(57)【要約】本発明は、ＰＣＳＫ９遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ、およびＰＣＳＫ９の発現を阻害し、ＰＣＳＫ９関連障害、例えば、高脂血症を治療するためにｓｉＲＮＡを用いる方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＳＫ９の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、ＡＤ−２７９１９からなる、ｄｓＲＮＡ。
【請求項２】
ＰＣＳＫ９の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、ＡＤ−９６８０を除く、表１、２、６、または７に記載のｄｓＲＮＡからなる、ｄｓＲＮＡ。
【請求項３】
ＰＣＳＫ９の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡは、センス鎖と、ＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡ転写物に対する相補性領域を含むアンチセンス鎖と、を含み、前記アンチセンス鎖は、表１、２、６、または７に列挙されるアンチセンス配列のうちの１つとはヌクレオチドが３個以下異なる少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む、ｄｓＲＮＡ。
【請求項４】
前記相補性領域が、少なくとも１７ヌクレオチド長である、請求項３に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項５】
前記相補性領域が、１９〜２１ヌクレオチド長である、請求項３に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項６】
前記相補性領域が、１９ヌクレオチド長である、請求項３に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項７】
前記相補性領域が、表１、２、６、または７のアンチセンス配列のうちの１つからなる、請求項３に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項８】
前記ｄｓＲＮＡが、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項３〜７のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項９】
前記修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも１個が、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項８に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１０】
前記修飾ヌクレオチドが、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、およびヌクレオチドを含む非天然塩基からなる群から選択される、請求項８に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１１】
それぞれの鎖が、３０ヌクレオチド長以下である、請求項３〜１０のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１２】
少なくとも１本の鎖が、少なくとも１個のヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項３〜１１のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１３】
少なくとも１本の鎖が、少なくとも２個のヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項１２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１４】
リガンドをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１５】
前記リガンドが、前記ｄｓＲＮＡの前記センス鎖の３’末端に結合される、請求項１４記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡを含有する細胞。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡの少なくとも１本の鎖をコードするベクター。
【請求項１８】
請求項１８に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡを含むＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
【請求項２０】
脂質製剤をさらに含む、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記脂質製剤が、核酸脂質粒子製剤である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
細胞内のＰＣＳＫ９発現を阻害する方法であって、
（ａ）請求項１〜１５のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡを前記細胞に導入することと、
（ｂ）ステップ（ａ）において生成された前記細胞をＰＣＳＫ９遺伝子の前記ｍＲＮＡ転写物の分解をもたらすのに十分な時間維持し、それによって、前記細胞内の前記ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害することと、を含む、方法。
【請求項２３】
前記ＰＣＳＫ９発現が少なくとも３０％阻害される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＰＣＳＫ９発現によって媒介される障害を治療する方法であって、そのような治療を必要とするヒトに、請求項１〜１５のいずれかに記載の治療的に有効な量のｄｓＲＮＡを投与することを含む、方法。
【請求項２５】
前記ヒトが、高脂血症を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ｄｓＲＮＡが、前記対象の体重１ｋｇ当たり０．０１ｍｇ〜５ｍｇの濃度で投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ＬＤＬＲ遺伝子に対してヘテロ接合性であるヒトにおける高コレステロール血症を治療するための方法であって、前記ヒトのＬＤＬＲ遺伝子型または表現型を決定することと、前記ヒトに、脂質で製剤化されたＡＤ−９６８０  ｄｓＲＮＡを含む有効な量のＭＣ３を０．０１〜５．０ｍｇ／ｋｇ（体重）の投与量で投与することと、を含み、投与が、血清コレステロールの低下をもたらす、方法。
【請求項２８】
ＬＤＬＲ遺伝子に対してヘテロ接合性である対象における高コレステロール血症を治療するための方法であって、前記対象に、ＰＣＳＫ９の発現を阻害するために有効な量のｄｓＲＮＡを投与することを含み、前記ｄｓＲＮＡは、センス鎖と、ＰＣＳＫ９  ＲＮＡ転写物に対する相補性領域を含むアンチセンス鎖と、を含み、前記ｄｓＲＮＡは、３０個以下の塩基対の長さである、方法。
【請求項２９】
前記アンチセンス鎖が、ＡＤ−９６８０のセンス配列またはＡＤ−１０７９２のセンス配列の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドに対して相補的である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ｄｓＲＮＡが、ＡＤ−１０７９２またはＡＤ−９６８０からなる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記ｄｓＲＮＡが、脂質で製剤化される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記ｄｓＲＮＡが、表Ａから選択される製剤において脂質で製剤化される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記対象が、霊長類または齧歯類である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記対象が、ヒトである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記有効な量が、前記対象の体重１ｋｇ当たり０．０１〜５．０ｍｇの濃度である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記対象のＬＤＬＲ遺伝子型または表現型を決定することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
投与が、前記対象の血清コレステロールの減少をもたらす、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
前記対象の前記血清コレステロールのレベルを決定することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１０年１０月２９日出願の米国仮出願第６１／４０８，５１３号の利益を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の参照
該当なし
【０００３】
本発明は、ＰＳＣＫ９を対象としたｓｉＲＮＡ組成物およびＰＣＳＫ９遺伝子発現の阻害方法、ならびにＰＣＳＫ９遺伝子発現に関連する病理学的状態、例えば、高脂血症の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９（ＰＣＳＫ９）は、サブチリシンセリンプロテアーゼファミリーのメンバーである。他の８個の哺乳類サブチリシンプロテアーゼ、ＰＣＳＫ１〜ＰＣＳＫ８（ＰＣ１／３、ＰＣ２、フューリン、ＰＣ４、ＰＣ５／６、ＰＡＣＥ４、ＰＣ７、およびＳ１Ｐ／ＳＫＩ−１とも呼ばれる）は、分泌経路で多種多様のタンパク質をプロセシングし、様々な生物学的プロセスにおいて役割を果たすプロタンパク質転換酵素である（Ｂｅｒｇｅｒｏｎ，Ｆ．（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２４，１−２２、Ｇｅｎｓｂｅｒｇ，Ｋ．，（１９９８）Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．９，１１−１７、Ｓｅｉｄａｈ，Ｎ．Ｇ．（１９９９）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．８４８，４５−６２、Ｔａｙｌｏｒ，Ｎ．Ａ．，（２００３）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１７，１２１５−１２２７、およびＺｈｏｕ，Ａ．，（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７４，２０７４５−２０７４８）。ＰＣＳＫ９はコレステロール代謝において役割を果たすと提唱されている。ＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡ発現は、コレステロール生合成酵素および低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）と同様に、マウスでは食事性コレステロール摂食によって下方制御され（Ｍａｘｗｅｌｌ，Ｋ．Ｎ．，（２００３）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４４，２１０９−２１１９）、ＨｅｐＧ２細胞ではスタチンによって上方制御され（Ｄｕｂｕｃ，Ｇ．，（２００４）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２４，１４５４−１４５９）、ステロール調節要素結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）トランスジェニックマウスでは上方制御される（Ｈｏｒｔｏｎ，Ｊ．Ｄ．，（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００，１２０２７−１２０３２）。さらに、ＰＣＳＫ９ミスセンス変異が、常染色体優性高コレステロール血症（Ｈｃｈｏｌａ３）の形態と関連していることが見出されている（Ａｂｉｆａｄｅｌ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３４．１５４−１５６、Ｔｉｍｍｓ．Ｋ．Ｍ．，（２００４）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１１４．３４９−３５３、Ｌｅｒｅｎ，Ｔ．Ｐ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．６５．４１９−４２２）。単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）が日本人集団のコレステロールレベルと関連しているため、ＰＣＳＫ９は、一般集団のＬＤＬコレステロールレベルを決定する役割も果たし得る（Ｓｈｉｏｊｉ，Ｋ．，（２００４）Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４９，１０９−１１４）。
【０００５】
常染色体優性高コレステロール血症（ＡＤＨ）は、患者が総コレステロールおよびＬＤＬコレステロールレベルの上昇、腱黄色腫、ならびに早期のアテローム性動脈硬化症を呈する単一遺伝子疾患である（Ｒａｄｅｒ，Ｄ．Ｊ．，（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１１，１７９５−１８０３）。ＡＤＨおよび劣性型の常染色体劣性高コレステロール血症（ＡＲＨ）（Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｃ．，（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．１４，１２１−１２７）の発症は、肝臓によるＬＤＬ取り込みの欠陥に起因する。ＡＤＨは、ＬＤＬ取り込みを阻止するＬＤＬＲ変異によって、またはＬＤＬＲに結合するＬＤＬ上のタンパク質であるアポリポタンパク質Ｂの変異によって引き起こされる場合がある。ＡＲＨは、そのクラスリンとの相互作用を介したＬＤＬＲ−ＬＤＬ複合体のエンドサイトーシスに必要なＡＲＨタンパク質の変異によって引き起こされる。したがって、ＰＣＳＫ９変異がＨｃｈｏｌａ３ファミリーにおいて原因となる場合、ＰＣＳＫ９が受容体を介するＬＤＬ取り込みにおいて役割を果たしている可能性が高いと思われる。
【０００６】
過剰発現研究は、ＬＤＬＲレベル、したがって、肝臓によるＬＤＬ取り込みを制御するＰＣＳＫ９の役割を指摘している（Ｍａｘｗｅｌｌ，Ｋ．Ｎ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１，７１００−７１０５、Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，４８８６５−４８８７５、Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｗ．，（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，５０６３０−５０６３８）。マウスにおける３日間もしくは４日間のマウスまたはヒトＰＣＳＫ９のアデノウイルス媒介性過剰発現は、総コレステロールおよびＬＤＬコレステロールレベルの上昇をもたらし、この結果は、ＬＤＬＲノックアウト動物においては見られない（Ｍａｘｗｅｌｌ，Ｋ．Ｎ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１，７１００−７１０５、Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，４８８６５−４８８７５、Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｗ．，（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，５０６３０−５０６３８）。加えて、ＰＣＳＫ９過剰発現は、ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡレベル、ＳＲＥＢＰタンパク質レベル、またはＳＲＥＢＰタンパク質核対細胞質比に影響を及ぼすことなく、肝臓ＬＤＬＲタンパク質のかなりの減少をもたらす。
【０００７】
ＰＣＳＫ９における機能喪失変異がマウスモデルで設計され（Ｒａｓｈｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）ＰＮＡＳ，１０２，５３７４−５３７９）、ヒト個体で同定されている（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３７：１６１−１６５）。両方の場合において、ＰＣＳＫ９機能の喪失は、総コレステロールとＬＤＬｃコレステロールの低下をもたらす。１５年以上にわたるレトロスペクティブな転帰研究では、ＰＣＳＫ９の１つのコピーの喪失が、ＬＤＬｃレベルをより低く変化させ、心血管心疾患の発症からのリスク便益保護の増大をもたらすことが示された（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３５４：１２６４−１２７２）。
【０００８】
二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）が、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として既知の高度に保存された調節機構において遺伝子発現を阻止することが示されている。国際公開第ＷＯ９９／３２６１９号（Ｆｉｒｅら）は、カエノラブディティス・エレガンスにおいて遺伝子の発現を阻害するために、少なくとも２５ヌクレオチド長のｄｓＲＮＡの使用を開示した。ｄｓＲＮＡは、植物（例えば、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅらの国際公開第ＷＯ９９／５３０５０号およびＨｅｉｆｅｔｚらの国際公開第ＷＯ９９／６１６３１号を参照のこと）、ショウジョウバエ属（例えば、Ｙａｎｇ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．（２０００）１０：１１９１−１２００を参照のこと）、ならびに哺乳動物（Ｌｉｍｍｅｒの国際公開第ＷＯ００／４４８９５号およびＫｒｅｕｔｚｅｒらの独国特許第１０１  ００  ５８６．５号を参照のこと）を含む他の生物における標的ＲＮＡを分解することも示されている。この天然機構は、現在、遺伝子の異常な調節または望ましくない調節によって引き起こされる障害を治療するための新しい種類の医薬品の開発の焦点となっている。
【０００９】
ＰＣＳＫ９を標的とするｓｉＲＮＡの説明を、２００７年５月１０日出願の米国特許出願第１１／７４６，８６４号（現在の米国特許第７，６０５，２５１号）および２００７年５月１０日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６８６５５号（国際公開第ＷＯ２００７／１３４１６１号として公開されている）で見出すことができる。さらなる開示を、２００９年６月４日出願の米国特許出願第１２／４７８，４５２号（米国第２０１０／００１００６６号として公開されている）および２００９年１月３０日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３２７４３号（国際公開第ＷＯ２００９／１３４４８７号として公開されている）で見出すことができる。
【発明の概要】
【００１０】
以下により詳細に記載されるように、ＰＣＳＫ９を標的とするｓｉＲＮＡを含む組成物が本明細書に開示される。ＰＣＳＫ９発現の阻害およびＰＣＳＫ９発現に関連した病状、例えば、高脂血症の治療のための方法も開示される。
【００１１】
したがって、本発明の一態様は、ＰＣＳＫ９の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であり、該ｄｓＲＮＡは、センス鎖と、ＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡ転写物に対する相補性領域を有するアンチセンス鎖と、を含み、アンチセンス鎖は、表１、２、６、または７に列挙されるアンチセンス配列のうちの１つとはヌクレオチドが３個以下異なる少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、表１、２、６、または７に記載のｄｓＲＮＡである。ｄｓＲＮＡは、ＡＤ−２７９１９であり得る。
【００１２】
本発明の任意のｄｓＲＮＡは、少なくとも１７ヌクレオチド長、例えば、１９〜２１ヌクレオチド長、例えば、１９ヌクレオチド長の相補性領域を有し得る。いくつかの実施形態において、相補性領域は、表１、２、６、または７のアンチセンス配列である。
【００１３】
ｄｓＲＮＡは、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含み得る。修飾ヌクレオチドの例として、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、コレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、およびヌクレオチドを含む非天然塩基が挙げられる。
【００１４】
本発明のｄｓＲＮＡのそれぞれの鎖は、典型的には、３０ヌクレオチド長以下であり、例えば、それぞれの鎖は、１５〜２５ヌクレオチド長、１９〜２３ヌクレオチド長、または２１ヌクレオチド長である。センス鎖およびアンチセンス鎖は、同一の長さであり得るか、または異なる長さであり得る。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡは、オーバーハングを含み、例えば、少なくとも１本の鎖は、少なくとも１個のヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。ｄｓＲＮＡは、少なくとも２個のヌクレオチドの３’オーバーハングを有する少なくとも１本の鎖を含み得、例えば、両方の鎖は、２個のヌクレオチドの３’オーバーハングを含み得る。
【００１６】
本発明のｄｓＲＮＡは、リガンドを含み得る。いくつかの実施形態において、リガンドは、ｄｓＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される。リガンドは、脂質に基づくリガンドであり得る。
【００１７】
本明細書に記載のｄｓＲＮＡを含有する細胞、本明細書に記載のｄｓＲＮＡの少なくとも１本の鎖をコードするベクター、および該ベクターを含有する細胞も本明細書に含まれる。
【００１８】
本発明のｄｓＲＮＡを含むＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物も本明細書に含まれる。医薬組成物は、脂質製剤を含み得る。一実施形態において、脂質製剤は、核酸脂質粒子製剤である。
【００１９】
本発明の別の態様は、細胞内のＰＣＳＫ９発現を阻害する方法であり、本発明のｄｓＲＮＡを細胞に導入するステップと、生成された細胞をＰＣＳＫ９遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解をもたらすのに十分な時間維持し、それによって、細胞内のＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するステップとを有する。いくつかの実施形態において、ＰＣＳＫ９発現は、少なくとも３０％阻害される。
【００２０】
ＰＣＳＫ９発現によって媒介される障害を治療する方法も含まれ、そのような治療を必要とするヒトに、治療的に有効な量の本発明のｄｓＲＮＡを投与することを含む。障害は、例えば、高脂血症であり得る。ｄｓＲＮＡを、例えば、対象の体重１ｋｇ当たり０．０１ｍｇ〜５ｍｇの濃度で投与してもよい。
【００２１】
別の実施形態では、本発明は、ＬＤＬＲ遺伝子に対してヘテロ接合性であるヒトにおける高コレステロール血症を治療するための方法を含み、ヒトのＬＤＬＲ遺伝子型または表現型を決定するステップと、ヒトに、脂質で製剤化されたＡＤ−９６８０  ｄｓＲＮＡを含む有効な量のＭＣ３を０．０１〜５．０ｍｇ／ｋｇ（体重）の投与量で投与するステップと、を有し、投与が、血清コレステロールの低下をもたらす。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、ＬＤＬＲ遺伝子に対してヘテロ接合性である対象における高コレステロール血症を治療するための方法を含み、対象に、ＰＣＳＫ９の発現を阻害するのに有効な量のｄｓＲＮＡを投与するステップを有し、前記ｄｓＲＮＡは、センス鎖と、ＰＣＳＫ９  ＲＮＡ転写物に対する相補性領域を含むアンチセンス鎖と、を含み、ｄｓＲＮＡは、３０個以下の塩基対の長さである。本方法のいくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、ＡＤ−９６８０のセンス配列またはＡＤ−１０７９２のセンス配列の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドに対して相補的である。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ＡＤ−１０７９２またはＡＤ−９６８０からなる。対象は、例えば、霊長類、例えば、ヒト、または齧歯類、例えば、マウスであってもよい。有効な量とは、例えば、対象の体重１ｋｇ当たり０．０１〜５．０ｍｇ／ｋｇの濃度であってもよい。本方法は、対象のＬＤＬＲ遺伝子型または表現型を決定すること、および／または対象における血清コレステロールレベルを決定することも含み得る。いくつかの実施形態において、投与が、対象における血清コレステロールの低下をもたらす。
【００２３】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、本方法において使用されるｄｓＲＮＡは、脂質で製剤化され、例えば、ｄｓＲＮＡは、表Ａから選択される製剤において脂質で製剤化される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】野生型およびＬＤＬＲヘテロ接合体マウスへのＰＣＳＫ９投与の結果を有するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、ＰＣＳＫ９遺伝子をサイレンシングするためにｓｉＲＮＡを用いて高脂血症等のＰＣＳＫ９遺伝子の下方制御によって調節され得る疾患治療の課題に対する解決策を提供する。
【００２６】
本発明は、ｓｉＲＮＡを用いて対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法を提供する。本発明は、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を下方制御することによって調節することができる病理学的状態および疾患（例えば、高脂血症）を治療するための組成物および方法も提供する。
【００２７】
定義
便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用されるある特定の用語および語句の意味が以下に提供される。本明細書の他の部分での用語の用法と、本項に提供されるその定義との間に明らかな相違がある場合、本項の定義を優先することとする。
【００２８】
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」、および「Ｕ」はそれぞれ、概して、塩基として、それぞれ、グアニン、シトシン、アデニン、チミジン、およびウラシルを含有するヌクレオチドを表す。「Ｔ」および「ｄＴ」は、本明細書において同義に使用され、ヌクレオ塩基がチミンであるデオキシリボヌクレオチド、例えば、デオキシリボチミンを指す。しかしながら、「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語は、以下でさらに詳述される修飾ヌクレオチド、または代替の置換部分も指すことができることが理解される。そのような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に変化させることなく、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルが他の部分によって置換されてもよいことは、当業者には周知である。例えば、制限なく、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含むヌクレオチドと塩基対形成し得る。したがって、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含有するヌクレオチドは、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列で、例えばイノシンを含有するヌクレオチドによって置換されてもよい。別の例では、アデニンおよびシトシンは、オリゴヌクレオチド中のどこでも、標的ｍＲＮＡとＧ−Ｕゆらぎ塩基対を形成するために、それぞれ、グアニンおよびウラシルと置換されてもよい。そのような置換部分を含有する配列は、本発明で取り上げられる組成物および方法に好適である。
【００２９】
「ＰＣＳＫ９」という用語は、プロタンパク質転換酵素スブチリシンケキシン９遺伝子またはタンパク質（ＦＨ３、ＨＣＨＯＬＡ３、ＮＡＲＣ−１、ＮＡＲＣ１としても知られている）を指す。ＰＣＳＫ９に対するｍＲＮＡ配列の例として、ヒト：ＮＭ＿１７４９３６、マウス：ＮＭ＿１５３５６５、およびラット：ＮＭ＿１９９２５３が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡ配列のさらなる例は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋを用いて容易に入手することができる。
【００３０】
本明細書で使用される「ｉＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡを含有し、かつＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を介してＲＮＡ転写物の標的切断を媒介する作用物質を指す。ｉＲＮＡという用語は、ｓｉＲＮＡを含む。
【００３１】
以下により詳しく記載されるように、「ｓｉＲＮＡ」および「ｓｉＲＮＡ作用物質」という用語は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を介してＲＮＡ転写物の標的切断を媒介するｄｓＲＮＡを指す。概して、ｓｉＲＮＡは、ｄｓＲＮＡである。
【００３２】
本明細書で使用される「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」は、標的ＲＮＡに対して「センス」および「アンチセンス」配向を有するといわれる２本の逆平行の実質的に相補的な核酸鎖を含むハイブリッド二本鎖領域を有するＲＮＡ分子または分子の複合体を指す。
【００３３】
「標的遺伝子」という用語は、発現を阻害するために本発明のｓｉＲＮＡによって標的化される目的とする遺伝子、例えば、ＰＣＳＫ９または第２遺伝子、例えば、ＸＢＰ−１を指す。
【００３４】
以下により詳しく記載されるように、「標的配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを含む、標的遺伝子の転写中に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続部分を指す。配列の標的部分は、少なくともその部分またはその近くでのｉＲＮＡ指向切断のための基質としての機能を果たすのに十分な長さである。例えば、標的配列は、概して、９〜３６ヌクレオチド長、例えば、１５〜３０ヌクレオチド長であり、それらの間のすべての部分的な範囲を含む。
【００３５】
本明細書で使用される「配列を含む鎖」という用語は、標準的なヌクレオチド命名法を用いて言及される配列によって記載されるヌクレオチド鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。
【００３６】
本明細書で使用される場合、別途示されない限り、「相補的」という用語は、第２のヌクレオチド配列との関連で第１のヌクレオチド配列を説明するために使用されるとき、当業者に理解されるように、特定の条件下で、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドとハイブリダイズして二本鎖構造を形成する、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの能力を指す。そのような条件は、例えば、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ、洗浄後５０℃または７０℃で１２〜１６時間を含み得るストリンジェントな条件であり得る。生物の内部で遭遇し得るような生理学的に関連する条件等の他の条件が適用されてもよい。当業者であれば、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終的な用途に従って、２つの配列の相補性の試験に最も適切な一連の条件を決定することができる。
【００３７】
ｉＲＮＡ内、例えば、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ内の相補的配列は、ヌクレオチド配列の一方もしくは両方の全長にわたる、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに対する第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの塩基対合を含む。そのような配列は、本明細書において、相互に対して「完全に相補的」と称され得る。しかしながら、本明細書において、第１の配列が第２の配列に対して「実質的に相補的」と称されるとき、これら２つの配列は、完全に相補的であり得るか、またはそれらの最終的な用途、例えば、ＲＩＳＣ経路を介する遺伝子発現の阻害にとって最も適切な条件下でハイブリダイズする能力を維持しながら、最大３０塩基対の二本鎖ハイブリダイゼーション時に、１つ以上であるが、通常５、４、３、または２個以下のミスマッチ塩基対を形成し得る。しかしながら、２個のオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション時に１つ以上の単鎖のオーバーハングを形成するように設計される場合、そのようなオーバーハングは、相補性の決定に関してミスマッチであると見なされないものとする。例えば、２１ヌクレオチド長の１個のオリゴヌクレオチドおよび２３ヌクレオチド長の別のオリゴヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡであって、長い方のオリゴヌクレオチドが、短い方のオリゴヌクレオチドに対して完全に相補的な２１個のヌクレオチドの配列を含むｄｓＲＮＡは、さらに、本明細書に記載の目的のために「完全に相補的」と称され得る。
【００３８】
本明細書で使用される「相補的」配列は、それらのハイブリダイズする能力に関して上記の要件が満たされる限り、非ワトソン−クリック型塩基対および／または非天然ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドから形成された塩基対も含み得るか、あるいはこれらの塩基対から完全に形成され得る。そのような非ワトソン−クリック塩基対には、Ｇ−Ｕゆらぎまたはフーグスティーン型塩基対が含まれるが、これらに限定されない。
【００３９】
本明細書の「相補的」、「完全に相補的」、および「実質的に相補的」という用語は、それらの使用の文脈から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間またはｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖と標的配列との間の塩基マッチングに対して使用され得る。
【００４０】
本明細書で使用される、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の「少なくとも一部に対して実質的に相補的」であるポリヌクレオチドは、標的遺伝子のｍＲＮＡ（例えば、ＰＣＳＫ９をコードするｍＲＮＡ）の連続部分に対して実質的に相補的ポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、配列がＰＣＳＫ９をコードするｍＲＮＡの中断されていない部分に対して実質的に相補的である場合、ＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡの少なくとも一部に対して相補的である。
【００４１】
当業者であれば、「ＲＮＡ分子」もしくは「リボ核酸分子」という用語が、発現されるか、または自然界で見つけられるＲＮＡ分子だけでなく、本明細書に記載されるか、または当技術分野で既知の１つ以上のリボヌクレオチド／リボヌクレオシド類似体もしくは誘導体を含むＲＮＡの類似体および誘導体も包含することを理解する。厳密に言えば、「リボヌクレオシド」は、ヌクレオシド塩基およびリボース糖を含み、「リボヌクレオチド」は、１つ、２つ、または３つのリン酸部分を有するリボヌクレオシドである。しかしながら、「リボヌクレオシド」および「リボヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用されるとき、同等であると見なされ得る。ＲＮＡは、例えば、以下の本明細書に記載されるように、核酸塩基構造またはリボースリン酸骨格構造において修飾され得る。しかしながら、リボヌクレオシド類似体または誘導体を含む分子は、二本鎖を形成する能力を維持しなければならない。非限定的な例として、ＲＮＡ分子は、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’ホスホロチオエート基を含むヌクレオシド、コレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオシド、ロックされたヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオシド、２’−アミノ−修飾ヌクレオシド、２’−アルキル−修飾ヌクレオシド、モルホリノヌクレオシド、ホスホルアミデート、もしくはヌクレオシドを含む非天然塩基、またはこれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない少なくとも１個の修飾リボヌクレオシドも含み得る。あるいは、ＲＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ分子の全長に至るまで、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個またはそれ以上の修飾リボヌクレオシドを含み得る。この修飾物は、ＲＮＡ分子におけるそのような複数の修飾リボヌクレオシドのそれぞれに対して同一である必要はない。一実施形態において、本明細書に記載の方法および組成物における使用が企図される修飾されたＲＮＡは、必要とされる二本鎖構造を形成する能力を有し、かつＲＩＳＣ経路を介して標的ＲＮＡの特異的分解を可能にするか、または媒介するペプチド核酸（ＰＮＡ）である。
【００４２】
一態様において、修飾リボヌクレオシドは、デオキシリボヌクレオシドを含む。そのような例において、ｉＲＮＡ剤は、例えば、ｄｓＲＮＡの二本鎖部分内でデオキシヌクレオシドオーバーハング（複数を含む）、または１つ以上のデオキシヌクレオシドを含む、１つ以上のデオキシヌクレオシドを含み得る。しかしながら、いかなる場合でも、「ｉＲＮＡ」という用語により包含される二本鎖ＤＮＡ分子でないことは自明である。
【００４３】
本明細書で使用される「ヌクレオチドオーバーハング」という用語は、ｉＲＮＡの二本鎖構造、例えば、ｄｓＲＮＡから突出する少なくとも１個の不対ヌクレオチドを指す。例えば、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３’末端が、他方の鎖の５’末端を越えて延在するか、またはその逆であるときに、ヌクレオチドオーバーハングが存在する。ｄｓＲＮＡは、少なくとも１個のヌクレオチドのオーバーハングを含み得るか、あるいは、該オーバーハングは、少なくとも２個のヌクレオチド、少なくとも３個のヌクレオチド、少なくとも４個のヌクレオチド、少なくとも５個のヌクレオチド、またはそれ以上を含み得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドを含むヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含むか、またはこれらからなり得る。該オーバーハング（複数を含む）は、センス鎖、アンチセンス鎖、またはそれらの任意の組み合わせ上にあり得る。さらに、オーバーハングのヌクレオチド（複数を含む）は、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖もしくはセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端、または両方の末端に存在し得る。該オーバーハング中のヌクレオチドのうちの１つ以上を、ヌクレオシドチオホスフェートで置換することができる。
【００４４】
ｄｓＲＮＡに関して本明細書で使用される「平滑」または「平滑末端化された」という用語は、ｄｓＲＮＡの所与の末端では不対ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が存在しない、すなわち、ヌクレオチドオーバーハングが存在しないことを意味する。ｄｓＲＮＡの一方または両方の末端が平滑であり得る。ｄｓＲＮＡの両方の末端が平滑である場合、該ｄｓＲＮＡは、平滑末端化されていると考えられる。明確にするために、「平滑末端化された」ｄｓＲＮＡは、両方の末端で平滑であるｄｓＲＮＡであり、すなわち、その分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングが存在しない。ほとんどの場合、そのような分子は、その全長にわたって二本鎖である。
【００４５】
「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」という用語は、標的配列に実質的に相補的な領域を含むｉＲＮＡの鎖、例えば、ｄｓＲＮＡの鎖を指す。本明細書で使用される「相補性領域」という用語は、配列、例えば本明細書で定義される標的配列に対して実質的に相補的なアンチセンス鎖の領域を指す。相補性領域が標的配列に対して完全に相補的でない場合、ミスマッチは、分子の内部領域または末端領域に存在し得る。概して、最も許容されるミスマッチは、末端領域内、例えば、５’および／または３’末端から５、４、３、または２ヌクレオチド以内に存在する。
【００４６】
本明細書で使用される「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」という用語は、その用語が本明細書で定義されるアンチセンス鎖の領域に対して実質的に相補的な領域を含むｉＲＮＡの鎖を指す。
【００４７】
本明細書で使用される「ＳＮＡＬＰ」という用語は、安定した核酸脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰは、ｉＲＮＡまたはｉＲＮＡが転写されるプラスミド等の核酸を含む還元された水性内部をコーティングする脂質の小胞を表す。ＳＮＡＬＰは、例えば、米国特許出願公開第２００６０２４００９３号、同第２００７０１３５３７２号、および国際出願第ＷＯ２００９０８２８１７号に記載されている。これらの出願は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【００４８】
「細胞への導入」は、ｉＲＮＡについて言及するとき、当業者に理解されるように、細胞への取り込みもしくは吸収を促進するか、またはそれをもたらすことを意味する。ｉＲＮＡの吸収または取り込みは、支援を受けない拡散プロセスもしくは能動的な細胞プロセスを介して、または補助剤もしくはデバイスによって生じ得る。この用語の意味は、インビトロ細胞に限定されず、ｉＲＮＡを生存生物の一部である「細胞に導入」することもできる。そのような場合、細胞への導入は、該生物への送達を含む。例えば、インビボ送達の場合、ｉＲＮＡを組織部位に注入するか、または全身投与することができる。インビボ送達は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，０３２，４０１号および同第５，６０７，６７７号、ならびに米国公開第２００５／０２８１７８１号に記載の送達系等のベータグルカン送達系によるものであり得る。インビトロでの細胞への導入には、電気穿孔法およびリポフェクション法等の当技術分野で既知の方法が含まれる。さらなるアプローチは、以下の本明細書に記載されるか、または当技術分野で既知である。
【００４９】
本明細書で使用される「〜の発現を調節する」という用語は、未処理の細胞における標的遺伝子の発現と比較して、本明細書に記載のｉＲＮＡ組成物で処理された細胞における標的遺伝子発現の少なくとも部分的な「阻害」または部分的な「活性化」を指す。
【００５０】
「活性化する」「強化する」、「〜の発現を上方制御する」、「〜の発現を増加させる」等の用語は、それらが標的遺伝子を指す限り、本明細書において、第１の細胞もしくは細胞群と実質的に同一であるが、そのように治療されていない第２の細胞もしくは細胞群（対照細胞）と比較して、標的遺伝子が転写され、かつ標的遺伝子の発現が増加するように処理された第１の細胞もしくは細胞群から単離または検出され得る標的ｍＲＮＡの量の増加によって示される、標的遺伝子の発現の少なくとも部分的な活性化を指す。
【００５１】
一実施形態において、標的遺伝子の発現は、本明細書に記載のｉＲＮＡの投与により、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％活性化される。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、本発明で取り上げられるｉＲＮＡの投与により、少なくとも約６０％、７０％、または８０％活性化される。いくつかの実施形態において、標的遺伝子の発現は、本明細書に記載のｉＲＮＡの投与により、少なくとも約８５％、９０％、もしくは９５％、またはそれ以上活性化される。いくつかの実施形態において、標的遺伝子発現は、未処理の細胞における発現と比較して、本明細書に記載のｉＲＮＡで処理された細胞において少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、またはそれ以上増加する。小さいｄｓＲＮＡによる発現の活性化は、例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０３：１７３３７−４２、米国第２００７０１１１９６３号、米国第２００５２２６８４８号に記載されており、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５２】
「サイレンシング」、「〜の発現を阻害する」、「〜の発現を下方制御する」、「〜の発現を抑圧する」等の用語は、それらが標的遺伝子を指す限り、本明細書において、第１の細胞もしくは細胞群と実質的に同一であるが、そのように処理されていない第２の細胞もしくは細胞群（対照細胞）と比較して、標的遺伝子が転写され、かつ標的遺伝子の発現が阻害されるように処理された第１の細胞もしくは細胞群から単離または検出され得る標的ｍＲＮＡの量の減少によって示される、標的遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑圧を指す。阻害の程度は、通常、以下で表される。
【数１】
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【００５３】
あるいは、阻害の程度を、標的遺伝子発現に機能的に結び付けられるパラメータ、例えば、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の量、またはある特定の表現型を示す細胞の数の減少、例えば、サイトカイン産生の欠如もしくは低下の観点から得ることができる。原則として、標的遺伝子サイレンシングは、構造的に、またはゲノム工学によってのいずれかで、標的を発現する任意の細胞において、任意の適切なアッセイを用いて決定され得る。しかしながら、所与のｉＲＮＡが標的遺伝子の発現をある程度阻害するか、したがって、本発明によって包含されるかを決定するために参照が必要とされる場合、以下の実施例で提供されるアッセイが、そのような参照のとしての役割を果たすものとする。
【００５４】
例えば、ある特定の場合において、標的遺伝子の発現は、本発明で取り上げられるｉＲＮＡの投与により、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、または５５％抑圧される。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、本発明で取り上げられるｉＲＮＡの投与により、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％抑圧される。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、本明細書に記載のｉＲＮＡの投与により、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上抑圧される。
【００５５】
標的遺伝子発現の文脈において本明細書で使用される「治療する」、「治療」等の用語は、標的発現によって媒介される病理学的プロセスからの緩和またはその軽減を指す。本発明の文脈において、（標的発現によって媒介される病理学的プロセス以外の）以下の本明細書に列挙される他の条件のうちのいずれかに関するする限り、「治療する」、「治療」等の用語は、そのような条件に関連する少なくとも１つの症状を緩和もしくは軽減するか、またはそのような条件の進行もしくは予想される進行を遅延もしくは逆転させることを意味する。
【００５６】
疾患マーカーまたは症状の文脈において、「低下する」とは、そのようなレベルにおける統計学的に有意な低下を意味する。減少は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、またはそれ以上であってもよく、好ましくは、そのような障害を有しない個人の正常範囲内として許容されるレベルまで減少する。
【００５７】
本明細書で使用される「治療的に有効な量」という語句は、標的遺伝子発現、例えば、ＰＣＳＫ９遺伝子発現によって媒介される病理学的プロセスの治療もしくは管理、または標的遺伝子発現によって媒介される病理学的プロセスの明らかな症状において治療的有用性を提供する量を指す。「予防的に有効な量」という語句は、標的遺伝子発現によって媒介される病理学的プロセスの予防または標的遺伝子発現によって媒介される病理学的プロセスの明らかな症状において治療的有用性を提供する量を指す。治療的に有効な特定量は、一般の医師であれば容易に決定することができ、例えば、標的遺伝子発現によって媒介される病理学的プロセスの種類、患者の病歴および年齢、標的遺伝子発現によって媒介される病理学的プロセスの段階、ならびに標的遺伝子発現によって媒介される病理学的プロセスを阻害する他の作用物質の投与等の当技術分野で既知の要因に応じて変化し得る。
【００５８】
本明細書で使用される「医薬組成物」は、薬理学的に有効な量のｉＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される「薬理学的に有効な量」、「治療的に有効な量」、または単に「有効な量」は、目的とする薬理学的結果もしくは治療結果をもたらすのに有効なｉＲＮＡの量を指す。例えば、疾患または障害に関連する測定可能なパラメータが少なくとも１０％減少するときに、所与の臨床治療が有効であると見なされる場合、その疾患または障害の治療に治療的に有効な薬物の量は、そのパラメータにおける少なくとも１０％の減少をもたらすために必要な量である。
【００５９】
「薬学的に許容される担体」という用語は、治療薬、例えば、ｓｉＲＮＡの投与のための担体を指す。担体は、以下により詳細に記載されており、脂質製剤、例えば、ＬＮＰ０９およびＳＮＡＬＰ製剤を含む。
【００６０】
二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）
ｓｉＲＮＡ、例えば、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡが本明細書に記載される。
【００６１】
ｄｓＲＮＡを、以下でさらに議論される当技術分野で既知の標準の方法によって、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃから市販されているもの等の自動ＤＮＡ合成機の使用によって合成することができる。合成のさらなる説明は、以下および実施例で見出される。
【００６２】
ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡが使用される条件下でハイブリダイズして二本鎖構造を形成するのに十分相補的な２本のＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、標的遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡの配列に由来する標的配列に対して実質的に相補的であり、かつ概して、完全に相補的な相補性領域を含む。他方の鎖（センス鎖）は、２本の鎖が好適な条件下で組み合わされるときにハイブリダイズして二本鎖構造を形成するように、アンチセンス鎖に相補的な領域を含む。
【００６３】
二本鎖領域が単一分子の２本の鎖から形成される場合、この分子は、二本鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端とそれぞれの他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの一本鎖（本明細書において「ヘアピンループ」と称される）によって分離される二本鎖領域を有し得る。ヘアピンループは、少なくとも１個の不対ヌクレオチドを含み得、いくつかの実施形態において、ヘアピンループは、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも２３個、またはそれ以上の不対ヌクレオチドを含み得る。
【００６４】
ｄｓＲＮＡの２本の実質的に相補的な鎖が別個のＲＮＡ分子によって含まれる場合、これらの分子は、共有結合される必要はないが、共有結合されてもよい。２本の鎖がヘアピンループ以外の手段により共有結合される場合、その結合構造は、「リンカー」と称される。
【００６５】
概して、ｓｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡの二本鎖構造は、１５〜３０塩基対（境界値も含む）、より一般的には、１８〜２５塩基対（境界値も含む）、さらにより一般的には、１９〜２４塩基対（境界値も含む）、および最も一般的には、１９〜２１塩基対（境界値も含む）の長さである。９〜３６塩基対の二本鎖を考慮すると、この二本鎖は、例えば、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６の範囲、および１５〜３０塩基対、１５〜２６塩基対、１５〜２３塩基対、１５〜２２塩基対、１５〜２１塩基対、１５〜２０塩基対、１５〜１９塩基対、１５〜１８塩基対、１５〜１７塩基対、１８〜３０塩基対、１８〜２６塩基対、１８〜２３塩基対、１８〜２２塩基対、１８〜２１塩基対、１８〜２０塩基対、１９〜３０塩基対、１９〜２６塩基対、１９〜２３塩基対、１９〜２２塩基対、１９〜２１塩基対、１９〜２０塩基対、２０〜３０塩基対、２０〜２６塩基対、２０〜２５塩基対、２０〜２４塩基対、２０〜２３塩基対、２０〜２２塩基対、２０〜２１塩基対、２１〜３０塩基対、２１〜２６塩基対、２１〜２５塩基対、２１〜２４塩基対、２１〜２３塩基対、または２１〜２２塩基対を含むが、これらに限定されないそれらの間の任意の部分的な範囲の任意の長さであり得る。
【００６６】
組成物が２個以上のｓｉＲＮＡを含むか、または方法が２個以上のｓｉＲＮＡを用いる場合、それぞれのｓｉＲＮＡは、同一または異なる二本鎖の長さを有し得る。
【００６７】
ｓｉＲＮＡ内の標的配列に対する相補性領域は、１５〜３０ヌクレオチド長（境界値も含む）、より一般的には、１８〜２５（境界値も含む）、さらにより一般的には、１９〜２４ヌクレオチド長（境界値も含む）、および最も一般的には、１９〜２１ヌクレオチド長（境界値も含む）である。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、１５〜２０ヌクレオチド長（境界値も含む）であり、他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、２５〜３０ヌクレオチド長（境界値も含む）である。相補性領域は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長であり得る。非限定的な例として、標的配列は、１５〜３０ヌクレオチド、１５〜２６ヌクレオチド、１５〜２３ヌクレオチド、１５〜２２ヌクレオチド、１５〜２１ヌクレオチド、１５〜２０ヌクレオチド、１５〜１９ヌクレオチド、１５〜１８ヌクレオチド、１５〜１７ヌクレオチド、１８〜３０ヌクレオチド、１８〜２６ヌクレオチド、１８〜２３ヌクレオチド、１８〜２２ヌクレオチド、１８〜２１ヌクレオチド、１８〜２０ヌクレオチド、１９〜３０ヌクレオチド、１９〜２６ヌクレオチド、１９〜２３ヌクレオチド、１９〜２２ヌクレオチド、１９〜２１ヌクレオチド、１９〜２０ヌクレオチド、２０〜３０ヌクレオチド、２０〜２６ヌクレオチド、２０〜２５ヌクレオチド、２０〜２４ヌクレオチド、２０〜２３ヌクレオチド、２０〜２２ヌクレオチド、２０〜２１ヌクレオチド、２１〜３０ヌクレオチド、２１〜２６ヌクレオチド、２１〜２５ヌクレオチド、２１〜２４ヌクレオチド、２１〜２３ヌクレオチド、または２１〜２２ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、標的配列は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個のヌクレオチドである。
【００６８】
組成物が２個以上のｓｉＲＮＡを含むか、または方法が２個以上のｓｉＲＮＡを用いる場合、それぞれのｓｉＲＮＡは、同一の長さまたは異なる長さの相補性領域を有し得る。
【００６９】
ｄｓＲＮＡ、例えば、本明細書に記載のｓｉＲＮＡのうちのいずれかは、１つ以上の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含む。一実施形態において、ｄｓＲＮＡの少なくとも一方の端は、１〜４個、または１、２、３、もしく４個のヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを有する。少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、それらの平滑末端化された対応物と比較して予想外に優れた阻害特性を有する。概して、一本鎖オーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端、またはあるいは、センス鎖の３’末端に位置する。ｄｓＲＮＡは、概してアンチセンス鎖の５’末端に位置する平滑末端も有し得る。別の実施形態では、オーバーハング内のヌクレオチドのうちの１つ以上が、ヌクレオシドチオホスフェートで置換される。組成物が２個以上のｓｉＲＮＡを含むか、または方法が２個以上のｓｉＲＮＡを用いる場合、それぞれのｓｉＲＮＡは、位置、長さ、およびヌクレオチドによって表される同一または異なるオーバーハングを有し得る。
【００７０】
ｓｉＲＮＡは、ＰＣＳＫ９遺伝子の第１の領域を標的とする。一実施形態において、ＰＣＳＫ９遺伝子は、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子である。別の実施形態では、ＰＣＳＫ９遺伝子は、マウスまたはラットＰＣＳＫ９遺伝子である。例示的なＰＣＳＫ９を標的とするｓｉＲＮＡは、２００７年５月１０日出願の米国特許出願第１１／７４６，８６４号（現在の米国特許第７，６０５，２５１号）および２００７年５月１０日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６８６５５号（国際公開第ＷＯ２００７／１３４１６１号として公開されている）に記載されている。さらなる開示を、２００９年６月４日出願の米国特許出願第１２／４７８，４５２号（米国第２０１０／００１００６６号として公開されている）および２００９年１月３０日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３２７４３号（国際公開第ＷＯ２００９／１３４４８７号として公開されている）において見出すことができる。標的配列、センス鎖配列、およびアンチセンス鎖配列は、すべての目的のために参照により組み込まれる。
【００７１】
表１、２、６、および７は、ＰＣＳＫ９を標的とするｓｉＲＮＡの標的配列、センス鎖配列、およびアンチセンス鎖配列を開示する。
【００７２】
いくつかの実施形態において、組成物は、２個以上のｓｉＲＮＡ、例えば、第２のｓｉＲＮＡを含むか、または方法は、２個以上のｓｉＲＮＡを用いる。一実施形態において、第２のｓｉＲＮＡは、第１のｓｉＲＮＡによって標的化された領域とは異なるＰＣＳＫ９の領域を標的化する。
【００７３】
あるいは、第２のｓｉＲＮＡは、異なる第２の遺伝子を標的化する。例として、ＰＣＳＫ９と相互作用し、かつ／または脂質代謝もしくはコレステロール代謝に関与する遺伝子が挙げられる。例えば、第２の標的遺伝子は、ＸＢＰ−１、ＰＣＳＫ５、ＡｐｏＣ３、ＳＣＡＰ、ＭＩＧ１２、ＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼ、またはＩＤＯＬ（ＬＤＬＲの誘導性分解剤）等であり得る。一実施形態において、第２の遺伝子は、ヒト遺伝子である。別の実施形態では、第２の遺伝子は、マウスまたはラット遺伝子である。
【００７４】
一実施形態において、第２のｓｉＲＮＡは、ＸＢＰ−１遺伝子を標的化する。例示的なＸＢＰ−１を標的とするｓｉＲＮＡを、２００９年４月１７日出願の米国特許出願第１２／４２５，８１１号（米国第２００９−０２７５６３８号として公開されている）において見出すことができる。標的配列、センス鎖配列、およびアンチセンス鎖配列は、すべての目的のために参照により組み込まれる。
【００７５】
さらなるｄｓＲＮＡ
表１、２、６、および７の配列のうちの１つからの少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上の連続ヌクレオチドの部分的な配列を有し、かつ標的遺伝子の発現を阻害するそれらの能力が完全な配列を含むｄｓＲＮＡとは５、１０、１５、２０、２５、または３０％以下異なるｄｓＲＮＡが、本発明に従って企図される。
【００７６】
加えて、表１、２、６、および７に提供されるＲＮＡは、ＲＩＳＣによって媒介される切断の影響を受けやすい標的遺伝子転写物中の部位を特定する。したがって、本発明は、そのような配列のうちの１つの配列内を標的とするｉＲＮＡをさらに特徴付ける。本明細書で使用されるとき、ｉＲＮＡは、ｉＲＮＡがその特定の部位内の任意の場所で転写物の切断を促進する場合、ＲＮＡ転写物の特定の部位内を標的とすると考えられている。そのようなｉＲＮＡは、概して、標的遺伝子中の選択された配列に対して連続的な領域由来のさらなるヌクレオチド配列にカップリングされる本明細書に提供される配列からの少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む。
【００７７】
標的配列は、概して、１５〜３０ヌクレオチド長であるが、任意の所与の標的ＲＮＡの切断を導くために、この範囲内の特定の配列の適合性において幅広いバリエーションがある。本明細書に提示される様々なソフトウェアパッケージおよびガイドラインは、任意の所与の遺伝子標的に最適な標的配列の同定に関する指針を提供するが、所与のサイズ（非限定的な例として、２１個のヌクレオチド）の「ウィンドウ」または「マスク」が、逐語的または比喩的に（例えば、コンピュータ内を含む）標的ＲＮＡ配列上に置かれて、標的配列としての役割を果たし得るそのサイズ範囲内の配列を同定するといった経験的アプローチを取ることもできる。完全な一連の起こり得る配列が選択された任意の所与の標的サイズについて同定されるまで、配列「ウインドウ」を最初の標的配列位置の１ヌクレオチド上流または下流に徐々に移動させることによって、次の可能性のある標的配列を同定することができる。この過程は、最適に機能するこれらの配列を同定するための（本明細書に記載のアッセイまたは当技術分野で既知のアッセイを用いて）同定された配列の系統的合成および試験に加えて、ｉＲＮＡ剤を用いて標的化されるとき、標的遺伝子発現の最良の阻害を媒介するこれらのＲＮＡ配列を同定することができる。したがって、例えば、上で同定される配列が効果的な標的配列を示すが、同等またはより良好な阻害特徴を有する配列を同定するために、阻害効率のさらなる最適化を所与の配列の１ヌクレオチド上流または下流に徐々に「ウィンドウを歩かせる（ｗａｌｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｗｉｎｄｏｗ）」ことによって達成することができることが企図される。
【００７８】
さらに、例えば、表１、２、６、および７において同定される任意の配列について、さらなる最適化を、より長い配列もしくはより短い配列を生成するためにヌクレオチドの系統的な付加または除去のいずれかを行い、かつこれらの配列およびその点から標的ＲＮＡを上方または下方により長いサイズもしくはより短いサイズのウィンドウを歩かせることによって生成された配列を試験することによって達成することができることが企図される。この場合もやはり、当技術分野で既知の阻害アッセイまたは本明細書に記載の阻害アッセイにおいて、新規の候補標的を生成するためのこのアプローチとこれらの標的配列に基づくｉＲＮＡの有効性についての試験を合わせることにより、阻害効率においてさらなる改善をもたらすこともできる。さらにさらには、そのような最適化配列を、例えば、本明細書に記載の修飾ヌクレオチドまたは当技術分野で既知の修飾ヌクレオチドの導入、オーバーハングの付加もしくは変化、または当技術分野で既知の他の修飾および／もしくは本明細書で議論される他の修飾（例えば、血清安定性の増加、または半減期の循環、熱安定性の増加、膜貫通送達の強化、特定の位置もしくは細胞型への標的化、サイレンシング経路酵素との相互作用の増加、エンドソームからの放出の増加等）によって調整して、発現阻害剤として分子をさらに最適化することができる。
【００７９】
表１、２、６、および７に記載のｉＲＮＡは、標的配列に対する１つ以上のミスマッチを含有し得る。一実施形態において、表１、２、６、および７に記載のｉＲＮＡは、３つ以下のミスマッチを含有する。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含有する場合、ミスマッチの範囲が相補性領域の中心に位置しないことが好ましい。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含有する場合、ミスマッチは、例えば、相補性領域の５’末端もしくは３’末端のいずれかから最後の５個のヌクレオチド内に制限されることが好ましい。例えば、ＰＣＳＫ９遺伝子の領域に対して相補的な２３個のヌクレオチドのｉＲＮＡ剤のＲＮＡ鎖の場合、ＲＮＡ鎖は、概して、中央の１３個のヌクレオチド内にはいかなるミスマッチも含有しない。本明細書に記載の方法または当技術分野で既知の方法を使用して、標的配列に対するミスマッチを含有するｉＲＮＡが、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現の阻害に効果的であるかを決定することができる。特にＰＣＳＫ９遺伝子内の特定の相補性領域が集団内に多型配列変異を有することで知られている場合、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する際にミスマッチを有するｉＲＮＡの有効性を考慮することは、重要である。
【００８０】
共有結合
いくつかの実施形態において、組成物は、２個以上のｓｉＲＮＡ、例えば、第２のｓｉＲＮＡを含むか、または方法は、２個以上のｓｉＲＮＡを用いる。その２個のｓｉＲＮＡを、共有リンカーを介して結合することができる。共有リンカーは、当業者に周知であり、例えば、核酸リンカー、ペプチドリンカー等を含む。
【００８１】
共有リンカーは、これら２個のｓｉＲＮＡを結合する。共有リンカーは、２本のセンス鎖、２本のアンチセンス鎖、１本のセンス鎖および１本のアンチセンス鎖、２本のセンス鎖および１本のアンチセンス鎖、２本のアンチセンス鎖および１本のセンス鎖、または２本のセンス鎖および２本のアンチセンス鎖を結合することができる。
【００８２】
共有リンカーは、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡおよび／またはペプチドを含み得る。リンカーは、一本鎖、二本鎖、部分的に一本鎖、または部分的に二本鎖であり得る。いくつかの実施形態において、リンカーは、ジスルフィド結合を含む。リンカーは、切断可能であり得るか、または切断不可能であり得る。
【００８３】
共有リンカーは、例えば、ｄＴｓｄＴｕｕ＝（５’−２’デオキシチミジル−３’−チオホスフェート−５’−２’デオキシチミジル−３’−ホスフェート−５’−ウリジル−３’−ホスフェート−５’−ウリジル−３’−ホスフェート）、ｒＵｓｒＵ（チオホスフェートリンカー：５’−ウリジル−３’−チオホスフェート−５’−ウリジル−３’−ホスフェート）、ｒＵｒＵリンカー、ｄＴｓｄＴａａ（ａａｄＴｓｄＴ、５’−２’デオキシチミジル−３’−チオホスフェート−５’−２’デオキシチミジル−３’−ホスフェート−５’−アデニル−３’−ホスフェート−５’−アデニル−３’−ホスフェート）、ｄＴｓｄＴ（５’−２’デオキシチミジル−３’−チオホスフェート−５’−２’デオキシチミジル−３’−ホスフェート）、ｄＴｓｄＴｕｕ＝ｕｕｄＴｓｄＴ＝５’−２’デオキシチミジル−３’−チオホスフェート−５’−２’デオキシチミジル−３’−ホスフェート−５’−ウリジル−３’−ホスフェート−５’−ウリジル−３’−ホスフェートであり得る。
【００８４】
共有リンカーは、ポリ（５’−アデニル−３’−ホスフェート−ＡＡＡＡＡＡＡＡ）またはポリ（５’−シチジル−３’−ホスフェート−５’−ウリジル−３’−ホスフェート−ＣＵＣＵＣＵＣＵ））等のポリＲＮＡ、例えば、Ｘｎ一本鎖ポリＲＮＡリンカーであり得、式中、ｎは、２〜５０（境界値も含む）、好ましくは４〜１５（境界値も含む）、最も好ましくは７〜８（境界値も含む）の整数である。修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドの混合物は、該ポリＲＮＡリンカーにも存在し得る。共有リンカーは、例えば、ポリ（５’−２’デオキシチミジル−３’−ホスフェート−ＴＴＴＴＴＴＴＴ）等のポリＤＮＡであり得、式中、ｎは、２〜５０（境界値も含む）、好ましくは４〜１５（境界値も含む）、最も好ましくは７〜８（境界値も含む）の整数である。修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドの混合物は、該ポリＤＮＡリンカーにも存在し得る。一本鎖ポリＤＮＡリンカーであって、式中、ｎは、２〜５０（境界値も含む）、好ましくは４〜１５（境界値も含む）、最も好ましくは７〜８（境界値も含む）の整数である。修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドの混合物は、該ポリＤＮＡリンカーにも存在し得る。
【００８５】
共有リンカーは、ジスルフィド結合、任意で、ビス−ヘキシル−ジスルフィドリンカーを含み得る。一実施形態において、ジスルフィドリンカーは、以下のものである。
【化１】
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【００８６】
共有リンカーは、ペプチド結合を含み得、例えば、アミノ酸を含み得る。一実施形態において、共有リンカーは、好ましくは４〜５個アミノ酸、任意でＸ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｙを含む１〜１０アミノ酸長のリンカーであり、式中、ＸおよびＹは、任意のアミノ酸を表す。
【００８７】
共有リンカーは、ＨＥＧ、ヘキサエチレングリコールリンカーを含み得る。
【００８８】
修飾
さらに別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、安定性または他の有益な特徴を強化するために化学的に修飾される。本発明で取り上げられる核酸を、参照により本明細書に組み込まれる「Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載される方法等の当技術分野において十分確立された方法によって合成および／または修飾することができる。修飾には、例えば、（ａ）末端修飾、例えば、５’末端修飾（リン酸化反応、共役、逆結合等）、３’末端修飾（共役、ＤＮＡヌクレオチド、逆結合等）、（ｂ）塩基修飾、例えば、安定な塩基、不安定な塩基、もしくはパートナーの広範なレパートリーとの塩基対合する塩基との置換、塩基の除去（脱塩基ヌクレオチド）、または結合された塩基の除去、（ｃ）糖修飾（例えば、２’位もしくは４’位で）、または糖の置換、ならびに（ｄ）ホスホジエステル結合の修飾もしくは置換を含む骨格修飾が含まれる。本発明で有用なＲＮＡ化合物の具体的な例として、修飾された骨格を含有するＲＮＡまたは非天然のヌクレオシド間結合を含有するＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。修飾された骨格を有するＲＮＡには、とりわけ、骨格にリン原子を有しないものが含まれる。本明細書の目的上、当技術分野において時折言及されるように、それらのヌクレオシド間骨格にリン原子を有しない修飾されたＲＮＡも、オリゴヌクレオシドと見なすことができる。特定の実施形態において、修飾されたＲＮＡは、そのヌクレオシド間骨格内にリン原子を有する。
【００８９】
修飾されたＲＮＡ骨格は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに正常な３’−５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’結合した類似体、およびヌクレオシド単位の隣接対が３’−５’から５’−３’へ、または２’−５’から５’−２’へ結合される逆極性を有するものを含む。様々な塩、混合塩、および遊離酸形態も含まれる。
【００９０】
上述のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，４６９，８６３号、同第４，４７６，３０１号、同第５，０２３，２４３号、同第５，１７７，１９５号、同第５，１８８，８９７号、同第５，２６４，４２３号、同第５，２７６，０１９号、同第５，２７８，３０２号、同第５，２８６，７１７号、同第５，３２１，１３１号、同第５，３９９，６７６号、同第５，４０５，９３９号、同第５，４５３，４９６号、同第５，４５５，２３３号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７６，９２５号、同第５，５１９，１２６号、同第５，５３６，８２１号、同第５，５４１，３１６号、同第５，５５０，１１１号、同第５，５６３，２５３号、同第５，５７１，７９９号、同第５，５８７，３６１号、同第５，６２５，０５０号、同第６，０２８，１８８号、同第６，１２４，４４５号、同第６，１６０，１０９号、同第６，１６９，１７０号、同第６，１７２，２０９号、同第６，２３９，２６５号、同第６，２７７，６０３号、同第６，３２６，１９９号、同第６，３４６，６１４号、同第６，４４４，４２３号、同第６，５３１，５９０号、同第６，５３４，６３９号、同第６，６０８，０３５号、同第６，６８３，１６７号、同第６，８５８，７１５号、同第６，８６７，２９４号、同第６，８７８，８０５号、同第７，０１５，３１５号、同第７，０４１，８１６号、同第７，２７３，９３３号、同第７，３２１，０２９号、および米国特許第ＲＥ３９４６４号が挙げられるが、これらに限定されず、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９１】
その中にリン原子を含まない修飾されたＲＮＡ骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合されたヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間結合により形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン骨格；硫化物、スルホキシド、およびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファミン酸骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびにＮ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２を混合した構成成分を有するものを有するものが含まれる。
【００９２】
上述のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，２１４，１３４号、同第５，２１６，１４１号、同第５，２３５，０３３号、同第５，６４，５６２号、同第５，２６４，５６４号、同第５，４０５，９３８号、同第５，４３４，２５７号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７０，９６７号、同第５，４８９，６７７号、同第５，５４１，３０７号、同第５，５６１，２２５号、同第５，５９６，０８６号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６０８，０４６号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６１８，７０４号、同第５，６２３，０７０号、同第５，６６３，３１２号、同第５，６３３，３６０号、同第５，６７７，４３７号、および同第５，６７７，４３９号が挙げられるが、これらに限定されず、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９３】
ｉＲＮＡでの使用に好適であるか、またはｉＲＮＡでの使用が企図される他のＲＮＡ模倣物では、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合の両方、すなわち、骨格が、新規の基に置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているそのようなオリゴマー化合物の１つであるＲＮＡ模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物では、ＲＮＡの糖骨格が、アミド含有骨格、具体的には、アミノエチルグリシン骨格に置換される。核酸塩基は維持され、その骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号、および同第５，７１９，２６２号が挙げられるが、これらに限定されず、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００で見出すことができる。
【００９４】
本発明で取り上げられるいくつかの実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するＲＮＡおよびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシド、具体的には、上記の米国特許第５，４８９，６７７号の−−ＣＨ２−−ＮＨ−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｏ−−ＣＨ２−−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られている］、−−ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、および−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−［天然のホスホジエステル骨格は、−−Ｏ−−Ｐ−−Ｏ−−ＣＨ２−−と表される］、ならびに上記の米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で取り上げられるＲＮＡは、上記の米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有する。
【００９５】
修飾されたＲＮＡは、１つ以上の置換糖部分も含有し得る。本明細書で取り上げられるｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、２’位置で、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルのうちの１つを含むことができ、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。例示的な好適な修飾には、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２が含まれ、式中、ｎおよびｍは、１〜約１０である。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、２’位置で、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、介入物、ｉＲＮＡの薬物動態学的特性を改善する基、またはｉＲＮＡの薬力学的特性を改善する基、および同様の特性を有する他の置換基のうちの１つを含む。いくつかの実施形態において、修飾には、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３であり、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られている）（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８：４８６−５０４）、すなわち、アルコキシ−アルコキシ基が含まれる。別の例示的な修飾は、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、本明細書の以下の実施例に記載の２’−ＤＭＡＯＥとしても知られているＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野で２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られている）、すなわち、同様に本明細書の以下の実施例に記載の２’−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ２）２である。
【００９６】
他の修飾には、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が含まれる。同様の修飾は、ｉＲＮＡのＲＮＡ上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上の糖または２’−５’結合したｄｓＲＮＡの３’位置および５’末端ヌクレオチドの５’位置でも行われ得る。ｉＲＮＡは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分等の糖模倣物も有し得る。そのような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第４，９８１，９５７号、同第５，１１８，８００号、同第５，３１９，０８０号、同第５，３５９，０４４号、同第５，３９３，８７８号、同第５，４４６，１３７号、同第５，４６６，７８６号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５１９，１３４号、同第５，５６７，８１１号、同第５，５７６，４２７号、同第５，５９１，７２２号、同第５，５９７，９０９号、同第５，６１０，３００号、同第５，６２７，０５３号、同第５，６３９，８７３号、同第５，６４６，２６５号、同第５，６５８，８７３号、同第５，６７０，６３３号、および同第５，７００，９２０号が挙げられるが、これらに限定されず、これらのうちのある特定の特許は、一般に、本出願とともに所有され、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９７】
ｉＲＮＡは、核酸塩基（多くの場合、当技術分野で単に「塩基」と称される）修飾または置換も含み得る。本明細書で使用される「非修飾」または「天然」の核酸塩基には、プリン塩基、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾された核酸塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニン等の他の合成および天然の核酸塩基が含まれる。さらに、核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号で開示されるもの、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００８で開示されるもの、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ  ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９０で開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３によって開示されるもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ  Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，ｄｓＲＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ  ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３によって開示されるものが含まれる。これらの核酸塩基のうちのある特定のものは、本発明で取り上げられるオリゴマー化合物の結合親和性を高めるのに特に有用である。これらには、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリンが含まれる。５−メチルシトシン置換は、核酸二本鎖の安定性を０．６〜１．２℃増加させることを示しており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ｄｓＲＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．���７６−２７８）、例示的な塩基置換であり、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせられると、さらにより著しくなる。
【００９８】
上述の修飾核酸塩基ならびに他の修飾核酸塩基のうちのある特定のものの調製を教示する代表的な米国特許には、上述の米国特許第３，６８７，８０８号、ならびに米国特許第４，８４５，２０５号、同第５，１３０，３０号、同第５，１３４，０６６号、同第５，１７５，２７３号、同第５，３６７，０６６号、同第５，４３２，２７２号、同第５，４５７，１８７号、同第５，４５９，２５５号、同第５，４８４，９０８号、同第５，５０２，１７７号、同第５，５２５，７１１号、同第５，５５２，５４０号、同第５，５８７，４６９号、同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号、同第５，６１４，６１７号、同第５，６８１，９４１号、同第６，０１５，８８６号、同第６，１４７，２００号、同第６，１６６，１９７号、同第６，２２２，０２５号、同第６，２３５，８８７号、同第６，３８０，３６８号、同第６，５２８，６４０号、同第６，６３９，０６２号、同第６，６１７，４３８号、同第７，０４５，６１０号、同第７，４２７，６７２号、および同第７，４９５，０８８号が挙げられるが、これらに限定されず、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれ、米国特許第５，７５０，６９２号も参照により本明細書に組み込まれる。
【００９９】
ｉＲＮＡのＲＮＡは、修飾されて１つ以上のロックされた核酸（ＬＮＡ）を含むこともできる。ロックされた核酸は、２’炭素および４’炭素を結合する追加の架橋を含む修飾されたリボース部分を有するヌクレオチドである。この構造は、３’内部構造立体配座において、リボースを効果的に「ロックする」。ｓｉＲＮＡへのロックされた核酸の付加は、血清中のｓｉＲＮＡの安定性を増加させ、オフターゲット効果を減少させることが示されている（Ｅｌｍｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３（１）：４３９−４４７、Ｍｏｏｋ，ＯＲ．ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ  Ｃａｎｃ  Ｔｈｅｒ  ６（３）：８３３−８４３、Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１（１２）：３１８５−３１９３）。
【０１００】
ロックされた核酸ヌクレオチドの調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第６，２６８，４９０号、同第６，６７０，４６１号、同第６，７９４，４９９号、同第６，９９８，４８４号、同第７，０５３，２０７号、同第７，０８４，１２５号、および同第７，３９９，８４５号が挙げられるが、これらに限定されず、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１０１】
ＲＮＡ分子の末端への潜在的安定化修飾には、Ｎ−（アセチルアミノカプロイル）−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−Ｃ６−ＮＨＡｃ）、Ｎ−（カプロイル−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−Ｃ６）、Ｎ−（アセチル−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−ＮＨＡｃ）、チミジン−２’−Ｏ−デオキシチミジン（エーテル）、Ｎ−（アミノカプロイル）−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−Ｃ６−アミノ）、２’−ドコサノイル−ウリジン−３’−ホスフェート、逆塩基ｄＴ（ｉｄＴ）等が含まれ得る。この修飾の開示を、２００９年７月７日に出願された米国仮特許出願第６１／２２３，６６５号（「‘６６５出願」）、表題「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｅｎｄ  Ｃａｐｓ」、および２０１０年７月７日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／４１２１４号で見出すことができる。
【０１０２】
リガンド
本発明のｓｉＲＮＡの別の修飾は、ｉＲＮＡの活性、細胞分布、または細胞取り込みを亢進する１つ以上のリガンド、部分、または結合体のＲＮＡに化学的に結合することを含む。そのような部分には、コレステロール部分等の脂質部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４：１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えば、ｂｅｒｙｌ−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６−３０９、Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，１９９１，１０：１１１１−１１１８、Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７−３３０、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９−５４）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチル−アンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１−３６５４、Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７−３７８３）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９−９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９−２３７）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３−９３７）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０３】
一実施形態において、リガンドは、組み込まれるｉＲＮＡ剤の分布、標的、または寿命を変化させる。好ましい実施形態では、リガンドは、例えば、そのようなリガンドがない種と比較して、選択された標的、例えば、身体の分子、細胞または細胞型、区画、例えば、細胞内もしくは臓器内区画、組織、臓器、または領域に対する強化された親和性を提供する。好ましいリガンドは、二本鎖核酸における二本鎖対合に関与しない。
【０１０４】
リガンドは、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、もしくはグロブリン）、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、もしくはヒアルロン酸）、または脂質等の天然に存在する物質を含み得る。リガンドは、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸等の組み換えまたは合成分子でもあり得る。ポリアミノ酸の例として、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ‐アスパラギン酸、ポリＬ‐グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−ＣＯ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例として、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、偽ペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣物ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第４級塩、またはαヘリックスペプチドが挙げられる。
【０１０５】
リガンドは、標的基、例えば、細胞もしくは組織標的剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質、またはタンパク質、例えば、腎細胞等の特定の細胞型に結合する抗体も含み得る。標的基は、サイロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸塩、ポリアスパラギン酸塩、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビオチン、またはＲＧＤペプチドもしくはＲＧＤペプチド模倣物であり得る。
【０１０６】
リガンドの他の例として、染料、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コール酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）、およびペプチド結合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾール群、アクリジン−イミダゾール結合体、テトラアザマクロサイクルのＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰが挙げられる。
【０１０７】
リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、コリガンドに対する特異親和性を有する分子、または抗体、例えば、癌細胞、内皮細胞、または骨細胞等の特定の細胞型に結合する抗体であり得る。リガンドは、ホルモンおよびホルモン受容体も含み得る。それらは、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、または多価フコース等の非ペプチド種も含み得る。リガンドは、例えば、リポ多糖体、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化因子、またはＮＦ−κＢの活性化因子であり得る。
【０１０８】
リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格を破壊することによって、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメント、および／または中間径フィラメントを破壊することによって、ｉＲＮＡ剤の細胞への取り込みを増加させることができる物質、例えば、薬物であり得る。その薬物は、例えば、タキソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド、ラトルンクリンＡ、ファロイジン、スインホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビンであり得る。
【０１０９】
１個のリガンドにおいて、リガンドは、脂質または脂質に基づく分子である。そのような脂質または脂質に基づく分子は、好ましくは、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、標的組織、例えば、身体の非腎臓標的組織への結合体の分布を可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であり得る。ＨＳＡに結合することができる他の分子もリガンドとして使用することができる。例えば、ネプロキシンまたはアスピリンを使用することができる。脂質または脂質に基づくリガンドは、（ａ）結合体の分解への耐性を増加させ、（ｂ）標的細胞もしくは細胞膜への標的化もしくは輸送を増加させることができ、かつ／または（ｃ）血清タンパク質、例えば、ＨＳＡへの結合を調整するために使用することができる。
【０１１０】
脂質に基づくリガンドを使用して、結合体の標的組織への結合を調節、例えば、制御することができる。例えば、より強力にＨＳＡに結合する脂質または脂質に基づくリガンドは、腎臓に対して標的化される可能性は低く、したがって、身体から排出される可能性が低い。ＨＳＡにそれほど強力に結合しない脂質または脂質に基づくリガンドを使用して、結合体を腎臓に標的化することができる。
【０１１１】
好ましい実施形態において、脂質に基づくリガンドは、ＨＳＡに結合する。好ましくは、それは、結合体が好ましくは非腎臓組織に分布されるように、十分な親和性でＨＳＡに結合する。しかしながら、親和性は、ＨＳＡ−リガンド結合が逆転することができない程度に強力ではないことが好ましい。
【０１１２】
別の好ましい実施形態において、脂質に基づくリガンドは、結合体が好ましくは腎臓に分布されるように、ＨＳＡに弱く結合するか、または全く結合しない。腎細胞を標的とする他の分子を、脂質に基づくリガンドの代わりに、またはそれに加えて使用することもできる。
【０１１３】
別の態様では、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖性細胞によって取り込まれる部分、例えば、ビタミンである。これらは、例えば、悪性または非悪性型の望ましくない細胞、例えば、癌細胞の増殖を特徴とする障害の治療に特に有用である。例示的なビタミンには、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫが含まれる。他の例示的なビタミンには、ビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキーサル、または癌細胞によって取り込まれる他のビタミンもしくは栄養素が含まれる。ＨＳＡおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）も含まれる。
【０１１４】
別の態様では、リガンドは、細胞透過剤、好ましくは、ヘリックス細胞透過剤である。好ましくは、ヘリックス細胞透過剤は、両親媒性である。例示的なヘリックス細胞透過剤は、ｔａｔまたはアンテノペディア等のペプチドである。ヘリックス細胞透過剤がペプチドである場合、それを修飾することができ、ペプチジル模倣物、インバートマー、非ペプチドまたは偽ペプチド結合、およびＤアミノ酸の使用を含む。ヘリックス剤は、好ましくは、αヘリックス剤であり、これは、好ましくは、親油性および疎油性相を有する。
【０１１５】
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣物であり得る。ペプチド模倣物（本明細書でオリゴペプチド模倣物とも称される）は、天然ペプチドに類似した定義された三次元構造にフォールディングすることができる分子である。ペプチドおよびペプチド模倣物のｉＲＮＡ剤への結合は、例えば、細胞認識および吸収を亢進させることにより、ｉＲＮＡの薬物動態学的分布に影響を及ぼすことができる。ペプチドまたはペプチド模倣物部分は、約５〜５０アミノ酸長、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長であり得る。
【０１１６】
ペプチドまたはペプチド模倣物は、例えば、細胞透過ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、Ｔｒｐ、またはＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、構造規制ペプチド、または架橋ペプチドであり得る。別の代替例において、ペプチド部分は、疎水性膜移行配列（ＭＴＳ）を含むことができる。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号１）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号２））も標的部分であり得る。ペプチド部分は、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質を含む極性巨大分子を、細胞膜にわたって運搬することができる「送達」ペプチドであり得る。例えば、ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質由来の配列（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号３））およびショウジョウバエアンテナペディア（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）タンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号４））が、送達ペプチドとして機能することができることが見出されている。ペプチドまたはペプチド模倣物は、ファージ表示ライブラリ、または１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）組み合わせライブラリ（Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２−８４，１９９１）から同定されるペプチド等のＤＮＡのランダム配列によってコードされ得る。好ましくは、組み込まれたモノマー単位を介してｄｓＲＮＡ剤に係留されるペプチドまたはペプチド模倣物は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）−ペプチド、またはＲＧＤ模倣物等の細胞標的化ペプチドである。ペプチド部分は、約５アミノ酸長〜約４０アミノ酸長の範囲であり得る。ペプチド部分は、安定性または直接立体配座特性を増加させる等の構造修飾を有し得る。以下に記載の構造修飾のいずれかを利用することができる。
【０１１７】
ＲＧＤペプチド部分を使用して、内皮腫瘍細胞または乳癌腫瘍細胞等の腫瘍細胞を標的とすることができる（Ｚｉｔｚｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６２：５１３９−４３，２００２）。ＲＧＤペプチドは、肺、腎臓、脾臓、または肝臓を含む様々な他の組織の腫瘍へのｄｓＲＮＡ剤の標的化を促進することができる（Ａｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：７８３−７８７，２００１）。好ましくは、ＲＧＤペプチドは、腎臓へのｉＲＮＡ剤の標的化を促進する。ＲＧＤペプチドは、線状または環状であってもよく、かつ修飾されてもよく、例えば、特定の組織への標的化を促進するためにグリコシル化またはメチル化されてもよい。例えば、グリコシル化されたＲＧＤペプチドは、αＶβ３を発現する腫瘍細胞にｉＲＮＡ剤を送達することができる（Ｈａｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，４２：３２６−３３６，２００１）。
【０１１８】
「細胞浸透ペプチド」は、細胞、例えば、細菌細胞もしくは真菌細胞等の微生物細胞、またはヒト細胞等の哺乳類細胞に浸透することができる。微生物細胞浸透ペプチドは、例えば、αヘリックス線状ペプチド（例えば、ＬＬ−３７もしくはセロピンＰ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α−デフェンシン、β−デフェンシン、もしくはバクテネシン）、または１個または２個のみの支配的なアミノ酸を含有するペプチド（例えば、ＰＲ−３９もしくはインドリシジン）であり得る。細胞浸透ペプチドは、核移行シグナル（ＮＬＳ）を含むこともできる。例えば、細胞透過ペプチドは、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１の融合ペプチドドメインおよびＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳに由来するＭＰＧ等の二分両親媒性ペプチドであり得る（Ｓｉｍｅｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２７１７−２７２４，２００３）。
【０１１９】
ＲＮＡ結合体の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第４，８２８，９７９号、同第４，９４８，８８２号、同第５，２１８，１０５号、同第５，５２５，４６５号、同第５，５４１，３１３号、同第５，５４５，７３０号、同第５，５５２，５３８号、同第５，５７８，７１７号、同第５，５８０，７３１号、同第５，５９１，５８４号、同第５，１０９，１２４号、同第５，１１８，８０２号、同第５，１３８，０４５号、同第５，４１４，０７７号、同第５，４８６，６０３号、同第５，５１２，４３９号、同第５，５７８，７１８号、同第５，６０８，０４６号、同第４，５８７，０４４号、同第４，６０５，７３５号、同第４，６６７，０２５号、同第４，７６２，７７９号、同第４，７８９，７３７号、同第４，８２４，９４１号、同第４，８３５，２６３号、同第４，８７６，３３５号、同第４，９０４，５８２号、同第４，９５８，０１３号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，２４５，０２２号、同第５，２５４，４６９号、同第５，２５８，５０６号、同第５，２６２，５３６号、同第５，２７２，２５０号、同第５，２９２，８７３号、同第５，３１７，０９８号、同第５，３７１，２４１号、同第５，３９１，７２３号、同第５，４１６，２０３号、同第５，４５１，４６３号、同第５，５１０，４７５号、同第５，５１２，６６７号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５６５，５５２号、同第５，５６７，８１０号、同第５，５７４，１４２号、同第５，５８５，４８１号、同第５，５８７，３７１号、同第５，５９５，７２６号、同第５，５９７，６９６号、同第５，５９９，９２３号、同第５，５９９，９２８号、および同第５，６８８，９４１号、同第６，２９４，６６４号、同第６，３２０，０１７号、同第６，５７６，７５２号、同第６，７８３，９３１号、同第６，９００，２９７号、同第７，０３７，６４６号が挙げられるが、これらに限定されず、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２０】
キメラ
所与の化合物のすべての位置が均一に修飾される必要はなく、実際には、前述の修飾のうちの２つ以上を、単一の化合物に、またはさらにはｉＲＮＡ内の単一のヌクレオシドに組み込むことができる。本発明は、キメラ化合物であるｉＲＮＡ化合物も包含する。「キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）」ｉＲＮＡ化合物または「キメラ（ｃｈｉｍｅｒａ）」は、本発明の文脈において、２つ以上の化学的にはっきりと異なる領域を含有し、それぞれ、少なくとも１つのモノマー単位、すなわち、ｄｓＲＮＡ化合物の場合はヌクレオチドで構成されるｉＲＮＡ化合物、好ましくはｄｓＲＮＡ化合物である。これらのｉＲＮＡは、典型的には、少なくとも１つの領域を含有し、ＲＮＡは、ｉＲＮＡに、ヌクレアーゼ分解への耐性の増加、細胞取り込みの増加、および／または標的核酸への結合親和性の増加を付与するように修飾される。ｉＲＮＡのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素の基質としての役割を果たすことができる。一例として、ＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮａｓｅＨの活性化は、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それによって、遺伝子発現のｉＲＮＡ阻害の効率を大きく亢進させる。その結果として、同一の標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、キメラｄｓＲＮＡが使用されるとき、多くの場合、より短いｉＲＮＡで同様の結果を得ることができる。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動、および必要であれば、当技術分野で既知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技法により、日常的に検出することができる。
【０１２１】
非リガンド基
ある特定の場合において、ｉＲＮＡのＲＮＡは、非リガンド基によって修飾され得る。いくつかの非リガンド分子が、ｉＲＮＡの活性、細胞分布、または細胞取り込みを亢進させるためにｉＲＮＡに結合されており、そのような結合を行うための手順は、科学文献で入手可能である。そのような非リガンド部分は、コレステロール等の脂質部分（Ｋｕｂｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００７，３６５（１）：５４−６１、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６、Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９１，１０：１１１、Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．ｐＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．ｐ１９９０，２５９：３２７、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５、３６：３６５１、Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）を含んでいる。そのようなＲＮＡ結合体の調製を教示する代表的な米国特許は、上に列記されている。典型的な結合プロトコルは、配列の１つ以上の位置にアミノリンカーを有するＲＮＡの合成を含む。次いで、アミノ基は、適切なカップリング試薬または活性化試薬を用いて結合させられる分子と反応する。結合反応は、依然として固体支持体に結合されたＲＮＡを用いて、または溶液相中でのＲＮＡの切断後のいずれかで行われ得る。典型的には、ＨＰＬＣによるＲＮＡ結合体の精製により、純粋な結合体が得られる。
【０１２２】
ｉＲＮＡの送達
ｉＲＮＡを必要とする対象へのｉＲＮＡの送達を、いくつかの異なる方法において達成することができる。インビボ送達を、対象に、ｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡを含む組成物を投与することによって直接行うことができる。あるいは、送達を、ｉＲＮＡの発現をコードして導く１つ以上のベクターを投与することによって間接的に行うことができる。これらの代替案は、以下でさらに議論される。
【０１２３】
直接送達
概して、核酸分子を送達する任意の方法を、ｉＲＮＡとともに使用するために適合することができる（例えば、Ａｋｈｔａｒ  Ｓ．ａｎｄ  Ｊｕｌｉａｎ  ＲＬ．（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（５）：１３９−１４４および国際公開第ＷＯ９４／０２５９５号を参照されたく、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる）。しかしながら、インビボでｉＲＮＡ分子をうまく送達するために考慮すべき重要な３つの要因：（ａ）送達された分子の生物学的安定性、（２）非特異的影響の防止、および（３）標的組織内での送達された分子の蓄積が存在する。ｉＲＮＡの非特異的影響を、例えば、組織（非限定的な例として、腫瘍）への直接注入もしくは移植による局所投与、または調製物の局所投与によって最小限に抑えることができる。治療部位への局所投与は、薬剤の局所濃度を最大にし、その他の点では薬剤によって悪影響を与えられ得るか、または薬剤を分解し得る全身組織への薬剤の曝露を制限し、投与されるｉＲＮＡ分子の全線量を低減させることが可能である。いくつかの研究は、ｉＲＮＡが局所投与されるとき、遺伝子産物のノックダウンが成功したことを示している。例えば、カニクイザルにおける硝子体内注入によるＶＥＧＦ  ｄｓＲＮＡの眼球内送達（Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ，ＭＪ．，ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｒｅｔｉｎａ  ２４：１３２−１３８）およびマウスにおける網膜下注入（Ｒｅｉｃｈ，ＳＪ．，ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０−２１６）はともに、加齢に伴う黄斑変性の実験モデルにおける新血管形成を予防することを示した。加えて、マウスにおけるｄｓＲＮＡの直接腫瘍内注入は、腫瘍の大きさを減少させ（Ｐｉｌｌｅ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：２６７−２７４）、腫瘍を有するマウスの生存期間を延長させることができる（Ｋｉｍ，ＷＪ．，ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：３４３−３５０、Ｌｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：５１５−５２３）。ＲＮＡ干渉も直接注入によるＣＮＳへの局所送達（Ｄｏｒｎ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ３２：ｅ４９、Ｔａｎ，ＰＨ．，ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：５９−６６、Ｍａｋｉｍｕｒａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ（２００２）ＢＭＣ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：１８、Ｓｈｉｓｈｋｉｎａ，ＧＴ．，ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １２９：５２１−５２８、Ｔｈａｋｋｅｒ，ＥＲ．，ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：１７２７０−１７２７５、Ａｋａｎｅｙａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．９３：５９４−６０２）および鼻腔内投与による肺への局所送達（Ｈｏｗａｒｄ，ＫＡ．，ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：４７６−４８４、Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１０６７７−１０６８４、Ｂｉｔｋｏ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：５０−５５）の成功を示している。疾患の治療のためにｉＲＮＡを全身投与する場合、ＲＮＡを、薬物送達系を用いて修飾するか、またはあ���いは送達することができ、これら両方の方法は、インビボでのエンドヌクレアーゼおよびエクソヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの急速分解を阻止する役目を果たす。ＲＮＡまたは医薬担体の修飾は、標的組織へのｉＲＮＡ組成物の標的化も可能にし、望ましくないオフターゲット効果を回避する。ｉＲＮＡ分子は、コレステロール等の親油基への化学結合によって修飾され、細胞取り込みを亢進し、分解を阻止することができる。例えば、親油性コレステロール部分に結合されるＡｐｏＢに対するｉＲＮＡは、マウスに全身投与され、肝臓および空腸の両方において、ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡのノックダウンをもたらした（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１７３−１７８）。アプタマーへのｉＲＮＡの結合は、前立腺癌のマウスモデルにおける腫瘍増殖を阻害し、腫瘍退行を媒介することが示されている（ＭｃＮａｍａｒａ，ＪＯ．，ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：１００５−１０１５）。代替の実施形態において、ｉＲＮＡを、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム等の薬物送達系、またはカチオン性送達系を用いて送達することができる。正電荷を持つカチオン性送達系は、（負電荷を持つ）ｉＲＮＡ分子の結合を促進し、負電荷を持つ細胞膜での相互作用も亢進させ、細胞によるｉＲＮＡの効率的な取り込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーは、ｉＲＮＡへの結合または誘発のいずれかによって、ｉＲＮＡを包む小胞またはミセル（例えば、Ｋｉｍ  ＳＨ．，ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １２９（２）：１０７−１１６を参照のこと）を形成することができる。小胞またはミセルの形成は、全身投与されるとき、ｉＲＮＡの分解をさらに阻止する。カチオン性ｉＲＮＡ複合体を作製および投与するための方法は、十分当業者の能力の範囲内である（例えば、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ３２７：７６１−７６６、Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．，ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９：１２９１−１３００、Ａｒｎｏｌｄ，ＡＳ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２５：１９７−２０５を参照されたく、参照によりこれら全体が本明細書に組み込まれる）。ｉＲＮＡの全身送達に有用な薬物送達系のいくつかの非限定的な例として、ＤＯＴＡＰ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ  ａｌ（２００３），上記参照、Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．，ｅｔ  ａｌ（２００３），上記参照）、オリゴフェクタミン、「固体核酸脂質粒子」（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ＴＳ．，ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：１１１−１１４）、カルジオリピン（Ｃｈｉｅｎ，ＰＹ．，ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：３２１−３２８、Ｐａｌ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｉｎｔ  Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２６：１０８７−１０９１）、ポリエチレンイミン（Ｂｏｎｎｅｔ  ＭＥ．，ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．Ａｕｇ  １６  Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ、Ａｉｇｎｅｒ，Ａ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７１６５９）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド（Ｌｉｕ，Ｓ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．３：４７２−４８７）、およびポリアミドアミン（Ｔｏｍａｌｉａ，ＤＡ．，ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３５：６１−６７、Ｙｏｏ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１７９９−１８０４）が挙げられる。いくつかの実施形態において、ｉＲＮＡは、全身投与用のシクロデキストリンを有する複合体を形成する。ｉＲＮＡおよびシクロデキストリンの投与方法およびそれらの医薬組成物を、米国特許第７，４２７，６０５号で見出すことができ、参照によりその全体が本明細書組み込まれる。
【０１２４】
ベクターによってコードされるｄｓＲＮＡ
別の態様では、本発明のｄｓＲＮＡを、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入される転写ユニットから発現させることができる（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ａ，ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＧ．（１９９６），１２：５−１０、Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａ．らの国際ＰＣＴ公開第ＷＯ００／２２１１３号、Ｃｏｎｒａｄの国際ＰＣＴ公開第ＷＯ００／２２１１４号、およびＣｏｎｒａｄの米国特許第６，０５４，２９９号を参照されたい）。発現は、使用される特定の構築物および標的組織または細胞型に応じて、一時的（約数時間〜数週間）または持続的（数週間〜数ヶ月、またはそれ以上）であり得る。これらの導入遺伝子を、線状構築物、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入することができ、これらは、組み込み型ベクターまたは非組み込み型ベクターであり得る。染色体外プラスミドとして受け継がれ得るように導入遺伝子を構築することもできる（Ｇａｓｓｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：１２９２）。
【０１２５】
ｉＲＮＡの個々の鎖（単数または複数）を、発現ベクター上のプロモーターから転写することができる。例えば、ｄｓＲＮＡを生成するために２本の別個の鎖を発現させるとき、２つの別個の発現ベクターを、（例えば、トランスフェクションまたは感染によって）標的細胞に共導入することができる。あるいは、ｄｓＲＮＡのそれぞれ個々の鎖を、いずれも同一発現プラスミド上に位置するプロモーターで転写することができる。一実施形態において、ｄｓＲＮＡがステム・ループ構造を有するように、ｄｓＲＮＡをリンカーポリヌクレオチド配列によって接続された逆方向反復として発現させる。
【０１２６】
ｉＲＮＡ発現ベクターは、概して、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。真核細胞と適合性のある発現ベクター、好ましくは、脊椎動物細胞と適合性のある発現ベクターを用いて、本明細書に記載のｉＲＮＡの発現に対する組み換え構築物を産生することができる。真核細胞の発現ベクターは、当技術分野で周知であり、いくつかの商業的供給源から入手可能である。典型的には、所望の核酸セグメントの挿入に便利な制限部位を含有するベクターが提供される。ｉＲＮＡを発現するベクターの送達は、静脈内もしくは筋肉内投与によって、患者から外植された標的細胞に投与し、その後、患者へ再導入することによって、または所望の標的細胞への導入を可能にする任意の他の手段等によって全身的であり得る。
【０１２７】
ｉＲＮＡ発現プラスミドを、カチオン性脂質担体（例えばオリゴフェクタミン）、または非カチオン性脂質に基づく担体（例えばＴｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯ（商標））を有する複合体として、標的細胞にトランスフェクトすることができる。１週間以上の期間にわたって標的ＲＮＡの異なる領域を標的化するｉＲＮＡ媒介ノックダウンのための複数回の脂質トランスフェクションも、本発明によって企図される。ベクターの宿主細胞への導入の成功は、様々な既知の方法を用いて観察することができる。例えば、一過性トランスフェクションを、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光マーカー等のレポーターを用いてシグナル伝達することができる。エクスビボでの細胞の安定したトランスフェクションを、ハイグロマイシンＢ耐性等の特定の環境要因（例えば、抗生物質および薬物）への耐性を有するトランスフェクト細胞を提供するマーカーを用いて確実にすることができる。
【０１２８】
本明細書に記載の方法および組成物とともに利用することができるウイルスベクター系には、（ａ）アデノウイルスベクター、（ｂ）レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルス等を含むが、これらに限定されないレトロウイルスベクター、（ｃ）アデノ関連ウイルスベクター、（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター、（ｅ）ＳＶ４０ベクター、（ｆ）ポリオーマウイルスベクター、（ｇ）乳頭腫ウイルスベクター、（ｈ）ピコルナウイルスベクター、（ｉ）オルトポックス等のポックスウイルスベクター、例えば、ワクシニアウイルスベクターまたはアビポックス、例えば、カナリア痘もしくは鶏痘、および（ｊ）ヘルパー依存性または弱毒アデノウイルスが含まれるが、これらに限定されない。複製欠損ウイルスも有益であり得る。異なるベクターは、細胞のゲノムに組み込まれるか、または組み込まれない。構築物は、所望の場合、トランスフェクションのためにウイルス配列を含んでもよい。あるいは、構築物を、エピソーム複製能力のあるベクター、例えば、ＥＰＶおよびＥＢＶベクターに組み込んでもよい。ｉＲＮＡの組み換え発現のための構築物は、概して、標的細胞内でのｉＲＮＡの発現を確実にするために、調節要素、例えば、プロモーター、エンハンサー等を必要とする。ベクターおよび構築物を考慮する他の態様は、以下にさらに記載される。
【０１２９】
ｉＲＮＡの送達に有用なベクターは、所望の標的細胞または組織内でのｉＲＮＡの発現に十分な調節要素（プロモーター、エンハンサー等）を含む。調節要素を、構成性発現あるいは調節性／誘導性発現のいずれかを提供するように選択することができる。
【０１３０】
ｉＲＮＡの発現を、例えば、ある特定の生理学的調節因子、例えば、循環グルコースレベルまたはホルモンに感受性のある誘導性調節配列を用いることによって正確に調節することができる（Ｄｏｃｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．８：２０−２４）。細胞または哺乳動物内でのｄｓＲＮＡ発現の制御に好適なそのような誘導性発現系には、例えば、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量化の化学誘導物質、およびイソプロピル−β−Ｄ１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による調節が含まれる。当業者であれば、ｉＲＮＡ導入遺伝子の使用目的に基づいて、適切な調節／プロモーター配列を選択することができる。
【０１３１】
特定の実施形態において、ｉＲＮＡをコードする核酸配列を含有するウイルスベクターを使用することができる。例えば、レトロウイルスベクターを使用することができる（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９（１９９３）を参照のこと）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージング、および宿主細胞ＤＮＡへの組み込みに必要な構成要素を含有する。ｉＲＮＡをコードする核酸配列は、患者への核酸の送達を促進する１つ以上のベクターにクローン化される。レトロウイルスベクターについてのさらなる詳細は、例えば、Ｂｏｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ６：２９１−３０２（１９９４）で見出すことができ、造血幹細胞の化学療法への耐性を高めるために、造血幹細胞にｍｄｒ１遺伝子を送達するレトロウイルスベクターの使用を記載する。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を例証する他の参考文献には、Ｃｌｏｗｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１（１９９４）、Ｋｉｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８３：１４６７−１４７３（１９９４）、Ｓａｌｍｏｎｓ  ａｎｄ  Ｇｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：１２９−１４１（１９９３）、およびＧｒｏｓｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．３：１１０−１１４（１９９３）がある。使用が企図されるレンチウイルスベクターには、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，１４３，５２０号、同第５，６６５，５５７号、および同第５，９８１，２７６号に記載のＨＩＶに基づくベクターが含まれる。
【０１３２】
アデノウイルスは、ｉＲＮＡの送達における使用でも企図される。アデノウイルスは、例えば、遺伝子を呼吸上皮に送達するのに特に魅力的なビヒクルである。アデノウイルスは、本来、呼吸上皮に感染し、軽度の病気を引き起こす。アデノウイルスに基づく送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染することができるという利点を有する。Ｋｏｚａｒｓｋｙ  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ３：４９９−５０３（１９９３）は、アデノウイルスに基づく遺伝子治療の総説を示す。Ｂｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：３−１０（１９９４）は、アカゲサルの呼吸上皮に遺伝子を移動させるためのアデノウイルスベクターの使用を実証した。遺伝子治療におけるアデノウイルス使用の他の例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４（１９９１）、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−１５５（１９９２）、Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２３４（１９９３）、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号、およびＷａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：７７５−７８３（１９９５）で見出すことができる。本発明で取り上げられるｉＲＮＡの発現に好適なＡＶベクター、組み換えＡＶベクターを構築する方法、およびベクターを標的細胞に送達する方法は、Ｘｉａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６−１０１０に記載されている。
【０１３３】
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの使用も企図される（Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：２８９−３００（１９９３）、米国特許第５，４３６，１４６号）。一実施形態において、ｉＲＮＡは、例えば、Ｕ６もしくはＨ１  ＲＮＡプロモーター、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのいずれかを有する組み換えＡＡＶベクターから、２つの別個の相補的な単鎖ＲＮＡ分子として発現され得る。本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡの発現に好適なＡＡＶベクター、組み換えＡＶベクターを構築する方法、およびベクターを標的細胞に送達する方法は、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｋ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７０：５２０−５３２、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２６、米国特許第５，２５２，４７９号、米国特許第５，１３９，９４１号、国際特許出願第ＷＯ９４／１３７８８号、および国際特許出願第ＷＯ９３／２４６４１号に記載されており、全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３４】
別の好ましいウイルスベクターは、ワクシニアウイルス等のポックスウイルス、例えば、修飾ウイルスアンカラ（ＭＶＡ）またはＮＹＶＡＣ等の弱毒化ワクシニア、カナリア痘もしくは鶏痘等のアビポックスである。
【０１３５】
ウイルスベクターの指向性を、該ベクターをエンベロープタンパク質もしくは他のウイルス由来の他の表面抗原でシュードタイピングすることによって、または異なるウイルスのキャプシドタンパク質を必要に応じて置換することによって修正することができる。例えば、レンチウイルスベクターを、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラ等由来の表面タンパク質でシュードタイピングすることができる。ＡＡＶベクターを異なるカプシドタンパク質血清型を発現するように操作することによって、ＡＡＶベクターを異なる細胞を標的化するように作製することができ、例えば、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ  Ｊ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７６：７９１−８０１を参照されたく、全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３６】
ベクターの医薬調製物は、許容される希釈剤中のベクターを含むことができるか、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれる徐放性マトリックスを含むことができる。あるいは、完全な遺伝子送達ベクター、例えば、レトロウイルスベクターを組み換え細胞から無傷で産生する場合、医薬調製は、遺伝子送達系を産生する１つ以上の細胞を含むことができる。
【０１３７】
ｉＲＮＡを含有する医薬組成物
一実施形態において、本発明は、本明細書に記載のｓｉＲＮＡおよび薬学的に許容できる担体を含有する医薬組成物を提供する。ｓｉＲＮＡを含有する医薬組成物は、ＰＣＳＫ９発現によって媒介される病理学的プロセス等の標的遺伝子の発現または活性に関連する疾患もしくは障害の治療に有用である。そのような医薬組成物は、送達様式に基づいて製剤化される。一例として、非経口送達、例えば、静脈内（ＩＶ）送達による全身投与用に製剤化される組成物がある。別の例として、例えば、連続的なポンプ注入等の脳への注入による脳実質への直接送達用に製剤化される組成物がある。
【０１３８】
本明細書で取り上げられる医薬組成物は、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な投与量で投与される。概して、ｓｉＲＮＡの好適な用量は、１日につきレシピエントの体重１キログラム当たり０．０１〜２００．０ミリグラム、概して、１日につき体重１キログラム当たり１〜５０ｍｇである。例えば、ｄｓＲＮＡを、単回用量当たり０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、１９ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２１ｍｇ／ｋｇ、２２ｍｇ／ｋｇ、２３ｍｇ／ｋｇ、２４ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、２６ｍｇ／ｋｇ、２７ｍｇ／ｋｇ、２８ｍｇ／ｋｇ、２９ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３１ｍｇ／ｋｇ、３２ｍｇ／ｋｇ、３３ｍｇ／ｋｇ、３４ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、３６ｍｇ／ｋｇ、３７ｍｇ／ｋｇ、３８ｍｇ／ｋｇ、３９ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４１ｍｇ／ｋｇ、４２ｍｇ／ｋｇ、４３ｍｇ／ｋｇ、４４ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、４６ｍｇ／ｋｇ、４７ｍｇ／ｋｇ、４８ｍｇ／ｋｇ、４９ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇで投与することができる。
【０１３９】
医薬組成物を１日１回投与することができるか、あるいはｉＲＮＡを１日にわたって適切な間隔で２回、３回、もしくはそれ以上の部分投与として、またはさらには連続注入もしくは放出制御製剤による送達を用いて投与することができる。その場合、それぞれの部分投与に含有されるｉＲＮＡは、１日当たりの総投与量を得るために、相応してより少なくなければならない。数日間にわたる送達のために、例えば、数日間にわたってｉＲＮＡの持続放出を提供する従来の持続放出製剤を用いて、投与量単位を配合することもできる。持続放出製剤は当技術分野において周知であり、本発明の薬剤とともに使用することができる薬剤等の特定の部位での薬剤の送達に特に有用である。本実施形態において、投与量単位は、相応する複数の１日量を含有する。
【０１４０】
ｓｉＲＮＡの単回用量のＰＣＳＫ９レベルへの効果が長続きすることができ、したがって、その後の用量が３、４、もしくは５日以下の間隔、または１、２、３、もしくは４週刊以下の間隔で投与される。
【０１４１】
当業者であれば、疾患もしくは障害の重症度、以前の治療、対象の総体的な健康状態および／もしくは年齢、ならびに存在する他の疾患を含むが、これらに限定されないある特定の要因が、対象を効果的に治療するのに必要とされる投与量およびタイミングに影響を及ぼし得ることが理解されよう。さらに、治療的に有効な量の組成物を用いた対象の治療には、単回治療または一連の治療が含まれ得る。本発明によって包含される個々のｉＲＮＡの効果的な投与量およびインビボ半減期は、従来の方法を用いて、または本明細書の他の箇所に記載の適切な動物モデルを用いたインビボ試験に基づいて推定することができる。
【０１４２】
マウス遺伝学の進歩により、ＰＣＳＫ９発現によって媒介される病理学的プロセス等の様々なヒト疾患を研究するためのいくつかのマウスモデルが作製された。そのようなモデルを、ｉＲＮＡのインビボ試験、ならびに治療的に有効な用量の決定のために使用することができる。好適なマウスモデルは、例えば、ヒトＰＣＳＫ９を発現する導入遺伝子を含有するマウスである。
【０１４３】
本発明は、本発明で取り上げられるｉＲＮＡ化合物を含む医薬組成物および製剤も含む。本発明の医薬組成物を、局所治療または全身治療が所望されるかに応じて、かつ治療される領域に応じて、いくつかの方法で投与することができる。投与は、局所（例えば、経皮パッチによる）、噴霧器の使用を含む肺内（例えば、粉末もしくはエアロゾルの吸入または吹送による）、気管内、鼻腔内、表皮および経皮、経口または非経口であり得る。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、もしくは筋肉内注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）もしくは注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）；例えば、埋め込みデバイスを用いた皮下投与；または頭蓋内、例えば、実質内、髄腔内、もしくは脳室内投与を含む。
【０１４４】
ｉＲＮＡを、肝臓（例えば、肝臓の肝細胞）等の特定の組織を標的化する様式で送達することができる。
【０１４５】
局所投与用の医薬組成物および製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ剤、坐薬、スプレー、液体、および粉末が含まれ得る。従来の医薬担体、水溶液、粉末、もしくは油性基剤、増粘剤等が必要であるか、または望ましくあり得る。被覆コンドーム、手袋等も有用であり得る。好適な局所製剤には、本発明で取り上げられるｉＲＮＡが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤、および界面活性剤等の局所送達剤と混合されるものが含まれる。好適な脂質およびリポソームには、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジル（ＤＯＰＥ）エタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ））、ならびにカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピル（ＤＯＴＡＰ）、およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＴＭＡ））が含まれる。本発明で取り上げられるｉＲＮＡは、リポソーム内に封入されるか、またはリポソーム、特にカチオン性リポソームと複合体を形成してもよい。あるいは、ｉＲＮＡは、脂質、具体的には、カチオン性脂質と複合されてもよい。好適な脂肪酸およびエステルには、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプリン酸、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ１−２０アルキルエステル（例えば、ミリスチン酸イソプロピル（ＩＰＭ））、モノグリセリド、ジグリセリド、またはそれらの薬学的に許容される塩が含まれるが、これらに限定されない。局所製剤は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，７４７，０１４号に詳細に記載されている。
【０１４６】
リポソーム製剤
薬物の製剤化のために研究および使用されているマイクロエマルジョンの他に、多くの界面活性剤の組織構造が存在する。これらには、単層、ミセル、二重層、および小胞が含まれる。リポソーム等の小胞は、薬物送達の観点からのそれらが提示する特異性および作用持続期間を理由に、大きな関心を集めている。本発明で使用される「リポソーム」という用語は、球状の二重層（単数または複数）に配置された両親媒性脂質から成る小胞を意味する。
【０１４７】
リポソームは、親油性物質および水性内部から形成される膜を有する単層状または多層状の小胞である。水性部分は、送達される組成物を含有する。カチオン性リポソームは、細胞壁に融合することができるといった利点を有する。非カチオン性リポソームは、細胞壁とそれほど効率的に融合することはできないが、マクロファージによりインビボで取り込まれる。
【０１４８】
哺乳類の無傷の皮膚を横断するために、脂質小胞は、好適な経皮勾配の影響下で、それぞれ５０ｎｍ未満の直径を有する一連の微細孔を通過しなければならない。したがって、高度に変形可能であり、かつそのような微細孔を通過することができるリポソームを使用することが望ましい。
【０１４９】
リポソームのさらなる利点には、天然のリン脂質から得られたリポソームが生体適合可能および生分解可能であること、リポソームが広範な水溶性および脂溶性薬物を組み込むことができること、リポソームがそれらの内部区画で封入された薬物を代謝および分解から保護することができることが含まれる（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製において考慮すべき重要な事項は、脂質の表面電荷、小胞の大きさ、およびリポソームの水性容積である。
【０１５０】
リポソームは、作用部位への活性成分の移動および送達に有用である。リポソーム膜が構造的に生体膜と同様であるため、リポソームが組織に適用されると、リポソームは細胞膜との融合を開始し、リポソームと細胞の融合が進行するにつれて、リポソームの内容物が細胞内に出て、そこで活性薬剤が作用し得る。
【０１５１】
リポソーム製剤は、多くの薬物の送達様式として広範な調査の焦点となっている。局所投与の場合、リポソームが他の製剤に勝るいくつかの利点を示すという証拠が増えつつある。そのような利点には、投与された薬物の高度な体内吸収に関連した副作用の減少、所望の標的における投与された薬物の蓄積の増加、ならびに多種多様の薬物（親水性および疎水性の両方）を皮膚に投与する能力が含まれる。
【０１５２】
いくつかの報告書は、高分子量のＤＮＡを含む薬剤を皮膚に送達するリポソームの能力について詳述している。鎮痛剤、抗体、ホルモン、および高分子量のＤＮＡを含む化合物が皮膚に投与されている。適用の大半が、表皮上層の標的化をもたらした。
【０１５３】
リポソームは、２つの広義のクラスに分類される。カチオン性リポソームは、負に荷電したＤＮＡ分子と相互に作用して安定した複合体を形成する正に荷電したリポソームである。正に荷電したＤＮＡ／リポソーム複合体は、負に荷電した細胞表面に結合し、エンドソーム内に取り込まれる。エンドソーム内の酸性ｐＨにより、リポソームは破裂し、その内容物を細胞質内に放出する（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８７，１４７，９８０−９８５）。
【０１５４】
ｐＨ感受性であるか、または負に荷電したリポソームは、ＤＮＡと複合体化するのではなく、ＤＮＡを封入する。ＤＮＡおよび脂質の両方が同様の電荷を持つため、複合体形成ではなく、反発が生じる。それにもかかわらず、一部のＤＮＡは、これらのリポソームの水性内部に封入される。ｐＨ感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを培養中の細胞単層に送達するために使用されている。外来性遺伝子の発現は、標的細胞内で検出された（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９２，１９，２６９−２７４）。
【０１５５】
リポソーム組成物の主要な種類の１つには、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質が含まれる。例えば、中性リポソーム組成物を、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。アニオン性リポソーム組成物は、概して、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成され、一方で、アニオン性の膜融合性リポソームは、主に、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。リポソーム組成物の別の種類は、例えば、大豆ホスファチジルコリン、および卵ホスファチジルコリン等のホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。別の種類は、リン脂質、および／またはホスファチジルコリン、および／またはコレステロールの混合物から形成される。
【０１５６】
いくつかの研究は、リポソーム製剤の皮膚への局所送達を評価している。インターフェロンを含有するリポソームのテンジクネズミの皮膚への適用が、皮膚ヘルペス痛の減少をもたらした一方で、他の手段（例えば、溶液またはエマルジョンとして）を介したインターフェロンの送達は効果的ではなかった（Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，２，４０５−４１０）。さらに、さらなる研究は、水溶液系を用いて、インターフェロンの投与に対するリポソーム製剤の一部として投与されたインターフェロンの有効性を試験し、リポソーム製剤が水溶液投与よりも優れていると結論付けた（ｄｕ  Ｐｌｅｓｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９２，１８，２５９−２６５）。
【０１５７】
非イオン性リポソーム系も、皮膚への薬物の送達、具体的には、非イオン性界面活性剤およびコレステロールを含む系における実用性を決定するために試験されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤が、シクロスポリンＡをマウス皮膚の真皮に送達するために使用された。結果として、そのような非イオン性リポソーム系が、シクロスポリンＡを皮膚の異なる層に沈着させることを促進する際に効果的であったことが示された（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，１９９４，４，６，４６６）。
【０１５８】
リポソームには、「立体的に安定化された」リポソームも含まれ、本明細書で使用されるこの用語は、１つ以上の特定化された脂質を含むリポソームを指し、リポソームに組み込まれるときに、そのような特定化された脂質を欠くリポソームと比較して、循環寿命の向上をもたらす。立体的に安定化されたリポソームの例として、リポソームの小胞を形成する脂質部分の一部が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１等の１つ以上の糖脂質を含むか、または（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分等の１つ以上の親水性ポリマーで誘導体化されるものである。任意の特定の理論によって束縛されるものではないが、当技術分野において、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ誘導体化脂質を含有する立体的に安定化されたリポソームにおいて、これらの立体的に安定化されたリポソームの循環半減期の増大が、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞への取り込みの減少に由来すると考えられている（Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８７，２２３，４２、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９３，５３，３７６５）。
【０１５９】
１つ以上の糖脂質を含む様々なリポソームが当技術分野で周知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８７，５０７，６４）は、リポソームの血液半減期を向上させるモノシアロガングリオシドＧＭ１、硫酸ガラクトセレブロシド、およびホスファチジルイノシトールの能力を報告した。これらの所見は、Ｇａｂｉｚｏｎらによって詳しく説明された（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８８，８５，６９４９）。米国特許第４，８３７，０２８号および国際公開第ＷＯ８８／０４９２４号（ともにＡｌｌｅｎら）は、（１）スフィンゴミエリンおよび（２）ガングリオシドＧＭ１または硫酸ガラクトセレブロシドエステルを含むリポソームを開示している。米国特許第５，５４３，１５２号（Ｗｅｂｂら）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示している。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、国際公開第ＷＯ９７／１３４９９号（Ｌｉｍら）に開示されている。
【０１６０】
１つ以上の親水性ポリマーによって誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム、およびそれらの調製方法は、当技術分野において既知である。Ｓｕｎａｍｏｔｏら（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，１９８０，５３，２７７８）は、ＰＥＧ部分を含有する非イオン性洗剤である２Ｃ１２１５Ｇを含むリポソームを記載している。Ｉｌｌｕｍら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９８４，１６７，７９）は、ポリマーグリコールでのポリスチレン粒子の親水性コーティングが、血液半減期の著しい向上をもたらすことを指摘した。ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）のカルボキシル基の結合によって修飾された合成リン脂質は、Ｓｅａｒｓ（米国特許第４，４２６，３３０号および同第４，５３４，８９９号）によって記載されている。Ｋｌｉｂａｎｏｖら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，２６８，２３５）は、ＰＥＧまたはＰＥＧステアレートで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームが血液循環半減期を著しく増加させることを実証する実験を記載した。Ｂｌｕｍｅら（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，９１）は、そのような見解を、他のＰＥＧ誘導体化リン脂質、例えば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）およびＰＥＧの組み合わせによって形成されるＤＳＰＥ−ＰＥＧに拡大した。リポソームの外部表面上に共有結合したＰＥＧ部分を有するリポソームが、Ｆｉｓｈｅｒの欧州特許第ＥＰ０  ４４５  １３１号Ｂ１および国際公開第ＷＯ９０／０４３８４号に記載されている。ＰＥＧで誘導体化されたＰＥの１〜２０モルパーセントを含有するリポソーム組成物、およびその使用方法が、Ｗｏｏｄｌｅら（米国特許第５，０１３，５５６号および同第５，３５６，６３３号）ならびにＭａｒｔｉｎら（米国特許第５，２１３，８０４号および欧州特許第ＥＰ０  ４９６  ８１３号Ｂ１）によって記載されている。いくつかの他の脂質−ポリマー結合体を含むリポソームが、国際公開第ＷＯ９１／０５５４５号および米国特許第５，２２５，２１２号（ともにＭａｒｔｉｎら）および国際公開第ＷＯ９４／２００７３号（Ｚａｌｉｐｓｋｙら）に開示されている。ＰＥＧ修飾セラミド脂質を含むリポソームが、国際公開第ＷＯ９６／１０３９１号（Ｃｈｏｉら）に記載されている。米国特許第５，５４０，９３５号（Ｍｉｙａｚａｋｉら）および米国特許第５，５５６，９４８号（Ｔａｇａｗａら）は、ＰＥＧ含有リポソームの表面上の官能部分でさらに誘導体化することができるＰＥＧ含有リポソームを記載している。
【０１６１】
核酸を含むいくつかのリポソームが当技術分野において既知である。Ｔｈｉｅｒｒｙらの国際公開第ＷＯ９６／４００６２号は、高分子量の核酸をリポソーム内に封入する方法を開示している。Ｔａｇａｗａらの米国特許第５，２６４，２２１号は、タンパク質結合リポソームを開示しており、そのようなリポソームの内容物がｄｓＲＮＡを含んでもよいことを断言している。Ｒａｈｍａｎらの米国特許第５，６６５，７１０号は、オリゴデオキシヌクレオチドをリポソーム内に封入するある特定の方法を記載している。Ｌｏｖｅらの国際公開第ＷＯ９７／０４７８７号は、ｒａｆ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含むリポソームを開示している。
【０１６２】
トランスファーソームはさらに別の種類のリポソームであり、薬物送達ビヒクルの魅力的な候補者である高度に変形可能な脂質凝集体である。トランスファーソームは脂質小滴として記載されてもよく、これは、高度に変形可能であるため、この小滴よりも小さい孔に容易に浸透することができる。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適合可能であり、例えば、自己最適化性であり（皮膚の孔の形状に適合する）、自己修復性であり、断片化することなく高い頻度で標的に到達し、多くの場合、自己装填性（ｓｅｌｆ−ｌｏａｄｉｎｇ）である。トランスファーソームを作製するために、表面エッジアクチベータ（ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｄｇｅ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、通常、界面活性剤を標準のリポソーム組成物に添加することが可能である。トランスファーソームは、血清アルブミンを皮膚に送達するために使用されている。トランスファーソームによって媒介される血清アルブミンの送達は、血清アルブミンを含有する溶液の皮下注入と同程度に効果的であることが示されている。
【０１６３】
界面活性剤は、エマルジョン（マイクロエマルジョンを含む）およびリポソーム等の製剤において幅広く適用される。多くの異なる種類の界面活性剤（天然および合成の両方）の特性を分類およびランク付けする最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）を用いた方法である。親水性基（「頭部基」としても知られる）の特性が、製剤に使用される異なる界面活性剤を分類するための最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
【０１６４】
界面活性剤分子がイオン化されていない場合、これは、非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬製品および化粧品において幅広く適用され、広範なｐＨ値にわたって使用可能である。概して、それらのＨＬＢ値は、それらの構造に応じて、２〜約１８の範囲内である。非イオン性界面活性剤には、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシ化エステル等の非イオン性エステルが含まれる。脂肪アルコールエトキシ化物、プロポキシ化アルコール、およびエトキシ化／プロポキシ化ブロックポリマー等の非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルも、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤が、非イオン性界面活性剤のクラスのなかで最も一般的な構成員である。
【０１６５】
界面活性剤分子が水中に溶解されるか、または分散するときに負の電荷を保有する場合、その界面活性剤は、アニオン性に分類される。アニオン性界面活性剤には、石鹸等のカルボン酸塩、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、アルキル硫酸塩およびエトキシ化アルキル硫酸塩等の硫酸エステル、アルキルベンゼンスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレート、およびスルホコハク酸塩等のスルホネート、ならびにホスフェートが含まれる。アニオン性界面活性剤クラスのなかで最も重要な構成員は、アルキル硫酸塩および石鹸である。
【０１６６】
界面活性剤分子が水中に溶解されるか、または分散するときに正の荷電を保有する場合、その界面活性剤はカチオン性に分類される。カチオン性界面活性剤には、第四アンモニウム塩およびエトキシ化アミンが含まれる。第四アンモニウム塩がこのクラスのなかで最も使用される構成員である。
【０１６７】
界面活性剤分子が正または負の電荷のいずれも保有する能力を有する場合、その界面活性剤は、両性に分類される。両性界面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン、およびフォスファチドが含まれる。
【０１６８】
薬品、製剤、およびエマルジョンにおける界面活性剤の使用が概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
【０１６９】
核酸脂質粒子
一実施形態において、本発明で取り上げられるｓｉＲＮＡは、例えば、核酸脂質粒子、例えば、ＳＰＬＰ、ｐＳＰＬＰ、またはＳＮＡＬＰを形成するために、脂質製剤中に完全に封入される。本明細書で使用される「ＳＮＡＬＰ」という用語は、ＳＰＬＰを含む安定した核酸脂質粒子を指す。本明細書で使用される「ＳＰＬＰ」という用語は、脂質小胞内に封入されたプラスミドＤＮＡを含む核酸脂質粒子を指す。核酸脂質粒子、例えば、ＳＮＡＬＰは、典型的には、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を阻止する脂質（例えば、ＰＥＧ−脂質結合体）を含有する。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは、静脈内（ｉ．ｖ．）注入後に循環寿命の延長を呈し、かつ遠位部位（例えば、投与部位から物理的に分離された部位）で蓄積するため、全身適用に非常に有用である。ＳＰＬＰは「ｐＳＰＬＰ」を含み、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／０３６８３号に記載の封入された縮合剤−核酸複合体を含む。
【０１７０】
本発明の粒子は、典型的には、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、より典型的には、約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、より典型的には、約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、最も典型的には、約７０ｎｍ〜約９０ｎｍの平均直径を有し、実質的に非毒性である。例えば、粒子の平均直径は、約５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、または１５０ｎｍであり得る。
【０１７１】
加えて、核酸は、本発明の核酸脂質粒子中に存在する場合、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に耐性を示す。核酸脂質粒子およびそれらの調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号、同第５，９８１，５０１号、同第６，５３４，４８４号、同第６，５８６，４１０号、同第６，８１５，４３２号、およびＰＣＴ公開第ＷＯ９６／４０９６４号に開示されている。
【０１７２】
一実施形態において、脂質：薬物の比率（質量／質量比率）（例えば、脂質：ｄｓＲＮＡの比率）は、約１：１〜約５０：１、約１：１〜約２５：１、約３：１〜約１５：１、約４：１〜約１０：１、約５：１〜約９：１、または約６：１〜約９：１の範囲内である。脂質：ｄｓＲＮＡの比率は、約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１、４８：１、４９：１、または５０：１であり得る。
【０１７３】
核酸脂質粒子は、カチオン性脂質を含む。カチオン性脂質は、例えば、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、もしくは３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、ｌ，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソレン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、またはそれらの類似体、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソレン（ＸＴＣ）、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン（ＡＬＮ１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）、１，１’−（２−（４−（２−（（２−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン−１−イル）エチルアザネジイル）ジドデカン−２−オール（Ｔｅｃｈ  Ｇ１、例えば、Ｃ１２−２００）、あるいはそれらの混合物であり得る。
【０１７４】
カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約１０モル％〜約７０モル％または約４０モル％を含み得る。カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の１０モル％、１５モル％、２０モル％、２５モル％、３０モル％、３５モル％、４０モル％、４５モル％、５０モル％、５５モル％、６０モル％、６５モル％、７０モル％、７５モル％、８０モル％、８５モル％、９０モル％、または９５モル％を含み得る。カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の５７．１モル％または５７．５モル％を含み得る。
【０１７５】
核酸脂質粒子は、概して、非カチオン性脂質を含む。非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、またはそれらの混合物を含むが、これらに限定されない、アニオン性脂質または中性脂質であり得る。
【０１７６】
非カチオン性脂質は、コレステロールが含まれる場合、粒子中に存在する全脂質の約５モル％〜約９０モル％、約１０モル％、または約５８モル％であり得る。非カチオン性脂質は、約５モル％、６モル％、７モル％、７．５モル％、７．７モル％、８モル％、９モル％、１０モル％、１１モル％、１２モル％、１３モル％、１４モル％、１５モル％、１６モル％、１７モル％、１８モル％、１９モル％、２０モル％、２５モル％、３０モル％、３５モル％、４０モル％、４５モル％、５０モル％、５５モル％、６０モル％、６５モル％、７０モル％、７５モル％、８０モル％、８５モル％、９０モル％、または９５モル％であり得る。
【０１７７】
核酸脂質粒子は、概して、結合した脂質を含む。粒子の凝集を阻害する結合した脂質は、例えば、限定することなく、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ−リン脂質、ＰＥＧ−セラミド（Ｃｅｒ）、またはそれらの混合物を含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質であり得る。ＰＥＧ−ＤＡＡ結合体は、例えば、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃｉ２）、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃｉ４）、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃｉ６）、またはＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ）８）であり得る。結合した脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＧ（ＰＥＧ−ジジミリストイルグリセロール（Ｃ１４−ＰＥＧ、もしくはＰＥＧ−Ｃ１４）（２０００の平均モル重量を有するＰＥＧ）、ＰＥＧ−ＤＳＧ（ＰＥＧ−ジスチリルグリセロール（Ｃ１８−ＰＥＧ、もしくはＰＥＧ−Ｃ１８）（２０００の平均モル重量を有するＰＥＧ）、またはＰＥＧ−ｃＤＭＡ：ＰＥＧ−カルバモイル−１，２−ジミリストイルオキシプロピルアミン（２０００の平均モル重量を有するＰＥＧ）であり得る。
【０１７８】
粒子の凝集を阻止する結合した脂質は、粒子中に存在する全脂質の０モル％〜約２０モル％、または約１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１１．０、１２．０、１３．０、１４．０、１５．０、１６．０、１７．０、１８、１９．０、もしくは２０．０モル％であり得る。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、核酸脂質粒子は、例えば、粒子中に存在する全脂質の約１０モル％〜約６０モル％または約４８モル％のコレステロールをさらに含む。例えば、核酸脂質粒子は、約５モル％、１０モル％、１５モル％、２０モル％、２５モル％、３０モル％、３５モル％、４０モル％、４５モル％、５０モル％、５５モル％、または６０モル％のコレステロールをさらに含む。核酸脂質粒子は、粒子中に存在する全脂質の約３１．５モル％、３４．４モル％、３５モル％、３８．５モル％、または４０モル％のコレステロールを含み得る。
【０１８０】
例示的な核酸脂質粒子
ＬＮＰ０１製剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際出願公開第ＷＯ２００８／０４２９７３号に記載されている。さらなる例示的な脂質ｄｓＲＮＡ製剤は、以下の通りである。
表Ａ
【表１−１】
2013545736.tif 000004
【表１−２】
2013545736.tif 000005
【０１８１】
製剤を含むＳＮＡＬＰ（１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ））は、参照により本明細書に組み込まれる２００９年４月１５日出願の国際公開第ＷＯ２００９／１２７０６０号に記載されている。
【０１８２】
製剤を含むＸＴＣは、例えば、２００９年１月２９日出願の米国仮出願第６１／１４８，３６６号、２００９年３月２日出願の米国仮出願第６１／１５６，８５１号、２００９年６月１０日出願の米国仮出願第  号、２００９年７月２４日出願の米国仮出願第６１／２２８，３７３号、２００９年９月３日出願の米国仮出願第６１／２３９，６８６号、および２０１０年１月２９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２２６１４号に記載されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８３】
製剤を含むＭＣ３は、例えば、２００９年９月２２日出願の米国仮出願第６１／２４４，８３４号、２００９年６月１０日出願の米国仮出願第６１／１８５，８００号、および２０１０年６月１０日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／２８２２４号に記載されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８４】
製剤を含むＡＬＮＹ−１００は、例えば、２００９年１１月１０日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／６３９３３号に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８５】
製剤を含むＣ１２−２００は、２００９年５月５日出願の米国仮出願第６１／１７５，７７０号、および２０１０年５月５日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／３３７７７号に記載されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８６】
カチオン性脂質の合成
本発明の核酸脂質粒子において使用される化合物、例えば、カチオン性脂質等のいずれも、実施例においてより詳細に記載される方法を含む、既知の有機合成技術によって調製することができる。すべての置換基は、別途示されない限り、以下に定義されるものとする。
【０１８７】
「アルキル」とは、１〜２４個の炭素原子を含有する直鎖もしくは分枝鎖の非環状もしくは環状の飽和脂肪族炭化水素を意味する。代表的な飽和直鎖アルキルには、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル等が含まれ、一方で、飽和分枝鎖アルキルには、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル等が挙げられる。代表的な飽和環状アルキルには、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等が含まれ、一方で、非飽和環状アルキルには、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニル等が挙げられる。
【０１８８】
「アルケニル」とは、上で定義されるように、隣接炭素原子間に少なくとも１つの二重結合を含有するアルキルを意味する。アルケニルには、シスおよびトランス異性体の両方が含まれる。代表的な直鎖および分枝鎖アルケニルには、エチレニル、プロピレニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニル等が挙げられる。
【０１８９】
「アルキニル」とは、上で定義されるように、隣接炭素間に少なくとも１つの三重結合をさらに含有する任意のアルキルまたはアルケニルを意味する。代表的な直鎖および分枝鎖のアルキニルには、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−メチル−１ブチニル等が挙げられる。
【０１９０】
「アシル」とは、以下で定義されるように、結合点の炭素がオキソ基で置換される任意のアルキル、アルケニル、またはアルキニルを意味する。例えば、−Ｃ（＝Ｏ）アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）アルケニル、および−Ｃ（＝Ｏ）アルキニルが、アシル基である。
【０１９１】
「複素環」とは、飽和、不飽和、または芳香族のいずれかであり、かつ、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１もしくは２個のヘテロ原子（その窒素および硫黄ヘテロ原子は、任意で酸化されてもよく、その窒素ヘテロ原子は、任意で四級化されてもよい）を含有する５〜７員の単環式または７〜１０員の二環式の複素環式環を意味し、これには、上記の複素環のうちのいずれかがベンゼン環に融合される二環式の環が含まれる。複素環は、任意のヘテロ原子または炭素原子を介して結合されてもよい。複素環には、以下で定義されるヘテロアリールが含まれる。複素環には、モルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｚｙｎｙｌ）、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル等が含まれる。
【０１９２】
「任意で置換されるアルキル」、「任意で置換されるアルケニル」、「任意で置換されるアルキニル」、「任意で置換されるアシル」、および「任意で置換される複素環」という用語は、置換されるとき、少なくとも１個の水素原子が、ある置換基に置換されることを意味する。オキソ置換基（＝Ｏ）の場合、２個の水素原子が置換される。この点において、置換基には、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲｘ、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘ、および−ＳＯｎＮＲｘＲｙが含まれ、ｎは、０、１、もしくは２であり、ＲｘおよびＲｙは、同一であるか、または異なり、独立して、水素、アルキル、または複素環であり、該アルキルおよび複素環置換基はそれぞれ、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲｘ、複素環、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘ、および−ＳＯｎＮＲｘＲｙのうちの１つ以上にさらに置換されてもよい。
【０１９３】
「ハロゲン」とは、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを意味する。
【０１９４】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、保護基の使用を必要とし得る。保護基の方法論は、当業者に周知である（例えば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｇｒｅｅｎ，Ｔ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ，１９９９を参照のこと）。簡潔に言えば、本発明の文脈内の保護基は、官能基の望ましくない反応性を減少させるか、または排除する任意の基である。保護基を、官能基に付加してある特定の反応中の反応性をマスクし、その後、除去して元の官能基を現すことができる。いくつかの実施形態において、「アルコール保護基」が使用される。「アルコール保護基」は、アルコール官能基の望ましくない反応性を減少させるか、または排除する任意の基である。保護基を、当技術分野で周知の手法を用いて付加および除去することができる。
【０１９５】
式Ａの合成
一実施形態において、本発明の核酸脂質粒子は、式Ａのカチオン性脂質を用いて製剤化され、ＸＴＣは、式Ａのカチオン性脂質であり、
【化２】
2013545736.tif 000006
式中、Ｒ１およびＲ２は独立して、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、それぞれ、任意で置換されてもよく、Ｒ３およびＲ４は独立して、低級アルキルであるか、またはＲ３およびＲ４は、一緒になって、任意で置換される複素環を形成することができる。
【０１９６】
概して、上の式Ａの脂質を、以下の反応スキーム１または２によって作製することができ、すべての置換基は、別途示されない限り、上で定義される通りである。
【化３】
2013545736.tif 000007
【０１９７】
脂質Ａ（式中、Ｒ１およびＲ２は独立して、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、それぞれ、任意で置換されてもよく、Ｒ３およびＲ４は独立して、低級アルキルであるか、またはＲ３およびＲ４は、一緒になって、任意で置換される複素環を形成することができる）を、スキーム１に従って調製することができる。ケトン１および臭化物２を購入するか、または当業者に既知の方法に従って調製することができる。１と２の反応により、ケタール３が得られる。ケタール３とアミン４との処理により、式Ａの脂質が得られる。式Ａの脂質を、式５の有機塩を有する対応するアンモニウム塩に変換することができ、式中、Ｘは、ハロゲン、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩等から選択されるアニオン性対イオンである。
【化４】
2013545736.tif 000008
【０１９８】
あるいは、ケトン１の出発物質を、スキーム２に従って調製することができる。グリニャール試薬６およびシアン化物７を購入するか、または当業者に既知の方法に従って調製することができる。６と７の反応により、ケトン１が得られる。ケトン１の式Ａの対応する脂質への変換は、スキーム１に記載される通りである。
【０１９９】
ＭＣ３の合成
ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ（すなわち、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート）の調製は、以下の通りであった。ジクロロメタン（５ｍＬ）中の（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−オール（０．５３ｇ）、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノブチル酸塩酸塩（０．５１ｇ）、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（０．６１ｇ）、および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（０．５３ｇ）の溶液を、室温で一晩撹拌した。溶液を希塩酸で、続いて、希重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。有機画分を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、溶媒をロータリーエバポレータ上で除去した。残渣を、１〜５％のメタノール／ジクロロメタン溶出勾配を用いて、シリカゲルカラム（２０ｇ）に通した。精製生成物を含有する画分を合わせ、溶媒を除去し、無色の油（０．５４ｇ）を得た。
【０２００】
ＡＬＮＹ−１００の合成
ケタール５１９［ＡＬＮＹ−１００］の合成を、以下のスキーム３を用いて行った。
【化５】
2013545736.tif 000009
スキーム３
【０２０１】
５１５の合成：
２口ＲＢＦ（１Ｌ）中の２００ｍＬの無水ＴＨＦ中のＬｉＡｌＨ４（３．７４ｇ、０．０９８５２ｍｏｌ）の撹拌懸濁液に、７０ｍＬのＴＨＦ中の５１４の溶液（１０ｇ、０．０４９２６ｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で、０℃で緩徐に添加した。添加が完了した後、反応混合物を室温まで加温し、その後、４時間加熱還流した。反応の進行をＴＬＣで監視した。（ＴＬＣによる）反応が完了した後、混合物を０℃まで冷却し、飽和Ｎａ２ＳＯ４溶液を慎重に添加して反応停止処理した。反応混合物を室温で４時間撹拌し、濾去した。残渣をＴＨＦで十分に洗浄した。濾液および洗浄液を混合し、４００ｍＬのジオキサンおよび２６ｍＬの濃縮ＨＣｌで希釈し、室温で２０分間撹拌した。揮発物質を真空下で揮散させて、白色の固体として５１５の塩酸塩を得た。収量：７．１２ｇ、１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ、４００ＭＨｚ）：δ＝９．３４（広域、２Ｈ）、５．６８（ｓ、２Ｈ）、３．７４（ｍ、１Ｈ）、２．６６〜２．６０（ｍ、２Ｈ）、２．５０〜２．４５（ｍ、５Ｈ）。
【０２０２】
５１６の合成：
２５０ｍＬの２口ＲＢＦ中の１００ｍＬの乾燥ＤＣＭ中の化合物５１５の撹拌溶液に、ＮＥｔ３（３７．２ｍＬ、０．２６６９ｍｏｌ）を添加し、窒素雰囲気下で０℃まで冷却した。５０ｍＬの乾燥ＤＣＭ中のＮ−（ベンジルオキシ−カルボニルオキシ）−スクシンイミド（２０ｇ、０．０８００７ｍｏｌ）を緩徐に添加した後、反応混合物を室温まで加温させた。（ＴＬＣによる２〜３時間の）反応が完了した後、混合物を１ＮのＨＣｌ溶液（１×１００ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１×５０ｍＬ）で順次洗浄した。その後、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を蒸発させて、粗物質を得て、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、粘着性の塊として５１６を得た。収量：１１ｇ（８９％）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ＝７．３６〜７．２７（ｍ、５Ｈ）、５．６９（ｓ、２Ｈ）、５．１２（ｓ、２Ｈ）、４．９６（ｂｒ．、１Ｈ）、２．７４（ｓ、３Ｈ）、２．６０（ｍ、２Ｈ）、２．３０〜２．２５（ｍ、２Ｈ）。ＬＣ−ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］−２３２．３（９６．９４％）。
【０２０３】
５１７Ａおよび５１７Ｂの合成：
シクロペンテン５１６（５ｇ、０．０２１６４ｍｏｌ）を、５００ｍＬの１口ＲＢＦ中の２２０ｍＬのアセトンおよび水（１０：１）の溶液中に溶解し、これに、Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド（７．６ｇ、０．０６４９２ｍｏｌ）、続いて、４．２ｍＬのｔｅｒｔ−ブタノール中の７．６％のＯｓＯ４の溶液（０．２７５ｇ、０．００１０８ｍｏｌ）を室温で添加した。反応が完了した後（約３時間）、混合物に固体Ｎａ２ＳＯ３を添加して反応停止処理し、結果として得られた混合物を室温で１．５時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭ（３００ｍＬ）で希釈し、水（２×１００ｍＬ）、続いて、飽和ＮａＨＣＯ３（１×５０ｍＬ）溶液、水（１×３０ｍＬ）、最後にブライン（１×５０ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を真空中で除去した。粗物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、ジアステレオマーの混合物を得て、これを分取ＨＰＬＣで分離した。収量：−６ｇ（粗）
【０２０４】
５１７Ａ−ピーク−１（白色の固体）、５．１３ｇ（９６％）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ、４００ＭＨｚ）：δ＝７．３９〜７．３１（ｍ、５Ｈ）、５．０４（ｓ、２Ｈ）、４．７８〜４．７３（ｍ、１Ｈ）、４．４８〜４．４７（ｄ、２Ｈ）、３．９４〜３．９３（ｍ、２Ｈ）、２．７１（ｓ、３Ｈ）、１．７２〜１．６７（ｍ、４Ｈ）。ＬＣ−ＭＳ−［Ｍ＋Ｈ］−２６６．３、［Ｍ＋ＮＨ４＋］−２８３．５存在、ＨＰＬＣ−９７．８６％。Ｘ線により確認された立体化学
【０２０５】
５１８の合成：
化合物５０５の合成について記載される手順と同様の手順を用いて、化合物５１８（１．２ｇ、４１％）を無色の油として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ＝７．３５〜７．３３（ｍ、４Ｈ）、７．３０〜７．２７（ｍ、１Ｈ）、５．３７〜５．２７（ｍ、８Ｈ）、５．１２（ｓ、２Ｈ）、４．７５（ｍ、１Ｈ）、４．５８〜４．５７（ｍ、２Ｈ）、２．７８〜２．７４（ｍ、７Ｈ）、２．０６−２．００（ｍ、８Ｈ）、１．９６〜１．９１（ｍ、２Ｈ）、１．６２（ｍ、４Ｈ）、１．４８（ｍ、２Ｈ）、１．３７〜１．２５（ｂｒ  ｍ、３６Ｈ）、０．８７（ｍ、６Ｈ）。ＨＰＬＣ−９８．６５％。
【０２０６】
化合物５１９の合成の一般的な手順：
ヘキサン（１５ｍＬ）中の化合物５１８（１当量）の溶液を、ＴＨＦ（１Ｍ、２当量）中のＬＡＨの氷冷溶液に、滴加様式で添加した。添加が完了した後、混合物を０．５時間にわたって４０℃で加熱し、その後、氷浴上で再び冷却した。混合物を飽和Ｎａ２ＳＯ４水溶液で慎重に加水分解し、その後、セライトを通して濾過し、油に還元した。カラムクロマトグラフィーが純粋な５１９（１．３ｇ、６８％）をもたらし、これを無色の油として得た。１３Ｃ  ＮＭＲ＝１３０．２、１３０．１（×２）、１２７．９（×３）、１１２．３、７９．３、６４．４、４４．７、３８．３、３５．４、３１．５、２９．９（×２）、２９．７、２９．６（×２）、２９．５（×３）、２９．３（×２）、２７．２（×３）、２５．６、２４．５、２３．３、２２６、１４．１、エレクトロスプレーＭＳ（正）：Ｃ４４Ｈ８０ＮＯ２（Ｍ＋Ｈ）＋に対する分子量、計算値６５４．６、実測値６５４．６．
【０２０７】
核酸脂質粒子の一般的な合成
標準の方法または押出を含まない方法のいずれかによって調製された製剤を、同様の様式で特徴付けることができる。例えば、製剤は、典型的には、目視検査を特徴とする。それらは、凝集体または堆積物を含まない白みがかった半透明の溶液であるはずである。脂質ナノ粒子の粒径および粒径分布を、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ（ＵＳＡ）を用いて、光散乱により測定することができる。粒子は、４０〜１００ｎｍ等の約２０〜３００ｎｍの粒径であるべきである。粒径分布は、単峰型であるべきである。製剤中、ならびに捕捉された画分中の総ｄｓＲＮＡ濃度は、色素排除アッセイを用いて推定される。製剤化されたｄｓＲＮＡの試料を、製剤破壊界面活性剤、例えば、０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の存在下または不在下で、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（分子プローブ）等のＲＮＡ結合染料とともにインキュベートすることができる。製剤中の総ｄｓＲＮＡを、標準曲線と比較して、界面活性剤を含有する試料からのシグナルによって決定することができる。捕捉された画分を、「遊離」ｄｓＲＮＡ含有量（界面活性剤の不在下におけるシグナルによって測定される）を総ｄｓＲＮＡ含有量から差し引くことによって決定する。捕捉されたｄｓＲＮＡのパーセントは、典型的には、８５％超である。ＳＮＡＬＰ製剤について、粒径は、少なくとも３０ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１１０ｎｍ、および少なくとも１２０ｎｍである。好適な範囲は、典型的には、少なくとも約５０ｎｍ〜少なくとも約１１０ｎｍ、少なくとも約６０ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、または少なくとも約８０ｎｍ〜少なくとも約９０ｎｍである。
【０２０８】
他の製剤
経口投与用の組成物および製剤には、粉末もしくは顆粒、微粒子、ナノ粒子、水もしくは非水性媒体中の懸濁液もしくは溶液、カプセル、ゲルカプセル、サシェット、錠剤、または小型錠剤が含まれる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が望ましくあり得る。いくつかの実施形態において、経口製剤とは、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡが、１つ以上の浸透促進剤、界面活性剤、およびキレート化剤と併用して投与されるものである。好適な界面活性剤には、脂肪酸および／またはそのエステルもしくは塩、胆汁酸および／またはその塩が含まれる。好適な胆汁酸／塩には、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸（ｇｌｕｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、グリコール酸（ｇｌｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム、ならびにグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが含まれる。好適な脂肪酸には、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプリン酸、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはそれらのモノグリセリド、ジグリセリド、もしくは薬学的に許容される塩（例えば、ナトリウム）が含まれる。いくつかの実施形態において、浸透促進剤の組み合わせ、例えば、胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩が使用される。１つの例示的な組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸、およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。浸透促進剤にはさらに、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが含まれる。本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡを、噴霧乾燥粒子を含む顆粒形態で経口送達するか、または微小粒子もしくはナノ粒子を形成するように複合することができる。ｄｓＲＮＡ複合剤には、ポリ−アミノ酸類；ポリイミン類；ポリアクリレート類；ポリアルキルアクリレート類、ポリオキセタン類、ポリアルキルシアノアクリレート類；カチオン化ゼラチン類、アルブミン類、デンプン類、アクリレート類、ポリエチレングリコール類（ＰＥＧ）、およびデンプン類；ポリアルキルシアノアクリレート類；ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン類、ポルラン（ｐｏｌｌｕｌａｎ）類、セルロース類、およびデンプン類が含まれる。好適な複合剤には、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アク��ルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミンおよびＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギン酸塩、ならびにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。  ｄｓＲＮＡの経口製剤およびそれらの調製は、米国特許第６，８８７，９０６号、米国公開第２００３００２７７８０号、および米国特許第６，７４７，０１４号に詳細に記載されており、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０９】
非経口、実質内（脳内への）、くも膜下腔内、脳室内、または肝内投与用の組成物および製剤には、滅菌水溶液が含まれてもよく、緩衝液、希釈剤、ならびに浸透促進剤、担体化合物、および他の薬学的に許容される担体もしくは賦形剤を含むが、これらに限定されない他の好適な添加剤も含有し得る。
【０２１０】
本発明の医薬組成物には、溶液、エマルジョン、およびリポソームを含有する製剤が含まれるが、これらに限定されない。これらの組成物を、予め形成された液体、自己乳化型固体、および自己乳化型半固体を含むが、これらに限定されない様々な構成成分から生成することができる。肝癌等の肝障害の治療時に肝臓を標的とする製剤が特に好ましい。
【０２１１】
好都合に単位剤形で提示することができる本発明の薬学的製剤を、製薬業界で周知の従来の技法に従って調製することができる。そのような技法には、活性成分を医薬担体（単数もしくは複数）または賦形剤（単数もしくは複数）と合わせるステップが含まれる。概して、この製剤は、活性成分を液体担体もしくは微粉化した固体担体、またはそれら両方と均一かつ密接に合わせ、その後、必要に応じて、その生成物を成形することによって調製される。
【０２１２】
本発明の組成物を、限定されないが、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、軟質ゲル、坐薬、および浣腸剤等であるが、これらに限定されない多くの可能な剤形のうちのいずれかに製剤化することができる。本発明の組成物を、水媒体、非水媒体、または混合媒体中の懸濁液として製剤化することもできる。水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む懸濁液の粘度を増加させる物質をさらに含有することができる。懸濁液は、安定剤を含有することもできる。
【０２１３】
さらなる製剤
エマルジョン
本発明の組成物を、エマルジョンとして調製および製剤化することができる。エマルジョンは、典型的には、通常直径０．１μｍを超える液滴の形態で別の液体中に分散した１つの液体の多相系である（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９、Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２４５、Ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  ２，ｐ．３３５、Ｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．３０１を参照のこと）。エマルジョンは、多くの場合、相互に密接に混合され、かつ分散する２つの非混合性液相を含む二相系である。概して、エマルジョンは、油中水（ｗ／ｏ）または水中油（ｏ／ｗ）のいずれかの種類であり得る。水相がバルク油相中で微細に分割され、微小液滴として分散する場合、結果として得られる組成物は、油中水（ｗ／ｏ）型エマルジョンと呼ばれる。あるいは、油相がバルク水相中で微細に分割され、微小液滴として分散する場合、結果として得られる組成物は、水中油（ｏ／ｗ）型エマルジョンと呼ばれる。エマルジョンは、分散相に加えて、さらなる構成成分と、分離相として水相、油相、またはそれ自体のいずれかに溶液として存在し得る活性薬物とを含有し得る。乳化剤、安定剤、染料、および抗酸化剤等の薬学的賦形剤も、必要に応じて、エマルジョン中に存在してもよい。薬学的エマルジョンは、例えば、油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）および水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）型エマルジョンの場合等、２つより多い相から成る多重エマルジョンでもあり得る。このような複合製剤は、多くの場合、単純な二元エマルジョンが提供しないある特定の利点を提供する。ｏ／ｗ型エマルジョンの個々の油滴が小さな水滴を囲む多重エマルジョンは、ｗ／ｏ／ｗ型エマルジョンを構成する。同様に、油性の連続相中で安定化された水の小球で囲まれた油滴の系は、ｏ／ｗ／ｏ型エマルジョンを提供する。
【０２１４】
エマルジョンは、熱力学的安定性をほとんどまたは全く特徴としない。多くの場合、エマルジョンの分散相または不連続相は、外相または連続相中に十分に分散し、乳化剤の手段または製剤の粘度によりこの形態が維持される。エマルジョンの相のいずれかは、エマルジョン型軟膏基剤およびクリームと同様に、半固体または固体であり得る。エマルジョンを安定化する他の手段は、エマルジョンのいずれかの相に組み込むことができる乳化剤の使用を必要とする。乳化剤を、広範に、４つのカテゴリー、すなわち、合成界面活性剤、天然に存在する乳化剤、吸収塩基、および微細分散固体に分類することができる（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９を参照のこと）。
【０２１５】
表面活性剤としても既知の合成界面活性剤は、エマルジョン製剤における広範な適用性が見出されており、文献において概説されている（例えば、Ａｎｓｅｌｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ、Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２８５、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９を参照のこと）。界面活性剤は、典型的には、両親媒性であり、親水性部分および疎水性部分を含む。界面活性剤の親水性と疎水性との比率は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と呼ばれており、製剤を調製する際の界面活性剤の分類および選択における貴重なツールである。界面活性剤は、親水基の性質（非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性）に基づいて、異なるクラスに分類することができる（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２８５を参照のこと）。
【０２１６】
エマルジョン製剤に使用される天然に存在する乳化剤には、ラノリン、蜜ろう、フォスファチド類、レシチン、およびアカシアが含まれる。吸収基剤は、それらが水を吸収してｗ／ｏ型エマルジョンを形成するが、無水ラノリンおよび親水性ペトロラタム等のそれらの半固体の稠度を維持することができるような親水性の性質を有する。微細に分割された固体も、特に界面活性剤と組み合わせて、かつ粘性の調製物中で、良好な乳化剤として使用されている。これらには、極性の無機固体、例えば、重金属水酸化物、非膨張性粘土、例えば、ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド性ケイ酸アルミニウムおよびコロイド性ケイ酸アルミニウムマグネシウム、顔料、ならびに非極性固体、例えば、炭素もしくはトリステアリン酸グリセリルが含まれる。
【０２１７】
多種多様の非乳化物質もエマルジョン製剤に含まれ、エマルジョンの特性に寄与する。これらには、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、湿潤剤、親水性コロイド、防腐剤、および抗酸化剤が含まれる（Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．３３５、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９）。
【０２１８】
親水性コロイドまたは親水コロイドには、多糖類（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラゲニン、グアーガム、カラヤガム、およびトラガカント）、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、ならびに合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）等の天然に存在するガムおよび合成ポリマーが含まれる。これらは、水中で分散または膨張して、分散相の液滴の周囲に強力な界面薄膜を形成し、かつ外相の粘度を増加させることによってエマルジョンを安定化させるコロイド溶液を形成する。
【０２１９】
エマルジョンが、多くの場合、微生物の成長を容易に支援し得る炭水化物、タンパク質、ステロール、およびフォスファチド等のいくつかの成分を含有するため、これらの製剤には、多くの場合、防腐剤が組み込まれる。エマルジョン製剤に含まれる一般的に使用される防腐剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、第四アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル、およびホウ酸が含まれる。製剤の劣化を阻止するために、抗酸化剤もエマルジョン製剤に一般的に添加される。使用される抗酸化剤は、フリーラジカルスカベンジャー、例えば、トコフェロール、アルキルガレート、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、または還元剤、例えば、アスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウム、ならびに抗酸化剤シナージスト、例えば、クエン酸、酒石酸、およびレシチンであり得る。
【０２２０】
皮膚、経口、および非経口経路を介するエマルジョン製剤の適用、ならびにそれらを製造するための方法は、文献に概説されている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９を参照のこと）。経口送達用のエマルジョン製剤は、製剤化の容易さ、ならびに吸収および生物学的利用能の観点からの有効性のため、非常に広範に使用されている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，およびＡｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ、Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２４５、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９を参照のこと）。鉱油ベースの緩下剤、油溶性ビタミン、および高脂肪栄養調製物が、ｏ／ｗ型エマルジョンとして一般的に経口投与されている物質である。
【０２２１】
本発明の一実施形態において、ｉＲＮＡおよび核酸の組成物が、マイクロエマルジョンとして製剤化される。マイクロエマルジョンを、水、油、および単一の光学的に等方性および熱力学的に安定した液体溶液である両親媒性物質の系として定義することができる（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ、Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２４５を参照のこと）。典型的には、マイクロエマルジョンは、最初に油を界面活性剤水溶液中に分散させ、その後、十分な量の第４の構成成分、概して、中間鎖長のアルコールを添加することによって調製されて、透明な系を形成する系である。  したがって、マイクロエマルジョンは、表面活性分子の界面薄膜によって安定化される２つの非混合性液体の熱力学的に安定した等方的に透明な分散物として記載されている（Ｌｅｕｎｇ  ａｎｄ  Ｓｈａｈ，ｉｎ：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．，Ｅｄ．，１９８９，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ１８５−２１５）。マイクロエマルジョンは、一般的には、油、水、界面活性剤、共界面活性剤、および電解質を含む３〜５個の構成成分を組み合わせて調製される。マイクロエマルジョンが油中水（ｗ／ｏ）型または水中油（ｏ／ｗ）型であるかは、使用される油および界面活性剤の特性、ならびに界面活性剤分子の極性頭部および炭化水素尾部の構造および幾何学的パッキングに依存する（Ｓｃｈｏｔｔ，ｉｎ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．２７１）。
【０２２２】
相図を利用する現象論的手法が広範に研究されており、マイクロエマルジョンの製剤化方法についての幅広い知識を当業者に提供している（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ、Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２４５、Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．３３５を参照のこと）。従来のエマルジョンと比較して、マイクロエマルジョンは、自然発生的に形成される熱力学的に安定した液滴の製剤において、非水溶性薬物を可溶化するといった利点を提示する。
【０２２３】
マイクロエマルジョンの調製に使用される界面活性剤には、単独で、または共界面活性剤と組み合わせて、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセクイオレエート（ｓｅｑｕｉｏｌｅａｔｅ）（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレエート（ＤＡＯ７５０）が含まれるが、これらに限定されない。共界面活性剤は、通常、エタノール、１−プロパノール、および１−ブタノール等の短鎖アルコールであるが、界面活性剤の薄膜に浸透し、その結果、界面活性剤分子間に生成される空所に起因して不規則な薄膜を形成することによって界面流動性を増加させる役割を果たす。しかしながら、マイクロエマルジョンは、共界面活性剤を使用することなく調製することができ、アルコールを含まない自己乳化型マイクロエマルジョン系が当技術分野で既知である。水相は、典型的には、水、薬物の水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコールの誘導体であり得るが、これらに限定されない。油相には、Ｃａｐｔｅｘ３００、Ｃａｐｔｅｘ３５５、Ｃａｐｍｕｌ  ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）のモノ、ジ、およびトリ−グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８〜Ｃ１０グリセリド、植物油、ならびにシリコーン油等の物質が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０２２４】
マイクロエマルジョンは、薬物の可溶化および薬物吸収の亢進の観点から特に興味深いものである。脂質ベースのマイクロエマルジョン（ｏ／ｗ型およびｗ／ｏ型の両方）がペプチドを含む薬物の経口生物学的利用能を亢進すると提議されている（例えば、米国特許第６，１９１，１０５号、同第７，０６３，８６０号、同第７，０７０，８０２号、同第７，１５７，０９９号、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５−１３９０、Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９３，１３，２０５を参照のこと）。マイクロエマルジョンは、改善された薬物可溶化、酵素加水分解からの薬物保護、界面活性剤が誘発する膜流動性および浸透性の変化による薬物吸収の潜在的亢進、調製の簡便性、固体剤形を上回る経口投与の簡便性、改善された臨床的有効性、ならびに低下した毒性の利点を提供する（例えば、米国特許第６，１９１，１０５号、同第７，０６３，８６０号、同第７，０７０，８０２号、同第７，１５７，０９９号、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５、Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５，１３８−１４３を参照のこと）。多くの場合、マイクロエマルジョンは、それらの構成成分が周囲温度で合わさるときに自然発生的に生じ得る。これは、熱不安定性の薬物、ペプチド、またはｉＲＮＡを製剤化するときに特に有利であり得る。マイクロエマルジョンは、化粧用途および薬学的用途の両方における活性構成成分の経皮送達においても効果的である。本発明のマイクロエマルジョン組成物および製剤が、消化管からのｉＲＮＡおよび核酸のさらなる体内吸収を促進し、かつｉＲＮＡおよび核酸の局所的な細胞取り込みを改善することが期待されている。
【０２２５】
本発明のマイクロエマルジョンは、製剤の特性を改善し、本発明のｉＲＮＡおよび核酸の吸収を亢進するために、モノステアリン酸ソルビタン（Ｇｒｉｌｌ  ３）、Ｌａｂｒａｓｏｌ、および浸透促進剤等のさらなる構成成分および添加剤も含有し得る。本発明のマイクロエマルジョンで使用される浸透促進剤を、５つの広範なカテゴリー、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、および非キレート非界面活性剤のうちの１つに分類することができる（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。これらのクラスはそれぞれ、上に記載されている。
【０２２６】
浸透促進剤
一実施形態において、本発明は、動物の皮膚への核酸、特にｉＲＮＡの効率的な送達をもたらすために、様々な浸透促進剤を採用する。ほとんどの薬物は、イオン化形態および非イオン化形態の両方で溶液中に存在する。しかしながら、通常、脂溶性または親油性の薬物のみが、容易に細胞膜を横断する。横断される膜が浸透促進剤で処理されている場合、非親油性薬物でさえも細胞膜を横断し得ることが見出されている。細胞膜にわたる非親油性薬物の拡散を支援することに加えて、浸透促進剤は、親油性薬物の透過性も亢進する。
【０２２７】
浸透促進剤を、５つの広範のカテゴリー、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、および非キレート非界面活性剤のうちの１つに分類することができる（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照のこと）。浸透促進剤の前述のクラスはそれぞれ、以下でより詳細に記載されている。
【０２２８】
界面活性剤：本発明に関連して、界面活性剤（または「表面活性剤」）は、水溶液中に溶解されると溶液の表面張力または水溶液と別の液体との間の界面張力を低減させ、粘膜を通るｉＲＮＡの吸収が亢進されるという結果をもたらす化学物質である。胆汁塩および脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤には、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル）（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照のこと）、およびＦＣ−４３等のペルフルオロ化合物エマルジョン（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２）が含まれる。
【０２２９】
脂肪酸：浸透促進剤として作用する様々な脂肪酸およびそれらの誘導体には、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ１−２０アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピルおよびｔ−ブチル）、ならびにそれらのモノグリセリドおよびジグリセリド（すなわち、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、カプリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、リノール酸塩等）が含まれる（例えば、Ｔｏｕｉｔｏｕ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３、Ｅｌ  Ｈａｒｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１−６５４を参照のこと）。
【０２３０】
胆汁塩：胆汁の生理学的役割には、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が含まれる（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２、Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３８  ｉｎ：Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ  Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６，ｐｐ．９３４−９３５を参照のこと）。様々な天然胆汁塩およびそれらの合成誘導体は、浸透促進剤として作用する。したがって、「胆汁塩」という用語には、天然に存在する胆汁の構成成分のうちのいずれか、ならびにそれらの合成誘導体のうちのいずれかが含まれる。好適な胆汁塩には、例えば、コール酸（またはその薬学的に許容できるナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリコール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、およびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が含まれる（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ  ９２、Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３９  Ｉｎ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０，ｐａｇｅｓ  ７８２−７８３、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３、Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３，２５、Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９，５７９−５８３を参照のこと）。
【０２３１】
キレート剤：本発明に関連して使用されるキレート剤を、金属イオンと複合体を形成することによって金属イオンを溶液から除去し、粘膜を通るｉＲＮＡ吸収が亢進されるという結果をもたらす化合物と定義することができる。本発明での浸透促進剤としての使用に関して、ほとんどの特徴付けられたＤＮＡヌクレアーゼが触媒作用に二価金属イオンを必要とし、それ故に、キレート剤によって阻害されるため、キレート剤は、ＤＮａｓｅ阻害剤としての機能も果たすさらなる利点を有する（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９３，６１８，３１５−３３９）。好適なキレート剤には、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチル酸塩、およびホモバニリン酸塩）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９、ならびにβジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）が含まれるが、これらに限定されない（例えば、Ｋａｔｄａｒｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ  ９２、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３、Ｂｕｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３−５１を参照のこと）。
【０２３２】
非キレート非界面活性剤：本明細書で使用される非キレート非界面活性剤浸透促進化合物を、キレート剤または界面活性剤としてわずかな活性しか示さないが、それにもかかわらず、消化器粘膜を通るｉＲＮＡの吸収を亢進する化合物と定義することができる（例えば、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９０、７、１−３３を参照のこと）。このクラスの浸透促進剤には、例えば、不飽和環状尿素、１−アルキル−および１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ  ９２）、ならびにジクロフェナクナトリウム、インドメタシン、およびフェニルブタゾン等の非ステロイド性抗炎症薬（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１−６２６）が含まれる。
【０２３３】
細胞レベルでｉＲＮＡの取り込みを亢進させる作用物質を、本発明の医薬組成物および他の組成物に添加することもできる。例えば、リポフェクチン（Ｊｕｎｉｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ、米国特許第５，７０５，１８８号）等のカチオン性脂質、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリリジン（Ｌｏｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＣＴ出願第ＷＯ９７／３０７３１号）等のポリカチオン性分子も、ｄｓＲＮＡの細胞取り込みを亢進することが知られている。市販のトランスフェクト試薬の例には、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ），Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００ＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｐｔｉｆｅｃｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  Ｑ２トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ；Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＴＡＰリポソームトランスフェクション試薬（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＳＰＥＲリポソームトランスフェクション試薬（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、またはＦｕｇｅｎｅ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）−２０試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）−５０試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）（ＯＺ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＥｃｏＴｒａｎｓｆｅｃｔ（ＯＺ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＴｒａｎｓＰａｓｓａ  Ｄ１トランスフェクション試薬（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＬｙｏＶｅｃ（商標）／ＬｉｐｏＧｅｎ（商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＰｅｒＦｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＮｅｕｒｏＰＯＲＴＥＲトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲトランスフェクション試薬（Ｇｅｎ���ａｎｔｉｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ  ２トランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、サイトフェクチントランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＢａｃｕｌｏＰＯＲＴＥＲトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＴｒｏｇａｎＰＯＲＴＥＲ（商標）トランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＲｉｂｏＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＰｌａｓＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＵｎｉＦＥＣＴＯＲ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＳｕｒｅＦＥＣＴＯＲ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、またはＨｉＦｅｃｔ（商標）（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）等が挙げられる。
【０２３４】
他の作用物質を利用して、エチレングリコールおよびプロピレングリコール等のグリコール、２−ピロール等のピロール、アゾン、ならびにリモネンおよびメントン等のテルペンを含む投与される核酸の浸透を亢進させることができる。
【０２３５】
担体
本発明のある特定の組成物は、担体化合物も製剤中に組み込む。本明細書で使用される「担体化合物」または「担体」は、不活性（すなわち、それ自体は生物学的活性を有しない）であるが、例えば、生物学的に活性な核酸を分解するか、または循環からそれを除去することを促進することによって、生物学的活性を有する核酸の生物学的利用能を低下させるインビボプロセスにより核酸と認識される核酸もしくはその類似体を指し得る。核酸と担体化合物の同時投与（典型的には、後者の物質を過剰に有する）は、恐らく共通の受容体への担体化合物と核酸との間の競合により、肝臓、腎臓、または他の循環外貯蔵所で回収される核酸の量の著しい減少をもたらし得る。例えば、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジン酸、または４−アセトアミド−４’イソチオシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸と同時投与されるとき、部分的にホスホロチオエートであるｄｓＲＮＡの肝組織における回収を低減させることができる（Ｍｉｙａｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＤｓＲＮＡ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５，５，１１５−１２１、Ｔａｋａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ＤｓＲＮＡ  ＆  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．，１９９６，６，１７７−１８３）。
【０２３６】
賦形剤
担体化合物とは対照的に、「医薬担体」または「賦形剤」は、１つ以上の核酸を動物に送達するための薬学的に許容される溶媒、懸濁剤、または任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は、液体または固体であってもよく、核酸および所与の医薬組成物の他の構成成分と組み合わされるときに、所望の用量、稠度等を提供するように、計画された投与様式を念頭において選択される。典型的な医薬担体には、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン（ｍａｉｚｅ  ｓｔａｒｃｈ）、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース等）、充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖類、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリル酸塩、またはリン酸水素カルシウム等）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、滑石、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、水素化植物油、トウモロコシデンプン（ｃｏｒｎ  ｓｔａｒｔｃｈ）、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等）、崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム等）、ならびに湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２３７】
核酸と有害に反応しない経口（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）投与に好適な薬学的に許容される有機または無機賦形剤を使用して、本発明の組成物を製剤化することもできる。好適な薬学的に許容される担体には、水、塩類溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が含まれるが、これらに限定されない。
【０２３８】
核酸の局所投与用の製剤は、滅菌および非滅菌水溶液、アルコール等の一般的な溶媒中の非水溶液、または液体もしくは固体油基剤中の核酸の溶液を含み得る。この溶液は、緩衝液、希釈剤、および他の好適な添加剤も含有し得る。核酸と有害に反応しない経口（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）投与に好適な薬学的に許容される有機または無機賦形剤を使用することができる。
【０２３９】
好適な薬学的に許容される賦形剤には、水、塩類溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４０】
他の構成成分
本発明の組成物は、その技術分野で確立された使用レベルの通常医薬組成物中に見られる他の補助成分をさらに含み得る。したがって、例えば、この組成物は、例えば、鎮痒薬、収斂薬、局所麻酔薬、もしくは抗炎症薬等の適合性の薬学的に活性な物質をさらに含有し得るか、または、染料、香味剤、防腐剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、および安定剤等の本発明の組成物の様々な剤形を物理的に製剤化するのに有用な物質をさらに含有し得る。しかしながら、そのような物質は、添加されるとき、本発明の組成物の構成成分の生物活性を過度に妨害すべきではない。製剤を滅菌し、所望の場合、その製剤の核酸（複数を含む）と有害に相互作用しない補助剤、例えば、滑沢剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液、着色剤、香味料、および／または芳香族物質等と混合することができる。
【０２４１】
水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む懸濁液の粘度を増加させる物質を含有し得る。懸濁液は、安定剤を含有することもできる。
【０２４２】
いくつかの実施形態において、本発明で取り上げられる医薬組成物は、（ａ）１つ以上のｉＲＮＡ化合物および（ｂ）非ＲＮＡｉ機序によって機能する１つ以上の生物学的作用物質を含む。そのような生物学的作用物質の例には、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、もしくはＢ７−Ｈ１（ＣＤ８０）のうちの１つ以上（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、もしくはＢ７−Ｈ１に対するモノクローナル抗体）、または１つ以上の組み換えサイトカイン（例えば、ＩＬ６、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ）を標的とする生物学的作用物質が挙げられる。
【０２４３】
そのような化合物の毒性および治療有効性を、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）を決定するために、細胞培養または実験動物における標準の薬学的手順により決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数を呈する化合物が好ましい。
【０２４４】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータを、ヒトに用いる投与量範囲の処方に使用することができる。本発明で取り上げられる組成物の投与量は、概して、毒性をほとんどまたは全く有しないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、採用される剤形および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変化し得る。本発明で取り上げられる方法において使用されるいずれの化合物においても、治療的に有効な用量を、細胞培養アッセイから最初に推定することができる。細胞培養において決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の半最大阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む、化合物、または適切な場合には、（例えば、減少したポリペプチドの濃度を得る）標的配列のポリペプチド産物の循環血漿濃度範囲を得るために、用量を動物モデルにおいて製剤化することができる。そのような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中レベルを、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【０２４５】
上述のそれらの投与に加えて、本発明で取り上げられるｓｉＲＮＡを、ＰＣＳＫ９発現によって媒介される病理学的プロセスの治療に効果的な他の既知の作用物質と組み合わせて投与することができる。いずれの場合においても、投与する医師は、当技術分野で既知であるか、または本明細書に記載される標準の有効性測定値を用いて、観察された結果に基づいて、ｉＲＮＡ投与の量およびタイミングを調整することができる。
【０２４６】
ＰＣＳＫ９を標的とするｓｉＲＮＡを用いた方法
一態様において、本発明は、哺乳動物におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害するためにｓｉＲＮＡの使用を提供する。方法は、標的ＰＣＳＫ９遺伝子の発現が減少するように、哺乳動物に本発明の組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＳＫ９発現は、長期間、例えば、少なくとも１週間、２週間、３週間、もしくは４週間、またはそれ以上の期間減少する。例えば、ある特定の場合において、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現は、本明細書に記載のｓｉＲＮＡの投与により、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％抑圧される。いくつかの実施形態において、ＰＣＳＫ９遺伝子は、ｓｉＲＮＡの投与により、少なくとも約６０％、７０％、または８０％抑圧される。いくつかの実施形態において、ＰＣＳＫ９遺伝子は、二本鎖オリゴヌクレオチドの投与により、少なくとも約８５％、９０％、または９５％抑圧される。
【０２４７】
本明細書に記載の方法および組成物を用いて、ＰＣＳＫ９遺伝子発現を下方制御することにより調節することができる疾患および病態を治療することができる。例えば、本明細書に記載の組成物を用いて、高脂血症、ならびに他の脂質不均衡の形態、例えば、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、および障害に関連する病理学的状態、例えば、心臓疾患、循環器疾患を治療することができる。いくつかの実施形態において、方法は、ヘテロ接合体ＬＤＬＲ遺伝子型を有する患者に有効な量のＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡを投与することを含む。
【０２４８】
したがって、本発明は、ＰＣＳＫ９によって媒介される障害または疾患の治療のためのｓｉＲＮＡの使用にも関する。例えば、ｓｉＲＮＡは、高脂血症の治療に使用される。
【０２４９】
ＰＣＳＫ９遺伝子が減少するといった結果は、好ましくは、哺乳動物の血液、より具体的には、血清中のＬＤＬｃ（低密度リポタンパク質コレステロール）レベルの減少をもたらす。いくつかの実施形態において、ＬＤＬｃレベルは、治療前のレベルと比較して、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、もしくは６０％、またはそれ以上減少する。
【０２５０】
方法は、治療される対象にｓｉＲＮＡを投与することを含む。治療される生物がヒト等の哺乳動物である場合、組成物を、経口経路、または静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、および気道（エアロゾル）投与を含む非経口経路を含むが、それらに限定されない当技術分野で既知の任意の手段を用いて投与することができる。いくつかの実施形態において、組成物は、静脈内への注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）または注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によって投与される。
【０２５１】
方法は、例えば、ＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡのレベルを少なくとも５日間、より好ましくは７、１０、１４、２１、２５、３０、または４０日間低下させるのに十分な用量のｓｉＲＮＡを投与すること、および任意で、ｄｓＲＮＡ第２の単回用量を投与することを含み、第２の単回用量は、第１の単回用量が投与された後に、少なくとも５日間、より好ましくは７、１０、１４、２１、２５、３０、または４０日間投与され、それによって、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を阻害する。
【０２５２】
一実施形態において、ｓｉＲＮＡの用量は、最高で４週間に１回、最高で３週間に１回、最高で２週間に１回、または最高で１週間に１回投与される。別の実施形態において、投与は、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、もしくは６ヶ月間、または１年間、あるいはそれより長い期間継続することができる。
【０２５３】
別の実施形態において、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬｃ）レベルが、７０ｍｇ／ｄＬ、１３０ｍｇ／ｄＬ、１５０ｍｇ／ｄＬ、２００ｍｇ／ｄＬ、３００ｍｇ／ｄＬ、もしくは４００ｍｇ／ｄＬ等を超える所定の最小レベルに到達するか、またはそれを上回る場合に、投与を提供することができる。
【０２５４】
概して、ｓｉＲＮＡは、免疫系を活性化せず、例えば、ＴＮＦ−アルファまたはＩＦＮ−アルファレベル等のサイトカインレベルを増加させない。例えば、本明細書に記載のインビトロＰＢＭＣアッセイ等のアッセイによって測定される場合、ＴＮＦ−アルファまたはＩＦＮ−アルファのレベルの増加は、ＰＣＳＫ９を標的としないｄｓＲＮＡ等の対照ｄｓＲＮＡで処理された対照細胞の３０％、２０％、もしくは１０％未満である。
【０２５５】
例えば、対象に、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、または２．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ等のｓｉＲＮＡの治療量を投与することができる。ｓｉＲＮＡを、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、または２５分間等の期間にわたって、静脈内注入により投与することができる。投与は、例えば、定期的に、例えば、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、またはそれ以上の期間、隔週（すなわち、２週間に１回）で繰り返される。最初の治療レジメン後、治療をより低い頻度で投与してもよい。例えば、３ヶ月間隔週で投与した後、投与を、６ヶ月間、もしくは１年間、またはそれ以上の期間、１ヶ月に１回、繰り返してもよい。ｓｉＲＮＡの投与は、例えば、患者の細胞、組織、血液、尿、または他のコンパートメント中のＰＣＳＫ９レベルを、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％、またはそれ以上低減させることができる。
【０２５６】
ｉＲＮＡの総量を投与する前に、患者に、５％の注入反応等の少量の用量を投与し、アレルギー反応等の副作用、または脂質レベルもしくは血圧の上昇を監視することができる。別の例において、患者を、上昇したサイトカイン（例えば、ＴＮＦ−αまたはＩＮＦ−α）レベル等の好ましくない免疫活性化作用を監視することができる。
【０２５７】
治療もしくは予防効果は、疾患状態の１つ以上のパラメータにおいて統計的に有意な改善が存在するとき、またはそれらが別の方法で予想される症状の悪化もしくは発現の失敗により、明らかである。一例として、疾患の測定可能なパラメータの少なくとも１０％、好ましくは、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％もしくはそれ以上の好ましい変化は、効果的な治療を示し得る。所与のｓｉＲＮＡ薬物またはその薬物の製剤の有効性を、当技術分野で既知の所与の疾患について、実験動物モデルを用いて判断することもできる。実験動物モデルを用いるとき、治療の有効性は、マーカーまたは症状の統計的に有意な減少が観察されるときに明らかである。
【０２５８】
さらなる作用物質
さらなる実施形態において、ｓｉＲＮＡの投与は、さらなる治療薬と組み合わせて投与される。ｓｉＲＮＡおよびさらなる治療薬を、同一の組成物と組み合わせて、例えば、非経口で投与することができるか、あるいはさらなる治療薬を、別個の組成物の一部として、または本明細書に記載の別の方法を用いて投与することができる。
【０２５９】
さらなる治療薬の例には、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化症、または脂質異常症等の脂質障害の治療に既知の作用物質が挙げられる。例えば、本発明で取り上げられるｓｉＲＮＡを、例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤（例えば、スタチン）、フィブラート、胆汁酸捕捉剤、ナイアシン、抗血小板薬、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬（例えば、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．’ｓ  Ｃｏｚａａｒ（登録商標）等のロサルタンカリウム）、アシルＣｏＡコレステロールアセチルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害剤、コレステロール吸収阻害剤、コレステロールエステル輸送タンパク質（ＣＥＴＰ）阻害剤、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＴＰ）阻害剤、コレステロール調節物質、胆汁酸調節物質、ペルオキシソーム増殖活性化受容体（ＰＰＡＲ）作動薬、遺伝子に基づく治療、複合血管保護剤（例えば、ＡｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃｓのＡＧＩ−１０６７）、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤、アスピリンもしくはアスピリン様の化合物、ＩＢＡＴ阻害剤（例えば、ＳｈｉｏｎｏｇｉのＳ−８９２１）、スクアレンシンターゼ阻害剤、または単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）−Ｉ阻害剤とともに投与することができる。例示的なＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤には、アトルバスタチン（ＰｆｉｚｅｒのＬｉｐｉｔｏｒ（登録商標）／Ｔａｈｏｒ／Ｓｏｒｔｉｓ／Ｔｏｒｖａｓｔ／Ｃａｒｄｙｌ）、プラバスタチン（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  ＳｑｕｉｂｂのＰｒａｖａｃｈｏｌ、ＳａｎｋｙｏのＭｅｖａｌｏｔｉｎ／Ｓａｎａｐｒａｖ）、シンバスタチン（ＭｅｒｃｋのＺｏｃｏｒ（登録商標）／Ｓｉｎｖａｃｏｒ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ’ｓ  Ｄｅｎａｎ，Ｂａｎｙｕ’ｓ  Ｌｉｐｏｖａｓ）、ロバスタチン（ＭｅｒｃｋのＭｅｖａｃｏｒ／Ｍｅｖｉｎａｃｏｒ、ＢｅｘａｌのＬｏｖａｓｔａｔｉｎａ，Ｃｅｐａ、Ｓｃｈｗａｒｚ  ＰｈａｒｍａのＬｉｐｏｓｃｌｅｒ）、フルバスタチン（ＮｏｖａｒｔｉｓのＬｅｓｃｏｌ（登録商標）／Ｌｏｃｏｌ／Ｌｏｃｈｏｌ、ＦｕｊｉｓａｗａのＣｒａｎｏｃ、ＳｏｌｖａｙのＤｉｇａｒｉｌ）、セリバスタチン（ＢａｙｅｒのＬｉｐｏｂａｙ／ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅのＢａｙｃｏｌ）、ロスバスタチン（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａのＣｒｅｓｔｏｒ（登録商標））、およびピチバスタチン（イタバスタチン／リシバスタチン）（Ｎｉｓｓａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｋｏｗａ  Ｋｏｇｙｏ，Ｓａｎｋｙｏ，およびＮｏｖａｒｔｉｓ）が挙げられる。例示的なフィブラートには、例えば、ベザフィブラート（例えば、ＲｏｃｈｅのＢｅｆｉｚａｌ（登録商標）／Ｃｅｄｕｒ（登録商標）／Ｂｅｚａｌｉｐ（登録商標）、ＫｉｓｓｅｉのＢｅｚａｔｏｌ）、クロフィブラート（例えば、ＷｙｅｔｈのＡｔｒｏｍｉｄ−Ｓ（登録商標））、フェノフィブラート（例えば、ＦｏｕｒｎｉｅｒのＬｉｐｉｔｉｌ／Ｌｉｐａｎｔｉｌ、ＡｂｂｏｔｔのＴｒｉｃｏｒ（登録商標）、ＴａｋｅｄａのＬｉｐａｎｔｉｌ、ジェネリック薬品）、ゲムフィブロジル（例えば、ＰｆｉｚｅｒのＬｏｐｉｄ／Ｌｉｐｕｒ）およびシプロフィブラート（Ｓａｎｏｆｉ−ＳｙｎｔｈｅｌａｂｏのＭｏｄａｌｉ���（登録商標））が挙げられる。例示的な胆汁酸捕捉剤には、例えば、コレスチラミン（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  ＳｑｕｉｂｂのＱｕｅｓｔｒａｎ（登録商標）およびＱｕｅｓｔｒａｎ  Ｌｉｇｈｔ（商標））、コレスチポール（例えば、ＰｈａｒｍａｃｉａのＣｏｌｅｓｔｉｄ）、ならびにコレセベラン（Ｇｅｎｚｙｍｅ／ＳａｎｋｙｏのＷｅｌＣｈｏｌ（商標））が挙げられる。例示的なナイアシン治療には、例えば、ＡｖｅｎｔｉｓのＮｉｃｏｂｉｄ、Ｕｐｓｈｅｒ−ＳｍｉｔｈのＮｉａｃｏｒ、ＡｖｅｎｔｉｓのＮｉｃｏｌａｒ、およびＳａｎｗａｋａｇａｋｕのＰｅｒｙｃｉｔ等の即時放出製剤が含まれる。ナイアシン持続放出製剤には、例えば、Ｋｏｓ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＮｉａｓｐａｎおよびＵｐｓｈｅｒ−ＳｍｉｔｈのＳＩｏ−Ｎｉａｃｉｎが挙げられる。例示的な抗血小板薬には、例えば、アスピリン（例えば、Ｂａｙｅｒのアスピリン）、クロピドグレル（Ｓａｎｏｆｉ−Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ／Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  ＳｑｕｉｂｂのＰｌａｖｉｘ）、ならびにチクロピジン（例えば、Ｓａｎｏｆｉ−ＳｙｎｔｈｅｌａｂｏのＴｉｃｌｉｄおよびＤａｉｉｃｈｉのＰａｎａｌｄｉｎｅ）が挙げられる。ＰＣＳＫ９を標的とするｄｓＲＮＡとの組み合わせに有用な他のアスピリン様の化合物には、例えば、Ａｓａｃａｒｄ（Ｐｈａｒｍａｃｉａの徐放性アスピリン）およびＰａｍｉｃｏｇｒｅｌ（Ｋａｎｅｂｏ／Ａｎｇｅｌｉｎｉ  Ｒｉｃｅｒｃｈｅ／ＣＥＰＡ）が含まれる。例示的なアンジオテンシン転換酵素阻害剤には、例えば、ラミプリル（例えば、ＡｖｅｎｔｉｓのＡｌｔａｃｅ）およびエナラプリル（例えば、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．のＶａｓｏｔｅｃ）が挙げられる。例示的なアシルＣｏＡコレステロールアセチルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害剤には、例えば、アバシマイブ（Ｐｆｉｚｅｒ）、エフルシマイブ（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  Ｐｉｅｒｒｅ  Ｆａｂｒｅ／Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＣＳ−５０５（ＳａｎｋｙｏおよびＫｙｏｔｏ）、ならびにＳＭＰ−７９７（Ｓｕｍｉｔｏ）が挙げられる。例示的なコレステロール吸収阻害剤には、例えば、エゼチミブ（Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｚｅｔｉａ（登録商標））およびパマケシド（Ｐｆｉｚｅｒ）が挙げられる。例示的なＣＥＴＰ阻害剤には、例えば、トルセトラピブ（ＣＰ−５２９４１４とも呼ばれる、Ｐｆｉｚｅｒ）、ＪＴＴ−７０５（Ｊａｐａｎ  Ｔｏｂａｃｃｏ）、およびＣＥＴｉ−Ｉ（Ａｖａｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）が挙げられる。例示的なミクロソームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＴＰ）阻害剤には、例えば、インプリタピド（Ｂａｙｅｒ）、Ｒ−１０３７５７（Ｊａｎｓｓｅｎ）、およびＣＰ−３４６０８６（Ｐｆｉｚｅｒ）が挙げられる。他の例示的なコレステロール調節物質には、例えば、ＮＯ−１８８６（Ｏｔｓｕｋａ／ＴＡＰ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）、ＣＩ−１０２７（Ｐｆｉｚｅｒ）、およびＷＡＹ−１３５４３３（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ）が挙げられる。例示的な胆汁酸調節物質には、例えば、ＨＢＳ−１０７（Ｈｉｓａｍｉｔｓｕ／Ｂａｎｙｕ）、Ｂｔｇ−５１１（Ｂｒｉｔｉｓ��  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ）、ＢＡＲＩ−１４５３（Ａｖｅｎｔｉｓ）、Ｓ−８９２１（Ｓｈｉｏｎｏｇｉ）、ＳＤ−５６１３（Ｐｆｉｚｅｒ）、およびＡＺＤ−７８０６（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）が挙げられる。例示的なペルオキシソーム増殖活性化受容体（ＰＰＡＲ）アゴニストには、例えば、テサグリタザール（ＡＺ−２４２）（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ネトグリタゾン（ＭＣＣ−５５５）（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ／Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）、ＧＷ−４０９５４４（Ｌｉｇａｎｄ  Ｐｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＧＷ−５０１５１６（Ｌｉｇａｎｄ  Ｐｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＬＹ−９２９（Ｌｉｇａｎｄ  ＰｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓおよびＥｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＬＹ−４６５６０８（Ｌｉｇａｎｄ  ＰｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓおよびＥｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＬＹ−５１８６７４（Ｌｉｇａｎｄ  ＰｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓおよびＥｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、およびＭＫ−７６７（ＭｅｒｃｋおよびＫｙｏｒｉｎ）が挙げられる。例示的な遺伝子に基づく治療には、例えば、ＡｄＧＷＥＧＦ１２１．１０（ＧｅｎＶｅｃ）、ＡｐｏＡｌ（ＵＣＢ  Ｐｈａｒｍａ／Ｇｒｏｕｐｅ  Ｆｏｕｒｎｉｅｒ）、ＥＧ−００４（Ｔｒｉｎａｍ）（Ａｒｋ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、およびＡＴＰ結合カセット輸送体Ａ１（ＡＢＣＡ１）（ＣＶ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ／Ｉｎｃｙｔｅ、Ａｖｅｎｔｉｓ、Ｘｅｎｏｎ）が含まれる。例示的な糖タンパク質Ｉｌｂ／ＩＩＩａ阻害剤には、例えば、ロキシフィバン（ＤＭＰ７５４とも呼ばれる、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、ガントフィバン（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ／Ｙａｍａｎｏｕｃｈｉ）、およびクロマフィバン（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）が挙げられる。例示的なスクワレン合成酵素阻害剤には、例えば、ＢＭＳ−１８８４９４１（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、ＣＰ−２１０１７２（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＣＰ−２９５６９７（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＣＰ−２９４８３８（Ｐｆｉｚｅｒ）、およびＴＡＫ−４７５（Ｔａｋｅｄａ）が挙げられる。例示的なＭＣＰ−Ｉ阻害剤は、例えば、ＲＳ−５０４３９３（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）である。抗アテローム性動脈硬化剤ＢＯ−６５３（Ｃｈｕｇａｉ  Ｐｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、およびニコチン酸誘導体ナイクリン（Ｙａｍａｎｏｕｃｈｉ  Ｐｈａｒｍａｃｕｔｉｃａｌｓ）も、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡと組み合わせた投与に適切である。ＰＣＳＫ９を標的とするｄｓＲＮＡとの投与に好適な例示的な併用療法には、例えば、アドビコール（Ｋｏｓ  Ｐｈａｒｍａｃｕｔｉｃａｌｓのナイアシン／ロバスタチン）、アムロジピン／アトルバスタチン（Ｐｆｉｚｅｒ）、ならびにエゼチミブ／シンバスタチン（例えば、Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ｐｈａｒｍａｃｕｔｉｃａｌｓのバイトリン（登録商標）１０／１０錠、１０／２０錠、１０／４０錠、および１０／８０錠）が含まれる。高コレステロール血症を治療するための薬剤であって、ＰＣＳＫ９を標的とするｄｓＲＮＡと組み���わせて投与するのに好適な薬剤には、例えば、ロバスタチン、ナイアシンアルトプレブ（登録商標）持続放出錠剤（Ａｎｄｒｘ  Ｌａｂｓ）、ロバスタチンカデュエット（登録商標）錠剤（Ｐｆｉｚｅｒ）、ベシル酸アムロジピン、アトルバスタチンカルシウムクレストール（登録商標）錠剤（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ロスバスタチンカルシウムレスコール（登録商標）カプセル（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、フルバスタチンナトリウムレスコール（登録商標）（Ｒｅｌｉａｎｔ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、フルバスタチンナトリウムリピトール（登録商標）錠剤（Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ）、アトルバスタチンカルシウムロフィブラ（登録商標）カプセル（Ｇａｔｅ）、ナイアスパン持続放出錠剤（Ｋｏｓ）、ナイアシンプラバコール錠（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、プラバスタチンナトリウムトリコール（登録商標）錠剤（Ａｂｂｏｔｔ）、フェノフィブラートバイトリン（登録商標）１０／１０錠（Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ｐｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、エゼチミブ、シンバスタチンＷｅｌＣｈｏｌ（商標）錠剤（Ｓａｎｋｙｏ）、塩酸コレセベラムゼチーア（登録商標）錠剤（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）、エゼチミブゼチーア（登録商標）錠剤（Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ｐｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、およびエゼチミブゾコール（登録商標）錠剤（Ｍｅｒｃｋ）が挙げられる。
【０２６０】
一実施形態において、ｓｉＲＮＡは、エゼチミブ／シンバスタチンの組み合わせ（例えば、Ｖｙｔｏｒｉｎ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））と組み合わせて投与される。
【０２６１】
一実施形態において、ｓｉＲＮＡが患者に投与され、その後、さらなる治療薬が患者に投与される（またはその逆も同様）。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡおよびさらなる治療薬は、同時に投与される。
【０２６２】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のｓｉＲＮＡの投与法を、最終使用者、例えば、介護人または対象に指導する方法を取り上げる。方法は、任意で、最終使用者にｓｉＲＮＡの１つ以上の用量を提供すること、および本明細書に記載のレジメンに基づいてｓｉＲＮＡを投与するよう最終使用者を指導し、それによって、最終使用者を指導することを含む。
【０２６３】
患者の特定
一態様において、本発明は、患者がＨＤＬの低下、ＡｐｏＢの低下、または総コレステロールの低下させることなくＬＤＬの低下を必要とするかに基づいて患者を選択することによって、患者を治療する方法を提供する。方法は、例えば、患者のＨＤＬレベルを実質的に低下させることなく、患者のＬＤＬレベルまたはＡｐｏＢレベルを低下させるのに十分な量のｓｉＲＮＡを患者に投与することを含む。
【０２６４】
遺伝性素因は、標的遺伝子関連疾患、例えば、高脂血症の発現に関与する。したがって、家族歴を得ることによって、または例えば、１つ以上遺伝子マーカーまたは変異体をスクリーニングすることによって、ｓｉＲＮＡを必要とする患者を特定することができる。高脂血症に関与する遺伝子の例には、例えば、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）、アポリポタンパク質（ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＢ、ＡｐｏＥ等）、コレステリルエステル輸送タンパク質（ＣＥＴＰ）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、肝性リパーゼ（ＬＩＰＣ）、内皮リパーゼ（ＥＬ）、レシチン：コレステリルアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２６５】
医師、看護師、または家族等の医療サービス提供者は、ｓｉＲＮＡを処方または投与する前に家族歴を得ることができる。加えて、遺伝子型または表現型を決定する試験を行うことができる。例えば、ＰＣＳＫ９  ｄｓＲＮＡが患者に投与される前に、ＰＣＳＫ９遺伝子型および／または表現型を同定するＤＮＡ試験を患者からの試料、例えば、血液試料上で行うことができる。別の実施形態では、関連した遺伝子型および／または表現型、例えば、ＬＤＬＲ遺伝子型を同定する試験が行われる。ＬＤＬＲ遺伝子を有する遺伝的変異体の例を、当技術分野で、例えば、参照により組み込まれる以下の出版物：Ｃｏｓｔａｎｚａ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ，ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，ａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｂｌｏｏｄ  ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｇｅｎｅｒａｌ  ａｄｕｌｔ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ａｍ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．１５；１６１（８）：７１４−２４、Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｉｓｋ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｎｄｉｄａｔｅｇｅｎｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｌｉｐｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｐｅｏｐｌｅ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ．Ｊａｎ；４５（１）：２２−８，Ｅｐｕｂ  ２００７  Ａｕｇ  ３１、およびＢｏｅｓ  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｇｅｎｅｔｉｃ−ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｎｇｅｎｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＨＤＬ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｌｅｖｅｌｓ：Ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｉｎ−ｄｅｐｔｈ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ  ４４：１３６−１６０，Ｅｐｕｂ  ２００８  Ｎｏｖ  １７で見出すことができる。
【０２６６】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての専門用語および科学用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。本発明で取り上げられるｉＲＮＡおよび方法の実践または試験の際に、本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および物質を使用することができるが、好適な方法および物質が以下に記載される。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含めて、本明細書が優先される。加えて、物質、方法、および例は、例示に過ぎず、限定するものではない。
【実施例】
【０２６７】
実施例１．ｉＲＮＡの合成
試薬の供給源
試薬の供給源が本明細書に具体的に提供されない場合、そのような試薬を、分子生物学における用途に対する品質／純度基準で、分子生物学用の試薬の任意の供給業者から入手することができる。
【０２６８】
オリゴヌクレオチドの合成
すべてのオリゴヌクレオチドを、ＡＫＴＡオリゴパイロット合成機上で合成する。標準の保護基、５’−Ｏ−ジメトキシトリチルＮ６−ベンゾイル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−アデノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホルアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−シチジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホルアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−−イソブチル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−グアノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホルアミダイト、および５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−ウリジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホルアミダイト（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有する市販の制御された孔質ガラス固体支持体（ｄＴ−ＣＰＧ、５００Å、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）およびＲＮＡホスホルアミダイトを、オリゴヌクレオチドの合成のために使用した。２’−Ｆホスホルアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−フルオロ−シチジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチル−ホスホルアミダイトおよび５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−フルオロ−ウリジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチル−ホスホルアミダイトを（Ｐｒｏｍｅｇａ）から購入する。ホスホルアミダイトはすべて、１０％のＴＨＦ／ＡＮＣ（ｖ／ｖ）中０．２Ｍの濃度で使用されるグアノシンを除いては、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）中０．２Ｍの濃度で使用する。１６分間のカップリング／再循環時間を用いる。活性化剤は、５−エチルチオテトラゾール（０．７５Ｍ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）であり、ＰＯ−酸化のためにヨウ素／水／ピリジンを使用し、ＰＳ−酸化のために２，６−ルチジン／ＡＣＮ（１：１ｖ／ｖ）中のＰＳ−酸化ＰＡＤＳ（２％）を使用する。
【０２６９】
３’−リガンド結合鎖を、対応するリガンドを含有する固体支持体を用いて合成する。例えば、コレステロール単位の配列への導入を、ヒドロキシプロリノール−コレステロールホスホルアミダイトから行う。コレステロールを、６−アミノヘキサノアート結合を介してトランス−４−ヒドロキシプロリノールに係留させて、ヒドロキシプロリノール−コレステロール部分を得る。５’末端Ｃｙ−３およびＣｙ−５．５（蛍光体）標識ｉＲＮＡを、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入する対応するＱｕａｓａｒ−５７０（Ｃｙ−３）ホスホルアミダイトから合成する。５’末端およびまたは内部位置へのリガンドの結合を、適切に保護されたリガンド−ホスホルアミダイト構成要素を用いて達成する。無水ＣＨ３ＣＮ中の０．１Ｍのホスホルアミダイト溶液を、５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾール活性化剤の存在下で、固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドに、１５分間にわたってカップリングさせる。リン酸塩へのヌクレオチド間亜リン酸塩の酸化を、（１）に報告される標準のヨウ素−水を用いるか、またはｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド／アセトニトリル／水（１０：８７：３）を用いて１０分間の酸化待機時間で、結合したオリゴヌクレオチドを処理することによって実行する。ホスホロチオアートを、ＤＤＴＴ（ＡＭ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入）、ＰＡＤＳ、またはＢｅａｕｃａｇｅ試薬等の硫黄転移試薬を用いた亜リン酸塩のホスホロチオアートへの酸化によって導入する。コレステロールホスホルアミダイトを、屋内で合成し、ジクロロメタン中０．１Ｍの濃度で使用する。コレステロールホスホラミダイトのカップリング時間は１６分間である。
【０２７０】
脱保護Ｉ（核酸塩基脱保護）
合成が完了した後、支持体を１００ｍＬのガラスボトル（ＶＷＲ）に移す。オリゴヌクレオチドを、５５℃で６．５時間の８０ｍＬのエタノールアンモニア混合物［アンモニア：エタノール（３：１）］を用いた塩基およびリン酸基の脱保護と同時に、支持体から切断する。ボトルを氷上で短期間冷却し、その後、エタノールアンモニア混合物を新しい２５０ｍＬボトルに濾過する。ＣＰＧをエタノール／水（１：１ｖ／ｖ）の２×４０ｍＬ部分で洗浄する。その後、混合物の体積を、ロータリーエバポレータを用いて約３０ｍＬに減少させる。その後、混合物をドライアイス上で冷凍し、真空遠心分離装置（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ）を用いて真空下で乾燥させる。
【０２７１】
脱保護ＩＩ（２’−ＴＢＤＭＳ基の除去）
乾燥させた残基を、２６ｍＬのトリエチルアミン、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（ＴＥＡ・３ＨＦ）またはピリジン−ＨＦ、およびＤＭＳＯ（３：４：６）中に再懸濁し、６０℃で９０分間加熱して、２’位のｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基を除去する。その後、反応物を５０ｍＬの２０ｍＭ酢酸ナトリウムで反応停止処理し、ｐＨを６．５に調整する。精製するまで、オリゴヌクレオチドを冷凍庫に保存する。
【０２７２】
分析
オリゴヌクレオチドを精製前に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析し、緩衝液およびカラムの選択は、配列および／または結合リガンドの性質に依存する。
【０２７３】
ＨＰＬＣ精製
リガンド結合オリゴヌクレオチドを、逆相分取ＨＰＬＣで精製する。非結合オリゴヌクレオチドを、屋内で充填したＴＳＫゲルカラムの陰イオン交換ＨＰＬＣで精製する。緩衝液は、１０％のＣＨ３ＣＮ中２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）（緩衝液Ａ）、および１０％のＣＨ３ＣＮ中２０ｍＭリン酸ナトリウム、１ＭのＮａＢｒ（ｐＨ８．５）（緩衝液Ｂ）である。全長オリゴヌクレオチドを含有する画分をプールし、脱塩し、凍結乾燥する。約０．１５ＯＤの脱塩されたオリゴヌクレオチドを水中で希釈して１５０μＬにし、その後、ＣＧＥおよびＬＣ／ＭＳ分析のために特殊のバイアルにピペットで移した。その後、化合物をＬＣ−ＥＳＭＳおよびＣＧＥで分析する。
【０２７４】
ｉＲＮＡの調製
ｉＲＮＡの一般的な調製について、等モル量のセンス鎖およびアンチセンス鎖を、１倍のＰＢＳ中で、９５℃で５分間加熱し、室温まで緩徐に冷却する。二本鎖の完全性を、ＨＰＬＣ分析により確認する。
【０２７５】
核酸配列を、標準の命名法、および具体的には、表Ｂの略語を用いて以下に提示する。
表Ｂ：核酸配列の表示において用いるヌクレオチドモノマーの略語これらのモノマーが、オリゴヌクレオチド中に存在する場合、５’−３’−ホスホジエステル結合によって相互に結合されることが理解される。
【表２】
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【０２７６】
実施例２．ＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡ設計、合成、およびスクリーニング
ＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡを用いた設計、合成、およびアッセイの詳細な記述を、２００７年５月１０日出願の米国特許出願第１１／７４６，８６４号（現在の米国特許第７，６０５，２５１号）および２００７年５月１０日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６８６５５号（国際公開第ＷＯ２００７／１３４１６１号として公開されている）および２００９年６月４日出願の米国特許出願第１２／４７８，４５２号（米国第２０１０／００１００６６号として公開されている）および２００９年１月３０日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３２７４３号（国際公開第ＷＯ２００９／１３４４８７号として公開されている）で見出すことができる。すべての目的のために、これらすべては、参照によりこれらの全体が組み込まれる。
【０２７７】
ｓｉＲＮＡ設計を実行して、プロタンパク質転換酵素スブチリシン／ケキシン型９遺伝子（ヒトシンボルＰＣＳＫ９）を標的とするｓｉＲＮＡをヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）（カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、以下、「カニクイザル（ｃｙｎｏ）」）から同定した。設計は、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑコレクションからのＰＣＳＫ９転写ＮＭ＿１７４９３６．２（ヒト）を使用し、Ａｌｎｙｌａｍのカニクイザルトランスクリプトーム配列決定の試みの一環としてカニクイザルＰＣＳＫ９転写を得た。ＲｅｆＳｅｑからのアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）（アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ））転写物ＮＭ＿００１１１２６６０．１を、カニクイザルデータを欠くＰＣＳＫ９転写領域でも利用した（以下を参照のこと）。
【０２７８】
ｓｉＲＮＡ設計および特異性の予測
３つの組のＰＣＳＫ９二本鎖、１）ヒトとＮＨＰ  ＰＣＳＫ９（利用可能な場合はカニクイザル、さもなければアカゲザル）との間に１００％の同一性を有する二本鎖、２）ＮＨＰ  ＰＣＳＫ９に対してアンチセンス位置１、１８、または１９でミスマッチを許容したヒトＰＣＳＫ９に対して１００％の同一性を有する二本鎖、ならびに３）ヒトＰＣＳＫ９に対してミスマッチおよび／または欠失を含有する二本鎖を設計した。それぞれの二本鎖組の大きさ、内容物、および設計基準は、以下の通りであった。
１．ヒトとカニクイザルＰＣＳＫ９（ヒトＰＣＳＫ９  ＮＭ＿１７４９３６．２のスパン位置（ｓｐａｎｎｉｎｇ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）６９５〜２９１６）ならびにヒトおよびアカゲザルＰＣＳＫ９（スパン位置１〜６９５／２９１６〜３５６１）が完全に一致したヒト／ＮＨＰ二本鎖。すべて２５〜６５％のＧＣ含有率を有し、いずれもアンチセンス位置１および２の両方でＧまたはＣを有さず、いずれも４より長い一連の反復ヌクレオチドを有さなかった。配列は、表１に列挙される。
２．アンチセンス位置１、１８、および１９でミスマッチを有するヒト／ＮＨＰ二本鎖。これらの二本鎖は、ヒトＰＣＫＳ９に完全一致するが、アンチセンス位置１、１８、または１９のうちのいずれかでＮＨＰ  ＰＣＳＫ９に対するミスマッチを許容する。カニクイザルおよび／またはアカゲザルＰＣＳＫ９転写物を、上の第１の組で使用した。すべて２５〜６５％のＧＣ含有率を有し、いずれもアンチセンス位置１でＧまたはＣを有さず、いずれも５より長い一連の反復ヌクレオチドを有さなかった。配列は、表１に列挙される。
３．設計されたミスマッチ（９本の二本鎖、表６を参照のこと）および／または欠失（１２本の二本鎖、表７を参照のこと）を有するヒトＰＣＳＫ９二本鎖。これらの二本鎖は、ＡＤ−９６８０の変異体である。
【０２７９】
候補二本鎖の予測特異性を、検索し、アライメントを解析し、オフターゲットおよびミスマッチスコアを生成し、頻度を計算し、かつそれぞれのｓｉＲＮＡ配列を特異性カテゴリーに割り当てたアルゴリズムを用いて、それぞれの配列から予測した。
【０２８０】
ＰＣＳＫ９配列の合成
ＰＣＳＫ９配列を、ＭｅｒＭａｄｅ１９２合成機上で、１ｕｍｏｌスケールで合成した。
【０２８１】
上および表１に記載のヒト−ＮＨＰ交差反応性配列を、修飾化学を用いて合成した。表２は、センスおよびアンチセンス鎖の修飾バーションを含む。この化学の詳細は、以下の通りである。
・センス鎖中のすべてのピリミジン（シトシンおよびウリジン）を、対応する２’−Ｏ−メチル塩基（２’Ｏ−メチルＣおよび２’−Ｏ−メチルＵ）に置換した。
・アンチセンス鎖において、リボＡヌクレオシドに隣接した（５’位に向かう）ピリミジン（ＣおよびＵ）を、それらの対応する２−Ｏ−メチルヌクレオシドに置換した。
・センス配列およびアンチセンス配列の両方の３’末端で２塩基ｄＴｄＴの拡張を導入した。この２塩基オーバーハングは、ホスホロチオエート結合を有する。
【０２８２】
ヒトのみのＰＣＳＫ９配列の合成の場合、異なる化学修飾および構造特性を、親一本鎖配列Ａ−１４６６４およびＡ−１４６６５（親二本鎖ＡＤ−９６８０）に導入した。表６および表７を参照されたい。
【０２８３】
構造特性は、一本鎖中の異なる部位でのミスマッチおよびまたは欠失の導入、２’ＯＭｅ化学修飾部位の交換、３’ｄＴｄＴオーバーハングの３’ｕｕオーバーハングへの置換、センス鎖の１０位でのユニバーサル塩基、２，４ジフルオロトルエン（２，４ＤＦＴ）の導入を含む。個々の配列の合成を、９６ウェルプレート中、１ｕｍｏｌスケールで、高スループットパラレル合成形式で行った。合成プロセスは、ホスホラミダイト化学を用いた固体支持されたオリゴヌクレオチド法に基づいた。個々のアミダイト溶液を、０．１Ｍ（（アセトニトリル中）で調製し、エチルチオテトラゾール（アセトニトリル中０．６Ｍ）を活性化因子として用いた。
【０２８４】
切断および脱保護：
第１のステップにおいてメチルアミン、および第２のステップにおいてトリエチルアミン３ＨＦを用いて、合成した配列を９６ウェルプレート内で切断および脱保護した。粗配列をアセトン：エタノール混合物を用いて沈殿させ、ペレットを０．０２Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液中に再懸濁させた。それぞれの配列からの試料をＬＣ−ＭＳによって分析し、結果として得られた質量データにより、配列の同一性を確認した。選択された組の試料もＩＥＸクロマトグラフィによって分析した。
【０２８５】
精製：
粗ＰＣＳＫ９一本鎖を、二等分し、そのうちの１つをイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑカラムを用いたＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ精製システムをこのプロセスのために使用した。精製を、カラムおよび６０℃に設定したインライン緩衝液加熱器を用いて行った。全長配列に対応する単一ピークを溶離液中に収集した。精製した一本鎖を、イオン交換クロマトグラフィーを用いて純度について分析した。
【０２８６】
精製した配列を、ＡＫＴＡ精製器を用いてＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラム上で脱塩した。脱塩したＰＣＫ９配列を、濃度および純度について分析した。その後、一本鎖をアニーリングに服従させた。センス一本鎖およびアンチセンス一本鎖の等モル量を合わせ、Ｔｅｃａｎ液体ハンドリングロボットを用いてアニーリングした。個々の二本鎖の純度を試験するために、それらをＣＧＥ（キャピラリーゲル電気泳動法）を用いて試験した。すべての二本鎖をスクリーニングアッセイのために解放した。
【０２８７】
実施例３：ＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡのインビトロスクリーニング：
細胞培養およびトランスフェクション：
Ｈｅｌａ細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を、１０％ＦＢＳ、ストレプトマイシン、グルタミン（ＡＴＣＣ）を補充したＥａｇｌｅのＭｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ、ＡＴＣＣ）中、５％ＣＯ２の雰囲気下で、３７℃でほぼコンフルエンスになるまで成長させた後、トリプシン処理によってプレートから放出させた。１つのウェル当たり５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭおよび５μＬのｓｉＲＮＡ二本鎖を、１つのウェル当たり１０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭおよび０．２μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ．カタログ番号１３７７８−１５０）とともに９６ウェルプレートに添加することによって、逆トランスフェクションを実行し、室温で１５分間インキュベートした。抗生物質を有さず、２．０×１０４Ｈｅｌａ細胞を含有する８０μＬの完全成長培地を添加した。場合によって、細胞を最初にウェルに添加し、４〜５時間後に、上述のトランスフェクション試薬を添加した。細胞をＲＮＡ精製の前に２４時間インキュベートした。０．１または１０ｎＭの最終二本鎖濃度で実験を行った。用量応答スクリーニングについて、ＨｅＬａ細胞を用量の範囲にわたってｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。
【０２８８】
ＭａｇＭＡＸ−９６全ＲＮＡ単離キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｆｏｒｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ、品番：ＡＭ１８３０）を用いた全ＲＮＡ単離：
細胞を回収し、１４０μＬの溶解／結合溶液中に溶解し、その後、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒを用いて８５０ｒｐｍで１分間混合した（混合速度はプロセスを通して同一であった）。２０マイクロリットルの磁気ビーズおよび溶解／結合エンハンサー混合物を細胞溶解物に添加し、５分間混合した。磁気ビーズを磁気スタンドを用いて捕捉し、ビーズを妨害することなく上清を除去した。上清を除去した後、磁気ビーズを洗浄液１（イソプロパノールを添加したもの）で洗浄し、１分間混合した。ビーズを再度捕捉し、上清を除去した。その後、ビーズを１５０μＬの洗浄液２（エタノールを添加したもの）で洗浄し、捕捉し、上清を除去した。その後、５０μＬのＤＮａｓｅ混合物（ＭａｇＭａｘ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮａｓｅ緩衝液およびＴｕｒｂｏ  ＤＮａｓｅ）をビーズに添加し、それらを１０〜１５分間混合した。混合した後、１００μＬのＲＮＡ再結合溶液を添加し、３分間混合した。上清を除去し、磁気ビーズを１５０μＬの洗浄液２で再度洗浄し、１分間混合し、上清を完全に除去した。磁気ビーズを２分間混合して乾燥させた後、ＲＮＡを５０μＬの水で溶出した。
【０２８９】
ＡＢＩ大容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ、カタログ番号４３６８８１３）を用いたｃＤＮＡ合成：
１反応当たり２μＬの１０倍緩衝液、０．８μＬの２５倍ｄＮＴＰ、２μＬのランダムプライマー、１μＬの逆転写酵素、１μＬのＲＮａｓｅ阻害剤、および３．２μＬの水Ｈ２Ｏのマスター混合物を、１０μＬの全ＲＮＡに添加した。ｃＤＮＡを、以下のステップ：２５℃で１０分間、３７℃で１２０分間、８５℃で５秒、４℃で維持を介して、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃ−１０００またはＳ−１０００サーマルサイクラー（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて生成した。
【０２９０】
リアルタイムＰＣＲ：
２μＬのｃＤＮＡを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０  ３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０４７２９７４００１）中、１ウェル当たり１μＬのＧＡＰＤＨ  ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３２６３１７Ｅ）、１μＬのＰＣＳＫ９  ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＨＳ０３０３７３５５＿Ｍ１）および１０μＬのＲｏｃｈｅプローブマスター混合物（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０４８８７３０１００１）を含有するマスター混合物に添加した。リアルタイムＰＣＲをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０リアルタイムＰＣＲ機（Ｒｏｃｈｅ）で行った。それぞれの二本鎖を、２つの独立したトランスフェクションにおいて試験し、それぞれのトランスフェクションを二重にアッセイした。
【０２９１】
分枝鎖ＤＮＡアッセイ−ＱｕｎａｔｉＧｅｎｅ２．０（Ｐａｎｏｍｉｃｓ、カタログ番号：ＱＳ００１１）：すべての他の二本鎖をスクリーニングするために使用
規定された用量（単数または複数）で２４時間インキュベートした後、培地を除去し、細胞を１００ｕＬの溶解混合物（２０ｍｇ／ｍＬの最終濃度の、１容量の溶解混合物、２容量のヌクレアーゼを含まない水、および１ｍＬ当たり１０ｕＬのプロテイナーゼ−Ｋの混合物）中に溶解し、その後、６５℃で３５分間インキュベートした。その後、２０μＬの作業プローブセット（遺伝子標的用のＴＴＲプローブおよび内在性コントロール用のＧＡＰＤＨ）ならびに８０ｕＬの細胞溶解物を捕捉プレートに添加した。捕捉プレートを５５℃±１℃でインキュベートした（約１６〜２０時間）。翌日、捕捉プレートを１倍洗浄緩衝液（ヌクレアーゼを含まない水、緩衝液構成成分１、および洗浄緩衝液構成成分２）で３時間洗浄し、その後、１分間遠心分離で乾燥させて２４０ｇにした。１００ｕＬの事前増幅作業試薬をアルミホイルで密封した捕捉プレートに添加し、５５℃±１℃で１時間インキュベートした。１時間のインキュベーション後、洗浄ステップを繰り返し、その後、１００μＬの増幅作業試薬を添加した。１時間後、洗浄および乾燥ステップを繰り返し、１００μＬの標識プローブを添加した。捕捉プレートを５０℃±１℃で１時間インキュベートした。その後、プレートを１倍洗浄緩衝液で洗浄し、乾燥させ、１００μＬの基質を捕捉プレートに添加した。５〜１５分間のインキュベーション後、捕捉プレートをＳｐｅｃｔｒａＭａｘ照度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて読み取った。
【０２９２】
データ分析
平均バックグラウンドをそれぞれの三重試料から差し引き、三重ＧＡＰＤＨ（対照プローブ）およびＰＣＳＫ９（実験プローブ）を平均化し、その後、比率：（実験プローブ−バックグラウンド）／（対照プローブ−バックグラウンド）を得ることによって、ｂＤＮＡデータを分析した。
【０２９３】
リアルタイムデータを△△Ｃｔ法を用いて分析した。それぞれの試料をＧＡＰＤＨ発現に正規化し、ノックダウンを非標的化二本鎖ＡＤ−１９５５でトランスフェクトした細胞と比較して評価した。
【０２９４】
ＩＣ５０をＸＬｆｉｔの４パラメータフィットモデルを用いて定義した。
【０２９５】
結果
表２に記載の１０７２エンドライト化学修飾したＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡを、０．１ｎＭおよび１０ｎＭの単回用量実験で使用した。結果が表３に示される。
【０２９６】
上位４５個の機能する二本鎖を、上述の用量応答アッセイで使用した。表４は、用量応答実験の結果を提供する。試験したｓｉＲＮＡのうちの４つが、先導ＡＤ−９６８０の範囲のＩＣ５０を呈した。
【０２９７】
表５は、０．１ｎＭノックダウンのＰＣＳＫ９先導最適化ｓｉＲＮＡの結果を提供する。
【０２９８】
先導ＡＤ−９６８０に基づくが、異なる修飾を有する二本鎖を、用量応答アッセイで使用した。結果が表６に示される。
【０２９９】
先導ＡＤ−９６８０に基づくが、アンチセンス鎖に欠失を有する二本鎖を、用量応答アッセイで使用した。結果が表７に示される。
【０３００】
実施例４．ＬＤＬＲ−／＋トランスジェニックマウスにおけるＰＣＳＫ９のサイレンシング
ＬＤＬＲ遺伝子に対してヘテロ接合性である患者における高コレステロール血症の治療の満たされていないニーズが大いに存在する。これらの個人は、ＬＤＬＲの１つの変異体および１つの重量コピーを有し、結果として、著しく上昇したＬＤＬｃレベルおよび心血管系イベントのより高い発生率／危険性を有する。ＬＤＬＲヘテロ接合体マウスにおけるｓｉＲＮＡを用いたＰＣＳＫ９のサイレンシングおよびそれらの総コレステロールへの効果を調査した。
【０３０１】
脂質で製剤化されたＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡを、０．１、０．３、１．０、および３．０ｍｇ／ｋｇで野生型およびＬＤＬＲヘテロ接合体マウスに投与した。３日後、マウスを屠殺し、肝臓ＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡレベルおよび血清総コレステロールレベルを決定した。
【０３０２】
Ｊａｃｋｓｏｎ研究所で、ＪＡＸ系統Ｂ６．１２９Ｓ７−Ｌｄｌｒｔｍ１Ｈｅｒ／Ｊ（ストック番号００２２０７）をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ストック番号０００６６４）と交配させ、雌ＬＤＬＲヘテロ接合体ノックアウトマウスをもたらした。ＬＤＬＲヘテロ接合体マウス（５匹／群、体重１８〜２０ｇ）におけるｓｉＲＮＡのボーラス投与を、２７Ｇ針を用いて、低容量尾静脈注入によって行った。マウスに、ＰＣＳＫ９を標的とするｓｉＲＮＡ（ＡＦ−０１１−１０７９２）を３．０、１．０、０．３、および０．１ｍｇ／ｋｇで投与し、対照ルシフェラーゼを標的とするｓｉＲＮＡ（ＡＦ−０１１−１９５５）を３ｍｇ／ｋｇで投与した。ｓｉＲＮＡを本明細書に記載されるように脂質で製剤化した。
【０３０３】
注入を容易にするために、投与前に約３分間、動物を赤外線ランプ下に置いた。投与の７２時間後、動物を二酸化炭素窒息により屠殺した。０．２ｍＬの血液を眼窩後方出血により収集し、分析まで−８０℃で保管した。肝臓を回収し、液体窒素中で凍結させた。凍結した肝臓を、６８５０Ｆｒｅｅｚｅｒ／Ｍｉｌｌ極低温粉砕機（ＳＰＥＸ  ＣｅｎｔｒｉＰｒｅｐ，Ｉｎｃ）を用いて粉砕し、粉末を分析まで−８０℃で保管した。
【０３０４】
マウス血清中の総血清コレステロールを、製造業者の指示に従って、ＷａｋｏコレステロールＥ酵素比色法（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ，ＵＳＡ）を用いて測定した。ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏソフトウェアを用いて、測定結果をＶＥＲＳＡ  Ｍａｘ  Ｔｕｎａｂｌｅマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）上で得た。
【０３０５】
プロトコルに従って、分岐ＤＮＡ技術ベースのＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ試薬システム（Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡレベルを検出した。１０〜２０ｍｇの凍結した肝臓粉末を６００μＬの０．３μｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、番号ＭＰＲＫ０９２）を含む組織および細胞溶解液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、番号ＭＴＣ０９６Ｈ）中に６５℃で１時間溶解した。その後、１０μＬの溶解物を９０ｕＬの溶解作業試薬（２容量の水中、１容量のストック溶解混合物）に添加し、マウスＰＣＳＫ９およびマウス対照配列ＧＡＰＤＨ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ，ＵＳＡ）に特異的なプローブセットを有するＰａｎｏｍｉｃｓ捕捉プレート上で、５５℃で一晩インキュベートした。その後、プロトコルに従って、信号増幅および検出のために捕捉プレートを処理し、化学発光を相対光ユニット（ＲＬＵ）としてマイクロプレート照度計Ｖｉｃｔｏｒ２−Ｌｉｇｈｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）上で読み取った。肝臓溶解物中のＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡ対ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの比率をそれぞれの治療群にわたって平均化し、ＰＢＳで処理した対照群と比較した。
【０３０６】
結果が図１に示される。非関連ｓｉＲＮＡ対照ＡＦ−０１１−１９５５ではなく、ＡＦ−０１１−１０７９２  ｓｉＲＮＡでのＬＤＬＲヘテロ接合体マウスの治療が、マウス肝臓におけるＰＣＳＫ９転写レベルの著しく用量依存的（６０％）な低下をもたらし（ＰＢＳ対照群に対して正規化されるときにより小さいＰＣＳＫ９対ＧＡＰＤＨ転写比率で示されるように）、ＡＦ−０１１で製剤化されたｓｉＲＮＡ分子がインビボで活性であることを示した。図１に示されるように、サイレンシング活性は、これらの動物における総コレステロールの２０〜３０％の低下に置き換えられた。
【０３０７】
ＬＤＬＲヘテロ接合体ノックアウトマウスにおけるＰＣＳＫ９サイレンシングは、総血清コレステロールの低下をもたらし、ＬＤＬＲの単一の重量コピーがＰＣＳＫ９機構を十分に効果的にすることを示す。
【０３０８】
実施例５．ヒトにおけるＰＣＳＫ９を標的とするｓｉＲＮＡでの総血清コレステロールの低減
ヒト対象を医薬組成物、例えば、ｓｉＲＮＡを有する核酸脂質粒子で治療する。
【０３０９】
ゼロ時間で、医薬組成物の好適な第１の用量を対象に皮下投与する。組成物を本明細書に記載されるように製剤化する。しばらくすると、例えば、総血清コレステロールの測定によって、対象の状態を評価する。この測定に伴って、該対象におけるＰＣＳＫ９発現、および／または成功したＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ標的化の産物を測定することができる。他の関連性のある基準も測定することができる。用量の数と強度を、対象の必要性に従って調整する。
【０３１０】
いくつかの実施形態において、対象は、ＬＤＬＲ変異または多型に対してヘテロ接合性である。
【０３１１】
治療後、対象の状態を治療前の状態と比較するか、または同様に罹患しているが、治療されていない対象の条件と比較する。
【０３１２】
当業者は、本開示に具体的に提示される方法および組成物に加えて、当業者が本発明を以下に添付される特許請求の範囲の全範囲内で実践することを可能にする方法および組成物に精通している。
表１．化学修飾していないＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡ（１０７２本の二本鎖、ＡＤ−２７０４３〜２８１２２）
【表３−１】
2013545736.tif 000011
【表３−２】
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【０３１３】
【表３−３】
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【表３−４】
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【０３１４】
【表３−５】
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【表３−６】
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【０３１５】
【表３−７】
2013545736.tif 000017
【表３−８】
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【０３１６】
【表３−９】
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【表３−１０】
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【０３１７】
【表３−１１】
2013545736.tif 000021
【表３−１２】
2013545736.tif 000022
【０３１８】
【表３−１３】
2013545736.tif 000023
【表３−１４】
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【０３１９】
【表３−１５】
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【表３−１６】
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【０３２０】
【表３−１７】
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【表３−１８】
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【０３２１】
【表３−１９】
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【表３−２０】
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【０３２２】
【表３−２１】
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【表３−２２】
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【０３２３】
【表３−２３】
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【表３−２４】
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【０３２４】
【表３−２５】
2013545736.tif 000035
【表３−２６】
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【０３２５】
【表３−２７】
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【表３−２８】
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【０３２６】
【表３−２９】
2013545736.tif 000039
【０３２７】
表２．エンドライト化学修飾したＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡ
【表４−１】
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【表４−２】
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【０３２８】
【表４−３】
2013545736.tif 000042
【表４−４】
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【０３２９】
【表４−５】
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【表４−６】
2013545736.tif 000045
【０３３０】
【表４−７】
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【表４−８】
2013545736.tif 000047
【０３３１】
【表４−９】
2013545736.tif 000048
【表４−１０】
2013545736.tif 000049
【０３３２】
【表４−１１】
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【表４−１２】
2013545736.tif 000051
【０３３３】
【表４−１３】
2013545736.tif 000052
【表４−１４】
2013545736.tif 000053
【０３３４】
【表４−１５】
2013545736.tif 000054
【表４−１６】
2013545736.tif 000055
【０３３５】
【表４−１７】
2013545736.tif 000056
【表４−１８】
2013545736.tif 000057
【０３３６】
【表４−１９】
2013545736.tif 000058
【表４−２０】
2013545736.tif 000059
【０３３７】
【表４−２１】
2013545736.tif 000060
【表４−２２】
2013545736.tif 000061
【０３３８】
【表４−２３】
2013545736.tif 000062
【表４−２４】
2013545736.tif 000063
【０３３９】
表３．ＰＣＳＫ９の１０ｎＭおよび０．１ｎＭノックダウン
【表５−１】
2013545736.tif 000064
【表５−２】
2013545736.tif 000065
【０３４０】
【表５−３】
2013545736.tif 000066
【表５−４】
2013545736.tif 000067
【０３４１】
【表５−５】
2013545736.tif 000068
【表５−６】
2013545736.tif 000069
【０３４２】
【表５−７】
2013545736.tif 000070
【表５−８】
2013545736.tif 000071
【０３４３】
【表５−９】
2013545736.tif 000072
【表５−１０】
2013545736.tif 000073
【０３４４】
【表５−１１】
2013545736.tif 000074
【表５−１２】
2013545736.tif 000075
【０３４５】
表４．ＰＣＳＫ９用量応答
【表６】
2013545736.tif 000076
【０３４６】
表５．ＰＣＳＫ９リード最適化ｓｉＲＮＡの０．１ｎＭノックダウン
【表７】
2013545736.tif 000077
【０３４７】
表６．ＡＤ−９６８０およびＡＤ−９６８０の修飾バージョン：用量応答スクリーニング
【表８】
2013545736.tif 000078
【０３４８】
表７．欠失を有するＡＤ−９６８０および有しないＡＤ−９６８０：用量応答スクリーニング
【表９】
2013545736.tif 000079
【０３４９】
表８．ＡＤ−９６８０およびＡＤ−１０７９２：センス鎖配列、アンチセンス鎖配列、および標的配列
【表１０】
2013545736.tif 000080
【図１】
2013545736.tif 000081
【手続補正書】
【提出日】平成25年7月17日(2013.7.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１１年１０月３１日出願の国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５８６８２の国内段階であり、２０１０年１０月２９日出願の米国仮出願第６１／４０８，５１３号の利益を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出された配列表を含み、その全体を本明細書に包含させる。２０１２年Ａ１月２７日に作成されたＳＣＩＩコピーは、19759PCTUS CRF sequencelisting.txtの名であり、７０２，５７８バイトのサイズである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
ペプチドまたはペプチド模倣物は、例えば、細胞透過ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、Ｔｒｐ、またはＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、構造規制ペプチド、または架橋ペプチドであり得る。別の代替例において、ペプチド部分は、疎水性膜移行配列（ＭＴＳ）を含むことができる。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号２４４１）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号２４４２））も標的部分であり得る。ペプチド部分は、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質を含む極性巨大分子を、細胞膜にわたって運搬することができる「送達」ペプチドであり得る。例えば、ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質由来の配列（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号２４４３））およびショウジョウバエアンテナペディア（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）タンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２４４４））が、送達ペプチドとして機能することができることが見出されている。ペプチドまたはペプチド模倣物は、ファージ表示ライブラリ、または１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）組み合わせライブラリ（Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２−８４，１９９１）から同定されるペプチド等のＤＮＡのランダム配列によってコードされ得る。好ましくは、組み込まれたモノマー単位を介してｄｓＲＮＡ剤に係留されるペプチドまたはペプチド模倣物は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）−ペプチド、またはＲＧＤ模倣物等の細胞標的化ペプチドである。ペプチド部分は、約５アミノ酸長〜約４０アミノ酸長の範囲であり得る。ペプチド部分は、安定性または直接立体配座特性を増加させる等の構造修飾を有し得る。以下に記載の構造修飾のいずれかを利用することができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４７】
表６．ＡＤ−９６８０およびＡＤ−９６８０の修飾バージョン：用量応答スクリーニング
【表８】
2013545736.tif 000082
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４８】
表７．欠失を有するＡＤ−９６８０および有しないＡＤ−９６８０：用量応答スクリーニング
【表９】
2013545736.tif 000083
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４９】
表８．ＡＤ−９６８０およびＡＤ−１０７９２：センス鎖配列、アンチセンス鎖配列、および標的配列
【表１０】
2013545736.tif 000084
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2013545736000001.app
【手続補正８】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＤＬＲ遺伝子に対してヘテロ接合性である対象における高コレステロール血症を治療するための医薬組成物であって、ＰＣＳＫ９の発現を阻害するために有効な量のｄｓＲＮＡを含み、前記ｄｓＲＮＡは、センス鎖と、ＰＣＳＫ９  ＲＮＡ転写物に対する相補性領域を含むアンチセンス鎖と、を含み、前記ｄｓＲＮＡは、３０個以下の塩基対の長さである、医薬組成物。
【請求項２】
前記アンチセンス鎖が、ＡＤ−９６８０のセンス配列の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドに対して相補的である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ｄｓＲＮＡが、ＡＤ−９６８０からなる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ｄｓＲＮＡが、脂質で製剤化される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ｄｓＲＮＡが、表Ａから選択される製剤において脂質で製剤化される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記対象が、霊長類または齧歯類である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記対象が、ヒトである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記有効な量が、前記対象の体重１ｋｇ当たり０．０１〜５．０ｍｇの濃度である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記対象のＬＤＬＲ遺伝子型または表現型を決定することをさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
投与が、前記対象の血清コレステロールの減少をもたらす、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記対象の前記血清コレステロールのレベルを決定することをさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記相補性領域が、表１、２、６、または７に列挙されるアンチセンス配列のうちの１つからなる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記ｄｓＲＮＡが、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記ｄｓＲＮＡが、少なくとも１個の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドおよび少なくとも１個の５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチドを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記ｄｓＲＮＡが、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびヌクレオチドを含む非天然塩基から選択される少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
それぞれの鎖が１９〜２４ヌクレオチド長である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
それぞれの鎖が２個のヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記ｄｓＲＮＡがリガンドをさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記ｄｓＲＮＡがｄｓＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合されるリガンドをさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記ｄｓＲＮＡが、ＡＤ−９６８０を除く表１、２、６、または７に記載のｄｓＲＮＡからなる、ＰＣＳＫ９の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）。
【国際調査報告】
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