(57)【要約】  本発明はマイクロ操作ツールのサンプル担体に対する位置決めを顕微鏡を用いて無衝突で行う方法であり、ａ）第１開口数ＮＡ1を有する顕微鏡対物レンズの焦点をサンプル担体表面の少なくとも１つの点Ｐに合わせることにより当該点Ｐの焦点位置ＺPを求め、ｂ）マイクロ操作ツールを顕微鏡の光軸上に位置決めし、ｃ）マイクロ操作ツールの焦点位置ＺMを顕微鏡対物レンズ又は第１開口数ＮＡ1よりも小さな第２開口数ＮＡ2を有する第２顕微鏡対物レンズの焦点をマイクロ操作ツールの先端に合わせることにより求め、ｄ）所定の許容差プロファイルΔＺを考慮して降下距離ＺA（Ｐ）をＺA（Ｐ）＝ＺM−ＺP−ΔＺにより計算し、ここでΔＺ＝ΔＺM＋ΔＺP、ΔＺM、ΔＺPはそれぞれ操作ツール又はサンプル担体の位置を求めるときの所定の許容差であり、ｅ）マイクロ操作ツールを降下距離ＺA（Ｐ）だけ降下させて点Ｐに位置決めする。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡を用いてマイクロ操作ツールをサンプル担体に対して無衝突で位置決めする方法であって、
ａ）第１の開口数ＮＡ1を有する顕微鏡対物レンズの焦点を前記サンプル担体の表面の少なくとも１つの点Ｐに合わせることによって、当該少なくとも１つの点の焦点位置ＺPを求めるステップと、
ｂ）前記マイクロ操作ツールを前記顕微鏡の光軸上に位置決めするステップと、
ｃ）前記顕微鏡対物レンズの焦点を又は前記第１の開口数ＮＡ1よりも小さな第２の開口数ＮＡ2を有する第２の顕微鏡対物レンズの焦点を前記マイクロ操作ツールの先端に合わせることによって、前記マイクロ操作ツールの焦点位置ＺMを求めるステップと、
ｄ）所定の許容差プロファイルΔＺを考慮して、降下距離ＺA（Ｐ）を次の式
ＺA（Ｐ）＝ＺM−ＺP−ΔＺ
によって計算するステップであって、
ΔＺ＝ΔＺM＋ΔＺP
であり、ΔＺMは前記操作ツールの位置を求めるときの所定の許容差であり、ΔＺPは前記サンプル担体の位置を求めるときの所定の許容差である、ステップと、
ｅ）前記マイクロ操作ツールを前記降下距離ＺA（Ｐ）だけ降下させることによって前記点Ｐに位置決めするステップ
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ステップｅ）の前に、ｉ番目の顕微鏡対物レンズ（ｉ＞１又はｉ＞２）のそれぞれに対し、前記顕微鏡対物レンズの開口数を増大させながら（ＮＡi＞ＮＡi-1）前記ステップｃ）及びｄ）を繰り返す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記操作ツールの許容差ΔＺM及び／又は前記サンプル担体の許容差ΔＺPは、下記の式
2013524291.tif 000007
に従い、位置測定に使用する各ｉ番目の対物レンズの被写界深度ｄtief, iによって与えられ、ここで、λは観察光の波長であり、ｎは顕微鏡対物レンズとサンプル担体の間の媒質の屈折率であり、Ｍiはｉ番目の対物レンズの倍率であり、ｅは観察に使用されるビデオカメラの解像度である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ステップｅ）の前に、前記サンプル担体の表面における所定の複数の点Ｐj（ｊ＝１，２，．．．）に対して前記ステップａ）〜ｄ）を実行し、各点Ｐjについて降下距離ＺA（Ｐj）をデータベースに格納し、格納された降下距離ＺA（Ｐj）を考慮しながら、各点Ｐjに対して前記ステップｅ）を実行する、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記ステップｅ）の前に、前記サンプル担体の表面の直線上に並んでいない３つの点Ｐ1、Ｐ2、Ｐ3に対して前記ステップａ）〜ｃ）を実行し、求められた焦点位置ＺP1、ＺP2、ＺP3から平面の方程式Ｅ（Ｐ）を計算し、前記ステップｄ）において、前記サンプル担体の表面の任意の点Ｐjについて降下距離ＺA（Ｐj）をＺA（Ｐj）＝ＺM−Ｅ（Ｐj）−ΔＺにより計算する、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ステップｃ）において、前記焦点位置ＺMとして前記操作ツールの先端の位置を求める、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ステップｃ）において、以下のステップ、すなわち、
ｃ１）前記操作ツールの先端における第１の点Ｑ1に焦点を合わせることによって、前記第１の点Ｑ1の焦点位置ＺQ1を求めるステップと、
ｃ２）前記点Ｑ1の焦点位置ＺQ1と前記操作ツールの先端における第２の点Ｑ2の焦点位置ＺQ2とが等しくなるまで、前記操作ツールを前記操作ツールの軸を中心として回転させ、前記Ｑ1に焦点を合わせるために改めて顕微鏡対物レンズを調節するステップと、
ｃ３）前記操作ツールの先端における第３の点Ｑ3に焦点を合わせることによって、前記第３の点Ｑ3の焦点位置ＺQ3を求めるステップと、
ｃ４）前記焦点位置ＺQ1、ＺQ2及びＺQ3が等しくなるまで、前記サンプル担体の平面に平行な軸回りに前記操作ツールを傾斜させ、前記点Ｑ3に焦点を合わせるために改めて前記顕微鏡対物レンズを調節するステップと、
ｃ５）前記操作ツールの焦点位置をＺA＝ＺQ1に定めるステップ
を実行することによって前記操作ツールの捩れ角及び傾斜角を補償する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ステップａ）においてさらに、第１の顕微鏡対物レンズの焦点を載置容器の表面の点Ｒに合わせることによって前記点Ｒの焦点位置Ｚcapを求める、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプル担体の表面の点及び／又は前記載置容器の表面の点を、位置決めテーブルを用いて前記サンプル担体及び／又は前記載置容器をシフトさせることによって動かす、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記焦点位置の測定を光学式距離測定システムによって行う、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はマイクロ操作ツールを、特にマイクロ注入、単一細胞取得、マイクロ切開等のためのツールを無衝突で位置決めする方法に関する。
【０００２】
先行技術
純粋濃縮された細胞培養の分子分析、さらには単一細胞の分子分析は、薬理ゲノミクス及びプロテオミクスの重要な前提であり、将来的には患者の医療プロファイリングにとってさらに重要となる可能性がある。従来は、細胞操作（例えば細胞収集またはマイクロ注入）における機械的及びプロセス工学的な制限のせいで、このターゲットを達成することは困難であり、相当な時間的コストをかけずには達成できなかった。とりわけ、遺伝子型と表現型を特定するのに必要とされる、非常に小さなサンプルからの単一細胞及び希少細胞の分離は非常に難しい。というのも、研究員が単一細胞を顕微鏡下で検出し、検出された細胞を毛管を使って操作しなければならないからである。
【０００３】
細胞分離の自動化を、すなわち、特に単一細胞の収集の自動化を可能にするためには、対物レンズとサンプル担体の正確には平坦でも水平でもない表面とに起因するすべての許容差を考慮した上で、毛管の先端の正確な位置測定、すなわち、顕微鏡のサンプル担体に対するマニピュレータ先端のＸ，Ｙ及びＺ方向における位置測定が必要である。しかし従来は、マニピュレータ先端のＺ方向における実際位置を付加的な測定手段なしに十分小さな許容差で自動的に求めることは不可能であった。それゆえ、単一細胞又は粒子の収集は手動又は半自動でしか可能でなかった。もっとも、このプロセスを自動化する幾つかのアプローチは知られている。しかし、この従来から公知の方法では対物レンズの結像許容差が考慮されないため、マニピュレータ先端の損傷が発生する。それに対して手動較正法ではハンドリングツールが十分に正確でない場合が多く、非常に熟練したユーザしかこのシステムを使いこなすことができない。
【０００４】
例えばEP 0 292 899 B1では、収集すべき細胞を容器に入れた後に、まず毛管の先端に焦点を合わせ、毛管の先端を顕微鏡の視野の中央に位置決めする。その後で、容器底部の細胞の平面に焦点を合わせ、毛管をサンプルに突き刺さるまで手動で降下させる。その際、突き刺さったかどうかは目で確かめる。ＸＹ平面内での位置及び降下させたときのＺ方向における動きの大きさは制御コンピュータにおいて把握される。この制御コンピュータは、後続の方法において、コンピュータによって座標系内で選択された別の細胞位置を自動的に突き刺すためにこれらのデータを使用する。ここに記した方法の欠点は、対象物担体までの距離（つまり、毛管の損傷が生じうる位置）が求められるのではなく、生体サンプルから恣意的に選ばれた細胞の表面のＺ座標しか求められないことにある。また、許容差も考慮されない。したがって、毛管の先端と対象物担体とが衝突し、それによって毛管が損傷する可能性がある。さらにこの場合、恣意的に選ばれた細胞へのテスト注入を介して微調整が行われる。その際、対象物担体の上に堆積する細胞は同じ細胞培養から由来しているが、異なる外的ジオメトリを有しているため、位置測定にとってこのような較正は非常に不正確である。
【０００５】
DE 10 2005 053 669 B4には、顕微鏡として形成された位置測定ユニットを用いてマニピュレータ先端の実際位置を求める一方で、同様に顕微鏡として形成され、サンプルテーブルのもう一方の面に配置された観察ユニットを用いてサンプル上の又はサンプル内のターゲット位置を観察するサンプル操作装置が記載されている。観察ユニットと位置測定ユニットのデータを比較することによって、制御部はマニピュレータ先端をターゲット位置へと変位させることができる。このサンプル操作装置の欠点は、位置測定対物レンズがマニピュレータ先端のオーダーの被写界深度を有しているため、Ｚ方向の測定が相応して不正確となり、ほぼ毛管自体の直径に相当する誤差を伴うことにある。しかし位置決めのためにこの誤差が考慮されることはない。また、対象物担体のＺ方向における位置も求められることがないため、位置測定対物レンズの誤差のせいで実際の位置が計算された位置から偏差した場合に、対象物担体とマニピュレータ先端との衝突が生じる可能性がある。
【０００６】
最後にDE 10 2007 046 267 A1では、例えば毛管である取得ツールが取付けエレメントによってツールヘッドに取り付けられ、サンプル容器内の対象細胞の空間的位置が撮像ユニットと画像評価ユニットとによって検出され、取得ツールは制御記憶ユニットと移動機構とによってまず較正位置へと動かされ、その後で、対象細胞上方の位置へと動かされる。次に、撮像ユニットと画像評価ユニットが対象細胞上方の取得ツールの空間的位置も検出し、ターゲット位置からの偏差を求める。制御記憶ユニットは移動機構によって取得ツールの位置を補正する。このサンプル操作装置の場合でも、較正位置における毛管の先端は顕微鏡の視野内に移動させなければならない。これは顕微鏡の倍率が高い場合には手動でしかできない。また、取得ツールを降下させるときに、例えば顕微鏡対物レンズの被写界深度によって決まる許容差が顧慮されないので、維持すべき距離が誤って計算され、その結果、衝突が生じかねない。
【０００７】
最後に、前掲文献のいずれにおいても、対象物担体のプロファイル、つまり、ＸＹ平面内の位置の関数としての対象物担体の表面のＺ位置の変化が求められないため、新しいＸＹ位置への移動後、状況によっては、対象物担体の表面のＺ座標の変化のせいで距離がまたも正しく計算されず、毛管の先端が対象物担体と衝突する可能性がある。ただし、そのような衝突の場合のために、DE 10 2007 046 267 A1に従って、付加的なセンサ又は操作ツールのサスペンションを設けてもよい。しかしそれでも損傷は確実には排除されず、サンプルの誤った取得ひいては時間的損失にもつながる。
【０００８】
現実にはよくあるが、オペレータには滅多に気づかれることのない状態、すなわち、対象物担体が斜めに、つまり正確には水平でなく挿入されている場合でも、毛管の位置誤差が生じる。毛管は、とりわけスタート位置が対象物担体の表面からほんの数μｍしか離れていない場合には、スタート位置へと移動させるときに早くも損傷を受けてしまう可能性がある。実際、斜めの対象物担体上のＺ位置の差は関心領域内で３０μｍまでになり、さらに対象物担体に対して使用される顕微鏡は塵等で汚れるので、Ｚ位置の差は１００μｍを超えうる。ガラスシャーレを使用した場合には、誤差は数倍になりうる。それでも１μｍ未満の刻みで接触較正を行わなければならない場合には、安全のために、スタート位置から対象物担体までの距離をもっと大きく（１００μｍより大きく）保っておかなければならない。１μｍ未満の刻みでは、接触較正に余りに多くの時間を要するので、これは実用的には大きな欠点となる。
【０００９】
発明の概要
それゆえ、本発明の課題は、サンプル表面の全体にわたって操作ツールを完全自動で正確かつ損傷なしに位置決めすることを可能にする、マイクロ操作ツールの無衝突位置決め方法を提供することである。この課題は請求項１に記載の特徴を備えた方法により解決される。本発明の特に有利な実施形態は従属請求項において規定されている。
【００１０】
顕微鏡を用いてマイクロ操作ツールをサンプル担体に対して無衝突で位置決めする本発明による方法は以下のステップを有する。
ａ）第１の開口数ＮＡ1を有する第１の顕微鏡対物レンズの焦点をサンプル担体表面上の少なくとも１つの点Ｐに合わせることによって、前記少なくとも１つの点の焦点位置ＺPを求める。
ｂ）マイクロ操作ツールを顕微鏡の光軸上に位置決めする。
ｃ）上記顕微鏡対物レンズの焦点を又は第１の開口数ＮＡ1よりも小さな第２の開口数ＮＡ2を有する第２の顕微鏡対物レンズの焦点をマイクロ操作ツールの先端に合わせることによって、マイクロ操作ツールの焦点位置ＺMを求める。
ｄ）所定の許容差プロファイルΔＺを考慮して降下距離ＺA（Ｐ）を次の式
ＺA（Ｐ）＝ＺM−ＺP−ΔＺ
によって計算する。ここで、
ΔＺ＝ΔＺM＋ΔＺP
であり、ΔＺMは操作ツールの位置を求めるときの所定の許容差であり、ΔＺPはサンプル担体の位置を求めるときの所定の許容差である。
ｅ）マイクロ操作ツールを降下距離ＺA（Ｐ）だけ降下させることによって点Ｐに位置決めする。
【００１１】
ここで、許容差又は許容差プロファイルとは、当業者にとって、位置を求める際に（個々の）光学素子又は光学システム全体に割り当てられる不正確さを意味しており、細胞顕微鏡検査ではふつうμｍ（１０-6ｍ）の単位で与えられる。したがって、本発明の方法によれば、操作ツールがサンプル担体の許容差プロファイル外にある限り、操作ツールを衝突なしにサンプル担体上方で動かすことができる。操作ツールは開口数の小さな対物レンズによってサンプル担体まで例えば１〜２ｍｍの距離で検出される。なお、この距離は顕微鏡とマニピュレータのジオメトリによって十分正確に決められている。よって、衝突は確実に回避される。全体的に、本発明の方法によってマイクロ操作装置の機能、効率、信頼性、とりわけ使い易さが改善される。ルーチン的な使用形態では、システム全体を完全自動で動作させることができる。しかし、本発明の方法は個々の方法ステップの完全に自動的な進行及び実行に限定されない。焦点位置の測定、及び／又は、Ｘ及びＹ方向における位置決め、及び／又は、Ｚ方向における降下（引き上げ）を手動で行うことも尚可能である。どの動作モードを選択するかには関係なく、本方法によれば、マイクロ操作ツールを数ミクロメートルの非常に高い位置精度で位置決めすることができ、同時にサンプル担体とツールとの衝突を避けることができる。とりわけ、サンプルの直径及び／又は操作ツール自体の直径よりも小さな距離で操作ツールをサンプル担体上方で動かすことができる。最後に、その他に較正のために必要な時間が大幅に短縮される。これは、既にサンプル担体の焦点位置を測定することによって、測定の開始値が方法に与えられていることに因る。
【００１２】
焦点位置は光軸上又は光軸の近傍で測定された関連する点の位置のＺ座標であり、この関連する点は測定を考慮して顕微鏡対物レンズにより光軸に鮮明に結像される。その際、結像の鮮明さは焦点調節システムによって自動的に、又は焦点を合わすべき点を示すビデオカメラの画像を考察することによって手動で、決定することができる。
【００１３】
マイクロ操作ツールを顕微鏡の光軸上で位置決めする際、所定の距離が維持される。この距離はふつうサンプル担体から１〜２ｍｍである。
【００１４】
好ましくは、操作ツールを降下させるステップｅ）の前に、ステップｃ）及びｄ）がそれぞれｉ番目の顕微鏡対物レンズ（ｉ＞１又はｉ＞２）を用いて繰り返される。なお、この繰り返しの際、顕微鏡対物レンズの開口数は増大していく（ＮＡi＞ＮＡi-1）。つまり、まずステップｃ）において、１番目の顕微鏡対物レンズ（開口数ＮＡ1）で、又は、サンプル担体の焦点位置を求めるために１番目の顕微鏡対物レンズの開口数よりも小さな開口数を有する２番目の顕微鏡対物レンズで、操作ツールの位置が求められ、ステップｄ）において、所定の許容差プロファイルを顧慮しながら降下距離が計算される。しかしその後で、操作ツールの位置を求める際の精度を改善するために、先行する対物レンズよりも大きな開口数と相応して小さな所定の許容差とを有する別の対物レンズを使用して、操作ツールの位置決めの安全マージンを表す許容差プロファイルを小さくしてもよい。このプロセスは反復して実行することができ、それによりマイクロメートル領域の高い精度を実現することが可能である。
【００１５】
本発明によれば、操作ツールとサンプル担体の許容差ΔＺM及びΔＺPは予め恣意的に決めることができるが、本発明の特に有利な実施形態では、操作ツールの許容差ΔＺM及び／又はサンプル担体の許容差ΔＺPは、下記の式に従い、位置測定に使用される各ｉ番目の対物レンズの被写界深度ｄtief, iにより与えられる。
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ここで、λは観察光の波長であり、ｎは顕微鏡対物レンズとサンプル担体の間の媒質の屈折率であり、Ｍiはｉ番目の対物レンズの倍率であり、ｅは観察に使用されるビデオカメラの解像度である。
【００１６】
観察光の波長は好ましくは５５０ｎｍの波長である。この波長は白色光（すなわち、およそ４００〜７００ｎｍの範囲の波長の連続体）を使用した場合でも正確な結果をもたらす。屈折率は顕微鏡対物レンズとサンプル担体の間の使用される媒質に依存し、通常は空気の屈折率（ｎ＝１）である。もっとも、顕微鏡対物レンズとサンプル担体の間の媒質がイマージョンオイル（ｎ＝１．５１５）又は水（ｎ＝１．３３）である界浸型光学素子の使用も考えられる。ビデオカメラはｅ＝１０μｍの標準的解像度を有していることが好ましいが、勿論さらに細かい又は粗い解像度のビデオカメラを使用してもよい。許容差プロファイルを求める際のパラメータとして被写界深度を使用することによって、ツールを降下させたときのサンプル担体表面と操作ツールの位置測定のあり得る偏差、すなわち測定誤差を、再生可能かつ確実に考慮することができ、サンプル担体表面との衝突を確実に避けることができる。
【００１７】
別の有利な実施形態では、ステップｅ）の前に、サンプル担体表面の所定の複数の点Ｐj（ｊ＝１，２，．．．）に対してステップａ）〜ｄ）が実行され、各点Ｐjの降下距離ＺA（Ｐj）がデータベースに格納され、格納された降下距離ＺA（Ｐj）を考慮しながら、各点Ｐjに対してステップｅ）が実行される。このようにして、所定の複数の点が適切に選ばれれば、サンプル操作前のサンプル担体の底面が平坦でなくても、大きな開口数を有する対物レンズでサンプル担体表面を走査することができ、各点Ｐjに関してそのＸ座標とＹ座標に依存して許容差プロファイルを含めた降下距離を記憶し、後でサンプル操作のために複数の点から任意の点を選択する際に呼び出すことができる。代替的に、降下距離ＺA（Ｐj）の代わりに点Ｐjの焦点位置、点ＰjのＸ座標及びＹ座標、ならびに対物レンズデータを開口数及び倍率に関する情報と共に記憶することも可能である。サンプル担体表面のこのようなトポグラフィを作成することにより、例えばシャーレ等のような平坦でない表面を有するサンプル担体もマイクロ操作に使用することができ、また全自動で作動させることができる。
【００１８】
好ましくは、ステップｅ）の前に、サンプル担体表面の直線上に並んでいない３つの点Ｐ1、Ｐ2、Ｐ3に対してステップａ）〜ｃ）が実行され、求められた焦点位置ＺP1、ＺP2、ＺP3から平面の方程式Ｅ（Ｐ）が計算され、ステップｄ）において、サンプル担体表面上の任意の点Ｐjの降下距離ＺA（Ｐj）がＺA（Ｐj）＝ＺM−Ｅ（Ｐj）−ΔＺにより計算される。
【００１９】
これは、例えば対象物担体（スライド）のような平坦なサンプル担体が顕微鏡ステージ上で光軸に対して正確に垂直ではなく配置される場合に特に有利である。実際、サンプル担体が顕微鏡ステージ上で光軸に対して正確に垂直ではなく配置されると、結構頻繁に誤差の原因となる。このことはつまり、顕微鏡ステージが別の位置に動かされるとすぐに対象物担体の平面が焦平面からはみ出しまうことを意味している。その結果、操作ツールと対象物担体の平面の間の距離も変化してしまう。本方法のこの実施形態によって、顕微鏡制御はこの作用を補償し、サンプル担体上の焦点、したがってまたサンプル担体と操作ツールの間の距離を、サンプル担体上のＸＹ位置に関係なく維持することができる。
【００２０】
好ましくは、ステップｃ）において、操作ツールの先端の位置が焦点位置ＺMとして求められる。このことによって確実に、サンプル担体に最も近づく操作ツールの動作部分の位置が較正され、ツールがサンプル担体に衝突することによる接触及び生じうる損傷が防止される。
【００２１】
別の特に有利な実施形態では、ステップｃ）において、以下のステップを実行することによって操作ツールの捩れ角及び傾斜角が補償される。
ｃ１）操作ツールの先端における第１の点Ｑ1に焦点を合わせることによって、第１の点Ｑ1の焦点位置ＺQ1を求める。
ｃ２）前記点Ｑ1の焦点位置ＺQ1と操作ツールの先端における第２の点Ｑ2の焦点位置ＺQ2とが等しくなるまで、操作ツールをその軸を中心として回転させ、前記Ｑ1に焦点を合わせるために改めて顕微鏡対物レンズを調節する。
ｃ３）操作ツールの先端における第３の点Ｑ3に焦点を合わせることによって、第３の点Ｑ3の焦点位置ＺQ3を求める。
ｃ４）焦点位置ＺQ1、ＺQ2及びＺQ3が等しくなるまで、サンプル担体の平面に平行な軸回りに操作ツールを傾斜させ、点Ｑ3に焦点を合わせるために改めて顕微鏡対物レンズを調節する。
ｃ５）操作ツールの焦点位置をＺA＝ＺQ1に定める。
操作ツールの傾斜角ないし捩れ角を補償することによって、サンプルと相互作用する操作ツールの端面の形状も考慮されるので、操作ツールのサンプル担体に対する位置を較正する際に極めて高い正確度を達成することが可能である。このことは、引き延ばされた毛管又は先端が或る角度をもって研磨ないし折られているような毛管の場合に特に重要である。実際、これによって確実に、毛管の開口部又は操作ツールの活動側がサンプルから均一かつ最小の距離に位置決めされ、毛管の場合であれば、この小さな距離のおかげで最適な吸い込み又は洗い流し作用を実現することができる。操作ツールをその軸を中心として回転させる際、好ましくは全体として最大±５°までの刻みが実行される。これはしかし懸念されるべきことではない。というのも、毛管は既に予め方向マーカーを用いて大まかに調節されているからである。毛管の傾斜角についても同じことが当てはまる。例えば、毛管は電気駆動装置によって好ましくは最大±２°の小さな刻みで傾けられ、同様に前もって角度指示によって傾斜角が大まかに調節される。
【００２２】
別の実施形態によれば、ステップａ）において、さらに第１の顕微鏡対物レンズの焦点を載置容器の表面の点Ｒに合わせることによって点Ｒの焦点位置Ｚcapを求めてもよい。このようにして、例えばサンプル担体から取得した細胞材料を載置する載置容器に関しても較正を行うことが可能である。対象物担体上のグリッドとは違って例えばキャップやチューブのような載置容器に載置する場合、つねに同じ載置位置に出会すので、載置容器内に１つの焦点しか求められない。その結果、方法が加速される。
【００２３】
有利には、サンプル担体の表面の点及び／又は載置容器の表面の点は、顕微鏡ステージのような位置決めテーブルによるサンプル担体及び／又は載置容器のシフトによって動かされる。位置決めテーブルはＸＹ平面内で動作するので、焦点調節と水平方向の位置決めとの分離が達成される。
【００２４】
別の実施形態では、焦点位置の測定を光学式距離測定システムによって行うことも考えられる。そうすることで、同様に、サブマイクロメートル領域の精度で焦点調節を行うことができる。
【００２５】
マイクロ操作ツールの実施例として、例えばガラス又は金属でできた毛管、ピペット、ニードル又は接着性のキャップが挙げられる。操作ツールは複数の操作先端の組み合わせから成っていてもよい。例えば、ｎ個の毛管の配列又は毛管とニードルと接着性キャップとの組み合わせであってよい。最後に、マイクロ操作ツールが例えば毛管とマイクロディセクタ、毛管とピンセット、毛管とマイクロディセクタとピンセット、又は接着性キャップとピンセットのような他の光学式マイクロ操作ツールを有する操作先端の組合せであることも考えられる。
【００２６】
以下に、以下の図面に図示された実施例に基づいて本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】１ａ）は、マイクロ操作ツールの較正時のマイクロ操作装置の拡大した一部を示し、１ｂ）は、サンプル担体の傾斜を概略的に示す。
【図２】マイクロ操作ツールを較正する本発明の方法の流れを説明するフローチャートである。
【図３】傾斜角とマイクロ操作ツールの軸回り回転角の補正を概略的に示す。
【図４】傾斜角と捩れ角の補正する方法の説明するフローチャートである。
【００２８】
発明の実施形態
まず導入として、任意の単一細胞又は希少細胞の自動化された分離について説明する。なお、この分離は細胞識別、細胞収集、細胞放出の３つのステップで行われる。その後で、図面を参照しながら本発明の有利な実施形態を説明する。
【００２９】
発明者はこの目的のために倒立顕微鏡と、細胞識別ユニットと、自動毛管調節器と、自動ポンプと、並進ステージとに基づいたシステムを用意した。収集と放出は（以下で詳細に説明される）高精度のポンプによって制御される。この高精度ポンプは、細胞分離プロセスのためにポンプ媒質のナノリットル体積を調節し、そのようにして方法の終了時点に行われるべき、ほんの１マイクロリットルの媒質の中の細胞材料の分子分析の基礎を形成する。
【００３０】
（粘着性のない）細胞はまったく機械的負荷を受けない。細胞収集は細胞を包囲する流体流のみに基づいて行われる。最適な条件の下では、部分的に粘着性を有する細胞でさえ同様にして収集することができる。細胞と収集に使用される毛管との間に接触は生じない。毛管の直径は細胞の直径よりも遙かに大きい。例えば６μｍの直径を有する細胞は４０μｍの直径を有する毛管によって効率的に収集される。
【００３１】
細胞の放出は様々なターゲット担体（保管器）上で行うことができる。いわゆる「グリッドデポジット」は（例えばＡｍｐｌｉＧｒｉｄ(R)のような）グリッド状に配置された点状載置部か、又は（ＩＢＩＤＩサンプルポケット対象物担体のような）グリッド状に配置された小さな容器のいずれかである。個々の点状載置部は透明な蓋とＰＣＲ管又はミクロ流体装置とから成っていてよい。つねにそうであるように、並進ステージ上の対象物担体のための多重保持体に対象物担体を嵌め込むことができるように、ターゲット担体の大きさはふつう標準的な対象物担体の大きさを超えてはならない。例えばウェルプレートのような比較的大きなターゲット担体に対しては、保持体を適合させなければならない。
【００３２】
細胞の収集及び放出は細胞識別と共に手動から全自動の動作モードまで様々な仕方で行うことができる。しかし、手動モードの場合でさえ、システムの何らかの構成要素（顕微鏡、ポンプ、毛管）を手で操作する必要はない。すべての動作プロセスはユーザがＰＣから開始させる。
【００３３】
図１ａ）には、対象物担体８が概略的に示されている。対象物担体の上にはサンプル物質７、例えば単一細胞が載せられている。顕微鏡対象物担体８は顕微鏡ステージ（図示せず）上でＸＹ方向に位置決めすることができる。Ｚ方向における位置決め、すなわち焦点調整は光軸５に沿って対物レンズ１０を変位させることで行われる。この実施形態では、マイクロ操作ツールとして毛管４が図示されている。一方、図２にはフローチャートが示されている。以下では、図１ａ）及びｂ）とこのフローチャートに基づいて、本発明の方法を説明する。
【００３４】
図１ａ）及びｂ）から分かるように、サンプル担体８のこの実施例では、ガラス製の従来の対象物担体が、顕微鏡ステージ（図示せず）上の光軸５に対して正確に垂直ではなく、小さな角度で傾いている。このことは、顕微鏡ステージが他の位置へと動かされるとすぐに、対象物担体平面が焦平面からはみ出ることを意味している。その際、毛管の先端と対象物担体平面との間の距離も変化する。これを阻止するためには、対象物担体８の傾斜角を検出し、両方の作用を補償できなければならない。
【００３５】
ステップＳ１１０（図２）では、焦平面の測定の初めにまず、使用される対物レンズ１０が選択される。許容差プロファイルが小さければ、倍率が高いほど、傾斜角がより正確に求められる。様々な倍率と開口数の対物レンズの許容差プロファイルの比較が表１に示されている。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
今のケースでは、Ｍ1＝６０、ＮＡ1＝０．７の対物レンズ、つまり開口数の大きな対物レンズが選択される。対象物担体８上には、次々に３つの点Ｐ1、Ｐ2、Ｐ3が置かれる。これらの点はすべてが共通の直線の上に並ぶのではなく、対象物担体８の平面を張る。変位駆動（顕微鏡ステージ）によって対物レンズ１０はまず点Ｐ1の位置へと動かされ、点Ｐ1に焦点が合わせられる。点Ｐ1の焦点位置のＸＹ座標及び座標ＺP1が求められ、顕微鏡制御部に記憶される。次に、顕微鏡ステージは第２の位置へ動かされ、対物レンズは点Ｐ2上に来る。対物レンズ１０は点Ｐ2に焦点が合わせられ、ＸＹ座標及びＺ座標（焦点位置ＺP2）が記憶される。最後に、顕微鏡ステージは点Ｐ3が光軸５上に乗るＸＹ位置へと動かされ、ＸＹ座標及び焦点位置ＺP3が記憶される。制御部は対象物担体平面上の記憶された３つの点のＸ、Ｙ及びＺ座標に基づいて平面の方程式Ｅ（Ｐ）を立て、水平方向に対する対象物担体の傾斜角を求める（ステップＳ１１０）。
【００３８】
次のステップＳ１２０では、操作ツール４の位置を求めるために、使用可能な最も低い対物レンズ倍率（最小の開口数）が選択される。下記の例では、このために０．１３の開口数と倍率Ｍ2＝４の対物レンズ１０が選択される。ここでは毛管であるマイクロ操作ツール４の先端は光軸５上を動かされ、対象物担体６までの距離が１〜２ｍｍである位置に位置決めされる。最も低い対物レンズ倍率を有する対物レンズ１０を用いて、毛管の先端に焦点を合わせることによって、毛管の先端の焦点位置ＺMが求められる（ステップＳ１３０）。上記データを用いて、ＸＹ平面内の各点について対象物担体の焦平面と操作先端との間の距離ＺM−Ｅ（Ｐ）が求められる（ステップＳ１４０）。もっとも、この距離は毛管４と対象物担体８の位置を求める際に入ってくる許容差をまだ考慮していない。毛管先端４が過度に深く降下するのを防ぐためには、これを考慮しなければならない。次のケースでは、位置測定の許容差は対物レンズパラメータによって予め設定されており、以下のように計算することができる。なお、被写界深度と呼ばれる深度領域は、結像光学系の対物空間内の領域のうちで像平面に十分鮮明に結像される領域の広がりである。
【００３９】
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この式から、被写界深度を浅くして位置測定の精度を上げるためには、比較的大きな開口数又は倍率を有する対物レンズを採用してもよいが、波長の短い光を用いて処理してもよいことが分かる。ルーチン動作においてマイクロ操作システムの波長を変更することは実用上の理由から有利でないので、位置決めの正確さを向上させるために、ここでは対物レンズの倍率又は開口数が変更される。
【００４０】
毛管４が対象物担体８と衝突するのを防ぐために、毛管先端と対象物担体との間の距離から許容差プロファイルΔＺ＝ΔＺM＋ΔＺPが引かれる。許容差プロファイルには、これまでに位置測定に使用された２つの対物レンズの被写界深度、すなわち、１つは対象物担体に対して、もう１つは毛管先端に対して使用された対物レンズの被写界深度が含まれている。したがって、降下距離ＺA（Ｐ）は、被写界深度によって定まる許容差を考慮して、下記のように毛管先端と対象物担体の焦点位置に依存して求められる。
【００４１】
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【００４２】
次に、プローブを値ＺＡ（Ｐ）だけ降下させる（Ｓ１５０）。後は、現時点の顕微鏡倍率と許容差決定の正確さが使用するに十分であるか否かを判定するだけである（Ｓ１６０）。もっと高い作業倍率が必要な場合には、より大きな開口数を有する対物レンズが使用され（Ｓ１７０）、毛管先端の測定がより高い精度で改めて実行される（Ｓ１３０−Ｓ１５０）。その場合、相応して上記式において、これから行われる毛管先端の更なる（ｉ番目の）位置測定のために使用された対物レンズの被写界深度の値が入れ替えられる。対象物担体の位置測定に使用された被写界深度の値は変更されない。
【００４３】
もし正確度が十分でなければ（Ｓ１８０）、較正を終了してもよい。確かにもっと正確な位置決めが必要な状況もありうるが、これよりも大きな開口数を有する対物レンズは使用できない。このような場合、毛管の先端が対象物担体の表面に軽く触れるまで（Ｓ２００）毛管の先端を１μｍよりも小さな刻みで降下させる（Ｓ１９０）ことが可能である。毛管の先端が対象物担体の表面に触れると、毛管は（その弾性のために割れずに）曲がり、その結果ＸＹ平面内での毛管の位置も変化する。このことは顕微鏡下で検出できる。このようにして、この点に関して超えてはならない最大の降下を決定することができる。毛管と対象物担体との接触点を求めた後には、対象物担体に対する毛管先端の位置の正確度はもはや許容差プロファイルの値にではなく、マニピュレータのＺ軸の正確度に依存するので、１μｍ未満の位置正確度が達成される。
【００４４】
実験が示すところによれば、較正プロセスを最も低い倍率で始めて、後でより高い倍率の対物レンズに変更するだけで十分である。これによって較正の時間的コストが著しく低減される。低い作業倍率（最大で２０×）の場合には、作業距離の長い対物レンズを使用して直接作業対物レンズで較正を行ってもよい。この場合、対物レンズで対象物担体の位置も毛管先端の位置も求められ、許容差プロファイルとして対物レンズの２倍の被写界深度が想定される。したがって対物レンズの交換は不要である。
【００４５】
図３を参照して説明される別の実施形態では、毛管４の傾斜角１１又は捩れ１２が較正の前に補償される。このような傾き又は捩れのせいで、毛管４の、収集すべき細胞構造及び対象物担体８の側の開口部は、対象物担体８と平行な平面内にない。その結果、毛管先端の一方の側が他方の側よりも対象物担体８又は細胞物質７から遠くなるので、毛管４の吸い込み作用又は洗い流し作用が不均一になってしまう。上記のように対象物担体８の傾斜角を計算し（Ｓ２１０）、毛管を降下させた（Ｓ２２０）後で、まず毛管の先端が光軸５上で動かされ、毛管支持体に挿入される前に毛管の軸回りの捩れ１２が方向マーカー９を用いて予め調節される（Ｓ２３０）。傾斜角１１もマーカー９を用いて予め大まかに調節される（Ｓ２４０）。前と同様に、最も低い倍率を有する対物レンズ１０が選択され、毛管４の先端が光軸５へと動かされる（Ｓ２５０）。対象物担体８と毛管の先端との間の距離はおよそ１〜２ｍｍである。対物レンズ１０は毛管先端の点Ｑ１に焦点が合わされ、そのＸ、Ｙ及びＺ座標が記憶される（Ｓ２６０）。
【００４６】
毛管４は、前記点Ｑ１と毛管先端の第２の点Ｑ２に焦点が合わせされるまで、電気駆動装置によって毛管の軸を中心として小刻みに回転させられる（Ｓ２７０）。その際、最大の捩れは±５°である。対物レンズ１０の新しいＺ座標は新たにＱ１に焦点を合わせることによって求められる。点Ｑ１とＱ２を同時に鮮明に結像することができない場合には、毛管４は最終的に点Ｑ１とＱ２に一緒に焦点が合わされるまで改めて小刻みに回転させられる。
【００４７】
続いて、マイクロマニピュレータを動かすことによって毛管先端の別の点Ｑ３を光軸５上へと動かし、対物レンズ１０の焦点を点Ｑ３に合わせる（Ｓ２９０）。点Ｑ３のＸ、Ｙ及びＺ座標を記憶する。
【００４８】
次に、毛管４の傾斜角１１を最大±２°だけ電気駆動装置によって小刻みに傾斜させる（Ｓ３００）。対物レンズのＺ座標は改めて点Ｑ１に焦点を合わせることによって求められる。点Ｑ１、Ｑ２及びＱ３が同時に鮮明に結像されない場合（Ｓ３１０「ノー」）には、再び傾斜によって点Ｑ１、Ｑ２及びＱ３に一緒に焦点を合わせる。３つの点すべてに焦点が合わせされるとすぐに（Ｓ３１０「イエス」）、つまり、点Ｑ１、Ｑ２及びＱ３のＺ方向における焦点位置が等しくなるとすぐに、これらの値のうちの１つが降下距離ＺAの計算に使用される。この手続が終了したときには、毛管４の開口部（先端）は細胞物質７又は対象物担体８の表面に平行である。
【００４９】
最後に、もっと高い正確度が必要な場合には（Ｓ３２０）、より高い倍率を用いて傾斜角１２と軸回りの回転方向１１の補正を繰り返してもよい（Ｓ２６０−Ｓ３１０）。その一方で、最大で２０×までの低い作業倍率に対しては、直接作業対物レンズで較正を行うことが可能である。それゆえ、対物レンズの交換は不要である。
【図１ａ）】
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【図１ｂ）】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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