(57)【要約】  対象における乳房状態をモニタリングするための方法が開示される。方法は、ペアードボックス２遺伝子対βデフェンシン−１遺伝子（ＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１）発現比率（「ドナルド予測計数」または「ＤＰＦ」）が乳房の状態と相関することを特徴とする、対象の乳房から採取した細胞におけるＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１発現比率を測定することを含む。乳房状態をモニタリングおよび薬物耐性を測定するためのキットも開示される。【選択図】図３２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における乳房状態をモニタリングするための方法であって：
前記対象の前記乳房から採取した細胞におけるペアードボックス２遺伝子対βディフェンシン−１遺伝子（ＰＡＸ２体ＤＥＦＢ１）発現比率を測定することであって、
前記のＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１発現比率が乳房状態と相関する、前記方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、１００：１またはそれ以上のＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１発現比率が前記対象における乳癌の存在を示し、かつ１００：１未満のＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１発現比率が前記対象における非癌または前癌乳房状態の存在を示すことを特徴とする前記方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記前癌乳房状態が乳房上皮内腫瘍であることを特徴とする前記方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記の測定する手順が：
対照遺伝子の発現レベルに対して相対的な前記ＰＡＸ２遺伝子発現レベルを測定すること；
同対照遺伝子の前記発現レベルに対して相対的な前記ＤＥＦＢ１遺伝子発現レベルを測定すること；および
前記ＰＡＸ２およびＤＥＦＢ１発現レベルに基づいて前記ＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１発現比率を測定することを含む前記方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、ＰＡＸ２、ＤＥＦＢ１および前記対照遺伝子の前記発現レベルが定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定されることを特徴とする前記方法。
【請求項６】
請求項４に記載の方法であって、ＰＡＸ２、ＤＥＦＢ１および前記対照遺伝子の前記発現レベルが発現マイクロアレイによって測定されることを特徴とする前記方法。
【請求項７】
請求項４に記載の方法であって、前記対照遺伝子がグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子であることを特徴とする前記方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記乳房組織より採取した細胞におけるエストロゲン受容体／プロゲステロン受容体／ヒト上皮成長因子受容体２（ＥＲ／ＰＲ／ＨＥＲ２）の状態を測定することをさらに含む前記方法。
【請求項９】
対象における乳房状態をモニタリングするためのキットであって：
組織サンプルにおけるＰＡＸ２発現を検出するための１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマー対；
前記組織サンプルにおけるＤＥＦＢ１発現を検出するための１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマー対；および
前記プライマーを用いて組織サンプルにおける前記ＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１発現比率をどのように測定するかについての説明書を含む前記キット。
【請求項１０】
請求項９に記載のキットであって、前記のＰＡＸ２発現を検出するための１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマー対が配列番号４３および４７、配列番号４４および４８、および配列番号４５および４９からなる群より選択される１つのオリゴヌクレオチドプライマー対を含むことを特徴とする前記キット。
【請求項１１】
請求項９に記載のキットであって、前記のＤＥＦＢ１発現を検出するための１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド対が配列番号３５および３７を含むことを特徴とする前記キット。
【請求項１２】
請求項９に記載のキットであって、１つまたはそれ以上の対照オリゴヌクレオチドプライマー対をさらに含む前記キット。
【請求項１３】
請求項１２に記載のキットであって、前記の１つまたはそれ以上の対照オリゴヌクレオチドプライマー対がβアクチン発現の発現を検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とする前記キット。
【請求項１４】
請求項１３に記載のキットであって、βアクチン発現の発現を検出するための前記オリゴヌクレオチドプライマーが配列番号３４および３６を含むことを特徴とする前記キット。
【請求項１５】
請求項１２に記載のキットであって、前記の１つまたはそれ以上の対照オリゴヌクレオチドプライマー対がＧＡＰＤＨ発現の発現を検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とする前記キット。
【請求項１６】
請求項１５に記載のキットであって、ＧＡＰＤＨ発現の発現を検出するための前記オリゴヌクレオチドプライマーが配列番号４２および４６を含むことを特徴とする前記キット。
【請求項１７】
請求項９に記載のキットであって、１つまたはそれ以上のＰＣＲ反応用試薬をさらに含む前記キット。
【請求項１８】
請求項９に記載のキットであって、１つまたはそれ以上のＲＮＡ抽出用試薬をさらに含む前記キット。
【請求項１９】
対象における乳房状態をモニタリングするためのキットであって：
ＰＡＸ２およびＤＥＦＢ１発現を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブを有するオリゴヌクレオチドマイクロアレイ；および
前記オリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて組織サンプルにおける前記ＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１発現比率をどのように測定するかについての説明書を含む前記キット。
【請求項２０】
請求項１９に記載のキットであって、組織サンプルよりＲＮＡを抽出するための試薬をさらに含む前記キット。
【請求項２１】
乳房状態を有する対象のための治療レジメンを決定するための方法であって：
前記対象における前記乳房状態を有する乳房組織から採取した細胞において対照遺伝子の発現レベルに対して相対的な前記ＰＡＸ２遺伝子発現レベルを測定すること；および
前記ＰＡＸ２遺伝子の前記相対発現レベルに基づいて前記対象に対する治療レジメンを決定することを含む前記方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、前記対照遺伝子がアクチン遺伝子またはＧＡＰＤＨ遺伝子であることを特徴とする前記方法。
【請求項２３】
請求項２１に記載の方法であって、前記乳房状態がエストロゲン受容体陰性および／またはプロゲステロン受容体陰性および／またはヒト上皮成長因子受容体２陰性乳癌であることを特徴とする前記方法。
【請求項２４】
請求項２１に記載の方法であって、前記乳房状態がエストロゲン受容体陽性および／またはプロゲステロン受容体陽性および／またはヒト上皮成長因子受容体２陽性乳癌であることを特徴とする前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願とのクロスリファレンス）
本明細書は、２００９年８月２４日に出願した米国特許出願番号第１２／５４６，２９２号の優先権を主張する。前述の明細書の全文は本明細書に参照文献として援用される。
【０００２】
本明細書は全般的に医学的診断に関し、かつ具体的には多様な組織における癌状態を診断するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
乳癌は、米国において女性の癌の最も多い原因でありかつ２番目に多い女性の癌死亡原因である。新規乳癌の大多数はマンモグラム上に異常が見られた結果として診断される一方、乳房組織における塊または硬さの変化も疾患の警戒徴候となることがある。過去数十年間の乳癌リスクに対する認識の高まりによって、スクリーニングを目的としたマンモグラフィを受ける女性の数が増加し、より早いステージでの癌の検出および結果としての生存率の改善につながっている。それでもなお、乳癌は４５〜５５歳の女性における最も多い死因である。
【０００４】
乳癌はいくつかのステージに分類することができる。ステージ０は原位置癌である（小葉癌および腺管癌を含む）。ステージＩは浸潤性乳癌の初期ステージである。腫瘍は直径が２センチ以下である。癌細胞は乳房外に拡散しない。ステージＩＩ腫瘍は、直径は２センチ以下であるが腋窩リンパ節に拡散した腫瘍、２〜５センチであってかつ腋窩リンパ節に拡散した可能性のある腫瘍、および５センチ（２インチ）よりも大きいが腋窩リンパ節に拡散していない腫瘍を含む。ステージＩＩＩは局所的に進行した癌である。さらにステージＩＩＩＡ、ＩＩＩＢおよびＩＩＩＣに分類される。ステージＩＶは遠隔転移癌である。癌は身体の他の部分に拡散している。初期ステージ治療の選択肢は後期ステージの選択肢と異なる。
【０００５】
多くの種類の癌が遺伝子の異常、すなわち突然変異によって引き起こされることが知られている。突然変異の蓄積および細胞の制御機能の低下は、正常な組織像から上皮内腫瘍（ＩＥＮ）などの初期前癌、徐々に重度のＩＥＮ、表層癌さらに最終的に浸潤性疾患へと進行性の表現型変化を引き起こす。一部の症例においてはこの過程が比較的急激であることがあるものの、概して数年、さらには数十年にわたって比較的緩やかに発生する。癌遺伝子依存は、癌細胞が悪性表現型を維持するために単一癌遺伝子の持続的活性化または過剰発現に生理的に依存することである。この依存は、腫瘍進行を特徴付ける他の変化の状況において発生する。
【０００６】
浸潤性癌への長い進行期間は臨床的介入の機会を提供する。したがって、浸潤性癌の発生を予防または遅延させるための治療手段を取ることができるよう、前癌状態を示すバイオマーカーを特定することが重要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の１つの態様は、対象における乳癌状態をモニタリングするための方法に関する。方法は、ペアードボックス２遺伝子対βディフェンシン−１遺伝子（ＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１）の発現比率が乳房状態と相関しかつ治療の過程を決定するために用いられる予後決定因子として役立ちうることを特徴とする、対象の乳房から採取した細胞のＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１発現比率を測定することを含む。
【０００８】
１つの実施形態においては、１００：１またはそれ以上のＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１発現比率は対象における乳癌の存在を示し、かつ１００：１未満のＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１発現比率は対象における非癌または前癌乳房状態の存在を示す。
【０００９】
他の実施形態においては、測定する手順は対照遺伝子の発現レベルに対するＰＡＸ２遺伝子の発現レベルを測定すること、同対照遺伝子の発現レベルに対するＤＥＦＢ１遺伝子の発現レベルを測定すること；およびＰＡＸ２およびＤＥＦＢ１の発現レベルに基づいてＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１発現比率を測定することを含む。
【００１０】
１つの実施形態においては、方法は乳房状態を有する乳房組織より採取した細胞におけるエストロゲン受容体／プロゲステロン受容体／ヒト上皮成長因子受容体（ＥＲ／ＰＲ／ＨＥＲ２）の状態を測定することをさらに含む。
【００１１】
本発明の他の態様は、乳房状態をモニタリングするためのキットに関する。１つの実施形態においては、乳房状態をモニタリングするためのキットは：組織サンプルにおけるＰＡＸ２発現を検出するための１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマー対、組織サンプルにおけるＤＥＦＢ１発現を検出するための１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマー対、およびプライマーを用いて組織サンプルにおけるＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１発現比率を測定する方法についての説明書を含む。他の実施形態においては、ＰＡＸ２発現を検出するための１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマー対は、配列番号：４３および４７、配列番号：４４および４８、ならびに配列番号：４５および４９からなる群より選択される１つのオリゴヌクレオチドプライマー対を含む。他の実施形態においては、配列番号：３５および３７を含むＤＥＦＢ１発現を検出するための１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマー対。
【００１２】
他の実施形態においては、キットはさらに１つまたはそれ以上の対照オリゴヌクレオチドプライマー対を含む。１つの実施形態においては、１つまたはそれ以上の対照オリゴヌクレオチドプライマー対は、βアクチン発現の発現を検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーを含む。好ましい実施形態においては、βアクチン発現の発現を検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーは配列番号３４および３６を含む。
【００１３】
他の実施形態においては、１つまたはそれ以上の対照オリゴヌクレオチドプライマー対はＧＡＰＤＨ発現の発現を検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーを含む。好ましい実施形態においては、ＧＡＰＤＨ発現の発現を検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーは配列番号４２および４６を含む。
【００１４】
他の関連する実施形態においては、キットはさらに１つまたはそれ以上のＰＣＲ反応用試薬を含む。
【００１５】
さらに他の実施形態においては、キットはさらに１つまたはそれ以上のＲＮＡ抽出用試薬を含む。
【００１６】
他の実施形態においては、乳房状態をモニタリングするためのキットはＰＡＸ２およびＤＥＦＢ１発現を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブを有するオリゴヌクレオチドマイクロアレイ、およびオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて組織サンプルにおけるＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１発現比率を測定する方法についての説明書を含む。
【００１７】
関連する実施形態においては、キットは組織サンプルよりＲＮＡを抽出するための試薬をさらに含む。
【００１８】
本発明の他の態様は、乳房状態を有する対象のための治療レジメンを決定するための方法に関する。方法は、前記対象の乳房状態を有する乳房組織より採取した細胞における対照遺伝子の発現レベルに対するＰＡＸ２遺伝子の発現レベルを測定し、かつＰＡＸ２遺伝子の相対的発現レベルに基づいて前記対象のための治療レジメンを決定する手順を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
本明細書に組み入れられかつその一部を構成する付属の図面は、開示された方法および構成要素の一定の実施形態を記載と共に例示し、開示された方法および構成要素の原理を説明するのに役立つ。
【００２０】
【図１Ａ−Ｃ】βディフェンシン−１（ＤＢＦＢ１）発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）分析を示す。ＤＥＦＢ１発現の導入を検証するためにＱＲＴ−ＰＣＲを実施した。図１Ａは、根治的前立腺摘除術を受けた６例の患者より採取した臨床サンプルにおいて比較したＤＥＦＢ１相対発現レベルを示す。図１Ｂは、ＤＥＦＢ１導入前後の良性および悪性前立腺臨床サンプル、ｈＰｒＥＣ細胞ならびに前立腺細胞株において比較したＤＥＦＢ１相対発現レベルを示す。図１Ｃは、単一の組織切片内にある良性組織、悪性組織、および前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）において分析したＤＥＦＢ１相対発現レベルを示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、良性組織に認められる平均ＤＥＦＢ１発現レベルと比較した、１例の患者における良性組織、悪性組織およびＰＩＮ組織ＤＥＦＢ１発現を示す。
【図２】膜完全性および細胞形態のＤＥＦＢ１誘導性変化の顕微鏡分析を示す。４８時間のＤＥＦＢ１導入後にＤＵ１４５、ＰＣ３およびＬＮＣａＰの細胞形態を位相差顕微鏡検査により分析した。膜ラフリングは黒い矢印で示され、かつアポトーシス小体は白い矢印で示される。
【図３】前立腺癌細胞におけるＤＥＦＢ１細胞毒性の分析を示す。前立腺細胞株ＤＵ１４５、ＰＣ３およびＬＮＣａＰをＰｏｎＡで１〜３日間処理してＤＥＦＢ１発現を誘導し、その後ＭＭＴ分析を実施して細胞の生存率を測定した。結果は平均±標準偏差、ｎ＝９に相当する。
【図４Ａ】ＤＵ１４５およびＰＣ３細胞におけるＤＥＦＢ１による細胞死の誘導を示す。前立腺細胞株ＤＵ１４５（Ａ）およびＰＣ３（Ｂ）においてＤＥＦＢ１発現を誘導し、さらにその後アネキシンＶ／ＦＩＴＣ／ヨウ化プロピジウム染色およびフローサイトメトリー分析を実施した。ヨウ化プロピジウムおよびアネキシンＶ陽性の細胞をアポトーシス細胞と見なした。各パネルの下に誘導時間を示す。各測定時点のボックスの隣の数字はヨウ化プロピジウム（ＰＩ）−アネキシンＶ＋細胞の割合（右下象限）およびＰＩ＋アネキシンＶ＋細胞（右上象限）を示す。データは異なる３つの実験を代表する１回の実験に由来する。
【図４Ｂ】同上
【図５Ａ−Ｈ】ＤＥＦＢ１導入後のパンカスパーゼ分析を示す。ＤＵ１４５およびＰＣ３細胞をＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫ標識フルオロメチルケトンで染色し、カスパーゼ活性を検出した。細胞は各条件においてＤＩＣ下で可視であった。共焦点顕微鏡分析では、対照ＤＵ１４５（Ｂ）、ＰＣ３細胞（Ｆ）およびＬＮＣａＰ（Ｊ）のカスパーゼ染色は判明しなかった。ＰｏｎＡで２４時間処理してＤＥＦＢ１を誘導した細胞は、ＤＵ１４５（Ｄ）およびＰＣ３（Ｈ）においてカスパーゼ活性を示した。ＬＮＣａＰ（Ｌ）ではカスパーゼ活性が検出されなかった。
【図５Ｉ−Ｌ】同上
【図６】ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ処理後のペアードボックスホメオチック遺伝子２（ＰＡＸ２）タンパク質発現のサイレンシングを示す。図６Ａは、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡデュプレックスをトランスフェクトしたＰＣ３およびＤＵ１４５細胞の０日目（レーン１）、２日目（レーン２）および４日目（レーン３）のウェスタンブロット分析を示す。図６Ｂは、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡデュプレックスをトランスフェクトしたＰＣ３およびＤＵ１４５細胞の０日目（レーン１）、２日目（レーン２）、４日目（レーン３）および６日目（レーン４）のウェスタンブロット分析を示す。ＰＡＸ２タンパク質は、ＤＵ１４５細胞で処理より４日後（レーン３）およびＰＣ３で処理より６日後と早期に検出不可能となった。ブロットを剥離し、内部対照としてのβアクチンについてリプローブした。
【図７】ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ処理後の前立腺癌細胞増殖の分析を示す。通常の増殖培地の存在下における６日目のＤＵ１４５、ＰＣ３およびＬＮＣａＰの位相差顕微鏡分析。陰性対照ｓｉＲＮＡによる処理は細胞に影響を示さなかった。しかし、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡによる処理後には、３つ細胞株の全てに有意な細胞数減少があった。
【図８】ＰＡＸ２のｓｉＲＮＡサイレンシング後の細胞死の分析を示す。前立腺癌細胞株ＰＣ３、ＤＵ１４５およびＬＮＣａＰを、４つのＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡまたは４つの非特異的対照ｓｉＲＮＡのプール０．５μｇで２、４または６日間処理し太後、細胞生存率を測定するためにＭＴＴアッセイを行った。結果は平均±標準偏差、ｎ＝９に相当する。
【図９】カスパーゼ活性の分析を示す。ＤＵ１４５、ＰＣ３およびＬＮＣａＰ細胞をカルボキシフルオレセイン標識フルオロメチルケトンで染色し、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ処理後のカスパーゼ活性を検出した。未処理および処理細胞の共焦点顕微鏡分析により、細胞がＤＩＣで可視であったことが示される。蛍光下での分析では対照ＤＵ１４５（Ｂ）、ＰＣ３細胞（Ｆ）およびＬＮＣａＰ（Ｊ）のカスパーゼ染色は示されなかった。しかし、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ処理した細胞はＤＵ１４５（Ｄ）、ＰＣ３（Ｈ）およびＬＮＣａＰ（Ｌ）においてカスパーゼ活性を誘導した。
【図１０】ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ処理後のアポトーシス因子の分析を示す。未処理対照細胞およびＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで６日間処理した細胞において、プロアポトーシス因子の発現の変化を比較した。図１０Ａは、ＤＵ１４５、ＰＣ３およびＬＮＣａＰにおいてＢｃｌ−２関連Ｘタンパク質（ＢＡＸ）の発現レベルが増加したことを示す。図１０Ｂは、ＤＵ１４５およびＬＮＣａＰにおいてＢＨ３共役ドメインデスアゴニスト（ＢＩＤ）発現が増加したがＰＣ３では変化したことを示す。図１０Ｃは、３つの細胞株全てにおいてＢｃｌ−２関連デスプロモーター（ＢＡＤ）の発現レベルが増加したことを示す。
【図１１】ＰＡＸ２とＤＮＡ認識配列の結合のモデルを示す。ＰＡＸ２転写リプレッサーは、ＤＥＦＢ１  ＴＡＴＡボックスの直近のＣＣＴＴＧ（配列番号１）認識部位と結合し、かつ転写およびＤＥＦＢ１タンパク質発現を妨害する。ＰＡＸ２タンパク質発現の阻害により正常なＤＥＦＢ１発現が可能となる。
【図１２】ＤＥＦＢ１リポーター構築物を例示する。ｍＲＮＡ開始部位より上流の始めの１６０塩基から構成されるＤＥＦＢ１プロモーターをＤＵ１４５細胞からＰＣＲ増幅し、ｐＧＬ３ルシフェラーゼリポータープラスミドにライゲーションした。
【図１３】ＰＡＸ２を阻害するとＤＥＦＢ１が発現することを示す。ＤＵ１４５、ＰＣ３、ＬＮＣａＰおよびＨＰｒＥＣをＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで４８時間処理した。処理前のＱＲＴ−ＰＣＲ分析ではＤＵ１４５、ＰＣ３およびＬＮＣａＰのＤＥＦＢ１発現は示されなかった。しかし、全ての細胞株において処理後にＤＥＦＢ１発現が回復した。ＰＡＸ２欠損ＨｐｒＥＣのｓｉＲＮＡ処理後にＤＥＦＢ１発現の変化はなかった。
【図１４】ＰＡＸ２阻害によってＤＥＦＢ１プロモーター活性が増加することを示す。ＰＣ３プロモーター／ｐＧＬ３およびＤＵ１４５プロモーター／ｐＧＬ３構築物を作製し、さらにそれぞれＰＣ３およびＤＵ１４５細胞にトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡによるＰＡＸ２阻害の前後のプロモーター活性を比較した。処理後のＤＥＦＢ１プロモーター活性はＤＵ１４５で２．６５倍およびＰＣ３で３．７８倍増加した。
【図１５Ａ】ＤＥＦＢ１プロモーターと結合したＰＡＸ２のＣｈＩＰ分析を示す。ＤＵ１４５およびＰＣ３細胞に対してＣｈＩＰ分析を実施した。抗ＰＡＸ２抗体による免疫沈降後、ＰＣＲを実施してＧＴＴＣＣ（配列番号２）ＰＡＸ２認識部位を含むＤＥＦＢ１プロモーター領域を検出した。これにより、前立腺癌細胞株においてＰＡＸ２転写リプレッサーがＤＥＦＢ１プロモーターと結合することが証明される。
【図１５Ｂ】同上
【図１６】ＤＮＡを有するＰｒｄＰＤおよびＰｒｄＨＤの予測構造を示す。ＤＮＡと結合したＰｒｄＰＤ（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）とＤＮＡと結合したＰｒｄＨＤ（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）の構造の座標を用い、２つのドメインがＰＨ０部位と結合した際のそのモデルを構築した。個々の結合部位は指定された特定の向きで相互に隣接する。ＲＥＤドメインは、ＰｒｄＰＤ結晶構造に基づいて向きを決めた。
【図１７】異なるペアードドメインのコンセンサス配列の比較を示す。図面の上部には、Ｐｒｄ−ペアードドメイン±ＤＮＡ複合体の結晶構造分析で報告されているタンパク質±ＤＮＡ接点の模式図を示す。白いボックスはａヘリックスを示し、網掛けボックスはｂ−シート、太線はｂ−ターンを示す。接触するアミノ酸は１文字コードで示す。直接的アミノ酸±塩基接点のみを示す。白丸は主溝接点を示す一方、赤い矢印は副溝接点を示す。このスキームを、ペアードドメインタンパク質の全既知のコンセンサス配列と整合する（トップスストランドのみを示す）。コンセンサス配列間の縦線は保存塩基対を示す。図の下部に位置番号を示す。
【図１８】化学予防戦略としてのＰＡＸ２のターゲティングを示す。異常ＰＡＸ２発現は、癌発生および進行の初期事象である。異形成または他の前癌段階中のＰＡＸ２阻害を癌予防のために用いることができる。
【図１９】アンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）がＤＵ１４５細胞のＰＡＸ２発現に及ぼす効果を示す。ＰＡＸ２発現に対するＡｎｇＩＩの効果を測定するために、処理後のＤＥＦＢ１タンパク質レベルをモニタリングした。この場合、ＰＡＸ２発現レベルは４時間と早期に上昇し、４８時間まで持続した。
【図２０】図２０Ａは、ＤＵ１４５におけるＰＡＸ２発現に対するロサルタン（Ｌｏｓ）の効果を示す。ＤＵ１４５細胞をアンジオテンシンＩＩタイプ１受容体（ＡＴＲ１）遮断剤ロサルタンで処理した。ＱＲＴ−ＰＣＲにより、処理後にＰＡＸ２メッセージレベルが少なくとも２分の１低下することが明らかとなった。図２０Ｂは、ＤＵ１４５細胞におけるアンジオテンシンＩＩタイプ２（ＡＴＲ２）阻害剤のＰＡＸ２発現への効果を示す。ＡＴＲ２受容体のＰＡＸ２発現に対する効果を測定するため、ＤＵ１４５細胞をＡＴＲ２受容体遮断剤ＰＤ１２３３１９で処理した。この場合、ＰＡＸ２発現は７から８倍上昇した。
【図２１】ＤＵ１４５においてＬｏｓがＰＡＸ２発現に対するＡｎｇＩＩの効果を遮断することを示す。ＤＵ１４５細胞を５μＭのＡｎｇＩＩで７２時間処理したところＰＡＸ２発現が２倍上昇した。さらに、１０μＭで７２時間処理したところ発現は３倍以上上昇した。細胞を５μＭロサルタンで処理したところ、増殖が５０％抑制された。さらに、ＡｎｇＩＩで処理する３０分前にロサルタンで処理したところ、増殖に対するＡｎｇＩＩの効果が阻害された。
【図２２】ＡｎｇＩＩがＤＵ１４５細胞増殖を増加させることを示す。ＤＵ１４５細胞を５μＭのＡｎｇＩＩで７２時間処理したところ増殖が２倍上昇した。さらに、１０μＭで７２時間処理したところ増殖が３倍以上上昇した。
【図２３】ＤＵ１４５細胞におけるＬｏｓおよびＭＡＰキナーゼ阻害剤のＰＡＸ２発現に対する効果を示す。図２３ＡはＤＵ１４５細胞をロサルタンで処理するとホスホ−ＥＲＫ１／２およびＰＡＸ２発現が抑制されることを示し；図２３ＢはＭＥＫキナーゼ阻害剤およびＡＩＣＡＲがＰＡＸ２タンパク質発現を抑制することを示し；図２３ＣはＭＥＫキナーゼ阻害剤およびロサルタンがホスホ−ＳＴＡＴ３タンパク質発現を抑制することを示す。
【図２４】ＤＵ１４５細胞におけるＬｏｓおよびＭＥＫキナーゼ阻害剤のＰＡＸ２活性化に対する効果を示す。図２４Ａは、ＤＵ１４５細胞をＡＴ１Ｒシグナリング阻害物質で処理したところＰＡＸ２の活性型であるホスホ−ＰＡＸ２タンパク質レベルが低下したことを示す。さらに、ＡＭＰキナーゼ誘導薬ＡＩＣＡＲで処理することによりＰＡＸ２発現が阻害された。図２４Ｂは、ＡＴ１ＲシグナリングをＬｏｓで阻害したところホスホ−ＪＮＫレベルが低下したことを示す。しかし、ＡｎｇＩＩはホスホ−ＪＮＫタンパク質レベルを上昇させた。
【図２５】ｈＰｒＥＣ細胞においてＡｎｇＩＩがＰＡＸ２を増加しかつＤＥＦＢ１発現を減少することを示す。ｈＰｒＥＣにおけるＡｎｇＩＩのＰＡＸ２レベルに対する効果を測定するために、細胞を７２および９６時間処理し、さらにＰＡＸ２およびＤＥＦＢ１発現をＱＲＴ−ＰＣＲで検討した。この場合、ＡｎｇＩＩ処理によってＰＡＸ２がＰＣ３前立腺癌細胞と同様のレベルまで劇的に増加した。逆に、ＤＥＦＢ１発現はＡｎｇＩＩ処理後に有意に減少した。
【図２６】ＡｎｇＩＩシグナリングおよびＰＡＸ２前立腺癌の模式図を示す。前立腺癌細胞におけるＰＡＸ２発現は、ＡＴ１Ｒシグナリング経路によって調節される。具体的には、ＭＥＫキナーゼシグナリングカスケードはＰＡＸ２発現の増加につながる。さらに、ＡＴ１ＲおよびＡｎｇＩＩはＪＮＫを介してＰＡＸ２をアップレギュレートする。
【図２７】前立腺癌に対する治療法としてのＰＡＸ２発現遮断の模式図を示す。図２７Ａは、ＰＡＸ２発現がＡＴ１Ｒシグナリング経路によって調節されることを示す。ＰＡＸ２発現を阻害するとＤＥＦＢ１の再発現および癌細胞死が発生する。図２７Ｂは下流のキナーゼＡＴ１Ｒを遮断するか、またはＰＡＸ２を直接抑制する化合物が、前立腺癌を治療するための新規手法を提供することを示す。
【図２８】ＤＥＦＢ１およびＰＡＸ２発現とグリーソンスコアの比較を示す。根治的前立腺摘除術を受けた６例の患者からの良性臨床サンプルにおいてＤＥＦＢ１の相対発現レベルを比較した。この場合、グリーソンスコアは隣接する良性前立腺組織においてＤＥＦＢ１発現レベルと逆相関した。相対ＤＥＦＢ１発現レベルが０．００５を上回る患者のグリーソンスコアは６であった。しかし、発現レベルが０．００５未満の者のグリーソンスコアは７であった。
【図２９Ａ】前立腺癌発生の予測因子としてのＰＡＸ２−ＤＥＦＢ１比率を示す。レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）前立腺癌切片に対してＱＲＴ−ＰＣＲを実施し、相対的なＤＥＦＢ１およびＰＡＸ２の発現レベルを測定した。ＤＥＦＢ１発現レベルは、正常からＰＩＮ、癌に向かって低下する。しかし、ＰＡＸ２発現は正常からＰＩＮから癌に向かって増加する。さらに、グリーソンスコア６の癌の患者番号１４５７は、グリーソンスコア７の癌の患者番号１５６９と比較して、正常組織およびＰＩＮ内のＤＥＦＢ１が多かった。逆に、患者番号１５６９は患者番号１４５７と比較して癌領域のＰＡＸ２レベルが高かった。
【図２９Ｂ】同上
【図３０】ドナルド予測係数（ＤＰＦ）が相対ＰＡＸ２−ＤＥＦＢ１発現比率に基づいていることを示す。前立腺組織のＤＰＦが上昇すると前立腺癌が発生する確率が増加する。ＤＰＦに基づくＰＡＸ２−ＤＥＦＢ１比率が０〜３９の組織は正常（良性）であった。ＰＡＸ２−ＤＥＦＢ１比率が４０〜９９の組織は、ＤＰＦスケールに基づくＰＩＮ（前癌）を呈していた。最後に、ＰＡＸ２−ＤＥＦＢ１比率が１００〜５００の組織は悪性（低から高グレードの癌）であった。
【図３１】ヒト前立腺組織におけるｈＢＤ−１発現の分析を示す。根治的前立腺摘除術を受けた患者からの正常臨床サンプルにおいてｈＢＤ−１の相対発現レベルを比較した。破線は、肉眼的切除検体とＬＣＭ由来検体の間で得られた値を比較するための基準点として使用し、対応するグリーソンスコアを各棒グラフの上に示す。図３１Ａは、肉眼的切除で得られた組織において比較したｈＢＤ−１発現レベルを示す。図３１Ｂは、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションによって得られた組織において比較したｈＢＤ−１発現レベルを示す。
【図３２】前立腺細胞株におけるｈＢＤ−１発現の分析を示す。図３２Ａは、ｈＢＤ−１誘導前後の前立腺癌細胞株における、ｈＰｒＥＣ細胞に対して比較したｈＢＤ−１発現レベルを示す。アスタリスクはｈＰｒＥＣと比較して統計的に高い発現レベルを示す。二重アスタリスクは、ｈＢＤ−１誘導前の細胞株と比較して統計的に有意な水準の発現を示す（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、ｐ＜０．０５）。図３２Ｂは免疫細胞化学検査によって前立腺癌細胞株ＤＵ１４５において検証した異所性ｈＢＤ−１発現を示す。ｈＰｒＥＣ細胞を、陽性（ポジティブ）対照としてのｈＤＢ−１について染色した（ａ：ＤＩＣおよびｂ：蛍光）。ＤＵ１４５細胞をｈＢＤ−１でトランスフェクトし、１８時間誘導した（ｃ：ＤＩＣおよびｄ：蛍光）。スケールバー＝２０μＭ。
【図３３】前立腺細胞におけるｈＢＤ−１細胞毒性の分析を示す。前立腺細胞株ＤＵ１４５、ＰＣ３、ＰＣ３／ＡＲ＋およびＬＮＣａＰをＰｏｎＡで１〜３日間処理してｈＢＤ−１発現を誘導し、その後ＭＭＴアッセイを実施して細胞の生存率を測定した。各棒グラフは、３回ずつ実施した独立した３つの実験の平均±標準誤差を示す。
【図３４Ａ】ヒト前立腺正常、ＰＩＮおよび腫瘍のＬＣＭ組織切片におけるｈＢＤ−１およびｃＭＹＣ発現のＱＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。各遺伝子の発現はβアクチンと比較した発現比率として示す。図３４Ａは正常、ＰＩＮおよび腫瘍切片におけるｈＢＤ−１発現レベルの比較を示す。図３４Ｂは正常、ＰＩＮおよび腫瘍切片におけるｃＭＹＣ発現レベルの比較を示す。
【図３４Ｂ】同上
【図３５】ｓｉＲＮＡを用いたＰＡＸ２ノックダウン後のｈＢＤ１発現のＱＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。ｈＢＤ−１発現レベルはβアクチンと比較した発現比率として示す。アスタリスクは、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ処理前の細胞株と比較して統計的に高い発現水準を示す（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、ｐ＜０．０５）。
【図３６】ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ処理後のＰＡＸ２タンパク質発現のサイレンシングを示す。図３６Ａは、ウェスタンブロット分析によって検討したＨＰｒＥＣ前立腺一次細胞（レーン１）およびＤＵ１４５（レーン２）、ＰＣ３（レーン３）およびＬＮＣａＰ（レーン４）前立腺癌細胞におけるＰＡＸ２発現を示す。ブロットを剥離し、内部対照としてのβアクチンについてリプローブして装填が均一であることを確認した。図３６Ｂは、ＤＵ１４５、ＰＣ３およびＬＮＣａＰのウエスタンブロット分析のいずれでも、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡデュプレックスによるトランスフェクト後のＰＡＸ２発現のノックダウンが確認されたことを示す。ブロットを再度剥離し、内部対照としてのβアクチンについてリプローブした。
【図３７】ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ処理後の前立腺癌細胞の増殖の分析を示す。通常のネガティブコントロール非特異的ｓｉＲＮＡの存在下における６日目のＨＰｒＥＣ（Ａ）、ＬＮＣａＰ（Ｃ）、ＤＵ１４５（Ｅ）およびＰＣ３（Ｇ）の位相差顕微鏡分析。ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡによる処理の後には、ＤＵ１４５（Ｄ）、ＰＣ３（Ｆ）およびＬＮＣａＰ（Ｈ）において細胞数の有意な減少があった。しかし、ＨＰｒＥＣ（Ｂ）においては影響がなかった思われた。バー＝２０μＭ。
【図３８】ＰＡＸ２のｓｉＲＮＡサイレンシング後の細胞死の分析を示す。前立腺癌細胞株ＰＣ３、ＤＵ１４５およびＬＮＣａＰをＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡまたは非特異的陰性対照ｓｉＲＮＡで２、４または６日間処理し、その後ＭＴＴアッセイを実施した。ＰＡＸ２のノックダウンにより、３つの細胞株全てにおいて相対細胞生存率が低下した。結果は平均±標準偏差、ｎ＝９に相当する。
【図３９】カスパーゼ活性の分析を示す。ＤＵ１４５、ＰＣ３およびＬＮＣａＰ細胞をカルボキシフルオレセイン標識フルオロメチルケトンで染色し、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ処理後のカスパーゼ活性を検出した。蛍光分析では対照ＤＵ１４５（Ａ）、ＰＣ３細胞（Ｃ）およびＬＮＣａＰ（Ｅ）のカスパーゼ染色は示されなかった。しかし、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ処理した細胞はＤＵ１４５（Ｂ）、ＰＣ３（Ｄ）およびＬＮＣａＰ（Ｆ）においてカスパーゼ活性を誘導した。バー＝２０μｍ。
【図４０】ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ処理後のアポトーシス因子の分析を示す。未処理対照細胞およびＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで６日間処理した細胞において、プロアポトーシス因子の発現の変化を比較した。図４０Ａは、ＤＵ１４５，ＰＣ３およびＬＮＣａＰにおけるＰＡＸ２ノックダウン後にＢＡＤ発現が上昇したことを示す。図４０Ｂは、ＢＩＤ発現レベルがＬＮＣａＰおよびＤＵ１４５において上昇したがＰＣ３細胞では上昇しなかったことを示す。図４０Ｃは、ＬＮＣａＰおよびＤＵ１４５においてＡＫＴ発現が低下したことを示す。しかし、ＰＡＸ２ノックダウン後のＰＣ３細胞のＡＫＴ発現に変化はなかった。結果は平均±標準偏差、ｎ＝９を表す。アスタリスクは統計的な差を示す（ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
特に規定しない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、開示された方法および構成要素が属する技術分野における通常の知識を有する者によって共通して理解されるところと同じ意味を有する。本明細書および付属の請求項に用いるところの単数形「１つの」および「その」は、文脈によって明確に指示されない限り複数の内容を含む。したがって、たとえば、「１つのペプチド」への言及は複数のそのようなペプチドを含み、「そのペプチド」への言及は１つまたはそれ以上のペプチドおよび当業者に既知であるその同等物への言及である、などである。
【００２２】
本発明の１つの態様は、癌の発生をモニタリングするための方法に関する。一定の実施形態においては、方法は、対象の前立腺または乳房における上皮内腫瘍などの前癌状態、および癌状態のモニタリングに関する。方法は、ペアードボックス２遺伝子対βデフェンシン−１遺伝子（ＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１）の発現比率が前立腺または乳房の状態と相関することを特徴とする、対象の前立腺または乳房から採取した細胞におけるＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１の発現比率を測定することを含む。遺伝子発現比率はｍＲＮＡレベルで（例：ＲＴ−ＰＣＲまたはオリゴヌクレオチドアレイによる）またはタンパク質レベルで（例：ウェスタンブロットまたは抗体アレイ）測定してもよい。
【００２３】
一定の実施形態においては、ＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１発現比率はｍＲＮＡレベルで測定し、本明細書においては「ドナルド予測係数」または「ＤＰＦ」と呼ばれる。
【００２４】
一定の実施形態においては、前立腺のＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１発現比率（ｍＲＮＡレベルで測定）は対象において正常、前癌性および癌性前立腺状態の間で識別するために用いられる。１つの実施形態においては、４０：１未満のＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１比率は正常な前立腺状態を示し、少なくとも４０：１から１００：１未満のＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１比率は前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）を示し、かつ少なくとも１００：１のＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１比率は前立腺癌を示す。
【００２５】
対象における前立腺癌を診断するための方法も提供される。方法は、ＰＡＸ２対βディフェンシン−１（ＤＥＦＢ１）の比率が少なくとも１００：１であることを特徴とする、対象の前立腺からの細胞においてＰＡＸ２およびＤＥＦＢ１レベルを検出することを含む。
【００２６】
対象における前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）を診断する方法も提供される。方法は、ＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１比率が少なくとも４０：１でありかつ１００：１未満であることを特徴とする、対象の前立腺からの細胞においてＰＡＸ２およびβＤＥＦＢ１レベルを検出することを含む。
【００２７】
他の一定の実施形態においては、乳房における（ＲＮＡレベルでの）ＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１発現比率は対象において非癌性（良性および／または前癌）乳房状態と癌性乳房状態を識別するために用いられる。１つの実施形態においては、１００：１未満のＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１比率は非癌（正常）状態および／または前癌（乳房上皮内腫瘍（ＭＩＮ））を示し、少なくとも１００：１のＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１比率は乳癌を示す。
【００２８】
対象において乳癌を診断するための方法も提供される。方法は、対象において少なくとも１００：１のＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１比率が乳癌を示すことを特徴とする、対象の乳房からの細胞においてＰＡＸ２およびＤＥＦＢ１レベルを検出することを含む。対象における非癌生乳房状態（正常および／またはＭＩＮ）を診断するための方法も提供される。方法は、対象において１００：１未満のＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１比率が非癌乳房状体を示すことを特徴とする、対象の乳房からの細胞においてＰＡＸ２およびＤＥＦＢ１のレベルを検出することを含む。
【００２９】
１つの実施形態においては、方法は乳房状態を有する乳房組織より採取したエストロゲン受容体／プロゲステロン受容体（ＥＲ／ＰＲ）の状態を測定することをさらに含む。乳房組織のＥＲ／ＰＲ状態を、同一組織のＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１比率と共に、対象の乳房状態の測定に用いてもよい。
【００３０】
これ以降用いるところの用語「乳房上皮内腫瘍」は小葉上皮内腫瘍および腺管上皮内腫瘍を含む。
【００３１】
本発明のモニタリングおよび診断方法は、臨床家に対して開始した組織または前癌組織についての予後決定因子を提供する。この検査の候補は（年齢、人種に基づく）癌のリスクの高い患者を含む。診断として、ＰＡＸ２検査が次に陽性または陰性となった後でバイオマーカーによる追加的スクリーニングを実施して癌の部位を決定することができる。さらに、これらの患者はＰＡＸ２／ＤＥＦＢ１モジュレーターによる治療の候補とすることができる。代替的に、この検査をその癌治療法の有効性の指標として患者（すなわちトリプルネガティブ乳癌の者）に対して用いて、治療経過を決定するか、または癌の再発をモニタリングすることができる。
【００３２】
他の例として、臨床家による直腸指診時の前立腺内結節の検出といった癌の潜在的な指標を呈した患者、またはＰＳＡの突発的上昇を経験した者は、しばしば「監視すべき待機」状態にある。これらの患者が癌を発症しているか、あるいはこれから発症するか確認することはしばしば困難である。これらの患者からの血漿／血清などのサンプル中のＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１比率の検出を、前立腺癌が疑われる男性からの生検資料の採取の決定を支援するために用いることが可能であり、これは不必要な前立腺生検件数の減少、および患者の疾患へのより早い介入につながる。
【００３３】
（前立腺癌）
現在、前立腺癌スクリーニングは直腸診および前立腺特異抗原（ＰＳＡ）レベルの測定からなる。直腸指診には相当な検査者間変動があり、かつＰＳＡレベルは良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、前立腺炎および他の疾患において上昇することもあるため、これらの方法は特異性に欠ける。
【００３４】
前立腺癌はグリーソンシステムを用いてスコアリングすることができる（Ｇｌｅａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９６６）。これは細胞学的性質ではなく組織構成を用いる。１から５の等級を用い（良好から低分化度）を用い、最も頻繁かつより重度な病変領域の合計スコアを合計する。グリーソンスコアは、腫瘍ステージの評価（ステージング）の他にも有用となりうる予後情報を提供する。２〜４および８〜９のグリーソンスコアは良好な予測値を有するが、腫瘍の約３／４は中間的な数値を有する。
【００３５】
前立腺癌のステージングには２種類の主要なシステム：ＴＮＭおよびジュウェットシステムを用いる（Ｂｅｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。ステージングは腫瘍のあらゆる転移的な拡散を評価することを考慮し、かつ局所リンパ節転移であるかまたは局所的浸潤であるか評価することが困難であることから、これは困難である。肉眼で腫瘍組織を正常組織から識別することが難しく、かつ前立腺は明瞭な皮膜がなく線維脂肪組織層に囲まれているため、腫瘍のサイズを測定することも難しい。
【００３６】
前立腺腫瘍（Ｔ）のステージはＴ１からＴ４までの４つのカテゴリーで表される。Ｔ１については、癌は顕微鏡的、片側性かつ触診不可能である。医師は腫瘍を触知することも、あるいは経直腸超音波検査などの撮影によって見ることもできない。ＢＰＨの治療によって疾患が明らかになることもあれば、ＰＳＡの上昇が原因で実施した針生検で確認されることもある。Ｔ２については、医師はＤＲＥにより癌を触知することができる。疾患は片側または両側前立腺に限局されると思われる。Ｔ３については、癌は前立腺のすぐ外側の組織まで進行している。Ｔ４については、癌は身体の他の部分に拡散している。
【００３７】
したがって、現行のスクリーニング方法では不満足であり；前立腺癌を診断する、または大半の患者で主な死因となるその転移的拡散の可能性を予測または予防するための信頼できる方法がない。
【００３８】
（乳癌）
乳癌のために一般的に用いられるスクリーニング法は自己および臨床的乳房検査、Ｘ線マンモグラフィ、および乳房磁気共鳴影像法（ＭＲＩ）である。乳癌スクリーニングを目的とした最新技術は、Ｘ線マンモグラフィに用いられる危険な放射線照射を用いることなく、音波を用いて３次元画像を作製しかつ乳癌を検出する超音波コンピューター断層撮影法である。遺伝子検査を用いることもある。乳癌の遺伝子検査は、典型的にはＢＲＣＡ遺伝子における突然変異の検査を包含する。乳癌のリスクが高い者を除き、一般的に推奨される技術ではない。
【００３９】
米国において、女性に最も多い死因の１つである乳癌の発生率はこの３０年の間に徐々に増加している。乳癌の病因が不明である一方で、特に３０歳未満の女性では、正常乳房上皮の悪性表現型へのトランスフォーメーションは遺伝的因子の結果であることもある（Ｍｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：６６−７１）。最近では、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２の発見およびキャラクタライゼーションによって家族性乳癌に寄与することのある遺伝的因子についての我々の知見が拡大している。これら２つの座位内における生殖細胞系突然変異は、乳癌および／または卵巣癌の障害リスクの５０〜８５％と関連している（Ｃａｓｅｙ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．９：８８−９３；Ｍａｒｃｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｃａｎｃｅｒ  ７７：６９７−７０９）。しかし、他の非遺伝的因子も疾患の病因に対して著しい影響を有する可能性がある。その由来にかかわらず、乳癌がその進行における初期に検出されない場合、その罹患率および死亡率は有意に上昇する。したがって、乳房組織における細胞のトランスフォーメーションおよび腫瘍形成の早期検出には相当な労力が集中されている。
【００４０】
現在、乳癌を鑑別するための主な方法は高密度腫瘍組織の存在の検出を介する。これは、乳房の外部の直接的検査によって、もしくはマンモグラフィまたは他のＸ線撮像法によって、異なる有効性の度合いで達成されうる（Ｊａｔｏｉ，１９９９，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．１７７：５１８−５２４）。しかし、後者の手法は相当な費用を伴う。マンモグラフを撮影するたびに、患者は検査時に用いる放射線の電離性によって乳房腫瘍が誘発されるというわずかなリスクを負う。さらに、当該プロセスは高価でありかつ技術者の主観的解釈が不正確さにつながることがあり、たとえばある研究では、調査対象の放射線科医群が１組のマンモグラムを個別に解釈したところ約３分の１に大きな臨床的不一致があったことが示されている。さらに、多くの女性がマンモグラムの受診は苦痛を伴う経験であると見なしている。したがって、米国国立癌研究所は、５０歳未満の女性はこれより年長の女性ほど乳癌を発症する可能性が高くないので、この集団に対してマンモグラムを推奨していない。しかし、５０歳未満の女性に発生する乳癌はわずかに約２２％であるものの、閉経前女性における乳癌の方が悪性度が高いことがデータより示唆されていることは認めざるを得ない。
【００４１】
（ＰＡＸ２）
ＰＡＸ遺伝子は、核転写因子をコードする９つの発生制御遺伝子のファミリーである。胚形成において重要な役割を果たし、かつ非常に整然とした時間的および空間的パターンで発現する。いずれも、進化の過程において高度に保持されるＤＮＡ結合ドメインをコードする３８４塩基対の「ペアードボックス」領域を含む（Ｓｔｕａｒｔ，ＥＴ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。発生プロセスに対するＰＡＸ遺伝子の影響は、ＰＡＸ遺伝子におけるヘテロ接合性不全にも直接起因すると考えることのできる数多くの天然マウスおよびヒト症候群によって証明されている。ＰＡＸ２配列はＤｒｅｓｓｌｅｒ他、１９９０に示されている。ヒトＰＡＸ２タンパク質およびその変異型のアミノ酸配列、さらには当該タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、配列番号５８〜６９（配列番号５８、ヒトＰＡＸ２のエクソン１によりコードされるアミノ酸配列；配列番号５９、ヒトＰＡＸ２遺伝子プロモーターおよびエクソン１；配列番号６０、ヒトＰＡＸ２のアミノ酸配列；配列番号６１、ヒトＰＡＸ２遺伝子；配列番号６２、ヒトＰＡＸ２遺伝子変異型ｂのアミノ酸配列；配列番号６３、ヒトＰＡＸ２遺伝子変異型ｂ；配列番号６４、ヒトＰＡＸ２遺伝子変異型ｃのアミノ酸配列；配列番号６５、ヒトＰＡＸ２遺伝子変異型ｃ；配列番号６６、ヒトＰＡＸ２遺伝子変異型ｄのアミノ酸配列；配列番号６７、ヒトＰＡＸ２遺伝子変異型ｄ；配列番号６８、ヒトＰＡＸ２遺伝子変異型ｅのアミノ酸配列；配列番号６９ヒトＰＡＸ２遺伝子変異型ｅ）。
【００４２】
ＰＡＸ２発現が検出されている癌の例を表１に示す。
【００４３】
【表１】
2013510558.tif 000003
【００４４】
（ＤＥＦＢ１）
βディフェンシンは、上皮および白血球の産生物である広域抗微生物活性スペクトラムを有する陽イオン性ペプチドである。単一遺伝子の産物であるこれら２つのエクソンは上皮表面に発現し、皮膚、角膜、舌、歯肉、唾液腺、食道、腸、腎臓、尿生殖路、および呼吸上皮を含む部位において分泌される。これまで、ヒトにおいては５つの上皮由来βディフェンシン遺伝子が同定およびキャラクタライゼーションされている：ＤＥＦＢ１（Ｂｅｎｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５），ＤＥＦＢ２（Ｈａｒｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、ＤＥＦＢ３（Ｈａｒｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、ＤＥＦＢ４およびＨＥ２／ＥＰ２。
【００４５】
各βディフェンシン遺伝子産物の一次構造は、小さなサイズ、６個のシステインモチーフ、高い正電荷、およびこれらの特性以外は多様性が非常に大きいことを特徴とする。ディフェンシンタンパク質の最も特徴的な性質は、３個のジスルフィド結合ネットワークを形成するその６個のシステインモチーフである。βディフェンシンタンパク質における３個のジスルフィド結合はＣ１−Ｃ５，Ｃ２−Ｃ４およびＣ３−Ｃ６間にある。隣接するシステイン残基の最も一般的な間隔は６、４、９、６、０である。βディフェンシンタンパク質におけるシステインの間隔は、カルボキシ末端に最も近いＣ５およびＣ６を除いて１または２アミノ酸異なることがある。全ての公知の脊椎動物βディフェンシン遺伝子においては、これら２つのシステイン残基は互いに隣接している。
【００４６】
βディフェンシンタンパク質の第２の特徴はその小さなサイズである。各βディフェンシン遺伝子はサイズの範囲が５９〜８０アミノ酸であり平均サイズが６５アミノ酸であるプレプロタンパク質をコードする。次に、この遺伝子産物は未知の機構によって開裂され、サイズの範囲が３６〜４７アミノ酸であり平均サイズが４５アミノ酸である成熟ペプチドを作製する。これらの範囲の例外は、βディフェンシンモチーフを含みかつ精巣上体に発現するＥＰ２／ＨＥ２遺伝子産物である。
【００４７】
βディフェンシンタンパク質の第３の特徴は、高い陽イオン残基濃度である。成熟ペプチドの正電荷残基（アルギニン、リジン、ヒスチジン）の個数の範囲は６〜１４であり平均は９である。
【００４８】
βディフェンシン遺伝子産物の最後の特徴は、その一次構造は多様であるが三次構造は見かけ上維持されることである。６個のシステイン以外には、このタンパク質ファミリーの全公知メンバーにおいて所与の位置に保持されているアミノ酸はない。しかし、二次および三次構造および機能にとって重要と見られる位置は維持されている。
【００４９】
βディフェンシンタンパク質の一次アミノ酸配列の多様性は大きいものの、このタンパク質ファミリーの三次構造が維持されていることは限定的データによって示唆される。ＢＮＢＤ−１２およびＤＥＦＢ２によってコードされるタンパク質が例示するように、構造の中核は３本鎖逆平行βシートである。３本のβ鎖がβターンとαヘアピンループによって連結され、かつ２本目のβ鎖はβバルジも含む。これらの構造がその固有の三次構造に折りたたまれるとき、一見ランダムであった陽イオンおよび疎水性残基の配列が球状タンパク質の２つの面に集中する。一方の面は親水性でありかつ正電荷側鎖の多くを含み、もう一方は疎水性である。溶液中では、ＤＥＦＢ２遺伝子によってコードされるＨＢＤ−２タンパク質は、過去にα−ディフェンシンの溶液構造またはβディフェンシンＢＮＤＢＤ−１２に帰せられていなかったＮ末端近傍のαヘリックスセグメントを示した。その側鎖がタンパク質の表面を向いたアミノ酸はβディフェンシンタンパク質間で保持されることがより少ない一方で、コアβシートの３本のβ鎖のアミノ酸残基はより高度に維持されている。
【００５０】
βディフェンシンペプチドはプレプロペプチドとして産生された後、開裂してＣ末端活性ペプチドフラグメントを遊離するが；気道上皮のヒトβディフェンシンペプチドの細胞内プロセシング、貯蔵および遊離経路は未知である。
【００５１】
（ＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１発現比率の測定）
組織におけるＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１発現レベルは、技術上公知であるあらゆる方法によって測定することができる。一定の実施形態においては、標的組織におけるＰＡＸ２およびＤＥＦＢ１発現のレベルは、生検サンプルといった標的組織から直接採取された１個または複数の細胞におけるＰＡＸ２およびＤＥＦＢ１のレベルを測定することによって測定される。他の実施形態においては、標的組織におけるＰＡＸ２およびＤＥＦＢ１発現のレベルは、血液または血漿といった一定の体液におけるＰＡＸ２およびＤＥＦＢ１のレベルを測定することによって間接的に測定される。
【００５２】
一定の実施形態においては、対象の前立腺または乳房におけるＰＡＸ２およびＤＥＦＢ１発現のレベルは、前立腺または乳房からの細胞サンプルを用いて測定することができる。細胞サンプルは前立腺または乳房の生検サンプルおよび血液サンプルを含む。生検とは、標的器官より小さな組織サンプルを切除してさらに分析する手技である。前立腺生検は、典型的にはＰＳＡ血液検査からのスコアが前立腺癌が存在する可能性と関係するレベルまで上昇したときに実施する。同様に、乳房生検は、典型的には乳房の塊または疑わしいマンモグラムを有する患者において実施する。
【００５３】
遺伝子発現のレベルはＲＮＡおよびタンパク質レベルで評価することができる。ＲＮＡレベルは、たとえばＤＮＡアレイ、ＲＴ−ＰＣＲおよびノーザンブロッティングで測定してもよい。タンパク質レベルはイムノアッセイおよび酵素分析で測定してもよい。一定の実施形態においては、ＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１発現比率は、対照遺伝子の発現レベルに対するＰＡＸ２遺伝子の発現レベルを測定し、同一の対照遺伝子の発現レベルに対するＤＥＦＢ１遺伝子の発現レベルを測定し、かつＰＡＸ２およびＤＥＦＢ１の発現レベルに基づいてＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１発現比率を算出することによって測定される。１つの実施形態においては、対照遺伝子はグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子である。
【００５４】
（オリゴヌクレオチドマイクロアレイ）
オリゴヌクレオチドマイクロアレイは、フィーチャーと呼ばれる、それぞれが少量（典型的にはピコモルの範囲）の特異的オリゴヌクレオチド配列を含む、整列した一連の複数のオリゴヌクレオチドの顕微鏡的スポットよりなる。特異的オリゴヌクレオチド配列は、厳密度の高い条件下でｃＤＮＡまたはｃＲＮＡサンプルをハイブリダイズするためのプローブとして用いられる短い遺伝子の切片または他のオリゴヌクレオチドエレメントとすることができる。通常、プローブ標的ハイブリダイゼーションは、標的における核酸配列の相対的な存在度を測定することを目的とした蛍光体標識した標的の蛍光ベース検出によって検出および定量される。
【００５５】
プローブは、典型的には（エポキシ−シラン、アミノ−シラン、リジン、ポリアクリルアミドなどを介した）化学的マトリクスとの共有結合により固形物表面に結合する。固形物表面はガラスまたはシリコンチップまたは顕微鏡的ビーズとすることができる。オリゴヌクレオチドアレイは、ヌクレオチドを測定するのか、それともその検出系の一部としてオリゴヌクレオチドを用いるかという点でのみ、他の種類のマイクロアレイと異なる。
【００５６】
オリゴヌクレオチドアレイを用いて標的組織または細胞における遺伝子発現を検出するために、目的の核酸を標的組織または細胞より精製する。ヌクレオチドは、発現プロファイリングを目的とした全ＲＮＡ、比較ハイブリダイゼーションを目的としたＤＮＡまたは後成的または調節研究を目的として免疫沈降させた（ＣｈＩＰオンチップ）特定のタンパク質と結合したＤＮＡ／ＲＮＡである。
【００５７】
１つの実施形態においては、全ＲＮＡはチオシアン酸グアニジウム−フェノール−クロロホルム抽出（例：トリゾール）によって分離される（核または細胞質そのままの全体）。精製されたＲＮＡは品質（例：キャピラリー電気泳動により）および量（例：ナノドロップ分光器を用いてについて分析してもよい。全ＲＮＡとは、ポリＴプライマーまたはランダムプライマーによりＤＮＡに逆転写されるＲＮＡである。ＰＣＲによってＤＮＡ産物を任意に増幅してもよい。ＲＴ手順において、または増幅後の追加的な手順がある場合はその手順において、増幅産物に標識を付加する。標識は蛍光標識または放射標識とすることができる。次に、標識ＤＮＡ産物をマイクロアレイにハイブリダイズする。次にマイクロアレイを洗い、さらにスキャンする。目的の遺伝子の発現レベルは、技術上周知の方法を用いたハイブリダイゼーションの結果に基づいて測定される。
【００５８】
（イムノアッセイ）
イムノアッセイは、その最も単純かつ直接的意味においては、抗体と抗原の間の結合を包含する結合分析である。多くのイムノアッセイの種類およびフォーマットが公知であり、いずれも開示されるバイオマーカーを検出するのに適している。イムノアッセイの例は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、放射免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）、イムノビーズキャプチャーアッセイ、ウェスタンブロッティング、ドットブロッティング、ゲルシフトアッセイ、フローサイトメトリー、タンパク質アレイ、多重ビーズアレイ、磁気キャプチャー、インビボイメージング、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、およびフォトブリーチング後の蛍光回復／局在測定（ＦＲＡＰ／ＦＬＡＰ）である。
【００５９】
一般的に、イムノアッセイは、免疫複合体の形成を可能とするのに有効な条件において、場合に応じ、（本明細書に開示されるバイオマーカーなどの）該当分子を含むと疑われるサンプルを該当分子に対する抗体と接触させること、または（本明細書に開示されるバイオマーカーに対する抗体などの）該当分子に対する抗体を当該抗体と結合することのできる分子と接触させることを包含する。多くの形態のイムノアッセイにおいて、その後に組織切片、ＥＬＩＳＡプレート、ドットブロットまたはウェスタンブロットといったサンプル−抗体組成物を洗い、あらゆる非特異的結合抗体種を除去し、一次免疫複合体内で特異的に結合する抗体のみを検出することを可能とする。
【００６０】
放射免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）は、放射標識した抗原を用いて血清中の特異抗体を検出する高感度測定法である。抗原を血清と反応させた後、たとえばプロテインＡセファロースビーズなどの特殊な試薬を用いて沈降させる。結合した放射標識免疫沈降物は、その後一般的にはゲル電気泳動により測定する。放射免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）は、ＨＩＶ抗体の存在を診断するための確認検査としてしばしば用いられる。ＲＩＰＡは、当分野ではファールアッセイ、プレシピチンアッセイ、放射免疫プレシピチンアッセイ、放射免疫沈降分析、放射免疫沈降分析、および放射免疫沈降分析などとも呼ばれる。
【００６１】
固形支持体（例：試験管、ウェル、ビーズ、またはセル）上のタンパク質またはタンパク質に対して特異的な抗体を検出する方法と組み合わせた、タンパク質またはタンパク質に対して特異的な抗体が支持体と結合してそれぞれ該当抗体またはタンパク質をサンプルから捕捉することを特徴とするイムノアッセイも考慮される。そのようなイムノアッセイの例はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリー、タンパク質アレイ、多重ビーズ分析法、および磁気キャプチャーを含む。
【００６２】
タンパク質アレイは、ガラス、膜、マイクロタイターウェル、質量分析計プレート、およびビーズまたは他の粒子を含む表面に固定したタンパク質を用いる固相リガンド結合アッセイである。アッセイは並列性が高く（多重）かつしばしば極小化される（マイクロアレイ、タンパク質チップ）。その利点は迅速かつ自動化可能である、高感度とすることができる、試薬に関して経済的、かつ１回の実験で豊富なデータが得られることなどを含む。バイオインフォルマティクス支援は重要であり；データハンドリングには高度なソフトウェアおよびデータ比較分析を要求される。しかし、多くのハードウェアおよび検出システムがそうであるように、ソフトウェアはＤＮＡアレイに対して用いられるものから適合化することができる。
【００６３】
キャプチャーアレイは診断チップおよび発現プロファイリング用アレイの基盤を形成する。従来の抗体、シングルドメイン、人工スカフォールド、ペプチドまたは核酸アプタマーなどの高親和性キャプチャー試薬を用いて、高スループットで特定の標的リガンドと結合およびこれを検出する。抗体アレイは市販されている。従来の抗体に加えて、ＦａｂおよびｓｃＦｖフラグメント、ラクダまたは組換えヒト同等物由来のシングルＶドメイン（ドマンティス、マサチューセッツ州ウォルサム）も、アレイにおいて有用となりうる。
【００６４】
非タンパク質捕捉分子、特に高い特異性および親和性でタンパク質リガンドと結合する１本鎖核酸アプタマー（ソマロジック、コロラド州ボールダー）もアレイにおいて用いられる。アプタマーは、セレックス（商標）法によってオリゴヌクレオチドのライブラリから選択し、またそのタンパク質との相互作用は、ブロモデオキシウリジン取り込みおよびＵＶ活性化架橋による共有結合によって強化することができる（フォトアプタマー）。リガンドとの光架橋によって、特異的立体要件によるアプタマーの交差反応性が低下する。アプタマーは、自動化オリゴヌクレオチド合成による精製の容易さおよびＤＮＡの安定性および堅牢性という利点を有し；フォトアプタマーアレイ上では、汎用的蛍光タンパク質染色を用いることができる。
【００６５】
キャプチャー分子のアレイの代替物は、ペプチド（例：タンパク質のＣ末端領域由来）を、重合可能なマトリクス内に構造的に相補的な配列特異的空隙を作製するための鋳型として用いる「分子インプリンティング」技術によって形成されるものであり；空隙はその後適切な一次アミノ酸配列を有する（変性）タンパク質を特異的に捕捉することができる（ＰｒｏｔｅｉｎＰｒｉｎｔ（商標）、Ａｓｐｉｒａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州バーリンゲーム）。
【００６６】
診断的にかつ発現プロファイリングにおいて用いることができる他の方法論は、固相クロマトグラフィー表面が血漿または腫瘍抽出物などの混合物に由来する同様の電荷または疎水性特性を有するタンパク質と結合し、さらにＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を用いて保持されたタンパク質を検出するＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ、カリフォルニア州フリーモント）である。
【００６７】
他の有用な方法論は、チップ上に多数の精製タンパク質を固定することによって構築される大スケール機能性チップ、および多重ビーズアッセイを含む。
【００６８】
（抗体）
本明細書においては、用語「抗体」は広義に用いられかつポリクローナルおよびモノクローナル抗体を共に含む。無傷の免疫グロブリン分子に加えて、たとえばＰＡＸ２がＤＥＦＢ１と相互作用することを妨げるよう、ＰＡＸ２またはＤＥＦＢ１と相互作用する能力について選択されている限り、それらの免疫グロブリン分子のフラグメントまたはポリマー、および免疫グロブリン分子のヒトまたはヒト化バージョンまたはそのフラグメントも用語「抗体」に含まれる。ＰＡＸ２とＤＥＦＢ１との相互作用に関与するＰＡＸ２またはＤＥＦＢ１の開示領域と結合する抗体も開示される。抗体は、本明細書に記載のインビトロアッセイまたは類似の方法を用いて、その所望の活性について試験することができ、その後に公知の臨床的検査法に従ってインビボ治療および／または予防活性を試験する。
【００６９】
本明細書のモノクローナル抗体は、所望の拮抗活性を示す限り、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一または相同である一方で、残余の鎖が他の種に由来するかまたは他の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一または相同である「キメラ抗体」、さらにはこうした抗体のフラグメントを具体的に含む（米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１  ６８５５（１９８４）を参照）。
【００７０】
本明細書で用いるところの用語「抗体」または「複数の抗体」は、ヒト抗体および／またはヒト化抗体も指すことがある。多くの非ヒト抗体（例：マウス、ラットまたはウサギに由来するものなど）は天然ではヒトに対して抗原性であるので、ヒトに投与するとき望ましくない免疫応答を引き起こすことがある。したがって、方法においてヒトまたはヒト化抗体を使用することは、ヒトに投与された抗体が望ましくない免疫応答を惹起する確率を低下させるのに役立つ。非ヒト抗体をヒト化する方法は技術上周知である。
【００７１】
（ゲノム薬理）
他の実施形態においては、乳癌のゲノム薬理を測定するためにＰＡＸ２および／またはＤＥＦＢ１発現プロフィールが用いられる。ゲノム薬理は、個体の遺伝子型とその個体の外来化合物または薬剤に対する応答の関係を指す。薬理活性薬剤の用量と血中濃度の関係を変化させることによって、治療薬の代謝の差が重度の毒性または治療の失敗につながることがある。したがって、医師または臨床家は、抗癌薬を投与するか否か決定する際、さらには抗癌薬による治療の用量および／または治療レジメンを調節する際に、関連するゲノム薬理研究において得られた知見を適用することを考慮してもよい。
【００７２】
ゲノム薬理は、患者における薬剤の処理および異常な作用が原因となる、薬剤に対する応答における臨床的に重大な遺伝的変異を扱う。一般的には、２種類のゲノム薬理的条件を識別することができる。薬剤が身体に作用する様式を変化させる単一の因子（薬剤作用の変化）として伝達される遺伝的条件または身体が薬剤に作用する様式を変化させる単一の因子（薬剤代謝の変化）として伝達される遺伝的条件。これらの遺伝薬理学的条件はまれな遺伝的欠損として、または天然に発生する遺伝多型として起こることがある。たとえば、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ欠損（Ｇ６ＦＤ）は、主な臨床的合併症が酸化薬剤（抗マラリア薬、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン）摂取およびソラ豆の摂取後の溶血である一般的な遺伝性酵素病である。
【００７３】
「ゲノムワイド関連」として知られる薬剤応答を予測する遺伝子を同定するための１つのゲノム薬理学的手法は、既知の遺伝子間連部位（例：それぞれが２つの変異型を有するヒトゲノム上の６０，０００〜１００，０００個の多型または可変部位からなる「両アレル」遺伝子マーカーマップなど）からなるヒトゲノムの高分解度マップに主として依拠している。そのような高分解度遺伝子マップは、第ＩＩ／ＩＩＩ相医薬品治験に参加する統計的に相当な数の被験者のそれぞれのゲノムのマップと比較し、具体的に観察される薬剤応答または副作用と関連する遺伝子を同定することができる。代替的に、ヒトゲノムにおける数千万個の公知の一塩基多型（ＳＮＰ）の組合せからそのような高分解度マップを作製することができる。本明細書で用いるところの「ＳＮＰ」は、ＤＮＡの全長内の単一のヌクレオチド塩基において発生する普通の変化である。たとえば、ＳＮＰはＤＮＡの１，０００塩基につき１回発生しうる。ＳＮＰは疾患の過程に関与することもある。しかし、大多数のＳＮＰは疾患と関連しないと思われる。このようなＳＮＰの発生に基づく遺伝子マップがある場合、個体はその個体ゲノムにおける特定のＳＮＰパターンに応じて遺伝的カテゴリーに分類することができる。このようにして、遺伝的に類似した個体間に共通した特性を考慮に入れ、このような遺伝的に類似した個体集団に対して治療レジメンを適合化することができる。したがって、ＰＡＸ２および／またはＤＥＦＢ１を乳房患者のＳＮＰマップに位置づけることにより、本明細書に記載の遺伝学的方法に従ってこれらの遺伝子をより容易に同定することが可能となりうる。
【００７４】
代替的に、薬剤応答を予想する遺伝子を特定するために「候補遺伝子アプローチ」と呼ばれる方法を用いることができる。この方法によれば、薬剤の標的をコードする遺伝子が判明している場合、集団においてその遺伝子の全ての一般変異体を比較的容易に同定することができ、かつ他のバージョンの遺伝子に対してあるバージョンを有することが特定の薬剤応答に関連しているか決定することができる。
【００７５】
１つの例示的実施形態として、薬剤代謝酵素の活性は薬剤作用の強度および持続時間の両者の主要な決定因子である。薬物代謝酵素（例：Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）およびチトクロームＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６およＣＹＰＺＣ１９）の遺伝子多型の発見は、ある薬剤の標準的かつ安全な用量の摂取後に一部の対象が予測された薬剤効果を得ることができないか、または過大な薬剤応答および重篤な毒性を示す理由についての説明を提供している。これらの多型は、母集団において２つの表現型、高代謝群および低代謝群として表される。低代謝表現型の有病率は母集団によって異なる。たとえば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は多型性が高く、かつ低代謝群において数種類の変異型が特定され、そのいずれもが機能的ＣＹＰ２Ｄ６の欠損につながっている。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の低代謝群は、標準用量を投与されるときに非常に高い頻度で過大な薬剤応答および副作用を経験する。ＣＹＰ２Ｄ６が形成する代謝物モルヒネを介したコデインの鎮痛効果で示されているように、代謝物が活性治療成分である場合、低代謝群は治療応答を示さない。もう一方の極は標準用量に応答しない、いわゆる超高速代謝群である。最近、超高速代謝の分子的根拠はＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅によることが確認されている。
【００７６】
代替的に、「遺伝子発現プロファイリング」と呼ばれる方法を用いて薬剤応答を予想する遺伝子を特定することができる。たとえば、薬剤を投与された動物の遺伝子発現は毒性と関連する遺伝子系路が活性化したか否かの目安とすることができる。
【００７７】
上記のゲノム薬理学的手法のうち２つ以上から得られた情報を用いて、個体の予防的または治療的処置のための適切な用量および治療レジメンを決定することができる。この知見を投与または薬剤の選択に適用するとき、副作用または治療の失敗を回避することができるため、乳房疾患を有する患者を治療する際に治療的または予防的有効性を向上させることができる。
【００７８】
１つの実施形態においては、ある対象におけるＰＡＸ２および／またはＤＥＦＢ１の発現プロフィール、さらにはＥＲ／ＰＲ状態を用いて、乳房疾患を有する個体に対する適切な治療レジメンを決定する。
【００７９】
他の実施形態においては、トリプルネガティブ乳癌（すなわちエストロゲン受容体（ＥＲ）陰性、プロゲステロン受容体（ＰＲ）陰性、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）陰性）の患者に対してＰＡＸ２発現レベル（典型的にはアクチン遺伝子またはＧＡＰＤＨ遺伝子のような対照遺伝子に対して測定）を用い、癌治療の有効性を測定するか、治療コースを決定するか、または癌の再発をモニタリングする。
【００８０】
（診断キット）
本発明の他の態様は、乳房状態をモニタリングするためのキットに関する。１つの実施形態においては、乳房状態をモニタリングするためのキットは：組織サンプルにおけるＰＡＸ２発現を検出するための１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマー対、組織サンプルにおけるＤＥＦＢ１発現を検出するための１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマー対、およびプライマーを用いて組織サンプル中のＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１発現比率を測定する方法についての説明書を含む。他の実施形態においては、配列番号：４３および４７、配列番号：４４および４８、および配列番号：４５および４９からなる群より選択される１つのオリゴヌクレオチドプライマー対を含むＰＡＸ２発現を検出するための１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマー対。他の実施形態においては、配列番号：３５および３７を含むＤＥＦＢ１発現を検出するための１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマー対。
【００８１】
他の実施形態においては、キットはさらに１つまたはそれ以上の対照オリゴヌクレオチドプライマー対を含む。１つの実施形態においては、１つまたはそれ以上の対照オリゴヌクレオチドプライマー対は、βアクチン発現の発現を検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーを含む。好ましい実施形態においては、βアクチン発現の発現を検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーは配列番号３４および３６を含む。
【００８２】
他の実施形態においては、１つまたはそれ以上の対照オリゴヌクレオチドプライマー対はＧＡＰＤＨ発現の発現を検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーを含む。好ましい実施形態においては、ＧＡＰＤＨ発現の発現を検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーは配列番号４２および４６を含む。
【００８３】
他の関連する実施形態においては、キットはさらに１つまたはそれ以上のＰＣＲ反応用試薬を含む。
【００８４】
さらに他の実施形態においては、キットはさらに１つまたはそれ以上のＲＮＡ抽出用試薬を含む。
【００８５】
他の実施形態においては、乳房状態をモニタリングするためのキットはＰＡＸ２およびＤＥＦＢ１発現を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブを有するオリゴヌクレオチドマイクロアレイ、およびオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて組織サンプル中のＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１発現比率を測定する方法についての説明書を含む。
【００８６】
関連する実施形態においては、キットは組織サンプルよりＲＮＡを抽出するための試薬をさらに含む。
【００８７】
本発明は、制限的と解釈すべきでない以下の実施例によってさらに例示される。本明細書全体において引用された全ての参照文献、特許および公開特許明細書、さらには図面および表はその全体を本明細書に参照文献として援用する。
【実施例１】
【００８８】
（ヒトβディフェンシン−１は後期ステージ前立腺癌に対して細胞毒性でありかつ前立腺癌腫瘍免疫において役割を果たす）
この実施例においては、ＤＥＦＢ１を誘導可能な発現系にクローニングし、正常な上皮細胞、およびアンドロゲン受容体陽性（ＡＲ＋）およびアンドロゲン受容体陰性（ＡＲ−）前立腺癌細胞株に対してどのような効果を有するか検討した。ＤＥＦＢ１発現の誘導により、ＡＲ−細胞ＤＵ１４５およびＰＣ３の細胞増殖は低下したが、ＡＲ＋前立腺癌細胞ＬＮＣａＰの増殖には影響しなかった。ＤＥＦＢ１はカスパーゼ介在性アポトーシスの迅速な誘発も引き起こした。本実施例に示したデータは、生得的腫瘍免疫におけるその役割のエビデンスを提供し、かつその低下が前立腺癌における腫瘍進行に寄与することを示す初めてのものである。
【００８９】
（材料と方法）
細胞株：細胞株ＤＵ１４５はＤＭＥＭ培地で培養し、ＰＣ３はＦ１２培地で増殖させ、さらにＬＮＣａＰはＲＰＭＩ培地で増殖させた（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州グランドアイランド）。３つの細胞株全ての増殖培地に１０％（ｖ／ｖ）胎仔ウシ血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加した。ｈＰｒＥＣ細胞を前立腺上皮基礎培地（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．、メリーランド州ウォーカーズビル）中で培養した。全ての細胞株は３７℃で５％ＣＯ２下に維持した。
【００９０】
組織サンプルおよびレーザーキャプチャーマイクロダイセクション：施設内倫理委員会が承認したプロトコルに従い、Ｈｏｌｌｉｎｇｓ癌センター腫瘍バンクを通じ、根治的前立腺切除術を受けた同意患者から採取した前立腺組織を入手した。これにはサンプルの処理、切片化、組織学的キャラクタライゼーション、ＲＮＡ精製およびＰＣＲ増殖のガイドラインが含まれた。凍結組織切片の病理学的検査の後、アッセイする組織サンプルが純粋な良性前立腺細胞集団よりなることを確認するために、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）を実施した。分析した各組織切片について、良性組織を含めた３つの異なる領域でＬＣＭを実施し、その後さらに採取した細胞をプールした。
【００９１】
ＤＥＦＢ１遺伝子のクローニング：逆転写ＰＣＲを用いて、ＲＮＡからＤＥＦＢ１  ｃＤＮＡを作製した。ＰＣＲプライマーはＣｌａＩおよびＫｐｎＩ制限部位を含むよう設計された。ＤＥＦＢ１  ＰＣＲ産物をＣｌａＩおよびＫｐｎＩによって制限消化し、さらにＴＡクローニングベクターにライゲーションした。次に、ＴＡ／ＤＥＦＢ１ベクターを熱ショックによりＥ．ｃｏｌｉにトランスフェクトし、さらに個々のクローンを選択して拡張した。Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＤＮＡ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ、カリフォルニア州バレンシア）でプラスミドを分離し、さらに自動シーケンシングで配列の完全性を検証した。次に、方向決定用の中間ベクターとして役立つＣｌａＩおよびＫｐｎＩで消化したｐＴＲＥ２に、ＤＥＦＢ１遺伝子フラグメントをライゲーションした。次に、ｐＴＲＥ２／ＤＥＦＢ１構築物をＡｐａＩおよびＫｐｎＩで消化してＤＥＦＢ１インサートを切り出し、これを同じくＡｐａＩおよびＫｐｎＩで二重消化したＥｃｄｙｓｏｎｅ  Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）のｐＩＮＤベクターにライゲーションした。構築物を再度Ｅ．ｃｏｌｉにトランスフェクトし、さらに個々のクローンを選択して拡張した。プラスミドを分離し、さらに自動シーケンシングによりｐＩＮＤ／ＤＥＦＢ１の配列完全性を再検証した。
【００９２】
トランスフェクション：１００ｍｍペトリ皿に細胞（１×１０６個）を播種し、１晩増殖させた。次に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて、ヘテロ二量体エクジソン受容体を発現するｐＶｇＲＸＲプラスミド１μｇおよびｐＩＮＤ／ＤＥＦＢ１ベクター構築物または空のｐＩＮＤ対照ベクター１μｇと共にオプティＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、ニューヨーク州グランドアイランド）中で細胞に同時トランスフェクトした。
【００９３】
ＲＮＡの分離および定量的ＲＴ−ＰＣＲ：ＤＥＦＢ１構築物をトランスフェクトした細胞におけるＤＥＦＢ１タンパク質発現を検証するために、ポナステロンＡ（ＰｏｎＡ）による２４時間誘導後にＲＮＡを採取した。簡潔に述べると、ＳＶ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マジソン）を用いて、トリプシン処理により回収した約１×１０６個の細胞より全ＲＮＡを分離した。この場合、細胞を溶解させ、さらにスピンカラムで遠心分離することにより全ＲＮＡを分離した。ＬＣＭによって採取した細胞については、メーカーのプロトコルに従いＰｉｃｏＰｕｒｅ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｒｃｔｕｒｕｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州マウンテンビュー）を用いて全ＲＮＡを分離した。ランダムプライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、両採取源からの全ＲＮＡ（各反応につき０．５μｇ）をｃＤＮＡに逆転写した。メーカーのプロトコルに従い、第１鎖の合成にはＡＭＶ逆転写酵素ＩＩ酵素（各反応につき５００単位；Ｐｒｏｍｅｇａ）を、第２鎖の合成にはＴｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ（各反応につき５００単位；Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。それぞれの場合、各後続ＰＣＲにつきｃＤＮＡを５０ｐｇ用いた。ＴａｑＭａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍのＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ＴｒａｎｓｃｒｉｐａｔａｓｅおよびＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、作製したｃＤＮＡに対して２段階ＱＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【００９４】
公開ＤＥＦＢ１配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｕ５０９３０）からＤＥＦＢ１のプライマー対（表２：ＱＲＴ−ＰＣＲプライマーの配列）を作製した。アニーリング温度５６℃を用いて、標準的な条件下でＰＣＲを４０サイクル実施した。さらに、ハウスキーピング遺伝子としてβアクチン（表３）を増幅し、全ｃＤＮＡの初期含有量を正規化した。ＤＥＦＢ１発現をＤＥＦＢ１とβアクチンの相対発現比率として算出し、さらにＤＥＦＢ１発現誘導細胞株と非誘導株、さらにはＬＣＭ良性前立腺組織と比較した。陰性対象として、ｃＤＮＡ鋳型を用いないＱＲＴ−ＰＣＲ反応も実施した。全ての反応は３本ずつ３回実施した。
【００９５】
【表２】
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【００９６】
ＭＴＴ細胞生存率アッセイ：細胞の増殖に対するＤＥＦＢ１の影響を検討するために、代謝３−［４，５−ジメチルチアゾール−２イル］−２，５ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイを実施した。ｐＶｇＲＸＲプラスミドおよびｐＩＮＤ／ＤＥＦＢ１構築物または空のｐＩＮＤベクターを同時トランスフェクトしたＰＣ３、ＤＵ１４５およびＬＮＣａＰを、９６ウェルプレート上に１〜５×１０３細胞／ウェルで播種した。播種より２４時間後、１０μＭポナステロンＡを含有する新鮮な増殖培地を毎日添加してＤＥＦＢ１発現を２４、４８および７２時間誘導した後、メーカーの取扱説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従ってＭＴＴ分析を実施した。反応は３本ずつ３回実施した。
【００９７】
フローサイトメトリー：ＤＥＦＢ１発現系を同時トランスフェクトしたＰＣ３およびＤＵ１４５細胞を６０ｍｍの皿で培養し、１０μＭポナステロンＡにより１２、２４および４８時間誘導した。各インキュベーション時間後、（非付着細胞があれば保持するために）プレートから培地を採取し、プレートを洗うのに用いたＰＢＳと合わせた。残りの付着細胞をトリプシン処理により回収し、さらに非付着細胞およびＰＢＳと合わせた。次に細胞を４℃で５分間ペレット化し（５００×ｇ）、ＰＢＳで２回洗い、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ  ５μＬおよびＰＩ  ５μＬを含む１×アネキシン結合バッファー（ｐＨ７．４の０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ／ＮａＯＨ、１．４Ｍ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＣａＣｌ２）１００ｕＬに再懸濁した。細胞を室温で遮光して１５分間インキュベートし、その後１×アネキシン結合バッファー４００μＬで希釈し、ＦＡＣスキャン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州サンホセ）で分析した。全ての反応は３回実施した。
【００９８】
顕微鏡分析：位相差顕微鏡により細胞の形態を分析した。ベクターを含まないか、空のプラスミドまたはＤＥＦＢ１プラスミドを含有するＤＵ１４５、ＰＣ３およびＬＮＣａＰ細胞を６ウェル培養プレートに播種した（ＢＤ  ＦＡＬＣＯＮ、米国）。翌日、１０μＭポナステロンＡを含有する培地でプラスミド含有細胞を４８時間誘導する一方で、対照細胞には新鮮な培地を与えた。次に、細胞を倒立型Ｚｅｉｓｓ  ＩＭ  ３５顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）の下で観察した。ＳＰＯＴ  Ｉｎｓｉｇｈｔ  Ｍｏｓａｉｃ  ４．２カメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国）を用いて、細胞の１視野の位相差写真を撮影した。倍率３２倍の位相差顕微鏡で細胞を検査し、デジタル画像を無圧縮ＴＩＦＦファイルとし保存し、さらに画像処理およびハードコピーの提示のためにＰｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳソフトウェア（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州サンホセ）にエクスポートした。
【００９９】
カスパーゼの検出：ＡＰＯ  ＬＯＧＩＸ（商標）Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ  Ｃａｓｐａｓｅ検出キット（Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カリフォルニア州マウンテンビュー）を用いて、前立腺癌細胞株におけるカスパーゼ活性の検出を実施した。活性カスパーゼは、活性カスパーゼと不可逆的に結合するＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫ阻害剤の使用によって検出した。簡便に述べると、ＤＥＦＢ１発現系を含有するＤＵ１４５およびＰＣ３細胞（１．５〜３×１０５）を３５ｍｍガラス底マクロウェル皿（Ｍａｔｅｋ、マサチューセッツ州アッシュランド）に撒き、培地のみまたは前述したところのＰｏｎＡ含有培地で２４時間処理した。次に、カルボキシフルオレセイン標識ペプチドフルオロメチルケトン（ＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫ）の３０×作業希釈液１０μＬを培地３００μＬに添加し、３５ｍｍ皿にそれぞれ加えた。次に、細胞を５％ＣＯ２下において３７℃で１時間インキュベートした。次に、培地を吸引し、１×作業用洗浄バッファー希釈液２ｍＬで細胞を２回洗った。細胞を、微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）または４８８ｎｍのレーザー励起の下で観察した。共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５  Ｐａｓｃａｌ）および６３×ＤＩＣ油浸レンズをＶａｒｉｏ  ２ＲＧＢ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｍｏｄｕｌｅで用いて蛍光信号を分析した。
【０１００】
統計解析：統計的な差は、対応のない数値に対するスチューデントのｔ検定を用いて評価した。両側計算によりｐ値を決定し、ｐ値が０．０５未満であれば統計的に有意であると見なした。
【０１０１】
前立腺組織および細胞株におけるＤＥＦＢ１発現：良性および悪性前立腺組織、ｈＰｒＥＣ前立腺上皮細胞ならびにＤＵ１４５、ＰＣ３およびＬＮＣａＰ前立腺癌細胞におけるＤＥＦＢ１発現レベルをＱＲＴ−ＰＣＲにより測定した。全ての良性臨床サンプルにおいてＤＥＦＢ１発現が検出された。相対ＤＥＦＢ１発現の平均量は０．００７３であった。さらに、ｈＰｒＥＣ細胞におけるＤＥＦＢ１相対発現は０．００８９であった。良性前立腺組織サンプルとｈＰｒＥＣにおいて検出されたＤＥＦＢ１発現には統計的な差がなかった（図１Ａ）。前立腺癌細胞株における相対ＤＥＦＢ１発現レベルの分析により、ＤＵ１４５、ＰＣ３およびＬＮＣａＰにおけるレベルが有意に低いことが明らかとなった。さらなる基準点として、患者番号１２１５からの前立腺組織の隣接悪性切片における相対ＤＥＦＢ１発現を測定した。３つの前立腺癌細胞株に認められたＤＥＦＢ１発現のレベルは、患者番号１２１５からの悪性前立腺組織と比較して有意差がなかった（図１Ｂ）。さらに、４サンプル全てにおける発現レベルは、内因性ＤＥＦＢ１発現がほとんど確認されない鋳型を含まない陰性対象に近かった（データは示さず）。ＤＥＦＢ１発現系をトランスフェクトした前立腺癌細胞株に対してもＱＲＴ−ＰＣＲを実施した。２４時間の誘導時間後の相対発現レベルはＤＵ１４５で０．０１３６０、ＰＣ３で０．０１５０３、かつＬＮＣａＰで０．１３８であった。ゲル電気泳動により増幅産物を検証した。
【０１０２】
良性、ＰＩＮおよび癌を含むＬＣＭ組織領域に対してＱＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＤＥＦＢ１の相対発現は良性領域で０．０１４６であるのに対し、悪性領域では０．０００９であった（図１Ｃ）。これは９４％の減少に相当し、有意な発現のダウンレギュレーションを再度証明する。さらに、ＰＩＮの分析によりＤＥＦＢ１発現レベルは７０％の減少である０．０４４と判明した。患者番号１４５７における発現を、他の６例の患者の良性領域で認められた平均発現レベルと比較すると（図１Ａ）、ほぼ２倍の発現に相当する比率１．９９７が明らかとなった（図１Ｄ）。しかし、良性組織における平均発現レベルと比較した発現比率はＰＩＮにおいて０．０５９５であり悪性組織において０．１２５であった。
【０１０３】
ＤＥＦＢ１は細胞膜透過性およびラフリングを引き起こす：前立腺癌細胞株におけるＤＥＦＢ１発現を誘導したところＤＵ１４５およびＰＣ３の細胞数は低下したが、ＬＮＣａＰの増殖には影響しなかった（図２）。陰性対照として、空のプラスミドを含有する全３種類の細胞株において増殖をモニタリングした。ＰｏｎＡ添加後のＤＵ１４５、ＰＣ３またはＬｎＣａＰ細胞における細胞の形態には、観測可能な変化はなかった。さらに、ＤＥＦＢ１誘導の結果としてＤｕ１４５およびＰＣ３のいずれにも形態学的変化が発生した。この場合、細胞の外観はより円形でありかつ細胞死を示す膜ラフリングを呈した。両細胞株にはアポトーシス小体も存在していた。
【０１０４】
ＤＥＦＢ１発現により細胞生存率が低下する：ＭＴＴアッセイにより、ＰＣ３およびＤＵ１４５細胞においてＤＥＦＢ１による細胞生存率の低下が示されたが、ＬＮＣａＰ細胞に対する有意な影響は示されなかった（図３）。２４時間後の相対的細胞生存率はＤＵ１４５で７２％およびＰＣ３で５６％であった。誘導から４８時間後の分析ではＤＵ１４５の細胞生存率が４９％でありかつＰＣ３における細胞生存率が３７％であることが判明した。ＤＥＦＢ１発現から７２時間後には、ＤＵ１４５およびＰＣ３細胞における相対細胞生存率はそれぞれ４４％および２９％となった。
【０１０５】
ＤＥＦＢ１は後期前立腺癌細胞において迅速なカスパーゼ介在性アポトーシスを引き起こす：ＰＣ３およびＤＵ１４５に対するＤＥＦＢ１の作用が細胞分裂抑制性であるかあるいは細胞毒性であるか測定するためにＦＡＣＳ分析を実施した。通常の増殖条件下において、ＰＣ３およびＤＵ１４５培養の９０％以上が生存しておりかつ非アポトーシス（左下象限）でありかつアネキシンＶまたはＰＩで染色されなかった（図４）。ＰＣ３細胞におけるＤＥＦＢ１発現誘導後のアポトーシス細胞数（右下および右上象限）は１２時間で合計１０％、２４時間で２０％、かつ４８時間で４４％であった。ＤＵ１４５細胞については、アポトーシス細胞は誘導より１２時間で合計１２％、２４時間で３４％、かつ４８時間で５９％であった。ＰｏｎＡによる誘導後に空のプラスミドを含有する細胞においてアポトーシスの増加は認められなかった（データは示さず）。
【０１０６】
カスパーゼ活性は共焦点レーザー顕微鏡分析によって測定した（図５）。ＤＵ１４５およびＰＣ３細胞のＤＥＥＦＢ１発現を誘導し、活発なアポトーシスを被る細胞における緑色蛍光ＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫのカスパーゼとの結合に基づいて活性をモニタリングした。ＤＩＣ下での細胞の分析により、０時間において生存可能な対照ＤＵ１４５（Ａ）、ＰＣ３（Ｅ）およびＬＮＣａＰ（Ｉ）細胞の存在が示された。４８８ｎｍの共焦点レーザーによって励起すると、検出可能な緑色染色は生成されず、ＤＵ１４５（Ｂ）、ＰＣ３（Ｆ）またはＬＮＣａＰ（Ｊ）にカスパーゼ活性がないことが示された。２４時間の誘導後、ＤＵ１４５（Ｃ）、ＰＣ３（Ｇ）およびＬＮＣａＰ（Ｋ）細胞はＤＩＣ下で再度可視となった。蛍光下の共焦点分析により、ＤＵ１４５（Ｄ）およびＰＣ３（Ｈ）細胞においてカスパーゼ活性を示す緑色染色が判明した。しかし、ＬＮＣａＰ（Ｌ）においては緑色染色がなく、ＤＥＦＢ１によるアポトーシスの誘導がないことが示された。
【０１０７】
結論として、この研究により前立腺癌におけるＤＥＦＢ１の機能的役割が提供される。さらに、これらの所見よりＤＥＦＢ１が腫瘍免疫に関与する生得免疫系の一部であることが示される。本明細書に提示するデータは、生理的レベルで発現されるＤＥＦＢ１はＡＲ−ホルモン不応性前立腺癌細胞に対して細胞毒性であるが、ＡＲ＋ホルモン感受性前立腺癌細胞または正常前立腺上皮細胞に対してはそうでないことを証明する。ＤＥＦＢ１が正常前立腺細胞において細胞毒性を伴わずに構造的に発現されることを考慮すると、末期ＡＲ−前立腺癌細胞は自らをＤＥＦＢ１細胞毒性に対して感受性とするような異なる表現型特性を有するかもしれない。したがって、ＤＥＦＢ１は後期前立腺癌の治療に対して有効な治療薬であり、また他の癌に対しても同様である可能性がある。
【実施例２】
【０１０８】
（ＰＡＸ２発現のｓｉＲＮＡ介在性ノックダウンによりｐ５３状態に依存しない前立腺癌細胞死が起こる）
本実施例は、ｐ５３遺伝子の状態が異なる前立腺癌細胞におけるＲＮＡ干渉によるＰＡＸ２発現阻害の効果を検討する。結果より、ＰＡＸ２阻害によってｐ５３状態とは無関係に細胞死がもたらされることが証明され、前立腺癌においてはＰＡＸ２によって阻害される追加的な腫瘍抑制遺伝子または細胞死経路が存在することが示される。
【０１０９】
（材料と方法）
ＰＡＸ２のｓｉＲＮＡサイレンシング：効率的な遺伝子サイレンシングを達成するために、ヒトＰＡＸ２  ｍＲＮＡ（アクセション番号ＮＭ＿００３９８９．１）を標的とした４つの相補的短鎖干渉性リボヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）のプールを合成した（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、米国コロラド州ラファイエット）。４つのｓｉＲＮＡの第２プールを内部標準として用い、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡの特異性を試験した。合成した配列のうち２つはＧＬ２ルシフェラーゼｍＲＮＡ（アクセション番号Ｘ６５３２４）を標的とし、２つは非配列特異的であった（表３：ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ配列．ＰＡＸ２タンパク質発現を阻害するために４つのｓｉＲＮＡプールを用いた）。ｓｉＲＮＡをアニーリングするために、３５Ｍの１本鎖をアニーリングバッファー（１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．４、２ｍＭ酢酸マグネシウム）において９０℃で１分間インキュベートした後、３７℃で１時間インキュベートした。
【０１１０】
【表３】
2013510558.tif 000005
【０１１１】
ウェスタン分析：簡潔に述べると、トリプシン処理により細胞を回収し、ＰＳＢで２回洗った。メーカーの取扱説明書（Ｓｉｇｍａ）に従って溶解バッファーを調製し、その後細胞に添加した。オービタルシェーカー上において４℃で１５分間インキュベーション後、細胞ライセートを採取し、１２０００×ｇで１０分間遠心分離して細胞デブリをペレット化した。その後タンパク質を含有する上清を採取して定量した。次に、タンパク質抽出物２５μｇを８〜１６％グラジエントＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ）に装填した。電気泳動後にタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、その後ＴＴＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ）中５％脱脂粉乳液で１時間ブロッキングした。次に、ブロットを１：２０００希釈ウサギ抗ＰＡＸ２一次抗体（Ｚｙｍｅｄ、カリフォルニア州サンフランシスコ）でプローブした。洗浄後、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートした抗ウサギ抗体（１：５０００希釈；Ｓｉｇｍａ）と共に膜をインキュベートし、Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｆｌｕｏｒｃｈｅｍ  ８９００上で化学発光試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてシグナル検出を可視化した。対照として、ブロットを剥離し、マウス抗βアクチン一次抗体（１：５０００，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＨＲＰコンジュゲート抗マウス二次抗体（１：５０００，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でリプローブし、シグナル検出を再度可視化した。
【０１１２】
位相差顕微鏡分析：位相差顕微鏡分析により、細胞増殖に対するＰＡＸ２ノックダウンの効果を分析した。この場合、１〜２×１０４細胞を６ウェル培養プレート（ＢＤ  ＦＡＬＣＯＮ、米国）上に播種した。翌日、細胞を培地のみ、陰性対照非特異的ｓｉＲＮＡまたはＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで処理し、さらに６日間インキュベートした。次に、細胞を倒立型ＺｅｉｓｓＩＭ３５顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）により倍率３２倍で観察した。ＳＰＯＴ  Ｉｎｓｉｇｈｔ  Ｍｏｓａｉｃ  ４．２カメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国）を用いて、細胞の１視野の位相差写真を撮影した。
【０１１３】
ＭＴＴ細胞毒性アッセイ：メーカーのプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従い、Ｃｏｄｅｂｒｅａｋｅｒトランスフェクション試薬を用いてＤＵ１４５、ＰＣ３およびＬＮＣａＰ細胞（１×１０５）にＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡプールまたは対照ｓｉＲＮＡプール０．５μｇをトランスフェクトした。次に、細胞懸濁液を希釈し、さらに１〜５×１０３細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、さらに２、４、または６日間増殖させた。培養後、３−［４，５−ジメチルチアゾール−２イル］−２，５ジフェニルテトラゾリウムブロミド、ＭＴＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の着色ホルマザン生成物への変換を測定することにより細胞生存率を測定した。走査型マルチウェル分光光度計上で５４０ｎｍにおける吸光度を読み取った。
【０１１４】
実施例１の記載に従い、前立腺癌細胞株におけるパンカスパーゼ検出および定量的リアルタイムＰＣＲを実施した。公開配列からＢＡＸ、ＢＩＤおよびＢＡＤプライマー対を作製した（表４：定量的ＲＴ−ＰＣＲプライマー．ＰＡＸ２およびＧＡＰＤＨを増幅するために用いたプライマーのヌクレオチド配列）。反応はＭｉｃｒｏＡｍｐ  Ｏｐｔｉｃａｌ  ９６ウェル反応プレート（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で実施した。アニーリング温度６０℃を用いて、標準的な条件下でＰＣＲを４０サイクル実施した。定量値は、指数的増幅が始まったサイクル数（閾値）により決定し、さらに３回繰り返して得られた値を平均した。メッセージレベルと閾値の間には逆関係があった。さらにＧＡＰＤＨをハウスキーピング遺伝子として用い、全ｃＤＮＡの初期含有量を正規化した。遺伝子発現は、プロアポトーシス遺伝子とＧＡＰＤＨ間の相対発現比率として算出した。全ての反応は３本ずつ実施した。
【０１１５】
【表４】
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【０１１６】
ＰＡＸ２タンパク質のｓｉＲＮＡ阻害：ｓｉＲＮＡがＰＡＸ２  ｍＲＮＡを有効にターゲティングしていることを確認するために、ウェスタン分析を実施して６日間の処理期間中のＰＡＸ２タンパク質発現レベルをモニタリングした。細胞に対してＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡのプールによるトランスフェクションを１ラウンド実施した。結果より、ＤＵ１４５（図６ａ）においては４日目まで、およびＰＣ３においては６日目まで（図６ｂ）にＰＡＸ２タンパク質のノックダウンが示されたことで、ＰＡＸ２  ｍＲＮＡの特異的ターゲティングが確認された。
【０１１７】
ＰＡＸ２のノックダウンにより前立腺癌細胞の増殖が阻害される：培地のみ、陰性対照非特異的ｓｉＲＮＡまたはＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡによる６日間処理後に細胞を分析した（図７）。ＤＵ１４５（ａ）、ＰＣ３（ｄ）およびＬＮＣａＰ（ｇ）細胞は、培地のみを含む培養皿において全て少なくとも９０％のコンフルエントに達した。ＤＵ１４５（ｂ）、ＰＣ３（ｅ）およびＬＮＣａＰ（ｈ）を陰性対照非特異的ｓｉＲＮＡで処理しても細胞の増殖に影響せず、細胞はやはり６日後にコンフルエントに達した。しかし、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで処理したところ細胞数は有意に減少した。ＤＵ１４５細胞は約１５％コンフルエント（ｃ）であり、ＰＣ３は１０％コンフルエントに過ぎなかった（ｆ）。ｓｉＲＮＡ処理後のＬＮＣａＰ細胞は５％コンフルエントであった。
【０１１８】
細胞毒性分析：２、４、および６日間曝露後に細胞生存率を測定し、さらに処理細胞の５７０〜６３０ｎｍ吸光度を未処理細胞のそれで割った比率として表す（図８）。２日間処理後の相対細胞生存率はＬＮＣａＰにおいて７７％、ＤＵ１４５において８２％、およびＰＣ３において７８％であった。４日後の相対的細胞生存率はＬＮＣａＰで４６％、ＤＵ１４５で５３％およびＰＣ３で６３％であった。６日間処理後の相対的細胞生存率はＬＮＣａＰで３１％、ＰＣ３で３７％およびＤＵ１４５で５３％まで低下した。陰性対照として、陰性対照非特異的ｓｉＲＮＡまたはトランスフェクション試薬のみによる６日間処理後に細胞生存率を測定した。いずれの条件についても、通常増殖培地と比較して細胞生存率に統計的に有意な変化はなかった。
【０１１９】
パンカスパーゼ検出：カスパーゼ活性は共焦点レーザー顕微鏡分析法によって検出した。ＤＵ１４５、ＰＣ３およびＬＮＣａＰ細胞をＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで処理し、蛍光緑色となる活発なアポトーシスを被る細胞におけるＦＡＭ標識ペプチドとカスパーゼの結合に基づいて活性をモニタリングした。培地のみで処理した細胞のＤＩＣ分析により、０時間における生存可能なＤＵ１４５（Ａ）、ＰＣ３（Ｅ）およびＬＮＣａＰ（Ｉ）細胞の存在が示される（図９）。４８８ｎｍの共焦点レーザーによって励起したところ、検出可能な緑色染色は生成されず、未処理ＤＵ１４５（Ｂ）、ＰＣ３（Ｆ）またはＬＮＣａＰ（Ｊ）にカスパーゼ活性がないことが示される。ＰＡＸ２  ｓｉＲＡＮによる４日間処理後、ＤＵ１４５（Ｃ）、ＰＣ３（Ｇ）およびＬＮＣａＰ（Ｋ）細胞はＤＩＣ下で再度可視となった。蛍光下で、処理されたＤＵ１４５（Ｄ）、ＰＣ３（Ｈ）およびＬＮＣａＰ（Ｌ）細胞は、カスパーゼ活性を示す緑色染色を呈した。
【０１２０】
ＰＡＸ２阻害のプロアポトーシス因子に対する影響：ＤＵ１４５、ＰＣ３およびＬＮＣａＰ細胞をＰＡＸ２に対するｓｉＲＮＡで６日間処理し、ｐ５３転写調節依存性および非依存性プロアポトーシス遺伝子の発現を測定し、細胞死経路をモニタリングした。ＢＡＸについては、ＬＮＣａＰにおいては１．８１倍、ＤＵ１４５においては２．７３倍、およびＰＣ３においては１．８７倍の増加があった（図１０ａ）。ＢＩＤの発現レベルはＬＮＣａＰにおいて１．３８倍およびＤＵ１４５において１．７７倍増加した（図１０ｂ）。しかしＰＣ３においては、ＢＩＤ発現レベルは処理後に１．４４分の１に低下した（図１０ｃ）。ＢＡＤの分析により、ＬＮＣａＰにおいては２．０倍、ＤＵ１４５については１．３８倍、およびＰＣ３については１．５８倍の発現増加が判明した（図１０ａ）。
【０１２１】
これらの結果より、前立腺癌細胞の生存がＰＡＸ２発現に依存性であることが証明される。ｐ５３発現細胞株ＬＮＣａＰ、ｐ５３突然変異株ＤＵ１４５、およびｐ５３欠損株ＰＣ３においてＰＡＸ２ノックダウンの結果としてｐ５３が活性化され、その後いずれの細胞株においてもカスパーゼ活性が検出され、プログラム細胞死が開始することが示された。ＢＡＸ発現は、３細胞株のいずれにおいてもｐ５３状態非依存的にアップレギュレートされた。プロアポトーシス因子ＢＡＤの発現も、ＰＡＸ２阻害後に３細胞株の全てにおいて増加した。ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ処理後、ＢＩＤ発現はＬＮＣａＰおよびＤＵ１４５において増加したものの、実はＰＣ３細胞において低下した。これらの結果より、前立腺癌において認められた細胞死はｐ５３発現の影響は受けるもののこれに依存しないことが示された。前立腺癌細胞におけるアポトーシスはｐ５３状態と無関係に他の細胞死経路によって開始することから、ＰＡＸ２が他の腫瘍抑圧因子を阻害することが示される。
【０１２２】
配列番号３〜６以外の、他の抗ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡの例は以下の配列（５’から３’方向）を有するｓｉＲＮＡを含むが、これに限定されない：
ＡＣＣＣＧＡＣＴＡＴＧＴＴＣＧＣＣＴＧＧ（配列番号７）、
ＡＡＧＣＴＣＴＧＧＡＴＣＧＡＧＴＣＴＴＴＧ（配列番号８）、
ＡＴＧＴＧＴＣＡＧＧＣＡＣＡＣＡＧＡＣＧ（配列番号９）、
ＧＵＣＧＡＧＵＣＵＡＵＣＵＧＣＡＵＣＣＵＵ（配列番号１０）、
ＧＧＡＵＧＣＡＧＡＵＡＧＡＣＵＣＧＡＣＵＵ（配列番号１１）、
【０１２３】
ＰＡＸタンパク質は、進化の間に保持されていた転写因子のファミリーであり、かつ「ペアードドメイン（ＰＤ）」および「ホメオドメイン（ＨＤ）」と呼ばれるドメインを通じて特定のＤＮＡ配列と結合することができる。ＰＤは一定のＰＡＸタンパク質（例：ＰＡＸ２とＰＡＸ６）によって共有されるコンセンサス配列である。ＰＤは、ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成するα３−ヘリックス内に位置するアミノ酸のＤＮＡ結合の方向を決定する。ＰＡＸ２については、ＨＤのアミノ酸がＣＣＴＴＧ（配列番号１）ＤＮＡコア配列を認識し、かつこれと特異的に相互作用する。この配列を含むオリゴヌクレオチドまたはその相補体はＰＡＸ２タンパク質の阻害物質であると予測される。
【０１２４】
１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＶがＤＥＦＢ１の１〜３５個の近接挟持ヌクレオチドでありかつＷが１〜３５個のヌクレオチドであることを特徴とする、Ｖ−ＣＣＴＴＧ−Ｗの配列（配列番号１２）を有する。ヌクレオチドは、通常はＤＥＦＢ１のＰＡＸ２  ＤＮＡ結合部位を挟む近接ヌクレオチドとすることができる。代替的に、ＤＥＦＢ１と無関係であり、かつ認識配列への干渉を回避するために定法により選択されることもできる。
【０１２５】
ＤＥＦＢ１プロモーターと結合するＰＡＸ２を阻害するオリゴヌクレオチドの他の例は以下の配列（５’から３’方向）を有するオリゴヌクレオチドを含むが、これに限定されない：
ＣＴＣＣＣＴＴＣＡＧＴＴＣＣＧＴＣＧＡＣ（配列番号１３）
ＣＴＣＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＧＡＣ（配列番号１４）
ＡＣＴＧＴＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＡＧＴＴＣＣＧＴＣＧＡＣＧＡＧＧＴＴＧＴＧＣ（配列番号１５）
ＡＣＴＧＴＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＧＴＴＧＴＧＣ（配列番号１６）
【実施例３】
【０１２６】
（ＰＡＸ２癌遺伝子の阻害は前立腺癌細胞のＤＥＦＢ１介在性細胞死をもたらす）
新規癌治療薬の開発の標的として役立つ腫瘍特異的分子の同定は、癌研究における主要な目標であると見なされている。実施例１は、前立腺癌において高頻度のＤＥＦＢ１発現の低下があること、およびＤＥＦＢ１発現の誘導はアンドロゲン受容体陰性ステージ前立腺癌において迅速なアポトーシスをもたらすことを証明した。これらのデータは、ＤＥＦＢ１が前立腺腫瘍抑制において役割を果たすことを示す。さらに、天然に発生する正常前立腺上皮の免疫系の成分であることを考慮すれば、ＤＥＦＢ１はほとんど副作用のない有効な治療薬となると期待される。実施例２は、ＰＡＸ２発現阻害によりｐ５３に非依存的な前立腺癌細胞死がもたらされることを証明した。これらのデータは、ＰＡＸ２によって阻害される追加プロアポトーシス因子または腫瘍抑圧因子があることを示す。さらに、データより前立腺癌において過剰発現している発癌因子ＰＡＸ２がＤＥＦＢ１の転写リプレッサーであることが示される。本試験の目的は、ＤＥＦＢ１発現の低下がＰＡＸ２癌遺伝子の異常発現によるものであるか、およびＰＡＸ２を阻害することによってＤＥＦＢ１介在性細胞死がもたらされるか否かを測定することである。
【０１２７】
（材料と方法）
ＲＮＡの分離および定量的ＲＴ−ＰＣＲは、実施例１の記載に従って実施した。ＤＥＦＢ１に対するプライマー対は公開ＤＥＦＢ１配列（目録番号Ｕ５０９３０）から作製した。アニーリング温度５６℃を用いて、標準的な条件下でＰＣＲを４０サイクル実施した。さらに、ハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＤＨを増幅し、全ｃＤＮＡの初期含有量を正規化した。ＤＥＦＢ１発現はＤＥＦＢ１とＧＡＰＤＨの相対発現比率として算出し、さらにＰＡＸ２発現のｓｉＲＮＡノックダウンの前後に複数の細胞株において比較した。全ての反応は３本ずつ３回実施した。
【０１２８】
ＤＥＦＢ１レポーター構築物の作製：ｐＧＬ３ルシフェラーゼレポータープラスミドを用いてＤＥＦＢ１レポーター活性をモニタリングした。この場合、ＤＥＦＢ１転写開始部位から１６０塩基上流の領域はＤＥＦＢ１  ＴＡＴＡボックスを含んだ。領域はＰＡＸ２結合に必要なＧＴＴＣＣ（配列番号２）配列も含んだ。ＰＣＲプライマーはＫｐｎ１およびＮｈｅ１制限部位を含むよう設計した。ＤＥＦＢ１プロモーターのＰＣＲ産物をＫｐｎＩおよびＮｈｅＩで制限消化し、さらに同様に制限消化したｐＧＬ３プラスミドにライゲーションした（図２）。構築物をＥ．ｃｏｌｉにトランスフェクトし、さらに個々のクローンを選択および拡張した。プラスミドを分離し、さらに自動シーケンシングによりＤＥＦＢ１／ｐＧＬ３構築物の配列完全性を再度検証した。
【０１２９】
ルシフェラーゼレポーター分析：この場合、ＤＥＦＢ１レポーター構築物または対照ｐＧＬ３プラスミド１μｇを１×１０６個のＤＵ１４５細胞にトランスフェクトした。次に、０．５×１０３個の細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、１晩増殖させた。次に、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡを含む新鮮培地または培地のみを添加し、細胞を４８時間インキュベートした。メーカーのプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従い、ＢｒｉｇｈｔＧｌｏキットによりルシフェラーゼを検出し、さらにプラスミドをＶｅｒｉｔａｓ自動９６ウェルルミノメーターで読み取った。プロモーター活性は関連する発光として表した。
【０１３０】
膜透過性の分析：アクリジンオレンジ（ＡＯ）／臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）二重染色を実施し、凝集クロマチン染色により細胞膜完全性の変化、およびアポトーシス細胞を鑑別した。ＡＯは生存細胞および初期のアポトーシス細胞を染色する一方、ＥｔＢｒは膜透過性を喪失した後期アポトーシス細胞を染色する。簡潔に述べると、細胞を２穴チャンバー培養スライド（ＢＤ  ＦＡＬＣＯＮ、米国）に播種した。空のｐＩＮＤプラスミド／ｐｖｇＲＸＲまたはｐＩＮＤ  ＤＥＦＢ１／ｐｖｇＲＸＲをトランスフェクトした細胞を、１０μＭポナステロンＡを含有する培地により２４または４８時間誘導した。対照細胞には２４および４８時間後に新鮮培地を供給した。膜完全性に対するＰＡＸ２阻害の効果を測定するために、ＤＵ１４５、ＰＣ３およびＬＮＣａＰを含む別個の培養スライドをＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで処理しさらに４日間インキュベートした。この後、細胞をＰＢＳで１回洗いさらにＡＯ（Ｓｉｇｍａ、米国）とＥｔＢｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）の混合溶液（１：１）（５ｕｇ／ｍＬ）２ｍＬで５分間染色した。染色後、細胞を再度ＰＢＳで洗った。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳ  Ｍ５  Ｐａｓｃａｌ  Ｖａｒｉｏ  ２レーザースキャニング共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、ドイツ・イェナ）で蛍光を観察した。励起カラーホイールは、ＡＯから発光した緑色光は緑色チャネルに、ＥｔＢｒからの赤色光は赤色チャネルに分離させるためのＢＳ５０５−５４０（緑色）およびＬＰ５６０（赤色）フィルターブロックを含む。各個別の実験内のレーザー出力およびゲイン制御設定は対照とＤＥＦＢ１誘導細胞の間で同一であった。ＡＯについては波長５４３ｎｍおよびＥｔＢｒについては４８８ｎｍの波長でＫｒ／Ａｒ混合ガスレーザーにより励起を提供した。スライドを倍率４０倍の位相差顕微鏡で分析し、デジタル画像を無圧縮ＴＩＦＦファイルとし保存し、画像処理およびハードコピー提示のためにＰｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳソフトウェア（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州サンホセ）にエクスポートした。
【０１３１】
ＰＡＸ２のＣｈＩＰ分析：クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）により、転写因子によるプロモーターのインビボ占有および免疫沈降による転写因子結合クロマチンの集積に基づくＤＮＡ結合性タンパク質の結合部位の同定が可能となる。Ｆａｒｎｈａｍ研究所が報告したプロトコルの変法を用いた；ｈｔｔｐ：／／ｍｃａｒｄｌｅ．ｏｎｃｏｌｏｇｙ．ｗｉｓｃ．ｅｄｕ／ｆａｒｎｈａｍ／においてオンライン閲覧もできる）。ＤＵ１４５およびＰＣ３細胞株はＰＡＸ２タンパク質を過剰発現するが、ＤＥＦＢ１は発現しない。細胞を１．０％ホルムアルデヒドを含有するＰＢＳで１０分間インキュベートし、タンパク質をＤＮＡに架橋させた。その後サンプルを超音波処理して平均長６００ｂｐのＤＮＡを得た。事前にプロテインＡダイナビーズで清澄化した超音波処理クロマチンをＰＡＸ２特異抗体または「無抗体」対照［アイソタイプでマッチングした対照抗体］と共にインキュベートした。その後洗った免疫沈降物を採取した。架橋を元に戻した後、プロモーター特異的プライマーを用いてＤＮＡをＰＣＲで分析し、ＰＡＸ２免疫沈降サンプル中にＤＥＦＢ１が示されるか否か測定した。プライマーは、ＤＥＦＢ１  ＴＡＴＡボックスおよび機能的ＧＴＴＣＣ（配列番号２）ＰＡＸ２認識部位を含むＤＥＦＢ１  ｍＲＮＡ開始部位よりすぐ上流の１６０ｂｐ領域を増幅するよう設計された。これらの研究については、陽性対照に（免疫沈降の前であるが架橋は戻してある）入力クロマチンの一部のＰＣＲを含めた。全ての手順はプロテアーゼ阻害剤の存在下で実施した。
【０１３２】
ＰＡＸ２のｓｉＲＮＡ阻害はＤＥＦＢ１発現を増加する：ｓｉＲＮＡ処理前のＤＥＦＢ１発現のＱＲＴ−ＰＣＲ分析により、相対発現レベルがＤＵ１４５で０．０００９７、ＰＣ３で０．００００１、およびＬＮＣａＰでは０．００００４であることが判明した（図１３）。ＰＡＸ２のｓｉＲＮＡノックダウン後は、相対発現はＤＵ１４５で０．０３２９４（３３８倍増加）、ＰＣ３で０．０００２０（２２．２倍増加）およびＬＮＣａＰにおいて０．０００１９（４．９２倍増加）であった。陰性対照として、ＰＡＸ２欠損株であるヒト前立腺上皮細胞株（ｈＰｒＥＣ）は処理前の発現レベルが処理前は０．００６８７かつｓｉＲＮＡ処理後は０．００６６１と判明し、ＤＥＦＢ１発現に統計的変化がないことが確認された。
【０１３３】
ＤＥＦＢ１は細胞膜透過性を引き起こす：共焦点レーザー顕微鏡分析法によって膜完全性をモニタリングした（図１４）。この場合、無傷の細胞は膜透過性であるＡＯにより緑色に染色される。さらに、原形質膜が崩壊した細胞は膜非透過性であるＥｔＢｒによって赤色に染色されるであろう。この場合、非誘導ＤＵ１４５（Ａ）およびＰＣ３（Ｄ）細胞はＡＯ染色陽性でかつ緑色発光したが、ＥｔＢｒでは染色されなかった。しかしＤＵ１４５（Ｂ）およびＰＣ３（Ｅ）におけるＤＥＦＢ１の誘導は、いずれも２４時間後に赤色染色で示される細胞質へのＥｔＢｒの蓄積をもたらした。４８時間後までに、ＤＵ１４５（Ｃ）およびＰＣ３（Ｆ）は核が凝集し見かけ上黄色となるが、これはそれぞれＡＯおよびＥｔＢｒの蓄積が原因で緑色および赤色染色が共存することによる。
【０１３４】
ＰＡＸ２の阻害によって膜透過性がもたらされる：細胞をＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで４日間処理し、さらに共焦点分析により膜完全性を再度モニタリングした。この場合、ＤＵ１４５およびＰＣ３は共に凝集した核を有し、見かけ上黄色となった。しかし、ＬＮＣａＰ細胞の細胞質および核はｓｉＲＮＡ処理後も緑色のままであった。細胞周辺部の赤色染色も、細胞膜の完全性の維持を示す。これらの所見は、ＰＡＸ２の阻害によって、ＤＵ１１４５およびＰＣ３においては特異的にＤＥＦＢ１介在性細胞死が起こるが、ＬＮＣａＰ細胞では起こらないことを示す。ＬＮＣａＰにおいて認められる死は、ＬＮＣａＰにおけるＰＡＸ２阻害後の既存の野生型ｐ５３のトランス活性化によるものである。
【０１３５】
ＰＡＸ２のｓｉＲＮＡ阻害はＤＥＦＢ１プロモーター活性を増加する：ＤＥＦＢ１／ｐＧＬ３構築物を含むＤＵ１４５細胞におけるＤＥＦＢ１プロモーター活性の分析により、４８時間処理後の相対的発光量は未処理細胞と比較して２．６５倍増加することが判明した。ＰＣ３細胞において、未処理細胞と比較した相対発光量は３．７８倍増加した。
【０１３６】
ＰＡＸ２はＤＥＦＢ１プロモーターと結合する：ＤＵ１４５およびＰＣ３細胞に対してＣｈＩＰ分析を実施し、ＰＡＸ２転写リプレッサーがＤＥＦＢ１プロモーターと結合するか測定した（図１５）。レーン１は分子量１００ｂｐのマーカーを含む。レーン２は、架橋および免疫沈降前にＤＵ１４５から増幅したＤＥＦＢ１プロモーターの１６０ｂｐ領域を表す陽性対照である。レーン３は、ＤＮＡを用いずに実施したＰＣＲを表す陰性対照である。レーン４および５は、それぞれ架橋したＤＵ１４５およびＰＣ３由来のＩｇＧを用いて実施した免疫沈降物からのＰＣＲを表す陰性対照である。架橋後に抗ＰＡＸ２抗体で免疫沈降したＤＮＡ２５ｐｇ（レーン６および８）および５０ｐｇ（レーン７および９）のＰＣＲ増幅は、それぞれＤＵ１４５およびＰＣ３において１６０ｂｐのプロモーターフラグメントを示す。
【０１３７】
これらの結果は、発癌因子ＰＡＸ２がＤＥＦＢ１発現を抑制することを証明する。抑制は転写レベルで発生する。さらに、ＤＥＦＢ１プロモーターのコンピュータ分析により、ＤＥＦＢ１  ＴＡＴＡボックスに隣接するＰＡＸ２転写リプレッサーに対するＧＴＴＣＣ（配列番号２）ＤＮＡ結合部位の存在が明らかとなった（図１）。ディフェンシン細胞毒性の証拠の１つは、膜完全性の破壊である。これらの結果より、前立腺癌細胞においてＤＥＦＢ１が異所性発現すると、細胞膜の崩壊が原因となって膜電位が減少することが示される。同じ現象はＰＡＸ２タンパク質発現の阻害後にも認められる。したがって、ＰＡＸ２発現または機能の抑制によって、ＤＥＦＢ１発現が再確立し、かつその後ＤＥＦＢ１介在性細胞死が発生する。また、この結果より、生得免疫を介した前立腺癌治療、および潜在的に他の癌治療のための治療法としてのＤＥＦＢ１の有用性が確立される。
【実施例４】
【０１３８】
（移植腫瘍細胞におけるＤＥＦＢ１発現の影響）
ＤＥＦＢ１の抗腫瘍能力を、ＤＥＦＢ１を過剰発現した腫瘍細胞をヌードマウスに注射することによって評価する。両方向テトラサイクリン応答性プロモーターを有するｐＢＩ−ＥＧＦＰベクターにＤＥＦＢ１をクローニングする。Ｔｅｔ−Ｏｆｆ細胞株は、ｐＴｅｔ−ＯｆｆをＤＵ１４５、ＰＣ３およびＬＮＣａＰ細胞にトランスフェクトし、さらにＧ４１８で選択することによって作製される。ｐＢＩ−ＥＧＦＰ−ＤＥＦＢ１プラスミドはｐＴＫ−Ｈｙｇと共にＴｅｔ−ｏｆｆ細胞株に同時トランスフェクトし、ハイグロマイシンによって選択する。生存率＞９０％の単一細胞懸濁液のみを用いた。各動物に対し、約５００，０００個の細胞を雌性ヌードマウスの右側腹部に皮下投与する。ベクターのみのクローンを投与された対照群およびＤＥＦＢ１を過剰発現するクローンを注射された群の２群がある。統計学者の決定に従い、各群マウス３５匹とする。動物は週２回体重測定し、キャリパーで腫瘍増殖をモニタリングし、さらに以下の式を用いてに腫瘍体積を決定する：体積＝０．５×（幅）２×長さ。全ての動物は、腫瘍のサイズが２ｍｍ３に達した時または移植より６ヶ月後にＣＯ２過剰投与によって屠殺し；腫瘍を切除し、秤量し、病理検査のために中性緩衝化ホルマリンに保存する。腫瘍の成長の群間差を、要約統計量および図面表示により記述的にキャラクタライゼーションする。統計的有意性は、ｔ検定またはノンパラメトリックな同等法のいずれかで評価する。
【実施例５】
【０１３９】
（移植腫瘍細胞に対するＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡの影響）
インビトロ試験で用いたヘアピンＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ鋳型オリゴヌクレオチドを用いて、インビボでＤＥＦＢ１発現アップレギュレーションの影響を検討する。センスおよびアンチセンス鎖（表４参照）をアニーリングし、ヒトＵ６  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの制御の下で、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ２．１  Ｕ６  ｈｙｇｒｏ  ｓｉＲＮＡ発現ベクター（Ａｍｂｉｏｎ）にクローニングする。クローン化プラスミドをシーケンシングし、検証し、ＰＣ３、Ｄｕ１４５およびＬＮＣａｐ細胞株にトランスフェクトする。スクランブルｓｈＲＮＡをクローニングし、本試験における陰性対照として用いる。ハイグロマイシン耐性コロニーを選択し、マウスに細胞を皮下導入し、さらに腫瘍の成長を上述の通りにモニタリングする。
【実施例６】
【０１４０】
（小分子ＰＡＸ２結合阻害剤の移植腫瘍細胞に対する作用）
ＰＡＸ２についてのＤＮＡ認識配列は、ヌクレオチド−７５と−７１の間のＤＥＦＢ１プロモーター内に存在する［＋１は転写開始部位を表す］。ＰＡＸ２  ＤＮＡ結合ドメインに相補的な短鎖オリゴヌクレオチドが提供される。そのようなオリゴヌクレオチドの例は、以下で提供されるＧＴＴＣＣ（配列番号２）認識配列を含む２０量体および４０量体オリゴヌクレオチドを含む。これらの鎖長は無作為に選択したが、他の鎖長は結合遮断剤として有効であると予測される。陰性対照としてスクランブル配列−（ＣＴＣＴＧ）（配列番号１７）を有するオリゴヌクレオチドを設計して特異性を検証した。オリゴヌクレオチドは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬またはＣｏｄｅｂｒｅａｋｅｒトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｉｎｃ．）によって前立腺癌細胞およびＨＰｒＥｃ細胞にトランスフェクトする。ＤＮＡ−タンパク質相互作用を確認するために、２本鎖オリゴヌクレオチドを［３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識し、電気泳動移動度シフトアッセイを実施する。さらに、オリゴヌクレオチドで処理した後にＱＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタン分析によりＤＥＦＢ１発現をモニタリングする。最後に、前述のようにＭＴＴアッセイおよびフローサイトメトリーにより細胞死を検出する。
認識配列Ｎｏ．１：ＣＴＣＣＣＴＴＣＡＧＴＴＣＣＧＴＣＧＡＣ（配列番号１３）
認識配列Ｎｏ．２：ＣＴＣＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＧＡＣ（配列番号１４）
スクランブル配列Ｎｏ．１：ＣＴＣＣＣＴＴＣＡＣＴＣＴＧＧＴＣＧＡＣ（配列番号１８）
認識配列Ｎｏ．３：ＡＣＴＧＴＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＡＧＴＴＣＣＧＴＣＧＡＣＧＡＧＧＴＴＧＴＧＣ（配列番号１５）
認識配列Ｎｏ．４：ＡＣＴＧＴＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＧＴＴＧＴＧＣ（配列番号１６）
スクランブル配列Ｎｏ．２：ＡＣＴＧＴＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＡＣＴＣＴＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＧＴＴＧＴＧＣ（配列番号１９）
【０１４１】
本発明のオリゴヌクレオチドのさらなる例は：
認識配列Ｎｏ．１：５’−ＡＧＡＡＧＴＴＣＡＣＣＣＴＴＧＡＣＴＧＴ−３’（配列番号２０）
認識配列Ｎｏ．２：５’−ＡＧＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＴＣＣＡＣＴＧＴ−３’（配列番号２１）
スクランブル配列Ｎｏ．１：５’−ＡＧＡＡＧＴＴＣＡＣＧＣＴＣＴＡＣＴＧＴ−３’（配列番号２２）
認識配列Ｎｏ．３：
５’−ＴＴＡＧＣＧＡＴＴＡＧＡＡＧＴＴＣＡＣＣＣＴＴＧＡＣＴＧＴＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣ−３’（配列番号２３）
認識配列Ｎｏ．４：
５’−ＧＴＴＡＧＣＧＡＴＴＡＧＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＴＣＣＡＣＴＧＴＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣ−３’（配列番号２４）
スクランブル配列Ｎｏ．２：
５’−ＧＴＴＡＧＣＧＡＴＴＡＧＡＡＧＴＴＣＡＣＧＣＴＣＴＡＣＴＧＴＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣ−３’（配列番号２５）
を含む。
【０１４２】
この代替的阻害オリゴヌクレオチドのセットは、（ＣＣＴＴＧ（配列番号１）コア配列と共に）ＰＡＸ２結合ドメインおよびホメオボックスに対する認識配列に相当する。これらはＤＥＦＢ１プロモーターに由来する実際の配列を含む。
【０１４３】
ＰＡＸ２遺伝子は、前立腺を含む多様な癌細胞の増殖および生存のために必要とされる。さらに、ＰＡＸ２発現の阻害によって生得的免疫成分ＤＥＦＢ１を介した細胞死が起こる。ＤＥＦＢ１発現および活性の抑制は、ＰＡＸ２タンパク質とＤＥＦＢ１プロモーター内のＧＴＴＣＣ（配列番号２）認識部位との結合によって完遂される。したがって、この経路は前立腺癌の治療に有効な治療的標的を提供する。この方法においては、配列はＰＡＸ２  ＤＮＡ結合部位と結合し、さらにＰＡＸ２とＤＥＦＢ１プロモーターの結合を遮断することによって、ＤＥＦＢ１発現および活性を可能とする。上述のオリゴヌクレオチド配列および実験は、さらなるＰＡＸ２阻害薬の設計のための実施例でありかつそのためのモデルを示す。
【０１４４】
インターロイキン−３、インターロイキン−４、インスリン受容体などにＧＴＴＣＣ（配列番号２）配列が存在することを考慮すれば、ＰＡＸ２はそれらの発現および活性も同様に制御する。したがって、本明細書に開示のＰＡＸ２阻害剤は、前立腺炎などの炎症および良性前立腺肥大（ＢＰＨ）と関連した方向のものを含む数多くの他の疾患においても有用性を有する。
【実施例７】
【０１４５】
（ＤＥＦＢ１発現の減少によって発癌が増加する）
機能低下マウスの作製：Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムは、前立腺発癌の基盤をなす分子的機構の解明において有用となっている。この場合、前立腺内における誘導崩壊にＤＥＦＢ１  Ｃｒｅ条件付きＫＯが用いられている。ＤＥＦＢ１  Ｃｒｅ条件付きＫＯは、ＤＥＦＢ１コードエクソンを挟むｌｏｘＰ部位を含むターゲティングベクターの作製、このベクターを有する標的ＥＳ細胞、およびのこれらの標的ＥＳ細胞からの生殖細胞系列キメラマウスの作製を包含する。ヘテロ接合体を前立腺特異的Ｃｒｅトランスジェニック体と交配し、ヘテロ接合体交雑雑種を用いて前立腺特異的ＤＥＦＢ１  ＫＯマウスを作製する。４つの遺伝毒性化学化合物がげっ歯類に前立腺癌を誘発することが確認されている：Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ＭＮＵ）、Ｎ−ニトロソビス２−オキソプロピルアミン（ＢＯＰ）、３，２Ｘ−ジメチル−４−アミノ−ビフェニル（ＭＡＢ）および２−アミノ−１−メチル−６−フェニルイミダゾール４，５−ビピリジン（ＰｈＩＰ）。ＤＥＦＢ１−トランスジェニックマウスは、前立腺腫および腺癌誘発試験用にこれらの発癌化合物を胃内投与または静脈内注射して処理する。組織学、免疫組織学、ｍＲＮＡおよびタンパク質分析により腫瘍増殖の差異および遺伝子発現の変化について前立腺サンプルを試験する。
【０１４６】
ＧＯＦマウスの作製：ＰＡＸ２誘導可能ＧＯＦマウスについては、ＰＡＸ２  ＧＯＦ（バイトランスジェニック）および野生型（モノトランスジェニック）の同腹仔に対し、５週齢よりドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を投与して前立腺特異性ＰＡＸ２発現を誘発する。簡潔に述べると、ＰＲＯＢＡＳＩＮ−ｒｔＴＡモノトランスジェニックマウス（ｔｅｔ依存性ｒｔＴＡ誘導物質の前立腺細胞特異性発現）を我々のＰＡＸ２トランスジェニック応答動物系と交配した。バイトランスジェニックマウスに対し、誘導のために飲料水よりＤｏｘを給餌した（週２回５００μｇ／Ｌを新たに調製して投与）。バイトランスジェニックマウスにおけるトランスジェニックファウンダー系統を用い、初回の実験で低いバックグラウンドレベル、良好な誘導性ならびにＰＡＸ２およびＥＧＦＰレポーターの細胞型特異的発現を確認する。実験群のサイズについては、各群（野生型およびＧＯＦ）において年齢および性別でマッチングした５〜７個体によって統計的有意性を考慮する。本試験における全動物について、始めに分析および比較のために前立腺組織を１週間おきに採取し、発癌時間パラメーターを決定する。
【０１４７】
ＰＣＲ遺伝子型決定、ＲＴ−ＰＣＲおよびｑＰＣＲ：以下のＰＣＲプライマーおよび条件を用いて、ＰＲＯＢＡＳＩＮ−ｒｔＴＡトランスジェニックマウスの遺伝子型を決定する：
ＰＲＯＢＡＳＩＮ５（フォワード）５’−ＡＣＴＧＣＣＣＡＴＴＧＣＣＣＡＡＡＣＡＣ−３’（配列番号２６）；
ＲＴＴＡ３（リバース）５’−ＡＡＡＡＴＣＴＴＧＣＣＡＧＣＴＴＴＣＣＣＣ−３’（配列番号２７）；
９５℃で５分間変性、その後９５℃で３０秒、５７℃で３０秒、７２℃で３０秒の３０サイクル、その後７２℃で５分間伸長し、６００ｂｐ産物を回収。
【０１４８】
以下のＰＣＲプライマーおよび条件を用いて、ＰＡＸ２誘導可能トランスジェニックマウスの遺伝子型を決定する：ＰＡＸ２フォワード５’−ＧＴＣＧＧＴＴＡＣＧＧＡＧＣＧＧＡＣＣＧＧＡＧ−３’（配列番号２８）；
逆５’ＩＲＥＳ  ５’−ＴＡＡＣＡＴＡＴＡＧＡＣＡＡＡＣＧＣＡＣＡＣＣＧ−３’（配列番号２９）；
９５℃で５分間変性、その後９５℃で３０秒、６３℃で３０秒、７２℃で３０秒の３４サイクル、その後７２℃で５分間伸長し、４６０ｂｐ産物を回収。
【０１４９】
以下のＰＣＲプライマーおよび条件を用いて、ｉｍｍｏｒｔｏマウスヘミ接合体の遺伝子型を決定する：Ｉｍｍｏｌ１、５’−ＧＣＧＣＴＴＧＴＧＴＣ  ＧＣＣＡＴＴＧＴＡＴＴＣ−３’（配列番号３０）；Ｉｍｍｏｌ２，５’−ＧＴＣＡＣＡＣＣＡＣＡＧＡＡＧＴＡＡＧＧＴＴＣＣ−３’（配列番号３１）；
９４℃で３０秒、５８℃で１分、７２℃で１分３０秒、３０サイクルで約１ｋｂ導入遺伝子バンドを得る。ＰＡＸ２ノックアウトマウスの遺伝子型を決定するために、以下のＰＣＲプライマーおよび条件を用いる：ＰＡＸ２フォワード５’−ＧＴＣＧＧＴＴＡＣＧＧＡＧＣＧＧＡＣＣＧＧＡＧ−３’（配列番号３２）；
ＰＡＸ２リバース５’−ＣＡＣＡＧＡＧＣＡＴＴＧＧＣＧＡＴＣＴＣＧＡＴＧＣ−３’（配列番号３３）；
９４℃１分、６５℃１分、７２℃３０秒、３６サイクルで２８０ｂｐバンドを得る。
【０１５０】
ＤＥＦＢ１ペプチド動物試験：Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより購入した６週齢の雄性胸腺欠損（ヌード）マウスの肩甲骨皮下に、１０６個の生存ＰＣ３細胞を注射する。注射より１週間後、動物を３群のうち１群に無作為割り付けする−Ｉ群：対照；ＩＩ群：ＤＥＦＢ１を１００μｇ／日、週５日、２〜１４週間腹腔内注射；ＩＩＩ群：ＤＥＦＢ１を１００μｇ／日、週５日、８〜１４週間腹腔内注射。動物は、１ケージにつき４匹として無菌飼育で維持し、毎日観察する。腫瘍は１０日おきにキャリパーを用いて測定し、腫瘍の体積はＶ＝（Ｌ×Ｗ２）／２を用いて算出した。
【実施例８】
【０１５１】
（上皮内腫瘍および癌の化学予防を目的としたＰＡＸ２発現のターゲティング）
癌化学予防は、癌の予防、もしくは前癌状態またはさらにより早期における治療と定義される。侵襲性癌への進行期間が長いことは重要な科学的機会であるが、化学予防薬候補の臨床的利点を示すことに対する経済的な障害でもある。したがって、近年の化学予防薬開発研究の重要な構成要素は、薬剤の臨床的利益または癌発生率減少効果を正確に予測する（癌より）早期のエンドポイントまたはバイオマーカーを特定することとなっている。多くの癌において、ＩＥＮは前立腺癌などの早期エンドポイントである。ＰＡＸ２／ＤＥＦＢ１経路がＩＥＮ中に、およびおそらくより早期の病理組織学的状態で調節解除されることを考慮すれば、これは強力な予測的バイオマーカーかつ癌化学予防のためのすぐれた標的となる。前立腺癌に対する化学予防薬としての有用性を有しうる、ＰＡＸ２を抑制しかつＤＥＦＢ１発現を高める数多くの化合物が示される。
【０１５２】
表１に示すように、ＰＡＸ２遺伝子は数多くの癌において発現される。さらに、数種類の癌が異常ＰＡＸ２発現を有することが示されている（図１８）。標的ＰＸＡ２発現を介した化学予防は、癌関連死亡に対して大きな影響をもたらしうる。アンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）は、血圧および心血管系恒常性の主な調節因子であり、かつ強力なマイトジェンとして認識されている。ＡｎｇＩＩは、Ｇ−タンパク質共役受容体スーパーファミリーに属するが組織分布および分子内シグナリング経路が異なる２つの受容体サブタイプ、アンジオテンシンＩ型受容体（ＡＴ１Ｒ）およびアンジオテンシンＩＩ型受容体（ＡＴ２Ｒ）と結合することより、その生物学的効果を媒介する。ＡｎｇＩＩは、その血圧に対する効果に加えて、創傷治癒などの組織リモデリング、心肥大および発生を包含する多様な病理的状況においてある役割を果たすことが示されている。実際に、前立腺を含む多様な癌細胞および組織におけるレニンーアンジオテンシン系（ＲＡＳ）のいくつかの成分の局所的発現が、最近の研究で明らかになっている。ＡＴ１Ｒのアップレギュレーションは、アポトーシスおよび増殖調節因子を回避することを学習した癌細胞に対して相当な利点をもたらす。
【０１５３】
（材料と方法）
試薬および処理：細胞は、５または１０ｕＭ  ＡｎｇＩＩ、５ｕＭ  ＡＴＲ１拮抗剤Ｌｏｓ、５ｕＭ  ＡＴＲ２拮抗剤ＰＤ１２３３１９、２５ｕＭ  ＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６、２０ｕＭ  ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤ＰＤ９８０５９もしくは２５０μＭ  ＡＭＰキナーゼ誘発物質ＡＩＣＡＲで処理した。
【０１５４】
ウェスタン分析は実施例２の記載に従って実施した。次にブロットを、１：１０００〜２０００希釈の一次抗体（抗ＰＡＸ２、抗ホスホＰＡＸ２、抗ＪＮＫ、抗ホスホＪＮＫ、抗ＥＲＫ１／２または抗ホスホＥＲＫ１／２）（Ｚｙｍｅｄ、カリフォルニア州サンフランシスコ）でプローブした。洗浄後、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（１：５０００希釈；Ｓｉｇｍａ）とコンジュゲートした抗ウサギ抗体と共に膜をインキュベートし、アルファイノテックフルオロケム８９００上で化学発光試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてシグナル検出を可視化した。対照として、ブロットを剥離し、マウス抗βアクチン１次抗体（１：５０００，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＨＲＰコンジュゲート抗マウス二次抗体（１：５０００，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でリプローブし、シグナル検出を再度可視化した。
【０１５５】
ＱＲＴ−ＰＣＲ分析は実施例１の記載にしたがって実施した。反応はＭｉｃｒｏＡｍｐ  Ｏｐｔｉｃａｌ  ９６ウェル反応プレート（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で実施した。アニーリング温度６０℃を用いて、標準的な条件下でＰＣＲを４０サイクル実施した。定量値は、指数的増幅が始まったサイクル数（閾値）により決定し、さらに３回繰り返して得られた値を平均した。メッセージレベルと閾値の間には逆相関があった。さらにＧＡＰＤＨをハウスキーピング遺伝子として用い、全ｃＤＮＡの初期含有量を正規化した。相対発現は、各遺伝子とＧＡＰＤＨの比率として算出した。全ての反応は３本ずつ実施した。
【０１５６】
チミジン取り込み：細胞の増殖は、［３Ｈ］チミジンリボチド［３Ｈ］ＴｄＲ）のＤＮＡへの取り込みによって測定した。ＤＵ１４５細胞の０．５×１０６個／ウェル懸濁液をその適切な培地に撒いた。細胞は、指示された濃度のＡｎｇＩＩの存在下または非存在下で７２時間インキュベートした。細胞を同一培地中で３７ｋＢｑ／ｍＬ［メチル−３Ｈ］チミジンに６時間曝露した。付着細胞は５％トリクロロ酢酸で固定し、ＳＤＳ／ＮａＯＨ溶解バッファーで１晩溶解した。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＬＳ３８０１液体シンチレーションカウンター（カナダ）で放射能を測定した。懸濁細胞培養は、セルハーベスター（Ｐａｃｋａｒｄ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．、コネティカット州メリデン）で回収し、また１４５０  ｍｉｃｒｏｂｅｔａ液体シンチレーションカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で放射能を測定した。
【０１５７】
ＤＵ１４５前立腺癌細胞におけるＰＡＸ２に対するＡｎｇＩＩの影響を検討するために、ＡｎｇＩＩで３０分から４８時間にわたって処理した後にＰＡＸ２発現を検討した。図１９に示すように、ＰＡＸ２発現はＡｎｇＩＩ処理後に時間と共に徐々に増加した。ＤＵ１４５をＬｏｓによって処理することでＲＡＳシグナリングを遮断すると、ＰＡＸ２発現は有意に低下した（図２０Ａ）。この場合、未処理ＤＵ１４５細胞と比較したＬｏｓ処理より４８時間後のＰＡＸ２発現は３７％であり、７２時間後は５０％であった（図２１）。ＡＴ２Ｒ受容体がＡＴ１Ｒの作用を妨害することは公知である。したがって、ＡＴ２Ｒ受容体の遮断がＰＡＸ２発現にもたらす影響を検討した。ＤＵ１４５をＡＴ２Ｒ遮断剤ＰＤ１２３３１９で処理することにより、ＰＡＸ２発現は４８時間処理後に７倍、９６時間後に８倍上昇した（図２０Ｂ）。まとめると、これらの所見よりＰＡＸ２発現はＡＴＲ１受容体によって調節されることが証明される。
【０１５８】
ＡｎｇＩＩがＡＴ１Ｒ介在性ＭＡＰＫ活性化およびＳＴＡＴ３のリン酸化を経て前立腺癌細胞の増殖に直接影響することは公知である。ＤＵ１４５をＡｎｇＩＩで処理したところ増殖率は２から３倍増加した（図２１）。しかし、Ｌｏｓで処理することによって増殖率は５０％低下した。さらに、Ｌｏｓで３０分間前処理することでＡＴ１Ｒ受容体を遮断したところ、ＡｎｇＩＩの増殖に対する影響が抑制された。
【０１５９】
ＰＡＸ２発現および活性化の調節におけるＡＴ１Ｒシグナリングの役割をさらに検討するために、多様なＭＡＰキナーゼシグナリング経路成分の遮断によるＰＡＸ２発現への影響を検討した。この場合、ＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６でＤＵ１４５細胞を処理したところＰＡＸ２発現が有意に低下した（図２２）。さらに、ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤ＰＤ９８０５９で処理してもＰＡＸは低下した。ＤＵ１４５細胞をＬｏｓで処理してもＥＲＫタンパク質レベルには影響がないが、ホスホＥＲＫの量は低下した（図２３Ａ）。しかし、ＤＵ１４５をＬｏｓで処理するとＰＡＸ２発現は有意に減少した。Ｕ０１２６およびＰＤ９８０５９によっても同様の結果が認められた。ＰＡＸ２発現はＥＲＫの下流の標的であるＳＴＡＴ３によって調節されることも公知である。ＤＵ１４５をＬｏｓ、Ｕ０１２６、およびＰＤ９８０５９で処理したところホスホＳＴＡＴ３タンパク質レベルが低下した（図２３Ｃ）。これらの結果は、前立腺癌細胞においてＰＡＸ２はＡＴ１Ｒを介して調節されることを証明する。
【０１６０】
さらに、ＪＮＫによるＰＡＸ２活性化に対するＡＴ１Ｒシグナリングの影響を検討した。ＤＵ１４５をＬｏｓ、Ｕ０１２６、およびＰＤ９８０５９で処理したところ、いずれもホスホＰＡＸ２タンパク質レベルが有意に低下するかまたは抑制された（図２４Ａ）。しかし、ＬｏｓおよびＵ０１２６はホスホＪＮＫタンパク質レベルを低下させなかった（図２４Ｂ）。したがって、ホスホＰＡＸ２の低下はＰＡＸ２レベルの低下よるものであって、リン酸化の低下によるものではないとみられる。
【０１６１】
５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミド−１−β−４−リボフラノシド（ＡＩＣＡＲ）は、エネルギー恒常性および代謝ストレスに対する応答を調節するＡＭＰキナーゼ活性化物質として幅広く用いられる。最近の報告では、活性化ＡＭＰＫの抗増殖およびプロアポトーシス作用が、薬剤またはＡＭＰＫ過剰発現を用いて示されている。ＡＭＰＫ活性化は、脂肪酸シンターゼ経路の阻害ならびにストレスキナーゼおよびカスパーゼ３の誘導を含む多様な機構によって、ヒト胃癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌、膵臓細胞および肝臓癌細胞においてアポトーシスを誘導し、かつマウス神経芽細胞において酸化ストレス誘導アポトーシスを亢進させることが示されている。さらに、ＰＣ３前立腺癌細胞を処理したところ、ｐ２１，ｐ２７およびｐ５３タンパク質の発現およびＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路の阻害が増加した。これらの経路はいずれもＰＡＸ２によって直接的または間接的に調節される。前立腺癌細胞をＡＩＣＡＲで処理したところ、ＰＡＸ２発現（図２３Ｂ）、さらにはその活性化対ホスホＰＡＸ２（図２４Ａ）が抑制された。さらに、ＰＡＸ２発現を調節するホスホＳＴＡＴ３も抑制された（図２３Ｃ）。
【０１６２】
最後に、ＰＡＸ２のアップレギュレーションおよび過剰発現につながる異常ＲＡＳシグナリングがＤＥＦＢ１腫瘍抑制因子遺伝子の発現を抑制するという仮説が立てられた。これを検討するために、正常前立腺上皮一次培養ｈＰｒＥＣをＡｎｇＩＩで処理し、さらにＰＡＸ２およびＤＥＦＢ１発現レベルを検討した。前立腺癌細胞に対する正常前立腺細胞において、ＤＥＦＢ１とＰＡＸ２発現の間の逆関係が発見された。未処理ｈＰｒＥＣは、ＰＣ３前立腺癌細胞における発現と比較して１０％の相対ＰＡＸ２発現を示した。逆に、未処理ＰＡＸ２は、ｈＰｒＥＣにおける発現と比較してわずか２％の相対ＤＥＦＢ１発現を示した。１０ｕＭ  ＡｎｇＩＩによる７２時間処理後、ＤＥＦＢ１発現は未処理ｈＰｒＥＣと比較して３５％低下し、９６時間後までにＤＥＦＢ１発現は未処理ｈＰｒＥＣと比較して５０％低下した。しかし、未処理ｈＰｒＥＣ細胞と比較して、ＰＡＸ２発現は７２時間で６６％増加し、９６時間後までにＰＡＸ２発現は７９％増加した。さらに、ｈＰｒＥＣにおける７２時間後のＰＡＸ２発現の増加は、ＰＣ３前立腺癌細胞で認められたＰＡＸ２レベルの７７％となった。ＡｎｇＩＩ処理より９６時間後のＰＡＸ２発現は、ＰＣ３におけるＰＡＸ２発現の８９％となった。これらの結果より、調節解除されたＲＡＳシグナリングは前立腺細胞においてＰＡＸ２発現のアップレギュレーションを介してＤＥＦＢ１発現を抑制することが証明される。
【０１６３】
アポトーシスの阻害は、癌の発生に寄与する重要な病態生理学的因子である。癌治療の顕著な進歩にもかかわらず、進行性疾患の治療においてはほとんど進歩していない。発癌は多年にわたる多段階、多経路の疾患進行であることを考慮し、この過程を阻害、遅延、または逆行させるための医薬品または他の薬剤の使用による化学予防は癌研究において非常に有望な領域であると認識される。この前立腺癌の化学予防を目的とした薬物療法の成功には、癌発生を抑制するという全般的な目標を有し、宿主に対する臨床的影響を最小限に維持しながら、標的細胞に対する特異的効果を有する治療薬を用いることが必要とされる。したがって、早期ステージ発癌の機構を理解することは特定の治療法の有効性を決定する上で重要である。異常ＰＡＸ２発現およびそのアポトーシスの抑止の重要性は、その後の腫瘍形成に対する寄与と共に、これが前立腺癌治療のための適切な標的となりうることを示唆している。前立腺癌においてＰＡＸ２はＡＴ１Ｒにより調節される（図２６）。この場合、ＲＡＳシグナリングが調節解除されるとＰＡＸ２癌遺伝子発現が増加し、さらにＤＥＦＢ１腫瘍抑制因子の発現が減少する。したがって、ＡＴ１Ｒ拮抗剤の使用によりＰＡＸ２発現が低下しかつＤＥＦＢ１の再発現を介した前立腺癌細胞死が増加する（図２７）。これらの結果によって、レニン−アンジオテンシンシグナリング経路、ＡＭＰキナーゼ経路またはＰＡＸ２タンパク質の不活性化（すなわち抗ＰＡＸ２抗体接種）を包含する他の方法を介したＰＡＸ２発現のターゲティングは、癌予防にとって有用な標的となりうるという新たな所見が提供される（表５：化学予防を目的としてＰＡＸ２発現を阻害するために用いられる化合物）。
【０１６４】
【表５】
2013510558.tif 000007
【０１６５】
この研究より、前立腺癌におけるＰＡＸ２癌遺伝子のアップレギュレーションはＲＡＳシグナリングの調節解除によるものであることが証明される。ＰＡＸ２発現は、アンジオテンシンＩ型受容体によって媒介されるＥＲＫ１／２シグナリング経路によって調節される。さらに、ロサルタン（Ｌｏｓ）によってＡＴ１Ｒを遮断することによりＰＡＸ２発現が抑制される。さらに、ＡＭＰＫ活性化剤であるＡＩＣＡＲもＰＡＸ２阻害剤の候補として有望性を示している。まとめると、これらの試験より、これらの薬剤クラスがＰＡＸ２発現阻害剤の候補として関係付けられ、かつ最終的に新規化学予防剤として役立ちうることが強く指摘される。
【実施例９】
【０１６６】
（前立腺組織の等級付け手段および前立腺癌発生の予測因子としてのＰＡＸ２−ＤＥＦＢ１発現レベル）
（材料と方法）
ＱＲＴ−ＰＣＲ分析：根治的前立腺切除術を受けた患者から前立腺切片を採取した。病理検査後、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを実施して正常、増殖性上皮内腫瘍（ＰＩＮ）および癌組織の領域を分離した。前述の方法によりＱＲＴ−ＰＣＲ分析を実施して発現を評価した。各領域のＤＥＦＢ１およびＰＡＸ２発現およびＧＡＰＤＨを内部標準として用いた。
【０１６７】
採血およびＲＮＡ分離：メーカーのプロトコルに従い、ＱＲＴ−ＰＣＲ用に各個人よりＰＡＸｇｅｎｅ（商標）Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ試験管（ＱＩＡＧＥＮ）に血液（２．５ｍＬ）を採取した。全血をＰＡＸ  ｇｅｎｅ安定化剤と完全に混合し、ＲＮＡ抽出前に６時間室温保存した。次に、メーカーの指示書（ＱＩＡＧＥＮ）に従い、ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡキットを用いて全ＲＮＡを抽出した。汚染ゲノムＤＮＡを除去するために、ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｓｙｓｔｅｍスピンカラムに吸収させた全ＲＮＡサンプルをＤＮａｓｅ  Ｉ（ＱＩＡＧＥＮ）と共に２５℃で２０分間インキュベートし、ゲノムＤＮＡを除去した。全ＲＮＡは溶離、定量し、さらにＰＡＸ２とＤＥＦＢ１発現比率を比較するために前述の方法に従ってＱＲＴ−ＰＣＲを実施する。
【０１６８】
ＬＣＭ正常組織のＱＲＴ−ＰＣＲ分析により、相対ＤＥＦＢ１発現レベルが０．００５を上回る患者は、０．００５未満の発現レベルを有する者と比較してグリーソンスコアが低いことが証明された（図２８Ａ）。したがって、ＤＥＦＢ１発現とグリーソンスコアの間には逆関係がある。逆に、悪性前立腺組織およびＰＩＮにおけるＰＡＸ２発現とグリーソンスコアの間には正の相関があった（図２８Ｂ）。
【０１６９】
別個の患者からの正常、ＰＩＮおよび癌組織におけるＰＡＸ２およびＤＥＦＢ１発現レベルを算出および比較した（図２９）。全般的に、ＧＡＰＤＨ内部対照に対するＰＡＸ２発現レベルの範囲は、正常（良性）組織では０と０．２の間、ＰＩＮにおいては０．２と０．３の間、および癌（悪性）組織においては０．３と０．５の間であった（図３０）。ＤＥＦＢ１については、ＰＡＸ２と比較して逆関係があった。この場合、ＧＡＰＤＨ内部対照に対するＤＥＦＢ１発現レベルの範囲は、正常（良性）組織で０．０６と０．００５の間、ＰＩＮにおいて０．００５と０．００３の間、および癌（悪性）組織において０．００３と０．００１の間であった。したがって、良性、前癌（ＰＩＮ）および悪性前立腺組織の予後決定因子として、ＰＡＸ２−ＤＥＦＢ１発現比率を用いた予測スケール（「ドナルド予測因子」または「ＤＰＦ」）と命名）が開示される。ＤＰＦに基づくＰＡＸ２−ＤＥＦＢ１比率が０〜３９である組織は正常（病理学的に良性）に相当するであろう。ＰＡＸ２−ＤＥＦＢ１比率が４０〜９９の組織は、ＤＰＦスケールに基づきＰＩＮ（前癌）に相当するであろう。最後に、ＰＡＸ２−ＤＥＦＢ１比率が１００〜５００の組織は悪性（低〜高度の癌）となるであろう。
【０１７０】
現在、前立腺癌発生の予測バイオマーカーに対する決定的なニーズがある。前立腺癌の発症がＰＳＡ検査または直腸指診といった現行のスクリーニング法によって疾患が検出可能となるはるか以前に起こることは公知である。前立腺癌の進行および早期発生のモニタリングが可能な信頼度の高い検査法であれば、より有効な疾患管理によって死亡率を大きく低下させると考えられる。本明細書には、医師が前立腺の病理学的状態を事前に十分に知ることを可能とする予測指標が開示される。ＤＰＦは、前立腺疾患の進行と関連するＰＡＸ２−ＤＥＦＢ１発現比率の低下を測定する。この強力な指標は、患者が前立腺癌を発症する可能性を予測できるのみならず、前悪性癌の初期発症を特定することもある。最終的に、この手段は、医師がより悪性度の高い疾患を有する患者をそうでない患者から識別することを可能とする。
【０１７１】
癌特異的マーカーの同定は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の同定を支援するために用いられている。末梢血中に播種された腫瘍細胞を検出することにより、腫瘍のステージング、予後判定、および補助療法の有効性を初期評価する代替的マーカーを同定するための臨床的に重要なデータを提供することができることを証明する新たなエビデンスも得られている。さらに、全循環細胞の遺伝子発現プロフィールを比較することにより、前立腺癌の早期検出のための予後決定因子として、それぞれ「免疫監視」および「癌生存」において重要な役割を果たすＤＥＦＢ１およびＰＡＸ２遺伝子の発現を検討することができる。
【実施例１０】
【０１７２】
（宿主防御ペプチドヒトβディフェンシン−１の機能分析：癌におけるその潜在的役割についての新たな洞察）
（材料と方法）
組織サンプルおよびレーザーキャプチャーマイクロダイセクション：根治的前立腺切除術を受ける前にインフォームド・コンセントを提出した患者より前立腺組織を採取した。施設内倫理委員会が承認したプロトコルに従い、Ｈｏｌｌｉｎｇｓ癌センター腫瘍バンクよりサンプルを入手した。これにはサンプルの処理、切片化、組織学的キャラクタラーぜーション、ＲＮＡ精製およびＰＣＲ増殖のガイドラインが含まれた。外科医および病理学者より受領した前立腺検体は、ＯＣＴコンパウンド中で速やかに凍結させた。各ＯＣＴブロックを切り出して連続切片とし、染色して検査した。良性細胞、前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）および癌を含む領域を同定し、我々がＡｒｃｔｕｒｕｓ  Ｐｉｘ  Ｃｅｌｌ  ＩＩシステム（カリフォルニア州、サニーヴェール）を用いて未染色スライドから領域を選択する際の指標とするために用いた。キャプチャーした材料を収容するカップを、Ａｒｃｔｕｒｕｓ  Ｐｉｃｏ  Ｐｕｒｅ  ＲＮＡ分離キットのライセート２０μＬに曝露し、速やかに処理した。ＲＮＡの量および品質は、５’アンプリコンを生成するプライマーセットを用いて評価した。セットはリボソームタンパク質Ｌ３２用（３’アンプリコンと５’アンプリコンの間隔は２９８塩基）、グルコースリン酸イソメラーゼ用（３９１塩基間隔）、およびグルコースリン酸イソメラーゼ用（８４３塩基間隔）のものを含む。通常、多様な調製組織に由来するサンプルを用いるとき、これらのプライマーセットについては０．９５から０．８０の比率が得られた。病理学者が追加的な腫瘍および正常サンプルを肉眼で切り出し、液体窒素で瞬間凍結してｈＢＤ−１およびｃＭＹＣ発現について評価した。
【０１７３】
ｈＢＤ−１遺伝子のクローニング：ｈＢＤ−１  ｃＤＮＡは、公開ｈＢＤ−１配列（アクセション番号Ｕ５０９３０）から作製したプライマーを用いて逆転写ＰＣＲによりＲＮＡから作製した（Ｇａｎｚ，２００４）。ＰＣＲプライマーはＣｌａＩおよびＫｐｎＩ制限部位を含むよう設計された。ｈＢＤ−１  ＰＣＲ産物はＣｌａＩおよびＫｐｎＩによって制限消化され、さらにＴＡクローニングベクターにライゲーションされた。次に、ＴＡ／ｈＢＤ１ベクターを熱ショックによりＥ．ｃｏｌｉのＸＬ−１  Ｂｌｕｅ株にトランスフェクトし、さらに個々のクローンを選択して拡張した。Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＤＮＡ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ、カリフォルニア州バレンシア）でプラスミドを分離し、さらに配列の完全性を自動シーケンシングで検証した。次に、ｈＢＤ−１遺伝子フラグメントを、方向決定を目的とした中間ベクターとして役立つ、ＣｌａＩおよびＫｐｎＩで消化したｐＴＲＥ２にライゲーションした。ｐＴＲＥ２／ｈＢＤ−１構築物をＡｐａＩおよびＫｐｎＩで消化してｈＢＤ−１インサートを切り取った。インサートを、これもＡｐａＩおよびＫｐｎＩで二重消化したエクジソーム誘導発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）のｐＩＮＤベクターにライゲーションした。構築物をＥ．ｃｏｌｉにトランスフェクトし、さらに個々のクローンを選択して拡張した。プラスミドを分離し、さらに自動シーケンシングによりｐＩＮＤ／ｈＢＤ−１の配列完全性を再度検証した。
【０１７４】
トランスフェクション：１００ｍｍペトリ皿に細胞（１×１０６個）を播種し、１晩増殖させた。次に、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）中で、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ヘテロ二量体エクジソン受容体を発現しているｐｖｇＲＸＲプラスミド１μｇ、およびｐＩＮＤ／ｈＢＤ−１ベクター構築物またはｐＩＮＤ／β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）対照ベクター１μｇで細胞を同時トランスフェクトした。トランスフェクション効率は、ポナステロンＡ（ＰｏｎＡ）によりβ−ｇａｌ発現を誘導し、さらに細胞をβ−ガラクトシダーゼ検出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色することによって測定した。細胞株について６０〜８５％の細胞がβガラクトシダーゼを発現していることを証明した陽性染色（青色）コロニーを計数することによるトランスフェクション効率の評価。
【０１７５】
免疫細胞化学：ｈＢＤ−１タンパク質発現を検証するために、ＤＵ１４５およびｈＰｒＥＣ細胞を１．５〜２×１０４細胞／チャンバーで２穴チャンバー培養スライド（ＢＤ  ＦＡＬＣＯＮ、米国）に播種した。ｐｖｇＲＸＲのみ（対照）またはｈＢＤ−１プラスミドをトランスフェクトしたＤＵ１４５細胞を１０μＭ  ＰｏｎＡを含む培地で１８時間誘導する一方で、非トランスフェクト細胞には新鮮な増殖培地を与えた。誘導後、細胞を１×ＰＢＳで洗い、４％パラホルムアルデヒドにより室温で１時間固定した。次に、細胞を１×ＰＢＳで６回洗い、さらに２％ＢＳＡ、０．８％正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バーリングゲーム）および０．４％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を添加した１×ＰＢＳを用いて室温で１時間ブロッキングした。次に、ブロッキング溶液で１：１０００に希釈したウサギ抗ヒトＢＤ−１一次ポリクローナル抗体（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ロッキーヒル）内で細胞を１晩インキュベートした。この後、細胞をブロッキング液で６回洗い、ブロッキング液で１：１０００希釈したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体中で１時間室温でインキュベートした。細胞をブロッキング液で６回洗った後、カバースリップをＧｅｌ  Ｍｏｕｎｔ  （Ｂｉｏｍｅｄａ、カリフォルニア州フォスターシティ）で載置した。最後に、微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）および４８８ｎｍのレーザー励起の下で細胞を観察した。Ｖａｒｉｏ  ２ＲＧＢレーザースキャニングモジュールで６３×ＤＩＣ油浸レンズを用いて、共焦点顕微鏡分析（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５  Ｐａｓｃａｌ）により蛍光信号を分析した。デジタル画像は、画像処理およびハードコピー提示のためにＰｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳソフトウェア（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）にエクスポートした。
【０１７６】
ＲＮＡの分離および定量的ＲＴ−ＰＣＲは、実施例１の記載に従って実施した。公開配列からｈＢＤ−１およびｃ−ＭＹＣのプライマー対を作製した（表６）。ｈＢＤ−１およびｃ−ＭＹＣに５６．４℃およびＰＡＸ２に５５℃のアニーリング温度を用いて、標準的な条件下でＰＣＲを４０サイクル実施した。さらに、ハウスキーピング遺伝子としてβアクチン（表６：ＱＲＴ−ＰＣＲプライマーの配列）を増幅し、全ｃＤＮＡの初期含有量を正規化した。良性前立腺組織サンプルにおける遺伝子発現を、βアクチンと比較した発現比率として算出した。誘導前後の悪性前立腺組織、ｈＰＲＥＣ前立腺一次培養、および前立腺癌細胞株におけるｈＢＤ−１発現のレベルを、ｈＰｒＥＣ細胞におけるｈＢＤ−１発現の平均レベルに対して算出した。陰性対象として、ｃＤＮＡ鋳型を用いないＱＲＴ−ＰＣＲ反応も実施した。全ての反応は最低３回実施した。
【０１７７】
ＭＴＴ細胞生存率アッセイは実施例１の記載に従って実施した。
【０１７８】
膜完全性分析は実施例３の記載に従って実施した。空のプラスミドまたはｈＢＤ−１プラスミドでトランスフェクトした細胞を、１０μＭ  ＰｏｎＡを含む培地で２４または４８時間誘導する一方で、非トランスフェクト細胞には測定時点毎に新鮮な培地を与えた。
【０１７９】
【表６】
2013510558.tif 000008
【０１８０】
フローサイトメトリーおよびカスパーゼ検出は実施例１の記載に従って実施した。
【０１８１】
ＰＡＸ２のｓｉＲＮＡサイレンシングは実施例２の記載にしたがって実施した。処理前に、メーカーの指示書にしたがってＣｏｄｅｂｒｅａｋｅｒトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｉｎｃ．）でｓｉＲＮＡ分子をコーティングした。
【０１８２】
統計解析：統計解析は、対応のない数値に対するスチューデントのｔ検定を用いることによって実施した。両側計算によりｐ値を決定し、ｐ値が０．０５未満であれば統計的に有意であると見なした。統計的な差はアスタリスクで示す。
【０１８３】
前立腺組織におけるｈＢＤ−１発現：分析した前立腺癌凍結組織切片のうち８２％はｈＢＤ−１発現をほとんど示さなかった（Ｄｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ｈＢＤ１−１発現レベルを比較するために、無作為選択した悪性領域に隣接する正常前立腺組織の肉眼的切除またはＬＣＭによって採取した正常前立腺組織に対し、ＱＲＴＰＣＲ分析を実施した。この場合、肉眼的に切除した正常臨床サンプルの全てにおいて、約６．６倍の発現レベルの差に相当する発現の範囲でｈＢＤ−１が検出された（図３１Ａ）。ＬＣＭでキャプチャーした正常組織サンプルは、発現における３２倍の差に相当する範囲のレベルでｈＢＤ−１を発現した（図３１Ｂ）。サンプル数を対応する患者プロフィールに対してマッチングしたところ、大半の症例において、グリーソンスコア６の患者サンプルにおけるｈＢＤ−１発現レベルはグリーソンスコア７の患者サンプルにおけるよりも高いことが判明した。さらに、同一の患者番号１３４３より肉眼的切除およびＬＣＭによって採取した組織においてｈＢＤ−１発現レベルを比較したところ、２つの分離法の間に８５４倍の発現差があることが証明された。したがって、これらの結果よりＬＣＭは前立腺組織におけるｈＢＤ−１発現を評価するより高感度の技術を提供することが示される。
【０１８４】
前立腺細胞株におけるｈＢＤ−１発現：前立腺癌細胞株においてｈＢＤ−１発現系をトランスフェクトした後のｈＢＤ−１アップレギュレーションを検証するために、ＱＲＴＰＣＲを実施した。さらに、鋳型のない陰性対照も実施し、また増幅産物をゲル電気泳動法により検証した。この場合、前立腺癌細胞株におけるｈＢＤ−１発現はｈＰｒＥＣ細胞と比較して有意に低くなった。ＤＵ１４５、ＰＣ３およびＬＮＣａＰにおける２４時間誘導後のｈＢＤ−１相対発現レベルは、ｈＢＤ−１誘導前の当該細胞株と比較して有意に上昇した（図３２Ａ）。
【０１８５】
次に、免疫細胞化学により、ＰｏｎＡによる誘導後にｈＢＤ−１発現系でトランスフェクトしたＤＵＣ１４５細胞において、ｈＢＤ−１のタンパク質発現を検証した。陽性対照として、ｈＢＤ−１を発現しているｈＰｒＥＣ前立腺上皮細胞も検討した。細胞をｈＢＤ−１に対する１次抗体で染色し、さらにタンパク質発現を二次抗体の緑色蛍光に基づいてモニタリングした（図３２Ｂ）。ＤＩＣ下で細胞を分析することにより、１８時間後にｈＢＤ−１発現が誘導されたｈＰｒＥＣ細胞およびＤＵ１４５細胞の存在を検証する。４８８ｎｍの共焦点レーザーの生成による励起によって、陽性対照としてのｈＰｒＣＥにおけるｈＢＤ−１タンパク質の存在を示す緑色蛍光が判明した。しかし、対照ＤＵ１４５細胞および空のプラスミドを導入したＤＵ１４５細胞においては検出可能な緑色蛍光はなく、ｈＢＤ−１発現は示されなかった。ｈＢＤ−１発現を誘導したＤＵ１４５細胞の共焦点分析により、ＰｏｎＡによる誘導後のｈＢＤ−１タンパク質の存在を示す緑色蛍光が判明した。
【０１８６】
ｈＢＤ−１発現により細胞生存率が低下する：ＤＵ１４５、ＰＣ３、ＰＣ３／ＡＲ＋およびＬＮＣａＰ前立腺癌細胞株における相対細胞生存率に対するｈＢＤ−１発現の影響を評価するために、ＭＴＴアッセイを実施した。空のベクターによるＭＴＴ分析では細胞生存率に統計的に有意な変化は示されなかった。ｈＢＤ−１誘導より２４時間後の相対的細胞生存率はＤＵ１４５細胞で７２％およびＰＣ３細胞で５６％であり、また４８時間後の細胞生存率はＤＵ１４５において４９％およびＰＣ３細胞において３７％低下した（図３３Ａ）。ｈＢＤ−１誘導より７２時間後の相対的細胞生存率はＤＵ１４５細胞で４４％およびＰＣ３細胞で２９％までさらに低下した。逆に、ＬＮＣａＰ細胞の生存率には有意な影響はなかった。ＬＮＣａＰに認められたｈＢＤ−１細胞毒性に対する耐性がアンドロゲン受容体（ＡＲ）の存在によるものであるか否か評価するために、異所性ＡＲ発現（ＰＣ３／ＡＲ＋）を用いてＰＣ３細胞におけるｈＢＤ−１細胞毒性を検討した。この場合、ＰＣ３／ＡＲ＋とＰＣ３細胞の間に差はなかった。したがって、データよりｈＢＤ−１は後期ステージ前立腺癌細胞に対して特異的な細胞毒性を有することが示される。
【０１８７】
ＰＣ３およびＤＵ１４５に対するｈＢＤ−１の影響が細胞分裂抑制性であるか、あるいは細胞毒性であるか測定するために、ＦＡＣＳ分析を実施して細胞死を測定した。正常増殖条件において、ＰＣ３およびＤＵ１４５培養の９０％以上が生存しておりかつ非アポトーシス（左下象限）でありかつアネキシンＶまたはＰＩで染色されなかった（図４）。ＰＣ３細胞においてｈＢＤ−１発現を誘導した後、初期アポトーシスおよび後期アポトーシス／壊死を被った細胞の個数（それぞれ右下および右上象限）は１２時間で合計１０％、２４時間で２０％、かつ４８時間で４４％であった。ＤＵ１４５細胞については、初期アポトーシスおよび後期アポトーシス／壊死を被った細胞の個数は誘導１２時間後で合計１２％、２４時間で３４％、かつ４８時間で５９％であった。ＰｏｎＡによる誘導後の空のプラスミドを含有する細胞においては、アポトーシスの増加は認められなかった。アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウム取り込み試験より、ｈＢＤ−１はＤＵ１４５およびＰＣ３前立腺癌細胞に対して細胞毒性を有することが判明しており、また結果より細胞死の機構としてのアポトーシスが示される。
【０１８８】
ｈＢＤ−１は膜完全性およびカスパーゼ活性の変化を引き起こす：ｈＢＤ−１誘導後の前立腺癌細胞に認められた細胞死がカスパーゼ介在性アポトーシスであるか否かを検討した。ｈＢＤ−１発現に関与する細胞機構をより良く理解するために、ｈＢＤ−１発現を誘導したＤＵ１４５およびＬＮＣａＰ細胞に対して共焦点レーザー顕微鏡分析を実施した（図５）。活発なアポトーシスを被る細胞における緑色蛍光ＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫのカスパーゼとの結合および開裂に基づいてパンカスパーゼ活性をモニタリングした。ＤＩＣ下での細胞の分析により、０時間における生存対照ＤＵ１４５（図５Ａ）およびＬＮＣａＰ（図５Ｅ）細胞の存在が示された。４８８ｎｍの共焦点レーザーで励起したところ検出可能な緑色染色は生成されず、ＤＵ１４５（図５Ｂ）またはＬＮＣａＰ（図５Ｆ）にカスパーゼ活性がないことが示された。２４時間の誘導後、ＤＵ１４５（図５Ｃ）およびＬＮＣａＰ（図５Ｇ）細胞をＤＩＣ下で再度可視化した。蛍光下の共焦点分析により、ｈＢＤ−１発現後のパンカスパーゼ活性を示すＤＵ１４５（図５Ｄ）細胞の染色が判明した。しかし、ｈＢＤ−１発現を誘導したＬＮＣａＰ（図５Ｈ）細胞においては緑色染色はなかった。したがって、ｈＢＤ−１誘導後に認められた細胞死はカスパーゼ介在性アポトーシスであった。
【０１８９】
提唱されているディフェンシンペプチドの抗微生物活性は、細孔形成による微生物膜の崩壊である（Ｐａｐｏ  ａｎｄ  Ｓｈａｉ、２００５）。ｈＢＤ−１発現が膜完全性を変化させたか測定するために、共焦点分析によりＥｔＢｒ取り込みを検討した。無傷の細胞は膜透過性であるＡＯによって緑色に染まる一方で、原形質膜が崩壊した細胞のみが膜不透過性ＥｔＢｒの取り込みによって赤色に染まった。対照ＤＵ１４５およびＰＣ３細胞はＡＯ染色陽性でかつ緑色発光したが、ＥｔＢｒでは染色されなかった。しかしＤＵ１４５およびＰＣ３においてｈＢＤ−１を誘導したところ、いずれも細胞質において２４時間で赤色染色で示されるＥｔＢｒ蓄積が見られた。４８時間までに、ＤＵ１４５およびＰＣ３は凝集した核を有し、それぞれＡＯおよびＥｔＢｒによる緑色および赤色染色の共存によって見かけ上黄色となった。逆に、ＡＯによって緑色蛍光が陽性であるが赤色ＥｔＢｒ蛍光がないことで示されるように、誘導４８時間後のＬＮＣａＰ細胞の膜完全性には観測可能な変化はなかった。この所見より、ｈＢＤ−１発現に応答した膜完全性および透過性の変化は初期と後期ステージ前立腺癌細胞の間で異なることが示される。
【０１９０】
ｈＢＤ−１とｃＭＹＣの発現レベルの比較：３例の患者より採取したＬＣＭ前立腺組織切片に対してＱＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した（図３４）。患者番号１４５７においては、ｈＢＤ−１発現により正常からＰＩＮまで２．７分の１の減少、ＰＩＮから腫瘍まで３．５分の１の減少、および正常から腫瘍まで９．３分の１の減少を示した（図３４Ａ）。同様に、患者番号１４５７においてｃＭＹＣ発現は正常からＰＩＮまで１．７分の１に減少、ＰＩＮから腫瘍まで１．７分の１に減少、および正常から腫瘍まで２．８分の１に減少という同様の発現パターンに従った（図３４Ｂ）。さらに、他の２例の患者におけるｃＭＹＣ発現には統計的に有意な減少があった。患者番号１５６９は正常からＰＩＮまで２．３分の１の減少があったのに対し、患者番号１５８６では正常からＰＩＮまで１．８分の１の減少、ＰＩＮから腫瘍まで４．３分の１の減少および正常から腫瘍まで７．９分の１の減少があった。
【０１９１】
ＰＡＸ２阻害後のｈＢＤ−１発現の誘導：ｈＢＤ−１発現を調節する際のＰＡＸ２の役割をさらに検討するために、ｓｉＲＮＡを用いてＰＡＸ２発現をノックダウンし、さらにｈＢＤ−１発現をモニタリングするためにＱＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡでｈＰｒＥＣ細胞を処理したところ、ｈＢＤ−１発現に対して影響を示さなかった（図３５）。しかし、ＰＡＸ２をノックダウンしたところｈＢＤ−１発現は未処理細胞と比較してＬＮＣａＰは４２倍、ＰＣ３は３７倍、およびＤＵ１４５は１０２６倍増加した（図１０ａ）。陰性対照として、細胞を非特異的ｓｉＲＮＡで処理したところ、ｈＢＤ−１発現には有意な影響を示さなかった。
【実施例１１】
【０１９２】
（ｐ５３状態の異なる前立腺癌細胞においてＰＡＸ２発現を阻害すると代替的な細胞死経路が誘導される）
（材料と方法）
細胞株：いずれもｐ５３変異状態が異なる癌細胞株ＰＣ３、ＤＵ１４５およびＬＮＣａＰ（表７：前立腺癌細胞株におけるｐ５３遺伝子変異）を、実施例１に記載の方法で培養した。
【０１９３】
ＰＡＸ２のｓｉＲＮＡサイレンシングおよびウェスタン分析は実施例２の記載に従って実施した。次に、ブロットを１：１０００希釈ウサギ抗ＰＡＸ２一次抗体（Ｚｙｍｅｄ、カリフォルニア州サンフランシスコ）でプローブした。洗浄後、膜をセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ウサギ抗体（ＨＲＰ）（１：５０００希釈；Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートし、シグナル検出をＡｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｆｌｕｏｒｃｈｅｍ  ８９００上で化学発光試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて可視化した。対照として、ブロットを剥離し、マウス抗βアクチン一次抗体（１：５０００，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＨＲＰコンジュゲート抗マウス二次抗体（１：５０００，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でリプローブし、シグナル検出を再度可視化した。
【０１９４】
【表７】
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【０１９５】
位相差顕微鏡分析およびＭＴＴ細胞毒性アッセイは実施例２の記載に従って実施した。
【０１９６】
パンカスパーゼ検出および定量的ＲＴ−ＰＣＲは、実施例１の記載に従って実施した。公開配列からＢＡＸ、ＢＩＤ、ＢＣＬ−２，ＡＫＴおよびＢＡＤのプライマー対を作製した（表８：定量的ＲＴ−ＰＣＲプライマー）。反応はＭｉｃｒｏＡｍｐ  Ｏｐｔｉｃａｌ  ９６ウェル反応プレート（ＰＥ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）中で実施した。アニーリング温度６０℃を用いて、標準的な条件下でＰＣＲを４０サイクル実施した。定量値は、指数的増幅が始まったサイクル数（閾値）により決定し、さらに３回の反復より得られた値を平均した。メッセージレベルと閾値の間には逆関係があった。さらにＧＡＰＤＨをハウスキーピング遺伝子として用い、全ｃＤＮＡの初期含有量を正規化した。相対発現は、各遺伝子とＧＡＰＤＨの比率として算出した。全ての反応は３本ずつ実施した。
【０１９７】
【表８】
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【０１９８】
膜透過性アッセイは実施例３の記載にしたがって実施した。ＰＣ３およびＬＮＣａＰ細胞をＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ、非特異的ｓｉＲＮＡまたは培地のみでトランスフェクトした。
【０１９９】
前立腺細胞におけるＰＡＸ２タンパク質発現の分析：ＨＰｒＥＣ前立腺一次培養およびＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５およびＰＣ３前立腺癌細胞株において、ウェスタン分析によりＰＡＸ２タンパク質発現を検討した。この場合、全ての前立腺癌細胞株においてＰＡＸ２タンパク質が検出された（図３６Ａ）。しかし、ＨＰｒＥＣに検出可能なＰＡＸ２タンパク質はなかった。ブロットを剥離し、内部対照としてβアクチンについてリプローブして装填が均一であることを確認した。ＤＵ１４５、ＰＣ３およびＬＮＣａＰ前立腺癌細胞株において、ＰＡＸ２特異的ｓｉＲＮＡによる選択的ターゲティングおよび阻害後のＰＡＸ２タンパク質発現もモニタリングした。細胞には、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡのプールによるトランスフェクションを６日間の処理期間にわたって１ラウンド実施した。ＰＡＸ２タンパク質は培地のみで処理した対照細胞に発現していた。３つの細胞株全てにおいて、ＰＡＸ２タンパク質のノックダウンを観察することによりＰＡＸ２  ｍＲＮＡの特異的ターゲティングを確認した（図３６Ｂ）。
【０２００】
ＰＡＸ２ノックダウンの前立腺癌細胞増殖に対する影響：光学顕微鏡分析およびＭＴＴ分析により、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡの細胞数および細胞生存率に対する影響を分析した。ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡの細胞数に対する影響を検討するために、ＰＣ３、ＤＵ１４５およびＬＮＣａＰ細胞株を培地のみ、非特異的ｓｉＲＮＡ、またはＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで６日間トランスフェクトした。各細胞株は培地のみを含む６０ｍｍ培養皿において８０〜９０％コンフルエントに到達した。ＨＰｒＥＣ、ＤＵ１４５、ＰＣ３およびＬＮＣａＰ細胞の非特異的ｓｉＲＮＡによる処理は、培地のみで処理した細胞と比較して細胞増殖にほとんど影響がないようであった（それぞれ図３８Ａ、３８Ｃおよび３８Ｅ）。ＰＡＸ２−欠損細胞株ＨＰｒＥＣをＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで処理したところ、細胞増殖に有意な影響がないようであった（図３７Ｂ）。しかし、前立腺癌細胞株ＤＵ１４５、ＰＣ３およびＬＮＣａＰをＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで処理したところ細胞数が有意に減少した（それぞれ３８Ｄ、３８Ｆおよび３８Ｈ）。
【０２０１】
ＰＡＸ２ノックダウンの前立腺癌細胞生存率に対する影響：細胞生存率は２、４および６日間曝露後に測定した。生存百分率は、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで処理した細胞の５７０〜６３０ｎｍの吸光度を未処理対照細胞で割った比率として算出した。陰性対照として、陰性対照非特異的ｓｉＲＮＡまたはトランスフェクション試薬のみによる各処理期間後に細胞生存率を測定した。相対細胞生存率は、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ処理後の生存百分率を非特異的ｓｈＲＮＡによる処理後の生存百分率で割ることにより算出した（図３８）。２日間処理後の相対細胞生存率はＤＵ１４５において１１６％、ＰＣ３において８１％、およびＬＮＣａＰにおいて９８％であった。４日間処理後の相対細胞生存率はＤＵ１４５で６９％、ＰＣ３で７９％およびＬＮＣａＰで８０％まで低下した。最終的に、６日までの相対的細胞生存率はＤＵ１４５で６３％、ＰＣ３で４３％およびＬＮＣａＰで４４％であった。さらに、トランスフェクション試薬のみで処理した後の細胞生存率も測定した。この場合、各細胞株は細胞生存率の有意な低下を示さなかった。
【０２０２】
パンカスパーゼ活性の検出：カスパーゼ活性は共焦点レーザー顕微鏡分析法によって検出した。ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５およびＰＣ３細胞をＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで処理し、蛍光緑色となる活発なアポトーシスを被る細胞におけるＦＡＭ標識ペプチドのカスパーゼとの結合に基づいて活性をモニタリングした。培地のみの細胞を分析したところ、生存ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５およびＰＣ３細胞の存在がそれぞれ示された。４８８ｎｍの共焦点レーザーによって励起したところ検出可能な緑色染色は生成されず、このことより未処理細胞にカスパーゼ活性がないことが示された（それぞれ３９Ａ、３９Ｃおよび３９Ｅ）。ＰＡＸ２  ｓｉＲＡＮによる４日間処理後、ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５およびＰＣ３細胞は蛍光下でカスパーゼ活性を示す緑色染色を呈した（それぞれ図３９Ｂ、３９Ｄおよび３９Ｆ）。
【０２０３】
ＰＡＸ２阻害のアポトーシス因子に対する影響：ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５およびＰＣ３細胞をＰＡＸ２に対するｓｉＲＮＡで４日間処理し、さらにＱＲＴＰＣＲによりプロおよび抗アポトーシス因子を共に測定した。ＰＡＸ２ノックダウン後にＢＡＤを分析したところ、ＬＮＣａＰで２倍、ＤＵ１４５で１．５８倍およびＰＣ３で１．３７５倍であることが明らかとなった（図４０Ａ）。ＢＩＤの発現レベルはＬＮＣａＰでは１．３８倍かつＤＵ１４５では１．７８倍増加したが、ＰＡＸ２発現抑制後のＰＣ３に認められたＢＩＤには統計的有意差はなかった（図４０Ｂ）。抗アポトーシス因子ＡＫＴを分析したところ、処理後の発現はＬＮＣａＰにおいては１．２５分の１にかつＤＵ１４５においては１．２８分の１に低下することが判明したが、ＰＣ３では変化が認められなかった（図４０Ｃ）。
【０２０４】
膜完全性および壊死の分析：ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５およびＰＣ３細胞において共焦点分析により膜完全性をモニタリングした。この場合、無傷の細胞は膜透過性であるＡＯによって緑色に染まる一方で、原形質膜が崩壊した細胞は膜不透過性ＥｔＢｒの細胞質への取り込みによって赤色に、かつ核内はＡＯとＥｔＢｒの共存により黄色に染まるであろう。未処理ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５およびＰＣ３細胞はＡＯ染色陽性でかつ緑色発光したが、ＥｔＢｒでは染色されなかった。ＰＡＸ２ノックダウン後は、ＡＯによる緑色蛍光が陽性であるが赤色ＥｔＢｒ蛍光がないことで示されるように、ＬＮＣａＰ細胞の膜完全性に観測可能な変化はなかった。これらの所見より、ＬＮＣａＰ細胞はＰＡＸ２ノックダウン後にアポトーシス性ではあるが壊死性ではない細胞死を被ることがあることがさらに示される。逆に、ＤＵ１４５およびＰＣ３におけるＰＡＸ２ノックダウンの結果、赤色染色で示されるようにＥｔＢｒが細胞質に蓄積した。さらに、ＤＵ１４５およびＰＣ３は共に凝集した核を有し、それぞれＡＯおよびＥｔＢｒによる緑色および赤色染色の共存によって見かけ上黄色であった。これらの結果より、ＤＵ１４５およびＰＣ３は、ＬＮＣａＰと比較して、壊死的細胞死を包含する代替的な細胞死経路を被ることを示している。
【実施例１２】
【０２０５】
（乳癌細胞株および腺管または小葉上皮内腫瘍を有する乳房組織におけるＰＡＸ２およびＤＥＦＢ−１発現）
ＰＡＸ２およびＤＥＦＢ−１発現は、腺管または小葉上皮内腫瘍の乳癌生検サンプル、および以下の乳癌細胞株において測定されるであろう：
【０２０６】
ＢＴ−２０：原発性浸潤性腺管癌より分離され；細胞はＥ−カドヘリン、ＥＲ、ＥＧＦＲおよびｕＰＡを発現する。
【０２０７】
ＢＴ−４７４：原発性浸潤性腺管癌より分離され；細胞はＥ−カドヘリン、ＥＲ、ＰＲを発現し、かつＨＥＲ２／ｎｅｕが増幅されている。
【０２０８】
Ｈｓ５７８Ｔ：原発性浸潤性腺管癌より分離され；Ｈｓ５７８Ｂｓｔと呼ばれる正常隣接組織からも細胞株が確立された。
【０２０９】
ＭＣＦ−７：胸水より確立された。細胞はＥＲを発現しかつエストロゲン反応性乳癌細胞の最も一般的な例である。
【０２１０】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１：胸水より確立された。細胞はＥＲ陰性であり、Ｅ−カドヘリン陰性でありかつインビトロ分析において浸潤性が高い。
【０２１１】
ＭＤＡ−ＭＢ−３６１：脳転移より確立された。細胞はＥＲ、ＰＲ、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する。
【０２１２】
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５：胸水より確立された。細胞はＥＲ陰性であり、Ｅ−カドヘリン陰性でありかつ免疫不全マウスにおいて浸潤性が高くかつ転移性である。
【０２１３】
ＭＤＡ−ＭＢ−４６８：胸水より確立された。細胞はＥＧＦＲが増幅されかつＥＲ陰性である。
【０２１４】
ＳＫ−ＢＲ−３：胸水より確立された。細胞はＨＥＲ／２ｎｅｕが増幅され、ＥＧＦＲを発現し、かつＥＲ陰性である。
【０２１５】
Ｔ−４７Ｄ：胸水より確立された。細胞はＥ−カドヘリン、ＥＲおよびＰＲの発現を保持する。
【０２１６】
ＺＲ−７５−１：腹水より確立された。細胞はＥＲ、Ｅ−カドヘリン、ＨＥＲ２／ｎｅｕおよびＶＥＧＦを発現する。
【０２１７】
ＰＡＸ２対ＤＥＦＢ１発現比率は、実施例９に記載の方法を用いて測定されるであろう。
【実施例１３】
【０２１８】
（乳癌細胞におけるＤＥＦＢ１の発現）
ＤＥＦＢ１は、実施例１に記載の方法を用いて乳癌細胞に発現されるであろう。細胞生存率およびカスパーゼ活性は、実施例１に記載の方法を用いて測定されるであろう。
【実施例１４】
【０２１９】
（乳癌細胞におけるＰＡＸ２発現の阻害）
乳癌細胞におけるＰＡＸ２発現は、実施例２に記載のｓｉＲＮＡを用いて阻害されるであろう。ＢＡＸ、ＢＩＤおよびＢＡＤなどのプロアポトーシス遺伝子の発現レベル、細胞生存率およびカスパーゼ活性は、実施例２の記載に従って測定されるであろう。
【実施例１５】
【０２２０】
（インビボにおけるＤＥＦＢ１発現の腫瘍増殖に対する影響）
ＤＥＦＢ１の抗腫瘍能力は、ＤＥＦＢ１を過剰発現した乳癌細胞をヌードマウスに注射することによって評価されるであろう。乳癌細胞は、ＤＥＦＢ１遺伝子を担持する発現ベクターによってトランスフェクトされるであろう。外因性ＤＥＦＢ１遺伝子を発現する細胞を選択およびクローニングするであろう。生存率＞９０％の単一細胞懸濁液のみを用いる。各動物に対し、約５００，０００個の細胞を雌性ヌードマウスの右側腹部に皮下投与する。ベクターのみのクローンを注射された対照群およびＤＥＦＢ１を過剰発現するクローンを注射された群の２群がある。統計学者の決定に従い、各群マウス３５匹とする。動物は週２回体重測定し、キャリパーで腫瘍増殖をモニタリングし、さらに以下の式を用いてに腫瘍体積を測定する：体積＝０．５×（幅）２×長さ。全ての動物は、腫瘍のサイズが２ｍｍ３に達した時または移植より６ヶ月後にＣＯ２過剰投与によって屠殺し；腫瘍を切除し、秤量し、病理検査のために中性緩衝化ホルマリンに保存する。腫瘍の増殖の群間差を、要約統計量および図面表示により記述的にキャラクタライゼーションする。統計的有意性は、ｔ検定またはノンパラメトリックな同等法のいずれかで評価する。
【実施例１６】
【０２２１】
（インビボにおけるＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡの腫瘍増殖に対する影響）
インビトロ試験で用いたヘアピンＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ鋳型オリゴヌクレオチドを用いて、インビボでＤＥＦＢ１発現アップレギュレーションの影響を検討する。センスおよびアンチセンス鎖（表３参照）をアニーリングし、ヒトＵ６  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの制御の下で、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ２．１  Ｕ６  ｈｙｇｒｏ  ｓｉＲＮＡ発現ベクター（Ａｍｂｉｏｎ）にクローニングする。クローン化プラスミドをシーケンシングし、検証し、さらに乳癌細胞株にトランスフェクトする。スクランブルｓｈＲＮＡをクローニングし、本試験における陰性対照として用いる。ハイグロマイシン耐性コロニーを選択し、マウスに細胞を皮下導入し、さらに腫瘍の増殖を上述の通りにモニタリングする。
【実施例１７】
【０２２２】
（小分子量ＰＡＸ２結合阻害剤の乳癌細胞に対する影響）
実施例６に記載された代替的な阻害性オリゴヌクレオチドは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬またはＣｏｄｅｂｒｅａｋｅｒトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｉｎｃ．）を用いて乳癌細胞にトランスフェクトされるであろう。ＤＮＡ−タンパク質相互作用を確認するために、２本鎖オリゴヌクレオチドを［３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識し、電気泳動移動度シフト分析を実施する。オリゴヌクレオチド処理後にＱＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタン分析によりＤＥＦＢ１発現をモニタリングするであろう。最後に、前述のようにＭＴＴアッセイおよびフローサイトメトリーにより細胞死を検出するであろう。
【０２２３】
上記の記載は、当業者に対して本発明をどのように実践するか教示することを目的としており、当業者が本記述を読む際に明白となるであろうそれらの明白な変更およびその変法の詳細を述べることは意図していない。しかし、全てのそのような明白な変更および変法は、以下の請求項に定義される本発明の範囲内に含まれることを意図する。請求項は、文脈が具体的に反対のことを示さない限り、そこに意図された目的にかなうために有効なあらゆる順序にある請求された構成要素および手順を包含することを意図する。
【図１Ａ−Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ−Ｈ】
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【図５Ｉ−Ｌ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2013510558.tif 000058