問題がある。第一に、動物由来製品は、レシピエントにおいて免疫応答を引き起こし、そのため移植すると拒絶に至らせる毒性タンパク質または免疫原を含む可能性がある(Martin et al., Nat Med. 2005 Feb;11(2):228-32)。第二に、動物製品の使用により、細胞療法や他の臨床的応用において深刻な健康上の危険性を及ぼし得る動物病原体（ウイルス、マイコプラズマおよびプリオンなど）の混入の危険性が高まる(Healy et al., Adv Drug Deliv Rev. 2005 Dec 12;57(13):1981-8)。実際には、政府機関が、そのような病原体を含む可能性がある動物由来製品を含有する細胞培養培地の使用を規制し、抑制し、禁止さえすることも増えてきている。第三に、細胞培養物中の不確定成分が、例えば、創薬および毒性学の研究における、細胞モデル実験の再現性を損なわせる。
【０００６】
血清または動物抽出物の使用についての欠点を克服するために、複数の血清フリー培地が開発された。Price et al．は、ＵＳ特許公報第２００２／００７６７４７号明細書において、ｈＥＳＣ培養によく使用される血清代替物、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）ＳＲ培地(Invitrogen, Carlsbad, CA)を開示している。しかしながら、この処方物は、ウシ血清アルブミンなどの動物由来製品を含有し、それゆえ、異種由来成分を全く含まないわけではない。ゼノフリーの血清代替物および培地は現在いくつかのものが入手可能である（Ｘ−Ｖｉｖｏ  １０、Ｘ−Ｖｉｖｏ  ２０、ＳＳＳ、Ｌｉｐｕｍｉｎ、Ｓｅｒｅｘ、Ｐｌａｓｍａｎａｔｅ、ＳＲ３）。これらの血清代替物は、多くの場合、単一細胞型の培養を支援するために特異的に処方されている。さらに、Thomson et al．は、ＵＳ特許公報第２００６／００８４１６８号明細書において、培養下でのＥＳＣの増殖を支援するとされる、血清フリーかつゼノフリー細胞培養培地を開示している。
【０００７】
残念ながら、Rajala et al.によりHum. Reprod., 2007, 22(5):1231-1238において、上述の総て処方物がｈＥＳＣの培養を可能にするのは新しい培地への適応期中の数代の継代の間だけであり、その後の継代では厳密な分化、続いての迅速な分化は起こらないことが示されている。
【０００８】
国際特許公報第ＷＯ２００８／１４８９３８号には、レチノールを含んでなるゼノフリー血清代替物と、ＥＳＣの維持および誘導用の該血清代替物を含んでなる培養培地が開示されている。しかしながら、多能性幹細胞および多分化性幹細胞を培養するための改良されたゼノフリー処方物の必要性がまだある。
【０００９】
ｈＥＳＣについてはいくつかのフィーダーフリー培養方法が開発されている。これらのフィーダーフリー方法の多くは動物由来成分を利用する。加えて、これらの方法には再現性が不十分であるという欠点があり、現在のところ、安定した正常核型を示す未分化ｈＥＳＣの長期維持はできない。また、酵素による継代を行うフィーダーフリー培養はｈＥＳＣについての要求が非常に厳しいためそれらにより異常が起こりやすくなる。
【００１０】
現在知られているｈＥＳＣ用培養培地に関連するこれらの問題から、多能性および正常な細胞核型を維持しながら実質的な分化を起こさずにｈＥＳＣの強い増殖を再現性よく長期間支援し、かつ、臨床上の安全性および有効性ならびに創薬および毒性学の検証に用いられるin vitro細胞モデルの標準化法に適用される予想規制ガイドラインに適合する、確定したゼノフリー培養培地の必要性が高い。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、臨床用幹細胞の誘導、維持および分化のための手段および方法を提供する。より具体的には、本発明は、血清代替物、該血清代替物を含んでなる最終培養培地、およびそれらの使用に関する。
【００１２】
本発明の目的は、共役リノール酸およびエイコサペンタエン酸からなる群から選択される少なくとも１種の脂肪酸を含んでなるゼノフリー血清代替物を提供することである。いくつかの実施形態では、共役リノール酸（ＣＬＡ）の濃度は、該血清代替物を添加した基本培地である最終培養培地で約０．５ｍｇ／ｌ〜約５ｍｇ／ｌのＣＬＡを含んでなるものであり、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）の濃度は、最終培養培地で約１ｍｇ／ｌ〜約１０ｍｇ／ｌのＥＰＡを含んでなるものである。
【００１３】
いくつかの実施形態では、血清代替物は、アクチビンＡおよび／またはレチノールをさらに含んでなり得る。いくつかの他の実施形態では、アクチビンＡの濃度は、最終培養培地で約０．００１ｍｇ／ｌ〜約０．０２ｍｇ／ｌのアクチビンＡを含んでなるものであり、かつ／またはレチノールの濃度は、最終培養培地で約０．２５ｍｇ／ｌ〜約１．０ｍｇ／ｌのレチノールを含んでなるものである。
【００１４】
いくつかのさらに他の実施形態では、血清代替物は、ステアリン酸をさらに含んでなり得る。いくつかのさらなる実施形態では、ステアリン酸の濃度は、最終培養培地で約０．５ｍｇ／ｌ〜約５ｍｇ／ｌのステアリン酸を含んでなるものである。
【００１５】
本発明のもう１つの目的は、基本培地および本発明の実施形態による血清代替物を含んでなるゼノフリー細胞培養培地を提供することである。
【００１６】
本発明のさらにもう１つの目的は、幹細胞の維持、増殖または分化のための本血清代替物または細胞培養培地の使用に関する。
【００１７】
さらに、本発明の目的は、幹細胞の誘導または単離のための本血清代替物または細胞培養培地の使用に関する。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、新規幹細胞株をin vitroで作出するための方法を提供することである。該方法は、ａ）望ましい起源の単離された細胞を供給すること、ｂ）本ゼノフリー培養培地と該細胞を接触させること、およびｃ）幹細胞培養に好適な条件下で該細胞を培養することを含んでなる。いくつかの実施形態では、その培養はフィーダー細胞層上で行われ得る。いくつかの実施形態では、該単離された細胞は胚起源、成体体細胞起源または間葉起源のものである。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、幹細胞を培養するための方法を提供することである。該方法は、ａ）本ゼノフリー培地と該幹細胞を接触させること、およびｂ）幹細胞培養に好適な条件下で該細胞を培養することを含んでなる。いくつかの実施形態では、その培養はフィーダー細胞層上で行われ得る。本培養培地は、in vitroでの何代もの継代にわたって実質的に未分化状態での幹細胞の維持および増殖を支援することが可能である。加えて、本発明による培養培地中で培養された幹細胞は、実質的に未分化であり、多能性または多分化能を保有し、ゲノムの完全性を維持する。
【００２０】
さらに、本発明の目的は、幹細胞を分化させるための方法を提供することである。該方法は、ａ）分化誘導剤（増殖因子など）または分化用細胞（例えば、ＥＮＤ２細胞）を添加した本ゼノフリー培地と該幹細胞を接触させること、およびｂ）幹細胞の分化に好適な条件下で該細胞を培養することを含んでなる。
【００２１】
本発明の他の目的、実施形態、詳細および利点は、次の図面、詳細な説明および実施例から明らかになるであろう。
【００２２】
以下において、添付の図面を参照し好ましい実施形態を用いて本発明をより詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１Ａ〜図１Ｄは、第５継代についての、本発明による培養培地中で異なる容量オスモル濃度で培養したｈＥＳＣ株ＨＳ４０１の光学顕微鏡画像である：２６０ｍＯｓｍ（図１Ａ）、２９０ｍＯｓｍ（図１Ｂ）、３２０ｍＯｓｍ（図１Ｃ）および３５０ｍＯｓｍ（図１Ｄ）。スケールバー５００μｍ。
【図２】図２Ａ〜図２Ｂは、本発明による培養培地中、かつ、脂質および脂質誘導体の存在下で培養したｈＥＳＣの形態および分化段階を示す図である。ＵＤ、ＰＤおよびＤＩＦＦは、それぞれ、未分化のｈＥＳＣコロニー、一部分化したｈＥＳＣコロニーおよび分化したｈＥＳＣコロニーを表す。図２Ａ）種々の脂質および脂質誘導体を添加した本発明による培養培地中で培養したＨＳ４０１細胞株。図２Ｂ）種々の脂質および脂質誘導体を添加した対照ｈＥＳ培地中で培養したＨＳ４０１細胞株。
【図３】図３Ａ〜図３Ｆは、レチノールに応じた幹細胞マーカーの増殖および発現の増加を示す。図３Ａ）第５継代についての、レチノールを含まない本発明による培養培地中で培養した３日目のｈＥＳＣ（Ｒｅｇｅａ  ０７／０４６）の明視野顕微鏡画像。図３Ｂ）第５継代についての、２．０μＭレチノールを含有する本発明による培養培地中で培養した３日目のｈＥＳＣ（Ｒｅｇｅａ  ０７／０４６）の明視野顕微鏡画像。レチノールの存在下では、レチノールなしで培養したコロニーと比べて、コロニーのサイズがより大きい。スケールバー５００μｍ。図３Ｃ〜Ｄ）第１２継代についての、２．０μＭレチノールを含有する本発明による培養培地中で培養したｈＥＳＣ（ＨＳ４０１）の蛍光顕微鏡画像、ＮａｎｏｇおよびＴＲＡ−１−８１の陽性発現を示している。挿入画像はＤＡＰＩ染色を示す。スケールバー２００μｍ。図３Ｅ）第１０継代についての、本発明による培養培地中、０．５μＭ、２．０μＭおよび３．５μＭのレチノールの不在下および存在下で培養したｈＥＳＣ株Ｒｅｇｅａ  ０７／０４６の細胞増殖解析。図３Ｆ）第１０継代についての、本発明による培養培地中、０．５μＭ、２．０μＭおよび３．５μＭのレチノールの不在下および存在下で培養したｈＥＳＣ株Ｒｅｇｅａ  ０７／０４６におけるＯｃｔ４、ＧＤＦ３、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＴＤＧＦ１およびＮａｎｏｇの発現についての定量ＲＴ−ＰＣＲ解析。
【図４】図４Ａ〜図４Ｃは、アクチビンＡに応じた増殖および幹細胞マーカーの発現の増加を示す。図４Ａ）第１０継代についての、本発明による培養培地中、５ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡの不在下および存在下で、ならびにｈＥＳ対照培地中で培養したｈＥＳＣ株Ｒｅｇｅａ  ０７／０４６の細胞増殖解析。図４Ｂ）第１０継代についての、本発明による培養培地中、５ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡの不在下および存在下で、ならびにｈＥＳ対照培地中で培養したｈＥＳＣ株Ｒｅｇｅａ  ０７／０４６におけるＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、ＧＤＦ３、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＧＡＢＲＢ３およびＧＤＦ３の発現についての定量ＲＴ−ＰＣＲ解析。図４Ｃ）第１０継代についての、本発明による培養培地中、５ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡの不在下および存在下で、ならびにｈＥＳ対照培地中で培養したｈＥＳＣ株Ｒｅｇｅａ  ０７／０４６の幹細胞マーカーＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０についてのＦＡＣＳ解析。
【図５】図５Ａ〜図５Ｊは、本発明による培養培地中で誘導し長期間培養したｈＥＳＣ株の特性評価を示す。図５Ａ）ｈＥＳＣ株、第３６継代のＲｅｇｅａ  ０７／０４６、第２５継代のＲｅｇｅａ  ０８／０１３、および第７１継代のＲｅｇｅａ  ０６／０４０の正常核型を示す、ギムザバンドによるカリオグラム。図５Ｂ）７日目のｈＥＳＣ株のＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−８１についての発現を示す定量ＦＡＣＳ解析。第４５継代のＲｅｇｅａ  ０７／０４６、第４１継代のＲｅｇｅａ  ０８／０１３、および第２６継代のＲｅｇｅａ  ０６／０４０。図５Ｃ）ｈＥＳＣ株第２９継代のＲｅｇｅａ  ０６／０４０、第５３継代のＲｅｇｅａ  ０７／０４６、および第４１継代のＲｅｇｅａ  ０８／０１３の細胞増殖解析。図５Ｄ）ｈＥＳＣ株第５２継代のＲｅｇｅａ  ０７／０４６、第４５継代のＲｅｇｅａ  ０８／０１３および第３３継代のＲｅｇｅａ  ０６／０４０におけるＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、ＧＡＢＲＢ３、ＧＤＦ３、ＤＮＭＴ３ＢおよびＴＤＧＦ１の発現についての定量ＲＴ−ＰＣＲ解析。図５Ｅ）第１継代の、本発明による培養培地中での凍結およびその後の融解後のｈＥＳＣ株０７／０４６（ｐ３３）１の未分化コロニー形態を示す明視野（スケールバー、５００μｍ）顕微鏡画像。図５Ｆ）ＡＦＰおよびＳＯＸ−１７（内胚葉マーカー）、α−心臓アクチンおよびＴ（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ；中胚葉マーカー）、ＳＯＸ−１およびＰＡＸ６（外胚葉マーカー）、ならびにハウスキーピング対照遺伝子としてのβ−アクチンの転写物を示しているin vitroで誘導したＥＢのＲＴ−ＰＣＲ解析。レーン１、５０−ｂｐ  ＤＮＡラダー。第４２継代のＲｅｇｅａ  ０７／０４６、第３５継代のＲｅｇｅａ  ０８／０１３、および第１０１継代のＲｅｇｅａ  ０６／０４０。図５Ｇ）ｈＥＳＣ株Ｒｅｇｅａ  ０８／０１３から分化した心筋細胞は心臓トロポニンＴについて陽性染色を示す。スケールバーは１００μｍである。図５Ｈ）ｈＥＳＣ株Ｒｅｇｅａ  ０８／０１３から分化した心筋細胞は心室ミオシン重鎖について陽性染色を示す。スケールバーは１００μｍである。図５Ｉ）本発明による培養培地中で培養したｈＥＳＣ株Ｒｅｇｅａ  ０８／０１３から誘導したニューロスフェアのＲＴ−ＰＣＲ解析では、神経前駆体マーカーであるＭｕｓａｓｈｉ、ＮｅｓｔｉｎおよびＰＡＸ６；ニューロンマーカーであるＭＡＰ−２、ＮＦ６８およびＯＴＸ２；ならびに星状細胞マーカーであるＧＦＡＰの発現が示された。多能性マーカーであるＯｃｔ４およびＮａｎｏｇの発現もｅｎｄｏ−ＡＦＰまたは中胚葉マーカーであるＴ／Ｂｒａｃｈｙｕｒｙの発現も検出されなかった。図５Ｊ）プレーティングしたニューロスフェアから移動する細胞の大部分はニューロンマーカーであるＭＡＰ−２について陽性染色を示し、星状細胞マーカーであるＧＦＡＰについて陽性であった細胞はほとんどなかった。スケールバーは１００μｍである。
【図６】図６Ａ〜図６Ｃは、本発明による培養培地中で培養したヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の特性評価を示す。図６Ａ）ｈＥＳ培地中および本発明による培養培地中で培養したヒトｉＰＳ細胞株のＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−８１についての発現を示す定量ＦＡＣＳ解析。ｈＥＳ培地中で培養した細胞サンプルは６日齢のコロニーのものであり、本発明による培養培地中で培養したｉＰＳ細胞株Ａからの細胞サンプルは７日齢のコロニーのものであり、ｉＰＳ細胞株Ｂからのサンプルは８日齢のコロニーのものである。ｈＥＳ培地での第１５継代の細胞株Ａ、本発明による培養培地での第１４継代の細胞株Ａ、およびｈＥＳ培地での第１６継代のｉＰＳ細胞株Ｂ、本発明による培養培地での第７継代のｉＰＳ細胞株Ｂ。図６Ｂ）ｈＥＳ培地での第１０継代のｉＰＳ細胞株Ａ、本発明による培養培地での第７継代のｉＰＳ細胞株Ａ、およびｈＥＳ培地での第１１継代のｉＰＳ細胞株Ｂ、本発明による培養培地での第８継代のｉＰＳ細胞株Ｂにおける６日目のコロニーでの、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、ＧＡＢＲＢ３、ＧＤＦ３、ＤＮＭＴ３ＢおよびＴＤＧＦ１の発現についての定量ＲＴ−ＰＣＲ解析。図６Ｃ）ＡＦＰおよびＳＯＸ−１７（内胚葉マーカー）、α−心臓アクチンおよびＴ（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ；中胚葉マーカー）、ＳＯＸ−１およびＰＡＸ６（外胚葉マーカー）、ならびにハウスキーピング対照遺伝子としてのβ−アクチンの転写物を示しているin vitroで誘導したＥＢのＲＴ−ＰＣＲ解析。レーン１、５０−ｂｐ  ＤＮＡラダー。第１０継代の両方の細胞株。
【図７】図７Ａ〜図７Ｅは、本発明による培養培地中で培養したヒト脂肪幹細胞（ＡＳＣ）の特性評価を示す。図７Ａ）８日目の、ヒト血清（ＨＳ）含有培地中で培養したＡＳＣの形態。（スケールバー５００μｍ）。図７Ｂ）８日目の、本発明による培養培地中で培養したＡＳＣの形態。（スケールバー５００μｍ）。図７Ｃ）１１日目の、ＨＳ培地中で培養したＡＳＣの形態。（スケールバー５００μｍ）。図７Ｄ）１１日目の、本発明による培養培地中で培養したＡＳＣの形態。（スケールバー５００μｍ）。図７Ｅ）ＷＳＴ−１増殖アッセイ。１日、４日、７日および１１日の時点にＨＳ培地および本発明による培養培地においてＡＳＣの増殖を調べ解析した。図のデータは平均±ＳＤとして示している。＊ｐ＜０．０５（ｎ＝７ドナー、４反復ウェル）。
【発明の具体的説明】
【００２４】
本発明は、臨床用幹細胞の誘導、維持および分化のための手段および方法に関する。より具体的には、本発明は、ゼノフリー血清代替処方物、および該血清代替物を含んでなる培養培地に関する。さらに、本発明は、幹細胞の誘導、培養、維持および分化のための方法に関する。
【００２５】
よって、本発明は、幹細胞のin vitroでの誘導、維持、増殖または分化に用いる任意の好適な基本培地を補うために使用し得る、確定したゼノフリー血清代替処方物または組成物を提供する。用途に応じて、該血清代替物は、血清フリー基本培地または血清含有基本培地、またはそれらの任意の組合せのいずれかを補うために使用し得る。ゼノフリー基本培地に本ゼノフリー血清代替物が添加されると、最終培養培地もゼノフリーである。
【００２６】
本明細書において、幹細胞という用語は、多能性幹細胞および多分化性幹細胞の両方を包含する。胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、様々な種類の細胞種に分化可能な多能性細胞である。真の胚性幹細胞株（ｉ）は、未分化状態でin vitro無限増殖が可能であり；（ｉｉ）長期培養後でも３つの胚性胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）系総てに分化可能であり；（ｉｉｉ）長期培養中正常核型を維持する。それゆえ、胚性幹細胞は多能性といわれる。
【００２７】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、多能性幹細胞のもう１つの例である。ｉＰＳ細胞は、分化した細胞から、一般的には成体体細胞（繊維芽細胞など）から発生上の初期化によって生成される。そのような細胞は、例えば、ＷＯ２００８／１５１０５８号およびＵＳ２００８／０７６１７６号明細書において記載されている。
【００２８】
多分化性幹細胞としては、限定されるものではないが、造血幹細胞および間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が挙げられ、これらは様々な細胞種に分化可能な成体幹細胞である。ＭＳＣは、骨髄および脂肪組織を含む異なる供給源から単離され得る。脂肪組織から誘導されたＭＳＣは、脂肪幹細胞（ＡＳＣ）と呼ばれている。
【００２９】
当技術分野では胚性幹細胞および成体幹細胞の両方の情報が充実している。本発明に従って培養されたｈＥＳＣを含む幹細胞は、任意の適当な技術（限定されるものではないが、免疫手術が挙げられる）を用いて任意の好適な供給源から得ることができる。例えば、ヒト胚性幹細胞を単離し、増殖させるための手法は、米国特許第６，０９０，６２２号明細書に記載されている。アカゲザルおよび他の非ヒト霊長類の胚性幹細胞を獲得するための手法は、米国特許第５，８４３，７８号明細書および国際特許公報第ＷＯ９６／２２３６２号に記載されている。加えて、アカゲザル胚性幹細胞を単離するための方法は、Thomson et al.により記載されている(1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848)。割球生検は、ドナー胚に損傷を与えずに胚性幹細胞の単離および増殖を可能にする魅力のある新技術である。幹細胞の他の獲得方法は、当技術分野では容易に入手することができる。
【００３０】
本明細書において提供する手段および方法は、任意の望ましい動物、好ましくは、霊長類（ヒト、有尾サルおよび無尾サルなど）、ならびに非霊長類哺乳類（マウス、ラット、ウマ、ヒツジ、パンダ、ヤギおよびシマウマなど）を含む哺乳類から誘導された幹細胞に適用できる。
【００３１】
ゼノフリー（ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ）という用語は、本明細書において、ヒト幹細胞を培養しようとする場合に、試薬の起源が異種供給源ではない、すなわち、非ヒト動物起源の材料を含まないということを意味する。また、ゼノフリーであるためには、例えば、ネズミ幹細胞の培養は、あらゆるマウス由来材料の不在下で行う必要がある。ヒト幹細胞の培養に好適なゼノフリー供給源には、化学合成もしくは合成製品または細菌、酵母、真菌、植物およびヒト由来の対象試薬の単離物、調製物もしくは精製物が含まれ得る。
【００３２】
血清代替物という用語は、本明細書において、最終細胞培養培地において動物血清の代わりに使用し得る処方物を意味する。従来の血清代替物は、一般には、ビタミン、アルブミン、脂質、アミノ酸、トランスフェリン、酸化防止剤、インスリンおよび微量元素を含んでなる。最終細胞培養培地は、増殖因子、非必須アミノ酸、β−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミンおよび／または抗生物質をさらに含んでなってもよく、それらは基本培地に直接加えられるかまたは血清代替物中にさらに含められる。
【００３３】
驚くべきことに、これまでに、共役リノール酸（ＣＬＡ）および／またはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）が幹細胞の未分化状態での維持において優れた結果をもたらすということが見出された。検証された様々な脂質および脂質誘導体の中で、これらの２種の脂肪酸が未分化形態の維持、未分化コロニー数の増加および幹細胞の多能性または多分化能の保持において優れていた。
【００３４】
従って、本発明による血清代替物は、共役リノール酸およびエイコサペンタエン酸からなる群から選択される少なくとも１種の脂肪酸を含んでなるゼノフリー処方物である。その血清代替物中のＣＬＡの好ましい濃度範囲は、最終培養培地が約０．５ｍｇ／ｌ〜約５ｍｇ／ｌ、より具体的には約２．５ｍｇ／ｌのＣＬＡを含んでなるものである。その血清代替物中のＥＰＡの好ましい濃度範囲は、最終培養培地が約１ｍｇ／ｌ〜約１０ｍｇ／ｌ、より具体的には約５ｍｇ／ｌのＥＰＡを含んでなるものである。従って、基本培地に２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の血清代替物を添加して最終培養培地にする実施形態では、該血清代替物は約２．５ｍｇ／ｌ〜約２５ｍｇ／ｌ、より具体的には約１２．５ｍｇ／ｌのＣＬＡおよび／または約５ｍｇ／ｌ〜約５０ｍｇ／ｌ、より具体的には２５ｍｇ／ｌのＥＰＡを含んでなる。血清代替物は、基本培地に加えられる形態により種々の割合で提供され得るため、それに応じて各成分の濃度が変化することは当業者には明らかである。
【００３５】
血清代替物への使用に二番目に最適な脂肪酸はステアリン酸である。血清代替物中のステアリン酸の好ましい濃度範囲は、最終培養培地が約０．５ｍｇ／ｌ〜約５ｍｇ／ｌ、より具体的には約２．５ｍｇ／ｌのステアリン酸を含んでなるようなものである。従って、基本培地に２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の血清代替物が添加される実施形態では、該血清代替物は、約２．５ｍｇ／ｌ〜約２５ｍｇ／ｌ、より具体的には約１２．５ｍｇ／ｌのステアリン酸を含んでなる。
【００３６】
また、驚くべきことに、アクチビンＡが、とりわけＣＬＡおよび／またはＥＰＡと組み合わせると、幹細胞増殖およびＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、ＧＤＦ３、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＧＡＢＲＢ３およびＧＤＦ３などの幹細胞マーカーの発現を促進するということも見出された。
【００３７】
従って、本発明による血清代替物は、アクチビンＡをさらに含んでなり得る。その血清代替物中のアクチビンＡの好ましい濃度範囲は、最終培養培地が約０．００１ｍｇ／ｌ〜約０．０２ｍｇ／ｌ、より具体的には約０．００５ｍｇ／ｌのアクチビンＡを含んでなるものである。よって、基本培地に２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の血清代替物が添加される実施形態では、該血清代替物は、約０．００５ｍｇ／ｌ〜約０．１ｍｇ／ｌ、より具体的には約０．０２５ｍｇ／ｌのアクチビンＡを含んでなる。
【００３８】
さらに、レチノール、すなわち、ビタミンＡが、極めて低い濃度で幹細胞の未分化増殖を支援するということも見出された。レチノールの有効濃度範囲は、ＷＯ２００８／１４８９３８に開示されているものより約１０倍低い。レチノールをＣＬＡおよび／またはＥＰＡと組み合わせて使用すると、とりわけ良好な結果が得られ、アクチビンＡの存在下でさらに良好な結果が得られる。血清代替物中のレチノールの好ましい濃度範囲は、最終培養培地が約０．２５ｍｇ／ｌ〜約１．０ｍｇ／ｌ、より具体的には約０．５７ｍｇ／ｌのレチノールを含んでなるものである。従って、基本培地に２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の血清代替物が添加される実施形態では、該血清代替物は、約１．２５ｍｇ／ｌ〜約５．０ｍｇ／ｌ、より具体的には約２．８５ｍｇ／ｌのレチノールを含んでなる。
【００３９】
【表１】
2013512667.tif 000002
【００４０】
いくつかの好ましい実施形態では、本発明による血清代替物は、アクチビンＡおよびＣＬＡおよび／またはＥＰＡを含んでなる。他の好ましい実施形態では、その血清代替物は、レチノールおよびＣＬＡおよび／またはＥＰＡを含んでなる。さらに好ましい実施形態では、その血清代替物は、アクチビンＡ、レチノールおよびＣＬＡおよび／またはＥＰＡを含んでなる。これらの成分の好ましい濃度は上に示している。これらの実施形態によるいずれの血清代替物もステアリン酸をさらに含んでなり得る。
【００４１】
さらなる実施形態では、血清代替物は、上に示した成分に加えて、脂質または脂質誘導体、ビタミン、アルブミンまたはアルブミン代替物、アミノ酸、ビタミン、トランスフェリン、トランスフェリン代替物、酸化防止剤、インスリンまたはインスリン代替物、微量元素および増殖因子からなる群から選択される、少なくとも１種の成分、好ましくはエンドトキシンフリーの成分、を含んでなる。そのような成分は、血清代替処方物中に、幹細胞の多能性と核型の両方を維持しながら実質的に未分化状態での幹細胞の増殖を支援するのに十分な濃度で存在すべきである。
【００４２】
よって、本発明による血清代替物は、少なくとも１種の他の脂質または脂質誘導体をさらに含んでなり得、そのような他の脂質または脂質誘導体としては、限定されるものではないが、リポタンパク質（超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）およびコレステロールなど）；リン脂質（ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリンおよびホスファチジルエタノールアミンなど）；脂肪酸（リノール酸、γ−リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、オレイン酸、ドコサヘキサエン酸、パルミチン酸、パルミトオレイン酸、ミリスチン酸およびそれらの誘導体（プロスタグランジンなど）など）が挙げられる。
【００４３】
本発明の様々な実施形態によれば、血清代替物は、上に示した脂質または脂質誘導体の、例えば、少なくとも２種、少なくとも３種または少なくとも４種を含んでなり得る。
【００４４】
血清代替物は、レチノールより他のビタミン（アスコルビン酸、ビオチン、塩化コリン、Ｄ−パントテン酸Ｃａ、葉酸、ｉイノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサール、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ１２、ビタミンＤ２など）をさらに含んでよい。一般には、いくつかのビタミンが基本培地に含められ、最終培地に追加のビタミン添加が行われ得る。一般には、本発明による細胞培養培地に、チアミンは約９ｍｇ／ｌの濃度で使用され、一方、アスコルビン酸は約５０μｇ／ｍｌの濃度で使用される。
【００４５】
本発明における使用に好適なアルブミン代替物には、アルブミンの代わりに使用することができ、アルブミンと本質的に同様の効果を有する任意の化合物が含まれる。本発明による血清代替物中および最終培養培地中のアルブミンまたはアルブミン代替物の好適な濃度は、当業者ならば当技術分野で周知の常法を用いて容易に決定することができる。一般には、アルブミンまたはアルブミン代替物は、最終培養培地に、約１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌの範囲、好ましくは約５ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌの範囲で使用される。一実施形態では、アルブミンは、本発明による細胞培養培地中約１０ｍｇ／ｍｌで存在する。
【００４６】
フェチュイン、α−フェトプロテインおよびそれらの任意の組合せは血清代替物においてアルブミンの代わりに使用し得る。しかしながら、それらは高価であるため、それらをアルブミンと組み合わせて使用することは実現可能であるかもしれない。１つの好ましい実施形態では、血清代替物は、約０．５ｍｇ／ｍｌのフェチュインと約０．２５ｍｇ／ｍｌのα−フェトプロテインを含んでなる。そのような実施形態では、基本培地に２０％血清代替物が添加される。一般的に、典型的な最終細胞培養培地は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌのフェチュインおよび／またはα−フェトプロテインを含んでなる。
【００４７】
本発明における使用に好適なアミノ酸としては、限定されるものではないが、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、およびそれらのＤ型および誘導体などのアミノ酸が挙げられる。アミノ酸の好適な濃度は、当業者ならば当技術分野で周知の常法を用いて容易に決定することができる。典型的な濃度範囲を表３に示す。本発明による血清代替物は、追加の非必須アミノ酸、例えば、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、およびそれらのＤ型および誘導体などを含んでよい。そのような追加の非必須アミノ酸は、血清代替物中に含めてよくまたは本発明による最終細胞培養培地に直接加えてもよい。非必須アミノ酸は、市販の混合物（Invitrogenによって提供されているＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）など）として供給され得る。一般には、本発明による最終培地中の該混合物の濃度は約１％である。
【００４８】
Ｌ−グルタミンは、安定したジペプチド型のＬ−グルタミン（例えば、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Invitrogen、２ｍＭ））として本発明による細胞培養培地に加えることが好ましい。必要に応じて、Ｌ−グルタミンは、本発明による血清代替物中に含めてよい。
【００４９】
トランスフェリンは細胞への鉄送達に関与し、体液中の遊離鉄濃度を制御し、鉄によるフリーラジカル毒性を防ぐ。本発明における使用に好適なトランスフェリン代替物には、トランスフェリンの代わりに使用することができ、トランスフェリンと本質的に同様の効果を有する任意の化合物が含まれる。そのような代替物としては、限定されるものではないが、鉄の塩およびキレート（例えば、クエン酸第二鉄キレートまたは硫酸第一鉄）が挙げられる。本発明による血清代替物中および最終培地中のトランスフェリンまたはトランスフェリン代替物の好適な濃度は、当業者ならば当技術分野で周知の常法を用いて容易に決定することができる。一般には、本発明による最終培地中のトランスフェリンまたはトランスフェリン代替物の好適な範囲は、約１μｇ／ｍｌ〜約１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは約５μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、およびより好ましくは約５μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌである。一実施形態では、トランスフェリンは、本発明による細胞培養培地中約８μｇ／ｍｌで存在する。
【００５０】
本発明における使用に好適な酸化防止剤としては、限定されるものではないが、グルタチオンおよびアスコルビン酸が挙げられる。本発明による血清代替物中および最終培地中の酸化防止剤の好適な濃度は、当業者ならば当技術分野で周知の常法を用いて容易に決定することができる。一実施形態によれば、本発明による細胞培養培地中、グルタチオンは１．５μｇ／ｍｌで存在し、アスコルビン酸は５０μｇ／ｍｌで存在する。
【００５１】
本発明における使用に好適なインスリン代替物には、インスリンの代わりに使用することができ、インスリンと本質的に同様の効果を有する任意の化合物が含まれる。本発明による血清代替物中および最終培地中のインスリンまたはインスリン代替物の好適な濃度は、当業者ならば当技術分野で周知の常法を用いて容易に決定することができる。一般には、最終培地中のインスリンの好適な範囲は、約１μｇ／ｍｌ〜約１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは約１μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、より好ましくは約５０μｇ／ｍｌ〜約１５μｇ／ｍｌである。一実施形態では、インスリンは約１０μｇ／ｍｌで存在する。
【００５２】
本発明における使用に好適な微量元素としては、限定されるものではないが、Ｍｎ２＋、Ｓｉ４＋、Ｍｏ６＋、Ｖ５＋、Ｎｉ２＋、Ｓｎ２＋、Ａｌ３＋、Ａｇ＋、Ｂａ２＋、Ｂｒ−、Ｃｄ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｒ３＋、Ｆ−、Ｇｅ４＋、Ｉ−、Ｒｂ＋、Ｚｒ４＋およびＳｅ４＋ならびにそれらの塩が挙げられる。微量元素またはそれらの塩の好適な濃度は、当業者ならば当技術分野で公知の常法を用いて容易に決定することができる。CellGro Mediatech Inc.によって提供されているＴｒａｃｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ＢおよびＴｒａｃｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  Ｃなどの市販の微量元素組成物もまた使用し得る。必要に応じて、微量元素Ｃｕ２＋および／またはＺｎ２＋は、例えば、CellGro Mediatech Inc.によって提供されている市販のＴｒａｃｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ  Ａ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎの形で含めてよい。
【００５３】
さらに、本発明者らは、塩化リチウムが胚性幹細胞の分化に有害である可能性があるということを示した。よって、特定の実施形態では、血清代替物は塩化リチウムを含まない。
【００５４】
本発明における使用に好適な増殖因子としては、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ−２）などの繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）が挙げられる。本発明による最終培地中のＦＧＦの好適な範囲は、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約２ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ、およびより好ましくは約４ｎｇ／ｍｌ〜約２０ｎｇ／ｍｌである。一実施形態では、ＦＧＦは約８ｎｇ／ｍｌで存在する。ＦＧＦを使用することが好ましいが、繊維芽細胞増殖因子受容体を活性化するように設計された特定の合成小ペプチド（例えば、組換えＤＮＡ変異体または変異株により生産されたもの）などの他の材料を、ＦＧＦの代わりに使用してもよい。増殖因子は、本発明による血清代替物中に含めてもよく、または本発明による最終細胞培養培地に別に加えてもよい。
【００５５】
また、本発明による血清代替物または培地の汚染を防止するために、抗生物質も使用することができる。好適な抗生物質またはそれらの組合せ、ならびに好適な濃度は、当業者には明らかである。しかしながら、その培地を臨床的応用のために細胞の培養に使用する場合には、抗生物質の使用を避けるほうがよいであろう。
【００５６】
さらに、β−メルカプトエタノールを、本発明による血清代替物中に含めてよく、または本発明による最終培養培地に別に加えてもよい。一般には、β−メルカプトエタノールの終濃度はその培養培地中約０．１ｍＭである。
【００５７】
本発明の明らかな実施形態では、本発明による血清代替物として供給する代わりに、上に記載した血清代替物の成分のいずれかを基本培地に直接加えて最終細胞培養培地を供給してよい。
【００５８】
本発明は、幹細胞のin vitro誘導、維持、増殖および分化用の、確定したゼノフリー培養培地をさらに提供する。該培養培地は、基本培地および本明細書に示した血清代替組成物を含んでなる。本発明における使用に好適な基本培地としては、限定されるものではないが、ＫｎｏｃｋＯｕｔ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＫＯ−ＤＭＥＭ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ  １６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２、ａ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ａＭＥＭ）、Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇ−ＭＥＭ）、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＭｅｄｉｕｍおよびＨｙＱ  ＡＤＣＦ−ＭＡｂ（ＨｙＣｌｏｎｅ）およびそれらの任意の組合せが挙げられる。１つの好ましい実施形態によれば、基本培地はＫＯ−ＤＭＥＭである。
【００５９】
「基本培地」という用語は、幹細胞の増殖支援が可能な任意の培地を指し、一般的には、標準的な無機塩、ビタミン、グルコース、緩衝系および必須アミノ酸を供給するものである。基本培地に約１ｇ／Ｌ〜約３．７ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムを添加することが好ましいことがある。好ましくは、基本培地に約２．２ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムを添加する。
【００６０】
前記血清代替物が添加される基本培地はそれ自体がゼノフリーであり得るし、またはそれに例えば血清をさらに添加し得る。
【００６１】
培養の浸透圧は、幹細胞培養物の成功および生命力に影響を及ぼす。浸透圧は、ミリオスモルで測定され、溶液中の溶解粒子の数の尺度であり、溶液により生じる浸透圧の測定値である。正常ヒト血清の浸透圧は約２９０ミリオスモルである。他の哺乳類細胞のin vitro培養用の培地では浸透圧が様々であり、３３０ミリオスモルという高い浸透圧を有する培地もいくつかある。好ましくは、本発明による培地の浸透圧は約２８０〜約３３０ミリオスモル（ｍＯｓｍｏｌ）の間である。しかしながら、その培地の浸透圧は、約２６０ミリオスモルと低い場合もあり、約３４０ミリオスモルと高い場合もある。本発明による一実施形態では、ｈＥＳＣを約３２０〜３３０ミリオスモルの浸透圧で増殖させる。
【００６２】
一実施形態によれば、脂質、アルブミン、アミノ酸、ビタミン、トランスフェリン、酸化防止剤、インスリンおよび微量元素はその血清代替物中に含められるが、一方、増殖因子、非必須アミノ酸、β−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミンおよび抗生物質は細胞培養培地に直接加えられる。１つの好ましい培養培地の最終組成物を、表２に例示する。
【００６３】
【表２】
2013512667.tif 000003
2013512667.tif 000004
【００６４】
本発明による血清代替物または培養培地は、液体または乾燥形で提供し得る。さらに、それらは、任意の好適な濃縮処方物としても提供し得る。例として、基本培地に１０％、１５％または２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の血清代替物を添加して、上に示した成分の終濃度とし得る。必要に応じて、血清代替物または培地の成分を相溶性のある部分処方物に分けてよい。
【００６５】
本発明による血清代替物および培養培地は多くの用途で有用である。また、本発明による血清代替物および培養培地は、ＥＳＣ、ＡＳＣおよびｉＰＳ細胞株などの新規幹細胞株の作出、すなわち、誘導または単離にも使用し得る。よって、本発明は、そのような目的に向けた方法を提供する。その方法は、望ましい起源の単離された細胞を供給する工程、本発明の実施形態によるゼノフリー培地と該細胞を接触させる工程、および細胞培養に好適な条件下で該細胞を培養する工程を含む。一実施形態では、該培地にラミニン（ヒト胎盤ラミニンなど）およびフィブロネクチン（ヒト血漿フィブロネクチンなど）が添加される。好ましくは、ラミニンおよびフィブロネクチンは、約５μｇ／ｍｌの濃度で使用される。
【００６６】
本発明のこの態様はまた、本発明が新規幹細胞株を作出するための血清代替物または培養培地の使用に関するように設計され得る。よって、本方法の総ての実施形態は、血清代替物または培養培地の該使用に適用される。
【００６７】
血清代替物および最終培養培地は、実質的に未分化状態での幹細胞の維持および増殖の支援、好ましくはin vitroでの何代もの継代にわたっての幹細胞の維持および増殖の支援に好適である。より具体的には、該処方物は、少なくとも約第２０継代、好ましくは少なくとも約第３０継代、およびより好ましくは少なくとも約第５０継代の間の幹細胞の維持および増殖に使用し得る。実施例４に示すように、第８０継代をも超える間の実質的に未分化状態での幹細胞の維持に成功している。該幹細胞は多能性または多分化能を保持する。例えば、胚性幹細胞は、内胚葉組織系、中胚葉組織系および外胚葉組織系へと分化する可能性を維持する。さらに、該幹細胞はゲノムの完全性を保持し、それは、例えば、変化していない核型によって、判別される。
【００６８】
治療用途では、本発明による培養培地は、非ヒト動物供給源から精製された、フィーダー細胞、馴化培地、血清または他の培地成分などの成分を含まない。より好ましくは、その培養培地は、組換え法または化学的方法を用いて合成された成分を含んでなる。
【００６９】
よって、本発明は、上記したゼノフリー培養により幹細胞を培養し維持するための方法を提供する。該方法は、本発明による培養培地と幹細胞を接触させること、および幹細胞培養に好適な条件下で該細胞を培養することを含む。そのような条件は当業者には明らかである。
【００７０】
本発明のこの態様はまた、本発明が幹細胞株を培養し維持するための血清代替物または培養培地の使用に関するように設計され得る。よって、本方法の総ての実施形態は、血清代替物または培養培地の該使用に適用される。
【００７１】
本培養培地はまた、細胞の増殖および分化の研究にも使用し得、そのような研究には、ｉ）未分化幹細胞の増殖に作用し、ｉｉ）幹細胞の分化に作用し、かつｉｉｉ）組織再生を調節する分子（例えば、薬物候補）を研究し、同定し、かつ／またはスクリーニングすることが含まれる。その培養培地はまた、遺伝子改変された幹細胞またはそれらから得られる分化した細胞における様々な作用物質（治療用タンパク質など）の生産にも使用し得る。
【００７２】
その血清代替物および最終培養培地はさらに望ましい系統への幹細胞の分化、とりわけ治療目的での幹細胞の分化にも使用し得る。これは、適当かつ十分な濃度の分化誘導剤を本培養培地に加えることによって達成され得る。分化誘導剤の限定されない例としては、Ｎｏｇｇｉｎ（乏突起神経膠細胞(oligodentrocytes)に分化させるために使用され得る）；ソニックヘッジホッグ(sonig hedgehog)およびレチノイン酸（運動ニューロンに分化させるために使用され得る）；ｂＦＧＦ（網膜細胞系統に分化させるために使用され得る）；およびＢＭＰ２（心筋細胞に分化させるために使用され得る）；アクチビンＡおよびＩＧＦ２（インスリン産生細胞に分化させるために使用され得る）；ならびにアクチビンＡ、ＢＭＰ２およびＢＭＰ４（肝細胞に分化させるために使用され得る）が挙げられる。さらに、分化誘導剤は、心筋細胞に分化させるために使用され得る、ＥＮＤ２などの分化用細胞であってよい。他の分化誘導剤は当技術分野で周知である。本発明のこの態様はまた、本発明が望ましい系統へ幹細胞を分化させるための方法に関するように設計され得る。その方法は、分化誘導剤を添加した本発明による培養培地と幹細胞を接触させること、および幹細胞培養に好適な条件下で該細胞を培養することを含む。現在の分化プロトコールは、細胞の特性および分化に未知の影響を及ぼす可能性がある様々な不確定製品および培養培地を利用する。本処方物、分化方法および使用はこれらの不利点を共有しない。
【００７３】
本発明による処方物、方法および使用は、所望により、フィーダー細胞層上での幹細胞株の培養および／または作出に使用し得る。好適なフィーダー細胞としては、限定されるものではないが、ヒト包皮繊維芽細胞、例えば、ＣＲＬ−２４２９(ATCC, Mananas, USA)などの繊維芽細胞が挙げられる。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本発明による処方物、方法および使用は、幹細胞のフィーダー細胞フリー培養に用いられる。
【実施例】
【００７５】
実施例１．ｈＥＳＣに対する培養培地浸透圧の影響
ゼノフリー処方物の性能を高めるために、本発明者らは本発明による培養培地の浸透圧を最適化した。浸透圧は５Ｍ  ＮａＣｌを用いて調整した。本発明者らは、第５継代についてのヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の培養において種々の異なる容量オスモル濃度を検証し、各継代後にそれらの細胞の形態を調べた。浸透圧３２０ｍＯｓｍで最良の性能が得られた（図１Ｃ）。浸透圧２６０ｍＯｓｍ（図１Ａ）では小さい不ぞろいのコロニーが形成され、浸透圧２９０ｍＯｓｍ（図１Ｂ）ではそれらのコロニーの形態が改善されたがコロニーサイズは小さかった。浸透圧３５０ｍＯｓｍではコロニーの増殖が明らかに抑制された（図１Ｄ）。
【００７６】
実施例２．特定の脂質および脂質誘導体はｈＥＳＣの未分化増殖を増強する
様々な脂質および脂質誘導体を、本発明による培養培地（ＲｅｇＥＳ）においておよびＫＯ−ＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、Invitrogen）を含有する従来のｈＥＳ培養培地において試験した。各継代の前に未分化コロニーの一般形態ならびにサイズおよび厚さを視覚に基づき評価した（表３）。それらの結果によれば、共役リノール酸、エイコサペンタエン酸、パルミトオレイン酸、リノール酸、リノール酸−オレイン酸−アラキドン酸混合物、および、とりわけレチノールでは、ｈＥＳ培地および本発明による培養培地の両方において未分化コロニーの形態が改善した（表３）。加えて、ステアリン酸、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、プロスタグランジンＦ２およびＤＬ−イソプロテレノールは、ｈＥＳ培養培地で不良な形態および／または過剰な分化をもたらしたが、一方、本発明による培養培地ではこれらの添加物は満足な形態をもたらした。
【００７７】
さらに、ｈＥＳＣコロニーは３つのカテゴリー；未分化、一部分化および分化、に分類された。各継代の前に各コロニータイプの数を計算した。後に、コロニー総量に対する各コロニータイプの割合値を計算した（図２）。本発明による培養培地では、共役リノール酸、エイコサペンタエン酸、ステアリン酸、レチノール、リノール酸−オレイン酸−アラキドン酸混合物、ＤＬ−イソプロテレノール、パルミトオレイン酸およびリノール酸の存在下で、対照ｈＥＳまたはヒト血清アルブミンの代わりにＡｌｂｕｍａｘ(Invitrogen)を含有するＡｌｂｕｍａｘ−ＲｅｇＥＳ培地中で培養したコロニーと比べて未分化コロニーの数が増加し、分化コロニーの数が減少した。ｈＥＳ培養培地では、コレステロール、アラキドン酸、共役リノール酸、レチノールおよびホスファチジルコリンの存在下で、対照ｈＥＳ培地中で培養したコロニーと比べて未分化コロニーの数が増加し、分化コロニーの数が減少した。
【００７８】
レチノールおよび共役リノール酸が、両方の培養培地においてコロニーの形態および未分化コロニーの数を全体的に改善することが見出された。レチノールおよび共役リノール酸の他、エイコサペンタエン酸も本発明による培養培地において未分化コロニーの数を増加させることにより優れた性能をもたらした。よって、共役リノール酸およびエイコサペンタエン酸が、ゼノフリー血清代替物中に含めるのに最も好ましい脂肪酸である。本発明による培養培地ではステアリン酸を用いて三番目に良好な性能が観察された。
【００７９】
【表３】
2013512667.tif 000005
【００８０】
実施例３．レチノールは増殖および幹細胞マーカーの発現を増加させる
レチノールを選択し、未分化ｈＥＳＣの維持についてさらに評価した。初期研究では、レチノールは０．１〜０．５μＭの濃度では効果がなく、形態や未分化コロニーの数の改善が見られないことが示された。しかしながら、さらなる評価では、レチノールが２．０μＭ以上の濃度でｈＥＳＣの増殖を改善するだけでなく、ｈＥＳＣ特異的マーカーの発現も誘導することが示された（図３）。２．０μＭのレチノールの存在下では、コロニーの増殖はより早く始まり、すでに３日目にはコロニーのサイズはより大きかった（図３Ａ〜図３Ｂ）。増殖アッセイでは、２．０μＭまたは３．５μＭのレチノールの存在下で培養したｈＥＳＣが、レチノールなしでまたは０．５μＭのレチノールの存在下で培養したｈＥＳＣと比べてほぼ２倍の増殖速度であることが示された（図３Ｅ）。レチノールの存在下で培養したｈＥＳＣの免疫細胞化学的染色では、幹細胞マーカーＮａｎｏｇおよびＴＲＡ−１−８１の発現が示された（図３Ｃ〜図３Ｄ）。さらに、レチノールは多能性の裏付けとなる遺伝子、とりわけＮａｎｏｇ、の発現を増加させ、２．０μＭおよび３．５μＭのレチノールの存在下で相対的発現レベルは２０倍を超えた（図３Ｆ）。
【００８１】
実施例４．アクチビンＡは本発明の培養培地の性能をさらに増強する
増殖アッセイでは、本発明による培養培地中５ｎｇ／ｍｌまたは１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡの存在下で培養したｈＥＳＣが、アクチビンＡなしで培養したｈＥＳＣと比べてほぼ２倍の増殖速度であり、その増殖速度が対照ｈＥＳ培地中で培養したｈＥＳＣと同程度であることが示された（図４Ａ）。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）および定量逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）解析では、アクチビンＡが多能性の裏付けとなるマーカーの発現を転写レベルと翻訳レベルの両方において増加させることが示された（図４Ｂ〜図４Ｃ）。
【００８２】
実施例５．本発明の培養培地におけるｈＥＳＣの誘導、長期培養および特性評価
新規ｈＥＳＣ株（０７／０４６および０８／０１３）は、本発明による培養培地を用いることにより、幹細胞研究のために提供された余剰の質の悪いヒト胚からの誘導に成功している。ヒトＥＳＣ株を、第８０継代を超える間連続培養している。これらの細胞株は定期的に核型決定し、正常な２倍体核型を示す（図５Ａ）。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）および定量逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）解析では、これらの細胞株が幹細胞マーカーを、ｈＥＳ培地を用いて誘導し、培養したｈＥＳＣ株Ｒｅｇｅａ  ０６／０４０と同程度のレベルで発現することが示された（図５Ｂ、図５Ｄ）。細胞増殖解析では、Ｒｅｇｅａ  ０７／０４６およびＲｅｇｅａ０８／０１３細胞株の細胞増殖速度がＲｅｇｅａ  ０６／０４０と同程度であることが示された（図５Ｃ）。本発明による培養培地はまた、ｈＥＳＣの凍結および融解にも使用することができる（図５Ｅ）。
【００８３】
新規細胞株がin vitroでそれらの多能性を維持することを確認するために、本発明者らは胚様体（ＥＢ）アッセイを行った。細胞株Ｒｅｇｅａ  ０７／０４６および０８／０１３のＥＢ由来細胞は３つの異なる胚系統、すなわち、内胚葉、外胚葉および中胚葉のマーカーを発現した（図５Ｆ）。また、本発明者らは、ゼノフリー条件で誘導し長期間誘導し、培養したｈＥＳＣが心筋細胞系統および神経細胞系統に分化することができるかどうかを検証した。心臓分化の開始後１２〜１６日後に自発収縮を繰り返す領域が観察された。解離した、自発収縮を繰り返す細胞は、横紋のあるパターンを形成し、心臓トロポニンＴマーカーおよび心室ミオシン重鎖マーカーについて陽性染色を示した（図５Ｇ〜図５Ｈ）。神経細胞を作製するために、本発明による培養培地中およびｈＥＳ培地中で培養したｈＥＳＣコロニーを、小クラスターに切開し、最大２０週間浮遊培養した。分化した細胞はＲＴ−ＰＣＲにおいて神経前駆体マーカー、ニューロンマーカーおよび星状細胞マーカーを発現した（図５Ｉ）。免疫細胞化学的染色では、細胞のニューロンおよび神経膠の運命が確認された（図５Ｊ）。これらの結果は、本発明によるゼノフリー培養培地で誘導し、培養したｈＥＳＣ株はそれらの多能性を維持し、さらに、これらの細胞株から心筋細胞および神経細胞を生成することができることを示した。
【００８４】
実施例６．本発明による培養培地におけるｉＰＳ細胞の培養および特性評価
ヒト多能性細胞用に開発した本発明による培養培地の性能をさらに示すために、本発明者らは２種のヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）株をヒトフィーダー細胞上でこれらの条件にて培養した。細胞の形態および幹細胞マーカー発現は、ｈＥＳ培地中で培養した細胞と比べて類似している（図６Ａ〜図６Ｂ）。加えて、ＥＢの解析では、本発明による培養培地中で培養したｉＰＳ細胞が３つの胚葉総てに分化する能力を維持することが示された（図６Ｃ）。
【００８５】
実施例７．本発明による培養培地におけるＡＳＣの培養および特性評価
脂肪組織サンプルから単離されたＡＳＣを用いて、間葉系幹細胞の培養についての本発明による培養培地の性能を評価した。本発明による培養培地中およびヒト血清含有培地（ＨＳ培地）中で増殖させたＡＳＣの増殖速度を決定するために、ＷＳＴ−１増殖解析をいくつかの時点（１、４、７および１１日目）で行った。両方の条件において７種のＡＳＣ株を解析に用いた。同時に、光学顕微鏡検査により細胞形態を観察して、増殖アッセイの結果を確認した（図７Ａ〜図７Ｄ）。増殖解析では、すでに４日目に、本発明による培養培地での培養物がＨＳ培地と比べてより速いＡＳＣ増殖速度を示すことが示された（図７Ｅ）。その後、７日目および１１日目にＡＳＣは本発明による培養培地において、ＨＳ培地と比べてより速い速度で増殖し続けた。４日目（ｐ＝０．０３５）、７日目（ｐ＝０．０２２）および１１日目（ｐ＝０．０１８）において本発明による培養培地とＨＳ培地との間で増殖速度に有意差が認められた（図７Ｅ）。
【００８６】
本発明による培養培地中およびＨＳ培地中で展開させたＡＳＣの表面マーカー発現特性を比較するために、フローサイトメトリーによる特性評価を行った（表４）。各培養条件につき４つの細胞株を解析した。両方の培養条件でＡＳＣの特徴的な表面マーカー発現プロフィールが維持されたが、統計分析では、ＨＳ培地中で培養したＡＳＣと本発明による培養培地中で培養したＡＳＣとのシアロムチン様接着分子ＣＤ３４（ｐ＝０．０４３）、白血球共通抗原ＣＤ４５（ｐ＝０．０１７）、接着分子ＣＤ１０５（ｐ＝０．０２０）およびＭＨＣクラスＩアイソタイプＨＬＡ−ＡＢＣ（ｐ＝０．０２１）についての発現に有意差が認められた。
【００８７】
【表４】
2013512667.tif 000006
【００８８】
技術の進歩とともに、本発明の概念を様々な方法で実行することができることは、当業者には明らかであろう。本発明およびその実施形態は、上記した実施例に限定されず、特許請求の範囲の範囲内で変更することができる。
【００８９】
引用した総ての参考文献は引用することにより本明細書の一部とされる。
【図１Ａ】
2013512667.tif 000007
【図１Ｂ】
2013512667.tif 000008
【図１Ｃ】
2013512667.tif 000009
【図１Ｄ】
2013512667.tif 000010
【図２Ａ】
2013512667.tif 000011
【図２Ｂ】
2013512667.tif 000012
【図３Ａ】
2013512667.tif 000013
【図３Ｂ】
2013512667.tif 000014
【図３Ｃ】
2013512667.tif 000015
【図３Ｄ】
2013512667.tif 000016
【図３Ｅ】
2013512667.tif 000017
【図３Ｆ】
2013512667.tif 000018
【図４Ａ】
2013512667.tif 000019
【図４Ｂ】
2013512667.tif 000020
【図４Ｃ】
2013512667.tif 000021
【図５Ａ】
2013512667.tif 000022
【図５Ｂ】
2013512667.tif 000023
【図５Ｃ】
2013512667.tif 000024
【図５Ｄ】
2013512667.tif 000025
【図５Ｅ】
2013512667.tif 000026
【図５Ｆ】
2013512667.tif 000027
【図５Ｇ】
2013512667.tif 000028
【図５Ｈ】
2013512667.tif 000029
【図５Ｉ】
2013512667.tif 000030
【図５Ｊ】
2013512667.tif 000031
【図６Ａ】
2013512667.tif 000032
【図６Ｂ】
2013512667.tif 000033
【図６Ｃ】
2013512667.tif 000034
【図７Ａ】
2013512667.tif 000035
【図７Ｂ】
2013512667.tif 000036
【図７Ｃ】
2013512667.tif 000037
【図７Ｄ】
2013512667.tif 000038
【図７Ｅ】
2013512667.tif 000039
【国際調査報告】
2013512667.tif 000040
2013512667.tif 000041
2013512667.tif 000042