(57)【要約】本発明は、真核生物細胞を用いる生物反応器中のＣＯ２制御を確立するための細胞培養培地用の新規の緩衝系の開発に関する。この技術は、プロセスの制御、プロセスの最適化及びスケーリングの目的のためにＣＯ２制御を可能にする。本発明はさらに特定の緩衝物質を含む特定の細胞培養培地に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオ医薬品の製造プロセスを最適化する方法であって、以下の工程：
ａ）対象の組み換え遺伝子を含み、対象の対応する生成物を産生する、真核生物宿主細胞を調製すること、
ｂ）１２mmol/L以下のＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンを含み、以下の緩衝液成分：
（ｉ）Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（Ｃ６Ｈ１５ＮＯ６Ｓ、ＴＥＳ）及び／又は
（ii）β−グリセロリン酸ナトリウム五水和物（Ｃ３Ｈ７Ｎａ２Ｏ６Ｐ×５ Ｈ２Ｏ、Ｓｏｄ−β）
を含む、細胞培養培地中で、工程ａ）からの細胞を培養すること、
ｃ）ｐＨを、非ＣＯ２発生性の酸性及び／又はアルカリ性溶液を用いて制御すること、
を含み、当該バイオプロセスの間、ｐＣＯ２が、ＣＯ２、Ｏ２、Ｎ２及び／又は空気の供給で、又は撹拌機の速度によって制御される、方法。
【請求項２】
ｐＣＯ２を制御する方法であって、以下の工程：
ａ）対象の組み換え遺伝子を含み、対象の対応する生成物を産生する、真核生物宿主細胞を調製すること、
ｂ）１２mmol/L以下のＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンを含み、以下の緩衝液成分：
（ｉ）Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（Ｃ６Ｈ１５ＮＯ６Ｓ、ＴＥＳ）及び／又は
（ii）β−グリセロリン酸ナトリウム五水和物（Ｃ３Ｈ７Ｎａ２Ｏ６Ｐ×５ Ｈ２Ｏ、Ｓｏｄ−β）
を含む、細胞培養培地中で、工程ａ）からの細胞を培養すること、
ｃ）ｐＨを、非ＣＯ２発生性の酸性及び／又はアルカリ性溶液を用いて制御すること、
を含み、当該バイオプロセスの間、ｐＣＯ２が、ＣＯ２、Ｏ２、Ｎ２及び／又は空気の供給で、又は撹拌機の速度によって制御される、方法。
【請求項３】
真核生物細胞を用いたバイオプロセスの再現性を改善する方法であって、少なくとも以下のパラメーター：ｐＣＯ２プロファイル、Ｏ２プロファイル、ｐＨプロファイル、温度プロファイル、速度が監視され、そして
ａ）細胞の培養が、１２mmol/L以下のＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンを含む細胞培養培地中で行われ、そして
ｂ）前記細胞培養培地が、以下の緩衝液成分：
（ｉ）Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（Ｃ６Ｈ１５ＮＯ６Ｓ、ＴＥＳ）及び／又は
（ii）β−グリセロリン酸ナトリウム五水和物（Ｃ３Ｈ７Ｎａ２Ｏ６Ｐ×５ Ｈ２Ｏ、Ｓｏｄ−β）
を含み、そして
ｃ）ｐＨの制御が、非ＣＯ２発生性の酸性及び／又はアルカリ性溶液を用いて行われ、そして
ｄ）当該バイオプロセスの間に、ｐＣＯ２が、ＣＯ２、Ｏ２、Ｎ２及び／又は空気の供給で、又は撹拌機の速度によって制御されることを特徴とする、方法。
【請求項４】
対象の組み換え生成物を調製する方法であって、以下の工程：
ａ）対象の組み換え遺伝子を含み、対象の対応する生成物を産生する、真核生物宿主細胞を調製すること、
ｂ）１２mmol/L以下のＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンを含み、以下の緩衝液成分：
（ｉ）Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（Ｃ６Ｈ１５ＮＯ６Ｓ、ＴＥＳ）及び／又は
（ii）β−グリセロリン酸ナトリウム五水和物（Ｃ３Ｈ７Ｎａ２Ｏ６Ｐ×５ Ｈ２Ｏ、Ｓｏｄ−β）
を含む、細胞培養培地中で、工程ａ）からの細胞を培養すること、
ｃ）ｐＨを、非ＣＯ２発生性の酸性及び／又はアルカリ性溶液を用いて制御すること、
を含み、当該バイオプロセスの間に、ｐＣＯ２が、ＣＯ２、Ｏ２、Ｎ２及び／又は空気の供給で、又は撹拌機の速度によって制御される、方法。
【請求項５】
対象の生成物が、タンパク質、好ましくは抗体もしくは抗体断片又はＦｃ融合タンパク質であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ｐＣＯ２が、ＣＯ２及び／又はＮ２ガスの導入によって制御されることを特徴とする、請求項１〜５の一項に記載の方法。
【請求項７】
細胞が、流加回分発酵法によって培養されることを特徴とする、請求項１〜６の一項に記載の方法。
【請求項８】
流加回分発酵法の０日目から最後まで、培地中にＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンが添加されない及び／又は用いられないことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
細胞培養培地が、８mmol/LのＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンを含むことを特徴とする、請求項１〜８の一項に記載の方法。
【請求項１０】
細胞培養培地が、完全にＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンを含まないことを特徴とする、請求項１〜９の一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＴＥＳ濃度が、１mmol/Lと１００mmol/L、１０〜９０、２０〜８０、３０〜５０の間、又は１００mmol/Lもしくは４０mmol/L以下であることを特徴とする、請求項１〜１０の一項に記載の方法。
【請求項１２】
Ｓｏｄ−β濃度が、１mmol/Lと１００mmol/L、５〜５０、１５〜３０の間、又は１００mmol/Lもしくは２５mmol/L以下であることを特徴とする、請求項１〜１０の一項に記載の方法。
【請求項１３】
工程ｃ）による酸性及び／又はアルカリ性溶液が、ＮａＯＨ、ＨＣｌ、Ｈ３ＰＯ４又はＨ２ＳＯ４、好ましくはＮａＯＨ又はＨＣｌであることを特徴とする、請求項１〜１２の一項に記載の方法。
【請求項１４】
真核生物細胞が、哺乳類細胞、好ましくはげっ歯類の細胞、好ましくはＣＨＯ、ＰＥＲ．Ｃ６又はＮＳ０の細胞であることを特徴とする、請求項１〜１３の一項に記載の方法。
【請求項１５】
初期増殖期のｐＣＯ２（０日目〜３日目又は１〜３日目、特に発酵の１日目）が、１０％以下、又は８％以下の値に制御され、好ましくは、ｐＣＯ２が、２％と８％の間又は３％と８％の間又は５％と８％の間の値に調節され、特に好ましくはｐＣＯ２値が５％又は３％であることを特徴とする、請求項１〜１４の一項に記載の方法。
【請求項１６】
０日目から１１日目（又は発酵が終わるまで）のｐＣＯ２が、３％に制御されることを特徴とする、請求項１〜１５の一項に記載の方法。
【請求項１７】
ｐＣＯ２値が、以下のとおり：
ｉ）好ましくは５〜１２％又は８〜１２％、特に好ましくは８〜１０％又は５〜１１％又は３〜１１％の、増殖期（３〜７日目又は４〜８日目）中の平均ｐＣＯ２（１２％以下）、
ii）好ましくは１５〜１８％又は５〜１０％又は１５％の、絶滅期（７〜１１日目又は９〜１１日目又は発酵の終わりまで）中の僅かに上昇したか又は高いｐＣＯ２（５％、８％又は１５％以上）
にさらに制御されることを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
１２mmol/L以下のＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンを含み、以下の緩衝液成分：
（ｉ）Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（Ｃ６Ｈ１５ＮＯ６Ｓ、ＴＥＳ）
及び／又は
（ii）β−グリセロリン酸ナトリウム五水和物（Ｃ３Ｈ７Ｎａ２Ｏ６Ｐ×５ Ｈ２Ｏ、Ｓｏｄ−β）を含む、細胞培養培地。
【請求項１９】
細胞培養培地が、８mmol/LのＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンを含むことを特徴とする、請求項１８に記載の細胞培養培地。
【請求項２０】
細胞培養培地が、完全にＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンを含まないことを特徴とする、請求項１８又は１９に記載の細胞培養培地。
【請求項２１】
ＴＥＳ濃度が、１mmol/Lと１００mmol/L、１０〜９０、２０〜８０、３０〜５０の間、又は１００mmol/Lもしくは４０mmol/L以下であることを特徴とする、請求項１８〜２０の一項に記載の細胞培養培地。
【請求項２２】
Ｓｏｄ−β濃度が、１mmol/Lと１００mmol/L、５〜５０、１５〜３０の間、又は１００mmol/Lもしくは２５mmol/L以下であることを特徴とする、請求項１８〜２０の一項に記載の細胞培養培地。
【請求項２３】
以下の構成要素：
（ａ）１２mmol/L以下のＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンを含むか、又は好ましくは完全にＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンを含まず、以下の緩衝液成分：
（ｉ）Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（Ｃ６Ｈ１５ＮＯ６Ｓ、ＴＥＳ）
及び／又は
（ii）β−グリセロリン酸ナトリウム五水和物（Ｃ３Ｈ７Ｎａ２Ｏ６Ｐ×５ Ｈ２Ｏ、Ｓｏｄ−β）を含む、細胞培養培地、
（ｂ）流加回分発酵槽、
（ｃ）真核生物細胞、好ましくは哺乳類細胞、げっ歯類の細胞、ハムスターの細胞、特に好ましくはＣＨＯ細胞
を含む、流加回分発酵機器の品目一式、又はキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
技術分野
本発明は、対象の組み換えタンパク質を生産する真核生物細胞を有するバイオ（生物）医薬品プロセス開発の分野に関する。特に、本発明は方法の操作を最適化する方法であり、Ｎａ２ＣＯ３及びＮａＨＣＯ３を含まないか又は減少した培地をｐＣＯ２制御と協同して使用することを含む方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
バイオ（生物）医薬品プロセス開発は、治療上のタンパク質、特に厳しいデッドラインを有する臨床上の（毒物学上の）研究のための抗体の生産のために、又は市場に供給するために、これまでより高い力価を提供する必要に直面している。
【０００３】
これらの時間制約の範囲内で、発現系が設計されなければならず、安定生産細胞クローンは、産生（例えばＣＨＯ細胞、ハイブリドーマ、ＢＨＫ又はＮＳＯ細胞）のために生成され及び選択されなければならず、拡張可能なバイオ（生物）医薬品製造方法が、培地の最適化及びプロセス管理を含めて設計されなければならない。この全ては、特定の生産性（＝特定の生成物の形成速度）及び達成される力価（生成物の収率）が最大になるように対処されなければならず、異なる大きさのプラントにおいて該方法が強力にかつ再現的に作動することを可能にする。近年、生成物力価の巨大な増加が組み換え真核生物細胞系において達成された。よって、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で、イムノグロブリン５g/L以上の生成物濃度が達成された。分子生物学及び細胞生物学の進歩は、遺伝子の細胞株の開発及び変化、培地の開発を含み、そしてとりわけ、栄養分（「飼料」）の添加のような「インプロセスの」管理戦略が、これを可能にした。しかしながら、真核生物細胞系、特に哺乳類細胞系の生産性は原核細胞系のそれに迫らず、したがって、特に発酵の間のプロセス管理のさらなる最適化及び発酵培地の最適化が、未だ必要である。
【０００４】
一つの特別な要請は、酸化性代謝の管理である。
全ての細胞は、酸化性代謝の範囲内でＣＯ２を生産し、様々な関連する輸送プロセスのためのＨＣＯ３−を必要とする。例えば強い増殖がある場合に発生しうる高いＣＯ２含有量は、ｐＨを低下させ、そして炭酸水素ナトリウム含有量の増加によって中和することができる。よって、炭酸水素ナトリウムは、緩衝物質かつ不可欠な栄養分である。炭酸水素ナトリウムは数ある中でも、Lindl, Toni; Gstraunthaler Gerhard (2002)：Zell- und Gewebekultur [Cell and Tissue Culture], 5th edition, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, p. 93, Point 4.4.3, or in Ling, C. T. et al (1968)：Chemically characterized concentrated corodies for continuous cell culture (The 7C's culture media), in Experimental Cell Research Nr. 52, p. 469-489.による教科書に、不可欠な栄養分として記載されている。
【０００５】
更に炭酸水素塩は、クエン酸回路において全身及び個々の細胞のｐＨ制御ならびにその量の制御に関与する。哺乳類細胞の膜は、炭酸水素塩のための輸送タンパク質を含み、膜透過輸送を支援する。ＣＯ２は拡散によって脂質二重層に浸透することができるのに対して、ＨＣＯ３−は荷電されており、特定の輸送タンパク質を用いてのみ膜を通過することができる。ＣＯ２／ＨＣＯ３−の酸−塩基特性を基礎として、細胞からのＣＯ２の放出は、細胞のアルカリ化をもたらすが、ＨＣＯ３−の流出は、細胞を酸性化する（Casey Joseph. R. (2006): Why bicarbonate? in Biochem. Cell Biol. No. 84, S. 930-939）。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概要
発酵プロセス中のＣＯ２を完全に制御することを可能にするという目的を達成するために、例えば炭酸水素ナトリウム緩衝液から生じるＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンは、代替的な緩衝物質と置き換えられなければならない。現在、以下の化学方程式に示すように、ＣＯ２は、乳酸（ＬＡ）との反応を通じて形成されうる：
【数１】
2013514071.tif 000002
現在では、ｐＨ値の調節は、Ｎａ２ＣＯ３溶液を用いて行われ、それは、式２に示すように、分解してＮａＨＣＯ３を形成することができる。式２による生成物ＮａＨＣＯ３は、次に式１の遊離体になる。
【数２】
2013514071.tif 000003
上記の通り、重要な細胞機能にとって必須であるため、細胞はＨＣＯ３−なしで存在することができない。したがって、ＨＣＯ３−（緩衝物質のＮａＨＣＯ３から、又はｐＨ調整剤のＮａ２ＣＯ３溶液から生じる）を完全になしで済ませることが不可能にみえる。しかしながら、細胞は、重炭酸イオンのさらなる供給源を有する。
【数３】
2013514071.tif 000004
式３は、例えばＣＯ２ガスが導入されるときに自発的に起こるのに対して、式４の反応は、細胞内酵素である炭酸脱水酵素によって更に促進される。よって細胞は、Ｈ２Ｏ（細胞培養培地に存在する）及びＣＯ２（例えばガスとして中に加えられるか、細胞周期の副産物である）から、それ自身の重炭酸イオンを必要に応じて合成することができる。
【０００７】
発酵系のｐＣＯ２を制御することの第一段階は、炭酸水素ナトリウム、ＮａＨＣＯ３に代わる緩衝物質の検索である。標準的な培地／ＮａＨＣＯ３含有標準緩衝液について、平衡はＣＯ２（ガス）とＣＯ２（溶液）との間に形成され、これは細胞培養のｐＨに影響する。
【０００８】
新規な、代わりの緩衝物質（例えば炭酸水素ナトリウムから生じるＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンを完全に又は部分的に置き換える）は、良好な緩衝液活性を有しなければならず、細胞培養に悪影響を与えてはならない。また、性能及び生成物形成（力価）は、少なくとも同じ高い水準のままでなければならない。例えば、新規な緩衝物質が実際良好な緩衝液の特性を示すが、細胞上の毒性を有するか又は細胞外で分泌される生成物に損傷を与える場合が起こりうる。更に、好ましくない反応が細胞培養培地の他の成分によって発生し、例えば活力比率を低くする場合がある。活力の低下は培養物中のより多くの死滅細胞を意味し、それは有害な細胞含有物、例えばプロテアーゼを発酵液へ放出する。第２の優先度として、新規な緩衝物質は、安価でなければならず、貯蔵及び取扱いにいかなる特別な処置も必要としてはならず、多くの供給元から得ることができなければならない。
【０００９】
発酵系のｐＣＯ２を制御することに対する第二の方法／他の方法は、より少ない有毒代謝産物が形成される（ラクタート、アンモニウム）、及び／又はｐＨを制御するための酸及びアルカリの追加を最小にするという点で、細胞の代謝に正の影響を及ぼす最適ＣＯ２プロファイルを決めることである。最適なプロファイルは、初期増殖期を短縮し、増殖期を長くし、そして増殖期の間に特定の生成物形成速度を上げる目的で、対応する増殖期（初期増殖期、増殖期、絶滅期）に適合する。よって、選択されたＣＯ２プロファイルは、計画的な方法における方法を管理するのに役立ち、幾つかの制御する節に分けられる：初期増殖期の低いｐＣＯ２（＜１０％のｔｂｄ、好ましくは３〜８％又は３〜５％、特に好ましくは５％又は３％）は、細胞のより速い始動を促進し、増殖期の適度なｐＣＯ２（＜１２％のｔｂｄ、好ましくは５〜１１％）は、高い増殖速度及びより良好な代謝を促進し、よって、より高いｐＣＯ２よりもラクタートの形成が少ないが、乾燥期の僅かに増加したか高いｐＣＯ２（＞５％、＞８％、＞１５％のｔｂｄ、好ましくは５〜１０％）は、アルカリの添加に対抗し、よって浸透圧を低下させ、それ故、生産性期を延長することを助ける。
【００１０】
他の重要な本発明の態様は、拡張性及び特に、異なる発酵槽の容量にわたる方法の変換可能性である。従来の発酵系において、ｐＣＯ２は使用する器材及び大きさに依存して、規模が増加するにつれて伝統的に増加する。従来の系においては、ｐＣＯ２はガス供給及びｐＨ制御を伴うため、細胞の代謝を同時に変えることなく、この現象に対抗することは可能ではない。ｐＣＯ２制御と組み合わせての本発明に記載されている緩衝液系によって、ｐＨ及びガス供給の制御（より正確にはｐＯ２の制御）からｐＣＯ２制御を解離させることによって、規模の増大を、容易にかつ発酵特性（＝性能）を基本的に変えずに、達成することができ、一方、同時に、ガス供給（より正確にはｐＯ２）、ｐＨ及びｐＣＯ２の制御を各々別に変換し、よって全ての発酵スケール上の同等の細胞培養性能を確実にする。
【００１１】
本発明は、バイオ（生物）医薬品の製造方法を最適化する方法を提供することによってこの目的を達成し、以下の工程：
ａ）対象の組み換え遺伝子を含み、対象の対応する生成物を産生する、真核生物宿主細胞を調製すること、
ｂ）１２mmol/L以下のＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンを含み、以下の緩衝液成分：
（ｉ）Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（Ｃ６Ｈ１５ＮＯ６Ｓ、ＴＥＳ）及び／又は
（ii）β−グリセロリン酸ナトリウム五水和物（Ｃ３Ｈ７Ｎａ２Ｏ６Ｐ×５ Ｈ２Ｏ、Ｓｏｄ−β）
を含む、細胞培養培地中で、工程ａ）からの細胞を培養すること、
ｃ）ｐＨを、非ＣＯ２発生性の酸及び／又はアルカリを用いて制御すること、
を含み、バイオプロセスの間に、ｐＣＯ２が、ＣＯ２、Ｏ２、Ｎ２及び／又は空気の供給で、又は撹拌機の速度を使用して制御され、該制御は、初期増殖期においてより低いｐＣＯ２を選択することを特徴とする。好ましくは、ｐＣＯ２は、ＣＯ２及び／又はＮ２で制御される。
【００１２】
更に、本発明は、１２mmol/L以下のＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンを含み、以下の緩衝液成分：
（ｉ）Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（Ｃ６Ｈ１５ＮＯ６Ｓ、ＴＥＳ）
及び／又は
（ii）β−グリセロリン酸ナトリウム五水和物（Ｃ３Ｈ７Ｎａ２Ｏ６Ｐ×５Ｈ２Ｏ、Ｓｏｄ−β）
を含む、細胞培養培地に関する。
【００１３】
バイオリアクター内で制御された発酵において、ｐＨは、ＣＯ２ガスの導入及び液体アルカリ、例えばＮａ２ＣＯ３の添加によって制御される。しかしながら、ｐＨがｐＣＯ２と独立して制御されることを可能にするために、緩衝液系及び付随するｐＨ制御は、ＣＯ２を放出しない物質を使用してもたらされなければならない。ＣＯ２発生性の緩衝液及び酸／塩基を除去することによってのみ、ＤＯ（溶存酸素、ｐＯ２）及びｐＣＯ２の独立した制御を達成することができる。加えて、緩衝液系及び酸／塩基はともに、重量オスモル濃度（osmo）に決定的に寄与する。したがって、酸／塩基を有するＣＯ２から独立した緩衝液系は、オスモリダクション（osmoreduction）のために特別に開発された。ｐＣＯ２制御は、付加的な制御変数として、バイオプロセスの最適化に寄与し、ｐＣＯ２プロファイルを最適化することによってプロセス性能を増加させるために用いられ、再現性及び拡張性を改善する。
【００１４】
本発明による方法の一つの利点は、特定の生成物形成速度／特定の生産性の顕著な改善である。更に、生成物の品質、発酵時間及び細胞代謝は、一般に正の影響を受けることができる。これは、例えば高い生成物の収率を達成すると同時に、流加回分法の発酵時間を延長することができることを意味する。
【００１５】
他の制御変数（ｐＣＯ２）の実現は、改良された方法の最適化を可能にする。ｐＨプロファイル、温度プロファイル、速度プロファイル、Ｏ２プロファイル及びｐＣＯ２プロファイルは、互いに独立して最適化されうる。最適化された条件は、異なるバイオプロセス及び生産の規模に対して再現性及び変換可能性の増加に顕著に寄与する。新規な緩衝液系を用いる別々のｐＣＯ２制御を導入することにより上記三つの制御変数を解離させることによってのみ、規模の独立した変換を達成することが可能であるということが、ここで重要である；従来の系では、三つの制御変数は、規模に応じて多かれ少なかれ全て互いに影響を与える。したがって、従来の系では、同様にこれら三つの制御変数を変換することができない。
【００１６】
浸透圧を減らした酸塩基緩衝液系は、細胞活力の増加を導き、細胞に特有の生産性を上昇させ、方法の時間を延長することによって、生産性のさらなる増大を可能にする。本発明によるｐＨ制御のための好ましい酸及びアルカリは、ＮａＯＨ（水酸化ナトリウム溶液）、酢酸、リン酸、硫酸及び塩酸である。塩酸、リン酸及び硫酸が好ましい。硫酸が、特に好ましい酸である。
【００１７】
新規なＮａＨＣＯ３を含まない培地の他の利点を、分析の分野で見いだすことができる：細胞培養技術の幾つかの実験において、二酸化炭素形成速度（ＣＥＲ）を決定することは重要である。ＣＯ２源緩衝液、塩基及び酸を除去することは、第一に例えば排気ガス分析によって炭素収支を達成することを可能にし、この炭素収支を方法の最適化に用いることができる。
【００１８】
炭素バランシィング（釣合試験）は、検出により、例えば排気の分析により実施される。新規な制御戦略は最適化のツールとして用いられる正確な炭素バランシィング（釣合試験）（例えばＣＥＲ）を可能にする。二酸化炭素形成速度は、１時間で培養液１リットル中の細胞によって形成されるＣＯ２の量を示す。オペレーターが重炭酸イオンによって緩衝される細胞培養培地を使用しなければならない場合、特色は二酸化炭素形成速度の測定において起こる。生理的ｐＨ範囲において、全炭酸塩には、ＣＯ２とＨＣＯ３−の間のバランス（平衡）にあり、これはｐＨによって影響を受ける。平衡を得るために、気体組成物は、加えられたまま及び発酵槽から取り除かれたまま分析される。これまで、細胞培養液の実際の貯蔵効果が知られていないため、培地ＮａＨＣＯ３のバランス（平衡）を得ることは困難だった。細胞に最適に適合している、ＨＣＯ３−又はＣＯ３を含まない新規な培地は、新しい可能性を開く。
【００１９】
本発明の他の利点は、バイオプロセスの再現性の改良である。これは、制御されたｐＣＯ２を有する異なるスケーリングでの繰り返し発酵の実行において、比較できる結果が最終的な力価、細胞数、代謝等に関して得られることを意味する。ｐＣＯ２を制御しない発酵の実行において、特にスケーリングが異なる場合、これらのパラメータは、１つの発酵の実行と他の発酵の実行の場合によって、かなり変動しうる。
【００２０】
図面の説明
使用するバイオリアクターの構造の例は実施例３に記載されている。しかしながら、バイオリアクターの構造は、異なる要件を満たすように原則として可変的である。例えば、上昇管は除外することができ、そしてその代わりに追加プローブを取り付けることができるか、又は、さらなる／他の溶液をホースポンプによって自動的に加えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１  変化するＮａＨＣＯ３濃度でのｐＯ２［％］の比較；緩衝液の条件：曲線１＝ＮａＨＣＯ３を含まない培地Ａ＋ゼロＮａＨＣＯ３（完全にＮａＨＣＯ３を含まない）；曲線２＝ＮａＨＣＯ３を含まない培地Ａ＋１mM ＮａＨＣＯ３；曲線３＝ＮａＨＣＯ３を含まない培地Ａ＋４mM ＮａＨＣＯ３；曲線４＝ＮａＨＣＯ３を含まない培地Ａ＋８mM ＮａＨＣＯ３＋２０mM ＨＥＰＥＳ；曲線５＝ＮａＨＣＯ３を含まない培地Ａ＋８mM ＮａＨＣＯ３；曲線６＝ＮａＨＣＯ３を含まない培地Ａ＋３６mM ＮａＨＣＯ３（対照）
【図２Ａ】図２  緩衝液のスクリーン；Ａ：高いｐＣＯ２プロファイルを有する緩衝液のスクリーン；ＳＦ０１＝ＮａＨＣＯ３を含まない、１００mM ＨＥＰＥＳ緩衝液（１／２）を有する培地；ＳＦ０２＝ＮａＨＣＯ３を含まない、１００mM ＨＥＰＥＳ緩衝液（２／２）を有する培地；ＳＦ０３＝ＮａＨＣＯ３を含まない、６０mM ＨＥＰＥＳ緩衝液（１／２）を有する培地；ＳＦ０４＝ＮａＨＣＯ３を含まない、６０mM ＨＥＰＥＳ緩衝液（２／２）を有する培地；ＳＦ０５＝ＮａＨＣＯ３を含まない、１００mM ＭＯＰＳ緩衝液（１／２）を有する培地；ＳＦ０６＝ＮａＨＣＯ３を含まない、１００mM ＭＯＰＳ緩衝液（２／２）を有する培地；ＳＦ０７＝ＮａＨＣＯ３を含まない、５０mM ＭＯＰＳ緩衝液（１／２）を有する培地；ＳＦ０８＝ＮａＨＣＯ３を含まない、５０mM ＭＯＰＳ緩衝液（２／２）を有する培地；ＳＦ０９＝ＮａＨＣＯ３を含まない、５０mM Ｓｏｄ−β（１／２）を有する培地；ＳＦ１０＝ＮａＨＣＯ３を含まない、５０mM Ｓｏｄ−β（２／２）を有する培地；ＳＦ１１＝ＮａＨＣＯ３を含まない、２５mM Ｓｏｄ−β（１／２）を有する培地；ＳＦ１２＝ＮａＨＣＯ３を含まない、２５mM Ｓｏｄ−β（２／２）を有する培地；ＳＦ１３＝ＮａＨＣＯ３を含まない、８０mM ＴＥＳ（１／２）を有する培地；ＳＦ１４＝ＮａＨＣＯ３を含まない、８０mM ＴＥＳ（２／２）を有する培地；ＳＦ１５＝ＮａＨＣＯ３を含まない、４０mM ＴＥＳ（１／２）を有する培地；ＳＦ１６＝ＮａＨＣＯ３を含まない、４０mM ＴＥＳ（２／２）を有する培地；ＳＦ１７＝ＮａＨＣＯ３を含まない、５０mM Trizma塩基（１／２）を有する培地；ＳＦ１８＝ＮａＨＣＯ３を含まない、５０mM Trizma塩基（２／２）を有する培地；ＳＦ１９＝ＮａＨＣＯ３を含まない、１００mM Trizma塩基（１／２）を有する培地；ＳＦ２０＝ＮａＨＣＯ３を含まない、１００mM Trizma塩基（２／２）を有する培地；ＳＦ２１＝培地Ａ（対照）（１／２）；ＳＦ２２＝培地Ａ（対照）（２／２）；ＳＦ２３＝ブランク培地Ａ（＝ＭＯＰＳを含まず、ＮａＨＣＯ３を含まない培地Ａ）（１／２）；ＳＦ２４＝ブランク培地Ａ（＝ＭＯＰＳを含まず、ＮａＨＣＯ３を含まない培地Ａ）（２／２）；ＳＦ４９＝ＮａＨＣＯ３を含まない、６０mM ＨＥＰＥＳ緩衝液＋８mM ＮａＨＣＯ３（１／１）を有する培地；ＳＦ５０＝ＮａＨＣＯ３を含まない、５０mM ＭＯＰＳ緩衝液＋８mM ＮａＨＣＯ３（１／１）を有する培地；ＳＦ５１＝ＮａＨＣＯ３を含まない、２５mM Ｓｏｄ−β＋８mM ＮａＨＣＯ３（１／１）を有する培地；ＳＦ５２＝ＮａＨＣＯ３を含まない、４０mM ＴＥＳ緩衝液＋８mM ＮａＨＣＯ３（１／１）を有する培地；ＳＦ５３＝ＮａＨＣＯ３を含まない、５０mM Trizma塩基緩衝液＋８mM ＮａＨＣＯ３（１／１）を有する培地
【図２Ｂ】Ｂ：低いｐＣＯ２プロファイルを有する緩衝液のスクリーン；ＳＦ２５＝ＮａＨＣＯ３を含まない、１００mM ＨＥＰＥＳ緩衝液（１／２）を有する培地；ＳＦ２６＝ＮａＨＣＯ３を含まない、１００mM ＨＥＰＥＳ緩衝液（２／２）を有する培地；ＳＦ２７＝ＮａＨＣＯ３を含まない、６０mM ＨＥＰＥＳ緩衝液（１／２）を有する培地；ＳＦ２８＝ＮａＨＣＯ３を含まない、６０mM ＨＥＰＥＳ緩衝液（２／２）を有する培地；ＳＦ２９＝ＮａＨＣＯ３を含まない、１００mM ＭＯＰＳ緩衝液（１／２）を有する培地；ＳＦ３０＝ＮａＨＣＯ３を含まない、１００mM ＭＯＰＳ緩衝液（２／２）を有する培地；ＳＦ３１＝ＮａＨＣＯ３を含まない、５０mM ＭＯＰＳ緩衝液（１／２）を有する培地；ＳＦ３２＝ＮａＨＣＯ３を含まない、５０mM ＭＯＰＳ緩衝液（２／２）を有する培地；ＳＦ３３＝ＮａＨＣＯ３を含まない、５０mM Ｓｏｄ−β（１／２）を有する培地；ＳＦ３４＝ＮａＨＣＯ３を含まない、５０mM Ｓｏｄ−β（２／２）を有する培地；ＳＦ３５＝ＮａＨＣＯ３を含まない、２５mM Ｓｏｄ−β（１／２）を有する培地；ＳＦ３６＝ＮａＨＣＯ３を含まない、２５mM Ｓｏｄ−β（２／２）を有する培地；ＳＦ３７＝ＮａＨＣＯ３を含まない、８０mM ＴＥＳ（１／２）を有する培地；ＳＦ３８＝ＮａＨＣＯ３を含まない、８０mM ＴＥＳ（２／２）を有する培地；ＳＦ３９＝ＮａＨＣＯ３を含まない、４０mM ＴＥＳ（１／２）を有する培地；ＳＦ４０＝ＮａＨＣＯ３を含まない、４０mM ＴＥＳ（２／２）を有する培地；ＳＦ４１＝ＮａＨＣＯ３を含まない、５０mM Trizma塩基（１／２）を有する培地；ＳＦ４２＝ＮａＨＣＯ３を含まない、５０mM Trizma塩基（２／２）を有する培地；ＳＦ４３＝ＮａＨＣＯ３を含まない、１００mM Trizma塩基（１／２）を有する培地；ＳＦ４４＝ＮａＨＣＯ３を含まない、１００mM Trizma塩基（２／２）を有する培地；ＳＦ４５＝培地Ａ（対照）（１／２）；ＳＦ４６＝培地Ａ（対照）（２／２）；ＳＦ４７＝ブランク培地Ａ（＝ＭＯＰＳを含まず、ＮａＨＣＯ３を含まない培地Ａ）（１／２）；ＳＦ４８＝ブランク培地Ａ（＝ＭＯＰＳを含まず、ＮａＨＣＯ３を含まない培地Ａ）（２／２）；ＳＦ５４＝ＮａＨＣＯ３を含まない、６０mM ＨＥＰＥＳ緩衝液＋８mM ＮａＨＣＯ３（１／１）を有する培地；ＳＦ５５＝ＮａＨＣＯ３を含まない、５０mM ＭＯＰＳ緩衝液＋８mM ＮａＨＣＯ３（１／１）を有する培地；ＳＦ５６＝ＮａＨＣＯ３を含まない、２５mM Ｓｏｄ−β＋８mM ＮａＨＣＯ３（１／１）を有する培地；ＳＦ５７＝ＮａＨＣＯ３を含まない、４０mM ＴＥＳ緩衝液＋８mM ＮａＨＣＯ３（１／１）を有する培地；ＳＦ５８＝ＮａＨＣＯ３を含まない、５０mM Trizma塩基緩衝液＋８mM ＮａＨＣＯ３（１／１）を有する培地
【図２Ｃ】Ｃ：８及び１１日目の力価に対する緩衝液のスクリーン；ＳＦ０１＝ＮａＨＣＯ３を含まない、１００mM ＨＥＰＥＳ緩衝液（１／２）を有する培地；ＳＦ０２＝ＮａＨＣＯ３を含まない、１００mM ＨＥＰＥＳ緩衝液（２／２）を有する培地；ＳＦ０３＝ＮａＨＣＯ３を含まない、６０mM ＨＥＰＥＳ緩衝液（１／２）を有する培地；ＳＦ０４＝ＮａＨＣＯ３を含まない、６０mM ＨＥＰＥＳ緩衝液（２／２）を有する培地；ＳＦ０５＝ＮａＨＣＯ３を含まない、１００mM ＭＯＰＳ緩衝液（１／２）を有する培地；ＳＦ０６＝ＮａＨＣＯ３を含まない、１００mM ＭＯＰＳ緩衝液（２／２）を有する培地；ＳＦ０７＝ＮａＨＣＯ３を含まない、５０mM ＭＯＰＳ緩衝液（１／２）を有する培地；ＳＦ０８＝ＮａＨＣＯ３を含まない、５０mM ＭＯＰＳ緩衝液（２／２）を有する培地；ＳＦ０９＝ＮａＨＣＯ３を含まない、５０mM Ｓｏｄ−β（１／２）を有する培地；ＳＦ１０＝ＮａＨＣＯ３を含まない、５０mM Ｓｏｄ−β（２／２）を有する培地；ＳＦ１１＝ＮａＨＣＯ３を含まない、２５mM Ｓｏｄ−β（１／２）を有する培地；ＳＦ１２＝ＮａＨＣＯ３を含まない、２５mM Ｓｏｄ−β（２／２）を有する培地；ＳＦ１３＝ＮａＨＣＯ３を含まない、８０mM ＴＥＳ（１／２）を有する培地；ＳＦ１４＝ＮａＨＣＯ３を含まない、８０mM ＴＥＳ（２／２）を有する培地；ＳＦ１５＝ＮａＨＣＯ３を含まない、４０mM ＴＥＳ（１／２）を有する培地；ＳＦ１６＝ＮａＨＣＯ３を含まない、４０mM ＴＥＳ（２／２）を有する培地；ＳＦ１７＝ＮａＨＣＯ３を含まない、５０mM Trizma塩基（１／２）を有する培地；ＳＦ１８＝ＮａＨＣＯ３を含まない、５０mM Trizma塩基（２／２）を有する培地；ＳＦ１９＝ＮａＨＣＯ３を含まない、１００mM Trizma塩基（１／２）を有する培地；ＳＦ２０＝ＮａＨＣＯ３を含まない、１００mM Trizma塩基（２／２）を有する培地；ＳＦ２１＝培地Ａ（対照）（１／２）；ＳＦ２２＝培地Ａ（対照）（２／２）；ＳＦ２３＝ブランク培地Ａ（＝ＭＯＰＳを含まず、ＮａＨＣＯ３を含まない培地Ａ）（１／２）；ＳＦ２４＝ブランク培地Ａ（＝ＭＯＰＳを含まず、ＮａＨＣＯ３を含まない培地Ａ）（２／２）；ＳＦ４９＝ＮａＨＣＯ３を含まない、６０mM ＨＥＰＥＳ緩衝液＋８mM ＮａＨＣＯ３（１／１）を有する培地；ＳＦ５０＝ＮａＨＣＯ３を含まない、５０mM ＭＯＰＳ緩衝液＋８mM ＮａＨＣＯ３（１／１）を有する培地；ＳＦ５１＝ＮａＨＣＯ３を含まない、２５mM Ｓｏｄ−β＋８mM ＮａＨＣＯ３（１／１）を有する培地；ＳＦ５２＝ＮａＨＣＯ３を含まない、４０mM ＴＥＳ緩衝液＋８mM ＮａＨＣＯ３（１／１）を有する培地；ＳＦ５３＝ＮａＨＣＯ３を含まない、５０mM Trizma塩基緩衝液＋８mM ＮａＨＣＯ３（１／１）を有する培地
【図３】図３  ｐＣＯ２制御；図３は、内部のｐＣＯ２測定（自動的なデータのアーカイブと共に探査する）及び血液ガス測定装置（ＢＧＡ）の外部の計測値の、時間とともにプロットされた経過を視覚的に示す。０日目（ｄ０）上の矢印（ＣＯ２プローブとＢＧＡの間の比較）で印をつけた最初の較正は、制御特性がまだあまりに不安定であるため、ほとんど効果を示さない。４日目（ｄ４）上の二回目の較正（２本目の矢印）から、内外の計測値の間の良好な相関関係を検出することができる。軸の説明：ｐＣＯ２−オンライン対ｐＣＯ２−ＢＧＡ；曲線Ａ＝内部のＣＯ２測定（ＣＯ２プローブ、Messrs Mettler Toledoを介する）；曲線Ｂ＝外部のＣＯ２測定（BGA Rapidlap、Messrs Siemensを介する）
【図４Ａ】図４  正常な生存細胞数濃度（Ａ）又は力価濃度（Ｂ）；Ａ：生存細胞数濃度（参照、ｐＣＯ２−制御／非制御）；Ａ＝ＦＳ ３３．１  培地Ｂ  ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋４０mM ＴＥＳ（ｐＣＯ２−制御）  ｐＨ試薬：ＮａＯＨ；Ｂ＝ＦＳ ３２．２  培地Ｂ  ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋４０mM ＴＥＳ＋８mM ＮａＨＣＯ３（非制御）  ｐＨ試薬：ＮａＯＨ；Ｃ＝ＦＳ ３２．３  培地Ｂ、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋４０mM ＴＥＳ＋８mM ＮａＨＣＯ３（非制御）  ｐＨ試薬：Ｎａ２ＣＯ３
【図４Ｂ】Ｂ：標準化した力価（参照、ｐＣＯ２−制御／非制御）；Ａ＝ＦＳ ３３．１  培地Ｂ、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋４０mM ＴＥＳ（ｐＣＯ２−制御）  ｐＨ試薬：ＮａＯＨ；Ｂ＝ＦＳ ３２．２  培地Ｂ、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋４０mM ＴＥＳ＋８mM ＮａＨＣＯ３（非制御）  ｐＨ試薬：ＮａＯＨ；Ｃ＝ＦＳ ３２．３  培地Ｂ、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋４０mM ＴＥＳ＋８mM ＮａＨＣＯ３（非制御）  ｐＨ試薬：Ｎａ２ＣＯ３
【図５Ａ】図５  緩衝液系の比較；Ａ：ｐＣＯ２プロファイル  制御／非制御；Ａ＝ＦＳ ３３．１  培地Ｂ、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋４０mM ＴＥＳ（ｐＣＯ２−制御）  ｐＨ試薬：ＮａＯＨ；Ｂ＝ＦＳ ３２．２  培地Ｂ、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋４０mM ＴＥＳ＋８mM ＮａＨＣＯ３（非制御）  ｐＨ試薬：ＮａＯＨ；Ｃ＝ＦＳ ３２．３  培地Ｂ、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋４０mM ＴＥＳ＋８mM ＮａＨＣＯ３（非制御）  ｐＨ試薬：Ｎａ２ＣＯ３
【図５Ｂ】Ｂ：ｐＣＯ２プロファイル  制御（１×）／非制御（５×）；Ｉ＝ＦＳ ３２．２  培地Ｂ、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋４０mM ＴＥＳ＋８mM ＮａＨＣＯ３（ＮａＯＨ）；II＝ＦＳ ３３．１  培地Ｂ、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋４０mM ＴＥＳ（ｐＣＯ２−制御）（ＮａＯＨ）；III＝ＦＳ ３２．４  培地Ｂ、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋２５mM Ｓｏｄ−β（ＮａＯＨ）；IV＝ＦＳ ３２．５  培地Ｂ、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋２５mM Ｓｏｄ−β＋１２mM ＮａＨＣＯ３（ＮａＯＨ）；Ｖ＝ＦＳ ３３．３  培地Ｂ、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋３６mM ＮａＨＣＯ３（比較対照）（ＮａＯＨ）；VI＝ＦＳ ３３．５  培地Ｂ、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋８mM ＮａＨＣＯ３（ＮａＯＨ）
【図５Ｃ】Ｃ：標準化した力価；Ｉ＝ＦＳ ３２．２  培地Ｂ、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋４０mM ＴＥＳ＋８mM ＮａＨＣＯ３（ＮａＯＨ）；II＝ＦＳ ３３．１  培地Ｂ、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋４０mM ＴＥＳ（ｐＣＯ２−制御）（ＮａＯＨ）；III＝ＦＳ ３２．４  培地Ｂ、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋２５mM Ｓｏｄ−β（ＮａＯＨ）；IV＝ＦＳ ３２．５  培地Ｂ、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋２５mM Ｓｏｄ−β＋１２mM ＮａＨＣＯ３（ＮａＯＨ）；Ｖ＝ＦＳ ３３．３  培地Ｂ、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋３６mM ＮａＨＣＯ３（比較対照）（ＮａＯＨ）；VI＝ＦＳ ３３．５  培地Ｂ、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋８mM ＮａＨＣＯ３（ＮａＯＨ）；ＴＥＳ緩衝液を用いて得られた生成物の力価又は生成物の濃度は、対照のそれと同じ水準であった。
【図６】図６  緩衝液系−標準化した生成物濃度の比較；ＣＯ２制御及びアルカリ溶液として１．２M ＮａＯＨを有する、図６の実験１．１〜１．６。１．１＝ＦＳ ３３．１  培地Ｂ、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋４０mM ＴＥＳ；１．２＝ＦＳ ３３．２  培地Ｂ、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋４０mM ＴＥＳ＋８mM ＮａＨＣＯ３；１．３＝ＦＳ ３３．２  培地Ｂ、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋２５mM Ｓｏｄ−β；１．４＝ＦＳ ３３．２  培地Ｂ、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋２５mM Ｓｏｄ−β＋８mM ＮａＨＣＯ３；１．５＝ＦＳ ３３．２  培地Ｂ、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋２５mM Ｓｏｄ−β＋１２mM ＮａＨＣＯ３；１．６＝ＦＳ ３３．２  培地Ｂ、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋２５mM Ｓｏｄ−β＋１６mM ＮａＨＣＯ３
【図７Ａ】図７  ＣＯ２プロファイルの比較；ＣＯ２制御、アルカリ溶液として１．２M ＮａＯＨを有し、ＮａＨＣＯ３を含まず、ＭＯＰＳを含まない＋２５mM Ｓｏｄ−βである培地Ｂを用いる、図７の実験３．１〜３．５；異なるＣＯ２プロファイル：３．１＝０〜３日目 ５％ ＣＯ２、３〜１１日目 ３％ ＣＯ２；３．２＝０〜２日目 ８％ ＣＯ２、２〜１１日目 ６％ ＣＯ２；３．３＝０〜４日目 ８％ ＣＯ２、４〜８日目 １０％ ＣＯ２、８〜１１日目 ８％ ＣＯ２；３．４＝０〜１日目 ８％ ＣＯ２、１〜２日目 ６％ ＣＯ２、２〜７日目 ８％ ＣＯ２、７〜１１日目 ５％ ＣＯ２；３．５＝０〜１１日目 ３％ ＣＯ２
【図７Ｂ】図７  ＣＯ２プロファイルの比較；ＣＯ２制御、アルカリ溶液として１．２M ＮａＯＨを有し、ＮａＨＣＯ３を含まず、ＭＯＰＳを含まない＋２５mM Ｓｏｄ−βである培地Ｂを用いる、図７の実験３．１〜３．５；異なるＣＯ２プロファイル：３．１＝０〜３日目 ５％ ＣＯ２、３〜１１日目 ３％ ＣＯ２；３．２＝０〜２日目 ８％ ＣＯ２、２〜１１日目 ６％ ＣＯ２；３．３＝０〜４日目 ８％ ＣＯ２、４〜８日目 １０％ ＣＯ２、８〜１１日目 ８％ ＣＯ２；３．４＝０〜１日目 ８％ ＣＯ２、１〜２日目 ６％ ＣＯ２、２〜７日目 ８％ ＣＯ２、７〜１１日目 ５％ ＣＯ２；３．５＝０〜１１日目 ３％ ＣＯ２
【図７Ｃ】図７  ＣＯ２プロファイルの比較；ＣＯ２制御、アルカリ溶液として１．２M ＮａＯＨを有し、ＮａＨＣＯ３を含まず、ＭＯＰＳを含まない＋２５mM Ｓｏｄ−βである培地Ｂを用いる、図７の実験３．１〜３．５；異なるＣＯ２プロファイル：３．１＝０〜３日目 ５％ ＣＯ２、３〜１１日目 ３％ ＣＯ２；３．２＝０〜２日目 ８％ ＣＯ２、２〜１１日目 ６％ ＣＯ２；３．３＝０〜４日目 ８％ ＣＯ２、４〜８日目 １０％ ＣＯ２、８〜１１日目 ８％ ＣＯ２；３．４＝０〜１日目 ８％ ＣＯ２、１〜２日目 ６％ ＣＯ２、２〜７日目 ８％ ＣＯ２、７〜１１日目 ５％ ＣＯ２；３．５＝０〜１１日目 ３％ ＣＯ２
【図８】図８  ナトリウム塩を用いた酸の適合性；ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋２５mM Ｓｏｄ−βである培地Ｂを用いて、３日目に異なるナトリウム塩を添加するＳＦ１〜１０：ＳＦ１＝水の添加（対照として）；ＳＦ２＝水の添加（対照として）；ＳＦ３＝塩化ナトリウムの添加（塩酸として）；ＳＦ４＝塩化ナトリウムの添加（塩酸として）；ＳＦ５＝酢酸ナトリウムの添加（酢酸として）；ＳＦ６＝酢酸ナトリウムの添加（酢酸として）；ＳＦ７＝硫酸ナトリウムの添加（硫酸として）；ＳＦ８＝硫酸ナトリウムの添加（硫酸として）；ＳＦ９＝リン酸水素二ナトリウムの添加（リン酸として）；ＳＦ１０＝リン酸水素二ナトリウムの添加（リン酸として）
【図９Ａ】図９  異なる酸の比較；  ＣＯ２制御、アルカリ溶液として１．２M ＮａＯＨを用いて、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋２５mM Ｓｏｄ−βである培地Ｂを用い、３日目に異なる酸（５０ml）を添加する、図９における実験４．３〜４．５：４．３＝９９mM塩酸の添加；４．４＝８１mMリン酸の添加；４．５＝５４mM硫酸の添加
【図９Ｂ】図９  異なる酸の比較；  ＣＯ２制御、アルカリ溶液として１．２M ＮａＯＨを用いて、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋２５mM Ｓｏｄ−βである培地Ｂを用い、３日目に異なる酸（５０ml）を添加する、図９における実験４．３〜４．５：４．３＝９９mM塩酸の添加；４．４＝８１mMリン酸の添加；４．５＝５４mM硫酸の添加
【図９Ｃ】図９  異なる酸の比較；  ＣＯ２制御、アルカリ溶液として１．２M ＮａＯＨを用いて、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋２５mM Ｓｏｄ−βである培地Ｂを用い、３日目に異なる酸（５０ml）を添加する、図９における実験４．３〜４．５：４．３＝９９mM塩酸の添加；４．４＝８１mMリン酸の添加；４．５＝５４mM硫酸の添加
【図１０】図１０  ＣＯ２制御無しの標準的方法とＣＯ２を制御する方法との比較；４．１＝培地Ｂ、アルカリ溶液として１M Ｎａ２ＣＯ３、ＣＯ２の制御無し（標準的方法）；４．３＝培地Ｂ、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋２５mM Ｓｏｄ−β、アルカリ溶液として１．２M ＮａＯＨ、ＣＯ２の制御及び９９mM塩酸の添加を伴う；４．４＝培地Ｂ、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋２５mM Ｓｏｄ−β、アルカリ溶液として１．２M ＮａＯＨ、ＣＯ２の制御及び８１mMリン酸の添加を伴う；４．５＝培地Ｂ、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋２５mM Ｓｏｄ−β、アルカリ溶液として１．２M ＮａＯＨ、ＣＯ２の制御及び５４mM硫酸の添加を伴う
【図１１Ａ】図１１  モデル細胞２を用いたＣＯ２プロファイルの比較；（Ａ）標準化した細胞濃度、（Ｂ）標準化した生成物濃度、（Ｃ）ＣＯ２プロファイル；ＣＯ２制御、アルカリ溶液として１．２M ＮａＯＨを有し、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋Ｓｏｄ−β ２５mMである培地Ｂを用いる、図１１の実験ＫＦ１〜ＫＦ５；異なるＣＯ２プロファイル：ＫＦ１＝０〜１１日、３％ＣＯ２；ＫＦ２＝０〜３日、７％ＣＯ２、３〜１１日、３％ＣＯ２；ＫＦ３＝０〜３日、１１％ＣＯ２、３〜１１日、３％ＣＯ２；ＫＦ４＝０〜３日、７％ＣＯ２、３〜７日、１１％ＣＯ２、７〜１１日、７％ＣＯ２；ＫＦ５＝０〜３日、７％ＣＯ２、３〜７日、１１％ＣＯ２、７〜１１日、３％ＣＯ２
【図１１Ｂ】図１１  モデル細胞２を用いたＣＯ２プロファイルの比較；（Ａ）標準化した細胞濃度、（Ｂ）標準化した生成物濃度、（Ｃ）ＣＯ２プロファイル；ＣＯ２制御、アルカリ溶液として１．２M ＮａＯＨを有し、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋Ｓｏｄ−β ２５mMである培地Ｂを用いる、図１１の実験ＫＦ１〜ＫＦ５；異なるＣＯ２プロファイル：ＫＦ１＝０〜１１日、３％ＣＯ２；ＫＦ２＝０〜３日、７％ＣＯ２、３〜１１日、３％ＣＯ２；ＫＦ３＝０〜３日、１１％ＣＯ２、３〜１１日、３％ＣＯ２；ＫＦ４＝０〜３日、７％ＣＯ２、３〜７日、１１％ＣＯ２、７〜１１日、７％ＣＯ２；ＫＦ５＝０〜３日、７％ＣＯ２、３〜７日、１１％ＣＯ２、７〜１１日、３％ＣＯ２
【図１１Ｃ】図１１  モデル細胞２を用いたＣＯ２プロファイルの比較；（Ａ）標準化した細胞濃度、（Ｂ）標準化した生成物濃度、（Ｃ）ＣＯ２プロファイル；ＣＯ２制御、アルカリ溶液として１．２M ＮａＯＨを有し、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋Ｓｏｄ−β ２５mMである培地Ｂを用いる、図１１の実験ＫＦ１〜ＫＦ５；異なるＣＯ２プロファイル：ＫＦ１＝０〜１１日、３％ＣＯ２；ＫＦ２＝０〜３日、７％ＣＯ２、３〜１１日、３％ＣＯ２；ＫＦ３＝０〜３日、１１％ＣＯ２、３〜１１日、３％ＣＯ２；ＫＦ４＝０〜３日、７％ＣＯ２、３〜７日、１１％ＣＯ２、７〜１１日、７％ＣＯ２；ＫＦ５＝０〜３日、７％ＣＯ２、３〜７日、１１％ＣＯ２、７〜１１日、３％ＣＯ２
【００２２】
発明の詳細な説明
実験は、一例として以下のことを示している：
結果１：１２mmol/L及び特に８mmol/Lの、ＮａＨＣＯ３濃度の減少は、対照のそれと同様に、有利なｐＯ２プロファイル（細胞増殖）を示す。
【００２３】
結果２：
→ＮａＨＣＯ３を含まない細胞培養培地又はＮａＨＣＯ３が低い（＝８mmol/L）細胞培養培地における最良の緩衝液物質の同定
→最良の緩衝液物質は：ＴＥＳ（例えば４０mmol/L）及びＳｏｄ−β（例えば２５mmol/L）である
【００２４】
図２Ａは、濃度Ｉの全ての緩衝液培地混合物は、Trizma塩基（ＳＦ１９及びＳＦ２０）を除き、細胞増殖を呈することを示している。最良の増殖は、二つの対照（ＳＦ２１及びＳＦ２２）において見られたが、緩衝液培地混合物との違いは、少なくともｄ８までは相対的に小さい。約４５の細胞濃度を有する、三つの最良の緩衝液は、Ｓｏｄ−β／Ｈ；ＴＥＳ／Ｋ＋ＮａＨＣＯ３／Ｄ及びＭＯＰＳ／Ｆ＋ＮａＨＣＯ３／Ｄである。Trizma塩基は、全ての濃度で十分に作動しない；ｐＨは確かに安定であるが、幾らか毒性が存在しうる。
【００２５】
図２Ｂにおいては、図２Ａと同じ基準を用いた。このＣＯ２プロファイルで達成された細胞密度は、実質的により低くなったことが疑いなく明らかである。対照はここでも疑いなく群を抜いているが、最大細胞密度２０は容認されない。約１８の細胞濃度を有する、ここでの二つの最良の緩衝液混合物は、Ｓｏｄ−β／Ｈ＋ＮａＨＣＯ３／Ｄ及びＭＯＰＳ／Ｆである。このため、さらなる評価は、関連するＣＯ２プロファイルを有するインキュベーター１からの振とうフラスコに、主に制限される。
【００２６】
一般的に、ＮａＨＣＯ３／Ｄとの組み合わせは、低い緩衝液濃度で有利である。図２Ｃは、得られた力価濃度を示す（標準化）。二三の例外を除き、力価の増加をｄ８とｄ１１の間に見ることができる。よって、減少したＮａＨＣＯ３濃度を有する培地である振とうフラスコＳＦ４９〜ＳＦ５２では、増加は１０倍さえ超える！
【００２７】
他の注目すべき事実は、初めて、従来の対照（ＳＦ２１及びＳＦ２２）が培地の新規な緩衝物質によって上回られたということである：ＴＥＳ／Ｋ＋ＮａＨＣＯ３／Ｄを有するＳＦ５２は、ｄ１１において標準化した生成物濃度８３．６という、非常に良好な結果を与える。
【００２８】
結果３
ｐＣＯ２制御実験は、２％の所望のｐＣＯ２値については、方法において顕著に現れない決定的な下限に達することを示している。
【００２９】
結果４：
それぞれ標準的な生存細胞数濃度（Ａ）及び力価濃度（Ｂ）に関する図４Ａ及びＢは、制御した発酵実験（三角形の符号を有する曲線）の細胞に特異的な生成物の形成速度が、比較の非制御発酵実験（ひし形を有する曲線）のそれより高いことを示している。加えて図４における試験は、ＮａＯＨを用いたｐＨ制御は、Ｎａ２ＣＯ３を用いるそれより良好な生成物の形成速度を有する傾向があることを示している。ｐＣＯ２プロファイルが更に最適化される場合、特異的な生成物の形成速度は、更により増加する。ｐＣＯ２制御実験（ＦＳ ３３．１）の生存細胞数密度は、図４Ｂに見られるように、最大で２０単位互いに外れる。ｄ１０から、二つの比較実験はまたごく僅かな相違しか示さないか、又は良好な適合性が得られる。ＦＳ ３３．１のより低い水準は、より高いｐＣＯ２プロファイルから生じることがありえ、負に解釈することができない。活力（図示せず）は、全ての実験で同じ水準である。アルカリ性溶液の消費（図示せず）は、あらゆる実験において低い。ＦＳ ３２．２（最高の生存細胞数濃度）では、予測されるとおり、より多くのアルカリ性溶液が、発酵の終了（ｄ９〜ｄ１１）の頃に加えられなければならない。しかしながら、この実験は、発酵の終わりに最も低い重量オスモル濃度（図示せず）、３９３mosmol/kgを有する。図４Ａは、ＦＳ ３２．３より低い細胞数を有するにもかかわらず、ＦＳ ３３．１がより高い力価濃度を有することを示す。濃度は、二つの同一の発酵実験、ＦＳ ３２．２とＦＳ ３２．３の間に、散乱の上部３分の１にある。これは、ｐＣＯ２調節を有する発酵実験が、より高い特定の生成物形成速度を有することを意味する。
【００３０】
結果５：
→理想的には、発酵実験は、以下の条件の下で起こる：完全にＮａＨＣＯ３がなく、ｐＣＯ２制御を有するＴＥＳ緩衝液（又はＳｏｄ−β緩衝液）。最良の終端力価は、このようにして達成される。
【００３１】
図５Ａは、制御された発酵実験（ＦＳ ３３．１）のｐＣＯ２プロファイルが、比較の発酵（ＦＳ ３２．２及びＦＳ ３２．３）から明らかに区別されることを示している。ＦＳ ３２．２及びＦＳ ３２．３が比較のために使用されるが、同一の比較相手が汚染により除外されているため、それらはより少ない量のＮａＨＣＯ３を有する。制御によって得られたｐＣＯ２プロファイルは、発酵の最初の３分の１において比較実験と明らかに区別され、大体は規定の値に続く（図５Ｂを参照されたい、ｄ１〜ｄ３でｐＣＯ２＝８％、ｄ３〜ｄ６でｐＣＯ２＝６％、ｄ６〜ｄ８でｐＣＯ２＝２％及びｄ８〜ｄ１１でｐＣＯ２＝４％）。通常より低いｐＣＯ２値が課される（６〜８日目、ｄ６〜ｄ８）場合、窒素ガスがＣＯ２を排出するように送り込まれる。低い所望の値には決して到達せず、３．２％のｐＣＯ２値が制御について臨界的な下限を表すことが見出された。窒素の需要の増加については、酸素もその結果排出され、これは酸素のより高い体積フローによって補償される。臨界的な総気体量は、達成することができ、ここで、法外に大量の発泡を観察することができる。
【００３２】
図５Ｂは、制御発酵実験が、全ての他の比較実験から驚くほど明らかに区別されることを示している。これは、制御によって達成されるｐＣＯ２プロファイルが、規定の値（ｄ１〜ｄ３でｐＣＯ２＝８％、ｄ３〜ｄ６でｐＣＯ２＝６％、ｄ６〜ｄ８でｐＣＯ２＝２％及びｄ８〜ｄ１１でｐＣＯ２＝４％）に実際に基づき、偶然に発生しないことを意味する。
【００３３】
図５Ｃは、ＮａＨＣＯ３のないＴＥＳ又は８mmol/LのＮａＨＣＯ３を有するＴＥＳによって得られる力価濃度が、対照（３６mmol/Lの濃度を有するＮａＨＣＯ３ベースの緩衝液）と同等であることを示している。無作為に選択され、かつ最適化されていないｐＣＯ２プロファイルにもかかわらず、ＮａＨＣＯ３のないＴＥＳ（制御）を用いる実験は、僅か６．１０％（対象を基に測定される）しか対照と異ならない最終濃度（力価）を達成する。ＴＥＳプラス８mmol/LのＮａＨＣＯ３（非制御）を有する実験は、僅か０．０１％（対象を基に測定される）しか対照と異ならない最終濃度（力価）を達成する。全く驚くべきことに、これはＮａＨＣＯ３がＴＥＳと完全に置き換えられることができることを示す。これは更に、ＴＥＳプラス８mmol/LのＮａＨＣＯ３（非制御）を有する実験の結果が、対照と同じ最終的な力価濃度を達成することを示している。
【００３４】
結果６：
最も高く、起こりうる生成物濃度を達成するためには、驚くべきことに、培地中にＮａＨＣＯ３を使用することは必要でない。図６に示される、ＴＥＳを用いての両方の実験の生成物濃度（１．１、１．２）は、驚いたことに、培地中でＮａＨＣＯ３を用いるものと用いないものの両方で、同じ生成物濃度を有する。Ｓｏｄ−βを使用する実験において、達成した生成物濃度は、全ての実験において、同様の最大生成物濃度が１１日目に達成される（１．３〜１．６）ため、培地中のＮａＨＣＯ３の量には今回も依存していない（図６を参照されたい）。
ＣＯ２−制御発酵プロセスにおいて、驚くべきことに、培地中のＮａＨＣＯ３の使用は必要でない。培地はＣＯ２を全く形成することができないため、培地中のＮａＨＣＯ３なしで、方法中のＣＯ２制御はより容易になる。
【００３５】
結果７：
驚くべきことに、発酵の開始時における低いＣＯ２分圧が、最適化された発酵結果のための決定的な要因であることが示された。
一方では、発酵方法を高いｐＣＯ２で始めることは有利ではない。異なるｐＣＯ２プロファイルを有する実験３．２以外の全ての実験の生存細胞濃度及びまた生成物濃度は、同様に進行して、おおよそ同じ最大値に達する（図７Ａ及び７Ｂを参照されたい）。実験３．２において、細胞はあまり増殖せず、したがってより低い生成物濃度を達成する。
【００３６】
図７Ｃにおいて関連するｐＣＯ２値を見るに、相当な違いは、実験３．２と他の全ての実験の間で見ることができる。３．２における１日目のｐＣＯ２は、８％を超える。一方、他の実験における１日目のｐＣＯ２値は、全て５％以下である。
細胞の増殖は、最初は高いｐＣＯ２によって阻害される。
【００３７】
結果８：
図８に示される生存細胞濃度は、細胞増殖が酢酸ナトリウムの添加によって影響を受けることを示している（ＳＦ５及び６）。生存細胞数は、酢酸ナトリウムが使用されるときに僅かに増加して、添加の３日後に再び後退し、そのため、酢酸ナトリウムが毒性を有するとみなすことができる。明示された細胞毒性のため、酢酸は、発酵方法におけるｐＨ制御のための好適な酸として使用されない。
他の塩類はいずれも細胞増殖上のいかなる毒性をも示さず、発酵方法の試験のために用いることができる。塩酸、硫酸及びリン酸が好ましい。
【００３８】
結果９：
図９Ｂに示すように、塩酸（４．３）、硫酸（４．４）及びリン酸（４．５）の添加の結果、同じ生成物濃度が発酵方法において達成される。
これらの混合物の生存細胞濃度を考慮する場合（図９Ａを参照されたい）、塩酸の添加を有する実験４．３で、他の実験より低い細胞数が得られることは明らかである。しかしながら、生成物濃度が他の全ての実験と丁度同程度の高さであるため、細胞の生産性は塩酸の添加の結果としてより高くなる。
【００３９】
硫酸の添加を有する実験４．４において、図９Ｃに示すように、７日目から、他の実験より少ないラクタートが形成される。ラクタートは特定の濃度以上で細胞上の毒性を有するため、その方法における低い乳酸濃度は有利である。
硫酸及び塩酸の両方が、発酵方法において有利である。硫酸は低い乳酸の生産を保障し、塩酸は高い細胞生産性を保障する。
【００４０】
結果１０：
標準的方法（４．１）が異なる酸を用いたＣＯ２制御方法（４．３〜４．５）と比較される場合、同程度の生成物濃度は全ての実験で得られる（図１０を参照されたい）。リン酸の添加を有する実験４．５において、実験４．１（標準的方法）とほぼ同じ最大生成物濃度が得られる。
【００４１】
ＣＯ２制御方法は、標準的方法と比較して生成物濃度に関していかなる不利な点も含まない。ＣＯ２制御方法が更に最適化される場合、生成物濃度は、標準方法と比べて増加することさえできる。
【００４２】
要約すると、結果は、試験される酸がｐＨを調整するために用いられる場合、低い乳酸形成の結果として、細胞増殖及び生産性に関して同等の性能ならびにより改良された性能をも示す。
【００４３】
結果１１：
結果７にて説明したような、異なるｐＣＯ２プロファイルについての方法の性能の結果をより広範なデータベースに配置するために、実施例９において、他の試験方法が、異なるｐＣＯ２プロファイルを用いて、今度は異なるモデル細胞（ＣＨＯ）を用いて使用される。
【００４４】
この試験方法で使用される異なるｐＣＯ２プロファイルは、図１１Ｃに示される。図１１Ａ及び１１Ｂから明らかなように、細胞増殖についての及び生成物濃度のパターンについての両方の発酵実験ＫＦ１は、残りの曲線のセットから明らかに区別される。この発酵槽実験（ＫＦ１）は、０日目から１１日目まで３％のｐＣＯ２を有するｐＣＯ２プロファイルにより行われた。
よってこの試験方法は、発酵の開始時（初期増殖期、特に０〜３日目）のＣＯ２分圧が最適化された発酵結果のための重要な要因であることを確認することが可能であった。
【００４５】
実施例９は、発酵の開始時に故意に選択された低いＣＯ２分圧が、細胞増殖について及び生成物濃度のパターンについて最善の結果を与えることを確認する。これはまた、特に、減少したＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオン（特に１２mmol/L又は８mmol/L未満のＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオン）を有する培養培地を使用する場合に、あるいは、完全にＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンを含まない培養培地を使用する場合に、真である。
【００４６】
定義
続いての非限定的な範例となる実施形態による本発明のより詳細な説明の前に、不定冠詞、例えば「ａ」又は「ａｎ」及び定冠詞、すなわち「ｔｈｅ」の使用は、二つの形のうちの一つが明確に除外され、言及が特定様式（単数又は複数）になされない限り、問題の用語の単数及び複数を含むことが指摘されるべきである。よって、単一の細胞だけを意味すると明確に述べられない限り、用語「細胞」は自動的に「複数の細胞」を含む。単数は明確に意味され、例えばここで、「ａ」又は「ｏｎｅ」は、（１）により補われる。
【００４７】
「バイオ（生物）医薬品の製造方法」は、発酵プロセスにおける真核生物細胞による生体分子の生産を意味する。これは、特にタンパク質、例えばＣＨＯ、ＮＳ０、ＰＥＲＣ．６細胞のような哺乳類細胞中の抗体の生産を含む。
【００４８】
生体分子によって意味される、特に対象のタンパク質又はＤＮＡもしくはＲＮＡ分子、例えばＲＮＡｉ、アンチセンスＲＮＡなどである。
【００４９】
バイオ（生物）医薬品の製造方法の最適化は、発酵プロセスの培地及び物理パラメータの適合を意味する。これらは、例えばｐＣＯ２、撹拌機の速度などを含む。最適化は、例えば、力価もしくは生成物の品質の増加（例えばタンパク質の異なるグリコシル化パターン又はタンパク質の他の翻訳後修飾）又は方法の頑健性（方法に影響を与えない、小さな方法の変動、軽微な変化に対する感度の欠如）を改善する。
【００５０】
用語「非ＣＯ２発生性の酸性及び／又はアルカリ性溶液」は、化学反応によってＣＯ２を出さない酸及びアルカリ性の溶液、例えばＮａＯＨ、ＨＣｌ、Ｈ３ＰＯ４、ＣＨ３ＣＯＯＨ、Ｈ２ＳＯ４を指す。
【００５１】
「ｐＣＯ２の制御」は、発酵溶液中のＣＯ２分圧が、所望の値に保たれる／制御されることを意味する。これは例えば、バイオプロセスの間にＣＯ２、Ｏ２、Ｎ２及び／又は空気の供給によって行われる。本発明において、「ｐＣＯ２の制御」は、好ましくはＣＯ２及び／又はＮ２ガスの供給によって行われる。
【００５２】
「ＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンを完全に含まない」は、０日目から発酵の終了まで使用される培地がＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンを含まないことを意味する。ＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンは、別個の添加（「飼料」）を通して、０日目から発酵の終了まで、培地に供給されない。
【００５３】
「流加回分」発酵／「流加回分」法又は「流加回分」プロセスは、最大充填水準までの基質の流入によって操作される発酵方法を意味する。用語「流加回分」は、堆積又は供給を意味する、英語「fed」及びbatchに由来する。時折、用語「流入方法」が、用語「流加回分法」に変えて用いられる。用語「流加発酵／流加回分法又は流加回分プロセス」は、プロセス技術において定着している。これらの用語は、「堆積」として、すなわち順々に実施され、そして最大充填水準までの試薬（出発物質）の流入（飼料）によって操作される方法を指す。
【００５４】
本発明の範囲内で、流加回分発酵／流加回分法又は流加回分プロセスは、好ましくは三つの部分：初期増殖期、増殖期、絶滅期に細分される。流加発酵の持続期間は、期限付きである。好ましくは、流加回分発酵／流加回分法又は流加回分プロセス全体の持続期間は、８〜１５日間であり、特に好ましくは、１１日間である。
【００５５】
流加回分発酵／流加回分法又は流加回分プロセスは、他の培養方法、例えばかん流培養又はかん流法における発酵又は連続培養と異なる。かん流培養では、細胞培養を含むインキュベーション反応器は、培養液の流れによって絶えずすすがれる。これは栄養、成長因子、抗生物質等の一定の濃度比、代謝最終生成物の除去ならびに、自然で生理学的かつ代謝の、周囲条件のシミュレーション（血液循環、拡散及び組織液の循環）を保障する。
【００５６】
細胞の「特異的な生産性」又は「特異的な生成物の形成速度」は、時間当たりで細胞により産生した、すなわち分泌したタンパク質の場合は、培地中に放出された、特定のタンパク質の量を示す。特異的な生産性は、培地中の生成物の濃度（＝力価、例えばＥＬＩＳＡによって決定される）及び考慮中の時間幅にわたって存在する生産細胞数、別名「ＩＶＣ」（時間にわたる生存細胞数の積分）の商から計算される。特異的な生産性は、通常、「ｐｃｄ」（＝pg／細胞×日＝細胞あたり、１日当たり分泌されたタンパク質のピコグラム）で与えられる。
【００５７】
用語「血清を含まない」は、細胞が、動物及び／又はヒト血清の非存在下、好ましくは血清から単離された任意のタンパク質の非存在下、好ましくは組み換え技術によらず生産されたタンパク質の非存在下で増殖したことを特徴とする、培養培地及びまた培養条件を意味する。その結果として、用語「血清を含まない条件で適合させた細胞」は、動物もしくはヒト血清又は血清タンパク質の非存在下で増加させることができる細胞を意味する。
【００５８】
用語「タンパク質を含まない」は、培養培地がいかなる動物タンパク質をも含まないことを意味し；バクテリア、酵母又は菌から単離したタンパク質は、動物タンパク質とみなさない。
【００５９】
用語「化学的に定義される」とは、血清を含まない、好ましくはタンパク質をも含まず、そして化学的に定義される物質からなる細胞培養培地を説明する。よって、化学的に定義された培地は、ほぼ純粋な個々の物質の混合物からなる。化学的に定義された培地の一つの例は、Messrs Invitrogen（Carlsbad、CA、US）製のＣＤ−ＣＨＯ培地である。
【００６０】
表現「懸濁液中で培養しうる細胞」は、液体培養（「懸濁液培養」）中での増殖に適合し、そして容器、例えば細胞培養のシャーレもしくはフラスコの表面への接着力が制限されるか又は失われた細胞を指す。血清無しの増殖及び懸濁液中での増殖の両者に適合した細胞は、「血清を含まない培地に適合した非接着性細胞」と呼ばれる。
【００６１】
用語「対象の遺伝子」又は「対象の組み換え遺伝子」は、対象の生成物についてコードする任意の所望の長さのヌクレオチド配列を包含する。遺伝子産物又は「対象の生成物」は一般にタンパク質、ポリペプチド、ペプチド又はその断片もしくは誘導体である。しかし、これはＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡでもよい。対象の遺伝子は、完全長であるか、短縮したものであるか、融合遺伝子であるか又は標識化した遺伝子であることができる。これは、ゲノムＤＮＡ又は好ましくはｃＤＮＡ又は対応する断片もしくは融合でもよい。対象の遺伝子は、自然の遺伝子配列でもよく、又は変異しているかもしくは修飾されていてもよい。そのような修飾は、特定の宿主細胞及びヒト型化に適合するためのコドン最適化を含む。例えば対象の遺伝子は、分泌され、細胞質内の、核に位置する、膜結合又は細胞表面に結合したポリペプチドについてコードすることができる。
【００６２】
用語「対象の生成物」は、生物薬剤学的に重要な物質、例えば、タンパク質／ポリペプチドだけでなく、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子（例えばｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）及び他の生成物、例えばウイルス、ウイルス粒子等も指す。
【００６３】
用語「対象のタンパク質」は、例えば抗体、酵素、サイトカイン、リンフォカイン、粘着分子、受容体及びその誘導体もしくは断片を含む、生物薬剤学的に重要なタンパク質／ポリペプチドに関する。しかし、対象のタンパク質／生成物は、これらの例に制限されない。一般に、アゴニストもしくはアンタゴニストとして作用し、及び／又は治療上もしくは診断上の用途を有する全てのポリペプチドは、重要であるか又は対象である。他の対象のタンパク質は、例えば、いわゆる「細胞工学」の範囲内で宿主細胞の特性を変えるために用いられるタンパク質／ポリペプチド、例えば抗アポトーシスのタンパク質、シャペロン、代謝酵素、グリコシル化酵素、及びその誘導体もしくは断片であるが、それらに制限されない。
【００６４】
用語「ポリペプチド」は、アミノ酸配列又はタンパク質について用いられ、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。この用語はまた、反応、例えばグリコシル化、リン酸エステル化、アセチル化又はタンパク質処理によって、翻訳後修飾されたタンパク質を含む。ポリペプチドの構造は、例えば、アミノ酸の置換、削除又は挿入及び他のタンパク質との融合によって、その生物活性を保持すると共に修飾されうる。加えて、ポリペプチドは多量体化して、ホモ及びヘテロマーを形成することができる。
【００６５】
組み換えタンパク質によって意味されるのは、宿主細胞の組み換え発現によって生じるタンパク質である。そのような組み換えタンパク質は、汚染の危険度を最小にするために、最も厳しい純度条件の下で産生される。組み換えタンパク質は、通常、適切な宿主細胞、例えば、酵母細胞、動物性細胞又は原核細胞（大腸菌又は他の菌株）に、発現ベクター、例えばプラスミド、バクテリオファージ、裸のＤＮＡ又はウイルスを使用して生じ、宿主細胞に組み換えタンパク質を導入する。
【００６６】
組み換えタンパク質は、組み換え遺伝子によってコードされて、組み換え細胞によって発現する。組み換えタンパク質は、通常、濃縮タンパク質溶液としての純化された形で、又は粉末形態で市販されている。組み換えＨＳＡは、例えば、さまざまな商業用供給元（例えばSigma Aldrich）から入手できる。治療上のタンパク質の例は、インスリン、インスリン様成長因子、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）及び他の成長因子、受容体、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、サイトカイン、例えばインターロイキン（ＩＬ）（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８）、インターフェロン（ＩＦＮ）−α、β、γ、ω又はτ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、例えばＴＮＦ−α、β又はγ、ＴＲＡＩＬ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１及びＶＥＧＦである。他の例は、モノクローナル、ポリクローナル、多特異的及び単鎖状の抗体及びその断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ及びＦｃ’断片、軽（Ｌ）及び重（Ｈ）のイムノグロブリン鎖及びその一定、可変又は高頻度可変領域ならびにＦｖ及びＦｄ断片である。抗体は、ヒト又はヒト以外の起源でもよい。ヒト化及びキメラ抗体もまた、可能である。
【００６７】
Ｆａｂ断片（抗原結合断片＝Ｆａｂ）は、隣接する定常領域によって一緒に保たれる両方の鎖の可変領域からなる。それらは、パパインのようなプロテアーゼで処理することによって、又はＤＮＡクローニングによって、従来の抗体から産生されうる。他の抗体断片は、ペプシンを用いたタンパク消化によって産生することができるＦ（ａｂ’）２断片である。
【００６８】
遺伝子クローニングによって、重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変部だけからなる、短縮した抗体断片を調製することもできる。これらは、Ｆｖ断片（可変断片＝可変部の断片）として公知である。恒常的な鎖のシステイン基を介する共有結合はこれらのＦｖ断片において可能でないため、それらは多くの場合、幾つかの他の方法によって安定化される。このため、重鎖及び軽鎖の可変領域は多くの場合、約１０〜３０のアミノ酸、好ましくは１５のアミノ酸の短いペプチド断片によって結合される。これは、ＶＨ及びＶＬがペプチドリンカーによって結合した単一のポリペプチド鎖を生じる。そのような抗体断片は、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）とも呼ばれる。ｓｃＦｖ抗体の例は公知であり、記載されている。
【００６９】
過去数年のうち、様々な計画が多量体ｓｃＦｖ誘導体の生産のために開発された。目的は、改良された薬物動態学的特性及び増加した結合活性を有する組み換え抗体を生産することである。ｓｃＦｖ断片の多量体化を達成するために、それらは、多量体化領域を有する融合タンパク質として生産される。多量体化領域は、例えば、ＩｇＧ又はヘリックス構造（「らせん状のコイル構造」）のＣＨ３領域、例えばロイシンジッパー領域であることができる。他の計画において、ｓｃＦｖ断片のＶＨとＶＬ領域の間の相互作用が、多量体化（例えば二重、三重及び五重特異性抗体）のために用いられる。
【００７０】
用語「二重特異性抗体」は、当該技術において二価ホモダイマーのｓｃＦｖ誘導体を示すために用いられる。５〜１０のアミノ酸にｓｃＦｖ分子のペプチドリンカーを短縮することは、ＶＨ／ＶＬ鎖の重ね合わせによって、ホモダイマーの形成をもたらす。二量体は、挿入されたジスルフィド架橋によって更に安定化されうる。二重特異性抗体の例を、文献で見つけることができる。
【００７１】
用語「ミニ抗体」は、当該技術において二価ホモダイマーのｓｃＦｖ誘導体を示すために用いられる。これは、イムノグロブリン、好ましくはＩｇＧ、最も好ましくはＩｇＧ１のＣＨ３領域を二量体化領域として含む、融合タンパク質からなる。これは、ヒンジ領域、またＩｇＧによって、ｓｃＦｖ断片とリンカー領域を接続する。
【００７２】
用語「三重特異性抗体」は、当該技術において三価ホモトリマーのｓｃＦｖ誘導体を示すために用いられる。リンカーシークエンスを用いないＶＨ−ＶＬの直接の融合は、トリマーの形成を導く。
【００７３】
二、三又は四価の構造を有するミニ抗体として当該技術において公知の断片もまた、ｓｃＦｖ断片の誘導体である。多量体化は、二、三又は四量体の「らせん状のコイル」構造によって達成される。
【００７４】
用語「抗体融合」又は「抗体融合タンパク質」は、抗体又は抗体部分へのタンパク質の融合／カップリングを示す。特に、これらは遺伝子工学によって産生される融合タンパク質を含み、ここでは、これにより血清中のタンパク質の半減期／安定性を増加させるために、治療上のタンパク質は抗体のＦｃ部分に連結する。該用語はまた、ペプチド及び抗体又は抗体の部分からなる抗体融合を包含する。
【００７５】
本発明の目的ために好ましい宿主細胞は、ハムスター細胞、例えばＢＨＫ２１、ＢＨＫ ＴＫ−、ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ Ｂ１及びＣＨＯ−ＤＧ４４細胞又はこれらの細胞株の誘導体／派生物である。特に好ましいものは、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯ−Ｋ１及びＢＨＫ２１細胞、特にＣＨＯ−ＤＧ４４及びＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞である。また適切なものは、マウス骨髄腫細胞、好ましくはＮＳ０及びＳｐ２／０細胞ならびにこれらの細胞系の誘導体／派生物である。
【００７６】
本発明に用いることができるハムスター及びマウス細胞の例は、以下の表１に与えられる。しかしながら、これらの細胞；ヒト、マウス、ラット、サル、げっ歯類の細胞系を含むがこれらに限定されない他の哺乳類細胞；又は酵母、昆虫、トリ及び植物細胞を含むがこれらに限定されない真核生物細胞の誘導体及び派生物が、バイオ（生物）医薬品タンパク質の生産のための宿主細胞として使用されうる。
【００７７】
【表１】
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【００７８】
本発明によれば、組み換え哺乳類細胞、好ましくはげっ歯類の細胞、最も好ましくはＮＳ０のようなマウス細胞及びＣＨＯ又はＢＨＫ細胞のようなハムスター細胞が、特に好まれる。
【００７９】
宿主細胞が血清を含まない条件下で定着され、適合され、完全に培養される場合が好ましい。特に好ましくは、宿主細胞は更に、血清を含まないだけでなくいかなる動物タンパク質／ペプチドも含まない培地中で、定着され、適合され、完全に培養される。
【００８０】
適切な栄養液の例は、市販の培地、例えばHam's F12（Sigma, Deisenhofen, Germany）、RPMI-1640（Sigma）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Sigma）、最小必須培地（ＭＥＭ；Sigma）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Sigma）、ＣＤ−ＣＨＯ（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）、ＣＨＯ−Ｓ（Invitrogen）、血清を含まないＣＨＯ−培地（Sigma）及びタンパク質を含まないＣＨＯ−培地（Sigma）を含む。
【００８１】
用語「産生細胞」又は「プロデューサー細胞」又は「産生クローン」は、タンパク質を調製するプロセスに用いられる細胞を示す。特にこれは、組み換えタンパク質の工業生産に用いられる遺伝子組み換え的に修飾された細胞を含む。本発明の範囲内で、該用語は特に、組み換えタンパク質を発現し、このタンパク質を調製するために用いられる遺伝子組み換え的に修飾された真核生物宿主細胞を含む。これは特に、治療上のタンパク質の生産のための単一クローン系細胞株を含む。
【００８２】
本発明による実施態様
本発明は、バイオ（生物）医薬品の製造方法を最適化する方法であって、以下の工程：
ａ）対象の組み換え遺伝子を含み、対象の対応する生成物を産生する、真核生物宿主細胞を調製すること、
ｂ）１２mmol/L以下のＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンを含み、以下の緩衝液成分：
（ｉ）Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（Ｃ６Ｈ１５ＮＯ６Ｓ、ＴＥＳ）及び／又は
（ii）β−グリセロリン酸ナトリウム五水和物（Ｃ３Ｈ７Ｎａ２Ｏ６Ｐ×５ Ｈ２Ｏ、Ｓｏｄ−β）
を含む、細胞培養培地中で、工程ａ）からの細胞を培養すること、
ｃ）ｐＨを、非ＣＯ２発生性の酸及び／又はアルカリを用いて制御すること、
を含み、バイオプロセスの間、ｐＣＯ２が、ＣＯ２、Ｏ２、Ｎ２及び／又は空気の供給で、又は撹拌機の速度を使用して制御される、方法を説明する。
【００８３】
本発明は、ｐＣＯ２を制御する方法であって、以下の工程：
ａ）対象の組み換え遺伝子を含み、対象の対応する生成物を産生する、真核生物宿主細胞を調製すること、
ｂ）１２mmol/L以下のＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンを含み、以下の緩衝液成分：
（ｉ）Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（Ｃ６Ｈ１５ＮＯ６Ｓ、ＴＥＳ）及び／又は
（ii）β−グリセロリン酸ナトリウム五水和物（Ｃ３Ｈ７Ｎａ２Ｏ６Ｐ×５ Ｈ２Ｏ、Ｓｏｄ−β）
を含む、細胞培養培地中で、工程ａ）からの細胞を培養すること、
ｃ）ｐＨを、非ＣＯ２発生性の酸及び／又はアルカリを用いて制御すること、
を含み、バイオプロセスの間、ｐＣＯ２が、ＣＯ２、Ｏ２、Ｎ２及び／又は空気の供給で、又は撹拌機の速度を使用して制御される、方法を説明する。
【００８４】
本発明は更に、真核生物細胞を用いたバイオプロセスの再現性を改善する方法であって、少なくとも以下のパラメーター：ｐＣＯ２プロファイル、Ｏ２プロファイル、ｐＨプロファイル、温度プロファイル、速度を監視し、そして
ａ）細胞の培養を、１２mmol/L以下のＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンを含む細胞培養培地中で行い、そして
ｂ）前記細胞培養培地が、以下の緩衝液成分：
（ｉ）Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（Ｃ６Ｈ１５ＮＯ６Ｓ、ＴＥＳ）及び／又は
（ii）β−グリセロリン酸ナトリウム五水和物（Ｃ３Ｈ７Ｎａ２Ｏ６Ｐ×５Ｈ２Ｏ、Ｓｏｄ−β）
を含み、そして
ｃ）ｐＨの制御を、非ＣＯ２発生性の酸性及び／又はアルカリ性溶液を用いて実施し、そして
ｄ）バイオプロセスの間、ｐＣＯ２が、ＣＯ２、Ｏ２、Ｎ２及び／又は空気の供給で、又は撹拌機の速度によって制御されることを特徴とする、方法を説明する。
【００８５】
本発明は更に、ｐＨを制御する方法であって、以下の工程：
ａ）対象の組み換え遺伝子を含み、対象の対応する生成物を産生する、真核生物宿主細胞を調製すること、
ｂ）１２mmol/L以下のＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンを含み、以下の緩衝液成分：
（ｉ）Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（Ｃ６Ｈ１５ＮＯ６Ｓ、ＴＥＳ）及び／又は
（ii）β−グリセロリン酸ナトリウム五水和物（Ｃ３Ｈ７Ｎａ２Ｏ６Ｐ×５ Ｈ２Ｏ、Ｓｏｄ−β）
を含む、細胞培養培地中で、工程ａ）からの細胞を培養すること、
ｃ）ｐＨを、非ＣＯ２発生性の酸性及び／又はアルカリ性溶液を用いて制御すること、
を含み、バイオプロセスの間、ｐＣＯ２が、ＣＯ２、Ｏ２、Ｎ２及び／又は空気の供給で、又は撹拌機の速度によって制御される、方法を説明する。
【００８６】
本発明は更に、力価／特定の生産性を増加させる方法であって、以下の工程：
ａ）対象の組み換え遺伝子を含み、対象の対応する生成物を生じる、真核生物宿主細胞を調製すること、
ｂ）１２mmol/L以下のＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンを含み、以下の緩衝液成分：
（ｉ）Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（Ｃ６Ｈ１５ＮＯ６Ｓ、ＴＥＳ）及び／又は
（ii）β−グリセロリン酸ナトリウム五水和物（Ｃ３Ｈ７Ｎａ２Ｏ６Ｐ×５ Ｈ２Ｏ、Ｓｏｄ−β）
を含む、細胞培養培地中で、工程ａ）からの細胞を培養すること、
ｃ）ｐＨを、非ＣＯ２発生性の酸性及び／又はアルカリ性溶液を用いて制御すること、
を含み、バイオプロセスの間、ｐＣＯ２が、ＣＯ２、Ｏ２、Ｎ２及び／又は空気の供給で、又は撹拌機の速度によって制御される、方法を説明する。
【００８７】
本発明は更に、生成物の品質を改善する方法であって、以下の工程：
ａ）対象の組み換え遺伝子を含み、対象の対応する生成物を産生する、真核生物宿主細胞を調製すること、
ｂ）１２mmol/L以下のＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンを含み、以下の緩衝液成分：
（ｉ）Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（Ｃ６Ｈ１５ＮＯ６Ｓ、ＴＥＳ）及び／又は
（ii）β−グリセロリン酸ナトリウム五水和物（Ｃ３Ｈ７Ｎａ２Ｏ６Ｐ×５ Ｈ２Ｏ、Ｓｏｄ−β）
を含む、細胞培養培地中で、工程ａ）からの細胞を培養すること、
ｃ）ｐＨを、非ＣＯ２発生性の酸性及び／又はアルカリ性溶液を用いて制御すること、
を含み、バイオプロセスの間、ｐＣＯ２が、ＣＯ２、Ｏ２、Ｎ２及び／又は空気の供給で、又は撹拌機の速度によって制御される、方法に関する。
【００８８】
本発明は更に、方法の頑健性を改善する方法であって、以下の工程：
ａ）対象の組み換え遺伝子を含み、対象の対応する生成物を産生する、真核生物宿主細胞を調製すること、
ｂ）１２mmol/L以下のＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンを含み、以下の緩衝液成分：
（ｉ）Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（Ｃ６Ｈ１５ＮＯ６Ｓ、ＴＥＳ）及び／又は
（ii）β−グリセロリン酸ナトリウム五水和物（Ｃ３Ｈ７Ｎａ２Ｏ６Ｐ×５ Ｈ２Ｏ、Ｓｏｄ−β）
を含む、細胞培養培地中で、工程ａ）からの細胞を培養すること、
ｃ）ｐＨを、非ＣＯ２発生性の酸性及び／又はアルカリ性溶液を用いて制御すること、
を含み、バイオプロセスの間、ｐＣＯ２が、ＣＯ２、Ｏ２、Ｎ２及び／又は空気の供給で、又は撹拌機の速度によって制御される、方法に関する。
【００８９】
本発明は更に、対象の組み換え生成物を調製する方法であって、以下の工程：
ａ）対象の組み換え遺伝子を含み、対象の対応する生成物を産生する、真核生物宿主細胞を調製すること、
ｂ）１２mmol/L以下のＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンを含み、以下の緩衝液成分：
（ｉ）Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（Ｃ６Ｈ１５ＮＯ６Ｓ、ＴＥＳ）及び／又は
（ii）β−グリセロリン酸ナトリウム五水和物（Ｃ３Ｈ７Ｎａ２Ｏ６Ｐ×５ Ｈ２Ｏ、Ｓｏｄ−β）
を含む、細胞培養培地中で、工程ａ）からの細胞を培養すること、
ｃ）ｐＨを、非ＣＯ２発生性の酸性及び／又はアルカリ性溶液を用いて制御すること、
を含み、バイオプロセスの間、ｐＣＯ２が、ＣＯ２、Ｏ２、Ｎ２及び／又は空気の供給で、又は撹拌機の速度によって制御される、方法を説明する。
【００９０】
本発明による製造方法の好ましい実施態様では、対象の生成物はタンパク質であり、好ましくは、抗体もしくは抗体断片又はＦｃ融合タンパク質である。
【００９１】
先に記載したとおりの本発明による一つの方法の好ましい実施態様では、ｐＣＯ２は、ＣＯ２及び／又はＮ２ガスの導入によって制御される。好ましくは、ｐＣＯ２は、ＣＯ２及び／又はＮ２ガスの導入によってもっぱら制御される。
【００９２】
先に記載したとおりの本発明による一つの方法の好ましい実施態様では、細胞培養培地は、８mmol/LのＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンを含む。
【００９３】
先に記載したとおりの本発明による一つの方法の特に好ましい実施態様では、細胞培養培地は、ＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンを完全に含まない。
【００９４】
先に記載したとおりの本発明による一つの方法の好ましい実施態様では、細胞の培養は、流加回分発酵法（そして例えばかん流法によってではない）によって実施される。好ましくは、細胞の培養は、流加回分法によって実施される。好ましくは、０日目から流加回分発酵／流加回分法の最後まで、培地中にＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンは一切加えられず、及び／又は用いられない。
【００９５】
先に記載したとおりの本発明による一つの方法の具体的な実施態様において、ＴＥＳ濃度は、１mmol/Lと１００mmol/L、１０〜９０、２０〜８０、３０〜５０の間、又は１００mmol/Lもしくは４０mmol/L以下である。１００mmol/Lより高いＴＥＳ濃度は、重量オスモル濃度の増加のために本発明に従っていない。
【００９６】
先に記載したとおりの本発明による一つの方法の具体的な実施態様において、Ｓｏｄ−β濃度は、１mmol/Lと１００mmol/L、５〜５０、１５〜３０の間、又は１００mmol/Lもしくは２５mmol/L以下である。１００mmol/Lより高いＳｏｄ−β濃度は、重量オスモル濃度の増加のために本発明に従っていない。
【００９７】
先に記載したとおりの本発明による一つの方法の具体的な実施態様において、ステップｃ）による酸性及び／又はアルカリ性溶液は、ＮａＯＨ、ＨＣｌ、Ｈ３ＰＯ４、ＣＨ３ＣＯＯＨ又はＨ２ＳＯ４、好ましくはＮａＯＨ又はＨＣｌである。
【００９８】
先に記載したとおりの本発明による一つの方法の具体的な実施態様において、真核生物細胞は、哺乳類細胞、好ましくはげっ歯類の細胞、好ましくはＣＨＯ、ＰＥＲ．Ｃ６又はＮＳ０細胞である。先に記載したとおりの本発明による方法の一つの具体的な実施態様において、真核生物細胞は、ＣＨＯ、ＰＥＲ．Ｃ６又はＮＳ０である。先に記載したとおりの本発明による一つの方法の好ましい実施態様では、ｐＣＯ２は、初期増殖期（０日目〜３日目又は１〜３日目、特に発酵の１日目）において、１０％以下又は８％以下の値に制御され、好ましくは、ｐＣＯ２は、２％から８％の間又は３％から８％の間又は５％から８％の間又は３％から５％の間の値に調節され、一方、５％又は３％のｐＣＯ２値が、特に好ましい。
【００９９】
他の好ましい実施態様において、０日目から１１日目（又は発酵の終了まで）のｐＣＯ２プロファイルは、３％ ｐＣＯ２に設定される。好ましくは、ｐＣＯ２は、０日目から１１日目（又は発酵の終了まで）まで３％に制御される。
【０１００】
他の好ましい実施態様において、該方法は更に、ｐＣＯ２値を更に以下のとおりに制御することを含む：
ｉ）好ましくは５〜１２％又は８〜１２％、特に好ましくは８〜１０％又は５〜１１％又は３〜１１％の増殖期（例えば３〜７日目又は４〜８日目）の平均ｐＣＯ２（１２％以下）、
ii）好ましくは１５〜１８％又は５〜１０％又は１５％の絶滅期（７〜１１日目又は９〜１１日目又は（流加回分）発酵の終了まで／細胞培養の終了まで）の僅かに上昇したか又は高いｐＣＯ２（５％、８％又は１５％以上）。
【０１０１】
本発明は更に、１２mmol/L以下のＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンを含み、以下の緩衝液成分：
（ｉ）Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（Ｃ６Ｈ１５ＮＯ６Ｓ、ＴＥＳ）
及び／又は
（ii）β−グリセロリン酸ナトリウム五水和物（Ｃ３Ｈ７Ｎａ２Ｏ６Ｐ×５Ｈ２Ｏ、Ｓｏｄ−β）を含む、細胞培地に関する。
【０１０２】
本発明は特に、１２mmol/L以下のＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンを含み、以下の緩衝液成分：
（ｉ）Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（Ｃ６Ｈ１５ＮＯ６Ｓ、ＴＥＳ）
及び／又は
（ii）β−グリセロリン酸ナトリウム五水和物（Ｃ３Ｈ７Ｎａ２Ｏ６Ｐ×５Ｈ２Ｏ、Ｓｏｄ−β）を含む、流加回分細胞培養培地を記述する。
【０１０３】
本発明による細胞培養培地の具体的な実施態様において、細胞培養培地は、８mmol/LのＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンを含む。
【０１０４】
本発明による細胞培養培地の具体的な実施態様において、細胞培養培地は、ＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンを完全に含まない。
【０１０５】
具体的な実施態様において、本発明による細胞培養培地は、好ましくは、細胞の流加回分培養のためのものである。
【０１０６】
本発明による細胞培養培地の具体的な実施態様において、培養される細胞は、真核生物細胞、特に哺乳類細胞、特にげっ歯類の細胞、特にハムスターの細胞、特にＣＨＯ細胞である。
【０１０７】
本発明による細胞培養培地の具体的な実施態様において、ＴＥＳ濃度は、１mmol/Lと１００mmol/L、１０〜９０、２０〜８０、３０〜５０の間、又は１００mmol/Lもしくは４０mmol/L以下である。１００mmol/Lより高いＴＥＳ濃度は、重量オスモル濃度の増加のために本発明に従っていない。
【０１０８】
本発明による細胞培養培地の具体的な実施態様において、Ｓｏｄ−β濃度は、１mmol/Lと１００mmol/L、５〜５０、１５〜３０の間、又は１００mmol/Lもしくは２５mmol/L以下である。１００mmol/Lより高いＳｏｄ−β濃度は、重量オスモル濃度の増加のために本発明に従っていない。
【０１０９】
本発明は更に、以下の成分：
（ａ）１２mmol/L以下のＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンを含むか、又は好ましくは完全にＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンを含まず、以下の緩衝液成分：
（ｉ）Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（Ｃ６Ｈ１５ＮＯ６Ｓ、ＴＥＳ）
及び／又は
（ii）β−グリセロリン酸ナトリウム五水和物（Ｃ３Ｈ７Ｎａ２Ｏ６Ｐ×５Ｈ２Ｏ、Ｓｏｄ−β）を含む、細胞培養培地、
（ｂ）流加回分発酵槽、
（ｃ）真核生物細胞、好ましくは哺乳類細胞、げっ歯類の細胞、ハムスターの細胞、特に好ましくはＣＨＯ細胞
を含む、流加回分発酵の設定又は流加回分発酵機器の品目一式もしくはキットを記述する。
【０１１０】
好ましくは、（ｃ）における細胞は、組み換え細胞である。組み換え細胞は、好ましくは発現しており、及び特に好ましくは精製及び単離されている、組み換え（例えば外因性）ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を含む。好ましくは、この組み換え細胞は、対象の遺伝子、特に治療タンパク質、好ましくは抗体、抗体断片又はＦｃ融合タンパク質を発現する。
【０１１１】
本発明による全ての方法は、プロセスと同義的に称される。よって、本発明はまた、例えば以下の工程（ステップ）：
ａ）対象の組み換え遺伝子を含み、対象の対応する生成物を産生する、真核生物宿主細胞を調製すること、
ｂ）１２mmol/L以下のＨＣＯ３−又はＣＯ３２−イオンを含み、以下の緩衝液成分：
（ｉ）Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（Ｃ６Ｈ１５ＮＯ６Ｓ、ＴＥＳ）及び／又は
（ii）β−グリセロリン酸ナトリウム五水和物（Ｃ３Ｈ７Ｎａ２Ｏ６Ｐ×５ Ｈ２Ｏ、Ｓｏｄ−β）
を含む、細胞培養培地中で、工程ａ）からの細胞を培養すること、
ｃ）ｐＨを、非ＣＯ２発生性の酸性及び／又はアルカリ性溶液を用いて制御すること、
を含み、バイオプロセスの間に、ｐＣＯ２が、ＣＯ２、Ｏ２、Ｎ２及び／又は空気の供給で、又は撹拌機の速度を用いて制御される、ｐＣＯ２の制御するためのプロセスに関する。
【０１１２】
先に記載したとおりの本発明によるプロセスの一つの好ましい実施態様では、ｐＣＯ２は、ＣＯ２及び／又はＮ２ガスの導入によってもっぱら制御される。
【実施例】
【０１１３】
実験の部
機器及び方法
発酵
実施した実験は、発酵容積２Ｌ（接種容量１．８Ｌ）を有するバイオリアクター中か、２５０ml振とうフラスコ（接種容量５０ml）中で、又はPresens社製SensorDish Reader（登録商標）（接種容量１．５ml）を用いてのいずれかで行った。
【０１１４】
バイオリアクターを用いた実験は、多数の利点、例えばリアルタイムのデータ収集及びプロセスパラメーターをアーカイブすること、温度、ｐＨ、ガス供給（ガスの異なる比率）及び撹拌機速度のプロセス変量の、確立しかつ妥当な制御を有する。得られたデータは、管理された条件によって再現することができ、より大きいバイオリアクターに移しうる（スケールアップ／スケーリング）。バイオリアクターでの収率は、比較すると、代わりの発酵方法を用いるより一般的に高い。これはとりわけ、栄養分のより良好な供給及び酸素導入の増加を提供する、乱流混合作用を有する一体化撹拌機に起因する。しかしながら、発酵の始めに装置／機器はまとめて滅菌されなければならず、発酵の間は日々の管理が必要とされ、そして発酵の後、機器は分解して慎重に掃除されなければならないため、操作は比較的複雑かつ時間がかかる。よって操作は、非常に労働集約的かつ高コストである。
【０１１５】
良好な結果が予備試験で既に得られ、そしてさらなるバイオリアクターの利点が必要とされている場合、バイオリアクターが発酵のために用いられる。
【０１１６】
バイオリアクターのために、異なる操作モードがある。バッチプロセスが主に一定容積を特徴とするのに対して、これは流加回分法においては可変である。発酵プロセスの間に細胞培養液への添加があるので、可変である。添加は、発酵プロセスを援助するために連続的な供給であるか、又は付加的なボーラスの形態であることができる。
【０１１７】
実験の部に記載されているバイオリアクターを使用する発酵において、流加回分法が用いられた。
【０１１８】
振とうフラスコ中での細胞の培養は、それを比較的単純な手段で実施することができるという利点がある。インキュベーター、ＬＡＦボックス（層流、滅菌の作業域）及び使い捨て可能なフラスコに加えて、他のいかなる技術的な機器も必要とされない。フラスコは、滅菌状態下で、定められた濃度の細胞培養培地及び接種材料で満たされ、そして次にインキュベーターに移される。インキュベーター上の設定（所望の温度、相対湿度、速度及び−ＣＯ２含有量）を調整することによって、細胞培養は、影響を受けることができる。振とうフラスコは滅菌包装で供給されるため、機器の他のいかなる準備も必要とされない。しかしながら、不利な点は明らかである：オンラインデータ収集を行うこと、ｐＨを制御すること、ガスを導入すること又は栄養供給を行うことができない。分析のためのサンプリングならびに飼料及びボーラスの添加は、ＬＡＦボックス下で実施されなければならない。これは汚染又は誤差の出所であり、そして通常の取り扱いに加えて多くの時間を取る。更に、分析の観点から、試料体積は制限を課す：例えば、発酵の開始時に、５０mlが接種され、そしてサンプルごとに、２〜３ミリリットルの量がとられる（一般的に毎日）。これは飼料及びボーラスの添加によって部分的に補償されるにもかかわらず、培養の総容積に関して、そのたびごとに大きな除去（removal）となる。一般的に、安価な振とうフラスコ中での試験は、取扱いの容易さ及び十分な評価可能性のため、バイオリアクター試験のための前駆体として非常に適切である。
【０１１９】
Sensor Dish Reader（＝ＳＤＲ）を使用する実験は、バイオリアクター及び振とうフラスコの利点を部分的に兼ね備える。この方法では、２４ウェルシャーレはウェル当たり１．５mlの細胞懸濁液のみを接種され、そしてシャーレは蓋をされ、インキュベーターに置かれる。センサーの位置は、各々のウェルの下側に適用される。ウェルプレートの下に、このセンサーを読み取る、いわゆるリーダーがある。これは、ｐＨ又はｐＯ２の、オンライン及びリアルタイムでの無侵襲計測（non-invasive）を可能にする。前もっての較正は必要とされない；較正データは、印刷されたロット番号を用いて、初めは制御ソフトウェアに自動的にロードされる。
【０１２０】
しかしながら、ＳＤＲの可能性は、ウェルのｐＨを読み込み、経時的にｐＯ２の低下を解釈することによって細胞発育に関して判定を出すことに限られている。該プロセスは、毒性、個々の物質の効果又は限界濃度の試験に推奨される。ＳＤＲは、複数の測定を必要とする試験においても有用である。サンプリングがなく、かつ実験は３日のみの実行時間を有するため、よっていかなる供給の必要性もないので、この方法は多くの時間を節約し、非常に快適な取扱いを可能にする。
【０１２１】
ｐＨ制御
Sensor Dish Readerを用いる試験及びインキュベーター内の振とうフラスコ中での発酵の間、能動的なｐＨ制御は実施されない。
【０１２２】
バイオリアクターのｐＨ制御は、Ｎａ２ＣＯ３（aq）及びＣＯ２（ガス）の添加によって、ＢＩで定期的に行われる。制御は、SimaticIT（登録商標）を使用して、自動的に行われる（ソフトウェアの節を参照されたい）。ｐＨactual＞ｐＨdesiredの場合、ＣＯ２(ガス)が導入され、ｐＨactual＜ｐＨdesiredの場合、Ｎａ２ＣＯ３（aq）が、所望の値、＋／−所定のデッドバンドが再び到達するまで、制御されたポンプを通して計量される。
【０１２３】
現在の例において、幾つかの発酵において、述べられた理由のため、Ｎａ２ＣＯ３（aq）は、等価な効果を有する水酸化ナトリウム溶液で置き換えられる。
【０１２４】
培地
基本的な細胞培養培地として、ＢＩ独自（proprietary）の培地が全ての発酵の標準培地として使用される。培地Ａ及びＢは、予め選択されたｐＨのみが異なる。両方の培地は、「ジャストインタイムの」基礎で、社内で生産される血清を含まない生産培地である。
【０１２５】
使用する流加培地はまた、社内で生産されるＢＩ独自の流加培地でもある。流加培地は、一般的に、高純度水（ＷＦＩ＝注射用水）、ブドウ糖、アミノ酸、成長因子及び例えば特定の細胞株に理想的である酵母からの生物学的エキスを含む。マルチ発酵において、流加培地はポンプによって連続的に供給され、その一方で振とうフラスコ中の発酵においては、ＬＡＦボックス下で、それが手動でピペットで取られる。
【０１２６】
バイオリアクター中の実験のために、いわゆるマルチ発酵槽（multifermenter）が使用される。それは各々２リットルの発酵容積を有する六つの同一の個々の発酵槽からなり、これは物理的に結合されて携帯ユニットを形成する。機器は、SimaticIT（登録商標）ソフトウェアを用いてＰＣで作動する。発酵槽の基本構成は、温度調節のための二重ジャケットならびにプローブ及び他の周辺機器、例えば上昇管がねじ止めされるカバープレートを備えた２Ｌのガラス容器によって形成される。
【０１２７】
バイオリアクター中の発酵において、バイオリアクターのカバープレートにねじ止めされる以下のプローブ：温度プローブ、ｐＯ２プローブ、ｐＨプローブ、ＣＯ２プローブが用いられる。
【０１２８】
実施される全ての発酵において、BI-HEX（登録商標）細胞が用いられる。BI-HEX（登録商標）は、Boehringer Ingelheim High Expression Systemを意味する。BI-HEX（登録商標）細胞は、ＣＨＯ細胞であり、対象の生成物を効果的に産生するように、その遺伝子の構造物が変えられ／最適化される。細胞が必要である場合、接種材料セクターからの対応するＣＨＯ細胞を有するアンプルは解凍され、拡張され、そして保存培養はバイオリアクター又は振とうフラスコ内の接種のための展開を確実にするために適用される。細胞は、細胞培養培地において細胞外で特定の生体分子、好ましくはタンパク質、好ましくは特異的な抗体を分泌する。これは力価の濃度が決定される場合に検出される。
【０１２９】
実施例１
ＳＤＲ実験（ＮａＨＣＯ３濃度の減少）
細胞についてのＮａＨＣＯ３の基本的な機能は、既に説明してきた。本実験は、ＮａＨＣＯ３濃度の減少が細胞増殖に影響をどのように与えるか、又は与えるかどうかを示すことを目的とする。評価は、細胞培養培地中の酸素消費量（細胞増殖による）について結論を出すことによってなされる。実験は、SensorDish Reader上で実施される。
【０１３０】
試験系列は、分離物を検出して、一般的な散乱を評価することが可能であるように、ｎ＝４で実施した。２４ウェルOxiDish OD24プレートを用いる。五つの異なるＮａＨＣＯ３濃度に加えて、特定濃度のＮａＨＣＯ３及びＨＥＰＥＳを有する試験系列が実験される。この組合せは文献に記載されているが、その例において３％のｐＣＯ２を用いて実験されるのみである。他の実験との比較を達成するように、本実験（６）は、５％のｐＣＯ２を用いて実験される。詳細について、表１の実験計画を参照されたい。
【０１３１】
変化をできるだけ低く保つために、同じ濃度の試験系列のための細胞懸濁液がプールにおいて生産され、ウェルの中へピペットで移され、そして次に算出された同一の量のＮａＨＣＯ３原液が提供される。
プラットフォーム：SensorDish Reader（ＳＤＲ）  細胞：ＣＨＯ  実行時間：９０ｈ
培地：培地Ａ  ｗ／ｏ  ＮａＨＣＯ３＋一定量／原液の緩衝液物質
給餌：−適用されない−    Ｔ／Ｌ：３６．８℃／７０％
ＣＯ２プロファイル：５％で一定    接種密度：０．６
【０１３２】
【表２】
2013514071.tif 000006
【０１３３】
試験系列番号５において、ＮａＨＣＯ３に加えて、ＨＥＰＥＳが原液によってプールにも加えられる。
【０１３４】
評価のために、図１のダイヤグラムが使われ、各々のウェルのｐＯ２値は時間に対して記録される。ダイヤグラムは、既に試験系列４における分離物を除外しており、４回の反復（試験系列４においては３回）の算術平均に基づく。
→  ８mmol/Lの減少したＮａＨＣＯ３濃度は、対照（細胞増殖）と同様に有利なｐＯ２プロファイルを示す。
【０１３５】
実施例２
振とうフラスコ実験
緩衝液系（細胞を含まない）の選択は、細胞を用いて直ちに操作される。この実験において使用する緩衝液系の選択の基準は、振とうフラスコインキュベーターへのガスの導入の間の、許容される重量オスモル濃度及び良好な緩衝液の特性である。試験設定／実験計画は、濃度Ｄ（＝８mmol/L）に減少したＮａＨＣＯ３−濃度を用いてさえ、良好な増殖速度（酸素消費量から導き出される）が得られるという実施例１の発見と合う。
【０１３６】
目的は、細胞の増殖能に関して、バイオリアクター中の続いての発酵の基礎として最良の緩衝液培地を決定することである。
【０１３７】
調製はできるだけ正確に、分析的に実施される。ｐＨ値は、ＢＧＡ比較によって調整される。より低い緩衝液濃度が、原液によって加えられる。製造の後、除菌ろ過が行われる。安全対策として、実験はｎ＝２で行われる。二つの異なるガス供給の変形を達成するために、実験は二つの異なるインキュベーターの間で分割される。概要は、実験計画に見いだすことができる。
プラットフォーム：インキュベーター内の振とうフラスコ
細胞：ＣＨＯ    実行時間：１１ｄ
培地：培地Ａ  ｗ／ｏ  ＮａＨＣＯ３  ｗ／ｏ  ＭＯＰＳ＋一定量／原液の緩衝液物質
給餌：１．５ml／日    Ｔ／Ｌ：３７℃／７０％
ＣＯ２プロファイル：実験計画を参照されたい
接種密度：１．１
【０１３８】
【表３】
2013514071.tif 000007
【０１３９】
【表４】
2013514071.tif 000008
【０１４０】
ｄ０（０日目）の分析は、ＬＡＦボックス下で、播種の直後に、すなわちインキュベーターのＣＯ２雰囲気のいかなる予備効果なしで、行われた。
【０１４１】
図２Ａは、濃度Ｉを有するTrizma塩基（ＳＦ１９及びＳＦ２０）を別にして全ての緩衝液培地混合物が、いくらかの細胞増殖を示すことを示している。最良の増殖は二つの対照（ＳＦ２１及びＳＦ２２）に見られているが、緩衝液培地混合物との違いは、少なくともｄ８まで、比較的小さい。４５の範囲内の細胞密度を有する三つの最良の緩衝液は、Ｓｏｄ−β／Ｈ；ＴＥＳ／Ｋ＋ＮａＨＣＯ３／Ｄ及びＭＯＰＳ／Ｆ＋ＮａＨＣＯ３／Ｄである。Trizma塩基は、任意の濃度において十分に動作せず、ｐＨは確実に安定であるが、いくらかの毒性を有しうる。
【０１４２】
図２Ｂにおいて、図２Ａと同じ基準が使われた。達成される細胞密度が、このＣＯ２プロファイルよりかなり低いことは明らかである。明らかに、対照はここでも最も良く実行するが、最大細胞密度２０は容認できない。１８の領域の細胞密度を有する最良の２つの緩衝液混合物は、この場合、Ｓｏｄ−β／Ｈ＋ＮａＨＣＯ３／Ｄ及びＭＯＰＳ／Ｆである。このためさらなる評価は、付随するＣＯ２プロファイルを有するインキュベーター１から、主に振とうフラスコに制限される。
一般的に、低い緩衝液濃度のＮａＨＣＯ３／Ｄとの組合せが有利である。
【０１４３】
ｐＣＯ２測定が行われる場合、定められたｐＣＯ２プロファイルが維持されることが見られる。サンプリングのタイミングがより遅くなればなるほど、測定されるｐＣＯ２がより低くなることは明らかである。これは、インキュベーターを繰り返し開く結果である。
【０１４４】
対照は、端の方のインキュベーター１においてｐＣＯ２の他の上昇を示し、これは恐らく細胞内での生産に起因する。
【０１４５】
発酵期にわたるｐＨの経過もまた測定される。ｐＨ値は、許容できるレベルである。対照（ＳＦ２１及びＳＦ２２）は、まだ２日目（ｄ２）の７．００＋／−０．０５の実際の出発値を越える。これはＢＧＡと比較してのｐＨ計からの偏りに起因しうる；対照は、培地（ｐＨがＢＧＡなしで選択される）の製造からいかなる干渉もなく、直接得られた。対照において、ｐＨ値は、細胞培養の酸性化に基づいて最後に最も鋭く下がる。
【０１４６】
図２Ｃは、達成される力価濃度（標準化した）を示す。幾つかの例外を除いて、力価の増加はｄ８とｄ１１の間に検出されうる。振とうフラスコＳＦ４９からＳＦ５２（減少したＮａＨＣＯ３濃度を有する培地）における増加は１０倍以上でさえありうる！
【０１４７】
他の注目に値する事実は、培地中の新規な緩衝液物質により初めて、従来の対照（ＳＦ２１及びＳＦ２２）が優る性能が示されたことであり：ＴＥＳ／Ｋ＋ＮａＨＣＯ３／Ｄを有するＳＦ５２はｄ１１で、標準化された生成物濃度８３．６の、非常に良好な結果を与える。
【０１４８】
結果：
→  ＮａＨＣＯ３を含まない細胞培養培地（表の左手側半分）又は減少したＮａＨＣＯ３（＝８mmol/L）の細胞培養培地（表の右手側半分）における最良の緩衝液物質の同定。
→  最良の緩衝液物質は：ＴＥＳ及びＳｏｄ−βであった。
【０１４９】
実施例３  バイオリアクターでの発酵
ｐＣＯ２制御の試験装置：
方法を制御するための異なる組合せで利用可能な、異なる型のレギュレーターがある。それらは以下のレギュレーターを含みうる：
１．Ｐ−レギュレーター：プロポーショナルレギュレーター。これらは、制御の精度についての要求が低い応用で用いられる。Ｐ−レギュレーターは、一定の制御偏差を有する。
２．Ｉ−レギュレーター：インテグラルレギュレーター。これらは、制御の速度についての要求が低いが非常に精密な応用で用いられる。
【０１５０】
実際には、ＰＩレギュレーターが最も頻繁かつ本発酵の制御においても用いられる。ＰＩレギュレーターは、Ｐ及びＩレギュレーターの利点を兼ねる：それらはＰコンテントによって速やかに、Ｉコンテントによって正確かついかなる不変の制御偏差無しに制御し；個々のレギュレーターの効果は合計される。
【０１５１】
制御特性は、制御している設定（Ｐ−Ｉ成分）の修飾によって発酵の次の過程において最適化されることが意図される。
【０１５２】
バイオリアクターは、以下の成分を含有する：
【０１５３】
【表５】
2013514071.tif 000009
【０１５４】
修飾バイオリアクターは、特に集積ＣＯ２プローブを含む。実験のハードウェア構成は原則として、変化することができ、異なる要件を満たす。例えば、上昇管は省略することができ、そしてその代わりに他のプローブを取り付けることができ、又は、さらなる／他の溶液をホースポンプで自動的に加えることができる。
【０１５５】
ｐＣＯ２測定は、目標値に変化した後レギュレーターが長期間発振することをまず第一に示す。接種の瞬間から８％の目標値が達成されるまで、レギュレーターは約２日間発振する。目標値が８％から６％まで低下する場合、レギュレーターは更に１４時間発振する；プロセス内の較正の後、約１２時間。
【０１５６】
ｐＣＯ２レギュレーターの最大の負の制御変数（−４５％）であてはまるガス体積フローもまた測定される。この制御変数にもかかわらず、２％ ｐＣＯ２＋０．３％の目標値は達成されない。これから、２％のｐＣＯ２目標値については、その過程で有用であると思われない臨界的下限に達すると結論することができる。導入される窒素が酸素を放出するため、これは酸素の体積フロー増加によって補償されなければならない。蓄積された全体のガス容量フローは、発泡に関して決定的な量に達しうる。制御がより高い水準で安定した後、ＣＯ２ガスの均一な供給が得られることもまた、明白である。
【０１５７】
図３において、ｐＣＯ２のオンラインデータ（分刻みでアーカイブしたｐＣＯ２プローブ測定に対応する）は、ＢＧＡでのサンプリングの後、外部的に測定される値と比較される。恒常的な違いを示すため、最初の較正はあまり成功していない。しかしながら、２回目の較正の後、続いての測定は合致する。これから、プロセス内の較正は、発振している制御特性が軽減したときのみ意味をなすと結論することができる。発酵の第二の四半期において、外部の計測値はより高い。このための仮説は、この時点で細胞代謝が非常に活発であり、多くのＣＯ２が形成されるということである。ガスをもはや供給されていないシリンジ内のサンプルにおいて、ＣＯ２はそれが測定されるまで蓄積することができる。
【０１５８】
よって図３は、ｐＣＯ２（自動でデータをアーカイブすることを伴うプローブ）の内部測定の、及び血液ガス分析装置上の外部測定の経過を視覚的に示す。０日目（ｄ０）の矢印で印をつけた第一の較正（ＣＯ２プローブとＢＧＡ間の比較）は、制御特性がまだあまりに不安定であるため、ほとんど効果を示さない。４日目（ｄ４）の２回目の較正（第二の矢印）から、良好な一致を内部及び外部測定の間で見ることができる。
【０１５９】
前もって実施される機能試験は、ｐＣＯ２制御の発振が緩衝液系に依存していることを示している。ＰＢＳ緩衝液のｐＣＯ２制御（試験として実施される）において、制御している系は僅か３時間後には安定である。
【０１６０】
マルチ発酵槽を使用する発酵は再び、ＳＤＲを使用する最適化試験に先行する。この予備試験において、実施例１に従って、異なるＮａＨＣＯ３濃度が培地Ｓｏｄ−β／Ｈ及びＴＥＳ／Ｋに関連して試験される。実験において、ｐＯ２の低下による評価に加えて、同様に覆われたウェルプレートがｐＨセンサーを備えて用いられる。結果は現在の実施例についての決定をするのに役立ち、最も有望な組合せ（ＴＥＳ／Ｋ＋ＮａＨＣＯ３／Ｄ及びＳｏｄ−β／Ｈ＋ＮａＨＣＯ３／Ｅ）が実験計画に含まれる（予備試験からのデータはここでは示されない。）。
【０１６１】
発酵は、異なる培地の組合せを有する二つのマルチ発酵槽（１２個の個別の発酵槽に対応する）において起こる。
【０１６２】
手順及び取扱いは、機器、方法及び操作工程の見出しで説明している節に基づく。試験の構成及び実験計画は、表５に要約される。
プラットフォーム：バイオリアクター／マルチ発酵槽    細胞：ＣＨＯ    実行時間：１１ｄ（１１日間）
培地：培地Ｂ  ｗ／ｏ  ＮａＨＣＯ３＋一定量／原液の緩衝液物質
給餌：ｄｘからの連続流加    Ｔ：３７．０℃    接種密度：１．７
ＣＯ２プロファイル：ｄ０〜ｄ３：８％  −  ｄ３〜ｄ６：６％  −  ｄ６〜ｄ８：２％  −  ｄ８〜ｄ１１：４％
【０１６３】
上に示したＣＯ２プロファイルは、残った発酵槽中で制御されたバイオリアクターＦＳ ３３．１に適用され、播種（ｄ０）の後、特定の制御強度の特定の時間の長さについて、ＣＯ２（ガス）は最小量の溶解したＣＯ２を有する細胞を提供するために加えられる。さらなるｐＣＯ２測定はｄ１に行われ、その経過で、培養物が平均して約２〜３％のＣＯ２を含んだことが判明した。細胞密度を決定する場面において、さらなる手動干渉は二酸化炭素ガスを供給するために必要ではないことが一緒に決定された。
【０１６４】
制御特性はもう一度観察された。後の段階でなされる客観的な評価を可能にするために、設定は変えないか又は手動介入を行った。制御特性の分析は、別々のレギュレーター調整（今後は、別々の正及び負の調整範囲は変動する）の基礎として役立つことを目的とする。
【０１６５】
【表６】
2013514071.tif 000010
【０１６６】
発酵システム（ＦＳ）３２．１、３２．６及び３３．６は、残念なことに、汚染のため発酵期にわたって失敗した。結果の考慮において、得られたデータは含めなかったか、又は有限の範囲のみ含めた。
【０１６７】
ｐＣＯ２制御とｐＣＯ２非制御との比較
ＦＳ ３２．１及びＦＳ ３２．６の両方（制御されたバイオリアクターＦＳ ３３．１のように、細胞培養培地ＴＥＳ／Ｋを用いて操作される）が汚染を理由に除外されたため、相違はＦＳ ３２．２とＦＳ ３２．３（両方ともＴＥＳ／Ｋ＋ＮａＨＣＯ３／Ｄ）を比べることによってのみ推定した。通常の生存細胞数濃度（Ａ）又は力価濃度（Ｂ）の図４Ａ及びＢは、制御された発酵実験の細胞特定の生成物形成速度（三角形の符号を有する曲線）が、相当する非制御の発酵実験（菱形の曲線）のそれより高いことを示している。
【０１６８】
更に、図４からの実験は、ＮａＯＨを用いたｐＨ制御が、Ｎａ２ＣＯ３を用いたそれより良い生成物形成速度を有する傾向があることを示している。
【０１６９】
ｐＣＯ２プロファイルのさらなる最適化の間、特定の生成物形成速度は更に増加する。
【０１７０】
図４Ｂに示すように、ｐＣＯ２を制御した実験（ＦＳ ３３．１）の生存細胞数密度は、最高で２０単位互いに離れる。ｄ１０からは、二つの比較実験はまた僅かな相違だけを示し、さもなければ、良好な適合が達成される。ＦＳ ３３．１のより低いレベルは、より高いｐＣＯ２プロファイルに起因しえて、負に解釈されてはならない。活力（図示せず）は、全ての実験で同じレベルである。
【０１７１】
アルカリ性溶液の消費（図示せず）は、全ての実験において低い。ＦＳ ３２．２（最高の生存細胞数濃度）において、より多くのアルカリ性溶液が、予想通りに発酵の最後の頃（ｄ９〜ｄ１１）に加えられなければならない。これにもかかわらず、発酵の終わりに、この実験は３９３mosmol/kgで最も低い重量オスモル濃度（図示せず）を有する。
【０１７２】
図４Ａは、ＦＳ ３２．３より低い細胞数を有することにもかかわらず、ＦＳ ３３．１がより高い力価濃度を有することを示している。濃度は、二つの同一の発酵実験ＦＳ ３２．２とＦＳ ３２．３の間の分散の上部三分の一にある。これは、ｐＣＯ２制御を用いた発酵実験が、より高い特定の生成物形成速度を有することを意味する。
【０１７３】
緩衝液系の比較
異なる緩衝液系は次に、互いに比較される。
【０１７４】
図５Ａは、制御された発酵実験（ＦＳ ３３．１）のｐＣＯ２プロファイルが、比較の発酵（ＦＳ ３２．２及びＦＳ ３２．３）と著しく異なることを示している。汚染により同一の比較相手がいないため、それらが少量のＮａＨＣＯ３を含む場合であっても、ＦＳ ３２．２及びＦＳ ３２．３が比較のために用いられる。制御によって得られたｐＣＯ２プロファイルは、発酵の最初の三分の一において比較実験から明らかに区別されて、主に所定の値に続く（図５Ｂを参照されたい、ｄ１〜ｄ３ ｐＣＯ２＝８％、ｄ３〜ｄ６ ｐＣＯ２＝６％、ｄ６〜ｄ８ ｐＣＯ２＝２％、そしてｄ８〜ｄ１１ ｐＣＯ２＝４％）。通常より低いｐＣＯ２値が課されるとき（６〜８日目、ｄ６〜ｄ８）、窒素ガスがＣＯ２を排出するように送り込まれる。低い目標値には決して達せず、３．２％のｐＣＯ２値は制御のための臨界的な下限を表すことが見いだされる。窒素の需要の増加については、酸素もまたその結果排出され、これは酸素のより高い体積フローによって補償される。臨界的な総気体量を達成することができ、ここで、過度に大量の発泡を観察することができる。
【０１７５】
図５Ｂは、制御された発酵実験がまた、全ての他の比較実験と驚くほど明らかに区別されることを示している。これは、制御によって達成されるｐＣＯ２プロファイルが所定の値（ｄ１〜ｄ３ ｐＣＯ２＝８％、ｄ３〜ｄ６ ｐＣＯ２＝６％、ｄ６〜ｄ８ ｐＣＯ２＝２％、そしてｄ８〜ｄ１１ ｐＣＯ２＝４％）に実際に基づき、偶然に発生しないことを意味する。
【０１７６】
図５Ｃは、ＮａＨＣＯ３のないＴＥＳ又は８mmol/LのＮａＨＣＯ３を有するＴＥＳによって得られる力価濃度が、対照（３６mmol/Lの濃度を有するＮａＨＣＯ３ベースの緩衝液）と同等であることを示している。ランダムに選択された及び最適化されていないｐＣＯ２プロファイルにもかかわらず、ＮａＨＣＯ３のないＴＥＳ（制御）を有する実験は、僅か６．１０％（対照を基に測定した）しか対照と異ならない最終濃度（力価）を達成する。ＴＥＳに加え８mmol/LのＮａＨＣＯ３（非制御）を有する実験は、僅か０．０１％（対照を基に測定した）しか対照と異ならない最終濃度（力価）を達成する。全く驚くべきことに、これはＮａＨＣＯ３がＴＥＳと完全に置き換えられることができることを示している。更に、ＴＥＳプラス８mmol/LのＮａＨＣＯ３（非制御）を有する実験の結果が、対照と同じ最終的な力価濃度を達成することを示している。
【０１７７】
理想的には、発酵実験は以下の条件の下で起こる：完全にＮａＨＣＯ３を含まず、ｐＣＯ２制御を有するＴＥＳ緩衝液。最良の最終力価はこのようにして達成される。
【０１７８】
実施例４  発酵検証  緩衝液系
六つのＣＯ２を制御されたバイオリアクターにおいて、培地中のＮａＨＣＯ３の最適濃度を決定するために、緩衝液系ＴＥＳ及びＳｏｄ−βが、ＮａＨＣＯ３の異なる濃度とともに用いられる。試験の構成は後述する：
プラットフォーム：バイオリアクター／マルチ発酵槽
方法：流加回分法
細胞：ＣＨＯ
接種密度:３×１０５vc/mL
開始体積：１，８Ｌ
実行時間：１１日間
培地：培地Ｂ、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋一定量/原液の緩衝液物質
給餌：２日目から継続して、飼料Ｉ
温度：３７℃
ｐＯ２：６０％
速度：１６０rpm
ｐＨ：０〜３日目  ６．９５±０．１５、３〜１１日目  ６．８０±０．１５
ｐＨ制御：ＮａＯＨ（１．２M ）（ＣＯ２なし）
ｐＣＯ２：０〜３日目  ５％、３〜１１日目  ３％
【０１７９】
異なる濃度のＮａＨＣＯ３を有して使用される緩衝液系を、表６に示す。
【０１８０】
【表７】
2013514071.tif 000011
【０１８１】
図６に示される標準化された生成物濃度は、同じ緩衝物質が用いられるとき、使用するＮａＨＣＯ３濃度における違いを示さない。ＴＥＳが用いられる（１．１、１．２）ときに、異なるＮａＨＣＯ３濃度によって同一の生成物濃度を呈する。Ｓｏｄ−β（１．３、１．４、１．５、１．６）及び異なる濃度のＮａＨＣＯ３を使用している他の発酵において、細胞の生産性が培地に使用されるＮａＨＣＯ３の濃度からは独立していることが確認される。このために、ＮａＨＣＯ３を用いずに細胞を培養することができる。
【０１８２】
実施例５  発酵の比較  ＣＯ２プロファイル
五つのＣＯ２を制御したバイオリアクターにおいて、発酵プロセスに最適のＣＯ２プロファイルを見つけるために、異なる所望のＣＯ２値は培養期間にわたって定められる。試験の構成は後述する：
プラットフォーム：バイオリアクター／マルチ発酵槽
方法：流加回分法
細胞：ＣＨＯ
接種密度：３×１０５vc/mL
開始体積：１．８Ｌ
実行時間：１１日間
培地：培地Ｂ、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋Ｓｏｄ−β（２５mM）
給餌：２日目から継続して、飼料Ｉ
温度：３７℃
ｐＯ２：６０％
速度：１６０rpm
ｐＨ：０〜３日目 ６．９５±０．１５、３〜１１日目 ６．８０±０．１５
ｐＨ制御：ＮａＯＨ（１．２M ）（ＣＯ２なし）
【０１８３】
六つの発酵プロセスの異なるＣＯ２プロファイルを、表７に示す。
【０１８４】
【表８】
2013514071.tif 000012
【０１８５】
０日目に、午後にＣＯ２修正のための他の試料をとることが省略されたので、０〜１日目の指定されたＣＯ２値（表６を参照されたい）は、図７Ｃに示すように、計測値に対応しない。
【０１８６】
標準化された生存細胞濃度及びまた異なるｐＣＯ２プロファイルを有する個々のプロセスの生成物濃度の両方は、実験３．２以外はほぼ同程度である。プロセス３．２において、細胞は他の全てのプロセスより増殖しない（図７Ａを参照されたい）。乏しい細胞増殖及び低い細胞密度のため、この実験の生成物濃度は、他より低い（図Ｂを参照されたい）。実験３．２のＣＯ２プロファイルに関して、図７Ｃは、これが１日目に高いｐＣＯ２（＞８％）を有する唯一の実験であることを示している。
【０１８７】
よって細胞増殖は、最初は高いｐＣＯ２によって負の影響を受ける。
【０１８８】
実施例６  Ｎａ塩を用いた振とうフラスコの酸耐性
１０個の２５０ml振とうフラスコにおいて、細胞は、ナトリウム塩の添加を用いてそれらの酸耐性を試験される。塩溶液は、前もって滴定によって決定される酸の量が、７．１から６．７までのｐＨシフトについて１．５mlの溶液にあるように選択される。３日目に、これらの異なる塩溶液１．５mlが振とうフラスコに加えられ、ｐＨシフトをシミュレーションする。
試験の構成は後述する：
培養容器／充填量：２５０mL／５０mL
細胞：ＣＨＯ
培地：培地Ｂ、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋Ｓｏｄ−β（２５mM）
接種密度：２×１０５vc/mL
培養期間：１１日間
培養条件：温度：３７℃
相対湿度：７０％
速度：０〜３日目 １２０rpm、３〜７日目 １４０rpm
ＣＯ２：０〜３日目 ５％、３〜１１日目 ３％
給餌：毎日１．５mlの、飼料Ｉ
【０１８９】
１０個の振とうフラスコへの異なる添加を、表８に示す。
【０１９０】
【表９】
2013514071.tif 000013
【０１９１】
図８に示される標準化された生存細胞濃度は、酢酸ナトリウムの添加によってＳＦ５及び６を除く全ての振とうフラスコ中の細胞が同様に増殖することを示している。これらの振とうフラスコにおいて、低い細胞濃度が達成され、細胞は７日目に死に始め、そのため、酢酸ナトリウムの添加は著しく低い増殖をもたらす。
【０１９２】
よって、バイオリアクター中のｐＨ調整のための酢酸の使用を除外することができる。
【０１９３】
実施例７  発酵の比較の酸
異なる酸が、３日目に６．９５から６．８までのｐＨシフトのために三つのＣＯ２−制御バイオリアクターに加えられる。酸性溶液の濃度は、物質の量が必要とするように選択され、滴定においてあらかじめ決定され、５０mlの溶液中に存在する。
試験の構成は後述する：
プラットフォーム：バイオリアクター／マルチ発酵槽
方法：流加回分法
細胞：ＣＨＯ
接種密度：３×１０５vc/mL
開始体積：１．８Ｌ
実行時間：１１日間
培地：培地Ｂ、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＭＯＰＳを含まない＋Ｓｏｄ−β（２５mM）
給餌：２日目から継続して、飼料Ｉ
温度：３７℃
ｐＯ２：６０％
速度：１６０rpm
ｐＨ：０〜３日目 ７．００±０．０５、３〜１１日目 ６．８０±０．０５
ｐＨ制御：ＮａＯＨ（１．２M ）（ＣＯ２なし）
【０１９４】
三つの発酵プロセスへの異なる添加を、表９に示す。
【０１９５】
【表１０】
2013514071.tif 000014
【０１９６】
図９Ａの標準化された細胞濃度はほぼ同様に動作し、そのため、１０日目に個々の実験の最大値が達せられる。塩酸の添加を有する実験４．３の細胞濃度は、常に他より下である。
【０１９７】
しかしながら、標準化された生成物濃度に関して（図９Ｂを参照されたい）、これらが全て同様に動作し、よって塩酸の添加を有する実験４．３において他のプロセスと同様、同じ生成物濃度が得られることは注目に値する。
【０１９８】
図９Ｃに示される乳酸濃度に関して、より少ない乳酸が硫酸（４．４）の添加の結果として発酵プロセスで生産されることは明らかである。
【０１９９】
よって、塩酸の添加は細胞のより高い生産性をもたらし、そして硫酸の添加は発酵プロセスにおけるより低い乳酸濃度をもたらす。
【０２００】
実施例８  ＣＯ２を制御したプロセスを用いた標準的プロセスの比較
四つのバイオリアクターにおいて、ＣＯ２制御がなく、ｐＨ制御のためにＮａ２ＣＯ３を使用する従来の培地Ｂを用いた標準的プロセスを、ＮａＨＣＯ３を含まず、ＭＯＰＳを含まない培地Ｂ＋Ｓｏｄ−β（２５mM）を用いて、そしてｐＨ制御のためにＮａＯＨ及び異なる酸を用いる、ＣＯ２を制御したプロセスと比較する。
試験の構成は後述する：
プラットフォーム：バイオリアクター／マルチ発酵槽
方法：流加回分法
細胞：ＣＨＯ
接種密度：３×１０５vc/mL
開始体積：１．８Ｌ
実行時間：１１日間
給餌：２日目から継続して、飼料Ｉ
温度：３７℃
ｐＯ２：６０％
速度：１６０rpm
ｐＨ：０〜３日目 ７．００±０．０５、３〜１１日目 ６．８０±０．０５
【０２０１】
三つの発酵プロセスへの異なる添加を、表１０に示す。
【０２０２】
【表１１】
2013514071.tif 000015
【０２０３】
図１０に示される実験４．１及び４．３〜４．５の標準化された生成物濃度は、非常に類似した様式で動作する。標準プロセス（４．１）及びリン酸の添加を有する実験４．５においてほぼ同一の生成物濃度が得られ、これは、ＣＯ２を制御したプロセスが達成することができる生産性又は生成物濃度に関していかなる不利な点を有さないことを意味する。
【０２０４】
実施例９  モデル細胞２を用いたＣＯ２プロファイルの比較
五つのバイオリアクターにおいて、ＮａＨＣＯ３を含まず、ＭＯＰＳを含まない培地Ｂ＋Ｓｏｄ−β（２５mM）を用いたＣＯ２を制御したプロセスと、様々なｐＣＯ２プロファイルについてのＮａＯＨの使用とを比較した。ｐＣＯ２は、Ｎ２及びＣＯ２ガスの導入によって能動的に制御され、ｐＨ制御のデカップリングによって行われうる。
試験の構成は、後述される：
プラットフォーム：バイオリアクター／マルチ発酵槽
方法：流加回分法
細胞：ＣＨＯ
接種密度：３×１０５vc/mL
開始体積：１．８Ｌ
実行時間：１１日間
給餌：２日目から継続して、飼料Ｉ
温度：３７℃
ｐＯ２：６０％
速度：１６０rpm
ｐＨ：０〜３日目 ７．００±０．０５、３〜１１日目 ６．８０±０．０５
【０２０５】
五つの発酵プロセスの異なるｐＣＯ２プロファイルを、表１１に示す。
【０２０６】
【表１２】
2013514071.tif 000016
【０２０７】
図１１Ａに示される標準化された生存細胞濃度は、発酵実験ＫＦ１について著しく良好な増殖特性を示している。標準化された生成物濃度についての図１１Ｂも、ＫＦ１についてより良好な結果を有する。この実験についての発酵期は、ｐＣＯ２の所望値が変化した三つの節に分けられる。最良の結果は３％のｐＣＯ２についての連続的に低い所定の値を用いて得られた。
【０２０８】
略語
以下は、本研究において用いられる略語及び符号の簡単な説明である。
【０２０９】
【表１３】
2013514071.tif 000017
2013514071.tif 000018
【図１】
2013514071.tif 000019
【図２Ａ】
2013514071.tif 000020
【図２Ｂ】
2013514071.tif 000021
【図２Ｃ】
2013514071.tif 000022
【図３】
2013514071.tif 000023
【図４Ａ】
2013514071.tif 000024
【図４Ｂ】
2013514071.tif 000025
【図５Ａ】
2013514071.tif 000026
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【国際調査報告】
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