(57)【要約】ラマンスペクトル取得分析システム（10）と、マイクロフロー制御システム（11）と、細胞/粒子選別システム（12）より構成される、細胞/粒子の分離に用いる選別装置である。前記マイクロフロー制御システムとラマンスペクトル取得分析システムが連結され、前記マイクロフロー制御システムとラマンスペクトル取得分析システムが連結されれ、前記細胞/粒子選別システムとマイクロフロー制御システムが連結される。本発明は、細胞/粒子の分離に用いる選別方法を公開する。前記選別装置は、効果的にナノ 〜ミクロンサイズの細胞、ナノ材料、粒子と細胞内容物を識別して選別することができ、かつ蛍光や放射性標識などの方法に比べ、同じ時間内に、もっと豊富な細胞や粒子の特徴情報を提供することができる。
2013542434.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞/粒子の分離に用いる選別装置であって、
ラマンスペクトル取得分析システムと、マイクロフロー制御システムと、細胞/粒子選別システムと、を含み、
前記マイクロフロー制御システムは、前記ラマンスペクトル取得分析システムと連通され、標的細胞/粒子のラマンレーザー励起によりラマン信号を生成し、標的細胞/粒子の選別を行い、
前記ラマンスペクトル取得分析システムは、前記細胞/粒子選別システムと連通され、標的細胞/粒子のラマン信号を受信し、標的細胞/粒子のラマンスペクトル信号を生成し、
前記細胞/粒子選別システムは、前記マイクロフロー制御システムと連結され、受信したラマンスペクトル信号によって、前記マイクロフロー制御システムを制御して、標的細胞/粒子の選別を行う、ことを特徴とする細胞/粒子の分離に用いる選別装置。
【請求項２】
前記ラマンスペクトル取得分析システムは、ラマン分光光度計を含み、
前記マイクロフロー制御システムは、荷台、マイクロフロー制御デバイス、及びマイクロフロー制御ポンプを含み、
前記細胞/粒子選別システムは、制御端末、力場制御器、及び力場発生器を含み、
前記ラマン分光光度計は、それぞれマイクロフロー制御デバイスと制御端末に連結され、
前記荷台は、マイクロフロー制御デバイスに連結され、前記マイクロフロー制御デバイスは、マイクロフロー制御ポンプと連結され、
前記制御端末は、力場制御器と連結され、前記力場制御器は、力場発生器と連結され、前記力場発生器はマイクロフロー制御デバイスと連結され、
前記荷台は、マイクロフロー制御デバイスへの標的細胞/粒子と保護液の輸送に用いられ、
前記マイクロフロー制御ポンプは、前記荷台からマイクロフロー制御デバイスへの標的細胞/粒子と保護液の輸送速度の制御に用いられ、
前記制御端末は、ラマンスペクトル信号に対し特異性の識別を行うと共に、状態信号のを生成及び送信に用いられ、
前記力場制御器は、受信した状態信号に基いて、制御信号を生成し、かつ前記制御信号を前記力場発生器へ送信し、
前記力場発生器は、受信した制御信号に基いて、オフ/オン操作の実行する、ことを特徴とする請求項１に記載の細胞/粒子の分離に用いる選別装置。
【請求項３】
前記マイクロフロー制御デバイスは、注入チャンネル、検出・選別エリア、及び収集チャンネルを含み、
前記注入チャンネルは、検出・選別エリアと連結され、標的細胞/粒子と保護液の注入と混合に用いられ、
前記検出・選別エリアは、収集チャンネルと連結され、
前記検出・選別エリアは、ラマンスペクトル分析エリアと細胞選別エリアを含み、前記ラマンスペクトル分析エリアは、混合後の標的細胞/粒子と保護液のラマンレーザーの励起によるラマン信号の生成に用いられ、前記細胞選別エリアは、標的細胞/粒子の選別に用いられ、
前記収集チャンネルは、選別された標的細胞/粒子の収集に用いられる、ことを特徴とする請求項２に記載の細胞/粒子の分離に用いる選別装置。
【請求項４】
前記保護液は、pH=5〜10の緩衝溶液である、ことを特徴とする請求項３に記載の細胞/粒子の分離に用いる選別装置。
【請求項５】
前記注入チャンネルは、標的細胞/粒子チャンネル、第1選別保護液チャンネル、及び第2選別保護液チャンネルを含み、
前記第1選別保護液チャンネルと第2選別保護液チャンネルは、標的細胞/粒子チャンネルの両側に位置し、かつ標的細胞/粒子チャンネルと連通されており、
前記検出・選別エリアは、検出・選別エリアチャンネルを含み、前記検出・選別エリアチャンネルは、標的細胞/粒子チャンネル、第1選別保護液チャンネル、及び第2選別保護液チャンネルと連通しており、
前記収集チャンネルは、第1収集チャンネルと第2収集チャンネルを含み、前記第1収集チャンネルと第2収集チャンネルは共に検出・選別チャンネルと連通されている、ことを特徴とする請求項４に記載の細胞/粒子の分離に用いる選別装置。
【請求項６】
前記力場制御器は、音響光学変調器であり、前記力場発生器は、光学力場発生器である、ことを特徴とする請求項２に記載の細胞/粒子の分離に用いる選別装置。
【請求項７】
前記力場制御器は、電場変調器であり、前記力場発生器は、電場力発生器である、ことを特徴とする請求項２に記載の細胞/粒子の分離に用いる選別装置。
【請求項８】
前記力場制御器は、電磁石制御器であり、前記力場発生器は、磁力発生器である、ことを特徴とする請求項２に記載の細胞/粒子の分離に用いる選別装置。
【請求項９】
細胞/粒子の分離に用いる選別方法であって、
1）細胞/粒子試料と選別保護液を混合して混合液を調製するステップと、
2）前記混合液はラマンレーザー励起によってラマン信号を生成するステップと、
3）前記ラマン信号によって相応のラマンスペクトル信号を生成するステップと、
4）前記ラマンスペクトル信号の特異性識別を行い、かつ識別結果によって状態信号を生成して送信するステップと、
5）前記状態信号を受信し、かつ該状態信号によって制御信号を生成して送信するステップと、
6）受信した制御信号によって、異なるタイプの細胞/粒子試料の運動軌道を制御し、それによって異なるタイプの細胞/粒子試料の選別を行うステップと、
を含むことを特徴とする細胞/粒子の分離に用いる選別方法。
【請求項１０】
前記ステップ1）は、
11)標的細胞/粒子試料を用意し、選別保護液を調合するステップであって、
生体細胞試料に対し、細胞の培養過程を経てから、異なる培養基の背景スペクトルが選別結果への影響を避けるように、遠心分離を行い、最終的に液体ミネラル培養基の中に移動させ、
ナノ材料、粒子、及び細胞内容物に対し、異なる溶液の背景スペクトルが選別結果への影響を避けるように、試料を液体ミネラル培養基や純水の中に溶解させ、
緩衝液ｐＨ値と緩衝液イオン使用量の関係によって、表を作成し、緩衝液の調合に必要な固体状態化学成分の量を計算し、そして測った固体状態化学成分を純水の中に溶解して、固体状態化学成分が全部溶けるまで振動し、それから純水を入れて定容を行うことで選別保護液が得られ、
12）標的細胞/粒子溶液および選別保護液を注入するステップであって、
ステップ（11）から取得した標的細胞/粒子溶液と選別保護液を、それぞれマイクロフロー制御デバイスの特定位置に入れて、マイクロフロー制御ポンプの駆動によって、それぞれマイクロフロー制御デバイス内の標的細胞/粒子注入チャンネル、第1選別保護液チャンネルと第2選別保護液チャンネルを流れ、上記標的細胞/粒子溶液と選別保護液の流速は、それぞれ0.1mm/s〜100mm/s である、
を更に含む、ことを特徴とする請求項９に記載の細胞/粒子の分離に用いる選別方法。
【請求項１１】
前記ステップ2）とステップ3）は、
マイクロフロー制御デバイス内の標的細胞/粒子溶液と選別保護液を混合した後、検出・選別エリア中のラマンスペクトル分析エリアを流れて、ラマンレーザーの励起によって、ラマン信号を生成し、ラマン分光光度計は、ラマン信号を受信し、かつ前記ラマン信号によって、相応するラマンスペクトル信号を生成するステップを含む、ことを特徴とする請求項１０に記載の細胞/粒子の分離に用いる選別方法。
【請求項１２】
前記ラマンレーザーの取込み頻度は0. 1ミリ秒〜10ミリ秒、ラマン信号の取得周波数は100 Hz〜10000 Hzである、ことを特徴とする請求項１１に記載の細胞/粒子の分離に用いる選別方法。
【請求項１３】
前記ステップ4は、
制御端末内の情報識別ソフトウェアは、取得したラマンスペクトル信号の情報に対し特異性の識別を行い、かつ識別結果に基いて状態信号を生成して送信するステップを含む、ことを特徴とする請求項１１又は１２に記載の細胞/粒子の分離に用いる選別方法。
【請求項１４】
前記ステップ5）は、
力場制御器が制御端末内の情報識別ソフトウェアに生成された状態信号を受信し、力場発生器のオフ/オンの制御を行い、
力場発生器オフ状態の時、検出・選別エリア中の細胞選別エリアは、ラマンレーザー力場、磁力や電場力がないので、標的細胞/粒子の運動状態は影響されなく、最終的に第1収集チャンネルに入り、
力場発生器オン状態の時、検出・選別エリア中の細胞選別エリアは、ラマンレーザー力場、磁力や電場力があるので、標的細胞/粒子の運動状態は影響され、運動軌道の偏りが発生し、最終的に第2収集チャンネルに入るようになるステップを含む、ことを特徴とする請求項１３に記載の細胞/粒子の分離に用いる選別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞/粒子の分離に用いる選別装置及び選別方法に関し、特に、ナノ〜ミクロンサイズの細胞/粒子の分離に用いる選別装置及び選別方法に関し、生物科学分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
合成生物学は、分子生物学の手段を利用して、細胞をソフト面（DNAを代表とする遺伝物質）とハード面（リボソームを代表とする細胞小器官）から系統的な改造を行うことで、特定の機能を持たせる。これらの生体細胞は自己複製し、かつ「合成工場」として、簡単かつ安価のエネルギーと物質（日光や二酸化炭素など）を、高付加価値を有する薬物、材料や生物エネルギーに転化し、あるいは分解しにくい汚染物質の取り除きに用いる。2009年イギリス王立協会のレポートに述べたように、合成生物学によって実現される突破と収益は必ず国家財産の重要な構成部分になる。しかし、合成生物学技術の発展は、先ず、革新機能を持つ生命成分（遺伝子、タンパク質、細胞、群落など）の取得に左右され、当分野において、現時点の研究では、三つの技術的困難に直面している。
【０００３】
まず、微生物は全世界のバイオマスの約半分を占める。その中に、多くの知られていない機能遺伝子が含んでいる。それに自然環境の中で、99%の微生物は培養できない微生物であり、伝統的な培養方法によって分離や研究することができない。例えば、クレイグ・ヴェンター氏（Craig Venter）によるバミューダサルガッソ海域での研究では、数百リットルの海水の中だけで、148種類の新しい微生物及び約120万個の知られていない遺伝子が発見された。別の研究によると、1グラムの土壌の中で、18000種以上の微生物を含んでおり、知られている原核生物の総数（16177種類）を超えた。このような事実から、人々は、培養できない微生物が未開発の生物資源として、生物エネルギー、工産業用生体触媒、環境修復、医薬などの分野において、計り知れない価値があると認識するようになった。従って、単細胞レベル（ミクロンサイズ）あるいはナノサイズ粒子の識別と選別プラットフォームを構築するには、培養できない微生物の中に含んだ遺伝子資源の探究に対して、大きな意義を持つ。
【０００４】
それから、伝統の細胞群体レベル性状によって測定された情報は、如実に細胞内部の生物過程とメカニズムを反映することができない。伝統の微生物学は、微生物細胞のキャラクタリゼーションについての研究は、群体細胞のレベルに基づく。最近の研究によると、同一の種群内に同じ遺伝子型の細胞は、著しい表現型の相違性を現れることができる。これは主として細胞内分子の衝突によって招いた遺伝子の表現ランダム性にまとめられる。この分子レベルに存在するDNA表現と時間と空間制御のランダム性によって、群体内細胞のキャラクタリゼーションの個体差が発生した。単細胞個体差メカニズムについての研究は、癌の発病メカニズムの発見、細胞分化と組織発育原理の理解、遺伝子表現特性と細胞特徴の識別に役立つ。従来の単細胞研究技術は、主にメタゲノムピロシーケンスと蛍光活性化細胞選別に基く。前者は遺伝子表現と培養できない微生物を研究する主な手段であるが、著しくDNA シーケンス解析に依存し、直接遺伝子表現メカニズムが発見できないだけではなく、特定機能を有する遺伝子の微生物を分離するのもできない。後者は細胞分離の有効な手段であるが、大半の生体細胞自身の蛍光効果が比較的弱いあるいは蛍光がないことで、蛍光標識追加過程に細胞死を招くので、この方法は生体細胞の選別に用いることができない。とりわけ重要なのは、メタゲノムピロシーケンスでも蛍光活性化細胞選別方法でも、すべて有効に異なる環境条件下で遺伝子表現と環境要素との間の関係を構築することができないので、培養できない微生物とその生態機能の間の連絡を取ることができない。そのため、生体単細胞レベルを通して、性状の識別と選別を実現することで、本当に細胞機能を理解＆改善することができるようになる。
【０００５】
最後に、従来の生体細胞選別技術は、主にフローサイトメトリーに基づく。そのコア技術として、細胞情報の識別である。情報識別過程では、走査時間と取得される情報量とが正比例する。すなわち、長時間の信号走査により高い情報量と解像度を取得することができ、短時間の信号走査により高い識別効率とフラックスを取得することができる。従って、適切な信号の走査時間を選ぶことで、十分な情報量と比較的高い識別効率を取得することが情報識別技術の核心である。従来のフローサイトメトリーの中で、細胞/粒子情報の識別は、主に通常の光信号を採用し、単位時間あたりに目標情報の取得率は比較的低いので、工学的応用の識別効率を満足させる前提で、十分な情報量が足りなく、細胞/粒子の形態、屈折率、反射率あるいは蛍光強度などの有限な指標について区分することしかできない。ラマンスペクトルは高効率、高フラックスの情報識別技術として、細胞/粒子選別技術分野で、一連の変革をもたらすことができる。特定の入射光線が化合物への非弾性散乱スペクトルの解析によって、ラマン顕微スペクトルは、直接化合物の分子振動や回転準位を測定することができ、ラマン特徴スペクトル線を分析することで、化合物の分子構成とメカニズムの情報を得られる。次の三つの長所がある。まず、ラマン顕微スペクトルは、単細胞全体の化学物質の指紋図鑑を取得する時に、いかなる標識をする必要がなく、核酸、蛋白質、炭水化物と脂質などを含める細胞内の多くの化合物情報を提供するので、生体細胞の細胞タイプ、生理特性とキャラクタリゼーションの変化の識別に役立つ。その次に、最新の研究結果によると、ラマンスペクトルは、共焦点ラマン顕微鏡法と合わせることで、ラマン光ピンセットを構築して単細胞の分析を行うことができる。単細胞レベルの同位体標識ラマンシフトを識別することができる同時に、蛍光in situハイブリダイゼーションと結びつけて、微生物群落のメカニズムと機能について分析することができる。最後、ラマンスペクトルの信号識別速度は比較的速くなり、マイクロ秒〜ミリ秒のレベルで、十分な強度の目標ラマンスペクトルを取得することができ、高フラックスの快速検出の必要を満たす。これに基づいて、ラマン光ピンセット選別技術は、ナノ 〜ミクロンサイズの細胞/粒子の高フラックス情報の快速識別技術を提供することができる。このような外因性標識に基づかない観測技術は、生体細胞内の代謝物と細胞外の細胞/粒子の間の相互作用について、有効な分析を行うことができ、単細胞レベルの遺伝子表現、細胞代謝機能と細胞間の相互作用などの重要情報を提供する。
【０００６】
上述したように、合成生物学研究分野の技術的な困難に対して、単細胞レベル（ナノ〜ミクロンサイズ）の細胞/粒子選別システムを構築することで、現代合成生物学の構想と系統生物学の手段を、単細胞方面と培養できない微生物体系方面まで広げることができる。細胞（ウィルス、微生物細胞、真菌細胞、植物細胞と動物細胞を含む）に適用するだけではなく、その他のナノ材料、粒子と細胞内容物の選別にも適用する。材料科学、環境微生物学、医学、分子生物学、生物工学とバイオエネルギー開発などの分野にも、重大な科学研究と工学的な価値がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は合成生物学研究分野の技術的な困難に対して、すなわち、単細胞レベルのナノ〜ミクロンサイズの細胞/粒子の選別ができないことで、現代合成生物学の構想と系統生物学の手段が、まだ単細胞レベルと培養できない微生物体系レベルに応用されない欠点に対して、ナノ〜ミクロンサイズの細胞/粒子の分離に用いる選別装置及び選別方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため、本発明は、ラマンスペクトル取得分析システムと、マイクロフロー制御システムと、細胞/粒子選別システムより構成される、細胞/粒子の分離に用いる選別装置である。上記マイクロフロー制御システムは、ラマンスペクトル取得分析システムと連通されて、標的細胞/粒子がラマンレーザーの励起によって、ラマン信号が発生させ、および標的細胞/粒子の選別に用いる。上記ラマンスペクトル取得分析システムは、細胞/粒子選別システムと連通されて、標的細胞/粒子のラマン信号の受信と標的細胞/粒子のラマンスペクトルの発生に用いる。上記細胞/粒子選別システムは、マイクロフロー制御システムと連通されて、受信したラマンスペクトル信号によって、上記マイクロフロー制御システムを制御して、標的細胞/粒子の選別を行う。
更に、本発明では下記のように改良することもできる。
【０００９】
上記ラマンスペクトル取得分析システムは、ラマン分光光度計を含む。上記マイクロフロー制御システムは、荷台、マイクロフロー制御デバイス及びマイクロフロー制御ポンプを含む。上記細胞/粒子選別システムは、制御端末、力場制御器と力場発生器を含む。上記ラマン分光光度計は、それぞれマイクロフロー制御デバイスおよび制御端末と連結される。上記荷台は、マイクロフロー制御デバイスと連結される。上記マイクロフロー制御デバイスはマイクロフロー制御ポンプと連結される。上記制御端末は、力場制御器と連結される。上記力場制御器は、力場発生器と連結される。上記力場発生器は、マイクロフロー制御デバイスと連結される。上記荷台は、マイクロフロー制御デバイスに標的細胞/粒子と保護液の輸送に用いる。上記マイクロフロー制御ポンプは、上記荷台から上記マイクロフロー制御デバイスに、標的細胞/粒子と保護液を輸送する速度の制御に用いる。上記制御端末は、生成されたラマンスペクトル信号特異性の識別と状態信号の送信に用いる。上記力場制御器は、受信した状態信号によって、制御信号を生成し、かつ上記制御信号を上記力場発生器に送信することに用いる。上記力場発生器は、受信した制御信号によって、オフ/オン操作することに用いる。
【００１０】
マイクロフロー制御ポンプは、試料の特徴に応じて、標的細胞/粒子と保護液の流動状態を、層流状態におけさせる。流速範囲は0. 1mm/s〜100 mm/sである。
【００１１】
また、上記マイクロフロー制御デバイスは、注入チャンネル、検出・選別エリアおよび収集チャンネルを含む。上記注入チャンネルは、検出・選別エリアおよび収集チャンネルと連通されて、標的細胞/粒子と保護液の注入と混合に用いる。上記検出・選別エリアは、収集チャンネルと連結される。上記検出・選別エリアは、ラマンスペクトル分析エリアと細胞選別エリアを含む。上記ラマンスペクトル分析エリアは、混合後の標的細胞/粒子と保護液が、ラマンレーザー励起によるラマン信号の生成に用いる。上記細胞選別エリアは、標的細胞/粒子の選別に用いる。上記チャンネルは、選別された標的細胞/粒子の収集に用いる。
上記細胞選別エリア内の標的細胞/粒子は、制御できる可変光学、磁場や電場に制御され、異なるタイプの細胞/粒子は、モーションパス差を生成した。
また、上記保護液はpH=5〜10の緩衝溶液である。
【００１２】
保護液の使用目的として、選別前の細胞や粒子を持続的に安定的なpH条件に置き、同時にデュアルチャネルで、保護液の混合と運送を行うことで、選別前の細胞や粒子は、安定的にチャンネルの中で運動することができるので、後のラマンスペクトルの識別と選別に好適である。従って、いかなるpH範囲5〜10の間の緩衝溶液は、すべて本発明に関わるラマンフロー選別装置の中で使うことができる。例えば10.8611 gNa2HP04・2H20と6. 0860gNaH2P04・2H20を、100mL純水の中に溶解させ、全部の結晶が溶解されるまで振動して、純水で1. 0Lに定容して保護液を作る。
【００１３】
また、上記注入チャンネルは、標的細胞/粒子チャンネル、第1選別保護液チャンネルと第2選別保護液チャンネルを含む。上記第1選別保護液チャンネルと第2選別保護液チャンネルは、標的細胞/粒子チャンネルの両側に位置し、かつ標的細胞/粒子チャンネルと連通されている。上記検出・選別エリアは、検出・選別チャンネルを含む。上記検出・選別チャンネルは、標的細胞/粒子チャンネルと、第1選別保護液チャンネルと、第2選別保護液チャンネルと連通されている。上記収集チャンネルは、第1収集チャンネルと第2収集チャンネルを含む。上記第1収集チャンネルと第2収集チャンネルは、検出・選別チャンネルと繋いている。
【００１４】
上記選別保護液チャンネルは、二つがある。試料液が保護液と合流してから、２方向の保護液の平衡作用を受けて、試料液は、保護液層内に層流状態を維持し、試料液の中の選別前の細胞や粒子が均一に、一つ一つ、安定的にチャンネルの中央で運動させることを確保し、効果的に選別効率と正確率を引き上げることができる。
また、上記力場制御器は、音響光学変調器である。上記力場発生器は、光学力場発生器である。
好ましくは、上記光学力場発生器は、400nm〜1500nmの精確な時間で、TTLパルスレーザーを遅らせる。
また、上記力場制御器は、電場変調器である。上記力場発生器は、電場力発生器である。
好ましくは、上記電場力発生器は、パルス遅延用単安定パルス発生器を採用する。
また、上記力場制御器は、電磁石制御器である。上記力場制御器は、磁力発生器である。
好ましくは、上記力場発生器としては、電磁カプラを使う。
【００１５】
また、本発明は、上記課題を解決するため、すなわち、細胞/粒子の分離に用いる選別方法を提供する。該方法は、下記ステップを含む。
1） 細胞/粒子の試料と選別保護液を混合して混合液を作る。
2） 上記混合液に対し、ラマンレーザー励起によってラマン信号を生成する。
3） 上記ラマン信号の生成によって相応のラマンスペクトル信号を生成する。
4） 上記ラマンスペクトル信号について、特異性の識別を行い、かつ識別の結果によって状態信号を生成して送信する。
5） 上記状態信号を受信し、かつ上記状態信号によって、制御信号を生成して送信する。
6） 受信した制御信号によって、異なるタイプの細胞/粒子試料の運動軌道を制御し、それによって異なるタイプの細胞/粒子試料の選別を行う。
【００１６】
上記ステップ1）は、更に下記を含む。
11）標的細胞/粒子の試料を用意し、および選別保護液を調合する。
生体細胞試料について、細胞培養過程を経てから、遠心分離を受け、そして最終的に液体ミネラル培養基の中に移転し、それによって異なる培養基の背景スペクトルが選別結果への影響を避ける。
【００１７】
上記遠心分離の回数および回転数は、生体細胞試料の具体的な種類と使用量によって決める。好ましくは、上記遠心分離の回数は3回、回転数は3000rpmである。
ナノ材料、粒子と細胞内容物について、試料を液体ミネラル培養基あるいは純水の中に溶解し、異なる溶液の背景スペクトルが選別結果への影響を避ける。
【００１８】
緩衝液のｐＨ値および緩衝液がイオン使用量との関係によって表を作成し、緩衝液の調合に必要な固体状態化学成分の量を計算し、そして測った固体状態化学成分を純水の中に溶解して、固体状態化学成分が全部溶けるまで振動し、それから純水を入れて定容を行うと、選別保護液が得られる。
【００１９】
12）標的細胞/粒子溶液と選別保護液を注入する。
ステップ（11）から得た標的細胞/粒子溶液と選別保護液を、それぞれマイクロフロー制御デバイスの特定位置に入れて、マイクロフロー制御ポンプの駆動によって、それぞれ層流方式で、マイクロフロー制御デバイス内部の標的細胞/粒子の注入チャンネル、第1選別保護液チャンネルと第2選別保護液チャンネルを流れる。上記標的細胞/粒子溶液と選別保護液の流速はそれぞれ0. 1mm/s〜100mm/s 。
【００２０】
また、ステップ2）とステップ3）は下記を含む。マイクロフロー制御デバイス内の標的細胞/粒子溶液と選別保護液は混合されてから、検出・選別エリアのラマンスペクトル分析エリアを流れて、ラマンレーザ励起によって、ラマン信号を生成し、ラマン分光光度計はラマン信号を受信し、かつラマン信号によって相応のラマンスペクトル信号を生成する。
また、上記ラマンレーザーのスキャンステップサイズは0. 1ミリ秒〜10ミリ秒、ラマン信号の取込み頻度は100 Hz〜10000 Hz。
【００２１】
また、ステップ4）は下記を含む。制御端末内の情報識別ソフトウェアは、得たラマンのスペクトル信号の情報について特異性の識別を行い、かつ識別の結果によって状態信号を生成して送信する。
【００２２】
また、ステップ5）は下記を含む。力場制御器は、制御端末内の情報識別ソフトウェアに生成された状態信号を受信し、力場発生器のオフやオンの制御を行う。力場発生器はオフ状態の時、検出・選別エリア中の細胞選別エリアには、ラマン励起用レーザ力場、磁力や電場力がないので、標的細胞/粒子の運動状態は影響されなく、最終的に第1収集チャンネルに入る。力場発生器はオン状態の時、検出・選別エリア中の細胞選別エリアには、ラマン励起用レーザ力場、磁力や電場力があるので、標的細胞/粒子の運動状態は影響され、運動軌道は偏りが発生し、最終的に第2収集チャンネルに入る。
【００２３】
本発明の有益な効果として、細胞/粒子の分離に用いる本発明の選別装置は、効果的にナノ〜ミクロンサイズの細胞、ナノ材料、粒子と細胞内容物を識別＆選別することができる。ラマンスペクトルは迅速、非侵襲的と高い情報内容などの特徴があるので、同様な時間内で、蛍光や放射性同位体標識などの方法と比べると、更に豊富な細胞や粒子の特徴情報を提供するので、材料科学、環境微生物学、医学、分子生物学、生物工学とバイオエネルギー開発などの分野の、細胞/粒子試料の高効率分析と選別に適用する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の実施例に関わる細胞/粒子の分離に用いるラマンフロー選別装置の構造略図である。
【図２】本発明に関わる細胞/粒子の分離に用いるラマンフロー選別装置第1実施例の構造略図である。
【図３】本発明に関わる細胞/粒子の分離に用いるラマンフロー選別装置第2実施例の構造略図である。
【図４】本発明に関わる細胞/粒子の分離に用いるラマンフロー選別装置第3実施例の構造略図である。
【図５】本発明の実施例に関わるマイクロフロー制御デバイスの構造略図である。
【図６】本発明の実施例に関わる細胞/粒子の分離に用いるラマンフロー選別装置のラマンスペクトル信号識別図である。
【図７】本発明の実施例に関わる細胞/粒子溶液と選別保護液注入の構造略図である。
【図８】本発明の実施例に関わる細胞/粒子溶液と保護液混合の構造略図である。
【図９】本発明の実施例に関わる混合の標的細胞/粒子溶液と保護液は、ラマンレーザ励起によるラマン信号の生成構造略図である。
【図１０】本発明の実施例に関わる異なるタイプの標的細胞/粒子選別の構造略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明の原理と特徴について図面を参照しながら説明する。ここで挙げられる実施例は本発明を説明するために用いるものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
本発明の目標検出対象は、標的細胞/粒子である。細胞、ナノ材料、粒子と細胞内容物を含む。上記細胞は、ウィルス、微生物細胞、真菌細胞、植物細胞と動物細胞などを含む。上記ナメ材料は、金ナノ粒子、銀ナノ粒子とナノ磁性粒子などを含む。上記粒子のサイズは、ナノ〜ミクロンサイズの花粉、粉塵、土壌粒子、海塩粒子とすす粒子などを含む。上記細胞内容物は、デオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）、蛋白質、脂質、多糖類と細胞小器官などを含む。
【００２６】
図1は、本発明の実施例に関わる細胞/粒子の分離に用いるラマンフロー選別装置の構造略図である。図に示すように、上記細胞/粒子の分離に用いるラマンフロー選別装置は、ラマンスペクトル取得分析システム（10）と、マイクロフロー制御システム（11）と、細胞/粒子選別システム（12）を含む。上記マイクロフロー制御システム（11）は、ラマンスペクトル取得分析システム（10）と連通されて、標的細胞/粒子が波長範囲400nm〜800nmのラマン励起レーザーの励起によるラマン信号の生成、および標的細胞/粒子の選別に用いる。上記ラマンスペクトル取得分析システム（10）は、細胞/粒子選別システム（12）と連通されて、標的細胞/粒子のラマン信号の受信および細胞/粒子のラマンスペクトル信号の生成に用いる。上記細胞/粒子選別システム（12）は、マイクロフロー制御システム（11）と連通されて、受信したラマンスペクトル信号によって、マイクロフロー制御システムを制御して、標的細胞/粒子の選別を行う。
【００２７】
上記ラマンスペクトル取得分析システムは、主にラマン分光光度計を含む。範囲400nm〜800nmのラマン励起レーザーの励起によって、標的細胞/粒子のラマンスペクトルを取得する。表面増強ラマン技術を採用することで、６桁の大きさのラマンスペクトル信号増幅をもたらす。それによってナノ〜ミクロンサイズの細胞/粒子への有効な応答時間は1ミリ秒以内に短縮し、快速、高クアルコム量の検出目的を実現する。ラマン分光光度計を、共焦点光子クランプ法と落射蛍光法と結びつけて、単細胞レベルで、細胞の鑑定や分離ができる同時に、ナノサイズの粒子状物質の有効な識別もできる。
【００２８】
本発明に関わる細胞/粒子の分離に用いるラマンフロー選別装置の基本的な動作原理として、ラマンスペクトルの特徴によって、標的細胞/粒子の情報について識別/分析を行う。コンピュータは自動的にラマンスペクトルデータを分析し、かつ細胞選別切替装置を制御する。光学、磁場や電場の技術手段を使って、特定の細胞/粒子について制御を行う。マイクロフロー制御デバイスによって、細胞/粒子が異なるマイクロフローチャンネルに分離される目的を実現する。
【００２９】
本発明に関わる細胞/粒子の分離に用いるラマンフロー選別装置は、前処理していないあるいは前処理された細胞や粒子の選別に用いる。細胞や粒子の前処理過程は、表面増強ラマン標識処理、磁性ナノ粒子標識処理、安定同位体標識処理と免疫標識処理などを含むことができる。異なる細胞や粒子の試料、あるいは同一の試料の異なる選別指標について、そのシステムの相応設置によって、選別フラックス量を最大化させる目的を実現する。
【００３０】
図2は、本発明に関わる細胞/粒子の分離に用いるラマンフロー選別装置第1実施例の構造略図である。図2に示すように、本実施例の中で、ラマンスペクトル収集分析システム20は、ラマン分光光度計201を含む。上記マイクロフロー制御システム21は、荷台211と、荷台211と連通されているマイクロフロー制御デバイス212と、マイクロフロー制御デバイス212と連通されているマイクロフロー制御ポンプ213を含む。上記細胞/粒子選別システム22は、制御端末221と、制御端末221と連通されている音響光学変調器222と、音響光学変調器222と連通されている光学力場発生器を含む。上記光学力場発生器は、赤外線レーザー224と低絞り値レンズ223を含む。上記音響光学変調器222は、それぞれ赤外線レーザー224と低絞り値レンズ223（絞り値0.18〜0.23）と連結される。上記低絞り値レンズ223は、マイクロフロー制御デバイス212と連結される。上記マイクロフロー制御デバイス212は、ラマン分光光度計201と連結される。上記ラマン分光光度計201は、制御端末221と連結される。
【００３１】
図3は、本発明に関わる細胞/粒子の分離に用いるラマンフロー選別装置第2実施例の構造略図である。図3に示すように、本実施例の中で、ラマンスペクトル収集分析システム30は、ラマン分光光度計301を含む。上記マイクロフロー制御システム31は、荷台311と、荷台311と連通されているマイクロフロー制御デバイス312と、マイクロフロー制御デバイス312と連通されているマイクロフロー制御ポンプ313を含む。上記細胞/粒子選別システム32は、制御端末321と、制御端末321と連通されている電磁石制御器322と、電磁石制御器322と連通されている磁力発生器を含む。上記磁力発生器は、電磁石323である。上記電磁石制御器322は、電磁石323と連結される。上記電磁石323は、マイクロフロー制御デバイス312と連結される。上記マイクロフロー制御デバイス312は、ラマン分光光度計301と連結される。上記ラマン分光光度計301は、制御端末321と連結される。
【００３２】
図4は、本発明に関わる細胞/粒子の分離に用いるラマンフロー選別装置第3実施例の構造略図である。図4に示すように、本実施の例の中で、ラマンスペクトル収集分析システム40は、ラマン分光光度計401を含む。上記マイクロフロー制御システム41は、荷台411と、荷台411と連通されているマイクロフロー制御デバイス412と、マイクロフロー制御デバイス412と連通されているマイクロフロー制御ポンプ413を含む。上記細胞/粒子選別システム42は、制御端末421と、制御端末421と連通されている電場変調器422と、電場変調器422と連通されている電場力発生器を含む上記電場力発生器は、パルス遅延用単安定パルス発生器423である。上記電場変調器422は、パルス遅延用単安定パルス発生器423と連結される。上記パルス遅延用単安定パルス発生器423は、マイクロフロー制御デバイス412と連結される。上記マイクロフロー制御デバイス412は、ラマン分光光度計401と連結される。上記ラマン分光光度計401は、制御端末421と連結される。
【００３３】
図5は、本発明の実施例に関わるマイクロフロー制御デバイスの構造略図である。図5に示すように、上記マイクロフロー制御デバイスは、注入チャンネル、検出・選別エリアと収集チャンネルを含む。上記検出・選別エリアは、ラマンスペクトル分析エリア56と細胞選別エリア57を含む。上記注入チャンネルは、標的細胞/粒子チャンネル50、第1選別保護液チャンネル51と第2選別保護液チャンネル52を含む。上記第1選別保護液チャンネル51と第2選別保護液チャンネル52は、標的細胞/粒子チャンネル50の両側に位置し、かつ標的細胞/粒子チャンネル50と連結される。上記検出・選別エリアは、検出・選別チャンネル53を含む。上記検出・選別チャンネル53は、標的細胞/粒子チャンネル50と、第1選別保護液チャンネル51と第2選別保護液チャンネル52と連結される。上記収集チャンネルは、第1収集チャンネル54と第2収集チャンネル55を含む。上記第1収集チャンネル54と第2収集チャンネル55は、すべて検出・選別チャンネル53と連結される。この図の中の標的細胞/粒子は、2種類異なるタイプの細胞/粒子を含む。それぞれ黒い楕円と白い楕円で示す。ラマン励起レーザーが、ラマンスペクトル分析エリア56の標的細胞/粒子への励起によって、ラマン信号を生成し、および細胞選別エリア57は、2種類異なるタイプの細胞/粒子の選別を行う。1種類タイプの細胞/粒子は、第1収集チャンネル54を通して収集を行い、他の種類のタイプの細胞/粒子は、第2収集チャンネル55を通して収集を行う。
【００３４】
上記標的細胞/粒子チャンネル50の内径は5μm〜300μm、長さは1mm〜50mm。第1選別保護液チャンネル51と第2選別保護液チャンネル52の内径は10μm〜300μm、長さは1mm〜50mm。検出・選別チャンネル53の内径は10μm〜400μm、長さは5mm〜100mm。第1収集チャンネル54と第2収集チャンネル55の内径は5μm〜300μm、長さは5mm〜100mm。
以下、具体的な２つの実施例によって、それぞれ細胞/粒子の分離に用いるラマンフロー選別装置およびその選別方法について更に詳しく説明する。
【００３５】
＜実施例1＞
細胞/粒子の分離に用いるラマンフロー選別装置の構築
1） ラマンスペクトル収集/分析システム
本実例に構築される、細胞/粒子の分離に用いるラマンフロー選別装置は、そのラマンスペクトル収集分析システムの中のラマン分光光度計は、共焦点顕微ラマン分光光度計（Princeton Instrument、 US）を使い、励起波長は514.5nm (Coherent，Innova 90-5 Ar-ion)。ナノ〜ミクロンサイズ顕微鏡は、ライカDM1IRB顕微鏡を使い、63倍の対物レンズ（Leica、 HCX PLAPO）を採用する。ラマンスペクトル信号の収集と分析ソフトウェアは、Labspec5.0を採用する。
【００３６】
2） マイクロフロー制御システム
本実例に構築される、細胞/粒子の分離に用いるラマンフロー選別装置のマイクロフロー制御システムの中に、マイクロフロー制御デバイスの試料注入チャンネル内径は100μm、長さは20 mm。保護液チャンネル内径は100μm、長さは20mm。検出・選別エリアの内径は300μm、長さは0 mm。第1収集チャンネル内径は200μm、長さは20 mm。第2収集チャンネル内径は100μm、長さは20 mm。マイクロフロー制御ポンプは200Series (Kd Scientific， US)を採用し、流速範囲は0.1〜100 mm/s。試料の流動と層流状態を維持する。
【００３７】
3）細胞/粒子選別システム
本実例に構築される、細胞/粒子の分離に用いるラマンフロー選別装置の、細胞/粒子選別システムの中のコンピュータソフトウェアは、Labspec 5.0を採用する。力場制御器は、音響光学変調器と光学力場発生器より構成される。その中の音響光学変調器はAOM ATD-274HD6(IntraAction、Bellwood、IL)を採用し、光学力場発生器は1064 nmの精確な時間遅延TTLパルスレーザー(LCS-DTL-322、Laser 2000 Ltd、US)を採用する。
【００３８】
＜実施例2＞
標的細胞/粒子の分離に用いるラマンフロー選別装置は同位体標識細胞についての選別
（1）標的細胞/粒子試料の用意および選別保護液の調製
液体ミネラル培養基を、細胞培養基として使う。1リットルの液体ミネラル培養基は、2. 5 g Na2HP04、2. 5 g KH2P04、1. 0 g NH4C1、0. 1 g MgS04・7H20、10μL飽和CaCl2溶液、10μL飽和FeS04溶液と1 mL Bauchop & Elsdenを含む。その中に、1LのBauchop & Elsden solutionは、10. 75 g MgS04、4. 5g FeS04 .7H20、2. 0g CaC03、1. 44 g ZnS04 .7H20、1.12gMgS04、4H2O、0.25gCuS04・5H20、 0.28g CoS04・7H20、0.06g H3B03と51. 3 mL飽和HC1溶液を含む。
100μLの海水試料を、10 mLの液体ミネラル培養基の中に入れる。同時に1. 70 mgの炭素13を入れる。標識されるNaHC03は、唯一の炭素源にして、その濃度は2 mM。30℃条件下で、14日間振動/培養して、選別前の細胞溶液を取得する。
10. 86105 g Na2HP04・2H20と6. 08595g NaH2P04・2H20を、100mL純水の中に溶解し、全部の結晶が溶解されるまで振動する。そして、純水を入れて1. 0 Lに定容し、選別保護液を取得する。
【００３９】
（2）標的細胞/粒子溶液と選別保護液の注入
図7に示すように、ステップ（1）から取得した15μLの試料液と150μLの選別保護液を、それぞれマイクロフローデバイスの特定位置に入れて、マイクロフロー制御ポンプの駆動によって、それぞれ層流方式で、マイクロフロー制御デバイス内部の試料注入チャンネルと保護液注入チャンネルを流れ、流速はそれぞれ1 mm/ s。
【００４０】
（3）ラマンスペクトルの生成
図8に示すように、マイクロフロー制御デバイス内の試料液と選別保護液は、混合されてから、ラマンスペクトル分析エリアを流れて、532 nm波長のラマン励起レーザーに照射され、ラマン信号を生成する。図8に示すように、このステップの中で、ラマン励起レーザーの取込み頻度は1 ms、ラマンスペクトル信号の取得周波数は1000 Hz。
【００４１】
（4）情報による異なるタイプの標的細胞/粒子の識別
情報識別ソフトウェアは、取得したラマン信号と情報について、自動的に運算/分析し、標的細胞のタイプを判断する。細胞溶液の中で、炭素13マークのNaHC03を、炭素源成長の微生物細胞として利用することができる。その細胞内容物は、炭素13を含んでいるので、その細胞のラマンスペクトル信号は、炭素13マークのNaHC03を、炭素源成長として利用できない微生物細胞と異なる。図6に示すように、黒い無標識曲線部分は、この範囲の溶液の中には、微生物細胞のラマンスペクトル信号がないことを表す。ソフトウェアは、自動的にこの部分の溶液を、0状態として標識する。◇標識曲線部分は、この範囲の溶液の中には、炭素13マークの微生物細胞のラマンスペクトル信号があるかどうかを示す。フトウェアは、自動的にこの部分の溶液を、0状態として標識する。●標識曲線部分は、この範囲の溶液の中には、炭素13マークの微生物細胞のラマンスペクトル信号があることを表す。ソフトウェアは、自動的にこの部分の溶液を、1状態として標識する。
【００４２】
（5）異なるタイプの標的細胞/粒子の選別
音響光学制御器は、情報識別ソフトウェアに生成された0/1標識信号を受信する。0状態では、音響光学制御器は、細胞/粒子選別サブシステムのオフ状態を維持し、1064 nm精確な時間遅延TTLパルスレーザー力場発生器（DG535、Stanford Research System、Palo Alto、 CA）はレーザーパルスが発生しない。細胞選別エリアは赤外線レーザー力場がない。炭素13マーク無しの微生物細胞の運動状態は影響されなくて、最終的に第1収集チャンネルに入る。1状態では、音響光学制御器は、細胞/粒子選別サブシステムのオン状態を維持する。1064 nm精確な時間遅延 TTLパルスレーザー力場発生器は、レーザーパルスを発生する。レーザーパルス細胞選別エリアは赤外線レーザー力場がある。炭素13マークの微生物細胞の運動状態は影響されなくて、運動軌道の偏りが発生し、最終的に第2収集チャンネルに入る。この過程は図10に示すとおりである。
【００４３】
（6）選別された標的細胞/粒子の回収
第1収集チャンネルと第2収集チャンネルの中の、それぞれ取得した炭素13マーク無しの微生物と炭素13マークの微生物細胞は、相応する回収瓶の中に収集される。その中の炭素13マークの微生物は、炭素13マークのNaHC03を、炭素源成長として利用することができる。これらの細胞について、更に培養、物種分類学鑑定、メタゲノム研究と機能的な遺伝子クローニングなどの分子生物学操作を行うことができる。
上記の説明は、本発明の好ましい実施例であり、本発明を制限するものではない。本発明趣旨と原則範囲内で行ったいかなる修正、同一交換、改善などは、すべて本発明の保護範囲内にするべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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