(57)【要約】プロドラッグおよびリン脂質に連結されたプロドラッグを含んでなるナノ粒子であって、連結が、粒子及び細胞膜の融合によって、ナノ粒子から標的細胞又は細胞膜内のサイトへのプロドラッグの遊離を促進するナノ粒子が開示される。さらに、ナノ粒子及びそれらの構成要素を製造し及び使用する方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞への化合物の生体内送達のための組成物であって、該組成物は非リポソーム粒子および少なくとも1つのプロドラッグを含んでなり、ここで、
(a) 粒子の外側表面は少なくとも1つのプロドラッグを含んでなる膜で、さらに約100%から約60%のリン脂質を含んでなり、粒子の外側表面は、標的細胞の細胞膜の外部の小葉に生体内で融合することができ、そのような融合は、結果的に粒子から標的細胞の外部の小葉までプロドラッグの移行をもたらし、
(b) プロドラッグは、ホスホグリセリドのアシル部分に連結された約3000da未満の化合物を含んでなり、ここで、化合物は酵素開裂によってホスホグリセリドバックボーンから放出されてもよく、
(c) プロドラッグは、本質的に標的細胞の外部の小葉へのプロドラッグの移行まで粒子の外側表面細胞膜に残り、および
(d) プロドラッグは外部の小葉から標的細胞の細胞膜の内部の小葉までさらに移送されて、酵素開裂する連結の開裂によって結果的に化合物の放出を細胞内でもたらす、組成物。
【請求項２】
粒子の外側表面はプロドラッグの高々3%を含んでなる、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
粒子の外側表面がポリソルベートの高々約10%を含んでなる、請求項1に記載の組成物。
【請求項４】
外側表面の約10%未満が架橋されている、請求項1に記載の組成物。
【請求項５】
外側表面はさらにホーミング配位子を含んでなる、請求項1に記載の組成物。
【請求項６】
外側表面はホーミング配位子を除いてPEG化されていない、請求項5に記載の組成物。
【請求項７】
ホーミング配位子は下記の群：抗体、抗体断片、ペプチド、アシアロ糖蛋白質、多糖、核酸、小分子およびペプチド模倣体から選ばれる、請求項5に記載の組成物。
【請求項８】
化合物はホスホグリセリドのsn-2アシル部分に連結されている、請求項1に記載の組成物。
【請求項９】
プロドラッグのアシル部分は、グリセリンバックボーンsn-2エステル結合からの長さで少なくとも4炭素原子である、請求項8に記載の組成物。
【請求項１０】
プロドラッグは、ペプチド、ペプチド模倣体若しくは類縁体、有機金属錯体、有機分子、核酸若しくはその類縁体から成る群から選択された化合物を含んでなる、請求項1に記載の組成物。
【請求項１１】
生体内で、酵素開裂する連結は実質的に細胞外で開裂されない、請求項1に記載の組成物。
【請求項１２】
プロドラッグは、化合物I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIIIおよびXIXから成る群から選択された化合物を含んでなる、請求項1に記載の組成物。
【請求項１３】
プロドラッグは、ドキソルビシン、ドセタセル、メチルプレドニゾロン、フマギリン若しくはその類縁体、カンプトテシン若しくはその類縁体及びPDT薬から選択された化合物を含んでなる、請求項1に記載の組成物。
【請求項１４】
プロドラッグは、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトールおよびホスファチジルセリンから成る群から選択されたホスホグリセリドを含んでなる、請求項1に記載の組成物。
【請求項１５】
粒子が約10nm及び10マイクロメートルの間にある、請求項1に記載の組成物。
【請求項１６】
化合物はプロドラッグである、請求項1に記載の組成物。
【請求項１７】
標的細胞への化合物の生体内送達のための方法であって、該方法は被験者に組成物を投与することを含んでなり、該組成物は非リポソーム粒子および少なくとも1つのプロドラッグを薬学的に許容できる担体中に含んでなり:
ここで、
(a) 粒子の外側表面は少なくとも1つのプロドラッグを含んでなる膜で、さらに約100%から約60%のリン脂質を含んでなり、粒子の外側表面は、標的細胞の細胞膜の外部の小葉に生体内で融合することができ、そのような融合は、粒子から標的細胞の外部の小葉までプロドラッグの移行を結果的にもたらし、
(b) プロドラッグは、ホスホグリセリドのアシル部分に連結された約3000da未満の化合物を含んでなり、ここで、該化合物は酵素開裂によってホスホグリセリドバックボーンから放出されてもよく、
(c) プロドラッグは、本質的に標的細胞の外部の小葉へのプロドラッグの移行まで粒子の外側表面細胞膜に残り、および
(d) プロドラッグは外部の小葉から標的細胞の細胞膜の内部の小葉までさらに移送されて、酵素開裂する連結の開裂によって結果的に化合物の放出を細胞内でもたらす、方法。
【請求項１８】
上記の方法において、組成物は静脈内投与される、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
上記の方法において、組成物はさらに追加の活性な薬学的有効成分を含んでなる、請求項17に記載の方法。
【請求項２０】
上記の方法において、組成物は、化合物I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIIIおよびXIXから成る群から選択されたプロドラッグを含んでなる、請求項17に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプロドラッグ組成物、1つ以上のプロドラッグを含んでなるナノ粒子およびその使用方法を包含する。
【背景技術】
【０００２】
政府の権利
本発明は、国立衛生研究所によって与えられたNS059302及びCA119342の下の政府支援で為された。政府は本発明にある権利を有する。
【０００３】
生体外の活性での既知の活性化合物は、これらの化合物の送達での障害のために生体内の療法にはアクセス可能ではないかもしれない。例えば、化合物には生体内の半減期に不足があることもあり、化合物を実際には生体内で役立たなくする。同様に、化合物は生体内で不安定であることもあり、生理学的条件の下に不活性化合物に変化し得る。又は、その代わりに、化合物は重要な毒性に関係しているかもしれず、その生体内の使用を困難にする。したがって、化合物の活性を生体内で維持し、潜在的な毒性を回避して、所望の標的細胞に到達する様にこれらの活性化合物を送達する方法について、必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の1つの態様は、標的細胞への化合物の生体内送達用の組成物を包含する。組成物は非リポソーム粒子および少なくとも1つのプロドラッグを含んでなる。粒子の外側表面は少なくとも1つのプロドラッグで構成された膜で、さらに約100%から約60%のリン脂質で構成され、粒子の外側表面は、標的細胞の細胞膜の外部の小葉に生体内で融合することができ、そのような融合は結果的に、粒子から標的細胞の外部の小葉までプロドラッグの移行をもたらす。プロドラッグは、ホスホグリセリドのアシル部分に連結された約3000da未満の化合物を含んでなり、そこで化合物は酵素開裂によってホスホグリセリドバックボーンから放出（又は、遊離：リリース）されてもよい。プロドラッグは、本質的に標的細胞の外部の小葉へのプロドラッグの移行まで粒子の外側表面細胞膜に残り、プロドラッグは外部の小葉から標的細胞の細胞膜の内部の小葉までさらに移送されて、酵素開裂する連結（リンケージ）の開裂によって結果的に化合物の放出を細胞内でもたらす。
【０００５】
本発明のもう一の態様は、標的細胞への化合物の生体内送達用の方法を包含する。その方法は被験者へ組成物、即ち薬学的に許容できる担体中に非リポソーム粒子および少なくとも1つのプロドラッグを含んでなる組成物、を投与することを含んでなる。粒子の外側表面は少なくとも1つのプロドラッグで構成された膜で、さらに約100%から約60%のリン脂質で構成され、粒子の外側表面は、標的細胞の細胞膜の外部の小葉に生体内で融合することができ、そのような融合は結果的に、粒子から標的細胞の外部の小葉までプロドラッグの移行をもたらす。プロドラッグは、ホスホグリセリドのアシル部分に連結された約3000da未満の化合物を含んでなり、そこで化合物は酵素開裂によってホスホグリセリドバックボーンから放出されてもよい。プロドラッグは、本質的に標的細胞の外部の小葉へのプロドラッグの移行まで粒子の外側表面細胞膜に残り、及び、プロドラッグは外部の小葉から標的細胞の細胞膜の内部の小葉までさらに移送されて、酵素開裂する連結の開裂によって結果的に化合物の放出を細胞内でもたらす。
【０００６】
他の態様および本発明の反復はより詳細に以下で議論される。
【０００７】
カラー図への言及
出願書類は、カラーで写された少なくとも1つの写真を含んでいる。カラー写真を伴ったこの特許出願公開のコピーは、リクエストおよび必要な料金の支払いの上、官庁によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図1は、プロドラッグによって送達されたドキソルビシン(A)およびフリーのドキソルビシン薬(B)で処理された細胞の光学顕微鏡イメージを示す。
【０００９】
【図２】図2は、未処理対照（コントロール）と比較して、細胞増殖に対するフリーのドキソルビシン薬およびプロドラッグ・ドキソルビシンの影響を示すグラフである。
【００１０】
【図３】図3は、ラットマトリゲル(matrigel)プラグモデル中のインテグリンにターゲットとされたPFCナノ粒子に組み入れられたドキソルビシン及びパクリタキセルのプロドラッグに対する脈管形成性の応答を表すグラフである(n=2/群)。
【００１１】
【図４】図4は、ウサギ中のvx2腫瘍モデル(n=2/群)中における、非プロドラッグパクリタキセルでの1.5Tでの血管形成コントラスト増強術における非意味変化(A)、およびインテグリンをターゲットとしたがPFCナノ粒子に組み入れられたパクリタキセルプロドラッグに対する脈管形成性の応答(B)、を例証する2つのグラフを表す。
【００１２】
【図５】図5は、ドキソルビシンおよび機能的な修飾用に利用可能なサイトを表す。
【００１３】
【図６】図6は、PC-ドキソルビシン共役1の合成スキームを表す。
【００１４】
【図７】図7は、PC-ドキソルビシン(PC-DXR)候補-1プロドラッグおよびそのプロドラッグの1H NMR(400MHZ)分光学を表す。
【００１５】
【図８】図8は、タキソールプロドラッグの合成スキームを表す。
【００１６】
【図９】図9は、2F2B内皮細胞に対するPC-パクリタキセル(PC-PXTL)プロドラッグの抗増殖性の影響を表すグラフである。
【００１７】
【図１０】図10は、シスプラチン-プロドラッグ-1の合成スキームを表す。
【００１８】
【図１１】図11は、シスプラチン-プロドラッグ-2の合成スキームを表す。
【００１９】
【図１２】図12は、メトトレキセートプロドラッグの合成スキームを表す。
【００２０】
【図１３】図13は、ブロテゾミブ(brotezomib)プロドラッグの合成スキームを表す。
【００２１】
【図１４】図14は、myc-阻害剤プロドラッグ(A)および代替変種(B)の合成スキームを表す。
【００２２】
【図１５】図15は、レナリドミド(lenalidomide)プロドラッグの合成スキームを表す。
【００２３】
【図１６】図16は、フマギリンプロドラッグ1(トップ)およびフマギリンプロドラッグ2の合成スキームを表す(ボトム)。
【００２４】
【図１７】図17は、光線力学療法(PDT)プロドラッグの合成スキームを表す。
【００２５】
【図１８】図18は、ドセタキセル-プロドラッグ(A)および代替変種(B)の合成スキームを表す。
【００２６】
【図１９】図19は、脂質膜に溶けたフマギリンが生体外で安定であるが、生体内で急速に失われることを説明する2つのグラフを表す。(A) フマギリンの生体外放出は4日間保持される。(B) フマギリンの生体内放出は数分内に生じる。
【００２７】
【図２０】図20は、αvβ3にターゲットとされたフマギリンプロドラッグの投与が移植組織体積増加を縮小させることを示すグラフを表す。
【００２８】
【図２１】図21は、αvβ3にターゲットとされたフマギリンプロドラッグがCyQuantアッセイによって測定されるような細胞増殖(A)を縮小すること、およびHUVEC細胞の中でAlamarのブルーアッセイ(Alamar blue assay)によって測定されるようなセルの代謝活性(B)を例証する2つのグラフを表す。
【００２９】
【図２２】図22は、Alamarのブルーアッセイの結果をドセタセルプロドラッグで例証したグラフを表す。7,000の2F2B細胞/ウエルが、αvβ3にターゲットとされた、薬物ナシ(対照)、ドセタセル又はドセタセルプロドラッグのいずれかを含んでなる粒子、に暴露された。
【００３０】
【図２３】図23は、腫瘍成長に対するドセタセルプロドラッグの影響を実証する顕微鏡写真及びグラフを表す。(A) 4枚のパネルは、ベースラインの、及び、ドセタセルプロドラッグを含んでなるαvβ3にターゲットとされた粒子又はドセタセルのないαvβ3にターゲットとされた粒子のいずれかに暴露されて3時間注射後の、組織の顕微鏡写真を示す。(B) 腫瘍容積はドセタセルプロドラッグの投与で減少する。(C) ドセタセルプロドラッグを含んでなる、αvβ3にターゲットとされた粒子(左側のパネル)又はドセタセルのないαvβ3にターゲットとされた粒子(右側のパネル)を持った腫瘍容積の実例。
【００３１】
【図２４】図24は、増殖指数に対するドセタセルプロドラッグの影響を表す。(A) αvβ3にターゲットとされ、ドセタセルプロドラッグを含んでなる粒子は、腫瘍細胞の増殖指数を縮小する。(B) 顕微鏡写真は、ドセタセルを含んでなる、αvβ3にターゲットとされた粒子への露出の後に縮小された増殖を実証する。増殖指数は、メチルグリーン核単独陽性エリアで除されたPCNA陽性エリアと等しい。
【００３２】
【図２５】図25は、細胞自滅（アポトーシス）指数に対するドセタセルプロドラッグの影響を表す。(A) αvβ3にターゲットとされ、ドセタセルプロドラッグを含んでなる粒子は、腫瘍細胞の細胞自滅指数を縮小する。(B) 顕微鏡写真は、ドセタセルを含んでなる、αvβ3にターゲットとされた粒子への露出の後に縮小された細胞自滅を実証する。細胞死滅指数は、メチルグリーン核単独陽性エリアで除されたTUNEL陽性エリアと等しい。
【００３３】
【図２６】図26は、myc薬の構造(A)、及びトリパンブルー排除(Trypan Blue Exclusion)を使用して、DMSOの対応する体積を含んでいる対照と比較して、myc-薬の異なる濃度で培養された多発性骨髄腫細胞株 i.H-929、ii.LP-1、iii.KMS-11、iv.UTMC-2の増殖に対するmyc薬の影響を示すグラフ(B)、を表す。
【００３４】
【図２７】図27は、そのαvβ3にターゲットとされたmyc-プロドラッグPFCナノ粒子が48時間でSMC増殖を縮小することを示すグラフを表す。
【００３５】
【図２８】図28は、myc-maxアンタゴニストプロドラッグが生体外の黒色腫増殖を48時間(A)で、および72時間(B)で、阻害することを例証するグラフ表す。Tg: 標的にされた; PFC: パーフルオロカーボン粒子; トゥイーン(tween): ポリソルベートミセル。
【００３６】
【図２９】図29は、ポリソルベートミセルの図を表す。
【００３７】
【図３０】図30は、ガラス面上に置かれたナノセル(nanocelle)液滴の水性分散体のタッピングモードAFMイメージ図を表す。
【００３８】
【図３１】図31は、メチルプレドニゾロンを含んでなるプロドラッグを表す。
【００３９】
【図３２】図32はカンプトテシンを含んでなるプロドラッグ(A)、およびカンプトテシンプロドラッグを合成するスキーム(B)を表す。
【００４０】
【図３３】図33は、PNAを含んでなる2つのプロドラッグを表す。
【００４１】
【図３４】図34は、フマギリン類縁体を作成するスキームを表す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
［発明の詳細な説明］
本発明は、1つ以上のプロドラッグ組成物、1つ以上のプロドラッグを含んでなる粒子およびその使用方法を提供する。有利には、本発明は、標的細胞に化合物の生体内送達用の組成物および方法を提供する。
【００４３】
1つの態様において、本発明は、非リポソーム・ナノ粒子(以下のセクションIIに記載されている)に埋め込まれたプロドラッグ(以下のセクションIに記載されている)を含んでなるドラッグデリバリーシステムを包含する。ナノ粒子はさらに随意に本明細書に記載されるようにホーミング配位子を含んでいてもよい。ドラッグデリバリーシステムは、薬物を不活性化するかもしれない生理学的条件からプロドラッグを保護する一方で、プロドラッグの細胞内の送達を可能にする。
【００４４】
I. プロドラッグ組成物
概して言えば、本発明のプロドラッグは、ホスホグリセリドのアシル部分に連結された化合物を包含する。適切なホスホグリセリドはホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトールおよびホスファチジルセリンを含んでいてもよい。化合物はホスホグリセリド中の一方の位置に連結されてもよい。例えば、化合物は、ホスホグリセリドのsn1位置又はsn2位置に連結されてもよい。好ましい実施態様において、化合物はsn2位置に連結される。
【００４５】
(a) 適切な化合物
概して言えば、本発明の適切な化合物は3000da未満である。一つの実施態様において、化合物は、約3000、2900、2800、2700、2600、2500、2400、2300、2200、2100、2000、1900、1800、1700、1600、1500、1400、1300、1200、1100、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、又は 100da未満ある。別の実施態様において、化合物は約2500da及び約200daの間にある。さらに別の実施態様において、化合物は約2000da及び約200daの間にある。いくつかの実施態様において、化合物を含んでなるプロドラッグが細胞膜の外部の小葉から細胞膜の内部の小葉まで移行する能力を維持する限り、化合物は3000daより大きくてもよい。
【００４６】
典型的には、適切な化合物は、化合物の活性部位の外側の反応性基を含んでなる。この反応部位は、下記に述べられるようなグリセリド・バックボーンへの化合物の結合を可能にする。本発明の適切な化合物は、小分子、金属原子、有機金属錯体、放射性化合物、アミノ酸重合体(例えばタンパク質、ペプチドなど)、炭水化物、脂質、核酸ポリマー又はその組み合わせを含んでなるグループから典型的には選ばれてよい。概して言えば、適切な化合物は、ホスホグリセリドに本明細書に記載されるように連結されてもよい。一旦化合物がグリセリド・バックボーンから開裂されれば、放出された剤型は活性化合物又は活性前化合物(pre-active compound)かもしれない。化合物は、化合物の所望の性状を増強するために誘導体化されてもよい。化合物を誘導する方法は当分野において知られている。
【００４７】
いくつかの実施態様において、例えば、化合物はそれら従来の剤型中の薬物、治療化合物、ステロイド、核酸に基づいた材料、又は誘導体、類縁体又はその組み合わせ、その元の形態で、又はナノ粒子へのとり込み又は吸着を増強するために疎水性の部分又は充填された部分で誘導されてもよい。そのような化合物は水可溶性でもよいし又は疎水性でもよい。化合物の非限定的例は、免疫関連性剤、甲状腺系剤、呼吸器系製品、抗腫瘍薬、駆虫剤、抗マラリア剤、有糸分裂阻害剤、ホルモン、抗原性虫剤、抗結核薬、心血管系製品、血液製剤、生物学的応答修飾物質、抗真菌剤、ビタミン、ペプチド、抗アレルギー性剤、抗凝固剤、循環器系作用薬、代謝の強化剤、抗ウイルス薬、狭心症薬、抗生物質、抗炎症剤、抗リュウマチ剤、麻薬、強心性配糖体、神経筋遮断薬、鎮静剤、局所麻酔薬、全身麻酔薬、又は放射性原子若しくはイオン、を含んでよい。ある実施態様において、化合物はアプタマー、又はペプチド核酸(PNA)又はロックされた核酸(LNA)のような、核酸誘導体である。
【００４８】
典型的な実施態様において、化合物は、ドキソルビシン、パクリタキセル、タキソール、レナリドミド、メトトレザト、ボルテゾミブ、myc-阻害剤、レナリドミド、シスプラチン、メチルプレドニゾロン、フマギリン、カンプトテシン、ペプチド核酸、PDT薬、又は薬学上の活性を保持するそれらの誘導体若しくは類縁体であってよい。一つの実施態様において、化合物はフマギリンの類縁体であってよい。いくつかの実施態様において、フマギリンの類縁体は実施例12において詳述された類縁体から選ばれる。他の実施態様において、化合物はPDT薬(式XIのプロドラッグ)であってよい。追加的な適切なPDT薬は当分野において知られておりポルフィマーナトリウム、アミノレブリン酸、及びアミノレブリン酸のメチルエステルを含んでいてよい。
【００４９】
他の典型的な実施態様において、化合物は以下の表Aにリストされた化合物から選ばれてよい。
表A:化合物の非限定的な例
【表１−１】
2013527157.tif 000002
【表１−２】
2013527157.tif 000003
【表１−３】
2013527157.tif 000004
【表１−４】
2013527157.tif 000005
【００５０】
(b) 連結(linkage)
上記セクションI(a)の中で定義されるように、本発明のプロドラッグはホスホグリセリドに連結された化合物を包含する。グリセリド・バックボーン及び化合物の間の連結は当分野において知られている任意の適切な連結であってよい。典型的な実施態様において、適切な連結は炭素、酸素、窒素又はその組み合わせを含んでいてもよい。
【００５１】
連結はグリセリド・バックボーンから数えて、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20又は20以上の原子を含んでいてもよい。典型的な実施態様において、連結はグリセリド・バックボーンから数えて、少なくとも5つの原子を含んでなる。
【００５２】
概して言えば、グリセリド・バックボーンのsn2位置が酵素によって開裂するように、連結は選択されている。典型的には、そのような酵素は細胞内で見つかってもよい。
【００５３】
更に、連結はそれ自身、酵素開裂性であってよい。典型的な実施態様において、連結は細胞内酵素によって開裂されてもよい。いくつかの実施態様において、グリセリドsn2位置又は連結のいずれかはリパーゼによって開裂されてもよい。例えば、1つの実施態様において、リパーゼはリン脂質A2リパーゼ(さらにホスホリパーゼA2として知られている)であってよい。別の実施態様において、リパーゼはリン脂質A1リパーゼ(さらにホスホリパーゼA1として知られている)であってよい。まだ別の実施態様において、リパーゼはホスホリパーゼB酵素であってよい。上記の実施態様の各々において、酵素が連結を開裂し、連結からその結果として化合物を放出することができる。
【００５４】
(c)化合物の放出された(released)形態
本発明のプロドラッグがグリセリド・バックボーンから開裂される場合、化合物の放出された形態が生み出される。放出された形態は活性化合物又は活性前化合物かもしれない。本明細書で使用されるように、「活性化合物」は細胞に薬学上の影響を持つ化合物である。そのような活性化合物は、上記のセクションI(b)で定義された連結、又はその部分を含んでいてもよい。「活性化合物」はさらにプロドラッグを生み出すために使用される化合物の代謝物質であってよい。
【００５５】
活性前化合物は、ここに用いられるように、上記で定義されるような活性化合物になるために酵素活性剤を必要とする化合物である。例えば、本発明の活性前化合物は、上記セクションI(a)で定義された化合物、上記セクションI(b)で定義された連結、又はその部分を含んでなってもよい。連結は、連結内の、又は連結及び化合物の間の酵素認識部位を含んでいてもよい。概して言えば、酵素は酵素認識部位に結合し、連結を開裂する。それは、上記で定義されたように、活性化合物をもたらすために活性前化合物から連結(又はその部分)を外すものである。他の実施態様において、活性化合物は活性前化合物の代謝物質であってもよい。
【００５６】
(d)プロドラッグを含んでなるナノ粒子
適用の典型的な実施態様において、プロドラッグはナノ粒子に含まれている。そのような実施態様において、標的細胞の細胞膜とナノ粒子の融合の後まで、プロドラッグはナノ粒子から実質的に放出されない。例示的な実施態様において、標的細胞の細胞膜の外部小葉とナノ粒子の融合の後まで、プロドラッグはナノ粒子から実質的に放出されない。
そのような融合はより詳細に以下記述される。簡単に言えば、しかしながら、標的細胞の細胞膜とナノ粒子の融合は、ナノ粒子と標的細胞の細胞膜の間の脂質移行を可能にする。例えば、いくつかの実例において、ナノ粒子の脂質膜は標的細胞の細胞膜の脂質膜の外部の小葉に融合してもよく、ナノ粒子誘導脂質および／または標的細胞の細胞膜へのプロドラッグの移行を可能にする。
【００５７】
融合、および引き続くナノ粒子から標的細胞へのプロドラッグの移行の後、プロドラッグは開裂されてもよく、グリセリド・バックボーンから化合物の放出された形態を分離する。概して言えば、この開裂は、標的細胞の細胞膜の外部の小葉から内部の小葉までのプロドラッグの移行の後に生じる。これは実質的に細胞内で放出された化合物に帰着する。放出された化合物は上述したように、連結又はその部分を含んでいてもよい。より詳細については、下記のセクションIIおよび実施例を参照すること。
(e) 典型的な実施例
【００５８】
典型的な実施態様において、本発明のプロドラッグは、式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII又はXIXのプロドラッグを含んでなる。別の典型的な実施態様において、本発明のプロドラッグは、式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII又はXIXから成るプロドラッグを含んでなる。別の典型的な実施態様において、本発明のプロドラッグは、式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII又はXIXのプロドラッグを含んでなり、ここにおいて、化合物はさらに、プロドラッグの機能を大きくは変更しない様に誘導体化される。別のさらに典型的な実施態様において、本発明のプロドラッグは、式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII又はXIXのプロドラッグを含んでなり、ここにおいて、ホスホグリセリドバックボーンはさらに、プロドラッグの機能を大きくは変更しない様に誘導体化される。
【００５９】
上記の典型的な実施態様の各々において、式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII又はXIXのプロドラッグにはグリセリド・バックボーン、及び式の中で表わされた原子数において異なってもよい化合物の間の連結があってもよい。例えば、連結は、式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII or XIXにとって、1、2、3、4、5、6、7又は7を超える原子の長さであってもよい。
表 B:典型的なプロドラッグ
【表２−１】
2013527157.tif 000006
【表２−２】
2013527157.tif 000007
【表２−３】
2013527157.tif 000008
【表２−４】
2013527157.tif 000009
【表２−５】
2013527157.tif 000010
【表２−６】
2013527157.tif 000011
【表２−７】
2013527157.tif 000012
【表２−８】
2013527157.tif 000013
【００６０】
II. ナノ粒子
本発明のナノ粒子は、上記セクションI中で議論されたようにプロドラッグ及び両親媒性の膜を含んでなる。いくつかの実施態様において、両親媒性の膜はプロドラッグを含んでなる。膜は、少なくとも粒子を目的として標的細胞の細胞膜に融合し、かつ標的細胞の細胞膜にプロドラッグを移送するのに必要な時間、生体内で安定している。
【００６１】
有利には、本発明のナノ粒子は非常に不安定な化合物を生体内の不活性化から保護し得る。これは、両親媒性の膜の中で、プロドラッグの形で部分的に、化合物が隔離されることによる。膜は生理学的条件(例えば、pH又は酵素開裂)による加水分解及び不活性化から化合物を保護する。これは、化合物の半減期を生体内で拡張して、細胞への活性体のデリバリー(送達)を可能にし、それによって、化合物の薬物動態学及び薬物力学的特性を増強する。その結果、プロドラッグとして調剤され、ここに記述されたナノ粒子に組み入れられた時、以前には殆ど生体内効能を持たなかった化合物が、生存可能な生体内の治療オプションになり得る。
【００６２】
通常、本発明のナノ粒子は約10nmから約10μmであってよい。いくつかの実施態様において、ナノ粒子は約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990又は1000nmであってよい。他の実施態様において、ナノ粒子は、約1、1.25、1.5、1.75、2、2.25、2.5、2.75、3、3.25、3.5、3.75、4、4.25、4.5、4.75、5、5.25、5.5、5.75又は6μmであってよい。まだ別の実施態様において、本発明のナノ粒子は100nm未満であってよい。さらに別の実施態様において、ナノ粒子は200nm未満であってよい。
【００６３】
(a) ナノ粒子の両親媒性膜
本発明のナノ粒子は両親媒性の膜を含んでなる。概して言えば、両親媒性の膜は、両親媒性の脂質(例えばリン脂質)の100%及び50%の間で構成されてもよい。いくつかの実施態様において、膜は約100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51又は50%のリン脂質で構成される。
【００６４】
両親媒性の膜の組成物は変わる場合がある、しかし上記セクションI中で議論されたプロドラッグの約0.1%から約75%までの間に典型的には含まれる。一つの実施態様において、ナノ粒子の脂質膜はプロドラッグの約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9又は1%を含んでなる。別の実施態様において、ナノ粒子の脂質膜はプロドラッグの、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74又は75パーセントを含んでなる。いくつかの実施態様において、ナノ粒子の脂質膜はプロドラッグの約10%〜約60%までを含んでなる。他の実施態様において、ナノ粒子の脂質膜はプロドラッグの約20%〜約50%までを含んでなる。さらに他の実施態様において、ナノ粒子の脂質膜はプロドラッグの約30%〜約40%までを含んでなる。
【００６５】
ナノ粒子脂質膜は、1以上のプロドラッグのタイプを含んでいてもよい。例えば、ナノ粒子脂質膜は1、2、3、4、5、6、又は6以上のタイプのプロドラッグを含んでいてもよい。各例において、プロドラッグを含んでなる膜のパーセントの合計は典型的には約0.1%から約70%になる。
【００６６】
典型的には、本発明のナノ粒子の安定した膜は生体内の使用と両立するに違いない。例えば、ナノ粒子の脂質膜は実質的に補体活性化経路や溶血を起こすべきでない。
【００６７】
標的細胞膜と粒子の融合の後まで、プロドラッグが粒子から実質的に放出されない限り、安定した膜の組成物は変わる場合がある。そして、プロドラッグは、ナノ粒子脂質膜から標的細胞膜まで移行することができる。両親媒性の膜はポリマー又は脂質及びポリマーの組み合わせを含んでいてもよい。一つの実施態様において、安定した膜は両親媒性の材料を含んでなる。句「両親媒性の材料」は、ここに使用されたように、疎水性および親水性の部分(例えば、脂質材料又は両親媒性重合体)の両方を持っている材料を指す。両親媒性の材料は自然の、合成の、又は半合成の材料であってもよい。本明細書で使用されるように、「自然の」は自然界中の見つかってもよい材料を指し、「合成の」は研究所設定の中で生み出されてもよい材料を指し、そして、「半合成の」は研究所設定の中で変更された天然素材を指す。一つの実施態様において、両親媒性の材料は脂質材料である。例えば、外側層は単一の脂質層であってよいし、又は多重層状の脂質層を含んでいてもよい。脂質材料はその最も広い意味において本明細書で使用され、誘導されたか自然か又は合成のリン脂質、脂肪酸、コレステロール、リソ脂質、脂質、スフィンゴミエリン、トコフェロール、グルコリピド、ステアリルアミン、カルディオリピン、プラスマロゲン、エーテルはエステルと連結した脂肪酸を伴った脂質、重合された脂質、リポタンパク質、糖脂質、誘導体化された界面活性剤、薬物で官能化された脂質、ターゲットとされた配位子で官能化された脂質、造影剤複合脂質、脂質ポリマー、界面活性剤又はその組み合わせを含み、これらに限定されない。
【００６８】
両親媒性の膜はさらに脂質を結合したポリエチレングリコールを含んでいてもよい(PEG)。概して言えば、しかしながら、膜は、10%を超えるPEGを含んではならない。いくつかの実施態様において、膜は10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1%未満のPEGを含んでなる。
【００６９】
さらに、安定した膜は界面活性剤を含んでもよい。いくつかの実施態様において、好ましい界面活性剤はリン脂質及びコレステロールである。さらに、界面活性剤は、しかし非限定的に以下を含んでいてもよい:1,2-ジパルミトイル-snグリセリン-3-ホスホエタノールアミン-N-4-(p-マレイミドフェニル)ブチルアミド、アミン-PEG2000-ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルエタノールアミン、アラビアゴム、コレステロール、ジエタノールアミン、モノステアリン酸グリセリンラノリンアルコール、レシチン、卵黄レシチンモノ-およびジグリセリドモノエタノールアミンオレイン酸、オレイルアルコール、ポロキサマー、落花生油、パルミチン酸、ポリオキシエチレン50ステアレート、ポリオキシル35ヒマシ油、ポリオキシル10オレイルエーテル、ポリオキシル20セトステアリルエーテル、ステアリン酸ポリオキシル40、ポリソルベート20、ポリソルベート40、ポリソルベート60、ポリソルベート80、プロピレングリコールジアセテート、プロピレングリコールモノステアレート、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレアート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ステアリン酸、トロラミンおよび乳化ろう。上記の界面活性剤は、ナノ粒子を安定させるのを支援するために単独で又は組み合わせで使用されてもよい。
【００７０】
一つの実施態様において、粒子の両親媒性の膜はポリソルベートを含んでいてもよい。例えば、膜は約1及び約50%の間のポリソルベートを含んでよい。ある実施態様において、膜は約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49又は50%のポリソルベートを含んでいてもよい。
【００７１】
さらに、使用されてもよい懸濁剤または粘性増加剤は、しかし非限定的に、以下を含有する:アラビアゴム、寒天、アルギン酸、アルミニウムモノステアレート、ベントナイト、マグマ、カルボマー934P、カルボキシメチルセルロース、カルシウムおよびナトリウム、およびナトリウム12、カラギーナン、セルロース、デキストリン、ゼラチン、グアーガム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、メチルセルロース、ペクチン、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポビドン、アルギン酸プロピレングリコール、二酸化ケイ素、アルギン酸ナトリウム、トラガントおよびキサンタンゴム。
【００７２】
様々な実施態様において、脂質膜の両親媒性の材料はナノ粒子を安定させるために架橋されてもよい。しかしながら、そのような架橋は、適切な脂質可動性がナノ粒子から標的細胞の細胞膜までプロドラッグの移行を促進することをさらに可能にするべきである。いくつかの実施態様において、粒子は外側層の表面上で架橋されていてもよい。他の実施態様において、粒子は外側層内で架橋されていてもよい。架橋は化学的架橋又は光化学的架橋であってもよい。手短かに言えば、適切な架橋剤は外側層の1つ以上の活性基に反応する。架橋剤はホモ二官能性又はヘテロ二官能性であってよい。適切な化学の架橋剤はグルタルアルデヒド、ビスカルボン酸スペーサー又はビスカルボン酸活性エステルを含んでいてもよい。さらに、外側層は、カルボジイミドカップリングプロトコルによってビスリンカーアミン/酸を使用して、化学上架橋されてもよい。その代わりに、粒子はクリック化学(click chemistry)プロトコルを使用して架橋されてもよい。さらに別の実施態様において、カルボジイミドカップリング化学、アシル化、活性エステルカップリング又はアルキル化が、外側層と架橋するために使用されてもよい。典型的な実施態様において、交差結合はカルボジイミド媒介である。いくつかの実施態様において、EDC(さらにEDAC又はEDCI、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩、即ち、高度に水可溶性カルボジイミドが、アミド結合を与える第一アミンのカップリング用カルボキシル基を活性化するために、4.0-6.0 のpH領域中で採用される。カップリング効率を増強するために、EDCはN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)又はスルホ-NHSと組み合わせて使用されてもよい。当業者は、適切な架橋剤が粒子および意図した用途の組成物に依存して、変わる場合があり変わることを認識する。
【００７３】
(b) 融合(fusion)
本発明のナノ粒子は標的細胞膜に融合してもよい。本明細書で使用されるように、「融合する」は、標的細胞の脂質膜とナノ粒子の脂質膜の整列を指す。それは2つの膜の間の相互作用が生じてもよいほどのものである。典型的な実施態様において、「融合」は、標的細胞の細胞膜の外部の小葉を持った粒子細胞膜のヘミフュージョンを指す。(Lanza, et al. Circulation 2002;106:2842; Partlow et al. Biomaterials 2008; 29: 3367; Soman, et al. Nano Letters 2008; 8:1131-1136)。一実施態様において、本発明のナノ粒子は、少なくともナノ粒子を目的として標的細胞の細胞膜に融合し、かつ標的細胞の細胞膜にプロドラッグを移送するのに必要な時間、生体内で安定している脂質膜を含んでなる。言い換えれば、本発明のナノ粒子は、ナノ粒子が標的細胞膜に融合し、ナノ粒子から標的細胞膜までプロドラッグを移送しない限り又は移送するまで、実質的にナノ粒子の脂質膜内のプロドラッグを保持する。他の実施態様において、本発明のナノ粒子は、少なくともナノ粒子を目的として標的細胞の細胞膜に融合し、かつナノ粒子の飲食作用をするのに必要な時間、生体内で安定している脂質膜を含んでなる。
【００７４】
ナノ粒子を目的として標的細胞膜に融合するのに必要な時間の長さは、他の因子に加えて、ナノ粒子(例えば、それがホーミング配位子を含んでなるか)、ナノ粒子のサイズ、意図した標的細胞の位置および利用されたプロドラッグに依存して、変わる場合があり変わる。当業者は、粒子ナノ粒子/プロドラッグ/標的細胞の組み合わせに必要な時間の理想的な長さを決定するために、当分野において公知の分析を行なうことができる。
【００７５】
いくつかの実施態様において、時間の長さは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20分である。他の実施態様において、時間の長さは、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30又は30分を超える時間である。例えば、時間の長さは、約30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100又は100分を超える時間かもしれない。典型的な実施態様において、時間の長さはおよそ20分である。
【００７６】
(c)プロドラッグの移送
上記で手短かに述べたように、本発明のプロドラッグは、ナノ粒子の脂質膜から細胞の脂質膜まで移送されてもよい。ある実施態様において、プロドラッグの移送を可能にするために、ナノ粒子の脂質膜は可動性でなければならない。更に、ある実施態様において、ナノ粒子脂質膜の脂質が、自由に標的細胞の脂質膜に交換することができねばならない。言い換えれば、これらの実施態様において、ナノ粒子脂質膜は標的細胞膜と脂質交換に対して本質的な表面バリヤ又はエネルギー障壁を持つべきでない。これは、例えば、ナノ粒子脂質膜の脂質組成物を密着させてもよい。脂質組成物は、当分野においてナノ粒子から標的細胞膜までプロドラッグを移送する適切な脂質可動性を保証すると知られていた方法を使用して試験された。典型的な実施態様において、実施例において示されるように、粒子の膜は標的細胞膜の外部の小葉を持ったヘミフュージョン構造を形成する。実施例において示されるように、そのような融合の出来事が視覚化されてもよい。従って、当業者は、上記で詳述されたガイドラインを使用して形成された特別の膜が標的細胞膜を持ったヘミフュージョン構造を形成するかどうか判断することができる。
【００７７】
ナノ粒子を標的細胞の脂質膜へ移送するのに必要な時間の量は、他の因子に加えて、ナノ粒子(例えば、それがホーミング配位子を含んでなるか)、ナノ粒子のサイズ、意図した標的細胞の位置および利用されたプロドラッグを含む幾つかの因子に依存して、変わる場合があり、実際に変わる。いくつかの実施態様において、時間の長さは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20分である。他の実施態様において、時間の長さは、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30又は30分を超える時間である。例えば、時間の長さは、約30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100又は100分を超える時間かもしれない。
【００７８】
(d) ホーミング配位子
いくつかの実施態様において、本発明のナノ粒子はホーミング配位子を含んでいてよい。本明細書で使用されるように、「ホーミング配位子」は、標的細胞膜とナノ粒子の融合を支援する生体分子を指す。
【００７９】
ホーミング配位子は、抗体、抗体断片、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、小分子、多糖、核酸、アプタマー、ペプチド模倣体、他の模倣体および医薬品を単独で又は組み合わせて含んでいてもよい(これらに限定されないが)。さらに、ホーミング配位子は微生物(ファージまたはウィルス)を含んでいてもよい。ホーミング配位子はさらに各々の上記のものの設計された類縁体又は誘導体であってよい。ホーミング配位子は、ナノ粒子に直接又は間接的に付けられてもよい。
【００８０】
ナノ粒子へのホーミング配位子の直接の接合は、ホーミング配位子-粒子錯体の調製を指す。そこにおいては、ホーミング配位子は、ナノ粒子表面へのイオンか、静電気か、疎水性か、他の非共有結合の手段によって吸着され(例えばアシル化された抗体、又は相補的な核酸配列間の雑種形成)、又は、脂質表面成分への共有結合によって表面に化学的に連結され、又は、本質的に、膜の成分として脂質膜に組み入れられる(例えばペプチド模倣体剤に誘導された脂質)。
【００８１】
間接接合は2工程以上で、ナノ粒子とホーミング配位子の錯体を生体内で形成することを指す。間接接合は、標的細胞または組織の表面への粒子の緊密で特別の融合をもたらすために化学的結合システムを利用する。間接ホーミングシステムの非限定的例はアビジンビオチンである。
【００８２】
アビジン-ビオチン相互作用は、多くの生物学的及び分析的なシステムに組み入れられており、生体内の適用に選択された有用な非共有結合のホーミングシステムである。
アビジンには生理学的条件の下の迅速で安定した結合を促進するビオチン(10-15M)に対する高親和性がある。このアプローチを利用するホーミングシステムは、調合物に依存して、2又は3工程で投与される。典型的には、ビオチン化された配位子(例えばモノクローナル抗体)が最初に投与され、ユニークな分子のエピトープに「あらかじめ誘導(pre-homed)される。」次に、アビジンが投与され、それは「予め誘導されている」配位子のビオチン部分に結合する。最後に、ビオチン化された粒子が添加され、占有されていないビオチン結合部位へ結合し、その結果としてアビジン上に、ビオチン化された配位子-アビジン-粒子「サンドイッチ」を完成する。アビジン-ビオチンアプローチは、表面の抗体の存在に次ぐ単核食細胞系(MP)によって誘導された(homed)粒子の加速された時期尚早のクリアランスを回避することができる。さらにアビジンは、4つの独立したビオチン結合部位を持ち、信号増幅を提供し、検知感度を改善する。
【００８３】
ホーミング配位子は、粒子表面のホーミング配位子および組成物の性質に依存する様々な方法によって、粒子の表面へ化学的に付けられてもよい。粒子へのホーミング配位子の直接的な蛋白質の化学接合が、表面内で本質的に存在する多数のアミノ基(例えばリジン)をしばしば利用する。その代わりに、粒子が形成された後、機能的に活性な化学基(例えば、ピリジルチオプロピオネート、マレイミド又はアルデヒド)がホーミング配位子接合用の化学の「鉤」として表面へ組み込まれてよい。別の共通の後加工アプローチはホーミング配位子添加に先立ってカルボジイミドで表面のカルボキシラートを活性化することである。
【００８４】
選択された共有結合連結戦略は、ホーミング配位子の化学的性質によって主として決定される。例えば、モノクローナル抗体および他の大きなタンパク質は厳しい処理状況の下で特性を失うかも知れない。しかし、炭水化物、短鎖ペプチド、アプタマー、医薬品又はペプチド模倣体の生物活性は、しばしばこれらの条件の下で保存することができる。
【００８５】
ホーミング配位子の高い結合完全性を保証し、ナノ粒子結合活性を最大限にするために、柔軟なスペーサーアーム(例えばポリエチレングリコール、アミノ酸、長鎖炭化水素又は短鎖炭化水素、糖、核酸、アプタマー(例えばポリデキストロース))又は単純なカプロエートブリッジを、活性化された表面官能基及びホーミング配位子の間に挿入することができる。これらの伸張は2nm以上であってよい。
【００８６】
ホーミング配位子は「プライマー材料」の使用により脂質材料内で固定されてもよい。「プライマー材料」は、特異的結合またはホーミング配位子に化学上連結する又は吸着する粒子に組み入れられた任意の界面活性剤コンパティブルな化合物である。すなわち、粒子およびホーミング配位子、又はホーミング配位子の成分(配位子にサブユニットがある場合)の間の共有結合を形成するために化学上利用することがある脂質膜へ組み込まれた任意の要素、又は誘導された要素である。ホーミング配位子は、当分野において知られている方法を使用して、カップリング剤で「プライマー材料」に共有結合で接合されてもよい。1つのタイプのカップリング剤は、カルボジイミド(例えば、1-エチル-3-(3-N,N ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩又は1-シクロヘキシル-3-(2-モルフォリノエチル)カルボジイミドp-トルエンスルフォン酸メチル)を使用してもよい。プライマー材料は、アミン-PEG2000-ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルエタノールアミン、N-カプロイルアミンホスファチジルエタノールアミン、N-ドデカニルアミンホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルエタノール、1,2-ジアシル-sn-グリセリン-3-ホスホエタノールアミン-N-[4-p-マレイミドフェニル)-ブチルアミド、N-スクシニル-ホスファチジルエタノールアミン、N-グルタリル基-ホスファチジルエタノールアミン、N-ドデカニル-ホスファチジルエタノールアミン、N-ビオチニル-ホスファチジルエタノールアミン、N-ビオチニルカプロイル-ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルエチレングリコールであってよい。他の適切なカップリング剤は、一方のエチレンの不飽和(アクロレイン、メタクロレイン又は2つのブテナール)を持っているアルデヒドカップリング剤を含むか、又は複数のアルデヒド基(グルタルアルデヒド、プロパンジアール又はブタンジアール)を有してもよい。他のカップリング剤は、2-イミノチオラン塩酸塩および二官能性のN-ヒドロキシスクシンイミドエステル(ジサクシニミジル基質、ジサクシニミジル酒石酸塩、ビス[2-(サクシニミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン、ジサクシニミジルプロピオナートおよびエチレングリコールビス(サクシニミジルスクシナート)を含んでもよい。ヘテロ二官能性試薬の非限定的例は、N-(5-アジド-2-ニトロベンゾイルオキシ)スクシンイミド、p-アジドフェニルブロミド、p-アジドフェニルグリオキサール,4-フルオロ-3-ニトロフェニルアジド、N-ヒドロキシスクシニミジル-4-アジドベンゾエート、m-マレイミドベンゾイルN-ヒドロキシスクシンイミドエステル、メチル-4-アジドフェニルグリオキサール、4-フルオロ-3-ニトロフェニルアジ化物、N-ヒドロキシスクシニミジル-4-アジドベンゾエート塩酸塩、p-ニトロフェニル2-ジアゾ-3,3,3-トリフルオロプロピオネート、N-サクシニミジル-6-(4'-アジド-2'-ニトロフェニルアミノ)ヘキサノアート、サクシニミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート、サクシニミジル4-(p-マレイミドフェニル)ブチラート、N-サクシニミジル(4-アジドフェニルジチオ)プロピオナート、N-サクシニミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナート、及びN-(4-アジドフェニルチオ)フタルアミドを含んでいてもよい。ホモ二官能性試薬の非限定的例は、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン、4,4'-ジフルオロ-3,3'-ジニトロジフェニルスルホン、4,4'-ジイソチオシアノ-2,2'-二スルホン酸スチルベン、p-フェニレンジイソチオシアナート、カルボニルビス(L-メチオニンp-ニトロフェニルエステル、4,4'-ジチオビスフェニルアジド、エリスリトールビスカーボネートおよび二官能性のイミドエステル(ジメチルアジポイミデート塩酸塩、ジメチルサブエリミデート、ジメチル3,3'-ジチオビスプロピオンイミデート塩酸塩およびその他同種のもの)を含んでいてもよい。「プライマー材料」への特異的結合種の共有結合形成は、従来のよく知られている反応によって、例えば上記の試薬で中性のpH、および25℃未満の温度の水液中で1時間〜一晩行なうことができる。
【００８７】
粒子膜は、一般にホーミング配位子を0%及び約3%の間に含有してよい。例えば、1つの実施態様において、膜はホーミング配位子の1%以内、ホーミング配位子の2%、又はホーミング配位子の3%まで、を含んでいてもよい。
【００８８】
(e) 受動ホーミング
ホーミング配位子を含んでなる本発明のナノ粒子の代わりとして、ナノ粒子は「受動ホーミング」を使用してもよい。本明細書で使用されるように、「受動ホーミング」は、ある組織の標的細胞膜において蓄積する、したがって、融合するナノ粒子の自然の傾向を指す。例えば、受動ホーミングは、ナノ粒子の脂質膜及び標的細胞の脂質膜の間の電荷相互作用を指してもよい。又は、他の実施態様において、受動ホーミングは、腫瘍組織中に見出される増強された浸透性効果を指してもよい。
【００８９】
(f) ナノ粒子コア
本発明のナノ粒子のコアは脂質膜の必要な特徴を密着させずに、変わる場合があり、変わる。一般的に言えば、しかしながら、コアは、ナノ粒子と標的細胞の細胞膜との間の適切な脂質移行を可能にさせるべきである。
【００９０】
(g)画像化/追跡試薬
本発明のナノ粒子は他の画像化/追跡試薬を含有する。例えば、ナノ粒子は、顕微鏡検査法(例えば蛍光顕微鏡、焦点を共有する顕微鏡検査法、電子顕微鏡検査)、磁気共鳴画像、断層撮影法、ガンマおよび陽電子放射形断層撮影法(ペット/CT)(SPECT/CT、平面)、ラジオグラフィー、コンピューター断層撮影(CT)、スペクトルCT、photoacousticな断層撮影法(パット)又は超音波に使用されてもよい画像化/追跡試薬を含んでもよい。画像化/追跡試薬は、その場で、生体内で、生体外で及び試験管内で検知できてもよい。顕微鏡画像化/追跡試薬は当分野においてよく知られていて、蛍光性の分子(FITC、ローダミンおよびAlexafluorシアン染料)を含んでもよい。同様に、磁気共鳴画像化分子、ラジオグラフィー画像化分子(常磁性および超常磁性剤など)、近赤外線(NIR)視覚剤および超音波分子は、当分野においてよく知られており、及び、適切な画像化分子は、粒子の組成物および粒子の意図した用途の考察の後に当業者によって選択されてもよい。ある実施態様において、外側層は、さらに放射線金属が放射性映像方法(ペット、SPECTおよび関連する方法)によって検知されるべきキレート化剤を含んでもよい。
【００９１】
(h) 医薬品組成物
本発明は、本発明のナノ粒子、又は複数のナノ粒子をさらに含んでなる医薬品組成物を含んでなる。医薬品組成物は、ナノ粒子の溶液、混合物又は懸濁液であってよい。一つの実施態様において、医薬品組成物は溶液であってよい。他の実施態様において、医薬品組成物は混合物であってよい。他の実施態様において、医薬品組成物は懸濁液であってよい。懸濁液の非限定的例はコロイドである。
【００９２】
幾つかの実施態様において、医薬品組成物はコロイドであってよい。概して言えば、コロイドは、懸濁液から容易に沈降しない粉体の懸濁液である。コロイドはマイクロ流体化によって形成されてもよい。
【００９３】
生物学的な組織の画像化および／または治療を可能にするために、本発明の粒子の医薬品組成物は被検者に投与されてもよい。適切な被検者は哺乳動物、両生動物、爬虫類、鳥、魚および昆虫を含んでいてもよい(これらに限定されないが)。哺乳動物の非限定的例は人間、人類以外の霊長類およびげっ歯動物を含む。
【００９４】
医薬品組成物は、治療および／または画像化用の有効量を送達するいくつかの異なる手段によって調剤され被検者に投与されてもよい。そのような組成物は、所望のものとして従来の無毒な薬学的に許容できる担体、アジュバント、添加剤および媒体を含んでいる用量単位調合物で一般に非経口的に、腹腔内で、血管内で又は肺内に投与されてもよい。用語非経口投与薬は本明細書で使用されるように、局所的、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、膀胱内、子宮内、耳介内、鼻腔内、視覚、眼内、肺内、経口、咽頭内、経直腸的、i尿道内又は経尿道、子宮内、膣内、胸骨内の注射又は浸剤を含んでいる。さらに、用語「非経口投与」は噴霧またはエーロゾルの投与技術を含んでいる。一つの実施態様において、組成物はボーラスで投与されてよい。好ましい実施態様において、組成物は静脈内で投与されてよい。医薬品組成物の調合物は、例えばHoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1975)およびLiberman, H. A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y. (1980)、の中で議論されている。
【００９５】
注射可能な調合薬(例えば水性の無菌注射剤、油性の懸濁液)は適切な分散又は湿潤剤および沈殿防止剤を使用して、既知の技術に従って調剤されてよい。無菌注射剤調合薬は、さらに無毒な非経口的に受容可能な希釈剤又は溶剤中の無菌注射剤溶液又は懸濁液であってよい。採用されてもよい受容可能な媒体および溶剤の中には、水、リンゲル液および等張食塩水がある。更に、無菌の固定油は、溶剤又は懸濁する媒体として通常採用される。この目的のために、どんな緩和な固定油も合成モノ-又はジグリセリドを含めて採用されてよい。更に、脂肪酸(例えばオレイン酸)は注射可能剤の調合薬に役立つ。ジメチルアセトアミド、イオン及び非イオンの洗剤を含む界面活性剤およびポリエチレングリコールは、使用することができる。さらに、溶剤および加湿薬(上記で議論されたもの)の合剤が有用である。画像化目的のために、非経口適用にとって調合物は、生物学的適合性溶液又は懸濁の形をしていてもよい。他のアジュバントおよび投与の様式は、薬学技術において広く知られている。
【００９６】
当業者は、治療および／または画像化のために被検者に投与される医薬品組成物の量および濃度が処理されかつ/または画像化される被検者および組織に部分的に依存するということを認識する。最適な量を決定する方法は当分野において知られている。そして、より多くの詳細が実施例中に見いだされ得る。
【００９７】
本発明の医薬品組成物は付加的な、当分野において知られている薬学的に活性な化合物をさらに含んでよい。
【００９８】
III. 方法
本発明の別の態様は、本発明のプロドラッグ又はナノ粒子のための使用の方法を包含する。本発明の方法は、一般的に、生体内で、生体外で又は試験管内で使用されてもよい。
【００９９】
一つの実施態様において、本発明は、細胞に化合物を送達する方法を提供する。方法は細胞への本発明のプロドラッグを投与することを含んでなる。典型的な実施態様において、方法は細胞への本発明のプロドラッグを含んでなるナノ粒子を投与することを含んでなる。さらなる典型的な実施態様において、方法は細胞への本発明のプロドラッグを含んでなる標的化されたナノ粒子を投与することを含んでなる。概して言えば、適切な細胞は任意の真核細胞である。そこでは、細胞膜の外部の小葉は、粒子の細胞膜でヘミフュージョン構造を形成することができる。
【０１００】
他の実施態様において、本発明は、被検者の血中での化合物の半減期を増加する方法を提供する。方法は被検者へ本発明のプロドラッグを投与することを含んでなる。典型的な実施態様において、方法は本発明のプロドラッグを含んでなるナノ粒子を投与することを含んでなる。概して言えば、適切な被検者は哺乳動物である。一つの実施態様において、適切な被験者はげっ歯類であってよい。別の実施態様において、適切な被検者は農業用の動物(例えばウマ、雌牛、ブタ、鶏など)であってよい。他の実施形態において、適切な被験者は、非ヒト霊長類である。さらに他の実施態様において、適切な被験者は、ヒトである。
【０１０１】
まだ他の実施態様において、本発明は、被検者の中での化合物の有効投与量を減らす方法を提供する。方法は被検者へ本発明のプロドラッグを投与することを含んでなる。典型的な実施態様において、方法は被検者へ本発明のプロドラッグを含んでなるナノ粒子を投与することを含んでなる。適切な被検者は上記で定義された通りである。
【０１０２】
まだ他の実施態様において、本発明は、細胞の中で化合物の放出を制御する方法を提供する。方法は細胞への本発明のプロドラッグを投与することを含んでなる。典型的な実施態様において、方法は細胞への本発明のプロドラッグを含んでなるナノ粒子を投与することを含んでなる。適切な細胞は上記で定義された通りである。
【０１０３】
更なる実施態様において、本発明は、被検者の血管形成を阻害する方法(被検者への本発明のプロドラッグを投与することを含んでなる方法)を提供する。そこにおいて、プロドラッグは抗脈管形成性の化合物を含んでなる。典型的な実施態様において、方法は被検者へ抗血管形成性化合物を含んでなるプロドラッグを含んでなるナノ粒子を投与することを含んでなる。
【０１０４】
典型的な実施態様において、本発明は、式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII又はXIXのプロドラッグを細胞へ投与する方法を包含する。方法は、式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII又はXIXのプロドラッグを含んでなるナノ粒子を細胞へ投与する方法を包含する。
【０１０５】
次の実施例は本発明の好ましい実施態様を実証するために含まれる。続く実施例において開示した技術が、本発明の実行の中でよく機能するために発明者によって発見された技術を表わすことは当業者によって評価されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示の光に照らして、開示された特別な実施態様において変更が可能であること、そして類似のまたは同様な結果を本発明の精神と範囲から離れることナシに依然として得ることができること、したがって、添付の図面において示され又は提示された事項は、例示的であって限定的ではないと解釈されるべきであることを認識するべきである。
【実施例】
【０１０６】
次の実施例は本発明の多様な反復を説明する。
【０１０７】
実施例1．ドキソルビシンプロドラッグの標的化および効能
5-炭素sn-2アシルスペーサーでホスファチジルコリンバックボーンに連結された、パクリタキセルまたはドキソルビシンを使用するプロドラッグ候補の2つの例を合成した(下記の実施例を参照)。製造された化合物の構造は1H NMR(400MHz)分光法によってキャラクタライズされた。インテグリンを発現するために誘発された2F2Bマウス内皮細胞において、αvβ3のインテグリンにターゲットとされたドキソルビシンプロドラッグの影響を試験した。光学顕微鏡検査を使用して、標的細胞へのドキソルビシンプロドラッグ移行および細胞内の分布を確認した(図1)。ターゲットとされたドキソルビシンプロドラッグは、脂質膜において、細胞膜の全体にわたって、および核において分配されたが、一方、フリーなドキソルビシン薬は核中にのみ見られた。細胞膜中のドキソルビシン分布は、より有効な治療のために核へのドキソルビシン移行のために貯蔵器として働く。酵素で放出された薬物は、さらにフリーなドキソルビシンによって誘発されたレベルより大きなレベルで内皮細胞増殖の著しい抑制を誘発した(図2)。
【０１０８】
実施例2．ドキソルビシン及びパクリタキセルのプロドラッグの生体内活性
ラットにおいて生体内のMatrigelプラグモデルを使用して、インテグリンにターゲットとされたドキソルビシンプロドラッグおよびパクリタキセルプロドラッグのPFCナノ粒子で抗血管形成治療を実証した。αvβ3のインテグリンにターゲットとされた常磁性のPFCナノ粒子で3TでのMRI血管新生マッピングを使用して、治療効果を評価した(図3)。血管形成は対照に対して両方の治療調合物によって減少した。パクリタキセルプロドラッグを使用して、ウサギ中のVx2腫瘍モデルで同様の結果を生体内で得た(図4)。したがって、試験管内溶出中にパクリタキセルまたはドキソルビシンの損失を示した先の研究への対比において、リン脂質プロドラッグ形態は循環中で、保持され、標的細胞へ送達され、酵素で放出されて、意図した抗増殖性の効果を発揮した。
【０１０９】
実施例3．Sn-2ドキソルビシンプロドラッグの合成
3を超えるサイトがドキソルビシンの機能的な修飾に利用可能である(図5)：側鎖カルボニル基(サイト1)、側鎖アルコール性基(サイト2)および糖部分中のアミン官能性(サイト3)である。この実施例において、サイト-3は下記に述べる修飾に使用した。
【０１１０】
16:0-09:0のALDO(PC)(1-パルミトイル-2-(9'-オキソ-ノナノイル)-グリセロ-3-ホスホコリン)とドキソルビシンを、TFAの存在下、メタノール(無水)中で反応させることにより、PCドキソルビシン(PC-DXR)共役1を合成した。引き続き生成するイミンをナトリウムシアノボロハイドライドで還元して、最終生産物を製造した。化合物の構造は1H NMR (400MHz)分光法によってキャラクタライズされた(図7)。このプロドラッグアプローチの概念の証明は、細胞内の分布ドキソルビシン、および上記の実施例1に記載された、酵素で放出された薬によってもたらされた内皮細胞増殖の著しい抑制によって微視的に実証された。
【０１１１】
実施例4．パクリタキセルプロドラッグの合成
パクリタキセルプロドラッグを5工程の合成方法に従って合成し、カラムクロマトグラフィーによって精製した(図8)。簡単には、市販のパクリタキセル(Avachem Scientific, Inc.)をピリジンの存在下、無水コハク酸で処理して、2'-スクシニルパクリタキセルを得た。この中間体のNHSエステル(6)はN-サクシニミジルジフェニルホスフェート(SDPP)での反応によって得てもよい。低温でモノ-Boc-エチレンジアミンの過剰でエステルを処理し、次いでターシャリ-Bocの脱保護を行った。柔軟で鎖状のジアミン(1,3-ジアミノプロパン)を、立体障害を減じるために選択した。最後に、パクリタキセルアミンを、パクリタキセルプロドラッグ(7)をもたらすためにALDO PC(又はPE)での還元的アミノ化に付した。
【０１１２】
実施例5．Sn-2パクリタキセルプロドラッグの検定
2F2Bマウス内皮細胞(ATCC、Manassas、VA、USA)を媒体中で2日間培養し、10nMのニコチン又は10μMのアンジオテンシンIIでアップレギュレートして、αvβ3インテグリンを発現させた。次いで、細胞は、変化する薬物ロード(0.5〜5モル%)において、ターゲットとされていないパクリタキセル対インテグリンターゲットとされたパクリタキセルのGNBナノ粒子処理に暴露されてもよい。対照として30分間フリーな薬物の対応量に細胞を暴露した。ウエルから解放されたナノ粒子又は吸収されない薬物を洗い流した。そして、培養物は6日間成長させ、付着した生細胞数を数えた。フリーのタキソール、αvβ3のインテグリンにターゲットとされたナノ粒子だけ又は食塩水の対応量に対してパクリタキセルPCプロドラッグナノ粒子(PC-PTXL)で処理された時、細胞の数は著しく減少した(図9)。
【０１１３】
実施例6．シスプラチンプロドラッグの合成
プラチナに基づいた抗癌プロドラッグの合成については、2つのアプローチに従ってもよい。最初のアプローチ(図10)は、酸化した脂質との接合が後続する、アミンで停止したシスプラチン(9)の調製を含んでいてもよい。HATU/DIPEAが存在する状態でのモノBoc-エチレンジアミンと化合物8のアミド化反応からもたらされたカップリング中間体は、化合物9をもたらすために脱保護に付されてもよい。化合物9は、シスプラチンプロドラッグ-1(10)を発生するためにメタノール中のALDO PCと還元的アミノ化を受けてもよい。
【０１１４】
2番目のアプローチ(図11)は、疎水的に変性されたキレート化するジアミンを持つ類縁体の合成を含んでいてもよい。シスプラチン中間体16は3工程で化合物13から得られてもよい。中間体16は、pH 6-7で得られる溶液のpHを維持することにより、K2PtCl4と錯体生成に付されてもよい。化合物13は、シスプラチンプロドラッグ-2(18)を発生するためにメタノール中のALDO PCで還元的アミノ化を受けてもよい。
【０１１５】
実施例7．メトトレキセートプロドラッグの合成
メトトレキセート接合体の合成は図12に記載されている。短いエチレンジアミンスペーサーがメトトレキセート及び酸化した脂質の間に導入されてもよい。6-ブロモメチル-プテリジン-2,4-ジアミントリヒドロブロミド(BPT・HBr、23)は宇部興産から購入され、25を生成するために中間体24とカップリングされてもよい。化合物25は、アミンで停止したメトトレキセート(26)をもたらすために、ターシャリ-Bocから脱保護され、メトトレキセートプロドラッグ(27)をもたらすために、エステル加水分解が後続してもよい26のALDO(PE)又は(PC)での還元的アミノ化が、先に記述したように行なわれてもよい。
【０１１６】
実施例8．ボルテゾミブプロドラッグの合成
ボルテゾミブプロドラッグ(図13)の不斉合成は、次の公表された方法によって中間体-1(N-スルフィニルα-アミノホウ素ピナコラート錯体)の調製を含んでよい。穏やかな酸性条件下のN-スルフィニル基の選択的な除去は、アミン塩酸塩(中間体2)をもたらし得る。次いで、中間体2はTBTU/DIPEAを媒介とした反応プロトコルによってN-Boc-L-フェニルアラニンとカップリングされてもよい。次いで、中間体-3(アミン塩酸塩)は、市販の3-アミノピラジン-2-カルボン酸とカップリングを受けてボルテゾミブのピナコールボロネートを生成し得る。これは引き続き、ピナコール金属イオン封鎖剤としてイソブチルボロニック酸を利用する二相条件下で加水分解されてもよい。最後に、中間体-4は、触媒的なTFAが存在する状態で、ALDO(PC)でナトリウムシアノボロハイドライドを媒介とした還元的アミノ化を受けて、ボルテゾミブプロドラッグを生成し得る。
【０１１７】
実施例9．MYC-インヒビタープロドラッグの合成
Myc-インヒビター-1は、雰囲気温度で炭酸カリウム溶液中に於いて触媒的なTween-80の存在下、4-エチルベンズアルデヒドをローダニンと反応させることにより合成されてもよい(図14)。その混合物は5%のHClで中和されてもよい。そして、沈殿剤は飽和したNaHSO3で処理され、水性のエタノールで再結晶してもよい。ピペリジン-モノ-ターシャリBocおよびホルムアルデヒドにこのローダニン誘導体を反応させてもよい。TFA存在下でのターシャリBocの脱保護はMyc-阻害剤-1を生成し得る。最後に、Myc-阻害剤-1は、触媒的なTFA存在下にALDO(PC)でナトリウムシアノボロハイドライドを媒介とした還元的アミノ化を受けて、Myc-ローダニンプロドラッグを生成し得る。
【０１１８】
実施例10．再狭窄におけるmyc-インヒビタープロドラッグ
Mycは、ヒト癌の50-80%でアップレギュレートされたヘリックス-ループ-ヘリックス転写因子をコード化し、1年当たり100,000の米国の癌死に関係している。Mycは標的遺伝子転写を制御するためにそのパートナーMaxとヘテロ二量体化し、細胞の生存率及び増殖を支配する調節及び管理機構へ深く統合される。最近の評価は、Mycがヒトゲノム中の約25,000の部位に結合することを示唆する。Mycタンパク質の損失は細胞増殖及び生長を阻害し、分化を加速し、細胞接着を増加させて、DNAの損傷に対する応答を強める。
【０１１９】
我々は、Mycが抗癌療法、特にMyc-Mad相互作用を許容する一方で、Myc-Max二量化の選択的で破壊的な干渉によってそれが高度に過剰発現されるMMの理想的なターゲットであると信じる。
【０１２０】
図27は、mycプロドラッグを含んでなる、αvβ3にターゲットとされた粒子がSMC増殖を縮小することを例証している。ヒト冠状動脈の平滑筋細胞をカバースリップ上に置き(2500個の細胞)、2時間培養した。処理をそれぞれ6回繰り返した。mycプロドラッグを含んでなる、αvβ3にターゲットとされた粒子の壁内デリバリーは、単独で又はステントと一緒に、再狭窄に魅力的な新しいアプローチを提供する。
【０１２１】
実施例11．レナリドミドプロドラッグの合成
レナリドミドは、TFAの触媒的な存在下、メタノール(無水)中で、ALDO(PE)又は(PC)存在下での還元的アミノ化に付され、引き続きNaCNBH3でワンポット還元し、レナリドミドプロドラッグを生成する(図15)。
【０１２２】
実施例12．フマギリンプロドラッグの合成
フマギロールジシクロヘキシルアミン塩へのフマギリンの鹸化により単刀直入な方法で最初のプロドラッグ(フマギリンプロドラッグ1)の合成を実行し、次いで、それを、DCC/DMAPで媒介されたカルボジイミドカップリングプロトコルを使用して活性化した。そして次に、酸化した脂質と一緒に誘導体化した。
【化１】
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【０１２３】
(3R,4S,5S,6R)-5-メトキシ-4-((2R,3R)-2-メチル-3-(3-メチルブト-2-エニル)オキシラン-2-イル)-1-オキサスピロ[2.5]オクタノ-6-オール(フマギロール、2)。
1:1メタノール:水2mLの中でフマギリンジシクロヘキシルアミン塩(0.2g、0.31mmol)を懸濁し、35%のNaOH溶液(0.62mmol)の0.07mLで処理した。氷浴の中で2時間暗褐色混合物を撹拌し、次に室温に暖めて、NaOH溶液の同当量で処理した。TLCで出発物質が検知されなくなる迄、その混合物を撹拌した(約4h);メタノールを蒸発し、酢酸エチルで残渣を抽出した。次いで、5%のクエン酸、食塩水、重炭酸塩および再び食塩水でその混合物を抽出し、次にMgSO4で乾燥し、真空で濃縮した。アセトニトリル中の活性炭処理でさらに粗生成物を精製し、セライトパッドを通して濾過した。濃縮により、無色の固体を59mg与えた(70%)。得られたHRMS: MH+(283.3)。
【０１２４】
フマギリンプロドラッグ1の調製用基本手順:
C16-09:0(COOH)PC 1-ヘキサデシル-2-アゼラオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(3.2mmol)の溶液、続いて(DMAP(44mg、3.2mmol)およびDCC(46mg、3.2mmol)を、乾燥したジクロロメタン(1ml)の中でフマギロール(11mg、0.4mmol)の溶液に添加した。反応液は、室温で夜通し撹拌し、次いで、その混合物をEtOAc/nヘキサン(1:2、v/v)を使用して、シリカゲルの短いパッド上に通した。そして、ろ過された溶媒を真空で除去し、オイル残渣を残し、それを、溶出溶媒としてのEtOAc/nヘキサン(1:4、v/v)でSiO2の上のカラムクロマトグラフィーによって精製して、淡黄色の固体としてフマギリンプロドラッグ-1化合物を得た。観測されたHR-MS: 991.5475(M+2K-2H)。
【０１２５】
他の戦略および具体的な実施例:
この工程の挑戦は、フマギリンおよび改善された膜保持特性を持ったその関連する候補の光学的および化学的に頑丈な類似物を開発することである。戦略のうちの1つは、それらの構造からの不安定で、薬理学的に不活発である(かつ関係がない)官能性の除去に引き続いて、システム全体に疎水的に同様の部分を導入する。本発明において、我々は光安定性の非結合性不飽和鎖で全てのトランス-デカテトラエンジオエートを置き換える意図である。我々は、潜在的に反応性のエポキシ基の各々が個々に又は組み合わせで置換されるフマギリン類似物を合成する。エステル結合は安定した共有結合の取り込みで置換される。パラレル合成戦略は、これらの類似物の膜付着特性を提供する部分の取り込みを可能にする。デカテトラエンジオイック尾は疎水的に比較可能な部分で置換される。フマギリン類似物を作成するための合成方法論はいくつかのグループによって探究されており、文献で開示されている。我々は、重要な治療のポテンシャルを持ったその生物学的活性の詳細な試験に関するさらなる研究に備えて提案された類似物用の効率的な合成方法論を開発する。(図34を参照。)
【化２】
2013527157.tif 000015
【０１２６】
安定なフマギリンプロドラッグの合成
フマギリンプロドラッグ1：フマギロール(1)はフマギリンの加水分解によって生成され、DCCで媒介された市販のPAzPC(16:0-9:0 COOH PC)とのカップリングに付される。製品は回収され、直ちに、クロロメチル官能性でスピロエポキシドを開環するために酢酸の存在下にLiClとの反応に付される。
【０１２７】
フマギリンプロドラッグ2：フマギロールはビス(4-ニトロフェニル)炭酸塩で活性化され、引続いてモノボック-エチレンジアミンと反応されて6を生成する。典型的な実験手順において、N2雰囲気下、乾燥したCH2Cl2中のフマギロール、ビス(4-ニトロフェニル)炭酸塩およびDMAPの混合物が、7時間撹拌される。反応液はCH2Cl2で希釈され、H2Oで洗浄される。その有機層はMgSO4で乾燥され、濃縮される。フラッシュクロマトグラフィー(EtOAc-ヘキサン)が使用されて、活性化されたフマギロールを与える。次いで、モノボックで保護されたエチレンジアミンが中間体-6を調製するために連結される。生成物は回収され、直ちに、クロロメチル官能性でスピロエポキシドを開環するために酢酸の存在下にLiClと反応される。ボックはTFAで脱保護される。そして、製品はALDO PCの存在下にシアノホウ化水素ナトリウムで媒介された還元的アミノ化に付される。
【０１２８】
前駆体化合物の合成：オバリシン(Ovalicin)(4)はTakahashiらによる文献手順に従って合成される。40a  10%の全収率中の光学的に純粋なオバリシンを生成するために市販の2,3:5,6-ジ-O-イソプロピリデン-R-D マンノフラノースが出発物質として使用される。フマギロールはSinova, Inc.から購入され、そのまま使用される。
【０１２９】
フマギロールはフマギノン(3)を生成するためにピリジニウム塩化クロム/ピリジン(PCC)を使用して、酸化に付されてもよい。典型的な実験の手順において、雰囲気温度で無水のCH2Cl2中のフマギロール(1当量)、ピリジニウム塩化クロム(PCC、8当量)およびピリジン(5当量)の混合物を10時間撹拌させる。そして、反応の完了は薄層クロマトグラフィーによってモニターされる。反応液はシリカゲルカラムクロマトグラフィー(EtOAc-CH2Cl2)によって精製されて、透明な油としてフマギノンを与える。
【化３】
2013527157.tif 000016
スキーム1．オバリシン及びフマギノンの前駆物質から類縁体1-2の合成
【０１３０】
合成類縁体1-2：上記で短く議論した様に、本発明において、我々は光安定性で、且つ非結合性不飽和鎖(類縁体1-2)で全てのトランス-デカテトラエンジオエートを置換する意図である。このように、疎水性尾で様々な結合していない置換基を持つ類縁体1-2が、水素(フマギリンシリーズ)又は水酸基のいずれかで調製される(オバリシンシリーズ)。簡潔には、前駆体化合物はそれぞれの置換された臭化アリルでインジウムを媒介とした有機金属のアリル化に付される。
【化４】
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スキーム2．オバリシン及びフマギノンの前駆体から類縁体3-6の合成
【０１３１】
類縁体3-6：類縁体-3はオバリシンヒドラゾンから合成することができる。簡潔には、オバリシン(又はフマギノン)はクロロメチル官能性でスピロエポキシドを開環するために酢酸の存在下にLiClで処理される。THF中のオバリシンの溶液は、LiCl及び酢酸で36時間攪拌され、THFの除去処理後、引続いてクロロホルムが添加される。有機層はH2O、重炭酸ナトリウムで洗浄され、乾燥され、シリカクロマトグラフィーによって精製される(30%のEtOAc-ヘキサン)。
【０１３２】
この中間体は、次に穏やかな酸性(酢酸)の条件下にヒドラジンで処理されて、対応するヒドラゾン与える。次いで、ヒドラゾンはナトリウムシアノホウ化水素で選択的な還元にさらされ、引続いて対応する酸(E-イソゲラン酸)40eの存在下にDCC/DMAPで媒介されたアミド化に付される(スキーム2)。最終工程で、スピロエポキシド官能性は随意に修正される。類縁体-4を含む修飾されたスピロエポキシド部分を与えるために、類縁体3は0℃でTHF中のKOtBuで処理される。
【０１３３】
個別の経路において、中間体-1は、対応するオキシム誘導体を与えるために穏やかな酸存在下にヒドロキシルアミンで処理される。オキシム誘導体は還元され、引続いてE-イソゲラン酸でDCCを媒介としたエステル化を受けて、類縁体5を生成する。2,6-オクタジエン酸塩化物もオキシム(類縁体6)をエステル化するために使用されてもよい。
【０１３４】
E-イソゲラン酸はEustache及び共著者による文献報告書に従って、E-イソゲラニオールから合成される。40e  所望のE-イソゲラン酸を得るために、E-イソゲラニオールが、水およびアセトン混合物中の硫酸存在下に三酸化クロムを媒介とした酸化に付される。酸は純粋なエナンチオ選択的なE-形態で得られ、シリカカラムを通過することにより副産物から分離される。簡単な方法で、2,6-オクタジエン酸-(2E,6E)は、PCl5で処理することにより酸塩化物に変換される。41
【化５】
2013527157.tif 000018
スキーム3．オバリシン及びフマギノンの前駆体から類縁体7-9の合成
【０１３５】
類縁体7-9：Liuらによる以前の報告に基づいて42、C4側鎖上のC10及びC20の炭素間の回転可能な単結合を所持する化合物が、固定したエポキシドおよびジエン側鎖を持った類縁体に比較して、MetAP-2に対する減じられた活性を示した。さらに、結晶学的なデータは、更なる最適化にとって重要なスペースがポケット内であることを示した42。すべて同時に、我々は、酸不安定な側鎖エポキシドをジエン部分に取り替えることに決定した。
【０１３６】
典型的な実験の手順において、類縁体-5は-78℃でn-BuLiの存在下にWCl6で処理され、引き続き0℃でTHF中のKOtBuによって処理されて、類縁体7を与える(スキーム3)。アルゴン雰囲気下、n-BuLiが-78℃でTHF中のWCl6の溶液に滴加され、引き続き、1/2時間攪拌を継続する。類縁体-5の溶液が添加され、2時間反応させる。NaOHが反応混合液に添加される。そして、生成物はエーテルで抽出される。その抽出液をNaOHおよび水で洗浄した。残留物はカラムクロマトグラフイー(酢酸エチルヘキサン)によって精製し、類縁体-7を与えた。類縁体8-9は、類縁体-7の合成に対して上記で記述されたルートに従って、類縁体-4および6からそれぞれに合成される。
【化６】
2013527157.tif 000019
スキーム 4．オバリシン及びフマギノンの前駆体から類縁体10-11の合成
【０１３７】
類縁体10-11：さらに我々は、所望の幾何学および置換パターンを提供してもよいオキシム官能性で環外の側鎖エポキシドを取り替える。Pyunら40mによる以前の報告は、類縁体を持つベンジルオキシムが優れた活性(MetAP-2分析中の約1 nM)を示すことを示した40m。C4オキシム類縁体が合成され評価される。Fardisらによって以前に報告されたように40b、中間体3は、容易にフマギロールから合成することができる。中間体-3は-78℃でオゾン分解に付され、続いて、硫化ジメチルで処理されて、対応するケトン誘導体を与える。ケトン誘導体はTsOHおよびモレキュラーシーブ(4Å)が存在する状態で、アミノベンジルオキシム(H2N-OBn)で処理されて、EおよびZベンジルオキシム(中間体4)の混合物を生成する。次いで、中間体-4は対応するケトン誘導体に酸化される。ヒドラジンまたはヒドロキシルアミンでの中間体-4の処理は対応するオキシム誘導体を発生する。次いで、それはE-イソゲラン酸と反応するためにDCC/DMAPで還元され活性化されて、類縁体10-11を生成する。
【化７】
2013527157.tif 000020
ダイヤグラム 4．オバリシン及びフマギノンの前駆体から類縁体12-15の合成
【０１３８】
類縁体12-15：フマギノールは、共有結合でMetAP-2を結合することなしに、MetAP2および内皮細胞増殖を選択的に阻害することが示されたフマギリンの新規な合成類縁体である40g。フマラノールは、上方に開いたスピロエポキシの部分を持った二環式の環状構造から成る。我々は、上記で議論された戦略に沿った関連するフマラノール類縁体を探究することを決定した。6-ケトン基のR-位置でカルボアニオンを形成するためにKOHと類縁体-10を反応させ、そのカルボア二オンは分子内のSN2型反応を受けてスピロエポキシ基(ダイヤグラム4)を開環し、二環式の環状構造(類縁体12)を生成する。同様に、類縁体13-15は、類縁体7および8からそれぞれに合成される。
【化８】
2013527157.tif 000021
ダイヤグラム 5．オバリシン及びフマギノンの前駆物質から類縁体16-19の合成
【０１３９】
類縁体16-19：さらに我々は、スピロ(C-3)エポキシドがチオメトキシド(スキーム5)官能性で開環される類縁体の合成を試みる。簡単に云えば、無水DMF中の類縁体-7の攪拌された溶液に、室温でチオメトキシドが添加される。反応液は2時間攪拌され、次に酢酸エチルで希釈され、飽和した水性のNaHCO3および水で洗浄される。有機相は乾燥され(無水のNa2SO4)、そして、残留物は類縁体-16を生成するためにシリカゲル(酢酸エチル: ヘキサン)上のカラムクロマトグラフィーによって精製される。同様の方法論に従って、類縁体17-19は、類縁体8-9および4からそれぞれに合成される。
【化９】
2013527157.tif 000022
スキーム 5．オバリシン及びフマギノンの前駆体から類縁体-20の合成
【化１０】
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スキーム 6．フマギロールから類縁体-21の合成
【０１４０】
合成類縁体20-25(フマギリン-PAF類縁体)：以前に記述されたように、この工程の挑戦のうちの1つは改善された膜付着特性を持った新しいフマギリン類縁体を開発することである。この目標に向けて、C4及びC6での置換に対するMetAP2の耐用性を理解することをターゲットにした一連のフマギリン-PAF類縁体が合成される。最初に、C4側鎖を不変のまま維持し、C6を修飾する。血小板活性化因子(PAF)-脂質(16:0)のC6での配置がこれらの化合物の膜付着特性を改善すると予想される。我々は、環状炭素及び疎水性の尾の間の接続を与える類縁体のフレキシブル部として(スキーム5および6)、短い(グリシン)、及び中間の(ε-アミノカプロン酸)スペーサーを使用することを計画する。リンカー分子は、PAFを結合したフマギリン候補の酵素加水分解を駆り立てる際に重要な部分で演じてもよい。リン脂質プロドラッグの退化へのリンカー長さの影響は、以前にDahanらによって研究された28f。より短いリンカー(2-炭素)は、5-炭素リンカーとの比較で、20倍のより少ないプロドラッグの放出を引き起こすことが分かった28f。簡潔には、オバリシン(又はフマギノン)は、穏やかな酸性(酢酸)の条件で、ε-アミノカプロン酸の存在下に処理されて、対応するヒドラゾンを与える。ヒドラゾンはナトリウムシアノホウ化水素で選択的に還元され、引続いてPAF (16:0)の存在下にDCC/DMAPで媒介されたアミド化に付されて、類縁体-20を結果として与える。
【化１１】
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ダイヤグラム 6．提案されたフマギリン類縁体22-27の構造
【０１４１】
それに代えて、フマギロールはビス(4-ニトロフェニル)炭酸塩で活性化され、続いて、グリシンと反応する。典型的な実験手順において、N2雰囲気下、乾燥したCH2Cl2中のフマギロール、ビス(4-ニトロフェニル)炭酸塩およびDMAPの混合物が、7時間撹拌される。CH2Cl2で反応液を希釈し、H2Oで洗浄する。その有機層はMgSO4で乾燥され、濃縮される。フラッシュクロマトグラフィー(EtOAcヘキサン)が、活性化されたフマギロールを与えた。次いで、グリシンが中間体-6を調製するために連結される。簡単には、N2雰囲気下、乾燥したCH2Cl2中の活性化されたフマギロール、グリシンおよびDMAPの溶液が、2時間撹拌される。反応の完成は薄層クロマトグラフィーによってモニターされる。反応液は、CH2Cl2で希釈し、H2Oで有機層を洗浄することによって後処理が為される。溶媒の除去に続くフラッシュクロマトグラフィー(MeOH-EtOAc)が、中間体-6の生成を結果した。最後に、PAF(16:0)剤との中間体-6のカルボジイミドを媒介としたエステル化(DCC/DMAP)が、類縁体21を生成する。
【０１４２】
C6にPAF剤を置換した後に、フマギリンのC4側鎖修飾が、望ましい薬理学的性質を持ったMetAP-2阻害剤を開発するために行なわれる。類縁体18および19のスピロエポキシド環は、類縁体23および25を生成するためにチオメトキシドで開環される。
ベンジルオキシムおよびジエン側鎖によるC4側鎖の置換が、類縁体22、24、26-27を与えるために遂行される(ダイヤグラム6)。
【０１４３】
合成フマギリン類縁体のキャラクタリゼーション：合成フマギリン類縁体の詳細なキャラクタリゼーションは、NMR、FT-IR、質量分析および元素分析によって行なわれる。1Hおよび13Cの信号帰属およびプロトンの空間的近さは、COSY, NOE実験に基づく。1Hおよび13Cの信号帰属はCOSY, NOESYおよび選択的な1DTOCSY13の測定に基づいて為される。分子の脂肪族の部分のプロトンプロトン結合定数は、分解能向上のためのガウシアンアポダイゼイションの後に1H-NMRスペクトルからの第1オーダー近似によって決定される。シクロヘキシル環およびC-4側鎖の研究は、同様の方法で行われる。
【０１４４】
実施例13．フマギリンプロドラッグ効能
図19に示されるように、脂質膜の中に溶解されたフマギリンは生体内で急速に遊離して、それを生体内で実際上効果を無くす。しかしながら、図20は、本発明のナノ粒子で投与されたフマギリンプロドラッグの生体内の有効性を示す。特に、図は、ターゲットとされたフマギリンナノ粒子(a-b)および対照(薬ナシ、c-d)での処理後生体内のMR信号増加を示す；2.28%のフマギリンを持ったανβ3のインテグリンにターゲットとされたナノ粒子、薬物のないανβ3のインテグリンにターゲットとされたナノ粒子、2.28mole%フマギリンPDを持ったターゲットとされていないナノ粒子、対、2.28mole%フマギリンPDを持ったανβ3のインテグリンにターゲットとされたナノ粒子、で処理されたラット中の減少されたMatrigel移植体積(%)。
【０１４５】
図21は、生体外の細胞増殖分析でのフマギリンプロドラッグの影響を示す。左側のパネルは、CyQuant NF分析による細胞増殖を目的とした、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)へのフマギリンプロドラッグを組み込まれたナノ粒子および対照ナノ粒子(ターゲットとされた薬ナシ、ターゲットとされない及びターゲットとされたフマギリン)の影響を示す。右側のパネルはAlamar Blue分析による細胞代謝活性を示す。
【０１４６】
実施例14．ドセタセルプロドラッグ
図18A又はBで示されるように合成されたドセタセルプロドラッグが、代謝活性を測定するためにalamar blue分析の2F2B細胞へ投与された。図22は、ドセタセルのないαvβ3にターゲットとされた粒子とドセタセルを持ったαvβ3にターゲットとされた粒子およびドセタセルプロドラッグを持ったαvβ3にターゲットとされた粒子の間の比較を示す。ドセタセルナシのターゲットとされた対照と比較して、分析が進行するにつれて、プロドラッグを含んでなる粒子は、細胞代謝活性の持続的な抑制を実証した。
【０１４７】
実施例15．光線力学療法(PDT)プロドラッグの合成
典型的な手順で、亜鉛でキレートされたポルフィリンベースのPDTプロドラッグが、直線的な方法で合成される。次いで、アミンで停止した亜鉛ポルフィリンPDTプロドラッグは、NaBH4および触媒的なトリフルオロ酢酸が存在する状態でALDO PCで還元的アミノ化に付される。
【０１４８】
実施例16．ポリソルベートミセル
本出願は診断治療適用および遺伝子送達システムのための、新規なナノ微粒子システムの設計、合成、物理化学的なキャラクタリゼーション、および使用を包含する。多機能のナノ粒子は制癌剤送達に非常に重要な役割を果たす。絶えず新規な新しい適用が開発されて、制癌剤送達でのナノ粒子の可能性は無限である。癌には脈管の内皮気孔、異種混合の血液供給、異種混合の構成などのような生理的な障壁がある。療法が成功するためには、これらの生理的な障壁を克服することが非常に重要である。ターゲットとされた分子イメージングおよびドラッグデリバリーを使用する癌の検知および治療にとって、ナノ微粒子剤は、医療分野で最新の業績であり、ナノ医学研究の基礎を形成する。様々なナノデバイスが、ナノ気孔、ナノチューブ、量子ドット(QD)、ナノシェル、デンドリマーおよびシェル架橋ナノ粒子、PFCナノ粒子、生物分解性のヒドロゲルなど含めて探究されてきた。
【０１４９】
ナノスケールデバイスはヒト細胞より100倍小さいが、大きな生体分子(酵素及び受容体)とサイズにおいて類似している。サイズ及び形に関して、50nm未満のナノ粒子は容易にほとんどの細胞に入ることができる。そして、それらが身体の中で循環するにつれて、20nm未満のものは血管から出ることができる。生体内の効率的な検知のための造影剤の高いペイロードを運ぶベクターとしてナノ粒子は設計されており、正常細胞を節約する一方で悪性細胞の中への化学療法剤又は治療用遺伝子の多量の供与量を運ぶカスタマイズされた標的ドラッグデリバリー賦形剤として役立つのにさらに適切である。このアプローチにおいて、ナノ粒子は、多くの現在の癌治療に伴う多くの場合承諾しがたい副作用を大幅に低減するか除去する。さらに、ナノ粒子のタイプは非常に重要で、2つのメインクラス(無機的、及び有機的な)へ分類することができる。リポソーム、デンドリマー、カーボンナノチューブ、乳剤および他の重合体のナノ粒子は、有機的な粒子の広く研究されたグループの例である。大部分の無機のナノ粒子は、表面上の保護有機物被覆と、粒子の蛍光的な、光学的な、磁気的な及び電子的な特性を規定する中心コアの同一の基本構造を共有する。この外側層は生理学上侵略的な環境における分解からコアを保護し、塩基性官能基(アミン及びチオール類)を持っている陽性に帯電された剤および生体分子と、静電気又は共有結合、又は両方を形成することができる。サイズに関して、無機のナノ粒子は2-50nmにわたる非常に小さな寸法で製造することができる(酸化鉄粒子への金)が、しかしながら、有機的な前駆物質でそのような小規模範囲を達成することは挑戦的である。癌中のより大きなナノ粒子は、それらが器官(肝臓、ひ臓および肺)を回避することを困難にすることができる。それは絶えず身体から外来物質を取り除いている。更に、それらは、正常及び癌組織の間で識別するべき細胞の中で、微妙な違いを利用することができるに違いない。確かに、研究者が、有効に免疫系を回避することができ、活動的に腫瘍をターゲットとすることができるナノ粒子を成功裡に巧みに計画実行し始めたのはつい最近である。
【０１５０】
したがって、ターゲットとされた治療の画像化用ナノ粒子の開発における最近の進歩にもかかわらず、脈管外の粒子(<20nm)で水可溶性の安定したシステムに対する持続性の必要性がさらに当分野において存在する。必要とされる特徴は、生体適合性、調整可能な放出特性および敵対的な生体内環境に対する耐性を持った容易にバイオ代謝可能な治療薬の内部隔離、を含む。これらの必要条件に基づいて、我々は、診断治療適用のための超微細の「柔軟なナノセル(nanocelle)ナノ粒子を開発した。ナノ粒子は、標的細胞または組織に特異的な配位子(インテグリンαvβ3、α5β1、ICAM-1、VCAM-1、VLA-4など)に接合することによって、標的細胞又は組織に特異的にされる。ナノ粒子はさらに、画像化及び療法へのそれらの適用を目的として、生理活性物質、プロドラッグ(フマギリン、myc-max阻害剤、カンプトテシン、シスプラチン、ステロイド、メトトレザト、パクリタキセル/ドセタセルなど)放射性核種などを含んでよい。粒子は、MR、CT、光学的、光音響、PET、SPECT及びUSのための造影剤と一緒に組み込まれる。
【０１５１】
ナノセルナノ粒子の調製
我々は、水に16-20nmの間の名目上の流体力学的径を持った可溶性のナノセルナノ粒子を調製した。これらの粒子のコアは、そのまわりを覆うリン脂質を持った生物学上適切な界面活性剤(すなわちTween80、スパン80、セスキオレイン酸ソルビタン、ソルビタンモノラウレート)からできている。粒子は、物理化学的な方法によって徹底的にキャラクタライズされる。
【０１５２】
avb3にターゲットとされたMyc-max阻害剤が担持されているナノセル粒子の調製のための典型的な手順:
典型的な実験の手順において、界面活性剤共混合物は高純度卵黄ホスファチジルコリン(99モル%、395.5mg)、PEG2000-ホスファチジルエタノールアミンに結合したαvβ3-ペプチド模倣体アンタゴニスト(0.1モル%、Kereos, Inc, St. Louis, MO, USA)(1モル%、6.0mg)及びmyc-maxプロドラッグの2モル%を含んでいた。界面活性剤共混合物を無水のクロロホルムに溶解し、膜を形成するために減圧下で蒸発させ、50℃真空オーブンで夜通し乾燥して、プローブ超音波処理によって水(5mL)へ分散した。この懸濁液を、ポリソルベート混合物(20%v/v、4ml)、蒸留・脱イオン化水(77.3%のw/v、計15.23ml)およびグリセリンと一緒にした(1.7%、w/v、0.37ml)。その混合物を、S110 Microfluidics乳化剤(Microfluidics)で、0℃で4分間20,000psiで連続的に後処理した。ナノセル粒子を、20,000 Da MWCOセルロース膜を長期間に使用してnanopure(0.2μm)水に対して透析し、次に、0.45μmのAcrodisc Syringeフィルタを通した。ナノ粒子は、いかなる細菌増殖も防ぐために典型的には4℃にてアルゴン雰囲気下で保管した。粒子の水和された状態の流体力学的径(16±4 nm)は、90°でレーザーを操作するBrookhaven動的光散乱実験によって測定される。脱水和された状態の直径および粒子高さは、TEM(1%の酢酸ウラニルで陰性に染色され、ニッケル表面上で乾燥された)、およびAFM(図xx)(タッピングモード、液滴を置き、ガラスカバースリップ上で乾燥された)を使用してそれぞれ測定される。
【０１５３】
生体外のプロドラッグ試験：細胞毒性分析
ヒトB16黒色腫細胞を96穴(ウエル)のプレート上に接種した(5000個の細胞/ウエル)。24時間後に、細胞を、avb3-インテグリンでターゲットとされたナノセルmycプロドラッグ(約0.5uM myc-PD)、フリーのmyc、ターゲットとされた薬物ナシ、又はターゲットとされなかったmycプロドラッグナノセルで、1時間培養した(1枚のプレート当たりの1つのサンプル当たり6つの複製)。ウエルは、PBSで3回洗浄し、そして、プレートをインキュベーターに戻した。薬物曝露の2から4日後に、細胞代謝活性をAlamar Blue(Invitrogen社)を使用して測定した。この分析は、代謝的に活性な細胞中における非蛍光性染料の、蛍光性基質への還元に基づく。この還元は、典型的には一次電子ドナーとしてNAD(P)Hを使用する異なるオキシドレダクターゼ酵素系に起因する。このレドックス反応は、得られる信号が存在する生細胞の数に比例するところで蛍光プレートリーダ(Ex 570nmおよびEm 587nm)を使用してモニターされた。各サンプルからの信号の強度は、陽性の対照(αvβ3インテグリンでターゲットとされた薬物無しナノ粒子)(時刻ポイント当たりn=3-6プレート)からの信号に標準化された(図28)。
【０１５４】
実施例17：PNAを含んでなるプロドラッグ
PNA及び接合体は、商用モノマー(Panagene社、Korea)を利用する標準の自動Fmoc PNA合成手順により自動ペプチドシンセサイザ上で2μmol Fmoc-PAL-PEG-PS上で合成される。自動合成の最終工程に従って、樹脂は、乾燥したDMF (2×3 mL)および乾燥したCH2Cl2 (2×3 mL)で洗浄され、次いで、N2流れの下で乾燥される。次いで、樹脂は、PNAを放出し且つ脱保護するために室温でトリフルオロ酢酸(300μL)およびm-クレゾール(100μL)とバイアル中で2時間震盪される。その溶液は樹脂からろ過され、氷冷されたEt2O(5mL)へ加えて、4℃で1時間保持する。得られる沈殿は、遠心分離によって集められ、逆相HPLCによって精製される。PNAリジン接合体は標準Fmoc化学を使用して、自動ペプチドシンセサイザ上で合成される(2μmol)。DMSO中のPNAリジン接合体(分光測光法で決定された0.19μmol)はPAzPCの溶液に添加され、1-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]-3-エチルカルボジイミドメチオダイドの添加に先立って30分間撹拌させる。得られる溶液を16時間撹拌させ、逆相HPLC技術によって精製した。
【０１５５】
実施例18：カンプトテシンプロドラッグの合成
【化１２】
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ダイヤグラム 7．カンプトテシンプロドラッグ1(トップ)およびプロドラッグ2(ボトム)のための合成経路
a.1) カンプトテシンプロドラッグ1の合成：カンプトテシンプロドラッグは、DCC/DMAPを媒介としたカップリングプロトコルが存在する状態でPAzPC(脂肪酸で変性され酸化された脂質16:0-9:0  COOH PC)と化合物の直接接合(カップリング)によって製造される。
【０１５６】
a.2) カンプトテシンプロドラッグ2の合成：カンプトテシンはビス(4-ニトロフェニル)炭酸塩で活性化され、引続いてモノボック-エチレンジアミンと反応されて6を生成する。典型的な実験手順において、N2雰囲気下、乾燥したCH2Cl2中のカンプトテシン、ビス(4-ニトロフェニル)炭酸塩およびDMAPの混合物が、7時間撹拌される。反応液はCH2Cl2で希釈され、H2Oで洗浄される。その有機層はMgSO4で乾燥され、濃縮される。フラッシュクロマトグラフィー(EtOAc-ヘキサン)が使用されて、活性化されたフマギロールを与える。次いで、モノボックに保護されたエチレンジアミンが中間体-6を調製するために連結される。生成物は回収され、直ちに、PAzPCとDCC/DMAPを媒介としたカップリングに付される。両方の類縁体の化学的同一性はNMRおよび質量分析によって確認される。
【０１５７】
実施例19．メチルプレドニゾロンプロドラッグ
メチルプレドニゾロンプロドラッグは、DCC/DMAPを媒介としたカップリングプロトコルが存在する状態でPAzPC(脂肪酸で変性され酸化された脂質16:0-9:0 COOH PC)と化合物の直接のカップリングによって生成される。
【化１３】
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【０１５８】
実施例20．ナノ粒子に配位子を接合（カップリング）する方法
ナノ粒子への配位子の接合は、包接複合体を形成するためにペプチド又は小分子配位子上のアダマンタンと自然に相互作用する粒子上のβ-シクロデキストリン(β-CD)と包接化合物プロトコルに従うことによりユニークに達成されてもよい。簡単には、シクロデキストリン-PEG-DSPE誘導体は、モノ-6-デオキシ-6-アミノ-β-シクロデキストリン経由で合成される。β-シクロデキストリンの7つの主要な水酸基のうちの1つはp-トルエンスルホニル塩化物を使用してトシル化される。アジドによるトシル基の置換およびトリフェニルホスフィンでの引き続く還元が、モノ-6-デオキシ-6-アミノ-β-シクロデキストリンを与える。カルボキシル活性化されたPEG-DSPEは、シクロデキストリン-PEG-DSPEを生成するためにモノ-6-デオキシ-6-アミノ-β-シクロデキストリンと接合する。アダマンタンアミンは、アダマンタンペプチド/配位子を生成するためにペプチドのカルボキシル末端への固層ペプチド合成における短いスペーサーを通して直接接合する。アダマンタンアミンおよびナノ粒子を担持しているβ-シクロデキストリンの単純な室温混合は、ペプチドと連結した標的化されたナノ粒子を生成する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
2013527157.tif 000042
【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
2013527157.tif 000064
【図３１】
2013527157.tif 000065
【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３】
2013527157.tif 000068
【図３４】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年12月7日(2012.12.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2013527157000001.app
【国際調査報告】
2013527157.tif 000070