(57)【要約】  本発明は、植物中で発現されるウィルス抗原、特にインフルエンザ抗原を利用する、新規クラスのビロソーム粒子の生成に関し、そしてこれらのビロソーム粒子を含むワクチン、特にインフルエンザワクチンに関する。
2013542928.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）タバコ植物中において組み換えで生産されるインフルエンザのヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）（ＨＡ）抗原、及び
（ｉｉ）脂質二重層
を含む、合成的に生産されるビロソーム粒子であって、ここで前記脂質二重層が、前記脂質二重層に固定された少なくとも１つのビスアシルオキシプロピルシステイン複合体を含む、前記ビロソーム粒子。
【請求項２】
前記インフルエンザのヘマグルチニン（ＨＡ）抗原が、前記ビロソーム粒子の脂質二重層中に存在する、請求項１に記載のビロソーム粒子。
【請求項３】
前記ビスアシルオキシプロピルシステイン複合体が、ＭＡＬＰ−２、ペグ化ビスアシルオキシプロピルシステイン、及び４−ＡＲＭ−ビスアシルオキシプロピルシステインからなる群から選択され、特にＢＰＰ−Ｇｌｙｃ−Ｃｙｓ−４−ａｒｍ−ＰＥＧである、請求項１又は２に記載のビロソーム粒子。
【請求項４】
前記ビスアシルオキシプロピルシステイン複合体が、ＭＡＬＰ−２及びＳ−［２，３−ビス（アシルオキシ）−（２Ｒ）−プロピル］−Ｌ−システイニル−カルボキシポリエチレングリコールからなる群から選択される、請求項３に記載のビロソーム粒子。
【請求項５】
前記ビスアシルオキシプロピルシステイン複合体が、Ｓ−［２，３−ビス（パルミトイルオキシ）−（２Ｒ）−プロピル］−Ｌ−システイニル−カルボキシポリエチレングリコールである、請求項４に記載のビロソーム粒子。
【請求項６】
適切な薬理学的に許容される物質希釈剤と場合により組み合わされる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のビロソーム粒子を含む、ワクチン。
【請求項７】
適切な薬理学的に許容される物質アジュバントと組み合わされる、請求項６に記載のワクチン。
【請求項８】
経鼻投与用の、請求項６又は７に記載のワクチン。
【請求項９】
ビロソーム粒子の生産方法であって、以下のステップ：
ａ）植物中において組み換えでインフルエンザのヘマグルチニン（ＨＡ）抗原を生産し；
ｂ）少なくとも１つのビスアシルオキシプロピルシステイン複合体を含む、リン脂質混合物を生産し；そして
ｃ）前記ウィルス抗原を前記リン脂質混合物と共に再構成して前記ビロソーム粒子を生産すること
を含む、前記生産方法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のビロソーム粒子、請求項６〜８のいずれか１項に記載のワクチン、又は請求項９に記載の方法によって生産されるビロソーム粒子の、インフルエンザの予防のための使用。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のビロソーム粒子、請求項６〜８のいずれか１項に記載のワクチン、又は請求項９に記載の方法によって生産されるビロソーム粒子を、それを必要とする患者へ適切な用量で投与することを含む、請求項１０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物中で発現されたウィルス抗原、特にインフルエンザ抗原を利用する、新規クラスのビロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅ）粒子の生成に関し、そしてこれらのビロソーム粒子を含むワクチン、特にインフルエンザワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
流感（ｆｌｕ）として通常知られているインフルエンザは、最も古く且つ最も一般的な疾患の１つである。それは、発熱、悪寒、咳、喉の痛みと頭痛のような様々な症状を特徴とする急性呼吸器疾患である。それは、くしゃみや咳を介して気道分泌により伝達される非常に伝染性の疾患である。それはほとんど、軽度のウィルス性感染であるが、インフルエンザは、幼児、高齢者及び免疫不全個人における高い羅患率及び死亡率の原因である（Cox N.J., Annu Rev Med, 2000, 51 :4-7-421）。
【０００３】
インフルエンザに対するワクチンは、防御抗原であるインフルエンザウィルスの表面タンパク質（ヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＨＡ）に基づいている。現在のインフルエンザワクチンは、３種の異なるインフルエンザ株、すなわちインフルエンザＡ  Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２、及びインフルエンザＢウィルスからのＨＡ抗原を含む。抗原連続変異の結果としての季節性インフルエンザウィルスの新規株の出現は、インフルエンザワクチン組成の毎年の修正を要する。定期的（平均して２０年ごとに）な抗原シフトが世界的大流行につながり、そして現在、２００９年のインフルエンザ大流行を引き起こした高病原性Ｈ１Ｎ１株に対する公衆衛生上の関心が特に高い。
【０００４】
ワクチン接種は、特に脅威のインフルエンザ大流行の面からインフルエンザウィルスによる感染を防ぐために最も効果的且つコスト効率の高い手段となっている。さらに、季節性インフルエンザワクチン生産の世界的容量は、４００万投与量が限度であり、それは世界的規模での高リスク患者に予防接種をするために必要な１０億投与量には程遠い（Emmanuel E.J. and Wertheimer A., Science 2006, 312:854-855）。
【０００５】
インフルエンザウィルスのヘマグルチニン（ＨＡ）に対する抗体は、インフルエンザワクチンの防御能力に大きな役割を果たす。前記分子は、細胞受容体を標的化する結合部位を含み、そしてその可変球状ドメインは中和エピトープの大部分を発現する（Wiley D.C., Wilson LA. and Skehel J.J., Nature 1981 , 289:373-378）。市販の季節性インフルエンザワクチンは、不活性化又は弱毒化インフルエンザウィルスに基づいている（Nichol K.L. and Treanor J.J., JID, 2006, 194 (Suppl.2), S111-S118）。サブユニットに基づくワクチンアプローチは、特にバキュロウィルスで発現される組み換えＨＡを用いて、臨床試験において検証されている（Goji .A,. et al., JID, 2008, 1998:635-638）。
【０００６】
通常、新規ウィルスに基づく多量の新規ワクチンの製造のためには、少なくとも約６ヶ月かかる。そのことは、世界的流行のワクチンの開発に対して重要なハードルを示している。２００９年流行のインフルエンザの高病原性Ｈ１Ｎ１株の場合、最初の症例は２００９年３月、メキシコにおいて報告されており（ＷＨＯウェブサイトを参照のこと）、そして最初の対応するワクチン、Ｆｏｃｅｔｒｉａ（登録商標）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）及びＰａｎｄｅｍｒｉｘ（登録商標）（Ｇｌａｘｏ−ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）は、２００９年９月２４日に欧州で承認を得るために推奨された（ＥＭＥＡウェブサイトを参照）に。両者とも鶏卵で生産されるが、当該卵に基づいて生産されたワクチンは、明らかにかなり低力価であり、したがって免疫原性がかなり低く、そのためアジュバントの添加が両者の場合に必要であった。
【０００７】
したがって、今日における主な生産方法は、いまだに卵を用いた技術を含むものであり、そしてそれによっては、世界中の高リスクの全個人を予防接種するために必要となるであろうワクチン投与数を生産することができない。一般的に、１個の卵がワクチンの１回投与量の生産のために必要とされる。
【０００８】
前記方法は、次のいくつかの限界に直面している：
−  必要とされる卵の数が多いために、困難且つ時間のかかるロジスティックス；
−  生産規模及び能力の限界；
−  大流行の鳥インフルエンザ又は大流行の２００９年インフルエンザの場合、生産元の問題；
−  汚染に対する生産方法の感受性；
−  生産方法の複雑さと期間（６ヶ月）；
−  いくつかの精製段階にもかかわらず、ワクチン接種を受けた人において望ましくないアレルギー反応を引き起こす可能性がある、微量の鳥タンパク質を含むかもしれないこと。
【０００９】
２００９年インフルエンザの高病原性Ｈ１Ｎ１株の場合、卵に基づいて生産されたワクチンは、一部においてかなり力価が低く、それに対応して免疫原性がかなり低く、したがってアジュバントの添加が必要である。
【００１０】
細胞に基づく技法が今日の卵に基づく方法と競合し始めている。最も先進的な技法は、ＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙ  Ｃａｎｉｎｅ  Ｋｉｄｎｅｙ）（マディン−ダービーイヌ腎臓）と呼ばれるイヌ腎臓細胞系に基づいている。それは、生産方法が開始されるまで、細胞が凍結され、そして貯蔵され得るという事実のために、論理的な工程としていくらかの利点を有する。このシステムはまた、製品の汚染に対して低い感受性を有し、そしてワクチン自体は、アレルギー反応を潜在的に引き起こし得る、残留する微量の卵タンパク質をも含まない。Ｖｅｒｏ及びＰＥＲ．Ｃ６細胞培養物を用いての、細胞に基づく他の技法が開発中である。２００９年インフルエンザの高病原性Ｈ１Ｎ１株に対するワクチン、すなわちＣｅｌｖａｐａｎ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ；Ｖｅｒｏ細胞において生産される、アジュバントを有さない）が、ＥＭＥＡにより２００９年１０月１日に欧州での承認のために推奨された（ＥＭＥＡのウェブサイトを参照のこと）。しかしながらそれらの生産方法は、使用される細胞系列にかかわらず、大量生産の観点で非常に限定された能力しか有さない。しかしながら、大量の適切なインフルエンザ抗原を迅速に利用できることが、インフルエンザ流行又は大流行の脅威に対応するために必須である。
【００１１】
グリーンバイオテクノロジーは、現在のインフルエンザワクチン生産システム（卵及び哺乳類細胞培養物）に関する多くの問題を克服する機会を提供する。植物の別の利点は、それらが動物病原体を有さないので、バイオ医薬品生産をより安全に生産することができる生命体となることである。
【００１２】
しかしながら、また、植物におけるインフルエンザ抗原の生産は、欠点がないわけではない。植物物質による汚染は、有害なアレルギー反応を導き、そして医薬品承認を妨げる可能性がある。したがって、植物抽出物からインフルエンザウィルスを単離し、そして精製する場合、細心の注意が払われなければならない。
【００１３】
ワクチンの効力を増強し、そしてそれにより、利用可能性の問題を克服するための別のアプローチとして、免疫刺激性の再構成されたインフルエンザビロソーム（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｏｓｏｍｅ）（ＩＲＩＶ）が開発された。ＩＲＩＶは、ビロソーム中に組みこまれた１つの抗原又は抗原の組み合わせを含み、ここで当該ビロソームは、リン脂質、本質的に再構成された機能性ウィルスエンベロープ及びインフルエンザヘマグルチニンタンパク質（ＨＡ）の混合物をさらに含む（例えば、国際公開第１９９２／１９２６７号を参照のこと）。
【００１４】
そのようなＩＲＩＶは例えば、不活性化Ａ型肝炎ウィルス由来の抗原を用いて非常に良好な結果を示す。しかしながら、そのようなＩＲＩＶワクチンにおいて、ＨＡに対する抗体は検出されなかった。そのことはＨＡ抗原に対する免疫応答がなかったことを示しており、したがって、「空（ｅｍｐｔｙ）」のＩＲＩＶの使用、すなわちインフルエンザヘマグルチニンタンパク質のみを有するＩＲＩＶの使用は、「単独型の（ｓｔａｎｄ  ａｌｏｎｅ）」ワクチンとして実施可能であるとは思われなかった。したがって、従来技術である「空」のＩＲＩＶは、ワクチンというよりも、むしろアジュバントと見なされていた。
【００１５】
最近、グリーンバイオテクノロジー及びＩＲＩＶ法の組み合わせが公開されている（国際公開第２００９／００９８７６号；国際公開第２００９／０７６７７８号）。それらの実験において、ウィルス様粒子（ＶＬＰ）が、植物において生産され、そして植物物質から単離された。この新規方法は、ＶＬＰ粒子の大量生産を可能にした。しかし残念ながら、ＶＬＰは非常に低い免疫原性を示し、強力なアジュバントの追加使用を必要とする。いくつかのアプローチが植物由来のインフルエンザ抗原の効能を増強するために試験されてきたにもかかわらず、植物由来のインフルエンザワクチンはまだ承認されていない。
【００１６】
したがって、本発明における技術的課題は、新規ワクチン、特にインフルエンザに対する新規ワクチンを提供することである。当該ワクチンは、当該技術分野で使用される方法に関連するワクチン生産の限界、例えばワクチンの量、再現性及び純度に関するワクチン生産の限界を克服し、同時に、ワクチンの免疫原性を維持したものである。
【００１７】
上記の技術的課題に対する解決策、すなわち高い再現性及び純度と同時に、高い免疫原性を有し、多量に生産され得るワクチン、特にインフルエンザワクチンは、従来技術において提供も示唆もされていない。
【００１８】
本発明は、請求項において特徴づけられる実施形態を提供することにより上記技術的課題を解決する。それらの実施形態を用いることにより、ワクチン、特にインフルエンザワクチンの生産能力及び品質を向上されることが可能となった。
【００１９】
本発明は、ワクチン及びワクチン生産のすべての分野に、特にインフルエンザワクチンの分野に適用できる。
【発明の概要】
【００２０】
本発明は、（ｉ）植物において組み換えで生産されるウィルス抗原、及び（ｉｉ）脂質二重層を含むビロソーム粒子を提供し、ここで前記脂質二重層は、以下の特徴の少なくとも１つにより特徴づけられる：
ａ）脂質二重層に固定された（ａｎｃｈｏｒｅｄ）少なくとも１つのビスアシルオキシプロピルシステイン複合体；
ｂ）脂質二重層に固定された植物ステロールが存在しないこと；
ｃ）脂質二重層に固定された少なくとも１つの動物ステロール；
ｄ）前記ウィルスの宿主細胞の細胞膜で見られるものと同じ、脂質二重層の細胞膜組成；
ｅ）脂質二重層に固定された植物由来のスフィンゴ脂質が存在しないこと。
【００２１】
特定の実施形態によれば、本発明は、（ｉ）タバコ植物中において組み換えで生産されるインフルエンザのヘマグルチニン（ＨＡ）抗原、及び（ｉｉ）脂質二重層を含む、合成的に生産されるビロソーム粒子に関し、ここで前記脂質二重層が、前記脂質二重層に固定された少なくとも１つのビスアシルオキシプロピルシステイン複合体を含む。
【００２２】
本発明はさらに、本発明のビロソーム粒子を含むワクチンであって、場合により、適切な薬理学的に許容される物質希釈剤と組み合わされる、前記ワクチンを提供する。
【００２３】
本発明はさらに、以下のステップ：
ａ）植物中において組み換えでウィルス抗原を生産し；
ｂ）以下の特徴：
少なくとも１つのビスアシルオキシプロピルシステイン複合体；
植物ステロールが存在しないこと；
少なくとも１つの動物ステロール；
前記ウィルスの宿主細胞の細胞膜で見られるものと同じ細胞膜組成；及び／又は
スフィンゴ脂質が存在しないこと
の少なくとも１つにより特徴づけられる、リン脂質の混合物を生産し；
ｃ）前記インフルエンザウィルス抗原を前記リン脂質混合物と共に再構成し、前記ビロソーム粒子を形成すること
を含む、ビロソーム粒子の生産方法を提供する。
【００２４】
本発明はさらに、本発明のビロソーム粒子、本発明のワクチン、又は本発明の方法により生産されるピロソーム粒子の感染性疾患の予防のための使用にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ビロソーム粒子の調製手順の原理を示す。（ａ）植物において発現されたＨＡインフルエンザ抗原、（ｂ）リン脂質の混合物、（ｃ）界面活性剤中に、ＨＡ及びリン脂質を含む、インフルエンザスパイクサブユニット抗原（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｓｐｉｋｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｔｉｇｅｎ）を溶解、（ｄ）界面活性剤の除去の後、表面上にＨＡを含むインフルエンザスパイクタンパク質を担持する再構成膜を含むビロソーム粒子。
【図２】図２は、グラジエントの銀染色を示す。
【図３】図３は、光子相関分光法（ＰＣＳ）を示す。
【図４】図４は、マウスにおけるビロソーム粒子の免疫原性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の一態様は、（ｉ）植物中において組み換えで生産されるウィルス抗原、及び（ｉｉ）脂質二重層を含むビロソーム粒子に関し、ここで前記脂質二重層は、次の特徴の少なくとも１つにより特徴づけられる：
ａ）脂質二重層に固定された少なくとも１つのビスアシルオキシプロピルシステイン複合体；
ｂ）脂質二重層に固定された植物ステロールが存在しないこと；
ｃ）脂質二重層に固定された少なくとも１つの動物ステロール；
ｄ）前記ウィルスの宿主細胞の細胞膜で見られるものと同じ、脂質二重層の細胞膜組成；
ｅ）脂質二重層に固定された植物由来のスフィンゴ脂質が存在しないこと。
【００２７】
用語「ビロソーム粒子（ｖｉｒｏｓｏｍｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）」とは、本明細書において使用される場合、リン脂質の混合物を含む脂質二重層を有する粒子のことであり、したがってそれは、本質的に再構成された機能性ウィルスエンベロープに類似する。特定の実施形態において、当該脂質二重層は、ユニラメラ二重層（ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｂｉｌａｙｅｒ）の形で存在する。
【００２８】
用語「ウィルス抗原（ｖｉｒｕｓ  ａｎｔｉｇｅｎ）」とは、本明細書において使用される場合、抗体の生成を促進し、免疫応答を引き起こすことができる全てのウィルス抗原であり得る。
【００２９】
１つの実施形態において、そのようなウィルス抗原は、オルトミクソウィルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に由来する抗原である。特定のかかる実施形態において、抗原はインフルエンザ由来の抗原であり、いくつかの実施形態において、インフルエンザＡ、Ｂ又はＣ由来の抗原である。いくつかの実施形態において、抗原はインフルエンザ糖タンパク質から選択される。いくつかの実施形態において、インフルエンザ抗原は、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、Ｍ１−タンパク質、Ｍ２−タンパク質、ＮＳ１−タンパク質、ＮＳ２（ＮＥＰ）−タンパク質、ＰＡ−タンパク質、ＰＢ１−タンパク質、ＦＢ１−Ｆ２−タンパク質及びＰＢ２−タンパク質から成る群の１又は２以上のメンバーから選択される。特定の実施形態において、ウィルス抗原はヘマグルチニン（ＨＡ）である。さらなる実施形態において、インフルエンザヘマグルチニンは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５及びＨ１６から成る群から選択され、特にＨ１である。
【００３０】
さらなる実施形態において、そのようなウィルス抗原の挿入又は付加変異体（すなわち、欠失され、挿入され、又は付加されたアミノ酸又はアミノ酸配列を有するタンパク質）が包含される。また、キメラ（すなわち、異なった起源の融合タンパク質又はタンパク質複合体）、化学的に修飾されたタンパク質（例えば、ペグ化タンパク質）及び修飾されたタンパク質（例えば、追加の非天然アミノ酸）が包含される。１つの実施形態において、植物由来の抗原は、インフルエンザヘマグルチニンに由来する。さらなる実施形態において、ウィルス抗原は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５及びＨ１６からなる群から選択されるインフルエンザヘマグルチニンに由来し、特にＨ１に由来する。
【００３１】
特定の実施形態において、ウィルス抗原、例えばヘマグルチニンＨＡは、膜貫通領域又はその誘導体を含む。
【００３２】
本発明の特定の実施形態において、ウィルス抗原はビロソーム粒子の脂質二重層中に位置する。
【００３３】
特定の実施形態において、ヘマグルチニン（ＨＡ）は、生物学的に活性である。
【００３４】
用語「生物学的に活性（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ）」とは、本明細書において使用される場合、実質的に生来のＨＡの完全な生物学的活性を示し、したがって、標的細胞へのシアル酸含有受容体経由での、本発明のビロソーム粒子の吸着を媒介することができる、ＨＡ又は誘導体に関する。さらに、そのようなＨＡ成分は、循環する抗インフルエンザ抗体により認識され得る。この生物学的活性は、本発明のビロソーム粒子の必須の特徴である。
【００３５】
理論には縛られないが、本発明のビロソーム粒子のＨＡ成分の機能は次のように説明され得る：
１）それは、標的細胞上のシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン）含有受容体に結合し、ビロソーム粒子−細胞相互作用を引き起こし；
２）それは、膜融合現象により細胞質中へのビロソーム粒子の侵入を媒介し、最終的にその放出を導き；そして
３）大部分のヒトは、疾病又はワクチン接種を通しての事前の曝露によって、ＨＡで「予備刺激される（ｐｒｉｍｅｄ）」と考えられ得るため、「認識抗原（ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ）」として機能する。
【００３６】
したがって、そのようなビロソーム粒子の本質的特徴は、それらの表面上に生物学的に活性であるウィルス糖タンパク質（ＨＡ）又はその誘導体を担持し、ＨＡ抗原が非特異的に分解され得る内細胞質体（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｏｍｅ）中において、ＨＡ抗原の望ましくない長期の滞在を回避することである。
【００３７】
抗原がマクロファージ及び他の補助細胞に受け入れられるべきであるという事実は非常に重要である。この目的のために、ビロソーム粒子の微粒子の性質は有利である。それが微生物の微粒子体を模倣するからである。
【００３８】
さらにすべての人間は、（以前のインフルエンザ感染又はワクチン接種のいずれか由来の）インフルエンザ抗原ＨＡに対する抗体を有するので、抗体−抗原複合体（免疫複合体）は速やかに形成される。しかしながら、これらの免疫複合体は、マクロファージ中へのみならず、リンパ濾胞（この中で、抗原は濾胞樹状細胞の表面上の細胞外位置に長期保持される）中への認識された抗原の侵入を促進する。かかる長期細胞外提示はもちろん、その多機能免疫刺激効果（免疫原性）のために、ワクチンの好ましい特徴である。マクロファージ及びリンパ濾胞のこの侵入工程は、オプソニン作用と呼ばれている。
【００３９】
さらに、抗体による結合は、抗原の免疫原性のための別の結果を有する。溶液中、所定の抗原Ａは、それらの表面上で抗Ａ特異性の抗体分子を示すＢ細胞に単に結合するが、免疫複合体はＦｃ受容体を介して任意のＢ細胞に付着することができる。リンパ節のＢ細胞領域へ侵入する、求心性リンパ管中のＢ細胞の能力のために、Ｆｃ受容体を介してのこの非特異的結合はおそらく、自然感染における１つの経路であり、それにより、前記抗原はリンパ濾胞に、そしてリンパ組織の他の部分に輸送される（Nossal, G.J.V., New Generation Vaccines (ed. Woodrow, G.C. and Levine, M.M.), Marcel Dekker, Inc., (1990) 85）。この機構は単球による輸送に付随するであろう。
【００４０】
したがって、ビロソーム粒子の表面上におけるインフルエンザ抗原の存在は、オプソニン作用の免疫学的機構を支持する。
【００４１】
１つの実施形態において、本発明のビロソーム粒子は、植物において５５０個のアミノ酸の単一ポリペプチド鎖として合成される完全ＨＡを含む。前記鎖はその後、アルギニン３２９（ＨＡ［インフルエンザＡウィルス（Ａ／ＴＷ／３６／０４（Ｈ３Ｎ２））］、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢＤ５９８５５．１のアルギニン３４５に対応する）の除去により、２本の鎖ＨＡ１（３６，３３４ダルトン）及びＨＡ２（２５，７５０ダルトン）に切断される。
【００４２】
これらの鎖は、ＨＡ１の位置１４のシステインと、ＨＡ２の位置１３７のシステインを含むジスルフィド結合により場合により共有結合され、そして当該二本鎖モノマーは非共有結合され、ＩＲＩＶの表面上で三量体を形成する。これらのＨＡ１又はＨＡ２ペプチドは、天然から又は合成源から、又は遺伝子工学により得られる。
【００４３】
さらに、大量の純粋タンパク質抗原の突然の適用は、特に静脈内経路が使用される場合、免疫応答におけるサプレッサー経路の活性化の危険性を包含する（Nossal, G.J.V., New Generation Vaccines, Marcel Dekker, Inc. New York, Basle (eds. Woodrow, Levine), (1990) 85を参照のこと）。他方では、徐放により、広く拡散された樹状細胞及びマクロファージへの抗原の広範なアクセスが可能となり、そしてそれはまた、クローン増殖の初期出現の後、まだ利用可能であることを保証し、それにより、二次応答のいくらかの面を可能にする。したがって、ビロソーム粒子により示される抗原の徐放は、ワクチンの別の好ましい特徴である。
【００４４】
用語「植物中において組み換えで生産される（ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｙ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ）」とは、本明細書において使用される場合、植物宿主での発現による、糖化タンパク質を包含するタンパク質の組み換えでの生産のことである。
【００４５】
本発明において、用語「植物宿主（ｐｌａｎｔ ｈｏｓｔ）」とは、異種タンパク質の組み換え発現のために適切である、任意の植物のことである。
【００４６】
特定の実施形態において、植物発現宿主は、タバコ植物、特にニコチアナ・ベンタミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔａｍｉａｎａ）である。
【００４７】
本発明の特定の実施形態において、植物中において組み換えで生産されるウィルス抗原は、植物発現宿主特有の炭水化物プロフィールを有する。
【００４８】
植物において完全なウィルス様粒子（ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）（ＶＬＰ）を生産する従来技術に反して、ウィルス抗原（例えば、ＨＡタンパク質）のみが植物において生産され、そして精製される。その後、植物中で生産されなかったリン脂質の混合物と共に、当該抗原は再構成される。
【００４９】
前述のように、従来技術の方法は通常、植物において完全なＶＬＰを生産する。すなわち、抗原及びリン脂質混合物並びにタンパク質は植物由来である。その後、ＶＬＰは植物生産物から単離され、そして自発的凝集により形成される。そのような「一段階（ｏｎｅ−ｓｔｅｐ）」の手法は、単純であるという利点を有するが、いくつかの欠点を有する。
【００５０】
第一に、当該手法によって、汚染のないＶＬＰを生産することは実質的に不可能である。しかしながら、植物物質による汚染は、アレルギー又は他の有害な身体反応の危険な原因である。したがって、そのようなＶＬＰ含有ワクチンについて医薬品承認を得ることは困難である。
【００５１】
第二に、自発的凝集及び粒子形成のために、任意の追加のプロセス制御を行うことができない。これは、サイズ及び組成の不均一な粒子をもたらす。
【００５２】
第三に、ＶＬＰの一部となるアジュバントと一緒に製剤化することができない。代わりに、アジュバントは、粒子形成が行われた後に添加され得るのみである。
【００５３】
本発明は、これらの欠点のすべてを克服する。
【００５４】
第一に、それは非常に純粋なビロソーム粒子をもたらすという利点を有する。ウィルス抗原（例えば、ＨＡタンパク質）のみが植物において生産され、一方でリン脂質及び粒子の他の成分は、非植物源からの化学的又は生化学的手段により生産されるからである。
【００５５】
驚くべきことに、本発明の純粋なビロソーム粒子は、従来技術のＶＬＰに比較して、増強された免疫原性を示す。理論に縛られるものではないが、純粋なビロソーム粒子は、植物糖脂質を含まず、そしてより「天然の（ｎａｔｉｖｅ）」ビロソームの構造に類似するため、抗原（例えば、ＨＡタンパク質）の重要なエピトープがマスクされず、したがって本発明のビロソーム粒子は、より強力な免疫応答を誘発できると考えられる。
【００５６】
第二に、ウィルス抗原（例えば、ＨＡタンパク質）へのリン脂質（及び他の成分）の制御された添加により、粒子組成の制御が可能となる。それは、粒子のサイズ及びそれらの組成が正確に管理され、そして個々の要求に応じて調節され得ることを意味する。さらに、免疫原性が、粒子の組成を微調整することにより改善され得る。
【００５７】
用語「リン脂質の混合物（ｍｉｘｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ）」とは、本明細書において使用される場合、天然又は合成のリン脂質又はそれらの混合物を含む。少なくとも、それは、ホスファチジルコリン又はホスファチジルエタノールアミンのようなグリセロリン脂質、及びコレステロールからなる群から選択される１又は２以上の化合物を含み、特にホスファチジルコリン及び／又はホスファチジルエタールアミンを含む。
【００５８】
粒子の制御された凝集により、粒子自体の脂質二重層中へのアジュバントの組込み（すなわち、埋包（ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）又は固定（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ））が可能となる。免疫原性を増強するために、いくつかの実施形態において、前記脂質二重層は、少なくとも１つのビスアシルオキシプロピルシステイン複合体を含む。当該複合体は、脂質二重層中に固定されており、その結果、ワクチン接種の準備ができている安定した粒子をもたらす。ビロソーム粒子の脂質二重層中にビスアシルオキシプロピルシステイン複合体を組込む利点は、ビロソーム粒子表面、抗原分布及びアジュバント分布間の理想的割合が安定して維持され得ることである。
【００５９】
本発明において、用語「ビスアシルオキシプロピルシステイン複合体（ｂｉｓａｃｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ」とは、一般式Ｉ：
【００６０】
【化１】
2013542928.tif 000003
【００６１】
［式中、
Ｒ1及びＲ2は、アルキル又はアルケニル基から独立して選択され、それらは、それらが結合している−Ｃ（＝Ｏ）−基と一緒になってアシル基、例えばパルミトイル基を形成し；
Ｙは、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−及び−Ｏ−ＣＯ−から選択され、特に−ＮＨ−であり；そして
Ｒ3は、脂質二重層中への組込みのために適切なポリマー部位、特にポリペプチド、又は下記一般式：
【００６２】
【化２】
2013542928.tif 000004
｛式中、
ｍは、５〜７００、特に１００〜５００から選択される整数であり；
Ｘは、−Ｏ−Ｒ4、−Ｎ（Ｒ4）2、−Ｓ−Ｒ4及び−ＣＯＯＲ4から選択され、ここでＲ4は、−Ｈ、−ベンジル、Ｃ1-6アルキルから選択され、そして−Ｎ（Ｒ4）2において、２つの残基Ｒ4は同一であっても又は異なっていても良い｝
で表されるポリ（エチレングリコール）部位である］
で表される分子のことである。
【００６３】
追加の実施形態において、ビロソーム粒子は、下記式ＩＩ：
【００６４】
【化３】
2013542928.tif 000005
【００６５】
［式中、
−  Ｒ1及びＲ2は、同一であっても又は異なっていても良く、それらが結合する−ＯＣ−部位と一緒になってアシル部位を形成し；
−  Ｌは、ＮＨ、Ｏ、Ｓ及びＯＣＯからなる群から選択されるリンカー部位であり；
−  Ｒ3は、下記式：
【００６６】
【化４】
2013542928.tif 000006
｛式中、
−  Ｘ1は、水素又は炭化水素であり、当該炭化水素は１又は２以上のヘテロ原子を含んでもよく；
−  Ｒ4は、独立して、水素、ＯＨ、Ｒ5、ＯＲ5又はＣＯ−Ｒ6のいずれか１つであり；
−  Ｒ5は、独立して、水素又はＣ1−Ｃ6アルキルのいずれか１つであり；
−  Ｒ6は、独立して、水素、ＯＨ、ＯＲ5又はＮＲ7Ｒ8のいずれか１つであり；
−  Ｒ7及びＲ8は、独立して、水素又は炭化水素のいずれか１つであり、前記炭化水素は１又は２以上のヘテロ原子を含み、そして環を形成してもよく、
−  ｎは、１〜１００の整数であり；
−  ｘは、独立して１〜１０の整数であり；
−  ｙは、０〜１０の整数である｝
で表される、同一であっても又は異なっていても良い、少なくとも２つのポリアルキレングリコール単位を含む、共有結合された複合体である］
で表されるビスアシルオキシプロピルシステイン複合体を含む。
【００６７】
したがって、本発明のいくつかの実施形態において、新規ビロソーム粒子は、ＭＡＬＰ−２（例えば、国際公開第９８／２７１１０号及び第２００３／０８４５６８号を参照のこと）、ペグ化ビスアシルオキシプロピルシステイン（例えば、国際公開第２００４／００９１２５号を参照のこと）、４−ＡＲＭ−ビスアシルオキシプロピルシステイン（特に、ＢＰＰ−Ｇｌｙｃ−Ｃｙｓ−４−ａｒｍ−ＰＥＧ；例えば国際公開第２００７／０５９９３１号を参照のこと）
【００６８】
【化５】
2013542928.tif 000007
【００６９】
及び他のビスアシルオキシプロピルシステイン複合体を包含する群から選択される、少なくとも１つのビスアシルオキシプロピルシステイン複合体を含み、特にＭＡＬＰ−２及びＳ−［２，３−ビス（アシルオキシ）−（２Ｒ）−プロピル］−Ｌ−システイニル−カルボキシポリエチレングリコールを含む群から選択される、少なくとも１つのビスアシルオキシプロピルシステイン複合体を含み、特にＳ−［２、３−ビス（パルミトイルオキシ）−（２Ｒ）−プロピル］−Ｌ−システイニル−カルボキシポリエチレングリコールを含む。
【００７０】
ＭＡＬＰ−２分子及びそのビスアシルオキシプロピルシステイン複合体、例えばビスパルミトイルオキシプロピルシステイン−ＰＥＧ分子は、マクロファージに対する強力な刺激剤として知られている。アジュバントとしてのＭＡＬＰ−２の有用性はこれまで示されている（例えば、国際公開第９８／２７１１０号及び第２００３／０８４５６８号を参照のこと）。アジュバントとしてのビスパルミトイルオキシプロピルシステイン−ＰＥＧ分子の有用性はこれまで示されている（例えば、国際公開第２００４／００９１２５号を参照のこと）。特に、ＭＡＬＰ−２及びビスパルミトイルオキシプロピルシステイン−ＰＥＧ分子は、粘膜免疫応答を増強する（例えば抗原−特異的ＩｇＡ抗体の増強された発現を促進する）効果的粘膜アジュバントとして作用し得ることが実証された。さらに、ＭＡＬＰ−２は、樹状細胞及びＢ−細胞（両細胞は特定の体液性免疫応答の誘導に重要な役割を果たす）を活性化できることが示された。
【００７１】
したがって、１つの実施形態において、ビロソーム粒子は経鼻（ｉｎｔｒａｎａｓａｌ）投与用である。
【００７２】
用語「植物ステロール（ｐｈｙｔｏｓｔｅｒｏｌ）」とは、植物由来のステロールのことである。植物ステロールが、特に感受性個体においてアテローム硬化症を促進し得るいくつかの証拠が存在する。したがって、さらなる実施形態において、前記脂質二重層は植物ステロールを含まない。本発明のビロソーム粒子の脂質二重層は、カンペステロール（ｃａｍｐｅｓｔｅｒｏｌ）、シトステロール（ｓｉｔｏｓｔｅｒｏｌ）及びスチグマステロール（ｓｔｉｇｍａｓｔｅｒｏｌ）を特に有さない。
【００７３】
用語「動物ステロール（ｚｏｏｓｔｅｒｏｌ）」とは、動物由来のステロール、例えばコレステロールのことである。コレステロールは、哺乳類細胞膜の必須成分であり、それは、適切な膜透過性及び流動性を確立するために必要とされる。したがって、別の実施形態において、脂質二重層は、少なくとも１つの動物ステロール、例えばコレステロールを含んでもよい。
【００７４】
用語「前記ウィルスの宿主細胞の細胞膜で見られるものと同じ、脂質二重層の細胞膜組成（ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｐｉｄ  ｂｉｌａｙｅｒ  ａｓ  ｉｔ  ｉｓ  ｆｏｕｎｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｏｆ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｓａｉｄ  ｖｉｒｕｓ）」とは、本明細書において使用される場合、異なる界（動物界、植物界、菌界、原生生物界、古細菌）において、それらの細胞膜組成は異なるという事実に関する。さらに、タンパク質機能及び特定のエピトープの免疫認識は、特定の脂質二重層組成により影響され得るという示唆が存在する。脂質二重層の物理学的特性（すなわち、流動性、極性、浸透性、安定性等）は、それらの組成にかなり依存するからである。したがって、いくつかの実施形態において、本発明のビロソーム粒子の特定の脂質二重層組成は、動物又はヒト脂質二重層の組成に類似する。いくつかの実施形態において、膜組成は、天然のインフルエンザビロソームの膜組成に類似するか又は同じである。
【００７５】
「スフィンゴ脂質（ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄｓ）」とは、本明細書において使用される場合、脂肪族アミノアルコールスフィンゴシンに由来する脂質の一種のことであり、スフィンゴ糖脂質を含む。これらの化合物は、シグナル伝達及び細胞認識において重要な役割を果たす。植物由来のスフィンゴ脂質は、植物細胞の細胞膜、液胞膜及び他の内膜の主要成分である。植物由来のスフィンゴ脂質と宿主免疫系との間の望ましくない交差反応を排除するために、いくつかの実施形態において、脂質二重層は植物由来のスフィンゴ脂質を含まない。
【００７６】
特定の複雑な哺乳類スフィンゴ糖脂質は、特定の機能、例えば細胞認識及びシグナル伝達に関与することが見出された。前記シグナル伝達は、隣接する細胞上に存在する類似する脂質と、又はタンパク質と、スフィンゴ糖脂質のグリコン構造体との特異的相互作用を包含する。したがって、いくつかの実施形態において、特定の哺乳類スフィンゴ脂質が、本発明のビロソーム粒子に存在してもよい。
【００７７】
他の哺乳類スフィンゴ脂質は通常、機械的に安定であって、化学耐性のある、細胞膜脂質二重層の外層を形成することにより、有害な環境因子に対して細胞表面を保護すると考えられている。しかしながら、そのような「保護表面」は、免疫原性のために必要である、宿主免疫系へエピトープを曝露する機会を減じる。したがって、いくつかの実施形態において、本発明のビロソーム粒子の脂質二重層は、いずれのスフィンゴ脂質もまったく含まない。
【００７８】
本発明のビロソーム粒子の上述の特徴（すなわち、ビスアシルオキシプロピルシステイン複合体を含むこと、植物ステロールを含まないこと、いくつかの動物ステロールを含むこと、特定の膜組成を有すること、及び／又は特定のスフィンゴ脂質を含むこと）は、状況、ワクチン接種されるべき疾患、及び使用される抗原にしたがって、当業者によって組み合わされてもよい。すなわち、例えば高免疫原性の抗原はホスファチジルコリン脂質二重層を含むビロソーム粒子において単に再構成され得るが、一方で低免疫原性の抗原はビスアシルオキシプロピルシステイン複合体、動物ステロール又は特定のスフィンゴ脂質のような免疫原性増強物質と共に再構成され得る。ほとんどの実施形態において、植物由来の物質は、本発明のビロソーム粒子に存在すべきではなく、したがって植物ステロール及び植物由来のスフィンゴ脂質は回避されるべきである。
【００７９】
本発明の特定の実施形態において、ビロソーム粒子は合成的に生産される。
【００８０】
したがって、特定の実施形態において、本発明は、（ｉ）タバコ植物中において組み換えで生産されるインフルエンザのヘマグルチニン（ＨＡ）抗原、及び（ｉｉ）脂質二重層を含む、合成的に生産されるビロソーム粒子に関し、ここで前記脂質二重層は、前記脂質二重層に固定された少なくとも１つのビスアシルオキシプロピルシステイン複合体を含む。
【００８１】
特定の実施形態において、ビロソーム粒子は、１又は２以上の追加のアジュバント（限定されないが、リポ多糖類を含む）をさらに含む。
【００８２】
本発明において、用語「リポ多糖類（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）」(又はＬＰＳ)とは、リポグリカンとしても知られる分子のことであり、共有結合でつながった脂質及び多糖からなる大分子であり；それらは、グラム陰性細菌の外膜に見出され、エンドトキシンとして作用し、そして動物において強い免疫応答を誘発する。したがって、いくつかの実施形態において、脂質二重層ビロソーム粒子は、追加の免疫刺激剤としてＬＰＳを含んでもよい。
【００８３】
ＬＰＳは、本発明により想定される場合、次の３種の部分を含む：
１．Ｏ抗原（又はＯ多糖）
２．コア−オリゴ糖
３．リピドＡ（Ｌｉｐｉｄ  Ａ）。
【００８４】
リピドＡは通常、複数の脂肪酸が取り付けられた、リン酸化グルコサミン二糖である。これらの疎水性脂肪酸鎖は、ＬＰＳを細菌の膜へと固定化し、そしてＬＰＳの残りの部分は細胞表面から突き出ている。リピドＡドメインは、グラム陰性細菌の多くの毒性に関与する。細菌細胞が免疫系により溶解されると、リピドＡ含有膜の断片が循環中に放出され、発熱、下痢及び可能性のある致命的な内毒素ショック（また、敗血症性ショックとも呼ばれる）を引き起こす。
【００８５】
コアオリゴ糖は、リピドＡに直接結合し、そして通常、糖、例えばヘプトース及び３−デオキシ−Ｄ−マンノオクツロソン酸（ｍａｎｎｏｏｃｔｕｌｏｓｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（また、ＫＤＯ、ケトデオキシオクツロソネート（ｋｅｔｏ−ｄｅｏｘｙｏｃｔｕｌｏｓｏｎａｔｅ）としても知られている）を含む。
【００８６】
ＬＰＳが反復性グリカンポリマーを含む場合、これは、Ｏ抗原、Ｏ多糖又は細菌のＯ鎖と呼ばれる。Ｏ抗原は、コアオリゴ糖と結合し、そしてＬＰＳ分子の最も外側のドメインを含む。Ｏ鎖の組成は株ごとに変化し、例えば、異なるＥ．コリ株により生産される１６０個以上の異なるＯ抗原構造体が存在する。Ｏ抗原は、細菌細胞の最外面上に曝露され、そして結果的に、宿主抗体による認識のための標的である。
【００８７】
本発明の追加の態様において、本発明は、本発明のビロソーム粒子を含むワクチンに関し、それは場合により、薬理学的に許容される適切な物質希釈剤と組み合わせられる。
【００８８】
本発明のビロソーム粒子は、有効なワクチン（例えば、インフルエンザワクチン）における強力な活性成分として使用され得、それは所望の抗原（例えば、ＨＡタンパク質）を、ＡＰＣ、例えばマクロファージ、ＤＣ、Ｂ細胞へと能動的に輸送する。当該ＡＰＣは、前記抗原を免疫系に提示し、強力で防御性のある免疫応答を誘導する。
【００８９】
特定の実施形態において、ワクチンは薬理学的に許容される適切な物質アジュバント（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ）と組み合わされる。
【００９０】
特定の他のかかる実施形態において、薬理学的に許容される適切な物質アジュバントは、ビロソーム粒子と一緒に製剤化される。
【００９１】
特定のかかる実施形態において、薬理学的に許容される適切な物質アジュバントは、ビロソーム粒子に添加される。
【００９２】
用語「物質アジュバント（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ）」とは、本明細書において使用される場合、活性抗原に対する体液性及び／又は細胞介在性（細胞性）免疫応答を増強するか、誘発するか、又は調節するために、活性抗原と一緒に製剤化される物質、及び／又は免疫付与時に活性抗原へ添加される物質、すなわち、所望する免疫応答を引き起こす物質を意味する。特に、本発明のアジュバントはまた、先天性免疫応答を増強するか又は誘発することができる。
【００９３】
新規ビロソーム粒子の免疫原性をさらに増強するために、広範囲の従来のアジュバントが使用され得る。最も有効な方法（例えば、フロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）完全アジュバントと一緒に免疫原を投与する方法）は、以下の節において説明される多くの別の原理を組み合わせる：
（Ａ）化学的免疫強化（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｍｍｕｎｏｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ）：
死滅させたマイコバクテリウムツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）菌又は有毒な微生物抽出物、例えばＥ．コリＬＰＳにより達成され得る、全免疫応答の強化を模倣する、純粋、安全、且つ効果的な非毒性有機小分子の研究には、長い研究の歴史が根底にある。
【００９４】
（Ｂ）インターロイキンとの同時投与：
例えば、ＩＬ−２と抗原との同時投与が、抗原及びインターロイキンの別々の投与よりも強い免疫応答の増強をもたらすいくつかの証拠が存在する（Staruch, M.J. and Wood, D.D., J. Immunol. 130 (1983), 2191を参照のこと）。
【００９５】
（Ｃ）高い免疫原性剤と抗原との同時表示：
特定のワクチンが高度に免疫原性である場合、このワクチンのアジュバント効果、及びそれが特定の免疫学的経路への応答を誘導するために有し得る特徴は、それと同時投与される抗原に対する応答に「波及する（ｓｐｉｌｌ ｏｖｅｒ）」ことができる。
【００９６】
例えば、死滅させた百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）又はコリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）菌は、強力な免疫原である。純粋なタンパク質が同じ注射で投与される場合、それに対する応答は増強される。（理由が不明である）特定の免疫原は、特定の方向にその応答を誘導する。例えば、寄生虫、例えばニポストロンジラス・ブラシリエンシス（Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）の抽出物は、強力なＩｇＥ応答を誘発する。寄生虫抽出物と同時投与される純粋なタンパク質はまた、ＩｇＥ応答を引き起こすであろう（Nossal, G.J.V., New Generation Vaccines, Marcel Dekker, Inc. New York, Basle (eds. Woodrow, Levine), (1990) 85を参照のこと）。おそらくこの効果は、特定の薬剤により誘発される特定のリンホカインの生産に幾分関連する。前記リンホカイン、例えばＩＬ−４は、イソタイプスイッチパターン（ｉｓｏｔｙｐｅ  ｓｗｉｔｃｈ  ｐａｔｔｅｒｎｓ）を誘導する。リンホカインのポリクローナル活性化特性はまた、一般的に免疫応答の増強のための基礎を形成することができる。
【００９７】
（Ｄ）疎水性アンカー及び免疫刺激複合体：
免疫刺激複合体における界面活性剤、例えばサポニン又はＱｕｉｌ  Ａは、多くの実験用及び動物用ワクチンに使用されてきた。それらは、いくつかの抗原、特にウィルス膜タンパク質の免疫原性を改善した。
【００９８】
特定の実施形態において、物質アジュバントは、ビスアシルオキシプロピルシステイン複合体及びＬＰＳからなる群から選択される。
【００９９】
特定の実施形態において、ビロソーム粒子含有ワクチンは経鼻投与用である。
【０１００】
本発明のさらに別の態様は、ビロソーム粒子の生産方法であって、以下のステップ：
ａ）植物中において組み換えでウィルス抗原を生産し；
ｂ）以下の特徴：
（ｉ）少なくとも１つのビスアシルオキシプロピルシステイン複合体；
（ｉｉ）植物ステロールが存在しないこと；
（ｉｉｉ）少なくとも１つの動物ステロール；
（ｉｖ）前記ウィルスの宿主細胞の細胞膜で見られるものと同じ細胞膜組成；及び／又は
（ｖ）スフィンゴ脂質が存在しないこと
の少なくとも１つにより特徴づけられる、リン脂質の混合物を生産し；
ｃ）前記インフルエンザウィルス抗原を前記リン脂質混合物と共に再構成し、前記ビロソーム粒子を形成すること
を含む、前記方法に関する。
【０１０１】
さらに別の態様において、本発明は、本発明のビロソーム粒子、本発明のワクチン、又は本発明の方法により生産されるビロソーム粒子の、感染性疾病の予防のための使用に関する。
【０１０２】
特定の実施形態において、本発明の使用は、適切な用量の本発明のビロソーム粒子、本発明のワクチン又は本発明の方法により生産されるビロソーム粒子を、それを必要とする患者に投与することを含む、感染性疾病の予防のための使用である。
【実施例】
【０１０３】
実施例は本発明を例示する。
実施例１：ビロソーム粒子の調製：
ＰＢＳに溶解されたニコチアナ・ベンタミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔａｍｉａｎａ）から発現され、そして精製されたインフルエンザヘマグルチニンを、粉末状の卵由来の脂質（レシチン、例えば卵ホスファチジルコリン）と混合し、界面活性剤として１００ｍＭのＯＥＧを含むＰＢＳに溶解する。脂質：タンパク質の比率は、２０：１〜１：１０の間で変化してもよい。本発明において、最適比率は６：１である。脂質：タンパク質の比率は、他の脂質（合成又はステロイドタイプ）が使用されたとしも、変化することができる。脂質及びインフルエンザＨＡは、場合により超音波パルスに供される。その後、当該混合物を０．２２ｍｍフィルターに通し、そして界面活性剤を、ＳＭ−２  Ｂｉｏ−Ｂｅａｄｓの一連の異なる経路に通して除去する。界面活性剤の除去は、ビロソーム粒子集団中の溶解された構成成分混合物の自発的会合を駆動する。ＳＭ−２  Ｂｉｏ−Ｂｅａｄｓの最後の通過の後、ビロソーム粒子集団を再び、０．２２ｍフィルターに通す。最終生産物は、正確な組成に応じて、平均直径８０〜１５０ｎｍのサイズを有する均質ビロソーム粒子集団である。
【０１０４】
実施例２：ビロソーム粒子生成の代替的改良：
脂質混合物、例えば卵由来のホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの粉末を、界面活性剤として１００ｍＭのＯＥＧを含むＰＢＳに溶解する。脂質比率は、２０：１〜１：１０の間で変化し得る。本発明において、最適範囲は５：１である。脂質：タンパク質比率は、２０：１〜１：１０の間で変化し得る。本発明において、最適比率は７：１である。脂質タンパク質比率は、他の脂質（合成又はステロイドタイプ）が使用されるか、又は異なる脂質の組み合わせが使用される場合、さらに変化し得る。脂質及びインフルエンザＨＡは、場合により超音波パルスに供され得る。
【０１０５】
その後、ＰＢＳに溶解された、ニコチアナ・ベンダミアナから発現され、そして精製されたインフルエンザヘマグルチニンを前記溶液と混合する。脂質及びインフルエンザＨＡは、場合により超音波パルスに供することができる。その後、当該混合物を、０．２２ｍｍフィルターに通して、そして界面活性剤を、ＳＭ−２  Ｂｉｏ−Ｂｅａｄｓへの一連の異なる経路に通して除去する。最後の段階において、界面活性剤を、ＳＭ−２  Ｂｉｏ−Ｂｅａｄｓを用いるバッチクロマトグラフィーにより除去する。前記除去は、正確な組成に応じて、平均直径８０〜１５０ｎｍのビロソーム粒子の均質な集団中の構成成分の自発的会合を駆動する。
【０１０６】
脂質及びタンパク質を溶解するために、選択される界面活性剤は、５０ｍＭの最終濃度である、ＯＥＧのＰＢＳ液である。しかしながら、２０〜１００ｍＭの濃度が使用されてもよい。非イオン性、イオン性又は両性イオン性の、ＯＥＧ以外の界面活性剤が使用されてもよい。
【０１０７】
実施例３：ショ糖グラジエント及び銀染色：
ショ糖グラジエント：不連続ショ糖グラジエントかけた超遠心分離を、個々の構成成分の固有濃度に基づく、ビロソーム粒子中への抗原の組み込みを評価するための分析方法として適用した。ＰＢＳ中のビロソーム粒子製剤のアリコートを、ＰＢＳ中、１０〜６０％（ｗ／ｖ）不連続ショ糖グラジエントの上部に適用し、そして１００，０００ｇで４℃にて２４時間、遠心分離した。その後集められた画分を、密度に関して分析し、その後ＳＤＳ  ＰＡＧＥ及び銀染色を行い、ＨＡ含有画分を決定した。
【０１０８】
銀染色：ＳＤＳ  ＰＡＧＥを、供給者の指示（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って実施した。ゲルの銀染色を、供給者の指示（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に従って実施した。
【０１０９】
実施例４：粒度測定：光子相関分光法：
出発材料として植物系から精製されたＨＡ、及び製剤化されたビロソーム粒子の流体力学直径、多分散指数及び統計学的粒子サイズ分布を、光子相関分光法又は動的光散乱により決定した。この方法は、経時的な光散乱の変動として測定されるブラウン運動のサイズ依存性速度に依存する。生データ、すなわち光強度の変化からのパラメーター計算のためのソフトウェアを含む、Malvern Zetasizer Nano (Malvern Ltd, Malvern, UK)がこの目的のために使用された。測定用にサンプルを０．９％ＮａＣｌで適切に希釈し、そしてその希釈溶液１ｍｌを、２５℃にて標準条件下で分析した。図３は、実施例１に従って生産されたビロソーム粒子の分析を示す。
【０１１０】
実施例５：マウスにおけるビロソーム粒子の免疫原性：
【０１１１】
ワクチン：遊離の植物由来ＨＡ抗原を有する、実施例１に従って調製された２種の異なるビロソーム粒子製剤の比較：
【０１１２】
前記製剤の免疫原性を、マウスモデルにおいて試験した。遊離抗原と比較して、ビロソーム粒子製剤を用いて実験を実施した。０日目及び７日目における２回の筋肉内注射によってマウスを免疫化した。２回目の免疫化から３週間後、採血し、そして血清抗体を分析した。幾何平均抗体力価として表現される結果を図４に要約する。
【０１１３】
縦列の数字は、抗ＨＡ抗体力価の範囲を表す。２８日目での遊離抗原及びビロソーム粒子ワクチン製剤についての幾何平均抗体力価（範囲）は、それぞれ１３９３（８００〜３２００）及び３６７６（３２００〜６４００）であった。したがって、本発明のビロソーム粒子調製物は、遊離抗原ワクチンよりもすぐれている。
【図１】
2013542928.tif 000008
【図２】
2013542928.tif 000009
【図３】
2013542928.tif 000010
【図４】
2013542928.tif 000011
【国際調査報告】
2013542928.tif 000012
2013542928.tif 000013
2013542928.tif 000014
2013542928.tif 000015