(57)【要約】  本発明は、脂質を生成する方法に関する。具体的には、本発明は、トランスジェニック生物またはその一部における１つ以上の非極性脂質のレベルおよび／または総非極性脂質含量を増加させる方法に関する。特定の一実施形態において、本発明は、植物、植物の種子および／もしくは葉、藻類、ならびに真菌類における１つ以上の非極性脂質のレベルおよび／または総非極性脂質含量を増加させるための、アシルトランスフェラーゼ、例えば、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ）の使用に関する。
2013534827.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抽出脂質を生成する方法であって、
ｉ）１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含み、前記１つ以上の外因性ポリヌクレオチドが欠如している対応する生物またはその一部と比較したときに、増加したレベルの１つ以上の非極性脂質を有する、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部を得るステップと、
ｉｉ）前記トランスジェニック非ヒト生物またはその一部から前記脂質を抽出し、それによって、前記抽出脂質を生成するステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記トランスジェニック非ヒト生物またはその一部の前記１つ以上の非極性脂質のレベルは、前記対応する非ヒト生物またはその一部よりも、重量基準で少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記トランスジェニック非ヒト生物またはその一部の前記１つ以上の非極性脂質のレベルは、前記対応する非ヒト生物またはその一部よりも、相対基準で少なくとも１％（ｗ／ｗ）大きい、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記トランスジェニック非ヒト生物またはその一部の総非極性脂質含量は、前記対応する生物またはその一部と比較して増加する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記トランスジェニック非ヒト生物またはその一部の前記総非極性脂質含量は、前記対応する非ヒト生物またはその一部よりも、重量基準で少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）大きい、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記トランスジェニック非ヒト生物またはその一部の前記総非極性脂質含量は、前記対応する非ヒト生物またはその一部よりも、相対基準で少なくとも１％（ｗ／ｗ）大きい、請求項４または請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記トランスジェニック非ヒト生物は、植物、藻類、または酵母もしくは真菌類等の発酵に好適な生物である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記植物は、ブラッシカ種、ゴシピウム・ヒルスツム、リナム・ウシタチシマム、ヘリアンサス種、カルタムス・ティンクトリウス、グリシネ・マクズ、ゼア・マイス、アラビドプシス・サリアナ、ソルガム・バイカラー、ソルガム・ブルガレ、アベナ・サティバ、トリフォリウム種、カメリナ・サティバ、ミスカンサス・ギガンテウス、またはミスカンサス・シネンシスである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記一部は、植物の種子、果実、または栄養部である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記一部は、植物種子であり、前記抽出脂質は、種子油である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記種子の総含油量または総脂肪酸含量は、前記１つ以上の外因性ポリヌクレオチドが欠如している対応する種子よりも、重量基準で少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）〜２５％（ｗ／ｗ）大きい、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記種子は、
ｉ）カノーラ植物、
ｉｉ）トウモロコシ植物、
ｉｉｉ）ダイズ植物、
ｉｖ）ルピナス植物、
ｖ）ピーナッツ植物、
ｖｉ）ヒマワリ植物、
ｖｉｉ）綿植物、
ｖｉｉｉ）ベニバナ植物、または
ｉｘ）アマ植物、
に由来する、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記カノーラ種子は、
ｉ）重量基準で少なくとも４５％の種子油、
ｉｉ）対応する種子よりも少なくとも５％（ｗ／ｗ）大きい相対種子油含量、
ｉｉｉ）対応する種子よりも少なくとも１０％（ｗ／ｗ）大きい相対ＤＡＧ含量、
ｉｖ）対応する種子よりも少なくとも５％（ｗ／ｗ）大きい相対ＴＡＧ含量、
のうちの１つ以上を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記トウモロコシ種子は、
ｉ）重量基準で少なくとも５％の種子油、
ｉｉ）対応する種子よりも少なくとも５％（ｗ／ｗ）大きい相対種子油含量、
ｉｉｉ）対応する種子よりも少なくとも１０％（ｗ／ｗ）大きい相対ＤＡＧ含量、および
ｉｖ）対応する種子よりも少なくとも５％（ｗ／ｗ）大きい相対ＴＡＧ含量、
のうちの１つ以上を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ダイズ種子は、
ｉ）重量基準で少なくとも２０％の種子油、
ｉｉ）対応する種子よりも少なくとも５％（ｗ／ｗ）大きい相対種子油含量、
ｉｉｉ）対応する種子よりも少なくとも１０％（ｗ／ｗ）大きい相対ＤＡＧ含量、および
ｉｖ）対応する種子よりも少なくとも５％（ｗ／ｗ）大きい相対ＴＡＧ含量
のうちの１つ以上を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ルピナス種子は、
ｉ）重量基準で少なくとも１０％の種子油、
ｉｉ）対応する種子よりも少なくとも５％（ｗ／ｗ）大きい相対種子油含量、
ｉｉｉ）対応する種子よりも少なくとも１０％（ｗ／ｗ）大きい相対ＤＡＧ含量および、
ｉｖ）対応する種子よりも少なくとも５％（ｗ／ｗ）大きい相対ＴＡＧ含量、
のうちの１つ以上を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記ピーナッツ種子は、
ｉ）重量基準で少なくとも５０％の種子油、
ｉｉ）対応する種子よりも少なくとも５％（ｗ／ｗ）大きい相対種子油含量、
ｉｉｉ）対応する種子よりも少なくとも１０％（ｗ／ｗ）大きい相対ＤＡＧ含量、および
ｉｖ）対応する種子よりも少なくとも５％（ｗ／ｗ）大きい相対ＴＡＧ含量
のうちの１つ以上を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記植物の前記栄養部は、葉もしくは茎等の気中植物部または緑色部である、請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
前記植物の栄養部のＴＡＧ、ＤＡＧ、ＴＡＧおよびＤＡＧ、またはＭＡＧ含量は、前記１つ以上の外因性ポリヌクレオチドが欠如している対応する植物の栄養部のＴＡＧ、ＤＡＧ、ＴＡＧおよびＤＡＧ、またはＭＡＧ含量よりも、相対基準で少なくとも１０％（ｗ／ｗ）大きい、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記抽出脂質の脂肪酸含量の少なくとも６０％（ｍｏｌ％）は、オレイン酸である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記抽出脂質の多価不飽和脂肪酸含量は、前記対応する生物またはその一部から抽出した脂質と比較して増加する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記抽出脂質中の多価不飽和脂肪酸のレベルは、前記対応する生物またはその一部から抽出した脂質と比較して増加し、前記多価不飽和脂肪酸は、エイコサジエン酸、アラキドン酸（ＡＲＡ）、アルファリノレン酸（ＡＬＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサトリエン酸（ＥＴＥ）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、またはこれらの２つ以上の組み合わせである、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記１つ以上の脂質のレベルおよび／または前記総非極性脂質含量は、前記抽出脂質から得られる脂肪酸メチルエステルのガスクロマトグラフィを使用した分析によって決定可能である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記方法は、前記トランスジェニック植物から前記種子を採取すること、前記種子から前記種子油を圧搾すること、および／または前記種子油を精製することをさらに含む、請求項１０〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、
ｉ）モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ）、
ｉｉ）ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２（ＤＧＡＴ２）、
ｉｉｉ）ＭＧＡＴおよびグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、
ｉｖ）ＭＧＡＴおよびＤＧＡＴ、または
ｖ）ＭＧＡＴ、ＧＰＡＴ、およびＤＧＡＴ
をコードする、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＧＰＡＴはまた、アラビドプシスＧＰＡＴ４またはＧＰＡＴ６等のＭＡＧを生成するホスファターゼ活性を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＤＧＡＴは、ＤＧＡＴ２である、請求項２５または請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＭＧＡＴをコードする前記外因性ポリヌクレオチドは、
ｉ）配列番号１〜４４のいずれか１つから選択される、ヌクレオチドの配列、
ｉｉ）配列番号４５〜８２のいずれか１つで提供される配列を有するアミノ酸を含むポリペプチド、またはその生物活性断片をコードする、ヌクレオチドの配列、
ｉｉｉ）ｉ）またはｉｉ）と少なくとも５０％同一である、ヌクレオチドの配列、および
ｉｖ）緊縮条件下で、ｉ）〜ｉｉｉ）のいずれか１つにハイブリッド形成する、ヌクレオチドの配列、
のうちの１つ以上を含む、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
ＧＰＡＴをコードする前記外因性ポリヌクレオチドは、
ｉ）配列番号８４〜１４１のいずれか１つから選択される、ヌクレオチドの配列、
ｉｉ）配列番号１４４〜２０１のいずれか１つで提供される配列を有するアミノ酸を含むポリペプチド、またはその生物活性断片をコードする、ヌクレオチドの配列、
ｉｉｉ）ｉ）またはｉｉ）と少なくとも５０％同一である、ヌクレオチドの配列、および
ｉｖ）緊縮条件下で、ｉ）〜ｉｉｉ）のいずれか１つにハイブリッド形成する、ヌクレオチドの配列、
のうちの１つ以上を含む、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
ＤＧＡＴ２をコードする前記外因性ポリヌクレオチドは、
ｉ）配列番号２０４のヌクレオチドの配列、
ｉｉ）配列番号２１２で提供される配列を有するアミノ酸を含むポリペプチド、またはその生物活性断片をコードする、ヌクレオチドの配列、
ｉｉｉ）ｉ）またはｉｉ）と少なくとも５０％同一である、ヌクレオチドの配列、および
ｉｖ）緊縮条件下で、ｉ）〜ｉｉｉ）のいずれか１つにハイブリッド形成する、ヌクレオチドの配列、
のうちの１つ以上を含む、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記トランスジェニック生物もしくはその一部の前記１つ以上の非極性脂質のレベルおよび／または前記総非極性脂質含量は、前記１つ以上の外因性ポリヌクレオチドが欠如しているが、アラビドプシス・サリアナＤＧＡＴ１をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、対応する生物またはその一部よりも、重量基準で少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）大きい、および／または相対基準で少なくとも１％（ｗ／ｗ）大きい、請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記トランスジェニック非ヒト生物またはその一部は、１つ以上の導入された変異体をさらに含み、および／またはＤＧＡＴ、ｓｎ−１−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ｓｎ−１−ＧＰＡＴ）、１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、アシルＣｏＡ：リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）、ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）、もしくはこれらの２つ以上の組み合わせから選択される、前記トランスジェニック非ヒト生物の内因性酵素またはその一部の生成および／もしくは活性を下方制御する、外因性ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記外因性ポリヌクレオチドは、アンチセンスポリヌクレオチド、センスポリヌクレオチド、触媒ポリヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、内因性酵素に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および２本鎖ＲＮＡから選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記非極性脂質は、ＴＡＧ、ＤＡＧ、ＴＡＧおよびＤＡＧ、ＭＡＧ、総ＰＵＦＡもしくはエイコサジエン酸（ＥＤＡ）である特異的ＰＵＦＡ、アラキドン酸（ＡＲＡ）、アルファリノレン酸（ＡＬＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサトリエン酸（ＥＴＥ）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、またはこれらの２つ以上の組み合わせである、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含み、前記１つ以上の外因性ポリヌクレオチドが欠如している対応する生物またはその一部と比較したときに、増加したレベルの１つ以上の非極性脂質を有する、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部。
【請求項３６】
前記トランスジェニック非ヒト生物またはその一部の前記１つ以上の非極性脂質のレベルは、前記対応する生物またはその一部よりも、重量基準で少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）大きく、および／または相対基準で少なくとも１％（ｗ／ｗ）大きい、請求項３５に記載のトランスジェニック非ヒト生物またはその一部。
【請求項３７】
前記トランスジェニック非ヒト生物またはその一部の前記総非極性脂質含量は、前記対応する生物またはその一部と比較して増加する、請求項３５または請求項３６に記載のトランスジェニック非ヒト生物またはその一部。
【請求項３８】
前記トランスジェニック非ヒト生物またはその一部の前記総非極性脂質含量は、前記対応する生物またはその一部よりも、重量基準で少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）大きい、および／または相対基準で少なくとも１％大きい、請求項３７に記載のトランスジェニック非ヒト生物またはその一部。
【請求項３９】
前記トランスジェニック非ヒト生物またはその一部の前記抽出脂質中の前記多価不飽和脂肪酸含量は、前記対応する生物またはその一部の前記抽出脂質と比較して増加する、請求項３５〜３８のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト生物またはその一部。
【請求項４０】
前記抽出脂質中の多価不飽和脂肪酸の含量は、前記対応する生物またはその一部から抽出した脂質と比較して増加し、前記多価不飽和脂肪酸は、エイコサジエン酸（ＥＤＡ）、アラキドン酸（ＡＲＡ）、アルファリノレン酸（ＡＬＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサトリエン酸（ＥＴＥ）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、またはこれらの２つ以上の組み合わせを含む、請求項３５〜３９のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト生物またはその一部。
【請求項４１】
前記１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、
ｉ）ＭＧＡＴ、
ｉｉ）ＤＧＡＴ２、
ｉｉｉ）ＭＧＡＴおよびＧＰＡＴ、
ｉｖ）ＭＧＡＴおよびＤＧＡＴ、または
ｖ）ＭＧＡＴ、ＧＰＡＴおよびＤＧＡＴ、
をコードする、請求項３５〜４０のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト生物またはその一部。
【請求項４２】
前記ＧＰＡＴはまた、アラビドプシスＧＰＡＴ４またはＧＰＡＴ６等のＭＡＧを生成するホスファターゼ活性を有する、請求項４１に記載のトランスジェニック非ヒト生物。
【請求項４３】
前記ＤＧＡＴは、ＤＧＡＴ２である、請求項４１または請求項４２に記載のトランスジェニック非ヒト生物。
【請求項４４】
ＭＧＡＴをコードする前記外因性ポリヌクレオチドは、
ｉ）配列番号１〜４４のいずれか１つから選択される、ヌクレオチドの配列、
ｉｉ）配列番号４５〜８２のいずれか１つで提供される配列を有するアミノ酸を含むポリペプチド、またはその生物活性断片をコードする、ヌクレオチドの配列、
ｉｉｉ）ｉ）またはｉｉ）と少なくとも５０％同一である、ヌクレオチドの配列、および
ｉｖ）緊縮条件下で、ｉ）〜ｉｉｉ）のいずれか１つにハイブリッド形成する、ヌクレオチドの配列、
のうちの１つ以上を含む、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト生物。
【請求項４５】
ＧＰＡＴをコードする前記外因性ポリヌクレオチドは、
ｉ）配列番号８４〜１４１のいずれか１つから選択される、ヌクレオチドの配列、
ｉｉ）配列番号１４４〜２０１のいずれか１つで提供される配列を有するアミノ酸を含むポリペプチド、またはその生物活性断片をコードする、ヌクレオチドの配列、
ｉｉｉ）ｉ）またはｉｉ）と少なくとも５０％同一である、ヌクレオチドの配列、および
ｉｖ）緊縮条件下で、ｉ）〜ｉｉｉ）のいずれか１つにハイブリッド形成する、ヌクレオチドの配列、
のうちの１つ以上を含む、請求項４１〜４４のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト生物。
【請求項４６】
ＤＧＡＴ２をコードする前記外因性ポリヌクレオチドは、
ｉ）配列番号２０４のヌクレオチドの配列、
ｉｉ）配列番号２１２で提供される配列を有するアミノ酸を含むポリペプチド、またはその生物活性断片をコードする、ヌクレオチドの配列、
ｉｉｉ）ｉ）またはｉｉ）と少なくとも５０％同一である、ヌクレオチドの配列、および
ｉｖ）緊縮条件下で、ｉ）〜ｉｉｉ）のいずれか１つにハイブリッド形成する、ヌクレオチドの配列、
のうちの１つ以上を含む、請求項４１〜４５のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト生物。
【請求項４７】
前記１つ以上の非極性脂質のレベルおよび／または前記トランスジェニック生物もしくはその一部の総脂質含量は、前記１つ以上の外因性ポリヌクレオチドが欠如しているが、アラビドプシス・サリアナＤＧＡＴ１をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、対応する生物またはその一部よりも、重量基準で少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）大きい、および／または相対基準で少なくとも１％（ｗ／ｗ）大きい、請求項４４〜４６のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト生物。
【請求項４８】
植物、藻類、または酵母もしくは真菌類等の発酵に好適な生物である、請求項３５〜４７のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト生物。
【請求項４９】
ｉ）ＭＧＡＴ、
ｉｉ）ＤＧＡＴ２、
ｉｉｉ）ＭＧＡＴおよびＧＰＡＴ、
ｉｖ）ＭＧＡＴおよびＤＧＡＴ、または
ｖ）ＭＧＡＴ、ＧＰＡＴ、およびＤＧＡＴ、
をコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む、トランスジェニック非ヒト生物。
【請求項５０】
請求項３５〜４８のいずれか１項に記載の１つ以上の特徴を特徴とする、請求項４９に記載のトランスジェニック非ヒト生物またはその一部。
【請求項５１】
１つ以上の非極性脂質を生成する増強された能力を伴う細胞を得る方法であって、
ｉ）細胞の中に、
ａ）ＭＧＡＴ、
ｂ）ＤＧＡＴ２
ｃ）ＭＧＡＴおよびＧＰＡＴ
ｄ）ＭＧＡＴおよびＤＧＡＴ、または
ｅ）ＭＧＡＴ、ＧＰＡＴ、およびＤＧＡＴ、をコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを導入することであって、
前記１つ以上の外因性ポリヌクレオチドが、前記細胞における前記１つ以上の外因性ポリヌクレオチドの発現を指令することができる１つ以上のプロモーターに操作可能に連結される、導入することと、
ｉｉ）前記細胞において前記１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを発現させることと、
ｉｉｉ）前記細胞の脂質含量を分析することと、
ｉｖ）前記外因性ポリヌクレオチドが欠如している対応する細胞と比較したときに、増加したレベルの１つ以上の非極性脂質を有する細胞を選択することと、
を含む、方法。
【請求項５２】
前記選択した細胞は、請求項３６〜４８のいずれか１項に記載の生物またはその一部の特徴の１つ以上を有する、請求項５１に記載の方法。 
【請求項５３】
前記第１および第２の外因性ポリヌクレオチドは、前記細胞のゲノムの中に安定的に組み込まれる、請求項５１または請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ステップｉ）の細胞からトランスジェニック植物を再生するステップをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
請求項５１〜５４のいずれか１項に記載の方法を使用して得られるトランスジェニック細胞または植物、またはそれから得られるトランスジェニック植物。
【請求項５６】
前記１つ以上の外因性ポリヌクレオチドが欠如している対応する生物またはその一部と比較したときに、１つ以上の非極性脂質を生成する増強された能力を伴う、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部を生成するための、
ｉ）ＭＧＡＴ、
ｉｉ）ＤＧＡＴ２、
ｉｉｉ）ＭＧＡＴおよびＧＰＡＴ
ｉｖ）ＭＧＡＴおよびＤＧＡＴ、または
ｖ）ＭＧＡＴ、ＧＰＡＴ、およびＤＧＡＴ
をコードする、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドの使用。
【請求項５７】
１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含み、前記外因性ポリヌクレオチドが欠如している対応する種子と比較したときに、増加したレベルの１つ以上の非極性脂質を有する、植物のトランスジェニック種子。
【請求項５８】
請求項３６〜４８に記載の特徴の１つ以上を含む、請求項５７に記載のトランスジェニック種子。
【請求項５９】
請求項５７または請求項５８に記載の種子を生成する、トランスジェニック植物。
【請求項６０】
ブラッシカ種、ゴシピウム・ヒルスツム、リナム・ウシタチシマム、ヘリアンサス種、カルタムス・ティンクトリウス、グリシネ・マク、ゼア・マイス、アラビドプシス・サリアナ、ソルガム・バイカラー、ソルガム・ブルガレ、アベナ・サティバ、トリフォリウム種、カメリナ・サティバ、ミスカンサス・ギガンテウス、またはミスカンサス・シネンシスである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
種子を生成する方法であって、
ｉ）請求項５９または請求項６０に記載のトランスジェニック植物を成長させることと、
ｉｉ）前記種子を収穫することと、
を含む、方法。
【請求項６２】
ｉ）発酵に好適である請求項４８に記載のトランスジェニック非ヒト生物と、発酵および脂肪酸生合成に必要とされる成分と、を含む液体組成物を収容する容器を提供するステップと、
ｉｉ）前記容器に収容された前記液体組成物の発酵に寄与する条件を提供するステップと、
を含む、発酵プロセス。
【請求項６３】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法によって得ること、または請求項３５〜５０のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト生物もしくはその一部から得ること、請求項５５に記載のトランスジェニック細胞もしくは植物から得ること、請求項５７もしくは請求項５８に記載のトランスジェニック種子から得ること、または請求項５９もしくは請求項６０に記載のトランスジェニック植物から得ることが可能な、抽出脂質。
【請求項６４】
前記抽出脂質の重量基準で少なくとも１％（ｗ／ｗ）であるＤＡＧ含量を含む、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部から得ることが可能な、抽出脂質。
【請求項６５】
工業製品を製造するための、請求項３５〜５０のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト生物またはその一部、請求項５５に記載のトランスジェニック細胞もしくは植物、請求項５７もしくは請求項５８に記載のトランスジェニック種子、請求項５９もしくは請求項６０に記載のトランスジェニック植物、または請求項６３もしくは請求項６４に記載の抽出脂質の使用。
【請求項６６】
前記工業製品は、燃料である、請求項６５に記載の使用。
【請求項６７】
ｉ）随意に、触媒の存在下で、請求項６３または請求項６４に記載の脂質をアルコールと反応させて、アルキルエステルを生成することと、
ｉｉ）随意に、アルキルエステルを石油に基づく燃料と混ぜ合わせることと、
を含む、燃料を生成する方法。
【請求項６８】
前記アルキルエステルは、メチルエステルである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
請求項３５〜５０のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト生物もしくはその一部、請求項５５に記載のトランスジェニック細胞もしくは植物、請求項５７もしくは請求項５８に記載のトランスジェニック種子、請求項５９もしくは請求項６０に記載のトランスジェニック植物、請求項６３もしくは請求項６４に記載の抽出脂質、またはその抽出物もしくは一部分を、少なくとも１つの他の食物成分と混合することを含む、飼料を生成する方法。
【請求項７０】
請求項３５〜５０のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト生物もしくはその一部、請求項５５に記載のトランスジェニック細胞もしくは植物、請求項５７もしくは請求項５８に記載のトランスジェニック種子、請求項５９もしくは請求項６０に記載のトランスジェニック植物、請求項６３もしくは請求項６４に記載の抽出脂質、またはその抽出物もしくは一部分を含む、飼料、化粧品、または化学薬品。
【請求項７１】
細胞においてＭＡＧ、ＤＡＧ、および／またはＴＡＧを生成する増加した能力を有するアシルトランスフェラーゼをコードする核酸分子を特定するための方法であって、
ｉ）前記細胞において活性であるプロモーターに操作可能に連結される核酸分子を含み、前記核酸分子は、請求項２７、２８、もしくは２９のいずれか１項以上で定義されるヌクレオチドの配列、および／もしくは配列番号２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、および２２７で提供される１つ以上のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列、または少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％それらに同一であるアミノ酸の配列を含む、細胞を得ることと、
ｉｉ）前記細胞において生成されるＭＡＧ、ＤＡＧ、および／またはＴＡＧのレベルが、前記核酸が欠如している対応する細胞と比較して増加したかどうかを判定することと、
ｉｉｉ）前記細胞においてＭＡＧ、ＤＡＧ、および／またはＴＡＧを生成する増加した能力を有するアシルトランスフェラーゼをコードする核酸分子を特定することと、
を含む、方法。
【請求項７２】
前記アシルトランスフェラーゼは、ＭＧＡＴ経路において酵素反応を触媒する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記アシルトランスフェラーゼは、ＭＧＡＴ、ＧＰＡＴ、および／またはＤＧＡＴである、請求項７１または請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記ＧＰＡＴはまた、アラビドプシスＧＰＡＴ４またはＧＰＡＴ６等のＭＡＧを生成するホスファターゼ活性を有する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記ＤＧＡＴは、ＤＧＡＴ２である、請求項７３または請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
ステップｉ）の前に、前記核酸分子を細胞の中に導入することをさらに含む、請求項７１〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記細胞は、植物細胞である、請求項７１〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記アシルトランスフェラーゼは、アラビドプシス・サリアナＤＧＡＴ１よりも多い量だけ、前記細胞におけるＴＡＧの生成を増加させる、請求項７１〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
ｉ）配列番号１〜６のいずれか１つから選択される、ヌクレオチドの配列、または
ｉｉ）ｉ）と少なくとも８０％同一である、ヌクレオチドの配列、
を含む、単離されたおよび／または組み換えポリヌクレオチド。
【請求項８０】
請求項７９に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項８１】
請求項７９に記載のポリヌクレオチドまたは請求項８０に記載のベクターを含む、トランスジェニック細胞。
【請求項８２】
請求項７９に記載のポリヌクレオチド、請求項８０に記載のベクター、または請求項８１に記載のトランスジェニック細胞を含む、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質を生成する方法に関する。具体的には、本発明は、トランスジェニック生物またはその一部における１つ以上の非極性脂質のレベルおよび／または総非極性脂質含量を増加させる方法に関する。特定の一実施形態において、本発明は、植物、植物の種子および／もしくは葉、藻類、ならびに真菌類における１つ以上の非極性脂質のレベルおよび／または総非極性脂質含量を増加させるための、アシルトランスフェラーゼ、例えば、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ）の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
種子油トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）等の脂質には、例えば、調理用途（ショートニング、生地、風味）、産業用途（石鹸、蝋燭、香水、化粧品において、乾燥剤、絶縁物、潤滑剤として好適なもの）といった数多くの用途があり、また、栄養価を提供する。また、バイオ燃料の生成に植物脂質を使用することにも関心が高まっている。
【０００３】
バイオ燃料
高まっている代替エネルギー源に対する要求は、植物由来のバイオ燃料の再生可能な供給によって少なくとも部分的に満たすことができる。化石燃料に対する現実的な代替物とするために、バイオ燃料は、既存のバイオ燃料生成による現在の予想外の副産物である食物供給の低減を伴わずに、生成の際に正味エネルギー利得を提供し、環境的利益を有し、経済的な競争力があり、かつ大量に生成できるべきである。
【０００４】
数多くの種が、主な貯蔵成分として脂質を種子に蓄積するので、植物は、顕著な脂質源の好例である。種によって種子重量の１５〜５０％に相当する、種子の中の栄養貯蔵脂質の主な形態は、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）である。しかしながら、脂質合成のための一次基質は、緑色光合成組織（葉および茎）において産生される炭水化物であり、該炭水化物は、次いで、葉緑体において代謝して、ＴＡＧの基本構成要素である、遊離脂肪酸およびアセチルコエンザイムＡ（アセチルＣｏＡ）ユニットを生成する。したがって、植物の葉は、ＴＡＧのための構成要素合成の主な場所である。油料種子に蓄積されるＴＡＧの量は、１つには、プラスチドにおいて生成される脂肪酸の量によって決定され得る（ＢａｏおよびＯｈｌｒｏｇｇｅ，１９９９）。ＴＡＧの最終的な貯蔵は、油体と称される種子の球状の小オルガネラにおいて起こる。葉バイオマスの約０．２〜０．３％だけしかＴＡＧに相当しない。
【０００５】
高バイオマス植物、特に、広葉の高バイオマス植物は、バイオ燃料としての大きな可能性を有する。特に、バイオマス植物の低い産生量と関連する高いコスト、労働要件、化学薬品の投入、または地理的制限のいずれもないときに、１エーカー（約４０４７ｍ２）あたり１００〜４００トンという低コストで高価値のバイオマス材料を生ずることができる植物が特に有用である。
【０００６】
モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ
モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ）酵素は、哺乳類と関連し、特に、哺乳類の腸と関連し、そこにおいて、モノアシルグリセロール（ＭＡＧ）および脂肪アシルＣｏＡからのジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の合成を直接触媒する。対照的に、植物に見られる一次ＴＡＧ合成経路は、ケネディ経路、すなわち、ＭＧＡＴステップを含まないグリセリンリン酸経路（図１）である。ケネディ経路において、ＤＡＧは、２ステップの反応でアシル化グリセロール骨格から形成される。この反応は、最初の、脂肪アシルＣｏＡをリゾホスファチジン酸（ＬｙｓｏＰＡ；ＬＰＡ）基質に添加する、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）によるアシル化のステップと、その後の、産物であるホスファチジン酸（ＰＡ）からリン酸基を除去して無機リン酸塩（Ｐｉ）およびＤＡＧを生ずるステップとから成る。対照的に、ＭＧＡＴは、脂肪アシルＣｏＡ由来のアシル基でＭＡＧをアシル化することによって、ＤＡＧの形成を直接触媒する。ＤＡＧの合成に続いて、別の酵素であるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）がＤＡＧをアシル化してＴＡＧを形成する。
【０００７】
最初の単離されたＭＧＡＴ遺伝子は、マウス（ＭＧＡＴ１）に由来するものであり、この遺伝子は、不可溶性の膜結合酵素をコードした（Ｙｅｎ他，２００２）。他の類似したＭＧＡＴ遺伝子は、動物において特徴付けられており、マウス（ＭＧＡＴ２）由来の第２のＭＧＡＴ遺伝子、および３つのヒト遺伝子が挙げられるが、ＭＧＡＴをコードするいかなる遺伝子も、植物からクローン化されたことが確認されていない（Ｃａｏ他，２００３、Ｃｈｅｎｇ他，２００３）。
【０００８】
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ
ＤＧＡＴは、植物、菌類、および哺乳類においてＴＡＧを生成する際の最終的な酵素ステップを触媒する、内在性膜タンパク質である。この酵素は、アシルコエンザイムＡ（アシルＣｏＡ）からＤＡＧにアシル基を転移させてＴＡＧを形成する役割を果たす。ＤＧＡＴは、植物および菌類、特に油料種子における膜および脂肪体画分と関連し、そこにおいて、エネルギーの蓄えとして使用される炭素の貯蔵に寄与する。ＤＧＡＴは、ＴＡＧ構造を調節して、ＴＡＧ合成を指令することが知られている。さらに、ＤＧＡＴ反応が脂質合成に特異的であることも知られている。野生型植物における種子特異的様式でのアシルＣｏＡに依存するＤＧＡＴの過剰発現は、種子油の堆積および平均種子重量の増大をもたらす（Ｊａｋｏ他，２００１）
【０００９】
脂質の商業的生産の収量を最大にするために、植物、種子、葉、藻類、および菌類等のトランスジェニック生物またはその一部において、脂質、特にＤＡＧおよびＴＡＧ等の非極性脂質のレベル増加させる、さらなる手段が必要である。
【発明の概要】
【００１０】
本発明者らは、驚くべきことに、ＭＧＡＴ遺伝子または関連する遺伝子のトランスジェニック発現が、植物細胞等の細胞における脂質収量の顕著な増加をもたらすことを実証した。本発明者らは、よく知られているケネディ経路とは異なる、植物等のトランスジェニック生物におけるＤＡＧおよびＴＡＧの合成のための新しい経路も特定した。
【００１１】
故に、本発明は、抽出脂質を生成する方法を提供し、該方法は、
ｉ）１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含み、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドが欠如している対応する生物またはその一部と比較したときに、増加したレベルの１つ以上の非極性脂質を有する、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部を得るステップと、
ｉｉ）トランスジェニック非ヒト生物またはその一部から脂質を抽出し、それによって、抽出脂質を生成するステップと、
を含む。
【００１２】
一実施形態において、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部の総非極性脂質含量は、対応する生物またはその一部と比較して増加する。
【００１３】
トランスジェニック非ヒト生物またはその一部は、以下の特徴（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）単独で、またはこれらを組み合わせてさらに定義され得る。すなわち、特徴（ｉ）１つ以上の非極性脂質または総非極性脂質含量の増加したレベルの程度を定量化し、対応する非ヒト生物またはその一部における、重量基準での増加の程度として、またはレベルと比較した相対的増加の程度として表され得る。および／または特徴（ｉｉ）植物属もしくは種、または真菌種もしくは藻類種、または他の細胞型を特定する。および特徴（ｉｉｉ）増加する１つ以上の特異的脂質を特定する。
【００１４】
特徴（ｉ）について、ある実施形態において、１つ以上の非極性脂質の増加の程度は、対応する非ヒト生物またはその一部よりも、重量基準で、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、または少なくとも２４％（ｗ／ｗ）大きく、好ましくは、重量基準で約２５％（ｗ／ｗ）の最大増加である。
【００１５】
また、特徴（ｉ）について、好ましい実施形態において、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部の総非極性脂質含量は、対応する生物またはその一部と比較して増加する。ある実施形態において、総脂質含量は、対応する非ヒト生物またはその一部よりも、重量基準で、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、または少なくとも２４％（ｗ／ｗ）増加し、好ましくは、重量基準で約２５％（ｗ／ｗ）の最大増加である。
【００１６】
さらに、特徴（ｉ）について、ある実施形態において、１つ以上の非極性脂質のレベルおよび／または総非極性脂質含量は、対応する非ヒト生物またはその一部よりも、相対基準で、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％大きい。
【００１７】
また、特徴（ｉ）について、１つ以上の非極性脂質のレベルおよび／または総非極性脂質含量の増加の程度は、対応する非ヒト生物またはその一部よりも、相対基準で、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍または少なくとも１０倍、好ましくは最高で約１２倍大きくなり得る。
【００１８】
特徴（ｉｉ）について、ある実施形態において、トランスジェニック非ヒト生物は、酵母もしくは他の真菌、好ましくは油性酵母もしくは他の真菌等の、発酵に好適な植物、藻類、または生物である。植物は、例えば、ブラッシカ種、ゴシピウム・ヒルスツム、リナム・ウシタチシマム、ヘリアンサス種、カルタムス・ティンクトリウス、グリシネ・マク、ゼア・マイス、アラビドプシス・サリアナ、ソルガム・バイカラー、ソルガム・ブルガレ、アベナ・サティバ、トリフォリウム種、エラエイス・ギネエンシス、ニコチアナ・ベンサミアナ、ホルデウム・ブルガレ、ルピナス・アングスティフォリウス、オリザ・サティバ、オリザ・グラベリマ、カメリナ・サティバ、ミスカンサス・ギガンテウス、またはミスカンサス・シネンシスであってもよい。
【００１９】
特徴（ｉｉｉ）について、ＴＡＧ、ＤＡＧ、ＴＡＧおよびＤＡＧ、ＭＡＧ、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）もしくは特異的ＰＵＦＡ（エイコサジエン酸（ＥＤＡ）、アラキドン酸（ＡＲＡ）、アルファリノレン酸（ＡＬＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサトリエン酸（ＥＴＥ）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）等）、またはこれらの２つ以上の組み合わせが増加する。ＴＡＧ、ＤＡＧ、ＴＡＧおよびＤＡＧ、ＭＡＧ、ＰＵＦＡ、または特異的ＰＵＦＡの増加の程度は、前述の特徴（ｉ）で定義される通りであり得る。好ましい実施形態において、ＭＡＧは、２−ＭＡＧである。好ましくは、ＤＡＧおよび／またはＴＡＧ、より好ましくは、ＤＡＧおよびＴＡＧの総量が増加する。
【００２０】
好ましい実施形態において、１つ以上の非極性脂質および／または総非極性脂質含量は、特徴（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）、もしくは特徴（ｉ）および（ｉｉ）、または特徴（ｉ）および（ｉｉｉ）の組み合わせによって定義される。
【００２１】
一実施形態において、該一部は、植物の種子、果実、塊茎、根、または栄養部である。植物の栄養部は、葉もしくは茎等の気中植物部または緑色部であり得る。別の実施形態において、一部は、多細胞生物の細胞である。この実施形態における特定の植物部の１つ以上の非極性脂質のレベルおよび／または総非極性脂質含量の増加の程度は、前述の特徴（ｉ）で定義される通りであり得る。ブラッシカ種、ゴシピウム・ヒルスツム、リナム・ウシタチシマム、ヘリアンサス種、カルタムス・ティンクトリウス、オリザ・サティバ、オリザ・グラベリマ、カメリナ・サティバ、グリシネ・マク、またはゼア・マイスの植物部は、好ましくは、種子であるのに対して、ソルガム・バイカラー、ソルガム・ブルガレ、アベナ・サティバ、トリフォリウム種、エラエイス・ギネエンシス、ニコチアナ・ベンサミアナ、ホルデウム・ブルガレ、ルピナス・アングスティフォリウス、ミスカンサス・ギガンテウス、またはミスカンサス・シネンシスの好ましい部分は、栄養部、具体的には、葉および茎である。
【００２２】
一実施形態において、該一部は、植物種子であり、抽出脂質は、種子油である。本発明の方法は、トランスジェニック植物から種子を採取すること、種子から種子油を圧搾すること、および／または１つ以上のステップで該種子油を精製することさらに含んでもよい。種子は、例えば、カノーラ植物、トウモロコシ植物、ダイズ植物、ルピナス植物、ピーナッツ植物、ヒマワリ植物、綿植物、ベニバナ植物、またはアマ植物に由来してもよい。
【００２３】
一実施形態において、種子の総含油量または総脂肪酸含量は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドが欠如している対応する種子よりも、重量基準で少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）〜２５％（ｗ／ｗ）大きい。
【００２４】
一実施形態において、種子油の相対ＤＡＧ含量は、対応する種子よりも少なくとも１０％、少なくとも１０．５％、少なくとも１１％、少なくとも１１．５％、少なくとも１２％、少なくとも１２．５％、少なくとも１３％、少なくとも１３．５％、少なくとも１４％、少なくとも１４．５％、少なくとも１５％、少なくとも１５．５％、少なくとも１６％、少なくとも１６．５％、少なくとも１７％、少なくとも１７．５％、少なくとも１８％、少なくとも１８．５％、少なくとも１９％、少なくとも１９．５％、少なくとも２０％（ｗ／ｗ）大きい。ある実施形態において、種子のＤＡＧ含量は、特徴（ｉ）で定義される量だけ増加し、該種子は、特徴（ｉｉ）で定義される属および／または種に由来する。
【００２５】
一実施形態において、種子油の相対ＴＡＧ含量は、対応する種子よりも、少なくとも５％、少なくとも５．５％、少なくとも６％、少なくとも６．５％、少なくとも７％、少なくとも７．５％、少なくとも８％、少なくとも８．５％、少なくとも９％、少なくとも９．５％、または少なくとも１０％（ｗ／ｗ）大きい。ある実施形態において、種子のＴＡＧ含量は、特徴（ｉ）で定義される量だけ増加し、該種子は、特徴（ｉｉ）で定義される属および／または種に由来する。一実施形態において、種子は、重量基準（ｗ／ｗ）で、少なくとも４５％、少なくとも４６％、少なくとも４７％、少なくとも４８％、少なくとも４９％、少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％または少なくとも５５％の含油量を有する、カノーラ種子である。
【００２６】
一実施形態において、種子は、重量基準（ｗ／ｗ）で少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、または少なくとも１０％の含油量を有する、トウモロコシ種子である。
【００２７】
一実施形態において、種子は、重量基準（ｗ／ｗ）で少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、または少なくとも３０％の含油量を有する、ダイズ種子である。
【００２８】
一実施形態において、種子は、重量基準（ｗ／ｗ）で少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、または少なくとも１６％の含油量を有する、ルピナス種子である。
【００２９】
一実施形態において、種子は、重量基準（ｗ／ｗ）で少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、または少なくとも５５％の含油量を有する、ピーナッツ種子である。
【００３０】
一実施形態において、種子は、重量基準（ｗ／ｗ）で少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％または少なくとも５５％の含油量を有する、ヒマワリ種子である。
【００３１】
一実施形態において、種子は、重量基準（ｗ／ｗ）で少なくとも４１％、少なくとも４２％、少なくとも４３％、少なくとも４４％、少なくとも４５％、少なくとも４６％、少なくとも４７％、少なくとも４８％、少なくとも４９％、または少なくとも５０％の含油量を有する、綿種子である。
【００３２】
一実施形態において、種子は、重量基準（ｗ／ｗ）で少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４２％、少なくとも４３％、少なくとも４４％、または少なくとも４５％の含油量を有する、ベニバナ種子である。
【００３３】
一実施形態において、種子は、重量基準（ｗ／ｗ）で少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、または少なくとも４０％の含油量を有する、アマ種子である。
【００３４】
一実施形態において、種子は、重量基準（ｗ／ｗ）で少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４２％、少なくとも４３％、少なくとも４４％、または少なくとも４５％の含油量を有する、カメリナ・サティバ種子である。
【００３５】
別の実施形態において、該生物部は、栄養植物部であり、栄養植物部のＴＡＧ、ＤＡＧ、ＴＡＧおよびＤＡＧ、またはＭＡＧ含量は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドが欠如している対応する植物の栄養部のＴＡＧ、ＤＡＧ、ＴＡＧおよびＤＡＧ、またはＭＡＧ含量よりも、相対基準で少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％（ｗ／ｗ）大きい。好ましい実施形態において、ＭＡＧは、２−ＭＡＧである。ある実施形態において、植物の栄養部のＴＡＧ、ＤＡＧ、ＴＡＧおよびＤＡＧ、またはＭＡＧ含量は、植物の栄養部の抽出可能な脂質におけるこれらの脂質成分の量から決定される。さらなる実施形態において、トランスジェニック植物の栄養部のＴＡＧ、ＤＡＧ、ＴＡＧおよびＤＡＧ、またはＭＡＧ含量は、特徴（ｉ）で定義される量だけ増加する。
【００３６】
一実施形態において、生物またはその一部の総非極性脂質含量の脂肪酸含量、またはそこから抽出される脂質の少なくとも６０％（ｍｏｌ％）は、オレイン酸である。
【００３７】
別の実施形態において、生物またはその一部のＰＵＦＡ含量は、対応する生物またはその一部と比較して増加する。この文脈において、ＰＵＦＡ含量は、エステル化ＰＵＦＡ（ＴＡＧ、ＤＡＧ等を含む）および非エステル化ＰＵＦＡの双方を含む。ある実施形態において、生物またはその一部のＰＵＦＡ含量は、好ましくは、生物またはその一部の抽出可能な脂質のＰＵＦＡの量から決定される。ＰＵＦＡ含量の増加の程度は、特徴（ｉ）で定義される通りであり得る。ＰＵＦＡ含量は、ＥＤＡ、ＡＲＡ、ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴＥ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、ＤＨＡ、またはこれらの２つ以上の組み合わせを含んでもよい。
【００３８】
別の実施形態において、生物もしくはその一部におけるＰＵＦＡ、またはそこから抽出した脂質のレベルは、対応する生物もしくはその一部、またはそこから抽出した脂質と比較して増加する。ＰＵＦＡは、ＥＤＡ、ＡＲＡ、ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴＥ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、ＤＨＡ、またはこれらの２つ以上の組み合わせであってもよい。ＰＵＦＡの増加の程度は、特徴（ｉ）で定義した通りであり得る。
【００３９】
ある実施形態において、１つ以上の非極性脂質（ＴＡＧ、ＤＡＧ、ＴＡＧおよびＤＡＧ、ＭＡＧ、ＰＵＦＡ、または特異的ＰＵＦＡ等）のレベルおよび／または総非極性脂質含量は、抽出脂質から得られる脂肪酸メチルエステルのガスクロマトグラフィを用いて決定可能である。これらの含量のいずれを決定するための代替の方法も、当技術分野で知られており、生物またはその一部からの脂質の抽出を必要としない方法、例えば、近方赤外線（ＮＩＲ）または核磁気共鳴（ＮＭＲ）による分析が挙げられる。
【００４０】
一実施形態において、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、
ｉ）モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ）、
ｉｉ）ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２（ＤＧＡＴ２）、
ｉｉｉ）ＭＧＡＴおよびグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、
ｉｖ）ＭＧＡＴおよびＤＧＡＴ、または、
ｖ）ＭＧＡＴ、ＧＰＡＴ、およびＤＧＡＴ
をコードする。
【００４１】
一実施形態において、外因性ポリヌクレオチドは、ｓｎ−１−ＭＡＧまたはｓｎ−２−ＭＡＧのいずれかのアシル化を触媒して、それぞれ、ｓｎ−１，３−ＤＡＧまたはｓｎ−１，２／２，３−ＤＡＧを形成する、ＭＧＡＴをコードする。好ましい実施形態において、ＭＧＡＴは、ｓｎ−２−ＭＡＧのアシル化を触媒して、ｓｎ−１，２／２，３−ＤＡＧを形成する。ＭＧＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドは、
ｉ）配列番号１〜４４のいずれか１つから選択される、ヌクレオチドの配列、
ｉｉ）配列番号４５〜８２のいずれか１つで提供される配列を有するアミノ酸を含むポリペプチド、またはその生物活性断片をコードする、ヌクレオチドの配列、
ｉｉｉ）ｉ）またはｉｉ）と少なくとも５０％同一である、ヌクレオチドの配列、または
ｉｖ）緊縮条件下で、ｉ）〜ｉｉｉ）のいずれか１つにハイブリッド形成する、ヌクレオチドの配列、
のうちの１つ以上を含んでもよい。
【００４２】
一実施形態において、外因性ポリヌクレオチドは、ＭＧＡＴ１をコードし、
ｉ）配列番号１、３〜５、または７〜２３のいずれか１つから選択されるヌクレオチドの配列、
ｉｉ）配列番号４５〜６１のいずれか１つで提供される配列を有するアミノ酸を含むポリペプチド、またはその生物活性断片をコードする、ヌクレオチドの配列、
ｉｉｉ）ｉ）またはｉｉ）と少なくとも５０％同一である、ヌクレオチドの配列、または
ｉｖ）緊縮条件下で、ｉ）〜ｉｉｉ）のいずれか１つにハイブリッド形成する、ヌクレオチドの配列、
のうちの１つ以上を含む。
【００４３】
別の実施形態において、外因性ポリヌクレオチドは、ＭＧＡＴ２をコードし、
ｉ）配列番号２、６、または２４〜３７のいずれか１つから選択されるヌクレオチドの配列、
ｉｉ）配列番号６２〜７５のいずれか１つで提供される配列を有するアミノ酸を含むポリペプチド、またはその生物活性断片をコードする、ヌクレオチドの配列、
ｉｉｉ）ｉ）またはｉｉ）と少なくとも５０％同一である、ヌクレオチドの配列、または
ｉｖ）緊縮条件下で、ｉ）〜ｉｉｉ）のいずれか１つにハイブリッド形成する、ヌクレオチドの配列、
のうちの１つ以上を含む。
【００４４】
別の実施形態において、外因性ポリヌクレオチドは、ＭＧＡＴ３をコードし、
ｉ）配列番号３８〜４４のいずれか１つから選択される、ヌクレオチドの配列、
ｉｉ）配列番号７６〜８２のいずれか１つで提供される配列を有するアミノ酸を含むポリペプチド、またはその生物活性断片をコードする、ヌクレオチドの配列、
ｉｉｉ）ｉ）またはｉｉ）と少なくとも５０％同一である、ヌクレオチドの配列、または
ｉｖ）緊縮条件下で、ｉ）〜ｉｉｉ）のいずれか１つにハイブリッド形成する、ヌクレオチドの配列、
のうちの１つ以上を含む。
【００４５】
別の実施形態において、外因性ポリヌクレオチドは、ｓｎ−１，３−ＤＡＧまたはｓｎ−１，２／２，３−ＤＡＧ、好ましくは、ｓｎ−１，２／２，３−ＤＡＧのアシル化を触媒するＤＧＡＴをコードして、ＴＡＧを形成する。ある実施形態において、外因性ポリヌクレオチドは、ＤＧＡＴ２をコードし、
ｉ）配列番号２０４〜２１１のいずれか１つから選択されるヌクレオチドの配列、
ｉｉ）配列番号２１２〜２１９のいずれか１つで提供される配列を有するアミノ酸を含むポリペプチド、またはその生物活性断片をコードする、ヌクレオチドの配列、
ｉｉｉ）ｉ）またはｉｉ）と少なくとも５０％同一である、ヌクレオチドの配列、または
ｉｖ）緊縮条件下で、ｉ）〜ｉｉｉ）のいずれか１つにハイブリッド形成する、ヌクレオチドの配列、のうちの１つ以上を含む。好ましい実施形態において、ＤＧＡＴ２は、配列番号２０４のヌクレオチドの配列、および／または配列番号２１２で提供される配列を有するアミノ酸を含むポリペプチドをコードする、ヌクレオチドの配列を含む。
【００４６】
別の実施形態において、外因性ポリヌクレオチドは、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）をコードする。好ましい実施形態において、ＧＰＡＴはまた、ホスファターゼ活性を有し、ＭＡＧを生成する（すなわち、Ｇ−３−Ｐをアシル化してｓｎ−１−ＬＰＡまたはｓｎ−２−ＬＰＡを形成し、ＬＰＡからリン酸基を除去してＭＡＧを形成するＧＰＡＴ）。さらなる好ましい実施形態において、ＧＰＡＴは、ｓｎ−２−ＧＰＡＴであり（すなわち、Ｇ−３−Ｐからｓｎ−２−ＬＰＡを生成するように選好を有する）、２−ＭＡＧ、例えば、アラビドプシスＧＰＡＴ４またはＧＰＡＴ６を生成するホスファターゼ活性を有する。ＧＰＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドは、
ｉ）配列番号８４〜１４１のいずれか１つから選択される、ヌクレオチドの配列、
ｉｉ）配列番号１４４〜２１０のいずれか１つで提供される配列を有するアミノ酸を含むポリペプチド、またはその生物活性断片をコードする、ヌクレオチドの配列、
ｉｉｉ）ｉ）またはｉｉ）と少なくとも５０％同一である、ヌクレオチドの配列、または
ｉｖ）緊縮条件下で、ｉ）〜ｉｉｉ）のいずれか１つにハイブリッド形成する、ヌクレオチドの配列、
のうちのいずれか１つを含んでもよい。
【００４７】
別のまたは付加的な実施形態において、外因性ポリヌクレオチドは、配列番号２２５、２２６、および２２７で提供される１つ以上の保存されたアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％同一であるアミノ酸の配列を含む、ホスファターゼ活性を有するＧＰＡＴをコードする。
【００４８】
一実施形態において、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、変異ＭＧＡＴおよび／またはＤＧＡＴおよび／またはＧＰＡＴをコードする。例えば、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、野生型ＭＧＡＴおよび／またはＤＧＡＴおよび／またはＧＰＡＴに関連して表１で例示されるような保存的アミノ酸置換体を有する、ＭＧＡＴおよび／またはＤＧＡＴおよび／またはＧＰＡＴをコードしてもよい。
【００４９】
一実施形態において、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部は、ＭＧＡＴをコードする第１の外因性ポリヌクレオチドと、ＧＰＡＴをコードする第２の外因性ポリヌクレオチドとを含む。第１および第２のポリヌクレオチドは、別々の分子として提供されてもよく、または、連続した単一分子として提供されてもよい。好ましい実施形態において、ＧＰＡＴは、アラビドプシスＧＰＡＴ４またはＧＰＡＴ６等の、ホスファターゼ活性を有するＧＰＡＴである。ホスファターゼ活性を有するＧＰＡＴは、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部において、Ｇ−３−ＰからのＭＡＧの形成を触媒するように作用する（すなわち、Ｇ−３−Ｐをアシル化してＬＰＡを形成し、その後、リン酸基を除去してＭＡＧを形成する）。次いで、ＭＧＡＴが、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部において、脂肪アシルＣｏＡから得られるアシル基でＭＡＧをアシル化することによって、ＤＡＧの形成を触媒するように作用する。アラビドプシス・サリアナＭＧＡＴ１等のＭＧＡＴは、ＤＧＡＴ活性をも有する場合に、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部において、ＴＡＧの形成を触媒するように作用し得る。
【００５０】
トランスジェニック非ヒト生物またはその一部は、例えばＤＧＡＴをコードする、第３の外因性ポリヌクレオチドを含んでもよい。第１、第２、および第３のポリヌクレオチドは、別々の分子として提供されてもよく、または、連続した単一分子として提供されてもよい。ＤＧＡＴは、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部において、脂肪アシルＣｏＡから得られるアシル基でＤＡＧ（好ましくはＭＧＡＴ経路によって生成されたもの）をアシル化することによって、ＴＡＧの形成を触媒するように作用する。
【００５１】
別の実施形態において、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部は、ＭＧＡＴをコードする第１の外因性ポリヌクレオチドと、ＤＧＡＴをコードする第２の外因性ポリヌクレオチドとを含む。第１および第２のポリヌクレオチドは、別々の分子として提供されてもよく、または、連続した単一分子として提供されてもよい。トランスジェニック非ヒトは、例えばＧＰＡＴ、好ましくは、アラビドプシスＧＰＡＴ４またはＧＰＡＴ６等の、ホスファターゼ活性を有するＧＰＡＴをコードする、第３の外因性ポリヌクレオチドを含んでもよい。第１、第２、および第３のポリヌクレオチドは、別々の分子として提供されてもよく、または、連続した単一分子として提供されてもよい。
【００５２】
さらなる実施形態において、トランスジェニック生物もしくはその一部の１つ以上の非極性脂質のレベルおよび／または総非極性脂質含量は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドが欠如しているが、アラビドプシス・サリアナＤＧＡＴ１（配列番号８３）をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、対応する生物またはその一部よりも、重量基準で少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）大きい、および／または相対基準で少なくとも１％（ｗ／ｗ）大きい。
【００５３】
さらなる一実施態様において、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部は、１つ以上の導入された変異体をさらに含み、および／またはＤＧＡＴ、ｓｎ−１−ＧＰＡＴ、１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、アシルＣｏＡ：リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）、ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）、もしくはこれらの２つ以上の組み合わせから選択される、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部の生成および／もしくは活性を下方制御する、外因性ポリヌクレオチドをさらに含む。ｓｎ−１−ＧＰＡＴは、その野生型の状態において、いかなる検出可能なホスファターゼ活性も有しないＧＰＡＴ、例えばＧＰＡＴ１またはＧＰＡＴ３であってもよい。ＧＰＡＴ１は、配列番号２０２で提供されるアミノ酸配列またはその相同体を有し得る。ＧＰＡＴ３は、配列番号２０３で示されるアミノ酸配列またはその相同体を有し得る。
【００５４】
外因性ポリヌクレオチドは、例えば、アンチセンスポリヌクレオチド、センスポリヌクレオチド、触媒ポリヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、内因性酵素に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および２本鎖ＲＮＡから選択されてもよい。
【００５５】
別の態様において、本発明は、抽出脂質を生成する方法を提供し、該方法は、
ｉ）外因性モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ）を含み、
外因性ＭＧＡＴが欠如しているそのような生物またはその一部と比較したときに、増加したレベルの非極性脂質を有する、トランスジェニック光合成生物またはその一部を得るステップと、
ｉｉ）トランスジェニック光合成生物またはその一部から脂質を抽出し、それによって、抽出脂質を生成するステップと、
を含む。
【００５６】
別の態様において、本発明は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含み、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドが欠如している対応する生物またはその一部と比較したときに、増加したレベルの１つ以上の非極性脂質を有する、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部を提供する。
【００５７】
好ましい実施形態において、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部の総脂質含量は、対応する生物またはその一部と比較して増加する。１つ以上の脂質または総非極性脂質含量の増加の程度は、特徴（ｉ）で定義される通りであり得る。トランスジェニック非ヒト生物またはその一部は、特徴（ｉｉ）で定義される通りであってもよい。非極性脂質は、特徴（ｉｉｉ）で定義される通りであってもよい。トランスジェニック非ヒト生物またはその一部は、特徴（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）、もしくは特徴（ｉ）および（ｉｉ）、または特徴（ｉ）および（ｉｉｉ）の組み合わせによって定義され得る。
【００５８】
一実施形態において、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部の１つ以上の非極性脂質のレベルは、対応する生物またはその一部よりも、重量基準で少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）大きく、および／もしくは相対基準で少なくとも１％（ｗ／ｗ）大きく、またはさらに特徴（ｉ）で定義される通りである。
【００５９】
さらなる実施形態において、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部の総非極性脂質含量は、対応する非ヒト生物またはその一部よりも、重量基準で少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）大きく、および／もしくは相対基準で少なくとも１％（ｗ／ｗ）より大きく、またはさらに特徴（ｉ）で定義される通りである。
【００６０】
一実施形態において、トランスジェニック非ヒト生物、またはそこから抽出した脂質のＰＵＦＡ含量は、対応する生物もしくはその一部またはそこから抽出した脂質と比較して増加する。ＰＵＦＡ含量の増加の程度は、特徴（ｉ）で定義される通りであり得る。
【００６１】
別の実施形態において、トランスジェニック非ヒト生物もしくはその一部、またはそこから抽出した脂質におけるＰＵＦＡのレベルは、対応する生物もしくはその一部またはそこから抽出した脂質と比較して増加する。ＰＵＦＡの増加の程度は、特徴（ｉ）で定義される通りであり得る。
【００６２】
さらなる実施形態において、トランスジェニック生物もしくはその一部の１つ以上の非極性脂質のレベルおよび／または総脂質含量は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドが欠如しているが、アラビドプシス・サリアナＤＧＡＴ１をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、対応する生物またはその一部よりも、重量基準で少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）大きい、および／または相対基準で少なくとも１％（ｗ／ｗ）大きい。
【００６３】
一実施形態において、トランスジェニック非ヒト生物は、植物、藻類、または酵母もしくは真菌類等の発酵に好適な生物である。植物は、特徴（ｉｉ）で定義される通りであり得る。
【００６４】
本発明また、
ｉ）ＭＧＡＴ、
ｉｉ）ＤＧＡＴ２、
ｉｉｉ）ＭＧＡＴおよびＧＰＡＴ
ｉｖ）ＭＧＡＴおよびＤＧＡＴ、または
ｖ）ＭＧＡＴ、ＧＰＡＴ、およびＤＧＡＴ
をコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む、トランスジェニック非ヒト生物を提供する。
【００６５】
トランスジェニック非ヒト生物は、本明細書で定義される１つ以上の特徴をさらに特徴としてもよい。１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、上記に定義される配列を含んでもよい。
【００６６】
別の態様において、本発明は、１つ以上の非極性脂質を生成する増強された能力を伴う細胞を得る方法を提供し、該方法は、
ｉ）細胞の中に、
ａ）ＭＧＡＴ、
ｂ）ＤＧＡＴ２、
ｃ）ＭＧＡＴおよびＧＰＡＴ、
ｄ）ＭＧＡＴおよびＤＧＡＴ、または
ｅ）ＭＧＡＴ、ＧＰＡＴ、およびＤＧＡＴ、をコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを導入することであって、
１つ以上の外因性ポリヌクレオチドが、細胞における１つ以上の外因性ポリヌクレオチドの発現を指令することが可能である１つ以上のプロモーターに操作可能に連結される、導入することと、
ｉｉ）細胞において１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを発現させることと、
ｉｉｉ）細胞の脂質含量を分析することと、
ｉｖ）外因性ポリヌクレオチドが欠如している対応する細胞と比較したときに、増加したレベルの１つ以上の非極性脂質を有する細胞を選択することと、
を含む。
【００６７】
好ましい実施形態において、選択された細胞の総脂質含量は、対応する細胞と比較して増加する。
【００６８】
一実施形態において、選択された細胞の１つ以上の非極性脂質および／または総非極性脂質含量は、対応する細胞よりも、重量基準で少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）大きく、および／もしくは相対基準で少なくとも１％（ｗ／ｗ）大きく、またはさらに特徴（ｉ）で定義される通りである。
【００６９】
別の実施形態において、選択された細胞のＰＵＦＡ含量は、対応する細胞と比較して増加する。ＰＵＦＡ含量の増加の程度は、特徴（ｉ）で定義される通りであり得る。
【００７０】
別の実施形態において、選択された細胞におけるＰＵＦＡのレベルは、対応する細胞と比較して増加する。ＰＵＦＡにおける増加の程度は、特徴（ｉ）で定義される通りであり得る。
【００７１】
この態様において、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、上で定義される配列を含んでもよい。さらに、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、本方法に先立って、ＭＧＡＴ、ＤＧＡＴ２、ＭＧＡＴおよびＧＰＡＴ、ＭＧＡＴおよびＤＧＡＴ、またはＭＧＡＴ、ＧＰＡＴ、およびＤＧＡＴをコードすることが分かっていないが、それらの候補であってもよい。したがって、本方法は、ＭＧＡＴ、ＤＧＡＴ２、ＭＧＡＴおよびＧＰＡＴ（好ましくは、ホスファターゼ活性も有するＧＰＡＴ）、ＭＧＡＴおよびＤＧＡＴ、またはＭＧＡＴ、ＧＰＡＴ（好ましくは、ホスファターゼ活性も有するＧＰＡＴ）、およびＤＧＡＴをコードするポリヌクレオチドを特定または選択するアッセイとして使用されてもよい。
【００７２】
ＧＰＡＴの発現は、ＧＰＡＴがホスファターゼ活性も有する場合に、細胞におけるＭＡＧレベルの増加をもたらし得、ＭＧＡＴの発現は、細胞におけるＤＡＧレベルの増加をもたらし得るのに対して、ＤＧＡＴの発現は、細胞におけるＴＡＧレベルの増加をもたらし得る。また、ＭＧＡＴの発現は、ＭＧＡＴがＤＧＡＴ活性も有する場合に、細胞におけるＴＡＧレベルの増加をもたらし得る。ＭＧＡＴおよびＤＧＡＴの発現は、細胞におけるＤＡＧおよび／またはＴＡＧレベルの増加をもたらし得る。ＭＧＡＴおよびＧＰＡＴの発現は、細胞におけるＭＡＧ（ＧＰＡＴが、ホスファターゼ活性も有する場合）および／またはＤＡＧレベルの増加をもたらし得る。ＭＧＡＴおよびＧＰＡＴの発現はまた、ＭＧＡＴがＤＧＡＴ活性も有する場合に、細胞のＴＡＧレベルの増加をもたらし得る。ＭＧＡＴ、ＧＰＡＴ、およびＤＧＡＴの発現は、細胞におけるＭＡＧ（ＧＰＡＴが、ホスファターゼ活性も有する場合）および／またはＤＡＧおよび／またはＴＡＧレベルの増加をもたらし得る。
【００７３】
一実施形態において、選択された細胞は、本発明による細胞である。
【００７４】
一実施形態において、外因性ポリヌクレオチドは、細胞のゲノムの中に安定的に組み込まれる。
【００７５】
本方法は、細胞からトランスジェニック生物を再生するステップ、および／または細胞から子孫を得る、例えば種子を得るステップをさらに含んでもよく、これらのステップは、ステップｉ）の後の任意の時点で起こり得る。
【００７６】
代替の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、細胞において一過性に発現する。
【００７７】
別の態様において、本発明は、本発明の方法を使用して得られるトランスジェニック細胞もしくは植物、またはその子孫を提供する。
【００７８】
別の態様において、本発明は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドが欠如している対応する生物またはその一部と比較したときに、１つ以上の非極性脂質を生成する増強された能力を伴う、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部を生成するための、
ｉ）ＭＧＡＴ、
ｉｉ）ＤＧＡＴ２
ｉｉｉ）ＭＧＡＴおよびＧＰＡＴ
ｉｖ）ＭＧＡＴおよびＤＧＡＴ、または
ｖ）ＭＧＡＴ、ＧＰＡＴ、およびＤＧＡＴ、
をコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチドの使用を提供する。増強された能力の程度は、特徴（ｉ）で定義される通りであり得る。トランスジェニック非ヒト生物またはその一部は、特徴（ｉｉ）で定義される通りであってもよく、または特徴（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）、もしくは特徴（ｉ）および（ｉｉ）、または特徴（ｉ）および（ｉｉｉ）の組み合わせによって定義されてもよい。１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、上記に定義される配列を含んでもよい。
【００７９】
別の態様において、本発明は、植物のトランスジェニック種子を提供し、該種子は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含み、外因性ポリヌクレオチドが欠如している対応する種子と比較したときに、増加したレベルの１つ以上の非極性脂質および／または総非極性脂質含量を有する。増加の程度は、特徴（ｉ）で定義される通りであり得る。トランスジェニック種子は、特徴（ｉｉ）で定義される属および／または種に由来するものであってもよい。トランスジェニック種子は、特徴（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）、もしくは特徴（ｉ）および（ｉｉ）、または特徴（ｉ）および（ｉｉｉ）の組み合わせによって定義される。１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、上記に定義される配列を含んでもよい。
【００８０】
別の態様において、本発明は、本発明の種子を生成する、トランスジェニック植物を提供する。遺伝子導入植物は、例えば、ブラッシカ種、ゴシピウム・ヒルスツム、リナム・ウシタチシマム、ヘリアンサス種、カルタムス・ティンクトリウス、グリシネ・マク、ゼア・マイス、アラビドプシス・サリアナ、ソルガム・バイカラー、ソルガム・ブルガレ、アベナ・サティバ、トリフォリウム種、エラエイス・ギネエンシス、ニコチアナ・ベンサミアナ、ホルデウム・ブルガレ、ルピナス・アングスティフォリウス、オリザ・サティバ、オリザ・グラベリマ、カメリナ・サティバ、ミスカンサス・ギガンテウス、またはミスカンサス・シネンシスであってもよい。
【００８１】
別の態様において、本発明は、種子を生成する方法を提供し、該方法は、
ｉ）本発明のトランスジェニック植物を成長させることと、
ｉｉ）種子を採取することと、
を含む。
別の態様において、本発明は、発酵プロセスを提供し、該プロセスは、
ｉ）発酵に好適である本発明のトランスジェニック非ヒト生物と、発酵および脂肪酸生合成に必要とされる成分と、を含む液体組成物を収容する容器を提供するステップと、
ｉｉ）容器に収容された液体組成物の発酵に寄与する条件を提供するステップと、
を含む。
【００８２】
別の態様において、本発明は、本発明の方法、本発明のトランスジェニック非ヒト生物、本発明のトランスジェニック細胞、本発明のトランスジェニック植物、または本発明のトランスジェニック種子から得ることが可能な、抽出脂質を提供する。抽出可能な脂質は、増強されたＴＡＧ含量、ＤＡＧ含量、ＴＡＧおよびＤＡＧ含量、ＭＡＧ含量、ＰＵＦＡ含量、もしくは特異的ＰＵＦＡ含量、および／または非極性脂質含量を有し得る。好ましい実施形態において、ＭＡＧは、２−ＭＡＧである。ＴＡＧ含量、ＤＡＧ含量、ＴＡＧおよびＤＡＧ含量、ＭＡＧ含量、ＰＵＦＡ含量、特異的ＰＵＦＡ含量、および／または総非極性脂質含量の増加の程度は、特徴（ｉ）で定義される通りであり得る。
【００８３】
本発明はまた、総抽出脂質の重量基準で少なくとも１％（ｗ／ｗ）または少なくとも２％（ｗ／ｗ）であるＤＡＧ含量を含む、抽出脂質を提供する。好ましくは、抽出脂質はまた、検出可能なレベルのＭＡＧを含む。一実施形態において、抽出脂質は、カノーラ、トウモロコシ、ダイズ、ルピナス、ピーナッツ、ヒマワリ、綿、ベニバナ、またはアマ油である。脂質は、検出可能なレベルのフェルラ酸、シクロプロペノイド脂肪酸（ＣＰＦＡ）、および／またはグルコシノレートを含んでもよい。
【００８４】
本発明はまた、工業製品を製造するための、本発明のトランスジェニック非ヒト生物またはその一部、本発明のトランスジェニック細胞、本発明のトランスジェニック植物、本発明のトランスジェニック種子、または本発明の抽出脂質の使用を提供する。工業製品は、例えば、燃料であり得る。燃料は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、または少なくとも３０％（ｗ／ｗ）等の、最小レベルの本発明による抽出脂質を含み得る。
【００８５】
別の態様において、本発明は、燃料を生成する方法を提供し、該方法は、
ｉ）随意に触媒の存在下で、本発明の脂質をアルコールと反応させて、アルキルエステルを生成することと、
ｉｉ）随意に、アルキルエステルを石油に基づく燃料と混ぜ合わせることと、
を含む。
一実施形態において、アルキルエステルは、メチルエステルである。本方法によって生成される燃料は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、または少なくとも３０％（ｗ／ｗ）等の、最小レベルの本発明の脂質を含み得る。
【００８６】
別の態様において、本発明は、飼料を生成する方法を提供し、該方法は、本発明のトランスジェニック非ヒト生物もしくはその一部、本発明のトランスジェニック細胞、本発明のトランスジェニック植物、本発明のトランスジェニック種子、本発明の抽出脂質、またはその抽出物もしくは一部分を、少なくとも１つの他の食物成分と混合することを含む。
【００８７】
別の態様において、本発明は、本発明のトランスジェニック非ヒト生物もしくはその一部、本発明のトランスジェニック細胞、本発明のトランスジェニック種子、本発明のトランスジェニック植物、本発明の抽出脂質、またはその抽出物もしくは一部分を含む、飼料、化粧品、または化学薬品を提供する。
【００８８】
別の態様において、本発明は、細胞におけるＭＡＧ、ＤＡＧ、および／またはＴＡＧを生成する増加した能力を有するアシルトランスフェラーゼをコードする核酸分子を特定するための方法を提供し、該方法は、
ｉ）細胞において活性であるプロモーターに操作可能に連結される核酸分子を含み、本明細書で定義されるヌクレオチドの配列、および／もしくは配列番号２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、および２２７で提供される１つ以上のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列、または少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％それらに同一であるアミノ酸の配列を含む、細胞を得ることと、
ｉｉ）細胞において生成されるＭＡＧ、ＤＡＧ、および／またはＴＡＧのレベルが、核酸が欠如している対応する細胞と比較して増加したかどうかを判定することと、
ｉｉｉ）細胞においてＭＡＧ、ＤＡＧ、および／またはＴＡＧを生成する増加した能力を有するアシルトランスフェラーゼをコードする核酸分子を特定することと、
を含む。
【００８９】
一実施形態において、核酸分子は、配列番号２２０、２２１、２２２、２２３、および２２４で提供される１つ以上の保存されたＤＧＡＴ２および／またはＭＧＡＴ１／２アミノ酸配列をコードする、ヌクレオチドの配列を含む。好ましい実施形態において、核酸分子は、配列番号２２０および／または配列番号２２４で提供される保存されたアミノ酸配列をコードする、ヌクレオチドの配列を含む。別のまたは付加的な実施形態において、核酸分子は、配列番号２２５、２２６、および２２７で提供される１つ以上の保存されたＧＰＡＴアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも６０％、より好ましくは、少なくとも６５％同一であるアミノ酸の配列をコードするヌクレオチドの配列を含む。
【００９０】
一実施形態において、本方法は、ＤＡＧおよび／またはＴＡＧを生成する増加した能力を有する、ＭＧＡＴを特定するためのものである。
【００９１】
別の実施形態において、本方法は、ホスファターゼ活性およびＭＡＧを生成する増加した能力を有する、ＧＰＡＴを特定するためのものである。好ましい実施形態において、本方法は、ホスファターゼ活性および２−ＭＡＧを生成する増加した能力を有する、ｓｎ−２−ＧＰＡＴを特定するためのものである。
【００９２】
別の実施形態において、本方法は、ＭＡＧおよび／またはＤＡＧおよび／またはＴＡＧ、好ましくは、ＴＡＧを生成する増加した能力をともに有する、ＭＧＡＴおよびＧＰＡＴを特定するためのものである。好ましい実施形態において、本方法は、ＭＧＡＴとともに２−ＭＡＧを生成するホスファターゼ活性、ｓｎ−１，２／２，３−ＤＡＧおよび／またはＴＡＧを生成する増加した能力を有する、ｓｎ−２−ＧＰＡＴを特定するためのものである。
【００９３】
別の実施形態において、本方法は、ＴＡＧを生成する増加した能力を有する、ＤＧＡＴを特定するためのものである。
【００９４】
別の実施形態において、本方法は、ＤＡＧまたはＴＡＧ、好ましくはＴＡＧを生成する増加した能力をともに有する、ＭＧＡＴおよびＤＧＡＴを特定するためのものである。
【００９５】
別の実施形態において、本方法は、ＭＡＧおよび／またはＤＡＧおよび／またはＴＡＧ好ましくは、ＴＡＧを生成する増加した能力をともに有する、ＭＧＡＴ、ＧＰＡＴ、およびＤＧＡＴを特定するためのものである。好ましい実施形態において、ＧＰＡＴは、ＭＡＧを生成するホスファターゼ活性を有する。さらなる好ましい実施形態において、ＧＰＡＴは、２−ＭＡＧを生成するホスファターゼ活性を有する、ｓｎ−２−ＧＰＡＴである。
【００９６】
一実施形態において、本方法は、ステップｉ）の前に、核酸分子を細胞の中に導入することをさらに含む。
【００９７】
別の実施形態において、本方法は、ステップｉ）の細胞からトランスジェニック植物を再生するステップと、随意に、トランスジェニック植物から種子を得るステップとをさらに含む。一実施形態において、細胞は、植物細胞である。ＭＡＧおよび／またはＤＡＧおよび／またはＴＡＧを生成する能力の増加の程度は、特徴（ｉ）で定義される通りであり得る。好ましい実施形態において、ＭＡＧは、２−ＭＡＧである。細胞は、特徴（ｉｉ）で定義される属および／または種に由来するものであってもよい。細胞は、特徴（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）、もしくは特徴（ｉ）および（ｉｉ）、または特徴（ｉ）および（ｉｉｉ）の組み合わせによって定義される。
【００９８】
別の実施形態において、ＭＧＡＴおよび／またはＧＰＡＴおよび／またはＤＧＡＴは、アラビドプシス・サリアナＤＧＡＴ１（配列番号８３）よりも大きい量だけ、細胞におけるＴＡＧの生成を増加させる。
【００９９】
別の態様において、本発明は、
ｉ）配列番号１〜６のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列、または
ｉｉ）ｉ）と少なくとも８０％同一である、ヌクレオチドの配列、
を含む、単離されたおよび／または組み換えポリヌクレオチドを提供する。
別の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む、ベクターを提供する。
【０１００】
別の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターを含む、トランスジェニック細胞を提供する。
【０１０１】
別の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、または本発明のトランスジェニック細胞を含む、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部を提供する。一実施形態において、トランスジェニック生物は、植物、藻類、または酵母もしくは真菌類等の発酵に好適な生物である。別の実施形態において、該一部は、植物の種子、果実、塊茎、根、または栄養部である。
【０１０２】
特定の実施形態で示されるように、広く説明される本発明の範囲から逸脱することなく、数多くの変形および／または修正が本発明に行われ得ることを当業者は理解するであろう。したがって、本実施形態は、あらゆる点において例示的なものに過ぎず、限定的なものではないとみなされる。本明細書で説明される各実施形態は、別途具体的に提示されない限り、必要な変更を加えて、あらゆる他の実施形態に適用される。
【０１０３】
この明細書の全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変形は、明示された要素、完全体、もしくはステップ、または一群の要素、完全体、もしくはステップを含むことを意味するが、任意の他の要素、完全体、もしくはステップ、または一群の要素、完全体、もしくはステップを除外しないことを意味するものと理解されるであろう。
【０１０４】
「および／または」という用語、例えば「Ｘおよび／またはＹ」という用語は、「ＸおよびＹ」もしくは「ＸまたはＹ」のいずれかを意味するものと理解されるものとし、どちらも意味すること、またはいずれかを意味することに対する明示的な支持を提供するものと解釈されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】脂質合成の中心的な分子であるＤＡＧにその大部分が集まる、種々の脂質合成経路の代表的な図である。このモデルは、グリセロール−３−リン酸（Ｇ−３−Ｐ）からＤＡＧを形成するために、二機能性のＭＧＡＴ／ＤＧＡＴによって使用することが可能である、ｓｎ−２−ＭＡＧを形成する１つの可能な経路を含む。省略形は、以下の通りである。     Ｇ−３−Ｐ：グリセロール−３−リン酸     ＬｙｓｏＰＡ：リゾホスファチジン酸     ＰＡ：ホスファチジン酸     ＭＡＧ：モノアシルグリセロール     ＤＡＧ：ジアシルグリセロール     ＴＡＧ：トリアシルグリセロール     アシルＣｏＡおよびＦＡ−ＣｏＡ：アシルコエンザイムＡおよび脂肪酸アシルコエンザイムＡ     ＰＣ：ホスファチジルコリン     ＧＰＡＴ：グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ、グリセロール−３−リン酸  Ｏ−アシルトランスフェラーゼ、アシルＣｏＡ：ｓｎ−グリセロール−３−リン酸  １−Ｏ−アシルトランスフェラーゼ、ＥＣ  ２．３．１．１５     ＧＰＡＴ４：グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ４     ＧＰＡＴ６：グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ６     ＬＰＡＡＴ：１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ、１−アシルグリセロール−３−リン酸塩  Ｏ−アシルトランスフェラーゼ、アシルＣｏＡ：１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸  ２−Ｏ−アシルトランスフェラーゼ、ＥＣ  ２．３．１．５１      ＰＡＰ：ホスファチジン酸ホスファターゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、リン酸ホスホヒドロラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、ＥＣ  ３．１．３．４      ＭＧＡＴ：モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ；２−アシルグリセロール  Ｏ−アシルトランスフェラーゼ、アシルＣｏＡ：２−アシルグリセロール  Ｏ−アシルトランスフェラーゼ、ＥＣ  ２．３．１．２２）活性を有する、アシルトランスフェラーゼ     Ｍ／ＤＧＡＴ：モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ；２−アシルグリセロール  Ｏ−アシルトランスフェラーゼ、アシルＣｏＡ：２−アシルグリセロール  Ｏ−アシルトランスフェラーゼ、ＥＣ  ２．３．１．２２）、および／またはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ；ジアシルグリセロール  Ｏ−アシルトランスフェラーゼ、アシルＣｏＡ：１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロール  Ｏ−アシルトランスフェラーゼ、ＥＣ  ２．３．１．２０）活性を有する、アシルトランスフェラーゼ     ＬＰＣＡＴ：アシルＣｏＡ：リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ、１−アシルグリセロホスホコリン  Ｏ−アシルトランスフェラーゼ、アシルＣｏＡ：１−アシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン  Ｏ−アシルトランスフェラーゼ、ＥＣ  ２．３．１．２３     ＰＬＤ−Ｚ：ホスホリパーゼＤゼータ、コリンホスファターゼ、レシチナーゼＤ、リポホスホジエステラーゼII、ＥＣ  ３．１．４．４     ＣＰＴ：ＣＤＰコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ、１−アルキル−２−アセチルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ、アルキルアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ、コリンホス���トランスフェラーゼ、ホスホリルコリン−グリセリドトランスフェラーゼ、ＥＣ  ２．７．８．２     ＰＤＣＴ：ホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ     ＰＬＣ：ホスホリパーゼＣ、ＥＣ  ３．１．４．３     ＰＤＡＴ：リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、リン脂質：１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロール  Ｏ−アシルトランスフェラーゼ、ＥＣ  ２．３．１．１５８     Ｐｉ：無機リン酸塩
【図２】それぞれが３５Ｓプロモーターから発現した、ｐ１９（陰性対照）、アラビドプシス・サリアナＤＧＡＴ１、マス・マスクルスＭＧＡＴ１、ならびにＤＧＡＴ１およびＭＧＡＴ１の組み合わせをコードする構築体で形質転換したニコチアナ・ベンサミアナ葉組織における、ＤＡＧおよびＴＡＧの相対的な増加を示す図である。ＭＧＡＴ１酵素は、葉組織におけるＤＡＧおよびＴＡＧ双方の蓄積を促進する際に、ＤＧＡＴ１酵素よりもはるかに活性であった。ＭＧＡＴ１遺伝子の発現は、ＤＧＡＴ１単独の発現と比較して、葉組織におけるＤＡＧおよびＴＡＧの蓄積が２倍になった。
【図３】ｐ１９（陰性対照）、アラビドプシス・サリアナＤＧＡＴ１、マス・マスクルスＭＧＡＴ２、ならびにＭＧＡＴ２およびＤＧＡＴ１の組み合わせをコードする構築体で形質転換したニコチアナ・ベンサミアナ葉組織における、ＴＡＧの相対的な増加を示す図である。誤差バーは、３つ組の試料の標準誤差を意味する。
【図４】ｓｎ−２−ＭＡＧ［１４Ｃ］および非標識オレイン酸を時間経過とともに供給した、一過性に形質転換したニコチアナ・ベンサミアナ葉溶解物から単離したＭＡＧ、ＤＡＧ、およびＴＡＧ画分における放射活性（ｄｐｍ）を示す図である。使用した構築体は、図３と同じである。
【図５】図４と同じであるが、［１４Ｃ］Ｇ−３−Ｐおよび非標識オレイン酸を供給した、放射活性（ｄｐｍ）を示す図である。
【図６】酵母アッセイにおいて、アラビドプシス・サリアナＤＧＡＴ１、およびマス・マスクルスＭＧＡＴ１によるが、マス・マスクルスＭＧＡＴ２にはよらないＴＡＧ形成を示す、ＴＬＣプレートのオートラジオグラムである。アッセイは、実施例５で説明される。
【発明を実施するための形態】
【０１０６】
配列リストの見出し
配列番号１：マス・マスクルスのコドンを最適化したＭＧＡＴ１
配列番号２：マス・マスクルスのコドンを最適化したＭＧＡＴ２
配列番号３：シオナ・インテスチナリスのコドンを最適化した予測ＭＧＡＴ１
配列番号４：トリボリウム・カスタネウムのコドンを最適化した予測ＭＧＡＴ１
配列番号５：ダニオ・レリオのコドンを最適化したＭＧＡＴ１
配列番号６：ダニオ・レリオのコドンを最適化したＭＧＡＴ２
配列番号７：マス・マスクルスのＭＧＡＴ１ポリヌクレオチド（ＡＦ３８４１６２）
配列番号８：ホモ・サピエンスのＭＧＡＴ１ポリヌクレオチド（ＡＦ３８４１６３）
配列番号９：パン・トログロデュテスの予測ＭＧＡＴ１ポリヌクレオチド転写物変異形（ＸＭ＿００１１６６０５５）
配列番号１０：パン・トログロデュテスの予測ＭＧＡＴ１ポリヌクレオチド転写物変異形２（ＸＭ＿０５２６０４４．２）
配列番号１１：カニス・ファミリアリスの予測ＭＧＡＴ１ポリヌクレオチド（ＸＭ＿５４５６６７．２）
配列番号１２：ボス・タウルスのＭＧＡＴ１ポリヌクレオチド（ＮＭ＿００１００１１５３．２）
配列番号１３：ラッタス・ノルベギカスのＭＧＡＴ１ポリヌクレオチド（ＮＭ＿００１１０８８０３．１）
配列番号１４：ダニオ・レリオのＭＧＡＴ１ポリヌクレオチド（ＮＭ＿００１１２２６２３．１）  
配列番号１５：カエノラブディティス・エレガンスの予測ＭＧＡＴ１ポリヌクレオチド（ＮＭ＿０７３０１２．４）
配列番号１６：カエノラブディティス・エレガンスの予測ＭＧＡＴ１ポリヌクレオチド（ＮＭ＿１８２３８０．５）
配列番号１７：カエノラブディティス・エレガンスの予測ＭＧＡＴ１ポリヌクレオチド（ＮＭ＿０６５２５８．３）
配列番号１８：カエノラブディティス・エレガンスの予測ＭＧＡＴ１ポリヌクレオチド（ＮＭ＿０７５０６８．３）
配列番号１９：カエノラブディティス・エレガンスの予測ＭＧＡＴ１ポリヌクレオチド（ＮＭ＿０７２２４８．３）
配列番号２０：クライベロマイセス・ラクティスの予測ＭＧＡＴ１ポリヌクレオチド（ＸＭ＿４５５５８８．１）
配列番号２１：アシビア・ゴシピイの予測ＭＧＡＴ１ポリヌクレオチド（ＮＭ＿２０８８９５．１）
配列番号２２：マグナポルテ・オリザエの予測ＭＧＡＴ１ポリヌクレオチド（ＸＭ＿３６８７４１．１）
配列番号２３：シオナ・インテスチナリスの予測ＭＧＡＴ１ポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２１２０８４３．１）
配列番号２４：マス・マスクルスのＭＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＡＹ１５７６０９）
配列番号２５：ホモ・サピエンスのＭＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＡＹ１５７６０８）
配列番号２６：パン・トログロデュテスの予測ＭＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＸＭ＿５２２１１２．２）
配列番号２７：カニス・ファミリアリスの予測ＭＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＸＭ＿５４２３０４．１）
配列番号２８：ボス・タウルスのＭＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＮＭ＿００１０９９１３６．１）
配列番号２９：ラッタス・ノルベギカスのＭＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＮＭ＿００１１０９４３６．２）
配列番号３０：ガッルス・ガッルスの予測ＭＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＸＭ＿４２４０８２．２）  
配列番号３１：ダニオ・レリオのＭＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＮＭ＿００１００６０８３．１）
配列番号３２：ドロソフィラ・メラノガスターのＭＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＮＭ＿１３６４７４．２）
配列番号３３：ドロソフィラ・メラノガスターのＭＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＮＭ＿１３６４７３．２）
配列番号３４ドロソフィラ・メラノガスターのＭＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＮＭ＿１３６４７５．２）
配列番号３５：アノフェレス・ガンビェのＭＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＸＭ＿００１６８８７０９．１）
配列番号３６：アノフェレス・ガンビェのＭＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＸＭ＿３１５９８５）
配列番号３７：トリボリウム・カスタネウムの予測ＭＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＸＭ＿９７００５３．１）
配列番号３８：ホモ・サピエンスのＭＧＡＴ３ポリヌクレオチド（ＡＹ２２９８５４）
配列番号３９：パン・トログロデュテスの予測ＭＧＡＴ３ポリヌクレオチド転写物変異形１（ＸＭ＿００１１５４１０７．１）
配列番号４０：パン・トログロデュテスの予測ＭＧＡＴ３ポリヌクレオチド転写物変異形２（ＸＭ＿００１１５４１７１．１）
配列番号４１：パン・トログロデュテスの予測ＭＧＡＴ３ポリヌクレオチド転写物変異形３（ＸＭ＿５２７８４２．２）
配列番号４２：カニス・ファミリアリスの予測ＭＧＡＴ３ポリヌクレオチド（ＸＭ＿８４５２１２．１）
配列番号４３：ボス・タウルスの予測ＭＧＡＴ３ポリヌクレオチド（ＸＭ＿８７０４０６．４）
配列番号４４：ダニオ・レリオの予測ＭＧＡＴ３ポリヌクレオチド（ＸＭ＿６８８４１３．４）
配列番号４５：マス・マスクルスのＭＧＡＴ１ポリペプチド（ＡＡＫ８４１７７．１）
配列番号４６：ホモ・サピエンスのＭＧＡＴ１ポリペプチド（ＡＡＫ８４１７８．１）
配列番号４７：パン・トログロデュテスの予測ＭＧＡＴ１ポリペプチドアイソフォーム１（ＸＰ＿００１１６６０５５．１）
配列番号４８：パン・トログロデュテスの予測ＭＧＡＴ１ポリペプチドアイソフォーム２（ＸＰ＿５２６０４４．２）
配列番号４９：カニス・ファミリアリスの予測ＭＧＡＴ１ポリペプチド（ＸＰ＿５４５６６７．２）
配列番号５０：ボス・タウルスのＭＧＡＴ１ポリペプチド（ＮＰ＿００１００１１５３．１）
配列番号５１：ラッタス・ノルベギカスのＭＧＡＴ１ポリペプチド（ＮＰ＿００１１０２２７３．１）
配列番号５２：ダニオ・レリオのＭＧＡＴ１ポリペプチド（ＮＰ＿００１１１６０９５．１）  
配列番号５３：カエノラブディティス・エレガンスの予測ＭＧＡＴ１ポリペプチド（ＮＰ＿５０５４１３．１）
配列番号５４：カエノラブディティス・エレガンスの予測ＭＧＡＴ１ポリペプチド（ＮＰ＿８７２１８０．１）
配列番号５５：カエノラブディティス・エレガンスの予測ＭＧＡＴ１ポリペプチド（ＮＰ＿４９７６５９．１）
配列番号５６：カエノラブディティス・エレガンスの予測ＭＧＡＴ１ポリペプチド（ＮＰ＿５０７４６９．１）
配列番号５７：カエノラブディティス・エレガンスの予測ＭＧＡＴ１ポリペプチド（ＮＰ＿５０４６４９．１）
配列番号５８：クライベロマイセス・ラクティスの予測ＭＧＡＴ１ポリペプチド（ＸＰ＿４５５５８８．１）
配列番号５９：アシビア・ゴシピイの予測ＭＧＡＴ１ポリペプチド（ＮＰ＿９８３５４２．１）
配列番号６０：マグナポルテ・オリザエの予測ＭＧＡＴ１ポリペプチド（ＸＰ＿３６８７４１．１）
配列番号６１：シオナ・インテスチナリスの予測ＭＧＡＴ１ポリペプチド（ＸＰ＿００２１２０８７９）
配列番号６２：マス・マスクルスのＭＧＡＴ２ポリペプチド（ＡＡ０２３６７３．１）
配列番号６３：ホモ・サピエンスのＭＧＡＴ２ポリペプチド（ＡＡ０２３６７２．１）
配列番号６４：パン・トログロデュテスの予測ＭＧＡＴ２ポリペプチド（ＸＰ＿５２２１１２．２）
配列番号６５：カニス・ファミリアリスの予測ＭＧＡＴ２ポリペプチド（ＸＰ＿５４２３０４．１）
配列番号６６：ボス・タウルスのＭＧＡＴ２ポリペプチド（ＮＰ＿００１０９２６０６．１）
配列番号６７：ラッタス・ノルベギカスのＭＧＡＴ２ポリペプチド（ＮＰ＿００１１０２９０６．２）
配列番号６８：ガッルス・ガッルスの予測ＭＧＡＴ２ポリペプチド（ＸＰ＿４２４０８２．２）  
配列番号６９：ダニオ・レリオのＭＧＡＴ２ポリペプチド（ＮＰ＿００１００６０８３．１）
配列番号７０：ドロソフィラ・メラノガスターのＭＧＡＴ２ポリペプチド（ＮＰ＿６１０３１８．１）
配列番号７１：ドロソフィラ・メラノガスターのＭＧＡＴ２ポリペプチド（ＮＰ＿６１０３１７．１）
配列番号７２：ドロソフィラ・メラノガスターのＭＧＡＴ２ポリペプチド（ＮＰ＿６１０３１９．２）
配列番号７３：アノフェレス・ガンビェのＭＧＡＴ２ポリペプチド（ＸＰ＿００１６８８７６１）
配列番号７４：アノフェレス・ガンビェのＭＧＡＴ２ポリペプチド（ＸＰ＿３１５９８５．３）
配列番号７５：トリボリウム・カスタネウムの予測ＭＧＡＴ２ポリペプチド（ＸＰ＿９７５１４６）
配列番号７６  ：ホモ・サピエンスのＭＧＡＴ３ポリペプチド（ＡＡ０６３５７９．１）
配列番号７７：パン・トログロデュテスの予測ＭＧＡＴ３ポリペプチドアイソフォーム１（ＸＰ＿００１１５４１０７．１）
配列番号７８：パン・トログロデュテスの予測ＭＧＡＴ３ポリペプチドアイソフォーム２（ＸＰ＿００１１５４１７１．１）
配列番号７９：パン・トログロデュテスの予測ＭＧＡＴ３アイソフォーム３（ＸＰ＿５２７８４２．２）
配列番号８０：カニス・ファミリアリスの予測ＭＧＡＴ３ポリペプチド（ＸＰ＿８５０３０５．１）
配列番号８１：ボス・タウルスの予測ＭＧＡＴ３ポリペプチド（ＸＰ＿８７５４９９．３）
配列番号８２：ダニオ・レリオの予測ＭＧＡＴ３ポリペプチド（ＸＰ＿６９３５０５．１）
配列番号８３：アラビドプシス・サリアナのＤＧＡＴ１ポリペプチド（ＣＡＢ４４７７４．１）
配列番号８４：アラビドプシス・サリアナのＧＰＡＴ４ポリヌクレオチド（ＮＭ＿１０００４３．４）
配列番号８５：アラビドプシス・サリアナのＧＰＡＴ６ポリヌクレオチド（ＮＭ＿１２９３６７．３）
配列番号８６：アラビドプシス・サリアナのＢＡＣ  Ｆ５Ｉ１０ポリヌクレオチド（ＡＦ１９５１１５．１）
配列番号８７：アラビドプシス・サリアナの未知タンパク質ポリヌクレオチド（ＡＹ０６２４６６．１）
配列番号８８：オリザ・サティバの第３染色体ポリヌクレオチド（ＡＣ１１８１３３．４）
配列番号８９：ピセア・シトケンシスのクローンＷＳ０２７６＿Ｆ１３ポリヌクレオチド（ＥＦ０８６０９５．１）
配列番号９０：ゼア・マイスのクローンＺＭ＿ＢＦｃ０１１０Ａ１ポリヌクレオチド（ＢＴ０６７６４９．１）
配列番号９１：アラビドプシス・サリアナのクローンＲＡＦＬ１６−１９−Ｈ０５ポリヌクレオチド（ＡＫ２２８８７０．１）
配列番号９２オリザ・サティバのクローンＪ０６５０５８Ｊ０１ポリヌクレオチド（ＡＫ２４１０３３．１）
配列番号９３：オリザ・サティバの第２染色体ポリヌクレオチド（ＣＭ０００１２７．１）
配列番号９４：オリザ・サティバの第５染色体ポリヌクレオチド（ＣＭ０００１３０．１）
配列番号９５：オリザ・サティバの第２染色体ポリヌクレオチド（ＣＭ０００１３９．１）
配列番号９６：オリザ・サティバの第１染色体ポリヌクレオチド（ＣＭ０００１２６．１）
配列番号９７：オリザ・サティバの第３染色体ポリヌクレオチド（ＣＭ０００１２８．１）
配列番号９８：オリザ・サティバの第３染色体ポリヌクレオチド（ＣＭ０００１４０．１）
配列番号９９：セラギネラ・ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉのＳＥＬＭＯｓｃａｆｆｏｌｄ＿１０２ポリヌクレオチド（ＧＬ３７７６６７．１）  
配列番号１００：セラギネラ・ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉのＳＥＬＭＯｓｃａｆｆｏｌｄ＿１０２ポリヌクレオチド（ＧＬ３７７６６７．１）
配列番号１０１：セラギネラ・ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉのＳＥＬＭＯｓｃａｆｆｏｌｄ＿８３ポリヌクレオチド（ＧＬ３７７６４８．１）
配列番号１０２：セラギネラ・ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉのＳＥＬＭＯｓｃａｆｆｏｌｄ＿５７ポリヌクレオチド（ＧＬ３７７６２２．１）
配列番号１０３：セラギネラ・ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉのＳＥＬＭＯｓｃａｆｆｏｌｄ＿２５ポリヌクレオチド（ＧＬ３７７５９０．１）
配列番号１０４：セラギネラ・ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉのＳＥＬＭＯｓｃａｆｆｏｌｄ＿１１ポリヌクレオチド（ＧＬ３７７５７６．１）
配列番号１０５：セラギネラ・ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉのＳＥＬＭＯｓｃａｆｆｏｌｄ＿１１ポリヌクレオチド（ＧＬ３７７５７６．１）
配列番号１０６：オリザ・サティバのＯｓ０１ｇ０８５５０００ポリヌクレオチド（ＮＭ＿００１０５１３７４．２）
配列番号１０７：オリザ・サティバのＯｓ０２ｇ０１１４４００ポリヌクレオチド（ＮＭ＿００１０５２２０３．１）
配列番号１０８：ゼア・マイスのＧＰＡＴ８ポリヌクレオチド（ＮＭ＿００１１５３９７０．１）
配列番号１０９：ゼア・マイスのＬＯＣ１００２８２９３０ポリヌクレオチド（ＮＭ＿００１１５５８３５．１）
配列番号１１０：ゼア・マイスのＬＯＣ１００３８２１１９ポリヌクレオチド（ＮＭ＿００１１７４８８０．１）
配列番号１１１：アラビドプシス・サリアナのＧＰＡＴ６ポリヌクレオチド（ＮＭ＿１２９３６７．３）
配列番号１１２：アラビドプシス・サリアナのＧＰＡＴ８ポリヌクレオチド（ＮＭ＿１１６２６４．５）
配列番号１１３：フィスコミトレラ・パテンスの予測タンパク質（ＰＨＹＰＡＤＲＡＦＴ＿１２８７３９）ポリヌクレオチド（ＸＭ＿００１７６４９４９．１）
配列番号１１４：フィスコミトレラ・パテンスの予測タンパク質（ＰＨＹＰＡＤＲＡＦＴ＿８３８２４）ポリヌクレオチド（ＸＭ＿００１７６９６１９．１）
配列番号１１５：フィスコミトレラ・パテンスの予測タンパク質（ＰＨＹＰＡＤＲＡＦＴ＿１８８３０８）ポリヌクレオチド（ＸＭ＿００１７６９６７２．１）
配列番号１１６：フィスコミトレラ・パテンスの予測タンパク質（ＰＨＹＰＡＤＲＡＦＴ＿１８９４９９）ポリヌクレオチド（ＸＭ＿００１７７１１３４．１）
配列番号１１７：フィスコミトレラ・パテンスの予測タンパク質（ＰＨＹＰＡＤＲＡＦＴ＿９５４８７）ポリヌクレオチドＸＭ＿００１７８０４８１．１）
配列番号１１８：ヴィティス・ヴィニフェラの予測タンパク質ＬＯＣ１００２４３３２１ポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２２６８４７７．１）  
配列番号１１９：ヴィティス・ヴィニフェラの予測タンパク質ＬＯＣ１００２４３０９３ポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２２７５３１２．１）
配列番号１２０：ヴィティス・ヴィニフェラの予測タンパク質ＬＯＣ１００２５９４３３ポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２２７５９９６．１）
配列番号１２１：ヴィティス・ヴィニフェラの予測タンパク質ＬＯＣ１００２６４８３２ポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２２７９０５５．１）
配列番号１２２：ポピュラス・トリコカルパの予測タンパク質ポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２３０９０８８．１）
配列番号１２３：ポピュラス・トリコカルパの予測タンパク質ポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２３０９２４０．１）
配列番号１２４：ポピュラス・トリコカルパの予測タンパク質ポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２３２２７１６．１）
配列番号１２５：ポピュラス・トリコカルパの予測タンパク質ポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２３２３５２７．１）
配列番号１２６：ソルガム・バイカラーのタンパク質ポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２４３９８４２．１）
配列番号１２７：ソルガム・バイカラーのタンパク質ポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２４５８７４１．１）
配列番号１２８：ソルガム・バイカラーのタンパク質ポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２４６３８７１．１）
配列番号１２９：ソルガム・バイカラーのタンパク質ポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２４６４５８５．１）
配列番号１３０：リシナス・コムニスのＥＲグリセリンリン酸アシルトランスフェラーゼポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２５１１８２７．１）
配列番号１３１：リシナス・コムニスのＥＲグリセリンリン酸アシルトランスフェラーゼポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２５１７３９２．１）
配列番号１３２：リシナス・コムニスのＥＲグリセリンリン酸アシルトランスフェラーゼポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２５２０１２５．１）
配列番号１３３：アラビドプシス・ｌｙｒａｔａのリン脂質／グリセロールアシルトランスフェラーゼファミリータンパク質ポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２８７２９０９．１）
配列番号１３４：アラビドプシス・ｌｙｒａｔａのＧＰＡＴ６ポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２８８１５１８．１）
配列番号１３５：ベルニシア・フォルジイの推定ＧＰＡＴ８ポリヌクレオチド（ＦＪ４７９７５３．１）
配列番号１３６：オリザ・サティバのＯｓ０３ｇ０７３５９００ポリヌクレオチド（ＮＭ＿００１０５７７２４．１）
配列番号１３７：アラビドプシス・サリアナのＧＰＡＴ４ポリヌクレオチド（ＮＭ＿１０００４３．４）
配列番号１３８：ポピュラス・トリコカルパの予測タンパク質ポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２３２０１０２．１）
配列番号１３９：ソルガム・バイカラーのタンパク質ポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２４５１３３２．１）
配列番号１４０：リシナス・コムニスのＥＲグリセリンリン酸アシルトランスフェラーゼポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２５３１３０４．１）
配列番号１４１：アラビドプシス・ｌｙｒａｔａのＧＰＡＴ４ポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２８８９３１５．１）
配列番号１４２：アラビドプシス・サリアナのＧＰＡＴ１ポリヌクレオチド（ＮＭ＿１００５３１．２）
配列番号１４３：アラビドプシス・サリアナのＧＰＡＴ３ポリヌクレオチド（ＮＭ＿１１６４２６．２）
配列番号１４４：アラビドプシス・サリアナのＧＰＡＴ４ポリペプチド（ＮＰ＿１７１６６７．１）  
配列番号１４５：アラビドプシス・サリアナのＧＰＡＴ６ポリペプチド（ＮＰ＿１８１３４６．１）  
配列番号１４６：アラビドプシス・サリアナのＦ５Ｉ１０．４遺伝子産物ポリペプチド（ＡＡＦ０２７８４．１）
配列番号１４７：アラビドプシス・サリアナの未知タンパク質ポリペプチド（ＡＡＬ３２５４４．１）
配列番号１４８：オリザ・サティバのタンパク質ポリペプチド（ＡＡＰ０３４１３．１）
配列番号１４９：ピセア・シトケンシスの未知ポリペプチド（ＡＢＫ２５３８１．１）
配列番号１５０：ゼア・マイスの未知ポリペプチド（ＡＣＮ３４５４６．１）
配列番号１５１：アラビドプシス・サリアナの予測タンパク質ポリペプチド（ＢＡＦ００７６２．１）
配列番号１５２：オリザ・サティバの無名タンパク質産物ポリペプチド（ＢＡＨ００９３３．１）
配列番号１５３：オリザ・サティバの予測タンパク質Ｏｓｌ＿０５５６６ポリペプチド（ＥＡＹ８４１８９．１）
配列番号１５４：オリザ・サティバの予測タンパク質Ｏｓｌ＿２０１５５ポリペプチド（ＥＡＹ９８２４５．１）
配列番号１５５：オリザ・サティバの予測タンパク質ＯｓＪ＿０５０９４ポリペプチド（ＥＡＺ２１４８４．１）
配列番号１５６：オリザ・サティバの予測タンパク質Ｏｓｌ＿０４４７８ポリペプチド（ＥＥＣ７１８２６．１）
配列番号１５７：オリザ・サティバの予測タンパク質Ｏｓｌ＿１３４２３ポリペプチド（ＥＥＣ７６１３７．１）
配列番号１５８：オリザ・サティバの予測タンパク質ＯｓＪ＿１２４８２ポリペプチド（ＥＥＥ５９８８２．１）
配列番号１５９：セラギネラ・ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉの予測タンパク質ＳＥＬＭＯＤＲＡＦＴ＿２６９６００ポリペプチド（ＥＦＪ０８９６３．１）
配列番号１６０：セラギネラ・ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉの予測タンパク質ＳＥＬＭＯＤＲＡＦＴ＿１８４９６２ポリペプチド（ＥＦＪ０８９６４．１）
配列番号１６１：セラギネラ・ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉの予測タンパク質ＳＥＬＭＯＤＲＡＦＴ＿２３５３３１ポリペプチド（ＥＦＪ１１２００．１）
配列番号１６２：セラギネラ・ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉの予測タンパク質ＳＥＬＭＯＤＲＡＦＴ＿１１８１５５ポリペプチド（ＥＦＪ１５６６４．１）
配列番号１６３：セラギネラ・ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉの予測タンパク質ＳＥＬＭＯＤＲＡＦＴ＿１０２２５７ポリペプチド（ＥＦＪ２４０８６．１）
配列番号１６４：セラギネラ・ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉの予測タンパク質ＳＥＬＭＯＤＲＡＦＴ＿１７０１６４ポリペプチド（ＥＦＪ２９８１６．１）
配列番号１６５：セラギネラ・ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉの予測タンパク質ＳＥＬＭＯＤＲＡＦＴ＿１７０１６５ポリペプチド（ＥＦＪ２９８１７．１）
配列番号１６６：オリザ・サティバのＯｓ０１ｇ０８５５０００ポリペプチド（ＮＰ＿００１０４４８３９．１）
配列番号１６７：オリザ・サティバのＯｓ０２ｇ０１１４４００ポリペプチド（ＮＰ＿００１０４５６６８．１）
配列番号１６８：ゼア・マイスのＧＰＡＴ８ポリペプチド（ＮＰ＿００１１４７４４２．１）
配列番号１６９：ゼア・マイスのＬＯＣ１００２８２９３０ポリペプチド（ＮＰ＿００１１４９３０７．１）
配列番号１７０：ゼア・マイスのタンパク質ＬＯＣ１００３８２１１９ポリペプチド（ＮＰ＿００１１６８３５１．１）
配列番号１７１：アラビドプシス・サリアナのＧＰＡＴ６ポリペプチド（ＮＰ＿１８１３４６．１）
配列番号１７２：アラビドプシス・サリアナのＧＰＡＴ８ポリペプチド（ＮＰ＿１９１９５０．２）
配列番号１７３：フィスコミトレラ・パテンスのタンパク質ポリペプチド（ＸＰ＿００１７６５００１．１）
配列番号１７４：フィスコミトレラ・パテンスのタンパク質ポリペプチド（ＸＰ＿００１７６９６７１．１）
配列番号１７５：フィスコミトレラ・パテンスのタンパク質ポリペプチド（ＸＰ＿００１７６９７２４．１）
配列番号１７６：フィスコミトレラ・パテンスのタンパク質ポリペプチド（ＸＰ＿００１７７１１８６．１）
配列番号１７７：フィスコミトレラ・パテンスのタンパク質ポリペプチド（ＸＰ＿００１７８０５３３．１）
配列番号１７８：ヴィティス・ヴィニフェラのタンパク質ポリペプチド（ＸＰ＿００２２６８５１３．１）
配列番号１７９：ヴィティス・ヴィニフェラのタンパク質ポリペプチド（ＸＰ＿００２２７５３４８．１）
配列番号１８０：ヴィティス・ヴィニフェラのタンパク質ポリペプチド（ＸＰ＿００２２７６０３２．１）
配列番号１８１：ヴィティス・ヴィニフェラのタンパク質ポリペプチド（ＸＰ＿００２２７９０９１．１）
配列番号１８２：ポピュラス・トリコカルパのタンパク質ポリペプチド（ＸＰ＿００２３０９１２４．１）
配列番号１８３：ポピュラス・トリコカルパのタンパク質ポリペプチド（ＸＰ＿００２３０９２７６．１）
配列番号１８４：ポピュラス・トリコカルパのタンパク質ポリペプチド（ＸＰ＿００２３２２７５２．１）
配列番号１８５：ポピュラス・トリコカルパのタンパク質ポリペプチド（ＸＰ＿００２３２３５６３．１）
配列番号１８６：ソルガム・バイカラーのタンパク質ＳＯＲＢＩＤＲＡＦＴ＿０９ｇ０２２０２０ポリペプチド（ＸＰ＿００２４３９８８７．１）
配列番号１８７：ソルガム・バイカラーのタンパク質ＳＯＲＢＩＤＲＡＦＴ＿０３ｇ０４０２６０ポリペプチド（ＸＰ＿００２４５８７８６．１）
配列番号１８８：ソルガム・バイカラーのタンパク質ＳＯＲＢＩＤＲＡＦＴ＿０１ｇ００８８８０ポリペプチド（ＸＰ＿００２４６３９１６．１）
配列番号１８９：ソルガム・バイカラーのタンパク質ＳＯＲＢＩＤＲＡＦＴ＿０１ｇ０２２１４０ポリペプチド（ＸＰ＿００２４６４６３０．１）
配列番号１９０：リシナス・コムニスのＥＲグリセリンリン酸アシルトランスフェラーゼポリペプチド（ＸＰ＿００２５１１８７３．１）
配列番号１９１：リシナス・コムニスのＥＲグリセリンリン酸アシルトランスフェラーゼポリペプチド（ＸＰ＿００２５１７４３８．１）
配列番号１９２：リシナス・コムニスのＥＲグリセリンリン酸アシルトランスフェラーゼポリペプチド（ＸＰ＿００２５２０１７１．１）
配列番号１９３：アラビドプシス・ｌｙｒａｔａのリン脂質／グリセロールアシルトランスフェラーゼファミリータンパク質ポリペプチド（ＸＰ＿００２８７２９５５．１）
配列番号１９４：アラビドプシス・ｌｙｒａｔａのＧＰＡＴ６ポリペプチド（ＸＰ＿００２８８１５６４．１）
配列番号１９５：ベルニシア・フォルジイの推定ＧＰＡＴポリペプチド（ＡＣＴ３２０３２．１）
配列番号１９６：オリザ・サティバのＯｓ０３ｇ０７３５９００ポリペプチド（ＮＰ＿００１０５１１８９．１）
配列番号１９７：アラビドプシス・サリアナのＧＰＡＴ４ポリペプチド（ＮＰ＿１７１６６７．１）
配列番号１９８：ポピュラス・トリコカルパのタンパク質ポリペプチド（ＸＰ＿００２３２０１３８．１）
配列番号１９９：ソルガム・バイカラーのタンパク質ＳＯＲＢＩＤＲＡＦＴ＿０４ｇ００１０６０ポリペプチド（ＸＰ＿００２４５１３７７．１）
配列番号２００：リシナス・コムニスのＥＲグリセリンリン酸アシルトランスフェラーゼポリペプチド（ＸＰ＿００２５３１３５０．１）
配列番号２０１：アラビドプシス・ｌｙｒａｔａのＧＰＡＴ４ポリペプチド（ＸＰ＿００２８８９３６１．１）
配列番号２０２：アラビドプシス・サリアナのＧＰＡＴ１ポリペプチド（ＮＰ＿５６３７６８．１）
配列番号２０３：アラビドプシス・サリアナのＧＰＡＴ３ポリペプチド（ＮＰ＿１９２１０４．１）
配列番号２０４：アラビドプシス・サリアナのＤＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＮＭ＿１１５０１１．３）
配列番号２０５：リシナス・コムニスのＤＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＡＹ９１６１２９．１）
配列番号２０６：ベルニシア・フォルジイのＤＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＤＱ３５６６８２．１）
配列番号２０７：モルティエレラ・ラマニアナのＤＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＡＦ３９１０８９．１）
配列番号２０８：ホモ・サピエンスのＤＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＮＭ＿０３２５６４．１）
配列番号２０９：ホモ・サピエンスのＤＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＮＭ＿００１０１３５７９．２）
配列番号２１０：ボス・タウルスのＤＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＮＭ＿２０５７９３．２）
配列番号２１１：マス・マスクルスのＤＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＡＦ３８４１６０．１）
配列番号２１２：アラビドプシス・サリアナのＤＧＡＴ２ポリペプチド（ＮＰ＿５６６９５２．１）
配列番号２１３：リシナス・コムニスのＤＧＡＴ２ポリペプチド（ＡＡＹ１６３２４．１）
配列番号２１４  ：ベルニシア・フォルジイのＤＧＡＴ２ポリペプチド（ＡＢＣ９４４７４．１）
配列番号２１５：モルティエレラ・ラマニアナのＤＧＡＴ２ポリペプチド（ＡＡＫ８４１７９．１）
配列番号２１６：ホモ・サピエンスのＤＧＡＴ２ポリペプチド（Ｑ９６ＰＤ７．２）
配列番号２１７：ホモ・サピエンスのＤＧＡＴ２ポリペプチド（Ｑ５８ＨＴ５．１）
配列番号２１８：ボス・タウルスのＤＧＡＴ２ポリペプチド（Ｑ７０ＶＺ８．１）
配列番号２１９：マス・マスクルスのＤＧＡＴ２ポリペプチド（ＡＡＫ８４１７５．１）
配列番号２２０：ＹＦＰトリペプチド−保存ＤＧＡＴ２および／またはＭＧＡＴ１／２配列モチーフ
配列番号２２１：ＨＰＨＧテトラペプチド−保存ＤＧＡＴ２またはＭＧＡＴ１／２配列モチーフ
配列番号２２２：ＥＰＨテトラペプチド−保存植物ＤＧＡＴ２配列モチーフ
配列番号２２３：ＲＸＧＦＸ（Ｋ／Ｒ）ＸＡＸＸＸＧＸＸＸ（Ｌ／Ｖ）ＶＰＸＸＸＦＧ（Ｅ／Ｑ）−推定グリセロールリン脂質ドメインの一部であるＤＧＡＴ２の長い保存配列モチーフ
配列番号２２４：ＦＬＸＬＸＸＸＮ−マウスＤＧＡＴ２の保存配列モチーフおよび推定中性脂質結合ドメインであるＭＧＡＴ１／２
配列番号２２５：ＧＰＡＴのｐｌｓＣアシルトランスフェラーゼドメイン（ＰＦ０１５５３）
配列番号２２６：ＧＰＡＴのＨＡＤ様ヒドロラーゼ（ＰＦ１２７１０）スーパーファミリードメイン
配列番号２２７ホスホセリンホスファターゼドメイン（ＰＦ００７０２）。ＧＰＡＴ４〜８は、このドメインに相同のＮ末端領域を含む。
配列番号２２８：保存ＧＰＡＴアミノ酸配列ＧＤＬＶＩＣＰＥＧＴＴＣＲＥＰ
配列番号２２９：保存ＧＰＡＴ／ホスファターゼアミノ酸配列（モチーフＩ）
配列番号２３０：保存ＧＰＡＴ／ホスファターゼアミノ酸配列（モチーフＩＩＩ）
【０１０７】
一般的な手法および定義
別途具体的に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、（例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、脂質および脂肪酸化学、バイオ燃料生成、ならびに生化学において）当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有するものと解釈されるものとする。
別途指示されていない限り、本発明で利用される組み換えタンパク質、細胞培養、および免疫学的手法は、標準的な手順であり、当業者によく知られている。そのような手法は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９８４）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（編），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １および２，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ  ａｎｄ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（編），ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９５および１９９６）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８，現在までの全ての最新版を含む）、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（編）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）、およびＪ．Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（現在までの全ての最新版を含む）等の出展の文献全体を通して記載および説明されている。
【０１０８】
選択された定義
「トランスジェニック非ヒト生物」という用語は、例えば、外因性ポリヌクレオチド（導入遺伝子）または外因性ポリペプチドを含む、植物、藻類、非ヒト動物、または酵母もしくは真菌等の発酵に好適な生物全体を指す。ある実施形態において、トランスジェニック非ヒト生物は、動物またはその一部ではない。一実施形態において、トランスジェニック非ヒト生物は、日光からエネルギーを得て、栄養のための有機化合物を合成することができる、光合成生物（例えば、植物または藻類）である。別の実施形態において、トランスジェニック非ヒト生物は、光合成細菌である。「外因性」という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとの関連において、その自然な状態と比較して変化した量で細胞に存在するときの、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。一実施形態において、細胞は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを自然に含まない細胞である。別の実施形態において、外因性ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、異なる属に由来する。別の実施形態において、外因性ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、異なる種に由来する。一実施形態において、外因性ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、宿主植物または植物細胞において発現し、外因性ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、異なる種または属に由来する。一実施形態において、外因性ポリペプチドは、外因性ＭＧＡＴである。本明細書で使用される「抽出脂質」という用語は、少なくとも６０％（ｗ／ｗ）の脂質を含む、トランスジェニック生物またはその一部から抽出される組成物を指す。
【０１０９】
本明細書で使用される「非極性脂質」という用語は、有機溶媒には溶解するが、水には溶解しない、脂肪酸およびその誘導体を指す。脂肪酸は、遊離脂肪酸および／またはエステル化形態であってもよい。エステル化形態の例としては、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、モノアシルグリセロール（ＭＡＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。非極性脂質としては、ステロール、ステロールエステル、および蝋エステルも挙げられる。非極性脂質は、「中性脂質」としても知られている。非極性脂質は、典型的に、室温で液体である。好ましくは、非極性脂質は、主に（＞５０％）、少なくとも１６個の炭素長である、脂肪酸を含む。より好ましくは、非極性脂質中の総脂肪酸の少なくとも５０％は、Ｃ１８脂肪酸、例えばオレイン酸である。一実施形態において、本発明の非極性脂質中の脂肪酸の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％を、ＴＡＧとして見出すことができる。非極性脂質は、例えば、強塩基で加水分解して遊離脂肪酸を放出させることによって、または分画、蒸留等によって、さらに精製または処理してもよい。本発明の非極性脂質は、種子から得られた場合に、「種子油」の一部を形成し得る。非極性脂質は、葉もしくは果実を含む他の植物部の中に存在し得、もしくはそこから得てもよく、または組み換え細胞もしくは非ヒト生物から得てもよいが、その場合、脂質は、本明細書で定義されるような種子油ではない。
【０１１０】
遊離ステロールおよびエステル化ステロール（例えば、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラジカステロール、Ｄ５−アベナステロール、シトスタノール、カンペスタノール、およびコレステロール）の抽出脂質中の濃度は、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ他，２００２で説明されるようになり得る。
【０１１１】
本明細書で使用される「種子油」という用語は、少なくとも６０％（ｗ／ｗ）の脂質を含む植物の種子／穀粒から得られる、または種子／穀粒中に種子油がさらに存在する場合に、種子／穀粒から得ることが可能な組成物を指す。すなわち、本発明の種子油は、種子／穀粒中またはその一部分に存在する種子油、ならびに種子／穀粒から抽出した種子油を含む。種子油は、好ましくは、抽出した種子油である。種子油は、典型的に、室温で液体である。好ましくは、種子油における総脂肪酸（ＴＦＡ）含量は、主に（＞５０％）、少なくとも１６個の炭素長である、脂肪酸を含む。より好ましくは、種子油中の総脂肪酸の少なくとも５０％は、Ｃ１８脂肪酸、例えばオレイン酸である。脂肪酸は、典型的に、例えば、ＴＡＧ、ＤＡＧ、アシルＣｏＡ、またはリン脂質等の、エステル化形態である。脂肪酸は、遊離脂肪酸および／またはエステル化形態であってもよい。一実施形態において、本発明の種子油中の脂肪酸の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％を、ＴＡＧとして見出すことができる。一実施形態において、本発明の種子油は、１つ以上の他の脂質、核酸、ポリペプチド、または種子もしくは粗抽出物に伴う他の汚染分子から分離された、「実質的に精製した」または「精製した」油である。実質的に精製した種子油は、種子もしくは抽出物に伴う他の成分を、少なくとも６０％含まない、より好ましくは少なくとも７５％含まない、より好ましくは少なくとも９０％含まないことが好ましい。本発明の種子油は、ステロール等が挙げられるが、これに限定されない、非脂肪酸分子をさらに含んでもよい。一実施形態において、種子油は、カノーラ油（ブラシカ・ナパス、ブラッシカ・ラパ亜種）、カラシ油（ブラシカ・ユンセア）、他のアブラナ油（例えば、ブラシカ・ナポブラシカ、ブラシカ・カメリナ）、ヒマワリ油（ヘリアンサス・アンヌス）、アマニ油（リナム・ウシタチシマム）、ダイズ油（グリシネ・マク）、サフラワー油（カルタムス・ティンクトリウス）、トウモロコシ油（ゼア・マイス）、タバコ油（ニコチアナ・タバカム）、ピーナッツ油（アラキス・ヒポゲア）、パーム油（エラエイス・ギネエンシス）、綿実油（ゴシピウム・ヒルスツム）、ヤシ油（ココス・ヌシフェラ）、アボカド油（パーシー・アメリカーナ）、オリーブ油（オレア・ユーロピア）、カシュー油（アナカルジウム・オクシデンタレ）、マカダミア油（マカダミア・インテルグリフォリア）、アーモンド油（プルナス・アミグダラス）、オートムギ種子油（アベナ・サティバ）、米油（オリザ・サティバまたはオリザ・グラベリマ）、またはアラビドプシス種子油（アラビドプシス・サリアナ）である。種子油は、当技術分野で知られている任意の方法によって、種子／穀粒から抽出されてもよい。これは、典型的に、ジエチルエーテル、石油エーテル、クロロホルム／メタノール、またはブタノール混合物等の非極性溶媒による抽出を伴い、一般に、最初に種子を粉砕することが含まれる。穀粒のデンプンに伴う脂質は、水飽和したブタノールで抽出され得る。種子油は、当技術分野で知られている方法によって「脱ガム」して多糖類を除去してもよく、または汚染物質を除去するための、または他の方法で処理して、純度、安定性、もしくは色を改善してもよい。種子油中のＴＡＧおよび他のエステルは、遊離脂肪酸を放出するように加水分解してもよく、または種子油を水素化してもよく、または当技術分野で知られているように化学的もしくは酵素的に処理されてもよい。
【０１１２】
本明細書で使用される「脂肪酸」という用語は、少なくとも８個の炭素原子長の飽和または不飽和の長脂肪族末端を伴う、カルボン酸を指す。典型的に、脂肪酸は、少なくとも１２個の炭素長の炭素−炭素結合鎖を有する。大部分の自然の脂肪酸は、それらの生合成が２個の炭素原子を有する酢酸塩を伴うので、偶数個の炭素原子を有する。脂肪酸は、遊離状態（非エステル化）であってもよく、またはＴＡＧ、ＤＡＧ、ＭＡＧ、アシルＣｏＡ（チオエステル）結合の一部、もしくは他の共有的に結合した形態等のエステル化形態であってもよい。本明細書では、エステル化形態で共有的に結合したときの脂肪酸を「アシル」基と称する。脂肪酸は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、またはジホスファチジルグリセロール等のリン脂質としてエステル化されてもよい。飽和脂肪酸は、鎖に沿っていかなる二重結合または他の官能基も含まない。「飽和」という用語は、全ての炭素（カルボン酸（−ＣＯＯＨ）基は除く）が可能な限り多くの水素を含むという点で、水素を指す。換言すれば、オメガ（ω）末端は、３つの水素（ＣＨ３−）を含み、鎖の範囲内の各炭素は、２つの水素（−ＣＨ２−）を含む。不飽和脂肪酸は、飽和脂肪酸に類似した形態のものであるが、１つ以上のアルケン官能基が鎖に沿って存在し、各アルケンが、鎖の単結合「−ＣＨ２−ＣＨ２−」部が、二重結合「−ＣＨ＝ＣＨ−」部分（すなわち、別の炭素に二重結合した炭素）と置換されていることが異なる。二重結合のどちらかの側に結合した、鎖の中の２個の隣の炭素原子は、シスまたはトランス配置で起こり得る。
【０１１３】
本明細書で使用される、「多価不飽和脂肪酸」または「ＰＵＦＡ」という用語は、その炭素鎖の中に少なくとも１２個の炭素原子を含み、少なくとも２個のアルケン基（炭素−炭素二重結合）を含む、脂肪酸を指す。
【０１１４】
「モノアシルグリセリド」または「ＭＡＧ」は、グリセロールが１つの脂肪酸でエステル化された、グリセリドである。本明細書で使用されるＭＡＧは、ｓｎ−１／３位に水酸基を含み（本明細書では、ｓｎ−１−ＭＡＧ、１−ＭＡＧ、または１／３−ＭＡＧとも称される）、またはｓｎ−２位に水酸基を含み（本明細書では、２−ＭＡＧとも称される）、したがって、ＭＡＧは、ＰＡまたはＰＣ等のリン酸化分子を含まない。したがって、ＭＡＧは、細胞中の中性脂質の成分である。
【０１１５】
「ジアシルグリセリド」または「ＤＡＧ」は、グリセロールが２つの脂肪酸でエステル化された、グリセリドである。本明細書で使用されるＤＡＧは、ｓｎ−１，３位またはｓｎ−１，２／２，３位に水酸基を含み、したがって、ＤＡＧは、ＰＡまたはＰＣ等のリン酸化分子を含まない。したがって、ＤＡＧは、細胞中の中性脂質の成分である。ＤＡＧ合成のケネディ経路（図１）では、前駆体ｓｎ−グリセロール−３−リン酸（Ｇ−３−Ｐ）が、ＬｙｓｏＰＡを形成するためにｓｎ−１位においてグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）によって触媒する第１の反応、続いて、ホスファチジン酸（ＰＡ）を形成するためにｓｎ−２位においてリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）によって触媒する第２のアシル化で、それぞれが脂肪酸コエンザイムＡエステルに由来する、２つのアシル基にエステル化される。次いで、この中間体は脱リン酸化されて、ＤＡＧを形成する。代替同化経路（図１）において、ＤＡＧは、ＭＧＡＴによって触媒されて、ｓｎ−１−ＭＡＧ、または好ましくは、ｓｎ−２−ＭＡＧのいずれかのアシル化によって形成され得る。ＤＡＧはまた、リパーゼによるアシル基の除去によってＴＡＧから形成してもよく、または本質的に、酵素ＣＰＴ、ＰＤＣＴ、またはＰＬＣのいずれかによるコリン頭部基の除去によってＰＣから形成してもよい（図１）。
【０１１６】
「トリアシルグリセリド」または「ＴＡＧ」は、グリセロールが３個の脂肪酸でエステル化された、グリセリドである。ＴＡＧ合成のケネディ経路では、ＤＡＧが前述のように形成され、次いで、第３のアシル基がエステル化されて、ＤＧＡＴの活性によってグリセロール骨格にエステル化される。ＴＡＧの形成のための代替経路は、本明細書で説明される酵素ＰＤＡＴおよびＭＧＡＴ経路によって触媒されるものを含む。
本明細書で使用される「アシルトランスフェラーゼ」という用語は、アシルＣｏＡから基質上にアシル基を転移させることができるタンパク質を指し、ＭＧＡＴ、ＧＰＡＴ、およびＤＧＡＴを含む。
【０１１７】
本明細書で使用される「モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ」または「ＭＧＡＴ」という用語は、アシルＣｏＡからＭＡＧ基質に脂肪アシル基を転移させてＤＡＧを生成する、タンパク質を指す。したがって、「モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性」という用語は、少なくとも、アシルＣｏＡからＭＡＧにアシル基を転移させてＤＡＧを生成することを指す。ＭＧＡＴは、哺乳類の腸における脂肪吸収でのその役割で最も知られており、そこでは食餌脂肪の消化から生成される脂肪酸およびｓｎ−２−ＭＡＧは、カイロミクロン合成および分泌のために、腸細胞においてＴＡＧに再合成される。ＭＧＡＴは、このプロセスの第１のステップを触媒し、そのプロセスでは、脂肪酸およびＣｏＡから形成される脂肪アシルＣｏＡ由来のアシル基、およびｓｎ−２−ＭＡＧが共有的に結合される。本明細書で使用される「ＭＧＡＴ」という用語は、ｓｎ−１／３−ＭＡＧおよび／またはｓｎ−２−ＭＡＧ基質に作用して、それぞれ、ｓｎ−１，３−ＤＡＧおよび／またはｓｎ−１，２／２，３−ＤＡＧを形成する、酵素を含む。好ましい実施形態において、ＭＧＡＴは、ｓｎ−１−ＭＡＧと比べてｓｎ−２−ＭＡＧ基質に対する選好を有するか、または基質として実質的にｓｎ−２−ＭＡＧだけを使用する（例としては、Ｃａｏ他，２００３（ｓｎ−１／３−１８：１−ＭＡＧよりも大きい、ｓｎ−２−１８：１−ＭＡＧに対するマウスＭＧＡＴ１の特異性（図５））、ＹｅｎおよびＦａｒｅｓｅ，２００３（マウスＭＧＡＴ１およびヒトＭＧＡＴ２の一般的な活性は、１−ＭＡＧアシル−受容体基質に対するよりも２−ＭＡＧに対する方が高い（図５））、およびＣｈｅｎｇ他，２００３（２−ＭＡＧに対するヒトＭＧＡＴ３の活性は、１／３−ＭＡＧ基質に対する活性よりもはるかに高い（図２Ｄ）が挙げられる）。
【０１１８】
本明細書で使用されるＭＧＡＴは、ＭＡＧと比較して、アシル基を先行的にＬｙｓｏＰＡに転送する酵素を含まず、そのような酵素は、ＬＰＡＡＴとして知られている。すなわち、ＭＧＡＴは、非リン酸化モノアシル基質がＬｙｓｏＰＡに対して低い触媒活性を有し得るが、選好的に非リン酸化モノアシル基質を使用する。好ましいＭＧＡＴは、ＬｙｓｏＰＡをアシル化する際に検出可能な活性を有しない。示されるように、ＭＧＡＴ（すなわち、ハツカネズミＭＧＡＴ２）はまた、ＤＧＡＴ機能を有し得るが、主に、ＭＧＡＴとして機能する。すなわち、酵素活性を、産物−ｎｍｏｌｅ／分／ｍｇ−タンパク質で表したときに、ＤＧＡＴとしての触媒活性よりも高い、ＭＧＡＴとしての触媒活性を有する（Ｙｅｎ他，２００２も参照されたい）。
【０１１９】
ＭＧＡＴには、それぞれ、ＭＧＡＴ１、ＭＧＡＴ２、およびＭＧＡＴ３と称される、３つの既知のクラスがある。ヒトＭＧＡＴ１遺伝子（ＡＦ３８４１６３）の相同体は、少なくとも、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、ラット、ゼブラフィッシュ、カエノラブディティス・エレガンス、シゾサッカロミセス・ポンベ、サッカロミセス・セレビシエ、クライベロマイセス・ラクティス、エレモテシウム・ゴシピイ、マグナポルテ・グリセア、およびニューロスポラ・クラッサに存在する（すなわち、配列が分かっている）。ヒトＭＧＡＴ２遺伝子（ＡＹ１５７６０８）の相同体は、少なくとも、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、ラット、ニワトリ、ゼブラフィッシュ、ミバエ、および蚊に存在する。ヒトＭＧＡＴ３遺伝子（ＡＹ２２９８５４）の相同体は、少なくとも、チンパンジー、イヌ、ウシ、およびゼブラフィッシュに存在する。しかしながら、他の生物由来の相同体は、当技術分野で知られている相同的配列を識別するための方法によって容易に特定することができる。
【０１２０】
ＭＧＡＴ１ポリペプチドの例としては、ホモ・サピエンス（ＡＦ３８４１６３）、マス・マスクルス（ＡＦ３８４１６２）、パン・トログロデュテス（ＸＭ＿００１１６６０５５、ＸＭ＿０５２６０４４．２）、カニス・ファミリアリス（ＸＭ＿５４５６６７．２）、ボス・タウルス（ＮＭ＿００１００１１５３．２）、ラッタス・ノルベギカス（ＮＭ＿００１１０８８０３．１）、ダニオ・レリオＭＧＡＴ１（ＮＭ＿００１１２２６２３．１）、カエノラブディティス・エレガンス（ＮＭ＿０７３０１２．４、ＮＭ＿１８２３８０．５、ＮＭ＿０６５２５８．３、ＮＭ＿０７５０６８．３、ＮＭ＿０７２２４８．３）、クライベロマイセス・ラクティス（ＸＭ＿４５５５８８．１）、アシビア・ゴシピイ（ＮＭ＿２０８８９５．１）、マグナポルテ・オリザエ（ＸＭ＿３６８７４１．１）、シオナ・インテスチナリスの予測（ＸＭ＿００２１２０８４３．１）由来のＭＧＡＴ１遺伝子によってコードされるタンパク質が挙げられる。ＭＧＡＴ２ポリペプチドの例としては、ホモ・サピエンス（ＡＹ１５７６０８）、マス・マスクルス（ＡＹ１５７６０９）、パン・トログロデュテス（ＸＭ＿５２２１１２．２）、カニス・ファミリアリス（ＸＭ＿５４２３０４．１）、ボス・タウルス（ＮＭ＿００１０９９１３６．１）、ラッタス・ノルベギカス、ガッルス・ガッルス（ＸＭ＿４２４０８２．２）、ダニオ・レリオ（ＮＭ＿００１００６０８３．１）、ドロソフィラ・メラノガスター（ＮＭ＿１３６４７４．２、ＮＭ＿１３６４７３．２、ＮＭ＿１３６４７５．２）、アノフェレス・ガンビェ（ＸＭ＿００１６８８７０９．１、ＸＭ＿３１５９８５）、トリボリウム・カスタネウム（ＸＭ＿９７００５３．１）由来のＭＧＡＴ２遺伝子によってコードされるタンパク質が挙げられる。ＭＧＡＴ３ポリペプチドの例としては、ホモ・サピエンス（ＡＹ２２９８５４）、パン・トログロデュテス（ＸＭ＿００１１５４１０７．１、ＸＭ＿００１１５４１７１．１、ＸＭ＿５２７８４２．２）、カニス・ファミリアリス（ＸＭ＿８４５２１２．１）、ボス・タウルス（ＸＭ＿８７０４０６．４）、ダニオ・レリオ（ＸＭ＿６８８４１３．４）由来のＭＧＡＴ３遺伝子によってコードされるタンパク質が挙げられる。
【０１２１】
本明細書で使用される「ＭＧＡＴ経路」は、ＴＡＧの形成のためのケネディ経路とは異なる同化経路を指し、そこにおいて、ＤＡＧは、ＭＧＡＴによって触媒された、ｓｎ−１−ＭＡＧ、または好ましくは、ｓｎ−２−ＭＡＧのいずれかのアシル化によって形成される。ＤＡＧは、その後、ＴＡＧまたは他の脂質を形成するために使用してもよい。ＭＧＡＴ経路を図１で例示する。
本明細書で使用される「ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ」（ＤＧＡＴ）という用語は、アシルＣｏＡからＤＡＧ基質に脂肪アシル基を転移させてＴＡＧを生成する、タンパク質を指す。したがって、「ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性」という用語は、アシルＣｏＡからＤＡＧにアシル基を転移させてＴＡＧを生成することを指す。ＤＧＡＴはまた、ＭＧＡＴ機能も有し得るが、主にＤＧＡＴとして機能する。すなわち、酵素活性を、産物−ｎｍｏｌｅ／分／ｍｇ−タンパク質で表したときに、ＭＧＡＴとしての触媒活性よりも高い、ＤＧＡＴとしての触媒活性を有する（例えば、Ｙｅｎ他，２００５を参照されたい）。
【０１２２】
ＤＧＡＴには、それぞれ、ＤＧＡＴ１、ＤＧＡＴ２、およびＤＧＡＴ３と呼ばれる、３つの既知のクラスがある。ＤＧＡＴ１ポリペプチドは、典型的に、１０個の膜貫通ドメインを有し、ＤＧＡＴ２ポリペプチドは、典型的に、２個の膜貫通ドメインを有するのに対して、ＤＧＡＴ３ポリペプチドは、典型的に、いずれも有しておらず、細胞質に溶解するが、膜には組み込まれないと考えられている。ＤＧＡＴ１ポリペプチドの例としては、アスペルギルス・フミガタス（受入番号ＸＰ＿７５５１７２）、アラビドプシス・サリアナ（ＣＡＢ４４７７４）、リシナス・コムニス（ＡＡＲ１１４７９）、ベルニシア・フォルジイ（ＡＢＣ９４４７２）、ベルノニア・ガラメンシス（ＡＢＶ２１９４５、ＡＢＶ２１９４６）、エウオニムス・アラツス（ＡＡＶ３１０８３）、カエノラブディティス・エレガンス（ＡＡＦ８２４１０）、ラッタス・ノルベギカス（ＮＰ＿４４５８８９）、ホモ・サピエンス（ＮＰ＿０３６２１１）、由来のＤＧＡＴ１遺伝子によってコードされるタンパク質、ならびにその変異形および／または変異体が挙げられる。ＤＧＡＴ２ポリペプチドの例としては、アラビドプシス・サリアナ（ＮＰ＿５６６９５２．１；配列番号２１２）、リシナス・コムニス（ＡＡＹ１６３２４．１；配列番号２１３）、ベルニシア・フォルジイ（ＡＢＣ９４４７４．１；配列番号２１４）、モルティエレラ・ラマニアナ（ＡＡＫ８４１７９．１；配列番号２１５）、ホモ・サピエンス（Ｑ９６ＰＤ７．２；配列番号２１６）（Ｑ５８ＨＴ５．１；配列番号２１７）、ボス・タウルス（Ｑ７０ＶＺ８．１；配列番号２１８）、マス・マスクルス（ＡＡＫ８４１７５．１；配列番号２１９）由来のＤＧＡＴ２遺伝子によってコードされるタンパク質、ならびにその変異形および／または変異体が挙げられる。
ＤＧＡＴ３ポリペプチドの例としては、ピーナッツ（アラキス・ヒポゲア、Ｓａｈａ他，２００６）、ならびに変異形および／またはその変異体由来のＤＧＡＴ３遺伝子によってコードされるタンパク質が挙げられる。ＤＧＡＴは、検出可能なＭＧＡＴ活性をほとんどまたは全く有さず、例えば、３００ｐｍｏｌ／分／ｍｇ−タンパク質、好ましくは、２００ｐｍｏｌ／分／ｍｇ−タンパク質、より好ましくは、１００ｐｍｏｌ／分／ｍｇ−タンパク質である。
【０１２３】
ＤＧＡＴ１ではなくＤＧＡＴ２は、ＭＧＡＴ酵素と高い配列相同性を共有し、これは、ＤＧＡＴ２およびＭＧＡＴ遺伝子が、共通の遺伝的起源を共有している可能性があることを示唆している。触媒する際には、複数のアイソフォームがＴＡＧ合成の際と同じステップを伴うが、これらのアイソフォームは、酵素のＤＧＡＴ／ＭＧＡＴファミリーの差次的な組織分配および細胞内局在化によって示唆されるように、異なった機能的役割を果たし得る。哺乳類では、ＭＧＡＴ１が、主に胃、腎臓、脂肪組織で発現するのに対して、ＭＧＡＴ２およびＭＧＡＴ３は、小腸において最も高い発現を示す。哺乳類では、ＤＧＡＴ１が、数多くの組織で偏在して発現し、小腸で最も高い発現を伴うのに対して、ＤＧＡＴ２は、肝臓において最大である。ＭＧＡＴ３は、生物情報科学分析から、齧歯動物にはなく、哺乳類およびヒトにだけより高く存在する。ＭＧＡＴ３は、ＭＧＡＴ１およびＭＧＡＴ３よりもＤＧＡＴ２に対して高い配列相同性を共有する。ＭＧＡＴ３は、ＭＡＧまたはＤＡＧを基質として使用したときに、ＭＧＡＴ１およびＭＧＡＴ２酵素よりも大幅に高い活性を呈するが（ＭＧＡＴ３＞ＭＧＡＴ１＞ＭＧＡＴ２）、これは、ＭＧＡＴ３が、推定ＴＡＧシンターゼとして機能することを示唆している。
【０１２４】
ＭＧＡＴ１およびＭＧＡＴ２は、どちらも、ＤＧＡＴ２と同じアシルトランスフェラーゼのクラスに属する。いくつかのＤＧＡＴ２において、ＤＧＡＴ２の触媒活性に重要であることが示されたモチーフのいくつかも、ＭＧＡＴアシルトランスフェラーゼに保存される。特に関心があるのは、コンセンサス配列ＦＬＸＬＸＸＸＮ（配列番号２２４）を伴う推定中性脂肪結合ドメインであり、配列中、各Ｘは独立に、プロリン以外の任意のアミノ酸であり、Ｎは、Ｎ末端膜貫通領域内に位置する任意の非極性アミノ酸であり、その後に推定グリセロール／リン脂質アシルトランスフェラーゼドメインが続く。ＦＬＸＬＸＸＸＮモチーフは、マウスＤＧＡＴ２（アミノ酸８１〜８８）およびＭＧＡＴ１／２で見られるが、酵母または植物ＤＧＡＴ２では見られない。これは、マウスＤＧＡＴ２の活性に重要である。他のＤＧＡＴ２および／またはＭＧＡＴ１／２配列のモチーフは、以下を含む。
【０１２５】
１．ＹＦＰトリペプチド（配列番号２２０）。大部分のＤＧＡＴ２ポリペプチドに、およびＭＧＡＴ１およびＭＧＡＴ２にも高度に保存され、例えば、マウスＤＧＡＴ２においてアミノ酸１３９〜１４１として存在する。酵素が機能しないようにした非保存的置換体で、酵母ＤＧＡＴ２内でこのモチーフを変異させる。
【０１２６】
２．ＨＰＨＧテトラペプチド（配列番号２２１）。ＭＧＡＴに、ならびに動物および菌類由来のＤＧＡＴ２配列に高度に保存され、例えばマウスＤＧＡＴ２においてアミノ酸１６１〜１６４として存在し、少なくとも酵母およびマウスＤＧＡＴ２の触媒活性に重要である。植物ＤＧＡＴ２アシルトランスフェラーゼは、代わりに、ＥＰＨＳ（配列番号２２２）保存配列を有するので、第１および第４のアミノ酸に対する保存的変化を許容することができる。
【０１２７】
３．  推定グリセロールリン脂質ドメインの一部である、より長い保存されたモチーフ。このモチーフの例は、ＲＸＧＦＸ（Ｋ／Ｒ）ＸＡＸＸＸＧＸＸＸ（Ｌ／Ｖ）ＶＰＸＸＸＦＧ（Ｅ／Ｑ）（配列番号２２３）であり、マウスＤＧＡＴ２においてアミノ酸３０４〜３２７として存在する。このモチーフは、その長さから予想されるように、他の配列よりもアミノ酸配列に保存されないが、相同体は、モチーフ検索によって認識することができる。間隔は、より保存されたアミノ酸の間で様々であり得る。すなわち、前述の配列と比較して、モチーフ内には、Ｘアミノ酸がより多い場合、またはＸアミノ酸がより少ない場合がある。
【０１２８】
本明細書で使用される「グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ」または「ＧＰＡＴ」という用語は、グリセロール−３−リン酸（Ｇ−３−Ｐ）をアシル化してＬｙｓｏＰＡおよび／またはＭＡＧを形成するタンパク質を指し、後者の産物は、ＧＡＰＴがＬｙｓｏＰＡに対してホスファターゼ活性も有する場合に形成する。転移させるアシル基は、典型的に、アシルＣｏＡに由来する。したがって、「グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性」という用語は、Ｇ−３−Ｐをアシル化してＬｙｓｏＰＡおよび／またはＭＡＧを形成することを指す。「ＧＰＡＴ」という用語は、Ｇ−３−Ｐをアシル化してｓｎ−１−ＬＰＡおよび／またはｓｎ−２−ＬＰＡ、好ましくは、ｓｎ−２−ＬＰＡを形成する、酵素を包含する。好ましい実施形態において、ＧＰＡＴは、ホスファターゼ活性を有する。最も好ましい実施形態において、ＧＰＡＴは、ｓｎ−２−ＭＡＧを生成するｓｎ−２−ＧＰＡＴを有する、ホスファターゼ活性である。
【０１２９】
本明細書で使用される、「ｓｎ−１−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ」（ｓｎ−１−ＧＰＡＴ）という用語は、ｓｎ−グリセロール−３−リン酸（Ｇ−３−Ｐ）をアシル化して選好的に１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸（ｓｎ−１−ＬＰＡ）を形成する、タンパク質を指す。したがって、「ｓｎ−１−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性」という用語は、ｓｎ−グリセロール−３−リン酸をアシル化して１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸（ｓｎ−１−ＬＰＡ）を形成することを指す。
【０１３０】
本明細書で使用される、「ｓｎ−２グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ」（ｓｎ−２−ＧＰＡＴ）という用語は、ｓｎ−グリセロール−３−リン酸（Ｇ−３−Ｐ）をアシル化して選好的に２−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸（ｓｎ−２−ＬＰＡ）を形成する、タンパク質を指す。したがって、「ｓｎ−２グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性」という用語は、ｓｎ−グリセロール−３−リン酸をアシル化して２−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸（ｓｎ−２−ＬＰＡ）を形成することを指す。
【０１３１】
ＧＰＡＴファミリーは大きく、全ての既知のメンバーは、２つの保存されたドメイン、すなわち、ｐｌｓＣアシルトランスフェラーゼドメイン（ＰＦ０１５５３、配列番号２２５）およびＨＡＤ様ヒドロラーゼ（ＰＦ１２７１０、配列番号２２６）スーパーファミリードメインを含む。これに加えて、アラビドプシス・サリアナにおいて、ＧＰＡＴ４〜８は全て、ホスホセリンホスファターゼドメイン（ＰＦ００７０２、配列番号２２７）に相同的なＮ末端領域を含む。ＧＰＡＴ４およびＧＰＡＴ６は、どちらも、ホスファターゼ活性に不可欠であることが知られている保存された残基、特に、Ｎ末端に位置するモチーフＩ（ＤＸＤＸ［Ｔ／Ｖ］［Ｌ／Ｖ］、配列番号２２９）およびモチーフIII（Ｋ−［Ｇ／Ｓ］［Ｄ／Ｓ］ＸＸＸ［Ｄ／Ｎ］、配列番号３３０）において特異的に保存されたアミノ酸（太字で示す）を含む（Ｙａｎｇ他，２０１０）。好ましくは、ＧＰＡＴは、グリセロール−３−リン酸（Ｇ−３−Ｐ）から、例えばアラビドプシス由来の（ＧＰＡＴ４（ＮＰ＿１７１６６７．１）およびＧＰＡＴ６（ＮＰ＿１８１３４６．１））から、ｓｎ−２−ＭＡＧ（本明細書で、「２−ＭＡＧ」とも称される）（図１）を生成する選好およびホスファターゼ活性を有する。より好ましくは、ＧＰＡＴは、脂肪酸基質としてアシルＣｏＡを使用する。
【０１３２】
ＧＰＡＴ４（ＮＰ＿１７１６６７）およびＧＰＡＴ６（ＮＰ＿１８１３４６）の相同体としては、ＡＡＦ０２７８４、ＡＡＬ３２５４４、ＡＡＰ０３４１３、ＡＢＫ２５３８１、ＡＣＮ３４５４６、ＢＡＦ００７６２、ＢＡＨ００９３３、ＥＡＹ８４１８９、ＥＡＹ９８２４５、ＥＡＺ２１４８４、ＥＥＣ７１８２６、ＥＥＣ７６１３７、ＥＥＥ５９８８２、ＥＦＪ０８９６３、ＥＦＪ０８９６４、ＥＦＪ１１２００、ＥＦＪ１５６６４、ＥＦＪ２４０８６、ＥＦＪ２９８１６、ＥＦＪ２９８１７、ＮＰ＿００１０４４８３９、ＮＰ＿００１０４５６６８、ＮＰ＿００１１４７４４２、ＮＰ＿００１１４９３０７、ＮＰ＿００１１６８３５１、ＮＰ＿１８１３４６、ＮＰ＿１９１９５０、ＸＰ＿００１７６５００１、ＸＰ＿００１７６９６７１、ＸＰ＿００１７６９７２４、ＸＰ＿００１７７１１８６、ＸＰ＿００１７８０５３３、ＸＰ＿００２２６８５１３、ＸＰ＿００２２７５３４８、ＸＰ＿００２２７６０３２、ＸＰ＿００２２７９０９１、ＸＰ＿００２３０９１２４、ＸＰ＿００２３０９２７６、ＸＰ＿００２３２２７５２、ＸＰ＿００２３２３５６３、ＸＰ＿００２４３９８８７、ＸＰ＿００２４５８７８６、ＸＰ＿００２４６３９１６、ＸＰ＿００２４６４６３０、ＸＰ＿００２５１１８７３、ＸＰ＿００２５１７４３８、ＸＰ＿００２５２０１７１、ＸＰ＿００２８７２９５５、ＸＰ＿００２８８１５６４、ＡＣＴ３２０３２、ＡＣＴ３２０３２、ＮＰ＿００１０５１１８９、ＮＰ＿１７１６６７、ＸＰ＿００２３２０１３８、ＸＰ＿００２４５１３７７、ＸＰ＿００２４５１３７７、ＸＰ＿００２５３１３５０、ＸＰ＿００２８７２９５５、およびＸＰ＿００２８８９３６１が挙げられる。
【０１３３】
保存されたモチーフまたは残基は、二機能性ＧＰＡＴ／ホスファターゼ酵素を同定するための、配列に基づく診断として使用することができる。あるいは、より緊縮な機能に基づくアッセイを利用することが可能である。そのようなアッセイは、例えば、標識したグリセロール−３−リン酸を細胞またはミクロソームに供給することと、薄層クロマトグラフィまたは類似した手法によって、標識した産物のレベルを定量化することとを含む。ＧＰＡＴ活性は、標識したＬＰＡの生成をもたらす一方で、ＧＰＡＴ／ホスファターゼ活性は、標識したＭＡＧの生成をもたらす。
【０１３４】
本明細書で使用される「野生型」という用語またはその変形は、遺伝的に修飾されていない細胞または非ヒト生物もしくはその一部を指す。
【０１３５】
「対応する」という用語は、本発明の細胞または非ヒト生物もしくはその一部と同一または同様の遺伝的背景を有するが、本明細書で説明されるように修飾されていない、細胞または非ヒト生物もしくはその一部（例えば、ＭＧＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドまたは外因性ＭＧＡＴが欠如している、細胞または非ヒト生物もしくはその一部）を指す。対応する細胞または非ヒト生物もしくはその一部は、核酸またはタンパク質発現のレベル、または、例えば非極性脂質産物および／または含量の、または本明細書で説明されるように修飾された細胞または非ヒト生物もしくはその一部による形質修飾の程度または性質を比較するための対照として使用することができる。
【０１３６】
本明細書で使用される「〜と比較する」は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドまたは外因性ポリペプチドを発現する、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部の非極性脂質のレベルまたは総非極性脂質含量を、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが欠如しているトランスジェニック非ヒト生物またはその一部と比較することを指す。
【０１３７】
本明細書で使用される「非極性脂質を生成する増強された能力」は、対応する細胞または非ヒト生物もしくはその一部と比較して、本発明の細胞または非ヒト生物もしくはその一部によって生成される非極性脂質の総量が増加することを指す、相対語である。一実施形態では、非極性脂質のＴＡＧまたは多価不飽和脂肪酸含量が増加する。
【０１３８】
本明細書で使用される「内因性酵素の生成および／または活性を下方制御する単離または組み換えポリヌクレオチド」という用語またはその変形は、内因性酵素、例えば、ＤＧＡＴ、ｓｎ−１グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、アシルＣｏＡ：リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）、ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）、またはこれらの２つ以上の組み合わせの、生成および／または活性を下方制御するＲＮＡ分子をコードする（例えば、ｓｉＲＮＡをコードする）ポリヌクレオチド、またはその生成および／または活性をそれ自体が下方制御する（例えば、細胞に直接送達することができるｓｉＲＮＡである）ポリヌクレオチドを指す。
【０１３９】
本明細書で使用される、「重量基準で」という用語は、物質を含む組成物（例えば、種子、葉）の重量のパーセンテージとしての、物質（例えば、ＴＡＧ、ＤＡＧ、脂肪酸）の重量を指す。例えば、トランスジェニック種子が１２０μｇの種子重量あたり２５μｇの総脂肪酸を有する場合、総脂肪酸のパーセンテージは、重量基準で２０．８％である。
【０１４０】
本明細書で使用される「相対基準で」という用語は、対応する組成物と比較したときの、パーセンテージとしての、物質を含む組成物中の物質の量を指す。
【０１４１】
本明細書で使用される「相対非脂質含量」という用語は、対応する細胞、生物、もしくはその一部、または細胞、生物、もしくはその一部から抽出した脂質と比較したときの、パーセンテージとしての、細胞、生物、もしくはその一部、またはそこから抽出した脂質の非極性脂質含量の表現を指す。例えば、トランスジェニック種子が２５μｇの総脂肪酸を有するのに対して、対応する種子が２０μｇの総脂肪酸を有する場合、相対基準での非極性脂質含量の増加は、２５％に相当する。
【０１４２】
ジアシルグリセロールおよびトリアシルグリセロールの生成
一実施形態において、本発明のトランスジェニック非ヒト生物またはその一部は、対応する非ヒト生物またはその一部よりも高いレベルの、ＤＡＧまたはＴＡＧ等の、好ましくは双方の非極性脂質を生成する。一実施例において、本発明のトランスジェニック植物は、対応する種子および／または葉と比較したときに、ＤＡＧまたはＴＡＧ等の、好ましくは双方の増加した非極性脂質含量を有する種子および／または葉を生成する。非ヒト生物またはその一部の非極性脂質含量は、対応する非ヒト生物またはその一部と比較したときに、重量基準で０．５％大きい。
【０１４３】
別の実施形態において、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部、好ましくは、植物または種子は、１つ以上の特定の脂肪酸について富化された、ＤＡＧおよび／またはＴＡＧを生成する。飽和および不飽和脂肪酸、ならびに短鎖および長鎖脂肪酸を含む、広範囲の脂肪酸をＤＡＧおよび／またはＴＡＧに組み込むことができる。ＤＡＧおよび／またはＴＡＧに組み込むことができる脂肪酸のいくつかの限定的でない例としては、カプリン脂肪酸（１０：０）、ラウリン脂肪酸（１２：０）、ミリスチン脂肪酸（１４：０）、パルミチン脂肪酸（１６：０）、パルミトレイン脂肪酸（１６：１）、ステアリン脂肪酸（１８：０）、オレイン脂肪酸（１８：１）、バクセン脂肪酸（１８：１）、リノール脂肪酸（１８：２）、エレオステアリン脂肪酸（１８：３）、γリノレン脂肪酸（１８：３）、αリノレン脂肪酸（１８：３ω３）、ステアリドン脂肪酸（１８：４ω３）、アラキン脂肪酸（２０：０）、エイコサジエン脂肪酸（２０：２）、ジホモ−γリノール脂肪酸（２０：３）、エイコサトリエン脂肪酸（２０：３）、アラキドン脂肪酸（２０：４）、エイコサテトラエン脂肪酸（２０：４）、エイコサペンタエン脂肪酸（２０：５ω３）、ベヘン脂肪酸（２２：０）、ドコサペンタエン脂肪酸（２２：５ω）、ドコサヘキサエン脂肪酸（２２：６ω３）、リグノセリン脂肪酸（２４：０）、ネルボン脂肪酸（２４：１）、セロチン脂肪酸（２６：０）、およびモンタン脂肪酸（２８：０）が挙げられる。本発明の１つの実施形態において、トランスジェニック生物またはその一部は、多価不飽和脂肪酸を含むＤＡＧおよび／またはＴＡＧについて富化される。
【０１４４】
本発明の一実施形態において、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部、好ましくは、植物または種子は、ＤＧＡＴ活性を有してもよく、または有しなくてもよい、本明細書に定義されるようにＭＧＡＴをコードするキメラＤＮＡで形質転換される。ＭＧＡＴの発現は、好ましくは、該トランスジェニック非ヒト生物またはその一部において、より高いレベルのＤＡＧまたはＴＡＧ等の非極性脂質、および／または増加した非極性脂質の収量をもたらす。好ましい実施形態において、トランスジェニック非ヒト生物は、植物である。
【０１４５】
さらなる実施形態において、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部は、ＧＰＡＴまたはＤＧＡＴをコードするキメラＤＮＡで形質転換される。好ましくは、生物は、双方のキメラＤＮＡで形質転換され、好ましくは、例えば単一のＴ−ＤＮＡ分子等の、１つのＤＮＡ分子に共有的に結合する。
【０１４６】
Ｙａｎｇ他（２０１０）は、グリセロール−３−リン酸（Ｇ−３−Ｐ）からｓｎ−２−ＭＡＧを生成することができる（図１）、ｓｎ−２選好およびホスファターゼ活性を有するアラビドプシス由来の、２つのグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ４およびＧＰＡＴ６）を説明している。これらの酵素は、クチン合成経路の一部であることが提唱されている。アラビドプシスＧＰＡＴ４およびＧＰＡＴ６は、脂肪酸基質としてアシルＣｏＡを使用することが示されている（Ｚｈｅｎｇ他，２００３）。
【０１４７】
二機能性ＧＰＡＴ／ホスファターゼをＭＧＡＴと組み合わせることで、一方の基質としてＧ−３−Ｐを使用し、もう一方の基質としてアシルＣｏＡに由来する２つのアシル基を使用する、新しいＤＡＧ合成経路を生ずる。同様に、そのような二機能性ＧＰＡＴ／ホスファターゼを、ＤＧＡＴ活性を有するＭＧＡＴと組み合わせることで、一方の基質としてグリセロール−３−リン酸を使用し、もう一方の基質としてアシルＣｏＡに由来する３つのアシル基を使用する、新しいＴＡＧ合成経路を生ずる。
【０１４８】
故に、本発明の一実施形態において、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部は、二機能性ＧＰＡＴ／ホスファターゼで、およびＤＧＡＴ活性を有しないＭＧＡＴで共形質転換される。これは、二機能性ＧＰＡＴ／ホスファターゼによるＭＡＧの生成をもたらし、次いで、ＭＧＡＴによってＤＡＧに変換され、次いで、ＤＧＡＴまたは他の活性によってＴＡＧに変換される。新しいＤＡＧの生成は、例えば、Ｂｅｎｇｈｅｚａｌ他（２００７、図２）によって説明されるような、致死ＳＬＣ１＋ＳＬＣ４ノックアウトを含む酵母株においてそのような共形質転換を行うことによって、確認および選択することが可能である。Ｂｅｎｇｈｅｚａｌ他（２００７）の図２は、２つの酵母ＬＰＡＴ（ＳＬＣ１およびＳＬＣ４）をノックアウトすることが致死的であることを示す。トランス中のｓｌｃ遺伝子（それらの場合、ＳＬＣ１）の１つを提供する補足プラスミドのため、ＳＬＣ１＋ＳＬＣ４二重酵母変異を維持することだけしかできない。ＦＯＡを培地に添加することによる陰性選択は、この補足プラスミドの損失（Ｕｒａ選択マーカーの対抗選択）をもたらし、細胞を生存できないようにする。
【０１４９】
本発明の別の実施形態において、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部、好ましくは、植物または種子は、二機能性ＧＰＡＴ／ホスファターゼおよびＤＧＡＴ活性を有するＭＧＡＴをコードするキメラＤＮＡで共形質転換される。これは、二機能性ＧＰＡＴ／ホスファターゼによるＭＡＧの生成をもたらし、ＭＧＡＴによってＤＡＧに変換され、次いで、ＴＡＧに変換される。
【０１５０】
さらなる実施形態では、いかなる検出可能なホスファターゼ活性も伴わない１つ以上の内因性ＧＰＡＴがサイレンシングされる。すなわち、例えば、ケネディ経路においてグリセロール−３−リン酸をアシル化してＬＰＡを形成するＧＰＡＴ（例えば、アラビドプシスＧＰＡＴ１）をコードする、１つ以上の遺伝子がサイレンシングされる。
【０１５１】
基質選好は、例えば、野生型ＭＧＡＴ遺伝子による相補を防止する濃度の特定の遊離脂肪酸（例えば、ＤＨＡ）をＭＧＡＴ変異形を発現するトランスジェニックＨ１２４６酵母株に供給することによって、新しいＤＡＧおよびＴＡＧ合成経路に操作することが可能である。供給された遊離脂肪酸を使用することができる変異形だけが成長するであろう。数サイクルのＭＧＡＴの操作により、特定の脂肪酸に対する増加した選好を伴うＭＧＡＴが生成されるであろう。
【０１５２】
上で説明した種々のケネディ経路の相補および補充は、初期の基質であるグリセロール−３−リン酸の遍在的な性質のため、任意の細胞型で行うことが可能である。一実施形態において、導入遺伝子の使用は、増加した油収量をもたらす。
【０１５３】
ポリヌクレオチド
「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、同じ意味で使用される。それらは、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはその類似体である、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを指す。本発明のポリヌクレオチドは、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成もしくは合成起源、２本鎖もしくは１本鎖のものであってもよく、また、その起源または操作によって、（１）自然界で伴うポリヌクレオチドの全部または一部を伴わない、（２）自然界で連結されるもの以外のポリヌクレオチドに連結する、または（３）自然界で生じない。ポリヌクレオチドの限定的でない例としては、遺伝子または遺伝子断片のコードもしくは非コード領域、連結分析から定義される座（単数または複数）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、任意の配列のキメラＤＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーが挙げられる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体等の修飾ヌクレオチドを含んでもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの集合前または集合後に与えられてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、標識化成分との複合体化等によって、ポリメリゼーション後にさらに修飾することができる。
【０１５４】
「単離されたポリヌクレオチド」とは、一般に、その自然状態において会合または連結されるポリヌクレオチド配列から分離された、ポリヌクレオチドを意味する。好ましくは、単離されたポリヌクレオチドは、自然に会合または連結されるポリヌクレオチド配列を、少なくとも６０％含まない、より好ましくは少なくとも７５％含まない、より好ましくは少なくとも９０％含まない。
【０１５５】
本明細書で使用される「遺伝子」という用語は、その最も広い文脈において解釈すべきであり、構造遺伝子の転写された領域、および翻訳された場合は、タンパク質コード領域を含み、かつ、５’および３’のいずれの末端においても少なくとも約２ｋｂの距離にわたって両末端上のコード領域に隣接して位置し、遺伝子の発現に関与する配列を含む、デオキシリボヌクレオチドを含む。この点に関して、遺伝子は、所与の遺伝子と自然に関連するプロモーター、エンハンサー、終結および／またはポリアデニル化シグナル等の制御シグナル、または異種制御シグナルを含み、その場合、遺伝子は、「キメラ遺伝子」と称される。タンパク質コード領域の５’に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配列と称される。タンパク質コード領域の３’または下流に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳配列と称される。「遺伝子」という用語は、ｃＤＮＡ形態およびゲノム形態の双方の遺伝子を包含する。遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」、「介在領域」、または「介在配列」と称される非コード配列で中断され得る、コード領域を含む。イントロンは、核ＲＮＡ（ｎＲＮＡ）の中に転写される、遺伝子のセグメントである。イントロンは、エンハンサー等の調節要素を含んでもよい。イントロンは、核転写物または一次転写物から除去または「スプライス」され、したがって、イントロンは、ｍＲＮＡ転写物中には存在しない。ｍＲＮＡは、翻訳中に、新生ポリペプチドにおけるアミノ酸の配列または順序を規定するように機能する。「遺伝子」という用語は、本明細書で説明される本発明のタンパク質の全部または一部をコードする合成分子または融合分子、および前述のいずれか１つに対する相補的ヌクレオチド配列を含む。
【０１５６】
本明細書で使用される「キメラＤＮＡ」は、自然界では自然に見出されないあらゆるＤＮＡ分子を指し、本明細書では「ＤＮＡ構築体」とも称される。典型的には、キメラＤＮＡは、自然界では一緒に自然に見出されない調節配列および転写配列またはタンパク質コード配列を含む。故に、キメラＤＮＡは、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ供給源に由来するが、自然界で見出されるものとは異なる様式で配置される調節配列およびコード配列を含むことができる。オープンリーディングフレームは、その自然の上流および下流の調節要素に連結されてもよく、または連結されなくてもよい。オープンリーディングフレームは、例えば、植物ゲノムの中、非自然的な場所、または細菌プラスミドもしくはウイルスベクター等の自然に見出されないレプリコンもしくはベクターに組み込まれ得る。「キメラＤＮＡ」という用語は、宿主において複製可能であるＤＡＮ分子に限定されず、例えば特異的アダプター配列によってレプリコンの中に連結することができるＤＮＡを含む。
【０１５７】
「導入遺伝子」とは、形質転換手順によってゲノムの中に導入された遺伝子である。「遺伝的に修飾された」、「トランスジェニック」という用語、およびその変形は、形質転換または形質導入によって遺伝子を細胞の中に導入することと、細胞中の遺伝子を変異させることと、細胞中の遺伝子もしくは上で説明したように修飾される任意の細胞の子孫の調節を遺伝子的に変化または調節させることとを含む。
【０１５８】
本明細書で使用される「ゲノム領域」という用語は、導入遺伝子または導入遺伝子群（本明細書では、塊とも称される）が細胞またはその祖先の中に挿入された、ゲノム内の位置を指す。そのような領域は、本明細書で説明される方法等により、人の介入によって組み込まれたヌクレオチドのみを含む。
【０１５９】
本発明の「組み換えポリヌクレオチド」は、人工組み換え方法によって構成または修飾された、核酸分子を指す。組み換えポリヌクレオチドは、その自然状態と比較して、（例えば、ｍＲＮＡの場合）変化した量で細胞中に存在し得るか、または変化した速度で発現し得る。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、自然にはそのポリヌクレオチドを含まない細胞の中に導入される。典型的に、外因性ＤＮＡは、ｍＲＮＡの転写のためのテンプレートとして使用され、次いで、形質転換した細胞内に本発明のポリペプチドをコードするアミノ酸残基の連続配列に翻訳される。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、細胞に対して内因性であり、その発現は、組み換え手段によって変化させられる。例えば、外因性制御配列が、関心の内因性遺伝子の上流に導入されて、形質転換された細胞が、遺伝子によってコードしたポリペプチドを発現することを可能にする。
【０１６０】
本発明の組み換えポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドが存在する、細胞に基づく、または細胞を含まない発現系の他の成分から分離されていないポリヌクレオチド、および該細胞に基づく、または細胞を含まない発現系において生成され、その後に、少なくとも他のいくつかの成分から精製されるポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドは、自然界に存在する隣接する一続きのヌクレオチドとすることができ、または単一のポリヌクレオチドを形成するように接合した異なる源（自然発生的および／または合成的なもの）に由来する２つ以上の隣接する一続きのヌクレオチドを含むことができる。典型的に、そのようなキメラポリヌクレオチドは、関心の細胞中のオープンリーディングフレームの転写を駆動するのに好適なプロモーターに操作可能に連結される本発明のポリペプチドをコードする、少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む。
【０１６１】
定義されたポリペプチドまたは酵素に関して、本明細書で提供されるものよりも高い同一性％の値が、好ましい実施形態を包含することを理解されるであろう。したがって、該当する場合、最小の同一性％の値に照らして、ポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましく少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．１％、より好ましくは少なくとも９９．２％、より好ましくは少なくとも９９．３％、より好ましくは少なくとも９９．４％、より好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．６％、より好ましくは少なくとも９９．７％、より好ましくは少なくとも９９．８％、およびさらにより好ましくは少なくとも９９．９％、関連する指定された配列番号と同一である、ポリヌクレオチド配列を含むことが好ましい。
【０１６２】
本発明の、または本発明に有用なポリヌクレオチドは、緊縮条件下で、本明細書で定義されるポリヌクレオチドに選択的にハイブリッド形成させてもよい。本明細書で使用される緊縮条件とは（１）ハイブリッド形成中に、ホルムアミド等の変性剤を用いること、例えば、４２℃で、０．１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン、０．１％のフィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、７５０ｍＭのＮａＣｌを有するｐＨ６．５の５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤、７５ｍＭのクエン酸クエン酸ナトリウムを伴う５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミドを用いること、または（２）０．２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中に、４２℃で、５０％のホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａｃｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハルト溶液、超音波振動処理したサケ精子ＤＮＡ（５０ｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、および１０％の硫酸デキストランを用いること、および／または（３）洗浄のために低イオン強度で高温を用いること、例えば、５０℃で０．０１５ＭのＮａＣｌ／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のＳＤＳを用いること、である。
【０１６３】
本発明のポリヌクレオチドは、自然発生的な分子と比較したときに、ヌクレオチド残基の欠失、挿入、または置換である、１つ以上の変異を保有し得る。参照配列に対して変異を有するポリヌクレオチドは、自然に発生するもの（すなわち、天然源から単離したもの）、または（例えば、上で説明したように、部位特異的変異誘発またはＤＮＡシャフリングを行うことによって）合成したものとすることができる。
【０１６４】
組み換えベクター
本発明の一実施形態は、組み換えベクターを含み、該組み換えベクターは、本明細書で定義される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドを宿主細胞に送達することができる。組み換えベクターとしては、発現ベクターが挙げられる。組み換えベクターは、異種ポリヌクレオチド配列、すなわち、自然には見出されず、本明細書で定義されるポリヌクレオチドに隣接し、好ましくは、異なる種に由来する、ポリヌクレオチド配列を含む。ベクターは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか、原核生物または真核生物のいずれかとすることができ、典型的に、ウイルスに由来するウイルスベクター、またはプラスミドである。プラスミドベクターは、典型的に、原核生物細胞、例えば、ｐＵＣ由来のベクター、ｐＳＫ由来のベクター、ｐＧＥＭ由来のベクター、ｐＳＰ由来のベクター、ｐＢＳ由来のベクター、または１つ以上のＴ−ＤＮＡ領域を含むバイナリーベクターにおける容易な発現カセットの選択、増幅、および形質転換を提供する、付加的な核酸配列を含む。付加的な核酸配列は、ベクターの自律複製を提供する複製の起源、好ましくは、抗生物質または除草剤耐性をコードする選択マーカー遺伝子、核酸配列または核酸構築体にコードされる遺伝子を挿入するための複数の部位を提供する一意の多重クローニング部位、ならびに原核生物および真核生物（特に植物）細胞の形質転換を増強する配列を含む。
【０１６５】
本明細書で使用される「操作可能に連結する」とは、２つ以上の核酸（例えば、ＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を指す。典型的に、転写配列に対する転写調節要素（プロモーター）の機能的関係を指す。例えば、プロモーターは、適切な細胞においてコード配列の転写を刺激または調節する場合に、本明細書で定義されるポリヌクレオチドのコード配列に操作可能に連結されている。一般に、転写配列に操作可能に連結されるプロモーター転写調節要素は、転写配列に物理的に隣接する。すなわち、それらは、シス作用性である。しかしながら、エンハンサー等のいくつかの転写調節要素は、それらが転写を増強するコード配列に物理的に隣接する、または極めて近接して位置する必要がない。
【０１６６】
複数のプロモーターが存在するときに、各プロモーターは、独立して同一であるかまたは異なっていてもよい。
【０１６７】
組み換えベクターはまた、（ａ）本明細書で定義される発現されるポリペプチドが、ポリペプチドを生成する細胞から分泌されることを可能にするように、シグナルペプチド配列をコードする、または発現したポリペプチドの局在化（例えば、細胞中の小胞体（ＥＲ）におけるポリペプチドの保持）、もしくはプラスチドの中への転移を提供する、１つ以上の分泌シグナル、および／または（ｂ）融合タンパク質としての核酸分子の発現を誘導する、融合配列を含む。好適なシグナルセグメントの例としては、本明細書で定義されるポリペプチドの分泌または局在化を指令することが可能な、あらゆるシグナルセグメントが挙げられる。好ましいシグナルセグメントとしては、ニコチアナ・ネクタリンシグナルペプチド（米国特許第ＵＳ５，９３９，２８８号）、タバコエクステンシンシグナル、またはダイズオレオシン油体結合タンパク質シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。組み換えベクターはまた、本明細書で定義されるポリヌクレオチドの核酸配列を囲んで、および／またはその中に、介在配列および／または非翻訳配列を含んでもよい。
【０１６８】
形質転換体の特定を容易にするために、組み換えベクターは、望ましくは、本明細書で定義されるポリヌクレオチドの核酸配列として、またはこれに加えて、選択可能な、もしくはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を含む。「マーカー遺伝子」とは、そのマーカー遺伝子を発現する細胞に異なる表現型を与えて、したがって、該マーカーを有しない細胞からそのような形質転換された細胞を区別することを可能にする、遺伝子を意味する。選択可能マーカー遺伝子は、選択剤（例えば、除草剤、抗生物質、放射線、熱、または非形質転換細胞に損傷を与える他の処理）に対する耐性に基づいて「選択」することができる形質を与える。スクリーニング可能なマーカー遺伝子（またはレポーター遺伝子）は、観察または試験を通して、すなわち「スクリーニング」によって特定することができる形質（例えば、非形質転換細胞中に存在しない、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、または他の酵素活性）を与える。例えば米国特許第ＵＳ４，３９９，２１６号で説明されるように、連結されていない遺伝子の共形質転換が、例えば植物の形質転換における効率的なプロセスでもあるので、関心のマーカー遺伝子およびヌクレオチド配列を連結させる必要はない。マーカーの実際の選択は、植物細胞等の細胞の選択との組み合せにおいてそれが機能的（すなわち、選択的）である限り、重要ではない。
【０１６９】
細菌性選択可能マーカーの例は、アンピシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、またはテトラサイクリン耐性、好ましくはカナマイシン耐性等の、抗生物質耐性を与えるマーカーである。植物の形質転換体の選択のための例示的な選択可能なマーカーとしては、ハイグロマイシンＢ耐性をコードするｈｙｇ遺伝子；カナマイシン、パロモマイシン、Ｇ４１８に対する耐性を与える、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔII）遺伝子；例えば欧州特許第ＥＰ２５６２２３号で説明されるような、グルタチオン由来の除草剤に対する耐性を与える、ラット肝臓由来のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子；例えば国際特許公開第ＷＯ８７／０５３２７号で説明されるような、過剰発現に応じてホスフィノトリシン等のグルタミンシンテターゼ阻害剤に対する耐性を付与する、グルタミンシンテターゼ遺伝子；例えば欧州特許第ＥＰ２７５９５７号で説明されるような、選択剤ホスフィノトリシンに対する耐性を与える、ストレプトマイセス・ヴィリドクロモゲネス由来のアセチルトランスフェラーゼ遺伝子；例えばＨｉｎｃｈｅｅ他（１９８８）によって説明されているようなＮ−ホスホノメチルグリシンに対する耐性を与える、５−エノルシキメート−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコードする遺伝子；例えば国際特許公開ＷＯ９１／０２０７１で説明されるような、ビアラホスに対する耐性を与えるｂａｒ遺伝子、ブロモキシニルに対する耐性を与える、クレブシーラオザエナエ由来のｂｘｎ等（Ｓｔａｌｋｅｒ他，１９８８）のニトリラーゼ遺伝子；メトトレキサートに対する耐性を与える、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（Ｔｈｉｌｌｅｔ他，１９８８）；イミダゾリノン、スルホニル尿素、または他のＡＬＳ阻害化学薬品に対する耐性を与える、変異アセトラクテートシンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）（欧州特許第ＥＰ１５４，２０４号）；５−メチルトリプトファンに対する耐性を与える、変異アントラニル酸シンターゼ遺伝子；または除草剤に対する耐性を与える、ダラポンデハロゲナーゼ遺伝子、が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７０】
好ましいスクリーニング可能なマーカーとしては、種々の発色基質が知られているβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）酵素をコードする、ｕｉｄＡ遺伝子；発色基質が知られている酵素をコードする、β−ガラクトシダーゼ遺伝子；カルシウム感受性生物発光検出において用いられ得る、エクオリン遺伝子（Ｐｒａｓｈｅｒ他，１９８５）；緑色蛍光タンパク質遺伝子（Ｎｉｅｄｚ他，１９９５）もしくその誘導体；または、生物発光検出を可能にする、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子（Ｏｗ他，１９８６）が挙げられるが、これらに限定されない。「リポーター分子」とは、その化学的性質によって、タンパク質産物を参照することによりプロモーター活性の決定を容易にする分析的に特定可能なシグナルを提供する分子を意味する。
【０１７１】
好ましくは、組み換えベクターは、植物細胞等の細胞のゲノムの中に安定的に組み込まれる。故に、組み換えベクターは、ベクターをゲノムに組み込むこと、または細胞の染色体に組み込むことを可能にする、適切な要素を含んでもよい。
【０１７２】
発現ベクター
本明細書で使用される「発現ベクター」は、宿主細胞を形質転換すること、および１個以上の特定のポリヌクレオチドの発現を生じさせることができる、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターである。好ましくは、発現ベクターはまた、宿主細胞内で複製することもできる。発現ベクターは、原核性または真核性とすることができ、典型的に、ウイルスまたはプラスミドである。本発明の発現ベクターとしては、細菌、真菌、内寄生性生物、節足動物、動物、藻類、および植物細胞を含む、本発明の宿主細胞において機能する（すなわち、遺伝子発現を指令する）、あらゆるベクターが挙げられる。本発明の特に好ましい発現ベクターは、酵母、藻類、および／または植物細胞の遺伝子発現を指令することができる。
【０１７３】
本発明の発現ベクターは、転写制御配列、翻訳制御配列、複製の起源等の調節配列、および宿主細胞と適合性があり、かつ本発明のポリヌクレオチドの発現を制御する他の調節配列を含む。特に、本発明の発現ベクターは、転写制御配列を含む。転写制御配列は、転写開始、伸長、および終結を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は、プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよびリプレッサー配列等の、転写開始を制御するものである。好適な転写制御配列としては、本発明の組み換え細胞の少なくとも１つにおいて機能することができる、あらゆる転写制御配列が挙げられる。使用する調節配列の選択は、関心の植物および／または標的器官もしくは組織等の標的生物に依存する。そのような調節配列は、植物もしくは植物ウイルス等の任意の真核生物から得てもよく、または化学的に合成してもよい。種々のそのような転写制御配列は、当業者に知られている。特に好ましい転写制御配列は、植物またはその一部の使用に応じて、構成的に、または段階特異的および／もしくは組織特異的に植物における転写を指令する際に活性なプロモーターである。
【０１７４】
植物細胞の安定した形質移入またはトランスジェニック植物の確立に好適な数多くのベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８５，  ｓｕｐｐ．１９８７、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９、およびＧｅｌｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９０で説明される。典型的には、植物発現ベクターは、例えば、５’および３’調節配列の転写制御下の１つ以上のクローン化した植物遺伝子、ならびに優性選択可能マーカーを含む。そのような植物発現ベクターはまた、プロモーター調節領域（例えば、誘発もしくは構成的、環境的もしくは発生的調節、または細胞もしくは組織特異的発現を制御する調節領域）、転写開始出発部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセッシングシグナル、転写終結部位、および／またはポリアデニル化シグナルをも含むことができる。
【０１７５】
植物細胞において活性である、多くの構成的プロモーターが説明されている。植物における構成的発現に好適なプロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルス（ＦＭＶ）３５Ｓ、サトウキビ桿状ウイルスプロモーター、コメリナ黄色斑点ウイルスプロモーター、リブロース−１，５−ビス−リン酸カルボキシラーゼの小サブユニット由来の光誘発性プロモーター、イネサイトゾルトリオースリン酸イソメラーゼプロモーター、アラビドプシスのアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼプロモーター、イネアクチン１遺伝子プロモーター、マンノピンシンターゼおよびオクトピンシンターゼプロモーター、Ａｄｈプロモーター、スクロースシンターゼプロモーター、Ｒ遺伝子複合体プロモーター、ならびにクロロフィルα／β結合タンパク質遺伝子プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。これらのプロモーターは、植物において発現されるＤＮＡベクターを作成するために使用されている（例えば、国際特許公開第ＷＯ８４／０２９１３号を参照されたい）。これらのプロモーターの全ては、種々の型の植物発現可能な組み換えＤＮＡベクターを作成するために使用されている。
【０１７６】
植物の源組織（例えば、葉、種子、根または茎）における発現の目的で、本発明で利用されるプロモーターは、これらの特異的組織において比較的高い発現を有することが好ましい。この目的のために、組織もしくは細胞に特異的な発現、または組織もしくは細胞で増強された発現を伴う遺伝子に対する数多くのプロモーターから選択してもよい。文献で報告されているそのようなプロモーターの例としては、エンドウ由来のクロロプラストグルタミンシンテターゼＧＳ２プロモーター、コムギ由来のクロロプラストフルクトース−１，６−ビスホスファターゼプロモーター、ジャガイモ由来の核光合成ＳＴ−ＬＳ１プロモーター、セリン／トレオニンキナーゼプロモーター、およびアラビドプシス・サリアナ由来のグルコアミラーゼ（ＣＨＳ）プロモーターが挙げられる。また、イースタンカラマツ（ラリクス・ラリキナ）由来のリブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼプロモーター、マツ由来のＣａｂ遺伝子（Ｃａｂ６）に対するプロモーター、コムギ由来のＣａｂ−１遺伝子に対するプロモーター、ホウレンソウ由来のＣａｂ−１遺伝子に対するプロモーター、イネ由来のＣａｂ１Ｒ遺伝子に対するプロモーター、ゼア・マイス由来のピルビン酸オルトリン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）プロモーター、タバコＬｈｃｂ１＊２遺伝子に対するプロモーター、アラビドプシス・サリアナＳｕｃ２スクロース−Ｈ３０共輸送体プロモーター、およびホウレンソウ由来のチラコイド膜タンパク質遺伝子（ＰｓａＤ、ＰｓａＦ、ＰｓａＥ、ＰＣ、ＦＮＲ、ＡｔｐＣ、ＡｔｐＤ、Ｃａｂ、ＲｂｃＳ）に対するプロモーターも、光合成活性組織において活性であることが報告されている。また、シロガラシ（シナピス・アルバ）由来のＬｈｃＢ遺伝子およびＰｓｂＰ遺伝子に対するプロモーター等の、クロロフィルα／β結合タンパク質に対する他のプロモーターを、本発明で利用してもよい。
【０１７７】
植物細胞におけるＲＮＡ結合タンパク質遺伝子の発現には、（１）熱、（２）光（例えば、エンドウＲｂｃＳ−３Ａプロモーター、メイズＲｂｃＳプロモーター）、（３）ホルモン（アブシジン酸等）、（４）損傷（例えば、ＷｕｎＩ）、または（５）化学薬品（ジャスモン酸メチル、サリチル酸、ステロイドホルモン、アルコール、Ｓａｆｅｎｅｒｓ（国際特許公開第ＷＯ９７／０６２６９号）によって調節されるプロモーターを含む、環境、ホルモン、化学、および／または発育シグナルに応答して調節される、種々の植物遺伝子プロモーターも使用することができ、または（６）器官特異的プロモーターを使用することも有益であり得る。
【０１７８】
本明細書で使用される「植物貯蔵器官特異的プロモーター」という用語は、他の植物組織と比較したときに、植物の貯蔵器官における遺伝子転写を選好的に指令するプロモーターを指す。好ましくは、プロモーターは、貯蔵器官における関心の遺伝子の発現を指令するだけであり、ならびに／または葉等の植物の他の部分における関心の遺伝子の発現は、ノーザンブロット分析および／もしくはＲＴ−ＰＣＲによって検出できない。典型的に、プロモーターは、貯蔵器官の成長および発育中の、特に貯蔵器官における貯蔵化合物の合成および蓄積段階中の、遺伝子の発現を駆動する。そのようなプロモーターは、双子葉植物の種子における種皮、胚、もしくは子葉、または単子葉植物の種子の胚乳もしくはアリューロン層等の、植物貯蔵器官全体またはその一部だけにおいて遺伝子発現を駆動することができる。
【０１７９】
ジャガイモ植物の塊茎、トマトの実、またはダイズ、キャノーラ、綿、ゼア・マイス、コムギ、イネ、およびオオムギの種子等の植物のシンク組織における発現の目的で、本発明で利用されるプロモーターは、これらの特異的組織において比較的高い発現を有することが好ましい。
塊茎特異的または塊茎で増強された発現を伴う遺伝子に対する多くのプロモーターが知られており、クラスＩパタチンプロモーター、ジャガイモ塊茎ＡＤＰＧＰＰ遺伝子に対するプロモーター、大サブユニットおよび小サブユニットの双方、スクロースシンターゼプロモーター、２２ｋＤタンパク質複合体およびプロテイナーゼ阻害剤を含む大塊茎タンパク質に対するプロモーター、顆粒結合デンプンシンターゼ遺伝子（ＧＢＳＳ）に対するプロモーター、ならびに他のクラスIおよびIIパタチンプロモーターが挙げられる。また、他のプロモーターを使用して、種子または果実等の特異的組織においてタンパク質を発現させることもできる。β−コングリシニンに対するプロモーター、またはナピン、ゼイン、リニン、およびファゼオリンプロモーター等の他の種子特異的プロモーターを使用することができる。根特異的プロモーターを使用してもよい。そのようなプロモーターの一例は、酸キチナーゼ遺伝子に対するプロモーターである。根組織における発現は、特定されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの根特異的サブドメインを利用することによって達成することも可能である。
【０１８０】
特に好ましい実施形態において、プロモーターは、脂質生合成が行われる組織および器官における発現を指令する。そのようなプロモーターは、種子における脂質組成物を修飾するのに好適な時点で種子の発育時に作用する。
【０１８１】
さらなる特に好ましい実施形態において、プロモーターは、植物貯蔵器官特異的プロモーターである。一実施形態において、植物貯蔵器官特異的プロモーターは、種子特異的プロモーターである。より好ましい実施形態において、プロモーターは、種子の胚における発現と比較して、または葉等の植物における他の器官と比較して、双子葉植物の子葉における、または単子葉植物の胚乳における発現を選好的に指令する。種子特異的発現のための好ましいプロモーターとしては、１）デサチュラーゼおよびエロンガーゼ等の、種子における脂質生合成および蓄積に関与する酵素をコードする遺伝子に由来するプロモーター、２）種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子に由来するプロモーター、ならびに３）種子における炭水化物生合成および蓄積に関与する酵素をコードする遺伝子に由来するプロモーターが挙げられる。好適である種子特異的プロモーターは、アブラナナピン遺伝子プロモーター（米国特許第ＵＳ５，６０８，１５２号）、ビキア・ファバＵＳＰプロモーター（Ｂａｕｍｌｅｉｎ他，１９９１）、アラビドプシス・オレオシンプロモーター（国際特許公開第ＷＯ９８／４５４６１号）、ファセオルス・ウルガリスファゼオリンプロモーター（米国特許第ＵＳ５，５０４，２００号）、ブラッシカＢｃｅ４プロモーター（国際特許公開第ＷＯ９１／１３９８０号）、またはレグミンＢ４プロモーター（Ｂａｕｍｌｅｉｎ他，１９９２）、およびトウモロコシ、オオムギ、コムギ、ライムギ、イネ等の単子葉植物において種子特異的発現を誘導するプロモーターである。好適である顕著なプロモーターは、オオムギｌｐｔ２もしくはｌｐｔ１遺伝子プロモーター（国際特許公開第ＷＯ９５／１５３８９号および国際特許公開第ＷＯ９５／２３２３０号）または国際特許公開第ＷＯ９９／１６８９０号で説明されるプロモーター（オオムギホルデイン遺伝子、イネグルテリン遺伝子、イネオリジン遺伝子、イネプロラミン遺伝子、コムギグリアジン遺伝子、コムギグルテリン遺伝子、トウモロコシゼイン遺伝子、オートムギグルテリン遺伝子、モロコシカジリン遺伝子、ライムギセカリン遺伝子に由来するプロモーター）である。他のプロモーターとしては、Ｂｒｏｕｎ他（１９９８）、Ｐｏｔｅｎｚａ他（２００４）、米国特許公開第ＵＳ２００７０１９２９０２号および米国特許公開第ＵＳ２００３０１５９１７３号で説明されるものが挙げられる。一実施形態において、種子特異的プロモーターは、子葉または胚乳等の種子の規定の部分において選好的に発現する。子葉特異的プロモーターの例としては、ＦＰ１プロモーター（Ｅｌｌｅｒｓｔｒｏｍ他，１９９６）、エンドウレグミンプロモーター（Ｐｅｒｒｉｎ他，２０００）、およびビーンフィトヘマグルトニンプロモーター（Ｐｅｒｒｉｎ他，２０００）が挙げられるが、これらに限定されない。胚乳特異的プロモーターの例としては、メイズゼイン−１プロモーター（Ｃｈｉｋｗａｍｂａ他，２００３）、イネグルテリン−１プロモーター（Ｙａｎｇ他，２００３）、オオムギＤ−ホルデインプロモーター（Ｈｏｒｖａｔｈ他，２０００）、およびコムギＨＭＷグルテニンプロモーター（Ａｌｖａｒｅｚ他，２０００）が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる実施形態において、種子特異的プロモーターは、胚において、および／または種子の発芽後に、発現しないか、または低レベルでしか発現しない。
【０１８２】
別の実施形態において、植物貯蔵器官特異的プロモーターは、塊茎特異的プロモーターである。例としては、ジャガイモパタチンＢ３３、ＰＡＴ２１、およびＧＢＳＳプロモーター、ならびにサツマイモスポラミンプロモーター（概説について、Ｐｏｔｅｎｚａ他，２００４を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、プロモーターは、塊茎の外層（表皮、樹皮）または胚と比較して、選好的に塊茎の髄中における発現を指令する。
【０１８３】
別の実施形態において、植物貯蔵器官特性プロモーターは、果実特異的プロモーターである。例としては、トマトポリガラクツロナーゼ、Ｅ８およびＰｄｓプロモーター、ならびにリンゴＡＣＣオキシダーゼプロモーター（概要について、Ｐｏｔｅｎｚａ他，２００４を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、プロモーターは、果実の表皮または果実内の種子と比較して、果実の可食部、例えば果実の髄における発現を選好的に指令する。
【０１８４】
５’非翻訳リーダー配列は、本発明のポリヌクレオチドの異種遺伝子配列を発現するように選択されるプロモーターに由来することができ、または生成すべき酵素のコード領域に対して異種であってもよく、および所望であれば、ｍＲＮＡの翻訳を増加させるように特異的に修飾することができる。導入遺伝子の発現を最適化する概説については、Ｋｏｚｉｅｌ他（１９９６）を参照されたい。また、５’非翻訳領域は、植物ウイルスＲＮＡ（とりわけ、タバコモザイクウイルス、タバコエッチウイルス、メイズ萎縮モザイクウイルス、アルファルファモザイクウイルス）から、好適な真核細胞遺伝子、植物遺伝子（コムギおよびトウモロコシクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子リーダー）から、または合成遺伝子配列から得ることもできる。本発明は、非翻訳領域がプロモーター配列を伴う５’非翻訳配列に由来する構築体に限定されない。リーダー配列はまた、無関係なプロモーターまたはコード配列に由来することもできる。本発明の状況において有用なリーダー配列は、メイズＨｓｐ７０リーダー（米国特許第ＵＳ５，３６２，８６５号および米国特許第ＵＳ５，８５９，３４７号）、およびＴＭＶオメガエレメントを含む。
【０１８５】
転写の終結は、発現ベクターにおいて関心のポリヌクレオチドに操作可能に連結される３’非翻訳ＤＮＡ配列によって達成される。組み換えＤＮＡ分子の３’非翻訳領域は、植物においてアデニレートヌクレオチドをＲＮＡの３’末端に付加させるように機能する、ポリアデニル化シグナルを含む。３’非翻訳領域は、植物細胞において発現される種々の遺伝子から得ることができる。一般に、この能力において、ノパリンシンターゼ３’非翻訳領域、エンドウ小サブユニットルビスコ遺伝子由来の３’非翻訳領域、ダイズ７Ｓ種子貯蔵タンパク質遺伝子由来の３’非翻訳領域を使用することができる。また、アグロバクテリウム腫瘍誘導性（Ｔｉ）プラスミド遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む、３’転写非翻訳領域も好適である。
【０１８６】
組み換えＤＮＡ技術は、例えば、宿主細胞内のポリヌクレオチドのコピー数、それらのポリヌクレオチドを転写する効率、結果として生じた転写物を翻訳する効率、および翻訳後修飾の効率を操作することによって、形質転換ポリヌクレオチドの発現を改善するために使用することができる。本明細書で定義されるポリヌクレオチドの発現を増加させるのに有用な組み換え手法としては、ポリヌクレオチドの高コピー数プラスミドへの操作可能な連結、ポリヌクレオチド分子の１つ以上の宿主細胞染色体への組み込み、ベクター安定配列のプラスミドへの追加、転写制御シグナル（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）の置換または修飾、転写制御シグナル（例えば、リボソーム結合部位、シャイン−ダルガルノ配列）の置換または修飾、宿主細胞のコドン使用に対応するポリヌクレオチドの修飾、および転写物を不安定にする配列の欠失が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８７】
転移核酸
転移核酸は、外因性ポリヌクレオチドを細胞に送達するために使用することができ、１つ、好ましくは２つの境界配列と、関心のポリヌクレオチドとを含む。転移核酸は、選択可能なマーカーをコードしてもよく、またはコードしなくてもよい。好ましくは、転移核酸は、細菌におけるバイナリーベクターの一部を形成し、バイナリーベクターは、細菌におけるベクターの複製を可能にするか、またはベクターを含む細菌細胞の選択もしくは維持を可能にする要素をさらに含む。真核細胞へ転移すると、バイナリーベクターの転移核酸成分は、真核細胞をゲノムに組み込むことができる。
【０１８８】
本明細書において使用される「染色体外転移核酸」という用語は、アグロバクテリウム種等の細菌から植物の葉細胞等の真核細胞に転移させることが可能な、核酸分子を指す。染色体外転移核酸は、転移させることが可能であり、その後に、その境界内に含まれるヌクレオチド配列をレシピエント細胞のゲノムに組み込むことを伴う要素としてよく知られている、遺伝的要素である。この点で、転移核酸は、典型的に、２つの「境界」配列が側面に位置するが、いくつかの事例において、一方の末端の単一の境界を使用することができ、転移させた核酸の第２の末端が、転移プロセスでランダムに生成される。関心のポリヌクレオチドは、典型的に、転移核酸の左境界様配列と右境界様配列との間に位置する。転移核酸内に含まれるポリヌクレオチドは、その発現、すなわち、ポリヌクレオチドの転写および／または翻訳を容易にする様々な異なるプロモーターおよびターミネーター調節要素に操作可能に連結されてもよい。アグロバクテリウム・ツメファシエンスまたはアグロバクテリウム・リゾゲネス等のアグロバクテリウム種に由来する転移ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）およびその人工の変異形／変異体は、おそらく、転移核酸の最高に特徴付けられている例である。別の例は、植物に由来するＴ−ＤＮＡ境界様配列を含む、Ｐ−ＤＮＡ（「植物ＤＮＡ」）である。
【０１８９】
本明細書で使用される「Ｔ−ＤＮＡ」は、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡを指すか、またはアグロバクテリウム・リゾゲネスＲｉプラスミドもしくはＴ−ＤＮＡ（転移ＤＮＡ）として機能するその人工の変異形に由来するＴ−ＤＮＡを指す。Ｔ−ＤＮＡは、右境界配列および左境界配列の両方を含むＴ−ＤＮＡ全体を含み得るが、転移のためには、シスにおいて必要とされる最小の配列、すなわち、右境界配列およびＴ−ＤＮＡ境界配列を含むことだけしか必要としない。本発明のＴ−ＤＮＡは、（存在する場合）右境界配列および左境界配列の間のどこかで、部位特異的リコンビナーゼに対する標的部位が側面に並ぶ関心のポリヌクレオチドをそれらに挿入している。ｖｉｒ遺伝子等の、植物細胞の中にＴ−ＤＮＡを転移させるためにトランスにおいて必要とされる因子をコードする配列は、Ｔ−ＤＮＡの中に挿入さてもよく、またはＴ−ＤＮＡと同じレプリコン上に存在してもよく、または、好ましくは、アグロバクテリウム宿主の適合性レプリコン上のトランスに存在する。そのような「バイナリーベクター系」は、当技術分野でよく知られている。
【０１９０】
本明細書において使用される「Ｐ−ＤＮＡ」は、植物ゲノムから単離された転移核酸またはその人工の変異形／変異体を指し、各末端または一方の末端だけにＴ−ＤＮＡ境界様配列を含む。境界様配列は、好ましくは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスまたはアグロバクテリウム・リゾゲネス等のアグロバクテリウム種由来のＴ−ＤＮＡ境界配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％であるが、１００％未満の配列同一性を共有する。したがって、Ｐ−ＤＮＡは、Ｐ−ＤＮＡ内に含まれるヌクレオチド配列を、例えばアグロバクテリウムから別の細胞に転移させるために、Ｔ−ＤＮＡの代わりに使用することができる。Ｐ−ＤＮＡは、転移させる外因性ポリヌクレオチドの挿入前に、クローニングを容易にするために修飾してもよく、好ましくは、いかなるタンパク質もコードするべきでない。Ｐ−ＤＮＡは、少なくとも右境界配列を含み、好ましくは左境界配列も含むことを特徴とする。
【０１９１】
本明細書で使用される転移核酸の「境界」配列は、植物もしくは細菌等の選択した生物から単離することができ、またはその人工の変異形／変異体とすることができる。境界配列は、それが連結するポリヌクレオチドの転移を促進し、かつ容易にし、また、レシピエント細胞ゲノムにおけるその組込みを容易にし得る。一実施形態において、境界配列は、長さが５〜１００塩基対（ｂｐ）、長さが１０〜８０ｂｐ、長さが１５〜７５ｂｐ、長さが１５〜６０ｂｐ、長さが１５〜５０ｂｐ、長さが１５〜４０ｂｐ、長さが１５〜３０ｂｐ、長さが１６〜３０ｂｐ、長さが２０〜３０ｂｐ、長さが２１〜３０ｂｐ、長さが２２〜３０ｂｐ、長さが２３〜３０ｂｐ、長さが２４〜３０ｂｐ、長さが２５〜３０ｂｐ、または長さが２６〜３０ｂｐの間である。アグロバクテリウム種に由来するＴ−ＤＮＡに由来する境界配列は、当技術分野でよく知られており、Ｌａｃｒｏｉｘ他（２００８）、ＴｚｆｉｒａおよびＣｉｔｏｖｓｋｙ（２００６）、ならびにＧｌｅｖｉｎ（２００３）で説明されるものが挙げられる。
【０１９２】
従来、遺伝子を植物細胞に転移させるためにアグロバクテリウム種だけが使用されてきたが、現在、アグロバクテリウム種と類似の方法で作用する、特定／開発された数多くの系が存在する。近年、いくつかの非アグロバクテリウム種が、遺伝子転移に適切になるように遺伝的に修飾されている（Ｃｈｕｎｇ他，２００６、Ｂｒｏｏｔｈａｅｒｔｓ他，２００５）。これらには、リゾビウム種ＮＧＲ２３４、シノリゾビウム・メリロティおよびメゾリゾビウム・ロティが挙げられる。細菌は、形質転換プロセスに必要とされる機構を伴う細菌、すなわち、アグロバクテリウムＴｉプラスミドおよび別々の小さいバイナリープラスミド上に存在するＴ−ＤＮＡセグメントによってコードされる一組の病原性遺伝子を提供することによって、遺伝子転移に対して適切なものとされる。このようにして操作される細菌は、異なる植物組織（葉片、カルス、および楕円形組織）、単子葉植物または双子葉植物、ならびに種々の異なる植物種（例えば、タバコ、イネ）を形質転換することが可能である。
【０１９３】
細菌から真核生物宿主への真核生物発現プラスミドの直接転移は、最初に、哺乳類細胞およびプラスミド担持大腸菌のプロトプラストの融合によって、数十年前に達成された（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ，１９８０）。それ以後、４つのグループ（Ｓｉｚｅｍｏｒｅ他，１９９５、Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ他，１９９５、Ｐｏｗｅｌｌ他，１９９６、Ｄａｒｊｉ他，１９９７）によって独立して発見され、遺伝子を哺乳類細胞中に送達することが可能な細菌の数は、着実に増加している（Ｗｅｉｓｓ，２００３）。
【０１９４】
シゲラ・フレクスネリの病原性プラスミド（ｐＷＲ１００）によって侵襲性とされた弱毒化Ｓ．フレクスネリ、サルモネラ・チフィムリウム、または大腸菌は、宿主細胞の侵襲、および代謝の減衰による細胞内死の後に、発現プラスミドを転移させることができることを示している。そのような組み換えシゲラまたはサルモネラの経鼻的または経口的のいずれかによる粘膜塗布は、発現プラスミドによってコードした抗原に対する免疫応答を誘発した。その間に、インビトロおよびインビボで発現プラスミドを哺乳類宿主細胞に転移させることができることを示した細菌のリストは、２倍を超え、Ｓ．チフィ、Ｓ．コレラスイス、リステリア・モノサイトゲネス、エルシニア・シュードツベルクローシス、およびＹ．エンテロコリチカについて文書化されている（Ｆｅｎｎｅｌｌｙ他，１９９９、Ｓｈｉａｕ他，２００１、Ｄｉｅｔｒｉｃｈ他，１９９８、Ｈｅｎｓｅ他，２００１、Ａｌ−Ｍａｒｉｒｉ他，２００２）。
【０１９５】
一般に、（Ｓ．フレクスネリまたはＬ．モノサイトゲネスのような）宿主細胞のサイトゾルに入り、この細胞区画内で溶解することができる全ての細菌は、ＤＮＡを転移させることができるはずであると考えられ得る。これは、ＤＮＡの転移を起こすために細菌を溶解させなければならないので、「不全性」または「自殺的」侵襲として知られている（Ｇｒｉｌｌｏｔ−Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ他，１９９９）。加えて、さらに多くの（Ｓ．チフィムリウムのような）食胞のままである細菌も溶解させることができ得る。したがって、侵襲的であるが、ファゴソーム回避ができないように操作した大腸菌の組み換え実験室株は、それらのプラスミドロードを、感染した哺乳類細胞の核に送達することができ得る（Ｇｒｉｌｌｏｔ−Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ他，１９９８）。さらに、近年、アグロバクテリウム・ツメファシエンスはまた、導入遺伝子を哺乳類細胞の中に導入することも示されている（Ｋｕｎｉｋ他，２００１）。
【０１９６】
本明細書で使用される「形質移入」、「形質転換」という用語およびそれらの変形は、全般的に、同じ意味で使用される。「形質移入された」または「形質転換された」細胞は、関心のポリヌクレオチドを導入するように操作されていてもよく、またはそれに由来する子孫細胞であってもよい。
【０１９７】
組み換え細胞
本発明はまた、本明細書で定義される１つ以上のポリヌクレオチドもしくはベクター、またはその組み合わせで形質転換される宿主細胞である、組み換え細胞、例えば、組み換え植物細胞も提供する。本明細書では、「組み換え細胞」という用語は、「トランスジェニック細胞」という用語と同じ意味で使用される。本発明の好適な細胞としては、例えば本明細書で説明されるポリペプチドまたは酵素をコードする本発明のポリヌクレオチドまたは組み換えベクターで形質転換することができる、あらゆる細胞が挙げられる。細胞は、好ましくは、それによって、脂質を生成するために使用することができる細胞である。組み換え細胞は、培養物中の細胞、インビトロの細胞、または例えば植物等の生物中の細胞、または例えば種子もしくは葉等の器官中の細胞であってもよい。好ましくは、細胞は、植物中にあり、より好ましくは、植物の種子中にある。
【０１９８】
ポリヌクレオチドが導入される宿主細胞は、非形質転換細胞か、または少なくとも１個の核酸で既に形質転換された細胞のいずれかとすることができる。そのような核酸は、脂質合成に関連していてもよく、または関連していなくてもよい。本発明の宿主細胞は、本明細書において定義されるポリペプチドを内因的に（すなわち、自然に）生成することができ得るか（その場合、それに由来する組み換え細胞は、ポリペプチドを生成する増強された能力を有する）、または本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチドで形質転換された後にだけ該タンパク質を生成することができ得る。一実施形態において、本発明の組み換え細胞は、非極性脂質を生成する増強された能力を有する。
【０１９９】
本発明の宿主細胞は、本明細書で説明される少なくとも１つのタンパク質を生成することができるあらゆる細胞とすることができ、細菌、真菌（酵母を含む）、寄生生物、節足動物、動物、藻類、および植物細胞が挙げられる。細胞は、原核生物であってもよく、または真核生物であってもよい。  好ましい宿主細胞は、酵母、藻類、および植物細胞である。好ましい実施形態において、植物細胞は、種子細胞であり、具体的には、種子の子葉または胚乳における細胞である。一実施形態において、細胞は、動物細胞である。動物細胞は、例えば、非ヒト動物細胞、非ヒト脊椎動物細胞、非ヒト哺乳類細胞、または魚類もしくは甲殻類等の水生動物、無脊椎動物、昆虫等の細胞等、あらゆる種類の動物のものであってもよい。節足動物細胞の非限定的な例としては、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ）細胞、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、トリコプルシア・ニ細胞、およびドロソフィラＳ２細胞等の、昆虫細胞が挙げられる。本発明の宿主細胞として有用な細菌細胞の例は、シネココッカス種（シネコシスティス種としても知られる）、例えば、シネココッカス・エロンガタスである。本発明の宿主細胞として有用な藻細胞の例としては、例えば、クラミドモナス種（例えば、クラミドモナス・ラインハーディ）、ドナリエラ種、ヘマトコッカス種、クロレラ種、スラウストキトリウム種、シゾキトリウム種、およびボルボックス種が挙げられる。
【０２００】
ここで記載する核酸の発現のための宿主細胞は、広範囲の温度およびｐＨ値にわたる単炭水化物もしくは複合炭水化物、有機酸、およびアルコール、ならびに／または炭化水素を含む、種々の原料上で成長する微生物宿主を含んでもよい。好ましい微生物宿主は、非極性脂質の合成が自然にできる、油脂性生物である。
【０２０１】
宿主細胞は、例えば、ヤロウィアリ・ポリティカまたは他の酵母等の、発酵プロセスに好適な生物であってもよい。
【０２０２】
トランスジェニック植物
本発明はまた、本発明の外因性ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、本発明の細胞、本発明のベクター、またはこれらの組み合わせを含む植物も提供する。「植物」という用語は、全植物を指すが、「その一部」という用語は、植物器官（例えば、葉、茎、根、花、果実）、単一の細胞（例えば、花粉）、種子、胚、胚乳、胚盤、または種皮等の種子部、脈管組織等の植物組織、植物細胞、およびその子孫を指す。本明細書で使用される植物部は、植物細胞を含む。
【０２０３】
本明細書で使用される「植物」という用語は、最も広い意味で使用される。草の種、観賞用もしくは装飾用植物、作物もしくは穀粒（例えば、油料種子、メイズ、ダイズ）、飼料もしくは馬草、果実もしくは野菜植物、ハーブ植物、木本植物、観花植物、または樹木が挙げられるが、これらに限定されない。植物を任意の特定の構造に限定することを意味するものではない。また、単細胞植物（例えば、微細藻類）も指す。植物を参照しての「その一部」という用語は、植物細胞およびその子孫、大部分が群体に分化される複数の植物細胞（例えば、ボルボックス）、植物の成長の任意の段階で存在する構造体、または植物組織を指す。そのような構造としては、葉、茎、花、果実、木の実、根、種子、種皮、胚が挙げられるが、これらに限定されない。「植物組織」という用語は、葉、茎、花、果実、木の実、根、種子に存在する、例えば、胚組織、胚乳、真皮組織（例えば、表皮、周皮）、脈管組織（例えば、木質部、篩部）、または基本組織（柔組織、厚角組織、および／または厚膜組織細胞を含む）、ならびに培養物中の細胞（例えば、単細胞、プロトプラスト、カルス、胚等）といった、分化したおよび分化していない植物の組織を含む。植物組織は、植物体、器官培養物、組織培養物、または細胞培養物中にあってもよい。
【０２０４】
「トランスジェニック植物」、「遺伝的に修飾された植物」、またはそれらの変形は、同じ種、変種、または栽培品種の野生型植物では見出されない導入遺伝子を含む植物を指す。本発明の文脈において定義されるトランスジェニック植物としては、所望の植物またはその一部において本明細書で定義される少なくとも１つのポリペプチドを生成させるように組み換え技術を使用して遺伝的に修飾された植物およびそれらの子孫が挙げられる。トランスジェニック植物部は、対応する意味を有する。
【０２０５】
本明細書において、「種子」および「穀粒」という用語は、同じ意味で使用される。「穀粒」は、成熟した穀粒、例えば、収穫した穀粒または依然として植物上にあるが収穫される状態にある穀粒を指すが、文脈に応じて、吸水または発芽後の穀粒を指すこともできる。成熟した穀粒は、一般的に、約１８％〜２０％未満の含水率を有する。本明細書で使用される「発育中の種子」は、典型的に、受精または開花後の植物の生殖構造において見出される成熟前の種子を指すが、植物から単離された成熟期前のそのような種子も指すことができる。
【０２０６】
本明細書で使用される「植物貯蔵器官」という用語は、例えば、タンパク質、炭水化物、脂質の形態でエネルギーを貯蔵するように特殊化された、植物の一部を指す。植物貯蔵器官の実施例は、種子、果実、塊状根、および塊茎である。本発明の好ましい植物貯蔵器官は、種子である。
【０２０７】
本明細書において使用される「表現型的に正常」という用語は、未修飾の植物またはその一部と比較したときに、成長し、繁殖する能力が大幅に低下していない、遺伝的に修飾された植物またはその一部、特に、本発明の種子、塊茎、または果実等の貯蔵器官を指す。一実施形態において、表現型的に正常な遺伝的に修飾された植物またはその一部は、植物貯蔵器官特異的プロモーターに操作可能に連結されるサイレンシングサプレッサーをコードする組み換えポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドを含まない対応する植物またはその一部と基本的に同じである成長または繁殖する能力を有する。好ましくは、バイオマス、成長速度、発芽率、貯蔵器官のサイズ、種子のサイズ、および／または生成された生存可能な種子の数は、同一の条件下で成長させたときに、該組み換えポリヌクレオチドが欠如している植物のバイオマス、成長速度、発芽率、貯蔵器官のサイズ、種子のサイズ、および／または生成された生存可能な種子の数の９０％を下回ることがない。この用語は、野生型植物と異なり得るが、例えば葉の芽のバレリーナ表現型等の、商業的目的のための植物の有用性をもたらさない植物の特徴を包含しない。
【０２０８】
本発明の実践に際して提供されるか、または使用が企図される植物には、単子葉植物および双子葉植物の双方が含まれる。好ましい実施形態において、本発明の植物は、作物植物（例えば、穀類および豆類、メイズ、コムギ、ジャガイモ、タピオカ、イネ、ソルガム、キビ、カッサバ、オオムギ、またはエンドウ）または他のマメ類である。植物は、食用の根、塊茎、葉、茎、花、または果実の生成のために成長させられ得る。植物は、野菜または観賞植物であってもよい。本発明の植物は、トウモロコシ（ゼア・マイス）、カノーラ（ブラシカ・ナパス、ブラッシカ・ラパ亜種）、他のブラッシカ（例えば、ルタバガ（ブラシカナポ・ブラシカ）またはブラシカ・カメリナ）、サトウダイコン（ベータ・バルガリス）クローバー（トリフォリウム種）、アマ（リナム・ウシタチシマム）、アルファルファ（メディカゴ・サティバ）、イネ（オリザ・サティバ）、ライムギ（セカレ・ケラレ）、モロコシ（ソルガム・バイカラー、ソルガム・ブルガレ）、ヒマワリ（ヘリアンサス・アンヌス）、コムギ（トリチウム・アエスチブム）、ダイズ（グリシネ・マク）、タバコ（ニコチア・ナタバカム）、ジャガイモ（ソラナム・チュベロスム）、ピーナッツ（アラキス・ヒポゲア）、綿（ゴシピウム・ヒルスツム）、サツマイモ（ロプモエア・バタツス）、カッサバ（マニホト・エスクレンタ）、コーヒー（コフェア種）、ココナッツ（ココス・ヌシフェラ）、パイナップル（アナナ・コモスス）、柑橘類の樹木（シトラス種）、ココア（テオブロマ・カカオ）、茶（カメリア・セネンシス）、バナナ（ムサ種）、アボカド（パーシー・アメリカーナ）、イチジク（フィクス・カシカ）、グァバ（プシディウム・グアジャバ）、マンゴー（マンギフェラ・インディカ）、オリーブ（オレア・ユーロピア）、パパイア（カリカ・パパヤ）、カシュー（アナカルジウム・オクシデンタレ）、マカダミア（マカダミア・インテルグリフォリア）、アーモンド（プルナス・アミグダラス）、サトウダイコン（ベータ・バルガリス）、オートムギ、またはオオムギであってもよい。
【０２０９】
他の好ましい植物としては、Ｃ４草（アンドロポゴン・ゲラルディイ、ボウテロア・クルチペンデュラ、Ｂ．グラシリス、ブークロエ・ダクティルオイディーズ、パニクム・ビルガツム、スキザクリウム・スコパリウム、ミスカンサス種（例えば、ミスカンサス・ギガンテウスおよびミスカンサス・シネンシス）、ソルガストラム・ヌタンス、スポロボルス・クリプタンサス、スイッチグラス（パニクム・ビルガツム）等）、Ｃ３草（エリムス・カナデンシス、マメ科植物のレスペデザ・カピタータおよびペタロステマム・ビロスム、広葉草本のアスター・アズレウス等）、および木質の植物（クエルクス・エリプソイダリスおよびＱ．マクロカルパ等）が挙げられる。
【０２１０】
好ましい実施形態において、植物は、被子植物である。
【０２１１】
一実施形態において、植物は、油料種子植物、好ましくは油料種子作物植物である。本明細書で使用される「油料種子植物」とは、植物の種子からの脂質の商業的生成に使用される、植物種である。油料種子植物は、アブラナ（例えば、カノーラ）、メイズ、ヒマワリ、ベニバナ、ダイズ、モロコシ、アマ（アマニ）、またはサトウダイコンであってもよい。さらに、油料種子植物は、他のブラッシカ、綿、ピーナッツ、ケシ、マスタード、トウゴマ、ゴマ、ベニバナ、または木の実を生成する植物であってもよい。植物は、その果実（例えば、オリーブ、アブラヤシ、またはココナッツ）において高レベルの脂質を生成し得る。本発明が適用され得る園芸植物は、レタス、エンダイブ、またはキャベツ、ブロッコリもしくはカリフラワーを含む野菜のブラッシカである。本発明は、タバコ、ククルビット、ニンジン、イチゴ、トマト、またはコショウに適用され得る。
【０２１２】
好ましい実施形態において、トランスジェニック植物は、その子孫が所望の表現型を分離しないように導入されたどの遺伝子（導入遺伝子）に対してもホモ接合性である。トランスジェニック植物はまた、例えばハイブリッド種子から成長したＦ１子孫等に導入された導入遺伝子に対してヘテロ接合性、好ましくは導入遺伝子に対して一様にヘテロ接合性であってもよい。そのような植物は、当技術分野でよく知られているハイブリッド強勢等の利点を提供し得る。
【０２１３】
適切な場合、トランスジェニック植物はまた、ＬＰＡＡＴ、ＬＰＣＡＴ、ＰＡＰ、もしくはリン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ１、ＰＤＡＴ２、またはＰＤＡＴ３、例えば、Ｇｈｏｓａｌ他，２００７を参照されたい）、またはこれらの２つ以上の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない、非極性脂質の生成に関与する酵素をコードする、付加的な導入遺伝子を含んでもよい。本発明のトランスジェニック植物はまた、外因性ポリヌクレオチドからオレオシンを発現し得る。
【０２１４】
植物の形質転換
トランスジェニック植物は、Ｓｌａｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００３）、およびＰ．Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ａｎｄ  Ｈ．Ｋｌｅｅ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（２００４）で一般に説明されているもの等の、当技術分野で知られている手法を使用して生成することができる。
【０２１５】
本明細書で使用される「安定的に形質転換する」、「安定的に形質転換された」という用語、およびそれらの変形は、ポリヌクレオチドが、それらの存在を積極的に選択することを必要とせずに、細胞分裂中に、子孫細胞に転移されるように、ポリヌクレオチドを細胞のゲノムに組み込むことを指す。安定した形質転換体またはその子孫は、染色体ＤＮＡに対するサザンブロットまたはゲノムＤＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション等の、当技術分野で知られているあらゆる手段によって選択することができる。
【０２１６】
一過性発現のために、または植物細胞ゲノムにおけるＤＮＡの安定的な組み込みのために、植物組織全体もしくは植物器官の細胞、または組織培養物中の外植体にＤＮＡを導入することができるので、アグロバクテリウム媒介転移は、遺伝子を植物細胞の中に導入するための広く適用可能な系である。ＤＮＡを植物細胞の中に導入するためのアグロバクテリウム媒介植物組み込みベクターの使用は、当技術分野でよく知られている（例えば、米国特許第ＵＳ５１７７０１０号、米国特許第ＵＳ５１０４３１０号、米国特許第ＵＳ５００４８６３号、または米国特許第ＵＳ５１５９１３５号を参照されたい）。転移されるＤＮＡの領域は、境界配列によって定義され、介在ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）は、通常、植物ゲノムの中に挿入される。さらに、Ｔ−ＤＮＡの組み込みは、比較的精密なプロセスであり、再配列をほとんどもたらさない。アグロバクテリウム媒介形質転換が効率的である植物品種では、遺伝子転移の容易かつ定義された性質のため、それが最適な方法である。好ましいアグロバクテリウム形質転換ベクターは、大腸菌ならびにアグロバクテリウムにおける複製が可能であり、（Ｋｌｅｅ他が、Ｐｌａｎｔ  ＤＮＡ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ａｇｅｎｔｓ，Ｈｏｈｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｌｌ，ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１７９−２０３（１９８５）で）説明しているように、好都合な操作を可能にする。
【０２１７】
使用され得る加速法としては、例えば、マイクロプロジェクタイルボンバードメント等が挙げられる。形質転換核酸分子を植物細胞に送達するための方法の１つの例は、マイクロプロジェクタイルボンバードメントである。この方法は、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９４）によって概説されている。非生物学的粒子（マイクロプロジェクタイル）を核酸で被覆して、推進力によって細胞の中に送達してもよい。例示的な粒子としては、タングステン、金、白金等から成るものが挙げられる。マイクロプロジェクタイルボンバードメントの特別の利点は、単子葉植物を再現的に形質転換する有効な手段であることに加えて、原形質体の単離も、アグロバクテリウム感染に対する感受性も必要としないことである。加速によってＤＮＡをゼア・マイス細胞に送達するための方法の例示的実施形態は、ＤＮＡで被覆した粒子を、ステンレス鋼またはＮｙｔｅｘスクリーン等のスクリーンを通して、懸濁液中で培養したトウモロコシ細胞で覆ったフィルタ表面上に推進するために使用することができる、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓα粒子送達システムである。本発明とともに使用するのに適切な粒子送達システムは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能なヘリウム加速ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ銃である。
【０２１８】
ボンバードメントのために、懸濁液中の細胞は、フィルタ上で濃縮させてもよい。衝突される細胞を含むフィルタは、マイクロプロジェクタイルストッピングプレートの下側に適切な距離で位置付けられる。所望により、銃と衝突される細胞との間に１つ以上のスクリーンも配置される。
【０２１９】
代替として、未成熟胚または他の標的細胞を固体培養培地上に配置してもよい。衝突される細胞は、マイクロプロジェクタイルストッピングプレートの下側に適切な距離で配置される。所望により、加速デバイスと衝突される細胞との間に１つ以上のスクリーンも配置される。本明細書で説明される手法の使用により、マーカー遺伝子を一過性に発現する細胞の最高１０００個以上の増殖巣が得られ得る。ボンバードメントの４８時間後に遺伝子産物を発現する増殖巣中の細胞数は、多くの場合１〜１０個の範囲であり、平均１〜３個の範囲である。
【０２２０】
ボンバードメント形質転換では、最大数の安定した形質転換体を生ずるように、ボンバードメント前培養条件およびボンバードメントパラメータを最適化してもよい。この技術では、ボンバードメントに関する物理的パラメータおよび生物学的パラメータの双方が重要である。物理的因子は、ＤＮＡ／マイクロプロジェクタイルの沈殿物の操作に関与するもの、または、マクロプロジェクタイルもしくはマイクロプロジェクタイルのいずれかの飛行および速度に影響を及ぼすものである。生物学的因子としては、ボンバードメント前および直後の細胞の操作に関与する全てのステップ、ボンバードメントと関連する外傷の軽減を補助するための標的細胞の浸透圧調整、また、線形化ＤＮＡまたは無損傷超螺旋プラスミド等の形質転換ＤＮＡの性質が挙げられる。ボンバードメント前操作は、未成熟胚の効を奏する形質転換のために特に重要であると考えられる。
【０２２１】
別の代替的実施形態では、プラスチドを安定的に形質転換させることができる。高等植物におけるプラスチド形質転換について開示されている方法としては、選択可能なマーカーを含むＤＮＡの粒子銃送達、および相同的組み換えを通してのプラスチドゲノムへのＤＮＡの標的化が挙げられる（米国特許第ＵＳ５，４５１，５１３号、米国特許第ＵＳ５，５４５，８１８号、米国特許第ＵＳ５，８７７，４０２号、米国特許第ＵＳ５，９３２，４７９号、および国際特許公開第ＷＯ９９／０５２６５号）。
【０２２２】
故に、条件を十分に最適化するために、小規模な研究でボンバードメントパラメータの種々の側面を調整することが望ましくなり得ると考えられる。特に、間隙距離、飛行距離、組織距離、およびヘリウム圧力等の物理的パラメータの調整が特に望まれる場合がある。また、レシピエント細胞の生理学的状態に影響を及ぼし、したがって、形質転換および組み込みの効率に影響を及ぼし得る条件を修正することによって、外傷低減因子を最小にする場合もある。例えば、浸透圧状態、組織水和、および継代培養状態、またはレシピエント細胞の細胞周期を、最適な形質転換のために調整してもよい。他の日常的な調整の実行は、本開示に照らして当業者に知られるであろう。
【０２２３】
植物プロトプラストの形質転換は、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール処理、電気穿孔、およびこれらの処理の組み合せに基づいた方法を使用して達成することができる。異なる植物の種類に対するこれらの系の適用は、プロトプラストからその特定の植物株を再生する能力に依存する。プロトプラストから穀類を再生するための例示的な方法が説明されている（Ｆｕｊｉｍｕｒａ他，１９８５、Ｔｏｒｉｙａｍａ他，１９８６、Ａｂｄｕｌｌａｈ他，１９８６）。
【０２２４】
細胞形質転換の他の方法を使用することもでき、そのような方法としては、花粉の中への直接のＤＮＡ転移によって、植物の生殖器官の中へのＤＮＡの直接注入によって、または未成熟胚の細胞の中へのＤＮＡの直接注入、その後の乾燥させた胚の再水和によって、植物の中にＤＮＡを導入することが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２５】
単一植物プロトプラストの形質転換体からの、または種々の形質転換された外植体からの、植物の再生、発育、および栽培は、当技術分野でよく知られている（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，（１９８８））。この再生および成長プロセスは、典型的に、形質転換細胞を選択するステップ、個別化した細胞を、発根した苗木段階を経て、通常の胚の発育段階を通して培養するステップを含む。トランスジェニック胚および種子は、同様に再生される。その後に、結果として生じたトランスジェニック発根芽を、土壌等の適切な植物成長培地に植え付ける。
【０２２６】
外来の外因性遺伝子を含む植物の発育または再生は、当技術分野でよく知られている。好ましくは、再生植物を自家授粉させて、ホモ接合性トランスジェニック植物を提供する。それ以外の場合、再生植物から得られた花粉を、農学的に重要な系列の種子から成長させた植物に交配する。逆に、これらの重要な系列の植物からの花粉を使用して、再生植物に授粉する。所望のポリヌクレオチドを含む本発明のトランスジェニック植物は、当業者によく知られている方法を使用して栽培される。
【０２２７】
主としてアグロバクテリウム・ツメファシエンスの使用による、双子葉植物を形質転換するための方法、およびトランスジェニック植物を得るための方法が、綿（米国特許第ＵＳ５，００４，８６３号、米国特許第ＵＳ５，１５９，１３５号、米国特許第ＵＳ５，５１８，９０８号）、ダイズ（米国特許第ＵＳ５，５６９，８３４号、米国特許第ＵＳ５，４１６，０１１号）、ブラッシカ（米国特許第ＵＳ５，４６３，１７４号）、落花生（Ｃｈｅｎｇ他，１９９６）、およびエンドウ（Ｇｒａｎｔ他，１９９５）について公開されている。
【０２２８】
外因性核酸の導入によって遺伝的変種を植物の中に導入するために、ならびにプロトプラストまたは未成熟植物胚から植物を再生するために、コムギおよびオオムギ等の穀物植物を形質転換するための方法は、当技術分野においてよく知られており、例えば、カナダ特許第ＣＡ２，０９２，５８８号、豪州特許第ＡＵ６１７８１／９４号、豪州特許第ＡＵ６６７９３９号、米国特許第ＵＳ６，１００，４４７号、国際特許公開第ＰＣＴ／ＵＳ９７／１０６２１号、米国特許第ＵＳ５，５８９，６１７号、米国特許第ＵＳ６，５４１，２５７号を参照されたく、また、他の方法は、国際特許公開第ＷＯ９９／１４３１４号に記載されている。好ましくは、トランスジェニックコムギまたはオオムギ植物は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介形質転換手順によって生成される。所望のポリヌクレオチドを担持するベクターは、組織培養した植物もしくは外植体の再生可能なコムギ細胞、またはプロトプラスト等の適切な植物系の中に導入されてもよい。
【０２２９】
再生可能なコムギ細胞は、好ましくは、未成熟胚の胚盤、成熟胚の胚盤、これらに由来するカルス、または分裂組織に由来する。
【０２３０】
トランスジェニック細胞およびトランスジェニック植物における導入遺伝子の存在を確認するために、当業者に知られている方法を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅またはサザンブロット分析を行うことができる。導入遺伝子の発現産物は、その産物の性質に依存して、種々の方法のいずれかで検出することができ、そのような方法としては、ウエスタンブロット法および酵素アッセイが挙げられる。タンパク質発現を数量化するための、および異なる植物組織における複製を検出するための１つの特に有用な方法は、ＧＵＳ等のレポーター遺伝子を使用することである。トランスジェニック植物が得られると、それらを成長させて、所望の表現型を有する植物組織または一部が生成され得る。植物組織または植物部は、収穫してもよく、および／または種子を採集してもよい。この種子は、所望の特徴を有する組織または一部を伴う付加的な植物を成長させるための源としての役割を果たし得る。
【０２３１】
アグロバクテリウムまたは他の形質転換方法を使用して形成されたトランスジェニック植物は、典型的には、１つの染色体上に単一の遺伝子座を含む。そのようなトランスジェニック植物は、付加遺伝子に対してヘミ接合性であると称することができる。付加遺伝子に対してホモ接合性であるトランスジェニック植物、すなわち、２つの付加遺伝子（染色体対の各染色体上の同じ遺伝子座に１つの遺伝子）を含むトランスジェニック植物が、より好ましい。ホモ接合性トランスジェニック植物は、ヘミ接合性トランスジェニック植物を自家受精させ、生成した種子の一部を発芽させ、そして、結果として生じた植物を関心の遺伝子について分析することによって得ることができる。
【０２３２】
２つの独立して隔離した外因性遺伝子または遺伝子座を含む２つの異なるトランスジェニック植物を交配させて（掛け合わせて）、両組の遺伝子または遺伝子座を含む子孫を生成することができることも理解されたい。適切なＦ１子孫の自殖は、双方の外因性遺伝子または遺伝子座に対してホモ接合性である植物を生成することができる。栄養繁殖と同じように、親植物への戻し交配および非トランスジェニック植物との異系交配も企図される。異なる形質および作物に一般的に使用される他の増殖方法の説明は、ＦｅｈｒのＢｒｅｅｄｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｃｕｌｔｉｖａｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｗｉｌｃｏｘ  Ｊ．ｅｄ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒｏｎｏｍｙ，Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．（１９８７）に見出すことができる。
【０２３３】
ＴＩＬＬＩＮＧ法
一実施形態において、ＴＩＬＬＩＮＧ法（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｌｏｃａｌ  Ｌｅｓｉｏｎｓ  ＩＮ  Ｇｅｎｏｍｅｓ）は、内因性遺伝子、例えば、ＤＧＡＴ、ｓｎ−１−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、アシルＣｏＡ：リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）、ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）、またはその二つ以上の組み合わせをコードする遺伝子がノックアウトされる植物を生成するために使用することができる。
【０２３４】
第１のステップでは、化学的変異原で種子（または花粉）を処理することによって新しい単一塩基対変化等の導入変異を、植物の集団において誘発させ、次いで、植物を変異が安定的に継承される世代まで成長させる。ＤＮＡを抽出し、種子を、集団の全てのメンバーから貯蔵して、経時的に繰り返して利用することができる供給源を作成する。
【０２３５】
ＴＩＬＬＩＮＧアッセイのために、ＰＣＲプライマーは、関心の単一の遺伝子標的を特異的に増幅するように設計される。標的が遺伝子ファミリーのメンバーまたは倍数体ゲノムの一部である場合は、特異性が特に重要である。次に、色素標識したプライマーを使用して、複数の固体のプールしたＤＮＡから、ＰＣＲ産物を増幅することができる。これらのＰＣＲ産物は、ミスマッチ塩基対の形成を可能にするように、変性させ、再アニールする。ミスマッチまたはヘテロ２本鎖は、自然発生的な一塩基多型（ＳＮＰ）（すなわち、集団からのいくつかの植物が、同じ多型性を持つ可能性がある）、および誘発されたＳＮＰ（すなわち、ごく稀に、個々の植物が変異を示す可能性がある）の双方を表す。ヘテロ２本鎖の形成後、ミスマッチＤＮＡを認識して切断する、ＣｅｌＩ等のエンドヌクレアーゼの使用は、ＴＩＬＬＩＮＧ集団内で新しいＳＮＰを発見するための鍵である。
【０２３６】
この手法を使用することで、何千もの植物をスクリーニングして、ゲノムの任意の遺伝子または特定の領域における単一塩基変化、ならびに小挿入もしくは欠失（１〜３０ｂｐ）を伴うあらゆる個体を特定することができる。アッセイされるゲノム断片は、０．３〜１．６ｋｂのサイズの範囲のいずれかになり得る。８重プーリング、１．４ｋｂの断片（ノイズのためＳＮＰの検出が問題を含む断片の末端を除く）、および１アッセイあたり９６レーンで、この組み合わせは、単一のアッセイあたり、ゲノムＤＮＡの最高１００万の塩基対をスクリーニングすることを可能にし、ＴＩＬＬＩＮＧを高スループットの手法にする。
【０２３７】
ＴＩＬＬＩＮＧは、ＳｌａｄｅおよびＫｎａｕｆ（２００５）、ならびにＨｅｎｉｋｏｆｆ他（２００４）でさらに説明されている。
【０２３８】
変異の効率的な検出を可能にすること加えて、高スループットのＴＩＬＬＩＮＧ技術は、自然多型性の検出に理想的である。したがって、既知の配列に対してヘテロ２本鎖を形成することによって未知の相同的ＤＮＡを確認することは、多型性部位の数および位置を明らかにする。少なくともいくつかの反復数多型性を含む、ヌクレオチドの変化、ならびに小挿入および欠失の双方が特定される。これは、Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇと呼ばれている（Ｃｏｍａｉ他，２００４）。
【０２３９】
各ＳＮＰは、２、３個のヌクレオチド内のそのおよその位置に記録される。したがって、各ハプロタイプを、その運動性に基づいて保管することができる。配列データは、ミスマッチ切断アッセイに使用される同じ増幅ＤＮＡのアリコートを使用して、比較的小さい漸増作業で入手することができる。単一の反応に対する左側または右側配列決定プライマーは、多型性に対するその近接度によって選択される。Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒソフトウエアは、複数のアラインメントを行って、塩基変化を発見し、それぞれの場合において、ゲルバンドを確認する。
【０２４０】
ＥｃｏＴＩＬＬＩＮＧ法は、完全配列決定よりも安価に行うことができ、現在、この方法が大部分のＳＮＰ発見に使用されている。変異させた植物由来のＤＮＡのプールではなく、整列させた生態型ＤＮＡを含むプレートをスクリーニングすることができる。検出は、塩基対に近い分解能を伴うゲル上であり、背景パターンは、レーン全体にわたって均一であるので、サイズが同一であるバンドをマッチさせることができ、したがって、単一のステップでＳＮＰを発見して遺伝子型決定することができる。このように、ＳＮＰの最終的な配列決定は、簡単かつ効率的であるが、スクリーニングに使用される同じＰＣＲ産物のアリコートをＤＮＡ配列決定に供することができるという事実によって、さらに簡単かつ効率的になる。
【０２４１】
外因性ＲＮＡレベルおよび安定化した発現の増強
転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）は、分解のために細胞ｍＲＮＡおよびウイルスｍＲＮＡの双方を標的とすることができる、ヌクレオチド配列特異的防御機構である。ＰＴＧＳは、組み換えポリヌクレオチドで安定的または一過性に形質転換された植物または菌類において起こり、導入されたポリヌクレオチドに対する配列類似性を伴うＲＮＡ分子の減少した蓄積をもたらす。
【０２４２】
植物またはその一部の貯蔵器官におけるサイレンシングサプレッサーの発現を制限することによって、ＲＮＡ分子レベルを増加させることができ、および／または、ＲＮＡ分子レベルを多くの世代にわたって安定化させることができる。本明細書で使用される「サイレンシングサプレッサー」は、特に最初に形質転換された植物からの世代の繰り返しを通じて、植物細胞における異なる導入遺伝子に由来する発現産物のレベルを増強する植物細胞において発現させることができる、いかなるポリヌクレオチドまたはポリペプチドでもある。一実施形態において、サイレンシングサプレッサーは、ウイルスサイレンシングサプレッサーまたはその変異体である。数多くのウイルスサイレンシングサプレッサーが当技術分野で知られており、Ｐ１９、Ｖ２、Ｐ３８、Ｐｅ−Ｐｏ、およびＲＰＶ−Ｐ０が挙げられるが、これらに限定されない。好適なウイルスサイレンシングサプレッサーの例としては、国際特許公開第ＷＯ２０１０／０５７２４６号で説明されるものが挙げられる。サイレンシングサプレッサーは、本発明の植物またはその一部において安定的に発現し得る。
【０２４３】
本明細書で使用される「安定的に発現される」またはその変形は、サイレンシングサプレッサーをコードする外因性ポリヌクレオチドが欠如している対応する植物と比較したときに、ＲＮＡ分子のレベルが、世代の繰り返しを通じて、例えば少なくとも３世代、少なくとも５世代、または少なくとも１０世代にわたって、子孫植物において基本的に同じであるか、またはより高いことを指す。しかしながら、この用語は、世代の繰り返しを通じて、前世代と比較したときに、ＲＮＡ分子のレベルの多少の低下、例えば１世代あたり１０％以上の低下があるという可能性を排除しない。
【０２４４】
サプレッサーは、任意の源、例えば、植物、ウイルス、哺乳類等から選択することができる。
【０２４５】
サプレッサーは、例えば、
フロックハウスウイルスＢ２、
ポソスラテントウイルスＰ１４、
ポソスラテントウイルスＡＣ２、
アフリカカッサバモザイクウイルスＡＣ４、
ベンディ黄色葉脈モザイク病Ｃ２、
ベンディ黄色葉脈モザイク病Ｃ４、
ベンディ黄色葉脈モザイク病βＣ１、
トマトクロロシスウイルスｐ２２、
トマトクロロシスウイルスＣＰ、
トマトクロロシスウイルスＣＰｍ、
トマトゴールデンモザイクウイルスＡＬ２、
トマト葉巻病ジャワウイルスβＣ１、
トマト黄化葉巻ジャワウイルスＶ２、
トマト黄化巻葉ウイルス−ＣｈｉｎａＣ２、
トマト黄化葉巻ＣｈｉｎａウイルスＹ１０分離菌βＣ１、
トマト黄化葉巻イスラエル系分離菌Ｖ２、
リョクトウ黄色モザイクウイルス−ＶｉｇｎａＡＣ２、
ハイビスカスクロロティックリングスポットウイルスＣＰ、
カブクリンクルウイルスＰ３８、
カブクリンクルウイルスＣＰ、
カリフラワーモザイクウイルスＰ６、
ビート黄色ウイルスｐ２１、
シトラストリステイザウイルスｐ２０、
シトラストリステイザウイルスｐ２３、
シトラストリステイザウイルスＣＰ、
ササゲモザイクウイルスＳＣＰ、
サツマイモクロロティックスタントウイルスｐ２２、
キュウリモザイクウイルス２ｂ、
トマトアスパーミーウイルスＨＣ−Ｐｒｏ、
ビートカーリートップウイルスＬ２、
土壌感染性ムギ類萎縮ウイルス１９Ｋ、
オオムギストライプモザイクウイルスＧａｍｍａｂ、
ポア半潜伏ウイルスＧａｍｍａｂ、
ピーナッツクランプペクルウイルスＰ１５、
イネ萎縮ウイルスＰｎｓ１０、
ククルビットアブラムシ媒介黄色ウイルスＰ０、
ビートウェスタン黄色ウイルスＰ０、
ジャガイモウイルスＸＰ２５、
キュウリ葉脈黄変ウイルスＰ１ｂ、
プラムポックスウイルスＨＣ−Ｐｒｏ、
サトウキビモザイクウイルスＨＣ−Ｐｒｏ、
ジャガイモウイルスＹ株ＨＣ−Ｐｒｏ、
タバコエッチウイルスＰ１／ＨＣ−Ｐｒｏ、
カブモザイクウイルスＰ１／ＨＣ−Ｐｒｏ、
コックスフットモットルウイルスＰ１、
コックスフットモットルウイルス−ノルウェー系分離菌Ｐ１、
イネ黄色モットルウイルスＰ１、
イネ黄色モットルウイルス−ナイジェリア系分離菌Ｐ１、
イネオーハブランカウイルスＮＳ３、
イネストライプウイルスＮＳ３、
アブラナ感染性タバコモザイクウイルス１２６Ｋ、
アブラナ感染性タバコモザイクウイルスｐ１２２、
タバコモザイクウイルスｐ１２２、
タバコモザイクウイルス１２６、
タバコモザイクウイルス１３０Ｋ、
タバコラットルウイルス１６Ｋ、
トマトブッシースタントウイルスＰ１９、
トマトスポッテッドウイルトウイルスＮＳ、
リンゴクロロティックリーフスポットウイルスＰ５０、
グレープバインウイルスＡｐ１０、
ＢＹＶｐ２１のブドウ葉巻随伴ウイルス−２相同体、
ならびに、その変異形／変異体であってもよい。前述のリストは、サプレッサーを得ることができるウイルス、および各特定のウイルスに由来するサプレッサーのためのタンパク質（例えば、Ｂ２、Ｐ１４等）またはコード領域の呼称を提供する。
【０２４６】
サプレッサーの複数のコピーが、使用されてもよい。異なるサプレッサーが、ともに（例えば、相前後して）使用されてもよい。
【０２４７】
基本的に、植物貯蔵器官において発現することが望ましいいかなるＲＮＡ分子も、サイレンシングサプレッサーと共発現させることができる。ＲＮＡ分子は、農業形質、耐虫性、耐病性、除草剤耐性、不稔性、穀粒特性等に影響を与え得る。コードされたポリペプチドは、脂質、デンプン、炭水化物、栄養素等の代謝に関与し得、またはタンパク質、ペプチド、脂質、蝋、デンプン、糖、炭水化物、香料、臭気、毒素、カロテノイド、ホルモン、ポリマー、フラボノイド、貯蔵タンパク質、フェノール酸、アルカロイド、リグニン、タンニン、セルロース、糖タンパク質、糖脂質等の合成を担い得る。
【０２４８】
特定の例において、植物は、ブラッシカ類（例えば、アブラナもしくはヒマワリ、ベニバナ、アマ、綿、ダイズ、またはメイズ）等の植物における脂質生成のための増加したレベルの酵素を生成した。
【０２４９】
非極性脂質の生成
当技術分野で日常的に行われている手法を使用して、本発明の細胞、生物、またはその一部によって生成される非極性脂質を抽出、処理、精製、および分析することができる。そのような手法は、ＦｅｒｅｉｄｏｏｎＳｈａｈｉｄｉ，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＦｏｏｄＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００１）Ｄ１．１．１−Ｄ１．１．１１、およびＰｅｒｅｚ−Ｖｉｃｈ他（１９９８）等の出展の文献全体を通して記載および説明されている。
【０２５０】
種子油の生成
典型的に、植物種子は、粗製種子油を生成するために調理、圧搾、および／または抽出され、次いで、脱ガムされ、精製され、消色され、そして、消臭される。一般に、種子を破砕するための手法は、当技術分野で知られている。例えば、油料種子は、水を噴霧することによって、例えば８．５％まで含水量を増加させることによって柔らかくし、そして、滑らかなローラーを使用して０．２３〜０．２７ｍｍの間隙設定でフレーク状にすることができる。種子の種類によっては、破砕する前に水を加えなくてもよい。熱の適用は、酵素を不活性化し、さらなる細胞の破裂を促進し、脂質液滴を癒合させ、タンパク質粒子を塊にし、これらの全てが、抽出プロセスを容易にする。
【０２５１】
大部分の種子油は、スクリュー圧搾機を通過させることによって放出される。次いで、スクリュー圧搾機から排出されたケーキを、ヒートトレースカラムを使用して、例えばヘキサンで溶媒抽出される。代替として、圧搾動作によって生成した粗製種子油に、スロット付きワイヤ排液頂部を伴う沈殿槽を通過させて、圧搾動作中に種子油とともに現れる固形物を除去することができる。浄化した種子油は、プレートおよびフレームフィルタを通過させて、あらゆる残りの微細な固形粒子を除去することができる。所望であれば、抽出プロセスから回収した種子油を、浄化した種子油と組み合わせて、混合粗製種子油を生成することができる。
【０２５２】
溶媒が粗製種子油から取り除かれると、圧搾されて抽出された部分が組み合わせられて、標準的な脂質処理手順（すなわち、脱ガム、苛性精製、消色、および脱臭）に供される。脱ガムは、濃縮したリン酸を粗製種子油に添加して非水和性リン脂質を水和可能な形態に変換し、存在する少量の金属をキレート化することによって行うことができる。ガムは、遠心分離によって種子油から分離される。種子油は、十分な量の水酸化ナトリウム溶液を添加して全ての脂肪酸を滴定し、そのように形成された石鹸を除去することによって精製することができる。
【０２５３】
脱臭は、真空下で種子油を２６０℃に加熱し、種子油１００ｍＬあたり約０．１ｍＬ／分の速度で蒸気を種子油の中に緩やかに導入することによって行うことができる。約３０分スパージした後に、種子油を真空下で冷却させる。種子油は、典型的に、ガラス容器に移され、アルゴンでフラッシングされ、その後に、冷凍下で貯蔵される。種子油の量が限られている場合、種子油は、真空下で、例えばＰａｒｒ反応器中に置いて、脱臭にかかったとされる時間と同じ長さで２６０℃に加熱することができる。この処理は、種子油の色を改善し、大半の揮発性物質を除去する。
【０２５４】
脂質の生成のための植物バイオマス
光合成に関与する植物の一部（例えば、より高度な植物の茎および葉、ならびに藻類等の水生植物）も、脂質を生成するために使用することができる。植物の種類とは関係なく、グリーンバイオマスから脂質を抽出するためのいくつかの方法がある。１つの方法は、物理的抽出であるが、これは、しばしば、溶媒抽出を使用しない。これは、いくつかの異なる種類の機械的抽出を使用した「従来の」方法である。搾油機で圧搾する抽出は一般的な種類であり、スクリュー圧搾機およびラム圧搾機による抽出方法も同様である。これらの方法を使用して抽出される脂質の量は、用いた植物材料および機械的プロセスによって大幅に変動する。機械的抽出は、典型的に、下記で説明される溶媒抽出よりも非効率的である。
【０２５５】
溶媒抽出では、有機溶媒（例えば、ヘキサン）を、少なくとも遺伝的に修飾された植物のグリーンバイオマスと（好ましくは、グリーンバイオマスを乾燥させてすりつぶした後に）混合する。当然、グリーンバイオマス以外の、植物の他の部分（例えば、脂質含有種子）も同様に、すりつぶして混合することができる。溶媒は、バイオマス中の脂質等を溶解し、次いで、この溶液を、機械的作用によって（例えば、前述の圧搾プロセスで）、バイオマスから分離する。この分離ステップはまた、濾過によって（例えば、圧搾濾過機または類似したデバイスで）、または遠心分離等によって行うこともできる。次いで、有機溶媒を、非極性脂質から（例えば、蒸留によって）分離することができる。この第２の分離ステップは、植物からの非極性脂質を生じ、従来の蒸気再生を用いれば、再使用可能な溶媒を生ずることができる。
【０２５６】
藻類燃料の生成
藻類養殖は、藻類（微細藻類を含む。また、植物プランクトン、微細植物、またはプランクトン藻類とも称され、一般的に海藻として知られる）の種の養殖を伴う水産養殖の１つの形態である。本発明において有用な藻類の種としては、例えば、クラミドモナス種（例えば、クラミドモナス・ラインハーディ）、ドナリエラ種、ヘマトコッカス種、クロレラ種、スラウストキトリウム種、シゾキトリウム種、およびボルボックス種が挙げられる。
【０２５７】
商業的および産業的な藻類栽培は、食物成分、食物、および藻類燃料の生成を含む、数多くの用途を有する。
【０２５８】
単一または混合した藻類培養物は、開口池（水路型池および湖等）または光バイオ反応器において培養することができる。
【０２５９】
藻類は、マイクロスクリーンを使用して、遠心分離によって、凝集（例えば、キトサン、ミョウバン、および塩化鉄を使用したもの）によって、およびフロス浮選によって収穫することができる。二酸化炭素の供給を中断することで、藻類を自然に凝集させることができ、これは、「自己凝集」と呼ばれる。フロス浮選では、カルチベーターが水に通気して泡立たせ、次いで、頂部から藻類をすくい取る。超音波および他の収穫方法が、現在開発されている。
【０２６０】
脂質は、機械的に破砕することによって藻類から分離され得る。藻類は、乾燥させたときに、その脂質含量を保持し、よって、搾油機で「圧搾する」ことができる。藻類の株が異なれば、それらの物理的性状も大幅に変動するので、特定の藻類の型について、様々な圧搾構成（スクリュー、搾油機、ピストン等）がより良好に機能する。
【０２６１】
藻類から脂質等の細胞成分を放出させるために、浸透圧衝撃が使用されることもある。浸透圧衝撃は、浸透圧力を突然減少させるもので、溶液中の細胞を破裂させることができる。
【０２６２】
超音波抽出は、抽出プロセス、特に、藻類から脂質を取り出すために用いられる酵素抽出プロセスを加速することができる。超音波は、キャビテーション気泡を溶媒材料中に作成するために使用される。これらの気泡が細胞壁の近くで崩壊すると、結果として生じる衝撃波および液体ジェットが細胞壁の破壊を生じさせ、細胞の内容物を溶媒中に放出させる。
【０２６３】
藻類からの脂質の抽出には、しばしば、化学溶媒（例えば、ヘキサン、ベンゼン、石油エーテル）が使用される。ソックスレー抽出は、特殊ガラス器具中で有機溶媒を還流させて、洗浄の繰り返しまたはパーコレーションを通して、藻類から脂質を抽出するために使用することができる。
【０２６４】
藻類から脂質を抽出するために、酵素抽出を使用してもよい。酵素抽出は、酵素を使用して、水を溶媒として作用させて細胞壁を分解する。酵素抽出は、超音波処理によって支援することができる。
【０２６５】
超臨界のＣＯ２を溶媒として使用することもできる。この方法では、ＣＯ２を加圧下で液化し、超臨界になる（液体およびガスの双方の性質を有する）まで加熱することで、溶媒として作用することを可能にする。
【０２６６】
脂質生成のための発酵プロセス
本明細書で使用される「発酵プロセス」という用語は、いかなる発酵プロセス、または発酵ステップをむいかなるプロセスをも指す。発酵プロセスとしては、アルコール（例えば、エタノール、メタノール、ブタノール）、有機酸（例えば、クエン酸、酢酸、イタコン酸、乳酸、グルコン酸）、ケトン（例えば、アセトン）、アミノ酸（例えば、グルタミン酸）、ガス（例えば、Ｈ２およびＣＯ２）、抗生物質（例えば、ペニシリンおよびテトラサイクリン）、酵素類、ビタミン類（例えば、リボフラビン、ベータカロテン）およびホルモン類を生成するために使用される発酵プロセスが挙げられるが、これらに限定されない。発酵プロセスはまた、消費アルコール業界（例えば、ビールおよびワイン）、酪農業界（例えば、発酵酪農製品）、革製品業界、およびタバコ業界で使用される発酵プロセスも含む。好ましい発酵プロセスとしては、当技術分野でよく知られているようなアルコール発酵プロセスが挙げられる。好ましい発酵プロセスは、当技術分野でよく知られているような嫌気性発酵プロセスである。好適な発酵性細胞は、典型的に、発酵させることが可能である、すなわち、グルコースまたはマルトース等の糖を所望の発酵産物に直接的または間接的に変換することが可能である微生物である。発酵性微生物の例としては、酵母等の真菌性生物、好ましくは、油脂性生物が挙げられる。本明細書で使用される「油脂性生物」は、その乾燥重量の少なくとも２５％がトリグリセリドとして蓄積するものである。本明細書で使用される「酵母」としては、サッカロミセス種、サッカロミセス・セレビジエ、サッカロミセス・カールベルゲンシス、カンジダ種、クルヴェロマイシス種、ピキア種、ハンゼヌラ種、トリコデルマ種、リポミセス・スターケイ、およびヤロウィア・リポリティカが挙げられる。好ましい酵母としては、ヤロウィア・リポリティカ、または他の油脂性酵母、およびサッカロミセス種、特に、サッカロミセス・セレビジエの株が挙げられる。
【０２６７】
トランスジェニック微生物は、好ましくは、脂肪酸生合成遺伝子およびアシルトランスフェラーゼ遺伝子の活性を最適化する条件下で成長させる。これは、脂質の最大で最も経済的な収量の生成をもたらす。概して、最適化され得る培地の条件としては、炭素源の種類および量、窒素源の種類および量、炭素対窒素の比率、酸素レベル、成長温度、ｐＨ、バイオマス生成段階の長さ、脂質蓄積段階の長さ、および細胞収穫時期が挙げられる。
【０２６８】
発酵培地は、好適な炭素源を含まなければならない。好適な炭素源としては、単糖類（例えば、グルコース、フルクトース）、二糖類（例えば、ラクトース、スクロース）、オリゴ糖、多糖類（例えば、デンプン、セルロース、またはこれらの混合物）、糖アルコール類（例えば、グリセロール）、または再生可能な原料（例えば、チーズホエー透過物、コーンスティープリーカー、サトウダイコンモラセス、オオムギモルト）由来の混合物が挙げられ得るが、これらに限定されない。加えて、炭素源としては、アルカン、脂肪酸、脂肪酸エステル、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、ならびに植物油（例えば、ダイズ油）および動物脂肪を含む脂肪酸の種々の商業的供給源が挙げられ得る。加えて、炭素基質としては、鍵となる生化学的中間体への代謝的変換が実証されている、１炭素基質（例えば、二酸化炭素、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸塩、炭素含有アミン）が挙げられ得る。したがって、本発明で利用される炭素の供給源は、様々な炭素含有基質を包含し得、宿主微生物の選択によってだけ限定されることが想定される。上述の炭素基質の全ておよびそれらの混合物は、本発明において好適であると考えられるが、好ましい炭素基質は、糖類および／または脂肪酸である。１０〜２２個の炭素を含むグルコースまたは脂肪酸が最も好ましい。
【０２６９】
窒素は、無機源（例えば、（ＮＨ４）２ＳＯ４）または有機源（例えば、尿素、グルタミン酸塩）から供給されてもよい。適切な炭素源および窒素源に加えて、発酵培地はまた、好適な無機質、塩、共同因子、緩衝剤、ビタミン類、および脂質の生成に必要な微生物の成長および酵素的経路の促進に好適な、当業者に知られている他の成分を含んでもよい。
【０２７０】
発酵に好適なｐＨの範囲は、典型的に、約ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０であり、初期成長条件の範囲としては、ｐＨ５．５〜ｐＨ７．０が好ましい。発酵は、好気性または嫌気性条件下で行われてもよいが、ここでは、微好気性条件が好ましい。
【０２７１】
典型的に、代謝の状態は、脂肪の成長と合成／貯蔵との間で「バランスを取ら」なければならないので、油脂性微生物の細胞における高レベルの脂質の蓄積は、２段階プロセスを必要とする。したがって、最も好ましくは、２段階発酵プロセスが微生物における脂質の生成に必要である。この手法において、発酵の第１段階は、細胞塊の生成および蓄積専用であり、迅速な細胞成長および細胞分裂を特徴とする。発酵の第２段階では、高レベルの脂質の蓄積を促進するために、培養物中に窒素欠乏状態を確立することが好ましい。この窒素欠乏の効果は、細胞中のＡＭＰの有効濃度を低減させることであり、それによって、ミトコンドリアのＮＡＤ依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼの活性が低減する。これが起こると、クエン酸が蓄積し、したがって、アセチルＣｏＡの大量のプールを細胞質中に形成し、脂肪酸の合成に備える。したがって、この段階は、細胞分裂の停止、それに続く、脂肪酸の合成およびＴＡＧの蓄積を特徴とする。
【０２７２】
細胞は、典型的に、約３０℃で成長するが、いくつかの研究は、より低い温度での増加した不飽和脂肪酸の合成を示している。プロセスの経済的な側面に基づいて、この温度シフトは、大量の微生物の成長が起こったときに、２段階発酵の第１段階の後に起こる可能性が高い。
【０２７３】
インスタントな核酸を使用した脂質の商業的生成が所望される場合に、種々の発酵プロセス設計が適用され得ることが想定される。例えば、組み換え微生物宿主由来の脂質の商業的生成は、バッチ、フェドバッチ、または連続発酵プロセスによって生成されてもよい。
【０２７４】
バッチ発酵プロセスは、閉じた系であり、該系において、培地組成は、プロセスの開始時にセットされ、プロセス中のｐＨおよび酸素レベルの維持に必要なもの以外は、さらなる添加を受けない。したがって、培養プロセスの開始時に、所望の生物が培地に接種され、培地への付加的な基質（すなわち、炭素源および窒素源）の追加を伴わずに、成長活性または代謝活性が可能となる。バッチプロセスにおいて、系の代謝物質およびバイオマス組成物は、培養が終了するまで常に変化する。典型的なバッチプロセスにおいて、細胞は、静止遅滞期から高成長対数期までを通して、そして最終的に静止期まで加減し、成長速度は、低下または停止される。静止段階において、未処理のままの細胞は、最終的に死滅する。標準的なバッチプロセスの変形例は、フェドバッチプロセスであり、該プロセスでは、発酵プロセスの間、基質が発酵槽に継続的に添加される。フェドバッチプロセスも、本発明において好適である。フェドバッチプロセスは、カタボライト抑制が細胞の代謝を阻害する傾向があるとき、またはどの時点においても培地中の基質の量を制限することが望ましい場合に有用である。フェドバッチ系における基質濃度の測定は困難であり、したがって、ｐＨ、溶解した酸素、および廃ガス（例えば、ＣＯ２）の分圧等の測定可能な因子の変化に基づいて推定され得る。バッチ培養法およびフェドバッチ培養法は、一般的であり、当技術分野でよく知られており、ＢｒｏｃｋのＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２．ｓｕｐ．ｎｄ  ｅｄ．，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．，（１９８９）、またはＤｅｓｈｐａｎｄｅおよびＭｕｋｕｎｄ（１９９２）で見出され得る。
【０２７５】
ここで記載する細胞を使用した脂質の商業的生成はまた、発酵プロセスによっても達成され得、該発酵プロセスでは、合成培地が生物反応器に連続的に添加されると同時に、産物回収のために等量の培地体積が同時に除去される。連続培養法は、一般に、細胞を、一定の細胞密度で成長の対数期に維持する。連続培養法または半連続培養法は、細胞成長または最終産物濃度に影響を及ぼす１つの因子もしくは任意の数の因子の調節を可能にする。例えば、１つの手法は、炭素源を制限して、全ての他のパラメータが代謝を加減することを可能にする。他の系では、成長に影響を及ぼすいくつかのの因子が連続的に変化させ得る一方で、培地濁度で測定される細胞濃度は、一定に保たれる。連続系は、恒常的成長を維持することを目指し、したがって、細胞成長速度は、培養物から取り除かれている媒体による細胞の損失に対してバランスを取らなければならない。連続培養プロセスの栄養および成長因子を調節する方法、ならびに産物形成の速度を最大化するための手法は、産業微生物学の技術分野でよく知られており、前掲のＢｒｏｃｋによって種々の方法が詳述されている。
【０２７６】
ＰＵＦＡを含む脂肪酸は、遊離脂肪酸として、またはアシルグリセロール、リン脂質、スルホリピド、または糖脂質等のエステル化形態で、宿主微生物中に見出され得、当技術分野でよく知られている種々の手段を通して宿主細胞から抽出され得る。
【０２７７】
概して、ＰＵＦＡを含む脂肪酸を精製するための手段としては、有機溶媒による抽出、超音波処理、超臨界流体抽出（例えば、二酸化炭素を使用する）、鹸化および圧搾等の物理的手段、またはそれらの組み合わせが挙げられ得る。特に関心があるのは、水の存在下でのメタノールおよびクロロホルムによる抽出である（ＢｌｉｇｈおよびＤｙｅｒ，１９５９）。所望により、負に帯電した部分をプロトン化し、それによって、所望の産物の有機層中への分配を増加させるために、水層を酸性化することができる。抽出後、窒素流の下での蒸発によって有機溶媒を除去することができる。複合体の形態で単離したときに、遊離脂肪酸またはそれほど複雑でない関心の複合体を放出するように、産物を酵素的または化学的に切断してもよく、次いで、所望の最終産物を得るために更なる操作に供することができる。望ましくは、脂肪酸の複合体の形態は、水酸化カリウムで切断する。
【０２７８】
さらなる精製が必要である場合は、標準的な方法を用いることができる。そのような方法としては、抽出、尿素での処理、分別結晶、ＨＰＬＣ、分別蒸留、シリカゲルクロマトグラフィ、高速遠心分離もしくは蒸留、またはこれらの手法の組合せが挙げられる。酸またはアルケニル基等の反応基の保護は、既知の技術（例えば、アルキル化またはヨウ素化）を通して、任意のステップで行なってもよい。使用される方法としては、メチルエステルを生成するための脂肪酸のメチル化が挙げられる。同様に、保護基は、任意のステップで除去されてもよい。望ましくは、ＧＬＡ、ＳＴＡ、ＡＲＡ、ＤＨＡ、およびＥＰＡ含有する画分の精製は、尿素での処理および／または分別蒸留による処理によって達成されてもよい。
【０２７９】
脂質の用途
説明される方法によって生成される脂質は、種々の用途を有する。いくつかの実施形態において、脂質は、食物油として使用される。他の実施形態において、脂質は、精製されて、潤滑剤として、またはプラスチックの合成等の他の工業的用途に使用される。いくつかの好適な実施形態において、脂質は、バイオディーゼルを生成するために精製される。
【０２８０】
バイオディーゼル
バイオディーゼルまたはアルキルエステルの生成は、よく知られている。脂質からのエステル生成には、次の３つの基本的な経路がある。すなわち、１）アルコールによる、脂質の塩基触媒エステル交換、２）メタノールによる脂質の直接的な酸触媒エステル化、および３）脂質の脂肪酸への変換、その後の、酸触媒によるアルキルエステルへの変換、である。
【０２８１】
いくつかの好ましい実施形態では、脂質をエステル交換して、メチルエステルおよびグリセロールを生成する。いくつかの好ましい実施形態では、触媒（カリウムまたは水酸化ナトリウム）の存在下で、脂質をアルコール（メタノールまたはエタノール等）と反応させて、アルキルエステルを生成する。アルキルエステルは、バイオディーゼルに使用すること、または石油に基づく燃料と混合することができる。
【０２８２】
飼料
本発明は、飼料として使用することができる組成物を含む。本発明の目的について、「飼料」としては、体内に取り込んだときに、（１）組織に栄養分を与える、もしくは組織を作り上げる、またはエネルギーを供給する役目をする、および／または（２）十分な栄養状態もしくは代謝機能を維持する、回復させる、もしくは支援する、（経腸および／もしくは腸管外摂取を含む）ヒトまたは動物の摂取のためのあらゆる食品または調製物が挙げられる。本発明の飼料は、乳児および／または幼児のための栄養組成物を含む。
【０２８３】
本発明の飼料は、例えば、本発明の細胞、本発明の植物、本発明の植物部、本発明の種子、本発明の抽出物、本発明の方法の産物、本発明の発酵プロセスの産物、または適切な担体を伴う組成物を含む。「担体」という用語は、栄養価を有してもよい、または有しなくてもよいあらゆる成分を包含するように、その最も広い意味で使用される。当業者が理解するように、担体は、飼料を摂取する生物に対して悪影響を有しないように、該飼料における使用に対して好適なものでなければならない（または十分に低い濃度で使用されなければならない）。
【０２８４】
本発明の飼料は、本明細書で開示される方法、細胞、または生物を使用することによって直接的または間接的に生成される脂質を含む。組成物は、固体または液体形態のいずれかであってもよい。加えて、組成物は、特定の用途に所望される量の食用の多量栄養素、ビタミン、および／または鉱物を含んでもよい。これらの成分の量は、組成物が、正常な個体による使用を意図しているのか、または代謝障害等を罹患している個体等の特別な必要性を有する個体による使用を意図しているのかに応じて変動する。
【０２８５】
栄養価を有する好適な担体の例としては、食用脂肪、炭水化物、およびタンパク質等の多量栄養素が挙げられるが、これらに限定されない。そのような食用脂肪の例としては、ヤシ油、ルリヂサ油、真菌油、ブラックカラント油、ダイズ油、ならびにモノグリセリドおよびジグリセリドが挙げられるが、これらに限定されない。そのような炭水化物の例としては、グルコース、食用のラクトース、および加水分解されたデンプンが挙げられるが、これらに限定されない。加えて、本発明の栄養組成物において利用され得るタンパク質の例としては、ダイズタンパク質、電気透析されたホエー、電気透析された脱脂乳、ミルクホエー、またはこれらのタンパク質の加水分解物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８６】
ビタミンおよび鉱物に関して、カルシウム、リン、カリウム、ナトリウム、塩化物、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、セレニウム、ヨウ素、ならびにビタミンＡ、Ｅ、Ｄ、Ｃ、およびＢ複合体が、本発明の飼料組成物に添加されてもよい。また、他のそのようなビタミンおよび無機質が添加されてもよい。
【０２８７】
本発明の飼料組成物において利用される成分は、半精製起源または精製起源のものとすることができる。半精製または精製とは、天然材料の精製によって、またはデノボ合成によって調製された材料を意味する。
【０２８８】
本発明の飼料組成物はまた、食餌による補充が必要とされないときであっても、食物に添加されてもよい。例えば、組成物は、あらゆる種類の食物に添加されてもよく、該食物としては、マーガリン、改質バター、チーズ、乳、ヨーグルト、チョコレート、キャンディ、スナック、サラダ油、料理油、料理脂肪、肉、魚、および飲料が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８９】
サッカロミセス種は、ビールの醸造およびワイン製造の双方で使用され、特にパンを焼く際の薬剤としても使用される。酵母は、野菜抽出物の主成分である。酵母はまた、動物飼料における添加剤としても使用される。本明細書で説明されるように脂質を合成するように適合させた、遺伝的に修飾された酵母株を提供できることが明らかになるであろう。次いで、これらの酵母株を、食品に、ならびにワインおよびビールの製造において使用して、増強した脂肪酸含量を有する産物を提供することができる。
【０２９０】
加えて、本発明に従って生成される脂肪酸、または対象遺伝子を含み発現するように形質転換された宿主細胞はまた、動物の組織または乳脂肪酸組成をヒトまたは動物の摂取に対してより望ましいものに変化させる、動物の食物サプリメントとしても使用され得る。そのような動物の例としては、ヒツジ、ウシ、ウマ等が挙げられる。
【０２９１】
さらに、本発明の飼料は、水産養殖で使用して、ヒトまたは動物が摂取する魚における脂肪酸のレベルを増加させることができる。
【０２９２】
本発明の好ましい飼料は、ヒトまたは他の動物の食物または餌として直接使用され得る、葉、果実、および茎等の植物、種子および他の植物部である。例えば、動物は、野外で成長したそのような植物を直接食べてもよく、または制御された給餌でより多くの計量した量を動物に給餌してもよい。本発明は、ヒトおよび他の動物における多価不飽和脂肪酸レベルを増加させるための餌としての、そのような植物および植物部の使用を含む。
【０２９３】
組成物
本発明はまた、本発明の方法を使用して生成される１つ以上の脂質を含む、組成物、特に医薬組成物も包含する。
【０２９４】
医薬組成物は、リン酸緩衝食塩水、水、エタノール、ポリオール、植物油、湿潤剤、または乳剤（油中水型乳剤等）等の、標準的な、よく知られている、無毒の薬学的に許容可能な担体、アジュバント、またはビヒクルと組み合わせた、脂質の１つ以上を含んでもよい。本組成物は、液体形態または固体形態のいずれかであってもよい。例えば、本組成物は、錠剤、カプセル、摂取可能な液体、粉末、局所用軟膏、またはクリームの形態であってもよい。適切な流動性は、例えば、分散液の場合に必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。また、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウム等を含むことも望ましくなり得る。そのような不活性希釈剤の他に、本組成物は、湿潤剤等のアジュバント、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、着香剤、および芳香剤を含むこともできる。
【０２９５】
懸濁液は、活性化合物に加えて、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカントゴム、またはこれらの物質の混合物等の懸濁化剤を含んでもよい。
【０２９６】
錠剤およびカプセル等の固体剤形は、当技術分野でよく知られている手法を使用して調製することができる。例えば、本発明に従って生成される脂質は、結合剤（アカシア、コーンスターチ、またはゼラチン等）、崩壊剤（ジャガイモデンプンまたはアルギン酸等）、および滑沢剤（ステアリン酸またはステアリン酸マグネシウム等）と組み合わせて、従来の錠剤基剤（ラクトース、スクロース、およびコーンスターチ等）とともに錠剤成形することができる。カプセル剤は、抗酸化剤および関連の脂質とともにこれらの賦形剤をゼラチンカプセルに組み込むことによって調製することができる。
【０２９７】
静脈内投与のために、本発明に従って生成される脂質またはその誘導体を、商業的配合物に組み込むことができる。
【０２９８】
特定の脂肪酸の典型的な投与量は、０．１ｍｇ〜２０ｇで、１日あたり１回〜５回（１日最高１００ｇ）服用され、好ましくは、１日あたり約１０ｍｇ〜約１、２、５または１０ｇの範囲（１回または複数回投与で服用）である。当技術分野で知られているように、最低で約３００ｍｇ／日の脂肪酸（特に、多価不飽和脂肪酸）が望ましい。しかしながら、あらゆる量の脂肪酸が対象にとって有益であることが認識されるであろう。
【０２９９】
本発明の医薬組成物の可能な投与経路としては、例えば、腸内および腸管外が挙げられる。例えば、液体調製物を経口的に投与してもよい。加えて、均質の混合物を水中に完全に分散させ、生理学的に許容される希釈剤、保存剤、緩衝剤、または噴射剤と無菌条件下で混合して、噴霧剤または吸入剤を形成することができる。
【０３００】
対象に投与される組成物の投与量は、当業者によって決定されてもよく、様々な因子、対象の体重、年齢、全体的な健康、既往歴、免疫状態等の種々の要因に依存する。
【０３０１】
さらに、本発明の組成物は、化粧品の目的で利用されてもよい。この組成物は、混合物が形成されるように、先在の化粧品組成物に添加されてもよく、または本発明に従って生成される脂肪酸を、化粧品組成物中の唯一の「活性」成分として使用してもよい。
【０３０２】
ポリペプチド
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、一般に、同じ意味で使用される。
【０３０３】
ポリペプチドまたはポリペプチド類は、参照アミノ酸配列に対するそのアミノ酸配列の同一性の程度（同一性％）によって、または一方の参照アミノ酸配列が他方よりも大きい同一性％を有することによって定義され得る。参照アミノ酸配列に対するポリペプチドの同一性％は、典型的に、ギャップ作成ペナルティ＝５およびギャップ伸長ペナルティ＝０．３のパラメータで、ＧＡＰ分析（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０、ＧＣＧプログラム）によって決定される。問い合わせ配列は、長さが少なくとも１００個のアミノ酸であり、ＧＡＰ分析は、少なくとも１００個のアミノ酸の領域にわたって２つの配列を整合させる。より好ましくは、問い合わせ配列は、長さが少なくとも２５０個のアミノ酸であり、ＧＡＰ分析は、少なくとも２５０個のアミノ酸の領域にわたって２つの配列を整合させる。さらにより好ましくは、ＧＡＰ分析は、それらの全ての長さにわたって２つの配列を整合させる。ポリペプチドまたはポリペプチド類は、参照ポリペプチドと同じ酵素活性もしくは異なる活性を有してもよく、または参照ポリペプチドの活性が欠如していてもよい。好ましくは、ポリペプチドは、参照ポリペプチドの活性の少なくとも１０％の酵素活性を有する。
【０３０４】
本明細書で使用される「生物活性断片」は、完全長参照ポリペプチドの定義された活性、例えばＭＧＡＴ活性を維持する、本発明のポリペプチドの一部分である。本明細書で使用される生物活性断片は、完全長ポリペプチドを除外する。生物活性断片は、定義された活性を維持する限り、あらゆるサイズの部分とすることができる。好ましくは、生物活性断片は、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも１０％を維持する。
【０３０５】
定義されたポリペプチドまたは酵素に関して、本明細書で提供されるものよりも高い同一性％の値が、好ましい実施形態を包含することを理解されるであろう。したがって、該当する場合、最小の同一性％の値に照らして、ポリヌクレオチド／酵素は、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましく少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．１％、より好ましくは少なくとも９９．２％、より好ましくは少なくとも９９．３％、より好ましくは少なくとも９９．４％、より好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．６％、より好ましくは少なくとも９９．７％、より好ましくは少なくとも９９．８％、およびさらにより好ましくは少なくとも９９．９％、関連する指定された配列番号と同一である、アミノ酸配列を含むことが好ましい。
【０３０６】
本明細書で定義されるポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド変化を本明細書で定義される核酸の中に導入することによって、または所望のポリペプチドのインビトロ合成によって調製することができる。そのような変異体は、例えば、アミノ酸配列内の残基の欠失、挿入、または置換を含む。最終ペプチド産物が所望の特徴を保有するならば、欠失、挿入、および置換の組み合せを行って、最終的な構築体に到達させることができる。
【０３０７】
変異（改変）ポリペプチドは、当技術分野で知られている手法、例えば、指向性進化または合理的な設計方策（下記参照のこと）を使用して調製することができる。変異／改変ＤＮＡ由来の産物は、本明細書で説明される手法を使用して容易にスクリーニングして、それらがアシルトランスフェラーゼ活性、例えばＭＧＡＴ、ＤＧＡＴ、ＧＰＡＴ／ホスファターゼ活性を保有するかどうかを判定することができる。
【０３０８】
アミノ酸配列変異体を設計する際に、変異部位の場所および変異の性質は、修飾される特徴に依存する。変異の部位は、例えば、（１）最初に選択した保存的アミノ酸と置換し、次いで達成する結果に応じてより異なる選択したアミノ酸と置換することによって、（２）標的残基を欠失させることによって、または（３）位置する部位に隣接して他の残基を挿入することによって、個別にまたは連続的に修飾することができる。
【０３０９】
アミノ酸配列欠失は、一般に、約１個〜１５個の残基、より好ましくは約１〜１０個の残基、および典型的に、約１〜５個の連続した残基の範囲に及ぶ。
【０３１０】
置換変異体は、除去されたポリペプチド分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基と、その場所に挿入された異なる残基とを有する。置換変異誘発について最も大きい関心の部位としては、活性部位として特定される部位が挙げられる。他の関心の部位は、種々の株または種から得られる特定の残基が同一である部位である。これらの位置は、生物活性にとって重要であり得る。これらの部位、とりわけ、少なくとも３つの他の同様に保存された部位の配列内に含まれる部位は、好ましくは、比較的に保存的な様式で置換される。そのような保存的置換を、「例示的置換」という見出しで表１に示す。
【０３１１】
好ましい実施形態において、突然変異体／変異形ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドと比較したときに、１つ、もしくは２つ、もしくは３つ、もしくは４つだけ、またはそれを超えない保存的アミノ酸変化を有する。保存的アミノ酸変化の詳細を表１で提供する。当業者が認識するように、そのようなわずかな変化は、組み換え細胞において発現したときに、ポリペプチドの活性を変化させないように合理的に予測され得る。
【０３１２】
【表１】
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【０３１３】
指向性進化
指向性進化では、ランダムな変異誘発がタンパク質に適用され、所望の品質、例えば増加したアシルトランスフェラーゼ活性を有する変異形を選択するために、選択レジームが使用される。次いで、さらなる一連の変異および選択が適用される。典型的な指向性進化方策は、次の３つのステップを伴う。すなわち、
【０３１４】
１）多様化：関心のタンパク質をコードする遺伝子は、ランダムに変異させて、および／または組み換えて、遺伝子変異形の大きいライブラリを作成する。変異形遺伝子ライブラリは、エラープローンＰＣＲ（例えば、Ｌｅｕｎｇ，１９８９、ＣａｄｗｅｌｌおよびＪｏｙｃｅ，１９９２を参照されたい）を通して、親テンプレートから調整されるＤＮａｓｅＩ消化断片のプールから（Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４ａ、Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４ｂ、Ｃｒａｍｅｒｉ他，１９９８、Ｃｏｃｏ他，２００１）、縮重オリゴヌクレオチドから（Ｎｅｓｓ他，２００２、Ｃｏｃｏ，２００２）、もしくは双方の混合物から、さらには未消化の親テンプレートから（Ｚｈａｏ他，１９９８、Ｅｇｇｅｒｔ他，２００５、Ｊｅｚｅｑｕｅｋ他，２００８）構成することができ、通常は、ＰＣＲを通して組み立てられる。ライブラリはまた、相同的または非相同的組み換えによって、インビボまたはインビトロで再結合させた親配列から作製することもできる（Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ他，１９９９、Ｖｏｌｋｏｖ他，１９９９、Ｓｉｅｂｅｒ他，２００１）。変異遺伝子ライブラリはまた、関心の遺伝子を好適なベクターにサブクローン化し、該ベクターを大腸菌ＸＬ−１  ｒｅｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）等の「ミューテーター」株に形質転換し、そして、該形質転換した細菌を好適な数の世代にわたって繁殖させることによって構成することもできる。変異遺伝子ライブラリはまた、Ｈａｒａｙａｍａ（１９９８）によって概略的に説明されるように、関心の遺伝子をＤＮＡシャフリングに供する（すなわち、インビトロで、ランダムな断片化および再組み立てによって、選択された変異遺伝子のプールを相同的に組み換える）ことによって構成することもできる。
【０３１５】
２）選択：ライブラリは、スクリーニングまたは選択を使用して、所望の性質を有する変異体（変異形）の存在について試験される。スクリーニングは、手動による高機能性変異体の特定および単離を可能にする一方で、選択は、全ての機能しない変異体を自動的に排除する。スクリーニングは、既知の保存されたアミノ酸モチーフの存在に対するスクリーニングを伴ってもよい。代替として、または加えて、スクリーニングは、変異したポリヌクレオチドを宿主生物またはその一部において発現させることと、例えば生物またはその一部から抽出された脂質中の結果として生じた産物のレベルを定量化することによって、アシルトランスフェラーゼ活性のレベルを分析することと、変異したポリヌクレオチドが欠如している対応する生物またはその一部と比較して、生物またはその一部から抽出した脂質中の産物のレベルを判定することと、随意に、親（変異していない）ポリヌクレオチドを発現させることとを伴ってもよい。代替として、スクリーニングは、標識基質を生物またはその一部に供給することと、変異したポリヌクレオチドが欠如している対応する生物またはその一部と比較して、生物またはその一部における基質または産物のレベルを判定することと、随意に、親（変異していない）ポリヌクレオチドを発現させることとを伴ってもよい。
【０３１６】
３）増幅：選択またはスクリーニングで同定される変異形は、何度も複製され、どのような変異が起こったのかを研究者が理解するためにそれらのＤＮＡを配列決定することを可能にする。
【０３１７】
合わせて、これらの３つのステップは、「１回」の指向性進化と称される。大部分の実験は、２回以上必要になる。これらの実験において、以前の回の「勝者」は、新しいライブラリを作成するために次の回において多様化される。実験終了後、全ての進化したタンパク質またはポリヌクレオチド変異体は、生化学的方法を使用して特徴付けられる。
【０３１８】
合理的設計
タンパク質は、タンパク質構造および折り畳みに関する既知の情報に基づいて、合理的に設計することができる。これは、ゼロからの設計（デノボ設計）によって、または天然の足場に基づく再設計（例えば、Ｈａｌｌｉｎｇａ，１９９７、およびＬｕ  ａｎｄ  Ｂｅｒｒｙ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ２，１１５３−１１５７（２００７）を参照されたい）によって達成することができる。タンパク質設計は、典型的に、所与または標的の構造に折り畳む配列を特定することを伴い、コンピュータモデルを使用して達成することができる。コンピュータによるタンパク質設計アルゴリズムは、標的構造に折り畳んだときにエネルギーが低い配列について配列−配座空間を検索する。コンピュータによるタンパク質設計アルゴリズムは、どのくらいの変異がタンパク質の構造および機能に影響を及ぼすのかを評価するために、タンパク質エネルギー学のモデルを使用する。これらのエネルギー関数は、典型的に、分子力学、統計学（すなわち知識に基づくもの）、および他の経験項を含む。好適な、入手可能なソフトウェアとしては、ＩＰＲＯ（Ｉｎｔｅｒａｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）、ＥＧＡＤ（ＡＧｅｎｅｔｉｃ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ）、Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｄｅｓｉｇｎ、Ｓｈａｒｐｅｎ、およびＡｂａｌｏｎｅ．が挙げられる。
【０３１９】
また、本発明の範囲内には、例えばビオチン化、ベンジル化、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質切断、抗体分子への結合、または他の細胞リガンド等によって、合成中または合成後に個別に修飾される、本明細書で定義されるポリペプチドが含まれる。これらの修飾体は、本発明のポリペプチドの安定性および／または生物活性を増加させる役目をし得る。
【０３２０】
アシルトランスフェラーゼの同定
一態様において、本発明は、細胞においてＭＡＧ、ＤＡＧ、および／またはＴＡＧを生成する増加した能力を有するアシルトランスフェラーゼをコードする核酸分子を特定するための方法を提供する。
【０３２１】
本方法は、細胞において活性であるプロモーターに操作可能に連結されるアシルトランスフェラーゼをコードする核酸分子を含む細胞を得ることを含む。核酸分子は、ＭＧＡＴ、ＧＰＡＴ、および／もしくはＤＧＡＴ、またはその変異体等の自然発生的なアシルトランスフェラーゼをコードし得る。変異体は、関心の既知の遺伝子に対するランダムな変異誘発、標的変異誘発、もしくは飽和変異誘発による、または異なる遺伝子をＤＮＡシャフリングに供する等による、当技術分野において標準的な手順（上記を参照されたい）を使用して操作されてもよい。例えば、ＭＧＡＴをコードする配列番号１〜４４のいずれか１つから選択される配列を含むポリヌクレオチドは、ランダムに変異させて、および／または組み換えて、例えばエラープローンＰＣＲおよび／またはＤＮＡシャフリングを使用して、遺伝子変異形（変異体）の大きいライブラリを作成してもよい。変異体は、それらが保存されたアミノ酸モチーフを含むことに基づいて、さらなる調査のために選択されてもよい。例えば、ＭＧＡＴをコードする候補核酸の場合、当業者は、（例えば、本明細書で説明されるような、植物細胞等の宿主細胞への形質移入、およびアシルトランスフェラーゼ（すなわち、ＭＧＡＴ）に対するアッセイによって）核酸が機能的ＭＧＡＴ変異体をコードするかどうかを試験する前に、配列番号２２０、２２１、２２２、２２３、および／または２２４で提供される配列を含むかどうかを判定してもよい。核酸またはその断片の直接ＰＣＲ配列決定は、正確なヌクレオチド配列を決定し、対応するアミノ酸配列を推測し、それによって、保存されたアミノ酸配列を特定するために使用されてもよい。保存されたアミノ酸配列に基づく縮重プライマーを、直接ＰＣＲ増幅に使用してもよい。縮重プライマーはまた、ＤＮＡハイブダイゼーションアッセイのプローブとして使用することもできる。代替として、保存されたアミノ酸配列は、タンパク質ハイブリダイゼーションアッセイで検出され得る。該アッセイは、例えば、保存されたアミノ酸配列に特異的に結合する抗体、または例えば、ＦＬＸＬＸＸＸＮ（推定中性脂質結合ドメイン、配列番号２２４）に結合する脂質等の、保存されたアミノ酸配列に特異的に結合する基質を利用する。
【０３２２】
一実施形態において、核酸分子は、ＭＧＡＴをコードする、ヌクレオチドの配列を含む。ヌクレオチドの配列は、ｉ）配列番号１〜４４のいずれか１つから選択される配列を含むか、ｉｉ）配列番号４５〜８２のいずれか１つで提供される配列を有するアミノ酸を含むポリペプチド、またはその生物活性断片をコードするか、ｉｉｉ）ｉ）またはｉｉ）と少なくとも５０％同一であるか、またはｉｖ）緊縮条件下で、ｉ）〜ｉｉｉ）のいずれか１つにハイブリッド形成してもよい。別のまたは付加的な実施形態において、核酸分子は、配列番号２２０、２２１、２２２、２２３、および２２４で提供される１つ以上の保存されたＤＧＡＴ２および／またはＭＧＡＴ１／２つのアミノ酸配列をコードする、ヌクレオチドの配列を含む。好ましい実施形態において、核酸分子は、配列番号２２０および／または配列番号２２４で提供される保存されたアミノ酸配列をコードする、ヌクレオチドの配列を含む。
【０３２３】
別の実施形態において、核酸分子は、ＧＰＡＴ、好ましくは、ホスファターゼ活性を有するＧＰＡＴをコードする、ヌクレオチドの配列を含む。ヌクレオチドの配列は、ｉ）配列番号８４〜１４１のいずれか１つから選択される配列を含むか、ｉｉ）配列番号１４４〜２０１のいずれか１つで提供される配列を有するアミノ酸を含むポリペプチド、またはその生物活性断片をコードするか、ｉｉｉ）ｉ）もしくはｉｉ）と少なくとも５０％同一であるか、またはｉｖ）緊縮条件下で、ｉ）〜ｉｉｉ）のいずれか１つにハイブリッド形成してもよい。別のまたは付加的な実施形態において、核酸分子は、配列番号２２５、２２６、および２２７で提供される１つ以上の保存されたＧＰＡＴアミノ酸配列をコードするヌクレオチドの配列、またはそれらと少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％同一であるアミノ酸の配列を含む。
【０３２４】
別の実施形態において、核酸分子は、ＤＧＡＴ２をコードする、ヌクレオチドの配列を含む。ヌクレオチドの配列は、ｉ）配列番号２０４〜２１１のいずれか１つから選択されるヌクレオチドの配列を含むか、ｉｉ）配列番号２１２〜２１９のいずれか１つで提供される配列を有するアミノ酸を含むポリペプチド、またはその生物活性断片をコードするか、ｉｉｉ）ｉ）もしくはｉｉ）と少なくとも５０％同一であるか、またはｉｖ）緊縮条件下で、ｉ）〜ｉｉｉ）のいずれか１つにハイブリッド形成してもよい。好ましい実施形態において、ＤＧＡＴ２は、配列番号２０４のヌクレオチドの配列、および／または配列番号２１２で提供される配列を有するアミノ酸を含むポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列を含む。
【０３２５】
細胞において活性であるプロモーターに操作可能に連結されるアシルトランスフェラーゼをコードする核酸分子を含む細胞は、例えば、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール処理、電気穿孔、およびこれらの処理の組み合せによって、核酸分子を細胞の中に導入すること等による当技術分野において標準的な手順を使用して得てもよい。細胞形質転換の他の方法を使用することもでき、直接的なＤＮＡ転移または注入によるＤＮＡの植物への導入が挙げられるが、これに限定されない。形質転換された植物細胞は、本明細書で説明されるアグロバクテリウム媒介転移および加速法を使用して得てもよい。
【０３２６】
本方法は、実施例１で例示されるような当技術分野で知られている手法を使用して、細胞中で生成されたＭＡＧ、ＤＡＧ、および／またはＴＡＧのレベルが、核酸が欠如している対応する細胞と比較して増加したかどうかを判定することをさらに含む。例えば、脂質は、クロロホルム／メタノール溶液中で抽出し、乾燥し、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）によって分離することができる。ＴＡＧ、ＤＡＧ、ＭＡＧ、遊離脂肪酸、および他の脂質がなにであるかは、ヨウ素蒸気で染色した後に、内部脂質標準で検証することができる。結果として生じたクロマトグラムは、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ、および既知の量の内部標準に基づいて定量化されたＭＡＧ、ＤＡＧ、およびＴＡＧの量を使用して分析することができ、細胞は、ｓｎ−２−モノオレオイルグリセロール［１４Ｃ］または［１４Ｃ］グリセロール−３−リン酸が供給され、液体シンチレーション計数によって数量化される放射活性が関連付けられてもよい（すなわち標識したＭＡＧ、ＤＡＧ、およびＴＡＧの量が定量化される）。
【０３２７】
本方法は、細胞のＭＡＧ、ＤＡＧ、および／またはＴＡＧを生成する増加した能力を有するアシルトランスフェラーゼをコードする核酸分子を特定することをさらに含む。好ましい実施形態において、アシルトランスフェラーゼは、ＭＧＡＴ経路における酵素反応を触媒する。さらなる好ましい実施形態において、ＤＡＧは、ＭＧＡＴ経路を介して増加する（すなわち、脂肪アシルＣｏＡによるＭＡＧのアシル化は、ＭＧＡＴによって触媒されて、ＤＡＧを形成する）。別のまたは付加的な実施形態において、基質ＭＡＧは、ホスファターゼ活性も有するＧＰＡＴによって生成され、および／またはＤＡＧは、ＤＧＡＴおよび／またはＤＧＡＴ活性を有するＭＧＡＴによって脂肪アシルＣｏＡでアシル化されて、ＴＡＧを形成する。
【実施例】
【０３２８】
実施例１．一般的な材料および方法
一過性発現系での植物細胞における遺伝子の発現
遺伝子は、基本的に、Ｖｏｉｎｎｅｔ他（２００３）およびＷｏｏｄ他（２００９）によって説明されるような一過性発現系を使用して発現させた。複製したエンハンサー領域を含む強力な構成的ｅ３５Ｓプロモーターによって発現するコード領域を含むバイナリベクターを、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＧＬ１に導入した。ｐ１９ウイルスサイレンシングサプレッサーを発現するためのキメラバイナリベクター３５Ｓ：ｐ１９を、国際特許公開第ＷＯ２０１０／０５７２４６号で説明されるように、ＡＧＬ１に別々に導入した。組み換え細胞を、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンおよび５０ｍｇ／Ｌのリファンビシンを補充したＬＢブロスにおいて、２８℃で静止期まで成長させた。次いで、細菌を、５０００ｇで、室温における５分間の遠心分離によってペレット化し、その後に、１０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ５．７、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、および１００μＭのアセトシリンゴンを含む浸潤緩衝液中に、ＯＤ６００＝１．０になるように再懸濁した。次いで、細胞を、２８℃で３時間振盪しながらインキュベートし、その後に、ＯＤ６００を測定し、ＯＤ６００＝０．１２５という最終濃度に到達させるために必要とされる量の、３５Ｓ：ｐ１９を含む各培養物を新鮮な管に加えた。最終的な体積は、前述の緩衝剤で補った。次いで、培養物混合物を葉に浸潤させ、浸潤後さらに３〜５日間植物を成長させ、その後、精製した細胞溶解物調製物または総脂質単離のために葉片を回収した。対照浸潤物は、３５ｓ：ｐ１９株だけとした。
【０３２９】
精製した葉溶解物アッセイ
上で説明したように事前に浸潤させたニコチアナ・ベンサミアナの葉組織を、ガラスホモジナイザを使用して、０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）および０．３３Ｍのスクロースを含む溶液中ですりつぶした。葉ホモジェネートを、４℃、２０，０００ｇで４５分間遠心分離し、その後に、各上清を採集した。各上清中のタンパク含有量を、Ｗａｌｌａｃ１４２０マルチレベルカウンタおよびＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ色素試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡＵＳＡ）を使用して、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）に従って測定した。アシルトランスフェラーゼアッセイでは、いくつかの改良を伴って、Ｃａｏ他（２００７）に従って、１００μｇのタンパク質を使用した。反応培地は、１００ｍＭのＨＣｌ（ｐＨ７．０）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（脂肪酸含まず）、２００ｍＭのスクロース、４０ｍＭの低温オレオイル−ＣｏＡ、１６．４μＭのｓｎ−２−モノオレオイルグリセロール［１４Ｃ］（５５ｍＣｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯＵＳＡ）、または６．０μＭの［１４Ｃ］グリセロール−３−リン酸（Ｇ−３−Ｐ）ジナトリウム塩（１５０ｍＣｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含めた。アッセイは、７．５分、１５分、または３０分にわたって行った。
【０３３０】
脂質分析
葉溶解物アッセイからの脂質の分析
溶解物アッセイによる脂質を、クロロホルム：メタノール：０．１ＭのＫＣｌ（２：１：１）を使用して抽出して、回収した。試料中の異なる脂質クラスを、１０％のホウ酸を含浸させたＳｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ６０薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）プレート（Ｍｅｒｃｋ，Ｄｅｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で分離した。脂質抽出物からＴＡＧを分画するために使用した溶媒系は、クロロホルム／アセトン（９０／１０  ｖ／ｖ）で構成した。個々の脂質クラスを、プレートをヨウ素蒸気に露出することによって視覚化し、同じＴＬＣプレート上で真正標準を並列に実行することによって特定した。プレートを、蛍光体撮像スクリーンに一晩露出し、ＤＰＭで定量化するために、液体シンチレーション計数の前にＦｕｊｉｆｉｌｍ  ＦＬＡ−５０００  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒによって分析した。
【０３３１】
総脂質の単離および分画
組織を、ＢｌｉｇｈおよびＤｙｅｒ（１９５９）によって説明されるように冷凍乾燥させて、総脂質を抽出した。各試料中の異なる脂質クラスを、Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ６０  ＴＬＣプレート上で分離した。中性脂質（ＮＬ）および極性脂質（ＰＬ）を分画するために使用した溶媒系は、ヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（７０／３０／１  ｖ／ｖ／ｖ）で構成した。個々の脂質クラスを、プレートをヨウ素蒸気に露出することによって視覚化し、同じＴＬＣプレート上で並列真正標準を実行することによって同定した。
【０３３２】
脂質試料中の脂肪酸組成を決定するために、ＴＡＧ、ＤＡＧおよび／もしくはＭＡＧ、またはＰＬ画分を含むＮＬの脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を、ＴＬＣプレートから対応するバンドを除去し、内部標準としての既知の量のヘキサデカン酸とともに、メタノール／ＨＣｌ／ジクロロメタン（１０／１／１  ｖ／ｖ／ｖ）溶液中で、８０℃で２時間インキュベートすることによって生成した。ＦＡＭＥを、ヘキサン／ＤＣＭ中で抽出し、ヘキサン中で小体積に濃縮し、ガスクロマトグラフに注入した。
【０３３３】
脂質画分中に存在する個々の脂肪酸および総脂肪酸（ＴＦＡ）の量を、各ピーク面積を決定することによって定量化し、既知の量の内部標準に対するピーク面積と比較することによって計算した。
【０３３４】
毛細管気液クロマトグラフィ（ＧＣ）
Ｅｑｕｉｔｙ（商標）−１溶融シリカ毛細管カラム（１５ｍ×０．１ｍｍのｉ．ｄ．、０．１μｍの膜厚）、ＦＩＤ、スプリット／スプリットレス注射器、ならびにＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ７６８３シリーズ自動試料採取器および注射器を備える、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ６８９０Ｎガスクロマトグラフ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用して、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）によってＦＡＭＥを分析した。ヘリウムを担体ガスとして使用した。試料を、１２０℃のオーブン温度で、スプリットレスモードで注入した。注入後、オーブン温度を、１分あたり１０℃で２７０℃まで上昇させ、最後に１分あたり５℃で３１０℃まで上昇させた。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウエア（ＲｅｖＢ．０３．０１（３１７）、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を用いてピークを定量化した。
【０３３５】
サッカロミセス・セレビシエＨ１２４６のＤＧＡＴアッセイ
サッカロミセス・セレビシエ株Ｈ１２４６は、ＤＧＡＴ活性が全くなく、かつ４つの遺伝子（ＤＧＡ１、ＬＲＯ１、ＡＲＥ１、ＡＲＥ２）におけるノックアウト変異の結果として、ＴＡＧおよびステロールエステルが欠如している。Ｈ１２４６成長媒体への遊離脂肪酸の添加（例えば、１ｍＭ、１８：１Δ９）は、ＤＧＡＴ活性がない場合に有毒である。したがって、そのような培地での成長は、この酵母株におけるＤＧＡＴ活性の存在についての指標または選択肢として使用することができる。
【０３３６】
Ｓ．セレビシエＨ１２４６を、ｐＹＥＳ２構築体（陰性対照）、ｐＹＥＳ２においてアラビドプシス・サリアナＤＧＡＴ１をコードする構築体、またはｐＹＥＳ２においてマス・マスクルスＭＧＡＴ２をコードする構築体で形質転換した。形質転換体には、［１４Ｃ］１８：１Δ９遊離脂肪酸を供給した。
【０３３７】
別々の実験では、Ｓ．セレビシエＨ１２４６を、ｐＹＥＳ２構築体（陰性対照）、ｐＹＥＳ２においてＢｅｒｎａｄｉａ  ｐｕｌｃｈｅｌｌａＤＧＡＴ１をコードする構築体、またはｐＹＥＳ２においてＭ．マスクルスＭＧＡＴ１をコードする構築体で形質転換し、１８：１Δ９遊離脂肪酸をそれに供給した。ｐＹＥＳ２で形質転換したＳ．セレビシエＳ２８８Ｃ野生型株を、陽性対照として提供した。
【０３３８】
酵母形質転換体を、滅菌ｍＱ水中に再懸濁して、ＯＤ６００＝１に希釈した。試料は、４つの連続する希釈物に、それぞれ１／１０にさらに希釈した。２μＬの各希釈物を、２μＬのｍＱ水および２μＬの非形質転換Ｈ１２４６細胞懸濁液（ＯＤ６００＝１）とともに、プレート（ＹＮＢＤ、ＹＮＢＧ、ＹＮＢＧ＋ＦＡ）のそれぞれにスポットした。プレートを、３０℃で６日間インキュベートし、その後に、成長を記録した。
プレート培地、プレートあたり４０ｍＬの培地
・    ＹＮＢＤ：ウラシルを含まず、２％のグルコース、０．０１％のＮＰ４０、および１００μＬのエタノールを含む、最小限のドロップアウト培地。
・    ＹＮＢＧ：ウラシルを含まず、２％のガラクトース、１％のラフィノース、０．０１％のＮＰ４０、および１００μＬのエタノールを含む、最小限のドロップアウト培地。
・    ＹＮＢＧ＋ＦＡ：ウラシルを含まず、２％のガラクトース、１％のラフィノース、０．０１％のＮＰ４０、および１００μＬのエタノールに溶解させた１ｍＭＣ１８：１Δ９を含む、最小限のドロップアウト培地。
【０３３９】
実施例２．植物細胞のモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの構成的発現
ＭＧＡＴ１
Ｍ．マスクルス由来の遺伝子によってコードしたモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１（ＭＧＡＴ１）（Ｙｅｎ他，２００２）、およびここでＭＧＡＴ１との比較として使用した、Ａ．サリアナのジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ１）（Ｂｏｕｖｉｅｒ−Ｎａｖｅ他，２０００）の酵素活性を、実施例１で説明されるように一過性発現系を使用して、Ｎ．ベンサミアナの葉組織において実証した。
末端を鈍化させるためにＴ４ＤＮＡポリメラーゼを処理した後に、３５Ｓプロモーターを含むＰｓｔＩをベクターｐＯＲＥ０４ｍｐのＳｆｏＩ部位に挿入することによって、３５Ｓ−ｐＯＲＥ０４と命名したベクターを作製した（Ｃｏｕｔｕ他，２００７）。ブラシカ・ナパスのためにコドン最適化したＭ．マスクルスＭＧＡＴ１をコードするキメラＤＮＡを、Ｇｅｎｅａｒｔによって合成し、０９５４３６４＿ＭＧＡＴ＿ｐＭＡと命名した。ＥｃｏＲＩ断片内に含まれる０９５４３６４＿ＭＧＡＴ＿ｐＭＡのコード領域全体をＥｃｏＲＩ部位の３５Ｓ−ｐＯＲＥ０４に挿入することによって、３５Ｓ：ＭＧＡＴ１と命名した、植物細胞における発現のためのＭ．マスクルスＭＧＡＴ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｑ９１ＺＶ４）をコードするキメラＤＮＡを作製した。３５Ｓ：ＭＧＡＴ１構築体を含むベクターを、ｐＪＰ３１８４と命名した。同様に、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ断片内に含まれるｐＸＺＰ５１３Ｅのコード領域全体をＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ部位の３５Ｓ−ｐＯＲＥ０４に挿入することによって、植物細胞における発現のためのＡ．サリアナＤＧＡＴ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＦ１９２６２）をコードするキメラＤＮＡ３５Ｓ：ＤＧＡＴ１を作製した。３５Ｓ：ＤＧＡＴ１構築体を含むベクターを、ｐＪＰ２０７８と命名した。
【０３４０】
キメラベクターを、２４℃の成長室において、Ｎ．ベンサミアナ植物の組織に浸潤させた培養物からのＡ．ツメファシエンス株ＡＧＬ１および細胞に導入した。試料間の直接的な比較を可能にし、葉の間での変動を低減するために、比較する試料を、同じ葉の両側に浸潤させた。実験は、３つ組で行った。浸潤に続いて、植物をさらに３日間成長させ、その後に、葉片を取り、凍結乾燥し、試料から抽出した脂質を、実施例１で説明されるように分画して、定量化した。この分析は、ＭＧＡＴ１およびＤＧＡＴ１遺伝子がＮ．ベンサミアナにおける葉油レベルを増加させるように機能していることを明らかにした。
【０３４１】
３５Ｓ：ｐ１９構築体だけで形質転換した葉組織（陰性対照）は、平均４μｇのＤＡＧ／ｍｇ乾燥葉重量由来の遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、および５μｇのＴＡＧ／ｍｇ乾燥葉重量由来のＦＦＡを含んでいた。３５Ｓ：ｐ１９構築体および３５Ｓ：ＤＧＡＴ１構築体（ＤＧＡＴ１の発現のための対照）で形質転換した葉組織は、平均４μｇのＤＡＧ／ｍｇ乾燥葉重量由来のＦＦＡ、および２２μｇのＴＡＧ／ｍｇ乾燥葉重量由来のＦＦＡを含んでいた。３５Ｓ：ｐ１９構築体および３５Ｓ：ＭＧＡＴ１構築体で形質転換した葉組織は、平均８μｇのＤＡＧ／ｍｇ乾燥葉重量由来のＦＦＡ、および４４μｇのＴＡＧ／ｍｇ乾燥葉重量由来のＦＦＡを含んでいた。３５Ｓ：ｐ１９構築体、３５Ｓ：ＤＧＡＴ１構築体、および３５Ｓ：ＭＧＡＴ１構築体で形質転換した葉組織は、３５Ｓ：ｐ１９および３５Ｓ：ＭＧＡＴ１浸潤体において観察したものよりも高いＤＡＧまたはＴＡＧを含有しなかった（図２）。また、種子中の飽和成分のレベルの減少は、ｐ１９対照またはＤＧＡＴ１試料と比較したときに、ＭＧＡＴの発現後に顕著であった（表２）。
【０３４２】
上で説明したデータは、ＭＧＡＴ１酵素が、葉組織におけるＤＡＧおよびＴＡＧ双方の蓄積を促進する際に、ＤＧＡＴ１よりもはるかに活性であったことを示した。ＭＧＡＴ１遺伝子の発現は、ＤＧＡＴ１が発現したときと比較して、２倍もの葉組織におけるＤＡＧおよびＴＡＧの蓄積をもたらした。この結果は、ＭＧＡＴが、マウス腸（植物葉とは大幅に異なる生物系）において発現する酵素であることを考えれば、非常に意外であり、また予想外であった。この研究は、植物細胞におけるＭＧＡＴの異所性発現を最初に示した。
【０３４３】
Ｍ．マスクルスＭＧＡＴ１を浸潤させた葉試料は、Ａ．サリアナＤＧＡＴ１だけを浸潤させた葉組織と比較して、２倍のＤＡＧおよびＴＡＧを蓄積した。マウスＭＧＡＴがＤＧＡＴとして非常に低い活性しか有しないことを考えれば、ＴＡＧの生成効率も意外であり、また予想外であった。ＭＧＡＴ１およびＤＧＡＴ１の双方をコードする遺伝子を浸潤させた葉組織は、ＭＧＡＴ１だけの葉試料よりも有意に蓄積しなかった。図１は、種々のＴＡＧの蓄積経路を表す図であり、その大部分は、ＤＡＧ（脂質合成における中心的な分子）に集束している。例えば、ＭＡＧ、ＤＡＧ、およびＴＡＧは、アシル基転移、リパーゼ、ＭＧＡＴ、ＤＧＡＴ、およびＰＤＡＴを含む種々の酵素活性を介して、相互変換することができる。ＭＧＡＴの発現後に、飽和レベルの減少も見られた。
【０３４４】
ＭＧＡＴ２
ＥｃｏＲＩ断片内に含まれるＭＧＡＴ２コード領域全体をＥｃｏＲＩ部位の３５Ｓ−ｐＯＲＥ０４に挿入することによって、３５Ｓ：ＭＧＡＴ２と命名した、植物細胞における発現のためのＭ．マスクルＭＧＡＴ２をコードするキメラＤＮＡを作製した。Ｍ．マスクルス由来の遺伝子によってコードしたモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２（ＭＧＡＴ２）（Ｙｅｎ，２００3）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｑ８０Ｗ９４）、およびＭＧＡＴ２との比較として使用したＡ．サリアナのＤＧＡＴ１の酵素活性は、実施例１で説明した一過性発現系を使用した、Ｎ．ベンサミアナの葉組織においても示された。
【０３４５】
対照と比較して、ＤＧＡＴ１の発現は、葉ＴＡＧで５．９倍、ＭＧＡＴ２で７．３倍、ＭＧＡＴ２＋ＤＧＡＴ１の組み合わせで９．８倍増加した（図３）。ＴＡＧにおけるそのような有意な増加を生ずる、ＭＧＡＴ２単独の能力は、いくつかの理由により、予想外であった。第１に、葉組織に存在する基質ＭＡＧの量は、低いことが分かっており、この基質からのＴＡＧの蓄積の増加は予想されない。第２に、ＭＧＡＴ活性単独の添加（すなわち、ＤＧＡＴ活性を有しないＭＧＡＴ２の添加）は、特に天然の活性ＤＧＡＴが通常ほとんど存在しない葉環境において、ＴＡＧではなく、ＤＡＧを生ずることが予想されるものであった。
【０３４６】
考察
本発明者らは、驚くべきことに、ＭＧＡＴ遺伝子のトランスジェニック発現が、植物細胞における脂質収量のかなりの増加をもたらすことを実証した。本発明者らは、Ｔｕｍａｎｅｙ他が、一部のＭＧＡＴ活性によってＤＧＡＴを単離したこと、およびＴｕｍａｎｅｙ他が、本明細書で定義されるように、ＭＧＡＴをコードする遺伝子のクローン化する試みに成功しなかったことを理解している。Ｔｕｍａｎｅｙ他（２００１）は、ピーナッツにおけるＭＧＡＴ活性を報告し、この活性の原因となる酵素を単離した。しかしながら、Ｔｕｍａｎｅｙ他は、ＤＧＡＴ活性についての試験結果を公表せず、したがって、報告した酵素は、いくつかのＭＧＡＴ活性を伴うＤＧＡＴであったと考えられる。実際に、以前の研究では、他の種においていかなるＭＧＡＴ活性も特定できなかった（Ｓｔｏｂａｒｔ他，１９９７）。さらに、意外なことに、Ｔｕｍａｎｅｙ他が単離した酵素は、膜結合酵素ではなく、可溶性のサイトゾル酵素であった。最後に、Ｔｕｍａｎｅｙ他は、後に、彼らがピーナッツ（Ｒａｊａｓｅｋｈａｒａｎ他，２００６）およびアラビドプシス（Ｇｈｏｓｈ他，２００６）からＭＧＡＴを単離したこと公表したが、これらの遺伝子の単離を説明しているいかなる論文もこれまでに公開されていない。
【０３４７】
実施例３．葉抽出物におけるトランスジェニックＭＧＡＴ活性の生化学的実証
実施例１で説明されるように、３５Ｓ：ＭＧＡＴ１、３５Ｓ：ＭＧＡＴ２、３５Ｓ：ＤＧＡＴ１を浸潤させたＮ．ベンサミアナの葉組織から細胞溶解物を作製した。３５Ｓ：ｐ１９構築体だけしか含まない株（陰性対照）、３５Ｓ：ｐ１９株を伴う３５Ｓ：ＭＧＡＴ２株、ならびに３５Ｓ：ｐ１９株を伴う３５Ｓ：ＭＧＡＴ２株および３５Ｓ：ＤＧＡＴ１アグロバクテリウム株の混合物について、それぞれ３つ組で、別々の葉浸潤を行った。３日後に３つ組の試料を採取し、精製した細胞溶解物を、機械的組織溶解および遠心分離によって調製した。実施例１で説明されるように［１４Ｃ］ＭＡＧを溶解物に供給することによって、精製した細胞溶解物のＭＧＡＴ活性を比較した。データを図４に示す。
【０３４８】
３５Ｓ：ｐ１９対照試料では、アッセイの全体を通して大部分の放射活性がＭＡＧに留まったので、ＭＧＡＴ活性がほとんど観察されなかった。対照的に、３５Ｓ：ＭＧＡＴ２試料中の大部分の標識したＭＡＧは、迅速にＤＡＧに変換された（図４中央パネル）。これは、３５Ｓ：ＭＧＡＴ２構築体から強力なＭＧＡＴ活性が発現したことを示している。さらに、かなり多くのＴＡＧも生成された。３５Ｓ：ＭＧＡＴ２試料で観察されたＴＡＧの生成は、天然のＮ．ベンサミアナＤＧＡＴ活性によるもの、または別のＴＡＧ合成経路によって生成されたものと考えられる。ＴＡＧの生成量は、３５Ｓ：ＤＧＡＴ１のさらなる添加によって大幅に増加した（図４右側パネル）。これは、ＭＧＡＴ２酵素が、植物栄養組織中のＤＧＡＴ１によるＴＡＧへの変換を利用できるＤＡＧを生成したことを示している。
【０３４９】
実施例４．葉抽出物のＭＧＡＴが利用できるＭＡＧの生成の生化学的実証
葉溶解物を使用した実施例３で説明されるインビトロのアッセイでは、基質（ｓｎ−２−ＭＡＧおよびオレオイル−ＣｏＡ）を外因的に供給したのに対して、無傷の植物組織におけるインビボのＭＧＡＴ活性では、これらの基質が天然に存在することを必要とするであろう。種々の植物組織における低レベルのＭＡＧの存在は、既に報告されている（ＨｉｒａｙａｍａおよびＨｕｊｉｉ，１９６５、Ｐａｎｅｋｉｎａ他，１９７８、Ｌａｋｓｈｍｉｎａｒａｙａｎａ他，１９８４、ＰｅｒｒｙおよびＨａｒｗｏｏｄ，１９９３）。ＭＧＡＴ２が天然の植物経路によって生成されたＭＡＧを利用できるかどうかを試験するために、前述の実験を繰り返すが、ここでは、［１４Ｃ］Ｇ−３−Ｐを溶解物に供給した。結果として生じたデータを図５に概略的に示す。
【０３５０】
標識したＭＡＧの生成が、全ての試料において観察され、これは植物葉溶解物中のＧ−３−ＰからのＭＡＧのデノボ生成を示す。３５Ｓ：ｐ１９対照試料においては比較的に低かったが、標識したＤＡＧおよびＴＡＧ産物も、全ての試料において観察された。これは、この試料において、内因性ケネディ経路によるこれらの中性脂質の生成が比較的に低かったことを示している。対照的に、ＭＧＡＴ２試料およびＭＧＡＴ２＋ＤＧＡＴ１試料中の大部分の標識が、ＤＡＧおよびＴＡＧプールに現れた。これは、外因的に添加したＭＧＡＴが、天然の植物経路によって、標識したＧ−３−Ｐから生成されたＭＡＧの変換を触媒したことを示している。
【０３５１】
実施例２〜４は、いくつかの要点を実証する。すなわち、１）葉組織は、Ｇ−３−ＰからＭＡＧを合成することができ、よって、ＭＡＧは、葉組織において発現する外因性ＭＧＡＴを利用することができる、２）哺乳類の腸に由来するＭＧＡＴであっても、内因性ＭＧＡＴを保有していないと思われている植物組織において機能することができ、脂質合成に関与する他の植物因子との首尾よい相互作用を必要とする、３）外因性ＭＧＡＴ活性によって生成されるＤＡＧは、ＴＡＧを生成するために、植物ＤＧＡＴまたは外因性ＤＧＡＴを利用することができる、および４）外因性ＭＧＡＴの発現は、大幅に増加したＴＡＧレベルを生ずることができ、そのレベルは、少なくとも外因性Ａ．サリアナＤＧＡＴ１の発現によって生ずるレベルと同じくらい大きい。
【０３５２】
実施例５．酵母におけるＤＧＡＴ１、ＭＧＡＴ１、およびＭＧＡＴ２の発現
ｐＹＥＳ２：ＤＧＡＴ１、ｐＹＥＳ２：ＭＧＡＴ１、およびｐＹＥＳ２：ＭＧＡＴ２を生ずるように、Ａ．サリアナＤＧＡＴ１、Ｍ．マスクルスＭＧＡＴ１、およびＭ．マスクルスＭＧＡＴ２をコードする遺伝子をｐＹＥＳ２ベクターに挿入することによって、キメラ酵母発現ベクターを構成した。これらの構成体を、ＤＧＡＴ活性が全くなく、かつ４つの遺伝子（ＤＧＡ１、ＬＲＯ１、ＡＲＥ１、ＡＲＥ２）におけるノックアウト変異の結果として、ＴＡＧおよびステロールエステルが欠如している、サッカロミセス・セレビシエ株Ｈ１２４６において形質転換した。酵母株Ｈ１２４６は、外因的に添加した脂肪酸からＤＡＧを合成することができるが、ノックアウト変異のため、ＤＡＧをＴＡＧに変換することができない。形質転換した酵母培養物に、［１４Ｃ］１８：１Δ９を供給し、その後に、実施例１で説明されるように全ての脂質を抽出して、ＴＬＣによって分画した。代表的なＴＬＣプレートのオートラジオグラムを図６に示す。
【０３５３】
ＤＧＡＴ活性の存在を示すＴＡＧの形成は、ＤＧＡＴ１（陽性対照）を含む酵母細胞および哺乳類のＭＧＡＴ１を含む酵母細胞のどちらでも観察されたが、ＭＧＡＴ２を含む細胞では観察されなかった。マウス由来のＭＧＡＴ１はまた、酵母細胞においてもＤＧＡＴ活性を有し、したがって、二重機能ＭＧＡＴ／ＤＧＡＴ酵素として機能するのに対して、ＭＧＡＴ２は、検出可能なＤＧＡＴ活性を有さず、したがって、単にＭＧＡＴだけであった、と結論付けられた。
アラビドプシス・サリアナ種子におけるＭＧＡＴ１の発現
【０３５４】
実施例６．植物、種子、および菌類におけるモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの発現
Ｍ．マスクルスＭＧＡＴ１をコードし、種子特異的プロモーター（ＦＰ１、切断したブラシカ・ナパス・ナピン・プロモーター）の制御下にある遺伝子を使用して、安定的に形質転換したＡ．サリアナおよび子孫種子を生成した。ＦＰ１プロモーターおよびグリシネ・マクのレクチンポリアデニル化シグナルが側面に並ぶＥｃｏＲＩ部位を含むＳａｌＩ断片をベクターｐＣＷ１４１のＳａｌＩ−ＸｈｏＩ部位に挿入することによって、ｐＪＰ３１７４と命名したベクターを作製した。ｐＣＷ１４１ベクターはまた、スクリーニング可能なマーカー遺伝子としてＦＰ１駆動、イントロン中断、種子分泌のＧＦＰも含んだ。ＥｃｏＲＩ断片内に含まれる構築体０９５４３６４＿ＭＧＡＴ＿ｐＭＡのコード領域全体を、ｐＪＰ３１７９を生成するＥｃｏＲＩ部位のｐＪＰ３１７４に挿入することによって、ＦＰ１：ＭＧＡＴ１−ＧＦＰと命名したキメラ遺伝子を作製した。このキメラベクターを、Ａ．ツメファシエンス株ＡＧＬ１に導入し、形質転換したアグロバクテリウムの培養物由来の細胞を使用して、形質転換のためのフローラルディップ法（ＣｌｏｕｇｈおよびＢｅｎｔ，１９９８）を使用してＡ．サリアナ（生態型コロンビア）植物を処理した。成熟後に、処理した植物に由来する種子を、ＬｅｉｃａＭＺＦＬIII解剖顕微鏡およびｅｂｑ１００水銀ランプの下で観察した。１５個のトランスジェニック種子（強いＧＦＰ陽性）および１５個の非トランスジェニック（ＧＦＰ陰性）種子を、単離して、それぞれプールした。ＧＦＰ陽性プールおよびＧＦＰ陰性プールを、実施例１で説明されるように、総脂肪酸含量について分析した。この分析は、ＭＧＡＴ構築体で形質転換した種子について平均的な脂肪酸含量および組成物を提供したが、ヘミ接合性およびホモ接合性双方の形質転換された種子を含んだかもしれない集団におけるものであった。
【０３５５】
この分析では、ＭＧＡＴ１遺伝子が、Ａ．サリアナ種子における種子油レベルを増加させるように機能し、１５個の非トランスジェニック種子（対照、野生型と同じ）が平均６９．４μｇの総脂肪酸を含む一方で、ＧＦＰ遺伝子で形質転換した１５個のトランスジェニック種子（したがって、ＦＰ１：ＭＧＡＴ１遺伝的構築体を含む可能性がある）が平均７１．９μｇの総脂肪酸を含むことを明らかにした。これは、対照（野生型）と比較して、３．５％の含油量の増加であった。この分析はまた、ＭＧＡＴ遺伝子が、種子から得た総抽出脂質の脂肪酸組成から見たときに、種子における多価不飽和脂肪酸を富化するように機能していることも明らかにした。特に、種子から抽出した総脂肪酸の割合として、存在するＡＬＡの量が、１６．０％から１９．６％まで増加した。同様に、脂肪酸２０：２ｎ６の割合は、１．２５％から１．９０％に増加し、脂肪酸２０：３ｎ３は、０．２６％から０．５１％に増加した（表２）。
【０３５６】
【表２】
2013534827.tif 000004
【０３５７】
ＦＰ１：ＭＧＡＴ１−ＧＦＰキメラＤＮＡを修飾してＧＦＰ遺伝子を除去する、さらなる実験を行った。ＦＰ１：ＭＧＡＴ１と命名したこの遺伝的構築体を、ＦＡＤ２についての変異体であるＡ．サリアナ系統に形質転換した。抗生物質耐性のＴ１植物由来のＴ２種子、ならびにこれらの植物と一緒に成長させた親系統の総脂肪酸含量を、実施例１に従って決定した。データを表３に示す。対照系統由来の種子の平均総脂肪酸は、種子１００個あたり３４７．９μｇであったのに対して、トランスジェニック種子の平均は、種子１００個あたり３８１．０μｇであった。平均を決定するために対照系統Ｃ６についてのデータを除外すると、対照の平均は、種子１００個あたり３７０μｇであった。トランスジェニック種子の含油量は、非形質転換種子の含油量と比較して、相対的に約３％の増加を示した。
【０３５８】
マウスＭＧＡＴ２遺伝子のコード領域、植物細胞における発現を最適化したコドンを、前述した構築体のＭＧＡＴ１と置換し、アラビドプシスに導入する。結果として生じたトランスジェニック植物由来の種子は、含油量が増加する。
【０３５９】
【表３Ａ】
2013534827.tif 000005
【表３Ｂ】
2013534827.tif 000006
【０３６０】
ブラシカ・ナパス種子におけるＭＧＡＴ１の発現
アラビドプシス・サリアナ種子のＭ．マスクルスＭＧＡＴ１の発現に使用されるベクターＦＰ１：ＭＧＡＴ１を使用して、形質転換されたＢ．ナパス植物を生成した。標準的な電気穿孔手順を介して、ベクターをＡ．ツメファシエンス株ＡＧＬ１に導入した。培養物を、１５０ｒｐｍで攪拌しながら、ＬＢ培地中で、２８℃で一晩成長させた。細菌細胞を、４０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって採集し、ＷｉｎａｎｓのＡＢ（Ｗｉｎａｎｓ、１９８８）で洗浄し、１０ｍＬのＷｉｎａｎｓのＡＢ培地（ｐＨ５．２）中に再懸濁し、そして１００μＭのアセトシリンゴンを添加しながら、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）およびリファンビシン（２５ｍｇ／Ｌ）で一晩成長させた。ブラッシカ細胞を感染させる２時間前に、スペルミジン（１２０ｍｇ／Ｌ）を添加し、細菌の最終的な密度を、新鮮なＡＢ媒体で０．３〜０．４のＯＤ６００ｎｍに調整した。１／２ＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ，１９６２）上で成長させた８日目のＢ．ナパス苗木由来の新鮮に単離した子葉柄、またはＭＳ培地上で３〜４日目までに１ｍｇ／Ｌチジアズロン（ＴＤＺ）＋０．１ｍｇ／Ｌのアルファ−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）で予め調整した胚軸セグメントを、１０ｍＬのアグロバクテリウム培養物で５分間感染させた。次いで、アグロバクテリウムを感染させた外植体（子葉柄および胚軸）を、滅菌濾紙で吸い取って余分なアグロバクテリウムを除去し、異なる抗酸化剤（５０ｍｇ／ＬのＬ−システインおよび１５ｍｇ／Ｌのアスコルビン）を補充した、または補充しない、共培養媒体（１ｍｇ／ＬＴＤＺ＋０．１ｍｇ／ＬＮＡＡ＋１００μＭアセトシリンゴンを伴うＭＳ媒体）に移した。全てのプレートを、パラフィルムで密閉し、暗所において２３〜２４℃で４８時間インキュベートした。
【０３６１】
次いで、共培養した外植体（子葉柄および胚軸）を、滅菌蒸留水＋５００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム＋５０ｍｇ／Ｌのチメンチンで１０分間洗浄し、滅菌蒸留水で１０分間すすぎ、滅菌濾紙で吸い取り、事前に選択した培地（ＭＳ＋１ｍｇ／ＬのＴＤＺ＋０．１ｍｇ／ＬのＮＡＡ＋２０ｍｇ／Ｌのアデニン硫酸（ＡＤＳ）＋１．５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３＋２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、および５０ｍｇ／Ｌのチメンチン）に移し、１６時間／８時間の光周期で、２４℃で５日間培養した。次いで、それらを、１．５ｍｇ／Ｌのグルフォシネートアンモニウムを伴う選択培地（ＭＳ＋１ｍｇ／ＬのＴＤＺ＋０．１ｍｇ／ＬのＮＡＡ＋２０ｍｇ／ＬのＡＤＳ＋１．５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３＋２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、および５０ｍｇ／Ｌのチメンチン）に移し、隔週で同じ培地に継代培養しながら、１６時間／８時間の光周期で、２４℃で４週間培養した。緑色カルスを伴う外植体を、芽形成開始培地（ＭＳ＋１ｍｇ／Ｌのカイネチン＋２０ｍｇ／ＬのＡＤＳ＋１．５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３＋２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシム＋５０ｍｇ／Ｌのチメンチン＋１．５ｍｇ／Ｌのグルフォシネートアンモニウム）に移して、さらに２〜３週間培養した。耐性を示す外植体から発生する芽を、芽伸長培地（０．１ｍｇ／Ｌのジベレリン酸＋２０ｍｇ／ＬのＡＤＳ＋１．５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３＋２５０ｍｇ／Ｌのセフロキシム＋１．５ｍｇ／Ｌのグルホシネートアンモニウムを伴うＭＳ培地）に移して、さらに２週間培養した。長さ２〜３ｃｍの健康な芽を選択し、発根培地（１ｍｇ／ＬのＮＡＡ＋２０ｍｇ／ＬのＡＤＳ＋１．５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３＋２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシムを伴う１／２のＭＳ）に移して、２〜３週間培養した。十分に定着した根付きの芽を、ポット（苗木栽培混合物）に移し、成長キャビネット中で２週間成長させ、その後に、温室に移した。１６個の個々の形質転換体が、ＦＰ１：ＭＧＡＴ１構築体に対してトランスジェニックであること、および温室条件下で正常に成長したことを確認した。植物の成長は正常であると思われ、植物は、稔性であり、正常に開花し、結実した。植物は、成熟期まで成長させ、形質転換された植物から得られた種子を採取して、種子の含油量および脂肪酸組成について分析する。ＭＧＡＴ１の種子特異的発現は、含油量を増加させ、ブラッシカ種子油における多価不飽和脂肪酸の割合を増加させる。
【０３６２】
マウスＭＧＡＴ２遺伝子のコード領域、植物細胞における発現を最適化したコドンを、前述した構築体のＭＧＡＴ１と置換し、ブラッシカに導入する。結果として生じたトランスジェニック植物由来の種子は、含油量が増加する。
【０３６３】
ゴシピウム・ヒルスツム種子におけるＭＧＡＴ１の発現
アラビドプシス・サリアナ種子のＭ．マスクルスＭＧＡＴ１の発現に使用したものと同じ種子特異的キメラ遺伝子を使用して、形質転換されたゴシピウム・ヒルスツム植物を生成した。ＦＰ１：ＭＧＡＴ１と命名したベクターを、標準的な電気穿孔手順を介してＡ．ツメファシエンス株ＡＧＬ１に導入し、アグロバクテリウム培養物由来の細胞を使用して、キメラＤＮＡをゴシピウム・ヒルスツム（変種Ｃｏｋｅｒ３１５）の細胞に導入した。１０日目の綿苗木から切除した子葉を外植体として使用し、Ａ．ツメファシエンスに感染させて２日間にわたって共培養した。この後に、０．１ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、０．１ｍｇ／Ｌのカイネチン、５０ｍｇ／Ｌの硫酸カナマイシン、および２５ｍｇ／Ｌのセフォタキシムを含むＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ，１９６２）に対する６週間選択が続いた。子葉外植体由来の健康なカルスを、２８℃で第２の６週間にわたって、５ｍｇ／Ｌの６−（γ、γ−ジメチルアリルアミノ）−プリン（２ｉｐ）、０．１ｍｇ／Ｌのナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシン、および２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシムを含むＭＳ媒体に移した。インキュベーションの約６〜１０週後に形成される体細胞胚を、同じ培地であるが植物ホルモンまたは抗生物質を添加していない培地上で発芽させて維持した。体細胞胚から発育した小植物を、土壌に移し、葉および根が発育した時点で、２８℃／２０℃（昼／夜）の成長温度で、温室において維持した。ＦＰ１−ＭＧＡＴ１構築体を含むトランスジェニック植物を、温室において成長させ、開花させ、種子を含む莢を生成させた。種子は、成熟期に採取する。ＭＧＡＴ１の種子特異的発現は、含油量を増加させ、綿種子油における多価不飽和脂肪酸の割合を増加させる。
【０３６４】
安定的な形質転換後のＮ．ベンサミアナ植物におけるＭＧＡＴ１およびのＭＧＡＴ２遺伝子の発現
Ｎ．ベンサミアナを、実施例２で説明される３５Ｓ：ＭＧＡＴ１構築体で安定的に形質転換した。３５Ｓ：ＭＧＡＴ１を、標準的な電気穿孔手順を介して、Ａ．ツメファシエンス株ＡＧＬ１に導入した。形質転換された細胞を、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）およびリファンビシン（２５ｍｇ／Ｌ）を補充した個体ＬＢ培地上で成長させ、２８℃で２日間インキュベートした。単一の群体を使用して、新鮮な培養を開始した。４８時間の活発な培養に続いて、細胞を２，０００ｘｇの遠心分離によって採集し、上清を除去した。ＯＤ６００＝０．５の密度で、５０％のＬＢおよび５０％のＭＳ培地を含む新鮮な溶液中に細胞を再懸濁した。
【０３６５】
インビトロで成長させたＮ．ベンサミアナの葉試料を切除し、Ａ．ツメファシエンス溶液に浸した状態で、鋭利な外科用メスで約０．５〜１ｃｍ２のサイズ正方形の区画に切断した。切断したＮ．ベンサミアナの葉部分を、Ａ．ツメファシエンスに浸漬し、室温で１０分間放置し、その後に、滅菌濾紙で吸い取り乾燥し、補助剤を伴わないＭＳプレート上に移した。２４℃で２日間の共培養に続いて、外植体を、滅菌液体ＭＳ培地で３回洗浄し、次いで、滅菌濾紙で吸い取り乾燥し、１．０ｍｇ／Ｌのベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、０．２５ｍｇ／Ｌのインドール酢酸（ＩＡＡ）、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン、および２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシムを補充した選択ＭＳ寒天培地上に置いた。プレートを、２４℃で２週間インキュベートして、形質転換されたＮ．ベンサミアナの葉部分から芽を発育させた。
【０３６６】
発芽トランスジェニック植物をインビトロで定着させるために、健康な緑色芽を切断して、２５μｇ／ＬのＩＡＡ、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン、および２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシムを補充したＭＳ寒天培地を含む２００ｍＬの組織培養ポットに移した。十分に大きい葉片を、トランスジェニック芽から取り出し、実施例１で説明されるように、ＴＡＧ分画および定量化分析のために凍結乾燥した（表４）。最良の３５Ｓ：ＭＧＡＴ１、Ｎ．ベンサミアナ植物は、対照系統における乾燥葉組織重量１００ｍｇあたり８５．０２μｇの平均ＴＡＧ含量と比較して、乾燥葉組織重量１００ｍｇあたり２０４．８５μｇのＴＡＧ含量を有し、ＴＡＧ含量が２４１％増加したことを示している。
【０３６７】
また、Ｎ．ベンサミアナを、実施例２で説明される３５Ｓ：ＭＧＡＴ２構築体、および対照バイナリベクターｐＯＲＥ４でも安定的に形質転換した（表５）。最良の３５Ｓ：ＭＧＡＴ２、Ｎ．ベンサミアナ植物は、対照系統における乾燥葉組織重量１００ｍｇあたり９．５μｇの平均ＴＡＧ含量と比較して、乾燥葉組織重量１００ｍｇあたり７９．０μｇのＴＡＧ含量を有し、ＴＡＧ含量が７３１％増加したことを表している。ＴＡＧ画分の脂肪酸プロファイルも、大幅に減少したレベルの飽和脂肪酸１６：０および１８：０、および増加したレベルの多価不飽和脂肪酸、特に１８：３のω３（ＡＬＡ）に変化した（表５）。同じ葉試料由来の極性脂質の脂肪酸プロファイルは、大きく影響を及ぼされなかったが、これは、非極性脂質の脂肪酸組成における変化が実質的であったことを示している。この実験における対照植物は、３５Ｓ：ＭＧＡＴ１構築体による従来の実験におけるものよりも小さく、また生理学的に異なっており、これは、実験毎に対照植物の含油量が異なることを説明し得る。３５Ｓ：ＭＧＡＴ１および３５Ｓ：ＭＧＡＴ２構築体と、対照植物とを直接比較する実験は、同じサイズおよび生理機能の植物を使用して行う。
【０３６８】
新しい組の構成的バイナリ発現ベクターを、複製エンハンサー領域（ｅ３５Ｓ）を伴う３５Ｓプロモーターを使用して作製した。最初に、ｐＪＰ３３４３を生ずるように、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片内に含まれるｅ３５ＳプロモーターをＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩのｐＯＲＥ０４の中にクローン化することによって、３５Ｓ：ＭＧＡＴ１＃２（ｐＪＰ３３４６）、３５Ｓ：ＭＧＡＴ２＃２（ｐＪＰ３３４７）、および３５Ｓ：ＤＧＡＴ１＃２（ｐＪＰ３３５２）を作製した。次いで、ＭＧＡＴ１およびＭＧＡＴ２遺伝子をそれぞれｐＪＰ３３４３のＥｃｏＲＩ部位の中にクローン化することによって、ｐＪＰ３３４６およびｐＪＰ３３４７を生成した。ＸｈｏＩ−ＡｓｉＳＩ部位内に含まれるＡ．サリアナＤＧＡＴ１をｐＪＰ３３４３のＸｈｏＩ−ＡｓｉＳＩ部位の中にクローン化することによって、ｐＪＰ３３５２を生成した。
【０３６９】
上で説明したように、アグロバクテリウム株ＡＧＬ１中のｐＪＰ３３４６、ｐＪＰ３３４７、およびｐＪＰ３３５２を使用して、Ｎ．ベンサミアナを形質転換した。確認されたトランスジェニック植物は、ｐＪＰ３３４６について１４個回収され、ｐＪＰ３３４７について２２個回収された。複数のカナマイシン耐性の形質転換された芽を、ｐＪＰ３３５２で生成した。ＭＧＡＴ１またはＭＧＡＴ２で形質転換した植物に対して、導入遺伝子の発現分析を行った。高レベルの発現を伴う植物を選択した。Ａ．サリアナＤＧＡＴ１で形質転換した植物に関する発現分析を行う。植物は、正常に成長し、成熟期まで成長させる。種子は、成熟期に収穫する。高発現子孫由来の種子を、ホモ接合性およびヘテロ接合性植物の双方を含むＴ２分離集団の脂質分析のために、土壌上に直接蒔く。高レベルのＭＧＡＴ１またはＭＧＡＴ２のいずれかを発現する植物の葉の含油量は、Ａ．サリアナＤＧＡＴ１で形質転換した植物または対照植物と比較して、大幅に増加する。
【０３７０】
上で説明したようにＡ．サリアナを形質転換するために、ＡＧＬ１中のｐＪＰ３３４６、ｐＪＰ３３４７、およびの対照ベクターも使用した。２５個のトランスジェニックＴ２植物がｐＪＰ３３４６由来のＴ−ＤＮＡを含むことが確認され、ｐＪＰ３３４６について４３個のトランスジェニック植物を特定した。トランスジェニック植物に関する発現の分析を行う。高発現子孫由来の種子を採取して、直接土壌上に蒔く。導入遺伝子が欠如している分離体由来のものを含む、Ｔ２およびＴ３子孫由来の葉の含油量を含む脂質分析を行う。最高レベルのＴＡＧは、ＭＧＡＴ導入遺伝子に対してホモ接合性である植物において得られる。
【０３７１】
【表４】
2013534827.tif 000007
【０３７２】
【表５】
2013534827.tif 000008
【０３７３】
安定的に形質転換されたトリフォリウム・レペンス植物のＭＧＡＴ１の発現
Ｍ．マスクルスＭＧＡＴ１をコードするキメラ遺伝子を使用して、トリフォリウム・レペンス（別の双子葉植物）を形質転換した。キメラ遺伝子３５Ｓ：ＭＧＡＴ１および３５Ｓ：ＤＧＡＴ１を含むベクターを、標準的な電気穿孔手順を介して、Ａ．ツメファシエンスに導入した。双方のベクターはまた、３５Ｓ：ＢＡＲ選択可能なマーカー遺伝子も含む。形質転換されたアグロバクテリウム細胞を、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）およびリファンビシン（２５ｍｇ／Ｌ）を補充した固体ＬＢ培地上で成長させ、２８℃で２日間インキュベートした。単一の群体を使用して、各構築体のための新鮮な培養を開始した。４８時間の活発な培養に続いて、アグロバクテリウム培養物を使用して、Ｌａｒｋｉｎ他（１９９６）によって説明されるように、給水種子から解離したＴ．レペンス（ｃｖ．Ｈａｉｆａ）子葉を処理した。３日間の共培養に続いて、外植体を、５ｍｇ／ＬのＰＰＴに露出して、形質転換された芽を選択し、次いで、発根培地に移して根を形成させ、その後に、土壌に移した。ＭＧＡＴ１を含む形質転換された植物を得た。３５Ｓプロモーターは、形質転換された植物の細胞において構成的に発現する。含油量は、少なくとも葉等の栄養組織において増加する。
【０３７４】
安定的に形質転換したホルデウム・ブルガレにおけるＭＧＡＴの発現
Ｍ．マスクルスＭＧＡＴ１を含むキメラベクターを使用して、安定的に形質転換されたホルデウム・ブルガレ（単子葉植物の植物）を生成した。キメラ遺伝子Ｕｂｉ：ＭＧＡＴ１およびＵｂｉ：ＤＧＡＴ１を含むベクターを、Ｍ．マスクルスＭＧＡＴ１およびＡ．サリアナＤＧＡＴ１コード領域全体を、それぞれ、ｐＷＶＥＣ８−Ｕｂｉの中にクローン化することによって構成した。キメラ遺伝子Ｕｂｉ：ＭＧＡＴ１およびＵｂｉ：ＤＧＡＴ１を含むベクターを、標準的な電気穿孔手順を介して、Ａ．ツメファシエンス株ＡＧＬ１に導入した。形質転換されたアグロバクテリウム細胞を、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）およびリファンビシン（２５ｍｇ／Ｌ）を補充した個体ＬＢ培地上で成長させ、プレートを、２８℃で２日間インキュベートした。それぞれの単一の群体を使用して、新鮮な培養を開始した。
【０３７５】
４８時間の活発な培養に続いて、アグロバクテリウム培養物を使用して、いくつかの改良を伴う公開された方法（Ｔｉｎｇａｙ他，１９９７、Ｂａｒｔｌｅｔｔ他，２００８）に従って、オオムギ（ｃｖ．ゴールデン・プロミス）の未成熟胚の細胞に形質転換した。簡潔には、長さが１．５〜２．５ｍｍの胚を、未成熟穎花から単離し、胚軸を除去した。結果として生じた外植体を、トランスジェニックアグロバクテリウムで２〜３日間共培養し、次いで、チメンチンおよびハイグロマイシンを含む培地上で４〜６週間暗所で培養して、胚形成カルスを生成させ、その後に、微光条件下で２週間転移培地に移した。次いで、カルスを再生培地に移して、芽および根を再生させ、その後に、土壌に移した。形質転換された植物を採取して、温室に移した。ＭＧＡＴ１コード領域は、Ｕｂｉプロモーターの制御下で、形質転換された植物の細胞において構成的に発現する。含油量は、少なくとも栄養組織において増加する。
【０３７６】
マウスＭＧＡＴ２遺伝子のコード領域、植物細胞における発現を最適化したコドンを、前述した構築体のＭＧＡＴ１と置換し、上で説明したようにホルデウムに導入する。結果として生じたトランスジェニック植物由来の栄養組織は、含油量が増加する。
【０３７７】
酵母細胞におけるＭＧＡＴの発現
Ｍ．マスクルスＭＧＡＴ１を含むキメラベクターを使用して、酵母（この実施例では、サッカロミセス・セレビシエ、すなわち、発酵による油の生成に好適な真菌微生物）を形質転換した。遺伝的構築体Ｇａｌ１：ＭＧＡＴ１は、ＥｃｏＲＩ断片内に含まれる０９５４３６４＿ＭＧＡＴ＿ｐＭＡと命名した構築体のコード領域全体を、ｐＪＰ３３０１を生成するＥｃｏＲＩ部位のｐＹＥＳ２に挿入することによって作製した。同様に、ここでは比較として使用される、酵素Ａ．サリアナＤＧＡＴ１を別々にコードする遺伝的構築体Ｇａｌ１：ＤＧＡＴ１を、Ａ．サリアナＤＧＡＴ１コード領域全体をｐＹＥＳ２に挿入することによって作製した。これらのキメラベクターを、熱衝撃によってＳ．セレビシエ株Ｓ２８８Ｃに導入し、形質転換体を、唯一の炭素源として２％のラフィノースを含む酵母最小培地（ＹＭＭ）プレート上に選択した。クローンの接種原培養物を、唯一の炭素源として２％のラフィノースを伴う液体ＹＭＭにおいて確立した。この培養物からの実験培養物を、初期のＯＤ６００が約０．３になるように、１％のＮＰ−４０を含むＹＭＭ培地中に接種した。培養物を、ＯＤ６００が約１．０になるまで、振盪（約１００ｒｐｍ）しながら２８℃で成長させた。この時点で、２％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように、ガラクトースを添加した。遠心分離によって収穫する前に、培養物を、振盪しながらさらに２５℃で４８時間インキュベートした。細胞ペレットを水で洗浄し、その後に、実施例１で説明されるように、脂質クラス分画および定量化分析のために凍結乾燥した。Ｇａｌプロモーターは、形質転換された酵母細胞において誘導的に発現し、細胞における含油量が増加する。
【０３７８】
マウスＭＧＡＴ２遺伝子のコード領域、酵母細胞における発現を最適化したコドンを、前述した構築体のＭＧＡＴ１と置換し、酵母に導入する。結果として生じたトランスジェニック細胞は、含油量が増加する。遺伝子はまた、含油量を増加させるために、油脂性酵母（ヤロウィア・リポリティカ）にも導入される。
【０３７９】
藻類細胞クラミドモナス・ラインハーディにおけるＭＧＡＴの発現
Ｍ．マスクルスＭＧＡＴ１を含むキメラベクターを使用して、安定的に藻類細胞を形質転換する。ＭＧＡＴ１コード領域を、カリフラワーモザイクウイルス３５ＳプロモーターカセットおよびＣ．ラインハーディＲＢＣＳ２プロモーターによって発現するパロモマイシン耐性遺伝子（アミノグリコシド−Ｏ−ホスホトランスフェラーゼVIII）を含むクローニングベクターの中にクローン化することによって、３５Ｓ：ＭＧＡＴ１と命名した遺伝的構築体を作製する。３５Ｓ：ＭＧＡＴ１を、改良したガラスビーズ法（Ｋｉｎｄｌｅ，１９９０）によって、５×１０７の対数的培養物ｃｃ５０３（クラミドモナス・ラインハーディの細胞壁欠損株）の中に別々に導入する。双方のベクターはまた、選択可能なマーカー遺伝子としてＢＬＥ耐性遺伝子も含む。簡潔には、非形質転換細胞の群体を、ＴＡＰ寒天培地プレート上で４日間にわたって約２４℃に保ち、１ｍＬあたり約５×１０６個の細胞まで成長させ、結果として生じた細胞を、室温で３分間、３０００ｇでペレット化し、再懸濁して３００μＬのＴＡＰ培地中に５×１０７個の細胞を生成する。３００μＬの直径０．６ｍｍのガラスビーズ、５Ｌ中０．６μｇのプラスミド、および１００μＬの２０％のＰＥＧ  ＭＷ８０００を添加し、混合物を、最高速度で３０秒間ボルテックスし、次いで、１０ｍＬのＴＡＰに移し、暗所で振盪しながら１６時間インキュベートする。細胞をペレット化し、２００μＬのＴＡＰ中に再懸濁し、次いで、５ｍｇ／Ｌのゼオシンを含むＴＡＰプレート上で平板培養し、暗所で３週間インキュベートする。形質転換された群体を、新鮮なＴＡＰ＋５ｍｇ／Ｌのゼオシンプレートに二次培養し、その後に、ゼオシン選択を伴う標準的な培地条件下で成長させる。遠心分離による収穫の後に、細胞ペレットを水で洗浄し、その後に、実施例１で説明されるように、脂質クラス分画および定量化分析のために凍結乾燥する。３５Ｓ：ＭＧＡＴ１プロモーターは、形質転換された藻細胞において構成的に発現する。細胞の含油量は、大幅に増加する。
【０３８０】
マウスＭＧＡＴ２遺伝子のコード領域、植物細胞における発現を最適化したコドンを、前述した構築体のＭＧＡＴ１と置換し、クラミドモナスに導入する。結果として生じたトランスジェニック細胞の含油量は、大幅に増加する。
【０３８１】
安定的に形質転換したルピナス・アングスティフォリウスにおけるＭＧＡＴの発現
Ｍ．マスクルスＭＧＡＴ１を含むキメラベクターを使用して、ルピナス・アングスティフォリウス（マメ科の植物）を形質転換する。アグロバクテリウム中のキメラベクター３５Ｓ：ＭＧＡＴ１および３５Ｓ：ＤＧＡＴ１を使用して、Ｐｉｇｅａｉｒｅ他（１９９７）によって説明されるようにＬ．アングスティフォリウスを形質転換する。簡潔には、茎頂外植体をトランスジェニックアグロバクテリウムとともに共培養し、その後に、ＰＰＴ溶液（２ｍｇ／ｍＬ）で完全に湿潤し、ＰＰＴを含まない再生培地上に移す。茎頂から発育した複数の腋芽を、２０ｍｇ／ＬのＰＰＴを含む培地上に摘出し、生存している芽を、２０ｍｇ／ＬのＰＰＴを含む新鮮な培地上に移す。次いで、健康な芽を土壌に移す。３５Ｓプロモーターは、形質転換された植物の細胞において構成的に発現し、栄養組織および種子における含油量が増加する。種子特異的プロモーターは、トランスジェニックルピナス種子の含油量をさらに増加させるために使用される。
【０３８２】
マウスＭＧＡＴ２遺伝子のコード領域、植物細胞における発現を最適化したコドンを、前述した構築体のＭＧＡＴ１と置換し、ルピナスに導入する。結果として生じたトランスジェニック植物由来の種子および栄養組織は、含油量が増加する。
ソルガム・バイカラーの安定的に形質転換した細胞におけるＭＧＡＴの発現
【０３８３】
Ｍ．マスクルスＭＧＡＴ１を含むキメラベクターを使用して、安定的にソルガム・バイカラーを形質転換する。Ａ．ツメファシエンス株ＡＧＬ１中のＵｂｉ：ＭＧＡＴ１およびＵｂｉ：ＤＧＡＴ１を使用して、Ｇｕｒｅｌ他（２００９）によって説明されるように、ソルガム・バイカラーを形質転換する。最初に、アグロバクテリウムを、４℃で５分間、５，０００ｒｐｍで遠心分離し、液体共培養培地でＯＤ５５０＝０．４に希釈する。次いで、事前に単離した未成熟胚を、１５分間アグロバクテリウム懸濁液に完全に浸し、次いで、２４℃で２日間、暗所の共培養培地上で、胚盤側を上にして培養する。次いで、未成熟胚を、１００ｍｇ／Ｌカルベニシリンを伴うカルス誘導培地（ＣＩＭ）に移してアグロバクテリウムの成長を阻害し、４週間そのままにする。次いで、組織を、再生培地に移して、発芽および発根させる。Ｕｂｉプロモーターは、形質転換された植物の細胞において構成的に発現し、少なくとも栄養組織における含油量が増加する。
【０３８４】
マウスＭＧＡＴ２遺伝子のコード領域、植物細胞における発現を最適化したコドンを、前述した構築体のＭＧＡＴ１と置換し、ソルガムに導入する。結果として生じたトランスジェニック植物由来の栄養組織は、含油量が増加する。
【０３８５】
グリシネ・マクの安定的に形質転換された植物におけるＭＧＡＴの発現
Ｍ．マスクルスＭＧＡＴ１をコードするキメラ遺伝子を使用して、グリシネ・マク（油の生成に使用され得る別のマメ科植物）を安定的に形質転換する。アグロバクテリウム中の３５Ｓ：ＭＧＡＴ１を使用して、Ｚｈａｎｇ他（１９９９）によって説明されるように、Ｇ．マクを形質転換する。アグロバクテリウムを、５日目の苗木由来の子葉外植体とともに３日間共培養する。次いで、外植体を、１．６７ｍｇ／ＬのＢＡＰおよび５．０ｍｇ／Ｌのグルホシネートを補充したＧａｍｂｏｒｇのＢ５培地上で４週間培養し、その後に、外植体を、ＭＳ主要塩および副次塩、ならびに１．０ｍｇ／Ｌのゼアチンリボシド、０．５ｍｇ／ＬのＧＡ３、および１．７ｍｇ／Ｌまたは２．０ｍｇ／Ｌのグルホシネートで修正した０．１ｍｇ／ＬのＩＡＡを補充したＢ５ビタミン（ＭＳ／Ｂ５）を含む培地に二次培養する。延びた芽を、さらなるグルホシネート選択を伴わずに、０．５ｍｇ／ＬのＮＡＡを補充したＭＳ／Ｂ５発根培地上で発根させる。３５Ｓプロモーターは、形質転換された植物の細胞において構成的に発現し、栄養組織および種子における含油量が増加する。
【０３８６】
マウスＭＧＡＴ２遺伝子のコード領域、植物細胞における発現を最適化したコドンを、前述した構築体のＭＧＡＴ１と置換し、グリシンに導入する。結果として生じたトランスジェニック植物由来の栄養組織および種子は、含油量が増加する。
【０３８７】
安定的に形質転換したゼア・マイスにおけるＭＧＡＴの発現
Ｍ．マスクルスＭＧＡＴ１をコードするキメラ遺伝子を使用して、ゼア・マイスを安定的に形質転換する。３５Ｓ：ＭＧＡＴ１および３５Ｓ：ＤＧＡＴ１を構成するベクターを使用して、Ｇｏｕｌｄ他（１９９１）によって説明されるように、ゼア・マイスを形質転換する。簡潔には、茎頂外植体を２日間トランスジェニックアグロバクテリウムとともに共培養し、その後に、カナマイシンおよびカルベニシリンを含むＭＳ塩培地上に移す。数回の継代培養の後に、形質転換された芽および根を自発的に形成させて、土壌に移植する。３５Ｓプロモーターは、形質転換された植物の細胞において発現し、栄養組織および種子における含油量が増加する。
【０３８８】
マウスＭＧＡＴ２遺伝子のコード領域、植物細胞における発現を最適化したコドンを、前述した構築体のＭＧＡＴ１と置換し、ゼア・マイスに導入する。結果として生じたトランスジェニック植物由来の栄養組織および種子は、含油量が増加する。代替として、種子における増加した発現および増加した含油量のために、ゼインプロモーター等の胚乳特異的プロモーターまたは単子葉植物の植物から得られる胚の特異的プロモーターの制御下で、ＭＧＡＴコード領域を発現させる。Ａ．サリアナＧＰＡＴ４またはＧＰＡＴ６等の、ホスファターゼ活性を伴うＧＰＡＴをコードするさらなるキメラ遺伝子を、ＭＧＡＴと組み合わせてゼア・マイスに導入すると、トウモロコシ種子における含油量がさらに増加する。
【０３８９】
安定的に形質転換したエラエイス・ギネエンシス（パーム油）におけるＭＧＡＴの発現
Ｍ．マスクルスＭＧＡＴ１をコードするキメラ遺伝子を使用して、エラエイス・ギネエンシスを安定的に形質転換する。アグロバクテリウム中のＵｂｉ：ＭＧＡＴ１およびＵｂｉ：ＤＧＡＴ１と命名したキメラベクターを使用する。４８時間の活発な培養に続いて、細胞を使用してＩｚａｗａｔｉ他（２００９）によって説明されるようにエラエイス・ギネエンシスを形質転換する。Ｕｂｉプロモーターは、形質転換された植物の細胞において構成的に発現し、少なくとも果実および種子における含油量が増加し、油を得るために使用してもよい。
【０３９０】
マウスＭＧＡＴ２遺伝子のコード領域、植物細胞における発現を最適化したコドンを、前述した構築体のＭＧＡＴ１と置換し、エラエイスに導入する。結果として生じたトランスジェニック植物由来の種子は、含油量が増加する。
【０３９１】
安定的に形質転換されたアベナ・サティバ（オートムギ）におけるＭＧＡＴの発現
Ｍ．マスクルスＭＧＡＴ１をコードするキメラ遺伝子を使用して、アベナ・サティバ（別の単子葉植物）を安定的に形質転換する。上で説明したように、どちらもＵｂｉ：ＢＡＲ選択可能なマーカーを含むＵｂｉ：ＭＧＡＴ１およびＵｂｉ：ＤＧＡＴ１と命名したキメラベクターを使用して、Ｚｈａｎｇ（１９９９）によって説明されるように、アベナ・サティバを形質転換する。
【０３９２】
マウスＭＧＡＴ２遺伝子のコード領域、植物細胞における発現を最適化したコドンを、前述した構築体のＭＧＡＴ１と置換し、アベナに導入する。結果として生じたトランスジェニック植物由来の種子は、含油量が増加する。
【０３９３】
実施例７．ＤＧＡＴ活性を伴うＭＧＡＴの操作
同等のＤＧＡＴ活性を伴うＭＧＡＴを、関心のＭＧＡＴ遺伝子に対してランダムな変異誘発、標的変異誘発、もしくは飽和変異誘発を行うことによって、または異なるＭＧＡＴおよび／もしくはＤＧＡＴ遺伝子をＤＮＡシャフリングに供することによって操作してもよい。ＤＧＡＴ機能は、例えば、４つの遺伝子（ＤＧＡ１、ＬＲＯ１、ＡＲＥ１、ＡＲＥ２）における変異を含むＨ１２４６等の遊離脂肪酸を供給したときのＴＡＧ合成の相補に対する絶対要件を有する酵母株を使用することによって、積極的にスクリーニングすることができる。そのような株におけるＭＧＡＴ変異形を形質転換し、次いで、野生型ＭＧＡＴ遺伝子によって相補を防止する遊離脂肪酸の濃度で、形質転換された酵母を供給することで、改善されたＤＧＡＴ活性により増加したＴＡＧ合成能力を伴う変異形の成長だけを可能にする。これらの変異した遺伝子のＭＧＡＴ活性は、標識したｓｎ−１またはｓｎ−２−ＭＡＧを供給し、標識したＤＡＧの生成を定量化することによって判定することができる。合理的なタンパク質設計と組み合わせた数回の指向性進化は、類似したＭＧＡＴおよびＤＧＡＴ活性を伴う新しいＭＧＡＴ遺伝子の生成をもたらすであろう。
【０３９４】
実施例８．植物におけるＡ．サリアナ・ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の構成的発現
酵母（Ｗｅｓｅｌａｋｅ，２００９）、および昆虫細胞（Ｌａｒｄｉｚａｂａｌ，２００１）におけるＡ．サリアナＤＧＡＴ２の発現は、ＤＧＡＴ活性を示さなかった。同様に、ＤＧＡＴ２は、Ａ．サリアナＤＧＡＴ１ノックアウト（Ｗｅｓｅｌａｋｅ他，２００９）を相補することができなかった。葉組織におけるＡ．サリアナＤＧＡＴ２の酵素活性は、実施例１において説明されるように、Ｎ．ベンサミアナ一過性発現系を使用して決定した。Ａ．サリアナＤＧＡＴ２（登録番号Ｑ９ＡＳＵ１）を、ゲノムＰＣＲによって得て、３５Ｓプロモーターの制御下で、バイナリ発現ベクターの中にクローン化して、３５Ｓ：ＤＧＡＴ２を生成した。このキメラベクターを、Ａ．ツメファシエンス株ＡＧＬ１の中に導入し、これらの培養物由来の細胞を、対照として３５Ｓ：ＤＧＡＴ１を使用して、２４℃の成長室においてＮ．ベンサミアナ植物の葉組織に浸潤させた。いくつかの直接比較物に、比較する試料を浸潤させて、同じ葉の両側に置いた。実験は、３つ組で行った。浸潤の後、植物をさらに５日間成長させ、葉片を取り出し、その後に、実施例１で説明されるように、脂質クラス分画および定量化分析のために凍結乾燥した。この分析は、ＤＧＡＴ１およびＤＧＡＴ２がどちらも、ニコチアナ・ベンサミアナにおける葉油レベルを増加させるように機能していることを明らかにした（表６）。
【０３９５】
３５Ｓ：ｐ１９構築体（陰性対照）で形質転換した葉組織は、乾燥葉重量１００ｍｇあたり平均３４．９μｇのＴＡＧ由来の遊離脂肪酸を含んでいた。３５Ｓ：ｐ１９および３５Ｓ：ＤＧＡＴ１構築体（陽性対照）で形質転換した葉組織は、乾燥葉重量１００ｍｇあたり平均１２６．７μｇのＴＡＧ由来の遊離脂肪酸を含んでいた。３５Ｓ：ｐ１９および３５Ｓ：ＤＧＡＴ２構築体で形質転換した葉組織は、乾燥葉重量１００ｍｇあたり平均３１０．０μｇのＴＡＧ由来の遊離脂肪酸を含んでいた。
【０３９６】
上で説明したデータは、Ａ．サリアナＤＧＡＴ２酵素が、葉組織におけるＴＡＧの蓄積の促進において、Ａ．サリアナＤＧＡＴ１酵素よりも活性であることを示す。ＤＧＡＴ２遺伝子の発現は、ＤＧＡＴ１が発現したときと比較して、２４５％も多い葉組織におけるＴＡＧの蓄積をもたらした。
【０３９７】
実施例９．トランスジェニック種子におけるＭＧＡＴおよびＧＰＡＴの共発現
Ｙａｎｇ他（２０１０）は、Ａ．サリアナ由来の２つのグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ４およびＧＰＡＴ６）がどちらも、Ｇ−３−Ｐからｓｎ−２−ＭＡＧを生成することができる、ｓｎ−２選好（すなわち、ｓｎ−１／３−ＭＡＧよりも選好的にｓｎ−２−ＭＡＧを形成する）およびホスファターゼ活性を有することを説明した（図１）。これらの酵素は、クチン合成経路の一部であることが提案された。ＧＰＡＴ４およびＧＰＡＴ６は、種子組織において高度に発現しなかった。そのような二機能性ＧＰＡＴ／ホスファターゼをＭＧＡＴと組み合わせることで、植物（特に油料種子）または他の細胞におけるＤＡＧ合成のための典型的なケネディ経路を置換または補充することができる基質としてＧ−３−Ｐを使用して、新しいＤＡＧ合成経路を生み出し、その結果、増加した含油量、特にＴＡＧレベルをもたらす。
【０３９８】
植物種子における発現のためのＭ．マスクルスＭＧＡＴ２とともに、Ａ．サリアナＧＰＡＴ４およびＧＰＡＴ６をコードする、それぞれ、ｐＪＰ３３８２およびｐＪＰ３３８３と命名したキメラＤＮＡを、ｐＪＰ３３７８を生ずるように、最初に、ＳｗａＩ断片内に含まれるＭＧＡＴ２コード領域全体をＳｍａＩ部位のｐＪＰ３３６２の中に挿入することによって作製した。ｐＪＰ３３６２は、選択可能なマーカーとして空のＦＡＥ１およびＦＰ１発現カセットならびにカナマイシン耐性遺伝子を含む、バイナリ発現ベクターであった。Ａ．サリアナＧＰＡＴ４を、ｃＤＮＡから増幅し、ＮｏｔＩ部位のｐＪＰ３３７８の中にクローン化して、短縮したナピンプロモーターＦＰ１によってＧＰＡＴ４が発現し、Ａ．サリアナＦＡＥ１プロモーターによってＭＧＡＴ２が発現する、ｐＪＰ３３８２を生じさせた。同様に、Ａ．サリアナＧＰＡＴ６を、ｃＤＮＡから増幅し、ＮｏｔＩ部位のｐＪＰ３３７８の中にクローン化して、ＧＰＡＴ６が短縮したナピンプロモーターＦＰ１に操作可能に連結され、Ａ．サリアナＦＡＥ１プロモーターによってＭＧＡＴ２が発現する、ｐＪＰ３３８４を生じさせた。ｐＪＰ３３８２およびｐＪＰ３３８３を、フローラルディップ法によって、Ａ．サリアナ（生態型コロンビア）に形質転換した。処理済みの植物由来の種子を、抗生物質（カナマイシン）を含む媒体上で平板培養して、形質転換された子孫植物（Ｔ１植物）を選択した。トランスジェニック苗木を、土壌に移して、温室で成長させた。発育胚における導入遺伝子の発現を判定した。最高レベルの発現を伴い、系統あたりのトランスジェニック：非トランスジェニックの比率が３：１を示し、単一座の導入遺伝子の挿入を示すトランスジェニック植物を選択し、成熟期まで成長させる。これらの植物（Ｔ２）から、一部が導入遺伝子に対してホモ接合性である種子を得る。各系統由来の５０個の子孫植物（Ｔ２植物）を、土壌中で成長させ、結果として生じた種子の脂質含量、ＴＡＧ含量、および脂肪酸組成を判定する。ＭＧＡＴおよびＧＰＡＴ４またはＧＰＡＴ６の双方を含む種子の中性脂質含量、特にＴＡＧ含量が、対照を超えて、またＭＧＡＴだけまたはＡ．サリアナＤＧＡＴ１だけを含む種子を超えて、大幅に増加する。ＭＡＧおよびＤＡＧ含量も増加する。種子から抽出した脂質の脂肪酸組成が改良され、特に、ＡＬＡ等の多価不飽和脂肪酸の含量が大幅に増加する。
【０３９９】
実施例１０．ＰＡＴサイレンシングおよび変異によるＭＧＡＴ媒介ＴＡＧの増加に対するＧＰＡＴ４およびＧＰＡＴ６の効果の試験
ＧＰＡＴファミリーは大きく、全ての既知のメンバーは、２つの保存されたドメイン、すなわち、ｐｌｓＣアシルトランスフェラーゼドメインおよびＨＡＤ様ヒドロラーゼスーパーファミリードメインを含む。これに加えて、Ａ．サリアナＧＰＡＴ４〜８は全て、ホスホセリンホスファターゼドメインに相同的なＮ末端領域を含む。Ａ．サリアナＧＰＡＴ４およびＧＰＡＴ６はどちらも、ホスファターゼ活性に重要であることが知られている保存された残基を含む（Ｙａｎｇ他，２０１０）。
【０４００】
保存されたアミノ酸配列ＧＤＬＶＩＣＰＥＧＴＴＣＲＥＰ（配列番号２２８）に基づく縮重プライマーを、葉組織において発現するＮ．ベンサミアナＧＰＡＴ上の断片を増幅するように設計した。３’のＲＡＣＥを、これらのプライマー、およびＮ．ベンサミアナの葉組織から単離されるＲＮＡ上のオリゴ−ｄＴリバースプライマーを使用して行う。ホスファターゼ活性を伴うＧＰＡＴ（すなわち、ＧＰＡＴ４／６様）を、上で説明したＮ末端ホスホセリンホスファターゼのドメイン領域との相同性によって特定する。これらの遺伝子を標的とする３５Ｓ駆動ＲＮＡｉ構築体を、Ａ．ツメファシエンス株ＡＧＬ１において生成させ、形質転換する。同様に、Ｖ２ウイルスサイレンシングサプレッサータンパク質を含む３５Ｓ：Ｖ２構築体を、Ａ．ツメファシエンス株ＡＧＬ１において形質転換する。Ｖ２は、天然の植物サイレンシング機構を抑制して、有効な一過性発現を可能にするだけでなく、ＲＮＡｉに基づく遺伝子サイレンシングも機能させることが知られている。
【０４０１】
次いで、ＴＡＧの蓄積を、以下の株混合物で浸潤した一過性に形質転換された葉の試料間で比較する。１）３５Ｓ：Ｖ２（陰性対照）、２）３５Ｓ：Ｖ２＋３５Ｓ：ＭＧＡＴ２（陽性対照）、３）３５Ｓ：Ｖ２＋ＧＰＡＴ−ＲＮＡｉ、４）３５Ｓ：Ｖ２＋ＧＰＡＴ−ＲＮＡｉ＋３５Ｓ：ＭＧＡＴ２。３５Ｓ：Ｖ２＋ＧＰＡＴ−ＲＮＡｉ＋３５Ｓ：ＭＧＡＴ２混合物は、ＧＰＡＴサイレンシングに起因して遮断されたｓｎ−２−ＭＡＧ合成のため、３５Ｓ：Ｖ２＋３５Ｓ：ＭＧＡＴ２試料よりもＴＡＧの蓄積が少なくなると予想される。
【０４０２】
類似した実験を、ホスファターゼ活性に重要であることが知られている保存された残基（Ｙａｎｇ他，２０１０）を除去するように変異させた、Ａ．サリアナおよびＮ．ベンサミアナＧＰＡＴ４／６様配列を使用して行う。次いで、これらの変異させた遺伝子（集合的にＧＰＡＴ４／６−デルタとして知られる）を、３５Ｓ駆動発現バイナリベクターの中にクローン化し、Ａ．ツメファシエンスにおいて形質転換させる。次いで、ＴＡＧの蓄積を、以下の株混合物で浸潤した一過性に形質転換された葉の試料間で比較する。１）３５Ｓ：ｐ１９（陰性対照）、２）３５Ｓ：ｐ１９＋３５Ｓ：ＭＧＡＴ２（陽性対照）、３）３５Ｓ：ｐ１９＋ＧＰＡＴ４／６−デルタ、４）３５Ｓ：ｐ１９＋ＧＰＡＴ４／６−デルタ＋３５Ｓ：ＭＧＡＴ２。３５Ｓ：ｐ１９＋ＧＰＡＴ４／６−デルタ＋３５Ｓ：ＭＧＡＴ２混合物は、ＧＰＡＴ変異に起因して遮断されたｓｎ−２−ＭＡＧ合成のため、３５Ｓ：ｐ１９＋３５Ｓ：ＭＧＡＴ２試料よりもＴＡＧの蓄積が少なくなると予想される。天然のＮ．ベンサミアナＧＰＡＴ４／６様遺伝子が存在することになるが、この実験では、ＧＰＡＴ４／６−デルタ構築体の高レベルの発現が、Ｇ−３−Ｐ基質を利用する内因性遺伝子に勝ることが予想される。
【０４０３】
【表６】
2013534827.tif 000009
【０４０４】
広く説明される本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、数多くの変形および／または修正が、特定の実施形態で示される本発明に行われ得ることを当業者は理解するであろう。したがって、本実施形態は、あらゆる点において例示的なものに過ぎず、限定的なものではないとみなされる。
【０４０５】
本明細書で論じられるおよび／または参照されるすべての刊行物は、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０４０６】
本明細書に含まれている文献、行為、材料、機器、物品等の考察は、いずれも単に本発明の背景を提供するためのものである。これらの事項のいずれかまたは全てが、先行技術の基礎の一部を形成するものであること、または本出願の各請求項の優先日以前に存在していたので本発明に関連する分野における共通の一般知識であったことを承認するものとして解釈されるべきではない。
【０４０７】
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【図１】
2013534827.tif 000010
【図２】
2013534827.tif 000011
【図３】
2013534827.tif 000012
【図４】
2013534827.tif 000013
【図５】
2013534827.tif 000014
【図６】
2013534827.tif 000015
【配列表】
2013534827000001.app
【国際調査報告】
2013534827.tif 000016
2013534827.tif 000017
2013534827.tif 000018
2013534827.tif 000019
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