(57)【要約】  ターゲット組換えポリペプチドを産生するためのプロセスを提供する。該プロセスは、ターゲットポリペプチドをコードする発現カセットを発現させ、そしてミトコンドリア・フォルダーゼをコードする発現カセットを同時発現する工程を含む。好ましいミトコンドリア・フォルダーゼには、Ｍｉａ４０およびＥｒｖ１、ならびにその相同体が含まれる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターゲット組換えポリペプチドの産生プロセスであって、ターゲットポリペプチドをコードする発現カセットを発現させ、そしてミトコンドリア・フォルダーゼをコードする発現カセットを同時発現する工程を含む、前記プロセス。
【請求項２】
ミトコンドリア・フォルダーゼがＭｉａ４０ファミリーのメンバーを含む、請求項１記載のプロセス。
【請求項３】
２つまたはそれより多い、好ましくは２つのミトコンドリア・フォルダーゼの発現カセットを同時発現させる、先行する請求項いずれか記載のプロセス。
【請求項４】
ミトコンドリア・フォルダーゼがＭｉａ４０ファミリーのメンバーおよびｅｒｖ１またはｅｒｖ２ファミリーのメンバーを含む、請求項３記載のプロセス。
【請求項５】
ターゲットポリペプチドをコードする発現カセットおよびミトコンドリア・フォルダーゼをコードする発現カセットが、異なるベクター上に位置する、先行する請求項いずれか記載のプロセス。
【請求項６】
ターゲットポリペプチドをコードする発現カセットおよびミトコンドリア・フォルダーゼをコードする発現カセットが、同じベクター上に位置する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項７】
ミトコンドリア・フォルダーゼを分泌リーダーとともに発現させる、先行する請求項いずれか記載のプロセス。
【請求項８】
ミトコンドリア・フォルダーゼを、可溶性融合パートナー、好ましくはチオレドキシンとともに発現させる、先行する請求項いずれか記載のプロセス。
【請求項９】
ターゲットポリペプチドをコードする発現カセットおよびミトコンドリア・フォルダーゼをコードする発現カセットを含む、タンパク質発現系。
【請求項１０】
ミトコンドリア・フォルダーゼがＭｉａ４０ファミリーのメンバーを含む、請求項９記載のタンパク質発現系。
【請求項１１】
２つまたはそれより多い、好ましくは２つのミトコンドリア・フォルダーゼの発現カセットを同時発現させる、請求項９または１０記載のタンパク質発現系。
【請求項１２】
ミトコンドリア・フォルダーゼを分泌リーダーとともに発現させる、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質発現系。
【請求項１３】
ミトコンドリア・フォルダーゼを、可溶性融合パートナー、好ましくはチオレドキシンとともに発現させる、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のタンパク質発現系。
【請求項１４】
ミトコンドリア・フォルダーゼをコードする発現カセットを含む、ベクター。
【請求項１５】
ミトコンドリア・フォルダーゼがＭｉａ４０ファミリーのメンバーを含む、請求項１４記載のベクター。
【請求項１６】
２つまたはそれより多い、好ましくは２つのミトコンドリア・フォルダーゼの発現カセットを含む、請求項１４または１５記載のベクター。
【請求項１７】
ミトコンドリア・フォルダーゼの発現カセットがまた、分泌リーダーもコードする、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１８】
ミトコンドリア・フォルダーゼの発現カセットが、可溶性融合パートナー、好ましくはチオレドキシンもまたコードする、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１９】
請求項９〜１３のいずれか一項に記載のタンパク質発現系、または請求項１４〜１８のいずれか一項に記載のベクターで形質転換されている、宿主細胞。
【請求項２０】
宿主が大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）である、請求項１９記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えポリペプチドを発現するためのプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
組換え技術によるポリペプチドの製造は、特に宿主生物が大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）である場合、有効でそして多用途の方法であることが証明されてきている。宿主細胞によって産生される組換えポリペプチドは、例えば不溶性封入体として、細胞質中に保持されることも可能であるし、あるいは周辺質内にまたは細胞用の培地内に分泌されることも可能である。細胞質中にポリペプチドを保持することにはいくつかの利点があるが、こうしたポリペプチドは、しばしば、不活性型で発現される。したがって、活性を持つ、正しくフォールディングされた型にポリペプチドを変換するためには、複雑な再フォールディング法を使用しなければならない。周辺質または培地内に分泌されるタンパク質は、しばしば、正しい型に容易に変換され、そしてより高い収量でより容易に得られうる。
【０００３】
周辺質内への分泌増加を達成する方法は、当該技術分野に周知であり、そしてシグナルペプチド配列としても知られるいわゆる分泌リーダーの使用を含む。こうした分泌リーダーには、天然宿主細胞系、例えば大腸菌におけるｓｐＡ、ｐｈｏＡ、リボース結合タンパク質、ｐｅｌＢ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＴ、ｄｓｂＡ、ｔｏｒＡ、ｔｏｒＴ、およびｔｏｌＴリーダー、ならびにＷＯ  ２００９／１４７３８２に開示されるものなどの真核リーダー配列が含まれる。米国特許５，６３９，６３５は、ＤｓｂＡおよびＤｓｂＣタンパク質を使用して、分泌を改善し、そして組換えポリペプチドのフォールディングを訂正することも可能であることを開示する。組換えポリペプチドの分泌を促進するためのさらなる方法を同定することが依然として望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ  ２００９／１４７３８２
【特許文献２】米国特許５，６３９，６３５
【発明の概要】
【０００５】
本発明にしたがって、ターゲット組換えポリペプチドの産生プロセスであって、ターゲットポリペプチドをコードする発現カセットを発現させ、そしてミトコンドリア・フォルダーゼをコードする発現カセットを同時発現する工程を含む、前記プロセスを提供する。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
ミトコンドリア・フォルダーゼは、ジスルフィド結合の形成およびミトコンドリア膜間腔におけるタンパク質の正しいフォールディングにおいて機能するタンパク質のクラスである。本発明のプロセスにおいて使用可能なミトコンドリア・フォルダーゼには、ミトコンドリア・スルフィドリル・オキシダーゼが含まれる。使用可能なミトコンドリア・フォルダーゼには、昆虫および植物ミトコンドリア・フォルダーゼ、ならびに特に哺乳動物および酵母ミトコンドリア・フォルダーゼ、ならびに前述のいずれかの機能性断片が含まれる。ミトコンドリア・フォルダーゼの機能性断片には、一般的に、対応する参照フォルダーゼのスルフィドリル・オキシダーゼ・ドメイン断片またはスルフィドリル・オキシダーゼ活性を有するその相同体が含まれる。例えば、酵母ミトコンドリア・フォルダーゼは、一般的に、ミトコンドリア膜に活性モチーフを係留するように働く配列を含む。本発明において、酵母ミトコンドリア・フォルダーゼは、存在するアンカー配列とともに使用してもよいし、またはアンカー配列は省かれてもよい。
【０００７】
ミトコンドリア・フォルダーゼの例は、Ｍｉａ４０ファミリーのメンバーおよびその相同体、ならびにＥｒｖファミリーのメンバー、特にＥｒｖ１およびＥｒｖ２ファミリーおよびその相同体である。
【０００８】
使用可能なＭｉａ４０ファミリーのメンバーには、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、イヌ（Ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）、ウマ（Ｅｑｕｕｓ  ｃａｂｂａｌｕｓ）、チャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、アメリカムラサキウニ（Ｓｔｒｏｇｙｌｏｃｅｎｔｒａｔｕｓ  ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ）、セイヨウミツバチ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、アカイエカ（Ｃｕｌｅｘ  ｐｉｐｉｅｎｓ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｓａ  ｃｒａｓｓａ）、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・クラバツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ）、アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｒｎｉｇａｔｕｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、アシュビア・ゴシピル（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｌ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、オストレオコッカス・タウリ（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｔａｕｒｉ）、コットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）およびキイロタマホコリカビ（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）由来のＭｉａ４０の相同体が含まれ、好ましくはヒトおよびサッカロミセス・セレビシエのものである。特定の態様において、使用可能なＭｉａ４０の相同体は、以下の配列番号１と、４０％より高い、しばしば５０％より高い、一般的に６０％より高い相同性、好ましくは８０％より高い相同性、最も好ましくは９０％より高い、特に９５％より高い相同性を有する。Ｍｉａ４０の好ましい相同体は、配列番号１を有するヒト・コイルドコイルヘリックスコイルドコイルヘリックスドメイン含有タンパク質−４（ＣＨＣＨＤ−４）である。
【０００９】
使用可能なＥｒｖファミリーのメンバーには、酵母、哺乳動物、昆虫および植物由来のＥｒｖ１およびＥｒｖ２の相同体が含まれる。使用可能なｅｒｖファミリーのメンバーには、ゼブラフィッシュ、アフリカツメガエル、ニワトリ、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ウマ、チャイニーズハムスター、アメリカムラサキウニ、セイヨウミツバチ、キイロショウジョウバエ、アカイエカ、アカパンカビ、クロコウジカビ、アスペルギルス・クラバツス、アスペルギルス・フミガツス、サッカロミセス・セレビシエ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ、アシュビア・ゴシピル、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ピキア・パストリス、ハンゼヌラ・ポリモルファ、オストレオコッカス・タウリ、コットンウッド、シロイヌナズナ、キイロタマホコリカビ、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓａｍ）、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）、タルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｔｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｕｒ）およびトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）由来のものが含まれ、好ましくはヒトおよびサッカロミセス・セレビシエのものである。
【００１０】
特定の態様において、Ｅｒｖ、例えばＥｒｖ１およびＥｒｖ２の相同体は、酸化還元中心、２つのアミノ酸によって分離されたシステイン対（−ＣＸＸＣ−モチーフ）および１６アミノ酸によって分離されたシステイン対（Ｃ−１６−Ｃモチーフ）およびフラビン・アデニン・ジヌクレオチド（ＦＡＤ）結合部位を含むスルフィドリル・オキシダーゼ領域を含む。
【００１１】
いくつかの好ましい態様において、配列番号６のアミノ酸７４〜１７３と、少なくとも４０％の相同性、好ましくは８０％より高い相同性、最も好ましくは９０％より高い、特に９５％より高い相同性を有するスルフィドリル・オキシダーゼ領域を含むＥｒｖ１相同体を使用する。
【００１２】
いくつかの態様において、使用可能なＥｒｖ１の相同体は、以下の配列番号６と、４０％より高い、しばしば５０％より高い、一般的に６０％より高い相同性、好ましくは８０％より高い相同性、最も好ましくは９０％より高い、特に９５％より高い相同性を有する。Ｅｒｖ１の好ましい相同体は、配列番号６を有するヒト肝再生タンパク質増強因子（ＡＬＲＰ）である。
【００１３】
特定の態様において、使用するミトコンドリア・フォルダーゼは、酸化還元中心、２つのアミノ酸によって分離されたシステイン対（−ＣＸＸＣ−モチーフ）および１６アミノ酸によって分離されたシステイン対（Ｃ−１６−Ｃモチーフ）およびＦＡＤ結合部位を含む、ｅｒｖ１またはｅｒｖ２、特に植物、酵母またはヒトｅｒｖ１またはｅｒｖ２の機能性断片、例えば８０〜１２０アミノ酸、一般的に９０〜１１０アミノ酸、そして特に約１００アミノ酸を含む断片である。
【００１４】
１またはそれより多いミトコンドリア・フォルダーゼは、ターゲットポリペプチド、好ましくは２またはそれより多く、そして特にＭｉａ４０ファミリーのメンバーおよびｅｒｖ１またはｅｒｖ２ファミリーのメンバーであるターゲットポリペプチドと同時発現されてもよい。
【００１５】
多くの好ましい態様において、ミトコンドリア・フォルダーゼを、好ましくはフォルダーゼのＮ末端側に付着した、分泌リーダーとともに発現させる。特定の態様において、フォルダーゼは、Ｎ末端タグと、該タグに、好ましくは該タグのＮ末端側で付着した分泌リーダーを含む。使用可能な配列リーダーの例には、大腸菌におけるｓｐＡ、ｐｈｏＡ、リボース結合タンパク質、ｐｅｌＢ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＴ、ｄｓｂＡ、ｔｏｒＡ、ｔｏｒＴ、およびｔｏｌＴリーダー、ならびにＷＯ  ２００９／１４７３８２に開示される配列番号１、２、３、４および５などの真核リーダー配列が含まれる。２またはそれより多いフォルダーゼを発現させる場合、使用される配列リーダーは、同じであってもまたは異なってもよい。配列リーダーおよびフォルダーゼの組み合わせは、一般的に、当業者に周知の方法によって組み合わせをスクリーニングし、そして所望の特性を提供する組み合わせを選択することによって同定される。使用される分泌リーダーは、フォルダーゼの周辺質へのトランスファーを達成する。
【００１６】
特定の態様において、ミトコンドリア・フォルダーゼ、特にＭｉａ４０ファミリーのメンバーを、周辺質におけるフォルダーゼの可溶性を増加させる可溶性融合パートナーとともに発現させる。可溶性融合パートナーの例は、当該技術分野に周知である。好ましい可溶性融合パートナーは、活性または不活性型のいずれでも使用可能なチオレドキシンである。
【００１７】
ミトコンドリア・フォルダーゼおよびターゲットポリペプチドの発現は、恒常性または誘導性のいずれであってもよいプロモーターの調節下にある。特定の態様において、ミトコンドリア・フォルダーゼの発現は恒常性プロモーターの調節下にあり、そしてターゲットポリペプチドの発現は誘導性プロモーターの調節下にある。他の態様において、ミトコンドリア・フォルダーゼおよびターゲットポリペプチドの両方の発現は、誘導性プロモーターの調節下にある。これらの態様において、誘導性プロモーターは、同じ誘導因子によって、または異なる誘導因子によって、調節されていてもよい。誘導性プロモーターが同じであってもまたは異なってもよいことが認識されるであろう。いくつかの態様において、ミトコンドリア・フォルダーゼおよびターゲットポリペプチドは、単一のプロモーター、好ましくは誘導性プロモーターの調節下にある。
【００１８】
２またはそれより多いミトコンドリア・フォルダーゼを同時発現させる場合、各フォルダーゼとともに、同じタイプのプロモーターまたは異なるプロモーターを使用してもよい。各フォルダーゼの発現は、望ましい場合、単一のプロモーターの調節下にあってもよい。
【００１９】
多くの好ましい態様において、プロモーターは原核プロモーターである。使用可能な原核プロモーターの例には：
ａ）ファージＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーター、特にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーター系、好ましくは単一のＴ７プロモーター、本明細書に援用されるＳｔｕｄｉｅｒおよびＭｏｆｆａｔ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １８９：１１３−１３０（１９８６）に開示されるものを含む、特にＴ７遺伝子１０プロモーター；および
ｂ）宿主ＲＮＡポリメラーゼに基づくプロモーター系、特に大腸菌ＲＮＡポリメラーゼに基づくプロモーター系
が含まれる。
【００２０】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ依存性プロモーター系を使用する場合、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの供給源が必要であり、これは、当該技術分野に知られる方法によって提供され、そして一般的に、必要なファージポリメラーゼを発現するλＤＥ３プロファージを宿主株内に挿入して、溶原性宿主株を生成することによる。また、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を所持する特殊化λ形質導入ファージに感染させることによって、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを細胞に送達してもよい。
【００２１】
本発明の側面において使用可能な恒常性プロモーターの例には、Ｔ７Ａ１、Ｔ７Ａ２、Ｔ７Ａ３、ｓｐｃリボソームタンパク質オペロンプロモーター、β−ラクタマーゼ遺伝子プロモーター、ファージλのＰＬプロモーター、複製調節プロモーターＰＲＮＡＩおよびＰＲＮＡＩＩ、ｒｒｎＢリボソームＲＮＡオペロンのＰ１およびＰ２プロモーター、Ｌａｃリプレッサータンパク質プロモーターｐＬａｃＩ、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）および形質膜Ｈ（＋）−ＡＴＰアーゼ（ＰＭＡ１）プロモーター、接合因子（ＭＦ）−αプロモーター、ＫＥＸ２、ＴＥＦ−１、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、およびヒトβ−アクチンプロモーターが含まれる。恒常性プロモーターのさらなる例には、調節領域を除去するように修飾されている誘導性プロモーター、例えばｌａｃまたはｔａｃオペレーターを除去するように修飾されたｌａｃまたはｔａｃプロモーターが含まれる。
【００２２】
使用可能な誘導性プロモーターの例には、ｌａｃ、ｌａｃＵＶ５、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｐｈｏＡ、アラビノース誘導性プロモーター、温度誘導性プロモーター（高温および低温両方）、銅誘導性プロモーター、ｕｓｐＡ、ｕｓｐＢ、ｍａｌＫ、浸透圧誘導性プロモーター、ガラクトース誘導性プロモーター、フェロモン誘導性プロモーター、グルコアミラーゼ・プロモーター、テトラサイクリン反応性プロモーター、ヒトｃ−ｆｏｓプロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、およびグルココルチコイド誘導性プロモーターが含まれる。
【００２３】
プロモーターは、一般的に、宿主細胞において有効であることが知られるプロモーターから選択されると認識される。例えば、大腸菌プロモーターは、一般的に、大腸菌宿主細胞において使用される。
【００２４】
恒常性または誘導性型のいずれかで使用される、好ましいプロモーターの例には、Ｔ７遺伝子１０プロモーター、Ｔ７Ａ１、Ｔ７Ａ２、Ｔ７Ａ３、lｐＬ、lｐＲ、ｌａｃ、ｌａｃＵＶ５、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ａｒａ、ｐｈｏＡおよびｒｒｎＢが含まれる。最も好ましいプロモーターは、lｐＬ、ｌａｃおよびｔａｃである。
【００２５】
本発明のプロセスにおいて使用される発現カセットは、発現ベクター内に含まれる。発現ベクターは宿主細胞ゲノム内に組み込まれてもよいが、好ましくは、染色体外要素、例えばプラスミド内に含まれる。あるいは、発現ベクターは、ファージまたはウイルスベクター内に組み込まれ、そしてこれらを用いて、宿主細胞系内に発現系を送達してもよい。発現ベクターは、当該技術分野に知られる方法によって組立て可能である。
【００２６】
本発明の発現ベクターは、一般的に、プラスミドの形で使用される。プラスミドは染色体外プラスミドまたは組込みプラスミドであってもよく、好ましくは染色体外プラスミドである。
【００２７】
誘導性プロモーターを含む発現ベクターは、一般的に、オペレーター配列を含む。本発明記載のプロセスにおいて使用可能なオペレーター配列には、ｌａｃ、ｇａｌ、ｄｅｏおよびｇｌｎが含まれる。１またはそれより多い完全パリンドロームオペレーター配列を使用してもよい。いくつかの態様において、２つの完全パリンドロームオペレーター配列を使用し、最も好適には、１つのオペレーター配列はプロモーターの下流に位置し、そして１つのオペレーター配列はプロモーターの上流に位置する。２つのオペレーター系を使用する場合、オペレーター配列には、好ましくは、プロモーターの調節を最大にするためにスペースが置かれる。多くの態様において、スペースは８５〜１５０塩基対、置かれており、好ましくは９０〜１２６塩基対、置かれており、そして最も好ましくは９１または９２塩基対、置かれている。特定の態様において、オペレーター配列は、転写開始点と重なる。
【００２８】
オペレーター系は、一般的に、適切なリプレッサー配列とともに使用されることが認識されるであろう。リプレッサー配列は、リプレッサータンパク質を産生し、例えばｌａｃオペレーターと用いる場合はｌａｃＩ遺伝子配列である。他のｌａｃリプレッサー配列もまた使用可能であり、例えば、ｌａｃリプレッサータンパク質レベルを増加させるために、ｌａｃＩＱ配列を使用してもよい。リプレッサー配列は、宿主細胞ゲノムによって、またはさらなる適合プラスミドを使用することによってもまた、提供可能である。
【００２９】
発現ベクターは、特にベクターがプラスミドを含む際、典型的には、以下の１またはそれより多くも含む：選択可能マーカー、例えば抗生物質耐性を与える配列、およびｃｅｒ安定性配列。
【００３０】
本発明のプロセスで使用可能な宿主細胞は、原核宿主細胞である。原核細胞の例には、細菌細胞、例えば大腸菌、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｓｅｓｃｅｎｓ）、プチダ菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を含むグラム陰性細菌細胞、ならびに枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を含むグラム陽性細菌細胞が含まれる。好ましい宿主細胞は、細菌、特に腸内細菌科、特に大腸菌、および特にそのＢまたはＫ１２株である。
【００３１】
多くの特に好ましい態様において、ターゲットポリペプチドは、分泌リーダー、特に周辺質への分泌を達成する周辺質分泌リーダーとともに発現され、好ましくは該リーダーをポリペプチドのＮ末端側に付着させる。いくつかの態様において、ターゲットポリペプチドは、Ｎ末端タグと、該タグに、好ましくは該タグのＮ末端側に付着した分泌リーダーを含む。
【００３２】
使用可能な配列リーダーの例には、大腸菌におけるｓｐＡ、ｐｈｏＡ、リボース結合タンパク質、ｐｅｌＢ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＴ、ｄｓｂＡ、ｔｏｒＡ、ｔｏｒＴ、およびｔｏｌＴリーダー、ならびにＷＯ  ２００９／１４７３８２に開示される配列番号１、２、３、４および５などの真核リーダー配列が含まれる。使用される配列リーダーは、ミトコンドリア・フォルダーゼで使用される任意の配列リーダーと同じであってもまたは異なっていてもよい。
【００３３】
本発明のプロセスによって発現可能なポリペプチドには、療法タンパク質およびペプチドが含まれ、サイトカイン、増殖因子、抗体、抗体断片、免疫グロブリン様ポリペプチド、酵素、ワクチン、ペプチドホルモン、例えばインスリン、ケモカイン、受容体、受容体断片、キナーゼ、ホスファターゼ、イソメラーゼ、ヒドロリアーゼ、転写因子および融合ポリペプチドが含まれる。
【００３４】
発現させてもよい抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および生物学的活性を有する抗体断片が含まれ、上記いずれかの多価および／または多重特異性型が含まれる。
【００３５】
天然存在抗体は、典型的には、ジスルフィド結合によって相互連結された２つの同一の重（Ｈ）鎖および２つの同一の軽（Ｌ）鎖の４つのポリペプチド鎖を含む。各重鎖は、可変領域（ＶＨ）および定常領域（ＣＨ）を含み、ＣＨ領域は、天然型において、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、可変領域（ＶＬ）および１つのドメイン、ＣＬを含む定常領域を含む。
【００３６】
ＶＨおよびＶＬ領域は、より保存された、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超過変性領域に、さらに細区分可能である。ＶＨおよびＶＬは各々、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に、以下の順で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【００３７】
発現可能な抗体断片は、望ましい生物学的活性を有する、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）抗体の部分を含む。抗体断片には、一般的に、少なくとも１つの抗原結合部位が含まれる。抗体断片の例には：（ｉ）ＶＬ、ＣＬ、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有するＦａｂ断片；（ｉｉ）２つのＦａｂ誘導体間でジスルフィド架橋によって二価断片を形成可能な、ＣＨ１ドメインのＣ末端に１またはそれより多いシステイン残基を有するＦａｂ’断片などのＦａｂ誘導体；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有するＦｄ断片；（ｉｖ）ＣＨ１ドメインのＣ末端に１またはそれより多いシステイン残基を有するＦｄ誘導体などのＦｄ誘導体；（ｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインを有するＦｖ断片；（ｖｉ）ＶＬおよびＶＨドメインが共有結合している一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体などの一本鎖抗体分子；（ｖｉｉ）定常領域ドメインを含みまたは含まずに別の可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬドメインポリペプチド）に連結された、定常領域ドメインを含まないＶＨまたはＶＬドメインポリペプチド（例えばＶＨ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬ、またはＶＬ−ＶＬ）；（ｖｉｉｉ）ドメイン抗体断片、例えばＶＨドメイン、またはＶＬドメイン、およびＶＨまたはＶＬドメインいずれかの抗原結合断片、例えば単離ＣＤＲ領域からなる断片などのドメイン抗体断片；（ｉｘ）２つの抗原結合部位を含むいわゆる「ディアボディ」、例えば同じポリペプチド鎖中で、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；ならびに（ｘ）相補性軽鎖ポリペプチドとともに抗原結合領域の対を形成する、タンデムＦｄセグメント対を含むいわゆる直鎖抗体が含まれる。
【００３８】
調製可能な好ましい抗体断片は、哺乳動物単一可変ドメイン抗体であり、これは、免疫グロブリン可変ドメインに特徴的な配列を含み、そして抗原に特異的に結合し（すなわち５００ｎＭまたはそれ未満、例えば４００ｎＭまたはそれ未満、好ましくは２５０ｎＭまたはそれ未満、および最も好ましくは１００ｎＭまたはそれ未満の解離定数）、そして単一可変ドメインとして抗原に結合する；すなわちいかなる相補性可変ドメインも含まない、フォールディングされたポリペプチドドメインを含む、抗体断片である。単一可変ドメイン抗体には、完全抗体可変ドメイン、ならびに修飾可変ドメイン、例えば抗体可変ドメインに特徴的でない配列によって１またはそれより多いループが置換されているもの、あるいは一部切除されている（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）か、またはＮもしくはＣ末端伸長を含む抗体可変ドメイン、ならびに可変ドメインのフォールディングされた断片が含まれる。調製可能な好ましい単一可変ドメインは、ＶＨおよびＶＬの群より選択され、ＶカッパおよびＶラムダを含む。最も好ましくは、単一可変ドメインは、ヒトまたはラクダ科（ｃａｍｅｌｉｄ）ドメインであり、ヒト化ラクダ科ドメインを含む。
【００３９】
ターゲットポリペプチドが、分泌される２またはそれより多い鎖を含む場合、特に、ターゲットポリペプチドが、２またはそれより多い鎖を含む断片抗体である場合、鎖の各々は、分泌リーダーに付着することも可能であり、そしてこうしたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをこれにしたがって設計する。使用される分泌リーダは同じであってもまたは異なってもよい。
【００４０】
発現系を、使用される細胞に関して、当該技術分野に周知の方法によって発現させる。好ましい発現法は、特に発酵によって、増殖培地中で宿主細胞を培養し、そして次いで発現されたポリペプチドを回収する工程を含む。用語「増殖培地」は、宿主細胞が増殖するために用いられる栄養培地を指す。多くの態様において、栄養液を使用する。所定の宿主細胞用の適切な増殖培地およびポリペプチドを回収する方法が、当該技術分野に周知である。
【００４１】
誘導性プロモーターを使用する場合、発現は、こうしたプロモーターに適した誘導因子、例えばイソプロピル−β−Ｄ−１チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、ＩＰＴＧの類似体、例えばイソブチル−Ｃ−ガラクトシド（ＩＢＣＧ）、ラクトースまたはメリビオースを添加することによって誘導可能である。他の誘導剤を用いてもよく、そしてこれらは、別の箇所により詳細に記載される（例えば、Ｔｈｅ  Ｏｐｅｒｏｎ，  ＭｉｌｌｅｒおよびＲｅｎｚｎｉｋｏｆｆ監修（１９７８）を参照されたい）。誘導因子は、個々にまたは組み合わせて使用してもよい。
【００４２】
本発明のプロセスによって産生されるポリペプチドは、望ましい場合、さらなる精製工程、例えば、イオン交換クロマトグラフィー；疎水性に基づくクロマトグラフィー、例えばＨＩＣ、逆相クロマトグラフィー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー、または混合様式クロマトグラフィー：あるいはサイズに基づく精製、例えばゲルろ過の１またはそれより多くに供してもよい。また、産生されるポリペプチドを１またはそれより多い再フォールディング工程に供してもよい。
【００４３】
ミトコンドリア・フォルダーゼおよびターゲットポリペプチドの同時発現に関して上述されるような発現カセットを含むタンパク質発現系は、本発明の別の側面を形成する。こうしたタンパク質発現系で形質転換された宿主細胞は、本発明のさらなる側面を形成する。ミトコンドリア・フォルダーゼの発現カセットを含むベクターは、本発明のさらに別の側面を含む。
【００４４】
本発明は以下の実施例によって、限定なしに例示される。
ポリペプチド、ベクターおよび株の要約
【００４５】
【表１】
2013544087.tif 000002
【実施例】
【００４６】
ｐＡＶＥ３５４の構築
ｐＡＶＥ３５４構築のための出発プラスミドは、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号７１１４７−３）であった。ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩでの消化によって、このベクターからＴ７プロモーターおよびマルチクローニングサイトを除去した。これらを、国際特許出願ＷＯ  ２００７／０８８３７１に記載されるように調製されたｐＡＶＥ０２９のＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ断片で置き換えた。生じたプラスミドをＮＢＪ０７３８−７−３と称し、そして制限消化および配列決定によって確認した。
【００４７】
ミトコンドリア・フォルダーゼ・ヒト・コイルドコイルヘリックスコイルドコイルヘリックスドメイン含有タンパク質−４（ＣＨＣＨＤ−４）タンパク質（Ｍｉａ４０ファミリーポリペプチド）のタンパク質配列を、Ｇｅｎｂａｎｋ、寄託番号ＡＡＨ３３７７５．１から得た（配列番号１：  ＳＹＡＲＱＥＧＫＤＲＩＩＦＶＴＫＥＤＨＥＴＰＳＳＡＥＬＶＡＤＤＰＮＤＰＹＥＥＨＧＬＩＬＰＮＧＮＩＮＷＮＣＰＣＬＧ  ＧＭＡＳＧＰＣＧＥＱＦＫＳＡＦＳＣＦＨＹＳＴＥＥＩＫＧＳＤＣＶＤＱＦＲＡＭＱＥＣＭＱＫＹＰＤＬＹＰＱＥＤＥＤＥＥＥＥＲＥＫＫＰＡＥＱＡＥＥＴＡＰＩＥＡＴＡＴＫＥＥＥＧＳＳ）。分泌リーダー（配列番号２：  ＭＫＶＳＴＡＦＬＣＬＬＬＴＶＳＡＦＳＡＱＶＬＡ）を含む融合タンパク質を設計した。これを、大腸菌チオレドキシンＡ（ＴｒｘＡ：  Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＡＡ６７５８２．１（配列番号３  ＩＩＨＬＴＤＤＳＦＤＴＤＶＬＫＡＤＧＡＩＬＶＤＦＷＡＥＷＳＧＰＳＫＭＩＡＰＩＬＤＥＩＡＤＥＹＱＧＫＬＴＶＡＫＬＮＩＤＱＮＰＧＴＡＰＫＹＧＩＲＧＩＰＴＬＬＬＦＫＮＧＥＶＡＡＴＫＶＧＡＬＳＫＧＱＬＫＥＦＬＤＡＮＬＡ）のＮ末端側で、タグ（ＤＹＫＤＥＤＫ−配列番号１６）を通じて付着させた。チオレドキシン活性部位５１ＣＧＰＣ５４を５１ＳＧＰＳ５４に変化させた。チオレドキシンＣ末端をＣＨＣＨＤ−４のＮ末端側に融合させ、これもまた突然変異させて、３位の非触媒システイン残基を除去し、そしてこれをセリン残基で置換した。リーダーを含むこの融合タンパク質のタンパク質配列を配列番号４に示す。
【００４８】
配列番号４
【００４９】
【化１】
2013544087.tif 000003
【００５０】
このタンパク質をコードする、配列番号５の遺伝子を、ＮＢＪ０７３８−７−３のＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位にクローニングし、そして制限消化および配列決定によって確認した。
【００５１】
配列番号５
【００５２】
【化２】
2013544087.tif 000004
【００５３】
ミトコンドリア・フォルダーゼ・ヒト肝再生タンパク質増強因子（ＡＬＲＰ、Ｅｒｖ１ファミリーポリペプチド）のタンパク質配列をＧｅｎｂａｎｋ寄託番号ＥＡＷ８５５８０．１から得た（配列番号６：  ＡＡＰＧＥＲＧＲＦＨＧＧＮＬＦＦＬＰＧＧ  ＡＲＳＥＭＭＤＤＬＡＴＤＡＲＧＲＧＡＧＲＲＤＡＡＡＳＡＳＴＰＡＱＡＰＴＳＤＳＰＶＡＥＤＡＳＲＲＲＰＣＲＡＣＶＤＦＫＴＷＭＲＴＱＱＫＲＤＴＫＦＲＥＤＣＰＰＤＲＥＥＬＧＲＨＳＷＡＶＬＨＴＬＡＡＹＹＰＤＬＰＴＰＥＱＱＱＤＭＡＱＦＩＨＬＦＳＫＦＹＰＣＥＥＣＡＥＤＬＲＫＲＬＣＲＮＨＰＤＴＲＴＲＡＣＦＴＱＷＬＣＨＬＨＮＥＶＮＲＫＬＧＫＰＤＦＤＣＳＫＶＤＥＲＷＲＤＧＷＫＤＧＳＣＤ）。ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ−配列番号１７）を通じて、これを、Ｎ末端側で、配列番号２の分泌リーダーに付着させた。リーダーを含むこの融合タンパク質のタンパク質配列を配列番号７に示す。
【００５４】
配列番号７
【００５５】
【化３】
2013544087.tif 000005
【００５６】
配列番号７をコードする遺伝子を、オペレーター配列を含まない大腸菌Ｌａｃプロモーター、および大腸菌における発現のために最適化されたＡＬＲＰ遺伝子コドンからなる配列、配列番号８を用いて合成した。これを、ＮＢＪ０７８−１８−３のＨｐａＩ部位内にＥｃｏＲＶ断片としてクローニングして、ｐＡＶＥ０３５４を作製し、そして制限消化および配列決定によって確認した。
【００５７】
配列番号８
【００５８】
【化４】
2013544087.tif 000006
【００５９】
ＣＬＤ３３１およびＣＬＤ４２０の構築
ｐＡＶＥ３１４の生成のための出発ベクターは、ＷＯ２００７／０８８３７１に記載されるように調製されたｐＡＶＥ０２９であった。ＬａｍＢリーダーを含むＩＧＦ−１の遺伝子をＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ断片として合成した。以下の配列番号９を参照されたい。これをｐＡＶＥ０２９  ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位内にクローニングした。最初のスクリーニングは、プラスミドＤＮＡの制限消化によった。次いで、配列決定によって配列を確認した。生じたプラスミドをｐＡＶＥ３１４と名付けた。
【００６０】
発現プラスミドｐＡＶＥ３１４を大腸菌株Ｗ３１１０に形質転換して、ＣＬＤ３３１を作製した。次いで、発現プラスミドｐＡＶＥ３５４をＣＬＤ３３１に形質転換して、ＣＬＤ４２０を作製した。生じた組換え株を精製し、そしてグリセロールストック中で−８０℃に維持した。
【００６１】
配列番号９
【００６２】
【化５】
2013544087.tif 000007
【００６３】
ＣＬＤ４２９およびＣＬＤ４３３の構築
ｐＡＶＥ３５６の生成のための出発ベクターは、ｐＡＶＥ０２９であった。ＯｍｐＡリーダーを含むヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の遺伝子をＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ断片として合成した。以下の配列番号１０を参照されたい。これをｐＡＶＥ０２９  ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位内にクローニングした。最初のスクリーニングは、プラスミドＤＮＡの制限消化によった。次いで、配列決定によって配列を確認した。生じたプラスミドをｐＡＶＥ３５６と名付けた。
【００６４】
配列番号１０
【００６５】
【化６】
2013544087.tif 000008
【００６６】
発現プラスミドｐＡＶＥ３５６をＷ３１１０に形質転換して、ＣＬＤ４２９を作製した。次いで、発現プラスミドｐＡＶＥ３５４をＣＬＤ４２９に形質転換して、ＣＬＤ４３３を作製した。生じた組換え株を精製し、そしてグリセロールストック中で−８０℃に維持した。
【００６７】
ＣＬＤ０４８およびＣＬＤ４２６の構築
株ＣＬＤ０４８をＷＯ  ２００７／０８８３７１に記載されるように調製した。
次いで、発現プラスミドｐＡＶＥ３５４をＣＬＤ０４８に形質転換して、ＣＬＤ４２６を作製した。生じた組換え株を精製し、そしてグリセロールストック中で−８０℃に維持した。
【００６８】
ＣＬＤ４３０およびＣＬＤ４２８の構築
ｐＡＶＥ１５７の生成のための出発ベクターは、ｐＡＶＥ０２９である。Ａ５Ｂ７  Ｆａｂの遺伝子をＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ断片として合成した。以下の配列番号１１を参照されたい。これをｐＡＶＥ０２９  ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位内にクローニングした。最初のスクリーニングは、プラスミドＤＮＡの制限消化によった。次いで、配列決定によって配列を確認した。生じたプラスミドをｐＡＶＥ１５７と名付けた。
【００６９】
配列番号１１
【００７０】
【化７】
2013544087.tif 000009
【００７１】
発現プラスミドｐＡＶＥ１５７をＷ３１１０に形質転換して、ＣＬＤ４３０を作製した。次いで、発現プラスミドｐＡＶＥ３５４をＣＬＤ４３０に形質転換して、ＣＬＤ４２８を作製した。生じた組換え株を精製し、そしてグリセロールストック中で−８０℃に維持した。
【００７２】
ＣＬＤ４５３およびＣＬＤ４５４の構築
ｐＡＶＥ３６６の生成のための出発ベクターは、ｐＡＶＥ０２９であった。ＯｍｐＡリーダーを含むＦＧＦ２１の遺伝子をＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ断片として合成した。以下の配列番号１２を参照されたい。これをｐＡＶＥ０２９  ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位内にクローニングした。最初のスクリーニングは、プラスミドＤＮＡの制限消化によった。次いで、配列決定によって配列を確認した。生じたプラスミドをｐＡＶＥ３６６と名付けた。
【００７３】
配列番号１２
【００７４】
【化８】
2013544087.tif 000010
【００７５】
発現プラスミドｐＡＶＥ３６６をＷ３１１０に形質転換して、ＣＬＤ４５３を作製した。次いで、発現プラスミドｐＡＶＥ３５４をＣＬＤ４５３に形質転換して、ＣＬＤ４５４を作製した。生じた組換え株を精製し、そしてグリセロールストック中で−８０℃に維持した。
【００７６】
ＣＬＤ４４２およびＣＬＤ４４３の構築
ｐＡＶＥ３６４の生成のための出発ベクターは、ｐＡＶＥ０２９であった。ＯｍｐＡリーダーを含むＲａｐＬＲの遺伝子をＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ断片として合成した。これをｐＡＶＥ０２９  ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位内にクローニングした。最初のスクリーニングは、プラスミドＤＮＡの制限消化によった。次いで、配列決定によって配列を確認した。生じたプラスミドをｐＡＶＥ３６４と名付けた。
【００７７】
発現プラスミドｐＡＶＥ３６４をＷ３１１０に形質転換して、ＣＬＤ４４２を作製した。次いで、発現プラスミドｐＡＶＥ３５４をＣＬＤ４４２に形質転換して、ＣＬＤ４４３を作製した。生じた組換え株を精製し、そしてグリセロールストック中で−８０℃に維持した。
【００７８】
ＲａｐＬＲ配列（配列番号１３）
【００７９】
【化９】
2013544087.tif 000011
【００８０】
ＣＬＤ４３８およびＣＬＤ４３９の構築
ｐＡＶＥ３６２の生成のための出発ベクターは、ｐＡＶＥ０２９であった。ＯｍｐＡリーダーを含むＥｌａｆｉｎの遺伝子をＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ断片として合成した。以下の配列番号１４を参照されたい。これをｐＡＶＥ０２９  ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位内にクローニングした。最初のスクリーニングは、プラスミドＤＮＡの制限消化によった。次いで、配列決定によって配列を確認した。生じたプラスミドをｐＡＶＥ３６２と名付けた。
【００８１】
配列番号１４
【００８２】
【化１０】
2013544087.tif 000012
【００８３】
発現プラスミドｐＡＶＥ３６２をＷ３１１０に形質転換して、ＣＬＤ４３８を作製した。次いで、発現プラスミドｐＡＶＥ３５４をＣＬＤ４３８に形質転換して、ＣＬＤ４３９を作製した。生じた組換え株を精製し、そしてグリセロールストック中で−８０℃に維持した。
【００８４】
ＣＬＤ４４０およびＣＬＤ４４１の構築
ｐＡＶＥ３６３の生成のための出発ベクターは、ｐＡＶＥ０２９であった。ＯｍｐＡリーダーを含むＭＩＣ６の遺伝子をＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ断片として合成した。以下の配列番号１５を参照されたい。これをｐＡＶＥ０２９  ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位内にクローニングした。最初のスクリーニングは、プラスミドＤＮＡの制限消化によった。次いで、配列決定によって配列を確認した。生じたプラスミドをｐＡＶＥ３６３と名付けた。
【００８５】
配列番号１５
【００８６】
【化１１】
2013544087.tif 000013
【００８７】
発現プラスミドｐＡＶＥ３６３をＷ３１１０に形質転換して、ＣＬＤ４４０を作製した。次いで、発現プラスミドｐＡＶＥ３５４をＣＬＤ４４０に形質転換して、ＣＬＤ４４１を作製した。生じた組換え株を精製し、そしてグリセロールストック中で−８０℃に維持した。
【００８８】
振盪フラスコ評価
テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）を補った５ｍｌルリア・ブロス（ＬＢ、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌトリプトン、および５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）内に、１０μｌの融解グリセロールストックを接種した。これを軌道振盪装置中、３７℃で１６時間インキュベーションした。次いで、この培養の５００μｌを用いて、５０ｍｌのルリア・ブロス（上述のような組成）を含有する２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに接種した。フラスコを、軌道振盪装置中、２００ｒｐｍ、３７℃でインキュベーションした。ＯＤ６００＝０．５＋／−０．１になるまで増殖を監視した。この時点で、フラスコを適切な濃度のＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）で誘導し、そして上記条件下で２２時間インキュベーションを続け、この間、増殖および産物蓄積の測定のために試料を採取した。
【００８９】
発酵評価
４５０μｌのグリセロールストックを、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、１０ｇ／Ｌグルコースおよび１５ｍｇ／Ｌテトラサイクリンを含有する４５０ｍＬのルリア・ブロス（ＬＢ）を含有する２．０Ｌ整流装置付き振盪フラスコに添加することによって、以下の結果中に記載するような株の発酵接種物を産生した。フォルダーゼを含まない株を培養する際には、クロラムフェニコールを添加しなかったが、フォルダーゼを含む株を培養する際には、３４ｍｇ／Ｌの濃度でクロラムフェニコールを含んだ。振盪装置−インキュベーター中、２００ｒｐｍの攪拌で、３７℃で１０時間接種物を増殖させた。２０ｍｌの振盪フラスコ接種物を用いて、フォルダーゼまたは酵母エキスを含まない株を培養した際には、酵母エキスおよびテトラサイクリンを補い、フォルダーゼを含む株を培養した際には、テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールを補って、４Ｌの最小グリセロールバッチ増殖培地を含有する５Ｌ作業体積発酵装置に接種した。以下に記載する操作条件下で発酵を行った。温度を３０℃の一定温度（ＩＧＦ−１株）に調節するか、または最初の７〜９時間は３７℃、次いで３０℃に低下させ、そして発酵の残りの時間、３０℃に調節した（他のすべて）。２５％（ｗ／ｖ）水酸化アンモニウムを自動的に添加することによって、ｐＨを７．０に調節した。溶解酸素圧（ｄＯＴ）セットポイントは、空気飽和の３０％であり、そして最低２５０ｒｐｍから最大１５００ｒｐｍの発酵装置スターラー速度および入口ガス流への酸素の補充の自動的な調整によって調節した。発酵容器への気流は、常に０．５ｖ／ｖ／分であった。
【００９０】
ｄＯＴの急激な上昇によって特徴付けられる炭素供給源（すなわちグリセロール）の枯渇まで、発酵をバッチ方式で行った。炭素供給源消耗時点で、グリセロール／硫酸アンモニウムフィードの添加によって、流加発酵を開始した。発酵におけるバイオマスレベルがＯＤ６００＝４５〜５５に到達したら、ＩＰＴＧを最終濃度２ｍＭ（ＩＧＦ−１）、０．１ｍＭ（ｈ−Ｇｈ）、または０．５ｍＭ  Ａ５−Ｂ７まで添加することによって、誘導を行った。誘導後、流加期を４０〜４８時間続けた（ＩＧＦ−１実行に関しては４０時間；残りは４８時間）。次いで、細胞および残った細胞不含増殖培地を採取した。採取した細胞をさらに、浸透圧ショック細胞分画に供して、可溶性大腸菌周辺質分画中に分配される、タンパク質含有細胞分画を単離した。
【００９１】
分析法
試料の全細胞溶解物のＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いて、振盪フラスコに関する集積レベルおよび発酵評価を行った。採取した細胞をさらに、浸透圧ショック細胞分画に供して、可溶性大腸菌周辺質分画中に分配される、タンパク質含有細胞分画を単離し、そしてＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いて、異なる分画中の集積レベルを決定した。ＯＳ１（浸透圧ショック）分画は、スクロース緩衝液中での洗浄後の上清であり、ＯＳ２分画は、低イオン強度緩衝液での洗浄後の上清であり、「上清／増殖」培地は、細胞不含残渣増殖培地であり、そして「細胞ペレット」は、浸透圧ショック分画後の細胞ペレットである。
【００９２】
精製された活性Ｄ１．３  Ｆａｂを用いて用意した標準曲線を参照することによって、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるリゾチーム（抗原）へのＤ１．３  Ｆａｂの結合を決定することにより、可溶性周辺質抽出物および残渣増殖培地中の生物学的活性Ｄ１．３  Ｆａｂの集積を概算した。
【００９３】
精製された活性Ｄ１．３  Ｆａｂを用いて用意した標準曲線を参照することによって、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるヒトＩｇＧ  Ｆａｂドメインに特異的な抗体へのＡ５Ｂ７  Ｆａｂの結合を決定することにより、可溶性周辺質抽出物および残渣増殖培地中の生物学的活性Ａ５Ｂ７  Ｆａｂの集積を概算した。
【００９４】
結果
株ＣＬＤ３３１および４２０
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロットによって、振盪フラスコ中、ＩＧＦ−１は、振盪フラスコおよび発酵の両方から、〜６ｋＤａのプロセシングされた産物として分泌されることが示され、分泌が成功したことが示された。
【００９５】
株ＣＬＤ４２９および４３３
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、振盪フラスコ中、ｈＧＨは、〜２２ｋＤａのプロセシングされた産物として分泌されることが示され、分泌が成功したことが示された。
【００９６】
株ＣＬＤ０４８および４３３
ＥＬＩＳＡ分析によって、振盪フラスコ中、同等の条件下で、Ｄ１．３は、フォルダーゼを含まない場合の３００μｇ／ｍｌに比較して、フォルダーゼを含むと６００μｇ／ｍｌで分泌されることが示された。これによって、フォルダーゼの発現は、活性産物収量の増加を導きうることが示された。
【００９７】
株ＣＬＤ４２８および４３０
ＥＬＩＳＡ分析によって、振盪フラスコ中、同等の条件下で、Ａ５Ｂ７は、フォルダーゼを含まない場合の１８ｎｇ／ｍｌ／ＯＤに比較して、フォルダーゼを含むと５４ｎｇ／ｍｌ／ＯＤで分泌されることが示された。
【００９８】
発酵装置において、Ａ５Ｂ７は、フォルダーゼを含まない場合の８７４μｇ／Ｌに比較して、フォルダーゼを含むと１３３５μｇ／Ｌで分泌された。
これらの結果は、フォルダーゼの発現が活性産物収量の増加を導きうることを示した。
【００９９】
株ＣＬＤ４５３および４５４
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロットによって、振盪フラスコ中、ＦＧＦ−２１は、〜２３ｋＤａのプロセシングされた産物として分泌されることが示され、分泌が成功したことが示された。
【０１００】
株ＣＬＤ４４２および４４３
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロットによって、振盪フラスコ中、ＲａｐＬＲ１は、〜１２ｋＤａのプロセシングされた産物として分泌されることが示され、分泌が成功したことが示された。
【０１０１】
株ＣＬＤ４３８および４３９
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロットによって、振盪フラスコ中、Ｅｌａｆｉｎは、フォルダーゼの存在下で、〜７ｋＤａのプロセシングされた産物として分泌されるが、フォルダーゼがないと、株中で検出不能であることが示された。これによって、フォルダーゼの発現は、産物分泌の増加を導きうることが示された。
【０１０２】
株ＣＬＤ４４０および４４１
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロットによって、振盪フラスコ中、ＭＩＣ６は、〜３９ｋＤａの産物として分泌されることが示され、分泌が成功したことが示された。
【配列表】
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【国際調査報告】
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