(57)【要約】  ビーズベースのアッセイシステムの検出領域でビーズに接着している分析物の正規化量を決定する方法であって、ａ）分析物の複合体に第１光を蛍光もしくは化学発光させるか、または染料を放出させるステップと、ｂ）検出領域でビーズから発光される第１光の積分強度、または検出領域でビーズから放出される染料の濃度、または両方を測定するステップと、ｃ）分析物がビーズに接着しているか否か、あるいはどれだけ多く接着しているかに関係なく、検出領域で光をビーズと相互作用させるステップと、ｄ）分析物に依存しないビーズとの相互作用の結果生じる第２光を測定するステップと、ｅ）第１光の積分強度、または染料の濃度、または両方から、かつ測定された第２光から、分析物の正規化量を決定するステップとを含む。【選択図】  図３Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビーズベースのアッセイシステムの検出領域でビーズに接着している分析物の正規化量を決定する方法であって、
ａ）分析物の複合体に第１光を蛍光もしくは化学発光させるか、または染料を放出させるステップと、
ｂ）検出領域でビーズから発光される第１光の積分強度、または検出領域でビーズから放出される染料の濃度、または両方を測定するステップと、
ｃ）分析物がビーズに接着しているか否か、あるいはどれだけ多く接着しているかに関係なく、検出領域で光をビーズと相互作用させるステップと、
ｄ）分析物に依存しないビーズとの相互作用の結果生じる第２光を測定するステップと、
ｅ）第１光の積分強度、または染料の濃度、または両方から、かつ測定された第２光から、分析物の正規化量を決定するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
分析物の正規化量を決定するステップは、
ａ）第１光の積分強度、または染料の濃度、または両方から、検出領域でビーズに接着している分析物の量を決定すること、
ｂ）測定された第２光から、検出領域のビーズの量を推定すること、および
ｃ）推定されたビーズの量を用いて分析物の量を正規化すること、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第２光を測定するステップは検出領域の画像を取得することを含み、ビーズの量を推定することは、画像処理ソフトウェアを用いて画像内のビーズを計数することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第２光を測定するステップは検出領域から第２光の積分強度を測定することを含み、分析物の正規化量を決定するステップは第２光の積分強度を用いることを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
ビーズの量を推定することは、検出領域からの第２光の積分強度だけを用いて推定すること、または検出領域からの第２光の積分強度だけおよび１つ以上の較正パラメータを用いることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
ビーズの量を推定することは、検出領域からの第２光の積分強度に比例する量を推定することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
相互作用はビーズからの光の反射を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
相互作用はビーズを介する光の屈折を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
相互作用は、光によるビーズからの励起蛍光発光を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
複合体は、第２光とは異なる波長範囲の第１光を発光させる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
複合体は、時間と共に変動するスペクトルの励起光をビーズに照射することによって、第２光とは異なる時間依存性で第１光を蛍光発光させられる、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
相互作用は、ビーズによる光の遮断または吸収、および光によるビーズ間の領域からの反射またはビーズ間の領域の通過を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
第１光、第２光、または両方の積分強度を測定することは、フィルタを通過した後の光を測定することを含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
複合体は第１光を発光させられ、第１光および第２光を測定するときにビーズは同一場所に位置する、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ビーズに接着している分析物を定量するためのシステムであって、
ａ）ビーズとビーズに接着している分析物とが保持される検出領域と、
ｂ）ビーズに接着している分析物の量に応じて、ビーズからの蛍光もしくは化学発光の積分強度またはビーズからの染料の触媒作用による放出のうちの１つ以上を測定する第１検出器と、
ｃ）分析物がビーズに接着しているか否か、あるいはどれだけ多く接着しているかに関係なく、検出領域でビーズと相互作用する光を発生する光源、
ｄ）相互作用の結果としてビーズから受光する光を測定する、第１検出器と同一かまたは異なる第２検出器と、
ｅ）第１および第２検出器の測定値を使用して、ビーズに接着している分析物の正規化量を決定するコントローラと、
を備えたシステム。
【請求項１６】
第１検出器が第１光を測定しているときに、第１光を第１検出器に優先的に進入させるように位置する第１フィルタをさらに備える、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
第２検出器が第２光を測定しているときに、第２光を第２検出器に優先的に進入させるように位置する第２フィルタをさらに備える、請求項１５または１６に記載のシステム。
【請求項１８】
分析物を定量するために使用される磁気ビーズをセルの検出領域に集中させる方法であって、磁場を用いてビーズを検出領域に引き寄せながらセルを振動させるステップを含む方法。
【請求項１９】
ビーズは磁性であり、方法は、請求項１８に記載の方法によって、検出領域にビーズを集中させるステップをさらに含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
セルを振動させるステップは、３０Ｈｚから２００Ｈｚの間の卓越周波数で振動させることを含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
卓越周波数は６０Ｈｚから１００Ｈｚの間である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
セルを振動させるステップは、少なくとも０．５ｍｍのピーク間振幅で振動させることを含む、請求項１８〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
ピーク間振幅は少なくとも１ｍｍである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
セルを振動させるステップは、ビーズが検出領域の縁部に位置する場合に、水平成分、垂直成分、または両方について、ビーズの少なくとも大部分に対し、ビーズの質量とビーズの最大加速度との積が、ビーズに掛かる磁力の０．３倍から１０倍になるように、振動させることを含む、請求項１８〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
ビーズに接着している分析物を定量するためのシステムであって、
ａ）ビーズ用の載置面を持つ検出セルと、
ｂ）ビーズが載置面上に位置するときに、ビーズを載置面の検出領域に向かって引き寄せるように位置する磁石と、
ｃ）磁石がビーズを検出領域に向かって引き寄せるときに、検出領域におけるビーズの集中を容易にするように検出セルを振動させる振動器と、
ｄ）ビーズに接着している分析物の量に応じて、検出領域におけるビーズからの蛍光もしくは化学発光の積分強度、または検出領域でビーズから放出される染料の濃度のうちの１つ以上を測定する第１検出器と、
ｅ）第１検出器の測定値を使用して、ビーズに接着している分析物の量を決定するコントローラと、
を備えたシステム。
【請求項２６】
システムはさらに、
ａ）分析物がビーズに接着しているか否か、あるいはどれだけ多く接着しているかに関係なく、検出領域でビーズと相互作用する光を発生する光源と、
ｂ）相互作用の結果としてビーズから受光する第２光を測定する、第１検出器と同一かまたは異なる第２検出器と、
を備え、コントローラが第１および第２検出器の測定値を使用して、ビーズに接着している分析物の正規化量を決定する、請求項２５に記載のシステム。
【請求項２７】
振動器は、検出領域外の載置面の少なくとも一部分に対し磁石がビーズを引き寄せるときに、ビーズの少なくとも一部分に対し、ビーズの質量と検出セルの最大加速度との積が、ビーズと載置面との間の静止摩擦力より大きくなるように、検出セルを振動させることができる、請求項２５または２６に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００９年１１月３０日に出願された米国仮特許出願Ｎｏ．６１／２６４８７３からの３５  ＵＳＣ  １１９（ｅ）下の優先権の利益を主張する。上述の文献の内容は参考としてここに完全に述べられているかのように組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、その一部の実施形態では、ビーズを用いて流体中の分析物を定量するためのシステムおよび方法に関し、さらに詳しくは、分析物をビーズに接着させて、蛍光によって測定する、生化学的、生物学的または生物医学的アッセイに関するが、それに限定されない。
【背景技術】
【０００３】
Ｒｏｔｈらの米国特許出願公開第２００７／０２８１３１１号明細書は、蛍光染料またはタグに結合された微小球またはビーズからの発光を測定するためのシステムを記載しており、蛍光染料またはタグは生物反応を示すかあるいはそれに略比例する。ビーズは磁性であり、ＣＣＤによってビーズが一度に多数のビーズずつ撮像される間、撮像容積内の磁石によって固定化される。該システムは、Ｃｈａｎｄｌｅｒらの米国特許第５９８１１８０号明細書に記載されていると言われる、蛍光粒子が連続的に一度に１つずつ検出される、フローサイトメータを用いる先行技術のシステムと比較される。
【０００４】
Ｒｏｔｈの米国特許出願公開第２００７／００６４９９０号明細書は、均一濃度の蛍光物質を有する粒子の第１画像、および未知の濃度の蛍光物質を有する粒子の第２画像を解析する方法を含む、蛍光粒子の画像を解析するための画像処理方法を記載している。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の一部の実施形態の態様は、磁場および振動を用いて検出領域にビーズを集中させ、かつ／またはビーズに接着している分析物の濃度の測定とは別個に、検出領域におけるビーズの数を光学的に測定する、分析物のビーズベースのアッセイに関する。
【０００６】
本発明の例示的実施形態では、ビーズベースのアッセイシステムの検出領域でビーズに接着している分析物の正規化量を決定する方法であって、
ａ）分析物の複合体に第１光を蛍光もしくは化学発光させるか、または染料を放出させるステップと、
ｂ）検出領域でビーズから発光される第１光の積分強度、または検出領域でビーズから放出される染料の濃度、または両方を測定するステップと、
ｃ）分析物がビーズに接着しているか否か、あるいはどれだけ多く接着しているかに関係なく、検出領域で光をビーズと相互作用させるステップと、
ｄ）分析物に依存しないビーズとの相互作用の結果生じる第２光を測定するステップと、
ｅ）第１光の積分強度、または染料の濃度、または両方から、かつ測定された第２光から、分析物の正規化量を決定するステップと、
を含む方法を提供する。
【０００７】
任意選択的に、分析物の正規化量を決定するステップは、
ａ）第１光の積分強度、または染料の濃度、または両方から、検出領域でビーズに接着している分析物の量を決定すること、
ｂ）測定された第２光から、検出領域のビーズの量を推定すること、および
ｃ）推定されたビーズの量を用いて分析物の量を正規化すること、
を含む。
【０００８】
任意選択的に、第２光を測定するステップは検出領域の画像を取得することを含み、ビーズの量を推定することは、画像処理ソフトウェアを用いて画像内のビーズを計数することを含む。
【０００９】
任意選択的に、第２光を測定するステップは検出領域から第２光の積分強度を測定することを含み、分析物の正規化量を決定するステップは第２光の積分強度を用いることを含む。
【００１０】
任意選択的に、ビーズの量を推定することは、検出領域からの第２光の積分強度だけを用いて推定すること、または検出領域からの第２光の積分強度だけおよび１つ以上の較正パラメータを用いることを含む。
【００１１】
任意選択的に、ビーズの量を推定することは、検出領域からの第２光の積分強度に比例する量を推定することを含む。
【００１２】
任意選択的に、相互作用はビーズからの光の反射を含む。
【００１３】
追加的に、または代替的に、相互作用はビーズを介する光の屈折を含む。
【００１４】
追加的に、または代替的に、相互作用は、光によるビーズからの励起蛍光発光を含む。
【００１５】
任意選択的に、複合体は、第２光とは異なる波長範囲の第１光を発光させる。
【００１６】
追加的に、または代替的に、複合体は、時間と共に変動するスペクトルの励起光をビーズに照射することによって、第２光とは異なる時間依存性で第１光を蛍光発光させられる。
【００１７】
任意選択的に、相互作用は、ビーズによる光の遮断または吸収、および光によるビーズ間の領域からの反射またはビーズ間の領域の通過を含む。
【００１８】
任意選択的に、第１光、第２光、または両方の積分強度を測定することは、フィルタを通過した後の光を測定することを含む。
【００１９】
任意選択的に、複合体は第１光を発光させられ、第１光および第２光を測定するときにビーズは同一場所に位置する。
【００２０】
任意選択的に、ビーズは磁性であり、方法はまた、磁場を用いてビーズを検出領域に引き寄せながらセルを振動させることによって、検出領域にビーズを集中させるステップをも含む。
【００２１】
さらに、本発明の例示的実施形態では、ビーズに接着している分析物を定量するためのシステムであって、
ａ）ビーズとビーズに接着している分析物とが保持される検出領域と、
ｂ）ビーズに接着している分析物の量に応じて、ビーズからの蛍光もしくは化学発光の積分強度またはビーズからの染料の放出のうちの１つ以上を測定する第１検出器と、
ｃ）分析物がビーズに接着しているか否か、あるいはどれだけ多く接着しているかに関係なく、検出領域でビーズと相互作用する光を発生する光源、
ｄ）相互作用の結果としてビーズから受光する光を測定する、第１検出器と同一かまたは異なる第２検出器と、
ｅ）第１および第２検出器の測定値を使用して、ビーズに接着している分析物の正規化量を決定するコントローラと、
を備えたシステムを提供する。
【００２２】
任意選択的に、システムはまた、第１検出器が第１光を測定しているときに、第１光を第１検出器に優先的に進入させるように位置する第１フィルタをも備える。
【００２３】
追加的に、または代替的に、システムはまた、第２検出器が第２光を測定しているときに、第２光を第２検出器に優先的に進入させるように位置する第２フィルタをも備える。
【００２４】
さらに、本発明の例示的実施形態では、分析物を定量するために使用される磁気ビーズをセルの検出領域に集中させる方法であって、磁場を用いてビーズを検出領域に引き寄せながらセルを振動させるステップを含む方法を提供する。
【００２５】
任意選択的に、セルを振動させるステップは、３０Ｈｚから２００Ｈｚの間の卓越周波数で振動させることを含む。
【００２６】
任意選択的に、卓越周波数は６０Ｈｚから１００Ｈｚの間である。
【００２７】
追加的に、または代替的に、セルを振動させるステップは、少なくとも０．５ｍｍのピーク間振幅（ｐｅａｋ  ｔｏ  ｐｅａｋ  ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）で振動させることを含む。
【００２８】
任意選択的に、ピーク間振幅は少なくとも１ｍｍである。
【００２９】
任意選択的に、セルを振動させるステップは、ビーズが検出領域の縁部に位置する場合に、水平成分、垂直成分、または両方について、ビーズの少なくとも大部分に対し、ビーズの質量とビーズの最大加速度との積が、ビーズに掛かる磁力の０．３倍から１０倍になるように、振動させることを含む。
【００３０】
さらに、本発明の例示的実施形態では、ビーズに接着している分析物を定量するためのシステムであって、
ａ）ビーズ用の載置面を持つ検出セルと、
ｂ）ビーズが載置面上に位置するときに、ビーズを載置面の検出領域に向かって引き寄せるように位置する磁石と、
ｃ）磁石がビーズを検出領域に向かって引き寄せるときに、検出領域におけるビーズの集中を容易にするように検出セルを振動させる振動器と、
ｄ）ビーズに接着している分析物の量に応じて、検出領域におけるビーズからの蛍光もしくは化学発光の積分強度、または検出領域でビーズから放出される染料の濃度のうちの１つ以上を測定する第１検出器と、
ｅ）第１検出器の測定値を使用して、ビーズに接着している分析物の量を決定するコントローラと、
を備えたシステムを提供する。
【００３１】
任意選択的に、システムはまた、
ａ）分析物がビーズに接着しているか否か、あるいはどれだけ多く接着しているかに関係なく、検出領域でビーズと相互作用する光を発生する光源と、
ｂ）相互作用の結果としてビーズから受光する第２光を測定する、第１検出器と同一かまたは異なる第２検出器と、
をも備え、コントローラが第１および第２検出器の測定値を使用して、ビーズに接着している分析物の正規化量を決定する。
【００３２】
任意選択的に、振動器は、検出領域外の載置面の少なくとも一部分に対し磁石がビーズを引き寄せるときに、ビーズの少なくとも一部分に対し、ビーズの質量と検出セルの最大加速度との積が、ビーズと載置面との間の静止摩擦力より大きくなるように、検出セルを振動させることができる。
【００３３】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【００３４】
本発明の実施形態の方法および／またはシステムを実行することは、選択されたタスクを、手動操作で、自動的にまたはそれらを組み合わせて実行または完了することを含んでいる。さらに、本発明の、方法および／またはシステムの実施形態の実際の機器や装置によって、いくつもの選択されたステップを、ハードウェア、ソフトウェア、またはファームウェア、あるいはオペレーティングシステムを用いるそれらの組合せによって実行できる。
【００３５】
例えば、本発明の実施形態による選択されたタスクを実行するためのハードウェアは、チップまたは回路として実施されることができる。ソフトウェアとして、本発明の実施形態により選択されたタスクは、コンピュータが適切なオペレーティングシステムを使って実行する複数のソフトウェアの命令のようなソフトウェアとして実施されることができる。本発明の例示的な実施形態において、本明細書に記載される方法および／またはシステムの例示的な実施形態による１つ以上のタスクは、データプロセッサ、例えば複数の命令を実行する計算プラットフォームで実行される。任意選択的に、データプロセッサは、命令および／またはデータを格納するための揮発性メモリ、および／または、命令および／またはデータを格納するための不揮発性記憶装置（例えば、磁気ハードディスク、および／または取り外し可能な記録媒体）を含む。任意選択的に、ネットワーク接続もさらに提供される。ディスプレイおよび／またはユーザ入力装置（例えば、キーボードまたはマウス）も、任意選択的にさらに提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００３７】
【図１】図１は、本発明の例示的実施形態に係る、分析物を定量するためのシステムの略平面図である。
【００３８】
【図２】図２は、図１のシステムを用いて実行される、分析物を定量する方法のフローチャートである。
【００３９】
【図３Ａ】図３Ａは、本発明の例示的実施形態に係る、図１のシステムと同様のシステムにおける検出セルならびに関連する照明および検出光学系の略側面図である。
【００４０】
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明の別の例示的実施形態に係る、図１のシステムと同様のシステムにおける検出セルならびに関連する照明および検出光学系の略側面図である。
【００４１】
【図３Ｃ】図３Ｃは、本発明のさらに別の例示的実施形態に係る、図１のシステムと同様のシステムにおける検出セルならびに関連する照明および検出光学系の略側面図である。
【００４２】
【図３Ｄ】図３Ｄは、本発明のさらに異なる例示的実施形態に係る、図１のシステムと同様のシステムにおける検出セルならびに関連する照明および検出光学系の略側面図である。
【００４３】
【図４Ａ】図４Ａは、本発明の例示的実施形態に係る、検出セルおよび関連照明光学系の略側面図である。
【００４４】
【図４Ｂ】図４Ｂは、本発明の異なる例示的実施形態に係る、検出セルおよび関連照明光学系の略側面図である。
【００４５】
【図５Ａ】図５Ａは、本発明の例示的実施形態に係る、振動器および磁石を持つ検出セルの略平面図である。
【００４６】
【図５Ｂ】図５Ｂは、図５Ａの検出セルの略側面図である。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明は、その一部の実施形態では、ビーズを用いて流体中の分析物を定量するためのシステムおよび方法に関し、さらに詳しくは、分析物をビーズに接着させて、蛍光または化学発光を使用するアッセイによって、または酵素結合アッセイによって測定する、生化学的または生物学的アッセイに関するが、それに限定されない。そのようなアッセイは生物医学的研究のみならず、臨床用にも使用することができる。
【００４８】
アッセイは、特定のリガンドに結合する分析物の既知の傾向に基づいて、流体試料中の既知の分析物、例えば血液試料中の生物学的マーカの有無または濃度を示すことができる。追加的に、または代替的に、アッセイは、例えば抗体の標的を見つけるために、特定のリガンドに結合する任意の分析物の有無または濃度を、たとえ今まで知られていなかった分析物でも、示すことができる。
【００４９】
本発明の一部の実施形態では、アッセイの結果は、疾病または他の異常な医学的状態の診断を直接提供するものではない。本発明のこれらの実施形態の一部では、アッセイの結果は、診断を下す際に証拠として、例えば診断を下す際に使用される複数の要因の１つとして使用することができる。他の場合、例えばアッセイが純粋に生物学的研究に使用される場合、アッセイの結果は、たとえ間接的にでも診断を下すためには使用されない。本発明の他の実施形態では、アッセイは診断的アッセイであり、例えば疾病のマーカの有無または濃度を見出して、診断結果を直接提供する。
【００５０】
本発明の一部の実施形態の態様は、分析物が接着するビーズを用いて、流体中の分析物のアッセイを実行するためのシステムおよび方法に関し、該システムおよび方法では、分析物の複合体からの蛍光または化学発光を励起させ、かつ検出領域における全てのビーズからの発光の積分強度を測定することによって、ビーズに接着している分析物の量を測定し、かつ分析物の量を正規化するために存在するビーズの数について別個の光学的測定を行なう。
【００５１】
代替的に、または追加的に、ビーズに接着している分析物の量は、例えば適切な酵素を用いて分析物の複合体に触媒作用を及ぼして染料または化学発光物質をビーズの周囲の液体中に放出させ、かつ液中の染料または化学発光物質の濃度を光学的に測定することによって、測定される。例えばＰｉｅｒｃｅ社によって販売されたＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅは、分析物がビーズに付着したリガンドに結合する場合に、ＨＲＰ酵素を用いて化学発光物質の励起を触媒する。しかし、蛍光発光を用いてビーズに付着している分析物の量を測定すると、蛍光発光のタイミングをより正確に制御することができるという、化学発光または酵素結合アッセイ法に勝る潜在的利点がある。本書における記載は一般的に、蛍光発光を用いてビーズに接着している分析物の量を測定することに言及するが、分析物の量を測定するためにそのような化学発光または酵素結合アッセイ法も使用することができること、および明記する場合を除き、記載の他の態様も一般的にこれらのケースに当てはまることを理解されたい。
【００５２】
本書で使用する場合、「分析物の複合体からの蛍光発光」または「分析物複合体からの蛍光発光」、および「分析物複合体を励起して蛍光発光させる」のような表現は、分析物の分子自体からの蛍光発光、およびより通常のケースの分析物の分子に直接または間接的に付着された蛍光タグ分子からの蛍光発光の両方を含む。
【００５３】
そのようなシステムは、一度に１つのビーズだけを検出器に通過させる必要のある複雑な流体工学を必要としないので、ビーズを一度に１つしか測定しない先行技術のシステムに勝る潜在的利点を有する。それはまた、分析物複合体からの蛍光発光がアレイ検出器を用いて撮像され、かつ画像処理ソフトウェアを用いてビーズが計数される、先行技術のシステムに勝る潜在的利点をも有する。そのようなアレイ検出器は、個々のビーズの低発光パワーを測定するために、非常に高価な冷却アレイ検出器でなければならないからである。代わりに、検出領域の全ビーズにおける分析物複合体からの積分蛍光発光を、任意選択的に比較的低感度かつ安価にできる単一の検出器によって、測定することができる。代替的に、単一の検出器は比較的高価かつ高感度の検出器であり、それは多くのビーズからの積分発光を測定し、かつ信号対雑音比は重要ではないので、アレイ検出器より正確な発光パワーの測定を行なうことができるという潜在的利点を有する。
【００５４】
分析物の量を正規化するために使用される、存在するビーズの数の別個の光学的測定もまた、検出領域の全ビーズによって反射、屈折、発光、シルエット化された積分光または検出領域の全ビーズとの他の相互作用を測定する、単一の安価な検出器によって行なうことができる。本書で使用する場合、「ビーズとの相互作用」とは、分析物に関連しない蛍光タグのような、ビーズに直接または間接的に付着した分子との相互作用を含む。代替的に、存在するビーズの数は、ビーズを計数するためにアレイ検出器および画像ソフトウェアを使用することによって測定することができるが、ビーズの数を測定するために使用される光は、ビーズに接着している分析物によって発光する蛍光より明るくすることができるので、アレイ検出器は特に高感度かつ高価なものである必要はない。
【００５５】
本発明の一部の実施形態の態様は、分析物を接着させた磁気ビーズを用いて流体中の分析物のアッセイを実行するためのシステムおよび方法であって、振動および磁場の組合せを用いてビーズを検出領域に集中させて成る、システムおよび方法に関する。振動がビーズと表面との間の静止摩擦力を克服し、磁力に応答してビーズを移動させる一方、磁場の勾配はビーズの位置する表面上でビーズを検出領域に引き寄せる。
【００５６】
ビーズを検出領域に集中させることは、特にビーズが単一の層にかなりの高密度に集中する場合、検出領域におけるビーズの数はあまり大きく変動しないという潜在的利点を有するので、ビーズが集中しない場合より正確にビーズの数を推定することができる。これは、検出領域の大部分にわたって、六角形のパッキングで、ビーズが最大可能な単層密度近くまで１層に充填される場合、特に当てはまる。たとえビーズがその最大可能な密度近くまで充填されない場合でも、検出領域にランダムに分布するビーズの数の百分率変化は、存在するビーズの数が多ければ多いほど、例えばビーズの数の平方根に比例して低下する。検出領域におけるビーズの数が多いほど、一般的に分析物複合体からの蛍光発光を励起しかつその強度を測定することによって行なわれる、ビーズに接着している分析物の量を測定する場合の信号対雑音比も改善される。ビーズ１個当たりの発光パワーは一般的にかなり低いので、ビーズを検出領域に高密度に充填させることが有利である。これは、例えば単一の検出器によって検出領域全体の積分蛍光発光を測定する場合、特に当てはまる。
【００５７】
任意選択的に、ひとたびビーズが検出領域に集中すると、検出領域全体の分析物複合体からの積分蛍光発光が測定され、かつ上述の通り、蛍光発光によって測定された分析物の量を正規化するために、ビーズの個数について別個の光学的測定が行なわれる。
【００５８】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示されるか、および／または図面および／または実施例において例示される構成要素および／または方法の組み立ておよび構成の細部に必ずしも限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施または実行されることが可能である。
【００５９】
システム全体の構成および方法
ここで図面を参照すると、図１は、流体の試料中の分析物を定量するための、例えば血液または血清の試料中の生体分子を定量するためのシステム１００を示す。システム１００を使用する方法については、図２のフローチャート２００を参照しながら説明する。システム１００は、多数の試料を自動的にまたは半自動的に定量するように設計されるが、記載する方法は、一度に１つの試料ずつ手動で使用することもできる。
【００６０】
２０２で、解析される試料をウェルプレート１０６の異なるウェルに添加する。２０４で、流体工学サブシステム１０２は、リザーバ１０４内の流体中に懸濁しているビーズを取り出し、試料が入っているウェルプレート１０６のウェル内にビーズを移送する。代替的に、ビーズは試料の前にウェル内に入れられる。流体工学サブシステムは任意選択的に真空および流体工学または微細流体工学部品、例えばポンプ、弁および管を使用して、ビーズの懸濁液および他の流体を異なるリザーバとウェルプレートとの間で移動させる。任意選択的に、分配アーム１０８がビーズを複数のウェルに、例えばウェルプレートの１列の全てのウェルに同時に移送し、次いで任意選択的に、分配アームが移動し、かつ／またはウェルプレートが移動し、試料が定量される全てのウェルにビーズが配置されるまで、この動作が別のウェル群、例えば次の列に対し繰り返される。同じ手順を使用して、リザーバ１１０内の緩衝溶液およびリザーバ１１２内の水のような他の流体を、下述するように、ウェルにかつウェルから移送することができる。
【００６１】
２０６で、分析物の分子がビーズの表面のリガンドに接着するように、ビーズは試料と共にインキュベートされる。例えばリガンドは、ビーズの表面を被覆して、分析物の分子を認識しかつ捕捉する抗体を含むことができる。任意選択的に、ウェルプレートは、ウェルプレートベース１１４に結合された１つ以上の振動器によって振動され、それはビーズおよび試料をより効率的に混合し、かつ分析物がビーズに接着するために必要な時間を短縮させる。ビーズおよび試料の混合はまた、流体工学サブシステムによって混合物を繰返しウェルから取り出しかつそれをウェルに戻すことによっても促進することができる。混合を促進するこれらの手段はまた、ビーズが別の物質と共にインキュベートされる下述のステップのいずれにも使用することができる。
【００６２】
２０８で、試料および他の流体は任意選択的に、流体工学サブシステム１０２によってウェルから取り出され、かつ任意選択的にビーズは、２１０で、例えばリザーバ１１２からの水またはリザーバ１１０からの緩衝流体により洗浄される。任意選択的に、ベース１１４は洗浄を促進するために洗浄中にウェルプレートを振動させ、これもまた任意選択的に、下述の通り、ビーズが洗浄される他の場合のいずれにおいても行なわれる。任意選択的に、ビーズは磁性であり、ベース１１４に取り付けられた磁石は、試料および他の流体が取り出されるとき、およびビーズの洗浄後に水または緩衝流体が取り出されるときに、ビーズをウェル内に維持する。例えば、磁石は、流体または水がウェルの底から抜き取られる間、ビーズを各ウェルの側壁に引き寄せるように配設することができ、あるいは磁石は、流体または水が頂部から吸い出される間、ビーズを各ウェルの底に引き寄せることができる。代替的に、または追加的に、流体を通過させることができるがビーズを通過させることのできないフィルタが、吸引または重力によってウェルから取り出される流体が通過する管路に配置される。このフィルタは例えばウェルの底に配置され、流体または水がウェルから取り出されるときに、ビーズはウェルに残るが、流体または水が取り出されないときには、管路は例えば弁によって閉鎖される。これらの手順もまた任意選択的に、ビーズが洗浄される他の場合のいずれにおいても行なわれる。取り出された流体または水は任意選択的に、流体工学サブシステム１０２によって排液処分場所１１６に移送される。
【００６３】
２１２で、ビーズに接着している分析物がもしあれば、任意選択的に蛍光タグが付けられる。このステップは、分析物自体がすでに蛍光性を持つ場合、省くことができる。任意選択的に、蛍光タグの代わりに化学発光タグが使用され、多くの文脈では、本書で蛍光発光に言及する場合、代わりに化学発光を使用してもよいことを理解されたい。追加的に、または代替的に、分析物は、下で説明する通り、酵素結合アッセイで使用される染料分子をタグ付けすることができる。
【００６４】
任意選択的に、分析物の蛍光タグ付けは次のステップを含む。最初に、リザーバ１１８に貯蔵されている検出抗体は、流体工学サブシステム１０２によってビーズの入ったウェルに、任意選択的にリザーバ１１０からの緩衝液と共に添加される。ビーズの表面に被覆された捕捉抗体と同様とすることのできる検出抗体は、ビーズに接着している分析物に付着する。ビーズおよび検出抗体は一緒にインキュベートされる。次いで、検出抗体を含有する流体が任意選択的に取り出され、ビーズは任意選択的に洗浄される。
【００６５】
検出抗体は、蛍光タグの分子に付着するように改変されるので、ビーズを被覆する捕捉抗体とは異なってもよい。例えば検出抗体はビオチン化することができる。検出抗体が分析物の分子に付着され、かつビーズが任意選択的に洗浄された後、リザーバ１２０からの蛍光タグ物質が流体工学サブシステム１０２によってウェルに添加される。適切な蛍光タグ物質は例えば、ビオチン化抗体に結合するストレプトアビジンＰＥである。他の蛍光タグ物質、および抗体を改変する他の方法も可能である。蛍光タグ物質はビーズと共にインキュベートされ、流体は取り出され、ビーズは任意選択的に２１４で洗浄される。
【００６６】
２１６で、ビーズは任意選択的に、流体中に懸濁したまま、流体工学サブシステム１０２によってウェルプレート１０６から検出ステーション１２２に移送される。本発明の一部の実施形態では、ビーズは小液滴の流体中に懸濁され、次いでそれらは、ビーズを移送するために、従来の流体工学システムを用いる代わりに、例えば静電気により操作される。追加的に、または代替的に、液滴を操作するこの技術は、検出ステーション１２２内、またはウェルプレート１０６内の検出領域にビーズを配置するためにビーズを移動させるために使用することができる。
【００６７】
検出ステーション１２２で、分析物は、蛍光タグからの蛍光発光によって、または任意選択的に、分析物が蛍光性を持つ場合には分析物自体からの蛍光発光によって検出される。上述の通り、これらのケースを両方とも本書では分析物複合体からの蛍光発光という。任意選択的に、検出ステーション１２２は複数の検出セルを有し、ウェルプレート１０６の異なるウェルからのビーズは、ビーズを検出セルに配置するための分配アーム１２４を用いて、検出ステーション１２２の異なるセルに移送される。例えばウェルプレート１０６の１列のウェルからのビーズは、検出ステーション１２２の対応するセルに移送される。任意選択的に、複数のウェルから複数の対応するセルへの移送は同時に行なわれる。代替的に、移送は順次行なわれ、例えば検出ステーション１２２は、ビーズを異なるセルに移送する準備中に、分配アーム１２４に対して相対的に移動する。
【００６８】
検出ステーション１２２は、各検出セル内の分析物複合体からの蛍光発光を検出する光学系および検出器サブシステム１２６を含む。任意選択的に、検出ステーションが２つ以上のセルを有する場合に、セルからセルに移動する関連光学系を持つ単一の検出器セットが存在する。代替的に、関連光学系を持つ２つ以上の検出器セット、または各検出セルに１つの検出器セットが存在し、異なる検出セルにおける測定を同時に行なうことができる。複数の検出器セットを同時に使用すると、検出器および光学系のコストおよびそれらの制御の複雑度が増大するが、大量の試料の測定の速度を高めることができる。
【００６９】
任意選択的に、検出器ステーション１２２は関連振動器および／または磁石をも有し、それらの機能については下述する。
【００７０】
本発明の一部の実施形態では、ビーズは別個の検出ステーションに移送されず、ウェルプレート１０６が検出ステーションとしても機能し、かつ各ウェルが検出器セルとして機能する。これらの実施形態では、ウェルからの蛍光発光を検出する関連光学系を持つ１つ以上の検出器セットが存在する。例えば、１列のウェルの数と同数の検出器セットを持つアームが存在し、該アームは１列のウェルから次の列のウェルに移動し、該アームは１列の全てのウェルで蛍光発光を同時に検出するために使用することができる。代替的に、ウェルからウェルに移動する単一の検出器セットだけが存在するか、あるいは２つ以上のウェルから同時に、または全てのウェルから同時に蛍光発光を検出することのできる様々な数の検出器セットが存在することができる。
【００７１】
ウェルプレート１０６が検出ステーションとして使用される場合には、任意選択的に、ベース１１４に関連付けられた振動器および磁石も、下述の通り、検出プロセスで使用される。この場合、上述したインキュベーションおよび洗浄手順中に流体が交換されるときには、磁石はビーズをウェルの側部に引き寄せるために使用される一方、下述の通り検出手順中には、磁石はウェルの中心の検出領域にビーズを引き寄せるために使用されるので、磁石は任意選択的にインキュベーション手順と検出手順との間に、ウェルに対して相対的に移動する。
【００７２】
２１８で、ビーズは任意選択的に、ビーズが入った各検出セルの検出領域に集中される。２２０で、光学系および検出器サブシステムは、各検出セルの検出領域のビーズに接着している分析物複合体からの蛍光発光を測定して、分析物の量を決定する。任意選択的に、光学系および検出器サブシステムはまた、分析物の量をビーズの数に対して正規化するために、各検出領域のビーズの量の別個の光学的測定をも行なう。分析物のこの正規化量は、２２２で検査されている試料中の分析物の濃度を、各検出セルに対して決定するために使用される。ビーズを集中させかつ分析物の量およびビーズの数を測定する方法は、以下でさらに詳細に記載する。アッセイがビーズに接着している分析物の量を検出するために使用される場合、分析物複合体に触媒作用を及ぼして、タグ付けされた染料分子を検出セル内のビーズの周りの流体中に放出させる触媒、例えば酵素が検出セル内に導入される。次いで検出セル内の染料の濃度が、１つ以上の光学検出器によって、例えば異なる波長の光を流体に通し、かつ異なる波長でどれだけの光が吸収されるかを比較することによって、測定される。本発明の一部の実施形態では、染料分子の代わりに、またはそれに加えて、化学発光分子が使用され、流体中のその濃度が発光光を測定することによって測定される。そのような酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法の概論は、２０１０年１１月２５日にｗｗｗ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／ＥＬＩＳＡからダウンロードされたＥＬＩＳＡに関するＷｉｋｉｐｅｄｉａの記事に掲載されている。
【００７３】
コントローラ１２８、例えばパーソナルコンピュータは任意選択的に、検出器によって得られた生データから試料中の分析物の濃度を計算するために使用される。この計算は、異なる検出器、例えばビーズの数を測定する検出器および分析物の量を測定する検出器の異なる感度および／または積分時間を考慮することができる。任意選択的に、コントローラ１２８によって行なわれる計算はその都度、最初に試料中の分析物の様々な既知の濃度を用いて試験を実行し、かつ検出器からの信号を観察することによって較正される。例えば、試験は任意選択的に、３ないし４桁の範囲を網羅する５ないし８つの異なる濃度の分析物に対して実行され、かつ所与の濃度での試験は、誤差を低減するために、任意選択的に１回以上繰り返されて平均される。試験結果は任意選択的に、試料中の分析物の濃度を、ビーズで測定されビーズの数に対して正規化された分析物の量に関連付ける較正曲線を得るために、モデルに、例えば５つのパラメータを持つモデルに当てはめられる。
【００７４】
コントローラ１２８、または１つ以上の異なるコントローラはまた任意選択的に、流体工学サブシステム１０２の機能、分配アーム１０８および１２４の動き、ウェルプレート１０６および検出器ステーション１２２に関連付けられた振動器の動作、磁石が可動である場合その動き、ユーザインタフェース、ならびに下述する光学系および検出器サブシステムの機能の１つ以上を制御するためにも使用される。ユーザインタフェースは任意選択的に、システムが無人のままでいる間に自動的にタスクを実行することができるように、ユーザが複合体プロトコルを作成することを可能にする。それはまた、任意選択的にユーザに動作モードを推奨し、任意選択的に結果を解析する解析モジュールを含み、任意選択的にプレートにおける試料の配置をユーザにグラフィックで示し、かつ任意選択的に、測定が完了したときと同様に測定が依然として行なわれている間にも、測定の結果を実時間で表示する。
【００７５】
光学系および検出器の構成
図３Ａないし３Ｄは、分析物複合体からの蛍光発光を測定するため、および検出セルの検出領域内のビーズの総数を測定するために使用される光学系および検出器サブシステムの異なる構成を示す。これらの図目は一定の縮尺で描かれたものではなく、かつ図面に示す角度は正確ではなく、例えば光ビームを９０度に反射させるミラーは、光ビームの方向に対して４５度に向けられているように見えないことがあるが、実際の装置ではそれらは４５度に向けられる。
【００７６】
図３Ａは、波長λ１、またはλ１を含む波長範囲の光ビームを生成する光源３０２を持つ光学系および検出器の構成３００を示す。便宜上、光ビームまたは別の光ビームはときどき、波長λ１または異なる波長を持つ光のある性質のため、特定の挙動を示すと記載されるが、このような場合に、光がある範囲の波長を有するときは、これらの性質はその範囲の他の波長、またはビームのパワーの大部分を含む波長の範囲にも当てはまることを理解されたい。波長λ１は、分析物複合体からの蛍光発光を励起させる波長から選択される。任意選択的に、光源３０２は例えば半値全幅が１００ｎｍ未満、または５０ｎｍ未満、または２０ｎｍ未満の比較的狭い範囲の波長を生成するので、下述するように、光源３０２からの迷光は、他の波長、例えばビーズからの蛍光発光を検出するように意図された検出器から容易に除去することができる。
【００７７】
光源３０２からの光ビームは任意選択的にレンズによって集束され、ビームスプリッタ３０４、例えば半透鏡に到達する。偏光ビームスプリッタも使用することができるが、偏光は一般的に、光とビーズとの相互作用に役割を果たさない。光ビームの一部分は任意選択的に、ビームスプリッタ３０４によって反射して、光源３０２の強度を監視する検出器３０６に進む。検出器３０６からの信号は、光源の強度の変動に対して、下述する他の検出器からの出力信号を補正するために使用することができる。追加的に、または代替的に、検出器３０６からの信号は、フィードバックによって光源３０２の強度を制御し、それを一定に維持するために使用することができる。代替的に、検出器３０６は存在せず、光源３０２の強度は任意選択的に、例えば光源３０２に内蔵する他の手段によって監視および／または制御される。
【００７８】
光ビームの残りはビームスプリッタ３０４を通過し、検出セル３１２の底面に位置するように図示されたダイクロイックミラー３０８に到達し、それは波長λ１の光をビーズ３１０の方向に反射させる。任意選択的に、光はレンズによってビーズ上に集束され、検出セル３１２の透明なカバーを通過する。
【００７９】
波長λ１の光は、波長λ２の分析物複合体からの蛍光発光を励起させる。波長λ１について上で説明した通り、本書で使用する語句「波長λ２」は「波長λ２を含む波長範囲」の省略表現とみなすことができ、この波長の光の性質に関する記述は、その範囲の全ての波長、または少なくとも蛍光発光のパワーの大部分を含む波長範囲に適用されることを意図している。これらの見解は、下で用いる語句「波長λ３」に対しても適用される。
【００８０】
波長λ２の発光光のみならず、ビーズから反射した波長λ１の光も、もしあればレンズを介してダイクロイックミラー３０８に戻る。ダイクロイックミラー３０８は、ビーズから反射した波長λ１の光を反射するが、ビーズから蛍光発光した波長λ２の光を通過させる。波長λ２の通過光は検出器３１６によって測定される。任意選択的に、分析物複合体からの蛍光発光に由来するはずのない他の波長の迷光を除去するフィルタ３１８が、検出器３１６の前に存在する。任意選択的に、ビーズが任意選択的に集中する検出セル３１２の検出領域、例えば検出セル３１２の底面の領域に由来しない光を遮断するストップ３２０も存在する。ストップ、フィルタ、およびレンズは、発光光ビームの経路に沿って図示する順番に位置する必要はない。検出領域からの光を検出する、記載の他の検出器はまた、たとえ図面に図示されていない場合でも、検出器が受光する光を検出領域に由来する光に限定するストップをも有することができ、これらのストップは、光路に沿ってレンズ、フィルタ、または他の光学素子の前、後、または間に位置することができる。光路上でダイクロイックミラーの前に位置する単一のストップは、光ビームがダイクロイックミラーによって分割された後、その光路上を進む光を受光する２つ以上の異なる検出器からの光を制限するために使用することができる。検出器はいずれも、検出器が受光する所望の波長範囲の、かつ所望の位置からの光を増大し、かつ／または検出器が受光する他の波長の、かつ他の場所からの光を低減させるために、レンズ、フィルタ、偏光子、拡散器、および他の光学素子を任意の順番に、たとえそれらが明示的に記載されていない場合でも、使用することもできる。
【００８１】
検出器３１６は、比較的低い強度の発光蛍光を用いてビーズの有用な画像を生成するのではなく、むしろ検出領域のビーズからの、分析物複合体からの発光蛍光の積分強度に応答する。任意選択的に、検出器３１６は単一の検出器であり、それに到達する光の全強度に対応する単一の出力信号を生成し、それは検出領域におけるビーズ上の分析物複合体から発光する光の積分強度に依存する。代替的に、検出器３１６は検出素子のアレイを含むことができる。各素子の出力はハードウェアまたはソフトウェアを用いて合計され、検出領域のビーズ上の分析物複合体から発光される光の積分強度に依存する出力信号を生成する。この場合、アレイの個々の素子は、分析物複合体からの発光蛍光を用いてビーズの有用な画像を生成するのに充分に高感度である必要はない。
【００８２】
分析物の量を測定するために、蛍光発光の代わりに、またはそれに加えて、化学発光を使用する場合には、発光光は、蛍光発光の場合のようにビーズの光学的励起によって励起されるのではなく、ビーズに接着している分析物複合体の化学発光を誘発するために、化学物質が検出セルに添加されることを理解されたい。分析物の量を測定するために酵素結合アッセイ法を使用する場合には、ビーズに接着している分析物複合体を誘発して、ビーズの周りの流体中に染料分子を放出させるために、適切な酵素が検出セルに添加され、かつ流体中の染料分子の濃度を決定するために、染料分子によって吸収された１つ以上の波長の光のわずかな部分を測定するのに、検出器３１６のような検出器が使用される。任意選択的に、この場合、光源３０２は染料分子の濃度を測定するための光源として使用され、かつこれらの１つ以上の波長の光を検出セルに伝達し、かつ流体を通し、次いで検出器まで伝達するために、フィルタ、ミラー、または上述したようないずれかの他の光学素子が任意選択的に使用される。
【００８３】
電解液の濃度を決定するために、蛍光発光、化学発光、酵素、または他の方法など、使用される方法に関係なく、任意選択的にビーズからの反射光を使用してビーズの数を推定する。分析物複合体による蛍光発光の場合、ダイクロイックミラー３０８から反射した波長λ１のビーズからの反射光は、ビームスプリッタ３０４に戻り、そこからその一部が、任意選択的にレンズおよびストップを介して、検出器３１４に反射される。検出器３１４によって受光された光の測定値は、検出セルの検出領域におけるビーズの数を推定するために使用される。任意選択的に、検出器３１４は、検出領域でビーズから反射した積分光に応じて出力信号を生成する。ビーズによって反射する光の量はビーズに接着している分析物の量に依存せず、ビーズの数のみに依存するので、この信号は検出領域におけるビーズの数を推定するために使用することができる。代替的に、または追加的に、検出器３１４は、検出領域におけるビーズの画像を生成するアレイ検出器である。ビーズからの反射光は比較的明るいので、検出器３１４は、比較的安価なＣＣＤまたはＣＭＯＳアレイ、例えば消費者市場向けに販売されているデジタルカメラ内のアレイを含むことができる。検出器３１４によって生成される画像は次いで、画像処理ソフトウェアによって解析され、検出領域におけるビーズの数のカウントを生成する。このように画像処理を用いることは、充分に明瞭な画像を形成するのに充分な光がビーズから反射し、かつ検出器３１４に入射する限り、測定されるビーズの数が光源３０２の強度の変化または検出器３１４に入射する迷光に比較的鈍感になるという潜在的な利点を有する。検出領域のビーズから反射する積分光に依存して、単一の信号からビーズの数を推定することは、単一の検出素子より多くの検出素子を使用する必要がなく、かつ画像処理ソフトウェアを実行する必要がないという潜在的な利点を有する。
【００８４】
図３Ｂは、代替的光学系および検出器の構成３２２を示す。ビームスプリッタ３０４の代わりに、ダイクロイックミラー３２４が存在する。光源３０２からの波長λ１の光の大部分または全部がダイクロイックミラー３２４を通過するが、任意選択的に、光の一部は、光源３０２の強度を監視するために使用される検出器３０６に反射する。代替的に、検出器３０６は存在せず、その場合、波長λ１の光はダイクロイックミラー３２４によって反射する必要がほとんどまたは全くなく、光源３０２の強度は他の手段によって、例えば光源３０２内部の手段によって監視または調整することができる。ダイクロイックミラー３２６は図３Ａのダイクロイックミラー３０８に取って代わり、ダイクロイックミラー３０８と同様に、ダイクロイックミラー３２６が波長λ１の光を検出器セル３１２内に反射させ、そこで光はビーズ３２８を照射する。ビーズ３２８は、それらに接着している分析物複合体から波長λ２の蛍光を発光することに加えて、それらに接着している分析物とは関係なく、それらを照射する波長λ１の光に応答して、波長λ３の蛍光をも発光する。波長λ３の光は、例えば化学反応または生化学反応によって、分析物が付着しているビーズだけでなく、全てのビーズに被覆されあるいは全てのビーズに埋め込まれた蛍光染料から放射される。
【００８５】
波長λ２およびλ３の発光光ならびに波長λ１の反射光はダイクロイックミラー３２６に到達し、該ミラーは波長λ２の光を通過させて検出器３１６に送り、かつ波長λ１およびλ３の光をダイクロイックミラー３２４の方向に反射させる。波長λ３の光はダイクロイックミラー３２４から反射し、検出器３２９に到達する。λ３の波長の発光光の強度は、分析物の量ではなく、ビーズの数に依存するので、検出器３２９からの信号は、検出セル３１２の検出領域におけるビーズの数を推定するために使用される。検出器３１６からの信号は、図３Ａの構成３００と同様に、ビーズに接着している分析物の量を決定するために使用される。ダイクロイックミラー３２６からダイクロイックミラー３２４に到達する波長λ１の光は大部分または完全に、ダイクロイックミラー３２４を通過する。波長λ１の光も検出領域におけるビーズの数に比例する強度を有するので、ダイクロイックミラー３２４から反射して検出器３２９に到達する波長λ１の光は害にならない。しかし、希望する場合、波長λ１の光は検出器３２９の前に位置するフィルタ（図示せず）によって除去することができる。
【００８６】
図３Ｃは、図３Ａおよび３Ｂに示した構成の代替例の光学系および検出器の構成３３０を示す。図３Ｂの構成３２２と同様に、構成３３０の検出器セル３１２は、ビーズに接着している分析物複合体から波長λ２の蛍光を発光することに加えて、どれだけの量の分析物がビーズに接着しているかに関係なく波長λ３の蛍光を発光する、ビーズ３２８を有する。しかし構成３３０は、図３Ａの構成３００における対応するビームスプリッタおよびダイクロイックミラーと同様に挙動するビームスプリッタ３０４およびダイクロイックミラー３０８を有する。加えて、波長λ３の光は、波長λ２の光と同様に、ダイクロイックミラー３０８を通過する。次いで第２ダイクロイックミラー３３２は波長λ２の光を波長λ３の光から分離し、一方、例えば波長λ３を反射してそれを検出器３２９に送り、他方、例えば波長λ２を透過してそれを検出器３１６に送る。図３Ｂの構成３２２と同様に、検出器３１６からの信号は、検出領域に存在する分析物の量を推定するために使用され、検出器３２９からの信号は、検出領域に存在するビーズの数を推定するために使用される。
【００８７】
構成３２２および３３０の変形例では、ビーズを照射してほとんど重複しない異なる範囲の波長を生成する２つの光源が存在する。波長範囲の一方は、ビーズに接着している分析物複合体からの波長λ２の発光を励起し、他方の波長範囲は、どれだけの量の分析物がビーズに接着しているかに関係なく、ビーズ上またはビーズ内の蛍光物質からの波長λ３の発光を励起する。蛍光発光が消えるときが存在するように間に充分な時間を置いて異なる期間中に２つの光源を作動させると、構成３２２および３３０のように、異なる波長を異なる検出器に向かわせるダイクロイックミラーを使用して、波長λ２の光を波長λ３の光から分離する必要がなくなる。代わりに、波長λ２の光および波長λ３の光は両方とも単一の検出器、例えば検出器３１６によって検出することができ、かつこれらの光は、２つの光源のタイミングに関連して、これらの光のタイミングによって区別することができる。代替的に、波長λ２の光および波長λ３の光に対してダイクロイックミラーおよび異なる検出器が使用され、かつ各検出器に到達する誤った蛍光波長の迷光を除外するために、異なるタイミングが使用される。光源のオンとオフのタイミングパターンもまた、光源からの光と相関しない他の迷光からの蛍光発光を区別するために使用することができる。これは、単一の光源しか存在しない構成３００、３２２、および３３０のような構成でも、光源を既知のパターンで変調することによって行なうことができる。
【００８８】
図３Ｄは、ダイクロイックミラーを全く使用しない、光学系および検出器の別の構成３３４を示す。光源３０２は検出セル３１２内のビーズ３１０を直接照射し、光の強度を監視するために光源３０２からの光の一部を任意選択的に、他の構成の場合と同様に、検出器３０６によって監視する。検出器３１４はビーズを直接観察して、そこから反射する光の強度を測定し、かつ／またはビーズの画像を形成してビーズを計数する。任意選択的に、検出器３１４は、ビーズに接着している分析物複合体から発光される波長λ２の光を遮断するために、検出器の前にフィルタ（図示せず）を有するが、ビーズから反射する波長λ１の光は、分析物複合体から発光される波長λ２の光よりずっと明るい傾向があるので、これは必ずしも必要というわけでなく、また検出器３１４がビーズの画像を形成し、かつビーズが画像処理ソフトウェアを用いて計数される場合には、光の強度がどうであろうと問題ではない。検出器３１６はその前にフィルタ３１８を有し、それは、波長λ１の反射光に比較してビーズから発光される波長λ２の光の比較的低い強度にもかかわらず、検出器３１６によって生成される信号が波長λ２の光に支配されるように、波長λ１の光をほとんど通さないがずっと多くの波長λ２の光を通す、例えば干渉フィルタとすることができる。この場合、光源３０２に狭い範囲の波長を使用することが特に有利になるので、検出器３１６に到達する波長λ２の光の量をあまり低減させることなく、波長λ１の光を検出器３１６から効果的に除去するために、狭帯域ノッチフィルタを使用することができる。図３Ａの構成３００と同様に、検出器３１６からの信号は、検出領域に存在する分析物の量を推定するために使用され、かつ検出器３１４からの信号は、検出領域に存在するビーズの数を推定するために使用される。
【００８９】
構成３３４の変形例では、単一の検出器、例えば検出器３１６だけが存在し、それは、検出器３１６の前で光路に出入りするようにフィルタ３１８を動かすことによって、波長λ１の光および波長λ２の光の両方を測定するために使用される。フィルタ３１８が検出器３１６の前に位置する場合、波長λ１の光は大部分が検出器３１６への進入を阻止され、検出器３１６は主として、分析物から発光される波長λ２の蛍光発光の強度に依存する出力信号を生成する。フィルタ３１８が検出器３１６の前で光路の外に移動すると、検出器３１６は主に、強度が一般的に波長λ２より高い波長λ１の光を受光し、検出器３１６は主として、ビーズから反射した波長λ１の光の強度に依存する出力信号を生成する。任意選択的に、フィルタ３１８が検出器３１６の前で光路の外に移動したときに、特に波長λ２の光を遮断し、かつ波長λ１の光を進入させる別のフィルタが検出器３１６の前で光路内に移動して、そのときに検出器３１６によって受光される波長λ２の光の量をさらに低減させる。
【００９０】
フィルタ３１８および任意選択的に別のフィルタを検出器３１６の前で光路に出入りするように移動させることは、機械的に、例えば回転するフィルタホイールを使用することによって行なわれる。代替的にフィルタ交換は、電子的に、例えばカー効果を用いて作動もしくは停止される干渉フィルタを用いることによって、または液晶の偏光を利用することによって、または同様の電子的効果によって行なわれる。
【００９１】
機械的または電子的なフィルタ切替えは、構成３２２および３３０について上述したように波長λ２の光および波長λ３の光に別々の検出器を使用する代わりに、単一の検出器を波長λ２の光に感応することから波長λ３の光に感応するように、かつ再び元に戻すように切り替えるためにも使用することができる。
【００９２】
図３Ａ〜３Ｄに示した構成の他の変形例では、異なる分析物に対して異なる波長の蛍光を発光しかつ／または異なる波長の光によって励起される異なる蛍光タグを使用することによって、２つ以上の分析物を同時に定量する多重アッセイを実行することができる。異なる発光波長は、ダイクロイックミラーによって分離し、かつ異なる検出器に送出することができる。追加的に、または代替的に、異なる蛍光タグによって発光された光は同一検出器によって検出し、それらの光が異なる期間に作動される異なる励起光によって励起されるので、かつ／または発光光が異なる波長を有し、異なるフィルタが検出器の前で光路に出入りするように切り替えられるので、区別することができる。
【００９３】
任意選択的に、多重アッセイでは、異なる分析物からの信号を正規化するために使用されるビーズの数が、各分析物に対して同一となるように、２つ以上の分析物のためのリガンドを同一ビーズに付着させることができる。代替的に、多重アッセイは、異なる分析物に結合されるリガンドを有する異なる種類のビーズの混合物を使用して実行される。この場合、各種類のビーズの数は任意選択的に、各分析物からの信号を正規化するために、独立して測定される。これは例えば、各種類のビーズに対して異なる蛍光発光波長および／または異なる励起波長を使用して、分析物の濃度とは関係なく、ビーズ上またはビーズ内の蛍光物質を励起させることによって行なわれる。代替的に、一部または全部の種類のビーズの数は独立して測定されず、異なる種類のビーズを均一に混合し、異なる種類のビーズの比率は一定であると想定して、異なる種類のビーズの複合された数または１種類のビーズの数を測定することによって、各種類のビーズの個数を推定することができるようにする。しかし、各種類のビーズの数を独立して測定することは、使用されるビーズの有限数から生じる各種類のビーズの数の統計誤差を回避するという潜在的な利点を有し、同数のビーズを用いてより正確な結果を、またはより少数のビーズを用いて同等に正確な結果をもたらすことができる。ビーズのコストはアッセイのコストの重要な部分であるので、使用されるビーズの数の低減は重要になり得る。
【００９４】
本発明の一部の実施形態では、ビーズが例えばウェルプレート１０６または検出セル１２２で水または別の液体で被覆されたときに、ビーズからの光が検出される。この場合、ビーズは任意選択的に、片面を液体に浸漬され、および検出器に向けた他の面が乾燥している透明な平板を介して観察される。この構成は、検出器から見て湾曲したメニスカスまたは液体の表面の波によるビーズの外見の歪みを回避するという利点を有する。
【００９５】
図３Ａ〜３Ｄは、ビーズの数が、ビーズから反射した光、またはビーズによって蛍光発光される光から推定される構成を示す。ビーズの数を推定するために、ビーズから屈折した光、またはビーズによってシルエット化された光を使用することも可能である。図４Ａは、光源４０２が検出セルの表面４０６に載置されたビーズ４０４に照射する構成４００を示す。この構成では、表面４０６は透明であり、光源４０２は表面のビーズとは反対側、すなわち表面の下に位置する。しかし、光源４０２は例えば図３Ｄに示すように斜めの角度で、上からビーズに照射することもでき、その場合、表面４０６は透明である必要はない。ビーズ４０４は透明であり、それらは小さいレンズのように働き、ビーズを通過する光を屈折させる。ビーズ４０４から屈折した一部の光線４０８は、検出器４１０に到達する。しかし光源４０２および検出器４１０は、ビーズによって屈折しない光源４０２からの光、例えばビーズを逸れた光線４１２が検出器４１０に到達せず、例えば検出器４１０の前のストップ４１４によって遮断されるように、配設される。検出器および光源がビーズのほぼ両側にあるので、光源、ビーズ、および検出器の構成はまた、ビーズから反射した光がほとんど検出器４１０に到達しないようにすることもできる。しかし、本発明の一部の実施形態では、ビーズから反射する光のかなりの量が検出器４１０にも到達する。検出器４１０からの信号は、ビーズの数を推定するために使用される一方、図３Ａ〜３Ｄの検出器３１６と同様の別の検出器は、ビーズに接着している分析物の量を推定するために使用される。任意選択的にビーズは着色され、ある波長だけを透過させる。次いで検出器４１０の前のフィルタはこれらの波長を優先的に通過させる一方、ビーズを通過せずに光源から来た多くの迷光を拒絶する。検出器４１０は検出領域のビーズからの積分光に依存する信号を生成し、かつ／または画像処理ソフトウェアを用いてビーズを計数するために使用される画像を生成する。
【００９６】
図４Ｂは、ビーズが位置する透明な表面４０６の反対側から光源４０２がビーズ４０４に照射する構成４１６を示す。光源４０２は、光線４１８のようなビーズ４０４を逸れた光線の場合、その光が検出器４１０に到達するように向けられる。しかし、ビーズ４０４に当たった光線は、光線４２０で示すように、ビーズの曲面からの反射によって、またはビーズが透明である場合にビーズの曲面を介する屈折によって、またはビーズが半透明または乳白色である場合に内部散乱によって、またはビーズが暗色である場合に吸収によって、散乱する。これらの全ての場合に、ビーズは光の一部が検出器４１０に到達することを阻止し、検出器４１０に到達した光を測定する検出器４１０からの信号は、どれだけのビーズが検出領域に存在するかを推定するために使用することができる。検出器４１０が撮像検出器である場合、ビーズは光を背景にして暗く見え、画像処理ソフトウェアによって計数することができる。
【００９７】
構成４１６の変形例では、光源４０２は表面４０６のビーズと同じ側、すなわち表面に位置し、表面は明るい色であり、あるいは光を検出器４１０に向かって直接反射するミラーである一方、ビーズは暗色である。次いで、ビーズは検出器４１０から見て再び光を背景に暗く見え、検出領域から検出器に到達する光の積分強度を表わす検出器４１０からの信号、または検出領域の画像は、検出領域のビーズの数を推定するために使用することができる。
【００９８】
任意選択的に、コントローラ１２８または１つ以上の他のコントローラは、画像処理ソフトウェアの実行、異なる光源または異なる検出器の使用の切替え、光源の変調、および異なるフィルタ間の切替えを含むが、それらに限らず、上述した光学系および検出器サブシステムの機能のいずれかを実行する。
【００９９】
磁石および振動によるビーズの集中化
図５Ａおよび５Ｂは、磁気ビーズを測定する前に磁石および振動を使用して磁気ビーズを検出領域に集中させる検出ステーション５００のそれぞれ平面図および側面図を示す。明確にするために、これらの図面は単一の検出セル５０２だけを示すが、任意選択的に検出ステーションは図１の検出ステーション１２２と同様に検出セルのアレイを含む。この場合、アレイ全体が任意選択的に、全ての検出セルを一緒に振動する１組の振動器を有し、各検出セルは任意選択的に、ビーズをその検出セルの検出領域に向かって引き寄せるそれ自体の磁石を有する。
【０１００】
図５Ａは、任意選択的に円形であり、検出セル５０２の中心にある検出領域５０４を示す。振動器５０６は任意選択的に検出セルの両側に位置し、振動コントローラ５０８の制御下でセルを振動させる。振動は、磁気ビーズ５１０とビーズが載置されている検出セルの底面との間の静止摩擦力を克服するのに充分な大きさの瞬時加速度を生み出す。磁石５１６は、検出セルの下に位置するので図５Ａの平面図では見えないが、図５Ｂの側面図では見え、ビーズを検出領域に引き寄せる不均一な磁場を生じる。これは、例えば、磁石が検出領域の中心に心合わせされた円形磁石であり、磁場の勾配が、検出セルの底面全体でまたは少なくとも検出領域以外のどこでも、径方向内向きに傾く成分を有するように、高さが直径よりあまり短かくなりすぎない場合には、特に当てはまる。そのような磁石の磁場の勾配は一般的に、直径がわずか数ミリメートルの希土類磁石によって生じる大きい磁場の勾配に対し、磁気ビーズを一般的に重力よりかなり大きい力で検出セルの底に対して垂直方向に引っ張る垂直成分をも有する。この垂直力は、検出セルの大部分で、静止摩擦力の適度に大きい係数に対し静止摩擦力を径方向の磁力より大きくするか、またはそれに匹敵させ、振動が存在しなければ、ビーズは全く動かない。
【０１０１】
検出セルへの流体入口５１２および流体出口５１４が概略的に示される。
【０１０２】
任意選択的に、磁石５１６は、検出セルに対して接近またはさらに離間するように、例えば図５Ｂにおける位置５１８に、垂直方向に移動することができる。磁石５１６と代替的磁石位置５１８との間の垂直距離はどちらも図５Ｂに一定の縮尺で描かれておらず、実際には磁石はその直径に対して一般的に高さが高く、その直径に対して垂直方向に図５Ｂに示されるより大きい距離を移動する。磁石が検出セルの底面に接近しすぎると、ビーズを表面から取り除くことが難しくなるので、磁石をさらに離間させる選択肢を持つことにより、測定が行なわれた後、セルを新しい組のビーズに使用することができるように、検出セルを空にすることが容易になる。また、例えば検出領域におけるビーズの濃度を最適化するために、磁石の垂直位置の調整を行なうことによって、ビーズに対する磁力の強さを調整可能にすることも有利である。
【０１０３】
任意選択的に、検出セル５０２は、撓みばねまたは拘束具５２２によって検出ステーションのベース５２０に結合される。ばねまたは拘束具は任意選択的に、振動からの慣性力に比べて相対的に小さい力を検出セルに及ぼし、あるいは検出セルがその公称位置にあるときには力を加えないが、検出セルが摺動してその公称位置から離れすぎることを防止する。代替的に、ばねは振動の慣性力に比べてかなりの力を及ぼし、検出セルは振動の周波数と同等の共振周波数を有する。任意選択的に、検出セルおよびばねの共振システムは比較的高いＱを有し、振動周波数は共振に近いので、振動の振幅はこの高いＱにより著しく増大し、その結果潜在的に、所与の振動器に対してビーズのより効率的な集中化が達成される。
【０１０４】
任意選択的に図３Ａ〜３Ｄまたは図４Ａ〜４Ｂに記載されているように構成された検出光学系５２４は、関連検出器および他の電子機器と共に、任意選択的に、検出領域の上の検出セルの頂部にある透明な窓５２６を通して検出領域を観察する。
【０１０５】
発明者らによって行なわれた試験で、以下の例示的パラメータ値を使用して、検出領域におけるビーズの良好な濃度が生じることが明らかになった。
【０１０６】
検出ステーションは、長さ９ｃｍ、幅１．５ｃｍのアルミニウム片から作られ、セルの中心間隔が９ｍｍの８つの検出セルのアレイを有する。各セルの中心にある検出領域は直径５ｍｍの円である。各セルの中心の下には磁石が配置され、各磁石はＮｄＢＦｅから作られた高さ３ｍｍ、直径４ｍｍの円筒形である。磁石の頂面から１ｍｍで磁石の軸に沿った検出領域の中心の磁場は２３００ガウスである。これらの磁石はＴＭＭ  Ｉｓｒａｅｌによって販売されている。
【０１０７】
振動器はＭＡＣＨ３  Ｇｉｌｅｔｔｅ電気かみそりから取った２つのモータであり、それらを振動させる回転子に軸外し質量を有する。２つのモータは、セルのアレイの長さの両端に取り付けられる。モータの速度はモータに送られる電圧によって制御され、ビーズの濃度を最適化する速度を見出すために様々な速度を試した。より高次の高調波と共に１．５ｍｍのピーク間水平振動振幅で主として８３Ｈｚの振動を発生する８３Ｈｚの回転速度は、約３０秒間続行させた場合に、ビーズの良好な濃度を生じることが分かった。検出セル、モータ、および磁石の組立体全体を平滑なベース上に配置し、ベースから突出するピンによって、組立体の水平運動を各方向に約１ｍｍに制限したが、組立体はそれ以外では抑制されなかった。
【０１０８】
これらの試験に使用した磁気ビーズは、Ｂｉｏ−Ｒａｄによって販売されているアッセイキット、例えばキット１７０−Ａ４０１１Ｍ、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｐｒｏ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ９−Ｐｌｅｘ  Ｐａｎｅｌ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｋｉｔに含まれるのと同じビーズであった。
【０１０９】
検出セルのパラメータおよびビーズを集中させるための振動および磁力の使用のパラメータに対し、ある範囲の値が可能である。例えば、検出領域は任意選択的に直径が約０．５ｍｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、５ｍｍ、もしくは１０ｍｍであり、あるいはより大きいか、より小さいか、または中間の長さである。磁石の直径もまた任意選択的に約０．５ｍｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、５ｍｍ、もしくは１０ｍｍであり、あるいはより大きいか、より小さいか、または中間の長さである。磁石の高さに対する磁石の直径の比は任意選択的に、約０．１、０．２、０．３、０．５、１、１．５、２、または３であり、あるいはより大きいか、より小さいか、または中間の数字である。磁石は円形断面を有するかあるいは均一断面の円筒形である必要はないが、軸線が検出領域の中心と整列する円形磁石を使用すると、方位角的に均一な半径方向の磁力をビーズに対して生成するという潜在的な利点がある。磁石の最近点から検出領域の中心までの距離は任意選択的に約０．２、０．５、１、１．５、２または３ｍｍであり、あるいはより大きいか、より小さいか、または中間的距離である。磁石は任意選択的に、例えばＮｄＦｅＢまたはＳｍＣｏのような希土類磁石であり、強力な磁場を生成し、かつ容易に消磁されないという潜在的利点を有する。
【０１１０】
検出セルのピーク間振動振幅は任意選択的に、約０．３、０．５、１、２、もしくは３ｍｍであり、あるいはより大きいか、より小さいか、または中間的距離である。振動周波数は任意選択的に、約１０、２０、３０、５０、１００、２００、もしくは３００Ｈｚであり、あるいはより大きいか、より小さいか、または中間的周波数である。任意選択的に２つ以上の異なる振動周波数が同時に、または連続的に使用され、それは、任意の単一の振動周波数よりビーズの濃度をより良く最適化するという潜在的利点を有する。振動は任意選択的に約１秒、３秒、１０秒、３０秒、１００秒、５分、１０分、あるいはより長いか、より短いか、または中間的時間、検出セルに加えられる。ビーズの少なくとも一部と検出領域の表面との間の静止摩擦係数は任意選択的に約０．０５、０．１、０．２、０．３、０．５、あるいはより大きいか、より小さいか、または中間的数字である。振動によるビーズのピーク慣性力（質量×加速度）とビーズを検出領域の中心で検出領域に押圧する磁力の垂直成分との比は任意選択的に約０．０５、０．１、０．２、０．３、０．５、１、１．５、２、３、５、１０、あるいはより大きいか、より小さいか、または中間的数字である。ビーズは任意選択的に直径が約２、５、１０、２０、または５０マイクロメートル、あるいはより大きいか、より小さいか、または中間的距離であり、かつそれらの磁気コアの直径は、ビーズの直径の約１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、または８５％、あるいはより大きいか、より小さいか、または中間的数字である。ビーズは球形または他の形状とすることができ、全部が同一形状または同一サイズである必要はなく、あるいは、たとえおおよそでも同一摩擦係数または同一磁気コアサイズおよび形状を有する必要はない。しかしほぼ均等なサイズの球形ビーズを使用すると、磁力に対するビーズの応答、および検出表面との摩擦力、およびビーズの流動挙動がビーズの向きに依存せず、かつビーズが非球形または異なる形状およびサイズであった場合より予測可能性が高くなるという潜在的な利点が得られる。同じことはビーズの磁気コアにも当てはまる。
【０１１１】
検出セルの振動は垂直、水平、または両方の組合せとすることができる。一般的に、振動は任意の方向に直線状、任意の面内で主軸が任意の方向の円状もしくは楕円状、または例えば異なる周波数で異なる方向および異なる平面上の運動の組合せとすることができる。本書で使用する場合、垂直とはビーズが載置されている表面に対し垂直な方向を指すが、ビーズを表面に引き寄せる磁力はしばしば重力より大きいので、ビーズが載置されている表面は、重力に対して水平である必要はない。垂直および水平振動は、ビーズが異なるメカニズムによって静止摩擦を克服することを可能にする。垂直振動は、振動サイクルの少なくとも一部分で、ビーズを表面に引き寄せる磁力に対抗する方向に作用する慣性力を発生させる。これはビーズと表面との間に作用する静止摩擦を低減し、充分に大きい場合、ビーズを表面から完全に上昇させることさえあり、いずれの場合も、ビーズが静止摩擦を克服し、かつ水平磁力の影響下で水平方向に移動することを可能にする。水平振動は振動サイクルの一部分で水平磁力を増大させる慣性力を発生させ、ビーズが静止摩擦を克服して水平磁力の方向に移動することを可能にする。振動サイクルの逆相では、慣性力は水平磁力に対抗し、静止摩擦を克服することのできないより弱い正味水平力、または慣性力および水平磁力が同一方向であるときより小さい距離だけビーズを慣性力の方向に移動させる少なくともより弱い正味水平力のいずれかを発生させる。いずれの場合も、ビーズは水平磁力の方向に正味ドリフトを受ける。
【０１１２】
任意選択的に、水平または垂直成分または両方について、少なくともビーズの大部分に対し、少なくとも検出領域の縁部では、慣性力が磁力より何倍も大きすぎることはない。例えば、慣性力の大きさは磁力の３倍以下、または５倍以下、または１０倍以下である。これは、ビーズを、主として振動サイクル全体でわずかな正味運動により前後に押動させるというより、むしろ検出領域に効率的に集中するように引き付けることができるという潜在的利点を有する。また、振動器が必要以上に強力である必要はないという潜在的利点をも有する。他方、任意選択的に慣性力は磁力の少なくとも０．３倍、少なくとも０．５倍、または少なくとも磁力と同等であり、それは慣性力が静止摩擦を克服するのに充分大きいという潜在的利点を有する。
【０１１３】
静止摩擦を克服するのに充分な振動周波数および振幅の概算は、水平か垂直かにかかわらず、ビーズの慣性力が磁力に匹敵するときの周波数および振幅を計算することによって得ることができる。磁力は、ビーズが鉄または同様の高透磁性の磁性材料から作られた球形コアを有する場合、鉄コアの体積×磁場エネルギ密度の空間的勾配Β２／μ０によって概算することができる。ここでΒは磁場強度であり、μ０は真空の透磁性である。慣性力はピーク間変位の２分の１×振動周波数ω（ラジアン／秒）の２乗×ビーズの質量によって得ることができる。ビーズの質量の大部分を磁気コアの質量が占める場合、慣性力が磁力に匹敵するための条件は、磁場強度、磁石の半径に匹敵する磁場勾配の縮尺長、振動周波数および振幅、ならびに磁気コアの密度のみに依存する。長さおよび高さがどちらも数ミリメートルの希土類磁石、および例えば約１ミリメートルのピーク間振動振幅の場合、慣性力を磁力に匹敵させるために必要な周波数は数十Ｈｚと予想される。これは、磁石の影響下でビーズを検出領域の中心に集中させるのに最も効果的であることが、発明者らによって明らかになった振動周波数に匹敵する。したがって、静止摩擦を克服する振動周波数および振幅を推定するこの方法は、少なくともビーズが空中にあるときには、ビーズの空気抵抗力が慣性力および磁力に比べて相対的に弱いので、かなり正確であるように思われる。
【０１１４】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【０１１５】
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。この用語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」を包含する。
【０１１６】
表現「から本質的になる」は、さらなる成分および／または工程が、特許請求される組成物または方法の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物または方法がさらなる成分および／または工程を含み得ることを意味する。
【０１１７】
本明細書中で使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または用語「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。
【０１１８】
用語「例示的」は、本明細書では「例（ｅｘａｍｐｌｅ，ｉｎｓｔａｎｃｅ又はｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ）として作用する」ことを意味するために使用される。「例示的」として記載されたいかなる実施形態も必ずしも他の実施形態に対して好ましいもしくは有利なものとして解釈されたりかつ／または他の実施形態からの特徴の組み入れを除外するものではない。
【０１１９】
用語「任意選択的」は、本明細書では、「一部の実施形態に与えられるが、他の実施形態には与えられない」ことを意味するために使用される。本発明のいかなる特定の実施形態も対立しない限り複数の「任意選択的」な特徴を含むことができる。
【０１２０】
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
【０１２１】
数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の示された数字および第２の示された数字「の範囲である／の間の範囲」という表現、および、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。
【０１２２】
本明細書中で使用される用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、それらに限定されない。
【０１２３】
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
【０１２４】
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０１２５】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０１２６】
２から８０００ピコグラム／ミリリットルの範囲の試料流体中のＩＬ８の７種類の濃度で、一連のＩＬ８アッセイを行なった。ビーズを検出領域に集中させるために振動は使用しなかった。各濃度で３回の試験を実行した。各試験に対し、検出領域のビーズを冷却ＣＣＤ検出器、すなわちＰＣＯによって販売されたＳｅｎｓｉｃａｍ  ｑｅにより撮像した。検出領域全体で分析物複合体からの積分蛍光発光を測定し、ビーズのデジタル画像で画像処理ソフトウェアを使用して、検出領域におけるビーズの数を計数した。各試験で平均して約３００個のビーズが検出領域に存在した。ＩＬ８の各濃度で３回の試験に対し、生の積分発光の平均および標準偏差のみならず、ビーズの数に対して正規化された積分発光の平均および標準偏差をも計算した。結果を表１に示す。
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【０１２７】
ＩＬ８濃度のほとんどの値で、３回の試験の標準偏差は、積分蛍光発光がビーズの数に対して正規化された場合に実質的に低くなる。これは、平均して約３００であったビーズの数が、約１００の標準偏差で試験毎にかなり変動したためである。ＩＬ８の最も低い濃度の場合だけ、標準偏差は生および正規化積分蛍光発光に対して同程度であった。これは、ＩＬ８の最も低い濃度では、蛍光発光の測定振幅が検出器の雑音レベルに近かったので、正規化された蛍光発光でも百分率標準偏差が高かったためであった。唯一の例外は、ビーズの数が３回の試験でほとんど変動せず、かつＩＬ８の他の濃度の場合より平均が低かった、３１．５ｐｇ／ｍｌのときであった。ビーズの数の変動または平均がＩＬ８の濃度に依存すると考えるべき理由がないので、これはおそらく単なる偶然である。
【０１２８】
検出領域におけるビーズの数のランダムな変動が試験毎に大きいので、ビーズの数が決定され、かつ積分蛍光発光がビーズの数によって正規化されると、アッセイの精度はかなり改善される。この点を例証するために行なったこの一連の試験では、積分蛍光発光は高感度冷却ＣＣＤアレイを用いて測定されるが、検出領域全体の積分蛍光発光を測定する代わりに、単一のより感度の低い室温検出器を使用し、かつ異なる検出器を使用してビーズの数を計数または測定した場合でも、同じ結果になるであろう。
【０１２９】
ＩＬ８濃度を決定するために正規化された蛍光発光を使用する精度の高さは、ＩＬ８濃度の関数として生の蛍光発光および正規化された蛍光発光の平均値を比較することによっても分かる。正規化平均値はＩＬ８濃度のより平滑な関数であり、低濃度ではほぼ線形であり、高濃度では平滑に飽和する。
【０１３０】
別の一連の実験では、ＩＬ８濃度の各値に対し、次の方法の各々を使用して、正規化された蛍光発光の標準偏差を決定した。
１）ビーズを撮像し、かつ各ビーズに対しＩＬ８による蛍光発光を直接測定する。ビーズは磁石および振動を用いて集中させなかった。
２）全てのビーズからのＩＬ８による積分蛍光発光を測定し、かつＩＬ８による蛍光発光とは異なる波長のビーズの積分固有蛍光発光を測定することによって、ビーズの数を決定する。ビーズの固有蛍光発光はＩＬ８濃度に依存しない。ビーズは磁石および振動を用いて集中させなかった。
３）磁石および振動を用いてビーズを集中させたこと以外は、方法２と同じ。
４）比較のため、ビーズが一度に１個ずつ検出器を通過し、そこで各ビーズの蛍光発光を測定する、市販のＢｉｏ−Ｐｌｅｘシステムを用いてビーズ１個当たりの蛍光発光を測定した。この方法は、ＩＬ８のビーズベースの蛍光発光アッセイから期待することのできる最良の性能の兆候をもたらすが、最初の３つの方法よりずっと高価であり、かつ遅い。
【０１３１】
これらの４つの方法の各々に対し、３つの実験を実行し、各実験内で、ビーズの位置を変更することなく、蛍光発光を３回測定した。各実験内の異なる測定の標準偏差を求め、かつ実験を代表する各実験内で行なわれた３つの実験の平均値を使用して、３つの実験の標準偏差をも求めた。各実験内の異なる測定の標準偏差は、確率論的機械誤差が結果に与える影響の程度の尺度である。３つの実験の標準偏差は、結果が異なる条件、例えば温度の相違、製造された方法の変動によるビーズのサイズおよび形状の相違、アッセイのプロトコルが実行された方法の相違、有限な貯蔵寿命または製造の相違による様々な化学的試薬の強度の相違、および検出セルにおけるビーズの数および分布の相違によって影響される程度の尺度である。
【０１３２】
表２、３、４、および５は、それぞれ方法１〜４について、各実験内の異なる測定および３つの実験に対するＩＬ８の各濃度の標準偏差の百分率を示す。
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【０１３３】
表２〜４に示す通り、方法１〜３はいずれも、表５に示すＢｉｏ−Ｐｌｅｘシステムほど低い標準偏差は生じなかったが、方法１〜３の各々の標準偏差はかなり小さく、全てのビーズからの積分蛍光発光の検出を用いる方法で、かなり良い結果が出せることを示している。これらの方法は、それらがかなり良い結果を出すならば、個々のビーズを一度に１個ずつ検出器に通すのでより複雑でありかつより長い時間がかかるＢｉｏ−Ｐｌｅｘシステムより好適とすることができる。
【０１３４】
ビーズの固有蛍光発光を使用してビーズの数を推定する方法２（表３）は、画像を用いてビーズを計数する方法１（表２）に匹敵する標準偏差をもたらし、ビーズの数を決定する両方の方法が潜在的に有用であることを実証している。
【０１３５】
磁石および振動を用いてビーズを集中させる方法３（表４）は、方法２（表３）よりわずかに低い標準偏差をもたらし、ビーズを集中させるために磁石および振動を使用することが有用であることを示している。
【０１３６】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
【０１３７】
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。
【図２】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図１】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【国際調査報告】
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