(57)【要約】【課題】本発明は、多孔性フィルム付きメンブレンセンサー及びこれを用いた免疫反応又は酵素反応の測定方法に関するものであり、より詳しくは、レセプターが固定されているメンブレン上に多孔性フィルムが結合されているメンブレンセンサー及びこれを用いた免疫反応又は酵素反応の測定方法に関するものである。【解決手段】本発明によると、多孔性フィルムの孔の大きさを調節してメンブレンバイオセンサーの感度を調節でき、これにより少量の試料だけを用いて高感度で分析対象物質を測定でき、メンブレンセンサーに様々な種類のレセプターを付けて多様な種類の分析対象物質を同時に測定できる。
2013512429.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メンブレン上に多数の孔を有する多孔性フィルムが付いており、各孔の位置に該当するメンブレン上にレセプターが固定されていることを特徴とするメンブレンバイオセンサー。
【請求項２】
前記多孔性フィルム上に接合体パッドがさらに形成されていることを特徴とする請求項１に記載のメンブレンバイオセンサー。
【請求項３】
前記レセプターは、抗体、抗原、酵素、ペプチド、蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ及びアプタマーで構成された群から選ばれることを特徴とする請求項１又は２に記載のメンブレンバイオセンサー。
【請求項４】
前記多孔性フィルムの孔の大きさは、１０〜５０００μｍであることを特徴とする請求項１又は２に記載のメンブレンバイオセンサー。
【請求項５】
前記メンブレンは、ニトロセルロースメンブレン（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）であることを特徴とする請求項１又は２に記載のメンブレンバイオセンサー。
【請求項６】
前記メンブレンバイオセンサーに用いられる試料は、分析対象物質に選択的に結合する物質と、信号発生物質の接合体をさらに含むことを特徴とする請求項１又は２に記載のメンブレンバイオセンサー。
【請求項７】
前記信号発生物質は、金属ナノ粒子、量子ドットナノ粒子、磁気ナノ粒子、酵素、酵素基質、酵素反応生成物質、吸光物質、蛍光物質又は発光物質であることを特徴とする請求項６に記載のメンブレンバイオセンサー。
【請求項８】
前記接合体パッドには、信号発生物質；又は分析対象物質に選択的に結合する物質と信号発生物質の接合体が塗布されていることを特徴とする請求項２に記載のメンブレンバイオセンサー。
【請求項９】
前記接合体パッド上にサンプルパッドが形成されていることを特徴とする請求項１又は２に記載のメンブレンバイオセンサー。
【請求項１０】
前記接合体パッドと多孔性フィルム間に流体の流れを良くするメンブレンを嵌めることを特徴とする請求項１又は２に記載のメンブレンバイオセンサー。
【請求項１１】
前記メンブレンを多孔性フィルムの各孔を含む領域に区画することを特徴とする請求項１又は２に記載のメンブレンバイオセンサー。
【請求項１２】
請求項１又は２に記載のメンブレンバイオセンサーを用いるが、前記メンブレンバイオセンサーに試料を垂直に注入することを含む免疫反応測定方法。
【請求項１３】
前記メンブレンバイオセンサーの各孔毎に相違する種類のレセプターが固定されていることを特徴とする請求項１２に記載の測定方法。
【請求項１４】
請求項１又は２に記載のメンブレンバイオセンサーを用いるが、前記メンブレンバイオセンサーに試料を垂直に注入することを含む酵素反応の測定方法。
【請求項１５】
前記メンブレンバイオセンサーの各孔毎に相違する種類のレセプターが固定されていることを特徴とする請求項１４に記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メンブレンセンサー及びこれを用いた免疫反応又は酵素反応の測定方法に関するものであり、より詳しくは、抗原−抗体反応を迅速に測定するメンブレンセンサー及びこれを用いた免疫反応又は酵素反応の測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
抗体−抗原反応を迅速に測定する方法として、ＬＦＡ（ｌａｔｅｒａｌ  ｆｌｏｗ  ａｓｓａｙ）システムが多く用いられる。ＬＦＡは、一般的に液体試料が毛細管現象によって流れ得るメンブレンに抗体が固定されており、メンブレンの上流層には接合体パッドと試料パッドが連結されており、メンブレンの下流層に吸収パッドが連結されている。前記接合体パッドには試料物質と選択的に結合し得る抗体が固定化された金ナノ粒子接合体が乾燥されている。前記メンブレンには、試料物質と選択的に反応する抗体及び金ナノ粒子に固定化された抗体と結合し得る物質がそれぞれ他の位置に固定化されている。前記試料物質と選択的に結合し得る、メンブレンに固定化された抗体と金ナノ粒子に固定化された抗体は、試料物質に対してサンドイッチ形態で結合されるように構成される。前記吸収パッドは、液体試料をよく吸収できる物質で構成される。このようなＬＦＡ装置に液体試料溶液をサンプルパッドに落とすと、試料が存在する場合は、試料に選択性を有する抗体−金ナノ粒子と、メンブレンに固定化された抗体がサンドイッチ形態で結合して前記抗体が固定化されたメンブレン位置に肉眼で確認できるバンドを形成するようになる。
【０００３】
しかし、従来のＬＦＡ方法で測定できる感度は、抗原蛋白質約１ｎｇ／ｍＬ程度であり、より高い感度を要求する試料は測定し難いという短所がある。また、より簡便に測定するために試料の体積を減らし、測定時間をより減らす必要がある。
【０００４】
メンブレン型センサーとして、現場診断用メンブレンストリップバイオセンサーシステム（特許文献１）；複合センサーメンブレン（特許文献２）；電気化学メンブレンストリップバイオセンサー（特許文献３）；Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｎａｌｙｔｅｓ  ｉｎ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｆｌｕｉｄ  Ｓａｍｐｌｅ（特許文献４）；メンブレンを有するセンサー及びその製造方法（特許文献５）；Ｔｅｓｔ  Ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｎａｌｙｔｅｓ  ｉｎ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓａｍｐｌｅ（特許文献６）等のように様々な形態が公開されている。しかし、前記の公開された特許では、多孔性フィルムを用いてセンサーの感度を調節することによりセンサーの感度を向上させ、多成分の物質を同時に検出し、試料の垂直注入によって試料の使用量及び分析対象物質の検出時間を減少させることができる技術の提示はなかった。
【０００５】
そこで本発明者等は、従来技術で具現できなかった技術を用いて高感度のメンブレンバイオセンサーを製作するために鋭意努力した結果、レセプターが固定されているメンブレンに多孔性フィルムを結合させたメンブレンバイオセンサーを製作した後、それを用いて試料を分析すれば少量の試料だけでも早い時間内に試料分析ができるということを確認し、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】韓国登録特許５９９４２０号公報
【特許文献２】日本公開特許２００６−５０７５１１号公報
【特許文献３】韓国登録特許３４８３５１号公報
【特許文献４】米国登録特許７４９４８１８号公報
【特許文献５】韓国登録特許５９１３９０号公報
【特許文献６】米国公開特許２００５−２１４１６１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、様々な種類の免疫反応又は酵素反応を同時に検出できる高感度のメンブレンバイオセンサーを提供する。本発明は、前記高感度のメンブレンバイオセンサーを利用した免疫反応又は酵素反応の測定方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を解決するために、本発明は、メンブレン上に多数の孔を有する多孔性フィルムが付いており、各孔の位置に該当するメンブレン上にレセプターが固定されていることを特徴とするメンブレンバイオセンサーを提供する。
【０００９】
本発明はまた、メンブレン上に多数の孔を有する多孔性フィルムが付いており、各孔の位置に該当するメンブレン上にレセプターが固定されていて、前記多孔性フィルム上に接合体パッドが形成されていることを特徴とするメンブレンバイオセンサーを提供する。
【００１０】
本発明はまた、前記メンブレンバイオセンサーを用いるが、前記メンブレンバイオセンサーに試料を垂直に注入することを含む免疫反応の測定方法を提供する。
【００１１】
本発明はまた、前記メンブレンバイオセンサーを用いるが、前記メンブレンバイオセンサーに試料を垂直に注入することを含む酵素反応の測定方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によると、多孔性フィルムの孔の大きさを調節してメンブレンバイオセンサーの感度を調節でき、少量の試料だけを用いて高感度で分析対象物質を測定でき、メンブレンセンサーに様々な種類のレセプターを付けて様々な種類の分析対象物質を同時に測定できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明にかかるメンブレンバイオセンサーの一例である。
【図２】本発明にかかるメンブレンバイオセンサーの他の例である。
【図３】本発明にかかるメンブレンバイオセンサーに３種類の異なるレセプターを固定した後、試料を注入して分析した結果を示した写真である。
【図４】本発明にかかるメンブレンバイオセンサーを用いてＣＲＰを検出した結果を示した写真である（Ｃｏｎｔｒｏｌ：ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ固定、Ｔｅｓｔ：ａｎｔｉ−ＣＲＰポリクローナル抗体固定）。
【図５】本発明にかかるメンブレンバイオセンサーを用いてＣＲＰの濃度及び時間による吸光度を測定した結果を示すグラフである。
【図６】比較例としてＬＦＡバイオセンサーを用いてＣＲＰを検出した結果を示した写真である。
【図７】本発明にかかるメンブレンバイオセンサーとＬＦＡバイオセンサーを用いてＣＲＰの濃度による吸光度を測定した比較結果を示すグラフである（ＦＴＨ：本発明にかかるメンブレンバイオセンサー、ＬＦＡ：ＬＦＡバイオセンサー）。
【図８】本発明にかかるメンブレンバイオセンサーを用いて酵素−化学発光反応によりＣＲＰを検出した結果を示した写真である（Ｃｏｎｔｒｏｌ：ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ固定、Ｔｅｓｔ：ａｎｔｉ−ＣＲＰポリクローナル抗体固定）。
【図９】本発明にかかるメンブレンバイオセンサーを用いて酵素−化学発光反応によりＣＲＰの濃度及び時間による発光度を測定した結果を示すグラフである。
【図１０】本発明にかかるメンブレンバイオセンサーを用いて酵素−化学発光反応によりＤ−グルコースを検出した結果を示した写真である（Ｃｏｎｔｒｏｌ：ペルオキシダーゼのみ固定、Ｔｅｓｔ：グルコースオキシダーゼ及びペルオキシダーゼ固定）。
【図１１】本発明にかかるメンブレンバイオセンサーを用いて酵素−化学発光反応によりＤ−グルコースの濃度による発光度を測定した結果を示すグラフである。
【図１２】本発明にかかるメンブレンバイオセンサーを用いて酵素−発色反応により対照血清の総コレステロールを測定した結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、一観点において、レセプターが固定されているメンブレン上に多孔性フィルムが付いていることを特徴とするメンブレンバイオセンサーに関するものである（図１）。
【００１５】
本発明は、他の観点において、レセプターが固定されているメンブレン上に多孔性フィルムが付いており、前記多孔性フィルム上に接合体パッドが形成されていることを特徴とするメンブレンバイオセンサーに関するものである（図２）。
【００１６】
本発明は、メンブレンに多孔性フィルムを付けてバイオセンサーを製造することにより、前記多孔性フィルムの孔の大きさによってセンサーの感度を調節し、前記多孔性フィルムの孔の個数によって多成分の分析対象物質を測定できることを特徴とする。また、本発明にかかるメンブレンバイオセンサーは、免疫反応又は酵素反応測定時に試料を垂直に落として測定するＦｌｏｗ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｈｏｌｅ（ＦＴＨ）方式を用いるため、少量の試料で短時間内に反応を測定できる。
【００１７】
本明細書で用いる用語「多孔性」は、多数の孔を有するという意味であり、「多孔性フィルム」は多数の孔が形成されているフィルムを意味する。本明細書で用いる用語「孔」は、同孔内で試料とレセプターが反応するように反応ウェル（ｗｅｌｌ）の役割をする程度の大きさを有する孔を意味する。
【００１８】
本発明において、前記メンブレンは、試料溶液を吸収できるメンブレンを使用でき、具体的なメンブレンの種類は当業者によって適切に選択できる。
【００１９】
本発明の一具体例において、前記メンブレンは、ニトロセルロースメンブレン（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）であることを特徴とし得る。前記ニトロセルロースメンブレンに試料、例えば、蛋白質を落とすと、蛋白質は初期に落とした位置から大きく拡散せず固定される。よって、前記ニトロセルロースメンブレン上に結合されている多孔性フィルムの孔に試料を注入すると、各孔の下のメンブレンでレセプターと試料との選択的な反応を起こして信号を測定するようにする。
【００２０】
本発明において、レセプターをメンブレン上に固定化させる方法は、物理的な吸着方法及び化学的方法を共に用いることができ、具体的な固定化方法は当業者によって適切に選択できる。
【００２１】
本発明において、前記多孔性フィルムの孔の大きさは、１０μｍ〜５０００μｍであることを特徴とし得るが、これに制限されるのではなく、１０〜４０００μｍ、１０〜３０００μｍ、１０〜２０００μｍ、１０〜１０００μｍ、５０〜５０００μｍ、５０〜４０００μｍ、５０〜３０００μｍ、５０〜２０００μｍ、５０〜１０００μｍ、１００〜５０００μｍ、１００〜４０００μｍ、１００〜３０００μｍ、１００〜２０００μｍ、１００〜１０００μｍ、２００〜５０００μｍ、２００〜４０００μｍ、２００〜３０００μｍ、２００〜２０００μｍ又は２００〜１０００μｍであり得る。前記多孔性フィルムの孔の大きさが小さい程試料が狭い領域でレセプターと反応してセンサーの感度は高く出るが、１０μｍ未満の場合は孔の大きさがより小さくなると試料の流れに障害が生じ得、５０００μｍを超えるとセンサーの感度が著しく低くなるという問題点がある。よって、多孔性フィルムの孔の大きさを１０μｍ〜５０００μｍにし、センサーの感度を調節することが好ましい。
【００２２】
本発明において、前記多孔性フィルムは孔の加工が容易な材質でなり得、例えば、ポリマー、ガラス、エラストマー、シリコン等の材質からなり得るが、これに制限されるのではない。具体的に、ポリイミド、アルミニウム、ポリアクリル、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）等であり得るが、これに制限されるのではない。
【００２３】
本発明において、前記多孔性フィルムは、フィルムの厚さが０．０１〜１ｍｍであり得、０．０１〜０．８ｍｍ、０．０１〜０．６ｍｍ、０．０１〜０．４ｍｍ、０．０１〜０．２ｍｍ、０．０５〜１ｍｍ、０．０５〜０．８ｍｍ、０．０５〜０．６ｍｍ、０．０５〜０．４ｍｍ又は０．０５〜０．２ｍｍであり得るが、これに制限されるのではない。
【００２４】
本発明において、前記多孔性フィルムは、メンブレンと接触する面に接着剤が塗布されている接着フィルムであり得る。この場合、多孔性フィルムを適当な大きさに切った後、前記メンブレン上に覆い被せることにより簡単に多孔性フィルムを付けることができる。しかし、これに制限されるのではなく、多孔性フィルムとメンブレンを付ける様々な方法が当業界に公知されていて当業者によって適切に選択できる。
【００２５】
本発明において、前記レセプターは分析対象物質と選択的に反応することが好ましく、具体的には、抗体、抗原、酵素、ペプチド、蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）及びアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）で構成された群から選ばれることを特徴とし得る。
【００２６】
本明細書において「選択的」という用語は、特定の二つの物質が相互特異的に結合しようとする性質を意味し、「特異的」という用語と混用し得る。
【００２７】
本発明において、前記メンブレンバイオセンサーに使用される試料は、分析対象物質に選択的に結合する物質と信号発生物質の接合体をさらに含むことを特徴とし得る。
【００２８】
つまり、本発明のメンブレンバイオセンサーに使用される試料は、例えば、分析対象物質が含まれたり含まれない任意の試料であり得、このような分析対象物質が含まれたり含まれない試料に分析対象物質に選択的に結合する物質と信号発生物質の接合体が混合された試料でもあり得る。前者の場合、分析対象物質に選択的に結合する物質と信号発生物質の接合体は、試料と別途に試料注入後にメンブレンバイオセンサーに注入してもよく、接合体パッド又はサンプルパッドに塗布した後、乾燥させて利用してもよい。後者の場合は、別途の接合体パッド又はサンプルパッドを用いずメンブレン及び多孔性フィルムだけで構成されたバイオセンサーに適用でき、試料内で予め分析対象物質−分析対象物質に選択的に結合する物質−信号発生物質の接合体が生成されてメンブレン上に固定されたレセプターと選択的に結合することにより、分析対象物質の検出ができる。
【００２９】
前記の「分析対象物質に選択的に結合する物質」は、分析対象物質と特異的な結合反応をする物質であって、例えば、抗体、抗原、酵素、ペプチド、蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）及びアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）で構成された群から選ばれ得る。前記の「分析対象物質に選択的に結合する物質」は、バイオセンサーのメンブレンに固定されたレセプターと同一な物質でもよく、レセプターとは相違する物質でもよい。
【００３０】
本発明において、前記信号発生物質は、金属ナノ粒子、量子ドット（ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ）ナノ粒子、磁気ナノ粒子、酵素、酵素基質、酵素反応生成物質、吸光物質、蛍光物質又は発光物質であることを特徴とし得る。
【００３１】
前記信号発生物質が金属ナノ粒子の場合は、レセプターと分析対象物質の選択的な反応による金属ナノ粒子の色変化を通じて分析対象物質を検出でき、メンブレン上でレセプターに選択的に結合された分析対象物質と金属ナノ粒子の結合体の吸光度、電気伝導度等を測定することにより分析対象物質を定量的に分析することもできる。このような金属ナノ粒子は、例えば、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、銅ナノ粒子等であり得るが、これに制限されるのではない。
【００３２】
前記信号発生物質が量子ドットナノ粒子の場合は、レセプターと分析対象物質の選択的な反応による量子ドットナノ粒子の蛍光を通じて分析対象物質を検出できる。
【００３３】
前記信号発生物質が磁気ナノ粒子の場合は、レセプターと分析対象物質の選択的な反応による磁気場の変化を通じて分析対象物質を検出できる。
【００３４】
前記信号発生物質が、酵素、酵素基質又は酵素反応生成物質の場合は、レセプターと分析対象物質の選択的な反応によって分析対象物質又はレセプターと前記酵素、酵素基質又は酵素反応生成物質が反応して酸化還元反応等のような酵素反応を起こすことになるが、このとき前記酵素反応による生成物の吸光、蛍光、発光等を測定することにより、分析対象物質を検出できる。このような酵素は、例えば、グルコースオキシダーゼ、グルコース脱水素酵素、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ等であり得るが、これに制限されるのではなく、酵素基質は、例えば、グルコース、過酸化水素等であり得るが、これに制限されるのではない。
【００３５】
これ以外にも、前記信号発生物質として当業界に公知の吸光物質、蛍光物質又は発光物質を使用でき、具体的な種類は当業者によって適切に選択され得る。本発明の一実施例によると、ルミノール（ｌｕｍｉｎｏｌ）を使用できるが、これに制限されるのではない。
【００３６】
本発明において分析対象物質が蛋白質抗原の場合、レセプターとして前記蛋白質に選択的な抗体がメンブレンに固定され、試料は前記蛋白質抗原と前記蛋白質抗原に選択的な抗体−金ナノ粒子接合体の混合物を使用することができる。前記接合体の抗体とメンブレンに固定された抗体は、それぞれ分析対象物質である蛋白質抗原と選択的に結合し、メンブレンに固定された抗体の位置でサンドイッチ形態（メンブレンに固定された抗体−蛋白質抗原−接合体の抗体−接合体の金ナノ粒子）で金ナノ粒子が結合され、前記金ナノ粒子の色変化によって分析対象物質を検出できる。このとき、多孔性フィルムの各孔毎に異なるレセプターを固定させると、各孔毎に異なる分析対象物質を検出できるため、孔の個数によって多成分の分析対象物質を測定できる。
【００３７】
本発明において、前記多孔性フィルム上に接合体パッドが形成されており、前記接合体パッドには信号発生物質；又は分析対象物質に選択的に結合する物質と信号発生物質の接合体が塗布されて乾燥されていることを特徴とし得る。
【００３８】
前記接合体パッドに信号発生物質が塗布されて乾燥されている場合は、例えば、前記信号発生物質が、酵素、酵素基質又は化学発光物質の場合、メンブレン上にレセプターと共に前記信号発生物質に反応する酵素基質又は酵素等を予め注入又は吸着させた後、試料を注入することにより酵素反応による信号発生物質の信号で分析対象物質を測定できる。前記接合体パッドに、分析対象物質に選択的に結合する物質と信号発生物質の接合体が塗布されて乾燥されている場合は、メンブレンセンサーに分析対象物質だけを垂直に落とすと、「レセプター−分析対象物質−接合体パッドに塗布されて乾燥されている分析対象物質に選択的に結合する物質と信号発生物質の接合体」の順序で結合されて、レセプターと分析対象物質の選択的な反応による信号発生物質の信号で分析対象物質を測定できる。
【００３９】
本発明において、前記接合体パッドとしては、接合体を塗布して乾燥した後、前記接合体パッドが液体にぬれると、接合体が接合体パッドから離れ易くなる物質であれば何れも使用でき、ＬＦＡシステムで一般的に使用される接合体パッドであれば全て使用できる。
【００４０】
本発明において、前記接合体パッド上にサンプルパッドが形成されていることを特徴とし得る。サンプルパッドは分析対象物質の異物質を取り除く役割をしてセンサーによるものより正確な測定を可能にする。例えば、分析対象物質が血液の場合、サンプルパッドは血液に含まれている血球又は血小板を取り除く役割をする（図２）。本発明においてサンプルパッドは、ＬＦＡシステムで使用するサンプルパッドを何れも使用できる。
【００４１】
本発明において、前記サンプルパッドには、信号発生物質；又は分析対象物質に選択的に結合する物質と信号発生物質の接合体が塗布されて乾燥されていることを特徴とし得る。
【００４２】
本発明において、メンブレンバイオセンサーは前記接合体パッドと多孔性フィルム間に流体の流れを良くするメンブレンを嵌めることを特徴とし得る。本発明の一実施例によると、例えば、スクリーンメッシュ（Ｚｏｎｙｌ  ＦＳＮ  １００，ＳＥＦＡＲ）、ｖｉｖｉｄメンブレン（Ｐａｌｌ，Ｖｉｖｉｄ  Ｐｌａｓｍａ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ−ＧＲ）等を使用できるが、これに制限されるのではなく、当業者によって適切に選択できる。
【００４３】
本発明において、メンブレンバイオセンサーは前記メンブレンを多孔性フィルムの各孔を含む領域に区画することを特徴とし得る。つまり、多孔性フィルムの各孔の下に流れる試料の流れを相互妨害しないために一つのメンブレン領域が一つの孔を含むようにメンブレンを区画できる。このような領域の区画によって多孔性フィルムの各孔の下にあるメンブレンの領域を相互分離するようにして、各孔の下に流れる試料が相互領域を与えないようにして測定の再現性を高めることができる。
【００４４】
前記メンブレンに領域を区画する方法は、当業界に公知の如何なる方法を用いても構わなく、当業者によって適切に選択できる。本発明の一実施例によると、前記メンブレンの領域を区画するためにレーザー加工機を使用できる。
【００４５】
本発明は、他の観点において、前記メンブレンバイオセンサーを用いるが、前記メンブレンバイオセンサーに試料を垂直に注入する段階を含む免疫反応測定方法に関するものである。
【００４６】
本発明は、また別の観点において、前記メンブレンバイオセンサーを用いるが、前記メンブレンバイオセンサーに試料を垂直に注入する段階を含む酵素反応の測定方法に関するものである。
【００４７】
例えば、グルコースを測定するために、多孔性フィルム下のメンブレンにレセプターとしてグルコース酸化酵素とペルオキシダーゼを固定し、ペルオキシダーゼの発色基質（例えば、ルミノール）が塗布されて乾燥された接合体パッドを前記多孔性フィルム上に形成した後、グルコースが含まれている試料を垂直に落とすと、グルコース酸化酵素によって生成された過酸化水素水と前記発色基質がペルオキシダーゼによって発光を誘発しグルコースを測定できる。
【００４８】
本発明にかかるメンブレンバイオセンサーは、前記メンブレンバイオセンサーに試料を垂直に注入することにより、少量の試料だけを利用して高感度で分析対象物質を測定できるだけでなく、早い時間内に分析対象物質を検出することができる。
【００４９】
本発明において、前記メンブレンバイオセンサーは各孔毎に相違する種類のレセプターが固定されていることを特徴とし得る。試料を前記メンブレンバイオセンサーに垂直に落とすと、各孔に固定された相違する種類のレセプターにそれぞれ選択的に結合する様々な分析対象物質を同時に検出できる。
【００５０】
以下、実施例を通じて本発明をより詳しく説明する。これら実施例は、単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されると解釈してはならないということは当業界で通常の知識を有する者において自明である。
【実施例１】
【００５１】
メンブレンバイオセンサーの製造及びこれを用いたｃＴｎＩ分析
【００５２】
１−１．金ナノ粒子−抗体接合体の合成
【００５３】
金ナノ粒子コロイド溶液（２０ｎｍ，ＢＢＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＧＢ）１ｍＬに０．１ＭのＢｏｒａｔｅ
ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．５）０．１ｍＬを入れ、１ｍｇ／ｍＬのａｎｔｉ−ｃＴｎＩ抗体（Ｈｙｔｅｓｔ，ＦＩＮ）１０μｌを入れて３０分間反応させた。前記反応後、１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ，Ｓｉｇｍａ，ＤＥ）をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ）に溶かした溶液０．１ｍＬを添加して１５分常温で反応させた。前記反応後、１０，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離して３回に亘って１０ｍＭのＰＢＳに溶かした１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ溶液１ｍＬを入れて精製・回収し、金ナノ粒子−抗体接合体を合成した。
【００５４】
１−２．メンブレンバイオセンサーの製造
【００５５】
ニトロセルロースメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，１８０ｓｅｃ  Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）を横、縦約２．５ｃｍ大の正方形に切断した。その後、０．１ｍｍ厚のポリアクリル両面テープを横、縦約１ｃｍ大の正方形に切断し、直径約０．４ｍｍ大の孔３つを開けて孔を形成し多孔性フィルムを製造した後、前記メンブレンに付けた。
【００５６】
前記メンブレンに結合された多孔性フィルムの３つの孔を通じて、レセプターとしてｃＴｎＩ抗体（ａｎｔｉ−ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｉポリクローナル抗体，Ｈｙｔｅｓｔ，ＦＩＮ）０．１ｍｇ／ｍＬ、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ，ＤＥ）０．１ｍｇ／ｍＬ及びＢＳＡ  １．０ｍｇ／ｍＬをそれぞれ０．５μｌずつ注入して乾燥した。１．０ｍｇ／ｍＬ濃度のＢＳＡで前記多孔性フィルムが結合されたメンブレンを濡らして再度乾燥することにより、多孔性フィルムを含むメンブレンバイオセンサーを製造した。
【００５７】
１−３．ｃＴｎＩ分析
【００５８】
０、０．１、１及び１０ｎｇ／ｍＬの濃度でｃＴｎＩを溶かした仮想血漿（１０ｍＭ  ＰＢＳ，１ｍｇ／ｍＬ  ＨＳＡ，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ）１５μｌと、前記１−１で製造された金ナノ粒子−抗体接合体溶液１０μｌを混合して１０分間静置し試料溶液を製造した。前記試料溶液を１−２で製造されたメンブレンバイオセンサーの多孔性フィルムに垂直に注入した。前記多孔性フィルムの孔を通じて試料溶液が注入され、３分程度過ぎたらほぼ全ての試料溶液が孔を通じて注入された。
【００５９】
図３は、試料を注入し３分経過後に測定した試料注入面（イ）、試料注入反対面（ロ）及び試料注入反対面の拡大イメージ（ハ）であり、Ｂ（レセプターとしてＢＳＡが固定された部分）、Ｃ（レセプターとしてａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧが固定された部分）は一定であるのに対し、Ｔ（レセプターとしてｃＴｎＩ抗体ポリクローナル抗体が固定された部分）はｃＴｎＩ濃度が増加することにより濃くなることが確認できた。
【００６０】
これに対して、次のように吸光度分析を行った。反応完了後、イメージを得てイメージ分析プログラム（Ｍｕｌｔｉ  ｇａｕｇｅ，Ｆｕｊｉ  Ｐｈｏｔｏ  Ｆｉｌｍ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を用いて結果値を分析した。信号分析は、反応部（Ｓｉｇｎａｌ）と反応部周囲（ｂａｃｋ
ｇｒｏｕｎｄ）の画素明暗度（ｐｉｘｅｌ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）の平均値を求め、二つの値の差を最終結果値として用いた。吸光度分析結果は表１の通りだった。
【００６１】
【表１】
2013512429.tif 000003
【実施例２】
【００６２】
メンブレンバイオセンサーの製造及びこれを用いたＣ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＲＰ）濃度分析
【００６３】
２−１．金ナノ粒子−抗体接合体の合成及び接合体パッドの製造
【００６４】
金ナノ粒子コロイド溶液（２０ｎｍ，ＢＢＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＧＢ）１ｍＬに０．１Ｍのホウ酸バッファ（ｐＨ８．５）０．１ｍＬを入れ、１ｍｇ／ｍＬのａｎｔｉ−ＣＲＰ抗体（Ａｂｃａｍ）１０μｌを入れて３０分間反応させた。前記反応後、１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｆｒｅｅ  Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ，Ｆｉｔｚｅｒａｌｄ）をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ）に溶かした溶液０．１ｍＬを添加して６０分間４℃で反応させた。前記反応後、１０，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離して３回に亘り１０ｍＭのＰＢＳに溶かした１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ溶液１ｍＬを入れて精製・回収し金ナノ粒子−抗体接合体を合成した。合成された金ナノ粒子−抗体接合体を２．５倍濃縮させた後、約７．５×３．５ｍｍに切断された接合体パッド（ｆｕｓｉｏｎ  ５，ｗｈａｔｍａｎ）に１０ｕＬずつ注入して乾燥した。
【００６５】
２−２．メンブレンバイオセンサーの製造
【００６６】
ニトロセルロースメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，２４０ｓｅｃ  Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）を約１５×１５ｍｍの大きさに切断し、レーザー加工機でメンブレンにＩ字形の線を引いた。０．１ｍｍ厚のポリアクリル両面接着剤テープを１０×１０ｍｍ大に切断し、０．５ｍｍ大の孔を左、右に２つ開けて孔を形成するようにフィルムを製造した後、前記メンブレンに付けた。この場合、接着剤の二つの孔が前記メンブレンに刻まれたＩ字形の左右それぞれに配置されるようにした。このようなことを行う理由は、二つの孔を通じて液体試料が流れるとき、各流れに影響を与え合わないようにするためである。前記メンブレンに結合された接着フィルムの一つの孔には、レセプターとしてａｎｔｉ−ＣＲＰポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）０．２ｍｇ／ｍＬを、また別の孔にはａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）０．２ｍｇ／ｍＬをそれぞれ５μｌずつ注入し、ＰＢＳバッファに１０ｍｇ／ｍＬの濃度に溶かしたＢＳＡを５μｌ、ＰＢＳバッファを１０μｌの順で注入し乾燥した。乾燥されたニトロセルロースメンブレンに６×３ｍｍ大に切断したスクリーンメッシュ（Ｚｏｎｙｌ  ＦＳＮ  １００，ＳＥＦＡＲ）、７．５×３．５ｍｍ大のｖｉｖｉｄメンブレン、２−１で製造された金ナノ粒子−抗体接合体が乾燥された接合体パッド（ｆｕｓｉｏｎ  ５，ｗｈａｔｍａｎ）、７．５×３．５ｍｍ大のサンプルパッド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の順でメンブレンの孔を覆うように積層してバイオセンサーを製造した。
【００６７】
２−３．ＣＲＰの分析及び信号の分析
【００６８】
０、０．０１、０．１、１、５及び１０μg／ｍＬの濃度にＣＲＰを溶かしたヒト血漿（ＣＲＰ  ｆｒｅｅ  ｓｅｒｕｍ）５０μｌをセンサーに注入し、反応時間の経過による吸光度を測定した。
【００６９】
図４のＣｏｎｔｒｏｌ領域（左側、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧが固定された部分）の場合、ＣＲＰ濃度と関係なく全て高い反応を示しているのに対し、Ｔｅｓｔ領域（右側、ａｎｔｉ−ＣＲＰポリクローナル抗体が固定された部分）はＣＲＰ濃度が０〜５μｇ／ｍＬの範囲では濃度増加によって信号が増加することが確認できた。
【００７０】
これに対して実施例１−３と同様な方法で吸光度分析をした結果、表２のようになった。
【００７１】
【表２】
2013512429.tif 000004
【００７２】
図５において、測定時間の経過により信号の大きさは増加するが、反応初期の３分が経過した後は反応が終了し、約１０分経過後にもその最終完了した反応吸光度がほぼ変化しないことが観察された。これは、反応開始後約３分以内の早い時間に測定結果を導出でき、反応終了後にも一定時間最終完了した反応信号が維持されるという事実を表している。
【００７３】
さらに、図６のように一般的なＬＦＡセンサーの測定領域に比べて本発明のセンサーの方がより広い測定可能範囲を有するということがわかる。このような結果は、本発明のセンサーが有する特性により早い時間に安定した測定結果を得ることができ、既存のセンサーと比較してより広い測定範囲を有するという長所がある。
【００７４】
比較例１：ＬＦＡバイオセンサーの製造及びこれを用いたＣ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＲＰ）濃度分析
【００７５】
１−１．金ナノ粒子−抗体接合体の合成及び接合体パッドの製造
【００７６】
前述の実施例２の２−２と同様な方法で金ナノ粒子−抗体接合体の合成及び接合体パッドを製造した。
【００７７】
１−２．ＬＦＡバイオセンサーの製造
【００７８】
ニトロセルロースメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，１８０ｓｅｃ  Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）を２５ｍｍ×３００ｍｍに切断した後、接着性のある３００ｍｍ×６０ｍｍのプラスチックカード（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に付けた。ディスペンサー（ｚｅｔａ  ｃｏ．）を用いてニトロセルロースメンブレン内にｃｏｎｔｒｏｌラインに１ｍｇ／ｍｌ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（ｓｉｇｍａ）、ベッドスピード７．０ｃｍ／秒、ポンプスピード０．８ｕｌ／ｃｍ、体積５０ｕｌを塗布し、ｔｅｓｔラインには１ｍｇ／ｍｌ  ａｎｔｉ−ＣＲＰポリクローナル抗体（ａｂｃａｍ）、ベッドスピード７．０ｃｍ／秒、ポンプスピード０．８ｕｌ／ｃｍ、体積５０ｕｌを塗布した。ニトロセルロースメンブレン上側方向には０．２ｍｍ程度重なるように吸収パッド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）をプラスチックカードに付けた後、３．５ｍｍ×６０ｍｍに切断した。切断された構造体のニトロセルロースメンブレン下側方向に３．８ｍｍ×６０ｍｍ大のインターパッド（ＭＦ１，ｗｈａｔｍａｎ）、金ナノ粒子−抗体接合体が乾燥された接合体パッド（ｆｕｓｉｏｎ  ５，ｗｈａｔｍａｎ）、サンプルパッド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の順でそれぞれ０．２ｍｍ程度重なるようにプラスチックカードに付けた。この完成した構造体をＬＦＡケース（インフォピア）に挿入してＬＦＡバイオセンサーを製造した。
【００７９】
１−３．ＣＲＰ分析及び信号分析
【００８０】
前述の実施例２の２−３と同様な方法でＣＲＰ信号を分析した。
図６は、ＬＦＡバイオセンサーを用いたＣＲＰ分析の結果、ＣＲＰ濃度が０．１〜１０μｇ／ｍＬの範囲でＣＲＰが検出されたことを示している。これに対して、実施例１−３と同様の方法で吸光度分析をした結果は、下記の表３に示した通りである。
【００８１】
【表３】
2013512429.tif 000005
【００８２】
図７に示したように、ＬＦＡセンサーはＣＲＰ濃度が０．１〜１０μｇ／ｍＬの場合に吸光度の違いが濃度に比例して表れないのに対し、本発明にかかるメンブレンセンサーはＣＲＰ濃度が０〜５μｇ／ｍＬの場合に濃度の増加によって吸光度も一緒に増加するため、ＬＦＡセンサーに比べて本発明のセンサーが分析対象物質の濃度に対してより広い測定可能範囲を有し、よって、分析対象物質をより正確に優れた感度で定量的に測定できるということが分かる。従って、本発明のセンサーは早い時間に安定した測定結果を得ることができるだけでなく、既存のＬＦＡセンサーに比べて検出範囲が広く、感度が高いため正確な定量分析ができるという長所がある。
【実施例３】
【００８３】
メンブレンバイオセンサーの製造及び酵素−化学発光（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｃｈｍｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を用いたＣ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＲＰ）濃度分析
【００８４】
３−１．バイオセンサーの製造
【００８５】
Ｄ−グルコース（Ｄｕｃｈｅｆａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ）とルミノール（Ｓｉｇｍａ）をそれぞれ５０ｍＭになるように０．１Ｍカーボネートバッファ（ｐＨ９．０）に溶かした後、７．５×３．５ｍｍに切断したサンプルパッド（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）に２０μｌずつ注入して乾燥した。ａｎｔｉ−ＣＲＰ抗体−ペルオキシダーゼ複合体（Ａｂｃａｍ）をＰＢＳバッファに２０μｇ／ｍＬの濃度に溶かした後、約７．５×３．５ｍｍの大きさに切断したＶｉｖｉｄメンブレン（Ｐａｌｌ，Ｖｉｖｉｄ  Ｐｌａｓｍａ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ−ＧＲ）に約７μｌを注入して乾燥した。
【００８６】
ニトロセルロースメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，２４０ｓｅｃ  Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）を約１５×１５ｍｍの大きさに切断し、レーザー加工機でメンブレンにＩ字形の線を引いた。０．１ｍｍ厚のポリアクリル両面接着剤テープを１０×１０ｍｍ大に切断し、０．５ｍｍ大の孔を左・右に２つ開けて孔を形成するようにフィルムを製造した後、前記メンブレンに付けた。この場合、接着剤の二つの孔が前記メンブレンに刻まれたＩ字形の左右それぞれに配置されるようにした。前記メンブレンに結合されたフィルムの２つの孔を通じて一方の孔にはレセプターとしてａｎｔｉ−ＣＲＰポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）０．５ｍｇ／ｍＬと２５０Ｕ／ｍＬのグルコースオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）混合液を、他方の孔には０．５ｍｇ／ｍＬ、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ，ＤＥ）と２５０Ｕ／ｍＬのグルコースオキシダーゼ混合液を１μｌずつ注入し、ＰＢＳバッファに１０ｍｇ／ｍＬの濃度に溶かしたＢＳＡを５μｌ、ＰＢＳバッファを１０μｌの順に注入して乾燥した。乾燥されたニトロセルロースメンブレンに６×３ｍｍ大に切断したスクリーンメッシュ（Ｚｏｎｙｌ  ＦＳＮ  １００，ＳＥＦＡＲ）、前記の製造されたａｎｔｉ−ＣＲＰ抗体−ペルオキシダーゼ複合体が乾燥されたｖｉｖｉｄメンブレン、前記の製造されたＤ−グルコース、ルミノールが乾燥されたサンプルパッドの順でメンブレンの孔を覆うように積層してバイオセンサーを製造した。
【００８７】
３−２．発光反応を用いたＣＲＰ信号分析
【００８８】
０、０．０１、０．１、１、５及び１０μｇ／ｍＬの濃度にＣＲＰを溶かしたＰＢＳバッファを５０μｌをセンサーに垂直に注入し、発光測定器（ＬＡＳ−３０００，ＦＵＪＩ  ＰＨＯＴＯ  ＦＩＬＭ  ＣＯ．，ＬＴＤ）を用いて時間経過による発光信号を測定した。
【００８９】
図８のＣｏｎｔｒｏｌ領域（左側，ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧとグルコースオキシダーゼが固定された部分）の場合、ＣＲＰ濃度と関係なく全て高い反応を示しているのに対し、Ｔｅｓｔ領域（右側，ａｎｔｉ−ＣＲＰポリクローナル抗体とグルコースオキシダーゼが固定された部分）の場合、ＣＲＰ濃度が０〜１μｇ／ｍＬの範囲では濃度の増加によって発光信号が増加することが確認できた。
【００９０】
これに対して発光度を分析し、その結果を図９及び下記表４に示した。測定時間の経過によって信号の大きさは増加するが、信号傾向性自体は３分と１５分にほぼ同一なことが分かり、よって試料注入後、約５分以内に測定結果を確認できると判断できる。
【００９１】
【表４】
2013512429.tif 000006
【実施例４】
【００９２】
メンブレンバイオセンサーの製造及び酵素−化学発光（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｃｈｍｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を用いたヒト血清におけるＤ−グルコース濃度分析
【００９３】
４−１．バイオセンサーの製造
【００９４】
ルミノール（Ｓｉｇｍａ）をそれぞれ５０ｍＭになるように０．１Ｍ  Ｃａｒｂｏｎａｔｅバッファ（ｐＨ９．０）に溶かした後、７．５×３．５ｍｍに切断されたサンプルパッド（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）に２０μＬずつ注入して乾燥した。
【００９５】
ニトロセルロースメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，２４０ｓｅｃ  Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）を約１５×１５ｍｍの大きさに切断し、レーザー加工機でメンブレンにＩ字形の線を引いた。０．１ｍｍ厚の両面接着剤テープを１０×１０ｍｍ大に切断し、０．５ｍｍ大の孔を左・右に２つ開けて孔を形成するようにフィルムを製造した後、前記メンブレンに付けた。この場合、接着剤の二つの孔が前記メンブレンに刻まれたＩ字形の左右それぞれに配置されるようにした。前記メンブレンに結合されたフィルムの２つの孔を通じて一方の孔にはグルコース分解酵素として２５０Ｕ／ｍＬのグルコースオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）と２５０Ｕ／ｍＬのペルオキシダーゼ（Ｔｏｙｏｂｏ）混合液を、他方の孔には２５０Ｕ／ｍＬのペルオキシダーゼ溶液を１μＬずつ注入して乾燥した。乾燥されたニトロセルロースメンブレンに６×３ｍｍ大に切断されたスクリーンメッシュ（Ｚｏｎｙｌ  ＦＳＮ  １００，ＳＥＦＡＲ）、約７．５×３．５ｍｍの大きさに切断されたＶｉｖｉｄメンブレン（Ｐａｌｌ，Ｖｉｖｉｄ  Ｐｌａｓｍａ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ−ＧＲ）、前記の製造されたルミノールが乾燥されたサンプルパッドの順でメンブレンの孔を覆うように積層してバイオセンサーを製造した。
【００９６】
４−２．発光反応を用いたＤ−グルコース信号分析
【００９７】
０、０．０４、０．２、１、５及び３０ｍＭの濃度にＤ−グルコースを溶かした正常ヒト血清（ＮＨＳ）（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）５０μＬをセンサーに垂直に注入し、発光測定器（ＬＡＳ−３０００，ＦＵＪＩ  ＰＨＯＴＯ  ＦＩＬＭ  ＣＯ．，  ＬＴＤ）を用いて測定試料注入後、１分後にＤ−グルコースの発光信号を測定した。
【００９８】
図１０のＣｏｎｔｒｏｌ領域（左側，ペルオキシダーゼだけ固定された部分）の場合、Ｄ−グルコース濃度と関係なく全ての反応が表れないのに対し、Ｔｅｓｔ領域（右側、グルコースオキシダーゼとペルオキシダーゼが固定された部分）の場合、Ｄ−グルコース濃度測定範囲（０〜３０ｍＭ）で濃度増加によって発光信号が増加することが確認できた。図１１は、Ｄ−グルコース濃度増加による発光信号の増加を表すグラフである。
【実施例５】
【００９９】
メンブレンバイオセンサーの製造及び酵素−発色反応（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｃｏｌｏｒ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を用いた対照血清のレベル１，レベル２の総コレステロール（Ｔｏｔａｌ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）反応の比較
【０１００】
５−１．バイオセンサーの製造
【０１０１】
ニトロセルロースメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，２４０ｓｅｃ  Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）を約１５×１５ｍｍの大きさに切断し、レーザー加工機でメンブレンに直径が２ｍｍになるように正三角形配列で３つの円を描いた。レーザー加工が完了したニトロセルロースメンブレンに、総コレステロールを測定するための反応溶液を製造してそれぞれの円に２μＬずつ注入して乾燥した。
【０１０２】
総コレステロール測定のために使用された反応溶液の組成及び含量は下記表５の通りである。
【０１０３】
【表５】
2013512429.tif 000007
【０１０４】
乾燥されたメンブレンの上に、０．１ｍｍ厚の両面接着剤テープを１０×１０ｍｍ大に切断し、１ｍｍ大の孔をそれぞれの円の中央に位置するように３つ開けて孔を形成するようにフィルムを製造した後、前記メンブレンに付け、５×５ｍｍ大に切断されたサンプルパッド（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を積層して製造した。
【０１０５】
５−２．対照血清レベル１、レベル２を用いた酵素発色反応の確認
【０１０６】
製造されたバイオセンサーに５０μＬのＬｉｐｉｄｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  レベル１とレベル２（ＬｉｑｕｉｃｈｅｋＴＭ，ＢＩＯ−ＲＡＤ）をそれぞれ注入してレベル１とレベル２の発色の程度を比較した。使用されたレベル１とレベル２のＣｏｎｔｒｏｌ  ｓｅｒｕｍは精度管理用血清であり、レベル１は正常範囲、レベル２は非正常範囲の高濃度コレステロールを含む。
【０１０７】
図１２のように、発色反応を通じてレベル１、レベル２の発色反応程度の差を確認した。総コレステロール濃度がより高いレベル２試料の色がより濃いことを確認した。
【０１０８】
以上にて、本発明の内容の特定部分を詳しく記述したが、当業界の通常の知識を有する者において、このような具体的な技術は単に好ましい実施様態であるだけで、これによって本発明の範囲が制限されるのではない点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は添付の請求項とそれらの等価物によって定義されると言える。
【符号の説明】
【０１０９】
１：メンブレン、１１：多孔性フィルム、２１，３１：レセプター、４１：試料、５１：接合体パッド、６１：サンプルパッド、Ｔ：レセプターとしてｃＴｎＩ抗体が固定された部分、Ｃ：レセプターとしてａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧが固定された部分、Ｂ：レセプターとしてＢＳＡが固定された部分
【図１】
2013512429.tif 000008
【図２】
2013512429.tif 000009
【図３】
2013512429.tif 000010
【図４】
2013512429.tif 000011
【図５】
2013512429.tif 000012
【図６】
2013512429.tif 000013
【図７】
2013512429.tif 000014
【図８】
2013512429.tif 000015
【図９】
2013512429.tif 000016
【図１０】
2013512429.tif 000017
【図１１】
2013512429.tif 000018
【図１２】
2013512429.tif 000019
【国際調査報告】
2013512429.tif 000020
2013512429.tif 000021
2013512429.tif 000022
2013512429.tif 000023
2013512429.tif 000024
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