(57)【要約】【課題】水溶性活性物質のオキサリプラチンを、比較的低廉な超臨界流体の製造設備を用いて経済的にナノ粒子を製造して簡単な製造工程と高回収率により商業化が容易であり、現在、注射剤形としてのみ製造されて患者に投与されているオキサリプラチンをナノ粒子化して胃酸に対して安定的で、生体利用率が改善されたオキサリプラチンの経口型製剤の開発を可能にして注射剤使用の不便さと問題点を改善し、患者の順応度を改善し、医療費を低減するオキサリプラチンのナノ粒子及びその製造方法を提供する。【解決手段】本発明によるナノ水準のオキサリプラチン粒子を製造する方法は、水溶性活性物質のオキサリプラチンのナノ粒子、これを含む薬剤学的組成物、及びオキサリプラチンと特定の共溶媒が混合された水性混合溶液に、固体相脂質と界面活性剤が混合された脂質混合溶液を乳化した後、超臨界流体ガスを用いて固体相脂質及び共溶媒を除去して経口投与が可能となることを特徴とする。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均粒子径が１０〜１０００ｎｍであることを特徴とする経口投与用オキサリプラチンのナノ粒子。
【請求項２】
平均粒子径が１０〜５００ｎｍであることを特徴とする請求項１に記載の経口投与用オキサリプラチンのナノ粒子。
【請求項３】
前記ナノ粒子は、共溶媒に分散する時、−３０〜−７０ｍＶのゼータ電位を有することを特徴とする請求項１に記載の経口投与用オキサリプラチンのナノ粒子。
【請求項４】
請求項１に記載の経口投与用オキサリプラチンのナノ粒子を有効性分として含むことを特徴とする薬剤学的組成物。
【請求項５】
前記組成物内のオキサリプラチンのナノ粒子と界面活性剤の重量比が１：０．１〜２．０の範囲であることを特徴とする請求項４に記載の薬剤学的組成物。
【請求項６】
前記界面活性剤は、ポロキサマ、ソルトール、またはゲルシルであることを特徴とする請求項５に記載の薬剤学的組成物。
【請求項７】
錠剤、懸濁剤、またはカプセル製剤として製造され、経口投与が可能であることを特徴とする請求項４に記載の薬剤学的組成物。
【請求項８】
賦形剤、結合剤、崩壊剤、及び滑沢剤から選択された１種または２種以上の補助剤をさらに含むことを特徴とする請求項４に記載の薬剤学的組成物。
【請求項９】
（１）オキサリプラチンを水、ジメチルスルホキシド、またはこれらの混合液の共溶媒に溶解して水性混合溶液を得る段階と、
（２）固体相脂質に界面活性剤を混合して脂質混合溶液を得る段階と、
（３）前記水性混合溶液に脂質混合溶液を添加して乳化液を得、これを冷却して乾燥させることにより固形物を得る段階と、
（４）前記固形物を反応器に投入し、超臨界流体ガスを入れて超臨界条件以上の圧力で加圧した後、超臨界流体ガスを用いて固体相脂質及び共溶媒を除去することにより、オキサリプラチンのナノ粒子を得る段階と、
を含むことを特徴とする経口投与用オキサリプラチンのナノ粒子の製造方法。
【請求項１０】
前記固体相脂質は、炭素数１０〜２２のアルコールであることを特徴とする請求項９に記載の経口投与用オキサリプラチンのナノ粒子の製造方法。
【請求項１１】
前記オキサリプラチンと界面活性剤の重量比が１：０．１〜２．０の範囲であることを特徴とする請求項９に記載の経口投与用オキサリプラチンのナノ粒子の製造方法。
【請求項１２】
前記界面活性剤は、ゲルシル、ソルトール、及びポロキサマから選択されることを特徴とする請求項９に記載の経口投与用オキサリプラチンのナノ粒子の製造方法。
【請求項１３】
前記（１）段階で、共溶媒にマンニトールを凝集防止剤としてさらに添加することを特徴とする請求項９に記載の経口投与用オキサリプラチンのナノ粒子の製造方法。
【請求項１４】
前記水性混合溶液に脂質混合溶液を添加して乳化する時、４０〜１００℃に加熱して行うことを特徴とする請求項９に記載の経口投与用オキサリプラチンのナノ粒子の製造方法。
【請求項１５】
前記（４）段階の超臨界条件以上の圧力は５０〜２００気圧であり、反応器の温度を１０〜４０℃の範囲内に調節して固体相脂質を除去することを特徴とする請求項９に記載の経口投与用オキサリプラチンのナノ粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水溶性活性物質のオキサリプラチンのナノ粒子、これを含む薬剤学的組成物、及びオキサリプラチンと特定の共溶媒が混合された水性混合溶液に、固体相脂質と界面活性剤が混合された脂質混合溶液を乳化した後、超臨界流体ガスを用いて固体相脂質及び共溶媒を除去して経口投与が可能となるナノ水準のオキサリプラチン粒子を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍学（ｏｎｃｏｌｏｇｙ）分野は、大部分の患者が経口薬（ｏｒａｌ  ｄｒｕｇ）よりも非経口的に（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｌｙ）治療を受けている医学分野である。過去１０年間、非経口薬物治療は増加しており、これに対して経口薬物治療分野はこれといった発展が見られなかった。現在、２０種以上の細胞殺傷型（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ）経口抗癌剤が知られており、開発されている大部分の経口薬物治療製剤は、既に知らされている非経口製剤薬物を新規な剤形に開発して経口投与を可能にした場合である。
【０００３】
最近、一部の経口用抗癌剤が承認され、この分野に関する研究が行われている。経口薬物治療療法は、投与方法が便利で、容易であるという長所を持つ。したがって、経口用製剤薬物の開発が盛んになり、今後、経口薬物治療療法の使用が増加傾向になると見込まれる。
【０００４】
タキサン系（ｔａｘａｎｅｓ）抗癌剤は、経口投与時、生体内の吸収率（ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）を増加させるために、Ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）阻害剤を併用投与する試みがあり、現在もタキサン製剤を経口投与可能にするための研究が行われている。
【０００５】
また、胃癌など消化器系の坑癌治療にたくさん用いられる５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）は、生体内の吸収率が低くて経口投与に適しておらず、下痢などの副作用を誘発すると知られている。カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）は、経口投与用坑癌治療に用いられる物質であって、腫瘍における酵素反応により５−フルオロウラシルに転換されるプロドラッグ（ｐｒｏｄｒｕｇ）薬物である。カペシタビンは、５−フルオロウラシルを静脈投与した時とほぼ同様の毒性を示し、乳癌と大腸癌に対して全世界的に許可を受けたもので、経口用抗癌剤開発の成功的な事例といえる（非特許文献１）。
【０００６】
オキサリプラチンのような白金系抗癌剤のうち、サトラプラチン（ｓａｔｒａｐｌａｔｉｎ）が最初の経口用製剤として開発されており、現在まで知らされた唯一の白金系経口用抗癌剤である。
【０００７】
数千種の白金錯化合物誘導体が合成されて前臨床段階の試験を行ったが、この中、約３０種だけ臨床試験段階にある（非特許文献２）。現在、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、及びオキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）の３種だけ米国ＦＤＡの承認を受けて注射剤の形態で使われている（非特許文献３）。
【０００８】
オキサリプラチン（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）は、白金と１，２−ジアミノシクロヘキサンで構成され、シュウ酸エステル配位子を離脱基として有する有機錯化合物であって、ＩＵＰＡＣ名は（Ｒ，Ｒ）−１，２−ジアミノシクロヘキサン（エタンジオエート−Ｏ，Ｏ）プラチナである。現在、オキサリプラチンは、エロキサチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ（登録商標））という商品名で進行性大腸癌及び転移性胃癌の治療剤として販売されており、通常、５−フルオロウラシル、ロイコボリンと共に併用投与されることもある。
【０００９】
転移性大腸癌の治療には化学療法を用いるが、Ｅｌｏｘａｔｉｎ（登録商標）（オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ））あるいはＦＯＬＦＯＸ（フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）／ロイコボリン（ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ）／オキサリプラチンの併用）、ＦＯＬＦＩＲＩ（フルオロウラシル／ロイコボリン）療法を用い、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ社製のＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ｂｅｖａｃｉｚｕｍｂ）が２００４年に米国ＦＤＡの承認を受けた。
【００１０】
オキサリプラチンは注射剤としてのみ患者に投与されており、エロキサチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ（登録商標））は凍結乾燥製剤の形態になって患者に投与する直前に注射用水またはグルコース溶液に希釈して使用する。凍結乾燥工程は複雑で、製造費用が高く、また、凍結乾燥された製品を用いるためには再構成が必要である。しかし、このような再構成過程でオキサリプラチンの損失、沈殿の発生、再構成における好ましくない粒子の生成、汚染への露出をもたらすなどの問題がある。特に、汚染問題は抗腫瘍物質の毒性のため、非常に深刻である。
【００１１】
このようなオキサリプラチンの注射剤用凍結乾燥製剤の不便さと問題点を改善するために、最近、注射用液状製剤の形態で販売しているが、オキサリプラチンを経口用製剤として製造するための試みはまだない。
【００１２】
上述したサトラプラチン（ｓａｔｒａｐｌａｔｉｎ）が、白金系化合物の唯一最初の経口用製剤として開発され、１９９３年に最初に論文に報告されたが、前立腺癌治療剤としてアメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）の承認はまだ受けていない（非特許文献４）。
【００１３】
オキサリプラチンが注射剤の形態としてのみ使用しなければならない理由に対して具体的に報告された文献はないが、オキサリプラチンと同じ系列の白金（ＩＩ）錯化合物のシスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）とカルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）は、胃腸管内で非常に吸収率が低いものであり、これは経口投与による臨床試験結果から確認された（非特許文献５）。
【００１４】
サトラプラチンは、このような白金（ＩＩ）系化合物の経口投与時、低い生体内吸収率の問題点を改善した白金（ＩＶ）系化合物であって、経口用製剤を開発するために新規な構造を有する化合物である。この化合物に対して、最近、臨床第３相の研究結果が報告された（非特許文献６）。
【００１５】
結局、経口投与が可能な抗癌剤薬物は、その必要性と注射剤の投与方式に比して長所が多いにもかかわらず、低い生体内吸収率など、多くの制約要因があるため、その発展速度が非常に遅く、成功的な経口剤形の開発が困難であった。
【００１６】
オキサリプラチンは、剤形開発と関連して前記問題点を改善するために、安定したオキサリプラチン水溶液製剤の開発が試みられてきた。特許文献１は、濃度が１〜５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨが４．５〜６の範囲のオキサリプラチン水溶液を含む非経口投与用のオキサリプラチン製剤を開示している。また、特許文献２及び特許文献３は、薬学的に安定したオキサリプラチン溶液剤の組成物及びその製造方法を開示している。特許文献４は、安定して凍結乾燥された薬学的配合物を開示しており、特許文献５は、直ちに使用可能なオキサリプラチン含有注射用溶液を開示しており、特許文献６は、非経口投与用オキサリプラチン溶液組成物を開示している。また、特許文献７及び特許文献８などは、より安定した組成物を製造する方法を開示しており、特許文献９は、オキサリプラチン物質の毒性を最小化して安定したオキサリプラチン組成物を製造する方法を開示している。
【００１７】
一方、特許文献１０は、難溶性物質のパクリタキセルのナノ粒子を含む経口投与用薬学組成物を開示しているが、明細書に例示された各種溶媒は、オキサリプラチンのような水溶性活性物質を溶かすことができないため、これを水溶性活性物質のナノ粒子の製造に適用することができない。
【００１８】
現在、医薬品に適用されているナノ技術は、生理活性に優れたにもかかわらず、水溶液に溶けない難溶性薬物を、水溶液に溶かすために使われている。また、薬物の安定性を高めて生体利用率を向上させるか、放出速度を制御して薬物が必要な時間だけ血中薬物の濃度を維持する技術がコア技術として浮び上がっている。このようなナノ技術を用いた薬物安定化技術は、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）など、難溶性及び安定性の問題のために使用が制限されている薬物に適用されて薬物の生体利用率を高め、薬効の長期間の持続に寄与している（非特許文献７）。
【００１９】
しかし、上述したように、オキサリプラチンの非経口投与のために、改善された組成物の形態及び製法や難溶性活性物質のナノ粒子化などに対する研究が行われてきたが、水溶性活性物質のオキサリプラチンを単独で含む経口投与用剤形に関する技術はまだ開発されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】米国特許第５，７１６，９８８号
【特許文献２】米国特許第６，４７６，０６８号
【特許文献３】米国特許第６，３０６，９０２号
【特許文献４】大韓民国登録特許第３６７，７５２号
【特許文献５】大韓民国登録特許第９１３，０６３号
【特許文献６】国際特許ＷＯ／２００５／０２０９８０
【特許文献７】米国公開特許第２００３−０１０９５１５号
【特許文献８】米国公開特許第２００４−０１２７５５７号
【特許文献９】大韓民国公開特許第１０−２００７−００６７７６８号
【特許文献１０】米国特許第７，２１７，７３５号
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】VJ O'Neil and CJ Twelves, British Jornal of Cancer (2002) 87:933-937
【非特許文献２】Lloyd R Kelland, Expert Opinion on Investigational Drugs (2000) 9(6): 1373-1382
【非特許文献３】Hak Choy et al., Clin. Cancer Res. (2008) 14(6): 1633-1638
【非特許文献４】ボク・イン・ソン, KOTRA動向資料(2007)
【非特許文献５】Lloyd R Kelland, Expert Opinion on Investigational Drugs (2000) 9(6): 1373-1382
【非特許文献６】Hak Choy et al., Clin. Cancer Res. (2008) 14(6): 1633-1638
【非特許文献７】大韓民国特許庁、２００６年／紛争に備えた特許マップ作成事業のナノ医薬品開発技術（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明者は、前記オキサリプラチンのような水溶性活性物質を経口投与用剤形として製造するために研究した結果、オキサリプラチンを特定の共溶媒に溶解させた水性混合溶液に、固体相脂質と界面活性剤が混合された脂質混合溶液を添加して乳化させ、超臨界流体ガスを入れて加圧することによりナノ粒子が得られ、これを経口投与用剤形として製造できることを発見して本発明を完成した。
【００２３】
したがって、本発明は、水性混合溶液に脂質混合溶液を添加する乳化工程及び超臨界流体ガスを用いて固体相脂質を除去する工程により製造された、吸収が容易な経口投与用オキサリプラチンのナノ粒子を提供することにその目的がある。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明は、平均粒子径が１０〜１０００ｎｍである経口投与用オキサリプラチンのナノ粒子及びこれを含む経口投与用薬剤学的組成物を特徴とする。
【００２５】
また、本発明は、
（１）オキサリプラチンを水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、またはこれらの混合液の共溶媒に溶解して水性混合溶液を得る段階と、
（２）固体相脂質に界面活性剤を混合して脂質混合溶液を得る段階と、
（３）前記水性混合溶液に脂質混合溶液を添加して乳化液を得、これを冷却して乾燥させることにより固形物を得る段階と、
（４）前記固形物を反応器に投入し、超臨界流体ガスを入れて超臨界条件以上の圧力で加圧した後、超臨界流体ガスを用いて固体相脂質及び共溶媒を除去することにより、オキサリプラチンのナノ粒子を得る段階と、
を含む経口投与用オキサリプラチンのナノ粒子の製造方法を他の特徴とする。
【発明の効果】
【００２６】
本発明は、現在、注射剤形としてのみ製造されて患者に投与されるオキサリプラチンをナノ粒子化して胃酸に対して安定的で、生体利用率が改善されたオキサリプラチンの経口型製剤の開発を可能にし、注射剤使用の不便さと問題点を改善して患者の順応度を改善し、医療費を低減することができる。また、水溶性活性物質のオキサリプラチンを、比較的低廉な超臨界流体の製造設備を用いて経済的にナノ粒子化できるため、簡単な製造工程と高回収率により商業化が容易である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】超臨界流体ガスを用いたオキサリプラチンのナノ粒子の製造工程を示す図面である。
【図２】実施例５により製造されたオキサリプラチンのナノ粒子のＳＥＭ写真である。
【図３】実施例５により製造されたオキサリプラチンのナノ粒子のＳＥＭ写真である。
【図４】通常のオキサリプラチン粉末のＳＥＭ写真である。
【図５】実施例６により製造されたオキサリプラチンのナノ粒子のＳＥＭ写真である。
【図６】実施例５により製造されたオキサリプラチンのナノ粒子とオキサリプラチン原末のｐＨ４．０ＵＳＰアセテートバッファにおける溶解度の経時変化を比較したグラフである。
【図７】実施例５により製造されたオキサリプラチンのナノ粒子とオキサリプラチン原末のｐＨ６．８フォスフェイトバッファにおける溶解度の経時変化を比較したグラフである。
【図８】オキサリプラチン原末とナノ粒子のＳＷ６２０細胞株に対するＧＩ50値を算出して比較したグラフである。
【図９】オキサリプラチン原末とナノ粒子のＨＣＴ１１６細胞株に対するＧＩ50値を算出して比較したグラフである。
【図１０】実施例５により製造されたオキサリプラチンのナノ粒子を腫瘍を持つヌードマウスに経口投与した場合とエロキサチンを注射した場合において、腫瘍の相対的大きさを比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、水溶性活性物質のオキサリプラチンのナノ粒子に関するものであって、前記ナノ粒子の製造方法は、（１）オキサリプラチンを水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、またはこれらの混合液の共溶媒に溶解して水性混合溶液を得る段階と、（２）固体相脂質に界面活性剤を混合して脂質混合溶液を得る段階と、（３）前記水性混合溶液に脂質混合溶液を添加して乳化液を得、これを冷却して乾燥させることにより固形物を得る段階と、（４）前記固形物を反応器に投入し、超臨界流体ガスを入れて超臨界条件以上の圧力で加圧した後、超臨界流体ガスを用いて固体相脂質及び共溶媒を除去することによりオキサリプラチンのナノ粒子を得る段階と、を含む。
【００２９】
以下、本発明のナノ粒子の製造方法を各段階別に詳細に説明する。
【００３０】
先ず、水溶性活性物質のオキサリプラチンを共溶媒に溶解して水性混合溶液を得る。これは、本発明に用いられる固体相脂質は水溶性活性物質を十分に溶かすことができないからである。前記共溶媒としては水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、またはこれらの混合物を用い、前記共溶媒は一般的なアルコールなどの溶媒とは異なり、極性が大きいため、オキサリプラチンを十分に溶解し、超臨界条件でＣＯ2ガスに対する溶解度が高いため、最終に得られる組成物に残留しないようにすることができる。
【００３１】
オキサリプラチンを前記共溶媒に溶解する時、追って製造されるナノ粒子の凝集を防止するために凝集防止剤をさらに追加することができる。前記凝集防止剤としては単糖類、多糖類、食物繊維、ガム類、またはタンパク質などが挙げられ、より好ましくはマンニトール、スクロース、ラクトース、グルコース、トレハロース、グリセロール、フルクトース、マルターゼ、デキストラン、ポリエチレングリコール、グリシン、アラニン、リジンなどであり、最も好ましくはマンニトールである。前記凝集防止剤は、オキサリプラチン１００重量部に対して１０〜１００重量部、より好ましくは２０〜６０重量部である。
【００３２】
次に、固体相脂質に界面活性剤を混合して脂質混合溶液を得る。
【００３３】
前記固体相脂質は、室温で固体相を維持し、その融点が比較的低い３０〜１００℃であるため、加熱により容易に溶けて前記活性物質に対する溶媒として作用でき、超臨界流体に対する高溶解度の脂質が用いられる。前記固体相脂質としては、炭素数１０〜２２のアルコール、飽和脂肪酸及びそのエステル、炭素数１０〜２２の飽和脂肪酸基を有するモノグリセリド化合物またはジグリセリド化合物、炭素数１６以上の炭化水素及び炭素数１０〜２２のトリグリセリド化合物の脂肪酸還元化合物からなる群から選択され、好ましくは炭素数１０〜２２のアルコール、より好ましくは炭素数１２〜１５のアルコールである。
【００３４】
本発明に用いられる界面活性剤は、活性物質のオキサリプラチンの凝集を防止し、前記固体相脂質によく溶解されて乳化反応を円滑に進行するようにして、製造されるナノ粒子の大きさを容易に調節し、かつ超臨界流体により容易に除去されてはいけないため、好ましくはゲルシル（Ｇｅｌｕｃｉｒｅ）、ソルトール（ｓｏｌｕｔｏｌ）、ポロキサマ（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）などを用いる。前記界面活性剤は、強い効能（ｐｏｔｅｎｃｙ）を有するため、粒子の大きさが小さく、均一なオキサリプラチンのナノ粒子が得られる。
【００３５】
前記界面活性剤の使用量は、オキサリプラチンと界面活性剤の重量比が１：０．１〜２．０、より好ましくは１：０．５〜１．５の範囲である。界面活性剤が前記範囲よりも少ない場合は、乳化物に対する安定性に問題が生じ、前記範囲を超える場合は、界面活性剤との凝集によりナノサイズの粒子が形成できない問題がある。
【００３６】
前記脂質混合溶液を前記水性混合溶液に添加して乳化液を得る。この時、脂質混合溶液を徐々に添加して乳化させるが、混合時、固体相脂質が水溶性活性物質に対する溶媒として作用するように４０〜１００℃に加熱して行うことが好ましく、より好ましくは５０〜８０℃に維持する。最終収得物のオキサリプラチンを３００ｎｍ以下の小くて均一なナノ粒子として得るためには、前記乳化過程が大変重要である。水性混合溶液を脂質混合溶液に添加すると、２つの溶液の相が分離されて乳化が進行しないため、必ず脂質混合溶液を水性混合溶液に徐々に添加しながら加熱して乳化させ、好ましくは水性混合溶液内にオキサリプラチンが１ｇ含まれた場合、５０〜１００ｇ／ｍｉｎの速度で脂質混合溶液を添加する。
【００３７】
次に、前記乳化液を冷却して乾燥させることにより固形物を得る。この時、乳化状態で、室温への自然冷却により固形化されると、粒子の大きさが大きくなって本発明で求められるナノ粒子が得られなくなるため、加熱状態で１０〜６０秒で２０〜３０℃まで急速冷却し、前記温度で乾燥させる。
【００３８】
前記得られた固形物を超臨界抽出機の反応器に投入し、超臨界流体ガスを入れて超臨界条件以上の圧力で加圧する。この時、固形物は粉砕して使用することが好ましいが、前記粉砕は周知の方法で行われ、粉砕された粒子の大きさが小さくて粒子の表面積が大きくなるほど固体相脂質などの除去工程に有利である。
【００３９】
前記超臨界流体ガスとは、二酸化炭素気体または窒素気体のように反応性がない気体であり、かつ特定温度と特定圧力、すなわち、超臨界温度と超臨界圧力下では超臨界流体（ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄ）となる気体をいう。
【００４０】
前記超臨界流体ガスを徐々に反応器に投入し、超臨界流体となる圧力、すなわち超臨界条件以上の圧力で加圧する。この時、反応器内の圧力は、反応器の大きさと混合物の量に応じて決定されるが、一般的に５０〜２００気圧の範囲に調節することが好ましく、温度は固体相脂質の融点以下の温度、好ましくは１０〜４０℃に維持する。反応器内の温度が高すぎると、界面活性剤が溶けるようになり、これによって混合物内に均一に分布していた活性物質及び凝集防止剤などが結晶成長して均一なナノ粒子が得られなくなる。反応器内の圧力が上昇して超臨界流体ガスが超臨界流体または亜臨界流体になる圧力に到達すると、その状態で反応器を回転させて超臨界流体または亜臨界流体が十分に固形物内に入り込むようにすることが好ましい。
【００４１】
前記超臨界流体ガスを用いてオキサリプラチンのナノ粒子を製造する工程の例を図１に示す。前記工程は、超臨界流体バッファタンク（ＣＯ2  ｂｕｆｆｅｒ  ｔａｎｋ、（１）〜（３））、反応器（ｒｅａｃｔｏｒ、（４））、分離器（ｓｅｐａｒａｔｏｒ、（５））など、大きく３つの部分からなる。先ず、前記得られた固形物を粉砕して反応器に投入した後、超臨界流体バッファタンクから超臨界流体を反応器に注入し、反応器を回転させる。そして、反応器内の圧力を５０〜２００気圧に調節し、固体相脂質と共溶媒を除去するために超臨界流体を循環させる。圧力差により、固体相脂質と共溶媒は超臨界流体に溶けて分離器内に収集され、反応器にはオキサリプラチンのナノ粒子と界面活性剤が混合された形態で残る。
【００４２】
前記製造方法により最終的に得られたオキサリプラチンのナノ粒子は１０〜１０００ｎｍの大きさを有し、好ましくは１０〜５００ｎｍ、より好ましくは１０〜３００ｎｍの大きさを有する。
【００４３】
また、前記オキサリプラチンのナノ粒子は、共溶媒に分散する時、−３０〜−７０ｍＶのゼータ電位（ｚｅｔａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を有するため、粒子間に凝集が発生せず、安定した状態で製剤化することができる。ゼータ電位は、粒子の外部的に活性化された電位である。また、個別粒子間の静電気的相互作用の測定値であって、懸濁液、特に分散された超微粒子を含有する分散液を安定化させる因子である。前記ゼータ電位の範囲内では粒子間の強い反発があるため、分散液が安定的に維持されるが、ゼータ電位の絶対値が前記範囲よりも小さい場合は粒子間の反発が弱くてファンデルワールス力により凝集物が形成される問題が発生する。
【００４４】
一方、本発明は、前記オキサリプラチンのナノ粒子を含む薬剤学的組成物を権利範囲とする。
【００４５】
前記製造方法により固体相脂質と共溶媒は除去され、オキサリプラチンのナノ粒子と界面活性剤が混合された状態の組成物が得られ、前記組成物内のオキサリプラチンのナノ粒子と界面活性剤の重量比は、最初に添加された量とほぼ同様で、１：０．１〜２．０、好ましくは１：０．５〜１．５の範囲である。
【００４６】
前記薬剤学的組成物は、賦形剤、結合剤、崩壊剤、及び滑沢剤のうち１つ以上の補助剤をさらに含んで経口用剤形として製造され、錠剤、懸濁液剤、カプセル剤などとして製造されることが経口投与に好ましい。
【００４７】
前記賦形剤としては、ラクトース、微結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、小麦デンプン、白糖、Ｄ−マンニトール、沈降炭酸カルシウム、デキストリンまたは予備ゼラチン化されたデンプンがあり、前記結合剤としては、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、デキストリン、ゼラチン、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ペーストまたはアラビアゴムがあり、前記崩壊剤としては、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスポビドン、クロスカルメロースナトリウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウムがあり、前記滑沢剤としては、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたは無水結晶ケイ酸などがある。
【００４８】
以下、下記実施例では本発明によるナノ粒子の製造方法を具体的に例示するが、これによって本発明が限定されることはない。
【００４９】
実施例１
オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）１ｇをジメチルスルホキシド２５ｇに７０℃で完全に溶解させて水性混合溶液を得た。また、固体相脂質としてミリスチールアルコール（ｍｙｒｉｓｔｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）６０ｇにポロキサマ（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）０．５ｇを５分間完全に溶かして脂質混合溶液を得た。前記水性混合溶液に脂質混合溶液を溶かした後、前記混合溶液をホモジナイザーを用いて１０，０００ｒｐｍ以上に撹拌しながらゆっくり添加して乳化させるが、乳化温度は８０℃を維持した。前記乳化過程から得られた乳化液を２５℃に急速冷却してオキサリプラチンが脂質に微細粒子として均一に分布された固形物を製造した後、これを粉砕機で粉砕した。前記粉砕物を超臨界抽出機の反応器に投入し、ＣＯ2ガスを注入しながら反応器を回転させた。反応器内の圧力を７０気圧以上に維持しながらＣＯ2を循環させ、固体相脂質のミリスチールアルコール及びジメチルスルホキシドを除去し、最終的に平均粒子径３００ｎｍ以下のオキサリプラチンのナノ粒子が含まれた組成物１．５ｇを得た。
【００５０】
実施例２
オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）１ｇをジメチルスルホキシド２５ｇに７０℃で完全に溶解させて水性混合溶液を得た。また、固体相脂質としてミリスチールアルコール（ｍｙｒｉｓｔｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）６０ｇにソルトール（ｓｏｌｕｔｏｌ）０．２ｇを７０℃で５分間完全に溶かして脂質混合溶液を得た。前記水性混合溶液に脂質混合溶液をホモジナイザーを用いて１０，０００ｒｐｍ以上に撹拌しながらゆっくり添加して乳化させるが、乳化温度は８０℃を維持した。前記乳化過程から得られた乳化液を２５℃に急速冷却してオキサリプラチンが脂質に微細粒子として均一に分布された固形物を製造した後、これを粉砕機で粉砕した。前記粉砕物を超臨界抽出機の反応器に投入し、ＣＯ2ガスを注入しながら反応器を回転させた。反応器内の圧力を７０気圧以上に維持しながらＣＯ2を循環させ、固体相脂質のミリスチールアルコール及びジメチルスルホキシドを除去し、最終的に平均粒子径３００ｎｍ以下のオキサリプラチンのナノ粒子が含まれた組成物１．２ｇを得た。
【００５１】
実施例３
オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）１ｇをマンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌ）０．４ｇと共に精製水９０ｇに７０℃で完全に溶解させて水性混合溶液を得た。また、固体相脂質としてミリスチールアルコール（ｍｙｒｉｓｔｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）９０ｇにゲルシル（Ｇｅｌｕｃｉｒｅ）４４／１４  １ｇを７０℃で５分間完全に溶かして脂質混合溶液を得た。前記水性混合溶液に脂質混合溶液をホモジナイザーを用いて１０，０００ｒｐｍ以上に撹拌しながらゆっくり添加して乳化させるが、乳化温度は８０℃を維持した。前記乳化過程から得られた乳化液を２５℃に急速冷却してオキサリプラチンが脂質に微細粒子として均一に分布された固形物を製造した後、これを粉砕機で粉砕した。前記粉砕物を超臨界抽出機の反応器に投入し、ＣＯ2ガスを注入しながら反応器を回転させた。反応器内の圧力を７０気圧以上に維持しながらＣＯ2を循環させ、固体相脂質のミリスチールアルコール及び精製水を除去し、最終的に平均粒子径３００ｎｍ以下のオキサリプラチンのナノ粒子が含まれた組成物２．４ｇを得た。
【００５２】
実施例４
オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）１ｇをマンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌ）０．４ｇと共に精製水９０ｇに７０℃で完全に溶解させて水性混合溶液を得た。また、固体相脂質としてミリスチールアルコール（ｍｙｒｉｓｔｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）９０ｇにソルトール（ｓｏｌｕｔｏｌ）１ｇを７０℃で完全に溶かして脂質混合溶液を得た。前記水性混合溶液に脂質混合溶液をホモジナイザーを用いて１０，０００ｒｐｍ以上に撹拌しながらゆっくり添加して乳化させるが、乳化温度は８０℃を維持した。前記乳化過程から得られた乳化液を２５℃に急速冷却してオキサリプラチンが脂質に微細粒子として均一に分布された固形物を製造した後、これを粉砕機で粉砕した。前記粉砕物を超臨界抽出機の反応器に投入し、ＣＯ2ガスを注入しながら反応器を回転させた。反応器内の圧力を７０気圧以上に維持しながらＣＯ2を循環させ、固体相脂質のミリスチールアルコール及び精製水を除去し、最終的に平均粒子径３００ｎｍ以下のオキサリプラチンのナノ粒子が含まれた組成物２．４ｇを得た。
【００５３】
実施例５
オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）１ｇをマンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌ）０．４ｇと共に精製水９０ｇに７０℃で完全に溶解させて水性混合溶液を得た。また、固体相脂質としてミリスチールアルコール（ｍｙｒｉｓｔｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）９０ｇにポロキサマ（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）１ｇを７０℃で５分間完全に溶かして脂質混合溶液を得た。前記水性混合溶液に脂質混合溶液をホモジナイザーを用いて１０，０００ｒｐｍ以上に撹拌しながらゆっくり添加して乳化させるが、乳化温度は８０℃を維持した。前記乳化過程から得られた乳化液を２５℃に急速冷却してオキサリプラチンが脂質に微細粒子として均一に分布された固形物を製造した後、これを粉砕機で粉砕した。前記粉砕物を超臨界抽出機の反応器に投入し、ＣＯ2ガスを注入しながら反応器を回転させた。反応器内の圧力を７０気圧以上に維持しながらＣＯ2を循環させ、固体相脂質のミリスチールアルコール及び精製水を除去し、最終的に平均粒子径３００ｎｍ以下のオキサリプラチンのナノ粒子が含まれた組成物２．４ｇを得た。
【００５４】
実施例６
オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）１ｇをジメチルスルホキシド２５ｇに７０℃で完全に溶解させて水性混合溶液を得た。また、固体相脂質としてミリスチールアルコール（ｍｙｒｉｓｔｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）６０ｇにポロキサマ（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）３．０ｇを５分間完全に溶かして脂質混合溶液を得た。前記水性混合溶液に脂質混合溶液を溶かした後、前記混合溶液をホモジナイザーを用いて１０，０００ｒｐｍ以上に撹拌しながらゆっくり添加して乳化させるが、乳化温度は８０℃を維持した。前記乳化過程から得られた乳化液を２５℃に急速冷却してオキサリプラチンが脂質に微細粒子として均一に分布された固形物を製造した後、これを粉砕機で粉砕した。前記粉砕物を超臨界抽出機の反応器に投入し、ＣＯ2ガスを注入しながら反応器を回転させた。反応器内の圧力を７０気圧以上に維持しながらＣＯ2を循環させ、固体相脂質のミリスチールアルコール及びジメチルスルホキシドを除去し、最終的にオキサリプラチン粒子が含まれた組成物４．０ｇを得た。
【００５５】
実験例１：オキサリプラチンのナノ粒子の粒度分布及びゼータ電位の測定
前記実施例により製造されたオキサリプラチンのナノ粒子５ｇを無水エタノール１０ｍＬに完全に分散させた後、粒度分析器（ＯＴＳＵＫＡ社製、ＥＬＳ−Ｚ）を用いて粒度分布を測定し、その結果を下記表１に示す。
オキサリプラチンのナノ粒子の粒度分布（ｎｍ）
【表１】
2013505291.tif 000003
前記表１に示すように、実施例の製造方法により平均３００ｎｍ以下の粒子が得られるが、特に、製造されたナノ粒子が狭い粒度分布（ｎａｒｒｏｗ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を示すことを確認した。
また、溶媒に分散されたナノ粒子の安定性を確認するために、ＥＬＳ−８０００（ＯＴＳＵＫＡ社製）を用いて製造されたオキサリプラチンのナノ粒子のコロイド状態のゼータ電位（ｚｅｔａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を測定し、その結果を下記表２に示す。
【表２】
2013505291.tif 000004
一般的にゼータ電位が−３０ｍＶ程度であれば、粒子間の凝集や結晶化が発生しないと知らされているが、本発明のオキサリプラチンのナノ粒子は、約−３５〜−６０ｍＶのゼータ電位を有するため、溶液内で非常に優れた静電気的安定性を示すことを確認した。
【００５６】
実験例２：オキサリプラチンのナノ粒子のＳＥＭ測定
実施例５により製造されたオキサリプラチンのナノ粒子は、電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈ（Ｓ−４７００Ｎ、Ｈｉｔａｃｈｉ社製））を用いて粒子の大きさ及び形態を確認し、その写真を図２及び３に示す。また、粒子の大きさを比較するために、原料として用いられたオキサリプラチン原末のＳＥＭ写真を図４に示す。
前記図２及び３に示すように、実施例５のオキサリプラチンのナノ粒子は、均一なナノサイズの粒子として製造されることを確認した。
ただし、実施例６により製造されたオキサリプラチン粒子のＳＥＭ写真を図５に示すが、この場合、過量の界面活性剤によりナノ粒子が凝集されて５０μｍ以上の粒子が形成されることを確認した。したがって、大きさが均一で、かつ安定したナノ粒子を製造するためには、界面活性剤の含量を調節することが好ましいことを確認した。
【００５７】
実験例３：オキサリプラチンのナノ粒子の溶解度測定
前記実施例５により製造されたオキサリプラチンのナノ粒子１２ｍｇを、２５℃でｐＨ４．０ＵＳＰアセテートバッファ５０ｍＬ及びｐＨ６．８フォスフェイトバッファ５０ｍＬにそれぞれ分散させた。次に、時間の経過に伴ってそれぞれ１ｍＬのサンプルを取り、１５分間３５００ｒｐｍで遠心分離した後、ＨＰＬＣ分析（Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  ｓｅｒｉｅｓ、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ社製、ＵＳＡ）を行った。
ＨＬＰＣ条件
Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１８カラム、流速１．１ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長２１０ｎｍ
移動相：ｐＨ３．０、リン酸／アセトニトリル＝９９／１（ｖ／ｖ）
また、オキサリプラチン原末５ｍｇに対しても上記のように時間の経過に伴って濃度を測定して比較し、その結果を図６及び７に示す。
前記図６及び７に示すように、本発明のオキサリプラチンのナノ粒子は５分内に９０％に近い溶解度を有するが、オキサリプラチン原末は、２時間が経過して最大溶解度を有することを確認した。このような溶解度の改善は、ナノ粒子化による表面積の増加に起因したことで、これによって、懸濁液剤などの経口製剤への剤形化を容易にすることができる。
【００５８】
実験例４：細胞生存分析
ＳＷ６２０及びＨＣＴ１１６細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２２７、ＵＳＡ）を９６−ウェルプレートに１ウェル当たり５×１０３ｃｅｌｌｓ／５０μｌを分注して４時間が経過した後、実施例５のオキサリプラチン粒子とオキサリプラチン原末の濃度を１０ｍＭにしてプレートに処理した。次に、３７℃で７２時間培養した後、１００μｌＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ．＃．Ｇ７５７３）試薬により処理した。オービタルシェーカーに２分間細胞溶解した後、１０分間照度計（Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に入れて安定化してルミネセンス（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を測定する。
前記過程により測定されたルミネセンス値を用いてＧＩ50値を算出した後、オキサリプラチン原末とナノ粒子の濃度による坑癌活性グラフをそれぞれ図８及び９に示す。
前記図８及び図９に示すように、オキサリプラチン原末のＧＩ50値はＳＷ６２０及びＨＣＴ１１６細胞株がそれぞれ２．２２μＭ及び０．５５μＭであるが、オキサリプラチンのナノ粒子は０．９２μＭ、０．１３μＭに過ぎず、大腸癌細胞に対する坑癌活性が約２．４倍、４．２倍程度向上することを確認した。
【００５９】
実験例５：生体内の坑癌活性比較
人間ＨＴ−２９大腸癌細胞を約７×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度でＰＢＳと混ぜてヌードマウスの皮下部位に０．１ｍｌ接種した後、腫瘍の広さが５ｃｍ2以上になると、試験化合物の投与を開始した。
前記腫瘍を持つヌードマウスは、総４グループに分け、それぞれ０．５％カルボキシルメチルセルロースナトリウム１０ｍｌ／ｋｇ、実施例５のオキサリプラチンのナノ粒子５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、及びエロキサチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ）５ｍｇ／ｋｇを投与した。この時、カルボキシルメチルセルロースナトリウム及びオキサリプラチンのナノ粒子は２０日間毎日経口投与し、エロキサチンは１週に１回ずつ３回静脈注射を投与した。２１日過ぎた後、腫瘍の大きさを測定し、その結果を下記表３に示し、時間経過に伴う腫瘍の相対的大きさを比較したグラフを図１０に示す。腫瘍の大きさは、腫瘍の最も広い幅をＷ、最も長い長さをＬとし、（Ｗ2×Ｌ）／２を適用して計算した。
【表３】
2013505291.tif 000005
前記表３及び図１０に示すように、本発明のオキサリプラチンのナノ粒子は経口投与されるため、従来の注射剤によるエロキサチンに比べて優れるか、ほぼ同様の腫瘍成長抑制効果を奏することを確認した。
【００６０】
製造例１：懸濁液剤
実施例５のオキサリプラチンのナノ粒子１０ｇをふるい（３５ｍｅｓｈ）にかけた後、カルボキシメチルセルロースナトリウム１００ｍｇが含まれた精製水２０ｍＬに入れて懸濁液を得た。
【００６１】
製造例２：錠剤
実施例５のオキサリプラチンのナノ粒子１２ｇをふるい（３５ｍｅｓｈ）にかけた後、クロスポビドン３ｇ、ラクトース１８．３５ｇ、及びポリビニルピロリドン０．９ｇを入れて混合し、ステアリン酸マグネシウム０．４５ｇ及びコロイド状二酸化ケイ素０．３ｇで５分間滑沢した後、加圧して錠剤を作った。
【００６２】
製造例３：錠剤
実施例５のオキサリプラチンのナノ粒子６ｇをふるい（３５ｍｅｓｈ）にかけた後、クロスポビドン３ｇ、ラクトース２４．３５ｇ、及びポリビニルピロリドン０．９ｇを入れて混合し、ステアリン酸マグネシウム０．４５ｇ及びコロイド状二酸化ケイ素０．３ｇで５分間滑沢した後、加圧して錠剤を作った。
【００６３】
製造例４：カプセル剤
実施例５のオキサリプラチンのナノ粒子１２ｇをふるい（３５ｍｅｓｈ）にかけた後、クロスポビドン１ｇと混合し、ステアリン酸マグネシウム０．１ｇで滑沢した。また、前記混合物を適当な装置を用いて硬いゼラチンカプセルに充填した。
【００６４】
比較例：錠剤
オキサリプラチン原末５ｇをふるい（３５ｍｅｓｈ）にかけた後、ポロキサマ５ｇ、マンニトール２ｇ、クロスポビドン３ｇ、ラクトース１８．３５ｇ、及びポリビニルピロリドン０．９ｇを入れて混合し、ステアリン酸マグネシウム０．４５ｇ及びコロイド状二酸化ケイ素０．３ｇで５分間滑沢した後、加圧して錠剤を作った。
【００６５】
実験例６：オキサリプラチンのナノ粒子の薬物動態パラメーター測定
前記製造例１〜３及び比較例により製造された錠剤及び懸濁剤１０ｍｇ／ｋｇをＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）系のラットに経口投与した。前記投与後、５、１０、１５、３０分、１、２、４、７、２４時間に採血し、採取した血液の白金濃度を分析して薬物動態パラメーターを測定した。前記薬物動態パラメーターにおける生体利用率は、対照物質としてエロキサチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ）５ｍｇ／ｋｇを静脈投与した場合を１００とし、その相対的な比率を示した相対的生体利用率を意味する。
【表４】
2013505291.tif 000006
オキサリプラチン製剤の薬物動態パラメーター（実験動物（ラット）数＝６）
前記表４に示すように、本発明により製造されたオキサリプラチンのナノ粒子を錠剤または懸濁液化して投与した結果、従来のオキサリプラチン原末を静脈投与した場合に比して、血漿最高濃度、ＡＵＣ、生体利用率が顕著に増加することを確認した。したがって、本発明のナノ粒子化により薬物の生体内吸収率を大きく増加させることができる。
【図２】
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【図３】
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【図４】
2013505291.tif 000009
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2013505291.tif 000013
【図９】
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【図１０】
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【図１】
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【国際調査報告】
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