(57)【要約】  人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を調製するための方法であって、少なくとも１種の幹細胞多能性因子を体細胞に導入するステップ（ステップ１）と、ステップ１で幹細胞多能性因子が導入された体細胞を、リチウム塩が添加された培地を用いて培養するステップ（ステップ２）と、人工多能性幹細胞の同定及び特徴付けを行うステップ（ステップ３）と、を含む方法が提供される。また、人工多能性幹細胞を調製するための培地であって、リチウム塩を含む培地が提供される。リチウム塩が添加された培地は、多能性幹細胞を効率よく誘導するために使用される。リチウム塩は、マウスｉＰＳ細胞の産生効率を５〜６０倍に増加させることができる。ｉＰＳ細胞を誘導するための本発明の方法は、ｉＰＳ技術の安全性の向上及び再生医学へのｉＰＳ細胞の応用に有利である。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工多能性幹細胞を調製するための方法であって、下記ステップを含む方法。
ステップ１：少なくとも１種の幹細胞多能性因子を体細胞に導入するステップ
ステップ２：ステップ１で幹細胞多能性因子が導入された体細胞を、リチウム塩が添加された培地を用いて培養するステップ
ステップ３：人工多能性幹細胞クローンの同定及び特徴付けを行うステップ
【請求項２】
人工多能性幹細胞の生成及び産生効率を示すために体細胞にレポーター遺伝子を導入するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
レポーター遺伝子はＯｃｔ４−ＧＦＰ又はＮａｎｏｇ−ＧＦＰ、好ましくはＯｃｔ４−ＧＦＰである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ１において、幹細胞多能性因子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ５、Ｎａｎｏｇ、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８及びＥｓｒｒｂからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ１において、幹細胞多能性因子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃであるか、又はＯｃｔ４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ステップ２において、リチウム塩は、塩化リチウム、炭酸リチウム、酢酸リチウム、臭化リチウム、アスパラギン酸リチウム、γ−リノレン酸リチウム、ヘパリンリチウム、硫酸リチウム、硝酸リチウム、及びリチウムイオンを含有する他の化学物質からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ステップ２においてリチウム塩は塩化リチウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ステップ２において、リチウム塩の濃度は０．１ｍＭ〜４０ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭ〜２０ｍＭ、より好ましくは５ｍＭ〜１０ｍＭ、最も好ましくは１０ｍＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ステップ２において、培地はｍＥＳ培地又はＫＳＲ培地であり、ｍＥＳ培地は、１５％ウシ胎児血清、１０００Ｕ／ｍＬ白血病抑制因子、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、ペニシリン／ストレプトマイシン、及びβ−メルカプトエタノールが添加されたＤＭＥＭであり、ＫＳＲ培地は、１５％血清代替物、１０００Ｕ／ｍＬ白血病抑制因子、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、ペニシリン／ストレプトマイシン、及びβ−メルカプトエタノールが添加されたＫｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ２は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃの４因子又はＯｃｔ４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４の３因子がステップ１で導入されたマウス胎仔線維芽細胞を、２日目にトリプシン処理し、フィーダー細胞上に播種し、ｍＥＳ培地を用いて培養し、３日目に、リチウム塩が添加されたｍＥＳ培地に培地を交換し、６日目に、リチウム塩が添加されたＫＳＲ培地に培地を交換し、８日目にＫＳＲ培地に培地を交換し、その後、優れた幹細胞様形態を有するコロニー又はＯｃｔ４−ＧＦＰ陽性コロニーを選択して継代培養に使用することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
体細胞は哺乳動物の体細胞である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
哺乳動物は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、サル又はヒトから選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
人工多能性幹細胞を調製するための培地であって、リチウム塩をさらに含む培地。
【請求項１４】
リチウム塩は、塩化リチウム、炭酸リチウム、酢酸リチウム、臭化リチウム、アスパラギン酸リチウム、γ−リノレン酸リチウム、ヘパリンリチウム、硫酸リチウム、硝酸リチウム、及びリチウムイオンを含有する他の化学物質からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１３に記載の培地。
【請求項１５】
リチウム塩は塩化リチウムである、請求項１３に記載の培地。
【請求項１６】
リチウム塩の濃度は０．１ｍＭ〜４０ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭ〜２０ｍＭ、より好ましくは５ｍＭ〜１０ｍＭ、最も好ましくは１０ｍＭである、請求項１３に記載の培地。
【請求項１７】
リチウム塩が添加されたｍＥＳ培地又はリチウム塩が添加されたＫＳＲ培地である、請求項１３に記載の培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬学及びバイオテクノロジーの分野に関する。より具体的には、人工多能性幹細胞の調製方法及び人工多能性幹細胞の調製用培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞は初期胚の内部細胞塊から生じる。胚性幹細胞は、自己複製すること、多能性を維持すること、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養される間に３種の胚葉の細胞に分化することができる。１９８１年のマウス胚性幹細胞及び１９９８年のヒト胚性幹細胞の樹立の成功［１、２］を受けて、再生医学の研究が真に始まった。胚性幹細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の出発細胞となり、臨床的移植用の細胞、組織又は器官に方向性をもって分化できることから、主に移植医療への応用が提唱されている。多くの特定の細胞型（例えば、神経細胞、心筋細胞）に関して、自己複製及び方向性のある分化のメカニズムに関する研究に基づいて種々の分化法が既に確立されている。これらの研究は、パーキンソン病、老人性認知症、心筋障害、糖尿病、肝硬変、及び他の疾患の治療に希望をもたらしている。しかし、胚性幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究から臨床応用に移行できるようにするには、多くの技術的課題及び倫理的問題（例えば、免疫拒絶のない胚性幹細胞を得る方法、患者に由来する胚性幹細胞を得る方法）が解決されなければならない。
【０００３】
Ｙａｍａｎａｋａらは、４種の転写因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃ）を過剰発現させることによって、マウス線維芽細胞が脱分化して、胚性幹細胞に類似した特徴を有する細胞（これは人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞と命名された。）になり得ることを２００６年に初めて報告した［３］。このＣｅｌｌの論文において、研究者らは、胚性幹細胞のシグナル調節に関与している２４種の遺伝子を候補遺伝子として最初に選択し、これらの遺伝子を運ぶレトロウイルスを用いてマウス線維芽細胞に形質導入し、細胞形態、胚性幹細胞に特異的な遺伝子の発現、奇形腫形成等に基づいて、ｉＰＳ細胞の多能性を特徴付けた。最終的に、２４種の候補遺伝子を、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃという４種の転写因子に絞り込んだ。研究者らは、この論文ではｉＰＳ細胞が関与したキメラマウスを得なかったが、幹細胞が分化細胞から直接得られるアプローチは、胚性幹細胞研究、さらに生命科学研究の世界に概念上の革新をもたらした。ｉＰＳ技術の出現は、ｉＰＳ細胞の生物医学的応用にも大きな関心を引き起こした。その理由は、患者の体細胞を供給源として用いて患者に特異的なｉＰＳ細胞を得ることができ、また、これらのｉＰＳ細胞が、疾患治療に使用可能な機能的な細胞、組織又は器官に分化できるからである。免疫適合性の問題や倫理的な問題はそのような応用によって回避することができる。
【０００４】
２００７年に、３つの異なる研究所が論文を発表し、生殖細胞系列に分化可能なマウスｉＰＳ細胞が得られたことを報告した［４〜６］。この後、いくつかの研究所が、ヒトｉＰＳ細胞が得られたことを報告した［７、８］。２００９年に、研究者らは、４倍体相補性アッセイによって生殖能力を有する完全なｉＰＳマウスを初めて得、これによりｉＰＳ細胞の分化全能性が実証された［９］。ｉＰＳは、多能性幹細胞を生じさせる技術として、臨床疾患の治療において計り知れない応用価値を有する。幹細胞を得るための従来の方法（例えば、核移植、細胞融合）とは異なり、ｉＰＳ細胞は、ヒト卵母細胞又はヒト胚性幹細胞に依存せずに得ることができる。また、体細胞をｉＰＳ細胞に再プログラム化することによって免疫学的拒絶を回避することができ、自家移植の実現可能性が高くなる。他方、ｉＰＳ細胞は、幹細胞の自己複製及びシグナル調節のメカニズムや多くの疾患のメカニズムの研究においても非常に重要である。
【０００５】
しかし、ｉＰＳ細胞の臨床応用には依然として２つの大きな障害、すなわち安全性への懸念及び低い誘導効率がある。バイオセーフティに関しては、初期の実験系で過剰発現した外来性遺伝子には２種の癌遺伝子（ｃ−Ｍｙｃ及びＫｌｆ−４）が含まれ、これらの外来性遺伝子はレトロウイルス感染により導入された。すなわち、ウイルス遺伝子の複数のコピーがゲノムに挿入される場合があり、これが遺伝子変異及び発癌を招く可能性がある。したがって、研究者らは、ｉＰＳ技術の応用の安全性を向上させるために、例えば、転写因子の数を絞り込むことによって［１０、１１］、あるいはゲノム中へのウイルス組込みを伴わない遺伝子トランスフェクション法を使用することによって［１２］、あるいは膜透過性転写因子タンパク質を直接添加して再プログラム化を誘導することによって［１３］ｉＰＳ技術を最適化することに取り組んだ。しかし、これらの方法は、ｉＰＳ細胞の誘導効率のさらなる低下をもたらした。現在のところ、ｉＰＳ細胞の生成効率は一般に１％未満であり、このことがｉＰＳ細胞の開発及び応用の主な障害となっている。そのため、研究者たちは、ｉＰＳ細胞の誘導効率を向上させ、また、ｉＰＳ細胞の基礎研究及び臨床応用を推し進める培養条件、方法又は低分子化合物を探し求めている。
【発明の開示】
【０００６】
すなわち、本発明者らは、先行技術に存在する問題を考慮して広範かつ集中的な研究を行い、本発明を完成させた。
【０００７】
ｉＰＳ細胞の生成効率を向上させるために、本発明は、人工多能性幹細胞を調製するための方法であって、下記ステップを含む方法を提供する。
ステップ１：少なくとも１種の幹細胞多能性因子を体細胞に導入するステップ
ステップ２：ステップ１で幹細胞多能性因子が導入された体細胞を、リチウム塩が添加された培地を用いて培養するステップ
ステップ３：人工多能性幹細胞クローンの同定及び特徴付けを行うステップ
【０００８】
好ましくは、この方法は、レポーター遺伝子を介して人工多能性幹細胞の生成及びその産生効率を示すために、体細胞にレポーター遺伝子を導入するステップをさらに含む。より好ましくは、レポーター遺伝子はＯｃｔ４−ＧＦＰ又はＮａｎｏｇ−ＧＦＰ、最も好ましくはＯｃｔ４−ＧＦＰである。
【０００９】
ステップ１において、幹細胞多能性因子のｃＤＮＡはウイルス感染によりマウス胎仔線維芽細胞に導入されるのが好ましい。
【００１０】
ステップ１において、好ましくは、幹細胞多能性因子は、例えば、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ５、Ｎａｎｏｇ、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８及びＥｓｒｒｂからなる群から選択される少なくとも１種である。より好ましくは、幹細胞多能性因子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃからなる群から選択される少なくとも１種である。最も好ましくは、幹細胞多能性因子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４からなる群から選択される少なくとも１種である。
【００１１】
好ましくは、ステップ２において、リチウム塩は、塩化リチウム、炭酸リチウム、酢酸リチウム、臭化リチウム、アスパラギン酸リチウム、γ−リノレン酸リチウム、ヘパリンリチウム、硫酸リチウム、硝酸リチウム、及びリチウムイオンを含有する他の化学物質からなる群から選択される。
【００１２】
より好ましくは、ステップ２においてリチウム塩は塩化リチウムである。
【００１３】
好ましくは、リチウム塩の濃度は０．１ｍＭ〜４０ｍＭである。より好ましくは、リチウム塩の濃度は０．５ｍＭ〜２０ｍＭである。さらに好ましくは、リチウム塩の濃度は１ｍＭ〜１０ｍＭである。さらに好ましくは、リチウム塩の濃度は５ｍＭ〜１０ｍＭである。最も好ましくは、リチウム塩の濃度は１０ｍＭである。
【００１４】
ステップ２で使用される培地は、例えば、１５％ウシ胎児血清、１０００Ｕ／ｍＬ白血病抑制因子（ＬＩＦ）、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、ペニシリン／ストレプトマイシン、及びβ−メルカプトエタノールが添加されたＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）（ｍＥＳ培地）、あるいは１５％血清代替物、１０００Ｕ／ｍＬ白血病抑制因子（ＬＩＦ）、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、ペニシリン／ストレプトマイシン、及びβ−メルカプトエタノールが添加されたＫｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭ（ＫＳＲ培地）である。
【００１５】
具体的には、ステップ２は下記操作を含むのが好ましい。
すなわち、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃの４因子又はＯｃｔ４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４の３因子がステップ１で導入されたマウス胎仔線維芽細胞を、ウイルス感染から２日目にトリプシン処理し、フィーダー細胞上に播種し、ｍＥＳ培地を用いて培養し、３日目に、リチウム塩が添加されたｍＥＳ培地に培地を交換し、６日目に、リチウム塩が添加されたＫＳＲ培地に培地を交換し、８日目にＫＳＲ培地に培地を交換する。
そして、優れた幹細胞様形態を有するコロニー又はＯｃｔ４−ＧＦＰ陽性コロニーを選択して継代培養に使用する。
【００１６】
「優れた幹細胞様形態を有するコロニー」とは、マウス胚性幹細胞の形態と比較した場合に細胞がそれと類似した形態を示すコロニーを意味する。「Ｏｃｔ４−ＧＦＰ陽性コロニー」とは、トランスジェニックＯｃｔ４−ＧＦＰレポーター遺伝子陽性コロニーを意味する。Ｏｃｔ４は胚性幹細胞に特異的な遺伝子であり、Ｏｃｔ４の発現は、マウス胎仔線維芽細胞が比較的正確な方法で多能性幹細胞に再プログラム化されていることを示す。
【００１７】
ステップ３において、人工多能性幹細胞コロニーの特徴付けの方法としては、ＡＰ染色、内在性Ｏｃｔ４発現の検出、定量的ＰＣＲによる多能性マーカー発現の検出、外来性ウイルス遺伝子のサイレンシングの検出、奇形腫形成、キメラ形成、及びジャームライントランスミッションの検出が挙げられる。
【００１８】
本発明の方法において、好ましくは、体細胞は哺乳動物の体細胞である。より好ましくは、哺乳動物は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、サル又はヒトである。
【００１９】
本発明はまた、人工多能性幹細胞を調製するための培地であって、リチウム塩をさらに含む培地を提供する。
【００２０】
好ましくは、リチウム塩は、塩化リチウム、炭酸リチウム、酢酸リチウム、臭化リチウム、アスパラギン酸リチウム、γ−リノレン酸リチウム、ヘパリンリチウム、硫酸リチウム、硝酸リチウム、及びリチウムイオンを含有する他の化学物質からなる群から選択される少なくとも１種である。
【００２１】
より好ましくは、リチウム塩は塩化リチウムである。
【００２２】
好ましくは、リチウム塩の濃度は０．１ｍＭ〜４０ｍＭである。より好ましくは、リチウム塩の濃度は０．５ｍＭ〜２０ｍＭである。さらに好ましくは、リチウム塩の濃度は１ｍＭ〜１０ｍＭである。さらに好ましくは、リチウム塩の濃度は５ｍＭ〜１０ｍＭである。最も好ましくは、リチウム塩の濃度は１０ｍＭである。
【００２３】
リチウム塩の濃度が４０ｍＭを超える場合、細胞は長期の培養の後に死滅する。リチウム塩の濃度が０．１ｍＭ未満である場合、ｉＰＳ細胞の産生効率を有意に高めることができない。
【００２４】
好ましくは、培地は、リチウム塩が添加されたｍＥＳ培地又はリチウム塩が添加されたＫＳＲ培地である。
【００２５】
本発明において、リチウム塩はｉＰＳ細胞の生成効率を高めることができる。リチウム塩添加培地が使用される実験群の誘導効率は、対照群の誘導効率と比較して約５倍（４因子導入群）又は約６０倍（３因子導入群）に増加することがフローサイトメトリー解析によって実証されている。また、再プログラム化時間は、ｉＰＳ誘導の間にリチウム塩を添加することによって短縮された。リチウム塩添加培地が使用される実験群では、感染８日目にＯｃｔ４−ＧＦＰ陽性コロニーが検出できる。他方、対照群では通常、Ｏｃｔ４−ＧＦＰ陽性コロニーは感染１０日目以降に検出される。リチウム塩の添加によって誘導されるｉＰＳ細胞は優れた分化全能性を有する。４因子又は３因子が形質導入されたｉＰＳクローンはキメラマウスを形成することができ、４因子ｉＰＳ細胞を用いて作り出したキメラマウスでは、ジャームライントランスミッション及び子孫の誕生が観察されている。本発明は、効率的なｉＰＳ細胞誘導方法を提供する。これらの方法は、ｉＰＳ細胞の基礎研究及び臨床応用を実質的に促進する可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】リチウム塩が添加された幹細胞培地を用いてｉＰＳ細胞の産生を促進するための実験手順を示すフローチャートである。
【図２】リチウム塩が添加された幹細胞培地を使用することによって、４因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃ）誘導ｉＰＳ細胞の生成効率が増加し、ｉＰＳ誘導時間が短縮されることを示す。Ａは、９６ウェルプレート上、１０ｍＭ  ＬｉＣｌで処理した１つのウェルの代表的な画像である。多くのＧＦＰ陽性コロニーが感染１０日目に形成された。Ｂは、Ｏｃｔ−ＧＦＰ陽性コロニーの統計学的データを示すグラフである。感染８日目に、ＬｉＣｌ処理ウェルでは約１０個のＯｃｔ−ＧＦＰ陽性コロニーが観察されたのに対し、対照ウェルではＧＦＰ陽性クローンがほとんど観察されなかったこと、感染１０日目に、ＬｉＣｌ処理ウェルでのＯｃｔ−ＧＦＰ陽性コロニーの数は約２０個に達したことを示す（＊はｐ＜０．０５を表す）。Ｃは、種々の濃度のＬｉＣｌを添加した際のＯｃｔ−ＧＦＰ陽性コロニーの統計学的データを示すグラフである。有意な用量効果が観察され、最も有意な効果は濃度１０ｍＭ（ＬｉＣｌ）で現れている（＊はｐ＜０．０５を表す）。
【図３】４因子誘導ｉＰＳ細胞の産生効率がリチウム塩の添加により増加することを示す、フローサイトメトリー解析の結果を示す。Ａは、ＦＡＣＳ解析により測定したＧＦＰ陽性細胞の割合（％）を示すグラフである。細胞は感染１２日目にトリプシン処理及び回収されている。Ｂは、３回の独立した実験の統計学的データを示すグラフである（＊＊＊はｐ＜０．００１を表す）。
【図４】リチウム塩が添加された幹細胞培地を使用することによって、３因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４）誘導ｉＰＳ細胞の産生効率が増加することを示す。Ａは、Ｏｃｔ−ＧＦＰ陽性コロニーの統計学的データを示すグラフである。感染１４日目のｉＰＳ細胞の産生効率が５ｍＭ又は１０ｍＭのＬｉＣｌによって高められる。Ｂは、フローサイトメトリーにより測定したＧＦＰ陽性細胞の割合（％）を示すグラフである。細胞は感染１６日目にトリプシン処理及び回収されている（＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を表す）。
【図５】アルカリホスファターゼ染色及び免疫蛍光染色の結果を示す。上：ｉＰＳ細胞が、胚性幹細胞に類似した形態を有し、Ｏｃｔ４−ＧＦＰを強く発現すること、これらの細胞におけるアルカリホスファターゼ染色が陽性かつ均一であることを示す。中央及び下：幹細胞に特異的なタンパク質Ｎａｎｏｇ及びＳＳＥＡ−１の免疫蛍光染色を示す。ｉＰＳ細胞は両方の幹細胞マーカーを発現している。
【図６】幹細胞に特異的な遺伝子の発現及び外来性ウイルス遺伝子のサイレンシングを確認する、定量的ＰＣＲによる解析を示す。Ａは、幹細胞に特異的な遺伝子の発現を示す。マウス胎仔線維芽細胞が陰性対照として、マウス胚性幹細胞株Ｅ１４細胞が陽性対照として使用されている。４因子＋リチウム塩により誘導されたｉＰＳクローン及び３因子＋リチウム塩により誘導されたｉＰＳクローンはいずれも、幹細胞に特異的な遺伝子（内在性Ｏｃｔ４遺伝子、内在性Ｓｏｘ２遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子及びＲｅｘ１遺伝子を含む。）を高度に発現している。Ｂは、外来性ウイルス遺伝子のサイレンシングを示す。ウイルスに４日間感染させたマウス胎仔線維芽細胞が陽性対照として、ＥＳ細胞が陰性対照として使用されている。４因子＋リチウム塩により誘導されたｉＰＳクローン及び３因子＋リチウム塩により誘導されたｉＰＳクローンはいずれも、外来性ウイルス遺伝子の優れたサイレンシングを示している。
【図７】奇形腫形成アッセイの結果を示す。奇形腫は、４因子＋リチウム塩により誘導されたｉＰＳ細胞から形成される。組織構造により判断すると、ｉＰＳ細胞は、次の３種の胚葉の特定の構造に分化できる。左：表皮様構造（外胚葉）；中央：筋肉及び軟骨様構造（中胚葉）；右：消化管の管腔構造（内胚葉）。
【図８】４因子＋リチウム塩により誘導されたｉＰＳ細胞のキメラ形成アッセイ及びジャームライントランスミッションアッセイの結果を示す。左：４因子＋リチウム塩により誘導されたｉＰＳ細胞がジャームライントランスミッションの能力を有することを示す。右：３因子＋リチウム塩により誘導されたｉＰＳ細胞がキメラ形成の能力を有することを示す。
【詳細な説明】
【００２７】
定義及び技術：
本発明の実験で使用される分子生物学、微生物学、細胞生物学、免疫学及びＤＮＡ組換えの従来の技術は、特に断らない限り当分野の技術範囲に入る。参考文献としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），２００２；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７））；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）等の一連の文献；ＰＣＲ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ（１９９５））；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７））；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，Ｖｏｌ．２（Ｗ．Ｆｒｅｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）が挙げられる。
【００２８】
特に断らない限り、本明細書中の用語はすべて、当業者が通常理解する意味を有する。本発明の理解を助けるために、本明細書で使用される用語の一部を以下に定義する。
【００２９】
本明細書において、「人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）」とは、幹細胞多能性因子が導入された体細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの再プログラム化から得られる細胞を意味する。このような細胞は、細胞形態、増殖特性、特定遺伝子の発現、ＤＮＡメチル化の様式等、多くの面でマウスＥＳ（胚性幹）細胞に非常に類似しており、また、ＥＳ細胞の培養条件下では、奇形腫形成、キメラ動物形成、ジャームライントランスミッション等の面でマウスＥＳ細胞に非常に類似している。
【００３０】
本明細書において、「体細胞再プログラム化の誘導のための幹細胞多能性因子」とは、幹細胞多能性を維持する上で重要な因子である。体細胞は、これらの因子を体細胞に導入することによって幹細胞に再プログラム化できる。多くの因子が、体細胞の再プログラム化を誘導する能力を有するものとして報告されている［１４〜１８］。好ましくは、多能性因子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２（又はＳｏｘ１）、Ｋｌｆ４（又はＫｌｆ２又はＫＬＦ５）、Ｎａｎｏｇ、ｃ−Ｍｙｃ（又はＬ−Ｍｙｃ又はＮ−Ｍｙｃ）、Ｌｉｎ２８及びＥｓｒｒｂからなる群から選択される少なくとも１種である。幹細胞多能性因子は任意の所望の種に由来してもよく、マウス幹細胞多能性因子が好ましい。
【００３１】
本明細書において、「再プログラム化の誘導」（場合により単に「誘導」という。）とは、体細胞を脱分化させて多能性幹細胞にするプロセスを意味する。好ましくは、幹細胞多能性を維持するのに不可欠な多能性因子のｃＤＮＡを体細胞に導入することによって、体細胞は脱分化して多能性幹細胞になるように誘導される。好ましくは、多能性因子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２（又はＳｏｘ１）、Ｋｌｆ４（又はＫｌｆ２又はＫｌｆ５）、Ｎａｎｏｇ、ｃ−Ｍｙｃ（又はＬ−Ｍｙｃ又はＮ−Ｍｙｃ）、Ｌｉｎ２８及びＥｓｒｒｂからなる群から選択される少なくとも１種である。
【００３２】
幹細胞多能性因子のｃＤＮＡの体細胞への導入は、種々の方法（例えば、ウイルス感染、リポソームトランスフェクション、エレクトロポレーション、微粒子銃、トランスポゾンを介した挿入発現、膜透過性タンパク質、薬物による誘導）で行うことができる。ｃＤＮＡを含むウイルスベクターがトランスフェクションに使用されるのが好ましい。ウイルスベクターとしては、例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスが挙げられる。レトロウイルスベクター（ＰＭＸベクター）を使用するのが好ましい。
【００３３】
本明細書において、「培地」は、例えば、１５％ウシ胎児血清、１０００Ｕ／ｍＬ白血病抑制因子（ＬＩＦ）、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、ペニシリン／ストレプトマイシン、及びβ−メルカプトエタノールが添加されたＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）（ｍＥＳ培地）、あるいは１５％血清代替物、１０００Ｕ／ｍＬ白血病抑制因子（ＬＩＦ）、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、ペニシリン／ストレプトマイシン、及びβ−メルカプトエタノールが添加されたＫｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭ（ＫＳＲ培地）である。
【００３４】
本明細書において、「レポーター遺伝子」は、細胞が胚性幹細胞類似の細胞に形質転換された状態を示すことができる。レポーター遺伝子は、遺伝子導入又は相同組換えの手法を用いて導入された蛍光タンパク質配列又は抗生物質耐性遺伝子配列を含む。蛍光タンパク質配列又は抗生物質耐性遺伝子配列は、胚性幹細胞に特異的な遺伝子のプロモーターの制御下にあり、それ故、細胞が胚性幹細胞に類似した状態となった場合に蛍光タンパク質遺伝子又は抗生物質耐性遺伝子の発現が活性化され、その結果、細胞は検出可能な特徴を有するようになる。この実施形態において、使用されるマウス胎仔線維芽細胞は、ホモ接合性のＯＧ２（Ｏｃｔ４−ＧＦＰ＋／＋）雄マウスを雌の１２９マウスと交配することによって得られた１３．５日目の胚から単離されたＯＧ２（Ｏｃｔ４−ＧＦＰ＋／−）細胞である。
【００３５】
本発明において、細胞多能性の検出法（例えば、ＡＰ染色、細胞蛍光染色、幹細胞に特異的な遺伝子の発現及びウイルス遺伝子のサイレンシングに関する定量的ＰＣＲ解析、ｉｎ  ｖｉｖｏの奇形腫形成解析、キメラ形成解析、ジャームライントランスミッション検出）は当業者により首尾よく適用される。
【実施例】
【００３６】
以下の実施例は、本発明者らが行った標準的な実験操作を例示するために提供される。以下の実施例は例示的なものにすぎず、本発明はこれらの実施例に限定されるものではないことは理解されるべきである。
【００３７】
本発明において使用される技術の概要：
本明細書に記載の各物質は、特に断らない限り、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されているものである。
【００３８】
レトロウイルスの作製及びｉＰＳ細胞の生成のための実験手順：
製造業者のプロトコールに従い、Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、マウスＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−ＭｙｃのｃＤＮＡを含むｐＭＸｓレトロウイルスベクター（Ａｄｄｇｅｎｅから購入）をｐｌａｔ−Ｅ細胞にトランスフェクトすることによって、レトロウイルスを得た。４８時間後、ウイルスを含有する上清を回収し、濾過した。濾過した上清に８ｍｇ／Ｌのポリブレンを添加し、次いで、マウス胎仔線維芽細胞を感染させるために使用した。ウイルスを含有する上清を添加する日を「０日目」として数える。ウイルスに感染した線維芽細胞をｍＥＳ培地中で培養し、感染１４日目〜１８日目（４因子感染実験）又は感染２０日目〜２４日目（３因子感染実験）に、Ｏｃｔ−ＧＦＰの発現及び幹細胞の典型的な形態に基づいてｉＰＳコロニーを採取した。
【００３９】
再プログラム化効率の測定のための実験手順：
再プログラム化効率の算定は、主として、Ｏｃｔ−ＧＦＰ陽性細胞を計数することによって行う。例えば、１．フローサイトメトリーを用いて、４因子に１０〜１２日間又は３因子に１４〜１６日間感染させた細胞培養物中のＯｃｔ−ＧＦＰ陽性細胞の割合を測定する。あるいは、２．蛍光顕微鏡を用いてウェル中のＯｃｔ−ＧＦＰ陽性コロニーを直接計数する。
【００４０】
ｉＰＳ細胞の特徴付けのための実験手順：
幹細胞マーカータンパク質のアルカリホスファターゼ染色、蛍光染色、多能性遺伝子の発現、ウイルス遺伝子のサイレンシング、奇形腫形成、キメラ形成及びジャームライントランスミッションの確認を行う［１９、２０］。
【００４１】
実施例１：
リチウム塩が添加された幹細胞培地は４因子誘導ｉＰＳ細胞の形成を促進できる。
【００４２】
ａ．Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４又はｃ−Ｍｙｃを有する同体積のウイルスを混合し、６ウェルプレートの１つのウェル中の合計１８０，０００個のＯＧ２マウス胎仔線維芽細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２で、１０％ウシ胎児血清が添加されたＤＭＥＭ培地中で細胞を培養した。ウイルス感染の日を「０日目」として数えた。２日目に、細胞をトリプシン処理し、ｍＥＳ培地に再懸濁し、次いで、放射線照射したマウス胎仔線維芽細胞フィーダーを予め播種した９６ウェルプレートに５，０００個／ウェルの密度で細胞を播種した。種々の濃度のＬｉＣｌ（０．６ｍＭ、１．２ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ及び４０ｍＭ）が添加されたｍＥＳ培地を３日目から使用した。６日目に、種々の濃度のＬｉＣｌ（０．６ｍＭ、１．２ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ及び４０ｍＭ）が添加されたＫＳＲ培地に培地を交換した。８日目に、培地を再びＫＳＲ培地に交換した。プロセス全体を図１に示す。
【００４３】
ｂ．ステップａの方法を用いて、８日目からＯｃｔ−ＧＦＰ陽性コロニーを観察し、倒立型蛍光顕微鏡で毎日計数し、蛍光顕微鏡を用いて写真を撮影した。図２Ａは、１０日目の９６ウェルプレートのウェルの代表的な画像であり、未処理のウェルよりも１０ｍＭ  ＬｉＣｌで処理したウェルの方が多くのＧＦＰ陽性コロニーが存在した。図２Ｂは、Ｏｃｔ−ＧＦＰ陽性コロニーの統計学的データを示す。８日目に、対照ウェルではＧＦＰ陽性コロニーがほとんど観察されなかったのに対し、１０ｍＭ  ＬｉＣｌで処理したウェルでは約１０個のＧＦＰ陽性コロニーが観察された。１０日目に、１０ｍＭ  ＬｉＣｌで処理したウェルでは約２０個のＧＦＰ陽性コロニーが観察され、誘導効率は対照ウェルの誘導効率の５〜６倍であった。図２Ｃは、種々の濃度のＬｉＣｌ（０．６ｍＭ、１．２ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ及び４０ｍＭ）での処理後に生成した陽性コロニーの数を示す。顕著な用量効果が観察され、ＬｉＣｌの最も有効な用量は１０ｍＭであった。
【００４４】
ｃ．ステップａの方法を用いて、１２日目に細胞をトリプシン処理し、フローサイトメトリーによりＯｃｔ−ＧＦＰ陽性細胞の割合を測定した。図３Ａは、代表的なＦＡＣＳプロットである。図３Ｂは、３回の独立した実験の統計学的データを示す。これらのデータは、４因子を用いて再プログラム化を誘導した場合、１０ｍＭ  ＬｉＣｌで処理したウェルの誘導効率は、処理無しのウェルの誘導効率に比べて５〜６倍に増加したことを示している。
【００４５】
実施例２：
リチウム塩が添加された幹細胞培地は３因子誘導ｉＰＳ細胞の形成を促進できる。
【００４６】
ａ．Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２又はＫｌｆ４を有する同体積のウイルスを混合し、６ウェルプレートの１つのウェル中の合計１８０，０００個のＯＧ２マウス胎仔線維芽細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２で、１０％ウシ胎児血清が添加されたＤＭＥＭ培地中で細胞を培養した。ウイルス感染の日を「０日目」として数えた。２日目に、細胞をトリプシン処理し、ｍＥＳ培地に再懸濁し、放射線照射したマウス胎仔線維芽細胞フィーダーを予め播種した９６ウェルプレートに５，０００個／ウェルの密度で細胞を播種した。種々の濃度のＬｉＣｌ（０．６ｍＭ、１．２ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ及び４０ｍＭ）が添加されたｍＥＳ培地を３日目から使用した。６日目に、種々の濃度のＬｉＣｌ（０．６ｍＭ、１．２ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ及び４０ｍＭ）が添加されたＫＳＲ培地に培地を交換した。８日目に、培地を再びＫＳＲ培地に交換した。プロセス全体を図１に示す。
【００４７】
ｂ．ステップａの方法を用いて、１２日目からＯｃｔ−ＧＦＰ陽性コロニーを観察し、倒立型蛍光顕微鏡で毎日計数し、蛍光顕微鏡を用いて写真を撮影した。図４Ａに示されるように、１４日目に、対照群と比較して、５ｍＭ又は１０ｍＭのＬｉＣｌで処理したウェルでのｉＰＳ細胞の誘導効率は有意に向上しており、１０ｍＭのＬｉＣｌで処理したウェルでのｉＰＳ細胞の誘導効率は約７倍に増加していた。
【００４８】
ｃ．ステップａの方法を用いて、１６日目に細胞をトリプシン処理し、フローサイトメトリーによりＯｃｔ−ＧＦＰ陽性細胞の割合を測定した。図４Ｂに示されるように、対照群でのＯｃｔ−ＧＦＰ陽性細胞の割合はわずか０．２４％であったのに対し、実験群では、１０ｍＭのＬｉＣｌで処理したＯｃｔ−ＧＦＰ陽性細胞の割合が１４．５％に達し、約６０倍に増加していた。
【００４９】
実施例３：
リチウム塩の添加によって得られるｉＰＳ細胞株は多能性を有する。
【００５０】
ａ．上述のように、マウス胎仔線維芽細胞をＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃの４因子又はＯｃｔ４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４の３因子に感染させ、ＬｉＣｌが添加された幹細胞培地中で培養した。感染１４日目（４因子の場合）又は感染２０日目（３因子の場合）に、形態及び蛍光発現に基づいて代表的なコロニーを選び出し、これらのコロニーを用いて、継代培養により同種のｉＰＳ細胞株を生成させた。
【００５１】
ｂ．樹立されたｉＰＳ細胞株を形態の観点から観察し、染色して幹細胞に特異的なタンパク質を検出した。図５に示されるように、ｉＰＳ細胞は、胚性幹細胞に類似した特徴的な形態を有し、Ｏｃｔ−ＧＦＰを強く発現し、かつアルカリホスファターゼ（ＡＰ）染色が陽性であった。幹細胞に特異的なタンパク質に対する抗体を用いてｉＰＳ細胞の免疫蛍光染色を行った。結果は、ｉＰＳ細胞が幹細胞に特異的なタンパク質Ｎａｎｏｇ及びＳＳＥＡ−１を発現したことを示していた。
【００５２】
ｃ．ｉＰＳ細胞からＲＮＡを抽出する前に、差次接着法を用いてフィーダー細胞を除去した。製造業者のプロトコールに従い、トリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）試薬を用いて全ＲＮＡを抽出した。プライムスクリプト（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ）（商標）キット（Ｔａｋａｒａ  ｃｏ．）を用いて逆転写を行った。ジャンプスタート（ＪｕｍｐＳｔａｒｔ）（商標）タックレディミックス（ＴａｑＲｅａｄｙ  Ｍｉｘ）（商標）キット（Ｓｉｇｍａ  ｃｏ．）及びＭｘ３０００Ｐサーマルサイクラー（ＡＢＩ  ｃｏ．）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。製造業者のプロトコールに従って一般的なＰＣＲ条件を使用した。ｉＰＳに特異的な遺伝子を同定するためのプライマーを表１に列挙した。
【００５３】
【表１】
2013545480.tif 000003
【００５４】
図６Ａに示されるように、本発明の方法により得られたｉＰＳ細胞は、内在性Ｏｃｔ４、内在性Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ及びＲｅｘ１を含む多能性因子を高レベルで発現し、それらの発現レベルは胚性幹細胞株Ｅ１４での発現レベルに匹敵していた。これに反して、これらの因子の発現は、元のマウス胎仔線維芽細胞では検出不可能であった。他方、図６Ｂに示されるように、本発明の方法により得られたｉＰＳ細胞はウイルス遺伝子をかなり上手くサイレンシングできた。これは、細胞が完全に幹細胞に再プログラム化されたことを示している。
【００５５】
ｄ．リチウム塩の添加により得られたマウス４因子誘導ｉＰＳ細胞をトリプシン処理し、ｉＰＳ細胞約１×１０６個をｍＥＳ培地２００μｌに再懸濁し、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの大腿内の筋肉に注入した。４〜５週間後、マウスを屠殺し、奇形腫をパラフィンに包埋し、薄片に切り、ＨＥ染色して解析した。図７に示されるように、３種の胚葉に由来する組織が、ｉＰＳ細胞から形成された奇形腫の切片中に存在した。それらの組織には、外胚葉に相当する表皮様組織、中胚葉に相当する筋肉及び軟骨様組織、及び内胚葉に相当する消化管の管腔様組織が含まれる。したがって、マウス胚性幹細胞と同様に、リチウム塩の添加により得られたマウス４因子誘導ｉＰＳ細胞は多能性であり、３種の胚葉の異なるタイプの細胞をもたらした。
【００５６】
ｅ．リチウム塩の添加により得られたマウス４因子誘導ｉＰＳ細胞をＩＣＲマウスの胚盤胞に注入し、胚盤胞中のマウス胚性幹細胞と混合した。次いで、正常に発達させるために、偽妊娠している雌ＩＣＲマウスの子宮に胚盤胞を移植した。仔マウスの毛色を観察して、キメラが形成されたかどうかを判断した。キメラが検出された場合、それらのキメラを白色ＩＣＲマウスと交配し、子孫動物の毛色を観察して、ジャームライントランスミッションが起こったかどうかを判断した。図８に示されるように、３因子ｉＰＳ細胞及び４因子ｉＰＳ細胞はいずれもキメラマウスを作り出すことができた。また、４因子ｉＰＳ細胞により生成されたキメラマウスの子孫に黒色マウスが現れた。これらの結果から、リチウム塩の添加により得られたｉＰＳ細胞が実際に生殖細胞系列をもたらすことが確認された。このことは、これらの細胞が多能性を有し、胚性幹細胞に非常に類似していることを示している。
【００５７】
要するに、本発明のリチウム塩添加培地を使用することによって、ｉＰＳ細胞を効率的に生成させることが可能となる。リチウム塩で処理した実験群の誘導効率は、対照群の誘導効率の５〜６倍（４因子誘導アッセイ）及び約６０倍（３因子誘導アッセイ）に増加することがフローサイトメトリー解析の結果により実証されている。また、再プログラム化時間は、ｉＰＳ誘導の間にリチウム塩を添加することによって短縮できる。リチウム塩で処理した実験群では感染８日目にＯｃｔ４−ＧＦＰ陽性コロニーが検出されるのに対して、対照群では１０日目までＯｃｔ４−ＧＦＰ陽性コロニーは見られない。リチウム塩を用いて誘導されるｉＰＳ細胞は優れた多能性を有する。４因子又は３因子が形質導入されたｉＰＳクローンはキメラマウスを形成することができ、４因子ｉＰＳ細胞を用いて生成させたキメラマウスにおいてジャームライントランスミッション及び子孫の誕生が観察されている。本発明は効率的なｉＰＳ細胞誘導方法を提供する。本発明の方法は、ｉＰＳ細胞の基礎研究及び臨床応用を実質的に促進する可能性がある。
【００５８】
上述の内容は、本発明の好ましい例にすぎず、本発明の権利の範囲を限定するものでないことは明らかである。したがって、本発明の特許請求の範囲に従って行われる同等の変更もまた本発明の範囲に包含される。
【００５９】
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１４．  Ｅｓｔｅｂａｎ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｃ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，２０１０．  ６（１）：ｐ．７１−９．
１５．  Ｉｃｈｉｄａ，Ｊ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｇｆ−Ｂｅｔａ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｒｅｐｌａｃｅｓ  ｓｏｘ２  ｉｎ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｂｙ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｎａｎｏｇ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，２００９．  ５（５）：ｐ．４９１−５０３．
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【図１】
2013545480.tif 000004
【図２】
2013545480.tif 000005
【図３】
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【図４】
2013545480.tif 000007
【図５】
2013545480.tif 000008
【図６】
2013545480.tif 000009
【図７】
2013545480.tif 000010
【図８】
2013545480.tif 000011
【配列表】
2013545480000001.app
【国際調査報告】
2013545480.tif 000012
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2013545480.tif 000014
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