(57)【要約】  本発明は、アルツハイマー型認知症の治療剤に関する。本発明によると、Ａβオリゴマーに結合することによりアルツハイマー型認知症の治癒または緩和をもたらす、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のペプチドが提供される。本発明のさらなる形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含有するものの、前置された、ペプチドの分泌を可能にする配列断片も有するペプチドが提供される。遺伝子治療を目的に、対応する、特に配列３〜６に記載のＤＮＡ配列およびベクターが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を特徴とするタンパク質。
【請求項２】
タンパク質であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載の配列断片を含むこと、および前記タンパク質の分泌性をもたらす配列断片を含むことを特徴とするタンパク質。
【請求項３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を特徴とする、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のタンパク質をコードするデオキシリボ核酸。
【請求項５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３による、請求項４に記載のデオキシリボ核酸。
【請求項６】
請求項３に記載のペプチドをコードするデオキシリボ核酸。
【請求項７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４による、請求項６に記載のデオキシリボ核酸。
【請求項８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に記載の配列断片を含有するベクター。
【請求項９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５を特徴とする、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に記載の配列断片を含有するベクター。
【請求項１１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を特徴とする、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のタンパク質を含有するかまたは前記タンパク質からなることを特徴とする医薬品。
【請求項１３】
配列１ならびに機能的に分泌性をもたらす配列断片を含有するかまたはそれらからなるタンパク質であることを特徴とする医薬品。
【請求項１４】
請求項４〜７のいずれか一つに記載のデオキシリボ核酸を含むかまたは前記デオキシリボ核酸からなることを特徴とする医薬品。
【請求項１５】
請求項８〜１１のいずれか一つに記載のベクターを含むかまたは前記ベクターからなることを特徴とする医薬品。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一つに記載の少なくとも一つの薬剤を体内に導入することを特徴とする、アルツハイマー型認知症の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー型認知症の治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー型認知症（ＡＤ）は、認知症の最も頻繁な形態であって、今日では、世界中で推定２４００万人の認知症患者の人々の６０％超に該当するものである。ＡＤの病理学的な主な特徴は、Ａβペプチドからなる老人斑またはアミロイド斑の形成、およびＴａｕタンパク質からなる神経原線維沈着の形成である。Ａβペプチドは、少なくとも２種の異なるプロテアーゼの活性により、前駆体タンパク質である「アミロイド前駆体タンパク質」（ＡＰＰ）から生成する。この前駆体タンパク質は、ニューロンの細胞壁中に局在する。ＡＰＰのタンパク質分解に際し、および後からの修飾により、長さおよび種類の異なるＡβ断片が生成する。９０年代にはアミロイド・カスケード仮説が立てられ、Ａβの斑状の沈着が症候の引き金であると仮定された。自由に拡散できるＡβオリゴマーは、斑に沈着したＡβ原線維よりも有毒である。最近の研究によると、班は、シナプスおよびニューロンの破壊と共局在するオリゴマーＡβのストックとして見なすことが可能である。
【０００３】
凝集するニューロン内Ａβ（Ａβｉ）は、早期ＡＤ病因の重要因子と見なされる。大部分がＡβ１−４２からなるＡβｉが、分泌されなかったＡβであるか、または再内在化されたＡβであるかは、まだ最終的には解明することができていない。しかしながら、２番目の可能性への示唆が蓄積しつつある。
【０００４】
これまでは、ＡＤの症状のみが治療可能である。病理過程を阻止するか、または後退させることができる承認医薬品は知られていない。ＡＤの治療を目的に研究される大抵の物質は、細胞外Ａβに焦点を合わせたものであるが、その際、可溶性のＡβオリゴマーを対象にはしていない。しかしながら、ほかでもなく可溶性のＡβオリゴマーを対象にすることが、病理過程を早期段階に阻止できるためには望まれる。
【０００５】
欧州特許第１３７９５４６号Ｂ１（特許文献１）には、様々な、Ｄ型エナンチオマーのペプチドが、β−アミロイドペプチドに結合するため、アルツハイマー型認知症の治療に適しているかもしれないと記載されている。特に、この明細書に開示された、請求項３の対案ｅ）に記載の、Ｄ３ペプチドとも呼ばれるペプチドは、Ａβ凝集を調節する。Ｄ３ペプチドは、可溶性Ａβオリゴマーと相互作用する。表面プラズモン共鳴による研究は、Ｄ３が好ましくは可溶性Ａβオリゴマーに結合することを示唆する。ＡＰＰトランスジェニックマウスモデルでは、Ｄ３は脳内の老人斑の数および関連した炎症プロセスを軽減する。
【０００６】
これまでは、アルツハイマー型認知症の緩和療法しか存在しない。非常に様々な治療可能性が、全力を挙げて研究されているにもかかわらず、これまでアルツハイマー型認知症の原因を治療することはできていない。その際、例えば、Ａβに結合することで（さらなる）凝集を不可能にさせる物質によってＡβ凝集を阻止することが頻繁に焦点にある。
【０００７】
ｉ）有毒な可溶性Ａβオリゴマーをｉｎ  ｖｉｖｏで軽減し、そしてｉｉ）ニューロンの外部のみならず内部でも有効な物質が必要とされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】欧州特許第１３７９５４６号Ｂ１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、アルツハイマー型認知症の、より優れた治療上の処置を可能にする薬剤を提供することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
意外なことに、この課題は、本発明により、請求項１〜１５に記載の薬剤を提供することによって解決される。さらに、請求項１６に記載のアルツハイマー型認知症治療方法が提供される。
【００１１】
以下に、配列表に列挙される配列を定義する。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１：本発明によりＡβオリゴマーに結合するＬ３ペプチド。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含むが、付加的に細胞膜を通る分泌を引き起こす配列断片も含む、模範的に挙げられた本発明によるペプチド。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３：ペプチドＮｏ．１をコードするＤＮＡ配列。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４：ペプチドＮｏ．２をコードするＤＮＡ配列。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含有し、蛍光を発する構造単位をコードするベクターをコードする配列。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を含有し、蛍光を発する構造単位をコードするベクターをコードする配列。
【００１２】
本発明によるペプチドは、好ましくは、Ｌ型エナンチオマーである。このペプチドをコードするＤＮＡ配列およびベクターも同様に、好ましくはＬ型エナンチオマーをコードする。本発明によると、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のペプチドは、Ａβペプチド、特にＡβオリゴマーに結合する。したがって、このペプチドは、アルツハイマー型認知症を治療するための医薬品である。したがって、アルツハイマー型認知症を治療するための医薬品は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のペプチド、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のペプチドを含有する成分からなり得る。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のペプチドは、ペプチドＤ３よりも優れたＡβペプチド結合特性を有する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のペプチドは、アルツハイマー型認知症を治療するための細胞内および細胞外での適用を可能にする。
【００１３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のペプチドは、例えば、メリフィールド合成、および配列１をコードするＤＮＡの発現によって、合成的に製造することができる。
【００１４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のペプチドは、さらに、アルツハイマー型認知症を治療するための医薬品の製造に使用することができる。
【００１５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のペプチドは、細胞内でも細胞外でもＡβオリゴマーに結合する。その結果、アルツハイマー型認知症を、細胞内での作用によっても細胞外での作用によっても治療することができる。
【００１６】
本発明の一発展形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載の配列断片であるが、そのペプチドが分泌性である、つまり細胞膜を通過して出ることができるという機能をコードする配列断片も含む配列断片を含有するタンパク質が提供される。このタンパク質は、細胞から輸送され得る。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のペプチドは、ペプチドＤ３よりも優れたＡβ結合特性を有する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のペプチドは、アルツハイマー型認知症の細胞内および細胞外治療を可能にする。
【００１７】
分泌を引き起こす配列断片は、当業者には公知である。模範的に、分泌性ペプチドとして、前記の特性を有する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に記載のペプチドを挙げることができる。好ましくは、分泌を引き起こす、ヒト由来であるかヒト配列と同一である配列断片が使用される。このことは、人間を治療する際に、分泌断片に対する望ましくない免疫応答が阻止され得るかまたは抑制され得るという利点をもたらす。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載の配列断片を含有する分泌性ペプチドは、細胞膜を通って出ることが可能であるため細胞膜の向こう側に存在する標的場所も有するということをもたらす。
【００１８】
分泌性ペプチドも同様に、メリフィールド合成によって、または対応するＤＮＡの発現によって製造可能である。これらの分泌性ペプチドは、医薬品である。さらに、これらのペプチドは、アルツハイマー型認知症を治療するための医薬品の製造に使用することができる。分泌性ペプチドは、細胞内または細胞外で使用することができる。
【００１９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＮｏ．２に記載の本発明によるペプチド、ならびに配列１に記載の配列部分を含有するさらなる分泌性ペプチドは、モノマー性、オリゴマー性、さらには原線維性または斑状のＡβペプチドにも結合する。本発明によるペプチドは、可溶性オリゴマーＡβペプチドに特に良好に結合する。特に多大な効果は、構造長Ａβ１−４２のＡβペプチドにおいて認められた。
【００２０】
本発明のさらなる有利な一形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のペプチドをコードするＤＮＡが提供される。
【００２１】
このＤＮＡは細胞内で発現可能であるため、アルツハイマー型認知症の治療に適した、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のペプチドが生成する。したがってこのＤＮＡは、遺伝子治療に適している。配列１に記載のペプチドをコードするＤＮＡは、特にアルツハイマー型認知症を治療するために使用可能な医薬品である。このＤＮＡは、さらに、アルツハイマー型認知症を治療するための医薬品の製造に使用することができる。
【００２２】
模範的に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に記載のＤＮＡを提供する。
【００２３】
さらに好ましい一実施形態では、機能的にそのペプチドの分泌性をコードする配列断片を含む、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含有するペプチドをコードするＤＮＡが提供される。このＤＮＡもまた細胞内で発現可能であるため、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に記載のペプチドが生成し、このペプチドは、分泌性である上にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載の断片を含有しており、アルツハイマー型認知症の治療に適している。したがって、このＤＮＡは、遺伝子治療に適している。好ましくは、ＤＮＡのうちの分泌を担う断片は、ヒト分泌配列をコードする。そのようなペプチドをコードするＤＮＡは、特にアルツハイマー型認知症の治療に使用することが可能な医薬品である。さらに、このＤＮＡは、アルツハイマー型認知症を治療するための医薬品の製造に使用することができる。
【００２４】
模範的に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に記載のＤＮＡを提供する。
【００２５】
本発明のさらなる一形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ断片を含有するベクターが提供される。これらのベクターは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のタンパク質をコードしつつ、発現されたＤＮＡ断片ないしタンパク質の分泌を機能的に引き起こすＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片も含有することができる。これらのベクターを用いて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のペプチド、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に記載のペプチドのような、それらの分泌性誘導体を細胞内で発現することができる。これらのベクターは、機能的に蛍光を発する構造部分をコードする断片を含有してもよい。模範的に、配列５または６に記載のベクターを提供することができる。
【００２６】
本発明によるベクターは、当業者には公知の方法により、市販ベクターから製造することができる。これらのベクターは、特にアルツハイマー型認知症を治療するための医薬品であって、アルツハイマー型認知症を治療するための医薬品の製造に使用可能である。特に適しているのはウイルスベクターであるが、それというのも、ウイルスベクターは、ヒトにおける遺伝子治療に、さらには動物のような別の生物の遺伝子治療にも特に良好に使用することができるからである。
【００２７】
遺伝子治療には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のペプチドをコードするデオキシリボ核酸、分泌性をもたらす配列断片、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に記載のペプチド用の配列断片を含む、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のペプチドをコードするデオキシリボ核酸、ならびに対応する核酸を含むベクターを使用することができる。模範的に、配列３〜６に記載のＤＮＡおよびベクターを使用することができる。これらを体内に導入する。
【実施例】
【００２８】
Ｌ３が中枢神経系の細胞内、例えばニューロン内または細胞内で発現され、続いて分泌されることによって、特に有毒なＡβオリゴマーの軽減を特異的にもたらす。このことは、特殊なウイルスベクターを利用して遂行することができる。細胞培養での実験を実施した。その際、Ｌ３が、細胞内でも細胞外でも発現された。
【００２９】
実験結果：
図において実験結果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】Ａβオリゴマーに対するＬ３およびＤ３の結合優先性の比較を示す。
【図２】ペプチドを添加しない、Ｌ３を添加、およびＤ３を添加した場合のＡβ−４２の密度勾配遠心分離の比較結果を示す。
【図３】Ｌ３を添加、および添加しなかった場合の、異なる時点でのＡβ１−４２粒子の流体力学的半径の比較を示す。
【図４】凝集挙動を分析するためのチオフラビンＴ試験および濁度試験を示す。
【図５】ＴｈＴ蛍光強度を示す。
【００３１】
図１は、Ａβ１−４２オリゴマーに対するＬ３およびＤ３の結合優先性の比較を示す。Ｌ３は、図１Ａに示され、Ｄ３は図１Ｂに示されている。Ｌ３は、Ｄ３よりも強い結合を示す。Ａβ１−４２モノマー（破線）、オリゴマー（実線）および原線維（点線）をＣＭ５バイオセンサーチップ上に固定化した。表面プラズモン共鳴を用いて相互作用分析を行った。ＲＵ：レゾナンスユニット（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｕｎｉｔｓ）。それぞれの場合に、ペプチド溶液（１００μｇ／ｍｌ）２５μｌを注入した。両ペプチドともＡβ１−４２オリゴマーに対して最もはっきりとした結合を示し、Ｌ３は、一般的にＤ３よりも高い最大共鳴を示す。同じ結果が、Ａβ１−４０オリゴマーに関しても得られる。
【００３２】
図２は、ペプチドを添加しない、Ｌ３を添加、およびＤ３を添加した場合のＡβ１−４２の密度勾配遠心分離の比較結果を示す。Ｌ３は、様々なＡβ型の複合的な混合物からなるＡβオリゴマーを沈殿させる。溶液およびＡβ−ペプチド混合物中でのＡβのサイズ分布を、イオジキサノール勾配（５〜５０％）上での沈降分析により検査した。混合物は、１２５μＭのＡβおよびそれぞれ１２５ｍＭのペプチドを含有した。遠心分離後にそれぞれ１４０μｌの１４フラクションを連続的なピペット操作により表面から得、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびそれに続く銀染色を利用して分析した。この結果は、ペプチドがＡβオリゴマーの含有量を著しく低下させ、検査時点においてＬ３はＤ３よりも高い程度で低下させることを示す。大きな凝集が生成し、この凝集は、さらなる以下の実験では非晶質、非原線維性、非アミロイド形成性として記載される。
【００３３】
図３は、Ｌ３を添加、および添加しなかった場合の、異なる時点でのＡβ１−４２粒子の流体力学的半径を比較する実験の結果を示す。動的光散乱が、溶液または懸濁液中に存在する粒子の流体力学的半径の特定に利用される。５μＭのＡβ１−４２オリゴマー粒子サンプルを、一方では５０μＭのＬ３サンプルの添加により、および他方では緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）により希釈した。Ｌ３を添加、および添加しなかった場合のＡβ１−４２粒子の流体力学的半径を、サンプル混合直後および２０分後にＤｙｎａＰｒｏ−光散乱システムで測定した。６５５．６ｎｍレーザ（１３ｍＷ−５８％レーザ強度）を使用した。取得時間は２秒、測定温度は２５℃であった。流体力学的半径の算出には、球状に沈降する粒子を想定した。Ｌ３は、大きなＡβ凝集体の迅速な形成を促進する。
【００３４】
図４は、Ｌ３の存在下でのＡβの凝集挙動を分析することを目的としたチオフラビンＴ試験および濁度試験の結果を示す。両試験とも、共通のストック溶液、２５μＭのＡβ（白塗棒グラフ）および１ｍＭのＬ３を含む２５μＭのＡβ（黒塗棒グラフ）から混合した。ＴｈＴ試験では、溶液５μｌをＴｈＴ溶液（５μＭのＴｈＴ；５０ｍＭグリセリンｐＨ８．５）２００μｌと混合し、蛍光分光光度計によりλｅｘ４４０ｎｍおよびλｅｍ＝４９０ｎｍにおいて測定した。ＴｈＴは、通常の原線維に結合することでより高い蛍光を有する色素であるため、線維化の尺度として利用される。濁度試験では、溶液の濁度を凝集の尺度として、ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計での３５５ｎｍにおける吸光として測定した。Ｌ３は、原線維性構造を有さない大きなＡβ凝集体の早急な生成を促進するため、チオフラビンＴ（ＴｈＴ）試験では陰性である。
【００３５】
図５は、ＴｈＴ蛍光強度を利用して測定した、Ａβ−Ｌ３凝集体のアミロイド形成特性に関する結果を示す。アミロイド形成凝集核は、「核細胞」として機能することで凝集プロセスを促進する粒子である。Ａβの凝集に関しては、既存のＡβオリゴマー／核が、モノマーの凝集プロセスを明らかに促進することが公知である。この実験のために、Ａβからなる核（三角形）、およびＡβとＬ３からなるような核（正方形）を製造した。ＡβおよびＡβ−Ｌ３混合物を５日間インキュベーションした後、核を遠心分離して洗浄した。ＴｈＴ試験では、新鮮に調製したＡβに核（２０％ｖ／ｖ）を加えた。コントロールとして、核を加えていないＡβを測定した（菱形）。ＴｈＴ蛍光を時間経過で示す。Ｌ３を含有する核は、核を含まないＡβ溶液と比べて、凝集の促進をもたらさない。このことは、Ａβ−Ｄ３凝集体がもはやアミロイド構造を有さないということの証拠である。ＡβとＬ３からなる凝集核は、Ａβ凝集核とは異なり、Ａβ凝集プロセスを促進しない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2013527757.tif 000009
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