(57)【要約】抗体及びその誘導体を含む新規モジュレータ、並びに異常増殖性疾患を治療する際にこのようなモジュレータを用いる方法、を提供する。本発明による、以降の、及びその他の態様は、ＣＤ４６に関連性の疾患（例えば、異常増殖性疾患又は腫瘍性疾患）の治療に使用することのできる方法、化合物、組成物及び物品を目的とする。これを受けて、本発明は、効率的にがん幹細胞を標的とし、各種悪性腫瘍に罹患している患者の治療に使用され得る、新規ＣＤ４６モジュレータを提供する。特定の実施形態では、本開示のＣＤ４６モジュレータは、ＣＤ４６ポリペプチド、そのリガンド又は遺伝子を認識し、競合し、刺激し、拮抗し、相互作用し、結合し、又は会合して、１つ以上の生理学的経路において、ＣＤ４６タンパク質を修飾、調節、変更、変化又は改変する任意の化合物を含み得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離したＣＤ４６モジュレータ。
【請求項２】
前記ＣＤ４６モジュレータがＣＤ４６アンタゴニストを含む、請求項１に記載の単離したＣＤ４６モジュレータ。
【請求項３】
前記ＣＤ４６モジュレータが、抗体又はそれらの免疫反応性断片を含む、請求項１に記載の単離したＣＤ４６モジュレータ。
【請求項４】
前記抗体又はそれらの免疫反応性断片が、モノクローナル抗体を含む、請求項３に記載の単離したＣＤ４６モジュレータ。
【請求項５】
前記モノクローナル抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体からなる群から選択される、請求項４に記載の単離したＣＤ４６モジュレータ。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体が、３つの相補性決定領域を有する軽鎖可変領域と、３つの相補性決定領域を有する重鎖可変領域とを含み、前記重鎖及び軽鎖相補性決定領域が、図１１Ｂに示す相補性決定領域を含む、請求項４に記載の単離したＣＤ４６モジュレータ。
【請求項７】
前記モノクローナル抗体がヒト化抗体である、請求項６に記載の単離したＣＤ４６モジュレータ。
【請求項８】
前記モノクローナル抗体が、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５３、配列番号５７、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６９、配列番号７３、配列番号７７、配列番号８１及び配列番号８５で示す通りのアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％配列相同性であり、かつ前記重鎖可変領域が、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２３、配列番号２７、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４７、配列番号５１、配列番号５５、配列番号５９、配列番号６３、配列番号６７、配列番号７１、配列番号７５、配列番号７９及び配列番号８３で示す通りのアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％配列相同性である、請求項４に記載の単離したＣＤ４６モジュレータ。
【請求項９】
請求項８に記載の重鎖可変領域のアミノ酸又は軽鎖可変領域のアミノ酸をコードしている核酸。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１１】
請求項８に記載のモノクローナル抗体から誘導されたヒト化抗体。
【請求項１２】
ＣＤ４６変異体Ａ由来のアミノ酸配列又はそれらの断片を含む、請求項１に記載の単離したＣＤ４６モジュレータ。
【請求項１３】
前記ＣＤ４６モジュレータが更に、免疫グロブリン定常領域を少なくとも一部分含む、請求項１２に記載の単離したＣＤ４６モジュレータ。
【請求項１４】
請求項１に記載の単離したＣＤ４６モジュレータであって、対象者に投与すると、がん起始細胞の発生頻度が減少する、単離したＣＤ４６モジュレータ。
【請求項１５】
前記発生頻度の減少が、がん起始細胞に豊富に存在することが既知である腫瘍細胞表面マーカーのフローサイトメトリー解析か、あるいはがん起始細胞に豊富に存在することが既知である腫瘍細胞表面マーカーの免疫組織化学的な検出を用い評価されるものである、請求項１４に記載の単離したＣＤ４６モジュレータ。
【請求項１６】
前記発生頻度の減少が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ限界希釈法を用い評価されるものである、請求項１４に記載の単離したＣＤ４６モジュレータ。
【請求項１７】
前記発生頻度の減少が、ｉｎ  ｖｉｖｏ限界希釈法を用い評価されるものであり、該希釈法は、ヒト腫瘍細胞の生細胞を、免疫不全マウスに移植する工程を含む、請求項１６に記載の単離したＣＤ４６モジュレータ。
【請求項１８】
前記発生頻度の減少が、ｉｎ  ｖｉｖｏ限界希釈法を用い評価されるものであり、該希釈法は、ポワソン分布を用いがん起始細胞の発生頻度を定量する工程を含む、請求項１７に記載の単離したＣＤ４６モジュレータ。
【請求項１９】
前記発生頻度の減少が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ限界希釈法を用い評価されるものであり、該希釈法は、ヒト腫瘍細胞の生細胞を限界希釈しｉｎ  ｖｉｔｒｏのコロニー支持条件に配置する工程を含む、請求項１６に記載の単離したＣＤ４６モジュレータ。
【請求項２０】
前記発生頻度の減少が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ限界希釈法を用い評価されるものであり、該希釈法は、ポワソン分布を用いがん起始細胞の発生頻度を定量する工程を含む、請求項１９に記載の単離したＣＤ４６モジュレータ。
【請求項２１】
前記がん起始細胞が腫瘍永続化細胞を含む、請求項１４に記載の単離したＣＤ４６モジュレータ。
【請求項２２】
治療有効量のＣＤ４６モジュレータを、モジュレータを必要としている対象者に投与する工程を含む、ＣＤ４６関連性疾患の治療方法。
【請求項２３】
前記ＣＤ４６モジュレータがＣＤ４６アンタゴニストを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＣＤ４６モジュレータが抗体又はそれらの免疫反応性断片を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体又はそれらの免疫反応性断片がモノクローナル抗体を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記モノクローナル抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記モノクローナル抗体が、３つの相補性決定領域を有する軽鎖可変領域と、３つの相補性決定領域を有する重鎖可変領域とを含み、前記重鎖及び軽鎖相補性決定領域が、図１１Ｂに示す相補性決定領域を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記モノクローナル抗体が、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域からなり、前記軽鎖可変領域が、配列番号配列番号１７、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５３、配列番号５７、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６９、配列番号７３、配列番号７７、配列番号８１及び配列番号８５で示す通りのアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％配列相同性であり、かつ前記重鎖可変領域が、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２３、配列番号２７、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４７、配列番号５１、配列番号５５、配列番号５９、配列番号６３、配列番号６７、配列番号７１、配列番号７５、配列番号７９及び配列番号８３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％配列相同性である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記モノクローナル抗体がｐａｎ−ＣＤ４６抗体を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記モノクローナル抗体が、１種以上のＣＤ４６スプライス変異体と免疫特異的に会合する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記１種以上のＣＤ４６スプライス変異体が、ＣＤ４６Ｄ、ＣＤ４６Ｆ及びＣＤ４６Ｊからなる群から選択されるスプライス変異体を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記異常増殖性疾患が腫瘍性疾患を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
前記腫瘍性疾患が固体腫瘍を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記腫瘍性疾患が、副腎がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、膵臓がん、前立腺がん又は乳がんを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記対象者において、がん起始細胞の発生頻度を減少させる工程を更に含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３６】
前記発生頻度の減少が、がん起始細胞に豊富に存在することが既知である腫瘍細胞表面マーカーのフローサイトメトリー解析を用い評価されるものである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記発生頻度の減少が、がん起始細胞に豊富に存在することが既知である腫瘍細胞表面マーカーの、免疫組織化学的検出を用い評価されるものである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記発生頻度の減少が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ限界希釈法を用い評価されるものである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記発生頻度の減少が、ｉｎ  ｖｉｖｏ限界希釈法を用い評価されるものであり、該希釈法は、ヒト腫瘍細胞の生細胞を、免疫不全マウスに移植する工程を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記発生頻度の減少が、ｉｎ  ｖｉｖｏ限界希釈法を用い評価されるものであり、該希釈法は、ポワソン分布を用いがん起始細胞の発生頻度を定量する工程を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記発生頻度の減少が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ限界希釈法を用い評価されるものであり、該希釈法は、ヒト腫瘍細胞の生細胞を限界希釈しｉｎ  ｖｉｔｒｏのコロニー支持条件に配置する工程を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記発生頻度の減少が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ限界希釈法を用い評価されるものであり、該希釈法は、ポワソン分布を用いがん起始細胞の発生頻度を定量する工程を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
抗がん剤を投与する工程を更に含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＣＤ４６モジュレータが、ＣＤ４６変異体Ａ又はそれらの断片を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＣＤ４６モジュレータが、免疫グロブリン定常領域又はそれらの断片を更に含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＣＤ４６モジュレータが融合タンパク質を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
第２ＣＤ４６モジュレータを投与する工程を更に含み、該第２ＣＤ４６モジュレータが前記ＣＤ４６モジュレータとは異なるものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項４８】
がん起始細胞の発生頻度を減少させる必要のある対象者において、がん起始細胞の発生頻度を減少させる方法であって、ＣＤ４６モジュレータを前記対象者に投与する工程を含む、方法。
【請求項４９】
前記がん起始細胞が腫瘍永続化細胞を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記腫瘍永続化細胞が１つ以上のマーカーを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＣＤ４６モジュレータがＣＤ４６アンタゴニストを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＣＤ４６モジュレータが抗体を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
前記抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記対象者が、副腎がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、膵臓がん、前立腺がん、及び乳がんからなる群から選択される腫瘍性疾患に罹患している、請求項４８に記載の方法。
【請求項５５】
前記がん起始細胞の発生頻度が少なくとも１０％減少する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５６】
前記発生頻度の減少が、がん起始細胞に豊富に存在することが既知である腫瘍細胞表面マーカーのフローサイトメトリー解析を用い評価されるものである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５７】
前記発生頻度の減少が、がん起始細胞に豊富に存在することが既知である腫瘍細胞表面マーカーの、免疫組織化学的検出を用い評価されるものである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５８】
前記発生頻度の減少が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ限界希釈法を用い評価されるものである、請求項４８に記載の単離したＣＤ４６モジュレータ。
【請求項５９】
前記発生頻度の減少が、ｉｎ  ｖｉｖｏ限界希釈法を用い評価されるものであり、該希釈法は、ヒト腫瘍細胞の生細胞を、免疫不全マウスに移植する工程を含む、請求項５８に方法。
【請求項６０】
前記発生頻度の減少が、ｉｎ  ｖｉｖｏ限界希釈法を用い評価されるものであり、該希釈法は、ポワソン分布を用いがん起始細胞の発生頻度を定量する工程を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記発生頻度の減少が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ限界希釈法を用い評価されるものであり、該希釈法は、ヒト腫瘍細胞の生細胞を限界希釈しｉｎ  ｖｉｔｒｏのコロニー支持条件に配置する工程を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記発生頻度の減少が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ限界希釈法を用い評価されるものであり、該希釈法は、ポワソン分布を用いがん起始細胞の発生頻度を定量する工程を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
抗がん剤により対象者を治療するにあたって腫瘍を感作させる方法であって、前記対象者にＣＤ４６モジュレータを投与する工程を含む、方法。
【請求項６４】
前記ＣＤ４６モジュレータが抗体である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記腫瘍が固体腫瘍である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記抗がん剤が化学療法剤を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記抗がん剤が生物学的製剤を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
異常増殖性疾患の診断を必要としている対象者に、次の工程を含む診断を行う方法：
前記対象者から組織試料を得る工程、
前記組織試料を少なくとも１種のＣＤ４６モジュレータと接触させる工程、並びに
前記試料と会合した前記ＣＤ４６モジュレータを検出又は定量する工程。
【請求項６９】
前記ＣＤ４６モジュレータがモノクローナル抗体を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記抗体を、制御可能にレポータと会合させた、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
ＣＤ４６関連性疾患の診断又は治療に有用な製造物品であって、ＣＤ４６モジュレータを収容する容器と、前記ＣＤ４６関連性疾患の治療又は診断に前記ＣＤ４６モジュレータを使用するための取扱説明書とを含む、製造物品。
【請求項７２】
前記ＣＤ４６モジュレータがモノクローナル抗体である、請求項７１に記載の製造物品。
【請求項７３】
前記容器が読み取り可能なプレートを含む、請求項７２に記載の製造物品。
【請求項７４】
固体腫瘍を含む腫瘍性疾患に罹患している対象者の治療法であって、１種以上のＣＤ４６スプライス変異体と免疫特異的に会合するＣＤ４６モジュレータを治療有効量で投与する工程を含む、治療法。
【請求項７５】
前記１種以上のＣＤ４６スプライス変異体が、ＣＤ４６Ｄ、ＣＤ４６Ｆ及びＣＤ４６Ｊからなる群から選択されるスプライス変異体を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記ＣＤ４６モジュレータがアンタゴニストを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記ＣＤ４６モジュレータが抗体を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７８】
前記抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記対象者が、副腎がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、膵臓がん、前立腺がん、及び乳がんからなる群から選択される腫瘍性疾患に罹患している、請求項７４に記載の方法。
【請求項８０】
腫瘍性疾患に罹患している患者の治療法であって、細胞毒性剤と会合させた少なくとも１種のＣＤ４６モジュレータを治療有効量で投与する工程を含む、治療法。
【請求項８１】
前記ＣＤ４６モジュレータが前記細胞毒性剤と複合している、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記ＣＤ４６モジュレータが抗体を含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記対象者が、副腎がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、膵臓がん、前立腺がん、及び乳がんからなる群から選択される腫瘍性疾患に罹患している、請求項８０に記載の方法。
【請求項８５】
がん起始細胞の集団を識別、単離、分画又は濃縮する方法であって、前記がん起始細胞をＣＤ４６モジュレータと接触させる工程を含む、方法。
【請求項８６】
前記ＣＤ４６モジュレータが抗体を含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８７】
前記抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８８】
前記がん起始細胞をフローサイトメトリー解析にかける工程を更に含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８９】
前記フローサイトメトリー解析がＦＡＣＳを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９０】
異常増殖性疾患に罹患している患者において、がん起始細胞を除去させる方法であって、ＣＤ４６モジュレータを投与する工程を含む、方法。
【請求項９１】
前記ＣＤ４６モジュレータがモノクローナル抗体を含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記モノクローナル抗体が細胞毒性剤と会合している、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記モノクローナル抗体がｐａｎ−ＣＤ４６抗体である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記モノクローナル抗体が、単一のＣＤ４６スプライス変異体と免疫特異的に会合する、請求項９２に記載の方法。
【請求項９５】
前記単一のＣＤ４６スプライス変異体が、ＣＤ４６Ｄ、ＣＤ４６Ｆ及びＣＤ４６Ｊからなる群から選択されるスプライス変異体を含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
ヒト化抗体を含むＣＤ４６モジュレータであって、前記抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は実質的に配列番号１９９に記載の通りのものであり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は実質的に配列番号２０１に記載の通りのものである、ＣＤ４６モジュレータ。
【請求項９７】
ｈＳＣ１．Ｎ７１抗体及び製薬上許容され得る担体を含む、組成物。
【請求項９８】
ヒト化抗体を含むＣＤ４６モジュレータであって、前記抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は実質的に配列番号２０３に記載の通りのものであり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は実質的に配列番号２０５に記載の通りのものである、ＣＤ４６モジュレータ。
【請求項９９】
ｈＳＣ１．Ｎ１４９抗体及び製薬上許容され得る担体を含む、組成物。
【請求項１００】
治療を必要としている対象者において、転移を阻害又は予防する方法であって、製薬学的有効量のＣＤ４６モジュレータを投与する工程を含む、方法。
【請求項１０１】
前記対象者が、ＣＤ４６モジュレータ投与の前又は後に腫瘍減量法により治療される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記腫瘍減量法が、少なくとも１種の抗がん剤の投与を含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記対象者が、ＣＤ４６モジュレータの投与時に寛解状態である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０４】
治療を必要としている対象者に対し維持療法を実施する方法であって、製薬学的有効量のＣＤ４６モジュレータを投与する工程を含む、方法。
【請求項１０５】
前記対象者が、前記ＣＤ４６モジュレータ投与前に腫瘍性疾患の治療を受けている、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記対象者が、前記ＣＤ４６モジュレータの投与時に、腫瘍性疾患に関しては無症状である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０７】
前記対象者を腫瘍性疾患に関し治療した後、前記ＣＤ４６モジュレータを６ヶ月以上投与する、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０８】
前記ＣＤ４６モジュレータがモノクローナル抗体を含む、請求項１０５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は米国特許法§１１９（ｅ）のもとに、２０１０年９月３日出願の米国特許仮出願第６１／３８０，１８１号の利益を主張し、この出願は本明細書において引用によりその全体が組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本願は、概して、組成物、並びにこの組成物を、異常増殖性疾患、その増殖、再発、再燃又は転移の治療又は改善に使用する方法に関する。広範には、本発明は、腫瘍性疾患の処置又は予防用のＣＤ４６アンタゴニスト及び融合コンストラクトなどの、ＣＤ４６モジュレータの使用法に関する。特に好ましい実施形態においては、本発明は、免疫療法による処置の際に抗ＣＤ４６抗体を使用する方法を提供し、腫瘍始原細胞の発生頻度を減少させることを包含する。
【背景技術】
【０００３】
幹細胞及び前駆細胞の分化及び細胞増殖は、組織形成時の組織成長、細胞置換、並びにすべての生物のその生涯の間のほとんどの組織修復に際し、協調して作用し、これを支持する、正常に進行する過程である。細胞の分化及び組織構築の維持は、数多くの因子及びシグナルの調節によりなされ、多くの場合、分化及び増殖の決定は、これらの因子により制御されている。通常、組織構築は、細胞分裂及び組織の成熟を制御する、微小環境からの刺激に、細胞が応答することで維持される。したがって、細胞増殖及び分化は、通常、損傷を受けた細胞若しくは死細胞の補充の際にのみ、あるいは成長の際にのみ必要に応じて生じる。残念なことに、例えば、各種シグナル伝達物質の不足又は過剰、微小環境の変化、遺伝子変異あるいはこれらの組み合わせなどの多種多様な要因により、細胞増殖及び／又は分化に混乱が生じる場合がある。通常の細胞増殖及び／又は分化が妨害されたかあるいはある程度の混乱が生じた場合には、がんなどの各種疾患又は障害が発生し得る。
【０００４】
がんの一般的な治療法としては、化学療法、放射線療法、外科手術、免疫療法（例えば、生体応答修飾物質療法、ワクチン又は分子標的治療）、あるいはこれらの組み合わせが挙げられる。残念ながら、非常に多くのがんは、これらの従来の治療法に対し非応答性であるか、あるいは応答性に乏しく、患者にはわずかな選択肢しか残されていない。例えば、遺伝子変異（例えば、ＫＲＡＳ）を示す一部の患者は、この変異により、一般的には効果の見られる特定の治療法に対して非応答性を示す。更に、利用可能な治療法のうち一部のもの、例えば外科手術などは、がんの種類によっては代案として現実的でない場合がある。これまでに治療を受けたことがあるものの、治療後に再燃した患者の治療を行う場合、現在の標準的な治療法には固有の制限があることは特に明白である。このような場合、治療レジメンに失敗し、その結果病状が悪化してしまった患者では、腫瘍は多くの場合、より進行が速くなるなど難治性のものになる可能性があり、最悪の場合不治の状態にまで陥ってしまう。長年にわたってがんの診断及び治療には多くの改善がなされてきたものの、既存の治療法では、再燃、腫瘍の再発生及び転移の予防はできないことから、多くの固形腫瘍患者に関し全生存率にほとんど変化が見られていない。したがって、より標的特異的なものでありかつ強力な治療法を開発すべきであるという課題が残っている。
【０００５】
治療研究の有望なものとしては、多くのがんで基礎をなすことが判明している腫瘍原性の「種」細胞を標的とする、分子標的治療の利用が挙げられる。この目的に際し、現在では、固形腫瘍のほとんどが、組織に常在する成熟した幹細胞集団を含有していることが知られている。組織の大部分を構成する分化細胞は、この幹細胞集団により生成される。腫瘍は、幹細胞から生じる不均一な細胞集団と同様、これらの組織において増殖するが、腫瘍と幹細胞は概して増殖及び組織形成の点で著しく異なる。腫瘍細胞の多くは増殖性に制限があると言う認識が高まっているが、ごく一部のがん細胞集団（一般的には、がん幹細胞又はＣＳＣとして公知）は、広範に自己複製するなどの特有の能力を有することから、腫瘍再発能をもつ。より詳細には、がん幹細胞は、「各腫瘍内に存在し（約０．１〜１０％）、無限の自己複製能を有し、かつ腫瘍前駆細胞へと分化し、続いて最終的には腫瘍細胞へと分化していくことで複製能が徐々に制限される腫瘍細胞を生成する、異なる細胞サブセット（すなわちＣＳＣ）」であるという定義で仮説されている。
【０００６】
近年、これらのＣＳＣ（腫瘍永続化細胞（ｔｕｍｏｒ  ｐｅｒｐｅｔｕａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）又はＴＰＣとしても公知）は、従来の化学療法剤又は放射線療法に対して抵抗性が高く、ひいては標準的な臨床治療後にも、再燃性腫瘍、二次腫瘍及び転移性腫瘍の成長の起点となることが更に明らかになってきている。それに加え、ＣＳＣにおいては、組織形成を制御する経路及び／又は正常組織に常在する幹細胞の自己複製経路が脱制御され、あるいは変更を受けることで、自己複製性がん細胞の持続的な増殖、及び腫瘍形成が生じることを示唆するような根拠が増えてきている。概してＡｌ−Ｈａｊｊ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，ＰＭＩＤ：１５３７８０８７；及びＤａｌｅｒｂａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，ＰＭＩＤ：１７５４８８１４；を参照されたい。これらの各々は引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。したがって、これらの多様な治療法を以ってしても、従来の及び近年の分子標的治療法の効果は、がんを永続化させ得る耐性がん細胞の存在及び／又は発生により制限されるようである。非特許文献１及び非特許文献２。これらの各々は引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。このような観察は、固形腫瘍に罹患している場合、患者の生存率を実質的に上昇させるには、従来の腫瘍減量剤（ｄｅｂｕｌｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）では着実な効果がないことにより、並びに腫瘍が成長し、再発し、転移する過程についての非常に洗練された理解が発展してきたことにより確認されている。したがって、近年の腫瘍性疾患の治療戦略では、腫瘍の再発、転移又は再燃の可能性を減少させるためには、がん細胞の排除、除去、サイレンシング又は分化促進が重要であるものと認識されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｈｕｆｆ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ４２：１２９３〜１２９７（２００６）
【非特許文献２】Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ８：８０６〜８２３（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本開示では、このような戦略を発展させるために、非従来的な異種移植片（ＮＴＸ）モデルなどの試行が組み込まれており、本明細書では免疫不全マウスにヒトの初代固形腫瘍試料を移植し、経時観察する。不均一性の腫瘍を形成し、無限に増殖させるという特有の能力をもつ細胞集団の存在が、本開示の技術により確認される。かねてより仮説されていた通り、ＮＴＸモデルでの試験により、腫瘍細胞のＣＳＣ集団は、化学療法及び放射線療法などの腫瘍減量レジメンに対し明らかに耐性がより高かったことが確認されたことから、臨床的奏効率と全生存率との不一致が裏付けられる可能性がある。更に、ＮＴＸモデルを採用したＣＳＣ研究がきっかけとなって、創薬、並びに腫瘍の再発及び転移に対して主な効力をもつことで患者の生存率を上昇させるＣＳＣ標的治療をもたらし得る薬剤候補の前臨床的評価は、根本的に変化している。進歩の一方で、ＣＳＣアイデンティティ及び分化能を特性評価する実験プラットフォームの不足に伴い、初代腫瘍組織及び／又は異種移植片腫瘍組織の取り扱いに関する技術に固有の問題は大きな課題を提示している。そのため、がん幹細胞を選択的に標的とし、かつ異常増殖性疾患の治療、予防及び／又は管理に使用することのできる、診断用、予防用又は治療用の化合物又は方法の開発が、実質的には求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
広義に、本発明による、以降の、及びその他の態様は、ＣＤ４６に関連性の疾患（例えば、異常増殖性疾患又は腫瘍性疾患）の治療に使用することのできる方法、化合物、組成物及び物品を目的とする。これを受けて、本発明は、効率的にがん幹細胞を標的とし、各種悪性腫瘍に罹患している患者の治療に使用され得る、新規ＣＤ４６モジュレータを提供する。特定の実施形態では、本開示のＣＤ４６モジュレータは、ＣＤ４６ポリペプチド、そのリガンド又は遺伝子を認識し、競合し、刺激し、拮抗し、相互作用し、結合し、又は会合して、１つ以上の生理学的経路において、ＣＤ４６タンパク質を修飾、調節、変更、変化又は改変する任意の化合物を含み得る。本発明の選択的な実施例では、ＣＤ４６モジュレータは、ＣＤ４６自体又はその断片を、単離形態、又は融合形態又は他の部分との会合形態（例えば、Ｆｃ−ＣＤ４６、ＰＥＧ−ＣＤ４６、又は標的部位と会合したＣＤ４６）のいずれかの形態で含み得る。他の選択された実施形態では、ＣＤ４６モジュレータは、本開示の目的用のＣＤ４６アンタゴニストを包含し、ＣＤ４６アンタゴニストは、ＣＤ４６を認識、競合、相互作用、結合又は会合し、がん起始細胞などの腫瘍性細胞の成長を中和、排除、抑制させる、感受性を増加させる、リプログラム、阻害又は制御する、任意のコンストラクト又は化合物を意味する。好ましい実施形態では、本発明のＣＤ４６モジュレータは、抗ＣＤ４６抗体、又はそれらの断片あるいは誘導体を包含し、これらのモジュレータは、予想外なことに、がん起始細胞が、増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）、維持、増殖（ｅｘｐａｎｄ）、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ）する能力を、又は腫瘍性細胞が生存、再発、再生及び又は転移するのを亢進する能力を、サイレンシング、中和、抑制、低下、消失、加減、減退、リプログラム、排除、又は阻害することが判明している。
【００１０】
一実施例では、ＣＤ４６モジュレータは、ヒト化抗体を包含してよく、この抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１９９に記載の通りのものであり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２０１に記載の通りのものである。他の好ましい実施例では、本発明は、ｈＳＣ１．Ｎ７１抗体と、製薬上許容可能な担体とを含有する、組成物の形態を取り得る。別の好ましい実施例では、ＣＤ４６モジュレータは、ヒト化抗体を包含してよく、この抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２０３に記載の通りのものであり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２０５に記載の通りのものである。更に他の好ましい実施例では、本発明は、ｈＳＣ１．Ｎ１４９抗体と、製薬上許容可能な担体とを含有する、組成物の形態を取り得る。
【００１１】
他の特定の実施例では、本発明は、対象者に投与することでがん起始細胞の発生頻度を減少させることのできるＣＤ４６モジュレータを含み得る。好ましくは、がん起始細胞の発生頻度の減少は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで限界希釈法を用い測定する。特に好ましい実施形態では、限界希釈法による解析はｉｎ  ｖｉｖｏで行い、ヒト腫瘍の生細胞を免疫不全マウスに移植し実施する。あるいは、限界希釈法による解析はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行い、この解析は、ヒト腫瘍の生細胞を限界希釈し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのコロニー支持条件に付着させ実施する。いずれの場合でも、発生頻度減少の解析、算出又は定量は、好ましくは、ポアソン分布を用い、正確に計数した上で行う。このような定量法が好ましい一方で、その他のより労働集約型の方法、例えばフローサイトメトリー又は免疫組織化学的解析を使用して、所望の値を得ることができることも理解されるであろうし、したがって、本発明の範囲内に含まれるものとして明確に企図される。このような場合では、発生頻度の減少は、がん起始細胞に豊富に含まれることが知られている腫瘍細胞表面マーカーの、フローサイトメトリーによる解析又は免疫組織化学的検出を用い判断され得る。
【００１２】
そのため、本発明の他の好ましい実施形態では、がん起始細胞の発生頻度を減少させる必要のある対象者に、治療有効量のＣＤ４６モジュレータを投与する工程を含む、ＣＤ４６関連性疾患の治療方法を包含する。また、がん起始細胞の発生頻度の減少は、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで限界希釈法を用い評価される。
【００１３】
この点から、本発明は、ＣＤ４６ポリペプチドが、多様な新生物に関する原因に関与する腫瘍永続化細胞（すなわち、がん幹細胞）と会合するという発見に、少なくとも一部基づくものであることも明らかである。より詳細には、本開示は、予想外にも、各種例示的なＣＤ４６モジュレータを投与することで、がん起始細胞からの腫瘍原性のシグナル伝達が、抑制、阻害又は排除され得る（すなわち、がん起始細胞の発生頻度が減少する）ことを示す。がん起始細胞の減少、又は排除、又はリプログラミング、又はサイレンシング、あるいは腫瘍の細胞形態を改変させること（例えば、分化誘導、ニッチの破壊）のいずれかによりシグナル伝達を抑制させると、腫瘍形成、腫瘍の維持、増殖、及び／又は転移及び再発が阻害され、ＣＤ４６関連性の疾患をより効果的に治療できるようになる。他の実施形態では、本開示のモジュレータは、腫瘍を成長させ得るＣＤ４６介在性のシグナル伝達を干渉、抑止又は遅延させる。更に、以降により詳細に議論されるように、ＣＤ４６ポリペプチドは補体経路に密接に関与する。本明細書に記載の新規ＣＤ４６モジュレータを用い、この経路において治療介入を行うことで、１つの機序（すなわち、がん起始細胞の減少及び補体の破壊）により疾患は緩和され、追加の効果又は相乗効果が得られる。
【００１４】
したがって、本発明の別の好ましい実施形態は、ＣＤ４６介在性疾患の治療法を包含し、治療法には、ＣＤ４６モジュレータを、これを必要としている対象者に投与する工程を含む。特に好ましい実施形態では、ＣＤ４６モジュレータは抗がん剤と会合させる（例えば、複合させる）。また、破壊効果及び副次効果は、対象者の腫瘍組織のＣＤ４６レベルが、隣接する正常な組織と比較して高い場合にも、あるいは抑制されているか又は抑圧されている場合にも得られる。
【００１５】
更には、本発明のＣＤ４６モジュレータを作成し、選択して、単一のアイソフォーム、あるいはＣＤ４６分子に関する一部の選ばれたアイソフォーム（すなわち、スプライス変異体）と反応させることもでき、本発明のＣＤ４６モジュレータには、ＣＤ４６アイソフォームの一部又はすべてと反応又は会合させることのできるｐａｎ−ＣＤ４６モジュレータが含まれ得ることも理解されるであろう。より詳細には、本明細書に開示され、以降実施例に示されるように、抗体などの好ましいモジュレータを、単一のスプライスバリアント（例えば、特異的なエキソンジャンクション）を示すドメインと、あるいは複数の又はすべてのＣＤ４６アイソフォーム間で保存されているドメイン（例えば、エキソン１〜６）と反応するよう生成し、選択することもできる。以下図５に示す通り、ＴＩＣにおいて特定のスプライス変異体が好ましく発現していること、並びにこの変異体が腫瘍原性の細胞の発生頻度を選択的に減少させ、及び／又はがん幹細胞集団を除去させる治療用の標的として供給することができることが判明したことは、本発明にとって重要である。
【００１６】
したがって、本発明の選択的な実施例はｐａｎ−ＣＤ４６モジュレータを含む。他に選択される実施形態では、本発明は、１つ以上のスプライス変異体と免疫特異的に会合するＣＤ４６モジュレータを含む。好ましくは、スプライス変異体は、ＣＤ４６Ｄ、ＣＤ４６Ｆ及びＣＤ４６Ｊからなる群から選択され得る。更に他の実施例では、本発明は、治療有効量のｐａｎ−ＣＤ４６モジュレータを、これを必要としている対象者に投与する工程を含む、治療法を含む。更に他の実施例は、１つ以上のスプライス変異体と免疫特異的に会合する、治療有効量のＣＤ４６モジュレータを、これを必要としている対象者に投与する工程を含む、治療法を含む。
【００１７】
本発明の他の態様は、本開示のモジュレータの能力を十分に引き出し、癌原生細胞の複数の生存経路に干渉すると同時に、がん起始細胞をサイレンシングさせるものである。このような、活性を複数もつＣＤ４６モジュレータ（例えば、ＣＤ４６アンタゴニスト）は、標準的な抗がん剤又は腫瘍減量剤と組み合わせて使用した場合に特に効果的であろう。これに加え、本開示の技術に従い、２種以上のＣＤ４６アンタゴニスト（例えば、ＣＤ４６上の２つの別個のエピトープに特異的に結合する抗体）を組み合わせて使用することもできる。更に、以降に一部詳細に議論される通り、本発明のＣＤ４６モジュレータは、複合又は非複合の状態で使用することができ、場合により、各種化学的又は生物学的抗がん剤と組み合わせて感作剤として使用することもできる。
【００１８】
したがって、本発明の別の好ましい実施形態は、抗がん剤により対象者を治療するにあたって腫瘍を感作させる方法を含み、この方法は、ＣＤ４６モジュレータを対象者に投与する工程を含む。本発明の特に好ましい態様では、ＣＤ４６モジュレータは、具体的には、がん起始細胞の発生頻度の減少をもたらす。発生頻度の減少は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで限界希釈法により判定される。
【００１９】
同様にして、本発明の化合物は各種生理的機序を介し治療効果をもつことから、本発明は、特定の細胞応答を引き出すよう特別に作成し、選択したエフェクタ又はモジュレータも目的とする。例えば、特定の実施形態では、好ましいモジュレータは、がん起始細胞の表面上又は表面付近でＣＤ４６と会合し、対象者の免疫応答を刺激するよう設計することができる。他の実施形態では、モジュレータは腫瘍の微小環境において、ＣＤ４６活性を中和し、ＣＤ４６基質の濃度を上昇させ、シグナル伝達に影響を与えるエピトープを標的とする、抗体を含んでよい。更に他の実施例では、本開示のモジュレータは、ＣＤ４６と会合した細胞を除去するか又は排除するよう作用し得る。本発明は、任意の特定の作用様式に制限されるものではなく、所望の結果が得られる任意の方法又はＣＤ４６モジュレータを包含することは重要であり、理解されたい。
【００２０】
本開示の実施例に関する好ましい実施例の構成は、腫瘍性疾患に罹患している対象者の治療法を目的とするものであり、治療有効量の少なくとも１種のＣＤ４６中和モジュレータを投与する工程を含む。
【００２１】
他の実施例は、ＣＤ４６関連性疾患に罹患している対象者の治療法を目的とし、治療有効量の少なくとも１種のＣＤ４６除去モジュレータを投与する工程を含む。
【００２２】
更に別の実施例では、本発明は、維持療法を提供し、この療法では、所定の期間にわたって本開示のエフェクタを投与し、続いて腫瘍塊を少なくとも一部除去するよう設計された手順（例えば、化学療法的な、放射線療法的な、又は外科的な除去）を開始する。治療レジメンでは、数週、数ヶ月、又は更には数年にわたってＣＤ４６モジュレータを投与し、予防的に作用させて、がん転移及び／又は腫瘍の再発を阻害させることもできる。更に他の実施例では、本開示のモジュレータは、公知の腫瘍減量レジメンと組み与して、がん転移を予防又は遅延することができる。
【００２３】
上記の治療用途以外に、ＣＤ４６関連性の疾患、特に、異常増殖性疾患を診断する際にも本発明のモジュレータを使用できることも認識される。そのため、好ましい実施形態は、異常増殖性疾患の診断を必要としている対象者に、次の工程ａ、ｂ及びｃからなる診断を行う方法を含む：
ａ．対象者から組織試料を得る工程、
ｂ．組織試料を少なくとも１種のＣＤ４６モジュレータと接触させる工程、並びに
ｃ．試料と会合したＣＤ４６モジュレータを検出又は定量する工程。
【００２４】
このような方法は、本開示と併せて容易に識別され、自動式プレートリーダー、専用のレポーターシステムなどの一般的に市販されている技術を用い容易に実施することができる。好ましい実施形態では、検出又は定量工程は、がん起始細胞の発生頻度を減少させ、かつそれらを検出することを含む。更に、これまでに言及した通り、限界希釈法による解析を、好ましくは発生頻度の減少を正確に計数するためにポワソン分布を使用して実施することができる。
【００２５】
同様に、本発明は、がんなどのＣＤ４６関連性疾患の診断及びモニタリングに有用なキットも提供する。この目的を達成するために、本発明は、好ましくは、ＣＤ４６関連性疾患の診断又は治療に有用であり、ＣＤ４６モジュレータを収容する容器と、ＣＤ４６関連性疾患の治療又は診断にＣＤ４６モジュレータを使用するための取扱説明書とを含む、物品を提供する。
【００２６】
本発明の他の好ましい実施形態は、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）又はレーザーによる分画などの方法による、がん起始細胞の集団又は下位集団の識別、単離、分画、又は濃縮に有用な手段として、本開示のモジュレータの特性を引き出すものでもある。
【００２７】
そのため、本発明の別の好ましい実施形態は、がん起始細胞の集団を識別、単離、分画又は濃縮する方法を目的とし、この方法は、がん起始細胞をＣＤ４６モジュレータと接触させる工程を含む。
【００２８】
ここまでの記載は要約であり、したがって、必要に応じて単純化し、総括し、詳細を省略している。これらを踏まえ、当業者であれば、この要約は例示目的のみのためであり、何らかの制限を意図するものではないことを認識するであろう。本明細書に記載の方法、組成物及び／又は装置及び／又は他の題材に関する他の態様、特徴、及び利点は、以降の教示により明らかとなろう。「発明の概要」は、下記の「発明を実施するための形態」において更に説明される、簡略化された概念に関し、選択肢を紹介するために提供されている。この「発明の概要」は、特許請求する主題の主要な特徴又は本質的な特徴を識別することを意図したものではなく、また、特許請求する主題の範囲を限定するために使用することを意図したものでもない。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】結腸直腸がん、乳がん、又は非小細胞性肺がんの患者から得られた固形腫瘍試料の、ＣＤ４６発現についての、フローサイトメトリーデータ。
【図１Ｂ】結腸直腸がん細胞、膵臓がん細胞、乳がん細胞、非小細胞性肺がん細胞、黒色腫細胞、卵巣がん細胞、及び頭部及び頸部がん細胞から得られた、非従来式の異種移植片腫瘍試料の、ＣＤ４６発現についての、フローサイトメトリーデータ。
【図２】細胞表面マーカーＣＤ４６、上皮表面抗原（ＥＳＡ）、ＣＤ６６ｃ、及びＣＤ３２４を用いフローサイトメトリーにより得られた、がん起始細胞の濃縮についての分散プロット。
【図３Ａ】非従来式の異種移植モデルでの連続継代により、ＣＤ４６ｈｉ細胞の腫瘍永続化能を実証する、フローサイトメトリー及び蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）データ。
【図３Ｂ】非従来式の異種移植モデルでの連続継代により、ＣＤ４６ｈｉ細胞の腫瘍永続化能を実証する、フローサイトメトリー及び蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）データ。
【図３Ｃ】非従来式の異種移植モデルでの連続継代により、ＣＤ４６ｈｉ細胞の腫瘍永続化能を実証する、フローサイトメトリー及び蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）データ。
【図４Ａ】結腸直腸がんにおけるＣＤ４６ｈｉ腫瘍永続化細胞の発生頻度に対するイリノテカンの効果を示すグラフ。
【図４Ｂ】結腸直腸がんにおけるＣＤ４６ｈｉ腫瘍永続化細胞の発生頻度に対するイリノテカンの効果を示すグラフ。
【図４Ｃ】結腸直腸がんにおけるＣＤ４６ｈｉ腫瘍永続化細胞の発生頻度に対するイリノテカンの効果を示すグラフ。
【図５Ａ】結腸直腸がん腫瘍永続化細胞、腫瘍前駆細胞、及び非腫瘍原生細胞において発現しているＣＤ４６スプライス変異体アイソフォーム。
【図５Ｂ】結腸直腸がん腫瘍永続化細胞、腫瘍前駆細胞、及び非腫瘍原生細胞において発現しているＣＤ４６スプライス変異体アイソフォーム。
【図５Ｃ】結腸直腸がん腫瘍永続化細胞、腫瘍前駆細胞、及び非腫瘍原生細胞において発現しているＣＤ４６スプライス変異体アイソフォーム。
【図６】結腸直腸腫瘍細胞集団において使用されるＣＤ４６エキソンについての定量的リアルタイムＰＣＲデータ。
【図７Ａ】隣接する正常な結腸直腸細胞及び腫瘍細胞における、ＣＤ４６タンパク質の発現についてのグラフ。
【図７Ｂ】隣接する神経内分泌型及び非神経内分泌型の正常な膵細胞及び腫瘍細胞における、ＣＤ４６タンパク質の発現についてのグラフ。
【図７Ｃ】隣接する正常な卵巣細胞及び腫瘍細胞における、ＣＤ４６タンパク質の発現についてのグラフ。
【図８Ａ】隣接する正常な結腸直腸細胞及び腫瘍細胞における、エキソン１０を含有するＣＤ４６スプライス変異体の発現についてのグラフ。
【図８Ｂ】隣接する神経内分泌型及び非神経内分泌型の正常な膵細胞及び腫瘍細胞における、エキソン１０を含有するＣＤ４６スプライス変異体の発現についてのグラフ。
【図８Ｃ】隣接する正常な卵巣細胞及び腫瘍細胞（図７Ｃ）における、エキソン１０を含有するＣＤ４６スプライス変異体の発現についてのグラフ。
【図９Ａ】Ｋ５６２細胞におけるＣＤ４６抗体の内部移行を表すグラフ。
【図９Ｂ】サポリン毒素により標識した抗マウス第２抗体を内部移行することのできるマウスモノクローナル抗ＣＤ４６抗体によるＫ５６２細胞の殺傷を表すグラフ。
【図１０Ａ】本明細書の実施例に記載の通りに単離され、クローン化された１８の別個の抗ＣＤ４６抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列。
【図１０Ｂ】本明細書の実施例に記載の通りに単離され、クローン化された１８の別個の抗ＣＤ４６抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列。
【図１０Ｃ】本明細書の実施例に記載の通りに単離され、クローン化された１８の別個の抗ＣＤ４６抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列。
【図１０Ｄ】本明細書の実施例に記載の通りに単離され、クローン化された１８の別個の抗ＣＤ４６抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列。
【図１０Ｅ】本明細書の実施例に記載の通りに単離され、クローン化された１８の別個の抗ＣＤ４６抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列。
【図１０Ｆ】本明細書の実施例に記載の通りに単離され、クローン化された１８の別個の抗ＣＤ４６抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列。
【図１０Ｇ】本明細書の実施例に記載の通りに単離され、クローン化された１８の別個の抗ＣＤ４６抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列。
【図１０Ｈ】本明細書の実施例に記載の通りに単離され、クローン化された１８の別個の抗ＣＤ４６抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列。
【図１０Ｉ】本明細書の実施例に記載の通りに単離され、クローン化された１８の別個の抗ＣＤ４６抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列。
【図１０Ｊ】本明細書の実施例に記載の通りに単離され、クローン化された１８の別個の抗ＣＤ４６抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列。
【図１０Ｋ】本明細書の実施例に記載の通りに単離され、クローン化された１８の別個の抗ＣＤ４６抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列。
【図１０Ｌ】本明細書の実施例に記載の通りに単離され、クローン化された１８の別個の抗ＣＤ４６抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列。
【図１０Ｍ】本明細書の実施例に記載の通りに単離され、クローン化された１８の別個の抗ＣＤ４６抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列。
【図１０Ｎ】本明細書の実施例に記載の通りに単離され、クローン化された１８の別個の抗ＣＤ４６抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列。
【図１０Ｏ】本明細書の実施例に記載の通りに単離され、クローン化された１８の別個の抗ＣＤ４６抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列。
【図１０Ｐ】本明細書の実施例に記載の通りに単離され、クローン化された１８の別個の抗ＣＤ４６抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列。
【図１０Ｑ】本明細書の実施例に記載の通りに単離され、クローン化された１８の別個の抗ＣＤ４６抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列。
【図１０Ｒ】本明細書の実施例に記載の通りに単離され、クローン化された１８の別個の抗ＣＤ４６抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列。
【図１１Ａ】本明細書の実施例に記載の通りに単離され、クローン化された１８の別個のＣＤ４６モジュレータの、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．に定義される通りの遺伝子の構成。
【図１１Ｂ】重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列についての表。
【図１２Ａ】抗ＣＤ４６抗体ＳＣ１．Ｎ１２２及びＳＣ１．Ｎ２９をＣＤ４６の各種領域に結合させたＥＬＩＳＡデータのグラフ。
【図１２Ｂ】抗ＣＤ４６抗体ＳＣ１．Ｎ２９を各種ＣＤ４６エキソンに結合させたＥＬＩＳＡデータのグラフ。
【図１３Ａ】ｈＳＣ１．Ｎ７１の重鎖（配列番号１９８及び配列番号１９９）及び軽鎖（配列番号２００及び配列番号２０１）可変領域の核酸及びアミノ酸配列。Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．により定義されたＣＤＲ配列は下線部。
【図１３Ｂ】ｈＳＣ１．Ｎ１４９の重鎖（配列番号２０２及び配列番号２０３）及び軽鎖（配列番号２０４及び配列番号２０５）可変領域の核酸及びアミノ酸配列。Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．により定義されたＣＤＲ配列は下線部。
【図１４】１２の別個のＣＤ４６モジュレータの免疫化学的な特徴についての表。
【図１５Ａ】４種の異なる濃度の抗原に対するマウス抗体ＳＣ１．Ｎ７１の親和性を示す図。
【図１５Ｂ】ヒト化抗体誘導体ｈ  ＳＣ１．Ｎ７１の親和性を示す図。
【図１５Ｃ】測定値を要約した表。
【図１６Ａ】本開示のモジュレータを用い生成した検量線。
【図１６Ｂ】健常者及び各種新生組織形成及びに罹患している患者から得られた試料で測定し、検量線から外挿した可溶性ＣＤ４６の血清中濃度。
【図１７】ストレプトアビジン標識サポリンを用い細胞死を誘導させる場合に、本開示のＣＤ４６モジュレータが分子標的剤として機能する程度についてのグラフ。
【図１８Ａ】本開示のＣＤ４６モジュレータは、細胞表面上で発現されたＣＤ４６と会合することを表す図。
【図１８Ｂ】レンチウイルスにより誘導したＣＤ４６−／ｌｏはＣＤ４６ｈｉ細胞の細胞死を介在するものの、本開示のモジュレータによる影響を比較的受けない（図１８Ｂ）ことを示す図。
【図１９Ａ】受容体依存性の取り込み及びストレプトアビジン−ＺＡＰ複合体の内部移行を介在し得る本発明のＣＤ４６モジュレータを示す図。モジュレータの非存在下では、観察された細胞死は比較的少ない。
【図１９Ｂ】本開示のモジュレータは異なる腫瘍種に対しても効果的に細胞死を介在することを示す図。
【図２０Ａ】ＣＤ４６モジュレータががん幹細胞の化学感受性を増感させ得ることを示す図。本開示のモジュレータの効果を対照と比較して示す。
【図２０Ｂ】ＣＤ４６モジュレータが腫瘍の再発を遅延させ、化学療法剤のみを用いた場合に比べてがんの進行を伴わない生存率を上昇させることを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
Ｉ．緒言
広義には、本発明の実施形態は、新規ＣＤ４６モジュレータ、並びにがんなどの異常増殖性疾患を治療、管理、緩和又は予防する際の本モジュレータの使用を目的とする。任意の特定の理論に束縛されることを望むものではないが、本開示のモジュレータは、腫瘍の成長の抑制又は遅延、及び腫瘍原性細胞の排除又は中和、並びに抗がん剤に対する細胞の感受性の変更に効果的であることが判明している。更に、驚くべきことに、従来では知られていなかったことだが、選別した腫瘍永続化細胞（ＴＰＣ）と、ＣＤ４６として公知のタンパク質とが、表現形特異的に会合することが判明した。この点に関し、選別したＴＰＣ（すなわち、がん幹細胞又はＣＳＣ）は、正常組織と比較した場合に、並びに固体腫瘍の大部分を構成している腫瘍前駆細胞（ＴＰｒｏｇ）及び非腫瘍原生（ＮＴＧ）細胞と比較した場合に、ＣＤ４６の発現レベルが高く、特異的なスプライス変異体を含む。したがって、選択された実施形態では、腫瘍の微小環境において、選別された細胞表面と会合するタンパク質濃度が上昇することから、ＣＤ４６は腫瘍関連性のマーカー（又は抗原）を含み、ＴＰＣ及び関連する新生物の検出、感作及び／又は抑圧に有効な剤を提供することが判明している。より詳細には、並びに更により驚くべきことに、ＣＤ４６は分泌性の物質のようであり（少なくともある程度）、腫瘍永続化細胞の除去、感作、排除、減少、リプログラミング、分化促進に関し、あるいはこれらの腫瘍永続化細胞を拡散及び／又は持続させて患者において腫瘍を成長又は再発させる能力の防止又は制限に関し、Ｆｃ−ＣＤ４６コンストラクト及び免疫応答性アンタゴニスト（例えば、該当するタンパク質に結合する抗体）などのＣＤ４６モジュレータが有用であることが更に確認されている。
【００３１】
好ましい実施形態では、本発明のＣＤ４６モジュレータは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド又はポリペプチドを含む。ここまでに示唆し、以降に詳細に議論する通りに、本明細書に開示された選択的な実施形態は、複合又は非複合の状態の抗ＣＤ４６抗体を含む。ＣＤ４６モジュレータの他の実施形態は、好ましくは、例えば、ＣＤ４６融合コンストラクト（例えば、ＣＤ４６−Ｆｃ、ＣＤ４６−標的部位など）又はＣＤ４６−複合体（例えば、ＣＤ４６−ＰＥＧ、ＣＤ４６−細胞毒性剤など）などの、ＣＤ４６又はそれらの形態、変異体、誘導体又は断片を含む。更に他の実施例では、モジュレータは、遺伝子の発現レベルを操作することができるものであり、アンチセンスコンストラクト、ｓｉＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡなどの化合物を含み得る。前述のＣＤ４６モジュレータは、腫瘍永続化細胞及び／又は関連する新生物の成長、増殖、又は生存を、例えば、ＣＤ４６モジュレータの形態、又は投与量及び送達方法に応じて、特定の細胞（非ＴＰＣ支持細胞）と競合する、あるいは刺激する又は拮抗する機序により、減弱させ得る。
【００３２】
これらの発見を考慮すると、当業者であれば、本発明の特に好ましい実施形態は、概してＣＤ４６モジュレータと、がん起始細胞の発生頻度を減少させる際のＣＤ４６モジュレータの使用とを目的としていることは明らかであろう。本明細書において広範に議論されている通り、本発明に準拠したＣＤ４６モジュレータは、ＣＤ４６と会合、結合、若しくは複合体形成する、又はＣＤ４６と反応又は競合する任意の化合物であり、所望により、腫瘍永続化細胞の発生頻度を減少させる。本明細書で開示される例示的なモジュレータには、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド又はポリペプチドを含む。特定の好ましい実施形態では、選別したモジュレータは、ＣＤ４６若しくはこれらの免疫応答性断片又はこれらの誘導体に結合する抗体を含み得る。このような抗体のもつ性質は、拮抗性のものであっても作用性のものであってもよい。他の好ましい実施例では、本発明に準拠するエフェクタは、ＣＤ４６自体又はそれらの反応性断片を含むＣＤ４６コンストラクトを含む。このようなＣＤ４６コンストラクトには融合タンパク質を包含することができ、コンストラクトは、免疫グロブリン、架橋ペプチド又は生体応答修飾物質などの他のポリペプチド由来の反応性ドメインを含有し得ることは認識されるであろう。更に他の好ましい態様では、遺伝子の発現レベルで所望の効果を発揮するＣＤ４６エフェクタ又はモジュレータは、核酸アセンブリを含み得る。本発明に準拠する更に他のモジュレータについて、以下に詳細に議論する。
【００３３】
これに関連し、以降の記載は、ＣＤ４６モジュレータ、ＣＤ４６アンタゴニスト及び抗ＣＤ４６抗体に関係するものである。以下に各用語についてより詳細な定義を提供するが、用語は概して本開示の目的に関し互換性のあるものであり、本文に記載のない限り、限定して解釈すべきでないことは明らかである。例えば、ＣＤ４６アンタゴニストに関してなされた指摘は、拮抗性をもつ本発明の抗体についても適用可能である。同様にして、用語「ＣＤ４６モジュレータ」は本開示のＣＤ４６アンタゴニストと抗ＣＤ４６抗体を明確に包含するものであり、後者は本文により除外されない範囲でモジュレータに対しても適用可能である。
【００３４】
ＩＩ．ＣＤ４６
ＣＤ４６は、補体調節タンパク質又はＭＣＰとしても既知である。ＣＤ４６は広範に発現するＩ型の膜貫通型タンパク質であり、エキソンスプライシング及びグリコシル化により、数多くのアイソフォームが存在する。引用によりその全文が本明細書に組み込まれるＲｅｃｅｎｔｌｙ  Ｋａｒｏｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ  １１８：１６６９〜１６７６（Ｓｅｐｔ．２００８）は、ＣＤ４６分子のアイソフォームを１４種検出したことを報告している。ｍＲＮＡは染色体１ｑ３２の単一遺伝子座から転写され、大規模な選択的スプライシングを経て、各種タンパク質のアイソフォームをコードしている複数の転写産物が生成される。遺伝子を構成している１４のエキソンのうち、エキソン１〜６が、すべてのＣＤ４６タンパク質アイソフォームにおいて保存されている一方で、７〜９は可変的に利用されるセリン−スレオニン−プロリン（「ＳＴＰ」）リッチ領域をコードしており、これにより、タンパク質アイソフォームにおいて主要な超可変部がもたらされることが判明している。エキソン１１及び１２はＣＤ４６の膜貫通領域をコードするのに対し、エキソン１３及び１４は、タンパク質の細胞質側末端をコードする。最長のｍＲＮＡ転写産物である変異体Ａ（ＮＭ＿００２３８９）は、遺伝子に含まれる１４のエキソンをすべて含む配列を含有する。エキソン７、８、９、及び１３の可変的スプライシングにより、ＣＤ４６の１４のアイソフォームのうちのほとんどが生成されると考えられ、タンパク質アイソフォームは、エキソン８のオルタナティブな組み込み又は除外により、主に６６及び５６ｋＤａで観察される。エキソン１３のオルタナティブな組み込み／除外により、分子の細胞質側末端をコードしている配列に変化が生じることから、これらを変化させることで、タンパク質の細胞内輸送、安定性、及びシグナル伝達特性に影響が出るものと考えられる。
【００３５】
Ｋａｒｏｓｉ  ｅｔ  ａｌ．に示される通り、ＣＤ４６のｍＲＮＡアイソフォームＤは、ＣＤ４６遺伝子のエキソン１〜６、８〜１２及び１４からなり（タンパク質ＮＰ＿７２２５４８をコードしている配列ＮＭ＿１５３８２６に相当）、アイソフォームＦは、エキソン１〜６、９〜１２、及び１４からなり（ＮＰ＿７５８８６３をコードしている配列ＮＭ＿１７２３５３に相当）、並びにアイソフォームＪはエキソン１〜６、８、１０〜１２、及び１４からなる（ＮＰ＿７５８８６６をコードしている配列ＮＭ＿１７２３５６に相当）。より詳細には、ＣＤ４６分子は、Ｎ端末ショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）モジュール（「Ｓｕｓｈｉ」ドメイン：１−３、２−４結合接続部にシステインを４つ含む）を４つ含み、これらのＳＣＲドメインは、遺伝子の最初の６つのエキソンによりコードされる。ＳＣＲ２、３、及び４モジュールは、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂに対する結合及び活性制御を有する一方（以下に議論する）、ＳＣＲ４の遠位に存在するＳＣＲ１モジュール及び配列は補体制御機能に必須のものではなく、エキソン７〜９、並びにエキソン１０をオルタナティブに組み込みコードされる膜近位細胞外配列は、主にＯ結合型の糖鎖により高度にグリコシル化される。
【００３６】
本開示の目的に関し、用語「ＣＤ４６」は、別途記載のない限り、任意のスプライス変異体又はそれらの免疫応答性断片、並びにこのようなタンパク質、スプライス変異体又は断片をコードしている任意の核酸配列を包含する、直前に示したものなどの任意のタンパク質を意味する。したがって、本明細書で述べる「ＣＤ４６マーカー」は、ＣＤ４６を構成する又はコードする任意の検出可能なタンパク質、ペプチド又は核酸配列を広範に包含するものである。好ましい実施形態では、ＣＤ４６マーカーは、全長の糖タンパク質（変異体Ａ）又はスプライス変異体又はそれらの免疫応答性断片を包含する。更により好ましくは、ＣＤ４６タンパク質マーカーは、選別した腫瘍原生細胞集団の細胞表面上に存在する。他の好ましい実施例では、ＣＤ４６マーカーは、全長のＣＤ４６、スプライス変異体又はそれらの断片をコードしている核酸配列（例えば、ＤＮＡ又はｍＲＮＡ）を含む。
【００３７】
前述の変異体に関し、更には本発明のＣＤ４６モジュレータを作製し、選別して単一のアイソフォーム（すなわち、スプライス変異体）、あるいはＣＤ４６分子に関する一部の選ばれたアイソフォーム（すなわち、スプライス変異体）と反応させることもでき、本発明のＣＤ４６モジュレータには、ＣＤ４６アイソフォームの一部又はすべてと反応又は会合させることのできるｐａｎ−ＣＤ４６モジュレータが含まれ得ることも理解されるであろう。より詳細には、本明細書に開示され、以降の実施例に示されるように、抗体などの本開示のモジュレータを、単一のスプライスバリアント（例えば、特異的なエキソンジャンクション）の示すドメインと、あるいは複数の又はすべてのＣＤ４６アイソフォーム間で保存されているドメイン（例えば、エキソン１〜６）と反応するよう生成し、選択することもできる。以下の実施例５に示される通り、ＴＩＣで特定のスプライス変異体が優先的に発現することが判明しており、かつこのような変異体は、腫瘍原性の細胞の発生頻度を選択的に減少させる及び／又はがん幹細胞集団を除去する治療薬として提供することができるため、このような生成は本発明にとって意味があるものである。
【００３８】
任意のイベントにおいて、数多くの生物学的機能にＣＤ４６が関与することが判明しており、この内の多くのものが免疫系の制御を包含している。ＣＤ４６のもつ他の主要な免疫調節機能としては、高等真核生物の自然免疫応答の一部に含まれる、補体タンパク質による損傷から、宿主細胞を保護することを目的とした、補体制御が挙げられる。具体的には、ＣＤ４６は、補体タンパク質Ｃ３ｂ及びＣ４ｂの、Ｉ因子介在型のタンパク質分解に関わる補因子である。活性型Ｃ３転換酵素は、Ｃ３ｂを不活性な断片へと開裂させ、それにより補体の不適切な活性化を予防する分子であることが判明している。自然免疫において機能するだけでなく、ＣＤ４６は獲得免疫応答も制御する。ＣＤ４６によるシグナル伝達により、Ｔ細胞の増殖と、抗炎症サイトカインであるＩＬ−１０の大部分を産生するという性質をもつ特定のクラスの制御性Ｔ細胞（Ｔｒ１と呼ばれる）への分化とが刺激される。これに加え、精子はＣＤ４６を高レベルで発現していることから、ＣＤ４６は、生殖への、恐らくは精子と卵母細胞の融合への関与が示唆されている。ＣＤ４６は胎盤でも高発現しており、胎児を母体からの免疫拒絶から保護する様機能している可能性がある。
【００３９】
更に、ＣＤ４６は、赤血球細胞を除く、正常なヒト細胞のほとんどで普遍的に発現していることも判明している。例えば、ＣＤ４６は、上皮細胞では強く、リンパ細胞及び内皮では中程度に、並びに破骨細胞、骨細胞、間質細胞及び筋肉細胞などの他の細胞では弱く発現しているという報告が存在する。広範に発現していることから、ヒトの数多くの病原体は、感染の足がかりとして細胞に結合する際に、ＣＤ４６を受容体又は共受容体として利用するという戦略をとっている。このような病原体としては、ヒトヘルペスウイルス６型、麻疹ウイルス、アデノウイルスの一部の血清型、並びにナイセリア属の常在菌由来の病原性種が挙げられる。一部のレトロウイルスは、表面にＣＤ４６模倣物を担持することで補体介在型の免疫から免れると考えられている（Ｓｔｏｉｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００５；Ｓａｉｆｕｄｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，１９９７）。
【００４０】
ＣＤ４６は、数多くの疾患、例えば、多発性硬化症（ＭＳ）などの自己免疫異常にも関係付けられている。ＭＳは、神経軸索を絶縁するミエリンタンパク質に対し、自己免疫応答が作動して脱ミエリン化が生じ、その結果、脱ミエリン化を起こした細胞の伝導性が損なわれ、神経障害及び神経異常が生じる慢性炎症性疾患である。ＭＳは脳及び脊髄の白質に瘢痕を生じる（硬化症）。ＭＳは病因が免疫、遺伝及び環境要因から複雑に構成される病気であり、これまでにいくつかの機序について調査されているものの、ＭＳ発病に関する理解は完全なものには程遠い。Ｔ細胞による免疫及び炎症を制御するという機能をもつため、ＣＤ４６はＭＳの発病に関与するものと考えられる。より詳細には、近年のデータにより、ＩＬ−１０産生に深刻な障害を受けている多発性硬化症患者では、ＣＤ４６が欠損しているか、又は不全状態であることが判明している。恐らく、ＩＬ−１０産生のこの欠如は、多発性硬化症患者で観察される炎症に関与しているものと考えられる（引用により本明細書に組み込まれるＡ．Ｌ．Ａｓｔｉｅｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００８  Ｊｕｎｅ；１２４（２）：１４９〜１５４）。場合によっては、自己反応性の抗ＣＤ４６抗体は、分子の正常な機能を損なう恐れがある。これらの抗体が、本明細書に記載のモジュレータとして機能する範囲内で、それらは本発明の範囲内に含まれ、適宜使用することができる。
【００４１】
ＣＤ４６は、正常細胞に存在する他、特定のがんでは発現レベルが増加する場合がある。例えば、ＣＤ４６発現は、乳がん（Ｔｈｏｒｓｔｅｉｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．ＡＰＭＩＳ  １０６：８６９〜７８（１９９８）；Ｈｏｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．３２：２１３〜９（１９９４））、結腸／直腸がん（Ａｎｄｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：５２２５〜３０（１９９０）；Ｋｏｒｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６８：９２６〜３１（１９９３）；Ｊｕｈｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．６４：２２２〜３０（１９９７）；Ｂｊｏｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４２：１８５〜９２（１９９６））、肺がん（Ｖａｒｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３：１７３〜８２（１９９８）；Ｖａｒｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｉ．１９：５２２〜９（１９９８））、卵巣がん（Ｂｊｏｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７０：１４〜２５（１９９７））、腎がん（Ｂｌｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．８０：３３５〜４４（２０００）；Ｇｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７４：１０３９〜４９（１９９６））、膵がん（Ｊｕｈｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．６４：２２２〜３０（１９９７））、並びに前立腺がん（Ｊａｒｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９９（ＮＯ．Ｉ，ＰＡＲＴ  ２）：Ｓ２１５（１９９７）；Ｌｉｕ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：３４２９〜３４３４（２０００））において上昇することが報告されている。また国際公開第０２／１８９４８号、及び同第０１／８８５３７を参照されたい。
【００４２】
タンパク質がまず初めに開示され、ＣＤ４６に対する数多くの抗体が製造されてきた。これらとしては、Ｅ４．３（ＣＤ４６−ＳＣＲ１）Ｓｐａｒｒｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９８３  ７：１、Ｍ１７７（ＣＤ４６−ＳＣＲ２）Ｓｅｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９０  １４５：２３８、Ｊ４／４８（ＣＤ４６−ＳＣＲ１）Ｐｅｓａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９８６  １３７：３６８９、ＧＢ２４（ＣＤ４６−ＳＣＲ３／４）Ｈｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １９８８  １８：２１、Ｈ３１６（ＣＤ４６−ＳＣＲ１）Ｓｔｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９８６  １３７：１６０４、ＭＨ６１（ＣＤ４６−ＳＣＲ３）Ｏｋａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ  １９９０  ５４：１１２１、ＴＲＡ−２−１０（ＣＤ４６−ＳＣＲ１）Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９１  ８３：２５７；ＭＣＩ２０．６（ＣＤ４６−ＳＣＲ１）Ｎａｎｉｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９９３  ６７：６０２５、１５８．２Ａ５  Ｖｉｌｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．、１９７．２Ｂ１  Ｖｉｌｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．、並びにＭＰＡ７米国特許第７，７４４，８７８が挙げられる。これらのそれぞれは引用により本明細書に組み込まれる。全般に、ウェブ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｗ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｕｉｄｅ／２０２７８１４６７０＿ｇ．ｈｔｍ）によりＬｏｖｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔ  Ｒｅｖを参照されたい。前掲の一覧に記載の抗体の多くには、活性なショートコンセンサスリピートドメイン（ＳＣＲ）が含まれる。
【００４３】
ＩＩＩ．がん起始細胞
従来の任意の技術とは対照的に、本発明は、がん起始細胞を標的化するのに、特に腫瘍永続化細胞を標的化するのに特に有用なＣＤ４６モジュレータを提供し、これにより腫瘍性疾患の治療、管理又は予防を促進する。より詳細には、これまでに示された通り、驚くべきことに、特定の腫瘍細胞の下位集団がＣＤ４６を発現しており、かつがん幹細胞の自己複製及び細胞の生存にとって重要な形態形成シグナル伝達の局在的な協調を改変するようであることが判明している。したがって、好ましい実施形態では、本開示の技術に従って、がん起始細胞の発生頻度を減少させるためにＣＤ４６のモジュレータを使用し、それにより異常増殖性疾患の治療又は管理を促進することができる。
【００４４】
本明細書で使用するとき、用語「がん起始細胞（ＴＩＣ）」は、腫瘍永続化細胞（ＴＰＣ；すなわちがん幹細胞又はＣＳＣ）、並びに非常に増殖性の高い腫瘍前駆細胞（ＴＰｒｏｇとする）のいずれをも包含し、合わせて一般的に、特有の腫瘍又は腫瘤の下位集団（すなわち０．１〜４０％）からなる。本開示の目的に関し、用語「腫瘍永続化細胞」及び「がん幹細胞」は、等価であり、本明細書において互換可能に使用することができる。反対に、ＴＰＣは、単離した細胞を少数個連続的に移植した場合に示される通り（マウスの場合２回以上）、腫瘍内に存在する腫瘍細胞の構成を完全に再現し得るという点と、無限の自己複製能をもつという点で、ＴＰｒｏｇとは異なる。以降により詳細に議論される通り、適切な細胞表面マーカーを用い行った場合、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）は、少なくともある程度の割合で、単個細胞及び細胞の凝集塊（すなわち、ダブレットなど）を識別できることから、非常に濃縮された細胞下位集団を単離するにあたって（純度９９．５％以上）信頼性の高い手法である。かかる技術を用いて、免疫不全マウスに高純度のＴＰｒｏｇ細胞を少数個移植した場合に、初回移植部位で腫瘍が成長し得るということが判明している。しかしながら、精製ＴＰＣ下位集団の場合とは異なり、ＴＰｒｏｇにより生成された腫瘍は細胞の表現形の不均一性という点で親腫瘍を完全に反映するものではなく、以降の移植においてひき続いて腫瘍形成を再開させるという能力に劣る。対照的に、ＴＰＣ下位集団は、親腫瘍の細胞不均一性を完全に再現するものであり、連続的に単離し移植した場合にも腫瘍を効果的に起始し得る。したがって、当業者であれば、ＴＰＣとＴＰｒｏｇは、いずれも初回移植部位において腫瘍を生成し得るものの、低濃度で連続的に移植した際に、不均一な腫瘍成長を永続的に起始するという能力はＴＰＣに特有のものであるという点で決定的に異なるということを認識するであろう。ＴＰＣの特性を評価するのに一般的な他のアプローチには、形態学、及び細胞表面マーカー、転写プロフィール、及び薬剤応答の評価が挙げられるが、マーカーの発現は、培養条件、並びにｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞株の継代により変化し得る。
【００４５】
したがって、本発明の腫瘍永続化細胞は、正常組織において細胞の分化段階を維持する正常幹細胞同様、好ましくは多系統への分化能を維持しつつ、無限の自己複製能をもつことにより区別される。したがって、腫瘍永続化細胞は、腫瘍原生の子孫細胞（すなわち、がん起始細胞：ＴＰＣ及びＴＰｒｏｇ）と、非腫瘍原生（ＮＴＧ）の子孫細胞のいずれをも生成することができる。本明細書で使用するとき、非腫瘍原生細胞（ＮＴＧ）は、がん起始細胞から生じるが、自身は自己複製能をもたない、あるいは腫瘍を構成する腫瘍細胞の不均一な分化系列を生成することのない腫瘍細胞を指す。実験的には、ＮＴＧ細胞には、過剰量の細胞を移植した場合でさえもマウスにおいて再現性よく腫瘍を形成する能力はない。
【００４６】
記載のように、ＴＰｒｏｇは、マウスにおいて腫瘍を形成する能力が制限されていることから、がん起始細胞（又はＴＩＣ）としても分類される。ＴＰｒｏｇはＴＰＣの子孫細胞であり、非自己複製性の細胞分裂を限定された回数で行う。更に、ＴＰｒｏｇ細胞は初期腫瘍前駆細胞（ＥＴＰ）及び後期腫瘍前駆細胞（ＬＴＰ）へと分裂可能であり、これらのそれぞれの前駆細胞は、表現型（例えば、細胞表面マーカー）により区別され、かつ腫瘍細胞の構築再現能が異なっている。このような専門上の違いが存在するにもかかわらず、ＥＴＰ及びＬＴＰのいずれもが、ＴＰＣと比較して、細胞を低濃度で移植した場合に連続的に腫瘍を再構築する能力に劣り、かつ親腫瘍の不均一性を反映しないことから、機能的にＴＰＣとは異なっている。これらの違いが存在するものの、稀に、各種ＴＰｒｏｇ集団が、通常であれば幹細胞が保有している自己複製能を獲得し、ＴＰＣ（又はＣＳＣ）になり得ることも判明している。任意のイベントにおいて、いずれの細胞型のがん起始細胞も、一人の患者の典型的な腫瘍塊で再現される傾向があり、かつ本明細書に開示される通りのモジュレータにより治療される傾向がある。すなわち、本開示の組成物は、個々の実施形態又は腫瘍の表現形の混在とは無関係に、概してこのようなＣＤ４６陽性がん起始細胞の発生頻度の減少又は化学受容性の変更に効果的である。
【００４７】
本発明に関する文脈において、ＴＰＣは、腫瘍塊を形成するＴＰｒｏｇ（ＥＴＰ及びＬＴＰのいずれも）、ＮＴＧ細胞、及び腫瘍浸潤性の非ＴＰＣ由来細胞（例えば、線維芽細胞／間質細胞、内皮及び造血細胞）と比べ、腫瘍原生が高く、比較的休止状態であり、かつ多くの場合、化学療法に対し抵抗性が高い。従来の治療法及びレジメンでは、その大部分が腫瘍の減量及び増殖速度の速い細胞に対する攻撃の両方を目的に設計されており、ＴＰＣは、より増殖速度の速いＴＰｒｏｇ、並びに腫瘍を増量している他の細胞集団と比べて、従来の治療法及びレジメンに対して耐性が高い傾向がある。更に、多くの場合、ＴＰＣは、従来の治療法に対して、自身を比較的化学療法抵抗性にものにし、例えば、多剤耐性輸送体の発現上昇、ＤＮＡ修復機序の強化及び抗アポトーシスタンパク質の増強などの他の特性を発現する。これらの特性のそれぞれはＴＰＣのもつ薬剤耐性に寄与するものであり、新生物が進行している患者のほとんどで、標準的な、腫瘍内科学的な治療レジメンにより長期的効果が得られないことの、すなわち、腫瘍の成長及び再発を続けるこれらの細胞（すなわち、ＴＰＣ又はＣＳＣ）の適切な標的化及び根絶に失敗することの主な理由となっている。
【００４８】
多くの従来技術とは異なり、本発明の新規組成物は、形態又は選別したモジュレータの具体的な標的にかかわらず（例えば、遺伝物質、ＣＤ４６又はＣＤ４６リガンド）、好ましくは対象者に投与することでがん起始細胞の発生頻度を減少させる。上記の通り、がん起始細胞の発生頻度の減少は、次のａ）、ｂ）、ｃ）及びｄ）の結果として生じ得る：ａ）がん起始細胞の排除、除去、感作、サイレンシング又は阻害、ｂ）がん起始細胞の成長、増殖又は再発の制御、ｃ）がん起始細胞の起始、増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）、維持、又は増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の妨害、あるいはｄ）腫瘍原生細胞の生存、再分化及び／又は転移の妨害。一部の実施形態では、がん起始細胞の発生頻度の減少は、１つ以上の生理学的経路に変化が生じた結果として生じる。経路に生じる変化は、がん起始細胞の減少又は排除によるもの、あるいはそれらのもつ性質を変更させるもの（例えば、分化誘導、ニッチの破壊）のいずれによるものでも、あるいは、腫瘍が周囲環境又は他の細胞に対して作用する能力を干渉するものでも、腫瘍形成、腫瘍維持及び／又は転移並びに再発を阻害し、ＣＤ４６介在性疾患の治療をより効果的なものにする。
【００４９】
がん起始細胞の発生頻度の減少を評価する際には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかでの限界希釈法による解析後に、好ましくは、ポワソン分布を用い細胞数を算出するか、あるいは規定の決定的なイベントの発生頻度、例えばｉｎ  ｖｉｖｏ又はそれ以外での腫瘍形成能を評価するなどの方法を用いることができる。がん起始細胞の発生頻度の減少度を算出するには限界希釈法が好ましいが、所望の値を効率的に判断するにあたって、正確さにはわずかに劣るものの、他の、より負担の少ない方法を使用してもよく、このような方法は本発明の技術に完全に使用可能である。したがって、当業者には理解されるように、発生頻度の減少度は、周知のフローサイトメトリー法又は免疫組織化学的手法により評価することもできる。ここまでに記載のすべての手法については、例えば、Ｄｙｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．２００８，ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２４１３４０２及びＨｏｅｙ  ｅｔ  ａｌ．２００９，ＰＭＩＤ：１９６６４９９１を参照されたい。これらの文献のいずれもが、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５０】
限界希釈法に対して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのがん起始細胞の発生頻度の算出は、分画化又は未分画化ヒト腫瘍細胞（例えば、それぞれ処理及び未処理腫瘍由来）のいずれかを、コロニー形成を促すｉｎ  ｖｉｔｒｏ成長条件に付着させることにより実施できる。この手法では、コロニー形成細胞は、コロニーの単純な計数及び評価により算出することができ、あるいは例えば、ヒト腫瘍細胞を連続希釈してプレートに付着させ、播種の少なくとも１０日後にコロニー形成が陽性であるか陰性であるかについて各ウェルを評価することからなる解析により算出することができる。がん起始細胞の発生頻度の判定能がより正確である、ｉｎ  ｖｉｖｏでの限界希釈法による実験又は解析には、非処理対照群又は処理群から得たヒト腫瘍細胞を、例えば、連続希釈して免疫不全マウスに移植し、続いて移植の少なくとも６０日後に、腫瘍形成が陽性であるか又は陰性であるかのいずれかについて各マウスを評価することを包含する。好ましくは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでの、限界希釈法による細胞発生頻度の算出は、陽性及び陰性応答に公知の発生頻度に対しポワソン分布を適用し、陽性応答（今回はそれぞれコロニー形成又は腫瘍形成）の定義を満たすイベントの発生頻度を得ることにより行う。
【００５１】
がん起始細胞の発生頻度を算出するのに使用でき、本発明に準拠する他の手法に関しては、ごく一般的なものは、定量化可能なフローサイトメトリー法及び免疫組織化学的染色法を含む。直前に記載の限界希釈法は正確な手法ではないものの、これらの手法はさほど労を要するものではなく、比較的短時間で妥当な値が得られる。したがって、当業者はフローサイトメトリー法を用い、がん起始細胞に豊富であることが既知である細胞表面タンパク質（例えば準拠し得るマーカーを以降の実施例１に示す）に結合する１種以上の抗体又は試薬を使用して、各種サンプルのＴＩＣレベルを測定することで、細胞表面マーカーのプロファイルを評価できることは明らかであろう。更に別の準拠する方法では、当業者は、これらの細胞を区別するものと考えられる細胞表面タンパク質に結合することのできる、１種以上の抗体又は試薬を用い、免疫組織化学法により、ｉｎ  ｓｉｔｕ（すなわち、組織切片）でＴＩＣ発生頻度を計数するであろう。
【００５２】
上記の任意の方法を用い、次に本明細書に記載の技術に従って、本開示のＣＤ４６モジュレータにより、ＴＩＣ（又はそこに含まれるＴＰＣ）の発生頻度の減少度を定量することができる。一部の例では、本発明の化合物はＴＩＣの発生頻度を１０％、１５％、２０％、２５％、３０％又は更には３５％減少させることができる（排除、分化誘導、ニッチの破壊、サイレンシングなどの各種機序により）。他の実施形態では、ＴＩＣの発生頻度の減少度は、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％又は６５％であり得る。特定の実施形態では、本開示の化合物は、ＴＩＣの発生頻度を７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は更には９５％減少させる。無論、ＴＩＣの発生頻度が任意に減少することで、これに対応して、新生物の腫瘍原性、持続性、再発及び攻撃性が減少する傾向があることは明らかであろう。
【００５３】
ＩＶ．ＣＤ４６モジュレータ
任意のイベントにおいて、本発明は、数多くのＣＤ４６介在性悪性腫瘍のうちのいずれか１つを診断、治療及び／又は予防する際の、ＣＤ４６アンタゴニストなどのＣＤ４６モジュレータの使用を目的とする。本開示のモジュレータは、単独で、あるいは化学療法剤又は免疫療法剤又は生体応答修飾物質などの様々な抗がん剤化合物と共に使用することができる。他に選択される実施形態では、２種以上の別個のＣＤ４６モジュレータを組み合わせて使用して抗腫瘍効果を増強させても、あるいは２種以上の別個のＣＤ４６モジュレータを用い多選択制のコンストラクトを作製してもよい。
【００５４】
特定の実施形態では、本発明のＣＤ４６モジュレータは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド又はポリペプチドを含む。更により好ましいＣＤ４６モジュレータには、例えば、ＣＤ４６融合コンストラクト（例えば、ＣＤ４６−Ｆｃ、ＣＤ４６−標的部位など）又はＣＤ４６−複合体（例えば、ＣＤ４６−ＰＥＧ、ＣＤ４６−細胞毒性剤、ＣＤ４６−ｂｒｍなど）などの、ＣＤ４６（ｓＣＤ４６）又はそれらの形態、変異体、誘導体又は断片を含む。他の実施形態では、ＣＤ４６モジュレータには抗体（例えば、抗ＣＤ４６ｍＡｂｓ）又はそれらの免疫応答性断片又は誘導体が含まれることも理解されるであろう。特に好ましい実施形態では、本発明のモジュレータには、中和抗体又はそれらの誘導体又は断片が含まれる。他の実施形態では、ＣＤ４６モジュレータには、内部移行抗体を含む。更に他の実施例では、ＣＤ４６モジュレータには除去抗体を含む。更に、前述の融合コンストラクトの場合、これらの抗体モジュレータは、細胞毒性剤、ポリマー、又は生体応答修飾物質（ＢＲＭ）などと複合させ、結合させ、あるいは会合させ、各種（場合により複数の）作用機序により、直接的な免疫治療に使用することができる。更に他の実施例では、モジュレータは、遺伝子の発現レベルを操作することができるものであり、アンチセンスコンストラクト、ｓｉＲＮＡ、及びマイクロＲＮＡなどの化合物を含み得る。
【００５５】
本開示のＣＤ４６モジュレータは、例えば、負荷量又は投与量及び送達方法のいずれかに関連するＣＤ４６モジュレータの形態に応じ、選択された経路の刺激又は拮抗、あるいは特定の細胞の排除などの各種機序により、腫瘍細胞、特にＴＰＣ及び／又は関連する新生物の成長、増殖又は生存を、除去、排除又は阻害することができる。したがって、本明細書で開示される好ましい実施形態は、腫瘍永続化細胞などの特定の腫瘍細胞の下位集団の除去、阻害又はサイレンシングを目的する。このような実施形態は単に例示目的のものであり、任意の要旨に制限されないことを強調する。むしろ本発明は、添付の特許請求の範囲に示される通り、ＣＤ４６モジュレータ、並びに任意の特定の機序又は標的腫瘍細胞集団とは無関係である各種ＣＤ４６介在性の異常増殖性疾患の治療、管理又は予防へのその使用を、広範に意図するものである。
【００５６】
同様の観点から、本開示の実施形態には１種以上のＣＤ４６アンタゴニストが含まれる。これを受けて、本発明のＣＤ４６アンタゴニストには、ＣＤ４６タンパク質若しくはそれらの断片を認識、反応、結合、合体、競合、会合するか、さもなければ相互作用して、腫瘍又はＮＴＧ細胞などのがん起始細胞又は他の腫瘍性細胞の成長を排除、サイレンシング、減少、阻害、妨害、制限又は制御する任意のリガンド、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質、抗体又はそれらの免疫学的に活性な断片若しくは誘導体が含まれ得ることは明らかであろう。選択された実施形態では、ＣＤ４６モジュレータはＣＤ４６アンタゴニストを含む。
【００５７】
本明細書で使用するとき、「アンタゴニスト」は、リガンドに対する受容体の結合又は酵素基質相互作用など、特定の又は特定化されたタンパク質の活性を中和、ブロック、阻害、抑制、減少、又は干渉することのできる分子を指す。本発明のより一般的なアンタゴニストには、抗体及び抗原結合断片又はそれらの誘導体、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、グリコペプチド、糖脂質、多糖、オリゴ糖、核酸、アンチセンスコンストラクト、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、生体有機分子、ペプチド模倣体、薬理剤及びそれらの代謝産物、転写及び翻訳制御配列、及び同様物などが含まれ得る。アンタゴニストとしては、小分子阻害剤、融合タンパク質、受容体分子、及び特異的にタンパク質に結合することで、標的基質に結合するタンパク質の基質結合部位を隔絶する誘導体、タンパク質のアンタゴニスト変異体、タンパク質を対象としたアンチセンス分子、ＲＮＡアプタマー、及びタンパク質に対するリボザイムも挙げられる。
【００５８】
本明細書で使用するとき、並びに２種以上の分子又は化合物に適用するとき、用語「認識する」又は「特的に認識する」は、分子を共有的に又は非共有的に、結合する、特異的に結合する、複合体形成する、会合する、相互作用する、連結する、連鎖する、ユニット化する、合体する、合併する又は連結する反応が、１つの分子が他の分子に対し作用することによるものであることを意味する。
【００５９】
更に、本明細書において実施例に記載される通り、ヒトＣＤ４６の一部のモジュレータは、特定の条件下で、ヒト以外の種（例えば、マウス）由来のＣＤ４６と交差反応し得る。他の例示的なモジュレータの場合、ヒトＣＤ４６の１つ以上のアイソフォームに特異的であり、かつ他の種由来のＣＤ４６相同分子種と交差反応を示さない。
【００６０】
任意のイベントにおいて、当業者であれば、本開示のモジュレータは複合体形態又は非複合体形態で使用できることを認識するであろう。すなわち、モジュレータは、製薬上活性な化合物、生体応答修飾物質、細胞毒性剤又は細胞増殖阻害剤、診断用部分又は生体適合性の修飾因子と会合あるいは複合（例えば、共有結合的に又は非共有結合的に）させることができる。この点において、複合体には、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、小分子、模倣剤、合成剤、無機分子、有機分子及び放射性同位体が含まれ得ることは理解されるであろう。更に、上記に示す通り、選別した複合体は、複合体に作用させるために使用される方法に少なくとも一部基づき、様々なモル比で共有結合的又は非共有結合的にＣＤ４６モジュレータと結合させることができる。
【００６１】
Ｖ．抗体
ａ．概論
これまでに言及した通り、本発明の特に好ましい実施形態には、ＣＤ４６モジュレータは抗体の形態で含まれる。本明細書において、用語「抗体」は、幅広い意味で使用され、具体的には、合成抗体、モノクローナル抗体、オリゴクローナル又はポリクローナル抗体、他クローン性抗体、組み換え法により産生された抗体、細胞内抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、一価の抗体、多価の抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、キメラ（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、一本鎖ＦｖＦｃｓ（ｓｃＦｖＦｃ）、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、及び所望の生物活性（すなわち、ＣＤ４６と会合する、又はこれと結合する）を示す免疫的に活性な任意のその他の抗体断片をその範囲に含む。幅広い意味で、本発明の抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、すなわち、抗原結合部位を含有する分子を包含する。これらの断片は、他の免疫グロブリンドメイン、例えば、限定するものではないが例えばＦｃ領域又はそれらの断片などと融合させてもよく、あるいは融合させなくてもよい。更に、本明細書においてより詳細に記載される通り、用語「抗体」には、具体的には、以下に記載の通りの、完全長の抗体、並びにＦｃ領域又は所望により、少なくとも１種のアミノ酸残基を変更させ、かつ免疫学的に活性な免疫グロブリン断片と融合させた、Ｆｃ領域の断片を含むＦｃ融合変異体を包含する。
【００６２】
以降により詳細に議論されるように、総称「抗体」又は「免疫グロブリン」には、生化学的、並びに重鎖の定常領域に含まれるアミノ酸配列に基づいて識別することのできる、５つの別個のクラスの抗体を包含し、これらは容易に適切なクラスに分類することができる。歴史的に、インタクト抗体の主要なクラスはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭと呼ばれる。ヒトにおいては、ＩｇＧ及びＩｇＡクラスは、更に構造及び特定の生化学的特性に応じ、これまでに確認されているサブクラス（アイソタイプ）、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２へと分類され得る。ＩｇＧのアイソタイプは、ヒトにおいては、血清中に豊富に存在する順に命名されており、血清中にはＩｇＧ１が最も豊富に含まれることは明らかであろう。
【００６３】
本発明の範囲内には、抗体の５つのすべてのクラス（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）並びにすべてのアイソタイプ（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、並びにそれらの変異体が含まれるが、例示目的のみのために、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンを含む好ましい実施形態を一部詳細に議論する。しかしながらこのような開示は、単に代表的な組成物、及び本発明の実施方法を示すことを目的とするものであり、本発明の範囲、すなわち本明細書に添付の特許請求の範囲を何らかの手段により制限することを意図するものではない。
【００６４】
このような観点に基づき、ヒトＩｇＧ免疫グロブリンは、分子量約２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖ポリペプチド鎖と、アイソタイプによって分子量５３，０００〜７０，０００の２つの同一の重鎖からなる。異なるクラスの抗体に対応する重鎖定常領域は、それぞれ対応するギリシャ文字α、δ、ε、γ及びμを下付きで表記する。任意の脊椎動物種の抗体の軽鎖に、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と名づけられた明確に区別される２つのタイプのうち１つを、それらの定常領域のアミノ酸配列に基づいて、割り当てることができる。当業者であれば、異なるクラスの免疫グロブリンがもつサブユニット構造及び３次元構造は公知のものであることを理解されるであろう。
【００６５】
４本の鎖が、Ｙ字形状になるようジスルフィド結合により連結され、ここで、軽鎖はＹ字分岐の根本から始まり、可変領域にわたってＹ字分岐の遠位端まで重鎖を覆うように続いている。それぞれの軽鎖は一本のジスルフィド共有結合により重鎖と結合しており、それに対し重鎖は２本のジスルフィド結合によりヒンジ領域で連結されている。それぞれの重鎖及び軽鎖は、通常、分子内ジスルフィド架橋により離間されており、架橋数はＩｇＧアイソタイプに基づき変化し得る。
【００６６】
それぞれの重鎖は可変領域（ＶＨ）を一端に有し、これに多数の定常領域が続く。それぞれの軽鎖は一端に可変領域（ＶＬ）を有し、もう一方の端に定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の第１の定常領域と整列し、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と整列している。この点に関し、軽鎖（ＶＬ）部及び重鎖（ＶＨ）部のいずれもの可変領域により、抗原認識性及び抗原特異性が決定されることは明らかであろう。反対に、軽鎖（ＣＬ）及び重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３）定常領域は、分泌、経胎盤性移動度、循環半減期、及び補体結合などの重要な生物学的特性を付与し、かつ制御する。慣例により、定常領域ドメインに付す番号は、抗原結合部位すなわち抗体アミノ末端から遠位になるほど大きくなる。したがって、抗体のアミノ又はＮ末端は可変領域を含み、カルボキシ又はＣ末端は定常領域を含む。したがって、ＣＨ３及びＣＬドメインは、実際にそれぞれ重鎖及び軽鎖カルボキシ末端を含む。
【００６７】
用語、「可変」は、免疫グロブリン間で配列が大きく異なる、可変領域内の特定の部位を指すものであり、これらのホットスポットは個々の抗体の結合性及び特異性の大部分を規定する。これらの超可変部位は、それぞれ軽鎖及び重鎖可変領域の両方に存在し、相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られる３つのセグメントにおいて顕在する。ＣＤＲに隣接し、更に非常に高度に保存された可変領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ぶ。より詳細には、天然に生じるＩｇＧ抗体単量体では、抗体の各腕に存在する６つのＣＤＲは、特異的に位置し、水性環境においてその３次元構造をとる抗体の抗原結合部位を形成する、短く、非連続的なアミノ酸配列である。
【００６８】
重鎖及び軽鎖可変領域の残部を構成するフレームワーク領域では、分子間でアミノ酸配列に生じる変動は少ない。むしろ、フレームワーク領域はその大部分がβ−シート構造をとっており、かつＣＤＲはループを形成してβ−シート構造を連結し、一部の場合ではβシート構造の一部を形成する。したがって、これらのフレームワーク領域は、鎖間の非共有結合的な相互作用により、６つのＣＤＲを正しい配向で位置させる足場を形成するよう作用する。ＣＤＲの配置により形成される抗原結合部位により、免疫応答性抗原（すなわち、ＣＤ４６）上のエピトープに対する表面相補性が決定される。この相補性表面により、免疫応答性抗原エピトープに対する抗体の非共有結合的結合が促進される。ＣＤＲの位置は、当業者により容易に認識され得ることは明らかであろう。
【００６９】
以降により詳細に議論される通り、標準的な組み換え及び発現技術を用い、重鎖及び軽鎖可変領域のすべて又は一部を組み換え、又は操作して効果的な抗体を産生することもできる。すなわち、第１抗体由来の重鎖又は軽鎖可変領域（又はそれらの任意の部分）を、任意の第２抗体由来の重鎖又は軽鎖可変領域の部分と混合し、及び対応させることができる。例えば、一実施形態では、第１抗体の軽鎖ＣＤＲを３つ含む完全な軽鎖可変領域を、第２抗体の重鎖ＣＤＲを３つ含む完全な重鎖可変領域と組み合わせて、操作的に抗体を生成することができる。更に、他の実施形態では、最適化された特性を有する所望の抗体を得るために、各種抗体由来の個々の重鎖及び軽鎖ＣＤＲを組み合わせ、及び対応させることができる。したがって、例示的な抗体には、第１抗体由来の軽鎖ＣＤＲ  ３つと、第２抗体由来の重鎖ＣＤＲを２つと、第３抗体由来の第３の重鎖ＣＤＲを１つ含ませることができる。
【００７０】
より詳細には、本発明に関する文脈において、図１１Ｂに示される本開示の任意の重鎖及び軽鎖ＣＤＲは、本開示の技術に従って、最適な抗ＣＤ４６（例えば、抗ＣＤ４６）抗体を生成する目的で、この方式により再構成することができることは明らかである。
【００７１】
任意のイベントにおいて、相補性決定領域の残基数は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，Ｖａ．）の提唱する通りに決定することができる。具体的には、残基数は、軽鎖可変領域においては２４〜３４（ＣＤＲ１）、５０〜５６（ＣＤＲ２）及び８９〜９７（ＣＤＲ３）個であり、重鎖可変領域においては、３１〜３５（ＣＤＲ１）、５０〜６５（ＣＤＲ２）及び９５〜１０２（ＣＤＲ３）個である。ここで、ＣＤＲは抗体間で大幅に変化する（及び定義によりＫａｂａｔコンセンサス配列と相同性を示さない）ことは留意すべきである。フレームワーク残基の最大アラインメントは、付番系においてＦｖ領域に使用することのできるスペーサー残基を頻繁に挿入する必要がある。これに加え、任意の所定のＫａｂａ位置で特定の個々の残基を同定することにより、空間又は対立遺伝子の相違に起因して、抗体鎖間で数値は変化し得る。Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７（１９８７）及びＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２〜７４５（１９９６）も参照されたい。これらの文献では、定義には互いに比較した場合のアミノ酸残基の重複又はサブセットが包含される。前掲の参照文献のそれぞれは、引用によりその全文を本明細書に組み込まれ、かつ前掲の参照文献のそれぞれで定義された通りのＣＤＲを包含するアミノ酸残基は、比較目的で掲載される。
【００７２】
【表１】
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１残基にはＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）の付番法に従って付番した
２残基にはＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）の付番法に従って付番した
３残基にはＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）の付番法に従って付番した
便宜上、図１１Ｂに掲載するＣＤＲはＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．による命名法を用いて命名しているが、本開示の内容は当業者であれば容易に確認することができ、かつそれぞれ重鎖及び軽鎖配列についてＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．又はＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．の定義する通りのＣＤＲを列挙することができるであろう。この観点から、実施例１６に掲載するヒト化抗体の解析にはＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．により定義される通りのＣＤＲを使用し、このＣＤＲについては、ヒト化抗体の配列を示す図１３Ａ及び１３Ｂにおいて下線を付した。したがって、ＣＤＲを含む抗体は、すべてこのような命名法により定義し、本発明の範囲内に例示的に組み込む。より広範には、用語「可変領域のＣＤＲアミノ酸残基」には、上掲の方法に基づき、任意の配列又は構成を用い識別されたＣＤＲのアミノ酸が包含される。
【００７３】
本明細書で使用するとき、用語「可変領域フレームワーク（ＦＲ）のアミノ酸残基」は、Ｉｇ鎖のフレームワーク領域内に存在するこれらのアミノ酸を指す。本明細書で使用するとき、用語「フレームワーク領域」又は「ＦＲ領域」には、可変領域の一部を構成するが、ＣＤＲ（例えば、ＫａｂａｔによるＣＤＲの定義により）は構成しないアミノ酸残基が含まれる。したがって、可変領域のフレームワーク配列は、長さがアミノ酸１００〜１２０個分であり、かつＣＤＲの外側のアミノ酸のみを包含する非連続的な配列である。
【００７４】
特定の実施例の重鎖可変領域、及びＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．により定義される通りのＣＤＲに関し、フレームワーク領域１は、アミノ酸１〜３０からなる可変領域ドメインに相当し、フレームワーク領域２は、アミノ酸３６〜４９からなる可変領域ドメインに相当し、フレームワーク領域３は、アミノ酸６６〜９４からなる可変領域ドメインに相当し、及びフレームワーク領域４は、アミノ酸１０３から可変領域末端までの可変領域ドメインに相当する。軽鎖フレームワーク領域は、同様にそれぞれ軽鎖可変領域のＣＤＲにより分離される。同様にして、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．又はＭｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．によるＣＤＲの定義によると、フレームワーク領域の境界は、それぞれ前述の通りにＣＤＲ終端により分離される。
【００７５】
前述の構造的な構成を念頭に置くことで、当業者であれば、本発明の抗体は、数多くの実施形態を構成し得ることを理解されるであろう。この観点から、準拠する抗体には、対象者において所望の生理的反応をもたらす任意の免疫応答性の抗体（本用語は本明細書に定義する通りのものである）が含まれ得る。本開示の任意の抗体を、本開示の手法と組み合わせて使用することができるが、本発明の特定の実施形態は、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒトモノクローナル抗体あるいはこれらの免疫応答性断片を含み得る。更に他の実施形態は、例えば、同種又は異種多量体コンストラクト、Ｆｃ変異体、及び複合体形成させた、又は糖鎖修飾を行った抗体を含み得る。更に、このような構成は相互排他的なものではなく、準拠する個々の抗体は本明細書で開示される機能的な態様の１つ以上を含み得ることは理解されるであろう。例えば、準拠する抗体には、ヒト化可変領域を備える単鎖二重特異性抗体、あるいは血清中半減期が調節されるようグリコシル化パターンを変更させるＦｃ改変を備える完全長のヒトＩｇＧ３抗体が含まれ得る。他の例示的な実施形態は、当業者には簡単に想像でき、かつ本発明の範囲内のものとして容易に認識できるであろう。
【００７６】
ｂ．抗体生成
本明細書に記載の技術に従って抗体を生成する目的で、周知の通りに、ウサギ、マウス、ラットなどの各種宿主動物に接種を行い、使用できる。免疫応答を増強するために使用できる、当該技術分野において公知のアジュバントとしては、限定するものではないが、接種する種に応じ、フロイントの（完全及び不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムなどを含むミネラルゲル、リゾレシチンなどの表面活性物質、プルロン酸ポリオール、多価アニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、及びジニトロフェノールが挙げられ、並びにＢＣＧ（ウシ型弱毒結核菌ワクチン）及びコリネバクテリウム・パルバムなどのヒト用アジュバントも有用である可能性がある。このようなアジュバントは、抗原を局所的に付着させて、抗原の急速な分散を防ぐことができ、あるいは宿主を刺激して、マクロファージ及び免疫系の他の構成要素が走化性を示す因子を分泌させる、物質を含有し得る。好ましくは、ポリペプチドを投与する場合には、免疫スケジュールは、数週間の間隔をとってポリペプチドを２回以上投与することを包含する。
【００７７】
スプライス変異体及び／又はペプチドから選択されたＣＤ４６免疫原により動物を免疫した後、当該技術分野で公知の手法を用い、この動物から抗体及び／又は抗体産生細胞を得ることができる。一部の実施形態では、抗ＣＤ４６ポリクローナル抗体を含有している血清は、動物を出血させるか、あるいは屠殺することで得られる。この血清を、動物から得られた状態で研究目的で使用することができ、あるいは別の方法では、抗ＣＤ４６抗体を一部又はすべて精製して、免疫グロブリン画分又は均質な抗体製剤を得ることもできる。
【００７８】
ｃ．モノクローナル抗体
本発明の特定の態様では、ポリクローナル抗体を複合させて使用することができるが、好ましい実施形態にはＣＤ４６反応性モノクローナル抗体の使用法が含まれる。本明細書で使用するとき、用語「モノクローナル抗体」又は「ｍＡｂ」は、実質的に均一な抗体集団、すなわち、生じ得る変異体、例えば、自然に生じ、微量に存在する可能性のある変異体を除き、それぞれの抗体が同一のものである集団から得られる抗体を指す。したがって、修飾語句「モノクローナル」は、この語句により修飾を受けている抗体が、別種の抗体の混合物ではないことを示すものであり、任意の種類の抗体に組み合わせて使用できる。特定の実施形態では、このようなモノクローナル抗体としては、ＣＤ４６と結合又は会合するポリペプチド配列を含む抗体が挙げられる。ＣＤ４６結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選別する工程を含む方法により得られる。
【００７９】
好ましい実施形態では、抗体産生細胞株は、免疫動物から単離された細胞から調製される。免疫後に動物は屠殺し、リンパ節及び／又は脾臓Ｂ細胞を、当業者に周知である手法により不死化させる。細胞の不死化方法としては、限定するものではないが、がん遺伝子を細胞に遺伝子導入させること、不死化細胞を選別する条件下で細胞を培養すること、発がん性又は変異誘導性化合物に曝露すること、細胞を不死化細胞、例えば骨髄腫細胞と融合させること、並びに腫瘍抑制遺伝子を不活性化させることなどが挙げられる。骨髄腫細胞と融合させる方法を用いる場合、好ましくは、この骨髄腫細胞は免疫グロブリンポリペプチドを分泌しない（非分泌性細胞株）。ＣＤ４６又はこの免疫応答性部分を用い不死化細胞を選別する。好ましい実施形態では、一次スクリーニングは酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）又はラジオイムノアッセイを用い実施する。
【００８０】
より一般的な、本発明に合致する別個のモノクローナル抗体は、当該技術分野で公知の、ハイブリドーマ法、組み換え法、ファージ・ディスプレイ法、酵母ライブラリ法、遺伝子組み換え動物（例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）又はＨｕＭＡｂ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標））又はこれらの手法の組み合わせなどの各種手法を用い調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、上記に広範に記載され、より詳細にはＨａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３〜６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）に教示されるハイブリドーマ法により産生でき、これらの文献のそれぞれは本明細書に組み込まれる。本開示のプロトコルを用い、抗体は、好ましくは哺乳動物に対し抗原及びアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射し、誘導させる。これまでに議論された通り、一般的には、免疫により免疫応答が惹起される。この反応には、活性化された脾細胞又はリンパ球が、抗原反応性の抗体（免疫した動物が遺伝子組み換え動物であると、完全にヒト型の抗体である場合もある）を産生することが含まれる。抗体は、動物の血清から回収することでポリクローナル抗体製剤として得られるものの、脾臓、リンパ節又は末梢血から単一のリンパ球を単離して、均一なモノクローナル抗体製剤を得ることはより望ましい。最も典型的には、脾臓からリンパ球を得て、これを不死化させ、ハイブリドーマに使用する。
【００８１】
例えば、上記のように、選別方法は、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、又は組み換えＤＮＡクローンなどのプールといった、複数種のクローンから、単一のクローンを選別することができるものである。選別したＣＤ４６結合配列は、例えば、標的に対する親和性を改善するために、標的結合配列をヒト化するために、細胞培養時の結合配列の産生性を改善するために、ｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫原性を低下させるために、又は多選択制の抗体を作成するために更に変更することができること、並びに変更させた標的結合配列を含む抗体は本発明のモノクローナル抗体であることは理解すべきである。通常、異なる抗原決定基（エピトープ）を標的とする別個の抗体を含有する、ポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤に含まれる各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の抗原決定基を標的とする。その特異性に加え、モノクローナル抗体製剤は、通常、交差反応性を有し得る他の免疫グロブリンが混入していないため、有利である。
【００８２】
ｄ．キメラ抗体
他の実施形態では、本発明の抗体は、少なくとも２つの異なる種又は型の抗体のタンパク質断片を共有結合させて得たキメラ抗体を含み得る。本明細書で使用するとき、用語「キメラ抗体」は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種から誘導された抗体、又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体中の相当する配列と同一であり、すなわち相同であり、その一方、鎖中の残部は、他の種から誘導された抗体、又は他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体中の、並びに所望の生物活性を示す場合に限り抗体断片中の、相当する配列と同一であり、すなわち相同であるコンストラクトを目的としていることは明らかであろう（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１〜６８５５（１９８４））。１つの例示的な実施形態では、本開示の技術に従うキメラ抗体には、ヒト種由来のマウスＶＨ及びＶＬアミノ酸配列及び定常領域を含み得る。他の準拠する実施形態では、本発明のキメラ抗体には、以下に記載のＣＤＲグラフト化又はヒト化抗体を含み得る。
【００８３】
一般的に、キメラ抗体を製造する際には、対象とされる患者種由来のアミノ酸を最大数含むキメラを生成することが目的とされる。一例は、ＣＤＲグラフト化抗体であり、この抗体は、特定の種由来の又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する１種以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含みつつ、抗体鎖の残部は、他の種から誘導された抗体、又は他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体中の、相当する配列と同一であり、すなわち相同性である。ヒトで使用する場合には、げっ歯類の抗体の可変領域又は選別したＣＤＲを、多くの場合、ヒト抗体にグラフト化させ、ヒト抗体が元々もつ可変領域又はＣＤＲを置き換える。これらのコンストラクトは、概して、完全長のモジュレータ機能部（例えば、ＣＤＣ、ＡＤＣＣなど）を提供しつつ、対象者の抗体による望ましくない免疫応答を減少させるのにあたって有利なものである。
【００８４】
ｅ．ヒト化抗体
ヒト化抗体は、ＣＤＲグラフト化抗体と同類である。一般的に、ヒト化抗体は、まずヒト以外の動物を免疫することで得られたモノクローナル抗体から生成される。本明細書で使用するとき、ヒト化形態の非ヒト（例えば、マウス）抗体とは、ヒト以外の免疫グロブリン由来の配列を、最小限度で含有しているキメラ抗体を指す。一実施形態では、ヒト化抗体は、レシピエントのＣＤＲ残基を所望の特異性、親和性、及び／又は結合能を有する、マウス、ラット、ウサギ、又はヒト以外の霊長類などのヒト以外の種由来のＣＤＲ残基（ドナー抗体）により置き換えたヒト免疫グロブリンである。
【００８５】
選別された実施形態では、ＣＤＲの置き換えを受ける抗体はコンセンサス配列を含み得る。ヒトフレームワークとの一致性を得るにあたり、数種のヒト重鎖又は軽鎖アミノ酸配列由来のフレームワークを整列させて、コンセンサスなアミノ酸配列を同定することができる。更に、多くの例では、ヒト免疫グロブリンの可変領域中の１つ以上のフレームワーク残基を、ドナー抗体由来の非ヒト残基と対応させて置き換える。これらのフレームワーク置換は、当業者に周知の手法により、例えば、ＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用をモデル化し、抗原の結合に必要なフレームワーク残基を同定し、配列比較して、特定の部位に含まれる特有なフレームワーク残基を同定するなどの手法により同定される。このような置換は、グラフト化ＣＤＲの適切な３次元構造を維持する助けとなり、多くの場合、フレームワーク置換をしていない同様のコンストラクトよりも無限性が改善される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体内に見出されない残基を含むことがある。周知の技術を用い、これらの改変を行うことで、抗体性能を更に洗練させることができる。
【００８６】
ＣＤＲグラフト及びヒト化抗体は、例えば、米国特許第６，１８０，３７０号、同第５，６９３，７６２号、同第５，６９３，７６１号、同第５，５８５，０８９号、及び同第５，５３０，１０１号に記載される。一般にヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変領域の実質的にすべてを含み、このドメインにおいて、ＣＤＲのすべて又は実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、フレームワーク領域のすべて又は実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、所望により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンの一部分を含むことになる。更なる詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２〜５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２９（１９８８）、及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３〜５９６（１９９２）を参照されたい。同様に、例えば、Ｖａｓｗａｎｉ  ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５〜１１５（１９９８）、Ｈａｒｒｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ２３：１０３５〜１０３８（１９９５）、Ｈｕｒｌｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８〜４３３（１９９４）、及び米国特許第６，９８２，３２１号及び同第７，０８７，４０９号を参照されたい。更に、ヒューマニアリング（ｈｕｍａｎｅｅｒｉｎｇ）と呼ばれる他の方法が、例えば、米国特許出願公開第２００５／０００８６２５号に記載される。本出願の目的に関し、用語「ヒト化抗体」は、フレームワーク置換を全く含まないか、最小限度で含むＣＤＲグラフト化抗体（すなわち、非ヒトＣＤＲを１つ以上グラフト化させたヒト抗体）を明確に包含する。
【００８７】
更に、非ヒト型抗ＣＤ４６抗体は、ヒトＴ細胞のエピトープを欠損させるか、国際公開第９８／５２９７６号及び同００／３４３１７号に開示される方法により脱免疫化させて、改変することもできる。簡単には、抗体の重鎖及び軽鎖可変領域が、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドをもつか、分析することができる。このようなペプチドは、Ｔ細胞のエピトープ（国際公開第９８／５２９７６及び同第００／３４３１７号に定義される通り）になる可能性があることが示されている。Ｔ細胞エピトープの欠損の可能性については、「ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｈｒｅａｄｉｎｇ」と命名されたコンピュータ・モデリングによるアプローチを用いて検証することができ、これに加えて国際公開第９８／５２９７６号及び同第００／３４３１７号に記載される通りにヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースからＶＨ及びＶＬ配列中に存在するモチーフを検索することができる。これらのモチーフは、ＭＨＣクラスＩＩの１８種の主要なＤＲアロタイプのいずれかと結合し、Ｔ細胞エピトープを構成する可能性がある。Ｔ細胞エピトープをもつ可能性があると示された場合には、このエピトープは、可変領域に含まれるアミノ酸残基を少数置換することにより、あるいは単一アミノ酸置換することにより、排除することができる。できる限り保存的な置換を行う。多くの場合、但し制限するものではないが、ヒト生殖系列抗体配列における位置と共通しているアミノ酸を使用できる。脱免疫化させる変化を確認した後、変異導入又は他の合成法（例えば、デノボ合成、及びカセット置換など）により、ＶＨ及びＶＬをコードしている核酸を作製することができる。所望により、変異を誘発させた可変配列をヒト定常領域と融合させることができる。
【００８８】
選択された実施形態では、ヒト化抗体の可変領域の残基のうち少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％は、親フレームワーク領域（ＦＲ）及びＣＤＲ配列と一致する。他の実施形態では、ヒト化抗体の残基のうち少なくとも８５％又は９０％は、親フレームワーク領域（ＦＲ）及びＣＤＲ配列と一致する。更に好ましい実施形態では、ヒト化抗体の残基のうち９５％超は、親フレームワーク領域（ＦＲ）及びＣＤＲ配列と一致する。
【００８９】
ヒト化抗体は、一般的な分子生物学、及び本明細書に記載されるような生体分子設計法を用い作製することができる。これらの手法としては、免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖のうち少なくとも１つから得られたＦｖ可変領域のすべて又は一部をコードする核酸配列の単離、操作、及び発現が挙げられる。このような核酸の供給源は、当業者に周知のものであり、例えば、上記のように、生殖系列の免疫グロブリン遺伝子、又は合成コンストラクトから、所定の標的に対し抗体又は免疫反応性の断片を産生するハイブリドーマ、真核細胞又はファージから得ることができる。次に、ヒト化抗体をコードしている組み換えＤＮＡを、適切な発現ベクターにクローン化することができる。
【００９０】
ヒト生殖系列の配列は、例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６〜７９８；Ｃｏｏｋ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １６：２３７〜２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２２７：７９９〜８１７；及びＴｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ  １４：４６２８〜４６３８に記載される。Ｖ  ＢＡＳＥディレクトリは、ヒト免疫グロブリン可変領域の配列を包括するディレクトリである（Ｒｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  ３３：６７１〜６７４を参照されたい）。これらの配列は、ヒト配列、例えば、フレームワーク領域及びＣＤＲの供給源として使用することができる。本明細書で説明されるような、コンセンサスなヒトフレームワーク領域、例えば、米国特許第６，３００，０６４号に記載のフレームワークも使用することができる。
【００９１】
ｆ．ヒト抗体
前述の抗体に加え、当業者であれば、本発明の抗体には完全なヒト抗体も含まれ得ることが理解されるであろう。本開示の目的に際し、用語「ヒト抗体」は、ヒトにより産生された抗体のものと一致するアミノ酸配列を保有しており、本明細書で開示される通りのヒト抗体の製造に際し使用される、任意の手法により作製された抗体を含む。このヒト抗体の定義には、具体的には非ヒト型抗原結合残基を含むヒト化抗体は除外される。
【００９２】
ヒト抗体は、当該技術分野において既知の様々な技術を用いて製造可能である。前掲の通り、本発明の技術に従いファージ・ディスプレイ法を使用して、免疫活性な結合領域を生成することもできる。したがって、本発明の特定の実施形態は、抗ＣＤ４６抗体又はその抗原結合部分の製造方法を提供し、本方法は、ファージで抗体（好ましくはヒト抗体）のライブラリを合成する工程と、このライブラリをＣＤ４６又はその抗体結合部分についてスクリーニングする工程と、ＣＤ４６に結合するファージを単離する工程と、ファージから免疫反応性の断片を得る工程と、を包含する。ＣＤ４６又は免疫応答を生成するための抗原断片を用い、ヒト又は非ヒトの免疫グロブリンの遺伝子座を含むＣＤ４６又はこれらの抗原部位を含む非ヒト動物を免疫する工程、免疫した動物から抗体産生細胞を抽出する工程、抽出した細胞から本発明の抗体重鎖及び軽鎖をコードしているＲＮＡを単離する工程、ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを生成する工程、プライマーを用いｃＤＮＡを増幅させる工程、ファージで抗体が発現されるようｃＤＮＡをファージディスプレイベクターに挿入する工程、を含む。より具体的には、ＶＨ及びＶＬドメインをコードしているＤＮＡを、ＰＣＲ法を用い、ｓｃＦｖリンカーを使用して組み換え、ファージミドベクター（例えば、ｐ  ＣＡＮＴＡＢ  ６又はｐＣｏｍｂ  ３  ＨＳＳ）にクローン化させる。次にこのベクターを用いＥ．ｃｏｌｉを電気穿孔処理し、続いてＥ．ｃｏｌｉをヘルパーファージに感染させる。これらの方法に使用するファージは、典型的にはｆｄ及びＭ１３などの繊維状ファージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ）であり、ＶＨ及びＶＬドメインを、通常、組み替え法によりファージ遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩのいずれかと融合させる。
【００９３】
本発明の組み換えヒト抗ＣＤ４６抗体は、上記のように作成した、コンビナトリアルな組み換え抗体ライブラリからスクリーニングして単離することができる。好ましい実施形態では、ライブラリは、Ｂ細胞から単離したｍＲＮＡより、ヒトＶＬ及びＶＨｃＤＮＡを調製し、これを用い作成した、ｓｃＦｖファージ・ディスプレイライブラリである。このようなライブラリの製造及びスクリーニング法は、当該技術分野において周知のものであり、並びにファージ・ディスプレイライブラリを作成するためのキットは市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａの「組み換えファージ抗体システム」、カタログ番号２７−９４００−０１、及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージ・ディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）。抗体ディスプレイライブラリの作成及びスクリーニングに使用することのできる他の方法試薬も存在する（例えば、米国特許第５，２２３，４０９、国際公開第９２／１８６１９号、同第９１／１７２７１号、同第９２／２０７９１号、同第９２／１５６７９号、同第９３／０１２８８号、同第９２／０１０４７号、同第９２／０９６９０号、Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０〜１３７２（１９９１）、Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１〜８５（１９９２）、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５〜１２８１（１９８９）、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２〜５５４（１９９０）、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５〜７３４（１９９３）、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９〜８９６（１９９２）、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４〜６２８（１９９１）、Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３５７６〜３５８０（１９９２）、Ｇａｒｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３〜１３７７（１９９１）、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：４１３３〜４１３７（１９９１）、及びＢａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７９７８〜７９８２（１９９１）を参照されたい）。
【００９４】
ライブラリ（天然又は合成のいずれであっても）により作製した抗体は中程度の親和性（Ｋａが約１０６〜１０７Ｍ−１程度）を有し得るが、親和性の成熟度は、本発明に記載の通りに二次ライブラリを構築及び再選別することで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで模倣することもできる。例えば、変異は、エラープローンポリメラーゼ（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１：１１〜１５（１９８９）に報告）を用い、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：８８９〜８９６（１９９２）又はＧｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ＵＳＡ，８９：３５７６〜３５８０（１９９２）の方法により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでランダムに導入することができる。加えて、親和性の成熟は、例えば、対象とするＣＤＲを含むランダムな配列を含むプライマーを使用し、ＰＣＲを用いることで、１つ以上のＣＤＲにランダムに変異導入し、次に各Ｆｖクローンを選別し、より親和性の高いクローンをスクリーニングすることで得ることができる。国際公開第９６０７７５４号は、免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域に変異導入し、軽鎖遺伝子のライブラリを作成するための方法を開示している。他の効果的なアプローチとしては、未免疫のドナーから得られる天然に生じるＶドメイン変異体のレパートリーを使用した、ファージ・ディスプレイにより選別した、ＶＨ又はＶＬドメインを組み換え、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：７７９〜７８３（１９９２）により報告されるように鎖の再シャッフリングを複数回行い、より親和性の高い変異体を選別するという手法も挙げられる。この技術により、解離定数Ｋｄ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）が約１０−９Ｍ以下の抗体及び抗体断片の産生が可能になる。
【００９５】
表面に結合対を発現する真核細胞（例えば、酵母）からなるライブラリを用いる、同様の手法も選択できることは更に理解されるであろう。この手法では、ファージ・ディスプレイ法と同様、真核生物のライブラリを、対象とする抗原（すなわち、ＣＤ４６）に関しスクリーニングし、候補となる結合対を発現する細胞を単離及びクローン化する。ライブラリの含有物を最適化し、反応性の結合対の親和性を成熟させるための工程を採用してもよい。例えば、米国特許第７，７００，３０２号及び米国特許出願第１２／４０４，０５９号を参照されたい。一実施形態では、ヒト抗体は、ヒト抗体を発現するファージライブラリから選択される（Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０９〜３１４（１９９６）、Ｓｈｅｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：６１５７〜６１６２（１９９８））、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２７：３８１（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１（１９９１））。他の実施形態では、ヒト抗体の結合対は、酵母などの真核細胞を用い作成したコンビナトリアルな抗体ライブラリから単離することができる。例えば、米国特許第７，７００，３０２号を参照されたい。このような技術は、候補となるモジュレータを大量にスクリーニングする際に有利なものであり、比較的容易に候補配列を操作すること（例えば、親和性の成熟又は組み換えシャッフリングなど）ができる。
【００９６】
ヒト抗体は、内因性免疫グロブリン遺伝子を一部又は完全に不活性化させたトランスジェニック動物（例えばマウス）の中に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによって作成することもできる。抗原負荷に応じ、遺伝子の再構成、組み立て及び抗体レパートリーを含むすべての面で、ヒトについて見られるものに非常に似ているヒト抗体の産生が観察される。このアプローチは、例えば、次の科学出版物：Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９〜７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６〜８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２〜１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５〜５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８２６（１９９６）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５〜９３（１９９５）と共にＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（登録商標）を用いる手法が、米国特許．第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、及び米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号に記載されている。別の方法としては、ヒト抗体は、標的抗原に対応する抗体を産生するヒトＢリンパ球の不死化によって調製可能である（このようなＢリンパ球は、腫瘍性疾患に罹患している個体から回収しても、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫してもよい）。例えば、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４７（ｌ）：８６〜９５（１９９１）；及び米国特許第５，７５０，３７３号を参照されたい。
【００９７】
ＶＩ．抗体特性
作製方法又は前述した抗体モジュレータの形態（例えば、ヒト化及びヒトなど）とは関係なく、本開示のモジュレータの好ましい実施形態は各種特性を示し得る。この点で、抗ＣＤ４６抗体産生細胞（例えば、ハイブリドーマ又は酵母コロニー）は、選別し、クローン化することができ、更には、望ましい特性に関し、例えば着実に成長する、及び抗体産生性が高いなどの望ましい特性、並びに以降により詳細に議論される望ましい抗体特性に関し、スクリーニングすることができる。ハイブリドーマは、例えば、ヌードマウスなどの、免疫系を欠損している同系の動物を用い、ｉｎ  ｖｉｖｏで増殖させることができ、あるいは細胞培養法を用いｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させることができる。それぞれ別個の抗体種を産生する、ハイブリドーマ及び／又はコロニーの選別、クローニング及び増殖法は、当業者には周知である。
【００９８】
ａ．中和抗体
特に好ましい実施形態では、本発明のモジュレータは、中和抗体又はそれらの誘導体若しくは断片が含まれる。用語「中和抗体」又は「中和アンタゴニスト」は、ＣＤ４６又は任意のリガンド又は酵素に結合し、あるいはこれらと相互作用し、リガンド又は酵素がその結合パートナー（例えば、ＣＤ４６）、すなわち基質と結合するのを阻害することで、分子の相互作用により生じ得る生物学的な応答を妨げる抗体又はアンタゴニストを指す。抗体、又はそれらの免疫学的な機能断片若しくは誘導体の結合性及び特異性を評価する際、過剰量の抗体により、結合パートナーが標的分子と結合する量が少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％以上減少した場合に（本明細書において、実施例に示される通りのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの競合的結合アッセイで測定された場合に）、抗体又は断片は、リガンド又は酵素と、その結合パートナーすなわち基質との結合を実質的に阻害するとされる。ＣＤ４６に対する抗体の場合、中和抗体又はアンタゴニストは、好ましくは血清第Ｉ因子により補体成分Ｃ３ｂ及びＣ４ｂを不活性化させるというＣＤ４６の能力を少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％以上消失させ、これにより遊離グリピカンの濃度は低下する。この活性の消失度は、当該技術分野で認識されている手法を用い直接測定でき、あるいはこのような減少が補体活性に対して示す影響を測定することにより測定できることは明らかであろう。
【００９９】
ｂ．内部移行抗体
ＣＤ４６が細胞から分泌され得ることを示すデータが存在する一方で、少なくとも一部のＣＤ４６は細胞表面と会合したままであり、これにより開示のモジュレータの内部移行が可能になる。したがって、抗ＣＤ４６抗体は、ＣＤ４６を発現する細胞により、少なくともある程度は内部移行され得る。例えば、がん起始細胞の表面でＣＤ４６に結合する抗ＣＤ４６抗体は、がん起始細胞に内部移行され得る。特に好ましい実施形態では、このような抗ＣＤ４６抗体に細胞毒性部分を会合させるか、又は細胞毒性基と複合させて、内部移行時に細胞を殺傷させることができる。
【０１００】
本明細書で使用するとき、内部移行する抗ＣＤ４６抗体は、哺乳動物細胞と会合したＣＤ４６に結合することで細胞に取り込まれるものである。内部移行抗体としては、抗体断片、ヒト又はヒト化抗体、及び抗体複合体が挙げられる。内部移行はｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで生じ得る。治療用途の際には、内部移行はｉｎ  ｖｉｖｏで生じ得る。ＣＤ４６発現細胞、特にＣＤ４６発現がん起始細胞を殺傷するのに十分又は適切な数の抗体分子を内部移行させることができる。一部の例では、抗体又は抗体複合体の力価に応じ、細胞への単一の抗体分子の取り込みは、抗体が結合する標的細胞を殺傷するのに十分なものである。例えば、特定の毒素は、抗体と複合体形成させた毒分子が内部移行することで、腫瘍細胞が殺傷されるのに足るよう、非常に強力である。抗ＣＤ４６抗体の内部移行が、哺乳動物細胞においてＣＤ４６に結合することに基づくものであるか否かを、以降の実施例に記載のものなどの各種アッセイ法により評価することができる。細胞中に抗体が内部移行するか否かについての検出方法は、その全体が引用により本明細書に組み込まれる米国特許第７，６１９，０６８号に記載される。
【０１０１】
ｃ．除去抗体（Ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）
他の好ましい実施形態では、本発明のモジュレータは、除去抗体又はそれらの誘導体若しくは断片が含まれる。用語「除去抗体」は、細胞表面上又は細胞表面付近のＣＤ４６に結合又は会合し、細胞死又は細胞除去を誘導、促進、又は引き起こす（例えば補体依存性の細胞毒性又は抗体依存性の細胞傷害活性により）抗体又は断片を指す。以降により詳細に議論される一部の実施形態では、選別した除去抗体は細胞毒性剤と会合又は複合させる。好ましくは、除去抗体は、所定の細胞集団に含まれる腫瘍永続化細胞のうち、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は９９％を除去、排除又は殺傷することができる。一部の実施形態では、この細胞集団は濃縮、分画、精製又は単離した腫瘍永続化細胞から構成され得る。他の実施形態では、細胞集団は、完全な腫瘍試料、あるいは腫瘍永続化細胞を含む不均一な腫瘍抽出物から構成され得る。当業者であれば、本開示の技術に従った腫瘍永続化細胞の除去をモニター及び定量するために、下記実施例に記載の標準的な生化学法を使用できることは明らかであろう。
【０１０２】
ｄ．エピトープ結合性
本開示の抗ＣＤ４６抗体が、選別した標的の示す別個のエピトープ又は抗原決定基と会合、又は結合し得ることが更に理解されるであろう。本明細書で使用するとき、用語「エピトープ」は、特定の抗体が認識し、及び特異的に結合することのできる標的抗原基を指す。抗原がＣＤ４６などのポリペプチドである場合、エピトープは、連続的なアミノ酸、及びタンパク質の３次元折り畳構造により並置される非連続的なアミノ酸の両方から形成され得る。連続的なアミノ酸から形成されるエピトープは、典型的にはタンパク質の変性時にも保持される一方で、３次元折り畳構造により形成されるエピトープは、一般的には、タンパク質の変性時に損なわれることになる。エピトープは一般的には少なくとも３個、及びより一般的には、少なくとも５個又は８〜１０個のアミノ酸を、特有の空間配置の下含有する。より詳細には、当業者であれば、用語「エピトープ」には、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体と特異的に結合することのできる、あるいは分子と相互作用することのできる任意のタンパク質の抗原決定基が包含されることを理解されるであろう。エピトープとなる抗原決定基は、通常、アミノ酸、又は炭水化物若しくは糖側鎖等の、化学的に活性な表面分子の集団からなり、特異的な３次元構造特性、並びに特異的な電荷特性を有する。加えて、エピトープは直線構造であっても、又は立体構造であってもよい。直線構造のエピトープでは、タンパク質及び相互作用分子（抗体など）間の相互作用点のすべてが、タンパク質の一次アミノ酸配列に従って直線状に現れる。立体構造を以って形成されるエピトープでは、相互作用点は、タンパク質の一次構造では互いに分離されているアミノ酸残基間で形成される。
【０１０３】
抗原上の所望のエピトープを決定したならば、例えば本開示に記載の手法を用い、このエピトープに対し抗体を生成することができる。あるいは、エピトープの探索時に、抗体の生成及び特性評価により、所望のエピトープに関する情報が解明され得る。この情報をもとに、次に同一のエピトープに対する結合性について、抗体を競合的にスクリーニングすることができる。この結合性に基づきスクリーニグを行う手法では、互いに競合的に結合する抗体、すなわち、抗原に対する結合について競合する抗体を発見するための、競合的試験が実施される。相互競合作用に基づく、抗体のビニング（ｂｉｎｎｉｎｇ）に関するハイスループットな手法は、国際公開第０３／４８７３１号に記載のものである。
【０１０４】
本明細書で使用するとき、用語「ビニング」は、抗原結合特性に基づき、抗体をグループ分けするための手法を指す。ビンの割り当ては、試験する抗体に観察される結合パターンがどの程度異なるかに応じ、ある程度任意のものである。したがって、この手法は、本発明の抗体を分類するのに有用なツールであるものの、ビンは必ずしもエピトープと直接相関するものではなく、このような一次評価は、当該技術分野で認識されている他の手法により更に確認すべきである。
【０１０５】
本仮出願に関し、選別した第１抗体（又はそれらの断片）が、第２抗体と同様のエピトープに結合するか否か、すなわち結合に際し第２抗体と相互に競合するか否かを、当該技術分野において既知の方法並びに以降実施例に記載の方法を用い、評価することができる。一実施形態では、本発明の第１抗体を飽和条件下でＣＤ４６に結合させ、次にＣＤ４６に対する第２抗体の結合能を測定する。試験抗体を、第１抗ＣＤ４６抗体と同時にＣＤ４６に対し結合させることができる場合、次に第２抗体を第１抗体とは異なるエピトープに結合させることができる。しかしながら、第２抗体をＣＤ４６に同時に結合させることができない場合には、第２抗体は、同一のエピトープ、重複するエピトープ、あるいは第１抗体が結合したエピトープとごく近接しているエピトープに結合させる。当該技術分野において既知である通り、並びに以降実施例において詳細が記載される通りに、所望のデータは、直接又は間接放射免疫測定法（ＲＩＡ）、直接又は間接固相酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、サンドイッチ式競合アッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システム（すなわち、表面プラズモン共鳴−ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）分析器（すなわち、生体膜干渉測定法（ｂｉｏ−ｌａｙｅｒ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）−ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．）、又はフローサイトメトリー法を用い得ることができる。本明細書で使用するとき、用語「表面プラズモン共鳴」は、バイオセンサーマトリックス内で、タンパク質の濃度の変化を検出することで、リアルタイムでの生体分子特異的な相互作用の解析を可能にする光学現象を指す。特に好ましい実施形態では、解析は、以降実施例に例示されるものなどのＢｉａｃｏｒｅ又はＦｏｒｔｅＢｉｏの装置を用い実施される。
【０１０６】
同一のエピトープに対し競合する抗体に関する文脈で使用するとき、用語「競合する」は、アッセイにおいて、試験下で、抗体又は免疫学的機能断片が、共通の抗原に対する参照抗体の特異的結合を、妨害又は阻害するとして、抗体間の競合が測定されることを意味する。典型的には、このようなアッセイには、固体表面に結合した精製抗原、あるいは未標識の試験免疫グロブリン及び標識参照免疫グロブリンのいずれかを担持している細胞の使用が含まれる。競合阻害は、試験免疫グロブリンの存在下で、固体表面又は細胞に結合した標識の量を評価することで測定される。通常、試験免疫グロブリンは過剰量で存在させる。競合アッセイにより同定される抗体（競合する抗体）としては、参照抗体のものと同一のエピトープに結合する抗体、及び立体障害を生じさせるにあたって、参照抗体の結合したエピロープと十分に近位にある、隣接するエピトープに結合する抗体、が挙げられる。競合結合を測定する方法に関する更なる詳細については、本明細書中の実施例に提供する。通常、競合する抗体が過剰に存在する場合、この抗体は、共通の抗原に対する参照抗体の特異的な結合を、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％阻害する。一部の例では、結合を少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９７％以上阻害する。
【０１０７】
エピトープ特異性に加え、本開示の抗体は、数多くの異なる物理特性、例えば、結合親和性、融解温度（Ｔｍ）、及び等電点などにより特性評価することができる。
【０１０８】
ｅ．結合親和性
この観点から、本発明は更に、ＣＤ４６に対する結合親和性の高い抗体の使用法を包含する。本発明の抗体は、解離定数Ｋｄ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）が１０−８Ｍ以下である場合にその標的とする抗原に特異的に結合するものである。抗体は、Ｋｄが５×１０−９Ｍ以下である場合に抗原に対し高親和性かつ特異的に結合し、Ｋｄが５×１０−１０Ｍ以下である場合には非常に高親和性に結合する。本発明の一実施例では、抗体のＫｄは１０−９Ｍ以下であり、解離速度は約１×１０−４／秒である。本発明の一実施例では、解離速度は１×１０−５／秒以下である。本発明の他の実施形態では、抗体は、約１０−８Ｍ〜１０−１０ＭのＫｄでＣＤ４６に結合し、更に他の実施形態では、２×１０−１０Ｍ以下のＫｄで結合する。本発明の更に他の選択的な実施形態は、解離定数すなわちＫｄ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）が１０−２Ｍ未満、５×１０−２Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−３Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５×１０−５Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１５Ｍ、又は５×１０−１５Ｍ未満である抗体を含む。
【０１０９】
特定の実施形態では、ＣＤ４６に免疫特異的に結合する本発明の抗体の結合速度定数、すなわちｋｏｎ速度（ＣＤ４６（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）ｋｏｎ←Ａｂ−Ａｇ）は少なくとも１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも２×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１ｓ−１、又は少なくとも１０８Ｍ−１ｓ−１である。
【０１１０】
他の実施形態では、ＣＤ４６に免疫特異的に結合する本発明の抗体のｋｏｆｆ速度（ＣＤ４６（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）ｋｏｆｆ←Ａｂ−Ａｇ）は、１０−１ｓ−１未満、５×１０−１ｓ−１未満、１０−２ｓ−１未満、５×１０−２ｓ−１未満、１０−３ｓ−１未満、５×１０−３ｓ−１未満、１０−４ｓ−１未満、５×１０−４ｓ−１未満、１０−５ｓ−１未満、５×１０−５ｓ−１未満、１０−６ｓ−１未満、５×１０−６ｓ−１未満、１０−７ｓ−１未満、５×１０−７ｓ−１未満、１０−８ｓ−１未満、５×１０−８ｓ−１未満、１０−９ｓ−１、５×１０−９ｓ−１又は１０−１０ｓ−１未満である。
【０１１１】
本発明の他に選択される実施形態では、抗ＣＤ４６抗体は少なくとも１０２Ｍ−１、少なくとも５×１０２Ｍ−１、少なくとも１０３Ｍ−１、少なくとも５×１０３Ｍ−１、少なくとも１０４Ｍ−１、少なくとも５×１０４Ｍ−１、少なくとも１０５Ｍ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１、少なくとも１０６Ｍ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも５×１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも５×１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも５×１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも５×１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも５×１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１、少なくとも５×１０１３Ｍ−１、少なくとも１０１４Ｍ−１、少なくとも５×１０１４Ｍ−１、少なくとも１０１５Ｍ−１又は少なくとも５×１０１５Ｍ−１である結合定数すなわちＫａ（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）を有する。
【０１１２】
ｆ．等電点
前述の結合特性に加え、抗ＣＤ４６抗体、及びすべてのポリペプチドなどのそれらの断片は、一般的には、ポリペプチドが正味電化を担持しなくなるｐＨとして定義される、等電点（ｐＩ）を有する。当該技術分野では、タンパク質の溶解度は、溶液のｐＨがタンパク質の等電点（ｐＩ）と等しい場合に、最も低くなることが既知である。したがって、溶解性は、抗体に含まれるイオン化可能な残基の数及び位置を変更し、ｐＩを調節することで、最適化できる。例えば、ポリペプチドのｐＩは、適切なアミノ酸置換を施すことで操作できる（例えば、リジンなどの帯電しているアミノ酸を、アラニンなどの非帯電残基に置換する）。任意の特定の理論に束縛されることを望むものではないが、抗体のｐＩが変更されるよう抗体にアミノ酸置換を行うと、抗体の溶解性及び／又は安定性が改善され得る。当業者であれば、特定の抗体に所望のｐＩをもたせるにはアミノ酸置換が最も適切であることを理解されるであろう。
【０１１３】
タンパク質のｐＩは、限定するものではないが、等電点電気泳動法及び各種コンピュータアルゴリズム（例えば、Ｂｊｅｌｌｑｖｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １４：１０２３を参照されたい）などの様々な方法により測定することができる。一実施形態では、本発明の抗ＣＤ４６抗体のｐＩは、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、又は約９．０よりも高い。他の実施形態では、本発明の抗ＣＤ４６抗体のｐＩは、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、又は９．０よりも高い。更に他の実施形態では、本発明の抗体のｐＩを変更させる置換は、ＣＤ４６に対する抗体の結合親和性を著しく減弱させるものではない。以降により詳細に議論される通り、具体的には、ＦｃγＲに対する結合性を変更させ、ｐＩにも変更をもたらすようなＦｃ領域の置換が想到される。好ましい実施形態では、具体的には、ＦｃγＲ結合性の変更、及びｐＩにおける任意の所望の変化のいずれに対しても作用するような、Ｆｃ領域の置換が選択される。本明細書で使用するとき、ｐＩ値は、主要な帯電形態に関するｐＩとして定義される。
【０１１４】
ｇ．熱安定性
更に、抗体のＦａｂドメインのＴｍは、抗体の熱安定性に関する良好な指標となり得、更には貯蔵寿命の指標になり得ることも認識されるであろう。Ｔｍは単に、所定のドメイン又は配列の５０％の立体構造がほどけることを意味する。Ｔｍが低ければ、より凝集性が高く／安定性が乏しいことを意味し、それに対しＴｍが高ければ、より凝集性が低く／安定性が高いことを意味する。したがって、抗体又は断片若しくは誘導体は、Ｔｍが高い方が好ましい。更に、当該技術分野で認められている手法により、抗ＣＤ４６抗体又はそれらのドメインの構成に変更を加えて、分子安定性を向上させたり、あるいは最適化することもできる。例えば、米国特許第７，９６０，１４２号を参照されたい。したがって、一実施形態では、選別した抗体のＦａｂドメインが有するＴｍ値は、少なくとも５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、９５℃、１００℃、１０５℃、１１０℃、１１５℃又は１２０℃より高い。他の実施形態では、抗体の有するＦａｂドメインが有するＴｍ値は、少なくとも約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃、約９０℃、約９５℃、約１００℃、約１０５℃、約１１０℃、約１１５℃又は約１２０℃より高い。タンパク質ドメイン（例えば、Ｆａｂドメイン）の溶解温度（Ｔｍ）は、当該技術分野において既知である、任意の標準的な手法により、例えば、示差走査熱量測定により測定できる（例えば、いずれも引用により本開示に組み込まれるＶｅｒｍｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７８：３９４〜４０４、Ｖｅｒｍｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７９：２１５０〜２１５４を参照されたい。）
ＶＩＩ．ＣＤ４６モジュレータ断片及び誘導体
インタクト融合コンストラクト、抗体、断片、又は誘導体のいずれであったとしても、本発明の選別したモジュレータは、ＣＤ４６と反応、結合、合体、複合、接続、付着、連結、相互作用、又は会合することで、所望の抗腫瘍性効果をもたらす。当業者であれば、抗ＣＤ４６抗体を含むモジュレータは、抗体に発現した１つ以上の結合部位を介して、ＣＤ４６と相互作用又は会合することを認識されるであろう。より詳細には、本明細書で使用するとき、用語「結合部位」は、対象とする標的分子（例えば、酵素、抗原、リガンド、受容体、基質又は阻害物質）に対する選択的な結合に関与する、ポリペプチド領域を含む。結合ドメインは、結合部位を少なくとも１つ含む（例えば、インタクトＩｇＧ抗体は、２つの結合ドメインと２つの結合部位を有する）。例示的な結合ドメインとしては、抗体可変領域、リガンドの受容体結合ドメイン、受容体のリガンド結合ドメイン、又は酵素ドメインが挙げられる。本発明の目的に際し、ＣＤ４６の酵素活性領域（例えば、Ｆｃ−ＣＤ４６融合コンストラクトの一部分など）は基質結合部位（例えば、グリピカン）を含み得る。
【０１１５】
ａ．断片
本発明を実施するにあたり選択されるモジュレータの形態（例えば、キメラ、ヒト化など）とは関係なく、同一の免疫反応性断片を本開示の手法に従って使用できることは理解されるであろう。広義に、用語「抗体断片」は、インタクト抗体（例えば、天然に生じる免疫グロブリン）の少なくとも一部分を含む。より詳細には、用語「断片」は、インタクト又は完全な抗体又は抗体鎖よりも少数のアミノ酸残基を含む、抗体又は抗体鎖（又はＦｃ融合体の場合にはＣＤ４６分子）の一部分又は部分を指す。用語「抗原結合性断片」は、抗原に結合する、又は抗原結合（すなわち、特異的結合）においてインタクト抗体（すなわち、その断片が派生したインタクト抗体）と競合する、免疫グロブリン又は抗体のポリペプチド断片を意味する。本明細書で使用するとき、用語「抗体分子の断片」としては、抗体の抗原結合性断片、例えば、抗体軽鎖（ＶＬ）、抗体重鎖（ＶＨ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単ドメインの抗体断片、二量体、線状（ｌｉｎｅａｒ）抗体、一本鎖抗体分子、及び抗体断片から生成される多選択性抗体（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）が挙げられる。同様にして、ＣＤ４６の酵素活性断片は、インタクトＣＤ４６と同様の様式（ある程度効果が劣る場合もあるものの）でＣＤ４６基質と相互作用し及びこの基質を改変する（例えば、基質を切り出す能力を保持している、ＣＤ４６分子の一部分を含む。
【０１１６】
当業者であれば、断片は、化学的に、又はインタクト若しくは完全モジュレータ（例えば、抗体又は抗体鎖）の酵素処理により、又は組み換え法により得ることができることを理解されるであろう。この観点から、インタクト抗体の消化に関して様々な抗体断片が定義されるが、当業者であれば、このような断片は、化学的手法又は組み換えＤＮＡ法のいずれかにより新規に合成できることを理解するであろう。したがって、本明細書で使用するとき、用語「抗体」は、明らかに、抗体、あるいは完全な抗体又は組み換えＤＮＡ法により新規に合成された抗体を改変することによって産生される断片、又はこれらの誘導体を包含する。
【０１１７】
より詳細には、抗体をパパイン消化し、それぞれ抗原結合部位を１つと残りのＦｃ断片とを備える、Ｆａｂ断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を産生する。この名称は容易に結晶化することを反映している。ペプシン処理を行うと、抗原結合部位を２つ備え、なおも抗原を架橋し得るＦ（ａｂ’）２断片が生成される。Ｆａｂ断片には、軽鎖定常ドメイン及び重鎖第一定常ドメイン（ＣＨ１）も含まれる。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域にシステインを１つ以上含むなど、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にいくつかの残基が付加されているという点でＦａｂ断片とは異なる。本明細書において、Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が、遊離チオール基を少なくとも１つ担持する、Ｆａｂ’についての表記である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元々、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片対として産生された。抗体断片に関し、他の化学的な結合も既知である。例えば、他の抗体断片に関する更に詳細な記述については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９９）を参照されたい。
【０１１８】
更に、Ｆｖ断片が完全な抗原認識及び結合部位を含有する抗体断片であることは認識されるであろう。この領域は、緊密に会合した（例えばｓｃＦｖにおいて自然に共有結合することのできる）、重鎖可変領域を１つと、軽鎖可変領域を１つと、を含む二量体から構成される。この構成では、各可変領域の３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を形成する。総じて、６つのＣＤＲ又はこれらのサブセットが、抗体に対し抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変領域（又はＦｖの半分は、抗原特異的な３つのＣＤＲのみを含む）であっても抗原を認識及び結合する能力を有するものの、通常、完全な結合部位と比べてその親和性は低くなる。
【０１１９】
他の実施形態では、抗体断片、例えば、Ｆｃ領域を含む抗体断片は、通常、インタクト抗体として存在する場合、例えば、ＦｃＲｎ結合、抗体半減期の調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合などの、Ｆｃ領域に関係している生体機能を少なくとも１つ保有する。一実施形態では、抗体断片は、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期がインタクト抗体と実質的に同様である、一価の抗体である。例えば、かかる抗体断片は、Ｆｃ配列と結合し、断片に生体内安定性を付与し得る、抗原結合腕を含み得る。
【０１２０】
ｂ．誘導体
他の実施形態では、本発明のモジュレータは一価又は多価（例えば、二価、三価など）であってよいことが更に理解されるであろう。本明細書で使用するとき、用語「結合価」は、抗体と会合する標的（すなわち、ＣＤ４６）結合部位となり得る部位の数を指す。各標的結合部位は、１つの標的分子又は特異的な位置又は標的分子上の部位に特異的に結合する。本発明の抗体が標的結合部位を１つ以上含む（多価である）場合、各標的結合部位は同一又は異なる分子（例えば、異なるリガンド若しくは異なる抗原、異なるエピトープ若しくは同一抗原の異なる位置）に特異的に結合し得る。本発明の目的に関し、対象とする抗体は、好ましくは、ヒトＣＤ４６に特異的な結合部位を少なくとも１つ有する。一実施例では、本発明の抗体は、分子の各結合部位が単一のＣＤ４６位置又はエピトープに特異的に結合するものであり、一価である。他の実施形態では、抗体は、１つ以上の位置又はエピトープと特異的に会合する１つ以上の結合部位及び異なる結合部位を含み、多価である。抗体が多価である場合、選別されたＣＤ４６ポリペプチド又はスプライス変異体上には複数のエピトープが存在してよく、あるいはＣＤ４６上には１つのエピトープが存在し、かつ他の分子又は表面上に第２の異なるエピトープが存在していてもよい。例えば、米国特許出願公開第２００９／０１３０１０５号を参照されたい。
【０１２１】
前掲の通り、多価の抗体は、所望の標的分子の異なるエピトープに免疫特異的に結合することができ、あるいは標的分子に加えて、異種エピトープ（例えば異種ポリペプチド又は固体支持材料）にも免疫特異的に結合することができる。この抗ＣＤ４６抗体の好ましい実施形態は２つの抗原のみに結合する（すなわち、二重特異性抗体）ものであるものの、三重特異性抗体などの、更に特異性を有する抗体も本発明に包含される。二重特異性抗体の例としては、制限するものではないが、ＣＤ４６に対する腕を一つと、任意の他の抗原（例えば、モジュレータ細胞マーカー）に対する他の腕とを備えるもの挙げられる。二重特異性抗体の製造方法は、当該技術分野において既知である。従来の完全長の二重特異性抗体の製造は、免疫グロブリン重鎖−軽鎖対を２つ共発現させることに基づくものであリ、この場合、２つの鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７〜５３９）。他の、より洗練された、準拠し得る多選択制のコンストラクト及びその作製法は、米国特許出願公開第２００９／０１５５２５５号に記載される。
【０１２２】
更に他の実施形態では、所望の結合特性を有する抗体可変領域（抗体抗原結合部位）を、免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合させる。好ましい融合は、少なくともヒンジ部、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３領域を含む、免疫グロブリンの重鎖定常ドメインを用い実施する。一例では、融合させるドメインのうち、少なくとも１つには、軽鎖との結合に必要な部位を含有している第１重鎖定常領域（ＣＨ１）が存在する。免疫グロブリン重鎖融合物と、必要に応じて免疫グロブリン軽鎖とをコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクターに挿入し、好適な宿主微生物に同時導入する。コンストラクトに使用される３つのポリペプチド鎖が不均一な比をなすことで最適な結果が得られる場合、このような同時導入を用いると、実施形態において３つのポリペプチド断片の相互比を調整する際に、非常に融通が利くことになる。しかしながら、少なくとも２つのポリペプチド鎖を等しい比で発現させることで、収率が高くなる場合、あるいは比が特に意味をもたない場合には、２つ又は３つすべてのポリペプチド鎖コード配列を、１つの発現ベクターに挿入することもできる。
【０１２３】
この手法に関し、一実施例では、二重特異性抗体は、１つの腕に、第１結合特異性（例えば、ＣＤ４６）を有するハイブリッド型免疫グロブリン重鎖を含み、他の腕にハイブリッド型免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性をもたらす）を含む。この非対称的な構造により、不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせからの所望の二重特異性化合物の分離が促進され、二重特異性分子のほんの半分に免疫グロブリン軽鎖が存在する場合に、分離に関する用意な手法が得られることが判明した。この手法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示される。二重特異性抗体の生成についての更なる詳細は、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０を参照されたい。国際公開第９６／２７０１１号に開示される他の手法に従って、抗体分子対を設計して、組み換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の割合を最大化させることができる。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインを少なくとも一部含む。この手法では、第１抗体分子の界面にある、小型のアミノ酸側鎖のうち１つ以上を、より大型の側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置き換える。第２抗体分子の界面上で、大型のアミノ酸側鎖を小型のアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はスレオニン）により置き換え、第一抗体分子の界面で置き換えた大型の側鎖と同一又は同様の大きさをもつ補償的な空間を生成する。これにより、ホモ二量体などの他の不要な最終産物よりもヘテロ二量体の収率が増加するという機序がもたらされる。
【０１２４】
二重特異性抗体も、架橋又は異種複合抗体に含まれる。例えば、異種複合体に含まれる抗体のうち１つは、アビジンと結合することができ、他方はビオチンと結合することができる。例えば、このような抗体は、不要な細胞に対する免疫系細胞を標的とする目的で（米国特許第４，６７６，９８０号）、並びにＨＩＶ感染治療（国際公開第９１／００３６０号、同第９２／２００３７３号、及び欧州特許第０３０８９号）に提案されている。任意の従来の架橋法により、異種複合抗体を作成できる。好適な架橋剤は当該技術分野において周知であり、数多くの架橋法と共に米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
【０１２５】
ＶＩＩＩ．ＣＤ４６モジュレータ−定常領域の改変
ａ．Ｆｃ領域及びＦｃ受容体
上記本開示のモジュレータ（例えば、Ｆｃ−ＣＤ４６又は抗ＣＤ４６抗体）の可変又は結合領域に対する各種変更、置換、付加又は欠失に加えて、当業者であれば、本発明の実施形態のうち一部のものは、定常領域（すなわち、Ｆｃ領域）にも置換又は変更を含み得ることを理解するであろう。より具体的には、本発明のＣＤ４６モジュレータは、とりわけ、得られるモジュレータに好ましい特性、例えば、限定するものではないが、薬物動態の変更、血清中半減期の延長、結合親和性の向上、免疫原性の減少、産生性の向上、Ｆｃリガンド結合性の向上、ＡＤＣＣ又はＣＤＣ活性の増感又は減感、グリコシル化及び／又はジスルフィド結合の変更、並びに結合特異性の変更などの、好ましい特性をもたらし得る、１つ以上の付加的アミノ酸置換、変異及び／又は変更を含有し得ることが企図される。この観点から、これらのＦｃ変異体は、本開示のモジュレータの有する抗腫瘍特性の有効性を増感させるにあたって有利に使用できる。
【０１２６】
本明細書において、用語「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリン重鎖の、Ｃ末端領域（天然の配列のＦｃ領域及び変異体配列のＦｃ領域など）を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は、場合により異なるものの、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６のアミノ酸残基から、あるいはＰｒｏ２３０のアミノ酸残基から、そのカルボキシ末端までの領域であると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端のリジン（ＥＵ付番系によると、残基４４７）は、例えば、抗体産生又は精製時に除去することができ、あるいは抗体重鎖をコードしている核酸を組み換え設計して除去することができる。したがって、インタクト抗体組成物には、すべてのＫ４４７残基が除去された抗体集団、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体集団、及びＫ４４７残基を有する抗体と有さない抗体との混合物を含む抗体集団が含まれ得る。機能性Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域の元の配列がもつエフェクタ機能を保有する。例示的なエフェクタ機能としては、Ｃ１ｑ結合、ＣＤＣ、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣ、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御などが挙げられる。このようなエフェクタ機能は、一般的に、結合ドメイン（例えば、抗体可変領域）が結合するＦｃ領域を必要とするものであり、開示の、例えば本明細書において定義される各種アッセイにより評価することができる。
【０１２７】
「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を説明する。一部の実施形態では、ＦｃＲはヒトの未改変のＦｃＲである。一部の実施形態では、ＦｃＲはＩｇＧ抗体に結合し（γ受容体）、ＦｃγＲＩ、Ｆｃ．ＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体（これらの受容体のアリル変異体及びあるいはスプライス変異体を含む）を含む。ＦｃγＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）が含まれ、これらは主にその細胞質ドメインにおいて異なる類似したアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。ＦγＲＩＩＢ受容体の阻害は、その細胞質ドメインに免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する。（例えば、Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３〜２３４（１９９７）を参照されたい）。例えば、ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７〜９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５〜３４（１９９４）；ａｎｄ  ｄｅ  Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０〜４１（１９９５）に概説される。将来的に同定されるものを含み、これらのＦｃＲは、本明細書において「ＦｃＲ」という用語に包含される。用語「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、特定の例においては、母体ＩｇＧの胎児への移行、（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））、並びに免疫グロブリン恒常性制御に関与する、胎児性受容体のＦｃＲｎも含む。ＦｃＲｎに対する結合性の測定法は既知である（例えば、Ｇｈｅｔｉｅ  ａｎｄ  Ｗａｒｄ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １８（１２）：５９２〜５９８（１９９７）、Ｇｈｅｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５（７）：６３７〜６４０（１９９７）、Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（８）：６２１３〜６２１６（２００４）、国際公開第２００４／９２２１９号（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）を参照されたい）。
【０１２８】
ｂ．Ｆｃ機能
本明細書で使用するとき、補体依存性細胞障害及びＣＤＣは、補体の存在下で、標的細胞が可溶化することを指す。補体活性化経路は、補体系（Ｃ１ｑ）の第１構成成分が同種抗原と複合した分子、例えば抗体に結合することで開始する。補体活性を評価するために、ＣＤＣアッセイ、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０２：１６３において説明されるようなＣＤＣアッセイを実施してもよい。
【０１２９】
更に、「抗体依存性細胞介在性細胞傷害」又は「ＡＤＣＣ」とは、細胞傷害性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した、分泌されたＩｇが、これらの細胞傷害性エフェクタ細胞が抗原を有する標的細胞に特異的に結合してその後標的細胞を細胞毒で殺傷することを可能にするような、細胞傷害の形態を意味する。標的腕に対し特異的に高親和性を示すＩｇＧ抗体は、このような殺傷の際にはなくてはならない。標的細胞の溶解は細胞外環境により生じるものであり、細胞同士が直接接触する必要があり、かつ補体は関与しない。
【０１３０】
ＦｃＲ結合親和性又はＡＤＣＣ活性を変更させたＣＤ４６モジュレータ変異体は、Ｆｃ領域の未改変の配列を含む親抗体又は未改変の抗体又はモジュレータと比較して、増感された又は減感されたＦｃＲ結合活性及び／又はＡＤＣＣ活性を有する。ＦｃＲに対する結合性が上昇しているモジュレータ変異体は、未改変のＦｃ領域配列を含む親又は未改変の抗体又はモジュレータと比べ、高親和性で少なくとも１つのＦｃＲと結合する。ＦｃＲに対する結合性が減少している変異体は、未改変のＦｃ領域配列を含む、親抗体又は未改変の抗体又はモジュレータと比べ、低親和性で少なくとも１つのＦｃＲと結合する。ＦｃＲに対する結合性が減少しているこのような変異体は、ＦｃＲに対する結合性をわずかに保有するものであるか、あるいは認識可能な結合性を全く保有しないものである場合があり、例えば、当該技術分野で周知の手法により測定した場合に、ＩｇＧ  Ｆｃ領域の未改変の配列と比較して、ＦｃＲに対する結合性が０〜２０％である。
【０１３１】
ＦｃＲｎに関し、本発明の抗体は、定常領域に、哺乳動物、好ましくはヒトにおける半減期（例えば、血清中半減期）を、５日超、１０日超、１５日超、好ましくは２０日超、２５日超、３０日超、３５日超、４０日超、４５日超、２ヶ月超、３ヶ月超、４ヶ月超、又は５ヶ月超にする改変を有する、Ｆｃ変異体も含有又は包含する。本発明の抗体（又はＦｃ含有分子）の、哺乳動物、好ましくはヒトにおける半減期が延長されることで、哺乳動物における抗体又は抗体断片の血清中力価が高くなり、したがって、抗体又は抗体断片の投与頻度が減少し及び／又は抗体又は抗体断片の投与濃度が減少することになる。半減期の延長された抗体は、当業者に既知の手法により生成できる。例えば、半減期の延長された抗体は、Ｆｃドメイン及びＦｃＲｎ受容体間の相互作用に関与するものとして同定されたアミノ酸残基を改変（例えば、置換、欠失又は付加）することで生成できる（例えば、国際公開第９７／３４６３１号、同第０４／０２９２０７号、米国特許第６，７３７，０５６号及び米国特許出願公開第２００３／０１９０３１１号を参照されたい）。ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒトＦｃＲｎに対する結合、並びにヒトＦｃＲｎ高親和結合性ポリペプチドの血中半減期は、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現する形質転換マウス又は遺伝子導入したヒト細胞株において、又は霊長類を用い、これらに対し変異型Ｆｃ領域をもつポリペプチドを投与することでアッセイできる。国際公開第２０００／４２０７２号は、ＦｃＲｎに対する結合性を増感又は減感させた抗体変異体を開示する。同様に、例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１〜６６０４（２００１）を参照されたい。
【０１３２】
ｃ．グリコシル化修飾
更に他の実施形態では、本発明の抗体のグリコシル化パターン又は組成は変更される。より具体的には、本発明の好ましい実施形態は、グリコフォームが１つ以上操作されており、すなわち、グリコシル化パターンの変更又はＦｃ領域を構成する分子に共有結合している糖鎖組成の変更を含む。グリコフォームの操作は、限定するものではないが、エフェクタ機能の増感又は減感、標的抗原に対する抗体の親和性の向上、又は抗体産生の促進などの様々な目的に関し有用なものであり得る。エフェクタ機能の減感が所望される場合、分子は糖鎖不含有の形態で発現するように操作され得ることは理解されるであろう。このような糖鎖修飾は、例えば、抗体配列内の、グリコシル化に関する１つ以上の部位を改変することで実施できる。すなわち、可変領域フレームワークのグリコシル化部位を１つ以上除去することで、除去された部位に対するグリコシル化が生じなくなるようなアミノ酸置換を１箇所以上に行うことができる（例えば、米国特許第５，７１４，３５０号及び同第６，３５０，８６１号を参照されたい）。反対に、Ｆｃ含有分子のエフェクタ機能を増感させるか、又は結合性を向上させたければ、グリコシル化部位を１箇所以上に追加設計することもできる。
【０１３３】
更に、又は代替え的に、Ｆｃ変異体は、例えば、フコシル残基の量が軽減された低フコシル化抗体、あるいはｂｉｓｅｃｔｉｎｇ  ＧｌｃＮＡｃ構造の量が増量した抗体などのように、グリコシル化組成を変更させて作成することができる。抗体のＡＤＣＣ能を増感させる目的で、これらのように及び同様に変更されたグリコシル化パターンが例証されてきた。操作型グリコフォームは、当業者に既知の任意の手法により、例えば、操作型又は変異体発現株を用いる手法、１種以上の酵素を同時発現させる手法（例えば、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ（ＧｎＴＩ１１））、Ｆｃ領域を含む分子を各種生物又は各種生物由来の細胞株において発現させる手法、又はＦｃ領域を含む分子を発現させた後に糖鎖修飾する手法により、生成することができる。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３〜２６７４０、Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６〜１並びに、欧州特許第１，１７６，１９５号、国際公開第０３／０３５８３５号、同第９９／５４３４２号、Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：１７６〜１８０、Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１７  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ７４：２８８〜２９４、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２６７３３〜２６７４０、Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：３４６６〜３４７３、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．第６，６０２，６８４号、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎｓ．１０／２７７，３７０号、同第１０／１１３，９２９号、国際公開第００／６１７３９（Ａ１）号、同第０１／２９２２４６（Ａ１）号、同０２／３１１１４０（Ａ１）号、同０２／３０９５４（Ａ１）号、Ｐｏｔｉｌｌｅｇｅｎｔ（商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．）、ＧｌｙｃｏＭＡｂ（商標）グリコシル化操作法（ＧＬＹＣＡＲＴ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ）、国際公開第０００６１７３９号、ＥＡ第０１２２９１２５号；米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号；Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，ＪＭＢ，３３６：１２３９〜４９．を参照されたい。
【０１３４】
ＩＸ．モジュレータの発現
ａ．概論
所望のＣＤ４６モジュレータをコードしているＤＮＡは、従来の手法を用い（例えば、抗体重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合することのできるオリゴヌクレオチドプローブを用い）容易に単離し、配列決定することができる。モジュレータが抗体である場合、単離し、サブクローニングしたハイブリドーマ細胞（又はコロニー由来のファージ若しくは酵母）を、このようなＤＮＡの好ましい供給源として提供できる。この核酸は、融合タンパク質、又はキメラ、ヒト化若しくは完全ヒト抗体などの剤を生成するにあたって、必要に応じて、本明細書に記載の通りに更に操作することができる。より詳細には、米国特許第７，７０９，６１１号に記載の通り、抗体を製造する際に、定常及び可変領域の配列をクローン化するにあたって、単離したＤＮＡ（改変されていてもよい）を使用できる。
【０１３５】
この例示的な手法は、選別した細胞からＲＮＡを抽出する工程と、ｃＤＮＡへと変換する工程と、及び抗体特異的なプライマーを用いるＰＣＲにより増幅させる工程と、を伴う。好適なプライマーは、本明細書に例示されている通り、当該技術分野において周知であり、数多くの市販元から容易に調達できる。コンビナトリアルライブラリのスクリーニングにより単離された組み換えヒト又は非ヒト抗体を発現させるためには、抗体をコードしているＤＮＡを組み換え発現ベクターにクローン化し、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、及びバクテリアなどの宿主細胞に導入することは理解されるであろう。更に他の実施形態では、モジュレータは、所望の作成物コンストラクトを別途産生しない、サルＣＯＳ細胞、ＮＳ０細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は骨髄腫細胞に導入し、発現させる。以降により詳細に議論されるように、所望のモジュレータを発現する、形質転換させた細胞を、比較的大容量で増殖させて、融合コンストラクト又は免疫グロブリンの臨床的及び商業的供給をもたらすことができる。
【０１３６】
ＣＤ４６モジュレータの所望の部分をコードしている核酸が、ファージ・ディスプレイ法、酵母ライブラリ、ハイブリドーマ系技術、合成、又は市販品として得られるのか、又はこれらにより誘導されるのかのいずれにせよ、本発明が、融合タンパク質及び抗ＣＤ４６抗体又は抗原結合断片又はそれらの誘導体などのＣＤ４６モジュレータをコードしている核酸分子及び配列を明確に包含することは理解されるであろう。本発明は、更に、高ストリンジェンシーなハイブリッド形成条件下で、あるいは、中程度又は低ストリンジェンシーな条件下（例えば、以降に定義される通り）で、本発明のモジュレータ又は断片又はこれらの変異体をコードするポリヌクレオチド配列を有する核酸に相補的なポリヌクレオチドとハイブリッド形成する、核酸又は核酸分子（例えば、ポリヌクレオチド）を包含する。本明細書で使用するとき、用語「核酸分子」又は「単離された核酸分子」は、少なくともＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を包含することを意図する。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であり得るが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。更に、本発明は、モジュレータをコードしているポリヌクレオチドを組み込む、制限するものではないがベクター、プラスミド、宿主細胞、コスミド又はウイルス性コンストラクトなどの任意の媒介物又はコンストラクトを含む。
【０１３７】
用語「単離された核酸」は、（ｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅された核酸、（ｉｉ）クローニングにより組み換え的に産生された核酸、（ｉｉｉ）精製された核酸、例えば、切断しゲル電気泳動することで分画された核酸、又は（ｉｖ）合成された核酸、例えば化学合成された核酸を意味する。単離された核酸は、ＤＮＡ組み換え手法により操作することのできる核酸である。
【０１３８】
より詳細には、本発明の一本鎖又は二本鎖抗体又は断片、誘導体、変異タンパク質、又はこれらの変異体などの、モジュレータをコードしている核酸、ハイブリダイゼーションのプローブとして使用するのに十分なポリヌクレオチド、ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを同定、解析、変異導入又は増幅させるためのＰＣＲプライマー又は配列決定用プライマー、ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンス核酸、及びこれらの相補的配列も提供される。核酸は任意の長さであってよい。核酸は、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１，０００、１，５００、３，０００、又は５，０００ヌクレオチド長以上であってよく、及び／又は１つ以上の追加の配列、例えば、制御配列を含んでもよく、及び／又は核酸、例えば、ベクターの一部であってもよい。これらの核酸は単鎖又は二本鎖であってよく、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡヌクレオチド、並びにこれらの人工的な変異体（例えば、ペプチド核酸）であってよい。本発明のモジュレータ（抗体又は免疫反応性断片又はそれらの誘導体など）をコードしている核酸は、好ましくは上記のように単離されたものである。
【０１３９】
ｂ．ハイブリダイゼーション及び同定
記載の通り、本発明は更に、特定のハイブリダイゼーション条件下で他の核酸とハイブリッド形成する核酸を提供する。核酸にハイブリッド形成させる手法は、当該技術分野において周知である。例えば、現行のプロトコルについては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１〜６．３．６を参照されたい。本開示の目的に関し、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、５ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ  ８．０）、ハイブリダイゼーション緩衝液（約５０％ホルムアミドを含む）、６ｘＳＳＣを含有している前洗浄用液を用い、ハイブリダイゼーション温度は５５℃（又は約５０％ホルムアミドを含む他の同様のハイブリダイゼーション溶液を用い、ハイブリダイゼーション温度は４２℃で）、及び洗浄条件では６０℃（０．５ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ）で行うものである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件では、４５℃にて６ｘＳＳＣでハイブリッド形成させ、続いて６８℃にて０．１ｘＳＳＣ、０．２％  ＳＤＳで１回以上洗浄を行う。更に、当業者は、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件を操作して、互いに少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８又は９９％同一であるヌクレオチド配列を構成している核酸が、典型的には互いにハイブリッド形成をしたままとどまるなどするように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加又は減少させることができる。より一般的な本開示の目的に関し、核酸配列に関する用語「実質的に同一」は、参照核酸配列に対し少なくとも約８５％、又は９０％、又は９５％、又は９７％配列相同性を示すヌクレオチド配列として解釈することができる。
【０１４０】
ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を及ぼす基本的なパラメータ、及び好適な条件を考案するための指針は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｃｈａｐｔｅｒｓ  ９  ａｎｄ  １１、及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ２．１０  ａｎｄ  ６．３〜６．４）に説明されており、当業者であれば、例えば、核酸の長さ及び／又は塩基組成に基づき容易に決定できる。
【０１４１】
本発明に従う核酸は、単独で存在し得ること、又は同種若しくは異種のものであり得る他の核酸との組み合わせで存在し得ることは更に理解されるであろう。好ましい実施形態では、核酸は、この核酸に対し同種又は異種であり得る発現制御配列と機能的に連結している。この文脈において、用語「同種」は、核酸が元から発現制御配列に機能的に連結していることも意味し、用語「異種」は、核酸が元々は発現制御配列に機能的に連結していないことを意味する。
【０１４２】
ｃ．発現
ＲＮＡ及び／又はタンパク質又はペプチドを発現する核酸と、発現制御配列とは、この核酸の発現又は転写が、制御下にある、すなわち発現制御配列の影響下にあるよう互いに共有結合している場合には、互いに機能的に連結している。次に、核酸が機能性タンパク質へと翻訳される場合、発現制御配列がコード配列に機能的に連結され、この発現制御配列の導入により、コード配列をフレーム・シフトさせずに核酸の転写が行われ、あるいは前記コード配列は所望のタンパク質又はペプチドへと翻訳され得ない。
【０１４３】
用語「発現制御配列」は、本発明に従って、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサ、並びに遺伝子の転写又はｍＲＮＡの転写を制御する他の制御配列を含む。本発明の具体的な実施形態では、発現制御配列は制御できる。発現制御配列の正確な構造は、種又は細胞型の機能に伴い変化し得るものであるが、一般的には、５’−非転写領域の配列と、５’−及び３’−非翻訳領域の配列とを含む。これらは、それぞれ転写及び翻訳の開始に関与し、例えば、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、及びＣＡＡＴ配列などが挙げられる。より詳細には、５’−非翻訳領域発現制御配列は、機能的に連結した核酸の転写制御に関するプロモーター配列を含有する、プロモーター領域を含む。発現制御配列には、エンハンサ配列又は上流活性化配列を含めることもできる。
【０１４４】
本発明によると、用語「プロモーター」又は「プロモーター領域」は、発現させる核酸配列の上流（５’）に位置し、ＲＮＡポリメラーゼの認識部位及び結合部位を提供して配列の発現を制御する核酸配列に関する。更に、プロモーター領域には、遺伝子の転写制御に関与する他の因子に対する、認識及び結合部位を含めることもできる。プロモーターは、原核細胞又は真核細胞の遺伝子の転写を調節することができる。更に、プロモーターは誘導可能で、かつ誘導剤に応答して転写を開始させることができるものであってよく、あるいは転写が誘導剤により調節されない場合には常時発現型であってもよい。誘導性プロモーターの調節下にある遺伝子は、誘導剤が存在しない場合には発現しないか、発現したとしてもほんのわずかな程度にしか発現しない。誘導剤の存在下で、遺伝子のスイッチはオンになり、すなわち転写レベルが上昇する。一般的に、この流れは、特異的な転写因子の結合により介在される。
【０１４５】
本発明による好ましいプロモーターとしては、ＳＰ６、Ｔ３及びＴ７ポリメラーゼのプロモーター、ヒトＵ６  ＲＮＡプロモーター、ＣＭＶプロモーター、並びにこれら（例えば、ＣＭＶ）の一部、又は部分を、他の、例えばヒトＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素）などの細胞タンパク質の遺伝子のプロモーターの一部又は部分と融合させた、追加のイントロンを含む、又は含まない、人工的なハイブリッド型プロモーターが挙げられる。
【０１４６】
本発明に従って、用語「発現」は、その最も一般的な意味で使用され、かつＲＮＡの産生、又はＲＮＡ及びタンパク質／ペプチドの産生を包含する。この用語には、核酸の部分的な発現も包含する。更に、発現は一過性に又は安定的に実施されてよい。
【０１４７】
好ましい実施形態では、核酸分子は本発明に従って、核酸の発現を調節する適切なプロモーターを有するベクター内に存在する。用語「ベクター」は、本明細書においてその最も一般的な意味で使用され、核酸を、例えば、原核細胞及び／又は真核細胞の適切な場所に導入し、ゲノムと一体化させることのできる、核酸用の任意の中間媒介物を含む。この種のベクターは、好ましくは細胞内で複製され、及び／又は発現する。ベクターには、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージ又はウイルス性ゲノムが含まれる。本明細書で使用するとき、用語「プラスミド」は、一般的に、染色体外の遺伝物質からなるコンストラクトに関し、通常は、染色体ＤＮＡとは独立して複製することのできる環状二本鎖ＤＮＡを指す。
【０１４８】
本発明を実施するにあたり、所望により、分子生物学、微生物学、及びＤＮＡ組み換え法における多くの従来的な手法が使用される。このような従来的な手法は、本明細書で定義される通りのベクター、宿主細胞及び組み換え法に関する。これらの手法は周知であり、例えばＢｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （３ｒｄ  Ｅｄ．），Ｖｏｌ．１〜３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２０００及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，ｓｕｐｒａに説明され、例えば細胞分離及び培養（例えば、後に続く核酸又はタンパク質分離に関して）に関する有用な情報には、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ及びこれに引用されている参照文献；Ｐａｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ系Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  （Ｅｄｓ．）（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  （Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）ａｎｄ  Ａｔｌａｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｓ  （Ｅｄｓ．）Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．が挙げられる。核酸製造法（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増幅、細胞からの精製、又は化学合成）、核酸操作法（例えば、部位特異的変異導入、制限酵素による消化、ライゲーションなど）、並びに各種ベクター、細胞株、及び核酸の操作及び製造に有用な要素は、上記参照に記載されている。これに加え、本質的に任意のポリヌクレオチド（例えば、標識又はビオチン化ポリヌクレオチド）を、任意の各種市販元に特注又は発注することができる。
【０１４９】
したがって、一態様では、本発明は、本発明の抗体又はこれらの部分の組み換え体を発現させることのできる組み換え宿主細胞を提供する。このような組み換え宿主細胞による発現を以って産生される抗体を、本明細書では組み換え抗体と呼ぶ。本発明は、このような宿主細胞の子孫細胞、及びこれらの細胞により産生される抗体も提供する。
【０１５０】
本明細書で使用するとき、用語「組み換え宿主細胞」（又は単に「宿主細胞」）は、組み換え発現ベクターが導入された細胞を意味する。この組み換え宿主細胞及び宿主細胞は、単に特定の対象とする細胞を意味するのみならず、このような細胞の子孫細胞も意味することは理解すべきである。連続する細胞世代には、変異又は環境的影響のいずれかにより何らかの改変が生じ得るため、子孫細胞は実際には親細胞と同一でない場合があるが、それでも本明細書で使用されるところの「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。このような細胞は、上記の通りの本発明に従うベクターを含み得る。
【０１５１】
他の態様では、本発明は本明細書に記載される通りの抗体又はこれらの一部の製造方法を提供する。一実施形態によると、この手法は、上記の通りにベクターを用い遺伝子導入又は形質転換した細胞を培養する工程と、抗体又はこれらの一部を回収する工程と、を含む。
【０１５２】
上記に示す通り、本発明の抗体（又は断片又はこれらの変異体）の発現には、好ましくは、所望の抗ＣＤ４６抗体をコードするポリヌクレオチドを含有している発現ベクターが含まれる。当業者に周知の手法を使用して、抗体コード配列と、適切な転写及び翻訳調節シグナルとを含む発現ベクターを構築できる。これらの手法としては、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組み換えＤＮＡ法、合成法、及びｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子組換え法が挙げられる。したがって、本発明の実施形態は、調節可能なようにプロモーターに連結された、本発明の抗ＣＤ４６抗体を（例えば、完全な抗体、抗体重鎖又は軽鎖、抗体重鎖又は軽鎖可変領域、又はこれらの一部、あるいは重鎖又は軽鎖ＣＤＲ、一本鎖Ｆｖ、あるいはこれらの断片又は変異体）コードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。好ましい実施形態では、このようなベクターは、抗体分子の重鎖をコードしているヌクレオチド配列（又はこれらの断片）、抗体軽鎖をコードしているヌクレオチド配列（又はこれらの断片）、又は重鎖及び軽鎖の両方をコードしているヌクレオチド配列を含有する。
【０１５３】
本発明のヌクレオチドを単離し、本明細書に記載の手法に従って改変したならば、これらは、抗ＣＤ４６抗体又はこれらの断片を含有するモジュレータを選別するために使用することができる。
【０１５４】
Ｘ．モジュレータ産生及び精製
当業界で認知されている分子生物学的手法及び現行のタンパク質発現法を用い、所望のモジュレータを大量に産生することができる。より詳細には、所望の製薬学的生成物を前臨床的、臨床的、又は商業的量で産生させるための様々な宿主細胞を含む、周知の及び市販のタンパク質産生系に、上記のように得、操作した抗体などのモジュレータをコードしている核酸分子を組み込むことができる。好ましい実施形態では、モジュレータをコードしている核酸分子を、選択した宿主細胞の中に効果的に組み込まれかつ続いて所望のＣＤ４６モジュレータを高発現するベクター又は発現ベクター内に設計する。
【０１５５】
好ましくは、ＣＤ４６モジュレータをコードしている核酸分子と、これらの核酸分子を含むベクターは、哺乳動物、植物、微生物、又は酵母宿主細胞の遺伝子導入に使用できるものの、モジュレータ産生には原核細胞系も使用できることは理解されたい。遺伝子導入は、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する任意の既知の方法によるものであってよい。哺乳動物細胞への異種ポリヌクレオチド導入法は当該技術分野において周知であり、デキストラン介在性遺伝子導入、リン酸カルシウム法、ポリブレン介在性遺伝子導入、プロトプラスト融合、電気穿孔法、リポフェクション法、及び核へのＤＮＡの直接微量注入が挙げられる。これに加え、核酸分子はウイルスベクターにより哺乳動物細胞に導入することもできる。哺乳動物細胞の形質転換法は、当該技術分野において周知である。例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号、及び同第４，９５９，４５５号を参照されたい。更に、植物細胞の形質転換法も当該技術分野において周知であり、例えば、アグロバクテリウム法、遺伝子銃法、直接注入法、電気穿孔法及びウイルスを用いる形質導入が挙げられる。微生物及び酵母細胞を形質転換させる手法も当業者に周知である。
【０１５６】
更に、宿主細胞には、本発明の発現ベクターを２つ、例えば、重鎖由来のポリペプチドをコードしている第１ベクターと、軽鎖由来のポリペプチドをコードしている第２ベクターとを同時導入することもできる。第２ベクターには、重鎖及び軽鎖ポリペプチドを実質的に当量発現させることのできる、選択性が同一のマーカーを含有させることができる。あるいは、重鎖及び軽鎖ポリペプチドをいずれもコードし、発現することのできる１種のベクターを使用することもできる。このような場合、遊離重鎖の過剰な毒性を避けるためにも、好ましくは軽鎖は重鎖よりも前に配置する。重鎖及び軽鎖コード配列には、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡが含まれ得る。
【０１５７】
ａ．宿主発現系
多くは市販されている、各種宿主発現ベクター系は、本明細書に記載の技術に準拠するものであり、本発明のモジュレータを発現させるために使用することができる。このような宿主発現系は、対象とするコード配列を発現し、続いて精製することのできる媒介物を意味するが、ｉｎ  ｓｉｔｕで本発明の分子を発現する適切なヌクレオチドコード配列により、形質転換又は遺伝子導入した細胞も意味する。このような系としては、限定するものではないが、組み換えバクテリオファージＤＮＡにより形質転換した、バクテリアなどの微生物（例えば、大腸菌、枯草菌、ストレプトミセス）、モジュレータコード配列を含有している、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ発現ベクター、モジュレータコード配列を含有している組み換え酵母発現ベクターにより遺伝子導入した酵母（例えば、サッカロミセス、ピキア）、モジュレータコード配列を含有している組み換えウイルスベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系、組み換えウイルスベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））又はモジュレータコード配列を含有している組み換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）を感染させた植物細胞系（例えば、タバコ、シロイヌナズナ、アオウキクサ、トウモロコシ、小麦、ジャガイモなど）、あるいは哺乳動物細胞（例えば、メタロチオネインプロモーター）のゲノム又は哺乳動物感染性ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニア・ウイルス７．５Ｋプロモーター）由来のプロモーターを含有している組み換え発現コンストラクトを内包している哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が挙げられる。
【０１５８】
バクテリア系では、発現させる分子の使用目的に応じ、数多くの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、モジュレータを含む製薬組成物を製造する際に、このようなタンパク質を大量に産生させる場合、容易に精製することのできる融合タンパク質を高レベルで発現するベクターが望ましい場合がある。このようなベクターとしては、限定するものではないが、融合タンパク質が産生されるようｌａｃＺコード領域を備えるフレームでコード配列をそれぞれベクターに連結させることのできる大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  １．２：１７９１（１９８３））、ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ａｎｄ  Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１〜３１０９（１９８５）、Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３〜５５０９（１９８９））、及び同様物が挙げられる。ｐＧＥＸベクターを使用して、外来ポリペプチドを、グルタチオン５−転移酵素（ＧＳＴ）を有する融合タンパク質として発現させることもできる。一般的に、このような融合タンパク質は可溶性であり、かつ細胞溶解液から、グルタチオンアガロースビーズに吸着及び結合させた後、遊離グルタチオンの存在下で溶出させることで、容易に精製できる。ｐＧＥＸベクターは、クローン化した標的遺伝子産物をＧＳＴ部分から放出できるよう、トロンビン、すなわち第Ｘａ因子認識部位を含有させて設計されている。
【０１５９】
昆虫系では、外来遺伝子を発現するベクターとして、オートグラファカリフォルニア核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を使用できる。このウイルスは、スポドプテラ・フルギペルダ細胞内で増殖する。コード配列を、それぞれウイルスの非必須領域（例えば、ポリへドリン遺伝子）にクローン化し、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリへドリンプロモーター）の制御下に配置することもできる。
【０１６０】
哺乳動物の宿主細胞では、数多くのウイルス性発現系を使用して、所望のヌクレオチド配列を導入することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、対象とするコード配列を、アデノウイルスの転写／翻訳調節複合体、例えば、後期プロモーター及び三分子リーダー配列（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  ｌｅａｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に連結させることもできる。このキメラ遺伝子は、次にｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ組み換え法によりアデノウイルスのゲノムに挿入することができる。挿入はウィルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１又はＥ３）に行うことで、生存能を有し、かつ感染させた宿主において分子を発現することのできる組み換えウイルスが得られる（例えば、Ｌｏｇａｎ  ａｎｄ  Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８  １：３５５〜３５９（１９８４）を参照されたい）。挿入したコード配列の効率的な翻訳には、特異的な開始シグナルも必要とされる場合がある。これらのシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列も挙げられる。更に、挿入物全体を確実に翻訳させるためには、開始コドンは、所望のコード配列読み枠に合わせて設計すべきである。これらの外来性翻訳調節シグナル及び開始コドンは、天然の遺伝子及び合成遺伝子のいずれにおいても多様な開始点となり得る。適切な転写エンハンサ配列、及び転写終結配列などを包含させることで発現効率は増加する（例えば、Ｂｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１〜５４４（１９８７）を参照されたい）。したがって、発現の際に宿主細胞として利用可能な、適した哺乳動物細胞株が当該技術分野において周知であり、及びアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が包含される。これらの細胞株としては、特に、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、２９３  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、アフリカミドリザル細胞腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝がん細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞、及び数多くの他の細胞株が挙げられる。
【０１６１】
組み換えタンパク質を、長期にわたって高収率で産生させるためには、発現が安定していることが好ましい。したがって、選別されたモジュレータを安定的に発現する細胞株を、当業界で認知されている標準的な手法を用い設計することもできる。ウイルス由来の複製起点を含有する発現ベクターを使用する以外には、宿主細胞は、適切な発現制御配列（例えば、プロモーター配列、エンハンサ配列、ターミネーター、ポリアデニル化部位など）の制御下にあるＤＮＡ、及び選択マーカーにより形質転換することができる。遺伝子操作を行った細胞は、外来ＤＮＡの導入後、栄養培地で１〜２日増殖させ、次に選択培地に切り替えて培養することができる。組み換えプラスミドに含まれる選択マーカーは、細胞に選別耐性を付与し、及び細胞の染色体にプラスミドを安定的に組み込ませ、細胞増殖巣の形態に成長させる。この形態にすることで、続いてクローン化し、増殖させて細胞株にすることができる。この手法は、細胞株を遺伝子操作して対象とする分子を発現させるのに有利なものであり得る。このように遺伝子操作した細胞株は、直接的に又は間接的に分子に作用する組成物のスクリーニング及び評価時に特に有用であり得る。
【０１６２】
数多くの選別系が当該技術分野において周知であり、かつ使用することができ、例えば、限定するものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン・グアニンホスホリボシル転移酵素（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ａｎｄ  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：２０２（１９９２））、及びアデニンホスホリボシル転移酵素（Ｌｏｗｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２２：８  １７（１９８０））遺伝子をそれぞれ、ｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞又はａｐｒｔ細胞に使用することができる。同様に、次の遺伝子を選別する際の基礎として代謝拮抗物質耐性を使用することもできる：ｄｈｆｒ（メトトレキサート耐性を付与）（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５２７（１９８１））、ｇｐｔ（ミコフェノール酸耐性を付与）（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２（１９８１））、ｎｅｏ（アミノグリコシドＧ−４１８耐性を付与）（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８〜５０５；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７〜９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３〜５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６〜９３２（１９９３）；及びＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１〜２１７（１９９３）；ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２  １５（Ｍａｙ，１９９３））、及びｈｙｇｒｏ（ハイグロマイシン耐性を付与）（Ｓａｎｔｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ３０：１４７（１９８４））。所望の組み換えクローンを選択するために、当該技術分野で公知の組み換えＤＮＡ技術をルーチン的に用いることができ、このような手法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）、並びにＤｒａｃｏｐｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）第１２及び１３章、Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）に記載される。安定的であり高収率の細胞株を確立するための、特に好ましい手法には、特定の条件下での発現を増感させるための効果的なアプローチを提供する、グルタミン合成酵素の遺伝子発現系（ＧＳ系）が含まれることは理解されたい。それぞれ引用により本明細書に組み込まれる欧州特許第０  ２１６  ８４６号、同第０  ２５６  ０５５号、同第０  ３２３  ９９７号、��び同第０  ３３８  ８４１号に関連付けてその全体又は一部についてＧＳ系を議論する。
【０１６３】
更には、挿入した配列の発現調節、あるいは遺伝子産物の修飾及びプロセシングは、所望の特定の様式で選択することができる。このようなタンパク質の修飾（例えば、グリコシル化）及びプロセシング（例えば、開裂）は、タンパク質の機能及び／又は精製に重要なものである場合がある。異なる宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング並びにタンパク質修飾に関し特徴及び特異的な機構をもつ。当該技術分野で既知の通り、発現させたポリペプチドに対し所望の修飾及びプロセシングが確実に行われるよう細胞株又は宿主系を選択できる。この目的を達成するために、本発明において、一次転写産物の適切なプロセシング、グリコシル化、及び遺伝子産物のリン酸化に関する細胞機構を保有する真核細胞を、宿主細胞として使用することは特に効果的である。したがって、宿主に特に好ましい哺乳動物細胞としては、限定するものではないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＮＳ０、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８並びに乳がん細胞株、例えば、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２Ｏ及びＴ４７Ｄなど、及び正常な乳腺細胞株、例えば、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ及びＨｓＳ７８Ｂｓｔなどが挙げられる。当業者であれば、モジュレータ及び選択される産生系に応じて、モジュレータの効率的な発現に好適な宿主細胞を容易に選択及び最適化することができる。
【０１６４】
ｂ．化学合成
前述の宿主細胞系に加え、本発明のモジュレータは、当該技術分野において既知の手法を用い、化学合成することもできることは理解されるであろう（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．，ａｎｄ  Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：１０５〜１１１を参照されたい）。例えば、本発明のポリペプチド断片に相当するペプチドを、ペプチド合成器を使用して合成することができる。更に、必要に応じて、ポリペプチド配列には非古典的なアミノ酸又は化学的なアミノ酸類似体を、置換又は付加などにより導入することができる。非古典的アミノ酸としては、限定するものではないが、一般的なアミノ酸のＤ型異性体、２，４−ジアミノブタン酸、α−アミノイソ酪酸、４−アミノブタン酸、Ａｂｕ、２−アミノブタン酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フルオロアミノ酸、合成アミノ酸、例えば、β−メチルアミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸、及び一般的なアミノ酸誘導体などが挙げられる。更に、アミノ酸はＤ体（右旋性）又はＬ体（左旋体）であってよい。
【０１６５】
ｃ．遺伝子組み換え系
本発明のＣＤ４６モジュレータは、対象とする免疫グロブリン重鎖及び軽鎖配列（あるいはこれらの断片又は誘導体又は変異体）をもつよう遺伝子組み換えされた哺乳動物又は植物を生成し、所望の化合物を回復可能な形態で産生させる、遺伝子組み換え法により製造することもできる。哺乳動物による遺伝子組み換え体の産生との関連において、抗ＣＤ４６抗体は、例えば、ヤギ、雌牛、又は他の哺乳動物の乳中に産生させ、これらから回収することができる。例えば、米国特許第５，８２７，６９０号、同第５，７５６，６８７号、同第５，７５０，１７２号、及び同第５，７４１，９５７号を参照されたい。一部の実施形態では、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む遺伝子組み換え非ヒト動物を、上記の通りのＣＤ４６又はこれらの免疫原性の部分により免疫化する。植物を用いる抗体製造法は、例えば、米国特許第６，０４６，０３７号及び同第５，９５９，１７７号に記載される。
【０１６６】
本発明の教示に従う遺伝子組み換え非ヒト動物又は植物は、本発明のＣＤ４６モジュレータをコードしている１つ以上の核酸分子を、標準的な遺伝子組み換え法により、動物又は植物に導入することで製造することができる。Ｈｏｇａｎ及び米国特許第６，４１７，４２９号を参照されたい。遺伝子組み換え動物の作成に使用する遺伝子組み換え細胞は、胚性幹細胞又は体細胞又は受精卵であってよい。遺伝子組み換え非ヒト生物は、キメラ体、非キメラヘテロ接合体、及びキメラホモ接合体であってよい。例えば、Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）、並びにＰｉｎｋｅｒｔ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照されたい。一部の実施形態では、ヒト以外の遺伝子組み換え動物は、標的とする遺伝子の破壊、及び標的とするコンストラクト、例えば、対象とする重鎖及び／又は軽鎖をコードしているコンストラクトによる置き換えを有する。一実施形態では、遺伝子組み換え動物は、ＣＤ４６に特異的に結合する重鎖及び軽鎖をコードする核酸分子を含み、これを発現する。抗ＣＤ４６抗体は、任意の遺伝子組み換え動物を用い製造することができるが、特に好ましい実施形態では、ヒト以外の動物は、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ又はウマである。更なる実施形態では、遺伝子組み換え非ヒト動物は、所望の医薬成分を、血液、乳、尿、唾液、涙、粘膜、及び他の体液中に発現し、この成分は、当業界で認知されている精製法を用い、容易に得ることができる。
【０１６７】
異なる細胞株又は遺伝子組み換え動物により発現させた、抗体などのモジュレータは、互いに異なるグリコシル化パターンを有する傾向がある。しかしながら、本明細書で提供される核酸分子によりコードされる、又は提供されたアミノ酸配列を含むすべてのモジュレータは、分子のグリコシル化状態とは無関係に、及びより一般的には、翻訳後修飾の存在又は非存在とは無関係に、本発明に一部含まれる。これに加え、本発明は、翻訳中又は翻訳後に、異なる修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解、抗体分子又は他の細胞リガンドに対する連結などの修飾を受けたモジュレータを包含する。限定するものではないが、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼによる特異的な分解、ＮａＢＨ４アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシン存在下での代謝合成などの既知の手法を用い、任意の多数の化学修飾を実施することができる。本発明に包含される各種翻訳後修飾としては、例えば、Ｎ−結合型又はＯ−結合型糖鎖、Ｎ端末又はＣ末端のプロセシング、アミノ酸骨格への化学修飾基付加、Ｎ−結合型又はＯ−結合型糖鎖の化学修飾、及び原核宿主細胞で発現させたことによるＮ端末メチオニン残基の付加又は欠失も挙げられる。更に、本文及び以降の実施例に示される通り、ポリペプチドは、モジュレータの検出及び単離を可能にする、酵素標識、蛍光標識、放射標識又は親和性標識などの、検出可能な標識により修飾することもできる。
【０１６８】
ｄ．精製
本発明のモジュレータは、組み換え発現系又は本明細書で開示される任意の他の手法により製造したならば、免疫グロブリンの精製に関する当該技術分野で既知の任意の手法により、あるいはタンパク質の精製に関する、より一般的な任意の他の標準的な手法により、精製することができる。この点により、モジュレータは単離することができる。本明細書で使用するとき、単離されたＣＤ４６モジュレータは、自然な環境に含まれる成分から、同定、及び分離及び／又は回収されたものである。自然環境由来の夾雑物は、診断又は治療用途でポリペプチドを使用する際に干渉する場合があり、このような夾雑物としては、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性又は非タンパク質性の溶質が挙げられる。ポリペプチドの天然環境にまつわる少なくとも１つの成分が存在しないことから、単離したモジュレータには、組み換え細胞内部に元々存在するモジュレータも包含される。
【０１６９】
組み換え法を用いる場合、ＣＤ４６モジュレータ（例えば、抗ＣＤ４６抗体又はそれらの誘導体又は断片）は、細胞内で、又は細胞膜周辺腔で産生させることができ、あるいは直接培地に分泌させることができる。所望の分子が、第一工程としてまずは細胞内に産生される場合、宿主細胞又は可溶化断片のいずれかからなる粒子状の残骸を、例えば、遠心分離又は限外濾過により除去する。例えば、Ｃａｒｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：１６３（１９９２）は、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞膜周辺腔に分泌された抗体の単離法を記載する。簡潔に言えば、酢酸ナトリウム（ｐＨ  ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホン酸フルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で、約３０分かけて細胞ペーストを解凍する。細胞の残骸を遠心分離により除去することができる。抗体が培地に分泌される場合、一般的には、このような発現系から得た上清には、市販のタンパク質濃縮フィルタ（例えば、Ａｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニット）を用い第一濃縮を行う。タンパク質分解を阻害するために、前出の任意の工程にＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を含有させてもよく、かつ周囲環境から混入した微生物の増殖を予防するために抗生物質を含有させてもよい。
【０１７０】
細胞から調製したモジュレータ（例えば、ｆｃ−ＣＤ４６又は抗ＣＤ４６抗体）組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び親和性クロマトグラフィーを用い精製することができ、なかでも親和性クロマトグラフィーは好ましい精製法である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの好ましさは、選別されたコンストラクト中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種類及びアイソタイプに応じて異なる。プロテインＡは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４の重鎖を基に抗体を精製するために、使用することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ６２：１（１９８３））。プロテインＧは、すべてのマウスアイソタイプ及びヒトＩｇＧ３に推奨される（Ｇｕｓｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  ５：１５６７（１９８６））。親和性リガンドを結合させるマトリックスはほとんどの場合アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。孔を調節したガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの、機械的に安定なマトリックスでは、アガロースと比べて流速を速くし、作業時間を短くすることができる。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、精製にはＢａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ；Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が有用である。回収する抗体に応じ、タンパク質精製用の他の手法、例えば、イオン交換カラムによる分留、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカゲルを用いるクロマトグラフィー、ヘパリンを用いるクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂を用いる（ポリアスパラギン酸縦列）セファロースクロマトグラフィー、等電点電気泳動法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫安沈殿も使用することができる。特に好ましい実施形態では、本発明のモジュレータは、プロテインＡ又はプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを用い少なくともある程度精製する。
【０１７１】
ＸＩ．ＣＤ４６モジュレータ複合体
本発明のモジュレータは、本開示の手法に従い精製したならば、医薬活性剤又は診断基又は生体適合性の修飾剤と、結合させる、融合させる、又は複合させる（例えば、共有結合的に又は非共有結合的に複合する）、又はこれらと会合させることもできる。本明細書で使用するとき、用語「複合する」は、広範に使用され、会合させる手法とは無関係に、本開示のモジュレータと会合する任意の分子を意味する。この点において、このような複合体には、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ポリマー、核酸分子、小分子、模倣剤、合成剤、無機分子、有機分子及び放射性同位体が含まれ得ることは理解されるであろう。更に、上記に示す通り、選別した複合体は、共有結合的又は非共有結合的にモジュレータと結合させることができ、複合体を作用させるのに使用する方法に少なくとも一部基づき、様々なモル比を示し得る。
【０１７２】
好ましい実施形態では、本発明のモジュレータは、選択された特性を付与する（例えば、生体毒素、バイオマーカー、及び精製タグなど）タンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドと複合体形成させることができ、又はこれらと会合させ得ることは明白である。より一般的には、本発明の選択的実施例は、異種タンパク質又はポリペプチドと組み換え法により融合させた、あるいは化学的に複合させた（共有結合的な複合及び非共有結合的な複合をいずれも包含する）モジュレータ又はこれらの断片の使用法を包含する。ここで、ポリペプチドは、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、又は少なくとも１００個のアミノ酸からなる。コンストラクトは必ずしも直接的に結合させる必要はなく、リンカー配列を介して結合させることもできる。例えば抗体の場合、特定の細胞表面受容体に対し特異性を有する抗体に本発明のモジュレータを融合又は複合体形成させることで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏのいずれにおいても、ＣＤ４６を発現している特定の細胞型にとっての異種ポリペプチドを標的とさせて、使用できる。これに加え、異種ポリペプチドと融合又は複合体形成させたモジュレータは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのイムノアッセイにも使用でき、かつ当該技術分野において既知の精製法とも適合性がある。例えば、国際公開第９３／２１２３２号、欧州特許第４３９，０９５号、Ｎａｒａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：９１〜９９、米国特許第５，４７４，９８１号、Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＰＮＡＳ  ８９：１４２８〜１４３２、及びＦｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６〜２４５２を参照されたい。
【０１７３】
ａ．生体適合性修飾剤
好ましい実施形態では、本発明のモジュレータは、所望される通りにモジュレータ特性を調節、変更、改良又は緩和させるために使用できる生体適合性の修飾因子と複合することができ、あるいはこれと会合させることができる。例えば、市販のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又は同様の生体適合性のポリマーなどの比較的高分子量のポリマー分子を結合させることで、抗体又は融合コンストラクトの、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を延長させることができる。当業者であれば、ＰＥＧは、多くの異なる分子量及び分子組成で得ることができ、これらは抗体に対し特定の特性を付与するよう（例えば、半減期を調整するなど）選択できることを理解するであろう。多官能性リンカーを用い、又はこれを用いずに、ＰＥＧを抗体又は抗体断片のＮ−又はＣ末端と部位特異的に複合体形成させることにより、あるいはリシン残基上に存在するε−アミノ基を介し複合体形成させることにより、ＰＥＧをモジュレータ又は抗体断片又は誘導体に取り付けることができる。生物活性の低下を最小限に抑える直鎖又は分枝鎖ポリマー誘導体化を使用することもできる。抗体分子がＰＥＧ分子により最適に修飾されていることを確認するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分析法により、結合の程度を厳密にモニターすることができる。未反応のＰＥＧは、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーを用いＰＥＧ化抗体から分離することができる。同様の方法で、本開示のモジュレータは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて抗体又は抗体断片がより安定的になるよう、あるいはこれらのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期が延長されるよう、アルブミンと複合させることもできる。この手法は当該技術分野において周知のものであり、例えば、国際公開第９３／１５１９９号、同第９３／１５２００号、及び同第０１／７７１３７号、及び欧州特許第０４１３，６２２号を参照されたい。当業者には他の生体適合性の結合分子も明白であり、このような結合分子は本開示の技術に従って容易に決定することができる。
【０１７４】
ｂ．診断薬又は検出薬
他の好ましい実施形態では、本発明のモジュレータ、又はそれらの断片、又は誘導体は、生物由来の分子（例えば、ペプチド又はヌクレオチド）、あるいは小分子又は放射性同位体などの診断薬又は検出薬と結合させる。このようなモジュレータは、異常増殖性疾患の発達又は進行を監視するのに、あるいは臨床試験手順の一貫として本開示のモジュレータを含む具体的な治療の有効性を評価するのに有用なものであり得る。このようなマーカーは、選別したモジュレータの精製、ＴＩＣの分離若しくは単離、又は前臨床試験若しくは毒性試験においても有用であり得る。
【０１７５】
このような診断及び検出は、検出可能な物質、例えば、限定するものではないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼなどの各種酵素、限定するものではないがストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンなどの補欠分子族、限定するものではないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙｎａｔｅ）、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌａｍｉｎｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ダンシルクロシド又はフィリコエリトリンなどの蛍光物質、限定するものではないが、ルミノールなどのなどの発光物質、限定するものではないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクロリンなどの生物発光物質、限定するものではないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、及びテクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、及び１１７Ｔｉｎなどの放射活性物質、陽電子放出金属（各種陽電子放出断層撮影を用いる）、非放射活性常磁性金属イオン、及び放射性標識した又は特定の放射性同位体分子と複合させた分子、などの検出可能な物をモジュレータを結合させることで実施できる。このような実施形態では、適切な検出手法が当業者に周知であり、かつ多様な市販元から容易に調達できる。
【０１７６】
これまでに示した通り、他の実施形態では、モジュレータ又はそれらの断片には、精製、又は免疫組織化学若しくはＦＡＣなどの診断手法を手助けするために、ペプチド又はフルオロフォアなどのマーカー配列を融合させることができる。好ましい実施形態では、マーカーのアミノ酸配列は、多く市販されているものの中から特にｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）で提供されるタグなどといった、ヘキサヒスチジンペプチドである。Ｇｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２１〜８２４に記載の通り、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の一般的な精製法に用いられる。精製に有用な他のペプチドタグとしては、限定するものではないが、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに相当する、赤血球凝集素「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３７：７６７）、及び「フラグ」タグ（米国特許第４，７０３，００４号）が挙げられる。
【０１７７】
ｃ．治療用部分
これまでに言及した通り、モジュレータ又はこれらの断片又は誘導体は、細胞毒又は細胞傷害性薬物（例えば細胞分裂阻害剤又は細胞破壊剤）、治療薬、あるいは放射活性金属イオン（例えば、α又はβ−放射体などの治療用部分）と複合、結合又は融合させるか、ないしは別の方法で会合させることもできる。本明細書で使用するとき、細胞毒又は細胞毒性剤には、任意の剤又は治療用部分、すなわち細胞にとって有害であり、細胞の増殖又は生存を阻害し得る部分が包含される。例としては、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラチン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｎｔｈｒａｃｉｎ）、ＤＭ−１及びＤＭ−４（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）などのマイタンシノイド、ジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、エピルビシン、及びシクロホスファミド及び誘導体、あるいはこれらの相同体が挙げられる。その他の細胞毒としては、アウリスタチン、例えば、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）及びモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、アマニチン、例えば、α−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン又はε−アマニチン（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＧ）、ＤＮＡ副溝結合剤、例えば、デュオカルマイシン誘導体（Ｓｙｎｔａｒｇａ，Ｂ．Ｖ．）及び修飾ピロロベンゾジアゼピン二量体（ＰＢＤｓ，Ｓｐｉｒｏｇｅｎ，Ｌｔｄ）などが挙げられる。更に、一実施例では、本発明のＣＤ４６モジュレータを抗ＣＤ３結合分子と会合させて、細胞毒性Ｔ細胞を補充させ、それらにがん起始細胞を標的とさせることもできる（ＢｉＴＥ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；例えば、引用により本明細書に組み込まれるＦｕｈｒｍａｎｎ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ＡＡＣＲ  Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．５６２５（２０１０）を参照されたい）。
【０１７８】
その他の準拠する治療用部分には、細胞毒性剤、例えば、限定するものではないが、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、次ブロもマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシスジクロロチアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビチン（旧称ダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧称アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン（ＡＭＣ））、及び抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）が挙げられる。治療用部分のより広範なリストは、国際公開第０３／０７５９５７号、及び米国特許出願公開第２００９／０１５５２５５号に見出すことができる。これらの各々は参照により本案件に組み込まれる。
【０１７９】
選別したモジュレータは、放射性物質又は放射性金属イオンと複合させるのに有用なマクロ環状キレート剤などの治療用部分と複合体形成させることもできる（放射性物質の例については上記を参照されたい）。特定の実施形態では、マクロ環状キレート剤は、リンカー分子により抗体と結合させることのできる１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−四酢酸（ＤＯＴＡ）である。このようなリンカー分子は、当該技術分野で公知であり、Ｄｅｎａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４：２４８３、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．１０：５５３、及びＺｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２６：９４３に記載されている。
【０１８０】
本発明の態様に準拠し得る例示的な放射性同位体としては、限定するものではないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、銅（６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、ビスマス（２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ）、テクネシウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２  Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、１１７Ｔｉｎ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒ、及び２１１Ａｔが挙げられる。他の放射性核種も、診断薬及び治療薬として利用することができ、特にエネルギー範囲が６０〜４，０００ｋｅＶの核種を利用することができる。当業者であれば、治療される状態、及び所望される治療特性に応じ、本開示のモジュレータと併用するのに適切な放射性同位体を容易に選択することができるであろう。
【０１８１】
本発明のＣＤ４６モジュレータは、所定の生体応答を修飾する治療的な部分又は薬剤と結合させることもできる。すなわち、本発明に準拠する治療薬又は部分は、古典的な化学治療薬に制限されないものであると解釈される。例えば、特に好ましい実施形態では、この薬剤部分は、所望の生物活性を保有しているタンパク質又はポリペプチド又はこれらの断片であり得る。例えば、このようなタンパク質としては、アブリン、リシンＡ、オンコナーゼ（又は他の細胞毒性ＲＮａｓｅ）、シュードモナス外毒素、コレラ毒素、又はジフテリア毒素などの毒素、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス剤、例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ  Ｉ（国際公開第９７／３３８９９号を参照されたい）、ＡＩＭ  ＩＩ（国際公開第９７／３４９１１号を参照されたい）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：１５６７）、及びＶＥＧＩ（国際公開第９９／２３１０５号を参照されたい）、血栓剤（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）又は抗血管新生薬、例えば、アンジオスタチン又はエンドスタチンなどのタンパク質、あるいは、例えば、リンホカイン（例えば、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、及び顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」））、又は増殖因子（例えば、成長ホルモン（「ＧＨ」））などの生体応答修飾物質が挙げられる。上記に述べた通り、モジュレータをポリペプチド部分と融合させるあるいは複合させる手法は、当該技術分野において既知である。これまでに開示した件名参照に加えて、例えば、米国特許第５，３３６，６０３号、同第５，６２２，９２９号、同第５，３５９，０４６号、同第５，３４９，０５３号、同第５，４４７，８５１号、及び同第５，１１２，９４６号、欧州特許第３０７，４３４号、同第３６７，１６６号、国際公開第９６／０４３８８号及び同第９１／０６５７０号、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：１０５３５、Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５４：５５９０、及びＶｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９：１１３３７を参照されたい。これらの各々は引用により本案件に組み込まれる。必ずしもモジュレータと部分とを直接的に会合させる必要はなく、リンカー配列を介して会合させてもよい。このようなリンカー分子は、当該技術分野で既知であり、Ｄｅｎａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４：２４８３、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １０：５５３、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  ２６：９４３、Ｇａｒｎｅｔｔ，２００２，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ５３：１７１に記載されている。これらの文献の各々が本明細書に組み込まれる。
【０１８２】
治療的な部分又は細胞毒性剤をモジュレータと複合させる、より一般的な手法は、当該技術分野で周知である。このような部分は、限定するものではないが、アルデヒド／シッフ結合、スルフヒドリル結合、酸不安定性の結合、ｃｉｓ−アコチニル結合、ヒドラゾン結合、酵素により分解可能な結合などの、当該技術分野で認識されている任意の方法により、モジュレータと複合させることができる（概要についてはＧａｒｎｅｔｔ，２００２，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ５３：１７１を参照されたい）。同様に、例えば、Ａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ＡｎｄがんＴｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３〜５６  （Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」，ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  （２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．６２３〜５３  （Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）、Ｔｈｏｒｐｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ‘８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５〜５０６（１９８５）、「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．３０３〜１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）、並びにＴｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９を参照されたい。好ましい実施形態では、治療的な部分又は細胞毒性剤と複合させたＣＤ４６モジュレータは、細胞表面と会合したＣＤ４６分子と結合することで細胞に内部移行され、それにより治療上の負荷量が送達され得る。
【０１８３】
ＸＩＩ．診断及びスクリーニング
記載の通り、本発明は、異常増殖性疾患の検出又は診断、並びにがん起始細胞の識別を目的とした、患者由来の細胞のスクリーニング法を提供する。このような手法には、治療に際し、がん患者を識別する工程、又はがんの進行を監視する工程が包含され、これらの工程には、患者から得た試料を、本明細書に記載されるようなＣＤ４６モジュレータと接触させ、試料中のＣＤ４６と結合した又は未結合のモジュレータの存在又は非存在を検出すること、あるいは、モジュレータがＣＤ４６と会合している程度について検出することが含まれる。モジュレータが、抗体又はそれらの免疫学的に活性な断片を含むものである場合、このモジュレータは試料中のＣＤ４６と会合し、その試料が腫瘍永続化細胞（例えば、がん幹細胞）を含有している可能性と、そのがん患者が本明細書に記載される通りのＣＤ４６モジュレータにより効果的に治療され得ることを示す。この手法は、更に、結合強度を対照と比較する工程を含んでもよい。反対に、選択したモジュレータがＦｃ−ＣＤ４６である場合、このモジュレータを試料と接触させて、本明細書に記載される通りの、分子の酵素特性を（直接的に又は間接的に）監視し、所望の情報を得ることができる。本明細書における教示に準拠する他の診断法は当該技術分野において周知であり、市販品（例えば、専用の検出系など）を用い、実施することができる。
【０１８４】
準拠する例示的なアッセイ法としては、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、競合結合試験、蛍光免疫測定法、免疫ブロット測定法、ウェスタンブロット解析、フローサイトメトリー解析、及びＥＬＩＳＡ解析が挙げられる。より一般的には、生体サンプル中のＣＤ４６の検出又はＣＤ４６酵素活性（すなわちこれらの阻害活性）の測定は、当該技術分野で既知の任意の測定法を用い実施することができる。
【０１８５】
他の態様では、及び以降により詳細に議論される通り、本発明は、異常増殖性疾患患者の疾患が、処置可能なものであるか、あるいはその進行（又は退縮）が監視可能であるかを識別する、異常増殖性疾患の検出、監視、又は診断用キットを提供し、キットは、本明細書に記載される通りのモジュレータと、試料に対するモジュレータの作用を検出するための試薬と、を含む。
【０１８６】
また、ＣＤ４６モジュレータと、細胞、細胞培養物、細胞集団、並びに同様にこれらの子孫細胞を含む細胞組成物とを使用して、ＣＤ４６（例えば、これらのポリペプチド又は遺伝子産物）と相互作用しこれらのがん起始細胞又は子孫細胞の機能又は活性に作用する化合物又は剤（例えば、薬剤）を選別又は同定することができる。したがって、本発明は更に、ＣＤ４６又はその基質と会合することで、がん起始細胞又はそれらの子孫細胞の機能又は活性に作用し得る、化合物又は剤を、評価又は同定する系及び方法を提供する。このような化合物及び剤は、例えば、異常増殖性疾患の治療用にスクリーニングされた治療薬候補であり得る。一実施形態では、系又は方法には、ＣＤ４６を示すがん起始細胞と、化合物又は剤（例えば、薬剤）とを含み、系又は方法では、細胞と、化合物又は剤（例えば、薬剤）とを互いに接触させる。
【０１８７】
本発明は、更に、がん起始細胞又は子孫細胞の活性又は機能を修飾させるＣＤ４６モジュレータ又は剤及び化合物の、スクリーニング法及び同定法を提供する。一実施形態では、方法は、がん起始細胞又はそれらの子孫細胞を試験薬又は化合物と接触させる工程と、試験薬又は化合物がＣＤ４６ｈｉがん起始細胞の活性又は機能を修飾し得るか判定する工程と、を含む。
【０１８８】
試験薬又は試験化合物が、集団内のがん起始細胞又はそれらの子孫細胞の、ＣＤ４６に関連する活性又は機能を修飾する場合、この試験薬又は化合物を活性な薬剤として同定する。修飾され得る代表的な活性又は機能としては、細胞形態の変化、マーカーの発現、分化又は脱分化、成熟、増殖、生存能、アポトーシス又は神経前駆細胞又はこれらの子孫細胞の細胞死が挙げられる。
【０１８９】
細胞又は細胞培養物、あるいは方法又は治療に関し使用する場合、「接触させる」は、組成物（例えば、ＣＤ４６ｈｉ細胞又は細胞培養物）と、文脈において引き合いに出した対象物との、直接的な又は間接的な相互作用を意味する。直接的な相互作用の具体例としては、物理的相互作用が挙げられる。間接的な相互作用の具体例としては、組成物が中間分子に作用し、これが次に、文脈上の対象物（例えば、細胞又は細胞培養物）に対し作用する場合が挙げられる。
【０１９０】
本発明のモジュレータは、この態様において、本発明のがん起始細胞又は子孫細胞の特定の態様（例えば、転移又は増殖）に相関するものとして判定された細胞の、活性又は機能に対する効果を検出するのに適した方式で、がん起始細胞又は子孫細胞の活性又は機能に対する作用を検出する。例示的な活性及び機能としては、限定するものではないが、形態的測定、発生マーカー、分化、増殖、生存能、細胞呼吸、ミトコンドリア活性、膜統合性、又は特定の状態と関係付けられる発現マーカーなどが挙げられる。したがって、がん起始細胞又は子孫細胞を化合物又は剤と接触させ、並びにがん起始細胞又は子孫細胞の活性又は機能に関する任意の修飾を、本明細書で開示される通りに測定することで、あるいは当業者に既知である手法で測定することで、化合物又は剤（例えば、治療薬候補）を、がん起始細胞又は子孫細胞に対する効果に関し評価することができる。
【０１９１】
剤及び化合物のスクリーニング法及び同定法としては、ハイスループットスクリーニングに好適なものが挙げられ、例えば、所望により所定の位置又はアドレスに置いた、すなわち配置した細胞アレイ（例えば、マイクロアレイ）が含まれる。ハイスループットな、ロボット又は人間による取扱法により、短時間の間に、化学的な相互作用を探索し、かつ多くの遺伝子の発現レベルを測定することができる。分子シグナル（例えば、フルオロフォア）と、情報を非常に高速で処理する自動解析法とを使用する技術が開発されてきた（例えば、Ｐｉｎｈａｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ．７：１３３（２００４）を参照されたい）。例えば、一度に数千の遺伝子の相互作用を探索するために、マイクロアレイ法が大規模に用いられ、これに対し特定の遺伝子に関する情報が提供されてきた（例えば、Ｍｏｃｅｌｌｉｎ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓｉ、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．５９３：１９（２００７）を参照されたい）。
【０１９２】
このようなスクリーニング法（例えば、ハイスループット）により、活性な剤及び化合物を迅速にかつ効果的に同定することができる。例えば、細胞は、培養皿、チューブ、フラスコ、ローラーボトル又はプレート（例えば８、１６、３２、６４、９６、３８４及び１５３６ウェルプレート又はディッシュなどの、単一の複数ウェルプレート又はディッシュ）に置くこと又は配置（前接種）することができ、所望により、可能性のある治療化合物を同定する目的で、予め位置を規定しておくことができる。例えば、スクリーニングすることのできるライブラリとしては、小分子ライブラリ、ファージ・ディスプレイライブラリ、完全ヒト抗体酵母ディスプレイライブラリ（Ａｄｉｍａｂ，ＬＬＣ）、ｓｉＲＮＡライブラリ、及びアデノウイルス製の形質導入ベクターが挙げられる。
【０１９３】
ＸＩＩＩ．医薬品及び治療用途
ａ．処方及び投与経路
任意の所望の複合物形態を取るモジュレータの形態、意図する送達形態、治療又は監視する疾患、及び数多くの他の可変要素に応じ、本発明の組成物は、当業界で認知されている手法を用い所望の通りに配合することができる。すなわち、ＣＤ４６モジュレータを含む本発明の組成物の、各種実施形態は、製薬上許容可能な多様な担体と共に処方される（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ｗｉｔｈ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ：Ｄｒｕｇｆａｃｔｓ  Ｐｌｕｓ，２０ｔｈ  ｅｄ．（２００３）、Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，７ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００４）、Ｋｉｂｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）を参照されたい）。賦形剤、アジュバント、及び希釈剤などの各種製薬上許容可能な担体は、数多くの市販元から容易に利用できる。更に、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、浸透圧調節剤、安定剤、及び湿潤剤などの、製薬上許容可能な種別の補助剤も利用することができる。特定の非限定例的な担体としては、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びこれらの混合物が挙げられる。
【０１９４】
より詳細には、一部の実施形態では、本発明の治療用組成物は未希釈の状態で、あるいは最小限の追加成分と共に投与できることが理解されるであろう。反対に、本発明のＣＤ４６モジュレータは、所望により、モジュレータの投与を容易にする、あるいは活性化合物を、作用部位への送達に関し製薬的に最適化された製剤に加工する助けとなる、当該技術分野において周知でありかつ比較的不活性な物質である、賦形剤及び補助剤などの製薬上許容可能な適切な担体を含有させて、配合することができる。例えば、賦形剤は、剤形若しくは堅牢性を与え、すなわちモジュレータの薬物動態を改善させる希釈剤として作用する。好適な賦形剤としては、限定するものではないが、安定化剤、湿潤剤及び乳化剤、オスモル濃度を変化させる塩、封入剤、緩衝剤、及び皮膚浸透性向上剤が挙げられる。
【０１９５】
全身投与用に開示するモジュレータは、経腸投与、非経口投与、又は局所投与用に配合することができる。これに加え、３種のすべての処方を同時に使用して、有効成分の全身投与を実施することもできる。非経口及び経口薬物送達用の賦形剤並びに処方については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２０ｔｈ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）に記載される。非経口投与に好適な処方としては、水溶性形態の、例えば水溶性塩の形態の活性化合物の、水溶液が挙げられる。これに加え、油性の注入用懸濁物に適切なものなどといった、活性化合物の懸濁物も投与することができる。好適な親油性溶媒又は賦形剤としては、脂肪油、例えば、ゴマ油、又は合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチル又はトリグリセリドが挙げられる。水性注入懸濁物には、懸濁液の粘度を上昇させる、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、及び／又はデキストランなどの物質を含有させることもできる。所望により、懸濁液には安定化剤を含有させてもよい。リポソームを使用して、細胞への送達用に剤を封入することもできる。
【０１９６】
経腸投与に好適な処方としては、硬質又は軟質ゼラチンカプセル、丸剤、錠剤（例えば、コーティング錠）、エリキシル剤、懸濁液、シロップ又は吸入剤、及びこれらの徐放性製剤剤が挙げられる。
【０１９７】
概して、ＣＤ４６モジュレータを含む本発明の化合物及び組成物は、これらの化合物及び組成物を必要としている患者に、各種経路により、例えば、限定するものではないが、経口、静脈内、動脈内、皮下、非経口、鼻腔内、筋肉内、心臓内、脳室内、気管内、頬側、直腸内、腹腔内、皮内、局所、経皮、及び髄腔内により、あるいは注入又は吸入によりｉｎ  ｖｉｖｏ投与することができる。対象とする組成物は、限定するものではないが、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、溶液、座薬、浣腸、注射薬、吸入薬、及び噴霧剤などといった、固体、半固体、液体、又は気体形態で処方することができる。適切な処方及び投与経路は、意図する適用法及び治療レジメンに従って選択することができる。
【０１９８】
ｂ．投与量
同様にして、特定の投与レジメン、すなわち、投与量、時期、及び反復頻度は、具体的な患者及び患者の治療歴によって異なる。半減期などの経験的考察は、一般的に、投与量の決定に寄与する。投与頻度は、治療過程にわたって決定し、調節することができ、がん起始細胞などの異常増殖性細胞又は腫瘍性細胞数の抑制、このような腫瘍性細胞の抑制維持、腫瘍性細胞の増殖抑制、又は転移がんの発達の遅延などに基づく。あるいは、対象とする治療用組成物が徐放性製剤であることが適切な場合もある。これまでに示唆した通り、徐放性を得るための各種処方及びデバイスが当該技術分野において既知である。
【０１９９】
治療上の観点から、製薬組成物は、具体的な効能に関する治療有効量又は予防有効量で投与する。治療有効量は、通常、治療する患者の体重、患者の生理的状態又は健康状態、治療する病状、あるいは治療する患者の年齢に応じて異なる。一般的に、本発明のＣＤ４６モジュレータは、１回の投与につき、体重１ｋｇあたり約１０μｇ〜約１００ｍｇの範囲で投与することができる。特定の実施形態では、本発明のＣＤ４６モジュレータは、１回の投与につき、体重１ｋｇあたり約５０μｇ〜約５ｍｇの範囲で投与することができる。特定の実施形態では、本発明のＣＤ４６モジュレータは、１回の投与につき、体重１ｋｇあたり約１００μｇ〜約１０ｍｇの範囲で投与することができる。所望により、本発明のＣＤ４６モジュレータは、１回の投与につき、体重１ｋｇあたり約１００μｇ〜約２０ｍｇの範囲で投与することができる。更に、所望により、本発明のＣＤ４６モジュレータは、１回の投与につき、体重１ｋｇあたり約０．５ｍｇ〜約２０ｍｇの範囲で投与することができる。特定の実施形態では、本発明の化合物の投与量は、体重１ｋｇあたり少なくとも約１００μｇ、少なくとも約２５０μｇ、少なくとも約７５０μｇ、少なくとも約３ｍｇ、少なくとも約５ｍｇ、少なくとも約１０ｍｇである。
【０２００】
他の投与レジメンは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，７４４，８７７号に記載の通りの体表面積（ＢＳＡ）算出法に基づくものである。当該技術分野で周知の通りに、ＢＳＡは患者の身長及び体重を用い算出される値であり、患者の体表面積により患者の大きさを表す尺度を提供する。ＢＳＡを用いる本発明の代表的な実施形態では、モジュレータの投与量は１０ｍｇ／ｍ２〜８００ｍｇ／ｍ２であり得る。他の好ましい実施例では、モジュレータの投与量は、５０ｍｇ／ｍ２〜５００ｍｇ／ｍ２、及び更により好ましくは１００ｍｇ／ｍ２、１５０ｍｇ／ｍ２、２００ｍｇ／ｍ２、２５０ｍｇ／ｍ２、３００ｍｇ／ｍ２、３５０ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ／ｍ２又は４５０ｍｇ／ｍ２であり得る。当然のことながら、投与量の算出法とは無関係に、選択した時間間隔で複数種の投与量を投与し、その個別の投与量を大幅に上回る完全な投与量を得ることもできる。
【０２０１】
いずれの治療においても、ＣＤ４６モジュレータは、モジュレータを必要としている患者に対し、必要とされている通りに好ましく投与する。投与頻度の決定は、主治医などの当業者により、治療する状態についての考察、治療する対象者の年齢、治療する状態の重症度、及び治療する対象者の全身の健康状態などに基づき行うことができる。一般的には、有効量のＣＤ４６モジュレータを、対象者に対し１回以上投与する。より具体的には、有効量のモジュレータを、患者に対し１ヶ月に１回、１ヶ月以上で１回、又は１か月以内に１回投与する。特定の実施形態では、有効量のＣＤ４６モジュレータを、少なくとも１ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、又は少なくとも１年間に複数回投与することができる。
【０２０２】
それまでに１回以上の投薬を受けた各患者に対し、本開示の治療用組成物の投与量及びレジメンを経験的に決定することもできる。例えば、一部の患者では、本開示に記載の通りに製造した治療用組成物の投与量を増量することもできる。選択した組成物の有効性を評価するために、特定の疾患、障害、又は状態に関するマーカーを経過観察することもできる。患者ががんを有する場合の実施形態では、経過観察には、触診又は目視観察による腫瘍の大きさの直接的な測定、Ｘ線又は他のイメージング技術による、腫瘍の大きさの間接的な測定、直接腫瘍細胞を採取し（生検）、腫瘍試料を顕微鏡観察により評価した場合の改善度、本明細書に記載の方法に従い識別された、間接腫瘍マーカー（例えば、前立腺がんであればＰＳＡ）又は抗原の測定、疼痛又は麻痺の抑制、発声、視覚、呼吸又は他の腫瘍に関連する身体障害の改善、食欲改善、あるいは認定試験により測定されるものとしての生活の質の改善又は寿命延長が含まれる。投与量は、個々の患者、新生物の種類、新生物の段階、新生物が患者体内の他の位置に転移しているか否か、並びにそれまでに治療が行われたか及び現在治療が行われているかに応じ変化することは、当業者には明らかであろう。
【０２０３】
ｃ．併用療法
本発明により想到される併用療法は、望ましくない腫瘍細胞の増殖の抑制又は阻害（例えば、内皮細胞）、がん発生の抑制、がんの再発の抑制又は予防、あるいはがんの広がり又は転移の抑制又は予防に特に有用であり得る。このような場合、本発明の化合物は、腫瘍塊（例えば、ＮＴＧ細胞）を支え、永続化させるＴＰＣを除去し、感作剤又は化学的感作剤として機能し得るため、現行の標準的な腫瘍減量剤（ｃａｒｅ  ｄｅｂｕｌｋｉｎｇ）又は抗がん剤をより効果的に使用できるようになる。すなわち、ＣＤ４６モジュレータ及び１種以上の抗がん剤を含む併用療法を使用することで、既にある程度成長しているがんを減少させることもでき、例えば、存在しているがん細胞数を減少させること、及び／又は腫瘍量を減少させること、あるいは少なくとも１つの症状又はがん副作用を寛解させることができる。このような場合、併用療法とは、ＣＤ４６モジュレータ及び１種以上の抗がん剤の投与を指し、抗がん剤の例としては、限定するものではないが、細胞毒性剤、細胞増殖阻害剤、化学療法剤、分子標的薬、生体応答修飾物質、免疫療法剤、がんワクチン、抗血管新生薬、サイトカイン、ホルモン療法剤、放射線療法剤及び抗転移剤が挙げられる。
【０２０４】
本発明の方法によると、併用療法の結果が、各治療（例えば、抗ＣＤ４６抗体による治療及び抗がん剤による治療）を別々に実施した場合に観察される効果を相加したものである必要はない。少なくとも相加効果を示すことが一般的に所望されるものの、何らかの抗腫瘍効果が、単独の治療で得られる効果よりも大きくなることは有益である。更に、本発明では、併用した治療法が相乗効果を示す必要はない。しかしながら、当業者であれば、好ましい実施形態を含む、選択された何らかの併用療法により、相乗作用が観察され得ることを理解するであろう。
【０２０５】
本発明に従って併用療法を実施するために、ＣＤ４６モジュレータ（例えば、抗ＣＤ４６抗体）を、１種以上の抗がん剤と組み合わせて、抗がん剤活性の結果を得るのに効果的な方法で、これらの剤を必要としている対象者に投与することができる。ＣＤ４６モジュレータ及び抗がん剤は、有効量で、結果を得るのに有効な期間にわたって存在させることで、結果として、所望の通りの腫瘍環境において、組み合わせられた状態で存在することになり、かつその作用の組み合わせが生じる。この目的を実現するために、ＣＤ４６モジュレータ及び抗がん剤を、同一の又は異なる投与経路を用い、１つの組成物として、又は２種以上の異なる組成物としてのいずれかで、同時に対象者に投与することができる。
【０２０６】
あるいは、モジュレータは、抗がん剤投与の前又は後に、例えば分単位から週単位の間隔で投与することができる。特定の実施形態では、抗がん剤及び抗体は別々に対象者に適用される。各送達間の時間間隔は、抗がん剤とモジュレータとが腫瘍に対し併用効果を発揮し得るようなものである。特定の実施形態では、抗がん剤とＣＤ４６モジュレータのそれぞれを、約５分以内の間隔〜約２週間の間隔で投与することが想到される。
【０２０７】
更に他の実施形態では、モジュレータ投与と抗がん剤投与との間は、数日間（２、３、４、５、６又は７日間）、数週間（１、２、３、４、５、６、７又は８週間）又は数ヶ月（１、２、３、４、５、６、７又は８ヶ月）空けることができる。ＣＤ４６モジュレータと１種以上の抗がん剤（併用療法）とは、１度、２度、あるいは少なくとも状態が治療、軽減又は治癒するまで投与することができる。好ましくは、併用療法剤は複数回投与する。併用療法剤は１日３回〜６ヶ月に１回投与することができる。投与は、１日３回、１日２回、１日１回、２日に１回、３日Ｃ回、１週間に１回、２週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、６ヶ月に１回などのスケジュールで行うことができ、あるいはミニポンプにより持続投与することもできる。これまでに示した通り、併用療法剤は、経口、粘膜、頬側、経鼻、吸入、静脈内、皮下、筋肉内、非経口、腫瘍内又は局所経路で投与することができる。併用療法剤は、腫瘍部位から離れた部位に投与することもできる。一般的に、併用療法剤が、腫瘍又はがんの増殖を停止させるものである場合、又は重量又は体積を減少させるものである場合、併用療法剤は、腫瘍が存在する間に投与するものである。
【０２０８】
一実施例では、がん治療を目的として、短期治療サイクル間に、がん患者に対しＣＤ４６モジュレータを１種以上の抗がん剤と併用投与する。抗体による治療期間は、使用する具体的な抗がん剤に従って変更され得る。本発明は、非連続的な投与、すなわち日用量を複数回に分割しての投与も企図する。具体的な抗がん剤に関する適切な治療期間は当業者により認識される。本発明は、各抗がん剤に関する最適な治療スケジュールを持続的に評価することを企図するものである。
【０２０９】
本発明は、少なくとも１サイクル、好ましくは１回以上のサイクル中に、併用療法剤を投与することを企図する。各サイクルに適切な期間は、サイクルの合計数、及び各サイクル間の間隔などとして、当業者により認識される。本発明は、各モジュレータ及び抗がん剤に最適な治療スケジュールを持続的に評価することを企図する。更に、本発明はまた、抗ＣＤ４６抗体又は抗がん剤を１回位以上投与する。モジュレータ及び抗がん剤は、交互に何日かおきに、又は何週間かおきに投与することができ、あるいは抗体療法剤の順序は、抗がん剤による治療を１回以上行った後に得ることもできる。任意の治療において、当業者には理解されるように、化学療法剤の適切な投与量は、一般に、その化学療法剤が単独で投与される場合、又は他の化学療法剤と組み合わせて投与される場合に、臨床治療に既に採用されている量及びその周辺量となる。
【０２１０】
他の好ましい実施形態では、本発明のＣＤ４６モジュレータは、疾患の初期症状を受けて維持療法剤として使用して、腫瘍再発の可能性を抑制又は排除することができる。好ましくは、疾患を治療し、初期腫瘍塊を排除、抑制又は寛解させ、患者を無症状にし、又は寛解させる。このような場合、対象者には、疾患の徴候がわずかであるか又は全く存在しない場合にも、標準的な診断法を用いながら、治療有効量の本開示のエフェクタを１回以上投与することができる。一部の実施形態では、エフェクタは所定の期間にわたって定期的に投与する。例えば、ＣＤ４６モジュレータは、１週間、２週間毎、１ヶ月、６週間毎、２ヶ月毎、３ヶ月毎、６ヶ月毎、又は年に１回投与することができる。本開示の技術を考えた場合に、当業者であれば、疾患が再発する可能性を低下させるのに好ましい投与量及び投与レジメンを容易に決定できるであろう。更に、患者の反応、並びに臨床パラメータ及び診断パラメータに基づき、このような治療を、数週間、数ヶ月、数年又は更には無期限に持続することができる。
【０２１１】
更に他の好ましい実施形態では、本発明のエフェクタは、腫瘍の転移を防ぎ、又は腫瘍転移の可能性を減少させるために、腫瘍減量治療前に予防的に使用することができる。本開示で使用するとき、腫瘍減量法は、広範に定義されるものであり、腫瘍又は腫瘍増殖を排除、抑制、治療又は寛解させる任意の手順、技術又は方法を意味し得る。例示的な腫瘍減量法としては、限定するものではないが、外科手術、放射線治療（すなわち、ビーム照射療法）、化学療法又は焼灼が挙げられる。本開示の観点において、当業者により容易により決定された適切な時期にて、臨床的手法及び診断的手法により示される通りにＣＤ４６モジュレータを投与し、腫瘍の転移を抑制することができる。エフェクタは、標準的な手法を用い決定される通りの治療有効量で、１回以上投与することができる。好ましくは投与レジメンには、適切な診断又は監視法を包含させ、投与レジメンはこれらを基に必要に応じ改変することができる。
【０２１２】
ｄ．抗がん剤
本明細書で使用するとき、用語「抗がん剤」は、がんなどの細胞増殖障害を治療するために使用できる、細胞毒性剤、細胞増殖阻害剤、抗血管新生薬、腫瘍減量剤、化学療法剤、放射線療法及び放射線治療薬、標識化抗がん剤、生体応答修飾物質、抗体、及び免疫療法剤などの任意の剤を意味する。当然のことながら、これまでに示した通りに選択した実施形態では、抗がん剤には複合体を含んでよく、及び投与前にモジュレータと会合させてもよい。
【０２１３】
用語、「細胞毒性剤」は、細胞の機能を低下又は阻害する、及び／又は細胞の破壊を招く物質を意味し、すなわち、細胞に対して毒性を持つ物質を意味する。典型的には、この物質は、生体から得られる天然に生じる分子である。細胞毒性剤の例としては、限定するものではないが、バクテリアの小分子毒素又は酵素活性による毒素（例えば、ジフテリア毒素、シュードモナス内毒素及び外毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ）、真菌（例えば、α−サルシナ、レストリクトシン）、植物（例えば、アブリン、リシン、モデシン、ビスキュミン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルス性タンパク質、サポリン、ゲロニン、モモルジン、トリコサンチン、大麦毒素、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン（ｍｉｔｅｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシン、及びトリコテシン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅｓ））、又は動物、例えば、細胞外膵ＲＮａｓｅなどの細胞毒性ＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅ  Ｉ、並びにこれらの断片及び／又は変異体が挙げられる。
【０２１４】
化学療法剤は、がん細胞の成長、増殖、及び／又は生存を非特異的に低下又は阻害させる化合薬品（例えば、細胞毒性又は細胞増殖阻害剤）を意味する。多くの場合、このような化学薬品は、細胞の成長又は分裂に必要とされる細胞内過程を対象とするものであり、急速に成長及び分裂を行うがん性細胞に特に効果的である。例えば、ビンクリスチンは微小管を脱重合させ、細胞が分裂期に移行するのを阻害する。概して、化学療法剤は、がん性細胞、あるいはがん性を帯びる傾向のある細胞又は腫瘍原性子孫細胞（例えば、ＴＩＣ）を生成する傾向のある細胞を阻害する、又は阻害するよう設計された任意の化学薬品を含み得る。多くの場合、このような剤が投与され、かつ多くの場合、例えば、ＣＨＯＰ処方と併用した場合に非常に効果的である。
【０２１５】
本発明のモジュレータと併用（又は複合させて使用）し得る抗癌剤の例としては、限定するものではないが、アルキル化剤、アルキルスルホン酸塩、アジリジン、エチレンイミン及びメチルアミルアミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）、アセトゲニン、カンプトテシン、ブリオスタチン、カリルスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）、ＣＣ−１０６５、クリプトフィシン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エリュテロビン、パンクラチスタチン、サルコジクチン、スポンギスタチン、ナイトロジェンマスタード、抗生物質、エンジイン抗生物質、ジネミシン、ビスホスホネート、エスペラミシン、色素タンパク質、エンジイン抗生発色剤、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルシノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クェラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン、代謝拮抗薬、葉酸類似体、プリン類似体、アンドロゲン、抗アドレナール薬、葉酸補給剤、例えば、フォリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、アセグラトン、アルドホスファミドグルコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン、ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）、ビスアントレン、エダトレキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）、デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）、デメコルシン、ジアジクオン、エフロリニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、エリプチニウム酢酸塩、エポロチン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシ尿酸、レンチナン、ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）、メイタンシノイド、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）、ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）、ペントスタチン、フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、２−エチルヒドラジソ、プロカルバジン、ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、ラゾキサン、リゾキシン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム、テアヌゾン酸、トリアゾクオン、２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン、トリコテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラキュリンＡ（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ  Ａ）ロリジンＡ及びアングイジン）、ウレタン、ビインデシン、ダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ピポブロマン、ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）、アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、タキソイド、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｎｂｕｃｉｌ）���ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）ゲムシタビン、６−チオグアニン、メルカプトプリン、メトトレキサート、白金類似体、ビンブラスチン、白金、エトポシド（ＶＰ−１６）、イホスファミド、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）ビノレルビン、ノバントロン、テニポシド、エダレキサート、ダウノマイシン、アミノプテリン、ゼローダ、イバンドロネート、イリノテカン（カムプトスター（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、ＣＰＴ−１１）、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ  ２０００、ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）、レチノイド、カペシタビン、コンブレラスタチン、ロイコボリン（ＬＶ）、オキサプラチン、細胞増殖を減少させるＰＫＣ−α阻害剤、Ｒａｆ阻害剤、Ｈ−Ｒａｓ阻害剤ＥＧＦＲ阻害剤及びＶＥＧＦ−Ａ阻害剤、並びにこれらのものの製薬上許容出来る塩、酸、又は誘導体が挙げられる。同様に、この定義には、腫瘍に対するホルモンの作用を制御又は阻害するよう作用する、抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体調節薬（ＳＥＲＭ）、アロマターゼを阻害し、副腎でのエストロゲン産生を制御するアロマターゼ阻害薬、及び抗アンドロゲンなどの抗ホルモン剤、並びにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類縁体）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＶＥＧＦ発現阻害剤及びＨＥＲ２発現阻害剤などのリボザイム、ワクチン、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）Ｉトポイソメラーゼ阻害剤、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ、ビノレルビン及びエスペラミシン、並びにこれらの任意のものの製薬上許容され得る塩、酸又は誘導体も包含される。他の実施形態では、がん治療用に承認されている、限定するものではないが、リツキシマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブ・オゾガマイシン（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ  ｏｚｏｇａｍｃｉｎ）、アレムツズバブ、イブリツモマブ・チウキセタン、トシツモバブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ（ｐａｔｉｔｕｍｕｍａｂ）、オファツムバブ、イピリムバブ、及びブレンツキシマブベドチンなどの抗体を使用することもできる。当業者であれば、本開示の技術に準拠する、その他の抗がん剤を容易に認識し得るであろう。
【０２１６】
ｅ．放射線療法
本発明は、ＣＤ４６モジュレータと放射線療法（すなわち、ガンマ線照射、Ｘ線照射、ＵＶ−照射、マイクロ波照射、及び電子線照射などの、局所的に腫瘍細胞内でＤＮＡの損傷を引き起こす任意の機序）の併用法も提供する。放射性同位体を腫瘍細胞に標的特異的に送達することによる併用療法も企図され、かつ分子標的薬又は他の標的手法と併用することができる。典型的には、放射線治療は、約１週間〜約２週間にわたって行う。放射線治療は、頭部及び頸部がんに罹患している対象者に対し約６〜７週にわたって行うことができる。所望により、放射線治療は、１回又は順次複数回行うことができる。
【０２１７】
ｆ．腫瘍性状態
本発明のＣＤ４６モジュレータは、単独で投与した場合にも、あるいは抗がん剤若しくは放射線療法と併用した場合にも、患者又は対象者において、良性又は悪性腫瘍（例えば、腎、肝臓、腎臓、膀胱、乳房、胃、卵巣、結腸直腸、前立腺、膵臓、肺、甲状腺、肝細胞がん、肉腫、神経膠芽腫、及び各種頭部及び頸部腫瘍）、白血病及びリンパ性腫瘍、神経細胞、膠細胞、星状細胞、視床下部の及び他の腺性、マクロファージ性、上皮性、間質性及び胞胚腔性疾患などの他の疾患、並びに炎症性、血管原生、免疫性疾患及び病原菌により発症する疾患を包含し得る腫瘍性状態を治療するのに特に有用である。本発明の治療用組成物及び方法を用いる治療に際し、特に好ましい標的は、固体腫瘍を含む腫瘍性状態である。他の好ましい実施例では、本発明のモジュレータは、血液系腫瘍の診断、予防又は治療に使用できる。好ましくは治療を行う患者又は対象者はヒトであるものの、本明細書で使用するとき、この用語は任意の哺乳動物種を明白に包含する。
【０２１８】
より具体的には、本発明に従う腫瘍状態の患者の治療は、限定するものではないが、副腎腫瘍、ＡＩＤＳ関連性のがん、胞状軟部肉腫、アストロサイト腫瘍、膀胱がん（扁平上皮細胞癌及び移行上皮がん）、骨がん（アダマンチノーマ、動脈瘤性骨嚢胞、骨軟骨腫、骨肉腫）、脳及び脊髄がん、転移性脳腫瘍、乳癌、頚動脈体腫瘍、頚管がん、軟骨肉腫、脊索腫、嫌色素性腎細胞がん、明細胞がん、結腸がん、大腸直腸がん、皮膚良性線維性組織球腫、繊維形成性小円形細胞腫瘍、上衣腫、ユーイング肉腫、骨外性粘液型軟骨肉腫、繊維形成性不全症オシウム（ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｍｐｅｒｆｅｃｔａ  ｏｓｓｉｕｍ）、線維性骨形成異常、胆嚢及び胆管がん、妊娠性絨毛性疾患、生殖細胞腫瘍、頭部及び頸部がん、膵島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓がん（腎芽腫細胞腫、乳頭状腎細胞がん）、白血病、脂肪腫／良性らい腫性腫瘍、脂肪肉腫／悪性らい腫性腫瘍、肝臓がん（胚芽腫、肝細胞がん）、リンパ腫、肺がん（小細胞癌、腺癌、扁平上皮細胞癌、大細胞がんなど）、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、多発性内分泌腫瘍腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経芽細胞腫、神経内分泌腫瘍、卵巣がん、膵臓がん、甲状腺乳頭がん、上皮小体腫瘍、小児がん、末梢神経腫瘍、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、前立腺がん、後方ブドウ膜黒色腫、まれな血液障害、腎転移がん、ラブドイド腫瘍、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚がん、軟組織肉腫、扁平細胞がん、胃癌、滑膜肉腫、精巣がん、胸腺がん、胸腺腫、甲状腺転移がん、及び子宮がん（頚がん、子宮内膜癌、及び平滑筋腫）からなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、がん性細胞は、限定するものではないが、乳がん、非小細胞性肺がん（ＮＳＣＬＣ）、小細胞性肺がん、膵臓がん、結腸がん、前立腺がん、肉腫、転移性腎臓がん、転移性甲状腺がん、及び明細胞がんなどの固体腫瘍群から選択される。
【０２１９】
血液系腫瘍に関し、本発明の化合物及び方法が、具体的には各種Ｂ細胞リンパ腫、例えば、低悪性度／ＮＨＬ濾胞性細胞リンパ腫（ＦＣＣ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞性リンパ腫（ＤＬＣＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度拡散性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽細胞ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非切れ込み核細胞性リンパ腫ＮＨＬ、巨大腫瘤病変ＮＨＬ、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、リンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞性リンパ腫（ＤＬＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、ＡＩＤＳ関連性リンパ腫、単球性Ｂ細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性リンパ球腫脹、小リンパ球性リンパ腫、濾胞性拡散性大細胞、小切れ込み核細胞型びまん性リンパ腫、大細胞性免疫芽細胞リンパ芽球腫、小型、非切れ込み型バーキット及び非バーキットリンパ腫、濾胞性、大細胞性リンパ腫、濾胞性、小切れ込み核細胞リンパ腫、及び濾胞性混合型小切れ込み型リンパ腫及び大細胞性リンパ腫の治療に効果的なものであり得ることも理解される。Ｇａｉｄｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ」ＩＮ  ＣＡＮＣＥＲ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ａｎｄ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＯＮＣＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．２：２１３１〜２１４５（ＤｅＶｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，５．ｓｕｐ．ｔｈ  ｅｄ．１９９７）を参照されたい。当業者であれば、多くの場合、これらのリンパ腫は分類系を変更することで異なった名称を有する場合があり、異なった名称に分類されたリンパ腫患者にも、本発明の治療レジメンの併用が有効な場合があることは明らかであろう。
【０２２０】
更に他の好ましい実施形態では、ＣＤ４６モジュレータを使用して、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ又はＢ−ＣＬＬ）などの白血病を含む、特定の骨髄腫及び血液系腫瘍を効果的に治療することができる。ＣＬＬは、主に高齢者の疾患であり、発症率は５０歳齢以降に増加し始め、６０代後半にピークに達する。一般的に、ＣＬＬには腫瘍性末梢血リンパ球の増殖が包含される。ＣＬＬの臨床的な所見には、リンパ球増加、リンパ腺腫、脾腫、貧血及び血小板減少が包含される。ＣＬＬの特性としては、モノクローナルＢ細胞の増殖、及び分化中間状態で停止したＢリンパ球の蓄積が挙げられ、このようなＢ細胞は、表面ＩｇＭ（ｓＩｇＭ）を発現し、あるいはｓＩｇＭ及びｓＩｇＤを両方発現し、かつ正常なＢ細胞と比べ密度の低い単一の軽鎖を発現する。しかしながら、これまでに示した通り、及び以降で実施例に示す通り、選別したＣＤ４６発現（例えば、ＣＤ４６）はＢ−ＣＬＬ細胞で上方制御されるため、本開示のモジュレータを誘因する標的となる。
【０２２１】
本発明はまた、良性又は前がん性腫瘍を示す対象者のがん予防又は予防治療も提供する。本発明を用いる治療から、任意の特定の腫瘍型又は腫瘍性疾患を除外すべきであるとは考えられない。しかしながら、本発明と、第２の治療薬、特に化学療法剤及び分子標的薬とを併用する場合には腫瘍の細胞型が関係してくる場合もある。
【０２２２】
本発明の更に他の好ましい実施形態は、固体腫瘍に罹患している対象者を治療するためにＣＤ４６モジュレータを使用することを含む。このような対象者では、これらの多くの固体腫瘍は、自身に対し、特に本開示のエフェクタによる治療に対する感受性を付する、各種遺伝変異を示す、組織を含む。例えば、ＫＲＡＳ、ＡＰＣ及びＣＴＮＮＢ１変異は結腸直腸がん患者において比較的共通して見られる。更に、これらの変異を有する腫瘍に罹患している患者、特にＫＲＡＳ変異を有する患者は、通常、ほとんどが現行の治療法に抵抗性を示す。また、典型的には単一アミノ酸置換の結果生じるＫＲＡＳ活性化変異は、肺腺がん、粘液性腺腫、及び膵腺管がんなどの悪性腫瘍を治療する際の他の困難性にも関与する。
【０２２３】
現在、ＥＧＦＲ又はＶＥＧＦ阻害薬のいずれかに対する結腸直腸がん患者の応答性に関し最も信頼性の高い予測法は、例えば、特定のＫＲＡＳ「活性化」変異について試験するものである。結腸直腸がんの３５〜４５％でＫＲＡＳに変異が生じており、変異型ＫＲＡＳを発現している患者は、ＥＧＦＲ又はＶＥＧＦ阻害薬に対し良好な応答性を示さない。例えば、結腸直腸がんが、パニツムマブ及びセツキシマブ治療に対し応答性を示さない場合、ＫＲＡＳ変異が予測される（Ｌｉｅｖｒｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６：３９９２〜５；Ｋａｒａｐｅｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．ＮＥＪＭ  ３５９：１７５７〜１７６５）。結腸直腸がん患者の約８５％がＡＰＣ遺伝子に変異を有しており（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ  ａｎｄ  Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ．ＮＥＪＭ  ３６１：２４４９〜６０）、及びこれまでに、家族性大腸腺腫症及び結腸直腸がんに罹患している患者に関し、８００超のＡＰＣ変異が特徴付けられている。これらの変異のほとんどでは、β−カテニンの破壊を介在する機能が低下した切断型（ｔｒｕｎｃａｔ）ＡＰＣタンパク質が生じる。β−カテニン遺伝子（ＣＴＮＮＢ１）に生じる変異によっても、β−カテニンの安定性が上昇し、その結果、核内移行及びそれに続くいくつかのがん原性転写プログラムの活性化が生じることになる。この過程もまた、変異型ＡＰＣが、β−カテニン破壊を適切に介在（この機能は正常な細胞増殖及び分化プログラムの確認に必要とされる）できないために生じる発がん機序である。
【０２２４】
ＸＩＶ．製造物品
用量１回分以上のＣＤ４６モジュレータを含む１つ以上の容器からなる医薬梱包体及びキットも提供する。特定の実施形態では、単位用量を提供し、この場合の単位用量は、例えば、抗ＣＤ４６抗体に加え１種以上の追加の剤を含む、あるいは追加の剤は含まない組成物を、規定量で含有するものである。他の実施形態では、このような単位用量は、注射用に１回用量を事前充填したシリンジとして供給する。更に他の実施形態では、単位用量で収容させる組成物には、生理食塩水、ショ糖あるいは同様物、緩衝剤（リン酸塩など）を含有させ、及び／又は安定でかつ有効なｐＨ範囲内で処方する。あるいは、特定の実施形態では、組成物は、適切な液体、例えば、滅菌水に溶解させ得る凍結乾燥粉末剤として提供できる。特定の好ましい実施形態では、組成物は、タンパク質の凝集を阻害する１種以上の物質（限定するものではないが、ショ糖及びアルギニンなど）を含む。容器に対し任意のラベル付け、あるいは関係付け（１つ以上）を行うことで、その容器が収容している組成物が、選択肢に含まれる疾患症状を診断又は治療する際に使用されるものであることを示す。
【０２２５】
本発明は、単位用量又は複数用量のＣＤ４６モジュレータと、所望により１種以上の抗がん剤とを作製するためのキットも提供する。キットは、容器とラベルを含み、あるいは容器と、容器を梱包するか若しくは容器と関係付けられた包装とを含む。好適な容器としては、例えば、瓶、バイアル瓶、シリンジなどが挙げられる。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から製造することができる。容器は、症状を治療するのに有効な組成物を収容し、滅菌済アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内注射用輸液バッグであるか、又は皮下注射針により貫通可能なストッパーを有するバイアル瓶であり得る）。このようなキットは、概して好適な容器と、製薬上許容され得るＣＤ４６モジュレータ処方とを包含し、所望によりモジュレータと同一の容器又は異なる容器内に、１種以上の抗がん剤を包含する。キットは、診断又は併用療法のいずれかを目的とした、その他の製薬上許容され得る処方も包含し得る。例えば、このようなキットには、本発明のＣＤ４６モジュレータに加えて、化学療法剤又は放射線治療薬などの抗がん剤、抗血管新生薬、抗転移剤、分子標的薬、細胞毒性剤、及び／又は他の抗がん剤などの範疇に含まれる、任意の１つ以上の剤も包含させることができる。このようなキットは、ＣＤ４６モジュレータと抗がん剤又は診断薬を複合させるのに適切な試薬も提供する（例えば、米国特許第７，４２２，７３９号を参照されたい。この特許については、引用によりその全体を本明細書に組み込む）。
【０２２６】
より詳細には、キットは、ＣＤ４６モジュレータと、追加の成分とを収容している単独の容器、又はＣＤ４６モジュレータのみを収容している単独の容器を包含してよく、あるいは各所望の剤用の別個の容器を包含してもよい。複合体として提供される併用治療薬が存在する場合、溶液は、それぞれをモル当量で組み合わせて、あるいは他の成分を過剰量にして組み合わせて予混合しておいてもよい。あるいは、キットに含まれるＣＤ４６モジュレータ及び任意の所望の抗がん剤は、患者への投与前には別個の容器内に隔離させておくこともできる。キットには、第２／第３の容器も包含させてもよく、これらの容器には、滅菌、製薬上許容可能な緩衝剤、あるいはその他の、静菌注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）、リンゲル液、及びブドウ糖溶液などの希釈剤を収容させることもできる。
【０２２７】
キットの成分を１種以上の溶液として提供する場合、この溶液は、好ましくは水溶液であり、滅菌水溶液が特に好ましい。しかしながら、キットの成分は乾燥粉末として提供してもよい。試薬又は成分を乾燥粉末として提供する場合、粉末は好適な溶媒を加えて溶解させることができる。この溶媒を他の容器で提供してもよいことも想定される。
【０２２８】
これまでに簡潔に示したキットには、抗体及び任意の所望の成分を動物又は患者に投与するための手段、例えば１つ以上の針又はシリンジ、あるいは更には点眼容器、ピペット、又は処方を動物に注射若しくは導入することのできる又は体の疾患領域に適用することのできるその他の同様の手段を包含させてもよい。本発明のキットは、典型的には、バイアル瓶又は同様物、並びに市販用に厳重に制限して他の要素を収容させるための手段、例えば、所望のバイアル瓶及び他の装置を入れて保持する射出又は吹込み成形プラスチック製容器も包含する。任意のラベル又はパッケージを挿入し、ＣＤ４６モジュレータ組成物は、がん、例えば、結腸直腸がんの治療に使用するためのものであることを示す。
【０２２９】
ＸＶ．調査用の試薬
本発明の他の好ましい実施形態は、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞選別法（ＭＡＣＳ）又はレーザー介在型分画法などの方法において、がん起始細胞集団又は下位集団を識別、単離、分画又は濃縮するのに有用な手段として、本開示のモジュレータの特性を引き出すものでもある。当業者であれば、本モジュレータは、がん幹細胞などのＴＩＣの特徴付け及び操作に適合性のあるいくつかの技術にも使用できることを理解するであろう（例えば、米国特許出願第１２／６８６，３５９号、同第１２／６６９，１３６号、及び同第１２／７５７，６４９号を参照されたい。これらの各々は引用によりその全体が本発明に組み込まれる）。
【０２３０】
ＸＶＩ．その他
本明細書において、別途記載のない限り、本明細書に関連して使用される科学用語及び専門用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。更には、文脈上必要とされない限り、単数形の用語は複数を包含し、複数形の用語は単数を包含するものとする。より詳細には、本明細書及び添付の「特許請求の範囲」において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、その文脈において別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば、「タンパク質（ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」を参照する場合には複数のタンパク質が包含され、及び同様に、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」を参照する場合には細胞混合物が包含される。これに加え、本明細書及び添付の特許請求の範囲に提供される範囲には、範囲を形成する両側の端点と、その点に挟まれるすべての点とが包含される。したがって、範囲２．０〜３．０には、２．０及び３．０と、２．０及び３．０に挟まれるすべての点とが包含される。
【０２３１】
全般的には、本明細書で説明される、細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、並びにタンパク質及び核酸の化学作用、並びにタンパク質及び核酸のハイブリダイゼーションに関連して利用される命名法と、それらの技術とは、当該技術分野において周知であり、かつ一般的に使用されるものである。本発明の方法及び技術は、別途記載のない限り、概して当業者に周知である一般的な手法に従って、かつ本明細書に引用及び議論する各種一般的な参照文献、及びより詳細な参照文献に記載される通りに実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０００）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．（２００２）、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９８）、並びにＣｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．（２００３）を参照されたい。酵素反応法及び精製法は、製造元の取扱説明に従って、又は当該技術分野で一般的に実施されるように、又は本明細書で説明されるように、実行される。本明細書に記載の分析化学、有機合成化学、及び医薬化学に関連し使用する専門用語、並びにこれらに関連する検査法及びこれらに関連する技術は周知のものであり、当該技術分野で一般的に使用される。
【０２３２】
本明細書に公開し又は引用するすべての参照文献又は文書は、引用により制限なくその全体を本明細書に組み込む。更に、任意の節見出しは単に構成目的のものであり、記載の内容を制限するものとして解釈されるものではない。
【実施例】
【０２３３】
したがって、一般的に記述される本発明は、以降の、例示目的のため提供され、本発明を制限することを意図するものではない実施例を参照することで、より容易に理解される。実施例は、以降の実験のすべてが実施されたこと、あるいは以降の実験のみが実施されたことを意図するものではない。別途記載のない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度はセ氏であり、圧力は大気圧又は大気圧付近の圧力である。
【０２３４】
（実施例１）
がん起始細胞集団におけるＣＤ４６発現
がん患者において存在する固体腫瘍の細胞不均一性を特徴づけ、特定の表現型マーカーを用い腫瘍永続化細胞（ＴＰＣ；すなわち、がん幹細胞：ＣＳＣ）のアイデンティティを解明し、臨床的に関連性のある治療対象を同定するために、巨大な非従来的な異種移植片（ＮＴＸ）腫瘍バンクを作製し、当業界で認知されている技術を用い維持した。様々な固体悪性腫瘍に罹患している数多くのがん患者を基に得た、不均一な腫瘍細胞を複数回継代させて、多数の別個の腫瘍細胞株からなるＮＴＸ腫瘍バンクを免疫不全マウスで増殖させた。多数の、良好に定義されている別個のＮＴＸ腫瘍細胞初期継代株が持続的に利用可能であると、細胞を細胞株から再現性よくかつ繰り返し精製できることから、ＴＰＣの同定及び単離が非常に促進される。より詳細には、マウスにおいて、表現型及び形態が不均一のものである腫瘍を生成する能力を基に、単離又は精製ＴＰＣを後ろ向きに非常に正確に定義する。この定義により、単離又は精製ＴＰＣが由来している患者の腫瘍試料が再現されることになる。したがって、単離した細胞小集団が、マウスにおいて完全に不均一の腫瘍を生成したならば、単離した細胞集団にはＴＰＣが含まれていることが強く示唆される。この試験において、ＮＴＸ細胞株の継代数を最小限に抑えることで、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験が非常に単純化され、容易に検証しやすい結果が得られる。更に、初期継代ＮＴＸ腫瘍は、イリノテカン（すなわち、Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））などの治療薬にも応答するため、腫瘍の成長、現行の治療法に対する耐性、並びに再発を駆り立てる機序についての、臨床的に意義のある洞察が得られる。
【０２３５】
樹立したこのＮＴＸ腫瘍細胞株を用い、フローサイトメトリーを行い、がん起始細胞（ＴＩＣ）の特徴付け、単離、精製又は濃縮に使用することのできる、並びに細胞集団に含まれるＴＰＣ及びＴＰｒｏｇ細胞の分離又は解析に使用することのできるそれぞれのマーカーに関し同定することで、ＮＴＸ腫瘍細胞株を構成する腫瘍細胞の表現型を解析した。この観点から、本発明者らは、タンパク質発現に基づき細胞を迅速に特徴付けし、及びそれと共に有用である可能性のあるマーカーを同定する、専用のプロテオミクスプラットフォーム（すなわち、ＰｈｅｎｏＰｒｉｎｔ（商標）アレイ）を採用した。ＰｈｅｎｏＰｒｉｎｔアレイは、９６ウェルプレートに整列させた数百の別個の結合分子（多くは供給業者から入手可能）を含む、専用のプロテオミクスプラットフォームであり、各ウェルにはフィリコエリトリン蛍光チャネルをもつ別個の抗体と、プレートのすべてのウェルに整列させた、異なる蛍光色素をもつ複数種のその他の抗体を含有する。このアレイにより、関連性のある細胞を迅速に算入するか、非フィコエリトリンチャンネルを基に関連性のない細胞を迅速に排除するかして、選別した腫瘍細胞下位集団の抗原発現レベルを測定できる。ＰｈｅｎｏＰｒｉｎｔアレイを、当業者に周知の組織解離法、移植法及び幹細胞法（Ａｌ−Ｈａｊｊ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）、Ｄａｌｅｒｂａ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）及びＤｙｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）、すべて上掲されており、これらの各々は、引用によりその全体が本発明に組み込まれる）と併用したところ、このアレイは、非常に効率的に、関連するマーカーの同定、並びにこれに続く特定のヒト腫瘍細胞下位集団の単離及び移植を行うにあたって有効なものである可能性が示された。
【０２３６】
したがって、数匹の免疫不全マウスにおいて、ヒト腫瘍に関し一般的に実施される通りに各種ＮＴＸ腫瘍細胞系を樹立し、８００〜２，０００ｍｍ３に到達した腫瘍をマウスから摘出し、当該技術分野で認識されている酵素消化法を用い、細胞を分散させて単個細胞懸濁液とした（例えば、本開示に組み込まれる米国特許出願公開第２００７／０２９２４１４号を参照されたい）。ＰｈｅｎｏＰｒｉｎｔアレイを用い、これらの懸濁液から、表面タンパク質発現についての絶対的データ（細胞毎のデータ）と、細胞対細胞ベースでの相対的データ（集団に含まれる他の細胞との比較データ）の両方を得て、より複雑な特徴付けと細胞集団の階層化とを行った。より詳細には、ＰｈｅｎｏＰｒｉｎｔアレイを用いたところ、先を見通して、ＴＩＣ又はＴＰＣをＮＴＧ腫瘍細胞及びがん間質と区別する、タンパク質又はマーカーを迅速に同定できた。ＮＴＸ腫瘍モデルから単離した場合、特定の細胞表面タンパク質の発現レベルが異なっている腫瘍細胞下位集団は比較的迅速に特徴付けされた。特に、腫瘍細胞集団で不均一に発現されているタンパク質を基に、特定のタンパク質又はマーカーを高発現している及び低発現している、別個の、高度に精製された腫瘍細胞下位集団を、単離し及び免疫不全マウスに移植することができることから、不均一に発現しているタンパク質は、それぞれの細胞下位集団においてＴＰＣが豊富に含まれているか否かを評価するにあたり手助けとなる。
【０２３７】
用語「濃縮」は、細胞の単離と同意語として使用され、開始又は初期細胞集団と比べた場合に、ある種の細胞が画分を占める割合が、画分に含まれる他の種類の細胞のものと比べて高くなっている生成物（分画）を意味する。好ましくは、「濃縮」は、細胞集団において、１種の細胞の割合が、初期細胞集団と比較して約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、又は５０％以上増加することを指す。
【０２３８】
本明細書で使用するとき、「マーカー」は、細胞又は組織に関する文脈において、疾患若しくは障害により影響を受ける組織又は細胞集団中で又はこれらの表面で同定されるものなどの、特定の細胞、細胞集団又は組織に対し同定が可能であるよう会合する、あるいは特定の細胞、細胞集団又は組織中で又はこれらの表面で特異的に見られる、任意の特徴的な形態をもつ化学的又は生物学的対象物を意味する。明示する通り、マーカーは形態、機能又は生化学な性質であってよい。好ましい実施形態では、マーカーは、特定の細胞腫（例えば、ＴＰＣ）により、あるいは特定の条件下の細胞により（例えば、細胞周期の特定の時点の細胞又は特定の微小環境に存在する細胞）差次的に又は選択的に発現される細胞表面抗原である。好ましくは、このようなマーカーはタンパク質であり、より好ましくは、抗体により認識されるエピトープ、アプタマー又は当該技術分野で既知の他の結合分子を保有する。しかしながら、マーカーは、限定するものではないが、タンパク質（ペプチド及びポリペプチド）、脂質、多糖、核酸及びステロイドなどの、細胞表面又は細胞内に見られる任意の分子からなる場合もある。形態マーカーの特性又は特色の例としては、限定するものではないが、形状、大きさ、及び核細胞質比が挙げられる。機能マーカーの特性又は特色の例としては、限定するものではないが、特定の基質に対する接着能、特定の染料に対する取り込み又は排除能、例えば、限定するものではないが、親油性染料の排除能、特定の条件下での遊走能、並びに特定の形態への分化能が挙げられる。マーカーは、レポーター遺伝子により発現されるタンパク質であってもよく、例えば、レポーター遺伝子をコードしている核酸配列を細胞に導入し、細胞によりレポーター遺伝子を発現及び転写させることで、マーカーとして使用できるレポータータンパク質を産生させることもできる。マーカーとして使用できるこのようなレポーター遺伝子としては、例えば、限定するものではないが、蛍光タンパク質、酵素、染色小粒タンパク質、及び耐性遺伝子などが挙げられる。
【０２３９】
これに関連し、用語「マーカー表現型」は、組織、細胞、又は細胞集団（例えば、安定なＴＰＣ表現型）に関する文脈において、特定の細胞又は細胞集団の特徴付け、識別、分離、単離又は濃縮に使用できる任意のマーカー又はマーカーの組み合わせを意味する。具体的な実施形態では、マーカーの表現型は細胞表面表現型を意味し、この場合、細胞表面マーカーの発現を組み合わせて検出又は同定することで評価できる。
【０２４０】
当業者であれば、各種がん幹細胞集団と関連付けられ、かつ腫瘍細胞下位集団の単離又は特徴付けに使用される数多くのマーカー（又はその非存在）を認識するであろう。この点において、例示的ながん幹細胞マーカーには、ＯＣＴ４、Ｎａｎｏｇ、ＳＴＡＴ３、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ２４、ＣＤ３４、ＮＢ８４、ＴｒｋＡ、ＧＤ２、ＣＤ１３３、ＣＤ２０、ＣＤ５６、ＣＤ２９、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ４６、トランスフェリン受容体、ＪＡＭ３、カルボキシペプチダーゼＭ、ＡＤＡＭ９、オンコスタチンＭ、Ｌｇｒ５、Ｌｇｒ６、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ｎｅｓｔｉｎ、Ｓｏｘ１、Ｂｍｉ−１、ｅｅｄ、ｅａｓｙｈ１、ｅａｓｙｈ２、ｍｆ２、ｙｙ１、ｓｍａｒｃＡ３、ｓｍａｒｃｋＡ５、ｓｍａｒｃＤ３、ｓｍａｒｃＥ１、ｍｌｌｔ３、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１６、ＡＸＩＮ１、ＢＣＬ９、ＭＹＣ，（ＴＣＦ４）ＳＬＣ７Ａ８、ＩＬ１ＲＡＰ、ＴＥＭ８、ＴＭＰＲＳＳ４、ＭＵＣ１６、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＳＬＣ６Ａ１４、ＳＬＣ４Ａ１１、ＰＰＡＰ２Ｃ、ＣＡＶ１、ＣＡＶ２、ＰＴＰＮ３、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＳＬＣ１Ａ１、ＣＸ３ＣＬ１、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＭＰＺＬ１、ＦＬＪ１００５２、Ｃ４．４Ａ、ＥＤＧ３、ＲＡＲＲＥＳ１、ＴＭＥＰＡＩ、ＰＴＳ、ＣＥＡＣＡＭ６、ＮＩＤ２、ＳＴＥＡＰ、ＡＢＣＡ３、ＣＲＩＭ１、ＩＬ１Ｒ１、ＯＰＮ３、ＤＡＦ、ＭＵＣ１、ＭＣＰ、ＣＰＤ、ＮＭＡ、ＡＤＡＭ９、ＧＪＡ１、ＳＬＣ１９Ａ２、ＡＢＣＡ１、ＰＣＤＨ７、ＡＤＣＹ９、ＳＬＣ３９Ａ１、ＮＰＣ１、ＥＮＰＰ１、Ｎ３３、ＧＰＮＭＢ、ＬＹ６Ｅ、ＣＥＬＳＲ１、ＬＲＰ３、Ｃ２０ｏｒｆ５２、ＴＭＥＰＡＩ、ＦＬＶＣＲ、ＰＣＤＨＡ１０、ＧＰＲ５４、ＴＧＦＢＲ３、ＳＥＭＡ４Ｂ、ＰＣＤＨＢ２、ＡＢＣＧ２、ＣＤ１６６、ＡＦＰ、ＢＭＰ−４、β−カテニン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ９、ＣＤ１４、ＣＤ３１、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ９０、ＣＸＣＲ４、ｄｅｃｏｒｉｎ、ＥＧＦＲ、ＣＤ１０５、ＣＤ６４、ＣＤ１６、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＣＤ４９ｂ、及びＣＤ４９ｆが含まれる。例えば、Ｓｃｈｕｌｅｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，ＰＭＩＤ：２０１８５３２９、米国特許第７，６３２，６７８号及び米国特許出願公開第２００７／０２９２４１４号、同第２００８／０１７５８７０号、同第２０１０／０２７５２８０号、同第２０１０／０１６２４１６号及び同第２０１１／００２０２２１号を参照されたい。これらの各々は引用により本開示に組み込まれる。これらの数多くのマーカーは、上記のＰｈｅｎｏＰｒｉｎｔアレイに包含させた。
【０２４１】
同様にして、特定の腫瘍型をもつがん幹細胞と関連する細胞表面表現型の非限定例としては、ＣＤ４４ｈｉＣＤ２４ｌｏｗ、ＡＬＤＨ＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ１２３＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋ＣＤ２４−、ＣＤ４６ｈｉＣＤ３２４＋ＣＤ６６ｃ−、ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋ＣＤ１０−ＣＤ１９−、ＣＤ１３８−ＣＤ３４−ＣＤ１９＋、ＣＤ１３３＋ＲＣ２＋、ＣＤ４４＋α２β１ｈｉＣＤ１３３＋、ＣＤ４４＋ＣＤ２４＋ＥＳＡ＋、ＣＤ２７１＋、ＡＢＣＢ５＋並びに、当該技術分野において既知である他のがん幹細胞表面表現型が挙げられる。例えば、Ｓｃｈｕｌｅｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０年、上掲）、Ｖｉｓｖａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、ＰＭＩＤ：１８７８４６５８及び米国特許出願公開第２００８／０１３８３１３号を参照されたい。これらの各々は引用によりその全体が本発明に組み込まれる。当業者であれば、直前に例示されたものなどのマーカーの表現型を、標準的なフローサイトメトリー解析及び細胞選別法と併用して、更なる解析のために、ＴＩＣ及び／又はＴＰＣ細胞又は細胞集団を、特徴付け、単離、精製又は濃縮できることを理解するであろう。対象とする本発明に関し、ＣＤ４６、ＣＤ３２４及び、所望によりＣＤ６６ｃは、解析した腫瘍標本が、患者由来の腫瘍標本（図１Ａ）あるいは患者の腫瘍標本から誘導したＮＴＸ腫瘍（図１Ｂ）のいずれであったにせよ、多くのヒト結腸直腸がん（「ＣＲ」）、乳房がん（「ＢＲ」）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、膵臓がん（「ＰＡ」）、黒色腫（「Ｍｅｌ」）、卵巣がん（「ＯＶ」）、並びに頭部及び頸部がん（「ＨＮ」）細胞の表面で高発現しており、あるいは不均一に発現している。
【０２４２】
図１Ａ及びＢに示すデータは、製造元の取扱説明に従ってＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い生成したフローサイトメトリー結果に基づく、タンパク質発現データである。このデータでは、それぞれの腫瘍細胞をヒストグラムプロットにより示す。アイソタイプ型対照抗体の染色バックグラウンドは、ヒストグラム内を灰色に塗りつぶして示し、ＭＥＭ−２５８抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  Ｉｎｃ．）により測定されたＣＤ４６発現は太字の黒い線で示す。
【０２４３】
本明細書において、発現が陰性（すなわち、「−」）である細胞は、対象とするタンパク質を標識する完全抗体染色カクテルの存在下で、追加の蛍光放射チャネルにおいて観察される発現が、蛍光チャネルにおいてアイソタイプ型対照抗体について観察される発現の９５パーセンタイルよりも低いか又は等しいものとして定義する。当業者であれば、陰性である状態を定義するこの手法が、陰性なものを「ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｎｕｓ  ｏｎｅ」又は「ＦＭＯ」染色として呼ぶことを理解するであろう。本明細書において、上記ＦＭＯ染色法によりアイソタイプ型対照抗体で観察される９５パーセンタイルよりも高発現を示す細胞は、「陽性」（すなわち、「＋」）と定義する。本明細書で定義するとき、各種細胞集団を広範に「陽性」として定義する。まず始めに、低発現（すなわち、「ｌｏ」）を示す細胞とは、概して、観察された発現が、アイソタイプ型対照抗体を用いＦＭＯ染色により測定した９５パーセンタイルを超え、かつアイソタイプ型対照抗体を用い上記のＦＭＯ染色法により観察した９５パーセンタイルの標準偏差内であった細胞として定義する。「高」発現（すなわち、「ｈｉ」）を示す細胞とは、観察された発現が、アイソタイプ型対照抗体を用いＦＭＯ染色により測定した９５パーセンタイルを超え、かつアイソタイプ型対照抗体を用い上記のＦＭＯ染色法により観察した９５パーセンタイルの標準偏差を超える細胞として定義する。他の実施形態では、９９パーセンタイルは、好ましくは、陰性及び陽性ＦＭＯ染色の境界点として使用し、特に好ましい実施形態では、パーセンタイルは９９％を超える。
【０２４４】
ＣＤ４６発現は、各固体腫瘍間で変動したが、概して、発現は、アイソタイプ型対照抗体により測定したバックグラウンド染色を上回っていた（図１Ａ及び１Ｂ）。ＣＤ４６は、結腸直腸及び膵臓がん患者から得た腫瘍において、特に不均一に発現していた。概して、別個の細胞下位集団は、それぞれＣＤ４６について陰性、低発現及び高発現を示した（図１Ｂ）。
【０２４５】
（実施例２）
ＦＡＣＳによるがん起始細胞集団の濃縮例及び移植例
対象とする特定のタンパク質を不均一に発現する腫瘍に含まれる細胞を、対象とする特定のタンパク質の高発現又は非／低発現に基づき単離し、次に免疫不全マウスに移植した。驚くべきことに、専用のＰｈｅｎｏＰｒｉｎｔアレイにより、不均一に発現したものとして同定したそれぞれのマーカーのうち、ほとんどのものが、がん起始細胞の濃縮に有用性を示さなかったことが観察された。細胞表面のＣＤ４６発現が高い又は低い結腸直腸及び膵臓腫瘍細胞が、免疫不全マウスにおいて強い腫瘍原生活性をもつか否かを評価するために、異なるそれぞれの細胞集団を、当業者に周知の手法である細胞分散及びＦＡＣＳ法を用いＴＮＸ腫瘍から単離し、細胞をマウス１匹あたりに１，０００〜３個移植した。腫瘍の大きさが８００〜２，０００ｍｍ３に達したなら、表現型を特性評価して、生成された腫瘍が移植細胞を単離した親腫瘍を表現しているか否かを判定するために、マウスを安楽死させ、腫瘍を摘出し、酵素消化により単個細胞懸濁液へと分散させた。
【０２４６】
表１は、これらの試験の結果を示す。空欄は、その試験が実施されなかったことを示す。上皮特異的な抗原（ＥＳＡ）について陽性を示すＣＤ４６ｈｉ細胞から生じる腫瘍は、追加のマーカー（すなわち、結腸直腸がん：ＣＤ３２４＋  ＣＤ６６ｃ−；膵臓がん：ＣＤ３２４＋）を必要としたものの、一貫して不均一な腫瘍を生成した。このような生成には細胞数２００個／マウス以下での移植が効果的であった。
【０２４７】
【表２】
2013544493.tif 000003
（実施例３）
ＣＤ４６ｈｉがん起始細胞下位集団は、ＮＴＸモデルにおいて連続継代することで腫瘍永続化能を示す。
【０２４８】
大多数の腫瘍細胞が腫瘍形成能に欠き、ひいては非腫瘍原生（ＮＴＧ）であるとして特徴づけされ得る一方で、正常胚発生及び造血腫瘍のいずれにおいても、移植することで腫瘍及び／又は組織を再形成し得る非常に増殖性の高い細胞に関する前例が存している。但し、この細胞は自己複製能を持たないことから（すなわち、分裂能が有限である）、短期再構成細胞（ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）又は前駆細胞と呼ばれる。
【０２４９】
ＣＤ４６ｈｉ細胞の下位集団の腫瘍原性が、他と比べ高いか低いかを評価するために、ＣＤ４６を、細胞の単離及び移植用のその他のマーカーと体系的に組み合わせた。この試験により、各抗原が高発現又は非／低発現であるかに基づきがん起始細胞を濃縮する際の手助けとすることができる、結腸直腸がんに関する追加の２つの細胞表面マーカー（ＣＤ３２４及びＣＤ６６ｃ）及び膵臓がんに関する追加の１つのマーカー（ＣＤ３２４）を同定した。結腸直腸がんにおけるこれらのマーカーの有用性としては、例えば、ＥＳＡ＋  ＣＤ４６ｈｉ  ＣＤ３２４＋  ＣＤ６６ｃ−細胞（すなわち、ｐ１、継代数１）の移植により生じる腫瘍は、完全に不均一なものであり、それらの由来する親腫瘍を完全に反映していた（図２；ｐ１腫瘍対親腫瘍）。これに対し、ＥＳＡ＋  ＣＤ４６ｈｉ  ＣＤ３２４＋  ＣＤ６６ｃ＋細胞を少数移植した場合には、完全に不均一な腫瘍は生成されず、ＣＤ６６ｃ−細胞は非常に少なかった。ＥＳＡ＋  ＣＤ４６ｈｉ  ＣＤ３２４＋  ＣＤ６６ｃ＋細胞は、非常に増殖性が高いものの自己複製特性には欠く腫瘍前駆細胞（ＴＰｒｏｇ）であることが示唆された。ＴＰＣ（ＥＳＡ＋  ＣＤ４６ｈｉ  ＣＤ３２４＋  ＣＤ６６ｃ−細胞）及びＴＰｒｏｇ（ＥＳＡ＋  ＣＤ４６ｈｉ  ＣＤ３２４＋  ＣＤ６６ｃ＋細胞）のプロスペクティブな累代移植により、これらの腫瘍細胞下位集団のアイデンティティは、ＥＳＡ＋  ＣＤ４６ｈｉ  ＣＤ３２４＋  ＣＤ６６ｃ−細胞から生じたＥＳＡ＋  ＣＤ４６ｈｉ  ＣＤ３２４＋  ＣＤ６６ｃ−細胞サブセットであると確認され、５０細胞の累代移植後にも腫瘍は効果的に生成されたのに対し（図２；ｐ２対ｐ１腫瘍）、ＥＳＡ＋  ＣＤ４６ｈｉ  ＣＤ３２４＋  ＣＤ６６ｃ＋細胞から生じた腫瘍には、累代移植後に効果的に腫瘍形成を再開する細胞は存在しなかった。明確化のため、腫瘍から単離した５０個のＥＳＡ＋  ＣＤ４６ｈｉ  ＣＤ３２４＋  ＣＤ６６ｃ＋細胞は、それぞれ２００個のＣＤ６６ｃ−又はＣＤ６６ｃ＋細胞からのみ生成され、腫瘍原性は非常に低かった。特にこれらの細胞はＣＤ６６ｃ＋由来の腫瘍から得られた。驚くべきことに、これらのデータは、固体腫瘍について、ＥＳＡ＋  ＣＤ４６ｈｉ  ＣＤ３２４＋  ＣＤ６６ｃ−細胞はＴＰＣであり、ＥＳＡ＋  ＣＤ４６ｈｉ  ＣＤ３２４＋  ＣＤ６６ｃ＋細胞はＴＰｒｏｇ細胞であるという興味深い観察結果を示す。
【０２５０】
結腸直腸がんに含まれる上記ＴＰＣ表現型についての精度を評価するために、上記のようにＦＡＣＳによりＥＳＡ＋  ＣＤ４６ｈｉ  ＣＤ３２４＋  ＣＤ６６ｃ−細胞を単離し（図３Ａ；ＦＡＣＳ後対ＦＡＣＳ前）、限界希釈して、それぞれマウス１匹あたり細胞を５０、２０、８及び３個移植した。腫瘍が首尾よく形成されたものとして定義される陽性応答に基づき、ポワソン分布を用い（図３Ｂ及び３Ｃを参照されたい）、ＥＳＡ＋  ＣＤ４６ｈｉ  ＣＤ３２４＋  ＣＤ６６ｃ−ＴＰＣの真のがん起始細胞発生頻度を算出した結果、およそ７±３細胞に１個であった。
【０２５１】
その他のマーカーは、腫瘍原性細胞の濃縮に同様に使用することのできる細胞表面マーカー又は酵素活性をもつものとして定義されていた（Ｄｙｌｌａ  ｅｔ  ａｌ（２００８），上掲）のに対し、結腸直腸腫瘍において、上記に定義されたＴＰＣ及びＴＰｒｏｇ細胞集団を濃縮するために組み合わせて用いた各タンパク質が、任意の組織又は腫瘍において、このような活性をもつ細胞と関連していることは知られていなかった。この機能により、この手法の性能はかなり改善され、更には移植時に単独で腫瘍生成能をもつ、別個の、非常に豊富に存在する固体腫瘍細胞下位集団を、同定、単離及び特徴付けするための技術が改善され、かつ腫瘍原性の細胞下位集団が、自己複製能を有するか否か（すなわち、それぞれＴＰｒｏｇ及びＴＰＣ）で識別されるようになる。それでも尚、ＴＰＣ及び非常に増殖性の高いＴＰｒｏｇ下位集団のいずれもが細胞表面でＣＤ４６を発現することから、ＣＤ４６標的モジュレータは、非常に増殖性の高い細胞（すなわち、ＴＰｒｏｇ）、及び腫瘍の増殖及び再発に関与する細胞（すなわち、ＴＰＣ）の両方を排除するにあたり、がん患者に有効なものであることが示唆された。
【０２５２】
その一方で、ＰｈｅｎｏＰｒｉｎｔアレイを用い同定したほとんどの細胞表面マーカーは、異なるマーカーを組み合わせて使用して、がん起始細胞に含まれる２つの下位集団（ＴＰＣ及びＴＰｒｏｇ）を同定し得る標準的なＦＡＣＳプロトコルを用い、結腸直腸腫瘍に含まれるがん起始細胞集団を濃縮した場合に、性能を示さなかった。
【０２５３】
（実施例４）
イリノテカン処理によるＣＤ４６ｈｉ腫瘍永続化細胞の発生頻度の上昇
がん幹細胞のパラダイムにおいて中心的な協議では、ＣＳＣ（すなわち、ＴＰＣ）は、イリノテカンなどの化学療法剤に対し比較的耐性である。ＣＤ４６ｈｉ  ＴＰＣが化学療法に耐性であるか否かを評価するため、マウスにＳＣＲｘ−ＣＲ４及びＣＲ１４結腸直腸腫瘍を起始させた。腫瘍容量の中央値が約３００ｍｍ３に達したならば、マウスは無作為化し、２０日間にわたって、１５ｍｇ／ｋｇイリノテカン又は対照（ＰＢＳ）の何れかにより週に２回処置し、２０日経過時点でマウスを安楽死させた（図４Ａ）。腫瘍を採取したところ、賦形剤処理したマウスが約７００ｍｍ３の腫瘍を有していた一方で、イリノテカンで処理したマウスでは、腫瘍は対照マウスのおよそ半分の大きさであった（約３８８ｍｍ３）。各処理群の腫瘍内ＴＰＣ発生頻度を、上記に定義した表現型ＥＳＡ＋  ＣＤ４６ｈｉ  ＣＤ３２４＋  ＣＤ６６ｃ−を用い定義したところ、腫瘍内ＴＰＣは、対照群のマウスと比較してイリノテカン処理群のマウスで２．５倍豊富に含まれていた（ｎ＝７；Ｐ＜０．０００１；図４Ｂ）。イリノテカン処理群では、それぞれ対照処理マウスと比較した場合に、小腫瘍においても明らかに豊富にＴＰＣが存在していたため、ＴＰＣ発生頻度の高さは腫瘍の大きさにより偏るものではなかった（図４Ｃ）。
【０２５４】
上記の、ＴＰＣ、及び非常に増殖性の高いＴＰｒｏｇ細胞集団が、いずれもＣＤ４６を発現するという観察結果、並びに処理後に残留していた腫瘍にＴＰＣが有意に豊富に存在していたという観察結果から、ＣＤ４６ｈｉ細胞が腫瘍の成長、再発及び治療耐性に強く関与していることが明示される。そのため、結腸直腸及び膵臓のいずれもについて複数の固形腫瘍からＣＤ４６ｈｉ細胞を単離し、次世代型配列決定プラットフォームのＳＯＬｉＤ３を用い、それぞれの腫瘍細胞下位集団についてすべてのトランスクリプトームを配列決定することで、タンパク質及び遺伝子発現をより詳細に研究した。
【０２５５】
（実施例５）
ＳＯＬｉＤによるすべてのトランスクリプトームの配列決定により、腫瘍永続化細胞集団中に存在するＣＤ４６スプライス変異体を明らかにする
いくつかの結腸直腸がん（ＳＣＲｘ−ＣＲ２、ＣＲ４、ＣＲ１１及びＣＲ１４）及び膵臓（ＳＣＲｘ−ＰＡ３及びＰＡ６）がんＮＴＸ細胞株を生成し、実施例１に記載の通りに継代し、免疫不全マウスに用い腫瘍を起始させた。これらのＮＴＸ株から生じた腫瘍を摘出し、摘出したばかりのＮＴＸ腫瘍から、各ＴＰＣ、ＴＰｒｏｇ及びＮＴＧ細胞を、実施例１に示した通りにＦＡＣＳを用い単離した。より具体的には、細胞集団は、ＣＤ４６、ＣＤ３２４及びＣＤ６６ｃマーカーを用い、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）により単離し、直ちにペレット化させ、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＬＴＰｌｕｓ  ＲＮＡ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）に溶解させた。この溶解液は、使用するまでの間−８０℃で保管した。解凍し、販売元の指示書に従ってＱｉａｇｅｎ  ＲＮＥａｓｙ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用い全ＲＮＡを抽出し、次に、販売元のプロトコル及び推奨される装置設定に従い、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用い定量化した。得られた全ＲＮＡ調製物は、遺伝子の配列決定及び解析に好適なものであった。
【０２５６】
ＴＰＣ、ＴＰｒｏｇ及びＮＴＧ細胞集団を、対照又はイリノテカン処理マウスから採取し、上記の通りに単離し、これらからＲＮＡ試料を得、次世代型配列決定プラットフォームのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳＯＬｉｄ  ３．０（配列決定はオリゴ単位でのライゲーション／検出に基づく）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、開始には全ＲＮＡを試料あたり少なくとも５ｎｇ用い、すべてのトランスクリプトームの配列決定を行った。ヒトゲノムから３４，６０９の遺伝子をマッピングしたＳＯＬｉＤプラットフォーム生成したデータによりＣＤ４６を検出することができた。すべての試料においてＣＤ４６の発現レベルが検証可能な測定値として得られた。
【０２５７】
一般的に、次世代型配列決定プラットフォームのＳＯＬｉＤ３は、クローンとして増幅させ、ビーズに結合させたＲＮＡ／ＤＮＡ断片を、並行して配列決定することができる。色素で標識したオリゴヌクレオチドとライゲーションさせ配列決定を行い、試料中に存在する各断片の５０塩基読み取り断片を生成した。合計５億以上の読み取り断片により、ゲノム中のタンパク質発現に関係するｍＲＮＡ転写レベルが正確に表される。ＳＯＬｉＤ３プラットフォームは、発現だけでなく既知及び未知の選択的スプライシングに関するＳＮＰも補足でき、かつ単に読み取り範囲に基づき新しくエキソンを発見できる可能性もある（読み取りマップは、ゲノムの配置に独特のものである）。したがって、この次世代型プラットフォームを使用することで、転写レベルでの発現における差異、並びにこれらの発現したｍＲＮＡ転写物の特定のスプライス変異体に関する差異又は優先度を決定することができる。更に、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの全トランスクリプトーム解析プロトコルに修正を加え、ＳＯＬｉＤ３プラットフォームにより解析したところ、増幅前の出発物質はわずかに約５ｎｇ程度しか必要とされなかった。選別した細胞集団から全ＲＮＡを抽出する際に、ＴＰＣサブセットが含まれる数が、例えば、ＮＴＧ又は腫瘍と比較して、非常に小さい場合、使用可能な出発物質はごく少量でしか得られないため、使用量が約５ｎｇ程度であることは重要である。ＳＯＬｉＤ３プラットフォームにおいて重複させて実施した結果得られた配列決定データを正規化し、形質転換させ、当業界で標準的な手法を用い倍数比を算出した。驚くべきことに、主にＣＤ４６タンパク質の表面発現の違いに基づいて単離したのにも関わらず、結腸直腸又は膵臓ＮＴＸ腫瘍株においてＣＤ４６遺伝子の発現を測定したところ、この発現はＣＤ４６ｈｉ又はＣＤ４６−／ｌｏ細胞集団間で著しく異なるものではなかった。
【０２５８】
より高等な哺乳動物では、タンパク質多様性の大部分は、翻訳時にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）によりコードされるエキソンの組み入れ又は除外（すなわち、選択的スプライシング）により生じる。トランスクリプトーム（すなわち、ｍＲＮＡ転写物）の配列決定により、特定の細胞集団にコードされるタンパク質についての有効な見通しが得られるのに対し、ｍＲＮＡの使用量及び／又は遺伝子発現を測定する他の技術は、更にかなりの作業（標的化再配列決定（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ））を必要とし、あるいはエクソン−エクソンジャンクションの使用（マイクロアレイ）について判断することができない。表２に示す通り、ＡＢＩ  ＳＯＬｉＤ３プラットフォームで、ｍＲＮＡ増幅プロトコル及びＮｅｘｔ−Ｇｅｎ配列決定を用い、全トランスクリプトームを配列決定することで得られたＣＤ４６転写物データの解析を基に、何人かの患者試料から得られたＴＰＣで発現していたＣＤ４６の主要な変異体ではエキソン１〜６、８〜１２及び１４が含まれるように周辺がスプライシングされており、したがってエキソン７及び１３が除外されていたことが示された（変異体Ｄ；ＮＭ＿１５３８２６）（表２）。同様に、ＴＰＣの大部分で発現していた次に主要な変異体は、エキソン８を読み飛ばしていたため、ＣＤ４６タンパク質に含まれるエキソンは１〜６、９〜１２及び１４に変化していた（変異体Ｆ；ＮＭ＿１７２３５３）。要約すると、結腸直腸及び膵臓ＴＰＣで発現されるすべての変異体はエキソン１〜６及び１０〜１４を使用しているものの、転写物の大部分は、タンパク質の細胞内部分をコードしているエキソン１３も読み飛ばしている。したがって、結腸直腸及び膵臓ＴＰＣにおいて発現したＣＤ４６転写物の多様性は、主にエキソン８の組み入れ又は除外に由来するものであった。他の結腸直腸腫瘍とは対照的に、ＳＣＲｘ−ＣＲ１４  ＮＴＸ腫瘍の転写物ではＣＤ４６エキソン７が使用されているが、これらのＣＤ４６変異体Ｊ（ＮＭ＿１７２３５６）転写物は、ＣＤ４６変異体Ｄの発現と比較するとやはりその量は少なかった（表２）。結腸直腸又は膵臓腫瘍細胞下位集団の転写物では、エキソン１３の使用はほとんど観察されなかった。
【０２５９】
【表３】
2013544493.tif 000004
それぞれのＮＴＸ腫瘍細胞下位集団から得たｍＲＮＡの全トランスクリプトーム配列決定により、翻訳後に使用されているＣＤ４６エキソンを正確に同定することができるようである。驚くべきことに、ＴＰＣ下位集団は、より分化している子孫細胞ＴＰｒｏｇ及びＮＴＧ細胞と同じＣＤ４６転写物を常にコード及び又は利用する訳ではないものと思われる。しかしながら、各腫瘍細胞下位集団においてコードされている転写物に関する情報は、ＴＩＣ集団で発現しているＣＤ４６タンパク質の標的治療の開発に役立つであろう。
【０２６０】
（実施例６）
ＲＴ−ＰＣＲによる、がん起始細胞濃縮細胞集団で発現しているＣＤ４６スプライス変異体の同定
ＳＯＬｉＤ全トランスクリプトーム配列決定により観察されたＣＤ４６のスプライス型が、ＮＴＸ腫瘍からＦＡＣＳにより単離したそれぞれの細胞集団において発現しているＣＤ４６型と実際に同一であるか評価するために、可溶化液を、１％  β−メルカプトエタノールを含有しているＲＬＴ−Ｐｌｕｓ緩衝液（製造元により供給）中で−７０℃にて保存した後、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用い全ＲＮＡを単離した。具体的には、解凍した可溶化液を、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用い懸濁し、ｇＤＮＡ  Ｅｌｉｍｉｎａｔｏｒカラムを用いゲノムＤＮＡを除去した後に、ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎｉＥｌｕｔｅスピンカラムに加え、全ＲＮＡを捕捉した。洗浄後、ＲＮａｓｅを不含有の水を用い全ＲＮＡを溶出した。単離した全ＲＮＡを、ＲＮＡ  ６０００  Ｐｉｃｏキットを用い、ＮａｎｏＤｒｏｐ  １０００分光光度計又はＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザのいずれかを使用して、製造元のプロトコルに従い定量した。次に、Ｑｕａｎｔａ  ｑＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ  ＳｕｐｅｒＭｉｘを用い、２０ｎｇの全ＲＮＡを逆転写し、ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼと、図５Ａに掲載のｅ６順方向及びｅ１４逆方向プライマーを用い、ＰＣＲにより増幅させた（アニーリング温度５４℃及び伸長温度７２℃で１分を４０サイクル）。観察された変異体間で保存されていたエキソン、すなわちエキソン６及び１４を利用し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＰｒｉｍｅｒＱｕｅｓｔ及びＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ３．０プログラムを用い、プライマー（配列番号１及び配列番号２）を設計した。１００ｂｐラダーのＤＮＡ分子量マーカーを用い、２％  Ｅ−Ｇｅｌで増幅産物を解析した。増幅後、ＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを用いＰＣＲ産物を精製し、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターにクローン化した。次にＴＯＰ１０細胞（配列決定用ＴＯＰＯ  ＴＡ  クローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いベクターを形質転換し、コロニーを挿入断片の存在の有無についてＰＣＲにより選別した。正しい挿入断片を含有しているプラスミドを、ＥＺＮＡプラスミドミニプレップキットＩ（Ｏｍｅｇａ  Ｂｉｏ−Ｔｅｋ）を用い単離し、Ｔ３及びＴ４配列決定プライマーを用い配列決定した。
【０２６１】
ＳＣＲｘ−ＣＲ５及びＳＣＲｘ−ＣＲ１１  ＮＴＸ腫瘍から単離したＣＤ４６ｈｉ細胞由来の、ＣＤ４６のエキソン６〜１４増幅産物を、図５Ｂのエチジウムブロマイド染色ゲルのレーン１（ＣＲ５）及び２（ＣＲ１１）に示す。分子量マーカー（１００ｂｐラダー）をレーンＬに、テンプレート不含対照（ＮＣ）を第４レーンに充填した。別個に分離したバンドを視認し、ｃＤＮＡを精製し、次に発現ベクターにクローン化し、バクテリアに導入した。単一のコロニーを採取し、Ｔ３及びＴ４プライマーを用い、上記に記載の通りに挿入断片を配列決定した。具体的には、ＣＲ５腫瘍細胞から増幅された主要な転写物には、エキソン６、９、１０、１１、１２及び１４（３２３ｂｐの増幅産物、変異体ＦすなわちｖＦ）が含まれていたのに対し、ＣＲ１１腫瘍細胞において主要に転写されていることが確認された転写物には、エキソン６、８、９、１０、１１、１２及び１４（３６８ｂｐの増幅産物、変異体ＤすなわちｖＤ）が含まれていた（図５Ｃ）。次に主要な転写産物について存在を検出し、確認したが（図５Ｃの表に示す）、バンドはかろうじて視認できる程度のものであった（データ不掲載）。ＳＣＲｘ−ＣＲ４  ＮＴＸ腫瘍株由来のＴＰＣ、ＴＰｒｏｇ及びＮＴＧ細胞集団から得たｍＲＮＡも増幅させ、配列決定したところ、上記の全トランスクリプトームＳＯＬｉＤ３配列決定で各種利用を確認していたのにもかかわらず、各種腫瘍細胞下位集団において、変異体Ｄ及びＦのより多義性の利用が示された（図５Ｃ）。
【０２６２】
（実施例７）
腫瘍及び濃縮細胞集団におけるＣＤ４６スプライス変異体の発現を決定するために設計したスプライス変異体特異的なプライマー／プローブを用いるｑＲＴ−ＰＣＲ
所定の細胞集団及び／又は全組織標本において、ＣＤ４６スプライス変異体の発現レベルをより迅速に確認するために、具体的には、エキソン６〜１２の利用について確認するために、ＡＢＩ  ７９００ＨＴリアルタイム定量的ＰＣＲ装置に適するよう特注でｑＲＴ−ＰＣＲプライマー及びＦＡＭプローブを設計した（図６）。各ＦＡＭプローブは、それぞれ、特定のスプライス変異体に特有の、特定のＣＤ４６エキソン−エキソンジャンクションを検出するよう設計し、標準的なＴａｑｍａｎ（登録商標）ｑＲＴ−ＰＣＲプロトコルを用い、少なくとも各サンプルを２本ずつ用意し、３８４ウェルプレートでＰＣＲを実施した。例えば、ＦＡＭ標識プローブは、エキソン８〜９ジャンクションを含むよう設計し、エキソン６、８、９及び１０を利用する転写物の使用率と区別した（ＣＤ４６変異体Ｃ、Ｄ及びＭ）及び６、７、８、９及び１０（ＣＤ４６変異体Ａ及びＢ）。同様にして、エキソン６〜９及び８〜１０の使用を捕捉するよう各ＦＡＭ標識プローブを設計したことで、転写物が、エキソン６、９及び１０（ＣＤ４６変異体Ｅ及びＦ）を利用しているのか、エキソン６、８及び１０（ＣＤ４６変異体Ｉ及びＪ）を利用しているのかを迅速に区別しかつｑＲＴ−ＰＣＲで定量することもできた。
【０２６３】
これまでの例に記載のデータ同様、１２の結腸直腸ＮＴＸ腫瘍により、主要な結腸直腸腫瘍では、ＣＤ４６エキソン６、８、９及び１０、又はＣＤ４６エキソン６、７、８、９及び１０を含む転写物が主要なスプライス変異体であることが示される（図６）。上記例に記載の通り、全トランスクリプトームの配列決定、及び捕捉した転写物の再配列決定によると、一次転写産物は６、８、９及び１０を利用しており、これらは概してエキソン７を含有していなかったことから、結腸直腸腫瘍で主要な一次転写産物はＣＤ４６変異体Ｄであることが示唆される。エキソン６、９及び１０（変異体Ｆ）、並びに６、８及び１０（変異体Ｊ）を利用している転写物も存在したが、ほとんどの患者において、それぞれ確実に量は少なかった（図６）。これらのエキソン−エキソンジャンクション特異的プライマー（配列番号：３〜８）についてスクリーニングした１２の試料のうち１つのものでは、すなわちＮＴＸ  腫瘍株ＳＣＲｘ−ＣＲ１５においては、エキソン６、９及び１０を発現している変異体が主要なＣＤ４６転写物であり、ＣＤ４６のエキソン６、８、９及び１０をコードしている転写物の発現は比較的弱かったことが示された。驚くべきことに、これらのデータ及び上記実施例で記載のデータによると、結腸直腸がん起始細胞では、ＣＤ４６一次スプライス変異体は、エキソン６、８、９及び１０（変異体Ｄ）又はエキソン６、９、及び１０（変異体Ｆ）のいずれかを利用する。結腸直腸腫瘍及び膵臓腫瘍のいずれもにおいて、ＣＤ４６が一貫して腫瘍惹起能に関連付けられ、かつこれらの細胞表面上で発現されるＣＤ４６タンパク質のコードには概してこれらの特異的エキソン−エキソンジャンクションが用いられることから、エキソンジャンクション６〜８、６〜９、及び割合は低いもののエキソンジャンクション８〜１０及び９〜１０（変異体Ｂ、Ｄ及びＦに存在する場合、エキソン１３も選択的に除外される）は、例えば、がん起始細胞に毒素を送達するか、又は細胞毒性Ｔ細胞を補充してこれらを除去する能力を持つ抗体の標的となる。
【０２６４】
（実施例８）
例示的な腫瘍試料におけるＣＤ４６タンパク質発現
これまでの実施例に記載される通り、ＴＩＣ上のＣＤ４６の表面発現の増加を記録し、これらの細胞及び腫瘍において、ＣＤ４６のコードに利用されているエキソンジャンクションを特徴付けした後で、同様の腫瘍試料においてＣＤ４６タンパク質が対応して増加することについての根拠を探索した。この観点から、逆相癌タンパク質ライセートアレイ（ＰｒｏｔｅｏＳｃａｎ（商標）アレイ、ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）には、１１の腫瘍型由来の４３２の組織ライセートの４種の希釈物、又はそれらの各々の隣接する正常な細胞組織と、外因性プロモーターによりＴＰ５３を過剰発現させていない、又は過剰発現させたＨＥＫ−２９３細胞からなる対照と共に用意した。このアレイで、抗ヒトＣＤ４６ウサギポリクローナル抗体（ＨＰＡ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）又は抗タンパク質コンストラクト（ＣＤ４６のエキソン６、８、９及び１０をコード）マウスモノクローナル抗体（以降実施例１０のＳＣ１．Ｎ２９）のいずれかを用い、ライセート中のＣＤ４６タンパク質発現を検出した。比色検出試薬及びプロトコルは、ＰｒｏｔｅｏＳｃａｎアレイの製造元により得た。作製したアレイ上のスポットは、ＢＺＳｃａｎ２  ｊａｖａソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｔａｇｃ．ｕｎｉｖ−ｍｒｓ．ｆｒ／ＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌＢｉｏｌｏｇｙ／ｂｚｓｃａｎ／）を用い、平台型スキャナによりデジタルイメージへと変換し、スポット強度を定量した。
【０２６５】
これらのアッセイの結果を図７Ａ〜７Ｃ及び図８Ａ〜Ｃに示す。ＣＤ４６タンパク質の発現が、種の異なる腫瘍型において上方制御されていることを示す。より詳細には、図７Ａ〜７Ｃは、ｐａｎ−ＣＤ４６抗体を採用し、疾患の様々なステージにわたる異なる腫瘍型を有する患者から得た標本由来（すなわち、腫瘍試料）の、隣接する正常な組織又は腫瘍組織における、ヒトＣＤ４６の発現レベルを示す。同様にして、図８Ａ〜８Ｃは、ＣＤ４６のエキソン１０と反応して、各種腫瘍試料中での発現レベルを示す、抗体を使用する。これまでに記載の通りにデータを生成し、スポットあたりの平均ピクセル強度（スポット強度）として表した。各データ群に関する直線プロットは、各分類に含まれる試料の中央値を表す。
【０２６６】
既知のすべてのＣＤ４６スプライス変異体に存在するエキソン１〜６によりコードされる領域内の領域を認識するｐａｎ−ＣＤ４６抗体（ＨＰＡ）を用い検出したところ、ＣＤ４６タンパク質の発現は、結腸直腸腫瘍標本のサブセット、特にステージＩＶの疾患患者の標本サブセットにおいて、有意に上昇していた（図７Ａ）。図７Ｂは、神経内分泌及び非神経内分泌形態の疾患を有する膵臓癌患者より得た腫瘍試料における発現レベルを示すのに対し、図７Ｃは、異なるステージの卵巣がん患者由来の試料における発現レベルを示す。同様にして、１４種のすべてのＣＤ４６転写物により利用されるＣＤ４６エキソン１０を認識する、より選択的な抗体（ＳＣ１．Ｎ２９、以降の実施例１５において特異性決定を行う）は、隣接する正常な組織と比べた場合に、より特異的に後期ステージの結腸直腸腫瘍（図８Ａ）、卵巣腫瘍（図８Ｂ）及び神経内分泌サブタイプの膵臓腫瘍（図８Ｃ）と反応していた。更に、ｐａｎ抗ＣＤ４６ポリクローナル抗体とは対照的に、ＣＤ４６エキソン１０特異的抗体（ＳＣ１．Ｎ２９）を用い標識した場合、隣接する正常な組織試料間のスポット強度及び標準偏差は有意に低かった。これらの結果は、上記腫瘍では、癌細胞においてはＣＤ４６タンパク質の発現が上方制御されていたが、正常組織ではＣＤ４６タンパク質の発現は最小であったことを示唆する。
【０２６７】
これらのデータは、上記実施例で見られた観察結果、すなわち、ＣＤ４６の過剰発現が、がん起始細胞及び／又はＴＰＣの増殖及び生存に関与している可能性があるという結果を支持する。ＣＤ４６の発現を示すこれまでの実施例から、結腸直腸及び膵臓腫瘍においてＴＰＣを豊富に含む細胞集団の境界が少なくとも一部画定され、並びにＣＤ４６の表面発現が腫瘍形成及び腫瘍増殖に関連することが少なくとも一部画定されたことを考慮して、抗ＣＤ４６抗体の生成に使用し得るＣＤ４６免疫原を構築することにした。
【０２６８】
（実施例９）
可溶性ＣＤ４６コンストラクトの作製及び発現
ＣＤ４６モジュレータの生成及び特徴付けに使用するため、Ｄ、Ｆ及びＪ型アイソフォームを用い、可溶性ＣＤ４６コンストラクトを３種作製した。
【０２６９】
腫瘍試料Ｃｄ４ｐ２から得たｃＤＮＡをもとにＰＣＲを行い、ＣＤ４６アイソフォームＤ（ＣＤ４６遺伝子のエキソン１〜６、８〜１２、及び１４；コード配列ＮＭ＿１５３８２６に相当）、及びアイソフォームＦ（エキソン１〜６、９〜１２、及び１４；コード配列ＮＭ＿１７２３５３に相当）の全長ＯＲＦを、ｐＥＮＴＲベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローン化した。ＤＮＡ配列決定により、アイソフォームＦクローンには、ＮＣＢＩの参照配列（ＮＭ＿１７２３５３）に関連する変異が含まれないのに対し、アイソフォームＤクローンには、翻訳領域のヌクレオチド＋８２２（ここで＋１とは、野生型ＣＤ４６のＯＲＦの開始配列ＡＴＧにおいて「Ａ」を示す）に単一のＣ→Ｔサイレント変異が含まれていたことが示された。ＣＤ４６アイソフォームＤのｃＤＮＡをテンプレートとして用い、スプライス部位重複伸長ＰＣＲ（ｓｐｌｉｃｅ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ）により、ＣＤ４６アイソフォームＪ（エキソン１〜６、８、１０〜１２、及び１４；ＮＭ＿１７２３５６のｃｄｓに相当する）の完全長の翻訳領域を生成した。ＤＮＡの配列決定を行い、上記のサイレント変異以外の変異がアイソフォームＪクローン中に存在していないことを確認した。
【０２７０】
これらの３種のＣＤ４６変異体のそれぞれから得た細胞外ドメイン（ＥＣＤ）コード配列を、ＰＣＲにより、ｐＳｅｃ−２−Ｈｙｇｒｏベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、マウスＩｇ  κ−鎖リーダー配列と８×Ｈｉｓタグとをフレーム内に含むようクローン化した。３種のＣＤ４６  ＥＣＤのｃＤＮＡは、各アイソフォームのすべてで成熟型Ｎ端末残基（Ｃｙｓ３５）から開始され、膜貫通型ドメイン（変異体アイソフォームの残基３４３に相当）まで続くＣＤ４６タンパク質をコードする。すべてのｃＤＮＡコンストラクトは、高忠実度ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ（商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いＰＣＲにより生成し、ｐＳｅｃ−Ｔａｇ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に固有のＳｆｉＩ−ＰｍｅＩ部位にクローン化した。異なるＣＤ４６スプライス変異体をコードしているプラスミドにより、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を一過性に形質転換した。一過性に形質転換させた細胞の培養上清から、Ｎｉアフィニティカラムにより、ヒスチジンタグと融合させた可溶性の分泌型ＣＤ４６  ＥＣＤタンパク質を精製した。ｐＨ  ７．２のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用い、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にてサイズ排除クロマトグラフィーを行い、タンパク質更に精製した。
【０２７１】
得られるコンストラクト、ＣＤ４６Ｄ−Ｈｉｓ（配列番号９）、ＣＤ４６Ｆ−Ｈｉｓ（配列番号１０）、及びＣＤ４６Ｊ−Ｈｉｓ（配列番号１１）のアミノ酸配列を、次に示す。
【０２７２】
【化１】
2013544493.tif 000005
（実施例１０）
ＣＤ４６モジュレータの生成
本開示の技術に従って、ＣＤ４６Ｄ−Ｈｉｓを用い接種を行い、ＣＤ４６モジュレータをマウス型抗体の形態で調製した。この調製に関し、マウス細胞株を３種用い、異常増殖性疾患の治療の際に、ＣＤ４６の作用を阻害するために使用することのできる、高親和性のマウスモノクローナル抗体を生成した。具体的には、ヒト組み換えＣＤ４６により、Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＤ−１、及びＦＶＢマウスの細胞株を免疫化し、次のとおりにハイブリドーマの調製に使用した：
抗原
マウスを、実施例９のＣＤ４６−Ｄ−Ｈｉｓの細胞外ドメインを含む組み換え融合タンパク質と、ＣＤ４６タンパク質配列に由来しかつエキソン−エキソンジャンクションがエキソン６〜８及び６〜９に位置する２種類の合成ペプチドと、の両方により免疫化した。
【０２７３】
固相合成法（ＡｎａＳｐｅｃ社）により、ペプチド（２１〜２２アミノ酸長さ）を合成した。ＣＤ４６タンパク質に含まれるペプチドのアミノ酸配列は次の通りである。
【０２７４】
エキソン６〜８ジャンクション：ＣＶＰＫＳＬＫＶＳＴＳＳＴＴＫＳＰＡＳＳＡＳ（配列番号１２）
エキソン６〜９ジャンクション  ＰＶＰＫＳＬＫＧＰＲＰＴＹＫＰＰＶＳＮＹＰＧ（配列番号１３）
免疫
雌Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＤ−１及びＦＶＢマウスの細胞株を用い、抗ＣＤ４６マウスモノクローナル抗体を調製した。合成ＣＤ４６ペプチド１及び２（各免疫につき、マウス１匹あたり５０μｇ）を、組み換え型ＣＤ４６Ｄ−Ｈｉｓ（マウス１匹あたり１０μｇ）と組み合わせた混合物を、足底注射により１０回投与し、マウスを免疫した。注射前に、免疫原混合物は等量のＴＩＴＥＲＭＡＸ又はアラムアジュバントにより乳化した。
【０２７５】
抗ＣＤ４６マウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの生成
血清が陽性を示した免疫マウスを屠殺し、流入領域リンパ節を（拡張されているならば膝窩及び鼠径部）を取り外し、抗体産生細胞の供給源として使用した。電気融合法により、１：１比でＢ細胞の単個細胞懸濁液（６．３５×１０７細胞）を、非分泌型Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ  ＃ＣＲＬ−１５８０）と融合させた。ＥＣＭ２００１型ｆｕｓｉｏｎ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃ社）を用い、電気的細胞融合を実施した。ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ  ＃Ａ９６６６）を添加し、１５％  Ｆｅｔａｌ  Ｃｌｏｎｅ  Ｉ  ｓｅｒｕｍ  （Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、１００μＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプリテン、及び１６μＭチミジンを含有させたハイブリドーマ選別培地（ＤＭＥＭ（Ｃｅｌｌｇｒｏカタログ番号１５−０１７−ＣＭ））に、細胞を再懸濁し、次いで最終的なＢ細胞播種数が９６ウェルプレートあたり２×１０６個になるように、２００μＬ／ウェルを２０枚の９６ウェル平底組織培養プレートに播種した。次に、このプレートを、５％  ＣＯ２及び９５％大気に設定した、調湿した３７℃インキュベータに７〜１０日間入れた。
【０２７６】
抗ヒトＣＤ４６抗体のスクリーニング：
１５枚の９６ウェルプレートから得た培養上清をＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。より具体的には、遺伝子導入したＨＥＫ−２９３細胞由来の、精製組み換え型ＣＤ４６Ｄ−Ｈｉｓ融合タンパク質の炭酸緩衝液溶液により、ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートを１００ｎｇ／ウェルでコーティングした。プレートを４℃で一晩インキュベートし、次に２００μｌ／ウェルの３％  ＢＳＡ／ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）でブロッキングした。ハイブリドーマを培養したプレートから得た上清を各ウェルに加え、室温で１〜２時間インキュベートした。このプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次に（ｔｈａｎ）抗ヤギマウスＩｇＧ（Ｆｃ断片特異的）を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｒｏｘｉｄａｓｅ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で室温で１時間標識した。洗浄後、このプレートはＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ３４０２８）で発色させ、分光光度計によりＯＤ  ４５０で解析した。
【０２７７】
細胞培地で増殖させた、ＣＤ４６特異的ハイブリドーマ（抗原と反応させた１５４の培養上清）を再播種し、再スクリーニングし、限界希釈から始め段階的にサブクローン化し、又は単個細胞をＦＡＣＳ選別した。得られたクローン集団を増殖させ、冷凍培地（９０％ＦＢＳ、１０％  ＤＭＳＯ）で冷凍保存し、及び液体窒素中に保管した。
【０２７８】
（実施例１１）
フローサイトメトリーによるＣＤ４６モジュレータ評価
フローサイトメトリーアッセイ用に、５０×１０６個のＳＷ４８０細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＣＬ−２２８；ヒトＣＤ４６を天然に高発現することが既知）を、最終濃度が２．５×１０６細胞／ｍＬになるように同数のチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｓ；ヒトＣＤ４６を発現しない）と混合した。１５枚の９６ウェルプレートの各ウェルで、実施例１０に記載のとおりに得た異なるクローンから得られたＣＤ４６抗体を含有している細胞上清２５μＬに細胞混合物２０μＬを加えた。試料を穏やかにボルテックス処理し混合して、プレートを４℃にて３０分間インキュベートした。次に細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次に４℃の暗所にてＤｙＬｉｇｈｔ６４９抗マウスＩｇＧ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  Ｉｎｃ．）により３０分間染色した。インキュベート後、細胞をＰＢＳにより洗浄し、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール；死細胞を解析から除外するため）により対比染色した。陽性対照試料は、１：１００希釈した市販のマウスモノクローナルＣＤ４６抗体（ＭＥＭ−２５８；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用い調製し、陰性対照は抗マウスＩｇＧのみで標識した。試料はフローサイトメトリーにより解析した。
【０２７９】
上記に記載のフローサイトメトリープロトコルを用い、１５４の陽性ハイブリドーマのうち１１４の上清（１，４４０のプロスペクティブなＣＤ４６抗体を発現しているハイブリドーマクローン以外のもの）を、細胞表面上のヒトＣＤ４６と相互作用する抗体を含有しているかについて判定した（データ不掲載）。フローサイトメトリーによる抗体スクリーニングにより、本発明のモジュレータは、細胞表面のＣＤ４６発現の特徴付け、及びＣＤ４６陽性細胞の探知に効果的に使用出来ることが示された。
【０２８０】
（実施例１２）
ＣＤ４６モジュレータの内部移行
抗ＣＤ４６抗体を産生するハイブリドーマから上清を得、この上清を、細胞表面にＣＤ４６を発現するＫ５６２細胞に内部移行する能力についてスクリーニングした。初期濃度１０６／ｍｌのＫ５６２細胞（単個細胞懸濁液）を、Ｈｕｍａｎ  ＴｒｕＳｔａｉｎ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  Ｉｎｃ．）により室温で１０分間ブロッキングし、各条件につき５×１０４細胞に希釈した。２つずつ用意した試料を、次に最終容量５０μＬにて、氷上で、抗体を含有している細胞上清を用い、３０分間染色した。細胞を次にＦＡＣＳ染色培地（ＦＳＭ；２％ウシ胎児血清／ハンクス平衡塩類溶液／２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］）で洗浄し、未結合の抗体を除去した。この工程後、抗マウスロバ抗体Ａｌｅｘａ６４７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により氷上で３０分第２染色した。試料を再度洗浄し、未結合の抗体を除去し、次いで内部移行培地に再懸濁した（２％ウシ胎仔血清／イスコフ改変ダルベッコ培地）。
【０２８１】
内部移行させるために、試料を５％  ＣＯ２、３７℃（又は対照は４℃）にて１時間インキュベートした。次に試料を氷冷し内部移行を停止させ、過剰量の氷冷ＦＳＭを加えた。内部移行せず、細胞表面に残存している、任意の抗体を除去するために、試料を、氷上で、低ｐＨのＰＢＳ（ｐＨ  ２．０）により１０分間処理した。この「酸による除去」後、試料をＦＳＭにより大規模に洗浄し、２μｇ／ｍＬ  ＤＡＰＩを含有させた１５０ｕｌのＦＳＭに再懸濁し、フローサイトメトリーにより解析した。抗体が内部移行（酸による除去工程時に、細胞表面からの除去から蛍光標識が保護される）した結果として、バックグラウンドを超える任意のシグナルが得られる。別途記載のない限り、すべてのインキュベーションはＦＳＭにて行った。
【０２８２】
上記の酸による除去プロトコルにより、抗ＣＤ４６抗体含有ハイブリドーマクローンの培養上清を少なくとも７５試料スクリーニングしたところ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ｂの陰性対照抗体と比較して、多くの上清の蛍光が陽性に転換していた（図９Ａ）。例えば、代表的なＳＣ１．Ｎ１４９及びＳＣ１．Ｎ７１のクローンは、これらのクローンから得た上清中に含まれる抗体が内部移行できるものであり、Ａｌｅｘａ６４７二次抗体を酸による除去から保護するという範囲内に含まれる、優れた内部移行を示した。これらのデータは、ヒトＣＤ４６スプライス変異体特異的ペプチドに対し生成された抗体サブセット及びＣＤ４６Ｄ−Ｈｉｓが、細胞上に存在する抗原に結合し、内部移行することができることを実証する（図９Ａ）。
【０２８３】
（実施例１３）
標的部位としてのＣＤ４６モジュレータ
抗体に安定的に結合させた細胞毒性薬を標的化させることで、固体腫瘍に罹患している患者に対し優れた治療効果を有し得る抗体によるアプローチが示される。上記のＣＤ４６特異的抗体が生細胞への細胞毒性剤の送達を介在し得るか否かを評価するため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞致死アッセイを実施した。このアッセイでは、リボソーム不活性化タンパク質のサポリン（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と複合体形成させた抗マウス２次抗体をマウスＦｃ領域を介しＣＤ４６抗体に結合させ、これらのサポリン複合体が細胞に内部移行しかつ細胞を殺傷する能力を、７２時間後に細胞の生存能を評価することで評価した。
【０２８４】
具体的には、ウェルあたり５，０００個のＫ５６２細胞を９６ウェルプレートのウェルに蒔いた。抗体を含有している上清からスクリーニングするか、あるいは上清から精製し、次に２０μｇ／ｍＬに希釈してスクリーニングするかのいずれかにより、上記の抗ＣＤ４６抗体をスクリーニングした。各抗体のアリコートをそれぞれ、抗マウスＺＡＰ又はＩｇＧ−ＺＡＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と１：１で混合し、５秒ボルテックス処理し、次に室温で１時間インキュベートした。次に、抗体−サポリン複合体を更に２回連続１０倍希釈し、各混合物からそれぞれ５０μＬを、５０μＬの培地とＫ５６２細胞とを予め分取しておいたウェルに加えた。次に、細胞／抗体複合体混合物を３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベート後、細胞を丸底９６ウェルプレート中でスピンダウンさせ、上清を除去し、新鮮な培養培地を各ウェルに１００μＬずつ加えた。この細胞を次に更に７２時間インキュベートし、次に製造元のプロトコル通りにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｉｎｃ．）を用い、生存細胞数を計数した。
【０２８５】
サポリン毒素の内部移行を介在する能力について、並びに上記の通りの細胞殺傷能について、ＣＤ４６特異的内部移行抗体クローンをスクリーニングしたところ、実施例１２の内部移行アッセイで内部移行することのできたすべての抗体クローンでｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて細胞の殺傷を介在することができた一方、非特異的なマウスＩｇＧ  ＳＡＰ抗体対照には細胞殺傷能はなかった（図９Ｂ）。これらの観察から、本開示の抗ＣＤ４６抗体の内部移行により、細胞への細胞毒性毒素の送達を介在することができ、例えば、結果として、ＣＤ４６ｈｉ細胞が死滅することが確認される。腫瘍の再生に関与し、かつ治療耐性をもつ結腸直腸及び膵臓腫瘍細胞上記の通りＣＤ４６ｈｉであることから、本明細書に記載のモノクローナル抗体は、現行の標準的な治療法と比べて患者の全生存率に有意に作用し得る治療薬として非常に有望である。
【０２８６】
（実施例１４）
ＣＤ４６モジュレータの配列決定
ここまでの例により、固定化したヒトＣＤ４６と明らかに高親和的に結合する、数多くの例示的な異なるモノクローナル抗体を選別した。図１１Ａ及び図１１Ｂに表で示す通り、実施例１０のｍＡｂｓをコードしているＤＮＡの配列解析により、その多くが特有のＶＤＪ再編成を有し、かつ新規相補性決定領域を示していたことが確認された。（注；図１１Ｂに示す相補性決定領域は、上掲Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．に記載の通りのものである。）
配列決定を始めるにあたり、ＴＲＩＺＯＬ試薬をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から購入した。ワンステップＲＴ  ＰＣＲキット及びＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットはＱｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．から購入し、ＲＮａｓｉｎはＰｒｏｍｅｇａから購入した。カスタムオリゴヌクレオチドはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。
【０２８７】
ＲＮＡ調製の際、ハイブリドーマ細胞はＴＲＩＺＯＬ試薬に溶解させた。１０４μＬ〜１０５μＬの細胞を、１ｍＬ  ＴＲＩＺＯＬに再懸濁させた。２００μＬクロロホルムを加え、チューブを激しく振盪させた。試料を４℃で１０分間遠心した。水相を新しいマイクロチューブに移し、等量のイソプロパノールを加えた。チューブを激しく振盪させ、室温で１０分インキュベートした。次に試料を４℃で１０分間遠心した。ペレットを１ｍＬ  ７０％エタノールで１度洗浄し、室温で簡単に乾燥させた。ＲＮＡペレットを４０μＬのＤＥＰＣ処理水に再懸濁した。調製したＲＮＡの品質を、１％アガロースゲルで３μＬを分離させて評価した。ＲＮＡは、使用時まで−８０℃のフリーザに保管した。
【０２８８】
マウス免疫グロブリン重鎖に特異的なコンセンサスプライマーのセットによりハイブリドーマの可変ＤＮＡ配列を増幅させ、及び可変領域プライマーの混合物を用いκ軽鎖を得た。ワンステップＲＴ−ＰＣＲキットを使用し、各ＲＮＡ試料からＶＨ及びＶＫ遺伝子断片を増幅した。ＱｉａｇｅｎワンステップＲＴ−ＰＣＲキットには、Ｓｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ及びＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素のブレンド、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＱｉａｇｅｎワンステップＲＴ−ＰＣＲ緩衝液、ｄＮＴＰミックス及びＱ−Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、「増幅の難しい」（例えば、ＧＣリッチな配列）テンプレート配列を効果的に増幅することのできる新規添加剤、が含まれる。
【０２８９】
ＲＮＡ  ３μＬ、１００μＭ重鎖又はκ軽鎖プライマーのいずれかを０．５、５×ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液を５μＬ、ｄＮＴＰを１μＬ、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼを含有している酵素ミックスを１μＬ、及びリボヌクレアーゼ阻害剤ＲＮａｓｉｎ（１ユニット）０．４μＬを含む反応混合物を調製した。反応混合物は、逆転写及びＰＣＲのいずれにも必要とされる試薬をすべて含有する。サーマルサイクラーのプログラムは、ＲＴ−ＰＣＲ工程は５０℃で３０分、９５℃で１５分の後に、（９５℃で３０秒、４８℃で３０秒、７２℃で１．０分）を３０サイクルとして設定した。その後、最後に７２℃で１０分インキュベートした。
【０２９０】
ＤＮＡの配列を直接決定するため、ＰＣＲ産物は製造元のプロトコルに従ってＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）ＰＣＲ精製キットにより精製した。５０μＬ滅菌水によりスピンカラムからＤＮＡを溶出させ、次に両方の鎖を直接配列決定した。ＰＣＲ断片を直接配列決定し、ＶＢＡＳＥ２を用いＤＮＡ配列を解析した（Ｒｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３３；６７１〜６７４，２００５）。
【０２９１】
上記のようにして、１８の例示的な抗体重鎖及び軽鎖可変領域に関するアミノ酸及び核酸配列をそれぞれ図１０Ａ〜１０Ｒに示し（配列番号：１４〜８５）、それに対しこれらの抗ｈＣＤ４６抗体に関する遺伝子の構成及び誘導されるＣＤＲ（上掲Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．により定義される通りのもの）は、それぞれ図１１Ａ及び１１Ｂに表として示す（配列番号：８６〜１９３）。
【０２９２】
注目すべきは、１８のモノクローナル抗体のうち、有意な画分（５０％）が、ＶＫ１０及びＶＫ１４軽鎖生殖系列断片を含有していると配列決定された。より詳細には、免疫したマウスレパートリーでは、ＩＧＫＶ１０−９４及びＩＧＫＶ１４−１１１遺伝子を使用する傾向が強かった。更なる解析により、１８のｍＡｂｓのうち６つがＩＧＫＶ１０−９４遺伝子を使用し、１９のｍＡｂｓｍのうち３つがＩＧＫＶ１４−１１１遺伝子を使用していることが示された。ＩＧＫＶ１４−１１１遺伝子断片を使用している３つの抗体（ＳＣ１．Ｎ５６、ＳＣ１．Ｎ６６及びＳＣ１Ｎ７７）は、ＣＤ４６  ｓｕｓｈｉドメイン１内に存在するエピトープを認識する。ＩＧＫＶ１０−９４遺伝子断片を使用している６つの抗体のうち５つはＳｕｓｈｉドメイン３〜４内のエピトープを認識する。クローン選別法の性質は明らかではないものの、これらの生殖系列遺伝子断片のＣＤＲ領域は、ＣＤ４６の抗原決定基に結合するのに望ましい立体構造を形成する。同時に、可変領域には、重鎖で観察されるような傾向はなかった。
【０２９３】
（実施例１５）
ＣＤ４６モジュレータのエピトープ決定
上記のように、ＣＤ４６はＩ型膜糖タンパク質であり、細胞外ドメインであるアミノ末端ドメイン（すなわち、エキソン１〜６にコードされ、すべてのＣＤ４６転写物に共通）は４つのショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）からなる。これらの各ＳＣＲは約６０個のアミノ酸からなるシステインリッチドメインである。ＣＤ４６の４つのＳＣＲの後にはＳＴＰドメインが続き、上掲Ｋａｒｏｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（引用によりその全体を本明細書に組み込む）に記載の通りに、このドメインにより３種のスプライス変異体、すなわちＣＤ４６Ｄ、ＣＤ４６Ｆ及びＣＤ４６Ｊが定義される。ｐａｎ−ＣＤ４６抗体（すなわち、１種以上のＳＣＲを結合する抗体）と抗ＣＤ４６抗体アイソフォームとを区別するため、概して実施例９に示す通りにｐＳｅｃ−Ｔａｇベクターによりｐａｎ−ＣＤ４６  ＥＣＤ−Ｆｃコンストラクトを生成した。このコンストラクトは４種のＳＣＲ（すなわち、エキソン１〜６）をコードするものであり、ＣＤ４６  ＥＣＤ変異体に関する上記の手法と同様の手法を用い、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞においてＣＤ４６  ＥＣＤ−Ｆｃを発現させる際に使用した（データ不掲載）。各ハイブリドーマの上清を、ｐａｎ−又はアイソフォーム特異的ＣＤ４６  ＥＣＤタンパク質のそれぞれとの結合性について試験した。ＣＤ４６抗原を、実施例９のＣＤ４６エキソン１〜６及びＣＤ４６Ｄ−Ｈｉｓ、ＣＤ４６Ｆ−Ｈｉｓ及びＣＤ４６Ｊ−Ｈｉｓから誘導し、Ｈｉｓ−タグ精製し、これによりＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。各モノクローナル抗体を、ＨＲＰ標識した抗マウスヤギＩｇＧにより検出した。Ｐａｎ−ＣＤ４６抗体を、ＣＤ４６細胞外ドメインの最初の６つのエキソンを含み、エキソン７〜１０は欠落しているＣＤ４６抗原と反応する能力をもとに識別した。１６０のうち１５５のｍＡｂｓが、外部ドメインを発現していたすべてのＣＤ４６組み換え体と結合し、ｐａｎ抗体であることが判明した。５つのｍＡｂはＣＤ４６の最初の６つのエキソン中のエピトープは認識しなかったものの、３種のスプライス変異体、すなわちＣＤ４６Ｄ、ＣＤ４６Ｆ及びＣＤ４６Ｊを定義するＳＴＰドメインは認識した。
【０２９４】
図１２Ａは、ＳＣ１．Ｎ１２２及びＳＣ１．Ｎ２９抗体のＥＬＩＳＡデータをグラフ表示する。このデータは、ＳＣ１．Ｎ１２２は、ＣＤ４６のエキソン１〜６（すなわち、ＣＤ４６ＥＣＤ−Ｆｃ）、ＣＤ４６Ｄ−Ｈｉｓ、ＣＤ４６Ｆ−Ｈｉｓ及びＣＤ４６Ｊ−Ｈｉｓに結合したことからｐａｎ−ＣＤ４６抗体であることを示す。それに対しＳＣ１．Ｎ２９はＣＤ４６のエキソン１〜６に対してほとんど又は全く結合しなかったものの、ＣＤ４６Ｄ−Ｈｉｓ、ＣＤ４６Ｆ−Ｈｉｓ，及びＣＤ４６Ｊ−Ｈｉｓに対しては結合を示した。したがって、これらのデータは、ＳＣ１．Ｎ２９は、エキソン８、及びエキソン９によりコードされるＳＴドメインに結合し、あるいはエキソン１０内の膜近接ドメインに結合することを示す。
【０２９５】
ＳＣ１．Ｎ２９により認識されるＣＤ４６領域をより詳細に識別するために、ＣＤ４６の各種エキソン−エキソンジャンクションから誘導した合成ペプチドをＥＬＩＳＡプレートに直接コーティングした。これらのペプチドに対するＳＣ１．Ｎ２９の結合を、ＨＲＰ標識抗マウスヤギＩｇＧにより検出した。図１２Ｂに示す通り、ＳＣ１．Ｎ２９は、エキソン９−エキソン１０ジャンクションから誘導したペプチド４に結合した。ＳＣ１．Ｎ２９が、ペプチド４（図１２Ｂ）及びＣＤ４６Ｊ（図１２Ａ）に結合したこと、並びにこのペプチドとＣＤ４６Ｊタンパク質はこれらの残基のみが共通していることから、これらのデータにより、ＳＣ１．Ｎ２９がエキソン１０内の領域に結合することが示唆された。
【０２９６】
（実施例１６）
ＣＤ４６モジュレータ用モノクローナル抗体のヒト化処理
コンピュータを用いるＣＤＲグラフト法（Ａｂｙｓｉｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ，ＵＣＬ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｐｌｃ．）並びに標準的な分子設計法によりマウス抗体ＳＣ１．Ｎ７１及びＳＣ１．Ｎ１４９をヒト化し、ｈＳＣ１．Ｎ７１及びｈＳＣ１．Ｎ１４９モジュレータを得た。マウスフレームワーク配列に対して最も相同性が高くなる配列、及びそのカノニカル構造に基づき、可変領域のヒトフレームワーク領域を選別した。各ＣＤＲドメインに割り当てられたアミノ酸を解析するにあたり、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌの付番に従う。最適なヒト化抗体を精製するために、いくつかのヒト化抗体変異体を作成した。いずれのヒト化抗体も、マウスハイブリドーマ由来の抗原結合相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトフレームワーク領域と会合させて保持する。ヒト化ＳＣ１．Ｎ７１ｍＡｂは、ＣＤ４６抗原に結合する際の結合親和性が改善されていたのに対し、ヒト化ＳＣ１．Ｎ１４９  ｍＡｂは、マウス対応物の場合と同様の抗原結合親和性を保有している。
【０２９７】
当該技術分野で認識されている手法を用い分子設計を行った。この目的に際し、製造元のプロトコル（Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）Ｐｌｕｓ  ＲＮＡ精製システム，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って、ハイブリドーマから全ｍＲＮＡを抽出した。完全マウスレパートリーを標的とするよう設計した、３２種のマウス特異的５’リーダー配列プライマーからなるプライマーミックスを、３’マウスＣγ１プライマーと組み合わせて使用して、抗体重鎖可変領域を増幅及び配列決定した。同様に、各Ｖｋマウスファミリーを増幅するよう設計した３２種の５’Ｖｋリーダー配列のプライマーミックスを、マウスκ定常領域に特異的な単一の逆方向プライマーと組み合わせて使用して、κ軽鎖を増幅及び配列決定した。ＶＨ及びＶＬ転写物を、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により１００ｎｇの全ＲＮＡから増幅させた。
【０２９８】
各ハイブリドーマに関し、合計８回のＲＴ−ＰＣＲ反応反応を実施した。８回のうち４回はＶκ軽鎖を、４回はＶγ重鎖（γ１）を増幅させた。増幅にはＱＩＡＧＥＮワンステップＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を使用した。抽出したＰＣＲ産物を、特定のＶ領域プライマーを用い直接配列決定した。ＩＭＧＴを用い、ヌクレオチド配列を解析して、生殖系列Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子のメンバーが最も高い配列相同性を有することを確認した。得られた配列に対し、Ｖ−ＢＡＳＥ２（上掲Ｒｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ）を用い、ＶＨ及びＶＬ遺伝子をマウス生殖系列のデータベースとアラインメントし、生殖系列の既知のＤＮＡ配列ＩｇＶ及びＪ領域と比較した。
【０２９９】
ヌクレオチド配列の情報から、ＳＣ１．Ｎ７１及びＳＣ１．Ｎ１４９の重鎖及び軽鎖のＶ、Ｄ及びＪ遺伝子断片に関するデータを得た。組み換えモノクローナル抗体をクローニングするため、配列データに基づき、抗体のＩｇ  ＶＨ及びＶＫ鎖のリーダー配列に特異的な、新しいプライマーセットを設計した。続いてＶ−（Ｄ）−Ｊ配列をマウスＩｇ生殖系列の配列とアラインメントした。重鎖遺伝子のＮ７１がＶＨＱ５２．ａ１３．３７（Ｖ）、ＤＳＰ２．９（Ｄ）及びＪＨ３として同定されたのに対し、重鎖遺伝子のＮ１４９はＩＧＨＶ１−１８（Ｖ）、ＤＳＰ２．８（Ｄ）及びＪＨ３として同定された。いずれのｍＡｂｓも、軽鎖遺伝子は、ＩＧＫＶ１０−９４及びＪＫ１生殖系列遺伝子ファミリーに由来するものであった。
【０３００】
ＳＣ１．Ｎ７１から得られた重鎖及び軽鎖配列を機能性ヒト可変領域の配列とアラインメントさせ、相同性及びカノニカル構造について再調査した。解析をもとに、ヒト化ＳＣ１．Ｎ７１コンストラクトに使用するために、フレームワークにアミノ酸置換を持たないＶＨ４−５９生殖系列及びＪＨ４Ｊ断片を選別した。ヒト化ＳＣ１．Ｎ７１重鎖の可変領域は、ヒトＶＨ４〜５９生殖系列配列に対して８８％の配列相同性を示し、かつマウス可変領域に対しては７８％の配列相同性を示す。ＳＣ１．Ｎ７１軽鎖に同様の手順を実施し、フレームワークにアミノ酸置換が存在しないヒト生殖系列のＶＫ  Ｏ２及びＪ断片ＪＫ１を選別した。得られた、ｈＳＣ１．Ｎ７１κ軽鎖由来の可変領域は、ヒトＶＫ  Ｏ２生殖系列の配列に対して９０％の配列相同性を示し（陽性Ｚスコア（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｚ  ｓｃｏｒｅ  ｖａｌｕｅ）は０．９４５）、かつマウス可変領域に対して８５％の配列相同性を示す。ヒト化ＳＣ１．Ｎ７１重鎖（配列番号：１９８及び１９９）、及びヒト化軽鎖（配列番号：２００及び２０１）の核酸配列及び対応するアミノ酸配列を図１３Ａに示し、ＣＤＲ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．により定義される通りのもの）に下線を付する。
【０３０１】
ｈＳＣ１．Ｎ１４９の誘導後に同様の手順を行った。この解析により、フレームワークにアミノ酸置換の存在しないＶＨ１−１８遺伝子断片及びＪ断片ＪＨ４を含むヒト化重鎖を得た。ヒト化ＳＣ１．Ｎ１４９重鎖重鎖の可変領域は、ＶＨ１−１８生殖系列配列に対して８７％の配列相同性を示し、かつマウス可変領域に対しては７７％の配列相同性を示す。軽鎖可変領域の解析では、フレームワークに置換の存在しないＶＫ  Ｏ２及びＪ断片が有効であると示された。ヒト化ＳＣ１．Ｎ１４９κ軽鎖由来の可変領域は、ヒトＶＫ  Ｏ２生殖系列の配列に対して８７％の配列相同性を示し（陽性Ｚスコアは０．９４２）、かつマウス可変領域に対して８０％の配列相同性を示す。ヒト化ＳＣ１．Ｎ１４９重鎖（配列番号：２０２及び２０３）、及びヒト化軽鎖（配列番号：２０４及び２０５）の核酸配列及び対応するアミノ酸配列を図１３Ａに示し、ＣＤＲ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．により定義される通りのもの）に下線を付する。
【０３０２】
両方の重鎖の合成ヒト化可変ＤＮＡ断片（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、ヒトＩｇＧ１発現ベクターにクローン化した。可変軽鎖断片をヒトＣ−κ発現ベクターにクローン化した。重鎖及び軽鎖をＣＨＯ細胞に同時導入し、抗体を発現させた。
【０３０３】
より具体的には、抗体産生に際し、マウス及びヒト化可変遺伝子ＰＣＲ産物を、ヒト免疫グロブリン発現ベクターに指向性クローニングさせた。Ｉｇ遺伝子特異的ＰＣＲに使用したすべてのプライマーは制限部位（ＩｇＨに関してはＡｇｅＩ及びＸｈｏＩ、ＩｇＫに関してはＸｍａＩ及びＤｒａＩＩＩ）を含んでいた。この制限部位により、それぞれヒトＩｇＧ１及びＩＧＫ定常領域を含む発現ベクターをクローニングした。簡潔に述べると、ＰＣＲ産物は、それぞれＡｇｅＩ及びＸｈｏＩ（ＩｇＨ）、ＸｍａＩ及びＤｒａＩＩＩ（ＩｇＫ）による消化後にＱｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社）により精製した。消化したＰＣＲ産物は、発現ベクターにライゲーションする前に精製した。総量１０μＬの２００Ｕ  Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、７．５μＬの消化及び精製済み遺伝子特異的ＰＣＲ産物、及び２５ｎｇ直線化させたベクターＤＮＡを用い、ライゲーション反応を実施した。３μＬのライゲーション産物を用い、形質転換受容性の大腸菌ＤＨ１０Ｂバクテリア（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、４２℃にて熱ショックにより形質転換させ、アンピシリン入りの寒天培地に播種した（１００μｇ／ｍＬ）。ＶＨ領域のＡｇｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、ｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１発現ベクターの同様の部位に挿入し、それに対し合成ＸｍａＩ−ＤｒａＩＩＩ  ＶＫ挿入物をｐＥＥ１２．４Ｈｕ−κ発現ベクターのＸｍａＩ−ＤｒａＩＩＩ部位にクローン化した。
【０３０４】
２９３ｆｅｃｔｉｎを使用し、適切なプラスミドによりＨＥＫ  ２９３細胞に遺伝子導入し、ヒト化抗体産生細胞を生成した。この際、プラスミドＤＮＡはＱＩＡｐｒｅｐスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１０％熱不活化ＦＣＳ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧ（すべてＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加して用い、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１１２６８）細胞を標準的な条件下において１５０ｍｍプレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で培養した。
【０３０５】
一過性形質導入を行うために、細胞を培養密度が８０％になるまで増殖させた。ＩｇＨ及び対応するＩｇＬ鎖を組み込んだ等量のベクターＤＮＡ（各ベクターＤＮＡをそれぞれ１２．５μｇ）を１．５ｍＬ  ｏｐｔｉ−ＭＥＭ／５０μＬ  ＨＥＫ  ２９３形質導入試薬に添加した。この混合物を室温で３０分インキュベートし、培養プレートに均一に分配した。形質導入の３日後に培養上清を回収し、新鮮な２０ｍＬ  ＤＭＥＭ（１０％  ＦＢＳ含有）に置き換え、形質導入の６日後に再度培養上清を回収した。８００×ｇで１０分間遠心分離して培養上清から細胞細片を取り除き、４℃で保存した。プロテインＧビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、組み換えキメラ及びヒト化抗体を精製した。
【０３０６】
（実施例１７）
ＣＤ４６モジュレータの結合特性評価
上記の通りに生成し選別したＣＤ４６モジュレータの結合特性を、各種手法により解析した。具体的には、概して標準的な手法を用い、上記実施例９に示した通りに、生成し及び発現させた３種のＣＤ４６相同体に対する親和性、動態学、ビニング、及び交差反応について数多くのＣＤ４６抗体を特性評価した。より詳細には、マカク（社内でタンパク質の配列決定を行い及び発現させた、データ不掲載）、マーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：Ｑ８ＨＹＸ８．２）、及びリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ  ｓｃｉｕｒｅｕｓ；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＡＢ６６８１９．１及びＡＡＣ３９６７１．１を組み合わせて作成したコンストラクト、データ不掲載）のＣＤ４６相同体を発現させ、ＦｏｒｔｅＢＩＯによる解析を行う前に精製した。ウェスタンブロットにより、還元又は非還元の抗原に対する抗体反応性も測定し、還元させた抗原に結合した数少ない抗体を試験した。これらの実験結果を図１４に表として示す。
【０３０７】
このデータに関し、正確性を保証するために３通りの方法で親和性を評価した。第１に、ＥＬＩＳＡを用い、連続希釈した抗原を標識した既定量の抗体について結合シグナルを測定し、相対的なモジュレータ活性を評価した（データ不掲載）。第２に、選別したモジュレータの親和性及び速度定数ｋｏｎ及びｋｏｆｆを測定し、次に標準的な抗原濃度系列でＦｏｒｔｅＢＩＯ  ＲＥＤ（ＦｏｒｔｅＢＩＯ，Ｉｎｃ．）によりバイオレイヤー干渉解析を行った。第３に、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、選別したモジュレータの親和性を測定した。標準的な抗原濃度系列に基づき、１：１のラングミュアの結合モデルを用い、抗原に結合した抗体のＫｄと、速度定数ｋｏｎ及びｋｏｆｆを測定した。図１４は、表中に記載の親和性測定を行うために用いた手法を（ＦはＦｏｒｔｅＢＩＯを意味し、ＢはＢｉａｃｏｒｅを意味する）確認するためのものである。概して、選別したモジュレータは、ナノモル濃度の範囲で比較的高い親和性を呈していた。
【０３０８】
ＣＤ４６モジュレータを更に特性評価するために、切断型タンパク質コンストラクトを作成し、そのそれぞれから４つのｓｕｓｈｉドメインを除去した。ＥＬＩＳＡを用い、これらのコンストラクトに対する結合性能を試験し、特定のモジュレータに関するＣＤ４６標的領域を同定した。試験した各抗体の結合ドメインは図１４に記載のものである。この実験に関する詳細については、実施例１４に記載済みある。
【０３０９】
ＣＤ４６モジュレータにより認識されるエピトープが連続的なアミノから構成されているのか、あるいは抗原の２次構造により併置された非連続的なアミノ酸により形成されているのかを評価するために、ウェスタンブロットを還元及び非還元条件下で実施した。より具体的には、当業者に周知である標準的な電気泳動法を用い、選別したモジュレータに対し、還元及び非還元条件下でＣＤ４６抗原を暴露させた。図１４詳細に示す通り、実質的にほとんどのＣＤ４６モジュレータは、ジスルフィド結合が変性していない（ＮＲ）抗原にのみ未反応したのに対し、２種のモジュレータは非還元及び還元抗原（ＮＲ／Ｒ）のいずれとも反応した。
【０３１０】
組み換え発現させたＣＤ４６抗原の単量体の濃度系列を用い、ＣＤ４６相同体に対するカニクイザル、マーモセット、及びリスザルの交差反応性をＦｏｒｔｅＢＩＯで評価した。図１４に掲載する通り、選別したモジュレータを任意の数の相同体と反応させた。具体的には、ＳＣ１．Ｎ７１及びＳＣ１．Ｎ１４９はカニクイザル及びマーモセットと反応したが、リスザルとは反応しなかった。表中の「ＮＤ」は、データが検出されなかったことを示す。
【０３１１】
（実施例１８）
選別したＣＤ４６モジュレータのエピトープの決定
上記の通りに生成し選別したＣＤ４６モジュレータによりエピトープが認識されるか評価する目的で、複数種の異なるＣＤ４６  ＥＣＤ変異体を構築し発現させた。より詳細には、各種ＣＤ４６  ＳＣＲドメイン（引用によりその全体を本明細書に組み込むＡｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１４７：３００５，１９９１に記載の通りのもの）を増幅させ、かつこれらのドメインをアフィニティー精製（Ｑｉａｇｅｎ，Ｎｉ−ＮＴＡ）用のＨｉｓ  ｔａｇと融合させるプライマーを用い、ＣＤ４６欠失変異体を設計した。次に、標準的な生化学法を用い、概して実施例９に示される通りに、それぞれ４種のＳＣＲドメインのうちの１種を欠失している４種の別個のＨｉｓ融合コンストラクトをクローン化し、発現させた。内毒素不含有のプラスミドＤＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）を単離し、２９３Ｆｅｃｔｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、接着性のＨＥＫ−２９３細胞遺伝子導入に使用した。遺伝子導入の７２時間後に、遺伝子導入したＨＥＫ−２９３細胞により発現された欠失変異体を含む、培養上清を回収した。特定のＳＣＲドメインを欠失させた各種ＣＤ４６タンパク質に対する認識能について、数種の抗ＣＤ４６モノクローナル抗体を試験した。より具体的には、本開示においてこれまでに他の節で記載した方法を用い、ＥＬＩＳＡアッセイを実施し、これまでに選別した抗体モジュレータが、ＳＣＲドメイン１〜４をそれぞれ任意に組み合わせたＣＤ４６を認識するものであるか同定した。１２種のこれらのモジュレータに関するデータは、図１４中の表に見出し「ドメイン」の下、見出すことができる。表中のこの項には、由来する結合ドメインを明記してある。抗体ＳＣ１．Ｎ２９はいずれのｓｕｓｈｉドメインにも結合しなかったが、実施例１５に示す通りのエキソン９には結合した。
【０３１２】
本実施例は、治療用の標的として選別したアイソフォーム又はスプライス変異体と免疫特異的に会合するＣＤ４６モジュレータを生成し、及び選別し得ることついて再度実証した。
【０３１３】
（実施例１９）
モノクローナル抗体製ＣＤ４６モジュレータの特徴付け
実施例１７に示した手法を用い、ヒト化コンストラクトｈＳＣ１．Ｎ７１及びｈＳＣ１．Ｎ１４９を解析して、結合特性を評価した。より具体的にはヒト化抗体の結合性能を、マウス親抗体と直接的に比較して、いずれの抗体に関しても、ヒト化加工により、速度定数にある程度微細な変化が生じたことが確認された。
【０３１４】
この観点で、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用い、マウスＳＣ１．Ｎ７１の親和性をＢｉａｃｏｒｅにより測定して得られた結果を図１５Ａに示す。濃度系列：１２．５、６．２５、３．１２５及び１．５６２５ｎＭ（図１５Ａ及び１５Ｂ中の頂部から底部へと生成された曲線）に基づき、１：１のラングミュア結合モデルを使用したところ、抗原に対する抗体の結合性に関するＫｄは１．１ｎＭであったと評価された。次にヒト化コンストラクトを用い同様の実験を行ったところ、同様の結果（図１５Ｂ）が得られたことから、ヒト化加工を行なっても、親和性に対し有害な効果は生じなかったことが示された。これに関し、ヒトＣＤ４６を用い試験した場合に、測定値から、ヒト化コンストラクトのＫｄが０．７×１０−９であったのに対し、マウス親抗体のＫｄは１．１×１０−９であったことが示された（図１５Ｃ）。
【０３１５】
次に、同様の実験を実施して、ｈＳＣ１．Ｎ１４９と、そのマウス親抗体ＳＣ１．Ｎ１４９を結合性について比較した（データ不掲載）。図１５Ｃに見られる通り、ヒト化抗体のＫｄが１．２×１０−９であったのに対し、マウス親抗体のＫｄは１．１×１０−９であった。
【０３１６】
親和性の測定に加え、抗体を更に試験して、マーモセット及びカニクイザル抗原に対する交差反応性について評価した。図１５Ｃに示す通り、ＳＣ１．Ｎ７１及びＳＣ１．Ｎ１４９のいずれもが、カニクイザル及びマーモセットのいずれのＣＤ４６相同体に対しても強い交差反応を示したことから、毒性試験を行った。マーモセット及びカニクイザルに対する反応性は、ヒト標的に対する反応性よりはわずかに低かったものの、それでも尚許容可能な治療濃度域に良好に収まるものである。
【０３１７】
（実施例２０）
ＣＤ４６モジュレータは診断薬として使用され得る
本開示に記載の手法に従い、本開示のＣＤ４６モジュレータを診断薬として使用して、患者から得た生体試料に含まれるＣＤ４６関連性のバイオマーカーを検出することもできる。
【０３１８】
これまでに言及した通り、ＣＤ４６は、細胞膜に存在するものの、メタロプロテアーゼにより膜から切断できることが知られている、Ｉ型糖タンパク質である。ＣＤ４６は、膜貫通型ドメインの両側に存在する膜近位領域に関するエキソンの切り替え及び／又は読み飛ばしに基づくｍＲＮＡの選択的スプライシングにより、様々な分子量をもつアイソフォームとして存在する。特定の疾患条件下の血清又は血漿などの体液中で、このような特性を示すＣＤ４６は検出可能なはずであり、したがって、診断用途に有用なものである可能性があり、あるいは疾患に関するバイオマーカーを提供するのに有用なものである可能性がある。本発明のこの態様を確認する目的で、サンドイッチＥＬＩＳＡを行い、図１６Ａ（挿入図）に示す通り抗ＣＤ４６抗体を用い検量線を生成し、この図１６Ａの検量線（主要図）を用い、健常者及びに各種固体腫瘍を罹患している患者から得た血清試料中に含まれるＣＤ４６濃度を定量化する（図１６Ｂ）。
【０３１９】
より詳細には、モノクローナル抗体ＳＣ１．Ｎ３５．６を、５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）に１μｇ／ｍＬで溶解させ、標準的なＥＬＩＳＡプレートに吸着させた。プレートを、ＰＢＳ（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０含有、すなわち（ＰＢＳＴ））により洗浄した後、２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含有させたＰＢＳ（以降「希釈液」と呼ぶ）でブロッキングし、２時間室温においた。プレート内のブロッキング液を捨て、このプレートに、希釈液で希釈した各種濃度のＣＤ４６Ｄ−Ｈｉｓ組み換え体精製物又は血清試料を加え、室温で最低２時間おいた。ＰＢＳＴで洗浄した後、このプレートに、ビオチン標識したＣＤ４６特異的ヤギポリクローナル抗体を加えた。この抗体は、希釈剤により０．５μｇ／ｍＬに希釈していた。１時間のインキュベート後、プレートを再度ＰＢＳＴで洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）標識ストレプトアビジンを１：２０００希釈した物を加えて、３０分インキュベートした。すべてのプレートをＰＢＳＴで２回洗浄した後、ウェルには１００μＬ  ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え、暗所で３０分間インキュベートした。１００μＬ／ウェルで２Ｍ硫酸を加え、呈色反応を停止させた。標準的なプレートリーダーを用い、すべてのウェルで吸光度（λ＝４５０ｎｍ）を読み取りした。
【０３２０】
このデータセットでは、１２名の健常な成人から得た血清試料と、１７名の結腸直腸がん患者、６名の黒色腫患者、１５名の乳がん患者、７名の卵巣がん患者、１０名の非小細胞肺がん患者、１４名の前立腺がん患者及び９名の膵臓がん患者の血清試料とを、血清中ＣＤ４６濃度について比較する。図１６Ｂに示される通り、これらのデータは、健常な成人の血清試料に含まれるＣＤ４６の平均濃度がおよそ１２．１±２．２ｎｇ／ｍＬであるのに比べ、結腸直腸、乳がん及び非小細胞肺がん患者における血清中ＣＤ４６濃度は非常に高いものである（それぞれ２６．６±３．４、３０．６±２．３及び４２．０±７．１ｎｇ／ｍＬ）。これらの結果は、本開示のモジュレータが、腫瘍性疾患を検出及び／又は監視する際の診断薬として効果的に機能し得ることを明示する。
【０３２１】
（実施例２１）
ＣＤ４６モジュレータは標的部位として機能する
抗体に安定的に結合させた細胞毒性薬を標的化させることで、固体腫瘍に罹患している患者に対し優れた治療効果を有し得る抗体によるアプローチが示される。上記のＣＤ４６特異的抗体が生細胞への細胞毒性剤の送達を介在し得るか否かを評価するため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞致死アッセイを実施した。このアッセイでは、リボソーム不活性化タンパク質のサポリン（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と複合体形成させたストレプトアビジンを、ビオチン化マウスＣＤ４６抗体モジュレータに結合させ、これらのサポリン複合体が細胞に内部移行しかつ細胞を殺傷する能力を、７２時間後に細胞の生存能を評価することで評価した。具体的には、ウェルあたり１０，０００個のＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートのウェルに蒔いた。翌日、上記の精製しビオチン標識した抗ＣＤ４６抗体を１００ｎＭに希釈した。各抗体のアリコートを、それぞれモル比１：１でストレプトアビジン−ＺＡＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と混合し、次いで室温で３０分インキュベートした。抗体−ストレプトアビジン−ＺＡＰ複合体を連続希釈し、このすべての希釈物をそれぞれ細胞に加えた。次に細胞／抗体−サポリン混合物を３７℃／５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。このインキュベート後、製造元のプロトコルに従いＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を用い、生存細胞数を計数した。抗体−ストレプトアビジン−ＺＡＰを添加しなかった培養物を参照として用い、参照の発光強度を、「１００％の細胞が生存」している場合の値として設定した。
【０３２２】
このプロトコルにより、これまでに実施例で示した通りに内部移行能を有していた数種の抗体が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、細胞の殺傷を介在する能力も有した一方で、ビオチン化したアイソタイプ型対照抗体には細胞殺傷能は存在しなかった。すなわち、これらの内部移行モジュレータのうちいくつかのものは、サポリン毒素の内部移行を介在し、細胞死をもたらし得るものであった。図１７は、この例示的な内部移行モジュレータＳＣ１．Ｎ７１、ＳＣ１．Ｎ１４６（マウス／ヒトキメラ抗体）及びＳＣ１．Ｎ１４９の有する細胞殺傷能を示す。図中、下方へ向かう曲線勾配は、対照と比較した場合に濃度依存的に細胞死が生じたことを意味するものである。これに加え、図１７に示すデータにより、実施例１６で得た２種の抗ＣＤ４６抗体、すなわちｈＳＣ１．Ｎ７１及びｈＳＣ１．Ｎ１４９が、もとのマウス抗体の能力を保有し、細胞によるＣＤ４６依存性の毒素の取り込みを介在することが実証される。具体的には、５０％細胞死（ＥＣ５０）を引き起こすにあたって、次の濃度が有効であるものと記録された：ビオチン−ヒトＩｇＧ１（５３．１ｎＭ）、ビオチン−マウスＳＣ１．Ｎ７１（５１．４ｐＭ）、ビオチンヒトＳＣ１．Ｎ７１（２６．６ｐＭ）、ビオチンキメラＳＣ１．Ｎ１４６（１２．１ｐＭ）、ビオチン−マウスＳＣ１．Ｎ１４９（７０．４ｐＭ）、ビオチンヒトＳＣ１．Ｎ１４９（１７４ｐＭ）。
【０３２３】
（実施例２２）
ＣＤ４６モジュレータは細胞表面上の受容体と相互作用する
細胞の殺傷が、ＣＤ４６モジュレータと、細胞表面上に発現したＣＤ４６受容体との相互作用により介在されるものであることを実証するために、レンチウイルスを用い、宿主細胞に対し遺伝子導入して低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を安定的に送達し、宿主細胞のゲノムに組み込み、発現させ、ＣＤ４６  ｍＲＮＡの領域に特異的に結合させ、細胞内でｍＲＮＡを急速に分解させ、宿主細胞によるＣＤ４６発現を減少又は消失させた。
【０３２４】
ＣＤ４６ヘアピン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む、第３世代のレンチウイルスストックを調製し、既存の手法を用い濃縮した。ＣＤ４６特異的なｓｈＲＮＡと、遺伝子導入の成功についてのマーカーとして青色蛍光タンパク質をコードしているレンチウイルスストックを用い、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入の６日後、ＣＤ４６の発現及び青色蛍光タンパク質の発現強度についてフローサイトメトリーにより細胞を解析し（データ不掲載）、ＣＤ４６の発現が最も下方制御され、かつ青色蛍光タンパク質の発現が最も高かった細胞（すなわち、ｓｈＲＮＡＣ１を発現している細胞）をＦＡＣＳにより選別した。選別した細胞を更に７日間培養し、次に実施例２１に記載の手法と同様のｉｎ  ｖｉｔｒｏ殺傷アッセイにおいて、その親対応物と比較試験した。更に、両方の細胞株を、フルオロフォアフィコエリトリン（Ｒ＆Ｄ系）標識抗ＣＤ４６抗体で染色し、フローサイトメトリーにより解析したところ、レンチウイルスを用い遺伝子導入した（及び選別した）細胞株において、ＣＤ４６の発現が下方制御されていたことが実証された。結果を、図１８Ａ及び１８Ｂに示す。
【０３２５】
より具体的には、図１８Ａは、抗ＣＤ４６抗体で染色した場合に、親対応物の平均蛍光強度（白色ピーク）と比較して、ＨＥＫ−２９３Ｔ−Ｃ１細胞の平均蛍光強度（灰色のピーク）が十分の一に減少していたことを示す。ＣＤ４６発現を下方制御するｓｈＲＮＡを発現している誘導体であるＨＥＫ２９３Ｔ−Ｃ１ではなく、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞は、ＣＤ４６モジュレータにより効果的に殺傷される（図１８Ｂ）。特定の実施例では、記載濃度の精製抗体、及びリボソーム不活性化タンパク質のサポリン（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＦＡＢ−ＺＡＰ）と複合体形成させた１２０ｎＭ抗マウスＩｇＧ分子Ｆａｂ断片を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞又は選別したＨＥＫ２９３Ｔ−Ｃ１細胞のいずれかに加えた。７２時間のインキュベート後、製造元のプロトコルに従い、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を用い、生存細胞数を測定した。細胞及びＦＡＢ−ＺＡＰを含有している培養物は参照としてのみ提供し、この場合の蛍光強度を「１００％の細胞が生存」している場合の値として設定した。
【０３２６】
（実施例２３）
ＣＤ４６モジュレータは受容体依存性の毒素の取り込みを介在する
何代にもわたってｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させた従来の細胞株は、患者から得た初代腫瘍細胞と比べてそのバイオロジーが非常に異なる。患者の腫瘍に似ているがん細胞を用い、ＣＤ４６モジュレータが、受容体依存性の毒素の取り込みを介在し得るか評価するために、免疫不全マウスに対し、患者由来のがん細胞を非従来式に異種移植して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ殺傷アッセイで試験した。
【０３２７】
具体的には、乳がん患者由来の細胞株であるＢＲ３１ｐ６細胞を、１０，０００個／ウェルでＰｒｉｍａｒｉａ  ＴＣプレートに播種し、低酸素濃度のインキュベータで２４時間培養した。培養培地を交換し、ビオチン化抗体及びストレプトアビジン−ＺＡＰ複合体を実施例２１に記載の通りに調製し、培養物に加え７２時間おいた。製造元のプロトコルに従いＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を用い、生存細胞数を計数した。抗体−ストレプトアビジン−ＺＡＰを添加しなかった培養物を参照として用い、参照の発光強度を、「１００％の細胞が生存」している場合の値として設定した。ＢＲ３１細胞は、ビオチン化ＳＣ１．Ｎ１４９及びストレプトアビジン−ＺＡＰが同時に存在した場合にのみ殺傷される。ＳＣ１．Ｎ１４９単独の場合でも、あるいはビオチン化アイソタイプ型対照抗体にストレプトアビジン−ＺＡＰを加えた場合にも、有意に細胞殺傷が介在される（図１９Ａ）。
【０３２８】
多くの固体腫瘍で効能を示す細胞毒用の賦形剤として、ＣＤ４６モジュレータを使用できるか評価するために、非従来式の異種移植に由来する腫瘍ＣＲ４２ｐ３、結腸直腸がん患者から誘導した細胞株、及び膵臓がん患者から誘導した細胞株ＰＡ２０ｐ６を、２０００個／ウェルでＰｒｉｍａｒｉａ  ＴＣプレートに播種した。低酸素濃度のインキュベータで７２時間培養した後、１．０ｎＭ精製抗体（ＣＤ４６モジュレータ又はそのアイソタイプ対照）及び４０ｎＭ  ＦＡＢ−ＺＡＰ（図１９Ｂを参照されたい）を培養物に加え、更に１６８時間培養した。製造元のプロトコルに従いＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を用い、生存細胞数を計数した。細胞及びＦＡＢ−ＺＡＰを含有している培養物は参照としてのみ提供し、この場合の蛍光強度を「１００％の細胞が生存」している場合の値として設定した。抗体ＳＣ１．Ｎ７１及びＳＣ１．Ｎ１４９は、ＣＲ４２及びＰＡ２０細胞を特異的に殺傷した。ＳＣ１．Ｎ１４９と比べ、ＳＣ１．Ｎ７１の方が幾分強力なようである（図１９Ｂ）。
【０３２９】
これらのデータにより、細胞毒性剤を、ＣＤ４６リガンドを発現している腫瘍原性細胞に選択的に内部移行させるために、本開示のモジュレータをベクターとして機能させた場合に、本開示のモジュレータが有する特異性及び広範な有効性が明示された。
【０３３０】
（実施例２４）
ＣＤ４６モジュレータは化学療法に対する膵臓腫瘍の感受性を増感させる
本開示のモジュレータが、膵臓腫瘍の化学受容性を増感させ得るか評価するために、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいて、抗ＣＤ４６抗体を抗がん剤と組み合わせた。
【０３３１】
より具体的には、患者から誘導した腫瘍株ＮＴＸ−ＰＡ１４を用い免疫不全マウスにおいて腫瘍を起始させ、平均腫瘍体積がおよそ５００ｍｍ３に達したすべてのマウスを、次に３群に無作為化した（１群当たりマウス１０匹）。２群は週に２回、２０ｍｇ／ｋｇゲムシタビン、及び１０ｍｇ／ｋｇの抗体標的化ＣＤ４６（ＳＣ１．Ｎ１４９）又は対照の非特異的イソタイプ適合抗体（ＭＯＰＣ）により処理した。残りの群は対照として用い、内部移行することのできない、あるいは細胞の殺傷を介在することのできない抗ＣＤ４６抗体薬複合体を週に１回２ｍｇ／ｋｇ投与した。３回めの投与の翌日（無作為化の８日後）、腫瘍は対応するレジメンに対して活発に応答していため、各群からマウスを２匹安楽死させ、残留ＴＰＣの発生頻度をフローサイトメトリーにより計数した。具体的には、上記の通りに処理したマウスから単離した腫瘍細胞からなる単個細胞懸濁液に抗体を用い、細胞を、ＴＰＣ下位集団の同定及び定量を可能にするマーカーと接触させた。抗ＣＤ４６抗体ＳＣ１．Ｎ１４９及びゲムシタビンを組み合わせて処理したマウス由来の腫瘍では、ＴＰＣ集団に関連する細胞表面マーカー（すなわち、ＣＤ４６及びＣＤ３２４）を発現しているヒト細胞の割合は、対照群及びゲムシタビンに加えＭＯＰＣ抗体により処理した群と比較して有意に少なかった（ＳＣ１．Ｎ１４９及びゲムシタビンではヒトの細胞は２７％であったのに対し、対照では約３９％）（図２０Ａ）。
【０３３２】
本試験で対照として用いたマウスのうち、腫瘍量が大きかったため安楽死させたマウスを除き、群中の残りの８匹マウスに、７週間の課程にわたってゲムシタビンと抗体により更に１１回処理を行った後（計１４回の処理）、マウスを週に２度抗体のみで処理し（それぞれＭＯＰＣ又はＳＣ１．Ｎ１４９）、腫瘍量（すなわち、腫瘍体積測定値）を監視した。概して、いずれのゲムシタビン処理群の腫瘍も、各治療レジメンに対し応答を示し、１００ｍｍ３以下に退縮したものの、ＳＣ１．Ｎ１４９抗体及びゲムシタビンで処理したマウスは、ゲムシタビン単独で処理したマウスにおける腫瘍よりも、より長期間増悪せずに生存した（それぞれ７５日対３０日）（図２０Ｂ）。
【０３３３】
これらのデータにより、抗ＣＤ４６抗体が、すい臓がんにおいて、標準的な化学療法剤であるゲムシタビンに対し腫瘍細胞の感受性を増感し得ることが実証される。ここまでの実施例により、未変性の抗ＣＤ４６抗体及びゲムシタビンの両方で処理したマウスでは、ゲムシタビン単独で処理したマウスに比べ、ＴＩＣによる腫瘍再発が有意に遅延していたことが示され、本開示に示すデータにより、未変性のＳＣ１．Ｎ１４９抗体が、ゲムシタビンなどの化学療法的剤に対するＴＩＣ感受性を特異的に増感し得ることを示唆する。
【０３３４】
（実施例２５）
ＣＤ４６モジュレータはＮＴＸマウスにおいてがん起始細胞減少し得る
少なくともＣＤ４６を発現している下位集団に関する、ヒト腫瘍断片又はヒト腫瘍細胞の単個細胞懸濁物を用い、マウス腎被膜下に異種移植を行い、又は異所性移植を行い、ヒト型の腫瘍を発生させた。次に、ヒト腫瘍の発生したマウスを無作為化し、次に、腫瘍体積が１００〜５００ｍｍ３に達したならば無作為化し、抗ヒトＣＤ４６抗体薬剤複合体（ＡＤＣ）を用い、例えば、単独で、あるいはイリノテカン又はゲムシタビンなどの標準的な化学療法剤と組み合わせてのいずれかで、週に１回又は２回、最大で１０ｍｇ／ｋｇを投与して処理した。好ましくはＡＤＣは、細胞毒性剤又は毒素と複合体形成させた抗ＣＤ４６抗体を含む。
【０３３５】
腫瘍の治療の数週間後、腫瘍を観察したところ、腫瘍は全く残らなくなるまで縮小していたか、ある程度の体積は保ったまま一部退縮していたか、あるいは体積を増加させずに維持しているかしていた。後者では、腫瘍体積の減少について評価したところ、腫瘍にはヒト細胞が残存していないこと（すなわち、残存しているマウス間質細胞から構成されている）が明らかになり、あるいは各種ｉｎ  ｖｉｔｒｏ解析（例えば、コロニー形成細胞の計数）及びｉｎ  ｖｉｖｏ解析（例えば、限界希釈法により、処理腫瘍中に存在するがん起始細胞が完全に減少しているか又は排除されていることを実証する）で測定した場合にがん起始細胞の減少又は排除が示される。マウスを更に観察し、腫瘍が再発するまでの期間が有意に延長されていること（すなわち、６０日以上）、又は全体的に腫瘍の再発が予防されていることが顕著である場合にはＴＩＣの減少又は排除が確認される。
【０３３６】
当業者であれば、本発明の精神又は中心となる性質から逸脱させずとも、本発明を他の特定の形態に組み込むことができることを更に認識するであろう。本発明に関するこれまでの記載は、単に例示的目的で実施形態を開示したものであり、他の変形も本発明の範囲内に含まれるものとして企図されることは理解されるであろう。したがって、本発明は本明細書で詳細に記載した特定の実施形態に制限されるものではない。むしろ、参照は、本発明の範囲及び内容の指標となる添付の特許請求の範囲に対しなすべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１０Ｉ】
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【図１０Ｊ】
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【図１０Ｋ】
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【図１０Ｌ】
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【図１０Ｍ】
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【図１０Ｎ】
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【図１０Ｏ】
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【図１０Ｐ】
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【図１０Ｑ】
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【図１０Ｒ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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