(57)【要約】  本発明は、１，３−プロパンジオール（PDO）の生産に有用なクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）の集団に関し、該集団は、表１で確認された変異体から選択された少なくとも一つのクロストリジウム・アセトブチリカムｓｐ．菌株を含み、該変異体の相対割合は特異的遺伝子から選択される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１，３−プロパンジオール（PDO）の生産に有用なクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）の集団であって、該集団は表１に示される変異体から選択される少なくとも一つのクロストリジウム・アセトブチリカムｓｐ．菌株を含み、前記変異体には相対割合で以下の遺伝子ファミリーが存在してなる、集団：
【表１】
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【請求項２】
-  受託番号I-4378としてCNCMに寄託されたDG1 pSPD5 PD0001VE05c01株；
-  受託番号I-4379としてCNCMに寄託されたDG1 pSPD5 PD0001VE05c05株；
-  受託番号I-4380としてCNCMに寄託されたDG1 pSPD5 PD0001VE05c07株
からなる群から選択されるクロストリジウム・アセトブチリカムの少なくとも一つの菌株を含んでなる、請求項１に記載の集団。
【請求項３】
前記菌株が、以下の点変異のうち少なくとも一つの変異をさらに有してなる、請求項１または２に記載の集団：
-  真核性のグルコキナーゼ調節遺伝子（炭水化物代謝）のホモログである推定糖リン酸イソメラーゼをコードする、クロストリジウム・アセトブチリカムゲノムのCA_C0175遺伝子座（locus）198989位でCがTに置換される 
-  RNAポリメラーゼシグマ因子RPOD（転写および翻訳制御）をコードする、クロストリジウム・アセトブチリカムゲノムのCA_C1300遺伝子座1444099位でGがAに置換される
-  Glu-tRNAGlnアミドトランスフェラーゼのサブユニットA（転写および翻訳制御）をコードする、クロストリジウム・アセトブチリカムゲノムのCA_C2670遺伝子座2787387位でCがTに置換される
-  ABCトランスポーター（２つのATPアーゼドメイン）のATPアーゼ成分をコードする、クロストリジウム・アセトブチリカムゲノムのCA_C3339遺伝子座3512658位でCがTに置換される
-  分岐鎖アミノ酸パーミアーゼ（トランスポーター）をコードする、クロストリジウム・アセトブチリカムゲノムのCA_C1610遺伝子座1752341位でCがTに置換される。
【請求項４】
唯一の炭素源としてグリセリンを含んでなる培養培地中で請求項１〜４のいずれか一項に記載の集団を培養し、かつ、培養培地から産生される１，３−プロパンジオールを回収することを含んでなる、１，３−プロパンジオールの産生方法。
【請求項５】
１，３−プロパンジオールがさらに精製される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
培養培地中における前記グリセリン濃度が９０と１２０ｇ／Ｌグリセリンの間、好ましくは約１０５ｇ／Ｌグリセリンである、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記グリセリンが工業用グリセリンにより提供される、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記工業用グリセリンが、バイオディーゼル生産の副産物である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記培養培地が、有機窒素を添加していない合成培地である、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１，３−プロパンジール生産のための新規に改変された微生物に関する。この微生物は増殖および高グリセリン濃度、特に工業用グリセリンの高濃度、の培地からの１，３−プロパンジオールの生産に適合している。また、本発明は、上記適合された微生物の培養条件および１，３−プロパンジオール生産のための製造プロセスにも関する。最後に、本発明は、改変された微生物により得られた１，３−プロパンジオールおよびその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
１，３−プロパンジオール（1,3-propanediol (PDO)）は、トリメチレングリコールやプロピレングリコールとも呼ばれ、最も古くから知られている発酵生成物のひとつである。クロストリジウム・パストゥリアヌム（Clostridium pasteurianum）を含んでいるグリセリン発酵培地中において、オーガスト  フロイドにより早くも１８８１年には最初に確認された。PDOはグリセリン発酵の典型的な生成物であり、他の有機基質の嫌気的変換において発見されている。極めて僅かな有機体（それらは全て微生物である）しかそれを生成できない。それらは、クレブシエラ（Klebsiella ）属（Ｋ．ニューモニエ（K. pneumoniae））、エンテロバクテリウム（Enterobacter）属（Ｅ．アグロメランス（E. agglomerans））そしてシトロバクテリア（Citrobacter）属（（C. freunddi））、ラクトバシラス（Lactobacilli）属（Ｌ．ブレビス（L. brevis ）およびＬ．ブチネリ（L. buchneri））、そしてＣ．ブチリカム（C. butyricum）およびＣ．パストゥリアヌム（C. pasteurianum）に属するクロストリジウム（Clostridia）属を包含する。
【０００３】
PDOは、二元機能有機化合物として、多くの合成反応、特にポリエステル、ポリエーテル、ポリウレタン、そして特に、ポリトリメチレン  テレフタラート（polytrimethylene terephtalate）（PTT）を生成するための重縮合のためのモノマーとして使用される可能性がある。これらの構造と反応特性が、化粧料、繊維製品（衣料繊維や床張り材）およびプラスチック（自動車産業および梱包またはコーティング）での幾つかの応用をもたらす。
【０００４】
PDOは種々の化学的経路で生産されうるが、それらは汚染物質を極度に包含する廃液の流れを生成し、製造コストは高価なものとなる。それ故、化学的に生産されたPDOは、石油化学的に利用可能な、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオールそして１，４−ブタンジオールのようなジオールと競争できない。この競争力を増強するために、１９９５年に、デュポンはグルコースからPDOへの生物学的変換のための研究プログラムを開始した。このプロセスは環境には優しいものの、ｉ）非常に高価な補因子であるビタミンＢ１２を用いる、そしてｉｉ）生産株が不安定であるため不連続なプロセスであるというデメリットがある。
【０００５】
バイオディーゼル産業で製造された大量のグリセリンが利用可能になったため、むしろ、連続的にビタミンＢ１２を必要とせず炭素収率がより高いプロセスが有利である。
【０００６】
PDOが、塩と水が混合した約８０−８５%のグリセリンを含むバイオディーゼル生成物の不要な副生成物であるグリセリンから生産され得ることは当技術分野で公知である。
【０００７】
Ｃ．ブチリカム（C. butyricum）がバッチおよび２段階連続発酵で増殖でき工業グリセリンからPDOを生産できることは従前に記載されていた（Papanikolaou et al., 2000）。しかしながら、グリセリンの最高濃度において、得られた最大PDO力価は０．０２ｈ−１の希釈率で４８．１ｇＬ−１であり、０．９ｇＬ−１ｈ−１の生産性を意味する。培養は、培地供給中９０ｇＬ−１の最大グリセリン濃度、および酵母エキス、バクテリアの微生物バイオマス生産の増大に役立つと当業者に知られている有機窒素を含有する高価な化合物の存在下で行われた。
【０００８】
出願ＷＯ２００６／１２８３８１は、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、Ｃ．ブチリカム（C. butyricum）またはＣ．パストゥリアヌム（ C. pasteuricum）のような天然のPDOを生産する微生物を用いてバッチおよび流加バッチ培養でのPDOの生産のためのこのグリセリンの使用を記載している。さらに、ＷＯ２００６／１２８３８１で使用された培地も酵母エキスを含む。この特許出願に記載されているように、達成した最大生産性は０．８と１．１ｇｌ−１ｈ−１の間であった。
【０００９】
「Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）DG1 pSPD5」と呼ばれる、Ｃ．ブチリカム（C. butyricum）からのビタミンＢ１２非依存性のグリセリン脱水酵素とPDOデヒドロゲナーゼを含むように改変されたＣ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）の性能がGonzalez-Pajuelo et al., 2005に記載されている。この菌株は、純粋なグリセリンを１２０ｇｌ−１まで含有している流加培地において、最初は増殖しPDOを産生する。さらに、最大６０ｇｌ−１の純粋グリセリンまたは工業用グリセリンを含有している流加培地における分析では何の差異も指摘されなかった。これらの結果は酵母エキスの存在下で得られた。その上、６０ｇｌ−１以上の工業用グリセリンの濃度に関しての試験は行われなかった。野生型のＣ．ブチリカムと改変された微生物「Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）DG1 pSPD5」を比較すると、全体的に同じような行動が観察された。
【００１０】
特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５６０７８において、発明者らはGonzalez-Pajuelo et al. (2005)で記載されたような「Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）DG1 pSPD5」の菌株を高濃度の工業用グリセリンの存在下および酵母エキスの非存在下の培地で生育させるために適用するプロセスを記載している。結果として生じた菌株は１２０ｇｌ−１までの工業用グリセリンを含む培地でPDOを生産でき、５３．５ｇ．Ｌ−１のPDO力価、０．５３ｇ．ｇ−１までの収率および２．８６ｇ．Ｌ−１ｈ−１までの生産性を示す。
【００１１】
今回の特許出願において、本発明者らは、高濃度の工業用グリセリンの存在下での適用後に得られるようなPDOの産生に有用な、適合した微生物の主な遺伝的改変にハイライトを当てる。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は１，３−プロパンジオール（PDO）の生産に有用なクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）の集団に関し、該集団は、表１に示される変異体から選択される少なくとも一つのクロストリジウム・アセトブチリカムｓｐ．菌株を含み、前記変異体の相対割合は以下の遺伝子ファミリーから選択される。
【表１】
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【００１３】
具体的には、本発明の集団は、
-  受託番号I-4378としてCNCMに寄託されたDG1 pSPD5 PD0001VE05c01株;
-  受託番号I-4379としてCNCMに寄託されたDG1 pSPD5 PD0001VE05c05株;
-  受託番号I-4380としてCNCMに寄託されたDG1 pSPD5 PD0001VE05c07株
からなる群から選択されるクロストリジウム・アセトブチリカムの少なくとも一つの菌株を含んでなる。
CNCMは、パリ・パスツール研究所の “国立微生物培養物コレクション（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes）”を意味する。
【００１４】
特に、本発明の詳細な態様によれば、上記集団は以下のうち少なくとも一つの点変異をさらに有してなる株を含んでなる：
-  真核性のグルコキナーゼ調節遺伝子（炭水化物代謝）のホモログである、推定糖リン酸イソメラーゼをコードする、クロストリジウム・アセトブチリカムゲノムのCA_C0175遺伝子座（locus）198989位でCがTに置換される 
-  RNAポリメラーゼシグマ因子RPOD（転写および翻訳制御）をコードする、クロストリジウム・アセトブチリカムゲノムのCA_C1300遺伝子座1444099位でGがAに置換される
-  Glu-tRNAGlnアミドトランスフェラーゼのサブユニットAをコードする、クロストリジウム・アセトブチリカムゲノムのCA_C2670遺伝子座2787387位でCがTに置換される
-  ABCトランスポーターのATPアーゼ成分をコードする、クロストリジウム・アセトブチリカムゲノムのCA_C3339遺伝子座3512658位でCがTに置換される
-  分岐鎖アミノ酸パーミアーゼ（トランスポーター）をコードする、クロストリジウム・アセトブチリカムゲノムのCA_C1610遺伝子座1752341位でCがTに置換される。
【００１５】
本願発明はまた、１，３−プロパンジオールの生産方法であって、唯一の炭素源としてグリセリンを含んでなる培養培地中で本発明にしたがって１，３−プロパンジオール（PDO）の産生に有用なクロストリジウム・アセトブチリカムの集団を培養し、かつ、培養培地から産生された１，３−プロパンジオールを回収することを含んでなる方法にも関する。
【発明の具体的説明】
【００１６】
１，３−プロパンジオール（PDO）の生産に有用なクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）の集団
１，３−プロパンジオールの生産に有用なクロストリジウム・アセトブチリカムの集団とは、単一炭素源としてグリセリンから１，３−プロパンジオールを生産するために改変されたクロストリジウム・アセトブチリカムの一以上の株を意味する。前記菌株は当技術分野で公知であり、特に、出願ＷＯ２００１０４３２４およびＷＯ２００８０５２５９５に開示されている。本発明の上記集団は幾つかの菌株の組み合わせでもよく、その大多数は、単一の株と同様、本発明に関する変異体、特に、それぞれ寄託番号  I-4378、I-4379、I-4380としてCNCMに登録されたDG1 pSPD5 PD0001VE05c01、DG1 pSPD5 PD0001VE05c05またはDG1 pSPD5 PD0001VE05c07、若しくは、DG1 pSPD5 PD0001VE05c08株を含む。
【００１７】
変異は、母株であるDG1 pSPD5 PD0001VTと比較したときに前記株のゲノム中のヌクレオチド、より詳しくはSNPs（「一塩基変異多型（Single Nucleotide Polymorphisms）」）と確認される変化である。前記株はＷＯ２００１０４３２４に開示されており、ゲノムシークエンスが公開されているATCC824株に由来する（Nolling et al., 2001）。
【００１８】
変異はコーディングまたは非コーディング配列で生じうる。これらの変異は対応するアミノ酸の改変がない場合には同義であり得、また、対応するアミノ酸が変化される場合には非同義であり得る。同義変異は翻訳されたタンパク質の機能に何の影響も及ぼさないが、変異された配列が制御因子の結合部位に位置している場合には、対応する遺伝子や他の遺伝子にさえも、その制御に影響を及ぼす可能性がある。非同義変異は、変異配列の性質に依存した制御と同様、その翻訳されたタンパク質の機能に影響を及ぼしうる。
【００１９】
１，３−プロパンジオールの生産に有用なクロストリジウム・アセトブチリカムの集団は、好ましくは付加的な改変、少なくとも以下の改変を含んでなる：
-  真核性のグルコキナーゼ調節遺伝子（炭水化物代謝）のホモログである、推定糖リン酸イソメラーゼをコードしている、クロストリジウム・アセトブチリカムゲノムの、CA_C0175遺伝子座（locus）、198989位でCがTに置換される 
-  RNAポリメラーゼシグマ因子RPOD（転写および翻訳制御）をコードしている、クロストリジウム・アセトブチリカムゲノムのCA_C1300遺伝子座、1444099位でGがAに置換される
-  Glu-tRNAGlnアミドトランスフェラーゼのサブユニットA（転写および翻訳制御）をコードしている、クロストリジウム・アセトブチリカムゲノムのCA_C2670遺伝子座、2787387位でCがTに置換される
-  ABCトランスポーター（２つのATPアーゼドメイン）のATPアーゼ成分をコードしている、クロストリジウム・アセトブチリカムゲノムのCA_C3339遺伝子座、3512658位でCがTに置換される
-  分岐鎖アミノ酸パーミアーゼ（トランスポーター）をコードしている、クロストリジウム・アセトブチリカムゲノムのCA_C1610遺伝子座、1752341位でCがTに置換される。
好ましくは、これらの変異体の１、２、３、４または５を含んでなり、これらの変異体の幾つかの組み合わせを含みうる。
本発明の菌株の集団は１２０ｇ．Ｌ−１までのグリセリン、そして特に工業用グリセリンを含んでなる培地で増殖しうる。
【００２０】
本発明の集団の菌株はクロストリジウムにおける突然変異生成および／または遺伝置換の標準的な手法で得られ、それは出願ＷＯ２００８０４０３８７に開示されるような手法であって、その内容は引用することにより本明細書の一部とされる。
【００２１】
当事者であれば、出願ＷＯ２００１０４３２４およびＷＯ２００８０５２５９５で開示された菌株の一つから開始し、同様にCNCM にそれぞれ受託番号I-4378、I-4379、I-4380として寄託されたc01、c05またはc07のうちの一つを使用し、さらなる変異体を誘導しうる。
【００２２】
好ましい実施形態によれば、本発明の集団は、表１で認識される変異体である、DG1 pSPD5 PD0001VE05c08株を含んでなる。当業者は、CNCM にそれぞれ受託番号I-4378、I-4379、I-4380として寄託されたDG1 pSPD5 PD0001VE05c01、DG1 pSPD5 PD0001VE05c05またはDG1 pSPD5 PD0001VE05c07株の一つから開始し、標準的な遺伝子置換と組換え技術を用いて、DG1 pSPD5 PD0001VE05c08に類似の菌株を作り出すために、クロストリジウム菌株にどのように変異を誘導するか理解する。
【００２３】
グリセリンを含んでなる培養培地
「適切な培養培地」または「培養培地」とは、クロストリジウム菌株や集団の増殖およびディオール産生に最適化された培養培地を指す。発酵工程は、一般的に、クロストリジウム種への使用に適合したことが既知の確定した組成の、グリセリンを含有している、合成、特に無機の培養培地を用いて、リアクター中で行われる。
【００２４】
「合成培地」との用語は微生物が成長するように化学的に確定した組成を含んでなる培養培地を意味する。本発明の培養培地では、有利には、グリセリンが唯一の炭素源である。
【００２５】
「グリセリン」と「グリセロール」の用語は同義であり、本発明においては同一分子を指し相互交換可能に使用される。
特定の実施態様によれば、グリセリンは、少なくとも５０％のグリセリン、好ましくは少なくとも８５％のグリセリンを含んでなるグリセリン組成物の形で培地に添加される。
【００２６】
有利には、本発明の培養培地で使用されるグリセリンは工業用グリセリンである。「工業用グリセリン」は実質的に精製することなく工業過程から得られるグリセリン製品を意味する。工業用グリセリンはまた「粗製グリセリン」とも呼ばれることもある。工業用グリセリンは７０％より多い、好ましくは８０％より多いグリセリン、水、および無機塩や脂肪酸のような不純物を含んでなる。工業用グリセリンにおけるグリセリンの最大含量は一般的に９０％であり、より一般的には約８５％である。
【００２７】
工業用グリセリンが得られる工業プロセスは、とりわけ、脂肪および油、特に植物由来の脂肪および油が、洗剤または潤滑剤のような工業製品へと加工される製造方法である。そのような製造方法では、工業用グリセリンは副産物と考えられる。
【００２８】
特定の実施態様によれば、工業用グリセリンは、バイオディーゼル製品からの副産物であり、バイオディーゼル製品から得られたグリセリンの既知の不純物を含んでなり、約８０〜８５％のグリセリン、塩、水、および脂肪酸のような幾つかの他の有機化合物を含んでなる。バイオディーゼル生産から得られた工業用グリセリンは、さらなる精製工程に付されていない。
【００２９】
好ましくは、培養培地は高濃度のグリセリンを含んでなる。
【００３０】
「高グリセリン含量」や「高濃度のグリセリン」という用語は、培養培地中のグリセリンが９０ｇ．Ｌ−１より多いことを意味する。好ましい実施態様によれば、上記濃度は、９０〜２００ｇ．Ｌ−１の間のグリセリンを含み、より詳しくいうと、９０〜１４０ｇ／Ｌの間のグリセリン、好ましくは約１２０ｇ．Ｌ−１のグリセリンである。
【００３１】
好ましくは、培養培地は有機窒素を添加していない合成培地である。
【００３２】
前記培養培地は当技術分野、特に、２０１０年５月５日に出願されたＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５６０７８、２０１０年１０月５日に出願されたＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６４８２５、で開示されており、その内容は引用することにより本明細書の一部とされる。
【００３３】
微生物の培養
本発明の方法では、生産はバッチ、流加バッチまたは連続プロセスで有利に行われる。１，３−プロパンジオールの生産のための工業的スケールでの微生物の培養は当技術分野で公知であり、特に、２０１０年５月５日に出願されたＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５６０７８、２０１０年１０月５日に出願されたＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６４８２５で開示されており、その内容は引用することにより本明細書の一部とされる。
【００３４】
１，３−プロパンジオールの回収
発酵培地から１，３−プロパンジオールを回収し、最終的に精製する方法は当業者に公知である。１，３−プロパンジオールは蒸留により単離されうる。ほとんどの実施態様によれば、１，３−プロパンジオールは発酵培地から酢酸のような副産物と共に蒸留され、そしてさらに公知の方法で精製される。
特に精製方法は出願ＷＯ２００９／０６８１１０およびＷＯ２０１０／０３７８４３で開示されており、その内容は引用することにより本明細書の一部とされる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】集団とクローンｃ０８の、植菌からＤ＝０．０６ｈ−１までのケモスタット培養の間の１，３−プロパンジオールの産生とグリセリンの消費の漸進的変化を示す。
【実施例】
【００３６】
実施例１  発生した集団からのクローンの単離
クローンの単離はクロストリジウム・アセトブチリカムDG1 pSPD5 PD0001VE05菌集団株の成育フラスコ培養から開始し寒天培地上で行われた。フラスコ培養に使用された合成培地は、脱イオン水１リットル当たり：グリセリン、３０ｇ；ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ；Ｋ２ＨＰＯ４、０．５ｇ；ＭｇＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、０．２ｇ；ＣｏＣｌ２  ６Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ；酢酸、９９．８％、２．２ｍｌ；ＮＨ４Ｃｌ、１．６５ｇ；ＭＯＰＳ、２３．０３ｇ、ビオチン、０．１６ｍｇ；ｐ−アミノ安息香酸、３２ｍｇ；ＦｅＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、０．０２８ｇ；レザズリン、１ｍｇおよびシステイン、０．５ｇを含有するものであった。培地のｐＨはＮＨ４ＯＨ  ６Ｎで６．５に調整された。
【００３７】
異なる培地が寒天培地での単離のために用いられた：市販のグリセリンまたは粗製グリセリンを含む合成寒天培地（上述と同じもの）とＣＧＭ（クロストリジウム成育培地（Clostridial Growth Medium））寒天培地は、脱イオン水１リットル当たり：市販または粗製グリセリン、３０ｇ；酵母エキス、５ｇ；ＫＨ２ＰＯ４、０．７５；Ｋ２ＨＰＯ４、０．７５ｇ；ＭｇＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、０．４ｇ；アスパラギン、２ｇ；（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｇ；ＮａＣｌ、  １ｇ；ＭｎＳＯ４、Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ；ＦｅＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ；ＭＯＰＳ、２３．０３ｇ；レザズリン、１ｍｇおよびシステイン、１５ｇを含有するものである。培地のｐＨはＮＨ４ＯＨ  ３Ｎで６．６に調整された。
【００３８】
細胞は４つの異なる方法でフラスコ培養（表２）から平板培養された： 
-  市販のグリセリンを含む合成培地の寒天平板培養；
-  粗製グリセリンを含む合成培地の寒天平板培養；
-  市販のグリセリンを含む富栄養培地の寒天平板培養；
-  粗製グリセリンを含む富栄養培地の寒天平板培養。
【００３９】
単離されたクローンは、寒天平板培地上で３回連続の継代培養の後に純粋と考えられた。さらに、純粋なクローンは市販または粗製グリセリンのいずれかを含んだ液体富栄養培地に移された（表２）。続いて、成育液体培地はさらなる特性解析までグリセリン２０％、−８０℃で保存された。
【００４０】
クローンは、その後、以下の方法で特徴付けられた：
-  保存後の生存能力の測定：合成培地での成長率の評価；
-  増殖と代謝の評価：培養の間のOD620nmおよび合成培地におけるPDO／グリセリン収率の測定
-  遺伝的評価：菌株の遺伝子型の確認のためのＰＣＲ解析；
-  単離されたクローンと集団との能力を比較するためのケモスタット培養（実施例２）；
-  クローンの配列解析のためのｇDNA抽出（実施例３）。
【００４１】
【表２】
2013545461.tif 000004
【００４２】
実施例２  粗製グリセリンを高濃度で含むケモスタット培養におけるクローンｃ０８の性能
微生物の菌株
単離されたクローンＣ．アセトブチリカム株DG1 pSPD5 PD0001VE05（菌株は１／ｐＳＯＬ１から保存可能な状態になり、２／dhaB1、dhaB2およびdhaT遺伝子、すなわち、１，３−プロパンジオール・オペロン、が含まれているプラスミドpSPD5で形質転換され、そして、３／高濃度の粗製グリセリンに移行される）。この単離プロトコールは実施例１に記載した。
【００４３】
培養培地
クロストリジウムのバッチ培養に用いられる合成培地は、脱イオン水１リットル当たり：グリセリン、３０ｇ；ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ；Ｋ２ＨＰＯ４、０．５ｇ；ＭｇＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、０．２ｇ；ＣｏＣｌ２  ６Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ；Ｈ２ＳＯ４、０．１ｍｌ；ＮＨ４Ｃｌ、１．５ｇ；ビオチン、０．１６ｍｇ；ｐ−アミノ安息香酸、３２ｍｇおよびＦｅＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、０．０２８ｇを含有するものであった。培地のｐＨはＮＨ４ＯＨ  ３Ｎで６．３に調整された。シグマから購入された市販のグリセリン（純度９９．５％）がバッチ培養に用いられた。
連続培養の添加培地は、水道水１リットル当たり：粗製グリセリン、１０５ｇ；ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ；Ｋ２ＨＰＯ４、０．５ｇ；ＭｇＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、０．２ｇ；ＣｏＣｌ２  ６Ｈ２Ｏ、０．０２６ｇ；ＮＨ４Ｃｌ、１．５ｇ；ビオチン、０．１６ｍｇ；ｐ−アミノ安息香酸、３２ｍｇ；ＦｅＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、０．０４ｇ；消泡剤、０．０５ｍｌ；ＺｎＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、８ｍｇ；ＣｕＣｌ２、２Ｈ２Ｏ、４ｍｇ；ＭｎＳＯ４、Ｈ２Ｏ、４０ｍｇ；Ｈ３ＢＯ３、２ｍｇ；Ｎａ２ＭｏＯ４、２Ｈ２Ｏ、０．８ｍｇを含有するものであった。この場合には培地のｐＨは調整しなかった。バイオディーゼルのためのエステル交換から得られる粗製グリセリンは、Ｎｏｖａｎｃｅ（Venette, France）から供給され、以下の純度を有していた。：グリセリン８４．８％（ｗ／ｗ）。
【００４４】
実験設定：
連続培養は５ｌバイオリアクターＴｒｙｔｏｎ（Pierre Guerin, France）で、作業容量２０００ｍｌで行われた。培養容量は培養レベルの自動制御により２０００ｍｌで一定に保たれた。培養は２００ＲＰＭで攪拌され、温度は３５℃に設定され、ＮＨ４ＯＨ  ５．５Ｎの自動添加によりｐＨは６．５に一定に維持された。ＰＯＲ測定（mV）は全培養に渡って制御された。嫌気性条件を作り出すために、容器中の滅菌された培地は６０℃で１時間、滅菌無酸素窒素でフラッシュされ、さらに、３５℃に達するまでフラッシュされた（２時間の間のフラッシュ）。バイオリアクターのガス出口はピロガロールを準備することにより酸素から保護された（Vasconcelos et al, 1994）。滅菌後、添加培地もまた室温に到達するまで滅菌無酸素窒素でフラッシュされ、酸素が入らないように２００ｍｂａｒの窒素圧下で維持された。
【００４５】
バッチおよび連続培養プロセス：
評価のためのプロセスは特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５６０７８（実施例２）に記載されている。
合成培地（上記のバッチ培養培地と同じものに酢酸、２．２ｇ．Ｌ−１およびＭＯＰＳ、２３．０３ｇ．Ｌ−１の添加を行ったもの）において１００ｍｌフラスコ中で増殖中の培養物で対数増殖期終了時に採取されたものが接種材料（５％  ｖ／ｖ）として用いられた。
培養物はまずバッチ式で増殖された。対数増殖期初期に市販のグリセリンをパルスで行った：１０５ｇ．Ｌ−１の粗製グリセリンを添加したパルス合成培地（バッチ培養で記載されたものと同じもの）が３時間の間、静的流速で加えられた（すなわち、１８ｇ．Ｌ−１のグリセリンの添加）。その後、連続バッチ式増殖を続け、対数増殖期の終了前に希釈率０．０２５ｈ−１での連続的添加が開始した。添加培地は１０５ｇ．Ｌ−１の粗製グリセリンを含む。バイオリアクターの接種後８−１０日および３滞留時間(3 residences times)後、希釈率は様々な段階で０．０２５ｈ−１から０．０６０ｈ−１に増加した：４８時間は０．０１ｈ−１ユニットの増加―２４時間は変化無し―４８時間０．０１ｈ−１ユニット増加―２４時間変化無し−４８時間０．０１５ｈ−１ユニット増加。その後、以下に記載されたＨＰＬＣプロトコルを用いて培養の安定化の後に１，３−プロパンジオールの生産とグリセリンの消費（図１）が続いた。特に、我々は残留グリセリン濃度が可能な限り低くなるまで待った。
C08クローンの総合的な性能は表３で示され、同一条件下での集団の性能およびGonzalez-Pajuelo et al. (2005)で記載されたようなＣ．アセトブチリカムDG1 pSPD5 PD0001VT株の性能と比較される。
【００４６】
分析手順：
細胞濃度は６２０ｎｍで比濁分析により測定され、直接測定した細胞乾燥重量と相関させた。グリセリン、１，３−プロパンジオール、エタノール、ブタノール、酢酸および酪酸濃度はＨＰＬＣ分析により測定された。分離はBiorad Aminex HPX-87Hカラムで行われ、検出は屈折率により達成された。操作条件は下記の通りであった：移動相  硫酸０．５ｍＭ；流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ、温度、２５℃。
【００４７】
【表３】
2013545461.tif 000005
【００４８】
これらの結果はＣ．アセトブチリカムDG1 pSPD5の適合集団は、Gonzalez-Pajuelo et al. (2005)からの適合されていないＣ．アセトブチリカムDG1 pSPD5 PD0001VT株に比べ、より高い濃度の工業用グリセリンにおいて増殖でき、従って、より良い力価および工業用グリセリンでのPDOの生産性を示す。
【００４９】
実施例３
ゲノムＤＮＡ抽出
PD0001VT、 PD0001VE05、 PD0001VE05c01、 PD0001VE05c05、 PD0001VE05c07 およびPD0001VE05c08株からのゲノムＤＮＡはQiagen Genomic kit 500G (Qiagen, Inc., Valencia, CA)を用いて抽出された。簡単には、細胞はペニシリンバイアル（７０ｍＬ）で後期対数増殖期（A620 1.5〜2.0）まで（実施例１および２に記載されたような）富栄養または合成グリセリン培地でそれぞれ嫌気的に増殖された。細胞溶解の間を通して厳しい嫌気的条件が維持された。細胞は回収されＳＥＴバッファー（２５％スクロース、０．０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０５Ｍ  ＥＤＴＡ）で２回洗浄された。細胞ペレットは１１ｍＬのＢ１キットバッファーに４４μＬのＲＮａｓｅ、３０ｍｇ／ｍＬリゾチームおよび１００μｇ／ｍＬ  プロテアーゼＫと共に懸濁された。その混合物は３７℃、４５分間培養し、遠心分離され、Qiagen DNA purification kitの使用説明書に従い、上清を用いてＤＮＡ抽出が行われた。その次に、ＤＮＡは５０μＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁された。
【００５０】
シークエンシング解析
天然のDG1 pSPD5 PD0001VT株のゲノムおよび発生した集団DG1 pSPD5 PD0001VE05はRoche GS FLX technologyを用いてシークエンシングされた。シークエンシングプロジェクトはEurofins Genomics MWG/ Operon (ZA de Courtabeauf-9 Avenue de la Laponie, 91978 Les Ulis Cedex)により、各株１毎にロングタグペアエンドライブラリ（Long-Tag paired end libraries）（８Ｋｂ）に行われ、GS FLX Titanium series chemistryを半分の稼働（最高 600000 読込、最高180000-300000の実際のペアードエンド読込（true paired end reads））させて、配列の生成およびコンティグの足場組み（scaffolding）が行われた。
【００５１】
発生した集団から単離されたクローンはNimbleGen (Roche NimbleGen Inc. 500 S. Rosa Rd. Madison WI 53719) により開発された比較ゲノムシークエンシング（comparative genomic sequencing）（CGS）を用いて配列決定された。CGS解析は２段階で行われた：第１段階、ゲノムの差異のある領域が天然の株と発生したクローンのＤＮＡの比較ハイブリダイゼーションにより同定された。第２段階、ゲノムの差異のある同定された領域だけが、完全に明らかにされた一連の一塩基変異多型（SNPs）を作り出すために配列決定された。
【００５２】
SNP解析
発生した集団のバイインフォマティックスおよびＳＮＰ解析はEurofins Genomics MWG / Operonにより行われた。この解析のために、両方の株の読み込みセットは別々に、ソフトウェアgsMapper (Roche 454, V2.3)を用いてGenbank 参照配列 (Clostridium acetobutylicum ATCC 824 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AE001437) にマッピングされた。３つのSNPファイルを適用して、ATCC824とDG1 pSPD5 PD0001VT、ATCC824とDG1 pSPD5 PD0001VE05、そしてDG1 pSPD5 PD0001VE05とDG1 pSPD5 PD0001VTの比較を行った。天然と発生した菌株の間の固有のSNPが以下に示すように存在する。低包括度（coverage）（＜２５）および低変異頻度（variant frequency）（＜８５％）は除かれ、ファミリーグループの注釈のために用いられたKEGGデータベースに従って１７ファミリーに分布した１６０の固有のSNPという結果となった。
【００５３】
単離されたクローンのSNP解析はNimbleGen (Roche)によって行われた。SNPファイは、Genbank参照配列 (Clostridium acetobutylicum ATCC 824 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AE001437)を用い、天然の DG1 pSPD5 PD0001VTと、DG1 pSPD5 PD0001VE05c01、DG1 pSPD5 PD0001VE05c05、DG1 pSPD5 PD0001VE05c07またはDG1 pSPD5 PD0001VE05c08との比較に適用された。
【００５４】
配列結果は表１に示され、以下の情報を含んでいる： 
RefStart      参照配列内のスタート位置で、ここで差異が生じる
RefNuc        差異位置（the difference location）での参照ヌクレオチド配列
VarNuc        差異位置での異なるヌクレオチド配列
VarFreq       差異位置に完全に及ぶ全読込（total reads）に対する異なる読込のパー
センテージ
タイプ        SNPが注釈遺伝子内、または注釈遺伝子間で発見されたか否かのリスト。
遺伝子中のSNPはコーディング（coding）として指定される。遺伝子間の
SNPは遺伝子間（intergenic）として指定される。
AA 変化       タンパク質のアミノ酸を変化するか否かに基づいてコーディングSNPを
分類する。Sは同義的なSNP（アミノ酸変化無し）を意味する。Nは非同義
的SNP（アミノ酸変化あり）を意味する。FC（フレームチェンジ）はヌク
レオチドの挿入や削除によりタンパク質の翻訳に改変があることを意味す              る。
ORIG_AA       SNP部位に対応する参考配列に関連したアミノ酸
SNP_AA        試験配列に関連したアミノ酸、SNP部位に対応する
遺伝子座タグ  Genbankからの対応遺伝子の遺伝子座タグ（locus tag）
機能          Genbankに記載の遺伝子の機能
ファミリー    KEGGからの遺伝子のファミリー
【００５５】
【表４−１】
2013545461.tif 000006
【００５６】
【表４−２】
2013545461.tif 000007
【００５７】
【表４−３】
2013545461.tif 000008
【００５８】
【表４−４】
2013545461.tif 000009
【００５９】
【表４−５】
2013545461.tif 000010
【００６０】
【表４−６】
2013545461.tif 000011
【００６１】
【表４−７】
2013545461.tif 000012
【００６２】
【表４−８】
2013545461.tif 000013
【００６３】
【表４−９】
2013545461.tif 000014
【００６４】
【表４−１０】
2013545461.tif 000015
【００６５】
参考文献
1. Gonzalez-Pajuelo M, Meynial-Salles I, Mendes F, Andrade JC, Vasconcelos I, 
and Soucaille P. 2005. Metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum 
for the industrial production of 1,3-propanediol from glycerol. Metabolic 
Engineering 7: 329-336.
2. Gonzalez-Pajuelo M, Meynial-Salles I, Mendes F, Soucaille P. and Vasconcel
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um VPI 3266, and an engineered strain, Clostridium acetobutylicum DG (pSPD5
). Applied and Environmental Microbiology, 72: 96-101.
3. Nolling J, Breton G, Omelchenko MV, Makarova KS, Zeng Q, Gibson R, Lee HM,
Dubois J, Qiu D, Hitti J, Wolf YI, Tatusov RL, Sabathe F, Doucette-Stamm 
L, Soucaille P, Daly MJ, Bennett GN, Koonin EV, Smith DR. 2001. Genome sequ
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4. Papanikolaou S, Ruiz-Sanchez P, Pariset B, Blanchard F and Fick M. 2000. 
High production of 1,3-propanediol from industrial glycerol by a newly isol
ated Clostridium butyricum strain. Journal of Biotechnology. 77: 191-208.
5. Vasconcelos I, Girbal L, Soucaille P. 1994. Regulation of carbon and elect
ron flow in Clostridium acetobutylicum grown in chemostat culture at neutra
l pH on mixtures of glucose and glycerol. Journal of bacteriology. 176(5): 
1443-1450.
【００６６】
2013545461.tif 000016
2013545461.tif 000017
【図１】
2013545461.tif 000019
【国際調査報告】
2013545461.tif 000020
2013545461.tif 000021