(57)【要約】  本発明は、一般的に、抗ＨＩＶ−１抗体を誘導する際に使用するのに適した配合物に、そして特に、広域反応性である抗ＨＩＶ−１抗体の誘導のためのＨＩＶ−１  ｇｐ４１膜近位外部領域（ＭＰＥＲ）ペプチド−リポソーム・コンジュゲートとともにＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを含む配合物に関する。本発明はまた、こうした配合物を用いて中和抗ＨＩＶ−１抗体を誘導する方法にも関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において、抗ＨＩＶ−１抗体の産生を誘導する方法であって、前記被験体に、前記誘導を達成するのに十分な量のリポソーム−ペプチド・コンジュゲートを投与する工程を含み、前記ペプチドが、前記リポソーム表面上に提示される膜近位外部領域（ＭＰＥＲ）エピトープを含み、そして前記コンジュゲートがＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンドを含む、前記方法。
【請求項２】
前記ペプチドが疎水性リンカーをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記リンカーが、前記ＭＰＥＲエピトープに対してＣ末端である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記リンカーがＧＴＨ１である、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記エピトープが配列ＥＬＤＫＷＡまたはＮＷＦＮＩＴを含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記エピトープが配列ＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮを含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記エピトープが配列ＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＳＷＮを含む、請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記エピトープが配列ＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦＮＩＴＮＷＬＷＹＩＫを含む、請求項５記載の方法。
【請求項９】
前記エピトープが配列ＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＳＷＮＷＦＮＩＴＮＷＬＷＹＩＫを含む、請求項５記載の方法。
【請求項１０】
前記ＴＲＬリガンドがＴＲＬ９リガンドである、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記ＴＲＬ９リガンドがオリゴＣｐＧである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記ＴＲＬリガンドがＴＲＬ７／８リガンドである、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記ＴＲＬ７／８リガンドがＲ８４８である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記ＴＲＬリガンドがＴＲＬ４リガンドである、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記ＴＲＬ４リガンドがモノホスホリルリピドＡである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記コンジュゲートがＴＲＬ９リガンドおよびＴＲＬ７／８リガンドを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
前記ＴＲＬ９リガンドがオリゴＣｐＧであり、そして前記ＴＲＬ７／８リガンドがＲ−８４８である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記コンジュゲートがＴＲＬ９リガンドおよびＴＲＬ４リガンドを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
前記ＴＲＬ９リガンドがオリゴＣｐＧであり、そして前記ＴＲＬ４リガンドがＲ−８４８である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記コンジュゲートがさらに、被包されたインターフェロン−αを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
前記コンジュゲートがプライムまたはブーストとして投与される、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
リポソーム表面上に提示されるＭＰＥＲエピトープ、および前記リポソームにコンジュゲート化された少なくとも１つのＴＲＬリガンドを含む、免疫原。
【請求項２３】
前記リポソーム内に被包されたインターフェロン−αをさらに含む、請求項２２記載の免疫原。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全内容が本明細書に援用される、２００９年４月３日出願の米国仮出願第６１／１６６，６２５号に優先権を請求する。
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号第ＡＩ  ０６７８５４号のもとに米国政府の援助を受けて作成された。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００２】
技術分野
本発明は、一般的に、抗ＨＩＶ−１抗体を誘導する際に使用するのに適した配合物に、そして特に、広域（ｂｒｏａｄｌｙ）反応性抗ＨＩＶ−１抗体の誘導のためのＨＩＶ−１  ｇｐ４１膜近位外部領域（ＭＰＥＲ）ペプチド−リポソーム・コンジュゲートとともにＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを含む配合物に関する。本発明はまた、こうした配合物を用いて中和抗ＨＩＶ−１抗体を誘導する方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
ＨＩＶ−１ワクチン開発に対する主要な課題の１つは、免疫原が、広域（ｂｒｏａｄｌｙ）中和抗体（ｎＡｂ）を誘導不能であることであった。ｎＡｂは、ＨＩＶ−１感染中に生成される。しかし、生成されるｎＡｂの大部分は、自己ウイルスまたは近縁関連株のみを中和する（Ｍｏｏｇら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７１：３７３４−３７４１（１９９７）、Ｇｒａｙら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８１：６１８７−６１９６（２００７））。ＨＩＶエンベロープ（Ｅｎｖ）は、常に突然変異して、存在するｎＡｂ反応からエスケープする（Ａｌｂｅｒｔら，  Ａｉｄｓ  ４：１０７−１１２（１９９０）、Ｗｅｉら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４２２：３０７−３１２（２００３））。ｎＡｂ反応は、ＨＩＶ感染経過に渡って発展はする。しかし、ＨＩＶ−１ウイルスの突然変異能のため、中和抗体反応は常に、ウイルス進化に「遅れを取っている」ように見える（Ｗｅｉら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４２２：３０７−３１２（２００３）、Ｒｉｃｈｍａｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １００：４１４４−４１４９（２００３）、Ｇｅｆｆｉｎら，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３１０：２０７−２１５（２００３））。
【０００４】
徹底的な研究の後、ＨＩＶに対する広域中和モノクローナル抗体（ｍＡｂ）がいくつか同定されてきている（Ｂｕｃｈａｃｈｅｒら，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍ．  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １０：３５９−３６９（１９９４）、Ｚｗｉｃｋら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７５：１０８９２−１０８９５（２００１）、Ｂｕｒｔｏｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８８：１０１３４−１０１３７（１９９１））。２つのこうした抗体、２Ｆ５および４Ｅ１０は、ＨＩＶの保存される膜近位外部領域（ＭＰＥＲ）をターゲティングし、広範囲の中和を有し（Ｂｉｎｌｅｙら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８：１３２３２−１３２５２（２００４））、そして新規に伝染したウイルスの、それぞれ８０％および１００％を中和することが示されてきている（Ｍｅｈａｎｄｒｕら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８：１４０３９−１４０４２（２００４））。いくつかの他の広域中和モノクローナル抗体と組み合わせて受動的に投与されると、２Ｇ１２、２Ｆ５および４Ｅ１０で構成されるｍＡｂのカクテルは、動物モデルにおいて、ウイルス感染から宿主を防御するのに成功する（Ｂａｂａら，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ６：２００−２０６（２０００）、Ｆｅｒｒａｎｔｅｌｌｉら，  Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  １８９：２１６７−２１７３（２００４）、Ｍａｓｃｏｌａら，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ６：２０７−２１０（２０００）、Ｒｕｐｒｅｃｈｔら，  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１：３３７０−３３７３（２００３））か、または抗レトロウイルス療法休止後のウイルスリバウンドを遅延させた（Ｔｒｋｏｌａら，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  １１：６１５−６２２（２００５））。
【０００５】
ＨＩＶ感染患者が２Ｆ５および４Ｅ１０抗体を自発的に発展させることは稀であり（Ｄｈｉｌｌｏｎら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８１：６５４８−６５６２（２００７））、そしてワクチン接種によって、２Ｆ５および４Ｅ１０様抗体の誘導が成功したことはない（Ｋｉｍら，  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２５：５１０２−５１１４（２００６）、Ｃｏｅｆｆｉｅｒら，  Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：６８４−６９３（２０００）、Ｊｏｙｃｅら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７：４５８１１−４５８２０（２００２）、Ｈｏら，  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３：１５５９−１５７３（２００５）、Ｚｈａｎｇら，  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２１０：６３９−６４５（２００５））という事実のため、ＨＩＶ感染を防止するための２Ｆ５および４Ｅ１０使用の潜在能力は、非常に損なわれる。天然ＨＩＶ−１感染中に２Ｆ５または４Ｅ１０様抗体を発展させる被験体を同定し、そしてこれらの広域中和抗体の機構またはこれに対する妨害を理解することは、ＡＩＤＳワクチン設計に重要である。
【０００６】
本発明は、少なくとも部分的に、２Ｆ５および４Ｅ１０  ｍＡｂに対する中和感受性の増加と関連する、ＨＩＶ−１  ＭＰＥＲ領域中の稀なＥｎｖ突然変異の同定および性質決定から生じる。本発明はまた、Ｂ細胞寛容を調節し、そして免疫原性が劣っているＨＩＶ−１  ｇｐ４１  ＭＰＥＲエピトープに対する抗体反応を増進することが可能な構築物の発展からも生じている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍｏｏｇら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７１：３７３４−３７４１（１９９７）
【非特許文献２】Ｇｒａｙら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８１：６１８７−６１９６（２００７）
【非特許文献３】Ａｌｂｅｒｔら，  Ａｉｄｓ  ４：１０７−１１２（１９９０）
【非特許文献４】Ｗｅｉら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４２２：３０７−３１２（２００３）
【非特許文献５】Ｒｉｃｈｍａｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １００：４１４４−４１４９（２００３）
【非特許文献６】Ｇｅｆｆｉｎら，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３１０：２０７−２１５（２００３）
【非特許文献７】Ｂｕｃｈａｃｈｅｒら，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍ．  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １０：３５９−３６９（１９９４）
【非特許文献８】Ｚｗｉｃｋら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７５：１０８９２−１０８９５（２００１）
【非特許文献９】Ｂｕｒｔｏｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８８：１０１３４−１０１３７（１９９１）
【非特許文献１０】Ｂｉｎｌｅｙら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８：１３２３２−１３２５２（２００４）
【非特許文献１１】Ｍｅｈａｎｄｒｕら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８：１４０３９−１４０４２（２００４）
【非特許文献１２】Ｂａｂａら，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ６：２００−２０６（２０００）
【非特許文献１３】Ｆｅｒｒａｎｔｅｌｌｉら，  Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  １８９：２１６７−２１７３（２００４）
【非特許文献１４】Ｍａｓｃｏｌａら，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ６：２０７−２１０（２０００）
【非特許文献１５】Ｒｕｐｒｅｃｈｔら，  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１：３３７０−３３７３（２００３）
【非特許文献１６】Ｔｒｋｏｌａら，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  １１：６１５−６２２（２００５）
【非特許文献１７】Ｄｈｉｌｌｏｎら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８１：６５４８−６５６２（２００７）
【非特許文献１８】Ｋｉｍら，  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２５：５１０２−５１１４（２００６）
【非特許文献１９】Ｃｏｅｆｆｉｅｒら，  Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：６８４−６９３（２０００）
【非特許文献２０】Ｊｏｙｃｅら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７：４５８１１−４５８２０（２００２）
【非特許文献２１】Ｈｏら，  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３：１５５９−１５７３（２００５）
【非特許文献２２】Ｚｈａｎｇら，  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２１０：６３９−６４５（２００５）
【発明の概要】
【０００８】
一般的に、本発明は、抗ＨＩＶ−１抗体を誘導する際に使用するのに適した配合物に関する。より具体的には、本発明は、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１  ＭＰＥＲペプチド−リポソーム・コンジュゲートとともにＴＬＲアゴニストを含む配合物に、そして該配合物を用いて、広域反応性中和抗ＨＩＶ−１抗体を誘導する方法に関する。
【０００９】
本発明の目的および利点は、以下の説明から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】自己および異種血清／抗体によるＴＮＤ＿６６９ＳおよびＴＮＤ＿６６９Ｌ  Ｅｎｖ−偽ウイルスの中和感受性。ＳＣ４２−１５ヶ月、ＳＣ４２−２７ヶ月およびＳＣ４２−５年は、感染１５ヶ月、２７ヶ月、および６５ヶ月後の自己血清であり；ＳＣ０３−ＴＴ２９はトリニダード・コホート由来の異種血清であり；ＩＢＢＪＴ、ＢＤは陽性対照として用いたＨＩＶ＋患者血清であり；ＨＩＶＩＧはＨＩＶ＋患者血清由来の精製プールＩｇＧである。試料の入手可能性が限定されているため、すべての試料を１回より多く試験したわけではない。１回より多く試験した試料に関しては、バーは平均力価に相当し、そしてエラーバーは標準誤差に相当する。
【図２】選択したＳＣ４２  Ｅｎｖ配列の部分的整列。ＴＮＤ＿６６９Ｓ、ＴＮＤ＿６６９Ｌおよび７５３４−ｘｘ（「ｘｘ」は図２に示す通りである）は、感染１５ヶ月後の血漿由来の配列である；示す他の配列は感染後第０週（２６６１−ｘ）、第１週（００ＳＣ４２−ｘｘ）および６０ヶ月（９５ＳＣ４２−ｘｘ）（「ｘ」および「ｘｘ」は図２に示す通りである）の血漿由来の選択した配列である。２Ｆ５および４Ｅ１０のコンセンサス・エピトープ配列を、それぞれ、青および緑の囲みで強調する。
【図３】図３Ａおよび３Ｂ。多様なモノクローナル抗体および進入阻害剤Ｔ２０によるＴＮＤ＿６６９ＳおよびＴＮＤ＿６６９Ｌ  Ｅｎｖ−偽ウイルスの中和。２つの株に対する各試薬の平均ＩＣ５０を、標準誤差を示すエラーバーとともに図３Ａに示す。ＴＮＤ＿６６９ＳおよびＴＮＤ＿６６９Ｌに対する各中和抗体強度のＩＣ５０値および倍相違を図３Ｂに示す。各ＩＣ５０を少なくとも２回の独立の試験から得た。２Ｆ５、４Ｅ１０、ＴｒｉＭａｂ、１ｂ１２、および２Ｇ１２に関するデータにはまた、Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ博士の研究室（デューク大学）が行った試験由来のデータの１セットも含まれる。ＴＮＤ＿６６９ＳおよびＴＮＤ＿６６９Ｌに対する各ｍＡｂのＩＣ５０間の倍相違（ＴＮＤ＿６６９Ｓ：ｔＮＤ＿６６９Ｌ）を表の最後の列に列挙し、そしてＴＮＤ＿６６９Ｓの感受性における有意な増加を伴うものを黄色で強調する（そして
【００１１】
【化１】
2013505201.tif 000003
【００１２】
で示す）。
【図４】図４Ａおよび４Ｂ。ペプチド吸収中和アッセイ。異なる用量の２Ｆ５ペプチドを用いて、ｍＡｂ  ２Ｆ５によるＴＮＤ＿６６９Ｓ  Ｅｎｖ−偽ウイルスの中和を試験した。突然変異体ペプチド（Ｌ６６９突然変異を含む２Ｆ５エピトープを含有する、２Ｆ５６５６−６７０／Ｌ６６９Ｓ）による２Ｆ５  ｍＡｂ中和の阻害を図４Ａに示す。コンセンサス・ペプチドを含有するペプチド（コンセンサス・ペプチド）によって生成される阻害曲線は同様である。ＩＣ５０データを図４Ｂ中の表に要約する。ＴＮＤ＿６６９Ｌウイルスに対してもまた同様の試験を行った。同様の傾向が観察されたが、２Ｆ５  ｍＡｂに対するＴＮＤ＿６６９Ｌの感受性が低いため、ＴＮＤ＿６６９Ｌ偽ウイルスを用いて生成されるデータは、定量的ではなかった。
【図５】図５Ａおよび５Ｂ。ｍＡｂ  ２Ｆ５に対するＦ５ｍｕｔ（図５Ａ）およびＦ５ｃｏｎ（図５Ｂ）ペプチドの結合アビディティーに関するＢＩＡｃｏｒｅ  ＳＰＲアッセイ。
【図６】図６Ａおよび６Ｂ。ペプチド−リポソーム・コンジュゲートに対する２Ｆ５  ｍＡｂの結合。図６Ａ。２Ｆ５ペプチド−リポソーム（破線）およびＬ６６９Ｓ突然変異体ペプチド−リポソーム（実線）に対する２Ｆ５  ｍＡｂの標準化特異的結合反応の比較。挿入図は、２Ｆ５  ｍＡｂ相互作用の解離期（１２０〜４００ｓ）の拡大図を示す。図６Ｂ。２Ｆ５  ｍＡｂ−ペプチド−リポソーム相互作用の遭遇−ドッキングモデル、ならびに会合および解離工程の概算される速度定数。
【図７】ＰＢＭＣにおける二重感染適合度アッセイ。９：１（ＴＮＤ＿６６９Ｓ：ＴＮＤ＿６６９Ｌ）の投入比での試験を示す。相対適合度値１＋Ｓ＝１．８６。（１＋Ｓ＝ｅｘｐ（ｄ）＝ｅｘｐ｛ｌｎ［（ＴＭ（ｔ２）ｘＴＬ（ｔ１））／（ＴＬ（ｔ２）ｘＴＭ（ｔ１））］／Δｔ｝。異なるウイルス投入比を用いた３回の個々の試験は、すべて、１．８０〜１．９０の１＋Ｓ値を生じた。
【図８】２つの広域中和抗体２Ｆ５および４Ｅ１０のエピトープを含むＨＩＶ−１  ｇｐ４１  ＭＰＥＲペプチド。合成リポソームにコンジュゲート化可能なｇｐ４１  ＭＰＥＲペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図９】リポソームとともに配合されたＴＬＲアゴニストの構造。免疫原設計の模式図は、アジュバントとして異なるＴＬＲアゴニストを含有するペプチド・リポソームを示す；ＴＬＲ４（リピドＡ）；ＴＬＲ９（ｏＣｐＧ）およびＴＬＲ７（Ｒ８４８）。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｃ。ＴＬＲアジュバントにコンジュゲート化されたＭＰＥＲペプチド−リポソームと２Ｆ５  ｍＡｂの相互作用。図１０Ａは、リピドＡ（２００μｇ用量当量）を含むｇｐ４１  ＭＰＥＲリポソーム構築物への２Ｆ５  ｍａｂの強い結合を示す。図１０Ｂは、ｏＣｐＧ（５０μｇ用量当量）コンジュゲート化ｇｐ４１  ＭＰＥＲリポソームへの２Ｆ５  ｍＡｂの結合を示す。図１０Ｃは、Ｒ８４８コンジュゲート化ｇｐ４１  ＭＰＥＲ含有リポソームに対する２Ｆ５  ｍＡｂの結合を示す。ＴＬＲアジュバントのみを含む対照リポソームに比較して、ｇｐ４１  ＭＰＥＲ−アジュバント・リポソーム構築物各々に対する、強い２Ｆ５  ｍＡｂ結合が観察された。
【図１１】ＩＦＮα被包ＭＰＥＲペプチド・リポソーム。
【図１２】複数のＴＬＲリガンドを伴うＩＦＮα被包リポソーム。これらの構築物は、二重ＴＬＲ誘発によって、Ｂ細胞反応において相乗作用を提供する潜在能力を有する。
【図１３】２Ｆ５（Ｏｆｅｋら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８：１０７２４（２００４））および４Ｅ１０（Ｃａｒｄｏｓｏら，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２２：１６３−１７３（２００５））の結晶構造、ならびに脂質およびＨＩＶ−１ウイルス膜への結合を排除するためのＣＤＲ  Ｈ３ループ中の突然変異設計。
【図１４Ａ】図１４Ａおよび１４Ｂ。４Ｅ１０（図１４Ａ）および２Ｆ５（図１４Ｂ）ＣＤＲ  Ｈ３の疎水性残基を置換すると、脂質結合が妨害され、そして両ｍＡｂがＨＩＶ−１を中和する能力が抑止される。
【図１４Ｂ】図１４Ａおよび１４Ｂ。４Ｅ１０（図１４Ａ）および２Ｆ５（図１４Ｂ）ＣＤＲ  Ｈ３の疎水性残基を置換すると、脂質結合が妨害され、そして両ｍＡｂがＨＩＶ−１を中和する能力が抑止される。
【図１５】２Ｆ５  ｍＡｂによるＱＺ４７３４およびＱＺ４７３４／Ｌ６６９Ｓ偽型化ウイルスの中和（ＴＺＭ−ｂｌ細胞に対して試験）。ＱＺ４７３４エンベロープ内にＬ６６９Ｓ単一突然変異を導入することによって、ＱＺ４７３４／Ｌ６６９Ｓを生成した。曲線脇の数値はＩＣ５０値を示す。
【図１６】２Ｆ５およびＴｒｉＭａｂ（２Ｆ５、４Ｅ１０および２Ｇ１２の１：１：１の組み合わせ）による、ＴＮＤ＿６６９Ｓおよび同じ血漿試料（感染後１５ヶ月）から単離された２つの他の株（７５３４．２および７５３４．１１）の中和。各バー上の数値はＩＣ５０値を示す。ＴＺＭ−ｂｌ細胞に対して試験を行った。
【図１７】ＭＰＥＲリポソーム免疫原で免疫したモルモット（ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ）における、ｇｐ４１  ＭＰＥＲ特異的抗体反応の誘導。
【図１８】ＭＰＥＲリポソーム免疫原で免疫した非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における、ｇｐ４１  ＭＰＥＲ特異的抗体反応の誘導。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、ＴＬＲリガンドおよびＨＩＶ−１  ｇｐ４１中和抗原を提示する、リポソームに基づくアジュバント・コンジュゲートに、そして該コンジュゲートを用いて、被験体（例えばヒト被験体）において、中和抗ＨＩＶ−１抗体を誘導する方法に関する。適切な中和抗原には、ｇｐ４１  ＭＰＥＲエピトープ・ペプチド（Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒら，  Ｊ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ５４：９１５−９２０（２００４）、ＳｔｉｅｇｌｅｒおよびＫａｔｉｎｇｅｒ，  Ｊ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ５１２：７５７−７５９（２００３）、Ｚｗｉｃｋら，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７９：１２５２−１２６１（２００５）、Ｐｕｒｔｓｃｈｅｒら，  ＡＩＤＳ  １０：５８７（１９９６））およびその変異体、例えばＭＰＥＲ  Ｍａｂ、２Ｆ５および４Ｅ１０に対してより高い中和感受性を与える変異体が含まれる。好ましい態様において、変異体は、ＭＰＥＲ  ｍＡｂ、２Ｆ５および４Ｅ１０に対して、より高い中和感受性を与えるＬ６６９Ｓ突然変異を持つＭＰＥＲエピトープ・ペプチドである（Ｓｈｅｎら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８３：３６１７−２５（２００９））。
【００１４】
本発明で使用するのに適したリポソームには、限定されるわけではないが、ＰＯＰＣ、ＰＯＰＥ、ＤＭＰＡ（またはスフィンゴミエリン（ＳＭ））、リソホスホリルコリン、ホスファチジルセリン、およびコレステロール（Ｃｈ）を含むものが含まれる。最適比を当業者が決定することも可能であるが、例には、４５：２５：２０：１０の比のＰＯＰＣ：ＰＯＰＥ（またはＰＯＰＳ）：ＳＭ：Ｃｈ、あるいはＰＯＰＣ：ＰＯＰＥ（またはＰＯＰＳ）：ＤＭＰＡ：Ｃｈが含まれる。使用可能なリポソームの別の配合物には、９：７．５：１のモル比で配合されたＤＭＰＣ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）（またはリソホスホリルコリン）、コレステロール（Ｃｈ）およびＤＭＰＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）が含まれる（Ｗａｓｓｅｆら，  ＩｍｍｕｎｏＭｅｔｈｏｄｓ  ４：２１７−２２２（１９９４）；  Ａｌｖｉｎｇら，  Ｇ．  Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ（監修），  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  第２版，  ｖｏｌ．  Ｉｌｌ  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  ＦＬ（１９９３）；  Ｒｉｃｈａｒｄｓら，  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６６（６）：２８５９０２８６５（１９９８））。上記脂質組成物をリピドＡと複合体形成させて、そして免疫原として用いて、リン脂質に対する抗体反応を誘導してもよい（Ｓｃｈｕｓｔｅｒら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２２：９００−９０５（１９７９））。好ましい配合物は、Ｓｃｈｕｓｔｅｒら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２２：９００−９０５（１９７９）にしたがって、リピドＡと複合体形成させた、６０：３０：１０の比のＰＯＰＣ：ＰＯＰＳ：Ｃｈを含む。
【００１５】
本発明にしたがって、免疫反応増進性ＴＬＲリガンド、例えばモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−Ａ、ＴＬＲ４リガンド）、オリゴＣｐＧ（ＴＬＲ  ９リガンド）およびＲ−８４８（ＴＬＲ  ７／８リガンド）を、個々に、または組み合わせて、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１  ＭＰＥＲペプチド免疫原とコンジュゲート化されたリポソーム内に配合する。ＴＬＲアゴニストの好ましい組み合わせは、ｏＣｐＧ（ＴＬＲ９）（Ｈｅｍｎｉら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：７４０−７４５（２００４））およびＲ８４８（ＴＬＲ７／８）（Ｈｅｍｎｉら，  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３：１９６−２００（２００２））を含む。
【００１６】
本発明の構築物のさらなる設計には、サイトカイン、インターフェロン（ＩＦＮ）−αが被包され、そして被包されたかまたは膜結合性のＣＤ４０リガンドを含むＭＰＥＲペプチド−リポソームが含まれる。２つの広域中和ｇｐ４１  ＭＰＥＲ抗体（２Ｆ５、４Ｅ１０）は、こうしたＴＬＲリガンド・アジュバントが会合したリポソーム構築物に高いアフィニティで結合する。これらの構築物を用いて、Ｂ細胞寛容を調節し、広域反応性中和抗体を作製可能な特定のＢ細胞集団に対してリポソームを向け、そして免疫原性が劣ったＨＩＶ−１  ｇｐ４１  ＭＰＥＲエピトープに対する抗体反応を増進することも可能である。
【００１７】
自己反応性Ｂ細胞は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）およびＴＬＲの二重会合に依存する機構を通じて、ＴＬＲリガンドによって活性化可能である（Ｌｅａｄｂｅｔｔｅｒら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４１６：６０３（２００２）；  Ｍａｒｓｈａｋ−Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎら，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２５：４１９−４１（２００７）、Ｈｅｒｌａｎｄｓら，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２９：２４９−２６０（２００８）、Ｓｃｈｌｏｍｃｈｉｋ，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２８：１８−２８（２００８））。本発明の好ましい免疫原設計において、可溶性ＩＦＮ−αは、ＭＰＥＲ６５６またはＭＰＥＲ６５６−Ｌ６６９ＳペプチドなどのＭＰＥＲペプチドにコンジュゲート化されたリポソーム内に被包される。ＩＦＮ−αは、ＢＣＲ活性化閾値を低下させることによって、自己反応性Ｂ細胞に対する選択性を調節し、そして緩和すると報告されてきている（Ｕｃｃｅｌｌｉｎｉら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８１：５８７５−５８８４（２００８））。免疫原設計は、膜結合性ＭＰＥＲエピトープへの結合およびＨＩＶ−１の中和の両方に、ｇｐ４１  ＭＰＥＲ抗体の脂質反応性が必要であるという観察から生じる。
【００１８】
リポソームがターゲティング可能なＢ細胞サブセットには、脂質およびＭＰＥＲのｇｐ４１エピトープの両方と反応する多重反応性抗体を作製可能であるいかなるＢ細胞サブセットも含まれる。これらのＢ細胞サブセットには、限定されるわけではないが、辺縁帯ＩｇＭ＋  ＣＤ２７＋  Ｂ細胞サブセット（Ｗｅｉｌｌら，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２７：２６７−８５（２００９）、Ｌｉら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ  １９５：１８１−１８８（２００２））、ヒトＢ細胞の移行性集団（Ｓｉｍｓら，  Ｂｌｏｏｄ  １０５：４３９０−４３９８（２００５））、およびマウス免疫グロブリン（Ｉｇ）軽鎖ラムダＸのヒト同等物を発現するＢ細胞のヒト同等物（Ｌｉら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １０３：１１２６４−１１２６９（２００６）、Ｗｉｔｓｃｈら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  ２０３：１７６１−１７７２（２００６））が含まれる。これらのＢ細胞サブセットはすべて、多重反応性抗体を作製する能力を有し、そしてしたがって、脂質およびＨＩＶ−１  ｇｐ４１の両方と反応する特性を有する抗体を作製する能力を有する。リポソームがその内部に脂質およびｇｐ４１の両方を有する特性を有する結果、これらの免疫原は関心対象のＢ細胞を選択的にターゲティングするはずである。これらのリポソームを用いて、Ｂ細胞の寛容を一過性に破壊するか、または稀なＢ細胞サブセットをターゲティングすることも可能であるため、以下に記載されるものなどの脱グリコシル化エンベロープ調製物などの他のＨＩＶ−１エンベロープ免疫原を、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ  ７／８アゴニストおよびＩＦＮαを含有するリポソーム中で配合してもよいことがわかる。
【００１９】
脱グリコシル化ＪＲＦＬ  ｇｐ１４０  Ｅｎｖタンパク質およびＣＤ４結合部位突然変異体ｇｐ１４０（ＪＲＦＬ  ＡＰＡ）が以前の出願に記載されてきている（例えばＷＯ２００８／０３３５００を参照されたい）。膜貫通ドメインを取り込むことによって、脱グリコシル化ｅｎｖおよび免疫抑制性でないようにＣＤ４に結合しないよう突然変異させたＥｎｖを、リポソーム中に係留してもよく、そして界面活性剤中で可溶化した後、合成リポソーム内に再構成してもよい。あるいは、Ｅｎｖ  ｇｐ１４０のＨｉｓタグ化（ｃ末端）型を、ＨＩＶ−１のｇｐ４１中間体型（ｇｐ４１中間体）に関して記載されるように、リポソーム内に係留してもよい。
【００２０】
多重反応性抗体を作製可能な多くのＢ細胞サブセットが、哺乳動物ＤＮＡにも結合することを考慮すると、リポソームへのＤＮＡの添加を用いて、免疫原を反応性Ｂ細胞にターゲティングすることも可能である。
【００２１】
本発明のリポソーム含有配合物を、例えば筋内、静脈内、腹腔内または皮下注射によって投与してもよい。さらに、配合物を鼻内経路によって、あるいは座薬様ビヒクルとして直腸内または膣に投与してもよい。一般的に、リポソームを生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．０などの水溶液中に懸濁する。最適投薬措置は、当業者によって容易に決定可能である。
【００２２】
本発明の特定の側面が、以下の限定しない実施例に、より詳細に記載されうる。公開ＰＣＴ出願第ＷＯ  ２００６／１１０８３１号および第ＷＯ  ２００８／１２７６５１号、米国公開出願第２００８／００３１８９０号および第２００８／００５７０７５号、米国仮出願第６０／９６０，４１３号、ならびに米国出願第１１／９１８，２１９号もまた参照されたい（また、２００９年４月３日出願の“Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ”と題される関連出願（代理人整理番号０１５７９−１４３０）および２００９年４月３日出願の“Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ”と題される関連出願（代理人整理番号０１５７９−１４３１）もまた参照されたい）。
【実施例】
【００２３】
実施例１
実験詳細
被験体
トリニダード血清転換コホートが先に記載された（Ｂｌａｔｔｎｅｒら，  Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  １８９：１７９３−１８０１（２００４））。簡潔には、性行為感染症（ＳＴＤ）クリニック由来の患者をＨＩＶ感染に関して監視し、そして血清転換に際して登録した。感染は、異性との性的接触を通じて起こり、そしてサブタイプＢウイルスがすべての感染の原因であった。本研究における関心対象の患者、ＳＣ４２は、感染までの５年間、抗ウイルス療法に関して未処置であった。
【００２４】
全長エンベロープの分子クローニング
全長ｇｐ１６０のクローニング戦略が先に記載されてきている（Ｗｅｉら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４２２：３０７−３１２（２００３）、Ｌｉら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９：１０１０８−１０１２５（２００５））。簡潔には、ＱＩＡｍｐウイルスＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を用いて患者血漿試料からウイルスＲＮＡを抽出し、そして続いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州カールスバッド）およびランダム六量体プライマーを用いて、ｃＤＮＡに逆転写した。以下のプライマーとともに、入れ子ＰＣＲによって、全長エンベロープ配列を生成した：第１周期プライマー  ５’ＯＵＴ  ５’−ＴＡＧＡＧＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧ−３’、ｎｔ  ５８５２−５８７６および３’ＯＵＴ  ５’−ＴＴＧＣＴＡＣＴＴＧＴＧＡＴＴＧＣＴＣＣＡＴＧ  Ｔ−３’  ｎｔ  ８９１２−８９３５；ならびに第二周期プライマー、５’Ｉｎｔｏｐｏ  ５’−ＣＡＣＣＴＡＧＧＣＡＴＣＴＣＣＴＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡ  ＡＧ−３’、ｎｔ  ５９５７−５９８２および３’ＩＮ  ５’−ＧＴＣＴＣＧＡＧＡＴＡＣＴＧＣＴＣＣＣＡＣＣＣ−３’、ｎｔ  ８８８１−８９０３。ＰＣＲ産物を精製し、そして次いで、製造者の指示にしたがって、定方向クローニングベクターｐｃＤＮＡ  ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に直接連結した。このｐｃＤＮＡ  ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯベクターは、サイトメガロウイルス・プロモーターを含有し、該プロモーターは、続く偽ウイルス産生のためのエンベロープタンパク質発現を可能にする。
【００２５】
単一突然変異導入のための突然変異誘発
製造者の指示にしたがってＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＸＬ部位特異的突然変異誘発キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ）を用いて、ＨＳ−ＭＰＥＲ内にＳ６６９Ｌ突然変異を導入して、ＨＳ−ＭＰＥＲ／Ｓ６６９Ｌを生成し、そしてＨＳ−ＭＰＥＲ内にＫ６６５Ｎ突然変異を導入して、ＨＳ−ＭＰＥＲ／Ｋ６６５Ｎを生成した。ＨＳ−ＭＰＥＲ内にＳ６６９Ｌ突然変異を導入するためのプライマーは：  ｆＮ−ＭＰＥＲ＿Ｓ６６９Ｌ（５’−ＧＧＡＴＡＡＧＴＧＧＧＣＡＡＧＴＴＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＧＴＴＴＧＡＣ−３’）およびｒ７５３４．５＿Ｓ６６９Ｌ（５’−ＧＴＣＡＡＡＣＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＡＡＣＴＴＧＣＣＣＡＣＴＴＡＴＣＣ−３’）であり；  ＨＳ−ＭＰＥＲ内にＫ６６５Ｎを導入するためのプライマーは：  ｆＨＳ−ＭＰＥＲ＿Ｋ６６５Ｎ（５’−ｇａａｔｔａｔｔａｇａａｔｔｇｇａｔａａＣｔｇｇｇｃａａｇｔｔｃｇｔｇｇ−３’）およびｒ７５３４．５＿Ｋ６６５Ｎ（５’−ＣＣＡＣＧＡＡＣＴＴＧＣＣＣＡＧＴＴＡＴＣＣＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＡＴＴＣ−３’）であった。
【００２６】
ｅｎｖ−偽ウイルスの産生および力価決定
マイナーな修飾を伴い、先に記載される方法（Ｌｉら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９：１０１０８−１０１２５（２００５））から修飾した方法にしたがって、ｅｎｖ−偽ウイルスの産生および力価決定を行った。ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、スイス・バーゼル）を用い、ｅｎｖ欠損ＨＩＶ−１骨格（ｐＳＧ３Δｅｎｖ）とともに、ｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯベクター中の全長ｅｎｖクローンを２９３Ｔ細胞内に同時トランスフェクションした。インキュベーション２４〜３６時間後に組織培養液を採取し、そして新鮮なウシ胎児血清をウイルスストックに添加して、最終濃度２０％を作製した。
【００２７】
先に記載されるように（Ｌｉら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９：１０１０８−１０１２５（２００５））、ＪＣ５３−ＢＬ細胞に対して、各ウイルス調製物の５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）を決定した。簡潔には、連続希釈ウイルスストックを用いて、９６ウェル平底プレート上のＪＣ５３−ＢＬ細胞を４８時間感染させた。次いで、細胞を溶解し、そしてＢｒｉｔｅＬｉｔｅＴＭアッセイ系（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ウォルトン）によって相対発光単位（ＲＬＵ）を決定した。細胞のみの対照のものの２．５倍を超えるルシフェラーゼ発光を示したウェルを、ウイルス感染に関して陽性と見なした。Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ式を用いて、ＴＣＩＤ５０を計算した。
【００２８】
中和アッセイ
先に記載されるように（Ｌｉら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９：１０１０８−１０１２５（２００５））、９６ウェル平底プレート上のＪＣ５３−ＢＬ細胞に対して、偽ウイルスに関する中和アッセイを行った。簡潔には、連続希釈血清試料または精製Ａｂを試験ウイルスとインキュベーションした後、ＪＣ５３−ＢＬ細胞を添加した。ＢｒｉｔｅＬｉｔｅＴＭアッセイ系で各ウェルの相対発光単位（ＲＬＵ）を測定し、そしてウイルス対照に比較してウイルス感染を５０％阻害可能である血清の最高希釈として（血清試料の場合）またはＡｂの最低濃度として（精製Ａｂの場合）ＩＣ５０を決定した。
【００２９】
ペプチド吸収中和アッセイ
中和アッセイからペプチド吸収中和アッセイを修飾した。ウイルス添加前に１時間、適切に希釈したペプチドと連続希釈血清試料または精製Ａｂをプレインキュベーションした後、通常の中和アッセイを行った。
【００３０】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ
先に記載されるように（Ａｌａｍら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７８：４４２４−４４３５（２００７））、２０℃で維持したＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）上でＳＰＲ結合アッセイを行った。記載されるように（Ａｌａｍら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７８：４４２４−４４３５（２００７）、Ａｌａｍら，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍ．  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ２０：８３６−８４５（２００４））、ＳＰ６２ペプチド−ｇｐ４  ６５２−６７１
【００３１】
【化２】
2013505201.tif 000004
【００３２】
およびＳＰ６２−Ｌ６６９Ｓ（ｇｐ４１  ６５２−６７１）
【００３３】
【化３】
2013505201.tif 000005
【００３４】
ならびにスクランブル化配列を持つ対照ペプチド（２Ｆ５６５６−６７０スクランブル化および２Ｆ５６５６−６７０／Ｌ６６９Ｓスクランブル化）のビオチン化型を個々に、ＢＩＡｃｏｒｅ  ＳＡセンサーチップ上に係留した。ストレプトアビジンへの１００〜１５０反応単位（ＲＵ）の結合が観察されるまで、各ペプチドを注入した。スクランブル化２Ｆ５ペプチド表面上の非特異的結合を減じた後、ｍＡｂ結合の特異的結合反応を得た。二価分析物モデル（二価Ｉｇ分子のアビディティーを説明する）を用いて、速度定数を測定し、そしてｍＡｂ  ２Ｆ５に関して０．０１〜１１９ｎＭの範囲の２Ｆ５力価決定から、結合曲線への全範囲曲線適合を得た。ｍＡｂ  ２Ｆ５を３０μＬ／分で２〜６分間注入し、そしてグリシン−ＨＣｌ  ｐＨ２．０およびサーファクタントＰ２０（０．０１％）を再生緩衝液として用いた。
【００３５】
リポソーム係留ペプチドを用いたＳＰＲアッセイを、上記と同様の様式で行った。用いたペプチドは、ＳＰ６２（ｇｐ４１  ６５２−６７１）−ＧＴＨ１（ＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＹＫＲＷＩＩＬＧＬＮＫＩＶＲＭＹＳ−ビオチン、コンセンサス２Ｆ５エピトープを含有する）およびＳＰ６２−Ｌ６６９Ｓ（ｇｐ４１  ６５２−６７１）−ＧＴＨ１（
【００３６】
【化４】
2013505201.tif 000006
【００３７】
Ｌ６６９Ｓ置換を伴う２Ｆ５エピトープを含有する）である。
適合度アッセイ
重要でない修飾を伴って、先に記載されるように（Ｌｕら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８：４６２８−４６３７（２００４））、二重感染適合度アッセイを行った。ｅｎｖ  ＰＣＲ産物、およびレポーター遺伝子を含むＮＬ４−３バックグラウンドベクターを同時トランスフェクションすることによって、ＴＮＤ＿６６９ＳまたはＴＮＤ＿６６９Ｌ  ｅｎｖおよびマーカー配列（ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ヒスチジノール・デヒドロゲナーゼ［ｈｉｓＤ］遺伝子またはヒト胎盤熱安定性アルカリホスファターゼ［ＰＬＡＰ］遺伝子のいずれか）を含有するＨＩＶ−１感染性キメラウイルスを生成した。二重感染適合度アッセイにおいて、特定の投入比（レポーター遺伝子のリアルタイムＰＣＲによって決定されるようなもの）の２つのキメラウイルスを用いて、ＰＢＭＣを同時感染させた（ＭＯＩ＝０．００１）。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて、対応するマーカー（ｈｉｓＤまたはＰＬＡＰ）によって、培養中の２つのＥｎｖ種を含むウイルスの相対産生を測定した。特定の時点（第４日、第７日および第１０日）で、総ウイルス集団中の個々のウイルスの割合を計算することによって、二重感染中の個々のウイルスの産生を決定した。先に記載されるように（Ｗｕら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８０：２３８０−２３８９（２００６））、以下の等式によって、個々のウイルスの相対適合度値（１＋Ｓ）を決定した：
（１＋Ｓ＝ｅｘｐ（ｄ）＝ｅｘｐ｛ｌｎ［（ＴＭ（ｔ２）ｘＴＬ（ｔ１））／（ＴＬ（ｔ２）ｘＴＭ（ｔ１））］／Δｔ｝
１＋Ｓ＝ｅｘｐ、ここでＳは選択係数であり；  Ｍｔ、Ｍ０、Ｌ１、およびＬ０は、それぞれ、接種物中の時点ｔでの、より適合した変異体またはより適合しない変異体の比率、および最初の比率（０）である。
【００３８】
結果
ＴＮＤ＿６６９Ｓエンベロープの同定
ＳＣ４２の血漿試料から複数の長期Ｅｎｖクローンを得て、ＥｎｖクローンからＮＬ４−３  Ｅｎｖ−偽型化ウイルスを作製し、そして自己血清および異種血清に対する、選択したＥｎｖクローンの中和感受性を試験した。自己血清による中和に非常に感受性であるエンベロープ株を同定した。慢性感染ＨＩＶ＋被験体から得たエンベロープ・クローンであるＴＮＤ＿６６９Ｓは、自己および異種血清の両方による中和に対して、予期されない高感度を示した。ＴＮＤ＿６６９Ｓは、同時期のおよび２７ヶ月（登録後）自己血清によって、それぞれ、８４５および１，３５３の力価で中和され、一方、その中和感受性が同じ時点（登録１５ヶ月後）から得られたエンベロープ・クローンに典型的であり、そしてそのエンベロープ配列に基づいて比較のために遡及的に選択された別の単離体であるＴＮＤ＿６６９Ｌは、同時期の自己血清中和に感受性でなく、そして登録２７ヶ月後の自己血清によって、わずか２６の力価でしか中和されなかった（図１）。次いで、ＴＮＤ＿６６９ＳおよびＴＮＤ＿６６９Ｌ  Ｅｎｖ−偽ウイルスを異種患者血清パネル、ならびに陽性対照として用いるいくつかのＨＩＶ＋血清／Ａｂに対して試験した。ＴＮＤ＿６６９Ｓ  Ｅｎｖ−偽ウイルスは、トリニダード・コホート内で、異種血清による中和に、最大４７倍より感受性であることが示された。試験した１４人の患者血清の中で、７つは、ＴＮＤ＿６６９Ｌ偽ウイルスよりも１０倍より効率的にＴＮＤ＿６６９Ｓ偽ウイルスを中和した（図１）。
【００３９】
Ｌ６６９Ｓ突然変異の同定
ＴＮＤ＿６６９Ｓエンベロープの中和感受性増加の原因となる遺伝子変動に関して、ＴＮＤ＿６６９ＳおよびＴＮＤ＿６６９Ｌ  ｇｐ１６０のタンパク質およびＤＮＡ配列を調べた。２つのｅｎｖ  ＤＮＡ配列間には６ヌクレオチドの相違がある。しかし、これらのうち５つは同義の（ｓｙｎｏｍｏｎｏｕｓ）突然変異であり、ＴＮＤ＿６６９ＳおよびＴＮＤ＿６６９Ｌ  Ｅｎｖ間に単一のアミノ酸相違を生じる。単一アミノ酸相違は、ＭＰＥＲ中、２Ｆ５エピトープのＣ末端近傍および４Ｅ１０エピトープの２ａａ上流である、６６９位に位置する（図２）。ＴＮＤ＿６６９Ｌは２Ｆ５コンセンサス配列を含有し、一方、ＴＮＤ＿６６９ＳはＬ６６９Ｓ突然変異を含有する。患者ＳＣ４２の登録１５ヶ月後の血漿から得られる１０のクローンのうち３つは、この突然変異を含有し、一方、この突然変異は、登録１週間後の血漿または登録５年後の血漿のいずれにも見られなかった。興味深いことに、ＬＡＮＬデータベース中、ほぼ１０００の全長Ｅｎｖ配列のうちわずか１つがこのＬ６６９Ｓ突然変異を含有する。
【００４０】
モノクローナル抗体に対するＬ６６９Ｓ突然変異体の感受性
Ｌ６６９Ｓ突然変異の位置に基づいて、２Ｆ５および４Ｅ１０  ｍＡｂに対するＴＮＤ＿６６９ＳおよびＴＮＤ＿６６９Ｌの感受性を試験した。驚くべきことではないが、ＴＮＤ＿６６９Ｓは２Ｆ５  ｍＡｂに非常に感受性であり、一方、ＴＮＤ＿６６９Ｌは中程度にしか感受性でなかった（図３）。興味深いことに、ＴＮＤ＿６６９Ｓはまた、ＴＮＤ＿６６９Ｌに比較して、４Ｅ１０  ｍＡｂによる中和に非常に感受性である。図３に示すように、ＴＮＤ＿６６９Ｓ  Ｅｎｖ−偽ウイルスに対する２Ｆ５および４Ｅ１０  ｍＡｂのＩＣ５０は、ＴＮＤ＿６６９Ｌ  Ｅｎｖ−偽ウイルスに対するものより、それぞれ、２７９倍および２７５倍低かった。ＴＮＤ＿６６９ＳおよびＴＮＤ＿６６９Ｌの平均ＩＣ５０は、２Ｆ５に関して、それぞれ０．０１４（±０．００５６）および３．９２（±１．５２）μｇ／ｍｌであり、そして４Ｅ１０に関して、それぞれ０．０３１（±０．０１２）および８．４９（±１．２９）μｇ／ｍｌであった。
【００４１】
グリカン依存性ｍＡｂ  ５２Ｄおよび進入阻害剤Ｔ２０を含む、いくつかの他の中和剤に対するＴＮＤ＿６６９ＳおよびＴＮＤ＿６６９Ｌ偽ウイルスの感受性もまた試験した（図３）。ＴＮＤ＿６６９Ｓ偽ウイルスに関しては、２Ｇ１２およびＴ２０に対する感受性の有意な相違はまったく観察されず、そして１７ｂおよび１ｂ１２に対する感受性のわずかな増加のみ（それぞれ〜２倍および４倍）が観察され、あるとしても、エンベロープ中の大きな変化が、ＴＮＤ＿６６９Ｓエンベロープに関して観察される中和感受性の劇的な増進を説明することは不可能であることが示された。１．７Ｂ、２３Ｅ、およびＥ５１に対する２つの株の感受性の相違は定量化不能であり、これはＴＮＤ＿６６９Ｌがこれらの抗体による中和に対して十分に感受性でないためである。興味深いことに、ＴＮＤ＿６６９Ｌエンベロープはまた、４４７−５２Ｄ中和に感受性ではなく、一方、ＴＮＤ＿６６９Ｌエンベロープは、０．３１μｇ／ｍｌのＩＣ５０で中和され、Ｌ６６９Ｓ突然変異と関連する４４７−５２Ｄ感受性の＞１６１倍の増進が示された。
【００４２】
単一のＬ６６９Ｓ突然変異が、表現型変化を説明する
Ｌ６６９Ｓ突然変異が単独で、表現型変化の原因であることを確認するため、部位特異的突然変異誘発によって、ＴＮＤ＿６６９Ｓ内に、Ｓ６６９Ｌ突然変異を導入した。生じたＴＮＤ＿６６９Ｓ／Ｓ６６９Ｌは、２Ｆ５に対して、ＴＮＤ＿６６９Ｌのものと匹敵する、中程度の感受性しか示さず、ＴＮＤ＿６６９ＳにおけるＬ６６９Ｓ突然変異が単独で、中和に対する感受性増加に寄与していることが確認された。次に、Ｌ６６９Ｓ突然変異と関連する表現型変化におけるウイルス骨格の役割を調べた。別の初代単離体、ＱＺ４７３４のエンベロープ内に、Ｌ６６９Ｓ突然変異を導入した。Ｌ６６９Ｓ突然変異は、ＱＺ４７３４  Ｅｎｖ−偽ウイルスを、２Ｆ５  ｍＡｂによる中和に対して、２対数規模より高く感受性にした（図１５）。さらに、Ｌ６６９Ｓ突然変異を共有する他の２つのクローンは、２Ｆ５に対する類似の度合いの感受性増加を示した（図１６）。これらの発見によって、Ｌ６６９Ｓが、ウイルス骨格に関わらず、ＭＰＥＲ抗体による中和に対するＨＩＶ−１エンベロープの感受性を増加させうることが示唆される。
【００４３】
ＴＮＤ＿６６９Ｓエンベロープの中和は、その慣用的エピトープに対する２Ｆ５結合によって仲介される
２Ｆ５耐性Ｅｎｖ変異体の性質決定によって、ＤＫＷコア領域中のＫ６６５Ｎ突然変異が２Ｆ５結合を抑止し、そして２Ｆ５耐性を生じることが示されてきている（Ｐｕｒｔｓｃｈｅｒら，  Ａｉｄｓ  １０：５８７−５９３（１９９６））。これによって、２Ｆ５エピトープＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮのコア領域中のＤＫＷが２Ｆ５結合に必須であることが示唆される。２Ｆ５によるＴＮＤ＿６６９Ｓエンベロープの強力な中和もまた、慣用的な２Ｆ５エピトープのコアアミノ酸への２Ｆ５  ｍＡｂの結合によって仲介されるかどうかを試験するため、ＴＮＤ＿６６９Ｓ／Ｋ６６５Ｎ突然変異体を作製し、そして２Ｆ５および４Ｅ１０  ｍＡｂに対するその感受性を試験した。ＴＮＤ＿６６９Ｓエンベロープ内にＫ６６５Ｎ突然変異を導入すると、完全な２Ｆ５耐性表現型が生じ、一方、４Ｅ１０に対するエンベロープの感受性は影響を受けなかった。
【００４４】
２Ｆ５ペプチドが２Ｆ５  ｍＡｂの中和活性を吸収する能力
Ｌ６６９Ｓ置換がＭＰＥＲ中和感受性を増加させる能力に関与するありうる機構を調べるため、コンセンサス２Ｆ５エピトープ（２Ｆ５６５６−６７０）またはＬ６６９Ｓ置換を含む２Ｆ５エピトープ（２Ｆ５６５６−６７０／Ｌ６６９Ｓ）のいずれかを含有するペプチドを合成し、そして続いて、これらが２Ｆ５  ｍＡｂ中和活性を吸収する能力に関して試験した。中和アッセイ前に、２Ｆ５  ｍＡｂをＦ５ｃｏｎまたはＦ５ｍｕｔペプチドのいずれかであらかじめ吸収した。驚くべきことに、Ｆ５ｍｕｔは、２Ｆ５  ｍＡｂ中和をＦ５ｃｏｎより強力には阻害しなかった。図６Ａおよび６Ｂに示すように、どちらのペプチドも、用量依存性方式で、ＴＮＤ＿６６９Ｓ  Ｅｎｖ偽ウイルスの２Ｆ５中和を阻害した。しかし、３μＭのＦ５ｍｕｔ（２Ｆ５  ｍＡｂのＩＣ５０を０．９５１μｇ／ｍｌまで減少させた）および０．３μＭのＦ５ｃｏｎ（２Ｆ５  ｍＡｂのＩＣ５０を０．９１１μｇ／ｍｌまで減少させた）によって達成される阻害が匹敵するレベルであることによって明らかであるように、Ｆ５ｃｏｎは、２Ｆ５中和を阻害する際、より効率的である（図４Ｂ）。
【００４５】
Ｌ６６９Ｓ突然変異は、そのエピトープに対する２Ｆ５  ｍＡｂの結合アビディティーを増加させなかった
Ｌ６６９Ｓ突然変異が２Ｆ５  ｍＡｂに対する２Ｆ５エピトープのアビディティーを増進する可能性を調べるため、コンセンサス２Ｆ５エピトープ（２Ｆ５６５６−６７０）またはＬ６６９Ｓ突然変異を含む２Ｆ５エピトープ（２Ｆ５６５６−６７０／Ｌ６６９Ｓ）のいずれかを含有するペプチドを、各ペプチドのスクランブル化型とともに、２Ｆ５結合熱力学に関して、ＢＩＡｃｏｒｅ  ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）において試験した。Ｆ５ｃｏｎおよびＦ５ｍｕｔペプチドに関する平衡解離定数（ＫＤ）は、それぞれ１１．０および２８．１ｎＭであり（図５）、Ｆ５ｃｏｎがＦ５ｍｕｔよりもわずかに高いアビディティーで２Ｆ５に結合するが、この２．７倍の相違が有意な相違ではないことが示される。結合ＥＬＩＳＡデータによってもまた、２Ｆ５  ｍＡｂによる２つのペプチドの結合間に有意な相違がないことが確認された（図５）。これによって、ＭＰＥＲ配列の示差的な感受性には、中和抗体のこの領域の曝露を改変する、ＭＰＥＲにおけるコンホメーション変化などの、他の要因が関与している可能性が示唆される。
【００４６】
脂質環境における２Ｆ５  ｍＡｂへのペプチドの結合
ＨＩＶ−１ウイルスにおいて、ＭＰＥＲはエンベロープ脂質二重層に極近接している。直接結合ＳＰＲアッセイは、２Ｆ５  ｍＡｂがＦ５ｃｏｎおよびＦ５ｃｏｎペプチドに匹敵するアビディティーで結合することを示した。脂質環境において、エピトープへの２Ｆ５  ｍＡｂの結合に対するＬ６６９Ｓ置換のありうる影響をさらに調べるため、リン脂質含有リポソームに係留されたペプチドを用いて、ＳＰＲ結合アッセイを行った。図６に示すように、Ｌ６６９Ｓ置換を含有するペプチドは、注入を停止した１０秒後、６１６．７の反応単位（バックグラウンドを減じたもの）で２Ｆ５  ｍＡｂに結合する一方、コンセンサス２Ｆ５エピトープは、４９４．６の反応単位で２Ｆ５に結合し、脂質環境において、Ｌ６６９Ｓ置換を含む２Ｆ５ペプチドが、コンセンサス２Ｆ５  ｍＡｂよりも強く、２Ｆ５  ｍＡｂに結合することが示された。
【００４７】
ＴＮＤ＿６６９Ｓウイルスの適合度は非常に損なわれている
ＭＰＥＲ構造における改変が適合度欠損を生じるかどうかを決定するため、ＮＬ４−３骨格、ならびにそれぞれＴＮＤ＿６６９ＳおよびＴＮＤ＿６６９Ｌエンベロープ配列を含有する複製コンピテント組換えウイルスを用いて、末梢血リンパ球における二重感染競合アッセイによって、ＴＮＤ＿６６９ＳおよびＴＮＤ＿６６９Ｌウイルスの相対適合度を調べた。９：１の投入比（ＴＮＤ＿６６９Ｓ：ＴＮＤ＿６６９Ｌ）で、感染４日後、ＴＮＤ＿６６９Ｓウイルスよりも、ＴＮＤ＿６６９Ｌウイルスが増殖し（図７）、ＴＮＤ＿６６９ＳウイルスにおけるＬ６６９Ｓ突然変異に関連する適合度の有意な喪失が示唆された。計算される相対適合度（１＋Ｓ）は１．８６である。適合度相違をさらに定量化するため、１：４の比（ＴＮＤ＿６６９Ｓ：ＴＮＤ＿６６９Ｌ）もまた調べ、そしてＴＮＤ＿６６９Ｓウイルスの適合度低下が確認された（データ未提示）。
【００４８】
要約すると、２Ｆ５および４Ｅ１０  ｍＡｂ中和両方に対するエンベロープの中和感受性を有意に増加させる、ＨＩＶ−１エンベロープにおける突然変異Ｌ６６９Ｓが同定された。ｍＡｂ  ２Ｆ５および４Ｅ１０に対するＴＮＤ＿６６９ＳおよびＴＮＤ＿６６９Ｌ  Ｅｎｖ−偽ウイルスの平均ＩＣ５０は、それぞれ、０．０１４および０．０３１μｇ／ｍｌである。９３のＨＩＶ−１株のパネルを多様なｍＡｂに対する中和感受性に関して調べたＢｉｎｌｅｙら（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８：１３２３２−１３２５２（２００４））による研究において、大部分の単離体は、１〜１０μｇ／ｍｌのＩＣ５０で２Ｆ５および４Ｅ１０によって中和される一方、９つの株のみが２Ｆ５  ｍＡｂによってＩＣ５０＜１μｇ／ｍｌで中和され、そして９つが４Ｅ１０  ｍＡｂによって＜１．０μｇ／ｍｌのＩＣ５０で中和された。２Ｆ５および４Ｅ１０  ｍＡｂに対するＴＮＤ＿６６９ＳのＩＣ５０は、それぞれ０．０５および０．１７μｇ／ｍｌのＩＣ５Ｏで、２Ｆ５および４Ｅ１０  ｍＡｂによって中和される２Ｆ５／４Ｅ１０  ｍＡｂ最高感受性株（ＢＵＳｘｘｘＭＮｃ）よりもさらにより低かった。比較すると、Ｌ６６９Ｓ突然変異は、先に報告された最も感受性であるウイルスよりも、２Ｆ５および４Ｅ１０  ｍＡｂ中和に対して、エンベロープをそれぞれ４倍および５倍、より感受性にする。
【００４９】
別の初代単離体ＱＺ４７３４にＬ６６９Ｓ突然変異を部位特異的突然変異誘発すると、ＱＺ４７３４／Ｌ６６９Ｓ  Ｅｎｖ−偽ウイルスが、２Ｆ５  ｍＡｂ中和に対して、２対数より高く、より感受性になることによって裏付けられるように、単一アミノ酸突然変異Ｌ６６９Ｓは、この特異的表現型の原因である。これをさらに確認するため、また、ＴＮＤ＿６６９Ｓの６６９位のセリンをロイシンに逆突然変異させると、ＴＮＤ＿６６９Ｓエンベロープで観察される超感受性の喪失が生じた。
【００５０】
ＴＮＤ＿６６９ＳおよびＴＮＤ＿６６９Ｌエンベロープはどちらも、バルクＰＣＲによって得られた。後に、単一ゲノム増幅（ＳＧＡ）を行ったが、エンベロープ配列は同定されず、Ｌ６６９Ｓ突然変異がｉｎ  ｖｉｖｏでは循環しないことが示された。さらに、Ｌ６６９Ｓ突然変異は、適合度の有意な喪失を生じ、これによって、天然感染中に存在していたとしても、適合度レベルが低いため、十分に長くは循環しないであろうことが示された。
【００５１】
Ｚｗｉｃｋら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９：１２５２−１２６１（２００５）による洗練されたアルカリスキャニング突然変異誘発研究において、２１のＭＰＥＲ  Ａｌａ突然変異体のうち１３が、２Ｆ５または４Ｅ１０  ｍＡｂ、あるいは両方に対して、親ＭＰＥＲよりもより感受性であった。ＨＩＶ−１  ＪＲ２におけるＬ６６９Ａ突然変異は、２Ｆ５および４Ｅ１０  ｍＡｂによる中和に対して、それぞれ５０倍および４５倍より感受性であり、そして最も感受性を増進する突然変異の１つであった。これらの知見を現在のデータと合わせると、ＭＰＥＲ中和抗体に対するＥｎｖ感受性に非常に影響を及ぼす、ＭＰＥＲの構造またはアクセス可能性などの、２Ｆ５および４Ｅ１０エピトープに共有される、何らかの共通の機構がありうると示唆される。
【００５２】
Ｌ６６９Ｓ置換に関連する、ＭＰＥＲ中和に対するＨＩＶ−１エンベロープ感受性増加の機構は、２Ｆ５および４Ｅ１０の中和機構に光を当て、そしてこれらのタイプの抗体を誘発する免疫原設計に関する重要な情報を提供するため、綿密な研究を行う正当な理由となる。
【００５３】
この突然変異が中和感受性を増加させうる多数の方式がある。まず、該突然変異は、Ｅｎｖにおいて劇的な変化を引き起こし、そしてウイルス粒子上の機能するＥｎｖスパイクの発現レベルに影響を及ぼした可能性もあった。多数の他の中和剤を用いた中和アッセイによって、ＴＮＤ＿６６９Ｓエンベロープの中和感受性増加は、全般的な効果ではないことが示されたため、Ｌ６６９Ｓ突然変異が、Ｅｎｖ発現レベルの変化を通じて、中和感受性を増進する可能性は低い。第二に、この突然変異は、ｇｐ４１の融合動力学を変化させた結果、融合プロセスをより緩慢にした可能性もあった。融合動力学が減少したＥｎｖは、２Ｆ５および４Ｅ１０中和に対してより感受性であることが示されてきている（Ｒｅｅｖｅｓら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９：４９９１−４９９９（２００５））。これは、Ｔ２０に対するＴＮＤ＿６６９Ｓエンベロープの感受性が、ＴＮＤ＿６６９Ｌエンベロープのもののわずか３倍であり、融合動力学がＬ６６９Ｓ突然変異によってそれほどは変化しないことが示唆されるため、可能性が低い。第三に、Ｌ６６９Ｓ突然変異自体が、２Ｆ５エピトープに対する２Ｆ５  ｍＡｂのより高いアビディティーの結合を生じる可能性がある。しかしこの仮説は、２Ｆ５へのペプチド結合に関する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ結果によって裏付けられず、該アッセイでは、２Ｆ５コンセンサス・ペプチド（コンセンサス２Ｆ５エピトープ配列を含有する）が２Ｆ５突然変異体ペプチド（Ｌ６６９Ｓ突然変異を含有する）よりもわずかにより高いアビディティーで結合した。さらに、この仮説は、ＴＮＤ＿６６９Ｓエンベロープの２Ｆ５および４Ｅ１０  ｍＡｂの両方に対する感受性の増加が同様の倍率であることを説明不能である。第四に、Ｌ６６９Ｓ突然変異は、Ｅｎｖの劇的なコンホメーション変化を引き起こし、より「開いた」ＭＰＥＲ構造を生じ、そしてしたがって、２Ｆ５および４Ｅ１０をターゲティングする抗体のより容易なアクセスを可能にした可能性があった。この仮説は、ＴＮＤ＿６６９Ｓエンベロープの２Ｆ５および４Ｅ１０  ｍＡｂの両方に対する感受性の増加が同様の度合いであることを非常によく説明しうる。Ｌ６６９Ｓ突然変異と関連する４４７−５２Ｄ感受性変化（＞１６１ｘ）によって、コンホメーション変化がＶ３ループの変化もまた引き起こした可能性もあることが示唆される。ＭＰＥＲをターゲティングする中和抗体に関する立体障害が多くのグループによって推測されてきている。いくつかの研究によって、２Ｆ５および４Ｅ１０間にありうる拮抗が観察されてきており（Ｚｗｉｃｋら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９：１２５２−１２６１（２００５）、Ｎｅｌｓｏｎら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８１：４０３３−４０４３（２００７））、空間の制限が、ＨＩＶウイルスの２Ｆ５および４Ｅ１０中和に影響を及ぼす要因でありうることが示唆されている。興味深いことに、２Ｆ５エピトープをＭＬＶ  Ｅｎｖに挿入すると（Ｏｕら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８０：２５３９−２５４７（２００６））、表面単位に２Ｆ５エピトープを持つＥｎｖが、膜貫通単位に２Ｆ５エピトープを持つＥｎｖよりも、２Ｆ５中和に１０倍以上より感受性である。さらに、ＨＩＶ  Ｅｎｖ��Ｖ１、Ｖ２、Ｖ４領域内に２Ｆ５エピトープを移植すると、やはり、２Ｆ５に対するｇｐｌ４０の結合が増加することが示され（Ｊｏｙｃｅら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７：４５８１１−４５８２０（２００２）、そしてＨＩＶ−２のＭＰＥＲへの２Ｆ５および４Ｅ１０エピトープの移植は、２Ｆ５／４Ｅ１０中和感受性の実質的な増加に関連することが示されてきており（Ｄｅｃｋｅｒら，  ｔｈｅ  Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  ＨＩＶ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，  Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｒｅｓｏｒｔ，  コロラド州キーストーン，  ２００６で提示）、これはおそらく、エピトープ・アクセス可能性の改善によるものである。これらのデータは、２Ｆ５感受性に対するエピトープ・アクセス可能性の影響を反映した。ＴＮＤ＿６６９Ｓの特性は、ありうるより「開かれた」ＭＰＥＲ構造にしたがう。
【００５４】
ＴＮＤ＿６６９Ｓ単離体を用いて、ワクチン接種によってまたは天然感染によって誘発された、２Ｆ５および４Ｅ１０様抗体の存在を検出することも可能である（今日までの研究は、ＨＩＶ−１感染患者およびワクチンにおける２Ｆ５または４Ｅ１０の検出に失敗している）。超感受性単離体は、２Ｆ５／４Ｅ１０が、天然感染またはワクチン接種中、非常に低レベルで生成されるかどうかに関して、非常に重要な情報を提供しうる。さらに、ＴＮＤ＿６６９Ｓエンベロープが持つようである、より曝露されたＭＰＥＲの証明は、ワクチン免疫原設計のための重要な適用を有する。
【００５５】
実施例２
ｇｐ４１  ＭＰＥＲペプチド・リポソーム・コンジュゲートの説明：
図８は、合成リポソームにコンジュゲート化可能なＨＩＶ−１  ｇｐ４１  ＭＰＥＲペプチド各々のアミノ酸配列を示す。これらの配列が用いられてきているが、７つ組反復２（ＨＲ２）領域（ａａ  ６３７−６８３）の全体を含む、より長いｇｐ４１配列、ならびにＨＲ２領域とともにＨＲ１領域を含む、より長い配列を用いてもよい（ａａ  ５４９−６０２）。ＳＰ６２ペプチドは、２Ｆ５  ｍＡｂエピトープを提示し、一方、ＭＰＥＲ６５６ペプチドには、２Ｆ５および４Ｅ１０  ｍＡｂ  ｇｐ４１エピトープ両方が含まれる（ＷＯ  ２００８／１２７６５１を参照されたい）。ＭＰＥＲペプチド配列の２つの変異体には、ＳＰ６２−Ｌ６６９ＳおよびＭＰＥＲ６５６−Ｌ６６９Ｓが含まれる。Ｌ６６９Ｓ突然変異は、自己および異種血清両方による中和に非常に感受性である、慢性感染ＨＩＶ−１＋被験体から得られたＨＩＶ−１エンベロープ・クローン（ＴＮＤ＿６６９Ｓ）において同定された（実施例１を参照されたい）。ＴＮＤ＿６６９Ｓは、２Ｆ５および４Ｅ１０  ｍＡｂの両方による中和に非常に感受性である（ＴＮＤ＿６６９Ｌに比較した際、約３００倍低いＩＣ５０を伴う）（Ｓｈｅｎ  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８３：３６１７−２５（２００９））。該突然変異は、ｍＡｂ  ２Ｆ５−ペプチド・リポソーム複合体（ＳＰ６２−Ｌ６６９Ｓペプチド−リポソーム）の有意により緩慢な解離速度を伴う、より好ましいｍＡｂ結合動力学を生じた。ＳＰ６２−リポソームのトリプトファン（Ｗ）侵入深度分析によって、Ｌ６６９Ｓ置換がコア２Ｆ５および４Ｅ１０エピトープの配向を改変可能であり、そしてこれらをＢ細胞認識によりアクセス可能にすることが示唆された。したがって、ＳＰ６２−Ｌ６６９ＳおよびＭＰＥＲ６５６−Ｌ６６９Ｓペプチドを持つリポソームの両方の型におけるＬ６６９Ｓ置換の使用は、好ましく曝露されたコアＭＰＥＲ中和エピトープおよび免疫後の中和抗体誘導の潜在能力を持つ、新規免疫原を提供する。
【００５６】
ｇｐ４１  ＭＰＥＲペプチド−アジュバント・コンジュゲートの説明
図９に示すＴｏｌｌ様受容体リガンドを、ｇｐ４１  ＭＰＥＲペプチド免疫原とともに、リポソーム型で配合した。図９に言及されるリガンドは、例のみであり、そしてＴＬＲアゴニストの他の型（Ｔａｋｅｄａら，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２１：３３５−３７６（２００３））もまた、類似のリポソーム内に取り込み可能である。
【００５７】
リピドＡおよびＲ−８４８含有ＭＰＥＲペプチド・リポソームの構築には、膜係留アミノ酸配列を有するＭＰＥＲペプチドおよび合成脂質、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸（ＤＭＰＡ）およびコレステロールを、それぞれ、０．２１６、４５．００、２５．００、２０．００および１．３３のモル分率で同時可溶化する方法を利用した（Ａｌａｍら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７８：４４２４−４４３５（２００７））。適切な量のＭＰＥＲペプチドをクロロホルム−メタノール混合物（７：３  ｖ／ｖ）中に溶解し、リピドＡをクロロホルム中に溶解するかまたはＲ−８４８をメタノール中に溶解し、適切な量のリン脂質のクロロホルムストックを窒素流中で乾燥させ、その後、一晩真空乾燥させた。押出し技術を用いて、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ  ７．４）中で、乾燥したペプチド−脂質フィルムから、リポソームを作製した。
【００５８】
オリゴ−ＣｐＧ複合体化ＭＰＥＲペプチド・リポソームの構築には、ＰＯＰＣの代わりに、陽イオン性脂質、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＰＯＥＰＣ）を用いた。ペプチド免疫原を含有する陽イオン性リポソームを、望ましい用量に適した量のｏＣｐＧストック溶液（１ｍｇ／ｍｌ）と混合することによって、ｏＣｐＧのコンジュゲート化を行った。
【００５９】
２Ｆ５  ｍＡｂの、ペプチド−リポソーム構築物中のそのエピトープに対する結合に関する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイによって、ＴＬＲアジュバントの取り込みまたはコンジュゲート化が、ＨＩＶ中和抗体２Ｆ５の結合に影響を及ぼさないことが明らかになった。両方のｍＡｂ、２Ｆ５および４Ｅ１０の強い結合が観察された。
【００６０】
実施例３
ＭＰＥＲ中和ｍＡｂ、４Ｅ１０および２Ｆ５の長いＣＤＲ  Ｈ３ループは、ビリオン膜脂質と相互作用すると仮定される疎水性面を有する（Ｏｆｅｋら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８：１０７２４（２００４）；  Ｃａｒｄｏｓｏら，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２２：１６３−１７３（２００５））。４Ｅ１０（ｓｃＦｖ）および２Ｆ５（ＩｇＧ）のＣＤＲＨ３突然変異体が構築されてきており（図１３を参照されたい）、そして中和ＭＰＥＲ  ｍＡｂの結合が経時的に起こり、そしてｇｐ４１の融合前中間体状態への結合前に、ウイルス膜脂質へのｍＡｂの結合によって開始されることが見出されてきている。４Ｅ１０  ｓｃＦｖは、名目（ｎｏｍｉｎａｌ）エピトープ・ペプチドおよび三量体ｇｐ４１融合中間体タンパク質の両方に強く結合するが、ＨＩＶ−１およびＳＩＶビリオンの両方に弱く結合し、そしてしたがって、４Ｅ１０がウイルス膜脂質に結合するが、ｇｐ４１の融合前状態には結合しないことが示される。４Ｅ１０のＣＤＲ  Ｈ３ループの疎水性面上の位でのアラニン置換（Ｗ１００ａ／Ｗ１００ｂ／Ｌ１００ｃＡ）は、ｇｐ４１エピトープへの同様の結合を示したが、同じ置換は、４Ｅ１０がＨＩＶ−１ウイルス膜に結合する能力を妨害した（図１４）。ｇｐ４１中間体タンパク質に結合するが、ＨＩＶ−１ウイルス膜に結合しない、４Ｅ１０  ＣＤＲ  Ｈ３突然変異体は、ＨＩＶ−１中和に失敗した。同様に、ＨＩＶ−１ビリオンへの結合が妨害されるが、ｇｐ４１エピトープ・ペプチドへの結合が妨害されていない、２Ｆ５  ＣＤＲ  Ｈ３突然変異体は、ＨＩＶ−１中和に失敗した（図１４）。ｇｐ４１融合中間体タンパク質による４Ｅ１０のＨＩＶ−１中和活性の遮断によって、４Ｅ１０がウイルス融合前ｇｐ４１に結合しないことがさらに示唆された。これらの結果によって、中和ＭＰＥＲ  ｍＡｂの結合が経時的に起こり、そしてｇｐ４１の融合前中間体状態への結合前に、ウイルス膜脂質へのｍＡｂの結合によって開始されるというモデルが裏付けられる。この結果の重要な暗示は、ＨＩＶ−１膜が、４Ｅ１０および２Ｆ５による結合および中和の、さらなる構造構成要素を構成することである。したがって、免疫原が４Ｅ１０および２Ｆ５様抗体反応を誘導するには、脂質構成要素が必要である可能性もある。
【００６１】
したがって、この戦略は、Ｂ細胞寛容を調節し、免疫原を反応性Ｂ細胞サブセットにターゲティングし、そしてリン脂質およびｇｐ４１  ＭＰＥＲエピトープに結合する多重反応性Ｂ細胞の誘導を可能にする潜在能力を有する。ＴＬＲリガンドと組み合わせて用いた際、リポソーム中のＩＦＮ−αの送達は、自己反応性プール由来の、そしてｇｐ４１  ＭＰＥＲエピトープに対する望ましい特異性を持つＢ細胞のＴＬＲ依存性活性化を可能にする潜在能力を有する。
【００６２】
構築物の説明：
ＨＩＶ−１  ｇｐ４１  ＭＰＥＲペプチド（図８）を、上に概略し、そして先に記載されるように（Ａｌａｍら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７８：４４２４−４４３５（２００７））、合成リポソームにコンジュゲート化してもよい。超音波処理したＭＰＥＲペプチド−リポソームの各々を調製し、そして次いで可溶性ＩＦＮαタンパク質と混合し、そして次いで、乾燥させ、そして再水和させて、サイトカインを被包してもよい。短時間ボルテックスした後、被包したＩＦＮαとともに再水和させたリポソームを３０分間超遠心することによって、収集してもよい。第一の設計において、リポソームをｏＣｐＧ（ＴＬＲ９）、ＭＰＬ−Ａ（ＴＬＲ４）またはＲ８４８（ＴＬＲ７／９）のいずれかにコンジュゲート化する（図１１）。これらのアジュバント化リポソーム構築物各々を、図８に示す、列挙するＭＰＥＲペプチド各々を用いて調製することも可能である。第二の設計を図１２に示し、そしてこれには、複数のＴＬＲリガンドが含まれ、ＴＬＲ９＋ＴＬＲ４およびＴＬＲ９＋ＴＬＲ  ７／８が同じリポソーム内に取り込まれる。これらの構築物の設計は、ＴＬＲ誘発において相乗作用を提供し、そして多重反応性Ｂ細胞を活性化する際に、ＴＬＲリガンドの強度を潜在的に増進することも可能である。
【００６３】
図１０に記載するように、２Ｆ５および４Ｅ１０  ｍＡｂ結合のＳＰＲ分析によって、アジュバント化リポソーム構築物上のＭＰＥＲエピトープ提示の評価を行ってもよい。
実施例４
実験詳細
２匹の免疫動物由来の代表的なデータによって、ＭＰＥＲペプチド・リポソームでの反復免疫後のＭＰＥＲ特異的抗体反応の誘導のためのプライム／ブースト戦略の適用を示す（図１７を参照されたい）。動物を、交互に、そして定期的な間隔で、まずＳＰ６２リポソームで（４ｘ）、そして次いでＥｎｖ  ｇｐ１４０（２ｘ）タンパク質で免疫した。最後の２回の免疫には、全長ＭＰＥＲ−６５６リポソームが含まれる（上記免疫原の説明を参照されたい）。示す配列を持つＭＰＥＲペプチドへの結合のＳＰＲ分析によって、免疫血清における結合反応を測定した。示す事後出血（ｐｏｓｔ−ｂｌｅｅｄ）時点で、各免疫動物由来の出血試料を収集した。各ＭＰＥＲ残基の単一アミノ酸置換を含む、ビオチン化アラニン置換ＭＰＥＲペプチドを用いて、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ａ１００上で、免疫血清のエピトープマッピングを行った。上部に円で囲んだ残基は、ＭＰＥＲペプチドへの結合に必要な非常に重要な残基（赤（下線）で示したものは、アラニン置換ペプチドへの結合に際して＞５０％減少を伴う）を示す。青の残基（下線なし）は、関与の度合いがより低い残基を示す（結合の＜２０〜５０％の減少）。
【００６４】
結果
提示する実験データは、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質のｇｐ４１上の中和エピトープをターゲティングする抗体の誘導における、設計されたＭＰＥＲリポソーム免疫原の適用を示す。該データは、構築されたＭＰＥＲペプチド・リポソームがモルモットなどの小動物および非ヒト霊長類（ＮＨＰ）で免疫原性であり、そして誘導される抗体反応が、ｇｐ４１  ＭＰＥＲ上のコア中和エピトープに特異的であることを示す。これらの研究はまた、ＭＰＥＲ特異的反応増進における、そして２Ｆ５コア残基ＤＫＷを含むコア中和エピトープへの抗体反応の集束における、プライム−ブースト戦略の適用も示す。提示する免疫スキームにおいて、データは、最初の反応における、コアＤＫＷのＮ末端にある残基から、後の時点で誘導されるコア中和エピトープの３つの残基すべて（ＤＫＷ）を含む反応への結合エピトープのシフトを示す。ＭＰＥＲリポソームでの最後の免疫は、広域中和ｍＡｂ  ２Ｆ５のコアＤＫＷ残基への抗体反応の集束を生じた。これらのデータは、モルモット（図１７）およびＮＨＰ（図１８）のような実験動物におけるＭＰＥＲ特異的抗体誘導のための、リポソーム型ＭＰＥＲ免疫原の設計の適用を示す。こうしたＭＰＥＲ免疫原設計は、ヒト試験の候補でありうる。
【００６５】
実施例５
図１８Ａに示すように、ＭＰＥＲ特異的結合反応は、ｇｐ１４０  Ｅｎｖタンパク質でのプライミング後には誘導されず、ＭＰＥＲリポソームでのブースト後に誘導された。ＭＰＥＲペプチドへの結合反応は、ｇｐ１４０タンパク質での複数の免疫後には検出されなかった。同じ動物をＭＰＥＲ−６５６リポソームでブーストすると、２Ｆ５名目エピトープ・ペプチドに特異的なＭＰＥＲ特異的反応が生じた。
【００６６】
図１８Ｂに示すように、抗体反応のエピトープマッピングは、中和２Ｆ５コア残基ＤＫＷへの反応の集束を示す。最初のより広域性である特異性は、３回目の免疫後、ＤＫＷコア残基に集束した。
【００６７】
４つのＮＨＰ免疫血清由来の結合データを示す。図１７に記載するように、結合反応測定およびエピトープマッピング実験を行った。
上に引用するすべての文書および他の情報供給源は、その全体が本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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