(57)【要約】本発明は、様々な癌において癌細胞および癌でない細胞を判別するための、ＯＭＤ（オステオモジュリン）および／またはＰＲＥＬＰ（プロリン／アルギニンリッチ末端ロイシンリッチリピートタンパク質）発現、特に過小発現の使用に関する物質および方法に関する。本発明は、例えば癌の惹起または発生を抑制するための療法において使用するための、ＯＭＤおよび／またはＰＲＥＬＰに基づく方法および物質をさらに提供する。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
正常細胞から癌細胞を判別する方法であって、ＯＭＤまたはそのバリアント；ＰＲＥＬＰまたはそのバリアントからなる一覧から選択される標的タンパク質が前記細胞の中で過小発現されるかどうかを判定することを含む、方法。
【請求項２】
前記方法は、ＯＭＤまたはそのバリアントおよびＰＲＥＬＰまたはそのバリアントの両方が前記細胞の中で過小発現されるかどうかを判定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が存在しているかまたは前記細胞が由来する個体において、癌の発症を診断、病期決定または予測することにおいて使用するための、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
個体の組織において癌の発症を診断、病期決定または予測するための方法であって、
（ａ）前記個体に由来する前記組織の試料において、（ｉ）ＯＭＤまたはそのバリアント；（ｉｉ）ＰＲＥＬＰまたはそのバリアント；（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方、からなる一覧から選択される標的タンパク質（複数可）の発現を判定することと、
（ｂ）前記試料中で観察された発現のパターンまたはレベルを、同じ個体に由来するかまたは１以上のさらなる健康な個体に由来する第２の臨床的に正常な組織試料の中の、または前記第２の臨床的に正常な組織試料に由来する、同じタンパク質（複数可）の前記発現のパターンまたはレベルと比較することを含み、前記試料において観察される発現の低下は、前記試料における癌細胞の存在の見込みと相関する、方法。
【請求項５】
前記発現のパターンまたはレベルは、前記もしくは各々の標的タンパク質のすべてもしくは一部分をコードする核酸配列、または前記核酸配列に相補的な配列を使用して評価される、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記発現のレベルは、ｍＲＮＡマイクロアレイおよびＲＴ−ＰＣＲを使用して評価される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記発現のパターンまたはレベルは、前記または各々の標的タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域のメチル化を検出することにより評価される、請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記または各々の標的タンパク質は、前記標的タンパク質に特異的に結合することができる結合部分である認識化合物を使用して検出され、前記結合部分は、検出可能な標識に任意に連結される、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記方法は、（ａ）癌細胞の存在について試験するべき組織試料を患者から入手する工程、（ｂ）試料調製プロセスにおいて調製された試料を生成する工程、（ｃ）前記調製された試料を前記または各々の標的タンパク質と反応する認識化合物と接触させる工程、および（ｄ）存在する場合、前記調製された試料において前記認識化合物の、前記標的タンパク質への結合を検出する工程を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
癌の診断用または予後診断用のマーカーとしての、
（ａ）（ｉ）ＯＭＤまたはそのバリアント；（ｉｉ）ＰＲＥＬＰまたはそのバリアント；（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方、からなる一覧から選択される標的タンパク質（複数可）、
（ｂ）前記または各々の標的タンパク質のすべてもしくは一部分をコードする核酸配列（複数可）、または前記標的タンパク質遺伝子のプロモーター、またはそれらに相補的な配列、または
（ｃ）各々が、前記または各々の標的タンパク質に特異的に結合することができる結合部分である、認識化合物（複数可）
のいずれかの使用。
【請求項１１】
試料中の癌の診断または予後診断のためのキットであって、
（ａ）評価対象の試料を受けるための容器または他の手段と、
（ｂ）前記試料中の、（ｉ）ＯＭＤまたはそのバリアント；（ｉｉ）ＰＲＥＬＰまたはそのバリアント；（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方、からなる一覧から選択される標的タンパク質（複数可）の存在および／または量を特異的に検出するための手段と、任意に
（ｃ）このようなアッセイを実施するための取扱説明書と
を含む、キット。
【請求項１２】
個体についての癌治療レジメンの有効性を１以上の時間点について判定する方法であって、
（ａ）前記個体の癌性組織における、（ｉ）ＯＭＤまたはそのバリアント；（ｉｉ）ＰＲＥＬＰまたはそのバリアント；（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方、からなる一覧から選択される標的タンパク質（複数可）の発現のベースライン値を測定する工程と、
（ｂ）治療用薬物を投与する工程と、次いで
（ｃ）投与後の１以上の場面における前記組織内での前記または各々の標的タンパク質の発現レベルを再測定する工程と
を含み、前記標的タンパク質発現レベルにおける観察される変化は、前記治療レジメンの有効性と相関する、方法。
【請求項１３】
癌治療化合物についてスクリーニングする方法であって、候補治療用化合物を、（ｉ）ＯＭＤまたはそのバリアント；（ｉｉ）ＰＲＥＬＰまたはそのバリアント、からなる一覧から選択される標的タンパク質（複数可）と接触させることと、（ａ）前記化合物と前記標的タンパク質との間の複合体の存在について、または（ｂ）前記標的タンパク質とリガンドまたはその結合パートナーとの間の複合体の存在についてアッセイすることと、を含む方法。
【請求項１４】
癌治療化合物についてスクリーニングする方法であって、候補治療用化合物を、（ｉ）ＯＭＤまたはそのバリアント；（ｉｉ）ＰＲＥＬＰまたはそのバリアント、からなる一覧から選択される標的タンパク質（複数可）と接触させることと、前記標的タンパク質の生物活性に対する前記化合物の効果をアッセイすることと、を含む方法。
【請求項１５】
癌治療化合物についてスクリーニングするためのモデル系を生成する方法であって、１以上の組み換えポリヌクレオチド、（ｉ）ＯＭＤまたはそのバリアント；（ｉｉ）ＰＲＥＬＰまたはそのバリアント；（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方、からなる一覧から選択される標的タンパク質（複数可）を用いて、真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞を安定に形質転換することを含む、方法。
【請求項１６】
癌治療化合物についてスクリーニングするためのモデル系を生成する方法であって、真核生物宿主細胞内で、（ｉ）ＯＭＤまたはそのバリアント；（ｉｉ）ＰＲＥＬＰまたはそのバリアント；（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方、からなる一覧から選択される標的タンパク質（複数可）をコードする１以上の内因性の遺伝子を不活化することを含む、方法。
【請求項１７】
癌治療化合物についてスクリーニングすることに好適な遺伝子導入の非ヒト動物であって、（ｉ）ＯＭＤまたはそのバリアント；（ｉｉ）ＰＲＥＬＰまたはそのバリアント；（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の標的タンパク質の両方、からなる一覧から選択される標的タンパク質（複数可）をコードする遺伝子（複数可）の不活性なコピーを含む、遺伝子導入の非ヒト動物。
【請求項１８】
癌治療化合物についてスクリーニングする方法であって、候補治療用化合物を、請求項１６に記載の動物に投与することと、前記治療薬の効果を判定することと、を含む方法。
【請求項１９】
癌治療化合物についてスクリーニングする方法であって、
（ａ）（ｉ）ＯＭＤまたはそのバリアント；（ｉｉ）ＰＲＥＬＰまたはそのバリアント；（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方、からなる一覧から選択される標的タンパク質（複数可）を過小発現する細胞を準備することと、
（ｂ）候補治療用化合物を前記細胞に加えることと、
（ｃ）前記標的タンパク質（複数可）の発現または生物活性に対する前記化合物の効果を判定することと、
任意に（ｄ）前記化合物が前記標的タンパク質（複数可）の前記発現または生物活性を上昇させる場合に、前記化合物を選択することと
を含む、方法。
【請求項２０】
前記候補治療用化合物の不存在下での前記または各々のタンパク質の発現または生物活性のレベルを、前記候補治療用化合物の存在下での発現または生物活性のレベルと比較することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
（ｉ）ＯＭＤまたはそのバリアント；（ｉｉ）ＰＲＥＬＰまたはそのバリアント；（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方、からなる一覧から選択される標的タンパク質（複数可）と前記化合物との間の複合体の形成について試験することを含む、請求項１９または請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
（ｉ）ＯＭＤまたはそのバリアント；（ｉｉ）ＰＲＥＬＰまたはそのバリアント；（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方、からなる一覧から選択される標的タンパク質（複数可）とリガンドまたは結合パートナーとの間の複合体の形成が、前記化合物によって妨害される程度について試験することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
癌治療化合物を製造する方法であって、
（ｉ）請求項１３および請求項１４および請求項１９から請求項２２のいずれか１項に記載の方法の使用によって、前記化合物についてスクリーニングすることと、
（ｉｉ）前記化合物を製造することと
を含む方法。
【請求項２４】
癌治療薬を製造する方法であって、
（ｉ）請求項２３に記載の方法の使用によって化合物を製造することと、
（ｉｉ）前記化合物を好適な薬学的に許容できる担体と合わせることと
を含む方法。
【請求項２５】
癌の処置のための医薬の調製における、請求項１３および請求項１４および請求項２０から請求項２２のいずれか１項に記載の方法によって特定される化合物の使用。
【請求項２６】
癌の処置を必要とする患者における癌の処置の方法であって、前記患者に、治療上有効量の、（ｉ）ＯＭＤまたはそのバリアント；（ｉｉ）ＰＲＥＬＰまたはそのバリアント；（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方、からなる一覧から選択される標的タンパク質（複数可）の発現または活性をインビボで上昇させる化合物を投与する工程を含む、方法。
【請求項２７】
癌の処置に使用するための、（ｉ）ＯＭＤまたはそのバリアント；（ｉｉ）ＰＲＥＬＰまたはそのバリアント；（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方、からなる一覧から選択される標的タンパク質（複数可）の発現または活性をインビボで上昇させる、化合物。
【請求項２８】
前記化合物は、（ｉ）ＯＭＤまたはそのバリアント；（ｉｉ）ＰＲＥＬＰまたはそのバリアント；（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方、からなる一覧から選択される標的タンパク質（複数可）をコードするポリヌクレオチドである、請求項２５から請求項２７のいずれか１項に記載の使用、方法または化合物。
【請求項２９】
前記化合物はベクター上にコードされる、請求項２８に記載の使用、方法または化合物。
【請求項３０】
前記化合物は前記標的タンパク質と相互作用し、前記標的タンパク質の生物活性を上昇または増大する、請求項２５から請求項２７のいずれか１項に記載の使用、方法または化合物。
【請求項３１】
前記化合物は、任意にマイトマイシンＣであるＤＮＡ損傷試薬と組み合わせて使用される、請求項２５から請求項２７のいずれか１項に記載の使用、方法または化合物。
【請求項３２】
前記処置は、以下の、腫瘍形成の阻害；Ｇ１期での細胞周期の停止；増殖の阻害；アポトーシスによる細胞死の増加；癌細胞の足場非依存性増殖またはコロニー形成能の低下；治療用ＤＮＡ損傷試薬に対する癌細胞の感度の上昇のうちの１以上をもたらす、請求項２５から請求項３１のいずれか１項に記載の使用、方法または化合物。
【請求項３３】
前記癌は上皮癌である、請求項１から請求項３２のいずれか１項に記載の使用、方法または化合物。
【請求項３４】
前記癌は、任意に膀胱癌もしくは腎癌である泌尿器の癌、または他の上皮癌から選択される、請求項１から請求項３３のいずれか１項に記載の使用、方法または化合物。
【請求項３５】
癌は、肺癌、乳癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、甲状腺癌、食道癌、小腸癌、および副腎癌から選択され、前記癌において、標的タンパク質は下方制御される、請求項１から請求項３４のいずれか１項に記載の使用、方法または化合物。
【請求項３６】
前記標的タンパク質および癌は、ＯＭＤ／肺癌；ＰＲＥＬＰ／肺癌；ＰＲＥＬＰ／前立腺癌；ＰＲＥＬＰ／乳癌から選択される、請求項１から請求項３５のいずれか１項に記載の使用、方法または化合物。
【請求項３７】
前記癌は、前記標的タンパク質に応答するすべての癌から選択される、請求項１から請求項３６のいずれか１項に記載の使用、方法または化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、例えば膀胱癌、腎癌、肺癌、乳癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、甲状腺癌、食道癌、小腸癌、および副腎癌などの癌および他の癌の処置および診断において使用するための方法および物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、細胞が制御されない足場非依存性増殖を示し組織恒常性維持の崩壊を生じる疾患である。従って、もともとの位置での癌の惹起の後、その細胞は、転移および浸潤によって体内の他の位置へと広がる。癌は様々な遺伝子の変化によって引き起こされるので、処置のための一般的な方法はない。最近、癌処置における顕著な進歩が成し遂げられた。しかしながら、多くの癌は、まだ処置に反応せず、多くはまだ致死的である。多くの腫瘍遺伝子および腫瘍抑制遺伝子が特定されており、これらの遺伝子に基づいて多くの診断方法が開発されている。しかしながら、診断方法はまだ不十分なままであり、この開発も、満足できる状態からは程遠い。早期の大多数の癌の一般的な診断の開発が非常に重要である。
【０００３】
膀胱癌および腎癌は泌尿器の腫瘍の主要な種類である。大多数の膀胱癌患者は、予後良好に、筋層非浸潤性膀胱癌、病期（段階）ｐＴａまたはｐＴ１を有する。しかしながら、膀胱癌は、あらゆる固形腫瘍の中で最も高い再発率を有し、６０〜７０％の患者が再発するであろう。これらの再発のうちの約１０％は、進行型の筋層浸潤性腫瘍へと進むであろう。それゆえ、膀胱癌の正確な病期の早期の検出および判定が必要とされる。
【０００４】
膀胱癌およびその再発の早期の検出は、予後の改善および長期生存にとって必須である。膀胱癌試験およびルイスＸ抗原試験などの膀胱癌についてのいくつかの試験が報告されている。しかしながら、それらの試験の感度および特異性はだいたい５０〜７０％の範囲にある。いくつかの診断方法は高感度を有するが低特異性であり、他方で、高特異性かつ低感度であるものもある。例えば、ＦＩＳＨは３０％感度および９５％特異性を有するが（非特許文献１）、他方で、ＨＡ−ＨＡａｓｅは８６％感度および６１％特異性を有する（非特許文献２）。癌組織を高精度で特定するための完璧な方法はない。この状況は腎癌についても当てはまる。腎癌は別のタイプの泌尿器の癌である。２つの最も一般的なタイプの腎癌は、腎細胞癌および腎盂癌である。約２００，０００の腎癌の新しい症例が、毎年、世界中で診断される。英国では、腎癌は、男性では、８番目に最も一般的な癌である。最も高い割合は、北アメリカで記録されている。しかしながら、まだ理想的な診断方法はない。それゆえ、癌の膀胱／腎臓細胞と癌でない膀胱／腎臓細胞とを高い感度および特異性で判別する方法を開発することが非常に重要である。
【０００５】
上記のことから、正常な組織および形質転換された組織において差異的に発現される、新しく特徴づけられた、特異的な、信頼性の高いマーカーの提供は、当該技術分野に対する有用な貢献となるであろうということは分かるであろう。「汎用マーカー」である（すなわち、多くの異なるタイプの癌と関連する）と思われるマーカーは特に有用である。なぜなら、そのようなマーカーは、診断の費用および時間を少なくするために使用することができるからである。いずれのこのようなマーカーも、とりわけ、膀胱癌／腎癌などの癌の診断、膀胱癌／腎癌などの癌の発症の予測、または膀胱癌／腎癌などの癌の処置で使用することができるであろう。
【０００６】
本発明者らは、２つのタンパク質、ＯＭＤ（オステオモジュリン（ｏｓｔｅｏｍｏｄｕｌｉｎ）、オステオアドへリン（ｏｓｔｅｏａｄｈｅｒｉｎ）としても知られる）およびＰＲＥＬＰ（プロリン／アルギニンリッチ末端ロイシンリッチリピートタンパク質、Ｐｒｏｌｉｎｅ／ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｅｎｄ  ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の発現が、癌の膀胱／腎臓細胞と癌でない膀胱／腎臓細胞とを高い感度および特異性で判別するために使用される可能性があるということを示した。さらには、ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの発現分析の組み合わせによって、膀胱癌および腎癌の両方の判定においてさらにより高い精度がもたらされる。本発明者らは、これらのタンパク質は、肺癌、乳癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、甲状腺癌、食道癌、小腸癌、および副腎癌などの他の癌において癌細胞と癌でない細胞とを判別するために使用することができるということも示した。
【０００７】
非特許文献３。Ｐｅｒｏｕらは、エストロゲン受容体陽性の癌  対  エストロゲン受容体陰性の癌における、ＯＭＤ  ｍＲＮＡの発現の低下を報告する。しかしながら、同じ論文は、通常の線維腺腫  対  浸潤性小葉癌におけるＯＭＤ  ｍＲＮＡの増加に言及する。
【０００８】
ＯＭＤまたはＰＲＥＬＰは、癌の技術分野の種々の公開された特許出願において、これまでに言及されてきた。
【０００９】
特許文献１は、ＯＭＤを、「骨転移に関連する遺伝子」であり、骨に局在する転移性の乳癌細胞が、分析した試料の大多数において、一貫してＯＭＤに対して強い免疫反応性を示すことが明らかに認められたとして記載する。ＰＲＥＬＰも触れられている。
【００１０】
特許文献２は、子宮の漿液性乳頭状腺癌および漿液性卵巣乳頭状腫瘍の遺伝子発現プロファイリングに関する。この文献は、これらは組織学的に区別がつかないことを注記し、オリゴヌクレオチドマイクロアレイがそれらを区別する可能性があるかどうかを見出そうとする。ＯＭＤの下方制御が、子宮の漿液性乳頭状腺癌に関して触れられている。
【００１１】
特許文献３は、信頼性が高くかつ効率的な乳癌の診断および予後診断の方法ならびに手段の必要性に関する。この文献は、ＯＭＤを含む少なくとも２００の腫瘍マーカーに特異的な成分の組を記載する。
【００１２】
特許文献４は、結腸癌に高度に特異的である腫瘍マーカーの提供、および結腸癌の病的状態を特定することができる方法の提供に関する。ＰＲＥＬＰは、下方制御される結腸癌関連タンパク質であると触れられている。
【００１３】
本願請求項に係る発明のＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの有用性は、これらの文献では教示されていない。
【００１４】
ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰは、系統樹（図１）において分派を構成する。それらの構造、発現、および機能は、スモールロイシンリッチリピートプロテオグリカン（ｓｍａｌｌ  ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ）（ＳＬＲＰ）ファミリーの他の分派の中のメンバーとは異なる。しかしながら、癌、および特に泌尿器の癌におけるＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの役割に関する検討はこれまでほとんどなかった。
【００１５】
ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰをコードする遺伝子の発現は癌の診断のための理想的な方法であるという本願明細書における開示に加えて、ＯＭＤまたは／およびＰＲＥＬＰの遺伝子発現または機能の活性化は、癌の惹起および発生を抑制することができるということがさらに開示される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】国際公開第２００８１０４５４３（Ａ２）号パンフレット（欧州特許第１９６１８２５号明細書）
【特許文献２】国際公開第０４１０８８９６（Ａ２）号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００８０７７１６５（Ａ１）号パンフレット
【特許文献４】欧州特許第２０２８４９２（Ａ１）号明細書
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｇｕｄｊｏｎｓｓｏｎ，Ｓ．、Ｉｓｆｏｓｓ，Ｂ．Ｌ，Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｋ．、Ｄｏｍａｎｓｋｉ，Ａ．Ｍ．、Ｗａｒｅｎｈｏｌｔ，Ｊ．、Ｓｏｌｌｅｒ，Ｗ．、Ｌｕｎｄｂｅｒｇ，Ｌ．Ｍ．、Ｌｉｅｄｂｅｒｇ，Ｆ．、Ｇｒａｂｅ，Ｍ．、およびＭａｎｓｓｏｎ，Ｗ．、「Ｔｈｅ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵｒｏＶｙｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｍｕｓｃｌｅ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ」、Ｅｕｒ  Ｕｒｏｌ、２００８年、第５４巻、４０２−４０８頁
【非特許文献２】Ｅｉｓｓａ，Ｓ．、Ｋａｓｓｉｍ，Ｓ．Ｋ．、Ｌａｂｉｂ，Ｒ．Ａ．、Ｅｌ−Ｋｈｏｕｌｙ，Ｉ．Ｍ．、Ｇｈａｆｆｅｒ，Ｔ．Ｍ．、Ｓａｄｅｋ，Ｍ．、Ｒａｚｅｋ，Ｏ．Ａ．、およびＥｌ−Ａｈｍａｄｙ，Ｏ．、「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｕｒｉｎｅ  ｆｏｒ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ  ２０  ＲＮＡｓ」、Ｃａｎｃｅｒ、２００５年、第１０３巻、１３５６−１３６２頁
【非特許文献３】「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｏｒｔｒａｉｔｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ    ｂｒｅａｓｔ  ｔｕｍｏｕｒｓ」、Ｎａｔｕｒｅ、２０００年８月１７日、第４０６巻、６７９７号、７４７−５２頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
従って、本発明は、癌のマーカーとしてのＯＭＤおよびＰＲＥＬＰ（これらのいずれも、本願明細書中では、このあと「本発明の標的タンパク質」と呼ばれることがある）の使用を記載し、およびこのような応用例においてそれらを使用するための方法を提供する。
【００１９】
以下で詳細に論じられるように、本発明の標的タンパク質は、とりわけ様々な癌、および特に上皮癌および膀胱癌または腎癌の診断用マーカーおよび予後診断用マーカーとして特に有用である。公知のマーカーの場合のように、本発明の標的タンパク質は、例えば、疾患の進行の早期で癌の存在を診断し、特に化学療法剤または複数の化学療法剤の組み合わせに対する特定の患者の腫瘍の感度または耐性に関して、臨床的に成功した成果の見込みを予測することを支援するために使用されてもよい。さらには、例えば、健康な組織において著しい毒性を引き起こすことなく腫瘍性細胞を特異的に標的にするために、および候補治療用化合物の、膀胱または腎臓および他の組織由来の癌性細胞の生物活性を調節する能力の評価のための方法を提供するために、これらの標的は、膀胱癌または腎癌および他の癌における治療的介入のために使用されてもよい。
【００２０】
従って、本発明は、癌の診断および処置に、具体的には、特定の腫瘍抗原の過小発現に基づいた、正常細胞からの腫瘍性細胞の判別、および腫瘍性細胞内でのこれらの抗原の差異的発現の利用を通した、処置の標的指向化に関する。本発明は、具体的には、病理学的に正常な細胞における発現と比較して腫瘍性細胞において過小発現される１以上のタンパク質（「標的タンパク質」）（例えば表２〜４を参照）の検出に関する。従って、これらの標的タンパク質、およびそれらをコードする核酸配列またはそれに相補的な配列は、膀胱癌もしくは腎癌などの癌の発症を診断もしくは予測すること、癌治療の有効性をモニターすることにおいて有用な癌マーカーとして、および／またはこのような治療の標的として使用することができる。
【００２１】
本発明は、特に、本発明の標的タンパク質、またはこのタンパク質をコードする遺伝子の過小発現に基づく、正常細胞からの腫瘍性細胞の判別に関する。この特定を可能にするために、本発明は、腫瘍性細胞では正常細胞と比較して発現が低下している特定のタンパク質の、発現のパターンを準備する。本発明は、このタンパク質およびこのタンパク質の発現パターンを検出し、この情報を癌の診断もしくは予後診断および処置、または癌処置の有効性の評価のために使用するための様々な方法を提供する。
【００２２】
例えば、このような方法は、以下のものを含む。
・個体由来の試料におけるＯＭＤおよび／またはＰＲＥＬＰのｍＲＮＡの検出または測定、ならびに検出されたレベルと、その個体における癌（例えば、膀胱癌または腎癌のような泌尿器の癌などの上皮癌）の見込み、病期または感受性との相関、
・個体由来の試料におけるＯＭＤおよび／またはＰＲＥＬＰの転写または翻訳の抑制の検出または測定、ならびに検出されたレベルと、その個体における癌（例えば、膀胱癌または腎癌のような泌尿器の癌などの上皮癌）の見込み、病期または感受性との相関、
・個体由来の試料におけるＯＭＤおよび／またはＰＲＥＬＰのタンパク質レベルの検出または測定、ならびに検出されたレベルと、その個体における癌（例えば、膀胱癌または腎癌のような泌尿器の癌などの上皮癌）の見込み、病期または感受性との相関、
・個体由来の試料におけるＯＭＤおよび／またはＰＲＥＬＰの活性の検出または測定、ならびに検出されたレベルと、癌（例えば、膀胱癌または腎癌のような泌尿器の癌などの上皮癌）の見込み、病期または感受性との相関。
【００２３】
さらには、他の態様では、本発明は、膀胱癌または腎癌などの癌を処置するための新規なスクリーニング系および治療学を提供する。この例としては、
・例えば、タンパク質ＯＭＤおよび／またはＰＲＥＬＰの安定化、または他の修飾によって、ＯＭＤおよび／またはＰＲＥＬＰの活性を増大させること、
・例えばＯＭＤおよび／もしくはＰＲＥＬＰをコードする遺伝子の転写活性化によって、またはタンパク質ＯＭＤおよび／もしくはＰＲＥＬＰをコードする核酸の導入によって、ＯＭＤおよび／またはＰＲＥＬＰをコードする遺伝子の発現を増大させること、
・ＯＭＤおよび／またはＰＲＥＬＰの活性と同様の活性を有するバリアントまたは類似体を含むこと
が挙げられる。
【００２４】
これにより、本発明は、上記標的タンパク質の差異的発現に基づく、膀胱癌または腎癌を含めた癌の診断、予後診断および処置のための広い範囲の新規な方法を提供する。本発明のこれらならびに他の多くのさらなる態様および利点は、以下の本発明の詳細な説明を考慮すれば、当業者には明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＯＭＤ、ＰＲＥＬＰ、およびケラトカンの構造。
【図２】ＳＹＢＲ（商標）  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用した、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲの検証。
【図３】ｑＲＴ−ＰＣＲを使用した、膀胱組織におけるＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの遺伝子発現の定量分析。
【図４】ｑＲＴ−ＰＣＲを使用した、腎臓組織におけるＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの遺伝子発現の定量分析。
【図５】ｑＲＴ−ＰＣＲを使用した、いくつかの正常組織、膀胱腫瘍組織および膀胱癌細胞株におけるＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの遺伝子発現の定量分析。
【図６】マイクロアレイを使用した、種々のタイプの癌におけるＯＭＤ遺伝子発現の定量分析。
【図７】マイクロアレイを使用した、種々のタイプの癌におけるＰＲＥＬＰ遺伝子発現の定量分析。
【図８】膀胱正常組織および癌組織におけるＰＲＥＬＰタンパク質の分布。
【図９】ＥＪ２８膀胱癌細胞におけるＯＭＤの過剰発現後の、異常な形状を有する細胞。
【図１０】ＯＭＤ発現は、アポトーシスから正常細胞を保護するのに対して、ＰＲＥＬＰ発現は効果を有しない。
【図１１】ＥＪ２８細胞におけるＯＭＤまたはＰＲＥＬＰの過剰発現は、当該細胞の、マイトマイシンＣ処置に対する感作をもたらす。
【図１２】ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの過剰発現されたタンパク質。
【図１３】５６３７膀胱癌細胞株を用いたｓｉＰＲＥＬＰ形質移入の効果。
【図１４】ＥＪ２８細胞の足場非依存性増殖を、ＯＭＤは消失させ、ＰＲＥＬＰは阻害する。
【図１５】ＯＭＤタンパク質を過剰発現するＥＪ２８細胞の異種移植の効果。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本願明細書に記載されるとおり、本発明者らは、ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの発現レベルが、多くの癌において著しく下方制御されるということを見出した。本願明細書に記載される態様および実施形態では、癌は、上皮癌、例えば膀胱癌および腎細胞癌などの泌尿器の癌であってもよい。他の態様または実施形態では、癌は、肺癌、乳癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、甲状腺癌、食道癌、小腸癌、または副腎癌であってもよい。
【００２７】
本発明に包含される特定の好ましいタンパク質／癌の組み合わせとしては、ＯＭＤ／肺癌、ＰＲＥＬＰ／肺癌、ＰＲＥＬＰ／前立腺癌、ＰＲＥＬＰ／乳癌などが挙げられる。
【００２８】
発癌の非常に早期においてさえも、両方の遺伝子についての遺伝子発現データを組み合わせるとき、腫瘍を、正常なものから明確に区別することができた。これらの新規な知見は、癌診断の新規な方法を提供する。また、これらの遺伝子の活性化は、正常細胞に影響することなく癌細胞のアポトーシスを増進し、抗癌剤への感度を高め、これは、これらの遺伝子の活性化によって癌の新規な処置を提供することができるということを実証する。
【００２９】
さらには、癌細胞を使用する異種移植研究により、マウスにおけるインビボでの過剰発現が癌の発生を完全に抑制することが示された。
【００３０】
これらの態様および実施形態のいくつかは、これより、より詳細に記載される。
【００３１】
ＯＭＤ
ＯＭＤは、ＳＬＲＰファミリーに属するケラタン硫酸プロテオグリカンである（Ｓｏｍｍａｒｉｎら、１９９８年）。ＯＭＤはヒドロキシアパタイトに対して高い親和性を有し、これは、ＳＬＲＰの中でもユニークな特徴であり、およそ６０％の酸性残基からなる伸長されたＣ末端領域によっておそらく媒介される。ＯＭＤは、早期分化型の骨芽細胞から発現され、類骨形成の後期で無機質沈着の開始時にピークを迎え、そしてＥＣＭの形成体として提案されている。ＯＭＤはＴＧＦ−β１およびＢＭＰ−２によって制御され、早期の高分化した骨芽細胞についてのマーカーである（Ｒｅｈｎら、２００６年）。
【００３２】
本願明細書に開示されるように、ＯＭＤの発現は、正常組織と比較して、膀胱癌および腎癌を含めた多くのタイプの悪性癌においては、著しく低減される可能性がある。
【００３３】
膀胱癌は染色体９の頻繁な遺伝子変異によって特徴づけられ、ＯＭＤ遺伝子は染色体９ｑ２２．３１に位置する。マイクロサテライトマーカーを用いた精密な欠失マッピングにより、この染色体上での、９ｐ２２−２３、９ｐ２１−２２、９ｐ１１−１３、９ｑ１２−１３、９ｑ２１−２２、９ｑ３１および９ｑ３３−３４における、いくつかの推定上の腫瘍抑制因子の遺伝子座の存在が示唆されている（Ｃｚｅｒｎｉａｋら、１９９９年；Ｈａｂｕｃｈｉら、１９９５年；Ｓｉｍｏｎｅａｕら、１９９６年；Ｓｉｍｏｎｅａｕら、１９９９年）。本願明細書中の結果を考慮して、本発明者らは、１ＭｂのＣＧＨアレイを使用して、悪性の膀胱組織におけるＯＭＤ遺伝子の遺伝子座の著しい（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）欠失を示す（データは示さず）。
【００３４】
ＰＲＥＬＰ
ＰＲＥＬＰは、もともと軟骨の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）内の豊富なタンパク質として特定され（Ｈｅｉｎｅｇａｒｄら、１９８６年）、他の結合組織においてもより低いレベルで検出され、この他の結合組織では、ＰＲＥＬＰはＢＭの近くに局在する（Ｓｔａｎｆｏｒｄら、１９９５年）。ＰＲＥＬＰは、ＢＭプロテオグリカンであるパールカンと相互作用し、この相互作用は、ＰＲＥＬＰの塩基性のＮ末端のＰｒｏおよびＡｒｇリッチなドメインとパールカンのアニオン性のヘパリン硫酸（ＨＳ）鎖との間の相互作用であると仮定された（Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎら、２０００年）。このＰＲＥＬＰ／ＨＳ相互作用は、ＰＲＥＬＰを細胞表面ＨＳ−プロテオグリカンに結合すると仮定される（Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎら、２０００年）。ＰＲＥＬＰのコアタンパク質は、コラーゲン原線維と相互作用し、そして細胞を、隣接するＥＣＭにあるＢＭに結合する役割を果たす可能性がある（Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎら、２００２年）。マウスにおけるＰＲＥＬＰの過剰発現は、真皮中のコラーゲン線維束の含有量およびサイズの減少を伴って、皮膚の構造変化を生じる（Ｇｒｏｖｅｒら、２００７年）。
【００３５】
診断および評価の方法
後出の実施例に示されるように、膀胱癌および腎癌を含めた多くのタイプの癌におけるＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの発現パターンが、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ、および癌組織の免疫組織化学を使用して調べられた。
【００３６】
１２６の膀胱癌試料および３１の正常対照試料が、レーザーキャプチャー顕微鏡を使用して顕微解剖され、ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの発現が、表１に示されるプライマーを使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲによって分析された。図２に示すとおり、これらの状態は確認された。
【００３７】
ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの発現レベルはともに、正常組織と比較して、腫瘍においては有意に低いことが判明した（いずれの場合もＰ＜０．０００１；図３Ａ〜Ｄおよび表２）。ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの発現は、早期の癌細胞では非常に早期から抑制されるので、腫瘍の病期に基づく分析では、ＯＭＤまたはＰＲＥＬＰのいずれについても早期（ｐＴａ／ｐＴ１）とｐＴ２段階との間の有意差は明らかにならなかった。しかしながら、Ｔ３／Ｔ４群の数は少なかったが、ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの発現レベルはともに、進行した段階ｐＴ３／ｐＴ４では、ｐＴ２と比較して有意に低かった。腫瘍病期Ｇ１とＧ２との間でＯＭＤ発現レベルの有意差が見出されたが、腫瘍病期Ｇ２とＧ３との間では有意差は見出されなかった。ＰＲＥＬＰ発現の場合は、腫瘍悪性度Ｇ１とＧ２との間のわずかな差を除いては、悪性度の進行に基づく顕著な特徴は何も見出すことはできなかった。ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの発現レベルはともに、転移したことが分かっている原発性腫瘍では、より低かった。表２に示すように、性別または再発状態によって分類したときには、有意差は認められなかった。本発明者らは、年齢、腫瘍サイズ、喫煙歴および浸潤状態に関しても定量的ＲＴ−ＰＣＲ結果を分析したが、有意差は見出せなかった（データは示さず）。
【００３８】
これらの結果は、ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの発現レベルは、膀胱での発癌の非常に早期から劇的に下方制御されること、およびこれらの遺伝子の発現レベルは、発癌の末期段階において低いままであることを示し、このことは、これらの遺伝子が癌のすべての病期および悪性度について理想的であることを示す。さらに、発現レベルは、腫瘍形成の病期と有意な相関を有し、このことは、これらの遺伝子が膀胱癌の病期の判定に好適であるということを示す。
【００３９】
次に、本発明者らは、７８の腎細胞癌試料および１５の正常対照試料においてＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの定量的遺伝子発現分析を実施した（図４；表３）。腫瘍組織における発現レベルは、ＯＭＤ（Ｐ＜０．０００１；図４Ｂ）およびＰＲＥＬＰ（Ｐ＜０．０００１；図４Ｄ）の両方について、正常組織における発現レベルよりも劇的に低かった。腫瘍病期に基づく結果の分析から、ｐＴ３およびｐＴ４の腫瘍組織におけるＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの発現レベルはともに、ｐＴ１およびｐＴ２におけるよりも有意に低いということが示された。しかしながら、腫瘍悪性度、転移状態、生存期間または組織学的な細胞の種類については有意差を見出すことはできなかった（表３）。加えて、試料の性別および年齢は、ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの発現レベルに差を示さなかった（データは示さず）。これらのデータは、ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの発現レベルは腎臓での発癌の初期段階から有意に下方制御されるということを示す。さらに、早期癌の発現レベルは、進行した段階よりも有意に高く、これは、ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰが、膀胱癌で観察されたような癌の病期の指標として機能することができるということを示す。
【００４０】
最後に、本発明者らの統計的な詳細な解析により、ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの発現分析に基づいて、組織が癌であるか否かをほとんど１００％の精度で予測することができるということが明らかになった。図３および４に示すように、本発明者らは、最初に、正常なものから腫瘍を区別するためのカットオフを設定する。カットオフ値を導くために、各データにおいて第３四分位数（ｘ．７５）から第１四分位数（ｘ．２５）を除算することにより、四分位範囲（ＩＱＲ）を算出した。本発明者らは、第１四分位数よりも１．５＊ＩＱＲ超低いかまたは第３四分位数よりも１．５＊ＩＱＲ高いいずれのデータ観察値も異常値と考え、カットオフ値を以下のとおりに導いた：カットオフ＝［（正常組織における最小の非異常値の観察値）＋（腫瘍組織における最大の非異常値の観察値）］／２。
【００４１】
ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの診断値は、表４に要約されている。膀胱の場合は、ほとんどの正常組織におけるＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの発現レベルは、カットオフ値を超えていたが（ＯＭＤ、３１のうち２６［特異性８３．９％］；ＰＲＥＬＰ、３１のうち２８［特異性９０．３％］）、他方で、ほとんどの腫瘍組織における発現は、カットオフを下回っていた（ＯＭＤ、１２６のうち１１２［感度８８．９％］；ＰＲＥＬＰ、１２６のうち１１４［感度９０．５％］；表４）。加えて、ほとんどすべての腫瘍組織の早期におけるＯＭＤおよびＰＲＥＬＰのレベルも、カットオフ値を下回っていた（ＯＭＤ、９０のうち８０［感度８８．９％］；ＰＲＥＬＰ、９０のうち８２［感度９１．２％］；表４）。これらの結果は、これらの遺伝子の発現レベルが、実際に膀胱癌の存在についての有用な指標であるということを示す。さらに、ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの両方のデータを組み合わせた（表４）。両方の遺伝子についてカットオフ未満のカテゴリーに属する正常組織試料は見出されなかった［特異性１００％］。重要なことは、１２６の腫瘍試料のうち１２０で、少なくとも１つの、ＰＲＥＬＰまたはＯＭＤがカットオフ未満であったことである［感度９５．２％］。これらのデータは、ＰＲＥＬＰおよびＯＭＤの両方のデータの組み合わせを用いて、正常試料から腫瘍を明確に区別することができたということを示す。
【００４２】
腎臓については、多くの正常組織におけるＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの発現レベルはカットオフを超えていたが（ＯＭＤ、１５のうち１３［特異性８６．７％］；ＰＲＥＬＰ、１５のうち１２［特異性８０．０％］）、他方で、多くの腫瘍組織における発現レベルはカットオフを下回っていた（ＯＭＤ、７８のうち６４［感度８２．１％］；ＰＲＥＬＰ、７８のうち６５［感度８２．５％］）。ほとんどの腫瘍組織の早期における両方の遺伝子の発現も、カットオフを下回っていた（ＯＭＤ、２５のうち２２［感度８８．０％］；ＰＲＥＬＰ、２５のうち２２［感度８８．０％］）。ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰについてのデータを合わせることにより、両方でカットオフ未満というカテゴリーに含まれる正常組織試料は生じなかった［特異性１００％］。他方、非常に多くの腫瘍の症例が、少なくとも１つでカットオフ未満というカテゴリーにあった（７９のうち７４［感度９３．６％］）。加えて、かなりの数の早期腫瘍の症例もこのカテゴリーにある（２５のうち２３［感度９２％］）。これらの結果は、膀胱癌の場合と同様に、正常試料から腎臓腫瘍試料を区別する区別することもでき、およそ８４％の腫瘍試料が早期から検出できたということを示す。
【００４３】
癌組織におけるＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの本発明の発現分析は、ＯＭＤベースおよびＰＲＥＬＰベースの癌診断の大きな価値を実証した。より多くの支持するエビデンスを得るために、複数の癌細胞株についてＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの発現レベルを測定し、正常組織および腫瘍組織と比較した。９種の正常組織、１０種の膀胱癌細胞株および膀胱腫瘍組織においてＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの定量的遺伝子発現分析を行った（図５）。正常組織におけるＯＭＤ発現レベルは、肺、胎生期の眼および膀胱では高く、胃、結腸、心臓、脳および腎臓では中程度であり、肝臓では低い。上で調べたように、レベルは、膀胱腫瘍組織でも非常に低い。加えて、ＯＭＤ発現レベルは、ほとんどの膀胱癌細胞株では、正常な膀胱組織と比較して有意に低い（図５Ａおよび５Ｂ）。興味深いことに、ＲＴ−４細胞における発現レベルは、他の細胞株よりも有意に高い。この細胞株は高分化型の膀胱細胞株であり、この結果は、本発明でのデータと整合する。
【００４４】
図５Ｃは、いくつかの正常組織および膀胱腫瘍組織におけるＰＲＥＬＰ発現を示す。レベルは、肺および膀胱では非常に高く、胃、結腸、胎生期の眼および腎臓では中程度であり、心臓、脳および肝臓では低い。レベルは、膀胱腫瘍組織ではきわめて低く、すべての膀胱癌細胞株では有意に低く、これらの膀胱癌細胞株は、膀胱腫瘍におけるレベル以下のレベルを有する。これらの結果は、ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰ遺伝子は正常組織において遍在的に発現され、発現レベルは膀胱腫瘍組織におけるよりも有意に高いということを明らかにする。さらには、ほとんどの膀胱癌細胞株における発現レベルは、正常な膀胱組織よりも有意に低い。このデータは、臨床試料を使用する本発明の知見の信頼性を強調する。
【００４５】
腫瘍形成におけるＯＭＤおよびＰＲＥＬＰのより一般的な役割を解明するために、多くのタイプの癌（膀胱癌、肺癌、乳癌、結腸癌、腎癌、胃癌、および前立腺癌などの上皮癌を含む）におけるＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの発現パターンを調べた（図６および７）。ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの発現は、周囲の上皮に由来する対照細胞と比較して、すべての癌のタイプの癌試料の大多数において非常に強く抑制される。これらの癌としては、肺癌、乳癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、甲状腺癌、食道癌、小腸癌、および副腎癌が挙げられる。
【００４６】
ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの診断上の価値をさらに探索するために、癌組織および正常組織の免疫組織化学を、ＰＲＥＬＰに特異的な抗体を使用することにより実施した（図８）。この抗体は正常組織および移行型の癌組織の正常部分を染色した。しかしながら、癌組織／試料の癌部分はまったく染色されず、上で論じたＲＴ−ＰＣＲ分析およびマイクロアレイ解析における知見と整合した。
【００４７】
従って、本発明の第１の態様は、癌細胞の特定のための方法であって、第１の個体由来の組織の試料において本発明の標的タンパク質の発現を判定する工程と、観察された発現のパターンを、同じ個体または第２の健康な個体由来の第２の臨床的に正常な組織試料における同じタンパク質の発現のパターンと比較する工程とを含み、この第１の個体由来の試料の中の腫瘍細胞の存在は、観察された発現パターンの相違によって示される、方法を提供する。
【００４８】
より具体的には、本発明は、標的タンパク質の差異的発現によって腫瘍および腫瘍性細胞、特にヒトの腫瘍性細胞を特徴づけるための診断アッセイであって、腫瘍性の表現型は、この標的タンパク質の差異的発現と関連づけられ、この標的タンパク質の差異的発現によって特定され、そしてこの標的タンパク質の差異的発現に基づいて診断されうるアッセイ、を提供する。この診断アッセイは、定性的にまたは好ましくは定量的に、標的タンパク質の発現レベルを検出する工程と、この発現レベルに基づいて癌の診断を行う工程とを含む。
【００４９】
これに関して、「発現を判定すること」は、標的タンパク質の生物活性の量を、単位時間あたりの活性単位などを単位として測定することを含む、本発明の標的タンパク質の存在の定性的および／または定量的な判定を意味する。
【００５０】
本願明細書で使用する場合、用語「発現」は、一般に、ポリペプチドがＲＮＡから産生される細胞プロセスを指す。
【００５１】
本発明の好ましい実施形態では、この方法は、膀胱癌または腎癌などの泌尿器の癌の診断に応用されてもよい。
【００５２】
文脈と矛盾しない限り、種バリアントも、患者が非ヒトの哺乳動物である本発明に包含され、同様に、ヒトのＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの対立遺伝子バリアントまたは他のバリアントも包含され、これらのタンパク質に言及するときは常に、同じ活性を共有するバリアント（例えば断片、対立遺伝子、ホモログ、他の生物のオルソログ、変異したヒトの遺伝子、他の生物の変異したオルソログ、タグ化されたタンパク質、類似の生物活性を有する他の改変遺伝子、または他の天然に存在するバリアント）を包含すると理解されるものとする。
【００５３】
以下（配列番号１）は、ヒトのＯＭＤの現在公開されているアミノ酸配列である。
ＭＧＦＬＳＰＩＹＶＩＦＦＦＦＧＶＫＶＨＣＱＹＥＴＹＱＷＤＥＤＹＤＱＥＰＤＤＤＹＱＴＧＦＰＦＲＱＮＶＤＹＧＶＰＦＨＱＹＴＬＧＣＶＳＥＣＦＣＰＴＮＦＰＳＳＭＹＣＤＮＲＫＬＫＴＩＰＮＩＰＭＨＩＱＱＬＹＬＱＦＮＥＩＥＡＶＴＡＮＳＦＩＮＡＴＨＬＫＥＩＮＬＳＨＮＫＩＫＳＱＫＩＤＹＧＶＦＡＫＬＰＮＬＬＱＬＨＬＥＨＮＮＬＥＥＦＰＦＰＬＰＫＳＬＥＲＬＬＬＧＹＮＥＩＳＫＬＱＴＮＡＭＤＧＬＶＮＬＴＭＬＤＬＣＹＮＹＬＨＤＳＬＬＫＤＫＩＦＡＫＭＥＫＬＭＱＬＮＬＣＳＮＲＬＥＳＭＰＰＧＬＰＳＳＬＭＹＬＳＬＥＮＮＳＩＳＳＩＰＥＫＹＦＤＫＬＰＫＬＨＴＬＲＭＳＨＮＫＬＱＤＩＰＹＮＩＦＮＬＰＮＩＶＥＬＳＶＧＨＮＫＬＫＱＡＦＹＩＰＲＮＬＥＨＬＹＬＱＮＮＥＩＥＫＭＮＬＴＶＭＣＰＳＩＤＰＬＨＹＨＨＬＴＹＩＲＶＤＱＮＫＬＫＥＰＩＳＳＹＩＦＦＣＦＰＨＩＨＴＩＹＹＧＥＱＲＳＴＮＧＱＴＩＱＬＫＴＱＶＦＲＲＦＰＤＤＤＤＥＳＥＤＨＤＤＰＤＮＡＨＥＳＰＥＱＥＧＡＥＧＨＦＤＬＨＹＹＥＮＱＥ。
【００５４】
配列番号２は、ヒトのＰＲＥＬＰの現在公開されているアミノ酸配列である。
ＭＲＳＰＬＣＷＬＬＰＬＬＩＬＡＳＶＡＱＧＱＰＴＲＲＰＲＰＧＴＧＰＧＲＲＰＲＰＲＰＲＰＴＰＳＦＰＱＰＤＥＰＡＥＰＴＤＬＰＰＰＬＰＰＧＰＰＳＩＦＰＤＣＰＲＥＣＹＣＰＰＤＦＰＳＡＬＹＣＤＳＲＮＬＲＫＶＰＶＩＰＰＲＩＨＹＬＹＬＱＮＮＦＩＴＥＬＰＶＥＳＦＱＮＡＴＧＬＲＷＩＮＬＤＮＮＲＩＲＫＩＤＱＲＶＬＥＫＬＰＧＬＶＦＬＹＭＥＫＮＱＬＥＥＶＰＳＡＬＰＲＮＬＥＱＬＲＬＳＱＮＨＩＳＲＩＰＰＧＶＦＳＫＬＥＮＬＬＬＬＤＬＱＨＮＲＬＳＤＧＶＦＫＰＤＴＦＨＧＬＫＮＬＭＱＬＮＬＡＨＮＩＬＲＫＭＰＰＲＶＰＴＡＩＨＱＬＹＬＤＳＮＫＩＥＴＩＰＮＧＹＦＫＳＦＰＮＬＡＦＩＲＬＮＹＮＫＬＴＤＲＧＬＰＫＮＳＦＮＩＳＮＬＬＶＬＨＬＳＨＮＲＩＳＳＶＰＡＩＮＮＲＬＥＨＬＹＬＮＮＮＳＩＥＫＩＮＧＴＱＩＣＰＮＤＬＶＡＦＨＤＦＳＳＤＬＥＮＶＰＨＬＲＹＬＲＬＤＧＮＹＬＫＰＰＩＰＬＤＬＭＭＣＦＲＬＬＱＳＶＶＩ。
【００５５】
従って、配列番号１〜２のいずれかで与えられる天然に存在する配列のアミノ酸バリアントは、本発明の標的タンパク質の定義の範囲内に含まれる。好ましくは、バリアント配列は、野生型配列と少なくとも７５％相同性を有し、より好ましくは提供された参照配列（配列番号１〜２）の少なくとも一部分と少なくとも８０％相同性、さらにより好ましくは少なくとも８５％相同性、なおより好ましくは少なくとも９０％相同性、または最も好ましくは少なくとも９５％相同性を有する。いくつかの実施形態では、相同性は９４〜９６％または９８％という高さになるであろう。これに関して相同性は、配列の類似性または同一性を意味し、同一性が好ましい。候補ペプチド領域が、参照のポリペプチドまたはペプチドオリゴマーに対して必要な百分率の類似性または同一性を有するかどうかを判定するために、候補アミノ酸配列および参照アミノ酸配列は、まず、市販されており当業者が広く使用している標準的なコンピュータープログラムを使用して配列比較される。好ましい実施形態では、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ方法が使用される（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）。それら２つの配列が配列比較されると、類似性％スコアが算出されてもよい。すべての例において、本願明細書において配列番号１〜２で示した天然に存在する配列のバリアントは、マーカータンパク質としての機能について確認される必要がある。具体的には、特定の形態または特定の生物学的区画の中でのそれらバリアントの存在または不存在は、個体における癌の存在または不存在を示すに違いない。このルーチンの実験は、本願明細書中の開示を踏まえて、当該技術分野で公知の標準的な方法を使用することにより実施することができる。
【００５６】
本発明の１つの態様では、標的タンパク質は、当該マーカータンパク質に特異的に結合することができる結合部分を使用して検出することができる。例として、この結合部分は、リガンド−受容体対、すなわち特異的な結合相互作用を有することができる一対の分子のメンバーを含んでもよい。この結合部分は、例えば、特異的な結合対、例えば抗体−抗原、酵素−基質、核酸−核酸、タンパク質−核酸、タンパク質−タンパク質、または当該技術分野で公知の他の特異的な結合対のメンバーを含んでもよい。本発明の標的タンパク質に対して高められた親和性を有する結合タンパク質が設計されてもよい。任意に、この結合部分は、酵素標識、蛍光標識、放射活性標識、りん光標識、有色粒子標識またはスピン標識などの検出可能な標識と連結されてもよい。標識された複合体は、例えば、視覚的に、または分光光度計もしくは他の検出器を用いて検出されてもよい。
【００５７】
本発明の好ましい実施形態は、組織、細胞、血液もしくは体内産物の試料、またはそれらから誘導される試料と接触させるため、および肯定的反応についてスクリーニングするための、認識剤、例えば本発明の標的タンパク質を認識する抗体の使用を伴う。肯定的反応は、例えば、凝集反応によって、または色の変化もしくは蛍光（例えば免疫染色）などの目に見えるようにできる変化によって、または放射免疫法または酵素結合抗体法の使用などの定量的方法によって示されてもよい。
【００５８】
それゆえ当該方法は、典型的には、（ａ）癌細胞の存在について試験するべき組織試料を患者から入手する工程と、（ｂ）試料調製プロセスにおいて調製された試料を生成する工程と、（ｃ）調製された試料を、本発明の標的タンパク質と反応する抗体などの認識剤と接触させる工程と、（ｄ）調製された試料において、存在する場合、標的タンパク質への認識剤の結合を検出する工程とを含む。ヒトの組織試料は、一般に、膀胱または腎臓に由来することになろう。
【００５９】
試料は、患者組織から切り取られた切片をさらに含んでもよいし、または試料は全細胞を含有してもよいし、または試料は、例えば、血液；血清；血漿；糞便；尿；膣内分泌物；乳房滲出液；髄液；唾液；腹水（ａｓｃｉｔｉｃ  ｆｌｕｉｄ）；腹水（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｆｌｕｉｄ）；痰；および膀胱もしくは腎臓の滲出液からなる群から選択される体液試料であってもよく、または浸出液であってもよく、浸出液の場合は、試料は細胞を含有してもよいし、または遊離抗原（ｓｈｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ）を含有してもよい。好ましい試料調製プロセスは、組織固定および薄片の生成を含む。次いで標的タンパク質への認識剤の結合を検出するために、この薄片を、免疫組織学的解析にかけることができる。好ましくは、この免疫組織学的解析は、複合酵素標識（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｅｎｚｙｍｅ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ）技法を含む。好ましい薄片調製方法としては、ホルマリン固定およびワックス包埋が挙げられる。代替の試料調製プロセスとしては、組織均質化が挙げられる。試料調製が組織均質化を含むとき、標的タンパク質への抗体の結合を検出するための好ましい方法はウエスタンブロット解析である。
【００６０】
あるいは、標的タンパク質への抗体の結合を検出するためにイムノアッセイを使用することができる。イムノアッセイの例は、抗体捕捉アッセイ、２抗体サンドイッチアッセイ、および抗原捕捉アッセイである。サンドイッチイムノアッセイでは、マーカータンパク質に結合することができる２種の抗体が一般に使用され、例えば一方は固体支持体上に固定され、一方は自由に溶液中にあり、検出可能な化学的化合物で標識されている。第２の抗体について使用されてもよい化学標識の例としては、放射性同位体、蛍光性化合物、スピン標識、コロイド状の金および有色のラテックスなどの有色の粒子、および、反応物質もしくは酵素基質に曝露されたときに有色の生成物もしくは電気化学的に活性な生成物を生成する酵素または他の分子が挙げられる。マーカータンパク質を含有する試料がこの系に置かれたとき、マーカータンパク質は、固定された抗体および標識された抗体の両方を結合して、支持体の表面上で「サンドイッチ」免疫複合体を形成する。複合体を形成したタンパク質は、結合していない試料成分および過剰の標識された抗体を洗い流し、支持体の表面上のタンパク質と複合体を形成した標識された抗体の量を測定することにより、検出される。あるいは、自由に溶液の中にある抗体（これは化学的部分、例えばハプテン、で標識されていてもよい）は、この自由な抗体または、例えば、それに対合したハプテンに結合する検出可能な部分で標識された第３の抗体によって検出されてもよい。好ましくは、このイムノアッセイは、固体支持体ベースのイムノアッセイである。あるいは、このイムノアッセイは、例えば比濁イムノアッセイまたは免疫比濁法などの当該技術分野で公知の免疫沈降技法のうちの１つであってもよい。ウエスタンブロット解析またはイムノアッセイが使用されるとき、そのウエスタンブロット解析またはイムノアッセイが複合酵素標識技法を含むことが好ましい。
【００６１】
当該認識剤が抗体であることが簡便であろうが、他の認識剤も公知であり、入手できる可能性があり、本発明で使用することができる。例えば、抗体の抗原結合ドメイン断片、例えばＦａｂ断片、を使用することができる。また、いわゆるＲＮＡアプタマーも使用してもよい。それゆえ、文脈と明らかに矛盾しない限り、用語「抗体」は、本願明細書で使用する場合、他の認識剤を包含することが意図されている。抗体が使用される場合には、その抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであってもよい。任意に、この抗体は、その抗体が本発明の標的タンパク質由来の前選択したエピトープを認識するような方法によって生成されてもよい。
【００６２】
単離された本発明の標的タンパク質を、組織試料または液体試料の中の当該タンパク質のレベルをモニターするための診断用および他の組織評価用のキットおよびアッセイの開発のために使用してもよい。例えば、このキットは、標的タンパク質に特異的に結合する抗体または他の特異的結合部分を含んでもよく、これにより、膀胱癌または腎癌関連のタンパク質の存在および／または濃度が組織試料または液体試料の中で検出および／または定量されるようになる。従って、本発明は、標的タンパク質を検出するための好適なキットであって、評価対象の試料を受けるための容器または他の手段と、試料中の本発明の標的タンパク質の存在および／または量を検出するための手段と、任意にこのようなアッセイを実施するための取扱説明書とを含んでもよいキット、の生成をさらに提供する。
【００６３】
ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰをコードする核酸に基づいてＯＭＤおよびＰＲＥＬＰのレベルを検出するための方法がいくつかある。これらには、ｍＲＮＡレベルの検出、タンパク質レベルの検出転写活性、の検出、翻訳活性の検出が含まれる。ｍＲＮＡレベルを検出するための方法としては、定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびマイクロアレイ解析が挙げられる。これらのうちのいくつかは、これより説明される。
【００６４】
特定の実施形態では、マーカーｍＲＮＡのレベルは、当該技術分野で公知の方法を使用して、生物試料中でインサイツ形式によっておよびインビトロ形式の両方によって測定することができる。インビトロ方法については、ｍＲＮＡの単離を妨げないいずれのＲＮＡ単離技法も、ＲＮＡの精製のために利用することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７−１９９９を参照）。加えて、例えば、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉの一段階ＲＮＡ単離プロセス（１９８９年、米国特許第４，８４３，１５５号）などの当業者にとって周知である技法を使用して、多数の組織試料を容易に処理することができる。
【００６５】
単離されたｍＲＮＡは、ハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイで使用することができ、ハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイの例としては、サザン分析またはノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応分析およびプローブアレイが挙げられるが、これらに限定されない。ｍＲＮＡレベルの検出のための１つの好ましい診断方法は、単離されたｍＲＮＡを、検出しようとする遺伝子によってコードされるｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる核酸分子（プローブ）と接触させることを伴う。この核酸プローブは、例えば全長ｃＤＮＡ、またはその一部分、例えば長さが少なくとも７、１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチドで、ストリンジェントな条件下で本発明のマーカーをコードするｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドであることができる。
【００６６】
例えば、約３０ヌクレオチドまたはこれより長いプローブがこの方法で用いられてもよい。ストリンジェントな条件は、０．１％  ＳＤＳ／０．１ｘＳＳＣ中、６８℃で洗浄することを含んでもよい。
【００６７】
ｍＲＮＡとプローブとのハイブリダイゼーションは、着目しているマーカーが発現されているということを示す。最も好ましい実施形態では、転移特異的な生物学的マーカーの検出および／または定量化は、好適なＤＮＡマイクロアレイを使用することにより実施される。このようなマーカー検出／定量化フォーマットでは、ｍＲＮＡは、固体表面に固定され、例えば単離されたｍＲＮＡをアガロースゲルの上で流し、ｍＲＮＡをそのゲルから膜へ、例えばニトロセルロースへトランスファーすることにより、プローブと接触させられる。別のフォーマットでは、プローブ（複数可）は、固体表面に固定され、ｍＲＮＡは、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  遺伝子チップアレイの中でプローブ（複数可）と接触させられる。当業者は、本発明のマーカーによってコードされるｍＲＮＡのレベルを検出することにおいて使用するための公知のｍＲＮＡ検出方法を容易に採用することができる。当該方法で用いられる発現プロファイルを生成するために実施されてもよい特異的ハイブリダイゼーション技術としては、米国特許第５，１４３，８５４号明細書；米国特許第５，２８８，６４４号明細書；米国特許第５，３２４，６３３号明細書；米国特許第５，４３２，０４９号明細書；米国特許第５，４７０，７１０号明細書；米国特許第５，４９２，８０６号明細書；米国特許第５，５０３，９８０号明細書；米国特許第５，５１０，２７０号明細書；米国特許第５，５２５，４６４号明細書；米国特許第５，５４７，８３９号明細書；米国特許第５，５８０，７３２号明細書；米国特許第５，６６１，０２８号明細書；米国特許第５，８００，９９２号明細書（これらの開示は、参照により本願明細書に援用したものとする）、ならびに国際公開第９５／２１２６５号パンフレット；国際公開第９６／３１６２２号パンフレット；国際公開第９７／１０３６５号パンフレット；国際公開第９７／２７３１７号パンフレット；欧州特許第３７３  ２０３号明細書；および欧州特許第７８５  ２８０号明細書に記載される技術が挙げられる。これらの方法では、表現型を決定する遺伝子（この発現がアッセイされている）の各々に対するプローブを含む「プローブ」核酸のアレイが、上記のようにして標的核酸と接触させられる。接触は、ハイブリダイゼーション条件下、例えば上記のとおりのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で実施され、その後、結合していない核酸は除去される。ハイブリダイズした核酸の得られるパターンは、調べられた遺伝子の各々についての発現に関する情報を提供し、その際、その発現情報は、その遺伝子が発現されているか否か、および、典型的には、どのレベルで発現されているかに関するものであるが、その発現データ、すなわち、発現プロファイル、は定性的および定量的であってもよい。
【００６８】
試料中のｍＲＮＡマーカーのレベルを測定するための代替の方法は、例えばＲＴ−ＰＣＲ（後述するとおり）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９１年、第８８巻、１８９−１９３頁）、自家持続配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９０年、第８７巻、１８７４−１８７８頁）、転写増幅系（Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８９年、第８６巻、１１７３−１１７７頁）、Ｑ−βレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９８８年、第６巻、１１９７頁）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉら、米国特許第５，８５４，０３３号明細書）またはいずれかの他の核酸増幅方法による核酸増幅、その後の、当業者にとって周知である技法を使用した、増幅された分子の検出のプロセスを伴う。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に少ない数で存在する場合には、そのような核酸分子の検出のためにとりわけ有用である。本願明細書で使用する場合、増幅プライマーは、遺伝子（それぞれ、＋鎖および−鎖、またはその逆）の５’または３’領域にアニールすることができ、かつそれらの間に短い領域を含む一対の核酸分子であるとして定義される。一般に、増幅プライマーは、長さが約１０〜３０ヌクレオチドであり、長さが約５０〜２００ヌクレオチドの領域に隣接する。適切な条件下でかつ適切な試薬を用いて、このようなプライマーは、プライマーが隣接するヌクレオチド配列を含む核酸分子の増幅を可能にする。
【００６９】
インサイツ方法については、ｍＲＮＡは、検出に先立って当該試料から単離される必要はない。このような方法では、細胞または組織試料は、公知の組織学的な方法を使用して調製／処理される。次いで、試料は支持体、典型的にはガラススライド、上に固定され、次いで、当該マーカーをコードするｍＲＮＡにハイブリダイズすることができるプローブと接触させられる。
【００７０】
マーカーの絶対的な発現レベルに基づいて判定を行うことに代わるものとして、判定は、当該マーカーの正規化された発現レベルに基づいてもよい。マーカーの発現を、マーカーではない遺伝子、例えば構成的に発現されるハウスキーピング遺伝子の発現と比較することにより、マーカーの絶対的な発現レベルを修正することによって、発現レベルは正規化される。正規化のための好適な遺伝子としてはアクチン遺伝子などのハウスキーピング遺伝子が挙げられる。この正規化によって、１つの試料の中の１以上の注目する組織特異的な生物学的マーカーの発現レベルの比較が可能になる。
【００７１】
あるいは、発現レベルは、相対的発現レベルとして提供することができる。マーカーの相対的発現レベルを測定するために、着目している試料についての発現レベルの測定に先立って、正常細胞分離株  対  癌細胞分離株の４、５、１０またはこれより多い試料について、マーカーの発現のレベルが測定される。より多くの試料でアッセイされた遺伝子の各々のメジアン発現レベルが測定され、これが、そのマーカーについてのベースライン発現レベルとして使用される。試験試料について測定された当該マーカーの発現レベル（発現の絶対的レベル）は、次に、そのマーカーについて得られる平均発現値で除算される。これは、相対的発現レベルを与え、この相対的発現レベル自体は、例えば＜５０％、＜３３％、＜２０％などへ分類することができる。
【００７２】
従って、１つの態様では、本発明は、個体の試料の中に存在する核酸分子を含む試験試料を入手する工程と、次いで、その試験試料の中の、標的タンパク質をコードするｍＲＮＡの量を測定する工程と、任意に、その試験試料の中のｍＲＮＡの量を所定の値と比較する工程とを含んでもよい。
【００７３】
より好ましくは、試験試料の中の、ｍＲＮＡの量を測定する工程は、ｍＲＮＡの特異的増幅、次いで例えば、後出の実施例に記載されるとおりのＲＴ−ＰＣＲ分析を介した、増幅された生成物の定量を伴う。
【００７４】
転写レベルは、エピジェネティックな修飾および転写因子によって制御される。特定のエピジェネティックな因子および／または転写因子の状態の測定は、転写活性を検出することができる。言い換えれば、発現および転写のレベルの低下はプロモーター過剰メチル化の結果であることが多いということは当該技術分野で公知である。それゆえ、本発明の１つの実施形態では、ＯＭＤまたはＰＲＥＬＰ遺伝子プロモーターが過剰メチル化されているかどうかを判定することが望ましい場合がある。プロモーターメチル化は、制限エンドヌクレアーゼ処理およびサザンブロット分析などの公知の技法によって検出することができる。技法としては、米国特許第５５５２２７７号明細書に公開されている技法、またはより最近の技法（例えばＫｅｎ  Ｉ．Ｍｉｌｌｓ、Ｂｅｒｎｉｅ  Ｈ．Ｒａｍｓａｈｏｙｅによる「ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（２００２年）；Ｍａｎｅｌ  Ｅｓｔｅｌｌｅｒによる「ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ：ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ，ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（２００５年）を参照）が挙げられる。それゆえ、本発明の方法では、検出される細胞成分がＤＮＡであるとき、制限エンドヌクレアーゼ分析は、プロモーターの過剰メチル化を検出するために好ましい。認識部位の一部としてＣＧを含み、かつＣがメチル化されているとき阻害されるいずれの制限エンドヌクレアーゼも利用することができる。好ましくは、このメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、ＢｓｓＨＩＩ、ＭｓｐＩ、またはＨｐａＩＩであり、これらは単独または組み合わせて使用される。他のメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、当業者にとって公知であろう。
【００７５】
本発明のこれらの実施形態では、従って、当該タンパク質の発現のパターンまたはレベルは、当該または各々の標的タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域のメチル化を検出することにより推測される、先行する請求項。一般に、（本願明細書に記載されるような参照または対照と比較して）過剰メチル化は、着目しているタンパク質の発現の減少と相関する。任意に、これは、プロモーター領域のメチル化を検出する試薬を使用して評価され、このプロモーター領域のメチル化を検出する試薬は、任意に制限エンドヌクレアーゼ、例えばＭｓｐＩ、ＨｐａＩＩおよびＢｓｓＨＩＩなどのメチル化感受性エンドヌクレアーゼであってもよい。
【００７６】
翻訳も、マイクロＲＮＡの作用などの複数の機構によって制御される。ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰタンパク質の翻訳抑制を検出するためのすべてのこのような方法論も、本発明に含まれる。
【００７７】
本発明のさらなる態様では、癌の処置のための候補治療用薬物の効果を評価する方法であって、当該薬物を患者に投与する工程と、細胞試料をこの患者から取り出す工程と、その細胞試料における本発明の標的タンパク質の発現プロファイルを判定する（例えば定量する）工程とを含む方法が本願明細書に提示される。この方法は、当該発現プロファイルを健康な個体の発現プロファイルと比較する工程をさらに含んでもよい。
【００７８】
好ましい実施形態では、患者は、上皮癌、例えば泌尿器の癌、例えば膀胱癌または腎癌についての処置を受けており、細胞試料は上皮組織、例えば膀胱または腎臓に由来する。さらに好ましい実施形態では、本発明は、１以上の時間点において治療レジメンの有効性を判定するための方法であって、与えられた個体における与えられた組織（例えば腫瘍）内での、試験されているタンパク質の発現についてのベースライン値を測定する工程と、与えられた治療用薬物を投与する工程と、次いでその後の１以上の場面において、その与えられた組織内での当該タンパク質の発現レベルを再測定する工程と、治療レジメンの有効性の目安としてタンパク質レベルの変化を観察する工程とを含む方法をさらに提供する。
【００７９】
従って、例えば、しかし限定されるわけではないが、本発明は、以下を包含する。
・実際の癌患者または癌と疑われる患者（例えば上皮癌、例えば泌尿器の癌、例えば膀胱癌または腎癌）由来の試料のＯＭＤおよび／またはＰＲＥＬＰのｍＲＮＡの検出。これは、当該技術分野で公知のいずれの方法、例えばマイクロアレイおよびＲＴ−ＰＣＲによって成し遂げられてもよい。
・実際の癌患者または癌と疑われる患者（例えば上皮癌、例えば泌尿器の癌、例えば膀胱癌または腎癌）由来の試料におけるＯＭＤおよび／またはＰＲＥＬＰタンパク質の検出。これは、当該技術分野で公知のいずれの方法、例えば特異的抗体およびＯＭＤ、ＰＲＥＬＰ結合タンパク質によって成し遂げられてもよい。
・実際の癌患者または癌と疑われる患者（例えば上皮癌、例えば泌尿器の癌、例えば膀胱癌または腎癌）由来の試料におけるＯＭＤおよび／またはＰＲＥＬＰ活性の検出。これは、当該技術分野で公知のいずれの方法によって成し遂げられてもよい。
・実際の癌患者または癌と疑われる患者（例えば上皮癌、例えば泌尿器の癌、例えば膀胱癌または腎癌）由来の試料における、ＯＭＤおよび／またはＰＲＥＬＰの転写および／またはｍＲＮＡ翻訳活性の抑制の度合いの検出。これは、当該技術分野で公知のいずれの方法、例えば特異的な転写下方制御およびエピジェネティックな修飾の検出によって成し遂げられてもよい。エピジェネティックな修飾は、癌試料の直接検査によって、および血液試料および尿試料などの体液の間接的検査によって検出することができる。これは、ｍｉＲＮＡ活性の検出などの特異的な翻訳制御（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）機構も含む。
・上記の検出方法を使用する、癌病期の判定。
・上記の検出方法を使用する、患者の予後診断の判定。
・上記の検出方法を使用する、癌処置の有効性の測定。
【００８０】
スクリーニング方法および治療戦略
ＯＭＤおよび／またはＰＲＥＬＰの活性化に基づく癌の処置のための新規な方法も本願明細書に開示される。上記の本発明の発現分析は、ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの下方制御が癌の発生に対して利点を有する可能性があるということを示唆した。そうであるなら、ＯＭＤまたは／およびＰＲＥＬＰの活性化が腫瘍形成を阻害し、新規な癌の処置をもたらすであろうということを推測することができる。これを実証するために、本発明者らは、癌に関連する特性に対する、癌細胞および異種移植片マウスモデルにおけるＯＭＤまたはＰＲＥＬＰの過剰発現の効果を調べた。この目的のために、ＯＭＤまたはＰＲＥＬＰを、膀胱癌細胞株ＥＪ２８の中で安定に過剰発現させた。ＯＭＤを形質移入された安定な細胞株は、Ｇ１期での細胞周期停止の高まりを示した。ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰはともに、細胞計数アッセイで測定されるとおり、増殖を阻害する。さらには、ＯＭＤまたはＰＲＥＬＰの安定な過剰発現は、アポトーシスによる細胞死の増加をもたらす。図９は、ＯＭＤ過剰発現によって誘導される異常な形態を示す。
【００８１】
また、癌細胞におけるＯＭＤまたはＰＲＥＬＰの活性化は、ＤＮＡ損傷試薬、マイトマイシンＣに対する感度を高めたが、これは、ＯＭＤまたはＰＲＥＬＰの活性化と抗癌剤との組み合わせが、より良好な癌の処置を提供することができるということを示す（図１０）。興味深いことに、この化学感作（ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）は癌細胞に特有であった。ＯＭＤ過剰発現は、実際、マイトマイシンＣ媒介性のアポトーシスから正常細胞を保護したが、他方で、ＰＲＥＬＰは正常細胞の感度に対して効果を有しなかった（図１０）。これは、マイトマイシンＣ処置と組み合わせたＯＭＤおよび／またはＰＲＥＬＰを用いた処置は、癌細胞の死滅を高めるが、正常細胞を保護するであろうということを示唆する。
【００８２】
ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰは、癌細胞の足場非依存性増殖にも影響を及ぼす。足場非依存性は癌細胞の顕著な特徴である。正常な上皮細胞は、成長の土台となる基質を必要とするが、癌腫細胞は、基質の不存在下で増殖することができ、従って腫瘍を形成することができる。軟寒天の中で癌細胞が成長する能力を測定することは、インビトロで足場非依存性および腫瘍形成能を測定するための代表的なアプローチである。驚くべきことに、ＯＭＤ過剰発現は、ＥＪ２８細胞の足場非依存性を完全に消失させ、これは、ＯＭＤは腫瘍形成を劇的に阻害することができるということを示唆する。ＰＲＥＬＰもＥＪ２８の足場非依存性増殖を阻害し、軟寒天中のコロニー形成能を、対照細胞において観察されたコロニー形成能の３分の１まで低下させる（図１４）。
【００８３】
癌細胞におけるＯＭＤまたはＰＲＥＬＰ活性化のインビボでの効果を評価するために、ヌードマウスを使用して異種移植実験を実施した。ＯＭＤを発現するＥＪ２８膀胱癌細胞またはＥＪ２８対照細胞をマウスに注入し、癌の発生を３週間モニターした。ＥＪ２８対照細胞を注入されたマウスは癌を発生したが、ＯＭＤを発現する細胞を注入されたマウスは癌をまったく形成しなかった（図１５）。この観察は、ＯＭＤ／ＰＲＥＬＰに基づく癌処置の有用性を確認する。
【００８４】
ＯＭＤまたはＰＲＥＬＰによって誘導されるアポトーシスのメカニズムを決定するために、本発明者らは、下流のシグナル伝達経路を調べた。この目的のために、ＯＭＤまたはＰＲＥＬＰを過剰発現する安定な細胞株およびＯＭＤまたはＰＲＥＬＰの抑制を有する安定でない細胞株を構築し、影響を受けるシグナル伝達経路を分析した。
【００８５】
これらの遺伝子を過剰発現させるために、２９３細胞のうちの形質転換されていない細胞を使用した。なぜなら、形質転換された癌細胞におけるこれらの遺伝子の過剰発現はアポトーシスの顕著な増加をもたらしたからである。また、構築のためにＴ−Ｒｅｘ−２９３系を使用した。なぜなら、この系は、挿入部位に基づく悪影響を引き起こさずに相対的に生理レベルでの発現に好適であるからである。図１２は、ＯＭＤ−１細胞およびＰＲＥＬＰ−１細胞が上記タンパク質の発現を有し、それらの発現レベルが自然の発現レベルに関連するということを示す。
【００８６】
遺伝子の発現をノックダウンするために、５６３７膀胱癌細胞を、ｓｉＯＭＤ、ｓｉＰＲＥＬＰ、ｓｉＥＧＦＰ、またはｓｉＦＦＬｕｃのｓｉＲＮＡコンストラクトで形質移入した。上記のように、大多数の膀胱癌細胞株における発現は強く抑制される。この５６３７細胞は、大多数の膀胱癌細胞株と比較して、比較的高い発現を有する。抑制後、ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの発現は、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって確認した。図１３は、ＰＲＥＬＰの発現はｓｉＰＲＥＬＰにおいては強く抑制されたが、ｓｉＥＧＦＰまたはｓｉＦＦＬｕｃの対照コンストラクトはＰＲＥＬＰレベルを抑制しなかったということを示す。
【００８７】
ＲＮＡをこれらの細胞から単離し、次いでｍＲＮＡの発現プロファイリングを、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＧｅｎｅｃｈｉｐシステムを使用して判定した。データから、統計的に有意に上方制御されるまたは下方制御される遺伝子が、対照との比較を通して特定される。これらの実験を検証するために、本発明者らは、定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して、マイクロアレイによって特定されたいくつかの遺伝子の発現レベルを確認した（図１３）。
【００８８】
次いで、ＯＭＤ過剰発現によって上方制御されＯＭＤ欠失によって抑制される遺伝子およびＯＭＤ過剰発現によって下方制御されＯＭＤ欠失によって上方制御される遺伝子が決定された（表５）。また、ＰＲＥＬＰ過剰発現によって上方制御されＰＲＥＬＰ欠失によって抑制される遺伝子およびＰＲＥＬＰ過剰発現によって下方制御されＰＲＥＬＰ欠失によって上方制御される遺伝子が決定された（表６）。興味深いことに、これらの一覧は、多くの腫瘍抑制因子遺伝子および腫瘍遺伝子を含み、顕著な重複もある。
【００８９】
影響を受けたシグナル伝達経路を決定するために、このマイクロアレイデータをＫＥＧＧパスウェイ解析による統計解析にかけた。本発明の統計解析により、ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰはともにｐ５３経路に最も強く影響を及ぼすということが明らかになった。また、ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰは、密着結合およびアポトーシス経路を制御する。加えて、ＯＭＤは、接着結合、Ｗｎｔ、アポトーシス経路を制御する（表７）。ＯＭＤまたはＰＲＥＬＰの抑制は、腫瘍形成に対して著しい影響を及ぼす。また、ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰは、腫瘍形成において機能的に大部分は重複している。さらには、本発明者らは、生化学ベースのアッセイを使用してシグナル伝達経路活性に対するＯＭＤまたはＰＲＥＬＰの効果を調べた。ＯＭＤまたはＰＲＥＬＰは、Ｗｎｔ、ＴＧＦ−ｂ、ＮＦｋＢ、ｍｙｃおよびｒａｓの経路などの複数の腫瘍関連のシグナル伝達経路を制御し、これは、アポトーシスおよび密着結合の制御をもたらす。すべての観察結果は、ＯＭＤおよび／またはＰＲＥＬＰの活性化は、ｐ５３経路、アポトーシスの経路、および密着結合経路などの腫瘍抑制活性の活性化を通して癌細胞を死滅させるための理想的な方法であるということを示す。
【００９０】
このように、本発明のさらなる実施形態は、本発明の標的タンパク質の過小発現によって特徴づけられる状態の、免疫療法的アプローチを介した処置のための治療法の開発である。
【００９１】
このような方法は、細胞中でＯＭＤおよび／もしくはＰＲＥＬＰを投与するかもしくは活性化すること、またはそれらの活性を模倣することを含んでもよい。例えば、タンパク質またはポリペプチドが、治療の利益を与えるのに十分な量で投与されてもよい。例として（これは、本発明の範囲を限定することは特に意図されていない）、これらは、裸のペプチドとして、薬理学的なパラメータ（例えば組織透過性、内因性のタンパク質分解への耐性、循環半減期など）が改善されるように１以上のさらなる分子（例えばリポソーム）に接合または封入されたペプチドとして、または体内の適切な部位で当該配列の発現を引き起こす好適な発現ベクターとして、投与されてもよい。
【００９２】
本発明の標的タンパク質の発現の下方制御は腫瘍細胞と関連しているので、これらのタンパク質はいくつかの点で腫瘍形成のプロセスに寄与する可能性が高い。結果として、本発明は、腫瘍細胞における標的タンパク質の発現レベルの上昇をもたらす。
【００９３】
従って、１つの好ましい方法は、膀胱癌または腎癌などの癌を有すると診断された患者に、治療上有効量の、インビボで標的タンパク質の発現を増加させる化合物を投与する工程を含む。
【００９４】
好ましい実施形態では、この化合物は、例えばＯＭＤおよび／またはＰＲＥＬＰをコードするポリヌクレオチドである。さらなる例として、標的タンパク質の発現を高めることができる本発明のコンストラクトは、裸のポリヌクレオチドとして、または細胞への組み込みを容易にするために担体（リポソームなど）と製剤化されて、対象に投与することができる。このようなコンストラクトは、適切なワクチンへと、例えばウイルスベクター（例えば牛痘）、細菌性コンストラクト、例えば周知のＢＣＧワクチンのバリアント、などに組み込まれてもよい。
【００９５】
従って、本発明によってもたらされる１つのＤＮＡに基づく治療的アプローチは、各々がＯＭＤおよび／またはＰＲＥＬＰをコードする１以上のヌクレオチド配列、好ましくは複数のヌクレオチド配列を含むベクターの使用である。
【００９６】
あるいは、発現レベルの上昇は、対応する遺伝子プロモーターの上方制御によって成し遂げることができよう。
【００９７】
スクリーニング方法
本発明のさらなる態様は、本発明の標的タンパク質の発現または生物活性を調節する組成物についてスクリーニングするための新規な方法を提供する。本願明細書で使用する場合、用語「生物活性」は、標的タンパク質とリガンドまたは結合パートナーとの間の相互作用から生じるいずれかの観察可能な効果を意味する。本発明に関する生物活性の代表的な、しかし非限定的な例としては、表５に示される遺伝子の制御または結合パートナーとの相互作用が上げられる。
【００９８】
用語「生物活性」は、本発明の標的タンパク質の発現の阻害および導入の両方をも包含する。さらには、用語「生物活性」は、本発明のタンパク質のポリペプチド誘導体によるリガンドまたは他のインビボでの結合パートナーの結合から生じるいずれかおよびすべての効果を包含する。１つの実施形態では、薬物候補をスクリーニングする方法は、本発明の標的タンパク質を発現する細胞を準備することと、候補治療用化合物をこの細胞に加えることと、当該タンパク質の発現または生物活性に対する当該化合物の効果を判定することとを含む。さらなる実施形態では、候補治療用化合物をスクリーニングする方法は、候補治療用化合物の不存在下での当該タンパク質の発現または生物活性のレベルを、候補治療用化合物の存在下での発現または生物活性のレベルと比較することを含む。
【００９９】
この候補治療用化合物が存在する場合には、その濃度は変わってもよく、発現レベルまたは生物活性の比較は、候補治療用化合物の添加または除去の後に行われてもよい。当該標的タンパク質の発現レベルまたは生物活性は、当該候補治療用化合物を用いた処置に応答して上昇または低下を示してもよい。
【０１００】
本発明の候補治療用分子としては、例として、宿主細胞の中で適切な核酸配列の発現によって、または合成有機化学を使用して生成されたペプチド、または当該技術分野で周知の従来の合成有機化学を使用して生成された非ペプチド小分子を挙げてもよい。スクリーニングアッセイは、同時の非常に多くの小分子のスクリーニングを容易にするために、自動化されてもよい。
【０１０１】
本願明細書で使用する場合、用語「候補治療用化合物」は、本発明の標的タンパク質（またはその断片）と相互作用すると考えられ、かつその後、このような相互作用について評価することができる物質を指す。代表的な候補治療用化合物としては、薬物および他の治療薬、天然物およびエキス、発癌性物質および環境汚染物質などの「生体異物」、ならびにステロイド、脂肪酸およびプロスタグランジンなどの「生体内物質」が挙げられる。本発明の方法を使用して検討することができる候補化合物の他の例としては、本発明の標的タンパク質のアゴニストおよびアンタゴニスト、毒素および毒物、ウイルス性エピトープ、ホルモン（例えばオピオイドペプチド、ステロイドなど）、ホルモン受容体、ペプチド、酵素、酵素基質、補因子、レクチン、糖類、オリゴヌクレオチドまたは核酸、オリゴ糖、タンパク質、小分子およびモノクローナル抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０２】
１つの好ましい実施形態では、本発明は、本発明の標的タンパク質またはその断片を発現する組み換えポリヌクレオチドを用いて安定に形質転換された真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞を、好ましくは競合結合アッセイにおいて利用する、薬物スクリーニングの方法を提供する。このような細胞は、生きた形態または固定された形態のいずれであっても、標準的な結合アッセイのために使用することができる。例えば、そのアッセイは、標的タンパク質と試験しようとする薬剤との間の複合体の形成を測定してもよいし、または当該標的タンパク質またはその断片と既知のリガンドまたは結合パートナーとの間の複合体の形成が、その試験しようとする薬剤によって妨害される程度を調べてもよい。従って、本発明は、薬物についてスクリーニングする方法であって、このような薬剤を本発明の標的タンパク質もしくはその断片または腫瘍細胞の中で見出されるそれらのバリアントと接触させる工程と、（ｉ）その薬剤と当該標的タンパク質、その断片またはバリアントとの間の複合体の存在、または（ｉｉ）当該標的タンパク質、断片もしくはバリアントとリガンドもしくは結合パートナーとの間の複合体の存在についてアッセイする工程と、を含む方法を提供する。このような競合結合アッセイでは、標的タンパク質または断片またはバリアントは、典型的には標識される。遊離の標的タンパク質、その断片またはバリアントは、タンパク質：タンパク質複合体の中に存在する標的タンパク質、その断片またはバリアントから分離され、遊離の（すなわち複合体を形成していない）標識の量は、それぞれ、標的タンパク質への試験しようとする薬剤の結合またはリガンドもしくは結合パートナーへの標的タンパク質の結合の結合に対する当該薬剤の妨害の尺度である。
【０１０３】
あるいは、本発明のアッセイは、当該標的タンパク質の生物活性に対する試験しようとする薬剤の影響を測定してもよい。従って、本発明は、薬物についてスクリーニングする方法であって、このような薬剤を、本発明の標的タンパク質もしくはその断片または腫瘍細胞の中で見出されるそれらのバリアントと接触させる工程と、当該標的タンパク質の生物活性に対するこのような薬剤の影響を当該技術分野で周知の方法によってアッセイする工程とを含む方法を提供する。このような活性アッセイでは、標的タンパク質、その断片またはバリアントの生物活性は、典型的には、レポーター系の提供によってモニターされる。例えば、これは、標的分子の生物活性によって受ける作用の程度に比例して検出可能なシグナルを生成する天然または合成の基質の提供を含んでもよい。
【０１０４】
ひとたび候補治療用化合物が解明されると、それらの有効性を高めるために当該技術分野で周知の合理的なドラッグデザイン方法論が用いられてもよいということが企図される。合理的なドラッグデザインの目的は、例えば、注目する生物活性のあるポリペプチドのより活性なまたは安定な形態である薬物、または例えばインビボでポリペプチドの機能を高めるかもしくは妨害する薬物を作り出すために、注目する生物活性のあるポリペプチドの構造類似体またはその注目する生物活性のあるポリペプチドが相互作用する小分子の構造類似体（例えばアゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤）を生成することである。１つのアプローチでは、最初に、注目するタンパク質、例えば本発明の標的タンパク質または、例えばリガンドとの複合体にある標的タンパク質の３次元構造が、Ｘ線結晶学によって、コンピューターモデリングによって、または最も典型的にはアプローチの組み合わせによって決定される。例えば、当業者は、新規な改善された候補治療用分子の設計における指針としての役割を果たす定量的構造活性相関（ＱＳＡＲ）の開発を支援する様々なコンピュータープログラムを使用してもよい。それほど多くはないが、ポリペプチドの構造に関する有用な情報が、相同タンパク質の構造に基づくモデリングによって得られる場合がある。加えて、ペプチドは、ペプチドの重要な領域を決定するために、そのペプチドの各アミノ酸残基がアラニン残基によって逐次置き換えられて、そのペプチドの活性に対するその効果が判定される、アラニンスキャニング（Ｗｅｌｌｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９９１年、第２０２巻、３９０−４１１頁）によって分析することができる。機能アッセイによって選択される標的特異的抗体の結晶構造から導かれるファルマコフォアに基づいて薬物を設計することも可能である。そのような機能的、標的特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を生成することにより、タンパク質結晶学の使用を回避することもさらに可能である。抗イディオタイプ抗体は、もとの標的タンパク質と同じ３次元コンフォメーションを有する。その後、これらの抗イディオタイプ抗体は、ライブラリーからペプチドを特定および単離するために使用することができ、このペプチド自体が、合理的なドラッグデザインでさらに使用するためのファルマコフォアとして働くことができる。
【０１０５】
インビボでの医薬としての使用のために、そのように特定された候補治療用化合物は、生理食塩水または医学分野において十分に特徴づけられている多くの他の有用な担体のうちの１つなどの好適な薬学的に許容できる担体と合わされてもよい。このような医薬組成物は、例えば直接注入によって悪性細胞へと直接与えられてもよいし、または、選ばれた製剤が本発明の標的タンパク質を含有する腫瘍細胞への治療上有効な分子の送達を可能にするならば、全身的に与えられてもよい。好適な用量範囲および細胞毒性レベルは、標準的な用量範囲決定の方法論を使用して評価されてもよい。投与される投与量は、例えば悪性腫瘍の性質、個体の年齢、体重および健康、ならびに他の要因に応じて代わってもよい。
【０１０６】
従って、以下の癌治療アプローチが本発明に含まれるが、これらに限定されるわけでない。
・ＯＭＤおよび／またはＰＲＥＬＰの活性を高めるための方法、
・いずれかの従来の方法、例えば発現プラスミド、発現コスミド、発現ｂａｃ、および発現ウイルスの導入を使用する、ＯＭＤおよび／またはＰＲＥＬＰをコードする核酸（例えばＤＮＡまたはｍＲＮＡ）の導入、
・ＯＭＤおよび／またはＰＲＥＬＰのタンパク質（複数可）の導入、
・ＯＭＤおよび／またはＰＲＥＬＰと同様の活性を有するかまたはその活性を増大させる分子の導入、
・ＯＭＤおよび／もしくはＰＲＥＬＰの内因性遺伝子の転写活性化、またはＯＭＤおよび／もしくはＰＲＥＬＰの内因性ｍＲＮＡの転写活性化、
・ＯＭＤおよび／またはＰＲＥＬＰの内因性タンパク質の安定化、
・ＯＭＤおよび／またはＰＲＥＬＰの内因性ｍＲＮＡの安定化、
・ＯＭＤおよび／またはＰＲＥＬＰに特異的な翻訳後修飾による活性化、
・ＯＭＤおよび／またはＰＲＥＬＰの遺伝子コピー数の増加。
【０１０７】
これらの方法のいずれかにおけるＯＭＤおよび／またはＰＲＥＬＰの使用。
【０１０８】
試験動物および細胞
本発明のさらなる態様は、本発明の標的タンパク質を発現し（または標的タンパク質の「ノックアウト」を含有し）、本願明細書で論じられる癌についての治療薬としての潜在的可能性を有する物質について研究および試験するためのモデル系として使用することができる細胞および動物を提供する。
【０１０９】
このような細胞は、本発明の標的タンパク質をコードする遺伝子における変異（体細胞変異または生殖細胞系列変異のいずれでも）を有する個体から単離されてもよいし、または当該技術分野で周知の方法を使用して、標的タンパク質またはそのバリアントを発現、過剰発現またはノックアウトするように操作することができる。試験物質が細胞に付与された後、その細胞のいずれかの関連する形質、例として挙げれば成長、生存率、ヌードマウスにおける腫瘍形成能、細胞の浸潤性、および成長因子依存性を評価することができ、これらの形質の各々についてのアッセイは当該技術分野で公知である。
【０１１０】
候補治療薬を試験するための動物は、動物全体の変異生成の後、または生殖系列細胞または接合体（ｚｙｇｏｔｅ）の処置後に、選択することができる。以下でより詳細に論じられるように、例として、そのような処置としては、典型的には第２の動物種由来の野生型またはバリアント型の本発明の標的タンパク質をコードする遺伝子の挿入、ならびに破壊された相同遺伝子の挿入を挙げることができる。あるいは、その動物の内因性の標的タンパク質遺伝子（複数可）は、当該技術分野で周知の従来の技法を使用して、挿入または欠失変異または他の遺伝子変異によって破壊されてもよい。試験物質が動物に投与された後、腫瘍の成長を評価することができる。この試験物質が腫瘍の成長を防止または抑制する場合、この試験物質は、本発明の標的タンパク質を発現する癌の、例えば膀胱癌または腎癌の処置のための候補治療薬である。これらの動物モデルは、潜在的可能性のある治療用化合物についてのきわめて重要な試験媒体を提供する。
【０１１１】
従ってこのように、本発明は、本発明の標的タンパク質をコードする遺伝子の不活性なコピーを含む遺伝子導入の非ヒト動物、特に齧歯動物を提供する。
【０１１２】
本発明は、本発明の推定上の治療薬の試験方法であって、当該治療薬を本発明に係る動物に投与する工程と、その治療薬の効果を判定する工程とを含む方法をさらに提供する。
【０１１３】
本発明の目的のために、本発明の標的タンパク質をコードする遺伝子の不活性なコピーと言うときは、その遺伝子のノックアウトまたは下方制御、および任意に例えば試験動物における癌表現型をもたらす、その遺伝子のいずれかの非野生型バリアントが含まれるということは理解されるであろう。従って、遺伝子は、その全体を削除されてもよいし、または例えば本発明の標的タンパク質をコードする遺伝子のオープンリーディングフレームへの終止コドンおよび任意に上流のコード配列の導入によって、当該動物が切断されたタンパク質を産生するように変異されていてもよい。同様に、このオープンリーディングフレームは、プロモーター領域における変異によって与えられる当該遺伝子の無傷の、不活性なコピーであってもよい。
【０１１４】
一般に、遺伝子の不活化は、標的相同組み換えによって作製されてもよい。このための技法は、それ自体は当該技術分野で公知である。これは、様々な方法で成し遂げられてもよい。典型的な戦略は、標的相同組み換えを使用して、胚性幹（ＥＳ）細胞の中で野生型遺伝子を置換、改変または削除することである。改変された標的遺伝子を含む標的化ベクターは、電気穿孔、リポフェクションまたはマイクロインジェクションによってＥＳ細胞の中へと導入される。いくつかのＥＳ細胞では、標的化ベクターは、同族の染色体ＤＮＡ配列と対合し、そのベクターによって運ばれる所望の変異を、相同組み換えによってゲノムへと移す。形質移入された細胞を特定するためにスクリーニングまたは濃縮手順が使用され、形質移入された細胞はクローニングされ、純粋な個体群（ポピュレーション）として維持される。次に、変化したＥＳ細胞が着床前のマウス胚の胚盤胞へと注入されるか、あるいはＥＳ細胞と合体して単一のキメラ胚盤胞を形成する２つの胚盤胞の間にこのＥＳ細胞が置かれている、凝集キメラが調製される。このキメラ胚盤胞は、育ての母の子宮へと外科的に移され、そこで出産予定日まで発生が進められる。得られた動物は、正常細胞およびドナー細胞のキメラであろう。典型的には、このドナー細胞は、キメラの子孫が容易に特定されるように、皮膚の色などの明らかに区別できる表現型を有する動物由来のものであろう。次にこの子孫は飼育され、その子孫は異種交配され、標的変異についてのヘテロ接合体およびホモ接合体が生じる。遺伝子導入動物の生成は、Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８９年、第２４４巻、１２８８−１２９２頁；ＶａｌａｎｃｉｕｓおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９１年、第１１巻、１４０２−１４０８頁；ならびにＨａｓｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９１年、第３５０巻、２４３−２４６頁（これらの開示は、参照により本願明細書に援用したものとする）にさらに記載されている。
【０１１５】
標的遺伝子組み換えにおける相同組み換えは、本発明の標的タンパク質をコードする野生型遺伝子を、具体的に明確な（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ）変異体型（例えば切断されているか、または１以上の置換を含有する）で置き換えるために使用されてもよい。
【０１１６】
不活性な遺伝子は、発現が、持続的にまたは一時的に、選択的にブロックされていてもよい遺伝子であってもよい。持続的なブロッキングは、シグナルに応答して遺伝子を削除するための手段を供給することにより、成し遂げられてもよい。このような手段の例は、ファージｌｏｘ部位が導入遺伝子のいずれかの末端に、または少なくともそれらの十分な部分の間に（例えば、いずれかの側に存在する２つのエクソンに、または１以上のイントロンに）与えられる、ｃｒｅ−ｌｏｘシステムである。ｃｒｅリコンビナーゼの発現は、２つのｌｏｘ部位の間の核酸の切除および環状化を引き起こす。発生学的に限定された様式でまたは組織限定的な様式でｃｒｅリコンビナーゼを発現する遺伝子導入動物、特にマウス、の種々の系統は、当該技術分野で現在入手できる。例えばＴｓｉｅｎ、Ｃｅｌｌ、１９９６年、第８７巻、第７号、１３１７−１３２６頁およびＢｅｔｚ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９６年、第６巻、第１０号、１３０７−１３１６頁を参照。これらの動物は、本発明の標的タンパク質をコードする遺伝子の機能を調べるために、本発明のｌｏｘ遺伝子導入動物と交配されてもよい。制御の別の機構は、細胞へのテトラサイクリンの添加がプロモーターに結合し、本発明の標的タンパク質をコードする遺伝子の発現をブロックするように、プロモーターを、テトラサイクリン耐性遺伝子、ｔｅｔ、から標的遺伝子の遺伝子座の制御領域へと供給することである。あるいはＧＡＬ４、ＶＰ１６および他のトランス活性化因子を使用して、遺伝子発現（本発明の標的タンパク質をコードする遺伝子を含有する導入遺伝子の遺伝子発現を含む）を調節することもできよう。さらには、この標的遺伝子が、異所的な部位で、つまり当該遺伝子が時間的にも空間的にも通常は発現されない部位で発現されることもできよう。
【０１１７】
遺伝子導入の標的指向化技法は、本発明の標的タンパク質をコードする遺伝子を削除するためにも使用してよい。標的遺伝子欠失の方法は、Ｂｒｅｎｎｅｒら、国際公開第９４／２１７８７号パンフレット（Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｓｙｓ）によって記載されており、この文献の開示は、参照により本願明細書に援用したものとする。
【０１１８】
本発明のさらなる実施形態では、野生型レベルよりも高く、本発明の標的タンパク質をコードする遺伝子を発現する非ヒト動物が提供される。好ましくは、これは、本発明の標的タンパク質をコードする遺伝子が、その遺伝子を発現する細胞が比較されるとき、同じ種の野生型動物で見出されるレベルの少なくとも１２０〜２００％で発現されるということを意味する。また、この遺伝子は、標的遺伝子が時間的にも空間的にも通常は発現されない異所的な位置で、発現されることもできよう。比較は、ノーザンブロッティングおよび転写物レベルの定量化によって適宜行ってよい。このより高いレベルの発現は、標的遺伝子の１以上の、例えば２または３の、さらなるコピーの存在に起因するか、または例えば、野生型遺伝子との作動可能な連結での強力なプロモーターまたはエンハンサーの導入によって過剰発現をもたらすような、本発明の標的タンパク質をコードする遺伝子に対する改変による可能性がある。遺伝子のさらなるコピーを有する動物の提供は、「ノックアウト」動物の提供について本願明細書に記載される技法を使用して成し遂げられてもよい。
【０１１９】
非ヒトの哺乳類動物としては、非ヒトの霊長類、齧歯動物、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタが挙げられる。齧歯動物としては、マウス、ラット、およびモルモットが挙げられる。両生類としてはカエルが挙げられる。ゼブラフィッシュなどの魚類も使用してよい。本発明の遺伝子導入の非ヒトの哺乳動物は、癌を研究する上での実験目的で、および癌の症候または進行を緩和するように設計された治療法の開発において使用されてもよい。「実験（の）」は、実験法が行われる研究施設に適用可能な現行の法令のもとで、このような動物実験法において使用するためにまたは試験目的で許容されるということを意味する。
【０１２０】
本願明細書中のいずれの副題も便宜のために付けられているにすぎず、決して本開示を限定しないと解釈されるべきである。
【０１２１】
本発明は、これより、以下の非限定的な表、図面および実施例を参照してさらに説明される。本発明の他の実施形態は、これらを踏まえて当業者が思い浮かべるであろう。
【０１２２】
本願明細書に引用したすべての参考文献の開示は、本発明を実施するために当業者が使用する可能性がある限りにおいて、相互参照によって本願明細書に具体的に援用されたものとする。
【０１２３】
表
表１。定量的ＲＴ−ＰＣＲのためのプライマー配列。定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析のために使用されたプライマーが示されている。
【０１２４】
表２。臨床膀胱組織におけるＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの発現レベルの統計解析。
【０１２５】
表３。臨床腎臓組織におけるＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの発現レベルの統計解析。
【０１２６】
表４。ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの発現レベルと発癌との関係。
【０１２７】
表５。ＯＭＤによって制御される遺伝子の一覧。ＯＭＤ過剰発現によって有意に活性化されＯＭＤ欠失によって抑制される遺伝子およびＯＭＤ過剰発現によって抑制されＯＭＤ抑制によって活性化される遺伝子が示されている。
【０１２８】
表６。ＰＲＥＬＰによって制御される遺伝子の一覧。ＰＲＥＬＰ過剰発現によって有意に活性化されＰＲＥＬＰ欠失によって抑制される遺伝子およびＰＲＥＬＰ過剰発現によって抑制されＰＲＥＬＰ抑制によって活性化される遺伝子が示されている。
【０１２９】
表７。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘのマイクロアレイデータに基づくＯＭＤのＫＥＧＧパスウェイ解析。表５および６に列挙される遺伝子から、ＫＥＧＧパスウェイ解析プログラムを使用して、影響を受けるシグナル伝達経路が決定された。
【０１３０】
図
図１。ＯＭＤ、ＰＲＥＬＰ、およびケラトカン（ｋｅｒａｔｏｃａｎ）の構造。ＯＭＤ、ＰＲＥＬＰ、およびケラトカンは、ＳＬＲＰファミリーの一派を形成する。これらは、非常に相同的であるが、他のファミリーのメンバーとは異なっている。
【０１３１】
図２。ＳＹＢＲ（商標）  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用した、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲの検証。Ａ、ＡＢＩ７７００リアルタイム検出デバイスからのＰＣＲ反応の読み出し情報。この実験では、ＰＣＲ反応は三重の試料で実施された。ＰＣＲ反応の終わりに近づくにつれて、生成された生成物の量の差が観察されることに留意されたい。Ｂ、このプロットの線形性は、インプットされたｃＤＮＡ濃度の範囲にわたる、このアッセイの等しい増幅を示す。Ｃ、溶解曲線は、増幅プロセス後のＰＣＲ産物のグラフ表示を与える。陽性試料における１つのピークは単一サイズの生成物を示唆する。各ＰＣＲ産物の融解温度は異なり、その配列およびサイズに依存する。Ｄ、３つのリアルタイム増幅プロットが示されている。
【０１３２】
図３。ｑＲＴ−ＰＣＲを使用した、膀胱組織におけるＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの遺伝子発現の定量分析。Ａ、ＯＭＤの発現プロファイル。定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して、膀胱癌および正常な膀胱試料のコホートにおける遺伝子発現が検討された。相対的遺伝子発現は、比較定量化の改変された方法であるＰｆａｆｆｌの方法を使用して評価された。Ｂ、正常組織および腫瘍組織におけるＯＭＤ遺伝子発現が箱髭図によって示される。Ｐ値は、マンホイットニーのＵ検定を使用して算出された。本発明者らは、カットオフ値を以下のようにして評価した：カットオフ（ＯＭＤ）＝［（正常な膀胱組織における最小の非異常値の観察値）＋（腫瘍膀胱組織における最大の非異常値の観察値）］／２。Ｃ、ＰＲＥＬＰの発現プロファイル。定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して、膀胱癌および正常な膀胱試料のコホートにおける遺伝子発現が検討された。相対的遺伝子発現は、比較定量化の改変された方法であるＰｆａｆｆｌの方法を使用して評価された。Ｄ、正常組織および腫瘍組織におけるＰＲＥＬＰ遺伝子発現が箱髭図によって示される。Ｐ値は、マンホイットニーのＵ検定を使用して算出された。本発明者らは、カットオフ値を、上に示したようにして評価した。
【０１３３】
図４。ｑＲＴ−ＰＣＲを使用した、腎臓組織におけるＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの遺伝子発現の定量分析。Ａ、ＯＭＤの発現プロファイル。定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して、膀胱癌および正常な膀胱試料のコホートにおける遺伝子発現が検討された。相対的遺伝子発現は、比較定量化の改変された方法であるＰｆａｆｆｌの方法を使用して評価された。Ｂ、正常組織および腫瘍組織におけるＯＭＤ遺伝子発現が箱髭図によって示される。Ｐ値は図３で示されている。Ｃ、ＰＲＥＬＰの発現プロファイル。定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して、膀胱癌および正常な膀胱試料のコホートにおける遺伝子発現が検討された。相対的遺伝子発現は、比較定量化の改変された方法であるＰｆａｆｆｌの方法を使用して評価された。Ｄ、正常組織および腫瘍組織におけるＰＲＥＬＰ遺伝子発現が箱髭図によって示される。Ｐ値は、マンホイットニーのＵ検定を使用して算出された。本発明者らは、カットオフ値を、図３に示したようにして評価した。
【０１３４】
図５。ｑＲＴ−ＰＣＲを使用した、いくつかの正常組織、膀胱腫瘍組織および膀胱癌細胞株におけるＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの遺伝子発現の定量分析。Ａ、９種の正常組織および膀胱癌組織におけるＯＭＤの相対的遺伝子発現。Ｂ、１０種の膀胱癌細胞株、および膀胱組織（正常および腫瘍）におけるオステオモジュリンの相対的遺伝子発現。Ｃ、９種の正常組織および膀胱腫瘍組織におけるＰＲＥＬＰの相対的遺伝子発現。Ｄ、１０種の膀胱癌細胞株、および膀胱組織（正常および腫瘍）におけるＰＲＥＬＰの相対的遺伝子発現。
【０１３５】
図６。マイクロアレイを使用した、種々のタイプの癌におけるＯＭＤ遺伝子発現の定量分析。点−箱（Ｄｏｔ−Ｂｏｘ）分析としてのＯＭＤ遺伝子発現プロファイルが、遺伝子発現プロファイリングデータを使用することによって得られた。いずれの場合も、対応する正常組織におけるＯＭＤ発現が最初に示され、次いで記載された癌組織におけるＯＭＤ発現が黄色の箱によって示されている。
【０１３６】
図７。マイクロアレイを使用した、種々のタイプの癌におけるＰＲＥＬＰ遺伝子発現の定量分析。点−箱分析としてのＰＲＥＬＰ遺伝子発現プロファイルが、遺伝子発現プロファイリングデータを使用することによって得られた。いずれの場合も、対応する正常組織におけるＰＲＥＬＰ発現が最初に示され、次いで記載された癌組織におけるＰＲＥＬＰ発現が黄色の箱によって示されている。
【０１３７】
図８。膀胱正常組織および癌組織におけるＰＲＥＬＰタンパク質の分布。正常な膀胱組織および膀胱癌組織を使用して、ＰＲＥＬＰ抗体（パネルＡ）または対照ＩｇＧ（パネルＢ）を使用する免疫組織化学が実施された。ＰＲＥＬＰタンパク質は、正常な膀胱組織において観察される。しかしながら、ＰＲＥＬＰタンパク質は、膀胱癌では完全に排除されている。陰性対照（パネルＢ）は染色されていない。
【０１３８】
図９。ＥＪ２８膀胱癌細胞におけるＯＭＤの過剰発現後の、異常な形状を有する細胞。ＥＪ２８膀胱癌細胞株は、ＯＭＤ発現コンストラクトを用いて安定に形質移入された。この形質移入により、アポトーシスを起こした細胞の数は増加し、この細胞は異常な形状を示した。
【０１３９】
図１０。ＯＭＤ発現は、アポトーシスから正常細胞を保護するのに対して、ＰＲＥＬＰ発現は効果を有しない。ＨＥＫ２９３細胞が、ＣＡＴ（対照）、ＯＭＤまたはＰＲＥＬＰのいずれかを用いて安定に形質移入され、１μｇ／ｍｌマイトマイシンＣを用いた処置に応答してＨＥＫ  ２９３細胞が受けるアポトーシスのレベルを測定するためにアッセイされた。（ａ）アネキシンアッセイ。細胞は、１用量の当該薬物で処置され、２４時間後に、細胞はトリプシン処理され、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ−６４７と結合したアネキシンおよびヨウ化プロピジウムの存在下でインキュベーションされ、フローサイトメトリによって調べられた。アポトーシスを受けている過程にある生細胞を含むアネキシン陽性、ＰＩ陰性の亜集団が、特定された。（ｂ）カスパーゼ活性アッセイ。１用量の当該薬物が投与され、２４時間後、細胞は、カスパーゼによる切断後に発光性生成物へと変換される基質の存在下でインキュベーションされた。ルミネッセンスが定量化され、カスパーゼ活性に比例していると確認された。（ａ）および（ｂ）の両方において、エラーバーは標準偏差を意味し、統計解析はｔ検定からなっていた。
【０１４０】
図１１。ＥＪ２８細胞におけるＯＭＤまたはＰＲＥＬＰの過剰発現は、当該細胞の、マイトマイシンＣ処置に対する感作をもたらす。
２つの対照ＥＪ２８細胞、２つのＯＭＤで安定に形質移入されたＥＪ２８細胞、およびＰＲＥＬＰで安定に形質移入されたＥＪ２８細胞が１μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣで処置される。また、陽性対照として、ＥＪ２８細胞が、陽性対照としてのより高濃度の５μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣを用いて処置される。次いで、アポトーシスを起こした細胞の比率が、カスパーゼ活性を測定することにより決定された。
【０１４１】
図１２。ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの過剰発現されたタンパク質。
ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの過剰発現されたタンパク質が、ウエスタンブロット法によって確認された。
【０１４２】
図１３。５６３７膀胱癌細胞株を用いたｓｉＰＲＥＬＰ形質移入の効果。Ａ、５６３７膀胱癌細胞株を用いたｓｉＰＲＥＬＰの形質移入の後、ＰＲＥＬＰ  ｍＲＮＡレベルに対するその効果が調べられた。Ｂ−Ｆ。５６３７膀胱癌細胞株を用いたｓｉＰＲＥＬＰを使用する本発明のマイクロアレイ解析により、多くの顕著に改変された遺伝子が特定された（表６を参照）。マイクロアレイデータの結果は、いくつかの選択された遺伝子の定量的ＲＴ−ＰＣＲによって確認された。Ｂ、ＺＭＡＴ３、Ｃ、ＣＡＳＰ３、Ｄ、ＣＳＮＫ１Ａ１、Ｅ、ＰＰＰ２Ｒ１Ｂ、Ｆ、ＤＮＭＴ１。
【０１４３】
図１４。ＥＪ２８細胞の足場非依存性増殖を、ＯＭＤは消失させ、ＰＲＥＬＰは阻害する。細胞が、ＤＭＥＭ＋０．６％  寒天の下層の上に重なるＤＭＥＭ＋０．３％  寒天に播かれた。３０００細胞が、６穴の皿のウェルに三重に播かれた。プレートは、２週間インキュベーションされ、コロニーが数えられた。エラーバーは標準偏差である。統計解析は、事後（ｐｏｓｔ−ｈｏｃ）ニューマン−クールズ（Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ）検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡからなっていた。「ａ」、「ｂ」などの文字によるグループ分けは、ニューマン−クールズ検定の結果を指す。互いに有意に異ならない細胞株は、同じ文字でラベルされている。互いに有意に異なる（ｐ＜０．０５）細胞株は、異なる文字でラベルされている。
【０１４４】
図１５。ＯＭＤタンパク質を過剰発現するＥＪ２８細胞の異種移植の効果。ＥＪ２８膀胱癌細胞またはＯＭＤを過剰発現するＥＪ２８細胞がヌードマウスに接種され、次いで癌発生が３週間モニターされた。１８日間の結果が示されている。ＥＪ２８細胞を接種された対照マウスは有意に癌を発生させたのに対し、ＯＭＤ発現細胞を接種されたマウスは癌をまったく発生させなかった。
【実施例】
【０１４５】
実施例１  −  ＳＬＲＰＳへの背景
ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰは、細胞外マトリクスに存在するタンパク質のスモールロイシンリッチリピートプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）ファミリーのメンバーである。
【０１４６】
細胞外マトリクス（ＥＣＭ）は、微小環境の制御を通して腫瘍の惹起および成長の制御において重要な役割を果たすと考えられている。正常細胞は、成長のために基底膜を必要とする。上皮の悪性腫瘍の発生があると、基底膜（ＢＭ）を支えて形成するＥＣＭの組織化および分布に大きな変化が生じる。浸潤性腫瘍は細胞に隣接した欠陥のあるＢＭを特徴とし、他方で良性腫瘍では、ＢＭは無傷のまま残る（Ｌｉｏｔｔａ、１９８６年）。
【０１４７】
ＳＬＲＰファミリーは、タンパク質の中心にある保存されたロイシンリッチ反復ドメインを特徴とする。反復の数は、メンバーによる。ＳＬＲＰファミリーのメンバーは著しく異なるＨ２末端およびＣＯＯＨ末端を有し、このことが、これらのタンパク質間の機能的差異を主にもたらす。多くのメンバーのＮ末端およびＣ末端領域は、重要なシステイン残基を有する。１６の公知のＳＬＲＰ遺伝子のうちの１０は、ヒト染色体１、９、および１２上にタンデムクラスターとして並んでおり、ラットおよびマウスにおいてシンテニー同等性（ｓｙｎｔｅｎｉｃ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）を有する。また、これらのタンパク質は糖修飾を有する。しかしながら、各メンバーは異なるタイプの糖修飾を有する。
【０１４８】
それらは、ＥＣＭにおけるシグナル伝達経路の統合のためにも、機能的に重要である（Ｈｏｃｋｉｎｇら、１９９８年；Ｋｕｒｉｙａｍａら、２００６年；Ｏｈｔａら、２００６年；Ｏｈｔａら、２００４年）。ＳＬＲＰファミリーのメンバーは、成長因子、シグナル伝達リガンドおよびＥＣＭ成分を含めた様々な細胞外タンパク質に結合し、様々な生物学的事象を制御する。これらの事象としては、リガンドにより誘導されるシグナル伝達が挙げられる。それらは、リガンドにより誘導される多くのシグナル伝達経路を、それらの細胞外のシグナル伝達成分との直接相互作用を通して制御する。異なるＳＬＲＰは、異なる経路および異なる生物学的事象を制御する。Ｔｓｕｋｕｓｈｉは、ＢＭＰ、ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ、およびＮｏｔｃｈ経路を制御するが（Ｋｕｒｉｙａｍａら、２００６年；Ｍｏｒｒｉｓら、２００７年；Ｏｈｔａら、２００６年；Ｏｈｔａら、２００４年）、他方で、デコリンはＥＧＦおよびＴＧＦ−β経路を制御する（Ｐａｔｅｌら、１９９８年；Ｔａｋｅｕｃｈｉら、１９９４年）。また、Ｉ型コラーゲンを含めたＥＣＭタンパク質との相互作用を通して（ＨｅｄｂｏｍおよびＨｅｉｎｅｇａｒｄ、１９９３年；Ｒａｄａら、１９９３年；Ｓｃｈｏｎｈｅｒｒら、１９９５年；Ｖｏｇｅｌら、１９８４年）、ＳＬＲＰファミリーのメンバーは、タンパク質−タンパク質相互作用および／またはタンパク質−炭水化物相互作用を通して、マトリクスのアセンブリおよび組織化を導くと考えられている。異なるＳＬＲＰは、コラーゲンの原線維形成に影響を及ぼす。インビトロでは、デコリン、フィブロモジュリンおよびルミカンと線維性コラーゲンとの相互作用は、原線維形成の速度を緩慢化しコラーゲン原線維直径に影響を与えることにより原線維サイズを変える。ＳＬＲＰは、異なる組織タイプに局在し（Ａｌｉｍｏｈａｍａｄら、２００５年）、およびコラーゲン沈着は組織ごとに異なり、そのため、ＳＬＲＰは、ＥＣＭ組織化に直接影響を及ぼすことが可能である。
【０１４９】
これらのプロテオグリカンの活性の多様性を反映して、これらのプロテオグリカンの変異は、異なるヒトの障害を生じることが知られている。例えば、ｎｙｃｔａｌｐｉｎ（Ｂｅｃｈ−Ｈａｎｓｅｎら、２０００年；Ｐｕｓｃｈら、２０００年）変異は、夜盲症と関連することが知られている。アスポリンは変形性関節症に関わる（Ｋｉｚａｗａら、２００５年）。デコリン、フィブロモジュリン、ケラトカンを欠損したマウスおよびルミカンを欠損したマウスは、皮膚、腱、角膜、および強膜におけるコラーゲン原線維の配列および構造に多くの異常性を示す（Ａｕｓｔｉｎら、２００２年；Ｄａｎｉｅｌｓｏｎら、１９９７年；Ｌｉｕら、２００３年；Ｓｖｅｎｓｓｏｎら、１９９９年）。さらに、ケラトカン遺伝子における変異は、ヒトにおける扁平角膜、角膜の平板化および角膜の屈折力の低下を特徴とする状態、という重篤な劣性遺伝性の形態を引き起こすことが示されている（Ｐｅｌｌｅｇａｔａら、２０００年）。また、ＳＬＲＰは、多くのシグナル伝達分子と機能的に重要な複合体を形成する。これらの知見は、ＳＬＲＰファミリーのメンバーの機能は多様であるということを示す。
【０１５０】
さらには、癌におけるＳＬＲＰの発現は、着目しているファミリーのメンバーおよび癌のタイプに応じて様々である。例えば、ＴＳＫのｍＲＮＡは乳癌および肺癌で増加し（国際公開第２００４０３５６２７号パンフレットを参照）、ルミカンは、研究されたいくつかの癌のタイプ［乳房（Ｌｅｙｇｕｅら、１９９８年）、子宮頸部（Ｎａｉｔｏら、２００２年）、膵臓および結腸（Ｌｕら、２００２年）］では過剰発現される。デコリンは乳癌（Ｌｅｙｇｕｅら、２０００年）および白血病（Ｃａｍｐｏら、２００６年）では過剰発現されるが、甲状腺癌（Ａｒｎａｌｄｉら、２００５年）および卵巣腫瘍（Ｎａｓｈら、２００２年）では過小発現される。バイグリカンは、膵臓癌では過剰発現される（Ｗｅｂｅｒら、２００１年）。また、機能の場合には、デコリンおよびルミカンは、いくつかの癌のタイプにおいて腫瘍抑制活性を有することが示唆されたが、ＴＳＫは発癌性である。乳癌では、ルミカン発現は、腫瘍悪性度、エストロゲンレベルおよび患者の年齢と相関する（Ｌｅｙｇｕｅら、１９９８年）。癌素因を示さないデコリンシングルノックアウトマウスおよび多くの異なる癌の素因を持つｐ５３シングルノックアウトマウスとは対照的に、デコリン／ｐ５３ダブルノックアウトマウスは、ほぼ一様に胸腺リンパ腫を発生させる（Ｉｏｚｚｏら、１９９９年ａ）。デコリンを欠くことが、ｐ５３欠損バックグラウンドにおいて発癌を加速するようである。機能分析は、ＳＬＲＰが、発癌に関わるいくつかのプロセスを制御することができるということを示唆する。デコリンの安定な形質移入は、マウスにおいて異種移植された癌細胞が、腫瘍を形成するのを抑制し（Ｓａｎｔｒａら、１９９５年）、また、ＥＧＦＲを結合し、その自己リン酸化を引き起こし、ＭＡＰキナーゼカスケードの長期活性化およびｐ２１  Ｃｉｐ１／ＷＡＦ１の上方制御を誘発することによりインビトロで扁平上皮癌細胞の増殖を抑制した（Ｉｏｚｚｏら、１９９９年ｂ；Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｏら、１９９８年）。外因性のデコリンを用いた異種移植された癌細胞の処置、またはルミカンを用いたそれら癌細胞の安定な形質移入は、レシピエントマウスにおいて転移を減少させたが（Ｒｅｅｄら、２００５年；Ｖｕｉｌｌｅｒｍｏｚら、２００４年）、他方で、バイグリカンを構成的に過剰発現するマウスは血管新生の増加を呈した（Ｓｈｉｍｉｚｕ−Ｈｉｒｏｔａら、２００４年）。
【０１５１】
このように、癌においてある役割を有する特定のＳＬＲＰについての前例は存在するが、ヒトの発癌におけるそれらの正確な役割は明らかではない。ＯＭＤまたはＰＲＥＬＰの発現パターンは、他のＳＬＲＰとはまったく異なる。また、ＯＭＤまたはＰＲＥＬＰは、Ｗｎｔ経路および密着結合経路を制御するが、これらは、他のＳＬＲＰの下流として報告されなかった。選択された癌における、腫瘍形成における各ＳＬＲＰメンバーの真の機能を知るために、明確な腫瘍における各ＳＬＲＰメンバーの慎重な詳細な分析が必要とされる。
【０１５２】
実施例２  −  定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用した、膀胱癌におけるＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの診断上の価値の検討
嚢胞切除術または経尿道的切除術のいずれかで原発性尿路上皮細胞癌の１２６の手術検体を集め、液体窒素中で直ちに凍結した。正常な膀胱の尿路上皮の３４の検体を、尿路上皮悪性腫瘍のエビデンスを有しない患者の巨視的に見て正常な尿路上皮の領域から集めた。この研究のための組織の使用は、ケンブリッジシャー州地域研究倫理委員会（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ  Ｌｏｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。
【０１５３】
以下の手順に従って、癌組織および正常組織をレーザーキャプチャー法により単離した。７μｍ厚さの５つの連続切片を各組織から切り出し、製造業者の手順書に従ってＨｉｓｔｏｇｅｎｅ（商標）  染色溶液（Ａｒｃｔｕｒｕｓ、米国、カリフォルニア州）を使用して染色した。次いで、スライドを、Ｐｉｘ  Ｃｅｌｌ  ＩＩレーザーキャプチャー顕微鏡（Ａｒｃｔｕｒｕｓ、米国、カリフォルニア州）を使用して、マイクロダイセクションのために、直ちに移した。ＲＮＡ抽出のために使用した組織に隣接した２つの７μｍの「サンドイッチ」切片を薄片にし、染色し、細胞充実性および腫瘍悪性度について、独立の顧問の泌尿器病理組織学者による評価を受けた。加えて、これらの切片を、炎症細胞浸潤の程度に従って等級付けした（低、中程度および顕著）。顕著な炎症細胞浸潤を示す試料は排除した（Ｗａｌｌａｒｄら、２００６年）。およそ１０，０００細胞を、各組織において間質および上皮／腫瘍区画の両方からマイクロダイセクションにかけた。混入を防止するために、顕著な炎症細胞浸潤を含有する組織を回避した。
【０１５４】
製造業者の手順書に従ってＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ（商標）  （Ｓｉｇｍａ、英国、ドーセット州（Ｄｏｒｓｅｔ））を使用して、全ＲＮＡを抽出した。デオキシリボヌクレアーゼ工程を含むＲＮＥａｓｙ  Ｍｉｎｉｋｉｔ（商標）  （Ｑｉａｇｅｎ、英国、クロウリー（Ｃｒａｗｌｅｙ））を使用して、ＲＮＡ純度を最適化した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００（商標）  全ＲＮＡ生物分析を実施した。各試料からの再懸濁したＲＮＡの１μｌをＲＮＡ  ６０００  ＮａｎｏＬａｂＣｈｉｐ（商標）に加え、製造業者の取扱説明書に従って処理した。すべてのチップおよび試薬は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）  （英国、ウェストロージアン（Ｗｅｓｔ  Ｌｏｔｈｉａｎ））から入手した。
【０１５５】
全ＲＮＡ濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（商標）  ＮＤ１０００分光光度計（Ｎｙｘｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、フランス、パリ）を使用して測定した。内因性の１８Ｓ  ＣＴ値を、無傷の出発のＲＮＡの量の正確な尺度として使用した。製造業者の取扱説明書に従って２０μｌの反応液の中で、２μｇのランダム６量体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、英国、ペーズリー（Ｐａｉｓｌｅｙ））を用いて１μｇの全ＲＮＡを逆転写した。次いでＰＣＲ等級の水を用いてｃＤＮＡを１：１００に希釈し、−２０℃で保存した。
【０１５６】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ反応のために、すべてのヒトのＧＡＰＤＨ（ハウスキーピング遺伝子）、ＳＤＨ（ハウスキーピング遺伝子）、ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰのための特異的プライマーを設計した（表１）。１８Ｓ増幅については、ＴａｑＭａｎ  Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＲｅａｇｅｎｔｓをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（英国、ウォリントン（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ））から購入した。ＰＣＲ反応は、製造者の手順書に従ってＡＢＩ  ｐｒｉｓｍ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、英国、ウォリントン）を使用して実施した。１８Ｓ分析についての反応は、１ｎｇの逆転写されたＲＮＡの同等物、ＵＮＧなしの５０％  ＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、英国、ウォリントン）、各々２００ｎＭの順方向プライマーおよび逆方向プライマーならびに１００ｎＭのプローブを含有する１０μｌ  ＰＣＲ量で実施した。増幅条件は、５０℃で２分、９５℃で１０分、次いで各々９５℃で１５秒および６０℃で１分からなる４０サイクルであった。標的遺伝子増幅についての反応条件は上記のとおりであったが、５ｎｇの逆転写されたＲＮＡの同等物を各反応で使用した。試料内の相対的ＲＮＡレベルを測定するために、１８Ｓ反応については２〜０．６２５ｎｇのＲＮＡおよびすべての標的遺伝子については２０〜０．５ｎｇのＲＮＡの範囲を網羅するｃＤＮＡの一系列の２倍希釈物から、ＰＣＲ反応についての標準曲線を調製した。ＡＢＩ  ｐｒｉｓｍ  ７７００は、４０サイクルのＰＣＲ反応全体にわたって蛍光レベルの変化を測定し、増幅が対数期に入った時点に相関する、各試料についてのサイクル閾値（Ｃｔ）を生成した。この値を、出発の鋳型の量の指標として使用し、従って、より低いＣｔ値は、より高い量の最初の無傷のｃＤＮＡを示した。マイクロダイセクションの精度を確認するために、ビメンチンおよびウロプラキンについてのプライマーおよびプローブを入手し、製造業者の取扱説明書に従って（Ａｓｓａｙｓ  ｏｎ  ｄｅｍａｎｄ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、英国、ウォリントン）  ｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。ビメンチンは、間葉系に由来する細胞の中で主に発現され、間質性マーカーとして使用した。ウロプラキンは尿路上皮分化のマーカーであり、上皮に由来する腫瘍の９０％までで保存されている（Ｏｌｓｂｕｒｇｈら、２００３年）。
【０１５７】
各標的遺伝子についてのＲＮＡ発現レベルを、内因性の１８Ｓ  ｒＲＮＡレベルに対して正規化した。等級相関研究のために、両側のスピアマンの順位相関（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  Ｓｐｅａｒｍａｎ’ｓ  Ｒａｎｋ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）を実施して、遺伝子発現と癌悪性度の上昇との間の関係の有意性を判定した。レーザーキャプチャーした組織における差異的発現の有意性を判定するために、両側マンホイットニーのＵ検定によるノンパラメトリック分析を実施した。この分析については、Ｐ＜０．０５のＰ値を有意と考えた。ＳＴＡＴＡ（バージョン８．０；ＳｔａｔａＣｏｒｐ、米国、テキサス州、カレッジ・ステーション（Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ））およびＳｔａｔＶｉｅｗ（バージョン５．０；ＳＡＳ、米国、ノースカロライナ州、ケーリー（Ｃａｒｙ））を使用して、統計的評価を行った。
【０１５８】
リアルタイムＰＣＲ読み出し情報は、与えられたレベルの蛍光を成し遂げるために必要なＰＣＲサイクルの数（「サイクル閾値」、Ｃｔ）として与えられる。本研究については、Ｃｔを、ＰＣＲの対数期（図２Ａ、蛍光曲線の直線部分）で固定した。初期のＰＣＲサイクルの間、ＰＣＲ産物に結合したＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ  Ｉによって発せられる蛍光シグナルは、通常、弱すぎて、バックグラウンドを上回って記録されず、約１５ＰＣＲサイクル後までは明らかにできなかった。ＰＣＲの対数期の間、蛍光は各サイクルで２倍になった。３５サイクル後、蛍光シグナルの強度は、通常、平坦になり始め、これは、ＰＣＲが飽和状態に到達したということを示す。Ｃｔは試料中の標的の初期量の対数に比例するので、別の標的に対する１つの標的の相対濃度は、同じレベルの蛍光を成し遂げるために必要なサイクル数の差（ΔＣｔ）に反映される。相対的蛍光の固定された閾値におけるＣｔ値を決定した。ＲＮＡ標的は、同様の効率で逆転され、転写され、その後増幅されると仮定して、Ｃｔ値を全ＲＮＡのｌｏｇの関数としてプロットすることにより較正曲線を構築した（図２Ｂ）。融解曲線プロファイルの分析から、増幅産物の特異的な蓄積が確認された（図２Ｃ）。三重のアッセイからデータを得たが、各々の三重のデータは常に同様であった（図２Ｄ）。
【０１５９】
結果は、図３および表２に示され、これまでに要約されている。
【０１６０】
実施例３  −  定量的ＲＴ−ＰＣＲによる、腎癌におけるＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの診断上の価値の検討
７８の原発性腎癌の腎細胞癌手術検体を集め、液体窒素中で直ちに凍結した。正常な腎臓の尿路上皮の１５の検体を、尿路上皮悪性腫瘍のエビデンスを有しない患者の巨視的に見て正常な尿路上皮の領域から集めた。この研究のための組織の使用は、ケンブリッジシャー州地域研究倫理委員会によって承認された。定量的ＲＴ−ＰＣＲについてのすべてのさらなる手順は、上記のとおりに実施した。
【０１６１】
結果は、図４および表３に示され、本文に要約されている。図３および４、表３および４に基づいて、本発明者らは、ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの診断上の価値を検討した（表４）。結果はこれまでに要約されている。
【０１６２】
実施例４  −  癌細胞株および正常なヒトの組織におけるＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの発現
ＲＮＡを、肺、胃、結腸、心臓、脳、肝臓、眼、膀胱および腎臓の正常なヒトの組織から単離した。また、ＲＮＡを２つの膀胱癌試料から単離した。次いで、定量的ＲＴ−ＰＣＲを、ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰのプライマー（表１）を使用して上記のとおりに実施した。図５Ａは、ＯＭＤが眼および肺で最も高く発現されるということを示す。また、肝臓を除くすべての他の組織でかなりの量の発現が観察された。他方、ＰＲＥＬＰは、肺および膀胱で高く発現される。肝臓を含めたすべての他の組織は、顕著な発現を有する（図５Ｃ）。癌細胞株、２５３ＪＢＶ、２５３Ｊ、Ｊ８２、Ｔ２４、ＥＪ２８、ＲＴ４、ＬＨＴ１３７６、ＭＴ１９７、ＵＭＶＣ、およびＨＴ１５７６を培養し、次いで全ＲＮＡを、上記のようにして単離した。正常な膀胱および膀胱癌からのＲＮＡを対照として使用した。上記癌細胞株におけるＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの発現を、記載したとおりの定量的ＲＴ−ＰＣＲによって判定した。ＯＭＤの発現は、ＲＴ４およびＬＨＴ１３７６を除くすべての膀胱癌細胞株において強く抑制された（図５Ｂ）。これは、表３に示すとおりの本発明の発現分析と整合する。ＯＭＤの発現レベルは、癌の病期と相関する。これらの細胞株は、高分化型の低悪性度の膀胱細胞株として知られている。ＰＲＥＬＰの場合には、その発現は、検討したすべての細胞株においてほぼ完全に抑制された（図５Ｄ）。
【０１６３】
実施例５  −  種々のタイプの癌におけるＯＭＤの診断上の価値の検討
上に示したように、ＯＭＤ遺伝子発現は膀胱癌および腎癌において非常に強く抑制される。種々のタイプの悪性組織および正常なヒトの組織におけるＯＭＤ遺伝子発現を検討するために、本発明者らは、非常に多くのヒト患者からの腫瘍および対応する正常組織から単離されたｍＲＮＡを使用したマイクロアレイ解析に基づく遺伝子発現データベース（Ｇｅｎｅ  Ｌｏｇｉｃ  Ｉｎｃ．（メリーランド州、ゲイザースバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ））を使用した。ＲＮＡを調製し、遺伝子発現分析を、およそ４０，０００遺伝子／ＥＳＴに相当するオリゴデオキシヌクレオチドを含有するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  ＨＧ−Ｕ１３３Ｐｌｕｓ２マイクロアレイを使用して、Ｇｅｎｅ  Ｌｏｇｉｃ  Ｉｎｃ．で測定した。本発明者らは、ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ  Ｉｎｃ．から購入した遺伝子発現プロファイリングデータおよび付随の臨床データを使用することにより、ＯＭＤ遺伝子発現プロファイルを、自社の点−箱分析として示した。
【０１６４】
図６に示すように、ＯＭＤ発現は、肺癌（腺癌、大細胞癌、小細胞癌、扁平上皮癌）、乳癌（浸潤性乳管癌および葉状腫瘍）、胃癌（消化管間質腫瘍）において有意に下方制御される。結腸癌（腺癌）、直腸癌（腺癌）、前立腺癌（腺癌）、子宮頸癌（扁平上皮癌）、子宮内膜癌（類内膜型腺癌、ミュラー管混合腫瘍）、卵巣癌（類内膜型腺癌、明細胞型腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅ）、ミュラー管混合腫瘍、乳頭状漿液型腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｐａｐｉｌｌａｒｙ  ｓｅｒｏｕｓ  ｔｙｐｅ）、漿液性嚢胞腺癌）、甲状腺癌（乳頭癌）、食道癌（腺癌）、小腸癌（消化管間質腫瘍）、副腎癌（副腎皮質癌）、腎癌（ウィルムス腫瘍、移行上皮癌、腎細胞癌）、および膀胱癌（移行上皮癌）。これらの知見は、ＯＭＤは種々のタイプの癌のマーカーとして機能できるということを示す。
【０１６５】
実施例６  −  種々のタイプの癌におけるＰＲＥＬＰの診断上の価値の検討
上に示したように、ＰＲＥＬＰ遺伝子発現は、膀胱癌および腎癌において非常に強く抑制される。種々のタイプの悪性組織および正常なヒトの組織におけるＰＲＥＬＰ遺伝子発現を検討するために、本発明者らは、非常に多くのヒト患者からの腫瘍および対応する正常組織から単離されたｍＲＮＡを使用したマイクロアレイ解析に基づく遺伝子発現データベース（Ｇｅｎｅ  Ｌｏｇｉｃ  Ｉｎｃ．（メリーランド州、ゲイザースバーグ）を使用した。ＲＮＡを調製し、遺伝子発現分析を、およそ４０，０００遺伝子／ＥＳＴに相当するオリゴデオキシヌクレオチドを含有するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  ＨＧ−Ｕ１３３Ｐｌｕｓ２マイクロアレイを使用して、Ｇｅｎｅ  Ｌｏｇｉｃ  Ｉｎｃ．で測定した。本発明者らは、ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ  Ｉｎｃ．から購入した遺伝子発現プロファイリングデータおよび付随の臨床データを使用することにより、ＰＲＥＬＰ遺伝子発現プロファイルを、自社の点−箱分析として示す。
【０１６６】
図７に示すように、ＰＲＥＬＰ発現は、肺癌（腺癌、腺扁平上皮癌、大細胞癌、小細胞癌、扁平上皮癌）、乳癌（浸潤性乳管癌ならびに、腺管および小葉混合型の浸潤性癌（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｍｉｘｅｄ  ｄｕｃｔａｌ  ａｎｄ  ｌｏｂｕｌａｒ  ｔｙｐｅ））、結腸癌（腺癌）、直腸癌（腺癌）、前立腺癌（腺癌）、子宮頸癌（扁平上皮癌）、子宮内膜癌（類内膜型腺癌）、卵巣癌（類内膜型腺癌、明細胞型腺癌、ミュラー管混合腫瘍、乳頭状漿液型腺癌、漿液性嚢胞腺癌）、食道癌（腺癌）、小腸（消化管間質腫瘍）、腎癌（ウィルムス腫瘍、移行上皮癌、腎細胞癌）、および膀胱癌（移行上皮癌）において有意に下方制御される。これらの知見は、ＰＲＥＬＰは種々のタイプの癌のマーカーとして機能できるということを示す。
【０１６７】
実施例７  −  膀胱の正常組織および癌組織におけるＰＲＥＬＰタンパク質分布
ＰＲＥＬＰの診断上の価値を確認するために、ＰＲＥＬＰ抗体および膀胱癌組織を使用して、免疫組織化学によってＰＲＥＬＰのタンパク質発現を調べた。新しいヒトの正常な膀胱および膀胱癌から凍結した切片を調製し、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドの中で、室温で１５分間固定した。次いで、この切片をＰＢＳ（−）中で５分間、３回洗浄し、メタノール中の０．３％過酸化水素で、室温で１５分間、処理した。このスライドをＰＢＳ（−）中で５分間、３回洗浄し、ＰＢＳ（−）中の３％  ＢＳＡ中でブロックした。次いで、第１抗体（ブロッキング溶液中の１／５００希釈した抗ＰＲＥＬＰ（マウスポリクローナル、カタログ番号：Ｈ００００５５１９−Ｂ０１、Ａｂｎｏｖａ）および正常マウスＩｇＧ（ｓｃ−２０５０、ＳａｎｔａＣｒｕｚ））をこのスライドに加え、４℃で一晩インキュベーションした。このスライドをＰＢＳ（−）中で５分間、３回洗浄し、第２抗体（ブロッキング溶液中の１／５００希釈した抗体）とともに室温で３０分間インキュベーションした。このスライドをＰＢＳ（−）中で５分間、３回洗浄し、ＡＢＣ試薬（ベクター）で、室温で３０分間処理した。ＰＢＳ（−）中で５分間、３回洗浄した後、このスライドを、観察しながら、ＤＡＢ基質キット（ベクター）とともに室温でインキュベーションした。好適な染色の際、過剰のＤＤＷによってこの反応を停止した。このスライドを、エタノールおよびキシレンによって脱水し、ＶｅｃｔａＭｏｕｎｔに載せた。
【０１６８】
ＰＲＥＬＰタンパク質は、正常な膀胱組織、とりわけ間質において広く発現される。他方、ＰＲＥＬＰタンパク質染色は、膀胱癌組織ではほぼ完全に排除されている（図８）。この知見は、本発明の、膀胱癌組織におけるＰＲＥＬＰ  ｍＲＮＡの分析と整合し、膀胱癌診断におけるＰＲＥＬＰの価値についての本発明をサポートする。
【０１６９】
実施例８  −  癌細胞に対するＯＭＤの効果
ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰをｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）へとサブクローニングした。Ｇ４１８を用いた選択によって、これらのプラスミドを用いて、膀胱癌細胞株、ＥＪ２８を安定に形質移入した。各プラスミドについて２つの独立のクローンを導いた（１つのクローンを導くことしかできなかったＭＴ−Ｐｒｅｌｐを除く）。次いで、これらの細胞の特性を調べた。ＯＭＤを形質移入された細胞およびＭｙｃタグ化されたＯＭＤを形質移入された細胞は、通常ではない形態を呈した。低コンフルエンスにあるとき、それらは活発に泡形成している細胞膜を伴って寄り集まっており、これは細胞接着に関する問題を示唆する。これらの細胞はアポトーシス細胞を含む。これは、平坦でおよび立方形であった対照細胞とは対照的である。ＯＭＤを形質移入された細胞は、対照細胞よりもゆっくりと増殖した。これは、細胞計数アッセイにおけるよりゆっくりの増殖およびＢｒｄＵ組み込みのより低い速度によって実証された。ＯＭＤを形質移入された細胞は、ＦＡＣＳ分析で測定したときの、より低い割合のＳ期の細胞も呈した。それらの細胞は、早期の膀胱癌の処置において使用される薬物であるマイトマイシンＣによって誘導されるアポトーシスに顕著に感作されていた（図１１）。ＯＭＤおよびＥＧＦＰを発現するＥＪ２８細胞の２つの独立のクローン、ＥＧＦＰを発現する２つの独立の対照ＥＪ２８クローン、およびｍｙｃタグ付きのＰＲＥＬＰおよびＥＧＦＰを発現するＥＪ２８細胞を、１μｇ／ｍｌ  マイトマイシンＣで処理した。また、ＥＧＦＰを発現するＥＪ２８細胞を、陽性対照として、より高濃度のマイトマイシンＣ（５μｇ／ｍｌ）で処理した。この陽性対照では、きわめて多い細胞死が観察された。８図１１に示すように、ＯＭＤを発現した細胞は、活性化されたアポトーシスを示し、これは、ＯＭＤ過剰発現が細胞をマイトマイシンＣ媒介性細胞死へと感作することを示す。また、ＰＲＥＬＰを発現する細胞も変化した特性を示した。それらの細胞は、より高い速度の内因性のアポトーシスを呈し、しかもマイトマイシンＣを用いた処置に応答してさらにより高い速度のアポトーシスを呈したが（図１１）、細胞周期阻害は観察されなかった。
【０１７０】
実施例９  −  ＯＭＤまたはＰＲＥＬＰは形質転換された癌細胞を選択的に死滅させる
ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰは、癌細胞を死滅させかつ抗癌剤媒介性細胞死を増強する能力を有する。興味深いことに、この化学感作は癌細胞に特有であった。ＯＭＤ過剰発現は実際に正常細胞をマイトマイシンＣ媒介性アポトーシスから保護したのに対し、ＰＲＥＬＰは正常細胞の感度に対しては効果がなかった（図１１）。これは、マイトマイシンＣ処置と組み合わせた、ＯＭＤおよび／またはＰＲＥＬＰを用いた処置は、癌細胞の死滅を高めるであろうが、正常細胞は保護するであろうということを示唆する。
【０１７１】
実施例１０  −  ＯＭＤは癌細胞の足場非依存性増殖を消失させ、ＰＲＥＬＰは癌細胞の足場非依存性増殖を減少させる
ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰは、癌細胞の顕著な特徴である足場非依存性にも影響を及ぼす。軟寒天の中に細胞を播き、細胞を２週間インキュベーションし、生成したコロニーの数を数えることにより、足場非依存性を測定した。驚くべきことに、ＯＭＤ過剰発現は、ＥＪ２８細胞の足場非依存性を完全に消失させ、これは、ＯＭＤは腫瘍形成を劇的に阻害することができるということを示唆していた。ＰＲＥＬＰもＥＪ２８の足場非依存性増殖を阻害し、軟寒天中のコロニー形成能を、対照細胞において観察されたコロニー形成能の３分の１まで低下させた（図１４）。
【０１７２】
実施例１１  −  ＯＭＤまたはＰＲＥＬＰ媒介性の癌細胞死の分子機構の検討
ＯＭＤまたはＰＲＥＬＰの活性化がどのように癌細胞を死滅させるかのメカニズムを決定するために、２つのタイプの細胞を構築した：ＯＭＤまたはＰＲＥＬＰを発現する細胞およびＯＭＤまたはＰＲＥＬＰを欠失した細胞。遺伝子を過剰発現するために、Ｔ−Ｒｅｘ−２９３系を製造業者の取扱説明書に従って使用した。この系は、内因性のタンパク質の発現に影響を及ぼさずに標的タンパク質の発現を可能にする。簡潔に言えば、２９３細胞を、リポフェクタミン２０００を使用して、ｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ／ＴＯ−ＯＭＤまたはｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ／ＴＯ−ＰＲＥＬＰを用いて形質移入した。安定に形質移入された細胞を選択し、次いで３つの独立のコロニーを単離した。これらの細胞株におけるＯＭＤまたはＰＲＥＬＰの同一の発現レベルを確認した後（図１２）、細胞株をさらなる分析のために使用した。
【０１７３】
ＯＭＤまたはＰＲＥＬＰ発現を欠失させるために、最初に本発明者らは好適な細胞株を検索した。なぜなら、ほぼすべての癌細胞株において、ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの発現は、たいていすでに抑制されているからである。本発明者らの検索によって、発現レベルは正常組織における発現レベルよりも低いが何らかの発現を有する５６３７膀胱癌細胞株を特定した。これらの５６３７細胞株を、ｓｉＰＲＥＬＰ、ｓｉＥＧＦＰ、またはｓｉＦＦＬｕｃを用いて形質移入した。ＯＭＤまたはＰＲＥＬＰレベルの抑制は、図１３に示すように、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって確認された。
【０１７４】
癌発生におけるＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの分子活性を判定するために、下流の標的遺伝子およびシグナル伝達経路を、マイクロアレイを使用するｍＲＮＡプロファイリングによって決定した。この目的のために、細胞を培養した後、上記のようにして全ＲＮＡを単離した。この全ＲＮＡを標識し、製造業者の取扱説明書に従って、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  ＧｅｎｅＣｈｉｐオリゴヌクレオチドアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）上でハイブリダイズした。簡潔に言えば、ハイブリダイゼーションシグナルを、各アレイについて全体の（ｇｌｏｂａｌ）トリム平均シグナル強度の値を５００に調整することによって決定したスケーリングファクターを使用して、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧＣＯＳソフトウェア（バージョン１．１．１）でスケーリングし、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇバージョン６．２（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）へとインポートした。次いでシグナル強度の中心を各チップの中央値（５０ｔｈ  ｐｅｒｃｅｎｔｉｌｅ）に合わせ、各個々の遺伝子について、起こりうる技術的な偏りを最小にするために最初に各特定のサブセットのメジアン強度に合わせ、次いで試料セット全体に合わせた。あらゆる反復可能なハイブリダイゼーションの強度を、さらなる分析の後で平均した。すべての試料の中でＧＣＯＳソフトウェアによって「ｐｒｅｓｅｎｔ（存在）」または「ｍａｒｇｉｎａｌ（わずか）」とラベルされた遺伝子だけを、さらなる分析において使用した。差異的に発現される遺伝子を、ウィルコクソン−マン−ホイットニー（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ−Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）のノンパラメトリック検定（Ｐ＜０．０５）を使用して特定した。適用できるときは常に、ベンジャミニ−ホッホバーグ（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ）のフォールス・ディスカバリー・レート（ｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ）多重検定による補正を加えた。各特定された遺伝子セットについて試料間の相関を評価するために、各比較に対して階層的クラスター分析を行った。
【０１７５】
表５および６は、ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの活性化および抑制によって発現が有意にかつ一貫して上方制御または下方制御されることを示す遺伝子を示す。これらの表には、多くの腫瘍遺伝子および腫瘍抑制遺伝子が挙げられている。ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰによって影響を受けるシグナル伝達経路を決定するために、本発明者らは、ＫＥＧＧパスウェイ解析プログラムによってこれらの遺伝子を分析した。表７は、ｐ５３経路はＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの共通の主要な下流の経路であるということを示す。このｐ５３経路は、腫瘍形成において最もよく確立されているシグナル伝達経路である。特に、ｐ５３の変異は、非常に多くの癌と関連していることが知られている。しかしながら、この変異で腫瘍形成のすべての場合を説明できるわけではない。また、ｐ５３の発現は早期から癌の特定の個体群で有意に抑制されるが、染色体１７上での異種接合性の喪失が尿路上皮癌の後期に起こる。これは、ほぼすべての癌において発現がほぼ完全に抑制されるＯＭＤおよびＰＲＥＬＰとの主な差異である。本発明での結果は、ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰの両方の抑制がｐ５３経路の抑制に著しく寄与するということを示唆する。また、両方の遺伝子は、密着結合およびアポトーシス経路を制御する。密着結合は腫瘍形成の初期段階を制御し、足場依存性増殖から外れることが知られている（Ｔｓｕｋｉｔａら、２００８年）。アポトーシス経路は、腫瘍形成にとって重要であることが周知である（ＢｒｏｗｎおよびＡｔｔａｒｄｉ、２００５年；Ｆｅｓｉｋ、２００５年；Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅら、２００２年；Ｌｉら、２００８年；Ｖａｚｑｕｅｚら、２００８年；ＹｕおよびＺｈａｎｇ、２００４年）。加えて、ＯＭＤは、同じく腫瘍形成の早期に関わることが知られているＷｎｔ経路（ＢｉｅｎｚおよびＣｌｅｖｅｒｓ、２０００年；Ｃｌｅｖｅｒｓ、２００４年；Ｐｏｌａｋｉｓ、２０００年；ＲｅｙａおよびＣｌｅｖｅｒｓ、２００５年；ＴａｉｐａｌｅおよびＢｅａｃｈｙ、２００１年）、および腫瘍形成にとって重要な接着結合経路（ＧｉｅｈｌおよびＭｅｎｋｅ、２００８年）を制御する。これらの知見は、ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰはだいたい機能的に補完しているが、完全に重なっているわけではないということを示す。また、影響を受ける経路は、ＴｓｕｋｕｓｈｉおよびデコリンなどのＳＬＲＰファミリーの他のメンバーとは著しく異なる。これらの分析は、ＯＭＤおよびＰＲＥＬＰは、ｐ５３経路、密着結合経路およびアポトーシス経路を含めた複数の腫瘍抑制シグナルの活性化を通して、癌細胞を死滅させるということを示す。これは、癌の処置についての本発明の価値を明確に実証する。
【０１７６】
実施例１２  −  マウス異種移植モデルを使用した、ＯＭＤの治療上の潜在的可能性の評価
６〜８週齢の雄のＭＦ１ヌードマウスを、Ｒｏｙａｌ  Ｆｒｅｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（英国、ロンドン）から入手した。５×１０６のＥＪ２８癌膀胱細胞を背中に、皮下に接種することによって腫瘍を誘導した。ＥＪ２８腫瘍を保有するＭＦ−１マウス（ｎ＝５）に、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＯＭＤ−ｍｙｃタグを有するｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰベクターを用いて安定に形質移入してサブクローニングした細胞を注入した。対照として、ＥＪ２８細胞を、過剰発現されるＯＭＤ遺伝子を持たないベクターを用いて形質移入した。カリパスを使用して腫瘍寸法を連続的に測定し、腫瘍体積を、次式を使用して算出した：体積＝（π／６）×ａ×６×ｃ（式中、ａ、ｂ、およびｃは、腫瘍の３つの直交軸を表す）。動物を、２５日間にわたって腫瘍成長について評価した。
【０１７７】
ＥＪ２８腫瘍を保有するマウスに対するＯＭＤの生物活性を、腫瘍体積の変化を測定することにより、測定した。図１５は、対照と比較して、ＯＭＤ−ｍｙｃ−タグを注入したＭＦ−１マウスにおけるＥＪ２８腫瘍の成長特性を示す。得られた結果は、ＯＭＤ遺伝子を有しない対照細胞と比較して、ＯＭＤ−ｍｙｃタグを有する腫瘍異種移植片の顕著な成長停止を示す。１８日目には、腫瘍成長が完全に阻害されたＯＭＤ−ｍｙｃタグで形質移入された細胞株（１．６０±１．０ｍｍ３）と比較して、対照についての腫瘍サイズは３７．９１±１６．５７ｍｍ３（ｎ＝５）であった。
【０１７８】
【表１】
2013514074.tif 000003
【表２】
2013514074.tif 000004
【表３】
2013514074.tif 000005
【表４】
2013514074.tif 000006
【表５】
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【表６】
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【表７】
2013514074.tif 000009
【０１７９】
参考文献
Ａｌｉｍｏｈａｍａｄ，Ｈ．、Ｈａｂｉｊａｎａｃ，Ｔ．、Ｌａｒｊａｖａ，Ｈ．、およびＨａｋｋｉｎｅｎ，Ｌ．（２００５年）、「Ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ  ｄｅｃｏｒｉｎ，ｂｉｇｌｙｃａｎ，ｆｉｂｒｏｍｏｄｕｌｉｎ  ａｎｄ  ｌｕｍｉｃａｎ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｉｎｇｉｖａ」、Ｊ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  Ｒｅｓ、第４０巻、７３−８６頁。
Ａｒｎａｌｄｉ，Ｌ．Ａ．、Ｂｏｒｒａ，Ｒ．Ｃ．、Ｍａｃｉｅｌ，Ｒ．Ｍ．、およびＣｅｒｕｔｔｉ，Ｊ．Ｍ．（２００５年）、「Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｒｅｖｅａｌ  ｔｈａｔ  ＤＣＮ，ＤＩＯ１，ａｎｄ  ＤＩＯ２  ａｒｅ  ｕｎｄｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｂｅｎｉｇｎ  ａｎｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｔｈｙｒｏｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ」、Ｔｈｙｒｏｉｄ、第１５巻、２１０−２２１頁。
Ａｕｓｔｉｎ，Ｂ．Ａ．、Ｃｏｕｌｏｎ，Ｃ．、Ｌｉｕ，Ｃ．Ｙ．、Ｋａｏ，Ｗ．Ｗ．、およびＲａｄａ，Ｊ．Ａ．（２００２年）、「Ａｌｔｅｒｅｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｆｉｂｒｉｌ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｃｌｅｒａ  ｏｆ  ｌｕｍｉｃａｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ」、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ、第４３巻、１６９５−１７０１頁。
Ｂｅｃｈ−Ｈａｎｓｅｎ，Ｎ．Ｔ．、Ｎａｙｌｏｒ，Ｍ．Ｊ．、Ｍａｙｂａｕｍ，Ｔ．Ａ．、Ｓｐａｒｋｅｓ，Ｒ．Ｌ．、Ｋｏｏｐ，Ｂ．、Ｂｉｒｃｈ，Ｄ．Ｇ．、Ｂｅｒｇｅｎ，Ａ．Ａ．、Ｐｒｉｎｓｅｎ，Ｃ．Ｆ．、Ｐｏｌｏｍｅｎｏ，Ｒ．Ｃ．、Ｇａｌ，Ａ．ら（２０００年）、「Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＮＹＸ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｎｙｃｔａｌｏｐｉｎ，ｃａｕｓｅ  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  ｎｉｇｈｔ  ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ」、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、第２６巻、３１９−３２３頁。
Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ，Ｅ．、Ａｓｐｂｅｒｇ，Ａ．、Ｈｅｉｎｅｇａｒｄ，Ｄ．、Ｓｏｍｍａｒｉｎ，Ｙ．、およびＳｐｉｌｌｍａｎｎ，Ｄ．（２０００年）、「Ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐａｒｔ  ｏｆ  ＰＲＥＬＰ  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ｈｅｐａｒｉｎ  ａｎｄ  ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、第２７５巻、４０６９５−４０７０２頁。
Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ，Ｅ．、Ｍｏｒｇｅｌｉｎ，Ｍ．、Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．、Ｔｉｍｐｌ，Ｒ．、Ｈｅｉｎｅｇａｒｄ，Ｄ．、およびＡｓｐｂｅｒｇ，Ａ．（２００２年）、「Ｔｈｅ  ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＲＥＬＰ  ｂｉｎｄｓ  ｐｅｒｌｅｃａｎ  ａｎｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎｓ  ａｎｄ  ｍａｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｃｈｏｒ」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、第２７７巻、１５０６１−１５０６８頁。
Ｂｉｅｎｚ，Ｍ．、およびＣｌｅｖｅｒｓ，Ｈ．（２０００年）、「Ｌｉｎｋｉｎｇ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｏ  Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ」、Ｃｅｌｌ、第１０３巻、３１１−３２０頁。
Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｍ．、およびＡｔｔａｒｄｉ，Ｌ．Ｄ．（２００５年）、「Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ」、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ、第５巻、２３１−２３７頁。
Ｃａｍｐｏ，Ｓ．、Ｃａｍｐｏ，Ｇ．Ｍ．、Ａｖｅｎｏｓｏ，Ａ．、Ｄ’Ａｓｃｏｌａ，Ａ．、Ｍｕｓｏｌｉｎｏ，Ｃ．、Ｃａｌａｂｒｏ，Ｌ．、Ｂｅｌｌｏｍｏ，Ｇ．、Ｑｕａｒｔａｒｏｎｅ，Ｅ．、およびＣａｌａｔｒｏｎｉ，Ａ．（２００６年）、「Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｅａｒｌｙ  ｓｔａｇｅ  ｏｆ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ  ａｎｄ  ｌｏｎｇ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ  ｄｅｃｏｒｉｎ」、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、第８８巻、１９３３−１９３９頁。
Ｃｌｅｖｅｒｓ，Ｈ．（２００４年）、「Ｗｎｔ  ｂｒｅａｋｅｒｓ  ｉｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、第５巻、５−６頁。
Ｃｚｅｒｎｉａｋ，Ｂ．、Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ，Ｖ．、Ｌｉ，Ｌ．、Ｈｏｄｇｅｓ，Ｓ．、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｄ．、Ｒｏｙ，Ｊ．Ｙ．、Ｌｕｔｈｒａ，Ｒ．、Ｌｏｇｏｔｈｅｔｉｓ，Ｃ．、Ｖｏｎ  Ｅｓｃｈｅｎｂａｃｈ，Ａ．Ｃ．、Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ｈ．Ｂ．ら（１９９９年）、「Ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓｅｄ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ９  ｉｎ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｓｔｅｐ  ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅａｒｌｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ」、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第１８巻、１１８５−１１９６頁。
Ｄａｎｉｅｌｓｏｎ，Ｋ．Ｇ．、Ｂａｒｉｂａｕｌｔ，Ｈ．、Ｈｏｌｍｅｓ，Ｄ．Ｆ．、Ｇｒａｈａｍ，Ｈ．、Ｋａｄｌｅｒ，Ｋ．Ｅ．、およびＩｏｚｚｏ，Ｒ．Ｖ．（１９９７年）、「Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｃｏｒｉｎ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ａｂｎｏｒｍａｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｆｉｂｒｉｌ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｓｋｉｎ  ｆｒａｇｉｌｉｔｙ」、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、第１３６巻、７２９−７４３頁。
Ｅｉｓｓａ，Ｓ．、Ｋａｓｓｉｍ，Ｓ．Ｋ．、Ｌａｂｉｂ，Ｒ．Ａ．、Ｅｌ−Ｋｈｏｕｌｙ，Ｉ．Ｍ．、Ｇｈａｆｆｅｒ，Ｔ．Ｍ．、Ｓａｄｅｋ，Ｍ．、Ｒａｚｅｋ，Ｏ．Ａ．、およびＥｌ−Ａｈｍａｄｙ，Ｏ．（２００５年）、「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｕｒｉｎｅ  ｆｏｒ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ  ２０  ＲＮＡｓ」、Ｃａｎｃｅｒ、第１０３巻、１３５６−１３６２頁。
Ｆｅｓｉｋ，Ｓ．Ｗ．（２００５年）、「Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｓ  ａ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ、第５巻、８７６−８８５頁。
Ｇｉｅｈｌ，Ｋ．、およびＭｅｎｋｅ，Ａ．（２００８年）、「Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｄｈｅｒｅｎｓ  ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ」、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ、第１３巻、３９７５−３９８５頁。
Ｇｒｏｖｅｒ，Ｊ．、Ｌｅｅ，Ｅ．Ｒ．、Ｍｏｕｎｋｅｓ，Ｌ．Ｃ．、Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｃ．Ｌ．、およびＲｏｕｇｈｌｅｙ，Ｐ．Ｊ．（２００７年）、「Ｔｈｅ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ＰＲＥＬＰ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  ｓｋｉｎ」、Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ、第２６巻、１４０−１４３頁。
Ｇｕｄｊｏｎｓｓｏｎ，Ｓ．、Ｉｓｆｏｓｓ，Ｂ．Ｌ，Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｋ．、Ｄｏｍａｎｓｋｉ，Ａ．Ｍ．、Ｗａｒｅｎｈｏｌｔ，Ｊ．、Ｓｏｌｌｅｒ，Ｗ．、Ｌｕｎｄｂｅｒｇ，Ｌ．Ｍ．、Ｌｉｅｄｂｅｒｇ，Ｆ．、Ｇｒａｂｅ，Ｍ．、およびＭａｎｓｓｏｎ，Ｗ．（２００８年）、「Ｔｈｅ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵｒｏＶｙｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｍｕｓｃｌｅ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ」、Ｅｕｒ  Ｕｒｏｌ、第５４巻、４０２−４０８頁。
Ｈａｂｕｃｈｉ，Ｔ．、Ｄｅｖｌｉｎ，Ｊ．、Ｅｌｄｅｒ，Ｐ．Ａ．、およびＫｎｏｗｌｅｓ，Ｍ．Ａ．（１９９５年）、「Ｄｅｔａｉｌｅｄ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ９ｑ  ｉｎ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ：  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｗｏ  ｔｕｍｏｕｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｌｏｃｉ」、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第１１巻、１６７１−１６７４頁。
Ｈｅｄｂｏｍ，Ｅ．、およびＨｅｉｎｅｇａｒｄ，Ｄ．（１９９３年）、「Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｍｏｄｕｌｉｎ  ａｎｄ  ｄｅｃｏｒｉｎ  ｔｏ  ｓｅｐａｒａｔｅ  ｓｉｔｅｓ  ｏｎ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒ  ｃｏｌｌａｇｅｎｓ」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、第２６８巻、２７３０７−２７３１２頁。
Ｈｅｉｎｅｇａｒｄ，Ｄ．、Ｌａｒｓｓｏｎ，Ｔ．、Ｓｏｍｍａｒｉｎ，Ｙ．、Ｆｒａｎｚｅｎ，Ａ．、Ｐａｕｌｓｓｏｎ，Ｍ．、およびＨｅｄｂｏｍ，Ｅ．（１９８６年）、「Ｔｗｏ  ｎｏｖｅｌ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｓｈｏｗ  ｗｉｄｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ａｍｏｎｇ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅｓ」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、第２６１巻、１３８６６−１３８７２頁。
Ｈｏｃｋｉｎｇ，Ａ．Ｍ．、Ｓｈｉｎｏｍｕｒａ，Ｔ．、およびＭｃＱｕｉｌｌａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９９８年）、「Ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ」、Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ、第１７巻、１−１９頁。
Ｉｏｚｚｏ，Ｒ．Ｖ．、Ｃｈａｋｒａｎｉ，Ｆ．、Ｐｅｒｒｏｔｔｉ，Ｄ．、ＭｃＱｕｉｌｌａｎ，Ｄ．Ｊ．、Ｓｋｏｒｓｋｉ，Ｔ．、Ｃａｌａｂｒｅｔｔａ，Ｂ．、およびＥｉｃｈｓｔｅｔｔｅｒ，Ｉ．（１９９９年ａ）、「Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｄｅｃｏｒｉｎ  ａｎｄ  ｐ５３  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、第９６巻、３０９２−３０９７頁。
Ｉｏｚｚｏ，Ｒ．Ｖ．、Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｏ，Ｄ．Ｋ．、ＭｃＱｕｉｌｌａｎ，Ｄ．Ｊ．、およびＥｉｃｈｓｔｅｔｔｅｒ，Ｉ．（１９９９年ｂ）、「Ｄｅｃｏｒｉｎ  ｉｓ  ａ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｌｉｇａｎｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、第２７４巻、４４８９−４４９２頁。
Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ，Ｒ．Ｗ．、Ｒｕｅｆｌｉ，Ａ．Ａ．、およびＬｏｗｅ，Ｓ．Ｗ．（２００２年）、「Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：  ａ  ｌｉｎｋ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」、Ｃｅｌｌ、第１０８巻、１５３−１６４頁。
Ｋｉｚａｗａ，Ｈ．、Ｋｏｕ，Ｉ．、Ｉｉｄａ，Ａ．、Ｓｕｄｏ，Ａ．、Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｙ．、Ｆｕｋｕｄａ，Ａ．、Ｍａｂｕｃｈｉ，Ａ．、Ｋｏｔａｎｉ，Ａ．、Ｋａｗａｋａｍｉ，Ａ．、Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｓ．ら（２００５年）、「Ａｎ  ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｐｅａｔ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｉｎ  ａｓｐｏｒｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ」、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、第３７巻、１３８−１４４頁。
Ｋｕｒｉｙａｍａ，Ｓ．、Ｌｕｐｏ，Ｇ．、Ｏｈｔａ，Ｋ．、Ｏｈｎｕｍａ，Ｓ．、Ｈａｒｒｉｓ，Ｗ．Ａ．、およびＴａｎａｋａ，Ｈ．（２００６年）、「Ｔｓｕｋｕｓｈｉ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ  ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｒｅｓｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＢＭＰ４  ａｎｄ  Ｘ−ｄｅｌｔａ−１  ａｃｔｉｖｉｔｙ」、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、第１３３巻、７５−８８頁。
Ｌｅｙｇｕｅ，Ｅ．、Ｓｎｅｌｌ，Ｌ、Ｄｏｔｚｌａｗ，Ｈ．、Ｈｏｌｅ，Ｋ．、Ｈｉｌｌｅｒ−Ｈｉｔｃｈｃｏｃｋ，Ｔ．、Ｒｏｕｇｈｌｅｙ，Ｐ．Ｊ．、Ｗａｔｓｏｎ，Ｐ．Ｈ．、およびＭｕｒｐｈｙ，Ｌ．Ｃ．（１９９８年）、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｌｕｍｉｃａｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、第５８巻、１３４８−１３５２頁。
Ｌｅｙｇｕｅ，Ｅ．、Ｓｎｅｌｌ，Ｌ．、Ｄｏｔｚｌａｗ，Ｈ．、Ｔｒｏｕｐ，Ｓ．、Ｈｉｌｌｅｒ−Ｈｉｔｃｈｃｏｃｋ，Ｔ．、Ｍｕｒｐｈｙ，Ｌ．Ｃ．、Ｒｏｕｇｈｌｅｙ，Ｐ．Ｊ．、およびＷａｔｓｏｎ，Ｐ．Ｈ．（２０００年）、「Ｌｕｍｉｃａｎ  ａｎｄ  ｄｅｃｏｒｉｎ  ａｒｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ」、Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、第１９２巻、３１３−３２０頁。
Ｌｉ，Ｘ．、Ｒｏｇｉｎｓｋｙ，Ａ．Ｂ．、Ｄｉｎｇ，Ｘ．Ｚ．、Ｗｏｏｄｗａｒｄ，Ｃ．、Ｃｏｌｌｉｎ，Ｐ．、Ｎｅｗｍａｎ，Ｒ．Ａ．、Ｂｅｌｌ，Ｒ．Ｈ．，Ｊｒ．、およびＡｄｒｉａｎ，Ｔ．Ｅ．（２００８年）、「Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｏｖｅｌ  ｓｅａ  ｃｕｃｕｍｂｅｒ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ，Ｆｒｏｎｄｏｓｉｄｅ  Ａ」、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、第１１３８巻、１８１−１９８頁。
Ｌｉｏｔｔａ，Ｌ．Ａ．（１９８６年）、「Ｔｕｍｏｒ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ−ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ：  Ｒｈｏａｄｓ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ａｗａｒｄ  ｌｅｃｔｕｒｅ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、第４６巻、１−７頁。
Ｌｉｕ，Ｃ．Ｙ．、Ｂｉｒｋ，Ｄ．Ｅ．、Ｈａｓｓｅｌｌ，Ｊ．Ｒ．、Ｋａｎｅ，Ｂ．、およびＫａｏ，Ｗ．Ｗ．（２００３年）、「Ｋｅｒａｔｏｃａｎ−ｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、第２７８巻、２１６７２−２１６７７頁。
Ｌｕ，Ｙ．Ｐ．、Ｉｓｈｉｗａｔａ，Ｔ．、Ｋａｗａｈａｒａ，Ｋ．、Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｍ．、Ｎａｉｔｏ，Ｚ．、Ｍｏｒｉｙａｍａ，Ｙ．、Ｓｕｇｉｓａｋｉ，Ｙ．、およびＡｓａｎｏ，Ｇ．（２００２年）、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｌｕｍｉｃａｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ」、Ｐａｔｈｏｌ  Ｉｎｔ、第５２巻、５１９−５２６頁。
Ｍｏｒｒｉｓ，Ｓ．Ａ．、Ａｌｍｅｉｄａ，Ａ．Ｄ．、Ｔａｎａｋａ，Ｈ．、Ｏｈｔａ，Ｋ．、およびＯｈｎｕｍａ，Ｓ．（２００７年）、「Ｔｓｕｋｕｓｈｉ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  Ｘｎｒ２，ＦＧＦ  ａｎｄ  ＢＭＰ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｇｅｒｍ  ｌａｙｅｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ」、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、第２巻、ｅ１００４頁。
Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｏ，Ｄ．Ｋ．、Ｓａｎｔｒａ，Ｍ．、Ｍａｎｎ，Ｄ．Ｍ．、ＭｃＱｕｉｌｌａｎ，Ｄ．Ｊ．、Ｗｏｎｇ，Ａ．Ｊ．、およびＩｏｚｚｏ，Ｒ．Ｖ．（１９９８）、「Ｄｅｃｏｒｉｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ」、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、第１０１巻、４０６−４１２頁。
Ｎａｉｔｏ，Ｚ．、Ｉｓｈｉｗａｔａ，Ｔ．、Ｋｕｒｂａｎ，Ｇ．、Ｔｅｄｕｋａ，Ｋ．、Ｋａｗａｍｏｔｏ，Ｙ．、Ｋａｗａｈａｒａ，Ｋ．、およびＳｕｇｉｓａｋｉ，Ｙ．（２００２年）、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｕｍｉｃａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｕｔｅｒｉｎｅ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｐｈｅｒｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｎｅｓｔｓ」、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ、第２０巻、９４３−９４８頁。
Ｎａｓｈ，Ｍ．Ａ．、Ｄｅａｖｅｒｓ，Ｍ．Ｔ．、およびＦｒｅｅｄｍａｎ，Ｒ．Ｓ．（２００２年）、「Ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｃｏｒｉｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｔｕｍｏｒｓ」、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、第８巻、１７５４−１７６０頁。
Ｏｈｔａ，Ｋ．、Ｋｕｒｉｙａｍａ，Ｓ．、Ｏｋａｆｕｊｉ，Ｔ．、Ｇｅｊｉｍａ，Ｒ．、Ｏｈｎｕｍａ，Ｓ．、およびＴａｎａｋａ，Ｈ．（２００６年）、「Ｔｓｕｋｕｓｈｉ  ｃｏｏｐｅｒａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ＶＧ１  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅ  ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｓｔｒｅａｋ  ａｎｄ  Ｈｅｎｓｅｎ’ｓ  ｎｏｄｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｈｉｃｋ  ｅｍｂｒｙｏ」、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、第１３３巻、３７７７−３７８６頁。
Ｏｈｔａ，Ｋ．、Ｌｕｐｏ，Ｇ．、Ｋｕｒｉｙａｍａ，Ｓ．、Ｋｅｙｎｅｓ，Ｒ．、Ｈｏｌｔ，Ｃ．Ｅ．、Ｈａｒｒｉｓ，Ｗ．Ａ．、Ｔａｎａｋａ，Ｈ．、およびＯｈｎｕｍａ，Ｓ．（２００４年）、「Ｔｓｕｋｕｓｈｉ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｓ  ａｎ  ｏｒｇａｎｉｚｅｒ  ｉｎｄｕｃｅｒ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＢＭＰ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｈｏｒｄｉｎ」、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ、第７巻、３４７−３５８頁。
Ｏｌｓｂｕｒｇｈ，Ｊ．、Ｈａｒｎｄｅｎ，Ｐ．、Ｗｅｅｋｓ，Ｒ．、Ｓｍｉｔｈ，Ｂ．、Ｊｏｙｃｅ，Ａ．、Ｈａｌｌ，Ｇ．、Ｐｏｕｌｓｏｍ，Ｒ．、Ｓｅｌｂｙ，Ｐ．、およびＳｏｕｔｈｇａｔｅ，Ｊ．（２００３年）、「Ｕｒｏｐｌａｋｉｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ａｎｄ  ｌｏｃａｌｌｙ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ」、Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、第１９９巻、４１−４９頁。
Ｐａｔｅｌ，Ｓ．、Ｓａｎｔｒａ，Ｍ．、ＭｃＱｕｉｌｌａｎ，Ｄ．Ｊ．、Ｉｏｚｚｏ，Ｒ．Ｖ．、およびＴｈｏｍａｓ，Ａ．Ｐ．（１９９８年）、「Ｄｅｃｏｒｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｅｌｅｖａｔｅｓ  ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  Ｃａ２＋  ｉｎ  Ａ４３１  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、第２７３巻、３１２１−３１２４頁。
Ｐｅｌｌｅｇａｔａ，Ｎ．Ｓ．、Ｄｉｅｇｕｅｚ−Ｌｕｃｅｎａ，Ｊ．Ｌ．、Ｊｏｅｎｓｕｕ，Ｔ．、Ｌａｕ，Ｓ．、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｋ．Ｔ．、Ｋｒａｈｅ，Ｒ．、Ｋｉｖｅｌａ，Ｔ．、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，Ｒ．、Ｆｏｒｓｉｕｓ，Ｈ．、およびｄｅ  ｌａ  Ｃｈａｐｅｌｌｅ，Ａ．（２０００年）、「Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＫＥＲＡ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｋｅｒａｔｏｃａｎ，ｃａｕｓｅ  ｃｏｒｎｅａ  ｐｌａｎａ」、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、第２５巻、９１−９５頁。
Ｐｏｌａｋｉｓ，Ｐ．（２０００年）、「Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ」、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、第１４巻、１８３７−１８５１頁。
Ｐｕｓｃｈ，ＣＭ．、Ｚｅｉｔｚ，Ｃ．、Ｂｒａｎｄａｕ，Ｏ．、Ｐｅｓｃｈ，Ｋ．、Ａｃｈａｔｚ，Ｈ．、Ｆｅｉｌ，Ｓ．、Ｓｃｈａｒｆｅ，Ｃ．、Ｍａｕｒｅｒ，Ｊ．、Ｊａｃｏｂｉ，Ｆ．Ｋ．、Ｐｉｎｃｋｅｒｓ，Ａ．ら（２０００年）、「Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  ｎｉｇｈｔ  ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ  ｉｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、第２６巻、３２４−３２７頁。
Ｒａｄａ，Ｊ．Ａ．、Ｃｏｒｎｕｅｔ，Ｐ．Ｋ．、およびＨａｓｓｅｌｌ，Ｊ．Ｒ．（１９９３年）、「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｆｉｂｒｉｌｌｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  （ｌｕｍｉｃａｎ  ａｎｄ  ｄｅｃｏｒｉｎ）  ｃｏｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ、第５６巻、６３５−６４８頁。
Ｒｅｅｄ，Ｃ．Ｃ．、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ，Ａ．、Ｋｉｒｂｙ，Ｓ．、Ｋａｙ，Ｐ．、Ｏｗｅｎｓ，Ｒ．Ｔ．、ＭｃＱｕｉｌｌａｎ，Ｄ．Ｊ．、およびＩｏｚｚｏ，Ｒ．Ｖ．（２００５年）、「Ｄｅｃｏｒｉｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｓｐｒｅａｄｉｎｇ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ」、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第２４巻、１１０４−１１１０頁。
Ｒｅｈｎ，Ａ．Ｐ．、Ｃｈａｌｋ，Ａ．Ｍ．、およびＷｅｎｄｅｌ，Ｍ．（２００６年）、「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏａｄｈｅｒｉｎ  （ＯＳＡＤ）  ｂｙ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ１  ａｎｄ  ＢＭＰ−２」、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、第３４９巻、１０５７−１０６４頁。
Ｒｅｙａ，Ｔ．、およびＣｌｅｖｅｒｓ，Ｈ．（２００５年）、「Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｉｎ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ」、Ｎａｔｕｒｅ、第４３４巻、８４３−８５０頁。
Ｓａｎｔｒａ，Ｍ．、Ｓｋｏｒｓｋｉ，Ｔ．、Ｃａｌａｂｒｅｔｔａ，Ｂ．、Ｌａｔｔｉｍｅ，Ｅ．Ｃ．、およびＩｏｚｚｏ，Ｒ．Ｖ．（１９９５年）、「Ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｄｅｃｏｒｉｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｈｅ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、第９２巻、７０１６−７０２０頁。
Ｓｃｈｏｎｈｅｒｒ，Ｅ．、Ｗｉｔｓｃｈ−Ｐｒｅｈｍ，Ｐ．、Ｈａｒｒａｃｈ，Ｂ．、Ｒｏｂｅｎｅｋ，Ｈ．、Ｒａｕｔｅｒｂｅｒｇ，Ｊ．、およびＫｒｅｓｓｅ，Ｈ．（１９９５年）、「Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｇｌｙｃａｎ  ｗｉｔｈ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｃｏｌｌａｇｅｎ」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、第２７０巻、２７７６−２７８３頁。
Ｓｈｉｍｉｚｕ−Ｈｉｒｏｔａ，Ｒ．、Ｓａｓａｍｕｒａ，Ｈ．、Ｋｕｒｏｄａ，Ｍ．、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｅ．、Ｈａｙａｓｈｉ，Ｍ．、およびＳａｒｕｔａ，Ｔ．（２００４年）、「Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｇｌｙｃａｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ」、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ、第９４巻、１０６７−１０７４頁。
Ｓｉｍｏｎｅａｕ，Ａ．Ｒ．、Ｓｐｒｕｃｋ，Ｃ．Ｈ．、３ｒｄ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｚｕｌｕｅｔａ，Ｍ．、Ｇｏｎｚａｌｇｏ，Ｍ．Ｌ．、Ｃｈａｎ，Ｍ．Ｆ．、Ｔｓａｉ，Ｙ．Ｃ．、Ｄｅａｎ，Ｍ．、Ｓｔｅｖｅｎ，Ｋ．、Ｈｏｒｎ，Ｔ．、およびＪｏｎｅｓ，Ｐ．Ａ．（１９９６年）、「Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｗｏ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｌｏｃｉ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ９ｐ  ｔｏ  ｑ  ａｎｄ  ｄｉｓｔａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ９ｑ  ｉｎ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｌ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ＧＡＳ１  ａｎｄ  ＰＴＣ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、第５６巻、５０３９−５０４３頁。
Ｓｉｍｏｎｅａｕ，Ｍ．、Ａｂｏｕｌｋａｓｓｉｍ，Ｔ．Ｏ．、ＬａＲｕｅ，Ｈ．、Ｒｏｕｓｓｅａｕ，Ｆ．、およびＦｒａｄｅｔ，Ｙ．（１９９９年）、「Ｆｏｕｒ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｌｏｃｉ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ９ｑ  ｉｎ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ：  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｗｏ  ｎｏｖｅｌ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ａｔ  ９ｑ２２．３  ａｎｄ  ９ｑ３１」、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第１８巻、１５７−１６３頁。
Ｓｏｍｍａｒｉｎ，Ｙ．、Ｗｅｎｄｅｌ，Ｍ．、Ｓｈｅｎ，Ｚ．、Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｕ．、およびＨｅｉｎｅｇａｒｄ，Ｄ．（１９９８年）、「Ｏｓｔｅｏａｄｈｅｒｉｎ，ａ  ｃｅｌｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｋｅｒａｔａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｉｎ  ｂｏｎｅ，ｂｅｌｏｎｇｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、第２７３巻、１６７２３−１６７２９頁。
Ｓｔａｎｆｏｒｄ，ＣＭ．、Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｐ．Ａ．、Ｅａｎｅｓ，Ｅ．Ｄ．、Ｌｅｍｂｋｅ，Ｌ．Ａ．、およびＭｉｄｕｒａ，Ｒ．Ｊ．（１９９５年）、「Ｒａｐｉｄｌｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ａｐａｔｉｔｉｃ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｉｎ  ａｎ  ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ（ＵＭＲ  １０６−０１  ＢＳＰ）」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、第２７０巻、９４２０−９４２８頁。
Ｓｖｅｎｓｓｏｎ，Ｌ、Ａｓｚｏｄｉ，Ａ．、Ｒｅｉｎｈｏｌｔ，Ｆ．Ｐ．、Ｆａｓｓｌｅｒ，Ｒ．、Ｈｅｉｎｅｇａｒｄ，Ｄ．、およびＯｌｄｂｅｒｇ，Ａ．（１９９９年）、「Ｆｉｂｒｏｍｏｄｕｌｉｎ−ｎｕｌｌ  ｍｉｃｅ  ｈａｖｅ  ａｂｎｏｒｍａｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｆｉｂｒｉｌｓ，ｔｉｓｓｕｅ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、およびａｌｔｅｒｅｄ  ｌｕｍｉｃａｎ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｅｎｄｏｎ」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、第２７４巻、９６３６−９６４７頁。
Ｔａｉｐａｌｅ，Ｊ．、およびＢｅａｃｈｙ，Ｐ．Ａ．（２００１年）、「Ｔｈｅ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ａｎｄ  Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ」、Ｎａｔｕｒｅ、第４１１巻、３４９−３５４頁。
Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｙ．、Ｋｏｄａｍａ，Ｙ．、およびＭａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｔ．（１９９４年）、「Ｂｏｎｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｄｅｃｏｒｉｎ  ｂｉｎｄｓ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｉｔｓ  ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、第２６９巻、３２６３４−３２６３８頁。
Ｔｓｕｋｉｔａ，Ｓ．、Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｙ．、Ｋａｔｓｕｎｏ，Ｔ．、およびＴａｍｕｒａ，Ａ．（２００８年）、「Ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ」、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第２７巻、６９３０−６９３８頁。
Ｖａｚｑｕｅｚ，Ａ．、Ｂｏｎｄ，Ｅ．Ｅ．、Ｌｅｖｉｎｅ，Ａ．Ｊ．、およびＢｏｎｄ，Ｇ．Ｌ（２００８年）、「Ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐ５３  ｐａｔｈｗａｙ，ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ、第７巻、９７９−９８７頁。
Ｖｏｇｅｌ，Ｋ．Ｇ．、Ｐａｕｌｓｓｏｎ，Ｍ．、およびＨｅｉｎｅｇａｒｄ，Ｄ．（１９８４年）、「Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ａｎｄ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｆｉｂｒｉｌｌｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｍａｌｌ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｏｆ  ｔｅｎｄｏｎ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ、第２２３巻、５８７−５９７頁。
Ｖｕｉｌｌｅｒｍｏｚ，Ｂ．、Ｋｈｏｒｕｚｈｅｎｋｏ，Ａ．、Ｄ’Ｏｎｏｆｒｉｏ，Ｍ．Ｆ．、Ｒａｍｏｎｔ，Ｌ、Ｖｅｎｔｅｏ，Ｌ、Ｐｅｒｒｅａｕ，Ｃ、Ａｎｔｏｎｉｃｅｌｌｉ，Ｆ．、Ｍａｑｕａｒｔ，Ｆ．Ｘ．、およびＷｅｇｒｏｗｓｋｉ，Ｙ．（２００４年）、「Ｔｈｅ  ｓｍａｌｌ  ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｌｕｍｉｃａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ」、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ、第２９６巻、２９４−３０６頁。
Ｗａｌｌａｒｄ，Ｍ．Ｊ．、Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｃ．Ｊ．、Ｖｅｅｒａｋｕｍａｒａｓｉｖａｍ，Ａ．、Ｂｕｒｔｔ，Ｇ．、Ｍｉｌｌｓ，Ｉ．Ｇ．、Ｗａｒｒｅｎ，Ａ．、Ｌｅｕｎｇ，Ｈ．Ｙ．、Ｍｕｒｐｈｙ，Ｇ．、Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｄ．Ｒ．、Ｎｅａｌ，Ｄ．Ｅ．ら（２００６年）、「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  プロファイリング  ａｎｄ  ｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ｉｎ  ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ」、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、第９４巻、５６９−５７７頁。
Ｗｅｂｅｒ，Ｃ．Ｋ．、Ｓｏｍｍｅｒ，Ｇ．、Ｍｉｃｈｌ，Ｐ．、Ｆｅｎｓｔｅｒｅｒ，Ｈ．、Ｗｅｉｍｅｒ，Ｍ．、Ｇａｎｓａｕｇｅ，Ｆ．、Ｌｅｄｅｒ，Ｇ．、Ａｄｌｅｒ，Ｇ．、およびＧｒｅｓｓ，Ｔ．Ｍ．（２００１年）、「Ｂｉｇｌｙｃａｎ  ｉｓ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｇ１−ａｒｒｅｓｔ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ」、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、第１２１巻、６５７−６６７頁。
Ｙｕ，Ｊ．、およびＺｈａｎｇ，Ｌ．（２００４年）、「Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ」、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、第１６巻、１９−２４頁。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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