(57)【要約】【課題】片側が開放された微細空洞の上に脂質２重層を生成する方法並びに脂質２重層を調査するための微細構造及び関連する測定装置を提供すること。【解決手段】本発明による方法は，微細空洞を電解質溶液で満たすステップと，溶解された脂質を含む液体を，微細空洞に向かう第１の方向に移動させるステップと，該液体を微細空洞から遠ざかる第２の方向に移動させるステップと，液体に接続された対向電極と，微細空洞内に配置された測定電極との間のインピーダンスを検出することによって，微細空洞上の脂質２重層の形成を監視するステップとを有する。微細構造は，少なくとも一つの微細空洞が形成される基板を有し，少なくとも一つの微細空洞は液体の層流が少なくとも二つの異なる流れ方向で，微細空洞上を流れるように，液体チャネルに接続される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
片側が開放され，基板内に形成された微細空洞の上に脂質２重層を生成する方法であって，
前記微細空洞内の電解質溶液と前記基板上の前記電解質溶液との間に連続性があるように，前記微細空洞を前記電解質溶液で満たし，前記微細空洞を含む前記基板を前記電解質溶液で部分的に覆うステップと，
脂質相を形成している溶解した脂質を含む液体を，前記基板を覆う水溶性電解質溶液内で，前記微細空洞に向かう第１方向に移動させるステップと，
前記微細空洞の外側に配置された接続された対向電極と，前記微細空洞の内側に配置された測定電極との間の直流抵抗又はインピーダンスの増加を検出することによって，前記微細空洞上の脂質相の位置を設定及び監視するステップと，
前記脂質相を前記微細空洞から遠ざかる第２方向に移動させるステップと，
前記液体に接続された対向電極と，前記微細空洞の内側に配置された測定電極との間の直流抵抗，インピーダンス及び／又は静電容量を検出することによって，前記微細空洞の上の脂質２重層の形成を監視するステップと，
を有する方法。
【請求項２】
前記脂質相の移動は液体流動内で起こる，請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１方向及び前記第２方向は反対方向であり，前記流動は層状である，請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記脂質相の移動は前記液体の懸滴の動きを介して起こる，請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記懸滴は移動可能なピペット又は滴を移動させるのに適した平面基板に付着する，請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記測定電極と前記対向電極との間のインピーダンスを検出するために，規定された時変電位差が印加され，前記電極間の電流強度の変化が監視される，請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記時変電位差は１mVと１００mVとの間，好適には１mVと３０mVとの間の振幅と，５msから５００msの期間とを有する矩形波パルスの形態を有するか，
前記時変電位差は１mVと１００mVとの間，好適には１mVと３０mVとの間のピーク振幅と，５msから５００msの期間とを有するランプ波形の形態を有するか，又は
前記時変電位差は１mVと５００mVとの間のピーク・ツ・ピーク振幅と，０．１Hzから１MHz，好適には１Hzから２０kHzの周波数とを有する正弦波の形態を有する，請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記液体は疎水性溶媒を含む，請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記疎水性溶媒は，ヘキサデカン，ドデカン，デカン，オクタン，ヘキサン又はペンタン，及びこれら物質の混合物を有し，前記の純粋物質又は前記混合物の選択は，前記脂質２重層の形成が極力迅速かつ高信頼であるように，前記微細空洞の寸法に適合している，請求項９に記載の方法。
【請求項１０】
前記測定電極と前記対向電極との間のオーム抵抗及び静電容量が監視される，請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
脂質２重層を調査するための微細構造を含む測定装置であって，
前記微細構造（１００）は，片側が開放されている少なくとも一つの微細空洞（１０４）が形成されている基板（１０２）を有し，少なくとも一つの測定電極（１２０）が前記微細空洞（１０４）の内側に配置され，前記少なくとも一つの微細空洞（１０４）は，層状の液体流動が，前記微細空洞の上を少なくとも二つの異なる流動方向で流動するように，流体チャネル（１０６）に接続している，測定装置。
【請求項１２】
前記測定電極は前記微細空洞の底を形成する，請求項１１に記載の測定装置。
【請求項１３】
少なくとも一つの対向電極（１２２）が，前記基板を覆う液体と電気接触するように，前記微細空洞の外側に配置される，請求項１１又は１２に記載の測定装置。
【請求項１４】
前記少なくとも一つの対向電極は液体チャネル（１０６）内に配置されるか，前記液体チャネルに電気的に接続される，請求項１３に記載の測定装置。
【請求項１５】
配列を形成するように配置された複数の微細空洞（１０４）が前記基板（１０２）内に提供される，請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の測定装置。
【請求項１６】
前記複数の微細空洞（１０４）はそれぞれ，別個に電気的接触できる少なくとも一つの測定電極（１２０）を有する，請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の測定装置。
【請求項１７】
前記液体を２方向に吐出する微細ポンプ（１２６）を更に備える，請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の測定装置。
【請求項１８】
前記微細ポンプ（１２６）は前記基板（１０２）内に集積されている，請求項１７に記載の測定装置。
【請求項１９】
前記基板（１０２）は，疎水性材料でできているか，疎水性表面被覆が施されている，請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の測定装置。
【請求項２０】
前記基板（１０２）はガラス支持体上の光構造化可能エポキシ樹脂によって形成されている，請求項１９に記載の測定装置。
【請求項２１】
前記少なくとも一つの測定電極（１２０）は，前記ガラス支持体上の回路基板導体構造によって形成される，請求項２０に記載の測定装置。
【請求項２２】
前記少なくとも一つの測定電極（１２０）は銀／塩化銀電極である，請求項１１〜２１のいずれか一項に記載の測定装置。
【請求項２３】
前記少なくとも一つの微細空洞は，１μｍから３００μｍ，好適には２μｍから１００μｍの最大直径と，０．１と１００との間，好適には０．３と１０との間のアスペクト比を有する，請求項１１〜２２のいずれか一項に記載の測定装置。
【請求項２４】
前記少なくとも一つの測定電極と，少なくとも一つの対向電極とが，電気抵抗，インピーダンス及び／又は静電容量の測定に適した増幅器，好適にはポテンショスタット，電圧クランプ又はパッチクランプ増幅器に接続されている，請求項１１〜２３のいずれか一項に記載の測定装置。
【請求項２５】
脂質２重層を調査するための微細構造を含む測定装置であって，
片側が開放されている少なくとも一つの微細空洞（１０４）が形成されている基板（１０２）を有し，
少なくとも一つの測定電極（１２０）が前記微細空洞（１０４）の内側に配置され，
前記測定電極と，少なくとも一つの対向電極とが，電気抵抗，インピーダンス及び／又は静電容量の測定に適した増幅器，好適にはポテンショスタット，電圧クランプ又はパッチクランプ増幅器に接続されており，
前記微細構造は，前記脂質２重層の光学的試験及び分析のための正立又は倒立顕微鏡に統合されている，測定装置。
【請求項２６】
脂質２重層を調査するための微細構造を含む測定装置であって，
片側が開放されている少なくとも一つの微細空洞（１０４）が形成されている基板（１０２）を有し，
少なくとも一つの測定電極（１２０）が前記微細空洞（１０４）の内側に配置され，
前記少なくとも一つの測定電極と，少なくとも一つの対向電極とが，電気抵抗，インピーダンス及び／又は静電容量の測定に適した増幅器，好適にはポテンショスタット，電圧クランプ又はパッチクランプ増幅器に接続され，
液体流動又は懸滴の形態の中の脂質相を移動させるための前記微細構造は，ピペット操作ロボットに組み込まれている，測定装置。
【請求項２７】
脂質２重層を調査するための微細構造を含む測定装置であって，
片側が開放されている少なくとも一つの微細空洞（１０４）が形成されている基板（１０２）を有し，
少なくとも一つの測定電極（１２０）が前記微細空洞（１０４）の内側に配置され，
前記少なくとも一つの測定電極と，少なくとも一つの対向電極とが，電気抵抗，インピーダンス及び／又は静電容量の測定に適した増幅器，好適にはポテンショスタット，電圧クランプ又はパッチクランプ増幅器に接続され，
前記微細構造は，前記微細構造内に液体流動を発生させるポンプに接続されている，測定装置。
【請求項２８】
脂質２重層を調査するための微細構造を含む測定装置であって，
片側が開放されている少なくとも一つの微細空洞（１０４）が形成されている基板（１０２）を有し，
少なくとも一つの測定電極（１２０）が前記微細空洞（１０４）の内側に配置され，
前記少なくとも一つの測定電極と，少なくとも一つの対向電極とが，電気抵抗，インピーダンス及び／又は静電容量の測定に適した増幅器，好適にはポテンショスタット，電圧クランプ又はパッチクランプ増幅器に接続され，
電子データ収集及び制御システムが，実時間で検出される直流抵抗，インピーダンス及び／又は静電容量の値に応じて，前記微細空洞に向かい，かつ前記微細空洞から遠ざかる，脂質相の動きのそれぞれに対して提供されるデバイスを制御するために，制御及び測定ユニットを備える，測定装置。
【請求項２９】
前記微細空洞上に脂質２重層を有し，該脂質２重層が少なくともイオン伝導性及び／又は電気的又は光学的方法によって検出可能な少なくとも一つのほかの生物物理学的性質を受け入れるように，少なくとも一つの膜タンパク質であって，該膜の上に広がっているか，該膜と関係している膜タンパク質が前記脂質２重層内にある，請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，片側が開放された微細空洞上に脂質２重層を容易に生成する方法並びに微細構造及び測定装置に関し，該微細構造及び測定装置は，この種の簡易かつ容易な脂質２重層の生成を可能にするものである。
【背景技術】
【０００２】
合成脂質２重層は，多くの理由から研究及び産業の関心事になっている。合成脂質２重層は細胞膜のモデルであり，これを用いて再構成された膜タンパク質の生物学的機能を特に詳細に調査することができる。このモデルシステムは，膜内の個別イオンチャネルを通る電流を測定するいわゆるパッチクランプ技法が開発される少し前から既に用いられているが，最近富みに復活が進んでいる。この理由の一つは，これらの脂質２重層の生成及び測定システムの小型化が成功したことである。（例えば，次の文献を参照されたい。Wonderlin, W. F.; Finkel, A.; French, R. J., Biophys J, 1990  58, (2), 289-297; Akeson, M.; Branton, D.; Kasianowicz, J. J.; Brandin, E.; Deamer, D. W., Biophys J, 1999  77, (6), 3227-3233; Pantoja, R.; Sigg, D.; Blunck, R.; Bezanilla, F.; Heath, J. R., Biophys J, 2001  81, (4), 2389-239; Pantoja, R.; Nagarah, J. M.; Starace, D. M.; Melosh, N. A.; Blunck, R.; Bezanilla, F.; Heath, J. R., Biosens Bioelectron, 2004  20, (3), 509-517; Fertig, N.; Meyer, C.; Blick, R. H.; Trautmann, C.; Behrends, J. C., Phys Rev E, 2001  6404, (4).; Fertig, N.; Klau, M.; George, M.; Blick, R. H.; Behrends, J. C., Appl Phys Lett, 2002  81, (25), 4865-4867; Fertig, N.; Blick, R. H.; Behrends, J. C., Biophys J, 2002  82, (6), 3056-3062; Mayer, M.; Kriebel, J. K.; Tosteson, M. T.; Whitesides, G. M., Biophys J, 2003  85, (4), 2684-2695; Malmstadt, N.; Nash, M. A.; Purnell, R. F.; Schmidt, J. J., Nano Lett, 2006  6, (9), 1961-1965; Sondermann, M.; George, M.; Fertig, N.; Behrends, J. C., Bba-Biomembranes, 2006  1758, (4), 545-551; Baaken, G.; Sondermann, M.; Schlemmer, C.; Ruhe, J.; Behrends, J. C., Lab Chip, 2008  8, (6), 938-44）時間及び程度に関する測定分解能が明確に向上した結果のほか，さらに，この小型化が，並列処理によって単位時間における測定処理量を大いに増加させるという予測を可能にした。
【０００３】
要求の観点からすると，上記の復活は少なくとも二つの要因によるものである。すなわち，あったとしてもパッチクランプ技法にはほとんど利用できないチャネル及び輸送体タンパク質を調査するための，活性物質の薬理学的スクリーニングと，分子コールタカウンタとしての細菌性細穴及び単一分子解析のためのナノリアクタの利用増加とである（例えば，Oxford Nanopore Technologies社によるポリマの質量分析又はDNA配列決定）。
【０００４】
しかし，高スループット調査用の脂質２重層の小型化はこれまで技術的に十分開発されてこなかった。例えばBaaken, Gerhardの学位論文，"Development of a microsystem-technical platform for parallel investigations of ion channels in artificial cell membranes"， Albert-Ludwig University, Freiburg, 2008，に記載されているとおり，細胞膜に関する高並列測定のための小型化及び集積密度に関する，チップベースの平面パッチクランプ技法の開発によって，近年，新たなベンチマークが実際に設定された。しかし合成膜に関する高スループット調査に関しては，今まで容易に自動化できる脂質２重層の生成の単純かつ再現可能な方法がなかった。本発明によって今やこれが可能になった。微細構造空洞上に脂質２重層を自動的に生成する，新規に開発された方法は，非常に単純な方法で高スループット電気生理学用に既存の装置を適合させ，脂質２重層の完全に自動化された並列測定のための完全なシステムを短時間で提供することを可能にする。
【０００５】
要約すれば，ここに開示する方法は，隔離された脂質２重層の生成に関する基礎的な実践的困難性及び欠点を克服するものであり，電気生理学の基礎的疑問への回答，及び活性物質の薬理学的スクリーニングに資するものである。
【０００６】
既存の方法は特に以降説明する欠点を有している。
【０００７】
細胞生理学モデル膜一般及び引き続く膜タンパク質の電気生理学調査の自動化に向けて欠くことのできないステップは，実験者による介入なしに，（小）開口上の隔離された脂質２重層の生成が容易かつ再現可能に達成できる方法を開発することである。
【０００８】
脂質２重層を表面又は開口上に塗布するために，ここ３０年来基本的に次の二つの方法が確立されている。すなわち，彩色（painting）技法（例えば，Mueller et al.，Z Kreislaufforschung，1963, 52 (7) 534 ff.，参照）及びLangmuir-Blodgett技法である。
【０００９】
彩色技法は塗布することが実際非常に単純であるが，成功するかどうかは実験者の手の器用さにほとんど唯一に依存し，したがって，この方法の自動化は非常に困難に見える。
【００１０】
Langmuir-Blodgett技法及びそれから開発された方法，又は関連する方法による塗布は，基板表面に規定された単一（mono）又は複数分子層を転送するために広く用いられている。論文，Takagi, M. A., K.; Kishimoto, U., Annu. Report Biol. Works Fac. of Sci. Osaka Univ, 1965 13, 107-110の著者ら，そして後に論文，Montal, M.; Mueller, P., Proceedings of the National Academy of Sciences, 1972  69, (12), 3561-3566の著者らがこの方法を簡略化し，今日では，例えば論文，Danelon, C.; Lindemann, M.; Borin, C.; Fournier, D.; Winterhalter, M., IEEE Transactions Nanobioscience, 2004 3, (1), 46-48に示されるように，双脂質膜生成のための多くの実験に用いられている。
【００１１】
基本的にこの方法においては最初に，二つの区画を分離する薄い疎水性基質膜の開口部が，電解液で満たすことによって両面が濡らされる。次に，区画のうち一つにおいて，水溶性電解質相の表面に直接脂質溶液を一滴加えた後，溶剤がほとんど蒸発するまで待つ必要がある。次に，開口部の下まで電解質の量を減らすことによって液レベルが低下させられ，再度上昇させられる。疎水性／親水性相互作用の結果として，脂質２重膜が開口部（opening）の上に形成される。しかし，自動化に必須と見える本方法の平面基板への直接転送は条件付で可能に過ぎない。脂質膜を生成した後に全体の実験装置は水溶液内に完全に格納される。
【００１２】
論文，Malmstadt, N.; Nash, M. A.; Purnell, R. F.; Schmidt, J. J., Nano Lett, 2006 6, (9), 1961-1965の著者らは脂質膜を生成するためにポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）内の微細構造チャネルを用いた。この方法は，微細チャネル内に取り込まれた脂質溶液の量を拡散及び蒸発によって連続的に減少させるために種々の溶剤に対するＰＤＭＳの浸透性を利用し，それによって二つの水溶液相の間に脂質膜を生成する。
【００１３】
Suzuki, H.; Tabata, K. V.; Noji, H.; Takeuchi, S., Langmuir, 2006 22, (4), 1937-1942の方法，そして論文，Sandison, M. E.; Zagnoni, M.; Abu-Hantash, M.; Morgan, H., J Micromech Microeng, 2007 17, (7), p. 189-196の著者らによって開発されたいわゆる大気ばく露技法においては，最初に比較的大きな開口（＞１００μｍ）の両側が微細溶液注入口又はピペット操作によって電解質溶液で濡らされる。
【００１４】
次に，彩色技法のように，脂質溶液の滴が開口部に置かれるか，微細溶液チャネルを介して供給される。水溶液相は一方の側に吸引され，大気中に溶剤が規定されたとおり蒸発することを可能にする。１滴の水を開口部に再投与／供給することによって，膜は保存される。
【００１５】
しかし，これらすべての既知の方法に共通な特徴は，脂質２重層が大気相内の反応又は，好適には肉眼で見えるポンプによる，両側からの複雑な（微細）溶液の出入りによってだけ生成することができるということである。さらに，従来の方法は実験装置に非常に特定の要求条件を課す。電気生理学実験を制御し監視するための支出もまた相当に増加する。方法論的には，これらの既知の方法は脂質２重層を生成することの自動化，速度及び有用性の可能性に関する基本的な実際上の課題を解決することはできない。特に，高スループット塗布のために検討することができる唯一のタイプである，片側だけで溶液が出入りする非常に小さい開口部上に脂質２重層を生成することには適していない。
【００１６】
さらに，国際公開第２００９／０６９６０８  Ａ１号によれば，平面脂質２重層膜配列を生成する方法が知られており，該方法においては，くし状の構造体が微細チェンバを形成しており，各微細チェンバが微細チャネル内に開口している。微細シリンジによって緩衝溶液及び脂質溶液を順次加えることによって，脂質２重層が微細チャネルと微細チェンバとの間の境界領域に形成される。上記特許文献に記載された脂質２重層を生成するシステム及び方法は，特に高スループット調査における計画塗布において，脂質２重層生成の自動化に十分再現可能かつ信頼性を有することからはほど遠い。しかし，国際公開第２００９／０６９６０８  Ａ１号に開示された既知の微細構造によっては特に，電極を有するチャンバの必要な規定が欠けているため，脂質２重層の形成を明解に，すなわち電気的測定によって，呈示することができない。その代わり，国際公開第２００９／０６９６０８  Ａ１号によれば光学的測定方法が用いられているが，それだけでは脂質２重層の明白な検出はできない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
したがって，本願発明の根本的課題は，特に高スループット調査に適したシステムにおいて，脂質２重層を生成するための，自動化に適した，迅速，高信頼かつ単純，かつ実時間制御の方法，これを可能にする微細構造，及び対応する測定装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
この課題は独立請求項の対象物によって解決される。本発明の有利な更なる実施形態は，従属請求項の対象物を形成する。
【００１９】
さらに，本発明は，ピペット操作ロボットに関する実験において，驚くべきことにはいくつかの場合，アルカン及び電解質溶液内の脂質塗布を，疎水性ポリマ層内に電気接点を有する微細空洞に単に置き換えることによって，脂質２重層の生成につながることが分かったという発見に基づくものである。
【００２０】
この非常に驚くべき，かつ最初はむしろほとんどできなかった観察が，境界面における恐らく自己組織化効果がこのことの原因ではないかという考察と，微細チャネルにおける例又は規定された懸滴の動きの場合のように，脂質及び電解質の移動を幾何学的に制御できれば，このような効果がより高い確率で発生するのではないかという疑問とにつながった。
【００２１】
これらの実験は非常に予期しない程度に成功であり，特徴的な高抵抗及び静電容量を有する脂質２重層が高い確率で検出できた。さらに，脂質２重層の存在が，イオンチャネルの再構成によって呈示することができた。このために，既に電解質で満たされたチャネル内の少量の脂質が，疎水性ポリマ内の微細空洞の上に加えられた。以降の戦略がうまくいくことが証明された。
【００２２】
水溶性電解質で既に満たされた微細チャネルであって，該微細チャネルの底に１又は複数の微細電極空洞があり，該微細電極空洞もまた同一の電解質で満たされた微細チャネルに少量の脂質溶液が詰められ，再度同一の電解質で満たされる。層流によって，脂質及び水溶液相はほとんど完全に分離されたままである。電解質溶液を更に加えることによって，微細チャネル内の脂質相が開口部又は基板内の壁に更に押し付けられる。脂質相の脂質分子は，境界面上の両親媒性に従って，疎水性部分及び親水性部分に対応する水溶液相に整列する。ここで，この自己整列処理によって，第１脂質単層が形成されると推定する。次に，電解質のある比率の量が微細チャネルから引き出される。したがって，流体の流動方向が逆転し，滴が壁又は開口部の位置から押し戻される。その結果必然的に形成された放射線状の流動断面（parabolic flow profile）は，出願人らの現在の考えによれば，第１単層上に第２脂質単層が塗布され，したがって，脂質２重層が形成されることになる。
【００２３】
驚くほどの高成功率の重要な前提条件は，基板材料の疎水性に加えて，この応用に適合した脂質溶液の特性を選択することである。反対に，脂質分子が完全に溶解しなければならない。すなわち，ミセル形成の臨界濃度（臨界ミセル濃度，ＣＭＣ）ができるだけ高いことが望ましい。反対に，脂質を溶解させるために用いる溶剤（ＳＯＬＶ）は，水溶性溶液にほとんど混和性がないか，非混和性であることが望ましい。疎水性溶剤，例えばヘキサデカン，ドデカン，デカン，オクタン，ヘキサン又はペンタン，及びこれら物質の混合物を用いることが好ましく，純粋物質を選択するか，混合物を選択するかは，脂質２重層の形成ができるだけ迅速かつ高信頼であるように，空洞の寸法に適合している。
【００２４】
上述の既存方法の欠点に対して，本方法においては大気との境界面の形成又は存在は必須ではない。第３の境界面を省くことによって，追加の制御不能の妨害要因が除外される。このことが脂質２重層がうまく生成された際の歩留を高めることになる。さらに，開口部の上及び下双方での（微細）溶液出入りが必要になることがある既存の方法に対して装置の費用が非常に減少する。これは，微細チップ生成においては通常慣例である，片側が閉じた構造を除外するという，微細開口部の設計に関する顕著な制約を克服することができる。したがって，唯一つのポンプ又は一つのピペットだけで，脂質２重層を生成することが可能である。種々の脂質溶液を一つの注入口を介して取り込むことができる。したがって，本方法の決定的な利点は，脂質２重層が，例えば単純な商業的に入手可能なピペット操作ロボットを用いて生成可能なことである。
【００２５】
本発明による装置及び手順は，本方法の根本的な利点につながる。すなわち，高度な自動化が可能である。
【００２６】
さらに，微細工学システムにおいては，脂質２重層は一つのステップでいくつかの開口部の上に生成することができる。学術的な基礎研究から活性物質の薬学的スクリーニングまで，細胞の人工的モデルとして，安定，単純，迅速かつ高信頼の脂質２重層生成は様々な応用のほとんどにおける決定的な要因である。後者に関しては特に，高い実験的スループットが一般的で生産的な開発に非常に重要である。基礎研究の利用者は，装置及びシステムの支出削減及び膜タンパク質又はモデル膜自身の調査に関して統計的に起こりえない事象に対する実験の単純化によって恩恵を受ける。要約すると，すべての電気生理学及び生物物理学の専門分野の利用者にとって，ここに提示した方法は，一般にモデル細胞膜に関する実験の実行を非常に短時間なものにするため，当該実験の効率を向上させるということができる。
【００２７】
本発明の有利な実施形態によれば，測定システムは，制御及び評価器ユニットを備える少なくとも一つの電子データ収集及び制御システムを備え，該システムは，実時間で検出されるＤＣ抵抗，インピーダンス及び／又は静電容量の値に関係する脂質相の動きのために用意されたデバイスを，各々の場合に制御することができる。このようにして，脂質相の開口部へ及び開口部からの自動又は半自動の帰還制御された動きと，脂質２重層の自動的に制御された形成とが可能になる。
【００２８】
本発明をより良く理解するために，次に掲げる図面に呈示された実際の例に基づいて，本発明をより詳細に説明する。同一部分は同一参照記号及び同一部品名称を有する。さらに，図示及び説明された実施形態の個々の特徴又は各特徴の組合せは，それ自体で本発明による独自の創意ある方法を表す。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】脂質溶液が第１流動方向に流れている微細構造の概略断面図である。
【図２】脂質溶液が第１空洞の上で止まっている図１の微細構造の概略断面図である。
【図３】脂質溶液が第２流動方向に流れている微細構造の概略断面図である。
【図４】脂質２重層の生成を監視するための電極装置を有する微細構造を通る概略断面図である。
【図５】集積微細ポンプを有する微細構造のブロック図である。
【図６】図４の装置を生成する微細工学生成方法の概要を示す図である。
【図７】四つの微細空洞を有する，本発明による微細構造の透視図である。
【図８】生物学的モデルシステムアラメシチンによって測定した時図表の例を示す図である。
【図９】図８の測定値のヒストグラムである。
【図１０】図８の測定結果の拡大した抜粋を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
図１は，脂質層の生成の第１ステップ中の本発明による微細構造１００を示す。最も単純な構成では，微細構造１００は基板１０２を有し，該基板内に少なくとも一つの微細空洞１０４が形成される。以降，これらの微細空洞１０４は穴（well），口（opening）又は開口部（aperture）とも呼ばれ，約１ミリメートル未満の寸法をした，片側に開いた空洞を表す。これらの寸法は主に，依然として安定である，各寸法に及ぶ自由懸架脂質層の大きさによって決定される。
【００３１】
「脂質層」は，以降，膜を形成する脂質からなる膜を指すものとする。膜形成脂質は，親水性及び疎水性部分を有する脂質であり，したがって両親媒性である。このことは，膜形成脂質がその性質に依存して，水のような極性溶媒内でミセル（両親媒性分子の球状集合体であって，分散媒内で自発的に密集する）又は脂質２重層を形成できるようにし，極性溶媒と反応するのは常に疎水性部分である。古細菌の膜を除くすべての生体膜は環境から細胞の中身を区切り，これらの脂質２重層から形成される。本願において，双脂質層，２重脂質層及び脂質２重層の用語は類義的に用いられる。
【００３２】
微細チャネル１０６は，微細空洞１０４の上に配置される。微細チャネルは，微細空洞１０４の反対側のカバー層１０８によって区切られ，例えば，カバープレート内に形成される。
【００３３】
本発明によれば，微細チャネル１０６及び微細空洞１０４は最初に水溶液相１１０で満たされる。図１に示すように，脂質相１１２が水溶液相１１０の中に取り込まれる。例えば微細ポンプ又はシリンジによって，脂質相１１２が第１開口部１０４の上に導かれて１１４の方向に（開口部の上に）層流断面を形成する。脂質分子１１６は，概略示したとおり，親水性端が水溶液相１１０に向き，親油性端が脂質相１１２に向くように，自身を整列させる。次に，基板１０２の材料は，疎水性面が脂質分子に向くように，疎水性材料だけで形成されるか，表面被覆される。
【００３４】
図２に概略示すように，次の処理ステップにおいて，微細空洞１０４の上の導管は止められ，脂質単層が微細空洞１０４の開口部の上に形成される。
【００３５】
本発明によれば，ポンプ圧を反転させることによって，脂質相１１２は，今度は開口部１０４から反対方向１１８に移動し，再度層流断面を形成する。図３に概略示すように，所望の脂質２重層が水で満たされた微細空洞１０４の上に形成される。この脂質２重層の形成は以降の記載によってより明確に分かるであろうが，再現可能であり，空洞の上に規定量の脂質溶液を置き，再度取り除くという指示された移動によって生じる。
【００３６】
さらに，図４から分かるように，上記規定量の脂質溶液の移動は，測定された電気的パラメータ，特にオーム抵抗及び静電容量による直接帰還によって行われる。
【００３７】
図４による微細構造は，図１，２及び３に関係して既に説明した部品に加えて，少なくとも一つの測定電極１２０と，少なくとも一つの対向電極１２２とを備える。Baaken, Gerhardの学位論文"Development of a microsystem-technical platform for parallel investigations of ion channels in artificial cell membranes", Albert-Ludwig University, Freiburg im Breisgau, November 2008に記載されたとおり，この配置によって測定を行うことができる。
【００３８】
特に，規定された時変の電位差を印加することによって，空洞内にある測定電極１２０と，空洞１０４の外にある対向電極１２２との間の電流を検出することができる。水溶性電解質相１１０と，疎水性溶液１１２との電気伝導度の差が，電流強度に変化を起こす。本発明によれば，これを空洞上の疎水性溶液の量を検出するために用いることができ，電気的に制御可能なポンプに直接接続されているときは，ポンプへの帰還を提供することができる。さらに，適用された脂質２重層の適切な機能的能力は，直接検証できる。
【００３９】
電極１２０用の電極材料として，貴金属，例えば金を検討してもよい。しかし好適には，微細ガルバニック被覆によって分極可能金電極の電気化学的振る舞いを，非分極可能電力の振る舞いに変換するために，金電極が，銀／塩化銀電極に相当するように被覆してもよい。これは，例えば前述のBaakenの学位論文による方法によって行うことができる。対向電極１２２もまた，銀／塩化銀電極を構成し，したがって安定な参照電位が得られるように，対応する被覆を施してもよい。電極のほかの選択可能な実施形態は，白金黒又は酸化イリジウムによる被覆を含む。
【００４０】
図５に概略示すとおり，対応するポンプ１２６は上記の電極システム並びに関係する制御及び評価ユニット１２４によって直接制御することができる。この種の閉制御回路は，これらの微細構造の完全に自動化された被覆を可能にする。もちろん，ポンプ１２６は微細ポンプである必要はなく，任意の別の適切な形態のものであってよい。しかし，微細ポンプを備えることによって，微細構造を，微細空洞１０４及びポンプ，並びに任意選択で制御及び評価ユニット１２４の電子回路を備えた集積微細システムとして生成することができる。
【００４１】
四つの微細空洞１０４を備えた微細構造の生成について，ここで図６及び７を参照して説明する。
【００４２】
第１ステップにおいて，基板，例えばガラスが準備される。ネガティブレジストの回転塗布及びばく露によって，測定電極１２０用の金属層の蒸着マスクを提供する。これらはステップＩＶに示すように，例えば蒸着によって生成される。ステップＶにおいてレジスト層が除去され，過剰金属領域が除去される。本発明によれば，微細空洞１０４の壁はＳＵ８レジストでできている。これは写真技法によって所望の構造で直接生成することができる。ステップＶＩＩに示すように，電着塗装を用いて，銀／塩化銀電極を生成するために必要な金属被覆を行うことができる。
【００４３】
図７は得られたチップの透視図を示しており，チップは，例えば別のガラス構造の形態であるカバー層を適用することによって，閉鎖システムに組み込まれる。このカバー層内に，ここでは別個に示されていないが，追加でチャネル構造が生成され，それぞれの場合，例えば図１〜３の装置に対応する開口部１０４のうち二つと結合する。
【００４４】
Baaken, Gerhardの学位論文"Development of a microsystem-technical platform for parallel investigations of ion channels in artificial cell membranes", Albert-Ludwig University, Freiburg im Breisgau, November 2008の４章に記載されたモデルタンパク質アラメシチンを用いて，開口部の上に機能的に活性な脂質２重層が実際に形成されたことを証明できる。図８，９及び１０は，例として本発明によって微細構造の上で行われた測定結果を示す。
【００４５】
実験が行われ，組み込まれたアラメシチンチャネルを有する脂質２重層が塗布されて測定された。Baakenの学位論文に詳細に記載されているように，印加された膜貫通電位に関してアラメシチンは膜内，実際は，脂質２重層内に排他的に穴を形成する。したがって，測定電極１２０と対向電極１２２との間に電位を印加することによって，２重脂質層内の穴を通る電流を測定することができる。アラメシチンチャネルが，壁を覆う脂質相にうまく取り込まれたとき，測定された電流は異なる導電性ステップを有するステップ関数に似た典型的な変動を示す。これらの異なる導電性ステップは，異なる数のアラメシチンモノマーを有する穴を表す。
【００４６】
図８は，一定保持電圧における時間による電流の変動の概要を示す。図９は図８の測定値のヒストグラムであり，電気的に非常に高い抵抗層が形成されていることを証明する。図１０は５１０ｍｓと５２０ｍｓとの間の時間範囲の拡大された抜粋である。特に，図１０のステップ状の電流変動はBaakenの学位論文の結果と一致して，アラメシチンの穴が中に組み込まれている，機能する双脂質膜の特性曲線を表す。この振る舞いは，タンパク質の単なる不規則な累積が高絶縁抵抗の原因であることを除外する。
【００４７】
このように，図８〜１０の測定結果は，本発明による生成方法によって，機能性脂質２重層がチャネル内の対応する壁の上に生成されたことを明白に示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年2月7日(2013.2.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
片側が開放され，基板内に形成された微細空洞の上に脂質２重層を生成する方法であって，
前記微細空洞内の電解質溶液と前記基板上の前記電解質溶液との間に連続性があるように，前記微細空洞を前記電解質溶液で満たし，前記微細空洞を含む前記基板を前記電解質溶液で部分的に覆うステップと，
脂質相を形成している溶解した脂質を含む液体を，前記基板を覆う水溶性電解質溶液内で，前記微細空洞に向かう第１方向に移動させるステップと，
前記微細空洞の外側に配置された接続された対向電極と，前記微細空洞の内側に配置された測定電極との間の直流抵抗又はインピーダンスの増加を検出することによって，前記微細空洞上の脂質相の位置を設定及び監視するステップと，
前記脂質相を前記微細空洞から遠ざかる第２方向に移動させるステップと，
前記液体に接続された対向電極と，前記微細空洞の内側に配置された測定電極との間の直流抵抗，インピーダンス及び／又は静電容量を検出することによって，前記微細空洞の上の脂質２重層の形成を監視するステップと，
を有する方法。
【請求項２】
前記脂質相の移動は液体流動内で起こる，請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１方向及び前記第２方向は反対方向であり，前記流動は層状である，請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記脂質相の移動は前記液体の懸滴の動きを介して起こる，請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記懸滴は移動可能なピペット又は滴を移動させるのに適した平面基板に付着する，請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記測定電極と前記対向電極との間のインピーダンスを検出するために，規定された時変電位差が印加され，前記電極間の電流強度の変化が監視される，請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記時変電位差は１mVと１００mVとの間，好適には１mVと３０mVとの間の振幅と，５msから５００msの期間とを有する矩形波パルスの形態を有するか，
前記時変電位差は１mVと１００mVとの間，好適には１mVと３０mVとの間のピーク振幅と，５msから５００msの期間とを有するランプ波形の形態を有するか，又は
前記時変電位差は１mVと５００mVとの間のピーク・ツ・ピーク振幅と，０．１Hzから１MHz，好適には１Hzから２０kHzの周波数とを有する正弦波の形態を有する，請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記液体は疎水性溶媒を含む，請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記疎水性溶媒は，ヘキサデカン，ドデカン，デカン，オクタン，ヘキサン又はペンタン，及びこれら物質の混合物を有し，前記の純粋物質又は前記混合物の選択は，前記脂質２重層の形成が極力迅速かつ高信頼であるように，前記微細空洞の寸法に適合している，請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記測定電極と前記対向電極との間のオーム抵抗及び静電容量が監視される，請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
脂質２重層を調査するための微細構造を含む測定装置であって，
前記微細構造（１００）は，片側が開放されている少なくとも一つの微細空洞（１０４）が形成されている基板（１０２）を有し，少なくとも一つの測定電極（１２０）が前記微細空洞（１０４）の内側に配置され，前記少なくとも一つの微細空洞（１０４）は，層状の液体流動が，前記微細空洞の上を少なくとも二つの異なる流動方向で流動するように，流体チャネル（１０６）に接続しており，
前記少なくとも一つの測定電極と，少なくとも一つの対向電極とが，電気抵抗，インピーダンス及び／又は静電容量の測定に適した増幅器，好適にはポテンショスタット，電圧クランプ又はパッチクランプ増幅器に接続され，
電子データ収集及び制御システムが，実時間で検出される直流抵抗，インピーダンス及び／又は静電容量の値に応じて，前記微細空洞に向かい，かつ前記微細空洞から遠ざかる，脂質相の動きのそれぞれに対して提供されるデバイスを制御するために，制御及び測定ユニットを備える，測定装置。
【請求項１２】
前記測定電極は前記微細空洞の底を形成する，請求項１１に記載の測定装置。
【請求項１３】
少なくとも一つの対向電極（１２２）が，前記基板を覆う液体と電気接触するように，前記微細空洞の外側に配置される，請求項１１又は１２に記載の測定装置。
【請求項１４】
前記少なくとも一つの対向電極は液体チャネル（１０６）内に配置されるか，前記液体チャネルに電気的に接続される，請求項１３に記載の測定装置。
【請求項１５】
配列を形成するように配置された複数の微細空洞（１０４）が前記基板（１０２）内に提供される，請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の測定装置。
【請求項１６】
前記複数の微細空洞（１０４）はそれぞれ，別個に電気的接触できる少なくとも一つの測定電極（１２０）を有する，請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の測定装置。
【請求項１７】
前記液体を２方向に吐出する微細ポンプ（１２６）を更に備える，請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の測定装置。
【請求項１８】
前記微細ポンプ（１２６）は前記基板（１０２）内に集積されている，請求項１７に記載の測定装置。
【請求項１９】
前記基板（１０２）は，疎水性材料でできているか，疎水性表面被覆が施されている，請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の測定装置。
【請求項２０】
前記基板（１０２）はガラス支持体上の光構造化可能エポキシ樹脂によって形成されている，請求項１９に記載の測定装置。
【請求項２１】
前記少なくとも一つの測定電極（１２０）は，前記ガラス支持体上の回路基板導体構造によって形成される，請求項２０に記載の測定装置。
【請求項２２】
前記少なくとも一つの測定電極（１２０）は銀／塩化銀電極である，請求項１１〜２１のいずれか一項に記載の測定装置。
【請求項２３】
前記少なくとも一つの微細空洞は，１μｍから３００μｍ，好適には２μｍから１００μｍの最大直径と，０．１と１００との間，好適には０．３と１０との間のアスペクト比を有する，請求項１１〜２２のいずれか一項に記載の測定装置。
【請求項２４】
前記微細構造は，前記脂質２重層の光学的試験及び分析のための正立又は倒立顕微鏡に統合されている，請求項１１に記載の測定装置。
【請求項２５】
前記液体流動又は懸滴の形態の中の前記脂質相を移動させるための前記微細構造は，ピペット操作ロボットに組み込まれている，請求項１１に記載の測定装置。
【請求項２６】
前記微細構造は，前記微細構造内に液体流動を発生させるポンプに接続されている，請求項１１に記載の測定装置。
【請求項２７】
前記微細空洞の上の脂質２重層を有し，前記脂質２重層が少なくともイオン伝導性及び／又は電気的又は光学的方法によって検出可能な少なくとも一つのほかの生物物理学的性質を受け入れるように，少なくとも一つの膜タンパク質であって，該膜の上に広がっているか，該膜と関係している膜タンパク質が前記脂質２重層内にある，請求項１１〜２６のいずれか一項に記載の測定装置。
【国際調査報告】
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