(57)【要約】  本発明は、ｎ−プロパノール、イソプロパノールを生産する方法、及びｎ−プロパノールをイソプロパノールとともに共生産する方法に関する。本発明はまた、プロピレンを生産するための方法、及びｎ−プロパノールとイソプロパノールを生産することができる宿主細胞に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
チオラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；
ＣｏＡ−トランスフェラーゼをコードする１又は複数の異種のポリヌクレオチド；
アセトアセテートデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；及び
イソプロパノールデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；
を含む組み換えラクトバチルス属（Lactobacillus）宿主細胞であって、
イソプロパノールを生産することが可能である、組み換え宿主細胞。
【請求項２】
前記細胞がラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・フルクチボランス（Lactobacillus fructivorans）又はラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）細胞である、請求項１に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項３】
前記チオラーゼが、
（ａ）配列番号３、３５、１１４、又は１１６の成熟ポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するチオラーゼ；
（ｂ）配列番号１、２、３４、１１３、若しくは１１５の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも中〜高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるチオラーゼ；及び
（ｃ）配列番号１、２、３４、１１３、又は１１５の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるチオラーゼ
から選択される、請求項１又は２に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項４】
前記チオラーゼをコードする異種のポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドとは異種のプロモーターと作動式に連結される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項５】
前記Ｃｏ−Ａトランスフェラーゼがスクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項６】
前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼが、第一のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチド、及び第二のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質複合体であって、
ここで前記第一のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号６の成熟ポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号４若しくは５の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも中〜高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号４又は５の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択され、そして
前記第二のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号９の成熟ポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号７若しくは８の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも中〜高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号７又は８の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択される、
請求項５に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項７】
前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼが、第一のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチド、及び第二のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質複合体であって、
ここで前記第一のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号１２の成熟ポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号１０若しくは１１の成熟ポリペプチドコーディング配列又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも中〜高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号１０又は１１の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択され、
そして前記第二のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号１５の成熟ポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号１３若しくは１４の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と少なくとも中〜高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号１３又は１４の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択される、
請求項５のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項８】
前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼが、アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項９】
前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼが、第一のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチド、及び第二のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質複合体であって、
ここで前記第一のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号３７の成熟ポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号３６の成熟ポリペプチドコーディング配列又はこれらの完全長相補鎖と少なくとも中〜高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号３６の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択され、
そして前記第二のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号３９の成熟ポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号３８の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と少なくとも中〜高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号３８の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択される、
請求項８に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１０】
前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼが、第一のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチド、及び第二のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質複合体であって、
ここで前記第一のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号４１の成熟ポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号４０の成熟ポリペプチドコーディング配列又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも中〜高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号４０の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択され、
そして前記第二のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号４３の成熟ポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号４２の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも中〜高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号４２の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択される、
請求項８に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１１】
前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼをコードする１又は複数の異種のポリヌクレオチドが、異種のプロモーターと作動式に連結される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１２】
前記アセトアセテートデカルボキシラーゼが、
（ａ）配列番号１８、４５、１１８、又は１２０の成熟ポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するアセトアセテートデカルボキシラーゼ；
（ｂ）配列番号１６、１７、４４、１１７、若しくは１１９の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも中〜高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアセトアセテートデカルボキシラーゼ；及び
（ｃ）配列番号１６、１７、４４、１１７、又は１１９の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるアセトアセテートデカルボキシラーゼ
から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１３】
前記アセトアセテートデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドとは異種のプロモーターと作動式に連結される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１４】
前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼが、
（ａ）配列番号２１、２４、４７、又は１２２の成熟ポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するイソプロパノールデヒドロゲナーゼ；
（ｂ）配列番号１９、２０、２２、２３、４６、若しくは１２１の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも中〜高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるイソプロパノールデヒドロゲナーゼ；及び
（ｃ）配列番号１９、２０、２２、２３、４６、又は１２１の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるイソプロパノールデヒドロゲナーゼ
からなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１５】
前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドとは異種のプロモーターと作動式に連結される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１６】
アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチドをさらに含む組み換え宿主細胞であって、ｎ−プロパノールを生産することができる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１７】
前記アルデヒドデヒドロゲナーゼが、
（ａ）配列番号２７、３０、３３、５１、５４、５７、６０、又は６３の成熟ポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するアルデヒドデヒドロゲナーゼ；
（ｂ）配列番号２５、２６、２８、２９、３１、３２、４８、４９、５０、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、若しくは６２の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも中〜高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアルデヒドデヒドロゲナーゼ；及び
（ｃ）配列番号２５、２６、２８、２９、３１、３２、４８、４９、５０、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、又は６２の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるアルデヒドデヒドロゲナーゼ
から選択される、請求項１６に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１８】
前記アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドとは異種のプロモーターと作動式に連結される、請求項１６又は１７に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１９】
メチルマロニル−ＣｏＡムターゼをコードする１又は複数の（いくつかの）異種のポリヌクレオチド；
メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；
メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；及び／又は
ｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチド
をさらに含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項２０】
イソプロパノールを生産する方法であって、
（ａ）イソプロパノールを生産するための好適な条件下において、培地中で請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞を培養し；そして
（ｂ）前記イソプロパノールを回収すること
を含む、方法。
【請求項２１】
イソプロパノール及びｎ−プロパノールを生産する方法であって、
（ａ）イソプロパノール及びｎ−プロパノールを生産するための好適な条件下において、培地中で請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞を培養し；
（ｂ）前記イソプロパノール及びｎ−プロパノールを回収すること
を含む、方法。
【請求項２２】
プロピレンを生産する方法であって、
（ａ）イソプロパノール及び／又はｎ−プロパノールを生産するための好適な条件下において、培地中で請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞を培養し；
（ｂ）前記イソプロパノール及び／又はｎ−プロパノールを回収し；
（ｃ）プロピレンを生産するための好適な条件下で、イソプロパノール及び／又はｎ−プロパノールを脱水し；そして
（ｄ）前記プロピレンを回収すること
を含む、方法。
【請求項２３】
前記培地が、サトウキビ汁を含む発酵培地である、請求項２０〜２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ｎ−プロパノール及びイソプロパノールの組み換え生産のための方法に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年１０月２９日に出願した米国仮出願第６１／４０８，１５４号；２０１０年１０月２９日に出願した米国仮出願第６１／４０８，１４６号；及び２０１０年１０月２９日に出願した米国仮出願第６１／４０８，１３８号の優先権の利益を主張する。これらの出願の内容は、これらが下記で完全に明らかにされたかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
配列表への言及
本出願は、コンピューターで読み取り可能な形態の配列表を含み、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【０００４】
生物材料の寄託への言及
本出願は、生物材料の寄託への言及を含み、この寄託は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００５】
関連技術の説明
石油の将来の供給に関する懸念は、再生可能エネルギーや他の原料の再生可能資源の分野における研究を促進する。バイオ燃料、例えばエタノールやバイオプラスチック（例えば、特にポリ乳酸）は、微生物を利用して農業資源から直接作ることができる製品の例である。さらに望ましい製品は、非酵素的化学変換、例えばエタノールのエチレンへの脱水を用いて得ることができる。
【０００６】
エチレンの重合は、幅広い有用な用途を有するプラスチックの一種であるポリエチレンを提供する。エチレンは、伝統的に非再生可能な精製された化石燃料により生産される。しかしながら、生物学的に得られたエタノールのエチレンへの脱水は、再生可能な炭素源、即ち発酵性糖の発酵に由来するエタノールからのエチレンへの代替の経路を提供する。このプロセスは、炭素同位体分布中の僅かな差異を除いて石油から生産されるポリエチレンと同一である「グリーンポリエチレン」の生産に用いられている。
【０００７】
同様に、イソプロパノールとｎ−プロパノールは、脱水されてプロピレンとなり、これは、順に重合されてポリプロピレンとなることができる。ポリエチレンと同様に、生物学的に生成された出発原料（即ち、イソプロパノールやｎ−プロパノール）を用いることは、「グリーンポリプロピレン」をもたらす。しかしながら、ポリエチレンとは異なり、再生可能資源からのポリエチレン出発原料の生産は、困難であることが分かっている。プロパノール生産における提案された取り組みは、国際公開第２００９／０４９２７４号、国際公開第２００９／１０３０２６号、国際公開第２００９／１３１２８６号、国際公開第２０１０／０７１６９７号、国際公開第２０１１／０３１８９７号、国際公開第２０１１／０２９１６６号、及び国際公開第２０１１／０２２６５１号に報告されている。プロパノールの生物学的生産のためのプロセスの開発の成功には、代謝経路における慎重な酵素の選択及び有効的で全体的な代謝工学的戦略を要することは明らかである。
【０００８】
組み換えｎ−プロパノール及びイソプロパノールを生産する方法を提供することは、当該技術分野において有益である。本発明は、かかる方法及び本方法に用いられる組み換え宿主細胞を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
本発明は、とりわけ、ｎ−プロパノール及び／又はイソプロパノール生産のための組み換え宿主細胞に関する。一つの態様では、前記宿主細胞は、チオラーゼ活性、ＣｏＡ−トランスフェラーゼ活性、アセトアセテートデカルボキシラーゼ活性、及び／又はイソプロパノールデヒドロゲナーゼ活性を含み、ここで宿主細胞は、イソプロパノールを生産する（あるいは生産することができる）。一つの態様では、前記宿主細胞は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を含み、ここで宿主細胞は、ｎ−プロパノールを生産する（あるいは生産することができる）。一つの態様では、前記宿主細胞は、チオラーゼ活性、ＣｏＡ−トランスフェラーゼ活性、アセトアセテートデカルボキシラーゼ活性、イソプロパノールデヒドロゲナーゼ活性、及び／又はアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を含み、ここで宿主細胞は、ｎ−プロパノール及びイソプロパノールを生産する（あるいは生産することができる）。これらの態様によっては、前記宿主細胞は、任意で、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ活性、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ活性、及び／又はｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼ活性をさらに含む。
【００１０】
一つの態様では、前記組み換え宿主細胞は、チオラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；ＣｏＡ−トランスフェラーゼをコードする１又は複数の（いくつかの）異種のポリヌクレオチド（例えば、スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼをコードする１又は複数の（いくつかの）異種のポリヌクレオチド）；アセトアセテートデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；イソプロパノールデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；及び／又はアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチドを含む。前記宿主細胞は、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼをコードする異種のポリヌクレオチド、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド、及び／又はｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチドをさらに含んでもよい。
【００１１】
本発明はまた、ｎ−プロパノールの生産、イソプロパノールの生産、又はｎ−プロパノール及びイソプロパノールの共生産のための組み換え宿主細胞を用いる方法に関する。
【００１２】
一つの態様では、本発明は、イソプロパノールを生産する方法であって、（ａ）イソプロパノールを生産するための好適な条件下において、培地中で、チオラーゼ活性、ＣｏＡ−トランスフェラーゼ活性、アセトアセテートデカルボキシラーゼ活性、及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ活性を有する組み換え宿主細胞を培養し；そして（ｂ）イソプロパノールを回収することを含む方法に関する。本発明の実施形態によっては、前記組み換え宿主細胞は、チオラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；ＣｏＡ−トランスフェラーゼをコードする１又は複数の（いくつかの）異種のポリヌクレオチド；アセトアセテートデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；及び／又はイソプロパノールデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチドを含む。
【００１３】
別の態様では、本発明は、ｎ−プロパノールを生産する方法であって、（ａ）ｎ−プロパノールを生産するための好適な条件下において、培地中で、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する組み換え宿主細胞を培養し；そして（ｂ）ｎ−プロパノールを回収することを含む方法に関する。本発明の実施形態によっては、前記組み換え宿主細胞は、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチドを含む。本発明の実施形態では、前記組み換え宿主細胞は、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼをコードする１又は複数の（いくつかの）異種のポリヌクレオチド；メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；及び／又はｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチドを含む。
【００１４】
別の態様では、本発明は、ｎ−プロパノール及びイソプロパノールを共生産する方法であって、（ａ）ｎ−プロパノール及びイソプロパノールを生産するための好適な条件下において、培地中で、チオラーゼ活性、ＣｏＡ−トランスフェラーゼ活性、アセトアセテートデカルボキシラーゼ活性、イソプロパノールデヒドロゲナーゼ活性、及びアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する組み換え宿主細胞を培養し；そして（ｂ）ｎ−プロパノール及びイソプロパノールを回収することを含む方法に関する。本発明の実施形態によっては、前記組み換え宿主細胞は、チオラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；ＣｏＡ−トランスフェラーゼをコードする１又は複数の（いくつかの）異種のポリヌクレオチド（例えば、スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼをコードする１又は複数の（いくつかの）異種のポリヌクレオチド）；アセトアセテートデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；イソプロパノールデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；及び／又はアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチドを含む。本発明の宿主細胞は、任意で、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼをコードする異種のポリヌクレオチド；メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼコードする異種のポリヌクレオチド；メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；及び／又はｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼコードする異種のポリヌクレオチドを更に含んでもよい。
【００１５】
本発明はまた、プロピレンを生産する方法であって、（ａ）ｎ−プロパノール及び／又はイソプロパノールを生産するための好適な条件下において、培地中で、本明細書に記載の組み換え宿主細胞を培養し；（ｂ）ｎ−プロパノール及び／又はイソプロパノールを回収し；（ｃ）プロピレンを生産するための好適な条件下で、ｎ−プロパノール及び／又はイソプロパノールを脱水し；そして（ｄ）プロピレンを回収することを含む方法に関する。
【００１６】
態様によっては、前記宿主細胞は、ラクトバチルス属（Lactobacillus）宿主細胞（例えば、Ｌ．プランタルム（L. plantarum）又はＬ．ロイテリ（L. reuteri）宿主細胞）である。他の態様では、前記宿主細胞は、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）（例えば、プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニッチ（Propionibacterium acidipropionici）宿主細胞）である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、イソプロパノールの生産のためのグルコースからの代謝経路を示す。
【図２】図２は、ｎ−プロパノールの生産のためのグルコースからの代謝経路を示す。
【図３】図３は、イソプロパノール及びｎ−プロパノールの共生産のためのグルコースからの代謝経路を示す。
【図４】図４はｐＴＲＧＵ８８の制限地図を示す。
【図５】図５はｐＳＪ１０６００の制限地図を示す。
【図６】図６はｐＳＪ１０６０３の制限地図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
定義
チオラーゼ：用語「チオラーゼ」とは、二つの分子のアセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡとＣｏＡへの化学反応を触媒するアシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．３．１．９）として、本明細書で定義される。本明細書に記載される本発明の目的において、チオラーゼ活性は、D. P. Wiesenborn et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol. 54:2717-2722により記載される手順に従って決定することができ、この内容は参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。例えば、チオラーゼ活性は、１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）中３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、１．０ｍＭアセチル−ＣｏＡ、０．２ｍＭＮＡＤＨ、１ｍＭジチオスレイトール、及び２Ｕの３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼを用いた、ＮＡＤＨの酸化と連動した縮合反応を観察することにより、分光光度的に測定することができる。３０℃において２分間、キュベット内容物の平衡化後、１０μＬの約１２５ｎｇのチオラーゼの添加により、反応を開始する。ＮＡＤＨの酸化による３４０ｎｍにおける吸光度の減少が測定され、６．２２ｍＭ-1ｃｍ-1の減衰係数が用いられる。チオラーゼ活性の一単位は、ｐＨ７．４、３０℃において１分間あたりに１マイクロモルのアセトアセチル−ＣｏＡを放出することができる酵素の量と等しい。
【００１９】
チオラーゼは、配列番号３、３５、１１４、又は１１６の成熟ポリペプチドの少なくとも２０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％のチオラーゼ活性を有してもよい。
【００２０】
ＣｏＡ−トランスフェラーゼ：本明細書で用いられる用語「ＣｏＡ−トランスフェラーゼ」とは、アセトアセチル−ＣｏＡからの補酵素Ａの除去を触媒し、アセトアセテートを生成する任意の酵素として定義される。態様によっては、ＣｏＡ−トランスフェラーゼは、ＥＣ  ２．８．３．９のアセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート／ブチレートＣｏＡトランスフェラーゼである。態様によっては、ＣｏＡ−トランスフェラーゼは、ＥＣ  ３．１．２．１１のアセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート／ブチレートＣｏＡヒドラーゼである。態様によっては、ＣｏＡ−トランスフェラーゼは、アセトアセチル−ＣｏＡとアセテートをアセトアセテートとアセチル−ＣｏＡに変換するアセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼである。
【００２１】
Ｃｏ−Ａトランスフェラーゼは、配列番号３７の成熟ポリペプチド及び配列番号３９の成熟ポリペプチドを含むタンパク質複合体；又は配列番号４１の成熟ポリペプチド及び配列番号４３の成熟ポリペプチドを含むタンパク質複合体の少なくとも２０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％のＣｏ−Ａトランスフェラーゼ活性を有してもよい。
【００２２】
態様によっては、前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼは、スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼである。本明細書で用いられる「スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ」は、アセトアセチル−ＣｏＡとスクシネートのアセトアセテートとスクシニル−ＣｏＡへの化学反応を触媒するアセトトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．８．３．５）である。スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼは、本明細書に記載されるように、１又は複数の（いくつかの）サブユニット（例えば、二つのヘテロマーサブユニット）を含むタンパク質複合体の形態でもよい。本明細書に記載される本発明の目的において、スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ活性は、L. Stols et al., 1989, Protein Expression and Purification 53:396-403により記載される手順に従って決定することができ、この内容は参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。例えば、スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ活性は、アセトアセチル−ＣｏＡのエノラートアニオンの形成を観察することにより分光光度的に測定することができ、ここで吸光度は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ中６７ｍＭリチウムアセトアセテート、３００μＭスクシニル−ＣｏＡ、及び１５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ｐＨ９．１のアッセイバッファ中、４分にわたる３１０ｎｍ／３０℃において測定される。スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ活性の一単位は、ｐＨ９．１、３０℃において１分間あたりに１マイクロモルのアセトアセテートを放出することができる酵素の量と等しい。
【００２３】
スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼは、配列番号６の成熟ポリペプチド及び配列番号９の成熟ポリペプチドを含むタンパク質複合体；又は配列番号１２の成熟ポリペプチド及び配列番号１５の成熟ポリペプチドを含むタンパク質複合体の少なくとも２０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％のスクシニル−Ｃｏ−Ａ：アセトアセテートトランスフェラーゼ活性を有してもよい。
【００２４】
アセトアセテートデカルボキシラーゼ：用語「アセトアセテートデカルボキシラーゼ」は、アセトアセテートの二酸化炭素とアセトンへの化学反応を触媒する酵素（ＥＣ  ４．１．１．４）として定義される。本明細書に記載される本発明の目的において、アセトアセテートデカルボキシラーゼ活性は、D.J. Petersen, et al., 1990, Appl. Environ. Microbiol. 56, 3491-3498により記載される手順に従って決定することができ、この内容は参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。例えば、アセトアセテートデカルボキシラーゼ活性は、２６℃において、５ｎＭアセトアセテート、０．１Ｍ  ＫＰＯ4、ｐＨ５．９中で、２７０ｎｍにおけるアセトアセテートの減少を観察することにより、分光光度的に測定することができる。アセトアセテートデカルボキシラーゼ活性の一単位は、ｐＨ５．９、２６℃において１分間あたりに１マイクロモルのアセトアセテートを消費することができる酵素の量と等しい。
【００２５】
アセトアセテートデカルボキシラーゼは、配列番号１８、４５、１１８、又は１２０の成熟ポリペプチドの少なくとも２０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％のアセトアセテートデカルボキシラーゼ活性を有してもよい。
【００２６】
イソプロパノールデヒドロゲナーゼ：用語「イソプロパノールデヒドロゲナーゼ」は、アセトンのイソプロパノールへの還元を触媒する任意の好適なオキシドレダクターゼ（例えば、ＥＣ  １．１．１．１又はＥＣ  １．１．１．８０の任意の好適な酵素）として定義される。本明細書に記載される本発明の目的において、イソプロパノールデヒドロゲナーゼ活性は、２５℃において、２５ｍＭリン酸カリウム中２００μＭ  ＮＡＤＰＨ及び１０ｍＭアセトンを含むアッセイにおいて、３４０ｎｍにおける吸光度の減少により、分光光度的に測定することができる。イソプロパノールデヒドロゲナーゼ活性の一単位は、６２２０Ｍ-1*ｃｍ-1のＮＡＤＰＨのモル吸光係数を用いて、１分間あたりに１マイクロモルのＮＡＤＰ＋を放出することができる酵素の量として定義することができる。
【００２７】
イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、配列番号２１、２４、４７、又は１２２の成熟ポリペプチドの少なくとも２０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％のイソプロパノールデヒドロゲナーゼ活性を有してもよい。
【００２８】
アルデヒドデヒドロゲナーゼ：用語「アルデヒドデヒドロゲナーゼ」は、アルデヒドの酸化を触媒する酵素（ＥＣ  １．２．１．３）として本明細書で定義される。アルデヒドデヒドロゲナーゼは、可逆的であり、例えばプロピオニル−ＣｏＡのプロパナールへの化学反応を触媒することができる。本明細書に記載される本発明の目的において、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、N. Hosoi et al., 1979, J. Ferment. Technol., 57:418-427により記載される手順に従って決定されることができ、この内容は参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。例えば、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、１００μｍｏｌプロピオンアルデヒド、３μｍｏｌ  ＮＡＤ＋、０．３μｍｏｌ  ＣｏＡ、３０μｍｏｌ  ＧＳＨ、１００μｇウシ血清アルブミン、１２０μｍｏｌベローナル−ＨＣｌバッファ（ｐＨ８．６）を含む３ｍＬの溶液を用いて、３０℃において、３４０ｎｍにおける吸光度の増加により、ＮＡＤ＋の還元を観察することにより、分光光度的に測定することができる。アルデヒドデヒドロゲナーゼトランスフェラーゼ活性の一単位は、ｐＨ８．６、３０℃において１分間あたりに１マイクロモルのプロピオニル−ＣｏＡを放出することができる酵素の量と等しい。
【００２９】
アルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号２７、３０、３３、５１、５４、５７、６０、又は６３の成熟ポリペプチドの少なくとも２０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％のアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有してもよい。
【００３０】
一つの態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、同一条件下で、プロピオニル−ＣｏＡ基質についての反応初速度（ｖ0）の９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、７．５％、５％、２．５％、又は１％未満であるアセチル−ＣｏＡ基質についての反応初速度（ｖ0）を有する。
【００３１】
メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ：用語「メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ」は、メチルマロニル−ＣｏＡのスクシニル−ＣｏＡへの可逆的異性化を触媒する酵素（ＥＣ  ５．４．９９．２）として本明細書で定義される。態様によっては、前記メチルマロニル−ＣｏＡムターゼは、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ活性のためにビタミンＢ１２を要求する。本明細書に記載される本発明の目的において、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ活性は、T. Haller et al., 2000, Biochemistry, 39:4622-4629により記載される手順に従って決定することができ、この内容は参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。例えば、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ活性は、ｐＨ７．５において、スクシニル−ＣｏＡ（２〜４３μＭ）、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ（８ｎＭ）、ＫＣｌ（３０ｍＭ）及び速度論的に過剰なメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ（ygfG, T. Haller et al., 2000、同上）を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌナトリウム（５０ｍＭ）の５００μＬ溶液中の３７℃におけるスクシニル−ＣｏＡの減少を測定するためのＨＰＬＣ分析により測定することができる。メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ活性の一単位は、ｐＨ７．５、３７℃において１分間あたりに１マイクロモルのスクシニル−ＣｏＡを消費することができる酵素の量と等しい。
【００３２】
メチルマロニル−ＣｏＡムターゼは、配列番号９３の成熟ポリペプチド配列；又は配列番号６６の成熟ポリペプチド配列を有する第一のサブユニット、及び配列番号６９の成熟ポリペプチド配列を有する第二のサブユニットを含むタンパク質複合体の少なくとも２０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％のメチルマロニル−ＣｏＡムターゼ活性を有してもよい。
【００３３】
メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ：用語「メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ」は、メチルマロニル−ＣｏＡのプロピオニル−ＣｏＡ及び二酸化炭素への化学反応を触媒する酵素（例えば、ＥＣ  ４．１．１．４１）として本明細書で定義される。メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼは、（２Ｒ）−メチルマロニル−ＣｏＡ、（２Ｓ）−メチルマロニル−ＣｏＡのいずれか若しくは双方の変換を触媒することができる。一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼは、同一の条件下で、（２Ｓ）−メチルマロニル−ＣｏＡよりも（２Ｒ）−メチルマロニル−ＣｏＡに優れた特異性を有する。別の態様では、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼは、同一の条件下で、（２Ｒ）−メチルマロニル−ＣｏＡよりも（２Ｓ）−メチルマロニル−ＣｏＡに優れた特異性を有する。
【００３４】
本明細書に記載される本発明の目的において、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性は、T. Haller et al., 2000、同上、により記載される手順に従って決定することができる。例えば、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性は、３７℃において、オキサルアセテート、トランスカルボキシラーゼ、及びラクテートデヒドロゲナーゼの存在下で、ＮＡＤＨの酸化を観察することによりメチルマロニル−ＣｏＡのプロピオニル−ＣｏＡへの変換を測定するために、連続的な分光光度的分析により測定することができる。この例では、リン酸カリウムの１．２ｍＬ溶液（１６．７ｍＭ）は、ｐＨ７．２において、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ（０．６μＭ）、メチルマロニル−ＣｏＡ（３〜４５μＭ）、オキサルアセテート（８．３・ｍＭ）、ＮＡＤＨ（０．３３ｍＭ）、トランスカルボキシラーゼ（５ｍＵ）、及びラクテートデヒドロゲナーゼ（４ｍＵ）を含む。メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性の一単位は、ｐＨ７．２、３７℃において１分間あたりに１マイクロモルのメチルマロニル−ＣｏＡを脱カルボキシル化することができる酵素の量と等しい。
【００３５】
メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼは、配列番号１０３の成熟ポリペプチドの少なくとも２０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％のメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性を有してもよい。
【００３６】
メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ：用語「メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ」は、メチルマロニル−ＣｏＡの化学的エピマー化（例えば、Ｒ−メチルマロニル−ＣｏＡからＳ−メチルマロニル−ＣｏＡへ、そして／あるいはＳ−メチルマロニル−ＣｏＡからＲ−メチルマロニル−ＣｏＡへ；ＥＣ  ５．１．９９．１を参照のこと）を触媒する酵素として本明細書で定義される。本明細書に記載される本発明の目的において、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ活性は、Dayem et al., 2002, Biochemistry, 41:5193-5201により記載される手順に従って決定することができ、この内容は参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。
【００３７】
メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼは、配列番号７５の成熟ポリペプチドの少なくとも２０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％のメチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ活性を有してもよい。
【００３８】
ｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼ：用語「ｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼ」は、プロパナールのｎ−プロパノールへの還元を触媒する任意のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．１）として本明細書で定義される。本明細書に記載される本発明の目的において、ｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼ活性は、C. Drewke and M. Ciriacy, 1988, Biochemica et Biophysica Acta, 950:54-60により記載される手順に従って決定することができ、この内容は参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。例えば、ｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼ活性は、ｐＨ８．３において、ＮＡＤＨ酸化のＮＡＤ+還元の反応速度論に従って、分光光度的に測定することができる。ｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼ活性の一単位は、ｐＨ８．３、３０℃において１分間あたりに１マイクロモルのプロパナールをｎ−プロパノールに変換することができる酵素の量と等しい。
【００３９】
異種のポリヌクレオチド：用語「異種のポリヌクレオチド」は、宿主細胞由来ではないポリヌクレオチド；コーディング領域に構造的改変がされた自己のポリヌクレオチド；組み換えＤＮＡ技術、例えば異なる（異種の）プロモーターによりＤＮＡ操作の結果としてその発現が量的に改変された自己のポリヌクレオチド；又は宿主細胞への１又は複数の（いくつかの）過剰なコピーのポリヌクレオチドの導入によりその発現が量的に改変された自己のポリヌクレオチドとして本明細書で定義される。
【００４０】
単離された／精製された：用語「単離された」又は「精製された」とは、天然に結合している少なくとも一つの成分から除去されたポリペプチド又はポリヌクレオチドを意味する。例えば、ポリペプチドは、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより測定して、少なくとも１％純粋、例えば少なくとも５％純粋、少なくとも１０％純粋、少なくとも２０％純粋、少なくとも４０％純粋、少なくとも６０％純粋、少なくとも８０％純粋、少なくとも９０％純粋、少なくとも９３％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９７％、少なくとも９８％純粋、又は少なくとも９９％純粋でもよく、そしてアガロース電気泳動により測定して、少なくとも１％純粋、例えば少なくとも５％純粋、少なくとも１０％純粋、少なくとも２０％純粋、少なくとも４０％純粋、少なくとも６０％純粋、少なくとも８０％純粋、少なくとも９０％純粋、少なくとも９３％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９７％、少なくとも９８％純粋、又は少なくとも９９％純粋でもよい。
【００４１】
成熟ポリペプチド配列：用語「成熟ポリペプチド配列」とは、任意の翻訳後配列修飾（例えばＮ末端プロセシング及び／又はＣ末端切断）後の、参照されるポリペプチド配列の部分を意味する。成熟ポリペプチド配列は、例えばSignalPプログラム（Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6）又はInterProScanプログラム（The European Bioinformatics Institute）に基づいて予測されてもよい。場合によっては、前記成熟ポリペプチド配列は、参照されるポリペプチド配列全体と同一でもよい。宿主細胞が、同一のポリヌクレオチドにより発現される２又はそれ以上の異なる成熟ポリペプチド配列（即ち、異なるＣ末端及び／又はＮ末端アミノ酸を有する）の混合物を生産し得ることは、当該技術分野において知られている。
【００４２】
成熟ポリペプチドコーディング配列：用語「成熟ポリペプチドコーディング配列」とは、参照される成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００４３】
配列同一性：二つのアミノ酸配列間、又は二つのヌクレオチド配列間の関係性は、「配列同一性」なるパラメータにより記載される。本発明の目的において、二つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、EMBOSSパッケージ (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277）のNeedleプログラム、好ましくはバージョン３．０．０以降により実行される、Needleman-Wunschアルゴリズム(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453）を用いて決定される。用いられる任意のパラメータは、１０のギャップ・オープン・ペナルティー（gap open penalty）、０．５のギャップ・エクステンション・ペナルティー（gap extension penalty）、及びEBLOSUM62（BLOSUM62のEMBOSSバージョン）置換マトリックスである。「最長同一性」（longest identity）と表示されたNeedleのアウトプット（-nobriefオプションを用いて得られる）は、％同一性として用いられ、以下の式に従い計算される。
（同一の残基×１００）／（アラインメント長−アラインメント中のギャップ総数）
【００４４】
本発明の目的において、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、EMBOSSパッケージ（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000、同上）のNeedleプログラム、好ましくはバージョン３．０．０以降、により実行される、Needleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970、同上）を用いて決定される。用いられる任意のパラメータは、１０のギャップ・オープン・ペナルティー、０．５のギャップ・エクステンション・ペナルティー、及びEDNAFULL（NCBI NUC4.4のEMBOSSバージョン）置換マトリックスである。「最長同一性」と表示されたNeedleのアウトプット（-nobriefオプションを用いて得られる）は、％同一性として用いられ、以下の式に従い計算される。
（同一のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメント長−アラインメント中のギャップ総数）
【００４５】
フラグメント：用語「フラグメント」とは、１又は複数の（例えば、２、いくつかの）アミノ酸が参照されるポリペプチド配列のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端から欠失したポリペプチドを意味する。一つの態様では、前記フラグメントは、チオラーゼ活性、ＣｏＡ−トランスフェラーゼ活性（例えば、スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ活性）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ活性、イソプロパノールデヒドロゲナーゼ活性、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ活性、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、又はｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼ活性を有する。別の態様では、前記フラグメント中のアミノ酸残基の数は、本明細書で参照される任意のアミノ酸配列のアミノ酸残基の数の少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％である。
【００４６】
サブ配列：用語「サブ配列」とは、参照されるヌクレオチド配列の５’末端及び／又は３’末端から欠失した１又は複数の（例えば、２、いくつかの）ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを意味する。一つの態様では、前記サブ配列は、チオラーゼ活性、ＣｏＡ−トランスフェラーゼ活性（例えば、スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ活性）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ活性、イソプロパノールデヒドロゲナーゼ活性、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ活性、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、又はｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼ活性を有するフラグメントをコードする。別の態様では、前記サブ配列中のヌクレオチド残基の数は、本明細書で参照される任意のポリヌクレオチド配列中のヌクレオチド残基の数の少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％である。
【００４７】
対立遺伝子変異体：用語「対立遺伝子変異体」とは、同一染色体座を占める２又はそれ以上の任意の代替形態の遺伝子を意味する。対立遺伝子の変異体は、変異によって自然に発生し、集団内で多様性をもたらし得る。遺伝子変異は、サイレント（コードされるポリペプチドにおいて変化がない）でもよく、あるいは改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。対立遺伝子変異体のポリペプチドは、対立遺伝子変異体の遺伝子によりコードされるポリペプチドである。
【００４８】
コーディング配列：用語「コーディング配列」とは、ポリペプチドのアミノ酸配列を直接的に特定するポリヌクレオチドを意味する。コーディング配列の境界は、一般的に、ＡＴＧ開始コドン、又は代替の開始コドン、例えばＧＴＧ及びＴＴＧで開始し、終止コドン、例えばＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡで停止する、オープンリーディングフレームにより決定される。前記コーディング配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ポリヌクレオチド、及び／又は組み換えポリヌクレオチドでもよい。
【００４９】
ｃＤＮＡ：用語「ｃＤＮＡ」とは、真核生物から得られる成熟し、すプライスされたｍＲＮＡから逆転写により調製することができるＤＮＡ分子を意味する。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡに存在するイントロン配列を欠く。最初の一次ＲＮＡ転写物は、成熟し、スプライスされたｍＲＮＡとして存在する前の、スプライシングを含む一連のステップを経て加工されるｍＲＮＡの前駆体である。場合によっては、ｃＤＮＡ配列は、ゲノムＤＮＡ配列と同一でもよい。
【００５０】
核酸コンストラクト：用語「核酸コンストラクト」とは、天然の遺伝子から単離された、あるいはさもなければ天然に存在しない核酸のセグメントを含むように改変された、あるいは合成された一本鎖、又は二本鎖のいずれかの核酸分子を意味する。核酸コンストラクトなる用語は、核酸コンストラクトが本発明のコーディング配列の発現のために必要な制御配列を含む場合、「発現カセット」なる用語と同義語である。
【００５１】
制御配列：用語「制御配列」とは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のために必要な全構成要素を意味する。各制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと同種又は異種でもよく、あるいは互いに同種又は異種でもよい。かかる制御配列としては、限定することなく、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターが挙げられる。少なくとも、制御配列は、プロモーター、転写及び翻訳停止シグナルを含む。制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコーディング領域と制御配列とのライゲーションを容易にする特異的な制限酵素認識部位を導入する目的のために、リンカーを提供してもよい。
【００５２】
作動式に連結：用語「作動式に連結」とは、制御配列がコーディング配列の発現を指示するように、制御配列がポリヌクレオチドのコーディング配列に対して適切な位置において置かれる配置を意味する。
【００５３】
発現：用語「発現」とは、限定することなく、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌などのポリペプチドの生産に関与する任意のステップを含む。
【００５４】
発現ベクター：用語「発現ベクター」とは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、それの発現のために提供されるさらなるヌクレオチドと作動式に連結される線形又は環状ＤＮＡ分子を意味する。
【００５５】
宿主細胞：用語「宿主細胞」とは、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクト又は発現ベクターにより、形質転換、トランスフェクション、及び形質導入等がされやすい任意の細胞種を意味する。用語「宿主細胞」は、複製の間に生じる変異による、親細胞と同一でない親細胞の任意の後代を包含する。
【００５６】
変異体：用語「変異体」とは、参照される酵素活性を有するポリペプチド、又は参照される酵素活性を有するタンパク質複合体のポリペプチドであって、１又は複数の（いくつかの）位置において、１又は複数の（いくつかの）アミノ酸残基の改変、即ち、置換、挿入、及び／又は欠失を含むポリペプチドを意味する。置換は、位置を占めるアミノ酸の様々なアミノ酸による置き換えを意味し；欠失は、位置を占めるアミノ酸の除去を意味し；そして挿入は、位置を占めるアミノ酸に隣接した１又は複数の（いくつかの）、例えば１〜３個のアミノ酸を付加することを意味する。
【００５７】
容積生産性：用語「容積生産性」とは、単位時間あたりに用いられるシステムの容量（例えば、培地及びこれら中の内容物の合計容量）あたりの生産される参照される生成物の量（例えば、生産されたｎ−プロパノール及び／又はイソプロパノールの量）を意味する。
【００５８】
発酵培地：用語「発酵培地」とは、１又は複数の（いくつかの）糖、例えばグルコース、フルクトース、スクロース、セロビオース、キシロース、キシルロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、及び／又は可溶性オリゴ糖を含む培地であって、宿主細胞により、一部において所望の生成物、例えばプロパノールに変換することができる培地を意味する。態様によっては、発酵培地は、天然資源、例えばサトウキビ、でんぷん、又はセルロース由来であり、酵素的加水分解（糖化）による資源の前処理の結果でもよい。一つの態様では、発酵培地は、１，２−プロパンジオールを含まない。
【００５９】
サトウキビ汁：用語「サトウキビ汁」とは、圧搾されたサッカルム属（Saccharum）草（サトウキビ）、例えば圧搾されたサッカルム・オフィシナルム（Saccharum officinarum）又はサッカルム・ロブスツム（Saccharum robustom）からの液体抽出物を意味する。
【００６０】
本明細書では、「約」なる数値又はパラメータへの言及は、数値又はパラメータ自体を対象とする態様を含む。例えば、「約Ｘ」に言及する記載は、態様「Ｘ」を含む。
【００６１】
本明細書及び特許請求の範囲で用いられるように、単数形「ａ」、「又は」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に示さない限り、複数形を含む。本明細書に記載の本発明の態様は、「からなる」及び／又は「本質的にからなる」態様を含むことは理解される。
【００６２】
文脈により他に定義される、あるいは明確に指示されない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語及び／又は科学用語は、本発明の属する技術分野における当業者により一般的に理解されるのと同一の意味を有する。
【００６３】
発明の詳細な説明
本発明は、とりわけ、ｎ−プロパノール又はイソプロパノール（例えば、図１及び２に示す）を生産するために、あるいはｎ−プロパノール又はイソプロパノール（例えば、図３に示す）を共生産するための、宿主細胞（例えば、原核生物宿主細胞）中での特定の遺伝子の過剰発現を記載する。本発明は、チオラーゼによるアセチル−ＣｏＡのアセトアセチル−ＣｏＡへのアセチル化、ＣｏＡ−トランスフェラーゼによるアセトアセチル−ＣｏＡのアセトアセテートへの変換、アセトアセテートデカルボキシラーゼによるアセトアセテートのアセトンへの脱カルボキシル化、イソプロパノールデヒドロゲナーゼによるアセトンのイソプロパノールへの還元、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼによるスクシニル−ＣｏＡのメチルマロニル−ＣｏＡへの異性化、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼによるメチルマロニル−ＣｏＡのプロピオニル−ＣｏＡへの脱カルボキシル化、アルデヒドデヒドロゲナーゼによるプロピオニル−ＣｏＡのプロパナールへの還元、及び／又はｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼによるプロパナールのｎ−プロパノールへの還元のための異種の遺伝子の使用を含む。任意の好適なチオラーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、アセトアセテートデカルボキシラーゼ、イソプロパノールデヒドロゲナーゼ、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、及び／又はｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼは、ｎ−プロパノール及び／又はイソプロパノールを生産するために用いられてもよい。
【００６４】
一つの態様では、本発明は、チオラーゼ活性、スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ活性、アセトアセテートデカルボキシラーゼ活性及び／又はイソプロパノールデヒドロゲナーゼ活性を含む組み換え宿主細胞であって、イソプロパノールを生産する（あるいは生産することができる）組み換え宿主細胞に関する。前記組み換え宿主細胞は、１又は複数の（いくつかの）異種のポリヌクレオチド、例えばチオラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（例えば、スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ）をコードする１又は複数の（いくつかの）異種のポリヌクレオチド；アセトアセテートデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；及び／又はイソプロパノールデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチドを含んでもよい。
【００６５】
一つの態様では、本発明は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を含む組み換え宿主細胞であって、プロパナール又はｎ−プロパノールを生産する（あるいは生産することができる）組み換え宿主細胞に関する。態様によっては、前記組み換え宿主細胞は、プロピオニル−ＣｏＡからプロパナール又はｎ−プロパノールを生産する（あるいは生産することができる）。前記組み換え宿主細胞は、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチドを含んでもよい。態様によっては、前記組み換え宿主細胞は、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼをコードする１又は複数の（いくつかの）異種のポリヌクレオチド；メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；及び／又はｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチドをさらに含む。
【００６６】
一つの態様では、本発明は、チオラーゼ活性、ＣｏＡ−トランスフェラーゼ活性（例えば、スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ活性）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ活性、イソプロパノールデヒドロゲナーゼ活性、及びアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を含む組み換え宿主細胞であって、ｎ−プロパノール及びイソプロパノールの双方を生産する（あるいは生産することができる）組み換え宿主細胞に関する。前記組み換え宿主細胞は、１又は複数の（いくつかの）異種のポリヌクレオチド、例えばチオラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（例えば、スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ）をコードする１又は複数の（いくつかの）異種のポリヌクレオチド；アセトアセテートデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；イソプロパノールデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；及び／又はアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチドを含んでもよい。前記宿主細胞は、任意で、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼをコードする異種のポリヌクレオチド、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド、及び／又はｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチドをさらに含んでもよい。
【００６７】
チオラーゼ及びチオラーゼをコードするポリヌクレオチド
本発明では、前記チオラーゼは、本発明の実施に好適である任意のチオラーゼであり得る。一つの態様では、前記チオラーゼは、増加した量のアセトアセチル−ＣｏＡが生産される培養条件下で過剰発現するチオラーゼである。
【００６８】
本明細書に記載される組み換え宿主細胞及び方法の一つの態様では、前記チオラーゼは、（ａ）配列番号３、３５、１１４、又は１１６の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するチオラーゼ；（ｂ）配列番号１、２、３４、１１３、若しくは１１５の成熟ポリペプチドコーディング配列又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるチオラーゼ；及び（ｃ）配列番号１、２、３４、１１３、又は１１５の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるチオラーゼから選択される。当業者に理解されるように、場合によっては、前記チオラーゼは、上記に記載の１超の選択肢（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の下に限定されてもよい。
【００６９】
一つの態様では、前記チオラーゼは、配列番号３、３５、１１４、又は１１６の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有し、かつチオラーゼ活性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７０】
一つの態様では、前記チオラーゼは、配列番号３の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有し、かつチオラーゼ活性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７１】
一つの態様では、前記チオラーゼは、配列番号３５の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有し、かつチオラーゼ活性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７２】
一つの態様では、前記チオラーゼは、配列番号１１４の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有し、かつチオラーゼ活性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７３】
一つの態様では、前記チオラーゼは、配列番号１１６の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有し、かつチオラーゼ活性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７４】
一つの態様では、前記チオラーゼが、配列番号３、３５、１１４、又は１１６と１０アミノ酸以下、例えば５アミノ酸以下、４アミノ酸以下、３アミノ酸以下、２アミノ酸以下、又は１アミノ酸以下異なるアミノ酸配列を含む。
【００７５】
一つの態様では、前記チオラーゼは、配列番号３のアミノ酸配列、又はこれらの対立遺伝子変異体；又はチオラーゼ活性を有する前述のフラグメントを含む。別の態様では、前記チオラーゼは、配列番号３の成熟ポリペプチドを含む、あるいはからなる。別の態様では、前記チオラーゼは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。別の態様では、前記チオラーゼは、配列番号３のアミノ酸１〜３９２を含む、あるいはからなる。一つの態様では、前記チオラーゼは、配列番号３５のアミノ酸配列、又はこれらの対立遺伝子変異体；又はチオラーゼ活性を有する前述のフラグメントを含む。別の態様では、前記チオラーゼは、配列番号３５の成熟ポリペプチドを含む、あるいはからなる。別の態様では、前記チオラーゼは、配列番号３５のアミノ酸配列を含む。別の態様では、前記チオラーゼは、配列番号３５のアミノ酸１〜３９２を含む、あるいはからなる。別の態様では、前記チオラーゼは、配列番号１１４の成熟ポリペプチドを含む、あるいはからなる。別の態様では、前記チオラーゼは、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む。別の態様では、前記チオラーゼは、配列番号１１６の成熟ポリペプチドを含む、あるいはからなる。別の態様では、前記チオラーゼは、配列番号１１６のアミノ酸配列を含む。
【００７６】
一つの態様では、前記チオラーゼは、配列番号１、２、３４、１１３、若しくは１１５の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる（例えばJ. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照のこと）。
【００７７】
一つの態様では、前記チオラーゼは、配列番号１若しくは２の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。
【００７８】
一つの態様では、前記チオラーゼは、配列番３４の成熟ポリペプチドコーディング配列又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。
【００７９】
一つの態様では、前記チオラーゼは、配列番１１３の成熟ポリペプチドコーディング配列又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。
【００８０】
一つの態様では、前記チオラーゼは、配列番１１５の成熟ポリペプチドコーディング配列又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。
【００８１】
一つの態様では、前記チオラーゼは、配列番号１、２、３４、１１３、又は１１５のサブ配列によりコードされ；前記サブ配列は、チオラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【００８２】
配列番号１、２、３４、１１３、若しくは１１５のポリヌクレオチド又はこれらのサブ配列；及び配列番号３、３５、１１４、若しくは１１６のアミノ酸配列；又はこれらのフラグメントは、当該技術分野において知られている方法に従って、異なる属又は種の株からチオラーゼをコードするＤＮＡを同定、及びクローニングするための核酸プローブを設計するために用いられてもよい。特に、かかるプローブは、これらの中で対応する遺伝子を同定及び単離するために、標準的なサザンブロッティング手順に従って、目的の属又は種のゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡとハイブリダイズするために用いることができる。かかるプローブは、配列全体よりも大幅に短くてよいが、少なくとも１４、好ましくは少なくとも２５、より好ましくは少なくとも３５、そして最も好ましくは少なくとも７０ヌクレオチド長であるべきである。核酸プローブは、少なくとも１００ヌクレオチド長であることが好ましい。例えば、前記核酸プローブは、少なくとも２００ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも３００ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも４００ヌクレオチド長、又は最も好ましくは少なくとも５００ヌクレオチド長でもよい。さらに長いプローブ、例えば好ましくは少なくとも６００ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも７００ヌクレオチド長、さらにより好ましくは少なくとも８００ヌクレオチド長、又は最も好ましくは少なくとも９００ヌクレオチド長である核酸プローブが用いられてもよい。ＤＮＡ及びＲＮＡプローブの双方を用いることができる。前記プローブは、典型的に、対応する遺伝子を検出するために、（例えば、32Ｐ、3Ｈ、35Ｓ、ビオチン又はアビジンで）標識される。かかるプローブは、本発明に含まれる。
【００８３】
かかる他の株から調製されるゲノムＤＮＡ、又はｃＤＮＡライブラリーは、上述のプローブとハイブリダイズし、チオラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡについてスクリーニングされてもよい。かかる他の株からのゲノムＤＮＡ又は他のＤＮＡは、アガロース若しくはポリアクリルアミドゲル電気泳動、又は他の分離技術により分離されてもよい。ライブラリーからのＤＮＡ又は分離されたＤＮＡは、ニトロセルロース又は他の好適な担体材料に移され、そして固定化されてもよい。配列番号１、２、３４、１１３、若しくは１１５、又はこれらのサブ配列と相同のクローン又はＤＮＡを同定するために、前記担体材料は、好ましくはサザンブロットに用いられる。
【００８４】
本発明の目的において、ハイブリダイゼーションとは、ポリヌクレオチドが、極めて低〜極めて高ストリンジェンシー条件下で、配列番号１、２、３４、１１３若しくは１１５の成熟ポリペプチドコーディング配列又はこれらの完全長相補鎖；又は前述のサブ配列に対応する標識された核酸プローブとハイブリダイズすることを意味する。これらの条件下で、核酸プローブがハイブリダイズする分子は、例えばＸ線フィルムを用いて検出することができる。
【００８５】
一つの態様では、前記核酸プローブは、配列番号１、２、３４、１１３、若しくは１１５の成熟ポリペプチドコーディング配列である。別の態様では、前記核酸プローブは、配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列である。別の態様では、前記核酸プローブは、配列番号１である。別の態様では、前記核酸プローブは、配列番号２の成熟ポリペプチドコーディング配列である。別の態様では、前記核酸プローブは、配列番号２である。別の態様では、前記核酸プローブは、配列番号３のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はそのフラグメントである。別の態様では、前記核酸プローブは、配列番号３４の成熟ポリペプチドコーディング配列である。別の態様では、前記核酸プローブは、配列番号３４である。別の態様では、前記核酸プローブは、配列番号３５のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はそのフラグメントである。別の態様では、前記核酸プローブは、配列番号１１３の成熟ポリペプチドコーディング配列である。別の態様では、前記核酸プローブは、配列番号１１３である。別の態様では、前記核酸プローブは、配列番号１１４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はそのフラグメントである。別の態様では、前記核酸プローブは、配列番号１１５の成熟ポリペプチドコーディング配列である。別の態様では、前記核酸プローブは、配列番号１１５である。別の態様では、前記核酸プローブは、配列番号１１６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はそのフラグメントである。
【００８６】
少なくとも１００ヌクレオチド長の長いプローブについて、極めて低〜極めて高ストリンジェンシー条件は、任意で１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング手順後、４２℃において、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍＬの剪断及び変性させたサケ精子ＤＮＡ、及び極めて低及び低ストリンジェンシーについては２５％ホルムアミド、中及び中〜高ストリンジェンシーについては３５％ホルムアミド、又は高及び極めて高ストリンジェンシーについては５０％ホルムアミドのいずれか中でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションとして定義される。前記担体材料は、４５℃で（極めて低ストリンジェンシー）、５０℃で（低ストリンジェンシー）、５５℃で（中ストリンジェンシー）、６０℃で（中〜高ストリンジェンシー）、６５℃で（高ストリンジェンシー）、及び７０℃で（極めて高ストリンジェンシー）、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、最終的に３回、各１５分間洗浄される。
【００８７】
約１５ヌクレオチド長〜約７０ヌクレオチドヌクレオチド長の短いプローブについて、ストリンジェンシー条件は、任意で１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング手順後、Bolton及びBolton and McCarthy（1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:1390）による計算を用いた、計算されたＴmより約５℃〜約１０℃低い温度において、０．９Ｍ  ＮａＣｌ、０．０９Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、６ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ−４０、１×デンハルト溶液、１ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ一塩基性リン酸二水素ナトリウム、０．１ｍＭ  ＡＴＰ、及び１ｍＬあたり０．２ｍｇの酵母ＲＮＡ中でのプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、及びハイブリダイゼーションとして定義される。前記担体材料は、最終的に、計算されたＴmより５℃〜１０℃低い温度において、６×ＳＣＣ＋０．１％ＳＤＳで１回、１５分間、６×ＳＳＣを用いて２回、各１５分間洗浄される。
【００８８】
一つの態様では、前記チオラーゼは、配列番号１、２、３４、１１３、又は１１５の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。一つの態様では、前記チオラーゼは、配列番号１の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。一つの態様では、前記チオラーゼは、配列番号２の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。一つの態様では、前記チオラーゼは、配列番号３４の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。一つの態様では、前記チオラーゼは、配列番号１１３の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。一つの態様では、前記チオラーゼは、配列番号１１５の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【００８９】
一つの態様では、前記チオラーゼは、配列番号３、３５、１１４、又は１１６の成熟ポリペプチドの１又は複数の（いくつかの）アミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む変異体である。好ましくは、アミノ酸変化は小さな性質であり、これは、保存的アミノ酸置換、又はタンパク質の折り畳み及び／又は活性に著しい影響を与えない挿入；典型的には１〜約３０個のアミノ酸の小さな欠失；及び小さなアミノ末端又はカルボキシル末端伸長、例えばアミノ末端のメチオニン残基；最大約２０〜２５残基までの小さなリンカーペプチド；又は正味電荷又は別の機能を変化させることにより精製を容易にする小さい伸長、例えばポリヒスチジンタグ、抗原エピトープ又は結合ドメインであるである。
【００９０】
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、及び小さいアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニン及びメチオニン）の群の中である。比活性を大きく改変しないアミノ酸置換は、当該技術分野では周知であり、例えば、H. Neurath and R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New Yorkにより記載されている。最も一般的に行われる変換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ，Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ及びＡｓｐ／Ｇｌｙである。
【００９１】
あるいは、前記アミノ酸変化は、ポリペプチドの物理化学的特性を変化させる性質である。例えば、アミノ酸変化は、ポリペプチドの熱安定性を向上させてもよく、基質特異性を改変してもよく、最適ｐＨ等を変化させてもよい。
【００９２】
親ポリペプチドにおいて必要不可欠なアミノ酸は、当該技術分野において知られている手順、例えば、部位特異的変異誘発、又はアラニン−スキャニング変異誘発（Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085）に従って、特定され得る。後者の技術では、一つのアラニン変異が分子中の全ての残基において導入され、得られる変異体分子は、分子の活性に重要なアミノ酸残基を特定するために、チオラーゼ的活性について試験される。また、Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708を参照のこと。酵素の活性部位、又は他の生物学的な相互作用はまた、推定の接触部位アミノ酸の変異と合わせて、核磁気共鳴、結晶学、電子線回折又は光親和性標識のような技術により決定されるような、構造の物理的な分析により決定され得る。例えば、de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64を参照のこと。必要不可欠なアミノ酸の同一性はまた、親ポリペプチドに関するポリペプチドとの同一性の分析から推測され得る。
【００９３】
１又は複数のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入は、変異誘発、組み換え、及び／又はシャッフリングの既知の方法に続いて、関連するスクリーニング手順、例えばReidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156；国際公開第９５／１７４１３号；又は国際公開第９５／２２６２５号により開示されるものを用いて、行なわれ、試験され得る。用いられ得る他の方法としては、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレー（例えばLowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; U.S. Patent No. 5,223,409；国際公開第９２／０６２０４号）、及び領域特異的変異誘発（Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127）が挙げられる。
【００９４】
変異誘発／シャッフリング法は、宿主細胞により発現された、クローニングされ、かつ変異誘発されたポリペプチドの活性を検出するための、ハイスループットでかつ自動化されたスクリーニング方法と組み合わされ得る（Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896）。活性ポリペプチドをコードする変異誘発されたＤＮＡ分子は宿主細胞から回収され、当該技術分野において標準的な方法を用いて迅速に配列決定され得る。これらの方法は、ポリペプチド中の個々のアミノ酸残基の重要性の迅速な決定を可能にする。
【００９５】
態様によっては、配列番号３、３５、１１４、又は１１６の成熟ポリペプチドのアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入の合計数は、１０以下、例えば１、２、３、４、５、６、７、８又は９以下である。態様によっては、配列番号３、３５、１１４、又は１１６の成熟ポリペプチドのアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入の合計数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。
【００９６】
別の態様では、前記チオラーゼは、配列番号３、３５、１１４、又は１１６のフラグメントであり、前記フラグメントはチオラーゼ活性を有する。別の態様では、前記フラグメントはチオラーゼ活性を有し、配列番号３、３５、１１４、又は１１６中のアミノ酸残基の数の少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％を含む。
【００９７】
前記チオラーゼは、別のポリペプチドが、本発明のポリペプチドのＮ末端又はＣ末端において融合される、融合ポリペプチド又は切断可能な融合ポリペプチドでもよい。融合ポリペプチドは、別のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと本発明のヌクレオチドとを融合することにより生産される。融合ポリペプチドを生産するための技術は、当該技術分野において知られており、これらがフレーム中にあり、融合ポリペプチドの発現が同一のプロモーター及びターミネーターの制御下であるように、ポリペプチドをコードするコーディング配列をライゲートすることを含む。融合タンパク質はまた、融合が翻訳後に行なわれるインテイン技術を用いて構築されてもよい（Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779）。
【００９８】
融合ポリペプチドは、二つのポリペプチド間の切断部位を更に含むことができる。融合タンパク質の分泌に関して、前記部位は、切断されて二つのポリペプチドを放出する。切断部位の例としては、限定することなく、Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; and Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; and Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48に開示される部位が挙げられる。
【００９９】
チオラーゼをコードするポリヌクレオチド、及び本明細書で言及される任意の態様において用いられる任意の他のポリペプチドを単離又はクローニングするための技術は、当該技術分野において知られており、ゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製、又はこれらの組み合わせを含む。かかるゲノムＤＮＡからのポリヌクレオチドのクローニングは、例えば、構造的特徴を共有するクローニングされたＤＮＡフラグメントを検出するために、よく知られているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は発現ライブラリーの抗体スクリーニングを用いることは有効的である。例えばInnis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New Yorkを参照のこと。他の核酸増幅手順、例えばリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、連結活性化転写（ＬＡＴ）及びヌクレオチド配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）が用いられてもよい。前記ポリヌクレオチドは、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）の株、又は別の若しくは関連する生物からクローニングされてもよく、ヌクレオチド配列の領域をコードするポリペプチドの対立遺伝子又は種変異体でもよい。
【０１００】
前記チオラーゼは、任意の属の微生物から得られてもよい。本発明の目的において、本明細書で用いられる用語「から得られる」とは、所定の起源と関連して、ポリヌクレオチドによりコードされるチオラーゼが、起源又は起源からのポリヌクレオチドが挿入されている細胞により生産されることを意味する。
【０１０１】
前記チオラーゼは、細菌チオラーゼでもよい。例えば、前記チオラーゼは、グラム陽性細菌ポリペプチド、例えばバチルス属（Bacillus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、クロストリジウム属（Clostridium）、ゲオバチルス属（Geobacillus）、若しくはオセアノバチルス属（Oceanobacillus）チオラーゼ、又はグラム陰性細菌ポリペプチド、例えば大腸菌（E. coli）、シュードモナス属（Pseudomonas）、サルモネラ属（Salmonella）、カンピロバクター属（Campylobacter）、ヘリコバクター属（Helicobacter）、フラボバクテリウム属（Flavobacterium）、フソバクテリウム属（Fusobacterium）、イリオバクター属（Ilyobacter）、ナイセリア属（Neisseria）、若しくはウレアプラズマ属（Ureaplasma）チオラーゼでもよい。
【０１０２】
一つの態様では、前記チオラーゼは、バチルス・アルカロフィラス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・フィルマス（Bacillus firmus）、バチルス・ロータス（Bacillus lautus）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・プミラス（Bacillus pumilus）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、又はバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）チオラーゼである。
【０１０３】
別の態様では、前記チオラーゼは、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Streptococcus equisimilis）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）、又はストレプトコッカス・エクィ（Streptococcus equi）亜種  ズーエピデミカス（Zooepidemicus）チオラーゼである。別の態様では、前記チオラーゼは、ストレプトマイセス・アクロモゲネス（Streptomyces achromogenes）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、又はストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）チオラーゼである。
【０１０４】
別の態様では、前記チオラーゼは、クロストリジウム属チオラーゼ、例えばクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）チオラーゼ（例えば、配列番号3のクロストリジウム・アセトブチリカムチオラーゼ）である。別の態様では、前記チオラーゼは、ラクトバチルス属チオラーゼ、例えばラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）チオラーゼ（例えば、配列番号３５のラクトバチルス・ロイテリチオラーゼ）、又はラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）チオラーゼ（例えば、配列番号１１４のラクトバチルス・ブレビスチオラーゼ）である。別の態様では、前記チオラーゼは、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）チオラーゼ、例えばプロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Propionibacterium freudenreichii）チオラーゼ（例えば、配列番号１１４のプロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ）である。
【０１０５】
前記チオラーゼは、真菌チオラーゼでもよい。一つの態様では、真菌チオラーゼは、酵母チオラーゼ、例えばカンジダ属（Candida）、クリベロマイセス属（Kluyveromyces）、ピキア属（Pichia）、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）、又はヤロウイア属（Yarrowia）チオラーゼである。
【０１０６】
別の態様では、真菌チオラーゼは、糸状菌チオラーゼ、例えばアクレモニウム属（Acremonium）、アガリクス属（Agaricus）、アルテルナリア属（Alternaria）、アスペルギルス属（Aspergillus）、アウレオバシジウム属（Aureobasidium）、ボトリオスペリア属（Botryospaeria）、セリポリオプシス属（Ceriporiopsis）、カエトミディアム属（Chaetomidium）、クリソスポリウム属（Chrysosporium）、クラビセプス属（Claviceps）、コクリオボルス属（Cochliobolus）、コプリノプシス属（Coprinopsis）、コプトテルメス属（Coptotermes）、コリナスクス属（Corynascus）、クリフォネクトリア属（Cryphonectria）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、ジプロディア属（Diplodia）、エクシディア属（Exidia）、フィロバシジウム属（Filibasidium）、フザリウム属（Fusarium）、ギベレラ属（Gibberella）、ホロマスチゴトイデス属（Holomastigotoides）、フミコラ属（Humicola）、イルペックス属（Irpex）、レンチヌラ属（Lentinula）、レプトスパエリア属（Leptospaeria）、マグナポルテ属（Magnaporthe）、メラノカルパス属（Melanocarpus）、メリピルス属（Meripilus）、ムコール属（Mucor）、ミセリオフトラ属（Myceliophthora）、ネオカリマスティクス属（Neocallimastix）、ニューロスポラ属（Neurospora）、ペシロマイセス属（Paecilomyces）、ペニシリウム属（Penicillium）、ファネロカエーテ属（Phanerochaete）、ピロミセス属（Piromyces）、ポイトラシア属（Poitrasia）、シュードプレクタニア属（Pseudoplectania）、シュードトリコニンファ属（Pseudotrichonympha）、リゾムコール属（Rhizomucor）、シゾフィラム属（Schizophyllum）、スシタリディウム属（Scytalidium）、タラロマイセス属（Talaromyces）、サーモアスカ属（Thermoascus）、チエラビア属（Thielavia）、トリポクラジウム属（Tolypocladium）、トリコデルマ属（Trichoderma）、トリコファエア属（Trichophaea）、バーティシリウム属（Verticillium）、ボルバリエラ属（Volvariella）、又はキシラリア属（Xylaria）チオラーゼである。
【０１０７】
別の態様では、前記チオラーゼは、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・ディアスタティカス（Saccharomyces diastaticus）、サッカロマイセス・ドウグラシ（Saccharomyces douglasii）、サッカロマイセス・クリヴェリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Saccharomyces norbensis）、又はサッカロマイセス・オビフォルミス（Saccharomyces oviformis）チオラーゼである。
【０１０８】
別の態様では、前記チオラーゼは、アクレモニウム・ セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）、アスペルギルス・アクレアツス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・フォエティダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、クリソスポリウム・ケラチノフィラム（Chrysosporium keratinophilum）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、クリソスポリウム・トロピクム（Chrysosporium tropicum）、クリソスポリウム・メルダリウム（Chrysosporium merdarium）、クリソスポリウム・イノプス（Chrysosporium inops）、クリソスポリウム・パニコラ（Chrysosporium pannicola）、クリソスポリウム・クイーンスランジカム（Chrysosporium queenslandicum）、クリソスポリウム・ゾナツム（Chrysosporium zonatum）、フザリウム・バクトリディオデス（Fusarium bactridioides）、フザリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フザリウム・クルックウェルエンス（Fusarium crookwellense）、フザリウム・クルモラム（Fusarium culmorum）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フザリウム・グラミヌム（Fusarium graminum）、フザリウム・ヘテロスポルム（Fusarium heterosporum）、フザリウム・ネグンディ（Fusarium negundi）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フザリウム・レティクラツム（Fusarium reticulatum）、フザリウム・ロゼウム（Fusarium roseum）、フザリウム・サンブシヌム（Fusarium sambucinum）、フザリウム・サルコチロウム（Fusarium sarcochroum）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Fusarium sporotrichioides）、フザリウム・スルプレウム（Fusarium sulphureum）、フザリウム・トルローサム（Fusarium torulosum）、フザリウム・トリコテシオイデス（Fusarium trichothecioides）、フザリウム・ヴェネナツム（Fusarium venenatum）、フミコーラ・グリセア（Humicola grisea）、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）、フミコーラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）、イルペックス・ラクテウス（Irpex lacteus）、ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ノイロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ペニシリウム フニクロスム（Penicillium funiculosum）、ペニシリウム・プルプロゲヌム（Penicillium purpurogenum）、ファネロケテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）、チエラビア・アクロマチカ（Thielavia achromatica）、チエラビア・アルボミセス（Thielavia albomyces）、チエラビア・アルボピロサ（Thielavia albopilosa）、チエラビア・アウストラレインシス（Thielavia australeinsis）、チエラビア・フィメティ（Thielavia fimeti）、チエラビア・ミクロスポラ（Thielavia microspora）、チエラビア・オビスポラ（Thielavia ovispora）、チエラビア・ペルビアナ（Thielavia peruviana）、チエラビア・スペデドニウム（Thielavia spededonium）、チエラビア・セトーサ（Thielavia setosa）、チエラビア・スブテルモフィラ（Thielavia subthermophila）、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンギ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギプラチアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）、又はトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）チオラーゼである。
【０１０９】
本発明の実施に用いることのできる他のチオラーゼポリペプチドとしては、例えば大腸菌チオラーゼ（NP_416728, Martin et aI., Nat. Biotechnology 21 :796-802 (2003)）、及びＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）チオラーゼ（NP_015297, Hiser et aI., J. BioI. Chem. 269:31383 -31389 (1994)）、Ｃ．パストゥリアヌム（C. pasteurianum）チオラーゼ（例えば、protein ID ABAI8857.l）、Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）チオラーゼ（例えば、protein ID EAP59904.1又はEAP59331.1）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）チオラーゼ（例えば、protein ID ABG86544.l, ABG83108.l）、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium diflicile）チオラーゼ（例えば、protein ID CAJ67900.1又はZP _01231975.1）、サーモアナエロバクター・サーモサッカロリチカム（Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum）チオラーゼ（例えば、protein ID CAB07500.1）、サーモアナエロバクター・テングコンジェンシス（Thermoanaerobacter tengcongensis）チオラーゼ（例えば、A.L\.M23825.1）、カルボキシドテルムス・ヒドロゲノフォルマンス（Carboxydothermus hydrogenoformans）チオラーゼ（例えば、protein ID ABB13995.l）、デスルホトマクルム・レデューセンス（Desulfotomaculum reducens）ＭＩ−ｌチオラーゼ（例えば、protein ID EAR45123.1）、又はカンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）チオラーゼ（例えば、protein ID BAA02716.1又はBAA02715.1）が挙げられる。
【０１１０】
前述の種について、本発明は、知られている種名にかかわらず、完全及び不完全な状態の双方、並びに分類学上の同等物、例えば、アナモルフを含むことは理解される。当業者は、適切な同等物の同一性を容易に認識する。
【０１１１】
これらの種の株は、公の多くの菌株保存機関、例えば、American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), and Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL)から容易に入手できる。
【０１１２】
前記チオラーゼはまた、上述のプローブを用いて、天然（例えば、土壌、堆肥、水等）から単離される微生物を含む他の起源、又は天然素材（例えば、土壌、堆肥、水等）から直接得られるＤＮＡサンプルから同定され、得られてもよい。自然の生息地から微生物及びＤＮＡを単離するための技術は、当該技術分野において知られている。チオラーゼをコードするポリヌクレオチドは、別の微生物のゲノム若しくはｃＤＮＡライブラリー、又は混合されたＤＮＡサンプルを同様にスクリーニングすることにより生成されてもよい。一度チオラーゼをコードするポリヌクレオチドが本明細書に記載されるような好適なプローブを用いて検出されると、前記配列は、当業者に知られている技術（例えばJ. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照のこと）を用いることにより単離又はクローニングされてもよい。
【０１１３】
ＣｏＡ−トランスフェラーゼ及びＣｏＡ−トランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド
本発明では、ＣｏＡ−トランスフェラーゼは、本発明の実施に好適である任意のＣｏＡ−トランスフェラーゼであり得る。態様によっては、前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼは、ＥＣ  ２．８．３．９のアセトアセチル−ＣｏＡ：アセテート／ブチレートＣｏＡトランスフェラーゼである。態様によっては、前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼは、ＥＣ  ３．１．２．１１のアセトアセチル−ＣｏＡヒドラーゼである。態様によっては、前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼは、アセトアセチル−ＣｏＡとアセテートをアセトアセテートとアセチル−ＣｏＡに変換するアセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼである。態様によっては、前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼは、スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼである。一つの態様では、前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼは、増加した量のアセトアセテートが生産される培養条件下で過剰発現するＣｏＡ−トランスフェラーゼである。
【０１１４】
本明細書に記載される組み換え宿主細胞及び方法の一つの態様では、前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼは、ＣｏＡ−トランスフェラーゼ活性を有するタンパク質複合体であって、ここでＣｏＡ−トランスフェラーゼ複合体をコードする１又は複数の（いくつかの）異種のポリヌクレオチドが第一のポリペプチドサブユニットをコードする第一の異種のポリヌクレオチド、及び第二のポリペプチドサブユニットをコードする第二のポリヌクレオチドを含む。一つの態様では、タンパク質複合体は、ヘテロマーのタンパク質複合体であって、第一のポリペプチドサブユニットと第二のポリペプチドサブユニットが、異なるアミノ酸配列を含む、タンパク質複合体である。
【０１１５】
一つの態様では、第一のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチド、及び第二のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチドは、単一の異種のポリヌクレオチドに含まれる。別の態様では、第一のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチド、及び第二のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチドは、別々の異種のポリヌクレオチドに含まれる。ＣｏＡ−トランスフェラーゼ及び他のポリペプチドに関する核酸コンストラクトの拡張された議論は、本明細書に記載される。
【０１１６】
本明細書に記載される組み換え宿主細胞及び方法の一つの態様では、前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼは、第一のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチド、及び第二のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、ＣｏＡ−トランスフェラーゼ活性を有するタンパク質複合体であって、
前記第一のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号６、１２、３７、又は４１の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号４、５、１０、１１、３６、若しくは４０の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号４、５、１０、１１、３６、又は４０の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択され、
前記第二のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号９、１５、３９、又は４３の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号７、８、１３、１４、３８、若しくは４２の成熟ポリペプチドコーディング配列又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号７、８、１３、１４、３８、又は４２の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択される、タンパク質複合体である。
当業者に理解されるように、場合によっては、第一及び第二のポリペプチドサブユニットは、上記に記載の１超の選択肢（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の下に限定されてもよい。
【０１１７】
本明細書に記載される組み換え宿主細胞及び方法の一つの態様では、前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼは、第一のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチド、及び第二のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質複合体であって、
前記第一のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号６の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号４若しくは５の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号４又は５の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択され、
前記第二のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号９の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号７若しくは８の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号７又は８の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択される、タンパク質複合体である。
【０１１８】
本明細書に記載される組み換え宿主細胞及び方法の一つの態様では、前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼは、第一のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチド、及び第二のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質複合体であって、
前記第一のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号１２の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号１０若しくは１１の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号１０又は１１の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択され、
前記第二のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号１５の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号１３若しくは１４の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号１３又は１４の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択される、タンパク質複合体である。
【０１１９】
本明細書に記載される組み換え宿主細胞及び方法の一つの態様では、前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼは、第一のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチド、及び第二のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質複合体であって、
前記第一のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号３７の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号３６の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号３６の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択され、
前記第二のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号３９の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号３８の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号３８の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択される、タンパク質複合体である。
【０１２０】
本明細書に記載される組み換え宿主細胞及び方法の一つの態様では、前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼは、第一のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチド、及び第二のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質複合体であって、
前記第一のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号４１の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号４０の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号４０の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択され、
前記第二のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号４３の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号４２の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号４２の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択される、タンパク質複合体である。
【０１２１】
一つの態様では、第一のポリペプチドサブユニットが、配列番号６、１２、３７、又は４１の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第二のポリペプチドサブユニットが、配列番号９、１５、３９、又は４３の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一つの態様では、第一のポリペプチドサブユニットが、配列番号６、１２、３７、又は４１と１０アミノ酸以下、例えば５アミノ酸以下、４アミノ酸以下、３アミノ酸以下、２アミノ酸以下、又は１アミノ酸以下異なるアミノ酸配列を含み、第二のポリペプチドサブユニットが、配列番号９、１５、３９、又は４３と１０アミノ酸以下、例えば５アミノ酸以下、４アミノ酸以下、３アミノ酸以下、２アミノ酸以下、又は１アミノ酸以下異なるアミノ酸配列を含む。
【０１２２】
一つの態様では、第一のポリペプチドサブユニットが、配列番号６の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第二のポリペプチドサブユニットが、配列番号９の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１２３】
一つの態様では、第一のポリペプチドサブユニットが、配列番号１２の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第二のポリペプチドサブユニットが、配列番号１５の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１２４】
一つの態様では、第一のポリペプチドサブユニットが、配列番号３７の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第二のポリペプチドサブユニットが、配列番号３９の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１２５】
一つの態様では、第一のポリペプチドサブユニットが、配列番号４１の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第二のポリペプチドサブユニットが、配列番号４３の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１２６】
一つの態様では、第一のポリペプチドサブユニットは、配列番号６、１２、３７、４１のアミノ酸配列、これらの対立遺伝子変異体、又は前述のフラグメントを含む、あるいはからなり；第二のポリペプチドサブユニットは、配列番号９、１５、３９、４３のアミノ酸配列、これらの対立遺伝子変異体、又は前述のフラグメントを含む、あるいはからなる。別の態様では、第一のポリペプチドサブユニットは、配列番号６のアミノ酸配列を含み；第二のポリペプチドサブユニットは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。別の態様では、第一のポリペプチドサブユニットは、配列番号９のアミノ酸配列を含み；第二のポリペプチドサブユニットは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。本明細書に記載の配列番号９の態様によっては、配列番号９のアミノ酸１は、バリン又はメチオニンでもよい。別の態様では、第一のポリペプチドサブユニットは、配列番号３７のアミノ酸配列を含み；第二のポリペプチドサブユニットは、配列番号３９のアミノ酸配列を含む。別の態様では、第一のポリペプチドサブユニットは、配列番号４１のアミノ酸配列を含み；第二のポリペプチドサブユニットは、配列番号４３のアミノ酸配列を含む。
【０１２７】
一つの態様では、第一のポリペプチドサブユニットは、配列番号４、５、１０、１１、３６、４０の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、第二のポリペプチドサブユニットは、配列番号７、８、１３、１４、３８、４２の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる（J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989、上記）。
【０１２８】
一つの態様では、第一のポリペプチドサブユニットは、配列番号４若しくは５の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、第二のポリペプチドサブユニットは、配列番号７若しくは８の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１２９】
一つの態様では、第一のポリペプチドサブユニットは、配列番号１０若しくは１１の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、第二のポリペプチドサブユニットは、配列番号１３若しくは１４の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１３０】
一つの態様では、第一のポリペプチドサブユニットは、配列番号３６の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、第二のポリペプチドサブユニットは、配列番号３８の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１３１】
一つの態様では、第一のポリペプチドサブユニットは、配列番号４０の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、第二のポリペプチドサブユニットは、配列番号４２の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１３２】
一つの態様では、第一のポリペプチドサブユニットは、配列番号４、５、１０、１１、３６、又は４０のサブ配列によりコードされ；そして／あるいは第二のポリペプチドサブユニットは、配列番号７、８、１３、１４、３８、又は４２のサブ配列によりコードされ、ここで第一のポリペプチドサブユニットは、第二のポリペプチドサブユニットと一緒にＣｏＡ−トランスフェラーゼ活性（例えば、スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ活性又はアセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性）を有するタンパク質複合体を形成する。
【０１３３】
配列番号４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、３６、３８、４０、若しくは４２のポリヌクレオチド；又はこれらのサブ配列；及び配列番号６、９、１２、１５、３７、３９、４１、４３のコードされたアミノ酸配列；又はこれらのフラグメントを、上述のように、異なる属又は種の株からのポリペプチドサブユニットをコードするＤＮＡを同定、及びクローニングするための核酸プローブを設計するために用いることができる。かかるプローブは、本発明に含まれる。かかる他の生物から調製されたゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーは、上述のように、上述のプローブとハイブリダイズし、ポリペプチドサブユニットをコードするＤＮＡについてスクリーニングされてもよい。
【０１３４】
一つの態様では、前記核酸プローブは、配列番号４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、３６、３８、４０、又は４２である。別の態様では、前記核酸プローブは、配列番号６、９、１２、１５、３７、３９、４１、４３をコードするポリヌクレオチド配列、又はこれらのサブ配列である。別の態様では、前記核酸プローブは、大腸菌ＤＳＭ  ２４１２２中のプラスミドｐＴＲＧＵ６０に含まれる成熟ポリペプチドコーディング配列であって、スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質複合体のポリペプチドサブユニットをコードする、成熟ポリペプチドコーディングである。別の態様では、前記核酸プローブは、大腸菌ＤＳＭ  ２４１２３中のプラスミドｐＴＲＧＵ６１に含まれる成熟ポリペプチドコーディング配列であって、スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質複合体のポリペプチドサブユニットをコードする、成熟ポリペプチドコーディング配列である。
【０１３５】
少なくとも１００ヌクレオチド長の長いプローブについて、極めて低〜極めて高ストリンジェンシー条件及び洗浄条件は上述のように定義される。約１５ヌクレオチド長〜約７０ヌクレオチドヌクレオチド長の短いプローブについて、ストリンジェンシー条件及び洗浄条件は上述のように定義される。
【０１３６】
別の態様では、第一のポリペプチドサブユニットが、配列番号４、５、１０、１１、３６、又は４０の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされ；第二のポリペプチドサブユニットが、配列番号７、８、１３、１４、３８、又は４２の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１３７】
別の態様では、第一のポリペプチドサブユニットが、配列番号４又は５の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされ、第二のポリペプチドサブユニットが、配列番号７又は８の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１３８】
別の態様では、第一のポリペプチドサブユニットが、配列番号１０又は１１の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされ、第二のポリペプチドサブユニットが、配列番号１３又は１４の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１３９】
別の態様では、第一のポリペプチドサブユニットは、大腸菌ＤＳＭ  ２４１２２中のプラスミドｐＴＲＧＵ６０に含まれる成熟ポリペプチドコーディング配列によりコードされ；そして／あるいは第二のポリペプチドサブユニットは、大腸菌ＤＳＭ  ２４１２３中のプラスミドｐＴＲＧＵ６１に含まれる成熟ポリペプチドコーディング配列によりコードされる。
【０１４０】
別の態様では、第一のポリペプチドサブユニットが、配列番号３６の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされ、第二のポリペプチドサブユニットが、配列番号３８の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１４１】
別の態様では、第一のポリペプチドサブユニットが、配列番号４０の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされ；第二のポリペプチドサブユニットが、配列番号４２の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１４２】
別の態様では、上述のように、第一のポリペプチドサブユニットが、配列番号６、１２、３７、４１の成熟ポリペプチドの１又は複数の（いくつかの）アミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む変異体であり；そして／あるいは第二のポリペプチドサブユニットが、配列番号９、１５、３９、又は４３の成熟ポリペプチドの１又は複数の（いくつかの）アミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む変異体である。態様によっては、配列番号６、９、１２、１５、３７、３９、４１、又は４３の成熟ポリペプチドのアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入の合計数は、１０以下、例えば１、２、３、４、５、６、７、８又は９以下である。態様によっては、配列番号６、９、１２、１５、３７、３９、４１、又は４３の成熟ポリペプチドのアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入の合計数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。
【０１４３】
別の態様では、第一のポリペプチドサブユニットは、配列番号６、１２、３７、若しくは４１のフラグメントであり、及び／又は第二のポリペプチドサブユニットは、配列番号９、１５、３９、若しくは４３のフラグメントであり、ここで第一及び第二のポリペプチドサブユニットは、ＣｏＡ−トランスフェラーゼ活性（例えば、スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ活性又はアセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性）を有するタンパク質複合体を一緒に形成する。
【０１４４】
ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（及びこれらのポリペプチドサブユニット）はまた、上述のように、融合ポリペプチド又は切断可能な融合ペプチドを含むことができる。
【０１４５】
ＣｏＡ−トランスフェラーゼ、及びこれらのポリペプチドサブユニットをコードするポリヌクレオチドを単離又はクローニングするために用いられる技術は、上記に記載される。
【０１４６】
前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（及びこれらのポリペプチドサブユニット）は、微生物の任意の属から得られてもよい。一つの態様では、前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼは、本明細書に記載の任意の微生物から得られる細菌、酵母、又は真菌のＣｏＡ−トランスフェラーゼでもよい。一つの態様では、前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼは、バチルス属スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ、例えば配列番号６の第一のポリペプチドサブユニット、及び配列番号９の第二のポリペプチドサブユニットを有するバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ；又は配列番号１２の第一のポリペプチドサブユニット、及び配列番号１５の第二のポリペプチドサブユニットを有するバチルス・モジャベンシス（Bacillus mojavensis）スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼである。別の態様では、前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼは、大腸菌アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、例えば配列番号３７の第一のポリペプチドサブユニット、及び配列番号３７の第二のポリペプチドサブユニットを有する大腸菌アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼである。別の態様では、前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼは、Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、例えば配列番号４１の第一のポリペプチドサブユニット、及び配列番号４３の第二のポリペプチドサブユニットを有するＣ．アセトブチリカム  アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼである。
【０１４７】
本発明の実施に用いることのできる他のスクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼとしては、例えばヘリコパクター・ピロリ（Helicobacter pylori）スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ（YP_627417, YP_627418, Corthesy-Theulaz, et aI., J Biol Chem 272:25659-25667 (1997)）、及びヒト（Homo sapiens）スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ（NP_000427, NP-071403, Fukao, T., et aI., Genomics 68:144-151 (2000); Tanaka, H., et aI., Mol Hum Reprod 8:16-23 (2002)）が挙げられる。
【０１４８】
ＣｏＡトランスフェラーゼ（及びこれらのサブユニット）はまた、上述のように天然（例えば、土壌、堆肥、水等）から単離される微生物などの他の起源、又は天然素材（例えば、土壌、堆肥、水等）から直接得られるＤＮＡサンプルから同定され、得られてもよい。
【０１４９】
アセトアセテートデカルボキシラーゼ及びアセトアセテートデカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド
本発明では、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼは、本発明の実施に好適である任意のアセトアセテートデカルボキシラーゼであり得る。一つの態様では、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼは、増加した量のアセトンが生産される培養条件下で過剰発現するアセトアセテートデカルボキシラーゼである。
【０１５０】
本明細書に記載される組み換え宿主細胞及び方法の一つの態様では、アセトアセテートデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１８、４５、１１８、又は１２０の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアセトアセテートデカルボキシラーゼ；（ｂ）配列番号１６、１７、４４、１１７、若しくは１１９の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアセトアセテートデカルボキシラーゼ；及び（ｃ）配列番号１６、１７、４４、１１７、又は１１９の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるアセトアセテートデカルボキシラーゼから選択される。当業者に理解されるように、場合によっては、アセトアセテートデカルボキシラーゼは、上記に記載の１超の選択肢（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の下に限定されてもよい。
【０１５１】
一つの態様では、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼは、配列番号１８の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。一つの態様では、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼが、配列番号１８と１０アミノ酸以下、例えば５アミノ酸以下、４アミノ酸以下、３アミノ酸以下、２アミノ酸以下、又は１アミノ酸以下異なるアミノ酸配列を含む。
【０１５２】
一つの態様では、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼは、配列番号１８のアミノ酸配列、これらの対立遺伝子変異体、又は前述のフラグメントを含む、あるいはからなる。別の態様では、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼは、配列番号１８の成熟ポリペプチドを含む。一つの態様では、配列番号１８の成熟ポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸１〜２４６を含む。
【０１５３】
一つの態様では、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼは、配列番号４５の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。一つの態様では、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼが、配列番号４５と１０アミノ酸以下、例えば５アミノ酸以下、４アミノ酸以下、３アミノ酸以下、２アミノ酸以下、又は１アミノ酸以下異なるアミノ酸配列を含む。
【０１５４】
一つの態様では、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼは、配列番号４５のアミノ酸配列、これらの対立遺伝子変異体、又は前述のフラグメントを含む、あるいはからなる。別の態様では、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼは、配列番号４５の成熟ポリペプチドを含む。一つの態様では、配列番号４５の成熟ポリペプチドは、配列番号４５のアミノ酸１〜２５９を含む。
【０１５５】
一つの態様では、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼは、配列番号１１８の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。一つの態様では、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼが、配列番号１１８と１０アミノ酸以下、例えば５アミノ酸以下、４アミノ酸以下、３アミノ酸以下、２アミノ酸以下、又は１アミノ酸以下異なるアミノ酸配列を含む。
【０１５６】
一つの態様では、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼは、配列番号１１８のアミノ酸配列、これらの対立遺伝子変異体、又は前述のフラグメントを含む、あるいはからなる。別の態様では、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼは、配列番号１１８の成熟ポリペプチドを含む。
【０１５７】
一つの態様では、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼは、配列番号１２０の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。一つの態様では、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼが、配列番号１２０と１０アミノ酸以下、例えば５アミノ酸以下、４アミノ酸以下、３アミノ酸以下、２アミノ酸以下、又は１アミノ酸以下異なるアミノ酸配列を含む。
【０１５８】
一つの態様では、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼは、配列番号１２０のアミノ酸配列、これらの対立遺伝子変異体、又は前述のフラグメントを含む、あるいはからなる。別の態様では、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼは、配列番号１２０の成熟ポリペプチドを含む。
【０１５９】
一つの態様では、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼは、配列番号１６若しくは１７の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる（J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989、上記）。一つの態様では、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼは、配列番号１６又は１７のサブ配列によりコードされ、ここで前記アセトアセテートデカルボキシラーゼは、アセトアセテートデカルボキシラーゼ活性を有する。
【０１６０】
一つの態様では、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼは、配列番号４４の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。一つの態様では、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼは、配列番号４４のサブ配列によりコードされ、ここで前記アセトアセテートデカルボキシラーゼは、アセトアセテートデカルボキシラーゼ活性を有する。
【０１６１】
一つの態様では、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼは、配列番号１１７の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。一つの態様では、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼは、配列番号１１７のサブ配列によりコードされ、ここで前記アセトアセテートデカルボキシラーゼは、アセトアセテートデカルボキシラーゼ活性を有する。
【０１６２】
一つの態様では、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼは、配列番号１１９の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。一つの態様では、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼは、配列番号１１９のサブ配列によりコードされ、ここでアセトアセテートデカルボキシラーゼは、アセトアセテートデカルボキシラーゼ活性を有する。
【０１６３】
配列番号１６、１７、４４、１１７、若しくは１１９のポリヌクレオチド；又はこれらのサブ配列；及び配列番号１８、４５、１１８、若しくは１２０のアミノ酸配列；又はこれらのフラグメントを、上述のように、異なる属又は種の株からのアセトアセテートデカルボキシラーゼをコードするＤＮＡを同定、及びクローニングするための核酸プローブを設計するために用いることができる。かかるプローブは、本発明に含まれる。かかる他の生物から調製されたゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーは、上述のように、上述のプローブとハイブリダイズし、アセトアセテートデカルボキシラーゼをコードするＤＮＡについてスクリーニングされてもよい。
【０１６４】
一つの態様では、前記核酸プローブは、配列番号１６、１７、４４、１１７、又は１１９である。一つの態様では、前記核酸プローブは、配列番号１６である。一つの態様では、前記核酸プローブは、配列番号１７である。一つの態様では、前記核酸プローブは、配列番号４４である。一つの態様では、前記核酸プローブは、配列番号１７である。一つの態様では、前記核酸プローブは、配列番号１１７である。一つの態様では、前記核酸プローブは、配列番号１７である。一つの態様では、前記核酸プローブは配列番号、１１９である。別の態様では、前記核酸プローブは、配列番号１８をコードするポリヌクレオチド配列、又はこれのサブ配列である。別の態様では、前記核酸プローブは、配列番号４５をコードするポリヌクレオチド配列、又はこれのサブ配列である。別の態様では、前記核酸プローブは、配列番号１１８をコードするポリヌクレオチド配列、又はこれのサブ配列である。別の態様では、前記核酸プローブは、配列番号１２０をコードするポリヌクレオチド配列、又はこれのサブ配列である。
【０１６５】
少なくとも１００ヌクレオチド長の長いプローブについて、極めて低〜極めて高ストリンジェンシー条件及び洗浄条件は上述のように定義される。約１５ヌクレオチド長〜約７０ヌクレオチドヌクレオチド長の短いプローブについて、ストリンジェンシー条件及び洗浄条件は上述のように定義される。
【０１６６】
別の態様では、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼは、アセトアセテートデカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号１６又は１７の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１６７】
別の態様では、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼは、アセトアセテートデカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号４４の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１６８】
別の態様では、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼは、アセトアセテートデカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号１１７の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１６９】
別の態様では、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼは、アセトアセテートデカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号１１９の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１７０】
別の態様では、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼは、上述のように、配列番号１８、４５、１１８、又は１２０の成熟ポリペプチドの１又は複数の（いくつかの）アミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む変異体である。態様によっては、配列番号１８又は４５の成熟ポリペプチドのアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入の合計数は、１０以下、例えば１、２、３、４、５、６、７、８又は９以下である。別の態様では、配列番号１８、４５、１１８、又は１２０の成熟ポリペプチドのアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入の合計数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。
【０１７１】
別の態様では、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼは、配列番号１８、４５、１１８、又は１２０のフラグメントであって、アセトアセテートデカルボキシラーゼ活性を有するフラグメントである。一つの態様では、前記フラグメント中のアミノ酸残基の数は、配列番号１８、４５、１１８、又は１２０中のアミノ酸残基の数の少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％である。
【０１７２】
アセトアセテートデカルボキシラーゼはまた、上述のように、融合ポリペプチド又は切断可能な融合ペプチドを含むことができる。
【０１７３】
アセトアセテートデカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドを単離又はクローニングするために用いられる技術は、上記に記載される。
【０１７４】
前記アセトアセテートデカルボキシラーゼは、微生物の任意の属から得られてもよい。一つの態様では、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼは、本明細書に記載の任意の微生物から得られる細菌、酵母、又は真菌のアセトアセテートデカルボキシラーゼでもよい。別の態様では、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼは、クロストリジウム属アセトアセテートデカルボキシラーゼ、例えば配列番号１８のクロストリジウム・ベイジェリンキー（Clostridium beijerinckii）アセトアセテートデカルボキシラーゼ、又は配列番号４５のクロストリジウム・アセトブチリクム（Clostridium acetobutylicum）アセトアセテートデカルボキシラーゼである。別の態様では、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼは、ラクトバチルス属アセトアセテートデカルボキシラーゼ、例えば配列番号１１８のラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salvarius）アセトアセテートデカルボキシラーゼ、又は配列番号１２０のラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）アセトアセテートデカルボキシラーゼである。
【０１７５】
本発明の実施に用いルことのできる他のアセトアセテートデカルボキシラーゼとしては、例えばクロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム（Clostridium saccharoperbutylacetonicum）アセトアセテートデカルボキシラーゼ（AAP42566.1, Kosaka, et aI., Biosci. Biotechnol Biochem. 71:58-68 (2007)）が挙げられる。
【０１７６】
アセトアセテートデカルボキシラーゼはまた、上述のように天然（例えば、土壌、堆肥、水等）から単離される微生物を含む他の起源、又は天然素材（例えば、土壌、堆肥、水等）から直接得られるＤＮＡサンプルから同定され、得られてもよい。
【０１７７】
イソプロパノールデヒドロゲナーゼ及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド
本発明では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、本発明の実施に好適である任意のイソプロパノールデヒドロゲナーゼあり得る。一つの態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、増加した量のイソプロパノールが生産される培養条件下で過剰発現するイソプロパノールデヒドロゲナーゼである。
【０１７８】
本明細書に記載される組み換え宿主細胞及び方法の一つの態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号２１、２４、４７、又は１２２の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するイソプロパノールデヒドロゲナーゼ；（ｂ）配列番号１９、２０、２２、２３、４６、若しくは１２１の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるイソプロパノールデヒドロゲナーゼ；及び（ｃ）配列番号１９、２０、２２、２３、４６、又は１２１の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるイソプロパノールデヒドロゲナーゼから選択される。当業者に理解されるように、場合によっては、イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、上記に記載の１超の選択肢（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の下に限定されてもよい。
【０１７９】
一つの態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、配列番号２１の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。別の態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、配列番号２４の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。別の態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、配列番号４７の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。別の態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、配列番号１２２の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。
【０１８０】
一つの態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、配列番号２１、２４、４７、１２２のアミノ酸配列、これらの対立遺伝子変異体、又は前述のフラグメントを含む、あるいはからなる。別の態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、配列番号２１の成熟ポリペプチドを含む。一つの態様では、配列番号２１の成熟ポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸１〜３５１である。別の態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、配列番号２４の成熟ポリペプチドを含む。一つの態様では、配列番号２４の成熟ポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸１〜３５２である。別の態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、配列番号４７の成熟ポリペプチドを含む。一つの態様では、配列番号４７の成熟ポリペプチドは、配列番号４７のアミノ酸１〜３５６である。別の態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、配列番号１２２の成熟ポリペプチドを含む。
【０１８１】
一つの態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、配列番号１９、２０、２２、２３、４６、若しくは１２１の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる（J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989、上記）。一つの態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、配列番号１９、２０、２２、２３、４６、又は１２１のサブ配列によりコードされ、ここで前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、イソプロパノールデヒドロゲナーゼ活性を有する。
【０１８２】
一つの態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、配列番号１９若しくは２０の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。一つの態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、配列番号１９又は２０のサブ配列によりコードされ、ここで前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、イソプロパノールデヒドロゲナーゼ活性を有する。
【０１８３】
一つの態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、配列番号２２若しくは２３の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。一つの態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、配列番号２２又は２３のサブ配列によりコードされ、ここで前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、イソプロパノールデヒドロゲナーゼ活性を有する。
【０１８４】
一つの態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、配列番号４６の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。一つの態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、配列番号４６のサブ配列によりコードされ、ここで前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、イソプロパノールデヒドロゲナーゼ活性を有する。
【０１８５】
一つの態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、配列番号１２１の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。一つの態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、配列番号１２１のサブ配列によりコードされ、ここで前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、イソプロパノールデヒドロゲナーゼ活性を有する。
【０１８６】
配列番号１９、２０、２２、２３、４６若しくは１２１のポリヌクレオチド；又はこれらのサブ配列；及び配列番号２１、２４、４７若しくは１２２のアミノ酸配列；又はこれらのフラグメントを、上述のように、異なる属又は種の株からのイソプロパノールデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを同定、及びクローニングするための核酸プローブを設計するために用いることができる。かかるプローブは、本発明に含まれる。かかる他の生物から調製されたゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーは、上述のように、上述のプローブとハイブリダイズし、イソプロパノールデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡについてスクリーニングされてもよい。
【０１８７】
一つの態様では、前記核酸プローブは、配列番号１９、２０、２２、２３、４６、又は１２１の成熟ポリペプチドコーディング配列である。一つの態様では、前記核酸プローブは、配列番号１９又は２０の成熟ポリペプチドコーディング配列である。別の態様では、前記核酸プローブは、配列番号１９又は２０である。別の態様では、前記核酸プローブは、配列番号２２又は２３の成熟ポリペプチドコーディング配列である。一つの態様では、前記核酸プローブは、配列番号２２又は２３の成熟ポリペプチドコーディング配列である。一つの態様では、前記核酸プローブは、配列番号４６の成熟ポリペプチドコーディング配列である。別の態様では、前記核酸プローブは、配列番号４６である。一つの態様では、前記核酸プローブは、配列番号１２１の成熟ポリペプチドコーディング配列である。別の態様では、前記核酸プローブは、配列番号１２１である。別の態様では、前記核酸プローブは、配列番号２１、２４、４７、１２２をコードするポリヌクレオチド配列又はこのサブ配列である。別の態様では、前記核酸プローブは、配列番号２１をコードするポリヌクレオチド配列又はこのサブ配列である。別の態様では、前記核酸プローブは、配列番号２４をコードするポリヌクレオチド配列又はこのサブ配列である。別の態様では、前記核酸プローブは、配列番号４７をコードするポリヌクレオチド配列又はこのサブ配列である。別の態様では、前記核酸プローブは、配列番号１２２をコードするポリヌクレオチド配列又はこのサブ配列である。
【０１８８】
少なくとも１００ヌクレオチド長の長いプローブについて、極めて低〜極めて高ストリンジェンシー条件及び洗浄条件は上述のように定義される。約１５ヌクレオチド長〜約７０ヌクレオチドヌクレオチド長の短いプローブについて、ストリンジェンシー条件及び洗浄条件は上述のように定義される。
【０１８９】
別の態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、配列番号１９、２０、２２、２３、４６、又は１２１の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。別の態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、配列番号１９又は２０の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。別の態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、配列番号２２又は２３の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。別の態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、配列番号４６の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。別の態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、配列番号１２１の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１９０】
別の態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、上述のように、配列番号２１、２４、４７、又は１２２の成熟ポリペプチドの１又は複数の（いくつかの）アミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む変異体である。一つの態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、配列番号２１の成熟ポリペプチドの１又は複数の（いくつかの）アミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む変異体である。別の態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、配列番号２４の成熟ポリペプチドの１又は複数の（いくつかの）アミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む変異体である。別の態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、配列番号４７の成熟ポリペプチドの１又は複数の（いくつかの）アミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む変異体である。別の態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、配列番号１２２の成熟ポリペプチドの１又は複数の（いくつかの）アミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む変異体である。態様によっては、配列番号２１、２４、４７又は１２２の成熟ポリペプチドのアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入の合計数は、１０以下、例えば１、２、３、４、５、６、７、８又は９以下である。態様によっては、配列番号２１、２４、４７又は１２２の成熟ポリペプチドのアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入の合計数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。
【０１９１】
別の態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、配列番号２１、２４、４７、又は１２２のフラグメントであり、前記フラグメントは、イソプロパノールデヒドロゲナーゼ活性を有する。一つの態様では、前記フラグメント中のアミノ酸残基の数は、配列番号２１、２４、４７、又は１２２中のアミノ酸残基の数の少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％である。
【０１９２】
イソプロパノールデヒドロゲナーゼはまた、上述のように、融合ポリペプチド又は切断可能な融合ペプチドを含むことができる。
【０１９３】
イソプロパノールデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを単離又はクローニングするために用いられる技術は、上記に記載される。
【０１９４】
前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、微生物の任意の属から得られてもよい。一つの態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、本明細書に記載の任意の微生物から得られる細菌、酵母、又は真菌のイソプロパノールデヒドロゲナーゼでもよい。別の態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、クロストリジウム属イソプロパノールデヒドロゲナーゼ、例えば配列番号２１のクロストリジウム・ベイジェリンキー（Clostridium beijerinckii）イソプロパノールデヒドロゲナーゼである。別の態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、サーモアナエロバクター属イソプロパノールデヒドロゲナーゼ、例えば配列番号２４のサーモアナエロバクター・エタノリカス（Thermoanaerobacter ethanolicus）イソプロパノールデヒドロゲナーゼである。別の態様では、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、ラクトバチルス属イソプロパノールデヒドロゲナーゼ、例えば配列番号４７のラクトバチルス・アントリ（Lactobacillus antri）イソプロパノールデヒドロゲナーゼ、又は配列番号１２２のラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）イソプロパノールデヒドロゲナーゼである。
【０１９５】
本発明の実施に用いることのできる他のデヒドロゲナーゼとしては、例えばサーモアナエロバクター・ブロッキイ（Thermoanaerobacter brockii）デヒドロゲナーゼ（P14941.1, Hanai et al., Appl. Environ. Microbiol. 73:7814-7818 (2007); Peretz et aI., Anaerobe 3:259-270 (1997)）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）デヒドロゲナーゼ（以前はアルカリゲネス・ユートロフス（Alcaligenes eutrophus)）(YP_299391.1, Steinbuchel and Schlegel et aI., Eur. J. Biochem. 141 :555-564 (1984)）、バークホルデリア属（Burkholderia）種ＡＩＵ  ６５２デヒドロゲナーゼ、及びフィトモナス属（Phytomonas）種デヒドロゲナーゼ（AAP39869.1, Uttaro and Opperdoes et al., Mol. Biochem. Parasitol. 85:213-219 (1997)）が挙げられる。
【０１９６】
イソプロパノールデヒドロゲナーゼはまた、上述のように天然（例えば、土壌、堆肥、水等）から単離される微生物を含む他の起源、又は天然素材（例えば、土壌、堆肥、水等）から直接得られるＤＮＡサンプルから同定され、得られてもよい。
【０１９７】
アルデヒドデヒドロゲナーゼ及びアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド
本発明では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、本発明の実施に好適である任意のアルデヒドデヒドロゲナーゼであり得る。一つの態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、増加した量のプロパナールが生産される培養条件下で過剰発現するアルデヒドデヒドロゲナーゼである。
【０１９８】
本明細書に記載される組み換え宿主細胞及び方法の一つの態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、（ａ）配列番号２７、３０、３３、５１、５４、５７、６０又は６３の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｂ）配列番号２５、２６、２８、２９、３１、３２、４８、４９、５０、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１若しくは６２の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアルデヒドデヒドロゲナーゼ；及び（ｃ）配列番号２５、２６、２８、２９、３１、３２、４８、４９、５０、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、又は６２の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるアルデヒドデヒドロゲナーゼから選択される。当業者に理解されるように、場合によっては、アルデヒドデヒドロゲナーゼは、上記に記載の１超の選択肢（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の下に限定されてもよい。
【０１９９】
一つの態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号２７の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。
【０２００】
別の態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号３０の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。
【０２０１】
別の態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号３３の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。
【０２０２】
別の態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号５１の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。
【０２０３】
別の態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号５４の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。
【０２０４】
別の態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号５７の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。
【０２０５】
別の態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号６０の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。
【０２０６】
別の態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号６３の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。
【０２０７】
一つの態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号２７、３０、３３、５１、５４、５７、６０、若しくは６３のアミノ酸配列、これらの対立遺伝子変異体、又は前述のフラグメントを含む、あるいはからなる。
【０２０８】
一つの態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号２５、２６、２８、２９、３１、３２、４８、４９、５０、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、若しくは６２の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖（例えばJ. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatus、上記を参照のこと）と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２０９】
一つの態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号２５若しくは２６の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２１０】
別の態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号２８若しくは２９の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２１１】
別の態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号３１若しくは３２の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２１２】
別の態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号４８、４９若しくは５０の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２１３】
別の態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号５２若しくは５３の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２１４】
別の態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号５５若しくは５６の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２１５】
別の態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号５８若しくは５９の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２１６】
別の態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号６１若しくは６２の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２１７】
一つの態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号２５、２６、２８、２９、３１、３２、４８、４９、５０、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、又は６２のサブ配列によりコードされ；ここで、前記サブ配列は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【０２１８】
配列番号２５、２６、２８、２９、３１、３２、４８、４９、５０、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、若しくは６２のポリヌクレオチド；又はこれらのサブ配列；及び配列番号２７、３０、３３、５１、５４、５７、６０、若しくは６３のアミノ酸配列；又はこれらのフラグメントを、上述のように、異なる属又は種の株からのアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを同定、及びクローニングするための核酸プローブを設計するために用いることができる。かかるプローブは、本発明に含まれる。かかる他の生物から調製されたゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーは、上述のように、上述のプローブとハイブリダイズし、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡについてスクリーニングされてもよい。
【０２１９】
少なくとも１００ヌクレオチド長の長いプローブについて、極めて低〜極めて高ストリンジェンシー条件及び洗浄条件は上述のように定義される。約１５ヌクレオチド長〜約７０ヌクレオチドヌクレオチド長の短いプローブについて、ストリンジェンシー及び洗浄条件は上述のように定義される。
【０２２０】
一つの態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号２５、２６、２８、２９、３１、３２、４８、４９、５０、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、又は６２の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２２１】
一つの態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号２５又は２６の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２２２】
一つ態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号２８又は２９の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２２３】
一つ態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号３１又は３２の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２２４】
一つ態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号４８、４９又は５０の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２２５】
一つ態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号５２又は５３の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２２６】
一つ態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号５５又は５６の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２２７】
一つ態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号５８又は５９の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２２８】
一つ態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号６１又は６２の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２２９】
一つの態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、上述のように、配列番号２７、３０、３３、５１、５４、５７、６０、又は６３の成熟ポリペプチドの１又は複数の（いくつかの）アミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む変異体である。態様によっては、配列番号２７、３０、３３、５１、５４、５７、６０、又は６３の成熟ポリペプチドのアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入の合計数は、１０以下、例えば１、２、３、４、５、６、７、８又は９以下である。別の態様では、配列番号２７、３０、３３、５１、５４、５７、６０、又は６３の成熟ポリペプチドのアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入の合計数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。
【０２３０】
別の態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号２７、３０、３３、５１、５４、５７、６０、又は６３のフラグメントであって、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するフラグメントである。一つの態様では、前記フラグメント中のアミノ酸残基の数は、配列番号２７、３０、３３、５１、５４、５７、６０又は６３中のアミノ酸残基の数の少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％である。
【０２３１】
前記アルデヒドデヒドロゲナーゼはまた、上述のように、融合ポリペプチド又は切断可能な融合ペプチドを含むことができる。
【０２３２】
アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを単離又はクローニングするために用いられる技術は、上記に記載される。
【０２３３】
前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、微生物の任意の属から得られてもよい。一つの態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、本明細書に記載の任意の微生物から得られる細菌、酵母、又は真菌のアルデヒドデヒドロゲナーゼでもよい。
【０２３４】
一つの態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、細菌のアルデヒドデヒドロゲナーゼである。例えば、グラム陽性細菌のポリペプチド、例えばバチルス属（Bacillus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、クロストリジウム属（Clostridium）、ゲオバチルス属（Geobacillus）、オセアノバチルス属（Oceanobacillus）若しくはプロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）のアルデヒドデヒドロゲナーゼ、又はグラム陰性細菌のポリペプチド、例えば大腸菌（E. coli）（Dawes et al., 1956, Biochim. Biophys. Acta, 22: 253、この内容は参照により本明細書に組み込まれる）、シュードモナス属（Pseudomonas）、サルモネラ属（Salmonella）、カンピロバクター属（Campylobacter）、ヘリコバクター属（Helicobacter）、フラボバクテリウム属（Flavobacterium）、フソバクテリウム属（Fusobacterium）、イリオバクター属（Ilyobacter）、ナイセリア属（Neisseria）、若しくはウレアプラズマ属（Ureaplasma）アルデヒドデヒドロゲナーゼでもよい。
【０２３５】
一つの態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、バチルス属アルデヒドデヒドロゲナーゼ、例えばバチルス・アルカロフィラス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・ファルマス（Bacillus firmus）、バチルス・ロータス（Bacillus lautus）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・プミラス（Bacillus pumilus）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、又はバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）アルデヒドデヒドロゲナーゼである。
【０２３６】
別の態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、ラクトバチルス属アルデヒドデヒドロゲナーゼ、例えばラクトバチルス・コリノイデス（Lactobacillus collinoides）アルデヒドデヒドロゲナーゼ（例えば、配列番号３０のラクトバチルス・コリノイデス  アルデヒドデヒドロゲナーゼ）である。
【０２３７】
別の態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、プロピオニバクテリウム属アルデヒドデヒドロゲナーゼ、例えばプロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Propionibacterium freudenreichii）アルデヒドデヒドロゲナーゼ（例えば、配列番号２７又は５１のプロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ  アルデヒドデヒドロゲナーゼ）である。
【０２３８】
別の態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、ロドシュードモナス属（Rhodopseudomonas）アルデヒドデヒドロゲナーゼ、例えばロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）アルデヒドデヒドロゲナーゼ（例えば、配列番号５４のロドシュードモナス・パルストリス  アルデヒドデヒドロゲナーゼ）である。
【０２３９】
別の態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、ロドバクター属アルデヒドデヒドロゲナーゼ、例えばロドバクター・カプスラータ（Rhodobacter capsulatus）アルデヒドデヒドロゲナーゼ（例えば、配列番号５７のロドバクター・カプスラータ  アルデヒドデヒドロゲナーゼ）である。
【０２４０】
別の態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、ロドスピリルム属（Rhodospirillum）アルデヒドデヒドロゲナーゼ、例えばロドスピリラム・ラブラム（Rhodospirillum rubrum）アルデヒドデヒドロゲナーゼ（例えば、配列番号６０のロドスピリラム・ラブラム  アルデヒドデヒドロゲナーゼ）である。
【０２４１】
別の態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、ユウバクテリウム属（Eubacterium）アルデヒドデヒドロゲナーゼ、例えばユウバクテリウム・ハリイ（Eubacterium hallii）アルデヒドデヒドロゲナーゼ（例えば、配列番号６３のユウバクテリウム・ハリイ  アルデヒドデヒドロゲナーゼ）である。
【０２４２】
別の態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、ストレプトコッカス属アルデヒドデヒドロゲナーゼ、例えばストレプトコッカス・エクイシミリス（Streptococcus equisimilis）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）、又はストレプトコッカス・エクィ（Streptococcus equi）亜種ズーエピデミカス（Zooepidemicus）アルデヒドデヒドロゲナーゼである。別の態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、ストレプトマイセス属アルデヒドデヒドロゲナーゼ、例えばストレプトマイセス・アクロモゲネス（Streptomyces achromogenes）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、又はストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）アルデヒドデヒドロゲナーゼである。
【０２４３】
別の態様では、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、クロストリジウム属アルデヒドデヒドロゲナーゼ、例えばクロストリジウム・ベイジェリンキイ（Clostridium beijerinckii）アルデヒドデヒドロゲナーゼ（例えば、配列番号３３のクロストリジウム・ベイジェリンキイ  アルデヒドデヒドロゲナーゼ）、又はクロストリジウム・クルイベリ（Clostridium kluyveri）アルデヒドデヒドロゲナーゼ（Burton et al., 1953, J. Biol. Chem., 202: 873、この内容は、参照により本明細書に組み込まれる）である。
【０２４４】
本発明の実施に用いることのできる他のアルデヒドデヒドロゲナーゼとしては、限定することなく、ロドコッカス・オパカス（Rhodococcus opacus）（GenBank Accession No. AP011115.1）、エントアメーバ・ディスパー（Entamoeba dispar）（GenBank Accession No. DS548207.1）、及びラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）（GenBank Accession No. ACHG01000187.1）が挙げられる。
【０２４５】
前記アルデヒドデヒドロゲナーゼはまた、ｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼ活性を含み、前記酵素は、プロピオニル−ＣｏＡをプロパナールに変換し、さらにプロパナールをｎ−プロパノールに還元することができる。アルコールデヒドロゲナーゼ活性及びアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するかかる多機能酵素の例としては、限定することなく、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）（GenBank Accession No. CR936503.1）、ジアルジア・インテスティナリス（Giardia intestinalis）（GenBank Accession No. U93353.1）、シュワネラ アマゾネンシス（Shewanella amazonensis）（GenBank Accession No. CP000507.1）、サーモシネココッカス・エロンガタス（Thermosynechococcus elongatus）（GenBank Accession No. BA000039.2）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）（GenBank Accession No. AE001438.3）、及びクロストリジウム・カルボキシディボランス（Clostridium carboxidivorans）ATCC No.BAA-624T（GenBank Accession No. ACVI01000101.1）が挙げられる。
【０２４６】
アルデヒドデヒドロゲナーゼはまた、上述のように天然（例えば、土壌、堆肥、水等）から単離される微生物を含む他の起源、又は天然素材（例えば、土壌、堆肥、水等）から直接得られるＤＮＡサンプルから同定され、得られてもよい。
【０２４７】
メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ及びメチルマロニル−ＣｏＡムターゼをコードするポリヌクレオチド
組み換え宿主細胞、及びこれらの使用の方法の態様によっては、宿主細胞は、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ活性を有する。態様によっては、前記宿主細胞は、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼをコードする１又は複数の（いくつかの）異種のポリヌクレオチドを含む。前記メチルマロニル−ＣｏＡムターゼは、本発明の実施に好適な任意のメチルマロニル−ＣｏＡムターゼでもよい。一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡムターゼは、増加した量のＲ−メチルマロニル−ＣｏＡが生産される培養条件下で過剰発現されるメチルマロニル−ＣｏＡムターゼである。
【０２４８】
一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡムターゼは、（ａ）配列番号９３の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するメチルマロニル−ＣｏＡムターゼ；（ｂ）配列番号７９若しくは８０の成熟ポリペプチドコーディング配列又はこれらの完全長相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるメチルマロニル−ＣｏＡムターゼ；及び（ｃ）配列番号７９又は８０の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるメチルマロニル−ＣｏＡムターゼから選択される。当業者に理解されるように、場合によっては、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼは、上記に記載の１超の選択肢（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の下に限定されてもよい。
【０２４９】
一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡムターゼは、配列番号９３の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、又はからなる。一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡムターゼが、配列番号９３の成熟ポリペプチドと１０アミノ酸以下、例えば５アミノ酸以下、４アミノ酸以下、３アミノ酸以下、２アミノ酸以下、又は１アミノ酸以下異なるアミノ酸配列を含む。
【０２５０】
一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡムターゼは、配列番号９３の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列、これらの対立遺伝子変異体、又はメチルマロニル−ＣｏＡムターゼ活性を有する前述のフラグメントを含む、あるいはからなる。別の態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡムターゼは、配列番号９３のアミノ酸配列を含む、あるいはからなる。別の態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡムターゼは、配列番号９３の成熟ポリペプチドを含む、あるいはからなる。
【０２５１】
一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡムターゼは、配列番号７９若しくは８０の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる（J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989、同上）。
【０２５２】
一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡムターゼは、配列番号７９又は８０の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２５３】
一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡムターゼは、配列番号７９又は８０、これらの成熟ポリペプチドコーディング配列、又は前述の変性したコーディング配列によりコードされる。一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡムターゼは、配列番号７９若しくは８０、又は前述の変性したコーディング配列によりコードされる。一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡムターゼは、配列番号７９又は８０の成熟ポリペプチドコーディング配列、又は前述の変性したコーディング配列によりコードされる。一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡムターゼは、配列番号７９若しくは８０のサブ配列、又はこれらの変性したコーディング配列によりコードされ、ここで前記サブ配列は、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【０２５４】
一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡムターゼは、上述のように、配列番号９３の成熟ポリペプチドの１又は複数の（いくつかの）アミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む変異体である。一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡムターゼは、上述のように、配列番号９３の１又は複数の（いくつかの）アミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む変異体である。一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡムターゼは、配列番号９３の成熟ポリペプチドの１又は複数の（いくつかの）アミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む変異体である。態様によっては、配列番号９３の成熟ポリペプチドのアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入の合計数は、１０以下、例えば１、２、３、４、５、６、７、８又は９以下である。
【０２５５】
別の態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡムターゼは、配列番号９３のフラグメントであって、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ活性を有するフラグメントである。一つの態様では、前記フラグメント中のアミノ酸残基の数は、配列番号９３中のアミノ酸残基の数の少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％である。
【０２５６】
本明細書に記載される組み換え宿主細胞及び方法の一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡムターゼは、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ活性を有するタンパク質複合体であり、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ複合体をコードする１又は複数の（いくつかの）異種のポリヌクレオチドは、第一のポリペプチドサブユニットをコードする第一の異種のポリヌクレオチド、及び第二のポリペプチドサブユニットをコードする第二の異種のポリヌクレオチドを含む。一つの態様では、第一のポリペプチドサブユニット及び第二のポリペプチドサブユニットは、異なるアミノ酸配列を含む。
【０２５７】
一つの態様では、第一のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチド、及び第二のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチドは、単一の異種のポリヌクレオチドに含まれる。別の態様では、第一のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチド、及び第二のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチドは、別々の異種のポリヌクレオチドに含まれる。メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ及び他のポリペプチドに関する核酸コンストラクトの拡大された議論は、本明細書に記載される。
【０２５８】
メチルマロニル−ＣｏＡムターゼタンパク質複合体の一つの態様では、第一のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号６６の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号６４若しくは６５の成熟ポリペプチドコーディング配列又はこれらの完全長相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号６４又は６５の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択され；そして
前記第二のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号６９の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号６７若しくは６８の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号６７又は６８の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択される。
【０２５９】
一つの態様では、第一のポリペプチドサブユニットが、配列番号６６の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；第二のポリペプチドサブユニットが、配列番号６９の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一つの態様では、第一のポリペプチドサブユニットが、配列番号６６の成熟ポリペプチドと１０アミノ酸以下、例えば５アミノ酸以下、４アミノ酸以下、３アミノ酸以下、２アミノ酸以下、又は１アミノ酸以下異なるアミノ酸配列を含み、第二のポリペプチドサブユニットが、配列番号６９の成熟ポリペプチドと１０アミノ酸以下、例えば５アミノ酸以下、４アミノ酸以下、３アミノ酸以下、２アミノ酸以下、又は１アミノ酸以下異なるアミノ酸配列を含む。
【０２６０】
一つの態様では、第一のポリペプチドサブユニットが、配列番号６６のアミノ酸配列、配列番号６６の成熟ポリペプチド、これらの対立遺伝子変異体、又は前述のフラグメントを含む、あるいはからなり；第二のポリペプチドサブユニットが、配列番号６９のアミノ酸配列、配列番号６９の成熟ポリペプチド、これらの対立遺伝子変異体、又は前述のフラグメントを含む、あるいはからなる。別の態様では、第一のポリペプチドサブユニットは、配列番号６６のアミノ酸配列を含み、第二のポリペプチドサブユニットは、配列番号６９のアミノ酸配列を含む。別の態様では、第一のポリペプチドサブユニットは、配列番号６６の成熟ポリペプチドを含み、第二のポリペプチドサブユニットは、配列番号６９の成熟ポリペプチドを含む。
【０２６１】
一つの態様では、第一のポリペプチドサブユニットは、配列番号６６の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ；第二のポリペプチドサブユニットは、配列番号６９の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる（J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989、同上を参照のこと）。
【０２６２】
一つの態様では、第一のポリペプチドサブユニットは、配列番号６６のサブ配列によりコードされ；及び／又は第二のポリペプチドサブユニットは、配列番号６９のサブ配列によりコードされ；ここで第一のポリペプチドサブユニットが第二のポリペプチドサブユニットと一緒にメチルマロニル−ＣｏＡムターゼ活性を有するタンパク質複合体を形成する。
【０２６３】
別の態様では、第一のポリペプチドサブユニットが、配列番号６６の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされ；第二のポリペプチドサブユニットが、配列番号６９の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２６４】
一つの態様では、第一のポリペプチドサブユニットは、配列番号６６、これらの成熟ポリペプチドコーディング配列、又は前述の変性したコーディング配列によりコードされ；第二のポリペプチドサブユニットは、配列番号６９、これらの成熟ポリペプチドコーディング配列、又は前述の変性したコーディング配列によりコードされる。一つの態様では、第一のポリペプチドサブユニットは、配列番号６６、又は前述の変性したコーディング配列によりコードされる。一つの態様では、第二のポリペプチドサブユニットは、配列番号６９、又は前述の変性したコーディング配列によりコードされる。一つの態様では、第一のポリペプチドサブユニットは、配列番号６６の成熟ポリペプチドコーディング配列、又は前述の変性したコーディング配列によりコードされる。一つの態様では、第二のポリペプチドサブユニットは、配列番号６９の成熟ポリペプチドコーディング配列、又は前述の変性したコーディング配列によりコードされる。
【０２６５】
一つの態様では、第一のポリペプチドサブユニットは、配列番号６６のサブ配列によりコードされ；及び／又は第二のポリペプチドサブユニットは、配列番号６９のサブ配列によりコードされ；ここで第一のポリペプチドサブユニットは第二のポリペプチドサブユニットと一緒にメチルマロニル−ＣｏＡムターゼ活性を有するタンパク質複合体を形成する。
【０２６６】
別の態様では、上述のように、第一のポリペプチドサブユニットは、配列番号６６又はこれらの成熟ポリペプチドの１又は複数の（いくつかの）アミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む変異体であり；そして／あるいは第二のポリペプチドサブユニットは、配列番号６９又はこれらの成熟ポリペプチドの１又は複数の（いくつかの）アミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む変異体である。態様によっては、配列番号６６若しくはこれらの成熟ポリペプチド配列のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入の合計数；又は配列番号６９若しくはこれらの成熟ポリペプチド配列のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入の合計数は、１０以下、例えば１、２、３、４、５、６、７、８又は９以下である。
【０２６７】
別の態様では、第一のポリペプチドサブユニットは、配列番号６６のフラグメントであり、そして／あるいは第二のポリペプチドサブユニットは、配列番号６９のフラグメントであり、ここで前記第一及び第二のポリペプチドサブユニットは、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ活性を有するタンパク質複合体を一緒に形成する。一つの態様では、前記フラグメント中のアミノ酸残基の数は、配列番号６６又は６９中のアミノ酸残基の数の少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％である。
【０２６８】
メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ（又はこれらのサブユニット）はまた、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼの対立遺伝子変異体、又は人工的な変異体でもよい。
【０２６９】
メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ（又はこれらのサブユニット）はまた、上述のように、融合ポリペプチド又は切断可能な融合ペプチドを含むことができる。
【０２７０】
メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ（及びこれらのサブユニット）をコードするポリヌクレオチドを単離又はクローニングするために用いられる技術は、上記に記載される。
【０２７１】
配列番号７９、８０、６４、６５、６７、及び６８のポリヌクレオチド配列；又はこれらのサブ配列；並びに配列番号９３、６６、及び６９のアミノ酸配列；又はこれらのフラグメントを、上述のように、異なる属又は種の株からのメチルマロニル−ＣｏＡムターゼをコードするＤＮＡを同定、及びクローニングするための核酸プローブを設計するために用いることができる。かかるプローブは、本発明に含まれる。かかる他の生物から調製されたゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーは、上述のように、上述のプローブとハイブリダイズし、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼをコードするＤＮＡについてスクリーニングされてもよい。
【０２７２】
少なくとも１００ヌクレオチド長の長いプローブについて、極めて低〜極めて高ストリンジェンシー条件及び洗浄条件は上述のように定義される。約１５ヌクレオチド長〜約７０ヌクレオチドヌクレオチド長の短いプローブについて、ストリンジェンシー及び洗浄条件は上述のように定義される。
【０２７３】
前記メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ及びこれらのサブユニットは、微生物の任意の属から得られてもよい。一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡムターゼは、本明細書に記載の任意の微生物から得られる細菌、酵母、又は真菌のメチルマロニル−ＣｏＡムターゼでもよい。
【０２７４】
一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡムターゼは、大腸菌メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ、例えば配列番号９３の大腸菌メチルマロニル−ＣｏＡムターゼである。
【０２７５】
別の態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡムターゼは、プロピオニバクテリウム属メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ、例えば配列番号６６の第一のサブユニット及び配列番号６９の第二のサブユニットを含むプロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Propionibacterium freudenreichii）メチルマロニル−ＣｏＡムターゼタンパク質複合体である。
【０２７６】
本発明の実施に用いることのできる他のメチルマロニル−ＣｏＡムターゼとしては、限定することなく、ヒト  メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ（GenBank ID P22033.3; Padovani, Biochemistry 45:9300-9306 (2006)を参照のこと）及びメチロバクテリウム・エキストロクエンス（Methylobacterium extorquens）メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ（mcmAサブユニット、GenBank ID Q84FZ1、及びmcmBサブユニット、GenBank ID Q6TMA2；Korotkova, J Biol Chem. 279:13652-13658 (2004)を参照のこと）、並びにシゲラ・フレクスネリ（Shigella flexneri）ｓｂｍ（GenBank ID NP_838397.1）、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enteric）ＳＡＲＩ  ０４５８５（GenBank ID ABX24358.1）及びエルシニア・フレデリクセニイ（Yersinia frederiksenii）ＹｆｒｅＡ＿０１０００８６１（GenBank ID ZP_00830776.1）が挙げられる。
【０２７７】
メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ、及びこれらのサブユニットはまた、上述のように天然（例えば、土壌、堆肥、水等）から単離される微生物を含む他の起源、又は天然素材（例えば、土壌、堆肥、水等）から直接得られるＤＮＡサンプルから同定され、得られてもよい。
【０２７８】
組み換え宿主細胞、及びこれらの使用の方法の態様によっては、宿主細胞は、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼと結合又は複合体化するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含む。かかるポリペプチドは、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼの活性を増加させ、例えば、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ起源遺伝子に由来し、隣接する遺伝子から発現させてもよい。
【０２７９】
一つの態様では、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼと結合又は複合体化するポリペプチドは、（ａ）配列番号７２又は９４の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号７０、７１、８１、若しくは８２の成熟ポリペプチドコーディング配列又はこれらの完全長相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号７０、７１、８１、又は８２の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択される。
【０２８０】
一つの態様では、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼと結合又は複合体化するポリペプチドは、配列番号７２の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、あるいはからなる。一つの態様では、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼと結合又は複合体化するポリペプチドは、配列番号７２の成熟ポリペプチドと１０アミノ酸以下、例えば５アミノ酸以下、４アミノ酸以下、３アミノ酸以下、２アミノ酸以下、又は１アミノ酸以下異なるアミノ酸配列を含む。
【０２８１】
一つの態様では、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼと結合又は複合体化するポリペプチドは、配列番号９４の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、あるいはからなる。一つの態様では、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼと結合又は複合体化するポリペプチドは、配列番号９４の成熟ポリペプチドと１０アミノ酸以下、例えば５アミノ酸以下、４アミノ酸以下、３アミノ酸以下、２アミノ酸以下、又は１アミノ酸以下異なるアミノ酸配列を含む。
【０２８２】
一つの態様では、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼと結合又は複合体化するポリペプチドは、配列番号７２又は９４の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列、これらの対立遺伝子変異体、又はメチルマロニル−ＣｏＡムターゼ活性を有する前述のフラグメントを含む、あるいはからなる。
【０２８３】
一つの態様では、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼと結合又は複合体化するポリペプチドは、配列番号７０若しくは７１の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる（J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989、上記）。
【０２８４】
一つの態様では、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼと結合又は複合体化するポリペプチドは、配列番号８１若しくは８２の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２８５】
一つの態様では、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼと結合又は複合体化するポリペプチドは、配列番号７０又は７１の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２８６】
一つの態様では、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼと結合又は複合体化するポリペプチドは、配列番号８１又は８２の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２８７】
一つの態様では、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼと結合又は複合体化するポリペプチドは、配列番号７０、７１、８１、８２、これらの成熟ポリペプチドコーディング配列、又は前述の変性したコーディング配列によりコードされる。
【０２８８】
一つの態様では、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼと結合又は複合体化するポリペプチドは、上述のように、配列番号７２又は９４の成熟ポリペプチドの１又は複数の（いくつかの）アミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む変異体である。態様によっては、配列番号７２又は９４の成熟ポリペプチドのアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入の合計数は、１０以下、例えば１、２、３、４、５、６、７、８又は９以下である。別の態様では、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼと結合又は複合体化するポリペプチドは、配列番号７２又は９４の成熟ポリペプチドのフラグメントである。
【０２８９】
本発明を実施するために用いることができる、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼと結合又は複合体化する他のポリペプチドとしては、限定することなく、プロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes）ＫＰＡＩ７１２０２（GenBank ID YP_055310.1）及びメチロバクテリウム・エキストロクエンス（Methylobacterium extorquens）ｍｅａＢ（GenBank ID 2QM8_B; Korotkova, J Biol Chem. 279: 13652-13658(2004)を参照のこと）からのポリペプチドが挙げられる。
【０２９０】
メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ及びメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド
組み換え宿主細胞、及びこれらの使用の方法の態様によっては、宿主細胞は、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性を有する。態様によっては、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチドを含む。メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼは、本発明を実施するのに好適である任意のメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼでもよい。一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼは、増加した量のプロピオニル−ＣｏＡが生産される好適な条件下で過剰発現するメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼである。
【０２９１】
一つの態様では、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼは、（ａ）配列番号１０３の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ；（ｂ）配列番号１０２の成熟ポリペプチドコーディング配列又はこれらの完全長相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ；及び（ｃ）配列番号１０２の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼから選択される。当業者に理解されるように、場合によっては、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼは、上記に記載の１超の選択肢（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の下に限定されてもよい。
【０２９２】
一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼは、配列番号１０３の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、又はからなる。一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼは、配列番号１０３の成熟ポリペプチドと１０アミノ酸以下、例えば５アミノ酸以下、４アミノ酸以下、３アミノ酸以下、２アミノ酸以下、又は１アミノ酸以下異なるアミノ酸配列を含む。
【０２９３】
一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼは、配列番号１０３のアミノ酸配列、配列番号１０３の成熟ポリペプチド配列、これらの対立遺伝子変異体、又はメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性を有する前述のフラグメントを含む、あるいはからなる。別の態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼは、配列番号１０３のアミノ酸配列を含む、あるいはからなる。別の態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼは、配列番号１０３の成熟ポリペプチドを含む、あるいはからなる。
【０２９４】
一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼは、配列番号１０２の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる（J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989、同上）。
【０２９５】
一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼは、配列番号１０２の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【０２９６】
一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼは、配列番号１０２、これらの成熟ポリペプチドコーディング配列、又は前述の変性したコーディング配列によりコードされる。一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼは、配列番号１０２、又はこれの変性したコーディング配列によりコードされる。一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼは、配列番号１０２の成熟ポリペプチドコーディング配列、又は前述の変性したコーディング配列によりコードされる。一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼは、配列番号１０２のサブ配列、又はこれらの変性したコーディング配列によりコードされ、ここで前記サブ配列は、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【０２９７】
一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼは、上述のように、配列番号１０３の成熟ポリペプチドの１又は複数の（いくつかの）アミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む変異体である。一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼは、配列番号１０３の成熟ポリペプチドの１又は複数の（いくつかの）アミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む変異体である。態様によっては、配列番号１０３のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入の合計数が、１０以下、例えば１、２、３、４、５、６、７、８又は９以下である。
【０２９８】
別の態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼは、配列番号１０３のフラグメント、又はこれの成熟ポリペプチドコーディング配列であり、前記フラグメントは、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性を有する。一つの態様では、前記フラグメント中のアミノ酸残基の数は、配列番号１０３中のアミノ酸残基の数の少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％である。
【０２９９】
メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼはまた、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼの対立遺伝子変異体、又は人工的な変異体でもよい。
【０３００】
メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼはまた、上述のように、融合ポリペプチド又は切断可能な融合ペプチドを含むことができる。
【０３０１】
メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドを単離又はクローニングするために用いられる技術は、上記に記載される。
【０３０２】
配列番号１０２のポリヌクレオチド配列、又はこれらのサブ配列；及び配列番号１０３のアミノ酸配列；又はこれらのフラグメントを、上述のように、異なる属又は種の株からのメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼをコードするＤＮＡを同定、及びクローニングするための核酸プローブを設計するために用いることができる。かかるプローブは、本発明に含まれる。かかる他の生物から調製されたゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーは、上述のように、上述のプローブとハイブリダイズし、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼをコードするＤＮＡについてスクリーニングされてもよい。
【０３０３】
一つの態様では、前記核酸プローブは、配列番号１０２、又はこれらの変性したコーディング配列である。別の態様では、前記核酸プローブは、配列番号１０２の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの変性したコーディング配列である。別の態様では、前記核酸プローブは、配列番号１０３、これらの成熟ポリペプチド配列又は前述のフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列である。
【０３０４】
少なくとも１００ヌクレオチド長の長いプローブについて、極めて低〜極めて高ストリンジェンシー条件及び洗浄条件は上述のように定義される。約１５ヌクレオチド長〜約７０ヌクレオチドヌクレオチド長の短いプローブについて、ストリンジェンシー及び洗浄条件は上述のように定義される。
【０３０５】
前記メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼは、微生物の任意の属から得られてもよい。一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼは、本明細書に記載の任意の微生物から得られる細菌、酵母、又は真菌のメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼでもよい。
【０３０６】
一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼは、大腸菌メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ、例えば配列番号１０３の大腸菌メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼである。
【０３０７】
本発明の実施に用いることのできる他のメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼとしては、限定することなく、プロピオニゲニウム・モデスツム（Propionigenium modestum）（ｍｍｄＡサブユニット、GenBank ID CAA05137；ｍｍｄＢサブユニット、GenBank ID CAA05140；ｍｍｄＣサブユニット、GenBank ID CAA05139；ｍｍｄＤサブユニット、GenBank ID CAA05138；Bott et al., Eur. J. Biochem. 250:590-599 (1997)を参照のこと）、及びベイロネラ・パルブラ（Veillonella parvula）（ｍｍｄＡサブユニット、GenBank ID CAA80872；ｍｍｄＢサブユニット、GenBank ID CAA80876；ｍｍｄＣサブユニット、GenBank ID CAA80873；ｍｍｄＤサブユニット、GenBank ID CAA80875；ｍｍｄＥサブユニット、GenBank ID CAA80874；Huder, J. Bioi. Chem. 268:24564-24571 (1993)を参照のこと）が挙げられる。
【０３０８】
メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼはまた、上述のように天然（例えば、土壌、堆肥、水等）から単離される微生物を含む他の起源、又は天然素材（例えば、土壌、堆肥、水等）から直接得られるＤＮＡサンプルから同定され、得られてもよい。
【０３０９】
メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ及びメチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼをコードするポリヌクレオチド
組み換え宿主細胞、及びこれらの使用の方法の態様によっては、宿主細胞は、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ活性を有する。態様によっては、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼをコードする異種のポリヌクレオチドを含む。メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼは、本発明を実施するのに好適である任意のメチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼでもよい。一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼは、増加した量のＳ−メチルマロニル−ＣｏＡが生産される好適な条件下で過剰発現するメチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼである。
【０３１０】
一つの態様では、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼは、（ａ）配列番号７５の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するメチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ；（ｂ）配列番号７３若しくは７４の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるエピメラーゼ；及び（ｃ）配列番号７３又は７４の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるメチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼから選択される。当業者に理解されるように、場合によっては、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼは、上記に記載の１超の選択肢（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の下に限定されてもよい。
【０３１１】
一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼは、配列番号７５の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、又はからなる。一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼが、配列番号７５の成熟ポリペプチドと１０アミノ酸以下、例えば５アミノ酸以下、４アミノ酸以下、３アミノ酸以下、２アミノ酸以下、又は１アミノ酸以下異なるアミノ酸配列を含む。
【０３１２】
一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼは、配列番号７５のアミノ酸配列、配列番号７５の成熟ポリペプチド配列、これらの対立遺伝子変異体、又はメチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ活性を有する前述のフラグメントを含む、あるいはからなる。別の態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼは、配列番号７５のアミノ酸配列を含む、あるいはからなる。別の態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼは、配列番号７５の成熟ポリペプチドを含む、あるいはからなる。
【０３１３】
一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼは、配列番号７３若しくは７４の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる（J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989、同上）。
【０３１４】
一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼは、配列番号７３又は７４の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【０３１５】
一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼは、配列番号７３若しくは７４、これらの成熟ポリペプチドコーディング配列、又は前述の変性したコーディング配列によりコードされる。一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼは、配列番号７３若しくは７４、又は前述の変性したコーディング配列によりコードされる。一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼは、配列番号７３若しくは７４の成熟ポリペプチドコーディング配列、又は前述の変性したコーディング配列によりコードされる。一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼは、配列番号７３若しくは７４のサブ配列、又はこれらの変性したコーディング配列によりコードされ、ここで前記サブ配列は、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【０３１６】
一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼは、上述のように、配列番号７５の成熟ポリペプチドの１又は複数の（いくつかの）アミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む変異体である。一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼは、配列番号７５の１又は複数の（いくつかの）アミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む変異体である。一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼは、配列番号７５の成熟ポリペプチドの１又は複数の（いくつかの）アミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含む変異体である。態様によっては、配列番号７５の成熟ポリペプチドのアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入の合計数が、１０以下、例えば１、２、３、４、５、６、７、８又は９以下である。
【０３１７】
別の態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼは、配列番号７５のフラグメントであって、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ活性を有するフラグメントである。一つの態様では、前記フラグメント中のアミノ酸残基の数は、配列番号７５中のアミノ酸残基の数の少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％である。
【０３１８】
メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼはまた、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼの対立遺伝子変異体、又は人工的な変異体でもよい。
【０３１９】
メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼはまた、上述のように、融合ポリペプチド又は切断可能な融合ペプチドを含むことができる。
【０３２０】
メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼをコードするポリヌクレオチドを単離又はクローニングするために用いられる技術は、上記に記載される。
【０３２１】
配列番号７５のポリヌクレオチド配列又はこれらのサブ配列；及び配列番号７３若しくは７４のアミノ酸配列又はこれらのフラグメントを、上述のように、異なる属又は種の株からのメチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼをコードするＤＮＡを同定、及びクローニングするための核酸プローブを設計するために用いることができる。かかるプローブは、本発明に含まれる。かかる他の生物から調製されたゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーは、上述のように、上述のプローブとハイブリダイズし、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼをコードするＤＮＡについてスクリーニングされてもよい。
【０３２２】
一つの態様では、前記核酸プローブは、配列番号７３若しくは７４、又はこれらの変性したコーディング配列である。別の態様では、前記核酸プローブは、配列番号７５の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの変性したコーディング配列である。別の態様では、前記核酸プローブは、配列番号７５、これの成熟ポリペプチド配列、又は前述のフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列である。
【０３２３】
少なくとも１００ヌクレオチド長の長いプローブについて、極めて低〜極めて高ストリンジェンシー条件及び洗浄条件は上述のように定義される。約１５ヌクレオチド長〜約７０ヌクレオチドヌクレオチド長の短いプローブについて、ストリンジェンシー及び洗浄条件は上述のように定義される。
【０３２４】
前記メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼは、微生物の任意の属から得られてもよい。一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼは、本明細書に記載の任意の微生物から得られる細菌、酵母、又は真菌のメチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼでもよい。
【０３２５】
一つの態様では、前記メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼは、プロピオニバクテリウム属メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ、例えばプロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Propionibacterium freudenreichii）メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ、例えば配列番号７５のプロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ  メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼである。
【０３２６】
本発明の実施に用いることのできる他のメチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼとしては、限定することなく、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＹｑｊＣ（GenBank ID NP_390273; Haller, Biochemistry, 39:4622-4629 (2000)を参照のこと）、ヒト  ＭＣＥＥ（GenBank ID Q96PE7.1; (Fuller, Biochemistry, 1213:643-650 (1983)を参照のこと）、ラッタス・ノルベギカス（Rattus norvegicus）Ｍｃｅｅ（GenBank ID NP 001099811.1; Bobik, Biol Chem. 276:37194-37198 (2001)を参照のこと）、プロピオニバクテリウム・シェルマニ（Propionibacterium shermanii）ＡＦ４５４５１１（GenBank ID AAL57846.1; Haller, Biochemistry 39:4622-9 (2000); McCarthy, Structure 9:637-46 (2001) and Fuller, Biochemistry, 1213:643-650 (1983）を参照のこと）、カエノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）ｍｍｃｅ（GenBank ID AAT92095.1; Kuhnl et al., FEBS J 272: 1465-1477 (2005)を参照のこと）、及びバチルス・セレウス（Bacillus cereus）ＡＥ０１６８７７（GenBank ID AAP08811.1）が挙げられる。
【０３２７】
メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼはまた、天然（例えば、土壌、堆肥、水等）から単離される微生物を含む他の起源、又は上述のように天然素材（例えば、土壌、堆肥、水等）から直接得られるＤＮＡサンプルから同定され、得られてもよい。
【０３２８】
Ｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼ及びＮ−プロパノールデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド
本発明では、前記ｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼは、本発明の実施に好適である任意のアルコールデヒドロゲナーゼであり得る。一つの態様では、前記ｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼは、増加した量のｎ−プロパノールが生産される培養条件下で過剰発現するｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼである。
【０３２９】
ｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを単離又はクローニングするために用いられる技術は、上記に記載される。
【０３３０】
前記ｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼは、微生物の任意の属から得られてもよい。一つの態様では、前記ｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼは、本明細書に記載の任意の微生物から得られる細菌、酵母、又は真菌のｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼでもよい。別の態様では、前記ｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼは、Ｐ．シェルマニ（P. shermanii）ｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼである。別の態様では、前記ｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼは、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）ｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼである。
【０３３１】
ｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼはまた、上述のように天然（例えば、土壌、堆肥、水等）から単離される微生物を含む他の起源、又は天然素材（例えば、土壌、堆肥、水等）から直接得られるＤＮＡサンプルから同定され、得られてもよい。
【０３３２】
核酸コンストラクト
本発明は、制御配列と適合性のある条件下で、好適な宿主細胞において、コーディング配列の発現を支持する１又は複数の（いくつかの）制御配列と連結された、チオラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド、ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（例えば本明細書に記載のスクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ）をコードする１又は複数の（いくつかの）異種のポリヌクレオチド、アセトアセテートデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド、イソプロパノールデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチド、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチド（及び任意で、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼをコードする異種のポリヌクレオチド、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド、及び／又はｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチド）を含む核酸コンストラクトに関する。かかる核酸コンストラクトは、本明細書に記載の任意の宿主細胞及び方法が用いられてもよい。本明細書に記載のポリヌクレオチドは、所望のポリペプチドの発現のために提供される様々な方法において操作されてもよい。ベクターへのこの挿入の前のポリヌクレオチドの操作は、発現ベクターに依存して望ましい、又は必須である。組み換えＤＮＡ法を用いるポリヌクレオチドを改変するための技術は、当該技術分野においてよく知られている。
【０３３３】
制御配列は、本明細書に記載される任意のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のための宿主細胞により認識されるポリヌクレオチドである、プロモーター配列でもよい。前記プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を仲介する転写制御配列を含む。前記プロモーターは、変異の、切断された、及びハイブリッドのプロモーターを含む選択の宿主細胞において転写活性を示す任意のポリヌクレオチドでもよく、そして前記宿主細胞と同種又は異種のいずれかの細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られてもよい。
【０３３４】
本明細書に記載の各ポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドとは異種のプロモーターと作動式に連結されてもよい。例えば、一つの態様では、チオラーゼをコードする異種のポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドとは異種のプロモーターと作動式に連結されてもよい。別の態様では、アセトアセテートデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドとは異種のプロモーターと作動式に連結されてもよい。別の態様では、イソプロパノールデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドとは異種のプロモーターと作動式に連結されてもよい。別の態様では、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドとは異種のプロモーターと作動式に連結されてもよい。別の態様では、ＣｏＡ−トランスフェラーゼをコードする異種のポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドとは異種のプロモーターと作動式に連結されてもよい。別の態様では、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼをコードする異種のポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドとは異種のプロモーターと作動式に連結されてもよい。別の態様では、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドとは異種のプロモーターと作動式に連結されてもよい。別の態様では、ｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドとは異種のプロモーターと作動式に連結されてもよい。
【０３３５】
上述のように、第一のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチド及び第二のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質複合体（例えば、ＣｏＡ−トランスフェラーゼタンパク質複合体）のために、各ポリヌクレオチドは、単一の異種のポリヌクレオチド（例えば、単一のプラスミド）、あるいは別々のポリヌクレオチド（例えば、別々のプラスミド上）に含まれてもよい。一つの態様では、第一のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチド及び第二のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチドは、第一のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチド及び第二のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチドの双方とは異種のプロモーターに作動式に連結される単一の異種のポリヌクレオチドに含まれてもよい。一つの態様では、第一のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチド及び第二のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチドは、別々の異種のポリヌクレオチドに含まれ、ここれ第一のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチド及び第二のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチドは異種のプロモーターと作動式に連結されてもよい。前述のプロモーターは、同一であっても異なってもよい。
【０３３６】
細菌宿主細胞における本発明の核酸コンストラクトの転写を指示するための好適なプロモーターの例としては、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）アルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）アルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルス・リケニフォルミス  ペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）マルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）レバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、バチルス・サブチリス  ｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子、大腸菌ｌａｃオペロン、大腸菌ｔｒｃプロモーター（Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315）、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）アガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、及び原核生物ベータ−ラクタマーゼ遺伝子（Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. atl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731）、及びｔａｃプロモーター（DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25）から得られるプロモーターが挙げられる。
【０３３７】
糸状菌宿主細胞における本発明の核酸コンストラクトの転写を指示するための好適なプロモーターの例としては、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）アセトアミダーゼ、アスぺルギルス・ニガー（Aspergillus niger）中性アルファ−アミラーゼ、アスぺルギルス・ニガー酸安定性アルファ−アミラーゼ、アスぺルギルス・ニガー又はアスぺルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、アスぺルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）ＴＡＫＡ  アミラーゼ、アスぺルギルス・オリゼー  アルカリプロテアーゼ、アスぺルギルス・オリゼー  トリオースリン酸イソメラーゼ、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼ（国際公開第９６／００７８７号）、フザリウム・ヴェネナツム（Fusarium venenatum）アミログルコシダーゼ（国際公開第００／５６９００号）、フザリウム・ヴェネナツム  Ｄａｒｉａ（国際公開第００／５６９００号）、フザリウム・ヴェネナツム  Ｑｕｉｎｎ（国際公開第００／５６９００号）、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ、リゾムコール・ミエヘイ  アスパラギン酸プロテイナーゼ、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）ベータ−グルコシダーゼ、トリコデルマ・リーゼイ  セロビオヒドラーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ  セロビオヒドラーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ  エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ  エンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ  エンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ  エンドグルカナーゼＩＶ、トリコデルマ・リーゼイ  エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・リーゼイ  キシラナーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ  キシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ  ベータ−キシロシダーゼから得られるプロモーター、並びにＮＡ２-ｔｐｉプロモーター（非限定的な例として、その非翻訳リーダーがアスペルギルス属中のトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子からの非翻訳のリーダーにより置き換えられる、アスペルギルス属中の中性アルファ−アミラーゼをコードする遺伝子からの改変されたプロモーター；その非翻訳リーダーがアスペルギルス・ニデュランス又はアスペルギルス・オリゼー中のトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子からの非翻訳のリーダーにより置き換えられる、アスぺルギルス・ニガー中の中性アルファ−アミラーゼをコードする遺伝子からの改変されたプロモーターが挙げられる）；及びこれらの変異導入され、切断された、ハイブリッドのプロモーターが挙げられる。
【０３３８】
酵母宿主では、有用なプロモーターは、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロマイセス・セレビシエ  ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロマイセス・セレビシエ  アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、サッカロマイセス・セレビシエ  トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、サッカロマイセス・セレビシエ  メタロチオネイン（ＣＵＰ１）、及びサッカロマイセス・セレビシエ  ３−ホスホグリセリン酸キナーゼについての遺伝子から得られる。酵母宿主のための他の有用なプロモーターは、Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488により記載される。
【０３３９】
前記制御配列はまた、転写を終結するために宿主細胞により認識される好適な転写ターミネーター配列でもよい。前記ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’末端に作動式に連結される。選択の宿主細胞において機能する任意のターミネーターは、本発明に用いられてもよい。
【０３４０】
糸状菌宿主細胞についての好ましいターミネーターは、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）アントラニル酸シンターゼ、アスぺルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼ、アスぺルギルス・ニガー  アルファ−グルコシダーゼ、アスぺルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）ＴＡＫＡ  アミラーゼ、及びフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼについての遺伝子から得られる。
【０３４１】
酵母宿主細胞についての好ましいターミネーターは、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ、サッカロマイセス・セレビシエ  シトクロムＣ（ＣＹＣ１）、及びサッカロマイセス・セレビシエ  グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼについての遺伝子から得られる。酵母宿主細胞についての他の有用なターミネーターは、Romanos et al., 1992、同上、により記載される。
【０３４２】
前記制御配列はまた、転写される場合、宿主細胞による翻訳に重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域である、好適なリーダー配列でもよい。前記リーダー配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’末端に作動式に連結される。選択の宿主細胞において機能する任意のリーダー配列は、本発明に用いられてもよい。
【０３４３】
糸状菌宿主細胞についての好ましいリーダーは、アスぺルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）ＴＡＫＡ  アミラーゼ及びアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）トリオースリン酸イソメラーゼについての遺伝子から得られる。
【０３４４】
酵母宿主細胞についての好ましいリーダーは、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロマイセス・セレビシエ  ３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロマイセス・セレビシエ  アルファ因子、及びサッカロマイセス・セレビシエ  アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）についての遺伝子から得られる。
【０３４５】
前記制御配列はまた、ポリアデニル化配列；ポリヌクレオチドの３’末端に作動式に連結される配列でもよく、そして転写される場合、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するためのシグナルとして宿主細胞により認識される。選択の宿主細胞において機能する任意のポリアデニル化配列は、用いられてもよい。
【０３４６】
糸状菌宿主細胞についての好ましいポリアデニル化配列は、アスぺルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）ＴＡＫＡ  アミラーゼ、アスぺルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）アントラニル酸シンターゼ、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼ、及びアスぺルギルス・ニガー  アルファ−グルコシダーゼについての遺伝子から得られる。
【０３４７】
酵母宿主細胞についての有用なポリアデニル化配列は、Guo and Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990により記載される。
【０３４８】
前記制御配列はまた、ポリペプチドのＮ末端に連結されるシグナルペプチドをコードし、細胞の分泌経路にポリペチドを向かわせるするシグナルペプチドコーディング領域でもよい。ポリヌクレオチドのコーディング配列の５’末端は、ポリペプチドをコードするコーディング配列のセグメントを含む翻訳リーディングフレームと天然に連結しているシグナルペプチドコーディング配列を先天的に含んでもよい。あるいは、コーディング配列の５’末端は、前記コーディング配列と異なるシグナルペプチドコーディング配列を含んでもよい。異種のシグナルペプチドコーディング配列は、前記コーディング配列がシグナルペプチドコーディング配列を天然に含まない場合、要求されてもよい。あるいは、異種のシグナルペプチドコーディング配列は、ポリペプチドの分泌を増大させるために、天然のシグナルペプチドコーディング配列を単純に置き換えてもよい。しかしながら、選択の宿主細胞の分泌経路に発現したポリペプチドを向かわせる任意のシグナルペプチドコーディング配列が用いられてもよい。
【０３４９】
細菌宿主細胞についての有効的なシグナルペプチドコーディング配列は、バチルス属ＮＣＩＢ  １１８３７マルトース産生アミラーゼ、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）サブチリシン、バチルス・リケニフォルミス  ベータ−ラクタマーゼ、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）アルファ−アミラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィラス  中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、及びバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ｐｒｓＡについての遺伝子から得られるシグナルペプチドコーディング配列である。更なるシグナルペプチドは、Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137により記載される。
【０３５０】
糸状菌宿主細胞についての有効的なシグナルペプチドコーディング配列は、アスぺルギルス・ニガー（Aspergillus niger）中性アミラーゼ、アスぺルギルス・ニガー  グルコアミラーゼ、アスぺルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）ＴＡＫＡ  アミラーゼ、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）セルラーゼ、フミコーラ・インソレンス  エンドグルカナーゼＶ、フミコーラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）リパーゼ、及びリゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼについての遺伝子から得られるシグナルペプチドコーディング配列である。
【０３５１】
酵母宿主細胞についての有用なシグナルペプチドは、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルファ因子、及びサッカロマイセス・セレビシエ  インベルターゼについての遺伝子から得られる。他の有用なシグナルペプチドコーディング配列は、Romanos et al., 1992、同上、に記載される。
【０３５２】
前記制御配列はまた、ポリペプチドのＮ末端に位置するプロペプチドをコードするプロペプチドコーディング配列でもよい。得られるポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド（又は場合によってはチモーゲン）として知られる。プロポリペプチドは、一般的に不活性であり、プロポリペプチドからプロペプチドの触媒的又は自己触媒的切断により活性ポリペプチドに変換され得る。前記プロペプチドコーディング配列は、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）アルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、バチルス・サブチリス  中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）ラッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号）、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ、及びサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルファ因子についての遺伝子から得られてもよい。
【０３５３】
シグナルペプチド及びプロペプチド配列の双方が、ポリペプチドのＮ末端に存在する場合、前記プロペプチド配列は、ポリペプチドのＮ末端の隣に位置し、前記シグナルペプチド配列は、プロペプチド配列のＮ末端の隣に位置する。
【０３５４】
宿主細胞の増殖に関するポリペプチドの発現の制御を可能にする調節配列を付加することはまた、好ましい。調節系の例としては、調節化合物の存在などの化学的又は物理的刺激に対する応答をオン・オフするための遺伝子の発現を引き起こすものが挙げられる。原核生物系における調節系としては、ｌａｃ、ｔａｃ、及びｔｒｐオペレーター系が挙げられる。酵母では、ＡＤＨ２系又はＧＡＬ１系が用いられてもよい。糸状菌では、アスぺルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼプロモーター、アスぺルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）ＴＡＫＡ  アルファ−アミラーゼプロモーター、及びアスぺルギルス・オリゼー  グルコアミラーゼプロモーターが用いられてもよい。調節配列の他の例としては、遺伝子増幅を可能にするものである。真核生物系において、これらの調節配列としては、メトトレキサートの存在下で増幅されるジヒドロホレートレダクターゼ遺伝子、及び重金属を用いて増幅するメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。これらの場合、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、調節配列と作動式に連結される。
【０３５５】
発現ベクター
本発明はまた、チオラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド、ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（例えば本明細書に記載されるスクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ）をコードする１又は複数の（いくつかの）異種のポリヌクレオチド、アセトアセテートデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド、イソプロパノールデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチド、及び／又はアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチド（及び任意で、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼをコードする異種のポリヌクレオチドメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチドメチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド、及び／又はｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチド）並びにプロモーター；及び転写及び翻訳終止シグナルを含む組み換え発現ベクターに関する。かかる組み換え発現ベクターは、本明細書に記載される任意の宿主細胞及び方法を用いてもよい。様々なヌクレオチド及び制御配列は、組み換え発現ベクターを生産するためにともに結合され、これはかかる部位においてポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの挿入又は置換を可能にする１又は複数の（いくつかの）の便利な制限酵素認識部位を含んでもよい。あるいは、前記ポリヌクレオチドは、発現のために、前記配列を含むポリヌクレオチド又は核酸コンストラクトを適切なベクターに挿入することにより発現されてもよい。発現ベクターの製作においては、コーディング配列は、前記コーディング配列が発現のために適切な制御配列とともに作動式に連結されるように位置する。
【０３５６】
前記組み換え発現ベクターは、好都合に組み換えＤＮＡ手順に供することができ、ポリヌクレオチドの発現をもたらし得る任意のベクター（例えば、プラスミド又はウイルス）でもよい。ベクターの選択は、典型的に、ベクターとベクターが導入される宿主細胞との適合性に依存する。前記ベクターは、線形又は閉環状プラスミドでもよい。
【０３５７】
一つの態様では、本明細書に記載のチオラーゼ、ＣｏＡ−トランスフェラーゼ、アセトアセテートデカルボキシラーゼ、イソプロパノールデヒドロゲナーゼ、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、及び／又はｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼをコードする各ポリヌクレオチドは、独立したベクター上に含まれる。一つの態様では、少なくとも二つのポリヌクレオチドは、単一のベクター上に含まれる。一つの態様では、チオラーゼ、ＣｏＡ−トランスフェラーゼ、アセトアセテートデカルボキシラーゼ、イソプロパノールデヒドロゲナーゼ、及びアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする全てのポリヌクレオチドは、単一のベクター上に含まれる。
【０３５８】
前記ベクターは、自立複製ベクター、即ち染色体外物質として存在し、その複製が、染色体の複製と独立しているベクター、例えばプラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、又は人工染色体でもよい。前記ベクターは、自己複製を確実にするための任意の手段を含んでもよい。あるいは、前記ベクターは、宿主細胞に導入される場合、ゲノムに統合され、それが統合された染色体と一緒に複製されるものでもよい。さらに、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを一緒に含む、一つのベクター若しくはプラスミド、又は２若しくはそれ以上のベクター若しくはプラスミド、又はトランスポゾンは用いられてもよい。
【０３５９】
前記ベクターは、好ましくは、形質転換された、トランスフェクトされた、形質導入された細胞等の容易な選択を可能にする、１又は複数の（いくつかの）選択可能マーカーを含む。選択可能マーカーは、遺伝子産物が殺生物剤若しくはウイルス抵抗性、重金属に対する抵抗性、及び栄養要求体に対する原栄養性等を提供する遺伝子である。
【０３６０】
細菌の選択可能なマーカーの例としては、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）若しくはバチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）からのｄａｌ遺伝子、又は抗生物質耐性、例えばアンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、又はテトラサイクリン耐性を与えるマーカーが挙げられる。酵母宿主細胞に好適なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、及びＵＲＡ３である。糸状菌宿主細胞において使用のための選択可能なマーカーとしては、限定することなく、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、及びｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、並びにこれらの同等物が挙げられる。アスペルギルス属細胞において使用には、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）又はアスぺルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）のａｍｄＳ及びｐｙｒＧ遺伝子、並びにストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）のｂａｒ遺伝子が、好ましい。
【０３６１】
前記ベクターは、好ましくはベクターの宿主細胞のゲノムへの統合、又はゲノムから独立した細胞におけるベクターの自己複製を可能にするエレメントを含んでもよい。
【０３６２】
宿主細胞ゲノムへの統合のために、前記ベクターは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列、又は相同的又は非相同的組み換えによるゲノムへの統合のためのベクターの任意の他のエレメントに依存してもよい。あるいは、前記ベクターは、染色体における正確な位置において宿主細胞のゲノムへの相同的組み換えによる統合を指示するための更なるポリヌクレオチドを含んでもよい。正確な位置における統合の可能性を増加させるために、統合エレメントは、十分な数の核酸、例えば１００〜１０，０００塩基対、４００〜１０，０００塩基対、及び８００〜１０，０００塩基対を含むべきであり、これは、相同的組み替えの確率を増大させるための対応する標的配列と高い程度の配列同一性を有する。前記統合エレメントは、宿主細胞のゲノムにおける標的配列と相同の任意の配列でもよい。さらに、前記統合エレメントは、ポリヌクレオチドをコードしてもコードしなくてもよい。他方で、前記ベクターは、非相同的組み換えにより、宿主細胞のゲノムに統合されてもよい。
【０３６３】
自己複製のために、前記ベクターは、前記宿主細胞においてベクターが自発的に複製することを可能にする複製起点をさらに含んでもよい。前記複製起点は、細胞において機能する自己複製を仲介する任意のプラスミド複製開始点でもよい。用語「複製起点」又は「プラスミド複製開始点」とは、プラスミド又はベクターがインビボで複製することを可能にするポリヌクレオチドを意味する。
【０３６４】
細菌の複製起点の例としては、大腸菌における複製を可能にする、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、及びｐＡＣＹＣ１８４、並びにバチルス属における複製を可能にするｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０、及びｐＡＭβ１であるプラスミドの複製起点である。
【０３６５】
酵母宿主細胞おいて使用のための複製起点の例としては、２ミクロン複製起点である、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、並びにＡＲＳ１とＣＥＮ３の組み合わせ、及びＡＲＳ４とＣＥＮ６の組み合わせである。
【０３６６】
糸状菌細胞に有用な複製起点の例としては、ＡＭＡ１及びＡＮＳ１（Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175；国際公開第００／２４８８３号）である。ＡＭＡ１遺伝子の単離及び前記遺伝子を含むプラスミド又はベクターの構築は、国際公開第００／２４８８３号に記載される方法に従って達成される。
【０３６７】
本発明のポリヌクレオチドの１超のコピーは、ポリペプチドの生産を増加させるために宿主細胞に挿入されてもよい。ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、少なくとも１つの更なるコピーが宿主細胞ゲノムに配列に統合されることにより、あるいは選択可能なマーカー遺伝子の増幅されたコピーを含む細胞、及びそれによりポリヌクレオチドの更なるコピーが適切な選択可能な薬剤の存在下において細胞を培養することにより選択され得る場合、ポリヌクレオチドを含む増幅可能で選択可能なマーカー遺伝子を含むことにより、得ることができる。
【０３６８】
本発明の組み換え発現ベクターを構築するための上述のエレメントをライゲートするために用いられる手順は、当業者によく知られている（例えばSambrook et al., 1989、同上、を参照のこと）。
【０３６９】
宿主細胞
本明細書に記載されるように、本発明は、とりわけ、ｎ−プロパノール、イソプロパノールの組み換え生産、又はｎ−プロパノール及びイソプロパノールの双方の共生産のためのポリペプチドの発現を指示する１又は複数の（いくつかの）制御配列と作動式に連結されてもよい、本明細書に記載の１又は複数の（いくつかの）ポリヌクレオチドを含む組み換え宿主細胞に関する。本発明はまた、ｎ−プロパノール、イソプロパノールの組み換え生産、又はｎ−プロパノール及びイソプロパノールの双方の共生産のためのかかる宿主細胞を用いる方法を含む。
【０３７０】
前記宿主細胞は、記載されるポリヌクレオチドのいずれか１つ又は複数の組み合わせを含んでもよい。例えば、ｎ−プロパノール及びイソプロパノールの双方の共生産のために設計される宿主細胞（例えば、ラクトバチルス属宿主細胞）は、チオラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（例えばスクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ）をコードする１又は複数の（いくつかの）異種のポリヌクレオチド；アセトアセテートデカルボキシラーゼアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；イソプロパノールデヒドロゲナーゼアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；及びアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチドを含んでもよく、ここで前記細胞はｎ−プロパノール及びイソプロパノールの双方を生産する（あるいは生産することができる）。
【０３７１】
一つの典型的な態様では、ｎ−プロパノール及びイソプロパノールの共生産のための前記組み換え宿主細胞（例えば、ラクトバチルス属宿主細胞）は、
（１）配列番号３、３５、１１４、又は１１６の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するチオラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；
（２）第一のポリペプチドサブユニット及び第二のポリペプチドサブユニットを含むＣｏＡ−トランスフェラーゼタンパク質複合体であって、第一のポリペプチドサブユニットが、配列番号６、１２、３７、又は４１の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有し、第二のポリペプチドサブユニットが、配列番号９、１５、３９、又は４３の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するタンパク質複合体をコードする１又は複数の（いくつかの）異種のポリヌクレオチド；
（３）配列番号１８、４５、１１８、又は１２０の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアセトアセテートデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；
（４）配列番号２１、２４、４７、又は１２２の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するイソプロパノールデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；及び
（５）配列番号２７、３０、３３、５１、５４、５７、６０、又は６３の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチドを含み、
ここで前記組み換え宿主細胞は、ｎ−プロパノール及びイソプロパノールを生産することができる。
【０３７２】
態様によっては、前記組み換え宿主細胞は、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼをコードする異種のポリヌクレオチド、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド、及び／又はｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチドをさらに含む。
【０３７３】
１若しくは複数の（いくつかの）ポリヌクレオチドを含むコンストラクト若しくはベクター（又は複数のコンストラクト若しくはベクター）は、前記コンストラクト又はベクターが、上述のように染色体組み込み体として、又は自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞に導入される。用語「宿主細胞」は、複製の間に生じる変異のために親細胞と同一でない親細胞の任意の後代を含む。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子、及びその起源に大きく依存する。後述する態様は、宿主細胞自体、及び宿主細胞を用いる方法に適用される。
【０３７４】
宿主細胞は、本発明のポリペプチドの組み換え生産を可能にする任意の細胞、例えば原核生物若しくは真核生物、及び／又はｎ−プロパノール、イソプロパノール、又はｎ−プロパノール及びイソプロパノールの双方の組み換え生産が可能である任意の細胞でもよい。
【０３７５】
原核生物宿主細胞は、任意のグラム陽性又はグラム陰性細菌でもよい。グラム陽性細菌としては、限定することなく、バチルス属（Bacillus）、クロストリジウム属（Clostridium）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、ゲオバチルス属（Geobacillus）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、オセアノバチルス属（Oceanobacillus）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、及びストレプトマイセス属（Streptomyces）が挙げられる。グラム陰性細菌としては、限定することなく、カンピロバクター属（Campylobacter）、大腸菌（E. coli）、フラボバクテリウム属（Flavobacterium）、フソバクテリウム属（Fusobacterium）、ヘリコバクター属（Helicobacter）、イリオバクター属（Ilyobacter）、ナイセリア属（Neisseria）、シュードモナス属（Pseudomonas）、サルモネラ属（Salmonella）、及びウレアプラズマ属（Ureaplasma）が挙げられる。
【０３７６】
細菌宿主細胞としては、限定することなく、バチルス・アルカロフィラス（Bacillus alkalophilus）バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・クラウジイ（Bacillus clausii）、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・ファルマス（Bacillus firmus）、バチルス・ロータス（Bacillus lautus）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・プミラス（Bacillus pumilus）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、及びバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）細胞などの任意のバチラス属細胞でもよい。
【０３７７】
細菌宿主細胞はまた、限定することなく、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Streptococcus equisimilis）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）、及びストレプトコッカス・エクィ（Streptococcus equi）亜種ズーエピデミカス（Zooepidemicus）細胞などの任意のストレプトコッカス属細胞でもよい。
【０３７８】
細菌宿主細胞はまた、限定することなく、ストレプトマイセス・アクロモゲネス（Streptomyces achromogenes）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及びストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）細胞などの任意のストレプトマイセス属細胞でもよい。
【０３７９】
細菌宿主細胞はまた、限定することなく、Ｌ．アセトトレランス（L. acetotolerans）、Ｌ．アシジファリネ（L. acidifarinae）、Ｌ．アシジピシス（L. acidipiscis）、Ｌ．アシドフィルス（L. acidophilus）、Ｌ．アギリス（L. agilis）、Ｌ．アルギダス（L. algidus）、Ｌ．アリメンタリウス（L. alimentarius）、Ｌ．アミロリティカス（L. amylolyticus）、Ｌ．アミロフィルス（L. amylophilus）、Ｌ．アミロトロフィカス（L. amylotrophicus）、Ｌ．アミロボラス（L. amylovorus）、Ｌ．アニマリス（L. animalis）、Ｌ．アントリ（L. antri）、Ｌ．アポデミ（L. apodemi）、Ｌ．アクアティカス（L. aquaticus）、Ｌ．アリゾネンシス（L. arizonensis）、Ｌ．アビアリウス（L. aviarius）、Ｌ．ババリクス（L. bavaricus）、Ｌ．ビフェルメンタンス（L. bifermentans）、Ｌ．ボバリウス（L. bobalius）、Ｌ．ブレビス（L. brevis）、Ｌ．ブチネリ（L. buchneri）、Ｌ．ブルガリクス（L. bulgaricus）、Ｌ．カカオヌム（L. cacaonum）、Ｌ．カメリエ（L. camelliae）、Ｌ．カピラタス（L. capillatus）、Ｌ．カルミ（L. carni）、Ｌ．カゼイ（L. casei）、Ｌ．カテナホルミス（L. catenaformis）、Ｌ．セロビサス（L. cellobiosus）、Ｌ．セティ（L. ceti）、Ｌ．コレオホミニス（L. coleohominis）、Ｌ．コリノイデス（L. collinoides）、Ｌ．コムポスチ（L. composti）、Ｌ．コンカバス（L. concavus）、Ｌ．・コンフューサス（L. confusus）、Ｌ．コリニホルミス（L. coryniformis）、Ｌ．クリスパタス（L. crispatus）、Ｌ．クルストラム（L. crustorum）、Ｌ．クルバタス（L. curvatus）、Ｌ．サイプリカセイ（L. cypricasei）、Ｌ．デルブリュッキイ（L. delbrueckii）、Ｌ．デキストリニクス（L. dextrinicus）、Ｌ．ディオリボランス（L. diolivorans）、Ｌ．ダイバージェンス（L. divergens）、Ｌ．・ジュリアニス（L. durianis）、Ｌ．エクイ（L. equi）、Ｌ．エクイカーソリス（L. equicursoris）、Ｌ．エクイジェネロシ（L. equigenerosi）、Ｌ．ファビファーメンタス（L. fabifermentans）、Ｌ．ファルシミニス（L. farciminis）、Ｌ．ファラギニス（L. farraginis）、Ｌ．フェリントシェンシス（L. ferintoshensis）、Ｌ．フェルメンタム（L. fermentum）、Ｌ．ホルニカリス（L. fornicalis）、Ｌ．フルクチボランス（L. fructivorans）、Ｌ．フルクトサス（L. fructosus）、Ｌ．フルメンティ（L. frumenti）、Ｌ．フクエンシス（L. fuchuensis）、Ｌ．ガリナラム（L. gallinarum）、Ｌ．ガッセリ（L. gasseri）、Ｌ．ガストリクス（L. gastricus）、Ｌ．ガネンシス（L. ghanensis）、Ｌ．グラミニス（L. graminis）、Ｌ．ハロトレランス（L. halotolerans）、Ｌ．ハッメシ（L. hammesii）、Ｌ．ハムステリ（L. hamsteri）、Ｌ．ハルビネンシス（L. harbinensis）、Ｌ．ハヤキテンシス（L. hayakitensis）、Ｌ．ヘルヴェティクス（L. helveticus）、Ｌ．ヘテロヒオキイ（L. heterohiochii）、Ｌ．ヒルガルディ（L. hilgardii）、Ｌ．ホモヒオキイ（L. homohiochii）、Ｌ．ホルデイ（L. hordei）、Ｌ．イネルス（L. iners）、Ｌ．イングルビエイ（L. ingluviei）、Ｌ．インテスティナリス（L. intestinalis）、Ｌ．ジェンセニ（L. jensenii）、Ｌ．ジョンソニ（L. johnsonii）、Ｌ．カリキセンシス（L. kalixensis）、Ｌ．カンドレリ（L. kandleri）、Ｌ．ケフィラノファシエンス（L. kefiranofaciens）、Ｌ．ケフィールグラナム（L. kefirgranum）、Ｌ．ケフィリ（L. kefiri）、Ｌ．キムチ（L. kimchii）、Ｌ．キソネンシス（L. kisonensis）、Ｌ．キタサトニス（L. kitasatonis）、Ｌ．クンケイ（L. kunkeei）、Ｌ．ラクティス（L. lactis）、Ｌ．ライヒマニ（L. leichmannii）、Ｌ．リンドネリ（L. lindneri）、Ｌ．マレフェルメンタンス（L. malefermentans）、Ｌ．マリ（L. mali）、Ｌ．マルタロミカス（L. maltaromicus）、Ｌ．マニホチボランス（L. manihotivorans）、Ｌ．ミンデンシス（L. mindensis）、Ｌ．マイナー（L. minor）、Ｌ．ミヌタス（L. minutus）、Ｌ．ムコサエ（L. mucosae）、Ｌ．ムリナス（L. murinus）、Ｌ．ナゲリ（L. nagelii）、Ｌ．ナムレンシス（L. namurensis）、Ｌ．ナンテンシス（L. nantensis）、Ｌ．ノデンシス（L. nodensis）、Ｌ．オエニ（L. oeni）、Ｌ．オリゴフェルメンタンス（L. oligofermentans）、Ｌ．オリス（L. oris）、Ｌ．オタキエンシス（L. otakiensis）、Ｌ．パニス（L. panis）、Ｌ．パンテリス（L. pantheris）、Ｌ．パラブレビス（L. parabrevis）、Ｌ．パラブクネリ（L. parabuchneri）、Ｌ．パラカゼイ（L. paracasei）、Ｌ．パラコリノイデス（L. paracollinoides）、Ｌ．パラファラギニス（L. parafarraginis）、Ｌ．パラケフィリ（L. parakefiri）、Ｌ．パラリメンタリウス（L. paralimentarius）、Ｌ．パラプランタラム（L. paraplantarum）、Ｌ．ペントサス（L. pentosus）、Ｌ．ペロレンス（L. perolens）、Ｌ．ピシコーラ（L. piscicola）、Ｌ．プランタラム（L. plantarum）、Ｌ．ポブジヒイ（L. pobuzihii）、Ｌ．ポンティス（L. pontis）、Ｌ．シタッシ（L. psittaci）、Ｌ．ラピ（L. rapi）、Ｌ．レニニ（L. rennini）、Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）、Ｌ．ラムノサス（L. rhamnosus）、Ｌ．リメ（L. rimae）、Ｌ．ロゴサエ（L. rogosae）、Ｌ．ロッシエ（L. rossiae）、Ｌ．ルミニス（L. ruminis）、Ｌ．セリムネリ（L. saerimneri）、Ｌ．サケイ（L. sakei）、Ｌ．サリバリウス（L. salivarius）、Ｌ．サンフランシセンシス（L. sanfranciscensis）、Ｌ．サツメンシス（L. satsumensis）、Ｌ．セカリフィラス（L. secaliphilus）、Ｌ．センマイズケイ（L. senmaizukei）、Ｌ．シャーペアエ（L. sharpeae）、Ｌ．シリギニス（L. siliginis）、Ｌ．シミリス（L. similis）、Ｌ．ソブリウス（L. sobrius）、Ｌ．スピチェリー（L. spicheri）、Ｌ．スシコーラ（L. sucicola）、Ｌ．スエビカス（L. suebicus）、Ｌ．サンキイ（L. sunkii）、Ｌ．サントリウス（L. suntoryeus）、Ｌ．タイワンシス（L. taiwanensis）、Ｌ．タイランデンシス（L. thailandensis）、Ｌ．サーモトレランス（L. thermotolerans）、Ｌ．トリコデス（L. trichodes）、Ｌ．ツセチ（L. tucceti）、Ｌ．ウリ（L. uli）、Ｌ．ウルツネンシス（L. ultunensis）、Ｌ．ウバルム（L. uvarum）、Ｌ．ワクシノステルカス（L. vaccinostercus）、Ｌ．ヴァギナリス（L. vaginalis）、Ｌ．ベルスモルデンシス（L. versmoldensis）、Ｌ．ヴィリデセンス（L. viridescens）、Ｌ．ヴィツリナス（L. vitulinus）、Ｌ．キシロサス（L. xylosus）、Ｌ．ヤマナシエンシス（L. yamanashiensis）、Ｌ．ゼアエ（L. zeae）、及びＬ．ジマエ（L. zymae）などの任意のラクトバチルス属細胞でもよい。一つの態様では、細菌宿主細胞は、Ｌ．プランタラム、Ｌ．フルクチボランス、又はＬ．ロイテリである。
【０３８０】
一つの態様では、前記宿主細胞は、エシェリキア属（例えば、大腸菌）、ラクトバチルス属（例えば、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・フルクチボランス（Lactobacillus fructivorans）、又はラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri））、及びプロピオニバクテリウム属（例えば、プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Propionibacterium freudenreichii））から選択される属のメンバーである。一つの好ましい態様のでは、前記宿主細胞は、ラクトバチルス属宿主細胞である。
【０３８１】
バチラス属細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、プロトプラスト形質転換により（例えばChang and Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115を参照のこと）、コンピテント細胞を用いることにより（例えばYoung and Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829、又はDubnau and Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221を参照のこと）、エレクトロポレーションにより（例えばShigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751を参照のこと）、あるいはコンジュゲーションにより（例えばKoehler and Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278を参照のこと）行なわれてもよい。大腸菌細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、プロトプラスト形質転換により（例えばHanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580を参照のこと）、あるいはエレクトロポレーションにより（例えばDower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145を参照のこと）行なわれてもよい。ストレプトマイセス属細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、プロトプラスト形質転換及びエレクトロポレーションにより（例えばGong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405を参照のこと）、コンジュゲーションにより（例えばMazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585を参照のこと）、あるいは形質導入により（例えばBurke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294を参照のこと）行なわれてもよい。シュードモナス属細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、エレクトロポレーションにより（例えばChoi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397を参照のこと）、あるいはコンジュゲーションにより（例えばPinedo and Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57を参照のこと）行なわれてもよい。ストレプトコッカス属細胞へのＤＮＡの導入は、天然の能力（competence）により（例えばPerry and Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297を参照のこと）、プロトプラスト形質転換により（例えばCatt and Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207を参照のこと）、エレクトロポレーションにより（例えばBuckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804を参照のこと）、あるいはコンジュゲーションにより（例えばClewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436を参照のこと）行なわれてもよい。また一方で、宿主細胞へのＤＮＡを導入するための当該技術分野において知られている方法を用いることができる。
【０３８２】
宿主細胞はまた、真核生物、例えば、哺乳動物、昆虫、植物、又は真菌細胞でもよい。
【０３８３】
前記宿主細胞は真菌細胞でもよい。本明細書で用いられる「真菌」としては、子嚢菌門（Ascomycota）、担子菌門（Basidiomycota）、ツボカビ門（Chytridiomycota）、及び接合菌門（Zygomycota）（Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UKにより定義される）及び卵菌門（Oomycota）（Hawksworth et al., 1995, 同上, page 171に引用される）並びに全ての栄養胞子形成菌（Hawksworth et al., 1995、同上）が挙げられる。
【０３８４】
真菌宿主細胞は酵母細胞でもよい。本明細書で用いられる「酵母」としては、有子嚢胞子酵母（エンドミセス目（Endomycetales））、担子胞子酵母、及び不完全真菌に属する酵母（不完全酵母菌類（Blastomycetes））が挙げられる。酵母の分類は、本発明の目的において、将来変更されてもよいので、酵母は、Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980)の記載に従って定義されるべきである。
【０３８５】
酵母宿主細胞は、カンジダ属（Candida）、ハンゼヌラ属（Hansenula）、クリベロマイセス属（Kluyveromyces）、ピキア属（Pichia）、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）、又はヤロウイア属（Yarrowia）細胞、例えばクリベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・ディアスタティカス（Saccharomyces diastaticus）、サッカロマイセス・ドウグラシ（Saccharomyces douglasii）、サッカロマイセス・クリヴェリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Saccharomyces norbensis）、又はサッカロマイセス・オビフォルミス（Saccharomyces oviformis）、又はヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）細胞でもよい。
【０３８６】
真菌宿主細胞は、糸状菌細胞でもよい。「糸状菌」としては、真菌類（Eumycota）の亜門及び卵菌門（Oomycota）の全ての糸状形態が挙げられる（Hawksworth et al., 1995、同上、により定義される）。糸状菌は、一般的に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及び他の複合多糖からなる菌糸壁により特性決定される。栄養増殖は菌糸伸長により、炭素異化は偏性好気性である。対照的に、酵母、例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）による栄養増殖は、単細胞性葉状体の出芽により、炭素異化は発酵性でもよい。
【０３８７】
前記糸状菌宿主細胞はまた、アクレモニウム属（Acremonium）、アスペルギルス属（Aspergillus）、アウレオバシジウム属（Aureobasidium）、ブジェルカンデラ属（Bjerkandera）、セリポリオプシス属（Ceriporiopsis）、クリソスポリウム属（Chrysosporium）、コプリナス属（Coprinus）、コリオラス属（Coriolus）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、フィリバシジウム属（Filibasidium）、フザリウム属（Fusarium）、フミコラ属（Humicola）、マグナポルテ属（Magnaporthe）、ムコール属（Mucor）、ミセリオフトラ属（Myceliophthora）、ネオカリマスティクス属（Neocallimastix）、ニューロスポラ属（Neurospora）、ペシロマイセス属、ペニシリウム属（Penicillium）、ファネロカエーテ属（Phanerochaete）、フレビア属（Phlebia）、ピロマイセス属（Piromyces）、プレオロータス属（Pleurotus）、シゾフィラム属（Schizophyllum）、タラロマイセス属（Talaromyces）、サーモアスカス属（Thermoascus）、チエラビア属（Thielavia）、トリポクラジウム属（Tolypocladium）、トラメテス属（Trametes）、又はトリコデルマ属（Trichoderma）細胞でもよい。
【０３８８】
例えば、前記糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス・アクレアツス（Aspergillus aculeatus）、アスぺルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・フォエティダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスぺルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、ブジェルカンデラ・アズスタ（Bjerkandera adusta）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオプシス・カレジエア（Ceriporiopsis caregiea）、セリポリオプシス・ギルベッセンス（Ceriporiopsis gilvescens）、セリポリオプシス・パノシンタ（Ceriporiopsis pannocinta）、セリポリオプシス・リブロサ（Ceriporiopsis rivulosa）、セリポリオプシス・サブルファ（Ceriporiopsis subrufa）、またはセリポリオプシス・サブベルミスポラ（Ceriporiopsis subvermispora）、クリソスポリウム・イノプス（Chrysosporium inops）、クリソスポリウム・ケラチノフィラム（Chrysosporium keratinophilum）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、クリソスポリウム・メルダリウム（Chrysosporium merdarium）、クリソスポリウム・パニコラ（Chrysosporium pannicola）、クリソスポリウム・クイーンスランジカム（Chrysosporium queenslandicum）、クリソスポリウム・トロピクム（Chrysosporium tropicum）、クリソスポリウム・ゾナツム（Chrysosporium zonatum）、コプリヌス・シネレウス（Coprinus cinereus）、コリオルス・ハースタス（Coriolus hirsutus）、フザリウム・バクトリディオデス（Fusarium bactridioides）、フザリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フザリウム・クロックウェルエンス（Fusarium crookwellense）、フザリウム・クルモラム（Fusarium culmorum）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フザリウム・グラミヌム（Fusarium graminum）、フザリウム・ヘテロスポルム（Fusarium heterosporum）、フザリウム・ネグンディ（Fusarium negundi）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フザリウム・レティクラツム（Fusarium reticulatum）、フザリウム・ロゼウム（Fusarium roseum）、フザリウム・サンブシヌム（Fusarium sambucinum）、フザリウム・サルコチロウム（Fusarium sarcochroum）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Fusarium sporotrichioides）、フザリウム・スルプレウム（Fusarium sulphureum）、フザリウム・トルローサム（Fusarium torulosum）、フザリウム・トリコテシオイデス（Fusarium trichothecioides）、フザリウム・ヴェネナツム（Fusarium venenatum）、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）、フミコーラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）、ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ノイロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ペニシリウム・プルプロゲヌム（Penicillium purpurogenum）、ファネロケテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）、フレビア・ラジアータ（Phlebia radiata）、プレウロツス・エリンギ（Pleurotus eryngii）、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）、トラメテス・ビロサ（Trametes villosa）、トラメテス・ベルシカラー（Trametes versicolor）、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンギ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギプラチアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）、又はトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）細胞でもよい。
【０３８９】
一つの態様では、前記宿主細胞はアスペルギルス属宿主細胞である。別の態様では、前記宿主細胞は、アスペルギルス・オリゼーである。
【０３９０】
真菌細胞は、本質的に知られている方法において、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、及び細胞壁の再生を含むプロセスにより形質転換されてもよい。アスペルギルス属及びトリコデルマ属宿主細胞の形質転換のための好適な手順は、欧州特許第２３８０２３号、及びYelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474に記載される。フザリウム属種を形質転換するための好適な方法は、Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156、及び国際公開第９６／００７８７号により記載される。酵母は、Becker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; and Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920に記載される手順を用いて形質転換されてもよい。
【０３９１】
態様によっては、前記宿主細胞は、本明細書に記載の１又は複数の（いくつかの）ポリヌクレオチドを含み、ここで前記宿主細胞は、同一の条件下で培養した場合、１又は複数の（いくつかの）ポリヌクレオチドを含まない宿主細胞と比較して、増加したレベルのイソプロパノール及び／又はｎ−プロパノールを分泌する（そして／あるいは分泌することができる）。態様によっては、前記宿主細胞は、同一の条件下で培養した場合、１又は複数の（いくつかの）ポリヌクレオチドを含まない宿主細胞と比較して、少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、又は５００％増加したレベルのイソプロパノール及び／又はｎ−プロパノールを分泌する、そして／あるいは分泌することができる。
【０３９２】
任意のこれらの態様では、前記宿主細胞は、理論的値の少なくとも１０％超、例えば少なくとも２０％超、少なくとも３０％超、少なくとも４０％超、少なくとも５０％超、少なくとも６０％超、少なくとも７０％超、少なくとも８０％超、又は少なくとも９０％超の収率において、ｎ−プロパノール及び／又はイソプロパノールを生産する（そして／あるいは生産することができる）。
【０３９３】
任意のこれらの態様では、前記組み換え宿主は、１時間あたり約０．１ｇ／Ｌ超、例えば１時間あたり約０．２ｇ／Ｌ超、１時間あたり約０．５ｇ／Ｌ超、１時間あたり約０．７５ｇ／Ｌ超、１時間あたり約１．０ｇ／Ｌ超、１時間あたり約１．２５ｇ／Ｌ超、１時間あたり約１．５ｇ／Ｌ超、１時間あたり約１．７５ｇ／Ｌ超、１時間あたり約２．０ｇ／Ｌ超、１時間あたり約２．２５ｇ／Ｌ超、１時間あたり約２．５ｇ／Ｌ超、又は１時間あたり約３ｇ／Ｌ超のｎ−プロパノール及び／又はイソプロパノール容積生産性（又は合わされたｎ−プロパノール及びイソプロパノール容積生産性）を有する。
【０３９４】
組み換え宿主細胞は、本技術分野において知られている方法を用いて、本明細書に記載される酵素の生産に好適な栄養培地中で培養されてもよい。例えば、前記細胞は、所望のポリペプチドの発現及び／又は単離を可能にする好適な培地及び条件下で行なわれる実験室用又は工業用発酵槽において、振盪フラスコ発酵、又は小スケール若しくは大スケールの発酵（連続的、バッチ、フェド−バッチ、又は固相状態発酵を含む）より培養されてもよい。培養は、当該技術分野において知られている手順を用いて、炭素及び窒素源、並びに無機塩を含む好適な栄養培地中で行なわれる。好適な培地は供給者により市販されており、公開されている組成物（例えばthe American Type Culture Collectionのカタログ）に従って調製されてもよく、市販の成分から調製されてもよい。
【０３９５】
ここで、酵素及びこれらの活性は、当該技術分野において知られている方法、及び／又は上述の方法を用いて検出することができる。これらの検出方法は、特定の抗体の使用、酵素産物の生成、酵素基質の消失を含んでもよい。例えば、Sambrook et aI., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); Ausubel et aI., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999); and Hanai et al., Appl. Environ. Microbiol. 73:7814-7818 (2007)を参照のこと。
【０３９６】
方法
本発明はまた、ｎ−プロパノール、イソプロパノールの生産、又はｎ−プロパノール及びイソプロパノールの共生産のための本明細書に記載の組み換え宿主細胞を用いる方法に関する。
【０３９７】
一つの態様では、本発明は、ｎ−プロパノールを生産する方法であって、（ａ）ｎ−プロパノールを生産するための好適な条件下において、培地中で本明細書に記載の組み換え宿主細胞（例えば、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ活性、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ活性、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、及び／又はｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼ活性を有する任意の宿主細胞）のいずれか一つを培養し；そして（ｂ）ｎ−プロパノールを回収することを含む方法を含む。一つの態様では、前記組み換え宿主細胞は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を含む。一つの態様では、本発明は、ｎ−プロパノールを生産する方法であって、ｎ−プロパノールを生産するための好適な条件下において、培地中で本明細書に記載の組み換え宿主細胞であって、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチドを含む（そして任意でメチルマロニル−ＣｏＡムターゼをコードする１又は複数の異種のポリヌクレオチド；メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；及び／又はｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチドを含む）前記宿主細胞のいずれか一つを培養し；そして（ｂ）ｎ−プロパノールを回収すること、を含む方法を含む。一つの態様では、前記培地は発酵培地である。
【０３９８】
一つの態様では、本発明は、例えばグルコース、スクシネート、スクシニル−ＣｏＡ、又はプロピオニル−ＣｏＡから、本明細書に記載のｎ−プロパノールを生産する方法を含む。一つの態様では、本発明は、例えばグルコース、スクシネート、スクシニル−ＣｏＡ、又はプロピオニル−ＣｏＡから、本明細書に記載の組み換え宿主細胞によりプロパナールを生産する方法を含む。
【０３９９】
一つの態様では、本発明は、イソプロパノールを生産する方法であって、（ａ）イソプロパノールを生産するための好適な条件下において、培地中で本明細書に記載の組み換え宿主細胞（例えば、チオラーゼ活性、スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ活性、アセトアセテートデカルボキシラーゼ活性、及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ活性を有する任意の宿主細胞）のいずれか一つを培養し；そして（ｂ）ｎ−プロパノールを回収すること、を含む方法を含む。一つの態様では、本発明は、イソプロパノールを生産する方法であって、（ａ）イソプロパノールを生産するための好適な条件下において、培地中で本明細書に記載の組み換え宿主細胞であって、チオラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼをコードする１又は複数の（いくつかの）異種のポリヌクレオチド；アセトアセテートデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；及び／又はイソプロパノールデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；を含む前記宿主細胞のいずれか一つを培養し、；そして（ｂ）イソプロパノールを回収することを含む方法を含む。一つの態様では、前記培地は発酵培地である。別の態様では、前記培地はサトウキビ汁（例えば、未滅菌サトウキビ汁）を含む発酵培地である。
【０４００】
一つの態様では、本発明は、ｎ−プロパノール及びイソプロパノールを共生産する方法であって、（ａ）ｎ−プロパノール及びイソプロパノールを生産するための好適な条件下において、培地中で本明細書に記載の組み換え宿主細胞（チオラーゼ活性、ＣｏＡ−トランスフェラーゼ活性、アセトアセテートデカルボキシラーゼ活性、イソプロパノールデヒドロゲナーゼ活性、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼを活性、メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、及び／又はｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼ活性を有する任意の宿主細胞）のいずれか一つを培養し、；そして（ｂ）ｎ−プロパノール及びイソプロパノールを回収することを含む方法を含む。一つの態様では、本発明はｎ−プロパノール及びイソプロパノールを共生産する方法であって、（ａ）ｎ−プロパノール及びイソプロパノールを生産するための好適な条件下において、培地中で本明細書に記載の組み換え宿主細胞であって、チオラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；ＣｏＡトランスフェラーゼ（例えばスクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ）をコードする１又は複数の（いくつかの）異種のポリヌクレオチド；アセトアセテートデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；イソプロパノールデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；及び／又はメチルマロニル−ＣｏＡムターゼをコードする異種のポリヌクレオチド；メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；及び／又はｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチドを含む前記宿主細胞のいずれか一つを培養し、；そして（ｂ）ｎ−プロパノール及びイソプロパノールを回収すること、を含む方法を含む。一つの態様では、前記培地は発酵培地である。別の態様では、前記培地はサトウキビ汁（例えば、未滅菌サトウキビ汁）を含む発酵培地である。
【０４０１】
本発明は、任意の１又は複数の（いくつかの）糖、例えばグルコース、フルクトース、スクロース、セロビオース、キシロース、キシルロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、及び／又は可溶性オリゴ糖を含む発酵培地中で行なわれてもよい。場合によっては、前記発酵培地は、天然資源、例えばサトウキビ、でんぷん、又はセルロース由来であり、酵素的加水分解（糖化）による資源の前処理の結果でもよい。一つの態様では、前記培地はサトウキビ汁（例えば、未滅菌サトウキビ汁）を含む発酵培地である。
【０４０２】
１又は複数の（いくつかの）糖からの適切な炭素源に加えて、発酵培地は、当業者に知られている他の栄養素又は刺激物、例えば主要栄養素（例えば、窒素源）及び微量栄養素（例えば、ビタミン、無機塩、及び金属補因子）を含んでもよい。態様によっては、前記炭素源は、優先的に少なくとも一つの窒素源、例えば酵母抽出物、Ｎ2、又はペプトン（例えば、Ｂａｃｔｏ（商標）ペプトン）で供給され得る。ビタミンの非限定的な例としては、マルチビタミン、ビオチン、パントテネート、ニコチン酸、メソイノシトール、チアミン、ピリドキシン、パラ−アミノ安息香酸、葉酸、リボフラビン並びにビタミンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥが挙げられる。無機塩及び金属補酵素の例としては、限定することなく、Ｎａ、Ｐ、Ｋ、Ｍｇ、Ｓ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｍｎ、及びＣｕが挙げられる。
【０４０３】
生産の方法に用いられる好適な条件は、本明細書の技術を考慮して当業者により決定されてもよい。本方法の態様によっては、宿主細胞は、約１２〜約２１６時間、例えば約２４〜約１４４時間、約３６〜約９６時間培養してもよい。温度は、典型的には、約ｐＨ３〜約ｐＨ８、例えば約ｐＨ４〜５、６又は７において、約２６℃〜約６０℃、特に約３４℃又は５０℃である。
【０４０４】
培養は、必要に応じて、嫌気的条件下、実質的に嫌気的（微好気的）条件下、又は好気的条件下で行なわれてもよい。手短に言えば、嫌気的とは、酸素のない環境を意味し、嫌気的（微好気的）とは、空気より酸素濃度が低い環境を意味し、好気的とは、酸素濃度が空気の酸素濃度と等しい、又はそれ以上である環境を意味する。実質的に嫌気的な条件としては、例えば、培地中の溶存酸素濃度が飽和の１０％未満を維持するような培養であるバッチ発酵又は連続発酵が挙げられる。実質的に嫌気的な条件としてはまた、酸素１％未満の大気で維持された密閉チャンバー内の液体培地中、又は固体寒天上の増殖細胞若しくは静止細胞が挙げられる。酸素のパーセントは、Ｎ2／ＣＯ2混合物又は他の非酸素ガスを培養に注入することにより維持することができる。実施形態によっては、培養は、嫌気条件下又は実質的に嫌気条件下で行なわれる。
【０４０５】
本発明の方法は、任意の好適な発酵オペレーションモードを用いることができる。例えば、発酵の初めに設定された培地及び宿主微生物に、特定の薬剤、例えばｐＨ制御、泡制御、又はプロセスの維持に要求されるものを除くさらなる投入がない、閉鎖系のバッチモード発酵を用いてもよい。本発明に記載されるプロセスはまた、フェド−バッチ、又は連続モードにおいて用いることができる。
【０４０６】
本発明の方法は、いくつかのバイオリアクター構成、例えば撹拌タンク、気泡塔、エアリフトリアクター、及び他の当業者に知られているものにおいて行なわれてもよい。
【０４０７】
前記方法は、必要に応じて遊離細胞培養、又は固定化細胞培養において行ってもよい。固定化細胞のための任意の材料支持体に、例えばアルギネート、繊維床、又はアーガイル材料、例えばクリソタイル、モンモリロナイトＫＳＦ、及びモンモリロナイトＫ−１０を用いてもよい。
【０４０８】
本発明の一つの態様では、生産物（例えば、ｎ−プロパノール及び／又はイソプロパノール）は、約０．０１ｇ／Ｌ超、例えば約０．０２ｇ／Ｌ、０．０５ｇ／Ｌ、０．０７５ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、８５ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１２５ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、又は２５０ｇ／Ｌ超の力価において生産される。本発明の一つの態様では、生産物（例えば、ｎ−プロパノール）は、糖質１ｇあたり約０．０１ｇ超、例えば糖質１ｇあたり約０．０２、０．０５、０．７５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、又は１．０ｇ超の力価において生産される。
【０４０９】
本発明の一つの態様では、生産物（例えば、イソプロパノール及び／又はｎ−プロパノール）の量は、同一の条件下で異種のポリヌクレオチドを含まない宿主細胞を培養することと比べて、少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、又は少なくとも１００％超である。
【０４１０】
組み換えｎ−プロパノール及びイソプロパノールは、任意で、これに限定することなく、クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー）、電気泳動手順、異なる可溶性、浸透性、蒸留、抽出（例えば、液体−液体抽出）、浸透気化、抽出的濾過、膜濾過、膜分離、逆濾過、又は限外濾過などの当該技術分野において知られている任意の手順を用いて発酵培地から回収することができる。一つの例では、イソプロパノールは、従来方法の蒸留により、他の発酵材料から分離され、精製される。従って、一つの態様では、前記方法は、回収したｎ−プロパノール及びイソプロパノールを蒸留により精製することをさらに含む。
【０４１１】
組み換えｎ−プロパノール及びイソプロパノールはまた、不純物（混入物質）をイソプロパノールからより容易に除去される生産物への化学的変換により、上述の手順（例えば、クロマトグラフィー、電気泳動手順、異なる可溶性、蒸留、又は抽出）により、そして／あるいは１又は複数の（いくつかの）不純物のｎ−プロパノール又はイソプロパノールへの直接的な化学的変換により、精製されてもよい。例えば、一つの態様では、本方法は、アセトン混入物をイソプロパノールに変換することにより、回収されたイソプロパノールを精製することをさらに含む、あるいはプロパナール混入物をｎ−プロパノールに変換することにより、回収されたｎ−プロパノールを精製することをさらに含む。アセトンからイソプロパノールへの、あるいはプロパナールからｎ−プロパノールへの変換は、当該技術分野において知られている任意の好適な還元剤（例えば、水素化アルミニウムリチウム（ＬｉＡｌＨ4）、ナトリウム種（例えばナトリウムアマルガム、又は水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ4））、スズ種（例えば塩化スズ（ＩＩ））、ヒドラジン、亜鉛−水銀アマルガム（Ｚｎ（Ｈｇ））、水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＨ）、シュウ酸（Ｃ2Ｈ2Ｏ4）、ギ酸（ＨＣＯＯＨ）、アスコルビン酸、鉄種（例えば硫酸鉄（ＩＩ））等）を用いて達成されてもよい。
【０４１２】
本発明の態様によっては、任意で精製される前及び／又は後の組み換えｎ−プロパノール及びイソプロパノールは、実質的に純粋である。イソプロパノールを生産する方法に関して、「実質的に純粋」とは、１５％以下の不純物を含むｎ−プロパノール及びイソプロパノールの回収された調製物を意味する（ここで、不純物とは、プロパノール以外の化合物を意味するが、他のプロパノール異性体を含まない）。一つのバリエーションでは、実質的に純粋なイソプロパノールの調製物であって、２５％以下の不純物、又は２０％以下の不純物、又は１０％以下の不純物、又は５％以下の不純物、又は３％以下の不純物、又は１％以下の不純物、又は０．５％以下の不純物を含む、調製物を提供する。
【０４１３】
本明細書に記載の方法のいずれかにより生産されるＮ−プロパノール及びイソプロパノールは、プロピレンに変換されてもよい。プロピレンを、当該技術分野において知られている酸触媒、例えば酸性アルミナ及びゼオライト、酸性有機スルホン酸レジン、鉱酸、例えばリン酸、硫酸、並びにルイス酸、例えば三フッ化ホウ素、及びアルミニウム化合物（March, Jerry. Advanced Organic Chemistry. New York: John Wiley and Sons, 1992）を用いたｎ−プロパノール及び／又はイソプロパノールの化学的脱水により生産することができる。ｎ−プロパノール及び／又はイソプロパノールのプロピレンへの脱水のための好適な温度は、典型的には、約１８０℃〜約６００℃、例えば３００℃〜約５００℃、又は３５０℃〜約４５０℃に及ぶ。
【０４１４】
ｎ−プロパノール及び／又はイソ−プロパノールの脱水反応は、典型的に、断熱又は等温リアクターで行なわれ、これはまた、固定若しくは流動床リアクターであり；約０．１〜約６０秒、例えば約１〜約３０秒の範囲の滞留時間を用いて最適化することができる。変換されていないアルコールを、脱水リアクターで再利用することができる。
【０４１５】
一つの態様では、本発明は、プロピレンを生産する方法であって、（ａ）ｎ−プロパノール及び／又はイソプロパノールを生産するための好適な条件下において、培地中で本明細書に記載の組み換え宿主細胞を培養し；（ｂ）ｎ−プロパノール及びイソプロパノールを回収し；（ｃ）プロピレンを生産するための好適な条件下で、ｎ−プロパノールとイソプロパノールを脱水し；（ｄ）プロピレンを回収することを含む方法を含む。一つの態様では、前記培地は発酵培地である。別の態様では、前記培地はサトウキビ汁（例えば、未滅菌サトウキビ汁）を含む．発酵培地である。一つの態様では、ｎ−プロパノール及びイソプロパノールを脱水する前に生産されるｎ−プロパノール及び／又はイソプロパノールの量（又はｎ−プロパノール及びイソプロパノールの合計量）は、力価において、約０．０１ｇ／Ｌ超、例えば約０．０２ｇ／Ｌ、０．０５ｇ／Ｌ、０．０７５ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、８５ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１２５ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、又は２５０ｇ／Ｌ超である。一つの態様では、プロピレンを生産するために好適な条件下でｎ−プロパノール及びイソプロパノールを脱水することは、当該技術分野において知られているように、ｎ−プロパノール及びイソプロパノールを酸触媒と接触させること、又は処理することを含む。
【０４１６】
脱水の間に生成され得る混入物質は、当該技術分野において知られている技術を用いた精製を通して除去されてもよい。例えば、プロピレンを、二酸化炭素などの酸性化合物を除去するために水又は苛性溶液で洗浄することができ、水などの極性化合物を吸収するために、あるいは例えば一酸化炭素の除去のために、床に注入されてもよい。あるいは、高級炭化水素、例えばプロパン、ブタン、ブチレン、及びより高級の化合物を分離するために、蒸留塔を用いることができる。エチレンなどの混入物質からのプロピレンの分離は、当該技術分野において知られている方法、例えば低温蒸留により、行なわれてもよい。
【０４１７】
本明細書に記載の生産の方法及び宿主細胞についての、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、及びプロピレンの生産について試験するための好適なアッセイを、当該技術分野において知られている方法を用いて行なうことができる。例えば、最終生産物のｎ−プロパノール及びイソプロパノール、中間体（例えば、アセトン）、並びに有機化合物を、例えばＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、ＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィー−質量分析）、及びＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析）、又は当該技術分野においてよく知られている日常的な手順を用いる他の好適な分析方法などの方法により、分析することができる。発酵培地中のｎ−プロパノール及びイソプロパノールの放出を、培養上清を用いて試験することもできる。発酵培地中の副産物及び残存糖（例えば、グルコース）を、例えばグルコース及びアルコールについて屈折率検出器、並びに有機酸についてＵＶ検出器（Lin et al., Biotechnol. Bioeng. 90:775 -779 (2005)）を用いて、あるいは当該技術分野においてよく知られている他の好適なアッセイ及び検出方法を用いて、ＨＰＬＣにより定量することができる。
【０４１８】
ｎ−プロパノールから生産されるプロピレンは、当該技術分野において知られている重合プロセスにより、ポリプロピレン又はポリプロピレンコポリマーに更に変換されてもよい。好適な温度は、典型的に、バルク重合について約１０５℃〜約３００℃、又は懸濁液中の重合について約５０℃〜約１００℃に及ぶ。あるいは、ポリプロピレンは、約６０℃〜約８０℃の温度範囲で、重合触媒、例えばチーグラー・ナッタ、又はメタロセン触媒の存在下で気相リアクターにおいて生産されることができる。
【０４１９】
本発明は、本発明の範囲を限定するものとして構成されるべきではない以下の実施例によりさらに記述される。
【実施例】
【０４２０】
実施例
バッファ及び基質として用いられる化学薬品は、少なくとも試薬グレードの化学薬品であった。
【０４２１】
培地
ＬＢプレートは、３７ｇＬＢ寒天（Sigma cat no. L3027）及び１Ｌまでの再蒸留水からなった。
【０４２２】
ＬＢＰＧＳプレートは、３７ｇＬＢ寒天（Sigma cat no. L3027）、０．５％でんぷん（Merck cat. no. 101252）、０．０１Ｍ  Ｋ2ＰＯ4、０．４％グルコース、及び１Ｌまでの再蒸留水からなった。
【０４２３】
ＴＹブイヨン培地は、２０ｇトリプトン（Difco cat no. 211699）、５ｇ酵母抽出物（Difco cat no. 212750）、７*１０-3ｇ塩化鉄（ferrochloride）、１*１０-3ｇ塩化マンガン（ＩＩ）、１．５*１０-3ｇ硫酸マグネシウム、及び１Ｌまでの再蒸留水からなった。
【０４２４】
最小培地（ＭＭ）は、２０ｇグルコース、１．１ｇ  ＫＨ2ＰＯ4、８．９ｇ  Ｋ2ＨＰＯ4；１．０ｇ（ＮＨ4）2ＳＯ4；０．５ｇクエン酸Ｎａ；５．０ｇ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；４．８ｍｇ  ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ；２ｍｇチアミン；０．４ｍｇ／Ｌビオチン；０．１３５ｇ  ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ；１０ｍｇ  ＺｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ；１０ｍｇ  ＣａＣｌ2・６Ｈ2Ｏ；１０ｍｇ  Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ；９．５ｍｇ  ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ；２．５ｍｇ  Ｈ3ＢＯ3；及び１Ｌまでの再蒸留水からなり、ＨＣｌでｐＨ７に調製された。
【０４２５】
ＭＲＳ培地は、以下の組成（Ｄｉｆｃｏ（商標）ラクトバチルスＭＲＳ寒天：プロテオースペプトンＮｏ．３（１０．０ｇ）、牛肉抽出物（１０．０ｇ）、酵母抽出物（５．０ｇ）、デキストロース（２０．０ｇ）、ポリソルベート８０（１．０ｇ）、クエン酸アンモニウム（２．０ｇ）、酢酸ナトリウム（５．０ｇ）、硫酸マグネシウム（０．１ｇ）、硫酸マンガン（０．０５ｇ）、リン酸二カリウム（２．０ｇ）、寒天（１５．０ｇ）及び１Ｌまでの水。Ｄｉｆｃｏ（商標）ラクトバチルスＭＲＳ培地：寒天を含まない同一の成分からなる。）を有するＤｉｆｃｏ（商標）ラクトバチルスＭＲＳ寒天又はＤｉｆｃｏ（商標）ラクトバチルスＭＲＳ培地のいずれかであるＤｉｆｃｏ（商標）から得られた。
【０４２６】
ＬＣ（ラクトバチルス属運搬）培地は、トリプチケース（１０ｇ）、トリプトース（３ｇ）、酵母抽出物（５ｇ）、ＫＨ2ＰＯ4（３ｇ）、Ｔｗｅｅｎ８０（１ｍｌ）、酢酸ナトリウム（１ｇ）、クエン酸アンモニウム（１．５ｇ）、システイン−ＨＣｌ（０．２ｇ）、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（１２ｍｇ）、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（０．６８ｍｇ）、ＭｎＳＯ4・２Ｈ2Ｏ（２５ｍｇ）、及び１Ｌまでの再蒸留水からなり、ＨＣｌでｐＨ７に調製された。滅菌グルコースは、１％（５ｍｌの２０％グルコースストック溶液／１００ｍｌ培地）までオートクレーブ後に添加された。
【０４２７】
宿主株
ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＳＪ１０６５６（Ｏ４ＺＹ１）：
プラスミドpVS2（von Wright, A., Tynkkynen, S., Suominen, M. (1987) Cloning of a Streptococcus lactis subsp. Lactis chromosomal fragment associated with the ability to grow in milk. Applied and Environmental Microbiology, 53, 1584-1588）を含むラクトバチルス・プランタルム株ＮＣ８（Aukrust, T., and Blom, H. (1992) Transformation of Lactobacillus strains used in meat and vegetable fermentations. Food Research International, 25, 253-261）を、５μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含むＭＲＳ寒天プレート上で受け取り、ＳＪ１０４９１として凍結させた。ＳＪ１０４９１を、実質的に、Ruiz-Barba et al. （Ruiz-Barba, J. L., Plard, J. C., Jimenez-Diaz, R. (1991) Plasmid profiles and curing of plasmids in Lactobacillus plantarum strains isolated from green olive fermentations. Journal of Applied Bacteriology, 71, 417-421）より記載されるように、０．１２５μｇ／ｍｌにおいてノボビオシンを含むＭＲＳ培地中で増殖させた培養物から単一コロニーにプレーティングすることにより、ｐＶＳ２について保存された。エリスロマイシン感受性コロニーを同定し、ｐＶＳ２の不存在をプラスミド調製及びプラスミド特異的プライマーを用いたＰＣＲ増幅により確認し、プラスミド−フリー誘導体をＳＪ１０５１１として凍結した。
【０４２８】
ＳＪ１０５１１をＭＲＳ培地に植菌し、振盪することなく３７℃で１日増殖させ、ＭＲＳ寒天プレート上に播種し、単一コロニーを得た。３７℃で一晩培養後、単一のコロニーをＭＲＳ寒天プレート上で再単離し、単一コロニーを得た。３７℃で二日間培養後、単一のコロニーをＭＲＳ寒天プレート上で再び再単離し、３７℃で三日間インキュベートし、プレート上での細胞増殖をこすり落とし、ＳＪ１０６５６（別名：Ｏ４ＺＹ１）として収集保存株に保存した。
【０４２９】
ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）ＳＪ１０６５５（Ｏ４ＺＸＶ）：
ラクトバチルス・ロイテリ  ＤＳＭ２００１６として記載される株を、公の株保存施設から得て、ＮＮ０１６５９９としてNovozymesの収集保存株に保存した。この株をＭＲＳ培地中で二次培養し、一定量をＳＪ１０４６８として凍結した。ＳＪ１０４６８をＭＲＳ培地に植菌し、振盪することなく３７℃で一日増殖させ、ＭＲＳ寒天プレートに播種し、単一のコロニーを得た。３７℃で二日間の培養後、単一のコロニーをＭＲＳ寒天プレート上で再単離し、３７℃で三日間インキュベートし、プレート上での細胞増殖をこすり落とし、ＳＪ１０６５５（別名：Ｏ４ＺＸＶ）として収集保存株に保存した。
【０４３０】
同一の細胞増殖を１０ｍｌ  ＭＲＳ培地に植菌するために用い、これを振盪することなく３７℃で３日間インキュベートし、その後、細胞を遠心分離により回収し、ゲノムＤＮＡを（QIAGEN製のQIAamp ＤＮＡ血液キットを用いて）調製し、ゲノム配列決定のために送った。
【０４３１】
ゲノム配列は、単離されたＳＪ１６５５（Ｏ４ＺＸＶ）が、密接に関連する株であるＤＳＭ２００１６よりも、ＪＣＭ１１１２と実質的に同一のゲノムを有することを明らかにした。ＪＣＭ１１１２及びＤＳＭ２００１６は、同一の起源の単離体Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）Ｆ２７５（Morita, H, Toh, H., Fukuda, S., Horikawa, H., Oshima, K., Suzuki, T., Murakami, M., Hisamatsu, S., Kato, Y., Takizawa, T., Fukuoka, H., Yoshimura, T., Itoh, K., O’Sullivan, D. J., McKay, L., Ohno, H., Kikuchi, J., Masaoka, T., Hattori, M. (2008) Comparative genome analysis of Lactobacillus reuteri and Lactobacillus fermentum reveal a genomic island for reuterin and cobalamin production. DNA research, 15, 151-161）に由来する。
【０４３２】
ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）ＳＪ１１０４４：
Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）ＳＪ１１０４４は、以下の手順によりＳＪ１０６５５（Ｏ４ＺＸＶ）から得られた。ＳＪ１０６５５をアルコール−デヒドロゲナーゼ発現コンストラクトを含むｐＶＳ２に基づくプラスミドである、ｐＳＪ１０７６９（下記に記載される）を用いて形質転換し、ＳＪ１１０１６（下記に記載される）を得た。
【０４３３】
ＳＪ１１０１６を０．２５μｇ／ｍｌノボビオシンを含むＭＲＳ培地中で増殖させ、プラスミドについて株を保存し、ＭＲＳ寒天プレート上にプレートし、エリスロマイシン感受性コロニーをレプリカ平板法により同定した。一つのかかる株をＳＪ１１０４４として保存した。株ＳＪ１１０４４を元の株ＳＪ１０６５５とともにエレクトロポレーションのために調製し、試験プラスミドとしてｐＳＪ１０６００（下記に記載される）を用いたエレクトロポレーション頻度において差がないことが観察された。
【０４３４】
かかる操作がされたＳＪ１１０４４エレクトロコンピテント細胞を、ＳＪ１０６５５の（同一の）代わりとしてその後、特定の実験に用いた。
【０４３５】
バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＤＮ１８８５は、（Diderichsen, B., Wedsted, U., Hedegaard, L., Jensen, B. R., Sjoholm, C. (1990) Cloning of aldB, which encodes alpha-acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from Bacillus brevis. Journal of Bacteriology, 172, 4315-4321）に記載されている。
【０４３６】
バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＪＡ１３４３は、ＰＬ１８０１の胞子形成陰性誘導体である。遺伝子ＳｐｏＩＩＡＣの部分は、胞子形成陰性表現型を得るために欠失している。
【０４３７】
大腸菌（Escherichia coli）：
ＳＪ２：（Diderichsen, B., Wedsted, U., Hedegaard, L., Jensen, B. R., Sjoholm, C. (1990) Cloning of aldB, which encodes alpha-acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from Bacillus brevis. Journal of Bacteriology, 172, 4315-4321）。
【０４３８】
ＭＧ１６５５：（Blattner, F. R., Plunkett, G. 3rd, Bloch, C. A., Perna, N. T., Burland, V., Riley, M., Collado-Vides, J., Glasner, J. D., Rode, C. K., Mayhew, G. F., Gregor, J., Davis, N. W., Kirkpatrick, H. A., Goeden, M. A., Rose, D. J., Mau, B., Shao, Y. (1997). The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science, 277, 1453-1462）。
【０４３９】
ＴＧ１：ＴＧ１は、一般的に用いられるクローニング株であり、供給者から得られ、以下の遺伝子型：Ｆ’［ｔｒａＤ３６  ｌａｃＩｑ  Δ（ｌａｃＺ）Ｍ１５  ｐｒｏＡ＋Ｂ＋］ｇｌｎＶ（ｓｕｐＥ）ｔｈｉ−１  Δ（ｍｃｒＢ−ｈｓｄＳＭ）５（ｒＫ−ｍＫ−ＭｃｒＢ−）ｔｈｉ  Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）を有する。
【０４４０】
実施例１：ラクトバチルス属株のためのエレクトロポレーションプロトコール
プラスミドＤＮＡをエレクトロポレーションによりラクトバチルス属株に導入した。
ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）株をエレクトロポレーションのために以下のように調製した。前記株を凍結保存培養から１％まで添加されたグリシンを含むＭＲＳ培地に植菌し、振盪することなく３７℃で一晩インキュベートした。これをその後、新しいＭＲＳ＋１％グリシンに、１：１００に希釈し、３７℃で振盪することなく、ＯＤ600が０．６に達するまでインキュベートした。細胞を３０℃で１０分間、４０００ｒｐｍにおける遠心分離により回収した。その後、前記細胞ペレットをもとの容量の１ｍＭ  ＭｇＣｌ2に再懸濁し、上述のように遠心分離によりペレットにした。その後、前記細胞ペレットをもとの容量の３０％  ＰＥＧ１５００に再懸濁し、上述のように遠心分離によりペレットにした。最終的に、これらをもとの容量の３０％  ＰＥＧ１５００に１／１００で穏やかに再懸濁し、５０μＬの量をアルコール／ドライアイス槽中で急速に凍結させ、使用まで−８０℃で保存した。
【０４４１】
プランタルムのエレクトロポレーションのために、凍結細胞を氷上で溶かし、２μＬのＴＥバッファ中ＤＮＡ懸濁液を添加した。４０μＬの混合物を氷冷した２ｍｍエレクトロポレーションキュベットに移し、１．５ｋＶ；２５マイクロファラッド；４００Ｏｈｍの設定で、BioRad Gene Pulser（商標）においてエレクトロポレーションを行なった。
【０４４２】
５００μＬのＭＲＳ−スクロース−ＭｇＣｌ2混合物（ＭＲＳ：６．５ｍｌ；２Ｍスクロース：２．５ｍｌ；１Ｍ  ＭｇＣｌ2：１ｍｌ）を添加し、プレーティングの前に、混合物を振盪することなく３０℃で２時間インキュベートした。
【０４４３】
ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）株をエレクトロポレーションのために以下のように調製した。前記株を凍結保存培養からＬＣＭ培地に植菌し、振盪することなく３７℃で一晩インキュベートした。５ｍＬの量を５００ｍｌＬＣＭに移し、振盪することなく、ＯＤ600が０．８に達するまで３７℃でインキュベートした。前記細胞を上述のように遠心分離により回収し、再懸濁し、室温において５０ｍｌのイオン交換滅菌水で２回洗浄し、そして遠心分離により回収した。最終的に、前記細胞を２．５ｍｌの３０％  ＰＥＧ１５００に穏やかに再懸濁し、５０μＬの量をアルコール／ドライアイス槽中で急速に凍結し、使用まで−８０℃で保存した。
【０４４４】
ロイテリのエレクトロポレーションのために、凍結細胞を氷上で溶かし、２μＬのＴＥバッファ中ＤＮＡ懸濁液を添加した。４０μＬの混合物を氷冷した２ｍｍエレクトロポレーションキュベットに移し、１〜３分間氷上に放置し、１．５ｋＶ；２５マイクロファラッド；４００Ｏｈｍの設定で、BioRad Gene Pulser（商標）においてエレクトロポレーションを行なった。５００μＬのＬＣＭを添加し、プレーティングの前に、前記混合物を振盪することなく３７℃で２時間インキュベートした。細胞を要求される抗生物質が添加されたＬＣＭ寒天プレート（％寒天で固めたＬＣＭ培地）又はＭＲＳ寒天プレートのいずれか上にプレートし、嫌気的チャンバー（Oxoid；Anaerogen sachetを備えている）中でインキュベートした。
【０４４５】
実施例２：発現ベクターｐＴＲＧＵ８８の構築
ＬａｃＩqリプレッサー、ｔｒｃプロモーター、及びマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含む２３４９ｂｐフラグメントを、下記に示すｐＴｒｃＢｇｌＩＩｔｏｐ及びｐＴｒｃＳｃａＩｂｏｔを用いてｐＴｒｃ９９Ａ（E. Amann and J. Brosius, 1985, Gene 40(2-3), 183-190）から増幅した。
【０４４６】
プライマーｐＴｒｃＢｇｌＩＩｔｏｐ：
５’−ＧＡＡＧＡＴＣＴＡＴＧＧＴＧＣＡＡＡＡＣＣＴＴＴＣＧＣＧＧ−３’（配列番号８３）
プライマーｐＴｒｃＳｃａＩｂｏｔ：
５’−ＡＡＡＡＧＴＡＣＴＣＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＴＴＣＴＧＡＧ−３’（配列番号８４）
【０４４７】
ＰＣＲを、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen, UK）を用いて行い、増幅反応を、９５℃で２分；その後９５℃で３０秒、４２℃で３０秒、そして７２℃で２分を２５サイクル；その後７２℃で３分を１サイクルでプログラムした。得られたＰＣＲ産物を製造者の使用説明書に従って、ＰＣＲ精製キット（Qiagen, Hilden, Germany）で精製し、各５ユニットのＢｇｌＩＩ（New England Biolabs, Ipswich, MA, USA）及びＳｃａＩ（New England Biolabs）（制限酵素認識部位は、上記プライマー中の下線である）で３７℃で一晩消化した。消化されたフラグメントを製造者の使用説明書に従って、ＰＣＲ精製キット（Qiagen）を用いて精製した。
【０４４８】
ｐ１５Ａ複製起点を有するプラスミドｐＡＣＹＣ１７７（Y. K. Mok, et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16(1), 356）を、５単位のＳｃａＩ（New England Biolabs）及び１０単位のＢａｍＨＩ（New England Biolabs）を用いて、３７℃で２時間消化した。消化物に１０単位の仔牛腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）（New England Biolabs）を添加し、インキュベーションをさらに１時間続け、３２５６ｂｐフラグメント及び６８５ｂｐフラグメントを得た。前記消化混合物を１％アガロースゲル上で泳動し、３２５６ｂｐフラグメントをゲルから抽出し、製造者の使用説明書に従ってQIAquickゲル抽出キットを（Qiagen, Hilden, Germany）用いて精製した。
【０４４９】
精製された２３４９ｂｐのＰＣＲ／制限フラグメントを、製造者の使用説明書に従って、ラピッドライゲーションキット（F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel Switzerland）を用いて３２５６ｂｐの制限フラグメントにライゲートさせ、ｐＭｌＢａ２を得た。プラスミドｐＭｌＢａ２をNew England Biolabsにより提案される標準バッファ３及びＢＳＡを用いてＰｓｔＩで消化し、ｂｌａＴＥＭ−１（ｂｌａＴＥＭ−１プロモーター及びＲＢＳを含む）の最初の５４７ｂｐを含む１０７８ｂｐＰｓｔＩフラグメント、並びにｐ１５Ａ複製起点、ＬａｃＩqリプレッサー、ｔｒｃプロモーター、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）、及びアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む４５２４ｂｐフラグメントを得た。
【０４５０】
４５２４ｂｐフラグメントを、１０ｍＭ  ＡＴＰ（F. Hoffmann-La Roche Ltd）を含むＴ４  ＤＮＡリガーゼバッファ中でＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃で一晩ライゲートさせた。１μＬの量のライゲーション混合物をエレクトロポレーションを用いて大腸菌ＳＪ２細胞を形質転換した。形質転換体を２０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢＰＧＳプレート上にプレートし、３７℃で一晩インキュベートした。選択されたコロニーを２００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢプレート、及び２０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢプレート上に縞状に播種した。アンピシリン感受性、かつカナマイシン耐性である８つの形質転換体を単離し、２０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢプレート上で縞状に播種し、純化した。８個のコロニーのそれぞれを液体ＴＹブイヨン培地中に植菌し、３７℃で一晩インキュベートした。各コロニーからのプラスミドをQiaprep（登録商標）スピンミニプレップキット（Qiagen）を用いて単離し、その後ＥｃｏＲＩ及びＭｌｕＩを用いて二重に消化した。各プラスミドは、Lonza（Basel, Switzerland）製の電気泳動システム「ＦｌａｓｈＧｅｌ（登録商標）システム」を用いて分析した場合、１０４１ｂｐ及び３４８３ｂｐの正しい制限パターンを得た。大腸菌ＴＲＧＵ８８と称される一つの形質転換体の一晩の液体培養物を、−８０℃で３０％グリセロール中で保存した。対応するプラスミドｐＴＲＧＵ８８（図４）を製造者の使用説明書を用いてQiaprep（登録商標）スピンミニプレップキット（Qiagen）を用いて大腸菌ＴＲＧＵ８８から単離し、−２０℃で保存した。
【０４５１】
実施例３：ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位においてサイレント変異を有する合成アミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子の設計及びベクターｐＴＲＧＵ１８６の構築
上記のベクターｐＴＲＧＵ８８中１５２４〜２４９４ｂｐに及ぶ９７１ｂｐのヌクレオチド配列は、後述のサイレント変異を用いて除かれる、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位を含むアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子のコーディング配列を含む。
【０４５２】
サイレント変異を含むｂｌａ遺伝子：
５’−ＣＡＴ  ＡＡＡ  ＣＴＴ  ＴＴＧ−３’
野生型ｂｌａ遺伝子：
５’−ＣＡＴ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＴＴＧ−３’
【０４５３】
サイレント変異を含む９７１ｂｐＤＮＡフラグメントを、ｐＴＲＧＵ１８６に合成的に構築した。得られた配列は、その後Geneart AG (Regenburg, Germany)により置換及び合成され、β−ラクタマーゼをコードする遺伝子ｂｌａＴＥＭ−１を含むｐＭＡバックボーンベクターに導入された。合成される場合、続くクローニングステップを容易にするために、ＤＮＡフラグメントをＳｔｕＩ制限酵素認識部位と隣接させた。
【０４５４】
アミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子の野生型ヌクレオチド配列（ＷＴ）、サイレント変異を含む配列、推定されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７６、７７、及び７８として示される。前記コーディング配列は、終始コドンを含む８１６ｂｐであり、コードされる予測タンパク質は、２７１アミノ酸である。
【０４５５】
実施例４：ベクターｐＴＲＧＵ８８のアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子中のＨｉｎｄＩＩＩ部位の除去、及びベクターｐＴＲＧＵ１８７の構築
ベクターｐＴＲＧＵ８８及びｐＴＲＧＵ１８でNEB製のｄａｍ-／ｄｃｍ-大腸菌（Cat. no. C2925H）を化学的に形質転換し、ＬＢ培地中５０ｍｌの一晩培養物の５ｘ４ｍｌから、Qiaprep（登録商標）スピンミニプレップキット（Qiagen）を用いてそれぞれ再単離した。
【０４５６】
ｐＴＲＧＵ８８中アミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子を、１３３６ｂｐ〜２６７５ｂｐに亘るＤＮＡフラグメントを切り出すために用いられるＳｔｕＩ制限酵素認識部位と隣接させた。このフラグメントは、コーディング配列の上流２８４ｂｐ、及び下流２４３ｂｐを含む。４００ｂｐ〜１３７６ｂｐに及ぶｐＴＲＧＵ１８６のＳｔｕＩフラグメントは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含まないコーディング配列、並びにコーディング配列の上流９９ｂｐ、及び下流６５ｂｐを含む。
【０４５７】
ｐＴＲＧＵ８８及びｐＴＲＧＵ１８６の双方をＳｔｕＩ（NEB）を用いて３７℃で一晩消化した。前記酵素を６５℃で２０分間熱不活性化し、ｐＴＲＧＵ８８反応混合物を３７℃で３０分間１Ｕ仔牛腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）（NEB）を用いて脱リン酸化した。消化されたｐＴＲＧＵ８８及びｐＴＲＧＵ１８６を１％アガロースゲルで泳動し、予測されるサイズ（ｐＴＲＧＵ８８：１３４０ｂｐ；ｐＴＲＧＵ１８６：９７７ｂｐ）のバンドを、その後、製造者の使用説明書に従ってQIAquickゲル抽出キット（Qiagen, Hilden, Germany）を用いて精製した。
【０４５８】
単離されたＤＮＡフラグメントを、１０ｍＭＡＴＰ（F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel Switzerland）を含むＴ４  ＤＮＡリガーゼバッファ中Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、１６℃で一晩ライゲートした。１μＬの量のライゲーション混合物でエレクトロポレーションにより大腸菌ＴＯＰ１０を形質転換した。形質転換体を２０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢプレート上にプレートし、３７℃で一晩インキュベートした。選択されたコロニーを、その後２０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢプレート上に縞状に播種した。大腸菌ＴＲＧＵ１８７の一つのコロニーを１０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む液体ＴＹブイヨン培地に植菌し、３７℃で一晩インキュベートした。対応するプラスミドｐＴＲＧＵ１８７をQiaprep（登録商標）スピンミニプレップキット（Qiagen）を用いて単離し、ＢａｍＨＩ及びＣｌａＩを含む制限酵素分析に供し、これはＢａｍＨＩ−ＣｌａＩ：１７６４ｂｐ及びＣｌａＩ−ＢａｍＨＩ：２７６０ｂｐのバンドをもたらし、ｐＴＲＧＵ１８７中の遺伝子の時計回りの向きを確認した。ｐＴＲＧＵ１８７を含む一晩の液体培養液からの大腸菌ＴＲＧＵ１８７を、−８０℃において３０％グリセロール中でに保存した。
【０４５９】
実施例５：ペプチド誘導可能ｐＳＩＰ発現ベクター
ペプチド誘導可能発現ベクターｐＳＩＰ４０９、ｐＳＩＰ４１０、及びｐＳＩＰ４１１（Sorvig, E., Mathiesen, G., Naterstad, K., Eijsink, V. G. H., Axelsson, L. (2005). High-level, inducible gene expression in Lactobacillus sakei and Lactobacillus plantarum using versatile expression vectors. Microbiology, 151, 2439-2449）は、Lars Axelsson, Nofima Mat AS, Norwayから提供された。ｐＳＩＰ４０９及びｐＳＩＰ４１０でエレクトロポレーションにより大腸菌ＳＪ２を形質転換し、３７℃においてＬＢ寒天プレート上でエリスロマイシン耐性（１５０μｇ／ｍｌ）を選択した。ｐＳＩＰ４０９を含む二つの形質転換体をＳＪ１０５１７及びＳＪ１０５１８として保存し、ｐＳＩＰ４１０を含む二つの形質転換体をＳＪ１０５１９及びＳＪ１０５２０として保存した。
【０４６０】
本質的に記載されるように（Yasbin, R. E., Wilson, G. A., Young, F. E. (1975). Transformation and transfection in lysogenic strains of Bacillus subtilis: Evidence for selective induction of prophage in competent cells. Journal of Bacteriology, 121, 296-304）、ｐＳＩＰ４１１で天然のコンピテントバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＤＮ１８８５細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢＰＧＳプレート上でエリスロマイシン耐性（５μｇ／ｍｌ）について選択した。二つのかかる形質転換体をＳＪ１０５１３及びＳＪ１０５１４として保存した。
【０４６１】
ｐＳＩＰ４１１でエレクトロポレーションにより大腸菌ＭＧ１６５５を形質転換し、３７℃においてＬＢ寒天プレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択し、二つの形質転換体をＳＪ１０５４２及びＳＪ１０５４３として保存した。
【０４６２】
ラクトバチルス属におけるこれらのベクターからの遺伝子発現の導入に使用のために、Ｍ−１９−Ｒと称され、以下のアミノ酸配列：「Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ」を有する誘導ペプチドを、「Polypeptide Laboratories France, 7 rue de Boulogne, 67100 Strasbourg, France」から得た。
【０４６３】
実施例６：構成的発現のためのｐＶＳ２に基づくベクターｐＳＪ１０６００及びｐＳＪ１０６０３の構築
一連の構成的発現ベクターは、プラスミドｐＶＳ２（von Wright, A., Tynkkynen, S., Suominen, M. (1987) Cloning of a Streptococcus lactis subsp. Lactis chromosomal fragment associated with the ability to grow in milk. Applied and Environmental Microbiology, 53, 1584-1588）及びRud et al.（Rud, I., Jensen, P. R., Naterstad, K., Axelsson, L. (2006) A synthetic promoter library for constitutive gene expression in Lactobacillus plantarum. Microbiology, 152, 1011-1019）により記載されるプロモーターに基づいて構築された。隣接する制限酵素認識部位の選択を含むＰ１１プロモーターを含むＤＮＡフラグメント、及び隣接する制限酵素認識部位の選択を含むＰ２７を含む別のフラグメントは、Geneart AG (Regenburg, Germany)により化学的に合成された。
【０４６４】
隣接する制限酵素認識部位の選択を含むＰ１１プロモーターを含むＤＮＡフラグメント、及び隣接する制限酵素認識部位の選択を含むＰ２７を含むＤＮＡフラグメントは、それぞれ配列番号：８５及び８６に示される。フラグメントが標準的なGeneartベクターであるｐＭＡに挿入される場合、双方のＤＮＡフラグメントは、ＤＮＡ調製物の形態において得られる。Ｐ１１を含むベクターで、大腸菌ＳＪ２細胞を形質転換し、プラスミドｐＳＪ１０５６０を含む形質転換体は、ＳＪ１０５６０として保存された。Ｐ２７を含むベクターで、大腸菌ＳＪ２細胞を形質転換し、プラスミドｐＳＪ１０５６１を含む形質転換体を、ＳＪ１０５６１として保存した。
【０４６５】
１７６ｂｐＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの形態中のプロモーターを含むフラグメントを、Geneartベクターから切り出し、ＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＵＣ１９とライゲートさせた。Ｐ１１を含むフラグメントをＳＪ１０５６０から調製されたベクターから切り出し、ｐＵＣ１９とライゲートさせ、ｐＳＪ１０５８５及びｐＳＪ１０５８６をそれぞれを含む大腸菌ＳＪ２の正確な形質転換体をＳＪ１０５８５及びＳＪ１０５８６として保存した。Ｐ２７を含むフラグメントをＳＪ１０５６１から調製されたベクターから切り出し、ｐＵＣ１９とライゲートさせ、ｐＳＪ１０５８７及びｐＳＪ１０５８８をそれぞれを含む大腸菌ＳＪ２の正確な形質転換体をＳＪ１０５８７及びＳＪ１０５８８として保存した。
【０４６６】
プラスミドｐＶＳ２をＳＪ１０４９１として保存された株であるラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＮＣ８において得て、当該技術分野において知られている標準的なプラスミド調製手順によりこの株から抽出し、大腸菌ＭＧ１６５５を形質転換し、３７℃においてＬＢ寒天プレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。二つのかかる形質転換体をＳＪ１０５８３及びＳＪ１０５８４として保存した。
【０４６７】
ｐＶＳ２にＰ１１を挿入するために、Ｐ１１を含む１７６ｂｐＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを切り出し、ｐＳＪ１０５８５からアガロースゲル電気泳動により精製し、ＳＪ１０５８３から調製されたＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＶＳ２とライゲートさせた。ライゲーション混合物でエレクトロポレーションにより大腸菌ＭＧ１６５５を形質転換し、ＬＢ寒天プレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択し、二つの可能性のある方向のうちの一つにおいてプロモーター挿入を含むプラスミドを双方ともに有する二つのかかる形質転換体を、ＳＪ１０６００及びＳＪ１０６０１として保存し、これはｐＳＪ１０６００（図５）及びｐＳＪ１０６０１を含む。
【０４６８】
二つの可能性のある方向のうちの他方においてプロモーター挿入を有する別の形質転換体を、ＳＪ１０６０２として保存し、これはｐＳＪ１０６０２を含む。ＳＪ１０６０２からのプラスミド調製物は、ＳＪ１０６００及びＳＪ１０６０１からの同程度の調製物よりも少ないＤＮＡを含むように見え、更なる研究において、ｐＳＪ１０６０２はプラスミド集団において支配的である欠失誘導体を含み、やや不安定であるように見えた。
【０４６９】
ｐＶＳ２にＰ２７を挿入するために、Ｐ２７を含む１７６ｂｐＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを切り出し、ｐＳＪ１０５８８からアガロースゲル電気泳動により精製し、ＳＪ１０５８３から調製されたＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＶＳ２とライゲートさせた。ライゲーション混合物でエレクトロポレーションにより大腸菌ＭＧ１６５５を形質転換し、ＬＢ寒天プレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択し、二つの可能性のある方向のうちの一つにおいてプロモーター挿入を含むプラスミドを双方ともに有する二つの形質転換体を、ＳＪ１０６０３及びＳＪ１０６０４として保存し、これはｐＳＪ１０６０３（図６）及びｐＳＪ１０６０４を含む。
【０４７０】
二つの可能性のある方向のうちの他方においてプロモーター挿入を有する別の形質転換体を、ＳＪ１０６０５として保存し、これはｐＳＪ１０６０５を含む。このプラスミドにおけるプロモーター方向性は、上述のようにｐＳＪ１０６０２においてと同一である。ＳＪ１０６０５からのプラスミド調製物は、ＳＪ１０６０３及びＳＪ１０６０４からの同程度の調製物よりも少ないＤＮＡを含むように見え、更なる研究において、ｐＳＪ１０６０５はプラスミド集団において支配的である欠失誘導体を含み、やや不安定であるように見えた。
【０４７１】
実施例７：発酵生成物分析
本明細書に記載の発酵培養中のアセトン、１−プロパノール及びイソプロパノールは、ＧＣ−ＦＩＤにより検出可能であった。サンプルを、メタノール中０．０５％テトラヒドロフランで、１＋１に希釈し、分析した。ＧＣパラメータは、表１に列挙する。
【０４７２】
【表１】
2013544083.tif 000002
【０４７３】
実施例８：イソプロパノール経路遺伝子のクローニング
クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）チオラーゼ遺伝子のクローニング及びベクターｐＳＪ１０７０５の構築
クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）において同定されたチオラーゼ遺伝子の１１７６ｂｐコーディング配列（終始コドンを含まない）を、大腸菌（Escherichia coli）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、及びラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）の３つの生物における最適な発現のために設計し、ｐＳＪ１０７０５に合成的に構築した。コドン最適化コーディング配列を含むＤＮＡフラグメントを、開始コドンの直前に配列５’−ＡＡＧＣＴＴＴＣ−３’（ＨｉｎｄＩＩＩ部位を付加し、開始領域をＮｃｏＩ−互換的ＢｓｐＨＩ部位に変換するために）、及びすぐ下流に配列５’−ＴＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＧＧＴＡＣＣ−３’（終始コドン、及び制限酵素認識部位ＸｂａＩ−ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩを付加するために）が含まれるように設計した。
【０４７４】
得られた配列は、その後Geneart AG (Regenburg, Germany)により置換及び合成され、β−ラクタマーゼをコードする遺伝子ｂｌａＴＥＭ−１を含むｐＭＡバックボーンベクターに導入された。GeneartからのＤＮＡ調製物で、エレクトロポレーションにより大腸菌ＳＪ２を形質転換し、アンピシリン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択し、２つの形質転換体を、ＳＪ１０７０５（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７０５）及びＳＪ１０７０６（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７０６）として保存した。
【０４７５】
Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）チオラーゼ遺伝子の野生型ヌクレオチド配列（ＷＴ）、コドン最適化ヌクレオチド配列（ＣＯ）、及び推定されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２、及び３である。前記コーディング配列は、終始コドンを含む１１７９ｂｐであり、コードされる予測されるタンパク質は、３９２個のアミノ酸である。ＳｉｇｎａｌＰプログラム（Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6）を用いて、配列中にシグナルペプチドはないことが予測された。このプログラムに基づいて予測される成熟タンパク質は、４１．４ｋＤａの予測分子量、及び７．０８の等電ｐＨを有する３９２個のアミノ酸を含む。
【０４７６】
ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）チオラーゼ遺伝子のクローニング及びベクターｐＳＪ１０６９４の構築
ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）由来の１１７６ｂｐチオラーゼコーディング配列（終始コドンを含まない）を、下記に示されるプライマー６７１８２６及び６７１８２７を用いて、ＳＪ１０４６８（同上）の染色体ＤＮＡから増幅した。
【０４７７】
プライマー６７１８２６：
５’−ＡＧＴＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＴＴＴＡＣＡＴＴＧＴＴＧＣ−３’（配列番号８７）
プライマー６７１８２７：
５’−ＡＴＧＣＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴＡＡＡＴＴＴＴＣＴＴＡＡＧＣＡＧＡＡＣＣＧ−３’（配列番号８８）
【０４７８】
ＰＣＲ反応を、９４℃で２分；その後９５℃で３０秒、５９℃で１分、そして７２℃で２分を１９サイクル；その後７２℃で５分を１サイクルでプログラムした。約１．２ｋｂのＰＣＲ増幅断片を、ＮｃｏＩ＋ＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動により精製し、その後アガロースゲル電気泳動により精製されたプラスミドｐＳＩＰ４０９のＥｃｏＲＩ−ＮｃｏＩベクターフラグメントとライゲートさせた。ライゲーション混合物で大腸菌ＳＪ２を形質転換し、アンピシリン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択し、形質転換体を制限酵素消化及びＤＮＡ配列決定により正確であるとみなし、ＳＪ１０６９４（ＳＪ２／ｐＳＪ１０６９４）として保存した。
【０４７９】
Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）チオラーゼ遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列（ＣＯ）、及び推定されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３４及び３５である。コーディング配列は、終始コドンを含む１１７９ｂｐであり、コードされ、予測されるタンパク質は、３９２個のアミノ酸である。ＳｉｇｎａｌＰプログラム（Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6）を用いて、配列中にシグナルペプチドがないことが予測された。このプログラムに基づいて予測される成熟タンパク質は、４１．０ｋＤａの予測分子量、及び５．４の等電ｐＨを有する３９２個のアミノ酸を含む。
【０４８０】
プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Propionibacterium freudenreichii）チオラーゼ遺伝子のクローニング及びベクターｐＳＪ１０６７６の構築
プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Propionibacterium freudenreichii）において同定されたチオラーゼ遺伝子の１１５２ｂｐコーディング配列（終始コドンを含まない）を、大腸菌（Escherichia coli）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、及びラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）の３つの生物における発現のために最適化し、合成的にｐＳＪ１０６７６に構築した。コドン最適化ＣＤＳを含むＤＮＡフラグメントを、開始コドンの直前に配列５’−ＡＡＧＣＴＴＴＣ−３’（ＨｉｎｄＩＩＩ部位を付加し、開始領域をＮｃｏＩ−互換的ＢｓｐＨＩ部位に変換するために）、及びすぐ下流に配列５’−ＴＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＧＧＴＡＣＣ−３’（配列番号１１２）（終始コドン、及び制限酵素認識部位ＸｂａＩ−ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩを付加するために）が含まれるように設計した。
【０４８１】
得られた配列は、その後Geneart AG (Regenburg, Germany)により置換及び合成され、β−ラクタマーゼをコードする遺伝子ｂｌａＴＥＭ−１を含むｐＭＡバックボーンベクターに導入された。Geneartに由来するＤＮＡ調製物で、エレクトロポレーションにより大腸菌ＳＪ２を形質転換し、アンピシリン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択し、２つの形質転換体を、ＳＪ１０６７６（ＳＪ２／ｐＳＪ１０６７６）及びＳＪ１０６７７（ＳＪ２／ｐＳＪ１０６７７）として保存した。
【０４８２】
Ｐ．フロイデンライシイ（P. freudenreichii）チオラーゼ遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列（ＣＯ）、及び推定されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１１３及び１１４である。前記コーディング配列は、終始コドンを含む１１５５ｂｐであり、コードされ、予測されるタンパク質は、３８４個のアミノ酸である。ＳｉｇｎａｌＰプログラム（Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6）を用いて、配列中にシグナルペプチドがないことが予測された。このプログラムに基づいて予測される成熟タンパク質は、３９．８ｋＤａの予測分子量、及び６．１の等電ｐＨを有する３８４個のアミノ酸を含む。
【０４８３】
ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）チオラーゼ遺伝子のクローニング及びベクターｐＳＪ１０６９９の構築
ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）において同定されたチオラーゼ遺伝子の１１６７ｂｐコーディング配列（終始コドンを含まない）を、大腸菌（Escherichia coli）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、及びラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）の３つの生物において最適な発現のために設計し、合成的にｐＳＪ１０６９９に構築した。コドン最適化ＣＤＳを含むＤＮＡフラグメントを、開始コドンの直前に配列５’−ＡＡＧＣＴＴＣＣ−３’（ＨｉｎｄＩＩＩ部位を付加し、開始領域をＮｃｏＩ部位に変換するために）、及びすぐ下流に配列５’−ＴＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＧＧＴＡＣＣ−３’（配列番号１１２）（終始コドン、及び制限酵素認識部位ＸｂａＩ−ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩを付加するために）が含まれるように設計した。
【０４８４】
得られた配列は、その後Geneart AG (Regenburg, Germany)により置換及び合成され、β−ラクタマーゼをコードする遺伝子ｂｌａＴＥＭ−１を含むｐＭＡバックボーンベクターに導入された。Geneartに由来するＤＮＡ調製物を、エレクトロポレーションにより大腸菌ＳＪ２に形質転換し、アンピシリン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択し、２つの形質転換体を、ＳＪ１０６９９（ＳＪ２／ｐＳＪ１０６９９）及びＳＪ１０７００（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７００）として保存した。
【０４８５】
Ｌ．ブレビス（L. brevis）チオラーゼ遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列（ＣＯ）、及び推定されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１１５及び１１６である。コーディング配列は、終始コドンを含む１１７０ｂｐであり、コードされ、予測されるタンパク質は、３８９個のアミノ酸である。ＳｉｇｎａｌＰプログラム（Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6）を用いて、配列中にシグナルペプチドがないことが予測された。このプログラムに基づいて予測される成熟タンパク質は、４０．４ｋＤａの予測分子量、及び６．５の等電ｐＨを有する３８９個のアミノ酸を含む。
【０４８６】
Ｂ．サブチリス（B. subtilis）スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ遺伝子のクローニング並びにベクターｐＳＪ１０６９５及びｐＳＪ１０６９７の構築
Ｂ．サブチリス（B. subtilis）スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼのｓｃｏＡサブユニットの６９９ｂｐコーディング配列（終始コドンを含まない）及びＢ．サブチリス（B. subtilis）スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼのｓｃｏＢサブユニットの６４８ｂｐコーディング配列を、大腸菌（Escherichia coli）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、及びラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）の３つの生物における最適な発現のために設計し、合成的にｐＳＪ１０６９５及びｐＳＪ１０６９７にそれぞれ構築した。
【０４８７】
コドン最適化コーディング配列を含むＤＮＡフラグメントを、開始コドンの直前に配列５’−ＡＡＧＣＴ  ＴＣＴＣＧ  ＡＧＡＣＴ  ＡＴＴＡＣ  ＡＡＧＧＡ  ＧＡＴＴＴ  ＴＡＧＣＣ−３’（配列番号８９）（ＨｉｎｄＩＩＩ部位、ラクトバチルスＲＢＳを付加し、ＮｃｏＩ中に開始コドンを持たせるために）、及びすぐ下流にＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位が含まれるように設計した。設計されたコンストラクトを、Geneart AGから得て、上述のように形質転換し、ＳＪ１０６９５（ＳＪ２／ｐＳＪ１０６９５）及びＳＪ１０６９６（ＳＪ２／ｐＳＪ１０６９６）を得た。
【０４８８】
スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼのＢ．サブチリス（B. subtilis）ｓｃｏＡサブユニットの野生型ヌクレオチド配列（ＷＴ）、コドン最適化ヌクレオチド配列（ＣＯ）、及び推定されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７、８、及び９である。コーディング配列は、終始コドンを含む７０２ｂｐであり、コードされ、予測されるタンパク質は、２３３個のアミノ酸である。ＳｉｇｎａｌＰプログラム（Nielsen et al.、同上）を用いて、配列中にシグナルペプチドがないことが予測された。このプログラムに基づいて予測される成熟タンパク質は、２５．１ｋＤａの予測分子量、及び６．５０の等電ｐＨを有する２３３個のアミノ酸を含む。
【０４８９】
コドン最適化ｓｃｏＢコーディング配列を含むＤＮＡフラグメントを、開始コドンの直前に配列５’−ＧＡＡＴＴ  ＣＡＣＴＡ  ＴＴＡＣＡ  ＡＧＧＡＧ  ＡＴＴＴＴ  ＡＧＴＣ−３’（配列番号９０）（ＥｃｏＲＩ部位、ラクトバチルスＲＢＳを付加し、ＮｃｏＩ−互換的ＢｓｐＨＩ部位中に開始コドンを持たせるために）、及びすぐ下流にＥａｇＩ及びＫｐｎＩ制限酵素認識部位が含まれるように設計した。設計されたコンストラクトをGeneart AGから得て、上述のように形質転換し、ＳＪ１０６９７（ＳＪ２／ｐＳＪ１０６９７）及びＳＪ１０６９８（ＳＪ２／ｐＳＪ１０６９８）を得た。
【０４９０】
スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼのＢ．サブチリス（B. subtilis）ｓｃｏＢサブユニットの野生型ヌクレオチド配列（ＷＴ）、コドン最適化ヌクレオチド配列（ＣＯ）、及び推定されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７、８、及び９である。コーディング配列は、終始コドンを含む６５１ｂｐであり、コードされ、予測されるタンパク質は、２１６個のアミノ酸である。ＳｉｇｎａｌＰプログラム（Nielsen et al.、同上）を用いて、配列中にシグナルペプチドがないことが予測された。このプログラムに基づいて予測される成熟タンパク質は、２３．４ｋＤａの予測分子量、及び５．０７の等電ｐＨを有する２１６個のアミノ酸を含む。
【０４９１】
Ｂ．モジャベンシス（B. mojavensis）スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ遺伝子のクローニング並びにベクターｐＳＪ１０７２１及びｐＳＪ１０７２３の構築
Ｂ．モジャベンシス（B. mojavensis）スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼのｓｃｏＡサブユニットの７１１ｂｐコーディング配列（終始コドンを含まない）及びＢ．モジャベンシス（B. mojavensis）スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼのｓｃｏＢサブユニットの６５４ｂｐコーディング配列（終始コドンを含まない）を、大腸菌（Escherichia coli）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、及びラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）の３つの生物における最適な発現のために設計し、合成的にｐＳＪ１０７２１及びｐＳＪ１０７２３にそれぞれ構築した。
【０４９２】
コドン最適化ｓｃｏＡコーディング配列を含むＤＮＡフラグメントを、開始コドンの直前に配列５’−ＡＡＧＣＴ  ＴＣＴＣＧ  ＡＧＡＣＴ  ＡＴＴＡＣ  ＡＡＧＧＡ  ＧＡＴＴＴ  ＴＡＧＣＣ−３’（配列番号８９）（ＨｉｎｄＩＩＩ部位、ラクトバチルスＲＢＳを付加し、ＮｃｏＩ部位中に開始コドンを持たせるために）、及びすぐ下流にＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位が含まれるように設計した。設計されたコンストラクトを、Geneart AGから得て、上述のように形質転換し、ＳＪ１０７２１（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７２１）及びＳＪ１０７２２（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７２２）を得た。
【０４９３】
スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼのＢ．モジャベンシス（B. mojavensis）ｓｃｏＡサブユニットの野生型ヌクレオチド配列（ＷＴ）、コドン最適化ヌクレオチド配列（ＣＯ）、及び推定されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０、１１、及び１２である。コーディング配列は、終始コドンを含む７１４ｂｐであり、コードされ、予測されるタンパク質は、２３７個のアミノ酸である。ＳｉｇｎａｌＰプログラム（Nielsen et al.、上記）を用いて、配列中にシグナルペプチドがないことが予測された。このプログラムに基づいて予測される成熟タンパク質は、２５．５ｋＤａの予測分子量、及び５．８２の等電ｐＨを有する２３７個のアミノ酸を含む。
【０４９４】
コドン最適化ｓｃｏＢヌクレオチドコーディング配列を含むＤＮＡフラグメントを、開始コドンの直前に配列５’−ＧＡＡＴＴ  ＣＡＣＴＡ  ＴＴＡＣＡ  ＡＧＧＡＧ  ＡＴＴＴＴ  ＡＧＴＣ−３’（配列番号９０）（ＥｃｏＲＩ部位、ラクトバチルスRBSを付加し、ＮｃｏＩ−互換的ＢｓｐＨＩ部位中に開始コドンを持たせるために）、及びすぐ下流にＥａｇＩ及びＫｐｎＩ制限酵素認識部位が含まれるように設計した。設計されたコンストラクトをGeneart AGから得て、上述のように形質転換し、ＳＪ１０７２３（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７２３）及びＳＪ１０７２４（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７２４）を得た。
【０４９５】
スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼのＢ．モジャベンシス（B. mojavensis）ｓｃｏＢサブユニットの野生型ヌクレオチド配列（ＷＴ）、コドン最適化ヌクレオチド配列（ＣＯ）、及び推定されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１３、１４、及び１５である。コーディング配列は、終始コドンを含む６５７ｂｐであり、コードされ、予測されるタンパク質は、２１８個のアミノ酸である。ＳｉｇｎａｌＰプログラム（Nielsen et al.、同上）を用いて、配列中にシグナルペプチドがないことが予測された。このプログラムに基づいて予測される成熟タンパク質は、２３．７ｋＤａの予測分子量、及び５．４０の等電ｐＨを有する２１８個のアミノ酸を含む。
【０４９６】
大腸菌アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子のクローニング並びにベクターｐＳＪ１０７１５及びｐＳＪ１０７１７の構築
大腸菌アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼのａｔｏＡサブユニット（ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ７６４５９）の６４８ｂｐコーディング配列（終始コドンを含まない）及び大腸菌アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼのａｔｏＤサブユニット（ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ７６４５８）の６６０ｂｐコーディング配列（終始コドンを含まない）を、大腸菌（Escherichia coli）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、及びラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）の３つの生物における発現のために最適化し、合成的にｐＳＪ１０７１５及びｐＳＪ１０７１７にそれぞれ構築した。
【０４９７】
コドン最適化ａｔｏＡサブユニットヌクレオチドコーディング配列を含むＤＮＡフラグメントを、開始コドンの直前に配列５’−ＡＡＧＣＴ  ＴＣＴＣＧ  ＡＧＡＣＴ  ＡＴＴＡＣ  ＡＡＧＧＡ  ＧＡＴＴＴ  ＴＡＧＣＣ−３’（配列番号８９）（ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩ部位、ラクトバチルスＲＢＳを付加し、ＮｃｏＩ部位中に開始コドンを持たせるために）、及びすぐ下流にＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位が含まれるように設計した。設計されたコンストラクトを、Geneart AGから得て、上述のように形質転換し、ＳＪ１０７１５（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７１５）及びＳＪ１０７１６（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７１６）を得た。
【０４９８】
アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼの大腸菌ａｔｏＡサブユニットのコドン最適化ヌクレオチド配列（ＣＯ）、及び推定されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３６及び３７である。コーディング配列は、終始コドンを含む６５１ｂｐであり、コードされ、予測されるタンパク質は、２１６個のアミノ酸である。ＳｉｇｎａｌＰプログラム（Nielsen et al.、同上）を用いて、配列中にシグナルペプチドがないことが予測された。このプログラムに基づいて予測される成熟タンパク質は、２３．０ｋＤａの予測分子量、及び５．９の等電ｐＨを有する２１６個のアミノ酸を含む。
【０４９９】
コドン最適化ａｔｏＤヌクレオチドコーディング配列を含むＤＮＡフラグメントを、開始コドンの直前に配列５’−ＧＡＡＴＴ  ＣＡＣＴＡ  ＴＴＡＣＡ  ＡＧＧＡＧ  ＡＴＴＴＴ  ＡＧＴＣ−３’（配列番号９０）（ＥｃｏＲＩ部位、ラクトバチルスＲＢＳを付加し、ＮｃｏＩ−互換的ＢｓｐＨＩ部位中に開始コドンを持たせるために）、及びすぐ下流にＥａｇＩ及びＫｐｎＩ制限酵素認識部位が含まれるように設計した。設計されたコンストラクトを、Geneart AGから得て、上述のように形質転換し、ＳＪ１０７１７（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７１７）及びＳＪ１０７１８（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７１８）を得た。
【０５００】
アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼの大腸菌ａｔｏＤサブユニットのコドン最適化ヌクレオチド配列（ＣＯ）、及び推定されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３８及び３９である。コーディング配列は、終始コドンを含む６６３ｂｐであり、コードされ、予測されるタンパク質は、２２０個のアミノ酸である。ＳｉｇｎａｌＰプログラム（Nielsen et al.、同上）を用いて、配列中にシグナルペプチドがないことが予測された。このプログラムに基づいて予測される成熟タンパク質は、２３．５ｋＤａの予測分子量、及び４．９の等電ｐＨを有する２２０個のアミノ酸を含む。
【０５０１】
クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子のクローニング並びにベクターｐＳＪ１０７２７及びｐＳＪ１０７３１の構築
Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼのｃｔｆＡサブユニット（ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ３３７５２）の６５４ｂｐコーディング配列（終始コドンを含まない）及びＣ．アセトブチリカム  アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼのｃｔｆＢサブユニット（ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ２３６７３）の６６３ｂｐコーディング配列（終始コドンを含まない）を、大腸菌（Escherichia coli）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、及びラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）の３つの生物における発現のために最適化し、合成的にｐＳＪ１０７２７及びｐＳＪ１０７３１にそれぞれ構築した。
【０５０２】
コドン最適化ｃｔｆＡサブユニットコーディング配列を含むＤＮＡフラグメントを、開始コドンの直前に配列５’−ＡＡＧＣＴ  ＴＣＴＣＧ  ＡＧＡＣＴ  ＡＴＴＡＣ  ＡＡＧＧＡ  ＧＡＴＴＴ  ＴＡＧＴＣ−３’（配列番号９１）（ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩ部位、ラクトバチルスＲＢＳを付加し、ＮｃｏＩ−互換的ＢｓｐＨＩ部位中に開始コドンを持たせるために）、及びすぐ下流にＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位が含まれるように設計した。設計されたコンストラクトをGeneart AGから得て、上述のように形質転換し、ＳＪ１０７２７（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７２７）及びＳＪ１０７２８（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７２８）を得た。
【０５０３】
アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼのＣ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）ｃｔｆＡサブユニットのコドン最適化ヌクレオチド配列（ＣＯ）、及び推定されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４０及び４１である。コーディング配列は、終始コドンを含む６５７ｂｐであり、コードされ、予測されるタンパク質は、２１８個のアミノ酸である。ＳｉｇｎａｌＰプログラム（Nielsen et al.、同上）を用いて、配列中にシグナルペプチドがないことが予測された。このプログラムに基づいて予測される成熟タンパク質は、２３．６ｋＤａの予測分子量、及び９．３の等電ｐＨを有する２１８個のアミノ酸を含む。
【０５０４】
コドン最適化ｃｔｆＢサブユニットコーディング配列を含むＤＮＡフラグメントを、開始コドンの直前に配列５’−ＧＡＡＴＴ  ＣＡＣＴＡ  ＴＴＡＣＡ  ＡＧＧＡＧ  ＡＴＴＴＴ  ＡＧＴＣ−３’（配列番号９０）（ＥｃｏＲＩ部位、ラクトバチルスＲＢＳを付加し、ＮｃｏＩ−互換的ＢｓｐＨＩ部位中に開始コドンを持たせるために）、及びすぐ下流にＥａｇＩ及びＫｐｎＩ制限酵素認識部位が含まれるように設計した。設計されたコンストラクトをGeneart AGから得て、上述のように形質転換し、ＳＪ１０７３１（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７３１）及びＳＪ１０７３２（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７３２）を得た。
【０５０５】
アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼのＣ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）ｃｔｆＢサブユニットのコドン最適化ヌクレオチド配列（ＣＯ）、及び推定されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４２及び４３である。コーディング配列は、終始コドンを含む６６６ｂｐであり、コードされ、予測されるタンパク質は、２２１個のアミノ酸である。ＳｉｇｎａｌＰプログラム（Nielsen et al.、同上）を用いて、配列中にシグナルペプチドがないことが予測された。このプログラムに基づいて予測される成熟タンパク質は、２３．６ｋＤａの予測分子量、及び８．５の等電ｐＨを有する２２１個のアミノ酸を含む。
【０５０６】
クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子のクローニング及びベクターｐＳＪ１０７１１の構築
Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）由来のアセトアセテートデカルボキシラーゼ（ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ２３６７０）の７７７ｂｐコーディング配列（終始コドンを含まない）を、大腸菌（Escherichia coli）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、及びラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）の３つの生物における発現のために最適化し、合成的にｐＳＪ１０７１１に構築した。
【０５０７】
コドン最適化アセトアセテートデカルボキシラーゼコーディング配列（ａｂｃ）を含むＤＮＡフラグメントを、開始コドンの直前に配列５’−ＡＡＧＣＴ  ＴＣＧＧＣ  ＣＧＡＣＴ  ＡＴＴＡＣ  ＡＡＧＧＡ  ＧＡＴＴＴ  ＴＡＧＣＣ−３’（配列番号９２）（ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥａｇＩ部位、及びラクトバチルスＲＢＳを付加するために）、及びすぐ下流にＫｐｎＩ制限酵素認識部位が含まれるように設計した。設計されたコンストラクトを、Geneart AGから得て、上述のように形質転換し、ＳＪ１０７１１（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７１１）及びＳＪ１０７１２（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７１２）を得た。
【０５０８】
Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列（ＣＯ）、及び推定されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４４及び４５である。コーディング配列は、終始コドンを含む７８０ｂｐであり、コードされ、予測されるタンパク質は、２５９個のアミノ酸である。ＳｉｇｎａｌＰプログラム（Nielsen et al.、同上）を用いて、配列中にシグナルペプチドがないことが予測された。このプログラムに基づいて予測される成熟タンパク質は、２７．５ｋＤａの予測分子量、及び６．２の等電ｐＨを有する２５９個のアミノ酸を含む。
【０５０９】
クロストリジウム・ベイジェリンキー（Clostridium beijerinckii）アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子のクローニング及びベクターｐＳＪ１０７１３の構築
Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）由来のアセトアセテートデカルボキシラーゼ（ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ７１６Ｓ５）の７３８ｂｐコーディング配列（終始コドンを含まない）を、大腸菌（Escherichia coli）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、及びラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）の３つの生物における発現のために最適化し、合成的にｐＳＪ１０７１３に構築した。
【０５１０】
コドン最適化アセトアセテートデカルボキシラーゼコーディング配列（ａｄｃ  Ｃｂ）を含むＤＮＡフラグメントを、開始コドンの直前に配列５’−ＡＡＧＣＴ  ＴＣＧＧＣ  ＣＧＡＣＴ  ＡＴＴＡＣ  ＡＡＧＧＡ  ＧＡＴＴＴ  ＴＡＧＣＣ−３’（配列番号９２）（ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥａｇＩ部位、ラクトバチルスＲＢＳを付加するために）、及びすぐ下流にＫｐｎＩ制限酵素認識部位が含まれるように設計した。設計されたコンストラクトを、Geneart AGから得て、上述のように形質転換し、ＳＪ１０７１３（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７１３）及びＳＪ１０７１４（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７１４）を得た。
【０５１１】
Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子の野生型ヌクレオチド配列（ＷＴ）、コドン最適化ヌクレオチド配列（ＣＯ）、及び推定されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１６、１７、及び１８である。コーディング配列は、終始コドンを含む７４１ｂｐであり、コードされ、予測されるタンパク質は、２４６個のアミノ酸である。ＳｉｇｎａｌＰプログラム（Nielsen et al.、同上）を用いて、配列中にシグナルペプチドがないことが予測された。このプログラムに基づいて予測される成熟タンパク質は、２７．５ｋＤａの予測分子量、及び６．１８の等電ｐＨを有する２４６個のアミノ酸を含む。
【０５１２】
ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salvarius）アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子のクローニング及びベクターｐＳＪ１０７０７の構築
Ｌ．サリバリウス（L. salvarius）由来のアセトアセテートデカルボキシラーゼ（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ：Ｑ１ＷＶＧ５）の８３１ｂｐＣＤＳ（終始コドンを含まない）を、大腸菌（Escherichia coli）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、及びラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）の３つの生物における発現のために最適化し、合成的にｐＳＪ１０７０７に構築した。
【０５１３】
コドン最適化アセトアセテートデカルボキシラーゼＣＤＳ（ａｄｃ  Ｌｓ）を含むＤＮＡフラグメントを、開始コドンの直前に配列５’−ＡＡＧＣＴ  ＴＣＧＧＣ  ＣＧＡＣＴ  ＡＴＴＡＣ  ＡＡＧＧＡ  ＧＡＴＴＴ  ＴＡＧＡＣ−３’（配列番号９２）（ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥａｇＩ部位、並びにラクトバチルスＲＢＳを付加するために）、及びすぐ下流にＫｐｎＩ制限酵素認識部位が含まれるように設計した。設計されたコンストラクトを、Geneart AGから得て、上述のように形質転換し、ＳＪ１０７０７（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７０７）及びＳＪ１０７０８（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７０８）を得た。
【０５１４】
Ｌ．サリバリウス（L. salvarius）アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列（ＣＯ）、及び推定されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１１７及び１１８である。コーディング配列は、終始コドンを含む８３４ｂｐであり、コードされ、予測されるタンパク質は、２７７個のアミノ酸である。ＳｉｇｎａｌＰプログラム（Nielsen et al.、同上）を用いて、配列中にシグナルペプチドがないことが予測された。このプログラムに基づいて予測される成熟タンパク質は、３０．９ｋＤａの予測分子量、及び４．６の等電ｐＨを有する２７７個のアミノ酸を含む。
【０５１５】
ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子のクローニング及びベクターｐＳＪ１０７０１の構築
Ｌ．プランタルム（L. plantarum）由来のアセトアセテートデカルボキシラーゼ（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ：Ｑ１ＷＶＧ５）の８４３ｂｐＣＤＳ（終始コドンを含まない）を、大腸菌（Escherichia coli）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、及びラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）の３つの生物における発現のために最適化し、合成的にｐＳＪ１０７０１に構築した。
【０５１６】
コドン最適化アセトアセテートデカルボキシラーゼＣＤＳ（ａｄｃ  Ｌｐ）を含むＤＮＡフラグメントを、開始コドンの直前に配列５’−ＡＡＧＣＴ  ＴＣＧＧＣ  ＣＧＡＣＴ  ＡＴＴＡＣ  ＡＡＧＧＡ  ＧＡＴＴＴ  ＴＡＧＣＣ−３’（配列番号９２）（ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥａｇＩ部位、並びにラクトバチルスＲＢＳを付加するために）、及びすぐ下流にＫｐｎＩ制限酵素認識部位が含まれるように設計した。設計されたコンストラクトを、Geneart AGから得て、上述のように形質転換し、ＳＪ１０７０１（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７０１）及びＳＪ１０７０２（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７０２）を得た。
【０５１７】
Ｌ．プランタルム（L. plantarum）アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列（ＣＯ）、及び推定されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１１９及び１２０である。コーディング配列は、終始コドンを含む８４６ｂｐであり、コードされ、予測されるタンパク質は、２８１個のアミノ酸である。ＳｉｇｎａｌＰプログラム（Nielsen et al.、同上）を用いて、配列中にシグナルペプチドがないことが予測された。このプログラムに基づいて予測される成熟タンパク質は、３０．８ｋＤａの予測分子量、及び４．７の等電ｐＨを有する２８１個のアミノ酸を含む。
【０５１８】
サーモアナエロバクター・エタノリカス（Thermoanaerobacter ethanolicus）イソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング及びベクターｐＳＪ１０７１９の構築
Ｔ．エタノリカス（T. ethanolicus）由来のイソプロパノールデヒドロゲナーゼ（ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ２ＭＪＴ８）の１０５６ｂｐコーディング配列（終始コドンを含まない）を、大腸菌（Escherichia coli）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、及びラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）の３つの生物における発現のために最適化し、合成的にｐＳＪ１０７１９に構築した。
【０５１９】
コドン最適化イソプロパノールデヒドロゲナーゼコーディング配列（ａｄｈ  Ｔｅ）を含むＤＮＡフラグメントを、開始コドンの直前に配列５’−ＧＧＴＡＣ  ＣＡＣＴＡ  ＴＴＡＣＡ  ＡＧＧＡＧ  ＡＴＴＴＴ  ＡＧＴＣ−３’（配列番号９５）（ＫｐｎＩ部位、ラクトバチルスＲＢＳを付加するために、そしてＮｃｏＩ−互換的ＢｓｐＨＩ部位中に開始コドンをもたせるために）、並びにすぐ下流にＸｍａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位が含まれるように設計した。設計されたコンストラクトを、Geneart AGから得て、上述のように形質転換し、ＳＪ１０７１９（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７１９）及びＳＪ１０７２０（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７２０）を得た。
【０５２０】
Ｔ．エタノリカス（T. ethanolicus）イソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子の野生型ヌクレオチド配列（ＷＴ）、コドン最適化ヌクレオチド配列（ＣＯ）、及び推定されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２２、２３、及び２４である。コーディング配列は、終始コドンを含む１０５９ｂｐであり、コードされ、予測されるタンパク質は、３５２個のアミノ酸である。ＳｉｇｎａｌＰプログラム（Nielsen et al.、同上）を用いて、配列中にシグナルペプチドがないことが予測された。このプログラムに基づいて予測される成熟タンパク質は、３７．７ｋＤａの予測分子量、及び６．２３の等電ｐＨを有する３５２個のアミノ酸を含む。
【０５２１】
クロストリジウム・ベイジェリンキー（Clostridium beijerinckii）イソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング及びベクターｐＳＪ１０７２５の構築
Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）由来のイソプロパノールデヒドロゲナーゼ（ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ２５９８４）の１０５３ｂｐコーディング配列（終始コドンを含まない）を、大腸菌（Escherichia coli）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、及びラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）の３つの生物における発現のために最適化し、合成的にｐＳＪ１０７２５に構築した。
【０５２２】
コドン最適化イソプロパノールデヒドロゲナーゼコーディング配列（ａｄｈ  Ｃｂ）を含むＤＮＡフラグメントを、開始コドンの直前に配列５’−ＧＧＴＡＣ  ＣＡＣＴＡ  ＴＴＡＣＡ  ＡＧＧＡＧ  ＡＴＴＴＴ  ＡＧＴＣ−３’（配列番号９５）（ＫｐｎＩ部位、ラクトバチルスＲＢＳを付加するために、そしてＮｃｏＩ−互換的ＢｓｐＨＩ部位中に開始コドンをもたせるために）、並びにすぐ下流にＸｍａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位が含まれるように設計した。設計されたコンストラクトを、Geneart AGから得て、上述のように形質転換し、ＳＪ１０７２５（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７２５）及びＳＪ１０７２６（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７２６）を得た。
【０５２３】
Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）イソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子の野生型ヌクレオチド配列（ＷＴ）、コドン最適化ヌクレオチド配列（ＣＯ）、及び推定されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９、２０、及び２１である。コーディング配列は、終始コドンを含む１０５６ｂｐであり、コードされ、予測されるタンパク質は、３５１個のアミノ酸である。ＳｉｇｎａｌＰプログラム（Nielsen et al.、同上）を用いて、配列中にシグナルペプチドがないことが予測された。このプログラムに基づいて予測される成熟タンパク質は、３７．８ｋＤａの予測分子量、及び６．６４の等電ｐＨを有する３５１個のアミノ酸を含む。
【０５２４】
ラクトバチルス・アントリ（Lactobacillus antri）イソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング及びベクターｐＳＪ１０７０９の構築
Ｌ．アントリ（L. antri）由来のイソプロパノールデヒドロゲナーゼ（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ：Ｃ８Ｐ９Ｖ７）の１０６８ｂｐコーディング配列（終始コドンを含まない）を、大腸菌（Escherichia coli）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、及びラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）の３つの生物における発現のために最適化し、合成的にｐＳＪ１０７０９に構築した。
【０５２５】
コドン最適化イソプロパノールデヒドロゲナーゼコーディング配列（ｓａｄｈ  Ｌａ）を含むＤＮＡフラグメントを、開始コドンの直前に配列５’−ＧＧＴＡＣ  ＣＡＣＴＡ  ＴＴＡＣＡ  ＡＧＧＡＧ  ＡＴＴＴＴ  ＡＧＴＣ−３’（配列番号９５）（ＫｐｎＩ部位、ラクトバチルスＲＢＳを付加するため）、並びにすぐ下流にＸｍａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位が含まれるように設計した。設計されたコンストラクトをGeneart AGから得て、上述のように形質転換し、ＳＪ１０７０９（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７０９）及びＳＪ１０７１０（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７１０）を得た。
【０５２６】
Ｌ．アントリ（L. antri）イソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列（ＣＯ）、及び推定されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４６及び４７である。コーディング配列は、終始コドンを含む１０７１ｂｐであり、コードされ、予測されるタンパク質は、３５６個のアミノ酸である。ＳｉｇｎａｌＰプログラム（Nielsen et al.、同上）を用いて、配列中にシグナルペプチドがないことが予測された。このプログラムに基づいて予測される成熟タンパク質は、３８．０ｋＤａの予測分子量、及び４．９の等電ｐＨを有する３５６個のアミノ酸を含む。
【０５２７】
ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）イソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング及びベクターｐＳＪ１０７０３の構築
Ｌ．ファーメンタム（L. fermentum）由来のイソプロパノールデヒドロゲナーゼ（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ：Ｂ２ＧＤＨ６）の１０６８ｂｐＣＤＳ（終始コドンを含まない）を、大腸菌（Escherichia coli）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、及びラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）の３つの生物における発現のために最適化し、合成的にｐＳＪ１０７０３に構築した。
【０５２８】
コドン最適化イソプロパノールデヒドロゲナーゼＣＤＳ（ｓａｄｈ  Ｌｆ）を含むＤＮＡフラグメントを、開始コドンの直前に配列５’−ＧＧＴＡＣ  ＣＡＣＴＡ  ＴＴＡＣＡ  ＡＧＧＡＧ  ＡＴＴＴＴ  ＡＧＴＣ−３’（配列番号９５）（ＫｐｎＩ部位及びラクトバチルスＲＢＳを付加するため）、並びにすぐ下流にＸｍａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位が含まれるように設計した。設計されたコンストラクトを、Geneart AGから得て、上述のように形質転換し、ＳＪ１０７０３（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７０３）及びＳＪ１０７０４（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７０４）を得た。
【０５２９】
Ｌ．ファーメンタム（L. fermentum）イソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列（ＣＯ）、及び推定されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１２１及び１２２である。コーディング配列は、終始コドンを含む１０７１ｂｐであり、コードされ、予測されるタンパク質は、３５６個のアミノ酸である。ＳｉｇｎａｌＰプログラム（Nielsen et al.、同上）を用いて、配列中にシグナルペプチドがないことが予測された。このプログラムに基づいて予測される成熟タンパク質は、３７．９ｋＤａの予測分子量、及び５．２の等電ｐＨを有する３５６個のアミノ酸を含む。
【０５３０】
実施例９：大腸菌中でのイソプロパノール生産のための経路コンストラクトの構築及び形質転換
Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子及びＣ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むｐＳＪ１０８４３の構築
プラスミドｐＳＪ１０７２５及びｐＳＪ１０７１３を、個別にＫｐｎＩ＋ＡｌｗＮＩで消化した。プラスミドｐＳＪ１０７２５を、さらにＰｖｕＩで消化し、望ましくないフラグメントのサイズを減少させた。得られたｐＳＪ１０７２５の１６８９ｂｐフラグメントと、ｐＳＪ１０７１３の２５５７ｂｐフラグメントを、それぞれゲル電気泳動を用いて精製し、その後、本明細書に概略されるようにライゲートさせた。一定量のライゲーション混合物を大腸菌ＳＪ２化学的コンピテント細胞の形質転換に用い、形質転換体を２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上で選択した。１００超の形質転換体の中から選択された４つのコロニーを、ＨｉｎｄＩＩＩを用いた制限酵素分析により、全て所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、これらのうちの二つを保存し、ＳＪ１０８４３（ＳＪ２／ｐＳＪ１０８４３）及びＳＪ１０８４４（ＳＪ２／ｐＳＪ１０８４４）を得た。
【０５３１】
Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子及びＣ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むｐＳＪ１０８４１の構築
プラスミドｐＳＪ１０７２５及びｐＳＪ１０７１１を、個別にＫｐｎＩ＋ＡｌｗＮＩで消化し、加えてｐＳＪ１０７２５を、さらにＰｖｕＩで消化し、望ましくないフラグメントのサイズを減少させた。得られたｐＳＪ１０７２５の１６８９ｂｐフラグメントと、ｐＳＪ１０７１１の２５９６ｂｐフラグメントを、それぞれゲル電気泳動を用いて精製し、その後、本明細書に概略されるようにライゲートさせた。一定量のライゲーション混合物を大腸菌ＳＪ２化学的コンピテント細胞の形質転換に用い、形質転換体を２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上で選択した。１００超の形質転換体の中から選択された４つのコロニーを、ＢｓｇＩを用いた制限酵素分析により、全て所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、これらのうちの二つを保存し、ＳＪ１０８４１（ＳＪ２／ｐＳＪ１０８４１）及びＳＪ１０８４２（ＳＪ２／ｐＳＪ１０８４２）を得た。
【０５３２】
Ｂ．サブチリス（B. subtilis）スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ遺伝子を含むｐＳＪ１０７４８の構築
プラスミドｐＳＪ１０６９７及びｐＳＪ１０６９５を、個別にＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化した。得られたｐＳＪ１０６９７の６９０ｂｐフラグメントと、ｐＳＪ１０６９５の３１０６ｂｐフラグメントを、それぞれゲル電気泳動を用いて精製し、その後、本明細書に概略されるようにライゲートさせた。
【０５３３】
一定量のライゲーション混合物をエレクトロポレーションによる大腸菌ＳＪ２の形質転換に用い、形質転換体を２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上で選択した。５０超の形質転換体の中から選択された３つのコロニーを、ＰｖｕＩを用いた制限酵素分析により、全て所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、これらのうちの二つを保存し、ＳＪ１０７４８（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７４８）及びＳＪ１０７４９（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７４９）を得た。
【０５３４】
Ｂ．モジャベンシス（B. mojavensis）スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ遺伝子を含むｐＳＪ１０７７７の構築
プラスミドｐＳＪ１０７２３及びｐＳＪ１０７２１を、それぞれＥｃｏＲＩ＋ＫｐｎＩで消化した。得られたｐＳＪ１０７２３の６９６ｂｐフラグメントと、ｐＳＪ１０７２１の３１１８ｂｐフラグメントを、それぞれゲル電気泳動を用いて精製し、その後、本明細書に概略されるようにライゲートさせた。
【０５３５】
一定量のライゲーション混合物を大腸菌ＳＪ２化学的コンピテント細胞の形質転換に用い、形質転換体を２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上で選択した。５００超の形質転換体の中から選択された４つのコロニーを、ＰｖｕＩを用いた制限酵素分析により、全て所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、保存し、ＳＪ１０７７７（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７７７）を得た。
【０５３６】
大腸菌アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子を含むｐＳＪ１０７５０の構築
プラスミドｐＳＪ１０７１７及びｐＳＪ１０７１５を、それぞれＥｃｏＲＩ＋ＫｐｎＩで消化した。得られたｐＳＪ１０７１７の７０２ｂｐフラグメントと、ｐＳＪ１０７１５の３０５１ｂｐフラグメントを、それぞれゲル電気泳動を用いて精製し、その後、本明細書に概略されるようにライゲートさせた。
【０５３７】
一定量のライゲーション混合物をエレクトロポレーションによる大腸菌ＳＪ２の形質転換に用い、形質転換体を２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上で選択した。５０超の形質転換体の中から選択された３つのコロニーを、ＡｐａＬＩを用いた制限酵素分析により、全て所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、これらのうちの二つを保存し、ＳＪ１０７５０（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７５０）及びＳＪ１０７５１（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７５１）を得た。
【０５３８】
クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子を含むｐＳＪ１０７５２の構築
プラスミドｐＳＪ１０７３１及びｐＳＪ１０７２７を、それぞれＥｃｏＲＩ＋ＫｐｎＩで消化した。得られたｐＳＪ１０７３１の７０５ｂｐフラグメントと、ｐＳＪ１０７２７の３０６１ｂｐフラグメントを、それぞれゲル電気泳動を用いて精製し、その後、本明細書に概略されるようにライゲートさせた。
【０５３９】
一定量のライゲーション混合物をエレクトロポレーションによる大腸菌ＳＪ２の形質転換に用い、形質転換体を２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上で選択した。５０超の形質転換体の中から選択された３つのコロニーを、ＰｖｕＩを用いた制限酵素分析により、全て所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、これらのうちの二つを保存し、ＳＪ１０７５２（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７５２）及びＳＪ１０７５３（ＳＪ２／ｐＳＪ１０７５３）を得た。
【０５４０】
クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）チオラーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１０７９８の構築
プラスミドｐＳＪ１０７０５を、ＢｓｐＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、他方でｐＳＪ１０６００をＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化した。得られたｐＳＪ１０７０５の１１９３ｂｐフラグメントと、ｐＳＪ１０６００の５１４７ｂｐフラグメントを、それぞれゲル電気泳動を用いて精製し、その後、本明細書に概略されるようにライゲートさせた。
【０５４１】
一定量のライゲーション混合物をエレクトロポレーションによる大腸菌ＴＧ１の形質転換に用い、形質転換体を２００μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含むＬＢプレート上で選択した。４つのコロニー中３つを、ＮｓｉＩを用いた制限酵素分析、及びＤＮＡ配列決定により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、これらのうちの二つを保存し、ＳＪ１０７９８（ＴＧ１／ｐＳＪ１０７９８）及びＳＪ１０７９９（ＴＧ１／ｐＳＪ１０７９９）を得た。
【０５４２】
Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）チオラーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１０７９６の構築
プラスミドｐＳＪ１０６９４をＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、得られた１．１９ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。プラスミドｐＳＪ１０６００をＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、得られた５．２ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物で大腸菌ＴＧ１エレクトロコンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。得られたコロニーのうちの４つを分析し、ＮｓｉＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、これらのうちの二つをＤＮＡ配列決定によりさらに確認し、保存し、ＳＪ１０７９６（ＴＧ１／ｐＳＪ１０７９６）及びＳＪ１０７９７（ＴＧ１／ｐＳＪ１０７９７）を得た。
【０５４３】
プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Propionibacterium freudenreichii）チオラーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１０７９５の構築
プラスミドｐＳＪ１０６７６をＢｓｐＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、得られた１．１７ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。プラスミドｐＳＪ１０６００をＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、得られた５．２ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物で大腸菌ＴＧ１エレクトロコンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。得られたコロニーのうちの４つを分析し、ＮｓｉＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、これらのうちの一つをＤＮＡ配列決定によりさらに確認し、保存し、ＳＪ１０７９５（ＴＧ１／ｐＳＪ１０７９５）を得た。
【０５４４】
ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）チオラーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１０７４３の構築
プラスミドｐＳＪ１０６９９をＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、得られた１．１８ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。プラスミドｐＳＪ１０６００をＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、得られた５．２ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＭＧ１６５５エレクトロコンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。得られたコロニーのうちの１６個を分析し、２つをＣｌａＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、更にＤＮＡ配列決定により確認し、保存し、ＳＪ１０７４３（ＴＧ１／ｐＳＪ１０７４３）及びＳＪ１０７５７（ＴＧ１／ｐＳＪ１０７５７）を得た。
【０５４５】
バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１０８８６の構築
プラスミドｐＳＪ１０７４８をＮｃｏＩ及びＫｐｎＩで消化し、得られた１．４ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。プラスミドｐＳＪ１０６００をＮｃｏＩ及びＫｐｎＩで消化し、得られた５．１ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＴＧ１化学的コンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。得られたコロニーのうちの４つを分析し、ＨｉｎｄＩＩＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、これらのうちの２つを更にＤＮＡ配列決定により確認し、保存し、ＳＪ１０８８６（ＴＧ１／ｐＳＪ１０８８６）及びＳＪ１０８８７（ＴＧ１／ｐＳＪ１０８８７）を得た。
【０５４６】
大腸菌アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１０８８８の構築
プラスミドｐＳＪ１０７５０をＮｃｏＩ及びＫｐｎＩで消化し、得られた１．３５ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。プラスミドｐＳＪ１０６００をＮｃｏＩ及びＫｐｎＩで消化し、得られた５．１ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＴＧ１化学的コンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。得られたコロニーのうちの４つを分析し、ＨｉｎｄＩＩＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、これらのうちの２つを更にＤＮＡ配列決定により確認し、保存し、ＳＪ１０８８８（ＴＧ１／ｐＳＪ１０８８８）及びＳＪ１０８８９（ＴＧ１／ｐＳＪ１０８８９）を得た。
【０５４７】
Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１０７５６の構築
プラスミドｐＳＪ１０７１３をＥａｇＩ及びＫｐｎＩで消化し、得られた０．７７ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。プラスミドｐＳＪ１０６００をＥａｇＩ及びＫｐｎＩで消化し、得られた５．１ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＴＧ１化学的コンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。得られたコロニーのうちの４つを分析し、ＣｌａＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、ＤＮＡ配列決定により確認し、ＳＪ１０７５６（ＴＧ１／ｐＳＪ１０７５６）として保存した。
【０５４８】
Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１０７５４の構築
プラスミドｐＳＪ１０７１１をＥａｇＩ及びＫｐｎＩで消化し、得られた０．８１ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。プラスミドｐＳＪ１０６００をＥａｇＩ及びＫｐｎＩで消化し、得られた５．１ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＭＧ１６５５エレクトロコンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。得られたコロニーのうちの４つを分析し、３つをＣｌａＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、ＤＮＡ配列決定により確認し、ＳＪ１０７５４（ＭＧ１６５５／ｐＳＪ１０７５４）及びＳＪ１０７５５（ＭＧ１６５５／ｐＳＪ１０７５５）として保存した。
【０５４９】
Ｌ．サリバリウス（L. salvarius）アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１０７８０の構築
プラスミドｐＳＪ１０７０７をＰｃｉＩ及びＫｐｎＩで消化し、得られた０．８４ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。プラスミドｐＳＪ１０６００をＮｃｏＩ及びＫｐｎＩで消化し、得られた５．１ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＭＧ１６５５エレクトロコンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。得られたコロニーのうちの４つを分析し、ＣｌａＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、２つをＤＮＡ配列決定により確認し、ＳＪ１０７８０（ＭＧ１６５５／ｐＳＪ１０７８０）及びＳＪ１０７８１（ＭＧ１６５５／ｐＳＪ１０７８１）として保存した。
【０５５０】
Ｌ．プランタルム（L. plantarum）アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１０７７８の構築
プラスミドｐＳＪ１０７０１をＮｃｏＩ及びＫｐｎＩで消化し、得られた０．８５ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。プラスミドｐＳＪ１０６００をＮｃｏＩ及びＫｐｎＩで消化し、得られた５．１ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＭＧ１６５５化学的コンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。得られたコロニーのうちの４つを分析し、ＣｌａＩを用いた制限酵素分析により、全て所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、２つをＤＮＡ配列決定により確認し、ＳＪ１０７７８（ＭＧ１６５５／ｐＳＪ１０７７８）及びＳＪ１０７７９（ＭＧ１６５５／ｐＳＪ１０７７９）として保存した。
【０５５１】
ラクトバチルス・アントリ（Lactobacillus antri）イソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１０７６８の構築
プラスミドｐＳＪ１０７０９をＫｐｎＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた１．１ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。プラスミドｐＳＪ１０６００をＸｍａＩ及びＫｐｎＩで消化し、得られた５．１ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＴＧ１エレクトロコンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。得られたコロニーのうちの４つを分析し、２つをＣｌａＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、ＤＮＡ配列決定により確認し、ＳＪ１０７６８（ＴＧ１／ｐＳＪ１０７６８）及びＳＪ１０７６９（ＴＧ１／ｐＳＪ１０７６９）として保存した。
【０５５２】
サーモアナエロバクター・エタノリカス（Thermoanaerobacter ethanolicus）イソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１０７４５、ｐＳＪ１０７６３、ｐＳＪ１０７６４、及びｐＳＪ１０７６７の構築
プラスミドｐＳＪ１０７１９をＢｓｐＨＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた１．０６ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。プラスミドｐＳＪ１０６００をＮｃｏ及びＸｍａＩで消化し、得られた５．１ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせた。ライゲーション混合物でＭＧ１６５５エレクトロコンピテント細胞を形質転換し、得られたコロニーのうちの１つを、ＣｌａＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、ＤＮＡ配列決定により確認し、ＳＪ１０７４５（ＭＧ１６５５／ｐＳＪ１０７４５）として保存した。ライゲーション混合物で大腸菌ＪＭ１０３エレクトロコンピテント細胞を形質転換し、４つのコロニーのうちの２つを、ＣｌａＩを用いた制限酵素分析により、所望のプラスミドを含んでいるとみなし、ＳＪ１０７６３（ＪＭ１０３／ｐＳＪ１０７６３）及びＳＪ１０７６４（ＪＭ１０３／ｐＳＪ１０７６４）として保存した。
【０５５３】
最終的に、ライゲーション混合物でＴＧ１エレクトロコンピテント細胞を形質転換し、４つのコロニーのうちの３つを、ＣｌａＩを用いた制限酵素分析により、所望のプラスミドを含んでいるとみなし、その一つであるＳＪ１０７６７（ＪＭ１０３／ｐＳＪ１０７６７）をＤＮＡ配列決定により確認した。
【０５５４】
クロストリジウム・ベイジェリンキー（Clostridium beijerinckii）イソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１０７８２の構築
プラスミドｐＳＪ１０７２５をＢｓｐＨＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた１．０６ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。プラスミドｐＳＪ１０６００をＮｃｏＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた５．１ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＭＧ１６５５エレクトロコンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。得られたコロニーのうちの４つを分析し、２つをＣｌａＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、ＤＮＡ配列決定により確認し、ＳＪ１０７８２（ＴＧ１／ｐＳＪ１０７８２）及びＳＪ１０７８３（ＴＧ１／ｐＳＪ１０７８３）として保存した。
【０５５５】
ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）イソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１０７６２の構築
プラスミドｐＳＪ１０７０３をＢｓｐＨＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた１．１ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。プラスミドｐＳＪ１０６００をＸｍａＩ及びＮｃｏＩで消化し、得られた５．１ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＪＭ１０３及びＴＧ１エレクトロコンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。形質転換体を分析し、２つ（各宿主株から一つ）をＣｌａＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、ＤＮＡ配列決定により確認し、ＳＪ１０７６２（ＪＭ１０３／ｐＳＪ１０７６２）及びＳＪ１０７６５（ＴＧ１／ｐＳＪ１０７６５）として保存した。形質転換体ＳＪ１０７６６（ＪＭ１０３／ｐＳＪ１０７６６）がラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）イソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むことを確認した。
【０５５６】
Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）チオラーゼ遺伝子、Ｂ．モジャベンシス（B. mojavensis）スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ遺伝子（双方のサブユニット）、Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子、及びＣ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１０９５４の構築
プラスミドｐＳＪ１０７９８をＸｈｏＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた６．３ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。プラスミドｐＳＪ１０７７７をＸｈｏＩ及びＥａｇＩで消化し、得られた１．４３ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。プラスミドｐＳＪ１０８４３をＥａｇＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた１．８５ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。３つの精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＴＧ１化学的コンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。得られたコロニーのうちの４つを分析し、ＸｂａＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、これらのうちの二つを保存し、ＳＪ１０９５４（ＴＧ１／ｐＳＪ１０９５４）及びＳＪ１０９５５（ＴＧ１／ｐＳＪ１０９５５）を得た。
【０５５７】
Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）チオラーゼ遺伝子、Ｂ．モジャベンシス（B. mojavensis）スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ遺伝子（双方のサブユニット）、Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子、及びＣ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１０９５６の構築
プラスミドｐＳＪ１０７９８をＸｈｏＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた６．３ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。プラスミドｐＳＪ１０７７７をＸｈｏＩ及びＥａｇＩで消化し、得られた１．４３ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。プラスミドｐＳＪ１０８４１をＥａｇＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた１．８９ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。３つの精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＴＧ１化学的コンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。得られたコロニーのうちの４つを分析し、ＸｂａＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、これらのうちの二つを保存し、ＳＪ１０９５６（ＴＧ１／ｐＳＪ１０９５６）及びＳＪ１０９５７（ＴＧ１／ｐＳＪ１０９５７）を得た。
【０５５８】
独立した構築プロセス（消化、フラグメント精製、ライゲーション、エレクトロポレーションによる形質転換）から、一つの形質転換体をＸｂａＩを用いた制限酵素分析により所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、ＳＪ１０９２６（ＴＧ１  ｐＳＪ１０９２６）として保存した。
【０５５９】
Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）チオラーゼ遺伝子、Ｂ．サブチリス（B. subtilis）スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ遺伝子（双方のサブユニット）、Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子、及びＣ．ベイジェリンキ  アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１０９４２の構築
プラスミドｐＳＪ１０７９８をＸｈｏＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた６．３ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。プラスミドｐＳＪ１０７４８をＸｈｏＩ及びＥａｇＩで消化し、得られた１．４３ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。プラスミドｐＳＪ１０８４３をＥａｇＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた１．８５ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。３つの精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＴＧ１化学的コンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。得られたコロニーのうちの４つを分析し、ＸｂａＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、これらのうちの二つを保存し、ＳＪ１０９４２（ＴＧ１／ｐＳＪ１０９４２）及びＳＪ１０９４３（ＴＧ１／ｐＳＪ１０９４３）を得た。
【０５６０】
Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）チオラーゼ遺伝子、Ｂ．サブチリス（B. subtilis）スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ遺伝子（双方のサブユニット）、Ｃ．アセトブチリカム  アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子、及びＣ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１０９４４の構築
プラスミドｐＳＪ１０７９８をＸｈｏＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた６．３ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。プラスミドｐＳＪ１０７４８をＸｈｏＩ及びＥａｇＩで消化し、得られた１．４３ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。プラスミドｐＳＪ１０８４１をＥａｇＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた１．８９ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。３つの精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＴＧ１化学的コンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。得られたコロニーのうちの４つを分析し、ＸｂａＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、これらのうちの二つを保存し、ＳＪ１０９４４（ＴＧ１／ｐＳＪ１０９４４）及びＳＪ１０９４５（ＴＧ１／ｐＳＪ１０９４５）を得た。
【０５６１】
Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）チオラーゼ遺伝子、大腸菌アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（双方のサブユニット）、Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子、及びＣ．ベイジェリンキ  アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１０９４６の構築
プラスミドｐＳＪ１０７９８をＸｈｏＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた６．３ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。プラスミドｐＳＪ１０７５０をＸｈｏＩ及びＥａｇＩで消化し、得られた１．３７ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。プラスミドｐＳＪ１０８４３をＥａｇＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた１．８５ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。３つの精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＴＧ１化学的コンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。得られたコロニーのうちの４つを分析し、ＸｂａＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、これらのうちの二つを保存し、ＳＪ１０９４６（ＴＧ１／ｐＳＪ１０９４６）及びＳＪ１０９４７（ＴＧ１／ｐＳＪ１０９４７）を得た。
【０５６２】
Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）チオラーゼ遺伝子、大腸菌アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（双方のサブユニット）、Ｃ．アセトブチリカム  アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子、及びＣ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１０９４８の構築
プラスミドｐＳＪ１０７９８をＸｈｏＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた６．３ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。プラスミドｐＳＪ１０７５０をＸｈｏＩ及びＥａｇＩで消化し、得られた１．３７ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。プラスミドｐＳＪ１０８４１をＥａｇＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた１．８９ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。３つの精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＴＧ１化学的コンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。得られたコロニーのうちの４つを分析し、ＸｂａＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、これらのうちの二つを保存し、ＳＪ１０９４８（ＴＧ１／ｐＳＪ１０９４８）及びＳＪ１０９４９（ＴＧ１／ｐＳＪ１０９４９）を得た。
【０５６３】
Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）チオラーゼ遺伝子、Ｃ．アセトブチリカム  アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（双方のサブユニット）、Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子、及びＣ．ベイジェリンキ  アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１０９５０の構築
プラスミドｐＳＪ１０７９８をＸｈｏＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた６．３ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。プラスミドｐＳＪ１０７５２をＸｈｏＩ及びＥａｇＩで消化し、得られた１．３８ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。プラスミドｐＳＪ１０８４３をＥａｇＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた１．８５ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。３つの精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＴＧ１化学的コンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。得られたコロニーのうちの４つを分析し、ＸｂａＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、これらのうちの二つを保存し、ＳＪ１０９５０（ＴＧ１／ｐＳＪ１０９５０）及びＳＪ１０９５１（ＴＧ１／ｐＳＪ１０９５１）を得た。
【０５６４】
Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）チオラーゼ遺伝子、Ｃ．アセトブチリカム  アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（双方のサブユニット）、Ｃ．アセトブチリカム  アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子、及びＣ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１０９５２の構築
プラスミドｐＳＪ１０７９８をＸｈｏＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた６．３ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。プラスミドｐＳＪ１０７５２をＸｈｏＩ及びＥａｇＩで消化し、得られた１．３８ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。プラスミドｐＳＪ１０８４１をＥａｇＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた１．８９ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。３つの精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＴＧ１化学的コンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。得られたコロニーのうちの４つを分析し、ＸｂａＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、これらのうちの二つを保存し、ＳＪ１０９５２（ＴＧ１／ｐＳＪ１０９５２）及びＳＪ１０９５３（ＴＧ１／ｐＳＪ１０９５３）を得た。
【０５６５】
Ｐ１１プロモーターの制御下でＣ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）チオラーゼ遺伝子、Ｂ．モジャベンシス（B. mojavensis）スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ遺伝子（双方のサブユニット）、Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子、及びＣ．ベイジェリンキ  アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１０７９０の構築
プラスミドｐＴＲＧＵ００１７８（２０１０年１０月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／４０８，１３８号を参照のこと）をＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで消化し、得られた１．２ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。ｐＴＲＧＵ００１７８をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化し、得られた２．１ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。プラスミドｐＳＩＰ４０９をＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで消化し、得られた５．７ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。３つの精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＳＪ２エレクトロコンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。２つの形質転換体をＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ、及びＨｉｎｄＩＩＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、ＳＪ１０５６２（ＳＪ２／ｐＳＪ１０５６２）及びＳＪ１０５６３（ＳＪ２／ｐＳＪ１０５６３）として保存した。
【０５６６】
プラスミドｐＳＪ１０５６２をＸｂａＩ及びＮｏｔＩで消化し、得られた７．５７ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。プラスミドｐＴＲＧＵ００２００（同上）をＸｂａＩ及びＮｏｔＩで消化し、得られた２．５２ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＭＧ１６５５エレクトロコンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。２つの形質転換体をＮｏｔＩ＋ＸｂａＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、ＳＪ１０５９３（ＭＧ１６５５／ｐＳＪ１０５９３）及びＳＪ１０５９４（ＭＧ１６５５／ｐＳＪ１０５９４）として保存した。
【０５６７】
プラスミドｐＴＲＧＵ００２００をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、得られた１．２ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。ｐＳＪ１０６００をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、得られた５．２ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＭＧ１６５５エレクトロコンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。２つの形質転換体をＥｃｏＲＩ＋ＢａｍＨＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、ＳＪ１０６９０（ＭＧ１６５５／ｐＳＪ１０６９０）及びＳＪ１０６９１（ＭＧ１６５５／ｐＳＪ１０６９１）として保存した。
【０５６８】
プラスミドｐＳＪ１０５９３をＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで消化し、得られた３．２５ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。ｐＳＪ１０６９０をＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ  Ｉで消化し、得られた６．３ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＴＧ１エレクトロコンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。２つの形質転換体をＮｓｉＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、ＳＪ１０７９０（ＴＧ１／ｐＳＪ１０７９０）及びＳＪ１０７９１（ＴＧ１／ｐＳＪ１０７９１）として保存した。
【０５６９】
Ｐ２７プロモーターの制御下でＣ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）チオラーゼ遺伝子、Ｂ．モジャベンシス（B. mojavensis）スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ遺伝子（双方のサブユニット）、Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子、及びＣ．ベイジェリンキ  アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むｐＳＪ１０７９２の構築
プラスミドｐＴＲＧＵ００２００をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、得られた１．２ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。ｐＳＪ１０６０３をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、得られた５．２ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＭＧ１６５５エレクトロコンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。２つの形質転換体をＥｃｏＲＩ＋ＢａｍＨＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、ＳＪ１０６９２（ＭＧ１６５５／ｐＳＪ１０６９２）及びＳＪ１０６９３（ＭＧ１６５５／ｐＳＪ１０６９３）として保存した。
【０５７０】
プラスミドｐＳＪ１０５９３をＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで消化し、得られた３．２５ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。ｐＳＪ１０６９２をＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで消化し、得られた６．３ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＴＧ１エレクトロコンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。２つの形質転換体をＮｓｉＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、ＳＪ１０７９２（ＴＧ１／ｐＳＪ１０７９２）及びＳＪ１０７９３（ＴＧ１／ｐＳＪ１０７９３）として保存した。
【０５７１】
Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）チオラーゼ遺伝子、Ｂ．モジャベンシス（B. mojavensis）スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ遺伝子（双方のサブユニット）、Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子、及びＣ．ベイジェリンキ  アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１１２０８の構築
プラスミドｐＳＪ１０７９６（下記に記載）をＸｈｏＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた６．３ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。プラスミドｐＳＪ１０９５４をＸｈｏＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた３．２８ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＴＧ１化学的コンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。得られたコロニーのうちの３つをＸｂａＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、これらのうちの２つを保存し、ＳＪ１１２０８（ＴＧ１／ｐＳＪ１１２０８）及びＳＪ１１２０９（ＴＧ１／ｐＳＪ１１２０９）を得た。
【０５７２】
Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）チオラーゼ遺伝子、Ｂ．サブチリス（B. subtilis）スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ遺伝子（双方のサブユニット）、Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子、及びＣ．ベイジェリンキ  アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１１２０４の構築
プラスミドｐＳＪ１０７９６（下記に記載）をＸｈｏＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた６．３ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。プラスミドｐＳＪ１０９４２をＸｈｏＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた３．２６ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＴＧ１化学的コンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。得られたコロニーの内の４つを分析し、ＸｂａＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、これらのうちの２つを保存し、ＳＪ１１２０４（ＴＧ１／ｐＳＪ１１２０４）及びＳＪ１１２０５（ＴＧ１／ｐＳＪ１１２０５）を得た。
【０５７３】
Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）チオラーゼ遺伝子、大腸菌アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（双方のサブユニット）、Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子、及びＣ．ベイジェリンキ  アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１１２３０の構築
プラスミドｐＳＪ１０７９６（下記に記載）をＸｈｏＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた６．３ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。プラスミドｐＳＪ１０９４６をＸｈｏＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた３．２３ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＴＧ１化学的コンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。得られたコロニーの内の７つを分析し、５つをＸｂａＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、これらのうちの２つを保存し、ＳＪ１１２３０（ＴＧ１／ｐＳＪ１１２３０）及びＳＪ１１２３１（ＴＧ１／ｐＳＪ１１２３１）を得た。
【０５７４】
Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）チオラーゼ遺伝子、Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（双方のサブユニット）、Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子、及びＣ．ベイジェリンキ  アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１１２０６の構築
プラスミドｐＳＪ１０７９６（下記に記載）をＸｈｏＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた６．３ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。プラスミドｐＳＪ１０９５１をＸｈｏＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた３．２３ｋｂフラグメントをゲル電気泳動を用いて精製した。精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＴＧ１化学的コンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。得られたコロニーの内の４つを分析し、２つをＸｂａＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、ＳＪ１１２０６（ＴＧ１／ｐＳＪ１１２０６）及びＳＪ１１２０７（ＴＧ１／ｐＳＪ１１２０７）として保存した。
【０５７５】
実施例１０：大腸菌の小スケールバッチ増殖の間のアセトン及びイソプロパノールの生産
実施例９に記載された大腸菌株を−８０℃保存培養から直接植菌し、３７℃で３００ｒｐｍで振盪させて、１％グルコース及び１００μｇ／ｍｌエリスロマイシンを添加したＬＢ培地中で一晩培養した。
【０５７６】
各培地から１．５ｍＬのサンプルを２４時間後に回収した。各サンプルを卓上遠心分離装置を用いて１５０００ｘｇにおいて遠心分離し、上清をガスクロマトグラフィーを用いて分析した。発酵培地中のアセトン及びイソプロパノールを上述のようにＧＣ−ＦＩＤにより検出した。結果を表２に示し、ここで遺伝子コンストラクトは、以下の略記で表す。
【０５７７】
ｔｈｌ＿Ｃａ：      Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）チオラーゼ遺伝子
ａｄｈ＿Ｃｂ：      Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）アルコールデヒドロゲナーゼ
ｓｃｏＡＢ＿Ｂｍ：  Ｂ．モジャベンシス（B. mojavensis）スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ遺伝子（双方のサブユニット）
ｓｃｏＡＢ＿Ｂｓ：  Ｂ．サブチリス（B. subtilis）スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ遺伝子（双方のサブユニット）
ａｔｏＡＤ＿Ｅｃ：  大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（双方のサブユニット）
ｃｔｆＡＢ＿Ｃａ：  Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（双方のサブユニット）
ａｄｃ＿Ｃｂ：      Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子
ａｄｃ＿Ｃａ：      Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子
【０５７８】
対照株として、大腸菌ＳＪ１０７６６（同一の発現ベクターバックボーンを含むが、配列番号１２１のイソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子Ｌ．ファーメンタム（L. fermentum）（ｓａｄｈ＿Ｌｆ）のみを含む）及び大腸菌ＳＪ１０７９９（同一の発現ベクターを含むが、配列番号２のＣ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）チオラーゼ遺伝子のみを含む）を同様の方法で植菌した。
【０５７９】
【表２】
2013544083.tif 000003
【０５８０】
同様の培養物を、振盪することなくインキュベートした；これらの全てにおいて、２−プロパノールレベルは、二つの対照株ＳＪ１０７６６及びＳＪ１０７９９０を除いて０．００１％〜０．００９％であり、一方でイソプロパノールは検出されなかった。
【０５８１】
実施例１１：様々なグルコース濃度下の大腸菌の小スケールバッチ増殖の間のアセトン及びイソプロパノールの生産
発酵培地（１００μｇ／ｍｌエリスロマイシン、及び１、２、５又は１０％グルコースのいずれかを含む、合計量１０ｍｌまでのＬＢ）に株を凍結培養から直接植菌し、３７℃で振盪させてインキュベートした。上清サンプルを１、２、及び３日後に摂取し、上述のようにアセトン及びイソプロパノール含量について分析した。株ＳＪ１０７６６（同一の発現ベクターバックボーンを含むが、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子ｓａｄｈ＿Ｌｆのみを含む）を陰性対照としてインキュベートした。
【０５８２】
結果を表３に示し、ここで、遺伝子コンストラクトは、実施例３に示される略記を用いて表される。全てのイソプロパノールオペロン株は、１ｇ／ｌ超のイソプロパノールを超えて生産することができ、この実験において最も多く生産した株であるＳＪ１０９４６は０．２０８％のイソプロパノールを生産した。
【０５８３】
【表３】
2013544083.tif 000004
【０５８４】
実施例１２：大腸菌の小スケールバッチ増殖の間のアセトン及びイソプロパノールの生産
選択された上述の大腸菌株を、−８０℃保存培養から直接、２式に植菌し、３７℃において、３００ｒｐｍで振盪させながら１０ｍｌチューブ中で、１％グルコース及び１００μｇ／ｍｌエリスロマイシンを添加したＬＢ培地中で一晩増殖させた。各培地からの１．５ｍＬサンプルを２４時間後に採取した。各サンプルを１５０００ｘｇで遠心分離し、上述のように上清をアセトン及びイソプロパノール含量について分析した。
【０５８５】
結果を表４に示し、ここで、遺伝子コンストラクトは、実施例３に示される略記で表され、ｔｈｌ＿Ｌｒは、Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）チオラーゼ遺伝子コンストラクトを表す。
【０５８６】
【表４】
2013544083.tif 000005
【０５８７】
この実験は、Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）チオラーゼ遺伝子を含むｐＳＪ１０６００に基づく発現ベクターを含む大腸菌ＴＧ１が、有意な量のイソプロパノールを生産することができることを示す。
【０５８８】
実施例１３：Ｌ．プランタルム（L. plantarum）におけるイソプロパノール生産のためのペプチド誘導可能経路コンストラクトの構築及び形質転換
クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）チオラーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１０７７６の構築
プラスミドｐＳＪ１０７０５をＢｓｐＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、ｐＳＩＰ４０９をＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化した。得られたｐＳＪ１０７０５の１．１９ｋｂフラグメントとｐＳＩＰ４０９の５．６ｋｂフラグメントをゲル電気泳動によりそれぞれ精製し、その後、本明細書に概略されるようにライゲートさせた。
【０５８９】
一定量のライゲーション混合物を、本明細書に記載されるように大腸菌ＭＧ１６５５化学的コンピテント細胞の形質転換に用い、形質転換体を３７℃で２００μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含むＬＢプレート上で選択した。１つの形質転換体を、ＰｓｔＩ＋ＮｓｉＩを用いた制限酵素分析、及びＤＮＡ配列決定により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、ＳＪ１０７７６（ＭＧ１６５５／ｐＳＪ１０７７６）として保存した。
【０５９０】
Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）チオラーゼ遺伝子、Ｂ．サブチリス（B. subtilis）スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ遺伝子、Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子、及びＣ．ベイジェリンキ  アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１０９０３の構築
プラスミドｐＳＪ１０７７６をＸｈｏＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた６．８ｋｂフラグメントをゲル電気泳動により精製した。プラスミドｐＳＪ１０７４８をＸｈｏＩ及びＥａｇＩで消化し、得られた１．４３ｋｂフラグメントをゲル電気泳動により精製した。プラスミドｐＳＪ１０８４３をＥａｇＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた１．８５ｋｂフラグメントをゲル電気泳動により精製した。３つの精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＴＧ１化学的コンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。得られたコロニーのうちの４つを分析し、２つの株をＢｓｐＨＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、保存し、ＳＪ１０９０３（ＴＧ１／ｐＳＪ１０９０３）及びＳＪ１０９０４（ＴＧ１／ｐＳＪ１０９０４）を得た。
【０５９１】
Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）チオラーゼ遺伝子、Ｂ．サブチリス（B. subtilis）スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ遺伝子、Ｃ．アセトブチリカム  アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子、及びＣ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１０９０５の構築
プラスミドｐＳＪ１０７７６をＸｈｏＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた６．８ｋｂフラグメントをゲル電気泳動により精製した。プラスミドｐＳＪ１０７４８をＸｈｏＩ及びＥａｇＩで消化し、得られた１．４３ｋｂフラグメントをゲル電気泳動により精製した。プラスミドｐＳＪ１０８４１をＥａｇＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた１．８９ｋｂフラグメントをゲル電気泳動により精製した。３つの精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＴＧ１化学的コンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。得られたコロニーのうちの４つを分析し、３つをＢｓｐＨＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、これらのうちの２つを保存し、ＳＪ１０９０５（ＴＧ１／ｐＳＪ１０９０５）及びＳＪ１０９０６（ＴＧ１／ｐＳＪ１０９０６）を得た。
【０５９２】
Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）チオラーゼ遺伝子、大腸菌アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子、Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子、及びＣ．ベイジェリンキ  アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１０９０７の構築
プラスミドｐＳＪ１０７７６をＸｈｏＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた６．８ｋｂフラグメントをゲル電気泳動により精製した。プラスミドｐＳＪ１０７５０をＸｈｏＩ及びＥａｇＩで消化し、得られた１．３７ｋｂフラグメントをゲル電気泳動により精製した。プラスミドｐＳＪ１０８４３をＥａｇＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた１．８５ｋｂフラグメントをゲル電気泳動により精製した。３つの精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＴＧ１化学的コンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。得られたコロニーのうちの４つを分析し、３つをＢｓｐＨＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、これらのうちの２つを保存し、ＳＪ１０９０７（ＴＧ１／ｐＳＪ１０９０７）及びＳＪ１０９０８（ＴＧ１／ｐＳＪ１０９０８）を得た。
【０５９３】
Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）チオラーゼ遺伝子、大腸菌アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子、Ｃ．アセトブチリカム  アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子、及びＣ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１０９０９の構築
プラスミドｐＳＪ１０７７６をＸｈｏＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた６．８ｋｂフラグメントをゲル電気泳動により精製した。プラスミドｐＳＪ１０７５０をＸｈｏＩ及びＥａｇＩで消化し、得られた１．３７ｋｂフラグメントをゲル電気泳動により精製した。プラスミドｐＳＪ１０８４１をＥａｇＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた１．８９ｋｂフラグメントをゲル電気泳動により精製した。３つの精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＴＧ１化学的コンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。得られたコロニーのうちの４つを分析し、３つをＢｓｐＨＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、これらのうちの２つを保存し、ＳＪ１０９０９（ＴＧ１／ｐＳＪ１０９０９）及びＳＪ１０９１０（ＴＧ１／ｐＳＪ１０９１０）を得た。
【０５９４】
Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）チオラーゼ遺伝子、Ｂ．モジャベンシス（B. mojavensis）スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ遺伝子、Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子、及びＣ．ベイジェリンキ  アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１０９１１の構築
プラスミドｐＳＪ１０７７６をＸｈｏＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた６．８ｋｂフラグメントをゲル電気泳動により精製した。プラスミドｐＳＪ１０７７７をＸｈｏＩ及びＥａｇＩで消化し、得られた１．４３ｋｂフラグメントをゲル電気泳動により精製した。プラスミドｐＳＪ１０８４３をＥａｇＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた１．８５ｋｂフラグメントをゲル電気泳動により精製した。３つの精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＴＧ１化学的コンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。得られたコロニーのうちの４つを分析し、２つをＢｓｐＨＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、保存し、ＳＪ１０９１１（ＴＧ１／ｐＳＪ１０９１１）及びＳＪ１０９１２（ＴＧ１／ｐＳＪ１０９１２）を得た。
【０５９５】
Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）チオラーゼ遺伝子、Ｂ．モジャベンシス（B. mojavensis）スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ遺伝子、Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子、及びＣ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１０９４０の構築
プラスミドｐＳＪ１０７７６をＸｈｏＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた６．８ｋｂフラグメントをゲル電気泳動により精製した。プラスミドｐＳＪ１０７７７をＸｈｏＩ及びＥａｇＩで消化し、得られた１．４３ｋｂフラグメントをゲル電気泳動により精製した。プラスミドｐＳＪ１０８４１をＥａｇＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた１．８９ｋｂフラグメントをゲル電気泳動により精製した。３つの精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＴＧ１化学的コンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。数個の得られたコロニーを分析し、２つをＢｓｐＨＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、保存し、ＳＪ１０９４０（ＴＧ１／ｐＳＪ１０９４０）及びＳＪ１０９４１（ＴＧ１／ｐＳＪ１０９４１）を得た。
【０５９６】
Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）チオラーゼ遺伝子、Ｃ．アセトブチリカム  アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子、Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子、及びＣ．ベイジェリンキ  アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１０９７３の構築
プラスミドｐＳＪ１０７７６をＸｈｏＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた６．８ｋｂフラグメントをゲル電気泳動により精製した。プラスミドｐＳＪ１０７５２をＸｈｏＩ及びＥａｇＩで消化し、得られた１．３８ｋｂフラグメントをゲル電気泳動により精製した。プラスミドｐＳＪ１０８４３をＥａｇＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた１．８５ｋｂフラグメントをゲル電気泳動により精製した。３つの精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＴＧ１化学的コンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。数個の得られたコロニーを分析し、２つをＰｓｔＩ及びＡｐａＬＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなし、保存し、ＳＪ１０９７３（ＴＧ１／ｐＳＪ１０９７３）及びＳＪ１０９７４（ＴＧ１／ｐＳＪ１０９７４）を得た。
【０５９７】
Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）チオラーゼ遺伝子、Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子、Ｃ．アセトブチリカム  アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子、及びＣ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＳＪ１０９７５の構築
プラスミドｐＳＪ１０７７６をＸｈｏＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた６．８ｋｂフラグメントをゲル電気泳動により精製した。プラスミドｐＳＪ１０７５２をＸｈｏＩ及びＥａｇＩで消化し、得られた１．３８ｋｂフラグメントをゲル電気泳動により精製した。プラスミドｐＳＪ１０８４１をＥａｇＩ及びＸｍａＩで消化し、得られた１．８９ｋｂフラグメントをゲル電気泳動により精製した。３つの精製されたフラグメントを混合し、ライゲートさせ、ライゲーション混合物でＴＧ１化学的コンピテント細胞を形質転換し、３７℃においてＬＢプレート上でエリスロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）を選択した。数個の得られたコロニーを分析し、３つをＰｓｔＩ及びＡｐａＬＩを用いた制限酵素分析により、所望の組み換えプラスミドを含んでいるとみなした。これらのうちの２つを、ＳＪ１０９７５（ＴＧ１／ｐＳＪ１０９７５）及びＳＪ１０９７６（ＴＧ１／ｐＳＪ１０９７６）として保存した。
【０５９８】
ペプチド誘導可能なイソプロパノールオペロンコンストラクトを含む発現ベクターを用いたＬ．プランタルム（L. plantarum）ＳＪ１０６５６の形質転換
Ｌ．プランタルム（L. plantarum）ＳＪ１０６５６を、プラスミドを用いて上述のエレクトロポレーションにより形質転換し、各プラスミドを含む形質転換体を得て、保存した（表５を参照のこと）。コンストラクトは、上記の実施例に示される略記を用いて表される。
【０５９９】
【表５】
2013544083.tif 000006
【０６００】
実施例１４：形質転換株のサブセットを用いたＬ．プランタルム（L. plantarum）におけるイソプロパノール及びアセトン生産
ＭＲＳ培地（１０μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含む２ｍｌの合計容量）に２ｍｌエッペンドルフチューブに−８０℃で保存されていたストックバイアルからの組み換えＬ．プランタルム（L. plantarum）株を植菌し、振盪することなく３７℃で一晩インキュベートした。翌日、これらの培養物から５０μＬ容量の培養液を用いて、各株についてＭＲＳ＋１０μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含む二つの１０ｍｌバイアルのそれぞれに植菌した（一つは、約５０ｎｇ／ｍｌの濃度においてｐＳＩＰベクターシステムのための誘導ペプチド（Ｍ−１９−Ｒ）を含む）。バイアルを閉じ、３７℃で振盪することなくインキュベートした。上清サンプルをインキュベーションの１日及び２日後に回収し、上述のようにアセトン及びイソプロパノール含量について分析した。結果を表６に示す。コンストラクトは、上記の実施例に示される略記を用いて表される。
【０６０１】
【表６】
2013544083.tif 000007
【０６０２】
実施例１４：Ｌ．プランタルム（L. plantarum）におけるイソプロパノール及びアセトン生産、並びにアセトン添加の効果
組み換えＬ．プランタルム（L. plantarum）株を３７℃で３日間、１０μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含む静置されたＭＲＳ培地において、培養した。培養物は、表７に示すように、誘導Ｍ−１９−Ｒポリペプチド（５０ｎｇ／ｍｌ）及び／又はアセトン（５ｍｌ／ｌ）を含むを含んだ。上清を、上述のようにアセトン及びイソプロパノールについて分析した。対照株ＳＪ１０６７８は、「空」ｐＳＪ１０６００発現ベクターを含む。結果を表７に示す。コンストラクトは、上記の実施例に示される略記を用いて表される。
【０６０３】
【表７】
2013544083.tif 000008
【０６０４】
表７に示すように、イソプロパノールは、誘導した場合、全てのイソプロパノール−オペロンを含む株において検出される。添加されず、誘導されない培養物は、検出可能なイソプロパノールを生産しなかった。アセトンの添加とともに、イソプロパノールは、誘導されないイソプロパノールオペロン培養物について少量検出され（しかし対照においては検出されない）、誘導ペプチドで誘導した場合、有意に増加した。
【０６０５】
実施例１５：Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）チオラーゼを有するコンストラクトを含む発現ベクターを含むＬ．プランタルム（L. plantarum）におけるイソプロパノール及びアセトン生産
選択された上記の組み換えＬ．プランタルム（L. plantarum）株（及びＢ、−Ｃ、−Ｄ等に示されるように、調製からの更なる形質転換体コロニー）を、ＭＲＳ培地（１０μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含む）を含む２ｍｌエッペンドルフチューブに植菌し、振盪させることなく、３７℃で一晩保存した。各植菌について、０．５ｍｌの上清サンプルを本明細書に記載のように、アセトン及びイソプロパノール含量について分析した。結果を表８に示す。コンストラクトは、上記の実施例に示される略記で表される。
【０６０６】
【表８】
2013544083.tif 000009
【０６０７】
実施例１６：イソプロパノール経路酵素発現
Ｌ．プランタルム（L. plantarum）におけるチオラーゼ発現及び活性
プラスミドｐＳＪ１０７９６及びｐＳＪ１０７９８を、上述のようにエレクトロポレーションによりＬ．プランタルム（L. plantarum）ＳＪ１０６５６に導入し、ＭＲＳ寒天プレート上でエリスロマイシン耐性（１０μｇ／ｍｌ）を選択した。３０℃で３日インキュベーション後、各形質転換から二つのコロニーをエリスロマイシン（１０μｇ／ｍｌ）を含むＭＲＳ培地に植菌し、一定量の細胞を３７℃で一晩インキュベーション後、遠心分離により、回収した。
【０６０８】
ＤＮＡを「Extract-Amp（商標）プラントキット」（Sigma）を用いて抽出し、プライマー６６３７８３及び６６３７８４（下記）を用いたＰＣＲ増幅を、プラスミド上に有するエリスロマイシン耐性遺伝子の存在を確認するために用いた。
【０６０９】
プライマー６６３７８３：５’−ＣＴＧＡＴＡＡＧＴＧＡＧＣＴＡＴＴＣ−３’（配列番号１２３）
プライマー６６３７８４：５’−ＣＡＧＣＡＣＡＧＴＴＣＡＴＴＡＴＣ−３’（配列番号１２４）
【０６１０】
ｐＳＪ１０７９６又はｐＳＪ１０７９８を有する形質転換体を、それぞれＳＪ１０８５８及びＳＪ１０８５９として保存した。
【０６１１】
Ｌ．プランタルム（L. plantarum）の以下の４つの株をチオラーゼ発現を確かめるために用いた。
ＳＪ１０８５７：望ましくない欠損を含む、配列番号１１４のプロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Propionibacterium freudenreichii）チオラーゼをコードする遺伝子を含む。
ＳＪ１０８５８：配列番号３５のラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）チオラーゼをコードするｐＳＪ１０７９６を含む。
ＳＪ１０８５９：配列番号３のクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）チオラーゼをコードするｐＳＪ１０７９８を含む。
ＳＪ１０８７０：配列番号１１６のラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）チオラーゼをコードする遺伝子を含む。
【０６１２】
前記株を、３７℃で１日の静置培養において１０μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含むＭＲＳ培地中で増殖させた。培養物をその後プールし、細胞を遠心分離により回収した。
【０６１３】
前記細胞ペレットを、サイクルの間、氷上で冷却しながら「Bead Beater」（FastPrep FP120, BIO101 Savant）において、４０秒、３サイクル、１．５ｍｌエッペンドルフチューブ中で５００μＬのバッファ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、２ｍＭ  ＤＴＴ）中でガラスボールを用いた処理により機械的に破砕した。細胞残屑を遠心分離により除去し、上清を分析に用いた。
【０６１４】
混合されたサンプル中のチオラーゼ酵素活性を後述のように確認した。
チオラーゼ酵素を、マイクロタイタープレートのウェル中で５０μｌ  ２００μＭアセトアセチル−ＣｏＡ（Sigma A1625）、５０μｌ  ２００μＭ補酵素Ａ（Sigma C3144）、５０μｌバッファ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、６０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ｐＨ８．０）、及び細胞溶解液からの５０μｌ上清（ＭｉｌｌｉＱ水で２０〜８０倍希釈）を混合することにより測定した。チオラーゼが触媒するアセチル−ＣｏＡの形成によるマグネシウムとのアセトアセチル−ＣｏＡ複合体の消失の反応速度を、続いて３１０ｎｍ（２０分間、毎秒２０秒に測定される）においてプレートリーダー（Molecular Devices, SpectraMax Plus）で分光光度的に測定した。添加される補酵素Ａを含まないブランクサンプルは含められ、引かれた。チオラーゼ活性を方程式：活性＝−（サンプルの傾斜−ブランクの傾斜）*希釈倍率、を用いて初期吸光度傾斜から計算した。混合された細胞溶解液中の活性は、４００±７０ｍＯＤ／分であった。
【０６１５】
混合されたサンプルを、導入された組み換えプラスミドから推定される４つのチオラーゼタンパク質に加えて、ゲノム配列から推定されるラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＷＣＦＳ１からなるデータベースとペプチドスペクトラムとを比較する下記の実施例に記載される質量分析計によるタンパク質分析に供した。
【０６１６】
同定された２７９個のタンパク質の中でも、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）チオラーゼを４．０２のｅｍＰＡＩ値で同定し、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）チオラーゼを１．５３のｅｍＰＡＩ値で同定した。
【０６１７】
別の実験では、株ＳＪ１０８５７、ＳＪ１０８５８、ＳＪ１０８５９、ＳＪ１０８７０、及びＳＪ１０９２７（正確なプロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Propionibacterium freudenreichii）チオラーゼ遺伝子を含む）を、３７℃で１日間、静置培養において１０μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含むＭＲＳ培地中で増殖させ、前記細胞を１ｍｌの培養量から遠心分離により回収した。
【０６１８】
それぞれの細胞ペレットを、サイクルの間、氷上で冷却しながら「Bead Beater」（FastPrep FP120, BIO101 Savant）において、４０秒、４サイクル、１．５ｍｌエッペンドルフチューブ中で５０μＬのバッファ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、２ｍＭ  ＤＴＴ）中でガラスボールを用いた処理により機械的に破砕した。４５０μＬのバッファを添加し、細胞残屑を遠心分離により除去し、上清を分析に用いた。
【０６１９】
有意なチオラーゼ酵素活性を、上述のアッセイを用いてＳＪ１０８５８及びＳＪ１０８５９（即ち、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）及びクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）チオラーゼを含むコンストラクトを含む株）からの溶解液において検出した。２２０ｍＯＤ／分及び１９ｍＯＤ／分の活性がそれぞれＳＪ１０８５８及びＳＪ１０８５９において見られた。
【０６２０】
Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）におけるチオラーゼ発現及び活性
Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）ＳＪ１０６５５のエレクトロコンピテント細胞を、選択されたチオラーゼをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを用いて上述のように調製及び形質転換した。以下のプラスミドは、示される形質転換体をもたらし、１０μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含むＭＲＳ寒天プレート上で選択し、嫌気性チャンバー中で３７℃においてインキュベートした。
【０６２１】
ｐＳＪ１０７９５（ｔｈｌ＿Ｐｆ；配列番号１１３を含む）：ＳＪ１１１７５
ｐＳＪ１０７９８（ｔｈｌ＿Ｃａ；配列番号２を含む）：ＳＪ１１１７７
ｐＳＪ１０７４３（ｔｈｌ＿Ｌｂ；配列番号１１５を含む）：ＳＪ１１１７９
ｐＳＪ１０７９６（ｔｈｌ＿Ｌｒ；配列番号３４を含む）：ＳＪ１１１８１
【０６２２】
これらの株を、３７℃で１日静置培養において、１０μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含むＭＲＳ培地中で増殖させ、前記細胞を４ｍｌの培養量から遠心分離により回収した。
【０６２３】
細胞を５００μＬのバッファ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、２ｍＭ  ＤＴＴ）で１回洗浄し、５０μＬのバッファに再懸濁し、サイクルの間、氷上で冷却しながら「Bead Beater」（FastPrep FP120, BIO101 Savant）において、４．０ｍ／ｓの設定で４０秒において４サイクル、１．５ｍｌエッペンドルフチューブ中でガラスボールによる処理により機械的に破砕した。４５０μＬのバッファを添加し、細胞残屑を遠心分離により除去し、上清を酵素活性分析に用いた。
【０６２４】
同様に、各培養物の１ｍｌを混合し、混合されたサンプルを上述のように洗浄、及び破砕し、この混合されたサンプルを他で記載されるように、質量分析によるタンパク質分析に用いた。
【０６２５】
クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）チオラーゼは８．１６の相対的ｅｍＰＡＩ値で検出され、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）チオラーゼは１．２の相対的ｅｍＰＡＩ値で検出され、そしてラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）チオラーゼは０．４６の相対的ｅｍＰＡＩ値で検出された。
【０６２６】
個別のサンプルを酵素活性分析のために用い、以下の相対的活性レベルを得た。
Ａ．ｐＳＪ１０７９５（ｔｈｌ＿Ｐｆ；配列番号１１３を含む）：ＳＪ１１１７５＝３６
Ｂ．ｐＳＪ１０７９８（ｔｈｌ＿Ｃａ；配列番号２を含む）：ＳＪ１１１７７＝２２０００
Ｃ．ｐＳＪ１０７４３（ｔｈｌ＿Ｌｂ；配列番号１１５を含む）：ＳＪ１１１７９＝２１００
Ｄ．ｐＳＪ１０７９６（ｔｈｌ＿Ｌｒ；配列番号３４を含む）：ＳＪ１１１８１＝３０００
【０６２７】
Ｌ．プランタルム（L. plantarum）におけるＣｏＡトランスフェラーゼ発現及び活性
プラスミドｐＳＪ１０８８６及びｐＳＪ１０８８７を、上述のようにエレクトロポレーションによりＬ．プランタルム（L. plantarum）ＳＪ１０６５６に導入し、ベクターのエリスロマイシン耐性遺伝子の存在をプライマー６６３７８３及び６６３７８４（同上）を用いたＰＣＲ増幅により確認した。
【０６２８】
ｐＳＪ１０８８６を含む形質転換体をＳＪ１０９２２として保存し、ｐＳＪ１０８８７を含む形質転換体をＳＪ１０９２３として保存した。
【０６２９】
同様に、ｐＳＪ１０８８８をＳＪ１０６５６に導入してＳＪ１０９８８を得て、ｐＳＪ１０８８９をＳＪ１０６５６に導入してＳＪ１０９２９を得た。
【０６３０】
株ＳＪ１０９２２及びＳＪ１０９２３（Ｂ．サブチリス（B. subtilis）ｓｃｏＡＢ遺伝子対を含む）並びに株ＳＪ１０９２９及びＳＪ１０９８８（大腸菌ａｔｏＡＤ遺伝子対を含む）を３７℃で１日間、２ｍｌの静置培養において１０μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含むＭＲＳ培地中で増殖させ、前記細胞を遠心分離により回収した。
【０６３１】
それぞれの細胞ペレットを、サイクルの間、氷上で冷却しながら「Bead Beater」（FastPrep FP120, BIO101 Savant）において、４０秒、５サイクル、１．５ｍｌエッペンドルフチューブ中で５０μＬのバッファ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、２ｍＭ  ＤＴＴ）中でガラスボールを用いた処理により機械的に破砕した。４５０μＬのバッファを添加し、細胞残屑を遠心分離により除去し、上清を分析に用いた。
【０６３２】
ＳＪ１０９２９及びＳＪ１０９２３からの溶解液をプールし、質量分析計により分析した。同定された４６１個のタンパク質の中でも、ＡｔｏＤサブユニットを３．９のｅｍＰＡＩ値で同定し、ＳｃｏＢサブユニットを０．１４のｅｍＰＡＩ値で同定した。
【０６３３】
同様に、ＳＪ１０９２２からの溶解液を、Ｂ．モジャベンシス（B. mojavensis）からのｓｃｏＡＢ遺伝子を含む発現プラスミドを含むＬ．プランタルム（L. plantarum）株から同様に得られた溶解液とともにプールし、分析した。同定された４７２個のタンパク質の中でも、Ｂ．サブチリス（B. subtilis）ＳｃｏＡサブユニットは０．６５のｅｍＰＡＩ値で同定され、Ｂ．サブチリス（B. subtilis）ＳｃｏＢサブユニットは０．１４のｅｍＰＡＩ値で同定された。
【０６３４】
スクシニル−ＣｏＡアセトアセテートトランスフェラーゼ活性を以下のプロトコールを用いて細胞溶解液において測定した。マイクロタイタープレートのウェル中で、５０μｌ  ８０ｍＭ  Ｌｉ−アセトアセテート（Sigma A8509）、５０μｌ  ４００μＭスクシニル−ＣｏＡ（Sigma S1129）、５０μｌバッファ（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、６０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．１）及び５０μｌ細胞溶解液（ＭｉｌｌｉＱ水で５〜２０ｘ希釈）を混合した。マグネシウムとの酵素的反応複合体において形成されるアセトアセチル−ＣｏＡを２０分間、２０秒毎に３１０ｎｍにおいて吸光度を測定することにより、プレートリーダー（Molecular Devices, SpectraMax Plus）において分光光度的に検出した。細胞溶解液を含まないブランクサンプルは、含まれる。トランスフェラーゼ活性を、方程式：活性＝（サンプルの傾斜−ブランクの傾斜）*希釈倍率、を用いて吸光度の増加の初期傾斜から計算した。ＳＪ１０９２２からの細胞溶解液において、５．６±０．５ｍＯＤ／分の活性が見られた。
【０６３５】
Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）におけるＣｏＡトランスフェラーゼ発現及び活性
Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）ＳＪ１０６５５のエレクトロコンピテント細胞を、選択されたＣｏＡトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを用いて、上述のように調製及び形質転換した。以下のプラスミドは、示される形質転換体をもたらし、１０μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含むＭＲＳ寒天プレート上で選択し、嫌気性チャンバー中で３７℃でインキュベートした。
【０６３６】
ｐＳＪ１０８８７（ｓｃｏＡＢ＿Ｂｓ；配列番号：５＋８を含む）：ＳＪ１１１９７
ｐＳＪ１０８８８（ａｔｏＡＤ＿Ｅｃ；配列番号：３６＋３８を含む）：ＳＪ１１１９９
ｐＳＪ１０９９０（ｃｔｆＡＢ＿Ｃａ；配列番号：４０＋４２を含む）：ＳＪ１１２２１
【０６３７】
これらの株を、３７℃で１日静置培養において、１０μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含むＭＲＳ培地中で増殖させ、細胞を４ｍｌの培養物量から遠心分離により回収した。
【０６３８】
細胞を５００μＬのバッファ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、２ｍＭ  ＤＴＴ）で１回洗浄し、５０μＬのバッファに再懸濁し、サイクルの間、氷上で冷却しながら「Bead Beater」（FastPrep FP120, BIO101 Savant）において、４．０ｍ／ｓの設定で４０秒において４サイクル、１．５ｍｌエッペンドルフチューブ中でガラスボールによる処理により機械的に破砕した。４５０μＬのバッファを添加し、細胞残屑を遠心分離により除去し、上清を酵素活性分析に用いた。
【０６３９】
同様に、各培養物の１ｍｌを混合し、混合されたサンプルを上述のように洗浄、及び破砕し、この混合されたサンプルを他で記載されるように、質量分析によるタンパク質分析に用いた。
【０６４０】
バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）からのＳｃｏＡサブユニットは、０．３３の相対的ｅｍＰＡＩ値で検出され、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）からのＳｃｏＢサブユニットは、０．０８の相対的ｅｍＰＡＩ値で検出され、そして大腸菌（Escherichia coli）からのＡｔｏＡサブユニットは０．０６の相対的ｅｍＰＡＩ値で検出された。
【０６４１】
個別のサンプルを酵素活性分析のために用い、以下の相対的活性レベルを得た。
Ａ．ｐＳＪ１０８８７（ｓｃｏＡＢ＿Ｂｓ；配列番号：５＋８を含む）：ＳＪ１１１９７
ＡｔｏＡＤ活性＝０±３０；ＳｃｏＡＢ活性＝３２０±４０
Ｂ．ｐＳＪ１０８８８（ａｔｏＡＤ＿Ｅｃ；配列番号：３６＋３８を含む）：ＳＪ１１１９９
ＡｔｏＡＤ活性＝６±４；ＳｃｏＡＢ活性＝１±２
Ｃ．ｐＳＪ１０９９０（ｃｔｆＡＢ＿Ｃａ；配列番号：４０＋４２を含む）：ＳＪ１１２２１
ＡｔｏＡＤ活性＝１±１；ＳｃｏＡＢ活性＝１±３
【０６４２】
Ｌ．プランタルム（L. plantarum）におけるアセトアセテートデカルボキシラーゼ発現及び活性
プラスミドｐＳＪ１０７５６を、上述のようにエレクトロポレーションによりＬ．プランタルム（L. plantarum）ＳＪ１０５１１（ＳＪ１０６５６と同一）に導入し、ベクターのエリスロマイシン耐性遺伝子の存在をプライマー６６３７８３及び６６３７８４（同上）を用いたＰＣＲ増幅により確認した。二つの形質転換体をＳＪ１０７８８及びＳＪ１０７８９として保存した。
【０６４３】
同様に、プラスミドｐＳＪ１０７５４及びｐＳＪ１０７５５で、ＳＪ１０５１１を形質転換し、ＳＪ１０７８６及びＳＪ１０７８７を得、プラスミドｐＳＪ１０７７８及びｐＳＪ１０７７９で、ＳＪ１０６５６を形質転換し、ＳＪ１０８４９及びＳＪ１０８５０を得、プラスミドｐＳＪ１０７８０及びｐＳＪ１０７８１で、ＳＪ１０６５６を形質転換し、ＳＪ１０８５１及びＳＪ１０８５２を得た。
【０６４４】
以下の８つの株をアルコールデカルボキシラーゼ発現を確認するために用いた。
配列番号４５のクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）アセトアセテートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子を双方ともに含む、ＳＪ１０７８６及びＳＪ１０７８７。
配列番号１８のクロストリジウム・ベイジェリンキー（Clostridium beijerinckii）アセトアセテートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子を双方ともに含む、ＳＪ１０７８８及びＳＪ１０７８９。
配列番号１１８のラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salvarius）アセトアセテートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子を双方ともに含む、ＳＪ１０８５１及びＳＪ１０８５２。
配列番号１２０のラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）アセトアセテートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子を双方ともに含む、ＳＪ１０８４９及びＳＪ１０８５０。
【０６４５】
前記株を３７℃で静置培養において１日、１０μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含むＭＲＳ培地中で増殖させ、培養物をプールし、細胞を遠心分離により回収した。細胞をもとの容量の１／３のバッファ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、２ｍＭ  ＤＴＴ）に懸濁し、サイクルの間、氷上で冷却しながら「Bead Beater」（FastPrep FP120, BIO101 Savant）において、４．０ｍ／ｓの設定で４０秒において５サイクル、１．５ｍｌエッペンドルフチューブにおいて５００μＬの量中でガラスボールを用いた処理により機械的に破砕した。細胞残屑を遠心分離により除去し、上清を分析に用いた。
【０６４６】
このプールされたサンプルを、上述のように質量分析計によるタンパク質分析に用い、同定された２４５個のタンパク質の中でも、クロストリジウム・ベイジェリンキー（Clostridium beijerinckii）アセトアセテートデカルボキシラーゼを０．２６のｅｍＰＡＩ値で同定した。
【０６４７】
Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）におけるアセトアセテートデカルボキシラーゼ発現及び活性
Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）ＳＪ１０６５５のエレクトロコンピテント細胞を、選択されたアセトアセテートデカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを用いて上述のように調製及び形質転換した。以下のプラスミドは、示される形質転換体をもたらし、１０μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含むＭＲＳ寒天プレート上で選択し、嫌気性チャンバー中で３７℃でインキュベートした。
【０６４８】
ｐＳＪ１０７５４（ａｄｃ＿Ｃａ；配列番号４４を含む）：ＳＪ１１１８３
ｐＳＪ１０７５６（ａｄｃ＿Ｃｂ；配列番号１７を含む）：ＳＪ１１１８５
ｐＳＪ１０７８０（ａｄｃ＿Ｌｓ；配列番号１１７を含む）：ＳＪ１１１８７
ｐＳＪ１０７７８（ａｄｃ＿Ｌｐ；配列番号１１９を含む）：ＳＪ１１１８９
【０６４９】
これらの株を、３７℃で１日静置培養において、１０μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含むＭＲＳ培地中で増殖させ、細胞を４ｍｌの培養物量から遠心分離により回収した。
【０６５０】
細胞を５００μＬのバッファ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、２ｍＭ  ＤＴＴ）で１回洗浄し、５０μＬのバッファに再懸濁し、サイクルの間、氷上で冷却しながら「Bead Beater」（FastPrep FP120, BIO101 Savant）において、４．０ｍ／ｓの設定で４０秒において４サイクル、１．５ｍｌエッペンドルフチューブ中でガラスボールによる処理により機械的に破砕した。４５０μＬのバッファを添加し、細胞残屑を遠心分離により除去し、上清を酵素活性分析に用いた。
【０６５１】
同様に、各培養物の１ｍｌを混合し、混合されたサンプルを上述のように洗浄、及び破砕し、この混合されたサンプルを他で記載されるように、質量分析によるタンパク質分析に用いた。
【０６５２】
ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）からのアセトアセテートデカルボキシラーゼは０．０８の相対的ｅｍＰＡＩ値で検出され、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）からのアセトアセテートデカルボキシラーゼは０．０８の相対的ｅｍＰＡＩ値で検出された。
【０６５３】
個別のサンプルを酵素活性分析のために用い、以下の相対的活性レベルを得た。
Ａ．ｐＳＪ１０７５４（ａｄｃ＿Ｃａ；配列番号４４を含む）：ＳＪ１１１８３＝６±１３
Ｂ．ｐＳＪ１０７５６（ａｄｃ＿Ｃｂ；配列番号１７を含む）：ＳＪ１１１８５＝−１±１６
Ｃ．ｐＳＪ１０７８０（ａｄｃ＿Ｌｓ；配列番号１１７を含む）：ＳＪ１１１８７＝７±１２
Ｄ．ｐＳＪ１０７７８（ａｄｃ＿Ｌｐ；配列番号１１９を含む）：ＳＪ１１１８９＝５±９
【０６５４】
Ｌ．プランタルム（L. plantarum）におけるアルコールデヒドロゲナーゼ発現及び活性
プラスミドｐＳＪ１０７４５を、上述のようにエレクトロポレーションによりＬ．プランタルム（L. plantarum）ＳＪ１０５１１（ＳＪ１０６５６と同一）に導入し、ベクターのエリスロマイシン耐性遺伝子の存在をプライマー６６３７８３及び６６３７８４（同上）を用いたＰＣＲ増幅により確認した。二つの形質転換体をＳＪ１０７８４及びＳＪ１０７８５として保存した。
【０６５５】
同様に、プラスミドｐＳＪ１０７６８及びｐＳＪ１０７６９を、ＳＪ１０６５６に導入し、それぞれＳＪ１０８８３及びＳＪ１０８９８を得、プラスミドｐＳＪ１０７８２及びｐＳＪ１０７８３を、ＳＪ１０６５６に導入し、それぞれＳＪ１０８８４及びＳＪ１０８８５を得、プラスミドｐＳＪ１０７６２及びｐＳＪ１０７６５を、ＳＪ１０６５６に導入し、それぞれＳＪ１０８９６及びＳＪ１０８９７を得た。全ての場合において、エリスロマイシン耐性遺伝子の存在をＰＣＲ増幅により確認した。
【０６５６】
以下の８つの株をアルコールデヒドロゲナーゼ発現を確認するために用いた。
配列番号４７のラクトバチルス・アントリ（Lactobacillus antri）アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を双方ともに含む、ＳＪ１０８８３及びＳＪ１０８９８。
配列番号１２２のラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）アルコールデヒドロゲナーゼをコードするｐＳＪ１０７５を双方ともに含む、ＳＪ１０８９６及びＳＪ１０８９７。
配列番号２４のサーモアナエロバクター・エタノリカス（Thermoanaerobacter ethanolicus）アルコールデヒドロゲナーゼ をコードする遺伝子を双方ともに含む、ＳＪ１０７８４及びＳＪ１０７８５。
配列番号２１のクロストリジウム・ベイジェリンキー（Clostridium beijerinckii）アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を双方ともに含む、ＳＪ１０７８４及びＳＪ１０７８５。
【０６５７】
前記株を３７℃で静置培養において１日、１０μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含むＭＲＳ培地中で増殖させ（２ｍｌエッペンドルフチューブ中１．５ｍｌ培養容量）、培養物をプールし、細胞を遠心分離により回収した。細胞をもとの容量の１／３のバッファ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、２ｍＭ  ＤＴＴ）に懸濁し、サイクルの間、氷上で冷却しながら「Bead Beater」（FastPrep FP120, BIO101 Savant）において、４．０ｍ／ｓの設定で４０秒において５サイクル、１．５ｍｌエッペンドルフチューブにおいて５００μＬの量中でガラスボールを用いた処理により機械的に破砕した。細胞残屑を遠心分離により除去し、上清を分析に用いた。
【０６５８】
このプールされたサンプルを、上述のように質量分析計によるタンパク質分析に用い、同定された１６０個のタンパク質の中でも、クロストリジウム・ベイジェリンキー（Clostridium beijerinckii）アルコールデヒドロゲナーゼを０．０９のｅｍＰＡＩ値で同定した。
【０６５９】
同一のプールされたサンプルを後述のようにイソプロパノールデヒドロゲナーゼ活性について分析した。
マイクロタイタープレートのウェル中で、５０μｌ  ２００ｍＭアセトン、５０μｌ  ４００μＭ  ＮＡＤＰＨ（Sigma N1630）、５０μｌバッファ（１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．２）及び５０μｌプールされた細胞溶解液（ＭｉｌｌｉＱ水で１〜２０ｘ希釈）を混合することにより測定した。ＮＡＤＰＨの消失をプレートリーダー（Molecular Devices, SpectraMax Plus）において２０分間、毎秒２０秒、３４０ｎｍにおいて吸光度を測定することにより観察した。イソプロパノールデヒドロゲナーゼ活性を方程式：活性＝サンプルの傾斜*希釈倍率、を用いて初期傾斜から計算した。１０．４±０．８ｍＯＤ／分の活性がサンプルにおいて見られた。
【０６６０】
Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）におけるアルコールデヒドロゲナーゼ発現及び活性
Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）ＳＪ１０６５５のエレクトロコンピテント細胞を、選択されたアルコールデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを用いて、上述のように調製及び形質転換した。以下のプラスミドは、示される形質転換体をもたらし、１０μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含むＭＲＳ寒天プレート上で選択し、嫌気性チャンバー中で３７℃でインキュベートした。
【０６６１】
ｐＳＪ１０７６８（ｓａｄｈ＿Ｌａ；配列番号４６を含む）：ＳＪ１１１９１
ｐＳＪ１０７６２（ｓａｄｈ＿Ｌｆ：配列番号１２１を含む）：ＳＪ１１２０１
ｐＳＪ１０７６６（ｓａｄｈ＿Ｌｆ；配列番号１２１を含む）：ＳＪ１１１９３
ｐＳＪ１０７８２（ａｄｈ＿Ｃｂ；配列番号２０を含む）：ＳＪ１１１９５
【０６６２】
これらの株を、３７℃で１日静置培養において、１０μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含むＭＲＳ培地中で増殖させ、細胞を４ｍｌの培養物量から遠心分離により回収した。
【０６６３】
細胞を５００μＬのバッファ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、２ｍＭ  ＤＴＴ）で１回洗浄し、５０μＬのバッファに再懸濁し、サイクルの間、氷上で冷却しながら「Bead Beater」（FastPrep FP120, BIO101 Savant）において、４．０ｍ／ｓの設定で４０秒において４サイクル、１．５ｍｌエッペンドルフチューブ中でガラスボールによる処理により機械的に破砕した。４５０μＬのバッファを添加し、細胞残屑を遠心分離により除去し、上清を酵素活性分析に用いた。
【０６６４】
同様に、各培養物の１ｍｌを混合し、混合されたサンプルを上述のように洗浄、及び破砕し、この混合されたサンプルを他で記載されるように、質量分析によるタンパク質分析に用いた。
【０６６５】
クロストリジウム・ベイジェリンキー（Clostridium beijerinckii）由来のアルコールデヒドロゲナーゼは０．１２の相対的ｅｍＰＡＩ値で検出され、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）由来のアルコールデヒドロゲナーゼは０．０４の相対的ｅｍＰＡＩ値で検出され、ラクトバチルス・アントリ（Lactobacillus antri）由来のアルコールデヒドロゲナーゼは０．０４の相対的ｅｍＰＡＩ値で検出された。
【０６６６】
個別のサンプルを酵素活性分析のために用い、以下の相対的活性レベルを得た。
Ａ．ｐＳＪ１０７６８（ｓａｄｈ＿Ｌａ；配列番号４６を含む）：ＳＪ１１１９１＝５±２
Ｂ．ｐＳＪ１０７６２（ｓａｄｈ＿Ｌｆ：配列番号１２１を含む）：ＳＪ１１２０１＝１±１
Ｃ．ｐＳＪ１０７６６（ｓａｄｈ＿Ｌｆ；配列番号１２１を含む）：ＳＪ１１１９３＝１９００
Ｄ．ｐＳＪ１０７８２（ａｄｈ＿Ｃｂ；配列番号２０を含む）：ＳＪ１１１９５＝３±４
【０６６７】
実施例１７：Ｌ．プランタルム（L. plantarum）アルコールデヒドロゲナーゼ発現株を用いたアセトンからのイソプロパノール生産
アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む発現ベクターを有する株、及び「空」発現ベクターを有する株（ＳＪ１０６７８）を、３７℃で静置培養において、１０μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含むＭＲＳ培地中（２ｍｌエッペンドルフチューブ中１．５ｍｌ培養容量）で２式増殖させ、ここで、培養物のうちの１つの培地にアセトン（約１００μＬのアセトン／リットル）を添加した。１日のインキュベーション後、１００μＬの上清を遠心分離により回収した。合計４日のインキュベーション後、別の１００μＬの上清が回収され、上述のようにアセトン及びイソプロパノール含量についてサンプルを分析した。結果を表９に示す。コンストラクトは、上記の実施例に示される略記を用いて表される。
【０６６８】
【表９】
2013544083.tif 000010
【０６６９】
アセトン添加は、ラクトバチルス・アントリ（Lactobacillus antri）、サーモアナエロバクター・エタノリカス（Thermoanaerobacter ethanolicus）、及びクロストリジウム・ベイジェリンキー（Clostridium beijerinckii）からのアルコールデヒドロゲナーゼを発現する株について測定されるイソプロパノール濃度を増加させた。全ての発酵において、少量のアセトンが検出された。対照株ＳＪ１０６７８及びラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）コンストラクトを含む株は、これらの試験条件下でイソプロパノールを生産しなかった。
【０６７０】
実施例１８：Ｌ．プランタルム（L. plantarum）アルコールデヒドロゲナーゼ発現株におけるイソプロパノール生産に関する様々なアセトン濃度の効果
株ＳＪ１０８９８、ＳＪ１０７８５、及びＳＪ１０８８５を、対照株ＳＪ１０６７８とともに様々なレベルで添加されるアセトンを含む培地中で発酵させた。株を凍結された収集保存株バイアルから、２ｍｌエッペンドルフチューブ中に１０μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含む１．８ｍｌ  ＭＲＳに植菌し、これを振盪させながら３７℃で一晩インキュベートした。これらの培養物から５０μＬを、１０μｇ／ｍｌエリスロマイシンと示されるアセトンレベルを含む１．８ｍｌ  ＭＲＳ培地に植菌するために用いた。１００μＬ上清を上述のように１日及び４日の発酵後、アセトン及び２−プロパノール含量の分析のために回収した。結果を表１０に示す。コンストラクトは、上記の実施例に示される略記を用いて表される。
【０６７１】
【表１０】
2013544083.tif 000011
【０６７２】
アセトンのイソプロパノールへの有意な変換は、３つのアルコールデヒドロゲナーゼ発現株について観察された一方で、イソプロパノールは、対照株ＳＪ１０６７８で検出されなかった。
【０６７３】
実施例１９：ラクトバチルス属誘導可能イソプロパノール−オペロンコンストラクトからの大腸菌におけるイソプロパノール生産
ペプチド誘導可能ラクトバチルス属プロモーターシステムにより制御されるイソプロパノールオペロンは上記に記載され、ここでプラスミドは、大腸菌において構築される。これらの大腸菌株を、上述のように３７℃で１日間、３００ｒｐｍで振盪させながらの、誘導ペプチドの添加を含む或いは含まない、ＬＢ＋１００μｇ／ｍｌエリスロマイシン＋１％グルコース中での発酵によるイソプロパノール生産について試験した。前記株を、凍結保存培養から発酵培地（試験管中１０ｍｌ）に直接植菌した。結果を表１１Ａに示す。コンストラクトは、上記の実施例に示される略記を用いて表される。
【０６７４】
【表１１】
2013544083.tif 000012
【０６７５】
有意なイソプロパノール生産は、試験された全てのイソプロパノールオペロンコンストラクトからの大腸菌において観察された。
【０６７６】
実施例２０：アセトン及び／又は１，２−プロパンジオールが添加されたＬ．ロイテリ（Ｌ. reuteri）アルコールデヒドロゲナーゼ発現株からのイソプロパノール生産
Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）ＳＪ１０６５５のエレクトロコンピテント細胞を、選択されたアルコールデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを用いて上述のように調製及び形質転換した。以下のプラスミドは示される形質転換体をもたらし、抽出されたプラスミドの制限酵素分析により確認された。
【０６７７】
ｐＳＪ１０６００：ＳＪ１１０１１及びＳＪ１１０１２
ｐＳＪ１０７６５：ＳＪ１１０１３及びＳＪ１１０１４
ｐＳＪ１０７６９：ＳＪ１１０１５及びＳＪ１１０１６
ｐＳＪ１０７８３：ＳＪ１１０２４
ｐＳＪ１０７４５：ＳＪ１１０５３及びＳＪ１１０５４
【０６７８】
形質転換体を１０μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含むＬＣＭ寒天プレート上で選択し、嫌気性チャンバー中で３７℃においてインキュベートした。
【０６７９】
別の実験では、Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）ＳＪ１０６５５のエレクトロコンピテント細胞を、上述のように調製及び形質転換した。以下のプラスミドは示される形質転換体をもたらし、抽出されたプラスミドの制限酵素分析により確認された、
【０６８０】
以下の株を保存した。
ｐＳＪ１０７６８：ＳＪ１１１９１及びＳＪ１１１９２：
ｐＳＪ１０７６６：ＳＪ１１１９３及びＳＪ１１１９４
ｐＳＪ１０７８２：ＳＪ１１１９５及びＳＪ１１１９６
ｐＳＪ１０７６２：ＳＪ１１２０１及びＳＪ１１２０２
【０６８１】
選択されたＬ．ロイテリ（L. reuteri）形質転換体を、凍結保存培養からエリスロマイシン（１０μｇ／ｍｌ）及びアセトン（５ｍｌ／ｌ）が添加された２ｍｌ  ＭＲＳ培地に直接植菌し、チューブを振盪させることなく、３７℃で３日間インキュベートした。上清を回収し、上述のように１−プロパノール、２−プロパノール及びアセトン含量について分析した。結果を表１１Ｂに示す。
【０６８２】
【表１２】
2013544083.tif 000013
【０６８３】
別の実験では、株ＳＪ１１０２４、ＳＪ１１０５３及びＳＪ１１０５４を、１０μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含むＭＲＳに植菌し、３７℃で一晩インキュベートした。これらの培養物を、下記の表に示されるようにアセトン及び／又は１，２−プロパンジオールが添加され、１０μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含むＭＲＳ培地を含む２ｍｌエッペンドルフチューブに植菌するために用い、振盪することなく、３７℃で２日間インキュベートした。その後１ｍｌ上清サンプルを本明細書に記載されるように分析し、結果をｎ−プロパノール、イソプロパノール、アセトン、及び１，２−プロパンジオール含量について、それぞれ表１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、及び１１Ｆに示す。
【０６８４】
【表１３】
2013544083.tif 000014
【０６８５】
【表１４】
2013544083.tif 000015
【０６８６】
【表１５】
2013544083.tif 000016
【０６８７】
【表１６】
2013544083.tif 000017
【０６８８】
実施例２１：Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）発現株を用いたイソプロパノール生産
Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）ＳＪ１１０４４を、上述のプロトコールを用いてエレクトロポレーションにより選択された組み換えプラスミドを用いて形質転換した。選択された形質転換された株（及び調製物からのさらなる形質転換体コロニー、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ等として示される）を１０μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含むＭＲＳ培地を含む２ｍｌエッペンドルフチューブに（プレート上のコロニーから）植菌し、振盪させることなく３７℃で一晩インキュベートした。０．５ｍｌの上清サンプルを本明細書に記載のように、アセトン及びイソプロパノール含量について分析した。結果を表１２Ａに示す。コンストラクトは、上述の実施例に示される略記で表される。
【０６８９】
【表１７】
2013544083.tif 000018
【０６９０】
４つの異なるラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）株及び植菌されていない培地対照サンプルを、多数の異なる培地において、２ｍｌの静置培養で３７℃で２日間インキュベートした。その後、サンプルを本明細書に記載のように、アセトン、ｎ−プロパノール及びイソプロパノール含量について分析した。結果を表１２Ｂに示す。コンストラクトは、上述の実施例に示される略記で表される。
【０６９１】
【表１８】
2013544083.tif 000019
【表１９】
2013544083.tif 000020
【０６９２】
実施例２２：サトウキビ汁におけるＬ．ロイテリ（L. reuteri）発現株を用いたイソプロパノール生産
株ＳＪ１１２７８を酵母抽出物（１０ｇ／ｌ）、Ｔｗｅｅｎ８０（１ｇ／ｌ）、ＭｎＳＯ４・Ｈ2Ｏ（５０ｍｇ／ｌ）及びエリスロマイシンを含むサトウキビ汁培地（ＢＲＩＸ＝５）において増殖させた。前記培養物を３７℃で１日間インキュベートした。
【０６９３】
５０ｍＬの上記培養物を、以下の組成：サトウキビ汁（ＢＲＩＸ１０に調整）；Pluronic/Dowfax 63N、１ｍＬ／Ｌ；Bacto酵母抽出物、１０ｇ／Ｌ；Ｔｗｅｅｎ８０、１ｇ／Ｌ；ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、２５ｍｇ／Ｌ；フィチン酸、６５０ｍｇ／Ｌ；エリスロマイシン、４ｍＬのエタノール中５ｍｇ／ｍＬ溶液を含む１９５０ｍＬ培地を含む発酵槽に植菌するために用いた。
【０６９４】
発酵は、窒素（０．１Ｌ／分）が注入され、４００ＲＰＭの速度で撹拌された。温度及びｐＨは、それぞれ３７℃及びｐＨ６．５で一定に保った。
【０６９５】
発酵の３日後、前記イソプロパノール濃度は０．３ｍＬ／Ｌであった。同一の条件下で（エリスロマイシンの添加を除く）増殖させた形質転換していない宿主株を用いた対照実験においては、イソプロパノールは検出することはできなかった。同一時点におけるｎ−プロパノール濃度は、ＳＪ１１２７８及び対照株での発酵について、それぞれ０．０７ｍＬ／Ｌ及び０．０８ｍＬ／Ｌまで測定された。
【０６９６】
発酵の３日後に得られたＳＪ１１２７８培養物を、コンタネーションについて分析し、ＳＪ１１２７８を含む発酵は、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）が混入していたことが分かった。植菌源は、その後再試験され、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）株ＳＪ１１２７８であることが分かった。培養物にコンタネーションがない場合、イソプロパノールの優れた力価が得られることは、想像される。
【０６９７】
実施例２３：ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）におけるｎ−プロパノール耐性
ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）は、後述の条件下でｎ−プロパノールに対する耐性を有することを示した。
【０６９８】
タンク発酵のための種菌源を調製するために、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）株の前培養を上述のように行なった。５０ｍＬのこの培養物を、後述のように調製された１９５０ｍＬの培地を含む発酵槽に植菌するために用いた。
【０６９９】
培地組成：水道水で５の最終ＢＲＩＸに調製された濃縮されたサトウキビ汁（ＢＲＩＸ５３）を、基本成分として用いた。この希釈されたサトウキビ汁に、酵母抽出物（Bacto）を１０ｇ／Ｌの量で添加し、消泡剤（Pluronic/Dowfax 63N）を１ｍＬ／Ｌの量で添加した。この混合物をラボスケール発酵槽（３リットルベッセル）に移し、１２１〜１２３℃で３０分間オートクレーブした。オートクレーブ後、温度を３７℃に調整し、８０ｍＬ（４０ｍｌ／Ｌに相当）のｎ−プロパノールを濾過滅菌によりタンクに添加した。
【０７００】
植菌後、温度を約３７℃に維持し、（例えば、１０％（ｗ／ｗ）ＮＨ4ＯＨの添加により）ｐＨを６．５又はｐＨ３．８のいずれかに維持した。Ｎ2の小流入は、４００ｒｐｍでの撹拌の間、培養物が嫌気的であることを確実にした。細胞増殖を観察するために、ＯＤ650測定を発酵の間中行った。
【０７０１】
ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）は、４％ｎ−プロパノール中ｐＨ６．５及びｐＨ３．８の双方において増殖が可能であった。ｐＨ３．８において、増殖速度は、幾分か遅かったが、発酵の約４０時間後に同一の最大ＯＤに到達した。発酵の１１２時間後に採取された発酵サンプルのガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣＭＳ）に基づく分析は、ｎ−プロパノールの初期量を示し、ｐＨ６．５及びｐＨ３．８は、それぞれ７９．８％及び９３．１％含んだ。これは、本実験に用いられるｎ−プロパノールが、９６％ｎ−プロパノールに加えて、約４％イソプロパノールを最初に含んでいたことを決定した。
【０７０２】
実施例２４：野生型ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）におけるｎ−プロパノール生産
野生型ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）Ｏ４ＺＸＶは、後述の条件下で、ｎ−プロパノールを生産することを示した。
【０７０３】
タンク発酵のための野生型ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）Ｏ４ＺＸＶの前培養を、通気又は振盪することなくＭＲＳ培地中で３７℃において２時間増殖させた。この培養物のサンプルを１９５０ｍＬの以下の培地を含む発酵槽に植菌するために用いた。
【０７０４】
培地組成：水道水で５の最終ＢＲＩＸに調製された濃縮されたサトウキビ汁（ＢＲＩＸ５３）を、基本成分として用いた。この希釈されたサトウキビ汁に、酵母抽出物（Bacto）を１０ｇ／Ｌの量で添加し、消泡剤（Pluronic/Dowfax 63N）を１ｍＬ／Ｌの量で添加した。この混合物をラボスケール発酵槽（３リットルベッセル）に移し、１２１〜１２３℃で３０分間オートクレーブした。
【０７０５】
オートクレーブ後、１０％（ｗ／ｗ）ＮＨ4ＯＨの添加によりｐＨを６．５に維持し、温度を３７℃で維持した。培養物をＮ2（１分あたり０．１リットル）の小流入により嫌気性を維持し、撹拌速度は４００ｒｐｍであった。
【０７０６】
発酵の４８時間後に採取された発酵サンプルのガスクロマトグラフィー−質量分析計（ＧＣＭＳ）に基づく分析は、培養物が約４０μＬ／Ｌ  ｎ−プロパノールを含むことを示した。
【０７０７】
ｐＨが、ｐＨ６．５の代わりにｐＨ３．８において一定に保たれることを除く同一条件下で、上記と同一の株を用いて行われた別の実験では、発酵の４８時間後に採取されたサンプルは、培養物が約４０μＬ／Ｌ  ｎ−プロパノールを含んだことを示した。
【０７０８】
実施例２５：ｎ−プロパノールアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング
Ｐ．フロイデンライシイ（P. freudenreichii）アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｐｄｕＰ  Ｐ  ｓｙｎ２）のクローニング、及びベクターｐＴＲＧＵ３０の構築
Ｐ．フロイデンライシイ（P. freudenreichii）において同定されたアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の１５００ｂｐコーディング配列を、大腸菌における発現のために最適化し、合成的にｐＴＲＧＵ３０に構築した。コドン最適化コーディング配列を含むＤＮＡフラグメントを、開始コドンの直前にリボソーム結合部位（ＲＢＳ、配列５’−ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣ−３’）が含まれるように設計した。
【０７０９】
得られた配列は、Geneart AG（Regenburg, Germany）により置換及び合成され、β−ラクタマーゼをコードする遺伝子ｂｌａＴＥＭ−１を含むｐＭＡバックボーンベクターに導入された。合成された場合、続くクローニングステップを容易にするために、コーディング配列及びＲＢＳフラグメントを制限酵素認識部位と隣接させた。ｐＭＡベクターにクローニングされた合成フラグメント全体は、ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ−ＲＢＳ−ＣＤＳ−ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩであり、ｐＴＲＧＵ３０をもたらす。
【０７１０】
Ｐ．フロイデンライシイ（P. freudenreichii）アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の野生型ヌクレオチド配列（ＷＴ）、コドン最適化ヌクレオチド配列（ＣＯ）、及び推定されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２５、２６、及び２７に示される。前記コーディング配列は、終始コドンを含む１５０３ｂｐであり、コードされ、予測されるタンパク質は、５００個のアミノ酸である。ＳｉｇｎａｌＰプログラム（Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6）を用いて、配列中にシグナルペプチドがないことが予測された。このプログラムに基づいて予測される成熟タンパク質は、５３．７ｋＤａの予測分子量、及び６．３９の等電ｐＨを有する５００個のアミノ酸を含む。
【０７１１】
Ｌ．コリノイデス（Ｌ. collinoides）アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｐｄｕＰ  Ｌｃ）のクローニング及びベクターｐＴＲＧＵ３１の構築
Ｌ．コリノイデス（Ｌ. collinoides）において同定されたアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の１４４３ｂｐコーディング配列を、大腸菌における発現のために最適化し、合成的にｐＴＲＧＵ３１に構築した。コドン最適化コーディング配列を含むＤＮＡフラグメントを、開始コドンの直前にリボソーム結合部位（ＲＢＳ、配列５’−ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣ−３’）が含まれるように設計した。
【０７１２】
得られた配列は、Geneart AG（Regenburg, Germany）により置換及び合成され、β−ラクタマーゼをコードする遺伝子ｂｌａＴＥＭ−１を含むｐＭＡバックボーンベクターに導入された。合成された場合、続くクローニングステップを容易にするために、コーディング配列及びＲＢＳフラグメントを制限酵素認識部位と隣接させた。ｐＭＡベクターにクローニングされた合成フラグメント全体は、ＰａｃＩ−ＮｏｔＩ−ＲＢＳ−ＣＤＳ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＡｓｃＩであり、ｐＴＲＧＵ３１をもたらす。
【０７１３】
Ｌ．コリノイデス（L. collinoides）アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の野生型ヌクレオチド配列（ＷＴ）、コドン最適化ヌクレオチド配列（ＣＯ）、及び推定されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２８、２９、及び３０に示される。前記コーディング配列は、終始コドンを含む１４４６ｂｐであり、コードされ、予測されるタンパク質は、４８１個のアミノ酸である。ＳｉｇｎａｌＰプログラム（Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6）を用いて、配列中にシグナルペプチドがないことが予測された。ベクターＮＴＩ（Invitrogen, Paisley, UK）分析に基づいて予測された成熟タンパク質は、５１．２ｋＤａの予測分子量、及び５．２４の等電ｐＨを有する４８１個のアミノ酸を含む。
【０７１４】
Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｐｄｕＰ  Ｃｂ）のクローニング及びベクターｐＴＲＧＵ８５の構築
Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）において同定されたアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の１４０４ｂｐコーディング配列を、大腸菌における発現のために最適化し、合成的にｐＴＲＧＵ８５に構築した。コドン最適化コーディング配列を含むＤＮＡフラグメントを、開始コドンの直前にリボソーム結合部位（ＲＢＳ、配列５’−ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣ−３’）が含まれるように設計した。
【０７１５】
得られた配列は、Geneart AG（Regenburg, Germany）により置換及び合成され、β−ラクタマーゼをコードする遺伝子ｂｌａＴＥＭ−１を含むｐＭＡバックボーンベクターに導入された。合成された場合、続くクローニングステップを容易にするために、コーディング配列及びＲＢＳフラグメントを制限酵素認識部位と隣接させた。ｐＭＡベクターにクローニングされた合成フラグメント全体は、ＰａｃＩ−ＮｏｔＩ−ＲＢＳ−ＣＤＳ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＡｓｃＩであり、ｐＴＲＧＵ８５をもたらす。
【０７１６】
Ｐ．フロイデンライシイ（P. freudenreichii）アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の野生型ヌクレオチド配列（ＷＴ）、コドン最適化ヌクレオチド配列（ＣＯ）、及び推定されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３１、３２、及び３３に示される。前記コーディング配列は、終始コドンを含む１４０７ｂｐであり、コードされ、予測されるタンパク質は、４６８個のアミノ酸である。ＳｉｇｎａｌＰプログラム（Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6）を用いて、配列中にシグナルペプチドがないことが予測された。ベクターＮＴＩ（Invitrogen, Paisley, UK）分析に基づいて予測された成熟タンパク質は、５１．３ｋＤａの予測分子量、及び５．８８の等電ｐＨを有する４６８個のアミノ酸を含む。
【０７１７】
Ｐ．フロイデンライシイ（P. freudenreichii）アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｐｄｕＰ＿Ｐｆ＿ｓｙｎ２ａ）のクローニング及びベクターｐＴＲＧＵ３００の構築
二つの潜在的な開始コドンがｐｄｕＰ＿Ｐｆ＿ｓｙｎ２中に見られ、一つはｐｄｕＰ＿Ｐｆ＿ｓｙｎ２ヌクレオチド配列の末端に適用され、二つ目は及び最初の開始コドンの９３ｂｐ下流に位置する。二つ目の開始コドンの適用は、Ｐ．フロイデンライシイ（P. freudenreichii）において同定されたアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の１４０７ｂｐコーディング配列を、生じる。この配列は、最初の９３ｂｐを除いて上記で適用される配列と同一であり、大腸菌における発現のために最適化された。前記配列を、合成的にｐＴＲＧＵ３００に構築した。コドン最適化コーディング配列を含むＤＮＡフラグメントを、開始コドンの直前にリボソーム結合部位（ＲＢＳ、配列５’−ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣ−３’）が含まれるように設計した。
【０７１８】
得られた配列は、Geneart AG（Regenburg, Germany）により置換及び合成され、β−ラクタマーゼをコードする遺伝子ｂｌａＴＥＭ−１を含むｐＭＡバックボーンベクターに導入された。合成された場合、続くクローニングステップを容易にするために、コーディング配列及びＲＢＳフラグメントを制限酵素認識部位と隣接させた。ｐＭＡベクターにクローニングされた合成フラグメント全体は、ＰａｃＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ−ＲＢＳ−ＣＤＳ−ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＡｓｃＩであり、ｐＴＲＧＵ３００をもたらす。
【０７１９】
Ｐ．フロイデンライシイ（P. freudenreichii）アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の野生型ヌクレオチド配列（ＷＴ）、コドン最適化ヌクレオチド配列（ＣＯ）、及び推定されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４８、４９、及び５１に示される。前記コーディング配列は、終始コドンを含む１４１０ｂｐであり、コードされ、予測されるタンパク質は、４６９個のアミノ酸である。ＳｉｇｎａｌＰプログラム（Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6）を用いて、配列中にシグナルペプチドがないことが予測された。ベクターＮＴＩ（Invitrogen, Paisley, UK）分析に基づいて予測された成熟タンパク質は、５０．１ｋＤａの予測分子量、及び５．６９の等電ｐＨを有する４６９個のアミノ酸を含む。
【０７２０】
Ｐ．フロイデンライシイ（P. freudenreichii）アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｐｄｕＰ＿Ｐｆ＿ｓｙｎ２ｂ）のクローニング及びベクターｐＴＲＧＵ３９９の構築
上述のｐｄｕＰ＿Ｐｆ＿ｓｙｎ２ａのクローニングは、前記遺伝子がインビボ転写効率を低くすることができる二次構造を潜在的に有することを示した。それ故、Ｐ．フロイデンライシイ（P. freudenreichii）において同定された同一のアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の１４０７ｂｐコーディング配列を、タンパク質のアミノ酸配列を維持しつつＤＮＡ配列を改変するために、大腸菌における発現のために再最適化した。再最適化配列は、合成的にｐＴＲＧＵ３９９に構築された。コドン最適化コーディング配列を含むＤＮＡフラグメントは、開始コドンの直前にリボソーム結合部位（ＲＢＳ、配列５’−ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣ−３’）を伴って設計された。
【０７２１】
得られた配列は、Geneart AG（Regenburg, Germany）により置換及び合成され、β−ラクタマーゼをコードする遺伝子ｂｌａＴＥＭ−１を含むｐＭＡバックボーンベクターに導入された。合成された場合、続くクローニングステップを容易にするために、コーディング配列及びＲＢＳフラグメントを制限酵素認識部位と隣接させた。ｐＭＡベクターにクローニングされた合成フラグメント全体は、ＰａｃＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ−ＲＢＳ−ＣＤＳ−ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＡｓｃＩであり、ｐＴＲＧＵ３９９をもたらす。
【０７２２】
Ｐ．フロイデンライシイ（P. freudenreichii）アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子のこの第二のコドン最適化ヌクレオチド配列（ＣＯ）は、配列番号５０として示される。前記コーディング配列は、終始コドンを含む１４１０ｂｐであり、コードされ、予測されるタンパク質は、上記の配列（配列番号５１）と同一である。
【０７２３】
Ｒ．パルストリス（R. palustris）アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｐｄｕＰ  Ｒｐ）のクローニング及びベクターｐＴＲＧＵ３４４の構築
Ｒ．パルストリス（R. palustris）において同定されたアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の１３９２ｂｐコーディング配列を、大腸菌における発現のために最適化し、合成的にｐＴＲＧＵ３４４に構築した。コドン最適化コーディング配列を含むＤＮＡフラグメントを、開始コドンの直前にリボソーム結合部位（ＲＢＳ、配列５’−ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣ−３’）が含まれるように設計した。
【０７２４】
得られた配列は、Geneart AG（Regenburg, Germany）により置換及び合成され、β−ラクタマーゼをコードする遺伝子ｂｌａＴＥＭ−１を含むｐＭＡバックボーンベクターに導入した。合成された場合、続くクローニングステップを容易にするために、コーディング配列及びＲＢＳフラグメントを制限酵素認識部位と隣接させた。ｐＭＡベクターにクローニングされた合成フラグメント全体は、ＥｃｏＲＩ−ＰａｃＩ−ＲＢＳ−ＣＤＳ−ＳｂｆＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩであり、ｐＴＲＧＵ８５をもたらす。
【０７２５】
Ｒ．パルストリス（R. palustris）アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の野生型ヌクレオチド配列（ＷＴ）、コドン最適化ヌクレオチド配列（ＣＯ）、及び推定されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５２、５３、及び５４に示される。前記コーディング配列は、終始コドンを含む１３９５ｂｐであり、コードされ、予測されるタンパク質は、４６４個のアミノ酸である。ＳｉｇｎａｌＰプログラム（Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6）を用いて、配列中にシグナルペプチドがないことが予測された。ベクターＮＴＩ（Invitrogen, Paisley, UK）分析に基づいて予測された成熟タンパク質は、４９．３ｋＤａの予測分子量、及び５．９８の等電ｐＨを有する４６４個のアミノ酸を含む。
【０７２６】
Ｒ．カプスラータ（R. capsulatus）アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｐｄｕＰ  Ｒｃ）のクローニング及びベクターｐＴＲＧＵ３４６の構築
Ｒ．カプスラータ（R. capsulatus）において同定されたアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の１５９９ｂｐコーディング配列を、大腸菌における発現のために最適化し、合成的にｐＴＲＧＵ３４６に構築した。コドン最適化コーディング配列を含むＤＮＡフラグメントを、開始コドンの直前にリボソーム結合部位（ＲＢＳ、配列５’−ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣ−３’）が含まれるように設計した。
【０７２７】
得られた配列は、Geneart AG（Regenburg, Germany）により置換及び合成され、β−ラクタマーゼをコードする遺伝子ｂｌａＴＥＭ−１を含むｐＭＡバックボーンベクターに導入された。合成された場合、続くクローニングステップを容易にするために、コーディング配列及びＲＢＳフラグメントを制限酵素認識部位と隣接させた。ｐＭＡベクターにクローニングされた合成フラグメント全体は、ＥｃｏＲＩ−ＰａｃＩ−ＲＢＳ−ＣＤＳ−ＳｂｆＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩであり、ｐＴＲＧＵ３４６をもたらす。
【０７２８】
Ｒ．カプスラータ（R. capsulatus）アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の野生型ヌクレオチド配列（ＷＴ）、コドン最適化ヌクレオチド配列（ＣＯ）、及び推定されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５５、５６、及び５７に示される。前記コーディング配列は、終始コドンを含む１６０２ｂｐであり、コードされ、予測されるタンパク質は、５３３個のアミノ酸である。ＳｉｇｎａｌＰプログラム（Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6）を用いて、配列中にシグナルペプチドがないことが予測された。ベクターＮＴＩ（Invitrogen, Paisley, UK）分析に基づいて予測された成熟タンパク質は、５５．９ｋＤａの予測分子量、及び６．３２の等電ｐＨを有する５３３個のアミノ酸を含む。
【０７２９】
Ｒ．ルブラム（R. rubrum）アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｐｄｕＰ  Ｒｒ）のクローニング及びベクターｐＴＲＧＵ３４８の構築
Ｒ．ルブラム（R. rubrum）において同定されたアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の１５９０ｂｐコーディング配列を、大腸菌における発現のために最適化し、合成的にｐＴＲＧＵ３４８に構築した。コドン最適化コーディング配列を含むＤＮＡフラグメントを、開始コドンの直前にリボソーム結合部位（ＲＢＳ、配列５’−ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣ−３’）が含まれるように設計した。
【０７３０】
得られた配列は、Geneart AG（Regenburg, Germany）により置換及び合成され、β−ラクタマーゼをコードする遺伝子ｂｌａＴＥＭ−１を含むｐＭＡバックボーンベクターに導入された。合成された場合、続くクローニングステップを容易にするために、コーディング配列及びＲＢＳフラグメントを制限酵素認識部位と隣接させた。ｐＭＡベクターにクローニングされた合成フラグメント全体は、ＥｃｏＲＩ−ＰａｃＩ−ＲＢＳ−ＣＤＳ−ＳｂｆＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩであり、ｐＴＲＧＵ３４８をもたらす。
【０７３１】
Ｒ．ルブラム（R. rubrum）アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の野生型ヌクレオチド配列（ＷＴ）、コドン最適化ヌクレオチド配列（ＣＯ）、及び推定されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５８、５９、及び６０に示される。前記コーディング配列は、終始コドンを含む１５９３ｂｐであり、コードされ、予測されるタンパク質は、５３０個のアミノ酸である。ＳｉｇｎａｌＰプログラム（Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6）を用いて、配列中にシグナルペプチドがないことが予測された。ベクターＮＴＩ（Invitrogen, Paisley, UK）分析に基づいて予測された成熟タンパク質は、５２．３ｋＤａの予測分子量、及び６．０６の等電ｐＨを有する４９８個のアミノ酸を含む。
【０７３２】
Ｅ．ハリイ（E. hallii）アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｐｄｕＰ  Ｅｈ）のクローニング及びベクターｐＴＲＧＵ３６１の構築
Ｅ．ハリイ（E. hallii）において同定されたアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の１４０４ｂｐコーディング配列を、大腸菌における発現のために最適化し、合成的にｐＴＲＧＵ３６０に構築した。コドン最適化コーディング配列を含むＤＮＡフラグメントを、開始コドンの直前にリボソーム結合部位（ＲＢＳ、配列５’−ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣ−３’）が含まれるように設計した。
【０７３３】
得られた配列は、Geneart AG（Regenburg, Germany）により置換及び合成され、β−ラクタマーゼをコードする遺伝子ｂｌａＴＥＭ−１を含むｐＭＡバックボーンベクターに導入された。合成された場合、続くクローニングステップを容易にするために、コーディング配列及びＲＢＳフラグメントを制限酵素認識部位と隣接させた。ｐＭＡベクターにクローニングされた合成フラグメント全体は、ＥｃｏＲＩ−ＰａｃＩ−ＲＢＳ−ＣＤＳ−ＳｂｆＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩであり、ｐＴＲＧＵ３４６をもたらす。
【０７３４】
Ｅ．ハリイ（E. hallii）アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の野生型ヌクレオチド配列（ＷＴ）、コドン最適化ヌクレオチド配列（ＣＯ）、及び推定されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号６１、６２、及び６３に示される。前記コーディング配列は、終始コドンを含む１４０７ｂｐであり、コードされ、予測されるタンパク質は、４６８個のアミノ酸である。ＳｉｇｎａｌＰプログラム（Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6）を用いて、配列中にシグナルペプチドがないことが予測された。ベクターＮＴＩ（Invitrogen, Paisley, UK）分析に基づいて予測された成熟タンパク質は、５０．９ｋＤａの予測分子量、及び５．７９の等電ｐＨを有する５３３個のアミノ酸を含む。
【０７３５】
実施例２６：ｎ−プロパノール生産のためのアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む経路コンストラクトの構築及び形質転換
Ｐ．フロイデンライシイ（P. freudenreichii）アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｐｄｕＰ  Ｐｆ  ｓｙｎ２）を発現するｐＴＲＧＵ４４の構築及び形質転換
アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む１５３６ｂｐフラグメントを、下記に示すプライマーＰ００１７及びＰ００２１を用いてｐＴＲＧＵ３０（実施例１５）から増幅した。
【０７３６】
プライマーｐ００１７：
５’−ＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＣＧＴ−３’（配列番号９６）
プライマーｐ００２１：
５’−ＴＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＧＣＧＧＡＴＡＴＴＣＡＧＧＣＣＡＣ−３’（配列番号９７）
【０７３７】
ＰＣＲ反応のために、Phusion（登録商標）Hot Start ＤＮＡポリメラーゼ（Finnzymes, Finland）を用い、増幅反応を、９５℃で２分；９５℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で１分を２９サイクル；その後７２℃で５分を１サイクルでプログラムした。得られたＰＣＲ産物を製造者の使用説明書に従って、ＰＣＲ精製キット（Qiagen）を用いて精製した。続いて、ＰＣＲ産物及びｐＴｒｃ９９Ａ（E. Amann and J. Brosius, 1985, Gene 40(2-3), 183-190）の双方を、ＸｂａＩ（New England Biolabs (NEB), Ipswich, MA, USA）及びＨｉｎｄＩＩＩ（NEB）（制限酵素認識部位は、上記のプライマー中の下線である）で３７℃で一晩消化した。前記酵素を６５℃で２０分間加熱不活性化し、ｐＴｒｃ９９Ａ反応混合物を３７℃で３０分間１Ｕ仔牛腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）（NEB）を用いて脱リン酸化した。消化されたｐＴｒｃ９９Ａ及びＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで泳動し、その後製造者の使用説明書に従ってQIAquickゲル抽出キットを（Qiagen, Hilden, Germany）用いて精製した。
【０７３８】
消化されたＰＣＲ産物を、１０ｍＭ  ＡＴＰ（F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel Switzerlland）を含むＴ４  ＤＮＡリガーゼバッファ中Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、１６℃で一晩ｐＴｒｃ９９Ａの４１５２ｂｐフラグメントとライゲートした。ライゲーション混合物の１μＬの量でエレクトロポレーションにより大腸菌ＴＯＰ１０を形質転換した。形質転換体を２００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢプレート上にプレートし、３７℃で一晩インキュベートした。選択されたコロニーを、その後２００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢプレート上に縞状に播種した。一つのコロニーである大腸菌ＴＲＧＵ４４を、２００μｇ／ｍＬアンピシリンを含む液体ＴＹブイヨン培地に植菌し、３７℃で一晩インキュベートした。対応するプラスミドｐＴＲＧＵ４４をQiaprep（登録商標）スピンミニプレップキット（Qiagen）を用いて単離し、にＤＮＡ配列決定に供し、アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子がベクターに統合されていることを確認した。ｐＴＲＧＵ４４を含む一晩の液体培養液からの大腸菌ＴＲＧＵ４４を、−８０℃で３０％グリセロールに保存した。
【０７３９】
Ｌ．コリノイデス（L. collinoides）アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｐｄｕＰ  Ｌｃ）を発現するｐＴＲＧＵ４２の構築及び形質転換
アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む１４７９ｂｐフラグメントを、下記に示すプライマーＰ００１３及びＰ００１９を用いてｐＴＲＧＵ３１から増幅した。
【０７４０】
プライマーｐ００１３：
５’−ＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＧＣＣ−３’（配列番号９８）
プライマーｐ００１９：
５’−ＴＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＧＡＣＣＴＣＣＣＡＧＧＡＡＣＧＣＡ−３’（配列番号９９）
【０７４１】
ＰＣＲ反応のために、Phusion（登録商標）Hot Start ＤＮＡポリメラーゼ（Finnzymes, Finland）を用い、増幅反応を、９５℃で２分；９５℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で１分を２９サイクル；その後７２℃で５分を１サイクルでプログラムした。得られたＰＣＲ産物を、製造者の使用説明書に従ってＰＣＲ精製キット（Qiagen）を用いて精製した。続いて、ＰＣＲ産物及びｐＴｒｃ９９Ａ（E. Amann and J. Brosius, 1985, Gene 40(2-3), 183-190）の双方を、ＸｂａＩ（New England Biolabs (NEB), Ipswich, MA, USA）及びＨｉｎｄＩＩＩ(NEB）（制限酵素認識部位は、上記のプライマー中の下線である）で３７℃で一晩消化した。前記酵素を６５℃で２０分間加熱不活性化し、ｐＴｒｃ９９Ａ反応混合物を３７℃で３０分間１Ｕ仔牛腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）（NEB）を用いて脱リン酸化した。消化されたｐＴｒｃ９９Ａ及びＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで泳動し、その後製造者の使用説明書に従ってQIAquickゲル抽出キットを（Qiagen, Hilden, Germany）用いて精製した。
【０７４２】
消化されたＰＣＲ産物を、１０ｍＭ  ＡＴＰ（F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel Switzerlland）を含むＴ４  ＤＮＡリガーゼバッファ中Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、１６℃で一晩ｐＴｒｃ９９Ａの４１５２ｂｐフラグメントとライゲートした。ライゲーション混合物の１μＬの量でエレクトロポレーションにより大腸菌ＴＯＰ１０を形質転換した。形質転換体を２００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢプレート上にプレートし、３７℃で一晩インキュベートした。選択されたコロニーを、その後２００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢプレート上に縞状に播種した。一つのコロニーである大腸菌ＴＲＧＵ４２を、２００μｇ／ｍＬアンピシリンを含む液体ＴＹブイヨン培地に植菌し、３７℃で一晩インキュベートした。対応するプラスミドｐＴＲＧＵ４２をQiaprep（登録商標）スピンミニプレップキット(Qiagen）を用いて単離し、ＤＮＡ配列決定に供し、アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子がベクターに統合されていることを確認した。ｐＴＲＧＵ４２を含む一晩の液体培養液からの大腸菌ＴＲＧＵ４２を、−８０℃で３０％グリセロールに保存した。
【０７４３】
Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｐｄｕＰ  Ｃｂ）を発現するｐＴＲＧＵ９１の構築及び形質転換
アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む１４４０ｂｐフラグメントを、下記に示すプライマーＰ００１５及びＰ００２０を用いてｐＴＲＧＵ８５から増幅した。
【０７４４】
プライマーｐ００１５：
５’−ＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＡＴ−３’（配列番号１００）
プライマーｐ００２０：
５’−ＴＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＧＣＣＣＧＣＣＡＧＣＡＣＧＣＡＡＣ−３’（配列番号１０１）
【０７４５】
ＰＣＲ反応のために、Phusion（登録商標）Hot Start ＤＮＡポリメラーゼ（Finnzymes, Finland）を用い、増幅反応を、９５℃で２分；９５℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で１分を２９サイクル；その後７２℃で５分を１サイクルでプログラムした。得られたＰＣＲ産物を製造者の使用説明書に従って、ＰＣＲ精製キット（Qiagen）を用いて精製した。続いて、ＰＣＲ産物及びｐＴｒｃ９９Ａ（E. Amann and J. Brosius, 1985, Gene 40(2-3), 183-190）の双方を、ＸｂａＩ（New England Biolabs (NEB), Ipswich, MA, USA）及びＨｉｎｄＩＩＩ（NEB）（制限酵素認識部位は、上記のプライマー中の下線である）で３７℃で一晩消化した。前記酵素を６５℃で２０分間加熱不活性化し、ｐＴｒｃ９９Ａ反応混合物を３７℃で３０分間１Ｕ仔牛腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）（NEB）を用いて脱リン酸化した。消化されたｐＴｒｃ９９Ａ及びＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで泳動し、その後製造者の使用説明書に従ってQIAquickゲル抽出キットを（Qiagen, Hilden, Germany）用いて精製した。
【０７４６】
消化されたＰＣＲ産物を、１０ｍＭ  ＡＴＰ（F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel Switzerlland）を含むＴ４  ＤＮＡリガーゼバッファ中Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、１６℃で一晩ｐＴｒｃ９９Ａの４１５２ｂｐフラグメントとライゲートした。ライゲーション混合物の１μＬの量でエレクトロポレーションにより大腸菌ＴＯＰ１０を形質転換した。形質転換体を２００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢプレート上にプレートし、３７℃で一晩インキュベートした。選択されたコロニーを、その後２００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢプレート上に縞状に播種した。一つのコロニーである大腸菌ＴＲＧＵ９１を、２００μｇ／ｍＬアンピシリンを含む液体ＴＹブイヨン培地に植菌し、３７℃で一晩インキュベートした。対応するプラスミドｐＴＲＧＵ９１をQiaprep（登録商標）スピンミニプレップキット（Qiagen）を用いて単離し、ＤＮＡ配列決定に供し、アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子がベクターに統合されていることを確認した。ｐＴＲＧＵ９１を含む一晩の液体培養液からの大腸菌ＴＲＧＵ９１を、−８０℃で３０％グリセロールに保存した。
【０７４７】
Ｐ．フロイデンライシイ（P. freudenreichii）アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｐｄｕＰ  Ｐｆ  ｓｙｎ２ａ）を発現するｐＴＲＧＵ５３１の構築及び形質転換
遺伝子ｐｄｕＰ＿Ｐｆ＿ｓｙｎ２ａをｐＴＲＧＵ３００中の隣接部位ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩを用いてベクターｐＴＲＧＵ８８にクローニングした。ｐＴＲＧＵ８８及びｐＴＲＧＵ３００の双方を、２０ｕｌベクター、５μｌ  NEB  ２バッファ、２μｌ  ＸｂａＩ、２μｌ  ＢａｍＨＩ、０．５μｌ  ＢＳＡ及び２０μｌ  Ｈ2Ｏを用いて消化した。ｐＴＲＧＵ８８及びｐＴＲＧＵ３００の双方を、３７℃で一晩消化した。前記酵素を６５℃で２０分間加熱不活性化し、ｐＴＲＧＵ８８反応混合物を３７℃で３０分間１Ｕ仔牛腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）（NEB）を用いて脱リン酸化した。消化されたｐＴＲＧＵ８８及びｐＴＲＧＵ３００を１％アガロースゲルで泳動し、予測されるサイズ（ｐＴＲＧＵ８８：４５１８ｂｐ；ｐＴＲＧＵ３００：１４３０ｂｐ）のバンドを、その後、製造者の使用説明書に従ってQIAquickゲル抽出キットを（Qiagen, Hilden, Germany）用いて精製した。
【０７４８】
単離されたＤＮＡフラグメントを、１０ｍＭ  ＡＴＰ（F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel Switzerlland）を含むＴ４  ＤＮＡリガーゼバッファ中Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、１６℃で一晩ライゲートした。１μＬの量のライゲーション混合物でエレクトロポレーションにより大腸菌ＴＯＰ１０を形質転換した。形質転換体を２０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢプレート上にプレートし、３７℃で一晩インキュベートした。選択されたコロニーを、その後２０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢプレート上に縞状に播種した。一つのコロニーである大腸菌ＴＲＧＵ３０４を、１０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む液体ＴＹブイヨン培地に植菌し、３７℃で一晩インキュベートした。対応するプラスミドｐＴＲＧＵ３０４をQiaprep（登録商標）スピンミニプレップキット(Qiagen）を用いて単離し、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩを含む制限酵素分析に供し、ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ：１４３０ｂｐ及びＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ：４５１８ｂｐのバンドを得て、ｐＴＲＧＵ８８中の前記遺伝子の正確な挿入を確認した。ｐＴＲＧＵ３０４を含む一晩の液体培養液からの大腸菌ＴＲＧＵ３０４を、−８０℃で３０％グリセロールに保存した。
【０７４９】
プラスミドｐＴＲＧＵ３０４で標準的なエレクトロポレーション技術を用いて大腸菌ＭＧ１６５５を形質転換した。形質転換体を２０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢプレート上にプレートし、３７℃で一晩インキュベートした。一つのコロニーである大腸菌ＴＲＧＵ５３１を、１０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む液体ＴＹブイヨン培地に植菌し、３７℃で一晩インキュベートした。対応するプラスミドｐＴＲＧＵ５３１をQiaprep（登録商標）スピンミニプレップキット（Qiagen）を用いて単離し、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩを用いた制限酵素分析に供し、ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ：１４３０ｂｐ及びＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ：４５１８ｂｐのバンドを得て、ｐＴＲＧＵ８８中の前記遺伝子の正確な挿入を確認した。ｐＴＲＧＵ３０４を含む一晩の液体培養液からの大腸菌ＴＲＧＵ３０４を、−８０℃で３０％グリセロールに保存した。
【０７５０】
Ｐ．フロイデンライシイ（P. freudenreichii）アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｐｄｕＰ  Ｐｆ  ｓｙｎ２ｂ）を発現するｐＴＲＧＵ５５１の構築及び形質転換
遺伝子ｐｄｕＰ＿Ｐｆ＿ｓｙｎ２ｂをｐＴＲＧＵ３９９中の隣接部位ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩを用いてベクターｐＴＲＧＵ８８にクローニングした。ｐＴＲＧＵ８８及びｐＴＲＧＵ３９９の双方を、２０ｕｌベクター、５μｌ  NEB  ２バッファ、２μｌ  ＸｂａＩ、２μｌ  ＥｃｏＲＩ、０．５μｌ  ＢＳＡ及び２０μｌ  Ｈ2Ｏを用いて消化した。ｐＴＲＧＵ８８及びｐＴＲＧＵ３９９の双方を、３７℃で一晩消化した。前記酵素を６５℃で２０分間加熱不活性化し、ｐＴＲＧＵ８８反応混合物を３７℃で３０分間１Ｕ仔牛腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）（NEB）を用いて脱リン酸化した。消化されたｐＴＲＧＵ８８及びｐＴＲＧＵ３９９を１％アガロースゲルで泳動し、予測されるサイズ（ｐＴＲＧＵ８８：４４９７ｂｐ；ｐＴＲＧＵ３９９：１４５２ｂｐ）のバンドを、その後、製造者の使用説明書に従ってQIAquickゲル抽出キットを（Qiagen, Hilden, Germany）用いて精製した。
【０７５１】
単離されたＤＮＡフラグメントを、１０ｍＭ  ＡＴＰ（F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel Switzerlland）を含むＴ４  ＤＮＡリガーゼバッファ中Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、１６℃で一晩ライゲートした。１μＬの量のライゲーション混合物でエレクトロポレーションにより大腸菌ＴＯＰ１０を形質転換した。形質転換体を２０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢプレート上にプレートし、３７℃で一晩インキュベートした。その後選択されたコロニーを、２０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢプレート上に縞状に播種した。一つのコロニーである大腸菌ＴＲＧＵ５４１を、２０μｇ／ｍＬアンピシリンを含む液体ＴＹブイヨン培地に植菌し、３７℃で一晩インキュベートした。対応するプラスミドｐＴＲＧＵ５４１をQiaprep（登録商標）スピンミニプレップキット（Qiagen）を用いて単離し、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩを含む制限酵素分析に供し、ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ：１４５２ｂｐ及びＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ：４４９７ｂｐのバンドを得て、ｐＴＲＧＵ８８中の前記遺伝子の正確な挿入を確認した。ｐＴＲＧＵ５４１を含む一晩の液体培養液からの大腸菌ＴＲＧＵ５４１を、−８０℃で３０％グリセロールに保存した。
【０７５２】
プラスミドｐＴＲＧＵ５４１で標準的なエレクトロポレーション技術を用いて大腸菌ＭＧ１６５５を形質転換した。形質転換体を２０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢプレート上にプレートし、３７℃で一晩インキュベートした。一つのコロニーである大腸菌ＴＲＧＵ５５１を、１０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む液体ＴＹブイヨン培地に植菌し、３７℃で一晩インキュベートした。対応するプラスミドｐＴＲＧＵ５５１をQiaprep（登録商標）スピンミニプレップキット（Qiagen）を用いて単離し、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩを用いた制限酵素分析に供し、ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ：１４５２ｂｐ及びＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ：４４９７ｂｐのバンドを得て、ｐＴＲＧＵ８８中の前記遺伝子の正確な挿入を確認した。ｐＴＲＧＵ５５１を含む一晩の液体培養液からの大腸菌ＴＲＧＵ５５１を、−８０℃で３０％グリセロールに保存した。
【０７５３】
Ｒ．パルストリス（R. palustris）アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｐｄｕＰ  Ｒｐ）を発現するｐＴＲＧＵ５４３の構築及び形質転換
遺伝子ｐｄｕＰ＿Ｒｐを、本質的には上述のようにｐＴＲＧＵ８８にクローニングした。前記遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントをベクターｐＴＲＧＵ３４４から切り出し、１４３７ｂｐＤＮＡバンドを単離することによりアガロースゲルから精製した。大腸菌ＴＯＰ１０をｐＴＲＧＵ８８及びｐｄｕＰ＿Ｒｐのライゲーション混合物で首尾よく形質転換し、一つのコロニーであるＴＲＧＵ５３３は、ｐＴＲＧＵ８８に正確に挿入された遺伝子を含んだ。対応するプラスミドであるｐＴＲＧＵ５３３を単離し、大腸菌ＭＧ１６５５を形質転換した。一つの形質転換体であるＴＲＧＵ５４３は、制限酵素分析により確認されるように正確なプラスミドを含み、−８０℃で３０％グリセロールに保存した。
【０７５４】
Ｒ．カプスラータ（R.capsulatus）アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｐｄｕＰ  Ｒｃ）を発現するｐＴＲＧＵ５４５の構築及び形質転換
遺伝子ｐｄｕＰ＿Ｒｃを、本質的には上述のようにｐＴＲＧＵ８８にクローニングした。前記遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントをベクターｐＴＲＧＵ３４６から切り出し、１６４４ｂｐＤＮＡバンドを単離することによりアガロースゲルから精製した。大腸菌ＴＯＰ１０をｐＴＲＧＵ８８及びｐｄｕＰ＿Ｒｃのライゲーション混合物で首尾よく形質転換し、一つのコロニーであるＴＲＧＵ５３５は、ｐＴＲＧＵ８８に正確に挿入された遺伝子を含んだ。対応するプラスミドであるｐＴＲＧＵ５３５を単離し、大腸菌ＭＧ１６５５を形質転換した。一つの形質転換体であるＴＲＧＵ５４５は、制限酵素分析により確認されるように正確なプラスミドを含み、−８０℃で３０％グリセロールに保存した。
【０７５５】
Ｒ．ラブラム（R. rubrum）アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｐｄｕＰ  Ｒｒ）を発現するｐＴＲＧＵ５４７の構築及び形質転換
遺伝子ｐｄｕＰ＿Ｒｒを、本質的には上述のようにｐＴＲＧＵ８８にクローニングした。前記遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントをベクターｐＴＲＧＵ３４８から切り出し、１６３５ｂｐＤＮＡバンドを単離することによりアガロースゲルから精製した。大腸菌ＴＯＰ１０をｐＴＲＧＵ８８及びｐｄｕＰ＿Ｒｒのライゲーション混合物で首尾よく形質転換し、一つのコロニーであるＴＲＧＵ５３７は、ｐＴＲＧＵ８８に正確に挿入された遺伝子を含んだ。対応するプラスミドであるｐＴＲＧＵ５３７を単離し、大腸菌ＭＧ１６５５を形質転換した。一つの形質転換体であるＴＲＧＵ５４７は、制限酵素分析により確かめられるように正確なプラスミドを含み、−８０℃で３０％グリセロールに保存した。
【０７５６】
Ｅ．ハリイ（E. hallii）アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｐｄｕＰ  Ｅｈ）を発現するｐＴＲＧＵ５４９の構築及び形質転換
遺伝子ｐｄｕＰ＿Ｅｈを、本質的には上述のようにｐＴＲＧＵ８８にクローニングした。前記遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントをベクターｐＴＲＧＵ３６１から切り出し、１４４９ｂｐＤＮＡバンドを単離することによりアガロースゲルから精製した。大腸菌ＴＯＰ１０をｐＴＲＧＵ８８及びｐｄｕＰ＿Ｅｈのライゲーション混合物で首尾よく形質転換し、一つのコロニーであるＴＲＧＵ５３９は、ｐＴＲＧＵ８８に正確に挿入された遺伝子を含んだ。対応するプラスミドであるｐＴＲＧＵ５３９を単離し、大腸菌ＭＧ１６５５を形質転換した。一つの形質転換体であるＴＲＧＵ５４９は、制限酵素分析により確かめられるように正確なプラスミドを含み、−８０℃で３０％グリセロールに保存した。
【０７５７】
実施例２７：異種のアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む組み換え大腸菌ＴＯＰ１０におけるｎ−プロパノールの生産
大腸菌株Ｔｒｃ９９Ａ（陰性対照）及びＴＲＧＵ４４、ＴＲＧＵ４２、及びＴＲＧＵ９１を、１００μｇ／ｍＬアンピシリン及び１ｍＭイソプロピル−ベータ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含む１０ｍＬ  ＬＢ培地中で、振盪（２５０ｒｐｍ）させながら一晩培養した。各株の０．５ｍＬサンプルを一晩のインキュベーション後採取した。各サンプルを卓上遠心分離装置を用いて１５０００ｘｇで１分間遠心分離し、上清を廃棄した。大腸菌Ｔｒｃ９９Ａ及び大腸菌ＴＲＧＵ４４、ＴＲＧＵ４２、及びＴＲＧＵ９１の細胞を、ロイシン（１ｍＭ）が添加された０．５ｍＬ最小培地（ＭＭ）に再懸濁し、これを各サンプルについて一つの新しい１０ｍＬ培養に植菌するために用いた。培養物を振盪（２５０ｒｐｍ）させながら３７℃で７２時間培養した。インキュベーション終了時に２ｍＬサンプルを採取し、続いて本明細書に記載されるようにアセトン、ｎ−プロパノール及びイソプロパノールについて標準を用いてガスクロマトグラフィーにより分析した。
【０７５８】
表１３に示すように、ｎ−プロパノールは、大腸菌ＴＲＧＵ４４により有意な量において生産されたが、Ｔｒｃ９９Ａ（陰性対照）、ＴＲＧＵ４２、及びＴＲＧＵ９１により生産されなかった。
【０７５９】
【表２０】
2013544083.tif 000021
【０７６０】
実施例２８：異種のアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む組み換え大腸菌ＭＧ１６５５におけるｎ−プロパノールの生産
大腸菌株ＴＲＧＵ２６９（陰性対照）、ＴＲＧＵ５３１、ＴＲＧＵ５５１、ＴＲＧＵ５４３、ＴＲＧＵ５４５、ＴＲＧＵ５４７、ＴＲＧＵ５４９を、１００μｇ／ｍＬアンピシリン及び１ｍＭイソプロピル−ベータ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含む１０ｍＬ  ＬＢ培地中で、振盪（２５０ｒｐｍ）させながら一晩培養した。ＯＤを測定し、２ｍｌのＯＤ（６００ｎｍ）＝１に相当する容量を、一晩のインキュベーション後採取した（全て１．３９ｍｌ〜２．９５ｍｌ）。各サンプルを卓上遠心分離装置を用いて５０００ｘｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。ＴＲＧＵ２６９（陰性対照）、ＴＲＧＵ５３１、ＴＲＧＵ５５１、ＴＲＧＵ５４３、ＴＲＧＵ５４５、ＴＲＧＵ５４７、ＴＲＧＵ５４９の細胞を、１μＭアデノシルコバラミン（ビタミンＢ１２）を添加した０．５ｍＬ最小培地（ＭＭ）に再懸濁し、これを各サンプルについて一つの新しい１０ｍＬ培養物に植菌するために用いた。培養物を振盪（２５０ｒｐｍ）させながら３７℃で１１６時間インキュベートした。インキュベーションの２０時間、４４時間、及び１１６時間後に２ｍＬサンプルを採取し、続いてｎ−プロパノール及びプロピオンアルデヒドについて標準を用いてガスクロマトグラフィーにより分析した。発酵培地中のアセトン、１−プロパノール及びイソプロパノールをＧＣ−ＦＩＤにより検出した。サンプルをメタノール中０．０５％テトラヒドロフランで１＋１に希釈し、上述のように分析した。
【０７６１】
表１４に示すように、ｎ−プロパノールは、大腸菌ＴＲＧＵ５５１、ＴＲＧＵ５４３、ＴＲＧＵ５４５、ＴＲＧＵ５４７、及びＴＲＧＵ５４９により、有意な量において生産されたが、ＴＲＧＵ２６９（陰性対照）や大腸菌ＴＲＧＵ５３１によっては生産されなかった。ｐｄｕＰ＿Ｐｆ＿ｓｙｎ２ａ及びｐｄｕＰ＿Ｐｆ＿ｓｙｎ２ｂは、同一の酵素をコードするがヌクレオチド配列において異なるので、ｎ−プロパノール生産に関する検出された違いは、二つの遺伝子の転写プロファイルの違いにより引き起こされると考えられる。
【０７６２】
【表２１】
2013544083.tif 000022
【０７６３】
実施例２９：Ｐ．フロイデンライシイ（P. freudenreichii）メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ小サブユニット遺伝子（ｍｕｔＡ）及び大サブユニット遺伝子（ｍｕｔＢ）、キナーゼＡｒｇＫ遺伝子（ａｒｇＫ）並びにメチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ遺伝子（ｍｍｅ）のクローニング、並びにベクターｐＴＲＧＵ３２０（ｍｕｔＡ）、ｐＴＲＧＵ３２２（ｍｕｔＢ）、ｐＴＲＧＵ３２４（ａｒｇＫ）及びｐＴＲＧＵ３５０（ｍｍｅ）の構築
ｍｕｔＡ、ｍｕｔＢ、ａｒｇＫ、及びｍｍｅの野生型配列のコーディング配列を、大腸菌における発現のために最適化し、合成的にｐＴＲＧＵ３２０（ｍｕｔＡ）、ｐＴＲＧＵ３２２（ｍｕｔＢ）、ｐＴＲＧＵ３２４（ａｒｇＫ）、及びｐＴＲＧＵ３５０（ｍｍｅ）を構築した。コドン最適化コーディング配列を含むＤＮＡフラグメントを、開始コドンの直前にリボソーム結合部位（ＲＢＳ、配列５’−ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣ−３’）が含まれるように設計した。
【０７６４】
得られた配列は、Geneart AG（Regenburg, Germany）により置換及び合成され、β−ラクタマーゼをコードする遺伝子ｂｌａＴＥＭ−１を含むｐＭＡバックボーンベクターに導入された。合成された場合、続くクローニングステップを容易にするために、各コーディング配列及びＲＢＳフラグメントを制限酵素認識部位と隣接させた。ｐＭＡベクターにクローニングされた合成フラグメント全体は、表１５に示されるようにｍｕｔＡについてＥｃｏＲＩ−ＲＢＳ−ＣＤＳ１−ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩであり、ｐＴＲＧＵ３２０をもたらす。同様に、ｍｕｔＢは、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩが両脇に配置され、コーディング配列がＢａｍＨＩ制限酵素認識部位及びＲＢＳにより分離される場合、これは一つのオペロンへのｍｕｔＡ及びｍｕｔＢの連続的なクローニングを可能にする。全ての残りの合成的に最適化された遺伝子の野生型ヌクレオチド配列（ＷＴ）、コドン最適化ヌクレオチド配列（ＣＯ）、及び推定されるアミノ酸配列の配列番号を表１５に示す。
【０７６５】
【表２２】
2013544083.tif 000023
【０７６６】
実施例３０：大腸菌メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ遺伝子（ｓｂｍ）、大腸菌プロテインキナーゼ遺伝子（ｙｇｆＤ）、大腸菌メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ遺伝子（ｙｄｇＧ）のクローニング、及び様々なｎ−プロパノール経路遺伝子の組み合わせの構築
【０７６７】
大腸菌メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ（ｓｂｍ）遺伝子、大腸菌プロテインキナーゼ遺伝子（ｙｇｆＤ）、及び大腸菌メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ遺伝子（ｙｄｇＧ）を、ＰＣＲを用いて大腸菌ゲノムから増幅し、表１６に示すように制限酵素認識部位、ＲＢＳ及び終始コドンを組み込んだ。加えて、ｐＴＲＧＵ３００（同上）中の遺伝子ｐｄｕＰ＿Ｐｆ＿ｓｙｎ２ａを必要な制限酵素認識部位を含まずに合成し、従って、後述のような正確な制限酵素認識部位を有するｐＴＲＧＵ３００から増幅した。
【０７６８】
【表２３】
2013544083.tif 000024
【０７６９】
以下のプライマーをＰＣＲ反応のために用いた。
ｓｂｍのクローニング
ＥｃｏＲＩ−ＲＢＳ−ｓｂｍ−ＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ
プライマーｐ２１７（配列番号１０４）：
５’−ＣＡＣＣＧＡＡＴＴＣＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＴＣＴＡＡＣＧＴＧＣＡＧＧＡＧＴＧＧＣＡＡＣ−３’
プライマーｐ２１８（配列番号１０５）：
５’−ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＡＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＴＣＡＴＧＡＴＧＣＴＧＧＣＴＴＡＴＣＡＧＡ−３’
【０７７０】
ｙｇｆＤのクローニング
ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＲＢＳ−ＣＤＳ３−ＡｓｃＩ−ＦｓｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ
プライマーｐ２１９（配列番号１０６）：
５’−ＣＡＣＣＧ  ＡＡＴＴＣ  ＧＣＧＧＣ  ＣＧＣＡＡ  ＧＡＡＧＧ  ＡＧＡＴＡ  ＴＡＣＣＡ  ＴＧＡＴＴ  ＡＡＴＧＡ  ＡＧＣＣＡ  ＣＧＣＴＧ  ＧＣＡＧ−３’
プライマーｐ２２０（配列番号１０７）：
５’−ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＡＡＧＣＴＴＧＧＣＣＧＧＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＡＡＴＣＡＡＡＡＴＡＴＴＧＣＧＴＣＴＧＧＡＴＡ−３’
【０７７１】
ｙｇｆＧのクローニング
ＥｃｏＲＩ−ＡｓｃＩ−ＦｓｅＩ−ＲＢＳ−ＣＤＳ５−ＰａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ
ｍｍｅを含まない経路へのクローニングの場合ＡｓｃＩ及びＸｂａＩ；ｍｍｅを含む経路へのクローニングの場合ＦｓｅＩ及びＸｂａＩ。
プライマーｐ２２９（配列番号１０８）
５’−ＣＡＣＣＧ  ＡＡＴＴＣ  ＧＧＣＧＣ  ＧＣＣＧＧ  ＣＣＧＧＣ  ＣＡＡＧＡ  ＡＧＧＡＧ  ＡＴＡＴＡ  ＣＣＡＴＧ  ＴＣＴＴＡ  ＴＣＡＧＴ  ＡＴＧＴＴ  ＡＡＣＧＴ  ＴＧ−３’
プライマーｐ２２２（配列番号１０９）：
５’−ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＡＡＧＣＴＴＴＴＡＡＴＴＡＡＣＴＡＡＴＧＡＣＣＡＡＣＧＡＡＡＴＴＡＧＧＴＴＴＡ−３’
【０７７２】
ｐｄｕＰ＿ｓｙｎ２ａのクローニング
ＥｃｏＲＩ−ＰａｃＩ−ＲＢＳ−ＣＤＳ６−ＳｂｆＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ
プライマーｐ２２３（配列番号１１０）：
５’−ＣＡＣＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＴＣＡ−３’
プライマーｐ２２４（配列番号１１１）：
５’−ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＡＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＴＴＡＧＣＧＧＡＴＡＴＴＣＡＧＧＣＣＡＣＴＣＴＴＴ−３’
【０７７３】
ＰＣＲ反応を、Phusion（登録商標）Hot Start ＤＮＡポリメラーゼ（Finnzymes, Finland）を用いて行った。得られたＰＣＲ産物を製造者の使用説明書に従って、ＰＣＲ精製キット（Qiagen, Hilden, Germany）を用いて精製した。続いて、ＰＣＲ産物及びクローニングベクターのそれぞれを、表１８に列挙する制限酵素を用いて３７℃で一晩消化した。前記酵素を６５℃で２０分間加熱不活性化し、クローニングベクター反応混合物を３７℃で３０分間１Ｕ仔牛腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）（NEB）を用いて脱リン酸化した。消化されたベクター及びＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで泳動し、その後製造者の使用説明書に従ってQIAquickゲル抽出キットを（Qiagen, Hilden, Germany）用いて精製した。
【０７７４】
３フラグメントライゲーションによるｐＴＲＧＵ１８７へのｓｂｍ及びｙｇｆＤ又はａｒｇＫの挿入
ｓｂｍを９６℃で２分；９６℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で１分１０秒を３０サイクル；その後７２℃で５分を１サイクルで増幅した。ｙｇｆＤを９６℃で２分；９６℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で４０秒を３０サイクル；その後７２℃で５分を１サイクルで増幅した。ＰＣＲ精製、ｓｂｍについてＥｃｏＲＩとＮｏｔＩ、及びｙｇｆＤについてＮｏｔＩとＸｂａＩでの消化を、本質的には本明細書に記載されるように行った。ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化されたｐＴＲＧＵ１８７、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで消化されたｓｂｍ、及びＮｏｔＩ及びＸｂａＩ消化されたｙｇｆＤの３フラグメントライゲーションを、反応中の一つの更なるＤＮＡフラグメントとともに、本質的には本明細書に記載されるように行った。１μＬの量のライゲーション混合物で化学的形質転換により大腸菌ＴＯＰ１０を形質転換した。形質転換体を２０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢプレート上にプレートし、一晩インキュベートした。その後選択されたコロニーを、２０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢプレート上に縞状に播種した。一つのコロニーである大腸菌ＴＲＧＵ３６７を、１０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む液体ＬＢブイヨン培地に植菌し、３７℃で一晩インキュベートした。対応するプラスミドｐＴＲＧＵ３６７をQiaprep（登録商標）スピンミニプレップキット（Qiagen）を用いて単離し、ＤＮＡ配列決定に供し、ｓｂｍ及びｙｇｆＤ遺伝子がベクターに正確に統合されていることを確認した。ｐＴＲＧＵ３６７を含む一晩の液体培養液からの大腸菌ＴＲＧＵ３６７を、−８０℃で３０％グリセロールに保存した。全てのｎ−プロパノール生合成遺伝子経路は、本質的に同一の手順に従う。ｎ−プロパノール生合成遺伝子経路全体のクローニングのために適用される制限酵素及びＤＮＡフラグメントは、下記の表１８に概要が示される。
【０７７５】
【表２４】
2013544083.tif 000025
【０７７６】
ｎ−プロパノール生合成遺伝子の形質転換体であるＴＲＧＵ３６２〜５１７を表１９に示す。対応するプラスミドｐＴＲＧＵ３６２〜５１７をQiaprep（登録商標）スピンミニプレップキット（Qiagen）を用いて単離し、クローニングされた遺伝子がエラーなくベクターに統合されているかを確認するために、ＰＣＲ産物がクローニングされている場合、ＤＮＡ配列決定に供した。ｐＴＲＧＵ３６２〜５１７を含む一晩の液体培養液からの大腸菌ＴＲＧＵ３６２〜５１７を−８０℃で３０％グリセロール中で保存した。
【０７７７】
【表２５】
2013544083.tif 000026
【表２６】
2013544083.tif 000027
【０７７８】
実施例３１：様々な異種のｎ−プロパノール経路遺伝子の組み合わせを含む組み換え大腸菌ＴＯＰ１０におけるｎ−プロパノールの生産
表１９（同上）に示されるプラスミドを含む大腸菌ＴＯＰ１０株を、１０μｇ／ｍｌカナマイシン及び１ｍＭイソプロピル−ベータ−チオガラクトピラノシドを含む１０ｍＬ  ＭＭ中で、振盪（２５０ｒｐｍ）させながら３７℃で一晩個別に培養した。最初に、表１９からＴＲＧＵ４０９〜ＴＲＧＵ４６８を培養し、続いて残りの株を本質的に同一の条件下で別々の実験において培養した。
【０７７９】
最初の培養実験では、各培地からの２ｍｌサンプルを１７時間、及び４１時間後に採取し、選択された株を６５時間後に採取した。各サンプルを上記のようにガスクロマトグラフィーを用いて分析した。各株により生産される前記プロパノールの力価を表２０に示す。
【０７８０】
【表２７】
2013544083.tif 000028
【０７８１】
表２０において得られる結果は、予測されるように、空ベクターを含むＴＲＧＵ１８７がプロパノールを生産しないことを示す。さらに、ｎ−プロパノール生合成経路の最初の３つの遺伝子が大腸菌において発現される場合、少量の１−プロパノールが検出された。これは、大腸菌が、天然のアルデヒドデヒドロゲナーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼを用いて、プロピオニル−ＣｏＡをゆっくりとｎ−プロパノールに還元することができることを示す。しかしながら、アルデヒドデヒドロゲナーゼｐｄｕＰ＿Ｒｐ、ｐｄｕＰ＿Ｒｃ、ｐｄｕＰ＿Ｒｒ及びｐｄｕＰ＿Ｅｈの発現は、プロパノール生産を７倍増加させる。
【０７８２】
表１９（同上）からの残りの株の培養を上述のように行い、結果を表２１に示す。
【０７８３】
【表２８】
2013544083.tif 000029
【０７８４】
大腸菌ＴＯＰ１０において発現されるｎ−プロパノール生合成遺伝子を含む全てのコンストラクト（表２１）は、ｎ−プロパノールの生産をもたらす。
【０７８５】
実施例３２：実施例３１から単離された株のゲル内消化を用いた半定量的分析及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
実施例３１からの培養物を、示される時点においてサンプリングした。サンプルを、５０００ｘｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞を−２０℃で凍結させた。選択されたサンプルを質量分析を用いて分析し、同定されたタンパク質の相対的レベルを以下の手順に従って決定した。
【０７８６】
Ａ．還元及びアルキル化
各５０μＬ  サンプルを、２０μｌ  NuPage LDSサンプルバッファ（Prod no. NP0007）、４μｌ  １Ｍ  ＤＴＴと混合し、９５℃で１０分間インキュベートした。０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．２中６μｌ  １Ｍヨードアセトアミドを添加する前に、前記サンプルを冷却した。その後前記サンプルを室温で２０分間暗所中でインキュベートした。
【０７８７】
Ｂ．電気泳動
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを製造者の助言に従って、NuPAGE MES SDSランニングバッファ（Prod no. NP0002）を用いて、NuPAGE  ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Prod no. NP0321）において各サンプルについて行なった。製造者の助言に従って、expedeon InstantBlue（商標）（Prod no. ISB01L）を用いてゲルを染色した。
【０７８８】
Ｃ．ゲル内消化及びペプチド抽出
各レーンからの６〜８バンドを切り出し、各スライスを９６ウェルプレート中の異なる位置に移した。ゲルスライスを１５０μｌ  ５０％エタノール／５０ｍＭ  ＮＨ4ＨＣＯ3で２回、３０分間洗浄し、続いて１００μｌアセトニトリルを添加することにより縮めた。１５分後に溶媒を除去し、ゲルスライスを１０分間SpeedVac中で乾燥させた。ゲルスライスを１ｍｌあたり２５ｍｇトリプシン（Roche, prod. no. 11418475001）を含む１５μｌ  ２５ｍＭ  ＮＨ4ＨＣＯ3で再膨潤させた。１０〜１５分後、２５μｌ  ２５ｍＭ  ＮＨ4ＨＣＯ3を各ウェルに添加した。その後９６ウェルプレートを３７℃で一晩インキュベートした。トリプシンペプチドを５０μｌ  ７０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡを添加し、室温で１５分間サンプルをインキュベートすることにより抽出した。上清をＨＰＬＣバイアルに移し、抽出を繰り返した。合わされた抽出物をSpeedVac中で乾燥させ、５０μｌ  ５％ギ酸中で再構成した。
【０７８９】
Ｄ．質量分析
放出されたトリプシンペプチドをNano LCクロマトグラフシステム（Easy nLC II, Thermo Scientific）を備えたOrbitrap Velos装置（Thermo Scientific）を用いて分析した。クロマトグラフシステムは、２ｃｍ、ＩＤ  １００μｍ、５μｍ  Ｃ１８−Ａ１ガードカラム（Proxeon, prod. no. SC001）及び１０ｃｍ、ＩＤ  ７５μｍ、３μｍ  Ｃ１８−Ａ２分離カラム（Proxeon, prod. no. SC200）が搭載され、表２２に示す条件を用いて行われた。１μＬの各サンプルを分析のために注入した。
【０７９０】
【表２９】
2013544083.tif 000030
【０７９１】
ＭＳ実験を、ＨＣＤ活性化を用いて上位１０のピークのＭＳ／ＭＳ分析を用いてｎ次の倍化動作（nth order double play）として行った。ＭＳスキャンを７５００の解像度、及び３５０〜１７５０ｍ／ｚのスキャン範囲を用いてOrbitrapにおいて行った。ＭＳ／ＭＳスキャンを表２３（可能な設定のみを表す）に示す設定を用いてOrbitrapにおいて行った。
【０７９２】
【表３０】
2013544083.tif 000031
【０７９３】
Ｅ．データベースサーチ
生ファイルをMascot及びMascot deamon ver. 2.3.0並びに関連する異種のタンパク質についての配列を含んだ社内のゲノムデータベースを用いて配列サーチに供した。各レーンからの生ファイルを融合させた。ｅｍＰＡＩ値をMascotサーチ結果から抽出し、Ishihama, Y et al（Yasushi Ishihama et al. (2005) Molecular & Cellular Proteomics, 4, 1265-1272）に従ってｍｏｌ％を計算した。表２４に示す設定をMascotサーチに用いた。
【０７９４】
【表３１】
2013544083.tif 000032
【０７９５】
選択されたサンプルのＭＳ結果
選択されたサンプルは、結果を確認するために２回、例えばＭＳ１、及びＭＳ７において分析された。得られた結果を表２５に示す。
【０７９６】
【表３２】
2013544083.tif 000033
【０７９７】
表２５の結果は、ｐｄｕＰ＿Ｐｆ＿ｓｙｎ２ａの発現は、低コピー数プラスミドｐＴＲＧＵ３０４（表２１）からよりも、ＴＲＧＵ３０２中の高コピー数プラスミドｐＴｒｃ９９Ａからの大腸菌ＴＯＰ１０において高いことを示す。ＴＲＧＵ４６２及びＴＲＧＵ４２２を除く全ての場合において、生産されたタンパク質は、ＭＳにより検出された。
【０７９８】
実施例３３：様々な異種のｎ−プロパノール経路遺伝子の組み合わせを含む組み換え大腸菌ＭＧ１６５５におけるｎ−プロパノールの生産
表１９に示すｐＴＲＧＵ４０９〜ｐＴＲＧＵ５１７のプラスミドを含む大腸菌ＭＧ１６５５を、１０μｇ／ｍＬカナマイシン及び１ｍＭイソプロピル−ベータ−チオガラクトピラノシドを含む１０ｍＬＭＭ中で、３７℃で振盪（２５０ｒｐｍ）させながら個別に一晩培養した。各培地から１７、４４、及び１１６時間後に２ｍｌのサンプルを採取した。各サンプルを本明細書で概略を示すようにガスクロマトグラフィーを用いて分析した。培養発現の結果を表２６に示す。
【０７９９】
【表３３】
2013544083.tif 000034
【表３４】
2013544083.tif 000035
【０８００】
表２６の結果は、いずれかの試験されたＰｄｕＰ遺伝子を含むｐＴＲＧＵ８８発現ベクターで形質転換された場合、大腸菌ＭＧ１６５５が、少量のｎ−プロパノールを生産することができることを示す。多くの場合において、想定されるｎ−プロパノール生合成経路の残りの遺伝子を挿入することは、生産されるプロパノールの量を増加させる。また、単一のｐｄｕＰ遺伝子発現、例えばｎｏ．１１〜１５、１７−２０、２２、３７、３９、４３、４５、及び４７と比較して、プロパノール生産が増加する遺伝子組み合わせのいくつかの例は示される。これらの中でも、多くの遺伝子組み合わせが、ＭｕｔＡＢ遺伝子と比較してＳｂｍ遺伝子を含むが、ＹｇｆＤ、Ｍｍｅ、ＹｇｆＧ及びＰｄｕＰ＿ｓｙｎ２ａと組み合わせてＭｕｔＡＢを含むｎｏ．４６は、ｐｄｕＰ＿Ｐｆ＿ｓｙｎ２ａ単独の発現と比較して１１６時間後に増加したプロパノール濃度をもたらさなかった。
【０８０１】
実施例３４：組み換え大腸菌ＴＯＰ１０におけるイソプロパノール及びｎ−プロパノールの生産
発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ及びｐＴＲＧＵ８８で、上述のエレクトロポレーションにより、大腸菌ＴＯＰ１０を同時に形質転換した。形質転換体を２００μｇ／ｍＬアンピシリン及び２０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天プレート上で選択した。その後選択されたコロニーを、２００μｇ／ｍＬアンピシリン及び２０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天プレート上に縞状に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。二つのコロニーが選択され、１００μｇ／ｍＬアンピシリン及び２０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む１０ｍＬ  ＴＹブイヨン培地のチューブを植菌するために用い、その後振盪（２５０ｒｐｍ）させながら３７℃で一晩インキュベートした。その後、培養物を遠心分離により回収し、Qiaprep（登録商標）スピンミニプレップキット（Qiagen）を用いてプラスミドを単離した。プラスミドをＸｂａＩで消化し、各形質転換体中の二つのプラスミドの存在を、上述のゲル電気泳動で分析した場合、４１７６ｂｐ及び４５２４ｂｐにおける二つのバンドの存在により、確認した。構築された大腸菌株ＴＲＧＵ２８４を−８０℃で３０％グリセロール中に保存した。
【０８０２】
前記発現ベクターｐＴＲＧＵ４４（同上）及びｐＴＲＧＵ１９６（Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobuylicum）チオラーゼ遺伝子、Ｂ．サブチリス（B. subtilis）スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ遺伝子、Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）アセトアセテートデカルボキシラーゼ遺伝子、及びＣ．ベイジェリンキ  イソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現する；２０１０年１０月２９日に出願された米国仮出願第６１／４０８，１３８号を参照のこと）を、上述のエレクトロポレーションにより、大腸菌ＴＯＰ１０を同時に形質転換した。形質転換体を２００μｇ／ｍＬアンピシリン及び２０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天プレート上で選択した。選択されたコロニーを、その後２００μｇ／ｍＬアンピシリン及び２０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天プレート上に縞状に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。二つのコロニーを選択し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン及び２０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む１０ｍＬ  ＴＹブイヨン培地のチューブを植菌するために用い、その後振盪（２５０ｒｐｍ）させながら３７℃で一晩インキュベートした。その後、培養物を遠心分離により回収し、Qiaprep（登録商標）スピンミニプレップキット（Qiagen）を用いてプラスミドを単離した。プラスミドをＸｂａＩで消化し、各形質転換体中の二つのプラスミドの存在を、上述のゲル電気泳動で分析した場合、ｐＴＲＧＵ４４及びｐＴＲＧＵ１９６について５６７６ｂｐ及び８９３０ｂｐにおける二つのバンドの存在により確認した。構築された大腸菌株ＴＲＧＵ２６１を−８０℃で３０％グリセロール中に保存した。
【０８０３】
大腸菌株Ｔｒｃ９９Ａ、ＴＲＧＵ４４、ＴＲＧＵ１９６、及びＴＲＧＵ２６１を、１００μｇ／ｍＬアンピシリン及び１ｍＭイソプロピル−ベータ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含む１０ｍＬ  ＬＢ培地中で、振盪（２５０ｒｐｍ）させながら３７℃で一晩培養した。各株からの０．５ｍＬのサンプルを採取し、卓上遠心分離装置を用いて１５０００ｘｇで１分間遠心分離し、上清を廃棄した。その後各株を、何も添加していない０．５ｍＬ最小培地（ＭＭ）に再懸濁した。その後、前記サンプルを各株について新しい１０ｍＬ培養物に植菌するために用いた。培養物を振盪（２５０ｒｐｍ）させながら３７℃で１１９時間インキュベートした。培養の終了時に２ｍＬサンプルを採取し、遠心分離し、各サンプルの上清をガスクロマトグラフィーにより分析した。発酵培地中のアセトン、１−プロパノール及びイソプロパノールを、本明細書に記載の手順を用いて、ＧＣ−ＦＩＤにより検出した。サンプルをメタノール中０．０５％テトラヒドロフランで１＋１に希釈し、分析した。
【０８０４】
【表３５】
2013544083.tif 000036
【０８０５】
表２８に示すように、ｎ−プロパノールは、大腸菌ＴＲＧＵ４４により２０ｍｇ／Ｌで生産され、ごく微量が陰性対照株大腸菌Ｔｒｃ９９Ａにおいて検出された。イソプロパノールは、大腸菌ＴＲＧＵ１９６により１０ｍｇ／Ｌにおいて生産された。驚くべきことに、大腸菌ＴＯＰ１０における異種のｐｄｕＰ及び異種のイソプロパノール経路遺伝子の共発現は、２０ｍｇ／Ｌにおいて生産されるｎ−プロパノール、及びイソプロパノールの２７倍の上方制御をもたらした。
【０８０６】
【表３６】
2013544083.tif 000037
【０８０７】
実施例３５：組み換え大腸菌におけるイソプロパノール及び１−プロパノールの生産
プラスミドｐＳＪ１０９４２及びｐＴＲＧｕ６６８で大腸菌ＴＧ１化学的コンピテント細胞を同時に形質転換し、ＬＢ寒天プレート上でエリスロマイシン（１００μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）耐性を選択し、更にエリスロマイシン（１００μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）を含むＴＹ培地中で増殖させ、ＨｉｎｄＩＩＩを用いた制限酵素分析により判断された株を二つのプラスミドを含んでいるとみなし、ＳＪ１１０４６として保存した。
【０８０８】
プラスミドｐＳＪ１０９４２及びｐＴＲＧｕ６７１で上述のように大腸菌ＴＧ１を同時に形質転換し、ＨｉｎｄＩＩＩを用いた制限酵素分析により判断された二つの株を二つのプラスミドを含んでいるとみなし、ＳＪ１１０４７及びＳＪ１１０４８として保存した。
【０８０９】
株ＳＪ１０９４２を１００μｇ／ｍｌエリスロマイシンとともに増殖させ、前述のようにエレクトロポレーションのために調製した。この株をプラスミドｐＴＲＧｕ５０７で形質転換し、ＬＢ寒天プレート上でエリスロマイシン（２００μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）耐性を選択した。二つの形質転換体を、ＨｉｎｄＩＩＩを用いた制限酵素分析により所望のプラスミドを含んでいるとみなし、ＳＪ１１０５１及びＳＪ１１０５２として保存した。
【０８１０】
本明細書に記載のように構築された株及びイソプロパノールオペロンのみを含むＳＪ１０９４２を、グルコース（１％）及びＢ１２ビタミン（１０μＬの５ｍＭ（７．９ｍｇ／ｍｌ）ストック溶液）を添加したＬＢ培地を含む１０ｍｌチューブ中に、収集保存株の凍結バイアルから、直接植菌した。Ｂ１２ビタミン添加を、２日の発酵後に繰り返した。抗生物質を、エリスロマイシンについて１００μｇ／ｍｌ（全ての株）、そしてカナマイシンについて２０μｇ／ｍｌ（株ＳＪ１１０４６、−４７、−４８、−５１及び−５２）添加した。
【０８１１】
培養物を、表２９、３０、及び３１に示すように、それぞれ２６℃、３０℃、又は３７℃のいずれかで振盪した。１−プロパノール、２−プロパノール、及びアセトンレベルを上述のように、１、２及び４日の発酵後、測定した。
【０８１２】
【表３７】
2013544083.tif 000038
【０８１３】
【表３８】
2013544083.tif 000039
【０８１４】
【表３９】
2013544083.tif 000040
【０８１５】
イソプロパノール及びｎ−プロパノールの双方は、双方の経路を含む株から生産された一方で、ｎ−プロパノールは、イソプロパノール経路のみを含む株により生産されなかった。
【０８１６】
実施例３６：代謝中間体からの組み換えＬ．ロイテリ（L. reuteri）におけるイソプロパノール及びｎ−プロパノールの生産
株ＳＪ１１０１１、ＳＪ１１０１２、ＳＪ１１０１５、ＳＪ１１０１６、及びＳＪ１１０２４（同上）を、エッペンドルフチューブ中で１０μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含む２ｍｌ  ＭＲＳに植菌し、振盪することなく３７℃で一晩インキュベートした。その後、５０μＬの量を、下記の表に示すように様々な濃度において、アセトン及び１，２−プロパンジオールが添加された１０μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含む新しい２ｍｌＭＲＳチューブに植菌するために用いた。培養物を３７℃で２日間インキュベートし、上清サンプルを上述のようにｎ−プロパノール、イソプロパノール、アセトン、及び１，２−プロパンジオールについて分析した。得られたｎ−プロパノール、イソプロパノール、アセトン、及び１，２−プロパンジオールのレベルをそれぞれ表３２、３３、３４、及び３５に示す。ＭＲＳ−１０ｅｒｍは、いずれの株も植菌していないが、インキュベーション及び分析を行った培養培地を意味する。
【０８１７】
実施例３６：代謝中間体からの組み換えＬ．ロイテリ（L. reuteri）におけるイソプロパノール及びｎ−プロパノールの生産
株ＳＪ１１０１１、ＳＪ１１０１２、ＳＪ１１０１５、ＳＪ１１０１６、及びＳＪ１１０２４（同上）を、エッペンドルフチューブ中で１０μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含む２ｍｌ  ＭＲＳに植菌し、振盪することなく３７℃で一晩インキュベートした。その後、５０μＬの量を、下記の表に示すように様々な濃度において、アセトン及び１，２−プロパンジオールが添加された１０μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含む新しい２ｍｌ  ＭＲＳチューブに植菌するために用いた。培養物を３７℃で２日間インキュベートし、上清サンプルを上述のようにｎ−プロパノール、イソプロパノール、アセトン、及び１，２−プロパンジオールについて分析した。得られたｎ−プロパノール、イソプロパノール、アセトン、及び１，２−プロパンジオールのレベルをそれぞれ表３２、３３、３４、及び３５に示す。ＭＲＳ−１０ｅｒｍは、いずれの株も植菌していないが、インキュベーション及び分析を行った培養培地を意味する。
【０８１８】
【表４０】
2013544083.tif 000041
【０８１９】
【表４１】
2013544083.tif 000042
【０８２０】
【表４２】
2013544083.tif 000043
【０８２１】
【表４３】
2013544083.tif 000044
【０８２２】
実施例は、小スケールバッチ培養において、組み換えＬ．ロイテリ（L. reuteri）が、１ｇ／ｌを上回る力価において代謝中間体からイソプロパノール及び１−プロパノールの双方を生産することができることを示す。
【０８２３】
実施例３７：組み換えＢ．サブチリス（B. subtilis）におけるイソプロパノールの生産
Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobuylicum）チオラーゼ（配列番号３）、Ｂ．サブチリス（B. subtilis）スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ（配列番号：６及び９）、Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）アセトアセテートデカルボキシラーゼ（配列番号１８）、及びＣ．ベイジェリンキ  アルコールデヒドロゲナーゼ（配列番号２１）をコードする遺伝子を、プラスミドｐＴＲＧＵ１９６からＰＣＲにより増幅した。プライマー（下記を参照のこと）は、チオラーゼ遺伝子の直前のａｍｙＬリボソーム結合部位を組み込んでいる。下線の配列は、チオラーゼ（Ｐ２６５）及びアルコールデヒドロゲナーゼ（Ｐ２６６）遺伝子のコーディング配列と相補的であった。
【０８２４】
プライマーｐ２６５：５’−ＣＣＡＣＡ  ＴＴＧＡＡ  ＡＧＧＧＧ  ＡＧＧＡＧ  ＡＡＴＣＡ  ＴＧＡＡＧ  ＧＡＡＧＴ  ＴＧＴＧＡ  ＴＴＧＣＴ  ＴＣＴ−３’（配列番号１２５）
プライマーｐ２６６：５’−ＡＧＴＣＧ  ＡＣＧＣＧ  ＧＣＣＧＣ  ＴＡＧＣＡ  ＣＧＣＧＴ  ＴＡＴＡＡ  ＧＡＴＧＡ  ＣＡＡＣＧ  ＧＣＴＴＴ  ＧＡＴ−３’（配列番号１２６）
【０８２５】
得られたフラグメントを、好適なプロモーターを含むように改変し、標準的な手順を用いてｐｅｌ遺伝子座を標的とする天然のコンピテントＢ．サブチリス（Ｂ. subtilis）ＪＡ１３４３細胞を形質転換した。形質転換体を０．０１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ７）、０．４％グルコース、及び１８０μｇ／ｍｌスペクチノマイシンを添加したＬＢ培地プレートで選択した。得られた形質転換体のうち、５つをイソプロパノール生産について試験した。これらのうち、３つの形質転換体が、上述の手順を用いた検出可能なイソプロパノール生産をもたらし、これらのうちの一つは、２０ｍｇ／ｌイソプロパノールをもたらした。
【０８２６】
上記と同様の手法を用いて、Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobuylicum）チオラーゼ（配列番号３）、Ｂ．モジャベンシス（B. mojavensis）スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ（配列番号：１２及び１５）、Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）アセトアセテートデカルボキシラーゼ（配列番号１８）、及びＣ．ベイジェリンキ  アルコールデヒドロゲナーゼ（配列番号２１）をコードする遺伝子を、配列番号：１２５及び１２６に示されるプライマーを用いてプラスミドｐＴＲＧＵ２００からＰＣＲにより増幅した。
【０８２７】
得られたフラグメントを上述の標準的な手順を用いてｐｅｌ遺伝子座を標的とする天然のコンピテントＢ．サブチリス（B. subtilis）ＪＡ１３４３細胞を形質転換した。３つの形質転換体をイソプロパノール生産について試験し、全てが１０ｍｇ／ｌイソプロパノールの生産をもたらした。陰性対照を試験し、イソプロパノールは、これらの条件下で組み換え遺伝子配列を含まずには生産されないことを確認した。
【０８２８】
生物学的材料の寄託
以下の生物学的材料は、ブダペスト条約の取り決めに従って、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)（Mascheroder Weg 1 B, D-38124 Braunschweig, Germany）に寄託され、以下の受託番号が与えられた。
寄託物                      受託番号                  寄託日
大腸菌  ＮＮ０５９２９８    ＤＳＭ  ２４１２２        ２０１０年１０月２６日
大腸菌  ＮＮ０５９２９９    ＤＳＭ  ２４１２３        ２０１０年１０月２６日
【０８２９】
前記株は、培養物の入手が、本特許出願が係属している間、これらに権利を与えるための外国の特許法により決定されるものに可能であることを確実にする条件下で寄託された。寄託物は、寄託された株の実質的な純粋培養を表す。寄託物は、諸外国における特許法による要求に応じて入手可能であり、ここで本願の同等物又はその後代は保管される。しかしながら、寄託物の利用可能性は、行政措置により認められる特許権の特例において、本発明を実施するライセンスに相当しないことは理解されるべきである。
【０８３０】
本発明は、以下の番号が付された段落により更に記述されてもよい。
【０８３１】
［Ａ１］アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチドを含む組み換え宿主細胞であって、ｎ−プロパノールを生産することができる、組み換え宿主細胞。
【０８３２】
［Ａ２］前記宿主細胞が原核生物である、段落Ａ１に記載の組み換え宿主細胞。
【０８３３】
［Ａ３］前記宿主細胞が、バチルス属（Bacillus）、クロストリジウム属（Clostridium）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、ゲオバチルス属（Geobacillus）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、オセアノバチルス属（Oceanobacillus）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、カンピロバクター属（Campylobacter）、エシェリキア属（Escherichia）、フラボバクテリウム属（Flavobacterium）、フソバクテリウム属（Fusobacterium）、ヘリコバクター属（Helicobacter）、イリオバクター属（Ilyobacter）、ナイセリア属（Neisseria）、シュードモナス属（Pseudomonas）、サルモネラ属（Salmonella）、及びウレアプラズマ属（Ureaplasma）からなる群から選択される属のメンバーである、段落Ａ２に記載の組み換え宿主細胞。
【０８３４】
［Ａ４］前記宿主細胞が、ラクトバチルス属（例えば、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・フルクチボランス（Lactobacillus fructivorans）、若しくはラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri））、又はプロピオニバクテリウム属（例えば、プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Propionibacterium freudenreichii））のメンバーである、段落Ａ３に記載の組み換え宿主細胞。
【０８３５】
［Ａ５］前記アルデヒドデヒドロゲナーゼが、
（ａ）配列番号２７、３０、３３、５１、５４、５７、６０、又は６３の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するアルデヒドデヒドロゲナーゼ；
（ｂ）配列番号２５、２６、２８、２９、３１、３２、４８、４９、５０、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、若しくは６２の成熟ポリペプチドコーディング配列又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアルデヒドデヒドロゲナーゼ；及び
（ｃ）配列番号２５、２６、２８、２９、３１、３２、４８、４９、５０、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、又は６２の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるアルデヒドデヒドロゲナーゼ
から選択される、段落Ａ１〜Ａ４のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０８３６】
［Ａ６］前記アルデヒドデヒドロゲナーゼが、配列番号２７、３０、３３、５１、５４、５７、６０、又は６３の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する、段落Ａ１〜Ａ５のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０８３７】
［Ａ７］前記アルデヒドデヒドロゲナーゼが、配列番号２５、２６、２８、２９、３１、３２、４８、４９、５０、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、若しくは６２の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、段落Ａ１〜Ａ６のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０８３８】
［Ａ８］前記アルデヒドデヒドロゲナーゼが、配列番号２５、２６、２８、２９、３１、３２、４８、４９、５０、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、又は６２の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる、段落Ａ１〜Ａ７のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０８３９】
［Ａ９］前記アルデヒドデヒドロゲナーゼが、配列番号２７、３０、３３、５１、５４、５７、６０、又は６３のアミノ酸配列を含む、又はからなる、段落Ａ１〜Ａ８のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０８４０】
［Ａ１０］前記アルデヒドデヒドロゲナーゼが、配列番号２７、３０、３３、５１、５４、５７、６０、又は６３の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を含む、又はからなる、段落Ａ１〜Ａ９のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０８４１】
［Ａ１１］前記アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドとは異種のプロモーターと作動式に連結される、段落Ａ１〜Ａ１０のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０８４２】
［Ａ１２］前記細胞が、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼをコードする１又は複数の（いくつかの）異種のポリヌクレオチド；メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；又はｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチドを更に含む、段落Ａ１〜Ａ１１のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０８４３】
［Ａ１３］前記メチルマロニル−ＣｏＡムターゼが、
（ａ）配列番号９３の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するメチルマロニル−ＣｏＡムターゼ；
（ｂ）配列番号７９若しくは８０の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるメチルマロニル−ＣｏＡムターゼ；及び
（ｃ）配列番号７９又は８０の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるメチルマロニル−ＣｏＡムターゼ
から選択される、段落Ａ１２に記載の組み換え宿主細胞。
【０８４４】
［Ａ１４］前記メチルマロニル−ＣｏＡムターゼがタンパク質複合体であって、前記メチルマロニル−ＣｏＡムターゼをコードする１又は複数の異種のポリヌクレオチドが、第一のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチド、及び第二のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、段落Ａ１３に記載の組み換え宿主細胞。
【０８４５】
［Ａ１５］前記第一のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号６６の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号６４若しくは６５の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号６４又は６５の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択され；
そして前記第二のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号６９の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号６７若しくは６８の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号６７又は６８の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択される、段落Ａ１４に記載の組み換え宿主細胞。
【０８４６】
［Ａ１６］メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ又はこれらのサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチドが、異種のプロモーターと作動式に連結される、段落Ａ１２〜Ａ１５のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０８４７】
［Ａ１７］前記細胞が、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼと結合又は複合体化するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを更に含む、段落Ａ１２〜Ａ１６のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０８４８】
［Ａ１８］前記メチルマロニル−ＣｏＡムターゼと結合又は複合体化する前記ポリペプチドが、
（ａ）配列番号７２又は９４の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号７０、７１、８１、若しくは８２の成熟ポリペプチドコーディング配列又はこれらの完全長相補鎖と、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び
（ｃ）配列番号７０、７１、８１、又は８２の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド
から選択される、段落Ａ１７に記載の組み換え宿主細胞。
【０８４９】
［Ａ１９］前記メチルマロニル−ＣｏＡムターゼと結合又は複合体化するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドとは異種のプロモーターと作動式に連結される、段落Ａ１７又はＡ１８に記載の組み換え宿主細胞。
【０８５０】
［Ａ２０］前記メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼが、
（ａ）配列番号１０３の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ；
（ｂ）配列番号１０２の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ；及び
（ｃ）配列番号１０２の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ
から選択される、段落Ａ１２に記載の組み換え宿主細胞。
【０８５１】
［Ａ２１］前記メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドとは異種のプロモーターと作動式に連結される、段落Ａ２０に記載の組み換え宿主細胞。
【０８５２】
［Ａ２２］前記メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼが、
（ａ）配列番号７５の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するメチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ；
（ｂ）配列番号７３若しくは７４の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるメチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ；及び
（ｃ）配列番号７３又は７４の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるメチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼ
から選択される、段落Ａ１２に記載の組み換え宿主細胞。
【０８５３】
［Ａ２３］前記メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼをコードする異種のポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドとは異種のプロモーターと作動式に連結される、段落Ａ２２に記載の組み換え宿主細胞。
【０８５４】
［Ａ２４］前記ｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドとは異種のプロモーターと作動式に連結される、段落Ａ２２に記載の組み換え宿主細胞。
【０８５５】
［Ａ２５］前記細胞が、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼをコードする異種のポリヌクレオチド、及びメチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、段落Ａ１〜Ａ２４のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０８５６】
［Ａ２６］前記細胞が、ｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、段落Ａ２５に記載の組み換え宿主細胞。
【０８５７】
［Ａ２７］前記細胞が、メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、段落Ａ２５又はＡ２６に記載の組み換え宿主細胞。
【０８５８】
［Ａ２８］段落Ａ１〜Ａ２７のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞を含む組成物。
【０８５９】
［Ａ２９］前記培地が発酵基質を含む、段落Ａ２８に記載の組成物。
【０８６０】
［Ａ３０］前記発酵基質が、サトウキビ汁（例えば、未滅菌サトウキビ汁）である、段落Ａ２９に記載の組成物。
【０８６１】
［Ａ３１］ｎ−プロパノールを更に含む、段落Ａ２８〜Ａ３０のいずれか一つに記載の組成物。
【０８６２】
［Ａ３２］前記ｎ−プロパノールが、力価において、約０．０１ｇ／Ｌ超、例えば約０．０２ｇ／Ｌ、０．０５ｇ／Ｌ、０．０７５ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、８５ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１２５ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、又は２５０ｇ／Ｌ超である、段落Ａ３１に記載の組成物。
【０８６３】
［Ａ３３］ｎ−プロパノールを生産する方法であって、
（ａ）ｎ−プロパノールを生産するための好適な条件下において、培地中で段落Ａ１〜Ａ３３に記載の組み換え宿主細胞を培養し；そして
（ｂ）前記ｎ−プロパノールを回収すること
を含む、方法。
【０８６４】
［Ａ３４］前記培地が発酵培地である、段落Ａ３３に記載の方法。
【０８６５】
［Ａ３５］前記発酵培地が、サトウキビ汁（例えば、未滅菌サトウキビ汁）を含む、段落Ａ３４に記載の方法。
【０８６６】
［Ａ３６］生産されるｎ−プロパノールが、力価において、約０．０１ｇ／Ｌ超、例えば約０．０２ｇ／Ｌ、０．０５ｇ／Ｌ、０．０７５ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、８５ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１２５ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、又は２５０ｇ／Ｌ超である、段落Ａ３３〜Ａ３５のいずれか一つに記載の方法。
【０８６７】
［Ａ３７］回収されたｎ−プロパノールを蒸留により精製することを更に含む、段落Ａ３３〜Ａ３６のいずれか一つに記載の方法。
【０８６８】
［Ａ３８］還元剤の存在下で、プロピオンアルデヒド混入物質をｎ−プロパノールに変換することにより、回収されたｎ−プロパノールを精製することを更に含む、段落Ａ３３〜Ａ３７のいずれか一つに記載の方法。
【０８６９】
［Ａ３９］得られたｎ−プロパノールが、実質的に純粋である、段落Ａ３３〜Ａ３７のいずれか一つに記載の方法。
【０８７０】
［Ａ４０］プロピレンを生産する方法であって、
（ａ）ｎ−プロパノールを生産するための好適な条件下において、培地中で段落Ａ１〜Ａ２７に記載の組み換え宿主細胞を培養し；
（ｂ）ｎ−プロパノールを回収し；
（ｃ）プロピレンを生産するための好適な条件下で前記ｎ−プロパノールを脱水し；そして
（ｄ）前記プロピレンを回収すること
を含む、方法。
【０８７１】
［Ａ４１］前記培地が発酵培地である、段落Ａ４０に記載の方法。
【０８７２】
［Ａ４２］前記発酵培地が、サトウキビ汁（例えば、未滅菌サトウキビ汁）を含む、段落Ａ４１に記載の方法。
【０８７３】
［Ａ４３］生産されるｎ−プロパノールが、力価で約０．０１ｇ／Ｌ超、例えば約０．０２ｇ／Ｌ、０．０５ｇ／Ｌ、０．０７５ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、８５ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１２５ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、又は２５０ｇ／Ｌ超である、段落Ａ４０〜Ａ４２のいずれか一つに記載の方法。
【０８７４】
［Ａ４４］前記ｎ−プロパノールを脱水することが、酸触媒でｎ−プロパノールを処理することを含む、段落Ａ４０〜Ａ４３のいずれか一つに記載の方法。
【０８７５】
［Ｂ１］
チオラーゼ活性；
スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ活性；
アセトアセテートデカルボキシラーゼ活性；及び
イソプロパノールデヒドロゲナーゼ活性
を含む、組み換え宿主細胞であって、
イソプロパノールを生産することができる、組み換え宿主細胞。
【０８７６】
［Ｂ２］チオラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；ＣｏＡ−トランスフェラーゼをコードする１又は複数の（いくつかの）異種のポリヌクレオチド；アセトアセテートデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；及び／又はイソプロパノールデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、組み換え宿主細胞であって、イソプロパノールを生産することができる、組み換え宿主細胞。
【０８７７】
［Ｂ３］前記宿主細胞が原核生物である、段落Ｂ１又はＢ２に記載の組み換え宿主細胞。
【０８７８】
［Ｂ４］前記宿主細胞が、バチルス属（Bacillus）、クロストリジウム属（Clostridium）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、ゲオバチルス属（Geobacillus）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、オセアノバチルス属（Oceanobacillus）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、カンピロバクター属（Campylobacter）、エシェリキア属（Escherichia）、フラボバクテリウム属（Flavobacterium）、フソバクテリウム属（Fusobacterium）、ヘリコバクター属（Helicobacter）、イリオバクター属（Ilyobacter）、ナイセリア属（Neisseria）、シュードモナス属（Pseudomonas）、サルモネラ属（Salmonella）、及びウレアプラズマ属（Ureaplasma）からなる群から選択される属のメンバーである、段落Ｂ３に記載の組み換え宿主細胞。
【０８７９】
［Ｂ５］前記宿主細胞が、ラクトバチルス属（例えば、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・フルクチボランス（Lactobacillus fructivorans）、若しくはラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri））、又はプロピオニバクテリウム属（例えば、プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Propionibacterium freudenreichii））のメンバーである、段落Ｂ４に記載の組み換え宿主細胞。
【０８８０】
［Ｂ６］前記細胞が、チオラーゼをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、段落Ｂ１〜Ｂ５のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０８８１】
［Ｂ７］前記細胞が、ＣｏＡ−トランスフェラーゼをコードする１又は複数の（いくつかの）異種のポリヌクレオチドＣｏＡ−トランスフェラーゼを含む、段落Ｂ１〜Ｂ６のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０８８２】
［Ｂ８］前記細胞が、アセトアセテートデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、段落Ｂ１〜Ｂ７のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０８８３】
［Ｂ９］前記細胞が、イソプロパノールデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、段落Ｂ１〜Ｂ８のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０８８４】
［Ｂ１０］前記細胞が、チオラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；ＣｏＡ−トランスフェラーゼをコードする１又は複数の（いくつかの）ポリヌクレオチド；アセトアセテートデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；イソプロパノールデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、段落Ｂ１〜Ｂ９のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０８８５】
［Ｂ１１］前記チオラーゼが、
（ａ）配列番号３、３５、１１４、又は１１６の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するチオラーゼ；
（ｂ）配列番号１、２、３４、１１３、若しくは１１５の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるチオラーゼ；及び
（ｃ）配列番号１、２、３４、１１３、又は１１５の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるチオラーゼ
から選択される、段落Ｂ７〜Ｂ１０のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０８８６】
［Ｂ１２］前記チオラーゼをコードする異種のポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドとは異種のプロモーターと作動式に連結される、段落Ｂ７〜Ｂ１０のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０８８７】
［Ｂ１３］前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼが、スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼである、段落Ｂ７〜Ｂ１２のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０８８８】
［Ｂ１４］前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼが、アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼである、段落Ｂ７〜Ｂ１２のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０８８９】
［Ｂ１５］前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼが、第一のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチド、及び第二のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質複合体であって、
ここで前記第一のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号６の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号４若しくは５の成熟ポリペプチドコーディング配列又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号４又は５の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択され；
そして前記第二のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号９の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号７若しくは８の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号７又は８の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択される、
段落Ｂ７〜Ｂ１４のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０８９０】
［Ｂ１６］前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼが、第一のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチド、及び第二のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質複合体であって、
ここで前記第一のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号１２の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号１０若しくは１１の成熟ポリペプチドコーディング配列又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号１０又は１１の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択され、
そして前記第二のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号１５の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号１３若しくは１４の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号１３又は１４の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択される、
段落Ｂ７〜Ｂ１４のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０８９１】
［Ｂ１７］前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼが、第一のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチド、及び第二のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質複合体であって、
ここで前記第一のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号３７の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号３６の成熟ポリペプチドコーディング配列又はこれらの完全長相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号３６の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択され、
そして前記第二のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号３９の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号３８の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号３８の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択される、
段落Ｂ７〜Ｂ１４のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０８９２】
［Ｂ１８］前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼが、第一のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチド、及び第二のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質複合体であって、
ここで前記第一のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号４１の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号４０の成熟ポリペプチドコーディング配列又はこれらの完全長相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号４０の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択され、
そして前記第二のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号４３の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号４２の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号４２の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択される、
段落Ｂ７〜Ｂ１４のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０８９３】
［Ｂ１８］前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼをコードする１又は複数の（いくつかの）異種のポリヌクレオチドが、異種のプロモーターと作動式に連結される、段落Ｂ７〜Ｂ１４のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０８９４】
［Ｂ１９］前記アセトアセテートデカルボキシラーゼが、
（ａ）配列番号１８、４５、１１８、又は１２０の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するアセトアセテートデカルボキシラーゼ；
（ｂ）配列番号１６、１７、４４、１１７、若しくは１１９の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアセトアセテートデカルボキシラーゼ；及び
（ｃ）配列番号１６、１７、４４、１１７、又は１１９の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるアセトアセテートデカルボキシラーゼ
から選択される、段落Ｂ８〜Ｂ１８のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０８９５】
［Ｂ２０］前記アセトアセテートデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドとは異種のプロモーターと作動式に連結される、段落Ｂ８〜Ｂ１９のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０８９６】
［Ｂ２１］前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼが、
（ａ）配列番号２１、２４、４７、又は１２２の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するイソプロパノールデヒドロゲナーゼ；
（ｂ）配列番号１９、２０、２２、２３、４６、若しくは１２１の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるイソプロパノールデヒドロゲナーゼ；及び
（ｃ）配列番号１９、２０、２２、２３、４６、又は１２１の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるイソプロパノールデヒドロゲナーゼ
からなる群から選択される、段落Ｂ９〜Ｂ２０のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０８９７】
［Ｂ２２］前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドとは異種のプロモーターと作動式に連結される、段落Ｂ９〜Ｂ２１のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０８９８】
［Ｂ２３］段落Ｂ１〜Ｂ２２のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞を含む、組成物。
【０８９９】
［Ｂ２４］前記培地が発酵基質を含む、段落Ｂ２３に記載の組成物。
【０９００】
［Ｂ２５］前記発酵基質が、サトウキビ汁（例えば、未滅菌サトウキビ汁）である、段落Ｂ２４に記載の組成物。
【０９０１】
［Ｂ２６］イソプロパノールを更に含む、段落Ｂ２３〜Ｂ２５のいずれか一つに記載の組成物。
【０９０２】
［Ｂ２７］前記イソプロパノールが、力価において、約０．０１ｇ／Ｌ超、例えば約０．０２ｇ／Ｌ、０．０５ｇ／Ｌ、０．０７５ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、８５ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１２５ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、又は２５０ｇ／Ｌ超である、段落Ｂ２６に記載の組成物。
【０９０３】
［Ｂ２８］イソプロパノールを生産する方法であって、
（ａ）イソプロパノールを生産するための好適な条件下において、培地中で段落Ｂ１〜Ｂ２２に記載の組み換え宿主細胞を培養し；そして
（ｂ）前記イソプロパノールを回収すること
を含む、方法。
【０９０４】
［Ｂ２９］前記培地が発酵培地である、段落Ｂ２８に記載の方法。
【０９０５】
［Ｂ３０］前記発酵培地が、サトウキビ汁（例えば、未滅菌サトウキビ汁）を含む、段落Ｂ２９に記載の方法。
【０９０６】
［Ｂ３１］生産されたイソプロパノールが、力価において、約０．０１ｇ／Ｌ超、例えば約０．０２ｇ／Ｌ、０．０５ｇ／Ｌ、０．０７５ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、８５ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１２５ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、又は２５０ｇ／Ｌ超である、段落Ｂ２８〜Ｂ３０のいずれか一つに記載の方法。
【０９０７】
［Ｂ３２］回収されたイソプロパノールを蒸留により精製することを更に含む、段落Ｂ２８〜Ｂ３１のいずれか一つに記載の方法。
【０９０８】
［Ｂ３３］還元剤の存在下で、アセトン混入物質をイソプロパノールに変換することにより、回収されたイソプロパノールを精製することを更に含む、段落Ｂ２８〜Ｂ３２のいずれか一つに記載の方法。
【０９０９】
［Ｂ３４］得られたイソプロパノールが、実質的に純粋である、段落Ｂ２８〜Ｂ３３のいずれか一つに記載の方法。
【０９１０】
［Ｂ３５］プロピレンを生産する方法であって、
（ａ）イソプロパノールを生産するための好適な条件下において、培地中で段落Ｂ１〜Ｂ２２に記載の組み換え宿主細胞を培養し；
（ｂ）前記イソプロパノールを回収し；
（ｃ）プロピレンを生産するための好適な条件下で、イソプロパノールを脱水し；そして
（ｄ）前記プロピレンを回収すること
を含む、方法。
【０９１１】
［Ｂ３６］前記培地が発酵培地である、段落Ｂ３５に記載の方法。
【０９１２】
［Ｂ３７］前記発酵培地が、サトウキビ汁（例えば、未滅菌サトウキビ汁）を含む、段落Ｂ３６に記載の方法。
【０９１３】
［Ｂ３８］生産されたイソプロパノールが、力価において、約０．０１ｇ／Ｌ超、例えば約０．０２ｇ／Ｌ、０．０５ｇ／Ｌ、０．０７５ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、８５ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１２５ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、又は２５０ｇ／Ｌ超である、段落Ｂ３５〜Ｂ３７のいずれか一つに記載の方法。
【０９１４】
［Ｂ３９］前記ｎ−プロパノールを脱水することが、酸触媒でｎ−プロパノールを処理することを含む、段落Ｂ３５〜Ｂ３８のいずれか一つに記載の方法。
【０９１５】
［Ｃ１］ｎ−プロパノール及びイソプロパノールを生産することができる組み換え宿主細胞。
【０９１６】
［Ｃ２］
チオラーゼ活性；
ＣｏＡ−トランスフェラーゼ活性；
アセトアセテートデカルボキシラーゼ活性；
イソプロパノールデヒドロゲナーゼ活性；及び
アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性；
を含む、組み換え宿主細胞であって、
ｎ−プロパノール及びイソプロパノールを生産することができる、段落Ｃ１に記載の組み換え宿主細胞。
【０９１７】
［Ｃ３］
チオラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；
ＣｏＡ−トランスフェラーゼをコードする１又は複数の（いくつかの）異種のポリヌクレオチド；
アセトアセテートデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；
イソプロパノールデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；及び
アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチド
を含む組み換え宿主細胞であって、
ｎ−プロパノール及びイソプロパノールを生産することができる、段落Ｃ１又はＣ２に記載の組み換え宿主細胞。
【０９１８】
［Ｃ４］
メチルマロニル−ＣｏＡムターゼをコードする１又は複数の（いくつかの）異種のポリヌクレオチド；
メチルマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；
メチルマロニル−ＣｏＡエピメラーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；及び／又は
ｎ−プロパノールデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチド；
をさらに含む、段落Ｃ３に記載の組み換え宿主細胞。
【０９１９】
［Ｃ５］前記宿主細胞が原核生物である、段落Ｃ１〜Ｃ４のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０９２０】
［Ｃ６］前記宿主細胞が、バチルス属（Bacillus）、クロストリジウム属（Clostridium）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、ゲオバチルス属（Geobacillus）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、オセアノバチルス属（Oceanobacillus）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、カンピロバクター属（Campylobacter）、エシェリキア属（Escherichia）、フラボバクテリウム属（Flavobacterium）、フソバクテリウム属（Fusobacterium）、ヘリコバクター属（Helicobacter）、イリオバクター属（Ilyobacter）、ナイセリア属（Neisseria）、シュードモナス属（Pseudomonas）、サルモネラ属（Salmonella）、及びウレアプラズマ属（Ureaplasma）からなる群から選択される属のメンバーである、段落Ｃ５に記載の組み換え宿主細胞。
【０９２１】
［Ｃ７］前記宿主細胞が、ラクトバチルス属（例えば、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・フルクチボランス（Lactobacillus fructivorans）、若しくはラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri））、又はプロピオニバクテリウム属（例えば、プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Propionibacterium freudenreichii））のメンバーである、段落Ｃ６に記載の組み換え宿主細胞。
【０９２２】
［Ｃ８］前記アルデヒドデヒドロゲナーゼが、
（ａ）配列番号２７、３０、３３、５１、５４、５７、６０、又は６３の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するアルデヒドデヒドロゲナーゼ；
（ｂ）配列番号２５、２６、２８、２９、３１、３２、４８、４９、５０、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、若しくは６２の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアルデヒドデヒドロゲナーゼ；及び
（ｃ）配列番号２５、２６、２８、２９、３１、３２、４８、４９、５０、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、又は６２の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるアルデヒドデヒドロゲナーゼ
から選択される、段落Ｃ３〜Ｃ７のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０９２３】
［Ｃ９］前記アルデヒドデヒドロゲナーゼが、配列番号２７、３０、３３、５１、５４、５７、６０、又は６３の成熟ポリペプチドと、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する、段落Ｃ３〜Ｃ８のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０９２４】
［Ｃ１０］前記アルデヒドデヒドロゲナーゼが、配列番号２５、２６、２８、２９、３１、３２、４８、４９、５０、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、若しくは６２の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件、例えば中ストリンジェンシー条件、中〜高ストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件、又は極めて高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、段落Ｃ３〜Ｃ９のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０９２５】
［Ｃ１１］前記アルデヒドデヒドロゲナーゼが、配列番号２５、２６、２８、２９、３１、３２、４８、４９、５０、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、又は６２の成熟ポリペプチドコーディング配列と、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる、段落Ｃ３〜Ｃ１０のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０９２６】
［Ｃ１２］前記アルデヒドデヒドロゲナーゼが、配列番号２７、３０、３３、５１、５４、５７、６０、又は６３のアミノ酸配列を含む、又はからなる、段落Ｃ３〜Ｃ１１のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０９２７】
［Ｃ１３］前記アルデヒドデヒドロゲナーゼが、配列番号２７、３０、３３、５１、５４、５７、６０、又は６３の成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を含む、又はからなる、段落Ｃ３〜Ｃ１２のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０９２８】
［Ｃ１４］前記アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドとは異種のプロモーターと作動式に連結される、段落Ｃ３〜Ｃ１３のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０９２９】
［Ｃ１５］前記チオラーゼが、
（ａ）配列番号３、３５、１１４、又は１１６の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％配列同一性を有するチオラーゼ；
（ｂ）配列番号１、２、３４、１１３、若しくは１１５の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるチオラーゼ；及び
（ｃ）配列番号１、２、３４、１１３、又は１１５の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるチオラーゼ
から選択される、段落Ｃ３〜Ｃ１４のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０９３０】
［Ｃ１６］前記チオラーゼをコードする異種のポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドとは異種のプロモーターと作動式に連結される、段落Ｃ３〜Ｃ１５のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０９３１】
［Ｃ１７］前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼが、スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼである、段落Ｃ３〜Ｃ１６のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０９３２】
［Ｃ１８］前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼが、アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼである、段落Ｃ３〜Ｃ１６のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０９３３】
［Ｃ１９］前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼが、第一のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチド、及び第二のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質複合体であって、
ここで前記第一のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号６の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号４若しくは５の成熟ポリペプチドコーディング配列又はこれらの完全長相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号４又は５の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択され、
そして前記第二のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号９の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号７若しくは８の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号７又は８の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択される、
段落Ｃ３〜Ｃ１８のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０９３４】
［Ｃ２０］前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼが、第一のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチド、及び第二のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、スクシニル−ＣｏＡ：アセトアセテートトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質複合体であって、
ここで前記第一のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号１２の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号１０若しくは１１の成熟ポリペプチドコーディング配列又はこれらの完全長相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号１０又は１１の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択され、
そして前記第二のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号１５の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号１３若しくは１４の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号１３又は１４の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択される、
段落Ｃ３〜Ｃ１８のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０９３５】
［Ｃ２１］前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼが、第一のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチド、及び第二のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質複合体であって、
ここで前記第一のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号３７の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号３６の成熟ポリペプチドコーディング配列又はこれらの完全長相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号３６の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択され、
そして前記第二のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号３９の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号３８の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号３８の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択される、
段落Ｃ３〜Ｃ１８のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０９３６】
［Ｃ２２］前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼが、第一のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチド、及び第二のポリペプチドサブユニットをコードする異種のポリヌクレオチドを含む、アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質複合体であって、
ここで前記第一のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号４１の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号４０の成熟ポリペプチドコーディング配列又はこれらの完全長相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号４０の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択され、
そして前記第二のポリペプチドサブユニットが、（ａ）配列番号４３の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号４２の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；及び（ｃ）配列番号４２の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドから選択される、
段落Ｃ３〜Ｃ１８のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０９３７】
［Ｃ２３］ＣｏＡ−トランスフェラーゼをコードする１又は複数の（いくつかの）異種のポリヌクレオチドが、異種のプロモーターと作動式に連結される、段落Ｃ３〜Ｃ２２のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０９３８】
［Ｃ２４］前記アセトアセテートデカルボキシラーゼが、
（ａ）配列番号１８、４５、１１８、又は１２０の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するアセトアセテートデカルボキシラーゼ；
（ｂ）配列番号１６、１７、４４、１１７、若しくは１１９の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアセトアセテートデカルボキシラーゼ；及び
（ｃ）配列番号１６、１７、４４、１１７、又は１１９の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるアセトアセテートデカルボキシラーゼ
から選択される、段落Ｃ３〜Ｃ２３のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０９３９】
［Ｃ２５］前記アセトアセテートデカルボキシラーゼをコードする異種のポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドとは異種のプロモーターと作動式に連結される、段落Ｃ３〜Ｃ２４のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０９４０】
［Ｃ２６］前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼが、
（ａ）配列番号２１、２４、４７、又は１２２の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するイソプロパノールデヒドロゲナーゼ；
（ｂ）配列番号１９、２０、２２、２３、４６、若しくは１２１の成熟ポリペプチドコーディング配列、又はこれらの完全長相補鎖と、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるイソプロパノールデヒドロゲナーゼ；及び
（ｃ）配列番号１９、２０、２２、２３、４６、又は１２１の成熟ポリペプチドコーディング配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるイソプロパノールデヒドロゲナーゼ
からなる群から選択される、段落Ｃ３〜Ｃ２５のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０９４１】
［Ｃ２７］前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼをコードする異種のポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドとは異種のプロモーターと作動式に連結される、段落Ｃ３〜Ｃ２６のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０９４２】
［Ｃ２８］前記宿主細胞が、１時間あたり約０．１ｇ／Ｌ超、例えば１時間あたり約０．２ｇ／Ｌ超、１時間あたり約０．５ｇ／Ｌ超、１時間あたり約０．７５ｇ／Ｌ超、１時間あたり約１．０ｇ／Ｌ超、１時間あたり約１．２５ｇ／Ｌ超、１時間あたり約１．５ｇ／Ｌ超、１時間あたり約１．７５ｇ／Ｌ超、１時間あたり約２．０ｇ／Ｌ超、１時間あたり約２．２５ｇ／Ｌ超、１時間あたり約２．５ｇ／Ｌ超、又は１時間あたり約３．０ｇ／Ｌ超のイソプロパノール及び／又はｎ−プロパノール容積生産性を有する、段落Ｃ１〜Ｃ２７のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞。
【０９４３】
［Ｃ２９］段落Ｃ１〜Ｃ２８のいずれか一つに記載の組み換え宿主細胞を含む、組成物。
【０９４４】
［Ｃ３０］前記培地が発酵基質を含む、段落Ｃ２９に記載の組成物。
【０９４５】
［Ｃ３１］前記発酵基質が、サトウキビ汁（例えば、未滅菌サトウキビ汁）である、段落Ｃ３０に記載の組成物。
【０９４６】
［Ｃ３２］イソプロパノール及び／又はｎ−プロパノールを更に含む、段落Ｃ２９〜Ｃ３１のいずれか一つに記載の組成物。
【０９４７】
［Ｃ３３］前記イソプロパノール及び／又はｎ−プロパノールが、力価において、約０．０１ｇ／Ｌ超、例えば約０．０２ｇ／Ｌ、０．０５ｇ／Ｌ、０．０７５ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、８５ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１２５ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、又は２５０ｇ／Ｌ超である、段落Ｃ３２に記載の組成物。
【０９４８】
［Ｃ３４］ｎ−プロパノール及びイソプロパノールを生産する方法であって、
（ａ）ｎ−プロパノール及びイソプロパノールを生産するための好適な条件下において、培地中で段落Ｃ１〜Ｃ２８に記載の組み換え宿主細胞を培養し；そして
（ｂ）前記ｎ−プロパノール及びイソプロパノールを回収すること
を含む、方法。
【０９４９】
［Ｃ３５］前記培地が発酵培地である、段落Ｃ３４に記載の方法。
【０９５０】
［Ｃ３６］前記発酵培地が、サトウキビ汁（例えば、未滅菌サトウキビ汁）を含む、段落Ｃ３５に記載の方法。
【０９５１】
［Ｃ３７］生産されるｎ−プロパノール及び／又はイソプロパノールが、力価において、約０．０１ｇ／Ｌ超、例えば約０．０２ｇ／Ｌ、０．０５ｇ／Ｌ、０．０７５ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、８５ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１２５ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、又は２５０ｇ／Ｌ超である、段落Ｃ３４〜Ｃ３６のいずれか一つに記載の方法。
【０９５２】
［Ｃ３８］回収されたｎ−プロパノール及びイソプロパノールを蒸留により精製することを更に含む、段落Ｃ３４〜Ｃ３７のいずれか一つに記載の方法。
【０９５３】
［Ｃ３９］還元剤の存在下で、プロピオンアルデヒド混入物質をｎ−プロパノールに変換すること、そして／あるいはアセトン混入物質をイソプロパノールに変換することにより、回収されたｎ−プロパノール及びイソプロパノールを精製することを更に含む、段落Ｃ３４〜Ｃ３８のいずれか一つに記載の方法。
【０９５４】
［Ｃ４０］得られたｎ−プロパノール及びイソプロパノールが、実質的に純粋である、段落Ｃ３４〜Ｃ３９のいずれか一つに記載の方法。
【０９５５】
［Ｃ４１］プロピレンを生産する方法であって、
（ａ）ｎ−プロパノール及びイソプロパノールを生産するための好適な条件下において、培地中で段落Ｃ１〜Ｃ２８に記載の組み換え宿主細胞を培養し；
（ｂ）前記ｎ−プロパノール及びイソプロパノールを回収し；
（ｃ）プロピレンを生産するための好適な条件下で、ｎ−プロパノール及びイソプロパノールを脱水し；そして
（ｄ）前記プロピレンを回収すること
を含む、方法。
【０９５６】
［Ｃ４２］前記培地が発酵培地である、段落Ｃ４１に記載の方法。
【０９５７】
［Ｃ４３］前記発酵培地が、サトウキビ汁（例えば、未滅菌サトウキビ汁）を含む、段落ＢＣ４２に記載の方法。
【０９５８】
生産されたｎ−プロパノール及び／又はイソプロパノールが、力価において、約０．０１ｇ／Ｌ超、例えば約０．０２ｇ／Ｌ、０．０５ｇ／Ｌ、０．０７５ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、８５ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１２５ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、又は２５０ｇ／Ｌ超である、段落Ｃ４１〜Ｃ４３のいずれか一つに記載の方法。
【０９５９】
［Ｃ４５］ｎ−プロパノール及びイソプロパノールを脱水することが、酸触媒でｎ−プロパノール及びイソプロパノールを処理することを含む、段落Ｃ４１〜Ｃ４３のいずれか一つに記載の方法。
【０９６０】
本明細書に開示される特定の態様は、本発明のいくつかの態様の例証として意図され、本明細書に記載され、請求される本発明は、これらの態様により範囲が限定されるものではない。任意の同等の態様は、本発明の範囲内であることを意図する。実際、本明細書に示され、記載されるものに加えて、本発明の様々な改変は、上述の記載から当業者に明らかになる。かかる改変はまた、特許請求の範囲内であることを意図する。矛盾する場合、定義を含む本開示が支配する。
【図１】
2013544083.tif 000045
【図２】
2013544083.tif 000046
【図３】
2013544083.tif 000047
【図４】
2013544083.tif 000048
【図５】
2013544083.tif 000049
【図６】
2013544083.tif 000050
【配列表】
2013544083000001.app
【国際調査報告】
2013544083.tif 000051
2013544083.tif 000052
2013544083.tif 000053