(57)【要約】本発明は、１型糖尿病発症のリスクを診断する方法と１型糖尿病発症を予防する方法とを含む。個体の遺伝的背景、メタボローム、抗体及び腸内微生物叢多様性を診断に用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）糞便試料を準備する工程と
（ｂ）該試料のクロストリジウム・レプツム群の多様性を分析する工程と
（ｃ）結果を健常個体から得た対照試料と比較する工程と
（ｄ）該被検体試料と該対照試料との間の相違を決定する工程と
を備え、クロストリジウム・レプツム群の細菌の多様性の低下が１型糖尿病リスクの増加を示す、個体における１型糖尿病リスクを診断する方法。
【請求項２】
試料におけるクロストリジウム・レプツム群の細菌の多様性を、
（ａ）試料からＤＮＡを抽出し、
（ｂ）プライマー５’−ＧＣＡＣＡＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴ−３’及びプライマー５’−ＣＧＣＣＣＧＧＧＧＣＧＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＧＧＧＧＧＧＧＴＴＴＴＲＴＣＡＡＣＧＧＣＡＧＴＣ−３’でＰＣＲを行い、
（ｃ）直線変性勾配を有するアクリルアミド−ビスアクリルアミド（３７．５：１）ゲルを用いてＤＧＧＥ分析を行い、
（ｄ）該ＤＧＧＥゲルを分析する
ことで決定し、クロストリジウム・レプツム群の細菌の多様性の低下が１型糖尿病リスクの増加を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
個体における１型糖尿病リスクの増加を診断する方法であって、
（i）被検体と健常対照個体との間で血清代謝物の濃度差を決定する工程と、
（ii）該個体の血清において一つ以上の糖尿病関連自己抗体(ＡＢ)（インシュリン抗体(ＩＡＡ)、グルタミン酸脱炭酸酵素自己抗体(ＧＡＤＡ)、膵島細胞自己抗体(ＩＣＡ)）の発生を決定する工程とを備え、
[Ａ]健常個体と比較したＡＢ陰性個体における代謝物レベルの上昇若しくはＡＢ陽性個体における代謝物レベルの低下が１型糖尿病リスクの増加を示すか、又は[Ｂ]健常個体と比較したＡＢ陰性個体における代謝物レベルの低下若しくはＡＢ陽性個体における代謝物レベルの上昇が１型糖尿病リスクの増加を示す、方法。
【請求項４】
[Ａ]の場合の代謝物がリゾホスファチジルコリンである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
個体の遺伝的背景を評価する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも一種のクロストリジウム属系統菌株群ＩＶ（クロストリジウム・レプツム群）の細菌又はその代謝物を個体に投与することにより、該個体における１型糖尿病の発症を予防する方法。
【請求項７】
前記個体は、１型糖尿病リスクが高いか又は１型糖尿病の発症に対して感受性である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記クロストリジウム・レプツム群の細菌の多様性の低下を診断することによって前記感受性又はリスクの増加を測定する、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記投与される細菌が非病原性である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は個体における１型糖尿病リスクの増加を診断する新規な方法に関する。本発明は更に、個体における１型糖尿病の発生を予防する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景、特に、実施に関して更なる詳細を提供する事例の背景を明らかにするために本明細書中で用いる刊行物及びその他の資料を、参照により援用する。
【０００３】
１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）は、膵島におけるインシュリン産生β細胞の選択的破壊から生じる自己免疫疾患である。通常、Ｔ１Ｄの診断には、膵島自己抗体陽性への抗体陽転（参考文献１）及びわずかな代謝障害（参考文献２）を含む長い前駆期が先行する。子供及び青少年の間のＴ１Ｄ発生率は、最近の数十年の間に欧米諸国で著しく増加しており（参考文献３）、現在これまでにないほど速い速度で増えている（参考文献４及び５）。このことは、Ｔ１Ｄ発病における環境及び遺伝環境の相互作用の重要な役割を示唆する。
【０００４】
メタボロームは、慢性疾患に対する感受性に後で影響を及ぼす遺伝的要因と初期環境要因双方に対して敏感である（参考文献６）。血清メタボロミクスからの最近の知見は、後にＴ１Ｄに進行する子供において代謝障害がβ細胞自己免疫マーカーより前に先行することを示唆する（参考文献２）。しかしながら、これら障害をもたらす環境原因及び組織特異的メカニズムは不明である。一般集団においてまた遺伝的リスクがある被検体群においてでさえ比較的低いその疾患発生率（参考文献１）を考慮すると、ヒトにおけるＴ１Ｄ発病の初期現象についての研究は、経過観察中の充分な数の被検体が顕性疾患に進行した時点で該疾患の「起源に遡る」ことを可能にするために多数の被検体の長期的かつ頻繁な経過観察を必要とすることから（参考文献２、７及び８）、大事業である。
【０００５】
非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスはＴ１Ｄの研究で幅広く用いられている自己免疫疾患の充分に特徴付けられたモデルである（参考文献９）。ＮＯＤ実験モデルが人間における免疫系及びＴ１Ｄ発病を完全に模倣しないことは明らかである（参考文献１０）。実際に、ＮＯＤマウスのごく一部のみが疾患まで進行し、自然発症糖尿病の発生率はメスで６０％〜８０％でありオスで２０％〜３０％である（参考文献９）。このようにＮＯＤマウスにおけるＴ１Ｄ発病に関して確率的要素が存在し、膵島特異的Ｔ細胞のランダムな発生によると考えられる（参考文献１１）。該疾患の発生率は環境に依存するようであり、その発生率が相対的に無菌の環境で最も高いこと（参考文献１２）及び腸内微生物叢が宿主の先天的な免疫系の変調を介してその発生率に影響し得ること（参考文献１３）を示す証拠がある。
【０００６】
国際公開第２００８／０３１９１７号公報は、体液代謝物プロファイルを１型糖尿病リスクの早期予測用ツールとして用いることを教示する。正確度を向上させるために代謝物レベルの低下と関連した糖尿病関連自己抗体の使用が提案されている。栄養学的介入、抗酸化療法、又はコリンプラスマローゲンの生化学的合成の刺激を該疾患の発症の予測に用いることが提案される。
【０００７】
しかしながら、１型糖尿病リスクが高い１型糖尿病にかかり易い個体を早期識別するための改良された方法が未だ必要である。また１型糖尿病の発症の効果的な予防も必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、
（ａ）糞便試料を準備する工程と
（ｂ）該試料のクロストリジウム・レプツム群の多様性を分析する工程と
（ｃ）結果を健常個体から得た対照試料と比較する工程と
（ｄ）該被検体試料と該対照試料との間の相違を決定する工程と
を備え、クロストリジウム・レプツム群の細菌の多様性の低下が１型糖尿病リスクの増加を示す、個体における１型糖尿病リスクを診断する方法、及び
（i）被検体と健常対照個体との間で血清代謝物の濃度差を決定する工程と
（ii）該個体の血清において一つ以上の糖尿病関連自己抗体(ＡＢ)（インシュリン抗体(ＩＡＡ)、グルタミン酸脱炭酸酵素自己抗体(ＧＡＤＡ)、膵島細胞自己抗体(ＩＣＡ)）の発生を決定する工程とを備え、
[Ａ]健常個体と比較したＡＢ陰性個体における代謝物レベルの上昇若しくはＡＢ陽性個体における代謝物レベルの低下が１型糖尿病リスクの増加を示すか、又は[Ｂ]健常個体と比較したＡＢ陰性個体における代謝物レベルの低下若しくはＡＢ陽性個体における代謝物レベルの上昇が１型糖尿病リスクの増加を示す（図１ｆ）ことを特徴とする更なる方法を提供することである。
【０００９】
発明の一実施形態では、事例[Ａ]で分析する代謝物がリゾホスファチジルコリンである。
【００１０】
本発明は、１型糖尿病リスクを有する個体を膵島自己免疫の発症の前又は付近である初期段階で診断できる相当な利点を提供する。特に、リスクが高い個体は可能な限り早期に診断すべきである。
【００１１】
腸内微生物叢試料は下部消化管から得ることができ、好ましくは、例えば糞便試料である。
【００１２】
初期段階でリスク群に属すると診断された時点で、腸内微生物叢の多様性を正常化することによって、個体における１型糖尿病の発症を予防することができる。具体的に、本発明の目的は、少なくとも一種のクロストリジウム属系統菌株群ＩＶ（クロストリジウム・レプツム群）の細菌又はその代謝物を個体に投与することによって該個体における１型糖尿病の発症を予防する方法を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
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【発明を実施するための形態】
【００１４】
［定義］
本発明に関して、クロストリジウム・レプツム群−クロストリジウム属系統菌株群ＩＶ−の細菌としては、例えば、アセトアナエロバクテリウム・エロンガツム(Ａｃｅｔａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｏｎｇａｔｕｍ)、アナエロフィルム・アギリ(Ａｎａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ  ａｇｉｌｅ)、アナエロフィルム・ペントソボランス(Ａｎａｅｒｏｆｉｌｕｍ  ｐｅｎｔｏｓｏｖｏｒａｎｓ)、アナエロツルンカス・コリホミニス(Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ  ｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ)、ブチリコッカス・プリカエコルム(Ｂｕｔｙｒｉｃｏｃｃｕｓ  ｐｕｌｌｉｃａｅｃｏｒｕｍ)、クロストリジウム・セルロシ(Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｉ)、クロストリジウム・レプツム(Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｅｐｔｕｍ)、クロストリジウム・メチルペントーサム(Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔｏｓｕｍ)、クロストリジウム・オルビスシンデンス(Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｏｒｂｉｓｃｉｎｄｅｎｓ)、クロストリジウム・スポロスフェロイデス(Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ)、クロストリジウム・ビリデ(Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｖｉｒｉｄｅ)、エタノリゲネス・ハービネンス(Ｅｔｈａｎｏｌｉｇｅｎｅｓ  ｈａｒｂｉｎｅｎｓｅ)、ユウバクテリウム・デスモランス(Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｓｍｏｌａｎｓ)、ユウバクテリウム・シラエウム(Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｒａｅｕｍ)、ユウバクテリウム・プラウティイ(Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｌａｕｔｉｉ)、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ(Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ)、ヒドロゲノアナエロバクテリウム・サッカロボランス(Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｖｏｒａｎｓ)、オシリバクター・バレリゲネス(Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ  ｖａｌｅｒｉｃｉｇｅｎｅｓ)、パピリバクター・シンナミボランス(Ｐａｐｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ  ｃｉｎｎａｍｉｖｏｒａｎｓ)、シュードフラボニフラクター・カピロサス(Ｐｓｅｕｄｏｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ  ｃａｐｉｌｌｏｓｕｓ)、ルミノコッカス・アルブス(Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｕｓ)、ルミノコッカス・ブローミイ(Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒｏｍｉｉ)、ルミノコッカス・カリダス(Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｌｌｉｄｕｓ)、ルミノコッカス・フラベファシエンス(Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ)、スポロバクター・ターミティディス(Ｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｒｍｉｔｉｄｉｓ)、サブドリグラヌルム・バリアビレ(Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ  ｖａｒｉａｂｉｌｅ)及び他の近縁であるが無培養の細菌が挙げられる。
【００１５】
本発明に関して、「非病原性細菌」とは、個体に有害でない細菌を意味する。特に、健常個体の腸内細菌叢に天然に存在する細菌が好ましい。
【００１６】
本発明に関して、「クロストリジウム・レプツム群の細菌の多様性の低下」という表現は、健常個体と罹患個体との間の統計的に有意な相違を意味する（例えば、それぞれ１７アンプリコン対１２アンプリコン）。
【００１７】
本発明に関して、「代謝物」は、好ましくは、リゾリン脂質（例えば、ｌｙｓｏＰＣ(１６：０)、ｌｙｓｏＰＣ(１８：０)のようなリゾホスファチジルコリン）、スフィンゴシン−１−リン酸、アラキドン酸、アラキドン酸由来の脂質メディエーター（例えば、プロスタグランジンＥ２又はロイコトリエンＬＴＡ４、ＬＴＢ４）、ドコサヘキサエン酸エイコサペンタエン酸由来の脂質メディエーター（例えば、レゾルビンＥ１及びレゾルビンＥ２のようなレゾルビン、マレシン、プロテクチン）、分枝鎖アミノ酸（バリン、イソロイシン、ロイシン）並びにそれらのケト酸（例えば、ケトロイシン）、グルタミン酸である。
【００１８】
本発明に関して、「健常個体と比較した代謝物レベルの上昇／低下」とは、代謝物の濃度が、膵島自己抗体を持たず１型糖尿病リスクがあると考えられない健常個体における平均濃度に関して規定した設定閾値より上／下であることを意味する。
【００１９】
本発明の一実施形態では、試料中のクロストリジウム・レプツム群の細菌の多様性を次のように決定する：
（ａ）糞便試料からＤＮＡを抽出する；
（ｂ）プライマー５’−ＧＣＡＣＡＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴ−３’及びプライマー５’−ＣＧＣＣＣＧＧＧＧＣＧＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＧＧＧＧＧＧＧＴＴＴＴＲＴＣＡＡＣＧＧＣＡＧＴＣ−３’を用いて、２０ｍＭのトリス−ＨＣＬ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭのＫＣｌ及び２ｍＭのＭｇＣl２を含む反応緩衝液中に１μＬの適当に希釈した鋳型ＤＮＡ、０．４μＭの両プライマー、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１．２５ユニットのＴａｑポリメラーゼ（インビトロジェン社）を含有する３０μＬの総容積でＰＣＲを行う。ＰＣＲプログラムは、９４℃で５分間の初期変性の後に、９４℃で４５秒間の変性、６０℃で３０秒間のプライマーアニーリング及び７２℃で６０秒間の伸長を３０サイクル、そして７２℃で３０分間の最終保持からなる；
（ｃ）ＤＧＧＥ分析は、Ｄｃｏｄｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（バイオ・ラッド社）を用い０．５×ＴＡＥ緩衝液（２０ｍＭのトリス−酢酸、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中で１６時間、８５Ｖ、６０℃にて維持して行う。３０％から６０％（１００％は７Ｍ尿素及び４０％(ｖｏｌ/ｖｏｌ)脱イオンホルムアミド）の直線変性勾配を有する８％アクリルアミド−ビスアクリルアミド（３７．５：１）ゲル上に試料をロードする。このゲルをＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（分子プローブ）で室温にて２０分間染色し、その画像をＧｅｌ  Ｄｏｃ  ＸＲ  Ｇｅｌ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（バイオ・ラッド社）で保存する；
（ｄ）該ＤＧＧＥゲルをＢｉｏＮｕｍｅｒｉｃｓソフトウエア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｓ  ＢＶＢＡ社）で分析する；
ここで、クロストリジウム・レプツム群の細菌の多様性の低下が１型糖尿病リスクの増加を示す。
【００２０】
血清代謝物の測定は、個体、好ましくは子供、の様々な年齢で追跡調査することができ、その結果を診断する子供と同一年齢の対照群と比較する。また診断する子供について様々な血清代謝物を測定することもでき、そのレベルを対照群についての該代謝物のレベルと比較する。
【００２１】
一実施形態では、１種以上の血清代謝物の上述するモニタリングを、子供における自己免疫の発生のモニタリング及び／又は１型糖尿病を発症する遺伝的リスクの決定と組み合わせる。
【００２２】
［前糖尿病ＮＯＤマウスにおける長期的な血清リピドミクス］
第一の目的は、ＮＯＤマウスが、後にＴ１Ｄへ進行する子供の長期的研究（１型糖尿病予測及び予防プロジェクト；ＤＩＰＰ）(参考文献２、８)において観察されたリピドームに基づく代謝表現型を反復できる１型糖尿病の良いモデルであるかを検証することである。従って、ＮＯＤマウスを用いたマウス実験を行い、人体実験に用いたプロトコールを検証した（研究１）。合計７０匹のＮＯＤ／Ｂｏｍマウス（メス２６匹）を３週齢から（ａ）糖尿病の発症（進行群）まで又は（ｂ）糖尿病表現型がいない場合には（非進行群）その後メスで３６週齢、オスで４０週齢まで、血清を収集しながら毎週モニターした（図１ａ）。ＤＩＰＰ研究 (参考文献２) と同様に、第一に、同一コロニーのマウスにおける糖尿病の進行個体と非進行個体との間の、初期の前糖尿病のリピドームプロファイルの相違に興味を持った。
【００２３】
合計１１７２試料、すなわち平均してマウス１匹あたり３０試料（メスのマウスから７３３試料及びオスのマウスから４３９試料）を含む２６匹のメスのマウス（１２匹の進行群、１４匹の進行群）及び１３匹のオスのマウス（７匹の進行群、６匹の非進行群）由来の完全な試料系列について、各試料で１５４種の脂質を測定して、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）と質量分析（ＭＳ）とを組み合わせて用いたリピドミーム解析(参考文献２)を行った。糖尿病の進行個体と非進行個体とで脂質濃度を比較すると、生後数週間（３〜１０週）はメスの進行群における全脂質低下傾向によって特徴付けられた一方、糖尿病の発症に近い期間（１５週以降）はトリアシルグリセロール及びリン脂質の上昇によって特徴付けられた（図１ｂ）。オスのマウスではこのような変化は観察されなかった（補足図１）。１０週齢でメスＮＯＤの進行群は非進行群よりも類似した血糖値を有した（図１ｃ）が、驚いたことに、進行群と非進行群との間に体重の差は明らかでないという事実（図１ｅ）にもかかわらず、進行群はグルコース刺激性血漿インスリンレベルと同様に高い空腹時血漿インスリンレベルを示した（図１ｄ）。と共に、これらの結果は、後に糖尿病に進行するマウスが若齢でグルコース刺激性インスリン分泌（ＧＳＩＳ）の上昇により特徴付けられること、又は後に糖尿病に進行するマウスが体重の程度に対して不適当にインスリン抵抗性であることを暗示する。実際、この１型糖尿病への初期発展段階に関連したＧＳＩＳの増加は、後に糖尿病に進行する子供がインスリン自己抗体（ＩＡＡ）陽性への抗体陽転に先立って低い血清ケトロイシンレベルと一層インスリン分泌性のアミノ酸であるロイシンレベルの上昇とにより特徴付けられるという我々の初期の知見（参考文献２、１４）と一致する。
【００２４】
［ヒト及びＮＯＤマウスの前糖尿病リピドームプロファイルのマッピング］  
マウスとヒトとの間で自己免疫性糖尿病の初期代謝表現型の類似性を体系的に研究するため、  メスのＮＯＤマウス及びＤＩＰＰ研究対象児（参考文献２）由来の長期的リピドームプロファイルの比較解析を進めた。しかしながら、遺伝的要因と環境的要因双方に対するメタボロームの感受性（参考文献６）及び可変的な疾患浸透度を考慮すると、リピドームプロファイルは異なるペースで独立に変化し得る。最近、正常発達又は初期疾患発症の期間におけるような経時的な代謝プロファイルの成熟を、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）方法論を用いて得られた代謝状態の点から記述できるという概念を紹介した（参考文献１５）。平均的なリピドームプロファイルの進行を観察する（図１ｂ）代わりに、我々のアプローチは、各個体のリピドームプロファイルをそれぞれのペースで成熟させることを可能にする。かかる個体プロファイルを、基礎となる統計モデルを用いて一連の進行的ＨＭＭ状態（平均脂質プロファイルにより記述される）に捕捉する。
【００２５】
ここで、ＨＭＭ方法論を適用してメスのＮＯＤマウスの長期的リピドームプロファイルを研究し（図２ａ）、若齢（３〜１０週）での代謝状態の進行を記述する３状態ＨＭＭを同定した（図２ｂ）。最初の２つの状態は、それぞれおよそ４週及び６週の平均週齢に相当し、進行群の中でリン脂質及びトリアシルグリセロールの減少により特徴付けられた（図２ｃ）。マウスモデルに特徴が類似する３状態ＨＭＭモデルを、Ｔ１Ｄに進行した子供の長期的研究由来の完全なリピドミクスデータ（参考文献２）にも適用した。ネステッドケース・コントーロール研究は５６人のＴ１Ｄ進行群及び７３人のマッチした非進行群を含み、計１１９６試料、すなわち誕生と糖尿病発症（進行群において）との間で平均して子ども一人当たり９．３試料で構成した。メスのＮＯＤマウスにおけるように、生後１年に相当する初期状態は、低いトリアシルグリセロール及び特異的なリン脂質により特徴付けられた（補足図２）。
【００２６】
糖尿病を呈している子供（補足図２）及び糖尿病を呈しているメスのＮＯＤマウス（図２ｃ）における状態進行の類似性は、リピドームに反映される初期疾患段階が、類似する代謝撹乱を共通に有することを示唆する。しかしながら、全身脂質代謝の相違及びリピドームプロファイルに対する食事関連効果を示す複数種を比較することは、常に難題である。結論として、マウスと人間との間の分子脂質のマッピングは些細なことであり得ない。マウス及びヒトのリピドームプロファイルの進行を比較するため、我々は、２つの種でそれらの依存性を捕捉する新たなマッピングアルゴリズムを適用した（参考文献１６）。このストラテジーを用いることによって種間でリピドームプロファイルを比較することが可能であり、我々は、進行群／非進行群対ヒト／マウスに関する二元配置分析によって疾患影響を捜した。我々は、種間の機能的及び構造的に関係する脂質の関連性を見出し（図２ｄ）、リン脂質の低下と若齢での疾患発症との強い関連性を確かめた（ＨＭＭ状態１）。従って我々は、膵島自己抗体に対する最初の抗体陽転に先立ち子供で認められる脂質変化は、メスのＮＯＤマウスの進行群における初期変化の特徴でもあると結論付けることができる。
【００２７】
［初期糖尿病の進行におけるリゾホスファチジルコリン及びＩＡＡ］
膵島自己抗体陽性への抗体陽転は、後にＴ１Ｄに進行する子供におけるリゾホスファチジルコリン（ｌｙｓｏＰＣ）血清レベルの一時的な上昇と関連する（参考文献２）。ここで、我々は、８週齢のＮＯＤマウスにおけるＩＡＡレベルを測定し、ＩＡＡ陰性（ＩＡＡ−）進行群のメスのＮＯＤマウスはＩＡＡ−非進行群と比較してｌｙｓｏＰＣが上昇したことを同様に確かめた（図１ｆ）。興味深いことに、高ｌｙｓｏＰＣを有するＩＡＡ陽性（ＩＡＡ＋）マウスは糖尿病から保護されたため（図１ｆ）、ＩＡＡ陽性は糖尿病進行と反対の関連性を有した。その疾患進行と反対の関連性のため、ｌｙｓｏＰＣと組み合わせたＩＡＡ測定は、ＮＯＤマウスをその糖尿病発症のリスクに従って階層化するのに役立ち得ることが推測できる。我々は、ＮＯＤマウスを用い「低リスク」群のマウスと比較して４．３倍高い自己免疫性糖尿病リスクがある（９５％下側信頼限界＝２．６、１０００倍リサンプリングから計算）指定した「高リスク」群において自己抗体陽性とｌｙｓｏＰＣ濃度とを組み合わせることにより、進行群と非進行群との間である程度充分に区別された（χ２＝５．７５、Ｐχ2＝０．００４４；補足図３）代理マーカーを得た。
【００２８】
［Ｔ１Ｄリスクに関連した特異的な膵島及び肝臓経路］
独立した実験において、最初の実験と同一コロニー由来の正常血糖のメスのＮＯＤマウスを８週齢（ｎ＝５７）又は１９週齢（ｎ＝１４）で屠殺して、血液、肝臓及び膵臓の試料を集めた（研究２）。上述したアルゴリズムを用いたその後のリスク層別化のために、ＵＰＬＣ／ＭＳに基づく血清リピドミクス解析用に１６匹の８週齢マウス（７匹はＩＡＡ＋）及び１３匹の１９週齢マウス（６匹はＩＡＡ＋）を選択した。糖尿病発症のリスクが高いマウスは、より重篤な膵島炎にかかる傾向を示した（図３ａ）。並行的な肝臓及び膵島のトランスクリプトミクスを１９週齢のマウスに行った。高リスクマウスと低リスクマウスとを比較した場合、ＩＡＡレベルと無関係に、遺伝子セット濃縮解析（Ｇｅｎｅ  Ｓｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：ＧＳＥＡ）(参考文献１７)を用いた膵島遺伝子発現データのパスウェイ解析は、予想した様に高リスク群において様々なアポトーシス経路及び免疫調節経路のアップレギュレーションを示した（表１）。これら経路は、糖尿病リスクと無関係にＩＡＡ＋マウスとＩＡＡ−マウスとを比較した場合にもアップレギュレートしたことから、自己免疫状態と関連していた。ＣＴＬＡ４経路由来のＣＤ３（参考文献１８）、Ｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達経路（参考文献１９、２０）及びＩＬ−７経路（参考文献２１）由来の炎症誘発性ケモカインＣＣＬ５（すなわちＲＡＮＴＥＳ）等、これら経路のアップレギュレートした遺伝子産物の幾つかは自己免疫性糖尿病への進行に関係することが知られている。
【００２９】
［表１．メスのＮＯＤマウスの膵島炎におけるパスウェイ解析］
（１）高い糖尿病リスク（ＨＲ）対低い糖尿病リスク（ＬＲ）及び（２）ＩＡＡ陽性ＬＲ対その他、の２つの異なる比較について偽発見率（ＦＤＲ）ｑ＜０．２５である、最大１０個の有意に影響を受けた経路を示す。ｎ＝１０の１９週齢のメスのＮＯＤマウス（３匹のＩＡＡ＋ＬＲ、２匹のＩＡＡ−ＬＲ、２匹のＩＡＡ＋ＨＲ、３匹のＩＡＡ−ＨＲ）の膵島でトランスクリプトミクスを行った。Ｎ：経路における遺伝子の数、ＮＥＳ：正規化濃縮スコア、Ｓｏｕｒｃｅ：遺伝子リスト情報源。
【００３０】
【表１】
2013524829.tif 000005
【００３１】
高リスクマウスにおいてアップレギュレートした様々な経路は、ＩＡＡ力価に関連しなかった。これら高い糖尿病発症リスクに関連する経路は、主に代謝経路であり、ＴＣＡサイクル及び解糖／糖新生のアップレギュレートした遺伝子を含んだ（表１）。これら経路の代謝産物を直接測定するため、我々は、飛行時間型質量分析計に連結した二次元ガスクロマトグラフィー（ＧＣ×ＧＣ−ＴＯＦＭＳ）を用いて（参考文献２２）膵島のメタボロミクス解析を行った。グルタミン酸及びアスパラギン酸などの幾つかの重要な代謝物だけでなく限界（ｍａｒｇｉｎａｌ）有意水準で全３つの分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）のアップレギュレートも見られたため、メタボロミクスは、高リスクマウスの膵島におけるエネルギー及びアミノ酸の代謝の異常調節を裏付けた（図３ｂ）。これら上昇したアミノ酸はβ細胞における既知のインスリン分泌促進物質である（参考文献２３）。この経路の最上位遺伝子であるグルコース−６−リン酸、触媒、２（Ｇ６ＰＣ２；高リスク群対低リスク群の比＋１１％、Ｐ＝０．００３４）は、肝臓から血流へのグルコース放出を制御する。しかしながら、この研究に含まれた動物は、先の長期的研究におけるように、正常血糖であり、２群間で体重に差はなかった。従って、β細胞及び肝臓における代謝変化は、自己免疫性糖尿病の発症リスクが高いマウスにおいてＧＳＩＳの上昇が観察されたことを説明できる（図１ｃ〜ｅ）。
【００３２】
［Ｔ１Ｄへの進行におけるインスリン抵抗性のマーカー］
臨床研究から、インスリン抵抗性がＴ１Ｄへの進行の危険因子であることの証拠が存在する（引用文献２４、２５）。また、ＮＯＤの遺伝的背景はマウスをインスリン抵抗性にしやすくし得ることも知られている（参考文献２６）。高リスクマウスの観察した代謝表現型について可能性のある説明としてのインスリン抵抗性を検査するため、別のＮＯＤコロニーにおいて２つの独立な研究を行い、ｎ＝３６のメスのＮＯＤ／ＭｒｋＴａｃマウスを８〜１１週齢の間ＧＳＩＳ、グルコース及びインスリン耐性並びに血漿レプチンについて検査し（研究３）、ｎ＝４２のメスのＮＯＤ／ＭｒｋＴａｃを１０週齢で屠殺して膵島炎、血漿レプチン及びアディポネクチンについて検査した（研究４）。先と同様に、血清リピドミクス及びＩＡＡアッセイを行って、マウスを糖尿病高リスク群と糖尿病低リスク群とに階層化した。
【００３３】
高リスクマウスにおけるＧＳＩＳの上昇を確認した（図４ａ）が、恒常性モデル評価（ＨＯＭＡ−ＩＲ）指標又は白色脂肪組織及び筋肉におけるＧＬＵＴ４発現で（補足図４ａ〜ｃ）、群間の腹腔内グルコース又はインスリンに対するグルコース応答に有意な差は認められなかった（図４ｂ〜ｃ）。より高齢なマウスの結果（図３ａ）と同じく、糖尿病発症のリスクが高い１０週齢のメスのＮＯＤマウスは低リスク対照群よりも既により膵島炎にかかる兆候を有しているが、両群における平均の膵島炎の度合いは中程度である（図４ｄ）。驚くべきことに、脂肪組織由来ホルモンであるレプチン（図４ｅ）及びアディポネクチン（図４ｆ）は両方とも、体重又は肥満度に有意な差が無いにも関わらず（補足図４ｄ〜ｆ）高リスクマウスの血漿で上昇した。
【００３４】
［腸内微生物叢の多様性の低下は糖尿病リスクと関連する］
最近、無菌マウスの血清メタボロームが後にＴ１Ｄに進行する子供の前自己免疫メタボロームと類似し（参考文献２７）、従って、Ｔ１Ｄ進行群の腸内微生物叢は重要な構成要素を欠き得るか又は子供をＴ１Ｄに罹りやすくする機能障害を有することを暗示していることを見出した。マウス及び人間で観察した糖尿病進行群のメタボロームの類似性（図２）を前提として、高リスクマウスと低リスクマウスとの間で観察した代謝の相違がそれらの腸内微生物組成の相違に影響され得ることを見出した。
【００３５】
先述した変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を用いた研究２から高リスクマウス及び低リスクマウス由来の盲腸試料の微生物組成を特徴付けた（参考文献２８、２９）。全細菌組成は高リスクマウスよりも低リスクマウスにおいて一貫しており（補足図５）、高リスクマウスの細菌はフィルミクテス門のクロストリジウム・レプツム群の多様性を有意に低下した（図３ｃ）ことを実際に見出した。
【００３６】
［ＩＡＡ陽性と自己免疫性糖尿病からの保護］
抗体陽転後の子供で代謝プロファイルが正常化すること（参考文献２）を前提に、自己抗体の発生が初期の代謝障害に対する生理反応であり得ることを先で提示した。本研究において（研究２のマウス）、メスのＩＡＡ＋低リスクマウスにおいてパスウェイを調査し、それらを他の全ての群に対して比較した。ＩＡＡ＋低リスクマウスは、ＩＬ−４経路及びＩＬ−６経路などの膵島の幾つかのシグナル伝達経路の上昇により特徴付けられた（表１）。ＩＬ−４はＮＯＤマウスで糖尿病から保護してくれることが知られている（参考文献３０）。対照的にＩＡＡ＋低リスクマウスでは、主としてミトコンドリア機能及びＴＣＡサイクル、ＢＣＡＡ異化、ベータ酸化、並びに酸化的リン酸化に関連する経路の発現が減少した。これら経路のダウンレギュレーションがＴ１Ｄに対してどのように保護し得るかは不明である。しかしながら、これら経路のダウンレギュレーションは活性酸素種（ＲＯＳ）産生が減少した状態をもたらし（参考文献３１）、少なくとも部分的にはβ細胞の機能性の保存を説明できる。これは、減少したＲＯＳ産生と糖尿病に進行しないＩＡＡ＋マウスにおけるβ細胞アポトーシスの予防とを関連付ける潜在的な保護メカニズムを提示する。我々の結果は、抗体陽転したが顕性疾患に進行しなかった個体における糖尿病からの保護の点について同様な研究の必要性を強く主張する。
【００３７】
この研究は、大規模臨床研究（参考文献２）からの我々の先の知見の組織特異的状況への翻訳可能性を強調する。また、我々の研究は、特異的代謝障害が、進化段階の初期に識別でき、自己免疫性糖尿病への進行に関係する発症メカニズムと潜在的につながりがあり得ることを目立たせる（補足図６）。
【００３８】
我々の研究は、Ｃ．レプツムのような特定の細菌群の多様性の低下が初期の代謝障害と関連することを暗示する。糖尿病に関連した微生物組成の相違が同一コロニーのマウスの中で観察されたという事実は、観察された微生物多様性の低下が恐らくは免疫性又は代謝性応答の結果であることを示唆する。微生物群落は障害に対し感受性で後にその本来の状態に戻ることができない場合があり（参考文献４４）、腸内微生物叢の多様性の低下は例えば肥満で認められている（参考文献４５）。興味深いことに、Ｃ．レプツム亜群由来の抗炎症性共生細菌であるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイの多様性の低下がクローン病をも特徴付ける（参考文献４６）。
【００３９】
本発明を下記の非限定的実施例により説明する。しかしながら、上記詳細な説明及び実施例で示す実施形態は説明的な目的のみのためのものであり、本発明の範囲内で様々な変更及び改変が可能であることを理解すべきである。
【実施例】
【００４０】
［実験動物及び試料収集］
全実験手法はトゥルク大学の実験動物福祉委員会により認可された。マウスは、固定した１２：１２時間の明暗周期で２１±１℃に保った動物室で飼育した。標準的なげっ歯類用固形飼料（Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｄｉｅｔ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ社、英国、ウィザム）及び水を自由摂取可能にした。用いたＮＯＤ／Ｂｏｍマウスのコロニーは、トゥルク大学の動物施設で繁殖及び維持し、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｅｕｒｏｐｅ社（デンマーク、ライ）から購入したマウスを起源とした。２６匹のメスと４４匹のオスのＮＯＤマウス（研究１）に、３週齢から開始してマウスが糖尿病を発症するまで（２週連続で血糖≧１４．０ｍｍｏｌ）又はメスのマウスが３６週齢、オスのマウスが４０週齢に達するまで毎週、尾静脈から静脈穿刺により血液試料採取を行った。メタボロミクス解析のために血清を分離して−７０℃で素早く凍結させた。８週齢でインスリン自己抗体（ＩＡＡ）の検出用血液試料を尾静脈から収集した。１０週齢で４時間絶食後及び２日間後の腹腔内グルコース（１ｇ／ｋｇ）投与５分後、正午から午後２時の間にインスリン用血漿試料を収集した。正常血糖のメスのＮＯＤ／Ｂｏｍマウスの別の群（研究２）を、８週齢（ｎ＝５７）又は１９週齢（ｎ＝１４）でＣＯ２麻酔下の断頭により屠殺して、血液、肝臓及び膵臓の試料を収集した。
【００４１】
メスのＮＯＤ／ＭｒｃＴａｃの別個の２群（ｎ＝３６及び４２、研究３及び４）は５週齢でＴａｃｏｎｉｃ  ＵＳＡ社（米国ニューヨーク州ハドソン）から供給された。研究３では、８週齢で４時間の絶食後グルコース（１０％ｗｔ／ｖｏｌ、体重１ｋｇあたり１ｇ）を投与して尾静脈血のグルコース及び血清インスリンを測定することによって腹腔内グルコース耐性試験を行った。１０週齢で尾静脈からリピドミクス用及びＩＡＡ用血清試料を収集した。１１週齢で１時間の絶食後ヒトインスリン（体重１ｋｇあたり１．０ＩＵ、プロタファン(Ｐｒｏｔａｐｈａｎｅ)、ノボ・ノルディスク社、デンマーク、バグスバード）を投与することによって腹腔内インスリン耐性試験を行った。研究４では、マウスを１０週齢で４時間の絶食後、麻酔下の心臓穿刺により屠殺した。生殖腺白色脂肪組織（ＷＡＴ）貯留物を注意深く切り離して加重し、肥満症のマーカーとして用いた。ＩＡＡ用、リピドミクス用及びアディポカインパネル解析用の血清試料、生殖腺ＷＡＴ、腓腹筋及びに膵臓の試料を収集し、分析まで−７０℃で保存した。ＨＯＭＡ−ＩＲ、すなわちインスリン耐性の推定値を、空腹時インスリン（μＩＵ／ｍＬ）×空腹時グルコース（ｍｍｏｌ／Ｌ）／２２．５として計算した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４を用いてスチューデントｔ検定又は二元配置ＡＮＯＶＡで統計的有意性を分析した。
【００４２】
［血漿中のグルコース、インスリン、レプチン及びアディポネクチン］
Ｐｒｅｃｉｓｉｏ  Ｘｔｒａ(商標)グルコースモニタリング装置（アボットダイアベティスケア社、イリノイ州）で血糖を測定した。マウスウルトラセンシティブＥＬＩＳＡキット（メルコディア社、スウェーデン、ウプサラ）で、又はＭｉｌｌｉｐｌｅｘマウスアディポカインパネル（ミリポア社、米国マサチューセッツ州ビレリカ）でレプチンとともに、血漿インスリンを分析した。ミリポア製マウスアディポネクチンＥＬＩＳＡキットで血漿アディポネクチンを測定した。
【００４３】
［膵島の単離］
Ｆｉｃｏｌｌ４００（シグマ・アルドリッチ社、米国ミシガン州セントルイス）勾配法（参考文献１ａ）を用いて膵島を単離した。簡単に言うと、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのグルコースを含有するｐＨ７．４のＨＢＳＳ中で、膵臓をコラゲナーゼＰ（０．５ｍｇ／ｍＬ、ロシュ・ダイアグノスティックス社、ドイツ、マンハイム）と共に１７分間インキュベートした。２ラウンドの洗滌後、ペレットを２５％Ｆｉｃｏｌｌ中に再懸濁し、密度２３％、密度２０％及び密度１１％のものを上に重層した。遠心分離後、密度２３％と密度２０％との間の膵島の層を収集し、２回洗滌してから、ペレットをメタボロミクス又はＲＮＡ抽出用溶解緩衝液中での均質化のために急速冷凍した。試料を解析まで−７０℃で保存した。  
【００４４】
［糖尿病の組織病理］
正常血糖のＮＯＤマウス由来の膵臓を凍結切片にした。＞２０μｍの間隔を空けた５μｍ切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色して、膵島炎について次の通りに格付けした。０：目に見える浸潤なし、I：膵島周囲炎、II：＜５０％の膵島浸潤を有する膵島炎、III：＞５０％の膵島浸潤を有する膵島炎。８匹のメスの１０週齢低リスクマウス由来の計６７８個の膵島（６０〜１２３個の膵島／匹）及び８匹の高リスクマウス由来の６３３個の膵島（５９〜１０２個の膵島／匹）、並びに４匹のメスの１９週齢低リスクマウス由来の５２個の膵島（１１〜１７個の膵島／匹）及び３匹の高リスクマウス由来の２８個の膵島（７〜１０個の膵島／匹）を格付けした。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４を用いてスチューデントｔ検定又は二元配置ＡＮＯＶＡで統計的有意性を分析した。
【００４５】
［ＩＡＡアッセイ］
ヒトＩＡＡについて既に文献記載された方法（参考文献２ａ）を少し改変した放射性結合マイクロアッセイ（ＲＩＡ）により、マウスＩＡＡを測定した。マウス血清（２．５μＬ）及び高ＩＡＡ力価を有するヒトから得た血清プールの標準試料の段階希釈物（５μＬ）を、過剰量の未標識ヒト組換えインスリン（ロシュ・ダイアグノスティックス社、ドイツ、マンハイム）の存在下又は不存在下で１５，０００ｃｐｍのモノ１２５Ｉ−(ＴｙｒＡ１４)−インスリン（アマシャムＧＥヘルスケア社、英国、バッキンガムシャー）と共に７２時間インキュベートした。８μＬのプロテインＡ及び４μＬのプロテインＧセファロース（アマシャムＧＥヘルスケア社）を含有する５０μＬのＴＢＴ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．１％ツイーン２０）を加えることにより、抗体複合体を沈降させた。反復洗滌の後、結合放射能を液体シンチレーション検出器（１４５０  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  Ｔｒｉｌｕｘ、パーキンエルマーライフサイエンス・ワラック社、フィンランド、トゥルク）で測定した。全結合から非特異的結合（過剰な未標識インスリン）を差し引くことにより特異的結合を計算して、各プレートについて実行した標準曲線に基づき相対ユニット数（ＲＵ）で表現した。マウスＩＡＡ陽性のカットオフ値は、１６匹のＢＡＬＢマウスで平均値＋３ＳＤＳ、すなわち、１．７９相対ユニット（ＲＵ）に設定した。
【００４６】
［リピドーム解析］
エッペンドルフチューブ中の血清試料（１０μＬ）に１０個の脂質化合物を含有する標準混合物を１試料あたり０．２μｇの濃度レベルで混ぜ、１０μＬの０．９％塩化ナトリウム及び１００μＬのクロロホルム：メタノール（２：１）と混合した。２分間ボルテックスをして１時間静置した後、試料を１０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、下側の有機層６０μＬをバイアルインサートに取り、２０μＬの３つの標識脂質標準試料を１試料あたり０．２μｇの濃度レベルで混ぜた。
【００４７】
Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＬＣ(商標)（ＵＰＬＣ、マサチューセッツ州ミルフォード）に連結したウォーターズＱ−Ｔｏｆ  Ｐｒｅｍｉｅｒ質量分析器でリピドミクス・ランを行った。溶媒系は、（１）１％の１Ｍ  ＮＨ４Ａｃと０．１％のＨＣＯＯＨとを含む水、（２）１％の１Ｍ  ＮＨ４Ａｃ、０．１％のＨＣＯＯＨを含むＬＣ／ＭＳグレードのアセトニトリル／イソプロパノール（５：２）で構成した。６５％Ａ／３５％Ｂから１００％Ｂまでのグラジエントランに６分間かけ、５分間の再平衡化工程を含む全実行時間は１８分であった。カラム（５０℃で実施）はＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ(商標)ＢＥＨ  Ｃ１８（１×５０ｍｍ、１．７μｍ粒子）であり、流速は０．２００ｍＬ／分であった。ＥＳＩ＋モードを用いて脂質をプロファイルし、ｍ／ｚが３００〜１２００の質量範囲でデータを収集した。ＭＺｍｉｎｅソフトウエア（バージョン０．６０）（参考文献３ａ、４ａ）を用いてデータを処理し、脂質同定は内部スペクトルライブラリーに基づいた（参考文献５）。
【００４８】
［メタボローム解析］
ＰＢＳで緩衝化した細胞溶液のタンパク質濃度に応じて、２０〜４０μＬの試料を膵島メタボローム解析用に取り分けた。１０μＬの内部標準標識パルミチン酸−１６,１６,１６−ｄ３（２５０ｍｇ／Ｌ）と４００μＬのメタノール溶媒を試料に加えた。２分間のボルテックスを行い室温で３０分間インキュベートした後、１０,０００ｒｐｍで５分間の遠心分離により上清を分離した。試料を一定流量の窒素ガスの下で乾燥させ、２５μＬのＭＯＸ（１時間、４５℃）及びＭＳＴＦＡ（１時間、４５℃）で誘導体化した。代謝物混合物に５種類のアルカンを含む保持指標標準混合物５μＬ（１２５ｐｐｍ）を加えた。
【００４９】
時間飛行型質量分析器に連結した二次元ガスクロマトグラフィー（ＧＣ×ＧＣ−ＴＯＦ／ＭＳ）によって、膵島試料を分析した。用いた機器は、アジレント・テクノロジー社（カリフォルニア州サンタ・クララ）製アジレントＧＣ６８９０Ｎ及びＣＴＣアナリティクスＡＧ社（スイス、ツヴィンゲン）製ＣｏｍｂｉＰＡＬオートサンプラーを備えたＬｅｃｏ  Ｐｅｇａｓｕｓ  ４Ｄ（Ｌｅｃｏ社、ミシガン州セントジョーゼフ）であった。変調器、二次オーブン及び時間飛行型質量分析器はＬｅｃｏ社製であった。ＧＣは、１：２０の比のスプリットモードで操作した。３９．６ｐｓｉｇの一定圧力のヘリウムをキャリアガスとして用いた。一次元目のＧＣカラムは非極性ＲＴＸ−５カラム（１０ｍ×０．１８ｍｍ×０．２０μｍ、Ｒｅｓｔｅｋ社、ペンシルバニア州ベレフォンテ）であり、極性ＢＰＸ−５０カラム（１．５０ｍ×０．１０ｍｍ×０．１μｍ、ＳＧＥアナリティカルサイエンス社、オーストラリア、リングウッド）に連結していた。温度プログラムは次の通りであった：開始温度５０℃、１分間→２９５℃、７℃／分、３分間。二次オーブンを前記オーブン温度より２０℃高く設定した。注入口及び移送ラインの温度を２６０℃に設定した。二次元分離時間を５秒に設定した。用いた質量範囲は４５〜７００ａｍｕであり、データ収集速度は１００スペクトル／秒であった。Ｌｅｃｏ  ＣｈｒｏｍａＴＯＦソフトウエアを用いて生データを処理してから、社内で開発したソフトウエアＭｙｌｌｙを用いてアラインメントした。社内の参照化合物ライブラリーをＰａｌｉｓａｄｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅマススペクトルライブラリー、６００Ｋ版（Ｐａｌｉｓａｄｅ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ニューヨーク州イサカ）と共に用いて、代謝物を同定した。
【００５０】
［遺伝子発現及びパスウェイ解析］
Ｒｎｅａｓｙミニキット（キアゲンＧｍｂＨ社、ドイツ、ヒルデン）を用いて膵島からのＲＮＡ抽出を行い、肝臓、骨格筋（腓腹筋）及び生殖腺白色脂肪組織からトリゾール試薬（インビトロジェン社、カリフォルニア州カールスバッド）に続いてＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅ Ｉ処理（キアゲンＧｎｂＨ社）を用いてＲＮＡ抽出を行い、Ｒｎｅａｓｙミニキットで精製を行った。マイクロアッセイ分析用の膵島及び肝臓を１９週齢の正常血糖のメスのＮＯＤ／Ｂｏｍマウスから集めた。ＧＬＵＴ４ ｍＲＮＡ発現用の骨格筋及び脂肪組織を１０週齢のメスのＮＯＤ／ＭｒｋＴａｃマウスから集めた。
【００５１】
骨格筋及び生殖腺白色脂肪組織におけるＧＬＵＴ４ ｍＲＮＡを定量リアルタイムＰＣＲにより測定した。Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡキットを製造元のプロトコールに従って用いてｃＤＮＡ合成を行った。リアルタイムＰＣＲは、７３００Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム、ＧＬＵＴ４用の予め設計したＴａｑＭａｎ(登録商標)Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ、及びβ−アクチン用のＴａｑＭａｎ(登録商標)Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ａｓｓａｙで行った。２０μＬのＰＣＲ反応物は、８μＬのｃＤＮＡ、８μＬのＴａｑＭａｎ(登録商標)Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、１μＬのＧＬＵＴ４  ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ、１μＬのβ−アクチンＴａｑＭａｎ  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ａｓｓａｙ及び２μＬのＤＥＰＣ水を含んだ。リアルタイムＰＣＲ用サイクルパラメータは次の通りであった：５０℃を２分間、９５℃を１０分間の後、９５℃１５秒間及び６０℃１分間を４０サイクル。ＧＬＵＴ４  ｍＲＮＡレベルはハウスキーピング遺伝子として用いたβ−アクチンに比例して発現した。比較ＣＴ法及びＲＱ＝２−ΔΔＣＴ式を用いて相対遺伝子発現量を算出した。全試薬はアプライド・バイオシステムズ社（米国カリフォルニア州フォスターシティ）製であった。
【００５２】
アンビオン社（テキサス州オースティン）のＩｌｌｕｍｉｎａ  ＲＮＡ  ＴｏｔａｌＰｒｅｐ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（カタログ番号ＡＭＩＬ１７９１）を用いて３００ｎｇの全ＲＮＡからＲＮＡ増幅を行った。一晩（１４時間）のＩＶＴ反応の間にｃＤＮＡをビオチン化した。増幅の前後でＲＮＡ／ｃＲＮＡ濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００（デラウエア州ウィルミントン）でチェックし、ＲＮＡ／ｃＲＮＡ品質をバイオラッド社（カリフォルニア州ハーキュリーズ）のＥｘｐｅｒｉｏｎ電気泳動ステーションにより制御した。
【００５３】
［ハイブリダイゼーション］１．５μｇの各試料をＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｗｈｏｌｅ−Ｇｅｎｏｍｅ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎプロトコール改訂版Ａに従ってＩｌｌｕｍｉｎａ社のマウスＷＧ−６  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＢｅａｄＣｈｉｐｓバージョン２（ＢＤ−２０１−０６０２）と一晩（１８時間）５８℃でハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションを１μｇ／ｍＬのシアニン３−ストレプトアビジン（ＧＥヘルスケア社、英国、チャルフォント）（カタログ番号ＰＡ４３００１）で検出した。チップをＩｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＡｒｒａｙ Ｒｅａｄｅｒ、ＢｅａｄＳｃａｎソフトウエアバージョン３．５でスキャンした。数値結果をＩｌｌｕｍｉｎａ社のＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏソフトウエアｖ１．０でいかなる正規化も行わずに抽出した。
【００５４】
［処理］Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏソフトウエアからエクスポートしたＢｅａｄ  Ｓｕｍｍａｒｙデータを、Ｒ/Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ（参考文献７ａ）のビーズアレイパッケージ（参考文献６ａ）を用いて次の通りに前処理した。データを、対数（底２）に変換し、分位法（参考文献８ａ）を用いて正規化して、１組のマイクロアレイについてプローブ輝度の分布を均等化した。
【００５５】
［パスウェイ解析］マイクロアレイ遺伝子発現データ解析に通常使用されるパスウェイ解析技術である遺伝子セット濃縮解析（ＧＳＥＡ）（参考文献９ａ）は、コルモゴルフ−スミルノフ様統計量を用いて、最もアップレギュレート又はダウンレギュレートした遺伝子群の中に選択遺伝子セットが濃縮されているかを検査する。マイクロアレイデータのための線形モデル (Ｌｉｎｅａｒ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｄａｔａ：ＬＩＭＭＡ)手法（参考文献１０ａ）は、線形モデルを各遺伝子の発現データにあてはめて、事後残差の標準偏差を用いて修正ｔ統計量を計算し、発現値の遺伝子特異的可変性を説明することにより、示差的に発現した遺伝子を同定する。ここで、遺伝子の示唆的発現を検査するためにＲ/Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージ（参考文献７ａ）及びＬＩＭＭＡ（参考文献１０ａ）を用いた。次に、遺伝子リストをランク付けるために修正ｔ統計量を用いて予めランク付けしたＧＳＥＡ解析を行い、Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）（参考文献１１ａ）、ＧｅｎＭＡＰＰ（参考文献１２ａ）、ＢｉｏＣａｒｔａ (ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ.ｂｉｏｃａｒｔａ.ｃｏｍ)、Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ (ＳＴＫＥ) (ｈｔｔｐ：//ｓｔｋｅ.ｓｃｉｅｎｃｅｍａｇ.ｏｒｇ/)及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ内で企画されているＫＥＧＧ(ＭＳｉｇＤＢ)（参考文献９ａ）のような様々なパスウェイデータベースから遺伝子セットの濃縮を検査した。
【００５６】
［クラスタリング］濃縮経路のリーディングエッジ（ｌｅａｄｉｎｇ  ｅｄｇｅ）遺伝子は、濃縮シグナルを説明する遺伝子である（参考文献９ａ）。ＧＳＥＡにより統計的有意性を見出される選択経路について、全リーディングエッジ遺伝子の平均発現量としてパスウェイプロファイルを計算した。次に、この選択経路のパスウェィプロファイルの行列を選択代謝物プロファイルで補強した。次に、この行列中の数値を自己抗体陰性非進行群（ＩＡＡ−＆ＮＰ）で正規化した、すなわち、可変性の各数値をＩＡＡ−及びＮＰ試料由来の平均値で除算して対数（底２）尺度に変換した。次に、可変性を単位分散にスケール変更した。最後に、クラスター間の距離を計算するためにユークリッド計量完全連結法（参考文献１４ａ）を用いて階層クラスタリングを適用した。数値をクラスタリングしヒートマップとして示すために、ｇｐｌｏｔｓと呼ばれるＲパッケージ（ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ.ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ.ｏｒｇ/）を用いた。  
【００５７】
［微生物解析］
ＦａｓｔＤＮＡ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｏｉｌ（ＱＢＩＯｇｅｎｅ社、カリフォルニア州カールスバッド)を製造元の使用説明書を改変して用い（参考文献１５ａ）、盲腸由来の３００ｍｇの糞便試料からＤＮＡを抽出した。最優勢菌ＰＣＲ−ＤＧＧＥ及び群特異的ＰＣＲ−ＤＧＧＥ（ビフィズス菌、ラクトバチルス群、ユーロバクテリウム・レクタル − ブラウティア・ココイダス・クロストリジウム群（Ｅｒｅｃ群）、クロストリジウム・レプツム・クロストリジウム群（Ｃｌｅｐｔ群）及びバクテロイダス標準属）のＰＣＲ−ＤＧＧＥを上述するように行った（参考文献１６）。ＢｉｏＮｕｍｅｒｉｃｓソフトウエアバージョン５．１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｓ ＢＶＢＡ社、ベルギー、シント・マルテンス・ラーテム)を用いてプロファイルの比較及びアンプリコンの定量を行った。スチューデントｔ検定を不等分散で用いて、アンプリコン数の統計分析を行った。少なくとも１％の総表面積を有するアンプリコンを類似性解析に含める複合データセットを用いるのに加えて、各細菌群からピアソン相関でクラスタリングを行った。ＢｉｏＮｕｍｅｒｉｃｓソフトウエアで主成分分析を行った。
【００５８】
［基礎統計分析］
Ｒ統計ソフトウエア（ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ.ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ.ｏｒｇ/）をデータの分析及び可視化に用いた。ウィルコクソン順位和検定を用いて濃度を比較し、Ｐ値＜０．０５を統計的有意と考えた。多重比較を説明するため、ｑ値を用いて（参考文献１７ａ、１８ａ）、有意に相違する脂質間の偽発見率を推定した。Ｒパッケージｑ値を用いて偽発見率を計算した。進行群の中央値濃度を非進行群の中央値濃度で除算して、得られた値の２を底としたｌｏｇをとることによって、倍率差を計算した。これは、ゼロより大きい／小さい値が進行群においてアップレギュレート／ダウンレギュレートした脂質に相当するため、解釈を簡単にする。クラスタリングでは、相関に基づくカスタマイズした距離メトリック：
ｄｉｊ＝１／ｌｏｇ(｜ｃｏｒ(ｘｉ,ｘｊ)｜)
（式中、ｘｉ及びｘｊは試料セット中の脂質ｉ及びｊの濃度を示す）を適用した。次いで、この距離測定（参考文献１９ａ）を用いてウォードの方法を階層クラスタリングに適用した。
【００５９】
［代謝状態進行の隠れマルコフモデル］
進行群及び非進行群における代謝状態の発展を別々の隠れマルコフモデル（参考文献２０ａ）によりモデル化し、個体を年齢の代わりに代謝状態に基づき整列させることと、進行群及び非進行群における代謝状態を比較することとを可能にした。モデルをデータに合わせるモデル化仮定は、個々のマウスが類似する発症進行を共通に有するが該状態のタイミングは変動してもよいことと、各状態における代謝物プロファイルは進行群と非進行群とで異なり得ること、である。ケヴィン・マーフィー(Ｋｅｖｉｎ Ｍｕｒｐｈｙ)によるＭＡＴＬＡＢツールボックス(ｈｔｔｐ：//ｐｅｏｐｌｅ.ｃｓ.ｕｂｃ.ｃａ/~ｍｕｒｐｈｙｋ/ Ｂａｙｅｓ/ｈｍｍ.ｈｔｍｌ)を用いて標準バウム−ウェルチアルゴリズムによりモデルフィッティングを行った。モデル構造を我々の先の研究（参考文献２０ａ）と同じやり方でブートストラップにより検証し、ノンパラメトリック・ブートストラップで信頼区間を推定した（５０００試料）。
【００６０】
［ヒト及びマウスの代謝物のマッピング］
2013524829.tif 000006
及び
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を、それぞれＮ個の試料及びＭ個の試料（Ｍ≧Ｎ）による次元ＤＸ及びＤＹである２つのデータ行列とする。タスクは、Ｘ中の各試料ｘｉがＹ中のｙｐ(ｉ)とマッチするようなＹ中の試料の順列ｐを見出すことである、つまり、２つのデータ行列間で試料の１対１のマッチングを推測する。これらデータ行列は同一データ空間にないため、マッチング基準として距離を用いることは不可能である。我々は、この問題を解決するためにデータセット間の統計的依存性に基づく新たな方法論を紹介している（参考文献２１）。そのアイディアは、データ特徴、すなわち統計的依存性を最大にする統計記述子から計算し、前記記述子に基づきマッチングを行うことである。実際、データセット間の統計的依存性が最大となるようにデータをより低次元の部分空間に投影し、この比較可能な部分空間において試料のマッチングを見出すであろう。
【００６１】
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及び
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を記述子とすると、ここで一次変換
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が選択される。相関性を依存性測定値として用いると、最適化問題
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を得る；相関性を最大化することは、正規分布したデータについての相互情報量を最大化することであり、一般的には合理的な計算上の近似値である。
【００６２】
反復アルゴリズムを用いて、この最適化問題を解く。第１段階では、所定の順列ｐを前提として予測（ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）を計算し、第２段階では、所定の予測を前提として順列を最適化する。これら２つの段階を収束まで交互に行う。実際、正準相関分析を用いて順列を前提として予測を計算することができ、所定の予測を前提として順列を解くことは、ハンガリー法アルゴリズムを用いて解くことができる割当問題をもたらす。
【００６３】
上記の方法を用いて、ヒト−マウスデータセットのいずれかのペアを前提としてマッチングを見出すことができる。そのマッチングは、様々なヒト−マウスデータセットペアにより得られた解を組み合わせてコンセンサスマッチングを与えることによって、さらに向上させることができる。簡単にするために、ヒト−マウスデータセットのペアが独立な試料であると仮定し、多数のデータセットを近似的に仮定することを保持する。
【００６４】
異なるマッチング解を組み合わせるため、観察された全てのマッチング解に基づき分割表を作成する。２つの種の脂質は分割表の行及び列の表示であり、各セルは、観察されたマッチング解において２つの種における対応する脂質が何回ペアになっているかの計数を与える。分割表を前提とするコンセンサスペアリングの発見は、分割表の行と列との間での最大二部マッチングの発見に帰着する。これを、ハンガリー法アルゴリズムを用いることにより再度解くことができる。  
【００６５】
［ブートストラップに基づく二元配置分析］
ＮＯＤマウスとＤＩＰＰ研究における人間とが共通に有する疾患影響を見出すため、最初に２つの種の生物の代謝物をペアにし、次いでＨＭＭにより人間とマウスの進行群及び非進行群の代謝状態を推定し、最後に進行群／非進行群対人間／マウスに対してブートストラップに基づく二元配置分析を行い、疾患影響及び生物効果並びにそれらの相互作用を同定した。データ駆動型ペアリング又は代謝物及び４つのＨＭＭを上述のように計算した。疾患影響の二元配置分析は、最小二乗法により推定されるただ１つの平均パラメーターで表される生物効果を最初に除き、次いで、プールした人間及びマウスの疾患影響についてブートストラップ信頼区間を計算することにより行った。生物効果及び交差効果は類似の方法で推定した。
【００６６】
［参考文献］
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【００６７】
［実施例中の参考文献］
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【００６８】
［補足図の参考文献］
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【図１−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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