(57)【要約】  本発明はインスリン感受性を増加する方法及び組成物に関し、抗酸化ＬＤＬ抗体の投与を含んでなる。
2013503195.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体のインスリン感受性を増加させる方法であって、酸化低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）のエピトープに選択的に結合する抗体を含んでなる有効量の組成物を被験体に投与することを含んでなる方法。
【請求項２】
被験体のインスリン感受性を増加させるための医薬品の製造における、酸化ＬＤＬのエピトープに選択的に結合する抗体の使用。
【請求項３】
被験体のインスリン感受性を増加させるための、酸化ＬＤＬのエピトープに選択的に結合する抗体を含んでなる医薬品。
【請求項４】
インスリン感受性を増加させるための、酸化ＬＤＬのエピトープに選択的に結合する抗体。
【請求項５】
酸化ＬＤＬのエピトープが酸化ＡｐｏＢ-１００のエピトープを有する請求項１に記載の方法、請求項２に記載の使用、請求項３に記載の医薬、又は請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
酸化ＡｐｏＢ-１００のエピトープが、配列番号：１−配列番号：３８からなる群から選択される請求項５に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項７】
酸化ＡｐｏＢ-１００のエピトープが、Ｐ４５（アミノ酸残基６６１-６８０-ＩＥＩＧＬＥＧＫＧＦＥＰＴＬＥＡＬＦＧＫ；配列番号：３２）、Ｐ１４３（アミノ酸残基２１３１-２１５０-ＩＡＬＤＤＡＫＩＮＦＮＥＫＬＳＱＬＱＴＹ；配列番号：１３）、Ｐ２１０（アミノ酸配列ＫＴＴＫＱＳＦＤＬＳＶＫＡＱＹＫＫＮＫＨ；配列番号：１４）、及び／又はＰ１２９（アミノ酸配列ＧＳＴＳＨＨＬＶＳＲＫＳＩＳＡＡＬＥＨＫ；配列番号：１６）である請求項５−６の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項８】
抗体がモノクローナル抗体である請求項１−７の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項９】
モノクローナル抗体がＩｇＧ１抗体である請求項８に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項１０】
モノクローナル抗体がヒト化抗体又はヒト抗体である請求項８−９の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項１１】
モノクローナル抗体がヒト抗体である請求項１０に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項１２】
モノクローナル抗体が、（ｉ）配列ＣＳＧＳＮＴＮＩＧＫＮＹＶＳ（配列番号：３９）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＡＮＳＮＲＰＳ（配列番号：４０）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び／又は（ｉｉｉ）配列ＣＡＳＷＤＡＳＬＮＧＷＶ（配列番号：４１）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する請求項１−１１の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項１３】
モノクローナル抗体が、（ｉ）配列ＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：４２）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳＩＳＶＧＧＨＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：４３）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び／又は（ｉｉｉ）配列ＡＲＩＲＶＧＰＳＧＧＡＦＤＹ（配列番号：４４）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する請求項１−１２の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項１４】
モノクローナル抗体が、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＡＶＮ（配列番号：４５）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＧＮＤＲＲＰＳ（配列番号：４６）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び／又は（ｉｉｉ）配列ＣＱＴＷＧＴＧＲＧＶ（配列番号：４７）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する請求項１−１１の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項１５】
モノクローナル抗体が、（ｉ）配列ＦＳＤＹＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：４８）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＧＶＳＷＮＧＳＲＴＨＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：４９）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び／又は（ｉｉｉ）配列ＡＲＡＡＲＹＳＹＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号：５０）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する請求項１−１１又は１４の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項１６】
モノクローナル抗体が、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ（配列番号：１２７）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＳＮＮＱＲＰＳ（配列番号：１２８）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＡＷＤＤＳＬＳＨＷＬ（配列番号：１２９）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する請求項１−１１の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項１７】
モノクローナル抗体が、（ｉ）配列ＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＶＰＧ（配列番号：１３０）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＴＬＧＧＳＧＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：１３１）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＫＬＧＧＲＳＲＹＧＲＷＰＲＱＦＤＹ（配列番号：１３２）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する請求項１−１１又は１６の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項１８】
モノクローナル抗体が、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＳ（配列番号：１３３）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＧＮＹＮＲＰＳ（配列番号：１３４）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＡＷＤＤＳＬＳＧＷＶ（配列番号：１３５）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する請求項１−１１の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項１９】
モノクローナル抗体が、（ｉ）配列  ＦＳＳＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：１３６）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳＩＳＧＳＧＲＲＴＹＹＡＤＳＶＱＧＲ（配列番号：１３７）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＲＬＶＳＹＧＳＧＳＦＧＦＤＹ（配列番号：１３８）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する請求項１−１１又は１８の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項２０】
モノクローナル抗体が、（ｉ）配列ＣＳＧＲＳＳＮＩＧＮＳＹＶＳ（配列番号：１３９）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号：１４０）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＧＷＤＤＴＬＲＡＷＶ（配列番号：１４１）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する請求項１−１１の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項２１】
モノクローナル抗体が、（ｉ）配列ＦＲＤＹＹＶＳＷＩＲＱＡＰＧ（配列番号：１４２）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳＩＳＧＳＧＧＲＴＹＹＡＤＳＶＥＧＲ（配列番号：１４３）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＲＶＳＡＬＲＲＰＭＴＴＶＴＴＹＷＦＤＰ（配列番号：１４４）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する請求項１−１１又は２０の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項２２】
ヒト抗体が、配列番号：６４、配列番号：６８、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：８０、配列番号：８４、配列番号：８８、配列番号：９２、配列番号：９６、配列番号：１００、配列番号：１０４、配列番号：１０８、配列番号：１１２、配列番号：１１６、配列番号：１２０、及び配列番号：１２４から成る群から選択される配列を含んでなる重鎖可変ドメインを有する請求項１−１１の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項２３】
ヒト抗体が、配列番号：６６、配列番号：７０、配列番号：７４、配列番号：７８、配列番号：８２、配列番号：８６、配列番号：９０、配列番号：９４、配列番号：９８、配列番号：１０２、配列番号：１０６、配列番号：１１０、配列番号：１１４、配列番号：１１８、配列番号：１２２、及び配列番号：１２６から成る群から選択される配列を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する請求項１−１１又は２２の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項２４】
ヒト抗体が、配列番号：１０４を含んでなる重鎖可変ドメイン、及び配列番号：１０６を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する請求項１−１１の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項２５】
ヒト抗体が、配列番号：６８を含んでなる重鎖可変ドメイン、及び配列番号：７０を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する請求項１−１１の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項２６】
ヒト抗体が、配列番号：９６を含んでなる重鎖可変ドメイン、及び配列番号：９８を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する請求項１−１１の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項２７】
ヒト抗体が、配列番号：７２を含んでなる重鎖可変ドメイン、及び配列番号：７４を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する請求項１−１１の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項２８】
ヒト抗体が、配列番号：７６を含んでなる重鎖可変ドメイン、及び配列番号：７８を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する請求項１−１１の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項２９】
抗体が抗原結合断片である請求項１−２８の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項３０】
抗原結合断片が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２  断片、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、及びダイアボディから成る群から選択される請求項２９に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項３１】
抗体が更に炎症を低減する請求項１−３０の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項３２】
炎症が糖尿病に関連する請求項３１に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項３３】
抗体が更に炎症マーカーのレベルを低減し、炎症マーカーがＩＬ-１β、ＩＬ-１５、ＥＮ-ＲＡＧＥ、ＭＣＰ-１、ＩＬ-６及びＴＮＦ-αから成る群から選択される請求項１−３２の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項３４】
被験体がメタボリックシンドロームを有する請求項１−３３の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項３５】
被験体がメタボリックシンドロームを発生する危険性にある請求項１−３３の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項３６】
被験体が、（ａ）男性では約１０２ｃｍ以上及び女性では約８８ｃｍ以上のの腹囲、（ｂ）約１５０ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時トリグリセリド、（ｃ）約９５ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時グルコース、及び（ｄ）高レベルの酸化ＬＤＬから成る群から選択される一又は複数の特徴を有する請求項３５に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項３７】
被験体が糖尿病に伴う炎症を更に有する請求項１−３６の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項３８】
被験体が一晩絶食後、約９５ｍｇ／ｄＬ以上の血液グルコースレベルを有する請求項１−３７の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項３９】
被験体が一晩絶食後、約１２６ｍｇ／ｄＬ以上の血液グルコースレベルを有する請求項３８に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項４０】
被験体が２時間の経口グルコース負荷試験後、約１４０ｍｇ／ｄＬ以上の血液グルコースレベルを有する請求項１−３９の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項４１】
被験体が２時間の経口グルコース負荷試験後、約２００ｍｇ／ｄＬ以上の血液グルコースレベルを有する請求項４０に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項４２】
被験体が糖尿病前症を有する請求項１−４１の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項４３】
被験体が糖尿病を患う請求項１−４２の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項４４】
糖尿病が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病及び妊娠糖尿病からなる群から選択される請求項４３に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項４５】
糖尿病がＩＩ型糖尿病である請求項４４に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項４６】
被験体が心臓血管疾患又は冠動脈心疾患を有する請求項１−４５の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項４７】
心臓血管疾患又は冠動脈心疾患が糖尿病に関連する請求項４６に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項４８】
被験体が動脈硬化症を有する請求項１−４７の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項４９】
動脈硬化症が糖尿病に関連する請求項４８に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項５０】
インスリン感受性の増加が、被験体における糖尿病前症を治療するためである請求項１−４９の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項５１】
インスリン感受性の増加が、被験体における糖尿病を治療するためである請求項１−４９の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項５２】
糖尿病が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病及び妊娠糖尿病からなる群から選択される請求項５１に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項５３】
糖尿病がＩＩ型糖尿病である請求項５２に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項５４】
インスリン感受性の増加が、被験体における心臓血管疾患又は冠動脈心疾患を治療するためである請求項１−５３の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項５５】
心臓血管疾患又は冠動脈心疾患が糖尿病に関連する請求項５４に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項５６】
インスリン感受性の増加が、被験体における動脈硬化症を治療するためである請求項１−５５の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項５７】
動脈硬化症が糖尿病に関連する請求項５７に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項５８】
第二の治療剤を投与することを更に含んでなる請求項１−５７の何れか一項に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項５９】
第二の治療剤がインスリンである請求項５８に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項６０】
第二の治療剤がスタチンである請求項５８に記載の方法、使用、医薬、又は抗体。
【請求項６１】
明細書に準拠してここに定義される何れかの抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００９年８月２８日に出願された、米国仮出願第６１／２３８，１１４号の優先権を主張するものであり、その内容は出典明記によりその全体を本明細書中に援用する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、抗酸化低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）抗体を用いる、被験体におけるインスリン感受性を増加する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
メタボリックシンドロームは複雑な疾患であり、アメリカ心臓協会によって以下の異常により特徴付けられる：腹部肥満、アテローム生成脂質異常症、高血圧、インスリン抵抗性（耐糖能障害の有無）、炎症促進性状態及び血栓形成促進性状態(Grundy et al., "DEFINITION OF METABOLIC SYNDROME" Circulation, 2004, V109, pages 433-438, Document Number DOI: 10.1161/01.CIR.0000111245.75752.C6、www.circulationaha.orgで入手可能であり、出典明記によりその全体を本明細書中に援用する)。当技術分野において、三以上の上記の症状を有する人々がメタボリックシンドロームを有すると考えられると一般的に認識されている。アメリカ心臓協会は、米国成人の約２０から２５パーセントがメタボリックシンドロームであると推定する。
【０００４】
メタボリックシンドロームを有する人々のかなりの人口が糖尿病前症であり、正常より高いが糖尿病と診断する程は高くない血液グルコースレベルを有し、ＩＩ型糖尿病、心疾患、及び脳卒中を発生する危険にある。糖尿病前症は、米国においてより一般的になっている。アメリカ保健社会福祉省は、２００７年に少なくとも５７００万の２０歳以上の米国成人が糖尿病前症を有したと推定する。糖尿病前症を有する人は、彼らが糖尿病を防止又は遅延する処置を取らなければ、１０年以内にＩＩ型糖尿病を発生するだろう。
【０００５】
糖尿病自体は、米国において推定２３６０万人、人口の７．８パーセントに影響する。彼らの内、１７９０万人が診断され、５７０万はまだ診断されていない。２００７年には、約１６０万人の２０歳以上の人が糖尿病であると診断された。糖尿病は、インスリン作用の欠失又は不足により、グルコース、タンパク質及び脂質の異常代謝の発生によって引き起こされる。
【０００６】
糖尿病の典型的な徴候は、正常範囲のグルコースレベルに対する血清グルコースレベルにおける異常増加、及び尿におけるグルコースの排出を含む。真性糖尿病は米国において何百万の人々に影響し、不均一疾患であるが、３つの主なカテゴリ、すなわちＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、及び妊娠糖尿病に分類される。米国の全糖尿病患者の約８０％がＩＩ型糖尿病カテゴリに入る。このタイプの糖尿病は、インスリン分泌障害及びインスリン抵抗性双方によって特徴づけられる。大多数の患者は肥満成人であり、幾つかの場合では体重の減少が正常血糖に回復させる。しかしながら、このタイプの糖尿病はまた、非肥満成人及び小児においても生じることができる。
【０００７】
メタボリックシンドローム、糖尿病前症及び糖尿病等のメタボリックシンドロームに関連する症状又は状態を予防又は治療する方法を改良するために、患者におけるインスリン感受性を増加する方法を見つける差し迫った必要性がある。
【発明の概要】
【０００８】
ここに提供されるものは、被験体のインスリン感受性を増加する方法であって、酸化低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）のエピトープに選択的に結合する抗体を含んでなる有効量の組成物を被験体に投与することを含んでなる方法である。
更に提供されるものは、被験体のインスリン感受性を増加するための医薬品の製造における、酸化ＬＤＬのエピトープに選択的に結合する抗体の使用である。
また提供されるものは、被験体のインスリン感受性を増加するために、酸化ＬＤＬのエピトープに選択的に結合する抗体を含んでなる医薬品である。
またここで提供されるものは、インスリン感受性を増加するために、酸化ＬＤＬのエピトープに選択的に結合する抗体である。
【０００９】
ここに提供される方法、使用、医薬品、及び抗体の何れかの幾つかの実施態様では、酸化ＬＤＬのエピトープは酸化ＡｐｏＢ-１００のエピトープを有する。幾つかの実施態様では、酸化ＬＤＬのエピトープは、表１のペプチド配列から成る群から選択される。幾つかの実施態様では、酸化ＬＤＬのエピトープは、配列番号：１−配列番号：３８から成る群から選択される。幾つかの実施態様では、酸化ＬＤＬのエピトープは、Ｐ４５（アミノ酸残基６６１-６８０-ＩＥＩＧＬＥＧＫＧＦＥＰＴＬＥＡＬＦＧＫ；配列番号：３２）、Ｐ１４３（アミノ酸残基２１３１-２１５０-ＩＡＬＤＤＡＫＩＮＦＮＥＫＬＳＱＬＱＴＹ；配列番号：１３）、Ｐ２１０（アミノ酸配列ＫＴＴＫＱＳＦＤＬＳＶＫＡＱＹＫＫＮＫＨ；配列番号：１４）、及び／又はＰ１２９（アミノ酸配列ＧＳＴＳＨＨＬＶＳＲＫＳＩＳＡＡＬＥＨＫ；配列番号：１６）である。
【００１０】
ここに提供される方法、使用、医薬品、及び抗体の何れか幾つかの実施態様では、抗体はモノクローナル抗体である。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体はＩｇＧ１抗体である。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体はヒト化抗体またはヒト抗体である。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＮＴＮＩＧＫＮＹＶＳ（配列番号：３９）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＡＮＳＮＲＰＳ（配列番号：４０）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び／又は（ｉｉｉ）配列ＣＡＳＷＤＡＳＬＮＧＷＶ（配列番号：４１）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、（ｉ）配列ＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：４２）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳＩＳＶＧＧＨＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：４３）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び／又は（ｉｉｉ）配列ＡＲＩＲＶＧＰＳＧＧＡＦＤＹ（配列番号：４４）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＡＶＮ（配列番号：４５）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＧＮＤＲＲＰＳ（配列番号：４６）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び／又は（ｉｉｉ）配列ＣＱＴＷＧＴＧＲＧＶ（配列番号：４７）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、（ｉ）配列ＦＳＤＹＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：４８）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＧＶＳＷＮＧＳＲＴＨＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：４９）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び／又は（ｉｉｉ）配列ＡＲＡＡＲＹＳＹＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号：５０）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ（配列番号：１２７）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＳＮＮＱＲＰＳ（配列番号：１２８）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＡＷＤＤＳＬＳＨＷＬ（配列番号：１２９）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、（ｉ）配列ＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＶＰＧ（配列番号：１３０）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＴＬＧＧＳＧＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：１３１）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び／又は（ｉｉｉ）配列ＡＫＬＧＧＲＳＲＹＧＲＷＰＲＱＦＤＹ（配列番号：１３２）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＳ（配列番号：１３３）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＧＮＹＮＲＰＳ（配列番号：１３４）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び／又は（ｉｉｉ）配列ＣＡＡＷＤＤＳＬＳＧＷＶ（配列番号：１３５）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、（ｉ）配列ＦＳＳＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：１３６）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳ��ＳＧＳＧＲＲＴＹＹＡＤＳＶＱＧＲ（配列番号：１３７）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＲＬＶＳＹＧＳＧＳＦＧＦＤＹ（配列番号：１３８）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＲＳＳＮＩＧＮＳＹＶＳ（配列番号：１３９）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号：１４０）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び／又は（ｉｉｉ）配列ＣＡＧＷＤＤＴＬＲＡＷＶ（配列番号：１４１）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、（ｉ）配列ＦＲＤＹＹＶＳＷＩＲＱＡＰＧ（配列番号：１４２）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳＩＳＧＳＧＧＲＴＹＹＡＤＳＶＥＧＲ（配列番号：１４３）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び／又は（ｉｉｉ）配列ＡＲＶＳＡＬＲＲＰＭＴＴＶＴＴＹＷＦＤＰ（配列番号：１４４）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を有する。
【００１１】
ここに提供される方法、使用、医薬品、及び抗体の何れか幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体はヒト抗体である。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、配列番号：６４、配列番号：６８、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：８０、配列番号：８４、配列番号：８８、配列番号：９２、配列番号：９６、配列番号：１００、配列番号：１０４、配列番号：１０８、配列番号：１１２、配列番号：１１６、配列番号：１２０、及び配列番号：１２４から成る群から選択される配列を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、配列番号：６６、配列番号：７０、配列番号：７４、配列番号：７８、配列番号：８２、配列番号：８６、配列番号：９０、配列番号：９４、配列番号：９８、配列番号：１０２、配列番号：１０６、配列番号：１１０、配列番号：１１４、配列番号：１１８、配列番号：１２２、及び配列番号：１２６から成る群から選択される配列を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、配列番号：１０４を含んでなる重鎖可変ドメイン及び配列番号：１０６を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、配列番号：６８を含んでなる重鎖可変ドメイン及び配列番号：７０を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、配列番号：９６を含んでなる重鎖可変ドメイン及び配列番号：９８を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、配列番号：７２を含んでなる重鎖可変ドメイン及び配列番号：７４を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、配列番号：７６を含んでなる重鎖可変ドメイン及び配列番号：７８を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。
【００１２】
ここに提供される方法、使用、医薬品、及び抗体の何れか幾つかの実施態様では、ヒト化抗体又はヒト抗体は抗原結合断片である。幾つかの実施態様では、抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２  断片、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、及びダイアボディから成る群から選択される。幾つかの実施態様では、抗体が更に、炎症を低減する。幾つかの実施態様では、炎症が糖尿病に関連する。幾つかの実施態様では、抗体は更に炎症マーカーのレベルを低減し、炎症マーカーがＩＬ-１β、ＩＬ-１５、ＥＮ-ＲＡＧＥ、ＭＣＰ-１、ＩＬ-６及びＴＮＦ-αから成る群から選択される。幾つかの実施態様では、炎症マーカーはＩＬ-１β、ＩＬ-１５、ＥＮ-ＲＡＧＥ、及びＴＮＦ-αである。
【００１３】
ここに提供される方法、使用、医薬品、及び抗体の何れか幾つかの実施態様では、被験体がメタボリックシンドロームを有する。幾つかの実施態様では、被験体がメタボリックシンドロームを発生する危険性にある。幾つかの実施態様では、被験体が、（ａ）男性では約１０２ｃｍ以上及び女性では約８８ｃｍ以上の腹囲、（ｂ）約１５０ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時トリグリセリド、（ｃ）約９５ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時グルコース、及び（ｄ）高レベルの酸化ＬＤＬから成る群から選択される一又は複数の特徴を有する。幾つかの実施態様では、被験体が糖尿病に関連する炎症を更に有する。幾つかの実施態様では、被験体が一晩絶食後、約９５ｍｇ／ｄＬ以上の血液グルコースレベルを有する。幾つかの実施態様では、被験体は、一晩絶食後、約１２６ｍｇ／ｄＬ以上の血液グルコースレベルを有する。幾つかの実施態様では、被験体は、２時間の経口グルコース負荷試験後、約１４０ｍｇ／ｄＬ以上の血液グルコースレベルを有する。幾つかの実施態様では、被験体は２時間の経口グルコース負荷試験後、約２００ｍｇ／ｄＬ以上の血液グルコースレベルを有する。幾つかの実施態様では、被験体は糖尿病前症を有する。幾つかの実施態様では、被験体は糖尿病である。幾つかの実施態様では、糖尿病が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病及び妊娠糖尿病からなる群から選択される。幾つかの実施態様では、糖尿病がＩＩ型糖尿病である。幾つかの実施態様では、被験体が心臓血管疾患又は冠動脈心疾患を有する。幾つかの実施態様では、心臓血管疾患又は冠動脈心疾患が糖尿病に関連する。幾つかの実施態様では、被験体が動脈硬化症を有する。幾つかの実施態様では、動脈硬化症が糖尿病に関連する。
【００１４】
ここに提供される方法、使用、医薬品、及び抗体の何れか幾つかの実施態様では、インスリン感受性の増加は、被験体における糖尿病前症を治療するためである。幾つかの実施態様では、インスリン感受性の増加は、被験体における糖尿病を治療するためである。幾つかの実施態様では、糖尿病は、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病及び妊娠糖尿病からなる群から選択される。幾つかの実施態様では、糖尿病はＩＩ型糖尿病である。幾つかの実施態様では、インスリン感受性の増加は、被験体における心臓血管疾患又は冠動脈心疾患を治療するためである。幾つかの実施態様では、心臓血管疾患又は冠動脈心疾患は糖尿病に関連する。幾つかの実施態様では、インスリン感受性の増加が、被験体における動脈硬化症を治療するためである。幾つかの実施態様では、動脈硬化症は糖尿病に関連する。
ここに提供される方法、使用、医薬品、及び抗体の何れか幾つかの実施態様では、方法、使用、又は医薬品は、第二の治療剤を更に含む。幾つかの実施態様では、第二の治療剤を投与することを更に含んでなる。幾つかの実施態様では、第二の治療剤はインスリンである。幾つかの実施態様では、第二の治療剤はスタチンである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図1は実験スケジュールの概略及び評価したパラメーターのリストを示す。
【図２】図２Ａは動物識別番号に基づく、インスリンに対するＩＶＧＴＴについての曲線下面積（ＡＵＣ；血清濃度-時間曲線下面積)結果を示す。図２Ｂは動物識別番号に基づく、ＩＶＧＴＴによって決定される時間に対する血漿インスリンレベル（ｕＩＵ／ｍＬ）を示す。
【図３】図３Ａはベースライン、フルクトース後、及びＩＶＧＴＴを使用した１２週間の２Ｄ０３治療後の、年齢適合、ＨＦＤ-上昇インスリン、ＨＦＤ-正常インスリンに関する平均血漿インスリン（ｕＩＵ／ｍＬ）を示す。図３ＢはＩＶＧＴＴを使用したインスリンＡＵＣにより測定された、２Ｄ０３を用いた治療の前後の、高脂肪又は普通食を与えられた動物のグルコース負荷試験を示す。
【図４】図４は動物識別番号に基づく、Rules-Based Medicineにより測定された時間に対するｎｇ／ｍＬでのＥＮ-ＲＡＧＥのレベルを示す。
【図５】図５は動物識別番号に基づく、Rules-Based Medicineにより測定された時間に対するｐｇ／ｍＬでのＦＧＦ-ベーシックのレベルを示す。
【図６】図６は動物識別番号に基づく、Rules-Based Medicineにより測定された時間に対するｐｇ／ｍＬでのＩＬ-１３のレベルを示す。
【図７】図７Ａは動物識別番号に基づく、Rules-Based Medicineにより測定された時間に対するμｇ／ｍＬでのＩＬ-１５のレベルを示す。図７Ｂは動物識別番号に基づく、Rules-Based Medicineにより測定された時間に対するｐｇ／ｍＬでのインターフェロン-γのレベルを示す。
【図８】図８Ａは動物識別番号に基づく、ＥＬＩＳＡにより測定された時間に対するｐｇ／ｍＬでのインターロイキン-１βのレベルを示す。図８Ｂは動物識別番号に基づく、ＥＬＩＳＡにより測定された時間に対するｐｇ／ｍＬでのＴＮＦ-αのレベルを示す。
【図９】図９Ａは動物識別番号に基づく、ＥＬＩＳＡにより測定された時間に対するｐｇ／ｍＬでのＩＬ-６のレベルを示す。図９Ｂは動物識別番号に基づく、Rules-Based Medicineにより測定された時間に対するｐｇ／ｍＬでのＩＬ-６のレベルを示す。
【図１０】図１０は、治療前期間（ベースライン期間）、治療期間、及び休薬期間（治療後期間）の間のＴ細胞サブポピュレーションを示す。白の棒はコントロール動物（ＣＴＲ）を示し、黒の棒は高脂肪及びフルクトース補充食（ＨＦＤ）の動物を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
Ｉ．治療方法及び使用
ここに提供されるものは、被験体のインスリン感受性を増加する方法であって、抗酸化ＬＤＬ抗体を含んでなる有効量の組成物を被験体に投与することを含んでなる方法である。ここで更に提供されるものは、被験体のインスリン感受性を増加するための医薬品の製造における抗酸化ＬＤＬ抗体の使用、被験体のインスリン感受性を増加する使用のための、酸化低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）のエピトープに選択的に結合する抗体を含んでなる医薬品である。
【００１７】
方法及び使用の何れかの幾つかの実施態様では、インスリン感受性は少なくとも約５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％又は２００％の何れかで増加する。幾つかの実施態様では、インスリン感受性は約５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％又は２００％の何れかで増加する。幾つかの実施態様では、インスリン感受性は減少する。幾つかの実施態様では、インスリン感受性は少なくとも約５％、１０％、２５％、５０％、７５％ま又は９０％の何れかで減少する。幾つかの実施態様では、インスリン感受性は約５％、１０％、２５％、５０％、７５％ま又は９０％の何れかで減少する。インスリン感受性は治療開始時と比較して増加されうる。幾つかの実施態様では、インスリン抵抗性は、治療開始時と比較して低下されうる。ここで使用される場合、「治療開始時」とは、抗酸化ＬＤＬ抗体への最初の曝露時又は前の期間を意味する。幾つかの実施態様では、「治療開始時」は、抗酸化ＬＤＬ抗体前約１年、９ヶ月、６ヶ月、３ヶ月、２ヶ月、又は１ヶ月の何れかである。幾つかの実施態様では、「治療開始時」は抗酸化ＬＤＬ抗体への最初の曝露と同時発生の直前である。
【００１８】
何れかの方法及び使用の幾つかの実施態様では、インスリン感受性及び／又はインスリン耐性は、以下の試験の一又は複数を用いて試験される：正常血糖高インスリンクランプ、インスリン抑制試験（ＩＳＴ）、インスリン耐性試験（ＩＴＴ）、モデル評価に対するグルコース継続注入（ＣＩＧＭＡ）、静脈内グルコース負荷試験（ＩＶＧＴＴ）、経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）、ＨＯＭＡモデル、空腹時インスリン（Ｉ０）、グルコース／インスリン比率（Ｇ／Ｉ比率）、及び／又はインスリン感受性インデックス（ＩＳＩ）。
【００１９】
何れかの方法及び使用の幾つかの実施態様では、インスリン感受性は正常血糖高インスリンクランプにより測定され、これは低血糖を起こすこと無く増加したインスリンレベルを代償するのに必要なグルコースの量を測定する。試験の最後の３０分間のグルコース注入の速度がインスリン感受性を決定する。高いレベル（７．５ｍｇ／ｍｉｎ以上）が必要な場合、患者はインスリン感受性である。非常に低いレベル（４．０ｍｇ／ｍｉｎ以下）は、体がインスリン作用に抵抗性であることを示す。４．０及び７．５ｍｇ／ｍｉｎの間のレベルは「耐糖能障害」を示唆し得、インスリン抵抗性の初期兆候である。被験体は、治療開始時で約９ｍｇ／ｍｉｎ、８ｍｇ／ｍｉｎ、７．５ｍｇ／ｍｉｎ、７．０ｍｇ／ｍｉｎ、６ｍｇ／ｍｉｎ、５ｍｇ／ｍｉｎ、又は４ｍｇ／ｍｉｎの何れかより大きいグルコース注入速度を有しうる。幾つかの実施態様では、インスリン感受性は、抗酸化ＬＤＬ抗体への曝露後、被験体において約７．５ｍｇ／ｍｉｎ、７．０ｍｇ／ｍｉｎ、６ｍｇ／ｍｉｎ、５ｍｇ／ｍｉｎ、又は４ｍｇ／ｍｉｎの何れか未満であるグルコース注入速度により示されるように増加しうる。
【００２０】
方法及び使用の何れかの幾つかの実施態様では、インスリン感受性はインスリン抑制試験（ＩＳＴ）を使用して試験される。１５０ｍｇ／ｄｌより大きい定常状態血漿グルコース（ＳＳＰＧ）レベルである被験体がインスリン抵抗性であると考えられる。幾つかの実施態様では、被験体は治療開始時点で、約１５０ｍｇ／ｄＬ、１７５ｍｇ／ｄＬ、又は２００ｍｇ／ｄＬの何れかより大きいＳＳＰＧレベルを有する。幾つかの実施態様では、インスリン感受性は、抗酸化ＬＤＬ抗体への曝露後、被験体において約１７５ｍｇ／ｄＬ、１５０ｍｇ／ｄＬ、又は１２５ｍｇ／ｄＬのより小さいＳＳＰＧレベルにより示されるように被験体において増加される。
【００２１】
方法及び使用の何れかの幾つかの実施態様では、インスリン感受性は、ＯＧＴＴ又はＩＶＧＴＴ等のグルコース負荷試験を使用して試験される。幾つかの実施態様では、被験体は２時間の経口グルコース負荷試験後、約２００ｍｇ／ｄＬ以上の血液グルコースレベルを有する。幾つかの実施態様では、被験体は耐糖能障害（ＩＧＴ）を有する。幾つかの実施態様では、被験体は７５ｇのグルコース投与の２時間後、約１４０ｍｇ／ｄＬ以上、１５０ｍｇ／ｄＬ以上、１６０ｍｇ／ｄＬ以上、１７０ｍｇ／ｄＬ以上、１８０ｍｇ／ｄＬ以上、１９０ｍｇ／ｄＬ以上又は２００ｍｇ／ｄＬ以上の何れかの血液グルコースレベルを有する。幾つかの実施態様では、被験体は７５ｇのグルコース投与の２時間後、約１４０ｍｇ／ｄＬ、１５０ｍｇ／ｄＬ、１６０ｍｇ／ｄＬ、１７０ｍｇ／ｄＬ、１８０ｍｇ／ｄＬ、１９０ｍｇ／ｄＬ又は２００ｍｇ／ｄＬの何れかの血液グルコースレベルを有する。
【００２２】
方法及び使用の何れかの幾つかの実施態様では、グルコーストレーサーが使用される。グルコースは、安定又は放射性原子で標識されることができる。一般的に用いられるトレーサーは、３-３Ｈグルコース（放射性）、６,６ ２Ｈグルコース（安定）及び１-１３Ｃグルコース（安定）である。高インスリン血症期間の開始前、３時間のトレーサー注入はグルコース生産の基礎率を決定する。血漿トレーサー濃度は、全身インスリン刺激グルコース代謝、並びに体によるグルコースの生産（すなわち内因性グルコース生産）の算出を可能にする。
【００２３】
方法及び使用の何れかの幾つかの実施態様では、被験体はメタボリックシンドロームを有する。幾つかの実施態様では、被験体はメタボリックシンドロームを発生する危険性にある。被験体は、（ａ）男性では約１０２ｃｍ以上及び女性では約８８ｃｍ以上のの腹囲、（ｂ）約１５０ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時トリグリセリド、（ｃ）約９５ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時グルコース、及び（ｄ）高レベルの酸化ＬＤＬから成る群から選択される一又は複数の特徴を有しうる。幾つかの実施態様では、被験体は、男性に関しては約４０ｍｇ／ｄＬ未満、女性に関しては約５０ｍｇ未満のコレステロールレベルを有する。幾つかの実施態様では、被験体は、約１３０／８５以上又は約１４０／９０以上の血圧レベルを有する。幾つかの実施態様では、高レベルの酸化ＬＤＬは、０．５ｎｍｏｌ／ｍｇ、０．６ｎｍｏｌ／ｍｇ、０．７ｎｍｏｌ／ｍｇ、０．８ｎｍｏｌ／ｍｇ、０．９ｎｍｏｌ／ｍｇ、１．０ｎｍｏｌ／ｍｇのアポタンパク質に等しい又はより大きい酸化ＬＤＬの何れかのおよそである。
【００２４】
方法及び使用の何れかの幾つかの実施態様では、空腹時グルコースレベルは約９５ｍｇ／ｄＬ、１００ｍｇ／ｄＬ、１０５ｍｇ／ｄＬ、１１０ｍｇ／ｄＬ、１１５ｍｇ／ｄＬ、１２０ｍｇ／ｄＬ、１２５ｍｇ／ｄＬ又は１３０ｍｇ／ｄＬの何れかである。幾つかの実施態様では、空腹時グルコースレベルは約９５ｍｇ／ｄＬ以上、１００ｍｇ／ｄＬ以上、１０５ｍｇ／ｄＬ以上、１１０ｍｇ／ｄＬ以上、１１５ｍｇ／ｄＬ以上、１２０ｍｇ／ｄＬ以上、１２５ｍｇ／ｄＬ以上又は１３０ｍｇ以上／ｄＬ以上の何れかである。被験体は一晩絶食後、約９５ｍｇ／ｄＬ以上の血液グルコースレベルを有しうる。幾つかの実施態様では、被験体は一晩絶食後、約１２６ｍｇ／ｄＬ以上の血液グルコースレベルを有しうる。
【００２５】
方法及び使用の何れかの幾つかの実施態様では、酸化低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）のエピトープに選択的に結合する抗体を含んでなる有効量の組成物の被験体への投与は、血糖コントロールを増加する（血糖コントロールを改善する）。方法及び使用の何れかの幾つかの実施態様では、酸化低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）のエピトープに選択的に結合する抗体を含んでなる有効量の組成物の被験体への投与は、脂質異化反応及び全エネルギー消費を増加する。幾つかの実施態様では、増加は、抗体での治療前と抗体での治療後のレベルの比較により決定される。
【００２６】
方法及び使用の何れかの幾つかの実施態様では、被験体は糖尿病前症を有する。幾つかの実施態様では、被験体は糖尿病を患う。幾つかの実施態様では、糖尿病は、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病及び妊娠糖尿病からなる群から選択される。糖尿病はＩＩ型糖尿病でありうる。幾つかの実施態様では、ここに提供される方法又は使用は、糖尿病の進行の治療、防止、又は遅延において有用である。糖尿病は、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病及び妊娠糖尿病からなる群から選択されうる。幾つかの実施態様では、ここに提供される方法又は使用は、糖尿病への糖尿病前症の進行の防止又は遅延において有用である。
【００２７】
方法及び使用の何れかの幾つかの実施態様では、被験体は心臓血管疾患又は冠動脈心疾患を有する。心臓血管疾患又は冠動脈心疾患は、糖尿病に関連しうる。心臓血管疾患又は冠動脈心疾患は、インスリン抵抗性及びメタボリックシンドロームに関連しうる。幾つかの実施態様では、被験体は動脈硬化症を有する。動脈硬化症は糖尿病に関連しうる。動脈硬化症は、インスリン抵抗性及びメタボリックシンドロームに関連しうる。
方法及び使用の何れかの幾つかの実施態様では、被験体は炎症を更に有する。炎症は糖尿病に関連しうる。
【００２８】
またここに提供されるのは、被験体における炎症を低減する方法であって、抗酸化ＬＤＬ抗体を含んでなる有効量の組成物を投与すること、及び／又は被験体における炎症を低減することにおける使用のための医薬品の調整における抗酸化ＬＤＬ抗体の使用を含んでなる。幾つかの実施態様では、方法及び使用は、上記のように、被験体において炎症を低減すること及びインスリン感受性を増加することを含み、抗酸化ＬＤＬ抗体を含んでなる有効量の組成物を投与することを含んでなる。幾つかの実施態様では、炎症は糖尿病に関連する。幾つかの実施態様では、炎症は、炎症性マーカーの低減レベルによるエビデンスに従い低減される。炎症性マーカーのレベルは、約５％、１０％、２５％、５０％、７５％又は９０％の何れかで低減されうる。幾つかの実施態様では、炎症性マーカーのレベルは、約５％、１０％、２５％、５０％、７５％又は９０％の何れかより大きく低減される。炎症性マーカーは、ＦＧＦ-ベーシック、ＩＬ-１β、ＩＬ-１５、ＩＬ-８、ＩＬ-１３、ＩＬ-６、ＭＣＰ-１、ＥＮ-ＲＡＧＥ及びＴＮＦ-αから成る群から選択されうる。幾つかの実施態様では、炎症性マーカーは、ＩＬ-１β、ＩＬ-１５、ＥＮ-ＲＡＧＥ及びＴＮＦ-αから成る群から選択される。炎症又は炎症性マーカーのレベルは、抗酸化ＬＤＬ抗体での治療開始時での炎症又は炎症性マーカーのレベルと比較して低減されうる。
【００２９】
方法及び使用の何れかの幾つかの実施態様では、方法及び使用はまた一以上の活性化合物を含有し、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものである。例えば、処方において抗炎症性物質、抗糖尿病剤、及び／又は「スタチン」クラスのコレステロール降下剤を更に投与することが所望されうる。幾つかの実施態様では、方法及び使用は、第二の活性薬剤を投与することを含む。幾つかの実施態様では、方法及び使用は第二の活性薬剤を投与することを含み、第二の活性薬剤はインスリンである。インスリンは、速効作用性、短時間作用性、通常作用性、中間型作用性、又は長時間作用性インスリンである。幾つかの実施態様では、インスリンはヒューマログ、リスプロ、ノボログ、アピドラ、ヒューマリン、アスパルト、レギュラーインスリン、ＮＰＨ、レンテ、ウルトラレンテ、ランタス、グラルギン、レベミル、又はデテミルであり得及び／又は含みうる。幾つかの実施態様では、方法及び／又は使用は第二の活性薬剤を投与することを含み、第二の活性薬剤はスタチンである。スタチンは、アトルバスタチン(例えばリピトール又はトルバスト)、セリバスタチン(例えばリポベイ又はバイコール)、フルバスタチン(例えばレスコール又はレスコール)、ロバスタチン(例えばメバコ−ル、アルトコール、又はアルトプレブ)メバスタチン、ピタバスタチン(例えばリバロ又はピタバ)、プラバスタチン(例えばプラバコール、セレクチン、又はリポスタット)ロスバスタチン(例えばクレストール)、シンバスタチン(例えばゾコール又はリペックス)、バイトリン、アドビコール、ベシレートカデュエット又はシムコールであり得及び含みうる。
【００３０】
方法及び使用の何れかの幾つかの実施態様では、抗酸化ＬＤＬ抗体は、静脈内投与等、例えば、ボーラスとして又は期間にわたる連続的注入によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、脳脊髄内、皮下、関節内、腱滑液鞘内、くも膜下腔内、経口、局所的、又は吸入経路によって、当技術分野で周知の方法及び経路により投与されることができる。ここに記載の方法及び使用が一以上の活性剤を含む場合、方法及び使用は、一又は複数の他の（すなわち更なる）活性剤と組み合わせた抗酸化ＬＤＬ抗体の投与を含みうる。一又は複数の他の活性剤「と組み合わせた」投与とは、同時（同時的）、何れかの順での、及び順次何れかの順での連続的投与を含む。組合せ投与は、別個の製剤又は単一の薬学的製剤を用いた同時投与、任意の順での連続的投与、及び任意の順での順次投与を含み、好ましくは、両（又は全）活性剤がそれらの生物学的活性を同時に働かせる期間が存在する。好ましくはこれらの組合せ治療は、結果として相乗的治療効果となる。
【００３１】
ここで使用される場合、「治療」又は「治療する」とは、臨床成績を含む有益な又は所望の結果を得るためのアプローチである。本発明の目的に関しては、有益な又は所望の結果は、限定するものではないが、以下の一又は複数を含む：疾患から生じる一又は複数の症状を低減する、疾患の程度を低減する、疾患を安定化する（例えば、疾患の悪化を防止又は遅延する）、疾患の進行を遅延又は遅くする、疾患状態を寛解する、疾患の治療に必要な一又は複数の他の薬物療法の用量を低減する、及び／又は生活の質を増加することを含む。
【００３２】
ここで使用される場合、「遅延する」とは、疾患の発達を延期する、妨げる、遅くする、安定化する及び／又は先送りにすることを意味する。この遅延は病歴及び／又は治療される個人に依存し様々な長さの時間でありうる。
何れかの方法及び使用の幾つかの実施態様では、ここに記載の治療の方法は、疾病の一又は複数の症状を寛解する（例えば、発生を低減する、期間を低減する、重症度を低減又は和らげる）。
「被験体」はここでは哺乳動物である。哺乳動物は、限定するものではないが、ヒト、家畜、スポーツ動物、齧歯類、霊長類及び特定のペットを含む。幾つかの実施態様では、哺乳動物はヒトである。
「症状」は、何れかの罹患状態、又は構造、機能、又は感覚における正常からの逸脱であり、被験体により経験される。
【００３３】
表現「有効量」とは、インスリン感受性を増加する及び／又は炎症（糖尿病に関連する炎症等）を低減するのに効果的な抗体（又は他の薬剤）の量を意味する。このような有効量は一般的に、インスリン耐性及び／又は炎症の兆候、症状又は他の指標における改善となる。
ここでの値又はパラメータの「約」という言及は、その値又はパラメータ自体に対する変動を含む（また記述）。例えば、「約Ｘ」という記載は「Ｘ」の記述を含む。
ここで使用される場合及び添付の特許請求の範囲では、単数形「ａ」、「又は（ｏｒ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに他の意味を示していない限り、複数の参照対象を含む。ここに記載された発明の態様及び変形例は、態様及び変形例「からなる」及び／又は「から本質的になる」ことを含む。
【００３４】
ＩＩ．抗体
ここに提供されるものは、インスリン感受性を増加する方法及び／又は使用の何れかにおける使用のための抗酸化ＬＤＬ抗体である。幾つかの実施態様では、抗酸化ＬＤＬ抗体は酸化ＬＤＬに結合する。
酸化ＬＤＬは、抗体により認識されることができる幾つかの異なるエピトープを有する。ＬＤＬは広範な様々な異なる化学反応により酸化的及び分解変化を受けうる。これらは、酸素、酵素（例えばミエロペルオキシダーゼ）、金属イオン（例えばＦｅ２＋及びＣｕ２＋）、フリーラジカル及び他のタイプの化学的ストレスの活性により引き起こされる様々なタイプの修飾により生じる反応を含む。
【００３５】
いくつかの酸化エピトープはＬＤＬのタンパク質部分にみられるが(Yang et al., J. Lipid Res. 42(11): 1891-6 (2001))、他はＬＤＬ粒子中に存在する脂質の変更である。多くの酸化的に変更し生物学的に活性なリン脂質が形成されうる(Heery et al., J. Clin. Invest. 96(5): 2322-30 (1995)；Friedman et al., J. Biol. Chem. 277(9): 7010-20 (2002)；Watson et al., J. Biol. Chem. 274(35): 34787-98 (1999))。多価不飽和脂肪酸は、脂肪酸ヒドロペルオキシドに変換され、すぐに非常に反応性の高い生成物、例えばマロンジアルデヒドおよび４-ヒドロキシノネナールを形成する(Smiley et al., J. Biol. Chem. 266(17): 11104-10 (1991))。この種の中間生成物は、ＬＤＬのＡｐｏＢ-１００タンパク質のリジンを有する共有結合性シッフ塩基およびマイケルタイプの生成物が形成される。また、反応性のアルデヒドは、ホスファチジルコリン部分のエステル結合により付着される脂肪酸にみられうる(Witztum & Berliner, Curr. Opin. Lipidol. 9(5): 441-8 (1998))。ｓｎ−２酸化アラキドン酸の炭素にアルデヒドを得、その結果ＰＯＶＰＣ(ｌ-パルミトイル-２(５-オキソ)バレロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン)が生じる最終に近い生成物である、リン脂質ｌ−パルミトイル−２−アラキドノイルｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン(ＰＡＰＣ)が頻繁にみられる。ＰＯＶＰＣはリジンと反応し、更に、アミンを含有するリン脂質、例えばホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルセリンと反応しうる。最終的に、様々な酸化脂質-タンパク質及び酸化脂質-脂質付加生成物が生じる。これらの酸化のいくつかは、酵素、例えば分泌フォスフォリパーゼによって制御される(Leitinger et al., Arterioscler Thromb Vasc. Biol. 19(5): 1291-8 (1999))。ニトロ化およびＨＯＣＬの付加などの他の酵素が起こす変化は、ミエロペルオキシダーゼによって行われる(Carr et al., Arterioscler Thromb Vasc. Biol. 20(7): 1716-23 (2000))。すべてのネオエピトープは、免疫原性で生物学的に活性であると考えられる(McIntyre et al., J. Biol. Chem. 274(36): 25189-92 (1999))。また、ホスホリルコリンおよびタンパク質の断片のように、ＬＤＬ粒子の酸化修飾の結果であり、それ自身酸化されたものでない潜在的エピトープは、酸化ＬＤＬ粒子の特徴であり、このようなエピトープは免疫療法の標的になりうる。
【００３６】
幾つかの実施態様では、抗酸化ＬＤＬ抗体は、酸化ＡｐｏＢ-１００（例えば、ＮＰ_０００３７５．２）のエピトープを含んでなる酸化ＬＤＬのエピトープに結合する。幾つかの実施態様では、抗酸化ＬＤＬ抗体は、表１のアミノ酸配列を含んでなる酸化ＡｐｏＢ-１００のエピトープに結合する。幾つかの実施態様では、抗酸化ＬＤＬ抗体は、表１の配列から成るペプチドに結合することが可能である。幾つかの実施態様では、抗酸化ＬＤＬ抗体は、配列番号：１−３８から成る群から選択される酸化ＡｐｏＢ-１００のエピトープに結合することが可能である。
【００３７】
ＷＯ２００２／０８０９５４、ＷＯ２００４／０３０６０７、Schiopu et al., Circulation 110(14):2047-52 (2004)、及びＷＯ２００７／０２５７８１に記載の各抗体は、本発明に関係することにおいて使用されうる抗体の例であり、出典明記により本明細書中に援用する。
2013503195.tif 000003
2013503195.tif 000004
【００３８】
上記表１に記載のように、ペプチドは共通の特徴を有する７のカテゴリにグループ化できる：
カテゴリーＡ：ＭＤＡ修飾ペプチドに対する高レベルのＩｇＧ抗体を産生する断片（ｎ＝３）。
カテゴリーＢ：高レベルのＩｇＭ抗体を産生するが、天然ペプチドとＭＤＡ修飾ペプチドとの間の差が無い断片（ｎ＝９）。
カテゴリーＣ：高レベルのＩｇＧ抗体を産生するが、天然ペプチドとＭＤＡ修飾ペプチドとの間に１０の差が無い断片（ｎ＝２）。
カテゴリーＤ：ＭＤＡ修飾ペプチドに対する高レベルのＩｇＧ抗体を産生し、ＡＨＰプールと比較してＮＨＰプールにおいて少なくとも２倍の抗体を産生する断片（ｎ＝５）。
カテゴリーＥ：ＭＤＡ修飾ペプチドに対する高レベルのＩｇＭ抗体を産生し、ＡＨＰプールと比較してＮＨＰプールにおいて少なくとも２倍の抗体を産生する断片（ｎ＝１１）。
カテゴリーＦ：高レベルのＩｇＧ抗体を産生するが、インタクトのペプチドとＭＤＡ修飾ペプチドとの間に差が無く、しかしＮＨＰプールと比較してＡＨＰプールにおいて少なくとも２倍の抗体を産生する断片（ｎ＝７）。
カテゴリーＧ：ＩｇＧ又はＩｇＭの何れのレベルの抗体を生産しない断片。
【００３９】
幾つかの実施態様では、抗酸化ＬＤＬ抗体は、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７から成る群から選択される酸化ＡｐｏＢ-１００のエピトープと結合することが可能である（例えば、結合する）。幾つかの実施態様では、抗酸化ＬＤＬ抗体は、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１６、及び配列番号：３２から成る群から選択される酸化ＡｐｏＢ-１００のエピトープと結合することが可能である。幾つかの実施態様では、抗酸化ＬＤＬ抗体は、配列番号：３２（ＩＥＩＧＬＥＧＫＧＦＥＰＴＬＥＡＬＦＧＫ）と結合することが可能である。
【００４０】
ＡｐｏＢ-１００のペプチド断片は、タンパク質化学技術を使用して、例えば部分タンパク質分解（内因性溶解又は外因性溶解のいずれか）あるいはデノボ合成によって作製されうることが理解されている。代替的に、変異体が組換え技術によって作製されて良い。核酸のクローニング、操作、修飾、及び発現、並びに発現したタンパク質の精製の適切な技術は当該技術分野において良く知られており、例えばSambrook et al (2001) "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", 3rd edition, Sambrook et al (eds), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USAに記載されており、出典明記により本明細書中に援用する。
【００４１】
「ペプチド」は、アミノ酸残基がペプチド（-ＣＯ-ＮＨ-）結合によって結合している分子だけでなく、ペプチド結合が反転した分子も含む。その様なレトロ-インベルソペプチド摸倣体（retro-inverso peptidemimetic）は、例えば、Meziere et al., J. Immunol. 159(7):3230-7 (1997)に開示されたもののような当該技術分野において既知の方法を用いて作製されて良い。この手法は、主鎖に関するが、側鎖の配向に関するものではない変化を有する擬ペプチドの作製を含む。少なくともＭＨＣクラスＩＩ及びＴヘルパー細胞応答について、これらの擬ペプチドは有用であることが示されている。レトロインベルソペプチドは、ＣＯ-ＮＨペプチド結合の代わりにＮＨ-ＣＯ結合を含有し、タンパク質溶解に対するより良好な耐性を有する。同様に、アミノ酸残基のＣα原子の間の間隔を保持する適当なリンカー部分が使用されることを条件としてペプチド結合が省かれてもよい。幾つかの実施態様では、リンカー部分は、ペプチド結合と実質的に同一の電荷分布及び実質的に同一の平面性を有する。ペプチドは、外因性タンパク質溶解性の消化に対する感受性の低減を支援するために、Ｎ又はＣ末端において簡便にブロックされて良いことも理解される。
【００４２】
幾つかの実施態様では、酸化ＬＤＬ抗体は表１に挙げられるＡｐｏＢ-１００のペプチドエピトープの断片（配列番号：１−３８）に結合する。表１に挙げられる「ＡｐｏＢ-１００のペプチドエピトープの断片」（配列番号：１−３８）は、表１に挙げられる任意の配列（配列番号：１−３８）の少なくとも６の連続アミノ酸から成る。幾つかの実施態様では、ＡｐｏＢ-１００のペプチドエピトープの断片は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８又は１９の何れかの、任意の配列の連続アミノ酸を含みうる。
【００４３】
幾つかの実施態様では、抗酸化ＬＤＬ抗体は、例えば表１に挙げられたもの等のＬＤＬの酸化エピトープに対して調整されてもよい。ペプチドは、ＬＤＬの酸化の間生じうる異なるアミノ酸を模倣するために、例えば鉄、酸素、銅、ミエロペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、次亜塩素酸等の様々な薬剤に曝露することによって、又はマロンデアルデヒド（malone dealdehyde (MDA)）修飾によって酸化されてもよい。あるいは、当該技術分野で知られる他の方法が、ＬＤＬのエピトープを酸化するために採用されうる。
【００４４】
抗体は、当業者にとって明らかであろう多くの方法において特徴付けられることができる。これらは、ＥＬＩＳＡ等の技術によるそれらの濃度の、及びＳＤＳ-ＰＡＧＥによる抗体純度の物理的測定を含む。加えて、ポリペチドの有効性は、酸化ＬＤＬへの分子の結合を、溶液又は固相系において、例えばＥＬＩＳＡ、表面プラスモン共鳴（例えばＢＩＡｃｏｒｅ）又は免疫蛍光測定等で検出することによって決定されることができる。幾つかの実施態様では、抗酸化ＬＤＬ抗体は、天然及び／又は非酸化ＬＤＬより大きい親和性で酸化ＬＤＬに結合する（すなわち、酸化ＬＤＬのエピトープに選択的に結合する）。幾つかの実施態様では、抗酸化ＬＤＬ抗体は、非酸化ＬＤＬに対するより、少なくとも約１．５、２、５、１０又は５０倍の何れかより大きい親和性でＬＤＬの酸化エピトープに結合する。幾つかの実施態様では、抗酸化ＬＤＬ抗体分子は、非酸化ＬＤＬに対するより、少なくとも約  １００、１，０００又は１０，０００より大きい親和性で酸化エピトープに結合する。このような結合は、当該技術分野でよく知られる方法により決定され得、例えば一Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム等である。幾つかの実施態様では、抗酸化ＬＤＬ抗体は、酸化ＬＤＬのエピトープと結合するが、天然／非酸化ＬＤＬとは結合しない。このような酸化及び天然ＬＤＬエピトープは、例えばＷＯ０２／０８０９５４に記載の方法によって決定されることができる。
【００４５】
幾つかの実施態様では、抗体は少なくとも約１０−４Ｍ、１０−６Ｍ又は１０−８Ｍ以上の何れかのそれらの標的エピトープに対する親和性を有する。
幾つかの実施態様では、抗酸化ＬＤＬ抗体は炎症を更に低減する。幾つかの実施態様では、炎症は糖尿病に関連する。幾つかの実施態様では、抗酸化ＬＤＬ抗体は炎症性マーカーのレベルを更に低減する。幾つかの実施態様では、炎症性マーカーは、ＩＬ-１β、ＩＬ-１５、ＩＬ-８、ＩＬ-６、ＭＣＰ-１、ＥＮ-ＲＡＧＥ及びＴＮＦ-αからなる群から選択される。幾つかの実施態様では、炎症性マーカーは、ＩＬ-１β、ＩＬ-１５、ＥＮ-ＲＡＧＥ及びＴＮＦ-αからなる群から選択される。幾つかの実施態様では、炎症及び炎症性マーカーのレベルは、抗酸化ＬＤＬ抗体を用いた治療前の炎症及び炎症性マーカーのレベルと比較して低減される。
【００４６】
（ｉ）定義
ここで、用語「抗体」は最も広い意味において使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成される多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及びそれらが所望の生物学的活性を示す限り抗体断片を包含する。用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）はここでの抗体と互換的に使用される。
【００４７】
抗体は全て免疫グロブリン折り畳みに基づいて様々な構造を有する天然に生じる免疫グロブリン分子である。例えば、ＩｇＧ抗体は機能的抗体を形成するためにジスルフィド結合している２つの「重」鎖と２つの「軽」鎖を持つ。各重鎖と軽鎖自体は「定常」（Ｃ）及び「可変」（Ｖ）領域を有する。Ｖ領域は抗体の抗原結合特異性を決定する一方、Ｃ領域は免疫エフェクターとの非抗原特異的相互作用において構造的サポートを与え機能する。抗体又は抗体の抗原結合断片の抗原結合特異性は、抗体又はその断片が特定の抗原に特異的に結合する能力である。  
【００４８】
抗体の抗原結合特異性は、Ｖ領域の構造的特性によって決定される。可変性は可変ドメインの１１０アミノ酸スパンに均一に分布はしていない。代わりに、Ｖ領域は、それぞれ９−１２アミノ酸長である「高頻度可変領域」と呼ばれる極端に可変性の短い領域によって分離された１５−３０のアミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲｓ）と呼ばれる相対的に不変の伸展からなる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ４つのＦＲ領域を含み、多くの場合、βシート構造に連結し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する３つのＣＤＲによって連結されたβシート配置になっている。各鎖の高頻度可変領域はＦＲ領域に極めて近接して保持されており、他の鎖の高頻度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に関与している（Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）。定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合には直接には関与しないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。
【００４９】
各Ｖ領域は典型的には３つの相補性決定領域（それぞれが「高頻度可変ループ」を含む「ＣＤＲ」）と４つのフレームワーク領域を含む。特定の所望の抗原に対して実質的な親和性で結合するのに必要とされる最少の構造単位である抗原結合部位は、従って３つのＣＤＲと、適切な高次構造でＣＤＲを保持し提示するためにそれらの間に散在した少なくとも３つ、好ましくは４つのフレームワーク領域を含むであろう。古典的な４本鎖抗体、例えばＡＰ３３は、ＶＨ及びＶＬドメインが協働して定める抗原結合部位を有している。ある種の抗体、例えばラクダ及びサメ抗体は、軽鎖を欠き、重鎖のみによって形成される結合部位に依存する。結合部位が重鎖又は軽差によって形成され、ＶＨとＶＬの間に協働がない単一ドメイン操作免疫グロブリンを調製することができる。
【００５０】
本明細書と特許請求の範囲を通して、特に明記しない限りは、免疫グロブリン重鎖の定常ドメイン中の残基の番号付けは、ここに出典を明示して援用するKabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)のＥＵインデックスのものである。「KabatのＥＵインデックス」とはヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付けを意味する。配列又は他の番号付けシステムを特に示さない限りは、Ｖ領域内の残基はKabat番号付けに従って番号付けをする。
【００５１】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。それは、軽鎖及び重鎖可変ドメインの両方の高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を連結し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する３つの高頻度可変領域により連結されたβシート配置を主に採る４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖の高頻度可変領域は、ＦＲによって近接して保持され、他の鎖の高頻度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabat等, Sequence of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接には関連していないが、様々なエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害活性(ＡＤＣＣ)における抗体の関与を示す。
【００５２】
ここで使用される場合「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合性を生じる抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば、ＶＬの残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）辺り、ＶＨの残基３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３）辺り(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))及び／又は「高頻度可変ループ」からの残基（例えば、ＶＬ，の残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）及び９１−９６（Ｌ３）と、ＶＨの残基２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３）(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）を含みうる。
【００５３】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基はここで定義した高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ')２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理は２つの抗原結合部位を持つＦ（ａｂ’）２  断片を生じ、尚、抗原と交差結合することができる。
【００５４】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。各可変ドメインの３つの高頻度可変領域が相互に作用してＶＨ-ＶＬ二量体表面に抗原結合部位を定めるのはこの配置においてである。集合的に、６つの高頻度可変領域が抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つの高頻度可変領域のみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
【００５５】
また、Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常ドメイン(ＣＨ１)を含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域の一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に２、３の残基が付加されている点で、Ｆａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’-ＳＨはここでＦａｂ’の名称であり、定常ドメインのシステイン残基(一又は複数)が少なくとも一の遊離チオール基を持つ。Ｆ(ａｂ’)２抗体断片は、最初はＦａｂ’断片の対として生産され、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)およびラムダ(λ)と称される明らかに異なる２つのうちの一方に割り当てられる。
【００５６】
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体には異なるクラスが割り当てられる。インタクトな抗体には５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、更にこれらの幾つかは、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２等のサブクラス(アイソタイプ)に分かれる。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られている。
【００５７】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。幾つかの実施態様では、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照。
【００５８】
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を意味し、その断片は同一のポリペプチド鎖（ＶＨ - ＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成が不可能なリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディは、例えば、EP 404,097; WO 93/11161; and Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により詳細に記載されている。
【００５９】
ここで使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、一般に少量で存在しうるモノクローナル抗体の生産中に生じうる可能な変異体を除いて同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物に対して、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが他の免疫グロブリンによって汚染されていない点で有利である。「モノクローナル」との修飾詞は、実質的に均一な抗体集団から得られているという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature 256, 495 (1975)により記載されたハイブリドーマ法によって作製することができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作製することができる(例えば、米国特許第４８１６５６７号を参照)。また「モノクローナル抗体」は、例えばClackson et al., Nature 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００６０】
ここでのモノクローナル抗体は、特に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来の又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応配列に一致するか又は類似するが、鎖の残りは、他の種由来の又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、並びにそれらが所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片における対応配列に一致するか又は類似する「キメラ」抗体(免疫グロブリン)を含む(U.S. Patent No. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。ここで対象とするキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、アカゲザル又はカニクイザルなどの旧世界サル）由来の可変ドメイン抗原結合配列とヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を含む(米国特許第５６９３７８０号)。
【００６１】
非ヒト(例えばマウス)の抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)からの高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。幾つかの場合では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲが、上述のＦＲ置換を除いて、ヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも一で、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。また、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。更なる詳細については、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。
【００６２】
ここでの目的に関して、「インタクトの抗体」は重及び軽可変ドメイン並びにＦｃ領域を含んでなるものである。
【００６３】
「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５０,０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖内ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン（ＶＨ）を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を、他端に定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
【００６４】
「ネイキッド抗体」とは、細胞傷害性部分又は放射標識等の異種性分子にコンジュゲートされていない(ここで定義される)抗体である。
【００６５】
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、抗体の研究、診断又は治療的な使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。ある実施態様では、タンパク質は、(１)例えばローリー法で測定した場合９５重量％を超える抗体、ある実施態様では９９重量％を超えるまで、(２)例えばスピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分なほど、あるいは、(３)例えばクーマシーブルーあるいは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一になるまで十分なほど精製される。抗体の自然環境の少なくとも一の成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツでの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一の精製工程により調製される。ここに記載の抗体又は抗体断片は何れの程度にも単離又は精製されてもよい。
【００６６】
「精製された」とは、抗体又は抗体断片の純度が増加し、その天然の環境で存在するよりもより純粋な形態で存在するようになった、及び／又は最初に合成された及び／又は実験室条件下で増幅されたことを意味する。純度は相対的な用語であり、必ずしも絶対純度を意味するものではない。
【００６７】
幾つかの実施態様では、抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害活性；Ｆｃ受容体結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害活性(ＡＤＣＣ)；貪食作用；細胞表面受容体のダウンレギュレーションが含まれる。
【００６８】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性」及び「ＡＤＣＣ」は、細胞媒介反応を称し、この反応において、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）を発現している非特異的細胞傷害細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ)が、標的細胞に結合した抗体を認識してその結果、標的細胞の溶解を引き起こす。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞うち、ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ravetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) の464ページの表３に要約されている。関心ある分子のADCC活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号又は同５，８２１，３３７号に記述されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなアッセイにおいて有用なエフェクター細胞には、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）が含まれる。代わりとして、もしくは付加的に、関心ある分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynesら, PNAS (USA) 95:652-656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価してもよい。
【００６９】
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。幾つかの実施態様では、その細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例には、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞及び好中球が含まれるが、ＰＢＭＣとＮＫ細胞が好適である。
【００７０】
「Ｆｃ受容体」もしくは「ＦｃＲ」なる用語は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載するために使用される。好適なＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）と結合するもので、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、これらの受容体の対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされた形態のものも含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性型受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害型受容体」）が含まれ、主としてその細胞質ドメインは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型受容体ＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫受容体活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motif ;ITAM)を含んでいる。阻害型受容体ＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫受容体阻害性モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif ;ITIM)を含んでいる(Daeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)を参照)。ＦｃＲに関しては、 Ravetch及びKinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-92 (1991); Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994); 及びde Haasら, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に総説されている。他のＦｃＲ、ここでは、将来的に同定されるものも含めて、「ＦｃＲ」という言葉によって包含される。また、前記言葉は、母性ＩｇＧが胎児に受け継がれる要因となっている新生児性受容体「ＦｃＲｎ」(Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994))も含まれる。
【００７１】
「補体依存性細胞傷害性」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解する分子の能力を称する。補体活性化経路は補体系（Ｃｌｑ）の第１成分が同族抗原と複合した分子(例えば抗体)に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施されてもよい。
【００７２】
（ｉｉ）ポリクローナル抗体
幾つかの実施態様では、抗酸化ＬＤＬ抗体はポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注射することにより動物に産生される（関連抗原の例としてＰＣＴ／ＧＢ２００６／０００９８７を参照、出典明記によりその全体を本明細書中に援用する）。免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターに関連する抗原を、二官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基によるコンジュゲート)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基による）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲとＲ１が異なったアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲによりコンジュゲートさせることが有用である。
【００７３】
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ（それぞれウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫化する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。数日ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物は、同じ抗原のコンジュゲートであるが、異なったタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なった架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートで追加免疫する。コンジュゲートはまたタンパク融合として組換え細胞培養中で調製することもできる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために適切に使用される。
【００７４】
（ｉｉｉ）モノクローナル抗体
幾つかの実施態様では、抗酸化ＬＤＬ抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、一般に少量で存在しうるモノクローナル抗体の生産中に生じうる可能な変異体を除いて同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。よって、「モノクローナル」との修飾詞は、別個の又はポリクローナル抗体の混合物ではない抗体の特性を示すものである。
例えば、モノクローナル抗体は最初にKohler等, Nature 256, 495 (1975)により記載されたハイブリドーマ法によって作製することができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作製することができる(例えば、米国特許第４８１６５６７号を参照)。
【００７５】
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記したようにして免疫し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫してもよい。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986))。
【００７６】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培養培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠失するならば、ハイブリドーマのための培養培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有するであろう(HAT培地)。
【００７７】
幾つかの実施態様では、骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの生産を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である細胞である。これらの中で、幾つかの実施態様では、好ましい骨髄腫細胞系は、マウス骨髄腫系、例えば、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USAから入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及びAmerican Type Culture Collection, Rockville, Maryland USAから入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されたものである。ヒト骨髄腫及びマウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞系もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために記載されている(Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
【００７８】
ハイブリドーマ細胞が生育している培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。幾つかの実施態様では、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）によって測定する。
【００７９】
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson et al., Anal. Biochem. 107:220 (1980)のスキャッチャード分析法によって測定することができる。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培養培地には、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地が包含される。加えて、該ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
【００８０】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような常套的な免疫グロブリン精製法により、培養培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
【００８１】
モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、常法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に分離され配列決定される。幾つかの実施態様では、ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源である。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、免疫グロブリンタンパク質を産生等しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中にトランスフェクトし、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成をなすことができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現に関する概説論文には、Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol. 5:256-262 (1993) and Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)が含まれる。
【００８２】
さらなる実施態様では、抗体又は抗体断片は、McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから単離することができる。Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の単離を記述している。続く刊行物は、鎖シャフリングによる高親和性（ｎＭ範囲)のヒト抗体の生産(Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992))、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993))を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の単離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する実行可能な別法である。
【００８３】
ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列を、相同的マウス配列に代えて置換することにより(米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison等, Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることで修飾できる。
典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインに置換され、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【００８４】
幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、ＩＥＩＡ８、ＩＥＩ-Ｇ８、ＩＥＩ-Ｄ８、ＫＴＴ-Ｄ６、１-Ｂ１２、１-Ｃ０７、１-Ｃ１２、１-Ｇ１０、２-Ｆ０７、２-Ｆ０９、４-Ａ０２、ＩＥＩ-Ｅ３、２Ｄ０３、ＬＤＯ-Ｄ４、及び／又はＫＴＴ-Ｂ８から一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、ＩＥＩ-Ｇ８、ＩＥＩ-Ｄ８、ＩＥＩ-Ｅ３、２Ｄ０３、ＬＤＯ-Ｄ４、及び／又はＫＴＴ-Ｂ８から一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。
【００８５】
幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、配列番号：６４、配列番号：６８、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：８０、配列番号：８４、配列番号：８８、配列番号：９２、配列番号：９６、配列番号：１００、配列番号：１０４、配列番号：１０８、配列番号：１１２、配列番号：１１６、配列番号：１２０、配列番号：１２４、配列番号：６６、配列番号：７０、配列番号：７４、配列番号：７８、配列番号：８２、配列番号：８６、配列番号：９０、配列番号：９４、配列番号：９８、配列番号：１０２、配列番号：１０６、配列番号：１１０、配列番号：１１４、配列番号：１１８、配列番号：１２２、及び配列番号：１２６から成る群から選択される配列から一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、ＷＯ２００４／０３０６０７（出典明記によりその全体を本明細書中に援用する）の図３に記載の抗体の一又は複数のＶＨ及び／又はＶＬ配列由来の一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、ＷＯ２００７／０２５７８１（出典明記によりその全体を本明細書中に援用する）の表２の抗体の一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。
【００８６】
幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、ＣＳＧＳＮＴＮＩＧＫＮＹＶＳ（配列番号：３９）、ＡＮＳＮＲＰＳ（配列番号：４０）、ＣＡＳＷＤＡＳＬＮＧＷＶ（配列番号：４１）、ＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：４２）、ＳＳＩＳＶＧＧＨＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：４３）、及びＡＲＩＲＶＧＰＳＧＧＡＦＤＹ（配列番号：４４）から成る群から選択される一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＮＴＮＩＧＫＮＹＶＳ（配列番号：３９）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＡＮＳＮＲＰＳ（配列番号：４０）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＳＷＤＡＳＬＮＧＷＶ（配列番号：４１）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、（ｉ）配列ＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：４２）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳＩＳＶＧＧＨＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：４３）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＲＩＲＶＧＰＳＧＧＡＦＤＹ（配列番号：４４）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＮＴＮＩＧＫＮＹＶＳ（配列番号：３９）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＡＮＳＮＲＰＳ（配列番号：４０）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＳＷＤＡＳＬＮＧＷＶ（配列番号：４１）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメイン、及び（ｉ）配列ＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：４２）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳＩＳＶＧＧＨＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：４３）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＲＩＲＶＧＰＳＧＧＡＦＤＹ（配列番号：４４）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。
【００８７】
幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＡＶＮ（配列番号：４５）、ＧＮＤＲＲＰＳ（配列番号：４６）、ＣＱＴＷＧＴＧＲＧＶ（配列番号：４７）、ＦＳＤＹＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：４８）、ＳＧＶＳＷＮＧＳＲＴＨＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：４９）、及びＡＲＡＡＲＹＳＹＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号：５０）から成る群から選択される一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＡＶＮ（配列番号：４５）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＧＮＤＲＲＰＳ（配列番号：４６）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＱＴＷＧＴＧＲＧＶ（配列番号：４７）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、（ｉ）配列ＦＳＤＹＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：４８）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＧＶＳＷＮＧＳＲＴＨＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：４９）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＲＡＡＲＹＳＹＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号：５０）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＡＶＮ（配列番号：４５）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＧＮＤＲＲＰＳ（配列番号：４６）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＱＴＷＧＴＧＲＧＶ（配列番号：４７）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメイン、及び（ｉ）配列ＦＳＤＹＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：４８）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＧＶＳＷＮＧＳＲＴＨＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：４９）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＲＡＡＲＹＳＹＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号：５０）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する
【００８８】
幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、ＣＳＧＳＳＳＳＩＧＮＮＦＶＳ（配列番号：５１）、ＤＮＮＫＲＰＳ（配列番号：５２）、ＣＡＡＷＤＤＳＬＮＧＷＶ（配列番号：５３）、ＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：５４）、ＳＳＩＳＴＳＳＮＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：５５）、及びＡＲＶＫＫＹＳＳＧＷＹＳＮＹＡＦＤＩ（配列番号：５６）から成る群から選択される一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＳＩＧＮＮＦＶＳ（配列番号：５１）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＤＮＮＫＲＰＳ（配列番号：５２）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＡＷＤＤＳＬＮＧＷＶ（配列番号：５３）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、（ｉ）配列ＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：５４）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳＩＳＴＳＳＮＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：５５）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＲＶＫＫＹＳＳＧＷＹＳＮＹＡＦＤＩ（配列番号：５６）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＳＩＧＮＮＦＶＳ（配列番号：５１）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＤＮＮＫＲＰＳ（配列番号：５２）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＡＷＤＤＳＬＮＧＷＶ（配列番号：５３）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメイン、及び（ｉ）配列ＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：５４）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳＩＳＴＳＳＮＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：５５）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＲＶＫＫＹＳＳＧＷＹＳＮＹＡＦＤＩ（配列番号：５６）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。
【００８９】
幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＧＥＳＶＳ（配列番号：５７）、ＳＮＮＱＲＰＳ（配列番号：５８）、ＣＡＡＷＤＤＳＬＮＧＷＶ（配列番号：５９）、ＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：６０）、ＳＳＩＳＳＳＧＲＦＩＹＹＡＤＳＭＫＧＲ（配列番号：６１）、及びＴＲＬＲＲＧＳＹＦＷＡＦＤＩ（配列番号：６２）から成る群から選択される一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＧＥＳＶＳ（配列番号：５７）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＳＮＮＱＲＰＳ（配列番号：５８）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＡＷＤＤＳＬＮＧＷＶ（配列番号：５９）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、（ｉ）配列ＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：６０）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳＩＳＳＳＧＲＦＩＹＹＡＤＳＭＫＧＲ（配列番号：６１）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＴＲＬＲＲＧＳＹＦＷＡＦＤＩ（配列番号：６２）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＧＥＳＶＳ（配列番号：５７）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＳＮＮＱＲＰＳ（配列番号：５８）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＡＷＤＤＳＬＮＧＷＶ（配列番号：５９）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメイン、及び（ｉ）配列ＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：６０）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳＩＳＳＳＧＲＦＩＹＹＡＤＳＭＫＧＲ（配列番号：６１）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＴＲＬＲＲＧＳＹＦＷＡＦＤＩ（配列番号：６２）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。
【００９０】
幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ（配列番号：１２７）、ＳＮＮＱＲＰＳ（配列番号：１２８）、ＣＡＡＷＤＤＳＬＳＨＷＬ（配列番号：１２９）、ＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＶＰＧ（配列番号：１３０）、ＳＴＬＧＧＳＧＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：１３１）、及びＡＫＬＧＧＲＳＲＹＧＲＷＰＲＱＦＤＹ（配列番号：１３２）から成る群から選択される一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ（配列番号：１２７）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＳＮＮＱＲＰＳ（配列番号：１２８）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＡＷＤＤＳＬＳＨＷＬ（配列番号：１２９）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、（ｉ）配列ＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＶＰＧ（配列番号：１３０）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＴＬＧＧＳＧＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：１３１）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＫＬＧＧＲＳＲＹＧＲＷＰＲＱＦＤＹ（配列番号：１３２）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ（配列番号：１２７）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＳＮＮＱＲＰＳ（配列番号：１２８）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＡＷＤＤＳＬＳＨＷＬ（配列番号：１２９）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメイン、及び（ｉ）配列ＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＶＰＧ（配列番号：１３０）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＴＬＧＧＳＧＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：１３１）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＫＬＧＧＲＳＲＹＧＲＷＰＲＱＦＤＹ（配列番号：１３２）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。
【００９１】
幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＳ（配列番号：１３３）、ＧＮＹＮＲＰＳ（配列番号：１３４）、ＣＡＡＷＤＤＳＬＳＧＷＶ（配列番号：１３５）、ＦＳＳＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：１３６）、ＳＳＩＳＧＳＧＲＲＴＹＹＡＤＳＶＱＧＲ（配列番号：１３７）、及びＡＲＬＶＳＹＧＳＧＳＦＧＦＤＹ（配列番号：１３８）から成る群から選択される一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＳ（配列番号：１３３）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＧＮＹＮＲＰＳ（配列番号：１３４）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＡＷＤＤＳＬＳＧＷＶ（配列番号：１３５）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、（ｉ）配列ＦＳＳＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：１３６）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳＩＳＧＳＧＲＲＴＹＹＡＤＳＶＱＧＲ（配列番号：１３７）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＲＬＶＳＹＧＳＧＳＦＧＦＤＹ（配列番号：１３８）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＳ（配列番号：１３３）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＧＮＹＮＲＰＳ（配列番号：１３４）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＡＷＤＤＳＬＳＧＷＶ（配列番号：１３５）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメイン（ｉ）配列ＦＳＳＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：１３６）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳＩＳＧＳＧＲＲＴＹＹＡＤＳＶＱＧＲ（配列番号：１３７）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＲＬＶＳＹＧＳＧＳＦＧＦＤＹ（配列番号：１３８）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。
【００９２】
幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、ＣＳＧＲＳＳＮＩＧＮＳＹＶＳ（配列番号：１３９）、ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号：１４０）、ＣＡＧＷＤＤＴＬＲＡＷＶ（配列番号：１４１）、ＦＲＤＹＹＶＳＷＩＲＱＡＰＧ（配列番号：１４２）、ＳＳＩＳＧＳＧＧＲＴＹＹＡＤＳＶＥＧＲ（配列番号：１４３）、及びＡＲＶＳＡＬＲＲＰＭＴＴＶＴＴＹＷＦＤＰ（配列番号：１４４）から成る群から選択される一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＲＳＳＮＩＧＮＳＹＶＳ（配列番号：１３９）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号：１４０）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＧＷＤＤＴＬＲＡＷＶ（配列番号：１４１）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、（ｉ）配列ＦＲＤＹＹＶＳＷＩＲＱＡＰＧ（配列番号：１４２）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳＩＳＧＳＧＧＲＴＹＹＡＤＳＶＥＧＲ（配列番号：１４３）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＲＶＳＡＬＲＲＰＭＴＴＶＴＴＹＷＦＤＰ（配列番号：１４４）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＲＳＳＮＩＧＮＳＹＶＳ（配列番号：１３９）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号：１４０）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＧＷＤＤＴＬＲＡＷＶ（配列番号：１４１）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメイン、及び（ｉ）配列ＦＲＤＹＹＶＳＷＩＲＱＡＰＧ（配列番号：１４２）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳＩＳＧＳＧＧＲＴＹＹＡＤＳＶＥＧＲ（配列番号：１４３）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＲＶＳＡＬＲＲＰＭＴＴＶＴＴＹＷＦＤＰ（配列番号：１４４）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。
【００９３】
（ｉｖ）ヒト化抗体
幾つかの実施態様では、抗酸化ＬＤＬ抗体はヒト化抗体である。非ヒト抗体をヒト化する方法は当該技術に記載されている。幾つかの実施態様では、、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、ヒト抗体の該当する配列を高頻度可変領域配列で置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988))に本質的に従って実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくらかの高頻度可変領域残基及び場合によってはいくらかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
【００９４】
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク領域(FR)として受け入れる(Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901 (1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用してよい(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993))。
【００９５】
さらに、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、幾つかの実施態では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは入手可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、FR残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【００９６】
幾つかの実施態様では、ヒト化抗体は、ＩＥＩＡ８、ＩＥＩ-Ｇ８、ＩＥＩ-Ｄ８、ＫＴＴ-Ｄ６、１-Ｂ１２、１-Ｃ０７、１-Ｃ１２、１-Ｇ１０、２-Ｆ０７、２-Ｆ０９、４-Ａ０２、ＩＥＩ-Ｅ３、２Ｄ０３、ＬＤＯ-Ｄ４、及び／又はＫＴＴ-Ｂ８から成る群から選択される一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。幾つかの実施態様では、ヒト化抗体は、ＩＥＩ-Ｇ８、ＩＥＩ-Ｄ８、ＩＥＩ-Ｅ３、２Ｄ０３、ＬＤＯ-Ｄ４、及び／又はＫＴＴ-Ｂ８からの一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。
【００９７】
幾つかの実施態様では、ヒト化抗体は、配列番号：６４、配列番号：６８、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：８０、配列番号：８４、配列番号：８８、配列番号：９２、配列番号：９６、配列番号：１００、配列番号：１０４、配列番号：１０８、配列番号：１１２、配列番号：１１６、配列番号：１２０、配列番号：１２４、配列番号：６６、配列番号：７０、配列番号：７４、配列番号：７８、配列番号：８２、配列番号：８６、配列番号：９０、配列番号：９４、配列番号：９８、配列番号：１０２、配列番号：１０６、配列番号：１１０、配列番号：１１４、配列番号：１１８、配列番号：１２２、及び配列番号：１２６から成る群から選択される配列から一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、ＷＯ２００４／０３０６０７（出典明記によりその全体を本明細書中に援用する）の図３に記載の抗体の一又は複数のＶＨ及び／又はＶＬ配列由来の一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。幾つかの実施態様では、モノクローナル抗体は、ＷＯ２００７／０２５７８１（出典明記によりその全体を本明細書中に援用する）の表２の抗体の一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。
【００９８】
幾つかの実施態様では、ヒト化抗体は、ＣＳＧＳＮＴＮＩＧＫＮＹＶＳ（配列番号：３９）、ＡＮＳＮＲＰＳ（配列番号：４０）、ＣＡＳＷＤＡＳＬＮＧＷＶ（配列番号：４１）、ＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：４２）、ＳＳＩＳＶＧＧＨＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：４３）、及びＡＲＩＲＶＧＰＳＧＧＡＦＤＹ（配列番号：４４）から成る群から選択される一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。幾つかの実施態様では、ヒト化抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＮＴＮＩＧＫＮＹＶＳ（配列番号：３９）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＡＮＳＮＲＰＳ（配列番号：４０）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＳＷＤＡＳＬＮＧＷＶ（配列番号：４１）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト化抗体は、（ｉ）配列ＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：４２）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳＩＳＶＧＧＨＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：４３）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＲＩＲＶＧＰＳＧＧＡＦＤＹ（配列番号：４４）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト化抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＮＴＮＩＧＫＮＹＶＳ（配列番号：３９）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＡＮＳＮＲＰＳ（配列番号：４０）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＳＷＤＡＳＬＮＧＷＶ（配列番号：４１）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメイン、及び（ｉ）配列ＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：４２）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳＩＳＶＧＧＨＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：４３）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＲＩＲＶＧＰＳＧＧＡＦＤＹ（配列番号：４４）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。
【００９９】
幾つかの実施態様では、ヒト化抗体は、ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＡＶＮ（配列番号：４５）、ＧＮＤＲＲＰＳ（配列番号：４６）、ＣＱＴＷＧＴＧＲＧＶ（配列番号：４７）、ＦＳＤＹＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：４８）、ＳＧＶＳＷＮＧＳＲＴＨＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：４９）、及びＡＲＡＡＲＹＳＹＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号：５０）から成る群から選択される一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。幾つかの実施態様では、ヒト化抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＡＶＮ（配列番号：４５）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＧＮＤＲＲＰＳ（配列番号：４６）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＱＴＷＧＴＧＲＧＶ（配列番号：４７）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト化抗体は、（ｉ）配列ＦＳＤＹＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：４８）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＧＶＳＷＮＧＳＲＴＨＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：４９）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＲＡＡＲＹＳＹＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号：５０）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト化抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＡＶＮ（配列番号：４５）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＧＮＤＲＲＰＳ（配列番号：４６）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＱＴＷＧＴＧＲＧＶ（配列番号：４７）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメイン、及び（ｉ）配列ＦＳＤＹＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：４８）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＧＶＳＷＮＧＳＲＴＨＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：４９）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＲＡＡＲＹＳＹＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号：５０）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する
【０１００】
幾つかの実施態様では、ヒト化抗体は、ＣＳＧＳＳＳＳＩＧＮＮＦＶＳ（配列番号：５１）、ＤＮＮＫＲＰＳ（配列番号：５２）、ＣＡＡＷＤＤＳＬＮＧＷＶ（配列番号：５３）、ＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：５４）、ＳＳＩＳＴＳＳＮＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：５５）、及びＡＲＶＫＫＹＳＳＧＷＹＳＮＹＡＦＤＩ（配列番号：５６）から成る群から選択される一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。幾つかの実施態様では、ヒト化抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＳＩＧＮＮＦＶＳ（配列番号：５１）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＤＮＮＫＲＰＳ（配列番号：５２）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＡＷＤＤＳＬＮＧＷＶ（配列番号：５３）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト化抗体は、（ｉ）配列ＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：５４）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳＩＳＴＳＳＮＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：５５）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＲＶＫＫＹＳＳＧＷＹＳＮＹＡＦＤＩ（配列番号：５６）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト化抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＳＩＧＮＮＦＶＳ（配列番号：５１）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＤＮＮＫＲＰＳ（配列番号：５２）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＡＷＤＤＳＬＮＧＷＶ（配列番号：５３）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメイン、及び（ｉ）配列ＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：５４）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳＩＳＴＳＳＮＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：５５）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＲＶＫＫＹＳＳＧＷＹＳＮＹＡＦＤＩ（配列番号：５６）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。
【０１０１】
幾つかの実施態様では、ヒト化抗体は、ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＧＥＳＶＳ（配列番号：５７）、ＳＮＮＱＲＰＳ（配列番号：５８）、ＣＡＡＷＤＤＳＬＮＧＷＶ（配列番号：５９）、ＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：６０）、ＳＳＩＳＳＳＧＲＦＩＹＹＡＤＳＭＫＧＲ（配列番号：６１）、及びＴＲＬＲＲＧＳＹＦＷＡＦＤＩ（配列番号：６２）から成る群から選択される一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。幾つかの実施態様では、ヒト化抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＧＥＳＶＳ（配列番号：５７）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＳＮＮＱＲＰＳ（配列番号：５８）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＡＷＤＤＳＬＮＧＷＶ（配列番号：５９）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト化抗体は、（ｉ）配列ＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：６０）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳＩＳＳＳＧＲＦＩＹＹＡＤＳＭＫＧＲ（配列番号：６１）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＴＲＬＲＲＧＳＹＦＷＡＦＤＩ（配列番号：６２）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト化抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＧＥＳＶＳ（配列番号：５７）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＳＮＮＱＲＰＳ（配列番号：５８）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＡＷＤＤＳＬＮＧＷＶ（配列番号：５９）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメイン、及び（ｉ）配列ＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：６０）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳＩＳＳＳＧＲＦＩＹＹＡＤＳＭＫＧＲ（配列番号：６１）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＴＲＬＲＲＧＳＹＦＷＡＦＤＩ（配列番号：６２）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。
【０１０２】
幾つかの実施態様では、ヒト化抗体は、ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ（配列番号：１２７）、ＳＮＮＱＲＰＳ（配列番号：１２８）、ＣＡＡＷＤＤＳＬＳＨＷＬ（配列番号：１２９）、ＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＶＰＧ（配列番号：１３０）、ＳＴＬＧＧＳＧＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：１３１）、及びＡＫＬＧＧＲＳＲＹＧＲＷＰＲＱＦＤＹ（配列番号：１３２）から成る群から選択される一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。幾つかの実施態様では、ヒト化抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ（配列番号：１２７）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＳＮＮＱＲＰＳ（配列番号：１２８）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＡＷＤＤＳＬＳＨＷＬ（配列番号：１２９）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト化抗体は、（ｉ）配列ＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＶＰＧ（配列番号：１３０）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＴＬＧＧＳＧＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：１３１）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＫＬＧＧＲＳＲＹＧＲＷＰＲＱＦＤＹ（配列番号：１３２）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト化抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ（配列番号：１２７）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＳＮＮＱＲＰＳ（配列番号：１２８）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＡＷＤＤＳＬＳＨＷＬ（配列番号：１２９）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメイン、及び（ｉ）配列ＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＶＰＧ（配列番号：１３０）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＴＬＧＧＳＧＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：１３１）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＫＬＧＧＲＳＲＹＧＲＷＰＲＱＦＤＹ（配列番号：１３２）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。
【０１０３】
幾つかの実施態様では、ヒト化抗体は、ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＳ（配列番号：１３３）、ＧＮＹＮＲＰＳ（配列番号：１３４）、ＣＡＡＷＤＤＳＬＳＧＷＶ（配列番号：１３５）、ＦＳＳＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：１３６）、ＳＳＩＳＧＳＧＲＲＴＹＹＡＤＳＶＱＧＲ（配列番号：１３７）、及びＡＲＬＶＳＹＧＳＧＳＦＧＦＤＹ（配列番号：１３８）から成る群から選択される一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。幾つかの実施態様では、ヒト化抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＳ（配列番号：１３３）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＧＮＹＮＲＰＳ（配列番号：１３４）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＡＷＤＤＳＬＳＧＷＶ（配列番号：１３５）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト化抗体は、（ｉ）配列ＦＳＳＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：１３６）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳＩＳＧＳＧＲＲＴＹＹＡＤＳＶＱＧＲ（配列番号：１３７）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＲＬＶＳＹＧＳＧＳＦＧＦＤＹ（配列番号：１３８）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト化抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＳ（配列番号：１３３）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＧＮＹＮＲＰＳ（配列番号：１３４）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＡＷＤＤＳＬＳＧＷＶ（配列番号：１３５）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメイン（ｉ）配列ＦＳＳＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：１３６）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳＩＳＧＳＧＲＲＴＹＹＡＤＳＶＱＧＲ（配列番号：１３７）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＲＬＶＳＹＧＳＧＳＦＧＦＤＹ（配列番号：１３８）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。
【０１０４】
幾つかの実施態様では、ヒト化抗体は、ＣＳＧＲＳＳＮＩＧＮＳＹＶＳ（配列番号：１３９）、ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号：１４０）、ＣＡＧＷＤＤＴＬＲＡＷＶ（配列番号：１４１）、ＦＲＤＹＹＶＳＷＩＲＱＡＰＧ（配列番号：１４２）、ＳＳＩＳＧＳＧＧＲＴＹＹＡＤＳＶＥＧＲ（配列番号：１４３）、及びＡＲＶＳＡＬＲＲＰＭＴＴＶＴＴＹＷＦＤＰ（配列番号：１４４）から成る群から選択される一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。幾つかの実施態様では、ヒト化抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＲＳＳＮＩＧＮＳＹＶＳ（配列番号：１３９）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号：１４０）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＧＷＤＤＴＬＲＡＷＶ（配列番号：１４１）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト化抗体は、（ｉ）配列ＦＲＤＹＹＶＳＷＩＲＱＡＰＧ（配列番号：１４２）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳＩＳＧＳＧＧＲＴＹＹＡＤＳＶＥＧＲ（配列番号：１４３）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＲＶＳＡＬＲＲＰＭＴＴＶＴＴＹＷＦＤＰ（配列番号：１４４）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト化抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＲＳＳＮＩＧＮＳＹＶＳ（配列番号：１３９）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号：１４０）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＧＷＤＤＴＬＲＡＷＶ（配列番号：１４１）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメイン、及び（ｉ）配列ＦＲＤＹＹＶＳＷＩＲＱＡＰＧ（配列番号：１４２）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳＩＳＧＳＧＧＲＴＹＹＡＤＳＶＥＧＲ（配列番号：１４３）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＲＶＳＡＬＲＲＰＭＴＴＶＴＴＹＷＦＤＰ（配列番号：１４４）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。
【０１０５】
（ｖ）ヒト抗体
幾つかの実施態様では、抗酸化ＬＤＬ抗体はヒト抗体である。ヒト化のための別法により、ヒト抗体を生産することができる。例えば、内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが今は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno. 7:33 (1993);及び米国特許第5,591,669号;同第5,589,369号; 及び同第5,545,807号を参照のこと。
【０１０６】
別に、ファージ表示技術(McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990))を、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させるために使用することができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３又はｆｄの大きい又は小さいコートタンパク質遺伝子のいずれかにインフレームでクローン化し、ファージ粒子の表面に抗体断片の機能として表示する。繊維状粒子がファージゲノムの単一ストランドのＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択により、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択がなされる。よって、ファージはＢ細胞の特性のいくつかを模倣している。ファージ表示は多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)を参照のこと。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源がファージ表示のために使用可能である。Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)は、免疫化されたマウス脾臓から得られたＶ遺伝子の小ランダム組合せライブラリからの抗-オキサゾロン抗体の異なった配列を単離した。非免疫化ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構成可能で、抗原(自己抗原を含む)とは異なる配列の抗体を、Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), or Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)に記載の技術に本質的に従って単離することができる。また、米国特許第５，５６５，３３２号及び同５，５７３，９０５号を参照のこと。
また、ヒト抗体は、活性化Ｂ細胞によりインビトロで生産してもよい(例えば米国特許第５，５６７，６１０号及び同５，２２９，２７５号を参照)。
【０１０７】
幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、ＩＥＩＡ８、ＩＥＩ-Ｇ８、ＩＥＩ-Ｄ８、ＫＴＴ-Ｄ６、１-Ｂ１２、１-Ｃ０７、１-Ｃ１２、１-Ｇ１０、２-Ｆ０７、２-Ｆ０９、４-Ａ０２、ＩＥＩ-Ｅ３、２Ｄ０３、ＬＤＯ-Ｄ４、及び／又はＫＴＴ-Ｂ８から一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、ＩＥＩ-Ｅ３、２Ｄ０３、ＬＤＯ-Ｄ４、及び／又はＫＴＴ-Ｂ８から一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。
【０１０８】
幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、表２から選択される軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、配列番号：６４、配列番号：６８、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：８０、配列番号：８４、配列番号：８８、配列番号：９２、配列番号：９６、配列番号：１００、配列番号：１０４、配列番号：１０８、配列番号：１１２、配列番号：１１６、配列番号：１２０、及び配列番号：１２４から成る群から選択される重鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、配列番号：６６、配列番号：７０、配列番号：７４、配列番号：７８、配列番号：８２、配列番号：８６、配列番号：９０、配列番号：９４、配列番号：９８、配列番号：１０２、配列番号：１０６、配列番号：１１０、配列番号：１１４、配列番号：１１８、配列番号：１２２、及び配列番号：１２６から成る群から選択される軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、配列番号：１０４を含んでなる重鎖可変ドメイン及び配列番号：１０６を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、配列番号：６８を含んでなる重鎖可変ドメイン及び配列番号：７０を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、配列番号：９６を含んでなる重鎖可変ドメイン及び配列番号：９８を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。
【０１０９】
幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、配列番号：６４、配列番号：６８、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：８０、配列番号：８４、配列番号：８８、配列番号：９２、配列番号：９６、配列番号：１００、配列番号：１０４、配列番号：１０８、配列番号：１１２、配列番号：１１６、配列番号：１２０、配列番号：１２４、配列番号：６６、配列番号：７０、配列番号：７４、配列番号：７８、配列番号：８２、配列番号：８６、配列番号：９０、配列番号：９４、配列番号：９８、配列番号：１０２、配列番号：１０６、配列番号：１１０、配列番号：１１４、配列番号：１１８、配列番号：１２２、及び配列番号：１２６から成る群から選択される配列から一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、ＷＯ２００４／０３０６０７（出典明記によりその全体を本明細書中に援用する）の図３に記載の抗体の一又は複数のＶＨ及び／又はＶＬ配列由来の一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、ＷＯ２００７／０２５７８１（出典明記によりその全体を本明細書中に援用する）の表２の抗体の一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。
2013503195.tif 000005
2013503195.tif 000006
2013503195.tif 000007
2013503195.tif 000008
2013503195.tif 000009
2013503195.tif 000010
2013503195.tif 000011
2013503195.tif 000012
【０１１０】
幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、ＣＳＧＳＮＴＮＩＧＫＮＹＶＳ（配列番号：３９）、ＡＮＳＮＲＰＳ（配列番号：４０）、ＣＡＳＷＤＡＳＬＮＧＷＶ（配列番号：４１）、ＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：４２）、ＳＳＩＳＶＧＧＨＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：４３）、及びＡＲＩＲＶＧＰＳＧＧＡＦＤＹ（配列番号：４４）から成る群から選択される一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＮＴＮＩＧＫＮＹＶＳ（配列番号：３９）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＡＮＳＮＲＰＳ（配列番号：４０）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＳＷＤＡＳＬＮＧＷＶ（配列番号：４１）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、（ｉ）配列ＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：４２）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳＩＳＶＧＧＨＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：４３）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＲＩＲＶＧＰＳＧＧＡＦＤＹ（配列番号：４４）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＮＴＮＩＧＫＮＹＶＳ（配列番号：３９）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＡＮＳＮＲＰＳ（配列番号：４０）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＳＷＤＡＳＬＮＧＷＶ（配列番号：４１）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメイン、及び（ｉ）配列ＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：４２）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳＩＳＶＧＧＨＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：４３）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＲＩＲＶＧＰＳＧＧＡＦＤＹ（配列番号：４４）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。
【０１１１】
幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＡＶＮ（配列番号：４５）、ＧＮＤＲＲＰＳ（配列番号：４６）、ＣＱＴＷＧＴＧＲＧＶ（配列番号：４７）、ＦＳＤＹＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：４８）、ＳＧＶＳＷＮＧＳＲＴＨＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：４９）、及びＡＲＡＡＲＹＳＹＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号：５０）から成る群から選択される一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＡＶＮ（配列番号：４５）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＧＮＤＲＲＰＳ（配列番号：４６）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＱＴＷＧＴＧＲＧＶ（配列番号：４７）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、（ｉ）配列ＦＳＤＹＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：４８）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＧＶＳＷＮＧＳＲＴＨＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：４９）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＲＡＡＲＹＳＹＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号：５０）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＡＶＮ（配列番号：４５）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＧＮＤＲＲＰＳ（配列番号：４６）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＱＴＷＧＴＧＲＧＶ（配列番号：４７）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメイン、及び（ｉ）配列ＦＳＤＹＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：４８）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＧＶＳＷＮＧＳＲＴＨＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：４９）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＲＡＡＲＹＳＹＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号：５０）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する
【０１１２】
幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、ＣＳＧＳＳＳＳＩＧＮＮＦＶＳ（配列番号：５１）、ＤＮＮＫＲＰＳ（配列番号：５２）、ＣＡＡＷＤＤＳＬＮＧＷＶ（配列番号：５３）、ＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：５４）、ＳＳＩＳＴＳＳＮＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：５５）、及びＡＲＶＫＫＹＳＳＧＷＹＳＮＹＡＦＤＩ（配列番号：５６）から成る群から選択される一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＳＩＧＮＮＦＶＳ（配列番号：５１）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＤＮＮＫＲＰＳ（配列番号：５２）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＡＷＤＤＳＬＮＧＷＶ（配列番号：５３）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、（ｉ）配列ＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：５４）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳＩＳＴＳＳＮＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：５５）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＲＶＫＫＹＳＳＧＷＹＳＮＹＡＦＤＩ（配列番号：５６）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＳＩＧＮＮＦＶＳ（配列番号：５１）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＤＮＮＫＲＰＳ（配列番号：５２）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＡＷＤＤＳＬＮＧＷＶ（配列番号：５３）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメイン、及び（ｉ）配列ＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：５４）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳＩＳＴＳＳＮＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：５５）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＲＶＫＫＹＳＳＧＷＹＳＮＹＡＦＤＩ（配列番号：５６）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。
【０１１３】
幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＧＥＳＶＳ（配列番号：５７）、ＳＮＮＱＲＰＳ（配列番号：５８）、ＣＡＡＷＤＤＳＬＮＧＷＶ（配列番号：５９）、ＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：６０）、ＳＳＩＳＳＳＧＲＦＩＹＹＡＤＳＭＫＧＲ（配列番号：６１）、及びＴＲＬＲＲＧＳＹＦＷＡＦＤＩ（配列番号：６２）から成る群から選択される一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＧＥＳＶＳ（配列番号：５７）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＳＮＮＱＲＰＳ（配列番号：５８）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＡＷＤＤＳＬＮＧＷＶ（配列番号：５９）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、（ｉ）配列ＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：６０）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳＩＳＳＳＧＲＦＩＹＹＡＤＳＭＫＧＲ（配列番号：６１）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＴＲＬＲＲＧＳＹＦＷＡＦＤＩ（配列番号：６２）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＧＥＳＶＳ（配列番号：５７）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＳＮＮＱＲＰＳ（配列番号：５８）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＡＷＤＤＳＬＮＧＷＶ（配列番号：５９）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメイン、及び（ｉ）配列ＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：６０）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳＩＳＳＳＧＲＦＩＹＹＡＤＳＭＫＧＲ（配列番号：６１）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＴＲＬＲＲＧＳＹＦＷＡＦＤＩ（配列番号：６２）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。
【０１１４】
幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ（配列番号：１２７）、ＳＮＮＱＲＰＳ（配列番号：１２８）、ＣＡＡＷＤＤＳＬＳＨＷＬ（配列番号：１２９）、ＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＶＰＧ（配列番号：１３０）、ＳＴＬＧＧＳＧＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：１３１）、及びＡＫＬＧＧＲＳＲＹＧＲＷＰＲＱＦＤＹ（配列番号：１３２）から成る群から選択される一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ（配列番号：１２７）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＳＮＮＱＲＰＳ（配列番号：１２８）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＡＷＤＤＳＬＳＨＷＬ（配列番号：１２９）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、（ｉ）配列ＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＶＰＧ（配列番号：１３０）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＴＬＧＧＳＧＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：１３１）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＫＬＧＧＲＳＲＹＧＲＷＰＲＱＦＤＹ（配列番号：１３２）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳ（配列番号：１２７）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＳＮＮＱＲＰＳ（配列番号：１２８）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＡＷＤＤＳＬＳＨＷＬ（配列番号：１２９）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメイン、及び（ｉ）配列ＦＳＮＡＷＭＳＷＶＲＱＶＰＧ（配列番号：１３０）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＴＬＧＧＳＧＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号：１３１）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＫＬＧＧＲＳＲＹＧＲＷＰＲＱＦＤＹ（配列番号：１３２）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。
【０１１５】
幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＳ（配列番号：１３３）、ＧＮＹＮＲＰＳ（配列番号：１３４）、ＣＡＡＷＤＤＳＬＳＧＷＶ（配列番号：１３５）、ＦＳＳＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：１３６）、ＳＳＩＳＧＳＧＲＲＴＹＹＡＤＳＶＱＧＲ（配列番号：１３７）、及びＡＲＬＶＳＹＧＳＧＳＦＧＦＤＹ（配列番号：１３８）から成る群から選択される一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＳ（配列番号：１３３）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＧＮＹＮＲＰＳ（配列番号：１３４）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＡＷＤＤＳＬＳＧＷＶ（配列番号：１３５）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、（ｉ）配列ＦＳＳＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：１３６）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳＩＳＧＳＧＲＲＴＹＹＡＤＳＶＱＧＲ（配列番号：１３７）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＲＬＶＳＹＧＳＧＳＦＧＦＤＹ（配列番号：１３８）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＹＶＳ（配列番号：１３３）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＧＮＹＮＲＰＳ（配列番号：１３４）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＡＷＤＤＳＬＳＧＷＶ（配列番号：１３５）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメイン（ｉ）配列ＦＳＳＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧ（配列番号：１３６）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳＩＳＧＳＧＲＲＴＹＹＡＤＳＶＱＧＲ（配列番号：１３７）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＲＬＶＳＹＧＳＧＳＦＧＦＤＹ（配列番号：１３８）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。
【０１１６】
幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、ＣＳＧＲＳＳＮＩＧＮＳＹＶＳ（配列番号：１３９）、ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号：１４０）、ＣＡＧＷＤＤＴＬＲＡＷＶ（配列番号：１４１）、ＦＲＤＹＹＶＳＷＩＲＱＡＰＧ（配列番号：１４２）、ＳＳＩＳＧＳＧＧＲＴＹＹＡＤＳＶＥＧＲ（配列番号：１４３）、及びＡＲＶＳＡＬＲＲＰＭＴＴＶＴＴＹＷＦＤＰ（配列番号：１４４）から成る群から選択される一又は複数（少なくとも１、２、３、４、５、又は６）のＣＤＲを有する。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＲＳＳＮＩＧＮＳＹＶＳ（配列番号：１３９）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号：１４０）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＧＷＤＤＴＬＲＡＷＶ（配列番号：１４１）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、（ｉ）配列ＦＲＤＹＹＶＳＷＩＲＱＡＰＧ（配列番号：１４２）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳＩＳＧＳＧＧＲＴＹＹＡＤＳＶＥＧＲ（配列番号：１４３）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＲＶＳＡＬＲＲＰＭＴＴＶＴＴＹＷＦＤＰ（配列番号：１４４）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ヒト抗体は、（ｉ）配列ＣＳＧＲＳＳＮＩＧＮＳＹＶＳ（配列番号：１３９）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ１；（ｉｉ）配列ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号：１４０）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列ＣＡＧＷＤＤＴＬＲＡＷＶ（配列番号：１４１）を含んでなるＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメイン、及び（ｉ）配列ＦＲＤＹＹＶＳＷＩＲＱＡＰＧ（配列番号：１４２）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ１；（ｉｉ）配列ＳＳＩＳＧＳＧＧＲＴＹＹＡＤＳＶＥＧＲ（配列番号：１４３）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列ＡＲＶＳＡＬＲＲＰＭＴＴＶＴＴＹＷＦＤＰ（配列番号：１４４）を含んでなるＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインを有する。
【０１１７】
（ｖｉ）抗体断片
幾つかの実施態様では、抗酸化ＬＤＬ抗体は抗体断片である。抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) and Brennan et al., Science 229:81 (1985)を参照)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、抗体断片は上述において検討した抗体ファージライブラリから単離することができる。別法として、Fab'-SH断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ（ａｂ’）２断片を形成することができる(Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992))。他のアプローチ法では、Ｆ（ａｂ’）２断片を組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。抗体断片の生産のための他の技術は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Fv断片(ｓｃＦＶ)である。ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；及び米国特許第５，５８７，４５８号を参照のこと。また、抗体断片は、例えば米国特許第５，６４１，８７０号に記載されているような「線形抗体」であってもよい。このような線形抗体断片は単一特異性又は二重特異性でありうる。
幾つかの実施態様では、ここに記載の抗体の断片が提供される。幾つかの実施態様では、抗体断片は抗原結合断片である。
【０１１８】
（ｖｉｉ）二重特異性抗体
幾つかの実施態様では、抗酸化ＬＤＬ抗体は二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、酸化ＬＤＬの２つの異なるエピトープに結合しうる。他のこのような抗体は酸化ＬＤＬに結合し、さらに第２の酸化ＬＤＬに結合する。あるいは、抗酸化ＬＤＬ結合アームは、細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）等のＩｇＧ（ＦｃγＲ）に対するＦｃ受容体、又はＴ細胞受容体分子（例えばＣＤ２又はＣＤ３）等の白血球上のトリガー分子に結合するアームと結合しうる。二重特異性抗体は全長抗体又は抗体断片(例えばＦ（ａｂ’）２  二重特異性抗体)として調製することができる。
【０１１９】
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(クアドローマ)は10個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法がＷＯ９３／０８８２９及びTraunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
【０１２０】
異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原-抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。幾つかの実施態様では、該融合は、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。幾つかの実施態様では、軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。これにより、組立に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が特に重要性を持たないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０１２１】
このアプローチ法の好適な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、ＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体を産生するさらなる詳細については、例えばSuresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)を参照されたい。
【０１２２】
米国特許第５，７３１，１６８号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体のパーセントを最大にすることができる。幾つかの実施態様では、界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモ二量体のような不要の他の最終産物に対してヘテロ二量体の収量を増大させるメカニズムが提供される。
【０１２３】
二重特異性抗体は、架橋した又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の一方はアビジンに結合され、他方はビオチンに結合され得る。そのような抗体は、例えば、不要の細胞に対する免疫系細胞をターゲティングするため(米国特許第4，６７６，９８０号）、及びＨＩＶ感染の治療のために提案された（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３、及びＥＰ０３０８９）。ヘテロコンジュゲート抗体は、あらゆる簡便な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は当該分野において良く知られており、幾つかの架橋技術と共に米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
【０１２４】
また、抗体断片から二重特異性抗体を生成する技術は文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は化学結合を使用して調製されてよい。Brennan et al., Science 229: 81 (1985)は、インタクトな抗体がタンパク質分解的に切断されてＦ(ａｂ’)２断片が生成する手順を記述する。これらの断片は、ジチオール錯化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元され、近隣のジチオールを安定化し、分子間ジスルフィド形成を妨げる。次いで、生成されるＦａｂ’断片はチオニトロベンゾエート(ＴＮＢ)誘導体に変換される。そして、Ｆａｂ’-ＴＮＢ誘導体の１つは、メルカプトエチルアミンによる還元によってＦａｂ’-チオールに再変換され、等モル量の他のＦａｂ’-ＴＮＢ誘導体と混合されて、二重特異性抗体が形成される。生産された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使われてよい。
【０１２５】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し単離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Fos及びJunタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ’部分に結合させる。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモ二量体の生産に対して使用することができる。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
【０１２６】
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991)。
【０１２７】
（ｖｉｉｉ）多価抗体
幾つかの実施態様では、抗酸化ＬＤＬ抗体は多価抗体である。多価抗体は二価抗体より早く、抗体が結合する抗原を発現する細胞により内部移行（及び／又は異化）されうる。ここに提供される抗体は、３個以上の抗原結合部位を有する（例えば、四価抗体）多価抗体（ＩｇＭクラスのもの以外）であり得、これらは、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現によって容易に生成され得る。多価抗体は、二量体形成ドメイン及び３個以上の抗原結合部位を含み得る。好ましい二量体形成ドメインは、Ｆｃ領域もしくはヒンジ領域を含む（またはこれらからなる）。この状況において、上記抗体は、Ｆｃ領域、および上記Ｆｃ領域に対してアミノ末端側に３個以上の抗原結合部位を含む。好ましい多価抗体は、本明細書において、３〜約８個、しかし好ましくは４個の抗原結合部位を含む（もしくはこれらからなる）。多価抗体は、少なくとも１個のポリペプチド鎖（および好ましくは、２個のポリペプチド鎖）を含み、ここでポリペプチド鎖は、２個以上の可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖は、ＶＤ１-（Ｘ１）ｎ-ＶＤ２-（Ｘ２）  ｎ-Ｆｃを含み得、ここでＶＤ１は、第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の可変ドメインであり、Ｆｃは、Ｆｃ領域の１個のポリペプチド鎖であり、Ｘ１及びＸ２は、アミノ酸もしくはポリペプチドを表し、ｎは、０もしくは１である。例えば、上記ポリペプチド鎖は、以下を含み得る：ＶＨ-ＣＨ１-可動性リンカー-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖；もしくはＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖。多価抗体は、本明細書において、好ましくは、少なくとも２個（および好ましくは４個）の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに含む。多価抗体は、本明細書において、例えば、約２〜約８個の軽鎖可変ドメインポリペプチドを含み得る。本明細書において企図された軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、必要に応じて、ＣＬドメインをさらに含む。
【０１２８】
（ｉｘ）他のアミノ酸配列修飾
ここに記載の酸化ＬＤＬ結合抗体のアミノ酸配列の修飾を考える。例えば、抗体の結合親和性及び／又は生物学的特性を向上させることができれば望ましい。ヒト化ＡＰ３３抗体のような抗ＨＣＶ抗体のアミノ酸配列変異体は、抗酸化ＬＤＬ抗体の核酸に適切なヌクレオチド変化を導入して、又はペプチド合成により調製されうる。そのような修飾は、抗酸化ＬＤＬ抗体のアミノ酸配列内の残基の、例えば、欠失型、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望する特徴を有していれば、欠失、挿入及び置換をどのように組合せてもよい。またアミノ酸変化はグリコシル化部位の数又は位置のような、抗酸化ＬＤＬ抗体の翻訳後プロセスを変化させうる。
【０１２９】
突然変異誘発に好ましい位置である抗酸化ＬＤＬ抗体のある残基又は領域の同定に有益な方法は、Cunningham及びWells Science, 244:1081-1085(1989)に開示されているように「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的となる残基又は残基の組が同定され(例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕ等の荷電した残基)、中性の、又は負に荷電したアミノ酸(最も好ましくはアラニン又はポリアラニン)で置換され、アミノ酸の酸化ＬＤＬ抗原との相互作用に影響を与える。ついで、置換に対する機能的感受性を示しているそれらアミノ酸位置を、置換の部位において、又は置換の部位のために、更なる又は他の変異体を導入することにより精製する。このように、アミノ酸配列変異体を導入する部位は予め決定されるが、突然変異自体の性質は予め決定される必要はない。例えば、与えられた部位における突然変異のパーフォーマンスを分析するために、標的コドン又は領域においてａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を実施し、発現した抗酸化ＬＤＬ抗体変異体を所望の活性についてスクリーニングする。
【０１３０】
アミノ酸配列挿入には、１残基から１００以上の残基を有するポリペプチドまでの長さに亘るアミノ末端融合及び／又はカルボキシ末端融合、並びに単一又は複数アミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を持つ抗酸化ＬＤＬ抗体又は細胞傷害性ポリペプチドに融合した抗体が含まれる。抗酸化ＬＤＬ抗体分子の他の挿入変異体には、抗体の血清半減期を増加させるポリペプチド又は(例えばＡＤＥＰＴのための)酵素への抗酸化ＬＤＬ抗体のＮ末端又はＣ末端の融合が含まれる。
【０１３１】
他のタイプの変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗酸化ＬＤＬ抗体中に異なった残基により置換される少なくとも一のアミノ酸残基を有する。置換突然変異について関心ある部位は高度可変領域を含むが、ＦＲ改変もまた考慮される。保存的置換は、「好ましい置換」と題して以下の表に示す。そのような置換が生物学的活性の変化をもたらすならば、表中に「例示的置換」と名前を付けた、又はアミノ酸クラスに関連して以下に更に記載されるより実質的な変化が、導入され得、産物がスクリーニングされうる。
2013503195.tif 000013
【０１３２】
抗体の生物学的性質における実質的修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩の維持についてのその効果が有意に異なる置換を選択することにより達成される。アミノ酸は、その側鎖の特性の類似性に従ってグループ化することができる(A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975))：
（１）無極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）無電荷極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。
【０１３３】
別法では、天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１３４】
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを伴うであろう。
抗酸化ＬＤＬ抗体の適切なコンフォメーションを維持することに関与していない任意のシステイン残基も、一般的には、セリンと置換して、分子の酸化的安定性を改善し、異常な架橋を防いでもよい。逆に、システイン結合をその抗体に付加して、その安定性を改善してもよい(特に抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合)。
【０１３５】
特に好ましい型の置換変異体は、親抗体（例えばヒト化抗体）の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的に、更なる発展のために選択され、得られた変異体は、それらが作製された親抗体と比較して改善された生物学的特性を有している。そのような置換変異体を作製する簡便な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性成熟を含む。簡潔に言えば、幾つかの高頻度可変領域部位(例えば６−７部位)を変異させて各部位においてあらゆる可能なアミノ酸置換を生成させる。このようにして生成された抗体変異体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物としてディスプレイされる。ファージディスプレイ変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。修飾のための候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体と酸化ＬＤＬの間の接点を特定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体がひとたび生成されると、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択することができる。
【０１３６】
抗体のアミノ酸変異体の他の型は、抗体の元のグリコシル化パターンを変更する。ヒト化抗体又はその断片は非アミノ酸部分を含みうる。例えば、抗体はグリコシル化されうる。かかるグリコシル化は宿主細胞又は宿主生物中での抗体の発現中に天然に生じうるか、又はヒト介入から生じる慎重な修飾でありうる。変更とは、抗体に見い出される一又は複数の糖鎖部分の欠失、及び／又は抗体に存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。
【０１３７】
抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン(ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸)のトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出される。Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの糖類のうち一つが結合することを意味するが、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた用いることができる。
【０１３８】
グリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、それが一又は複数の上述したトリペプチド配列(Ｎ結合グリコシル化部位のもの)を含むように変化させることによって簡便に達成される。該変化は、元の抗体の配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(Ｏ-結合グリコシル化部位の場合)。
【０１３９】
抗酸化ＬＤＬ抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該分野で知られた様々な方法によって調製される。これらの方法は、限定するものではないが、天然源からの単離(天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合)又は初期に調製された変異体もしくは抗酸化ＬＤＬ抗体の非変異体バージョンのオリゴヌクレオチド媒介(又は部位特異的)突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製を含む。
【０１４０】
エフェクター機能に関して、例えば抗体の抗原依存性細胞媒介性細胞傷害性(ＡＤＣＣ)及び／又は補体依存性細胞傷害性(ＣＤＣ)を向上させるために、本発明の抗体を修飾することが望ましい場合がある。これは、抗体のＦｃ領域に一又は複数のアミノ酸置換を導入することで達成されうる。あるいは又は加えて、Ｆｃ領域にシステイン残基を導入することによってこの領域での鎖間のジスルフィド結合形成が起こりうる。このようにして生成されたホモ二量体抗体は改善された内部移行能及び／又は増加した補体媒介細胞死滅及び抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有しうる。Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) and Shopes, B. J., Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照のこと。抗腫瘍活性が亢進されたホモ二量体抗体もまたWolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993)に記載されているようなヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製されうる。あるいは、抗体を二重Ｆｃ領域を持つように操作して、それによって補体媒介性溶解及びＡＤＣＣ能を亢進した。Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照。
【０１４１】
米国特許出願公開第２００６／００６７９３０号に記載されているように、抗体の血清半減期を増大させるために、アミノ酸改変を抗体中に行うことができ、出典明記によりその全体を本明細書中に援用する。
【０１４２】
（ｘ）他の抗体修飾
抗体の他の修飾がここで考察される。例えば、抗体は様々な非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン類、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーに結合されうる。また抗体は、例えばコアセルベーション法又は界面重合により調製されたマイクロカプセル(例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセル）にコロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルションに捕捉することができる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences, 16版, Osol A.編(1980)に開示されている。
【０１４３】
加えてもしくはあるいは、ヒト化抗体又はその断片に他の化学修飾を施してもよい。一つのそのような望ましい修飾は一又は複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分の付加である。ペグ化はインビボで様々な抗体断片の半減期を有意に増大させることが示されている(Chapman 2002 Adv. Drug Delivery Rev. 54, 531-545)。しかしながら、抗体断片の無作為のペグ化は抗原に対する断片の結合親和性に非常に致命的な影響を持ちうる。これを避けるためには、ペグ化をヒト化抗体又はその断片の特定の標的残基に限定することが望ましい(Knight等, 2004 Platelets 15, 409-418及び上掲のChapmanを参照)。
【０１４４】
（ｘｉ）所望の特性を有する抗体のスクリーニング
興味ある抗体が結合する酸化ＬＤＬ上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするためには、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載されたもののような常套的な交差ブロックアッセイを実施することができる。このアッセイは、試験抗体が本発明の抗酸化ＬＤＬ抗体と同じ部位又はエピトープに結合するかどうかを決定するために使用することができる。あるいは、又は加えて、エピトープマッピングを当該分野で知られている方法によって実施することができる。例えば、抗体配列を例えばアラニンスキャニングによって変異誘発させ接触残基を同定することができる。変異体抗体は正しい折り畳みを確実にするためにポリクローナル抗体との結合について最初に試験される。異なった方法では、酸化ＬＤＬの異なった領域に対応するペプチドを、試験抗体又は試験抗体群及び特徴付けられた又は既知のエピトープの抗体との競合アッセイで使用することができる。
【０１４５】
ＩＩＩ．方法及び使用における使用のための抗体の取得
ここに記載の方法及び使用において使用される抗体は、当技術分野で周知の方法を使用して得られ、組換え方法を含む。以下のセクションはこれらの方法に関するガイダンスを提供する。
【０１４６】
（ｉ）ポリヌクレオチド
ここで交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。
ポリヌクレオチドは、ここに記載の抗酸化ＬＤＬ抗体の何れかをコードしうる。例えば、ポリヌクレオチドは、軽鎖又は重鎖等の全免疫グロブリン分子鎖をコードしうる。完全な重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）ばかりでなく重鎖定常領域（ＣＨ）を含み、これは典型的には３つの定常ドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３；及び「ヒンジ」領域を含む。ある状況では、定常領域の存在が望ましい。
【０１４７】
ポリヌクレオチドは可変軽鎖及び／又は可変重鎖をコードしうる。幾つかの実施態様では、ポリヌクレオチドは、表２から選択される軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号：６３、配列番号：６７、配列番号：７１、配列番号：７５、配列番号：７９、配列番号：８３、配列番号：８７、配列番号：９１、配列番号：９５、配列番号：９９、配列番号：１０３、配列番号：１０７、配列番号：１１１、配列番号：１１５、配列番号：１１９、及び配列番号：１２３から成る群から選択される重鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号：６５、配列番号：６９、配列番号：７３、配列番号：７７、配列番号：８１、配列番号：８５、配列番号：８９、配列番号：９３、配列番号：９７、配列番号：１０１、配列番号：１０５、配列番号：１０９、配列番号：１１３、配列番号：１１７、配列番号：１２１、及び配列番号：１２５から成る群から選択される軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号：１０３を含んでなる重鎖可変ドメイン及び配列番号：１０５を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号：６７を含んでなる重鎖可変ドメイン及び配列番号：６９を含んでなる軽鎖可変ドメインを有する。
【０１４８】
ポリヌクレオチドによってコードされうる他のポリペプチドは、抗原結合抗体断片、例えば単一ドメイン抗体（「ｄＡｂｓ」）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２及び「ミニボディ」を含む。ミニボディは（典型的には）ＣＨ１及びＣＫ又はＣＬドメインが切り取られた二価抗体断片である。ミニボディは一般的な抗体より小さいので、それらは臨床／診断使用では良好な組織浸透を達成するはずであるが、ｄＡｂｓのような一価抗体断片よりも高い結合親和性を保持しなければならない二価である。従って、内容が矛盾しない限り、ここで使用される「抗体」なる用語は抗体分子全体ばかりでなく、上で検討したタイプの抗原結合抗体断片もまた包含する。
【０１４９】
コードされたポリペプチドは典型的にはＩＥＩＡ８、ＩＥＩ-Ｇ８、ＩＥＩ-Ｄ８、ＫＴＴ-Ｄ６、１-Ｂ１２、１-Ｃ０７、１-Ｃ１２、１-Ｇ１０、２-Ｆ０７、２-Ｆ０９、４-Ａ０２、ＩＥＩ-Ｅ３、２Ｄ０３、ＬＤＯ-Ｄ４、及び／又はＫＴＴ-Ｂ８のものと同一又は実質的に同一のＣＤＲ配列を有している一方。よって、本発明のポリヌクレオチドは、ＩＥＩＡ８、ＩＥＩ-Ｇ８、ＩＥＩ-Ｄ８、ＫＴＴ-Ｄ６、１-Ｂ１２、１-Ｃ０７、１-Ｃ１２、１-Ｇ１０、２-Ｆ０７、２-Ｆ０９、４-Ａ０２、ＩＥＩ-Ｅ３、２Ｄ０３、ＬＤＯ-Ｄ４、及び／又はＫＴＴ-Ｂ８の重鎖及び／又は軽鎖（適切な場合）に対してここに記載された重鎖及び／又は軽鎖可変領域を有するポリペプチドを好ましくはコードする。コードされるポリペプチドが部分的な又は完全な重鎖及び／又は軽鎖定常領域を含む場合、これはまた有利にはヒト由来のものである。
【０１５０】
幾つかの実施態様では、コードされるポリペプチドのフレームワーク領域の少なくとも一つ、最も好ましくはフレームワーク領域の各々は、ヒト化抗体の結合活性を増加させるために、ＩＥＩＡ８、ＩＥＩ-Ｇ８、ＩＥＩ-Ｄ８、ＫＴＴ-Ｄ６、１-Ｂ１２、１-Ｃ０７、１-Ｃ１２、１-Ｇ１０、２-Ｆ０７、２-Ｆ０９、４-Ａ０２、ＩＥＩ-Ｅ３、２Ｄ０３、ＬＤＯ-Ｄ４、及び／又はＫＴＴ-Ｂ８のものとより類似するようにするヒトアクセプターに対するアミノ酸置換を含む。
【０１５１】
幾つかの実施態様では、コードされたポリペプチド中に存在する各フレームワーク領域は、対応するヒトアクセプターフレームワークに対して少なくとも一つのアミノ酸置換を含む。よって、例えば、フレームワーク領域は、アクセプターフレームワーク領域に対して、全体で３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５のアミノ酸置換を含みうる。有利には、変異は、ＩＥＩＡ８、ＩＥＩ-Ｇ８、ＩＥＩ-Ｄ８、ＫＴＴ-Ｄ６、１-Ｂ１２、１-Ｃ０７、１-Ｃ１２、１-Ｇ１０、２-Ｆ０７、２-Ｆ０９、４-Ａ０２、ＩＥＩ-Ｅ３、２Ｄ０３、ＬＤＯ-Ｄ４、及び／又はＫＴＴ-Ｂ８フレームワーク内の等価な位置に存在する残基に一致させるための逆突然変異である。幾つかの実施態様では、６の逆突然変異が重鎖及び軽鎖の一においてなされる。
【０１５２】
適切には、ここに記載のポリヌクレオチドは単離され、及び／又は精製されうる。幾つかの実施態様では、ポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドである。
「単離されたポリヌクレオチド」なる用語は、分子がその通常の又は自然の環境から除去され又は分離されており、又はそれがその通常の又は自然の環境では存在しないような形で製造されたことを示すものである。幾つかの実施態様では、ポリヌクレオチドは精製されたポリヌクレオチドである。精製されたという用語は、少なくとも幾らかの汚染分子又は物質が除去されたことを示すものである。
【０１５３】
適切には、ポリヌクレオチドは、関連したポリヌクレオチドが組成物中に存在する支配的な（つまり最も豊富な）ポリヌクレオチドを構成するように、実質的に精製される。
重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコードする挿入断片を含んでなる組換え核酸が、ここに記載の方法において使用されうる。定義では、そのような核酸は、コード化一本鎖核酸、前記コード化核酸とそれに対する相補的核酸からなる二重鎖核酸、又はこれらの相補的（一本鎖）核酸自体を含む。
【０１５４】
修飾はまた抗酸化ＬＤＬ抗体の重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインの外側に作製することもできる。そのような変異体核酸は、一又は複数のヌクレオチドが同じアミノ酸をコードする新しいコドンを有する他のヌクレオチドによって置き換えられるサイレント変異でありうる。そのような変異体配列は縮重配列でありうる。縮重配列は元々コードされていたアミノ酸配列の変化を生じないで他のヌクレオチドによって限られない数のヌクレオチドが置き換えられる点で遺伝暗号の意味内で変性される。そのような縮重配列は、重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインの最適な発現を得るために特定の宿主、特に酵母、最近又は哺乳動物細胞によって好まれるその異なった制限部位及び／又は特定のコドンの頻度のために有用でありうる。
【０１５５】
本発明は、ここに定義された特定の性質を有するポリペプチドのアミノ酸配列又はそのようなポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列と配列同一性又は配列相同性の度合いを有する配列（以下「相同配列」と称す）の使用を包含する。ここで、「ホモログ」なる用語は、対象のアミノ酸配列及び対象のヌクレオチド配列とある相同性を有しているものを意味する。ここで、「相同性」なる用語は、「同一性」と等しくできる。
【０１５６】
幾つかの実施態様では、相同のアミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列は機能的活性を保持し及び／又は抗体の活性を亢進するポリペプチドを提供し及び／又はコードしなければならない。幾つかの実施態様では、相同配列は、対象配列と少なくとも７５、８５、又は９０％同一であり、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一でありうるアミノ酸配列を含むものである。典型的には、相同体は対象アミノ酸配列と同じ活性部位等を含むであろう。相同性は類似性（つまり、類似の化学的性質／機能を有しているアミノ酸残基）によってもまた考慮されうるが、幾つかの実施態様では、配列同一性によって相同性を表現するのが好ましい。
【０１５７】
本文脈において、相同配列は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（対象配列）と少なくとも７５、８５、又は９０％同一であり、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一でありうるヌクレオチド配列を含むものである。典型的には、相同体は対象配列と活性部位等をコードする同じ配列を含むであろう。相同性は類似性（つまり、類似の化学的性質／機能を有しているアミノ酸残基）によってもまた考慮されうるが、幾つかの実施態様では、配列同一性によって相同性を表現するのが好ましい。
【０１５８】
（ｉｉ）組換え抗体の発現
以降の説明は主に、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターによって形質転換されたか形質移入された細胞を培養することによるポリペプチドの産生に関する。当然ながら、当分野でよく知られる代替的方法を用いてポリペプチドが調製されることが考えられる(例えば固相法又はインビトロタンパク質合成法)。
【０１５９】
ここに記載のポリヌクレオチドは、抗体の生産のために発現ベクターに挿入されうる。ここに記載された軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸を場合によっては定常領域に結合させ、発現ベクター中に挿入する。軽鎖及び重鎖を、同じ又は異なった発現ベクター中でクローニングすることができる。免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡセグメントを、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確実にする発現ベクター中の制御配列に作用可能に連結させる。発現制御配列は、限定しないが、プロモーター（例えば、天然に付随するか異種性のプロモーター）、シグナル配列、エンハンサーエレメント、及び転写終結配列を含む。
【０１６０】
適切には、発現制御配列は、真核生物宿主細胞（例えば、ＣＯＳ細胞-例えばＣＯＳ７細胞-又はＣＨＯ細胞）を形質転換し又は形質移入することができるベクター中の真核生物プロモーター系である。ベクターが適切な宿主中にひとたび導入されたならば、宿主がヌクレオチド配列の高レベルの発現、及び交差反応抗体の収集と精製に適した条件下に維持される。
これらの発現ベクターはエピソームとして又は宿主染色体ＤＮＡの一体部分として宿主生物中で典型的に複製可能である。
【０１６１】
選択遺伝子成分−一般に、発現ベクターは、典型的には、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にするために選択可能マーカー（例えばアンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性又はネオマイシン耐性）を含む（例えば、Itakura等, 米国特許第４７０４３６２号を参照）。幾つかの実施態様では、選択遺伝子は、（ａ）例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、又はテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、（ｂ）栄養要求性欠陥を補い、又は（ｃ）例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【０１６２】
選択スキームの一例では、宿主細胞の増殖を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換される細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
【０１６３】
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの他の例は、ここに記載の抗酸化ＬＤＬ抗体をコードする核酸の捕捉にコンピテントな細胞の同定を可能にするもの、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々である。
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Ｍｔｘ)を含む培地において形質転換体の全てを培養することで最初に同定される。野生型ＤＨＦＲが用いられる場合に適切な宿主細胞はＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞株（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ-９０９６）である。
【０１６４】
あるいは、ここに記載の抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲ遺伝子、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(ＡＰＨ)のような他の選択可能マーカーと共に形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーに対する選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照のこと。
【０１６５】
酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である(Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979))。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で増殖する能力に欠ける酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85:12 (1977)。酵母宿主細胞ゲノムにｔｒｐ１破壊が存在することは、ついでトリプトファンの不存在下における増殖による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ ２０，６２２又は３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。<BR>
【０１６６】
また、１．６μｍの円形プラスミドｐＫＤ１由来のベクターは、クルイヴェロマイシス(Kluyveromyces)酵母の形質転換に用いることができる。あるいは、組換え仔ウシキモシンの大規模生産のための発現系がＫ.ラクティス(lactis)に対して報告されている。Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)。クルイヴェロマイシスの工業的な菌株による組換え体成熟ヒト血清アルブミンの分泌のための安定した複数コピー発現ベクターもまた開示されている。Fleer 等, Bio/Technology,9:968-975 (1991)。
【０１６７】
シグナル配列成分−  抗酸化ＬＤＬ抗体は、組換え的に直接ばかりでなく、好ましくはシグナル配列又は成熟タンパク質又はポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種ポリペプチドとの融合体ポリペプチドとしても生産することができる。好ましく選択される異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識され、プロセシングされる（つまり、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、１ｐｐ、又は熱安定エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列と置換できる。酵母の分泌では、天然シグナル配列を、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（サッカロミセス(Saccharomyces)及びクルベロマイセス(Kluyveromyces)α因子イーダー）、又は酸ホスファターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス(C. albicans)グルコアミラーゼリーダー、又はＷＯ９０／１３６４６に記載のシグナルによって置換されうる。哺乳動物細胞発現では、哺乳動物シグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用できる。
【０１６８】
そのような前駆体領域のＤＮＡを、ここに記載の抗酸化ＬＤＬ抗体をコードするＤＮＡに読み枠を一致させてライゲートさせる。
複製起点−  発現ベクターとクローニングベクターは共にベクターが一又は複数の選択された宿主細胞で複製するようにする核酸配列を含んでいる。一般に、クローニングベクターでは、この配列は、ベクターを宿主染色体ＤＮＡとは独立に複製させるものであり、複製起点又は自己複製配列を含む。そのような配列は様々な細菌、酵母、及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点は殆どのグラム陰性細菌に適しており、２μプラスミド起点は酵母に対して適しており、様々なウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）が哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製起点成分は哺乳動物発現ベクターには必要ではない（ＳＶ４０起点はただそれが初期プロモーターを含んでいるので典型的に使用されうる）。
【０１６９】
プロモーター成分−  発現及びクローニングベクターは宿主生物によって認識され抗酸化ＬＤＬ抗体をコードする核酸に作用可能に結合しているプロモーターを通常含む。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、βラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターを含む。しかし、他の既知の細菌プロモーターも好適である。細菌系で使用するプロモータもまた抗酸化ＬＤＬ抗体をコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(Ｓ.Ｄ.)配列を含むであろう。
【０１７０】
真核生物に対してのプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ２５から３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から７０から８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルでありうるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクター中に適切に挿入される。
【０１７１】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ又は他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
【０１７２】
増殖条件によって制御される転写の更なる利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-ホスフェートデヒドロゲナーゼに対するプロモーター領域、及びマルトース及びガラクトース利用の原因である酵素である。酵母発現に使用する適したベクター及びプロモーターはＥＰ７３，６５７に更に記載されている。酵母エンハンサーもまた酵母プロモーターと共に有利に使用される。
【０１７３】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの抗酸化ＬＤＬ抗体の転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及び最も好ましくはサルウィルス４０(ＳＶ４０)、又は異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合性である限り、調節されうる。
【０１７４】
ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点を更に含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主中でＤＮＡを発現させる系が、米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の変形例は米国特許第４６０１９７８号に開示されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞中でのヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現について、Reyes等, Nature, 297：598-601(1982)を参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
【０１７５】
エンハンサーエレメント成分−  より高等の真核生物による抗酸化ＬＤＬ抗体をコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のためのエンハンサーエレメントについては、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、ＨＣＶ結合抗体コード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされうるが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
【０１７６】
転写終結成分−  真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、また転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、時には３'の非翻訳領域から一般に入手できる。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
【０１７７】
ポリヌクレオチド配列（例えば、可変重鎖及び／又は可変軽鎖コード化配列及び任意成分の発現制御配列）を含むベクターは、細胞宿主のタイプに応じて変わるよく知られた方法によって宿主細胞に移入されうる。例えば、塩化カルシウム形質移入が一般に原核生物宿主に対して利用され、リン酸カルシウム処理、電気穿孔法、リポフェクション、微粒子銃又はウイルスベースの形質移入が他の細胞宿主に対して使用されうる。一般にはSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2版, 1989)を参照。哺乳動物細胞を形質転換させるために使用される他の方法は、the use of ポリブレン、プロトプラスト融合、リポソーム、電気穿孔法、及びマイクロインジェクションの使用を含む（一般には、上掲のSambrook等を参照）。トランスジェニック動物の生産に対しては、導入遺伝子を受精した卵母細胞中に微量注入することができ、又は胚性幹細胞のゲノム中に導入することができ、かかる細胞の核を除核した卵母細胞中に移すことができる。
【０１７８】
重鎖及び軽鎖を別個の発現ベクターにクローニングしたとき、ベクターを同時形質移入して発現させ、インタクトな免疫グロブリンのアセンブリを得る。ひとたび発現されると、全抗体、それらの二量体、個々の軽鎖及び重鎖、又は他の免疫グロブリン形態を、硫酸アンモニウム沈降、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ精製、ゲル電気泳動等(一般的にはScopes, Protein Purification (Springer- Verlag, N.Y., (1982)を参照)を含む当該分野の標準的な手順に従って精製することができる。少なくとも約９０から９５％の均一性の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８から９９％又はそれ以上の均一性が、薬学的使用のため、最も好ましい。
【０１７９】
（ｉｉｉ）コンストラクト
典型的には、コンストラクトは、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの適切な宿主中における発現を可能にする発現ベクターである。コンストラクトは、例えば次のものの一又は複数を含みうる：宿主中で活性なプロモーター；一又は複数の調節配列、例えばエンハンサー；複製起点；及びマーカー、好ましくは選択可能マーカー。宿主は真核生物又は原核生物宿主でありうるが、真核生物（特に哺乳動物）宿主が好ましいであろう。適切なプロモーターの選択は明らかに使用される宿主細胞にある程度依存するが、ヒトウイルス、例えばＨＳＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ等からのプロモーターを含みうる。数多くのプロモーターが当業者に知られている。
【０１８０】
コンストラクトは、３つの軽鎖高頻度可変ループ又は３つの重鎖高頻度可変ループを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含みうる。あるいは、ポリヌクレオチドは、３つの重鎖高頻度可変ループ及び適切な長さの適切に可動性のリンカーによって結合させられた３つの軽鎖高頻度可変ループを含むポリペプチドをコードしうる。他の可能性は、単一のコンストラクトが軽鎖ループを含むものと重鎖ループを含むものの２つの別個のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含みうることである。別個のポリペプチドは独立に発現され得るか又は単一の共通のオペロンの一部を形成しうる。
【０１８１】
コンストラクトは、一又は複数の調節特性、例えばエンハンサー、複製起点、及び一又は複数のマーカー（選択可能等）を含みうる。コンストラクトは、プラスミド、酵母人工染色体、酵母ミニ染色体の形態を取り得、又はウイルス、特に弱毒ウイルス又はヒトに対して非病原性の類似物のゲノムの全て又は一部に組み込まれうる。
【０１８２】
コンストラクトは、哺乳動物、好ましくはヒトの患者に安全に投与するために簡便に製剤化されうる。典型的には、それらは複数のアリコートで提供され、各アリコートは少なくとも一の正常な成人ヒト患者の効果的な免疫化のために十分なコンストラクトを含む。
コンストラクトは液体又は固形形態で提供され得、好ましくは、使用前に滅菌された水が典型的には再水和させられる凍結乾燥粉末として提供される。
コンストラクトは、コンストラクトの投与に応じて（例えば特異的抗体力価によって測定して）患者の免疫応答を増大させる効果を有するアジュバント又は他の成分と共に製剤化されうる。
【０１８３】
（ｉｖ）ベクター
「ベクター」なる用語は発現ベクター及び形質転換ベクター及びシャトルベクターを含む。
「発現ベクター」なる用語はインビボ又はインビトロ発現可能なコンストラクトを意味する。
「形質転換ベクター」なる用語は、該種のものであり得、又は異なった種のものでありうる一実体から他の実体に移され得るコンストラクトを意味する。コンストラクトがある種から他の種へ移され得る場合、例えば大腸菌プラスミドから細菌、例えばバシラス属に移される場合、形質転換ベクターはしばしば「シャトルベクター」と呼ばれる。それは大腸菌プラスミドから植物のアグロバクテリウムへ移すことができるコンストラクトでさえありうる。
【０１８４】
ベクターは、本発明で包含されるポリペプチドの発現をもたらすために以下の記載の適切な宿主細胞中に形質転換されうる。よって、更なる態様では、本発明は、本発明で使用されるポリペプチドを調製するための方法であって、上に記載の発現ベクターで形質転換され又はそれが形質移入された宿主細胞を、ポリペプチドをコードするコード配列のベクターによる発現がもたらされる条件下で培養し、発現されたポリペプチドを回収することを含む方法を提供する。
【０１８５】
ベクターは、例えば複製起点、場合によっては上記ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーター及び場合によってはプロモーターの制御因子を有するプラスミド、ウイルス又はファージベクターでありうる。
ベクターは当該分野でよく知られている一又は複数の選択可能なマーカー遺伝子を含みうる。
【０１８６】
（ｖ）宿主細胞
宿主細胞は、例えば細菌、酵母又は他の真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、又は哺乳動物細胞でありうる。
本発明は、本発明に係るポリペプチドを製造するように遺伝子操作されたトランスジェニック多細胞宿主生物をまた提供する。生物は例えばトランスジェニック哺乳類生物（例えばトランスジェニックヤギ又はマウス株）でありうる。
【０１８７】
大腸菌は使用することができる一原核生物宿主である。他の微生物宿主は、桿菌、例えばバチルス・スブチリス、及び他の腸内細菌科、例えばサルモネラ、セラチア、及び様々なシュードモナス種を含む。これらの原核生物宿主において、典型的には宿主細胞と適合性がある発現制御配列（例えば複製起点）を含む発現ベクターを作製することができる。また、任意の数の様々なよく知られたプロモーターが存在し、例えばラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、βラクタマーゼプロモーター、又はファージλからのプロモーター系ある。典型的には、プロモーターは、場合によってはオペレーター配列と共に発現を制御し、転写及び翻訳を開始させ完了させるためのリボソーム結合部位配列等を有する。
【０１８８】
他の微生物、例えば酵母を発現に使用することができる。サッカロミセスは好ましい酵母宿主であり、発現制御配列(例えば、プロモーター)、複製起点、終結配列等を所望に応じて有する適切なベクターを含む。典型的なプロモーターは、３-ホスホグリセリン酸キナーゼ及び他の解糖酵素を含む。誘導性酵母プロモーターは、とりわけ、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソチトクロムＣ、及びマルトース及びガラクトース利用の原因の酵素を含む。
【０１８９】
微生物に加えて、哺乳動物組織細胞培養をまた用いて、ここに記載のヒト化抗体又はその断片を発現し、生産することができ、ある場合には好ましい（Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987)を参照）。ある実施態様に対しては、真核生物細胞（例えば、ＣＯＳ７細胞)が好ましいが、これは異種タンパク質（例えばインタクトな免疫グロブリン）を分泌可能な多くの適切な宿主細胞株が当該分野で開発されているためであり、ＣＨＯ細胞株、様々なＣｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、好ましくはミエローマ細胞株、又は形質転換されたＢ細胞又はハイブリドーマを含む。
【０１９０】
ある実施態様では、宿主細胞は脊椎動物宿主細胞である。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株(ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１)；ヒト胚腎臓株(２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977))；ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub等, P roc. Natl. Acad. ScL USA 77:4216 (1980)）又はＣＨＯ-ＤＰ-１２株；マウスのセルトリ細胞(ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))；サル腎細胞 (ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザル腎細胞(ＶＥＲＯ-７６, ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞(ＭＤＣＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ３Ａ, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞(Ｗ１３８, ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２, ＨＢ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞(ＭＭＴ０６０５６２, ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)である。
【０１９１】
あるいは、抗体コード化配列を導入遺伝子中に取り込み、トランスジェニック動物のゲノム内に導入し、続いてトランスジェニック動物の乳中で発現させることができる（例えば米国特許第５７４１９５７号；同第５３０４４８９号；及び同第５８４９９９２号を参照)。適切な導入遺伝子は、カゼイン又はβラクトグロブリンのような乳腺特異的遺伝子由来のエンハンサー及びプロモーターに作用可能に連結した軽鎖及び／又は重鎖のコード配列を含む。
【０１９２】
あるいは、ここに記載の抗体はトランスジェニック植物（例えばタバコ、トウモロコシ、ダイズ及びアルファルファ）において生産することができる。改善された「植物抗体」ベクター(Hendy等(1999) J. Immunol. Methods 231:137-146)及び形質転換性作物種の増加と組み合わさった精製方策が、かかる方法を、ヒト及び動物の治療法のためばかりでなく、工業的使用（例えば触媒抗体）のために組換え体免疫グロブリンを生産する実際的で効果的な手段にした。更に、植物生産抗体は安全で効果的であることが示され、動物誘導材料の使用を回避する。更に、植物及び哺乳動物細胞生産抗体のグリコシル化パターンの差は抗原結合又は特異性に殆ど又は全く影響を持たない。また、毒性又はＨＡＭＡは、植物由来の分泌性二量体ＩｇＡ抗体の局所経口投与を受ける患者には観察されなかった(Larrick等 (1998) Res. Immunol. 149:603-608を参照)。
【０１９３】
完全長抗体、抗体断片、及び抗体融合タンパク質は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされていない場合、例えば治療用抗体が細胞傷害剤（例えば毒素）にコンジュゲートされ、免疫コンジュゲート自体が腫瘍細胞破壊に効果を示す場合、細菌中で生産することができる。完全長抗体はより大なる循環半減期を有している。大腸菌中での生産は速く、より費用効率が高い。細菌中での抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、発現及び分泌を最適化するための翻訳開始領域（ＴＩＲ）及びシグナル配列を記載している米国特許第５６４８２３７号；米国特許第５７８９１９９号；及び米国特許第５８４０５２３号（これらの特許は出典明示によりここに援用される）を参照のこと。発現後、抗体は可溶型画分の大腸菌細胞ペーストから単離され、アイソタイプに応じて例えばプロテインＡ又はＧカラムを通して精製することができる。最終の精製は、例えばＣＨＯ細胞中で発現された抗体を精製するためのプロセスと同様に実施することができる。
【０１９４】
ここに記載のグリコシル化抗酸化ＬＤＬ抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。数多くのバキュロウイルス株及び変異株及びスポドプテラ・フルギペルダ（イモムシ）、ネッタイシマカ（蚊）、ヒトスジシマカ（蚊）、キイロショウジョウバエ（ショウジョウバエ）、及びカイコのような宿主からの対応する許容可能な昆虫宿主細胞が同定されている。形質移入のための様々なウイルス株が公的に入手でき、例えば、オートグラファ・カルフォニカＮＰＶのＬ-１変異株及びカイコＮＰＶのＢｍ-５株であり、かかるウイルスを、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質移入のために、本発明に係るここでのウイルスとして使用することができる。
【０１９５】
（ｖｉ）抗体の精製
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内、細胞膜周辺腔に生産され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生産される場合、第一の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。Carter等, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌された抗体の単離方法を記載している。簡単に述べると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム(ｐＨ３．５)、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド(ＰＭＳＦ)の存在下で約３０分間解凍する。細胞細片は遠心分離で除去できる。抗体が培地に分泌される場合、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はミリポアＰｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過装置を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の増殖を防止してもよい。
【０１９６】
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる(Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983))。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている(Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986))。アフィニティーリガンドが結合されるマトリックスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成できるものより早い流量及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィー(例えばポリアスパラギン酸カラム)、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される抗体に応じて利用可能である。
【０１９７】
予備的精製工程に続いて、興味ある抗体及び汚染物質を含む混合液に、ｐＨ約２．５−４．５、好ましくは低塩濃度(例えば約０−０．２５Ｍ塩)の溶出緩衝液を用いて低ｐＨ疎水性作用クロマトグラフィーを施すことができる。
【０１９８】
ＩＶ．薬学的組成物
ここに記載の方法及び使用における使用のための、抗酸化ＬＤＬ抗体を含んでなる薬学的組成物をここに提供する。本発明に従い使用される抗体の薬学的製剤は、保存のために、所望の純度を有する抗体を任意の薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤と混合することにより(Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態に調整される。許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスフェート、シトレート、及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料(例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質複合体)；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１９９】
幾つかの実施態様では、抗酸化ＬＤＬ抗体を含んでなる薬学的製剤は凍結乾燥される。このような凍結乾燥製剤は適切な希釈液を用いて高タンパク質濃度に再構成され得、再構成された製剤は、ここに記載の治療される哺乳動物に皮下投与されうる。
該抗体又は抗体の結晶化形状がまた考えられる。例えばＵ．Ｓ．２００２／０１３６７１９Ａ１ (Shenoy et al.)を参照のこと。
【０２００】
ここに記載の製剤はまた、治療される特定の徴候に対して必要に応じて一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有してもよい。例えば、抗炎症性物質、抗糖尿病剤、及び／又は「スタチン」クラスのコレステロール降下剤を更に投与することが所望されうる。幾つかの実施態様では、方法及び使用は、第二の活性薬剤を投与することを含む。幾つかの実施態様では、方法及び使用は第二の活性薬剤を投与することを含み、第二の活性薬剤はインスリンである。インスリンは、速効作用性、短時間作用性、通常作用性、中間型作用性、又は長時間作用性インスリンである。幾つかの実施態様では、インスリンはヒューマログ、リスプロ、ノボログ、アピドラ、ヒューマリン、アスパルト、レギュラーインスリン、ＮＰＨ、レンテ、ウルトラレンテ、ランタス、グラルギン、レベミル、又はデテミルであり得及び／又は含みうる。幾つかの実施態様では、方法及び／又は使用は第二の活性薬剤を投与することを含み、第二の活性薬剤はスタチンである。スタチンは、アトルバスタチン(例えばリピトール又はトルバスト)、セリバスタチン(例えばリポベイ又はバイコール)、フルバスタチン(例えばレスコール又はレスコール)、ロバスタチン(例えばメバコ−ル、アルトコール、又はアルトプレブ)メバスタチン、ピタバスタチン(例えばリバロ又はピタバ)、プラバスタチン(例えばプラバコール、セレクチン、又はリポスタット)ロスバスタチン(例えばクレストール)、シンバスタチン(例えばゾコール又はリペックス)、バイトリン、アドビコール、ベシレートカデュエット又はシムコールであり得及び含みうる。このような他の製剤のタイプ及び有効量は、例えば、製剤に存在する抗体の量及び被験体の臨床パラメーターに依存する。これらは一般的に前記で使用されたのと同じ投薬量及び投与経路で、又は前記で採用した用量の約１から９９％で使用される。幾つかの実施態様では、第二の活性剤及び抗酸化ＬＤＬ抗体は単一薬学的製剤である。幾つかの実施態様では、第二の活性剤及び抗酸化ＬＤＬ抗体は別個の製剤中にある。
【０２０１】
また活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されるマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリー系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)に、あるいはマクロエマルションに捕捉させうる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A.編 (1980)に開示されている。
【０２０２】
徐放性調合物を調製してもよい。徐放性調合物の適切な例は、抗体を含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリックスを含み、そのマトリックスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチルメタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号)、Ｌ-グルタミン酸とγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸が含まれる。
【０２０３】
インビボ投与に使用される製剤は無菌でありうる。これは、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
【０２０４】
Ｖ．製造品
ここに記載の抗酸化ＬＤＬ抗体は、ここに記載の方法及び使用に関する指示を含んでなる製造品内に収容されてもよい。好ましくは、製造品は：（ａ）容器内にここに記載の抗酸化ＬＤＬ抗体及び薬物学的に許容可能な担体又は希釈剤を含んでなる組成物を含んでなる容器：及び（ｂ）インスリン抵抗性を患っている及び／又は増加されたインスリン感受性を必要としている被験体に組成物を投与するための指示を有するパッケージ挿入物を含む。
【０２０５】
幾つかの実施態様では、被験体はメタボリックシンドロームを有する。幾つかの実施態様では、被験体はメタボリックシンドロームを発生する危険性にある。幾つかの実施態様では、被験体は、（ａ）男性では約１０２ｃｍ以上及び女性では約８８ｃｍ以上のの腹囲、（ｂ）約１５０ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時トリグリセリド、（ｃ）約９５ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時グルコース、及び（ｄ）高レベルの酸化ＬＤＬから成る群から選択される一又は複数の特徴を有する。幾つかの実施態様では、被験体が糖尿病に関連する炎症を更に有する。幾つかの実施態様では、被験体は一晩絶食後、約９５ｍｇ／ｄＬ以上の血液グルコースレベルを有する。幾つかの実施態様では、被験体は一晩絶食後、約１２６ｍｇ／ｄＬ以上の血液グルコースレベルを有する。幾つかの実施態様では、被験体は２時間の経口グルコース負荷試験後、約１４０ｍｇ／ｄＬ以上の血液グルコースレベルを有する。幾つかの実施態様では、被験体は２時間の経口グルコース負荷試験後、約２００ｍｇ／ｄＬ以上の血液グルコースレベルを有する。幾つかの実施態様では、被験体は糖尿病前症を有する。幾つかの実施態様では、被験体は糖尿病を患う。幾つかの実施態様では、糖尿病は、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病及び妊娠糖尿病からなる群から選択される。幾つかの実施態様では、糖尿病はＩＩ型糖尿病である。
【０２０６】
製造品は容器と該容器上又はそれに付随したラベル又はパッケージ挿入物を含んでなる。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ等が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成されうる。容器は、インスリン感受性の治療に効果的な組成物を保持又は収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤は抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物は、抗体及び提供される任意の他の薬物の投与量及び間隔に関する特定の指導と共に、組成物がインスリン感受性をそれらに苦しむ患者において治療するたに用いられることを示す。更に製造品は、薬剤的に許容可能な希釈バッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝液食塩水、リンガー液およびデキストラン溶液等を含んでなる第二の容器を有してもよい。製造品は更に他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業及び使用者の立場から望ましい他の材料を含んでもよい。
【０２０７】
場合によっては、ここに記載の製造品は、抗体の他に別の（例えば第二の）薬剤を含んでなる、及びかかる薬剤を用いて哺乳動物を治療することの指示を更に含んでなる容器を更に有する。幾つかの実施態様では、第二の薬剤は抗炎症剤、抗糖尿病剤、及び／又は「スタチン」クラスのコレステロール降下剤である。幾つかの実施態様では、第二の活性剤はインスリンである。幾つかの実施態様では、インスリンは、速効性、短時間作用性、通常作用性、中間型作用性、又は長時間作用性インスリンである。幾つかの実施態様では、インスリンはヒューマログ、リスプロ、ノボログ、アピドラ、ヒューマリン、アスパルト、レギュラーインスリン、ＮＰＨ、レンテ、ウルトラレンテ、ランタス、グラルギン、レベミル、又はデテミルであり得及び／又は含みうる。幾つかの実施態様では、方法及び／又は使用は第二の活性薬剤を投与することを含み、第二の活性薬剤はスタチンである。スタチンは、アトルバスタチン(例えばリピトール又はトルバスト)、セリバスタチン(例えばリポベイ又はバイコール)、フルバスタチン(例えばレスコール又はレスコール)、ロバスタチン(例えばメバコ−ル、アルトコール、又はアルトプレブ)メバスタチン、ピタバスタチン(例えばリバロ又はピタバ)、プラバスタチン(例えばプラバコール、セレクチン、又はリポスタット)ロスバスタチン(例えばクレストール)、シンバスタチン(例えばゾコール又はリペックス)、バイトリン、アドビコール、ベシレートカデュエット又はシムコールであり得及び含みうる。
【０２０８】
「パッケージ挿入物」は、指示、使用法、用量、投与、禁忌、包装された製品と組合せられる他の治療用製品、及び／又はこのような治療用製品の使用に関する注意についての情報を含む、治療用製品又は薬物の市販パッケージに常套的に含まれる指示を意味するために使用される。
本発明の更なる詳細が、以下の非限定的な実施例により示される。本明細書において開示される全引例を、出典明記により本明細書に援用する。
【０２０９】
実施例
実施例は、本発明の純粋な例示であることを意図し、よって本発明を限定するものと決して考えるべきではなく、また上で検討された発明の態様及び実施態様を記載し詳述する。上記実施例及び詳細な記載は例証のために提供されるものであり、限定のためではない。
実施例１−高脂肪及びフルクトース摂取アカゲザルにおける血清バイオマーカー及びインスリン抵抗性への高酸化ＬＤＬ抗体の効果
【０２１０】
炎症、代謝、凝固促進活性、及びインスリン抵抗性の血清マーカーへの抗酸化ＬＤＬ抗体の効果を調査するために、高脂肪及びフルクトース摂取アカゲザルを抗酸化ＬＤＬ抗体で処置した。
【０２１１】
実験計画
ベースライン期間（フルクトースの再開；最初の３ヵ月）
フルクトース補給の開始前に、静脈内グルコース負荷試験（ＩＶＧＴＴ）、体脂肪に関して二重エネルギーＸ線光吸収分析（ＤＥＸＡ）走査、及び頸動脈内膜-中膜厚（ＣＩＭＴ）の超音波計測を各動物に一度実施した。同時に（ＩＶＧＴＴのためのグルコース投与の前に）尿サンプルをケージパンから３−１０ｍＬ回収することにより、各動物から収集した。２つの血液サンプル（フルクトース前１及びフルクトース前２、表４に記載、図１も参照）を各１０の動物から、４日以上離して採取した。１つはグルコースの投与の前、ＩＶＧＴＴのための鎮静時であってもよい。
【０２１２】
全動物への走査が完了した後、第二の血液サンプル採取後、７匹の高脂肪及びフルクトース補充食（「ＨＦＤ」）動物へのフルクトース補充を開始し、研究の終了まで継続した （ＨＦＤ＝高脂肪＋フルクトース食、限られた運動；動物番号１９２６７、２０１６９、２０２８０、２０２８２、２０３５８、２１０７４、２１９３）。３匹の他の動物は普通食を与えた（普通食グループ＝普通食＋普通運動；動物番号１９８３６、１９８４３、２３５２７）。
【０２１３】
血液サンプルを、表４に記載のようにベースライン期間の間に全１０匹の動物から採取した。図１をまた参照。３ヵ月のベースライン期間の終わりに、全１０匹の動物は再度ＩＶＧＴＴ、ＤＥＸＡ及びＣＩＭＴを受け、そして尿サンプルを収集した。
【０２１４】
処置期間
ベースライン期間の完了後、全１０匹の動物を、１２週の間、週に一度、静脈内に１０ｍｇ／ｋｇの用量で抗酸化ＬＤＬ抗体（２Ｄ０３）で処置した。投与量は毎週体重に対し調節した。投与は、使い捨てのシリンジ及び針又はバタフライ型カテーテルを使用して腕又は脚の浅静脈（例えば橈側皮静脈、伏在静脈）により静脈内投与した。静脈内注射の後に、およそ１ｍＬの生理食塩水洗浄を行った。実験において使用した抗酸化ＬＤＬ抗体製剤は、２０ｍＭのヒスチジン酢酸、１５０ｍＭのアルギニン酢酸、及び０．０２％のポリソルベート２０（ｐＨ  ５．５）中において１５０ｍｇ／ｍｌの２Ｄ０３であった。
【０２１５】
合計１３の投与を各動物に行った。投薬のこの第一日目を研究０日目とした。動物は研究０、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０、７７及び８４日目に投与された。最初の投与の日を研究０日目とする。研究０日目に先行する全日程を、研究−１日目、研究−２日目等とする。研究０日目に続く全日程を、研究１日目、研究２日目等とする。治療期間の間、血液サンプルを下の表４に定めるように様々な時間点で採取した。図１もまた参照のこと。最終用量の投与の後一週間内に全動物は再度ＩＶＧＴＴ／ＤＥＸＡ／ＣＩＭＴ及び採尿を受けた。
【０２１６】
治療後観察期間
抗酸化ＬＤＬ抗体（２Ｄ０３）の最終用量の投与の後、全１０匹の動物を更に１２週間観察した。下記の表４に記載のように、血液サンプルを期間を通して様々な時間点で採取した。観察期間の最後に、最終のＩＶＧＴＴ／ＤＥＸＡ／ＣＩＭＴを行い、最終的な尿サンプルを収集した。
2013503195.tif 000014
2013503195.tif 000015
2013503195.tif 000016
【０２１７】
材料及び方法
実験で使用した動物
Macaca mulatta (アカゲザル)を実験で使用した。アカゲザルは、このクラスの医薬に反応する認容非ヒト霊長動物モデルである。高脂肪及びフルクトース摂取及び制限された運動の場合、これらの動物は、過去の研究において、インスリン耐性を有するヒトに見られるインスリン耐性のほとんどの特徴を呈することが示された。これらのサルの使用は、ヒトに見られると予期されうるものに定量的及び定性的に類似である実験反応を同定する可能性を最大にする。
【０２１８】
投薬時のこれらのサルの体重範囲は、ＨＦＤ動物が１４．４から２１ｋｇ、普通食グループで７．８から９．８の範囲であった。これらのサルは全て雄、９．５から１２．５歳の非ナイーブ動物であった。
【０２１９】
ＨＦＤ及び普通食
ＨＦＤグループの動物は、Customized Primate Research Center Diet 5A1F (Lab Diet, Inc.)を与えられた。動物は一日当たり２０までのビスケットを午前に半分午後に半分提供された。これらの動物はまた、毎日、ピーナッツバター食（３００ｋｃａｌ）及びリンゴ半分を与えられた。動物は、彼らの朝食を１０：００に与えられ、朝食の残りは１４：００に撤去された。夕食は１５：００に与えられ、食事の残りを１７：００に撤去された。消灯時の間は動物に食物を入手可能としなかった。ＨＦＤグループの各動物はまた、週に３回、５００ｍＬの１０％フルクトースのcherry Kool-Aidを与えられた。
【０２２０】
普通食グループの動物は、Monkey Diet #5038又はMonkey Diet Jumbo #5037(Lab Diet Inc.)を与えられた。動物は一日当たり２０までのビスケットを午前に半分午後に半分提供された。普通食グループの動物は、フルクトース補充は受けなかった。彼らは上記と同様に食事が与えられた。
各動物の食物摂取量（ビスケット・カウント）を研究の間、モニタし記録した（週末を除く）。
【０２２１】
空腹時サンプルを得るために、サンプリングの日の採血後まで食物は（夕食の後）一晩動物に与えられなかった。
【０２２２】
グルコース及びインスリン耐性試験
ＩＶＧＴＴを、無菌デキストロース溶液（６００ｍｇ／ｋｇ）の静脈内ボーラス注入後、血液グルコースクリアランスを測定することによって実施した。動物を試験の前に一晩絶食にし、手順のためにＴｅｌｅｚｏｌ（３ｍｇ／ｋｇ）によって鎮静させた。１ｍＬの血液サンプルを、デキストロースの投与前、及びデキストロースの投与後１、３、５、１０、２０、４０及び６０分で採取した。血液グルコースを、グルコメーター(Onetouch Ultra Blood Glucose Monitor; LifeScan; Milpitas, CA)で全血において直ちに測定した。血漿をImmulite 2000を用いてONPRC/OHSU Endocrine Services Laboratory (Portland, OR)により、インスリンに対して検定した。グルコース及びインスリンレベルを時間に対してプロットした、インスリン及びグルコース曲線下面積（ＡＵＣ）をPrism GraphPadソフトウェアを使用して算出した。
【０２２３】
ＤＥＸＡスキャン
体組成分析のために、動物をＴｅｌｅｚｏｌ（３ｍｇ／ｋｇ）で鎮静しケタミンによって鎮静を維持した。動物をDEXA（Hologic Discovery A）上に横たえ、全身スキャンを実施した。中央体脂肪量並びに全体脂肪を算出した。これを中央及び全除脂肪量と比較した。
【０２２４】
頸動脈超音波走査
動物をケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ）によって鎮静した。頸動脈をSiemens Doppler Ultrasound machineを用いて画像化した。頸動脈の内膜厚をSiemensからの自動化ソフトウェアパッケージにより算出した。
【０２２５】
体重
処置期間の間、被験物質体積を用量１０ｍｇ／ｋｇに保つために、投与の前日、給餌の前に全動物の体重を測定した。ベースライン及び処置後観察期間の間、２週間に一度動物の体重を測定した。
【０２２６】
採尿
尿サンプルを、フルクトース前、−１週目、１２週目（最終投与後）、及び２４週目に各動物から収集した。３のクリーン尿１０ｍＬをケージパンから回収することにより各動物から収集した。尿を遠心分離し大きいデブリを除去し、動物番号、研究日、日付、及びサンプルタイプ（「尿」）で標識された清潔な管に入れられた。
【０２２７】
採血及び処理
静脈血液サンプルを、表４に示す研究において各１０の動物から採取した。
ＲＴＴにおいて収集した血液（血清）を室温で２０−３０分間凝固させ、血清を得るために遠心分離した。管を、動物番号、サンプル時間点、サンプル表記（「尿」）、及び日付で清潔に標識した。血清をドライアイス上で発送されるまでおよそ７０℃で保管した。これらのサンプルを、様々なバイオマーカー、被験物質及び抗被験物質抗体レベル、及び血清化学プロファイルに関して検定した。
【０２２８】
血球算定法及びヘモグロビンＡ１ｃのためにＬＴＴにおいて採取した血液（ＥＤＴＡ）を冷蔵し検定のために移した。
LipoScienceの脂質プロファイル分析のためにＬＴＴにおいて採取した血液（ＥＤＴＡ）を、遠心分離し血漿を得た。血漿を、動物番号、サンプル時間点、サンプル表記（「ＥＤＴＡ血漿」）、及び日付で標識された清潔なプラスチック管に移した。管を４℃（冷蔵）で保管し、分析のためにウェットアイス上で一晩発送した。
【０２２９】
PaxGene管に採取した血液を、赤血球溶解のために、採取後２時間室温に置かせた。次いで管を将来のマイクロアレイ分のために７０℃のフリーザーに移した。
ＧＴＴにおいて採血された血液（リチウムヘパリン）を、Ｔ細胞分析のために免疫学の専門家に移した。Ｔ細胞ソーティングから回収された細胞を将来のサイトカイン発現／放出分析のために７０℃で保管した。
ＢＴＴにおいて採取された血液（クエン酸ナトリウム）を遠心分離し血漿を得た。血漿を、動物番号、サンプル時間点、サンプル表記（「クエン酸血漿」）、及び日付で標識された清潔なプラスチック管に移し、７０℃で保管した。
【０２３０】
アッセイ
血清２Ｄ０３濃度
２Ｄ０３濃度の測定のための血清サンプルを、７０℃で保管し検定の直前に解凍した。各血清サンプルの２Ｄ０３の濃度を、抗原結合ベースＥＬＩＳＡ法を用いて決定した。アッセイでは、捕獲剤としてＭＤＡ ＡｐｏＢ１００ (Academy BioMedical Company, Inc.; Houston, TX)及び検出剤としてウサギ抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ(Dako; Glostrup, Denmark)を使用した。検定の報告対象となる範囲はウェルにおいて１．４から１９５ｎｇ／ｍＬであった。１：２００の最小の血清サンプル希釈を全てのサンプルに使用した。最小の定量化可能濃度は２８０ｎｇ／ｍＬであった。
【０２３１】
抗治療抗体アッセイ
抗治療抗体（ＡＴＡ）レベルを、７０℃で保管し試験前に解凍した血清から、Meso Scale Discovery (MSD) 電気化学発光プラットフォーム (Gaithersburg, MD)のために開発されたアッセイを使用して測定した。
【０２３２】
Rules Based Medicine Multi Analyte Profile
冷凍された血清を、Human Multi Analyte Profile (version 1.6)、８９の異なるバイオマーカーの専有LuminexベースアッセイのためにRules Based Medicine Inc. (Austin, TX)に提出した。幾つかの重要な分析をまた、アカゲザル分析物を捕獲すると立証された特異的アカゲザル抗体又はヒト抗体を使用してＥＬＩＳＡにより測定した。
【０２３３】
酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）
全アッセイを、市販のキットを使用して、また製造者の指導に従い実施した。アッセイは、アカゲザル分析物を捕獲すると立証されたアカゲザル特異的抗体又はヒト抗体を使用した。幾つかの分析物はRules Based Medicine多分析物パネルにおいても測定されたものと同一であった。以下の分析物を、７０℃で保管し検定の前に解凍した血清においてＥＬＩＳＡにより測定した：
・酸化ＬＤＬ: Oxidized LDL Competitive ELISA kit, Mercodia, Inc., Catalog No. 10 1158 01
・顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ-ＣＳＦ）: Monkey GM CSF kit, Cell Sciences, Inc., Catalog No. CKM000
・インターフェロンガンマＩＦＮ-γ: Interferon gamma (Monkey) EIA kit, ALPCO Immuno assays, Inc., Catalog No. 45 IFNMK E01
・腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ-α）: TNF-α Monkey ELISA Kit, Invitrogen Inc., Catalog No. KPC3011
・アディポネクチン: Human Serum Adiponectin Kit Acrp30, Alpha Diagnostic International, Inc. Catalog No. 100 140 ADH
・C反応性タンパク質（ＣＲＰ）: Monkey C Reactive Protein Kit, Alpha Diagnostics Inc., Catalog No. 1050
・インターロイキン-１８（ＩＬ-１８）: IL-18 Kit, MBL, Inc., Catalog No. 7620
・インターロイキン-８（ＩＬ-８）: Interleukin-8 ELISA Kit, R&D, Inc., Catalog No. D8050
・可溶性ＣＤ４０（ｓＣＤ４０）: Soluble CD40 ELISA kit, Kamya Biomedical, Catalog No. KT 004
・インターロイキン-１受容体アンタゴニスト（ＩＬ-１ｒａ）: IL 1ra kit, Biosource International (now Invitrogen), Catalog No. KAC1181
・単球走化性タンパク質1 （ＭＣＰ-１）: Monocyte chemoattractant protein 1 ELISA kit BD OptEIA, Becton Dickinson, Catalog No. 559017
・インターロイキン６（ＩＬ-６）: Monkey Interleukin 6 ELISA Kit, Cell Sciences, Inc., Catalog No. CKM005
・インターロイキン１ベータ（ＩＬ-１β）: Monkey Interleukin 1 beta ELISA Kit, Cell Sciences, Inc., Catalog No. CKM039。
【０２３４】
リポタンパク質粒子分析
新鮮なＥＤＴＡ抗凝固剤処置血漿（冷蔵）を、LipoScienceに、リポタンパク質細画分の核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析のために一晩で発送した。
【０２３５】
以下の１０のサブクラスカテゴリの濃度を測定した：大ＶＬＤＬ（存在すればキロミクロンを含む）（＞６０ｎｍ）、中ＶＬＤＬ（３５−６０ｎｍ）、小ＶＬＤＬ（２７−３５ｎｍ）、ＩＤＬ（２３−２７ｎｍ）、大ＬＤＬ（２１．２−２３ｎｍ）、中小ＬＤＬ（１９．８−２１．２ｎｍ）、超小ＬＤＬ（１８−１９．８ｎｍ）、大ＨＤＬ（８．８−１３ｎｍ）、中ＨＤＬ（８．２−８．８ｎｍ）、及び小ＨＤＬ（７．３−８．２ｎｍ）。「中小」及び「極小」ＬＤＬサブクラスは、脂質レベル及び冠疾患及び糖尿病の結果と非常に類似した相関を有すると分かったため、それらを一つの「小ＬＤＬ」サブクラス（１８−２１．２ｎｍ）にグループ化した。ＶＬＤＬ及びＬＤＬサブクラス粒子濃度をｎｍｏｌ／Ｌの単位で与え、ＨＤＬサブクラスのものをμｍｏｌ／Ｌにおいて与えた。サブクラスレベルの更なる合計はまた、全ＶＬＤＬ、ＬＤＬ（ＩＤＬを含む）及びＨＤＬ粒子濃度を提供した。重み付き平均ＶＬＤＬ、ＬＤＬ及びＨＤＬ粒子サイズ（ｎｍ直径単位）を、そのＮＭＲシグナルの振幅から推定されるその相対質量百分率を乗じた各サブクラスの直径の合計として算出した。
【０２３６】
血清化学パネル
１７の分析物に加えてＨＤＬ、ＬＤＬ、コレステロール及びトリグリセライドの標準血清化学プロファイルを、Roche Cobas Integra 400マルチチャンネル化学分析計(Roche, Inc.; Indianapolis, IN)を使用して、７０℃で保管し検定直前に解凍した血清から実施した。インスリンレベルを、Siemens Immulite 2000イムノアッセイ分析計(Siemens, Inc.; Piscataway, NJ)を使用して同じ解凍血清から測定した。
【０２３７】
尿分析
７０℃で保管した尿を解凍し、尿試験紙(Multistix SG 10, Siemens, Inc.; Piscataway NJ)によって試験した。
【０２３８】
全血球計算
１０の血液パラメーターの標準パネルを、Horiba ABX Pentra 60 C (Horiba ABX; Irvine, CA)を使用して、新鮮なＥＤＴＡ抗凝固処置した全血に実施した。
【０２３９】
ヘモグロビンＡ１ｃ
ＨｂＡ１ｃレベルを、Bayer (Pittsburgh, PA)からのA1cNowキットを使用し、製造者の指示に従いＥＤＴＡ抗凝固処置の全血から測定した。
【０２４０】
Ｔ細胞表現型検査及び選別
Ｔ細胞表現型検査を、フルクトース給餌の開始前、投与の開始前、投与６週目（投薬７の投与前）、及び最終投薬後１０週間で実施した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をFicoll-Histopaque (Sigma; St Louis, MO)での遠心分離後に全血から単離した。細胞を制御凍結保存機器手順(CryoMed Freezer No. 7454; ThermoForma; Marietta, OH)を使用することによって、次の分析のために冷凍した。全ての抗体をPharMingen (San Diego, CA)、Ebioscience (San Diego, CA)、又はCaltag (Burlingame, CA)から購入し、製造者の推奨に従って使用した。サンプルをFACSCalibur又はFACSLSRII (Becton Dickinson; San Jose, CA)を使用して収集し、データをCellQuest (BD Biosciences; Mountain View, CA)又はFlowJo (Treestar; Ashland, OR)を使用して分析し、サンプルにつき最低で１０５のイベントを収集した。
【０２４１】
薬物動態分析
２Ｄ０３の薬物動態（ＰＫ）パラメーターを、WinNonlin Professional Edition (version 5.2.1, Pharsight Corporation; Mountain View, CA)を使用して非コンパートメント解析により算出した。公称投与量及びサンプリング時間を使用した。
以下のパラメーターを推定した：
・Ｃｍａｘ−血清中の最大観察濃度
・ｔ１／２― 排出半減期
・ＡＵＣ０−７−線形台形公式により推定された、０から７日目の血清濃度時間曲線下面積
・ＡＵＣτ−線形台形公式により推定された、定常状態示す８４から９１日目の血清濃度時間曲線下面積
・ＣＬＳＳ−定常状態のクリアランス
・ＶＳＳ−定常状態の分布容積
・ＡＲ−Ｃｔｒｏｕｇｈの蓄積比（８４及び７日目での投与前濃度の比率）。
【０２４２】
統計解析
有意性の不定推定（Occasional estimates）を多測定に対する補正を適用することなくペアｔ検定評価を使用して算出した。
【０２４３】
結果
ＩＶＧＴＴ
グルコース負荷試験の結果を表５に示す。２Ｄ０３治療期間の間、１０の内８の動物においてインスリン感受性における改善があり（インスリンＡＵＣの低下）、１匹を除く全ての動物が１２週休薬後にベースラインインスリンＡＵＣ（の増加）への回帰を示した（図２Ａ）。ＩＶＧＴＴ前血清グルコースレベルは、この研究の間変化しなかった。７匹の内４匹のＨＦＤ動物が、研究全体にわたって上昇又は非常に可変のＩＶＧＴＴ前血漿インスリンレベルを有した。他の３匹のＨＦＤ動物は、３匹のコントロールのサルと類似の血漿インスリンレベルを有した。ＩＶＧＴＴ前インスリンは、２Ｄ０３を用いた処置の間１０匹の動物の内７匹において減少し、そして休薬後に１０匹の動物の内６匹において増加した（図２Ｂ）。
ＩＶＧＴＴにより示されるインスリン感受性は、高フルクトース食動物において、２Ｄ０３を用いた治療後増加した（上昇インスリンレベルの有無）（図３Ａ）。更に、ＩＶＧＴＴ実験を使用したインスリンＡＵＣにより測定された耐糖能は、高フルクトース食及び普通食動物の双方において、２Ｄ０３を用いた治療後低減した（図３Ｂ）。
2013503195.tif 000017
2013503195.tif 000018
【０２４４】
２Ｄ０３処置に起因するパーセント体脂肪量又はパーセント躯幹脂肪量における著しい変化は無かった。２匹のコントロール動物(動物１９８３６及び２３５２７）は、９ヶ月の研究の間、それらの体脂肪を著しく増加した。
【０２４５】
体重
ＨＦＤグループの平均体重変化は、−９週から２４週の実験期間の間、＋０．５ｋｇ（−０．２〜＋０．８範囲）であった。１匹のコントロール動物（動物１９８４３）は、その期間において体重変化を見せなかったが、動物１９８３６は１．６ｋｇを得て、動物２３５２７は２．７ｋｇを得た。高脂肪食の持続的な消費に関わらず、ＨＦＤ動物は
３匹のコントロール動物の内２匹程の体重の増加はなかった。
【０２４６】
食物摂取量
食物摂取量は、実験の間、変化しなかった。
【０２４７】
分析
血清２Ｄ０３濃度
最初の静脈内投与後の平均２Ｄ０３ Ｃｍａｘは２３６±３０μｇ／ｍＬであった。最終の静脈内投与後の平均２Ｄ０３ Ｃｍａｘは２８６±４６μｇ／ｍＬであった。全ての動物が、初回投与後およそ３６及び４９μｇ／ｍＬ間の、最後から二番目の投与後２３及び１３７μｇ／ｍＬの間の２Ｄ０３のトラフ血清レベルを得た。
【０２４８】
抗治療抗体（ＡＴＡ）分析
２Ｄ０３に対する抗体を、１１２、１２６及び１４０日目に動物１９２６７からの血清において検出し、１４日目を超えるとそのサルでは血清濃度下降となった。この動物に関する血清濃度は、残りの動物のものより一定して低かった。更に、ＨＦＤグループの動物２０１６９及び２１９３７及びコントロールグループの動物１９８３６及び１９８４３は、回復期の間、２Ｄ０３に対する抗体について陽性であった：しかしながら、血清２Ｄ０３濃度は、ＡＴＡに対して検査陽性でなかったそれらのサルと類似であった。
【０２４９】
Rules Based Medicine多分析物アッセイ
８９のパラメータを、Rules Based Medicineによって試験した。以下の分析物が治療期間の間著しい変化を示した：ＧＭ-ＣＳＦ、ＥＮ-ＲＡＧＥ、ＦＧＦ-ベーシック、ＩＬ-１β、ＴＮＦ-α、ＩＬ-１３、ＩＬ-１５、インターフェロン-γ及びトロンボポイエチン。
全動物において８週時間点でスパイクされたＧＭ-ＣＳＦレベルは、治療期間の最後ではベースラインへ向かい、４週間でベースライン値に戻った。
【０２５０】
ＥＮ-ＲＡＧＥ、ＦＧＦ-ベーシック、ＩＬ-１β及びＴＮＦ-αレベルは全て２Ｄ０３治療の間減少し、休薬期間の終わりまで低いままであったが、ＦＧＦ-ベーシックはベースライン値への幾らかの回復を示した（例えば、図４及び５を参照）。
ＩＬ-１３及びＩＬ-１５の値はＲＢＭアッセイの検出限界に近かったが、双方とも２Ｄ０３治療の間、減少を示し、休薬期間まで持続した（それぞれ、図６及び７Ａ）。インターフェロン-γレベルは治療期間の間、若干上昇し、休薬期間の最初の４週間上昇を続け、２０週目に短期の下降、及び２４週目に別の増加を示した（図７Ｂ）。
トロンボポイエチンレベルは２Ｄ０３処置の間増加し、休薬期間の間にベースラインに戻った。
【０２５１】
酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡによって測定した酸化ＬＤＬは実験期間の間変動したが、２Ｄ０３処置の間この分析物への明瞭な効果は見られなかった。
フルクトース補充の開始後、ＨＦＤ動物はコントロール動物より高いＩＬ-１βレベルを示した。これらのレベルは、２Ｄ０３処置期間の間、コントロール動物のレベルに対し著明に減少した。この減少は、休薬期間の終わりまで維持された（図８Ａ）。ＩＬ-１βの著しい減少はまた、ＲＢＭアッセイで測定された（図５Ｂを参照）；しかしながら、治療前値におけるＨＦＤ及びコントロールグループ間の分離は、これらの結果において明らかではなかった。測定された絶対値もまた、いくらか低かった。
【０２５２】
ＴＮＦ-αの治療前レベルは、コントロールと比較してＨＦＤ動物において上昇した。これらのレベルは、治療期間の間顕著に減少され、減少は休薬期間にわたり維持された（図８Ｂ）。
ＥＬＩＳＡによって測定したＩＬ-６は、２Ｄ０３療期間の間に変動性に小さな増加を示し、休薬期間にわたり持続した。ＲＢＭパネルにおいて測定されたＩＬ-６レベルは高く変動したが、投与中変動性に増加はしなかった（図９Ａ−Ｂ）。
【０２５３】
研究の間、ＩＬ-１受容体アンタゴニスト（ＩＬ-１ｒａ）レベルにおける変化はなかった。この研究の９ヶ月の間何れの動物においても、アディポネクチン、ＣＲＰ、ＩＬ-１８又は可溶性ＣＤ４０リガンドにおける顕著な変化はなかった。これは、Rules Based Medicine多分析物プロファイルで得られた、これらの分析物に対する結果と一致する。
【０２５４】
リポタンパク質粒子分析
２Ｄ０３を用いた治療期間、測定された何れの脂質細画分において顕著な変化はなかった。ＨＦＤ動物では、小ＶＬＤＬ粒子濃度及び全ＶＬＤＬ粒子及びキロミクロンは、フルクトース補充の開始のすぐ後最初は低い傾向であり、治療期間を通してわずかに減少を続け、休薬期間に横ばいに見られた。
【０２５５】
フルクトース前時間点では、７匹のＨＦＤ動物の内５匹において、ＩＤＬ粒子はコントロール動物と比較して著明に上昇した。１匹を除く全てのこれらの動物において、ＩＤＬレベルは、食事へのフルクトースの添加後の最初の時間点で下降を始めた。残りの動物においては、フルクトースの添加後の２番目の時間点で下降した。そして、全てのサルのＩＤＬレベルは、残りの研究の間下がり続けた。２Ｄ０３を用いた治療はこのパラメーターには影響しないように見えた。
【０２５６】
血清化学パネル
ＢＵＮは、研究を通して、普通食動物と比較してＨＦＤ動物において低かった（ＨＦＤ ７．５±１．７ｍｇ／ｄＬ対コントロール１６．９±２．７  ｍｇ／ｄＬ治療前）。普通食動物では、異常に高くはならないが、ＢＵＮは治療期間の間わずかに増加した（ＨＦＤ ｍａｘ１１．３±３．３ｍｇ／ｄＬ（１２週目）対コントロールｍａｘ ２４±６．５ｍｇ／ｄＬ（１２週目）)が、最終投与後４週間内にベースラインに戻った。血清クレアチニンは正常値外となることはなかったが、治療期間の間殆どの動物においてわずかに増加した（ＨＦＤ ０．９３±０．０９ｍｇ／ｄＬ治療前から最大１．１９±０．０６ｍｇ／ｄＬ（１２週目）対コントロール０．８５±０．１ｍｇ／ｄＬ治療前から最大１．１４±０．１６ｍｇ／ｄＬ（１２週目））。このパラメーターは治療後、４週間でベースラインに戻った。
【０２５７】
尿中タンパク質：クレアチニン比は治療期間の間顕著には変化しなかった。血清アルブミンは、２Ｄ０３治療の後４週間、全ての動物においてわずかに減少し、最終投与後の４週間治療前ベースラインのおよそ１２５％の最大に増加し、休薬期間の終わりまでにベースライン値に戻った。血清カルシウムレベルは、治療前平均の５．９±０．２５  ｍｇ／ｄＬ（ＨＦＤ）及び５．７±０．７２ｍｇ／ｄＬ（コントロール）から８週目の４．４±０．８  ｍｇ／ｄＬ（ＨＦＤ）及び５．０  ±  ０．４  ｍｇ／ｄＬ（コントロール）に降下し、１２週目の８．５±０．７ｍｇ／ｄＬ（ＨＦＤ）及び８．０±０．２ｍｇ／ｄＬ（コントロール）への増加が続いた。増加は研究の終了まで続いた。血清無機リンは、実験の間変化しなかった。ベースライン血清塩化物は９６．７±  ２．３ｍｇ／ｄＬ（ＨＦＤ）及び９４．１±５．６  ｍｇ／ｄＬ（コントロール)であった。血清塩化物は治療期間を通して徐々に増加し、これは休薬期まで続いた（ｍａｘ １１０．３±２．６ｍｇ／ｄＬ ＨＦＤ（２４週目）；ｍａｘ １１０．３±３．２ｍｇ／ｄＬコントロール（２４週目））。同じ期間に対してナトリウムレベルの変動性の増加があった。
【０２５８】
尿分析
大部分のＨＦＤ及びコントロール動物は、フルクトース前及び治療前期時間点の間で尿タンパク含有量の増加を示した。１匹を除く全ての動物が、２Ｄ０３治療の間、尿タンパクにおける降下を示した（投与前から１２週目時間点）。大部分の動物のタンパク質レベルは、１２週休薬の終わりまでに投与前レベルへ増加した。
ＨＦＤ動物の内２匹がフルコース前時間点で尿グルコースに対して陽性であった。投与前又は投与後期間の時間点の何れでもグルコースは尿サンプルに検出されなかった。しかしながら、休薬時間の最後まで４匹のＨＦＤ動物は、尿グルコース陽性の結果を有した。
【０２５９】
全血球計算値
研究期間を通して、測定パラメーターの何れにも顕著な変化はなかった。ＲＢＭにおいて測定されたトロンボポイエチンレベルが治療期の間上昇したが、血小板数は研究の９ヶ月にわたり安定であった。
【０２６０】
ヘモグロビンＡ１ｃ
ヘモグロビンＡ１ｃは、研究開始時何れの動物においても上昇されなく、治療において変化しなかった。
【０２６１】
Ｔ細胞表現型検査及び選別
Ｔ細胞表現型検査は、１２週の２Ｄ０３治療後ＣＤ８陽性Ｔ細胞サブポピュレーションにおいて、エフェクターメモリーからセントラルメモリーへの移行を示した。およそ６０％のＣＤ８陽性Ｔ細胞はエフェクターメモリー及び２０％セントラルメモリー（治療前）対２０％のエフェクターメモリー及び６０％のセントラルメモリー（治療後）であった。２Ｄ０３治療の間、ＣＤ４サブポピュレーションにおいても、セントラルメモリーから天然への移行があった。これらの移行は休薬期間の終わりに逆転した。マルチ測定に対して未補正のペアＴ検定計算は、これらの集団移行が有意であることを示す（図１０）。
【０２６２】
薬物動態学分析
２Ｄ０３は、初期分布期及び続く排出期を有する二相性プロファイルを呈する。２Ｄ０３蓄積が観察され、６３日目に定常状態達した。平均蓄積率はＨＦＤグループに対して２．７０及びコントロールグループに対して４．５８として算出された。平均排出半減期（ｔ１／２）は、ＨＦＤのサルに対して１３．７±２．５０日（９．３８−１６．５日）、及び普通食のサルに対して１１．６±３．７８日（８．４７−１５．８日）として算出された。定常状態でのＡＵＣ（ＡＵＣτ）は全てのサルに関して類似であり、ＨＦＤ及び普通食のサルに対してそれぞれおよそ８４３及び６８０日μｇ／ｍＬであった。ＣＬＳＳは、ＨＦＤのサルに対して１２．２ｍＬ／日／ｋｇ、及び普通食のサルに対して１５．６ｍＬ／日／ｋｇとして算出された。ＶＳＳは、ＨＦＤのサルに対して２７５ｍＬ／ｋｇ及び普通食のサルに対して４０５ｍＬ／ｋｇであった。
【０２６３】
２Ｄ０３に対する抗体が動物１９２６７からの血清サンプルにおいて検出され、これは１４日目以降での血清濃度における降下に導いたため、この動物はＰＫ分析から除外した。加えた、ＨＦＤグループの動物２０１６９及び２１９３７及びコントロールグループの動物１９８３６及び１９８４３も、回復期の間２Ｄ０３に対する抗体に対して陽性であったが、これらの動物はＰＫ分析に含まれた。
【０２６４】
結論
ＨＦＤのアカゲザルは、肥満及びインスリン抵抗性となり、炎症性サイトカイン上昇を伴った。１０ｍｇ／ｋｇの２Ｄ０３ ＩＶでの毎週の治療は、インスリン感受性を改善し、炎症性サイトカインプロファイルを「正常化」した。２Ｄ０３は、幾つかの促進性及び抗炎症性メディエーターを調整することが示された。減少が、ＩＬ-１β、ＴＮＦ-α、ＩＬ-１３、ＩＬ-１５、ＦＧＦ-ベーシック、特にＥＮ-ＲＡＧＥに見られた。逆に、ＧＭ-ＣＳＦレベルは増加した。この用量は、幾つかの血清化学分析において測定される中程度の傾向のみを有し良好な耐性であった。
【０２６５】
２Ｄ０３は、ＬＤＬ分子のマロンジアルデヒド酸化ａｐｏ Ｂ １００タンパク質部分に高い親和性で結合する完全長ヒトＩｇＧ１抗体である。まとめると、これらのデータは、２Ｄ０３は抗炎症性であり、ＨＦＤのアカゲザルのインスリン感受性を改善し、またＩＩ型糖尿病等の疾病及び障害の治療に対する２Ｄ０３の治療的可能性を支持する過去の実験的観察と一致することを実証する。
【図１】
2013503195.tif 000019
【図２】
2013503195.tif 000020
【図３】
2013503195.tif 000021
【図４】
2013503195.tif 000022
【図５】
2013503195.tif 000023
【図６】
2013503195.tif 000024
【図７】
2013503195.tif 000025
【図８】
2013503195.tif 000026
【図９】
2013503195.tif 000027
【図１０】
2013503195.tif 000028
【配列表】
2013503195000001.app
【国際調査報告】
2013503195.tif 000029
2013503195.tif 000030
2013503195.tif 000031
2013503195.tif 000032