(57)【要約】  本発明は、肺の粘膜層に浸透する病原体タンパク質と結合することのできる生体適合性ナノ、メソ及びマイクロポリマー粒子に関する。肺粘膜層の周知の病原体タンパク質は、負に帯電している。これらのタンパク質は、肺の表面張力を低く維持して、正常に呼吸するために不可欠である肺の界面活性物質系に損傷を与える。本発明に基づくポリマー粒子は、２０ｎｍ〜１０μｍの直径を有し、水不溶性であり、正の表面電荷及び低い表面疎水性を有している。この粒子の等電点は、正に帯電した粒子として肺粘膜内に存在するように、５よりも大きく、また、結合する病原体タンパク質の等電点よりも大きい。本発明に基づくポリマー粒子は、例えば沈殿法又はエマルション法によって製造することができる。本発明に基づくポリマー粒子は、肺の表面張力を低く維持し、肺サーファクタントを保護するために用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺の粘膜層に浸透する病原体タンパク質と結合する生体適合性ナノ、メソ及びマイクロポリマー粒子であり、該粒子は、
−  ２０ｎｍ〜１０μｍの直径を有し、
−  水不溶性であり、
−  正の表面電荷を有し、
−  液滴法で測定した接触角１２０°未満に相当する、低い表面疎水性を有し、
−  前記粒子が生理学的条件下において正に帯電した粒子として肺内に存在するとともに、結合する前記病原体タンパク質の等電点よりも大きいように、５より大きい等電点を有し、
−  ＋２０ｍＶよりも大きい正のζ電位を有する
ことを特徴とする、ポリマー粒子。
【請求項２】
前記ポリマー粒子を製造できるモノマーは、アクリレート、メタクリレート、ブチルメタクリレート、（２−ジメチルアミノエチル）−メタクリレート、アミン類、アミド類、アセタール類、ポリエステル類、ケタール類、酸無水物、及び糖類から選択されていることを特徴とする、請求項１に記載のポリマー粒子。
【請求項３】
ホモポリマー、コポリマー、ブロックポリマー、グラフトコポリマー、スターポリマー、櫛形ポリマー、高度に分岐したポリマー、ランダムポリマーまたはデンドリマーであることを特徴とする、請求項２に記載のポリマー粒子。
【請求項４】
前記ポリマー粒子は、ポリ−（ブチルメタクリレート）−ｃｏ−（２−ジメチルアミノエチル）−メタクリレート−ｃｏ−メタクリル酸メチルで構成されることを特徴とする、請求項１に記載のポリマー粒子。
【請求項５】
前記ポリ−（ブチルメタクリレート）−ｃｏ−（２−ジメチルアミノエチル）−メタクリレート−ｃｏ−メタクリル酸メチルにおいて、ブチルメタクリレート、２−（ジメチルアミノエチル）−メタクリレート及びメタクリル酸メチルが１：２：１（ｗ／ｗ／ｗ）の割合で存在していることを特徴とする、請求項４に記載のポリマー粒子。
【請求項６】
前記ポリマー粒子が、好ましくは２００ｎｍ〜１０μｍの直径を有していることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリマー粒子。
【請求項７】
前記ポリマー粒子が、特に好ましくは２００ｎｍ〜６μｍの直径を有していることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリマー粒子。
【請求項８】
前記ポリマー粒子は、圧電性のエアロゾル発生器、ノズル式エアロゾル発生器、超音波式エアロゾル発生器、ソフトミスト吸入器、計量投与用吸入器又はドライパウダー吸入器を使って噴霧することができることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリマー粒子。
【請求項９】
ａ）第１の、有機溶媒、好ましくは極性非プロトン性溶媒に前記ポリマーを溶かし、
ｂ）前記ポリマー溶液を第２の溶媒に加えるか、又は前記ポリマー溶液を前記溶媒に対して透析することによって粒子を沈殿させ、このとき前記第１及び第２の溶媒は完全又は部分的に互いに混合可能であるが、前記第２の溶媒は前記ポリマーを溶かさない、
ｃ）前記第１の溶媒を取り除き、懸濁液中に粒子を保存する、
という工程を特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリマー粒子製造方法。
【請求項１０】
前記工程ａ）において、溶媒１ｍｌ当たり１〜４０ｍｇ、好ましくは１０〜３０ｍｇのポリマーを溶かすことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
・前記工程ａ）の前記ポリマーが、ホモポリマー、コポリマー、ブロックポリマー、グラフトコポリマー、スターポリマー、櫛形ポリマー、高度に分岐したポリマー、ランダムポリマーまたはデンドリマーであり、そのモノマー単位が、アクリレート、メタクリレート、ブチルメタクリレート、（２−ジメチルアミノエチル）−メタクリレート、アミン類、アミド類、アセタール類、ポリエステル類、ケタール類、酸無水物、及び糖類から選択され、
・前記第１の溶媒が、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、トリクロロメタン及びエチルアミンから選択され、
・前記第２の溶媒は、前記第１の溶媒と完全又は部分的に混合可能であるが、前記ポリマーを溶かさない
ことを特徴とする、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記工程ａ）において、溶媒１０ｍｌ当たり２００ｍｇのポリマーを溶かすことを特徴とする、請求項９〜１１のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
・ポリ−（ブチルメタクリレート）−ｃｏ−（２−ジメチルアミノエチル）−メタクリレート−ｃｏ−メタクリル酸メチルである前記ポリマーは、ブチルメタクリレート、２−（ジメチルアミノエチル）−メタクリレート及びメタクリル酸メチルの割合が１：２：１（ｗ／ｗ／ｗ）であり、
・前記第１の溶媒がアセトンであり、
・前記第２の溶媒が水である
ことを特徴とする、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
肺の表面張力の増加及び肺サーファクタントの損傷に伴って起こる肺疾患の予防及び／又は治療のための医薬品を製造するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリマー粒子の使用。
【請求項１５】
新生児呼吸窮迫症候群、急性／成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺損傷（ＡＬＩ）、肺感染症、肺炎、肺高血圧、心原性肺水腫、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）／肺気腫、間質性肺疾患、肺腫瘍、中毒性肺胞炎、肺胞出血症候群、嚢胞性線維症、特発性肺ヘモジデリン沈着症、膠原病、血管炎、塵肺症、好酸球性肺浸潤、放射線損傷、遺伝性又は先天性肺疾患の予防及び／又は治療のための医薬品を製造するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリマー粒子の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、正の表面電荷及び正のζ電位を有するナノ、メソ及びマイクロポリマー粒子を提供する。これらの粒子は、特定の疾患において、肺の粘膜層（肺胞被覆層）に浸透し、それによって肺サーファクタントの生物物理学的特性に影響を与える病原体タンパク質と結合することができる。この方法により、本発明に基づくポリマー粒子は、肺の界面活性物質系を保護する。
【０００２】
〔技術分野〕
本発明は、内科、薬理学、ナノテクノロジー及び医療技術の分野に関する。
〔背景技術〕
哺乳類の肺胞腔は、表面張力を減少させて呼吸時の肺胞の虚脱を防止している複雑な界面活性物質系によって覆われている。肺サーファクタントは、ＩＩ型肺胞上皮細胞から分泌され、約９０％の脂質と１０％のタンパク質とを含んでいる。肺胞表面を覆う脂質は、主としてリン脂質（８０〜９０％）を含み、中性脂質を僅かな割合で（１０〜２０％）含んでいる。リン脂質の中では、ホスファチジルコリン（７０〜８０％）とホスファチジルグリセロールとが優位を占め、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンが少量存在する。肺胞サーファクタントのタンパク質質量の約半分は、高分子量親水性タンパク質であるサーファクタント結合タンパク質ＳＰ−Ａ及びＳＰ−Ｄ、並びに低分子量疎水性タンパク質であるサーファクタント結合タンパク質ＳＰ−Ｂ及びＳＰ−Ｃから成る。数多くのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験において、リン脂質（ホスファチジルコリンおよびホスファチジルグリセロール）とサーファクタントタンパク質（ＳＰ−Ｂ及びＳＰ−Ｃ）との間の複雑な相互作用が研究されており、これらは、圧縮・膨張サイクル中に肺胞領域の表面張力を０ｍＮ／ｍにまで減少させることができる。この種の極めて低い表面張力は、リン脂質の豊富な表面膜によってのみ達成することができる。さらに、これらの単分子層は十分な安定性及び流動性を有しており、空気−水界面の表面変化の間に、個々のサーファクタント成分の交換を可能にしている。表面膜の圧縮中（呼気）は、ＳＰ−Ｂ及びＳＰ−Ｃが単分子層の清浄を促進し、特に非リン脂質化合物は、「表面結合性貯留」が形成されるバルク相に戻される（「絞り出し」）。肺胞表面が膨張する場合（吸気）、ＳＰ−Ｂ及びＳＰ−Ｃは、「表面結合性サーファクタント貯留」内にあるサーファクタント脂質の迅速な再流入と再拡大とを容易にし、このことは、表面張力の増加を制限するために不可欠である。
【０００３】
肺の粘膜層への血漿タンパク質（アルブミン）の混入は、肺サーファクタント機能に影響を及ぼす。このことは、例えば成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）で説明されている（Ｗ．Ｓｅｅｇｅｒ，Ｃ．Ｇｒｕｂｅ，Ａ．Ｇｕｎｔｈｅｒ，Ｒ．Ｓｃｈｍｉｄｔ：“Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ"，Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ  １９９３，６：９７１−９７７）。異常のあるサーファクタント機能は、その他の肺疾患及び心臓疾患でも観察される（Ａ．Ｇｕｎｔｈｅｒ，Ｃ．Ｓｉｅｂｅｒｔ，Ｒ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｓ．Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｆ．Ｇｒｉｍｍｉｎｇｅｒ，Ｍ．Ｙａｂｕｔ，Ｂ．Ｔｅｍｍｅｓｆｅｌｄ，Ｄ．Ｗａｌｍｒａｔｈ，Ｈ．Ｍｏｒｒ，Ｗ．Ｓｅｅｇｅｒ：“Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｅｖｅｒｅ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ，ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ａｎｄ  ｃａｒｄｉｏｇｅｎｉｃ  ｌｕｎｇ  ｅｄｅｍａ"，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １９９６，１５３：１７６−１８４；Ａ．Ｇｕｎｔｈｅｒ，Ｒ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｆ．Ｎｉｘ，Ｍ．Ｙａｂｕｔ−Ｐｅｒｅｚ，Ｃ．Ｇｕｔｈ，Ｓ．Ｒｏｓｓｅａｕ，Ｃ．Ｓｉｅｂｅｒｔ，Ｆ．Ｇｒｉｍｍｉｎｇｅｒ，Ｈ．Ｍｏｒｒ，Ｈ．Ｇ．Ｖｅｌｃｏｖｓｋｙ，Ｗ．Ｓｅｅｇｅｒ：“Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ，ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｐｎｅｕｍｏｎｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ"，Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ  １９９９，１４：５６５−４７３）。この種の疾患における可能な治療戦略として、合成又は天然のサーファクタントを肺の中に注入するサーファクタント補充療法が長年にわたり評価されてきた。しかし、この治療法は、肺の粘膜層の有害なタンパク質の存在という本質的な問題を解決していない。それによって、治療的に肺の中に注入されるサーファクタントの損傷又は不活化も生じる可能性がある。
【０００４】
近年では、生体適合性ポリマー粒子が肺内投与にも可能な薬物キャリアとして研究されてきた。カプセル化された有効物質の肺内への直接投与により、有効物質を望ましい作用部位に長時間にわたり放出制御することができ、このことが薬理効果を延長させることにつながる。さらに、ポリマー粒子製剤は、カプセル化された有効物質を分解から保護し、呼吸器系内における特定の作用部位又は細胞集団に適切に作用することができる。一方、生分解性ポリマー粒子については、数多くのｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ試験において優れた肺適合性が示されている。
【０００５】
驚くべきことに、肺に送り込まれたナノ、メソ及びマイクロポリマー粒子は、肺粘膜層に浸透する血漿タンパク質を粒子の表面に吸着することによって、肺サーファクタント機能に有利な影響を及ぼすことができる。吸着された血漿タンパク質は、空気−水界面のサーファクタント構造を損傷することはできない。
【０００６】
本発明の結果は、本発明に基づくナノ、メソ及びマイクロポリマー粒子が肺の低い表面張力を回復及び維持し、肺サーファクタントを保護するために適していることを示している。
【０００７】
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明の課題は、肺の低い表面張力を回復及び維持し、肺サーファクタントを保護するのに適した薬剤を提供することである。
【０００８】
〔課題を解決するための手段〕
肺の低い表面張力を回復及び維持し、肺サーファクタントを保護する薬剤を提供するという課題は、本発明に基づいて、肺の粘膜層に浸透する病原体タンパク質と結合する生体適合性ナノ、メソ及びマイクロポリマー粒子によって解決され、これらの粒子は、
−  ２０ｎｍ〜１０μｍの直径を有し、
−  水不溶性であり、
−  正の表面電荷を有し、
−  液滴法で測定した接触角が１２０°未満に相当する、低い表面疎水性を有し、
−  粒子が生理学的条件下において正に帯電した粒子として肺内に存在し、同時に、結合する病原体タンパク質の等電点よりも大きいように、５よりも大きい等電点を有し、
−  ＋２０ｍＶよりも大きい正のζ電位を有することを特徴とする。
【０００９】
驚くべきことに、これらの特徴を備える生体適合性ナノ、メソ及びマイクロポリマー粒子は、肺粘膜に浸透する病原体タンパク質と結合することによって、肺の低い表面張力を維持し、肺サーファクタントを保護することが確認された。肺粘膜は、肺液層とも呼ばれる。
【００１０】
以下では、本発明に基づく生体適合性ナノ、メソ及びマイクロポリマー粒子を、「ポリマー粒子」と短縮して呼ぶ。
天然のサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｂ及びＳＰ−Ｃは、分子量が１０ｋＤａ以下の比較的小さなタンパク質である。これらは疎水性が高く、約１０〜１２の等電点（ＩＥＰ）を有し、生理学的条件下において正に帯電している。
【００１１】
これに対して、例えば病原体血漿タンパク質といった周知の病原体タンパク質は著しく大きく、明らかにより大きな分子量（ＭＷ）を有している。サーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｂ及びＳＰ−Ｃとは逆に、これらのＩＥＰは８よりも小さく、従って生理学的条件下では負に帯電している。さらに、これらの病原体タンパク質は、天然のサーファクタントタンパク質よりも明らかに疎水性が低い。生理学的に関連する病原体タンパク質の例は、アルブミン（ＩＥＰ：約４．６；ＭＷ約６６ｋＤａ）、フィブリノゲン（ＩＥＰ：約５．８；ＭＷ：約３４０ｋＤａ）及びヘモグロビン（ＩＥＰ：約７．１；ＭＷ：約６４ｋＤａ）である。肺内で発生する病原体タンパク質の等電点及び分子量は、当業者には周知である。
【００１２】
病原体タンパク質は、肺の粘膜層に浸透し、天然のサーファクタントタンパク質のリン脂質との生理学的相互作用を阻害するため、肺の表面張力を増加させる。
本発明に基づくポリマー粒子は、５よりも大きい等電点（ＩＥＰ）を有することにより、肺の生理学的条件下で正に帯電している粒子として存在する。好ましい実施形態では、本発明に基づくポリマー粒子が、７よりも大きい等電点を有している。特に好ましい実施形態では、本発明に基づく粒子が、９よりも大きい等電点を有している。さらに、本発明に基づくポリマー粒子の等電点は、結合させる病原体タンパク質のＩＥＰよりも大きいように選択することができる。当業者には、例えば高分子電解質滴定などを用いて、ポリマーの等電点を測定する方法が知られている。当業者は、請求項の保護範囲を逸脱することなく、この知識を使用することができる。
【００１３】
任意で、本発明に基づくポリマー粒子は、常時、正に帯電していることができる。このことは、ポリマー粒子が第四級窒素原子を備えるポリマーである場合に該当する。
本発明に基づくポリマー粒子は、２０ｎｍ〜１０μｍの直径を有する。少なくとも２００ｎｍの直径を有する粒子は、肺のマクロファージによって積極的に認識され、吸収及び分解される。肺マクロファージは、肺深部（呼吸気管支、肺胞腔）の効率的なクリアランス機構である。２００ｎｍよりも小さいナノ粒子は、非特異的機序（受動輸送、拡散、エンドサイトーシス、トランスサイトーシスなど）によって、肺深部の粘膜層から上皮細胞、マクロファージ、免疫細胞、樹枝状細胞、内皮細胞又は間質の中に取り除かれる。しかし、本発明に基づくポリマー粒子は、１０μｍよりも大きくなることはない。なぜなら、肺のマクロファージはこれより大きな粒子を効果的に吸収できず、分解できないからである。好ましい実施形態では、本発明に基づくポリマー粒子が、２００ｎｍ〜１０μｍの直径を有している。特に好ましい実施形態では、本発明に基づくポリマー粒子が、２００ｎｍ〜６μｍの直径を有している。
【００１４】
本発明に基づくポリマー粒子は、水不溶性である。この場合、水不溶性ポリマーとは、本発明の意味において、水溶解度が０．１重量パーセントよりも小さいポリマーを意味する。
【００１５】
本発明に基づくポリマー粒子は、正の表面電荷及び＋２０ｍＶより大きい正のζ電位を有することにより、静電相互作用によって病原体タンパク質を吸着することができる一方、天然のサーファクタントタンパク質は吸着されない。好ましい実施形態では、本発明に基づくポリマー粒子が、正の表面電荷及び＋４０ｍＶより大きいζ電位を有している。特に好ましい実施形態では、本発明に基づくポリマー粒子が、正の表面電荷及び＋６０ｍＶより大きいζ電位を有している。正の表面電荷を備える粒子は、カチオン性粒子である。
【００１６】
親水性病原体タンパク質の吸着は、本発明に基づくポリマー粒子の低い表面疎水性によって、さらに有利になる。これに対し、疎水性サーファクタントタンパク質は吸着されない。本発明に基づき、「低い表面疎水性」とは、液滴法で測定した接触角が１２０°未満であることを意味する。好ましい実施形態では、本発明に基づくポリマー粒子が、液滴法で測定した接触角が９０°よりも小さい表面疎水性を有している。特に好ましい実施形態では、本発明に基づくポリマー粒子が、液滴法で測定した接触角が６０°よりも小さい表面疎水性を有している。
【００１７】
本発明に基づくポリマー粒子によって生じる病原体タンパク質の吸着は、粒子とタンパク質との間の純粋に物理的な相互作用プロセスに基づいていることが分かる。請求項１の特徴を有する全ての粒子が肺の粘膜層における病原体タンパク質の吸着に適していることは、当業者には明らかである。
【００１８】
本発明に基づくポリマー粒子を製造するのに適したモノマーは、限定はされないが、例えばアクリレート、メタクリレート、ブチルメタクリレート、（２−ジメチルアミノエチル）−メタクリレート、アミン類、アミド類、アセタール類、ポリエステル類、ケタール類、酸無水物、及び糖類である。この場合、ホモポリマー、コポリマー、ブロックポリマー、グラフトコポリマー、スターポリマー、櫛形ポリマー、高度に分岐したポリマー、ランダムポリマー（統計学的ポリマー、ｓｔａｔｉｓｔｉｓｃｈｅｓ  Ｐｏｌｙｍｅｒ）またはデンドリマーであってもよい。
【００１９】
本発明に基づくポリマー粒子は、正の表面電荷を有している。このことは、ポリマー自体が正の電荷を有している（例えば、カチオン性アクリレート、カチオン性櫛型ポリマーなど）か、もしくはポリマーを周知の粒子調製方法（例えば、ナノ析出、エマルション法など）によって処理するかいずれかを意味している。さらに、帯電していない、又は負の電荷を有するポリマーも使用することができ、これらのポリマーは周知の粒子製造方法（例えば、ナノ析出、エマルション法など）によって処理することができる。粒子の正電荷は、カチオン性乳化剤（塩化セチルピリジニウムなど）の存在により、製造中に生成される。さらに、追加工程（キトサン、ＤＥＡＥ−デキストラン、ＤＥＡ−ＰＡ、ＤＥＡＰＡ−ＰＶＡ、ＰＥＩなどの正に帯電したコーティング物質によるコーティング）により、製造後の粒子に正の表面電荷を備えることができる。この場合、ＤＥＡＥはジエチルアミノエチル基を、ＤＥＡ−ＰＡはジエチルアミノ−ポリアミドを、ＤＥＡＰＡ−ＰＶＡはジエチルアミノプロピルアミン修飾ポリビニルアルコールを、ＰＥＩはポリエチレンイミンを表している。
【００２０】
好ましい実施形態では、本発明に基づくポリマー粒子が、ポリ−（ブチルメタクリレート）−ｃｏ−（２−ジメチルアミノエチル）−メタクリレート−ｃｏ−メタクリル酸メチルから成る。このターポリマーは当業者には周知であり、本発明の範囲内で、本発明に基づくポリマー粒子の製造に用いることができる。この場合、ブチルメタクリレート、２−（ジメチルアミノエチル）−メタクリレート及びメタクリル酸メチルの３種類のモノマーの割合は、結果的に生じる粒子が請求項１の特徴を有している限り、本発明に基づいて変更することができる。どのターポリマー組成がこの条件を満たしているか確定する方法は、当業者には周知である。すなわち、当業者は大きな労力をかけることなく、また特許請求項の保護範囲を逸脱することなしに、適合するターポリマーを検出することができる。
【００２１】
特に好ましい実施形態では、ブチルメタクリレート、２−（ジメチルアミノエチル）−メタクリレート及びメタクリル酸メチルが１：２：１（ｗ／ｗ／ｗ）の割合で存在している。この種のターポリマーはＥｕｄｒａｇｉｔ（オイドラギット）（登録商標）Ｅ１００という名称で知られている。そのようなポリマーから製造される本発明に基づく粒子は、その等電点が８〜９にあることを特徴とすることができる。接触角は、８０〜９０°、例えば８６°である。さらに、そのζ電位は正であり、この場合、＋２０ｍＶよりも大きく、例えば＋４０〜＋６０ｍＶである。そのような粒子の直径は、有利には２００ｎｍよりも大きく、例えば４００〜５００ｎｍである。この粒子は、肺胞マクロファージによって積極的に貪食され、下気道の粘膜層から取り除くことができる。また、肺への吸入によって投与することも可能である。
【００２２】
本発明に基づくポリマー粒子は、例えばナノ析出又はエマルション法によって調製することができる。さらに、ナノ粒子は塩析法又は重合によって調製することができ、微粒子は噴霧乾燥によって製造することができる。
【００２３】
ナノ析出によって粒子を製造する場合、ポリマーの０．１〜１０％溶液（ｗ／ｖ）を第１の極性非プロトン性溶媒内で生成し、続いて、第２溶媒内で沈殿させる。この場合、第１の溶媒はポリマーを溶かし、第２の溶媒と完全又は部分的に混合できなければならないが、その際、第２の溶媒はポリマーを溶かさない。適した極性非プロトン性溶媒は、例えば、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、トリクロロメタン及びエチレンアミン（Ｅｔｈｙｌｅｎａｍｉｎ）である。第２の溶媒として水を使用するのが有利である。
【００２４】
沈殿生成は、ポリマー溶液を第２の溶媒に加えるか、又はポリマー溶液をこの溶媒に対して透析することによって行うことができる。続いて、この有機溶媒を取り除き、懸濁液中に粒子を保存する。
【００２５】
この場合、第１の溶媒の選択は、製造方法に左右される。原則的に、ポリマーを溶かし、第２の溶媒と完全又は部分的に混合できるような溶媒は、第１の溶媒として適している。本発明に基づくポリマー粒子の規定直径及び狭い粒度分布は、選択された製造方法、有機相中のポリマー濃度、撹拌速度、混合速度及び容量比によって調整することができる。さらに、このポリマー溶液には、オプションで、例えばアニオン性又は非イオン性の界面活性剤を添加することができる。界面活性剤の添加によって、本発明に基づくポリマー粒子の直径及び粒度分布を規定通りに調整することができる。言及した直径及び粒度分布の調整方法は、当業者には周知であり、特許請求項の保護範囲を逸脱することなく使用することができる。
【００２６】
本発明の利点は、ポリマー粒子の製造方法を提供することであり、本方法は、
ａ）第１の、有機、好ましくは極性非プロトン性溶媒にポリマーを溶かす工程、
ｂ）ポリマー溶液を第２の溶媒に加えるか、又はポリマー溶液をこの溶媒に対して透析することによって粒子を沈殿させ、このとき第１及び第２の溶媒は完全又は部分的に互いに混合可能であるが、第２の溶媒はポリマーを溶かさない工程、
ｃ）第１の溶媒を取り除き、懸濁液中に粒子を保存する工程、
という各工程を有している。
【００２７】
この場合、工程ａ）において、溶媒１ｍｌ当たり１〜４０ｍｇ、好ましくは１０〜３０ｍｇのポリマーを溶かす場合は有利である。さらに、工程ａ）のポリマーが、ホモポリマー、コポリマー、ブロックポリマー、グラフトコポリマー、スターポリマー、櫛形ポリマー、高度に分岐したポリマー、ランダムポリマー（ｓｔａｔｉｓｔｉｓｃｈｅｓ  Ｐｏｌｙｍｅｒ）またはデンドリマーであり、そのモノマー単位が、アクリレート、メタクリレート、ブチルメタクリレート、（２−ジメチルアミノエチル）−メタクリレート、アミン類、アミド類、アセタール類、ポリエステル類、ケタール類、酸無水物、及び糖類から選択され、第１の溶媒が、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、トリクロロメタン及びエチレンアミン（Ｅｔｈｙｌｅｎａｍｉｎ）から選択され、第２の溶媒は第１の溶媒と完全又は部分的に混合可能であるが、第２の溶媒はポリマーを溶かさない場合は有利である。
【００２８】
工程ａ）において、溶媒１ｍｌ当たり２０ｍｇのポリマーを溶かす場合は特に有利である。この場合、ポリ−（ブチルメタクリレート）−ｃｏ−（２−ジメチルアミノエチル）−メタクリレート−ｃｏ−メタクリル酸メチルを含むポリマーは、ブチルメタクリレート、２−（ジメチルアミノエチル）−メタクリレート及びメタクリル酸メチルの割合が１：２：１（ｗ／ｗ／ｗ）であり、第１の溶媒がアセトンであり、第２の溶媒が水であってよい。
【００２９】
本発明に基づくポリマー粒子は、有利には、圧電性のエアロゾル発生器、ノズル式エアロゾル発生器、超音波式エアロゾル発生器、ソフトミスト吸入器、計量投与用吸入器又はドライパウダー吸入器を使って噴霧することができ、従って、肺への投与は、ネブライザーを用いてエアロゾル（懸濁液、粉末）の吸入により行われる。この投与のためには、本発明に基づくポリマー粒子が、深肺部に達することができるように、６μｍよりも小さい直径を有している場合は有利である。
【００３０】
肺投与のもう１つの方法は、例えばカテーテル、気管支鏡又は挿管（例えばチューブ又は気管カニューレ）などを介する注入がある。
本発明に基づくポリマー粒子は、肺の表面張力の増加及び肺サーファクタントの損傷に伴って起こる肺疾患の予防及び／又は治療のための医薬品の製造に使用することができる。本発明に基づくポリマー粒子は、肺の低い表面張力を回復及び維持し、肺サーファクタントを保護することに用いられる。
【００３１】
従って、本発明に基づくポリマー粒子は、新生児呼吸窮迫症候群、急性／成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺損傷（ＡＬＩ）、肺感染症、肺炎、肺高血圧、心原性肺水腫、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）／肺気腫、間質性肺疾患、肺腫瘍、中毒性肺胞炎、肺胞出血症候群、嚢胞性線維症、特発性肺ヘモジデリン沈着症、膠原病、血管炎、塵肺症、好酸球性肺浸潤、放射線損傷、遺伝性又は先天性肺疾患、以上の疾患を治療又は診断する薬剤の製造に用いることができる。
【００３２】
この場合、本発明に基づくポリマー粒子の作用は、上述したように、病原体タンパク質が吸着されることによる、純粋に物理的特性である。続いて、病原体タンパク質を吸着したポリマー粒子は、肺のマクロファージによって排除されるか、又は非特異的クリアランス機構によって肺粘膜層から取り除かれる。
【００３３】
本発明のさらなる特徴、詳細及び利点は、請求項の文面及び以下の実施例の説明、並びに図に示されている。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】約５００ｎｍの平均粒径を備えるＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｅ１００ナノ粒子の走査型電子顕微鏡写真である。
【図２】約５００ｎｍの平均粒径を備える製造直後のＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｅ１００ナノ粒子の、動的光散乱法（ＤＬＳ）による粒度分布曲線である。実線は粒径の密度分布を示し、破線は粒径の累積分布を示している。
【図３ａ】ＢＳＡ及びシトクロムＣとともに粒子を培養した後の各タンパク質に対する、約５００ｎｍの平均粒径を備えるＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｅ１００ナノ粒子の吸着性能（Γ）を、様々な濃度（ａ）及びラングミュアモデルに適合したＢＳＡとシトクロムＣ吸着データ（ｂ）で示した図である。（ｂ）の実線は測定データの回帰曲線である。（ａ）の値は、平均値±標準偏差として表示されている（ｎ＝３）。
【図３ｂ】ＢＳＡ及びシトクロムＣとともに粒子を培養した後の各タンパク質に対する、約５００ｎｍの平均粒径を備えるＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｅ１００ナノ粒子の吸着性能（Γ）を、様々な濃度（ａ）及びラングミュアモデルに適合したＢＳＡとシトクロムＣ吸着データ（ｂ）で示した図である。（ｂ）の実線は測定データの回帰曲線である。（ａ）の値は、平均値±標準偏差として表示されている（ｎ＝３）。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
（材料）
以下に説明されている実施例で使用されるカチオン性ポリマー、すなわちポリ−（ブチルメタクリレート）−ｃｏ−（２−ジメチルアミノエチル）−メタクリレート−ｃｏ−メタクリル酸メチル１：２：１（Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｅ１００）は、Ｒｏｅｈｍ社（ダルムシュタット、ドイツ）から購入した。シトクロムＣ（ウシ心臓由来、９５％）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（シュタインハイム、ドイツ）から購入した。これらの試験において使用されたその他の全ての化学物質及び溶媒は、市販で入手可能な最高純度を有している。
【００３６】
（方法）
１．ナノ粒子の製造
ナノ粒子は、Ｈｙｕｎ−Ｊｅｏｎｇ  Ｊｅｏｎ，Ｙｏｕｎｇ−Ｉｌ  Ｊｅｏｎｇ，Ｍｉ−Ｋｙｅｏｎｇ  Ｊａｎｇ，Ｙｏｕｎｇ−Ｈｏｏｎ  Ｐａｒｋ，Ｊａｅ−Ｗｏｏｎ  Ｎａｈ：“Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ−ｆｒｅｅ  ｐｏｌｙ（ＤＬ−ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  ｎｏｒｆｌｏｘａｃｉｎ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ"，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  ２０００，２０７：９９−１０８で説明されている方法に基づいて生成された。本発明においては、２００ｍｇのポリマー（Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｅ１００）を１０ｍｌのアセトンに溶解した。次に、１０ｍｌのポリマー溶液を透析チューブ（孔径１０ｋＤａ）の中に加え、蒸留水に対して２４時間透析した。粒子は、製造直後に特性解析され、使用された。
【００３７】
ナノ粒子の特性解析
項目１の方法で製造されたナノ粒子は、以下の項目２〜４で説明されている方法によって特性解析された。
【００３８】
２．走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）
希釈されたナノ粒子懸濁液の１滴を、シリコンウェハースの上に加えた。次に、全ての試料を真空乾燥し、Ｇａｔａｎ  Ａｌｔｏ  ２５００  Ｓｐｕｔｔｅｒ  Ｃｏａｔｅｒｓ（Ｇａｔａｎ社、ミュンヘン、ドイツ）を使って白金でコーティングした。ナノ粒子の形態は、走査型電子顕微鏡（ＪＳＭ−７５００Ｆ、日本電子、エヒング（Ｅｃｈｉｎｇ）、ドイツ）を用いて２〜５ｋＶで検査した。
【００３９】
３．粒径及びζ電位の測定
得られたナノ粒子の流体力学的粒径及び粒度分布を、動的光散乱法（ＤＬＳ）によって測定した。ζ電位は、レーザードップラー流速計（ＬＤＡ）によって、ゼータサイザーナノＺＳ／ＺＥＮ３６００（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、ヘレンベルク、ドイツ）を用いて特定した。全ての試験は、２５℃の温度で、適切な希釈液中の試料で実施した。ＤＬＳのため、濾過し、２回蒸留した水で試料を希釈した。ＬＤＡには、試料を希釈するため、１．５６ｍＭのＮａＣｌを用いた。全ての測定は３度実施され、最低１０回のナノ粒子の製造直後に実施された。
【００４０】
４．タンパク質のナノ粒子への吸着
シトクロムＣ及びＢＳＡのナノ粒子への吸着を測定するため、モデルタンパク質シトクロムＣ（ＩＥＰ＝１０、ＭＷ＝１２．３ｋＤａ）及び病原体モデルタンパク質ＢＳＡ（ＩＥＰ＝約４．６、ＭＷ＝約６６ｋＤａ）の規定濃度及び規定量をもつナノ粒子懸濁液を２５℃で３時間培養した。ナノ粒子に吸着したタンパク質の量は、ナノ粒子懸濁液に添加したタンパク質の量と、水相に残留している吸着しなかったタンパク質の量との差によって特定した。培養後、試料を１６，０００×ｇで２時間遠心分離機にかけ（遠心分離機５４１８、エッペンドルフ、ハンブルク、ドイツ）、上澄み液中の結合していないタンパク質は、シトクロムＣ及びＢＳＡの吸光係数によってそれぞれ特定した。各タンパク質濃度について、培養時間中のタンパク質損失を検出するため、ナノ粒子を含まない対照試料を作成した。タンパク質負荷率は、以下の式のように計算した。
【００４１】
【数１】
2013545717.tif 000002
【００４２】
５．表面疎水性
表面疎水性は、液滴法で特定することができる。この場合、当業者に知られている方法は光学的接触角測定である。
【００４３】
６．等電点
ポリマー粒子の等電点は、高分子電解質滴定によって特定することができる。
（結果）
１．ナノ粒子の特性
「項目３の方法」に従って特定されたナノ粒子の物理化学的特性が表１に示されている。
【００４４】
【表１】
2013545717.tif 000003
【００４５】
使用したナノ粒子製剤の構造、粒径及び粒度分布を特定するため、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）による測定が実施された。図１から、ナノ粒子が約５００ｎｍの平均粒径を有していることが分かる。この場合、白い尺度の長さは、表示されているように１μｍである。表示されているほとんどの粒子は、この尺度の約半分に該当する直径を有している。この写真は、倍率８０００倍、電圧２．０ｋＶで撮影された。これらのナノ粒子は、ほぼ球形である。ナノ粒子製剤の粒径及び粒度分布を、さらに動的光散乱法（ＤＬＳ）によって調べた。ＤＬＳによる密度及び累積粒度分布の典型的な曲線が図２に示されている。この場合、実線は密度分布を示し、その目盛は左のｙ軸で読み取ることができる。破線は累積粒度分布を示し、その目盛は右のｙ軸で読み取ることができる。最大の密度分布が約５００ｎｍの粒径にあることが分かる。従って、図２に示されている曲線は、全ての製剤について、平均粒径が約５００ｎｍであり、狭い粒度分布を有していることを証明している。走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）のデータは、動的光散乱法（ＤＬＳ）のデータとよく一致している。
【００４６】
Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｅ１００ナノ粒子の表面電荷（ζ電位）はレーザードップラー流速計を使って特定され、ζ電位は＋５３．７ｍＶであり、正電位であった。
粒子の等電点は８．５±０．５、接触角は８６°である。
【００４７】
２．シトクロムＣ及びＢＳＡのナノ粒子への吸着
様々なナノ粒子製剤表面のサーファクタント結合タンパク質の吸着をシミュレーションするため、正に帯電しているモデルタンパク質シトクロムＣを使用した（図３）。ＢＳＡは、粘膜層内の病原体タンパク質のモデルタンパク質として選択された。図３ａの吸着等温線に示されているように、シトクロムＣ及びＢＳＡ（Γ）の吸着量が、シトクロムＣ又はＢＳＡ濃度（Ｃ0）の関数としてそれぞれ記載されており、ナノ粒子表面に吸着されたシトクロムＣの量は、最大１５μｇ／ｍｇポリマー（ｎ＝３）であり、ＢＳＡの場合は最大１００μｇ／ｍｇポリマー（ｎ＝３）であった。続いて、これらの吸着データを、検査した濃度範囲にわたって、以下の式によって説明されるラングミュア吸着モデルに適合させた。
【００４８】
【数２】
2013545717.tif 000004
【００４９】
ここで、Γは吸着されたタンパク質の量を示し、ｃeは培養培地中のタンパク質平衡濃度であり、ｂはナノ粒子とタンパク質との間の親和性に関する係数を示し、Γmは最大吸着容量を示している。回帰直線を図３ｂに示し、ラングミュアの式のために算出したパラメータを表２に示す。これらのデータは、ナノ粒子表面上のタンパク質の単分子層の形成を示した（Ｒ2＞０．９９）。親和性（ｂ）及びナノ粒子表面へのモデルタンパク質のギブズ自由吸着エネルギー（ΔＧ0）は、使用したタンパク質の種類に依存している。正に帯電しているシトクロムＣに対しては、僅かな親和性しか認められなかったが（ｂ＝０．０３１±０．０１２ｍｌ／ｍｇ（平均値±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝３）及びΔＧ0＝＋１．７±１．５ｋＪ／ｍｏｌ（平均値±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝３））、ＢＳＡに対する親和性はより高かった（ｂ＝０．０７０±０．０２６ｍｌ／ｍｇ（平均値±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝３）及びΔＧ0＝−４．８±０．７ｋＪ／ｍｏｌ（平均値±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝３））。
【００５０】
【表２】
2013545717.tif 000005
【００５１】
本発明は、説明された実施形態のいずれかに限定されるものではなく、様々な方法で適用することができる。
請求項、明細書及び図から生じる特徴及び利点の全ては、構造的な詳細、空間的配置及び方法の工程を含み、それ自体でも、様々な組合せにおいても本発明の要素であり得る。
【００５２】
全体として、肺疾患治療に対し、コロイドキャリアの目標とする製造及び最適化のためのサーファクタント成分と血漿タンパク質とのポリマー粒子の相互作用メカニズムに関する知見を使用できることが確認された。
【００５３】
ポリマーナノ粒子表面へのサーファクタント結合タンパク質の吸着により、肺サーファクタント機能は悪化する。吸着されたサーファクタントタンパク質は、空気−水界面のサーファクタント構造をもはや組織することはできないため、（度合及び時間経過について）天然のサーファクタント材料と同様の方法で表面張力を減少させることはできない。
【００５４】
血漿タンパク質（例えば、アルブミン）の肺粘膜層への浸透は、例えば成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）について説明されているように、肺サーファクタントの機能障害を引き起こす（Ｗ．Ｓｅｅｇｅｒ，Ｃ．Ｇｒｕｂｅ，Ａ．Ｇｕｎｔｈｅｒ，Ｒ．Ｓｃｈｍｉｄｔ：“Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ"，Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ  １９９３，６：９７１−９７７）。肺粘膜層に浸透した血漿タンパク質のポリマーナノ粒子表面への吸着により、肺サーファクタント機能に有利な影響を与えることが可能となる。吸着された血漿タンパク質は、空気−水界面のサーファクタント構造をもはや損傷することはできない。
【００５５】
本発明に基づく生体適合性ナノ、メソ及びマイクロポリマー粒子は、生理学的に関連するサーファクタント結合タンパク質を肺粘膜層から取り除くことなく、有害なタンパク質を除去することができる。この方法により、本発明に基づくポリマー粒子は、肺の界面活性物質系を保護する。
【図１】
2013545717.tif 000006
【図２】
2013545717.tif 000007
【図３ａ】
2013545717.tif 000008
【図３ｂ】
2013545717.tif 000009
【国際調査報告】
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2013545717.tif 000011
2013545717.tif 000012
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