(57)【要約】  塩化コリンの含有量が高い細胞培養培地を提供する。細胞培養培地はごく適量のアミノ酸をさらに含み、特に細胞培養培地中のグルタミンの量は限られる。細胞培養培地は、細胞培養を使用するポリペプチドの大規模生産に使用することができる。塩化コリンの含有量が高い細胞培養培地はフェドバッチ細胞培養に特に適しており、この場合細胞生存率は長時間高レベルに留まり、高いポリペプチド力価、ただし限られた量のアミノ酸を使用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＨＯ細胞におけるポリペプチドの組換え産生のための細胞培養培地であって、６０〜２５００ｍｇ／Ｌの塩化コリンまたは等量の別のコリン塩を含み、２０〜５７ｍｍｏｌ／Ｌのアミノ酸の全濃度を有する、細胞培養培地。
【請求項２】
８０〜１０００ｍｇ／Ｌの塩化コリンまたは等量の別のコリン塩を含む、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項３】
３５〜５４ｍｍｏｌ／Ｌのアミノ酸の全濃度を有する、請求項１または２に記載の細胞培養培地。
【請求項４】
５００〜１４００ｍｇ／Ｌの濃度でグルタミンを含有する、請求項１から３のいずれかに記載の細胞培養培地。
【請求項５】
細胞培養培地中のグルタミンの含有量が９００〜１２００ｍｇ／Ｌの量である、請求項４に記載の細胞培養培地。
【請求項６】
ｍｍｏｌ／Ｌで表す以下の濃度で以下のアミノ酸：
アルギニン  ４．０〜６．０
アスパラギン  ３．０〜６．０
アスパラギン酸  ２．５〜４．０
グリシン  ０．３〜０．８
ヒスチジン  ０．６〜１．０
イソロイシン  ２．０〜５．０
ロイシン  ３．０〜７．０
リシン  ２．０〜４．０
メチオニン  １．０〜１．５
フェニルアラニン  １．０〜２．０
プロリン  ２．５〜６．０
セリン  ３．０〜８．０
スレオニン  ２．０〜３．５
トリプトファン  ０．４〜１．０
バリン  ２．５〜５．０
チロシン  １．０〜２．０
シスチン  ０．５〜１．０
を含む、請求項４または５のいずれかに記載の細胞培養培地。
【請求項７】
無血清および無タンパク質培地である、請求項１から６のいずれかに記載の細胞培養培地。
【請求項８】
生産期を含む、組換えポリペプチドを産生するための方法であって、請求項１から７のいずれかに記載の細胞培養培地中で組換えＣＨＯ細胞を培養し、組換えポリペプチドを発現させる方法。
【請求項９】
組換えポリペプチドが組換え抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
フェドバッチプロセスで細胞を培養する、請求項８または９のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの一般的な分野、特に産業規模でポリペプチドを産生するための細胞の培養およびそれらの使用に関する。
【０００２】
本発明は、長期間にわたり高い細胞生存率での細胞の培養を可能にする、塩化コリンの含有量が高い細胞培養培地を提供する。本発明による細胞培養培地は、特に産業規模で、ＣＨＯ細胞培養系を使用したポリペプチドの組換え発現によるポリペプチドの産生に使用するとき、高いポリペプチド生産性および／または改善された品質の獲得をさらに可能にする。
【背景技術】
【０００３】
組換え技術を使用したポリペプチドの調製は、この数十年の間に標準的手順に発展している。各ポリペプチドをコードする遺伝子のクローニング、次に発現される遺伝子による適切な発現宿主の二次形質転換、および最終産生、および得られた組換えポリペプチド産物の精製による組換えポリペプチドへのアクセスは、全く新しいクラスの生物学的に設計および産生される治療剤へのアクセスをもたらしている。
【０００４】
医薬品産業界では、組換えＤＮＡ技術を使用し、次に生物工学の分野で開発された産生法を使用して調製される、医薬品活性がある化合物の数が増加し続けている。
【０００５】
このようなバイオ製品には、自己免疫疾患、炎症障害、免疫抑制、腫瘍学などを含めた様々な医療分野において、重要な治療選択肢に発展しているモノクローナル抗体が含まれる。
【０００６】
生物源のこのような治療剤の開発には、それによって多量の組換えポリペプチドへのアクセスをもたらす産業規模での生産が必要とされる。好ましい発現系は、昆虫細胞、酵母などに基づく大部分の他の真核生物発現系、または一層伝統的な原核生物発現系より優れた、哺乳動物細胞培養系である。
【０００７】
しかしながら、哺乳動物細胞培養には、特に産業規模で多大な課題がある。哺乳動物細胞培養のための生産施設は、多くの方法条件の完全な最適化を必要とする。
【０００８】
生産プロセス全体を制御するための最も重要な方法のパラメーターの１つは、細胞を増殖させる培地である。適切な細胞培養培地は全ての必要な栄養素を細胞培養にもたらさなければならず、血清またはタンパク質、例えば増殖因子のような動物起源の成分を培地に加えない場合、これは非常に難しい。
【０００９】
さらに、哺乳動物細胞培養は、ポリペプチド生産プロセスの異なる段階で特定の補充成分を必要とする。したがって、細胞培養培地は、ａ）より低い密度での宿主細胞の初期成長および増殖中、ｂ）それに続く、より高い密度への細胞の培養中、ｃ）培養細胞におけるポリペプチド形成の実際のプロセス中に必要な基質をもたらさなければならない。
【００１０】
組換えポリペプチドを産生するためのプロセス全体は、増殖期および生産期を含むことが好ましい。増殖期中、増殖培地を使用することにより宿主細胞を高密度に培養して、その後の二次ポリペプチド産生を最大にする。生産期中における、多量の望ましいポリペプチドの実際の形成は、生産培地の使用によって達成される。ポリペプチド生産プロセス全体の各期中に細胞の具体的代謝要件を満たすために、それぞれ増殖期および生産期用の異なる培地組成が設計されている。例えば生産培地は、増殖培地より多量のアミノ酸を含有することが多い。
【００１１】
したがって、ポリペプチドの大規模産生のためのそれらの使用に特に重点を置いた細胞培養培地を開発するための、相当な努力が過去になされている。それにもかかわらず、細胞培養培地の連続的な改善は依然として、品質および量的収率の点でポリペプチド産生をさらに高めるための重要な目標である。
【００１２】
細胞培養培地の多くの成分が、ポリペプチド産生に関するそれらの役割の点で過去に調べられている。考えられる標的は、無機塩、アミノ酸、グルコースのような炭素源、またはビタミンである。
【００１３】
例えば、ビタミン、塩化コリンまたはアミノ酸のような化合物の補充は、無タンパク質条件下で培養した細胞の生存率および生産性を、増大することができることが実証されている（Kim do Y et. al., Cytotechnology 2005, 47, 37-49）。
【００１４】
塩化コリンは、細胞のリン脂質前駆体として働く細胞培養培地の標準的な成分である。細胞によって取り込まれ処理された後、それは、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルイノシトールと共に、ホスファチジルコリンと呼ばれる細胞膜中の主要リン脂質の１つとなる。
【００１５】
Ｄ−ＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）およびＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２のような一般に使用される細胞培養培地は、広範囲の哺乳動物細胞系の増殖用に広く使用されている。これらの培地は、それぞれ４ｍｇ／Ｌおよび８．９８ｍｇ／Ｌの量の塩化コリンを含む。
【００１６】
（ＢｉｏＣｏｎｃｅｐｔから市販されている）ＨａｍのＦ−１２および（ＨｙＣｌｏｎｅから市販されている）ＭＥＭのような他の市販の培地も、それぞれ１３．９６ｍｇ／Ｌおよび５６ｍｇ／Ｌの少量の塩化コリンを含む。
【００１７】
米国特許第６，１８０，４０１号は、動物細胞培養中にポリペプチドを産生するための改良法を開示する。１つの目的は、最終産物濃度を増大することである。グルコース濃度、モル浸透圧濃度およびグルタミン濃度を含めた、いくつかのパラメーターを改変して、生産期中の産物収量を最大にする。米国特許第６，１８０，４０１号は、５０．８６ｍｇ／Ｌの塩化コリン含有量を有する細胞培養培地を開示する。
【００１８】
米国特許第５，１２２，４６９号は、様々な哺乳動物細胞系、特にチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）を増殖するための培養培地を開示し、単層としてまたは哺乳動物細胞の小規模および大規模増殖に適した縣濁液中での、高密度での細胞の培養を可能にする。１つのさらなる利点は高い産物収量である。培地は、高レベルの特定アミノ酸を含有する化学的に定義された培養培地である。塩化コリンの含有量は５０．８６ｍｇ／Ｌである。
【００１９】
非常に少数の塩化コリンの含有量が高い培地のみが、従来技術において知られている。Ｗａｙｍｏｕｔｈは、マウスＬ９２９線維芽細胞結合組織細胞系の培養に使用することができる細胞培養培地を記載している（C. Waymouth, J. Natl. Cancer. Inst., 1959, 22, 1003-1017）。この培地は無血清の化学的に定義された合成培地であり、２５０ｍｇ／Ｌの塩化コリン含有量を有する。この培地は名称Ｗａｙｍｏｕｔｈ培地ＭＢ  ７５２／１（ＢｉｏＣｏｎｃｅｐｔ  ａｎｄ  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の下で市販されている。知られている適用は、そのｉｎ  ｖｉｖｏ評価前の全器官培養、胸水からの癌細胞系の樹立、およびおそらく腫瘍性の細胞の増殖に限られる。
【００２０】
ＷＯ０２／１０１０１９は、比較的高い塩化コリンの含有量、それぞれ１０１．７２ｍｇ／Ｌおよび２０９．４０ｍｇ／Ｌを有する、２つの培地組成を開示する。これらの培地は、組換えタンパク質産生に対するグルタミンおよびグルタミン酸の影響を調べるのに使用された。しかしながら、両方の培地は多量のグルタミンを依然含有していた。
【００２１】
ポリペプチド産生に対する細胞培養培地中の塩化コリン含有量の役割に関する限り、限られた情報のみが従来技術から入手可能である。米国特許第６，０４８，７２８号は、ハイブリドーマ細胞を使用して、生物学的産物の生成に対する細胞培養培地中の塩化コリン含有量の役割を大まかに論じている。抗体発現細胞の場合、最大量の抗体の分泌が、Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔの他の試薬と組合せて、４ｍｇ／Ｌを超える、および好ましくは約４〜７５ｍｇ／Ｌのコリンサプリメントを含有する培地中で観察された。これらの濃度において、コリンは非制限的であり、明らかな毒性がないと記載される。
【００２２】
生産用細胞培養培地、特に組換えポリペプチドの大規模工業生産における使用のために設計された培地は、多量の成分、例えばアミノ酸を必要とする。
【００２３】
しかしながら、高度に濃縮された細胞培養培地は、選択した培地成分の限られた可溶性を示す。限られた可溶性は技術的問題点となる。大規模生産用の高度に濃縮された培地には、例えば生産期中および特に保存中に、個々の成分の沈殿のリスクがあるからである。これは培地組成の変動、および産物形成の臨界点で細胞培養条件の悪化をもたらす可能性がある。
【００２４】
さらなる結果として、沈殿は実際の生産プロセスからの主要培地成分の効率よい除去をもたらす。このような欠点を克服するために設計される他のリサイクルプロセスは、実現するのが技術的に困難であり、資源および時間の点でさらなる努力を必要とする。低濃縮細胞培養培地は、ポリペプチド産生において同様に有効であると、工業生産プロセスにおける有意なコスト削減を達成することが可能である。
【００２５】
前述の課題および既存の欠点を考慮すると、バイオテクノロジー産業の分野において、さらに高い収率、すなわち改善された特異的および全体的生産性、ならびに高い品質で、組換えポリペプチドの産生を産業規模で可能にする、改善された培養培地が絶えず必要とされる。改良型細胞培養培地は、生産期中の生産性を改善するのに特に望ましい。
【００２６】
ポリペプチド生産プロセスの具体的な技術目標は、生産プロセスの最後に高い細胞生存率を維持して、特に産生時間の延長により、ポリペプチドの最終収率を最大にすることである。さらに、形成された組換えポリペプチドの凝集の低下、および特にグリコシル化パターンなどの翻訳後修飾の点での改善された品質も、重要な技術目標である。
【００２７】
最後に、細胞増殖、ポリペプチド生産性、組換えポリペプチドの質およびポリペプチド機能の点で同様に有効であるまたは一層優れながら、少量の成分を含有するポリペプチドの大規模生産用の改良型生産培地が望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
前述の技術的課題に対処するため、本発明は、特にバイオテクノロジーによる生産プロセスの後期段階で細胞特異的生産性および細胞生存率の予期せぬ改善をもたらす、塩化コリンの含有量が高い細胞培養培地を提供する。さらに、この細胞培養培地の使用により、組換え産物の質も驚くほど改善することができる。本発明による細胞培養培地は、生産期中に使用するのに特に適している。したがって本発明は、ＣＨＯ細胞からの組換えポリペプチドの産生を可能にする。
【００２９】
細胞培養培地は特に生産培地として使用して、生産期中に高い細胞増殖、高い生存細胞密度および高いポリペプチド力価を得ることができる。本発明による細胞培養培地を使用することにより、凝集の低下および／または組換え産物の改善グリコシル化パターンなどのより良い翻訳後修飾の点で、品質を改善することができることも見出される。
【００３０】
本発明中では、塩化コリンを使用することが好ましい。しかしながら、異なる対イオンの使用に基づくと、他のコリン源、例えば水酸化コリン、酒石酸コリン／重酒石酸コリン、コリン硫酸、コリンリン酸、または任意の他のコリン化合物も、本発明による細胞培養培地中で使用するのに適している。このような他のコリン化合物を使用する場合、それらの量は、前に与えた濃度範囲および値で塩化コリンを使用して得るのと、同じモルコリン濃度を得るように選択することが好ましい。すなわち、他のコリン塩は、前述の塩化コリンの濃度と等しい濃度で存在するのが好ましい。これは、以下に言及する具体的な態様および実施形態にも当てはまる。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
本発明の第一の態様によれば、６０ｍｇ／Ｌ〜２５００ｍｇ／Ｌの範囲内の塩化コリン含有量である細胞培養培地を提供する。細胞培養培地中の塩化コリン含有量は、８０ｍｇ／Ｌ以上、あるいは１６０ｍｇ／Ｌ以上、２００ｍｇ／Ｌ以上または２２０ｍｇ／Ｌ以上であってよい。細胞培養培地中の塩化コリンの含有量は、２５００ｍｇ／Ｌ、あるいは１０００ｍｇ／Ｌ、８４０ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌまたは３００ｍｇ／Ｌに限られる。塩化コリンは約２４０ｍｇ／Ｌの濃度で存在してよい。
【００３２】
本発明の第一の態様による細胞培養培地は、２０〜５７ｍｍｏｌ／Ｌのアミノ酸の全濃度により表される、ごく限られた含有量のアミノ酸をさらに含む。あるいは、全アミノ酸濃度は２５ｍｍｏｌ／Ｌ超、３０ｍｍｏｌ／Ｌ超、３５ｍｍｏｌ／Ｌ超またはさらに４０ｍｍｏｌ／Ｌ超である。さらに、全アミノ酸濃度は５４ｍｍｏｌ／Ｌ未満であってよい。全アミノ酸濃度は、例えば約５１ｍｍｏｌ／Ｌであってよい。
【００３３】
さらに細胞培養培地は、低含有量のグルタミンを場合によっては含む。特に、グルタミンは５００〜１４００ｍｇ／Ｌ、あるいは８００〜１４００ｍｇ／Ｌ、またはさらに９００〜１２００ｍｇ／Ｌの濃度で存在する。
【００３４】
本発明の第一の態様による細胞培養培地中のアミノ酸の含有物は、ｍｍｏｌ／ｌで表す以下の濃度で以下のアミノ酸：
アルギニン  ４．０〜６．０、好ましくは４．５〜５．５
アスパラギン  ３．０〜６．０、好ましくは４．０〜５．５
アスパラギン酸  ２．５〜４．０、好ましくは３．０〜３．６
グリシン  ０．３〜０．８、好ましくは０．５〜０．７
ヒスチジン  ０．６〜１．０、好ましくは０．７〜０．９
イソロイシン  ２．０〜５．０、好ましくは３．０〜４．０
ロイシン  ３．０〜７．０、好ましくは３．５〜６．０
リシン  ２．０〜４．０、好ましくは２．５〜３．５
メチオニン  １．０〜１．５、好ましくは１．２〜１．４
フェニルアラニン  １．０〜２．０、好ましくは１．３〜１．８
プロリン  ２．５〜６．０、好ましくは３．０〜５．５
セリン  ３．０〜８．０、好ましくは４．０〜７．０
スレオニン  ２．０〜３．５、好ましくは２．５〜３．１
トリプトファン  ０．４〜１．０、好ましくは０．５〜０．８
バリン  ２．５〜５．０、好ましくは３．０〜４．５
チロシン  １．０〜２．０、好ましくは１．２〜１．８
シスチン  ０．５〜１．０、好ましくは０．６〜０．８
を場合によっては含むことができる。
【００３５】
細胞培養培地は、無血清および無タンパク質であることが好ましい。さらにそれらは、タンパク質加水分解物を含まないことが好ましい。
【００３６】
本発明の第二の態様によれば、生産期を含む組換えポリペプチドを産生するための方法であって、本発明の第一の態様による細胞培養培地中で組換えＣＨＯ細胞を培養する方法を提供する。
【００３７】
調製される組換えポリペプチドは特に組換え抗体である。
【００３８】
本発明の方法中、細胞はフェドバッチプロセスで培養することが好ましい。
【００３９】
図１〜図８中、３種の培地は、低コリン増殖培地（
【化１】
2013524826.tif 000002
（菱形）；対照１）、生産培地（
【化２】
2013524826.tif 000003
（三角形）；対照２）および高コリン増殖培地、すなわち追加量の２００ｍｇ／ｌの塩化コリンを補充した低コリン増殖培地（
【化３】
2013524826.tif 000004
（四角形））である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】３種の異なる細胞培養培地中での時間の関数として、振とうフラスコ中で培養したｍＡｂ１を発現する細胞の標準生存細胞密度を示す図である（実験１）。
【図２】３種の異なる細胞培養培地中での時間の関数として、振とうフラスコ中で培養したｍＡｂ１を発現する細胞の生存率を示す図である（実験１）。
【図３】３種の異なる培地に関する時間の関数として、振とうフラスコ中でのｍＡｂ１発現細胞の培養後に得た標準ポリペプチド力価を示す図である（実験１）。
【図４】３種の異なる細胞培養培地中での時間の関数として、振とうフラスコ中で培養したｍＡｂ２を発現する細胞の標準生存細胞密度を示す図である（実験２）。
【図５】３種の異なる細胞培養培地中での時間の関数として、振とうフラスコ中で培養したｍＡｂ２を発現する細胞の生存率を示す図である（実験２）。
【図６】３種の異なる培地に関する時間の関数として、振とうフラスコ中でのｍＡｂ２発現細胞の培養後に得た標準ポリペプチド力価を示す図である（実験２）。
【図７】３種の異なる細胞培養培地中での時間の関数として、振とうフラスコ中で培養したｍＡｂ３を発現する細胞の標準生存細胞密度を示す図である（実験３）。
【図８】３種の異なる細胞培養培地中での時間の関数として、振とうフラスコ中で培養したｍＡｂ３を発現する細胞の生存率を示す図である（実験３）。
【図９】３種の異なる培地に関する時間の関数として、振とうフラスコ中でのｍＡｂ３発現細胞の培養後に得た標準ポリペプチド力価を示す図である（実験３）。
【図１０】振とうフラスコ中での７日間の培養後に産生したｍＡｂ３の凝集率を示す図である。凝集率はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって測定する。エラーバーは３つの生物学的レプリカの標準偏差である。
【図１１】３種の異なる細胞培養培地中での時間の関数として、バイオリアクターにおいてフェドバッチ操作で培養したｍＡｂ３発現細胞の標準生存細胞密度を示す図である（実験４）。
【図１２】３種の異なる細胞培養培地中での時間の関数として、バイオリアクターにおいてフェドバッチ操作で培養したｍＡｂ３発現細胞の生存率を示す図である（実験４）。
【図１３】３種の異なる培地を使用し時間の関数として、バイオリアクターにおけるフェドバッチ操作で、ｍＡｂ３発現細胞を使用して得た標準ポリペプチド力価を示す図である（実験４）。
【図１４】様々な濃度の塩化コリンを補充した低コリン増殖培地を使用した、１３日の細胞培養後に得た標準ｍＡｂ３抗体力価を示す図である。
【図１５】様々な濃度の塩化コリンを補充した低コリン増殖培地を使用した、細胞培養の第１３日のｍＡｂ３を発現する細胞の生存率を示す図である。
【図１６】様々な濃度の塩化コリンを補充した低コリン増殖培地を使用した、第３日（１００％）から始めて第１３日までのｍＡｂ３発現細胞の標準生存細胞密度を示す図である。
【図１７】様々な濃度の塩化コリンを補充した低コリン増殖培地を使用した、第３日から始めて第１３日までのｍＡｂ３を発現する細胞の生存率を示す図である。
【図１８】様々な濃度の塩化コリンを補充した低コリン増殖培地を使用した、培養の第３日から始めて第１３日までのｍＡｂ３抗体力価の標準化した増大を示す図である。
【図１９】様々な濃度の塩化コリンを補充した低コリン増殖培地を使用した、第０日から始めて第１７日までのｍＡｂ４発現細胞の標準生存細胞密度を示す図である。
【図２０】様々な濃度の塩化コリンを補充した低コリン増殖培地を使用した、第０日から始めて第１７日までのｍＡｂ４を発現する細胞の生存率を示す図である。
【図２１】様々な濃度の塩化コリンを補充した低コリン増殖培地を使用した、第１７日のｍＡｂ４を発現する細胞の生存率を示す図である。
【図２２】様々な濃度の塩化コリンを補充した低コリン増殖培地を使用した、第７日から始めて第１７日までの標準ｍＡｂ４抗体力価を示す図である。
【図２３】様々な濃度の塩化コリンを補充した低コリン増殖培地を使用した、第１７日の標準ｍＡｂ４抗体濃度を示す図である。
【図２４】様々な濃度の塩化コリンを補充した低コリン増殖培地を使用して細胞培養の１７日以内に得た、ｍＡｂ４発現細胞の標準平均細胞特異的生産性（ｑＰ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
細胞の培養、およびこれらの細胞培養物からのその後のポリペプチド産生に使用される従来の細胞培養培地は、少量の塩化コリンのみを含有する。従来技術中に記載された非常に少数の細胞培養培地のみが、適量またはさらに多量の塩化コリンを含有する。しかしながら、これらの培地は、特に生産期中に使用したときの、多量の塩化コリンが細胞特異的生産性、細胞増殖および品質に対して有する役割の点で、系統的に調べられていない。
【００４２】
本発明によれば、少量の塩化コリンを含む培地と比較して、多量の塩化コリンを含む生産培地として細胞培養培地を使用してＣＨＯ細胞を培養したとき、細胞特異的生産性（またはポリペプチド発現）の予期せぬ改善が観察される。多量の塩化コリンを補充したときの増殖培地も、生産期中のＣＨＯ細胞の培養に有効な生産培地として驚くことに使用することができ、それによって多量のポリペプチド、好ましくは細胞培養中の組換えポリペプチド発現によって得られるポリペプチドを得ることができることが、本明細書で実証される。
【００４３】
塩化コリンは本発明に従い使用することが好ましいが、異なる対イオンの使用に基づくと、他のコリン源、例えば水酸化コリン、酒石酸コリン／重酒石酸コリン、コリン硫酸、コリンリン酸、または他の各コリン化合物も、本発明による細胞培養培地中で使用するのに同様に適している。
【００４４】
本発明によるポリペプチドの産生用の細胞培養培地の使用は、ポリペプチドの組換え発現用のＣＨＯ細胞の培養を一般に含む。細胞培養培地は、ポリペプチドの大規模生産に使用することが好ましい。ポリペプチドの大規模生産は、治療活性がある生物製剤の調製に使用される組換えポリペプチドの、工業生産に典型的に必要とされる量と関係がある。少なくとも５００Ｌの体積、少なくとも１０００Ｌ、少なくとも５０００Ｌまたはさらに高体積の細胞培養は、典型的には大規模生産用途となる。
【００４５】
ポリペプチド産生に使用する本発明による細胞培養培地中の塩化コリンの量は、大規模なポリペプチド産生に使用された使用済み細胞培養培地から知られる塩化コリン含有量より有意に多い。
【００４６】
したがって、本発明は、６０ｍｇ／Ｌ以上、８０ｍｇ／Ｌ以上、１６０ｍｇ／Ｌ以上、２００ｍｇ／Ｌ以上またはさらに２２０ｍｇ／Ｌ以上などの高含有量の塩化コリンを含むＣＨＯ細胞を使用する、組換えポリペプチドの産生に適している。細胞培養培地中の塩化コリンの含有量は、２５００ｍｇ／Ｌ、１０００ｍｇ／Ｌ、８４０ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌまたはさらに３００ｍｇ／Ｌに限られる。塩化コリンは約２４０ｍｇ／Ｌの濃度で存在してよい。
【００４７】
塩化コリン濃度が高くなるほど、培地に関するコストは高くなる。したがって、高すぎる塩化コリン濃度はコストの観点から不利である。さらに、塩化コリン含有量は培地のモル浸透圧濃度に貢献する。高すぎる塩化コリン濃度は、それらが他の培地成分と共に、望むより高い全体モル浸透圧濃度をもたらし得るので、不利である可能性がある。特にフェドバッチプロセスでは、高すぎる開始モル浸透圧濃度を使用することは望ましくない。これが、供給戦略に制約を課す可能性があるからである。
【００４８】
前述の理由で、本発明者らは、最適塩化コリン濃度は本明細書で述べる範囲内にあると考える。
【００４９】
塩化コリン以外のコリン化合物を使用する場合、それらは等しい濃度で利用する。等しい濃度は、前述の範囲内の濃度で塩化コリンを使用するときに得るのと同じ範囲内にある、コリンのモル濃度を得ることを意味する。
【００５０】
本発明の第一の態様によれば、細胞培養培地は、アミノ酸の全濃度により表されるごく限られた含有量のアミノ酸を含む。より詳細には、本発明の第一の態様による細胞培養培地は、２０〜５７ｍｍｏｌ／Ｌのアミノ酸の全濃度によって特徴付けられる。全アミノ酸濃度は２５ｍｍｏｌ／Ｌ超、３０ｍｍｏｌ／Ｌ超、３５ｍｍｏｌ／Ｌ超またはさらに４０ｍｍｏｌ／Ｌ超であってよい。さらに、全アミノ酸濃度は５４ｍｍｏｌ／Ｌ未満であってよい。全アミノ酸濃度は、例えば約５１ｍｍｏｌ／Ｌであってよい。
【００５１】
同時に、塩化コリン濃度は前述の通り、すなわち６０ｍｇ／Ｌ〜２５００ｍｇ／Ｌの範囲内であり、好ましい範囲および値も前述の通りである。
【００５２】
本発明の第一の態様による細胞培養培地は、特に生産培地として使用して、生産期中に高い細胞増殖、高い生存細胞密度および高いポリペプチド力価を得ることができる。さらに、特に凝集の低下および／または改善グリコシル化パターンなどのより良い翻訳後修飾の点で、高い品質の組換え産物が得られる。
【００５３】
細胞培養物の増殖および結果としてのポリペプチド生産性に対するアミノ酸グルタミンの役割は、近年広範囲の研究の主題となっている。グルタミンはポリペプチド合成に重要な基本構造要素であるだけでなく、哺乳動物細胞の主要エネルギー源にもなることが見出されている。したがって、高濃度のグルタミンが、ポリペプチド産生に使用される細胞培養培地中に通常含まれている。細胞培養培地中の多量のグルタミンは、特に産業規模で、細胞増殖およびポリペプチド発現に重要である。
【００５４】
それにもかかわらず、グルタミン代謝はグルタミンの分解およびアンモニウムイオンの蓄積をもたらし、これは細胞増殖およびポリペプチド産生に対して毒性がある副産物として知られる。したがって、細胞培養中はグルタミンの量を制限することが望ましい。いくつかのグルタミン代替物質、例えばグルタミン酸が従来技術中で示唆されている。しかしながら、フェドバッチプロセスにおけるグルタミン酸とグルタミンの置換は少ない副産物形成だけでなく、低い生産性にもつながることが記載されている（Doverskog et, al., J. Biotechnol., 1997, 59, 103-115）。したがって、高い細胞増殖およびポリペプチド生産性を依然可能にしながら、少量のグルタミンを含有する細胞培養培地が望ましい。
【００５５】
多量の塩化コリンの添加によって、細胞の生産性に大きく影響を与えない状態で、特に生産期中、いくつかの知られている培地と比較して少量のグルタミンを含む培地の使用が可能になることが分かっている。
【００５６】
したがって、本発明の第一の態様によれば、従来技術からの培地と比較して有意に少ない、任意選択量のグルタミンをさらに含む細胞培養培地を提供する。細胞培養培地は、グルタミン酸などのようなグルタミン代替物質は含まなくてもよい。細胞培養培地は、５００〜１４００ｍｇ／Ｌ、８００〜１４００ｍｇ／Ｌ、または９００〜１２００ｍｇ／Ｌの濃度でグルタミンを場合によっては含む。
【００５７】
同時に、塩化コリン濃度は前述の通り、すなわち６０ｍｇ／Ｌ〜２５００ｍｇ／Ｌの範囲内であり、好ましい範囲および値も前述の通りである。さらに、細胞培養培地中のアミノ酸の全濃度は同時に２０〜５７ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましい範囲および値も前述の通りである。
【００５８】
本発明の第一の態様の、別の任意選択の修飾によれば、個々のアミノ酸のそれぞれの量は以下に定義する通りである。
【００５９】
アミノ酸のこのような適量は、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩのような従来型細胞培養培地中に含有されるアミノ酸の量より一層高いが、同時に、大規模生産に使用される典型的な生産培地中に含有されるアミノ酸の量より有意に低い。
【００６０】
生産培地中の多量のアミノ酸は、特に大規模またはさらに産業規模でポリペプチド生産を実施するとき、高い生産性および高い品質に重要であると考えられる。特に生産期中に使用される細胞培養培地において、多量の塩化コリンの存在によって、個々のアミノ酸の量が制限されることが現在分かっている。
【００６１】
本発明の第一の態様の、この任意選択の修飾による細胞培養培地中の個々のアミノ酸の含有物は、ｍｍｏｌ／ｌで表す以下の量で以下のアミノ酸：
アルギニン  ４．０〜６．０、好ましくは４．５〜５．５
アスパラギン  ３．０〜６．０、好ましくは４．０〜５．５
アスパラギン酸  ２．５〜４．０、好ましくは３．０〜３．６
グリシン  ０．３〜０．８、好ましくは０．５〜０．７
ヒスチジン  ０．６〜１．０、好ましくは０．７〜０．９
イソロイシン  ２．０〜５．０、好ましくは３．０〜４．０
ロイシン  ３．０〜７．０、好ましくは３．５〜６．０
リシン  ２．０〜４．０、好ましくは２．５〜３．５
メチオニン  １．０〜１．５、好ましくは１．２〜１．４
フェニルアラニン  １．０〜２．０、好ましくは１．３〜１．８
プロリン  ２．５〜６．０、好ましくは３．０〜５．５
セリン  ３．０〜８．０、好ましくは４．０〜７．０
スレオニン  ２．０〜３．５、好ましくは２．５〜３．１
トリプトファン  ０．４〜１．０、好ましくは０．５〜０．８
バリン  ２．５〜５．０、好ましくは３．０〜４．５
グルタミン  ６．０〜１０．０、好ましくは７．５〜９．０
チロシン  １．０〜２．０、好ましくは１．２〜１．８
シスチン  ０．５〜１．０、好ましくは０．６〜０．８
を含む。
【００６２】
同時に、塩化コリン濃度は前述の通り、すなわち６０ｍｇ／Ｌ〜２５００ｍｇ／Ｌの範囲内であり、好ましい範囲および値も前述の通りである。さらに、細胞培養培地中のアミノ酸の全濃度は同時に２０〜５７ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましい範囲および値も前述の通りである。
【００６３】
塩化コリンの高含有量のため、アミノ酸のそれぞれの量は、ポリペプチドの大規模生産用に使用する、他の細胞培養培地において使用する量より有意に低くてよい。言い換えると、多量の塩化コリンの添加によって、細胞増殖、細胞生存率およびポリペプチド力価の低下なしに、大部分のアミノ酸の量を有意に減らすことができる。これには、低濃度の大部分のアミノ酸を含む細胞培養培地を使用することができ、それによって可溶性が低い細胞培養培地の成分が沈殿する問題を回避できる技術的利点がある。さらに、細胞培養培地に関する有意なコストの低下が達成されるが、ポリペプチド産物の全体的性質および収率は影響を受けず、またはさらに改善される可能性がある。以下に記載するように、組換えポリペプチド産物の凝集は、本発明による細胞培養培地の使用によって減らすことが可能である。さらに、グリコシル化パターンの改善または組換えポリペプチドの凝集低下などの他のタンパク質品質特性のような、より良い翻訳後修飾も得られている。いくつかの場合、本発明によって開示する細胞培養培地の修飾は、細胞生存率および細胞増殖、ならびに結果としてポリペプチド力価の改善も手助けする。
【００６４】
用語「細胞培養培地」は、長時間にわたり細胞を増殖するのに使用することができる栄養素の水溶液を指す。典型的には、細胞培養培地は以下の成分を含む。通常、炭水化物化合物、好ましくはグルコース、アミノ酸、好ましくは全必須アミノ酸および非必須アミノ酸を含めたアミノ酸の基底集合、ビタミン、および／または低濃度で必要とされる他の有機化合物、遊離脂肪酸、および微量元素、無機塩を含めた無機化合物、緩衝化合物およびヌクレオシドおよび塩基であるエネルギー源。
【００６５】
用語「増殖培地」は、生産プロセス全体の増殖期中に通常使用される細胞培養培地を指す。増殖期は、高い細胞増殖および低いポリペプチド生産によって主に特徴付けられる、培養／生産プロセス全体の第一期である。増殖期は細胞を増殖する目的を果たし、指数関数的増殖期中に生産用バイオリアクターに接種するのに適した数の細胞を生成することを意味する。
【００６６】
用語「生産培地」は、生産プロセス全体の生産期中に通常使用される細胞培養培地を指す。生産期は、多量の産物を生産する目的を果たす、培養／生産プロセス全体の第二期である。生産期中、細胞は、可能な限り生存および生産形態で維持されなければならない。
【００６７】
例えば治療活性がある組換えポリペプチドを産生するための、製薬産業の分野における細胞培養培地の使用は、安全性および汚染の問題のため、生物起源の任意の物質の使用を一般に可能にしない。したがって、本発明による細胞培養培地は、無血清および／または無タンパク質培地であることが好ましい。用語「無血清および／または無タンパク質培地」は、組織加水分解物、ウシ胎児血清などのような動物源由来の添加剤を含有しない化学的に完全に定義された培地を表す。さらに、タンパク質、特にインスリン、トランスフェリンなどのような成長因子も、本発明による細胞培養に加えないことが好ましい。さらに、本発明による細胞培養培地は、大豆、小麦または米ペプトンまたは酵母加水分解物などのような、加水分解タンパク質源を補充しないことも好ましい。
【００６８】
本発明による細胞培養培地は、様々な細胞培養プロセス中で使用することができる。細胞の培養は、接着培養、例えば単層培養、または好ましくは浮遊培養で実施することができる。
【００６９】
例えばバイオテクノロジー産業において確立した様々な発酵プロセスによって、細胞の大規模培養を使用することができる。本発明による細胞培養培地を使用して、灌流およびケモスタットのような不連続および連続細胞培養プロセスを利用することができる。反復フェドバッチおよび反復バッチを含めた不連続プロセスは、好ましい一実施形態である。
【００７０】
バッチ細胞培養は、フェドバッチ培養または単純バッチ培養を含む。用語「フェドバッチ細胞培養」は、細胞および細胞培養培地を最初に培養容器に供給し、他の培養栄養素を、培養の停止前に定期的な細胞および／または産物採取有りまたは無しで培養プロセス中に、培養物に連続的または不連続な増加で供給する、細胞培養を指す。用語「単純バッチ培養」は、細胞および細胞培養培地を含めた細胞培養に関する全ての成分を、培養プロセスの開始時に培養容器に供給する手順に関する。
【００７１】
本発明による細胞培養培地中で培養する細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【００７２】
本発明による細胞培養および細胞培養培地から産生することができるポリペプチドは制限されない。ポリペプチドは組換え型または非組換え型であってよい。本明細書で使用する用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合により接合した３つ以上のアミノ酸の鎖で構成される分子、２本以上のこのような鎖を含有する分子、例えばグリコシル化によってさらに修飾された１本または複数本のこのような鎖を含む分子を包含する。用語ポリペプチドはタンパク質を包含するものとする。
【００７３】
本発明による細胞培養および細胞培養培地によって産生される好ましいクラスのポリペプチドは、組換え抗体である。
【００７４】
用語「抗体」は広義に使用し、（完全長モノクローナル抗体を含めた）モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ナノボディ、修飾抗体、抗体のサブユニット、抗体誘導体、人工抗体、抗体とタンパク質の組合せ、および望ましい生物活性を示すほど十分長い抗体断片を具体的には含む。本明細書で使用するモノクローナル抗体はヒト抗体であってよい。
【００７５】
しかしながら、抗体以外のポリペプチド、例えば、膜貫通タンパク質、受容体、ホルモン、増殖因子、プロテアーゼ、凝固および抗凝固タンパク質、阻害剤タンパク質、インターロイキン、輸送因子、融合タンパク質などのようなポリペプチドを、本発明による細胞培養および細胞培養培地を使用して産生することもできる。細胞培養培地はウイルスの生成に使用することもできる。
【００７６】
このような細胞培養プロセスから得られる産物は、医薬調製物の調製に使用することができる。用語「医薬調製物」は、哺乳動物、特にヒトへの投与に適した、またはそれに適合する組成物を指す。さらに、本発明による（１つまたは複数の）タンパク質は、薬学的に許容される界面活性剤、レシピエント、担体、希釈剤および賦形剤などの、生物学的活性剤の他の成分と一緒に投与することができる。
【００７７】
本発明による細胞培養培地中の多量の塩化コリンの存在によって、高密度での細胞増殖をサポートする培地の能力に悪影響を与えずに、細胞培養培地中のアミノ酸含有量を低下させることが可能であり、同時に高いポリペプチド力価を可能にする。この影響は、生産プロセス全体の生産期に特に重要である。
【００７８】
多くの実験は、ごく少量の塩化コリンと組合せて高濃度の選択アミノ酸を含む従来の生産培地と比較したとき、本発明による細胞培養培地によって、さらに良い性能パラメーターが得られることをさらに明らかにしている。
【００７９】
特定の理論に拘束されることなく、リン脂質前駆体コリンの濃度は、他のリン脂質以外の細胞膜の完全性および機能を保つのに必要な、必須細胞膜成分ホスファチジルコリンの量と関係があると考えられる。低コリン含有量の培地中で増殖する細胞は、コリンが非必須培地成分であり細胞がそれを独立して合成することができるに違いないとしても、培養プロセス中この基質中で、したがってホスファチジルコリン中で限られると考えることができる。しかしながら、不活性または限定的経路は、限られた量のコリンが十分な量のホスファチジルコリンを生成するのに利用可能である理由であり得る。これが、膜、特に小胞体およびゴルジ複合体の膜の「異常な」組成をもたらす可能性がある。これは、これらの膜の機能に悪影響を与え、細胞内のポリペプチド発現率またはポリペプチド輸送を低減する可能性がある。ホスファチジルコリン欠損ＣＨＯ細胞におけるゴルジ複合体から原形質膜へのポリペプチド輸送の阻害は、Testerink et al. (2009;Journal of Lipid Research, Vol 50, 2182-2192)によって示された。この欠陥は外因性ホスファチジルコリンの添加によって救済することが可能である。
【００８０】
いくつかの重要な利点は、本発明による細胞培養培地の特異的組成に起因する。
【００８１】
第一に、本発明による細胞培養培地中のアミノ酸の全含有量を減らすことによって、細胞増殖、生存細胞密度およびポリペプチド生産性の点で、類似またはさらに改善された技術性能パラメーターで細胞培養プロセスを実施することができ、一方で同時に、細胞培養中のアミノ酸またはいくつかの選択アミノ酸の全含有量を減らすことによって、細胞培養培地に関する限り、コスト低減により生産プロセスのより良い全体的経済収支をもたらす。
【００８２】
第二に、本発明による細胞培養培地は、細胞培養培地中に含有される成分、特に比較的高濃度で培地中に含有される疎水性アミノ酸の沈殿のリスクを回避する。これは培地の保存中に特に有利である。これらの成分に関して、低濃度は、細胞増殖およびポリペプチド生産中の、必須基質の供給の悪化の回避に役立つ。これは生産プロセス全体の生産期中に特に有益である。
【００８３】
第三に、本発明による細胞培養培地は、高品質を有する組換えポリペプチドの生成を可能にする。形成されるポリペプチドの凝集は低下し、細胞は、より良い翻訳後修飾でグリコシル化パターンも改善されたポリペプチドを生成することができる。
【００８４】
組換え発現中に形成されるポリペプチドの凝集は、低い産物収率をもたらす技術上の問題点である。さらに凝集は、機能活性があるポリペプチド産物を精製するのを一層困難にする。
【００８５】
したがって、実際の生産プロセス中に可能な限り、形成されるポリペプチド産物の凝集を減らすことが望ましい。本発明による細胞培養培地は、典型的な生産培地と比較すると、組換えポリペプチド産物の凝集の低下をもたらすことが分かっている。
【００８６】
多くのポリペプチドは、翻訳後修飾、特にポリペプチドグリコシル化に曝される。結果として生じるポリペプチドは、共有結合したオリゴ糖鎖を含む。グリコシル化は、ポリペプチド機能の重要なメディエーターとして知られている。したがって、内因性グリコシル化構造を正確に模倣する組換えポリペプチド生産に使用する宿主細胞系の能力は、品質の重要な態様である。組換えポリペプチドの治療有効性は、免疫原性が原因の不適切なポリペプチドグリコシル化、および不適切にグリコシル化したポリペプチドの投与後に低減するｉｎ  ｖｉｖｏ半減期によって強く影響を受ける可能性がある。
【００８７】
一般にマンノシル化は、特に組換え抗体の分野で、組換えポリペプチド生産における重要な態様と考えられる。ポリペプチドの高マンノシル化を回避することは、組換えポリペプチド生産における一般的な目的である。したがって、組換えポリペプチドの生産中に可能な限り高マンノシル化を低減することは、重要な目的である。
【００８８】
本発明による細胞培養培地は、非常に低度の高マンノシル化がある組換えポリペプチドの生産を可能にする。この技術効果は、典型的な生産培地に関して特に有意である。例えば、本発明による細胞培養培地を使用した発現から得た組換えポリペプチドの全体量の、高マンノシル化がある高マンノシル化組換えポリペプチドの相対量は、生産培地と比較して約５０％低いことが望ましい。
【００８９】
さらに、本発明による細胞培養培地の使用によって得た組換えポリペプチドには、従来の増殖培地または生産培地の使用によって得た対応するポリペプチドと比較して、高い割合のβ−ガラクトシル化があることが、驚くことに分かっている。
【００９０】
高いコリン濃度を有する培地のさらなる利点は、それが生産期および増殖期用に一培地のみを有することを可能にし、時間および資源を節約することである。
【実施例】
【００９１】
以下の実験は、本出願において定義する本発明をさらに例示するものとする。
【００９２】
細胞培養培地の記載
３種の以下の培地を試験する：
低コリン増殖培地、すなわち４０ｍｇ／Ｌの塩化コリン含有量を有する培地（対照１）；
生産培地（対照２）；
高コリン増殖培地、すなわち、追加量の２００ｍｇ／Ｌの塩化コリンを補充して２４０ｍｇ／Ｌの塩化コリン全含有量にした、低コリン増殖培地。
【００９３】
最初の２種の培地（低コリン増殖培地および生産培地）は比較目的のみで使用し、一方で塩化コリンの含有量が高い第三の培地は本発明による培地を表す。
【００９４】
低コリン増殖培地は、細胞培養物の成長および増殖用に設計した典型的な培地である。この培地は高密度の細胞に到達するまで細胞の培養を可能にし、これは大規模ポリペプチド生産に関する重要な要件である。しかしながら、低コリン増殖培地は細胞培養からのポリペプチド生産用には設計されていない。５１．１ｍｍｏｌ／Ｌの培地中のアミノ酸全濃度を考慮すると多くのアミノ酸の含有量は低度〜適度であるからである。
【００９５】
低コリン増殖培地のアミノ酸組成は以下の通りである：
【００９６】
【表１】
2013524826.tif 000005
【００９７】
低コリン増殖培地とは対照的に、第二の培地（生産培地）は、細胞培養を使用する大規模ポリペプチド生産に有用な培地である。この生産培地は、低コリン増殖培地と比較したとき、より多量の大部分のアミノ酸を含有するが（培地中のアミノ酸全濃度は９０．５０ｍｍｏｌ／Ｌである）、他の成分の量は基本的に同一である。
【００９８】
使用した生産培地のアミノ酸組成は以下の通りである：
【００９９】
【表２】
2013524826.tif 000006
【０１００】
この比較生産培地中の塩化コリンの含有量も、低コリン増殖培地中より有意に高い。従来技術から知られている生産培地が、さらに少量の塩化コリンを通常含有することを記すことは重要である。したがって、比較生産培地中の塩化コリンの高含有量は、それらの塩化コリン含有量が知られている増殖培地と通常違わない従来技術から知られている生産培地との重要な違いとして考えなければならない。
【０１０１】
第三の培地は、高コリン増殖培地、すなわち、２４０ｍｇ／ｌの塩化コリン全含有量をもたらす２００ｍｇ／ｌの塩化コリンを補充した低コリン増殖培地によって表される、本発明による培地である。塩化コリンの高含有量以外、本発明による第三の培地は、依然典型的な増殖培地として考えることができる。
【０１０２】
これらの実施例は、生産期中に使用したとき、低コリン増殖培地のような増殖培地中の、多量の塩化コリンによって得られる顕著な改善を実証し、塩化コリンの含有量が高いこのような増殖培地は、細胞増殖、細胞生存率およびポリペプチド力価の点で少量の塩化コリン補充培地よりはるかに優れているだけでなく、同じ態様で等しく多量の塩化コリンを含む生産培地よりさらに優れていることを実証する。多量の塩化コリンの添加は、正常増殖培地において、より良い細胞増殖および生存率、および改善されたポリペプチド力価を得るのに役立つ。
【０１０３】
実験設定
実験用に、無血清、無タンパク質培地条件に適合させることによって、ｄｈｆｒ（＋）ＣＨＯ−Ｋ１細胞系ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１に由来する親ＣＨＯ細胞系を使用する（Kao et. al., Genetics, 1967, 55, 513-524; Kao et. al., PNAS, 1968, 60, 1275-1281; Puck et. al., J. Exp. Med., 1958, 108, 945-959）。この親細胞系の３アリコートをトランスフェクトして、それぞれ３つの異なるモノクローナル抗体ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３を発現させる。
【０１０４】
振とうフラスコの実験（実験１〜３）
全９本の振とうフラスコ（各実験用に３個）を、培地以外同じ条件下で操作する。条件は、１日当たり２および０．４％の初期培養体積の供給率で第３日および第５日において開始する１日２回の大量供給でのフェドバッチ培養、第５日における３６．５℃から３３℃への温度変動、インキュベーター中に１０％のＣＯ２、１５０ｒｐｍの振とう速度（ストローク半径＝２５ｍｍ）を含む。細胞の細胞増殖／生存率および結果として生じる発現組換え抗体の力価を決定する。
【０１０５】
ａ）実験１
図１および２は、細胞増殖および生存率の点で、実験１中で培養したｍＡｂ１発現細胞に関して得た結果を示す。
【０１０６】
図１および２中に示すように、塩化コリンの含有量が高い本発明の培地（高コリン増殖培地）は、塩化コリンの含有量が低い低コリン増殖培地と比較したとき、最大生存細胞密度の５３％の増大、および生存率の緩慢な低下を示す。
【０１０７】
図３は、ポリペプチド力価の点で、実験１中で培養した細胞に関して得た結果を示す。
【０１０８】
図３中に示すように、塩化コリンの含有量が高い本発明の培地（高コリン増殖培地）において得た組換え抗体のポリペプチド力価は、ごく少量の塩化コリンを有し単に典型的な増殖培地を表す低コリン増殖培地と比較して、第１３日で３３０％のポリペプチド力価の増大を示す。
【０１０９】
図３は、塩化コリンの含有量が高い本発明の培地は、生産培地から得られる力価より若干高いポリペプチド力価の獲得をさらに可能にすることも明らかにする。
【０１１０】
ｂ）実験２
図４および５は、細胞増殖および生存率の点で、実験２中で培養したｍＡｂ２発現細胞に関して得た結果を示す。
【０１１１】
図４および５により示すように、塩化コリンの含有量が高い本発明の培地（高コリン増殖培地）は、ごく少量の塩化コリンを有する低コリン増殖培地と比較したとき、細胞増殖に対してごくわずかな影響を有するが、プロセスの最後に有意に高い生存率を与える。
【０１１２】
図６は、ポリペプチド力価の点で、実験２中で培養した細胞に関して得た結果を示す。
【０１１３】
図６は、低コリン増殖培地と比較したときの、本発明による細胞培養培地に関する、第１１日におけるポリペプチド力価の８５％の増大を明らかにする。さらに、本発明による細胞培養培地において得たポリペプチド力価は、等しく高含有量の塩化コリンを有する生産培地において得たポリペプチド力価と比較したときさらに高い。
【０１１４】
ｃ）実験３
図７および８は、細胞増殖および生存率の点で、実験３中で培養したｍＡｂ３発現細胞に関して得た結果を示す。
【０１１５】
図７および８により示すように、ごく少量の塩化コリンを含む比較用細胞培養培地（低コリン増殖培地）と比較したとき、本発明による細胞培養培地を用いた培養プロセスの最後に高い細胞生存率を得る。
【０１１６】
図９は、ポリペプチド力価の点で、実験３中で培養した細胞に関して得た結果を示す。
【０１１７】
図９は、本発明による細胞培養培地において得たポリペプチド力価は、比較用培地、低コリン増殖培地と比較したとき、第１１日において１４５％増大することを明らかにする。さらに本発明による細胞培養培地に関するポリペプチド力価は、塩化コリンの含有量が高い生産培地を使用することにより得る力価より若干高い。
【０１１８】
生産培地における高濃度の塩化コリンの使用は、２４０ｍｇ／Ｌの標準塩化コリン量を有する生産培地の使用と比較したとき、改善された細胞増殖またはポリペプチド力価をもたらさなかったことが、実験によってさらに確認されている。
【０１１９】
以下の追加実験を実施して、ポリペプチド品質に対する細胞培養培地の影響を決定する。特に、産物を分析して、凝集およびグリコシル化に対する培地の影響を決定する。
【０１２０】
図１０は、全量の組換え抗体と比較した組換え抗体産物の凝集率を示す。本発明による細胞培養培地における凝集率は、生産培地と比較して３０％超低減する。
【０１２１】
異なる細胞培養培地におけるｍＡｂ３の発現、次に組換え抗体のグリコシル化パターンの分析は、塩化コリンの含有量が高い本発明による増殖培地は、望ましくないグリコシル化パターンを表す高マンノシル化を含む、組換え抗体および少量の全組換え産物をもたらすことを示す。本発明による培地の使用は、生産培地の使用と比較して、高マンノシル化の点で５５％を超える低減をもたらす。
【０１２２】
バイオリアクターにおけるフェドバッチ操作（実験４）
以下の実験は、バイオリアクターにおけるフェドバッチ操作である。それは前述の実験３に相当する。ｍＡｂ３を発現する細胞を使用した。条件は以下の通りである。２Ｌの開始体積、１日当たり２および０．４％の初期培養体積の供給率で第３日および第５日において開始する２つの異なる供給液の連続供給、第５日における３６．５℃から３３℃への温度変動、ｐＯ２＝３０％、ｐＨ＝６．９（不動帯０．１）、ＣＯ２および０．５ＭのＮａＯＨで制御、振とう速度＝３００ｒｐｍ。
【０１２３】
図１１および１２は、バイオリアクターにおけるフェドバッチ操作として実施した実験４中の、細胞の生存細胞密度および生存率に関して得た結果を示す。
【０１２４】
細胞の細胞増殖および生存率に関して、バイオリアクターにおけるフェドバッチ操作からの結果は、振とうフラスコ実験において得た結果と一致する。すなわち、バイオリアクターにおけるフェドバッチ操作は基本的に、振とうフラスコ実験において得た結果を確認する。
【０１２５】
振とうフラスコ実験中と同様に、生産培地において得たピーク生存細胞密度は、塩化コリンの含有量が高い本発明の細胞培養培地（高コリン増殖培地）と比較して若干高かった。しかしながら、本発明の細胞培養培地、すなわち高含有量の塩化コリンを補充した培地を使用して、ごく少量の塩化コリンを有する非補充増殖培地と比較したとき、生存率は有意に高いレベルに留まった。
【０１２６】
図１３は、バイオリアクターにおけるフェドバッチ操作として実施した実験４中の、ポリペプチド力価に関して得た結果を示す。
【０１２７】
塩化コリンの含有量が高い本発明の細胞培養培地に関して第１１日において測定したポリペプチド力価は、ごく少量の塩化コリンを有する比較増殖培地と比較したとき１７０％増大した。
【０１２８】
塩化コリンの含有量が高い本発明の細胞培養培地に関して得たポリペプチド力価は、振とうフラスコ実験において比較目的で生産培地の使用により得たポリペプチド力価よりも優れてさえいるが、バイオリアクターにおけるフェドバッチ操作での実験は、生産培地と比較して、塩化コリンの含有量が高い本発明の細胞培養培地における若干低いポリペプチド力価を明らかにする。それにもかかわらず、塩化コリンの含有量が高い本発明の細胞培養培地の使用により、バイオリアクターにおいて得たポリペプチド力価は非常に高く、比較目的で生産培地の使用により得たポリペプチド力価と依然匹敵するレベルである。
【０１２９】
バイオリアクターにおける実験４は、塩化コリンの含有量が高い本発明の細胞培養培地は、各細胞培養培地中のアミノ酸の全量または選択アミノ酸の量を有意に低減することができる一方で、匹敵するポリペプチド力価の獲得を可能にすることによって、従来の生産培地の適切な代替となることをさらに確認する。
【０１３０】
バイオリアクターにおける実験４は、ポリペプチド生産用の増殖培地を使用するとき、典型的な増殖培地中の塩化コリン含有量の増大は、ポリペプチド力価の多大な増大を得るのに役立つことも再度証明する。
【０１３１】
増殖培地への異なる濃度の塩化コリンの添加
さらなる実験組では、塩化コリンを様々な濃度（４０；８０；１２０；１６０；２００；２４０；５００；８４０；１０００；３０００および５０００ｍｇ／ｌ、合計）で粉末状増殖培地に加える。このようにして得た培地は、概略的に前述したように、それぞれｍＡｂ３およびｍＡｂ４の生成に使用する。
【０１３２】
培養の全期間にわたる（それぞれ１３、１７日）、ｍＡｂ３に関する標準抗体濃度、標準生存細胞密度、および生存率、およびさらにｍＡｂ４に関する標準細胞特異的生産性を、図１４〜図２４中にさらに示す。
【０１３３】
これらのデータから見ることができるように、培養１３または１７日後に生存率および抗体濃度に関する最小値を、合計４０ｍｇ／ｌの塩化コリンを有する増殖培地において得る。３０００ｍｇ／ｌ以上の濃度が細胞の生存率に悪影響を与えることはないが、細胞はこれらの培地中では増殖しないので、抗体濃度は１未満に留まる。４０ｍｇ／ｌを超える全てのコリン濃度に関して生存率は高い。生存率に対する塩化コリンの濃度依存的影響があるようである。培地中の高い塩化コリン濃度は、培養の末期に高い生存率をもたらした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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