(57)【要約】  β−クロト−またはその部分、ＦＧＦＲ１ｃまたはその部分、またはＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−に特異的に結合する結合タンパク質、ならびに同様に任意の他のタンパク質が提供される。コ−ド配列、治療方法、および医薬組成物も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−クロト−を選択的に結合する結合タンパク質であって、
Ｃ［ＡＧＰ］［ＡＰＳ］［ＤＧＮ］［ＥＱ］Ｆ［ＱＲＴ］Ｃ［ＧＮＲＳ］［ＧＮＳ］［ＧＴ］［ＧＫＱＳ］［−ＩＫ］Ｃ［ＩＬＶ］Ｐ［ＬＱＲＶ］［ＡＥＨＰ］Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ［ＤＬＶ］［ＤＮ］ＤＣＧＤ［ＧＮ］ＳＤＥ［ＡＥＫＰＳ］［ＧＬＰＳ］［−ＡＥＶ］［−ＩＴ］Ｃ（配列番号２５４）、
ＣＬＰＤＥＦＱＣ［ＳＧ］ＳＧＲＣＩＰＱ［ＨＴ］Ｗ［ＶＬ］ＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥ［ＰＳ］ＰＡ［ＨＴ］Ｃ（配列番号５９７）、および
Ｃ［ＡＧＰＲ］［ＡＰ］［ＤＧＮＳ］［ＥＱ］Ｆ［ＱＲＴ］Ｃ［ＧＳＫ］Ｎ［ＧＴ］［ＧＨＲ］［Ｒ］Ｃ［ＩＬＶ］［ＰＳ］［ＡＬＱ］［ＮＳＴ］Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ［ＤＥＶ］ＤＤＣ［ＧＬ］ＤＧＳＤＥ［ＡＥＴ］［ＤＮＳ］［−Ａ］［−Ｔ］Ｃ（配列番号２４９）
のうちの１以上を含み、この中で、括弧内のアミノ酸は、指定された位置における代替的なアミノ酸を示し、かつ「−」は、指定された位置にアミノ酸がないことを示す、該結合タンパク質。
【請求項２】
ＣＧＰＤＱＦＲＣＳＳＧＫＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＴＣ（配列番号２５５）、
ＣＧＡＮＥＦＱＣＲＳＴＧＩＣＶＰＶＥＷＶＣＤＧＤＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＶＣ（配列番号２５６）、
ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣ（配列番号２５７）、
ＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣ（配列番号２５８）、
ＣＡＳＧＥＦＴＣＮＮＧＱＣＶＰＬＡＷＲＣＤＧＶＮＤＣＱＤＧＳＤＥＫＧＣ（配列番号２５９）、
ＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣ（配列番号２６０）、
ＣＰＰＤＥＦＱＣＲＧＴＫＫＣＬＰＬＡＷＶＣＤＧＤＮＤＣＥＤＤＳＤＥＥＳＣ（配列番号２６１）、
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣ（配列番号１２３７）、
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣ（配列番号１３２６）、
ＣＡＰＧＥＦＴＣＫＮＴＧＲＣＩＰＬＮＷＲＣＤＧＤＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＤＣ（配列番号１３２７）、および
ＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣ（配列番号１３２８）
のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項３】
β−クロト−と選択的に結合する結合タンパク質であって、
【化１】
2013512672.tif 000098
のうちの１つ以上を含み、この中で、括弧内のアミノ酸は、指定された位置における代替的なアミノ酸を示し、かつ「−」は、指定された位置にアミノ酸がないことを示す、該結合タンパク質。
【請求項４】
ＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣ（配列番号１５９）、
ＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣ（配列番号１３２３）、
ＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣ（配列番号１３２４）、および
ＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣ（配列番号１３２５）
のうちの１つ以上を含む、請求項３に記載の結合タンパク質。
【請求項５】
ＦＧＦＲ１ｃと選択的に結合する結合タンパク質であって、
【化２】
2013512672.tif 000099
を含み、この中で、括弧内のアミノ酸は、指定された位置における代替的なアミノ酸を示し、かつ「−」は、指定された位置にアミノ酸がないことを示す、該結合タンパク質。
【請求項６】
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＱＶＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＤＳＣ（配列番号１０９）、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＹＣ（配列番号１１０）、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＴＮＣ（配列番号１１１）、
ＣＧＥＧＬＦＴＣＧＳ  ＴＮＩＣＩＳＳＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＮＣ（配列番号１１２）、
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＮＣ（配列番号１１３）、
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＥＡＷＩ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＫＮＣ（配列番号１１４）、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＡＫＩＣＩＳＨＡＷＶ  ＣＤＧＩＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＮＣ（配列番号１１５）、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＮ  ＳＫＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＤＤＮ  ＳＤＥＫＹＣ（配列番号１１６）、
ＣＧＡＳＬＦＴＣＲＲ  ＳＮＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＭＮＣ（配列番号１１７）、および
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＫＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＫＮＣ（配列番号１１８）
のうちの１つ以上を含む、請求項５に記載の結合タンパク質。
【請求項７】
前記結合タンパク質はさらに、配列ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号１２）を含むリンカ−を含む、請求項６に記載の結合タンパク質。
【請求項８】
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＶＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＤＳＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号２９３）、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＹＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号２９４）、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号２９５）、
ＣＧＥＧＬＦＴＣＧＳＴＮＩＣＩＳＳＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号４４８）、
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号２９７）、
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＥＡＷＩＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号４４９）、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＡＫＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＩＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号４５０）、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＮＳＫＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＤＤＮＳＤＥＫＹＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号４６４）、
ＣＧＡＳＬＦＴＣＲＲＳＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＭＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号２９６）、および
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＫＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号２８７）
のうちの１つ以上を含む、請求項７に記載の結合タンパク質。
【請求項９】
配列
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号２９７）
を含む、請求項８に記載の結合タンパク質。
【請求項１０】
β−クロト−と選択的に結合する結合タンパク質であって、
（ａ）配列
【化３】
2013512672.tif 000100
によって表される群から選択される配列を含む第一のβ−クロト−結合ドメインと、
（ｂ）配列
【化４】
2013512672.tif 000101
によって表される群から選択される配列を含む第二のβ−クロト−結合ドメインと、を含み、
この中で、括弧内のアミノ酸は、指定された位置における代替的なアミノ酸を示し、かつ「−」は、指定された位置にアミノ酸がないことを示す、該結合タンパク質。
【請求項１１】
（ａ）および（ｂ）を接合する少なくとも１つのリンカ−をさらに含む、請求項１０に記載の結合タンパク質。
【請求項１２】
前記リンカ−は、ＥＴＰＴ（配列番号１３１９）、ＧＤＳＨＩＬＰＦＳＴＰＧＰＳＴ（配列番号１４）、ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号１２）、ＰＡＰＴ（配列番号１３２０）、ＱＡＰＴ（配列番号１３２１）、ＡＱＰＴ（配列番号１３２２）、ＡＨＴ、ＰＥＲＴ（配列番号７）、ＴＴＲＴ（配列番号８）、ＧＴＴＧＰＴ（配列番号９）、ＥＴＳＧＰＴ（配列番号１０）、ＳＱＤＰＥＦＨＫＶＳ（配列番号１１）、ＧＲＰＧＰＧＡＴＳＡＰＡＡおよび（配列番号１３）のうちの１つ以上である、請求項１１に記載の結合タンパク質。
【請求項１３】
請求項１０に記載の結合タンパク質であって、（ａ）のβ−クロト−結合ドメインは、
ＣＧＰＤＱＦＲＣＳＳＧＫＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＴＣ（配列番号２５５）、
ＣＧＡＮＥＦＱＣＲＳＴＧＩＣＶＰＶＥＷＶＣＤＧＤＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＶＣ（配列番号２５６）、
ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣ（配列番号２５７）、
ＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣ（配列番号２５８）、
ＣＡＳＧＥＦＴＣＮＮＧＱＣＶＰＬＡＷＲＣＤＧＶＮＤＣＱＤＧＳＤＥＫＧＣ（配列番号２５９）、
ＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣ（配列番号２６０）、
ＣＰＰＤＥＦＱＣＲＧＴＫＫＣＬＰＬＡＷＶＣＤＧＤＮＤＣＥＤＤＳＤＥＥＳＣ（配列番号２６１）、
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣ（配列番号１２３７）、
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣ（配列番号１３２６）、
ＣＡＰＧＥＦＴＣＫＮＴＧＲＣＩＰＬＮＷＲＣＤＧＤＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＤＣ（配列番号１３２７）、および
ＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣ（配列番号１３２８）
のうちの１つ以上を含む、該結合タンパク質。
【請求項１４】
請求項１０に記載の結合タンパク質であって、（ｂ）のβ−クロト−結合ドメインは、
ＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣ（配列番号１５９）、
ＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣ（配列番号１３２３）、
ＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣ（配列番号１３２４）、および
ＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣ（配列番号１３２５）
のうちの１つ以上を含む、該結合タンパク質。
【請求項１５】
（ａ）β−クロト−と選択的に結合する１つ以上のドメインと（ｂ）ＦＧＦＲ１ｃと選択的に結合する１つ以上のドメインとを含む、β−クロト−およびＦＧＦＲ１ｃと選択的に結合する結合タンパク質であって、
【化５】
2013512672.tif 000102
の１つ以上を含むＦＧＦＲ１ｃ結合ドメイン
を含み、この中で、括弧内のアミノ酸は、指定された位置における代替的なアミノ酸を示し、かつ「−」は、指定された位置にアミノ酸がないことを示す、該結合タンパク質。
【請求項１６】
（ａ）および（ｂ）を接合する少なくとも１つのリンカ−をさらに含む、請求項１０に記載の結合タンパク質。
【請求項１７】
前記リンカ−は、ＥＴＰＴ（配列番号１３１９）、ＧＤＳＨＩＬＰＦＳＴＰＧＰＳＴ（配列番号１４）、ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号１２）、ＰＡＰＴ（配列番号１３２０）、ＱＡＰＴ（配列番号１３２１）、ＡＱＰＴ（配列番号１３２２）、ＡＨＴ、ＰＥＲＴ（配列番号７）、ＴＴＲＴ（配列番号８）、ＧＴＴＧＰＴ（配列番号９）、ＥＴＳＧＰＴ（配列番号１０）、ＳＱＤＰＥＦＨＫＶＳ（配列番号１１）、およびＧＲＰＧＰＧＡＴＳＡＰＡＡ（配列番号１３）のうちの１つ以上である、請求項１６に記載の結合タンパク質。
【請求項１８】
請求項１５に記載の結合タンパク質であって、
（ｉ）（ａ）のβ−クロト−結合ドメインは、
ＣＧＰＤＱＦＲＣＳＳＧＫＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＴＣ（配列番号２５５）、
ＣＧＡＮＥＦＱＣＲＳＴＧＩＣＶＰＶＥＷＶＣＤＧＤＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＶＣ（配列番号２５６）、
ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣ（配列番号２５７）、
ＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣ（配列番号２５８）、
ＣＡＳＧＥＦＴＣＮＮＧＱＣＶＰＬＡＷＲＣＤＧＶＮＤＣＱＤＧＳＤＥＫＧＣ（配列番号２５９）、
ＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣ（配列番号２６０）、
ＣＰＰＤＥＦＱＣＲＧＴＫＫＣＬＰＬＡＷＶＣＤＧＤＮＤＣＥＤＤＳＤＥＥＳＣ（配列番号２６１）、
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣ（配列番号１２３７）、
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣ（配列番号１３２６）、
ＣＡＰＧＥＦＴＣＫＮＴＧＲＣＩＰＬＮＷＲＣＤＧＤＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＤＣ（配列番号１３２７）、および
ＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣ（配列番号１３２８）
のうちの１つ以上を含み、かつ
（ｉｉ）（ｂ）のＦＧＦＲ１ｃ結合ドメインは、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＱＶＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＤＳＣ（配列番号１０９）、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＹＣ（配列番号１１０）、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＴＮＣ（配列番号１１１）、
ＣＧＥＧＬＦＴＣＧＳ  ＴＮＩＣＩＳＳＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＮＣ（配列番号１１２）、
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＮＣ（配列番号１１３）、
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＥＡＷＩ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＫＮＣ（配列番号１１４）、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＡＫＩＣＩＳＨＡＷＶ  ＣＤＧＩＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＮＣ（配列番号１１５）、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＮ  ＳＫＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＤＤＮ  ＳＤＥＫＹＣ（配列番号１１６）、
ＣＧＡＳＬＦＴＣＲＲ  ＳＮＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＭＮＣ（配列番号１１７）、および
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＫＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＫＮＣ（配列番号１１８）
のうちの１つ以上を含む、該結合タンパク質。
【請求項１９】
前記（ｂ）のＦＧＦＲ１ｃ結合ドメインは、配列ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号 １２）を含むリンカ−をさらに含む、請求項１８に記載の結合タンパク質。
【請求項２０】
前記ＦＧＦＲ１ｃ結合ドメインは、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＶＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＤＳＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号２９３）、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＹＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号２９４）、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号２９５）、
ＣＧＥＧＬＦＴＣＧＳＴＮＩＣＩＳＳＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号４４８）、
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号２９７）、
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＥＡＷＩＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号４４９）、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＡＫＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＩＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号４５０）、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＮＳＫＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＤＤＮＳＤＥＫＹＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号４６４）、
ＣＧＡＳＬＦＴＣＲＲＳＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＭＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号２９６）、および
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＫＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号２８７）
のうちの１つ以上を含む、請求項１９に記載の結合タンパク質。
【請求項２１】
（ａ）β−クロト−と選択的に結合する１つ以上のドメインと、（ｂ）ＦＧＦＲ１ｃと選択的に結合する１つ以上のドメインとを含む、β−クロト−およびＦＧＦＲ１ｃを選択的に結合する結合タンパク質であって、
【化６】
2013512672.tif 000103
のうちの１つ以上を含むβ−クロト−結合ドメインと、
（ｂ）配列
【化７】
2013512672.tif 000104
によって表される群から選択される配列を含むＦＧＦＲ１ｃ結合ドメインとを含み、この中で、括弧内のアミノ酸は、指定された位置における代替的なアミノ酸を示し、かつ「−」は、指定された位置にアミノ酸がないことを示す、該結合タンパク質。
【請求項２２】
（ａ）および（ｂ）を接合する少なくとも１つのリンカ−をさらに含む、請求項１０に記載の結合タンパク質。
【請求項２３】
前記リンカ−は、ＥＴＰＴ（配列番号１３１９）、ＧＤＳＨＩＬＰＦＳＴＰＧＰＳＴ（配列番号１４）、ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号１２）、ＰＡＰＴ（配列番号１３２０）、ＱＡＰＴ（配列番号１３２１）、ＡＱＰＴ（配列番号１３２２）、ＡＨＴ、ＰＥＲＴ（配列番号７）、ＴＴＲＴ（配列番号８）、ＧＴＴＧＰＴ（配列番号９）、ＥＴＳＧＰＴ（配列番号１０）、ＳＱＤＰＥＦＨＫＶＳ（配列番号１１）、およびＧＲＰＧＰＧＡＴＳＡＰＡＡ（配列番号１３）のうちの１つ以上である、請求項２２に記載の結合タンパク質。
【請求項２４】
（ｉ）（ａ）のβ−クロト−結合ドメインは、
ＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣ（配列番号１５９）、
ＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣ（配列番号１３２３）、
ＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣ（配列番号１３２４）、および
ＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣ（配列番号１３２５）
のうちの１つ以上を含み、かつ
（ｉｉ）（ｂ）のＦＧＦＲ１ｃ結合ドメインは、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＱＶＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＤＳＣ（配列番号１０９）、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＹＣ（配列番号１１０）、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＴＮＣ（配列番号１１１）、
ＣＧＥＧＬＦＴＣＧＳ  ＴＮＩＣＩＳＳＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＮＣ（配列番号１１２）、
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＮＣ（配列番号１１３）、
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＥＡＷＩ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＫＮＣ（配列番号１１４）、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＡＫＩＣＩＳＨＡＷＶ  ＣＤＧＩＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＮＣ（配列番号１１５）、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＮ  ＳＫＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＤＤＮ  ＳＤＥＫＹＣ（配列番号１１６）、
ＣＧＡＳＬＦＴＣＲＲ  ＳＮＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＭＮＣ（配列番号１１７）、および
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＫＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＫＮＣ（配列番号１１８）
のうちの１つ以上を含む、請求項２１に記載の結合タンパク質。
【請求項２５】
前記（ｂ）のＦＧＦＲ１ｃ結合ドメインはさらに、配列ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号１２）を含むリンカ−を含む、請求項２４に記載の結合タンパク質。
【請求項２６】
前記ＦＧＦＲ１ｃ結合ドメインは、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＶＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＤＳＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号２９３）、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＹＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号２９４）、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号２９５）、
ＣＧＥＧＬＦＴＣＧＳＴＮＩＣＩＳＳＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号４４８）、
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号２９７）、
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＥＡＷＩＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号４４９）、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＡＫＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＩＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号４５０）、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＮＳＫＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＤＤＮＳＤＥＫＹＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号４６４）、
ＣＧＡＳＬＦＴＣＲＲＳＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＭＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号２９６）、および
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＫＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号２８７）
のうちの１つ以上を含む、請求項２５に記載の結合タンパク質。
【請求項２７】
（ａ）β−クロト−と選択的に結合する１つ以上のドメインと、（ｂ）ＦＧＦＲ１ｃと選択的に結合する１つ以上のドメインとを含む、β−クロト−およびＦＧＦＲ１ｃと選択的に結合する結合タンパク質であって、
【化８】
2013512672.tif 000105
のうちの１つ以上を含む第一の結合ドメインと、
（ｉｉ）
【化９】
2013512672.tif 000106
のうちの１つ以上を含む、第二の結合ドメインと、
（ｉｉｉ）該第一の結合ドメインおよび該第二の結合ドメインを接合するリンカ−
とを含むβ−クロト−結合ドメインと、
（ｂ）配列
【化１０】
2013512672.tif 000107
によって表される群から選択される配列を含むＦＧＦＲ１ｃ結合ドメインと、
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の配列を接合するリンカ−とを含み、
この中で、括弧内のアミノ酸は、指定された位置における代替的なアミノ酸を示し、かつ「−」は、指定された位置にアミノ酸がないことを示す、該結合タンパク質。
【請求項２８】
（ａ）の第一の結合ドメインは、
ＣＧＰＤＱＦＲＣＳＳＧＫＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＴＣ（配列番号２５５）、
ＣＧＡＮＥＦＱＣＲＳＴＧＩＣＶＰＶＥＷＶＣＤＧＤＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＶＣ（配列番号２５６）、
ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣ（配列番号２５７）、
ＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣ（配列番号２５８）、
ＣＡＳＧＥＦＴＣＮＮＧＱＣＶＰＬＡＷＲＣＤＧＶＮＤＣＱＤＧＳＤＥＫＧＣ（配列番号２５９）、
ＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣ（配列番号２６０）、
ＣＰＰＤＥＦＱＣＲＧＴＫＫＣＬＰＬＡＷＶＣＤＧＤＮＤＣＥＤＤＳＤＥＥＳＣ（配列番号２６１）、
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣ（配列番号１２３７）、
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣ（配列番号１３２６）、
ＣＡＰＧＥＦＴＣＫＮＴＧＲＣＩＰＬＮＷＲＣＤＧＤＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＤＣ（配列番号１３２７）、および
ＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣ（配列番号１３２８）
のうちの１つ以上を含む、請求項２７に記載の結合タンパク質。
【請求項２９】
（ａ）の第二の結合ドメインは、
ＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣ（配列番号１５９）、
ＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣ（配列番号１３２３）、
ＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣ（配列番号１３２４）、および
ＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣ（配列番号１３２５）
のうちの１つ以上を含む、請求項２７に記載の結合タンパク質。
【請求項３０】
（ａ）のリンカ−は、ＥＴＰＴ（配列番号１３１９）、ＧＤＳＨＩＬＰＦＳＴＰＧＰＳＴ（配列番号１４）、ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号１２）、ＰＡＰＴ（配列番号１３２０）、およびＱＡＰＴ（配列番号１３２１）のうちの１つ以上を含む、請求項２７に記載の結合タンパク質。
【請求項３１】
前記ＦＧＦＲ１ｃ結合ドメインは、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＱＶＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＤＳＣ（配列番号１０９）、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＹＣ（配列番号１１０）、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＴＮＣ（配列番号１１１）、
ＣＧＥＧＬＦＴＣＧＳ  ＴＮＩＣＩＳＳＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＮＣ（配列番号１１２）、
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＮＣ（配列番号１１３）、
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＥＡＷＩ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＫＮＣ（配列番号１１４）、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＡＫＩＣＩＳＨＡＷＶ  ＣＤＧＩＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＮＣ（配列番号１１５）、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＮ  ＳＫＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＤＤＮ  ＳＤＥＫＹＣ（配列番号１１６）、
ＣＧＡＳＬＦＴＣＲＲ  ＳＮＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＭＮＣ（配列番号１１７）、および
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＫＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＫＮＣ（配列番号１１８）
のうちの１つ以上を含む、請求項２７に記載の結合タンパク質。
【請求項３２】
配列ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号１２）を含むリンカ−をさらに含む、請求項３１に記載の結合タンパク質。
【請求項３３】
前記結合タンパク質は、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＶＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＤＳＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号２９３）、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＹＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号２９４）、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号２９５）、
ＣＧＥＧＬＦＴＣＧＳＴＮＩＣＩＳＳＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号４４８）、
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号２９７）、
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＥＡＷＩＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号４４９）、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＡＫＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＩＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号４５０）、
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＮＳＫＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＤＤＮＳＤＥＫＹＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号４６４）、
ＣＧＡＳＬＦＴＣＲＲＳＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＭＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号２９６）、および
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＫＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号２８７）
のうちの１つ以上を含む、請求項３２に記載の結合タンパク質。
【請求項３４】
前記ＦＧＦＲ１ｃ結合ドメインは、
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号２９７）
の１つ以上を含む、請求項３３に記載の結合タンパク質。
【請求項３５】
（ｃ）のリンカ−は、ＡＱＰＴ（配列番号１３２２）、ＡＨＴ、ＰＥＲＴ（配列番号７）、ＴＴＲＴ（配列番号８）、ＧＴＴＧＰＴ（配列番号９）、ＥＴＳＧＰＴ（配列番号１０）、ＳＱＤＰＥＦＨＫＶＳ（配列番号１１）、ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号１２）、ＧＲＰＧＰＧＡＴＳＡＰＡＡ（配列番号１３）、およびＧＤＳＨＩＬＰＦＳＴＰＧＰＳＴ（配列番号１４）のうちの１つ以上を含む、請求項２７に記載の結合タンパク質。
【請求項３６】
配列
ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号３５９）
を含む、請求項２７に記載の結合タンパク質。
【請求項３７】
配列
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号３３９）
を含む、請求項２７に記載の結合タンパク質。
【請求項３８】
配列
ＣＡＰＧＥＦＴＣＫＮＴＧＲＣＩＰＬＮＷＲＣＤＧＤＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＤＣＰＡＰＴＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号１２７０）
を含む、請求項２７に記載の結合タンパク質。
【請求項３９】
配列
ＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣＱＡＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号１２７１）
を含む、請求項２７に記載の結合タンパク質。
【請求項４０】
（Ｂ１）ａ−（Ｌ１）ｘ−（Ｂ２）ｂ−（Ｌ２）ｙ−（１Ｃ）ｃ−（Ｌ３）ｚ
を含み、式中、ａ、ｂ、ｃ、ｘ、ｙ、およびｚは、０、１、または２であり、しかしながら、ａ、ｂ、およびｃのうちの少なくとも１つが、１または２であることを条件とし、
式中、Ｂ１は、請求項１に記載のアミノ酸配列であり、
式中、Ｂ２は、請求項３に記載のアミノ酸配列であり、
式中、１Ｃは、請求項５に記載のアミノ酸配列であり、
式中、Ｌ１は、請求項１２に記載のアミノ酸配列であり、
式中、Ｌ２は、請求項１７に記載のアミノ酸配列であり、かつ
式中、Ｌ３は、ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬである、
結合タンパク質。
【請求項４１】
前記結合タンパク質はさらに、哺乳類における半減期延長部分を欠失する結合タンパク質の血清半減期と比較して、哺乳類における結合タンパク質の血清半減期を延長させる該半減期延長部分を含む、請求項１、３、５、１０、１５、２１、２７、３６、３７、３８、または３９に記載の結合タンパク質。
【請求項４２】
前記半減期延長部分は、ポリエチレングリコ−ル（ＰＥＧ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、免疫グロブリン（ＩｇＧ）、およびＦｃ部分のうちの１つ以上である、請求項４１に記載の結合タンパク質。
【請求項４３】
前記半減期延長部分は、血液因子を特異的に結合するタンパク質配列を含む、請求項４１に記載の結合タンパク質。
【請求項４４】
前記血液因子は、血清アルブミン、免疫グロブリン、または赤血球である、請求項４３に記載の結合タンパク質。
【請求項４５】
前記結合タンパク質は、１以上の非天然アミノ酸を含むアミノ酸配列を含む、請求項１、３、５、１０、１５、２１、２７、３６、３７、３８、または３９に記載の結合タンパク質。
【請求項４６】
下記のうちの１つ以上を含む結合タンパク質をコ−ドするポリヌクレオチド：
（ａ）β−クロト−結合ドメイン、
（ｂ）ＦＧＦＲ１ｃ結合ドメイン、
（ｃ）１つ以上のβ−クロト−結合ドメインおよびＦＧＦＲ１ｃ結合ドメイン、ならびに
（ｄ）請求項１、３、５、１０、１５、２１、２７、３６、３７、３８、または３９に記載の結合タンパク質。
【請求項４７】
請求項４６に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクタ−。
【請求項４８】
請求項４７に記載の発現ベクタ−を含む宿主細胞。
【請求項４９】
結合タンパク質の発現を誘導するのに好適な条件下で、請求項４８に記載の宿主細胞をインキュベ−トすることと、任意に、該発現したポリペプチドを単離することとを含む、該結合タンパク質を作製する方法。
【請求項５０】
（ａ）請求項１、３、５、１０、１５、２１、２７、３６、３７、３８、または３９に記載の結合タンパク質と、（ｂ）医薬として許容し得る製剤とを含む、医薬組成物。
【請求項５１】
前記医薬として許容し得る製剤は、担体、アジュバント、溶解剤、安定剤、または抗酸化剤である、請求項５０に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
代謝異常を治療することを必要とするヒト患者に、請求項５０に記載の医薬組成物を投与することを含む、該代謝異常を治療するための方法。
【請求項５３】
前記代謝異常は、糖尿病、肥満、脂質異常症、高血圧症、肝脂肪変性（ｈｅｐａｔｏｓｔｅａｔｏｓｉｓ）、非アルコ−ル性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、急性膵炎、メタボリックシンドロ−ム、粥状硬化症などの心血管疾患、および加齢のうちの１つ以上である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記代謝異常が糖尿病である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記代謝異常が肥満である、請求項５３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１０年９月９日に提出された米国仮特許出願第６１／３８１，３６４号および２００９年１２月２日に提出された米国仮特許出願第６１／２６６，０６１号の利益を主張し、それらは本明細書において参照によって組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出されており、その全体が参照によってこれによって組み込まれる配列表を含有する。２０１０年１１月１２日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピ−は、Ａ１５１８ＮＰ．ｔｘｔと命名されており、サイズが１メガバイトである。
【背景技術】
【０００３】
線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）は、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１、およびＦＧＦ２３を含む、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）のサブファミリ−に属する分泌ポリペプチドである（Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｔｒｅｎｄ  Ｇｅｎｅｔ．  ２０：  ５６３−６９）。ＦＧＦ２１は、それが、ヘパリン非依存性であり、かつグルコ−ス、脂質、およびエネルギ−代謝の調節におけるホルモンとして機能するという点で、非定型ＦＧＦである。
【０００４】
ＦＧＦ２１は、肝臓および膵臓において高度に発現され、主として肝臓において発現されるＦＧＦファミリ−の唯一のメンバ−である。ＦＧＦ２１を過剰発現するトランスジェニックマウスは、低成長速度、低血糖値、および低トリグリセリドレベルならびに年齢関連性の２型糖尿病、島過形成、および肥満症がないといった代謝表現型を示す。げっ歯動物モデルおよび霊長動物モデルにおける組換えＦＧＦ２１タンパク質の薬理学的投与は、正常化レベルの血糖値、トリグリセリドレベルおよびコレステロ−ルレベルの低下、ならびに耐糖能およびインスリン感受性の改善をもたらす。さらに、ＦＧＦ２１は、エネルギ−消費、身体活動、および代謝速度を増加させることによって、体重および体脂肪を低下させる（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５８：２５０−２５９）。ＦＧＦ２１が急性膵炎において保護効果を有しているかもしれないという証拠もまたある（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９  Ｇａｓｔｅｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １３７（５）：１７９５−１８０４）。
【０００５】
実験的研究は、ヒトにおける２型糖尿病、肥満症、異脂肪血症、および他の代謝状態または障害の治療のためのＦＧＦ２１の薬理学的投与を支持する（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．  ２９７：Ｅ１１０５−Ｅ１１１４  ；Ｒｙｄｅｎ  ２００９  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ６６：２０６７−７３において概説される）。
【０００６】
ＦＧＦ２１は、その受容体の活性化を通して脂肪細胞へのグルコ−ス取り込みおよび脂質恒常性を刺激する肝臓由来内分泌性ホルモンである。興味深いことには、標準的なＦＧＦ受容体であるＦＧＦＲ１ｃに加えて、ＦＧＦ２１受容体もまた、欠くことのできない補助因子としての膜結合β−クロト−から成る。ＦＧＦ２１受容体の活性化は、様々な代謝パラメ−タに対して多数の有益な効果をもたらす。
【０００７】
哺乳動物では、ＦＧＦは、４つのＦＧＦＲ１〜４のセットを介してそれらの作用を媒介し、それらのＦＧＦ受容体は複数のスプライス変異体において発現される。ＦＧＦ受容体はそれぞれ、リガンド結合に際して活性化されて、ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）、ＲＡＦ１、ＡＫＴ１、およびＳＴＡＴを含む下流のシグナル伝達経路をもたらす細胞内チロシンキナ−ゼドメインを含有する（Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８  ＢｉｏＤｒｕｇｓ  ２２：３７−４４）。いくつかの報告は、ＦＧＦＲ１〜３の「ｃ」−レポ−タ−スプライス変異体が、β−クロト−に対して特異的な親和性を示し、ＦＧＦ２１に対する内因性受容体として作用することができることを示唆した（Ｋｕｒｏｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８２：２６６８７−２６６９５）；Ｏｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０４：７４３２−７４３７；Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２１５，  １−７）。β−クロト−およびＦＧＦＲ４の両方を大量に発現する肝臓において、β−クロト−−ＦＧＦＲ４複合体へのＦＧＦ２１の強力な結合にもかかわらず、ＦＧＦ２１は、ＭＡＰＫのリン酸化を誘発しない。３Ｔ３−Ｌ１細胞および白色脂肪組織において、ＦＧＦＲ１は、圧倒的に豊富な受容体であり、そのため、この組織におけるＦＧＦ２１の主な機能的受容体は、β−クロト−−ＦＧＦＲ１ｃ複合体である可能性が最も高い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｔｒｅｎｄ  Ｇｅｎｅｔ．  ２０：  ５６３−６９
【非特許文献２】Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５８：２５０−２５９
【非特許文献３】Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９  Ｇａｓｔｅｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １３７（５）：１７９５−１８０４
【非特許文献４】Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．  ２９７：Ｅ１１０５−Ｅ１１１４
【非特許文献５】Ｒｙｄｅｎ  ２００９  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ６６：２０６７−７３
【非特許文献６】Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８  ＢｉｏＤｒｕｇｓ  ２２：３７−４４
【非特許文献７】Ｋｕｒｏｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８２：２６６８７−２６６９５
【非特許文献８】Ｏｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０４：７４３２−７４３７
【非特許文献９】Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２１５，  １−７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本開示は、ＦＧＦ２１媒介性のシグナル伝達を活性化することができる二重特異性結合タンパク質を含む結合タンパク質、つまりＦＧＦ２１の機能を模倣するアゴニスト結合タンパク質を提供する。そのような結合タンパク質は、ＦＧＦ２１様の活性および選択性を有するが、タンパク質安定性、低免疫原性、生産の容易性、および望ましいｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期などのような付加的な治療上望ましい特徴を有する分子であり得る。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示の一態様では、β−クロト−に選択的に結合する結合タンパク質が、提供される。一実施形態では、結合タンパク質は、以下のうちの１つまたは複数を含み：
Ｃ［ＡＧＰ］［ＡＰＳ］［ＤＧＮ］［ＥＱ］Ｆ［ＱＲＴ］Ｃ［ＧＮＲＳ］［ＧＮＳ］［ＧＴ］［ＧＫＱＳ］［−ＩＫ］Ｃ［ＩＬＶ］Ｐ［ＬＱＲＶ］［ＡＥＨＰ］Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ［ＤＬＶ］［ＤＮ］ＤＣＧＤ［ＧＮ］ＳＤＥ［ＡＥＫＰＳ］［ＧＬＰＳ］［−ＡＥＶ］［−ＩＴ］Ｃ；  （配列番号２５４）
ＣＬＰＤＥＦＱＣ［ＳＧ］ＳＧＲＣＩＰＱ［ＨＴ］Ｗ［ＶＬ］ＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥ［ＰＳ］ＰＡ［ＨＴ］Ｃ；  （配列番号５９７）、および
Ｃ［ＡＧＰＲ］［ＡＰ］［ＤＧＮＳ］［ＥＱ］Ｆ［ＱＲＴ］Ｃ［ＧＳＫ］Ｎ［ＧＴ］［ＧＨＲ］［Ｒ］Ｃ［ＩＬＶ］［ＰＳ］［ＡＬＱ］［ＮＳＴ］Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ［ＤＥＶ］ＤＤＣ［ＧＬ］ＤＧＳＤＥ［ＡＥＴ］［ＤＮＳ］［−Ａ］［−Ｔ］Ｃ  （配列番号２４９）、
括弧中のアミノ酸は、指定の位置での代替アミノ酸を示し、「−」は、指定の位置にアミノ酸がないことを示す。特定の実施形態では、請求項１の結合タンパク質は、以下のうちの１つまたは複数を含む：
ＣＧＰＤＱＦＲＣＳＳＧＫＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＴＣ  （配列番号２５５）；
ＣＧＡＮＥＦＱＣＲＳＴＧＩＣＶＰＶＥＷＶＣＤＧＤＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＶＣ  （配列番号２５６）；
ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣ  （配列番号２５７）；
ＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣ  （配列番号２５８）；
ＣＡＳＧＥＦＴＣＮＮＧＱＣＶＰＬＡＷＲＣＤＧＶＮＤＣＱＤＧＳＤＥＫＧＣ  （配列番号２５９）；
ＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣ  （配列番号２６０）；
ＣＰＰＤＥＦＱＣＲＧＴＫＫＣＬＰＬＡＷＶＣＤＧＤＮＤＣＥＤＤＳＤＥＥＳＣ  （配列番号２６１）；
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣ  （配列番号１２３７）；
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣ  （配列番号１３２６）；
ＣＡＰＧＥＦＴＣＫＮＴＧＲＣＩＰＬＮＷＲＣＤＧＤＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＤＣ  （配列番号１３２７）；および
ＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣ  （配列番号１３２８）。
【００１１】
β−クロト−に選択的に結合する結合タンパク質が、提供される。一実施形態では、結合タンパク質は、以下のうちの１つまたは複数を含み：
ＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥ［ＰＳ］［ＰＱ］［ＡＱ］［−Ｈ］Ｃ；  （配列番号３９４）
Ｃ［ＥＬＰＱＲ］［ＡＰＳ］［ＤＧＩＮ］［ＥＧＱ］［ＦＱ］［ＦＫＰＱＲＴ］［−Ｅ］Ｃ［ＧＮＲＳ］［ＮＳ］Ｇ［ＨＮＱＲ］Ｃ［ＩＶ］Ｐ  ［ＡＥＬＰＱＲＶ］［ＡＨＰＱＲＴ］Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ［ＤＥＶ］［ＤＮＰ］ＤＣ［ＧＬＱ］Ｄ［ＤＧＮＳ］ＳＤＥ［ＡＥＫＴ］［ＤＧＬＮＳ］［−Ａ］［−Ｈ］Ｃ；  （配列番号２１７）；および
Ｃ［ＡＧＰ］［ＡＰＳ］［ＤＧＮ］［ＥＱ］Ｆ［ＱＲＴ］Ｃ［ＧＮＲＳ］［ＧＮＳ］［ＧＴ］［ＧＫＱＳ］［−ＩＫ］Ｃ［ＩＬＶ］Ｐ  ［ＬＱＲＶ］［ＡＥＨＰ］Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ［ＤＬＶ］［ＤＮ］ＤＣＧＤ［ＧＮ］ＳＤＥ［ＡＥＫＰＳ］［ＧＬＰＳ］［−ＡＥＶ］［−ＩＴ］Ｃ，  （配列番号２５４）、
括弧中のアミノ酸は、指定の位置での代替アミノ酸を示し、「−」は、指定の位置にアミノ酸がないことを示す。特定の実施形態では、結合タンパク質は、以下のうちの１つまたは複数を含む：
ＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣ  （配列番号１５９）；
ＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣ  （配列番号１３２３）；
ＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣ  （配列番号１３２４）；および
ＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣ  （配列番号１３２５）。
【００１２】
本開示の他の態様では、ＦＧＦＲ１ｃに選択的に結合する結合タンパク質が、提供される。一実施形態では、結合タンパク質は、
ＣＧ［ＡＥ］［ＧＳ］ＬＦＴＣ［ＧＲ］［ＮＲＳ］［ＡＳＴ］［ＫＮ］ＩＣＩＳ［ＥＨＱＳ］［ＡＶ］Ｗ［ＩＶ］ＣＤＧ［ＩＶ］ＤＤＣ［ＤＥ］ＤＮＳＤＥ［ＤＫＭＮＴ］［ＮＳＹ］Ｃ，  （配列番号１０８）を含み、
括弧中のアミノ酸は、指定の位置での代替アミノ酸を示し、「−」は、指定の位置にアミノ酸がないことを示す。
【００１３】
特定の実施形態では、結合タンパク質は、以下のうちの１つまたは複数を含む：
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＱＶＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＤＳＣ  （配列番号１０９）；
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＹＣ  （配列番号１１０）；
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＴＮＣ  （配列番号１１１）；
ＣＧＥＧＬＦＴＣＧＳ  ＴＮＩＣＩＳＳＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＮＣ  （配列番号１１２）；
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＮＣ  （配列番号１１３）；
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＥＡＷＩ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＫＮＣ  （配列番号１１４）；
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＡＫＩＣＩＳＨＡＷＶ  ＣＤＧＩＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＮＣ  （配列番号１１５）；
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＮ  ＳＫＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＤＤＮ  ＳＤＥＫＹＣ  （配列番号１１６）；
ＣＧＡＳＬＦＴＣＲＲ  ＳＮＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＭＮＣ  （配列番号１１７）；および
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＫＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＫＮＣ  （配列番号１１８）。結合タンパク質は、配列ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号１２）を含むリンカ−をさらに含むことができる。
【００１４】
さらに他の特定の実施形態では、結合タンパク質は、以下のうちの１つまたは複数を含む：
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＶＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＤＳＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号２９３）；
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＹＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号２９４）；
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号２９５）；
ＣＧＥＧＬＦＴＣＧＳＴＮＩＣＩＳＳＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号４４８）；
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号２９７）；
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＥＡＷＩＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号４４９）；
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＡＫＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＩＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号４５０）；
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＮＳＫＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＤＤＮＳＤＥＫＹＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号４６４）；
ＣＧＡＳＬＦＴＣＲＲＳＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＭＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号２９６）；および
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＫＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号２８７）。
【００１５】
他の実施形態では、結合タンパク質は、配列：
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号２９７）を含む。
【００１６】
本開示のさらなる態様では、β−クロト−に選択的に結合する結合タンパク質が、提供される。一実施形態では、結合タンパク質は、
（ａ）配列：
Ｃ［ＡＧＰ］［ＡＰＳ］［ＤＧＮ］［ＥＱ］Ｆ［ＱＲＴ］Ｃ［ＧＮＲＳ］［ＧＮＳ］［ＧＴ］［ＧＫＱＳ］［−ＩＫ］Ｃ［ＩＬＶ］Ｐ  ［ＬＱＲＶ］［ＡＥＨＰ］Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ［ＤＬＶ］［ＤＮ］ＤＣＧＤ［ＧＮ］ＳＤＥ［ＡＥＫＰＳ］［ＧＬＰＳ］［−ＡＥＶ］［−ＩＴ］Ｃ；  （配列番号２５４）
ＣＬＰＤＥＦＱＣ［ＳＧ］ＳＧＲＣＩＰＱ［ＨＴ］Ｗ［ＶＬ］ＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥ［ＰＳ］ＰＡ［ＨＴ］Ｃ  （配列番号５９７）
Ｃ［ＡＧＰＲ］［ＡＰ］［ＤＧＮＳ］［ＥＱ］Ｆ［ＱＲＴ］Ｃ［ＧＳＫ］Ｎ［ＧＴ］［ＧＨＲ］［−Ｒ］Ｃ［ＩＬＶ］［ＰＳ］［ＡＬＱ］  ［ＮＳＴ］Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ［ＤＥＶ］ＤＤＣ［ＧＬ］ＤＧＳＤＥ［ＡＥＴ］［ＤＮＳ］［−Ａ］［−Ｔ］Ｃ  （配列番号２４９）によって示される群から選択される配列を含む第１のβ−クロト−結合ドメイン；ならびに
（ｂ）配列：
ＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥ［ＰＳ］［ＰＱ］［ＡＱ］［−Ｈ］Ｃ；  （配列番号３９４）
Ｃ［ＥＬＰＱＲ］［ＡＰＳ］［ＤＧＩＮ］［ＥＧＱ］［ＦＱ］［ＦＫＰＱＲＴ］［−Ｅ］Ｃ［ＧＮＲＳ］［ＮＳ］Ｇ［ＨＮＱＲ］Ｃ  ［ＩＶ］Ｐ［ＡＥＬＰＱＲＶ］［ＡＨＰＱＲＴ］Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ［ＤＥＶ］［ＤＮＰ］ＤＣ［ＧＬＱ］Ｄ［ＤＧＮＳ］ＳＤＥ［ＡＥＫＴ］［ＤＧＬＮＳ］［−Ａ］［−Ｈ］Ｃ；  （配列番号２１７）；および
Ｃ［ＡＧＰ］［ＡＰＳ］［ＤＧＮ］［ＥＱ］Ｆ［ＱＲＴ］Ｃ［ＧＮＲＳ］［ＧＮＳ］［ＧＴ］［ＧＫＱＳ］［−ＩＫ］Ｃ［ＩＬＶ］Ｐ  ［ＬＱＲＶ］［ＡＥＨＰ］Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ［ＤＬＶ］［ＤＮ］ＤＣＧＤ［ＧＮ］ＳＤＥ［ＡＥＫＰＳ］［ＧＬＰＳ］［−ＡＥＶ］［−ＩＴ］Ｃ，  （配列番号２５４）によって示される群から選択される配列を含む第２のβ−クロト−結合ドメインを含み、
括弧中のアミノ酸は、指定の位置での代替アミノ酸を示し、「−」は、指定の位置にアミノ酸がないことを示す。
【００１７】
一実施形態では、結合タンパク質は、（ａ）および（ｂ）をつなぐ少なくとも１つのリンカ−をさらに含む。リンカ−は、たとえば、以下のうちの１つまたは複数とすることができる：ＥＴＰＴ  （配列番号１３１９）、ＧＤＳＨＩＬＰＦＳＴＰＧＰＳＴ  （配列番号１４）、ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号１２）、ＰＡＰＴ  （配列番号１３２０）、ＱＡＰＴ  （配列番号１３２１）、ＡＱＰＴ  （配列番号１３２２）、ＡＨＴ、ＰＥＲＴ  （配列番号７）、ＴＴＲＴ  （配列番号８）、ＧＴＴＧＰＴ  （配列番号９）、ＥＴＳＧＰＴ  （配列番号１０）、ＳＱＤＰＥＦＨＫＶＳ  （配列番号１１）、ＧＲＰＧＰＧＡＴＳＡＰＡＡ  （配列番号１３）。他の特定の実施形態では、（ａ）のβ−クロト−結合ドメインは、以下のうちの１つまたは複数を含む：
ＣＧＰＤＱＦＲＣＳＳＧＫＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＴＣ  （配列番号２５５）；
ＣＧＡＮＥＦＱＣＲＳＴＧＩＣＶＰＶＥＷＶＣＤＧＤＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＶＣ  （配列番号２５６）；
ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣ  （配列番号２５７）；
ＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣ  （配列番号２５８）；
ＣＡＳＧＥＦＴＣＮＮＧＱＣＶＰＬＡＷＲＣＤＧＶＮＤＣＱＤＧＳＤＥＫＧＣ  （配列番号２５９）；
ＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣ  （配列番号２６０）；
ＣＰＰＤＥＦＱＣＲＧＴＫＫＣＬＰＬＡＷＶＣＤＧＤＮＤＣＥＤＤＳＤＥＥＳＣ  （配列番号２６１）；
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣ  （配列番号１２３７）；
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣ  （配列番号１３２６）；
ＣＡＰＧＥＦＴＣＫＮＴＧＲＣＩＰＬＮＷＲＣＤＧＤＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＤＣ  （配列番号１３２７）；および
ＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣ  （配列番号１３２８）。
【００１８】
さらに他の特定の実施形態では、（ｂ）のβ−クロト−結合ドメインは、以下のうちの１つまたは複数を含む：
ＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣ  （配列番号１５９）；
ＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣ  （配列番号１３２３）；
ＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣ  （配列番号１３２４）；および
ＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣ  （配列番号１３２５）。
【００１９】
本開示のさらなる他の態様では、β−クロト−およびＦＧＦＲ１ｃに選択的に結合する結合タンパク質が、提供される。一実施形態では、結合タンパク質は、（ａ）β−クロト−に選択的に結合する１つまたは複数のドメインおよび（ｂ）ＦＧＦＲ１ｃに選択的に結合する１つまたは複数のドメインを含み、
結合タンパク質は、
（ａ）以下のうちの１つまたは複数を含むβ−クロト−結合ドメイン：
Ｃ［ＡＧＰ］［ＡＰＳ］［ＤＧＮ］［ＥＱ］Ｆ［ＱＲＴ］Ｃ［ＧＮＲＳ］［ＧＮＳ］［ＧＴ］［ＧＫＱＳ］［−ＩＫ］Ｃ［ＩＬＶ］Ｐ  ［ＬＱＲＶ］［ＡＥＨＰ］Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ［ＤＬＶ］［ＤＮ］ＤＣＧＤ［ＧＮ］ＳＤＥ［ＡＥＫＰＳ］［ＧＬＰＳ］［−ＡＥＶ］［−ＩＴ］Ｃ；  （配列番号２５４）
ＣＬＰＤＥＦＱＣ［ＳＧ］ＳＧＲＣＩＰＱ［ＨＴ］Ｗ［ＶＬ］ＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥ［ＰＳ］ＰＡ［ＨＴ］Ｃ；  （配列番号５９７）
Ｃ［ＡＧＰＲ］［ＡＰ］［ＤＧＮＳ］［ＥＱ］Ｆ［ＱＲＴ］Ｃ［ＧＳＫ］Ｎ［ＧＴ］［ＧＨＲ］［−Ｒ］Ｃ［ＩＬＶ］［ＰＳ］［ＡＬＱ］  ［ＮＳＴ］Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ［ＤＥＶ］ＤＤＣ［ＧＬ］ＤＧＳＤＥ［ＡＥＴ］［ＤＮＳ］［−Ａ］［−Ｔ］Ｃ；  （配列番号２４９）；
（ｂ）以下の１つまたは複数のを含むＦＧＦＲ１ｃ結合ドメイン：
ＣＧ［ＡＥ］［ＧＳ］ＬＦＴＣ［ＧＲ］［ＮＲＳ］［ＡＳＴ］［ＫＮ］ＩＣＩＳ［ＥＨＱＳ］［ＡＶ］Ｗ［ＩＶ］ＣＤＧ［ＩＶ］ＤＤＣ［ＤＥ］ＤＮＳＤＥ［ＤＫＭＮＴ］［ＮＳＹ］Ｃ；  （配列番号１０８）
を含み、
括弧中のアミノ酸は、指定の位置での代替アミノ酸を示し、「−」は、指定の位置にアミノ酸がないことを示す。
【００２０】
結合タンパク質は、（ａ）および（ｂ）をつなぐ少なくとも１つのリンカ−をさらに含むことができる。特定の実施形態では、リンカ−は、以下のうちの１つまたは複数である：ＥＴＰＴ  （配列番号１３１９）、ＧＤＳＨＩＬＰＦＳＴＰＧＰＳＴ  （配列番号１４）、ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号１２）、ＰＡＰＴ  （配列番号１３２０）、ＱＡＰＴ  （配列番号１３２１）、ＡＱＰＴ  （配列番号１３２２）、ＡＨＴ、ＰＥＲＴ  （配列番号７）、ＴＴＲＴ  （配列番号８）、ＧＴＴＧＰＴ  （配列番号９）、ＥＴＳＧＰＴ  （配列番号１０）、ＳＱＤＰＥＦＨＫＶＳ  （配列番号１１）、ＧＲＰＧＰＧＡＴＳＡＰＡＡ  （配列番号１３）。
【００２１】
他の特定の実施形態では、
（ｉ）（ａ）のβ−クロト−結合ドメインは、以下のうちの１つまたは複数を含み：
ＣＧＰＤＱＦＲＣＳＳＧＫＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＴＣ  （配列番号２５５）；
ＣＧＡＮＥＦＱＣＲＳＴＧＩＣＶＰＶＥＷＶＣＤＧＤＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＶＣ  （配列番号２５６）；
ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣ  （配列番号２５７）；
ＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣ  （配列番号２５８）；
ＣＡＳＧＥＦＴＣＮＮＧＱＣＶＰＬＡＷＲＣＤＧＶＮＤＣＱＤＧＳＤＥＫＧＣ  （配列番号２５９）；
ＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣ  （配列番号２６０）；
ＣＰＰＤＥＦＱＣＲＧＴＫＫＣＬＰＬＡＷＶＣＤＧＤＮＤＣＥＤＤＳＤＥＥＳＣ  （配列番号２６１）；
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣ  （配列番号１２３７）；
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣ  （配列番号１３２６）；
ＣＡＰＧＥＦＴＣＫＮＴＧＲＣＩＰＬＮＷＲＣＤＧＤＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＤＣ  （配列番号１３２７）；および
ＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣ  （配列番号１３２８）、
（ｉｉ）（ｂ）のＦＧＦＲ１ｃ結合ドメインは、以下のうちの１つまたは複数を含む：
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＱＶＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＤＳＣ  （配列番号１０９）；
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＹＣ  （配列番号１１０）；
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＴＮＣ  （配列番号１１１）；
ＣＧＥＧＬＦＴＣＧＳ  ＴＮＩＣＩＳＳＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＮＣ  （配列番号１１２）；
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＮＣ  （配列番号１１３）；
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＥＡＷＩ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＫＮＣ  （配列番号１１４）；
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＡＫＩＣＩＳＨＡＷＶ  ＣＤＧＩＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＮＣ  （配列番号１１５）；
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＮ  ＳＫＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＤＤＮ  ＳＤＥＫＹＣ  （配列番号１１６）；
ＣＧＡＳＬＦＴＣＲＲ  ＳＮＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＭＮＣ  （配列番号１１７）；および
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＫＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＫＮＣ  （配列番号１１８）。
【００２２】
他のさらなる特定の実施形態では、（ｂ）のＦＧＦＲ１ｃ結合ドメインは、配列ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号１２）を含むリンカ−をさらに含む。他の特定の実施形態では、ＦＧＦＲ１ｃ結合ドメインは、以下のうちの１つまたは複数を含む：
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＶＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＤＳＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号２９３）；
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＹＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号２９４）；
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号２９５）；
ＣＧＥＧＬＦＴＣＧＳＴＮＩＣＩＳＳＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号４４８）；
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号２９７）；
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＥＡＷＩＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号４４９）；
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＡＫＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＩＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号４５０）；
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＮＳＫＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＤＤＮＳＤＥＫＹＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号４６４）；
ＣＧＡＳＬＦＴＣＲＲＳＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＭＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号２９６）；および
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＫＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号２８７）。
【００２３】
本開示の他の態様では、（ａ）β−クロト−に選択的に結合する１つまたは複数のドメインおよび（ｂ）ＦＧＦＲ１ｃに選択的に結合する１つまたは複数のドメインを含む、β−クロト−およびＦＧＦＲ１ｃに選択的に結合する結合タンパク質が、提供される。一実施形態では、結合タンパク質は、
（ａ）以下のうちの１つまたは複数を含むβ−クロト−結合ドメイン：
ＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥ［ＰＳ］［ＰＱ］［ＡＱ］［−Ｈ］Ｃ；  （配列番号３９４）
Ｃ［ＥＬＰＱＲ］［ＡＰＳ］［ＤＧＩＮ］［ＥＧＱ］［ＦＱ］［ＦＫＰＱＲＴ］［−Ｅ］Ｃ［ＧＮＲＳ］［ＮＳ］Ｇ［ＨＮＱＲ］  Ｃ［ＩＶ］Ｐ［ＡＥＬＰＱＲＶ］［ＡＨＰＱＲＴ］Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ［ＤＥＶ］［ＤＮＰ］ＤＣ［ＧＬＱ］Ｄ［ＤＧＮＳ］ＳＤＥ［ＡＥＫＴ］［ＤＧＬＮＳ］［−Ａ］［−Ｈ］Ｃ；  （配列番号２１７）；
Ｃ［ＡＧＰ］［ＡＰＳ］［ＤＧＮ］［ＥＱ］Ｆ［ＱＲＴ］Ｃ［ＧＮＲＳ］［ＧＮＳ］［ＧＴ］［ＧＫＱＳ］［−ＩＫ］Ｃ［ＩＬＶ］Ｐ［ＬＱＲＶ］［ＡＥＨＰ］Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ［ＤＬＶ］［ＤＮ］ＤＣＧＤ［ＧＮ］ＳＤＥ［ＡＥＫＰＳ］［ＧＬＰＳ］［−ＡＥＶ］［−ＩＴ］Ｃ；  （配列番号２５４）および
（ｂ）配列：
ＣＧ［ＡＥ］［ＧＳ］ＬＦＴＣ［ＧＲ］［ＮＲＳ］［ＡＳＴ］［ＫＮ］ＩＣＩＳ［ＥＨＱＳ］［ＡＶ］Ｗ［ＩＶ］ＣＤＧ［ＩＶ］ＤＤＣ［ＤＥ］ＤＮＳＤＥ［ＤＫＭＮＴ］［ＮＳＹ］Ｃ；  （配列番号１０８）によって示される群から選択される配列を含むＦＧＦＲ１ｃ結合ドメインを含み、
括弧中のアミノ酸は、指定の位置での代替アミノ酸を示し、「−」は、指定の位置にアミノ酸がないことを示す。
【００２４】
結合タンパク質は、（ａ）および（ｂ）をつなぐ少なくとも１つのリンカ−をさらに含むことができる。特定の実施形態では、リンカ−は、以下のうちの１つまたは複数を含む：ＥＴＰＴ  （配列番号１３１９）、ＧＤＳＨＩＬＰＦＳＴＰＧＰＳＴ  （配列番号１４）、ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号１２）、ＰＡＰＴ  （配列番号１３２０）、ＱＡＰＴ  （配列番号１３２１）、ＡＱＰＴ  （配列番号１３２２）、ＡＨＴ、ＰＥＲＴ  （配列番号７）、ＴＴＲＴ  （配列番号８）、ＧＴＴＧＰＴ  （配列番号９）、ＥＴＳＧＰＴ  （配列番号１０）、ＳＱＤＰＥＦＨＫＶＳ  （配列番号１１）、ＧＲＰＧＰＧＡＴＳＡＰＡＡ  （配列番号１３）。
【００２５】
特定の実施形態では、
（ｉ）（ａ）のβ−クロト−結合ドメインは、以下のうちの１つまたは複数を含み：
ＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣ  （配列番号１５９）；
ＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣ  （配列番号１３２３）；
ＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣ  （配列番号１３２４）；および
ＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣ  （配列番号１３２５）、
（ｉｉ）（ｂ）のＦＧＦＲ１ｃ結合ドメインは、以下のうちの１つまたは複数を含む：
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＱＶＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＤＳＣ  （配列番号１０９）；
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＹＣ  （配列番号１１０）；
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＴＮＣ  （配列番号１１１）；
ＣＧＥＧＬＦＴＣＧＳ  ＴＮＩＣＩＳＳＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＮＣ  （配列番号１１２）；
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＮＣ  （配列番号１１３）；
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＥＡＷＩ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＫＮＣ  （配列番号１１４）；
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＡＫＩＣＩＳＨＡＷＶ  ＣＤＧＩＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＮＣ  （配列番号１１５）；
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＮ  ＳＫＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＤＤＮ  ＳＤＥＫＹＣ  （配列番号１１６）；
ＣＧＡＳＬＦＴＣＲＲ  ＳＮＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＭＮＣ  （配列番号１１７）；および
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＫＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＫＮＣ  （配列番号１１８）。
【００２６】
（ｂ）のＦＧＦＲ１ｃ結合ドメインは、リンカ−をさらに含むことができ、一実施形態では、リンカ−は、配列ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号１２）を含む。特定の実施形態では、ＦＧＦＲ１ｃ結合ドメインは、以下のうちの１つまたは複数を含む：
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＶＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＤＳＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号２９３）；
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＹＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号２９４）；
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号２９５）；
ＣＧＥＧＬＦＴＣＧＳＴＮＩＣＩＳＳＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号４４８）；
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号２９７）；
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＥＡＷＩＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号４４９）；
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＡＫＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＩＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号４５０）；
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＮＳＫＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＤＤＮＳＤＥＫＹＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号４６４）；
ＣＧＡＳＬＦＴＣＲＲＳＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＭＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号２９６）；および
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＫＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号２８７）。
【００２７】
さらに他の態様では、（ａ）β−クロト−に選択的に結合する１つまたは複数のドメインおよび（ｂ）ＦＧＦＲ１ｃに選択的に結合する１つまたは複数のドメインを含む、β−クロト−およびＦＧＦＲ１ｃに選択的に結合する結合タンパク質が、提供される。
【００２８】
一実施形態では、結合タンパク質は、
（ａ）（ｉ）以下のうちの１つまたは複数を含む第１の結合ドメイン：
Ｃ［ＡＧＰ］［ＡＰＳ］［ＤＧＮ］［ＥＱ］Ｆ［ＱＲＴ］Ｃ［ＧＮＲＳ］［ＧＮＳ］［ＧＴ］［ＧＫＱＳ］［−ＩＫ］Ｃ［ＩＬＶ］Ｐ［ＬＱＲＶ］［ＡＥＨＰ］Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ［ＤＬＶ］［ＤＮ］ＤＣＧＤ［ＧＮ］ＳＤＥ［ＡＥＫＰＳ］［ＧＬＰＳ］［−ＡＥＶ］［−ＩＴ］Ｃ；  （配列番号２５４）；
ＣＬＰＤＥＦＱＣ［ＳＧ］ＳＧＲＣＩＰＱ［ＨＴ］Ｗ［ＶＬ］ＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥ［ＰＳ］ＰＡ［ＨＴ］Ｃ；  （配列番号５９７）；
Ｃ［ＡＧＰＲ］［ＡＰ］［ＤＧＮＳ］［ＥＱ］Ｆ［ＱＲＴ］Ｃ［ＧＳＫ］Ｎ［ＧＴ］［ＧＨＲ］［−Ｒ］Ｃ［ＩＬＶ］［ＰＳ］［ＡＬＱ］［ＮＳＴ］Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ［ＤＥＶ］ＤＤＣ［ＧＬ］ＤＧＳＤＥ［ＡＥＴ］［ＤＮＳ］［−Ａ］［−Ｔ］Ｃ；  （配列番号２４９）；
（ｉｉ）以下のうちの１つまたは複数を含む第２の結合ドメイン：
ＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥ［ＰＳ］［ＰＱ］［ＡＱ］［−Ｈ］Ｃ；  （配列番号３９４）；
Ｃ［ＥＬＰＱＲ］［ＡＰＳ］［ＤＧＩＮ］［ＥＧＱ］［ＦＱ］［ＦＫＰＱＲＴ］［−Ｅ］Ｃ［ＧＮＲＳ］［ＮＳ］  Ｇ［ＨＮＱＲ］Ｃ［ＩＶ］Ｐ［ＡＥＬＰＱＲＶ］［ＡＨＰＱＲＴ］Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ［ＤＥＶ］［ＤＮＰ］ＤＣ［ＧＬＱ］Ｄ［ＤＧＮＳ］ＳＤＥ［ＡＥＫＴ］［ＤＧＬＮＳ］［−Ａ］［−Ｈ］Ｃ；  （配列番号２１７）；
Ｃ［ＡＧＰ］［ＡＰＳ］［ＤＧＮ］［ＥＱ］Ｆ［ＱＲＴ］Ｃ［ＧＮＲＳ］［ＧＮＳ］［ＧＴ］［ＧＫＱＳ］［−ＩＫ］Ｃ［ＩＬＶ］Ｐ［ＬＱＲＶ］［ＡＥＨＰ］Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ［ＤＬＶ］［ＤＮ］ＤＣＧＤ［ＧＮ］ＳＤＥ［ＡＥＫＰＳ］［ＧＬＰＳ］［−ＡＥＶ］［−ＩＴ］Ｃ；  （配列番号２５４）；ならびに
（ｉｉｉ）第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインをつなぐリンカ−、を含むβ−クロト−結合ドメイン；ならびに
（ｂ）配列：
ＣＧ［ＡＥ］［ＧＳ］ＬＦＴＣ［ＧＲ］［ＮＲＳ］［ＡＳＴ］［ＫＮ］ＩＣＩＳ［ＥＨＱＳ］［ＡＶ］Ｗ［ＩＶ］ＣＤＧ［ＩＶ］ＤＤＣ［ＤＥ］ＤＮＳＤＥ［ＤＫＭＮＴ］［ＮＳＹ］Ｃ；  （配列番号１０８）によって示される群から選択される配列を含むＦＧＦＲ１ｃ結合ドメインならびに
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の配列をつなぐリンカ−を含み、
括弧中のアミノ酸は、指定の位置での代替アミノ酸を示し、「−」は、指定の位置にアミノ酸がないことを示す。
【００２９】
特定の実施形態では、（ａ）の第１の結合ドメインは、以下のうちの１つまたは複数を含む：
ＣＧＰＤＱＦＲＣＳＳＧＫＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＴＣ  （配列番号２５５）；
ＣＧＡＮＥＦＱＣＲＳＴＧＩＣＶＰＶＥＷＶＣＤＧＤＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＶＣ  （配列番号２５６）；
ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣ  （配列番号２５７）；
ＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣ  （配列番号２５８）；
ＣＡＳＧＥＦＴＣＮＮＧＱＣＶＰＬＡＷＲＣＤＧＶＮＤＣＱＤＧＳＤＥＫＧＣ  （配列番号２５９）；
ＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣ  （配列番号２６０）；
ＣＰＰＤＥＦＱＣＲＧＴＫＫＣＬＰＬＡＷＶＣＤＧＤＮＤＣＥＤＤＳＤＥＥＳＣ  （配列番号２６１）；
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣ  （配列番号１２３７）；
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣ  （配列番号１３２６）；
ＣＡＰＧＥＦＴＣＫＮＴＧＲＣＩＰＬＮＷＲＣＤＧＤＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＤＣ  （配列番号１３２７）；および
ＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣ  （配列番号１３２８）。他の特定の実施形態では、（ａ）の第２の結合ドメインは、以下のうちの１つまたは複数を含む：
ＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣ  （配列番号１５９）；
ＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣ  （配列番号１３２３）
ＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣ  （配列番号１３２４）；および
ＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣ  （配列番号１３２５）。
【００３０】
さらに他の実施形態では、（ａ）のリンカ−は、以下のうちの１つまたは複数を含む：
ＥＴＰＴ  （配列番号１３１９）、ＧＤＳＨＩＬＰＦＳＴＰＧＰＳＴ  （配列番号１４）、ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号１２）、ＰＡＰＴ  （配列番号１３２０）、およびＱＡＰＴ  （配列番号１３２１）。
【００３１】
さらなる実施形態では、ＦＧＦＲ１ｃ結合ドメインは、以下のうちの１つまたは複数を含む：
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＱＶＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＤＳＣ  （配列番号１０９）；
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＹＣ  （配列番号１１０）；
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＴＮＣ  （配列番号１１１）；
ＣＧＥＧＬＦＴＣＧＳ  ＴＮＩＣＩＳＳＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＮＣ  （配列番号１１２）；
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＮＣ  （配列番号１１３）；
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＥＡＷＩ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＫＮＣ  （配列番号１１４）；
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＡＫＩＣＩＳＨＡＷＶ  ＣＤＧＩＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＮＣ  （配列番号１１５）；
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＮ  ＳＫＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＤＤＮ  ＳＤＥＫＹＣ  （配列番号１１６）；
ＣＧＡＳＬＦＴＣＲＲ  ＳＮＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＭＮＣ  （配列番号１１７）；および
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＫＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＫＮＣ  （配列番号１１８）。
【００３２】
ＦＧＦＲ１ｃ結合ドメインは、配列ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号１２）を含むリンカ−をさらに含むことができ、特定の実施形態では、以下のうちの１つまたは複数を含むことができる：
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＶＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＤＳＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号２９３）；
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＹＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号２９４）；
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号２９５）；
ＣＧＥＧＬＦＴＣＧＳＴＮＩＣＩＳＳＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号４４８）；
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号２９７）；
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＥＡＷＩＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号４４９）；
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＡＫＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＩＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号４５０）；
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＮＳＫＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＤＤＮＳＤＥＫＹＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号４６４）；
ＣＧＡＳＬＦＴＣＲＲＳＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＭＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号２９６）；および
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＫＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号２８７）。たとえば、ＦＧＦＲ１ｃ結合ドメインは、以下の１つまたは複数を含むことができる：
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号２９７）。さらなる実施形態では、（ｃ）のリンカ−は、以下のうちの１つまたは複数を含むことができる：
ＡＱＰＴ  （配列番号１３２２）、ＡＨＴ、ＰＥＲＴ  （配列番号７）、ＴＴＲＴ  （配列番号８）、ＧＴＴＧＰＴ  （配列番号９）、ＥＴＳＧＰＴ  （配列番号１０）、ＳＱＤＰＥＦＨＫＶＳ  （配列番号１１）、ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号１２）、ＧＲＰＧＰＧＡＴＳＡＰＡＡ  （配列番号１３）、およびＧＤＳＨＩＬＰＦＳＴＰＧＰＳＴ  （配列番号１４）。
【００３３】
特定の一実施形態では、結合タンパク質は、配列：
ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３５９）を含む。
【００３４】
他の特定の実施形態では、結合タンパク質は、配列：
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥ  ＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３３９）を含む。
【００３５】
さらに他の特定の実施形態では、結合タンパク質は、配列：
ＣＡＰＧＥＦＴＣＫＮＴＧＲＣＩＰＬＮＷＲＣＤＧＤＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＤＣＰＡＰＴＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号１２７０）を含む。
【００３６】
さらに他の特定の実施形態では、結合タンパク質は、配列：
ＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰ  ＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣＱＡＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号１２７１）を含む。
【００３７】
他の態様では、
（Ｂ１）ａ−（Ｌ１）ｘ−（Ｂ２）ｂ−（Ｌ２）ｙ−（１Ｃ）ｃ−（Ｌ３）ｚを含む結合タンパク質が、提供され、
ａ、ｂ、ｃ、ｘ、ｙ、およびｚは、０、１、または２であり、しかしながら、ａ、ｂ、およびｃの少なくとも１つが、１または２であることを条件とし；Ｂ１は、以下うちの１つまたは複数を含むアミノ酸配列であり：Ｃ［ＡＧＰ］［ＡＰＳ］［ＤＧＮ］［ＥＱ］Ｆ［ＱＲＴ］Ｃ［ＧＮＲＳ］［ＧＮＳ］［ＧＴ］［ＧＫＱＳ］［−ＩＫ］Ｃ［ＩＬＶ］Ｐ  ［ＬＱＲＶ］［ＡＥＨＰ］Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ［ＤＬＶ］［ＤＮ］ＤＣＧＤ［ＧＮ］ＳＤＥ［ＡＥＫＰＳ］［ＧＬＰＳ］［−ＡＥＶ］［−ＩＴ］Ｃ  （配列番号２５４）；ＣＬＰＤＥＦＱＣ［ＳＧ］ＳＧＲＣＩＰＱ［ＨＴ］Ｗ［ＶＬ］ＣＤＧＬＮＤＣＧＤ  ＧＳＤＥ［ＰＳ］ＰＡ［ＨＴ］Ｃ  （配列番号５９７）；およびＣ［ＡＧＰＲ］［ＡＰ］［ＤＧＮＳ］［ＥＱ］Ｆ［ＱＲＴ］Ｃ  ［ＧＳＫ］Ｎ［ＧＴ］［ＧＨＲ］［Ｒ］Ｃ［ＩＬＶ］［ＰＳ］［ＡＬＱ］［ＮＳＴ］Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ［ＤＥＶ］ＤＤＣ［ＧＬ］ＤＧＳＤＥ［ＡＥＴ］［ＤＮＳ］［−Ａ］［−Ｔ］Ｃ  （配列番号２４９）；Ｂ２は、以下のうちの１つまたは複数を含むアミノ酸配列であり：ＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥ［ＰＳ］［ＰＱ］［ＡＱ］［−Ｈ］Ｃ  （配列番号３９４）；Ｃ［ＥＬＰＱＲ］［ＡＰＳ］［ＤＧＩＮ］［ＥＧＱ］［ＦＱ］［ＦＫＰＱＲＴ］［−Ｅ］Ｃ［ＧＮＲＳ］［ＮＳ］Ｇ  ［ＨＮＱＲ］Ｃ［ＩＶ］Ｐ［ＡＥＬＰＱＲＶ］［ＡＨＰＱＲＴ］Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ［ＤＥＶ］［ＤＮＰ］ＤＣ［ＧＬＱ］Ｄ［ＤＧＮＳ］ＳＤＥ［ＡＥＫＴ］［ＤＧＬＮＳ］［−Ａ］［−Ｈ］Ｃ  （配列番号２１７）；およびＣ［ＡＧＰ］［ＡＰＳ］［ＤＧＮ］［ＥＱ］Ｆ  ［ＱＲＴ］Ｃ［ＧＮＲＳ］［ＧＮＳ］［ＧＴ］［ＧＫＱＳ］［−ＩＫ］Ｃ［ＩＬＶ］Ｐ［ＬＱＲＶ］［ＡＥＨＰ］Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ  ［ＤＬＶ］［ＤＮ］ＤＣＧＤ［ＧＮ］ＳＤＥ［ＡＥＫＰＳ］［ＧＬＰＳ］［−ＡＥＶ］［−ＩＴ］Ｃ  （配列番号２５４）、括弧中のアミノ酸は、指定の位置での代替アミノ酸を示し、「−」は、指定の位置にアミノ酸がないことを示し、１Ｃは、ＣＧ［ＡＥ］［ＧＳ］ＬＦＴＣ［ＧＲ］［ＮＲＳ］［ＡＳＴ］［ＫＮ］ＩＣＩＳ［ＥＨＱＳ］［ＡＶ］Ｗ［ＩＶ］ＣＤＧ［ＩＶ］  ＤＤＣ［ＤＥ］ＤＮＳＤＥ［ＤＫＭＮＴ］［ＮＳＹ］Ｃ  （配列番号１０８）を含むアミノ酸配列であり；括弧中のアミノ酸は、指定の位置での代替アミノ酸を示し、「−」は、指定の位置にアミノ酸がないことを示し、Ｌ１は、以下のうちの１つまたは複数を含むアミノ酸配列であり：ＥＴＰＴ  （配列番号１３１９）、ＧＤＳＨＩＬＰＦＳＴＰＧＰＳＴ  （配列番号１４）、ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号１２）、ＰＡＰＴ  （配列番号１３２０）、およびＱＡＰＴ  （配列番号１３２１）；Ｌ２は、以下のうちの１つまたは複数を含むアミノ酸配列であり：ＡＱＰＴ  （配列番号１３２２）、ＡＨＴ、ＰＥＲＴ  （配列番号７）、ＴＴＲＴ  （配列番号８）、ＧＴＴＧＰＴ  （配列番号９）、ＥＴＳＧＰＴ  （配列番号１０）、ＳＱＤＰＥＦＨＫＶＳ  （配列番号１１）、ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号１２）、ＧＲＰＧＰＧＡＴＳＡＰＡＡ  （配列番号１３）、およびＧＤＳＨＩＬＰＦＳＴＰＧＰＳＴ  （配列番号１４）；Ｌ３は、ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬである。
【００３８】
さらなる態様では、本明細書において提供される結合タンパク質は、哺乳動物における半減期延長成分を欠く結合タンパク質の血清半減期と比較して、哺乳動物における結合タンパク質の血清半減期を増加させる半減期延長成分をさらに含むことができる。たとえば、半減期延長成分は、ポリエチレングリコ−ル（ＰＥＧ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、免疫グロブリン（ＩｇＧ）、およびＦｃ成分のうちの１つまたは複数である。半減期延長成分はまた、血清アルブミン、免疫グロブリン、または赤血球などのような血液因子に特異的に結合するタンパク質配列を含むことができる。
【００３９】
他の態様では、結合タンパク質は、１つまたは複数の天然に存在しないアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むことができる。
【００４０】
様々な実施形態では、以下のうちの１つまたは複数を含む結合タンパク質をコ−ドするポリヌクレオチドもまた、提供される：（ａ）β−クロト−結合ドメイン；（ｂ）ＦＧＦＲ１ｃ結合ドメイン；（ｃ）１つまたは複数のβ−クロト−結合ドメインおよびＦＧＦＲ１ｃ結合ドメイン；ならびに（ｃ）アミノ酸配列ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲ  ＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３５９）；ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰ  ＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３３９）；ＣＡＰＧＥＦＴＣＫＮＴＧＲＣＩＰＬＮＷＲＣＤＧＤＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＤＣＰＡＰＴＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号１２７０）；またはＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰ  ＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣＱＡＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号１２７１）を含む結合タンパク質。コ−ドされる結合タンパク質はまた、半減期延長成分をも含むことができる。提供されるポリヌクレオチドのいずれかを含む発現ベクタ−、およびその発現ベクタ−を含む宿主細胞もまた、提供される。結合タンパク質を作製するための方法もまた、提供され、その方法は、結合タンパク質の発現を誘発するのに適した条件下で、開示される宿主細胞をインキュベ−トすること、および任意選択で、発現されたポリペプチドを単離することを含む。
【００４１】
他の態様では、医薬組成物が、提供され、特定の実施形態では、（ａ）本明細書において提供される結合タンパク質；および（ｂ）薬学的に許容される製剤化剤を含む。薬学的に許容される製剤化剤は、担体、補助剤、可溶化剤、安定剤、または酸化防止剤とすることができる。
【００４２】
さらなる態様では、代謝障害を治療するための方法が、提供される。方法は、その必要性のあるヒト患者に、開示される医薬組成物を投与するステップを含む。代謝障害は、たとえば、糖尿病、肥満症、異脂肪血症、高血圧症、脂肪肝（ｈｅｐａｔｏｓｔｅａｔｏｓｉｓ）、非アルコ−ル性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、急性膵炎、メタボリックシンドロ−ム、アテロ−ム性動脈硬化症などのような心血管疾患、および加齢のうちの１つ以上とすることができる。特定の実施形態では、代謝障害は、糖尿病であり、他の特定の実施形態では、代謝障害は、肥満症である。
【００４３】
一態様では、本開示は、本明細書において開示される結合タンパク質、単量体、および多量体のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む結合タンパク質、単量体、および多量体を提供する。
【００４４】
他の態様では、本明細書において開示される結合タンパク質、単量体、および多量体は、組換え体であり、したがって自然界において見出されない。そのような結合タンパク質、単量体、および多量体は、本明細書において記載されるように遺伝子操作される。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本明細書において開示される結合タンパク質が、ＦＧＦ２１のｉｎ  ｖｉｖｏにおけるシグナル伝達活性を模倣する方法を概略的に示す図である。
【図２】保存システインを示すための、様々なＬＤＬ受容体クラスＡドメイン由来の部分的なアミノ酸配列のアライメントを示す図である（記載順に、それぞれ配列番号７６８〜７８０）。畳み込まれたドメインの３つのジスルフィド結合におけるシステインの結合性を、コンセンサス配列上に概略的に示す。その側鎖がカルシウム結合に寄与する残基は、コンセンサス配列においてアスタリスクを用いて示す。
【図３】パネルＡは、Ａドメインの例を概略的に示す配列である。パネルＡは、約４０アミノ酸長のＡドメインにおける保存アミノ酸を概略的に示す。保存システイン残基は、Ｃによって示し、保存負荷電アミノ酸は、マイナス（「−」）符号を有する円によって示す。「Ｈ」を有する円は、保存疎水性残基を示す。パネルＢは、リンカ−を介して結び付けられる２つの畳み込まれたＡドメインを概略的に示す図である。パネルＢはまた、２つのカルシウム結合部位である、Ｃａ＋２を有する濃い円およびそれぞれの畳み込まれたＡドメイン内の３つのジスルフィド結合、合計６つのジスルフィド結合を強調表示する。
【図４】ＬＤＬ受容体ファミリ−の天然に存在するメンバ−によって認識されるリガンドのいくつかを紹介するリストであり、阻害剤、プロテア−ゼ、プロテア−ゼ複合体、ビタミン−担体複合体、リポタンパク質代謝に関与するタンパク質、非ヒトリガンド、抗生物質、ウイルス、および他を含む。
【図５Ａ】Ａドメインのアライメントを示す図である（記載順に、それぞれ配列番号７８１〜９６６、１２４１、および９６７〜９９６）。図の上にある小文字（ａ〜ｑ）は、保存残基を示す。
【図５Ｂ】Ａドメインのアライメントを示す図である（記載順に、それぞれ配列番号７８１〜９６６、１２４１、および９６７〜９９６）。図の上にある小文字（ａ〜ｑ）は、保存残基を示す。
【図５Ｃ】Ａドメインのアライメントを示す図である（記載順に、それぞれ配列番号７８１〜９６６、１２４１、および９６７〜９９６）。図の上にある小文字（ａ〜ｑ）は、保存残基を示す。
【図５Ｄ】Ａドメインのアライメントを示す図である（記載順に、それぞれ配列番号７８１〜９６６、１２４１、および９６７〜９９６）。図の上にある小文字（ａ〜ｑ）は、保存残基を示す。
【図５Ｅ】Ａドメインのアライメントを示す図である（記載順に、それぞれ配列番号７８１〜９６６、１２４１、および９６７〜９９６）。図の上にある小文字（ａ〜ｑ）は、保存残基を示す。
【図５Ｆ】Ａドメインのアライメントを示す図である（記載順に、それぞれ配列番号７８１〜９６６、１２４１、および９６７〜９９６）。図の上にある小文字（ａ〜ｑ）は、保存残基を示す。
【図５Ｇ】Ａドメインのアライメントを示す図である（記載順に、それぞれ配列番号７８１〜９６６、１２４１、および９６７〜９９６）。図の上にある小文字（ａ〜ｑ）は、保存残基を示す。
【図５Ｈ】Ａドメインのアライメントを示す図である（記載順に、それぞれ配列番号７８１〜９６６、１２４１、および９６７〜９９６）。図の上にある小文字（ａ〜ｑ）は、保存残基を示す。
【図６】標的タンパク質に結合する単量体ドメインを同定し、選択した単量体ドメインを単離し、選択した単量体ドメインを様々な組み合わせでつなぐことによって、選択した単量体ドメインの多量体を生成し、かつリガンドに結合する１つを超える単量体を含む多量体を同定するために多量体をスクリ−ニングするための一般的な手法を概略的に示す図である。
【図７】誘導選択の戦略を概略的に示す図である。適切な結合特性を有する単量体ドメインを、単量体ドメインのライブラリ−から同定する。次いで、同定した単量体ドメインを、単量体ドメインのナイ−ブライブラリ−由来の単量体ドメインに連結し、多量体のライブラリ−を形成する。多量体ライブラリ−は、標的に同時に結合する１対の単量体ドメインを同定するためにスクリ−ニングする。次いで、最適な結合特性が多量体において得られるまで、このプロセスを繰り返すことができる。
【図８】半減期延長分子に結合する少なくとも１つの単量体ドメインならびに１つまたは複数の標的分子（たとえばβ−クロト−およびＦＧＦＲ１ｃ）に結合する１つまたは複数の単量体ドメインを含む本開示の多量体の実現可能な立体構造を示す図である。図において、２つの単量体ドメインが、第１の標的分子（標的１）に結合し、１つの単量体ドメインが、第２の標的分子（標的２）に結合し、半減期延長分子に結合する単量体ドメインは、多量体のＮ末端またはＣ末端のいずれかに配置することができる。
【図９】本開示の結合タンパク質の要素を形成することができる様々なリンカ−配列の例を示す表であり、４残基；６残基；９残基（配列番号１８）、１１残基（配列番号１２）、１３残基（配列番号１３）、および１５残基（配列番号１４）を含むリンカ−を示す。
【図１０】同定したＦＧＦＲ１ｃ結合単量体（記載順に、それぞれ配列番号９９７〜１０２９）およびそれらの特性を示す表であり、配列は、精製タグＳＬＱＫＡＳＧＡＬＥＨＨＨＨＨＨＨＨ  （配列番号１）を含む。
【図１１】ナイ−ブＡ１足場ライブラリ−のパニングに由来する、同定したβ−クロト−結合単量体（記載順に、それぞれ配列番号１０３０〜１０６６）およびそれらの特性を示す表であり、配列は、精製タグＳＬＱＫＡＳＧＡＬＥＨＨＨＨＨＨＨＨ  （配列番号１）を含む。
【図１２】ナイ−ブＬＮＲ足場ライブラリ−のパニングに由来する、同定したβ−クロト−結合単量体（記載順に、それぞれ配列番号１１６６および１２９９〜１３１８）ならびにそれらの特性を示す表であり、配列は、精製タグＳＬＱＫＡＳＧＡＬＥＨＨＨＨＨＨＨＨ  （配列番号１）を含む。
【図１３】β−クロト−結合単量体Ｍ０１、Ｍ２５、Ｍ４２、およびＭ５０（記載順に、それぞれ配列番号４９３、５１９、および３０５〜３０６）を突然変異させることによって生成したβ−クロト−結合単量体を示す表であり（記載順に、それぞれ配列番号１０６７〜１０９８）、配列は、精製タグＳＬＱＫＡＳＧＡＬＥＨＨＨＨＨＨＨＨ  （配列番号１）を含む。
【図１４−１】β−クロト−結合単量体Ｍ０１（配列番号４９３）、Ｍ０６（配列番号４９９）、Ｍ０８（配列番号６９４）、Ｍ２１（配列番号５０８）、Ｍ４２（配列番号３０５）、およびＭ５０（配列番号３０６）ならびに関連するＥＣ５０値に基づいて生成した二量体β−クロト−結合タンパク質（記載順に、それぞれ配列番号１０９９〜１１５９）を示す表である。
【図１４−２】β−クロト−結合単量体Ｍ０１（配列番号４９３）、Ｍ０６（配列番号４９９）、Ｍ０８（配列番号６９４）、Ｍ２１（配列番号５０８）、Ｍ４２（配列番号３０５）、およびＭ５０（配列番号３０６）ならびに関連するＥＣ５０値に基づいて生成した二量体β−クロト−結合タンパク質（記載順に、それぞれ配列番号１０９９〜１１５９）を示す表である。
【図１５】増強された特性を有する結合タンパク質を生成するために使用したＦＧＦＲ１ｃ結合単量体Ｍ０３（配列番号２８７）、Ｍ０８（配列番号６９４）、Ｍ１５（配列番号２８９）、Ｍ２３（配列番号２９０）、Ｍ３１（配列番号２９１）、およびＭ３３（配列番号２９２）、β−クロト−結合単量体ｎｅｗＭ０３、ｍｕｔＭ０７、ｍｕｔＭ１９、およびＲＩ  Ｍ０２、ならびにβ−クロト−結合二量体ＷＤ０１（配列番号１１０７）、ＷＤ０２（配列番号１１０８）、ＷＤ３１（配列番号１１４３）、Ｄ０２（配列番号１１４０）、Ｄ０５（配列番号１１５５）、Ｄ０６（配列番号１１０５）、Ｄ０７（配列番号１１５６）、Ｄ０９（配列番号１１２３）、ＷＤ２５（配列番号６４０）、およびＤ２５（配列番号１１２９）  を含む結合タンパク質（記載順に、それぞれ配列番号１１６０〜１１７９）の配列を示す表であり、配列は、精製タグＳＬＱＫＡＳＧＡＬＥＨＨＨＨＨＨＨＨ  （配列番号１）を含む。
【図１６】図１５に示す結合タンパク質の特性を示す表である。
【図１７】受容体−Ｆｃタンパク質ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ結合アッセイを示す図である。
【図１８】ビオチン化標的タンパク質のＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ結合アッセイを示す図である。
【図１９】ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎリガンド非依存性阻害アッセイを示す図である。
【図２０】ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎリガンド依存性阻害アッセイを示す図である。
【図２１】抗ｈｕＩｇＧ単量体半減期ドメインを含む結合タンパク質についてのＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎリガンド依存性阻害アッセイを示す図である。
【図２２Ａ】リンカ−を有していないまたはＧ４Ｓ（配列番号２）、（Ｇ４Ｓ）２（配列番号３）、もしくは（Ｇ４Ｓ）３（配列番号４）リンカ−を有する、様々な立体配置をした、ＦＧＦＲ１ｃ結合単量体Ｍ１５（配列番号５１０）と共にβ−クロト−結合単量体Ｍ０１（配列番号４９３）、Ｍ４２（配列番号３０５）、およびＭ５０（配列番号３０６）を含む結合タンパク質（記載順に、それぞれ配列番号１１８０〜１２００）を示す表であり、配列は、精製タグＳＬＱＫＡＳＧＡＬＥＨＨＨＨＨＨＨＨ  （配列番号１）を含む。
【図２２Ｂ】リンカ−を有していないまたはＧ４Ｓ（配列番号２）、（Ｇ４Ｓ）２（配列番号３）、もしくは（Ｇ４Ｓ）３（配列番号４）リンカ−を有する、様々な立体配置をした、ＦＧＦＲ１ｃ結合単量体Ｍ１５（配列番号５１０）と共にβ−クロト−結合単量体Ｍ０１（配列番号４９３）、Ｍ４２（配列番号３０５）、およびＭ５０（配列番号３０６）を含む結合タンパク質（記載順に、それぞれ配列番号１１８０〜１２００）を示す表であり、配列は、精製タグＳＬＱＫＡＳＧＡＬＥＨＨＨＨＨＨＨＨ  （配列番号１）を含む。
【図２２Ｃ】リンカ−を有していないまたはＧ４Ｓ（配列番号２）、（Ｇ４Ｓ）２（配列番号３）、もしくは（Ｇ４Ｓ）３（配列番号４）リンカ−を有する、様々な立体配置をした、ＦＧＦＲ１ｃ結合単量体Ｍ１５（配列番号５１０）と共にβ−クロト−結合単量体Ｍ０１（配列番号４９３）、Ｍ４２（配列番号３０５）、およびＭ５０（配列番号３０６）を含む結合タンパク質（記載順に、それぞれ配列番号１１８０〜１２００）を示す表であり、配列は、精製タグＳＬＱＫＡＳＧＡＬＥＨＨＨＨＨＨＨＨ  （配列番号１）を含む。
【図２３Ａ】図２２に示す結合タンパク質の特性を示す表である（記載順に、それぞれ配列番号１１８０〜１２００）。配列番号２として開示される（１ＸＧ４Ｓ）配列番号３として開示される（２ＸＧ４Ｓ）、および配列番号４として開示される（３ＸＧ４Ｓ）。
【図２３Ｂ】図２２に示す結合タンパク質の特性を示す表である（記載順に、それぞれ配列番号１１８０〜１２００）。配列番号２として開示される（１ＸＧ４Ｓ）配列番号３として開示される（２ＸＧ４Ｓ）、および配列番号４として開示される（３ＸＧ４Ｓ）。
【図２３Ｃ】図２２に示す結合タンパク質の特性を示す表である（記載順に、それぞれ配列番号１１８０〜１２００）。配列番号２として開示される（１ＸＧ４Ｓ）配列番号３として開示される（２ＸＧ４Ｓ）、および配列番号４として開示される（３ＸＧ４Ｓ）。
【図２４Ａ】結合タンパク質Ｃ２１１４（配列番号１１８０）、Ｃ２１２２（配列番号１１８３）、Ｃ２１１６（配列番号１１８７）、Ｃ２１２０（配列番号１１８８）、Ｃ２１１７（配列番号１１９５）、およびＣ２１２１（配列番号１１９６）が、ＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の両方に結合する能力を有することを実証する、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して生成した一連のプロットを示す図である。３ＸＧ４Ｓは配列番号４として開示され、１ＸＧ４Ｓは配列番号２として開示される。
【図２４Ｂ】結合タンパク質Ｃ２１１４（配列番号１１８０）、Ｃ２１２２（配列番号１１８３）、Ｃ２１１６（配列番号１１８７）、Ｃ２１２０（配列番号１１８８）、Ｃ２１１７（配列番号１１９５）、およびＣ２１２１（配列番号１１９６）が、ＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の両方に結合する能力を有することを実証する、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して生成した一連のプロットを示す図である。３ＸＧ４Ｓは配列番号４として開示され、１ＸＧ４Ｓは配列番号２として開示される。
【図２４Ｃ】結合タンパク質Ｃ２１１４（配列番号１１８０）、Ｃ２１２２（配列番号１１８３）、Ｃ２１１６（配列番号１１８７）、Ｃ２１２０（配列番号１１８８）、Ｃ２１１７（配列番号１１９５）、およびＣ２１２１（配列番号１１９６）が、ＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の両方に結合する能力を有することを実証する、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して生成した一連のプロットを示す図である。３ＸＧ４Ｓは配列番号４として開示され、１ＸＧ４Ｓは配列番号２として開示される。
【図２５Ａ】結合タンパク質Ｃ２１１４（配列番号１１８０）、Ｃ２１２２（配列番号１１８３）、Ｃ２１１６（配列番号１１８７）、Ｃ２１２０（配列番号１１８８）、Ｃ２１１７（配列番号１１９５）、およびＣ２１２１（配列番号１１９６）が、ヒトおよびマウスβ−クロト−の両方に結合する能力を有することを実証する、Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎアッセイを使用して生成した一連のプロットである。（Ｇ４Ｓ）３は配列番号４として開示され、（Ｇ４Ｓ）１は配列番号２として開示される。
【図２５Ｂ】結合タンパク質Ｃ２１１４（配列番号１１８０）、Ｃ２１２２（配列番号１１８３）、Ｃ２１１６（配列番号１１８７）、Ｃ２１２０（配列番号１１８８）、Ｃ２１１７（配列番号１１９５）、およびＣ２１２１（配列番号１１９６）が、ヒトおよびマウスβ−クロト−の両方に結合する能力を有することを実証する、Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎアッセイを使用して生成した一連のプロットである。（Ｇ４Ｓ）３は配列番号４として開示され、（Ｇ４Ｓ）１は配列番号２として開示される。
【図２６Ａ】結合タンパク質Ｃ２１１４（配列番号１１８０）、Ｃ２１２２（配列番号１１８３）、Ｃ２１１６（配列番号１１８７）、Ｃ２１２０（配列番号１１８８）が、ＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の複合体へのＦＧＦ−２１の結合をブロックする能力を有しておらず、結合タンパク質Ｃ２１１７（配列番号１１９５）、さらにＣ２１２１（配列番号１１９６）が、ＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の複合体へのＦＧＦ−２１の結合をブロックすることを実証する、Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎアッセイを使用して生成した一連のプロットである。（Ｇ４Ｓ）３は配列番号４として開示され、（Ｇ４Ｓ）１は配列番号２として開示される。
【図２６Ｂ】結合タンパク質Ｃ２１１４（配列番号１１８０）、Ｃ２１２２（配列番号１１８３）、Ｃ２１１６（配列番号１１８７）、Ｃ２１２０（配列番号１１８８）が、ＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の複合体へのＦＧＦ−２１の結合をブロックする能力を有しておらず、結合タンパク質Ｃ２１１７（配列番号１１９５）、さらにＣ２１２１（配列番号１１９６）が、ＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の複合体へのＦＧＦ−２１の結合をブロックすることを実証する、Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎアッセイを使用して生成した一連のプロットである。（Ｇ４Ｓ）３は配列番号４として開示され、（Ｇ４Ｓ）１は配列番号２として開示される。
【図２７Ａ】結合タンパク質Ｃ２１１４（配列番号１１８０）、Ｃ２１２２（配列番号１１８３）、Ｃ２１１６（配列番号１１８７）、Ｃ２１２０（配列番号１１８８）、Ｃ２１１７（配列番号１１９５）、およびＣ２１２１（配列番号１１９６）が、ＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の両方に結合する能力を有し、ＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の間の相互作用をブロックしないことを実証する、Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎアッセイを使用して生成した一連のプロットである。（Ｇ４Ｓ）３は配列番号４として開示され、（Ｇ４Ｓ）１は配列番号２として開示される。
【図２７Ｂ】結合タンパク質Ｃ２１１４（配列番号１１８０）、Ｃ２１２２（配列番号１１８３）、Ｃ２１１６（配列番号１１８７）、Ｃ２１２０（配列番号１１８８）、Ｃ２１１７（配列番号１１９５）、およびＣ２１２１（配列番号１１９６）が、ＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の両方に結合する能力を有し、ＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の間の相互作用をブロックしないことを実証する、Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎアッセイを使用して生成した一連のプロットである。（Ｇ４Ｓ）３は配列番号４として開示され、（Ｇ４Ｓ）１は配列番号２として開示される。
【図２８】結合タンパク質Ｃ２１１４（配列番号１１８０）、Ｃ２１１６（配列番号１１８７）、Ｃ２１１７（配列番号１１９５）が、ＦＧＦＲ１ｃ結合単量体およびβ−クロト−結合単量体と比較して、ＦＧＦＲ１ｃ−β−クロト−複合体に対して親和性の改善を有することを実証する、結合ＥＬＩＳＡを使用して生成した表およびプロットである。３ＸＧ４Ｓは配列番号４として開示され、１ＸＧ４Ｓは配列番号２として開示される。
【図２９Ａ】結合タンパク質Ｃ２１１４（配列番号１１８０）、Ｃ２１３９（配列番号１１８１）、Ｃ２１４０（配列番号１１８２）、Ｃ２１２２（配列番号１１８３）、Ｃ２１３０（配列番号１１８４）、Ｃ２１３１（配列番号１１８５）、Ｃ２１３２（配列番号１１８６）、Ｃ２１１６（配列番号１１８７）、Ｃ２１２０（配列番号１１８８）、Ｃ２１２０Ａ（配列番号１１８８）、Ｃ２１４１（配列番号１１８９）、Ｃ２１４２（配列番号１１９０）、Ｃ２１３３（配列番号１１９１）、Ｃ２１３４（配列番号１１９２）、Ｃ２１３５（配列番号１１９３）、Ｃ２１３６（配列番号１１９４）、Ｃ２１１７（配列番号１１９５）、Ｃ２１２１（配列番号１１９６）、Ｃ２１４３（配列番号１１９７）、Ｃ２１４４（配列番号１１９８）、Ｃ２１３７（配列番号１１９９）、およびＣ２１３８（配列番号１２００）が、それらのβ−クロト−結合親単量体（Ｍ０１、Ｍ４２、およびＭ５０、記載順に、それぞれ配列番号４９３および３０５〜３０６）よりも、ヒトＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−を発現するＡＭ  １Ｄ細胞への結合の増強を示すことを実証する、フロ−サイトメトリ−アッセイを使用して生成した一連のプロットおよび表である。（０ＸＧ４Ｓ）および（１ＸＧ４Ｓ）は配列番号２として開示され、（２ＸＧ４Ｓ）は配列番号３として開示され、（３ＸＧ４Ｓ）は配列番号４として開示される。
【図２９Ｂ】結合タンパク質Ｃ２１１４（配列番号１１８０）、Ｃ２１３９（配列番号１１８１）、Ｃ２１４０（配列番号１１８２）、Ｃ２１２２（配列番号１１８３）、Ｃ２１３０（配列番号１１８４）、Ｃ２１３１（配列番号１１８５）、Ｃ２１３２（配列番号１１８６）、Ｃ２１１６（配列番号１１８７）、Ｃ２１２０（配列番号１１８８）、Ｃ２１２０Ａ（配列番号１１８８）、Ｃ２１４１（配列番号１１８９）、Ｃ２１４２（配列番号１１９０）、Ｃ２１３３（配列番号１１９１）、Ｃ２１３４（配列番号１１９２）、Ｃ２１３５（配列番号１１９３）、Ｃ２１３６（配列番号１１９４）、Ｃ２１１７（配列番号１１９５）、Ｃ２１２１（配列番号１１９６）、Ｃ２１４３（配列番号１１９７）、Ｃ２１４４（配列番号１１９８）、Ｃ２１３７（配列番号１１９９）、およびＣ２１３８（配列番号１２００）が、それらのβ−クロト−結合親単量体（Ｍ０１、Ｍ４２、およびＭ５０、記載順に、それぞれ配列番号４９３および３０５〜３０６）よりも、ヒトＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−を発現するＡＭ  １Ｄ細胞への結合の増強を示すことを実証する、フロ−サイトメトリ−アッセイを使用して生成した一連のプロットおよび表である。（０ＸＧ４Ｓ）および（１ＸＧ４Ｓ）は配列番号２として開示され、（２ＸＧ４Ｓ）は配列番号３として開示され、（３ＸＧ４Ｓ）は配列番号４として開示される。
【図３０Ａ】図２９に示す結合タンパク質（記載順に、それぞれ配列番号４９３および３０５〜３０６）が、ＦＧＦ２１応答性レポ−タ−細胞系に対してアゴニスト活性を示すことを実証する、細胞ベ−スのアッセイを使用して生成した一連のプロットおよび表である。（０ＸＧ４Ｓ）および（１ＸＧ４Ｓ）は、配列番号２として開示され、（２ＸＧ４Ｓ）は、配列番号３として開示され、（３ＸＧ４Ｓ）は、配列番号４として開示される。
【図３０Ｂ】図２９に示す結合タンパク質（記載順に、それぞれ配列番号４９３および３０５〜３０６）が、ＦＧＦ２１応答性レポ−タ−細胞系に対してアゴニスト活性を示すことを実証する、細胞ベ−スのアッセイを使用して生成した一連のプロットおよび表である。（０ＸＧ４Ｓ）および（１ＸＧ４Ｓ）は、配列番号２として開示され、（２ＸＧ４Ｓ）は、配列番号３として開示され、（３ＸＧ４Ｓ）は、配列番号４として開示される。
【図３１Ａ】図１７に示す単量体および二量体を使用して生成した、結合タンパク質についてのＦＧＦ−２１応答性レポ−タ−細胞アッセイにおいて観察されたアゴニスト活性のレベルを示す、一連の棒グラフである。
【図３１Ｂ】図１７に示す単量体および二量体を使用して生成した、結合タンパク質についてのＦＧＦ−２１応答性レポ−タ−細胞アッセイにおいて観察されたアゴニスト活性のレベルを示す、一連の棒グラフである。
【図３１Ｃ】図１７に示す単量体および二量体を使用して生成した、結合タンパク質についてのＦＧＦ−２１応答性レポ−タ−細胞アッセイにおいて観察されたアゴニスト活性のレベルを示す、一連の棒グラフである。
【図３１Ｄ】図１７に示す単量体および二量体を使用して生成した、結合タンパク質についてのＦＧＦ−２１応答性レポ−タ−細胞アッセイにおいて観察されたアゴニスト活性のレベルを示す、一連の棒グラフである。
【図３２Ａ】ＦＧＦＲ１ｃ結合単量体Ｍ０３（配列番号２８７）、Ｍ０８（配列番号６９４）、Ｍ１５（配列番号２８９）、Ｍ３１（配列番号２９１）、Ｍ２３（配列番号２９０）、およびＭ３３（配列番号２９２）、Ｍ０３ｍｕｔＭ０１（配列番号２９３）、Ｍ０３ｍｕｔＭ０４（配列番号２９４）、Ｍ０３ｍｕｔＭ０５（配列番号２９５）、Ｍ０３ｍｕｔＭ０６（配列番号２９６）、Ｍ０３ｍｕｔＭ０９（配列番号２９７）、Ｍ２３ｍｕｔＭ１０（配列番号２９８）、Ｍ２３ｍｕｔＭ１１（配列番号２９９）、Ｍ２３ｍｕｔＭ１４（配列番号３００）、Ｍ２３ｍｕｔＭ１５（配列番号３０１）、Ｍ２３ｍｕｔＭ１６（配列番号３０２）、Ｍ２３ｍｕｔＭ１７（配列番号３０３）ならびにβ−クロト−結合二量体ＷＤ０１（配列番号３０７）、ＷＤ０２（配列番号３０８）、ＷＤ０３（配列番号３０９）、ＷＤ０４（配列番号６０１）、Ｍ０３（配列番号２８７）、ＲＩ＿Ｄ０９（配列番号６２０）、ＷＤ０５（配列番号６０５）、ＷＤ０６（配列番号３１０）、ＷＤ２１（配列番号６３３）、ＷＤ２２（配列番号３１１）、ＷＤ２５（配列番号６４０）、ＷＤ２８（配列番号６４３）、ＷＤ２９（配列番号３１２）、およびＷＤ３１（配列番号６５６）を含む結合タンパク質の配列を示す表である（記載順に、それぞれ配列番号３１４〜３９２、１２０１〜１２３４、および１２６５〜１２７５）。
【図３２Ｂ】ＦＧＦＲ１ｃ結合単量体Ｍ０３（配列番号２８７）、Ｍ０８（配列番号６９４）、Ｍ１５（配列番号２８９）、Ｍ３１（配列番号２９１）、Ｍ２３（配列番号２９０）、およびＭ３３（配列番号２９２）、Ｍ０３ｍｕｔＭ０１（配列番号２９３）、Ｍ０３ｍｕｔＭ０４（配列番号２９４）、Ｍ０３ｍｕｔＭ０５（配列番号２９５）、Ｍ０３ｍｕｔＭ０６（配列番号２９６）、Ｍ０３ｍｕｔＭ０９（配列番号２９７）、Ｍ２３ｍｕｔＭ１０（配列番号２９８）、Ｍ２３ｍｕｔＭ１１（配列番号２９９）、Ｍ２３ｍｕｔＭ１４（配列番号３００）、Ｍ２３ｍｕｔＭ１５（配列番号３０１）、Ｍ２３ｍｕｔＭ１６（配列番号３０２）、Ｍ２３ｍｕｔＭ１７（配列番号３０３）ならびにβ−クロト−結合二量体ＷＤ０１（配列番号３０７）、ＷＤ０２（配列番号３０８）、ＷＤ０３（配列番号３０９）、ＷＤ０４（配列番号６０１）、Ｍ０３（配列番号２８７）、ＲＩ＿Ｄ０９（配列番号６２０）、ＷＤ０５（配列番号６０５）、ＷＤ０６（配列番号３１０）、ＷＤ２１（配列番号６３３）、ＷＤ２２（配列番号３１１）、ＷＤ２５（配列番号６４０）、ＷＤ２８（配列番号６４３）、ＷＤ２９（配列番号３１２）、およびＷＤ３１（配列番号６５６）を含む結合タンパク質の配列を示す表である（記載順に、それぞれ配列番号３１４〜３９２、１２０１〜１２３４、および１２６５〜１２７５）。
【図３３】結合タンパク質Ｃ２７３７（配列番号３７０）、Ｃ２７３８（配列番号３７１）、Ｃ２７３９（配列番号３７２）、Ｃ２７４０（配列番号３７３）、およびＣ２７４１（配列番号３７４）（左パネル）ならびにＣ２７４２（配列番号３７５）、Ｃ２７４３（配列番号３７６）、Ｃ２７４４（配列番号３７７）、Ｃ２７４５（配列番号３７８）、およびＣ２７４７（配列番号３７９）（右パネル）が、４つの様々な安定したルシフェラ−ゼレポ−タ−細胞系においてＦＧＦ２１様のシグナル伝達活性を誘発することを実証する、細胞ベ−スのアッセイを使用して生成した一連のプロットである。
【図３４】結合タンパク質Ｃ２７４８（配列番号３８０）、Ｃ２７４９（配列番号３８１）、Ｃ２７５０（配列番号３８２）、Ｃ２７５１（配列番号３８３）、およびＣ２７５２（配列番号３８４）（左パネル）ならびにＣ２７５３（配列番号３８５）、Ｃ２７５４（配列番号３８６）、およびＣ２７５７（配列番号３８７）（右パネル）が、４つの様々な安定したルシフェラ−ゼレポ−タ−細胞系においてＦＧＦ２１様のシグナル伝達活性を誘発することを実証する、細胞ベ−スのアッセイを使用して生成した一連のプロットである。
【図３５】結合タンパク質Ｃ２７９４（配列番号３９０）、Ｃ２７９５（配列番号３９１）、およびＣ２７９６（配列番号３９２）が、４つの様々な安定したルシフェラ−ゼレポ−タ−細胞系においてＦＧＦ２１様のシグナル伝達活性を誘発することを実証する、細胞ベ−スのアッセイを使用して生成した一連のプロットである。
【図３６】結合タンパク質Ｃ２７３９（配列番号３７２）、Ｃ２７４２（配列番号３７５）、Ｃ２７４８（配列番号３８０）、Ｃ２７５２（配列番号３８４）、Ｃ２７９４（配列番号３９０）が、ＦＧＦ２１様のシグナル伝達活性を誘発することを実証する、脂肪細胞の細胞ベ−スのアッセイを使用して生成したプロットである。
【図３７】一時的にトランスフェクトしたＬ６細胞ベ−スのアッセイを使用して生成した一連の棒グラフであり、結合タンパク質Ｃ２７９４  （配列番号３９０）、Ｃ２７４５  （配列番号３７８）、Ｃ２７４８  （配列番号３８０）、Ｃ２７５１  （配列番号３８３）、およびＣ２７４０  （配列番号３７３）のＦＧＦ２１様のシグナル伝達活性を誘発する能力が、ＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の両方の存在を必要とすることを実証する。
【図３８Ａ】結合タンパク質Ｃ３０９０  （配列番号３３５）、Ｃ３０９１  （配列番号３３６）、Ｃ３０９２  （配列番号３３７）、Ｃ３０９３  （配列番号３３８）、Ｃ３０９４  （配列番号３３９）、Ｃ３０９５  （配列番号３４０）、Ｃ３０９６  （配列番号３４１）、Ｃ３０９７  （配列番号３４２）、Ｃ３０９８  （配列番号３４３）、Ｃ３０９９  （配列番号３４４）、Ｃ３１００  （配列番号３４５）、Ｃ３１０２  （配列番号３４６）、Ｃ３１０３  （配列番号３４７）、Ｃ３１０４  （配列番号３４８）、およびＣ３１０５  （配列番号３４９）が、ヒトＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−を発現する第１のルシフェラ−ゼレポ−タ−細胞系においてＦＧＦ２１様のシグナル伝達活性を示すことを実証する、細胞ベ−スのアッセイを使用して生成した一連のプロットである。
【図３８Ｂ】結合タンパク質Ｃ３０９０  （配列番号３３５）、Ｃ３０９１  （配列番号３３６）、Ｃ３０９２  （配列番号３３７）、Ｃ３０９３  （配列番号３３８）、Ｃ３０９４  （配列番号３３９）、Ｃ３０９５  （配列番号３４０）、Ｃ３０９６  （配列番号３４１）、Ｃ３０９７  （配列番号３４２）、Ｃ３０９８  （配列番号３４３）、Ｃ３０９９  （配列番号３４４）、Ｃ３１００  （配列番号３４５）、Ｃ３１０２  （配列番号３４６）、Ｃ３１０３  （配列番号３４７）、Ｃ３１０４  （配列番号３４８）、およびＣ３１０５  （配列番号３４９）が、ヒトＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−を発現する第１のルシフェラ−ゼレポ−タ−細胞系においてＦＧＦ２１様のシグナル伝達活性を示すことを実証する、細胞ベ−スのアッセイを使用して生成した一連のプロットである。
【図３９Ａ】結合タンパク質Ｃ３０９０  （配列番号３３５）、Ｃ３０９１  （配列番号３３６）、Ｃ３０９２  （配列番号３３７）、Ｃ３０９３  （配列番号３３８）、Ｃ３０９４  （配列番号３３９）、Ｃ３０９５  （配列番号３４０）、Ｃ３０９６  （配列番号３４１）、Ｃ３０９７  （配列番号３４２）、Ｃ３０９８  （配列番号３４３）、Ｃ３０９９  （配列番号３４４）、Ｃ３１００  （配列番号３４５）、Ｃ３１０２  （配列番号３４６）、Ｃ３１０３  （配列番号３４７）、Ｃ３１０４  （配列番号３４８）、およびＣ３１０５  （配列番号３４９）が、ヒトＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−を発現する第２のルシフェラ−ゼレポ−タ−細胞系においてＦＧＦ２１様のシグナル伝達活性を示すことを実証する、細胞ベ−スのアッセイを使用して生成した一連のプロットである。
【図３９Ｂ】結合タンパク質Ｃ３０９０  （配列番号３３５）、Ｃ３０９１  （配列番号３３６）、Ｃ３０９２  （配列番号３３７）、Ｃ３０９３  （配列番号３３８）、Ｃ３０９４  （配列番号３３９）、Ｃ３０９５  （配列番号３４０）、Ｃ３０９６  （配列番号３４１）、Ｃ３０９７  （配列番号３４２）、Ｃ３０９８  （配列番号３４３）、Ｃ３０９９  （配列番号３４４）、Ｃ３１００  （配列番号３４５）、Ｃ３１０２  （配列番号３４６）、Ｃ３１０３  （配列番号３４７）、Ｃ３１０４  （配列番号３４８）、およびＣ３１０５  （配列番号３４９）が、ヒトＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−を発現する第２のルシフェラ−ゼレポ−タ−細胞系においてＦＧＦ２１様のシグナル伝達活性を示すことを実証する、細胞ベ−スのアッセイを使用して生成した一連のプロットである。
【図４０Ａ】結合タンパク質Ｃ３０９０  （配列番号３３５）、Ｃ３０９１  （配列番号３３６）、Ｃ３０９２  （配列番号３３７）、Ｃ３０９３  （配列番号３３８）、Ｃ３０９４  （配列番号３３９）、Ｃ３０９５  （配列番号３４０）、Ｃ３０９６  （配列番号３４１）、Ｃ３０９７  （配列番号３４２）、Ｃ３０９８  （配列番号３４３）、Ｃ３０９９  （配列番号３４４）、Ｃ３１００  （配列番号３４５）、Ｃ３１０２  （配列番号３４６）、Ｃ３１０３  （配列番号３４７）、Ｃ３１０４  （配列番号３４８）、およびＣ３１０５  （配列番号３４９）が、ヒトＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−を発現する第３のルシフェラ−ゼレポ−タ−細胞系においてＦＧＦ２１様のシグナル伝達活性を示すことを実証する、細胞ベ−スのアッセイを使用して生成した一連のプロットである。
【図４０Ｂ】結合タンパク質Ｃ３０９０  （配列番号３３５）、Ｃ３０９１  （配列番号３３６）、Ｃ３０９２  （配列番号３３７）、Ｃ３０９３  （配列番号３３８）、Ｃ３０９４  （配列番号３３９）、Ｃ３０９５  （配列番号３４０）、Ｃ３０９６  （配列番号３４１）、Ｃ３０９７  （配列番号３４２）、Ｃ３０９８  （配列番号３４３）、Ｃ３０９９  （配列番号３４４）、Ｃ３１００  （配列番号３４５）、Ｃ３１０２  （配列番号３４６）、Ｃ３１０３  （配列番号３４７）、Ｃ３１０４  （配列番号３４８）、およびＣ３１０５  （配列番号３４９）が、ヒトＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−を発現する第３のルシフェラ−ゼレポ−タ−細胞系においてＦＧＦ２１様のシグナル伝達活性を示すことを実証する、細胞ベ−スのアッセイを使用して生成した一連のプロットである。
【図４１Ａ】結合タンパク質Ｃ３０９０  （配列番号３３５）、Ｃ３０９１  （配列番号３３６）、Ｃ３０９２  （配列番号３３７）、Ｃ３０９３  （配列番号３３８）、Ｃ３０９４  （配列番号３３９）、Ｃ３０９５  （配列番号３４０）、Ｃ３０９６  （配列番号３４１）、Ｃ３０９７  （配列番号３４２）、Ｃ３０９８  （配列番号３４３）、Ｃ３０９９  （配列番号３４４）、Ｃ３１００  （配列番号３４５）、Ｃ３１０２  （配列番号３４６）、Ｃ３１０３  （配列番号３４７）、Ｃ３１０４  （配列番号３４８）、およびＣ３１０５  （配列番号３４９）が、ヒトＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−を発現する第４のルシフェラ−ゼレポ−タ−細胞系においてＦＧＦ２１様のシグナル伝達活性を示すことを実証する、細胞ベ−スのアッセイを使用して生成した一連のプロットである。
【図４１Ｂ】結合タンパク質Ｃ３０９０  （配列番号３３５）、Ｃ３０９１  （配列番号３３６）、Ｃ３０９２  （配列番号３３７）、Ｃ３０９３  （配列番号３３８）、Ｃ３０９４  （配列番号３３９）、Ｃ３０９５  （配列番号３４０）、Ｃ３０９６  （配列番号３４１）、Ｃ３０９７  （配列番号３４２）、Ｃ３０９８  （配列番号３４３）、Ｃ３０９９  （配列番号３４４）、Ｃ３１００  （配列番号３４５）、Ｃ３１０２  （配列番号３４６）、Ｃ３１０３  （配列番号３４７）、Ｃ３１０４  （配列番号３４８）、およびＣ３１０５  （配列番号３４９）が、ヒトＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−を発現する第４のルシフェラ−ゼレポ−タ−細胞系においてＦＧＦ２１様のシグナル伝達活性を示すことを実証する、細胞ベ−スのアッセイを使用して生成した一連のプロットである。
【図４２】結合タンパク質Ｃ３１９２  （配列番号３５０）、Ｃ３１９３  （配列番号３５１）、Ｃ３１９４  （配列番号３５２）、Ｃ３１９５  （配列番号３５３）、Ｃ３１９６  （配列番号３５４）、Ｃ３１９７  （配列番号３５５）、Ｃ３１９８  （配列番号３５６）、Ｃ３１９９  （配列番号３５７）、Ｃ３２００  （配列番号３５８）、Ｃ３２０１  （配列番号３５９）、Ｃ３２０２  （配列番号３６０）、Ｃ３２０３  （配列番号３６１）、Ｃ３２０４  （配列番号３６２）、Ｃ３２０５  （配列番号３６３）、Ｃ３２０６  （配列番号３６４）、Ｃ３２０７  （配列番号３６５）、Ｃ３２０８  （配列番号３６６）、Ｃ３２０９  （配列番号３６７）、Ｃ３２１０  （配列番号３６８）、およびＣ３２１１  （配列番号３６９）が、ヒトＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−を発現する第１のルシフェラ−ゼレポ−タ−細胞系においてＦＧＦ２１様のシグナル伝達活性を示すことを実証する、細胞ベ−スのアッセイを使用して生成した一連のプロットである。
【図４３】結合タンパク質Ｃ３１９２  （配列番号３５０）、Ｃ３１９３  （配列番号３５１）、Ｃ３１９４  （配列番号３５２）、Ｃ３１９５  （配列番号３５３）、Ｃ３１９６  （配列番号３５４）、Ｃ３１９７  （配列番号３５５）、Ｃ３１９８  （配列番号３５６）、Ｃ３１９９  （配列番号３５７）、Ｃ３２００  （配列番号３５８）、Ｃ３２０１  （配列番号３５９）、Ｃ３２０２  （配列番号３６０）、Ｃ３２０３  （配列番号３６１）、Ｃ３２０４  （配列番号３６２）、Ｃ３２０５  （配列番号３６３）、Ｃ３２０６  （配列番号３６４）、Ｃ３２０７  （配列番号３６５）、Ｃ３２０８  （配列番号３６６）、Ｃ３２０９  （配列番号３６７）、Ｃ３２１０  （配列番号３６８）、およびＣ３２１１  （配列番号３６９）が、ヒトＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−を発現する第２のルシフェラ−ゼレポ−タ−細胞系においてＦＧＦ２１様のシグナル伝達活性を示すことを実証する、細胞ベ−スのアッセイを使用して生成した一連のプロットである。
【図４４】結合タンパク質Ｃ３１９２  （配列番号３５０）、Ｃ３１９３  （配列番号３５１）、Ｃ３１９４  （配列番号３５２）、Ｃ３１９５  （配列番号３５３）、Ｃ３１９６  （配列番号３５４）、Ｃ３１９７  （配列番号３５５）、Ｃ３１９８  （配列番号３５６）、Ｃ３１９９  （配列番号３５７）、Ｃ３２００  （配列番号３５８）、Ｃ３２０１  （配列番号３５９）、Ｃ３２０２  （配列番号３６０）、Ｃ３２０３  （配列番号３６１）、Ｃ３２０４  （配列番号３６２）、Ｃ３２０５  （配列番号３６３）、Ｃ３２０６  （配列番号３６４）、Ｃ３２０７  （配列番号３６５）、Ｃ３２０８  （配列番号３６６）、Ｃ３２０９  （配列番号３６７）、Ｃ３２１０  （配列番号３６８）、およびＣ３２１１  （配列番号３６９）が、ヒトＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−を発現する第３のルシフェラ−ゼレポ−タ−細胞系においてＦＧＦ２１様のシグナル伝達活性を示すことを実証する、細胞ベ−スのアッセイを使用して生成した一連のプロットである。
【図４５】結合タンパク質Ｃ３１９２  （配列番号３５０）、Ｃ３１９３  （配列番号３５１）、Ｃ３１９４  （配列番号３５２）、Ｃ３１９５  （配列番号３５３）、Ｃ３１９６  （配列番号３５４）、Ｃ３１９７  （配列番号３５５）、Ｃ３１９８  （配列番号３５６）、Ｃ３１９９  （配列番号３５７）、Ｃ３２００  （配列番号３５８）、Ｃ３２０１  （配列番号３５９）、Ｃ３２０２  （配列番号３６０）、Ｃ３２０３  （配列番号３６１）、Ｃ３２０４  （配列番号３６２）、Ｃ３２０５  （配列番号３６３）、Ｃ３２０６  （配列番号３６４）、Ｃ３２０７  （配列番号３６５）、Ｃ３２０８  （配列番号３６６）、Ｃ３２０９  （配列番号３６７）、Ｃ３２１０  （配列番号３６８）、およびＣ３２１１  （配列番号３６９）が、ヒトＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−を発現する第４のルシフェラ−ゼレポ−タ−細胞系においてＦＧＦ２１様のシグナル伝達活性を示すことを実証する、細胞ベ−スのアッセイを使用して生成した一連のプロットである。
【図４６】β−クロト−を発現しない細胞を使用して生成した一連のプロットであり、結合タンパク質Ｃ３１９２  （配列番号３５０）、Ｃ３１９３  （配列番号３５１）、Ｃ３１９４  （配列番号３５２）、Ｃ３１９５  （配列番号３５３）、Ｃ３１９６  （配列番号３５４）、Ｃ３１９７  （配列番号３５５）、Ｃ３１９８  （配列番号３５６）、Ｃ３１９９  （配列番号３５７）、Ｃ３２００  （配列番号３５８）、Ｃ３２０１  （配列番号３５９）、Ｃ３２０２  （配列番号３６０）、Ｃ３２０３  （配列番号３６１）、Ｃ３２０４  （配列番号３６２）、Ｃ３２０５  （配列番号３６３）、Ｃ３２０６  （配列番号３６４）、Ｃ３２０７  （配列番号３６５）、Ｃ３２０８  （配列番号３６６）、Ｃ３２０９  （配列番号３６７）、Ｃ３２１０  （配列番号３６８）、およびＣ３２１１  （配列番号３６９）のＦＧＦ２１様のシグナル伝達活性を誘発する能力が、ＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の両方の存在を必要とすることを実証する。
【図４７Ａ】カニクイザルＦＧＦＲ１ｃおよびカニクイザルβ−クロト−を発現する細胞を使用して生成した一連のプロットであり、結合タンパク質Ｃ３０９０  （配列番号３３５）、Ｃ３０９１  （配列番号３３６）、Ｃ３０９２  （配列番号３３７）、Ｃ３０９３  （配列番号３３８）、Ｃ３０９４  （配列番号３３９）、Ｃ３０９５  （配列番号３４０）、Ｃ３０９６  （配列番号３４１）、Ｃ３０９７  （配列番号３４２）、Ｃ３０９８  （配列番号３４３）、Ｃ３０９９  （配列番号３４４）、Ｃ３１００  （配列番号３４５）、Ｃ３１０２  （配列番号３４６）、Ｃ３１０３  （配列番号３４７）、Ｃ３１０４  （配列番号３４８）、Ｃ３１０５  （配列番号３４９）、Ｃ２７３９  （配列番号３７２）、およびＣ２７５２  （配列番号３８４）が、ヒトＦＧＦＲ１ｃを安定して発現し、カニクイザルβ−クロト−を一時的にトランスフェクトした第４のルシフェラ−ゼレポ−タ−細胞系においてＦＧＦ２１様のシグナル伝達活性を示すことを実証する。ヒトＦＧＦＲ１ｃおよびカニクイザルＦＧＦＲ１ｃについてのアミノ酸配列は、同一である。
【図４７Ｂ】カニクイザルＦＧＦＲ１ｃおよびカニクイザルβ−クロト−を発現する細胞を使用して生成した一連のプロットであり、結合タンパク質Ｃ３０９０  （配列番号３３５）、Ｃ３０９１  （配列番号３３６）、Ｃ３０９２  （配列番号３３７）、Ｃ３０９３  （配列番号３３８）、Ｃ３０９４  （配列番号３３９）、Ｃ３０９５  （配列番号３４０）、Ｃ３０９６  （配列番号３４１）、Ｃ３０９７  （配列番号３４２）、Ｃ３０９８  （配列番号３４３）、Ｃ３０９９  （配列番号３４４）、Ｃ３１００  （配列番号３４５）、Ｃ３１０２  （配列番号３４６）、Ｃ３１０３  （配列番号３４７）、Ｃ３１０４  （配列番号３４８）、Ｃ３１０５  （配列番号３４９）、Ｃ２７３９  （配列番号３７２）、およびＣ２７５２  （配列番号３８４）が、ヒトＦＧＦＲ１ｃを安定して発現し、カニクイザルβ−クロト−を一時的にトランスフェクトした第４のルシフェラ−ゼレポ−タ−細胞系においてＦＧＦ２１様のシグナル伝達活性を示すことを実証する。ヒトＦＧＦＲ１ｃおよびカニクイザルＦＧＦＲ１ｃについてのアミノ酸配列は、同一である。
【図４８】カニクイザルＦＧＦＲ１ｃおよびカニクイザルβ−クロト−を発現する細胞を使用して生成した一連のプロットであり、結合タンパク質Ｃ３１９２  （配列番号３５０）、Ｃ３１９３  （配列番号３５１）、Ｃ３１９４  （配列番号３５２）、Ｃ３１９５  （配列番号３５３）、Ｃ３１９６  （配列番号３５４）、Ｃ３１９７  （配列番号３５５）、Ｃ３１９８  （配列番号３５６）、Ｃ３１９９  （配列番号３５７）、Ｃ３２００  （配列番号３５８）、Ｃ３２０１  （配列番号３５９）、Ｃ３２０２  （配列番号３６０）、Ｃ３２０３  （配列番号３６１）、Ｃ３２０４  （配列番号３６２）、Ｃ３２０５  （配列番号３６３）、Ｃ３２０６  （配列番号３６４）、Ｃ３２０７  （配列番号３６５）、Ｃ３２０８  （配列番号３６６）、Ｃ３２０９  （配列番号３６７）、Ｃ３２１０  （配列番号３６８）、およびＣ３２１１  （配列番号３６９）が、ヒトＦＧＦＲ１ｃを安定して発現し、カニクイザルβ−クロト−を一時的にトランスフェクトした第４のルシフェラ−ゼレポ−タ−細胞系においてＦＧＦ２１様のシグナル伝達活性を示すことを実証する。ヒトＦＧＦＲ１ｃおよびカニクイザルＦＧＦＲ１ｃについてのアミノ酸配列は、同一である。
【図４９Ａ】ヒトＦＧＦＲ１ｃおよびヒトβ−クロト−を発現する細胞を使用して生成した一連のプロットであり、結合タンパク質Ｃ３０９４  （配列番号３３９）、Ｃ４１６８  （配列番号１２６５）、Ｃ４１６９  （配列番号１２６６）、Ｃ４１７０  （配列番号１２６７  ）、Ｃ４１７１  （配列番号１２６８）、Ｃ４１７２  （配列番号３５１）、Ｃ４１７３  （配列番号１２６９）、Ｃ４１７４  （配列番号１２７０）、Ｃ４１７５  （配列番号３５５）、Ｃ４１７６  （配列番号１２７１）、Ｃ４１７７  （配列番号１２７２）、およびＣ４１７８  （配列番号１２７３）が、ＦＧＦ２１様のシグナル伝達を誘発することができることを実証する。
【図４９Ｂ】ヒトＦＧＦＲ１ｃおよびヒトβ−クロト−を発現する細胞を使用して生成した一連のプロットであり、結合タンパク質Ｃ３０９４  （配列番号３３９）、Ｃ４１６８  （配列番号１２６５）、Ｃ４１６９  （配列番号１２６６）、Ｃ４１７０  （配列番号１２６７  ）、Ｃ４１７１  （配列番号１２６８）、Ｃ４１７２  （配列番号３５１）、Ｃ４１７３  （配列番号１２６９）、Ｃ４１７４  （配列番号１２７０）、Ｃ４１７５  （配列番号３５５）、Ｃ４１７６  （配列番号１２７１）、Ｃ４１７７  （配列番号１２７２）、およびＣ４１７８  （配列番号１２７３）が、ＦＧＦ２１様のシグナル伝達を誘発することができることを実証する。
【図５０Ａ】ＦＧＦ−２１により刺激した場合にルシフェラ−ゼを発現する、４つの様々な安定したルシフェラ−ゼレポ−タ−系を使用して生成した一連のプロットであり、結合タンパク質Ｃ４３１１  （ＬＮＲＭ０１＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔＭ０９）  （配列番号１２７４）およびＣ４３１２  （Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔＭ０９＿ＬＮＲＭ０１）  （配列番号１２７５）が、ＦＧＦ２１様のシグナル伝達を誘発することができることを実証する。
【図５０Ｂ】ＦＧＦ−２１により刺激した場合にルシフェラ−ゼを発現する、４つの様々な安定したルシフェラ−ゼレポ−タ−系を使用して生成した一連のプロットであり、結合タンパク質Ｃ４３１１  （ＬＮＲＭ０１＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔＭ０９）  （配列番号１２７４）およびＣ４３１２  （Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔＭ０９＿ＬＮＲＭ０１）  （配列番号１２７５）が、ＦＧＦ２１様のシグナル伝達を誘発することができることを実証する。
【図５１】カニクイザルＦＧＦＲ１ｃおよびカニクイザルβ−クロト−を発現する細胞を使用して生成した一連のプロットであり、結合タンパク質Ｃ３２０１−ＨＳＡ  （配列番号７１３）、Ｃ３２０３−ＨＳＡ  （配列番号７１４）、ＨＳＡ−Ｃ３２０１  （配列番号７１１）、およびＨＳＡ−Ｃ３２０３  （配列番号７１２）が、ＦＧＦ２１様のシグナル伝達を誘発することができることを実証する。
【図５２】ヒトＦＧＦＲ１ｃおよびヒトβ−クロト−を発現する細胞を使用して生成した一連のプロットであり、結合タンパク質Ｃ３２０１−ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ−ＨＳＡ  （配列番号４）およびＣ３２０１−ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ−ＨＳＡ  （配列番号４１８）が、Ｃ３２０１−ＨＳＡ  （配列番号７１３）と等価な効力および効能により、ＦＧＦ２１様のシグナル伝達を誘発することができることを実証し、結合タンパク質は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ  （配列番号３）リンカ−によってＨＳＡに連結されている。
【図５３】ヒトＦＧＦＲ１ｃおよびヒトβ−クロト−を発現する細胞を使用して生成した一連のプロットであり、結合タンパク質Ｃ３２０１−ＨＳＡ  （配列番号７１３）、Ｃ３２０１−ＨＳＡ  （Ｎ１４Ｓ／Ｓ８６Ｇ）  （配列番号１２８８）、Ｃ３２０１−ＨＳＡ  （Ｓ１６Ｑ／Ｓ８６Ｇ）  （配列番号１２８９）、Ｃ３２０１−ＨＳＡ  （Ｓ１６Ｎ／Ｓ８６Ｇ）  （配列番号１２９０）、およびＣ３２０１−ＨＳＡ  （Ｓ１６Ｇ／Ｓ８６Ｇ）  （配列番号１２９１）が、等価な効力および効能によりＦＧＦ２１様のシグナル伝達を誘発することができることを実証する。
【図５４】ヒトＦＧＦＲ１ｃおよびヒトβ−クロト−を発現する細胞を使用して生成した一連のプロットであり、結合タンパク質Ｃ３０９４−ＨＣＦＣ（配列番号１２９５）、Ｃ３２０１−ＨＣＦＣ（配列番号１２９４）、Ｃ４１７４−ＨＣＦＣ（配列番号１２９６）、およびＣ４１７６−ＨＣＦＣ（配列番号１２９７）が、ＦＧＦ２１様のシグナル伝達を誘発することができることを実証する。
【図５５】肥満のカニクイザルにおいて実行する６８日間の試験についての試験計画を図解で示す図である。
【図５６】試験した肥満のカニクイザルの午前食物摂取量に対するビヒクルおよびＣ３２０１−ＨＳＡ（配列番号７１３）の効果を示すプロットである。
【図５７】試験した肥満のカニクイザルのリンゴ摂取量に対するビヒクルおよびＣ３２０１−ＨＳＡ（配列番号７１３）の効果を示すプロットである。
【図５８】試験した肥満のカニクイザルの午後食物摂取量に対するビヒクルおよびＣ３２０１−ＨＳＡ（配列番号７１３）の効果を示すプロットである。
【図５９】試験した肥満のカニクイザルの体重に対するビヒクルおよびＣ３２０１−ＨＳＡ（配列番号７１３）の効果を示すプロットである。
【図６０】試験した肥満のカニクイザルのボディマス指数（ＢＭＩ）に対するビヒクルおよびＣ３２０１−ＨＳＡ（配列番号７１３）の効果を示すプロットである。
【図６１】研究した肥満のカニクイザルの腹囲（ＡＣ）に対するビヒクルおよびＣ３２０１−ＨＳＡ（配列番号７１３）の効果を示すプロットである。
【図６２】試験した肥満のカニクイザルの皮下脂肪厚（ＳＦＴ）に対するビヒクルおよびＣ３２０１−ＨＳＡ  （配列番号７１３）の効果を示すプロットである。
【図６３】試験した肥満のカニクイザルの耐糖能試験の間の血漿グルコ−ス濃度に対するビヒクルおよびＣ３２０１−ＨＳＡ（配列番号７１３）の効果を示すプロットである。
【図６４】試験した肥満のカニクイザルの耐糖能試験の間の血漿インスリン濃度に対するビヒクルおよびＣ３２０１−ＨＳＡ（配列番号７１３）の効果を示すプロットである。
【図６５】試験した肥満のカニクイザルの空腹時血漿グルコ−ス濃度に対するビヒクルおよびＣ３２０１−ＨＳＡ（配列番号７１３）の効果を示すプロットである。
【図６６】試験した肥満のカニクイザルの空腹時血漿インスリン濃度に対するビヒクルおよびＣ３２０１−ＨＳＡ  （配列番号７１３）の効果を示すプロットである。
【図６７】試験した肥満のカニクイザルの摂取した血漿トリグリセリド濃度に対するビヒクルおよびＣ３２０１−ＨＳＡ（配列番号７１３）の効果を示すプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
定義
本明細書において使用される節の見出しは、構成上の目的のみのためのものであり、記載される主題を限定するものとして解釈されないものとする。
【００４７】
本明細書において別様に定義されない限り、本出願に関連して使用される科学用語および専門用語は、当業者らによって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって別様に必要とされない限り、単数形の用語は、複数を含み、複数形の用語は、単数を含むものとする。
【００４８】
標準的な慣例に従って、本明細書において使用される、「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、明確にそうではないと示されない限り、１つまたは複数を意味する。
【００４９】
本明細書において使用される、配列モチ−フにおける括弧の使用は、括弧内の位置が存在するまたは不在であることを示す（たとえば、「［ｅｋｑ］」は、位置が不在であるまたはＥ、Ｋ、もしくはＱのいずれかがその位置にあり得ることを示す）。１つを超える「ｘ」が括弧において使用される場合（たとえば「［ｘｘ］」）、ｘは、それぞれ実現可能な位置を示す。したがって、「［ｘｘ］」は、ゼロ、１つ、または２つのアミノ酸がその位置（複数可）にあり得ることを示し、アミノ酸はそれぞれ、任意のアミノ酸から独立して選択される。不在のアミノ酸はまた、「−」によって示すことができる。
【００５０】
「ＦＧＦ２１様のシグナル伝達活性」という用語は、ＦＧＦ２１の活性の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％以上の、好ましくは、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％以上のＦＧＦ２１様のアゴニスト効能レベルを、以下のアッセイのうちの１つにおいて示すことを意味する：（１）実施例９において記載されるアッセイなどのような、ＦＧＦ２１に応答するように遺伝子操作された組換え細胞系におけるレポ−タ−、たとえばルシフェラ−ゼアッセイ；（２）実施例１０において記載されるアッセイなどのような、ＦＧＦ２１に応答するように遺伝子操作された組換え細胞系、たとえばラット筋芽細胞Ｌ６細胞における、下流のシグナル伝達分子における変化、たとえばＥＲＫリン酸化を示すアッセイ；および（３）実施例１１において記載されるアッセイなどのような、ＦＧＦ２１に応答する初代ヒト脂肪細胞における、下流のシグナル伝達分子における変化、たとえばＥＲＫリン酸化を示すアッセイ。そのような結合タンパク質の実質的な活性の「効力」は、前述のアッセイにおいて、結合タンパク質の１００ｎＭ以下の、好ましくは１０ｎＭ以下のＥＣ５０を有するものとして定義される。
【００５１】
本明細書において使用される、「結合タンパク質」という用語は、ＦＧＦＲ１ｃ、β−クロト−、またはＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の両方、たとえばヒトＦＧＦＲ１ｃ、ヒトβ−クロト−、またはヒトＦＧＦＲ１ｃおよびヒトβ−クロト−の両方などのような特定の標的タンパク質に特異的に結合するタンパク質を指す。結合タンパク質は、本明細書において定義され、記載される、リンカ−配列を介して互いにつながれて、「多量体」を形成する１つまたは複数の単量体を含むことができる。明確にするために、結合タンパク質の定義は、抗体を明確に除外する。
【００５２】
結合タンパク質は、解離定数（ＫＤ）が≦１０−７Ｍである場合に、その標的に「特異的に結合する」と表現される。結合タンパク質は、実施例７において記載されるアッセイなどのような結合アッセイを使用して試験される場合に、ＫＤが≦５×１０−９Ｍである場合、「高度な親和性」で、ＫＤが≦５×１０−１０Ｍである場合、「非常に高度な親和性」で、その標的に特異的に結合する。一実施形態では、結合タンパク質は、結合ＥＬＩＳＡによって決定して、約１０−８Ｍ〜１０−１０ＭのＥＣ５０で、ＦＧＦＲ１ｃ、β−クロト−、またはＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の両方、たとえばヒトＦＧＦＲ１ｃ、ヒトβ−クロト−、またはヒトＦＧＦＲ１ｃおよびヒトβ−クロト−の両方に結合するであろう、また、さらに他の実施形態では、結合タンパク質は、結合ＥＬＩＳＡによって決定して、ＥＣ５０≦５×１０−９で結合するであろう。したがって、単量体、多量体、または結合タンパク質を指す場合の、ポリペプチドに「特異的に（または選択的に）結合する」という表現は、タンパク質（たとえば細胞または組織の溶解物）および他の生物学的製剤の不均一な集団におけるポリペプチドの存在の決定因とすることができる結合反応を指す。したがって、抗体結合アッセイにおいて使用される標準的な条件またはアッセイ下で、結合タンパク質（たとえば単量体または多量体）は、バックグラウンドよりも特定の標的分子に特異的に結合し（たとえばバックグラウンドの２×、５×、１０×、またはそれ以上）、試料中に存在する他の分子に有意な量では結合しない。
【００５３】
「単量体ドメイン」または「単量体」という用語は、タンパク質またはポリペプチドにおいて見出される別々の領域を指すために、区別なく本明細書において使用される。単量体ドメインは、側面に位置する天然のアミノ酸配列の非存在下において溶液中で天然の三次元構造を形成することができる。本明細書において開示されるいくつかの単量体ドメインは、標的分子に特異的に結合することができる。たとえば、標的分子に結合する三次元構造を形成するポリペプチドは、単量体ドメインである。本明細書において使用される、「単量体ドメイン」という用語は、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を包含しない。２つ以上の単量体は、リンカ−配列を介して互いにつなげて、多量体を形成することができる。
【００５４】
「単量体ドメイン変異体」という用語は、単量体ドメイン配列のヒトによる操作から結果として生じる単量体ドメインを指す。ヒトにより操作される変化の例は、たとえばランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、組換え、定向進化、オリゴ特異的強制組換え事象（ｏｌｉｇｏ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｆｏｒｃｅｄ  ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ  ｅｖｅｎｔ）、突然変異の直接的な遺伝子合成による組み込みなどを含む。用語「単量体ドメイン変異体」は、抗体の突然変異誘発相補性決定領域（ＣＤＲ）を包含しない。
【００５５】
「ル−プ」という用語は、単量体ドメインタンパク質の足場構造の集合によって、典型的に周囲に暴露され、標的結合に関与する、単量体ドメインの一部を指す。本開示は、ジスルフィド結合の可能性、タンパク質二次構造の間の架橋、および分子動態（たとえば可動性）などのような、特異的な特徴によって同定される３つのタイプのル−プを提供する。３つのタイプのル−プ配列は、システインにより定められるル−プ配列、構造により定められるル−プ配列、およびＢ因子により定められるル−プ配列である。
【００５６】
本明細書において使用される、「システインにより定められるル−プ配列」という用語は、同じファミリ−の少なくとも１つの他の天然に存在する単量体ドメインに関して保存されているシステイン残基によってそれぞれの末端で結合する、天然に存在する単量体ドメインコ−ド配列の部分配列を指す。システインにより定められるル−プ配列は、天然に存在する単量体ドメインの複数の配列アライメント、それに続く、保存システイン残基を同定するための配列分析によって、同定される。保存システイン残基のそれぞれの連続する対の間の配列は、システインにより定められるル−プ配列である。システインにより定められるル−プ配列は、それぞれの末端に隣接するシステイン残基を含まない。システインにより定められるル−プ配列を有する単量体ドメインは、ＬＤＬ受容体Ａドメイン、ＥＧＦ様ドメイン、ｓｕｓｈｉドメイン、フィブロネクチン１型ドメイン、およびその他同種のものを含む。したがって、たとえば、コンセンサス配列ＣＸ６ＣＸ４ＣＸ６ＣＸ５ＣＸ８Ｃ（配列番号５）によって示されるＬＤＬ受容体Ａドメインの場合には、Ｘ６、Ｘ４、Ｘ５、およびＸ８はそれぞれ、示される数のアミノ酸を含む、システインにより定められるル−プ配列を示す。
【００５７】
「Ｂ因子により定められるル−プ配列」という用語は、Ｂ因子により定められるル−プにおけるアルファ炭素についてのＢ因子が、単量体ドメイン全体において２５％の最も高度なアルファ炭素Ｂ因子の一つである、単量体ドメインコ−ド配列の少なくとも３つのアミノ酸残基の部分配列を指す。典型的に、部分配列についての平均アルファ炭素Ｂ因子は、少なくとも約６５である。本明細書において使用される、「Ｂ因子」（または「温度因子」または「デバイ−ワラ−因子」）という用語は、Ｘ線散乱デ−タに由来する。Ｂ因子は、電子密度が分散する程度を説明する、それぞれの原子または原子のグル−プについての、Ｘ線散乱項に適用することができる因子であり、本明細書において開示される実施において用いられるＢ因子は、等方性または異方性のものとすることができる。「平均アルファ炭素Ｂ因子」という用語は、
ｎ
（Σ  Ｂ因子Ｃαｉ）  ／  ｎ
ｉ＝１
を指し、
ｎは、ル−プ中の残基の数に対応し、少なくとも３であり、Ｂ因子Ｃαｉは、ル−プのアミノ酸残基ｉのアルファ炭素についてのＢ因子である。
【００５８】
「多量体」という用語は、少なくとも２つの単量体ドメインを含むタンパク質を示すために本明細書において使用される。多量体中の個別の単量体ドメインは、リンカ−によってともにつなぐことができる。多量体はまた、コンビナトリアルモザイクタンパク質または組換えモザイクタンパク質としても知られている。
【００５９】
「ファミリ−」および「ファミリ−クラス」という用語は、それらのアミノ酸配列における類似性に基づいてともに分類されるタンパク質を示すために区別なく使用される。これらの類似する配列は、それらが、タンパク質の機能および／またはタンパク質の三次元構造の維持にとって重要であるので、一般に保存されている。そのようなファミリ−の例は、ＬＤＬ受容体Ａドメインファミリ−、ＦＧＦファミリ−のＦＧＦ１９サブファミリ−、およびその他同種のものを含む。さらに、同じ標的分子に結合する、関連する配列は、共通配列モチ−フに基づいてファミリ−に分けることができる。
【００６０】
「リガンド」という用語は、本明細書において「標的分子」とも呼ばれるが、種々様々の物質および分子を包含し、単純な分子から複雑な標的に及ぶ。標的分子は、単量体ドメインによる認識が可能なタンパク質、核酸、脂質、炭水化物、または任意の他の分子とすることができる。たとえば、標的分子は、化学化合物（つまり、たとえば有機分子、無機分子、または有機原子および無機原子の両方を有するが、ポリヌクレオチドおよびタンパク質を除く分子などのような非生物学的化合物）、化学化合物の混合物、一連の空間的に局在化した化合物、生体高分子、バクテリオファ−ジペプチドディスプレイライブラリ−、ポリソ−ムペプチドディスプレイライブラリ−、細菌、植物、菌類、または動物（たとえば哺乳動物）細胞もしくは組織、タンパク質、毒素、ペプチドホルモン、細胞、ウイルス、またはその他同種のものなどのような生物学的物質から作製される抽出物を含むことができる。他の標的分子は、たとえば細胞全体、組織全体、関連するタンパク質もしくは関連しないタンパク質の混合物、ウイルスもしくは細菌株の混合物、またはその他同種のものを含む。標的分子はまた、本明細書において記載されるスクリ−ニングアッセイに包含されることによってまたは特異的なタンパク質相互作用を増強するもしくは阻害することによって（つまり、２つの所定のポリペプチドの間の結合相互作用を選択的に阻害する作用物質）、定めることもできる。標的分子の例は、β−クロト−およびＦＧＦＲ１ｃを含む。
【００６１】
「リンカ−」という用語は、２つ以上の別々の個別の単量体ドメインをつなぐまたは結び付ける成分または成分のグル−プを示すために本明細書において使用される。リンカ−は、別々の個別の単量体ドメインが、多量体においてともにつながれる場合に、個別のまま残ることを可能にする。リンカ−成分は、典型的に、実質的に直線状の成分である。適したリンカ−は、ポリペプチド、ポリ核酸、ペプチド核酸、およびその他同種のものを含む。適したリンカ−はまた、炭素主鎖中に組み込まれる１つまたは複数の酸素原子を有する任意選択で置換されるアルキレン成分を含む。典型的に、リンカ−の分子量は、約２０００ダルトン未満である。より典型的には、リンカ−の分子量は、約１５００ダルトン未満であり、約１０００ダルトン未満であることが多い。リンカ−は、たとえば、多量体中の別々の個別の単量体ドメインのそれぞれが、個別の結合部位を介して同じ標的分子に結合する場合に、別々の個別の単量体ドメインが協力するのを可能にするのに十分に小さいものとすることができる。例示的なリンカ−は、ポリペプチドをコ−ドするポリヌクレオチドまたはアミノ酸のポリペプチドまたは他の天然に存在しない成分を含む。リンカ−は、天然の配列の一部、その変異体、または合成配列とすることができる。リンカ−は、たとえば、天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、またはその両方の組み合わせを含むことができる。本明細書において開示される結合タンパク質中に用いることができる特定のリンカ−の例は、ＡＴＨＴ  （配列番号６），  ＰＥＲＴ  （配列番号７），  ＴＴＲＴ  （配列番号８），  ＧＴＴＧＰＴ  （配列番号９），  ＥＴＳＧＰＴ  （配列番号１０），  ＳＱＤＰＥＦＨＫＶＳ  （配列番号１１），  ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号１２），  ＧＲＰＧＰＧＡＴＳＡＰＡＡ  （配列番号１３），  ＧＤＳＨＩＬＰＦＳＴＰＧＰＳＴ  （配列番号１４），  ［ＡＥＫＰＴ］［ＡＥＫＬＰＴ］［ＥＨＰＲ］Ｔ  （配列番号１５），  ［ＡＥＫＲＴ］［ＡＧＳ］［ＡＰＳＶ］［ＡＥＧＶ］［ＨＰ］Ｔ  （配列番号１６），  ＰＴＫＲＰＥＥＶ  （配列番号１７），  ＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号１８），  ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号１２），  ＧＲＰＧＰＧＡＴＳＡＰＡＡ  （配列番号１３），  ＧＤＳＨＩＬＰＦＳＴＰＧＰＳＴ  （配列番号１４），  ［ＡＥＰＴ］［ＡＥＰＱ］［ＨＰ］Ｔ  （配列番号２２），  ［ＥＧＴ］［ＡＧＲ］［ＡＳＴ］［ＥＧＶ］［ＰＲ］Ｔ  （配列番号２３），  ＫＡＰＶＰＴ  （配列番号２４），  ＳＱＤＰＧＦＨＫＶ  （配列番号２５），  ［ＡＰＫ］［ＡＴ］［ＨＰＲ］Ｔ  （配列番号２６），  ［ＥＱ］［ＡＲＴ］［ＨＰ］Ｔ  （配列番号２７），  ＥＱＲＴ  （配列番号２８），  ＲＲＡＡＨＴ  （配列番号２９），  ［ＡＫ］［ＡＧ］［ＰＳ］［ＥＧ］［ＨＰ］Ｔ  （配列番号３０），  ＥＴＰＴ  （配列番号１３１９），  ＰＡＰＴ  （配列番号１３２０），  ＱＡＰＴ  （配列番号１３２１），  ＡＱＰＴ  （配列番号１３２２），および保存的置換を含む配列を含み、括弧中のアミノ酸は、指定の位置での代替アミノ酸を示す。
【００６２】
「個別の」という用語は、独立しており、たとえば他の単量体ドメインを含む他の成分と複合体を形成した場合でさえ独立したままである成分の特性を示すために本明細書において使用される。単量体ドメインは、それを認識し、タンパク質から分離することができる独立した特性を有するので、タンパク質中の個別のドメインである。たとえば、ＦＧＦＲ１ｃのリガンド結合能力は、独立した特性である。個別の他の例は、リンカ−によって多量体においてともにつながれたまたは複合体を形成した場合でさえ個別の独立したドメインのままである、多量体中の個別の単量体ドメインを含む。個別の特性の他の例は、リガンドに対する、多量体における個別の結合部位である。
【００６３】
本明細書において使用される、「定向進化」は、ポリヌクレオチド変異体が、反復的なプロセスにおいて発現され、生成され、活性（たとえば結合活性を有するポリペプチド）についてスクリ−ニングされるプロセスを指す。スクリ−ニングにおける１つまたは複数の候補が選択され、次いで、プロセスは、新しい変異体を生成するために、候補をコ−ドするポリヌクレオチドを使用して繰り返される。定向進化は、少なくとも２回の変異生成を含み、３、４、５、１０、２０回、またはそれ以上の変異生成および選択を含むことができる。変異は、たとえばエラ−プロ−ンＰＣＲ、遺伝子組換え、化学的突然変異誘発。およびその他同種のものによるものを含む、当業者らに公知の任意の方法によって生成することができる。
【００６４】
「シャフリング」という用語は、同一でない配列の間の組換えを示すために本明細書において使用される。いくつかの実施形態では、シャフリングは、ｃｒｅ／ｌｏｘおよび／またはｆｌｐ／ｆｒｔ系を介してのなどのような、相同組換えまたは非相同組換えを介してのクロスオ−バ−を含むことができる。シャフリングは、たとえば、すべて、同一でない配列の間の組換え事象に基づき、より詳細に記載されるまたは本明細書において下記に参考文献を挙げるｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏシャフリング方式、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏシャフリング方式、二本鎖または一本鎖鋳型を利用するシャフリング方式、プライマ−ベ−スのシャフリング方式、核酸断片化ベ−スのシャフリング方式、およびオリゴヌクレオチド媒介性のシャフリング方式ならびに他の類似する組換えベ−スの方式を含む、様々な異なる方式を用いることによって実行することができる。
【００６５】
本明細書において使用される「ランダム」という用語は、２つ以上のアミノ酸から構成され、確率的なまたはランダムなプロセスによって構築されたポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を指す。ランダムポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、不変の配列を含むことができるフレ−ムワ−クまたは足場材料モチ−フを含むことができる。
【００６６】
本明細書において使用される「擬似ランダム」という用語は、いくつかの位置での残基変異性の程度が、限られるが、任意の擬似ランダム位置が、残基変異の少なくともいくらかの程度で可能になるように、変異性が限られるポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のセットを指す。
【００６７】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、２つ以上のアミノ酸のアミノ酸配列を指すために本明細書において区別なく使用される。
【００６８】
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸ならびに天然に存在するアミノ酸に類似する方法で機能するアミノ酸類似体／アミノ酸模倣体／天然に存在しないアミノ酸を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コ−ドによってコ−ドされるアミノ酸ならびに後に修飾されるアミノ酸、たとえばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメ−ト、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ、基本的な化学構造、つまり、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素を有する化合物、たとえばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾Ｒ基（たとえばノルロイシン）または修飾ペプチド主鎖を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ、基本的な化学構造を保持する。
【００６９】
「アミノ酸模倣体」は、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸に類似する方法で機能する化学化合物である。「天然に存在しないアミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸と同じ、基本的な化学構造を有するが、翻訳複合体によって成長中のポリペプチド鎖の中に組み込まれない化合物である。「天然に存在しないアミノ酸」は、天然にコ−ドされるアミノ酸（２０種の一般的なアミノ酸を含むが、これらに限定されない）の修飾（たとえば翻訳後修飾）によって生じるが、それら自体、翻訳複合体によって、成長中のポリペプチド鎖の中に天然に組み込まれないアミノ酸を含むが、これらに限定されない。
【００７０】
結合タンパク質配列に挿入することができるまたは抗原結合配列における野生型残基と置換することができる天然に存在しないアミノ酸の例の非限定的なリストは、β−アミノ酸、ホモアミノ酸、環状アミノ酸、および誘導体化された側鎖を有するアミノ酸を含む。例として（Ｌ形態またはＤ形態の；括弧中に略称）、シトルリン（Ｃｉｔ）、ホモシトルリン（ｈＣｉｔ）、Ｎα−メチルシトルリン（ＮＭｅＣｉｔ）、Ｎα−メチルホモシトルリン（Ｎα−ＭｅＨｏＣｉｔ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、Ｎα−メチルオルニチン（Ｎα−ＭｅＯｒｎまたはＮＭｅＯｒｎ）、サルコシン（Ｓａｒ）、ホモリシン（ｈＬｙｓまたはｈＫ）、ホモアルギニン（ｈＡｒｇまたはｈｒ）、ホモグルタミン（ｈＱ）、Ｎα−メチルアルギニン（ＮＭｅＲ）、Ｎα−メチルロイシン（Ｎα−ＭｅＬまたはＮＭｅＬ）、Ｎ−メチルホモリシン（ＮＭｅＨｏＫ）、Ｎα−メチルグルタミン（ＮＭｅＱ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン（Ｔｉｃ）、オクタヒドロインド−ル−２−カルボン酸（Ｏｉｃ）、３−（１−ナフチル）アラニン（１−Ｎａｌ）、３−（２−ナフチル）アラニン（２−Ｎａｌ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン（Ｔｉｃ）、２−インダニルグリシン（ＩｇＩ）、パラ−ヨ−ドフェニルアラニン（ｐＩ−Ｐｈｅ）、パラ−アミノフェニルアラニン（４ＡｍＰまたは４−Ａｍｉｎｏ−Ｐｈｅ）、４−グアニジノフェニルアラニン（Ｇｕｆ）、グリシルリシン（「Ｋ（Ｎε−グリシル）」または「Ｋ（グリシル）」または「Ｋ（ｇｌｙ）」と略称される）、ニトロフェニルアラニン（ｎｉｔｒｏｐｈｅ）、アミノフェニルアラニン（ａｍｉｎｏｐｈｅまたはＡｍｉｎｏ−Ｐｈｅ）、ベンジルフェニルアラニン（ｂｅｎｚｙｌｐｈｅ）、γ−カルボキシグルタミン酸（γ−ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕ）、ヒドロキシプロリン（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏ）、ｐ−カルボキシルフェニルアラニン（Ｃｐａ）、α−アミノアジビン酸（Ａａｄ）、Ｎα−メチルバリン（ＮＭｅＶａｌ）、Ｎ−α−メチルロイシン（ＮＭｅＬｅｕ）、Ｎα−メチルノルロイシン（ＮＭｅＮｌｅ）、シクロペンチルグリシン（Ｃｐｇ）、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、アセチルアルギニン（ａｃｅｔｙｌａｒｇ）、α，−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、α，γ−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、４−メチル−フェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、β，β−ジフェニル−アラニン（ＢｉＰｈＡ）、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、４−フェニル−フェニルアラニン（またはビフェニルアラニン；４Ｂｉｐ）、α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、ベ−タ−アラニン、ベ−タ−アミノプロピオン酸、ピペリジン酸、アミノカプロン酸、アミノヘプタン酸、アミノピメリン酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリシン、アロ−ヒドロキシリシン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリン、４−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、γ−カルボキシグルタメ−ト、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセ��ン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、ω−メチルアルギニン、４−アミノ−Ｏ−フタル酸（４ＡＰＡ）、および他の類似するアミノ酸ならびに明確に列挙したもののいずれかの誘導体化形態を含む。
【００７１】
「保存的アミノ酸置換」は、類似する側鎖を有する残基の可換性を指す。たとえば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグル−プは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグル−プは、セリンおよびトレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグル−プは、アスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸のグル−プは、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸のグル−プは、リシン、アルギニン、およびヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグル−プは、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換のグル−プは、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。
【００７２】
本明細書において使用される、結合タンパク質、単量体、または多量体との関連において使用される場合の「組換え」という用語は、結合タンパク質、単量体、または多量体が、自然界において見つけられず、自然界において見出される、改変されていない供給源（たとえば細胞、組織、または生体液）から単離することができないことを意味する。この用語が、たとえば細胞または核酸、タンパク質、もしくはベクタ−に関連して使用される場合、それは、細胞、核酸、タンパク質、またはベクタ−が、異種核酸もしくは異種タンパク質の導入または天然の核酸もしくはタンパク質の改変によって修飾されていることまたは細胞が、そのように修飾された細胞に由来することを示す。したがって、たとえば、組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）形態内に見出されない遺伝子を発現するまたは他の場合には異常に発現される、過小発現される、もしくは全く発現されない天然の遺伝子を発現する。
【００７３】
本明細書において使用される、結合タンパク質、単量体、または多量体との関連において使用される場合の用語「非組換え」は、結合タンパク質、単量体、または多量体が、自然界において見つけられ、自然界において見出され、改変されていない供給源（たとえば細胞、組織、または体液）から単離することができることを意味する。
【００７４】
語句「核酸配列」は、５’から３’末端に読まれるデオキシリボヌクレオチド塩基もしくはリボヌクレオチド塩基の一本鎖もしくは二本鎖のポリマ−またはその類似体を指す。
【００７５】
「コ−ドする」という用語は、１つまたは複数のアミノ酸をコ−ドするポリヌクレオチド配列を指す。この用語は、開始コドンまたは終止コドンを必要としない。アミノ酸配列は、ポリヌクレオチド配列によって提供される６つの異なるリ−ディングフレ−ムのいずれの１つにおいてもコ−ドすることができる。
【００７６】
「プロモ−タ−」という用語は、転写を開始するための、ＲＮＡポリメラ−ゼおよび他のタンパク質の認識および結合に関与する、転写の開始点の上流および／または下流に位置する領域または配列を指す。
【００７７】
「ベクタ−」は、宿主染色体から独立している場合、宿主生物における複製が可能であるポリヌクレオチドを指す。ベクタ−の例はプラスミドを含む。ベクタ−は、典型的に、複製開始点を有する。ベクタ−は、たとえば、転写および翻訳タ−ミネ−タ−、転写および翻訳開始配列、ならびに特定の核酸の発現の調節に有用なプロモ−タ−を含むことができる。
【００７８】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列との関連における「同一の」または「同一性」パ−セントという用語は、同じである２つ以上の配列または部分配列を指す。「同一性パ−セント」は、比較される分子におけるアミノ酸またはヌクレオチドの間の同一の残基のパ−セントを意味し、比較されている分子の中で最も小さなもののサイズに基づいて計算される。これらの計算については、特定の数学的モデルまたはコンピュ−タ−プログラム（つまり「アルゴリズム」）によってアライメントにおけるギャップ（もしあれば）を検討しなければならない。アライメントされた核酸またはポリペプチドの同一性を計算するために使用することができる方法は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  （Ｌｅｓｋ，  Ａ．  Ｍ．，  ｅｄ．），  （１９８８）  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，  （Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．  Ｗ．，  ｅｄ．），  １９９３，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  Ｉ，  （Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｈ．  Ｇ．，  ｅｄｓ．），  １９９４，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ：  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，  Ｇ．，  （１９８７）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，  （Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  ｅｄｓ．），  １９９１，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｍ．  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；およびＣａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  ＳＩＡＭ  Ｊ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．  ４８：１０７３において記載されるものを含む。
【００７９】
同一性パ−セントを計算する際に、比較されている配列は、配列の間で最大の一致を与える方法でアライメントされる。同一性パ−セントを決定するために使用されるコンピュ−タ−プログラムは、ＧＡＰを含むＧＣＧプログラムパッケ−ジである（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８４）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １２：３８７；  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）。コンピュ−タ−アルゴリズムＧＡＰは、パ−セント配列同一性が決定されることになっている２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドをアライメントするために使用される。配列は、それぞれのアミノ酸またはヌクレオチドの最適な一致のためにアライメントされる（アルゴリズムによって決定される「一致スパン」）。ギャップオ−プンペナルティ−（３×平均対角線として計算され、「平均対角線」は、使用されている比較マトリックスの対角線の平均値であり、「対角線」は、特定の比較マトリックスによってそれぞれの完全なアミノ酸の一致に割り当てられるスコアまたは数である）およびギャップ延長ペナルティ−（通常、ギャップオ−プンペナルティ−の１／１０である）、ＰＡＭ  ２５０またはＢＬＯＳＵＭ  ６２などのような比較マトリックスが、アルゴリズムと共に使用される。ある実施形態では、標準的な比較マトリックス（Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９７８）  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：３４５−３５２  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＰＡＭ  ２５０  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｍａｔｒｉｘ；  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８９：１０９１５−１０９１９  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＢＬＯＳＵＭ  ６２  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｍａｔｒｉｘを参照されたい）もまた、アルゴリズムによって使用される。
【００８０】
ＧＡＰプログラムを使用してポリペプチド配列またはヌクレオチド配列についての同一性パ−セントを決定するために推薦されるパラメ−タは、以下のものである。
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７０，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３−４５３；
比較マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ  ６２  ｆｒｏｍ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  上記を参照；
Ｇａｐペナルティ−：１２（しかし、エンドギャップに対するペナルティ−なし）
Ｇａｐ長ペナルティ−：４
類似性の閾値：０
【００８１】
２つのアミノ酸配列をアライメントするためのある種のアライメント手法は、２つの配列の短い領域のみの一致をもたらし得、２つの完全長配列の間には有意な関係がないが、この小さなアライメントした領域は、非常に高度な配列同一性を有し得る。したがって、選択されたアライメント方法（たとえばＧＡＰプログラム）は、標的ポリペプチドの少なくとも５０の隣接するアミノ酸にわたるアライメントをもたらすために、そのように所望される場合、調節することができる。
【００８２】
「実質的に同一の」は、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用してまたは手動のアライメントおよび目視検査によって測定して、比較ウィンドウまたは示される領域に関して最大の一致を目的として比較され、アライメントされた場合に、特定の割合の同じアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列を指す（特定の領域に関してまたは特定されない場合、配列全体に関して６０％の同一性、任意選択で、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性）。任意選択で、同一性または実質的な同一性は、長さが少なくとも約５０のヌクレオチドである領域に関してまたは長さが１００〜５００もしくは１０００以上のヌクレオチドまたはアミノ酸である領域に関して、または特定されない場合、配列の全長に関して存在する。本開示は、ＦＧＦＲ１ｃ、β−クロト−、またはＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の両方に結合する結合配列を含むポリペプチドを提供し、結合配列は、配列番号３３５〜３９２および配列番号１１８０〜１２００のいずれかを含むが、これらに限定されない、本明細書において提供される、ＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−に結合する少なくとも１つの結合配列と実質的に同一である（たとえば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一である）。
【００８３】
ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、２つの配列が天然に存在する配列において見出されるのと同じ方法で連結されない場合、第２の配列「に対して異種」である。たとえば、異種コ−ド配列に作動可能に連結されるプロモ−タ−は、いかなる天然に存在する対立遺伝子変異体とも異なるコ−ド配列を指す。「異種リンカ−」という用語は、多量体に関して使用される場合、多量体が、自然界において互いに同じ関係で見つけられないリンカ−および単量体を含むことを示す（たとえば、それらは、自然界において通常発現されない組換え融合タンパク質を形成する）。
【００８４】
「配列同一性の割合（％）」は、比較ウィンドウに関して２つの最適にアライメントされた配列の比較によって決定され、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適なアライメントを目的として、参照配列（追加または欠失を含まない）と比較して、追加または欠失（つまりギャップ）を含むことができる。割合（％）は、一致する位置の数を得るために、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列において生じる位置の数を決定し、比較のウィンドウにおける位置の総数によって一致した位置の数を割り、配列同一性の割合（％）を得るために結果に１００を掛けることによって計算される。
【００８５】
本明細書において使用される「比較ウィンドウ」は、２つの配列が最適にアライメントされた後に、配列を、同数の近接する位置の参照配列と比較することができる、２０〜６００、通常約５０〜約２００、より通常では、約１００〜約１５０から成る群から選択される近接する位置の数のいずれか１つのセグメントに対する参照を含む。比較のための配列のアライメントの方法は、当技術分野において周知である。比較のための配列の最適なアライメントは、たとえば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  （１９７０）  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２ｃの局所性相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ  （１９７０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ  （１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュ−タ−インプリメンテ−ションによって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または手動のアライメントおよび目視検査によって（たとえばＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９９５  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照されたい）、行うことができる。
【００８６】
有用なアルゴリズムの１つの例は、ＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、これは、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０において記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、デ−タベ−ス配列における同じ長さのワ−ドとアライメントされた場合に、一致するまたはいくらかの正の値の閾値スコアＴを満たすクエリ−配列における長さＷの短いワ−ドを特定することによって、高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を特定することを含む。Ｔは、近隣ワ−ドスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｓｕｐｒａ）。これらの最初の近隣ワ−ドヒットは、それらを含有する、より長いＨＳＰを見つけるために検索を開始するためにシ−ドとして作用する。ワ−ドヒットは、累積アライメントスコアが増加し得る限り、それぞれの配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメ−タＭ（１対のマッチ残基に対する報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基に対するペナルティ−スコア；常に＜０）を使用して、計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスが、累積スコアを計算するために使用される。それぞれの方向におけるワ−ドヒットの伸長は、累積アライメントスコアが、その最大達成値から量Ｘ分減少した場合；累積スコアが１つまたは複数の負スコアリング残基アライメントの蓄積により０以下になる場合；またはどちらかの配列の末端に到達した場合、に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメ−タＷ、Ｔ、およびＸが、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、１１のワ−ド長（Ｗ）、１０の期待（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワ−ド長および１０の期待（Ｅ）およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ｓｅｅ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  （１９８９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１０９１５）、５０のアライメント（Ｂ）、１０の期待（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。
【００８７】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列の間の類似性の統計分析を実行する（たとえばＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの測定値は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の一致が偶然生じる可能性の指標を提供する。たとえば、核酸は、参照核酸に対する試験核酸の比較における最小和確率が、約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、参照配列に類似していると考えられる。
【００８８】
Ｉ．導入
本開示は、本明細書において定義されるように、ＦＧＦ２１媒介性のシグナル伝達を誘発することができる結合タンパク質を提供する。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＦＧＦ２１の成熟形態が、分子の活性形態である。完全長ＦＧＦ２１をコ−ドするヌクレオチド配列が、提供される；シグナル配列をコ−ドするヌクレオチドに下線が付されている。
ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＴＣＧ  ＧＡＣ  ＧＡＧ  ＡＣＣ  ＧＧＧ  ＴＴＣ  ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＣＴＧ  ＴＧＧ  ＧＴＴ  ＴＣＴ  ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＧＣＴ  ＧＧＴ  ＣＴＴ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＧＧＡ  ＧＣＣ  ＴＧＣ  ＣＡＧ  ＧＣＡ  ＣＡＣ  ＣＣＣ  ＡＴＣ  ＣＣＴ  ＧＡＣ  ＴＣＣ  ＡＧＴ  ＣＣＴ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＣＡＡ  ＴＴＣ  ＧＧＧ  ＧＧＣ  ＣＡＡ  ＧＴＣ  ＣＧＧ  ＣＡＧ  ＣＧＧ  ＴＡＣ  ＣＴＣ  ＴＡＣ  ＡＣＡ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ＧＣＣ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＡＣＡ  ＧＡＡ  ＧＣＣ  ＣＡＣ  ＣＴＧ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  ＡＧＧ  ＧＡＧ  ＧＡＴ  ＧＧＧ  ＡＣＧ  ＧＴＧ  ＧＧＧ  ＧＧＣ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＧＡＣ  ＣＡＧ  ＡＧＣ  ＣＣＣ  ＧＡＡ  ＡＧＴ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＡＡＡ  ＧＣＣ  ＴＴＧ  ＡＡＧ  ＣＣＧ  ＧＧＡ  ＧＴＴ  ＡＴＴ  ＣＡＡ  ＡＴＣ  ＴＴＧ  ＧＧＡ  ＧＴＣ  ＡＡＧ  ＡＣＡ  ＴＣＣ  ＡＧＧ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＴＧＣ  ＣＡＧ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  ＧＡＴ  ＧＧＧ  ＧＣＣ  ＣＴＧ  ＴＡＴ  ＧＧＡ  ＴＣＧ  ＣＴＣ  ＣＡＣ  ＴＴＴ  ＧＡＣ  ＣＣＴ  ＧＡＧ  ＧＣＣ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＣＧＧ  ＧＡＧ  ＣＴＧ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＧＡＧ  ＧＡＣ  ＧＧＡ  ＴＡＣ  ＡＡＴ  ＧＴＴ  ＴＡＣ  ＣＡＧ  ＴＣＣ  ＧＡＡ  ＧＣＣ  ＣＡＣ  ＧＧＣ  ＣＴＣ  ＣＣＧ  ＣＴＧ  ＣＡＣ  ＣＴＧ  ＣＣＡ  ＧＧＧ  ＡＡＣ  ＡＡＧ  ＴＣＣ  ＣＣＡ  ＣＡＣ  ＣＧＧ  ＧＡＣ  ＣＣＴ  ＧＣＡ  ＣＣＣ  ＣＧＡ  ＧＧＡ  ＣＣＡ  ＧＣＴ  ＣＧＣ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＣＣＡ  ＣＴＡ  ＣＣＡ  ＧＧＣ  ＣＴＧ  ＣＣＣ  ＣＣＣ  ＧＣＡ  ＣＣＣ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＣＣＡ  ＣＣＣ  ＧＧＡ  ＡＴＣ  ＣＴＧ  ＧＣＣ  ＣＣＣ  ＣＡＧ  ＣＣＣ  ＣＣＣ  ＧＡＴ  ＧＴＧ  ＧＧＣ  ＴＣＣ  ＴＣＧ  ＧＡＣ  ＣＣＴ  ＣＴＧ  ＡＧＣ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＧＧＡ  ＣＣＴ  ＴＣＣ  ＣＡＧ  ＧＧＣ  ＣＧＡ  ＡＧＣ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＴＡＣ  ＧＣＴ  ＴＣＣ  ＴＧＡ  （配列番号３１）
完全長ＦＧＦ２１のアミノ酸配列が、提供され、シグナル配列を構成するアミノ酸に下線が付されている。
Ｍ  Ｄ  Ｓ  Ｄ  Ｅ  Ｔ  Ｇ  Ｆ  Ｅ  Ｈ  Ｓ  Ｇ  Ｌ  Ｗ  Ｖ  Ｓ  Ｖ  Ｌ  Ａ  Ｇ  Ｌ  Ｌ  Ｌ  Ｇ  Ａ  Ｃ  Ｑ  Ａ  Ｈ  Ｐ  Ｉ  Ｐ  Ｄ  Ｓ  Ｓ  Ｐ  Ｌ  Ｌ  Ｑ  Ｆ  Ｇ  Ｇ  Ｑ  Ｖ  Ｒ  Ｑ  Ｒ  Ｙ  Ｌ  Ｙ  Ｔ  Ｄ  Ｄ  Ａ  Ｑ  Ｑ  Ｔ  Ｅ  Ａ  Ｈ  Ｌ  Ｅ  Ｉ  Ｒ  Ｅ  Ｄ  Ｇ  Ｔ  Ｖ  Ｇ  Ｇ  Ａ  Ａ  Ｄ  Ｑ  Ｓ  Ｐ  Ｅ  Ｓ  Ｌ  Ｌ  Ｑ  Ｌ  Ｋ  Ａ  Ｌ  Ｋ  Ｐ  Ｇ  Ｖ  Ｉ  Ｑ  Ｉ  Ｌ  Ｇ  Ｖ  Ｋ  Ｔ  Ｓ  Ｒ  Ｆ  Ｌ  Ｃ  Ｑ  Ｒ  Ｐ  Ｄ  Ｇ  Ａ  Ｌ  Ｙ  Ｇ  Ｓ  Ｌ  Ｈ  Ｆ  Ｄ  Ｐ  Ｅ  Ａ  Ｃ  Ｓ  Ｆ  Ｒ  Ｅ  Ｌ  Ｌ  Ｌ  Ｅ  Ｄ  Ｇ  Ｙ  Ｎ  Ｖ  Ｙ  Ｑ  Ｓ  Ｅ  Ａ  Ｈ  Ｇ  Ｌ  Ｐ  Ｌ  Ｈ  Ｌ  Ｐ  Ｇ  Ｎ  Ｋ  Ｓ  Ｐ  Ｈ  Ｒ  Ｄ  Ｐ  Ａ  Ｐ  Ｒ  Ｇ  Ｐ  Ａ  Ｒ  Ｆ  Ｌ  Ｐ  Ｌ  Ｐ  Ｇ  Ｌ  Ｐ  Ｐ  Ａ  Ｐ  Ｐ  Ｅ  Ｐ  Ｐ  Ｇ  Ｉ  Ｌ  Ａ  Ｐ  Ｑ  Ｐ  Ｐ  Ｄ  Ｖ  Ｇ  Ｓ  Ｓ  Ｄ  Ｐ  Ｌ  Ｓ  Ｍ  Ｖ  Ｇ  Ｐ  Ｓ  Ｑ  Ｇ  Ｒ  Ｓ  Ｐ  Ｓ  Ｙ  Ａ  Ｓ  （配列番号３２）
【００８９】
本開示は、非組換え生物において発現されず、ＦＧＦＲ１ｃ、β−クロト−、またはＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の両方に結合する結合タンパク質を提供する。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−は、ＦＧＦ２１と結合して、シグナル伝達複合体を形成する。図１、略図Ａを参照されたい。ＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の両方に結合するいくつかの結合タンパク質は、ＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−を局在化させることによって、ＦＧＦ２１のｉｎ  ｖｉｖｏにおけるシグナル伝達活性を模倣することができ、そのため、シグナル伝達複合体におけるＦＧＦ２１に代わることができる。図１、略図Ｂを参照されたい。そのような結合タンパク質が、本明細書において開示される。
【００９０】
一般に、本開示の結合タンパク質は、ＦＧＦＲ１ｃ、β−クロト−、またはＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の両方に結合する１つまたは複数の単量体ドメインを含む。これらのドメインは、複数のポリペプチド変異体を生成するために様々なポリペプチド足場を使用し、次いで、ＦＧＦＲ１ｃ、β−クロト−、またはＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の両方に結合する変異体を選択して、容易に同定することができる。そのため、本開示はまた、ＦＧＦＲ１ｃ、β−クロト−、またはＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の両方に結合するタンパク質を選択するための方法を提供する。ＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の両方に結合するタンパク質は、たとえば、糖尿病、肥満症、異脂肪血症、高血圧症、脂肪肝、非アルコ−ル性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、急性膵炎、アテロ−ム性動脈硬化症などのような心血管疾患、および加齢などのような代謝障害を治療することを含む様々な目的に有用である。本明細書において開示されるポリペプチドは、試料中のＦＧＦＲ１ｃおよび／またはβ−クロト−を検出し、定量化するのに有用である。ヒトＦＧＦＲ１ｃ（配列番号３３）およびヒトβ−クロト−（配列番号３４）のアミノ酸配列は、公知であり、ここで提供される。
ヒトＦＧＦＲ１ｃ（配列番号３３）
ＭＷＳＷＫＣＬＬＦＷＡＶＬＶＴＡＴＬＣＴＡＲＰＳＰＴＬＰＥＱＡＱＰＷＧＡＰＶＥＶＥＳＦＬＶＨＰＧＤＬＬＱＬＲＣＲＬＲＤＤＶＱＳＩＮＷＬＲＤＧＶＱＬＡＥＳＮＲＴＲＩＴＧＥＥＶＥＶＱＤＳＶＰＡＤＳＧＬＹＡＣＶＴＳＳＰＳＧＳＤＴＴＹＦＳＶＮＶＳＤＡＬＰＳＳＥＤＤＤＤＤＤＤＳＳＳＥＥＫＥＴＤＮＴＫＰＮＰＶＡＰＹＷＴＳＰＥＫＭＥＫＫＬＨＡＶＰＡＡＫＴＶＫＦＫＣＰＳＳＧＴＰＮＰＴＬＲＷＬＫＮＧＫＥＦＫＰＤＨＲＩＧＧＹＫＶＲＹＡＴＷＳＩＩＭＤＳＶＶＰＳＤＫＧＮＹＴＣＩＶＥＮＥＹＧＳＩＮＨＴＹＱＬＤＶＶＥＲＳＰＨＲＰＩＬＱＡＧＬＰＡＮＫＴＶＡＬＧＳＮＶＥＦＭＣＫＶＹＳＤＰＱＰＨＩＱＷＬＫＨＩＥＶＮＧＳＫＩＧＰＤＮＬＰＹＶＱＩＬＫＴＡＧＶＮＴＴＤＫＥＭＥＶＬＨＬＲＮＶＳＦＥＤＡＧＥＹＴＣＬＡＧＮＳＩＧＬＳＨＨＳＡＷＬＴＶＬＥＡＬＥＥＲＰＡＶＭＴＳＰＬＹＬＥＩＩＩＹＣＴＧＡＦＬＩＳＣＭＶＧＳＶＩＶＹＫＭＫＳＧＴＫＫＳＤＦＨＳＱＭＡＶＨＫＬＡＫＳＩＰＬＲＲＱＶＴＶＳＡＤＳＳＡＳＭＮＳＧＶＬＬＶＲＰＳＲＬＳＳＳＧＴＰＭＬＡＧＶＳＥＹＥＬＰＥＤＰＲＷＥＬＰＲＤＲＬＶＬＧＫＰＬＧＥＧＣＦＧＱＶＶＬＡＥＡＩＧＬＤＫＤＫＰＮＲＶＴＫＶＡＶＫＭＬＫＳＤＡＴＥＫＤＬＳＤＬＩＳＥＭＥＭＭＫＭＩＧＫＨＫＮＩＩＮＬＬＧＡＣＴＱＤＧＰＬＹＶＩＶＥＹＡＳＫＧＮＬＲＥＹＬＱＡＲＲＰＰＧＬＥＹＣＹＮＰＳＨＮＰＥＥＱＬＳＳＫＤＬＶＳＣＡＹＱＶＡＲＧＭＥＹＬＡＳＫＫＣＩＨＲＤＬＡＡＲＮＶＬＶＴＥＤＮＶＭＫＩＡＤＦＧＬＡＲＤＩＨＨＩＤＹＹＫＫＴＴＮＧＲＬＰＶＫＷＭＡＰＥＡＬＦＤＲＩＹＴＨＱＳＤＶＷＳＦＧＶＬＬＷＥＩＦＴＬＧＧＳＰＹＰＧＶＰＶＥＥＬＦＫＬＬＫＥＧＨＲＭＤＫＰＳＮＣＴＮＥＬＹＭＭＭＲＤＣＷＨＡＶＰＳＱＲＰＴＦＫＱＬＶＥＤＬＤＲＩＶＡＬＴＳＮＱＥＹＬＤＬＳＭＰＬＤＱＹＳＰＳＦＰＤＴＲＳＳＴＣＳＳＧＥＤＳＶＦＳＨＥＰＬＰＥＥＰＣＬＰＲＨＰＡＱＬＡＮＧＧＬＫＲＲ
ヒトβ−クロト−（配列番号３４）
ＭＫＰＧＣＡＡＧＳＰＧＮＥＷＩＦＦＳＴＤＥＩＴＴＲＹＲＮＴＭＳＮＧＧＬＱＲＳＶＩＬＳＡＬＩＬＬＲＡＶＴＧＦＳＧＤＧＲＡＩＷＳＫＮＰＮＦＴＰＶＮＥＳＱＬＦＬＹＤＴＦＰＫＮＦＦＷＧＩＧＴＧＡＬＱＶＥＧＳＷＫＫＤＧＫＧＰＳＩＷＤＨＦＩＨＴＨＬＫＮＶＳＳＴＮＧＳＳＤＳＹＩＦＬＥＫＤＬＳＡＬＤＦＩＧＶＳＦＹＱＦＳＩＳＷＰＲＬＦＰＤＧＩＶＴＶＡＮＡＫＧＬＱＹＹＳＴＬＬＤＡＬＶＬＲＮＩＥＰＩＶＴＬＹＨＷＤＬＰＬＡＬＱＥＫＹＧＧＷＫＮＤＴＩＩＤＩＦＮＤＹＡＴＹＣＦＱＭＦＧＤＲＶＫＹＷＩＴＩＨＮＰＹＬＶＡＷＨＧＹＧＴＧＭＨＡＰＧＥＫＧＮＬＡＡＶＹＴＶＧＨＮＬＩＫＡＨＳＫＶＷＨＮＹＮＴＨＦＲＰＨＱＫＧＷＬＳＩＴＬＧＳＨＷＩＥＰＮＲＳＥＮＴＭＤＩＦＫＣＱＱＳＭＶＳＶＬＧＷＦＡＮＰＩＨＧＤＧＤＹＰＥＧＭＲＫＫＬＦＳＶＬＰＩＦＳＥＡＥＫＨＥＭＲＧＴＡＤＦＦＡＦＳＦＧＰＮＮＦＫＰＬＮＴＭＡＫＭＧＱＮＶＳＬＮＬＲＥＡＬＮＷＩＫＬＥＹＮＮＰＲＩＬＩＡＥＮＧＷＦＴＤＳＲＶＫＴＥＤＴＴＡＩＹＭＭＫＮＦＬＳＱＶＬＱＡＩＲＬＤＥＩＲＶＦＧＹＴＡＷＳＬＬＤＧＦＥＷＱＤＡＹＴＩＲＲＧＬＦＹＶＤＦＮＳＫＱＫＥＲＫＰＫＳＳＡＨＹＹＫＱＩＩＲＥＮＧＦＳＬＫＥＳＴＰＤＶＱＧＱＦＰＣＤＦＳＷＧＶＴＥＳＶＬＫＰＥＳＶＡＳＳＰＱＦＳＤＰＨＬＹＶＷＮＡＴＧＮＲＬＬＨＲＶＥＧＶＲＬＫＴＲＰＡＱＣＴＤＦＶＮＩＫＫＱＬＥＭＬＡＲＭＫＶＴＨＹＲＦＡＬＤＷＡＳＶＬＰＴＧＮＬＳＡＶＮＲＱＡＬＲＹＹＲＣＶＶＳＥＧＬＫＬＧＩＳＡＭＶＴＬＹＹＰＴＨＡＨＬＧＬＰＥＰＬＬＨＡＤＧＷＬＮＰＳＴＡＥＡＦＱＡＹＡＧＬＣＦＱＥＬＧＤＬＶＫＬＷＩＴＩＮＥＰＮＲＬＳＤＩＹＮＲＳＧＮＤＴＹＧＡＡＨＮＬＬＶＡＨＡＬＡＷＲＬＹＤＲＱＦＲＰＳＱＲＧＡＶＳＬＳＬＨＡＤＷＡＥＰＡＮＰＹＡＤＳＨＷＲＡＡＥＲＦＬＱＦＥＩＡＷＦＡＥＰＬＦＫＴＧＤＹＰＡＡＭＲＥＹＩＡＳＫＨＲＲＧＬＳＳＳＡＬＰＲＬＴＥＡＥＲＲＬＬＫＧＴＶＤＦＣＡＬＮＨＦＴＴＲＦＶＭＨＥＱＬＡＧＳＲＹＤＳＤＲＤＩＱＦＬＱＤＩＴＲＬＳＳＰＴＲＬＡＶＩＰＷＧＶＲＫＬＬＲＷＶＲＲＮＹＧＤＭＤＩＹＩＴＡＳＧＩＤＤＱＡＬＥＤＤＲＬＲＫＹＹＬＧＫＹＬＱＥＶＬＫＡＹＬＩＤＫＶＲＩＫＧＹＹＡＦＫＬＡＥＥＫＳＫＰＲＦＧＦＦＴＳＤＦＫＡＫＳＳＩＱＦＹＮＫＶＩＳＳＲＧＦＰＦＥＮＳＳＳＲＣＳＱＴＱＥＮＴＥＣＴＶＣＬＦＬＶＱＫＫＰＬＩＦＬＧＣＣＦＦＳＴＬＶＬＬＬＳＩＡＩＦＱＲＱＫＲＲＫＦＷＫＡＫＮＬＱＨＩＰＬＫＫＧＫＲＶＶＳ
【００９１】
本開示は、リンカ−および他の配列によって結合される様々な単一ドメインを含む結合タンパク質を提供するが、ドメインの多量体はまた、合成し、使用することもできる。いくつかの実施形態では、結合タンパク質のドメインのいくつか（またはいくつかの実施形態では、任意選択で、すべて）は、ＦＧＦＲ１ｃ、β−クロト−、またはＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の両方に結合する。いくつかのこれらの実施形態では、２つ以上のドメインは同一であり、ＦＧＦＲ１ｃおよび／またはβ−クロト−などのような標的タンパク質の同じ部分に結合する。他の実施形態では、多量体におけるドメインの少なくともいくつかが、ＦＧＦＲ１ｃおよび／またはβ−クロト−の異なる部分に結合する。さらに他の実施形態では、結合タンパク質の少なくともいくつかのドメインは、ＦＧＦＲ１ｃまたはβ−クロト−以外の分子（複数可）（たとえば、血清アルブミン、免疫グロブリン、または赤血球などのような血液因子）に結合する。
【００９２】
ＩＩ．単量体ドメインの一般的な考察
本明細書において開示される結合タンパク質は、１つまたは複数の単量体ドメインを含む。本開示の結合タンパク質を生成するのに特に適している単量体ドメインは、ジスルフィド結合を含むシステインリッチドメインである。本明細書において開示される結合タンパク質の要素を形成するシステインリッチドメインは、典型的に、αヘリックス、β−シ−ト、またはβ−バレル構造を形成しない。典型的に、ジスルフィド結合は、三次元構造へのドメインの畳込みを促進する。通常、システインリッチドメインは、少なくとも２つのジスルフィド結合、より典型的に、少なくとも３つのジスルフィド結合を有する。いくつかの実施形態では、単量体ドメインにおけるアミノ酸の少なくとも５、１０、１５、または２０％は、システインである。
【００９３】
単量体ドメインは、任意の数の特徴を有することができる。たとえば、いくつかの実施形態では、ドメインは、動物（たとえばヒト）における低い免疫原性を有するまたは免疫原性を有していない。単量体ドメインはまた、小さなサイズを有することもできる。いくつかの実施形態では、ドメインは、皮膚または他の組織に浸透することができるほど十分に小さい。さらに、単量体ドメインは、様々なｉｎ  ｖｉｖｏ半減期または安定性を有することができる。
【００９４】
本明細書において開示される結合タンパク質において使用するのに適している例証となる単量体ドメインは、たとえばＥＧＦ様ドメイン、Ｋｒｉｎｇｌｅドメイン、フィブロネクチンＩ型ドメイン、フィブロネクチンＩＩ型ドメイン、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、ＰＡＮドメイン、Ｇｌａドメイン、ＳＲＣＲドメイン、Ｋｕｎｉｔｚ／ウシ膵臓トリプシン阻害剤ドメイン、Ｋａｚａｌ型セリンプロテア−ゼ阻害剤ドメイン、トレフォイル（Ｐ型）ドメイン、フォンウィルブランド因子Ｃ型ドメイン、アナフィラトキシン様ドメイン、ＣＵＢドメイン、チログロブリンＩ型リピ−ト、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン、Ｓｕｓｈｉドメイン、Ｌｉｎｋドメイン、トロンボスポンジンＩ型ドメイン、免疫グロブリン様ドメイン、Ｃ型レクチンドメイン、ＭＡＭドメイン、フォンウィルブランド因子Ａ型ドメイン、ソマトメジンＢドメイン、ＷＡＰ型４ジスルフィドコアドメイン、Ｆ５／８Ｃ型ドメイン、ヘモペキシンドメイン、ＳＨ２ドメイン、ＳＨ３ドメイン、ラミニン型ＥＧＦ様ドメイン、Ｃ２ドメイン、当業者らに公知の他のそのようなドメイン、ならびにその誘導体および／または変異体を含む。図２は、ＬＤＬ受容体ファミリ−中の分子中に見出される様々な種類の単量体ドメインを概略的に図で示す。
【００９５】
いくつかの実施形態では、適した単量体ドメイン（たとえば、独立してまたはいくらかの限られた支援により畳み込む能力を有するドメイン）は、Ｓｉｍｐｌｅ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ  （ＳＭＡＲＴ）、Ｓｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ＳＭＡＲＴ：  ａ  ｗｅｂ−ｂａｓｅｄ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｂｉｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ，  （２０００）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８（１）：２３１−２３４）を参照されたいまたはＣＡＴＨ（Ｐｅａｒｌ  ｅｔ．ａｌ．，  Ａｓｓｉｇｎｉｎｇ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｔｏ  ＣＡＴＨ，  （２０００）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８（１）：２７７−２８２を参照されたい）などのような計算配列分析ツ−ルによって定義される、β−サンドイッチまたはβ−バレル三次元構造を含有するタンパク質ドメインのファミリ−から選択することができる。
【００９６】
他の実施形態では、開示される結合タンパク質の単量体ドメインは、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、ａｎｔｉｃａｌｉｎドメイン、およびＣＴＬＡ−４由来のＩｇ様ドメイン以外のドメインを含む。これらのドメインのいくつかの態様は、ＷＯ０１／６４９４２、ＷＯ９９／１６８７３、およびＷＯ  ００／６００７０において記載されている。
【００９７】
本明細書において記載されるように、単量体ドメインは、システインリッチとすることができる。適したシステインリッチ単量体ドメインは、たとえばＬＤＬ受容体クラスＡドメイン（「Ａドメイン」）またはＥＧＦドメインを含む。単量体ドメインはまた、負荷電残基のクラスタ−を有することもできる。図３Ａは、Ａドメインの例を示す。
【００９８】
本明細書において記載されるように、単量体ドメインは、相同な天然に存在するドメインが結合するかもしれない標的以外の標的に結合する能力について選択することができる。したがって、いくつかの実施形態では、実質的に同一の天然に存在する単量体ドメインが結合するかもしれない標的または標的タンパク質のクラスもしくはファミリ−に結合しない単量体ドメイン（およびそのような単量体を含む多量体）が、提供される。
【００９９】
単量体ドメインの特徴は、独立して畳み込む能力および安定した構造を形成する能力を含むことができる。したがって、単量体をコ−ドするポリヌクレオチド配列は保存されている必要はないが、単量体ドメインの構造は、保存されていることが多い。たとえば、Ａドメイン構造は、Ａドメインファミリ−のメンバ−の中で保存されているが、Ａドメイン核酸配列は保存されていない。したがって、たとえば、単量体ドメインは、必ずしもその核酸配列によってではなく、そのシステイン残基およびカルシウムに対するその親和性によって、Ａドメインとして分類される。図３Ｂを参照されたい。
【０１００】
特に、Ａドメイン（時に「補体型リピ−ト」または「ＬＤＬ受容体型もしくはクラスＡドメイン」と呼ばれる）は、約３０〜５０または３０〜６５のアミノ酸を含有する。いくつかの実施形態では、ドメインは、約３５〜４５アミノ酸、いくつかの場合では約３５〜４０アミノ酸を含む。３０〜５０アミノ酸内に、約６つのシステイン残基がある。６つのシステインのうち、ジスルフィド結合は、以下のシステインの間で典型的に見出される：Ｃ１およびＣ３、Ｃ２およびＣ５、Ｃ４およびＣ６。ドメインのシステイン残基は、ジスルフィド連結されて、コンパクトで、安定した、機能的に独立した成分を形成する。図３Ｂを参照されたい。これらのリピ−トのクラスタ−は、リガンド結合ドメインを構成し、特異なクラスタリングにより、リガンド結合に関しての特異性を与えることができる。図４は、ＬＤＬ受容体ファミリ−メンバ−によって認識される様々なリガンドの例示的なリストを示す。
【０１０１】
Ａドメインを同定するのに有用な１つの典型的なコンセンサス配列は、以下である：Ｃ−［ＶＩＬＭＡ］−Ｘ（５）−Ｃ−［ＤＮＨ］−Ｘ（３）−［ＤＥＮＱＨＴ］−Ｃ−Ｘ（３，４）−［ＳＴＡＤＥ］−  ［ＤＥＨ］−［ＤＥ］−Ｘ（１，５）−Ｃ（配列番号３５）。上記に提供される定義と一致して、括弧中の残基は、ある位置で実現可能な残基を示す。「Ｘ（＃）」は、残基の数を示す。これらの残基は、任意のアミノ酸残基とすることができる。２つの数を含有する括弧は、その位置を占めることができるアミノ酸の範囲を指す。（たとえば、「［ＤＥ］−Ｘ（１，５）−Ｃ」（配列番号３６）は、アミノ酸ＤＥに１、２、３、４、または５つの残基が続き、それにシステイン、「Ｃ」が続くことを意味する）。このコンセンサス配列は、第３のシステインで始まるＡドメインの一部のみを示す。第２のコンセンサスは、以下のとおりである：Ｃ−Ｘ（３−１５）−Ｃ−Ｘ（４−１５）−Ｃ−Ｘ（６−７）−Ｃ−［Ｎ，Ｄ］−Ｘ（３）−［Ｄ，Ｅ，Ｎ，Ｑ，Ｈ，Ｓ，Ｔ］−Ｃ−Ｘ（４−６）−Ｄ−Ｅ−Ｘ（２−８）−Ｃ（配列番号３７）。第２のコンセンサスは、６つのシステイン残基すべてにわたるアミノ酸残基を推定するものである。いくつかの実施形態では、Ａドメイン変異体は、上記配列のいずれかと実質的に同一の配列を含む。本開示のための、「ＬＤＬ受容体クラスＡ」ドメインに対する参照は、ドメインの起源または結合特性を示すように意図されないことに注意されたい。
【０１０２】
さらなる例示的なＡドメインは、以下の配列を含み：
ＣａＸ３−１５ＣｂＸ３−１５ＣｃＸ６−７Ｃｄ（Ｄ，Ｎ）Ｘ４ＣｅＸ４−６ＤＥＸ２−８Ｃｆ（配列番号３８）
Ｃは、システインであり、Ｘｎ−ｍは、独立して選択されるアミノ酸のｎ〜ｍの数を示し、（Ｄ，Ｎ）は、位置がＤまたはＮのいずれかとすることができることを示し、Ｃａ−Ｃｃ、Ｃｂ−Ｃｅ、およびＣｄ−Ｃｆは、ジスルフィド結合を形成する。
【０１０３】
現在まで、少なくとも２９０の天然に存在するヒトＡドメインが、ｃＤＮＡ配列に基づいて同定されている。図５を参照されたい。天然に存在するＡドメインを含有する例示的なタンパク質は、たとえば補体成分（たとえばＣ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、および因子Ｉ）、セリンプロテア−ゼ（たとえばエンテロペプチダ−ゼ、マトリプタ−ゼ、およびコリン）、膜貫通型タンパク質（たとえばＳＴ７、ＬＲＰ３、ＬＲＰ５、およびＬＲＰ６）、ならびにエンドサイト−シス受容体（たとえばソ−ティリン関連受容体、ＬＤＬ受容体、ＶＬＤＬＲ、ＬＲＰ１、ＬＲＰ２、およびＡｐｏＥＲ２）を含む。ドメインおよびＡドメイン変異体は、本明細書において開示される結合タンパク質における単量体ドメインおよびその変異体として機能することができる。Ａドメインのさらなる記載は、以下の刊行物およびその中で引用される参考文献において見出すことができる：Ｈｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｈｅｒｔｚ，  Ｔｈｅ  ＬＤＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ：  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  （２００１）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １１：７４−８１；Ｋｒｉｅｇｅｒ，  Ｔｈｅ  “ｂｅｓｔ”  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｓ，  ｔｈｅ  “ｗｏｒｓｔ”  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｓ：  Ａ  ｔａｌｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，  （１９９８）  ＰＮＡＳ  ９５：  ４０７７−４０８０；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ，  Ｔｈｅ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｑｕａｒｔｅｔ，  （２００１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９２：  １３１０−１３１２；およびＭｏｅｓｔｒｕｐ  ａｎｄ  Ｖｅｒｒｏｕｓｔ，  Ｍｅｇａｌｉｎ−ａｎｄ  Ｃｕｂｉｌｉｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｂｏｕｎｄ  Ｖｉｔａｍｉｎｓ，  Ｌｉｐｉｄｓ，  ａｎｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅｓ  ｉｎ  Ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａ，  （２００１）  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｎｕｔｒ．  ２１：４０７−２８。
【０１０４】
多くの他のドメイン型もまた、ＦＧＦＲ１ｃおよび／またはβ−クロト−結合単量体ドメインを生成するために使用することができる。例示的なＥＧＦ単量体ドメインは、配列：
ＣａＸ３−１４ＣｂＸ３−７ＣｃＸ４−１６ＣｄＸ１−２ＣｅＸ８−２３Ｃｆ（配列番号３９）を含み、Ｃは、システインであり、Ｘｎ−ｍは、独立して選択されるアミノ酸のｎ〜ｍの数を示し、Ｃａ−Ｃｃ、Ｃｂ−Ｃｅ、およびＣｄ−Ｃｆは、ジスルフィド結合を形成する。
【０１０５】
本明細書において記載されるドメインのそれぞれは、例示的なモチ−フ（つまり足場）を用いる。ある種の位置は、ｘとマ−クされ、任意のアミノ酸が位置を占めることができることを示す。これらの位置は、多くの異なるアミノ酸の可能性を含むことができ、それによって配列多様性、したがって異なる標的分子に対する親和性を可能にする。モチ−フ中の括弧の使用は、位置内の代替の実現可能なアミノ酸を示す（たとえば、「［ｅｋｑ］」は、Ｅ、Ｋ、またはＱのいずれかがその位置にあり得ることを示す）。本明細書において使用される、配列モチ−フにおける括弧の使用は、括弧内の位置が存在するまたは不在であることを示す（たとえば、「（［ｅｋｑ］）」は、位置が不在であるまたはＥ、Ｋ、もしくはＱのいずれかがその位置にあり得ることを示す）。１つを超える「ｘ」が括弧において使用される場合（たとえば「（ｘｘ）」）、ｘは、それぞれ実現可能な位置を示す。したがって、「（ｘｘ）」は、ゼロ、１つ、または２つのアミノ酸がその位置（複数可）にあり得ることを示し、アミノ酸はそれぞれ、任意のアミノ酸から独立して選択される。不在のアミノ酸はまた、「−」によって示すことができる。αは、たとえばＷ、Ｙ、Ｆ、またはＬなどのような芳香族／疎水性アミノ酸を示し、βは、たとえばＶ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｍ、またはＦなどのような疎水性アミノ酸を示し、χは、たとえばＧ、Ａ、Ｓ、またはＴなどのようなより小さな極性アミノ酸を示し、δは、たとえばＫ、Ｒ、Ｅ、Ｑ、またはＤなどのような荷電アミノ酸を示し、εは、たとえばＶ、Ａ、Ｓ、またはＴなどのような小さなアミノ酸を示し、φは、たとえばＤ、Ｅ、またはＮなどのような負荷電アミノ酸を示す。
【０１０６】
適したドメインは、たとえばトロンボスポンジン１型ドメイン、トレフォイルドメイン、およびチログロブリンドメインを含む。
【０１０７】
トロンボスポンジン１型（「ＴＳＰ１」）ドメインは、約３０〜５０または３０〜６５のアミノ酸を含有する。いくつかの実施形態では、ドメインは、約３５〜５５アミノ酸、いくつかの場合では約５０アミノ酸を含む。３５〜５５アミノ酸内に、約４〜約６つのシステイン残基が典型的にある。６つのシステインのうち、ジスルフィド結合は、以下のシステインの間で典型的に見出される：Ｃ１およびＣ５、Ｃ２およびＣ６、Ｃ３およびＣ４。ドメインのシステイン残基は、ジスルフィド連結されて、ねじれたベ−タストランドを含む、コンパクトで、安定した、機能的に独立した成分を形成する。これらのリピ−トのクラスタ−は、リガンド結合ドメインを構成し、特異なクラスタリングにより、リガンド結合に関しての特異性を与えることができる。
【０１０８】
例示的なＴＳＰ１ドメイン配列およびコンセンサス配列は、以下のとおりである（記載順に、それぞれ配列番号４０〜４５）
（１）  （ｘｘｘｘｘｘ）Ｃ１ｘｘｘＣ２ｘｘｘｘｘ（ｘ）ｘｘｘｘｘＣ３ｘｘｘｘ（ｘｘｘ）ｘｘｘｘｘＣ４ｘｘｘｘｘｘ（ｘ）ｘｘｘＣ５（ｘ）ｘｘｘｘＣ６  （配列番号４０）；
（２）  （ＷｘｘＷｘｘ）Ｃ１ｘｘｘＣ２ｘｘＧｘｘ（ｘ）ｘＲｘｘｘＣ３ｘｘｘｘ（Ｐｘｘ）ｘｘｘｘｘＣ４ｘｘｘｘｘｘ（ｘ）ｘｘｘＣ５（ｘ）ｘｘｘｘＣ６  （配列番号４１）；
（３）  （ＷｘｘＷｘｘ）Ｃ１ＳＸＴＣ２ｘｘＧｘｘ（ｘ）ｘＲｘＲｘＣ３ｘｘｘｘ（Ｐｘｘ）ｘｘｘｘｘＣ４ｘｘｘｘｘｘ（ｘ）ｘｘｘＣ５（ｘ）ｘｘｘｘＣ６  （配列番号４２）；
（４）  （ＷｘｘＷｘｘ）Ｃ１［ＳＴＮＤ］［ＶＫＡＱ］［ＴＳＰＬ］Ｃ２ｘｘ［ＧＱ］ｘｘ（ｘ）ｘ［ＲＥ］ｘ［ＲＫＴＶＭ］ｘ［Ｃ３ＶＬＤＲ］ｘｘｘｘ（［ＰＱ］ｘｘ）  ｘｘｘｘｘ［Ｃ４ＬＤＡＥ］ｘｘｘｘｘｘ（ｘ）ｘｘｘＣ５（ｘ）ｘｘｘｘＣ６  （配列番号４３）；
（５）  （ＷｘｘＷｘｘ）Ｃ１［ＳＴＮＤ］［ＶＫＡＱ］［ＴＳＰＬ］Ｃ２ｘｘ［ＧＱ］ｘｘ（ｘ）ｘ［ＲＥ］ｘ［ＲＫＴＶＭ］ｘ［Ｃ３ＶＬＤＲ］ｘｘｘｘ（［ＰＱ］ｘｘ）  ｘｘｘｘｘ［Ｃ４ＬＤＡＥ］ｘｘｘｘｘｘ（ｘ）ｘｘｘＣ５（ｘ）ｘｘｘｘＣ６  （配列番号４４）；および
（６）  Ｃ１［ＮＳＴ］［ＡＥＧＩＫＬＱＲＳＴＶ］［ＡＤＥＮＰＱＲＳＴ］Ｃ２［ＡＤＥＴＧＳ］ｘＧｘ［ＩＫＱＲＳＴＶ］ｘ［ＡＱＲＳＴ］ｘ［ＡＬＭＲＴＶ］ｘＣ３ｘｘｘｘｘｘｘｘｘ  （ｘｘｘｘｘｘｘ）Ｃ４ｘｘｘｘｘｘｘｘｘ（ｘｘ）Ｃ５ｘｘｘｘＣ６  （配列番号４５）。いくつかの実施形態では、トロンボスポンジン１型ドメイン変異体は、上記配列のいずれかと実質的に同一の配列を含む。
【０１０９】
現在まで、少なくとも１６７７の天然に存在するトロンボスポンジンドメインが、ｃＤＮＡ配列に基づいて同定されている。天然に存在するトロンボスポンジンドメインを含有する例示的なタンパク質は、たとえば補体経路におけるタンパク質（たとえばプロペルジン、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８Ａ、Ｃ８Ｂ、およびＣ９）、細胞外マトリックスタンパク質（たとえばミンディン、Ｆ−ｓｐｏｎｄｉｎ、ＳＣＯ−ｓｐｏｎｄｉｎ）、スポロゾイト周囲表面タンパク質２、ならびにプラスモジウムのＴＲＡＰタンパク質を含む。トロンボスポンジン１型ドメインは、たとえばＲｏｓｚｍｕｓｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＢＲＣ  ２９６：１５６  （２００２）；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５５：５７７７−８５  （１９９５）；Ｓｃｈｕｌｔｚ−Ｃｈｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０：７３０４−７３１０  （１９９５）；Ｓｃｈｕｌｔｚ−Ｃｈｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９：２６７８３−８  （１９９４）；Ｂｏｒｋ，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３２７：１２５−３０  （１９９３）；およびＬｅｕｎｇ−Ｈａｇｅｓｔｅｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ７１：２８９−９９  （１９９２）においてさらに記載されている。
【０１１０】
本開示の結合タンパク質の生成において使用するに適している他の例示的な単量体ドメインは、トレフォイルドメインである。トレフォイル単量体ドメインは、典型的に、３０〜５０または３０〜６５アミノ酸である。いくつかの実施形態では、ドメインは、約３５〜５５アミノ酸、いくつかの場合では約４５アミノ酸を含む。３５〜５５アミノ酸内に、約６つのシステイン残基が典型的にある。６つのシステインのうち、ジスルフィド結合は、以下のシステインの間で典型的に見出される：Ｃ１およびＣ５、Ｃ２およびＣ４、Ｃ３およびＣ６。
【０１１１】
少なくとも１４９の天然に存在するトレフォイルドメインが、ｃＤＮＡ配列に基づいて同定されている。天然に存在するトレフォイルドメインを含有する例示的なタンパク質は、たとえばタンパク質ｐＳ２（ＴＦＦ１）、鎮痙性ペプチドＳＰ（ＴＦＦ２）、腸トレフォイル因子（ＴＦＦ３）、腸スクラ−ゼイソマルタ−ゼ、ならびに上皮を保護することによって微生物感染に対する防御に関与し得るタンパク質（たとえばアフリカツメガエルｘＰ１、ｘＰ４、外皮ムチンＡ．１およびＣ．１を含む。トレフォイルドメインは、たとえばＳａｎｄｓ  ａｎｄ  Ｐｏｄｏｌｓｋｙ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ５８：２５３−２７３  （１９９６）；  Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９１：２２０６−２２１０  （１９９４）；ＤｅＡ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９１：１０８４−１０８８  （１９９４）；Ｈｏｆｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １８：２３９−２４３  （１９９３）においてさらに記載されている。例示的なトレフォイルドメイン配列およびコンセンサス配列は、以下のとおりである（記載順に、それぞれ配列番号４６〜５１）
（１）Ｃ１（ｘｘ）ｘｘｘｘｘｘｘｘｘＣ２ｘｘ（ｘ）ｘｘｘｘｘｘｘＣ３ｘｘｘｘＣ４Ｃ５ｘｘｘｘｘ（ｘ）ｘｘｘｘｘＣ６  （配列番号４６）；
（２）Ｃ１（ｘｘ）ｘｘｘｘｘｘＲｘｘＣ２ｘｘ（ｘ）ｘｘｘｘｘｘｘＣ３ｘｘｘｘＣ４Ｃ５ｘｘｘｘｘ（ｘ）ｘｘｘｘｘＣ６  （配列番号４７）；
（３）Ｃ１（ｘｘ）ｘｘｘｐｘｘＲｘＮＣ２Ｇｘ（ｘ）ＰＸＩＴｘｘｘＣ３ｘｘｘｇＣ４Ｃ５ＦＤｘｘｘ（ｘ）ｘｘｘＰＷＣ６Ｆ  （配列番号４８）；
（４）Ｃ１（ｘｘ）ｘｘｘ［ＰＶＡＥ］ｘｘＲｘ［ＮＤＰＭ］Ｃ２［ＧＡＩＹ］［ＹＰＦＳＴ］（［ＤＥ］ｘ）［ＰＳＫＱ］ｘ［ＩＶＡＰ］［ＴＳＡ］ｘｘ［ＱＥＤＫ］Ｃ３ｘｘ［ＫＲＬＮ］［ＧＮＫ］Ｃ４Ｃ５［ＦＷＹ］［ＤＮＲＳ］［ＳＤＰＮＴＥ］ｘｘ（ｘ）ｘｘｘ［ＰＫＩ］［ＷＥＡＳＨ］Ｃ６［ＦＹ］  （配列番号４９）；
（５）Ｃ１（ｘｘ）ｘｘｘ［ＰＶＡＥ］ｘｘＲｘ［ＮＤＰＭ］Ｃ２［ＧＡＩＹ］［ＹＰＦＳＴ］（［ＤＥ］ｘ）［ＰＳＫＱ］ｘ［ＩＶＡＰ］［ＴＳＡ］ｘｘ［ＫＥＱＤ］Ｃ３ｘｘ［ＫＲＬＮ］［ＧＮＫ］Ｃ４Ｃ５［α］［ＤＮＲＳ］［ＳＤＰＮＴＥ］ｘｘ（ｘ）ｘｘｘ［ＰＫＩ］［ＷＥＡＳＨ］Ｃ６［ＦＹ］  （配列番号５０）；
（６）Ｃ１（［ＤＮＰＳ］）［ＡＤＩＫＬＮＰＲＳＴＶ］［ＤＦＩＬＭＶ］［ＡＤＥＮＰＲＳＴ］［ＡＤＥＬＰＲＶ］［ＥＨＫＬＮＱＲＳ］［ＡＤＥＧＫＮＳＶ］［ＫＱＲ］［ＦＩＫＬＱＲＴＶ］［ＤＮＰＱＳ］Ｃ２［ＡＧＩＹ］［ＦＬＰＳＶＹ］［ＤＫＮＰＱＳ］［ＡＤＦＧＨＬＰ］［ＡＩＰＶ］［ＳＴ］［ＡＥＧＫＰＱＲＳ］［ＡＤＥＧＫＰＱＳ］［ＤＥＩＫＮＱＴ］Ｃ３［ＡＤＥＦＫＮＱＲＴ］［ＡＤＥＧＫＮＱＳ］［ＧＮ］Ｃ４Ｃ５［ＷＹＦＨ］［ＤＥＩＮＲＳ］［ＡＤＧＮＰＳＴ］［ＡＥＦＧＱＬＲＳＴＷ］［ＧＩＫＮＳＶＭＱ］（［ＡＦＭＰＲＳＴＶ］  ［ＤＥＧＫＬＮＳ］［ＡＦＩＱＳＴＶ］［ＩＫＮＰＶ］Ｗ）Ｃ６  （配列番号５１）。
【０１１２】
本開示の結合タンパク質の生成において使用するに適している他の例示的な単量体ドメインは、チログロブリンドメインである。チログロブリン単量体ドメインは、典型的に、３０〜８５または３０〜８０のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ドメインは、約３５〜７５アミノ酸、いくつかの場合では約６５アミノ酸を含む。３５〜７５アミノ酸内に、約６つのシステイン残基が典型的にある。６つのシステインのうち、ジスルフィド結合は、以下のシステインの間で典型的に見出される：Ｃ１およびＣ２、Ｃ３およびＣ４、Ｃ５およびＣ６。
【０１１３】
少なくとも２５１の天然に存在するチログロブリンドメインが、ｃＤＮＡ配列に基づいて同定されている。ＴｇのＮ末端部は、Ｔｇ  １型リピ−トとして公知の、約６５のアミノ酸のドメインの１０のリピ−トを含有する。たとえばＭａｌｔｈｉｅｒｙ  Ｙ，  Ｌｉｓｓｉｔｚｋｙ  Ｓ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  （１９８７）  １６５（３）：４９１−８；  Ｍｏｌｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２４０：１２５−１３３  （１９９６）を参照されたい。天然に存在するチログロブリンドメインを含有する例示的なタンパク質は、たとえばＨＬＡクラスＩＩ関連インバリアント鎖、ヒト膵臓癌マ−カ−タンパク質、ナイドジェン（エンタクチン）、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）、サキシフィリン（ｓａｘｉｐｈｉｌｉｎ）、シロザケ卵システインプロテイナ−ゼ阻害剤、およびエクイスタチン（ｅｑｕｉｓｔａｔｉｎ）を含む。Ｔｈｙｒ−１および関連するドメインは、ＭＥＲＯＰＳプロテイナ−ゼ阻害剤ファミリ−Ｉ３１、クランＩＸに属する。チログロブリンドメインは、たとえばＭｏｌｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２４０：１２５−１３３  （１９９６）；Ｇｕｎｃａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ  １８：７９３−８０３  （１９９９）；Ｃｈｏｎｇ  ａｎｄ  Ｓｐｅｉｃｈｅｒ，  ＤＷ  ２７６：５８０４−５８１３  （２００１）においてさらに記載されている。
【０１１４】
例示的なチログロブリンドメイン配列およびコンセンサス配列は、以下のとおりである（記載順に、それぞれ配列番号５２〜５６）
（１）Ｃ１ｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘ（ｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘ）ｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘＣ２ｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘＣ３ｘ（ｘ）ｘ（ｘｘｘ）ｘｘｘｘＣ４ｘＣ５ｘｘｘｘ（ｘ）ｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘ（ｘｘ）ｘＣ６  （配列番号５２）；
（２）Ｃ１ｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘ（ｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘ）ｘｘｘｘｘｘｘＹｘＰｘＣ２ｘｘｘＧｘｘｘｘｘＱＣ３ｘ（ｘ）ｘ（ｘｘｘ）ｘｘｘｘＣ４ＷＣ５Ｖｘｘｘ（ｘ）ＧｘｘｘｘＧｘｘｘｘｘｘｘｘ（ｘｘ）ｘＣ６  （配列番号５３）；
（３）Ｃ１ｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘ（ｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘ）ｘｘｘｘｘｘｘｙｘＰｘＣ２ｘｘｘＧｘｙｘｘｘＱＣ３ｘ（ｘ）Ｓ（ｘｘｘ）ｘｘＧｘＣ４Ｗ  Ｃ５ＶＤｘｘ（ｘ）ＧｘｘｘｘＧｘｘｘｘｘｇｘｘ（ｘｘ）ｘＣ６  （配列番号５４）；
（４）Ｃ１［ＱＥＲＬ］ｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘ（ｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘ）ｘｘｘｘｘｘｘ［ＹＦＨＰ］ｘＰｘＣ２ｘｘｘＧｘ［ＹＦ］ｘｘ［ＶＫＲＬ］ＱＣ３ｘ（ｘ［ＳＡ］ｘｘｘ）ｘｘ［ＧＳＡ］ｘＣ４［ＷＹＦ］Ｃ５Ｖ［ＤＮＹＦＬ］ｘｘ（ｘ）Ｇｘｘｘｘ［ＧＤＮＥ］ｘｘｘｘｘＧｘｘ（ｘｘ）ｘＣ６  （配列番号５５）；
（５）Ｃ１［ＱＥＲＬ］ｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘ（ｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘ）ｘｘｘｘｘｘｘ［αＨＰ］ｘＰｘＣ２ｘｘｘＧｘ［α］ｘｘ［ＶＫＲＬ］ＱＣ３ｘ  （ｘ［ＳＡ］ｘｘｘ）ｘｘ［ＧＡＳ］ｘＣ４［α］Ｃ５Ｖ［ＤＮα］ｘｘ（ｘ）Ｇｘｘｘｘ［φＧ］ｘｘｘｘｘＧｘｘ（ｘｘ）ｘＣ６  （配列番号５６）。
【０１１５】
本開示の結合タンパク質を生成するのに使用することができる他の例示的な単量体ドメインは、ラミニン−ＥＧＦドメインである。ラミニン−ＥＧＦドメインは、典型的に、３０〜８５または３０〜８０のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ドメインは、約４５〜６５アミノ酸、いくつかの場合では約５０アミノ酸を含む。４５〜６５アミノ酸内に、相互作用して４つのジスルフィド結合を形成する約８つのシステイン残基が典型的にある。ラミニンは、細胞接着、成長遊走、および分化を媒介する基底膜の主な非コラ−ゲン性成分である。それらは、別個であるが関連するアルファ、ベ−タ、およびガンマ鎖から構成される。３つの鎖は、長いア−ムおよび３つの短い球状のア−ムから成る、十字形の分子を形成する。長いア−ムは、３つの鎖すべてによって寄与され、鎖間ジスルフィド結合によって架橋されるコイルドコイル構造から成る。
【０１１６】
例示的なラミニンＥＧＦドメイン配列およびコンセンサス配列は、以下のとおりである（記載順に、それぞれ配列番号５７〜５９）
（１）Ｃ１ｘＣ２ｘｘｘｘｘｘ（ｘｘｘ）ｘｘＣ３ｘｘｘ（ｘｘｘｘｘｘ）ｘｘｘｘＣ４ｘＣ５ｘｘｘｘｘｘｘｘＣ６ｘｘＣ７ｘｘｘｘｘｘｘ（ｘｘｘｘｘ）ｘｘｘｘｘＣ８  （配列番号５７）
（２）Ｃ１ｘＣ２ｘｘｘｘｘｘ（ｘｘｘ）ｘｘＣ３ｘｘｘ（ｘｘｘｘｘｘ）ｘｘｇｘＣ４ｘＣ５ｘｘｘｘｘＧｘｘＣ６ｘｘＣ７ｘｘｘｘｘｘｘ（ｘｘｘｘｘ）ｘｘｘｘｘＣ８  （配列番号５８）
（３）Ｃ１ｘＣ２［ＮＤＨ］ｘｘｘｘｘ（ｘｘｘ）ｘｘＣ３ｘｘｘ（ｘｘｘｘｘｘ）ｘｘＧｘＣ４ｘＣ５ｘｘｘｘｘＧｘｘＣ６［ＤＥＮＱ］ｘＣ７ｘｘ［ＧＮ］［ＹＦＨＴ］ｘｘｘ（ｘｘｘｘｘ）ｘｘｘｘｘＣ８  （配列番号５９）  。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、単量体ドメインは、Ｎｏｔｃｈ／ＬＮＲ単量体ドメイン、ＤＳＬ単量体ドメイン、Ａｎａｔｏ単量体ドメイン、インテグリンベ−タ単量体ドメイン、およびＣａ−ＥＧＦ単量体ドメインである。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、Ｃａ−ＥＧＦ単量体ドメインは、以下の配列を含む（配列番号６０）：
ＤｘＤＥＣ１ｘｘ（ｘｘ）ｘｘｘｘＣ２ｘ（ｘｘ）ｘｘｘｘｘＣ３ｘＮｘｘＧｘＦｘＣ４ｘ（ｘｘｘ）ｘＣ５ｘｘｇｘｘｘｘｘｘｘ（ｘｘｘｘｘ）ｘｘｘＣ６。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、Ｎｏｔｃｈ／ＬＮＲ単量体ドメインは、以下の配列を含む（配列番号６１）：
Ｃ１ｘｘ（ｘｘ）ｘｘｘＣ２ｘｘｘｘｘＮＧｘＣ３ｘｘｘＣ４ＮｘｘｘＣ５ｘｘＤＧｘＤＣ６。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、ＤＳＬ単量体ドメインは、以下の配列を含む：
Ｃ１ｘｘｘＹＹＧｘｘＣ２ｘｘＦＣ３ｘｘｘｘＤｘｘｘＨｘｘＣ４ｘｘｘＧｘｘｘＣ５ｘｘＧＷｘＧｘｘＣ６  （配列番号６２）。
【０１２１】
Ａｎａｔｏ単量体ドメインは、以下の配列を含む（配列番号６３）：
Ｃ１Ｃ２ＸＤＧｘｘｘｘｘ（ｘ）ｘｘｘｘＣ３ｅｘｒｘｘｘｘｘｘ（ｘｘ）ｘｘＣ４ｘｘｘＦｘｘＣ５Ｃ６。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、インテグリンベ−タ単量体ドメインは、以下の配列を含み（配列番号１２４０）：
Ｃ１ｘｘＣ２ｘｘｘｘｐｘＣ３ｘＷＣ４ｘｘｘｘＦｘｘｘ（Ｇｘ）ｘｘｘｘＲＣ５ＤｘｘｘｘＬｘｘｘｇＣ６
「ｘ」は、任意のアミノ酸である。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、Ｎｏｔｃｈ／ＬＮＲ単量体ドメインのＣ１〜Ｃ５、Ｃ２〜Ｃ４、およびＣ３〜Ｃ６は、ジスルフィド結合を形成し、ＤＳＬ単量体ドメインのＣ１〜Ｃ５、Ｃ２〜Ｃ４、およびＣ３〜Ｃ６は、ジスルフィド結合を形成する。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、Ｃａ−ＥＧＦ単量体ドメインは以下の配列を含む：
Ｄ［β］［ＤＮ］ＥＣ１ｘｘ（ｘｘ）ｘｘｘｘＣ２［ＰＤＧ］（Ｄｘ）ｘｘｘｘｘＣ３ｘＮｘｘＧ［ＳＧＴ］［α］ｘＣ４ｘ（ｘｘｘ）ｘＣ５ｘｘ［ＧＳＮ］［αＳ］ｘｘｘｘｘｘ（ｘｘｘｘｘ）ｘｘｘＣ６  （配列番号６４）。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、Ｎｏｔｃｈ／ＬＮＲ単量体ドメインは、以下の配列を含む：
Ｃ１ｘｘ（ｘ［βα］）ｘｘｘＣ２ｘ［φｓ］ｘｘｘ［φ］［ＧＫ］ｘＣ３［ＮＤ］ｘ［φＳＡ］Ｃ４［φＳ］ｘｘ［ａｅｇ］Ｃ５ｘ［α］  ＤＧｘＤＣ６  （配列番号６５）。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、ＤＳＬ単量体ドメインは以下の配列を含む：
Ｃ１ｘｘｘ［α］［αＨ］［ＧＳＮＡ］ｘｘＣ２ｘｘ［α］Ｃ３ｘ［ＰＡＥ］ｘｘ［ＤＡ］ｘｘ［χＬ］［ＨＲＧＫ］［αＫ］ｘＣ４［ＤＮＳＧ］ｘｘＧｘｘｘＣ５ｘｘＧ［α］ｘＧｘｘＣ６  （配列番号６６）。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、Ａｎａｔｏ単量体ドメインは以下の配列を含む：
Ｃ１Ｃ２ｘ［ＤＨＴＬ］［ＧＡ］ｘｘｘｘ［ＰＬＡＮＴ］（ｘｘ）ｘｘｘｘＣ３［ＥＳＱＤＡＴ］ｘ［ＲＬＰＳ］ｘｘｘｘｘｘ（［ＧＥＰＡ］ｘ）ｘｘＣ４ｘｘ［ＡＶＦＰＴ］  ［ＦＱＶＹ］ｘｘＣ５Ｃ６  （配列番号６７）。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、インテグリンベ−タ単量体ドメインは、以下の配列を含み：
Ｃ１ｘｘＣ２［β］ｘｘ［ＧＨＤＳ］［ＰＫ］ｘＣ３［χ］［α］Ｃ４ｘｘｘｘ［α］ｘｘｘ（［ＧＲ］ｘｘ）ｘ［χ］ｘＲＣ５［ＤＮＡＥ］ｘｘｘｘＬ［βＫ］ｘｘ  ［ＧＮ］Ｃ６  （配列番号６８）
αは、Ｗ、Ｙ、Ｆ、およびＬから選択され
βは、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｍ、およびＦから選択され、
χは、Ｇ、Ａ、Ｓ、およびＴから選択され、
δは、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｑ、およびＤから選択され、
εは、Ｖ、Ａ、Ｓ、およびＴから選択され、
φは、Ｄ、Ｅ、およびＮから選択される。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、Ｃａ−ＥＧＦ単量体ドメインは、以下の配列を含む：
Ｄ［ＶＩＬＦ］［ＤＮ］ＥＣ１ｘｘ（ｘｘ）ｘｘｘｘＣ２［ＰＤＧ］（Ｄｘ）ｘｘｘｘｘＣ３ｘＮｘｘＧ［ＳＧＴ］［ＦＹ］ｘＣ４ｘ（ｘｘｘ）ｘＣ５ｘｘ［ＧＳＮ］  ［αＳ］ｘｘｘｘｘｘ（ｘｘｘｘｘ）ｘｘｘＣ６  （配列番号６９）。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、Ｎｏｔｃｈ／ＬＮＲ単量体ドメインは、以下の配列を含む：
Ｃ１ｘｘ（ｘ［ＹＩＦＬＶ］）ｘｘｘＣ２ｘ［ＤＥＮＳ］ｘｘｘ［ＮＤＥ］［ＧＫ］ｘＣ３［ＮＤ］ｘ［ＤＥＮＳＡ］Ｃ４［ＮＳＤＥ］ｘｘ［ＡＥＧ］Ｃ５ｘ［ＷＹＦ］ＤＧｘＤＣ６  （配列番号７０）。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、ＤＳＬ単量体ドメインは、以下の配列を含む：
Ｃ１ｘｘｘ［ＹＷＦ］［ＹＦＨ］［ＧＡＳＮ］ｘｘＣ２ｘｘ［ＦＹ］Ｃ３ｘ［ＰＡＥ］ｘｘ［ＤＡ］ｘｘ［ＧＬＡＳＴ］［ＨＲＧＫ］［ＹＫＦＷ］ｘＣ４［ＤＳＧＮ］ｘｘＧｘｘｘＣ５ｘｘＧ［ＷＬＦＹ］ｘＧｘｘＣ６  （配列番号７１）。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、Ａｎａｔｏ単量体ドメインは、以下の配列を含む：
Ｃ１Ｃ２ｘ［ＡＤＥＨＬＴ］ｇｘｘｘｘｘｘｘｘ（ｘ）［ＤＥＲＳＴ］Ｃ３ｘｘｘｘｘｘｘｘｘ（ｘｘ［ＡＥＲＳＶ］）Ｃ４ｘｘ［ＡＰＶＴ］［ＦＭＱ］［ＥＫＬＱＲＴＶ］  ［ＡＤＥＨＱＲＳＫ］（ｘ）Ｃ５Ｃ６  （配列番号７２）。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、インテグリンベ−タ単量体ドメインは、以下の配列を含む：
Ｃ１［ＡＥＧＫＱＲＳＴ］［ＫＲＥＱＤ］Ｃ２［ＩＬ］［ＡＥＬＱＲＶ］［ＶＩＬＡＳ］［ＤＧＨＳ］［ＫＰ］ｘＣ３［ＧＡＳＴ］［ＷＹ］Ｃ４ｘｘｘｘ［ＦＬ］ｘｘｘｘ（ｘｘｘｘ  ［ＶＩＬＡＲ］Ｒ）Ｃ５［ＡＮＤ］［ＤＩＬＲＴ］［ＩＫＬＰＱＲＶ］［ＡＤＥＰＳ］［ＡＥＮＱ］Ｌ［ＩＫＬＱＶ］ｘ  ［ＡＤＫＮＲ］［ＧＮ］Ｃ６  （配列番号７３）。
単量体ドメインをコ−ドするポリヌクレオチドは、発現を介して単量体ドメインを作製するために典型的に用いられる。単量体ドメインをコ−ドする核酸は、様々な異なる供給源に由来し得る。単量体ドメインのライブラリ−は、天然に存在する単量体ドメイン、改変された単量体ドメイン（つまり単量体ドメイン変異体）、またはその組み合わせをコ−ドする複数の異なる核酸を発現させることによって調製することができる。たとえば、足場において介在するアミノ酸が、ランダムに生成されたアミノ酸を含むが、アミノ酸の足場が一定のままである（たとえばＬＤＬ  Ａ受容体ドメイン、ＥＧＦドメイン）ライブラリ−を設計することができる。
【０１３４】
選択されるまたは所望のリガンドまたはリガンドの混合物に結合する単量体ドメインを同定するための方法もまた、本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、単量体ドメインは、所望の特性（たとえば結合親和性）について同定されまたは選択され、次いで、単量体ドメインから多量体を形成する。図６を参照されたい。それらの実施形態については、所望の特性（たとえば特異的な結合特性）を有するドメインの選択をもたらす任意の方法を使用することができる。たとえば、方法は、それぞれの核酸が単量体ドメインをコ−ドする、複数の異なる核酸を提供すること、複数の異なる核酸を翻訳し、それによって、複数の異なる単量体ドメインを提供すること、所望のリガンドまたはリガンドの混合物の結合について複数の異なる単量体ドメインをスクリ−ニングすること、および所望のリガンドまたはリガンドの混合物に結合する複数の異なる単量体ドメインのメンバ−を同定することを含むことができる。
【０１３５】
単量体ドメインは、非組換え体（たとえば、細胞から単離されたもの）または改変されたもの（たとえば組換え変異体）とすることができる。用語「非組換え体」は、自然界においてタンパク質配列を見出すことができることを示すためにこれに関連して使用される。たとえば、非組換え単量体ドメインは、ヒト単量体ドメインまたは異なる種もしくは供給源、たとえば哺乳動物、霊長動物、げっ歯動物、魚、鳥、爬虫類動物、植物などに由来するドメインを含むことができる。非組換え単量体ドメインは、多くの方法によって、たとえばゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって、得ることができる。
【０１３６】
結合タンパク質の要素であるかどうかに関わらず、本明細書において開示される単量体ドメインは、非組換えドメインまたは組換え変異体とすることができる。単量体ドメインのライブラリ−は、非組換え単量体ドメイン、組換え単量体ドメイン変異体、またはその組み合わせを含有することができる。
【０１３７】
単量体ドメイン変異体は、原始ドメイン、キメラドメイン、ランダム化ドメイン、突然変異ドメイン、およびその他同種のものを含むことができる。たとえば、原始ドメインは、系統発生分析に基づくものとすることができる。キメラドメインは、１つまたは複数の領域が、同じファミリ−の他のドメイン由来の対応する領域と交換されるドメインである。たとえば、キメラドメインは、可能性として低下した免疫原性を有する新規なドメインを形成するために、同じファミリ−の多数の関連するドメイン由来のル−プ配列を組み合わせることによって構築することができる。当業者らは、ランダムアミノ酸配列の生成ではなく、同じファミリ−の様々な関連するドメインからル−プ領域を組み合わせることによって、修飾結合ドメイン単量体を構築する免疫性の利点を認識するであろう。たとえば、ル−プ配列またはさらにヒトＬＤＬ受容体クラスＡドメインにおいて天然に存在する多数のル−プ配列を組み合わせることにより、変異体ドメインを構築することによって、結果として生じるドメインは、新規な結合特性を含有し得るが、露出したル−プがすべてヒト起源であるので、免疫原性のタンパク質配列を含有していない可能性がある。内因性の環境におけるル−プアミノ酸配列の組み合わせは、本明細書において開示される単量体構築物のすべてに適用することができる。したがって、ヒトタンパク質から誘導されるキメラ単量体ドメインのライブラリ−を生成するための方法であって、ヒトタンパク質の少なくとも２つの異なる天然に存在する変異体のそれぞれに由来する少なくとも１つのル−プに対応するル−プ配列を提供することであって、ル−プ配列は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列であることおよび少なくとも２つの異なるキメラ配列のライブラリ−を生成するためにル−プ配列を共有結合することであって、キメラ配列はそれぞれ、少なくとも２つのル−プを有するキメラ単量体ドメインをコ−ドすることを含む方法もまた提供される。典型的に、キメラドメインは少なくとも４つのル−プおよび通常少なくとも６つのル−プを有する。上記に記載されるように、本開示は、ジスルフィド結合の可能性、タンパク質二次構造の間の架橋、および分子動態（つまり可動性）などのような、特異的な特徴によって同定される３つのタイプのル−プを提供する。３つのタイプのル−プ配列は、システインにより定められるル−プ配列、構造により定められるル−プ配列、およびＢ因子により定められるル−プ配列である。
【０１３８】
ランダム化ドメインは、１つまたは複数の領域がランダム化されたドメインである。ランダム化は、全体のランダム化または任意選択で、配列多様性の天然の分布に基づいて部分的なランダム化に基づくものとすることができる。
【０１３９】
本開示はまた、ＦＧＦＲ１ｃまたはβ−クロト−またはＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の両方に結合する１つまたは複数の単量体ドメインを含む、１つまたは複数の結合タンパク質をコ−ドする組換え核酸を提供する。たとえば、結合タンパク質は、ＥＧＦ様ドメイン、Ｋｒｉｎｇｌｅドメイン、フィブロネクチンＩ型ドメイン、フィブロネクチンＩＩ型ドメイン、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、ＰＡＮドメイン、Ｇｌａドメイン、ＳＲＣＲドメイン、Ｋｕｎｉｔｚ／ウシ膵臓トリプシン阻害剤ドメイン、Ｋａｚａｌ型セリンプロテア−ゼ阻害剤ドメイン、トレフォイル（Ｐ型）ドメイン、フォンウィルブランド因子Ｃ型ドメイン、アナフィラトキシン様ドメイン、ＣＵＢドメイン、チログロブリンＩ型リピ−ト、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン、Ｓｕｓｈｉドメイン、Ｌｉｎｋドメイン、トロンボスポンジンＩ型ドメイン、免疫グロブリン様ドメイン、Ｃ型レクチンドメイン、ＭＡＭドメイン、フォンウィルブランド因子Ａ型ドメイン、ソマトメジンＢドメイン、ＷＡＰ型４ジスルフィドコアドメイン、Ｆ５／８Ｃ型ドメイン、ヘモペキシンドメイン、ＳＨ２ドメイン、ＳＨ３ドメイン、ラミニン型ＥＧＦ様ドメイン、Ｃ２ドメイン、および１つまたは複数のその変異体から成る群由来の非組換えドメインを含むように選択することができる。他の実施形態では、天然に存在するポリペプチドは、Ｐｆａｍデ−タベ−スおよび／またはＳＭＡＲＴデ−タベ−スにおいて見出される単量体ドメインをコ−ドする。
【０１４０】
本明細書において開示されるおよび／または本明細書において記載される方法によって産生される結合タンパク質、たとえば単量体ドメイン、多量体、およびそのライブラリ−を含む、本開示のすべての組成物は、任意選択で、親和性物質のマトリックスに結合することができる。親和性物質の例は、ビ−ズ、カラム、固体担体、マイクロアレイ、試薬支持物の他のプ−ル、およびその他同種のものを含む。
【０１４１】
さらに、本明細書において開示されるおよび／または本明細書において記載される方法によって産生される結合タンパク質はすべて、任意選択で、天然に存在しないアミノ酸を含むことができる。用語「天然に存在しないアミノ酸」は、天然にコ−ドされるアミノ酸（２０種の一般的なアミノ酸を含むが、これらに限定されない）の修飾（たとえば翻訳後修飾）によって生じるが、それら自体、翻訳複合体によって、成長中のポリペプチド鎖の中に天然に組み込まれないアミノ酸を含むが、これらに限定されない。そのような天然に存在しないアミノ酸の例は、Ｎ−アセチルグルコサミニルＬ−セリン、−アセチルグルコサミニル−Ｌ−スレオニン、Ｏ−ホスホチロシン、および上記に提供されるものを含むが、これらに限定されない。
【０１４２】
ＩＩＩ．本開示の単量体
本開示は、１つまたは複数の単量体を含む結合タンパク質を提供する。特に、方法、組成物、およびキットならびにＦＧＦＲ１ｃおよび／またはβ−クロト−に結合し、リンカ−を介してつながれる２つ以上の単量体ドメインを含む多量体（コンビナトリアルモザイクタンパク質または組換えモザイクタンパク質としても知られている）の要素を形成することができる別々の単量体ドメインが、記載される。多量体は、別々の単量体ドメインと比較して、リガンドまたはリガンドの混合物に対する、改善された結合活性もしくは親和性または改変された特異性などのような、改善された表現型を有するものを同定するためにスクリ−ニングすることができ、これらのおよび他のアプロ−チを使用して同定される多量体が、提供される。
【０１４３】
単量体ドメインは、任意のサイズとすることができる。いくつかの実施形態では、単量体ドメインは、約２５〜約５００、約３０〜約２００、約３０〜約１００、約３５〜約５０、約３５〜約１００、約９０〜約２００、約３０〜約２５０、約３０〜約６０、約９〜約１５０、約１００〜約１５０、約２５〜約５０、または約３０〜約１５０のアミノ酸を有する。同様に、単量体ドメインは、たとえば、約３０〜約２００のアミノ酸約２５〜約１８０のアミノ酸、約４０〜約１５０のアミノ酸、約５０〜約１３０のアミノ酸、または約７５〜約１２５のアミノ酸を含むことができる。たとえば、単量体ドメインは、典型的に、溶液中で安定した立体構造を維持することができ、熱安定性であることが多く、たとえば、結合親和性を失うことなく、少なくとも１０分間、９５℃で安定している。いくつかの実施形態では、単量体ドメインは、独立して、畳込み、安定した立体構造をとることができる。一実施形態では、安定した立体構造は、イオン（たとえば金属イオンまたはカルシウムイオンなど）によって安定化される。安定した立体構造は、任意選択で、ジスルフィド結合（たとえば少なくとも１、２、３、またはそれ以上のジスルフィド結合）を含有することができる。ジスルフィド結合は、任意選択で、２つのシステイン残基の間で形成することができる。いくつかの実施形態では、単量体ドメイン（または単量体ドメイン変異体）は、例示される配列と実質的に同一である。
【０１４４】
本明細書において記載されるように、単量体ドメインは、システインリッチとすることができる。適したシステインリッチ単量体ドメインは、たとえばＬＤＬ受容体クラスＡドメイン（「Ａドメイン」）またはＥＧＦ様ドメインを含む。単量体ドメインはまた、負荷電残基のクラスタ−を有することもできる。特に、Ａドメイン（時に「補体型リピ−ト」と呼ばれる）は、約３０〜５０または３０〜６５のアミノ酸を含有する。いくつかの実施形態では、ドメインは、約３５〜４５アミノ酸、いくつかの場合では約４０アミノ酸を含む。３０〜５０アミノ酸内に、偶数のシステイン残基、典型的に、約６つのシステイン残基がある。６つのシステインのうち、ジスルフィド結合は、以下のシステインの間で典型的に見出される：Ｃ１およびＣ３、Ｃ２およびＣ５、Ｃ４およびＣ６。Ａドメインは、リガンド結合成分を構成する。ドメインのシステイン残基は、ジスルフィド連結されて、コンパクトで、安定した、機能的に独立した成分を形成する。これらのリピ−トのクラスタ−は、リガンド結合ドメインを構成し、特異なクラスタリングにより、リガンド結合に関しての特異性を与えることができる。
【０１４５】
単量体ドメインの他の特徴は、リガンドに結合する能力（たとえば、ＬＤＬ受容体クラスＡドメインもしくはＣＵＢドメイン（補体Ｃ１ｒ／Ｃ１ｓ、Ｕｅｇｆ、および骨形成因子−１ドメイン）においてのように）、エンドサイト−シスもしくは内部移行に関与する能力（たとえばＬＤＬ受容体の細胞質側末端もしくはメガリンの細胞質側末端においてのように）、イオンに結合する能力（たとえばＬＤＬ受容体ＡドメインによるＣａ２＋結合）、ならびに／または細胞接着に関与する能力（たとえばＥＧＦ様ドメインにおいてのように）を含む。それらの二次構造を維持するためにイオンに結合する他の単量体ドメインは、たとえばすべてカルシウムに結合するＡドメイン、ＥＧＦドメイン、ＥＦハンド（たとえばカルモジュリンおよびトロポニンＣにおいて見つけられ、存在するものなど）、カドヘリンドメイン、Ｃ型レクチン、Ｃ２ドメイン、アネキシン、Ｇｌａドメイン、トロンボスポンジン３型ドメインならびにＺｎに結合するＺｎフィンガ−（たとえばＣ２Ｈ２型Ｃ３ＨＣ４型（ＲＩＮＧフィンガ−）、インテグラ−ゼＺｎ結合ドメイン、ＰＨＤフィンガ−、ＧＡＴＡ  Ｚｎフィンガ−、ＦＹＶＥ  Ｚｎフィンガ−、およびＢボックスＺｎフィンガ−）を含む。
【０１４６】
単量体ドメインの特徴は、独立して畳み込む能力および安定した構造を形成する能力を含む。したがって、単量体をコ−ドするポリヌクレオチド配列は保存されている必要はないが、単量体ドメインの構造は、保存されていることが多い。たとえば、Ａドメイン構造は、Ａドメインファミリ−のメンバ−の中で保存されているが、Ａドメイン核酸配列は保存されていない。したがって、たとえば、単量体ドメインは、必ずしもその核酸配列によってではなく、そのシステイン残基およびカルシウムに対するその親和性によって、Ａドメインとして分類される。
【０１４７】
本明細書において記載されるように、単量体ドメインは、相同な天然に存在するドメインが結合することができる標的以外の標的に結合する能力について選択することができる。したがって、いくつかの実施形態では、相同な天然に存在するドメインが結合することができる標的または標的タンパク質のクラスもしくはファミリ−に結合しない単量体ドメイン（およびそのような単量体を含む多量体）が、提供される。
ＩＩＩ．  Ａ．ＦＧＦＲ１ｃ結合タンパク質
【０１４８】
いくつかの態様では、ヒトＦＧＦＲ１ｃまたはその一部に結合する（たとえば、選択的に結合する）単量体ドメインが、提供される。ＦＧＦＲ１ｃの一部は、たとえば、ポリペプチドの少なくとも５、１０、１５、２０、３０、５０、１００、またはそれ以上の隣接するアミノ酸を含むことができる。いくつかの実施形態では、単量体は、１０−３Ｍ（たとえば１０−４Ｍなど）よりも強力な親和性でＦＧＦＲ１ｃに結合するであろう。いくつかの実施形態では、親和性は、１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、または１０−１０Ｍよりも強力である。
【０１４９】
Ａドメイン足場を有する多くのＦＧＦＲ１ｃ結合配列が、生成された。実施例において詳細に記載されるように、ＦＧＦＲ１ｃに結合する単量体ドメインの３つのファミリ−（つまりファミリ−１〜３または「Ｆａｍ  １〜３」）が、同定された。これらのファミリ−に基づいて生成されるコンセンサスモチ−フは、ファミリ−内のバインダ−の間の共通のアミノ酸残基を示す。
【０１５０】
ＩＩＩ．  Ａ．１．ファミリ−１の配列
ファミリ−１は、以下のコンセンサスモチ−フ（配列番号７４）を有する。
Ｃ［ＡＧＬＱＲＶ］［ＡＬＰＳＴ］［ＤＧＩＮＲＳ］［ＥＬＱ］Ｆ［ＰＱＴ］Ｃ［ＧＨＫＮＱＲＳ］［ＤＧＮＳ］［ＧＳＴ］［ＥＧＫＮＲＳ］［ＩＲＳＴ−］Ｃ［ＩＬＶ］［ＰＳ］［ＬＰＱＲＶ］［ＡＨＫＰＱＲＴ］Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ［ＤＥＶ］［ＤＮＰ］ＤＣ［ＥＧＲ］Ｄ  ［ＤＧＮＳ］ＳＤＥ［ＡＥＫＳＴ］［ＤＧＮＰＳ］［ＡＤ−］［ＩＨ−］Ｃ
ＦＧＦＲ１ｃファミリ−１のモチ−フを含む例示的な配列は、以下の配列を含む：
ＣＡＳＧＱＦＱＣＳＮＧＮＣＶＰＱＨＷＶＣＤＧＤＮＤＣＥＤＮＳＤＥＥＤＣ  （配列番号７５），
ＣＡＳＧＱＦＴＣＲＳＴＮＩＣＬＳＬＡＷＬＣＤＧＤＤＤＣＥＤＮＳＤＥＳＰＡＩＣ  （配列番号７６），
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＫＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣ  （配列番号７７），
ＣＲＳＲＱＦＱＣＫＧＳＳＴＣＩＰＶＱＷＶＣＤＧＤＮＤＣＧＤＳＳＤＥＡＧＣ（配列番号７８），
ＣＧＡＧＱＦＱＣＲＳＴＮＩＣＩＳＬＫＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＳＣ  （配列番号７９），
ＣＧＡＧＱＦＱＣＲＳＴＮＩＣＶＳＬＡＷＲＣＤＧＥＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＳＣ  （配列番号８０），
ＣＧＡＧＱＦＴＣＮＳＴＮＩＣＩＳＰＲＷＶＣＤＧＶＮＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣ  （配列番号８１），
ＣＧＡＧＱＦＴＣＲＤＴＮＩＣＩＳＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＡＤＣ  （配列番号８２），
ＣＧＡＧＱＦＴＣＲＳＴＫＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＡＧＣ  （配列番号８３），
ＣＧＡＧＱＦＴＣＲＳＴＫＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣ  （配列番号８４），
ＣＧＡＧＱＦＴＣＲＳＴＫＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＳＣ  （配列番号８５），
ＣＧＡＧＱＦＴＣＲＳＴＮＩＣＬＰＬＱＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＡＧＣ  （配列番号８６），
ＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＬＴＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＧＳＤＥＳＰＤＨＣ  （配列番号８７）
ＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＬＴＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＡＧＣ  （配列番号８８），
ＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣ  （配列番号８９），
ＣＧＡＲＱＦＰＣＲＧＳＲＩＣＩＳＱＰＷＶＣＤＧＤＮＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣ  （配列番号９０），
ＣＧＰＧＱＦＴＣＱＤＴＥＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣ  （配列番号９１），
ＣＧＰＩＱＦＴＣＲＮＴＮＩＣＬＳＶＨＷＶＣＤＧＥＤＤＣＥＤＧＳＤＥＥＧＣ  （配列番号９２），
ＣＧＰＮＱＦＴＣＲＳＴＮＩＣＬＳＱＴＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＧＳＤＥＴＮＣ  （配列番号９３），
ＣＧＰＳＱＦＴＣＲＮＴＮＩＣＩＳＬＲＷＲＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＥＧＣ  （配列番号９４），
ＣＧＳＮＱＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＤＳＤＥＴＧＣ  （配列番号９５），
ＣＧＳＳＥＦＱＣＲＮＳＲＲＣＩＰＰＡＷＶＣＤＧＤＮＤＣＧＤＳＳＤＥＫＳＣ  （配列番号９６），
ＣＧＳＳＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＬＰＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣ  （配列番号９７），
ＣＧＳＳＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＬＰＲＡＲＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＡＧＣ  （配列番号９８），
ＣＧＳＳＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＬＰＲＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＡＧＣ  （配列番号９９），
ＣＧＳＳＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＬＰＲＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣ  （配列番号１００），
ＣＧＴＧＱＦＴＣＲＳＴＫＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣ  （配列番号１０１），
ＣＬＳＤＱＦＴＣＲＳＴＮＩＣＬＰＬＱＷＶＣＤＧＤＤＤＣＥＤＮＳＤＥＥＤＣ  （配列番号１０２），
ＣＱＳＮＥＦＱＣＲＳＴＧＲＣＩＳＶＡＷＶＣＤＧＥＤＤＣＲＤＳＳＤＥＡＤＣ  （配列番号１０３），
ＣＲＬＮＥＦＰＣＧＳＧＳＣＩＳＬＨＷＶＣＤＳＶＰＤＣＲＤＤＳＤＥＴＤＣ  （配列番号１０４），
ＣＶＰＧＱＦＱＣＮＮＧＮＣＩＰＶＴＷＬＣＤＧＤＮＤＣＧＤＳＳＤＥＡＰＡＨＣ  （配列番号１０５），
ＣＶＳＧＱＦＱＣＧＮＧＮＣＩＰＱＡＷＬＣＤＧＤＮＤＣＧＤＳＳＤＥＫＤＣ  （配列番号１０６）、および
ＣＶＳＧＱＦＱＣＧＮＧＮＣＩＰＲＰＷＲＣＤＧＤＮＤＣＧＤＳＳＤＥＴＧＣ  （配列番号１０７）。
【０１５１】
ＩＩＩ．  Ａ．２．ファミリ−２配列
ファミリ−２は、以下のコンセンサスモチ−フ（配列番号１０８）を有する。
ＣＧ［ＡＥ］［ＧＳ］ＬＦＴＣ［ＧＲ］［ＮＲＳ］［ＡＳＴ］［ＫＮ］ＩＣＩＳ［ＥＨＱＳ］［ＡＶ］Ｗ［ＩＶ］ＣＤＧ［ＩＶ］ＤＤＣ［ＤＥ］ＤＮＳＤＥ［ＤＫＭＮＴ］［ＮＳＹ］Ｃ
【０１５２】
ＦＧＦＲ１ｃファミリ−２モチ−フを含む例示的な配列は、以下の配列を含む：
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＱＶＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＤＳＣ  （配列番号１０９），
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＹＣ  （配列番号１１０），
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＴＮＣ  （配列番号１１１），
ＣＧＥＧＬＦＴＣＧＳ  ＴＮＩＣＩＳＳＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＮＣ  （配列番号１１２），
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＮＣ  （配列番号１１３），
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＥＡＷＩ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＫＮＣ  （配列番号１１４），
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＡＫＩＣＩＳＨＡＷＶ  ＣＤＧＩＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＮＮＣ  （配列番号１１５），
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＮ  ＳＫＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＤＤＮ  ＳＤＥＫＹＣ  （配列番号１１６），
ＣＧＡＳＬＦＴＣＲＲ  ＳＮＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＭＮＣ  （配列番号１１７）、および
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳ  ＴＫＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＫＮＣ  （配列番号１１８）。
【０１５３】
ＩＩＩ．  Ａ．３．ファミリ−３配列
ファミリ−３は、以下のコンセンサスモチ−フ（配列番号１１９）を有する：
ＣＧ［ＡＰＳＴ］［ＤＮ］［ＬＭＱ］ＦＴＣ［ＱＲ］［ＲＳ］ＴＮ［ＩＭ］ＣＩＳ［ＤＫＰＱＲ］［ＡＴＶ］ＷＶＣＤＧＶＤＤＣ［ＤＥ］Ｄ  ［ＤＥＮＹ］ＳＤＥ［ＩＱＲＴ］［ＡＧＴＶ］Ｃ。
【０１５４】
ＦＧＦＲ１ｃファミリ−３モチ−フを含む例示的な配列は、以下の配列を含む：
ＣＧＡＮＬＦＴＣＱＳ  ＴＮＩＣＩＳＤＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＴＴＣ  （配列番号１２０），
ＣＧＴＮＭＦＴＣＱＲ  ＴＮＩＣＩＳＤＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹ  ＳＤＥＴＡＣ  （配列番号１２１），
ＣＧＴＮＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＭＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＴＶＣ  （配列番号１２２），
ＣＧＳＮＬＦＴＣＲＲ  ＴＮＩＣＩＳＫＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮ  ＳＤＥＴＧＣ  （配列番号１２３），
ＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹ  ＳＤＥＩＧＣ  （配列番号１２４），
ＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＰＴＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＤＤＮ  ＳＤＥＩＧＣ  （配列番号１２５），
ＣＧＰＮＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＲＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＤＤＥ  ＳＤＥＱＧＣ  （配列番号１２６），
ＣＧＳＮＬＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＤＤＤ  ＳＤＥＴＧＣ  （配列番号１２７），
ＣＧＳＤＭＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＫＶＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＤ  ＳＤＥＲＧＣ  （配列番号１２８）、および
ＣＧＳＮＱＦＴＣＲＳ  ＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶ  ＣＤＧＶＤＤＣＥＤＤ  ＳＤＥＴＧＣ  （配列番号１２９）。
【０１５５】
本明細書において記載されるように、単量体ドメインは、連結して、同じ標的（たとえばＦＧＦＲ１ｃ）に結合する多量体を形成することができる。本開示は、ホモ（つまり少なくとも２つの同一の単量体）およびヘテロ（つまり同じ標的に結合する異なる単量体）多量体の両方を含むポリペプチドを提供する。
【０１５６】
ＩＩＩ．  Ｂ．β−クロト−単量体結合タンパク質
いくつかの態様では、β−クロト−ポリペプチドまたはその一部に結合する（たとえば、選択的に結合する）単量体ドメインが、提供される。ポリペプチドの一部は、たとえば、ポリペプチドの少なくとも５、１０、１５、２０、３０、５０、１００、またはそれ以上の隣接するアミノ酸とすることができる。いくつかの実施形態では、単量体は、１０−３Ｍ（たとえば１０−４Ｍなど）よりも強力な親和性でβ−クロト−に結合するであろう。いくつかの実施形態では、親和性は、１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８、または１０−９Ｍよりも強力である。Ａドメイン足場を有する多くのβ−クロト−結合配列が、生成された。実施例において詳細に記載されるように、β−クロト−に結合する単量体ドメインの５つのファミリ−（つまりファミリ−６〜９または「Ｆａｍ  ６〜９」）が、同定された。これらのファミリ−に基づいて生成されるコンセンサスモチ−フは、ファミリ−内のバインダ−の間の共通のアミノ酸残基を示す。さらに、ＬＮＲ／Ｎｏｔｃｈ足場を有する多くのβ−クロト−結合配列が、生成された。実施例において詳細に記載されるように、β−クロト−に結合するＬＮＲ／Ｎｏｔｃｈ単量体ドメインの１つのファミリ−（ファミリ−５または「Ｆａｍ  ５」）が同定された。このファミリ−に基づいて生成されるコンセンサスモチ−フは、ファミリ−内のバインダ−の間の共通のアミノ酸残基を示す。
【０１５７】
ＩＩＩ．  Ｂ．１．ファミリ−４配列
ファミリ−４は、以下のコンセンサスモチ−フ（配列番号１３０）を有する。
Ｃ［ＬＡＰＲＶＫＱＧＨＳ］［ＡＰＳＨＲ］［−Ｔ］［ＤＮＧＳＨＡＦ］［ＥＨＱ］Ｆ［ＨＰＱＴＲＷ］Ｃ［ＧＳＱＲＮＬＨＫ］
［ＳＮＤ］［ＧＳＴＮＹ］［ＲＨＱＧＨＮＳＥ］［ＲＩＴ−］Ｃ［ＩＬＶ］［ＨＮＰＳ］［ＡＧＨＬＳＱＰＲＥＶ］
［ＴＰＧＳＲＡＨＮ−］［ＷＬ］［ＩＬＲＶ］ＣＤ［ＧＭＷ］［ＧＹＤＶＥＬ］［ＰＷＬＤＮ］ＤＣ［ＧＥＲＱＬＫ］Ｄ  ［ＧＮＤＳＫＷＨＹ］［ＰＱＳＷ］Ｄ［ＥＰＱＹ］［ＡＰＳ−］［ＬＰＱＳ−］［ＡＥＨＫＬＴＶ］［ＨＩＬＳＴＤＮＧＭＶＷ］Ｃ
【０１５８】
β−クロト−ファミリ−４モチ−フを含む例示的な配列は、以下の配列を含む：
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧ  ＳＧＲＣＩＰＱＴＷ  ＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤ  ＧＳＤＥＳＰＡＨＣ  （配列番号１３１）；
ＣＡＡＮＥＦＴＣＲ  ＳＧＲＣＬＳＲＰＷ  ＬＣＤＧＥＮＤＣＧＤ  ＧＳＤＥＡＤＣ  （配列番号１３２）；
ＣＧＳＮＱＦＴＣＲ  ＳＴＮＩＣＩＳＱＡＷ  ＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤ  ＤＳＤＥＴＧＣ  （配列番号１３３）；
ＣＰＳＮＱＦＰＣＲ  ＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷ  ＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤ  ＧＳＤＥＳＰＡＴＣ  （配列番号１３４）；
ＣＰＳＮＱＦＰＣＲ  ＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷ  ＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤ  ＧＳＤＥＳＰＡＴＣ  （配列番号１３５）；
ＣＡＡＮＥＦＲＣＳ  ＮＧＲＣＩＰＥＰＷ  ＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤ  ＧＳＤＥＰＰＨＣ  （配列番号１３６）；
ＣＰＳＮＥＦＱＣＱ  ＮＳＧＲＣＩＰＲＲＷ  ＬＣＤＧＥＤＤＣＧＤ  ＮＳＤＥＡＳＣ  （配列番号１３７）；
ＣＱＳＳＥＦＱＣＳ  ＮＧＳＣＩＰＲＰＬ  ＶＣＤＧＥＮＤＣＧＤ  ＳＳＤＥＴＤＣ  （配列番号１３８）；
ＣＲＰＧＥＦＲＣＲ  ＳＴＮＴＣＩＳＱＳＬ  ＲＣＤＧＥＰＤＣＲＤ  ＧＳＤＥＰＥＤＣ  （配列番号１３９）；
ＣＲＳＳＥＦＰＣＨ  ＧＹＳＴＣＩＳＬＳＬ  ＬＣＤＧＶＤＤＣＡＤ  ＮＳＤＥＥＳＣ  （配列番号１４０）；
ＣＨＨＨＨＦＨＣＬ  ＳＧＥＣＩＮＴＷ  ＲＣＤＧＧＰＤＣＫＤ  ＫＳＤＥＥＮＣ  （配列番号１４１）；
ＣＳＲＡＨＦＨＣＬ  ＳＧＥＣＩＨＨＨＷ  ＲＣＤＧＧＰＤＣＫＤ  ＫＳＤＥＥＮＣ  （配列番号１４２）；
ＣＳＡＦＥＦＨＣＬ  ＳＧＥＣＩＨＳＳＷ  ＲＣＤＭＤＷＤＣＫＤ  ＱＰＤＱＬＷＣ  （配列番号１４３）；
ＣＳＡＦＥＦＨＣＬ  ＳＧＥＣＩＨＳＳＷ  ＲＣＤＷＹＷＤＣＫＤ  ＹＷＤＰＬＶＣ  （配列番号１４４）；
ＣＳＡＦＥＦＨＣＬ  ＳＧＥＣＩＨＳＳＷ  ＲＣＤＷＤＤＤＣＫＤ  ＷＱＤＹＶＭＣ  （配列番号１４５）；
ＣＳＡＦＥＦＨＣＬ  ＳＧＥＣＩＨＳＳＷ  ＲＣＤＷＤＬＤＣＫＤ  ＨＰＤＥＶＭＣ  （配列番号１４６）；
ＣＶＰＮＱＦＰＲＧ  ＮＧＳＣＩＰＬＰＬ  ＶＣＤＧＶＤＤＣＬＤ  ＤＳＤＥＫＮＣ  （配列番号１４７）；
ＣＶＰＮＱＦＱＣＧ  ＳＧＲＣＬＰＨＰＬ  ＧＣＤＧＶＤＤＣＬＤ  ＧＳＤＥＡＳＣ  （配列番号１４８）；
ＣＶＳＤＥＦＰＣＲ  ＤＮＮＩＣＶＬＬＨＬ  ＬＣＤＧＶＤＤＣＬＤ  ＳＳＤＥＴＧＣ  （配列番号１４９）；
ＣＡＰＳＱＦＱＣＨ  ＤＮＮＩＣＬＬＥＧＬ  ＬＣＤＧＥＤＤＣＡＤ  ＧＳＤＥＡＰＶＣ  （配列番号１５０）；
ＣＲＳＳＱＦＰＣＱ  ＤＳＮＩＣＶＬＥＴＬ  ＬＣＤＧＶＤＤＣＶＤ  ＤＳＤＥＥＤＣ  （配列番号１５１）；
ＣＲＳＮＱＦＲＣＮ  ＳＧＨＣＬＰＲＰＷ  ＬＣＤＧＶＤＤＣＱＤ  ＤＳＤＥＴＤＣ  （配列番号１５２）；
ＣＲＰＧＱＦＷＣＮ  ＳＧＲＣＬＰＰＡＷ  ＲＣＤＧＶＮＤＣＧＤ  ＤＳＤＥＰＬＡＬＣ  （配列番号１５３）；
ＣＬＰＮＱＦＲＣＧ  ＮＧＨＣＬＳＲＴＷ  ＶＣＤＧＶＰＤＣＥＤ  ＮＳＤＥＳＬＡＨＣ  （配列番号１５４）；
ＣＰＡＧＱＦＱＣＧ  ＮＧＱＣＬＳＬＴＷ  ＬＣＤＧＶＰＤＣＧＤ  ＮＳＤＥＳＳＡＬＣ  （配列番号１５５）；
ＣＰＰＳＱＦＴＣＧ  ＮＧＲＣＶＳＬＧＷ  ＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤ  ＧＳＤＥＳＰＡＬＣ  （配列番号１５６）；
ＣＰＰＳＱＦＴＣＧ  ＮＧＲＣＶＳＬＧＷ  ＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤ  ＧＳＤＥＳＰＡＬＣ  （配列番号１５７）；
ＣＲＰＮＥＦＰＣＮ  ＮＧＲＣＬＳＱＴＷ  ＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤ  ＧＳＤＥＳＰＥＬＣ  （配列番号１５８）；
ＣＱＳＮＥＦＲＣＲ  ＳＧＲＣＩＰＱＨＷ  ＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤ  ＧＳＤＥＳＱＱＣ  （配列番号１５９）；
ＣＱＰＤＥＦＴＣＳ  ＳＧＲＣＩＰＱＰＷ  ＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤ  ＧＳＤＥＰＰＡＨＣ  （配列番号１６０）；
ＣＱＰＤＥＦＴＣＲ  ＳＧＲＣＩＰＱＰＷ  ＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤ  ＧＳＤＥＰＰＧＨＣ  （配列番号１６１）；
ＣＰＰＮＱＦＲＣＧ  ＮＧＨＣＬＳＶＳＷ  ＬＣＤＧＶＰＤＣＧＤ  ＮＳＤＥＡＬＡＩＣ  （配列番号１６２）；
ＣＲＡＮＥＦＲＣＮ  ＳＧＲＣＬＳＱＴＷ  ＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤ  ＧＳＤＥＳＬＡＩＣ  （配列番号１６３）；
ＣＲＡＮＱＦＴＣＮ  ＮＧＨＣＬＳＲＴＷ  ＬＣＤＧＶＰＤＣＥＤ  ＮＳＤＥＳＬＡＩＣ  （配列番号１６４）；
ＣＲＡＮＱＦＴＣＮ  ＮＧＨＣＬＳＲＴＷ  ＬＣＤＧＶＰＤＣＥＤ  ＮＳＤＥＳＬＡＩＣ  （配列番号１６５）；
ＣＲＡＮＱＦＴＣＮ  ＮＧＨＣＬＳＲＴＷ  ＬＣＤＧＶＰＤＣＥＤ  ＮＳＤＥＳＬＡＩＣ  （配列番号１６６）；
ＣＬＰＧＱＦＲＣＮ  ＳＧＨＣＬＳＱＴＷ  ＶＣＤＧＹＮＤＣＧＤ  ＧＳＤＥＰＬＡＴＣ  （配列番号１６７）；
ＣＫＰＴＮＥＦＲＣＳ  ＮＧＨＣＩＳＲＡＬ  ＬＣＤＧＥＮＤＣＥＤ  ＮＳＤＥＴＳＣ  （配列番号１６８）；
ＣＡＳＳＥＦＱＣＲ  ＳＴＲＴＣＶＰＬＧＷ  ＶＣＤＧＤＮＤＣＰＤ  ＮＳＤＥＴＤＣ  （配列番号１６９）；
ＣＨＳＦＮＱＦＥＣＲ  ＮＧＱＣＩＰＬＨＬ  ＶＣＤＧＶＰＤＣＧＤ  ＮＳＤＥＴＤＣ  （配列番号１７０）；
ＣＱＡＴＡＱＦＱＣＤ  ＮＧＨＣＬＳＡＮＷ  ＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤ  ＮＳＤＥＥＤＣ  （配列番号１７１）；
ＣＱＡＴＡＱＦＱＣＤ  ＮＧＨＣＬＳＡＮＷ  ＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤ  ＮＳＤＥＥＤＣ  （配列番号１７２）；
ＣＫＳＩＡＱＦＥＣＳ  ＮＧＨＣＬＳＲＴＷ  ＬＣＤＧＶＤＤＣＧＤ  ＮＳＤＥＡＬＡＴＣ  （配列番号１７３）；
ＣＲＰＳＥＦＱＣＧ  ＮＧＳＣＬＳＡＴＷ  ＬＣＤＧＶＰＤＣＧＤ  ＧＳＤＥＳＰＥＴＣ  （配列番号１７４）；
ＣＲＰＮＥＦＱＣＧ  ＮＧＨＣＬＳＡＮＷ  ＬＣＤＧＶＤＤＣＧＤ  ＤＳＤＥＴＳＣ  （配列番号１７５）；
ＣＰＳＳＱＦＱＣＫ  ＮＧＨＣＬＳＲＴＷ  ＬＣＤＧＶＤＤＣＱＤ  ＧＳＤＥＳＰＡＩＣ  （配列番号１７６）；
ＣＰＳＳＱＦＱＣＫ  ＮＧＨＣＬＳＲＴＷ  ＬＣＤＧＶＤＤＣＱＤ  ＧＳＤＥＳＰＡＴＣ  （配列番号１７７）；
ＣＲＳＳＱＦＱＣＮ  ＮＧＨＣＬＳＰＴＷ  ＶＣＤＧＹＤＤＣＥＤ  ＧＳＤＥＡＮＣ  （配列番号１７８）；
ＣＲＳＳＥＦＱＣＮ  ＮＧＨＣＬＳＡＴＷ  ＶＣＤＧＹＤＤＣＥＤ  ＧＳＤＥＡＮＣ  （配列番号１７９）；
ＣＰＡＮＱＦＲＣＮ  ＮＧＨＣＬＳＲＴＷ  ＶＣＤＧＹＤＤＣＥＤ  ＧＳＤＥＡＮＣ  （配列番号１８０）；
ＣＰＡＮＱＦＲＣＮ  ＮＧＨＣＬＳＧＴＷ  ＬＣＤＧＶＤＤＣＧＤ  ＮＳＤＥＳＳＡＴＣ  （配列番号１８１）；
ＣＲＳＳＥＦＱＣＧ  ＮＧＨＣＬＳＲＴＷ  ＬＣＤＧＶＮＤＣＧＤ  ＤＳＤＥＫＮＣ  （配列番号１８２）；
ＣＬＳＮＱＦＱＣＤ  ＮＧＨＣＬＳＬＴＷ  ＲＣＤＧＹＮＤＣＧＤ  ＳＳＤＥＥＮＣ  （配列番号１８３）；および
ＣＲＳＳＥＦＫＣＫ  ＮＧＨＣＬＳＡＴＷ  ＶＣＤＧＹＶＤＣＧＤ  ＤＳＤＥＥＤＣ  （配列番号１８４）。
【０１５９】
ＩＩＩ．  Ｂ．２．ファミリ−５配列
ファミリ−５は、組換えβ−クロト−に対するナイ−ブＬＮＲ／Ｎｏｔｃｈ足場ライブラリ−のパニングによって生成された。
【０１６０】
ファミリ−５は、以下のコンセンサスモチ−フ（配列番号１２４２）を有する。
Ｃ［ＨＮＰ−］［ＡＰ−］［ＨＩＫＬＭＰＲＶ−］［ＡＥＩＬＹ］［ＡＤＥＧＱＲＹ］［ＡＤＥＨＩＫＬＮＰＱＳ］［ＤＨＬＭＳＹ］Ｃ［Ａ  ＥＫＰＱＴ］［ＡＥＨＫＮＱＲＳ］［ＦＬＲＹ］［ＤＦＶＹ］ＧＤＧ［ＤＥＧＩＫＮＲＳＶ］Ｃ［ＤＥＧＨＮＱＲＳ］［ＥＫＰＱＳ］［ＡＤＥＧＨＰＱ］Ｃ［ＤＧＮＳ］［ＦＬＮＳＴ］［ＡＥＰＳＹ］［ＡＥＧＫＲＴ］Ｃ［ＡＤＧＩＬＮＳＶ］ＷＤＧ［ＤＦＧＬＭＶ］［ＤＮ］Ｃ  （配列番号１２４２）
【０１６１】
β−クロト−ファミリ−５モチ−フを含む例示的な配列は、以下の配列を含む：
ＣＩＡＡＫＬＣＥＡＬＤＧＤＧＶＣＨＫＥＣＤＬＥＥＣＤＷＤＧＧＤＣＱＲＩＦＬＴＤＰＴ  （配列番号１２４３）；
ＣＰＰＨＩＥＤＨＣＥＲＲＤＧＤＧＶＣＱＫＰＣＤＦＹＧＣＬＷＤＧＶＮＣＤＭＤＬＶＱＥＬＴ  （配列番号１２４４）；
ＣＮＰＩＩＱＨＹＣＥＴＹＤＧＤＧＬＣＥＳＡＣＮＦＹＧＣＡＷＤＧＦＤＣＱＶＩＳＤＫＤＳＴ  （配列番号１２４５）；
ＣＭＡＹＮＬＣＴＡＬＶＧＤＧＥＣＤＱＥＣＤＴＰＴＣＮＷＤＧＧＤＣＡＶＫＳＡＰＤＳＴ  （配列番号１２４６）；
ＣＭＥＡＫＳＣＱＡＲＤＧＤＧＤＣＧＱＧＣＮＬＡＥＣＩＷＤＧＭＤＣＲＰＥＷＩＲＥＬＴ  （配列番号１２４７）；
ＣＮＰＬＹＤＤＨＣＡＡＦＦＧＤＧＧＣＧＰＥＣＳＬＡＥＣＬＷＤＧＧＤＣＥＥＥＲＤＡＤＶＴ  （配列番号１２４８）；
ＣＮＤＶＫＣＫＲＬＤＧＤＧＨＡＳＮＬＶＴＮＡＥＣＬＷＤＧＬＤＣＰＤＶＶＩＳＤＬＴ  （配列番号１２４９）；
ＣＩＡＡＫＬＣＥＲＬＤＧＤＧＳＣＱＳＥＣＧＮＡＴＣＧＷＤＧＭＤＣＤＥＫＥＮＤＥＬＴ  （配列番号１２５０）；
ＣＭＡＹＬＬＣＫＫＹＹＧＤＧＩＣＲＳＥＣＤＴＡＴＣＳＷＤＧＦＤＣＰＶＮＥＩＥＤＬＴ  （配列番号１２５１）；
ＣＰＰＨＩＥＤＨＣＥＲＲＤＧＤＧＶＣＱＫＰＣＤＦＹＧＣＬＷＤＧＶＤＣＤＭＤＬＶＥＥＬＴ  （配列番号１２５２）；
ＣＭＡＹＮＬＣＱＡＬＶＧＤＧＳＣＮＳＥＣＤＴＥＴＣＧＷＤＧＭＤＣＡＴＶＥＧＡＥＡＴ  （配列番号１２５３）；
ＣＲＥＹＳＭＣＴＲＦＤＧＤＧＩＣＨＥＱＣＧＹＰＲＣＬＷＤＧＬＤＣＡＮＮＦＤＨＥＶＴ  （配列番号１２５４）；
ＣＮＰＬＹＤＰＨＣＲＳＹＦＧＤＧＤＣＧＰＧＣＤＬＡＡＣＬＷＤＧＧＤＣＰＧＶＡＡＡＥＬＴ  （配列番号１２５５）；
ＣＨＰＬＩＲＥＹＣＥＫＦＦＧＤＧＧＣＤＳＧＣＮＮＳＲＣＤＷＤＧＤＤＣＧＬＩＱＨＧＤＶＴ  （配列番号１２５６）；
ＣＮＰＬＹＤＤＨＣＡＡＦＦＧＤＧＧＣＧＰＥＣＳＬＡＥＣＬＷＤＧＧＤＣＥＥＥＲＤＡＤＶＴ  （配列番号１２５７）；
ＣＮＰＫＹＤＡＨＣＡＳＹＦＧＤＧＥＣＤＰＡＣＳＬＡＥＣＶＷＤＧＤＤＣＤＰＮＦＬＴＤＶＴ  （配列番号１２５８）；
ＣＰＰＨＩＥＤＨＣＥＲＲＤＧＤＧＶＣＱＫＰＣＤＦＹＧＣＬＷＤＧＶＤＣＤＭＤＬＶＥＥＬＴ  （配列番号１２５９）；
ＣＮＰＰＩＧＱＹＣＴＱＬＦＧＤＧＤＣＧＰＤＣＤＬＡＥＣＶＷＤＧＤＤＣＤＰＶＡＶＰＤＶＴ  （配列番号１２６０）；
ＣＮＰＶＹＤＰＹＣＡＡＦＦＧＤＧＧＣＧＰＨＣＧＬＡＥＣＶＷＤＧＭＤＣＤＨＫＥＶＲＥＬＴ  （配列番号１２６１）；
ＣＨＰＬＩＲＥＹＣＴＨＹＤＧＤＧＥＣＤＫＧＣＤＳＡＫＣＫＷＤＧＤＤＣＤＭＤＶＬＡＥＶＴ  （配列番号１２６２）；
ＣＨＰＬＩＲＥＹＣＴＨＹＤＧＤＧＥＣＤＫＧＣＤＳＡＫＣＫＷＤＧＤＤＣＤＭＤＶＬＡＥＶＴ  （配列番号１２６３）；
【０１６２】
ＩＩＩ．  Ｂ．３．ファミリ−６配列
ファミリ−６は、β−クロト−  Ｍ０１（配列番号４９３）を突然変異させ、β−クロト−に対する増加した結合親和性を有する単量体ドメインを選択することによって生成された。
【０１６３】
ファミリ−６は、以下のコンセンサスモチ−フ（配列番号１８５）を有する。
Ｃ［ＬＭＰ］［ＰＳＴ］［ＤＨ］ＥＦ［ＱＲ］Ｃ［ＧＲ］ＳＧ［ＲＷ］ＣＩＰ［ＬＱＲ］［ＡＫＲＳＴ］Ｗ［ＧＶ］ＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＧＥ［ＳＷ］ＰＡ［ＨＬＱ］Ｃ；
【０１６４】
β−クロト−ファミリ−６モチ−フを含む例示的な配列は、以下の配列を含む：
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＬＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣ  （配列番号１８６）；
ＣＬＰＤＥＦＱＣＲＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＱＣ  （配列番号１８７）；
ＣＬＰＨＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＷＰＡＱＣ  （配列番号１８８）；
ＣＬＰＨＥＦＱＣＲＳＧＲＣＩＰＱＡＷＧＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＱＣ  （配列番号１８９）；
ＣＬＳＤＥＦＱＣＲＳＧＲＣＩＰＱＲＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＷＰＡＱＣ  （配列番号１９０）；
ＣＭＰＤＥＦＱＣＲＳＧＲＣＩＰＲＳＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＳＨＣ  （配列番号１９１）；
ＣＭＴＤＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＷＰＡＱＣ  （配列番号１９２）；および
ＣＰＰＤＥＦＱＣＲＳＧＷＣＩＰＱＫＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＬＣ  （配列番号１９３）。
【０１６５】
ＩＩＩ．  Ｂ．４．ファミリ−７配列
ファミリ−７は、β−クロト−  Ｍ２５（配列番号５１９）を突然変異させ、β−クロト−に対する増加した結合親和性を有する単量体ドメインを選択することによって生成された。
【０１６６】
ファミリ−７は、以下のコンセンサスモチ−フ（配列番号１９４）を有する。
Ｃ［ＬＲＷ］［ＰＳＴ］［ＧＳ］［ＡＥＨＱＳ］Ｆ［ＨＱ］Ｃ［ＮＳ］［ＮＴ］ＧＨＣＬＳ［ＡＰＱＲＳ］［ＳＴ］ＷＶＣＤＧ［ＦＹ］  ［ＤＥＶＹ］ＤＣ［ＤＥＧ］Ｄ［ＧＷ］ＳＤＥ［ＡＳＶ］［ＫＮ］Ｃ；
【０１６７】
β−クロト−ファミリ−７モチ−フを含む例示的な配列は、以下の配列を含む：
ＣＬＰＳＱＦＱＣＮＮＧＨＣＬＳＲＴＷＶＣＤＧＹＤＤＣＧＤＷＳＤＥＳＮＣ  （配列番号１９５）；
ＣＬＳＧＱＦＱＣＳＮＧＨＣＬＳＲＴＷＶＣＤＧＹＶＤＣＥＤＧＳＤＥＡＫＣ  （配列番号１９６）；
ＣＬＳＳＳＦＱＣＮＮＧＨＣＬＳＲＴＷＶＣＤＧＹＹＤＣＥＤＧＳＤＥＶＮＣ  （配列番号１９７）；
ＣＲＳＧＱＦＱＣＮＮＧＨＣＬＳＡＴＷＶＣＤＧＹＤＤＣＤＤＧＳＤＥＡＮＣ  （配列番号１９８）；
ＣＲＳＧＱＦＱＣＮＮＧＨＣＬＳＱＴＷＶＣＤＧＹＤＤＣＤＤＧＳＤＥＡＮＣ  （配列番号１９９）；
ＣＲＳＧＱＦＱＣＮＮＧＨＣＬＳＲＴＷＶＣＤＧＹＤＤＣＤＤＧＳＤＥＡＮＣ  （配列番号２００）；
ＣＲＳＧＱＦＱＣＮＮＧＨＣＬＳＳＴＷＶＣＤＧＦＤＤＣＥＤＧＳＤＥＡＮＣ  （配列番号２０１）；
ＣＲＳＳＥＦＱＣＮＮＧＨＣＬＳＡＴＷＶＣＤＧＹＤＤＣＥＤＧＳＤＥＳＮＣ  （配列番号２０２）；
ＣＲＳＳＥＦＱＣＮＴＧＨＣＬＳＲＴＷＶＣＤＧＹＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＮＣ  （配列番号２０３）；
ＣＲＴＳＨＦＨＣＮＮＧＨＲＬＳＲＴＷＶＣＤＧＹＥＤＣＥＤＧＳＤＥＡＮＣ  （配列番号２０４）；
ＣＷＳＳＡＦＱＣＮＮＧＨＣＬＳＰＳＷＶＣＤＧＹＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＮＣ  （配列番号２０５）；および
ＣＲＳＧＱＦＱＣＮＮＧＨＣＬＳＡＴＷＶＣＤＧＹＤＤＣＤＤＧＳＤＥＡＮＣ  （配列番号２０６）。
【０１６８】
ＩＩＩ．  Ｂ．５．ファミリ−８配列
ファミリ−８は、β−クロト−  Ｍ４２（配列番号３０５）を突然変異させ、β−クロト−に対する増加した結合親和性を有する単量体ドメインを選択することによって生成された。
ファミリ−８は、以下のコンセンサスモチ−フ（配列番号２０７）を有する。
Ｃ［ＥＱ］［ＰＳ］［ＤＥ］ＥＦ［ＭＲＴ］Ｃ［ＲＳ］ＳＧＲＣＩＰ［ＱＶ］［ＨＩＳＴ］ＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥ［ＰＲ］Ｐ［ＡＥ］［ＨＱ］Ｃ；
【０１６９】
β−クロト−ファミリ−８モチ−フを含む例示的な配列は、以下の配列を含む：
ＣＥＰＥＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＴＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣ  （配列番号２０８）；
ＣＱＰＤＥＦＴＣＲＳＧＲＣＩＰＱＳＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣ  （配列番号２０９）；
ＣＱＰＤＥＦＴＣＳＳＧＲＣＩＰＱＩＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＲＰＥＨＣ  （配列番号２１０）；および
ＣＱＳＤＥＦＭＣＳＳＧＲＣＩＰＶＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＲＰＡＱＣ  （配列番号２１１）。
【０１７０】
ＩＩＩ．  Ｂ．５．ファミリ−９配列
ファミリ−９は、β−クロト−  Ｍ５０（配列番号３０６）を突然変異させ、β−クロト−に対する増加した結合親和性を有する単量体ドメインを選択することによって生成された。
ファミリ−９は、以下のコンセンサスモチ−フ（配列番号２１２）を有する。
Ｃ［ＨＮＰ］［ＳＴＷ］Ｆ［ＨＮ］［ＨＫＱ］Ｆ［ＥＫ］ＣＲＮ［ＧＲ］ＱＣＩＰＬ［ＨＹ］ＬＶＣＤＧＶＰＤＣ［ＡＧ］Ｄ［ＤＮ］ＳＤＥＴ［ＡＤＹ］Ｃ；
【０１７１】
β−クロト−ファミリ−９モチ−フを含む例示的な配列は、以下の配列を含む：
ＣＨＳＦＮＱＦＥＣＲＮＲＱＣＩＰＬＹＬＶＣＤＧＶＰＤＣＡＤＮＳＤＥＴＤＣ  （配列番号２１３）；
ＣＨＴＦＮＫＦＥＣＲＮＧＱＣＩＰＬＹＬＶＣＤＧＶＰＤＣＧＤＮＳＤＥＴＡＣ  （配列番号２１４）；
ＣＮＳＦＮＱＦＥＣＲＮＲＱＣＩＰＬＹＬＶＣＤＧＶＰＤＣＧＤＮＳＤＥＴＹＣ  （配列番号２１５）；および
ＣＰＷＦＨＨＦＫＣＲＮＧＱＲＩＰＬＨＬＶＣＤＧＶＰＤＣＧＤＤＳＤＥＴＤＣ  （配列番号２１６）。
【０１７２】
ＩＩＩ．  Ｃ．β−クロト−二量体結合タンパク質
本明細書において記載されるように、単量体ドメインは、連結して、同じ標的（たとえばβ−クロト−）に結合する多量体を形成することができる。本開示は、ホモ（つまり少なくとも２つの同一の単量体）およびヘテロ（つまり同じ標的に結合する異なる単量体）多量体の両方を含むポリペプチドを提供する。「ウォ−キングライブラリ−」と呼ばれるさらなるライブラリ−は、ファ−ジディスプレイ選択単量体（つまり、選択された単量体）をナイ−ブ単量体ライブラリ−の表現型（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）全部と連結することによって生成された。
【０１７３】
いくつかの態様では、β−クロト−ポリペプチドまたはその一部に結合する（たとえば、選択的に結合する）二量体ドメインが、提供される。ポリペプチドの一部は、たとえば、ポリペプチドの少なくとも５、１０、１５、２０、３０、５０、１００、またはそれ以上の隣接するアミノ酸とすることができる。いくつかの実施形態では、二量体は、１０−３Ｍ（たとえば１０−４Ｍなど）よりも強力な親和性でβ−クロト−に結合するであろう。いくつかの実施形態では、親和性は、１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８、１０−９Ｍ、または１０−１０Ｍよりも強力である。
【０１７４】
２つの単量体ドメインを含む多くのβ−クロト−結合配列が、生成された。実施例において詳細に記載されるように、β−クロト−に結合する単量体ドメインの１２のファミリ−（つまりファミリ−１０〜２１または「Ｆａｍ  １０〜２１」）が、同定されている。これらは図１４において概説される。これらのファミリ−に基づいて生成されるコンセンサスモチ−フは、ファミリ−内のバインダ−の間の共通のアミノ酸残基を示す。
【０１７５】
ＩＩＩ．  Ｃ．１．ファミリ−１０配列
ファミリ−１０は、β−クロト−  Ｍ０１（配列番号４９３）のＣ末端にナイ−ブ単量体ライブラリ−の表現型全体をライゲ−ションし、β−クロト−に対する増加した結合親和性を有する二量体ドメインを選択することによって生成された。
【０１７６】
ファミリ−１０は、第２のドメイン（配列番号２１７）について以下のコンセンサスモチ−フを有する。
Ｃ［ＥＬＰＱＲ］［ＡＰＳ］［ＤＧＩＮ］［ＥＧＱ］［ＦＱ］［ＦＫＰＱＲＴ］［−Ｅ］Ｃ［ＧＮＲＳ］［ＮＳ］Ｇ［ＨＮＱＲ］Ｃ［ＩＶ］  Ｐ［ＡＥＬＰＱＲＶ］［ＡＨＰＱＲＴ］Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ［ＤＥＶ］［ＤＮＰ］ＤＣ［ＧＬＱ］Ｄ［ＤＧＮＳ］ＳＤＥ［ＡＥＫＴ］［ＤＧＬＮＳ］［−Ａ］［−Ｈ］Ｃ
【０１７７】
β−クロト−ファミリ−１０（第２のドメイン）モチ−フを含む例示的な配列は、以下の配列を含む：
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏＷＤ０１  ＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣ  （配列番号２１８）；
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏＷＤ０２  ＣＰＳＳＥＦＲＣＮＮＧＲＣＩＰＬＨＷＶＣＤＧＤＤＤＣＱＤＮＳＤＥＴＤＣ  （配列番号２１９）；
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏＷＤ０３  ＣＲＰＧＥＦＲＣＮＮＧＲＣＶＰＱＴＷＶＣＤＧＥＤＤＣＧＤＮＳＤＥＴＤＣ  （配列番号２２０）；
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏＷＤ０４  ＣＬＳＤＱＦＲＣＧＮＧＲＣＶＰＲＡＷＬＣＤＧＤＮＤＣＱＤＧＳＤＥＴＮＣ  （配列番号２２１）；
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏＷＤ０５  ＣＬＰＧＱＦＰＣＧＮＧＲＣＩＰＥＴＷＬＣＤＧＤＤＤＣＱＤＧＳＤＥＫＧＣ  （配列番号２２２）；
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏＷＤ０６  ＣＱＰＮＥＦＱＣＧＮＧＲＣＩＰＡＱＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＥＤＣ  （配列番号２２３）；
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏＷＤ０７  ＣＥＳＩＧＱＦＥＣＧＮＧＨＣＩＰＰＴＷＬＣＤＧＶＮＤＣＱＤＳＳＤＥＡＬＡＨＣ  （配列番号２２４）；
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏＷＤ０８  ＣＱＳＮＥＦＲＣＲＮＧＱＣＩＰＬＴＷＬＣＤＧＤＮＤＣＬＤＳＳＤＥＥＳＣ  （配列番号２２５）；
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏＷＤ０９  ＣＰＳＧＥＦＴＣＧＳＧＲＣＩＰＰＴＷＶＣＤＧＥＰＤＣＬＤＧＳＤＥＫＳＣ  （配列番号２２６）；
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏＷＤ１０  ＣＬＰＤＥＦＫＣＧＳＧＲＣＩＰＬＲＷＶＣＤＧＤＤＤＣＱＤＧＳＤＥＴＤＣ  （配列番号２２７）；
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏＷＤ１５  ＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＴＣ  （配列番号２２８）；
ＢＫ＿Ｒ１ｃ＿Ｄ１４  ＣＲＳＤＥＦＲＣＧＮＧＲＣＩＰＬＴＷＶＣＤＧＥＤＤＣＱＤＳＳＤＥＴＧＣ  （配列番号２２９）；
ＢＫ＿Ｒ１ｃ＿Ｄ１５  ＣＲＳＮＱＦＴＣＧＮＧＮＣＩＰＱＰＷＶＣＤＧＥＤＤＣＧＤＤＳＤＥＥＳＣ  （配列番号２３０）；および
ＢＫ＿Ｒ１ｃ＿Ｄ１６  ＣＰＰＧＱＦＲＣＮＮＧＲＣＩＰＶＨＷＲＣＤＧＥＮＤＣＱＤＤＳＤＥＫＳＣ  （配列番号２３１）。
【０１７８】
ＩＩＩ．  Ｃ．２．ファミリ−１１配列
ファミリ−１１は、β−クロト−  Ｍ０１（配列番号４９３）のＮ末端にナイ−ブ単量体ライブラリ−の表現型全体を連結し、β−クロト−に対する増加した結合親和性を有する二量体ドメインを選択することによって生成された。
【０１７９】
ファミリ−１１は、第２のドメイン（配列番号２３２）について以下のコンセンサスモチ−フを有する。
Ｃ［ＡＧＬＰ］ＰＤ［ＥＱ］Ｆ［ＫＲ］Ｃ［ＧＫＮＲＳ］ＳＧ［ＮＱＲＳ］Ｃ［ＩＬ］Ｐ［ＥＬＱ］［ＤＨＮＴ］Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ［ＤＬＶ］［ＤＮ］ＤＣ［ＥＧＶ］Ｄ［ＧＳ］ＳＤＥ［ＡＥＴ］［ＤＧＮＰ］［−Ｄ］［−Ｌ］Ｃ
【０１８０】
β−クロト−ファミリ−１１（第２のドメイン）モチ−フを含む例示的な配列は、以下の配列を含む：
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏＷＤ１１  ＣＰＰＤＱＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＡＮＣ  （配列番号２３３）；
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏＷＤ１２  ＣＡＰＤＱＦＲＣＳＳＧＱＣＩＰＥＴＷＬＣＤＧＤＤＤＣＶＤＳＳＤＥＡＧＣ  （配列番号２３４）；
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏＷＤ１３  ＣＧＰＤＥＦＲＣＮＳＧＲＣＬＰＬＤＷＲＣＤＧＶＤＤＣＥＤＧＳＤＥＡＰＤＬＣ  （配列番号２３５）；
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏＷＤ１４  ＣＧＰＤＱＦＲＣＫＳＧＮＣＬＰＬＮＷＶＣＤＧＶＤＤＣＧＤＳＳＤＥＥＧＣ  （配列番号２３６）；
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏＷＤ１６  ＣＬＰＤＥＦＲＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＴＧＣ  （配列番号２３７）；
ＢＫ＿Ｒ１ｃ＿Ｄ０６  ＣＡＰＤＱＦＲＣＳＳＧＱＣＩＰＥＴＷＬＣＤＧＤＤＤＣＶＤＳＳＤＥＡＧＣ  （配列番号２３８）；および
ＢＫ＿Ｒ１ｃ＿Ｄ１２  ＣＧＰＤＱＦＫＣＮＳＧＳＣＩＰＬＴＷＶＣＤＧＤＮＤＣＧＤＤＳＤＥＴＤＣ  （配列番号２３９）。
【０１８１】
ＩＩＩ．  Ｃ．３．ファミリ−１２配列
ファミリ−１２は、β−クロト−  Ｍ０６（配列番号４９９）のＮ末端にナイ−ブ単量体ライブラリ−の表現型全体を連結し、β−クロト−に対する増加した結合親和性を有する二量体ドメインを選択することによって生成された。
ファミリ−１２は、第２のドメイン（配列番号２４０）について以下のコンセンサスモチ−フを有する。
ＣＡ［ＰＳ］［ＤＮＳ］［ＥＱ］Ｆ［ＱＲ］Ｃ［ＧＨ］［ＤＮ］［ＧＮＴ］［ＧＨＮ］［−ＩＴ］Ｃ［ＩＬ］［ＬＰＳ］［ＥＲ］［ＡＧＴ］［ＷＬ］ＬＣ  ＤＧ［ＤＥＶ］［ＤＮ］ＤＣ［ＡＥＧ］ＤＧＳＤＥ［ＡＥ］［ＤＧ］Ｃ
【０１８２】
β−クロト−ファミリ−１２（第２のドメイン）モチ−フを含む例示的な配列は、以下の配列を含む：
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏ  ＷＤ１８  ＣＡＳＮＱＦＲＣＧＮＧＨＣＬＳＲＴＷＬＣＤＧＶＮＤＣＥＤＧＳＤＥＡＤＣ  （配列番号２４１）；
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏ  ＷＤ１９  ＣＡＰＤＥＦＲＣＨＮＴＧＴＣＩＰＲＡＷＬＣＤＧＤＮＤＣＧＤＧＳＤＥＥＧＣ  （配列番号２４２）；
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏ  ＷＤ２０  ＣＡＰＳＱＦＱＣＨＤＮＮＩＣＬＬＥＧＬＬＣＤＧＥＤＤＣＡＤＧＳＤＥＡＤＣ  （配列番号２４３）；および
ＢＫ＿Ｒ１ｃ＿Ｄ０９  ＣＡＳＮＱＦＲＣＧＮＧＨＣＬＳＲＴＷＬＣＤＧＶＮＤＣＥＤＧＳＤＥＡＤＣ  （配列番号２４４）。
【０１８３】
ＩＩＩ．  Ｃ．４．ファミリ−１３配列
ファミリ−１３は、β−クロト−  Ｍ０６（配列番号４９９）のＣ末端にナイ−ブ単量体ライブラリ−の表現型全体を連結し、β−クロト−に対する増加した結合親和性を有する二量体ドメインを選択することによって生成された。
【０１８４】
ファミリ−１３は、第２のドメイン（配列番号２４５）について以下のコンセンサスモチ−フを有する。
Ｃ［ＡＰ］Ｐ［ＤＧ］［ＥＱ］Ｆ［ＲＴ］Ｃ［ＫＮＲ］［ＮＳ］Ｇ［ＱＲ］Ｃ［ＩＶ］Ｐ［ＬＱ］［ＡＨＰ］Ｗ［ＬＶ］ＣＤＧ［ＤＥ］［ＤＮ］ＤＣ［ＧＱ］ＤＮＳＤＥ［ＥＳＴ］［ＤＮＰ］［−Ａ］［−Ｔ］Ｃ
【０１８５】
β−クロト−ファミリ−１３（第２のドメイン）モチ−フを含む例示的な配列は、以下の配列を含む：
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏＷＤ１７    ＣＰＰＤＱＦＲＣＲＮＧＲＣＶＰＬＡＷＶＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＴＤＣ  （配列番号２４６）；
ＢＫ＿Ｒ１ｃ＿Ｄ１９  ＣＡＰＧＥＦＴＣＫＳＧＱＣＩＰＬＨＷＬＣＤＧＤＮＤＣＧＤＮＳＤＥＳＰＡＴＣ  （配列番号２４７）；および
ＢＫ＿Ｒ１ｃ＿Ｄ２０  ＣＰＰＧＱＦＲＣＮＮＧＲＣＩＰＱＰＷＬＣＤＧＤＤＤＣＱＤＮＳＤＥＥＮＣ  （配列番号２４８）。
【０１８６】
ＩＩＩ．  Ｃ．５．ファミリ−１４配列
ファミリ−１４は、β−クロト−  Ｍ０８（配列番号６９４）のＮ末端にナイ−ブ単量体ライブラリ−の表現型全体を連結し、β−クロト−に対する増加した結合親和性を有する二量体ドメインを選択することによって生成された。
ファミリ−１４は、第２のドメイン（配列番号２４９）について以下のコンセンサスモチ−フを有する。
Ｃ［ＡＧＰＲ］［ＡＰ］［ＤＧＮＳ］［ＥＱ］Ｆ［ＱＲＴ］Ｃ［ＧＳＫ］Ｎ［ＧＴ］［ＧＨＲ］［−Ｒ］Ｃ［ＩＬＶ］［ＰＳ］［ＡＬＱ］［ＮＳＴ］  Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ［ＤＥＶ］ＤＤＣ［ＧＬ］ＤＧＳＤＥ［ＡＥＴ］［ＤＮＳ］［−Ａ］［−Ｔ］Ｃ
【０１８７】
β−クロト−ファミリ−１４（第２のドメイン）モチ−フを含む例示的な配列は、以下の配列を含む：
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏ  ＷＤ２１  ＣＡＰＧＥＦＴＣＫＮＴＧＲＣＩＰＬＮＷＲＣＤＧＤＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＤＣ  （配列番号２５０）；
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏ  ＷＤ２２  ＣＰＡＤＥＦＲＣＳＮＴＧＲＣＶＰＬＳＷＬＣＤＧＥＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＮＣ  （配列番号２５１）；
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏ  ＷＤ２３  ＣＧＰＳＱＦＱＣＳＮＧＲＣＬＰＡＴＷＶＣＤＧＤＤＤＣＬＤＧＳＤＥＡＳＡＴＣ  （配列番号２５２）；および
ＢＫ＿Ｒ１ｃ＿Ｄ２５  ＣＲＰＮＥＦＲＣＧＮＧＨＣＬＳＱＴＷＶＣＤＧＶＤＤＣＬＤＧＳＤＥＥＳＣ  （配列番号２５３）。
【０１８８】
ＩＩＩ．  Ｃ．６．ファミリ−１５配列
ファミリ−１５は、β−クロト−  Ｍ２１（配列番号５０８）のＮ末端にナイ−ブ単量体ライブラリ−の表現型全体を連結し、β−クロト−に対する増加した結合親和性を有する二量体ドメインを選択することによって生成された。
【０１８９】
ファミリ−１５は、第２のドメイン（配列番号２５４）について以下のコンセンサスモチ−フを有する。
Ｃ［ＡＧＰ］［ＡＰＳ］［ＤＧＮ］［ＥＱ］Ｆ［ＱＲＴ］Ｃ［ＧＮＲＳ］［ＧＮＳ］［ＧＴ］［ＧＫＱＳ］［−ＩＫ］Ｃ［ＩＬＶ］Ｐ［ＬＱＲＶ］  ［ＡＥＨＰ］Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ［ＤＬＶ］［ＤＮ］ＤＣＧＤ［ＧＮ］ＳＤＥ［ＡＥＫＰＳ］［ＧＬＰＳ］［−ＡＥＶ］［−ＩＴ］Ｃ
β−クロト−ファミリ−１５（第２のドメイン）モチ−フを含む例示的な配列は、以下の配列を含む：
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏ  ＷＤ２７  ＣＧＰＤＱＦＲＣＳＳＧＫＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＴＣ  （配列番号２５５）；
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏ  ＷＤ２８  ＣＧＡＮＥＦＱＣＲＳＴＧＩＣＶＰＶＥＷＶＣＤＧＤＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＶＣ  （配列番号２５６）；
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏ  ＷＤ２９  ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣ  （配列番号２５７）；
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏ  ＷＤ２５  ＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣ  （配列番号２５８）；
ＢＫ＿Ｒ１ｃ＿Ｄ０８  ＣＡＳＧＥＦＴＣＮＮＧＱＣＶＰＬＡＷＲＣＤＧＶＮＤＣＱＤＧＳＤＥＫＧＣ  （配列番号２５９）；
ＢＫ＿Ｒ１ｃ＿Ｄ１１  ＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣ  （配列番号２６０）；および
ＢＫ＿Ｒ１ｃ＿Ｄ１８  ＣＰＰＤＥＦＱＣＲＧＴＫＫＣＬＰＬＡＷＶＣＤＧＤＮＤＣＥＤＤＳＤＥＥＳＣ  （配列番号２６１）。
【０１９０】
ＩＩＩ．  Ｃ．７．  ファミリ−１６配列
ファミリ−１６は、β−クロト−  Ｍ２１（配列番号５０８）のＣ末端にナイ−ブ単量体ライブラリ−の表現型全体を連結し、β−クロト−に対する増加した結合親和性を有する二量体ドメインを選択することによって生成された。
ファミリ−１６は、第２のドメイン（配列番号２６２）について以下のコンセンサスモチ−フを有する。
Ｃ［ＡＰ］［ＡＰ］［ＧＮ］ＱＦ［ＲＴ］Ｃ［ＧＲ］ＮＧ［ＮＳ］ＣＩＰ［ＡＬ］［ＨＴ］Ｗ［ＬＶ］ＣＤＧＤＮＤＣ［ＧＱ］Ｄ［ＧＮ］ＳＤＥ
［ＥＴ］［ＤＮ］Ｃ
【０１９１】
β−クロト−ファミリ−１７（第２のドメイン）モチ−フを含む例示的な配列は、以下の配列を含む：
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏ  ＷＤ２４  ＣＰＰＧＱＦＲＣＲＮＧＳＣＩＰＡＴＷＬＣＤＧＤＮＤＣＧＤＮＳＤＥＥＤＣ          （配列番号２６３）；および
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏ  ＷＤ２６  ＣＡＡＮＱＦＴＣＧＮＧＮＣＩＰＬＨＷＶＣＤＧＤＮＤＣＱＤＧＳＤＥＴＮＣ          （配列番号２６４）。
【０１９２】
ＩＩＩ．  Ｃ．８．ファミリ−１７配列
ファミリ−１７は、β−クロト−  Ｍ４２（配列番号３０５）のＮ末端にナイ−ブ単量体ライブラリ−の表現型全体を連結し、β−クロト−に対する増加した結合親和性を有する二量体ドメインを選択することによって生成された。
ファミリ−１７は、第２のドメイン（配列番号２６５）について以下のコンセンサスモチ−フを有する。
Ｃ［ＡＰＱＲ］［ＡＳＰ］［ＤＧ］［ＥＱ］Ｆ［ＰＱ］Ｃ［ＥＫＮＲ］［ＮＳ］［ＧＴ］［ＧＨＮ］［−Ｒ］Ｃ［ＩＬＶ］［ＰＳ］［ＡＬＰＲ］［ＡＮＲＴ］  Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ［ＥＶ］［ＤＮ］ＤＣ［ＡＧＲ］Ｄ［ＧＮＳ］ＳＤＥ［ＡＥＫＳ］［ＧＬＮＳ］［−Ａ］［−Ｈ］Ｃ
【０１９３】
β−クロト−ファミリ−１７（第２のドメイン）モチ−フを含む例示的な配列は、以下の配列を含む：
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏ  ＷＤ３１  ＣＡＰＤＱＦＲＣＫＳＧＮＣＩＰＬＡＷＲＣＤＧＥＤＤＣＲＤＧＳＤＥＥＳＣ  （配列番号２６６）；
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏ  ＷＤ３２  ＣＱＡＧＱＦＱＣＥＳＧＮＣＶＰＰＮＷＬＣＤＧＥＮＤＣＡＤＳＳＤＥＡＮＣ  （配列番号２６７）；
ＢＫ＿Ｒ１ｃ＿Ｄ２１  ＣＰＳＧＱＦＱＣＮＮＧＨＣＬＳＡＴＷＬＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＫＧＣ  （配列番号２６８）；および
ＢＫ＿Ｒ１ｃ＿Ｄ２４  ＣＲＰＤＥＦＰＣＲＳＴＧＲＣＶＰＲＲＷＶＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＳＬＡＨＣ  （配列番号２６９）。
【０１９４】
ＩＩＩ．  Ｃ．９．ファミリ−１８配列
ファミリ−１８は、β−クロト−  Ｍ４２（配列番号３０５）のＣ末端にナイ−ブ単量体ライブラリ−の表現型全体を連結し、β−クロト−に対する増加した結合親和性を有する二量体ドメインを選択することによって生成された。
【０１９５】
ファミリ−１８は、第２のドメイン（配列番号２７０）について以下のコンセンサスモチ−フを有する。
ＣＲＰ［ＤＧ］ＥＦ［ＱＲ］Ｃ［ＧＫＲ］［ＮＳ］Ｇ［ＨＲ］Ｃ［ＩＶ］Ｐ［ＧＬＱ］［ＰＴ］Ｗ［ＲＶ］ＣＤＧ［ＤＥ］［ＤＰ］ＤＣＱＤ［ＧＳ］ＳＤＥ［ＡＥＴ］［ＤＧＮ］Ｃ
【０１９６】
β−クロト−ファミリ−１８（第２のドメイン）モチ−フを含む例示的な配列は、以下の配列を含む：
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏ  ＷＤ３０  ＣＲＰＧＥＦＱＣＧＳＧＨＣＩＰＧＰＷＶＣＤＧＤＰＤＣＱＤＧＳＤＥＡＮＣ  （配列番号２７１）；
ＢＫ＿Ｒ１ｃ＿Ｄ２２  ＣＲＰＤＥＦＲＣＫＮＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＥＤＤＣＱＤＳＳＤＥＴＤＣ  （配列番号２７２）；および
ＢＫ＿Ｒ１ｃ＿Ｄ２３  ＣＲＰＤＥＦＲＣＲＮＧＲＣＶＰＬＴＷＲＣＤＧＥＤＤＣＱＤＧＳＤＥＥＧＣ  （配列番号２７３）。
【０１９７】
ＩＩＩ．  Ｃ．１０．ファミリ−１９配列
ファミリ−１９は、β−クロト−  Ｍ５０（配列番号３０６）のＮ末端にナイ−ブ単量体ライブラリ−の表現型全体を連結し、β−クロト−に対する増加した結合親和性を有する二量体ドメインを選択することによって生成された。
【０１９８】
ファミリ−１９は、第２のドメイン（配列番号２７４）について以下のコンセンサスモチ−フを有する。
Ｃ［ＡＧＬＲ］［ＡＰＳ］［ＤＧＮ］［ＥＱ］Ｆ［ＲＱＴ］Ｃ［ＧＨＫＮＲＳ］［ＮＳ］［ＧＳＴＹ］［ＤＥＧＮＲ］［−ＲＴ］Ｃ［ＩＬＶ］Ｐ  ［ＡＧＬＰＲＶ］［ＡＨＮＰＴ］Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ［ＤＥＶ］［ＤＮ］ＤＣ［ＡＥＧＲＶ］Ｄ［ＤＧＮ］ＳＤＥ［ＡＥＳＴ］［ＡＤＧＮＳ］［−Ｄ］Ｃ
【０１９９】
β−クロト−ファミリ−１９（第２のドメイン）モチ−フを含む例示的な配列は、以下の配列を含む：
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏ  ＷＤ３５  ＣＡＰＧＥＦＱＣＳＮＧＮＣＬＰＰＮＷＬＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＳＡＤＣ  （配列番号２７５）；
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏ  ＷＤ３６  ＣＡＰＤＥＦＲＣＲＮＧＮＣＩＰＬＰＷＶＣＤＧＥＮＤＣＲＤＤＳＤＥＥＤＣ  （配列番号２７６）；
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏ  ＷＤ３７  ＣＬＳＤＱＦＱＣＮＮＹＥＴＣＩＰＲＰＷＬＣＤＧＤＤＤＣＶＤＧＳＤＥＥＤＣ  （配列番号２７７）；
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏ  ＷＤ３８  ＣＡＡＧＥＦＱＣＳＳＧＲＣＬＰＲＰＷＶＣＤＧＤＮＤＣＧＤＤＳＤＥＴＮＣ  （配列番号２７８）；
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏ  ＷＤ３９  ＣＲＳＧＥＦＲＣＫＮＧＲＣＩＰＱＨＷＶＣＤＧＥＮＤＣＧＤＤＳＤＥＴＮＣ  （配列番号２７９）；
ＢＫ＿Ｒ１ｃ＿Ｄ０５  ＣＡＡＧＱＦＲＣＨＮＳＤＴＣＬＰＧＡＷＶＣＤＧＤＮＤＣＧＤＮＳＤＥＡＳＣ  （配列番号２８０）；
ＢＫ＿Ｒ１ｃ＿Ｄ０７  ＣＡＰＮＥＦＲＣＲＳＴＧＲＣＩＰＶＮＷＶＣＤＧＤＤＤＣＡＤＮＳＤＥＡＧＣ  （配列番号２８１）；
ＢＫ＿Ｒ１ｃ＿Ｄ１０  ＣＧＡＤＱＦＱＣＧＳＧＲＣＶＰＡＴＷＲＣＤＧＥＤＤＣＧＤＧＳＤＥＥＮＣ  （配列番号２８２）；および
ＢＫ＿Ｒ１ｃ＿Ｄ１７  ＣＬＰＧＱＦＴＣＧＮＧＲＣＩＰＬＰＷＶＣＤＧＶＮＤＣＥＤＮＳＤＥＥＳＣ  （配列番号２８３）。
【０２００】
ＩＩＩ．  Ｃ．１１．ファミリ−２０配列
ファミリ−２０は、β−クロト−  Ｍ５０（配列番号３０６）のＣ末端にナイ−ブ単量体ライブラリ−の表現型全体を連結し、β−クロト−に対する増加した結合親和性を有する二量体ドメインを選択することによって生成された。
【０２０１】
ファミリ−２０は、第２のドメイン（配列番号２８４）について以下のコンセンサスモチ−フを有する。
Ｃ［ＬＱ］［ＰＳ］Ｇ［ＥＱ］ＦＲＣ［ＫＱ］［ＮＴ］［ＧＴ］Ｒ［−Ｔ］Ｃ［ＩＬ］Ｐ［ＬＲ］［ＡＫ］［ＬＷ］［ＬＶ］ＣＤＧＶＤＤＣ［ＥＬ］
ＤＤＳＤＥ［ＡＫ］ＤＣ
【０２０２】
β−クロト−ファミリ−２０（第２のドメイン）モチ−フを含む例示的な配列は、以下の配列を含む：
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏ  ＷＤ３３  ＣＱＳＧＥＦＲＣＱＮＴＲＴＣＬＰＬＫＬＬＣＤＧＶＤＤＣＬＤＤＳＤＥＫＤＣ  （配列番号２８５）；および
ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏ  ＷＤ３４  ＣＬＰＧＱＦＲＣＫＴＧＲＣＩＰＲＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＤＳＤＥＡＤＣ  （配列番号２８６）。
【０２０３】
ＩＩＩ．  Ｄ．ＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−二重特異性結合タンパク質
ＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の両方に特異的に結合する、多くの結合タンパク質が作製された。これらの二重特異性結合タンパク質は、リンカ−を介して、様々な組み合わせで、ファミリ−１〜３のうちの１つから選択されるＦＧＦＲ１ｃ結合配列を、ファミリ−４〜２０のうちの１つから選択されるβ−クロト−結合配列につなぐことによって、形成された。二重特異性タンパク質を調製するために使用された、ファミリ−１〜３由来の配列は以下のとおりでであった：
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＫＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ
（配列番号２８７）
ＣＧＡＧＱＦＴＣＲＤＴＮＩＣＩＳＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＡＤＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ
（配列番号２８８）
ＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ
（配列番号２８９）
ＣＧＳＮＱＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＤＳＤＥＴＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ
（配列番号２９０）
ＣＬＳＤＱＦＴＣＲＳＴＮＩＣＬＰＬＱＷＶＣＤＧＤＤＤＣＥＤＮＳＤＥＥＤＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ
（配列番号２９１）
ＣＲＬＮＥＦＰＣＧＳＧＳＣＩＳＬＨＷＶＣＤＳＶＰＤＣＲＤＤＳＤＥＴＤＣＰＥＲＴ
（配列番号２９２）
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＶＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＤＳＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ
（配列番号２９３）
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＹＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ
（配列番号２９４）
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ
（配列番号２９５）
ＣＧＡＳＬＦＴＣＲＲＳＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＭＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ
（配列番号２９６）
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ
（配列番号２９７）
ＣＧＡＮＬＦＴＣＱＳＴＮＩＣＩＳＤＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＴＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ
（配列番号２９８）
ＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹＳＤＥＩＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ
（配列番号２９９）
ＣＧＳＤＭＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＫＶＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＤＳＤＥＲＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ
（配列番号３００）
ＣＧＳＮＬＦＴＣＲＲＴＮＩＣＩＳＫＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ
（配列番号３０１）
ＣＧＳＮＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＤＤＤＳＤＥＴＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ
（配列番号３０２）
ＣＧＴＮＬＦＴＣＲＳＴＮＭＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＶＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ
（配列番号３０３）。
【０２０４】
二重特異性タンパク質を調製するのに使用された、ファミリ−４〜２０由来の配列は以下のとおりでであった：
Ｍ０１  ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ
（配列番号３０４）
Ｍ４２  ＣＱＰＤＥＦＴＣＳＳＧＲＣＩＰＱＰＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ
（配列番号３０５）
Ｍ５０  ＣＨＳＦＮＱＦＥＣＲＮＧＱＣＩＰＬＨＬＶＣＤＧＶＰＤＣＧＤＮＳＤＥＴＤＣＧＤＳＨＩＬＰＦＳＴＰＧＰＳＴ  （配列番号３０６）
ＬＮＲ＿Ｍ０１    ＣＩＡＡＫＬＣＥＡＬＤＧＤＧＶＣＨＫＥＣＤＬＥＥＣＤＷＤＧＧＤＣＱＲＩＦＬＴＤＰＴ
（配列番号１２４３）
ＷＤ０１  ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴ  （配列番号３０７）
ＷＤ０２  ＣＬＰＤＥＦＱＣＳＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＰＳＳＥＦＲＣＮＮＧＲＣＩＰＬＨＷＶＣＤＧＤＤＤＣＱＤＮＳＤＥＴＤＣＥＲＳＧＲＴ  （配列番号３０８）
ＷＤ０３  ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＲＰＧＥＦＲＣＮＮＧＲＣＶＰＱＴＷＶＣＤＧＥＤＤＣＧＤＮＳＤＥＴＤＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３０９）
ＷＤ０４
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＬＳＤＱＦＲＣＧＮＧＲＣＶＰＲＡＷＬＣＤＧＤＮＤＣＱＤＧＳＤＥＴＮＣＥＱＰＴ  （配列番号６０１）
ＷＤ０５
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＬＰＧＱＦＰＣＧＮＧＲＣＩＰＥＴＷＬＣＤＧＤＤＤＣＱＤＧＳＤＥＫＧＣＡＱＰＴ（配列番号１２６４）
ＷＤ０６  ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＱＰＮＥＦＱＣＧＮＧＲＣＩＰＡＱＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＥＤＣＴＥＨＴ  （配列番号３１０）
ＷＤ０８
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＱＳＮＥＦＲＣＲＮＧＱＣＩＰＬＴＷＬＣＤＧＤＮＤＣＬＤＳＳＤＥＥＳＣＰＡＨＴ（配列番号６０３）
ＷＤ２１
ＣＡＰＧＥＦＴＣＫＮＴＧＲＣＩＰＬＮＷＲＣＤＧＤＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＤＣＰＡＰＴＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号６３３）
ＷＤ２２  ＣＰＡＤＥＦＲＣＳＮＴＧＲＣＶＰＬＳＷＬＣＤＧＥＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＮＣＫＡＨＴＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＴＣＫＡＰＶＰＴ  （配列番号３１１）
ＷＤ２５
ＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣＱＡＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号６４０）
ＷＤ２８
ＣＧＡＮＥＦＱＣＲＳＴＧＩＣＶＰＶＥＷＶＣＤＧＤＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＶＣＧＤＳＨＩＬＰＦＳＴＰＧＰＳＴＣＱＰＤＥＦＴＣＳＳＧＲＣＩＰＱＰＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号６４３）
ＷＤ２９  ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３１２）
ＷＤ３１  ＣＬＰＤＥＦＲＣＧＮＧＮＣＩＳＶＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＥＤＧＳＤＥＥＤＣＥＳＰＥＨＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３１３）。
【０２０５】
生成された二重特異性ポリペプチドは、以下の配列を含む（図２２および３２において要約される）。
Ｒ１ｃ  Ｍ１５−ｂＫＭ０１  （Ｃ２１１４）
ＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３１４）
Ｒ１ｃ  Ｍ１５−（Ｇ４Ｓ）  （配列番号２）−ｂＫＭ０１  （Ｃ２１３９）
ＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＧＧＧＧＳＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３１５）
Ｒ１ｃ  Ｍ１５−（Ｇ４Ｓ）２  （配列番号３）−ｂＫＭ０１  （Ｃ２１４０）
ＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３１６）
Ｒ１ｃ  Ｍ１５−（Ｇ４Ｓ）３  （配列番号４）−ｂＫＭ０１  （Ｃ２１２２）
ＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３１７）
ｂＫＭ０１−Ｒ１ｃ  Ｍ１５  （Ｃ２１３０）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３１８）
ｂＫＭ０１−（Ｇ４Ｓ）２  （配列番号３）−Ｒ１ｃ  Ｍ１５  （Ｃ２１３１）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＬＨＫＶＳＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３１９）
ｂＫＭ０１−（Ｇ４Ｓ）３  （配列番号４）−Ｒ１ｃ  Ｍ１５  （Ｃ２１３２）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＬＨＫＶＳＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３２０）
Ｒ１ｃ  Ｍ１５−ｂＫＭ４２  （Ｃ２１１６）
ＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＱＰＤＥＦＴＣＳＳＧＲＣＩＰＱＰＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３２１）
Ｒ１ｃ  Ｍ１５−（Ｇ４Ｓ）  （配列番号２）−ｂＫＭ４２  （Ｃ２１２０）
ＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＧＧＧＧＳＣＱＰＤＥＦＴＣＳＳＧＲＣＩＰＱＰＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３２２）
Ｒ１ｃ  Ｍ１５−（Ｇ４Ｓ）２  （配列番号３）−ｂＫＭ４２  （Ｃ２１４１）
ＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＣＱＰＤＥＦＴＣＳＳＧＲＣＩＰＱＰＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３２３）
Ｒ１ｃ  Ｍ１５−（Ｇ４Ｓ）３  （配列番号４）−ｂＫＭ４２  （Ｃ２１４２）ＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＣＱＰＤＥＦＴＣＳＳＧＲＣＩＰＱＰＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３２４）
ｂＫＭ４２−Ｒ１ｃ  Ｍ１５  （Ｃ２１３３）
ＣＱＰＤＥＦＴＣＳＳＧＲＣＩＰＱＰＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３２５）
ｂＫＭ４２−（Ｇ４Ｓ）  （配列番号２）−Ｒ１ｃ  Ｍ１５  （Ｃ２１３４）
ＣＱＰＤＥＦＴＣＳＳＧＲＣＩＰＱＰＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＳＬＧＧＧＧＳＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３２６）
ｂＫＭ４２−（Ｇ４Ｓ）２  （配列番号３）−Ｒ１ｃ  Ｍ１５  （Ｃ２１３５）
ＣＱＰＤＥＦＴＣＳＳＧＲＣＩＰＱＰＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＳＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３２７）
ｂＫＭ４２−（Ｇ４Ｓ）３  （配列番号４）−Ｒ１ｃ  Ｍ１５  （Ｃ２１３６）
ＣＱＰＤＥＦＴＣＳＳＧＲＣＩＰＱＰＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＳＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＬＦＭＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３２８）
Ｒ１ｃ  Ｍ１５−ｂＫＭ５０  （Ｃ２１１７）
ＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＨＳＦＮＱＦＥＣＲＮＧＱＣＩＰＬＨＬＶＣＤＧＶＰＤＣＧＤＮＳＤＥＴＤＣＧＤＳＨＩＬＰＦＳＴＰＧＰＳＴ  （配列番号３２９）
Ｒ１ｃ  Ｍ１５−（Ｇ４Ｓ）  （配列番号２）−ｂＫＭ５０  （Ｃ２１２１）
ＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＧＧＧＧＳＣＨＳＦＮＱＦＥＣＲＮＧＱＣＩＰＬＨＬＶＣＤＧＶＰＤＣＧＤＮＳＤＥＴＤＣＧＤＳＨＩＬＰＦＳＴＰＧＰＳＴ  （配列番号３３０）
Ｒ１ｃ  Ｍ１５−（Ｇ４Ｓ）２  （配列番号３）−ｂＫＭ５０  （Ｃ２１４３）
ＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＣＨＳＦＮＱＦＥＣＲＮＧＱＣＩＰＬＨＬＶＣＤＧＶＰＤＣＧＤＮＳＤＥＴＤＣＧＤＳＨＩＬＰＦＳＴＰＧＰＳＴ  （配列番号３３１）
Ｒ１ｃ  Ｍ１５−（Ｇ４Ｓ）３  （配列番号４）−ｂＫＭ５０  （Ｃ２１４４）
ＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＣＨＳＦＮＱＦＥＣＲＮＧＱＣＩＰＬＨＬＶＣＤＧＶＰＤＣＧＤＮＳＤＥＴＤＣＧＤＳＨＩＬＰＦＳＴＰＧＰＳＴ  （配列番号３３２）
ｂＫＭ５０−Ｒ１ｃ  Ｍ１５  （Ｃ２１３７）
ＣＨＳＦＮＱＦＥＣＲＮＧＱＣＩＰＬＨＬＶＣＤＧＶＰＤＣＧＤＮＳＤＥＴＤＣＧＤＳＨＩＬＰＦＳＴＰＧＰＳＴＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３３３）
ｂＫＭ５０−（Ｇ４Ｓ）  （配列番号２）−Ｒ１ｃ  Ｍ１５  （Ｃ２１３８）
ＣＨＳＦＮＱＦＥＣＲＮＧＱＣＩＰＬＨＬＶＣＤＧＶＰＤＣＧＤＮＳＤＥＴＤＣＧＤＳＨＩＬＰＦＳＴＰＧＰＳＴＧＧＧＧＳＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３３４）
ｂＫＷＤ０１＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ０１  （Ｃ３０９０）  ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＶＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＤＳＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３３５）；
ｂＫＷＤ０１＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ０４  （Ｃ３０９１）  ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＹＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３３６）；
ｂＫＷＤ０１＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ０５  （Ｃ３０９２）  ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３３７）；
ｂＫＷＤ０１＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ０６  （Ｃ３０９３）  ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＡＳＬＦＴＣＲＲＳＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＭＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３３８）；
ｂＫＷＤ０１＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ０９  （Ｃ３０９４）  ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３３９）；
ｂＫＷＤ０１＿Ｒ１ｃＭ２３ｍｕｔ１０  （Ｃ３０９５）  ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＡＮＬＦＴＣＱＳＳＮＩＣＩＳＤＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＴＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３４０）；
ｂＫＷＤ０１＿Ｒ１ｃＭ２３ｍｕｔ１１  （Ｃ３０９６）  ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹＳＤＥＩＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３４１）；
ｂＫＷＤ０１＿Ｒ１ｃＭ２３ｍｕｔ１４  （Ｃ３０９７）  ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＳＤＭＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＫＶＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＤＳＤＥＲＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３４２）；
ｂＫＷＤ０１＿Ｒ１ｃＭ２３ｍｕｔ１５  （Ｃ３０９８）  ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＳＮＬＦＴＣＲＲＴＮＩＣＩＳＫＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３４３）；
ｂＫＷＤ０１＿Ｒ１ｃＭ２３ｍｕｔ１６  （Ｃ３０９９）  ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＳＮＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＤＤＤＳＤＥＴＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３４４）；
ｂＫＷＤ０１＿Ｒ１ｃＭ２３ｍｕｔ１７  （Ｃ３１００）  ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＴＮＬＦＴＣＲＳＴＮＭＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＶＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３４５）；
ｂＫＷＤ０３＿Ｒ１ｃＭ１５  （Ｃ３１０２）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＲＰＧＥＦＲＣＮＮＧＲＣＶＰＱＴＷＶＣＤＧＥＤＤＣＧＤＮＳＤＥＴＤＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３４６）；
ｂＫＷＤ０６＿Ｒ１ｃＭ１５  （Ｃ３１０３）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＱＰＮＥＦＱＣＧＮＧＲＣＩＰＡＱＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＥＤＣＴＥＨＴＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３４７）；
ｂＫＷＤ２２＿Ｒ１ｃＭ１５  （Ｃ３１０４）
ＣＰＡＤＥＦＲＣＳＮＴＧＲＣＶＰＬＳＷＬＣＤＧＥＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＮＣＫＡＨＴＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＴＣＫＡＰＶＰＴＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３４８）；
ｂＫＷＤ２９＿Ｒ１ｃＭ１５  （Ｃ３１０５）
ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３４９）；
ｂＫＷＤ０６＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ０６  （Ｃ３１９２）  ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＱＰＮＥＦＱＣＧＮＧＲＣＩＰＡＱＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＥＤＣＴＥＨＴＣＧＡＳＬＦＴＣＲＲＳＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＴＤＥＭＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３５０）；
ｂＫＷＤ０６＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ０９  （Ｃ３１９３）  ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＱＰＮＥＦＱＣＧＮＧＲＣＩＰＡＱＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＥＤＣＴＥＨＴＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３５１）；
ｂＫＷＤ０６＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ１１  （Ｃ３１９４）  ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＱＰＮＥＦＱＣＧＮＧＲＣＩＰＡＱＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＥＤＣＴＥＨＴＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹＳＤＥＩＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３５２）；
ｂＫＷＤ０６＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ１７  （Ｃ３１９５）  ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＱＰＮＥＦＱＣＧＮＧＲＣＩＰＡＱＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＥＤＣＴＥＨＴＣＧＴＮＬＦＴＣＲＳＴＮＭＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＶＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３５３）；
ｂＫＷＤ２２＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ０６  （Ｃ３１９６）  ＣＰＡＤＥＦＲＣＳＮＴＧＲＣＶＰＬＳＷＬＣＤＧＥＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＮＣＫＡＨＴＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＴＣＫＡＰＶＰＴＣＧＡＳＬＦＴＣＲＲＳＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＭＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３５４）；
ｂＫＷＤ２２＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ０９  （Ｃ３１９７）  ＣＰＡＤＥＦＲＣＳＮＴＧＲＣＶＰＬＳＷＬＣＤＧＥＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＮＣＫＡＨＴＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＴＣＫＡＰＶＰＴＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３５５）；
ｂＫＷＤ２２＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ１１  （Ｃ３１９８）  ＣＰＡＤＥＦＲＣＳＮＴＧＲＣＶＰＬＳＷＬＣＤＧＥＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＮＣＫＡＨＴＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＴＣＫＡＰＶＰＴＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹＳＤＥＩＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３５６）；
ｂＫＷＤ２２＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ１７  （Ｃ３１９９）  ＣＰＡＤＥＦＲＣＳＮＴＧＲＣＶＰＬＳＷＬＣＤＧＥＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＮＣＫＡＨＴＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＴＣＫＡＰＶＰＴＣＧＴＮＬＦＴＣＲＳＴＮＭＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＶＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３５７）；
ｂＫＷＤ２９＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ０６  （Ｃ３２００）  ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＡＳＬＦＴＣＲＲＳＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＭＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３５８）；
ｂＫＷＤ２９＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ０９  （Ｃ３２０１）  ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３５９）；
ｂＫＷＤ２９＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ１１  （Ｃ３２０２）  ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹＳＤＥＩＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３６０）；
ｂＫＷＤ２９＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ１７  （Ｃ３２０３）  ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＴＮＬＦＴＣＲＳＴＮＭＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＶＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３６１）；
Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ０６＿ｂＫＷＤ２２  （Ｃ３２０４）
ＣＧＡＳＬＦＴＣＲＲＳＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＭＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＰＡＤＥＦＲＣＳＮＴＧＲＣＶＰＬＳＷＬＣＤＧＥＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＮＣＫＡＨＴＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＴＣＫＡＰＶＰＴ  （配列番号３６２）；
Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ０９＿ｂＫＷＤ２２  （Ｃ３２０５）
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＰＡＤＥＦＲＣＳＮＴＧＲＣＶＰＬＳＷＬＣＤＧＥＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＮＣＫＡＨＴＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＴＣＫＡＰＶＰＴ  （配列番号３６３）；
Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ１１＿ｂＫＷＤ２２  （Ｃ３２０６）
ＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹＳＤＥＩＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＰＡＤＥＦＲＣＳＮＴＧＲＣＶＰＬＳＷＬＣＤＧＥＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＮＣＫＡＨＴＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＴＣＫＡＰＶＰＴ  （配列番号３６４）；
Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ１７＿ｂＫＷＤ２２  （Ｃ３２０７）
ＣＧＴＮＬＦＴＣＲＳＴＮＭＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＶＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＰＡＤＥＦＲＣＳＮＴＧＲＣＶＰＬＳＷＬＣＤＧＥＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＮＣＫＡＨＴＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＴＣＫＡＰＶＰＴ  （配列番号３６５）；
Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ０６＿ｂＫＷＤ２９  （Ｃ３２０８）
ＣＧＡＳＬＦＴＣＲＲＳＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＭＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３６６）；
Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ０９＿ｂＫＷＤ２９  （Ｃ３２０９）
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３６７）；
Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ１１＿ｂＫＷＤ２９  （Ｃ３２１０）
ＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹＳＤＥＩＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３６８）；
Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ１７＿ｂＫＷＤ２９  （Ｃ３２１１）
ＣＧＴＮＬＦＴＣＲＳＴＮＭＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＶＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＰＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３６９）；
Ｒ１ｃＭ０３＿ＢＫＷＤ０１  （Ｃ２７３７）
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＫＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴ  （配列番号３７０）；
Ｒ１ｃＭ０３＿ＢＫＷＤ０２  （Ｃ２７３８）
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＫＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＬＰＤＥＦＱＣＳＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＰＳＳＥＦＲＣＮＮＧＲＣＩＰＬＨＷＶＣＤＧＤＤＤＣＱＤＮＳＤＥＴＤＣＥＲＳＧＲＴ  （配列番号３７１）；
ＢＫＷＤ０２＿Ｒ１ｃＭ０３  （Ｃ２７３９）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＳＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＰＳＳＥＦＲＣＮＮＧＲＣＩＰＬＨＷＶＣＤＧＤＤＤＣＱＤＮＳＤＥＴＤＣＥＲＳＧＲＴＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＫＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３７２）；
Ｒ１ｃＭ０３＿ＢＫＷＤ２５  （Ｃ２７４０）
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＫＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣＱＡＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３７３）；
Ｒ１ｃＭ０８＿ＢＫＷＤ０１  （Ｃ２７４１）
ＣＧＡＧＱＦＴＣＲＤＴＮＩＣＩＳＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＡＤＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴ  （配列番号３７４）；
ＢＫＷＤ０１＿Ｒ１ｃＭ０８  （Ｃ２７４２）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＡＧＱＦＴＣＲＤＴＮＩＣＩＳＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＡＤＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３７５）；
Ｒ１ｃＭ０８＿ＢＫＷＤ０２  （Ｃ２７４３）
ＣＧＡＧＱＦＴＣＲＤＴＮＩＣＩＳＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＡＤＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＬＰＤＥＦＱＣＳＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＰＳＳＥＦＲＣＮＮＧＲＣＩＰＬＨＷＶＣＤＧＤＤＤＣＱＤＮＳＤＥＴＤＣＥＲＳＧＲＴ  （配列番号３７６）；
ＢＫＷＤ０２＿Ｒ１ｃＭ０８  （Ｃ２７４４）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＳＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＰＳＳＥＦＲＣＮＮＧＲＣＩＰＬＨＷＶＣＤＧＤＤＤＣＱＤＮＳＤＥＴＤＣＥＲＳＧＲＴＣＧＡＧＱＦＴＣＲＤＴＮＩＣＩＳＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＡＤＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３７７）；
Ｒ１ｃＭ０８＿ＢＫＷＤ２５  （Ｃ２７４５）
ＣＧＡＧＱＦＴＣＲＤＴＮＩＣＩＳＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＡＤＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣＱＡＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３７８）；
Ｒ１ｃＭ１５＿ＢＫＷＤ０１  （Ｃ２７４７）
ＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴ  （配列番号３７９）；
Ｒ１ｃＭ３１＿ＢＫＷＤ２５  （Ｃ２７４８）
ＣＬＳＤＱＦＴＣＲＳＴＮＩＣＬＰＬＱＷＶＣＤＧＤＤＤＣＥＤＮＳＤＥＥＤＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣＱＡＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３８０）；
Ｒ１ｃＭ１５＿ＢＫＷＤ０２  （Ｃ２７４９）
ＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＬＰＤＥＦＱＣＳＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＰＳＳＥＦＲＣＮＮＧＲＣＩＰＬＨＷＶＣＤＧＤＤＤＣＱＤＮＳＤＥＴＤＣＥＲＳＧＲＴ  （配列番号３８１）；
ＢＫＷＤ０２＿Ｒ１ｃＭ１５  （Ｃ２７５０）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＳＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＰＳＳＥＦＲＣＮＮＧＲＣＩＰＬＨＷＶＣＤＧＤＤＤＣＱＤＮＳＤＥＴＤＣＥＲＳＧＲＴＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３８２）；
Ｒ１ｃＭ１５＿ＢＫＷＤ２５  （Ｃ２７５１）
ＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣＱＡＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３８３）；
ＢＫＷＤ０１＿Ｒ１ｃＭ２３  （Ｃ２７５２）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＳＮＱＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＤＳＤＥＴＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３８４）；
Ｒ１ｃＭ２３＿ＢＫＷＤ０２  （Ｃ２７５３）
ＣＧＳＮＱＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＤＳＤＥＴＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＬＰＤＥＦＱＣＳＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＰＳＳＥＦＲＣＮＮＧＲＣＩＰＬＨＷＶＣＤＧＤＤＤＣＱＤＮＳＤＥＴＤＣＥＲＳＧＲＴ  （配列番号３８５）；
ＢＫＷＤ０２＿Ｒ１ｃＭ２３  （Ｃ２７５４）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＳＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＰＳＳＥＦＲＣＮＮＧＲＣＩＰＬＨＷＶＣＤＧＤＤＤＣＱＤＮＳＤＥＴＤＣＥＲＳＧＲＴＣＧＳＮＱＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＤＳＤＥＴＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３８６）；
ＢＫＷＤ０１＿Ｒ１ｃＭ３１  （Ｃ２７５７）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＬＳＤＱＦＴＣＲＳＴＮＩＣＬＰＬＱＷＶＣＤＧＤＤＤＣＥＤＮＳＤＥＥＤＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３８７）；
ＢＫＷＤ０５＿Ｒ１ｃＭ０８  （Ｃ２７９２）
ＣＡＡＧＱＦＲＣＨＮＳＤＴＣＬＰＧＡＷＶＣＤＧＤＮＤＣＧＤＮＳＤＥＡＳＣＱＫＲＴＣＨＳＦＮＱＦＥＣＲＮＧＱＣＩＰＬＨＬＶＣＤＧＶＰＤＣＧＤＮＳＤＥＴＤＣＧＤＳＨＩＬＰＦＳＴＰＧＰＳＴＣＧＡＧＱＦＴＣＲＤＴＮＩＣＩＳＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＡＤＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３８８）；
ＢＫＷＤ０６＿Ｒ１ｃＭ０８  （Ｃ２７９３）
ＣＡＰＤＱＦＲＣＳＳＧＱＣＩＰＥＴＷＬＣＤＧＤＤＤＣＶＤＳＳＤＥＡＧＣＡＳＴＶＰＴＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＧＡＧＱＦＴＣＲＤＴＮＩＣＩＳＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＡＤＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３８９）；
ＢＫＷＤ０１＿Ｒ１ｃＭ１５  （Ｃ２７９４）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３９０）；
Ｒ１ｃＭ１５＿ＢＫＷＤ３１  （Ｃ２７９５）
ＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＬＰＤＥＦＲＣＧＮＧＮＣＩＳＶＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＥＤＧＳＤＥＥＤＣＥＳＰＥＨＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３９１）；
Ｒ１ｃＭ１５＿ＢＫＷＤ０６  （Ｃ２７９６）
ＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＡＰＤＱＦＲＣＳＳＧＱＣＩＰＥＴＷＬＣＤＧＤＤＤＣＶＤＳＳＤＥＡＧＣＡＳＴＶＰＴＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３９２）；
ｂＫＷＤ０２＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔＭ０９  （Ｃ４１６８）        ＣＬＰＤＥＦＱＣＳＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＰＳＳＥＦＲＣＮＮＧＲＣＩＰＬＨＷＶＣＤＧＤＤＤＣＱＤＮＳＤＥＴＤＣＡＱＰＴＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号１２６５）；
ｂＫＷＤ０３＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔＭ０９  （Ｃ４１６９）        ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＲＰＧＥＦＲＣＮＮＧＲＣＶＰＱＴＷＶＣＤＧＥＤＤＣＧＤＮＳＤＥＴＤＣＡＱＰＴＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号１２６６）；
ｂＫＷＤ０４＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔＭ０９  （Ｃ４１７０）        ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＬＳＤＱＦＲＣＧＮＧＲＣＶＰＲＡＷＬＣＤＧＤＮＤＣＱＤＧＳＤＥＴＮＣＥＱＰＴＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号１２６７）；
ｂＫＷＤ０５＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔＭ０９  （Ｃ４１７１）        ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＬＰＧＱＦＰＣＧＮＧＲＣＩＰＥＴＷＬＣＤＧＤＤＤＣＱＤＧＳＤＥＫＧＣＡＱＰＴＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号１２６８）；
ｂＫＷＤ０８＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔＭ０９  （Ｃ４１７３）        ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＱＳＮＥＦＲＣＲＮＧＱＣＩＰＬＴＷＬＣＤＧＤＮＤＣＬＤＳＳＤＥＥＳＣＰＡＨＴＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号１２６９）；
ｂＫＷＤ２１＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔＭ０９  （Ｃ４１７４）        ＣＡＰＧＥＦＴＣＫＮＴＧＲＣＩＰＬＮＷＲＣＤＧＤＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＤＣＰＡＰＴＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号１２７０）；
ｂＫＷＤ２５＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔＭ０９  （Ｃ４１７６）        ＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣＱＡＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号１２７１）；
ｂＫＷＤ２８＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔＭ０９  （Ｃ４１７７）        ＣＧＡＮＥＦＱＣＲＳＴＧＩＣＶＰＶＥＷＶＣＤＧＤＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＶＣＧＤＳＨＩＬＰＦＳＴＰＧＰＳＴＣＱＰＤＥＦＴＣＳＳＧＲＣＩＰＱＰＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号１２７２）；
Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔＭ０９＿ｂＫＷＤ０１  （Ｃ４１７８）
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴ（配列番号１２７３）；
ＬＮＲＭ０１＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔＭ０９  （Ｃ４３１１）
ＣＩＡＡＫＬＣＥＡＬＤＧＤＧＶＣＨＫＥＣＤＬＥＥＣＤＷＤＧＧＤＣＱＲＩＦＬＴＤＰＴＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号１２７４）；および
Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔＭ０９＿ＬＮＲＭ０１  （Ｃ４３１２）
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＩＡＡＫＬＣＥＡＬＤＧＤＧＶＣＨＫＥＣＤＬＥＥＣＤＷＤＧＧＤＣＱＲＩＦＬＴＤＰＴ（配列番号１２７５）
【０２０６】
ＩＶ．血清半減期の改善
本開示は、血液因子（たとえば血清アルブミン、免疫グロブリン、または赤血球）に結合する（たとえば選択的に結合する）単量体ドメインをさらに提供する。いくつかの実施形態では、本明細書において開示される単量体は、１０−３Ｍ未満の親和性（つまり１０−３Ｍの親和性よりも強力な結合）で血液因子に結合するであろう。いくつかの実施形態では、親和性（つまりＫＤ）は、１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８、または１０−９Ｍ未満である。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、単量体ドメインは、免疫グロブリンポリペプチドまたはその一部に結合する。
【０２０８】
したがって、本開示は、ヒトを含む動物における、たとえば、多量体または対象のタンパク質を含む結合タンパク質の血清半減期を延長するための方法を提供する。一実施形態では、方法は、血清アルブミン（たとえばヒト血清アルブミン）、ＩｇＧ、赤血球細胞などのような血液運搬分子または細胞などのような半減期エキステンダ−に特異的に結合する結合タンパク質として同定された単量体ドメインを最初に提供することを含む。次いで、半減期エキステンダ−結合単量体は、対象のタンパク質（たとえばＦＧＦＲ１ｃ、β−クロト−、もしくはＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の両方または異なる標的）に対して結合親和性を有する他の単量体ドメインに共有結合される。この複合体形成は、半減期延長をもたらし、多量体および／またはタンパク質（複数可）のタンパク分解性の分解および／または他の除去から多量体および／または結合タンパク質（複数可）を保護し、それによって、タンパク質および／または多量体の半減期を延長する。本明細書において開示される結合タンパク質のこの使用の１つの変形として、対象のタンパク質に共有結合された半減期エキステンダ−結合単量体を含む。対象のタンパク質は、単量体ドメイン、単量体ドメインの多量体、または合成薬剤を含むことができる。その代わりに、免疫グロブリンまたは赤血球のいずれかに結合する単量体は、上記の方法を使用して生成することができ、半減期延長に使用することができる。
【０２０９】
半減期エキステンダ−結合多量体は、典型的に、少なくとも２つのドメイン、キメラドメイン、突然変異誘発ドメイン（たとえばＦＧＦＲ１ｃに結合するもの、β−クロト−に結合するもの、または単量体のそれぞれのタイプのうちの１つ、および血液運搬分子または細胞に結合するもの）の多量体である。適したドメインは、半減期エキステンダ−への結合についてさらにスクリ−ニングされ、選択される、本明細書において記載されるものをすべて含む。半減期エキステンダ−結合多量体は、たとえば、半減期エキステンダ−結合活性についてあらかじめスクリ−ニングされる単量体ドメインを使用し、本明細書において記載される多量体を作製するための方法に従って生成される。分子の血清半減期は、たとえば少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、４００、５００、またはそれ以上の時間、延長することができる。
【０２１０】
半減期延長単量体ドメインは、結合タンパク質（たとえばＦＧＦＲ１ｃ、β−クロト−、またはＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の両方に結合する単量体ドメインを含むタンパク質）のＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端の両方に連結することができる。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、多量体は、ヒト血清アルブミンのＮ末端もしくはＣ末端または免疫グロブリンＧのＦｃドメインのＮ末端もしくはＣ末端に共有結合することができる。そのような融合は、天然の内因性血清アルブミンおよびＩｇＧによって使用される内皮におけるＦｃＲｎスカベンジャ−経路を通過する結果として、血清半減期を増強した。分子の血清半減期は、たとえば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、４００、５００、またはそれ以上の時間、延長することができる。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、Ｎ末端配列は、アミド連結化学作用を介してポリエチレングリコ−ル（ＰＥＧ）成分の追加を可能にするために、結合タンパク質に追加される。ＰＥＧの追加は、結合タンパク質の流体力学半径を増加させて、したがって、腎臓濾過を介しての排泄を低下させる。そのような目的のために入手可能なＰＥＧ分子は、一連の分子量で、直線状または分枝状分子のいずれかとして手に入る。
【０２１３】
Ｖ．多量体
多量体を生成するための方法は、本開示の他の態様を形成する。本明細書において記載される結合タンパク質のいくつかを含む多量体は、少なくとも２つの単量体ドメイン（たとえばＦＧＦＲ１ｃに結合する１つのドメインおよびβ−クロト−に結合する１つのドメイン、β−クロト−に結合する２つのドメイン、またはＦＧＦＲ１ｃに結合する２つのドメイン）を含む。たとえば、多量体は、２〜約１０の単量体ドメイン、２〜約８の単量体ドメイン、約３〜約１０の単量体ドメイン、約７の単量体ドメイン、約６の単量体ドメイン、約５の単量体ドメイン、または約４の単量体ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、多量体は、３または少なくとも３の単量体ドメインを含む。いくつかの実施形態では、多量体は、２、３、４、５、６、７、または８を超えない単量体ドメインを有する。単量体ドメインサイズの実現可能な範囲を考慮して、多量体は、たとえば、１００ｋＤ未満、９０ｋＤ未満、８０ｋＤ未満、７０ｋＤ未満、６０ｋＤ未満、５０ｋＤ未満、４０ｋＤ未満、３０ｋＤ未満、２５ｋＤ未満、２０ｋＤ未満、１５ｋＤ未満、１０ｋＤ未満とすることができるまたはより小さいもしくはより大きなものとすることができる。いくつかの場合では、単量体ドメインは、対象の標的分子（たとえばＦＧＦＲ１ｃまたはβ−クロト−）への結合について、あらかじめ選択されている。いくつかの実施形態では、多量体は、１０−３Ｍ未満の親和性（つまり１０−３Ｍの親和性よりも強力な結合）で、ＦＧＦＲ１ｃ、β−クロト−、もしくはＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の両方（またはたとえば、ＨＳＡもしくはＩｇＧなどのような血液因子）に結合するであろう。いくつかの実施形態では、親和性は、１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、または１０−１０Ｍ未満である。いくつかの実施形態では、多量体の親和性は、多量体におけるそれぞれの単量体ドメインの親和性の合計よりも強力（小さい）であろう。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、単量体ドメインはそれぞれ、１つの標的分子（たとえばＦＧＦＲ１ｃまたはβ−クロト−）に特異的に結合するが、他の実施形態では、単量体はそれぞれ、おそらく、同じ標的タンパク質上の異なる位置で、同じ標的分子（たとえばβ−クロト−またはＦＧＦＲ１ｃ）に結合する。これらの実施形態のいくつかでは、単量体はそれぞれ、標的分子上の異なる位置（エピト−プと類似性の）に結合する。同じ標的分子に結合する多数の単量体ドメインは、結合活性効果をもたらし、個々の単量体の親和性と比較して、標的分子に対する多量体の親和性の改善をもたらす。いくつかの実施形態では、多量体は、単量体ドメイン単独の親和性の少なくとも約１．５、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、または１０００倍の親和性を有する。いくつかの実施形態では、多量体の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上（たとえばすべて）の単量体は、カルシウムイオンまたは他のイオンなどのようなイオンに結合する。
【０２１５】
多量体は、単量体ドメインの様々な組み合わせを含むことができる。たとえば、単一の多量体では、単量体ドメインは、同一のものとすることができる（たとえば、ＦＧＦＲ１ｃに結合する２つ以上の同一のドメインもしくはβ−クロト−に結合する同一の２つ以上のドメイン）または異なるものとすることができる（たとえば、ＦＧＦＲ１ｃに結合する１つまたは複数のドメインおよびβ−クロト−に結合する１つまたは複数のドメイン）。さらに、選択された単量体ドメインは、同じ単量体ドメインファミリ−由来の様々な異なる単量体ドメインまたは異なるドメインファミリ−由来の様々な単量体ドメインまたは任意選択で、その両方の組み合わせを含むことができる。たとえば、単量体ドメインは、ＦＧＦＲ１ｃ結合単量体ドメインのファミリ−１〜３またはβ−クロト−結合単量体ドメインのファミリ−４〜１０から選択することができる。いくつかの実施形態では、単量体ドメインの少なくとも１つは、ファミリ−１〜３（ＦＧＦＲ１ｃ結合単量体）から選択され、他の単量体ドメインは、ファミリ−４〜１０（β−クロト−結合単量）から選択される。例示的なＦＧＦＲ１ｃ、β−クロト−、および二重特異性ＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−結合二量体が、本明細書において提供される。
【０２１６】
生成することができる多量体のさらなる例は、以下を含む：
（１）ホモ多量体（同じドメインの多量体、つまりＡ１−Ａ１−Ａ１−Ａ１）；
（２）同じドメインクラスの異なるドメインのヘテロ多量体（たとえばＡ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４）。たとえば、ヘテロ多量体は、Ａ１、Ａ２、Ａ３、およびＡ４が、特定のＬＤＬ受容体クラスＡドメインの様々な組換え変異体であるまたはＡ１、Ａ２、Ａ３、およびＡ４のいくつかが、ＬＤＬ受容体クラスＡドメインの非組換え変異体である多量体を含む。
（３）異なる単量体ドメインクラス由来のドメインのヘテロ多量体、たとえばＡ１−Ｂ２−Ａ２−Ｂ１。たとえば、Ａ１およびＡ２は、ＬＤＬ受容体クラスＡ由来の２つの異なる単量体ドメイン（組換えまたは非組換えのいずれか）であり、Ｂ１およびＢ２は、クラスＥＧＦ様ドメイン由来の２つの異なる単量体ドメイン（組換えまたは非組換えのいずれか）である。
【０２１７】
他の実施形態では、多量体は、異なる標的分子（たとえば血清アルブミン、免疫グロブリン、または赤血球などのような血液因子）に対して特異性を有する単量体ドメインを含む。たとえば、いくつかの実施形態では、多量体は、ＦＧＦＲ１ｃ、β−クロト−、またはＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の両方に結合する１、２、３、またはそれ以上の単量体ドメインおよび第２の標的分子に結合する少なくとも１つの単量体ドメインを含む。例示的な標的分子は、たとえば、多量体の血清半減期を延長する血清分子（たとえば免疫グロブリンまたは血清アルブミン）を含む。多量体の血清半減期を延長する例示的な分子は、たとえば、赤血球細胞（つまり赤血球）、ＩｇＧ、およびＨＳＡなどのような血清アルブミンを含む。多量体の例は、たとえば、ＦＧＦＲ１ｃ結合ドメインのファミリ−１〜３由来の単量体ドメインならびにβ−クロト−結合ドメインのファミリ−４〜１９由来の単量体（ならびに任意選択で、２、３、４、またはそれ以上のＦＧＦＲ１ｃおよび／またはβ−クロト−結合ドメイン）ならびに免疫グロブリン結合単量体ドメインを含むことができる。
【０２１８】
多量体ライブラリ−は、ホモ多量体、同じ単量体クラスの異なる単量体ドメインのヘテロ多量体または異なる単量体クラス由来の単量体ドメインのヘテロ多量体またはその組み合わせを含有することができる。
【０２１９】
本明細書において記載される単量体ドメインはまた、免疫ドメイン含有ヘテロ多量体（つまり少なくとも１つの免疫ドメイン変異体および１つの単量体ドメイン変異体を有する多量体）において容易に用いることもできる。したがって、多量体は、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、単一ドメイン抗体、単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）、またはＦａｂ断片などのような少なくとも１つの免疫ドメイン；およびたとえばＥＧＦ様ドメイン、Ｋｒｉｎｇｌｅドメイン、フィブロネクチンＩ型ドメイン、フィブロネクチンＩＩ型ドメイン、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、ＰＡＮドメイン、Ｇｌａドメイン、ＳＲＣＲドメイン、Ｋｕｎｉｔｚ／ウシ膵臓トリプシン阻害剤ドメイン、Ｋａｚａｌ型セリンプロテア−ゼ阻害剤ドメイン、トレフォイル（Ｐ型）ドメイン、フォンウィルブランド因子Ｃ型ドメイン、アナフィラトキシン様ドメイン、ＣＵＢドメイン、チログロブリンＩ型リピ−ト、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン、Ｓｕｓｈｉドメイン、Ｌｉｎｋドメイン、トロンボスポンジンＩ型ドメイン、免疫グロブリン様ドメイン、Ｃ型レクチンドメイン、ＭＡＭドメイン、フォンウィルブランド因子Ａ型ドメイン、ソマトメジンＢドメイン、ＷＡＰ型４ジスルフィドコアドメイン、Ｆ５／８Ｃ型ドメイン、ヘモペキシンドメイン、ＳＨ２ドメイン、ＳＨ３ドメイン、ラミニン型ＥＧＦ様ドメイン、Ｃ２ドメイン、またはその変異体などのような、少なくとも１つの単量体ドメインを有することができる。
【０２２０】
ドメインが連結されて、多量体を形成する前に、ドメインは、選択される必要はない。一方、ドメインは、連結されて多量体になる前に、標的分子に結合する能力について選択することができる。したがって、たとえば、多量体は、ある標的分子（たとえばβ−クロト−）に結合する２つのドメインおよび第２の標的分子（たとえばＦＧＦＲ１ｃ）に結合する第３のドメインおよび半減期修飾因子ドメインに結合する第４のドメインを含むことができる。図８を参照されたい。
【０２２１】
多量体は、１つまたは複数の以下の性質を有することができる：多価性、多特異的、単鎖、熱安定性、血清半減期および／または保存半減期の延長。さらに、どの単量体ドメインも、イオン（たとえば金属イオンもしくはカルシウムイオン）に結合することができずまたは１つ、１つを超える、もしくはすべての単量体ドメインがイオンに結合することができ、どの単量体ドメインも、ＬＤＬ受容体Ａドメインおよび／もしくＥＧＦ様ドメインに由来せずまたは１つ、１つを超える、もしくはすべての単量体ドメインがＬＤＬ受容体Ａドメインおよび／もしくＥＧＦ様ドメインに由来し得、少なくとも１つ、１つを超える、またはすべての単量体ドメインが、組換えとすることができ、ならびに／または少なくとも１つ、１つを超える、またはすべての単量体ドメインが、単量体ドメイン当たり１つ、２つ、３つ、または４つのジスルフィド結合を含むことができる。いくつかの実施形態では、多量体は、少なくとも２つの（または少なくとも３つの）単量体ドメインを含み、少なくとも１つの単量体ドメインは、組換え単量体ドメインであり、単量体ドメインは、カルシウムに結合する。いくつかの実施形態では、多量体は、少なくとも４つの単量体ドメインを含み、少なくとも１つの単量体ドメインは、組換えであり、
ａ．単量体ドメインはそれぞれ、３０〜１００アミノ酸であり、それぞれの単量体ドメインは、少なくとも１つのジスルフィド結合を含むまたは
ｂ．単量体ドメインはそれぞれ、３０〜１００アミノ酸であり、細胞外タンパク質に由来するまたは
ｃ．単量体ドメインはそれぞれ、３０〜１００アミノ酸であり、タンパク質標的に結合する。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、多量体は、少なくとも４つの単量体ドメインを含み、少なくとも１つの単量体ドメインは、組換えであり、
ａ．単量体ドメインはそれぞれ、３５〜１００アミノ酸であるまたは
ｂ．ドメインはそれぞれ、少なくとも１つのジスルフィド結合を含み、ヒトタンパク質および／もしくは細胞外タンパク質に由来する。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、多量体は、少なくとも２つの単量体ドメインを含み、少なくとも１つの単量体ドメインは、組換えであり、ドメインはそれぞれ、
ａ．２５〜５０アミノ酸長であり、少なくとも１つのジスルフィド結合を含むまたは
ｂ．２５〜５０アミノ酸長であり、細胞外タンパク質に由来するまたは
ｃ．２５〜５０アミノ酸であり、タンパク質標的に結合するまたは
ｄ．３５〜５０アミノ酸長である。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、多量体は、少なくとも２つの単量体ドメインを含み、少なくとも１つの単量体ドメインは、組換えであり、
ａ．単量体ドメインはそれぞれ、少なくとも１つのジスルフィド結合を含むまたは
ｂ．少なくとも１つの単量体ドメインは、細胞外タンパク質に由来するまたは
ｃ．少なくとも１つの単量体ドメインは、標的タンパク質に結合する。
【０２２５】
同定された単量体ドメインおよび／または多量体は、生物学的活性を有することができ、これは、選択されるまたは所望されるリガンドまたは標的の少なくとも選択的な結合を含むことを意味し、いくつかの実例では、代謝経路を刺激するまたは阻害するために、シグナルまたはメッセンジャ−として作用するために、細胞の活性を刺激するまたは阻害するなどのために、他の化合物の結合をブロックする能力をさらに含むであろう。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される結合タンパク質の１つまたは複数の単量体ドメインは、ＦＧＦＲ１ｃまたはβ−クロト−またはＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の両方に結合する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の単量体ドメインの結合は、ＦＧＦＲ１ｃもしくはβ−クロト−への他の分子の結合をブロックするまたは有意に、また、本明細書において提供される実施例において示されるように、ＦＧＦ２１のｉｎ  ｖｉｖｏにおける活性を模倣し、したがって、ＦＧＦ２１媒介性のシグナル伝達事象を活性化する。
【０２２６】
単量体ドメインおよび／または多量体を選択するために、単一のリガンドを使用することができるまたは任意選択で、様々なリガンドを使用することができる。単量体ドメインは、単一のリガンドまたは様々なリガンドに結合することができる。本発明の多量体は、単一のリガンドに対する多数の別々の結合部位を有することができるまたは任意選択で、様々なリガンドに対する多数の結合部位を有することができる。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、多量体は、同じまたは他の多量体に結合し、凝集体を形成する。凝集は、たとえば、２つの単量体ドメイン上の疎水性ドメインの存在によって媒介され、２つの単量体ドメインの間の非共有結合相互作用の形成をもたらすことができる。その代わりに、凝集は、他の多量体における単量体ドメインに対して結合特異性を有する多量体における１つまたは複数の単量体ドメインによって促進されてもよい。凝集体はまた、単量体ドメインまたは多量体に対する親和性ペプチドの存在により形成され得る。凝集体は、単一の多量体よりも多くの標的分子結合ドメインを含有することができる。
【０２２８】
細胞表面標的（たとえばβ−クロト−またはＦＧＦＲ１ｃ）および第２の標的の両方に対する親和性を有する多量体は、結合活性効果の増加のために提供されてもよい。いくつかの場合では、膜流動性は、相互作用の間隔および原子価を最適化する（自己集合により）際に、タンパク質リンカ−よりも可動性となり得る。いくつかの場合では、多量体は、それぞれ異なる細胞上にあるまたは一方は細胞上にあり、他方は多数の結合部位を有する分子上にある２つの異なる標的に結合するであろう。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、本明細書において開示される単量体または多量体は、融合タンパク質を形成するために他のポリペプチドに連結される。融合パ−トナ−が多量体を形成する場合、それは望ましいものとなり得るが、任意のポリペプチドを、融合パ−トナ−として使用することができる。たとえば、単量体または多量体は、たとえば、以下の抗体の位置または位置の組み合わせに融合することができる：
１．任意選択で、リ−ダ−ペプチドの直後およびドメイン開始点直前のＶＨ１および／もしくはＶＬ１ドメインのＮ末端（フレ−ムワ−ク領域１）；
２．ＶＨ１もしくはＶＬ１ドメインに取って代わるＣＨ１もしくはＣＬ１ドメインのＮ末端；
３．任意選択で、ＣＨ１ドメイン後およびヒンジ（Ｆｃ融合）におけるシステイン残基前の重鎖のＮ末端；
４．ＣＨ３ドメインのＮ末端；
５．任意選択で、短いリンカ−を介して最後のアミノ酸残基に付加されたＣＨ３ドメインのＣ末端；
６．ＣＨ３ドメインに取って代わるＣＨ２ドメインのＣ末端；
７．任意選択で、鎖間ジスルフィドを形成するシステイン後のＣＬ１もしくはＣＨ１ドメインのＣ末端；または
８．ＶＨ１もしくはＶＬ１ドメインのＣ末端。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるものなどのような、１つまたは複数の単量体または多量体ドメインは、医薬品を形成するために分子（たとえばタンパク質、核酸、有機小分子など）に連結される。結合タンパク質との融合に適している例示的な医薬タンパク質は、たとえばサイトカイン、抗体、ケモカイン、増殖因子、インタ−ロイキン、細胞表面タンパク質（たとえばＦＧＦＲ１ｃまたはβ−クロト−）、細胞外ドメイン、細胞表面受容体、細胞毒などを含む。例示的な小分子医薬品は、毒素または治療剤を含む。いくつかの実施形態では、金属が、本明細書において開示される結合タンパク質に結合することができる。これは、たとえば、ＭＲＩにおいて使用される造影剤として有用となり得る。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ポリペプチドが、単量体または多量体のＮ末端またはＣ末端に融合される。本明細書において記載されるように、異種配列は、アミノ酸配列または非アミノ酸含有ポリマ−とすることができる。ＨＳＡ配列（複数可）はまた、単量体または多量体に直接またはリンカ−もしくはアダプタ−分子を介して融合することができる。リンカ−またはアダプタ−分子は、１つまたは複数のアミノ酸残基（またはアミノ酸長）、たとえば１、２、３、４、５、６、７、８、または９残基（またはアミノ酸長）、好ましくは、１０〜５０アミノ酸残基（またはアミノ酸長）、たとえば１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０残基（またはアミノ酸長）、より好ましくは１５〜３５アミノ酸残基（またはアミノ酸長）とすることができる。リンカ−またはアダプタ−分子はまた、融合成分の分離を可能にするために、ＤＮＡ制限エンドヌクレア−ゼに対するまたはプロテア−ゼに対する切断部位を用いて設計することができる。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、単量体または多量体は、組織または疾患特異的標的タンパク質に結合するように選択される。組織特異的タンパク質は、動物における他の組織と比較して、１つまたはいくつかの特定の組織において独占的にまたは有意により高濃度で発現されるタンパク質である。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、標的タンパク質（たとえばＦＧＦＲ１ｃまたはβ−クロト−）が発現される特異的な組織または疾患関連性の細胞（複数可）を、結果として生じる複合体または融合物が標的にするように、１つまたは複数の標的タンパク質に結合する単量体または多量体は、医薬タンパク質または小分子に連結される。そのような複合体または融合物において使用される単量体または多量体は、標的タンパク質への結合について最初に選択することができ、続いて、結合が、他の非標的細胞または組織において低下するまたはなくなることが所望される他の細胞または組織に対する負の選択によって選択することができる（たとえば薬剤毒性の下限値を設定した骨髄または他の組織を標的にしないようにするように）。医薬品を感受性の組織から離して維持することによって、より高用量を安全に投与することができるように、治療濃度域を増加させる。他の代替では、ｉｎ  ｖｉｖｏパニングは、単量体または多量体のライブラリ−を動物に注射し、次いで、対象の特定の組織または細胞に結合する単量体または多量体を単離することによって、動物において実行することができる。
【０２３４】
本明細書において記載される結合タンパク質はまた、医薬タンパク質および単量体または多量体の間のリンカ−ペプチドを含むことができる。ペプチドリンカ−配列は、たとえば、ポリペプチドがそれぞれ、畳込みして、その二次構造および三次構造になるのを確実にするのに十分である距離だけ、ポリペプチド成分を分離するために用いることができる。融合タンパク質は、一般に、化学的なコンジュゲ−ションを含む標準的な技術を使用して調製することができる。融合タンパク質はまた、標準的な技術によって発現系において組換えタンパク質として発現させることができる。
【０２３５】
多量体または単量体ドメインは、当技術分野において公知の任意の方法に従って産生することができる。いくつかの実施形態では、誘発可能なプロモ−タ−の転写の制御下でポリペプチドをコ−ドするプラスミドを含む大腸菌が、タンパク質を発現させるために使用される。細菌を採取した後、それらは、超音波処理および均質化などのような機械的な方法によって、界面活性剤を用いる化学的な抽出、または熱の適用によって溶解し、次いで、遠心分離によって浄化することができる。
【０２３６】
ポリペプチドは、Ｎｉ−ＮＴＡアガロ−ス溶出（６×Ｈｉｓ（配列番号３９３）タグ付きの場合）またはＤＥＡＥセファロ−ス溶出（タグなしの場合）を使用して、精製することができ、透析によってなどのように再畳み込みさせることができる。ミスフォ−ルドタンパク質は、ヨ−ド酢酸を用いて遊離スルフヒドリルをキャップすることによって中和することができる。Ｑセファロ−ス溶出、フェニルセファロ−スフロ−スル−、ブチルセファロ−スフロ−スル−、ＳＰセファロ−ス溶出、ＤＥＡＥセファロ−ス溶出、および／またはＣＭセファロ−ス溶出は、ポリペプチドを精製するために使用することができる。同等のな陰イオンおよび／または陽イオン交換精製ステップもまた、用いることができる。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、単量体または多量体は、熱溶解、典型的に、それに続く、ほとんどのタンパク質が再生するのを予防するための急速な冷却を使用して精製することができる。本明細書において開示されるタンパク質の熱安定性により、所望のタンパク質は、熱によって変性されず、そのため、高純度をもたらす精製ステップを可能にするであろう。いくつかの実施形態では、細菌細胞培養物から単量体または多量体を精製するために連続的なフロ−加熱プロセスが、使用される。たとえば、細胞懸濁液は、細菌の溶解をもたらす温度（たとえば約６５〜１００℃）に設定されたウォ−タ−バス中に浸水させたステンレススチ−ルコイルを通過させることができる。溶解された流出物は、冷却バスに送られ、急速冷却を達成し、変性した大腸菌タンパク質の再生を予防する。大腸菌タンパク質は、変性し、再生を予防されるが、単量体または多量体は、それらの足場の例外的な安定性によりこれらの条件下で変性しない。加熱時間は、流速およびコイルの長さを調節することによって制御することができる。このアプロ−チにより、代替アプロ−チと比較して、高度な収率および例外的に高度な純度（たとえば＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９６％、＞９７％、＞９８％、または＞９９％）を有する活性なタンパク質が得られ、臨床材料の大規模生産に適用可能である。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、本明細書において記載される単量体または多量体の生成後に、結合タンパク質は、ジスルフィド結合による連結の混乱を予防するためにヨ−ド酢酸を含む溶液において保存される。いくつかの実施形態では、０．１〜１００ｍＭ（たとえば１〜１０ｍＭ）ヨ−ド酢酸が、保存のために溶液中に含まれる。所望の場合、ヨ−ド酢酸は、個体に投与される前に除去することができる。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、単量体または多量体を含むポリペプチドは、たとえばタンパク質安定性のために、それ自体に（Ｃ末端からＮ末端に）連結される。
【０２４０】
ＶＩ．リンカ−
単量体ドメインは、リンカ−によってつながれ、多量体を形成することができる。たとえば、リンカ−は、多量体におけるそれぞれの個別の別々の単量体ドメインの間に位置することができる。
【０２４１】
リンカ−を介して選択された単量体ドメインをつなぐことは、当技術分野において知られている様々な技術を使用して達成することができる。たとえば、選択される単量体ドメインをコ−ドするポリヌクレオチドのコンビナトリアル構築は、制限消化および再連結によって、ＰＣＲベ−スのセルフプライミングオ−バ−ラップ反応（ｓｅｌｆ−ｐｒｉｍｉｎｇ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、または他の組換え法によって達成することができる。リンカ−は、単量体が、標的多量体に結合するその能力について同定される前にまたは単量体が、標的多量体に結合する能力について選択された後に単量体に結合することができる。
【０２４２】
リンカ−は、天然に存在する、合成、またはその両方の組み合わせのものとすることができる。たとえば、合成リンカ−は、たとえば配列およびサイズの両方がランダム化されたリンカ−とすることができる。一態様では、ランダム化されたリンカ−は、完全にランダム化された配列を含むことができ、または任意選択で、ランダム化されたリンカ−は、天然リンカ−配列に基づくものとすることができる。リンカ−は、たとえば非ポリペプチド成分、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはその他同種のものを含むことができる。図９を参照されたい。そこでは本明細書において提供される結合タンパク質の成分を形成することができるヒトゲノムから採取されるＡドメインリンカ−において天然に存在する多様性に基づくリンカ−の例を提供する。
【０２４３】
リンカ−は、強固な、可動性の、またはその両方の組み合わせのものとすることができる。リンカ−可動性は、リンカ−およびリンカ−が相互作用する単量体ドメインの両方の組成に依存し得る。リンカ−は、２つの選択される単量体ドメインをつなぎ、個別の別々の単量体ドメインとして単量体ドメインを維持する。リンカ−は、個別の別々の単量体ドメインが、協働するが、多量体における同じリガンドに対する多数の個別の結合部位またはたとえば多量体における異なるリガンドに対する多数の個別の結合部位などのような個別の特性をさらに維持することを可能にすることができる。リンカ−は、リガンド（複数可）とそれ自体、相互作用し、多量体を構成する単量体によって提供されるそれらの結合部位に加えて、結合部位を提供することができる。
【０２４４】
２つ以上の単量体ドメインが結び付けられることになっている特定の場合に適したリンカ−の選択は、たとえば、単量体ドメインの性質、ポリペプチド多量体が結合するはずである標的の構造および性質、ならびに／またはタンパク質分解および酸化に対するペプチドリンカ−の安定性を含む、様々なパラメ−タに依存し得る。
【０２４５】
本開示は、一度所望の単量体ドメイン／変異体が同定されたら、リンカ−の選択を最適化するための方法を提供する。一般に、単量体ドメイン組成に関して固定されているが、リンカ−の組成および長さが多様な組成物を有する多量体のライブラリ−は、上記に記載されるように、容易に調製し、スクリ−ニングすることができる。
【０２４６】
リンカ−のさらなる考察は、たとえば、参照によって本明細書において組み込まれる米国特許出願公開第２００５／００４８５１２号において見出すことができる。
【０２４７】
ＶＩＩ．標的分子に対する親和性を有する単量体または多量体の同定
当業者らは、所望の特性（たとえば結合親和性）を有する単量体ドメインを容易に同定することができる。この点では、所望の特性（たとえば特異的な結合特性）を有するドメインの選択をもたらす任意の方法を使用することができる。たとえば、方法は、それぞれの核酸が単量体ドメインをコ−ドする、複数の異なる核酸を提供すること、複数の異なる核酸を翻訳し、それによって、複数の異なる単量体ドメインを提供すること、所望のリガンドまたはリガンドの混合物の結合について複数の異なる単量体ドメインをスクリ−ニングすること、および所望のリガンドまたはリガンドの混合物に結合する複数の異なる単量体ドメインのメンバ−を同定することを含むことができる。
【０２４８】
さらに、部位特異的変異誘発およびランダム突然変異誘発（たとえば化学的突然変異誘発）などのような突然変異誘発の任意の方法を、たとえば単量体ドメインライブラリ−用の単量体ドメインを産生するために使用することができる。いくつかの実施形態では、エラ−プロ−ンＰＣＲを、変異体を生成するために用いることができる。さらなる方法は、複数の天然に存在する単量体ドメインにおける保存アミノ酸をアライメントすることによって、複数の天然に存在する単量体ドメインをアライメントすることおよび組換え単量体ドメインを生成するために、保存アミノ酸を維持し、保存アミノ酸のまわりにアミノ酸を挿入する、欠失させる、または改変することによって、組換え単量体ドメインを設計することを含む。一実施形態では、保存アミノ酸は、システインを含む。他の実施形態では、挿入ステップは、ランダムなアミノ酸を使用するまたは任意選択で、挿入ステップは、天然に存在する単量体ドメインの一部を使用する。その一部は、理想的には、同じファミリ−由来のドメイン由来のル−プをコ−ドすることができる。アミノ酸は、合成オリゴヌクレオチドを使用してまたはシャフリングによってまたは制限酵素ベ−スの組換えによって挿入されるまたは交換される。本開示のヒトキメラドメインを、最小限の免疫原性が所望される治療上の適用において用いることができる。本開示は、ヒトキメラドメインのライブラリ−を生成するための方法を提供する。ヒトキメラ単量体ドメインライブラリ−は、上記に記載されるように、ヒト単量体ドメインの様々な変異体由来のル−プ配列を組み合わせることによって構築することができる。組み合わせられるル−プ配列は、配列により定められるル−プ、構造により定められるル−プ、Ｂ因子により定められるル−プ、またはその任意の２以上の組み合わせとすることができる。
【０２４９】
その代わりに、ヒトキメラドメインライブラリ−は、ル−プレベルと比較して、アミノ酸レベルで、天然に存在するヒト単量体ドメインを修飾することによって生成することができる。いくつかの実施形態では、免疫原性の可能性を最小限にするために、ヒト単量体ドメインの同じファミリ−由来のタンパク質配列中に天然に存在する残基のみ、キメラ配列を生成するために利用される。これは、単量体ドメインの同じファミリ−由来の少なくとも２つのヒト単量体ドメインの配列アライメントを提供し、ヒト単量体ドメインの間で異なるヒト単量体ドメイン配列における対応する位置におけるアミノ酸残基を同定し、２つ以上のヒトキメラ単量体ドメインを生成することによって、達成することができ、ヒトキメラ単量体ドメイン配列はそれぞれ、単量体ドメインの同じファミリ−由来の２つ以上のヒト単量体ドメイン由来の残基にタイプおよび位置が対応するアミノ酸残基から成る。ヒトキメラ単量体ドメインのライブラリ−は、標的分子への結合について、ヒトキメラ単量体ドメインのライブラリ−をスクリ−ニングし、標的分子に結合するヒトキメラ単量体ドメインを同定することによって、対象の標的に結合するヒトキメラ単量体ドメインを同定するために用いることができる。最初の配列アライメントステップにおいて用いられる適した天然に存在するヒト単量体ドメイン配列は、本明細書において記載される天然に存在する単量体ドメインのいずれかに対応するものを含む。
【０２５０】
本開示のヒト単量体変異体ライブラリ−のドメイン（様々なル−プまたは単一のアミノ酸残基によって生成されるかどうかに関わらず）は、当業者らに知られている方法によって調製することができる。これらのライブラリ−を生成するのに特に適している方法は、参照によって本明細書において組み込まれるＷＯ０１／２３４０１において記載されるスプリットプ−ル（ｓｐｌｉｔ−ｐｏｏｌ）方式およびトリヌクレオチド合成方式である。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、本開示の単量体ドメインは、
（ａ）候補タンパク質配列を提供し、
（ｂ）候補タンパク質配列をヒトタンパク質配列のデ−タベ−スと比較し、
（ｃ）デ−タベ−スから、ヒトタンパク質配列の一部に対応する候補タンパク質配列の一部を特定し、かつ
（ｄ）候補タンパク質配列およびデ−タベ−スからのヒトタンパク質配列の一致の程度を決定することによって潜在的な免疫原性についてスクリ−ニングされる。
【０２５２】
一般に、候補タンパク質配列およびデ−タベ−ス由来の１つまたは複数のヒトタンパク質配列の間の一致の程度が大きいほど、デ−タベ−ス由来のヒトタンパク質配列のいずれともほとんど一致していない候補タンパク質と比較して推定される免疫原性の可能性は低くなる。候補タンパク質をスクリ−ニングするための本発明の方法の実施において使用するのに適しているヒトタンパク質配列のデ−タベ−スは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブサイトで見出すことができる。このウェブサイトは、配列の間の局所性の類似性の領域を見つけるために使用することができる資源として基本的な局所性アライメント検索ツ−ル（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ，ＢＬＡＳＴ）アルゴリズムを提供する。プログラムは、デ−タベ−スを配列決定するためにヌクレオチドまたはタンパク質配列を比較し、一致の統計的有意性を計算する。比較のために入手可能なデ−タベ−スは、多くの脊椎動物、無脊椎動物、植物、菌類、原生動物、原核生物、および始生代の種の全ゲノム由来の配列情報を含有する。ＢＬＡＳＴは、配列の機能的なおよび進化の関係を推測するために、ならびに遺伝子ファミリ−のメンバ−を同定するのを支援するために使用することができる。ＮＣＢＩで入手可能な第２のツ−ル、ＣＯＢＡＬＴ（制約条件ベ−スのアライメントツ−ル）は、デ−タベ−ス検索に適用することができる多数の配列の同時のアライメントを可能にする。これらの方法は、たとえばキメラ単量体ドメインなどのようなキメラタンパク質におけるクロスオ−バ−配列が、免疫原性の事象を引き起こすかどうかを決定するのに特に有用である。クロスオ−バ−配列がヒトタンパク質配列のデ−タベ−スにおいて見出される配列の一部に対応する場合、クロスオ−バ−配列は、免疫原性の事象を引き起こす可能性がより少ない。
【０２５３】
デ−タベ−ス由来のヒトタンパク質配列の一部に関する情報は、ヒト様キメラタンパク質のタンパク質ライブラリ−を設計するために使用することができる。そのようなライブラリ−は、天然に存在するヒトタンパク質中に存在する「クロスオ−バ−配列」に関する情報を使用することによって生成することができる。本明細書において使用される、「クロスオ−バ−配列」という用語は、少なくとも１つの天然に存在するヒトタンパク質中にその全体が見つけられ、配列の一部が、２つ以上の天然に存在するタンパク質中に見出される配列を指す。したがって、後者の２つ以上の天然に存在するタンパク質の組換えにより、配列のキメラ部分が、実際に、他の天然に存在するタンパク質中に見出される配列に対応するキメラタンパク質が生成されるであろう。クロスオ−バ−配列は、第１のアミノ酸位置が、第１および第２の天然に存在するヒトタンパク質配列中に見出されるのとタイプおよび位置が同一であるが、第３の天然に存在するヒトタンパク質配列とはそうでない、アミノ酸残基によって占められる、連続する２つのアミノ酸残基位置のキメラジャンクションを含有する。第２のアミノ酸位置は、第２および第３の天然に存在するヒトタンパク質配列中に見出されるのとタイプおよび位置が同一であるが、第１の天然に存在するヒトタンパク質配列とはそうでない、アミノ酸残基によって占められる。言いかえれば、上に記載されるように、「第２の」天然に存在するヒトタンパク質配列は、クロスオ−バ−配列がその全体で現れる天然に存在するヒトタンパク質に対応する。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、ヒト様キメラタンパク質のライブラリ−は、
（ａ）タンパク質の同じファミリ−由来のタンパク質に対応する、デ−タベ−ス由来のヒトタンパク質配列を特定し、タンパク質の同じファミリ−由来のヒトタンパク質配列を参照タンパク質配列とアライメントし、
（ｂ）同じファミリ−の様々なヒトタンパク質配列に由来する部分配列のセットを特定し、部分配列はそれぞれ、様々な天然に存在するヒトタンパク質配列に由来する、少なくとも１つの他の部分配列と同一性の領域を共有しており、
（ｃ）第１、第２、および第３の部分配列からキメラジャンクションを特定し、そこで部分配列はそれぞれ、様々な天然に存在するヒトタンパク質配列に由来し、キメラジャンクションは、第１のアミノ酸位置が、第１および第２の天然に存在するヒトタンパク質配列と共通するが、第３の天然に存在するヒトタンパク質配列とはそうでない、アミノ酸残基によって占められ、第２のアミノ酸位置が、第２および第３の天然に存在するヒトタンパク質配列に共通のアミノ酸残基によって占められる、連続する２つのアミノ酸残基位置を含み、それぞれ、部分配列のセット由来の２つ以上の部分配列に配列が対応し、それぞれ、１つまたは複数の同定されたキメラジャンクションを含むヒト様キメラタンパク質分子を生成することによって生成される。
【０２５５】
したがって、たとえば、第１の天然に存在するヒトタンパク質配列がＡ−Ｂ−Ｃであり、第２がＢ−Ｃ−Ｄ−Ｅであり、第３がＤ−Ｅ−Ｆである場合、キメラジャンクションは、Ｃ−Ｄである。その代わりに、第１の天然に存在するヒトタンパク質配列がＤ−Ｅ−Ｆ−Ｇであり、第２がＢ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆであり、第３がＡ−Ｂ−Ｃ−Ｄである場合、キメラジャンクションは、Ｄ−Ｅである。ヒト様キメラタンパク質分子は、様々な方法で生成することができる。たとえば、キメラジャンクションをコ−ドする配列を含むオリゴヌクレオチドは、ヒト様キメラタンパク質およびそのライブラリ−を生成するために、部分配列の上記セット由来の２つ以上の部分配列に配列が対応するオリゴヌクレオチドと組換えることができる。天然に存在するヒトタンパク質をアライメントするために使用される参照配列は、天然に存在するヒトタンパク質の同じファミリ−由来の配列またはファミリ−におけるタンパク質のキメラもしくは他の変異体である。
【０２５６】
天然に存在する単量体ドメインの断片をコ−ドする核酸はまた、完全長修飾単量体ドメインを生成するために、（たとえば化学的または酵素により産生される断片を使用することによって）混合するおよび／または組換えることもできる。断片および単量体ドメインはまた、ドメインまたはその断片をコ−ドする核酸を操作することによって組換えることもできる。たとえば、単量体ドメインの断片をコ−ドする核酸構築物の連結を、改変された単量体ドメインを生成するために使用することができる。
【０２５７】
改変された単量体ドメインはまた、ペプチド配列の保存、ランダム、擬似ランダム、または定義される配列をコ−ドする合成オリゴヌクレオチド（たとえば重複オリゴヌクレオチド）の収集物を提供することによって、生成され、次いで、単量体ドメインをコ−ドするポリヌクレオチド中に連結によって所定の部位に挿入することができる。同様に、１つまたは複数の単量体ドメインの配列多様性は、部位特異的変異誘発、突然変異、擬似ランダム突然変異、限定ｋｅｒｎａｌ突然変異（ｄｅｆｉｎｅｄ  ｋｅｒｎａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）、コドンベ−スの突然変異、およびその他同種のものを用いて単量体ドメインを突然変異させることによって拡張することができる。結果として生ずる核酸分子は、クロ−ニングおよび増幅のために宿主において増やすことができる。いくつかの実施形態では、核酸は、シャフルされる。
【０２５８】
本開示はまた、単量体ドメインをコ−ドする複数の核酸を組換え、所望のリガンドまたはリガンドの混合物またはその他同種のものに結合する単量体ドメインについて、結果として生じるライブラリ−をスクリ−ニングする方法を提供する。選択された単量体ドメイン核酸はまた、たとえば、天然様の機能的単量体ドメインを産生するために、選択される配列と実質的に同一の野生型または天然に存在する配列と戻し交雑することによってなどのように、中性の配列（つまり結合に対して実質的ではない機能効果を有する配列）をコ−ドするポリヌクレオチド配列とシャフリングすることによって、戻し交雑することもできる。一般に、戻し交雑の間に、続く選択は、特性、たとえば、リガンドへの結合を保持するように適用される。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、単量体ライブラリ−は、シャフリングによって調製される。そのような場合では、単量体ドメインは、単量体ドメインをコ−ドする核酸配列をコンビナトリアルに組換えるために単離され、シャフルされる（組換えは、単量体ドメインの間でもしくは単量体ドメイン内でまたはその両方で起こり得る）。第１のステップは、所望の特性（たとえばある種のリガンドに対する親和性）を有する単量体ドメインを同定することを含む。組換えの間に保存アミノ酸を維持しながら、単量体ドメインをコ−ドする核酸配列を組換えることができるまたは組換え、つないで、多量体にすることができる。
【０２６０】
本明細書において開示される方法および組成物の利点は、単量体ドメインおよび／または多量体を選択するために、公知のリガンドまたは未知のリガンドを使用することができるということである。リガンド構造に関する事前の情報は、対象の単量体ドメインまたは対象の多量体を単離するために必要とされない。同定された単量体ドメインおよび／または多量体は、生物学的活性を有し得、これは、選択されるまたは所望されるリガンドに対して少なくとも特異的な結合親和性を含むことが意図され、いくつかの実例では、代謝経路を刺激するまたは阻害するために、シグナルまたはメッセンジャ−として作用するために、細胞の活性を刺激するまたは阻害するなどのために、他の化合物の結合をブロックする能力をさらに含むであろう。単量体ドメインはまた、天然リガンドがまだ同定されていない受容体（オ−ファン受容体）に対するリガンドとして機能するように生成することができる。これらのオ−ファンリガンドは、それらが結合する受容体をブロックするまたは活性化するように生成することができる。
【０２６１】
単量体ドメインおよび／または多量体を選択するために、単一のリガンドを使用することができるまたは任意選択で、様々なリガンドを使用することができる。本開示の単量体ドメインは、単一のリガンドまたは様々なリガンドに結合することができる。本開示の多量体は、単一のリガンドに対する多数の別々の結合部位を有することができるまたは任意選択で、様々なリガンドに対する多数の結合部位を有することができる。
【０２６２】
いくつかの実施形態では、多量体または単量体は、複数の（たとえば２、３、またはそれ以上）様々な種由来のタンパク質に結合する能力についてスクリ−ニングされる。たとえば、ヒトおよび霊長動物のオルソロガスタンパク質は、スクリ−ニングし、それによって、ヒトおよび霊長動物の両方由来のタンパク質（たとえばＩｇＧ、ＨＳＡ、他の血清半減期エキステンダ−、または他のタンパク質）に結合するポリペプチドを生成することができ、それによって、ヒトにおいて使用のための、霊長動物における毒性の分析を容易にする。
【０２６３】
本明細書において開示される方法によって産生される組成物もまた、開示される。たとえば、本開示は、本明細書において開示される方法によって産生される単量体ドメインを含む１つのおよび／または複数のライブラリ−から選択されるもしくは同定される単量体ドメインを含む。
【０２６４】
本開示はまた、単量体ドメインのライブラリ−および単量体ドメインをコ−ドする核酸のライブラリ−をも提供する。ライブラリ−は、単量体ドメインをコ−ドする、たとえば約１００、２５０、５００、もしくはそれ以上の核酸を含むことができるか、あるいはライブラリ−は、単量体ドメインをコ−ドする、たとえば約１００、２５０、５００、もしくはそれ以上のポリペプチドを含むことができる。ライブラリ−は、同じシステインフレ−ムを含有する単量体ドメイン、たとえばＡドメインまたはＥＧＦ様ドメインを含むことができる。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、変異体は、単量体ドメイン（たとえばＬＤＬ受容体クラスＡドメイン）の同じファミリ−由来の２つ以上の異なる配列を組換えることによって生成される。その代わりに、様々なファミリ−由来の２つ以上の異なる単量体ドメインを、多量体を形成するために組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、多量体は、以下のファミリ−クラスの少なくとも１つの単量体または単量体変異体から形成される：ＥＧＦ様ドメイン、Ｋｒｉｎｇｌｅドメイン、フィブロネクチンＩ型ドメイン、フィブロネクチンＩＩ型ドメイン、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、ＰＡＮドメイン、Ｇｌａドメイン、ＳＲＣＲドメイン、Ｋｕｎｉｔｚ／ウシ膵臓トリプシン阻害剤ドメイン、Ｋａｚａｌ型セリンプロテア−ゼ阻害剤ドメイン、トレフォイル（Ｐ型）ドメイン、フォンウィルブランド因子Ｃ型ドメイン、アナフィラトキシン様ドメイン、ＣＵＢドメイン、チログロブリンＩ型リピ−ト、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン、Ｓｕｓｈｉドメイン、Ｌｉｎｋドメイン、トロンボスポンジンＩ型ドメイン、免疫グロブリン様ドメイン、Ｃ型レクチンドメイン、ＭＡＭドメイン、フォンウィルブランド因子Ａ型ドメイン、ソマトメジンＢドメイン、ＷＡＰ型４ジスルフィドコアドメイン、Ｆ５／８Ｃ型ドメイン、ヘモペキシンドメイン、ＳＨ２ドメイン、ＳＨ３ドメイン、ラミニン型ＥＧＦ様ドメイン、Ｃ２ドメイン、およびその誘導体。他の実施形態では、単量体ドメインおよび様々な単量体ドメインは、Ｐｆａｍデ−タベ−スおよび／またはＳＭＡＲＴデ−タベ−スにおいて見出される１つまたは複数のドメインを含むことができる。上記の方法によって産生されるライブラリ−、ライブラリ−の１つまたは複数のメンバ−を含む１つまたは複数の細胞、およびライブラリ−の１つまたは複数のメンバ−を含む１つまたは複数のディスプレイもまた、本開示の態様を形成する。
【０２６６】
任意選択で、単量体ドメインをコ−ドする核酸文字列のデ−タセットを、たとえば、単量体ドメインをコ−ドする第１の文字列を、様々な単量体ドメインをコ−ドする１つまたは複数の文字列と混合し、それによって、本明細書において記載されたものを含む、単量体ドメインをコ−ドする核酸文字列のデ−タセットを産生することによって生成することができる。他の実施形態では、単量体ドメインおよび様々な単量体ドメインは、Ｐｆａｍデ−タベ−スおよび／またはＳＭＡＲＴデ−タベ−スにおいて見出される１つまたは複数のドメインを含むことができる。方法は、単量体ドメインをコ−ドする第１の文字列および様々な単量体ドメインをコ−ドする１つまたは複数の第２の文字列をコンピュ−タ−に挿入することならびにコンピュ−タ−においてその多量体文字列（複数可）またはライブラリ−（複数可）を生成することをさらに含むことができる。
【０２６７】
ライブラリ−は、所望のリガンドまたはリガンドの混合物の結合などのような所望の特性についてスクリ−ニングすることができる。たとえば、単量体ドメインのライブラリ−のメンバ−は、ディスプレイし、公知もしくは未知のリガンドまたはリガンドの混合物への結合についてあらかじめスクリ−ニングすることができる。次いで、単量体ドメイン配列は、突然変異誘発する（たとえば、組換える、化学的に改変する）または他の方法で改変することができ、新しい単量体ドメインは、改善された親和性のリガンドまたはリガンドの混合物への結合について再びスクリ−ニングすることができる。選択される単量体ドメインは、組み合わせまたはつなぎ、多量体を形成することができ、次いで、これらは、リガンドまたはリガンドの混合物に対する改善された親和性もしくは結合活性または特異性の改変についてスクリ−ニングすることができる。改変はされた特異性は、特異性が広げられる、たとえば、複数の関連するウイルスの結合を意味し得、または任意選択で、特異性の改変は、特異性が狭くなること、たとえばリガンドの特異的な領域内での結合を意味し得る。当業者らは、結合活性を計算するのに入手可能な多くの方法があることを認識するであろう。たとえばＭａｍｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ３７：２７５４−２７９４  （１９９８）；Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２６１：１４９−１５８  （１９９８）を参照されたい。
【０２６８】
ＶＩＩＩ．ＦＧＦＲ１ｃまたはβ−クロト−に結合する単量体ドメインの選択
事前のスクリ−ニングを、ＦＧＦＲ１ｃまたはβ−クロト−に結合することができる作用物質についてスクリ−ニングすることによって行うことができる。結合アッセイは、１つまたは複数の試験作用物質（つまり本明細書において開示される単量体または多量体）とＦＧＦＲ１ｃまたはβ−クロト−タンパク質（またはその断片）を接触させることおよびタンパク質および試験作用物質が結合複合体を形成するのに十分な時間待つことを含むことができる。いかなる形成された結合複合体も、多くの確立された分析技術のいずれかを使用して検出することができる。タンパク結合アッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ（増幅発光近接ホモジニアスアッセイ）、免疫組織化学結合アッセイ、フロ−サイトメトリ−、または他のアッセイを含むが、これらに限定されない。そのようなアッセイにおいて利用されるＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−タンパク質は、天然に発現させる、クロ−ニングする、または合成することができる。類似する方法を、ＩｇＧまたはＨＳＡに結合する単量体ドメインまたは多量体を同定するために使用することができる。
【０２６９】
本明細書において開示されるスクリ−ニング方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるか細胞ベ−スのアッセイとして実行することができる。細胞ベ−スのアッセイは、ＦＧＦＲ１ｃ、β−クロト−、またはＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の両方が発現される任意の細胞において実行することができる。細胞ベ−スのアッセイは、作用物質結合または作用物質による活性の修飾についてスクリ−ニングするために、ＦＧＦＲ１ｃおよび／またはβ−クロト−を含有する細胞全体または細胞画分を含むことができる。本明細書において開示される方法に従って使用することができる例示的な細胞型は、たとえば、あらゆる哺乳動物細胞ならびに酵母を含む菌類の細胞および細菌細胞を含む。細胞は、初代細胞または腫瘍細胞または他のタイプの不死細胞系とすることができる。もちろん、ＦＧＦＲ１ｃまたはβ−クロト−は、内生的にＦＧＦＲ１ｃまたはβ−クロト−を含有しない細胞において組換え発現させることができる。
【０２７０】
ＦＧＦＲ１ｃまたはβ−クロト−活性アッセイはまた、ＦＧＦＲ１ｃまたはβ−クロト−の修飾因子（アンタゴニストまたはアゴニスト）を同定するために使用することができる。さらに、実施例において記載されるものなどのようなＦＧＦ２１媒介性の活性の修飾因子を同定するための活性アッセイもまた、用いることができる。これらの実施形態では、１つまたは複数の試験作用物質を、ＦＧＦＲ１ｃまたはＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の両方を発現する細胞に接触させ、次いで、ＦＧＦＲ１ｃまたはＦＧＦ２１媒介性の活性についてそれぞれ試験する。修飾因子がβ−クロト−依存性の活性（ＦＧＦ−２１の特徴）を有することを決定するために、それが、ＦＧＦＲファミリ−（ＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ、およびＦＧＦＲ４）ならびにβ−クロト−のメンバ−を同時発現する細胞上でアゴニスト活性を誘発することができることを示すことが必要である（たとえば、図３７を参照されたい）。例示的なＦＧＦＲ１ｃ媒介性の活性は、β−クロト−の非存在下における、ＦＧＦ−１に応答する、ＥＲＫ経路感受性のプロモ−タ−の制御下でのルシフェラ−ゼ発現の活性化を含み（たとえば図４６を参照されたい）、例示的なＦＧＦ２１媒介性の活性は、β−クロト−の存在下における、ＦＧＦ−２１に応答する、ＥＲＫ経路感受性のプロモ−タ−の制御下でのルシフェラ−ゼ発現の活性化を含む（たとえば図３０および３１、３３〜３５、３８、４５、ならびに４７〜４９を参照されたい）。他の実施形態では、下流の分子の事象もまた、シグナル伝達活性を決定するためにモニタ−することができる。たとえば、ＦＧＦ２１媒介性のシグナル伝達は、ＥＲＫ経路によって媒介され、本明細書において、たとえば実施例９、１０、および１１において開示されるものを含む、ＥＲＫ経路を通してシグナル伝達を測定するための様々な方法が、公知である。
【０２７１】
いくつかの実施形態では、実施例９において本明細書において開示されるものなどのような活性アッセイはまた、同定されたアゴニスト単量体または多量体（たとえばＦＧＦＲ１ｃまたはβ−クロト−の両方に結合するもの）が、アンタゴニスト活性を欠く（つまり、それらはＦＧＦ２１媒介性のシグナル伝達をブロックしない）ことを確認するために使用することもできる。
【０２７２】
先のスクリ−ニング方法のいずれかによって最初に同定される作用物質は、明らかな活性を検証するためにさらに試験することができる。そのような試験は、適した動物モデルを用いて行うことができる。そのような方法の基本的な方式は、最初のスクリ−ニングの間に同定された対象の作用物質を、ヒトについてのモデルとしての役割を果たす動物に投与することおよび次いで、ＦＧＦ２１媒介性のシグナル伝達が、実際に調整されるおよび／または所望の生理学的な効果が観察される（たとえば、血糖レベル、血中インスリンレベル、もしくは血中脂質レベルの低下）および／または疾患または状態が回復する（たとえば糖尿病もしくは肥満症）かどうかを決定することを含む。検証研究において一般に利用される動物モデルは、任意の種類の哺乳動物である。適した動物の特定の例は、非ヒト霊長動物（カニクイザルおよびアカゲザルを含む）、マウス、ならびにラットを含むが、これらに限定されない。
【０２７３】
ドメインのライブラリ−からのＦＧＦＲ１ｃまたはβ−クロト−に結合する単量体ドメインの選択は、様々な手順のいずれかを使用して達成することができる。たとえば、所望の特性（たとえばＦＧＦＲ１ｃまたはβ−クロト−またはＩｇＧへの結合）を有する単量体ドメインを同定するためのある方法は、それぞれ、単量体ドメインをコ−ドする、複数の核酸を翻訳すること、複数の核酸によってコ−ドされるポリペプチドをスクリ−ニングすること、およびたとえば、所望のリガンドまたはリガンドの混合物に結合する単量体ドメインを特定し、それによって、選択された単量体ドメインを産生することを含む。それぞれの核酸によって発現される単量体ドメインは、当技術分野において公知の方法によって、リガンドに結合するそれらの能力について試験することができる（たとえば、本明細書において記載されるパニング、アフィニティ−クロマトグラフィ−、ＥＬＩＳＡ、Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ、またはＦＡＣＳ分析）。
【０２７４】
本明細書において述べられるように、単量体ドメインの選択は、ＦＧＦＲ１ｃもしくはβ−クロト−またはその断片または他の標的分子（たとえば脂質、炭水化物、核酸、およびその他同種のもの）などのようなリガンドへの結合に基づくものとすることができる。リガンドは、組換え精製タンパク質として提供することができるか、または細菌、菌類、昆虫、もしくは哺乳動物細胞などのような細胞の表面上に発現させることができる。他の分子を、任意選択で、たとえばＣａ＋２などのようなイオンを、標的と共に、方法において含むことができる。
【０２７５】
単量体ドメインがリガンドに結合するその能力に基づいて選択される場合、選択の根拠は、通常、高度な親和性を予測するゆっくりとした解離速度に基づく選択を含むことができる。リガンドの原子価もまた、選択された単量体ドメインの平均結合親和性を制御するために変動させることができる。リガンドは、競合化合物を含むことによって、希釈によって、または当業者らに公知の他の方法によってなどのように、様々な密度で表面または基質に結合することができる。高密度（原子価）の所定のリガンドは、比較的低い親和性を有する単量体ドメインを濃縮するために使用することができるのに対して、低密度（原子価）は、高度な親和性単量体ドメインを優先的に濃縮することができる。
【０２７６】
様々なレポ−トディスプレイベクタ−または系を、本明細書において開示される単量体ドメインおよび／または多量体をコ−ドする核酸を発現し、かつ所望の活性について試験するために使用することができる。たとえば、ファ−ジディスプレイ系は、単量体ドメインがファ−ジ表面上に融合タンパク質として発現される系である（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ  Ｗｉｓ．）。ファ−ジディスプレイは、典型的にバクテリオファ−ジコ−トタンパク質との融合物として、糸状バクテリオファ−ジの表面上の、単量体ドメインをコ−ドするポリペプチド配列の提示を含むことができる。
【０２７７】
一般に、これらの方法では、ファ−ジ粒子または細胞はそれぞれ、天然のファ−ジまたは細胞タンパク質配列に加えて、単一の種のディスプレイポリペプチドをディスプレイする個々のライブラリ−メンバ−としての役割を果たす。核酸は、その一部が複数の核酸によってコ−ドされる融合タンパク質の転写をもたらす部位のファ−ジＤＮＡにクロ−ニングされる。核酸分子を含有するファ−ジは、細胞において複製および転写を経る。融合タンパク質のリ−ダ−配列は、ファ−ジ粒子の先端への融合タンパク質の運搬を指示する。したがって、核酸によって部分的にコ−ドされる融合タンパク質は、検出のためにファ−ジ粒子上にディスプレイされ、上記および下記に記載される方法によって選択される。たとえば、ファ−ジライブラリ−は、ＦＧＦＲ１ｃもしくはβ−クロト−またはその断片などのような所定のリガンドとインキュベ−トすることができ、リガンドに結合する融合タンパク質配列を示すファ−ジ粒子を、所定のリガンドに結合するポリペプチド配列を示さないものから区別をして分割することができる。たとえば、その分離は、所定のリガンドを固定することによって提供することができる。固定されたリガンドに結合したファ−ジ粒子（つまりライブラリ−メンバ−）は、次いで、回収され、続く一連の親和性濃縮およびファ−ジ複製のために、選択されたファ−ジ亜集団を増幅するために複製される。親和性濃縮およびファ−ジ複製のいくつかのラウンドの後に、このように選択されたファ−ジライブラリ−メンバ−は、単離され、ディスプレイされたポリペプチド配列をコ−ドするヌクレオチド配列が決定され、それによって、所定のリガンドに結合するポリペプチドの配列を特定する。そのような方法は、ＰＣＴ公開ＷＯ  ９１／１７２７１、ＷＯ  ９１／１８９８０、ＷＯ  ９１／１９８１８、およびＷＯ  ９３／０８２７８においてさらに記載されている。
【０２７８】
他のディスプレイ系の例は、リボソ−ムディスプレイ、ヌクレオチド連結ディスプレイ（たとえば米国特許第６，２８１，３４４号；第６，１９４，５５０号、第６，２０７，４４６号、第６，２１４，５５３号、および第６，２５８，５５８号を参照されたい）、ポリソ−ムディスプレイ、細胞表面ディスプレイ、ならびにその他同種のものを含む。細胞表面ディスプレイは、様々な細胞（たとえば大腸菌、酵母、および／または哺乳動物細胞）を含む。細胞がディスプレイとして使用される場合、核酸、たとえば、ＰＣＲ増幅、それに続く消化によって達成される核酸は、細胞の中に導入され、翻訳される。任意選択で、本明細書において開示される単量体ドメインまたは多量体をコ−ドするポリペプチドを、たとえば注射によって細胞の中に導入することができる。
【０２７９】
本開示の単量体および多量体のライブラリ−は、所望のリガンド（たとえばＦＧＦＲ１ｃもしくはβ−クロト−）またはリガンドの混合物の結合などのような所望の特性についてスクリ−ニングすることができる。たとえば、単量体ドメインのライブラリ−のメンバ−は、ディスプレイし、公知もしくは未知のリガンドまたはリガンドの混合物への結合についてあらかじめスクリ−ニングすることができる。次いで、単量体ドメイン配列は、突然変異誘発する（たとえば、組換える、化学的に改変する）または他の方法で改変することができ、新しい単量体ドメインは、改善された親和性のリガンドまたはリガンドの混合物への結合について再びスクリ−ニングすることができる。選択された単量体ドメインは、組み合わせまたはつなぎ、多量体を形成することができ、次いで、これらは、改善された親和性もしくは結合活性またはリガンドまたはリガンドの混合物に対する特異性の改変についてスクリ−ニングすることができる。改変された特異性は、特異性、たとえば、複数の関連するリガンドの結合が広げられることを意味し得るか、または任意選択で、特異性の改変は、特異性が狭くなること、たとえばリガンドの特異的な領域内での結合を意味し得る。当業者らは、結合活性を計算するのに入手可能な多くの方法があることを認識するであろう。たとえばＭａｍｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ３７：２７５４−２７９４  （１９９８）；Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２６１：１４９−１５８  （１９９８）を参照されたい。
【０２８０】
当業者らは、結果を最適化するために、変異を生成し、所望の特性についてスクリ−ニングするステップを繰り返す（つまり、反復的に実行する）ことができることを認識するであろう。たとえば、ファ−ジディスプレイライブラリ−または他の類似の形式において、ライブラリ−の第１のスクリ−ニングは、比較的低いストリンジェンシ−で実行することができ、それによって、できる限り多くの、標的分子と結合した粒子が選択される。次いで、選択された粒子は、単離することができ、単量体または多量体をコ−ドするポリヌクレオチドを、粒子から単離することができる。次いで、さらなる変異を、これらの配列から生成することができ、続いて、より高度な親和性でスクリ−ニングすることができる。
【０２８１】
本開示のすべての組成物、たとえば、単量体ドメインならびにその多量体およびライブラリ−は、任意選択で、親和性物質のマトリックスに結合することができる。親和性物質の例は、ビ−ズ、カラム、固体担体、マイクロアレイ、試薬支持物の他のプ−ル、およびその他同種のものを含む。
【０２８２】
比較的大きい標的に結合することができる多量体が所望される場合、それらは、多くの開示される結合タンパク質を生成するために実行されたような「ウォ−キング」選択法によって生成することができる。この方法は、単量体ドメインのライブラリ−を提供し、第１の標的分子に対する親和性について単量体ドメインのライブラリ−をスクリ−ニングすることによって実行される。一度、標的に結合する少なくとも１つの単量体が、同定されたら、その単量体は、新しいライブラリ−または単量体ドメインのもとのライブラリ−のそれぞれの残りのメンバ−に共有結合される。次いで、多量体（二量体）のこの新しいライブラリ−は、増加した親和性で標的に結合する多量体についてスクリ−ニングされ、増加した親和性で標的に結合する多量体を同定することができる。「ウォ−キング」単量体選択法は、リンカ−長の制約を考慮して、互いに付加的にまたはさらに相乗的に作用することができる単量体から構成される多量体を構築するための方法を提供する。このウォ−キング技術は、大きい標的タンパク質に高度な親和性で結合することができる多量体について選択し、構築する場合、非常に有用である。ウォ−キング方法は、さらに多くの単量体を追加するために繰り返し、それによって、ともに連結された２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上の単量体を含む多量体をもたらすことができる。この「ウォ−キング」方法は、実施例７において記載されるように、β−クロト−特異的結合タンパク質の生成において用いられた。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、選択された多量体は、２つを超えるドメインを含む。そのような多量体は、たとえばそれぞれの新しいドメインの追加が個々に試験され、ドメインの効果が逐次的な様式で試験される、ステップ様式で生成することができる。図７を参照されたい。代替の実施形態では、ドメインは、２つを超えるドメインを含む多量体を形成するために連結され、より小さな多量体またはその代わりにそれぞれのドメインがどのように結合するのかについての予備的知識なしで結合について選択される。
【０２８４】
本開示の方法はまた、単量体または多量体を進化させるための方法を含む。ドメイン内組換えを、新しい組換えユニットを形成するために、単量体全体にわたって単量体の中に、または様々な単量体の一部を利用することによって導入することができる。ドメイン間組換え（たとえば、多量体の中へのもしくはその間での様々な単量体の組換え）またはモジュ−ル（たとえば多量体内の多数の単量体）の組換えを達成することができる。ライブラリ−間組換えもまた、企図される。
【０２８５】
単量体または多量体を進化させるための方法は、たとえば、以下のステップのいずれかまたはすべてを含むことができる：それぞれ、単量体ドメインをコ−ドする、複数の様々な核酸を提供するステップ；複数の異なる核酸を翻訳し、これにより、複数の異なる単量体ドメインを提供するステップ、所望のリガンド（たとえばＦＧＦＲ１ｃもしくはβ−クロト−）またはリガンドの混合物の結合について複数の異なる単量体ドメインをスクリ−ニングするステップ；所望のリガンドまたはリガンドの混合物に結合する複数の異なる単量体ドメインのメンバ−を同定し、これにより、選択された単量体ドメインを提供するステップ；少なくとも１つの多量体を生成するために少なくとも１つのリンカ−と選択された単量体ドメインをつなぐステップであって、少なくとも１つの多量体は、少なくとも２つの選択された単量体ドメインおよび少なくとも１つのリンカ−を含むステップ；ならびに選択された単量体ドメインと比較して、所望のリガンドまたはリガンドの混合物に対する改善された親和性もしくは結合活性または改変された特異性について、少なくとも１つの多量体をスクリ−ニングするステップ。
【０２８６】
変異は、単量体または多量体のいずれにも導入することができる。単量体を改善する例は、単量体の２つ以上（たとえば３、４、５、またはそれ以上）の部分が、結果として生じる増幅産物に変異を導入する（たとえばシャフリングまたは他の組換え方法によって）ための条件下で別々に増幅され、それによって単量体の様々な部分についての変異体のライブラリ−を合成する、ドメイン内組換えを含む。ＰＣＲ断片の両方が共通して有する「中央」または「重複」配列中に中央プライマ−の５’末端を配置することによって、結果として生じる「左」側および「右」側ライブラリ−は、単量体のもとのプ−ルの新規な変異体を生成するように重複ＰＣＲによって組み合わせることができる。次いで、これらの新しい変異体を、所望の特性についてスクリ−ニングする、たとえば標的に対してパニングするまたは機能効果についてスクリ−ニングすることができる。「中央」プライマ−は、単量体の任意のセグメントに対応するように選択することができ、典型的に、単量体内の足場または１つもしくは複数のコンセンサスアミノ酸（たとえばＡドメインにおいて見出されるものなどのようなシステイン）に基づくであろう。
【０２８７】
同様に、多量体は、単量体レベルで変異を導入し、次いで、単量体変異体ライブラリ−を組換えることによって生成することができる。大規模化すると、所望の特性を有する多量体（単一またはプ−ル）は、より長い多量体を形成するために組換えることができる。いくつかの場合では、変異は、ライブラリ−を形成するために単量体またはリンカ−の中に導入される（典型的に合成して）。これは、たとえば、２つの様々な標的に結合する２つの様々な多量体を用いて達成され、それによって、一方の標的に結合する部分および第２の標的に結合する部分を有する多量体を最終的に選択することができる。
【０２８８】
さらなる変異を、ドメインの間に様々な長さおよび組成のリンカ−を挿入することによって導入することができる。これは、ドメインの間の最適なリンカ−の選択を可能にする。いくつかの実施形態では、リンカ−の最適な長さおよび組成は、ドメインの最適な結合を可能にするであろう。いくつかの実施形態では、特定の結合親和性（複数可）を有するドメインが、様々なリンカ−を介して連結され、最適なリンカ−が、結合アッセイにおいて選択される。たとえば、ドメインが、所望の結合特性について選択され、次いで、様々なリンカ−を含むライブラリ−に形成される。次いで、ライブラリ−は、最適なリンカ−を同定するためにスクリ−ニングすることができる。その代わりに、標的分子結合に対するドメインまたはリンカ−の効果が知られていない多量体ライブラリ−を形成することができる。
【０２８９】
本開示の方法はまた、複数の単量体ドメインを提供することによって、１つまたは複数の選択される多量体を生成することを含む。複数の単量体ドメインは、所望のリガンドまたはリガンドの混合物の結合についてスクリ−ニングされる。所望のリガンドまたはリガンドの混合物に結合する、複数のドメインのメンバ−が、同定され、それによって、所望の親和性を有するドメインを提供する。同定されたドメインは、多量体を生成するために少なくとも１つのリンカ−とつながれ、多量体はそれぞれ、少なくとも選択されたドメインのうちの２つおよび少なくとも１つのリンカ−を含み、多量体は、選択されたドメインと比較して、所望のリガンドまたはリガンドの混合物に対する改善された親和性もしくは結合活性または改変された特異性についてスクリ−ニングされ、それによって、１つまたは複数の選択された多量体を同定する。
【０２９０】
多量体ライブラリ−は、いくつかの実施形態において、レコンビナ−ゼベ−スのアプロ−チにおいて２つ以上のライブラリ−または単量体または多量体を組み合わせることによって生成することができ、ライブラリ−メンバ−はそれぞれ、組換え部位（たとえばｌｏｘ部位）を含む。分子多様ライブラリ−メンバ−のより大きなプ−ルは、原理上、より高度な標的結合親和性および機能的活性などのような所望の特性を有するより多くの変異体を有する。ライブラリ−が、大腸菌に形質転換することができるファ−ジベクタ−において構築される場合、ライブラリ−サイズ（典型的に１０９〜１０１０のメンバ−）は、大腸菌の形質転換率によって制限される。レコンビナ−ゼ／組換え部位系（たとえばＣｒｅ−ｌｏｘＰ系）およびｉｎ  ｖｉｖｏ組換えを、大腸菌の形質転換率によってサイズが制限されないライブラリ−を生成するために利用することができる。
【０２９１】
たとえば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系は、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３のメンバ−を有する二量体ライブラリ−またはさらに大きな多様性を生成するために使用することができる。いくつかの実施形態では、一方のナイ−ブ単量体ライブラリ−についての宿主としての大腸菌および第２のナイ−ブ単量体ライブラリ−を保持する線状ファ−ジが、使用される。この場合のライブラリ−サイズは、感染性ファ−ジ（一方のライブラリ−を保持する）の数および感染大腸菌細胞（他方のライブラリ−を保持する）の数によってのみ制限される。たとえば、１０１２超のファ−ジを１０１２の大腸菌細胞（ＯＤ６００＝１で１Ｌ）に感染させることにより、１０１２もの二量体の組み合わせを産生することができる。
【０２９２】
多量体の選択は、単量体ドメインを同定するための上記に言及されるものを含む、様々な技術を使用して達成することができる。他の選択法は、たとえば、選択された単量体ドメインと比較して、リガンドに対する改善された親和性もしくは結合活性または改変された特異性に基づく選択を含む。たとえば、選択は、特異的な細胞型または関連する細胞もしくはタンパク質タイプ（たとえば様々なウイルス血清型）のセットに対する選択的な結合に基づくものとすることができる。次いで、選択された特性（たとえばリガンドの結合活性）の最適化は、本開示において言及されるように、ドメインを組換えるおよび個々の単量体ドメインもしくはリンカ−ドメインのアミノ酸配列またはそのようなドメインをコ−ドするヌクレオチド配列を操作することによって、達成することができる。
【０２９３】
多量体を同定するための１つの方法は、多量体のディスプレイによって達成することができる。単量体ドメインと同様に、多量体は、上記に記載されるように、任意選択で発現されるまたは様々なディスプレイ系、たとえばファ−ジディスプレイ、リボソ−ムディスプレイ、ポリソ−ムディスプレイ、ヌクレオチド連結ディスプレイ（たとえば、米国特許第６，２８１，３４４号；第６，１９４，５５０号、第６，２０７，４４６号、第６，２１４，５５３号、および第６，２５８，５５８号を参照されたい）ならびに／もしくは細胞表面ディスプレイによりディスプレイされる。細胞表面ディスプレイは、大腸菌、酵母、または哺乳動物の細胞を含むが、これらに限定されない。さらに、多数の結合部位を有する多量体のディスプレイライブラリ−は、リガンドまたは多数のリガンドに対する結合活性もしくは親和性または改変された特異性についてパニングすることができる。
【０２９４】
単量体または多量体は、ツ−ハイブリッドスクリ−ニングアッセイを使用して、酵母細胞における標的結合活性についてスクリ−ニングすることができる。この種のスクリ−ニングでは、スクリ−ニングされることとなる単量体または多量体ライブラリ−は、ライブラリ−のそれぞれの単量体または多量体および酵母転写活性化因子断片（つまりＧａｌ４）の間の融合タンパク質の形成を指示するベクタ−の中にクロ−ニングされる。「標的」タンパク質をコ−ドする配列は、標的および残りのＧａｌ４タンパク質（ＤＮＡ結合ドメイン）の間の融合タンパク質の生産をもたらすベクタ−の中にクロ−ニングされる。第３のプラスミドは、Ｇａｌ４結合部位のＤＮＡ配列の下流にレポ−タ−遺伝子を含有する。標的タンパク質に結合することができる単量体は、それと共にＧａｌ４活性化ドメインをもたらし、したがって、機能的Ｇａｌ４タンパク質を再構成する。レポ−タ−遺伝子の上流の結合部位に結合したこの機能的Ｇａｌ４タンパク質は、レポ−タ−遺伝子の発現および標的結合タンパク質としての単量体または多量体の選択をもたらす（Ｃｈｉｅｎ  ｅｔ．ａｌ．  （１９９１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ）  ８８：９５７８；  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｓ．  ａｎｄ  Ｓｏｎｇ  Ｏ．  （１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：  ２４５を参照されたい）。ライブラリ−スクリ−ニングのためのツ−ハイブリッド系の使用は、米国特許第５，８１１，２３８号においてさらに記載されている（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓ．Ｃ．  ａｎｄ  Ｈｕｎｔ  Ｓ．Ｗ．  （１９９３）  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐ．  １７：１５５；  Ｄｕｒｆｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌ．  ７：５５５；  Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：６８０；  Ｌｕｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７３：１０６７；  Ｈａｒｄｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌ．  ６：８０１；  Ｂａｒｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０；  ａｎｄ  Ｖｏｊｔｅｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７４：２０５もまた参照されたい）。他の有用なスクリ−ニング系は、大腸菌／ＢＣＣＰ相互作用スクリ−ニング系である（Ｇｅｒｍｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （Ｕ．Ｓ．Ａ．）  ９０：９９３；  Ｇｕａｒｅｎｔｅ  Ｌ．  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （Ｕ．Ｓ．Ａ．）  ９０：１６３９）。
【０２９５】
他の変形は、複数の結合化合物の使用を含み、単量体ドメイン、多量体、またはこれらの分子のライブラリ−を、様々な結合特異性を有するリガンドまたは化合物の多様性について、同時にスクリ−ニングすることができる。多数の所定のリガンドまたは化合物は、多くの単量体ドメインまたは多量体に対して、単一のライブラリ−または順次的なスクリ−ニングにおいて同時にスクリ−ニングすることができる。１つの変形では、それぞれ個別のビ−ズ（またはビ−ズのサブセット）上にコ−ドされる多数のリガンドまたは化合物を混合し、適した結合条件下で、単量体ドメイン、多量体、またはこれらの分子のライブラリ−と共にインキュベ−トすることができる。次いで、多数のリガンドまたは化合物を含むビ−ズの収集物を、親和性選択によって、選択された単量体ドメイン、選択された多量体、またはライブラリ−メンバ−を単離するために使用することができる。一般に、続く親和性スクリ−ニングのラウンドは、ビ−ズ、そのサブセット、またはわずか１つもしくは２つの個々のリガンドもしくは化合物しか含有していないビ−ズの同様の混合物を含むことができる。このアプロ−チは、効率的なスクリ−ニングを提供し、ラボラトリ−オ−トメ−ション、バッチ処理、およびハイスル−プットスクリ−ニング方法と適合する。
【０２９６】
他の実施形態では、多量体は、多数のリガンドに結合する能力について同時にスクリ−ニングすることができ、リガンドはそれぞれ、異なる標識を含む。たとえば、リガンドはそれぞれ、異なる蛍光標識を用いて標識し、同時に多量体または多量体ライブラリ−と接触させることができる。次いで、所望の親和性を有する多量体が、所望の標識に連結された標識の存在に基づいて同定される（たとえばＦＡＣＳ分取によって）。
【０２９７】
単量体ドメインまたは多量体（便宜上、以下の議論において「親和性作用物質」と呼ばれる）のいずれかのライブラリ−は、多くの異なる形式で、多数のリガンドに対して同時にスクリ−ニングする（つまりパニングする）ことができる。たとえば、多数のリガンドは、単純な混合物中で、アレイにおいて、細胞または組織上にディスプレイして（たとえば、細胞もしくは組織は、本明細書において開示される単量体ドメインもしくは多量体が結合することができる多数の分子を提供する）、および／または固定して、スクリ−ニングすることができる。親和性作用物質のライブラリ−は、任意選択で、酵母またはファ−ジディスプレイ系上にディスプレイすることができる。同様に、所望の場合、リガンド（たとえば、ｃＤＮＡライブラリ−においてコ−ドされる）は、酵母またはファ−ジディスプレイ系においてディスプレイすることができる。
【０２９８】
最初に、親和性作用物質ライブラリ−は、多数のリガンドに対してパニングされる。任意選択で、結果として生じる「ヒット」は、親和性作用物質の結果として生じる集団を濃縮するために１回または複数回、リガンドに対してパニングされる。
【０２９９】
所望の場合、個々の親和性作用物質および／またはリガンドが何であるかを決定することができる。いくつかの実施形態では、親和性作用物質は、ファ−ジ上にディスプレイされる。最初のスクリ−ニングにおいて結合するとして同定された親和性作用物質は、第１および第２の部分に分けられる。第１の部分は、細菌に感染させ、使用されるファ−ジのタイプに依存して、プラ−クまたは細菌コロニ−のいずれかをもたらす。発現されたファ−ジは、固定され、次いで、下記に記載されるように選択されたファ−ジにおいてディスプレイされるリガンドを用いてプロ−ブされる。
【０３００】
第２の部分は、ビ−ズにつながれ、または他の方法で固定され、もとの混合物中に少なくともいくつかのリガンドを含有するファ−ジディスプレイライブラリ−を、固定された第２の部分に接触させる。第２の部分に結合するファ−ジを、続いて溶出し、上記の段落において記載される固定されたファ−ジに接触させる。ファ−ジ−ファ−ジ相互作用が、検出され（たとえば、リガンド発現ファ−ジに特異的なモノクロ−ナル抗体を使用して）、結果として生じるファ−ジポリヌクレオチドを、単離することができる。
【０３０１】
いくつかの実施形態では、親和性作用物質−リガンド対が何であるかが、決定される。たとえば、親和性作用物質およびリガンドの両方がファ−ジまたは酵母上にディスプレイされる場合、対由来のＤＮＡは、単離し、配列決定することができる。いくつかの実施形態では、リガンドおよび親和性作用物質に特異的なポリヌクレオチドが増幅される。それぞれの反応の増幅プライマ−は、結果として生じる増幅産物が融合されるように相補的であり、それによって、親和性作用物質の少なくとも１つの部分およびリガンドの少なくとも１つの部分をコ−ドするポリヌクレオチドを含むハイブリッドポリヌクレオチドを形成する、５’配列を含むことができる。結果として生じるハイブリッドを、親和性作用物質およびリガンドの両方を同定するために、親和性作用物質またはリガンド（たとえば、ｃＤＮＡコ−ド）ポリヌクレオチドライブラリ−をプロ−ブするために使用することができる。
【０３０２】
上記方法は、複数数の多量体を同時に生成し、同定するために「ウォ−キング」と容易に組み合わせることができ、複数の多量体はそれぞれ、リガンドの混合物中のリガンドに結合する。これらの実施形態では、親和性作用物質（単量体ドメインまたは多量体）の第１のライブラリ−は、複数のリガンドに対してパニングされ、溶出された親和性作用物質は、多量体親和性作用物質のライブラリ−（たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の単量体を含む）の形成するために、親和性作用物質の第１または第２のライブラリ−に連結され、これらは、続いて、複数のリガンドに対してパニングされる。この方法は、より多くの多量体親和性作用物質を生成し続けるために繰り返すことができる。単量体ドメインの数を増加させることにより、特定の標的に対する、親和性および結合活性の増加をもたらしてもよい。もちろん、それぞれの段階で、パニングは、有意なバインダ−を濃縮するために、任意選択で繰り返される。いくつかの場合では、ウォ−キングは、単量体の末端に組換え部位（たとえばｌｏｘ部位）を挿入し、レコンビナ−ゼ媒介性の事象によって単量体ライブラリ−を組換えることによって促進されるであろう。
【０３０３】
上記の方法の選択された多量体は、たとえば、選択された多量体を組換えるまたはシャフリングする（組換えは、多量体の間でまたは多量体内でまたはその両方で起こり得る）、選択された多量体を突然変異させることなどによって、さらに操作することができる。これは、改変された多量体をもたらす。次いで、それらをスクリ−ニングし、選択された多量体と比較して、増強された特性を有するメンバ−を選択し、それによって、選択された改変された多量体を産生することができる。本明細書における説明を考慮して、以下のプロセスが続き得るのは明らかである。組換えもしくは非組換え単量体ドメインを組換えることができる、または変異体を形成することができる。任意選択で、ドメインは、それらが意図される宿主において免疫原性である可能性がより低い配列について最初にまたは後に選択される。任意選択で、組換えドメインを含むファ−ジライブラリ−は、所望の親和性についてパニングされる。ファ−ジによって発現される単量体ドメインまたは多量体は、標的に対するＩＣ５０についてスクリ−ニングすることができる。ヘテロマ−またはホモマ−多量体を選択することができる。選択されたポリペプチドは、たとえば、ヘテロまたはホモ多量体標的を含む任意の標的に対するそれらの親和性について選択することができる。
【０３０４】
本明細書において記載される方法によって産生されるリンカ−、多量体、または選択された多量体は、本開示の態様を形成する。本明細書において記載されるように産生されるまたは本明細書において開示される方法によって選択される多量体を含むライブラリ−、たとえば約１００、２５０、５００、またはそれ以上のメンバ−を含むライブラリ−が、提供される。いくつかの実施形態において、ライブラリ−のメンバ−を含む１つまたは複数の細胞もまた、含まれる。組換えポリペプチドのライブラリ−、たとえば約５０、１００、２５０、５００、またはそれ以上の異なる組換えポリペプチドを含むライブラリ−もまた、本開示の特徴である。
【０３０５】
本明細書において開示されるポリペプチドを含む組成物は、親和性物質、たとえば組換えポリペプチドのマトリックスに結合することができる。親和性物質の例は、たとえば、ビ−ズ、カラム、固体担体、および／またはその他同種のものを含む。
ＩＸ．治療薬および予防的治療法
【０３０６】
他の態様では、本開示はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、本明細書において記載される１つまたは複数の核酸または結合タンパク質（または薬学的に許容される賦形剤および１つもしくは複数のそのような核酸もしくはポリペプチドを含む組成物）を、たとえば、ヒトを含む哺乳動物、霊長動物、マウス、ブタ、雌ウシ、ヤギ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスタ−、ウマ、ヒツジ；または鳥（たとえばニワトリもしくはアヒル）、魚、または無脊椎動物などのような非哺乳動物脊椎動物を含む対象に投与することによって、治療上または予防的に、疾患または障害を治療するための方法を提供する。
【０３０７】
ＦＧＦＲ１ｃ、β−クロト−、またはＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の両方に結合する結合タンパク質、特に、ＦＧＦＲ１ｃおよび／またはβ−クロト−結合単量体ドメインまたは多量体を含む結合タンパク質を含む、ＦＧＦ２１媒介性のシグナル伝達を活性化するものを、多くのヒト疾患を治療するために用いることができる。例示的な結合するドメインは、以下を含むが、それれらに限定されない、本明細書において開示される特異的配列を含む：
ファミリ−１  モチ−フ：
Ｃ［ＡＧＬＱＲＶ］［ＡＬＰＳＴ］［ＤＧＩＮＲＳ］［ＥＬＱ］Ｆ［ＰＱＴ］Ｃ［ＧＨＫＮＱＲＳ］［ＤＧＮＳ］［ＧＳＴ］［ＥＧＫＮＲＳ］［ＩＲＳＴ−］Ｃ［ＩＬＶ］［ＰＳ］［ＬＰＱＲＶ］［ＡＨＫＰＱＲＴ］Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ［ＤＥＶ］［ＤＮＰ］ＤＣ［ＥＧＲ］Ｄ  ［ＤＧＮＳ］ＳＤＥ［ＡＥＫＳＴ］［ＤＧＮＰＳ］［ＡＤ−］［ＩＨ−］Ｃ；  （配列番号７４）  （ナイ−ブＡ１）
ファミリ−２  モチ−フ：
ＣＧ［ＡＥ］［ＧＳ］ＬＦＴＣ［ＧＲ］［ＮＲＳ］［ＡＳＴ］［ＫＮ］ＩＣＩＳ［ＥＨＱＳ］［ＡＶ］Ｗ［ＩＶ］ＣＤＧ［ＩＶ］ＤＤＣ［ＤＥ］ＤＮＳＤＥ［ＤＫＭＮＴ］［ＮＳＹ］Ｃ；（配列番号１０８）（Ｍ０３／Ｍ１５突然変異体）
ファミリ−３  モチ−フ：
ＣＧ［ＡＰＳＴ］［ＤＮ］［ＬＭＱ］ＦＴＣ［ＱＲ］［ＲＳ］ＴＮ［ＩＭ］ＣＩＳ［ＤＫＰＱＲ］［ＡＴＶ］ＷＶＣＤＧＶＤＤＣ［ＤＥ］Ｄ［ＤＥＮＹ］ＳＤＥ［ＩＱＲＴ］［ＡＧＴＶ］Ｃ  （配列番号１１９）  （Ｍ２３突然変異体）
ファミリ−４  モチ−フ：
Ｃ［ＬＡＰＲＶＫＱＧＨＳ］［ＡＰＳＨＲ］［−Ｔ］［ＤＮＧＳＨＡＦ］［ＥＨＱ］Ｆ［ＨＰＱＴＲＷ］Ｃ［ＧＳＱＲＮＬＨＫ］
［ＳＮＤ］［ＧＳＴＮＹ］［ＲＨＱＧＨＮＳＥ］［ＲＩＴ−］Ｃ［ＩＬＶ］［ＨＮＰＳ］［ＡＧＨＬＳＱＰＲＥＶ］
［ＴＰＧＳＲＡＨＮ−］［ＷＬ］［ＩＬＲＶ］ＣＤ［ＧＭＷ］［ＧＹＤＶＥＬ］［ＰＷＬＤＮ］ＤＣ［ＧＥＲＱＬＫ］Ｄ  ［ＧＮＤＳＫＷＨＹ］［ＰＱＳＷ］Ｄ［ＥＰＱＹ］［ＡＰＳ−］［ＬＰＱＳ−］［ＡＥＨＫＬＴＶ］［ＨＩＬＳＴＤＮＧＭＶＷ］Ｃ；（配列番号１３０）（β−クロト−ナイ−ブＡ１）
ファミリ−５  モチ−フ：
Ｃ［ＨＮＰ−］［ＡＰ−］［  ＨＩＫＬＭＰＲＶ−］［ＡＥＩＬＹ］［ＡＤＥＧＱＲＹ］［ＡＤＥＨＩＫＬＮＰＱＳ］［ＤＨＬＭＳＹ］Ｃ［ＡＥＫＰＱＴ］［ＡＥＨＫＮＱＲＳ］［ＦＬＲＹ］［ＤＦＶＹ］ＧＤＧ［ＤＥＧＩＫＮＲＳＶ］Ｃ［ＤＥＧＨＮＱＲＳ］［ＥＫＰＱＳ］［ＡＤＥＧＨＰＱ］Ｃ［ＤＧＮＳ］［ＦＬＮＳＴ］［ＡＥＰＳＹ］［ＡＥＧＫＲＴ］Ｃ［ＡＤＧＩＬＮＳＶ］ＷＤＧ［ＤＦＧＬＭＶ］［ＤＮ］Ｃ（配列番号１２４２）
（β−クロト−ナイ−ブＬＮＲ／Ｎｏｔｃｈ）
ファミリ−６  モチ−フ：
Ｃ［ＬＭＰ］［ＰＳＴ］［ＤＨ］ＥＦ［ＱＲ］Ｃ［ＧＲ］ＳＧ［ＲＷ］ＣＩＰ［ＬＱＲ］［ＡＫＲＳＴ］Ｗ［ＧＶ］ＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＧＥ［ＳＷ］ＰＡ［ＨＬＱ］Ｃ；（配列番号１８５）
β−クロト−  Ｍ０１突然変異誘発
ファミリ−７  モチ−フ：
Ｃ［ＬＲＷ］［ＰＳＴ］［ＧＳ］［ＡＥＨＱＳ］Ｆ［ＨＱ］Ｃ［ＮＳ］［ＮＴ］ＧＨＣＬＳ［ＡＰＱＲＳ］［ＳＴ］ＷＶＣＤＧ［ＦＹ］［ＤＥＶＹ］ＤＣ［ＤＥＧ］Ｄ［ＧＷ］ＳＤＥ［ＡＳＶ］［ＫＮ］Ｃ；
（配列番号１９４）
β−クロト−  Ｍ２５突然変異誘発
ファミリ−８  モチ−フ：
Ｃ［ＥＱ］［ＰＳ］［ＤＥ］ＥＦ［ＭＲＴ］Ｃ［ＲＳ］ＳＧＲＣＩＰ［ＱＶ］［ＨＩＳＴ］ＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥ［ＰＲ］Ｐ［ＡＥ］  ［ＨＱ］Ｃ；
（配列番号２０７）
β−クロト−  Ｍ４２突然変異誘発
ファミリ−９  モチ−フ：
Ｃ［ＨＮＰ］［ＳＴＷ］Ｆ［ＨＮ］［ＨＫＱ］Ｆ［ＥＫ］ＣＲＮ［ＧＲ］ＱＣＩＰＬ［ＨＹ］ＬＶＣＤＧＶＰＤＣ［ＡＧ］Ｄ［ＤＮ］ＳＤＥＴ  ［ＡＤＹ］Ｃ；（配列番号２１２）  
β−クロト−  Ｍ５０突然変異誘発
ファミリ−１０  モチ−フ：
Ｃ［ＥＬＰＱＲ］［ＡＰＳ］［ＤＧＩＮ］［ＥＧＱ］［ＦＱ］［ＦＫＰＱＲＴ］［−Ｅ］Ｃ［ＧＮＲＳ］［ＮＳ］Ｇ［ＨＮＱＲ］Ｃ［ＩＶ］Ｐ  ［ＡＥＬＰＱＲＶ］［ＡＨＰＱＲＴ］Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ［ＤＥＶ］［ＤＮＰ］ＤＣ［ＧＬＱ］Ｄ［ＤＧＮＳ］ＳＤＥ［ＡＥＫＴ］［ＤＧＬＮＳ］［−Ａ］［−Ｈ］Ｃ；（配列番号２１７）
β−クロト−  Ｍ０１（配列番号４９３）からのＣ末端ウォ−ク
ファミリ−１１  モチ−フ：
Ｃ［ＡＧＬＰ］ＰＤ［ＥＱ］Ｆ［ＫＲ］Ｃ［ＧＫＮＲＳ］ＳＧ［ＮＱＲＳ］Ｃ［ＩＬ］Ｐ［ＥＬＱ］［ＤＨＮＴ］Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ［ＤＬＶ］  ［ＤＮ］ＤＣ［ＥＧＶ］Ｄ［ＧＳ］ＳＤＥ［ＡＥＴ］［ＤＧＮＰ］［−Ｄ］［−Ｌ］Ｃ；（配列番号２３２）
β−クロト−  Ｍ０１（配列番号４９３）からのＮ末端ウォ−ク
ファミリ−１２  モチ−フ：
ＣＡ［ＰＳ］［ＤＮＳ］［ＥＱ］Ｆ［ＱＲ］Ｃ［ＧＨ］［ＤＮ］［ＧＮＴ］［ＧＨＮ］［−ＩＴ］Ｃ［ＩＬ］［ＬＰＳ］［ＥＲ］［ＡＧＴ］［ＷＬ］ＬＣ  ＤＧ［ＤＥＶ］［ＤＮ］ＤＣ［ＡＥＧ］ＤＧＳＤＥ［ＡＥ］［ＤＧ］Ｃ；（配列番号２４０）
β−クロト−  Ｍ０６（配列番号４９９）からのＮ末端ウォ−ク
ファミリ−１３  モチ−フ：
Ｃ［ＡＰ］Ｐ［ＤＧ］［ＥＱ］Ｆ［ＲＴ］Ｃ［ＫＮＲ］［ＮＳ］Ｇ［ＱＲ］Ｃ［ＩＶ］Ｐ［ＬＱ］［ＡＨＰ］Ｗ［ＬＶ］ＣＤＧ［ＤＥ］［ＤＮ］ＤＣ
［ＧＱ］ＤＮＳＤＥ［ＥＳＴ］［ＤＮＰ］［−Ａ］［−Ｔ］Ｃ；（配列番号２４５）
β−クロト−  Ｍ０６（配列番号４９９）からのＣ末端ウォ−ク
ファミリ−１４  モチ−フ：
Ｃ［ＡＧＰＲ］［ＡＰ］［ＤＧＮＳ］［ＥＱ］Ｆ［ＱＲＴ］Ｃ［ＧＳＫ］Ｎ［ＧＴ］［ＧＨＲ］［−Ｒ］Ｃ［ＩＬＶ］［ＰＳ］［ＡＬＱ］［ＮＳＴ］Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ［ＤＥＶ］ＤＤＣ［ＧＬ］ＤＧＳＤＥ［ＡＥＴ］［ＤＮＳ］［−Ａ］［−Ｔ］Ｃ；（配列番号２４９）
β−クロト−  Ｍ０８（配列番号６９４）からのＮ末端ウォ−ク
ファミリ−１５  モチ−フ：
Ｃ［ＡＧＰ］［ＡＰＳ］［ＤＧＮ］［ＥＱ］Ｆ［ＱＲＴ］Ｃ［ＧＮＲＳ］［ＧＮＳ］［ＧＴ］［ＧＫＱＳ］［−ＩＫ］Ｃ［ＩＬＶ］Ｐ［ＬＱＲＶ］  ［ＡＥＨＰ］Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ［ＤＬＶ］［ＤＮ］ＤＣＧＤ［ＧＮ］ＳＤＥ［ＡＥＫＰＳ］［ＧＬＰＳ］［−ＡＥＶ］［−ＩＴ］Ｃ；（配列番号２５４）
β−クロト−  Ｍ２１（配列番号４８１）からのＮ末端ウォ−ク
ファミリ−１６  モチ−フ：
ＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥ［ＰＳ］［ＰＱ］［ＡＱ］［−Ｈ］Ｃ；（配列番号３９４）
β−クロト−  Ｍ２１（配列番号４８１）からのＣ末端ウォ−ク
ファミリ−１７  モチ−フ：
Ｃ［ＡＰＱＲ］［ＡＳＰ］［ＤＧ］［ＥＱ］Ｆ［ＰＱ］Ｃ［ＥＫＮＲ］［ＮＳ］［ＧＴ］［ＧＨＮ］［−Ｒ］Ｃ［ＩＬＶ］［ＰＳ］［ＡＬＰＲ］［ＡＮＲＴ］  Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ［ＥＶ］［ＤＮ］ＤＣ［ＡＧＲ］Ｄ［ＧＮＳ］ＳＤＥ［ＡＥＫＳ］［ＧＬＮＳ］［−Ａ］［−Ｈ］Ｃ；
（配列番号２６５）
β−クロト−  Ｍ４２（配列番号３０５）からのＮ末端ウォ−ク
ファミリ−１８  モチ−フ：
ＣＲＰ［ＤＧ］ＥＦ［ＱＲ］Ｃ［ＧＫＲ］［ＮＳ］Ｇ［ＨＲ］Ｃ［ＩＶ］Ｐ［ＧＬＱ］［ＰＴ］Ｗ［ＲＶ］ＣＤＧ［ＤＥ］［ＤＰ］ＤＣＱＤ［ＧＳ］ＳＤＥ［ＡＥＴ］［ＤＧＮ］Ｃ；
（配列番号２７０）
β−クロト−  Ｍ４２（配列番号３０５）からのＣ末端ウォ−ク
ファミリ−１９  モチ−フ：
Ｃ［ＡＧＬＲ］［ＡＰＳ］［ＤＧＮ］［ＥＱ］Ｆ［ＲＱＴ］Ｃ［ＧＨＫＮＲＳ］［ＮＳ］［ＧＳＴＹ］［ＤＥＧＮＲ］［−ＲＴ］Ｃ［ＩＬＶ］Ｐ  ［ＡＧＬＰＲＶ］［ＡＨＮＰＴ］Ｗ［ＬＲＶ］ＣＤＧ［ＤＥＶ］［ＤＮ］ＤＣ［ＡＥＧＲＶ］Ｄ［ＤＧＮ］ＳＤＥ［ＡＥＳＴ］［ＡＤＧＮＳ］［−Ｄ］Ｃ；（配列番号２７４）
β−クロト−  Ｍ５０（配列番号３０６）からのＮ末端ウォ−ク
ファミリ−２０  モチ−フ：
Ｃ［ＬＱ］［ＰＳ］Ｇ［ＥＱ］ＦＲＣ［ＫＱ］［ＮＴ］［ＧＴ］Ｒ［−Ｔ］Ｃ［ＩＬ］Ｐ［ＬＲ］［ＡＫ］［ＬＷ］［ＬＶ］ＣＤＧＶＤＤＣ
［ＥＬ］ＤＤＳＤＥ［ＡＫ］ＤＣ；（配列番号２８４）
β−クロト−  Ｍ５０（配列番号３０６）からのＣ末端ウォ−ク。
【０３０８】
ＦＧＦ２１媒介性のシグナル伝達の活性化が寛解性の例示的なヒト疾患は、たとえば、糖尿病、肥満症、異脂肪血症、高血圧症、脂肪肝、非アルコ−ル性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、急性膵炎、メタボリックシンドロ−ム、アテロ−ム性動脈硬化症などのような心血管疾患、および加齢を含む。
【０３０９】
いくつかの態様では、本明細書において開示される単量体または多量体が、上記の列挙される病気のうちの１つの治療のために使用される少なくとも１つの他の分子と共に対象に投与される。他の分子は、単量体もしくは多量体と共に製剤中に調製することができる、または単量体または多量体が投与されるのと同時に、その前に、またはその後に投与することができる。
【０３１０】
他の態様では、本開示は、１つまたは複数の他の治療薬と共に、本明細書において記載される単量体および多量体などのような、本開示の治療用単量体または多量体を用いて、糖尿病について対象を治療するための方法を提供する。一実施形態では、そのような併用療法は、相乗効果を達成する。単量体または多量体は、現在利用可能な１つまたは複数の２型糖尿病治療薬と組み合わせて投与することができる。これらの治療薬は、ビグアナイド（メトホルミン）およびスルホニル尿素（グリブリド、グリピジドなど）を含む。グルコ−スホメオスタシスの維持に指示されるさらなる治療薬は、ＰＰＡＲγアンタゴニスト（ピオグリタゾン、ロシグリタゾン）；およびアルファグルコシダ−ゼ阻害剤（アカルボ−ス、ボグリボ−ス）を含む。さらなる治療薬は、Ｅｘｅｎａｔｉｄｅ（登録商標）（グルカゴン様ペプチド）およびＳｙｍｌｉｎ（登録商標）（プラムリンチド）などのような注射用治療薬を含む。
【０３１１】
いくつかの実施形態では、ＦＧＦＲ１ｃ、β−クロト−、またはＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の両方に結合する、本明細書において記載される単量体または多量体を含む結合タンパク質は、対象における血糖濃度および／または血液トリグリセリド濃度および／または血中脂質濃度および／または血中インスリン濃度を減少させるために使用される。対象は、糖尿病または肥満症の遺伝的な病歴（天然に存在するまたは誘導される）を有する人、または他の場合には、高濃度のグルコ−ス、高濃度のトリグリセリド、もしくは高濃度の脂質の不健康な影響の危険性がある人とすることができる。ＦＧＦ２１は、血糖濃度および脂質濃度の調節物質である。これは、マウスにおけるＦＧＦ２１の投与が血糖を低下させ（Ｂｅｒｇｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ  ２００９  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １５０：  ４０８４−９３）、脂肪肝を反転させ、エネルギ−消費を増加させ、かつインスリン感受性を改善し（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ  ２００９  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５８：  ２５０−９）、肥満症を治療する（Ｃｏｓｋｕｎ  ｅｔ  ａｌ  ２００８  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４９：  ６０１８−２７）という事実によって証拠づけられる。糖尿病性アカゲザルでは、長期にわたるＦＧＦ２１の投与は、低血糖症を引き起こすことなく、空腹時血糖値、フルクトサミン、トリグリセリド、インスリン、およびグルカゴンを低下させることが示されている。さらに、血清脂質プロファイルに対する改善およびわずかであるが有意な減量が観察された（Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００７）  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４８：  ７７４−８１）。
【０３１２】
いくつかの実施形態では、ＦＧＦＲ１ｃ、β−クロト−、またはＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の両方に結合する、本明細書において記載される単量体または多量体を含む結合タンパク質は、急性膵炎における炎症性の損傷を低下させるために使用される。これは、ＦＧＦ２１ノックアウトマウスにおけるセルレインを用いる膵炎の実験的な誘発に続く重症疾患によって証拠づけられる。肝臓特異的プロモ−タ−からヒトＦＧＦ２１を恒常的に発現するトランスジェニックマウスは、セルレイン投与に続いて、膵臓における炎症の減少を示した（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００９）  Ｇａｓｔｅｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １３７（５）：１７９５−１８０４）。
【０３１３】
いくつかの実施形態では、ＦＧＦＲ１ｃ、β−クロト−、またはＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の両方に結合する、本明細書において開示される単量体または多量体を含む結合タンパク質は、血糖および／または血中脂質濃度を低下させる薬剤と組み合わせて投与される。スタチン、樹脂（コレスチラミン、コレスチポ−ル、コレセベラム）、およびニコチン酸脂質濃度を低下させる薬剤の例である。例示的なスタチンは、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、およびシンバスタチンを含むが、これらに限定されない。血糖濃度を低下させる化合物の例は、インスリンおよびロシグリタゾンを含む。
【０３１４】
本開示の一態様では、ｅｘ  ｖｉｖｏ方法において、対象の対象の１つまたは複数の細胞または細胞の集団（たとえば、腫瘍細胞、腫瘍組織試料、器官細胞、血球、皮膚の細胞、肺、心臓、筋肉、脳、粘膜、肝臓、腸、脾臓、胃、リンパ系、子宮頸部、膣、前立腺、口、舌など）が対象から得られまたは取り出され、疾患、障害、または他の状態を予防的にまたは治療上治療するのに有効である量の本明細書において提供される、選択された結合タンパク質と接触させる。次いで、接触させた細胞は、それらが得られた部位までまたは治療されることとなる対象における、対象の他の部位（たとえば、上記に定義されるものを含む）まで、対象に戻されるまたは送達される。所望される場合、接触させた細胞を、標準的なよく知られている移植技術を使用して、対象における、対象の組織、器官、または系の部位（上記に記載されるすべてを含む）に移植することができる、または、たとえば、標準的な送達もしくは注入技術を使用して、血液またはリンパ系に送達することができる。
【０３１５】
対象の対象の１つまたは複数の細胞または細胞の集団を、疾患、障害、または他の状態を予防的にまたは治療上治療するのに有効な量の、本明細書において開示された、選択された結合タンパク質と直接または間接的に接触させるｉｎ  ｖｉｖｏ方法もまた、提供される。直接的な接触／投与方式では、選択された結合タンパク質は、典型的に、治療されることとなる細胞または対象の組織部位（たとえば、腫瘍細胞、腫瘍組織試料、器官細胞、血球、皮膚の細胞、肺、心臓、筋肉、脳、粘膜、肝臓、腸、脾臓、胃、リンパ系、子宮頸部、膣、前立腺、口、舌など）に、局所的投与、注射（たとえば針もしくは注射器を使用することによって）、またはワクチンもしくは遺伝子銃送達、組織、器官、もしくは皮膚部位の中に押し込むことを含む様々な方式のいずれかによって、直接投与されるまたは移入される。選択された結合タンパク質は、たとえば、筋肉内に、皮内に、皮膚下に、皮下に、経口的に、腹腔内に、鞘内に、静脈内に送達することができる、または体腔内に（たとえば外科手術の間を含む）または吸入または膣もしくは直腸投与によって配置することができる。例示的な送達は、たとえば、経口送達（舌下または腸取り込み／送達）、在宅注射（たとえば、約１．４ｍｌ以下の容量で製剤）、経皮的取り込み／送達、皮下移植可能なポンプ、肺取り込み／送達（全身性もしくは非全身性）、血液脳関門取り込み／送達、および／または鼻取り込み／送達を含む。
【０３１６】
経口送達のための計画アプロ−チは、たとえば、結合タンパク質中に、ＰｅｐＴ１、ＰｅｐＴ２、ＨＰＴ１、ＡＢＣファミリ−などのような粘膜ペプチドトランスポ−タ−に対する結合親和性を含むこと；結合タンパク質への移動ドメイン（シュ−ドモナスエキソトキシンＡ由来のＰＥ３８もしくはＰＥ４０）の追加；またはトランスフェリン受容体などのような血液脳関門トランスポ−タ−に対する結合親和性を含むことを含む。
【０３１７】
経上皮送達についての４つの主要なメカニズムは、
（１）経細胞：拡散により細胞を通る：主として、小分子によって使用される。
（２）傍細胞：デスモソ−ム／タイトジャンクションを通して細胞のまわりで：主として、親水性ペプチドによって使用される。
（３）経細胞輸送：ピノサイト−シスにより小胞内で細胞を通る
（４）トランスポ−タ−／担体に結合する分子について、担体またはトランスポ−タ−媒介性。
【０３１８】
他のアプロ−チでは、結合タンパク質は、細胞を横切って血清に輸送され、薬剤を運ぶ、細胞表面上でまたは小胞内で受容体に結合するように設計される。そのような受容体は、トランスポ−タ−と呼ばれる。１つのそのような受容体は、血清への肺および腸送達のために使用することができる新生児免疫グロブリンＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）である。他の受容体は、血液脳関門を横切って脳脊髄液に輸送することができるトランスフェリン受容体である。その代わりに、単量体または多量体は、肺および腸運搬のために、新生児Ｆｃ受容体に結合するように設計される。この方法は、ｐＨ感受性の放出のために、最終製剤を操作することを含むことができる。
【０３１９】
本開示を考慮すると、様々な戦略が可能である。公知のトランスポ−タ−（たとえばＰｅｐＴ１、ＨＰＴ−１、ＰｅｐＴ２、ＡＢＣファミリ−、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＭＤＲ）に結合する結合タンパク質を特定することができる。他の有用ない結合剤は、Ｃａｃｏ２細胞に結合する単量体または多量体を同定することによって同定することができる（たとえば、Ｃａｃｏ２細胞による１４Ｃセファレキシン取り込みを使用する取り込みブロックアッセイを使用する）。たとえばＢｌａｎｃｈｅｔｔｅ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  ５８：１４２−１５１  （２００４）；Ｌｏｗ，  Ｓ．Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  −  ａｄｖａｎｃｅ  ａｃｃｅｓｓ  Ａｐｒｉｌ  ７  ２００５；Ｌｅｅ，  Ｖ．  Ｊ．  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ  ２９  （２００１）；Ｒｕｂａｓ，  Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ８５：１６５−１６９  （１９９６）；Ｙａｎｇ，  Ｃ．Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６：１３３１−１３４３  （１９９９）；Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，  Ｃ．Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｕｔ  ５２：１７８８−１７９９  （２００３）；Ｃｌｅｌａｎｄ，  Ｊ．Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：２１２−２１９  （２００１）；Ｎｉｅｌｓｅｎ，  Ｃ．Ｕ．  ａｎｄ  Ｂｒｏｄｉｎ，  Ｂ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ４：３７３−３８８  （２００４）；Ｋｕｎｔａ，  Ｊ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ５：１０９−１２４  （２００４）を参照されたい。
【０３２０】
他のアプロ−チでは、多量体のファ−ジライブラリ−は、哺乳動物の口腔に適用することができ、ファ−ジまたはファ−ジ由来のＤＮＡは、好都合の送達剤である配列について濃縮するために動物の血清中で回収することができる。経口的に輸送されることが公知の天然ドメインまたはペプチドもまた、本明細書において開示される単量体または多量体に融合することができる。さらに他の代替では、ファ−ジディスプレイドメインは、適切な体液（鼻、腸など）または精製プロテア−ゼに対する抵抗性について選択される。
【０３２１】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける間接的な接触／投与方式では、選択された結合タンパク質は、典型的に、治療されることとなる細胞にまたは上記に記載されるものを含む対象の組織部位（たとえば皮膚細胞、臓器系、リンパ系、血球系など）に、治療を促進することができる１つまたは複数の細胞または細胞の集団にポリペプチドを直接接触させるまたは投与することによって、投与されるまたは間接的に移入される。たとえば、対象の体内の腫瘍細胞は、対象の部位（たとえば、対象の組織、器官、もしくは細胞、または体内の血液もしくはリンパ系）への選択された結合タンパク質の送達が起こり、有効な予防的なまたは治療上の治療が結果として生じるように、十分な量の選択された結合タンパク質と血液もしくはリンパ系、皮膚、または器官の細胞を接触させることによって治療することができる。そのような接触、投与、または移入は、上記に記載される投与の１つまたは複数の経路または様式を使用することによって典型的に成される。
【０３２２】
他の態様では、本開示は、対象の１つもしくは複数の細胞または対象の対象の細胞の集団（たとえば、腫瘍細胞、腫瘍組織試料、器官細胞、血球、皮膚の細胞、肺、心臓、筋肉、脳、粘膜、肝臓、腸、脾臓、胃、リンパ系、子宮頸部、膣、前立腺、口、舌など）が、対象から得られまたは取り出され、疾患、障害、または他の状態を予防的にまたは治療上治療するのに有効である、対象の生物学的に活性な結合タンパク質（たとえば選択された単量体ドメインおよび／または多量体）をコ−ドする本明細書において開示される核酸配列を含むポリヌクレオチド構築物を有する当該１つまたは複数の細胞または細胞の集団を接触させることによって形質転換される、ｅｘ  ｖｉｖｏ方法を提供する。１つまたは複数の細胞または細胞の集団は、細胞へのポリヌクレオチド構築物（およびプロモ−タ−）の取り込みが起こり、標的核酸配列の十分な発現が結果として生じ、疾患、障害、または状態を予防的にまたは治療上、治療するのに有効である、選択された結合タンパク質をコ−ドする生物学的に活性なポリペプチドの量を産生するように、十分な量のポリヌクレオチド構築物および当該核酸配列の発現を制御するプロモ−タ−と接触させる。ポリヌクレオチド構築物は、核酸配列の発現を制御するプロモ−タ−配列（たとえばＣＭＶプロモ−タ−配列）および／または所望される場合、本明細書において開示される少なくとも１つもしくは複数の他のポリペプチドをコ−ドする１つもしくは複数のさらなるヌクレオチド配列、サイトカイン、補助剤、もしくは同時刺激分子、または対象の他のポリペプチドを含むことができる。
【０３２３】
トランスフェクションに続いて、形質転換細胞は、それらが得られた組織部位もしくは系までまたは対象において治療されることとなる他の部位（たとえば、腫瘍細胞、腫瘍組織試料、器官細胞、血球、皮膚の細胞、肺、心臓、筋肉、脳、粘膜、肝臓、腸、脾臓、胃、リンパ系、子宮頸部、膣、前立腺、口、舌など）まで、対象に戻される、送達される、または移入される。所望される場合、細胞は、標準的な周知の移植技術を使用して、対象における、対象の組織、皮膚、器官、もしくは体の系に移植することができるまたは標準的な送達もしくは注入技術を使用して、血液もしくはリンパ組織系に送達することができる。形質転換細胞のそのような送達、投与、または移入は、上記に記載される投与の１つまたは複数の経路または様式を使用することによって典型的に成される。標的核酸の発現は、天然に存在しまたは誘発することができ（より詳細に本明細書において記載される）、部位または組織系で疾患または状態を治療するのに十分で、かつ有効な量のコ−ドポリペプチドが、発現される。
【０３２４】
他の態様では、対象の１つまたは複数の細胞または対象の細胞の集団（たとえば、上記に記載されるそれらの細胞および細胞系および対象を含む）が、細胞または細胞の集団を疾患、障害、または他の状態を予防的にまたは治療上、治療するのに有効である対象の生物学的に活性な結合タンパク質（たとえば選択された単量体ドメインおよび／または多量体）をコ−ドする本開示の核酸配列を含むポリヌクレオチド構築物と接触させること（または上記に記載される投与の１つもしくは複数の経路もしくはモ−ドを使用して細胞もしくは細胞の集団に投与するもしくは移入すること）によって、対象の体内に形質転換されるｉｎ  ｖｉｖｏ方法もまた、提供される。
【０３２５】
ポリヌクレオチド構築物は、疾患または障害に罹患している細胞（複数可）に直接投与するまたは移入することができる（たとえば、上記に記載される投与の１つまたは複数の経路または様式を使用する直接的な接触によって）。その代わりに、ポリヌクレオチド構築物は、細胞へのポリヌクレオチド構築物（およびプロモ−タ−）の取り込みが起こり、核酸配列の十分な発現が結果として生じ、疾患または障害を予防的にまたは治療上、治療するのに有効である、生物学的に活性な結合タンパク質の量を産生し、それによって、ポリヌクレオチド構築物または結果として生じる発現結合タンパク質が、対象の体の最初の送達部位、系、組織、または器官から対象の体の疾患部位、組織、器官、または系に（たとえば血液またはリンパ組織系を介して）天然にまたは自動的に移入されるように、最初に、非疾患細胞（複数可）または他の疾患細胞を、上記に記載される投与の１つまたは複数の経路または様式を使用して、生物学的に活性な結合タンパク質をコ−ドする核酸配列および核酸配列の発現を制御するプロモ−タ−を含む十分な量のポリヌクレオチド構築物と直接接触させることによって、疾患または障害に罹患している細胞（複数可）に間接的に投与するまたは移入することができる。標的核酸の発現は、自然に起こるか、または発現結合タンパク質の量が、部位または組織系で疾患または状態を治療するのに十分で、かつ有効となるように、誘発することができる（下記により詳細に記載される）。ポリヌクレオチド構築物は、核酸配列の発現を制御するプロモ−タ−配列（たとえばＣＭＶプロモ−タ−配列）および／または所望される場合、本明細書において開示される少なくとも１つもしくは複数の他の結合タンパク質をコ−ドする１つもしくは複数のさらなるヌクレオチド配列、サイトカイン、補助剤、もしくは同時刺激分子、または対象の他の結合タンパク質を含むことができる。
【０３２６】
本明細書において記載されるｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏ治療方法のそれぞれにおいて、賦形剤および本開示の結合タンパク質または核酸を含む組成物は、投与するまたは送達することができる。一態様では、薬学的に許容される賦形剤および本明細書において開示される結合タンパク質または核酸を含む組成物が、疾患または障害を治療するのに有効な量で、上記に記載される対象に投与されるまたは送達される。
【０３２７】
他の態様では、上記に記載されるそれぞれのｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏ治療方法において、細胞（複数可）または対象に投与されるポリヌクレオチドの量は、対象の１つまたは複数の細胞への当該ポリヌクレオチドの取り込みが起こり、当該核酸配列の十分な発現が結果として生じ、免疫原（たとえば抗原）によって誘発される免疫応答を含む、対象における免疫応答を増強するのに有効である量の生物学的に活性な結合タンパク質を産生する量とすることができる。他の態様では、それぞれのそのような方法について、細胞（複数可）または対象に投与される結合タンパク質の量は、免疫原（たとえば抗原）によって誘発されるものを含む、対象における免疫応答を増強するのに十分な量とすることができる。
【０３２８】
さらに他の態様では、ポリヌクレオチド構築物（またはポリヌクレオチド構築物を含む組成物）が生理活性結合タンパク質を対象に送達するために使用されるｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ治療方法において、ポリヌクレオチド構築物の発現は、誘発可能なオンおよびオフ遺伝子発現系を使用することによって誘発することができる。そのようなオンおよびオフ遺伝子発現系は、それぞれ、Ｔｅｔ−Ｏｎ（商標）遺伝子発現系およびＴｅｔ−Ｏｆｆ（商標）遺伝子発現系を含む（それぞれのそのような系の詳細な説明については、たとえばＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｃａｔａｌｏｇ  ２０００，  ｐｇ．  １１０−１１１を参照されたい）。
【０３２９】
他の制御可能または誘発可能なオンおよびオフ遺伝子発現系は、当業者らに公知である。そのような系を用いると、ポリヌクレオチド構築物の標的核酸の発現は、正確で、可逆的で、かつ定量的な方法で調節することができる。標的核酸の遺伝子発現は、たとえば、標的核酸を含むポリヌクレオチド構築物を含有する安定したトランスフェクト細胞が、対象の組織部位、器官、または系に送達されたまたは移入されたまたはそれと接触した後に、誘発することができる。そのような系は、標的核酸の発現を遅延させるまたは正確に制御する（たとえば外科手術および／または外科手術に続く治癒の完了のための時間を提供する；標的核酸を含むポリヌクレオチド構築物が治療されることとなる部位、細胞、系、または組織に到着する時間を提供する；構築物により形質転換された細胞を含有する移植片が、それがその上にまたはその中に継ぎ合わせられたまたは付加されたなどの組織または器官の中に組み込まれるようになる時間を提供する）ことが有利である治療方法および方式において特に有益である。
【０３３０】
Ｘ．  さらなる多量体の使用
本開示の多量体の可能性のある用途は、多様であり、親和性薬剤、特に結合タンパク質、ならびにより特定にはＦＧＦＲ１ｃ、β−クロト−、またはＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の両方に結合する二重特異性結合タンパク質が所望されるいずれの使用も含む。
【０３３１】
いくつかの場合、一対の単量体または多量体が、同じ標的に（すなわち、サンドイッチベ−スのアッセイにおける使用のために）結合するよう選択される。一致した単量体対または多量体対を選択するために、２つの異なる単量体または多量体は典型的には、標的タンパク質を同時に結合することができる。このような対を特定するための１つのアプロ−チは、以下を包含する：
（１）標的タンパク質を結合するようあらかじめ選択されたファ−ジ混合物またはタンパク質混合物を固定化すること、
（２）標的タンパク質を、固定化したファ−ジまたはタンパク質と接触させ、洗浄すること、
（３）ファ−ジ混合物またはタンパク質混合物を、結合した標的と接触させ、洗浄すること、および
（４）固定化したファ−ジまたはタンパク質を溶出することなく、結合したファ−ジまたはタンパク質を溶出すること。
【０３３２】
本明細書に提供される多量体ドメインまたは単量体ドメインに関する１つの使用は、検出または他の親和性ベ−スのアッセイにおいて抗体または他の親和性薬剤を置き換えることである。したがって、いくつかの実施態様において、単量体ドメインまたは多量体は、混合物における標的以外の成分を結合する能力に対して選択される。一般的なアプロ−チには、アッセイ中に試料の組成を模倣することを含む、アッセイの条件に厳密に類似する条件下で親和性選択を実施することが含まれ得る。したがって、選択の工程には、単量体ドメインまたは多量体を、標的リガンドを含まない混合物と接触させること、および混合物に結合するいずれの単量体ドメインまたは多量体ドメインに対しても選択することが含まれ得る。したがって、アッセイにおいて試料を表す（抗体、単量体ドメイン、または多量体を用いて枯渇し得る標的リガンドを含まない）混合物（血清、血液、組織、細胞、尿、精液、など）は、遮断剤として用いられ得る。このようなアプロ−チは、例えば、その標的に結合するが他の血清タンパク質または非標的組織に結合しない医薬タンパク質を作製するのに望ましくあり得る。
【０３３３】
例えば、選択された単量体ドメインまたは多量体が、２つのタンパク質、例えばＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−のｉｎ  ｖｉｖｏでの会合を生じるシグナル伝達事象を模倣する、本明細書に説明されるものなどのアゴニストが作製され得る。図１を参照されたい。任意に、本明細書に開示される方法を採用して、アンタゴニストを生成することができる。例えば、２つの異なるタンパク質、例えば酵素および基質と結合する多量体は、例えば、酵素活性および／または基質転換を含むタンパク質機能を阻害することができる。
【０３３４】
いくつかの実施態様において、単量体ドメインは、リガンド阻害、リガンドクリアランス、またはリガンド刺激のために用いられる。これらの方法における可能性のあるリガンドには、例えば、ＦＧＦＲ１ｃおよび／またはβ−クロト−が含まれ得る。
【０３３５】
別の実施態様において、受容体に結合する少なくとも２つの単量体を含む多量体を用いて、多量体を結合する両者によって２つの受容体を近くさせ、それにより受容体を活性化させる。本明細書に説明される結合タンパク質のサブセットは、この様式で挙動する。例えば、実施例１１を参照されたい。
【０３３６】
本明細書に開示される組成物の可能性のある使用に関するさらなる例には、薬剤結合（例えば、標的化のための放射性ヌクレオチドを結合すること、薬剤の半減期延長のための医薬的結合、過量服用治療および嗜癖療法のための制御された物質結合）をすることのできる単量体ドメインおよびその多量体、免疫機能調節（例えば、ＣＴＬＡ−４のような受容体と結合することによる免疫原性遮断、ＣＤ８０のような受容体と結合することによる免疫原性亢進、またはＦｃ型の結合による補体活性化）、ならびに特化した送達（例えば、リンカ−開裂、電子輸送ドメイン、二量体化ドメイン、もしくは下記に対する特異的結合による緩徐な放出が含まれる：細胞進入ドメイン、ＦｃＲなどのクリアランス受容体、経粘膜輸送のためのｐｌｇＲなどの経口送達受容体、およびトランスフェリンＲなどの血液−脳転移受容体）。
【０３３７】
さらなる実施態様において、単量体または多量体は、検出可能な標識（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、など）と共有結合することができるかまたは、リポ−タ−遺伝子産物（例えば、ＣＡＴ、ルシフェラ−ゼ、セイヨウワサビペルオキシダ−ゼ、アルカリホスファタ−ゼ、ＧＦＰ、など）に融合した融合ポリペプチドとして発現することができる。
【０３３８】
ＸＩ．単量体ドメインならびに／または多量体核酸およびポリペプチドのさらなる操作
本明細書で説明するように、本開示の結合タンパク質は変化することができる。これらの結合タンパク質をコ−ドする修飾されたまたは変化した核酸配列を生成するための種々の多様性発生手順に関する説明は、本明細書および提供される参考文献において説明される。
【０３３９】
本開示の別の態様には、単量体ドメイン、選択された単量体ドメイン、多量体、および／または多量体コ−ド核酸のクロ−ニングおよび発現が含まれる。したがって、多量体ドメインは、当該技術分野で周知の発現系を用いて単一のタンパク質として合成することができる。ベクタ−、プロモ−タ−の使用を含む本明細書で有用な分子生物学的技術、ならびに単量体ドメイン、選択された単量体ドメイン、多量体、および／または選択された多量体などの核酸を発現することと関連した多くの他のトピックを説明する一般的な教科書には、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  （Ｂｅｒｇｅｒ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （２ｎｄ  Ｅｄ．），    Ｖｏｌ．  １−３，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．が含まれる。ポリメラ−ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガ−ゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑ−レプリカ−ゼ増幅、および他のＲＮＡポリメラ−ゼ仲介性技術（例えば、ＮＡＳＢＡ）を含む、単量体ドメインおよび多量体コ−ド核酸を同定、単離、およびクロ−ン化する上で有用な、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増幅方法を通じて当業者を方向付けるのに十分な技術の例は、Ｂｅｒｇｅｒ，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ、およびＭｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）、米国特許第４，６８３，２０２号、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  （Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ）  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  （１９９０）  （Ｉｎｎｉｓ）、Ａｒｎｈｅｉｍ  ＆  Ｌｅｖｉｎｓｏｎ  （Ｏｃｔｏｂｅｒ  １，  １９９０）  Ｃ＆ＥＮ    ３６−４７、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  ＮＩＨ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （１９９１）  ３，  ８１−９４、Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６，  １１７３、Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７，  １８７４、Ｌｏｍｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ  ３５，  １８２６、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１，  １０７７−１０８０、Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ  （１９９０）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８，  ２９１−２９４、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，  （１９８９）  Ｇｅｎｅ  ４���  ５６０、Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｇｅｎｅ  ８９，  １１７、ならびにＳｏｏｋｎａｎａｎ  ａｎｄ  Ｍａｌｅｋ  （１９９５）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：  ５６３−５６４において見出される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増幅された核酸をクロ−ン化する改良された方法は、Ｗａｌｌａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  米国特許第５，４２６，０３９号において説明されている。ＰＣＲによって大きな核酸を増幅する改良された方法は、Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３６９：  ６８４−６８５およびそれにおける参考文献に要約されており、その中で、最大４０ｋｂのＰＣＲアンプリコンが生成される。当業者は、本質的にいずれのＲＮＡも、制限消化、ＰＣＲ増幅、ならびに逆転写酵素およびポリメラ−ゼを用いた配列決定に好適な二本鎖ＤＮＡへと変換されることができることを認識するであろう。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、およびＢｅｒｇｅｒを参照されたい。
【０３４０】
本開示は、本開示のベクタ−の宿主細胞への導入、組換え技術による本開示の単量体ドメイン、選択された単量体ドメイン、多量体、および／または選択された多量体の産生にも関する。宿主細胞は、例えばクロ−ン化ベクタ−または発現ベクタ−であり得る本開示のベクタ−を用いて遺伝子操作される（すなわち、形質導入、形質転換、または形質移入される）。ベクタ−は例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファ−ジ、などの形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロモ−タ−を活性化し、形質転換体を選択し、または関心対象の単量体ドメイン、選択された単量体ドメイン、多量体、および／もしくは選択された多量体遺伝子（複数可）を増幅するために適宜修正された従来の栄養物質培地において培養することができる。温度、ｐＨ、およびこれらに類するものなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞とともにすでに用いられたものであり、当該技術分野において、ならびにＦｒｅｓｈｎｅｙ  （１９９４）  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，  ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，  ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｗｉｌｅｙ−  Ｌｉｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋおよびその中で引用された参考文献を含む、本明細書で引用された参考文献において、当業者に明らかであろう。
【０３４１】
先に記載されたように、本開示の結合タンパク質は、植物、酵母、真菌、細菌、およびこれらに類するものなどの被動物細胞においても産生することができる。実際、記載されるように、ファ−ジディスプレイは、このようなポリペプチドを産生するための特に適切な技術である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｂｅｒｇｅｒ、およびＡｕｓｕｂｅｌに加えて、細胞培養に関する詳細は、Ｐａｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．    Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ、Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  （ｅｄｓ）  （１９９５）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  （Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）  ａｎｄ  Ａｔｌａｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｓ  （ｅｄｓ）  Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ  （１９９３）  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  ＦＬ．において見出されることができる。
【０３４２】
本開示は、薬理学的特性を改良し、免疫原性を低下させ、または多量体および／もしくは単量体ドメインの細胞もしくは組織への（例えば、血液脳関門を通じてのもしくは皮膚を通じての）輸送を容易にするために、単量体ドメイン、免疫ドメイン、および／または多量体の変更も提供する。これらの種類の変更には、種々の修飾（例えば、糖基の付加またはグリコシル化）、ＰＥＧの付加、あるタンパク質（例えば、ＨＡＳもしくは他の血清タンパク質）と結合するタンパク質ドメインの付加、細胞の内へ、外へ、および細胞を通じてシグナルが移動もしくは輸送するタンパク質断片もしくは配列の付加、血清中の多量体の半減期を延長することのできるタンパク質もしくはタンパク質ドメイン（例えば、ＨＡＳまたは、ＩｇＧのＦｃドメイン）の付加が含まれる。追加的な成分を多量体および／または単量体ドメインに付加して、多量体および／または単量体ドメインの特性を操作することもできる。例えば、公知の受容体と結合するドメイン（例えば、Ｆｃ受容体を結合するＦｃ領域タンパク質ドメイン）、毒素（複数可）もしくは毒素の部分、多量体もしくは単量体ドメインを活性化するために任意に開裂することのできるプレドメイン、リポ−タ−分子（例えば、緑色蛍光タンパク質）、（放射線療法のための放射性核種、ビオチン、もしくはアビジンのような）リポ−タ−分子を結合する成分、または修飾の組み合わせを含む、種々の成分を付加することもできる。
【０３４３】
ＸＩＩ．  動物モデル
本開示の別の態様は、単量体または多量体ドメインを含む結合タンパク質の免疫原性を試験するための特異的非ヒト動物モデルの開発である。このような非ヒト動物モデルを作製する方法は、受け手の非ヒト動物の少なくともいくつかの細胞に、タンパク質の同じファミリ−由来の複数のヒトタンパク質をコ−ドする遺伝子を含むベクタ−を導入することを含み、この中で、遺伝子は、タンパク質の同じファミリ−由来の複数のヒトタンパク質を発現することのできる遺伝的に修飾された非ヒト動物が得られるようベクタ−が導入される細胞の少なくともいくつかにおいて機能的であるプロモ−タ−に各々作用可能に連結される。
【０３４４】
本発明に開示される方法の実施および組成物において採用される好適な非ヒト動物には、ヒト以外のすべての脊椎動物が含まれる（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、およびこれらに類するもの）。典型的には、タンパク質のファミリ−の複数のメンバ−には、該ファミリ−の少なくとも２のメンバ−、通常少なくとも１０のファミリ−メンバ−が含まれる。いくつかの実施態様において、該複数には、タンパク質のファミリ−のすべての公知のメンバ−が含まれる。用いられることのできる例示的な遺伝子には、例えば、ＬＤＬ受容体クラスＡドメインファミリ−、ＥＧＦ様ドメインファミリ−、および本明細書に説明される他のドメインファミリ−のメンバ−など、単量体ドメインをコ−ドするものが含まれる。
【０３４５】
本開示の非ヒト動物モデルを用いて、非ヒト動物モデルによって発現するタンパク質の同じファミリ−由来の単量体または多量体ドメインを含む結合タンパク質の免疫原性についてスクリ−ニングすることができる。本開示には、先に説明された方法に従って作製された非ヒト動物モデル、ならびに体細胞および生殖細胞が、タンパク質の同じファミリ−由来の複数のヒトタンパク質をコ−ドするＤＮＡ分子を発現するトランスジェニック非ヒト動物が含まれ、この中で、ＤＮＡ分子は、胚期においてトランスジェニック非ヒト動物へと導入され、およびこの中で、ＤＮＡ分子は、ＤＮＡ分子が導入された細胞の少なくともいくつかにおけるプロモ−タ−に各々作用可能に連結される。
【０３４６】
ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン由来の結合タンパク質をスクリ−ニングするのに有用なマウスモデルの一例を、以下の通り説明する。野生型ヒトＬＤＬ受容体クラスＡドメイン単量体をコ−ドする遺伝子クラスタ−を、ＰＣＲを用いてヒト細胞から増幅させる。２００の異なるＡドメインのほぼすべては、各約７ｋｂの３つの個別のＰＣＲ増幅反応のみを用いて増幅することができる。次に、これらの断片を用いて、先に説明された方法に従ってトランスジェニックマウスを作出する。トランスジェニックマウスは、ヒトＡドメインを「自己」として認識し、したがって、Ａドメインに関してヒトの「自己」を模倣する。個々のＡドメイン由来の単量体または多量体をこれらのマウスにおいて、Ａドメイン由来の単量体または多量体をマウスに注射し、次に、生じた免疫応答（または応答の欠失）を分析することによって試験する。マウスを試験して、マウス抗ヒト応答（ＭＡＨＲ）を発達させたかどうかを決定する。ＭＡＨＲの発生を結果として生じない単量体および多量体は、ヒトに投与された場合、非免疫原性である可能性が高い。
【０３４７】
歴史的に、トランスジェニックマウスにおけるＭＡＨＲ試験を用いて、個々の単一のタンパク質についてトランスジェニックであるマウスにおける該単一のタンパク質を試験する。対照的に、上記の方法は、「自己」としてヒトタンパク質のファミリ−全体を認識し、かつ大幅に変動する結合活性および使用を各々可能にする多数のバリアントタンパク質を評価するために用いられることのできる、非ヒト動物モデルを提供する。
【０３４８】
ＸＩＩＩ．  キット
開示された方法において採用されることのできる成分（典型的は、混合されていない形態にある）、ならびに包装材料、成分を用いることおよび／または方法を実施するための説明書、ならびに成分を保持するための１つ以上の容器（反応チュ−ブ、カラム、など）を含むキットは、本開示の態様を形成する。本明細書に説明される化合物および方法を含むキットは、多量体ライブラリ−、または単一種類の単量体もしくは多量体、例えば、本明細書に説明されるＦＧＦＲ１ｃおよび／またはβ−クロト−結合タンパク質のうちの１つ以上を含む結合タンパク質を含むことができる。キットには、緩衝剤など、標的分子結合を促進するのに好適な試薬、または検出可能に標識された分子を含む検出を容易にする試薬も含まれ得る。単量体ドメインまたはそれに類するものに対するリガンド結合を較正するための標準物質も、キットに含めることができる。
【０３４９】
本開示は、商業的に価値のある結合アッセイおよび該アッセイを実施するためのキットも提供する。アッセイのうちのいくつかにおいて、１つ以上のリガンドを採用して、単量体ドメイン、免疫ドメイン、および／または多量体の結合を検出する。このようなアッセイは、結合タンパク質に対するリガンド（複数可）の結合を検出するための、当該技術分野における任意の公知の方法、例えば、フロ−サイトメトリ−、蛍光顕微鏡、プラズモン共鳴、およびこれらに類するものに基づいている。
【０３５０】
開示されたアッセイに基づいたキットも提供される。このようなキットは、容器と１つ以上のリガンドとを含むことができる。キットは、アッセイを実施するための指示書、追加的な検出試薬、緩衝剤、もしくはこれらの成分のいずれかの使用のための説明書、またはこれらに類するものも含むことができる。あるいは、キットには、本開示の結合タンパク質の発現のための細胞、ベクタ−（例えば、本発明に開示されたポリペプチドを含む発現ベクタ−、分泌ベクタ−）を含むことができる。
【０３５１】
さらなる態様において、本明細書に提供される任意の組成物、単量体ドメイン、免疫ドメイン、多量体、細胞、細胞培養物、装置、装置部品、あるいはキットの、本明細書の任意の方法もしくはアッセイの実施のための、および／または、本明細書の任意のアッセイもしくは方法を実施するための任意の装置もしくはキットの使用のための、および／または細胞、細胞培養物、組成物、もしくは本明細書の他の特徴の治療製剤としての使用のための、使用が提供される。本明細書の成分すべての、本明細書に説明される治療のための治療製剤としての製造も提供される。
【０３５２】
ＸＩＶ．  集積系
本開示は、単量体ドメイン、選択された単量体ドメイン、多量体、および／または選択された多量体、ならびにこのような結合タンパク質をコ−ドする核酸、に対応する文字列を含む計算機、計算機可読媒体、ならびに、集積系を提供する。これらの配列は、インシリコでの組換え方法によって、または標準的な配列整列もしくは文書処理ソフトウェアによって操作することができる。
【０３５３】
例えば、種々の厳密性および文字列の長さに関する異なる種類の類似性および留意点は、本明細書の集積系において検出および認識することができる。例えば、多くの相同性決定方法が、生体高分子の配列の比較分析のために、文書処理におけるスペルチェックのために、および種々のデ−タベ−スからのデ−タ検索のために設計されている。天然ポリヌクレオチドにおける４つの主要な核酸塩基の間の二本鎖対での相補体の相互作用を理解によって、相補的な相同のポリヌクレオチド鎖のアニ−リングを模倣するモデルは、本明細書の配列に対応する文字列に関して典型的に実施される配列整列化または他の操作（例えば、文書処理操作、配列もしくはサブシ−ケンスの文字列を含む図、出力表の構築、など）の基礎としても用いられ得る。配列類似性を計算するためのＧＯを有するソフトウェアパッケ−ジの一例は、ＢＬＡＳＴであり、本明細書の配列に対応する文字列を入力することによって適応することができる。
【０３５４】
ＢＬＡＳＴは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０において説明されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、米国国立バイオテクノロジ−情報センタ−を通じて公共的に入手可能である。このアルゴリズムは、問題の配列における長さＷの短いワ−ドを特定することによって高スコア化配列対（ＨＳＰ）をまず特定することを包含し、該問題の配列は、デ−タベ−ス配列における同じ長さのワ−ドと整列化されると、いくつかの正の値の閾値スコアＴと一致しまたは満たすかのいずれかである。Ｔは、近隣ワ−ドスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、上述）。これらの最初の近隣ワ−ドヒットは、該ヒットを含有する、より長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシ−ドとして作用する。次に、累積的整列スコアが増大できる限り、ワ−ドヒットを各配列に沿って両方向に伸長させる。累積スコアを、ヌクレオチド配列のためにはパラメ−タＭ（一対の一致した残基についての報酬スコア、常に０より大きい）およびＮ（ミスマッチ残基についての罰則スコア、常に０未満）を用いて算出する。アミノ酸配列について、スコア化マトリックスを用いて、累積スコアを算出する。各方向におけるワ−ドヒットの伸長は、累積整列スコアが、その最大達成値から量Ｘほど減少する場合、累積スコアが１以上の負のスコア化残基整列の蓄積により０以下になる場合、またはいずれかの配列の末端に到達する場合、停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメ−タＷ、Ｔ、およびＸが、整列の感度および速度を決定する。（ヌクレオチド配列のための）ＢＬＡＳＴＮプログラムは、既定値として１１のワ−ド長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、１００のカットオフ、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列のために、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、既定値として３のワ−ド長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア化マトリックスを用いる（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  （１９８９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１０９１５参照）。
【０３５５】
有用な配列整列化アルゴリズムの追加的な例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、漸次的な対をなす整列化を用いて関連配列の群から複数の配列整列を作製する。ＰＩＬＥＵＰは、整列を作製するよう用いられたクラスタ−化関連性を示す系統樹をプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，  （１９８７）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ３５：３５１−３６０の漸次的整列化方法の簡素化したものを用いる。用いられる方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＆  Ｓｈａｒｐ，  （１９８９）  ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３によって説明される方法と類似している。該プログラムは、例えば、最大５，０００文字長の最大３００の配列を整列化することができる。複数の整列化手順は、２つの最も類似した配列の対をなす整列化で開始し、２つの整列化した配列のクラスタ−を作る。次に、このクラスタ−を、整列化した配列の次にもっとも関連のある配列またはクラスタ−と整列させることができる。２つのクラスタ−の配列は、２つの個々の配列の対をなす整列の単純な伸長によって整列化することができる。最終的な整列は、一連の漸次的な対をなす整列化によって達成される。本プログラムを用いて、クラスタ−化関連性の樹状図または系統樹の提示をプロットすることもできる。プログラムは、配列比較の領域に特異的な配列およびそのアミノ酸もしくはヌクレオチド座標を指定することによって実行される。例えば、単量体ドメインファミリ−における保存されたアミノ酸を決定するために、またはファミリ−における単量体ドメインの配列を比較するために、問題の配列またはコ−ド核酸を整列化して、構造−機能情報を提供する。
【０３５６】
一態様において、計算機システムを用いて、単量体ドメインに対応する文字列の「ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ」配列組換えまたはシャッフリングを実施する。種々のこのような方法は、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｋｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒ  Ｓｔｒｉｎｇｓ，  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ＆  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｄｅｓｉｒｅｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ”  ｂｙ  Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖ  ａｎｄ  Ｓｔｅｍｍｅｒ，  ｆｉｌｅｄ  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ５，  １９９９  （ＵＳＳＮ  ６０／１１８８５４）および“Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｋｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒ  Ｓｔｒｉｎｇｓ，  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ＆  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｄｅｓｉｒｅｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ”  ｂｙ  Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖ  ａｎｄ  Ｓｔｅｍｍｅｒ，  ｆｉｌｅｄ  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １２，  １９９９  （ＵＳＳＮ  ０９／４１６，３７５）に示される。簡潔には、遺伝的オペレ−タ−を遺伝アルゴリズムに用いて、例えば、突然変異、組換え、死滅、およびこれらに類するものなどの遺伝的事象を模倣することによって、所与の配列を変化させる。配列を最適化するための多次元分析も、例えば第３７５条適用において説明されるように、計算機システムにおいて実行されることができる。
【０３５７】
デジタルシステムは、例えば、遺伝子再構築もしくは組換えのために用いられるオリゴヌクレオチドを合成するよう、または（適切な注文形式を印刷することによって、もしくはインタ−ネット上の注文形式に連関することによって）商業源からオリゴヌクレオチドを注文するよう、オリゴヌクレオチド合成装置に命令することもできる。
【０３５８】
デジタルシステムには、（組換え体、例えば本明細書の組換え単量体ドメイン、の配列または整列に基づいて）核酸合成を制御するための出力要素も含めることができ、すなわち、本開示の集積系には、任意に、オリゴヌクレオチド合成装置またはオリゴヌクレオチド合成制御装置が含まれる。該システムには、例えば、アッセイに関して上記のとおり本明細書の配列に対応する文字列を用いて実施される整列化または他の操作から下流に生じる他の操作を含むことができる。
【実施例】
【０３５９】
上述の本発明は、明確性および理解の目的のためにいくぶん詳細に説明されたが、形態および詳細における種々の変更が、本発明の新の範囲から逸脱することなくなされることができることは、本開示の読み取りから当業者に明らかであろう。例えば、先に説明された技術、方法、組成物、装置、およびシステムはすべて、種々の組み合わせで用いることができる。本出願に引用された刊行物、特許、特許出願、または他の文書はすべて、各個々の刊行物、特許、特許出願、または他の文書がすべての目的のために引用により組み込まれるよう個々に示された場合と同じ程度まで、すべての目的のためにそれらのすべての内容が全体として引用により組み込まれる。ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／１３２５７およびＰＣＴ／ＵＳ０３／３５６６４ならびに米国特許公報第２００５／００８９９３２号は、それらのすべての内容が全体として引用により本明細書により組み込まれる。
【０３６０】
実施例１
本実施例は、単量体ドメインの選択および多量体の作製を説明する。
【０３６１】
単量体ドメインを同定するための出発材料ならびに選択された単量体ドメインおよび手順から作製する多量体は、種々のヒトおよび／または非ヒト配列のいずれかに由来し得る。例えば、所望のリガンドまたはリガンドの混合物に特異的な結合を有する選択された単量体ドメインを作製するために、１つ以上の単量体ドメイン遺伝子（複数可）を、あるリガンドに結合する単量体ドメインのファミリ−から選択する。該１つ以上の単量体ドメイン遺伝子をコ−ドする核酸配列を、ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって得ることができるか、または任意に、重複するオリゴヌクレオチドを用いて合成的に産生することができる。
【０３６２】
最も普遍的には、次に、これらの配列を、発現およびスクリ−ニングのために、細胞表面ディスプレイフォ−マット（すなわち、細菌、酵母、または哺乳類（ＣＯＳ）細胞表面ディスプレイ、ファ−ジディスプレイ）へとクロ−ン化する。組換え体配列を適切な宿主細胞へと形質移入（形質導入または形質転換）し、該宿主細胞において、該配列を細胞表面で発現および表示する。例えば、細胞を、標識された（例えば、蛍光標識された）所望のリガンドで染色することができる。染色された細胞をフロ−サイトメトリ−によって選別し、選択された単量体ドメインをコ−ドする遺伝子を陽性細胞から（例えば、プラスミド単離、ＰＣＲまたは増殖、およびクロ−ン化によって）回収する。染色および選別の過程を（例えば、所望の濃度の濃縮が得られるまで、所望のリガンドの漸減濃度を用いて）複数回反復することができる。あるいは、所望のリガンドもしくはリガンドの混合物を結合する細胞を同定するために用いられることのできる当該技術分野で公知の任意のスクリ−ニング法もしくは検出法を採用することができる。
【０３６３】
所望のリガンドまたはリガンドの混合物を結合する細胞から回収された、選択された単量体ドメインをコ−ドする遺伝子は、本明細書にまたは引用された参考文献に説明された方法のいずれかに従って、任意に組換えられることができる。次に、この回の分岐において産生された組換え配列を、同じかまたは異なる方法によってスクリ−ニングして、所望のリガンドまたは標的リガンドに対する改良された親和性を有する組換え遺伝子を同定する。多様化および選択過程は、所望の親和性が得られるまで任意に反復される。
【０３６４】
前記方法によって選択された選択された単量体ドメイン核酸は、例えば、ＤＮＡ連結、または任意に、ＰＣＲベ−スの自己プライミング重複反応による、選択された単量体ドメインをコ−ドする核酸配列の組み合わせ構築によって多量体を作製するようリンカ−配列を介して互いに接合することができる。次に、発現およびスクリ−ニングのために、多量体をコ−ドする核酸配列を、細胞表面ディスプレイフォ−マット（すなわち、細菌、酵母、または哺乳類（ＣＯＳ）細胞表面ディスプレイ、ファ−ジディスプレイ）へとクロ−ニングする。組換え体配列を適切な宿主細胞へと形質移入（形質導入または形質転換）し、そこで該組換え体配列は細胞表面に発現および表示される。例えば、該細胞は、標識された、例えば、蛍光標識された所望のリガンドまたはリガンドの混合物を用いて染色することができる。染色された細胞は、フロ−サイトメトリ−によって選別され、選択された多量体をコ−ドする遺伝子は陽性細胞から（例えば、ＰＣＲまたは増殖およびクロ−ン化によって）回収される。陽性細胞には、選択された単量体ドメイン（複数可）と比較して所望のリガンドまたはリガンドの混合物に対する改良された結合活性もしくは親和性または変更した特異性を有する多量体が含まれる。染色および選別の過程は、（例えば、所望の濃度の濃縮が得られるまで、所望のリガンドまたはリガンドの混合物の漸減する濃度を用いて）複数回反復されることができる。あるいは、所望のリガンドまたはリガンドの混合物を結合する細胞を同定するために用いられることのできる当該技術分野で公知の任意のスクリ−ニング方法または検出方法を採用することができる。
【０３６５】
所望のリガンドまたはリガンド混合物を結合する細胞から回収された選択された多量体をコ−ドする遺伝子は、本明細書においてまたは引用された参考文献において説明された方法のいずれかに従って任意に組み合わされることができる。次に、この回の多様化において生じた組換え体配列を、同じかまたは異なる方法によってスクリ−ニングし、所望のリガンドまたは標的リガンドに対する改良された結合活性もしくは親和性または変更した特異性を有する組換え体遺伝子を同定する。多様化および選択過程は、所望の結合活性もしくは親和性または変更した特異性が得られるまで、任意に反復される。
【０３６６】
実施例２
本実施例は、より大きな多様性のライブラリ−を作製するためのｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質組換えを説明する。
【０３６７】
直交性ｌｏｘＰ部位によって隣接された単量体コ−ドプラスミドベクタ−（ｐＣＫ由来のベクタ−、下記参照）を、その互換性のあるｌｏｘＰ部位を介してファ−ジベクタ−を用いてＣｒｅ依存性様式で組換えた。組換えファ−ジベクタ−を、組換え体コンストラクトに特異的なプライマ−を用いたＰＣＲによって検出した。ＤＮＡ配列決定は、正確な組換え体産物が生じることを示した。
【０３６８】
試薬および実験手順
（ｐＣＫ−ｃｒｅ−ｌｏｘ−単量体−ｌｏｘＰ）
本ベクタ−は、２つの特に関連した特徴を有する。第一に、該ベクタ−は、Ｐｌａｃの制御下で部位特異的ＤＮＡリコンビナ−ゼＣｒｅをコ−ドするｃｒｅ遺伝子を保持する。Ｃｒｅを、ｐ７０５−ｃｒｅ（ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ製）から、ＰＣＲ産物の両端でＸｂａＩ（５’）およびＳｆｉＩ（３’）を組み込むｃｒｅ特異的プライマ−を用いてＰＣＲ増幅した。この産物を、ＸｂａＩおよびＳｆｉＩで消化し、ｐＣＫ  、ｂｌａ−、ｐＣＫ１１０９１９−ＨＣ−Ｂｌａ（ｐＡＣＹＣｏｒｉ）のＣｍＲ誘導体の同一部位へとクロ−ン化した。
【０３６９】
第二の特徴は、Ｃｒｅによって触媒される部位特異的ＤＮＡ組換えに必要な２つの直交するｌｏｘＰ部位であるｌｏｘＰ（野生型）およびｌｏｘＰ（ＦＡＳ）によって隣接された未変性Ａドメインライブラリ−である。例えば、Ｓｉｅｇｅｌ，  Ｒ．Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５０５：４６７−４７３  （２００１）を参照されたい。これらの部位は、ほとんど別のものと組換えられることはない。ｌｏｘＰ部位を、順次てｐＣＫ−ｃｒｅへと構築した。５’−リン酸化型オリゴヌクレオチドであるｌｏｘＰ（Ｋ）およびｌｏｘＰ（Ｋ＿ｒｃ）は、消化されたＥｃｏｒＩおよびＨｉｎＤＩＩＩで消化したｐＣＫへの連結を可能にするようｏｘＰ（ＷＴ）ならびにＥｃｏＲＩおよびＨｉｎＤＩＩＩと和合性のあるオ−バ−ハングを保有しており、互いにハイブリッド形成して、標準的な連結反応においてｐＣＫ−ｃｒｅに連結した（Ｔ４リガ−ゼ、１６℃で一晩）。
【０３７０】
結果として生じたプラスミドを、ＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩで消化し、ならびにｌｏｘＰ（ＦＡＳ）とＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩと和合性のあるオ−バ−ハングとを保有するハイブリッド形成された５’−リン酸化型オリゴであるｌｏｘＰ（Ｌ）およびｌｏｘＰ（Ｌ＿ｒｃ）に連結した。ライブラリ−構築の準備をするために、ｐＣＫ−ｃｒｅ−ｌｏｘ−Ｐ（ｗｔ）−ｌｏｘＰ（ＦＡＳ）の大規模精製（Ｑｉａｇｅｎ  ＭＡＸＩプレップ）を、Ｑｉａｇｅｎのプロトコ−ルに従って実施した。Ｑｉａｇｅｎ精製したプラスミドをさらなる生成のため位ＣｓＣｌ勾配遠心に供した。このコンストラクトを次に、ＳｐｈＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、既存のＡドメインライブラリ−プ−ルのＰＣＲ増幅を介して得られる消化された未処理のＡドメインライブラリ−インサ−トに連結した。設計によって、ｌｏｘＰ部位および単量体はフレ−ム内にあり、ｌｏｘＰでコ−ドされたリンカ−とともに単量体を生じる。このライブラリ−を、下記に説明されるようなｉｎ  ｖｉｖｏでの組換え手順において利用した。
【０３７１】
（ｆＵＳＥ５ＨＡ−単量体−ｌｏｘ−ｌｏｘベクタ−）
本ベクタ−は、Ｇｅｏｒｇｅ  Ｓｍｉｔｈの実験室（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）製のｆＵＳＥ５の誘導体である。これをその後、免疫検出アッセイのためのＨＡタグを保有するよう修飾した。ｌｏｘＰ部位をｆＵＳＥ５ＨＡへと連続的に構築した。終止コドンの鎖であるｌｏｘＰ（ＷＴ）とＸｍａＩおよびＳｆｉＩと和合性のあるオ−バ−ハングとを保有する５’−リン酸化型オリゴヌクレオチドであるｌｏｘＰ（Ｉ）およびｌｏｘＰ（Ｉ）＿ｒｃを互いにハイブリッド形成させ、標準的な連結反応（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｔ４リガ−ゼ、１６℃で一晩）においてＸｍａＩおよびＳｆｉＩで消化したｆＵＳＥ５ＨＡへ連結した。
【０３７２】
結果として生じたファ−ジベクタ−を次に、ＸｍａＩおよびＳｐｈＩで消化し、ｌｏｘＰ（ＦＡＳ）とＸｍａＩおよびＳｐｈＩと和合性のあるオ−バ−ハングとを保有するハイブリッド形成されたオリゴであるｌｏｘＰ（Ｊ）およびｌｏｘＰ（Ｊ）＿ｒｃへ連結した。このコンストラクトをＸｍａＩ／ＳｆｉＩで消化した後、あらかじめ切断しておいた（ＸｍａＩ／ＳｆｉＩ）未処理のＡドメインライブラリ−インサ−ト（ＰＣＲ産物）へと連結した。終止コドンは、ｌｏｘＰ部位間に位置し、ｇＩＩＩの発現を防止し、結果的に感染性ファ−ジの産生を防止する。
【０３７３】
連結されたベクタ−／ライブラリ−をその後、下で説明されるように、ｆＵＳＥ５ＨＡ−単量体−ｌｏｘ−ｌｏｘの救出を可能にするｇＩＩＩ発現プラスミドを保持する大腸菌宿主へと形質転換した。
【０３７４】
（ｐＣＫ−ｇＩＩＩ）
本プラスミドは、その未変性プロモ−タ−の制御下でｇＩＩＩを保有する。本プラスミドは、プライマ−ｇＩＩＩプロモ−タ−＿ＥｃｐＲＩおよびｇＩＩＩプロモ−タ−＿ＨｉｎＤＩＩＩを用いて、ＶＣＳＭ１３ヘルパ−ファ−ジ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からｇＩＩＩおよびそのプロモ−タ−をＰＣＲ増幅させることによって構築した。この産物をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎＤＩＩＩで消化し、ｐＣＫ１１０９１９−ＨＣ−Ｂｌａの同じ部位へとクロ−ン化した。ｇＩＩＩは、それ自体のプロモ−タ−の制御下にあるので、ｇＩＩＩの発現は、おそらく構成的であり、ｐＣＫ−ｇＩＩＩを大腸菌ＥＣ１００（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）へと形質転換した。
【０３７５】
（ｉｎ  ｖｉｖｏでの組換え手順）
要約すると、該手順は、以下の鍵となる工程を包含する：ａ）ｇＩＩＩを発現する大腸菌宿主を用いたプラスミドからのｆＵＳＥ５ＨＡ−単量体−ｌｏｘ−ｌｏｘライブラリ−の感染性物質（すなわち救出物）の産生、ｂ）第二のライブラリ−（ｐＣＫ）のクロ−ン化およびＦ＋ＴＧ１大腸菌への形質転換、ｃ）救出されたｆＵＳＥ５ＨＡ−単量体−ｌｏｘ−ｌｏｘファ−ジライブラリ−を用いた第二のライブラリ−を保有する培養物の感染。
【０３７６】
（ａ．ファ−ジベクタ−の救出）
ｐＣＫ−ｇＩＩＩを保有する電気コンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞を標準的なプロトコ−ルによって調製した。これらの細胞は、４×１０８／μｇＤＮＡの形質転換頻度を有し、ｆＵＳＥ５ＨＡ−ｌｏｘ−ｌｏｘベクタ−および未処理のＡドメインライブラリ−インサ−トの大規模連結（約５μｇベクタ−ＤＮＡ）を用いて電気穿孔した。約７０μＬ細胞／キュベットで個々の電気穿孔（１００ｎｇＤＮＡ／電気穿孔）の後、９３０μＬの温ＳＯＣ培地を添加し、細胞を３７℃で１時間振蘯しながら回復させておいた。次に、テトラサイクリンを０．２μｇ／ｍＬの終濃度まで添加し、細胞を３７℃で約４５分間振蘯した。一定分量のこの培養物を収集し、１０倍連続希釈して播種し、結果として生じるライブラリ−サイズ（１．８×１０７）を決定した。残存する培養物を２×５００ｍＬの２×ＹＴ（ｐＣＫ−ｇＩＩＩおよびｆＵＳＥ５ＨＡベ−スのベクタ−を選択するためにそれぞれ２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコ−ルおよび２０μｇ／ｍＬテトラサイクリンを有する）へと希釈し、３０℃で一晩増殖させた。
【０３７７】
救出されたファ−ジを、標準的なＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿プロトコ−ルを用いて収集した。力価は、およそ１×１０１２形質導入単位／ｍＬであった。
【０３７８】
（ｂ．第二のライブラリ−のクロ−ン化および大腸菌宿主への形質転換）
連結したｐＣＫ／未処理のＡドメインライブラリ−を、およそ１０８の期待されたライブラリ−サイズで細菌Ｆ＋宿主へと電気穿孔した。３７℃で振蘯しながら１時間の回復期の後、電気穿孔した細胞を２×ＹＴ（＋２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコ−ル）におけるＯＤ６００約０．０５へと希釈し、３７℃で対数期中間へと増殖させた後、ｆＵＳＥＨＡ−単量体−ｌｏｘ−ｌｏｘにより感染させた。
【０３７９】
（ｃ．第二のライブラリ−を保有する培養物の、救出されたｆＵＳＥ５ＨＡ−単量体−ｌｏｘ−ｌｏｘファ−ジライブラリ−による感染）
組換え体の作製を最大化するために、培養物内の大腸菌の高い感染率（５０％超）が望ましい。大腸菌の感染性は、Ｆ線毛の発現および増殖条件を含む、いくつかの因子に依存する。大腸菌背景であるＴＧ１（Ｆ’を保有）およびＫ９１（Ｈｆｒ株）は、組換え系のための宿主であった。
【０３８０】
オリゴヌクレオチド
ｌｏｘＰ（Ｋ）
［Ｐ−５’  ａｇｃｔｔａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａｇａａａｇｇｔａｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔａｇａｔｃｔｃｇｔｇｃｔｇｃａｔｇｃｇｇｔｇｃｇ］（配列番号３９５）
ｌｏｘＰ（Ｋ＿ｒｃ）
［Ｐ−５’  ａａｔｔｃｇｃａｃｃｇｃａｔｇｃａｇｃａｃｇａｇａｔｃｔａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａｔａｃｃｔｔｔｃｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔａａｇｃｔ］（配列番号３９６）
ｌｏｘＰ（Ｌ）
［Ｐ−５’  ａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａｇｃａｔａｃａｔｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔｃｇａｇ］（配列番号３９７）
ｌｏｘＰ  （Ｌ＿ｒｃ）
［Ｐ−５’  ｃｔｃｇａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａａｔｇｔａｔｇｃｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔｇ］（配列番号３９８）
ｌｏｘＰ（Ｉ）
［Ｐ５’ｃｃｇｇｇａｇｃａｇｇｇｃａｔｇｃｔａａｇｔｇａｇｔａａｔａａｇｔｇａｇｔａａａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａｔａｃｃｔｔｔｃｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔｃｇｔｃｔｇ］（配列番号３９９）
ｌｏｘＰ（Ｉ）＿ｒｃ
［Ｐ−５’  ａｃｇａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａｇａａａｇｇｔａｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔｔｔａｃｔｃａｃｔｔａｔｔａｃｔｃａｃｔｔａｇｃａｔｇｃｃｃｔｇｃｔｃ］（配列番号４００）
ｌｏｘＰ（Ｊ）
［５’  ｃｃｇｇｇａｃｃａｇｔｇｇｃｃｔｃｔｇｇｇｇｃｃａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａｇｃａｔａｃａｔｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔｇ］（配列番号４０１）
ｌｏｘＰ（Ｊ）＿ｒｃ
［５’  ｃａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａａｔｇｔａｔｇｃｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔｇｇｃｃｃｃａｇａｇｇｃｃａｃｔｇｇｔｃ］（配列番号４０２）
ｇＩＩＩプロモ−タ−＿ＥｃｏＲＩ
［５’  ａｔｇｇｃｇａａｔｔｃｔｃａｔｔｇｔｃｇｇｃｇｃａａｃｔａｔ（配列番号４０３）
ｇＩＩＩプロモ−タ−＿ＨｉｎＤＩＩＩ
［５’  ｇａｔａａｇｃｔｔｔｃａｔｔａａｇａｃｔｃｃｔｔａｔｔａｃｇｃａｇ］（配列番号４０４）
【０３８１】
実施例３
本実施例は、ＥＧＦベ−スの単量体ライブラリ−の構築を説明する。
【０３８２】
ＣａＥＧＦドメインライブラリ−Ｅ３は、以下のパタ−ン：
Ｘ（５）Ｃ１−Ｘ（４／６）−Ｃ２−Ｘ（４，５）−Ｃ３−Ｘ（８）−Ｃ４−Ｘ（１）−Ｃ５−Ｘ（８／１２）−Ｃ６（配列番号４０５）
を有する３６〜４３のアミノ酸のタンパク質ドメインをコ−ドする。
【０３８３】
本表は、ヒトカルシウム結合ＥＧＦドメインの天然の多様性に基づいて、ライブラリ−において、各位置について、どのアミノ酸がコ−ドされるかを説明する：
【表１】
2013512672.tif 000002
【０３８４】
単量体カルシウム結合ＥＧＦドメインをコ−ドするＤＮＡ配列のライブラリ−Ｅ３を、Ｓｔｅｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  １６４：４９−５３  （１９９５）において説明されるような構築ＰＣＲによって作製した。このＰＣＲ反応において用いられるオリゴヌクレオチドは、２つの群、すなわち群１および群２である。該オリゴヌクレオチドは、以下のとおりである；
【０３８５】
群１（配列番号４０６〜４１１、それぞれ出現順序で）：
１．  ５’−ＡＡＡＡＧＧＣＣＴＣＧＡＧＧＧＣＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＡＴＧＧＴ−３’（配列番号４０６）
２．  ５’−ＣＣＴＧＡＡＣＣＡＣＣＡＣＡＫＨＫＡＣＣＧＹＫＳＮＢＧＣＡＣＧＧＡＹＹＣＧＲＣＲＭＡＣＡＴＴＣＡ  ＴＹＡＡＹＡＴＣＴＤＹＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＣＣＣ−３’（配列番号４０７）
３．  ５’−ＣＣＴＧＡＡＣＣＡＣＣＡＣＡＫＮＴＧＳＣＧＹＹＧＹＫＭＨＳＧＣＡＣＧＧＡＹＹＣＧＲＣＲＭＡＣＡ  ＴＴＣＡＴＹＡＡＹＡＴＣＴＤＹＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＣＣＣ−３’（配列番号４０８）
４．  ５’−ＣＣＴＧＡＡＣＣＡＣＣＡＣＡＫＨＫＡＣＣＧＹＫＳＮＢＧＣＡＡＲＢＡＹＢＣＧＶＡＨＹＣＷＳＫＢＹ  ＡＣＡＴＴＣＡＴＹＡＡＹＡＴＣＴＤＹＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＣＣＣ−３’（配列番号４０９）
５．  ５’−ＣＣＴＧＡＡＣＣＡＣＣＡＣＡＫＮＴＧＳＣＧＹＹＧＹＫＭＨＳＧＣＡＡＲＢＡＹＢＣＧＶＡＨＹＣＷ  ＳＫＢＹＡＣＡＴＴＣＡＴＹＡＡＹＡＴＣＴＤＹＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＣＣＣ−３’（配列番号４１０）
６．  ５’−ＴＧＡＡＴＴＴＴＣＴＧＴＡＴＧＡＧＧＴＴＴＴＧＣＴＡＡＡＣＡＡＣＴＴＴＣＡＡＣＡＧＴＴＴＣＧＧＣＣＣＣＡ  ＧＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＣＣＡＣＣＴＧＡＡＣＣＡＣＣＡＣＡ−３’（配列番号４１１）
【０３８６】
群２（配列番号 ４１２〜４１５、それぞれ出現順序で）：
１．  ５’−ＡＣＧＧＴＧＣＣＴＡＣＣＣＧＴＡＴＧＡＴＧＴＴＣＣＧＧＡＴＴＡＴＧＣＣＣＣＧＧＧＴＧＧＣＡＡＴＧ  ＧＴ−３’（配列番号４１２）
２．  ５’−ＣＣＴＧＡＡＣＣＡＣＣＡＣＡＧＨＫＴＤＢＡＣＣＧＧＨＡＷＡＧＣＣＴＫＳＣＲＳＧＣＡＳＨＢＡＣＡＫ  ＹＫＡＷＡＧＣＹＡＣＣＣＤＳＴＲＷＡＴＹＴＷＢＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＣＣＣ−３’（配列番号４１３）
３．  ５’−ＣＣＴＧＡＡＣＣＡＣＣＡＣＡＫＢＹＫＢＴＫＣＹＧＫＹＣＢＳＡＢＹＣＮＧＣＤＢＡＷＡＧＣＣＴＫＢＧ  ＢＫＧＣＡＳＨＢＡＣＡＫＹＫＡＷＡＧＣＹＡＣＣＣＤＳＴＲＷＡＴＹＴＷＢＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＣＣＣ−３’（配列番号４１４）
４．  ５’−ＡＡＡＡＧＧＣＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＡＣＣＡＣＣＡＣＡ−３’（配列番号４１５）
ここで、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ、Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｓ＝Ｃ／Ｇ、Ｗ＝Ａ／Ｔ、Ｂ＝Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｄ＝Ａ／Ｇ／Ｔ、Ｈ＝Ａ／Ｃ／Ｔ、Ｖ＝Ａ／Ｃ／Ｇ、およびＮ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔである。
【０３８７】
群１および群２のオリゴヌクレオチドの個別のＰＣＲの後、群１のＰＣＲ断片をＢｏｍＩで消化し、群２のＰＣＲ断片をＢｓｒＤＩで消化した。消化産物をＱｉａｇｅｎ  Ｑｉａｑｕｉｃｋカラムを用いて精製した後、互いに連結した。連結したＤＮＡを次に、２つのプライマ−を用いたＰＣＲにおいて増幅した。使用したプライマ−は、
５’−ＡＡＡＡＧＧＣＣＴＣＧＡＧＧＧＣＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＡＴＧＧＴ−３’（配列番号４１６）
５’−ＡＡＡＡＧＧＣＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＡＣＣＡＣＣＡＣＡ−３’（配列番号４１７）
であった。
【０３８８】
ＰＣＲ産物をＱｉａｇｅｎ  Ｑｉａｑｕｉｃｋカラムで精製し、ＳｆｉＩで消化した。消化した産物をＱｉａｇｅｎ  Ｑｉａｑｕｉｃｋカラムで精製した。ＤＮＡ断片を、フレ−ム内ＨＡ−エピト−プおよびグリシン、セリン可撓性リンカ−を保有するｆｕｓｅ５の誘導体であるファ−ジディスプレイベクタ−ｆｕｓｅ５−ＨＡ（Ｇ４Ｓ）４（配列番号４１８）のＳｆｉＩ制限部位へと連結した。連結混合物をＴｒａｎｓｆｏｒＭａｘ（商標）ＥＣ１００（商標）電気コンピテント大腸菌細胞へと電気穿孔した。形質転換した大腸菌細胞を、２０μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含有する２×ＹＴ培地において３７℃で一晩増殖した。結果として生じたライブラリ−は、２×１０９の独立したクロ−ンを含有した。ファ−ジ粒子をＰＥＧ沈殿によって培地から精製した。ファ−ジの力価は、１．３×１０１２／ｍＬであった。２４の個々のクロ−ンの配列を決定し、これらはライブラリ−設計と一致した。
【０３８９】
実施例４
本実施例は、組換えたライブラリ−を作製するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのタンパク質内組換え、および無作為化されたシステイン間ル−プを有するライブラリ−を作製する方法を説明する。
【０３９０】
組換えを、ドメイン内最適化のために用いることができる。例えば、たがいに対して単一のドメインの２つ以上のセグメントを組換えるＰＣＲ重複反応が用いられることができる。示されたのと同じ方法で、２、３、４、５、またはそれより多くの断片重複反応を用いることができる。この組換え過程は、多くの用途を有する。１つの用途は、配列情報なしであらかじめ選択された数百のクロ−ンの大きなプ−ルを組換えることである。各重複が作用するのに必要なものは、クロ−ンの各々における同じ位置に沿内する（比較的）定常な配列の１つの既知の領域だけである。Ａドメインについて、典型的にこれらのクロ−ンは、５つのシステイン間セグメントすべてにわたって分布される２０〜２５のアミノ酸が無作為化されたライブラリ−に由来していたであろう。ドメイン内組換え方法は、無作為な断片化および、組換えられるべきクロ−ンのすべてにおける固定された重複部位を必要としないＤＮＡ配列相同性に基づいた再構築に基づいた標準的なＤＮＡ組換え（例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−３９１  （１９９４））によって、配列と関連した単量体ドメインのプ−ルに関しても実施することができる。
【０３９１】
この過程の別の用途は、各ライブラリ−における異なるル−プを無作為化するために、システイン間ル−プのうちの唯一が各々のライブラリ−において無作為化される、複数の個別の未処理の（パニングされていないことを意味する）ライブラリ−を作製することである。これらのライブラリ−を標的に対して個別にパニングした後、次に、選択されたクロ−ンを組換える。パニングされた各ライブラリ−から、無作為化したセグメントのみをＰＣＲによって増幅した後、複数の無作為化したセグメントを単一のドメインへと組み合わせて、シャッフルされたライブラリ−を作製し、該ライブラリ−をパニングし、増大した効力についてスクリ−ニングする。この過程は、既知の配列の少数のクロ−ンをシャッフルするために用いられることもできる。
【０３９２】
任意の共通配列を、クロスオ−バ−点として用いることができる。Ａドメインまたは他のシステイン含有単量体について、システイン残基は、クロスオ−バ−のための論理的な箇所である。しかしながら、計算機モデル化など、最適なクロスオ−バ−部位を決定する他の方法がある。あるいは、最高のエントロピ−を有するかまたは最少数の分子内接触を有する残基も、クロスオ−バ−ための良好な部位であり得る。
【０３９３】
無作為化されたシステイン間ル−プを有するタンパク質から構成されるライブラリ−を作製する例示的な方法を下記に呈する。本実施例において、先に説明された個別のル−プの個別のライブラリ−アプロ−チとは対照的に、複数のシステイン間ル−プが同じライブラリ−において同時に無作為化される。
【０３９４】
以下のパタ−ンを有する３９〜４５のアミノ酸のタンパク質ドメインをコ−ドするＡドメインＮＮＫライブラリ−を構築した：
Ｃ１−Ｘ（４，６）−Ｅ１−Ｆ−Ｒ１−Ｃ２−Ａ−Ｘ（２，４）−Ｇ１−Ｒ２−Ｃ３−Ｉ−Ｐ−Ｓ１−Ｓ２−Ｗ−Ｖ−Ｃ４−Ｄ１−Ｇ２−Ｅ２−Ｄ２−Ｄ３−Ｃ５−Ｇ３−Ｄ４−Ｇ４−Ｓ３−Ｄ５−Ｅ３−Ｘ（４，６）−Ｃ６  （配列番号４１９）、
ここで、
Ｃ１−Ｃ６：システイン、
Ｘ（ｎ）：各位置に任意の残基を有するｎ個のアミノ酸の配列
Ｅ１−Ｅ３：グルタミン、
Ｆ：フェニルアラニン、
Ｒ１−Ｒ２：アルギニン、
Ａ：アラニン、
Ｇ１−Ｇ４：グリシン、
Ｉ：イソロイシン、
Ｐ：プロリン、
Ｓ１−Ｓ３：セリン
Ｗ：トリプトファン、
Ｖ：バリン、
Ｄ１−Ｄ５：アスパラギン酸、かつ
Ｃ１−Ｃ３、Ｃ２−Ｃ５、およびＣ４−Ｃ６は、ジスルフィドを形成する。
【０３９５】
ライブラリ−を、Ｓｔｅｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  １６４：４９−５３  （１９９５）において説明されるような構築ＰＣＲによってチロシンコドン（ＴＡＴ）または可変性非保存性コドン（ＮＮＫ）を含有するＤＮＡ配列のライブラリ−を作製することによって構築した。天然のＡ−ドメイン足場および、（先に説明された）ライブラリ−Ａ１を構築するために用いられた設計と比較して、このアプロ−チは、１）これらの潜在的に決定的な残基を無作為化する代わりに、既存の残基のうちのより多くをしかるべきところに維持し、２）２０のアミノ酸すべて（ＮＮＫコドン）の可変長のアミノ酸の鎖を挿入し、それによりシステイン間残基の平均数が、天然ンＡドメインまたはＡ１ライブラリ−のものを超えて伸びる。チロシン残基の割合は、オリゴヌクレオチドにおけるチロシンコドンを含むことによって増大し、なぜなら、チロシンは、抗原結合部位において大きな比率を占めることが見いだされていたからであり、おそらく、チロシンがなすことのできる多数の異なる接触のためである。本ＰＣＲ反応において用いられるオリゴヌクレオチドは、出現する順序においてそれぞれ、配列番号 ４２０〜４４６である：
【０３９６】
１．  ５’−ＡＴＡＴＣＣＣＧＧＧＴＣＴＧＧＡＧＧＣＧＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＣＧＴＧＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＧＡＡＴＴＣＣＧＡ−  ３’（配列番号４２０）
２．  ５’−ＡＴＡＴＣＣＣＧＧＧＴＣＴＧＧＡＧＧＣＧＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＣＧＴＧＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＧＡＡＴＴＣＣＧＡ−  ３’（配列番号４２１）
３．  ５’−ＡＴＡＴＣＣＣＧＧＧＴＣＴＧＧＡＧＧＣＧＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＣＧＴＧＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＧＡＡＴＴＣＣＧＡ−  ３’（配列番号４２２）
４．  ５’−ＡＴＡＴＣＣＣＧＧＧＴＣＴＧＧＡＧＧＣＧＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＣＧＴＧＴＴＡＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＧＡＡＴＴＣＣＧＡ−  ３’（配列番号４２３）
５．  ５’−ＡＴＡＴＣＣＣＧＧＧＴＣＴＧＧＡＧＧＣＧＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＣＧＴＧＴＮＮＫＴＡＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＧＡＡＴＴＣＣＧＡ−  ３’（配列番号４２４）
６．  ５’−ＡＴＡＴＣＣＣＧＧＧＴＣＴＧＧＡＧＧＣＧＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＣＧＴＧＴＮＮＫＴＡＴＮＮＫＮＮＫＧＡＡＴＴＣＣＧＡ−  ３’（配列番号４２５）
７．  ５’−ＡＴＡＴＣＣＣＧＧＧＴＣＴＧＧＡＧＧＣＧＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＣＧＴＧＴＮＮＫＮＮＫＴＡＴＮＮＫＧＡＡＴＴＣＣＧＡ−  ３’（配列番号４２６）
８．  ５’−ＡＴＡＴＣＣＣＧＧＧＴＣＴＧＧＡＧＧＣＧＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＣＧＴＧＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＴＡＴＧＡＡＴＴＣＣＧＡ−  ３’（配列番号４２７）
９．  ５’−ＡＴＡＴＣＣＣＧＧＧＴＣＴＧＧＡＧＧＣＧＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＣＧＴＧＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＴＡＴＮＮＫＧＡＡＴＴＣＣＧＡ−  ３’（配列番号４２８）
１０．  ５’−ＡＴＡＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＣＧＧＴＡＴＡＣＡＴＣＧＴＣＣＭＮＮＭＮＮＴＧＣＡＣＡＴＣＧＧＡＡＴＴＣ−  ３’（配列番号４２９）
１１．  ５’−ＡＴＡＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＣＧＧＴＡＴＡＣＡＴＣＧＴＣＣＭＮＮＭＮＮＭＮＮＴＧＣＡＣＡＴＣＧＧＡＡＴＴＣ−  ３’（配列番号４３０）
１２．  ５’−ＡＴＡＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＣＧＧＴＡＴＡＣＡＴＣＧＴＣＣＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＴＧＣＡＣＡＴＣＧＧＡＡＴＴＣ−  ３’（配列番号４３１）
１３．  ５’−ＡＴＡＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＣＧＧＴＡＴＡＣＡＴＣＧＴＣＣＡＴＡＭＮＮＭＮＮＴＧＣＡＣＡＴＣＧＧＡＡＴＴＣ−  ３’（配列番号４３２）
１４．  ５’−ＡＴＡＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＣＧＧＴＡＴＡＣＡＴＣＧＴＣＣＭＮＮＡＴＡＭＮＮＭＮＮＴＧＣＡＣＡＴＣＧＧＡＡＴＴＣ−  ３’（配列番号４３３）
１５．  ５’−ＡＴＡＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＣＧＧＴＡＴＡＣＡＴＣＧＴＣＣＭＮＮＡＴＡＭＮＮＴＧＣＡＣＡＴＣＧＧＡＡＴＴＣ−  ３’（配列番号４３４）
１６．  ５’−ＡＴＡＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＣＧＧＴＡＴＡＣＡＴＣＧＴＣＣＭＮＮＭＮＮＡＴＡＴＧＣＡＣＡＴＣＧＧＡＡＴＴＣ−  ３’  （配列番号４３５）
１７．  ５’−ＡＴＡＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＣＧＧＴＡＴＡＣＡＴＣＧＴＣＣＭＮＮＭＮＮＡＴＡＭＮＮＴＧＣＡＣＡＴＣＧＧＡＡＴＴＣ−  ３’（配列番号４３６）
１８．  ５’−ＡＣＣＧＴＣＴＴＣＴＴＧＧＧＴＡＴＧＴＧＡＣＧＧＧＧＡＧＧＡＣＧＡＴＴＧＴＧＧＴＧＡＣＧＧＡＴＣＴＧＡＣＧＡＧ−  ３’（配列番号４３７）
１９．  ５’−ＡＴＡＴＧＧＣＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＣＡＡＴＧＡＴＣＣＡＣＣＧＣＣＣＣＣＡＣＡＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＣＴＣＧＴＣＡＧＡＴＣＣＧＴ−  ３’（配列番号４３８）
２０．  ５’−ＡＴＡＴＧＧＣＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＣＡＡＴＧＡＴＣＣＡＣＣＧＣＣＣＣＣＡＣＡＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＣＴＣＧＴＣＡＧＡＴＣＣＧＴ−  ３’（配列番号４３９）
２１．  ５’−ＡＴＡＴＧＧＣＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＣＡＡＴＧＡＴＣＣＡＣＣＧＣＣＣＣＣＡＣＡＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＣＴＣＧＴＣＡＧＡＴＣＣＧＴ−  ３’（配列番号４４０）
２２．  ５’−ＡＴＡＴＧＧＣＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＣＡＡＴＧＡＴＣＣＡＣＣＧＣＣＣＣＣＡＣＡＡＴＡＭＮＮＭＮＮＭＮＮＣＴＣＧＴＣＡＧＡＴＣＣＧＴ−  ３’（配列番号４４１）
２３．  ５’−ＡＴＡＴＧＧＣＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＣＡＡＴＧＡＴＣＣＡＣＣＧＣＣＣＣＣＡＣＡＭＮＮＡＴＡＭＮＮＭＮＮＭＮＮＣＴＣＧＴＣＡＧＡＴＣＣＧＴ−  ３’（配列番号４４２）
２４．  ５’−ＡＴＡＴＧＧＣＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＣＡＡＴＧＡＴＣＣＡＣＣＧＣＣＣＣＣＡＣＡＭＮＮＡＴＡＭＮＮＭＮＮＣＴＣＧＴＣＡＧＡＴＣＣＧＴ−  ３’（配列番号４４３）
２５．  ５’−ＡＴＡＴＧＧＣＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＣＡＡＴＧＡＴＣＣＡＣＣＧＣＣＣＣＣＡＣＡＭＮＮＭＮＮＡＴＡＭＮＮＣＴＣＧＴＣＡＧＡＴＣＣＧＴ−  ３’（配列番号４４４）
２６．  ５’−ＡＴＡＴＧＧＣＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＣＡＡＴＧＡＴＣＣＡＣＣＧＣＣＣＣＣＡＣＡＭＮＮＭＮＮＭＮＮＡＴＡＣＴＣＧＴＣＡＧＡＴＣＣＧＴ−  ３’（配列番号４４５）
２７．  ５’−ＡＴＡＴＧＧＣＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＣＡＡＴＧＡＴＣＣＡＣＣＧＣＣＣＣＣＡＣＡＭＮＮＭＮＮＭＮＮＡＴＡＭＮＮＣＴＣＧＴＣＡＧＡＴＣＣＧＴ−  ３’（配列番号４４６）
ここで、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ、Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｓ＝Ｃ／Ｇ、Ｗ＝Ａ／Ｔ、Ｂ＝Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｄ＝Ａ／Ｇ／Ｔ、Ｈ＝Ａ／Ｃ／Ｔ、Ｖ＝Ａ／Ｃ／Ｇ、およびＮ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔである。
【０３９７】
本ライブラリ−を、各プ−ルが４００ｐｍｏｌのＤＮＡを含有するオリゴヌクレオチドの４つのプ−ルの混合物を用いて、ＰＣＲ増幅１０周期の初回を通じて構築した。プ−ル１は、オリゴヌクレオチド１〜９を含有し、プ−ル２は、１０〜１７を含有し、プ−ル３は、１８のみを含有し、およびプ−ル４は、１９〜２７を含有した。完全に構築されたライブラリ−を、プ−ル１および４を用いてＰＣＲの追加的な８周期を通じて得た。ライブラリ−断片をＸｍａＩおよびＳｆｉＩで消化した。ＤＮＡ断片を、フレ−ム内ＨＡエピト−プを保有するｆｕｓｅ５の誘導体であるファ−ジディスプレイベクタ−ｆｕｓｅ５−ＨＡの対応する制限部位へと連結した。連結混合物をＴｒａｎｓｆｏｒＭａｘ（商標）ＥＣ１００（商標）電気コンピテント大腸菌細胞へと電気穿孔し、結果として２×１０９の個々のクロ−ンのライブラリ−を生じた。形質転換した大腸菌細胞を、２０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含有する２×ＹＴ培地において３７℃で一晩増殖させた。ファ−ジ粒子をＰＥＧ沈殿によって培地から精製し、１．１×１０１３／ｍＬの力価を決定した。２４のクロ−ンの配列が決定され、ライブラリ−設計の期待値と一致した。
【０３９８】
実施例５
本実施例は、標的に結合するための単量体および／またはリンカ−を最適化することによる多量体の最適化を説明する。標的への多量体の結合の最適化のための１つのアプロ−チは、単量体、多量体、およびリンカ−の最適化が関与する。まず、単量体のライブラリ−を、標的（例えば、ＦＧＦＲ１ｃまたはβ−クロト−）に対する結合についてパニングする。しかしながら、単量体のいくつかは、互いに離れた標的上の位置で結合し得、それによりこれらの部位に結合するドメインは、リンカ−ペプチドによって接続されることができない。それゆえ、単量体の最適化前にこれらの単量体からホモ三量体またはヘテロ三量体の大きなライブラリ−を作製およびスクリ−ニングすることは有用である。これらの三量体ライブラリ−は、例えば、（単量体の大きなプ−ルから作製されるヘテロ三量体について典型的な）ファ−ジに関してスクリ−ニングされることができ、または個別に作製およびアッセイされることができる（例えば、ホモ三量体について）。本方法によって、最良の三量体が同定される。本アッセイには、機能的タンパク質ベ−スのまたは細胞ベ−スのアッセイにおける標的に対する結合アッセイまたは多量体のアゴニストもしくはアンタゴニストの効力の決定が含まれ得る。
【０３９９】
次に、単一の最良の三量体の単量体ドメイン（複数可）を、第二の工程として最適化するホモ多量体は、最適化するのが最も容易であり、なぜなら、ヘテロ多量体も合成されることはできるが、唯一のドメイン配列が存在するからである。ホモ多量体について、単量体と比較して多量体による結合の増大は、結合活性効果である。
【０４００】
ドメイン配列自体の最適化（例えば、組換えまたはＮＮＫ無作為化による）およびファ−ジのパニングの後、改良された単量体を用いて、リンカ−ライブラリ−を有する二量体を構築する。リンカ−ライブラリ−は、例えば、ＮＮＫ組成および／または可変配列長を有するリンカ−から形成されることができる。
【０４０１】
このリンカ−ライブラリ−のパニングの後、最良のクロ−ン（例えば、阻害における効力または他の機能的アッセイによって決定される）を、複数の（例えば、２、３、４、５、６、７、８など）の配列を最適化されたドメインならびに長さおよび配列を最適化されたリンカ−から構成された多量体へと転換する。
【０４０２】
実施例６
本実施例は、Ａドメインの構造分析を説明する。
【０４０３】
ほとんどすべてのタンパク質について言えるように、Ａドメインの全表面のわずかな画分のみが、単一の標的を結合するのに関与する。該ドメインの解像構造に基づいて、所与の標的に結合する上で協調することができそうな隣接する残基の位置を同定することができる。本明細書では、隣接する残基のこのような基を構造カテゴリ−と呼ぶ。一例として、４つのこのようなカテゴリ−が、Ａドメイン構造の検討を通じて同定されており、上端、下端、ル−プ１、およびル−プ２と命名されている。所与のカテゴリ−内でのみで多様性を許すライブラリ−を設計することによって、ライブラリ−によって許容される理論的配列空間は有意に減少することができ、物理的ライブラリ−による理論的な空間のより良好な適用範囲を可能にする。さらに、上端および下端のカテゴリ−など、非重複カテゴリ−の場合、異なる標的に対して選択された半ドメイン配列が、選択された標的に同時にまたはそれに代わるものとして結合することができるであろう単一の配列へと組み合わされることができる。いずれの場合も、ドメインの半分のみを占有する結合部位を作製することで、大きさが半分で、かつ免疫原性エピト−プの数の半分を有するであろう分子を作製することが可能となる。
【０４０４】
（Ａ−ドメインの位置の構造上の分類）
正準のＡ−ドメイン配列（配列番号４４７）を下記に示し、高い多様性位置は、Ｘとして表される。上端、下端、ル−プ１、またはル−プ２のいずれかのカテゴリ−に属する位置を丸印（○）で示す。
【表２】
2013512672.tif 000003
【０４０５】
実施例７
本実施例は、ヒトＦＧＦＲ１ｃまたはヒトβ−クロト−を結合する単量体または多量体についてのスクリ−ニングを説明する。
【０４０６】
ファ−ジライブラリ−を、固相支持体（例えば、Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐプレ−トまたはＤｙｎａｌビ−ズ）上でまたは溶液中で（例えば、Ｄｙｎａｌビ−ズを用いて捕捉）のいずれかで数回を通じてパニングした。（ａ）ヒトＦＧＦＲ１ｃ（ｈｕＦＧＦＲ１ｃ）または組換えヒトβ−クロト−（ｒｈβ−クロト−）に結合する個々のファ−ジクロ−ンの最高頻度と、（ｂ）結合陽性ファ−ジクロ−ンのうちで高い配列多様性とを有する出力ファ−ジプ−ルを、タンパク質スクリ−ニングのために選択した。
【０４０７】
Ｉ．第１回（ＭａｘｉＳｏｒｐプレ−トまたはＤｙｎａｌビ−ズ）
１．標的ｈｕＦＧＦＲ１ｃ−Ｆｃの被覆
（Ａ．プレ−トの被覆）
各Ａ−ドメインライブラリ−について５つまたは６つのウェルをＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２（１００μＬ合計容積／ウェル）に希釈した５０ｎＭ  ｈｕＦＧＦＲ１ｃ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で、室温で振蘯しながら１〜２時間直接被覆した。加えて、１つの陰性対照ウェル／ライブラリ−を、ＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２のみとともにインキュベ−トした。あるパニングする系譜について、ライブラリ−を、ｈｕＩｇＧで被覆したプロテインＡビ−ズにあらかじめ結合し、ｈｕＩｇＧ結合ファ−ジを減算した。ある他の系譜について、プロテインＭ１０（ヒトＦｃに結合）を添加して、ファ−ジ結合インキュベ−ション工程の間、ｈｕＦＧＦＲ１ｃ−ＦｃのＭ１０エピト−プにＡ１ライブラリ−ファ−ジが結合するのを遮断した。
【０４０８】
（Ｂ．ビ−ズの被覆）
２０μＬのプロテインＡビ−ズ（Ｄｙｎａｌ  ＡＳＡ）を５００μＬのＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２における５０ｎＭのｈｕＦＧＦＲ１ｃ−Ｆｃとともにインキュベ−トし、エッペンドルフチュ−ブにおいて室温で１時間回転させた。陰性対照として、標的を有さない２０μＬのプロテインＡビ−ズを５００μＬのＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２においてインキュベ−トし、室温で１時間回転させた。標的を添加する前に、Ｄｙｎａｌビ−ズをＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２で少なくとも２回洗浄し、ビ−ズをバルクで被覆したことに留意されたい。あるパニングする系譜について、ライブラリ−をｈｕＩｇＧにあらかじめ結合させ、ｈｕＩｇＧ結合ファ−ジを減算した。ある他の系譜について、プロテインＭ１０（ヒトＦｃに結合）を添加して、Ａ１ライブラリ−ファ−ジがファ−ジ結合インキュベ−ション工程の間にｈｕＦＧＦＲ１ｃ−ＦｃのＭ１０エピト−プに結合するのを遮断した。３回のパニングを、いくつかの系譜について５０ｎＭの定常標的濃度で実施した。他の系譜は、各回に標的濃度の５倍低下を採用した（例えば、第１回については５０ｎＭ、第２回については１０ｎＭ、および第３回については２ｎＭ）。
【０４０９】
２．標的組換えヒトβ−クロト−の被覆
（Ａ．プレ−トの被覆）
パニングにおいて用いられる各ライブラリ−（Ａ１、１ＡＪＪ、ＤＳＬ、およびＬＮＲ）のための５または６のウェルを、ＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２（１００μＬ総容積／ウェル）において希釈された５０ｎＭまたは１００ｎＭ（第１回）の組換えヒトβ−クロト−（ｒｈβ−クロト−）で、室温で振蘯しながら１〜２時間直接被覆した。加えて、１つの陰性対照ウェル／ライブラリ−をＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２のみとともにインキュベ−トした。あるパニングの系譜について、抗ＨＩＳタグ抗体をまずプレ−トに被覆した後、ＨＩＳタグ付きｒｈβ−クロト−を被覆し、抗体を介して標的を表した。あるパニングの系譜について、免疫グロブリンＦｃドメイン結合剤を、ｒｈβ−クロト−に適用する前にプロテインＡ／ＦＧＦＲ１ｃ−Ｆｃを用いてライブラリ−から減算した。ある他の系譜について、プレ−トに塗布したプロテインＡを用いて、ｈｕＦＧＦＲ１ｃ−Ｆｃ（５０ｎＭ）およびｒｈβ−クロト−（２５０ｎＭ）（第１回）、１０ｎＭ／２５ｎＭ（第２回）、および２ｎＭ／５ｎＭ（第３回）から構成される複合体を形成した。
【０４１０】
（Ｂ．ビ−ズの被覆）組換えヒトβ−クロト−−Ｆｃ融合体をプロテインＡビ−ズ、Ｄｙａｘストレプトアビジンビ−ズ、またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｔａｌｏｎビ−ズに固定化し、ライブラリ−（Ａ１、１ＡＪＪ、ＤＳＬ、およびＬＮＲ）に対してパニングした。あるパニングの系譜について、Ｆｃ結合剤をｒｈβ−クロト−に適用される前にプロテインＡ／ＩｇＧを用いてライブラリ−から減算し、一方、ストレプトアビジン結合剤を、ストレパビン（Ｓｔｒｅｐａｖｉｎ）ビ−ズを用いてライブラリ−から減算した。加えて、あらかじめ形成されたｈｕＦＧＦＲ１ｃ−Ｆｃ（５０ｎＭ）とｒｈβ−クロト−−ＨＩＳ（２５０ｎＭ）との複合体を２０μＬのプロテインＡビ−ズによって捕捉し、Ａ１および１ＡＪＪライブラリ−に対してパニングした。３回のパニングをいくつかの系譜について５０ｎＭの定常標的濃度で実施し、ある系譜は、各回標的濃度の５倍低下を採用した（例えば、第１かいについて５０ｎＭ、第２回について１０ｎＭ、および第３回について２ｎＭ）。
【０４１１】
３．ブロッキング
（Ａ．プレ−トのブロッキング）
被覆溶液を除去し、ウェルを２００μＬ／ウェルのＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２で１回洗浄した。２５０μＬ／ウェルのＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２における１％ＢＳＡ（プロテア−ゼ非含有）を添加し、室温で振蘯しながら１時間インキュベ−トした。代替的な試薬（例えば、カゼインまたは乳）をブロッキングに用いることができる。
【０４１２】
（Ｂ．ビ−ズのブロッキング）
被覆溶液を除去し、ビ−ズをＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２で２回洗浄した。５００μＬの１％ＢＳＡ（プロテア−ゼ非含有）をＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２に添加し、室温で１時間回転させた。上記のように、代替的なブロッキング試薬を用いることができる。
【０４１３】
４．洗浄
（Ａ．プレ−トの洗浄）
ウェルを２００μＬ／ウェルのＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２で３回洗浄して、過剰量の標的／ブロッキング剤を除去した。
【０４１４】
（Ｂ．ビ−ズの洗浄）
ビ−ズを１０００μＬのＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２で３回洗浄して、過剰量の標的／ブロッキング剤を除去した。ビ−ズを、各洗浄後数分間磁石に集めておき、ビ−ズの損失を回避した。
【０４１５】
５．ファ−ジの付加
（Ａ．プレ−トへのファ−ジの付加）
約１００〜１０００のライブラリ−等価物（ＬＮＲ、ＤＳＬ等のファ−ジライブラリ−など、Ａ１ドメインベ−スのライブラリ−またはその他）をファ−ジ付加緩衝液（１％無脂肪乳／０．２％ＢＳＡ（プロテア−ゼ非含有）、またはＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２における他の適切なブロッキング剤）に添加し、室温で振蘯しながら１〜２時間インキュベ−トした。第２〜３回において、合計２５〜６０μＬの収集したファ−ジを５〜６ウェル（＋１つの陰性対照）の各々に付加した。
【０４１６】
（Ｂ．ビ−ズへのファ−ジ付加）
約１００〜１０００のライブラリ−等価物をＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２における５００μＬの１％の無脂肪乳＋１００μＬの１％ＢＳＡ（プロテア−ゼ非含有）に添加し、室温で回転とともに１〜２時間インキュベ−トした。第２〜３回において、合計１００μＬの収集されたファ−ジをビ−ズに付加した。
【０４１７】
６．洗浄
（Ａ．プレ−トの洗浄）
プレ−トを２００μＬ／ウェルのＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で５〜７回洗浄した。
【０４１８】
（Ｂ．ビ−ズの洗浄）
ビ−ズを８００μＬのＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で８〜１２回洗浄した。ビ−ズの再懸濁を、収集したビ−ズに洗浄緩衝液を直接分配することによって、または上下にピペッティングすることによって容易にした。あるいは、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ装置（Ｔｈｅｒｍｏ  ＬａｂＳｙｓｔｅｍｓ）または等価物をビ−ズ洗浄に用いる。
【０４１９】
７．ファ−ジ溶出
（Ａ．プレ−トの溶出）
１００μＬ／ウェルの低ｐＨ緩衝液［０．２ＭグリシンｐＨ２．０］を添加し、プレ−トを室温で振蘯しながら１０分間インキュベ−トした。次に、１００μＬの１ＭトリスｐＨ７．５を各ウェルに添加して、溶液を中和した。
（Ｂ．ビ−ズの溶出）
１００μＬの０．２ＭグリシンｐＨ２．０をビ−ズに添加した後、これを（エッペンドルフラックにおいて）室温で１０分間振蘯しながらインキュベ−トした。次に、４００μＬの１ＭトリスｐＨ７．５を各ウェルに添加して、溶液を中和した。
【０４２０】
（Ｃ．溶出および同時感染）
ファ−ジを先のように０．２ＭグリシンｐＨ２．０によって溶出した後、残存するファ−ジをＯＤ６００約０．５〜０．８の２００〜５００μＬの対数期ＢｌｕｅＫａｎ  Ｋ９１大腸菌細胞を用いて回収した。細胞を（プレ−トについて）各ウェルまたは吸引したビ−ズに添加した。感染を３７℃で３０分間振蘯せずに進行させておいた。次に、２００μＬの容積をプ−ルし、約３〜５ｍＬの２×ＹＴ／０．２μｇ／ｍＬのテトラサイクリンに添加し、３７℃で１５分間振蘯した。
【０４２１】
８．感染：（プレ−トおよびビ−ズのプロトコ−ルについて同じ）
（２×ＹＴ／４０μｇ／ｍＬカナマイシンにおける）適切な容積の対数期ＢｌｕｅＫａｎ  Ｋ９１大腸菌をＯＤ６００約０．５〜０．８まで増殖させた。培養物がこのＯＤ６００に到達すると、即用いるかまたは使用前に氷上に置くかのいずれかであったが、氷上での時間は一般的に最小化した。
【０４２２】
Ａ．５０ｍＬの滅菌コニカルチュ−ブに、溶出したファ−ジを３ｍＬの対数期ＢｌｕｅＫａｎ  Ｋ９１大腸菌培養物と混合し、３７℃で２５分間振蘯せずにインキュベ−トした。滅菌コニカルチュ−ブをＡｉｒＰｏｒｅテ−プ（Ｑｉａｇｅｎ）で被覆し、曝気を容易にした。
【０４２３】
Ｂ．テトラサイクリンを０．２μｇ／ｍＬの終濃度まで添加し、３７℃で１５分間振蘯した。
【０４２４】
Ｃ．１０μＬの一定分量を力価測定のためにサンプリングし、２×ＹＴにおいて１０倍で連続希釈し（１０−１〜１０−６）、２×ＹＴ／２０μｇ／ｍＬテトラサイクリンプレ−ト上で８μＬ／希釈スポット（または７０〜９０μＬ／プレ−ト）で播種し、３０℃または３７℃で一晩インキュベ−トした。これらのプレ−トは、その後のファ−ジ標的結合ＥＬＩＳＡに用いられる単一のコロニ−を生じた。
【０４２５】
Ｄ．感染した３ｍＬの培養物を５０ｍＬの２×ＹＴ／２０μｇ／ｍＬテトラサイクリンへと約１０倍希釈し、３０℃で一晩振蘯しながら飽和するまでインキュベ−トした。
【０４２６】
（９．入れたファ−ジの力価測定をパニングの最新の回において用いた（プレ−トおよびビ−ズのプロトコ−ルについて同じ））
Ａ．収集したファ−ジの１００倍連続希釈物（１０−４〜１０−１０）を２×ＹＴで作製した。
【０４２７】
Ｂ．ＯＤ６０００．５〜０．６の１００μＬ／ウェルの対数期ＢｌｕｅＫａｎ  Ｋ９１大腸菌培養物を、９６ウェルポリプロピレンプレ−トのうちの７ウェルに添加した。
【０４２８】
Ｃ．１０μＬの希釈したファ−ジを、１００μＬのＢｌｕｅＫａｎ  Ｋ９１大腸菌を含有するウェルに添加した。
【０４２９】
Ｄ．ファ−ジ／細胞混合物を３７℃で２５分間振蘯せずにインキュベ−トし、プレ−トをＡｉｒＰｏｒｅテ−プ（Ｑｉａｇｅｎ）で被覆して、曝気を可能にした。
【０４３０】
Ｅ．テトラサイクリンを０．２μｇ／ｍＬの終濃度まで添加し、プレ−トを３７℃で１５分間振蘯した。
【０４３１】
Ｆ．８μＬの各希釈物（１０−４〜１０−１０）を乾２×ＹＴアガ−／２０μｇ／ｍＬテトラサイクリンプレ−トへと播種した。
【０４３２】
Ｇ．プレ−トを３０℃または３７℃で一晩インキュベ−トした。
【０４３３】
（１０．ファ−ジの収集（プレ−トおよびビ−ズのプロトコ−ルについて同じ））
Ａ．一晩の培養物を、使い捨て５０ｍＬチュ−ブにおいて６５００または６８００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、細胞をペレット化した。
【０４３４】
Ｂ．標準的なＰＥＧ／ＮａＣｌファ−ジ−沈殿手順を、１／５容積の２０％ＰＥＧ／１５％ＮａＣｌストックを培養上清に添加することによって実施した。これを、反復して転倒させ、氷上で４５分間〜１時間インキュベ−トすることによって、十分に混合した。
【０４３５】
Ｃ．培養物を６５００または６８００ｒｐｍで４０分間遠心分離してファ−ジをペレット化し、上清を廃棄した。
【０４３６】
Ｄ．ファ−ジペレットを１ｍＬのＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＬ  ＣａＣｌ２に再懸濁し、エッペンドルフチュ−ブに転移させ、１３０００ｒｐｍで少なくとも２分間遠心分離して、不溶性材料をペレット化した。
【０４３７】
Ｅ．上清を新しいチュ−ブに転移させ、１／５容積のＰＥＧ／ＮａＣｌを添加し、混合し、氷上で約５〜２０分間インキュベ−トした。
【０４３８】
Ｆ．次に、混合物を１３０００ｒｐｍで少なくとも２分間遠心分離し、上清を除去した。ペレット化され精製されたファ−ジをおよそ１ｍＬのＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２に再懸濁し、４℃で保存した。
【０４３９】
ＦＧＦＲ１ｃに対する結合として同定された単量体を図１０に示し、β−クロト−に対する結合として同定された単量体を図１１に示す。
【０４４０】
（ＩＩ．第２回および第３回のパニング）
一般に、第２回および第３回のパニング条件は、上記の第１回におけるのと同じであったが、例外は、被覆した標的を出発濃度（例えば、５０ｎＭ）で保持するかまたは標的濃度を各その後の回についておよそ２〜５倍低下させ、プレ−ト（またはビ−ズ）をパニングの各その後の回でおよそ２〜４の追加的な回数洗浄したかのいずれかであることであった。
【０４４１】
（ＩＩＩ．突然変異誘発およびファ−ジディスプレイパニングを通じての抗ＦＧＦＲ１ｃ単量体の最適化）
突然変異誘発ライブラリ−を、個々の配列（出現順序でそれぞれ配列番号 ２８７、２９０、および２９２）が以下の通りである抗ＦＧＦＲ１ｃ単量体Ｍ０３、Ｍ２３、およびＭ３３に基づいて構築した。
【表３】
2013512672.tif 000004
【０４４２】
突然変異誘発ライブラリ−に用いられるプライマ−を以下の表に列挙し（出現順序でそれぞれ配列番号 ４５１〜４６０）、この中で、共通５’−ｒｅｓｃｕｅプライマ−を各ライブラリ−について独特な３’−ｒｅｓｃｕｅプライマ−とともにすべてのライブラリ−について設計した。大文字は固定された塩基を表すのに対し、小文字は、０．８５：０．０５：０．０５：０．０５の比率の塩基の混合物を表す（例えば、「ａ」は、０．８５Ａ、０．０５Ｔ、０．０５Ｇ、および０．０５Ｃの混合物を示す）。
【表４】
2013512672.tif 000005
【０４４３】
突然変異誘発ライブラリ−を以下の通り構築した。各単量体についての「ＦＯＲ」および「ＲＥＶ」変異原性オリゴヌクレオチドを、９塩基対重複（ＴＧＣＧＡＣＧＧＣ）（配列番号４６１）を介して３０〜３１℃でアニ−リングし、ＬＡ  Ｔａｑポリメラ−ゼ（Ｔａｋａｒａ）を用いたＰＣＲ伸長によって二本鎖ＤＮＡを作製するよう伸長した。構築されたライブラリ−インサ−トを５’／３’「ｒｅｓｃｕｅ」プライマ−の対によって増幅し、カラム（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製し、ＳｆｉＩおよびＸｍａＩ（ＮＥＢ）によって消化した。消化されたライブラリ−インサ−トをゲル精製し、ＳｆｉＩ／ＸｍａＩで消化されたｆＵＳＥ５ＨＡベクタ−へと連結した。連結されたｆＵＳＥ５ＨＡベクタ−をエタノ−ルまたはイソプロパノ−ル沈殿によって精製し、ＥＣ１００電気コンピテント細胞へと電気穿孔した（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。電気穿孔した細胞を一晩増殖させ、ファ−ジをパニングにおいて使用するために収集した。
【０４４４】
パニングプロトコ−ルは、本質的に上記のとおりだが、変更を伴った。ｈｕＦＧＦＲ１ｃをプレ−トまたはプロテインＡビ−ズに２または２０ｎＭ（第１回）、０．１、０．５、または５ｎＭ（第２回）、０．０２、０．１、または１ｎＭ（第３回）で被覆した。標的とともにファ−ジインキュベ−ション後、プレ−トまたはビ−ズを７回、９回、または１３回洗浄した。いくつかのパニングは３７℃で１１回の洗浄を有し、またはパニングは、精製された親単量体結合タンパク質の１０倍または５００倍モル過剰量の存在下であった。
【０４４５】
（ＩＶ．突然変異誘発およびファ−ジパニングを通じての抗−ｒｈβ−クロト−単量体の最適化）
突然変異誘発ライブラリ−を、個々の配列（出現順序でそれぞれ配列番号 ４６２〜４６３および３０５〜３０６）が以下のとおりである抗−ｒｈβ−クロト−単量体Ｍ０１、Ｍ２５、Ｍ４２、およびＭ５０に基づいて構築した。
【表５】
2013512672.tif 000006
【０４４６】
構築は、本質的にＦＧＦＲ１ｃ突然変異誘発ライブラリ−について説明されるのと同じであった。プライマ−配列を以下の表に示し（出現順序でそれぞれ配列番号 ４６６〜４７８）、この中で、大文字は固定された塩基を表すのに対し、小文字は、０．９１：０．０３：０．０３：０．０３の比率での塩基の混合物を表す（例えば「ａ」は、０．９１Ａ、０．０３Ｔ、０．０３Ｇ、および０．０３Ｃの混合物を示す）。
【表６】
2013512672.tif 000007
【０４４７】
各単量体についての「ＦＯＲ」および「ＲＥＶ」オリゴヌクレオチドを用いて、ＦＧＦＲ１ｃ突然変異誘発ライブラリ−について説明されるように各ライブラリ−を構築した。
【０４４８】
パニングプロトコ−ルは、本質的に上記のとおりだが、以下の変更を伴った：ｒｈβ−クロト−および組換えネズミベ−タ−クロト−（ｍｕβ−クロト−）を２ｎＭおよび１０ｎＭ（第１回）、３．３ｎＭおよび０．６７ｎＭ（第２回および第３回）で被覆した。ある系譜において、標的は、第１〜３回においてｒｈβ−クロト−であり、第１〜３回においてｒｍｕβ−クロト−であり、ｒｈβ−クロト−（第１回）、ｒｍｕβ−クロト−（第２回）であり、次いで、ｒｈβ−クロト−（第３回）であった。洗浄の回数は、第１、２、および３回についてそれぞれ７回、９回、および１１回であった。
【０４４９】
図１３は、本方法を用いて作製されたβ−クロト−結合単量体の配列を示す。
【０４５０】
Ｖ．二量体を作製するためのドメインウォ−キングを通じての抗−ｒｈβ−クロト−単量体の最適化
２セットの「ウォ−キングした二量体」のライブラリ−を構築した。セット１は、シ−ド単量体Ｍ０１、Ｍ０２、Ｍ０８、Ｍ２１、およびＭ４２（以下の表においてそれぞれ配列番号 ３０４、４８０、６９４、４８１、および３０５、αスクリ−ンアッセイにおいて初期シグナル全体を上回る増大したシグナルを誘導する「スパイク単量体」）を含有し、セット２は、シ−ド単量体Ｍ０６、Ｍ４６、およびＭ５０（以下の表においてそれぞれ配列番号 ４８３〜４８４、および３０６、αスクリ−ンアッセイにおいて初期シグナル全体からシグナルを変動させない「非スパイク」単量体）を含有した。これらの単量体のアミノ酸配列は、以下のとおりである。
【表７】
2013512672.tif 000008
【０４５１】
各セットの単量体をＮ末端またはＣ末端のいずれかで未処理の結合タンパク質ライブラリ−（例えば、Ａ１ドメインライブラリ−）に融合させ、未処理のＡ１ドメインライブラリ−に融合したセット１またはセット２のいずれかの単量体から構成される二量体ライブラリ−である「ウォ−キングした／ウォ−キングするライブラリ−」を構築した。これらのライブラリ−を以下の様式で構築した。ＰＣＲを用いて、２つの個別の反応において、ａ）ｐＥＴＦ（ＡＣＣＣＧＴＡＴＧＡＴＧＴＴＣＣＧＧＡＴＴＡ（配列番号４８６）／ｐＥＴＢ２ｒ（ＧＡＴＧＴＡＴＴＣＧＧＣＣＣＣＡＧＡ  ＧＧＣＣＴＧＣＡＡＴＧＡＣ（配列番号４８７））を用いて選択された単量体のコ−ド配列、およびｂ）２１ｎｅｗ１（ＧＡＡＡＴＴＣＡＣＣＴＣＧＡＡＡＧＣＡＡ（配列番号４８８））／２３（ＡＴＧＧＧＴＴＣＣＴＡＴＴＧＧＧＣＴ（配列番号４８９））を用いた単量体ライブラリ−における未処理の単量体のコ−ド配列を増幅した。約２００ｂｐ産物を２〜３％アガロ−スゲルから単離し、Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラムを用いて精製した。先の（ａ）および（ｂ）由来の各産物を個別の反応においてＢｓｒＤＩまたはＢｐｍＩ（ＮＥＢ）のいずれかで消化した。ＢｐｍＩで消化した単量体は、ＢｓｒＤＩで消化した単量体に連結されることのできるオ−バ−ハングを有する。精製された消化産物を、Ｔ４  ＤＮＡリガ−ゼ（ＮＥＢ）を用いて互いに連結した。ＢｓｒＤＩで切断した未処理の単量体とＢｐｍＩで切断した選択された単量体との連結は、（セット１または２由来の）Ｃ末端の選択された単量体に融合されたＮ末端の未処理の単量体から構成されたウォ−キングする二量体ライブラリ−を作製する。ＢｐｍＩで切断された未処理の単量体とＢｓｒＤＩで切断された選択された単量体の連結は、（セット１または２由来の）Ｎ末端の選択された単量体に融合したＣ末端の未処理の単量体から構成されたウォ−キングする二量体ライブラリ−を作製する。プライマ−ｐＥＴＦ／ｐＥＴＢ２ｒを用いて、連結物由来の連結された二量体をＰＣＲ増幅し、精製された産物をＳｆｉＩ、次いでＸｍａＩを用いて消化した。消化された産物をファ−ジベクタ−ｆＵＳＥ５ＨＡに連結し、典型的には１０８〜１０９の独特なメンバ−を有する、ファ−ジディスプレイされた二量体の「ウォ−キングした／ウォ−キングするライブラリ−」を作製した。
【０４５２】
パニングプロトコ−ルは、本質的に上記のとおりだが、変更を伴った。ｒｈβ−クロト−を１０ｎＭおよび２ｎＭ（第１回）、３．３ｎＭおよび０．６７ｎＭ（第２回）、１．１ｎＭおよび０．２２ｎＭ（第３回）で被覆した。洗浄回数は、第１、２、および３回についてそれぞれ７、９、および１１回であった。
【０４５３】
図１４は、ウォ−キングした二量体方法を用いて作製されたβ−クロト−結合多量体の配列を示す。
【０４５４】
ＶＩ，パニング出力の分析（プレ−トおよびビ−ズプロトコ−ルについて同じ）
（ファ−ジＥＬＩＳＡ）
分析されるべき各出力「ファ−ジプ−ル」について（適用可能な場合、典型的には第２、３、および４回）、独立したクロ−ンを、Ｃｏｓｔａｒ９６ウェルポリプロピレン深ウェルプレ−トにおいて増殖した１ｍＬ（２×ＹＴ／２０μｇ／テトラサイクリンｍＬ）培養物に接種した。接種チップを残し、プレ−トを３７℃で一晩振蘯させた。細胞を３６００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によってペレット化した。培養上清を保持し、ＥＬＩＳＡを下記のとおり実施した。
【０４５５】
ＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２において２０ｎＭに希釈した標的タンパク質（ｈＦＧＦＲ１ｃまたはｈβクロト−）を１００μＬ／ウェルで９６ウェルＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレ−トへと直接被覆した。各ファ−ジクロ−ンについて、標的のないウェルも、１００μＬ／ウェルのＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２単独を用いて被覆した。プレ−トを４℃で一晩、または室温で１．５時間、振蘯しながらインキュベ−トした。プレ−トを空にし、ウェルを２００μＬ／ウェルの１％ＢＳＡ（小部分Ｖ）／ＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２でブロッキングし、室温で１時間振蘯しながらインキュベ−トした。次に、プレ−トをＴＢＳ［ｐＨ７．５］／1ｍＭ  ＣａＣｌ２で３回洗浄した。次に、４０μＬの画ファ−ジ上清をウェルに、６０μＬの０．２％ＢＳＡ／［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２／０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０の存在下で添加した。被覆したプレ−トを室温で１．５時間、振蘯しながらインキュベ−トした。
【０４５６】
プレ−トをＴＢＳ［ｐＨ７．５］／１ｍＭ  ＣａＣｌ２／０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。次に、ＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２＋０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０において１：５０００で希釈した、１００μＬ／ウェルのα−Ｍ１３−ＨＲＰモノクロ−ナル抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を添加した。プレ−トを室温で１時間振蘯しながらインキュベ−トした。プレ−トをＴＢＳ［ｐＨ７．５］／２ｍＭ  ＣａＣｌ２／０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。１：１に希釈した１００μＬ／ウェルのＴＭＢ／Ｈ２Ｏ２混合物（Ｐｉｅｒｃｅ）をＥＬＩＳＡ顕色のために添加した。反応物を、最強のＯＤ６５０シグナルが約１．０に到達するまで青色にさせておいた。反応を１００μＬ／ウェルの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止させ、陽性ウェルは、色が青色から黄色へと変化した。一旦、反応が停止すると、ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏソフトウェアを用いて、ＥＬＩＳＡプレ−ト読み取り装置においてＯＤ４５０で反応を読み取った。
【０４５７】
ファ−ジＥＬＩＳＡ陽性ファ−ジプ−ルを、該プ−ルが（ａ）ｈＦＧＦＲ１ｃまたはｈｂクロト−に結合した個々のファ−ジクロ−ンの高い頻度、および（ｂ）結合陽性ファ−ジクロ−ン間の高い配列多様性を有した場合、発現ベクタ−へのサブクロ−ン化のために選択した。これらの基準に合致するプ−ルを、下記に概略した過程におけるタンパク質スクリ−ニングのために選択した。所与のファ−ジプ−ルから発現ベクタ−ｐＥｖｅへと単量体または多量体配列をサブクロ−ン化するために、およそ１０８〜１０１０のファ−ジを以下の通り、２５周期のＰＣＲによって増幅した：
【０４５８】
ＰＣＲレシピ
０．５〜１μＬの精製されたファ−ジ
５μＬの１０×緩衝液
８μＬの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ
５μＬの１０μＭ  ＶＳ−Ｆｏｒプライマ−
５’−ＡＴＣＡＴＣＴＧＧＣＣＧＧＴＣＣＧＧＣＣＴＡＣＣＣＧＴＡＴＧＡＴＧＴＴＣＣＧＧＡ−３’；（配列番号４９０）
５  μＬの１０μＭ  ＥｖｅＮｕｔプライマ−
５’−ＡＡＡＡＧＧＣＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＴＴＣＴＧＣＡＡＴＧＡＣ−３’；（配列番号４９１）
２６μＬのＨ２Ｏ
０．５μＬのＬＡ  Ｔａｑポリメラ−ゼ（１単位）（Ｔａｋａｒａ）
周期：２５×［９４℃／１０秒、−４５℃／３０秒、−７２℃／３０秒］
【０４５９】
ＰＣＲ産物を２％アガロ−スゲルにおいて分析のために泳動した。単量体または多量体産物（およそ２００ｂｐ）をＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、ＳｆｉＩ（ＮＥＢ）で消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋカラムで再度精製した後、Ｔ４  ＤＮＡリガ−ゼ（ＮＥＢ）を用いて、ＳｆｉＩ消化したベクタ−ｐＥｖｅに連結した。連結物を電気コンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌へと形質転換し、カナマイシンを４０μｇ／ｍＬで含有する２×ＹＴプレ−トへと播種した。一晩増殖後、およそ３０００〜６０００の個々のクロ−ンを２×ＹＴ／カナマイシンへと接種し、一晩増殖した。陽性対照および陰性対照もプレ−トに含んだ。
【０４６０】
ＶＩＩ．１ｍＬの細胞溶解物における数千の単量体タンパク質のスクリ−ニング
（１ｍＬの加熱した溶解物のタンパク質生成）
（第１日）：  個々のクロ−ンを、５００μＬ／ウェルの２×ＹＴ／４０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する９６ウェルＣｏｓｔａｒ深ウェルプレ−トのウェルへと接種した。培養物を一晩増殖し（接種チップをウェルに残した）、その間、３００ｒｐｍ、３７℃で振蘯した。この過程で、細胞溶解物レベルで個々の部分的に精製された数千の単量体のスクリ−ニングが可能となった。
【０４６１】
（第２日）：１００μＬの一晩培養物を、１ｍＬ／ウェルの２×ＹＴ／４０μｇ／ｍＬカナマイシン＋１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する新しい９６ウェルＣｏｓｔａｒ深ウェルプレ−トへと接種した（残余の一晩培養物を、２５％グリセロ−ル終濃度の添加によって格納した後、後の使用のために−８０℃で保存した）。プレ−トをＡｉｒＰｏｒｅテ−プ（Ｑｉａｇｅｎ）で被覆し、培養物を約０．８〜１．０のＯＤ６００に到達するまで、３００ｒｐｍ、３７℃で振蘯しながら増殖した。一旦、所望のＯＤ６００に到達すると、培養物を１ｍＭ  ＩＰＴＧで３時間、３７５ｒｐｍ、３７℃で振蘯しながら誘導した。次に、誘導された培養物を含有するプレ−トを３６００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離して、細胞をペレット化した。上清を取り出して廃棄し、残余の細胞ペレットを１００μＬのＴＢＳ［ｐＨ７．５］／１ｍＭ  ＣａＣｌ２に再懸濁した。再懸濁した細胞を９６ウェル深ウェルプレ−トからポリプロピレンＰＣＲプレ−トへと転移させ、ＰＣＲ機械において６５℃で５分間加熱した。次に、加熱／溶解した細胞を３６００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離した。遠心分離後、タンパク質生成が完了し、タンパク質溶解物は、結合ＥＬＩＳＡアッセイおよび／または競合αスクリ−ンアッセイを介した一次スクリ−ンにおける特徴づけのために準備ができた。
【０４６２】
（ＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−タンパク質ＥＬＩＳＡ）
９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレ−トを１００μＬ／ウェルの、ＴＢＳ［ｐＨ７．５］／１ｍＭ  ＣａＣｌ２における２０ｎＭ  ｈｕＦＧＦＲ１ｃ／Ｆｃまたは２０ｎＭ  ｈｕβクロト−−Ｈｉｓで被覆し、被覆したプレ−トを４℃で一晩または室温（ＲＴ）で１．５時間、振蘯しながらインキュベ−トした。抗ｈｕＩｇＧ単量体ドメインを含む結合タンパク質のために、ｈｕＦＧＦＲ１ｃ−ＨｉｓをｈｕＦＧＦ−Ｆｃの替わりに被覆した。ウェルを空にした後、２００μＬ／ウェルの１％ＢＳＡ（画分Ｖ）／ＴＢＳ［ｐＨ７．５］／１ｍＭ  ＣａＣｌ２でブロッキングした。被覆したプレ−トを室温で１時間、振蘯しながらインキュベ−トした。プレ−トをＴＢＳ［ｐＨ  ７．５］／１ｍＭ  ＣａＣｌ２で３回洗浄した。１ｍＬの溶解調製物由来のタンパク質をウェルに、ＴＢＳ［ｐＨ７．５］／１ｍＭ  ＣａＣｌ２／０．１％ＢＳＡ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０に１：１０希釈した単一点濃度として添加して、ウェルあたり１００μＬの最終容積にした。Ｎｉ／Ｑ精製したタンパク質について、滴定曲線は、１〜３μＭで出発し、単量体についてはＴＢＳ［ｐＨ７．５］／１ｍＭ  ＣａＣｌ２／０．１％ＢＳＡ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０において１：３で、突然変異単量体については１：４で連続希釈し、または、最後の地点でタンパク質がない１２ｐｔについてのウォ−キングした二量体を１００μＬ／ウェルでプレ−トに添加した。被覆したプレ−トを室温で１．５時間振蘯しながらインキュベ−トした。プレ−トをＴＢＳ［ｐＨ７．５］／１ｍＭ  ＣａＣｌ２／０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。１００μＬ／ウェルの、ＴＢＳ［ｐＨ７．５］／１ｍＭ  ＣａＣｌ２／０．１％ＢＳＡ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０で１：２０００希釈した抗ＨＡ−ＨＲＰ検出抗体（Ｒｏｃｈｅ／１２０１３８１９００１）を添加した。被覆したプレ−トを室温で１時間、振蘯しながらインキュベ−トした。プレ−トをＴＢＳ［ｐＨ７．５］／１ｍＭ  ＣａＣｌ２／０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。１００μＬ／ウェルの１：１に希釈したＴＭＢ／Ｈ２ＳＯ４混合物を添加した。色相は、最強シグナルのＯＤ６５０が約１．０に到達するまで、青色になったままであった。反応は、１００μＬ／ウェルの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止させた。一旦停止させると、プレ−トを、ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏソフトウェアを用いてＯＤ４５０でＥＬＩＳＡプレ−ト読み取り装置で読み取った。
【０４６３】
（受容体−Ｆｃタンパク質αスクリ−ン結合アッセイ）
すべてのアッセイ成分をαスクリ−ン緩衝液：ＮａＯＨを有する４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、１００ｍＭ  ＮａＣｌに希釈した。白色の、３８４ウェルの、減少した容積のＧｒｅｉｎｅｒマイクロタイタ−アッセイプレ−トに３回の添加をした。添加している間はインキュベ−ション時間を設けなかった。アッセイ最終容積は６μＬであった。第一に、２μＬの、１ｍＬの溶解調製物由来のタンパク質の１：５０希釈物を、プレ−トに添加した（１：１５０最終アッセイ希釈）。Ｎｉ／Ｑ精製したタンパク質について、１μＭ最終で出発し、１２ｐｔについて１：３希釈し、最後の地点でタンパク質を有さない、２μＬ／ウェルの滴定曲線をプレ−トに添加した。第二に、２μＬ／ウェルの９ｎＭでのｈＦＧＦＲ１ｃ／Ｆｃ（３ｎＭアッセイ終濃度）をプレ−トに添加した。あるいは、２μＬ／ウェルの、９ｎＭでのファミリ−メンバ−標的−Ｆｃ（３ｎＭアッセイ終濃度）をプレ−トに添加した。単量体突然変異誘発のために、標的−Ｆｃ濃度を６×で０．５ｎＭアッセイ終濃度に低下させた。αスクリ−ンビ−ズが感光性であるので、アッセイの残りを緩和光または緑色フィルタ−光で実施したことに留意されたい。第三に、３ｎＭのビオチン−ラット抗ＨＡ抗体（クロ−ン３Ｆ１０、Ｒｏｃｈｅ／１２  １５８  １６７  ００１）と、両方とも４０μｇ／ｍＬ（１０μｇ／ｍＬアッセイ終濃度）に希釈したαスクリ−ンストレプトアビジン「ドナ−ビ−ズ」およびプロテインＡ「アクセプタ−ビ−ズ」（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／６７６０６１７Ｍ）との２μＬ／ウェルの混合物を、図１７に示すように、プレ−トに添加した。次に、アッセイプレ−トを上部シ−ルで被覆し、８００ｒｐｍで約１分間スピンダウンした。次に、プレ−トを暗所で室温で一晩インキュベ−トし、翌日Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｌａｔｅ読み取り装置（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で読み取った。
【０４６４】
（ビオチン−標的タンパク質αスクリ−ン結合アッセイ）
すべてのアッセイ成分をαスクリ−ン緩衝液：ＮａＯＨを有する４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、１００ｍＭ  ＮａＣｌに希釈した。白色の、３８４ウェルの、減少した容積のＧｒｅｉｎｅｒマイクロタイタ−アッセイプレ−トに３回の添加をし、添加間にインキュベ−ション時間を設けなかった。アッセイ最終容積は、６μＬであった。第一に、２μＬの、１ｍＬの溶解調製物由来のタンパク質の１：５０希釈物を、プレ−トに添加した（１：１５０最終アッセイ希釈）。Ｎｉ／Ｑ精製したタンパク質について、１μＭ最終で出発し、１２ｐｔについて１：３希釈し、最後の地点でタンパク質を有さない、２μＬ／ウェルの滴定曲線をプレ−トに添加した。第二に、２μＬ／ウェルの１５ｎＭでのビオチン−ｂクロト−−Ｈｉｓ（５ｎＭアッセイ終濃度）をプレ−トに添加した。あるいは、２μＬ／ウェルの、１５ｎＭでのファミリ−メンバ−標的−ビオチン（５ｎＭアッセイ終濃度）をプレ−トに添加した。αスクリ−ンビ−ズが感光性であるので、アッセイの残りを緩和光または緑色フィルタ−光で実施した。第三に、６ｎＭのラット抗ＨＡ抗体（クロ−ン３Ｆ１０、Ｒｏｃｈｅ／１１  ８６７  ４３１  ００１）と、両方とも４０μｇ／ｍＬ（１０μｇ／ｍＬアッセイ終濃度）に希釈したαスクリ−ンストレプトアビジン「ドナ−ビ−ズ」および抗ｍｕＩｇＧ「アクセプタ−ビ−ズ」（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／６７６０６０６Ｍ）との２μＬ／ウェルの混合物を、図１８に示すように、プレ−トに添加した。次に、アッセイプレ−トを上部シ−ルで被覆し、８００ｒｐｍで約１分間スピンダウンした。次に、プレ−トを暗所で室温で一晩インキュベ−トし、翌日Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｌａｔｅ読み取り装置（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で読み取った。
【０４６５】
（αスクリ−ンリガンド非依存性阻害アッセイ）
すべてのアッセイ成分をαスクリ−ン緩衝液：ＮａＯＨを有する４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、１００ｍＭ  ＮａＣｌに希釈した。白色の、３８４ウェルの、減少した容積のＧｒｅｉｎｅｒマイクロタイタ−アッセイプレ−トに３回の添加をし、添加間にインキュベ−ション時間を設けなかった。アッセイ最終容積は、６μＬであった。第一に、２μＬの、１ｍＬの溶解調製物由来のタンパク質の１：５希釈物を、プレ−トに添加した（１：１５最終アッセイ希釈）。Ｎｉ／Ｑ精製したタンパク質について、１μＭ最終で出発し、１２ｐｔについて１：３希釈し、最後の地点でタンパク質を有さない、２μＬ／ウェルの滴定曲線をプレ−トに添加した。第二に、２μＬ／ウェルの１５ｎＭでのビオチン−ｂクロト−−Ｈｉｓ（５ｎＭアッセイ終濃度）をプレ−トに添加した。αスクリ−ンビ−ズが感光性であるので、アッセイの残りを緩和光または緑色フィルタ−光で実施したことに留意されたい。第三に、９０ｎＭのｈＦＧＦＲ１ｃ／Ｆｃ（３０ｎＭ終濃度）と、両方とも４０μｇ／ｍＬ（１０μｇ／ｍＬアッセイ終濃度）に希釈したαスクリ−ンストレプトアビジン「ドナ−ビ−ズ」およびプロテインＡ「アクセプタ−ビ−ズ」（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／６７６０６１７Ｍ）との２μＬ／ウェルの混合物を、図１９に示すように、プレ−トに添加した。あるいは、１５ｎＭ（５ｎＭ終濃度）の２μＬ／ウェルのｈＦＧＦＲ４／Ｆｃおよびαスクリ−ン（先と同じ希釈）をプレ−トに添加した。次に、アッセイプレ−トを上部シ−ルで被覆し、８００ｒｐｍで約１分間スピンダウンした。次に、プレ−トを暗所で室温で一晩インキュベ−トし、翌日Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｌａｔｅ読み取り装置（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で読み取った。
【０４６６】
（αスクリ−ンリガンド依存性阻害アッセイ）
すべてのアッセイ成分をαスクリ−ン緩衝液：ＮａＯＨを有する４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、１００ｍＭ  ＮａＣｌに希釈した。白色の、３８４ウェルの、減少した容積のＧｒｅｉｎｅｒマイクロタイタ−アッセイプレ−トに３回の添加をし、添加間にインキュベ−ション時間を設けなかった。アッセイ最終容積は、８μＬであった。第一に、２μＬの、１ｍＬの溶解調製物由来の希釈されていないタンパク質２μＬを、プレ−トに添加した（１：４最終アッセイ希釈）。Ｎｉ／Ｑ精製したタンパク質について、１μＭ最終で出発し、１２ｐｔについて１：３希釈し、最後の地点でタンパク質を有さない、２μＬ／ウェルの滴定曲線をプレ−トに添加した。陽性対照については、１μＭ最終で出発し、１２ｐｔについて１：３希釈し、最後の地点でリガンドを有さない滴定曲線をプレ−トに２μＬ／ウェルで添加した。第二に、４μＬ／ウェルの８０ｎＭでのｈｕｂクロト−−Ｈｉｓ（またはｍｕｂクロト−−Ｈｉｓ）（４０ｎＭアッセイ終濃度）と６０ｎＭでのｈｕＦＧＦＲ１ｃ／Ｆｃ（３０ｎＭアッセイ終濃度）をプレ−トに添加した。あるいは、４μＬ／ウェルの１４ｎＭでのｈｕｂクロト−−Ｈｉｓ（またはｍｕｂクロト−−Ｈｉｓ）（７ｎＭアッセイ終濃度）と１０ｎＭでのｈｕＦＧＦＲ４／Ｆｃ（５ｎＭアッセイ終濃度）との混合物をプレ−トに添加した。αスクリ−ンビ−ズが感光性であるので、アッセイの残りを緩和光または緑色フィルタ−光で実施した。第三に、２８ｎＭのビオチン−ｈｕＦＧＦ２１（７ｎＭ終濃度）と、両方とも４０μｇ／ｍＬ（１０μｇ／ｍＬアッセイ終濃度）に希釈したαスクリ−ンストレプトアビジン「ドナ−ビ−ズ」およびプロテインＡ「アクセプタ−ビ−ズ」（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／６７６０６１７Ｍ）との２μＬ／ウェルの混合物を、図２０に示すように、プレ−トに添加した。次に、アッセイプレ−トを上部シ−ルで被覆し、８００ｒｐｍで約１分間スピンダウンした。次に、プレ−トを暗所で室温で一晩インキュベ−トし、翌日Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｌａｔｅ読み取り装置（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で読み取った。
【０４６７】
（αスクリ−ンリガンド依存性阻害アッセイ（抗ｈｕＩｇＧ単量体半減期ドメインを含む結合タンパク質用））
すべてのアッセイ成分をαスクリ−ン緩衝液：ＮａＯＨを有する４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、１００ｍＭ  ＮａＣｌに希釈した。白色の、３８４ウェルの、減少した容積のＧｒｅｉｎｅｒマイクロタイタ−アッセイプレ−トに３回の添加をし、添加間にインキュベ−ション時間を設けなかった。アッセイ最終容積は、８μＬであった。第一に、１μＭ最終で出発し、１２ｐｔについて１：３希釈し、最後の地点でタンパク質を有さない、２μＬ／ウェルの滴定曲線をプレ−トに添加した。陽性対照については、１μＭ最終で出発し、１２ｐｔについて１：３希釈し、最後の地点でリガンドを有さない非標識ｈｕＦＧＦ２１の滴定曲線をプレ−トに２μＬ／ウェルで添加した。第二に、４μＬ／ウェルの８０ｎＭでのｈｕｂクロト−−Ｈｉｓ（またはｍｕｂクロト−−Ｈｉｓ）（４０ｎＭアッセイ終濃度）と６０ｎＭでのｈｕＦＧＦＲ１ｃ−Ｈｉｓ（３０ｎＭアッセイ終濃度）をプレ−トに添加した。あるいは、４μＬ／ウェルの１４ｎＭでのｈｕｂクロト−−Ｈｉｓ（またはｍｕｂクロト−−Ｈｉｓ）（７ｎＭアッセイ終濃度）と１０ｎＭでのｈｕＦＧＦＲ４／Ｆｃ（５ｎＭアッセイ終濃度）との混合物をプレ−トに添加した。αスクリ−ンビ−ズが感光性であるので、アッセイの残りを緩和光または緑色フィルタ−光で実施した。第三に、２８ｎＭのビオチン−ｈｕＦＧＦ２１（７ｎＭ終濃度）と、両方とも４０μｇ／ｍＬ（１０μｇ／ｍＬアッセイ終濃度）に希釈したαスクリ−ンストレプトアビジン「ドナ−ビ−ズ」およびニッケルキレ−ト「アクセプタ−ビ−ズ」（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／６７６０６１９Ｍ）との２μＬ／ウェルの混合物を、図２１に示すように、プレ−トに添加した。次に、アッセイプレ−トを上部シ−ルで被覆し、８００ｒｐｍで約１分間スピンダウンした。次に、プレ−トを暗所で室温で一晩インキュベ−トし、翌日Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｌａｔｅ読み取り装置（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で読み取った。
【０４６８】
ＶＩＩＩ．ファ−ジディスプレイで選択された単量体の多量体化および組換え
ｐＥｖｅへサブクロ−ニングした単量体（ｐＥｖｅ／単量体）を２つの以下の方法のうちの１つで多量体化した。ｐＥｖｅ／単量体プラスミド（個々にまたはプ−ルで）をＢｓｒＤＩまたはＢｐｍＩ（ＮＥＢ）のいずれかで消化した。約１．１ｋｂのＢｓｒＤＩおよび約２．９のＢｐｍＩ断片を１％アガロ−スゲルから単離し、Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラムで精製した。２つの断片の各々のプ−ルを、Ｔ４  ＤＮＡリガ−ゼ（ＮＥＢ）を用いて連結し、その後、連結物をＱｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラムで精製した。先のファ−ジサブクロ−ニングの節で説明されたプライマ−ＶＳ−ＦｏｒおよびＥｖｅＮｕｔを用いて、多量体コ−ド配列を連結物からＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、ＳｆｉＩ（ＮＥＢ）で消化した後、ｐＥｖｅと連結し、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌を形質転換した。多量体を生成する他の方法は、ｐＥｖｅ／単量体プラスミド（個々にまたはプ−ルで）から単量体を、上記のプライマ−ＶＳ−ＦｏｒおよびＥｖｅＮｕｔで増幅することである。増幅した単量体を精製し、ＢｓｒＤＩまたはＢｐｍＩ（ＮＥＢ）で消化し、連結して多量体を作製した。連結した産物をＶＳ−ＦｏｒおよびＥｖｅＮｕｔプライマ−で増幅した後、精製、ＳｆｉＩによる消化、ｐＥＶＥベクタ−との連結、およびＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌への形質転換が続いた。ＰＣＲ産物を精製し、ＳｆｉＩ（ＮＥＢ）で消化した後、ｐＥｖｅとの連結およびＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌の形質転換が続いた。この方法は、出発単量体の異なる組み合わせから構成される二量体を作製した。この方法は、三量体など、他の多量体を作製するために用いられることもできる。三量体を生成する場合、ｐＥｖｅ／二量体およびｐＥｖｅ／単量体のプ−ルが出発材料である。該プ−ルを先のとおり処理する。「ウォ−キングライブラリ−」を作製するための下記に説明されるのと類似した分子生物学手順も使用して、多量体を生成した。すべての場合、先のとおりタンパク質を発現させ、精製し、スクリ−ニングした。
【０４６９】
「ウォ−キングライブラリ−」と呼ばれる追加的なライブラリ−を、ファ−ジディスプレイで選択した単量体（すなわち、選択された単量体）を未処理の単量体ライブラリ−の完全な提示と連結することによって生成した。これらのライブラリ−を以下の様式で構築した。ＰＣＲを用いて、２つの個別の反応において増幅した：ａ）ｐＥＴＦ（ＡＣＣＣＧＴＡＴＧＡＴＧＴＴＣＣＧＧＡＴＴＡ、配列番号 ４８６）／ｐＥＴＢ２ｒ（ＧＡＴＧＴＡＴＴＣＧＧＣＣＣＣＡＧＡ  ＧＧＣＣＴＧＣＡＡＴＧＡＣ、配列番号 ４８７）を有する選択された単量体のコ−ド配列、およびｂ）２１ｎｅｗ１を有する単量体ライブラリ−における未処理の単量体のコ−ド配列（ＧＡＡＡＴＴＣＡＣＣＴＣＧＡＡＡＧＣＡＡ、配列番号 ４８８）／２３（ＡＴＧＧＧＴＴＣＣＴＡＴＴＧＧＧＣＴ、配列番号 ４８９）。約２００ｂｐの産物を３％アガロ−スゲルから単離し、Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラムで精製した。（ａ）および（ｂ）由来の各産物を個別の反応においてＢｓｒＤＩまたはＢｐｍＩ（ＮＥＢ）のいずれかで消化した。ＢｐｍＩで消化した単量体は、ＢｓｒＤＩで消化した単量体に連結されることのできるオ−バ−ハングを有する。精製された消化産物を、Ｔ４  ＤＮＡリガ−ゼ（ＮＥＢ）を用いて互いに連結した。ＢｓｒＤＩで切断した未処理の単量体とＢｐｍＩで切断した選択された単量体との連結は、Ｃ末端で選択された単量体に融合したＮ末端未処理単量体から構成されるウォ−キング二量体ライブラリ−を生じる。ＢｐｍＩで切断された未処理の単量体とＢｓｒＤＩで切断された選択された単量体との連結は、Ｎ末端で選択された単量体に融合したＣ末端未処理単量体から構成されるウォ−キング二量体ライブラリ−を生じる。プライマ−ｐＥＴＦ／ｐＥＴＢ２ｒを用いて、連結物から連結された二量体コ−ド配列をＰＣＲ増幅し、精製した産物をＳｆｉＩ、次いでＸｍａＩで消化した。消化した産物をファ−ジベクタ−−ｆＵＳＥ５ＨＡに連結し、典型的には１０８〜１０９の独特なメンバ−を有するファ−ジディスプレイ二量体「ウォ−キングライブラリ−」を生成した。三量体（またはより大きな多量体）「ウォ−キングライブラリ−」は、類似の様式で生成されることができるが、例外は、出発材料が、二量体（またはより大きい）および未処理の単量体であることである。ウォ−キングライブラリ−を上記のとおりβ−クロト−に対してパニングし、スクリ−ニングした。
【０４７０】
ＩＸ．結合アッセイおよび競合アッセイにおける精製された単量体の特徴づけ
一旦タンパク質を、加熱したタンパク質溶解物レベルで特徴づけると、最良の単量体をさらなる特徴づけのために選択した。個々のクロ−ンのより大規模な培養を調製し、８×Ｈｉｓタグ（配列番号４９２）を有する単量体をＮｉ−ＮＴＡ樹脂を介して精製した。これらのニッケル精製した単量体を、結合ＥＬＩＳＡおよびαスクリ−ン競合アッセイにおいてアッセイした。精製された単量体の特徴づけからのタンパク質配列デ−タおよび生化学的デ−タは、図１０〜１２にある。
【０４７１】
（ＮｉＮＴＡのための５００μＬ培養物からのタンパク質の精製）
（第１日）３ｍＬの２×ＹＴ＋４０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する１５ｍＬ培養チュ−ブにおいて、適切な「一次的中物ウェル」を格納したグリセロ−ルストックを接種した。培養物を３００ｒｐｍ、３７℃で一晩振蘯した。
【０４７２】
（第２日）２ｍＬの一晩培養物を５００ｍＬの２×ＹＴ＋４０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する１Ｌのエルレンマイヤ−振蘯フラスコへと接種した。培養物を３７５ｒｐｍで３７℃で、約０．８〜１．０のＯＤ６００に到達するまで振蘯しながら増殖した。一旦、所望のＯＤ６００に到達すると、培養物を３７５ｒｐｍで振蘯しながら、ＩＰＴＧの１ｍＭ終濃度で３時間誘導した。３時間の誘導後、５００ｍＬの培養物を清浄な／オ−トクレ−ブ処理したＳｏｒｖａｌｌチュ−ブに移動させ、８０００ｒｐｍで４℃で８分間遠心分離して、細胞をペレット化した。
【０４７３】
一旦細胞をペレット化すると、上清を取り出して廃棄し、２０ｍＬのニッケル結合／洗浄緩衝液（２０ｍＭトリス［ｐＨ７．５］／２０ｍＭイミダゾ−ル／３００ｍＭ  ＮａＣｌ／０．２ｍＭ  ＣａＣｌ２）を各チュ−ブに添加した。ペレットを、見える塊がなくなるまで、１０ｍＬ血清学的ピペットで再懸濁した後、再懸濁した細胞（約３０ｍＬ）を３５ｍＬのＯａｋｒｉｄｇｅチュ−ブに移動させ、８０℃で１０分間水浴で加熱して、細胞を溶解した。加熱後、溶解した細胞を含有する温Ｏａｋｒｉｄｇｅチュ−ブを氷／水浴中に冷却するまで約１０分間置いた。一旦冷却されると、チュ−ブを１８，０００ｒｐｍで４℃で３０分間遠心分離して、細胞をペレット化した。
【０４７４】
ＮｉＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）をニッケル結合緩衝液３×で洗浄した後、タンパク質溶解物に添加して、樹脂を平衡化した。ニッケル結合／洗浄緩衝液における合計１．５ｍＬのＮｉＮＴＡ樹脂を適切に（タンパク質ＩＤで）標識されたきれいな５０ｍＬねじキャップチュ−ブに添加した。溶解した細胞をペレット化した後、タンパク質上清を取り出して、１．５ｍＬの洗浄されたＮｉＮＴＡ樹脂を含有する５０ｍＬチュ−ブに添加した。タンパク質は、室温で０．５時間穏やかに揺らがすことによって、ＮｉＮＴＡ樹脂に結合させておいた。ＮｉＮＴＡ樹脂とのインキュベ−ション後、タンパク質に結合したＮｉＮＴＡを有する５０ｍＬチュ−ブを約１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を穏やかに注ぎ出し、廃棄した。
【０４７５】
ＮｉＮＴＡ樹脂＋結合したタンパク質を、１ｍＬのニッケル結合／洗浄緩衝液を、樹脂を含有する５０ｍＬのチュ−ブに添加し、渦巻いて再懸濁し、次に、混合物を、真空多岐管に装着されたカラムへとピペットで移すことにより、適切に標識を付した１５ｍｌのｌｏｎｔｅｃｈカラムに移した。ＮｉＮＴＡ樹脂＋結合したタンパク質を少なくとも１０カラム容積（１５ｍＬ）のＮｉＮＴＡ洗浄緩衝液で洗浄した。ＮｉＮＴＡ樹脂＋結合および洗浄したタンパク質を含有する１５ｍＬカラムを清浄な１５ｍＬねじキャップ収集チュ−ブへと移動させ、４ｍＬのＮｉ溶出緩衝液（２０ｍＭトリス［ｐＨ７．５］、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、２００ｍＭイミダゾ−ル）を各カラムに添加して、１５ｍＬの収集チュ−ブへとタンパク質を溶出した。次に、これを重力によって溶出させておいた。
【０４７６】
溶出したタンパク質を、１８．５ゲ−ジ針および５ｍＬ注射器を用いてスライド−Ａ−ライザ−カセット（適切な分子量カットオフ−単量体については３．５ｋＤａカットオフを使用し、二量体および三量体については１０ｋＤａカットオフを使用した）へと移し、カセットを負荷した。溶出したタンパク質を含有するスライド−Ａ−ライザ−カセットを、酸化還元試薬（２０ｍＭトリス［ｐＨ  ７．５］、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノ−ル、０．２５ｍＭ  ２−ヒドロキシエチルジスルフィド）を含有する透析緩衝液に一晩置いた。
【０４７７】
（第３日）一晩透析したタンパク質を含有するスライド−Ａ−ライザ−カセットを酸化還元試薬を有さない透析緩衝液（２０ｍＭトリス［ｐＨ  ７．５］、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２）に移動させた。３時間の透析後、スライド−Ａ−ライザ−カセットを、酸化還元せずに新鮮なＴＢＳ／ＣａＣｌ２へとさらに３時間移した。第二の透析変化後、１８．５ゲ−ジ針および５ｍＬ注射器を用いて、タンパク質をスライド−Ａ−ライザ−カセットから取り出し、０．２ミクロン注射器フィルタ−を用いて、適切に標識された１５ｍＬポリプロピレンチュ−ブへと濾過することによって、タンパク質を移動させた。
【０４７８】
精製された結合タンパク質を、リポ−タ−細胞アッセイにおける「最良のアゴニスト」として選択し、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ陰イオン交換によってさらに精製して、夾雑物質を除去した。
【０４７９】
（Ｑ−セファロ−ス精製）
１ｍＬのＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ−Ｆｌｏｗ  Ｒｅｓｉｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１５ｍＬのＣｌｏｎｔｅｃｈカラムに添加した。２０ｍＭトリス［ｐＨ７．５］、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２の１５カラム容積（または１５ｍＬ）を有する樹脂を平衡化した。２ｍＬ（約５ｍｇ）の濾過したＮｉＮＴＡ精製したタンパク質を樹脂に添加し、タンパク質を重力によって樹脂に結合させておいた。９６ウェルプレ−トの第一のカラムへの通過画分を収集した。タンパク質を負荷したカラムを１５ｍＬ収集チュ−ブに移動させ、樹脂／結合したタンパク質を２０ｍＭトリス［ｐＨ７．５］、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２の１０カラム容積（または１０ｍＬ）で洗浄した。一旦洗浄すると、タンパク質のＮａＣｌ勾配溶出を開始した。ＮａＣｌ濃度を以下の通り勾配において変動させた：２０ｍＭトリス［ｐＨ７．５］の塩基、１ｍＭ  ＣａＣｌ２に対して１００ｍＭ、１５０ｍＭ、１８０ｍＭ、２００ｍＭ、２２０ｍＭ、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ。画分を９６ウェル深ウェルポリプロピレンプレ−ト−２ｍＬ／収集物に１ｍＬ刻みで収集した。タンパク質を含有する画分をＢｒａｄｆｏｒｄによって試験し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分析した。画分を上記のとおりの結合ＥＬＩＳＡおよび競合アッセイにおいて、以下の変更を伴って試験した。５００ｍＬのＮｉＮＴＡで精製された調製物またはＮｉＮＴＡ＋Ｑ−セファロ−スで精製した調製物由来のタンパク質をプレ−トに、１：５〜１：１００の第一の希釈で、次いで、１：４の連続希釈、その後、緩衝液のみとして最後の地点で出発する１２地点濃度曲線として添加した。
【０４８０】
（ＦＧＦＲ１ｃ結合単量体）
以下は、未処理のＡ１ライブラリ−のパニングから同定されたＦＧＦＲ１ｃ単量体（それぞれ出現順序で配列番号 ４９３〜５０８、２８８、２９０、５１１、２９２、５１３、２９１、５１５〜５１７、２８９、５１９〜５２２、２８７、および５２４〜５２５、図１０参照）の要約である：
【０４８１】
【化１】
2013512672.tif 000009
2013512672.tif 000010
2013512672.tif 000011
【０４８２】
以下は、ＦＧＦＲ１ｃ結合単量体についてのコンセンサス配列である。保存された残基は太字である。フレ−ムワ−クシステインは、
【０４８３】
【化２】
2013512672.tif 000012
として示した。同定されたリンカ−の範囲も列挙する。
【０４８４】
【化３】
2013512672.tif 000013
【０４８５】
以下は、Ｍ０３／Ｍ１５突然変異体単量体ライブラリ−のパニングから同定されたＦＧＦＲ１ｃ結合単量体（出現順序でそれぞれ、配列番号 ２９３〜２９５、４４８、２９７、４４９〜４５０、４６４、２９６、および２８７）の要約である。
【０４８６】
【化４】
2013512672.tif 000014
【０４８７】
以下は、Ｍ０３／Ｍ１５突然変異体単量体ライブラリ−のパニングから同定されたＦＧＦＲ１ｃ単量体についての共通配列である。保存された残基は太字である。フレ−ムワ−クシステインを
【０４８８】
【化５】
2013512672.tif 000015
として示した。同定されたリンカ−の範囲も列挙する。
【０４８９】
【化６】
2013512672.tif 000016
【０４９０】
以下は、Ｍ２３突然変異体単量体ライブラリ−のパニングから同定されたＦＧＦＲ１ｃ単量体（出現順序でそれぞれ、配列番号 ２９８、４７９、３０３、３０１、２９９、４８２、４８５、３０２、３００、および２９０）の要約である。
【０４９１】
【化７】
2013512672.tif 000017
【０４９２】
以下は、Ｍ２３突然変異体単量体ライブラリ−のパニングから同定されたＦＧＦＲ１ｃ単量体のコンセンサス配列である。保存された残基は太字である。フレ−ムワ−クシステインを
【０４９３】
【化８】
2013512672.tif 000018
として示した。同定されたリンカ−の範囲も列挙する。
【０４９４】
【化９】
2013512672.tif 000019
【０４９５】
（βクロト−結合単量体および二量体）
以下は、未処理のＡ１ライブラリ−のパニングから同定されたβクロト−単量体（出現順序でそれぞれ、配列番号 ３０４、５１０、２９０、５１２、５１２、４８０、５１４、５１８、５２３、５２７〜５３６、４８４、５３７〜５４１、４８３、４８３、５４２、４８１、３０５、５４３〜５４７、５４７〜５５０、３０６、５５１、５５１〜５６２、１２３５、および５６３、図１１参照）の要約である。
【０４９６】
【化１０】
2013512672.tif 000020
2013512672.tif 000021
2013512672.tif 000022
2013512672.tif 000023
【０４９７】
以下は、βクロト−結合単量体についてのコンセンサス配列である。保存された残基は太字である。フレ−ムワ−クシステインを
【０４９８】
【化１１】
2013512672.tif 000024
として示した。同定されたリンカ−の範囲も列挙する。
【０４９９】
【化１２】
2013512672.tif 000025
【０５００】
以下は、未処理のＬＮＲライブラリ−のパニングから同定されたβ−クロト−単量体（出現順序でそれぞれ、配列番号 １２４３、１２４６、１２５３、１２５１、１２５０、１２７６、１２４７、１２５４、１２７７、１２５５、１２５７、１２６１、１２５８、１２６０、１２７８、１２４４、１２５２、１２７９、１２４５、１２５６、および１２６２、ファミリ−５、図１２参照）の要約である。
【０５０１】
【化１３】
2013512672.tif 000026
2013512672.tif 000027
【０５０２】
以下は、ＬＮＲライブラリ−のパニングから同定されたβ−クロト−単量体についての共通配列である。フレ−ムワ−クシステインは
【０５０３】
【化１４】
2013512672.tif 000028
として示した。
【０５０４】
【化１５】
2013512672.tif 000029
【０５０５】
β−クロト−に対するＬＮＲライブラリ−パニングに由来するすべての単量体は、９アミノ酸長リンカ−を有する。以下は、これらのリンカ−についてのコンセンサス配列である。
［ＡＤＥＧＰＱＲ］［ＤＥＨＬＭＰＲＴＶ］［ＤＥＩＫＮＶ］［ＡＥＦＬＱＲＳＶＷ］［ＡＤＧＨＩＬＮＳＶ］［ＡＤＥＧＨＰＱＲＴ］
［ＤＥ］［ＡＬＰＳＶ］Ｔ（配列番号１２８１）
【０５０６】
以下は、β−クロト−Ｍ０１から構築された突然変異誘発ライブラリ−のパニングから同定されたβ−クロト−単量体（出現順序でそれぞれ、配列番号 １９〜２１、５２６、４６５、５０９、および５６３、ファミリ−６、図１３参照）の要約である。
【０５０７】
【化１６】
2013512672.tif 000030
【０５０８】
以下は、β−クロト−Ｍ０１から構築された突然変異誘発ライブラリ−のパニングから同定されたβ−クロト−結合単量体についてのコンセンサス配列である。フレ−ムワ−クシステインは、
【０５０９】
【化１７】
2013512672.tif 000031
として示した。
【０５１０】
【化１８】
2013512672.tif 000032
【０５１１】
以下は、β−クロト−Ｍ２５から構築された突然変異誘発ライブラリ−のパニングから同定されたβ−クロト−単量体（出現順序でそれぞれ、配列番号 ５６４〜５６９、および５６９〜５７４、ファミリ−７、図１３参照）の要約である。
【０５１２】
【化１９】
2013512672.tif 000033
【０５１３】
以下は、β−クロト−Ｍ２５から構築された突然変異誘発ライブラリ−のパニングから同定されたβ−クロト−結合単量体についてのコンセンサス配列である。フレ−ムワ−クシステインは、
【０５１４】
【化２０】
2013512672.tif 000034
として示した。
【０５１５】
【化２１】
2013512672.tif 000035
【０５１６】
以下は、β−クロト−Ｍ４２から構築された突然変異誘発ライブラリ−のパニングから同定されたβ−クロト−単量体（出現順序でそれぞれ、配列番号５７６〜５７９、ファミリ−８、図１３参照）の要約である。
【０５１７】
【化２２】
2013512672.tif 000036
【０５１８】
以下は、β−クロト−Ｍ４２から構築された突然変異誘発ライブラリ−のパニングから同定されたβ−クロト−結合単量体についてのコンセンサス配列である。フレ−ムワ−クシステインは、
【０５１９】
【化２３】
2013512672.tif 000037
として示した。
【０５２０】
【化２４】
2013512672.tif 000038
【０５２１】
以下は、β−クロト−Ｍ５０から構築された突然変異誘発ライブラリ−のパニングから同定されたβ−クロト−単量体（出現順序でそれぞれ、配列番号 ５８０〜５８３、ファミリ−９、図１３参照）の要約である。
【０５２２】
【化２５】
2013512672.tif 000039
【０５２３】
以下は、β−クロト−Ｍ５０から構築された突然変異誘発ライブラリ−のパニングから同定されたβ−クロト−結合単量体についてのコンセンサス配列である。フレ−ムワ−クシステインは、
【０５２４】
【化２６】
2013512672.tif 000040
として示した。
【０５２５】
【化２７】
2013512672.tif 000041
【０５２６】
以下は、β−クロト−Ｍ０１のＮ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定されたβ−クロト−のウォ−キングした二量体（出現順序でそれぞれ、配列番号 ５８４および５８４〜５９０、ファミリ−１０、図１４参照）の要約である。
【０５２７】
【化２８】
2013512672.tif 000042
【０５２８】
以下は、β−クロト−Ｍ０１のＮ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体由来のＮ末端単量体についてのコンセンサス配列である。フレ−ムワ−クシステインは、
【０５２９】
【化２９】
2013512672.tif 000043
として示した。
【０５３０】
【化３０】
2013512672.tif 000044
【０５３１】
以下は、β−クロト−Ｍ０１のＣ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体由来の単量体ドメイン１と単量体ドメイン２の間のリンカ−である。
ＡＳＴＶＰＴ（配列番号５９１）
ＡＴＰＴ（配列番号５９２）
ＴＫＲＴ（配列番号５９３）
ＥＫＲＴ（配列番号５９４）
ＳＱＤＰＥＦＨＫＶ（配列番号１８）
ＲＲＰＧＰＴ（配列番号５９５）
ＫＴＰＡＲＴ（配列番号５９６）
【０５３２】
以下は、β−クロト−Ｍ０１のＮ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体由来のＣ末端単量体についてのコンセンサス配列である。フレ−ムワ−クシステインは、
【０５３３】
【化３１】
2013512672.tif 000045
として示した。
【０５３４】
【化３２】
2013512672.tif 000046
【０５３５】
以下は、β−クロト−Ｍ０１のＮ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−に由来する選択されたウォ−キングした二量体のためのシ−ドを提供したβ−クロト−Ｍ０１関連配列（この上にある共通整列化を先に示す（配列番号５９７））である。
ＣＬＰＤＥＦＱＣＳＳ  ＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣ  ＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳ  ＤＥＳＰＡＨＣ（配列番号１２３６）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳ  ＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣ  ＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳ  ＤＥＰＰＡＨＣ（配列番号１２３７）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳ  ＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣ  ＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳ  ＤＥＳＰＡＴＣ（配列番号１２３８）
【０５３６】
以下は、β−クロト−Ｍ０１のＮ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体のＣ末端に組み込まれたリンカ−である。
ＳＱＤＰＥＦＨＫＶ（配列番号１２）
ＫＡＰＶＰＴ（配列番号２４）
ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号１８）
【０５３７】
以下は、β−クロト−Ｍ０１のＣ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定されたβ−クロト−のウォ−キングした二量体（出現順序でそれぞれ、配列番号 ５９８、３０７、５９９〜６００、３１０、３０８〜３０９、および６０１〜６０６、ファミリ−１１、図１４参照）の要約である。
【０５３８】
【化３３】
2013512672.tif 000047
【０５３９】
以下は、β−クロト−Ｍ０１のＣ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体由来のＮ末端単量体についてのコンセンサス配列である。フレ−ムワ−クシステインは、
【０５４０】
【化３４】
2013512672.tif 000048
として示した。
【０５４１】
【化３５】
2013512672.tif 000049
【０５４２】
以下は、β−クロト−Ｍ０１のＣ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体の単量体ドメイン１と単量体ドメイン２の間のリンカ−である。
ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号１８）
ＫＡＰＶＰＴ（配列番号２４）
ＳＱＤＰＥＦＨＫＶ（配列番号１２）
【０５４３】
以下は、β−クロト−Ｍ０１のＣ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体由来のＣ末端単量体についてのコンセンサス配列である。フレ−ムワ−クシステインは、
【０５４４】
【化３６】
2013512672.tif 000050
として示した。
【０５４５】
【化３７】
2013512672.tif 000051
【０５４６】
以下は、β−クロト−Ｍ０１のＣ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体のＣ末端におけるリンカ−である。
ＴＴＰＧＨＴ（配列番号６０８）
ＡＱＰＴ（配列番号６０９）
ＫＥＨＴ（配列番号６１０）
ＧＧＡＥＰＴ（配列番号６１１）
ＴＥＨＴ（配列番号６１２）
ＥＲＳＧＲＴ（配列番号６１３）
ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号１２）
ＥＱＰＴ（配列番号６１４）
ＥＰＰＴ（配列番号６１５）
ＰＡＨＴ（配列番号６１６）
ＫＧＰＥＨＴ（配列番号６１７）
ＴＡＳＧＲＴ（配列番号６１８）
ＴＡＴＶＲＴ（配列番号６１９）
【０５４７】
以下は、β−クロト−Ｍ０６のＮ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定されたβ−クロト−のウォ−キングしたβ−クロト−のウォ−キングした二量体（出現順序でそれぞれ、配列番号６２０および６２０〜６２２、ファミリ−１２、図１４参照）の要約である。
【０５４８】
【化３８】
2013512672.tif 000052
【０５４９】
以下は、β−クロト−Ｍ０６のＮ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体由来のＮ末端単量体についてのコンセンサス配列である。フレ−ムワ−クシステインは、
【０５５０】
【化３９】
2013512672.tif 000053
として示した。
【０５５１】
【化４０】
2013512672.tif 000054
【０５５２】
以下は、β−クロト−Ｍ０６のＮ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体の単量体ドメイン１と単量体ドメイン２の間のリンカ−である。
ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号１２）
ＫＧＳＧＰＴ（配列番号６２３）
ＡＡＰＥＨＴ（配列番号６２４）
【０５５３】
以下は、β−クロト−Ｍ０６のＮ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体由来のＣ末端単量体についてのコンセンサス配列である。フレ−ムワ−クシステインは、
【０５５４】
【化４１】
2013512672.tif 000055
として示した。
【０５５５】
【化４２】
2013512672.tif 000056
【０５５６】
以下は、β−クロト−Ｍ０６のＮ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体のＣ末端のリンカ−である。
ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号１２）
【０５５７】
以下は、β−クロト−Ｍ０６のＣ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定されたβ−クロト−のウォ−キングした二量体（出現順序でそれぞれ、配列番号 ６２６〜６２８、ファミリ−１３、図１４参照）の要約である。
【０５５８】
【化４３】
2013512672.tif 000057
【０５５９】
以下は、β−クロト−Ｍ０６のＣ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体由来のＮ末端単量体についてのコンセンサス配列である。フレ−ムワ−クシステインは、
【０５６０】
【化４４】
2013512672.tif 000058
として示した。
【０５６１】
【化４５】
2013512672.tif 000059
【０５６２】
以下は、β−クロト−Ｍ０６のＣ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された単量体ドメイン１と単量体ドメイン２の間のリンカ−である。
ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号１２）
【０５６３】
以下は、β−クロト−Ｍ０６のＣ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体由来のＣ末端単量体についてのコンセンサス配列である。フレ−ムワ−クシステインは、
【０５６４】
【化４６】
2013512672.tif 000060
として示した。
【０５６５】
【化４７】
2013512672.tif 000061
【０５６６】
以下は、β−クロト−Ｍ０６のＣ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体のＣ末端のリンカ−である。
ＫＡＴＶＰＴ（配列番号６２９）
ＥＳＰＧＰＴ（配列番号６３０）
ＫＲＳＶＲＴ（配列番号６３１）
【０５６７】
以下は、β−クロト−Ｍ０８のＮ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定されたβ−クロト−のウォ−キングした二量体（出現の順序でそれぞれ、配列番号 ６３２〜６３３、３１１、および６３４、ファミリ−１４、図１４参照）の要約である。
【０５６８】
【化４８】
2013512672.tif 000062
【０５６９】
以下は、β−クロト−Ｍ０８のＮ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体由来のＮ末端単量体についてのコンセンサス配列である。フレ−ムワ−クシステインは、
【０５７０】
【化４９】
2013512672.tif 000063
として示した。
【０５７１】
【化５０】
2013512672.tif 000064
【０５７２】
以下は、β−クロト−Ｍ０８のＮ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体の単量体ドメイン１と単量体ドメイン２の間のリンカ−である。
ＧＲＰＧＰＧＡＴＳＡＰＡＡ  （配列番号１３）
ＰＡＰＴ  （配列番号６３５）
ＫＡＨＴ  （配列番号６３６）
ＡＴＲＴ  （配列番号６３７）
【０５７３】
以下は、β−クロト−Ｍ０８のＮ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体由来のＣ末端単量体についてのコンセンサス配列である。フレ−ムワ−クシステインは、
【０５７４】
【化５１】
2013512672.tif 000065
として示した。
【０５７５】
【化５２】
2013512672.tif 000066
【０５７６】
以下は、β−クロト−Ｍ０８のＮ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体のＣ末端のリンカ−である。
ＫＡＰＶＰＴ  （配列番号２４）
ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号１２）
ＳＱＤＰＧＦＨＫＶ  （配列番号２５）
【０５７７】
以下は、β−クロト−Ｍ２１のＮ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定されたβ−クロト−のウォ−キングした二量体（出現の順序でそれぞれ、配列番号 ６３９〜６４０、３１２、および６４１〜６４３、ファミリ−１５、図１４参照）の要約である。
【０５７８】
【化５３】
2013512672.tif 000067
【０５７９】
以下は、β−クロト−Ｍ２１のＮ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体由来のＮ末端単量体についてのコンセンサス配列である。フレ−ムワ−クシステインは、
【０５８０】
【化５４】
2013512672.tif 000068
として示した。
【０５８１】
【化５５】
2013512672.tif 000069
【０５８２】
以下は、β−クロト−Ｍ２１のＮ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体の単量体ドメイン１と単量体ドメイン２の間のリンカ−である。
ＴＰＨＴ  （配列番号６４４）
ＱＡＰＴ  （配列番号６４５）
ＥＴＰＴ  （配列番号６４６）
ＡＳＡＶＨＴ  （配列番号６４７）
ＱＲＨＴ  （配列番号６４８）
ＧＤＳＨＩＬＰＦＳＴＰＧＰＳＴ  （配列番号１４）
【０５８３】
以下は、β−クロト−Ｍ２１のＮ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体由来のＣ末端単量体についてのコンセンサス配列である。フレ−ムワ−クシステインは、
【０５８４】
【化５６】
2013512672.tif 000070
として示した。
【０５８５】
【化５７】
2013512672.tif 000071
【０５８６】
以下は、β−クロト−Ｍ２１のＮ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体のＣ末端のリンカ−である。
ＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号１８）
ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号１２）
【０５８７】
以下は、β−クロト−Ｍ２１のＣ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定されたβ−クロト−のウォ−キングした二量体（出現の順序でそれぞれ、配列番号 ６５０〜６５１、ファミリ−１６、図１４参照）の要約である。
【０５８８】
【化５８】
2013512672.tif 000072
【０５８９】
以下は、β−クロト−Ｍ２１のＣ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体由来のＮ末端単量体についてのコンセンサス配列である。フレ−ムワ−クシステインは、
【０５９０】
【化５９】
2013512672.tif 000073
として示した。
【０５９１】
【化６０】
2013512672.tif 000074
【０５９２】
以下は、β−クロト−Ｍ２１のＣ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体の単量体ドメイン１と単量体ドメイン２の間のリンカ−である。
ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号１２）
【０５９３】
以下は、β−クロト−Ｍ２１のＣ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体由来のＣ末端単量体についてのコンセンサス配列である。フレ−ムワ−クシステインは、
【０５９４】
【化６１】
2013512672.tif 000075
として示した。
【０５９５】
【化６２】
2013512672.tif 000076
【０５９６】
以下は、β−クロト−Ｍ２１のＣ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体のＣ末端のリンカ−である。
ＴＰＰＴ  （配列番号６５２）
ＥＥＨＴ  （配列番号６５３）
【０５９７】
以下は、β−クロト−Ｍ４２のＮ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定されたβ−クロト−のウォ−キングした二量体（出現の順序でそれぞれ、配列番号 ６５４〜６５７、ファミリ−１７、図１４参照）の要約である。
【０５９８】
【化６３】
2013512672.tif 000077
【０５９９】
以下は、β−クロト−Ｍ４２のＮ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体由来のＮ末端単量体についてのコンセンサス配列である。フレ−ムワ−クシステインは、
【０６００】
【化６４】
2013512672.tif 000078
として示した。
【０６０１】
【化６５】
2013512672.tif 000079
【０６０２】
以下は、β−クロト−Ｍ４２のＮ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体の単量体ドメイン１と単量体ドメイン２の間のリンカ−である。
ＧＤＳＨＩＬＰＦＳＴＰＧＰＳＴ    （配列番号１４）
ＱＴＰＴ    （配列番号６５８）
ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ    （配列番号１２）
ＲＲＡＡＨＴ    （配列番号２９）
【０６０３】
以下は、β−クロト−Ｍ４２のＮ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体由来のＣ末端単量体についてのコンセンサス配列である。フレ−ムワ−クシステインは、
【０６０４】
【化６６】
2013512672.tif 000080
として示した。
【０６０５】
【化６７】
2013512672.tif 000081
【０６０６】
β−クロト−Ｍ４２単量体ドメインにおける複数の突然変異を含有する追加的なシ−ド配列を、β−クロト−Ｍ４２のＮ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングからの出力において同定した。
ＣＱＰＤＥＦＱＣＧＳ  ＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣ  ＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳ  ＤＥＳＰＡＨＣ  （配列番号１２３９）
【０６０７】
以下は、β−クロト−Ｍ４２のＮ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体のＣ末端のリンカ−である。
ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ    （配列番号１２）
ＫＡＰＶＰＴ  （配列番号２４）
【０６０８】
以下は、β−クロト−Ｍ４２のＮ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定されたβ−クロト−のウォ−キングした二量体（出現の順序でそれぞれ、配列番号 ６６０〜６６２、ファミリ−１８、図１４参照）の要約である。
【０６０９】
【化６８】
2013512672.tif 000082
【０６１０】
以下は、β−クロト−Ｍ４２のＣ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体のＮ末端単量体についてのコンセンサス配列である。フレ−ムワ−クシステインは、
【０６１１】
【化６９】
2013512672.tif 000083
として示した。
【０６１２】
【化７０】
2013512672.tif 000084
【０６１３】
以下は、β−クロト−Ｍ４２のＣ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体の単量体ドメイン１と単量体ドメイン２の間のリンカ−である。
ＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号１２）
ＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号１８）
【０６１４】
以下は、β−クロト−Ｍ４２のＣ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体由来のＣ末端単量体についてのコンセンサス配列である。フレ−ムワ−クシステインは、
【０６１５】
【化７１】
2013512672.tif 000085
として示した。
【０６１６】
【化７２】
2013512672.tif 000086
【０６１７】
以下は、β−クロト−Ｍ４２のＣ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体のＣ末端のリンカ−である。
ＥＳＴＶＲＴ  （配列番号６６４）
ＡＰＰＴ  （配列番号６６５）
ＥＱＲＴ  （配列番号２８）
【０６１８】
以下は、β−クロト−Ｍ５０のＮ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定されたβ−クロト−のウォ−キングした二量体（出現の順序でそれぞれ、配列番号 ６６６〜６７４、ファミリ−１９、図１４参照）の要約である。
【０６１９】
【化７３】
2013512672.tif 000087
【０６２０】
以下は、β−クロト−Ｍ５０のＮ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体由来のＮ末端単量体についてのコンセンサス配列である。フレ−ムワ−クシステインは、
【０６２１】
【化７４】
2013512672.tif 000088
として示した。
【０６２２】
【化７５】
2013512672.tif 000089
【０６２３】
以下は、β−クロト−Ｍ５０のＮ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体の単量体ドメイン１と単量体ドメイン２の間のリンカ−である。
ＱＫＲＴ（配列番号６７５）
ＰＥＰＴ  （配列番号６７６）
ＴＥＰＴ  （配列番号６７７）
ＥＡＰＧＲＴ  （配列番号６７８）
ＲＡＳＡＨＴ  （配列番号６７９）
ＧＲＱＧＰＧＡＴＳＡＰＡＡ  （配列番号６８０）
ＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号１８）
ＥＴＲＴ  （配列番号６８１）
ＥＱＨＴ  （配列番号６８２）
【０６２４】
以下は、β−クロト−Ｍ５０のＮ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体由来のＣ末端単量体についてのコンセンサス配列である。フレ−ムワ−クシステインは、
【０６２５】
【化７６】
2013512672.tif 000090
として示した。
【０６２６】
【化７７】
2013512672.tif 000091
【０６２７】
以下は、β−クロト−Ｍ５０のＮ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体のＣ末端のリンカ−である。
ＧＤＰＨＩＬＰＦＳＴＰＧＰＳＴ  （配列番号６８４）
【０６２８】
以下は、β−クロト−Ｍ５０のＣ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定されたβ−クロト−のウォ−キングした二量体（出現の順序でそれぞれ、配列番号 ６８５〜６８６、ファミリ−２０、図１４参照）の要約である。
【０６２９】
【化７８】
2013512672.tif 000092
【０６３０】
以下は、β−クロト−Ｍ５０のＣ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体由来のＮ末端単量体についてのコンセンサス配列である。フレ−ムワ−クシステインは、
【０６３１】
【化７９】
2013512672.tif 000093
として示した。
【０６３２】
【化８０】
2013512672.tif 000094
【０６３３】
以下は、β−クロト−Ｍ５０のＣ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体の単量体ドメイン１と単量体ドメイン２の間のリンカ−である。
ＧＤＰＨＩＬＰＦＳＴＰＧＰＳＴ  （配列番号６８４）
【０６３４】
以下は、β−クロト−Ｍ５０のＣ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体由来のＣ末端単量体についてのコンセンサス配列である。フレ−ムワ−クシステインは、
【０６３５】
【化８１】
2013512672.tif 000095
として示した。
【０６３６】
【化８２】
2013512672.tif 000096
【０６３７】
以下は、β−クロ−Ｍ５０のＣ末端のウォ−キングした二量体ライブラリ−のパニングから同定された二量体のＣ末端のリンカ−である。
ＧＴＴＧＲＴ  （配列番号６８７）
ＧＲＰＧＰＧＡＴＳＡＰＡＡ（配列番号１３）
【０６３８】
実施例８
本実施例は、ＦＧＦＲ１ｃ結合単量体とβクロト−結合単量体を組み合させることによって作製された結合タンパク質を生成およびスクリ−ニングすることを説明する。
【０６３９】
ＰＣＲベ−スの方法を用い、β−クロト−またはＦＧＦＲ１ｃ結合タンパク質コ−ド配列のプ−ルをＰＣＲ増幅し、消化し、互いに連結して、二重特異性分子を作製した。
【０６４０】
一般に、（ｉ）ＦＧＦＲ１ｃ結合単量体ならびに（ｉｉ）β−クロト−結合単量体および二量体結合タンパク質のコ−ド配列を、５’プライマ−Ｕ＿ｖｓ＿ｆｏｒ（ｇｇｔｃａｔａｃｔｇａａｃｃｇＡＴＧＧＣＣＧＧＴＣＣＧＧＣＣＴＡＣ）（配列番号６８８）および３’プライマ−ＥｖｅＮｕｔ（ａａａ  ａｇｇ  ｃｃｃ  ｃａｇ  ａｇｇ  ｃｃｔ  ｔｃｔ  ｇｃａ  ａｔｇ  ａ）（配列番号６８９）を用いて個々にＰＣＲ増幅し、「生成物Ａ」を作製した。これらの遺伝子はまた、５’プライマ−のＢｐｍＩ＿ｆｏｒ（ａｔｇｃｃｃｃｇｇｇｔｃｔｇｇａｇｇｃｇｔｃｔｇｇｔｇｇｔｔｃ）（配列番号６９０）および３’プライマ−ＥｖｅＮｕｔＵｒｅｓｃｕｅ（ｇｇｔａｃｃａｔｇｃｔｔｇｃａｔｔｃＧＧＣＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＴＴＣＴＧＣＡＡＴＧＡ）（配列番号６９１）を用いてＰＣＲ増幅して、「生成物Ｂ」を作製した。
【０６４１】
ＰＣＲ産物をＱｉａｇｅｎ９６ウェルブロックで精製した後、制限エンドヌクレア−ゼで消化した。「生成物Ａ」をＢｓｒＤＩで消化し、「生成物Ｂ」をＢｐｍＩで消化し、すべて９６ウェルＱｉａｇｅｎブロックで精製した。
【０６４２】
２断片連結を１２プ−ルで実施した。各連結において、６０〜１２０ｎｇの各断片を１０μＬの容積で、Ｔ４  ＤＮＡリガ−ゼ（ＮＥＢ）を用いて室温で４時間連結した。０．５μＬの連結物における連結した産物（すなわち、結合タンパク質についての遺伝子）を優先的に、５’プライマ−Ｒｅｓｃｕｅ＿ｆｕｓｉｏｎ＿ｆｏｒ（ｇｇｔｃａｔａｃｔｇａａｃｃｇ）（配列番号６９２）および３’プライマ−Ｒｅｓｃｕｅ１＿ｒｅｖ（ｇｇｔａｃｃａｔｇｃｔｔｇｃａｔｔｃ）（配列番号６９３）を用いてＰＣＲ増幅した。生成物を精製し、ＳｆｉＩで消化した後、ゲル精製し、ｐＥＶＥ発現ベクタ−へとサブクロ−ン化した。正確なクロ−ンをＤＮＡ配列決定によって同定した。
【０６４３】
（ＦＧＦＲ１ｃ／βクロト−結合タンパク質）
ＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の両方に結合するであろう一連のヘテロ二量体結合タンパク質を生成した（図２２〜２３参照）。
【０６４４】
以下は、アゴニスト活性について試験した１セットの結合タンパク質を生成するために用いられたＦＧＦＲ１ｃ単量体を要約する（図１０、１５、および１６参照）。結果として生じた二重特異性多量体は、ＥＬＩＳＡ（図２４）およびＡｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ（図２５）によってＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−を結合することが示された。二重特異性多量体は、ＡｌｐｈａｓｃｒｅｅｎにおけるＦＧＦＲ１ｃ／β−クロト−複合体に対するＦＧＦ−２１の結合を遮断するかもしれないししないかもしれない（図２６）が、ＡｌｐｈａｓｃｒｅｅｎにおけるＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−の会合を遮断しない（図２７）。多量体は、結合ＥＬＩＳＡにおける単離された成分の実用頭部に対するＦＧＦＲ１ｃ／β−クロト−複合体についての（図２８）、およびフロ−サイトメトリ−による形質移入された細胞の表面上のＦＧＦＲ１ｃ／β−クロト−複合体についての（図２９）結合活性増加を呈する。加えて、多量体は、ＦＧＦ−２１感受性ルシフェラ−ゼリポ−タ−細胞に添加した場合、ＦＧＦ−２１様アゴニスト応答を誘導した（図３０）。
【０６４５】
Ｍ０３        ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＫＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号２８７）
Ｍ０８        ＣＧＡＧＱＦＴＣＲＤＴＮＩＣＩＳＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＡＤＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号６９４）
Ｍ１５            ＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号２８９）
Ｍ２３          ＣＧＳＮＱＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＤＳＤＥＴＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号２９０）
Ｍ３１            ＣＬＳＤＱＦＴＣＲＳＴＮＩＣＬＰＬＱＷＶＣＤＧＤＤＤＣＥＤＮＳＤＥＥＤＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号２９１）
Ｍ３３            ＣＲＬＮＥＦＰＣＧＳＧＳＣＩＳＬＨＷＶＣＤＳＶＰＤＣＲＤＤＳＤＥＴＤＣＰＥＲＴ  （配列番号２９２）
Ｍ０３ｍｕｔ０１      ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＶＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＤＳＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号２９３）
Ｍ０３ｍｕｔ０４      ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＹＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号２９４）
Ｍ０３ｍｕｔ０５      ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号２９５）
Ｍ０３ｍｕｔ０６      ＣＧＡＳＬＦＴＣＲＲＳＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＭＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号２９６）
Ｍ０３ｍｕｔ０９      ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号２９７）
Ｍ２３ｍｕｔ１０      ＣＧＡＮＬＦＴＣＱＳＴＮＩＣＩＳＤＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＴＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号２９８）
Ｍ２３ｍｕｔ１１      ＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹＳＤＥＩＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号２９９）
Ｍ２３ｍｕｔ１４      ＣＧＳＤＭＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＫＶＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＤＳＤＥＲＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３００）
Ｍ２３ｍｕｔ１５      ＣＧＳＮＬＦＴＣＲＲＴＮＩＣＩＳＫＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号６９５）
Ｍ２３ｍｕｔ１６      ＣＧＳＮＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＤＤＤＳＤＥＴＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号６９６）
Ｍ２３ｍｕｔ１７      ＣＧＴＮＬＦＴＣＲＳＴＮＭＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＶＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号６９７）
【０６４６】
以下は、結合タンパク質のセットを生成するために用いられたβ−クロト−単量体および二量体を要約する（図１５、１６、および３２参照）：
Ｍ０１
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３０４）
Ｍ４２
ＣＱＰＤＥＦＴＣＳＳＧＲＣＩＰＱＰＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３０５）
Ｍ５０
ＣＨＳＦＮＱＦＥＣＲＮＧＱＣＩＰＬＨＬＶＣＤＧＶＰＤＣＧＤＮＳＤＥＴＤＣＧＤＳＨＩＬＰＦＳＴＰＧＰＳＴ  （配列番号３０６）
ＬＮＲ＿Ｍ０１
ＣＩＡＡＫＬＣＥＡＬＤＧＤＧＶＣＨＫＥＣＤＬＥＥＣＤＷＤＧＧＤＣＱＲＩＦＬＴＤＰＴ  （配列番号１２４３）
ＷＤ０１        ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴ  （配列番号３０７）
ＷＤ０２        ＣＬＰＤＥＦＱＣＳＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＰＳＳＥＦＲＣＮＮＧＲＣＩＰＬＨＷＶＣＤＧＤＤＤＣＱＤＮＳＤＥＴＤＣＥＲＳＧＲＴ  （配列番号３０８）
ＷＤ０３        ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＲＰＧＥＦＲＣＮＮＧＲＣＶＰＱＴＷＶＣＤＧＥＤＤＣＧＤＮＳＤＥＴＤＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３０９）
ＷＤ０４
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＬＳＤＱＦＲＣＧＮＧＲＣＶＰＲＡＷＬＣＤＧＤＮＤＣＱＤＧＳＤＥＴＮＣＥＱＰＴ  （配列番号６０１）
ＷＤ０５
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＬＰＧＱＦＰＣＧＮＧＲＣＩＰＥＴＷＬＣＤＧＤＤＤＣＱＤＧＳＤＥＫＧＣＡＱＰＴ（配列番号１２６４）
ＷＤ０６        ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＱＰＮＥＦＱＣＧＮＧＲＣＩＰＡＱＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＥＤＣＴＥＨＴ  （配列番号３１０）
ＷＤ０８
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＱＳＮＥＦＲＣＲＮＧＱＣＩＰＬＴＷＬＣＤＧＤＮＤＣＬＤＳＳＤＥＥＳＣＰＡＨＴ（配列番号６０３）
ＷＤ２１
ＣＡＰＧＥＦＴＣＫＮＴＧＲＣＩＰＬＮＷＲＣＤＧＤＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＤＣＰＡＰＴＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号６３３）
ＷＤ２２        ＣＰＡＤＥＦＲＣＳＮＴＧＲＣＶＰＬＳＷＬＣＤＧＥＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＮＣＫＡＨＴＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＴＣＫＡＰＶＰＴ  （配列番号３１１）
ＷＤ２５
ＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣＱＡＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号６４０）
ＷＤ２８
ＣＧＡＮＥＦＱＣＲＳＴＧＩＣＶＰＶＥＷＶＣＤＧＤＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＶＣＧＤＳＨＩＬＰＦＳＴＰＧＰＳＴＣＱＰＤＥＦＴＣＳＳＧＲＣＩＰＱＰＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号６４３）
ＷＤ２９        ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３１２）
ＷＤ３１        ＣＬＰＤＥＦＲＣＧＮＧＮＣＩＳＶＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＥＤＧＳＤＥＥＤＣＥＳＰＥＨＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３１３）
【０６４７】
（結合タンパク質の調製および試験）
まず、結合タンパク質を細菌溶解物における粗調製物としての活性についてスクリ−ニングした（図３１）。
【０６４８】
（１ｍＬの加熱した溶解物のタンパク質生成）（第１日）：個々のクロ−ンを、２×ＹＴ／４０μｇ／ｍＬカナマイシンの５００μＬ／ウェルを含有する９６ウェルＣｏｓｔａｒ深ウェルプレ−トのウェルへと接種した。培養物を一晩増殖させ（接種チップをウェルに残した）、その間、３００ｒｐｍ、３７℃で振蘯した。この過程は、細胞溶解物レベルにおける個々の部分的に精製された数千の単量体のスクリ−ニングを可能にした。
【０６４９】
（第２日）
１００μＬの一晩培養物を１ｍＬ／ウェルの２×ＹＴ／４０μｇ／ｍＬカナマイシン＋１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する新しい９６ウェルＣｏｓｔａｒ深ウェルプレ−トへと接種した（残りの一晩培養物を、２５％グリセロ−ル終濃度の添加によって格納した後、その後の使用のために−８０℃で保存した）。プレ−トをＡｉｒＰｏｒｅテ−プ（Ｑｉａｇｅｎ）で被覆し、培養物を３７５ｒｐｍ、３７℃で振蘯しながら、約０．８〜１．０のＯＤ６００に到達するまで増殖した。一旦所望のＯＤ６００に到達すると、培養物を１ｍＭ  ＩＰＴＧで３時間誘導し、この間、３７５ｒｐｍ、３７℃で振蘯した。次に、誘導した培養物を含有するプレ−トを３６００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離し、細胞をペレット化した。上清を取り出して廃棄し、残りの細胞ペレットを１００μＬのＴＢＳ［ｐＨ７．５］／１ｍＭ  ＣａＣｌ２に再懸濁した。再懸濁した細胞を９６ウェル深ウェルプレ−トから９６ウェルポリプロピレンＰＣＲプレ−トに移動させ、ＰＣＲ機械で６５℃で５分間加熱した。次に、加熱／溶解した細胞を３６００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離した。遠心分離後、タンパク質生成が完了し、タンパク質溶解物は、ＥＬＩＳＡ、Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ、およびＦＧＦ−２１感受性ルシフェラ−ゼリポ−タ−細胞アッセイにおける特徴づけのために準備ができた。
【０６５０】
溶解物濃度での初期的スクリ−ニングの後、選択されたＦＧＦＲ１ｃ／β−クロト−結合タンパク質を、規模拡大した発現および精製のために、元の実用頭部を発現および精製するために用いられる同じ方法を用いて選択した（実施例７参照）。
【０６５１】
実施例９
本実施例は、ＦＧＦ−２１およびＦＧＦ−２１模倣分子に応答したリポ−タ−細胞株におけるルシフェラ−ゼ発現の活性化を示す実験を説明する。
【０６５２】
使用したリポ−タ−細胞株は、チャイニ−ズハムスタ−卵巣（ＣＨＯ）細胞に由来し、Ａｍｇｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋから得た細胞株である、ＡＭ−１Ｄに由来した。細胞株を、非必須アミノ酸（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）およびピルビン酸ナトリウム（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）を補充したダルベッコ変法イ−グル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）において維持した。
【０６５３】
ヒトＦＧＦＲ１ｃを安定して発現するＡＭ−１Ｄ細胞株を派生させた（ＡＭ−１Ｄ−ｈｕＦＧＦＲ１ｃ）。ｐＴＴ５−ｃｙｎｏβ−クロト−（２５ｎｇ  ＤＮＡ／ウェル）、ｐＦＲ−ルシフェラ−ゼリポ−タ−コンストラクト（１５０ｎｇ  ＤＮＡ／ウェル）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、およびｐＦＡ−Ｇａｌ４−Ｅｌｋトランス活性化因子（１０ｎｇ／ウェルＤＮＡ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を有する９６ウェルプレ−ト形式におけるこの細胞株の一過性形質移入は、ＦＧＦ−２１に応答性のある細胞を作製する。
【０６５４】
ＡＭ−１Ｄ  ｈｕＦＧＦＲ１ｃ細胞を第１日目に、白色のポリ−Ｄ−リシンで被膜した９６ウェルプレ−ト（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に２．５×１０４個／ウェルの密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベ−トした。第２日目に、細胞に、本明細書に説明されたＤＮＡを形質移入し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベ−トした。第３日目に、培地を細胞上で交換し、アッセイ培地（ＨａｍのＦ１２培地＋１％ウシ血清アルブミン）と置き換えた。第４日目に、アッセイを実施した。試験標品（結合タンパク質を含有する粗細菌溶解物または精製された結合タンパク質）の希釈をアッセイ培地において実施し、９６ウェルプレ−トに添加した。各９６ウェルプレ−トは、ヒトＦＧＦ−２１の陽性対照滴定も含んだ。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベ−トし、その後、製造元の説明書に従って、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｓｔｅａｄｙｇｌｏルシフェラ−ゼ試薬を１：１の比で、混合しながら添加した。アゴニスト活性は、発光シグナルに直接比例した。
【０６５５】
ヒトＦＧＦＲ１ｃ、ヒトβ−クロ−＋Ｇａｌ４−Ｅｌｋトランス活性化因子、およびＦＡ−ルシフェラ−ゼリポ−タ−（３７１Ｆシリ−ズ）を安定して発現する一連のＡＭ−１Ｄ細胞株を派生させた。４つのクロ−ンをこれらの試験に用いた（３７１Ｆ−１Ｄ２、３７１Ｆ−１Ｅ１１、３７１Ｆ−２Ｅ１０、３７１Ｆ−２Ｇ１０）。ＡＭ−１Ｄ  ３７１Ｆ細胞を第１日目に、白色のポリ−Ｄ−リシンで被膜した９６ウェルプレ−ト（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に２．０×１０４個／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベ−トした。第２日目に、培地を細胞上で交換し、アッセイ培地（ＨａｍのＦ１２培地＋１％ウシ血清アルブミン）と交換した。第３日目に、アッセイを実施した。試験標品（結合タンパク質を含有する粗細菌溶解物、または精製された結合タンパク質）の希釈をアッセイ培地において実施し、９６ウェルプレ−トに添加した。各９６ウェルぷれ−とは、ヒトＦＧＦ−２１の陽性対照滴定も含んだ。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベ−トし、その後、製造元の説明書に従って、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｓｔｅａｄｙｇｌｏルシフェラ−ゼ試薬を１：１の比で、混合しながら添加した。アゴニスト活性は、発光シグナルに直接比例した。
【０６５６】
これらのアッセイは、互いに対する、および未変性ヒトＦＧＦ−２１に対する結合タンパク質の効力および効能の決定を許容し、それらの生物学的活性に基づいた結合タンパク質の階級わけを可能にした。本アッセイ由来のデ−タの例を、図３０、３１、３３〜３５、３８〜４９に示す。
【０６５７】
実施例１０
本実施例は、ＦＧＦ−２１またはＦＧＦ−２１模倣分子による活性化を可能にするＦＧＦ受容体およびクロト−タンパク質共受容体の特異的な対の同定を可能にする実験を説明する。本デ−タの例を図３７に示す。
【０６５８】
Ｌ６細胞を１０％ウシ胎仔血清およびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したダルベッコ変法イ−グル培地において維持した。製造元のプロトコ−ルに従って、リポフェクタミン２０００形質移入試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、細胞に発現ベクタ−を形質移入した。２４ウェルプレ−トに播種したＬ６細胞（１０６個／ウェル）に、ＦＧＦＲ１ｂ、１ｃ、２ｂ、２ｃ、３ｂ、３ｃ、およびＦＧＦＲ４ならびにαクロト−またはβクロト−を含む種々のＦＧＦ受容体を形質移入し、ＦＧＦ−２１またはＦＧＦ−２１模倣分子による処理の前に０．２％ウシ血清アルブミンにおいて一晩血清飢餓させた。培地を１０分後に吸引し、プレ−トを液体窒素において瞬間凍結させた。各ウェルにおける細胞を６０μＬの完全溶解緩衝液において溶解し、全ＥＲＫおよびリン酸化型ＥＲＫを、ＭＳＤ全細胞溶解物ホスホ−ＥＲＫ１／２キット（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ）を用いて、製造元の説明書に従って測定した。
【０６５９】
実施例１１
本実施例は、ＦＧＦ−２１およびＦＧＦ−２１模倣分子に応じた培養ヒト脂肪細胞におけるＥｒｋリン酸化の誘導を示す実験を説明する。
【０６６０】
（初代ヒト脂肪細胞培養および分化）
Ｚｅｎ−Ｂｉｏ，  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，  ＮＣ由来の凍結保存した皮下ヒト脂肪前駆細胞（ロット番号ＳＬ００３７）を液体窒素タンクに保存した。
【０６６１】
細胞を液体窒素から取り出し、撹拌しながら３７℃の水浴へと即時配置した。細胞を、細胞バイアル（Ｚｅｎ−Ｂｉｏ，  ＰＭ−１）あたり１０ｍＬの脂肪前駆細胞培地を含有する滅菌した円錐底遠心チュ−ブに添加した。細胞を２８０×ｇ。２０℃で５分間遠心分離した。培地を吸引し、細胞をＰＭ−１に再懸濁した。
【０６６２】
細胞を計数し、およそ１．３×１０６個をＰＭ−１培地におけるＴ−１７５培養フラスコに播種した。細胞を５％ＣＯ２の加湿した３７℃のインキュベ−タ−において増殖した。
【０６６３】
細胞が８５〜９０％培養密度になるまで（約３〜４日間）、細胞をインキュベ−トした。
【０６６４】
培地を吸引し、脂肪前駆細胞を滅菌ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳを除去し、細胞をフラスコから、５ｍＬの０．２５％トリプシン／２．２１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液を添加することによって放出した。細胞を３７℃で５分間トリプシン処理しておいた。トリプシンを１５ｍＬのＰＭ−１で中和し、スピンさせ、ＰＭ−１に再懸濁し、計数した。
【０６６５】
ウェルあたり４００，０００個をＧｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  ６−ウェルプレ−ト（ＶＷＲ＃８２０５０−８４２）上で３ｍＬのＰＭ−１において播種し、５％ＣＯ２を有する加湿した３７℃のインキュベ−タ−において増殖した。
【０６６６】
いったん細胞が完全にコンフルエントになると（播種２４〜４８時間後）、すべてのウェルから完全な容積のＰＭ−１を除去し、３ｍＬの脂肪細胞分化培地（Ｚｅｎ−Ｂｉｏ，  ＤＭ−２）を添加することによって、分化を誘導した。次に、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で７日間インキュベ−トした。
【０６６７】
７日後、１．８ｍＬのＤＭ−２を除去し、２．４ｍＬの脂肪細胞維持培地（Ｚｅｎ−Ｂｉｏ，  ＡＭ−１）を添加した。その後２〜３日ごとに、１．８ｍＬのＡＭ−１を除去し、１．８ｍＬの新鮮なＡＭ−１を添加した。分化の１４日後は、ＡＭ−１の最後の交換となった。
【０６６８】
（ｐＥＲＫのための初代ヒト脂肪細胞処理）
分化の１７日後にすべての培地をウェルから除去し、各ウェルを２ｍＬの温ＰＢＳで２回洗浄した。脂肪細胞を、ウェルあたり２ｍＬの、１：１低グルコ−スＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ＃１１８８５）およびＦ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ＃１１７６５）から構成され０．２％の脂肪酸非含有ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，  Ａ９２０５）を有する脂肪細胞血清飢餓培地において３時間血清飢餓させた。
【０６６９】
３時間のインキュベ−ション後、１．４ｍＬ培地を除去し、細胞を適切な用量の結合タンパク質で、３７℃で１０分間処理した（飢餓培地における６０μＬの１１×試料を各ウェルに添加）。組換えＦＧＦ−２１を陽性対照として用いた。
【０６７０】
１０分間の処理後、培地をウェルから吸引し、細胞を２ｍＬの冷ＰＢＳで２回洗浄した。
１７５μＬ／ウェルの溶解緩衝液において細胞を溶解
溶解緩衝液：
５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４
１５０ｍＭ  ＮａＣｌ
１％ノニデットＰ４０
０．２５％デオキシコ−ル酸ナトリウム
１ｍＭ  ＮａＦ
１錠の完全プロテア−ゼ阻害剤カクテル／５０ｍＬ（Ｒｏｃｈｅ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）
０．７μｇ／ｍＬペプスタチン
１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４
【０６７１】
プロテア−ゼ阻害剤Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ  ＮａＦ、新鮮なペプスタチンを溶解前に添加した。
【０６７２】
プレ−トを液体窒素において瞬間凍結させ、その後の使用または溶解物の回収に伴う進行まで、−８０℃で保存した。
【０６７３】
溶解物を収集する前に、プレ−トを４℃で２０分間振蘯し、溶解物を１．５ｍＬのエッペンドルフチュ−ブに移した。
【０６７４】
溶解物を１５，０００ｒｐｍで３０分間、４℃でスピンした。
【０６７５】
溶解物（未希釈）をＤＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ，  カタログ番号５００−０１１６）で定量した。
【０６７６】
（リン酸化型／全ＥＲＫのＭＳＤアッセイ）
ＭＳＤ（Ｍｅｓｏ−Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）リン酸化型ＥＲＫ１／２、全ＥＲＫ１／２全細胞溶解キット（カタログ番号Ｋ１１１０７Ｄ−１、Ｖ２）を用いて、ヒト脂肪細胞溶解物を試験した。
【０６７７】
キットに含まれるパッケ−ジインサ−ト上のプロトコ−ルに従った。２５μｇの細胞溶解物を各ウェルに添加した。
【０６７８】
一旦アッセイが終了すると、リンタンパク質％をＭＳＤ式：
リンタンパク質％＝（（２×ｐＥＲＫ）／（ｐＥＲＫ＋全ＥＲＫ））×１００
に従って決定した。
【０６７９】
本デ−タの例を図３６に示す。
【０６８０】
（ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞ベ−スのアッセイにおけるＦＧＦ−２１と類似したアゴニスト活性を有する結合タンパク質）
以下は、未変性のＦＧＦ−２１のものと類似のまたはをれを超過する効能を有することが示されたＦＧＦＲ１ｃ／βクロト−二重特異性結合タンパク質の配列を要約する。これらの結合タンパク質の有効性は、未変性のＦＧＦ−２１の有効性の１０％〜１００％で変動する。本アッセイの結果を図３８〜４５、４７〜５０に示す。これらのタンパク質は、β−クロト−の不在下ではシグナル伝達を活性化しないことが示された（図４６）。
【０６８１】
最初に列挙されたＮ末端単量体
ｂＫＷＤ０１＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ０１  （Ｃ３０９０）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＶＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＤＳＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３３５）；
ｂＫＷＤ０１＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ０４  （Ｃ３０９１）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＹＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３３６）；
ｂＫＷＤ０１＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ０５  （Ｃ３０９２）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３３７）；
ｂＫＷＤ０１＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ０６  （Ｃ３０９３）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＡＳＬＦＴＣＲＲＳＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＭＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３３８）；
ｂＫＷＤ０１＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ０９  （Ｃ３０９４）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３３９）；
ｂＫＷＤ０１＿Ｒ１ｃＭ２３ｍｕｔ１０  （Ｃ３０９５）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＡＮＬＦＴＣＱＳＳＮＩＣＩＳＤＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＴＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３４０）；
ｂＫＷＤ０１＿Ｒ１ｃＭ２３ｍｕｔ１１  （Ｃ３０９６）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹＳＤＥＩＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３４１）；
ｂＫＷＤ０１＿Ｒ１ｃＭ２３ｍｕｔ１４  （Ｃ３０９７）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＳＤＭＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＫＶＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＤＳＤＥＲＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３４２）；
ｂＫＷＤ０１＿Ｒ１ｃＭ２３ｍｕｔ１５  （Ｃ３０９８）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＳＮＬＦＴＣＲＲＴＮＩＣＩＳＫＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３４３）；
ｂＫＷＤ０１＿Ｒ１ｃＭ２３ｍｕｔ１６  （Ｃ３０９９）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＳＮＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＤＤＤＳＤＥＴＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３４４）；
ｂＫＷＤ０１＿Ｒ１ｃＭ２３ｍｕｔ１７  （Ｃ３１００）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＴＮＬＦＴＣＲＳＴＮＭＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＶＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３４５）；
ｂＫＷＤ０３＿Ｒ１ｃＭ１５  （Ｃ３１０２）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＲＰＧＥＦＲＣＮＮＧＲＣＶＰＱＴＷＶＣＤＧＥＤＤＣＧＤＮＳＤＥＴＤＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３４６）；
ｂＫＷＤ０６＿Ｒ１ｃＭ１５  （Ｃ３１０３）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＱＰＮＥＦＱＣＧＮＧＲＣＩＰＡＱＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＥＤＣＴＥＨＴＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３４７）；
ｂＫＷＤ２２＿Ｒ１ｃＭ１５  （Ｃ３１０４）
ＣＰＡＤＥＦＲＣＳＮＴＧＲＣＶＰＬＳＷＬＣＤＧＥＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＮＣＫＡＨＴＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＴＣＫＡＰＶＰＴＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３４８）；
ｂＫＷＤ２９＿Ｒ１ｃＭ１５  （Ｃ３１０５）
ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３４９）；
ｂＫＷＤ０６＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ０６  （Ｃ３１９２）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＱＰＮＥＦＱＣＧＮＧＲＣＩＰＡＱＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＥＤＣＴＥＨＴＣＧＡＳＬＦＴＣＲＲＳＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＴＤＥＭＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３５０）；
ｂＫＷＤ０６＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ０９  （Ｃ３１９３）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＱＰＮＥＦＱＣＧＮＧＲＣＩＰＡＱＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＥＤＣＴＥＨＴＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３５１）；
ｂＫＷＤ０６＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ１１  （Ｃ３１９４）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＱＰＮＥＦＱＣＧＮＧＲＣＩＰＡＱＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＥＤＣＴＥＨＴＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹＳＤＥＩＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３５２）；
ｂＫＷＤ０６＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ１７  （Ｃ３１９５）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＱＰＮＥＦＱＣＧＮＧＲＣＩＰＡＱＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＥＤＣＴＥＨＴＣＧＴＮＬＦＴＣＲＳＴＮＭＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＶＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３５３）；
ｂＫＷＤ２２＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ０６  （Ｃ３１９６）
ＣＰＡＤＥＦＲＣＳＮＴＧＲＣＶＰＬＳＷＬＣＤＧＥＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＮＣＫＡＨＴＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＴＣＫＡＰＶＰＴＣＧＡＳＬＦＴＣＲＲＳＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＭＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３５４）；
ｂＫＷＤ２２＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ０９  （Ｃ３１９７）
ＣＰＡＤＥＦＲＣＳＮＴＧＲＣＶＰＬＳＷＬＣＤＧＥＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＮＣＫＡＨＴＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＴＣＫＡＰＶＰＴＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３５５）；
ｂＫＷＤ２２＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ１１  （Ｃ３１９８）
ＣＰＡＤＥＦＲＣＳＮＴＧＲＣＶＰＬＳＷＬＣＤＧＥＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＮＣＫＡＨＴＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＴＣＫＡＰＶＰＴＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹＳＤＥＩＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３５６）；
ｂＫＷＤ２２＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ１７  （Ｃ３１９９）
ＣＰＡＤＥＦＲＣＳＮＴＧＲＣＶＰＬＳＷＬＣＤＧＥＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＮＣＫＡＨＴＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＴＣＫＡＰＶＰＴＣＧＴＮＬＦＴＣＲＳＴＮＭＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＶＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３５７）；
ｂＫＷＤ２９＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ０６  （Ｃ３２００）
ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＡＳＬＦＴＣＲＲＳＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＭＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３５８）；
ｂＫＷＤ２９＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ０９  （Ｃ３２０１）
ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３５９）；
ｂＫＷＤ２９＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ１１  （Ｃ３２０２）
ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹＳＤＥＩＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３６０）；
ｂＫＷＤ２９＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ１７  （Ｃ３２０３）
ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＴＮＬＦＴＣＲＳＴＮＭＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＶＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３６１）；
Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ０６＿ｂＫＷＤ２２  （Ｃ３２０４）
ＣＧＡＳＬＦＴＣＲＲＳＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＭＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＰＡＤＥＦＲＣＳＮＴＧＲＣＶＰＬＳＷＬＣＤＧＥＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＮＣＫＡＨＴＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＴＣＫＡＰＶＰＴ  （配列番号３６２）；
Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ０９＿ｂＫＷＤ２２  （Ｃ３２０５）
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＰＡＤＥＦＲＣＳＮＴＧＲＣＶＰＬＳＷＬＣＤＧＥＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＮＣＫＡＨＴＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＴＣＫＡＰＶＰＴ  （配列番号３６３）；
Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ１１＿ｂＫＷＤ２２  （Ｃ３２０６）
ＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹＳＤＥＩＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＰＡＤＥＦＲＣＳＮＴＧＲＣＶＰＬＳＷＬＣＤＧＥＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＮＣＫＡＨＴＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＴＣＫＡＰＶＰＴ  （配列番号３６４）；
Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ１７＿ｂＫＷＤ２２  （Ｃ３２０７）
ＣＧＴＮＬＦＴＣＲＳＴＮＭＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＶＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＰＡＤＥＦＲＣＳＮＴＧＲＣＶＰＬＳＷＬＣＤＧＥＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＮＣＫＡＨＴＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＴＣＫＡＰＶＰＴ  （配列番号３６５）；
Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ０６＿ｂＫＷＤ２９  （Ｃ３２０８）
ＣＧＡＳＬＦＴＣＲＲＳＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＭＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３６６）；
Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ０９＿ｂＫＷＤ２９  （Ｃ３２０９）
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３６７）；
Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ１１＿ｂＫＷＤ２９  （Ｃ３２１０）
ＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹＳＤＥＩＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３６８）；
Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔ１７＿ｂＫＷＤ２９  （Ｃ３２１１）
ＣＧＴＮＬＦＴＣＲＳＴＮＭＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＶＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＰＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３６９）；
Ｒ１ｃＭ０３＿ＢＫＷＤ０１  （Ｃ２７３７）
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＫＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴ  （配列番号３７０）；
Ｒ１ｃＭ０３＿ＢＫＷＤ０２  （Ｃ２７３８）
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＫＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＬＰＤＥＦＱＣＳＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＰＳＳＥＦＲＣＮＮＧＲＣＩＰＬＨＷＶＣＤＧＤＤＤＣＱＤＮＳＤＥＴＤＣＥＲＳＧＲＴ  （配列番号３７１）；
ＢＫＷＤ０２＿Ｒ１ｃＭ０３  （Ｃ２７３９）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＳＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＰＳＳＥＦＲＣＮＮＧＲＣＩＰＬＨＷＶＣＤＧＤＤＤＣＱＤＮＳＤＥＴＤＣＥＲＳＧＲＴＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＫＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３７２）；
Ｒ１ｃＭ０３＿ＢＫＷＤ２５  （Ｃ２７４０）
ＣＧＡＧＬＦＴＣＲＳＴＫＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣＱＡＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３７３）；
Ｒ１ｃＭ０８＿ＢＫＷＤ０１  （Ｃ２７４１）
ＣＧＡＧＱＦＴＣＲＤＴＮＩＣＩＳＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＡＤＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴ  （配列番号３７４）；
ＢＫＷＤ０１＿Ｒ１ｃＭ０８  （Ｃ２７４２）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＡＧＱＦＴＣＲＤＴＮＩＣＩＳＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＡＤＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３７５）；
Ｒ１ｃＭ０８＿ＢＫＷＤ０２  （Ｃ２７４３）
ＣＧＡＧＱＦＴＣＲＤＴＮＩＣＩＳＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＡＤＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＬＰＤＥＦＱＣＳＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＰＳＳＥＦＲＣＮＮＧＲＣＩＰＬＨＷＶＣＤＧＤＤＤＣＱＤＮＳＤＥＴＤＣＥＲＳＧＲＴ  （配列番号３７６）；
ＢＫＷＤ０２＿Ｒ１ｃＭ０８  （Ｃ２７４４）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＳＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＰＳＳＥＦＲＣＮＮＧＲＣＩＰＬＨＷＶＣＤＧＤＤＤＣＱＤＮＳＤＥＴＤＣＥＲＳＧＲＴＣＧＡＧＱＦＴＣＲＤＴＮＩＣＩＳＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＡＤＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３７７）；
Ｒ１ｃＭ０８＿ＢＫＷＤ２５  （Ｃ２７４５）
ＣＧＡＧＱＦＴＣＲＤＴＮＩＣＩＳＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＡＤＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣＱＡＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３７８）；
Ｒ１ｃＭ１５＿ＢＫＷＤ０１  （Ｃ２７４７）
ＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴ  （配列番号３７９）；
Ｒ１ｃＭ３１＿ＢＫＷＤ２５  （Ｃ２７４８）
ＣＬＳＤＱＦＴＣＲＳＴＮＩＣＬＰＬＱＷＶＣＤＧＤＤＤＣＥＤＮＳＤＥＥＤＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣＱＡＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３８０）；
Ｒ１ｃＭ１５＿ＢＫＷＤ０２  （Ｃ２７４９）
ＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＬＰＤＥＦＱＣＳＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＰＳＳＥＦＲＣＮＮＧＲＣＩＰＬＨＷＶＣＤＧＤＤＤＣＱＤＮＳＤＥＴＤＣＥＲＳＧＲＴ  （配列番号３８１）；
ＢＫＷＤ０２＿Ｒ１ｃＭ１５  （Ｃ２７５０）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＳＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＰＳＳＥＦＲＣＮＮＧＲＣＩＰＬＨＷＶＣＤＧＤＤＤＣＱＤＮＳＤＥＴＤＣＥＲＳＧＲＴＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３８２）；
Ｒ１ｃＭ１５＿ＢＫＷＤ２５  （Ｃ２７５１）
ＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣＱＡＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３８３）；
ＢＫＷＤ０１＿Ｒ１ｃＭ２３  （Ｃ２７５２）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＳＮＱＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＤＳＤＥＴＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３８４）；
Ｒ１ｃＭ２３＿ＢＫＷＤ０２  （Ｃ２７５３）
ＣＧＳＮＱＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＤＳＤＥＴＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＬＰＤＥＦＱＣＳＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＰＳＳＥＦＲＣＮＮＧＲＣＩＰＬＨＷＶＣＤＧＤＤＤＣＱＤＮＳＤＥＴＤＣＥＲＳＧＲＴ  （配列番号３８５）；
ＢＫＷＤ０２＿Ｒ１ｃＭ２３  （Ｃ２７５４）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＳＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＰＳＳＥＦＲＣＮＮＧＲＣＩＰＬＨＷＶＣＤＧＤＤＤＣＱＤＮＳＤＥＴＤＣＥＲＳＧＲＴＣＧＳＮＱＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＤＳＤＥＴＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３８６）；
ＢＫＷＤ０１＿Ｒ１ｃＭ３１  （Ｃ２７５７）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＬＳＤＱＦＴＣＲＳＴＮＩＣＬＰＬＱＷＶＣＤＧＤＤＤＣＥＤＮＳＤＥＥＤＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３８７）；
ＢＫＷＤ０５＿Ｒ１ｃＭ０８  （Ｃ２７９２）
ＣＡＡＧＱＦＲＣＨＮＳＤＴＣＬＰＧＡＷＶＣＤＧＤＮＤＣＧＤＮＳＤＥＡＳＣＱＫＲＴＣＨＳＦＮＱＦＥＣＲＮＧＱＣＩＰＬＨＬＶＣＤＧＶＰＤＣＧＤＮＳＤＥＴＤＣＧＤＳＨＩＬＰＦＳＴＰＧＰＳＴＣＧＡＧＱＦＴＣＲＤＴＮＩＣＩＳＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＡＤＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３８８）；
ＢＫＷＤ０６＿Ｒ１ｃＭ０８  （Ｃ２７９３）
ＣＡＰＤＱＦＲＣＳＳＧＱＣＩＰＥＴＷＬＣＤＧＤＤＤＣＶＤＳＳＤＥＡＧＣＡＳＴＶＰＴＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＧＡＧＱＦＴＣＲＤＴＮＩＣＩＳＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＡＤＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３８９）；
ＢＫＷＤ０１＿Ｒ１ｃＭ１５  （Ｃ２７９４）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３９０）；
Ｒ１ｃＭ１５＿ＢＫＷＤ３１  （Ｃ２７９５）
ＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＬＰＤＥＦＲＣＧＮＧＮＣＩＳＶＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＥＤＧＳＤＥＥＤＣＥＳＰＥＨＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３９１）；  ａｎｄ
Ｒ１ｃＭ１５＿ＢＫＷＤ０６  （Ｃ２７９６）
ＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＡＰＤＱＦＲＣＳＳＧＱＣＩＰＥＴＷＬＣＤＧＤＤＤＣＶＤＳＳＤＥＡＧＣＡＳＴＶＰＴＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３９２）。
ｂＫＷＤ０２＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔＭ０９  （Ｃ４１６８）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＳＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＰＳＳＥＦＲＣＮＮＧＲＣＩＰＬＨＷＶＣＤＧＤＤＤＣＱＤＮＳＤＥＴＤＣＡＱＰＴＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号１２６５）
ｂＫＷＤ０３＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔＭ０９  （Ｃ４１６９）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＲＰＧＥＦＲＣＮＮＧＲＣＶＰＱＴＷＶＣＤＧＥＤＤＣＧＤＮＳＤＥＴＤＣＡＱＰＴＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号１２６６）
ｂＫＷＤ０４＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔＭ０９  （Ｃ４１７０）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＬＳＤＱＦＲＣＧＮＧＲＣＶＰＲＡＷＬＣＤＧＤＮＤＣＱＤＧＳＤＥＴＮＣＥＱＰＴＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号１２６７）
ｂＫＷＤ０５＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔＭ０９  （Ｃ４１７１）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＬＰＧＱＦＰＣＧＮＧＲＣＩＰＥＴＷＬＣＤＧＤＤＤＣＱＤＧＳＤＥＫＧＣＡＱＰＴＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号１２６８）
ｂＫＷＤ０８＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔＭ０９  （Ｃ４１７３）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＴＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＱＳＮＥＦＲＣＲＮＧＱＣＩＰＬＴＷＬＣＤＧＤＮＤＣＬＤＳＳＤＥＥＳＣＰＡＨＴＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号１２６９）
ｂＫＷＤ２１＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔＭ０９  （Ｃ４１７４）
ＣＡＰＧＥＦＴＣＫＮＴＧＲＣＩＰＬＮＷＲＣＤＧＤＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＤＣＰＡＰＴＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号１２７０）
ｂＫＷＤ２５＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔＭ０９  （Ｃ４１７６）
ＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣＱＡＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号１２７１）
ｂＫＷＤ２８＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔＭ０９  （Ｃ４１７７）
ＣＧＡＮＥＦＱＣＲＳＴＧＩＣＶＰＶＥＷＶＣＤＧＤＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＶＣＧＤＳＨＩＬＰＦＳＴＰＧＰＳＴＣＱＰＤＥＦＴＣＳＳＧＲＣＩＰＱＰＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号１２７２）
Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔＭ０９＿ｂＫＷＤ０１  （Ｃ４１７８）
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴ（配列番号１２７３）
ＬＮＲＭ０１＿Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔＭ０９  （Ｃ４３１１）
ＣＩＡＡＫＬＣＥＡＬＤＧＤＧＶＣＨＫＥＣＤＬＥＥＣＤＷＤＧＧＤＣＱＲＩＦＬＴＤＰＴＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号１２７４）
Ｒ１ｃＭ０３ｍｕｔＭ０９＿ＬＮＲＭ０１  （Ｃ４３１２）
ＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＩＡＡＫＬＣＥＡＬＤＧＤＧＶＣＨＫＥＣＤＬＥＥＣＤＷＤＧＧＤＣＱＲＩＦＬＴＤＰＴ（配列番号１２７５）
【０６８２】
実施例１２
本実施例は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの結合タンパク質の半減期を延長するための方法を説明する。
【０６８３】
Ａ．ＩｇＧ結合剤および血清半減期延長
本開示はさらに、血液因子（例えば、血清アルブミン、免疫グロブリン、または赤血球）に結合する（例えば、選択的に結合する）単量体ドメインを提供する。いくつかの実施態様において、本明細書に開示される単量体は、１０−３Ｍよりも低い親和性を有する血液因子に結合する（すなわち、１０−３Ｍの親和性よりも強く結合する）。いくつかの実施態様において、親和性は、１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、または１０−８Ｍよりも低い。
【０６８４】
いくつかの実施態様において、単量体ドメインは、免疫グロブリンポリペプチドまたはその部分に結合する。
【０６８５】
いくつかの実施態様において、単量体ドメインは、ヒト血清アルブミンまたはその部分に結合する。
【０６８６】
免疫グロブリンに結合する単量体ドメインの２つのファミリ−（すなわち、ＡドメインＩｇＧファミリ−２および３）は同定された。
【０６８７】
ＩｇＧファミリ−２は、以下の共通モチ−フ（配列番号６９８）：
［ＥＱ］ＦＸＣＲＸ［ＳＴ］ＸＲＣ［ＩＶ］ＸＸＸＷ［ＩＬＶ］ＣＤＧＸＸＤＣＸＤ［ＤＮ］ＳＤＥ
を含む。
【０６８８】
ＩｇＧファミリ−２モチ−フを含む例示的な配列を本明細書に表す。ＩｇＧ結合単量体または多量体に対する引用は、本実施例において具現化された各ファミリ−２配列を包含する。
【０６８９】
ＩｇＧファミリ−３は、２つの以下の共通モチ−フ（出現の順序でそれぞれ、配列番号 ６９９〜７００）のうちのいずれかを含む：
ＣＸＳＳＧＲＣＩＰＸＸＷＶＣＤＧＸＸＤＣＲＤＸＳＤＥ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６９９）；  または
ＣＸＳＳＧＲＣＩＰＸＸＷＬＣＤＧＸＸＤＣＲＤＸＳＤＥ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７００）。
【０６９０】
ＩｇＧファミリ−３モチ−フを含む例示的な配列を本実施例において表す。ＩｇＧ結合単量体または多量体に対する引用は、本実施例において具現化された各ファミリ−３配列を包含する。
【０６９１】
赤血球（ＲＢＣ）または血清アルブミン（ＣＳＡ）に結合する単量体ドメインは、米国特許公報第２００５／００４８５１２号に説明されており、例えば、配列番号 ７０１〜７０４：
【０６９２】
【化８３】
2013512672.tif 000097
を含む。
【０６９３】
例えば本明細書に開示される多量体もしくは動物における関心対象のタンパク質を含む、タンパク質の血清半減期を延長するための方法も本明細書で提供される。関心対象のタンパク質は、治療的、予防的、またはさもなくば所望の機能性を有する任意のタンパク質であり得る。この方法は、まず、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）、ＩｇＧ、赤血球等のような、血液保持分子または細胞などの半減期延長剤に特異的に結合する結合タンパク質として同定された単量体ドメインを提供することを含む。次に、半減期延長剤結合単量体を、関心対象のタンパク質（例えば、ＦＧＦＲ１ｃまたは異なる標的）に対する結合親和性を有する別の単量体ドメインに共有結合する。この複合体形成は結果的に、多量体および／または結合タンパク質（複数可）を、多量体および／またはタンパク質（複数可）のタンパク質分解および／または他の除去から保護して半減期延長を生じ、それによりタンパク質および／または多量体の半減期を延長する。この使用に関する１つのバリエ−ションには、関心対象のタンパク質に共有結合した半減期延長剤結合単量体が含まれる。関心対象のタンパク質には、単量体ドメイン、単量体ドメインの多量体、または合成薬が含まれ得る。あるいは、免疫グロブリンまたは赤血球のいずれかに結合する単量体は、先の方法を用いて生成され得、半減期の延長に用いられ得る。
【０６９４】
半減期延長剤結合多量体は典型的には、少なくとも２つのドメイン、キメラドメイン、または突然変異したドメイン（すなわち、ＦＧＦＲ１ｃおよび／またはβ−クロト−に結合するもの、および血液保持分子もしくは細胞に結合するもの）の多量体である。好適なドメインには、本明細書に説明されるもののすべてが含まれ、半減期延長剤に結合するためにさらにスクリ−ニングおよび選択される。半減期延長剤結合多量体は、例えば、半減期延長剤結合活性についてあらかじめスクリ−ニングされた単量体ドメインを用いて、本明細書に説明される多量体を作製するための方法に従って生成される。分子の血清半減期は、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、４００、５００、またはそれより長い時間であるよう延長されることができる。
【０６９５】
ＩｇＧもしくはＨＡＳに結合する単量体などの半減期延長単量体ドメインは、標的分子（例えば、ＦＧＦＲ１ｃ／βクロト−結合タンパク質）のＮ末端およびＣ末端の両方に連結することができる。ＦＧＦＲ１ｃ、βクロト−、およびＩｇＧに結合する結合タンパク質の例示的な配列として、以下が挙げられる（出現の順にそれぞれ、配列番号 ７０５〜７１０）：
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＨＰＴＧＱＦＲＣＲＳＳＧＲＣＶＳＰＴＷＶＣＤＧＤＲＤＣＷＤＧＳＤＥＤＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号７０５）
ＣＨＰＴＧＱＦＲＣＲＳＳＧＲＣＶＳＰＴＷＶＣＤＧＤＲＤＣＷＤＧＳＤＥＤＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号７０６）
ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＨＰＴＧＱＦＲＣＲＳＳＧＲＣＶＳＰＴＷＶＣＤＧＤＲＤＣＷＤＧＳＤＥＤＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＳＬＱ  （配列番号７０７）
ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＴＮＬＦＴＣＲＳＴＮＭＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＶＣＳＱＤＰＥＦＨＲＶＣＨＰＴＧＱＦＲＣＲＳＳＧＲＣＶＳＰＴＷＶＣＤＧＤＲＤＣＷＤＧＳＤＥＤＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＳＬＱ  （配列番号７０８）
ＣＨＰＴＧＱＦＲＣＲＳＳＧＲＣＶＳＰＴＷＶＣＤＧＤＲＤＣＷＤＧＳＤＥＤＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＳＬＱ  （配列番号７０９）
ＣＨＰＴＧＱＦＲＣＲＳＳＧＲＣＶＳＰＴＷＶＣＤＧＤＲＤＣＷＤＧＳＤＥＤＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＴＮＬＦＴＣＲＳＴＮＭＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＶＣＳＱＤＰＥＦＨＲＶＳＬＱ  （配列番号７１０）
【０６９６】
Ｂ．ヒト血清アルブミン融合
いくつかの実施態様において、結合タンパク質ドメインを、ヒト血清アルブミンのＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合する。このことは、（結合タンパク質−ヒト血清アルブミンポリペプチドの部分としての）結合タンパク質をＦｃＲｎスカベンジャ−経路に差し向けることによって、結合タンパク質に血清アルブミン様半減期を与える。加えて、質量の増加は、無処置の結合タンパク質−腎濾過による血清由来のヒト血清アルブミンの損失を防止する。
【０６９７】
結合タンパク質−ヒト血清アルブミン融合物は、酵母細胞または哺乳類細胞において発現することができる。
【０６９８】
ＦＧＦＲ１ｃ／βクロト−結合タンパク質は、ヒト血清アルブミンのＮ末端またはＣ末端に連結することができる。結合タンパク質配列は、ヒト血清アルブミンコ−ド配列に直接的に、または中間連結配列を介して連結されることができる。この文脈において、結合タンパク質はなおも、リポ−タ−細胞アッセイにおけるＦＧＦ２１様シグナル伝達を誘導することのできるアゴニストとして機能する（例えば、図５１〜５３参照）。このようなポリペプチドの例示的な配列として以下が挙げられる：
ＨＳＡ−Ｃ３２０１
ｄａｈｋｓｅｖａｈｒｆｋｄｌｇｅｅｎｆｋａｌｖｌｉａｆａｑｙｌｑｑｃｐｆｅｄｈｖｋｌｖｎｅｖｔｅｆａｋｔｃｖａｄｅｓａｅｎｃｄｋｓｌｈｔｌｆｇｄｋｌｃｔｖａｔｌｒｅｔｙｇｅｍａｄｃｃａｋｑｅｐｅｒｎｅｃｆｌｑｈｋｄｄｎｐｎｌｐｒｌｖｒｐｅｖｄｖｍｃｔａｆｈｄｎｅｅｔｆｌｋｋｙｌｙｅｉａｒｒｈｐｙｆｙａｐｅｌｌｆｆａｋｒｙｋａａｆｔｅｃｃｑａａｄｋａａｃｌｌｐｋｌｄｅｌｒｄｅｇｋａｓｓａｋｑｒｌｋｃａｓｌｑｋｆｇｅｒａｆｋａｗａｖａｒｌｓｑｒｆｐｋａｅｆａｅｖｓｋｌｖｔｄｌｔｋｖｈｔｅｃｃｈｇｄｌｌｅｃａｄｄｒａｄｌａｋｙｉｃｅｎｑｄｓｉｓｓｋｌｋｅｃｃｅｋｐｌｌｅｋｓｈｃｉａｅｖｅｎｄｅｍｐａｄｌｐｓｌａａｄｆｖｅｓｋｄｖｃｋｎｙａｅａｋｄｖｆｌｇｍｆｌｙｅｙａｒｒｈｐｄｙｓｖｖｌｌｌｒｌａｋｔｙｅｔｔｌｅｋｃｃａａａｄｐｈｅｃｙａｋｖｆｄｅｆｋｐｌｖｅｅｐｑｎｌｉｋｑｎｃｅｌｆｅｑｌｇｅｙｋｆｑｎａｌｌｖｒｙｔｋｋｖｐｑｖｓｔｐｔｌｖｅｖｓｒｎｌｇｋｖｇｓｋｃｃｋｈｐｅａｋｒｍｐｃａｅｄｙｌｓｖｖｌｎｑｌｃｖｌｈｅｋｔｐｖｓｄｒｖｔｋｃｃｔｅｓｌｖｎｒｒｐｃｆｓａｌｅｖｄｅｔｙｖｐｋｅｆｎａｅｔｆｔｆｈａｄｉｃｔｌｓｅｋｅｒｑｉｋｋｑｔａｌｖｅｌｖｋｈｋｐｋａｔｋｅｑｌｋａｖｍｄｄｆａａｆｖｅｋｃｃｋａｄｄｋｅｔｃｆａｅｅｇｋｋｌｖａａｓｑａａｌｇｌｇｇｇｇｓｇｇｇｇｓｃｇａｄｑｆｒｃｇｎｇｓｃｖｐｒａｗｒｃｄｇｖｄｄｃｇｄｇｓｄｅａｐｅｉｃｅｔｐｔｃｑｓｎｅｆｒｃｒｓｇｒｃｉｐｑｈｗｌｃｄｇｌｎｄｃｇｄｇｓｄｅｓｑｑｃｓａｐａｓｅｐｐｇｓｌｃｇｅｇｌｆｔｃｒｓｔｎｉｃｉｓｈａｗｖｃｄｇｖｄｄｃｅｄｎｓｄｅｎｎｃｓａｐａｓｅｐｐｇｓｌ    （配列番号７１１）
ＨＳＡ−Ｃ３２０３
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＴＮＬＦＴＣＲＳＴＮＭＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＶＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号７１２）
Ｃ３２０１−ＨＳＡ
ＳＧＧＳＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ  （配列番号７１３）
Ｃ３２０３−ＨＳＡ
ＳＧＧＳＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＴＮＬＦＴＣＲＳＴＮＭＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＶＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ  （配列番号７１４）
Ｃ３０９４−ＨＳＡ
ＳＧＧＳＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧ
ＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＥＧＬＦＴＣＲ
ＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＡ
ＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴ
ＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦ
ＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰ
ＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳ
ＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥ
ＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬ
ＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴ
ＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫ
ＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹ
ＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦ
ＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡ
ＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ  （配列番号１２８２）
ＨＳＡ−Ｃ３０９４
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫ
ＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦ
ＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥ
ＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱ
ＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤ
ＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡ
ＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬ
ＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬ
ＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱ
ＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨ
ＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡ
ＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨ
ＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣ
ＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤ
ＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号１３３１）
Ｃ４１７４−ＨＳＡ
ＳＧＧＳＣＡＰＧＥＦＴＣＫＮＴＧＲＣＩＰＬＮＷＲＣＤＧＤＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＤＣＰＡＰＴＣＰＳＮＱＦ
ＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＥＧＬＦＴ
ＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡ
ＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥ
ＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹ
ＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣ
ＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬ
ＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡ
ＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡ
ＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥ
ＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥ
ＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫ
ＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤ
ＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ  （配列番号１２８３）
ＨＳＡ−Ｃ４１７４
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡ
ＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥ
ＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹ
ＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣ
ＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬ
ＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡ
ＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡ
ＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥ
ＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥ
ＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫ
ＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤ
ＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＣＡＰＧＥ
ＦＴＣＫＮＴＧＲＣＩＰＬＮＷＲＣＤＧＤＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＤＣＰＡＰＴＣＰＳＮＱＦＰＣＲＳＴＧＩＣＩ
ＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳ
ＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号１３３２）
Ｃ４１７６−ＨＳＡ
ＳＧＧＳＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣＱＡＰＴＣＱＳＮＥ
ＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＥＧＬＦＴ
ＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡ
ＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥ
ＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹ
ＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣ
ＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬ
ＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡ
ＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡ
ＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥ
ＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥ
ＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫ
ＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤ
ＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ  （配列番号１２８４）
ＨＳＡ−Ｃ４１７６
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡ
ＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥ
ＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹ
ＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣ
ＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬ
ＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡ
ＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡ
ＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥ
ＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥ
ＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫ
ＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤ
ＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＣＧＰＤＥ
ＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣＱＡＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩ
ＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳ
ＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ（配列番号１３３３）
【０６９９】
いくつかの実施態様において、ＦＧＦＲ１ｃまたはβ−クロト−ならびにＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロト−に結合する任意の単量体または多量体をＨＡＳ（配列番号７１５）に融合することができる。
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ  （配列番号７１５）
【０７００】
単量体または多量体は、図９に説明されるリンカ−のうちのいずれかまたは任意の他のポリペプチド配列を用いて、ＨＳＡに連結することができる。リンカ−を介して、選択された単量体ドメインを接合することは、当該技術分野で公知の種々の技術を用いて達成することができる。ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４）、およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４１８）からなるリンカ−は、ＨＳＡ（配列番号７１５）に対するリンカ−Ｃ３２０１（配列番号３５９）に対して用いられており、結果として生じる分子は、ＦＧＦ−２１様アゴニスト活性を保有している（図５２）。このようなポリペプチドの例示的な配列には、以下が含まれる：
Ｃ３２０１−ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ−ＨＳＡ  （配列番号７１３）（「ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ」は、配列番号 ３として開示される）
ＳＧＧＳＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ
Ｃ３２０１−ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ−ＨＳＡ  （配列番号１２８５）（「ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ」は、配列番号４として開示される）
ＳＧＧＳＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ
Ｃ３２０１−ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ−ＨＳＡ  （配列番号１２８６）（「ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ」は、配列番号４１８として開示される）
ＳＧＧＳＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ
【０７０１】
いくつかの実施態様において、結合タンパク質ドメインおよびＨＳＡの融合物は、当該技術分野で公知の種々の技術を用いて哺乳類細胞において発現することができる。哺乳類細胞における発現は結果として、あるアミノ酸の側鎖への炭水化物部分の付加をもたらすことができる。これらのグリコシル化部位は、いくつかの公に入手可能なアルゴリズムによって同定することができる。アスパラギンが共通モチ−フＮ−Ｘ−［Ｓ／Ｔ］（配列番号１２８７）の脈絡で位置し、そこで、Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸であり得る場合、炭水化物部分がアスパラギン残基の側鎖に付加されると、Ｎ連結されたグリコシル化が生じる。Ｏ連結されたグリコシル化のための認識モチ−フ（セリンまたはトレオニン残基の側鎖への炭水化物部分の付加）は、あまり十分に定義されておらず、Ｏ連結されたグリコシル化は、プロリンの豊富な配列の脈絡で見いだされるセリンおよびトレオニン残基に優先的に生じる。
【０７０２】
結合タンパク質−ＨＳＡ融合物Ｃ３２０１−ＨＳＡ（配列番号７１３）の分析は、Ｎ１６でのＮ連結されたグリコシル化部位およびＳ８６でのＯ連結されたグリコシル化部位を同定した。以下の二重突然変異を実施して、これらのグリコシル化部位を除去し、タンパク質の均質性を改良した。
【０７０３】
Ｃ３２０１−ＨＳＡ  （Ｎ１４Ｓ／Ｓ８６Ｇ）
ＳＧＧＳＣＧＡＤＱＦＲＣＧＳＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＧＥＰＰＧＳＬＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ  （配列番号１２８８）
Ｃ３２０１−ＨＳＡ  （Ｓ１６Ｑ／Ｓ８６Ｇ）
ＳＧＧＳＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＱＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＧＥＰＰＧＳＬＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ  （配列番号１２８９）
Ｃ３２０１−ＨＳＡ  （Ｓ１６Ｎ／Ｓ８６Ｇ）
ＳＧＧＳＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＮＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＧＥＰＰＧＳＬＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ  （配列番号１２９０）
Ｃ３２０１−ＨＳＡ  （Ｓ１６Ｇ／Ｓ８６Ｇ）
ＳＧＧＳＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＧＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＧＥＰＰＧＳＬＣＧＥＧＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ  （配列番号１２９１）
【０７０４】
これらの変化がなされた後、結合タンパク質−ＨＳＡ融合物は、リポ−タ−細胞および初代脂肪細胞アッセイにおいて、親結合タンパク質−ＨＳＡ融合物と同じＦＧＦ−２１様アゴニスト活性を保有する（図５３）。
【０７０５】
Ｃ．一価のＩｇＧ−Ｆｃドメインへの融合
いくつかの実施態様において、結合タンパク質ドメインは、（Ｇ４Ｓ）７リンカ−（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号１２９２）によって連結される２つの重鎖Ｆｃからなる一価のヒトＩｇＧ−ＦｃのＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合する。この一価のヒトＩｇＧ−Ｆｃは、本明細書で、および略語「ＨＣＦＣ」によって関係した図に説明される。
【０７０６】
一価のヒトＩｇＧ２−Ｆｃ  （ＨＣＦＣ）  （配列番号１２９３）
ＥＲＫＳＳＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＲＫＳＳＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
【０７０７】
このことは、（結合タンパク質−一価のヒトＩｇＧ−Ｆｃポリペプチドの部分としての）結合タンパク質をＦｃＲｎスカベンジャ−経路に差し向けることによって、結合タンパク質に延長した半減期を与える。加えて、質量の増加は、腎濾過による血清由来の未処置の結合タンパク質−一価のヒトＩｇＧ−Ｆｃの損失を防止する。
【０７０８】
結合タンパク質−一価のヒトＩｇＧ−Ｆｃ融合物は、細菌、酵母、または哺乳類細胞において発現することができる。
【０７０９】
ＦＧＦＲ１ｃ／βクロト−結合タンパク質は、一価のヒトＩｇＧ−ＦｃのＮ末端またはＣ末端に連結させることができる。結合タンパク質配列は、一価のヒトＩｇＧ−Ｆｃコ−ド配列に直接連結的に、または中間連結配列を介して連結させることができる。この脈絡で、結合タンパク質はなおも、アゴニストとして機能し、リポ−タ−細胞アッセイにおけるＦＧＦ２１様シグナル伝達を誘導することができる（図５４）。このようなポリペプチドの例示的な配列として、以下が挙げられる：
Ｃ３２０１−ＨＣＦＣ  （配列番号１２９４）
ＳＧＧＳＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥ
ＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＰＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＥＧＬＦＴＣ
ＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＡＳＧＧＧＧＳＧ
ＧＧＧＥＲＫＳＳＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶ
ＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧ
ＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴ
ＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲ
ＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＲＫＳＳＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤ
ＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴ
ＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹ
ＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤ
ＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
Ｃ３０９４−ＨＣＦＣ  （配列番号１２９５）
ＳＧＧＳＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧ
ＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＥＧＬＦＴＣＲ
ＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＡＳＧＧＧＧＳＧＧ
ＧＧＥＲＫＳＳＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳ
ＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫ
ＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣ
ＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷ
ＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ
ＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＲＫＳＳＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴ
ＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦ
ＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴ
ＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳ
ＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
Ｃ４１７４−ＨＣＦＣ  （配列番号１２９６）
ＳＧＧＳＣＡＰＧＥＦＴＣＫＮＴＧＲＣＩＰＬＮＷＲＣＤＧＤＤＤＣＧＤＧＳＤＥＴＤＣＰＡＰＴＣＰＳＮＱＦ
ＰＣＲＳＴＧＩＣＩＰＬＡＷＶＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＥＧＬＦＴ
ＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＡＳＧＧＧＧＳ
ＧＧＧＧＥＲＫＳＳＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤ
ＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮ
ＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬ
ＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳ
ＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ
ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＲＫＳＳＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫ
ＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳ
ＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶ
ＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬ
ＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
Ｃ４１７６−ＨＣＦＣ  （配列番号１２９７）
ＳＧＧＳＣＧＰＤＥＦＲＣＮＮＧＱＣＩＰＬＰＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＮＳＤＥＰＬＥＩＣＱＡＰＴＣＱＳＮＥ
ＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＥＧＬＦＴ
ＣＲＳＴＮＩＣＩＳＨＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＮＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＡＳＧＧＧＧＳ
ＧＧＧＧＥＲＫＳＳＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤ
ＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮ
ＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬ
ＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳ
ＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ
ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＲＫＳＳＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫ
ＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳ
ＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶ
ＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬ
ＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
【０７１０】
先に説明された単量体または多量体は、リンカ−ＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１２９８）によって一価のヒトＩｇＧ−Ｆｃに連結されることができる。加えて、単量体または多量体は、本明細書に説明されるリンカ−のいずれか、例えば、図９に表されるものを用いることによって、または、リンカ−配列（例えば、（ＧｘＳ）ｙ配列、式中、Ｇはグリシンであり、Ｓはセリンであり、かつｘおよびｙは独立して任意の数である）として通常みなされるものを含む、任意の他のポリペプチド配列を介して、一価のヒトＩｇＧ−Ｆｃに連結されることができる。選択された単量体ドメインを、リンカ−を介して接合することは、標準的なペプチド化学反応を含む、当該技術分野で公知の任意の技術を用いて達成することができる。
【０７１１】
Ｄ．ＰＥＧ化
いくつかの実施態様において、Ｎ末端配列を結合タンパク質分子に付加し、アミド連結化学反応を介したポリエチレングリコ−ル（ＰＥＧ）部分の付加を可能にする。ＰＥＧの付加は、結合タンパク質の水力学的半径を増大させ、したがって、腎濾過を介した排泄を低下させる。このような目的のために入手可能なＰＥＧ分子は、ある範囲の分子量および直鎖または分岐鎖のいずれかの分子として入ってくる。任意の大きさの直鎖または分岐鎖ＰＥＧ分子を採用することができる（例えば、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ、または１００ｋＤａ）。
【０７１２】
ＰＥＧを結合タンパク質にアミド連結化学反応を介して共有結合させることは、使用可能な第一級アミンを必要とする。第一級アミンは、例えば、ポリペプチド配列内のＮ末端アミン、または任意のリシン残基のアミン側鎖であり得る。リシン残基は、ポリペプチド配列から作成することができ、正の帯電を保存し、活性を維持するよう、アルギニン残基と置き換えられることができる。１以上の内部リシン残基を１以上のアルギニン残基と置換し、かつ生物学的活性を維持した例示的な配列として、以下が挙げられる；
ＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹＳＤＥＩＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３６８）
ＣＧＡＮＬＦＴＣＱＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹＳＤＥＩＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号７１６）
ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＡＮＬＦＴＣＱＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹＳＤＥＩＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号７１７）
ＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳＳＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹＳＤＥＩＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号７１８）
ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳＳＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹＳＤＥＩＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号７１９）
ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＤＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹＳＤＥＩＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号７２０）
ＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＩＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号７２１）
ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＩＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号７２２）
ＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹＳＤＥＴＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号７２３）
ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹＳＤＥＴＧＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号７２４）
ＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹＳＤＥＩＴＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号７２５）
ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹＳＤＥＩＴＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号７２６）
ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＴＮＬＦＴＣＲＳＴＮＭＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＶＣＳＱＤＰＥＦＨＫＶ  （配列番号３６１）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＫＮＣＡＱＰＴＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＫＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号３９０）
修飾された配列（ＫからＲへの置換）；
ＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹＳＤＥＩＧＣＳＱＤＰＥＦＨＲＶＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号７２７）
ＣＧＡＮＬＦＴＣＱＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹＳＤＥＩＧＣＳＱＤＰＥＦＨＲＶＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号７２８）
ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＡＮＬＦＴＣＱＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹＳＤＥＩＧＣＳＱＤＰＥＦＨＲＶ  （配列番号７２９）
ＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳＳＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹＳＤＥＩＧＣＳＱＤＰＥＦＨＲＶＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号７３０）
ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳＳＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹＳＤＥＩＧＣＳＱＤＰＥＦＨＲＶ  （配列番号７３１）
ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＤＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹＳＤＥＩＧＣＳＱＤＰＥＦＨＲＶ  （配列番号７３２）
ＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＩＧＣＳＱＤＰＥＦＨＲＶＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号７３３）
ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＩＧＣＳＱＤＰＥＦＨＲＶ  （配列番号７３４）
ＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹＳＤＥＴＧＣＳＱＤＰＥＦＨＲＶＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号７３５）
ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹＳＤＥＴＧＣＳＱＤＰＥＦＨＲＶ  （配列番号７３６）
ＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹＳＤＥＩＴＣＳＱＤＰＥＦＨＲＶＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号７３７）
ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＡＮＬＦＴＣＲＳＴＮＩＣＩＳＰＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＹＳＤＥＩＴＣＳＱＤＰＥＦＨＲＶ  （配列番号７３８）
ＣＧＡＤＱＦＲＣＧＮＧＳＣＶＰＲＡＷＲＣＤＧＶＤＤＣＧＤＧＳＤＥＡＰＥＩＣＥＴＰＴＣＱＳＮＥＦＲＣＲＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＳＱＱＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＧＴＮＬＦＴＣＲＳＴＮＭＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＴＶＣＳＱＤＰＥＦＨＲＶ  （配列番号７３９）
ＣＬＰＤＥＦＱＣＧＳＧＲＣＩＰＱＨＷＬＣＤＧＬＮＤＣＧＤＧＳＤＥＰＰＡＨＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬＣＲＡＧＥＦＲＣＳＮＧＲＣＶＰＬＴＷＬＣＤＧＥＤＤＣＱＤＮＳＤＥＲＮＣＡＱＰＴＣＧＡＮＱＦＴＣＨＮＴＮＩＣＩＳＱＡＷＶＣＤＧＶＤＤＣＥＤＮＳＤＥＲＮＣＳＡＰＡＳＥＰＰＧＳＬ  （配列番号７４０）
【０７１３】
Ｎ末端第一級アミンへの１つのＰＥＧ分子の付加を可能にするＮ末端配列として、以下が挙げられる；
ＭＤＹ
ＭＨＹ
ＭＨＨ
ＭＲＤ
ＭＲＹ
ＭＹＶ
【０７１４】
種々の実施態様において、２つのＰＥＧ分子をＮ末端領域に付加することができ、１つのＰＥＧ分子をＮ末端第一級アミンにおいて付加することができ、１つのＰＥＧ分子を内部リシン残基において付加することができる。２つのＰＥＧ分子の結合タンパク質への付加を可能にするＮ末端配列の例として、以下が挙げられる；
ＭＫＨ
ＭＤＫ
ＭＥＫ
ＭＲＫ
ＭＹＫ
ＭＨＫ
ＭＫＫ
ＭＤＹＫ  （配列番号７４１）
ＭＨＹＫ  （配列番号７４２）
ＭＨＨＫ  （配列番号７４３）
ＭＲＤＫ  （配列番号７４４）
ＭＲＹＫ  （配列番号７４５）
ＭＹＶＫ  （配列番号７４６）
ＭＤＹＳＫ  （配列番号７４７）
ＭＨＹＳＫ  （配列番号７４８）
ＭＨＨＳＫ  （配列番号７４９）
ＭＲＤＳＫ  （配列番号７５０）
ＭＲＹＳＫ  （配列番号７５１）
ＭＹＶＳＫ  （配列番号７５２）
ＭＤＹＳＡＫ  （配列番号７５３）
ＭＨＹＳＡＫ  （配列番号７５４）
ＭＨＨＳＡＫ  （配列番号７５５）
ＭＲＤＳＶＫ  （配列番号７５６）
ＭＲＹＳＶＫ  （配列番号７５７）
ＭＹＶＳＶＫ  （配列番号７５８）
ＭＲＤＳＶＳＶＫ  （配列番号７５９）
ＭＲＤＳＶＹＡＫ  （配列番号７６０）
ＭＲＤＳＶＲＤＳＶＫ  （配列番号７６１）
ＭＲＤＳＶＹＡＲＤＫ  （配列番号７６２）
ＭＲＤＳＶＲＤＹＡＳＶＫ  （配列番号７６３）
ＭＲＤＳＶＧＧＧＧＳＶＫ  （配列番号７６４）
ＭＲＤＳＶＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＫ  （配列番号７６５）
ＭＲＤＳＶＹＡＲＤＹＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＫ  （配列番号７６６）
ＭＲＤＳＶＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＫ  （配列番号７６７）
【０７１５】
実施例１３
（カニクイザル試験）
Ｃ３２０１−ＨＳＡと命名された結合タンパク質コンストラクトを、実施例１〜１１において開示された方法を用いて生成した。Ｃ３２０１−ＨＳＡは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に融合した結合タンパク質Ｃ３２０１を含むが、本実施例において、および手短に「Ｃ３２０１」によって関連図において参照する。Ｃ３２０１の結合タンパク成分は、β−クロト−のウォ−キングした二量体ＷＤ２９（配列番号３１２）およびＦＧＦＲ１ｃ  ｍｕｔＭ０９（配列番号２９７）を含む配列番号３５９の配列によって説明される。半減期延長剤ＨＳＡ（配列番号７１５）と融合すると、Ｃ３２０１（すなわち、Ｃ３２０１−ＨＳＡ）は、配列番号７１３の配列を含んだ。本明細書に説明されるように、Ｃ３２０１を発現させ、精製し、および特徴づけて、肥満のカニクイザルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。実験計画および結果を下記に示す。
【０７１６】
（１３．１  試験設計）
本試験を肥満のカニクイザルにおいて実施した。サルは８〜１９歳であった。サルの体重は、７〜１４kgの範囲であり、ＢＭＩは３６〜７４kg／ｍ２の範囲であった。サルを６週間馴化させたのち、化合物の投与を開始した。順化期間の間、サルを、椅子への拘束、皮下注射（ＰＢＳ、０．１ｍＬ／kg）、経管栄養（水、１０ｍＬ／kg）、ならびに非ＯＧＴＴおよびＯＧＴＴ試料のための採血を含む試験関連手順となじませた。４週間の訓練後、基線ＯＧＴＴおよび血漿代謝パラメ−タを測定した。３０匹のサルを選択し、２つの処置群へと無作為化し、体重、グルコ−スＯＧＴＴ特性、ならびに血漿グルコ−スおよびトリグリセリド濃度の類似の基線濃度を得た。
【０７１７】
本試験を盲検様式で実施した。ビヒクル（ｎ＝１０）、Ｃ３２０１−ＨＳＡ低用量（ｎ＝１０）、Ｃ３２０１−ＨＳＡ高用量（ｎ＝１０）。化合物を、毎週、最初の２週間は、Ｃ３２０１−ＨＳＡ低用量については０．５mg／kg、およびＣ３２０１−ＨＳＡ高用量については２．５mg／kgを投与し、ならびに最後の２週間は、Ｃ３２０１−ＨＳＡ低用量については１ｍｇ／kg、およびＣ３２０１−ＨＳＡ高用量については５mg／kgを投与した。Ｃ３２０１−ＨＳＡの４回の注射の後、化合物の洗い出しおよび処理からの回復について動物を追加的な６週間モニタ−した。食餌摂取量、体重、臨床化学反応、およびＯＧＴＴを該試験を通じてモニタ−した。食餌摂取量を毎食測定した。体重を毎週測定した。血液試料を絶食状態または摂餌状態で異なる日に収集し、グルコ−ス、インスリン、およびトリグリセリドの濃度を測定した。本試験の開始後２週間ごとにＯＧＴＴを実施した。処理を開始する日を０とし、詳細な試験計画を図５５に示す。
【０７１８】
本実施例において呈される結果は、本試験の６８日を通じて収集されたデ−タを表す。
【０７１９】
（１３．２  食餌摂取量に及ぼすＣ３２０１−ＨＳＡの効果）
動物に１日に２回給餌し、各動物は、順化期間の間に確立された１２０ｇの製剤された食餌を受容した。各食餌後に残された食餌を取り出して、秤量し、食餌摂取量を算出した。給餌時刻は、午前８：００〜午前８：３０（±３０分）、次いで、午後４：３０〜午後５：００（±３０分）であった。果実（リンゴ、１５０ｇ）を各動物に午後１１：３０〜午後１２：３０（±３０分）毎日供給した。
【０７２０】
ビヒクルと比較すると、Ｃ３２０１−ＨＳＡ低および高用量（ｎ＝１０）は、サルにおける午前の食餌摂取量を減少させなかった（図５６）。しかしながら、リンゴ食摂取量は、７日間〜２１日間有意に減少し（図５７）、午後の食餌摂取量は、低および高用量で統計的に有意に低下した（図５８）。しかしながら、効果は低下し、食餌摂取量は、２１日間で基線または対照レベル近くまで戻った（図５８）。
【０７２１】
（１３．３  体重に及ぼすＣ３２０１−ＨＳＡの効果）
体重を試験の間毎週モニタ−した。４週間の処理の経過にわたって、ビヒクルで処理された動物の体重は、定常なままだったのに対し、Ｃ３２０１−ＨＳＡ（低および高用量）で処理した動物の体重は、漸減した。体重は、６週間の洗い出し期の終了までに基線に戻った（図５９）。
【０７２２】
（１３．４  ボディマス指数（ＢＭＩ）、腹部周囲長（ＡＣ）、および皮下脂肪厚（ＳＦＴ）に及ぼすＣ３２０１−ＨＳＡの効果）
ＢＭＩ、ＡＣ、およびＳＦＲを本試験の間、毎週モニタ−し、体重を測定する時は、試験化合物の投与前および投与後の両方であった。ＢＭＩは、個人の身長の平方によって除される個人の体重として定義される。ＳＦＴは、カリパスを用いて測定した、カリパスの真下の皮膚および脂肪の二重層の厚さである。ＢＭＩ、ＳＦＴ、およびＡＣは、体組成、特に皮下脂肪を示す比較的正確で、単純で、かつ安価な測定である。ビヒクルで処置した動物は、比較的安定したＢＭＩ、ＳＦＴ、およびＡＣを示した。Ｃ３２０１−ＨＳＡで処置した動物は、４週間の試験の経過にわたって、用量依存様式でＢＭＩ、ＡＣ、およびＳＦＴのレベル低下を示し、Ｃ３２０１−ＨＳＡ化合物が結果的ンい、脂肪量の減少を生じることを示唆した。ＢＭＩ、ＡＣ、およびＳＦＴについての結果をそれぞれ図６０〜６２に示す。これらの測定されたパラメ−タは、６週間の洗い出し期間の終了時において基線レベルに戻った。
【０７２３】
（１３．５  経口グルコ−ス耐性試験（ＯＧＴＴ）に及ぼすＣ３２０１−ＨＳＡの効果）
ＯＧＴＴを処理の開始前および開始後に実施した。Ｃ３２０１−ＨＳＡ注射の前に、グルコ−スおよびインスリン濃度についての基線値をＯＧＴＴの間測定し（それぞれ図５７および５８）、ビヒクルとＣ３２０１−ＨＳＡ群の間に統計的に有意な差はなかった。投与後ＯＧＴＴを処理期間の間２週間ごとに、および洗い出し期間の３週間後に実施した。Ｃ３２０１−ＨＳＡ高用量は、処理の４週間後にたグルコ−ス耐性をわずかに改良した。使用した動物モデルはグルコ−ス不耐性ではなく、観察された控えめな効果を説明する（図６３）。インスリン濃度は、Ｃ３２０１−ＨＳＡで処理した動物において統計的に有意に低下した（ＯＧＴＴの間の時間０、３０、および１８０で観察された有意性は、処理の２週間後に実施した）（図６４）。
【０７２４】
（１３．６  絶食および摂餌血中グルコ−スおよびインスリン濃度に及ぼすＣ３２０１−ＨＳＡの効果）
一晩絶食した動物から、または午前の給餌後に給餌された条件下で血液を収集した。絶食条件において、採血を各注射の５日後に毎週実施した。給餌条件において、採血を最初の注射後の２日後、１１日後、１６日後、２５日後、および４６日後に実施した。Ｃ３２０１−ＨＳＡは、絶食時または摂餌時血中グルコ−ス濃度を低下させなかった（図６５）。Ｃ３２０１−ＨＳＡで処理したサルのいずれにおいても低血糖を観察しなかった。しかしながら、Ｃ３２０１−ＨＳＡは、絶食時および摂餌時の血漿インスリン濃度における統計的に有意な低下をもたらした（図６６）。
【０７２５】
（１３．７  トリグリセリド濃度に及ぼすＣ３２０１−ＨＳＡの効果）
測定をグルコ−スおよびインスリン測定のために収集された同じ試料から実施した。トリグリセリド濃度は、摂餌時条件において測定すると、Ｃ３２０１−ＨＳＡで処理した動物において有意に低下した（図６７）。
【０７２６】
（１３．８  結論）
雄の肥満のカニクイザルにおいて実施した試験において、Ｃ３２０１−ＨＳＡで処置した動物は、改良された代謝性パラメ−タを示した。体重は減少し、体組成は改良された。食餌摂取量の短期減少が観察され、効果は低下し、食餌摂取量は、試験への２１日目での基線または対照濃度に回復した。絶食時のインスリンおよび摂餌時のトリグリセリドの濃度もＣ３２０１−ＨＳＡによって低下した。ＯＧＴＴの間に測定されたインスリン濃度も改良した。
【図１】
2013512672.tif 000108
【図２】
2013512672.tif 000109
【図３】
2013512672.tif 000110
【図４】
2013512672.tif 000111
【図５Ａ】
2013512672.tif 000112
【図５Ｂ】
2013512672.tif 000113
【図５Ｃ】
2013512672.tif 000114
【図５Ｄ】
2013512672.tif 000115
【図５Ｅ】
2013512672.tif 000116
【図５Ｆ】
2013512672.tif 000117
【図５Ｇ】
2013512672.tif 000118
【図５Ｈ】
2013512672.tif 000119
【図６】
2013512672.tif 000120
【図７】
2013512672.tif 000121
【図８】
2013512672.tif 000122
【図９】
2013512672.tif 000123
【図１０】
2013512672.tif 000124
【図１１】
2013512672.tif 000125
【図１２】
2013512672.tif 000126
【図１３】
2013512672.tif 000127
【図１４−１】
2013512672.tif 000128
【図１４−２】
2013512672.tif 000129
【図１５】
2013512672.tif 000130
【図１６】
2013512672.tif 000131
【図１７】
2013512672.tif 000132
【図１８】
2013512672.tif 000133
【図１９】
2013512672.tif 000134
【図２０】
2013512672.tif 000135
【図２１】
2013512672.tif 000136
【図２２Ａ】
2013512672.tif 000137
【図２２Ｂ】
2013512672.tif 000138
【図２２Ｃ】
2013512672.tif 000139
【図２３Ａ】
2013512672.tif 000140
【図２３Ｂ】
2013512672.tif 000141
【図２３Ｃ】
2013512672.tif 000142
【図２４Ａ】
2013512672.tif 000143
【図２４Ｂ】
2013512672.tif 000144
【図２４Ｃ】
2013512672.tif 000145
【図２５Ａ】
2013512672.tif 000146
【図２５Ｂ】
2013512672.tif 000147
【図２６Ａ】
2013512672.tif 000148
【図２６Ｂ】
2013512672.tif 000149
【図２７Ａ】
2013512672.tif 000150
【図２７Ｂ】
2013512672.tif 000151
【図２８】
2013512672.tif 000152
【図２９Ａ】
2013512672.tif 000153
【図２９Ｂ】
2013512672.tif 000154
【図３０Ａ】
2013512672.tif 000155
【図３０Ｂ】
2013512672.tif 000156
【図３１Ａ】
2013512672.tif 000157
【図３１Ｂ】
2013512672.tif 000158
【図３１Ｃ】
2013512672.tif 000159
【図３１Ｄ】
2013512672.tif 000160
【図３２Ａ】
2013512672.tif 000161
【図３２Ｂ】
2013512672.tif 000162
【図３３】
2013512672.tif 000163
【図３４】
2013512672.tif 000164
【図３５】
2013512672.tif 000165
【図３６】
2013512672.tif 000166
【図３７】
2013512672.tif 000167
【図３８Ａ】
2013512672.tif 000168
【図３８Ｂ】
2013512672.tif 000169
【図３９Ａ】
2013512672.tif 000170
【図３９Ｂ】
2013512672.tif 000171
【図４０Ａ】
2013512672.tif 000172
【図４０Ｂ】
2013512672.tif 000173
【図４１Ａ】
2013512672.tif 000174
【図４１Ｂ】
2013512672.tif 000175
【図４２】
2013512672.tif 000176
【図４３】
2013512672.tif 000177
【図４４】
2013512672.tif 000178
【図４５】
2013512672.tif 000179
【図４６】
2013512672.tif 000180
【図４７Ａ】
2013512672.tif 000181
【図４７Ｂ】
2013512672.tif 000182
【図４８】
2013512672.tif 000183
【図４９Ａ】
2013512672.tif 000184
【図４９Ｂ】
2013512672.tif 000185
【図５０Ａ】
2013512672.tif 000186
【図５０Ｂ】
2013512672.tif 000187
【図５１】
2013512672.tif 000188
【図５２】
2013512672.tif 000189
【図５３】
2013512672.tif 000190
【図５４】
2013512672.tif 000191
【図５５】
2013512672.tif 000192
【図５６】
2013512672.tif 000193
【図５７】
2013512672.tif 000194
【図５８】
2013512672.tif 000195
【図５９】
2013512672.tif 000196
【図６０】
2013512672.tif 000197
【図６１】
2013512672.tif 000198
【図６２】
2013512672.tif 000199
【図６３】
2013512672.tif 000200
【図６４】
2013512672.tif 000201
【図６５】
2013512672.tif 000202
【図６６】
2013512672.tif 000203
【図６７】
2013512672.tif 000204
【配列表】
2013512672000001.app
【国際調査報告】
2013512672.tif 000205
2013512672.tif 000206
2013512672.tif 000207
2013512672.tif 000208
2013512672.tif 000209