(57)【要約】本発明は、ｉ）双極性トランスカロテノイド、ｉｉ）シクロデキストリン、及びｉｉｉ）コーティングを含む双極性トランスカロテノイドの経口送達のための医薬組成物を含む双極性トランスカロテノイドの様々な製剤に関する。本発明はまた、このような製剤の調製及びそれらの使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）双極性トランスカロテノイド、
ｉｉ）シクロデキストリン、及び
ｉｉｉ）コーティングを含む、双極性トランスカロテノイドの経口送達のための医薬組成物。
【請求項２】
双極性トランスカロテノイドが塩である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
双極性トランスカロテノイドがＴＳＣである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
コーティングが腸溶コーティングである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
コーティングが５．５を上回るｐＨで双極性トランスカロテノイドを放出する腸溶コーティングである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
コーティングが６．５を上回るｐＨで双極性トランスカロテノイドを放出する腸溶コーティングである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
コーティングが腸内で双極性トランスカロテノイドを放出するコーティングである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
コーティングがアクリレートポリマーである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
シクロデキストリンがアルファシクロデキストリン、ベータシクロデキストリン及びガンマシクロデキストリンからなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
双極性トランスカロテノイドが、合成トランスナトリウムクロセチネートであって、組成物中のトランス異性体の純度レベルが、ＵＶ−可視光分析において、ＵＶ波長範囲で生じるピークの吸光度で除した可視波長範囲で生じる最高のピークの吸光度が７．５を上回る、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
単位剤形である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
錠剤、丸剤又はカプセル剤の形態である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
双極性トランスカロテノイドをシクロデキストリンと混合するステップと、
この混合物をカプセルに添加するか、又は錠剤を作製するステップと、
腸溶コーティングを添加するステップと
を含む、双極性トランスカロテノイドを経口送達するための医薬組成物の形成方法。
【請求項１４】
哺乳類に請求項１の組成物の治療有効量を経口的に投与することを含む、哺乳類における酸素の拡散率の増加方法。
【請求項１５】
低酸素症を特徴とする疾患又は病気を有する哺乳類の治療方法であって、前記哺乳類に請求項１の組成物の治療有効量を経口的に投与することを含む方法。
【請求項１６】
低酸素症を特徴とする疾患又は病気のリスクがある哺乳類の治療方法であって、前記哺乳類に請求項１の組成物の治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項１７】
低酸素症を特徴とする前記疾患又は病気が、虚血、癌、外傷性脳損傷、呼吸器疾患、出血性ショック、心臓血管疾患、多臓器不全、アテローム性動脈硬化、ＰＡＤ、ＰＶＤ、心筋梗塞、肺気腫、喘息、ＡＬＩ、ＡＲＤＳ、ＣＯＰＤ、高血圧、脳浮腫、乳頭腫、脊髄損傷、脳卒中及び中枢神経系の病気からなる群から選択される、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
代謝異常症候群を有する哺乳類の治療方法であって、前記哺乳類に双極性トランスカロテノイドを含む組成物の治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項１９】
癌を有する哺乳類の治療方法であって、前記哺乳類に本質的に双極性トランスカロテノイド塩からなる組成物の治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項２０】
パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、フリードライヒ運動失調症、ハンチントン病、レビー小体病及び脊髄性筋萎縮症からなる群から選択される神経変性疾患を有する哺乳類の治療方法であって、前記哺乳類に双極性トランスカロテノイドを含む組成物の治療有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項２１】
双極性トランスカロテノイドが双極性トランスカロテノイド塩である、請求項１８又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
組成物がシクロデキストリンをさらに含む、請求項１９又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
組成物を経口的に投与する、請求項１８、１９又は２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、拡散増強化合物の製剤に関する。本発明の組成物は通常、双極性トランスカロテノイド、シクロデキストリン及びコーティングを含む。経口送達のために、ｐＨ応答性化合物で腸溶コーティングした組成物が含まれる。
【背景技術】
【０００２】
治療薬の経口的送達は、この経路が概して、患者のコンプライアンスを高め、注射に伴う副作用の数を減少させ、使用者に利便性をもたらすので、一般に患者にとって最も評判の良い薬剤送達方法であると考えられている。このような投与経路は、慢性的な病気の患者に投与するために非常に好都合である。
【０００３】
カロテノイドは、イソプレノイド単位からなる炭化水素の一種である。分子の主鎖は、共役した炭素−炭素二重結合及び単結合から構成され、ペンダント基を有することもできる。クロセチン及びトランスナトリウムクロセチネート（ＴＳＣ）は、水溶液中において酸素の拡散率を増加させることが知られている。
【０００４】
米国特許第６，０６０，５１１号は、トランスナトリウムクロセチネート（ＴＳＣ）及びその使用に関する。この特許は、酸素拡散率の改善及び出血性ショックの治療などのＴＳＣの様々な使用を対象としている。
【０００５】
米国特許出願第１０／６４７，１３２号は、双極性トランスカロテノイド塩（ＢＴＣ）を作製するための合成方法及びそれらの使用方法に関する。
【０００６】
米国特許出願第１１／３６１，０５４号は、改善されたＢＴＣ合成方法及びＢＴＣの新たな使用に関する。
【０００７】
米国特許出願第１２／０８１，２３６号は、末梢血管疾患の前処理として、及び末梢血管疾患の治療における双極性トランスカロテノイドの使用に関する。
【０００８】
米国特許出願第１２／２８９，７１３号は、低分子拡散を高める治療薬の新たな種類に関する。
【０００９】
米国特許仮出願第６１／２１３，５７５号は、血栓溶解剤と併せた拡散増強化合物の使用に関する。
【００１０】
様々な双極性トランスカロテノイド製剤が開示されてきた。所有者共通の出願、米国特許出願第１０／６４７，１３２号及び米国特許出願第１１／３６１，０５４号を参照のこと。
【発明の概要】
【００１１】
本発明の医薬組成物は、拡散増強化合物、シクロデキストリン及びコーティングを含む。本発明はまた、双極性トランスカロテノイドを経口送達するための医薬組成物の形成方法であって、双極性トランスカロテノイドをシクロデキストリンと混合するステップと、この混合物をカプセル剤に添加するか、又は錠剤を作製するステップと、コーティング、有利には腸溶コーティングを添加するステップとを含む方法に関する。本発明にはまた、哺乳類において酸素の拡散率を増加させる方法、並びに虚血、癌、外傷性脳損傷、呼吸器疾患、出血性ショック、心臓血管疾患、多臓器不全、アテローム性動脈硬化、ＰＡＤ、ＰＶＤ、心筋梗塞、肺気腫、喘息、ＡＬＩ、ＡＲＤＳ、ＣＯＰＤ、高血圧、脳浮腫、乳頭腫、脊髄損傷、中枢神経系の病気、特に神経変性を特徴とする疾患、及び代謝異常症候群及びその合併症などの低酸素症を特徴とする疾患又は病気を有する哺乳類の治療方法も含まれる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
トランスナトリウムクロセチネート（ＴＳＣ）などの双極性トランスカロテノイド（ＢＴＣ）は、カロテノイドファミリーの化合物のメンバーであるが、カプセル剤又は丸剤の形態で販売されているその他のカロテノイド（例えば、ベータカロテン又はビタミンＡ）と類似した方法で経口的に投与することはできない。ＢＴＣ化合物の経口製剤の開発において説明しなければならない２つの要素は、その他のカロテノイド化合物とは全く異なるｐＨ及び溶解性の問題である。その他のカロテノイド化合物の製剤化で使用された方法は、ＴＳＣなどの化合物では全くうまくいかない。
【００１３】
ＴＳＣは、酸性条件、例えば、胃内で存在する酸性条件の下で沈殿する。この固形物質は、胃の酸性環境においては実際に不溶性である。ＴＳＣは酸性条件下で安定ではなく、沈殿可能なシス異性体に変換される。胃の厳しい酸性環境においてＴＳＣを保護し、より都合のよいｐＨ領域においてＴＳＣを放出する系が考案された。より都合のよいｐＨは小腸内に存在する。インサイツクローズドループ研究によって、ＴＳＣを小腸に直接投与すると、胃と比べて生物学的利用率が増加することが示された。以下の実施例参照のこと。ＴＳＣの効果は、体内で見出されるＴＳＣ濃度レベルに左右されると考えられている。ＴＳＣの効果は、ＴＳＣを経口的に投与することによって延長させることができる。
【００１４】
双極性トランスカロテノイドの錠剤には、錠剤作製に通常使用される添加剤が含まれる。錠剤はまた、酸性の胃内ではなく消化管のより高いｐＨ領域（＞５．５）で溶解するように、腸溶コーティングを有すると有利である。
【００１５】
本発明の組成物
本発明の組成物は全て、医薬品グレード、すなわち医薬組成物になるように製造される。このような製剤には、当業者には公知の薬学的に許容される担体並びにその他の治療薬を含めることができる。この製剤には、拡散増強化合物の拡散率を改善する能力を阻害する化合物は含まれないのが有利である。
【００１６】
本発明の組成物は、ａ）拡散増強化合物、ｂ）シクロデキストリン及びｃ）コーティングを含む。代わりに、ｐＨ応答性担体（すなわち、ＴＳＣはポリマーマトリクス中で分散／保持される）、又は持続放出系（徐放、制御放出などとしても知られている）を使用することができる。
【００１７】
Ａ．拡散増強化合物
本発明の拡散増強化合物には、いずれも参照により全体を本明細書に組み込んだ米国特許出願第１０／６４７，１３２号、米国特許出願第１１／３６１，０５４号、米国特許出願第１２／０８１，２３６号及び米国特許出願第１２／２８９，７１３号において記載されているものが含まれる。
【００１８】
本発明の拡散増強化合物には、トランスカロテノイドジエステル、ジアルコール、ジケトン及びジアシッドを含むトランスカロテノイド、双極性トランスカロテノイド（ＢＴＣ）及び双極性トランスカロテノイド塩（ＢＴＣＳ）がある。ＴＳＣなどの下式を有する双極性トランスカロテノイド化合物が含まれる：
ＹＺ−ＴＣＲＯ−ＺＹ
式中、
Ｙ＝陽イオン、
Ｚ＝陽イオンに関連する極性基、及び
ＴＣＲＯ＝トランスカロテノイド骨格である。
【００１９】
より具体的には、
Ｙ（２つの末端が同じであっても異なっていてもよい）＝Ｈ又はＨ以外の陽イオン、好ましくはＮａ＋又はＫ＋又はＬｉ＋である。Ｙは、有利には１価の金属イオンである。Ｙはまた、有機陽イオン、例えば、Ｒ４Ｎ＋、Ｒ３Ｓ＋であり、式中、ＲはＨ又はＣｎＨ２ｎ＋１で、ｎは１〜１０、有利には１〜６である。例えば、Ｒはメチル、エチル、プロピル又はブチルであってもよい。
【００２０】
Ｚ（二つの末端が同じであっても異なっていてもよい）＝Ｈ又は陽イオンに関連する極性基である。所望により、カロテノイド（又はカロテノイド関連化合物）の末端の炭素を含み、この基はカルボキシル（ＣＯＯ−）基又はＣＯ基（例えば、エステル、アルデヒド又はケトン基）又はヒドロキシル基であってもよい。この基はまた、硫酸基（ＯＳＯ３−）又は１リン酸基（ＯＰＯ３−）、（ＯＰ（ＯＨ）Ｏ２−）、２リン酸基、３リン酸基又はそれらの組み合わせであってもよい。この基はまた、ＣＯＯＲ（式中、ＲはＣｎＨ２ｎ＋１である）のエステル基であってもよい。
【００２１】
ＴＣＲＯ＝トランスカロテノイド又は直鎖状で、ペンダント基（以下に定義）を有するカロテノイド関連骨格（有利には、炭素１００個未満である）であり、通常は「共役した」又は交互になった炭素−炭素二重及び単結合を含む（一実施形態では、ＴＣＲＯはリコペンのように完全には共役していない）。ペンダント基（Ｘ）は通常メチル基であるが、以下に記述したようなその他の基であってもよい。有利な実施形態では、骨格の単位は、それらの配置が分子の中心で逆向きになるようにつながっている。炭素−炭素二重結合を囲む４個の単結合は全て、同じ平面で結合している。ペンダント基が炭素−炭素二重結合と同じ側にあるならば、この基はシス（「Ｚ」としても知られている）と呼ばれ、炭素−炭素結合と反対の側にあるならば、トランス（「Ｅ」としても知られている）と呼ばれる。この場合は全て、異性体はシス及びトランスと呼ばれるだろう。
【００２２】
本発明の化合物は、トランスである。シス異性体は通常有害物であり、拡散率の増加を引き起こさない。一実施形態では、骨格が直鎖状のままの場合シス異性体を利用することができる。ペンダント基の置換は、分子の中心点に対して対称であってもよく、或いは、ペンダント基の種類に関して、又は中心の炭素に対する空間的関係のいずれかに関して、分子の左側が分子の右側と同じように見えない非対称であってもよい。
【００２３】
ペンダント基Ｘ（同じであっても異なっていてもよい）は、水素（Ｈ）原子、又は１０個以下、有利には４個以下の炭素を有する直鎖若しくは枝分かれ鎖炭化水素（所望によりハロゲンを含有する）又はハロゲンである。Ｘはまた、エステル基（ＣＯＯ−）又はエトキシ／メトキシ基であってもよい。Ｘの例は、メチル基（ＣＨ３）、エチル基（Ｃ２Ｈ５）、フェニル又は環にペンダント基を有する、又は有さない芳香族性単環構造、ＣＨ２Ｃｌなどのハロゲン含有アルキル基（Ｃ１〜Ｃ１０）、Ｃｌ若しくはＢｒなどのハロゲン又はメトキシ（ＯＣＨ３）若しくはエトキシ（ＯＣＨ２ＣＨ３）である。ペンダント基は、同じであっても異なっていてもよいが、利用されるペンダント基は骨格を直鎖に維持しなければならない。
【００２４】
多くのカロテノイドが天然に存在するが、カロテノイド塩は存在しない。参照により全体を本明細書に組み込んだ所有者共通の米国特許第６，０６０，５１１号は、トランスナトリウムクロセチネート（ＴＳＣ）に関する。ＴＳＣは、天然に生じるサフランを水酸化ナトリウムと反応させ、次いでトランス異性体を主に選択する抽出によって作製された。
【００２５】
カロテノイド又はカロテノイド塩のシス及びトランス異性体の存在は、水性溶液に溶解したカロテノイド試料の紫外線−可視スペクトルを観察することによって測定することができる。スペクトルを見ると、最高のピークの吸光度の値は、３８０〜４７０ｎｍの可視波長範囲内で生じる（この数値は使用した溶媒及びＢＴＣ又はＢＴＣＳの鎖長に左右される）。ペンダント基の付加及び異なる鎖長によって、このピーク吸光度は変化し得るが、当業者であれば、これらの分子の共役主鎖構造に対応する可視範囲の吸光度ピークの存在を、２２０〜３００ｎｍのＵＶ波長範囲内で生じるピークの吸光度によって除すると、異性体の純度レベルを決定するために使用することができることを認識するであろう。トランスカロテノイドジエステル（ＴＣＤ）又はＢＴＣＳを水に溶解すると、可視波長範囲の最高ピークは３８０ｎｍ〜４７０ｎｍの間であったが（正確な化学構造、主鎖長及びペンダント基に左右される）、ＵＶ波長範囲のピークは２２０〜３００ｎｍの間であろう。参照により全体を本明細書に組み込んだＭ．Ｃｒａｗ及びＣ．ＬａｍｂｅｒｔのＰｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．３８（２）、２４１〜２４３（１９８３）によれば、計算の結果（クロセチンを分析した場合）は３．１で、精製後は６．６に増加した。
【００２６】
米国特許出願第１０／６４７，１３２号及び米国特許出願第１１／３６１，０５４号に記載されたように、合成ＴＳＣに対してＣｒａｗ  ａｎｄ  Ｌａｍｂｅｒｔ分析を実施すると、その比は７．０を上回り（例えば、７．０〜８．５）、有利には７．５を上回り（例えば、７．５〜８．５）、最も有利には８を上回る。合成された物質は、「より純粋な」又は非常に精製されたトランス異性体である。
【００２７】
有利には、トランスカロテノイドはクロセチン、クロシン、ＴＳＣなどの双極性トランスカロテノイド（ＢＴＣ）塩又はカロテノイドジエステル、アルコール若しくは酸である。
【００２８】
Ｂ．シクロデキストリン
界面活性剤、キレート化剤、グリコール、ポリエチレングリコール及びその他などの多くの添加剤は、薬物の胃腸管からの生物学的利用率を増加させることが示唆されたことがあるが、双極性トランスカロテノイドと共にシクロデキストリンを用いると極めて良好に作用する。
【００２９】
双極性トランスカロテノイドと組み合わせたシクロデキストリンの詳細な記載は、参照により全体を本明細書に組み込んだ所有者共通の米国特許出願第１１／３６１，０５４号に見出すことができる。
【００３０】
有利には、双極性トランスカロテノイドは、トランスカロテノイド及びシクロデキストリン、例えば、アルファシクロデキストリン、ベータシクロデキストリン又はガンマシクロデキストリンを含む組成物の形態である。シクロデキストリンは、ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン又は２−ヒドロキシプロピル−ガンマ−シクロデキストリンであってもよい。別の実施形態では、組成物はマンニトール及び生理食塩水をさらに含む。さらに他の実施形態では、組成物は炭酸水素塩又はグリシンなどのｐＨを調節する化合物をさらに含む。
【００３１】
有利には、双極性トランスカロテノイドのシクロデキストリンに対する比は、最高１：１０である。有利には、最高１：４、例えば、２：１、１：１又は１：４である。
【００３２】
Ｃ．コーティング
腸溶コーティングは、経口医薬品が吸収される消化系での位置を制御する、経口医薬品に適用されるバリヤーである。腸溶とは、小腸を意味し、したがって、腸溶コーティングは医薬品が小腸に到達する前に放出するのを防ぐ。ほとんどの腸溶コーティングは、胃内で見出される強い酸性のｐＨで安定な表面を与えることによって作用するが、より弱い酸性の（相対的により塩基性の）ｐＨで迅速に崩壊する。例えば、腸溶コーティングは胃の酸性分泌液（ｐＨ１〜３）では溶解しないが、小腸内に存在するより高いｐＨ（ｐＨ５．５を上回る）環境では溶解する。腸溶コーティングに使用される物質には、脂肪酸、ワックス及びシェラック並びにプラスチックが含まれる。
【００３３】
双極性トランスカロテノイドは酸性条件において沈殿する。このような種類の薬物では、胃の酸曝露から活性物質を保護し、代わりにより溶けやすい塩基性ｐＨ環境（腸のｐＨ５．５以上）に活性物を送達させ、その所望する作用を与えることができるように、腸溶コーティングを製剤に付加する。
【００３４】
ＴＳＣの効果は、体内で見出されるＴＳＣ濃度レベルに左右されると考えられている。ＴＳＣの効果は、ＴＳＣを経口的に投与することによって延長させることができる。ＴＳＣは酸性条件において沈殿するので、本発明の組成物は胃の厳しい酸性環境においてＴＳＣを保護し、腸におけるより都合のよいｐＨ領域でＴＳＣを放出する。
【００３５】
腸溶コーティングは、胃内での胃液中における溶解から活性物質を保護するために、経口投与製剤に適用される。腸溶コーティングを使用する最も一般的な理由には、
胃の酵素及び胃液の酸性からの活性物質の保護、
働き又は臭いの遮蔽、
悪心及び嘔吐を含む胃の刺激の防御、
吸収制御のための徐放、
全身吸収のためにより都合のよい、消化管の特定の部位への活性物質の送達が含まれる。
【００３６】
別の実施形態には、ＴＳＣなどの双極性トランスカロテノイドを腸のより多くの部分で吸収させるため、したがって、吸収に利用可能な表面領域を増加させるため、より広い範囲のｐＨ値で反応する腸溶コーティングを使用することが含まれる。
【００３７】
コーティングの組成
腸溶コーティング物質に使用するために利用可能な物質は多い。ほとんどは、コーティング物質（カルナウバロウ、ケラチン、グルテンなど）のゆっくりした浸食、又はｐＨ応答性コーティングのいずれかによって機能を果たす。浸食機構に頼る物質は、胃内容排出時間に左右される。第２の種類、ｐＨ応答性コーティングは、疎水性であり、低いｐＨ条件では不水溶性で、高いｐＨで可溶性になる。したがって、コーティングは、胃の厳しい酸性環境では不溶性で、腸の高いｐＨ領域で溶解する。崩壊が起こる特定のｐＨに基づいて選択できるｐＨ感受性ポリマーは多く利用可能である。以下の表では、最も一般的なｐＨ感受性ポリマーのいくつかを挙げる。
【００３８】
【表１】
2013527231.tif 000002
【００３９】
３種類の市販のアクリレートポリマークリル酸及びメタクリル酸のエステルから得られたコポリマーは、オイドラギットＬ３０Ｄ−５５、Ｌ１００及びＦＳ３０Ｄである。これらのポリマーのｐＨ依存性機能は、それらの官能性カルボン酸基
【化１】
2013527231.tif 000003
によって決定される。
【００４０】
オイドラギットＬ３０Ｄ−５５：溶解は、十二指腸の標的放出領域に関連するｐＨ５．５以上で生じる。
【化２】
2013527231.tif 000004
【００４１】
オイドラギットＬ１００：溶解は、回腸の標的放出領域のｐＨ６．０以上で生じる。
【化３】
2013527231.tif 000005
【００４２】
オイドラギットＦＳ３０Ｄ：溶解は、空腸の標的放出領域のｐＨ７．０以上で生じる。
【００４３】
Ｄ．その他の成分
拡散増強化合物を緩衝するために薬剤を添加することができる。浸透圧に影響を及ぼすために、又は経口製剤に必要な配合剤としてその他の薬剤を添加することができる。具体的な緩衝剤には、グリシン、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸マグネシウム及び水酸化アルミニウムが含まれる。浸透圧に影響を及ぼす具体的な薬剤には、マンニトール及び多糖類が含まれる。
【００４４】
添加することができるその他の薬剤には、以下が含まれる。
【００４５】
プロソルブ（Ｐｒｏｓｏｌｖ）９０は、ケイ酸化微結晶性セルロースである。プロソルブＳＭＣＣ９０は、錠剤製剤のためにその種類で最高の圧縮性と流動性のバランスをもたらすといわれている。プロソルブＳＭＣＣ９０は製剤の流動性を改善し、粒子の硬度を高め、含量均一性を改善する。
【００４６】
クロスポビドンＸＬ９０は、球状化助剤として、及び微結晶性セルロースの代替として錠剤化で使用される架橋結合ポリビニルピロリドンである。球状化、球形化（ｍａｒｍｕｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）、ペレット化及びマイクロペレット化は全て同じこと、すなわち製薬及び関連産業で使用するための小球体状の製品の製造を意味する。これらのプロセスによって生成した製品は全て、球状体、球体、微粒子、ペレット、マイクロペレット又は薬剤ペレットと呼ぶことができる。これらの用語は全て、同じことを意味している。大きさの範囲は通常、直径約０．８ｍｍ〜１．５ｍｍであるが、より小さくても大きくてもよい。対照的に、顆粒化という用語は通常、バッチ内でのサイズ範囲が大きい、不規則な形状の粒子を意味する。顆粒化された材料は通例密度が低い。
【００４７】
オクタデカン酸、マグネシウム塩とも呼ばれるステアリン酸マグネシウムは、室温で固形の白色物質である。化学式Ｃ３６Ｈ７０ＭｇＯ４を有する。２価のステアレート（ステアリン酸の陰イオン）及び１個のマグネシウム陽イオン（Ｍｇ２＋）を含有する塩である。ステアリン酸マグネシウムは約８８℃で融解し、水には溶解せず、ヒトが消費しても安全であると通例考えられている。ステアリン酸マグネシウムは無害であると広く見なされているので、医療用錠剤及びカプセル剤の製造において充填剤として使用されることが多い。この点に関して、この物質はまた、滑沢特性を有するので使用されることが多く、化学粉末を固形の錠剤に圧縮する間に成分が製造機器に固着するのを防ぐ。
【００４８】
コリドン（Ｋｏｌｌｉｄｏｎ）は、様々な分子量のポリビニルポリマーであり、懸濁化剤及び分散化剤及び医薬品のビヒクルとして使用される。
【００４９】
製剤化の方法
経口投与に適した本発明の製剤は、丸剤、カプセル剤、サシェ剤又は錠剤などの分離した単位として、散剤若しくは顆粒剤として、又は溶液剤、懸濁剤若しくは乳剤として提供することができる。経口投与に適した製剤は、ロゼンジ剤及びパステル剤をさらに含む。この製剤は、単位剤形で便利に提供することができ、製薬業界では公知の方法によって調製することができる。製剤は、拡散増強化合物の速放、又は遅放又は制御放出のためのものであってもよい。徐放系（持続放出、制御放出などとしても知られている）の利点は、投与頻度を減少させることができ、同じ薬物のその他の製剤と比較して全身の薬物濃度が長期の間より一定であることである。
【００５０】
本発明の組成物の適切な投薬量は、所与の化合物の代謝、治療する病気の重症度に左右される。「治療上有効な」用量では、所望する効果を有さなくてはならず、すなわち、組成物を投与する適応症の症状を軽減しなくてはならない。治療上有効な投薬量は、治療する病気、病気の重症度、対処する哺乳類患者それぞれの病期及び個々の特性、並びに拡散増強効果のクリアランスに左右される。
【００５１】
通常、本発明の組成物は、双極性トランスカロテノイドと選択したシクロデキストリンを最高１：１０の比で混合することによって作製される。混合は、任意の薬学的に許容される方法によって行う。次に、この混合物をカプセル容器に添加するか、錠剤（型などからの放出を促進するために前述した成分を含有することもできる）に圧縮する。次に、カプセル剤又は錠剤は、連続したコーティングを施すような方法でオイドラギットなどのｐＨ感受性ポリマーでコーティングされる。
【００５２】
本発明の一実施形態では、複数の種類の腸溶コーティングビーズをカプセル又は経口送達用のその他の系の中に入れる。これらのビーズは、第１のコーティングを有するビーズの第１の部分又は群及び第２のコーティングを有するビーズの第２の部分又は群から構成される。様々なコーティングを備えたビーズの他の群も追加することができる。一例としては、様々なｐＨ値で放出し、１種類のみのビーズを含有するカプセル剤よりも長い時間にわたって放出する、３種類のオイドラギットコーティングを有するビーズを含有するカプセル剤がある。
【００５３】
治療的使用及び投与様式
本発明の組成物は、低酸素レベル（低酸素症）を経験した組織を有する哺乳類の治療又は中枢神経系に関与する様々な病気において治療的に使用される。
【００５４】
本発明の組成物の使用には、それぞれ参照により全体を本明細書に組み込んだ所有者共通の米国特許第６，０６０，５１１号、米国特許出願第１０／６４７，１３２号、米国特許出願第１１／３６１，０５４号、米国特許出願第１２／０８１，２３６号及び米国特許仮出願第６１／２１３，５７５号で開示されたものが含まれる。
【００５５】
本発明の経口組成物は、
出血性ショック、
呼吸器疾患、喘息、肺気腫、ＡＬＩ、ＡＲＤＳ、ＣＯＰＤ
虚血、
心臓血管疾患、アテローム性動脈硬化、心筋梗塞、高血圧、心室細動、
脳卒中、外傷性脳損傷、脳浮腫、
中枢神経系の病気（アルツハイマー疾患、パーキンソン病、及びその他の神経変性疾患）、神経変性とは、神経細胞の死を含む神経細胞の構造及び機能の進行性の欠如を包括した用語で、変性神経疾患の例には、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、フリードライヒ運動失調症、ハンチントン病、レビー小体病及び脊髄性筋萎縮症が含まれ、実施例７を参照のこと、
関節炎、
貧血、（未熟児の貧血、ファンコニ−貧血、溶血性貧血、小球性貧血、正色素性貧血、大球性貧血、遺伝性球状赤血球症、鎌状赤血球貧血、温式自己免疫性溶血性貧血、寒冷凝集溶血性貧血）、
慢性腎不全、高血圧、
乳頭腫、脊髄損傷、
癌（有利には、ｉ）体外照射、ガンマナイフ、近接照射療法、トモセラピー及び分割、３次元原体照射療法を含む陽子線照射、腔内照射並びに強度変調放射線療法（ＩＭＲＴ）を含む放射線療法、及び／又はｉｉ）テモゾロミドを含む化学療法の補助として）、
糖尿病、糖尿病性網膜症、
末梢血管疾患／跛行、塞栓症、血液凝固、脊柱管狭窄症／神経性跛行、
ウェゲナー肉芽腫症などの臓器が十分な酸素を獲得できない疾患の治療に有用である。
【００５６】
本発明の組成物はまた、前記の疾患／病気の危険がある哺乳類の前治療として、又は治療のために有用である。
【００５７】
これらの組成物はまた、神経保護、すなわち、パーキンソン病又はアルツハイマー病などの神経変性疾患に関連した合併症を防御又は遅延させるのに有用である。これらはまた、手術の前、最中又は後にこれらの組成物を投与することによって、哺乳類において、手術によって生じる虚血の量を軽減させるのに有用である。
【００５８】
これらの組成物はまた、呼吸／労作が増加するか、又はストレスを与えられたときの能力の増強、有酸素代謝の増加、及び走行、歩行又は懸垂などの身体活動中の耐久性の増加において有用である。
【００５９】
以下の使用では、拡散増強化合物は、経口、経鼻又は吸入、局所、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、経皮及び骨内を含む）、膣内又は直腸内を含む任意の適切な経路によって投与される。好ましい投与経路は、状況に左右される。吸入経路、又は静脈内若しくは筋肉内注射は、緊急の事態において、拡散増強化合物を血流に非常に迅速に入れることが必要な場合の治療に有利である。一実施形態では、滅菌水に溶解したシクロデキストリン及び双極性トランスカロテノイドの組成物を筋肉内（ＩＭ）又は静脈内（ＩＶ）のいずれかに注射することができる。したがって、製剤には、このような経路によって投与するために適したもの（液体又は噴霧するための粉末）が含まれる。好ましい経路は、例えば、患者の病気及び年齢によって変化させてもよいことを理解されたい。
重篤な四肢虚血
パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、フリードライヒ運動失調症、ハンチントン病、レビー小体病及び脊髄性筋萎縮症、
多発硬化症、
代謝異常症候群
末梢神経障害
脳性麻痺
癌−ＴＳＣなどの双極性トランスカロテノイド塩は、多くの種類の癌性腫瘍の退縮を引き起こすため、すなわち、照射又はその他の化学療法を用いずに使用される化学療法である。実施例８は、ＴＳＣによる癌性腫瘍の治療に関する。ＴＳＣは、癌細胞を殺滅して作用するのではなく、理論に結びつけることは望まないが、細胞をより成熟した（したがって、より正常に近い）細胞に復帰させることによって作用すると考えられる。癌の治療のためのレチノイド（オールトランスレチノイン酸）又はそれらの塩の使用は、本発明から排除する。治療することができる癌／腫瘍の種類の例は、皮膚、肺、乳、脳、膀胱、前立腺及び結腸癌／腫瘍である。
【００６０】
一実施形態では、複数の拡散増強化合物を投与する。或いは、ヘモグロビン又はフルオロカーボン及び拡散増強化合物を一緒に与えることができる。
【００６１】
以下の実施例は本発明の組成物及び方法を例示するが、限定はしない。当業者には明らかな、通常遭遇する様々な条件及びパラメータのその他の適切な改変及び適応は、本発明の精神及び範囲に入る。
【実施例】
【００６２】
実施例１
錠剤組成物（シクロデキストリン無し）
【００６３】
以下の成分から構成される２種類の製剤を作製した：
６５％ブレンド
６５．０％  ＴＳＣ
２６．０％  プロソルブ９０
２．９％  クロスポビドンＸＬ９０
１．５％  ステアリン酸マグネシウム
４．６％  コリドン
【００６４】
６０％ブレンド
６０．４％  ＴＳＣ
３０．１％  プロソルブ９０
３．８％  クロスポビドンＸＬ９０
１．４％  ステアリン酸マグネシウム
４．３％  コリドン
【００６５】
ＴＳＣ錠剤は、３（３）ステップで作製した：
ステップ１：ＴＳＣ７０％、プロソルブ２５％及びコリドン２５  ５％を含有する混合物を袋内で５分間混合し、ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）ローラーコンパクターを使用して回転により圧密化した。ローラーコンパクターの条件は、回転圧＝８００ｐｓｉ、スクリュー速度＝１０ｒｐｍ、回転速度＝０．９５ｒｐｍであった。これによって、ＴＳＣブレンドＩと呼ばれるブレンドが生成した。
ステップ２：ステップ１のＴＳＣブレンドＩをクロスポビドンＸＬ１０及びステアリン酸マグネシウムを使用して回転により圧密化した。パーセントは、ＴＳＣブレンドＩ  ９７．５％、クロスポビドンＸＬ１０  ２％及びステアリン酸マグネシウム  ０．５％であった。このステップの生成物は、ＴＳＣ顆粒ＩＩと呼ばれる。
ステップ３：ステップ２のリボンを手で押しつぶして、２０メッシュスクリーンで篩った。得られた顆粒を添加剤（以下参照）と一緒に混合し、ＴＳＣ  ６５％及びＴＳＣ  ６０％を含有する最終ブレンドを得た。
【００６６】
ＴＳＣ６５％ブレンド ＴＳＣ６０％ブレンド
ＴＳＣ顆粒ＩＩ  ９５．２％            ＴＳＣ顆粒ＩＩ  ８８．５％
プロソルブ９０  ２．８％              プロソルブ９０  ８．５％
クロスポビドンＸＬ  １％              クロスポビドンＸＬ  ２％
ステアリン酸マグネシウム  １％        ステアリン酸マグネシウム  １％
【００６７】
ステップ４：この錠剤をＣＡＰ（酢酸フタル酸セルロース）でコーティングした。
【００６８】
胃及び腸での吸収の差を示すために、以下の研究を実施した。
【００６９】
実施例２
ＴＳＣ溶液の吸収
体重約３００〜４００ｇの雄スプラーグドーリー（ＳＤ）系及びウィスター系ラットそれぞれを各実験の前に２４時間絶食させた。水は自由に摂取させ、金網底のケージを使用することによって糞食を防いだ。イソフルランで麻酔を導入し、維持した。頸動脈を露出させ、ＰＥ−５０チューブを用いてカニューレ処置した。絹縫合糸を使用してカニューレを固定し、傷に２％リドカインを塗布した。
【００７０】
カニューレ処置の後、動物を２群：ＴＳＣ投薬製剤を１）経管栄養によって胃、又は２）腸の隔離された部分に直接投与、の１つに入れた。隔離された腸部分に投与するために、正中線切開を行い、腹部及び腸部分を露出させた。この研究で、回腸を隔離し、ＰＥ−５０チューブでカニューレ処置し、次いで、洗浄液が透明になるまで通常の３７℃生理食塩水で洗浄した。この部分を元に戻し、腹部をクランプし、ラットを1時間安定させた。次に、ＴＳＣ製剤を隔離した部分に導入した。腸を元に戻し、腹部を縫合糸によって閉じた。ＴＳＣ投与後、個々の時間間隔で頸動脈から血液試料約０．３ｍＬを採取した。ヘパリンナトリウム少量を血液凝固阻止剤として使用した。血液試料を遠心し、得られた血漿の量を３倍量のメタノールと混合し、撹拌した。次に、血漿混合物を遠心し、上清をＨＰＬＣによって分析してＴＳＣレベルを測定した。
【００７１】
この研究で投与したＴＳＣ投薬製剤は、静脈用製剤（ＴＳＣ  ２０ｍｇ／ｍＬ、ガンマシクロデキストリン  ８％、グリシン  ５０ｍＭ及びマンニトール  ２．３％）から構成された。次のページの図１は、ＴＳＣを小腸に直接投与すると、胃の場合と比べて生物学的利用率が増加することを示している。
【００７２】
【表２】
2013527231.tif 000006
【００７３】
実施例３
腸溶コーティング錠剤（シクロデキストリン無し）
ＴＳＣは沈殿し、胃の厳しい酸性環境下では実際に不溶性である。ＴＳＣは胃の厳しい環境から保護され、小腸のより都合のよい、高いｐＨ領域で放出されなければならない。この研究では、ＴＳＣの錠剤を作製し（表１）、オイドラギットＬ１００又は酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）のいずれかで腸溶コーティングした。両種の保護コーティングの強度は、腸溶コーティング錠剤をまず、人工胃液（ＳＧＦ）を含有する溶解セル中に入れ、次に人工腸液（ＳＩＦ）を含有する別のセルに移すＵＳＰ溶解研究で確かめた。コーティング及び錠剤はＳＧＦ中においては完全なまま残存したが、ＳＩＦ中では溶解が起こった。この研究は、ＵＳＰプロトコールにしたがって実施した。
【００７４】
【表３】
2013527231.tif 000007
【００７５】
これらの錠剤は、当業者に公知の錠剤化技術を使用して作製した。
【００７６】
次に、腸溶コーティングしたＴＳＣで何が起こるか調べるために、ＣＡＰでコーティングし、６５％ブレンドを使用してＴＳＣ  ３００ｍｇを含有する錠剤を犬に経口的に投与した。非常に低い血漿ＴＳＣ濃度が見出され、この製剤では臨床使用するには生物学的利用率が低すぎることが示唆された。
【００７７】
実施例４
ＴＳＣの腸吸収及びシクロデキストリンの効果
ＴＳＣにガンマシクロデキストリンを添加して全身的吸収に対する効果を測定するために、さらに研究を実施した。
【００７８】
体重約３００〜４００ｇの雄スプラーグドーリー（ＳＤ）系及びウィスター系ラットそれぞれを各実験の前に２４時間絶食させた。水は自由に摂取させ、金網底のケージを使用することによって糞食を防いだ。イソフルランで麻酔を導入し、維持した。頸動脈を露出させ、ＰＥ−５０チューブを用いてカニューレ処置した。絹縫合糸を使用してカニューレを固定し、傷に２％リドカインを塗布した。
【００７９】
カニューレ処置後、正中線切開を行い、腹部及び腸部分を露出させた。この研究において、空腸を隔離し、ＴＳＣ製剤を近位空腸に投与した。ＴＳＣ約６０ｍｇ／ｋｇを０．５：１〜最高４：１まで（ｗｔ．ＴＳＣ：ｗｔ．ガンマシクロデキストリン）の様々なガンマシクロデキストリン比で投与した。腸部分内でのＴＳＣの動きは、投与の部位の遠位には制限されなかった。腸を元に戻し、腹部を縫合糸によって閉じた。ＴＳＣ投与後、個々の時間間隔で頸動脈から血液試料約０．３ｍＬを採取した。ヘパリンナトリウム少量を血液凝固阻止剤として使用した。血液試料を遠心し、得られた血漿の量を３倍量のメタノールと混合し、撹拌した。次に、血漿混合物を遠心し、上清をＨＰＬＣによって分析してＴＳＣレベルを測定した。
【００８０】
γ−シクロデキストリンは、図３に示したように、ＴＳＣの吸収を非常に高めることが見出された。
【００８１】
【表４】
2013527231.tif 000008
【００８２】
以下は小腸へのインサイツでのＴＳＣ投与後のｐｋ曲線である。この曲線は、シクロデキストリンがＴＳＣの腸吸収を著しく増加させることを示している。
【００８３】
以下の図は、投与後の時間（分）に対するＴＳＣ血漿濃度（μｇ／ｍＬ）である。
【００８４】
【表５】
2013527231.tif 000009
【００８５】
実施例５
Ｃｍａｘについてのスケーラビリティー
ガンマシクロデキストリンは、ＧＩ管におけるＴＳＣの全身吸収を非常に高めることが見出されてきた。前記の研究で使用したＴＳＣの投薬量は多く、したがって、ＴＳＣＳ投与量に関して（Ｃｍａｘを用いて）全身吸収のスケーラビリティーを測定するために、ＴＳＣをガンマシクロデキストリンと１：１（ｗｔ．ＴＳＣ：ｗｔ．ガンマシクロデキストリン）の比の用量で追加投与した。以下の研究では、ＴＳＣは、以下の投薬量、２．５、５、１０及び６０ｍｇ／ｋｇで、空腸の腸部分に投与した。
【００８６】
この研究のため、体重約３００〜４００ｇの雄スプラーグドーリー（ＳＤ）系及びウィスター系ラットそれぞれを各実験の前に２４時間絶食させた。水は自由に摂取させ、金網底のケージを使用することによって糞食を防いだ。イソフルランで麻酔を導入し、維持した。頸動脈を露出させ、ＰＥ−５０チューブを用いてカニューレ処置した。絹縫合糸を使用してカニューレを固定し、傷に２％リドカインを塗布した。
【００８７】
カニューレ処置後、正中線切開を行い、腹部及び腸部分を露出させた。この研究において、空腸を隔離し、ＴＳＣ製剤を近位空腸に投与した。腸部分内でのＴＳＣの動きは、投与の部位の遠位には制限されなかった。腸を元に戻し、腹部を縫合糸によって閉じた。ＴＳＣ投与後、個々の時間間隔で頸動脈から血液試料約０．３ｍＬを採取した。ヘパリンナトリウム少量を血液凝固阻止剤として使用した。血液試料を遠心し、得られた血漿の量を３倍量のメタノールと混合し、撹拌した。次に、血漿混合物を遠心し、上清をＨＰＬＣによって分析してＴＳＣレベルを測定した。
【００８８】
結果は図４に示す。図４の線は、データの直線回帰であり、優れた一致が得られることを示している。このことは、γ−シクロデキストリンの包含によって得られたデータは、その他のＴＳＣ投薬量に対してスケーラブルであることを示唆している。
【００８９】
【表６】
2013527231.tif 000010
実施例６
腸溶コーティングを有する場合、及び有さない場合の腸吸収
経口的送達で使用するためにＴＳＣと共にガンマシクロデキストリンを含めることの利点を調べるためにさらに研究を実施した。この研究では、ＴＳＣ及びガンマシクロデキストリンを１：４（ｗｔ  ＴＳＣ：ｗｔ．ガンマシクロデキストリン）の比でサイズ９のゼラチンカプセルに充填し、１）コーティングしないまま、２）オイドラギットＬ３０Ｄ−５５（本明細書ではＬＳ３０Ｄ５５とも呼ぶ）（５．５より高いｐＨで崩壊するコーティング）で腸溶コーティング、又は３）オイドラギットＦＳ３０Ｄ（７より高いｐＨで崩壊するコーティング）で腸溶コーティングした。ＴＳＣのみを含有する（シクロデキストリンを含まない）コーティングしていないカプセル剤も投与した。
【００９０】
この研究のため、体重約３００〜４００ｇの雄スプラーグドーリー（ＳＤ）系及びウィスター系ラットそれぞれを各実験の前に２４時間絶食させた。水は自由に摂取させ、金網底のケージを使用することによって糞食を防いだ。イソフルランで麻酔を導入し、維持した。頸動脈を露出させ、ＰＥ−５０チューブを用いてカニューレ処置した。絹縫合糸を使用してカニューレを固定し、傷に２％リドカインを塗布した。
【００９１】
カニューレ処置後、薬物製品を含有するゼラチンカプセル剤を投与シリンジ（Ｔｏｒｐａｃ、Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ  ＮＪ）で胃に投与し、その後経管栄養によって胃に滅菌水０．３ｍＬを投与した。ＴＳＣ投与後、個々の時間間隔で頸動脈から血液試料約０．３ｍＬを採取した。ヘパリンナトリウム少量を血液凝固阻止剤として使用した。血液試料を遠心し、得られた血漿の量を３倍量のメタノールと混合し、撹拌した。次に、血漿混合物を遠心し、上清をＨＰＬＣによって分析してＴＳＣレベルを測定した。
【００９２】
以下の図は、ゼラチンカプセル剤に含有される乾燥粉末をラットに経口投与した後、７時間にわたる血流中の濃度を示しており、カプセル剤は全て同量のＴＳＣ（約４ｍｇ）を含有している。
【００９３】
ＴＳＣのみは、カプセル剤中にＴＳＣ単独であることを示す。
【００９４】
ＴＳＣ：ＣＤ（１：４）コーティング無しは、ＴＳＣ対シクロデキストリンが１対４の混合物から作製され、ゼラチンカプセルにコーティングが適用されていないカプセル剤である。
【００９５】
ＬＳ３０Ｄ５５は、同じ１：４カプセルで、オイドラギットＬＳ３０Ｄ５５（５．５より高いｐＨで崩壊するコーティング）でコーティングされている。
【００９６】
ＦＳ３０Ｄは、同じ１：４カプセルで、オイドラギットＦＳ３０Ｄ（７より高いｐＨで崩壊するコーティング）でコーティングされている。
【００９７】
【表７】
2013527231.tif 000011
【００９８】
以下の棒グラフは、コーティングしていないカプセル剤及びオイドラギットでコーティングしたカプセル剤で得られる（ＴＳＣのみと比較した）吸収の改善パーセントを示している。
【００９９】
【表８】
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【０１００】
実施例７
神経変性疾患
神経変性疾患の主要な側面は、前述したように、神経細胞の死滅である。様々な動物モデルにおいて、神経細胞死に対するＴＳＣの効果を観察する研究が実施されてきた。
【０１０１】
これを実施した最初の研究は、出血性脳卒中のラットモデルを使用して実施された研究であった。この研究では、右の大脳基底核に酵素コラゲナーゼを頭蓋の穿孔から注射し、その結果、脳血管の一部が破裂し、出血した。次に、コラゲナーゼを投与してから３時間後にＴＳＣの注射を開始し、コラゲナーゼを投与して４８時間後に動物を屠殺した。
【０１０２】
脳内で出血がある場合、血液が貯留し、血腫を形成する。この血腫の周囲では、神経細胞の死滅が存在する。しかし、ＴＳＣで治療すると、神経細胞の死滅の約２０％の低下を引き起こされた。染色、フルオロジェイド（ｆｌｕｏｒｏｊａｄｅ）を使用すると、脳の所与の脳切片において「死滅した」神経細胞の数を計数することが可能である。出血性脳卒中ラットモデルで形成された血腫周辺の領域でこの計数を実施した。以下の図に示したように、ＴＳＣで治療した動物では神経細胞死の約３０％の低下が認められた。
【０１０３】
【表９】
2013527231.tif 000013
【０１０４】
神経生存能に対するＴＳＣの効果を調べるために使用した別のモデルは、パーキンソン病のラットモデルである。このモデルでは、頭蓋穿孔が頭蓋骨を通して黒質の領域に開いている。脳内に６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）を注射することによってパーキンソン病様状態が誘導される。６−ＯＨＤＡの１０□ｇの量をこのモデルに頻繁に注射し、第１の研究で使用した。
【０１０５】
このモデルによる第１の研究は、クロセチンによる前処理が６−ＯＨＤＡ  １０□ｇ注射後の神経細胞死に対して有益な効果を有することが見出された文献に見られる研究を模倣して考案された。この研究では、６−ＯＨＤＡを注射する前に、ＴＳＣを０．１ｍｇ／ｋｇの投薬量で７日間注射した（クロセチン研究で実施されたのと同じ投与計画）。６−ＯＨＤＡを注射した後、４週間はさらなる治療を行わなかった。
【０１０６】
その時点でラットを屠殺し、脳を取り出し、生きた神経細胞を計数するためにＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓに送った。これによって、６−ＯＨＤＡを注射した脳の右側並びに未処理の脳の左側の計数が得られた。これによって、生理食塩水で前処理した対照の細胞死のＴＳＣで前処理した動物に対する比較（処理側の計数／未処理側の計数）が可能になった。以下の図はこれらの結果を示す。
【０１０７】
【表１０】
2013527231.tif 000014
【０１０８】
以上のように、この治療を行った後の生神経細胞のパーセントは、約２倍である。これは、対照において神経細胞の約８５％が死滅するという、神経細胞死の非常に厳しいモデルであることも注意されたい。
【０１０９】
６−ＯＨＤＡ注射後の神経細胞死に対する後処理の効果を知ることは、さらにより興味深い。このことを調べるために、６−ＯＨＤＡ  ５□ｇを再度前記のように黒質内に注射したが、治療はこの注射の後に開始した。次に、屠殺するまで動物にＴＳＣ（０．２５ｍｇ／ｋｇ）を４週間毎日注射して投与した。脳を取り出し、神経細胞の計数のためにＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓに送った。
【０１１０】
【表１１】
2013527231.tif 000015
【０１１１】
このように、ＴＳＣ治療によってより多くの生神経細胞（約２０％多い）が存在し、これらのデータは統計学的に有意な差である（ｐ＜０．０５）。
【０１１２】
この研究の興味深い結果は、以下の図に示したように、脳の６−ＯＨＤＡ側の脳切片は、生理食塩水又はＴＳＣのいずれを注射したのかに関わらず、ほとんど同じ数の生神経細胞を示した。このことは、ＴＳＣが生神経細胞の生存能に影響を及ぼさないことを示している。
【０１１３】
【表１２】
2013527231.tif 000016
【０１１４】
これらの結果は、出血性脳卒中モデルで見出された結果と合わせると、ＴＳＣが脳において神経保護効果を発揮することを教示している。
【０１１５】
実施例８
ＴＳＣによる化学療法
肺転移マウスモデルは、腫瘍療法を評価するために広く使用されているモデルである。Ｂ１６（マウス黒色腫）細胞では、本質的に全ての細胞が尾静脈への静脈内細胞注射で「取り込まれ」、腫瘍は優先的に肺において形成される。したがって、肺転移という用語は、得られた全肺結節が専門的には本当の転移ではなく独立した「原発」腫瘍であるとしても、広く使用されている。
【０１１６】
Ｂ１６細胞中のメラニンは、残りの肺組織のように脱色しないので、腫瘍結節は、取り出した肺をＦｅｋｅｔｅ溶液で脱色後、容易に視覚化することができる。メラニンが欠乏した（白色）結節の画分は常に存在するが、腫瘍罹患を少なく見積もることのないように、これらも注意深く計数する必要がある。
【０１１７】
本研究では、８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。これらのマウスを５匹以下の群に分けて収容し、食餌及び水は自由に摂取させた。
【０１１８】
Ｂ１６細胞は、バージニア大学のＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇによって、標準的プロトコールを使用して培養された。細胞は、指数関数的増殖期で受け取った。細胞は、ハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）で５×１０５細胞／ｍＬの濃度で供給された。
【０１１９】
細胞は、受け取り後直ちに注射し、この日を０日目と指定した。０日目に、全マウスの尾静脈に細胞懸濁液０．１ｍＬを静脈内注射し、これは各マウスに０．５×１０５細胞を与えたことを意味する。次に、マウスを４日目までそのままにした。
【０１２０】
４日目に、マウスを２群に分けた：Ａ群、５匹のマウスからなり、尾静脈に生理食塩水０．０５ｍＬを静脈内注射した。Ｂ群、７匹のマウスからなり、尾静脈にＴＳＣ溶液０，０５ｍＬを静脈内注射し、ＴＳＣ投薬量は０．１４２ｍｇ／ｋｇ／日であった。同じ注射を５〜８日目及び１１〜１５日目に繰り返した。１８日目に二酸化炭素を使用してマウスを屠殺した。肺を切り出し、Ｆｅｋｅｔｅ溶液で濯いでからその中に入れ、室温で保存した。
【０１２１】
その後、腫瘍の数の視覚的計数を得るために、無作為かつ盲検的に、肺を視覚的に評価した。小さな腫瘍及び中程度の大きさ及び大きな腫瘍の混合が存在することが見出された。したがって、腫瘍は２つの異なる群、小さい腫瘍及び中程度／大きい腫瘍で視覚的に計数した。腫瘍の大部分は黒いが、いくつか白い腫瘍も存在した。
【０１２２】
腫瘍計数の結果を表及び以下の図に示す。表によって、各種の腫瘍群の中央値（ｍｅｄ．）の数並びに平均±標準偏差が示される。第１の図は中央値を示し、第２の図は平均値を示す。標準偏差が大きいので、群に統計学的差はなかった。
【０１２３】
【表１３】
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【０１２４】
【表１４】
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【０１２５】
【表１５】
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【０１２６】
開示した本発明から逸脱することなく、本発明の化合物及び組成物の両方、並びに関連する方法に数多くの改変及び付加を行うことができることは当業者には容易に理解されよう。
【０１２７】
本出願は、参照により全体を本明細書に組み込んだ、２０１０年６月２日出願の米国特許仮出願第６１／３５０，８０４号の優先権を主張する。
【国際調査報告】
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