(57)【要約】  本発明は、哺乳類の癌を治療する方法、及びこのような治療に有用な医薬組合せに関する。特に、前記方法は、ＭＥＫ阻害剤：Ｎ−｛３−［３−シクロプロピル−５−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル］フェニル｝アセトアミド又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物と、ＰＩ３キナーゼ阻害剤：２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミド又はその薬学的に許容できる塩とを含んでなる、新規組合せ、それを含んでなる医薬組成物、及びＮＮに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）構造（Ｉ）の第１の化合物：
【化１】
2013505962.tif 000028
又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物と、
（ｉｉ）構造（ＩＩ）によって表される第２の化合物：
【化２】
2013505962.tif 000029
又はその薬学的に許容できる塩と、
を含んでなる、組合せ。
【請求項２】
構造（Ｉ）の化合物が、水和物である、請求項１に記載の組合せ。
【請求項３】
構造（Ｉ）の化合物が、酢酸、エタノール、ニトロメタン、クロロベンゼン、１−ペンタノール、イソプロピルアルコール、エチレングリコール、３−メチル−２−ブタノール、及びジメチルスルホキシドからなる群より選択される溶媒和物である、請求項１に記載の組合せ。
【請求項４】
構造（Ｉ）の化合物が、ジメチルスルホキシド溶媒和物である、請求項１に記載の組合せ。
【請求項５】
１つ又は複数の薬学的に許容できる担体と共に、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組合せを含んでなる、組合せキット。
【請求項６】
構造（Ｉ）の化合物又はその溶媒和物の量が、０．１２５ｍｇ〜１０ｍｇから選択される量であり、構造（ＩＩ）の化合物の量が、０．０５ｍｇ〜１０ｍｇから選択される量である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組合せ。
【請求項７】
それを必要としているヒトにおける癌を治療する方法であって、治療上有効な量のＮ−｛３−［３−シクロプロピル−５−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル］フェニル｝アセトアミド又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物と、２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミド又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物との組合せを、上記ヒトに投与することを含み、
前記組合せが、一定期間以内に投与され、
前記組合せが、持続時間にわたって投与される、方法。
【請求項８】
Ｎ−｛３−［３−シクロプロピル−５−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル］フェニル｝アセトアミド又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物の量が、約０．５ｍｇ〜約４ｍｇから選択され、２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミド又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物の量が、約０．５ｍｇ〜約５ｍｇから選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
Ｎ−｛３−［３−シクロプロピル−５−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル］フェニル｝アセトアミド又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物の量が、約０．１２５ｍｇ〜約３ｍｇから選択され、２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミド又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物の量が、約０．０５ｍｇ〜約３ｍｇから選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
Ｎ−｛３−［３−シクロプロピル−５−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル］フェニル｝アセトアミド又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物と、２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミド又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物の量とが、各日互いに１２時間以内で、少なくとも７日間連続して投与され、任意で、次いで１サイクル以上の反復投薬が行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
Ｎ−｛３−［３−シクロプロピル−５−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル］フェニル｝アセトアミド又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物と、２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミド又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物の量とが、各日互いに２４時間以内で、少なくとも７日間連続して投与され、任意で、次いで１サイクル以上の反復投薬が行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
それを必要としているヒトにおける癌を治療する方法であって、約０．１２５ｍｇ〜１０ｍｇのＮ−｛３−［３−シクロプロピル−５−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル］フェニル｝アセトアミド又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物を、１日１回、１日目〜３０日目まで前記ヒトに投与し、任意で、次いで、１サイクル以上反復すること、および約０．０５ｍｇ〜１０ｍｇの２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミド又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物を、１日目から３０日目まで上記ヒトに定期的に投与し、任意で、次いで１サイクル以上反復することを含んでなる、方法。
【請求項１３】
それを必要としているヒトにおける癌を治療する方法であって、約０．５ｍｇ〜４ｍｇのＮ−｛３−［３−シクロプロピル−５−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル］フェニル｝アセトアミド又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物を、１日１回、１日目から３０日目まで前記ヒトに投与し、任意で、次いで、１サイクル以上反復すること、および約０．５ｍｇ〜５ｍｇの２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミド又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物を、１日目から３０日目まで前記ヒトに定期的に投与し、任意で、次いで１サイクル以上反復することを含んでなる、方法。
【請求項１４】
それを必要としているヒトにおける癌を治療する方法であって、約０．０５ｍｇ〜１０ｍｇの２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミド又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物を、１日１回または２回、１日目からから３０日目まで前記ヒトに投与し、任意で、次いで、１サイクル以上反復すること、および約０．１２５ｍｇ〜１０ｍｇのＮ−｛３−［３−シクロプロピル−５−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル］フェニル｝アセトアミド又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物を、１日目から３０日目まで前記ヒトに定期的に投与し、任意で、次いで１サイクル以上反復することを含んでなる、方法。
【請求項１５】
それを必要としているヒトにおける癌を治療する方法であって、約０．５ｍｇ〜５ｍｇの２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミド又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物を、１日１回または２回、１日目から３０日目まで前記ヒトに投与し、任意で、次いで、１サイクル以上反復すること、および約０．５ｍｇ〜４ｍｇのＮ−｛３−［３−シクロプロピル−５−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル］フェニル｝アセトアミド又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物を、１日目から〜３０日目まで上記ヒトに定期的に投与し、任意で、１サイクル以上反復することを含んでなる、方法。
【請求項１６】
２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミドが、２〜４日毎に１回投与され、任意で、次いで１サイクル以上反復される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１７】
２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミドが、５〜７日毎に１回投与され、任意で、次いで１サイクル以上反復される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１８】
２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミドが、８〜１５日毎に１回投与され、任意で、次いで１サイクル以上反復される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１９】
Ｎ−｛３−［３−シクロプロピル−５−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル］フェニル｝アセトアミドジメチルスルホキシドが、２〜４日毎に１回投与され、任意で、次いで１サイクル以上反復される、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項２０】
Ｎ−｛３−［３−シクロプロピル−５−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル］フェニル｝アセトアミドジメチルスルホキシドが、５〜７日毎に１回投与され、任意で、次いで１サイクル以上反復される、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項２１】
Ｎ−｛３−［３−シクロプロピル−５−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル］フェニル｝アセトアミドジメチルスルホキシドが、８〜１５日毎に１回投与され、任意で、次いで１サイクル以上反復される、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記癌が、結腸癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、または乳癌である、請求項１２〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記癌が、膵臓癌、結腸癌、または肺癌である、請求項１２および１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記癌が、乳癌である、請求項１３および１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記癌が、ＫＲＡＳ突然変異体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記乳癌が、ＥＲ陰性乳癌である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記乳癌が、基底様乳癌である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記乳癌が、三重陰性癌である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記癌が、肝臓癌である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記癌が、膵臓癌である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
前記癌が、ＨＥＲ２陰性、ＥＲ陰性、およびＰＲ陰性癌である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
前記肝臓癌が、ＮＲＡＳ突然変異体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記癌が、ＨＥＲ２陽性乳癌である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３４】
Ｎ−｛３−［３−シクロプロピル−５−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル］フェニル｝アセトアミドが、ジメチルスルホキシド溶媒和物の形態で投与される、請求項７〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類の癌を治療する方法、及びこのような治療に有用な組合せに関する。特に、前記方法は、ＭＥＫ阻害剤：Ｎ−｛３−［３−シクロプロピル−５−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル］フェニル｝アセトアミド又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物と、ＰＩ３Ｋ阻害剤：２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミド又はその薬学的に許容できる塩とを含んでなる新規組合せ、それを含んでなる医薬組成物、及び癌の治療においてこのような組合せを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌を含む過増殖性障害の有効な治療は、腫瘍学分野における継続的な目標である。一般的に、癌は、細胞の分裂、分化及びアポトーシス細胞死を制御する正常なプロセスの調節解除に起因する。アポトーシス（プログラム細胞死）は、胚発生、並びに神経変性疾患、心血管疾患及び癌等の各種疾患の病変形成において重要な役割を果たす。アポトーシスのキナーゼ調節に関与している経路のうち最も広く研究されている経路のうちの１つは、細胞表面の成長因子受容体から核への細胞内シグナル伝達である（Ｃｒｅｗｓ及びＥｒｉｋｓｏｎ，Ｃｅｌｌ，７４：２１５−１７，１９９３年）。
【０００３】
酵素のうち重要な大きなファミリーは、タンパク質キナーゼ酵素ファミリーである。現在、約５００の異なる公知のタンパク質キナーゼが存在している。タンパク質キナーゼは、ＡＴＰ−Ｍｇ２＋複合体のγ−ホスフェートを様々なタンパク質におけるアミノ酸の側鎖に移動させることによって前記アミノ酸の側鎖のリン酸化を触媒する機能を有する。これら酵素は、細胞内のシグナル伝達プロセスの大部分を制御して、それによって、タンパク質におけるセリン、スレオニン、及びチロシンの残基のヒドロキシル基の可逆的リン酸化を通して細胞の機能、成長、分化、及び破壊（アポトーシス）を支配する。タンパク質キナーゼが、シグナル伝達、転写調節、細胞運動、及び細胞分裂を含む多くの細胞機能の重要な調節因子であることが研究によって示されている。また、幾つかの癌遺伝子がタンパク質キナーゼをコードしていることも示されており、これは、癌遺伝子においてキナーゼが何らかの役割を果たしていることを示唆する。これらプロセスは、高度に調節されており、それは、各キナーゼが１以上のキナーゼによってそれ自体調節される複雑な相互に関連する経路によって調節されていることが多い。結果として、異常な又は不適切なタンパク質キナーゼ活性は、良性及び悪性の増殖性障害、並びに免疫系及び神経系の不適切な活性化から生じる疾患を含むこのような異常なキナーゼ活性に関連する疾患状態の発生の一因となる場合がある。その生理学的な関連性、多様性、及び偏在性に起因して、タンパク質キナーゼは、生化学的及び医学的研究において最も重要且つ広く研究されている酵素のファミリーのうちの１つになっている。
【０００４】
酵素のタンパク質キナーゼファミリーは、典型的に、リン酸化するアミノ酸残基に基づいて、タンパク質チロシンキナーゼとタンパク質セリン／スレオニンキナーゼの２つの主なサブファミリーに分類される。タンパク質セリン／スレオニンキナーゼ（ＰＳＴＫ）としては、サイクリックＡＭＰ及びサイクリックＧＭＰ依存性タンパク質キナーゼ、カルシウム及びリン脂質依存性タンパク質キナーゼ、カルシウム及びカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ、カゼインキナーゼ、細胞分裂周期タンパク質キナーゼ、及び他のものが挙げられる。これらキナーゼは、通常、細胞質性であるか、又は恐らくアンカリングタンパク質によって細胞の顆粒画分に結合している。異常なタンパク質セリン／スレオニンキナーゼ活性は、関節リウマチ、乾癬、敗血性ショック、骨粗鬆、多くの癌、及び他の増殖性疾患等の多数の病状に関連しているか又は前記病状に罹りやすい。したがって、セリン／スレオニンキナーゼ及び前記セリン／スレオニンキナーゼがその一部であるシグナル伝達経路は、薬物設計の重要な標的である。チロシンキナーゼは、チロシン残基をリン酸化する。チロシンキナーゼは、細胞調節において同様に重要な役割を果たしている。これらキナーゼは、上皮成長因子受容体、インスリン受容体、血小板由来成長因子受容体、及び他のものを含む成長因子及びホルモン等の分子に対する幾つかの受容体を含む。多くのチロシンキナーゼは、細胞の外側に位置する受容体ドメインと、内側のキナーゼドメインとを有する膜貫通タンパク質であることが研究によって示されている。また、同様にチロシンキナーゼの調節因子を同定するための多くの研究が進められている。
【０００５】
マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）キナーゼ／細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）キナーゼ（以下、ＭＥＫと称する）は、多数の細胞過程の調節に関与していることが知られている。Ｒａｆファミリー（Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆ等）は、ＭＥＫファミリー（ＭＥＫ−１、ＭＥＫ−２等）を活性化し、ＭＥＫファミリーは、ＥＲＫファミリー（ＥＲＫ−１及びＥＲＫ−２）を活性化する。概して言えば、ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路のシグナル伝達活性は、ｍＲＮＡ翻訳を制御する。これは、細胞周期と関係する遺伝子を含む。したがって、この経路の過活性化は、無制御の細胞増殖を導き得る。全てのヒト悪性腫瘍の約３０％でＥＲＫの過活性化によるＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路の調節解除がみられている（Ａｌｌｅｎ，ＬＦら，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００３年．３０（５  Ｓｕｐｐｌ  １６）：１０５−１６）。ＲＡＳ（ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ及びＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫの両方を通じてシグナル伝達することができる）は、全ての癌の１５％において突然変異型の発癌性タンパク質を有している（Ｄａｖｉｅｓ，Ｈら．Ｎａｔｕｒｅ．２００２年．４１７：９４９−５４）。また、特定の腫瘍の種類（例えば、黒色腫）において、活性化ＢＲＡＦ突然変異が高頻度で同定されている（Ｄａｖｉｅｓ，Ｈら．Ｎａｔｕｒｅ．２００２年．４１７：９４９−５４）。ＭＥＫ自体における活性化突然変異は、ヒト癌ではそれほど頻繁に生じないと思われるが、ＭＥＫは、ＥＲＫ経路において中心的な役割を果たしているので、ヒト癌を治療するための重要な薬物標的であると考えられる。更に、ＭＥＫ阻害活性は、ＥＲＫ１／２活性の阻害及び細胞増殖の抑制を有効に誘導し（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．２７６，Ｎｏ．４，ｐｐ．２６８６−２６９２，２００１年）、化合物が腫瘍形成及び／又は癌等の望ましくない細胞増殖によって引き起される疾患に対する効果を示すと予測される。
【０００６】
ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路は、中でもヒトの癌において最も一般に活性化される経路である。腫瘍形成及び腫瘍進行におけるこの経路の機能及び重要性は、十分に確立されている（Ｓａｍｕｅｌｓ及びＥｒｉｃｓｏｎ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｐ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２００６年．１８：７７−８２）。ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達は、細胞の生存、増殖、及び代謝の極めて重要な調節因子であると思われる。これは、哺乳類のラパマイシンの標的（ｍＴＯＲ）、ＰＩ３Ｋタンパク質ファミリーのメンバー、並びに細胞成長及び翻訳の直接調節因子の活性化を含む。したがって、腫瘍におけるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達の調節解除は、無制限の生殖能及びアポトーシスの回避を含む悪性腫瘍の多数の特徴を示す細胞表現型の一因となる（Ｈａｎａｈａｎ及びＷｅｉｎｂｅｒｇ，Ｃｅｌｌ．２０００年．１００：５７−７０）。
【０００７】
ＰＩ３Ｋファミリーは、特にそのキナーゼドメイン内に配列相同性を共有する１５のタンパク質から成る、しかし、それらは、基質特異性及び調節様式が異なる（Ｖｉｖａｎｃｏ及びＳａｗｙｅｒｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，２００２年．２：４８９−５０１）。クラスＩ  ＰＩ３キナーゼは、ホスファチジルイノシトール（ＰｔｄＩｎｓ）として知られているイノシトール含有脂質の３位をリン酸化する。クラスＩファミリーのメンバーの一次基質であるＰｔｄＩｎｓ−４，５−Ｐ２（ＰＩＰ２）は、これらキナーゼによってＰｔｄＩｎｓ−３，４，５−Ｐ３（ＰＩＰ３）に変換される。ＰＩＰ３は、プレクストリン相同ドメインを含有するタンパク質を、それらが活性化される細胞膜に動員する重要な二次伝達物質である。これらのタンパク質のうち最も研究されているのは、細胞の生存、成長及び増殖を促進するＡＫＴである。活性化されると、ＡＫＴは細胞質及び核に移動し、そこでｍＴＯＲ（ＴＯＲＣ１）を含む多数の基質をリン酸化する。ＡＫＴに加えて、ＰＩ３Ｋは、ＰＤＫ１、ＣＤＣ４２、及びＲＡＣ１等の発癌に関連している他の経路を活性化する（Ｓａｍｕｅｌｓ及びＥｒｉｃｓｏｎ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｐ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２００６年．１８：７７−８２）。
【０００８】
ヒトの腫瘍における研究では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路の活性化は、多くの機序を介して生じる場合がある。前記経路の遺伝的調節解除が一般的であり、多数の方法で生じる場合がある（Ｓａｍｕｅｌｓ及びＥｒｉｃｓｏｎ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｐ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２００６年．１８：７７−８２に概説されている）。（ＰＩ３Ｋのｐ１１０α触媒サブユニットをコードする）ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の活性化突然変異は、乳房、卵巣、子宮内膜、及び結腸直腸の癌を含むヒトの腫瘍のかなりの割合で生じている。また、頻度は低いが、この遺伝子のＤＮＡ増幅の活性化も多数の異なる腫瘍の種類で生じている。ＰＩ３Ｋのｐ８５α調節サブユニット（ＰＩＫ３Ｒ１）における突然変異は、ＰＩＫ３Ｒ１とＰＩＫ３ＣＡとの間のＣ２−ｉＳＨ２相互作用を破壊すると考えられており、卵巣、膠芽細胞腫、及び結腸直腸癌で生じる。腫瘍の抑制因子であるＰＴＥＮは、ＰＩＰ３を脱リン酸化してＰＩＰ２を生成するのでＰＩ３Ｋ経路の阻害剤として作用するが、一般的に、突然変異しているか、欠失しているか、又は後成的にサイレンシングされている。最後に、前記経路は、ＡＫＴのＤＮＡ増幅又は突然変異によってＰＩ３Ｋの下流で遺伝的に活性化される場合もあるが、これら遺伝的事象は、ヒトの癌において生じる頻度が非常に低い。ＰＩ３Ｋのアイソフォーム、特にＰＩ３Ｋαの阻害は、癌の治療において有用であることが知られている（例えば、国際公開第０５／１２１１４２号、国際公開第０８／１４４４６３号、国際公開第０８／１４４４６４号、国際公開第０７／１３６９４０号を参照されたい）。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の１つの実施形態は、
（ｉ）構造（Ｉ）の化合物：
【化１】
2013505962.tif 000002
Ｎ−｛３−［３−シクロプロピル−５−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル］フェニル｝アセトアミド（以下化合物Ａと称する）
又はその薬学的に許容できる塩と、
（ｉｉ）構造（ＩＩ）の化合物：
【化２】
2013505962.tif 000003
２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミド（以下化合物Ｂと称する）
又はその薬学的に許容できる塩とを含んでなる組合せを提供する。
【００１０】
本発明の１つの実施形態は、それを必要としているヒトにおける癌を治療する方法であって、治療上有効な量の化合物Ａ又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物、好適にはそのジメチルスルホキシド溶媒和物と、化合物Ｂ又はその薬学的に許容できる塩との組合せを、上記ヒトにインビボ投与することを含んでなる方法を提供する。
【００１１】
本発明の１つの実施形態は、それを必要としているヒトにおける癌を治療する方法であって、治療上有効な量の化合物Ａ又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物、好適にはジメチルスルホキシド溶媒和物と、化合物Ｂ又はその薬学的に許容できる塩との組合せを、上記ヒトにインビボ投与することを含み、
前記組合せが、一定期間以内に投与され、
前記組合せが、持続時間にわたって投与される方法を提供する。
【００１２】
本発明の１つの実施形態は、それを必要としているヒトにおける癌を治療する方法であって、治療上有効な量の化合物Ａ又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物、好適にはジメチルスルホキシド溶媒和物と、化合物Ｂ又はその薬学的に許容できる塩との組合せを、上記ヒトにインビボ投与することを含み、
前記化合物Ａ及び化合物Ｂが順次投与される方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、抗増殖性活性を示す組合せに関する。好適には、前記方法は、Ｎ−｛３−［３−シクロプロピル−５−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル］フェニル｝アセトアミド（化合物Ａ）又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物、好適にはジメチルスルホキシド溶媒和物であって、構造Ｉによって表される化合物：
【化３】
2013505962.tif 000004
と、
２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミド（化合物Ｂ）又はその薬学的に許容できる塩であって、以下の構造によって表される化合物：
【化４】
2013505962.tif 000005
とを共投与することにより癌を治療する方法に関する。
【００１４】
Ｎ−｛３−［３−シクロプロピル−５−（２−フルオロ−４−ヨードフェニルアミノ）−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１−イル］フェニル｝アセトアミドとしても知られている化合物Ａは、その薬学的に許容できる塩及び溶媒和物と共に、特に癌の治療においてＭＥＫ活性の阻害剤として有用であることが、国際出願日が２００５年６月１０日である国際特許出願第ＰＣＴ／ＪＰ２００５／０１１０８２号に開示され、請求されている。国際公開日が２００５年１２月２２日である国際特許公開第２００５／１２１１４２号は、参照することによって全開示が本明細書に組み込まれ、化合物Ａは、実施例４−１の化合物である。化合物Ａは、国際特許出願第ＰＣＴ／ＪＰ２００５／０１１０８２号に記載の通り調製することができる。化合物Ａは、引用することにより本明細書の一部とされる２００６年１月１９日公開の米国特許出願公開第２００６／００１４７６８号に記載の通り調製することができる。
【００１５】
好適には、化合物Ａは、ジメチルスルホキシド溶媒和物の形態である。好適には、化合物Ａは、ナトリウム塩の形態である。好適には、化合物Ａは、水和物、酢酸、エタノール、ニトロメタン、クロロベンゼン、１−ペンタノール、イソプロピルアルコール、エチレングリコール及び３−メチル−１−ブタノールから選択される溶媒和物の形態である。これら溶媒和物及び塩の形態は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＪＰ２００５／０１１０８２号又は米国特許出願公開第２００６／００１４７６８号の記載から当業者によって調製され得る。
【００１６】
化合物Ｂは、その薬学的に許容できる塩と共に、特に癌の治療においてＰＩ３Ｋ活性の阻害剤として有用であることが、国際出願日が２００８年５月１６日である国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６３８１９号に開示され、請求されている。国際公開日が２００８年１１月２７日である国際特許公開第２００８／１４４４６３号は、引用することにより本明細書の一部とされ、化合物Ｂは、実施例３４５の化合物である。化合物Ｂは、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６３８１９号に記載の通り調製することができる。
【００１７】
好適には、化合物Ｂは、遊離塩基の形態である。
【００１８】
本発明の化合物は、溶質（本発明では、化合物Ａ又はその塩及び／又は化合物Ｂ又はその塩）及び溶媒によって形成される可変化学量論の複合体であると理解される溶媒和物を形成することができる。本発明の目的のためのこのような溶媒は、溶質の生物活性に干渉することはできない。好適な溶媒の例としては、水、メタノール、ジメチルスルホキシド、エタノール及び酢酸が挙げられるが、これらに限定されない。好適には、使用される溶媒は、薬学的に許容できる溶媒である。好適な薬学的に許容できる溶媒の例としては、限定するものではないが、水、ジメチルスルホキシド、エタノール及び酢酸が挙げられる。好適には、使用される溶媒は水である。
【００１９】
本発明の化合物の薬学的に許容できる塩は、当業者によって容易に調製される。
【００２０】
本発明で使用する用語「治療」及びその派生語は、治療的療法を意味する。特定の病態に関して、治療は、以下を意味する：（１）病態の生物学的徴候のうちの１つ以上の病態を寛解又は予防する、（２）（ａ）病態を導くか若しくは病態の原因となる生物学的カスケードにおける１以上の点、又は（ｂ）病態の生物学的徴候のうちの１つ以上に干渉する、（３）病態又はその治療に関連する症状、作用、又は副作用のうちの１以上を軽減する、あるいは（４）病態又は病態の生物学的徴候のうちの１つ以上の進行を遅らせる。これらによる予防的療法も検討される。当業者は、「予防」が絶対的な用語ではないことを認識する。医学では、「予防」とは、病態又はその生物学的徴候の可能性又は重篤度を実質的に低下させるか、又はこのような病態又はその生物学的徴候の発生を遅らせるために薬物を予防的に投与することを指すと理解される。例えば、被験体が強い癌の家族歴を有している場合、又は被験体が発癌物質に曝露された場合等、被験体が癌を発現するリスクが高いと考えられる場合、予防的療法が適切である。
【００２１】
用語「定期的投与（ｐｅｒｉｏｄｉｃａｌｌｙ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」又はその派生語は、休薬期間には薬物をヒトに投与しないことを意味する。休薬期間（時に、薬物休暇、薬剤休暇、構造化治療中断、又は戦略的治療中断とも呼ばれる）は、患者がある期間服用を中止しているときであり、数日間から数ヶ月間のいずれであってもよい。
【００２２】
本明細書で使用するとき、用語「有効な量」は、例えば、研究者又は臨床医によって求められている組織、系、動物、又はヒトの生物学的反応又は医学的反応を誘発する薬物又は医薬剤の量を意味する。更に、用語「治療上有効な量」は、このような量を投与されていない対応する被験体と比較したとき、疾患、障害又は副作用の治療、治癒、予防又は寛解を改善させるか、あるいは疾患又は障害の進行速度を低下させる任意の量を意味する。また、この用語は、正常な生理機能を強化するのに有効な量を範囲内に含む。
【００２３】
本発明で使用する用語「組合せ」及びその派生語は、治療上有効な量の化合物Ａ又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物と化合物Ｂ又はその薬学的に許容できる塩との同時投与又は任意の方式による別々の連続投与を意味する。好ましくは、投与が同時ではない場合、互いに近接した時間に化合物を投与する。更に、同じ剤形で化合物を投与するかどうかは重要ではなく、例えば、ある化合物を局所的に投与してもよく、他の化合物を経口で投与してもよい。好適には、両方の化合物を経口で投与する。
【００２４】
本発明で使用する用語「組合せキット」は、本発明に係る化合物Ａ又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物と化合物Ｂ又はその薬学的に許容できる塩とを投与するために用いられる１つ又は複数の医薬組成物を意味する。両方の化合物を同時に投与する場合、組合せキットは、化合物Ａ又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物と化合物Ｂ又はその薬学的に許容できる塩とを、錠剤等の単一の医薬組成物に又は別々の医薬組成物に含有することができる。化合物を同時には投与しない場合、組合せキットは、化合物Ａ又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物と、化合物Ｂ又はその薬学的に許容できる塩とを、別々の医薬組成物に含有する。組合せキットは、化合物Ａ又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物と、化合物Ｂ又はその薬学的に許容できる塩とを、単一の包装内の別々の医薬組成物に、又は別々の包装内の別々の医薬組成物に含むことができる。
【００２５】
１つの態様では、以下の構成要素：
薬学的に許容できる担体を伴う、化合物Ａ又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物と、
薬学的に許容できる担体を伴う、化合物Ｂ又はその薬学的に許容できる塩と、
を含んでなる組合せキットが提供される。
【００２６】
本発明の１つの実施形態では、組合せキットは以下の構成要素：
薬学的に許容できる担体を伴う、化合物Ａ又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物と、
薬学的に許容できる担体を伴う、化合物Ｂ又はその薬学的に許容できる塩と、を含み、
前記構成要素は、順次、別々に、及び／又は同時に投与されるのに好適な形態で提供される。
【００２７】
１つの実施形態では、組合せキットは、
薬学的に許容できる担体を伴う、化合物Ａ又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物を含んでなる第１の容器と、
薬学的に許容できる担体を伴う、化合物Ｂ又はその薬学的に許容できる塩を含んでなる第２の容器と、前記第１の容器及び第２の容器を収容するための収容手段を含んでなる。
【００２８】
「組合せキット」は、用法・用量に関する説明書等の説明書を備えていてもよい。このような用法・用量に関する説明書は、例えば、薬物の製品ラベルによって医師に提供される種類であってもよく、患者に対する説明書等の医師によって提供される種類であってもよい。
【００２９】
本発明で使用する用語「三重陰性」乳癌とは、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）又はＨｅｒ２／ｎｅｕの遺伝子を発現しない任意の乳癌を意味する。乳癌のこのサブタイプは、臨床的に、より侵襲性が高く且つ標準的な治療に対してより応答性が低いことを特徴とし、全体的な患者の予後の悪さと関連している。若年女性、ＢＲＣＡ１突然変異を有する女性、並びにアフリカ系アメリカ人及びヒスパニック系民族に属する女性、及び出産後間もない女性において診断される頻度が高い。
【００３０】
基底様乳房腫瘍は、再発までの時間が短い侵襲性の強い乳癌のサブタイプである。閉経前のアフリカ系アメリカ人女性は、通常エストロゲン、プロゲステロン、及びＨＥＲ２受容体について三重陰性である基底様乳房腫瘍を発現する平均リスクがより高い。基底様乳房腫瘍は、悪性度が高く、後期で診断され、且つ強力な化学療法レジメンを必要とする場合がある。
【００３１】
本発明で使用する用語「化合物Ａ２」は、化合物Ａ又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物を意味する。
【００３２】
本発明で使用する用語「化合物Ｂ２」は、化合物Ｂ又はその薬学的に許容できる塩を意味する。
【００３３】
好適には、「一定期間」内に本発明の組合せを投与する。
【００３４】
本発明で使用する用語「一定期間」及びその派生語は、ある化合物Ａ２及び化合物Ｂ２の投与と他の化合物Ａ２及び化合物Ｂ２の投与との間の時間間隔を意味する。別段の定義がない限り、一定期間は、同時投与を含んでもよい。別段の定義がない限り、一定期間は、単一日の間の化合物Ａ２及び化合物Ｂ２の投与を指す。
【００３５】
好適には、化合物が「一定期間」以内に投与されるが、同時には投与されない場合、前記化合物は、互いに約２４時間以内で両方とも投与され、この場合一定期間は約２４時間になり、好適には、互いに約１２時間以内で両方とも投与され、この場合一定期間は約１２時間になり、好適には、互いに約１１時間以内で両方とも投与され、この場合一定期間は約１１時間になり、好適には、互いに約１０時間以内で両方とも投与され、この場合一定期間は約１０時間になり、好適には、互いに約９時間以内で両方とも投与され、この場合一定期間は約９時間になり、好適には、互いに約８時間以内で両方とも投与され、この場合一定期間は約８時間になり、好適には、互いに約７時間以内で両方とも投与され、この場合一定期間は約７時間になり、好適には、互いに約６時間以内で両方とも投与され、この場合一定期間は約６時間になり、好適には、互いに約５時間以内で両方とも投与され、この場合一定期間は約５時間になり、好適には、互いに約４時間以内で両方とも投与され、この場合一定期間は約４時間になり、好適には、互いに約３時間以内で両方とも投与され、この場合一定期間は約３時間になり、好適には、互いに約２時間以内で両方とも投与され、この場合一定期間は約２時間になり、好適には、互いに約１時間以内で両方とも投与され、この場合一定期間は約１時間になる。本発明で使用するとき、化合物Ａ２の投与と化合物Ｂ２の投与との間隔が約４５分間未満である場合は、同時投与とみなされる。
【００３６】
好適には、本発明の組合せが「一定期間」投与されるとき、化合物は、「持続時間」にわたって共投与される。
【００３７】
本発明で使用する用語「持続時間」及びその派生語は、本発明の両方の化合物が指定の連続日数にわたって投与されることを意味する。別段の定義がない限り、連続日数は、治療の開始と共に始まるか又は治療の終わりと共に終わる必要はなく、連続日数が治療の過程における幾つかの点で生じることのみを必要とする。
【００３８】
「一定期間」の投与に関して：
好適には、両方の化合物は、少なくとも１日間一定期間以内に投与され、この場合持続時間は少なくとも１日間になり、好適には、治療の過程中に、両方の化合物が少なくとも３日間連続して一定期間以内に投与され、この場合持続時間は少なくとも３日間になり、好適には、治療の過程中に、両方の化合物が少なくとも５日間連続して一定期間以内に投与され、この場合持続時間は少なくとも５日間になり、好適には、治療の過程中に、両方の化合物が少なくとも７日間連続して一定期間以内に投与され、この場合持続時間は少なくとも７日間になり、好適には、治療の過程中に、両方の化合物が少なくとも１４日間連続して一定期間以内に投与され、この場合持続時間は少なくとも１４日間になり、好適には、治療の過程中に、両方の化合物が少なくとも３０日間連続して一定期間以内に投与され、この場合持続時間は少なくとも３０日間になる。
【００３９】
好適には、「一定期間」中に化合物が投与されない場合、前記化合物は順次投与される。本発明で使用する用語「順次投与」及びその派生語は、化合物Ａ２及び化合物Ｂ２のうちの一方を２日間以上連続して１日当たり１回投与し、次いで、化合物Ａ２及び化合物Ｂ２のうちの他方を２日間以上連続して１日当たり１回投与することを意味する。また、本発明では、化合物Ａ２及び化合物Ｂ２のうちの一方と化合物Ａ２及び化合物Ｂ２のうちの他方との順次投与間で利用される休薬日も考えられる。本発明で使用する休薬日は、化合物Ａ２及び化合物Ｂ２のうちの一方の順次投与後且つ化合物Ａ２及び化合物Ｂ２のうちの他方の投与前の、化合物Ａ２も化合物Ｂ２も投与されない期間である。好適には、休薬日は、以下から選択される期間になる：１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間。
【００４０】
順次投与に関して：
好適には、２〜３０日間連続して化合物Ａ２及び化合物Ｂ２のうちの一方を投与し、次いで、任意の休薬日を設け、次いで、２〜３０日間連続して化合物Ａ２及び化合物Ｂ２のうちの他方を投与する。好適には、２〜２１日間連続して化合物Ａ２及び化合物Ｂ２のうちの一方を投与し、次いで、任意の休薬日を設け、次いで、２〜２１日間連続して化合物Ａ２及び化合物Ｂ２のうちの他方を投与する。好適には、２〜１４日間連続して化合物Ａ２及び化合物Ｂ２のうちの一方を投与し、次いで、１〜１４日間の休薬日を設け、次いで、２〜１４日間連続して化合物Ａ２及び化合物Ｂ２のうちの他方を投与する。好適には、３〜７日間連続して化合物Ａ２及び化合物Ｂ２のうちの一方を投与し、次いで、３〜１０日間の休薬日を設け、次いで、３〜７日間連続して化合物Ａ２及び化合物Ｂ２のうちの他方を投与する。
【００４１】
好適には、化合物Ｂ２を順序の最初に投与し、次いで、任意の休薬日を設け、次いで、化合物Ａ２を投与する。好適には、３〜２１日間連続して化合物Ｂ２を投与し、次いで、任意の休薬日を設け、次いで、３〜２１日間連続して化合物Ａ２を投与する。好適には、３〜２１日間連続して化合物Ｂ２を投与し、次いで、１〜１４日間の休薬日を設け、次いで、３〜２１日間連続して化合物Ａ２を投与する。好適には、３〜２１日間連続して化合物Ｂ２を投与し、次いで、３〜１４日間の休薬日を設け、次いで、３〜２１日間連続して化合物Ａ２を投与する。好適には、２１日間連続して化合物Ｂ２を投与し、次いで、任意の休薬日を設け、次いで、１４日間連続して化合物Ａ２を投与する。好適には、１４日間連続して化合物Ｂ２を投与し、次いで、１〜１４日間の休薬日を設け、次いで、１４日間連続して化合物Ａ２を投与する。好適には、７日間連続して化合物Ｂ２を投与し、次いで、３〜１０日間の休薬日を設け、次いで、７日間連続して化合物Ａ２を投与する。好適には、３日間連続して化合物Ｂ２を投与し、次いで、３〜１４日間の休薬日を設け、次いで、７日間連続して化合物Ａ２を投与する。好適には、３日間連続して化合物Ｂ２を投与し、次いで、３〜１０日間の休薬日を設け、次いで、３日間連続して化合物Ａ２を投与する。
【００４２】
「一定期間」の投与及び「順次」投与に続いて反復投薬を行ってもよく、続いて交互投薬プロトコールを行ってもよく、また、前記反復投薬又は交互投薬プロトコールの前に休薬日を設けてもよいことが理解される。
【００４３】
好適には、本発明に係る組合せの一部として投与される化合物Ａ２の量は、約０．１２５ｍｇ〜約１０ｍｇから選択される量であり、好適には、前記量は、約０．２５ｍｇ〜約９ｍｇから選択され、好適には、前記量は、約０．２５ｍｇ〜約８ｍｇから選択され、好適には、前記量は、約０．５ｍｇ〜約８ｍｇから選択され、好適には、前記量は、約０．５ｍｇ〜約７ｍｇから選択され、好適には、前記量は、約１ｍｇ〜約７ｍｇから選択され、好適には、前記量は、約５ｍｇである。したがって、本発明に係る組合せの一部として投与される化合物Ａの量は、約０．１２５ｍｇ〜約１０ｍｇから選択される量である。例えば、本発明に係る組合せの一部として投与される化合物Ａ２の量は、０．１２５ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．５ｍｇ、０．７５ｍｇ、１ｍｇ、１．５ｍｇ、２ｍｇ、２．５ｍｇ、３ｍｇ、３．５ｍｇ、４ｍｇ、４．５ｍｇ、５ｍｇ、５．５ｍｇ、６ｍｇ、６．５ｍｇ、７ｍｇ、７．５ｍｇ、８ｍｇ、８．５ｍｇ、９ｍｇ、９．５ｍｇ、１０ｍｇであってよい。
【００４４】
好適には、本発明に係る組合せの一部として投与される化合物Ｂ２の量は、約０．２５ｍｇ〜約７５ｍｇから選択される量であり、好適には、前記量は、約０．５ｍｇ〜約５０ｍｇから選択され、好適には、前記量は、約１ｍｇ〜約２５ｍｇから選択され、好適には、前記量は、約２ｍｇ〜約２０ｍｇから選択され、好適には、前記量は、約４ｍｇ〜約１６ｍｇから選択され、好適には、前記量は、約６ｍｇ〜約１２ｍｇから選択され、好適には、前記量は、約１０ｍｇである。したがって、本発明に係る組合せの一部として投与される化合物Ｂ２の量は、約０．５ｍｇ〜約５０ｍｇから選択される量である。例えば、本発明に係る組合せの一部として投与される化合物Ｂ２の量は、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１１ｍｇ、１２ｍｇ、１３ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ、１６ｍｇ、１７ｍｇ、１８ｍｇ、２０ｍｇ、２１ｍｇ、２２ｍｇ、２３ｍｇ、２５ｍｇ、２６ｍｇ、２７ｍｇ、２８ｍｇ、２９ｍｇ、３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ、又は５０ｍｇであってよい。
【００４５】
本発明で使用するとき、化合物Ａ２及び化合物Ｂ２について指定される全ての量は、１用量当たり遊離又は非塩及び非溶媒和化合物の投与量として示される。
【００４６】
癌治療の他の療法的方法と共に本発明の方法を使用してもよい。
【００４７】
療法で使用するために、治療上有効な量の本発明の組合せは、化学物質原料として投与することが可能であるが、１つ又は複数の医薬組成物として前記組合せを提示することが好ましい。したがって、本発明は、化合物Ａ２及び／又は化合物Ｂ２と１つ以上の薬学的に許容できる担体とを含んでなる医薬組成物を更に提供する。本発明の組合せは、上記の通りである。担体は、製剤の他の成分と適合し、医薬製剤化でき、且つそのレシピエントに対して有害でないという意味で許容可能でなければならない。本発明の別の態様によれば、化合物Ａ２及び／又は化合物Ｂ２を１つ以上の薬学的に許容できる担体と混合することを含んでなる医薬製剤の調製プロセスも提供される。上述の通り、利用される医薬組合せのこのような要素は、別々の医薬組成物で提示されてもよく、又は１つの医薬製剤に一緒に製剤化されてもよい。
【００４８】
１単位用量当たり所定の量の活性成分を含有する単位用量形態で医薬製剤を提示してもよい。当業者に公知であるように、１用量当たりの活性成分の量は、治療される病態、投与経路、並びに患者の年齢、体重、及び病態に依存する。好ましい単位投薬量製剤は、日用量若しくはサブ用量（ｓｕｂ−ｄｏｓｅ）、又はその適切な割合の活性成分を含有しているものである。更に、薬学分野において周知である任意の方法によってこのような医薬製剤を調製することもできる。
【００４９】
化合物Ａ２及び化合物Ｂ２は、任意の適切な経路によって投与することができる。適切な経路としては、経口、直腸内、鼻内、局所（頬側及び舌下を含む）、膣内、及び非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、鞘内、及び硬膜外を含む）が挙げられる。好ましい経路は、例えば、組合せのレシピエントの病態、及び治療される癌によって変化し得ることが認識される。また、投与される剤の各々は、同一経路によって投与されても異なる経路によって投与されてもよく、且つ化合物Ａ２及び化合物Ｂ２は、１つの医薬組成物／製剤に一緒に配合されてもよいことも認識される。
【００５０】
本発明の化合物又は組合せは、カプセル剤、錠剤又は注射可能な調製物等の便利な剤形に組み込まれる。固体又は液剤の医薬担体が使用される。固体の担体としては、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム二水塩、白土、スクロース、滑石、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、ステアリン酸マグネシウム及びステアリン酸が挙げられる。液体の担体としては、シロップ、落花生油、オリーブ油、生理食塩水及び水が挙げられる。同様に、担体は、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリル等の持続放出材料を単独で又はろうと共に含んでもよい。固体の担体の量は広く変化するが、好ましくは、１投薬量単位当たり約２５ｍｇ〜約１ｇである。液体の担体が用いられるとき、調製物は、好適には、シロップ剤、エリキシル剤、乳剤、軟質ゼラチンカプセル剤、アンプル等の無菌注射液、又は水性若しくは非水性の液体懸濁剤の形態である。
【００５１】
例えば、錠剤又はカプセル剤の形態の経口投与については、活性薬物構成要素は、エタノール、グリセロール、水等の経口で無毒な薬学的に許容できる不活性担体と組合せてもよい。散剤は、化合物を好適な微細な大きさに粉砕し、例えばデンプン又はマンニトール等の可食性炭水化物等の同様に粉砕された医薬担体と混合することによって調製される。また、着香剤、防腐剤、分散剤及び着色剤が存在してもよい。
【００５２】
上述の成分に加えて、製剤が、対象の製剤の種類を考慮して当技術分野において従来用いられている他の剤を含んでもよく、例えば、経口投与に好適な製剤が、着香剤を含んでもよいことを理解すべきである
【００５３】
上述の通り、治療上有効な量の本発明の組合せ（化合物Ｂ２と組合せられた化合物Ａ２）がヒトに投与される。典型的に、本発明の投与される剤の治療上有効な量は、例えば、被験者の年齢及び体重、治療を必要とする正確な病態、病態の重篤度、製剤の性質、並びに投与経路を含む多くの要因に依存する。最終的に、治療上有効な量は、主治医の裁量による。
【００５４】
公知の手順に従って有効性、有利且つ相乗的な特性について本発明の組合せを試験する。好適には、一般的に以下の組合せ細胞増殖アッセイに従って、有効性、有利且つ相乗的な特性について本発明の組合せを試験する。１０％のＦＢＳ及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンを添加した各細胞種に適切な培養培地中９６又は３８４ウェルプレートに細胞をプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。化合物Ａ２の希釈液（１０の希釈液、化合物を含まないもの、化合物によって０．２５０〜２０μＭから出発して３倍ずつ希釈したものを含む）で細胞を格子状方式（ｇｒｉｄ  ｍａｎｎｅｒ）で処理し、また、化合物Ｂ２（１０の希釈液、化合物を含まないもの、化合物によって０．１５０〜２０μＭから出発して３倍ずつ希釈したものを含む）でも処理し、更に７２時間上記の通りインキュベートする。場合によっては、化合物を互い違いの方式（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ｍａｎｎｅｒ）で添加し、インキュベーション時間を最高７日間延長してもよい。製造業者のプロトコールに従って、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬を使用して細胞増殖を測定し、０．５秒間読み取る発光モードに設定されたＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）リーダーでシグナルを読み取る。下記の通りデータを分析する。
【００５５】
ｔ＝０値の百分率として結果を表し、化合物濃度に対してプロットする。ｔ＝０値を１００％に正規化し、化合物の添加時に存在する細胞数を表す。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌソフトウェアのＩＤＢＳ  ＸＬｆｉｔプラグインを使用して濃度に対する細胞の生存率の４−又は６−パラメータ曲線当てはめを用い、細胞増殖の５０％の阻害に必要な濃度（ｇＩＣ５０）を求めて、各化合物及び／又は化合物の組合せについての細胞応答を求める。細胞を含有していないウェルから得られた値を減じることによってバックグラウンド補正を行う。各薬物の組合せについて、Ｃｈｏｕ及びＴａｌａｌａｙ（１９８４年）Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，２２，３７−５５；並びにＢｅｒｅｎｂａｕｍ，ＭＣ（１９８１年）Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５，２６９−３３５に記載されている方法等の公知の方法に従って組合せ指数（ＣＩ）、最高の単剤に対する超過（Ｅｘｃｅｓｓ  Ｏｖｅｒ  Ｈｉｇｈｅｓｔ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ａｇｅｎｔ，ＥＯＨＳＡ）、及びＢｌｉｓｓ超過（Ｅｘｃｅｓｓ  Ｏｖｅｒ  Ｂｌｉｓｓ，ＥＯＢｌｉｓｓ）を計算する。
【００５６】
本発明の組合せは上記アッセイにおいて活性であるので、前記組合せは癌の治療において有利な治療的有用性を示す。
【００５７】
好適には、本発明は、以下から選択される癌を治療するか又は重篤度を低下させる方法に関する：脳（神経膠腫）、膠芽腫、Ｂａｎｎａｙａｎ−Ｚｏｎａｎａ症候群、カウデン病、レルミット−デュクロス病、乳房、炎症性乳癌、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、脳室上衣腫、髄芽細胞腫、結腸、頭頸部、腎臓、肺、肝臓、黒色腫、卵巣、膵臓、前立腺、肉腫、骨肉腫、骨巨細胞腫、甲状腺、
リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、ヘアリーセル白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性好中球性白血病、急性リンパ性Ｔ細胞白血病、形質細胞腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、マントル細胞白血病、多発性骨髄腫、巨核芽球性白血病、多発性骨髄腫、急性巨核球性白血病、前骨髄性白血病、赤白血病、
悪性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、リンパ芽球性Ｔ細胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、
神経芽細胞腫、膀胱癌、尿路上皮癌、肺癌、外陰部癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、中皮腫、食道癌、唾液腺癌、肝細胞癌、胃癌、鼻咽頭癌、頬側癌、口腔癌、ＧＩＳＴ（消化管間質腫瘍）及び睾丸癌。
【００５８】
好適には、本発明は、以下から選択される癌を治療するか又は重篤度を低下させる方法に関する：脳（神経膠腫）、膠芽腫、Ｂａｎｎａｙａｎ−Ｚｏｎａｎａ症候群、カウデン病、レルミット−デュクロス病、乳房、結腸、頭頸部、腎臓、肺、肝臓、黒色腫、卵巣、膵臓、前立腺、肉腫及び甲状腺。
【００５９】
好適には、本発明は、卵巣、肝臓、結腸、乳房、膵臓、及び前立腺から選択される癌を治療するか又は重篤度を低下させる方法に関する。
【００６０】
好適には、本発明は、乳房、肝臓、肺、膵臓、及び結腸から選択される癌を治療するか又は重篤度を低下させる方法に関する。
【００６１】
好適には、本発明は、特定のバイオマーカーについて野性型又は突然変異型のいずれかである癌を治療するか又は重篤度を低下させる方法に関する。
【００６２】
用語「野性型」は、当技術分野において理解されている通り、遺伝子改変を含まないネイティブな集団で生じるポリペプチド又はポリヌクレオチドの配列を指す。また、当技術分野において理解されている通り、「突然変異型」は、それぞれ野性型のポリペプチド又はポリヌクレオチドで見出される対応するアミノ酸又は核酸と比べて、アミノ酸又は核酸の少なくとも１つが改変されているポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む。突然変異型という用語には、最も広く見出される（野性型）核酸鎖と比べて、核酸鎖の配列中に単一塩基対の差異が存在する一塩基多型（ＳＮＰ）が含まれる。
【００６３】
特定のバイオマーカーについて野性型又は突然変異型のいずれかであり且つＰＩ３Ｋ／Ｐｔｅｎについて野性型又は突然変異型のいずれかである癌は、公知の方法によって同定される。
【００６４】
ＫＲＡＳとしても知られているＶ−Ｋｉ−ｒａｓ２  Ｋｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルス癌遺伝子のホモログは、ヒトではＫＲＡＳ遺伝子によってコードされているタンパク質である。Ｒａｓファミリーの他のメンバーと同様に、ＫＲＡＳタンパク質は、ＧＴＰａｓｅであり、多くのシグナル伝達経路の初期に働く。ＫＲＡＳは、通常、Ｃ末端にイソプレニル基が存在しているので、細胞膜に拘束されている。突然変異すると、ＫＲＡＳは癌遺伝子になる。正常なＫＲＡＳ遺伝子のタンパク質生成物は、正常な組織のシグナル伝達において必須の機能を果たしており、ＫＲＡＳ遺伝子の突然変異は、多くの癌における発現の必須段階である。
【００６５】
Ｎ−ｒａｓ癌遺伝子は、ＲＡＳ遺伝子ファミリーのメンバーである。Ｎ−ｒａｓ癌遺伝子は、１番染色体に位置し、前骨髄球性白血病株であるＨＬ６０において活性化される。近傍の遺伝子の順序は、以下の通りである：ｃｅｎ――ＣＤ２――ＮＧＦＢ――ＮＲＡＳ――ｔｅｌ。哺乳類のｒａｓ遺伝子ファミリーは、ｈａｒｖｅｙ及びｋｉｒｓｔｅｎ  ｒａｓ遺伝子（ｃ−Ｈｒａｓ１及びｃ−Ｋｒａｓ２）、それぞれの不活性偽遺伝子（ｃ−Ｈｒａｓ２及びｃ−Ｋｒａｓ１）、並びにＮ−ｒａｓ遺伝子からなる。これらは、Ｃ末端の４０アミノ酸のみが著しく異なる。これらｒａｓ遺伝子は、ＧＴＰ／ＧＤＰ結合活性及びＧＴＰａｓｅ活性を有し、その正常な機能は、細胞増殖の正常な制御に関与するＧ様調節タンパク質である可能性がある。アミノ酸残基１２、１３、又は６１を変化させる突然変異は、培養細胞を形質転換させるＮ−ｒａｓの能力を活性化し、様々なヒト腫瘍に関連している。Ｎ−ｒａｓ遺伝子は、２Ｋｂ及び４．３Ｋｂの２つの主な転写産物を特定する。この２つの転写産物間の差は、２Ｋｂの転写産物の末端部位が単に伸長されていることである。Ｎ−ｒａｓ遺伝子は、７つのエキソン（−Ｉ、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ）からなる。より小さな２Ｋｂの転写産物は、ＶＩａエキソンを含有し、より大きな４．３Ｋｂの転写産物は、単にＶＩａエキソンのより長い形態であるＶＩｂエキソンを含有する。両方の転写産物は、３’非翻訳領域が異なるだけであるので、同一のタンパク質をコードしている。より短い２Ｋｂの転写産物の配列を本明細書に提示する。４．３Ｋｂの転写産物の配列は、入手不可能である。
【００６６】
野性型又は突然変異型のＲａｓ／Ｒａｆ又はＰＩ３Ｋ／ＰＴＥＮ腫瘍細胞は、ＤＮＡ増幅及びシーケンシング技術、それぞれノーザンブロット及びサザンブロットが挙げられるがこれらに限定されないＤＮＡ及びＲＮＡの検出技術、並びに／又は様々なバイオチップ及びアレイ技術によって同定することができる。これは、細胞遺伝学的異常及び転写産物量を含み得る。野性型及び突然変異型のポリペプチドは、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットまたは、免疫細胞化学等の免疫診断技術が挙げられるが、これらに限定されない様々な技術によって検出することができる。
【００６７】
本発明は、Ｎ−｛３−［３−シクロプロピル−５−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル］フェニル｝アセトアミド又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物と、２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミド又はその薬学的に許容できる塩とを含んでなる組合せを提供する。
【００６８】
また、本発明は、療法で使用するための、Ｎ−｛３−［３−シクロプロピル−５−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル］フェニル｝アセトアミド又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物と、２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミド又はその薬学的に許容できる塩とを含んでなる組合せを提供する。
【００６９】
また、本発明は、癌の治療において使用するための、Ｎ−｛３−［３−シクロプロピル−５−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル］フェニル｝アセトアミド又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物と、２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミド又はその薬学的に許容できる塩とを含んでなる組合せを提供する。
【００７０】
また、本発明は、Ｎ−｛３−［３−シクロプロピル−５−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル］フェニル｝アセトアミド又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物と、２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミド又はその薬学的に許容できる塩との組合せを含んでなる医薬組成物を提供する。
【００７１】
また、本発明は、Ｎ−｛３−［３−シクロプロピル−５−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル］フェニル｝アセトアミド又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物と、２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミド又はその薬学的に許容できる塩とを含んでなる組合せキットを提供する。
【００７２】
また、本発明は、薬剤の製造における、Ｎ−｛３−［３−シクロプロピル−５−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル］フェニル｝アセトアミド又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物と、２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミド又はその薬学的に許容できる塩とを含んでなる組合せの使用を提供する。
【００７３】
また、本発明は、癌を治療するための薬剤の製造における、Ｎ−｛３−［３−シクロプロピル−５−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル］フェニル｝アセトアミド又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物と、２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミド又はその薬学的に許容できる塩とを含んでなる組合せの使用を提供する。
【００７４】
また、本発明は、それを必要としている被験体に、Ｎ−｛３−［３−シクロプロピル−５−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル］フェニル｝アセトアミド又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物と、２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミド又はその薬学的に許容できる塩との組合せを投与することを含んでなる癌を治療する方法を提供する。
【００７５】
また、本発明は、癌を治療する方法であって、それを必要としている被験体に、Ｎ−｛３−［３−シクロプロピル−５−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル］フェニル｝アセトアミド又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物と、２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミド又はその薬学的に許容できる塩との組合せを投与することを含み、前記Ｎ−｛３−［３−シクロプロピル−５−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル］フェニル｝アセトアミド又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物の量が、約０．５ｍｇ〜約３ｍｇから選択され、２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミド又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物の量が、約０．５ｍｇ〜約３ｍｇから選択される方法を提供する。
【実施例】
【００７６】
以下の実施例は、例示のみを意図し、いかなる方法でも本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００７７】
実験の詳細
ＭＥＫ阻害剤の調製
本発明の組合せにおいて使用するのに好適なＭＥＫ阻害剤、特に、Ｎ−｛３−［３−シクロプロピル−５−（２−フルオロ−４−ヨードフェニルアミノ）６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１−イル］フェニル｝アセトアミドジメチルスルホキシド
【化５】
2013505962.tif 000006
は、国際公開第２００５／１２１１４２号パンフレットに従って調製することができる。
【００７８】
本発明の組合せにおいて使用するのに好適なＰＩ３Ｋ阻害剤、特に、２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミド
【化６】
2013505962.tif 000007
は、国際公開第０８／１４４４６３号パンフレット（実施例３４５）に従って調製することができる。
【００７９】
実験の章に記載される化合物Ａは、Ｎ−｛３−［３−シクロプロピル−５−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１−イル］フェニル｝アセトアミドのジメチルスルホキシド溶媒和物を指す。
【００８０】
腫瘍細胞株における、化合物Ａ、化合物Ｂ、及びこれらの組合せによるインビトロ細胞増殖阻害及びアポトーシス誘導
実験番号１：結腸、肺、及び膵臓細胞株
実験の準備
ヒト結腸癌（ｎ＝２６）、肺癌（ｎ＝１４）、及び膵臓癌（ｎ＝６）由来の細胞株のパネルを用いて化合物ＡとＢとの組合せ薬物試験を実施した（表１）。細胞株は、［ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）又はＤＳＭＺ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から］商業的に購入し、（２０％のウシ胎仔血清で増殖させたＣａｐａｎ−１及びＨｕＰ−Ｔ４を除いて）２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び１０％のウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ−１６４０中で増殖させ、多湿インキュベータ内で３７℃及び５％ＣＯ２にて維持した。
【００８１】
実験のプロトコール
固定比の薬物組合せアッセイ
固定比の薬物組合せアッセイの希釈設計は、図１から分かる。まず、１００％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中１０ｍＭの原液として試験化合物を調製した。ＤＭＳＯを用いて化合物の更なる希釈を行った。第１の試験化合物（化合物Ａと命名した）は、１０希釈点にわたって３倍希釈系列を用いて９６ウェルマイクロタイタープレートの列Ｂ〜Ｅにて水平希釈した。第２の試験化合物（化合物Ｂと命名した）は、１０希釈点にわたって３倍希釈系列を用いて別個の９６ウェルマイクロタイタープレートの列Ｄ〜Ｇにて同様に水平希釈した。各薬物プレートから等体積を用いて２つの化合物を細胞培養培地中で合わせた。これによって、薬物の細胞培養培地による１：５０希釈物が得られた。化合物Ａを列Ｂ及びＣに個々に滴定し、化合物ＢのみをプレートのＦ及びＧに投薬した。細胞に添加する前に細胞培養培地において薬物を更に１：１０で希釈した。細胞に薬物を添加することによって、更に薬物が１：２で希釈された。薬物プレートは、細胞に対して合計で１：１０００に希釈された。化合物Ｂの最終投薬濃度範囲は、０．００８〜１５０．０ｎＭであり、化合物Ａでは０．０１３〜２５０．０ｎＭであった。ポジティブコントロールは、０．１％のＤＭＳＯ及び細胞を含み、薬物を含まない培養培地からなっていた。ネガティブコントロールは、０．１％のＤＭＳＯ溶液を含む培養培地からなっていた。
【００８２】
アッセイは、各細胞株に関する以前の研究から推定される適切な播種密度を用いて９６ウェルマイクロタイタープレートにて実施された。投薬後、細胞株を３７℃、５％ＣＯ２、湿り空気中で７２時間インキュベートする。製造業者のプロトコールに従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）試薬を用いて細胞の増殖を測定した。プレートをＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ溶液で処理し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）プレートリーダーを用いてＲＬＵ（相対光単位）について分析する。
【００８３】
データ分析
３つの独立したメトリック（ｍｅｔｒｉｃｓ）を用いて化合物Ｂ及び化合物Ａの増殖阻害に対する組合せ効果について分析した。
１．最高の単剤に対する超過（ＥＯＨＳＡ）−薬物の組合せ効果を測定するための１つの標準的な基準は、絶対的な条件で細胞増殖阻害に対する効果を分析することである。この場合、薬物の組合せをより応答性の高い２つの個々の処理（単剤）と比較する。各組合せの実験について、曲線に沿って各用量について最高の単剤に対する効果の百分率を求める。この「最高の単剤の超過（ＥＯＨＳＡ）」の尺度は、薬物の組合せの相乗作用を評価するために用いられる基準の１つである（Ｂｏｒｉｓｙ  ＡＡ  Ｅｌｌｉｏｔｔ  ＰＪ，Ｈｕｒｓｔ  ＮＷ，Ｌｅｅ  ＭＳ，Ｌｅｈａｒ  Ｊ，Ｐｒｉｃｅ  ＥＲ，Ｓｅｒｂｅｄｚｉｊａ  Ｇ，Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ＧＲ，Ｆｏｌｅｙ  ＭＡ，Ｓｔｏｃｋｗｅｌｌ  ＢＲ，Ｋｅｉｔｈ  ＣＴ．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００３年６月２４日；１００（１３）：７９７７−８２）。
２．Ｂｌｉｓｓ相乗作用−組合せの相乗作用を求めるために用いられることが多い第２の基準は、Ｂｌｉｓｓ独立性又は「相加性」を超える過剰な阻害を評価することである（Ｂｌｉｓｓ，Ｃ．Ｉ，Ｍｅｘｉｃｏ，ＤＦ，Ｔｈｅ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｏｉｓｏｎｓ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｊｏｉｎｔｌｙ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ１９３９年，Ｖｏｌ２６，Ｉｓｓｕｅ３，１９３９年８月）。このモデルは、以下を用いて、独立に２つの化合物の併用応答を推定する：
スコア＝Ｅａ＋Ｅｂ−（Ｅａ＊Ｅｂ）
（式中、Ｅａは、化合物Ａの効果（又は阻害率）であり、Ｅｂは、化合物Ｂの効果である）。２つの化合物の組合せから得られる効果を、Ｂｌｉｓｓによって予測される相加性と比較し、応答曲線に沿って各用量について相乗作用スコアを求める。
３．組合せ指数（ＣＩ）−相乗作用を評価するための第３の基準は、Ｃｈｏｕ及びＴａｌａｌａｙ（Ｃｈｏｕ  ＴＣ，Ｔａｌａｌａｙ  Ｐ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｄｏｓｅ−ｅｆｆｅｃｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ：ｔｈｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｒｕｇｓ  ｏｒ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ａｄｖ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇｕｌ．１９８４年；２２：２７−５５）によって導かれた組合せ指数（ＣＩ）である。以下の等式は、異なる作用機序で挙動する化合物に用いられるモデルである（互いに排反ではない）。
【数１】
2013505962.tif 000008
【００８４】
ＣＩ値が小さいほど、組合せが潜在的に有している相乗作用が大きい。ＣＩが１を超えることは、試験されている組合せが拮抗的である可能性があることを示唆する。また、ＣＩスコアは、各化合物について上記式中のＩＣ５０をそれぞれの阻害濃度に置き換えることによって２５％（ＩＣ２５）及び７５％（ＩＣ７５）の阻害濃度が求められる。
【００８５】
４パラメータロジスティック当てはめを用いてｇＩＣ５０値を計算するためにＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌにおけるＸＬｆｉｔのモデル２０５において強度値の百分率を用いた。増殖域の中点（ｇＩＣ５０）は、化合物添加時（Ｔ＝０）における細胞数と、７２時間目におけるＤＭＳＯで処理された対象細胞の増殖との間の中間に入る。時間０における細胞数（Ｔ０）を応答曲線の底部の強度値（Ｙｍｉｎ）で除して、細胞死の尺度を求める（Ｙｍｉｎ／Ｔ０）。Ｙｍｉｎ／Ｔ０の値が１未満であることは、より高い値と比べたとき、処理による効力がより強いことを示す。
【００８６】
ＥＯＨＳＡ及びＢｌｉｓｓの場合、適切な命名（相乗作用、中程度の相乗作用等）を行うために実験における両方の技術的複製物において相乗作用スコアを見なければならない。各組合せの実験は、単剤としての２つの化合物についての複製物、並びに組合せについての技術的複製物を含む。
【００８７】
極めて低い濃度（例えば、用量１、用量２）におけるＥＯＨＳＡ及びＢｌｉｓｓの相乗作用スコアは、より変動が大きいので、一般的に分析から除外される。対照的に、治療上の投薬範囲から大きく外れた最高濃度（用量１０）における相乗作用スコアは、観察される効果が標的としない事象を受けやすいので一般的に分析から除外される。
【００８８】
ＥＯＨＳＡ及びＢｌｉｓｓ相乗作用尺度について、スコアは、応答曲線に沿って各用量について求められる。スコアは、「拮抗的」（＜−１０）、「相加的」（−１０〜１０）、「中程度に相乗的」（１０〜２０）、又は「相乗的」（＞２０）に分類した。これらスコアは、どのモデルが解釈されるかによって、最高の単剤を超える百分率又はＢｌｉｓｓ相加性を超える百分率を反映する。
【００８９】
組合せ指数については、ＣＩが低いほど、組合せが潜在的に有している相乗作用が大きい。０〜０．７のスコアは、相乗的であるとみなされ、一方０．７〜０．９のスコアは中程度に相乗的であるとみなされる。全ての他のスコアは、組合せ指数について相乗作用を示さなかった。
【００９０】
組合せにおける化合物のうちの１つについて２５％の阻害濃度に達しなかった細胞株については、ＣＩ値が計算できなかったので、ＣＩの欄に「ＮＡ」と記載した。
【００９１】
細胞株の突然変異データ
ＫＲＡＳ遺伝子の状態について突然変異データを照合した。データ源は、Ｃａｔｏｌｏｇ  ｏｆ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＯＳＭＩＣ）の一部として公開されている癌細胞株の突然変異スクリーニングデータである（Ｂａｍｆｏｒｄ  Ｓ．ら．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．２００４年．９１：３５５−５８）。増殖アッセイにおいて用いられる細胞株の同一性をＣＯＳＭＩＣデータベースのものと確実に一致させるために、感受性スクリーニングにおける細胞株とＣＯＳＭＩＣにおける細胞株との間で遺伝子型の比較を行った。具体的には、以下の通りであった：
１．Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ５００Ｋ「ＳＮＰ  Ｃｈｉｐ」（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）及びＲＬＭＭアルゴリズム（Ｒａｂｂｅｅ及びＳｐｅｅｄ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００６年．２２：７−１２）を用いて各細胞株の遺伝子型を計算する。
２．ＣＯＳＭＩＣにおける突然変異プロファイルを有する各細胞株について予め計算された遺伝子型一致に対して各細胞株の遺伝子型一致を同定する。
３．遺伝子型一致に基づいて各細胞株の突然変異状態を割り当てる。
【００９２】
結果
ＰＩ３Ｋ阻害剤である化合物ＢとＭＥＫ阻害剤である化合物Ａとの組合せで処理された各細胞株について、相乗作用の程度の包括的分類を行った。細胞株は、少なくとも１メトリックで相乗的であるとスコア付けされた場合、相乗作用を有するとみなした。結腸、膵臓、及び肺の細胞株についての相乗作用データを表１〜４に提示する。膵臓細胞株の計算についてのデータは、補遺Ａの表７〜９に見出すことができる。
【００９３】
【表１−１】
2013505962.tif 000009
【表１−２】
2013505962.tif 000010
【００９４】
【表２−１】
2013505962.tif 000011
【表２−２】
2013505962.tif 000012
【００９５】
【表３】
2013505962.tif 000013
【００９６】
【表４】
2013505962.tif 000014
【００９７】
実験番号２：エストロゲン受容体について分析された乳癌細胞株
実験の準備
ヒト乳癌（ｎ＝１０）由来の細胞株のパネルを用いてＭＥＫ阻害剤（化合物Ａ）とＰＩ３Ｋ阻害剤（化合物Ｂ）との組合せ薬物試験を実施した（表１）。細胞株は、［ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）又はＤＳＭＺ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から］商業的に購入し、２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び１０％のウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ−１６４０中で増殖させ、多湿インキュベータ内で３７℃及び５％ＣＯ２にて維持した。
【００９８】
実験のプロトコール
固定比の薬物組合せアッセイ
固定比の薬物組合せアッセイの希釈設計は、図１から分かる。まず、１００％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中１０ｍＭの原液として試験化合物を調製した。ＤＭＳＯで化合物の更なる希釈を行った。第１の試験化合物（化合物１と命名した）は、１０希釈点にわたって３倍希釈系列を用いて９６ウェルマイクロタイタープレートの列Ｂ〜Ｅにて水平希釈した。第２の試験化合物（化合物２と命名した）は、１０希釈点にわたって３倍希釈系列を用いて別個の９６ウェルマイクロタイタープレートの列Ｄ〜Ｇにて同様に水平希釈した。各薬物プレートから等体積を用いて２つの化合物を細胞培養培地中で合わせた。これによって、細胞培養培地による薬物の１：５０希釈物が得られた。化合物１を列Ｂ及びＣに個々に滴定し、化合物２のみをプレートの列Ｆ及びＧに投薬した。細胞に添加する前に細胞培養培地において薬物をさらに１：１０で希釈した。細胞に薬物を添加することによって、更に薬物が１：２で希釈された。薬物プレートは、細胞に対して合計で１：１０００に希釈された。ＧＳＫ２１２６４５８Ａの最終投薬濃度範囲は、０．００８〜１５０．０ｎＭであり、ＧＳＫ１１２０２１２Ｂでは０．０１３〜２５０．０ｎＭであった。ポジティブコントロールは、０．１％のＤＭＳＯ及び細胞を含み、薬物を含まない培養培地からなっていた。ネガティブコントロールは、０．１％のＤＭＳＯ溶液を含む培養培地からなっていた。
【００９９】
アッセイは、各細胞株に関する以前の研究から推定される適切な播種密度を用いて９６ウェルマイクロタイタープレートにて実施された。投薬後、細胞株を３７℃、５％ＣＯ２、湿り空気中で７２時間インキュベートした。製造業者のプロトコールに従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）試薬を用いて細胞の増殖を測定した。プレートをＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ溶液で処理し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）プレートリーダーを用いてＲＬＵ（相対光単位）について分析する。
【０１００】
データ分析
４パラメータロジスティック当てはめを用いて増殖域の中点（ｇＩＣ５０）、時間ゼロにおける細胞数（Ｔ０）、及び応答曲線の底部の強度値（Ｙｍｉｎ）を含む応答メトリックを計算するためにＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌにおけるＸＬｆｉｔのモデル２０５において強度値の百分率を用いた。各組合せの実験は、単剤としての２つの化合物についての複製物、並びに組合せについての技術的複製物を含む。平均値は、後続の分析のために用いた。
【０１０１】
３つの独立したメトリック：ｉ）最高の単剤を超える超過（ＥＯＨＳＡ、Ｂｏｒｉｓｙら，２００３年；ＦＤＡ  ２１  ＣＦＲ  ３００．５０）、ｉｉ）Ｂｌｉｓｓ相乗作用、及びｉｉｉ）組合せ指数（ＣＩ）を用いて、化合物Ａ及び化合物Ｂの増殖阻害に対する組合せ効果を分析した。これら３つのメトリックの説明及びこれらの計算方法は、上記の通りである。また、各メトリックによる相乗作用の程度を求めるために用いられる基準も上記に見出される。ＥＯＨＳＡ及びＢｌｉｓｓについては、適切な命名（相乗作用、中程度の相乗作用等）を行うために実験における両方の技術的複製物において相乗作用スコアを見なければならない。簡潔に述べると、上記３つのメトリック（ＣＩ、Ｂｌｉｓｓ相乗作用、ＥＯＨＳＡ）のうちの少なくとも１つが上述の相乗作用の範囲内にスコア付けされた場合、細胞株は相乗的であるとみなした。
【０１０２】
エストロゲン受容体（ＥＲ）及びプロゲステロン受容体（ＰＲ）の転写産物量は、トリプリケートでＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ２  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓを用いて全ての細胞株について測定した。全てのプローブのシグナル強度を正規化することによって推定された転写産物量は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｕｉｔｅ  ５．０におけるｍａｓ５アルゴリズムを用いて１５０の値に正規化した。続く分析では、代表的なプローブを選択し、トリプリケートについての平均プローブ強度を用いた。
【０１０３】
結果
化合物Ａと化合物Ｂとの組合せで処理された各細胞株について、相乗作用の程度の包括的分類を行った。
【０１０４】
【表５】
2013505962.tif 000015
【０１０５】
【表６】
2013505962.tif 000016
【０１０６】
【表７】
2013505962.tif 000017
【０１０７】
実験番号３：Ｈｅｒ２  ＤＮＡコピー数の変化について分析されたパネルの肝細胞癌細胞株及びパネルの乳癌細胞株における化合物Ａ及びＢによるインビトロ細胞増殖阻害及びアポトーシス誘導
細胞株及び増殖条件
肝細胞癌（ＨＣＣ）由来のヒト腫瘍細胞株、Ｃ３Ａ、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、ＳＮＵ１８２、ＳＮＵ３８７、ＳＮＵ３９８、ＳＮＵ４２３、ＳＮＵ４４９、及びＳＮＵ４７５は、ＡＴＣＣから購入した。ＡＴＣＣから入手したヒト乳房腫瘍細胞株ＨＣＣ２２１８、ＨＣＣ１４１９、ＢＴ−４７４、ＳＫ−ＢＲ−３、ＵＡＣＣ８９３、ＪＩＭＴ−１、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＨＣＣ２０２、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩ、ＨＣＣ１５６９、ＨＣＣ１９３７、ＨＣＣ３８、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７、ＨＣＣ１９５４、ＨＣＣ１５００、ＢＴ４８３、ＫＰＬ−１、ＳＵＭ２２５、及びＺＲ−７５−１、Ａｓｔｅｒａｎｄ，ＰＬＣ（Ｄｅｔｒｏｉｔ  ＭＩ）から入手したＳＵＭ５２及びＳＵＭ１９０は、１０％ＦＢＳを含有しているＲＰＭＩ１６４０培地中で培養し、ＳＫＢＲ３−Ｗ１３及びＢＴ−４７４−Ｊ４は、１０％ＦＢＳ及び１μＭのラパチニブを含有しているＲＰＭＩ１６４０培地中で培養し、ＫＰＬ−４株は、紅林淳一博士（川崎医科大学、岡山、日本）より供与頂き、５％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で培養した。欧州細胞バンク（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＵＫ））から入手したＪＩＭＴ−１は、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））に対して臨床的に抵抗性である患者に由来する株である。ＳＫ−ＢＲ−３−Ｗ１３は、０．５μＭのラパチニブでＳＫ−ＢＲ−３細胞を単回処理した後クローニングシリンダによって単離された単一細胞クローンである。ＢＴ−４７４−Ｊ４は、選択したＢＴ−４７４細胞のプールに由来する単一細胞クローンであり、３μＭの濃度までラパチニブ中で増殖させた。
【０１０８】
細胞増殖阻害アッセイ及び組合せのデータ分析
１ウェル当り５００〜２，０００細胞で、９６ウェル組織培養プレート（ＮＵＮＣ  １３６１０２）中の１０％ＦＢＳを含有しているＲＰＭＩ培地に細胞を播種した。プレーティングの約２４時間後、化合物Ａ又はＢ又は２：１（それぞれ化合物Ａ及びＢ）の一定モル比の２つの剤の組合せのいずれかの１０個の、２倍又は３倍連続希釈液に細胞を曝露した。場合によっては、１０％ＦＢＳを含有しているＲＰＭＩ培地中で、２ｎｇ／ｍＬの肝細胞成長因子（ＨＧＦ）の存在下又は不在下にて、細胞を増殖させた。３日間化合物の存在下で細胞をインキュベートした。製造業者のプロトコールに従ってＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加することにより、ＡＴＰレベルを求めた。簡潔に述べると、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（登録商標）を各プレートに添加し、２０分間インキュベートし、次いで、積分時間０．５秒間のＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｌプレートリーダーで発光シグナルを読み取った。全てのアッセイは、少なくともデュープリケートで行った。
【０１０９】
３日間化合物又は化合物の組合せで処理した後、細胞増殖の阻害を推定し、ビヒクル（ＤＭＳＯ）で処理された細胞とシグナルを比較した。ビヒクル（ＤＭＳＯ）で処理された対照ウェルに対する細胞増殖を計算した。対照細胞の増殖の５０％を阻害する化合物の濃度（ＩＣ５０）を、以下の等式
【数２】
2013505962.tif 000018
（式中、Ａは、最小応答（ｙｍｉｎ）であり、Ｂは最大応答（ｙｍａｘ）であり、Ｃは曲線の変曲点（ＥＣ５０）であり、Ｄは、ヒル係数である）によって非線形回帰を用いてｙ＝ＤＭＳＯ処理された対照ウェルの５０％であるとき後方補間した。
【０１１０】
効力に対する組合せの効果は、組合せ指数（ＣＩ）及び最高単剤を超える超過（ＥＨＯＳＡ）法を用いて評価した。
【０１１１】
この実験では、化合物Ａ及びＢの共投与は、ＣＩ＜０．９又はＥＯＨＳＡＴＤ＞０である場合、効力に対する特定の細胞株において又は応答尺度において相乗的相互作用を示す。
【０１１２】
細胞のアポトーシスアッセイ−カスパーゼ−３／７活性化及びＤＮＡ断片化
アポトーシスの誘導について調べるために、全ての細胞株を９６ウェル組織培養プレートに１ウェル当たり５，０００細胞でプレーティングし、約２４時間付着させた。次いで、細胞を上記化合物で処理した。化合物処理の２４時間後、製造業者によって提供される説明書に従ってＣａｓｐａｓｅ  Ｇｌｏ（商標）３／７（Ｐｒｏｍｅｇａ，カタログ番号Ｇ８０９３）を用いて活性カスパーゼ３及びカスパーゼ７のレベルを求めた。化合物処理の４８時間後、製造業者によって提供される説明書に従ってＲｏｃｈｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ＥＬＩＳＡ（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｃ．，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；カタログ番号１１  ７７４  ４２５  ００１）を用いてアポトーシスのレベルを推定した。
【０１１３】
選択された細胞株を分子的に特性評価する目的のために、幾つかの鍵となるタンパク質の発現レベルをウエスタンブロットによって測定した。これらは、Ｅ−カドヘリン（ＣＤＨ−１）、ビメンチン（ＶＩＭ）、ＨＥＲ３  ＳＴＡＴ３、ＭＥＴ、ＡＫＴ及びＥＲＫ１／２を含んでいた。いずれの場合もアクチンを対照として用いた。
【０１１４】
ＤＮＡコピー数
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ５００Ｋ  ｃｈｉｐ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｉｎｃ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、全ての乳癌細胞株について、ＨＥＲ２遺伝子におけるＤＮＡコピー数のデータを集めた。簡潔に述べると、各株からＤＮＡを抽出し、制限酵素Ｎｓｐ又はＳｔｙで切断し、アダプターにライゲーションし、ＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ後、ＤＮＡを断片化し、標識し、変性させ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ５００Ｋ  ｃｈｉｐにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションが完了したら、各アッセイ物を洗浄し、染色した。イメージデータを収集した。パネル１０の２倍体非腫瘍形成性リンパ芽球性細胞株から同様に集めたデータを用いてＤＮＡのコピー数を計算した。全ての「ＳＮＰチップ」イメージ（「ＣＥＬファイル」）を抽出し、ｄＣｈｉｐソフトウェアパッケージを用いて読み取り、正規化した（Ｌｉｎら．２００４年．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０：１２３３−４０）。リンパ芽球性レファレンスパネルを用いて全ての癌細胞株についてＳＮＰに関する「コピー数比」（ｌｏｇ２目盛）を計算し、循環二分割（ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｂｉｎａｒｙ  ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）によって分析してノイズを低減した（Ｏｌｓｈｅｎら．２００４年．Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．５：５５７−７２）。ＨＥＲ２＞０．６５のｌｏｇ２比を有する細胞株をＨＥＲ２＋とみなした。
【０１１５】
結果
化合物Ａと化合物Ｂとの組合せによる肝細胞癌細胞株に対する細胞増殖阻害及びアポトーシスの効果
１０個の肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞株においてウエスタンブロットによって分析された遺伝的背景及びタンパク質の発現を図２に示した。細胞株Ｃ３Ａ、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５及びＳＮＵ１８２は、高レベルのＣＤＨ−１を発現し、非常に低い〜低いレベルのＶＩＭを発現するが、一方、ＳＮＵ３８７、ＳＮＵ３９８、ＳＮＵ４２３、ＳＮＵ４４９、及びＳＮＵ４７５細胞株は、比較的高いレベルのＶＩＭ及び非常に低いレベルのＣＤＨ−１を発現する。高レベルのＣＤＨ−１及び低レベルのＶＩＭ又はＶＩＭが発現しないことは、上皮細胞に特徴的であり、一方、高いＶＩＭ及び低いＣＤＨ−１は、間葉細胞に特徴的である。したがって、Ｃ３Ａ、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、及びＳＮＵ１８２は、上皮様細胞と定義され、ＳＮＵ３８７、ＳＮＵ３９８、ＳＮＵ４２３、ＳＮＵ４４９及びＳＮＵ４７５は、間葉様細胞と定義される。これは、ＨＥＲ３が上皮様ＨＣＣ細胞で高度に発現し、ＡＸＬが間葉様細胞において高度に発現するという事実に一致している（このデータも図２に示す）。ＳＴＡＴ３、ＡＫＴ、及びＥＲＫ１／２（総タンパク質）は、上皮様細胞及び間葉様細胞において同程度のレベルで発現し、一方、ＭＥＴの発現は可変的であるが、細胞のいずれの群との関連も異なっていなかった。ＡＫＴのリン酸化／活性化は、間葉様細胞株において選択的に観察され、ｐＡＫＴ−Ｔ３０８よりもｐＡＫＴ−Ｓ４７３のレベルの方が高かった。また、ｐＥＲＫ１／２も、間葉様細胞において異なって存在していたが、排他的ではなかった。
【０１１６】
化合物Ａ、化合物Ｂ、及びこれらの組合せによる細胞増殖阻害の効果を１０個のＨＣＣ細胞株で求めた。（少なくとも２つの独立した実験から得られた）平均ＩＣ５０及びＩＣ５０における組合せ効果を表８に要約する。３つの上皮様ＨＣＣ細胞株（ＨｅｐＧ２、Ｃ３Ａ、及びＨｅｐ３Ｂ）は、化合物Ａによる細胞増殖阻害に対する感受性が強く（ＩＣ５０＜３７ｎＭ）、ＳＮＵ１８２及びＰＬＣ／ＰＲＦ／５上皮様細胞株は、化合物Ａに対する感受性が弱かった（ＩＣ５０＝１．２〜２．８μＭ）。２つの間葉様ＨＣＣ細胞株（ＳＮＵ３８７及びＳＮＵ４２３）は、化合物Ａによる細胞増殖阻害に対する感受性が中程度であったが（ＩＣ５０＝７４〜５７７ｎＭ）、３つの間葉様細胞株（ＳＮＵ３９８、ＳＮＵ４４９、及びＳＮＵ４７５）は、化合物Ａによる細胞増殖阻害に対して感受性ではなかった。全ての１０個のＨＣＣ株は、化合物Ｂによる細胞増殖阻害に対して感受性であった（ＩＣ５０＜１０３ｎＭ）。更に、化合物Ａ及び化合物Ｂ（１：２比）による組合せ処理は、８〜１０個のＨＣＣ細胞株において、０．２２〜０．７８の組合せ指数値によって示される、又はＥＯＨＳＡＴＤ分析（５〜２０ｐｐｔ）及びＥＯＨＳＡ分析（１２〜２７ｐｐｔ）による最高の単剤よりも大きいことによって示される通り強い相乗作用を示した。ＨＧＦの存在は、薬物単独又は組合せのいずれかに対する応答性において一貫した効果を有していなかった。
【０１１７】
カスパーゼ−３／７の活性によって示される、化合物Ａ、化合物Ｂ、又は化合物Ａと化合物Ｂとの組合せがアポトーシスを誘導する能力についてこれら１０個のＨＣＣ株を更に評価した。カスパーゼ３の活性化は、アポトーシスの誘導の指標である。これら細胞についての代表的なカスパーゼ３／７活性曲線を図３に示す。ＳＮＵ１８２を除く全ての細胞株は、化合物Ａ又は化合物Ｂによる単剤処理に対して化合物Ａと化合物Ｂとの組合せ処理によってアポトーシスの強い増強を示した。ＳＮＵ１８２細胞は、これら単剤処理に対する化合物Ａと化合物Ｂとの組合せ処理によって中程度のアポトーシス増強を示した。
【０１１８】
化合物Ａと化合物Ｂとの組合せによるＨｅｒ２レベルについて測定されたヒトの乳房腫瘍細胞株に対する細胞増殖阻害の効果
ＨＥＲ２遺伝子のコピー数変化の分析によって、１４個がＨＥＲ２陽性（ＨＥＲ２＋）乳房腫瘍株であると同定された。これらは、ＢＴ４７４、ＢＴ４７４−Ｊ４、ＨＣＣ１４１９、ＨＣＣ１９５４、ＨＣＣ２０２、ＨＣＣ２２１８、ＪＩＭＴ−１、ＫＰＬ−４、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＳＫ−ＢＲ−３、ＳＫ−ＢＲ−３−Ｗ１３、ＳＵＭ１９０、ＳＵＭ２２５、及びＵＡＣＣ８９３であった。合計１０個が、ＨＥＲ２陰性（ＨＥＲ２−）であるとみなされた。これらは、ＢＴ４８３、ＨＣＣ１５００、ＨＣＣ１５６９、ＨＣＣ１９３７、ＨＣＣ３８、ＫＰＬ−１、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩ、ＺＲ−７５−１、及びＳＵＭ５２を含んでいた。
【０１１９】
化合物Ａ、化合物Ｂ、及びこれらの組合せによる細胞増殖阻害の効果をこれら２５個の細胞株について求めた。（少なくとも２つの独立した実験から得られた）平均ＩＣ５０値及びＩＣ５０における組合せ効果を表９に要約する。
【０１２０】
細胞株ＳＵＭ５２及びＭＤＡ−ＭＢ−１７５ＩＩは、ＩＣ５０値が０．０９９μＭ以下と化合物Ａに対して感受性である。対照的に、ＨＣＣ１９３７、ＳＫ−Ｂｒ−３−Ｗ１３、及びＭＤＡ−ＭＢ−１５７を除く全ての株は、ＩＣ５０＜０．１μＭと化合物Ｂに対して感受性である。化合物Ａと化合物Ｂとの組合せは、０．４８〜０．８３の組合せ指数（ＣＩ）値、及びＳＵＭ５２、ＨＣＣ１９５４（ＨＥＲ２＋）及びＭＤＡ−ＭＢ−１７５ＩＩ（ＨＥＲ２−）細胞株において最も活性の高い単剤分析（ＥＯＳＨＡ）よりも１５〜２５ｐｐｔ高い相乗作用を示した。また、化合物Ａと化合物Ｂとの組合せは、ＨＥＲ２＋（ＳＵＭ１９０、ＨＣＣ２０２）及びＨＥＲ２−株（ＭＤＡ−ＭＢ−１５７、ＨＣＣ１９３７）のサブセットにおいて最も活性の高い単剤分析（ＥＯＳＨＡ）よりも１０〜１５ｐｐｔ超える利点を示した。化合物Ａと化合物Ｂとの組合せは、残りの株において最も活性の高い単剤に匹敵する効果を示した。Ｈｅｒ２＋株（ｎ＝１４）についての平均ＥＯＨＳＡスコアは、９．１（±７．４）であり、一方、Ｈｅｒ２−株（ｎ＝１０）についての平均スコアは、６．９（±７．２）であった。これらＥＯＨＳＡスコアは、群間で有意に異なってはいなかった（ｐ＝０．４５；ｔ−検定）。
【０１２１】
【表８】
2013505962.tif 000019
【０１２２】
【表９−１】
2013505962.tif 000020
【表９−２】
2013505962.tif 000021
【０１２３】
実施例１−カプセル剤組成物
以下の表Ｉに示される比率の成分を標準的な２部分硬質カプセルに充填することによって、本発明の組合せを投与するための経口剤形を作製する。
【表１０】
2013505962.tif 000022
【０１２４】
実施例２−カプセル剤組成物
以下の表ＩＩに示される比率の成分を標準的な２部分硬質カプセルに充填することによって、本発明の化合物のうちの１つを投与するための経口剤形を作製する。
【表１１】
2013505962.tif 000023
【０１２５】
実施例３−カプセル剤組成物
以下の表ＩＩＩに示される比率の成分を標準的な２部分硬質カプセルに充填することによって、本発明の化合物のうちの１つを投与するための経口剤形を作製する。
【０１２６】
【表１２】
2013505962.tif 000024
【０１２７】
実施例４−錠剤組成物
以下の表ＩＶに示されるように、スクロース、微結晶性セルロース及び本発明の組合せの化合物を、示されている比率で１０％のゼラチン溶液と混合し、果粒化する。濡れた状態の果粒を篩にかけ、乾燥させ、デンプン、滑石及びステアリン酸と混合し、次いで、篩にかけ、錠剤に圧縮する。
【０１２８】
【表１３】
2013505962.tif 000025
【０１２９】
実施例５−錠剤組成物
以下の表Ｖに示されるように、スクロース、微結晶性セルロース及び本発明の組合せの化合物のうちの１つを、示されている比率で１０％のゼラチン溶液と混合し、果粒化する。濡れた状態の果粒を篩にかけ、乾燥させ、デンプン、滑石及びステアリン酸と混合し、次いで、篩にかけ、錠剤に圧縮する。
【０１３０】
【表１４】
2013505962.tif 000026
【０１３１】
実施例６−錠剤組成物
以下の表ＶＩに示されるように、スクロース、微結晶性セルロース及び本発明の組合せの化合物のうちの１つを、示されている比率で１０％のゼラチン溶液と混合し、果粒化する。濡れた状態の果粒を篩にかけ、乾燥させ、デンプン、滑石及びステアリン酸と混合し、次いで、篩にかけ、錠剤に圧縮する。
【表１５】
2013505962.tif 000027
【０１３２】
本発明の好ましい態様を上に例証しているが、本発明は、本明細書に開示される正確な説明に限定されるものではなく、以下の請求項の範囲内で行われる全ての変更に対する権利が保持されると理解するものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】
【図２】
【図３】
【図３】
2013505962.tif 000030
【図１】
2013505962.tif 000031
【図２】
2013505962.tif 000032
【国際調査報告】
2013505962.tif 000033
2013505962.tif 000034