(57)【要約】本発明は、レシオメトリックに基づくCEST画像化法におけるCEST剤のNMRで区別可能な立体異性体、ならびに濃度非依存CEST応答性作用剤として有用な溶液中で少なくとも２つのNMRで区別可能な立体異性体を示しているランタニド(III)錯体化合物、に属する非等価可動プロトンの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
レシオメトリックに基づくCEST画像化法における、CEST剤のNMRで区別可能な立体異性体の使用。
【請求項２】
レシオメトリックに基づくCEST画像化法における、CEST剤がペンダントアーム上にヒドロキシルプロトン交換基を付与されている大環状キレート配位子を含むランタニド(III)錯体化合物である請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ランタニド(III)錯体のランタニド(III)金属イオンが、プラセオジム(III)、ネオジム(III)、ジスプロシウム(III)、エルビウム(III)、テルビウム(III)、ホルミウム(III)、ツリウム(III)、イッテルビウム(III)およびユーロピウム(III)（ここで、およびイッテルビウム(III)）から選ばれる請求項２に記載の使用。
【請求項４】
ランタニド(III)イオンが、イッテルビウム(III)またはユーロピウム(III)である請求項３に記載の使用。
【請求項５】
錯体の大環状キレート配位子が、式(I)：
2013542948.tif 000015
[式中、
Rは、-CH(R2)-COOHである；
R1は、H、または-O-、-N-、-CO-、-NHCO-、-CONH-基から選ばれる基によって任意に中断され、１つ以上のハロゲン原子、ヒドロキシル(-OH)基、フェニルもしくは置換フェニル基によって、または-COOH、-NHR3もしくは-NR4R5(ここで、R3、R4およびR5は、互いに同一もしくは異なって、１つ以上のヒドロキシルもしくはC1-C3アルコキシ基によって任意に置換される直鎖もしくは分枝鎖のC1-C3アルキル基から選ばれる)から選ばれる基によって任意に置換される直鎖もしくは分枝鎖のC1-C5アルキル鎖である；
R2は、H、または１つ以上のC1-C3アルコキシによって任意に置換されるC1-C5アルキル鎖、あるいはヒドロキシアルコキシ基である]
で示される化合物であるか、またはその二量体もしくは多量体誘導体である請求項２〜４のいずれか１つに記載の使用。
【請求項６】
式(I)の化合物において、R2がHであり、R1が-H、-CH3、-CH2CH3、-CH2OH、-CH2-O-CH3、-CH(CH2OH)2、-CH2-CH(OH)-CH2OH、-CH2-O-CH2-C6H5、-CH2-O-CH2-(C6H5-COOH)、-CH2-O-CH2-(C6H5-NO2)から選ばれる基である請求項５に記載のランタニド(III)錯体化合物の使用。
【請求項７】
式(I)の化合物において、R2がH、R1が-CH3であり、ランタニド金属イオンがイッテルビウム(III)またはユーロピウム(III)から選ばれる請求項５または６のいずれか１つに記載の使用。
【請求項８】
CEST剤が、1-[1,3,4-トリヒドロキシブタン-2-イル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-4,7,10-三酢酸のランタニド(III)キレート錯体である請求項１〜４のいずれか１つに記載の使用。
【請求項９】
濃度非依存性CEST造影剤としての、請求項５または６のいずれか１つに定義する式(I)のランタニド(III)錯体化合物、またはその二量体もしくは多量体誘導体、あるいは請求項８に記載のランタニド(III)キレート錯体の使用。
【請求項１０】
診断対象の物理的または化学的パラメーターの濃度非依存性マップを得るための、CEST応答剤としての請求項９に記載のランタニド(III)錯体化合物の使用。
【請求項１１】
CEST剤のNMRで区別可能な立体異性体に属する磁気的に非等価な交換可能なプロトンを利用することを含むレシオメトリックに基づくCEST画像化法。
【請求項１２】
CEST剤が、請求項２〜８のいずれか１つに定義するLn(III)錯体化合物を含む請求項１１に記載のレシオメトリックに基づくCEST画像化法。
【請求項１３】
濃度非依存性インビボCEST画像化を提供するための請求項１１または１２に記載のレシオメトリックに基づくCEST画像化法。
【請求項１４】
ヒトまたは動物の体器官、体液または組織における診断対象の物理的または化学的パラメーターの濃度非依存性インビボマップを得るための、請求項１１または１２に記載のレシオメトリックに基づくCEST画像化法。
【請求項１５】
i)必要に応じて、対象のヒトまたは動物の体器官、領域、体液または組織のMRI形態画像を記録すること；
ii)前投与されたランタニド錯体のNMRで区別可能な立体異性体に属する２つの磁気的に非等価な可動プロトンの共鳴周波数に精密に調整された周波数の範囲において、Z-スペクトルを集め、そして、これらの２つの可動プロトンプールについて測定された飽和移動(ST)効果からレシオメトリック値を計算すること；
iii)計算されたST値から、関心のあるヒトまたは動物の体器官、領域、体液または組織における対象のパラメーターの濃度非依存性マップを得、必要に応じて、該マップを形態画像上に重ね合わせること；
を含む、CEST MRI技術を用いることによる、式(I)のLn(III)キレート錯体またはその二量体もしくは多量体誘導体を前投与されたヒトまたは動物患者における診断対象の物理的または化学的パラメーターの測定方法。
【請求項１６】
HPDO3A四量体、その塩およびその常磁性金属イオンとのキレート錯体。
【請求項１７】
(Yb3+)4HPDO3A四量体および適当な生理的に許容しうる添加剤および／または担体を含む診断用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学交換依存性飽和移動(CEST)に基づく磁気共鳴画像化(MRI)の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、濃度非依存応答性を示すCESTシステム、ならびに診断対象の物理的または化学的パラメーターのインビボマッピングにおけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学交換飽和移動(CEST)モダリティは、１つ以上の交換可能なプロトンプールを含む分子(CEST剤)の使用に基づいて近年導入された画像化法である(たとえば、Balaban RS.、Methods in Biomedical Magnetic Resonance 画像化 and Spectroscopy. Chichester、UK：John Wiley & Sons；2000. Vol.1. p 661-6667；Young IR、編集を参照)。
【０００３】
この画像化技術は、可動プロトンのスピンを飽和させるために、NMRスペクトルから導き出されるその共鳴周波数に精確に集中させた、第二の高周波数(rf)パルスが適用される、高解像度NMRにおいて二重共鳴実験として知られる現象に基づく。したがって、化学交換によってバルク水に移動される飽和磁化が生成され、バルク水シグナルの整った減少が得られる。この効果は、飽和移動またはST効果と呼ばれる。得られるCESTに基づくMR画像におけるコントラストは、移動の程度によって決定される：より大きいのは、水プロトンに移動した飽和磁化の量であり、より小さいのは、得られる水シグナルの強度であり、より強いのは、記録されたMRI画像におけるコントラスト(負のコントラスト)である。
【０００４】
CEST剤の基本的要件は、交換部位活性化および飽和の移動の両方を可能にするような、適当な交換速度(Kex)を有する可動プロトン(または本明細書で互換的に用いる交換可能なプロトン)の存在およびバルク水プロトンによる適当な化学シフト分離である。おおむね、KexがΔνに到達するとき(Kex≒Δν)(ここで、Δνは、２つの交換プールの間の、Hzで示す化学シフト分離である)に、この条件は達成される。既知のCEST造影剤は、主として反磁性システムと常磁性システムに分類される。最初、低分子量反磁性CEST剤(DIACEST)の適当な例は、この分野でほとんどの仕事を行ったBalaban(WO 00/66180)によって提供された。巨大分子反磁性剤は、たとえば、J. Am. Chem. Soc 2001；123:8628-8629に開示されている。
【０００５】
Sherryによって最初に報告された(たとえば、J. Am. Chem. Soc 2001；123:1517-1518を参照)常磁性CEST剤(PARACEST)は、主として、４つの磁気的に等価な、あるいは偽等価なN-H可動プロトンプールを提供する、DOTAの大環状テトラアミド誘導体を含む。常磁性CEST剤における重要な発見は、Magn. Reson. Med 2002；47:639-648にも議論されている。
【０００６】
Woodsらは、OH基もまた、少なくとも無水溶媒の使用などの特定の実験条件下でPARACESTプローブを用いるCEST実験において利用できることを実証した(たとえば、J. Am. Chem. Soc 2006； 128:10155-10162を参照)。しかしながら、純水に試験錯体を溶解することによって、ヒドロキシと金属結合水プロトンからCEST効果を検出することはできず、このように、インビボCEST適用のためのその可能な使用は妨げられた。
【０００７】
後に、Morrowおよび共同研究者らは、ペンダントアルコール基を含む中性配位子をもつ３＋に荷電したLn(III)大環状錯体を用いることによって、アルコールドナー基からのCEST効果が、純水中で検出されうることを実証した(たとえば、Inorg. Chem. 2009；48：7237-7243を参照)。用いたシクレン誘導体の複数の立体異性体の存在は、溶液中に１つのジアステレオマー体のみを有するLn(III)錯体は、PARACEST実験のために潜在的に有利であると結論付ける文献に議論されている。
【０００８】
別の種類の特に高感度の常磁性CEST剤は、水性内部空間における水プロトンのための常磁性シフト試薬を含むリポソームであるLIPOCESTによって代表される(たとえば、Angew. Chem. Int Ed Engl 2003；42：4527-4529を参照)。
【０００９】
CEST剤のうち、特に興味深いのは、「応答性」剤、すなわち、飽和移動能力が、該剤が分配される微小環境の診断対象の物理化学的パラメーターと相関する少なくとも１つの交換可能なプロトンを付与する造影剤である。これらの剤は、典型的なCEST剤として働くこと、およびCESTコントラストを提供することに加えて、体器官もしくはそれらが分配される領域のpH、温度、代謝物または特定のイオン濃度、O2またはCO2分圧、たんぱく質もしくは酵素活性から代表的に選ばれる該パラメーターの変化について報告することもでき、したがって、これらのパラメーター変化に緊密に関連する特定の疾患の有用なバイオマーカーとして働く(たとえば、Top Curr. Chem. 2002、221、123-164を参照)。
【００１０】
この点で、CEST法において観察される飽和移動(ST)の量は、水およびCESTプローブ含量、言い換えれば、対象組織におけるその局所的濃度に依存する。結論として、これらの剤によって示される特定の応答特性は、実際には、その実際の濃度が分かっている場合にのみ適切に利用される。
【００１１】
その代わりに、インビボ定量において効果的に利用可能であるためには、CEST応答性剤は、濃度非依存性モードでその応答性を示すべきである。
【００１２】
この課題は、少なくとも２セットの、そのST効果が、対象の物理化学的パラメーターへの異なる従属性を示す、磁気的に非等価なプロトンを含むCEST剤を用いることによって達成することができる。
【００１３】
この場合、実際に、以下の式(1)に基づくレシオメトリックアプローチを利用することができる。
2013542948.tif 000002
この式は、Balaban and Wardによって最初に開示された(上記式の詳細については、たとえば、Magn. Reson. Med. 2000；44:799-802を参照)。該アプローチは、それぞれ、上記式においてサイト1およびサイト2として示される、２つの異なる共鳴の選択的照射によって誘発されるST効果の間の比較比を用いる。それは、測定されたST量、そして投与されたCESTプローブの絶対濃度に依存しない評価された診断パラメーターを作成する。
【００１４】
このレシオメトリックアプローチの利用を可能にする応答性剤の例として、通例、１つは金属イオンに配位したペンダントアーム上の第一級アミド基に属し、２つ目はキレート錯体のLn中心に配位した水分子によって典型的に表される、２つの磁気的に非等価なプロトン部位を含む単分子ランタニド(Ln)錯体が挙げられる(たとえば、Angew. Chem. Int Ed 2002；41：1919-1921および4334-4336を参照)。
【００１５】
CEST活性プロトンの２つのプールを含む5,6-ジヒドロウラシルおよびイオパミドールなどの反磁性分子は、濃度非依存pHレポーターとしても成功している。
(たとえば、Magn. Reson. Med. 2000；44:799-802、Invest. Radiol. 2004；39:235-243；Magn. Reson. Med. 2005；53：830-834およびJ. Am. Chem. Soc 2005；131：1380-1381を参照)。
【００１６】
あるいは、たとえば配位したLn(III)イオンに応じて、２つ(またはそれ以上)の、生体内分布パターンは同じであるが、NMR特性が異なるCESTプローブを含むCESTシステムを利用してもよく、それぞれのプローブは異なるプロトンプールを提供する(たとえば、Magn. Reson. Med. 2002；47：639-648を参照)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
しかしながら、主として、濃度非依存応答性を示すCESTシステムの数が限られているという理由から、応答性CEST剤の開発は依然として不十分である。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
発明の概要
上記課題にしたがって、本発明は、設定されたCESTに基づく濃度非依存応答手順ならびに別の濃度非依存応答性を示すCESTシステムを承諾する、磁気的に非等価な可動プロトンの代替源の同定に関する。
【００１９】
本発明の解決手段は、磁気的に非等価な交換可能なプロトンの代替源として、常磁性CEST剤のNMRで区別可能な立体異性体を用いることに関する。
【００２０】
さらに詳しくは、本発明は、レシオメトリックに基づくCEST画像化法を設定するための、磁気的に非等価な可動プロトンの源としての常磁性CEST剤のNMRで区別可能な異性体の使用に関する。
【００２１】
さらなる実施態様において、本発明は、常磁性CEST剤のNMRで区別可能な少なくとも２つの異性体に属する磁気的に非等価な可動プロトンを利用することを含むレシオメトリックに基づくCEST MRI法に関する。
【００２２】
別の実施態様において、本発明は、溶液中で少なくとも２つのNMRで区別可能な立体異性体を示す、キレート形成配位子のペンダントアーム上の交換基を付与されているランタニド(III)錯体化合物、ならびに濃度非依存CESTコントラストを提供するための濃度非依存CESTコントラスト剤としてのレシオメトリックに基づくCEST画像化法におけるこれらの錯体の使用に関する。
【００２３】
さらに別の実施態様において、本発明は、濃度非依存応答性CEST剤としての該同定されたランタニド(III)錯体化合物の使用、ならびにヒトまたは動物の体器官、体液または組織における診断対象の物理的または化学的パラメーターの濃度非依存マップを提供するためのその使用を含むレシオメトリックに基づくCEST画像化法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】D2O中のYbHPDO3Aの1H NMRスペクトル(278K、600 MHz)。
【図２】パネルa)錯体の２つの区別可能な異性体のOHプロトン交換によって示される異なる化学シフト(それぞれ、72および99 ppm、20℃にて)を強調表示する、D2O(下部)およびH2O(上部)中のYbHPDO3Aの1H NMRスペクトルの拡大図；パネルb)YbHPDO3AのZ-スペクトル(24 mM溶液、293 K、pH7.31、照射パワー24 μT、照射時間 2s)。
【図３】パネルa)すべて濃度24 mMであるが、pHが異なるYbHPDO3Aの溶液を含むファントム(キャピラリー1-11)、またはpHは同じ(7.31)であるが、の濃度が異なる(3〜24 mM)YbHPDO3Aの溶液を含むファントム(キャピラリー7、12-14)のインビトロMR画像(プロトン密度)；パネルb)ファントムの凡例；パネルc)72 ppmでのヒドロキシルプロトンの照射(20℃；照射パワーパルス24 μT)によって得られるSTマップ；パネルe)それぞれ72 ppm(四角)および99 ppm(丸)での２つの異性体のヒドロキシルプロトンの照射によって得られる、pHの変動によるST効果の変動(較正曲線)(24mM 溶液、20℃；照射パルス24 μT；照射時間2秒)；パネルf)パネルe)のST曲線へのレシオメトリックアプローチの適用によって得られる、pHへのレシオメトリック値の依存性を示すレシオメトリック曲線。図において、レシオメトリック値(グラフの縦軸(y)上に示される)は、それぞれ72 ppm(サイト1)および99 ppm(サイト2)での可動プロトンの照射において上記式(1)を用いることによって計算される値を表す。
【図４】パネルa)温度へのレシオメトリック値の依存性を示すレシオメトリック曲線(それぞれ20℃(四角)および37℃(丸)にて記録されたST較正曲線におけるレシオメトリックアプローチの適用によって得られるレシオメトリック値)；パネルb)24 μTの照射パルスを用いることによって37℃(濃い線)および20℃、同じpH(灰色の線)にて記録されたYbHPDO3A(24mM溶液、pH7.31)のZ-スペクトル。
【図５】パネルa)YbHPDO3Aの溶液とともにインキュベートされた(キャピラリー2)か、または電気穿孔された(キャピラリー1)MSH細胞、あるいはPBSでインキュベートされ、参照として用いた細胞からなる３つの異なるペレットを含むファントムのインビトロMR画像。空のキャピラリー(4)もまた、ファントムに含める；パネルb)およびc)それぞれ72および99 ppmでファントムを照射して集めたSTマップ。
【図６】Bruker Avance300分光計で記録した、YbHPDO3Aの150 mM溶液200 μLを注射したマウスの膀胱から得られたZ-スペクトル。記録されたスペクトルにおいて、濃い線は、適合曲線に対応し、淡い線は、0 ppmに対応する最小のZ-スペクトルを有するように変換された適合曲線に対応する。
【図７】実施例６で33℃にて記録された較正曲線から得られた、この温度にてインビトロで測定されたYbHPDO3Aのレシオメトリック曲線。
【図８】YbHPDO3Aの静脈内注射の前(PRE)および直後(Post)のマウスの腫瘍領域に記録された形態学的画像(左の画像)およびSTマップ。それぞれ66.2および91.6 ppmでの照射時に計算されたST効果は、腫瘍領域が明るい領域(実際に観察される画像においては赤)として表示される対応する解剖学的画像に重ね合わせられている。図において、記号＠は、飽和転移を促進するために用いた照射周波数、すなわち、66.2および91.6 ppmを示す。
【図９】YbHPDO3Aの四量体誘導体の式、(Yb3+)4HPDO3A四量体あるいは単に四量体として示される場合もある。
【図１０】パネルa)YbHPDO3A四量体の２つの異性体のヒドロキシルプロトンを照射して、298〜312Kの範囲での、異なる温度で測定されたレシオメトリック曲線およびレシオメトリックアプローチの適用；パネルb)YbHPDO3A四量体のNMRで区別可能な２つの異性体。
【図１１】0.26〜8.4 mMの範囲での、異なる濃度のYbHPDO3A四量体を含むファントムのMRI画像(pH7.4および298K)。左はT2強調画像；右は得られたSTマップ。
【図１２】パネルa)D2O中でのEuHPDO3Aの1H NMRスペクトル；パネルb)生理的温度において依然として区別可能な、それぞれ20.5および16.7の化学シフト(pH2および20℃)を有する、NMRで区別可能な２つの異性体の存在を確認する、D2O、278 K、pH2(上部)およびH2O、310K、pH2(下部)におけるEuHPDO3A NMRスペクトルの拡大図(Advance 600分光計)。
【図１３】パネルa)異なる電力パルスでのpH5.92および37℃におけるEU(III)HPDO3A(20mM)のZ-スペクトル；パネルb)異なる電力パルスでのpH7.46および37℃におけるEU(III)HPDO3A(20mM)のZ-スペクトル；パネルc)pH7.46、37℃および照射パワー24 μTにおけるEU(III)HPDO3A 20mMのSTプロフィール。
【図１４】pH5.8および298 Kにおいて化合物2の溶液の7Tで獲得されたZ-スペクトル。
【図１５】化合物2によって示された２つの磁気的に非等価な異性体のヒドロキシルプロトンの照射によって得られたST効果のpHへの依存性(20℃にて)(較正曲線)。
【図１６】図１５のST曲線に対するレシオメトリックアプローチの適用によって得られるST(レシオメトリック値)のpHへの依存性を報告するレシオメトリック曲線。
【図１７】278Kおよび298K、ならびに600 MHzの磁場にて、D2O中で記録された化合物3の1H NMRスペクトルの比較。相対的に低い温度にて記録された高解像度スペクトルは、溶液中の２つの主要異性体(SAPおよびTSAP)による２つのセットのシグナルの存在を明らかに示す。これらの同じシグナルは、室温にてはるかに広い。
【図１８】20℃；磁場7T、照射パワー24 μTにて、6.41〜8の範囲での異なるpH値で緩衝された溶液(20mM)から記録された化合物3のZ-スペクトル。
【図１９】293 K、磁場7T、照射パワー24 μTにて、5.08〜6.30の範囲での異なるpH値で緩衝された化合物4の水性溶液(20mM)から得られた飽和移動STプロフィール(左)および対応するZ-スペクトル(右)。
【図２０】それぞれ75および100 ppmでのヒドロキシルプロトン照射により得られたST曲線から化合物4について計算されたレシオメトリック値のpHへの依存性を示すレシオメトリックST曲線。
【図２１】20℃；磁場7T、照射パワー24 μTにて、5.5〜8.1の範囲での異なるpHで緩衝された水性溶液(20mM)から記録された化合物5のZ-スペクトル。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の詳細な記載
本明細書で開示する、濃度非依存性CEST MRI法を可能にする磁気的に非等価な可動プロトンの源は、常磁性CEST剤の少なくとも２つのNMRで区別可能な異性体に属する可動プロトンで表される。
【００２６】
この点に関して、他に特記しない限り、「CEST剤のNMRで区別可能な異性体」という表現は、分離され、NMRスペクトルにおいて区別可能な可動プロトンシグナル、あるいは言い方を変えれば、交換可能なプロトンに対する別個の共鳴(NMRスペクトルにおいて)を示す可動プロトンシグナル、を提供するCEST剤の立体異性体を意味し、各共鳴はNMRで区別可能な立体異性体の１つに対応する。
【００２７】
この点で、この種の磁気的に非等価なプロトンを提供する適当なCEST剤は、溶液中で少なくとも２つのNMRで区別可能な立体異性体を示す、キレート配位子ペンダントアーム上にプロトン交換基を含むランタニド(III)錯体化合物が好ましい。
【００２８】
実際のところ、興味深いことに、これらの錯体化合物のNMRスペクトルは、レシオメトリックに基づくCEST画像化法において選択的に照射される交換可能なプロトンに対する少なくとも２つの、各共鳴がNMRで区別可能な異性体の１つに対応する、分離された共鳴を示す。
【００２９】
レシオメトリックに基づくCEST画像化法において利用できる磁気的に非等価な可動プロトンの源として適当なランタニド(III)錯体化合物のNMRで区別可能な異性体の使用は、本発明の１つの実施態様を構成する。
【００３０】
インビボCESTに基づく方法における非等価な可動プロトンの、この別の源を適切に利用するために、CESTプローブとして用いるランタニド錯体が、生理的条件下で複数のNMRで区別可能な立体異性体を示すことが必要であるか、あるいは言い方を変えれば、Ln(III)錯体が示す異なる立体異性体の交換可能なプロトンの共鳴が、水溶液中、室温および生理的pHにて、依然として適当にシフトされ、良好に検出可能であることが必要であることが今では明らかである。
【００３１】
複数のNMRで区別可能な異性体の混合物として溶液中に存在する、ペンダントアーム上にヒドロキシル(-OH)プロトン交換基を付与されている大環状キレート配位子を含む、特定の種類のLn(III)錯体化合物を本明細書において同定する。これらの錯体化合物のNMRスペクトルが、水溶液中ならびに生理的pHおよび温度下で依然として存在し、良好に分離される異なる立体異性体に対応する、交換可能なOHプロトンに対する少なくとも２つの共鳴を示すのが有利である。
【００３２】
レシオメトリックに基づくCEST画像化法における特定の種類のランタニド(III)錯体化合物の使用は、本発明の好ましい実施態様を表す。
【００３３】
したがって、本発明の１つの実施態様は、対象となるランタニド錯体のNMRで区別可能な立体異性体によってそれぞれ提供される(少なくとも２つの)磁気的に非等価な可動プロトンを利用するレシオメトリックに基づくCEST画像化法における、ペンダントアーム上にヒドロキシルプロトン交換基を付与されているキレート配位子を含むランタニド(III)錯体化合物の使用に関する。
【００３４】
適当なランタニド(III)金属イオン(またはLn(III))は、プラセオジム(III)、ネオジム(III)、ジスプロシウム(III)、エルビウム(III)、テルビウム(III)、ホルミウム(III)、ツリウム(III)、イッテルビウム(III)およびユーロピウム(III)から選ばれ、ユーロピウム(III)およびイッテルビウム(III)が好ましく、イッテルビウム(III)が特に好ましい。
【００３５】
一方、本発明の適当なキレート配位子は、単一のペンダントアーム上にヒドロキシル(OH)プロトン交換基を付与されている大環状キレート配位子を包含する。
【００３６】
式(I)：
2013542948.tif 000003
[式中、
Rは、-CH(R2)-COOHである；
R1は、H、または-O-、-N-、-CO-、-NHCO-、-CONH-基から選ばれる基によって任意に中断され、１つ以上のハロゲン原子、ヒドロキシル(-OH)基、フェニルもしくは置換フェニル基によって、または-COOH、-NHR3もしくは-NR4R5(ここで、R3、R4およびR5は、互いに同一もしくは異なって、H、または１つ以上のヒドロキシルもしくはC1-C3アルコキシ基によって任意に置換される直鎖もしくは分枝鎖のC1-C3アルキル基から選ばれる)から選ばれる基によって任意に置換される直鎖もしくは分枝鎖のC1-C5アルキル鎖である；
R2は、H、または１つ以上のC1-C3アルコキシによって任意に置換されるC1-C5アルキル鎖、あるいはヒドロキシアルコキシ基である]
で示されるキレート配位子が好ましい。
【００３７】
この点で、式(I)のキレート配位子が三価の正に架電したランタニド(III)金属イオンと錯形成する場合、R部分のカルボキシル基は、対応する脱プロトン化形態(-CH(R2)-COO-)であることは当業者には明らかである。
【００３８】
本明細書において、他に特記しない限り、用語「直鎖もしくは分枝鎖のC1-C3アルキル基」は、炭素原子数1〜5個の直線状もしくは分枝状のアルキル鎖を意味する。アルキル基の適当な例は、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチルなどを含む。
【００３９】
上記アルキル基は、1つ以上の上述のハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、ヒドロキシアルコキシ、フェニルまたは置換フェニル基によってさらに置換および／または中断されてもよい。
【００４０】
ハロゲンまたはハロゲン原子は、ヨウ素、塩素、臭素またはフッ素原子を意味し、これらの後者が特に好ましい。
【００４１】
用語「置換フェニル」は、１つ以上のハロゲン原子、ヒドロキシル(OH)またはC1-C3アルコキシ基；あるいは-(CH2)nCOOH、-NO2、-NHR3または-NR4R5基から選ばれる基(ここで、nは、0または1であり、R3、R4およびR5は、前記と同意義である)によって置換されたフェニル基を意味する。
【００４２】
用語「C1-C3アルコキシ」は、アルキル部分が３個以下の炭素原子を含む、いずれかのアルキルオキシ基を意味する。
【００４３】
ヒドロキシアルコキシ基は、アルキル部分がヒドロキシル基によってさらに置換されている上記C1-C3アルコキシ基のいずれかを意味する。
【００４４】
本発明のアルコキシまたはヒドロキシアルコキシ基の適当な例は、たとえば、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、ヒドロキシメチルオキシ、-2-ヒドロキシエトキシ、2,3-ジヒドロキシプロポキシなどを含む。
【００４５】
式(I)の化合物において、R2がHであり、R1がH、または酸素原子によって任意に中断されるか、または-OH、-NH2または(ヒドロキシル、C1-C3アルコキシ、ニトロまたはカルボキシル基によって順に置換されてもよいか、またはされない)フェニルによって任意に置換される直鎖もしくは分枝鎖のC1-C4アルキル鎖であるのが好ましい。
【００４６】
式(I)の化合物において、R2がHであり、R1が-H、-CH3、-CH2CH3、-CH2OH、-CH2-O-CH3、-CH(CH2OH)2、-CH2-CH(OH)-CH2OH、-CH2-O-CH2-C6H5、-CH2-O-CH2-(C6H5-COOH)、-CH2-O-CH2-(C6H5-NO2)から選ばれる基であるのがより好ましい。
【００４７】
キレートされるLn(III)イオンが、Yb(III)またはEu(III)から選ばれ、R2がHであり、R1が-CH3である式(I)の配位子を有するLn(III)錯体が本発明において特に好ましい。
【００４８】
適切な場合に官能化されてもよいそれらのR1基を介して任意に連結された、少なくとも２つの式(I)のキレート配位子を含む二量体または多量体誘導体は、本発明に含まれ、一般に感度が増大される。
【００４９】
したがって、異なる実施態様において、本発明は、キレート配位子が、式(I)の化合物の二量体または多量体誘導体であるLn(III)錯体化合物に関する。
【００５０】
このタイプの化合物の一例は、たとえば、後述の実施例１ならびにその製造用反応工程式に開示される。
【００５１】
４つ(以下)の常磁性金属イオンを有する、本明細書において互換的に用いられる実施例１の四量体キレート配位子またはHPDO3A-四量体もしくはその塩およびそのキレート化錯体は、新規であり、本発明のさらなる目的を較正する。
【００５２】
この点で、適当な常磁性金属イオンは、以下から選ばれる：Fe(2+)、Fe(3+)、Cu(2+)、Ni(2+)、Rh(2+)、Co(2+)、Cr(3+)、Gd(3+)、Eu(3+)、Dy(3+)、Tb(3+)、Pm(3+)、Nd(3+)、Tm(3+)、Ce(3+)、Y(3+)、Ho(3+)、Er(3+)、La(3+)、Yb(3+)、Mn(3+)、Mn(2+)。常磁性金属イオンが、Gd(3+)、またはYb(3+)、Eu(3+)もしくはDy(3+)から選ばれるランタニド金属であるのがより好ましい。
【００５３】
本発明のさらなる目的は、MR画像化における使用のための適当な添加剤および／または担体とともに、式(I)のキレート配位子の二量体または多量体誘導体の常磁性または特にLn(III)ビス-もしくはポリ-キレート錯体あるいはその生理的に許容しうる塩を含む診断用組成物である。好ましい実施態様において、該診断用組成物は、図９に示す構造を有する(Yb3+)4HPDO3A-四量体を含む。
【００５４】
大環状骨格上に少なくとも３つのカルボン酸基を含む式(I)のキレート配位子は、生理的に許容しうる塩の形態であるのが都合がよい。
【００５５】
本発明の配位子を塩化するのに用いる無機塩基のカチオンの適当な例は、カリウム、ナトリウム、カルシウムまたはマグネシウムなどのアルカリまたはアルカリ土類金属のイオンを含む。
【００５６】
好ましい有機塩基のカチオンは、特に、エタノールアミン、ジエタノールアミン、モルホリン、グルカミン、N-メチルグルカミン、N,N-ジメチルグルカミンなどの第一級、第二級および第三級アミンのカチオンを含む。
【００５７】
この目的のために適当に用いることができる好ましい無機酸のアニオンは、クロリド、ブロミド、ヨージドなどのハロ酸のイオンまたはスルフェートなどのその他のイオンを含む。
【００５８】
好ましい有機酸のアニオンは、製薬技術において、たとえばアセテート、スクシネート、シトレート、フマレート、マレエートまたはオキサレートなどの、塩基性物質の塩化のために通常用いられる酸のアニオンを含む。
【００５９】
好ましいアミノ酸のカチオンおよびアニオンは、たとえば、タウリン、グリシン、リシン、アルギニン、オルニチンあるいはアスパラギン酸およびグルタミン酸などのカチオンおよびアニオンを含む。
【００６０】
一方、大環状配位子の３つのカルボン酸基はすべて、３＋に荷電したランタニドイオンのキレート化に関与する。結果として、式(I)のLn(III)錯体化合物は、中性であり、したがって、さらなる中和あるいは塩化を行うことなく、インビボ適用に適している。
【００６１】
むしろ、キレート配位子がさらなる酸性基を含む場合、たとえば上述のものから選ばれる製薬技術において通常用いられるカチオンによるその中和は、その生理的に許容しうる塩を提供することが必要である。
【００６２】
R1がHとは異なる式(I)のLn(III)キレート錯体およびその二量体または多量体は、ペンダントアーム上のヒドロキシル化炭素によって表される不斉中心を含む。したがって、溶液中で、それらは、時計回りまたは反時計回りのアセテートアームの配置において、大環状環の２つの配座において、および不斉中心の配座(R,S)において本質的に異なる複数の立体異性体を示す。この点で、当業者は、R1がHである場合、該炭素はそのキラリティーを失うが、アセテートアームの配置または環の配座において異なる異性体は存在することを認識している。
【００６３】
本発明は、好ましい種類の錯体化合物によって室温にて水溶液中で示されるジアステレオ異性体が、NMRスペクトルにおいて区別可能であるという観察に基づく。さらに詳しくは、我々は、本発明によって説明される式(I)のLn(III)錯体化合物が、生理的温度およびpHにおいて溶液中で、それぞれ錯体のNMRで区別可能な異なるジアステレオ異性体に対応する交換可能なOHプロトンに対する少なくとも２つの適当にシフトされた共鳴を示すことを見出した。有利なことに、同じ錯体の異なる立体異性体が、同じインビボ生体内分布および同じ経時的相対濃度比を有することが判明した。したがって、複数の適当にシフトしたOHプロトン共鳴において、溶液中で示される式(I)のLn(III)錯体化合物のNMRで区別可能な立体異性体は、対象の錯体の局所的濃度によって影響されないインビボCEST画像を提供するためにインビボ条件で利用できるレシオメトリックに基づくCEST-MRI法を設定するために有効に利用することができる。
【００６４】
さらに、興味深いことに、本発明のLn(III)錯体化合物のOHの交換可能なプロトンの選択的飽和によって得られる飽和移動STの量は、それらが分散する微小環境の物理的または化学的パラメーターに対して著しく感度が高い、あるいは言い方を変えれば、応答性が高い。結果として、本発明の特定の種類のLn(III)錯体化合物は、CEST画像化法において利用されて濃度非依存性CESTコントラストを提供できることに加えて、特に、CEST剤自体の局所的濃度に影響されない、診断対象のインビボ測定および物理的または化学的パラメーターのマップを提供することができるレシオメトリックに基づくCEST画像化法において反応性CEST剤としても有効に利用されうる。
【００６５】
したがって、さらなる実施態様において、本発明は、特に、診断対象の物理的または化学的パラメーターのインビボ決定のためのレシオメトリックに基づくCEST画像化法における、濃度非依存性CEST応答剤としての式(I)のLn(III)錯体化合物の使用に関する。
【００６６】
本発明において、他に特記しない限り、「診断対象の物理的または化学的パラメーター」は、温度、pH、酸素(pO2)または二酸化炭素(pCO2)の分圧、特定のイオンもしくは代謝物濃度、または特定の酵素活性から選ばれるパラメーターを意味する。
【００６７】
この点で、医師が、調査対象の体器官または領域における物理的または化学的パラメーターの値またはマップを知ることによって、評価パラメーターに厳密に依存する診断対象の生理的または代謝的過程の診断評価を提供することができることが今では明らかである。
【００６８】
さらなる実施態様において、本発明は、適当な高周波パルスを利用、すなわち、照射し、適当なCESTプローブの２つ以上のNMRで区別可能な立体異性体によって提供される少なくとも２つの磁気的に非等価な可動プロトンのバルク水シグナルへの飽和移動を誘発することを含む、レシオメトリックに基づくCEST MRI法、に関する。
【００６９】
この点で、いずれかの適当なCESTプローブのNMRで区別可能な異性体に属する磁気的に非等価な可動プロトンを利用するレシオメトリックに基づくCEST MRI法が、本発明に含まれるであることは当業者には明らかである。
【００７０】
特に好ましい実施態様において、 CESTプローブは、HPDO3Aキレート配位子のLn(III)錯体、またはその二量体または多量体誘導体であるビス-もしくはポリ-キレート錯体、あるいはその生理的に許容しうる塩である。
【００７１】
したがって、本発明の好ましい実施態様において、本発明は、式(I)のLn(III)錯体化合物、またはその二量体もしくは多量体誘導体を用いて、濃度非依存性インビボCEST画像化を提供することを含む、レシオメトリックに基づくCEST MRI法に関する。該レシオメトリックに基づくCEST MRI法が、CEST剤の局所的濃度に影響されない、ヒトまたは動物の体器官、体液、組織における診断対象の物理的または化学的パラメーターのインビボ定量のために用いられるのがさらに好ましい。
【００７２】
さらに詳しくは、好ましい実施態様において、本発明は、
a)式(I)のLn(III)キレート錯体またはその二量体もしくは多量体誘導体をヒトまたは動物患者に投与し、必要に応じて、好ましくはT2加重シーケンスを用いることによって、対象のヒトまたは動物の体器官、領域、体液または組織のMRI形態画像を記録すること；
b)投与されたランタニド錯体のNMRで区別可能な立体異性体に属する２つの磁気的に非等価な可動プロトンの共鳴周波数に精密に調整された周波数の範囲のZ-スペクトルを集め、そして、これらの２つの可動プロトンプールについて測定された飽和移動効果(ST)からレシオメトリック値を計算すること；
c)該ヒトまたは動物の体器官、領域、体液または組織の濃度非依存性画像を得ること；
（ここで、方法のステップCが、方法のステップb)において測定されたST効果から得られたレシオメトリック値マップを、あらかじめ記録された対象のヒトまたは動物の体器官、領域、体液または組織の形態画像上に重ね合わせることを含むのが好ましい）；
を含む、ヒトまたは動物の体器官、領域、体液または組織の画像を得るための濃度非依存性CEST画像化法に関する。この点で、ステップb)において、２つの磁気的に非等価な可動プロトンの共鳴周波数は、既知でない場合、CEST画像化前に適当に記録されうる該錯体のNMRスペクトルから得られる。
【００７３】
ヒトまたは動物の体器官、領域、体液または組織のインビボ画像を得るために、上記CEST画像化法をインビトロ(エクスビボ)、あるいは好ましくはインビボで実施することができる。
【００７４】
もう１つの好ましい実施態様において、本発明は、
i)式(I)のLn(III)キレート錯体またはその二量体もしくは多量体誘導体をヒトまたは動物患者に投与し、必要に応じて、対象のヒトまたは動物の体器官、領域、体液または組織のMRI形態画像を記録すること；
ii)投与されたランタニド錯体のNMRで区別可能な立体異性体に属する２つの磁気的に非等価な可動プロトンの共鳴周波数に精密に調整された周波数の範囲において、Z-スペクトルを集め、そして、これらの２つの可動プロトンプールについて測定された飽和移動(ST)効果からレシオメトリック値を計算すること；
iii)計算されたSTから、関心のあるヒトまたは動物の体器官、領域、体液または組織における対象のパラメーターの濃度非依存性マップ(またはレシオメトリックマップ)を得、必要に応じて、該マップを形態画像上に重ね合わせること；
（該測定は、インビトロ(エクスビボ)、あるいは好ましくはヒトまたは動物の体器官、領域、体液または組織においてインビボで行う）；
を含む、CEST MRI技術を用いることによる、ヒトまたは動物の体器官、領域、体液または組織における診断対象の物理的または化学的パラメーターの測定方法に関する。
【００７５】
特に好ましい実施態様において、本発明は、HPDO3Aキレート配位子、またはその二量体もしくは多量体誘導体、またはその生理的に許容しうる塩のLn(III)キレート錯体の、NMRで区別可能な異性体に属する磁気的に非等価な可動プロトンを利用することを含む、対象のヒトまたは動物の体器官、領域、体液または組織におけるpHのインビボマップを得るための濃度非依存性CEST画像化法に関する。
【００７６】
この点で、可動プロトン周波数を照射し、Z-スペクトルを集め、レシオメトリックST効果を計算し、較正曲線を用いることによって体器官または領域における所望の物理的または化学的パラメーターのマップを得ることを含む、先に詳述した画像化ステップが、一度正しく設定されると、現在の診断実務において用いられる手順にしたがって、断層撮影法によって、そして、たとえば、実験セクションおよび参照することにより本発明に援用される引用文献において提供される画像化プロトコルなどに開示されているデータ処理手順を用いることによって、自動的に行われることは当業者には明らかである。
【００７７】
本発明方法において、本発明のCEST剤として働く、式(I)のLn(III)錯体化合物(またはその二量体もしくは多量体、またはその生理的に許容しうる塩)は、適当な医薬製剤の形態で投与される。
【００７８】
この点で、特に好ましい実施態様によれば、上記のCESTに基づく方法の両方は、適当な量の本発明のランタニド錯体化合物を含む医薬製剤を適当に前投与されたヒトまたは動物の身体において行われる。言い換えれば、特に好ましい実施態様によれば、本発明は、ヒトまたは動物の体器官、領域、体液または組織のインビボ画像化方法、あるいは適当な量の本発明のランタニド錯体化合物を含む医薬製剤を適当に前投与されたヒトまたは動物の身体において行われるCEST磁気共鳴画像化技術の使用による、ヒトまたは動物の体器官、領域、体液または組織における物理的または化学的パラメーターの、CEST MRI技術の使用による、インビボ評価もしくはマッピング方法に関する。本明細書で用いる「適当な量」は、その意図する診断目的：すなわち、たとえば、濃度非依存性対照画像を獲得すること、またはCESTに基づくMRI画像化技術の使用による、関心のあるヒトまたは動物の体器官、領域、体液または組織における対象のパラメーターの濃度非依存性マップを提供すること；を実現させるのに十分な本発明の造影剤またはその医薬組成物の量を意味する。
【００７９】
この点において、該投与または前投与は、たとえば、血管内注射（たとえば、静脈内、動脈内、脳室内注射用など）によって、または髄腔内、腹腔内、リンパ管内、腔内、経口または経腸で行うことができる。
【００８０】
式(I)のランタニド(III)錯体化合物の注射可能な医薬製剤は、典型的に、有効成分、すなわち、ランタニド錯体またはその医薬的に許容しうる塩、ならびに医薬的に許容しうる賦形剤を、薬理学的観点から適当な純度の水に溶解することによって製造される。得られる製剤は、適当に滅菌されて用いることができ、あるいは、別法として、凍結乾燥され、使用前に再構成されることもできる。
【００８１】
これらの製剤は、0.01〜0.5 mmol/体重kgの範囲の用量で、診断要求に応じた濃度で投与することができる。
【００８２】
先に述べたように、本発明の特に好ましい実施態様は、R2がHであり、R1が-CH3であり、キレート化Ln(III)イオンがYb(III)またはEu(III)から選ばれる、式(I)のLn(III)錯体である。したがって、この配位子のランタニド錯体化合物は、本発明の非限定的代表例として用いられている。
【００８３】
この配位子は、当業界で、HPDO3Aという名称で知られており、そのGd3+とのキレート化錯体は、従来のMRI画像化において用いられる公知の造影剤であり、ProHance(登録商標)として長く販売されている。この造影剤が示す非常に低い毒性および優れた耐容性は、当業界で長い間知られており、CEST画像化法におけるその使用を、この技術が要求する、従来のMRIにおいて典型的に用いられる10倍の用量(0.1 mmol/Kg)までの用量でさえも特に有利で安全にする。
【００８４】
HPDO3AのGd(III)およびYb(III)錯体の構造は、x線によって決定されている(たとえば、Kumar、K.；Chang、C. A.；Francesconi、L. C.；Dischino、D. D.；Malley、M. F.；Gougoutas、J. Z.；Tweedle、M. F. Inorg. Chem.1994、33、3567-75を参照)。該引用文献において、ラセミ溶液から出発したとしても、キラル2-ヒドロキシプロピル基を含む非対称ユニットの存在は、２つの別の錯体のすべての配位アームが、同じ配向を有する、すなわち、同じ様式でねじれている、大環の相対的配置が異なるジアステレオマー配置を有する２つの独立した錯体をもたらすことが報告されている。
【００８５】
溶液において、以下の構造：
2013542948.tif 000004
を有する(OH可動プロトンが丸で囲まれている)HPDO3AのLn(III)錯体は、典型的に、８つの異性体、さらに詳しくは、以下のスキーム1にて図式化される４つのジアステレオマーと４つのエナンチオンマーを示す。
【００８６】
スキーム1
【化１】
2013542948.tif 000005
【００８７】
それぞれRおよびS体に帰属する可能性が最も高い２つのジアステレオ異性体は、NMRスペクトル(図１に示す)において、特に、２つの主要なジアステレオ異性体に合理的に帰属する飽和移動の２つの領域を明確に示すYb-HPDO3AのZ-スペクトル(図２ｂに示す)において検出可能である。代わって、他の２つのジアステレオ異性体の証拠は、異なる温度で記録された錯体のNMRスペクトルの比較によって誘導される。
【００８８】
上記のすべてと完全に一致して、錯体の２つのNMRで区別可能なジアステレオ異性体のヒドロキシル基は、図２ａで示すように、20℃においてそれぞれ72および99 ppmという化学シフトの十分な相違ならびに交換速度の相違を示し、レシオメトリックに基づく本発明方法を設立するために利用することができる
【００８９】
pHに対するこの錯体によって示される応答性もまた、実験セクションにおいて詳細に報告するインビトロMRI実験によって実証されている。
【００９０】
得られた結果は、Yb-HPDO3Aジアステレオ異性体のOH可動プロトンのそれぞれによって示されるpHにおける飽和移動の従属が異なることを確認する。このことから、間葉系幹細胞を用いて行う試験における細胞内pHの濃度非依存性評価を可能にするレシオメトリックアプローチの利用ができるようになる。
【００９１】
興味深いことに、それぞれ図５のパネルbおよびcに示す、この試験から得られたSTマップは、ST効果が、YbHPDO3Aとともにインキュベートされたか、電気穿孔された細胞についてのみ見られ、いずれかの飽和が、錯体が無い場合に記録されたことを確認する。観察されたST効果は、測定されたpH7.00±0.2に対応する電気穿孔された細胞についてはより高く、細胞2のペレットで測定されたpHは、6.8±0.3であった。
【００９２】
特に、図８に示すように、Yb(III)HPDO3Aが示すpHに対する高感度は、腫瘍領域(皮下腫瘍)の環境pHの測定における、その有効な使用を可能にする。我々の知る限り、この結果は、CEST剤以前には達成されていなかった。
【００９３】
Yb(III)HPDO3Aが示す環境温度に対する応答性もまた試験されている。得られた結果は、特に、２つのNMRで区別可能なジアステレオマーの２つのヒドロキシルプロトンの化学シフトによって示される温度に対する関連感度を強調表示した。したがって、化学シフトは、濃度に依存しないので、環境の温度は、錯体のZ-スペクトルにおいて観察される化学シフトの値によって簡単に正確に得ることができる。
【００９４】
予想どおり、感度、特に、温度に対する感度の大幅な増加が、区別できる立体異性体のそれぞれについて４個以下のOH可動プロトンを含む、Yb(III)HPDO3Aの四量体誘導体で観察されている。
【００９５】
Yb(III)HPDO3Aが示すpHに対する同じ応答性もまた、対応するEu(III)錯体化合物について証明された。図１２に示す、この錯体のNMRスペクトルは、２つの主要な異性体をはっきりと示す。これらの異性体のヒドロキシルプロトンに属するシグナルは、それぞれ水およびD2O中にEuHPDO3Aを含む２つの異なる溶液のNMRスペクトルを比較することによって評価されている。したがって、２つの化学シフト(２つのジアステレオ異性体のOHプロトンによる)は、pH=2および37℃において、それぞれ20.5 ppm(水から)および16.7 ppmにて付与されている。しかしながら、図１３に示すように、生理的pH値に対して溶液pHを増加させることによって、プロトン交換速度は増加し、これらの２つのシグナル間の化学シフトにおける分離は減少して、生理的条件下での選択的照射が困難になる。しかしながら、STプロフィールを、異なる照射パルスを用いることによって記録したことから、6μT(照射パワー)で行うことによって、２つの別の共鳴の両方を観察し、次いで、レシオメトリック測定を行うことが可能であることが示され、飽和移動は、(真の吸収周波数に関して)中間値の共鳴周波数、すなわち約18ppmを用いることによって、どんな場合でも依然として観察される。
【００９６】
上述したすべてから、YbHPDO3AおよびEuHPDO3Aが、pHおよび温度のインビボ評価のための応答性CEST剤として効果的に用いることができるということが結論づけられる。
【００９７】
この点で、Yb-およびEu-HPDO3Aの両方が、対応するガドリニウム錯体であるProHance(登録商標)が示すような生体内分布、排出および耐容性に関して同じ特性をもつと見てよく、したがって、それらは、従来の解剖学的画像化と同種の画像化を促進する。しかしながら、有利なことに、Yb-およびEu-錯体の使用は、CESTに基づく解剖学的画像の獲得を可能にし、該剤が分配された増強された解剖学的領域のpHおよび／または温度に関するさらなる情報が、従来のMRIにおいてProHance(登録商標)によってすでに可能になっている解剖学的情報をさらに補完し、統合する。
【００９８】
原理のさらなる証拠として、以下の式：
2013542948.tif 000006
化合物2
で示される、4-[2-ヒドロキシ-3-[4,7,10-トリス[カルボキシメチル-2-(1,1-ジメチルエトキシ)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデシ-1-イル]プロポキシ]安息香酸のYb(III)錯体(以下、化合物2)が示すpHへの応答性も評価した。
【００９９】
化合物2のZ-スペクトル(図１４に示す)は、溶液内の錯体の２つの主要なジアステレオ異性体に起因する飽和移動の２つの領域を示す。２つの別のジアステレオ異性体の存在は、２つの適当にシフトされたOHプロトン共鳴、それぞれ50および94 ppmを提供する。
【０１００】
図１５および図１６から明らかなように、この錯体で行う応答性試験は、Yb(III)HPDO3Aの可動プロトンに見られる、この錯体のジアステレオ異性体のヒドロキシルプロトンによって示されるより高い交換速度ゆえの、より酸性のpH、好ましくは5.5〜6.2の範囲のpHにおける、そのpHに対するより高い感度を確認した。
【０１０１】
本発明のpH応答性剤のさらなる例は、以下の式：
2013542948.tif 000007
化合物3
で示される、1-(2-ヒドロキシエチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-4,7,10-三酢酸のYb3+ 錯体(以下、化合物3)によって表される。
【０１０２】
図１７に示す、この化合物のNMRスペクトルは、化合物のSAPおよびTSAP体に対応する２つの主要な異性体の存在に起因する２セットのシグナルを示す。実際、アセテートアームの配置または大環の配座のいずれかにおいて異なる４つの異性体が、溶液中に存在する。これらの異性体は、エナンチオマーのカップルなのでエナンチオマーが１つのNMR観測点から区別可能であるような２セットのシグナルがNMRスペクトルにおいて実際に期待される。上記と完全に一致して、化合物3のZ-スペクトル(試験されたpH値のそれぞれについて図１８に示す)は、共鳴がそれぞれ78および99 ppmにてシフトされる、この化合物によって提供される２つの異なる正反四角柱またはねじれ正反四角柱(SAPおよびTSAP)異性体のヒドロキシエチルアーム上のOH基に起因する２つの飽和領域の存在を示す。
【０１０３】
図１８に示す、この化合物を用いて6.4〜8のpH範囲で行った応答性試験の結果は、pHに対するその感度を確認する。
【０１０４】
本発明のLn(III)錯体化合物のもう１つの例は、以下の式：
2013542948.tif 000008
化合物4
で示される1-[2,3-ジヒドロキシ-3-アミンプロピル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-4,7,10-三酢酸のYb(III)錯体(以下、化合物4)である。
【０１０５】
この場合、２つの別のジアステレオ異性体の存在は、それぞれ２つの異なるSAPおよびTSAP異性体上の２つの異なるヒドロキシル-OH基に属する４つの非等価な可動プロトンを提供すべきである。
【０１０６】
実際、化合物4のZ-スペクトルおよび飽和移動STプロフィール(図１９に示す)は、それぞれ10、75および100 ppmにおける３つの安定にシフトしたプロトン共鳴の存在を確認する。それらのうち、大きくシフトした共鳴(それぞれ75および100 ppmにて)は、溶液中の化合物の２つの異なる異性体(SAPおよびTSAP)によって提供される金属中心の配位圏に最も近いOH基の交換プロトンに合理的に起因し、一方、より小さくシフトした共鳴は、金属中心からより離れた残りのOH基の交換プロトンに起因する。第４の交換プールは、おそらく、NMRの時間スケールでは交換速度が速すぎるという理由から、スペクトルにおいて検出されない。
【０１０７】
この錯体化合物を用いてインビトロで行われた応答性試験は、図１９および図２０からわかるように、そのpHに対する感度を確認する。
【０１０８】
特に、得られた結果は、それぞれ75 ppmおよび100 ppmにて２つのジアステレオ異性体のOH可動プロトンによって示される飽和移動のpHへの依存性が、異なることを確認する。このことは、pH値6.8で、この錯体化合物で標識したマウスマクロファージ細胞(J774)を用いて行った試験において、細胞内pHの濃度非依存性評価を可能にするレシオメトリックアプローチを利用できるようにする。
【０１０９】
さらなる例として、以下の構造式：
2013542948.tif 000009
化合物5
で示される1-[1,3,4-トリヒドロキシブタン-2-イル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-4,7,10-三酢酸のYb錯体(以下、化合物5)を調査した。
【０１１０】
この点において、この同じキレート配位子のGd3+錯体が、従来のMRI画像化における使用について臨床的に承認され、GADOVIST(登録商標)として市販されている周知の造影剤であるということは注目すべきである。その製造は、EP0448191に記載されている。
【０１１１】
この化合物の構造は、たとえば、Yb(III)HPDO3Aに関し、潜在的立体異性体の数を有意に増加させる２つの不斉中心を包含する。
【０１１２】
図２１に示すこの化合物のZ-スペクトルは、許可される複数のうち２つの最も豊富な立体異性体によるものである、それぞれ50および75 ppmにて区別可能な少なくとも２つのピークを示す。この化合物の可動プロトンを特徴付ける高い交換速度は、最も豊富なNMRで区別可能な異性体が、5.5前後のより低いpH値のみで検出可能であることをもたらす。代わって、より高いpH値においては、化合物構造の変化に起因する可能性が高い、スペクトル中-75におけるピークが現れる。
【０１１３】
本発明の好ましい式(I)のランタニド(III)錯体に包含されないが、上記化合物5は、本発明の濃度非依存性CEST画像化法を設定するのを可能にする、溶液中の作用剤のNMRで区別可能な立体異性体のヒドロキシル基に属する非等価な可動プロトンを提供する。
【０１１４】
したがって、本発明のレシオメトリックに基づくCEST画像化法における1-[1,3,4-トリヒドロキシブタン-2-イル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-4,7,10-三酢酸のランタニド(III)錯体の使用、ならびに該Ln(III)錯体の２つのNMRで区別可能な異性体によって提供される２つの磁気的に非等価な可動プロトンを利用するレシオメトリックに基づくCEST MRI法は、本発明に包含され、そのさらなる実施態様を構成する。
【０１１５】
実験セクション
式(I)のキレート配位子は当業界で周知であるか、あるいは周知の手順または当業者に公知の合成経路にしたがって容易に製造することができる。
【０１１６】
さらに、合成手順の非限定的例として、たとえば、レシオメトリックに基づくCEST画像化法における本発明のランタニド(III)錯体化合物の使用に関する詳細を記載する以下の実施例１〜３などが挙げられる。
【０１１７】
CEST画像化法および条件
Micro2.5マイクロイメージングプローブを備えたBruker Avance 300分光計で、7 Tにて取得した画像において、CEST MRコントラスト増強を測定した。代表的なRAREスピンエコー系列(RAREファクター64)、エコー時間3.3 msおよびTR値5を用いた。10 mmの正方視野(FOV)をもつ64x64の収集マトリックスを用いた。全シーケンスに先行して、連続波パルス2秒およびRF強度24、12、6 μTからなる飽和スキームを行った。Development and validation of a smoothing-splines-based correction method for improving the analysis of CEST-MR images、Stancanello J Terreno E、Delli Castelli D、Cabella C、Uggeri F 1、Aime S.；CONTRAST MEDIA & MOLECULAR IMAGING Volume：3、Issue：4、Pages：136-149、2008；およびMethods for an improved detection of the MRI-CEST effect. Terreno E、Stancanello J、Longo D、Delli Castelli D、Milone L、Sanders HMHF、Kok MB、Uggeri F、Aime S；CONTRAST MEDIA & MOLECULAR 画像化；Volume：4；Issue：5；Pages：237-247、2009(これらは、全体として参照することにより本発明に援用される)に開示されたように、広範に作動するMATLABプラットホームにコンパイルされたソフトウェアを用いることによってレシオメトリック値を決定するために、Z-スペクトルを連続的に分析した。Bruker Avance 600分光計(12T)で溶液の磁化率の測定を介して、溶液の全常磁性濃度を決定した。
【実施例１】
【０１１８】
(Yb3+)4HPDO3A四量体の製造
以下に主なステップを詳述するスキーム2に図式化された合成手順を用いることによって、四量体キレート錯体であるYbHPDO3A四量体を製造した。
スキーム2
【化２】
2013542948.tif 000010
【化３】
2013542948.tif 000011
【０１１９】
3,6-ジオキサ-8-ノネン酸(I)
THF(100 ml)中の2-アリルオキシエタノール(112 g；1.1 mol)の溶液を、THF(250 ml)中の水素化ナトリウムの懸濁液(油中60 %)(88 g；2.2 mol)に機械攪拌しながら滴下した。室温にて20時間後、THF(150 ml)中のブロモ酢酸(138.9 g；1.0 mol)の溶液を滴下し、溶媒の自発還流を引き起こした。溶液を還流下で2時間維持し、次いで、エタノール(50 ml)で希釈し、30分後、懸濁液を濃縮した。残渣を水(400 ml)に溶解し、溶液をエチルエーテル(3 x 100 ml)、ジクロロメタン(2 x 100 ml)で洗浄した；水性相を37%塩酸でpH1に酸性化し、生成物をジクロロメタン(300 ml＋4 50 ml)で抽出した。有機相を水(4 x 50 ml)、食塩水(40 ml)で洗浄し、液体残留物に蒸発させ、67 Paで減圧蒸留して、3,6-ジオキサ-8-ノネン酸(I)(119.5 g；0.746 mol)を無色液体で得た。収率75 %。p.eb67-Pa 98 -100℃。標記93.5 %。
【０１２０】
12,12’-ビス[2-アザ-3-オキソ-5,8-ジオキサ-11-ウンデカニル]-1,13-ジエン-4,7,17,20-トリオキサ-9,15-ジオキソ-10,14-ジアザトリコサン(II)
3,6-ジオキサ-8-ノネン酸(I)(40.1 g；0.25 mol)、ジイソプロピルエチルアミン(42.6 ml；32.4 g；0.25 mol)およびO-(ベンジルトリアゾール-1-イル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート[HBTU](96.0 g；0.25 mol)を、ジメチルホルムアミド(200 ml)中の2,2’-ビス-アミノメチレン-1,3-ジアミノプロパン(7.2 g；0.050 mol)の懸濁液に加えた。5日後、溶液を蒸発させ、残渣(200 g)をエチルエーテル(4 x 400 ml、4 x 50 ml)で処理し；エーテル溶液を5% NaHCO3溶液(6 x 50 ml)、塩水で洗浄し、蒸発させて、残渣(84.6 g)を水(2 x 100 ml)で処理し、次いで、高真空下で乾燥して、12,12’-ビス[2-アザ-3-オキソ-5,8-ジオキサ-11-ウンデカニル]-1,13-ジエン-4,7,17,20-トリオキサ-9,15-ジオキソ-10,14-ジアザトリコサン(II)を固体残渣(34.5 g)で得た。
【０１２１】
12,12’-ビス[2-アザ-3-オキソ-5,8-ジオキサ-10,11-オキシランウンデシル]-(1,2)(22,23)-ジオキシラン-4,7,17,20-トリオキサ-9,15-ジオキソ-10,14-ジアザトリコサン(III)
クロロホルム(500 ml)中のm-クロロ過安息香酸(70.5 %)(MCPBA)(36.9 g；0.150 mol)の溶液を水から分離し、クロロホルム(300 ml)中の12,12’-ビス[2-アザ-3-オキソ-5,8-ジオキサ-11-ウンデカニル]-1,13-ジエン-4,7,17,20-トリオキサ-9,15-ジオキソ-10,14-ジアザトリコサン(II)(17.5 g；0.025 mol)の溶液に攪拌しながら滴下した。室温にて2日後、m-クロロ過安息香酸およびm-クロロ安息香酸の両方が完全に除去されるまで、溶液を5% NaHCO3溶液で洗浄し、次いで、水および塩水で洗浄した。有機溶液を蒸発させ、残渣12,12’-ビス[2-アザ-3-オキソ-5,8-ジオキサ-10,11-オキシランウンデシル]-(1,2)(22,23)-ジオキソラン-4,7,17,20-トリオキサ-9,15-ジオキソ-10,14-ジアザトリコサン(III)をワックス状固体(20.0 g)で得た。
【０１２２】
1,23-ビス[4,7,10-トリアセティック[1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-(1)-イル]]-12,12’-ビス[11[4,7,10-トリアセティック)-[1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-(1)-イル]]2-アザ-3-オキソ-5,8-ジオキシ-10-ヒドロキシウンデカニル]2,22-ジヒドロキシ-4,7,17,20-テトラオキシ-9,15-ジオキソ-10,14-ジアザトリコサン(V)
アセトニトリル(50 ml)中の12,12’-ビス[2-アザ-3-オキソ-5,8-ジオキサ-10,11-オキシランウンデシル]-(1,2)(22,23)-ジオキシラン-4,7,17,20-トリオキサ-9,15-ジオキソ-10,14-ジアザトリコサン(III)(3.6 g；0.0047 mol)、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7-三酢酸の1,1-ジメチルエチル トリス-エステル(10.3 g；0.020mol)およびジイソプロピルエチルアミン(4.0 ml；0.047 mol)の溶液を50℃にて10日間加熱した。溶液を蒸発させて、1,23-ビス[4,7,10-トリス(1,1-ジメチルエチルアセテート)[1,4,7,10-テトラアザシクロデカン-(1)-イル]]-12,12’-ビス[11[4,7,10-トリス(1,1-ジメチルエチルアセテート)[1,4,7,10-テトラアザシクロデカン-(1)-イル]]-2-アザ-3-オキソ-5,8-ジオキシ-10-ヒドロキシウンデカニル]-2,22-ジヒドロキシ-4,7,17,20-テトラオキシ-9,15-ジオキソ-10,14-ジアザトリコサン(IV)を得た。粗残渣を氷浴で冷却した；攪拌しながら、トリフルオロ酢酸(20 ml)を加えた；ついで、トリスイソプロピルシラン(100 mcl)の溶液を加えた。5日後、エチルエーテル(200 ml)を加え、沈殿をろ過し、乾燥した(13.4 g)。固体を水(15 ml)に溶解し、溶離液(勾配：0〜100 % v/v)としてメタノール／水を用いるAmberchrome CG161(2.6 x 55 cm)(AKTA FPLC)上のクロマトグラフィーによって精製した。純粋な画分を凍結乾燥して、所望生成物(V)を白色固体で得た(4.4 g)。
【０１２３】
錯適定による標記化合物＝74 %(0.1N 硫酸亜鉛およびムレキシド、pH10にて)、主要不純物は、トリフルオロ酢酸によって表される。
【０１２４】
得られた生成物のNMR(13C)スペクトルは、キレート配位子の構造と一致する。
【０１２５】
1,23-ビス[4,7,10-トリアセテート[1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-(1)-イル]]-12,12’-ビス[11[4,7,10-トリアセテート)-[1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-(1)-イル]]2-アザ-3-オキソ-5,8-ジオキシ-10-ヒドロキシウンデカニル]2,22-ジヒドロキシ-4,7,17,20-テトラオキシ-9,15-ジオキソ-10,14-ジアザトリコサン・テトライッテルビウム錯体(1:4)(VI)
水(25 ml)中の塩化イッテルビウム・六水和物(3.92 mol)の溶液を、攪拌している水(100 ml)中の配位子(3.5 g；0.98 mmol；配位子の正確なモル量は、錯適定によって決定された)の溶液に加え、2N水酸化ナトリウム(11.4 ml)で、pH7まで溶液を非常にゆっくりと中和した。過剰の配位子が、＜0.2 %であり、pHが一定である場合、溶液をSephadex G10カラムによって脱塩し、溶液を凍結乾燥した後、所望の錯体、1,23-ビス[4,7,10-トリアセテート[1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-(1)-イル]]-12,12’-ビス[11[4,7,10-トリアセテート)-[1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-(1)-イル]]2-アザ-3-オキソ-5,8-ジオキシ-10-ヒドロキシウンデカニル]2,22-ジヒドロキシ-4,7,17,20-テトラオキシ-9,15-ジオキソ-10,14-ジアザトリコサン・イッテルビウム錯体(1:4)(VI)(2.3 g)を得た。
【実施例２】
【０１２６】
1-(2-ヒドロキシエチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-4,7,10-三酢酸のイッテルビウムキレート錯体(化合物3)の製造
以下に主なステップを詳述するスキーム3に図式化された一般的合成手順を用いることによって、化合物3に対応するイッテルビウムキレート錯体を製造した。
スキーム3
2013542948.tif 000012
【０１２７】
1-[2-[テトラヒドロピラン-(2-イル)-オキソ]エチル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-4,7,10-トリアセティック-(1,1-ジメチルエチルエステル)(VIII)
【０１２８】
J. Org. Chem. 1986、51、752-755に記載の手順にしたがって、(2-ブロモメトキシ)テトラヒドロピラン(VII)を合成した。この基質(27.5 mmol；5.75 g)を50 mlのアセトニトリルに溶解し、アセトニトリル(150 ml)中のK2CO3(75 mmol；10.37 g)およびたとえば、W096/28433などの開示にしたがって製造したDO3A-トリス-tert-ブチルエステル・ブロモハイドレート(25 mmol；14.89 g)の懸濁液に滴下した。一夜室温に置いた後、混合物をろ過し、蒸発させた。次いで、残渣を酢酸エチル(100 ml)に溶解し、水および塩水で洗浄した。有機溶液を減圧濃縮し、酢酸エチル／エタノール勾配を用いるシリカゲルクロマトグラフィーによって、粗生成物を精製した。生成物含有画分を合せて蒸発させて、黄色油状物(8.1 g；収率49 %)を得た。
【０１２９】
1H-NMR(600 MHz、CD3Cl)and 13C NMR(150 MHz、CD3Cl)は、所望の構造と一致した。
MS [M+H]+ 計算値：642.46 実測値：643.64。
【０１３０】
1-(2-ヒドロキシエチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-4,7,10-三酢酸(IX)
THP部分を除去するために、中間体VIII(15 g；21.5 mmol)を水(30 ml)、THF(60 ml)および酢酸(120 ml)に溶解し、室温にて24時間攪拌した。次いで、混合物を濃縮し、トリイソプロピルシラン(120 μl)およびTFA(40 ml)を0℃にて滴下した。室温にて3日後、ジエチルエーテル(200 ml)で粗生成物を沈殿させ、ろ過し、Amberchrom CG161樹脂および0.2% TFA水溶液を用いる液体クロマトグラフィーによって精製した。次いで、所望生成物含有画分をあわせ、凍結乾燥し、1N HCl(60 ml)で酸性化し、再度凍結乾燥した(7.3 g；収率80 %)。
【０１３１】
1H-NMR(600 MHz、D2O)および13C NMR(150 MHz、D2O)は、所望の構造と一致した。
MS [M+H]+ 計算値：390.21 実測値：391.53。
【０１３２】
1-(2-ヒドロキシエチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-4,7,10-トリアセテート(3-)メタレート(X)
配位子付加法(J. Med. Chem. 2006、49、4926を参照)により、水溶液中のMeCl3(Me＝Yb、Eu、TmまたはDy)を用いて、pH6.5にて錯体形成反応を行った。IXの水溶液に、0.1 N NaOHでpHを6.5に維持しながら、等モル量の水性MeCl3溶液をゆっくりと加えた。pHが一定になるまで、混合物を室温にて攪拌した。キシレノールオレンジアッセイ(Contrast Med. Mol. Imaging 2006、1、184を参照)を用いてモニターし、金属がわずかに過剰に達したとき、少し過剰の配位子を加えた(＜2 %)。次いで、サイズ排除クロマトグラフィーにより錯体を脱塩し、凍結乾燥した。
【０１３３】
エバンス試験(DM Corsi、C. P. Iglesias、H. van Bekkum、JA Peters、Magnetic Resonance in Chemistry、2001、39、(11)、723-726)によって測定ｓれた標記錯体は、98%であった。
【実施例３】
【０１３４】
1-[2,3-ジヒドロキシプロピル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-4,7,10-三酢酸のイッテルビウムキレート錯体(化合物4)の製造
以下に主なステップを詳述するスキーム4に図式化された合成手順を用いることによって、化合物4に対応するイッテルビウムキレート錯体を製造した。
スキーム4
【化４】
2013542948.tif 000013
【０１３５】
1-[2,3-ジヒドロキシプロピル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-4,7,10-三酢酸(XIII)
アセトニトリル(50 ml)中の2,3-エポキシプロパノール(12.0 g；0.20 mol)、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7-三酢酸の1,1-ジメチルエチル トリス-エステル(10.3 g；0.020mol)(XI)およびジイソプロピルエチルアミン(8.0 ml；0.09 mol)の溶液を、50℃にて3日間加熱した。溶液を蒸発させて、1-[2,3-ジヒドロキシプロピル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-4,7,10-トリス(1,1-ジメチルエチルアセテート)(XII)を得た。粗生成物をジクロロメタン(100 ml)に溶解し、氷浴で冷却し、次いで、攪拌しながらトリフルオロ酢酸(15 ml)を加えた；ジクロロメタンを蒸発させ、トリフルオロ酢酸(90 ml)およびトリイソプロピルシラン(200 μl)を加えた。1日後、エチルエーテル(200 ml)を加え、沈殿をろ過し、乾燥した(16.5 g)。固体を水(30 ml)に溶解し、水を溶離液として用い、アンバーライトXAD 1600(5 x 12 cm)(AKTA FPLC)で精製した。純粋な画分を凍結乾燥した後、所望の配位子(XIII)を白色固体で得た(10.6 g)。
NMR(13C)スペクトルは、キレート配位子の構造と一致する。
次いで、回収した配位子の錯適定(0.1N 硫酸亜鉛およびムレキシド、pH2にて)を行って、その完全な錯形成に必要な酸化ランタニドの量を評価した。
得られた標記化合物(41.9%)は、配位子の錯形成後に除去される溶媒およびトリフルオロ酢酸の残留する存在が確認される。
【０１３６】
1-[2,3-ジヒドロキシ-3-アミンプロピル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-4,7,10-トリアセテート・メタレート(XIV)；
水(30 ml)中の1-[2,3-ジヒドロキシプロピル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-4,7,10-三酢酸(XII)(4.4 g；4.43 mmol；錯適定によって計算)の溶液に、攪拌しながら酸化金属(2.21 mmol)を加え、溶液を90℃に加熱した。酸化物が溶解したら、溶液を冷却し、ミリポア0.45 μmでろ過し、pH7になるまでリライト3ASFBをゆっくりと加えた；樹脂をろ過し、溶液を凍結乾燥して、[2,3-ジヒドロキシプロピル]-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-4,7,10-トリアセテート・メタレート(XIV)を得た。
2013542948.tif 000014
【０１３７】
pH5.8の指示薬としてキシレノールオレンジを用いる0.001 Mの金属塩化物による錯適定によって過剰の配位子を測定した。
標記錯体は、エバンス試験によって測定した(DM Corsi、C. P. Iglesias、H. van Bekkum、JA Peters 、Magnetic Resonance in Chemistry、39、11、pages 723-726、2001)。
【実施例４】
【０１３８】
インビトロ試験
pHに対するYb(III)HPDO3Aの応答性
14個のキャピラリーを含むファントムを用いて、pHに対するYb(III)HPDO3Aの応答性をインビトロで調査した。キャピラリーのうち、11個は、5.19〜8.75の範囲で異なるpHを有する濃度24 mMのYbHPDO3Aの溶液を含み(キャピラリー 1-11)、3個は、pH7.31にて、3〜24 mMの範囲のYbHPDO3Aの溶液を含むものである。20℃および37℃にてCEST MRI実験を行った。それぞれ72および99 ppmで照射されたファントムのMR画像を記録し、図３に示した。さらに詳しくは、図3c)は、72 ppmでのヒドロキシルプロトンの照射(20℃；照射パワーパルス24 μT)により得られたSTマップを示し、図3d)は、99 ppmでのヒドロキシルプロトンの照射(20℃；照射パワーパルス24 μT)により得られたSTマップを示す。
【０１３９】
得られた結果から、溶媒中の２つのYb(III)HPDO3Aジアステレオマーの各OHプロトンによって示される飽和移動のpH依存性が異なることが確認でき、レシオメトリックアプローチの利用が可能であることがわかる。次いで、それぞれ72および99 ppmでの２つの異性体のヒドロキシルプロトンの照射から得られたpHの変動に伴うST効果の変動を測定することによって、図3e)に示す較正曲線を行い、図3f)のレシオメトリック曲線が得られた。
【実施例５】
【０１４０】
細胞内pHを評価するためのYb(III)HPDO3Aの使用
試験のための細胞株として、間葉系幹細胞を選択した。実験に用いる細胞をマウス骨髄細胞から抽出し、次いで、20% FBS(ウシ胎仔血清)を加えたαMEM培地中で培養した。初代培養にて、細胞にプリモシン（primocin）を加える。集密が約70%になったとき、0.25トリプシン−EDTAで細胞をはがし、PBSで洗浄し、次いで、0.15 M YbHPDO3Aの溶液に再懸濁した。細胞の一部を37℃にて3時間インキュベートし、一部を電気穿孔した。細胞をPBSで洗浄し、MRI実験用に調製した。
【０１４１】
さらに詳しくは：1)PBS中、37℃、pH7.4にて、0.15MのYbHPDO3Aを含む溶液とともに3時間インキュベートされたMSH細胞のペレット(キャピラリー2)；2))PBS中、pH7.4にて、0.15MのYbHPDO3Aの溶液とともに電気穿孔されたMSH細胞のペレット(キャピラリー3)；3)PBSのみとともにインキュベートされ、参照として用いられたMSH細胞のペレット(キャピラリー1)、および空のキャピラリー(キャピラリー4)を含むファントムについてのCESTマップ(図５に示す)を得た。それぞれ、72および99 ppmにてファントムを照射して、ST効果%を測定した。それぞれ図５のパネルbおよびcに記載の得られたSTマップから、錯体の不在下でも何らかの飽和は記録されたが、ST効果%は、YbHPDO3Aとともにインキュベートされたか、または電気穿孔された細胞についてのみ見られたことが示される。キャピラリー2のインキュベートされた細胞のペレットにおいて測定されたpHは、6.8±0.3であったが、観察されたST効果は、7.00±0.2という測定されたpHに対応する、電気穿孔された細胞について、より高かった。
【実施例６】
【０１４２】
インビボ試験
黒色腫の動物モデルにおけるpHの評価のためのYb(III)HPDO3Aの使用
黒色腫の動物モデルにおいて、1.2mmol/KgのYbHPDO3Aの静脈内注射で、インビボ測定を行った。6〜10週齢の雌性C57Bl6マウス(Charles River Laboratories、カルコ、イタリア)の左わき腹に、ATCC(マナッサス、バージニア州、アメリカ合衆国)から入手し、10% FBS、2 mMグルタミン、100 U/mlペニシリンおよび100 μg/mlストレプトマイシンを補足したDMEM培地(ダルベッコ変法イーグル培地)中で培養した約1×106個のB16マウス黒色腫細胞を含む単独懸濁液0.2 mlの皮下接種を行った。
【０１４３】
Micro2.5 マイクロ画像化プローブを備えたBruker Avance 300(ブルカー、ドイツ)分光計を用い、7 Tにて、CEST造影MR画像を得た。
【０１４４】
細胞接種の7日後、すなわち、腫瘍体積が平均直径約4 mmに達したとき、マウスにYbHPDO3Aの溶液(CEST剤1.2 mmol/Kg、すなわち、ProHance(登録商標)の臨床的承認用量の3倍に対応する、200 μLの150 mM YbHPDO3A溶液)を注射した。
【０１４５】
方形連続波(持続時間 2s、パワー12 μT、周波数範囲 1 ppmステップにおいて-20〜20 ppm)、次いで、RAREシーケンス(RAREファクター8、実効エコー時間 4.1 ms)を用いることによって、CEST剤の静脈内注射の前および直後に、Z-スペクトルを得た。膀胱、腎臓および腫瘍においてCESTコントラストを測定した。膀胱で集めたZ-スペクトル(図６に記載)は、予測された37℃より低い生理的T(33℃)に対応する交換プールについてのシフトを明らかにした。次いで、この温度で、pHからのST依存性の較正を繰り返し、次いで、前記実施例２で記載した手順を行った。得られたレシオメトリック曲線を図７に示す。
【０１４６】
次いで、レシオメトリック法の適用によって、膀胱、腎臓および腫瘍においてST効果を測定したところ、膀胱において6.06 ±0.2、腎臓髄質において6.24±0.2、腫瘍において6.6±0.2のpHが得られた。
【０１４７】
図８において、腫瘍領域において計算されたSTマップを、対応する解剖学的画像に重ね合わせたが、実際に断層表示上に現れる画像においては鮮赤色である明るい領域として現れる
【実施例７】
【０１４８】
インビトロ試験
温度に対するYb(III)HPDO3Aの応答特性
pH7.31のYb(III)HPDO3A(24mM)の溶液を用いて試験した。それぞれ20および37℃で記録した溶液のZスペクトルは、溶液中のNMRで区別可能なYb(III)HPDO3Aジアステレオ異性体のヒドロキシルプロトンの化学シフトは、温度に対して非常に感度が高いことを示した。事実、図４の、パネルb)に示すように、20℃から37℃に変わると、錯体の２つの異なる立体異性体に対応する共鳴周波数は、それぞれ99から88 ppmに、72から64.3 ppmに変わる。プロトン化学シフトは、CEST剤の濃度に依存しないので、Z-スペクトルを集めるだけで、環境の温度を正確に決定すること、そして、適切なインビトロ較正を用いてpHを決定することが可能になる。
【実施例８】
【０１４９】
温度に対するYb(III)HPDO3A四量体の応答特性
0.26〜8.4 mMの範囲の異なる濃度、pH7.4および298Kにて、血清中のYbHPDO3A四量体の溶液を含むファントムを用いて試験を行った。単量体について前述したように操作することにより、温度における(四量体錯体の立体異性体の)OH可動プロトンの化学シフトの依存性を試験した。図１０に示す、得られたレシオメトリック曲線から、実施例７において単量体で得られた結果が実質的に確認される。しかしながら、予想通り、そして図１０のパネルb)から明らかなように、四量体錯体の分子当たりの感度は大きく増加した(対応する単量体と比較して)。
【実施例９】
【０１５０】
細胞内pHを評価するための化合物4の使用
試験用細胞株として、マウスマクロファージ細胞(J774)を選択した。この化合物を用いて得られたレシオメトリック曲線の感度の範囲を、まず、細胞内pHの範囲で適切に調節した。
【０１５１】
さらに詳しくは、それぞれ75 ppm(サイト1)および100 ppm(サイト2)にて２つのシフトされた可動プロトンプールを照射することによってpHに関して計算されたST曲線に対してレシオメトリックアプローチを適用することによって、5.5〜7の範囲のpHにおけるレシオメトリックSTの変動を表す図２０に示すレシオメトリック曲線が得られた。
【０１５２】
化合物4をマウスマクロファージ細胞(J774)に入れた。J774は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC、マナッサス、バージニア)から入手した。細胞を、10% ウシ胎児血清(FBS)、100 U/mlペニシリンおよび100 mg/mlストレプトマイシンを補足したダルベッコ変法イーグル培地培地(DMEM)中で培養した。細胞を、約2x104細胞/cm2の密度で75-cm2フラスコに播種し、湿度の高い5% CO2インキュベーター中、37℃にて培養した。J774を70 mMの化合物4とともに一夜インキュベートした。細胞を洗浄し、その生育培地とともに3時間再度インキュベートした。次いで、0.25%トリプシン−EDTAで細胞をはがし、MRI CEST実験用に調製した。
【０１５３】
化合物4または生育培地とともに一夜インキュベートされた細胞のペレットを含むファントムのZ-スペクトルを得ることによって、飽和移動のレシオメトリック値を計算した。
インキュベートされた細胞について観察されたST効果から、pH値6.8を得た。
【実施例１０】
【０１５４】
インビトロ試験
pHに対する化合物4の応答性
濃度20 mMおよび5.08〜7.4の範囲の異なるpHを有するイッテルビウム錯体の溶液を含む６個のキャピラリーを含むファントムを用いることにより、pHに対する化合物4の応答性をインビトロで審査した。CEST MRI実験を20℃にて行った。それぞれ75および100 ppmにて照射された(照射パワー24 μT)ファントムから集めたZ-スペクトルを図１９に示す。
pHの関数として得られたレシオメトリックST曲線を図２０に示す。
【図１】
2013542948.tif 000016
【図２ａ】
2013542948.tif 000017
【図２ｂ】
2013542948.tif 000018
【図３ａ−３ｄ】
2013542948.tif 000019
【図３ｅ】
2013542948.tif 000020
【図３ｆ】
2013542948.tif 000021
【図４ａ】
2013542948.tif 000022
【図４ｂ】
2013542948.tif 000023
【図５ａ】
2013542948.tif 000024
【図５ｂ】
2013542948.tif 000025
【図５ｃ】
2013542948.tif 000026
【図６】
2013542948.tif 000027
【図７】
2013542948.tif 000028
【図８】
2013542948.tif 000029
【図９】
2013542948.tif 000030
【図１０ａ】
2013542948.tif 000031
【図１０ｂ】
2013542948.tif 000032
【図１１】
2013542948.tif 000033
【図１２ａ】
2013542948.tif 000034
【図１２ｂ】
2013542948.tif 000035
【図１３ａ】
2013542948.tif 000036
【図１３ｂ】
2013542948.tif 000037
【図１３ｃ】
2013542948.tif 000038
【図１４】
2013542948.tif 000039
【図１５】
2013542948.tif 000040
【図１６】
2013542948.tif 000041
【図１７】
2013542948.tif 000042
【図１８】
2013542948.tif 000043
【図１９】
2013542948.tif 000044
【図１９−２】
2013542948.tif 000045
【図２０】
2013542948.tif 000046
【図２１】
2013542948.tif 000047
【国際調査報告】
2013542948.tif 000048
2013542948.tif 000049
2013542948.tif 000050