(57)【要約】  リアルタイムＰＣＲの間の多形成の検出のための方法及びキットに係り、該ターゲット核酸配列のリアルタイムＰＣＲ増幅は、目的単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の横に配置された配列にアニーリングするＰＣＲプライマーを使用して行われる。該リアルタイムＰＣＲ反応は、ＳＮＰ位置のＤＮＡ配列にアニーリングするように考案された、ＲＮＡ配列を含む標識されたプローブを含む。その後、ＰＣＲ断片のＳＮＰと、ＳＮＰに相補的な前記プローブのＲＮＡ配列との間にＲＮＡ：ＤＮＡ異型二本鎖が形成される。該ＲＮＡ：ＤＮＡ異型二本鎖内ＲＮＡ配列のＲＮａｓｅ Ｈ切断は、ターゲット核酸内ＳＮＰの存在を示す、該標識から発生する信号強度の増加を引き起こす。
2013545442.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）多形成を有するターゲットＤＮＡの存在について試験されるサンプルを提供する段階と、
ｂ）前記ターゲットＤＮＡにアニーリングすることができる増幅プライマー対を提供する段階であり、第１増幅プライマーは、多形成位置の上流にアニーリングし、第２増幅プライマーは、多形成位置の下流にアニーリングする段階と、
ｃ）検出可能な標識、並びにＤＮＡ核酸配列及びＲＮＡ核酸配列を含むプローブを提供する段階であり、前記プローブのＲＮＡ核酸配列は、前記多形成を含むターゲットＤＮＡ配列の選択された領域に完全に相補的であり、前記プローブのＤＮＡ核酸配列は、前記ターゲットＤＮＡ配列の選択された領域に隣接したＤＮＡ配列に実質的に相補的である段階と、
ｄ）前記プローブ内のＲＮＡ配列が、前記多形成を含むＰＣＲ断片内の相補的なＤＮＡ配列とＲＮＡ：ＤＮＡ異型二本鎖を形成することができる条件下で、増幅ポリメラーゼ活性、増幅緩衝液、ＲＮａｓｅ Ｈ活性とプローブとの存在下で、前記第１増幅プライマー及び第２増幅プライマー間のＰＣＲ断片を増幅させる段階と、
ｅ）前記プローブ上の標識からの信号放出のリアルタイム増加を検出する段階と、を含み、
前記信号の増加は、ターゲットＤＮＡ内多形成の存在を示すターゲットＤＮＡ内多形成のリアルタイム検出方法。
【請求項２】
前記プロープ上の標識からの信号放出のリアルタイム増加は、前記ＲＮＡ：ＤＮＡ異型二本鎖内プローブのＲＮＡ配列のＲＮａｓｅ Ｈ切断から引き起こされることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プローブのＲＮＡ核酸配列は、前記ターゲットＤＮＡ内の多形成に相補的であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記多形成は、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記プローブのＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列は、共有結合されていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記プローブ上の検出可能な標識は、蛍光標識であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記蛍光標識は、ＦＲＥＴ対を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＣＲ断片は、固体支持体に結合されていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ａ）多形成を有するターゲットＤＮＡの存在について試験されるサンプルを提供する段階と、
ｂ）前記ターゲットＤＮＡにアニーリングすることができる増幅プライマー対を提供する段階であり、第１増幅プライマーは、多形成位置の上流にアニーリングし、第２増幅プライマーは、前記多形成位置の下流にアニーリングする段階と、
ｃ）検出可能な標識、並びにＤＮＡ核酸配列及びＲＮＡ核酸配列を含むプローブを提供する段階であり、前記プローブのＲＮＡ核酸配列は、前記多形成位置で、野生型ＤＮＡ配列を含むターゲットＤＮＡ配列の選択された部位に完全に相補的であり、前記プローブのＤＮＡ核酸配列は、前記ターゲットＤＮＡ配列の選択された部位に隣接したＤＮＡ配列に実質的に相補的である段階と、
ｄ）前記プローブ内のＲＮＡ配列が、前記多形成を含むＰＣＲ断片内の相補的なＤＮＡ配列とＲＮＡ：ＤＮＡ異型二本鎖を形成することができる条件下で、増幅ポリメラーゼ活性、増幅緩衝液、ＲＮａｓｅ Ｈ活性とプローブとの存在下で、前記第１増幅プライマー及び第２増幅プライマー間のＰＣＲ断片を増幅させる段階と、
ｅ）前記プローブ上の標識からの信号放出のリアルタイム減少を検出する段階と、を含み、
前記信号の減少は、前記ターゲットＤＮＡ内の多形成の存在を示すターゲットＤＮＡ内多形成のリアルタイム検出方法。
【請求項１０】
ａ）多形成を有するターゲットＲＮＡの存在について試験されるサンプルを提供する段階と、
ｂ）前記ＲＮＡターゲットのｃＤＮＡにアニーリングすることができる増幅プライマー対を提供する段階であり、第１増幅プライマーは、多形成位置の上流にアニーリングし、第２増幅プライマーは、前記多形成位置の下流にアニーリングする段階と、
ｃ）検出可能な標識、並びにＤＮＡ核酸配列及びＲＮＡ核酸配列を含むプローブを提供する段階であり、前記プローブのＲＮＡ核酸配列は、多形成を含むｃＤＮＡ配列の選択された部位に完全に相補的であり、前記プローブのＤＮＡ核酸配列は、前記ｃＤＮＡ配列の選択された部位に隣接したＤＮＡ配列に実質的に相補的である段階と、
ｄ）逆転写酵素活性、増幅ポリメラーゼ活性、逆転写酵素ＰＣＲ緩衝液、ＲＮａｓｅ Ｈ活性とプローブとの存在下、及び前記プローブ内のＲＮＡ配列が、前記多形成を含むＲＴ−ＰＣＲ ＤＮＡ断片内の相補的な配列とＲＮＡ：ＤＮＡ異型二本鎖を形成することができる条件下で、前記第１増幅プライマー及び第２増幅プライマー間の逆転写酵素ＰＣＲ断片を増幅させる段階と、
ｅ）前記プローブ上の標識からの信号放出のリアルタイム増加を検出する段階と、を含み、
前記信号の増加は、前記ＲＮＡターゲット内の多形成の存在を示すＲＮＡターゲット内多形成のリアルタイム検出方法。
【請求項１１】
前記プロープ上の標識からの信号放出のリアルタイム増加は、前記ＲＮＡ：ＤＮＡ異型二本鎖内プローブのＲＮＡ配列のＲＮａｓｅ Ｈ切断から引き起こされることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記プローブのＲＮＡ核酸配列は、前記ターゲットＲＮＡ内の多形成位置のｃＤＮＡに相補的なＲＮＡ配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記多形成は、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＲＮＡターゲットは、ｍＲＮＡ転写体であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記プローブのＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列は、共有結合されていることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記プローブ上の検出可能な標識は、蛍光標識であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記蛍光標識は、ＦＲＥＴ対であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記プローブまたはＰＣＲ断片は、固体支持体に結合されたことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＲＮａｓｅ Ｈ活性は、ホットスタート、熱安定性の活性であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
ａ）多形成を有するＲＮＡターゲットの存在について試験されるサンプルを提供する段階と、
ｂ）前記ＲＮＡターゲットのｃＤＮＡにアニーリングすることができる増幅プライマー対を提供する段階であり、第１増幅プライマーは、多形成位置の上流にアニーリングし、第２増幅プライマーは、前記多形成位置の下流にアニーリングする段階と、
ｃ）検出可能な標識、並びにＤＮＡ核酸配列及びＲＮＡ核酸配列を含むプローブを提供する段階であり、前記プローブのＲＮＡ核酸配列は、前記多形成位置で、野生型ＤＮＡ配列を含むｃＤＮＡの選択された部位に完全に相補的であり、前記プローブのＤＮＡ核酸配列は、前記ｃＤＮＡの選択された部位に隣接したＤＮＡ配列に実質的に相補的である段階と、
ｄ）逆転写酵素活性、増幅ポリメラーゼ活性、逆転写酵素ＰＣＲ緩衝液、ＲＮａｓｅ Ｈ活性とプローブとの存在下、及び前記プローブ内のＲＮＡ配列が、前記多形成を含むＲＴ−ＰＣＲ ＤＮＡ断片内の相補的な配列とＲＮＡ：ＤＮＡ異型二本鎖を形成することができる条件下で、前記第１増幅プライマー及び第２増幅プライマー間の逆転写酵素ＰＣＲ断片を増幅させる段階と、
ｅ）前記プローブ上の標識からの信号放出のリアルタイム減少を検出する段階とを含み、
前記信号の減少は、前記ＲＮＡターゲット内の多形成の存在を示すＲＮＡターゲット内多形成のリアルタイム検出方法。
【請求項２１】
ａ）第１増幅プライマーは、多形成位置の上流にアニーリングし、第２増幅プライマーは、多形成位置の下流にアニーリングする、ターゲットＤＮＡにアニーリングすることができる増幅プライマー対と、
ｂ）検出可能な標識、並びにＤＮＡ核酸配列及びＲＮＡ核酸配列を含むプローブであり、前記プローブのＲＮＡ核酸配列は、多形成を含むターゲットＤＮＡ配列の選択された部位に完全に相補的であり、前記プローブのＤＮＡ核酸配列は、前記ターゲットＤＮＡ配列の選択された部位に隣接したＤＮＡ配列に実質的に相補的であるプローブと、
ｃ）増幅ポリメラーゼ活性、増幅緩衝液及びＲＮａｓｅ Ｈ活性とを含むターゲットＤＮＡ内多形成のリアルタイム検出のためのキット。
【請求項２２】
前記プローブのＲＮＡ核酸配列は、前記ターゲットＤＮＡ内多形成に相補的な配列を含むことを特徴とする請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記多形成は、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）であることを特徴とする請求項２１に記載のキット。
【請求項２４】
前記プローブのＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列は、共有結合されていることを特徴とする請求項２１に記載のキット。
【請求項２５】
前記プローブ上の検出可能な標識は、蛍光標識であることを特徴とする請求項２１に記載のキット。
【請求項２６】
前記蛍光標識は、ＦＲＥＴ対であることを特徴とする請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記プローブまたはＰＣＲ断片は固体支持体に結合されたことを特徴とする請求項２１に記載のキット。
【請求項２８】
ａ）第１増幅プライマーは、多形成位置の上流にアニーリングし、第２増幅プライマーは、多形成位置の下流にアニーリングする、ターゲットＤＮＡにアニーリングすることができる増幅プライマー対と、
ｂ）検出可能な標識、並びにＤＮＡ核酸配列及びＲＮＡ核酸配列を含むプローブであり、前記プローブのＲＮＡ核酸配列は、多形成位置で、野生型ＤＮＡ配列を含むターゲットＤＮＡ配列の選択された部位に完全に相補的であり、前記プローブのＤＮＡ核酸配列は、前記ターゲットＤＮＡ配列の選択された部位に隣接したＤＮＡ配列に実質的に相補的であるプローブと、
ｃ）増幅ポリメラーゼ活性、増幅緩衝液及びＲＮａｓｅ Ｈ活性とを含むターゲットＤＮＡ内多形成のリアルタイム検出のためのキット。
【請求項２９】
ａ）第１増幅プライマーは、多形成配列位置の上流にアニーリングし、第２増幅プライマーは、多形成配列位置の下流にアニーリングする、ＲＮＡターゲットのｃＤＮＡにアニーリングすることができる増幅プライマー対と、
ｂ）検出可能な標識、並びにＤＮＡ核酸配列及びＲＮＡ核酸配列を含むプローブであり、前記プローブのＲＮＡ核酸配列は、多形成を含むｃＤＮＡの選択された部位に完全に相補的であり、前記プローブのＤＮＡ核酸配列は、前記ｃＤＮＡの選択された部位に隣接したＤＮＡ配列に実質的に相補的であるプローブと、
ｃ）逆転写酵素活性、増幅ポリメラーゼ活性、逆転写酵素ＰＣＲ緩衝液；及びＲＮａｓｅ Ｈ活性とを含むＲＮＡターゲット内多形成のリアルタイム検出のためのキット。
【請求項３０】
前記プローブのＲＮＡ核酸配列は、前記ターゲットＤＮＡ内多形成の位置に相補的な配列を含むことを特徴とする請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
前記多形成は、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）であることを特徴とする請求項２９に記載のキット。
【請求項３２】
前記プローブのＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列は、共有結合されていることを特徴とする請求項２９に記載のキット。
【請求項３３】
前記プローブ上の検出可能な標識は、蛍光標識であることを特徴とする請求項２８に記載のキット。
【請求項３４】
前記蛍光標識は、ＦＲＥＴ対であることを特徴とする請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
前記プローブまたは逆転写酵素ＰＣＲ断片は、固体支持体に結合されたことを特徴とする請求項２９に記載のキット。
【請求項３６】
前記逆転写酵素活性及び増幅ポリメラーゼ活性は、同一の分子で発見されることを特徴とする請求項２９に記載のキット。
【請求項３７】
ａ）第１増幅プライマーは、多形成配列位置の上流にアニーリングし、第２増幅プライマーは、多形成配列位置の下流にアニーリングする、ＲＮＡターゲットのｃＤＮＡにアニーリングすることができる増幅プライマー対と、
ｂ）検出可能な標識、並びにＤＮＡ核酸配列及びＲＮＡ核酸配列を含むプローブであり、前記プローブのＲＮＡ核酸配列は、多形成位置で、野生型ＤＮＡ配列を含むｃＤＮＡの選択された部位に完全に相補的であり、前記プローブのＤＮＡ核酸配列は、前記ｃＤＮＡの選択された部位に隣接したＤＮＡ配列に実質的に相補的であるプローブと、
ｃ）逆転写酵素活性、増幅ポリメラーゼ活性、逆転写酵素ＰＣＲ緩衝液；及びＲＮａｓｅ Ｈ活性とを含むＲＮＡターゲット内多形成のリアルタイム検出のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、２０１０年１０月７日付けで提出された米国仮特許出願第６１／３９０，７０１号、及び２０１１年６月１３日付けで提出された米国特許出願第１３／１５８，５９３号に係わる優先権を主張し、その内容は、参照によって全体として本明細書に挿入される。
【０００２】
本発明は、ＳＮＰ特異的CataCleave（商標）プローブを使用した単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ：single nucleotide polymorphism）のリアルタイムＰＣＲに関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトゲノムプロジェクト（ＨＧＰ：human genome project）の完成は、特定のヒト個体群内での遺伝的多様性、及び多様性が遺伝的疾患（genetic disease）の発病または素因（predisposition）といかように係わるかということに係わるさらにすぐれた理解を可能にした。例えば、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）とされる個体間の単一ヌクレオチド差は、一部状況では、だれが特定の疾患を病むだろうか、あるいはだれが前記疾患に対する特別な治療に反応するかということを予測することができる、表現型における劇的な違いに係わる原因ともなりうる。薬物誘電体学（pharmacogenomics）の範囲は、医学的治療が患者の遺伝的構成（genetic make-up）にあつらえられる迅速なアプローチ方法である。患者のＤＮＡで、遺伝的突然変異の迅速であって信頼するだけの検出は、医師の臨床的診断及び医学的治療の選択指針を提供することができる。これは、発癌遺伝子（oncogene）のコーディング領域（coding region）内の分離突然変異（discrete mutation）の存在が、癌感受性（susceptibility）及び予後の強力な予測子である腫瘍学（oncology）で特に事実である。
【０００４】
例えば、ＢＲＣＡ腫瘍抑制遺伝子（tumor suppressor gene）内の有害な突然変異の存在に対する遺伝子検査は、今やほとんどの医療行為において一般的である。有害なＢＲＣＡ−１突然変異は、低い年齢では、（閉経前）女性の乳房癌及び／または卵巣癌の発病危険、及び子宮頚部癌、子宮癌、膵臓癌及び大腸癌の発病危険を大きく増大させる。有害なＢＲＣＡ２突然変異は、追加して膵臓癌、胃癌、胆嚢癌及び胆道癌及び黒色腫の危険を増大させる。ＴＰ５３、ＰＴＥＮ、ＳＴＫ１１／ＬＫＢ１、ＣＤＨ１、ＣＨＥＫ２、ＡＴＭ、ＭＬＨ１及びＭＳＨ２を含む、さまざまな他の遺伝子の突然変異が、遺伝性（hereditary）乳房腫瘍及び／または卵巣腫瘍と関連性があった。
【０００５】
核酸増幅の出現で、任意のＤＮＡ配列の中の単一分子ほど小さいものでも、ＳＮＰ配列分析を可能にするのに十分な回数で複製される。ＳＮＰは、ＤＮＡ配列分析（ＤＮＡ sequencing）、蛍光プローブ検出（fluorescent probe detection）、質量分光分析（mass spectrometry）またはＤＮＡマイクロアレイ混成化（ＤＮＡ microarray hybridization）（例えば、特許文献１，２）のような多様な技法によって検出される。該方法のうち多数が、全般的な不良な敏感度（sensitivity）、コスト、時間浪費または後ＰＣＲ処理（post−ＰＣＲ processing）の必要性により、高い出願処理量にもかかわらず、不十分な状態である。現存するＳＮＰ検出方法はまた、許容することができない高いレベルの偽陽性（false positive）及び／または偽陰性（false negative）の結果を示す。
【０００６】
前述の理由によって、ＤＮＡ増幅と同時に遂行されるＳＮＰの正確なリアルタイム検出に係わる充足されない要求が当該技術分野に存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国登録特許第５，８８５，７７５号明細書
【特許文献２】米国登録特許第６，３６８，７９９号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列を含む特異的プローブを使用するリアルタイムＰＣＲの間、ＳＮＰの迅速な検出のための方法及びそのキットを開示するものである。前記方法は、コスト効率が高く、信頼するだけの方法であり、単一ＰＣＲ断片上の一つ以上のＳＮＰの高処理率検出（high throughput detection）を促進するように保証する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一具現例において、多形成を有するターゲットＤＮＡの存否について試験するサンプルを提供する段階と、第１増幅プライマーが、前記多形成位置（position of the polymorphism）の上流にアニーリングし、第２増幅プライマーは、前記多形成位置の下流にアニーリングする、前記ターゲットＤＮＡにアニーリングすることができる増幅プライマー（amplification primer）対を提供する段階と、検出可能な標識（label）と、ＤＮＡ核酸配列及びＲＮＡ核酸配列とを含むプローブを提供する段階であり、前記プローブのＲＮＡ核酸配列は、多形成を含むターゲットＤＮＡ配列の選択された部位に完全に相補的であり（entirely complementary）、前記プローブのＤＮＡ核酸配列は、前記ターゲットＤＮＡ配列の選択された部位に隣接したＤＮＡ配列に実質的に相補的（substantially complementary）である段階と、前記プローブ内のＲＮＡ配列が、多形成を含むＰＣＲ断片内の相補的なＤＮＡ配列と、ＲＮＡ：ＤＮＡ異型二本鎖（heteroduplex）とを形成することができる条件下で、増幅ポリメラーゼ（amplifying polymerase）活性、増幅緩衝液（amplification buffer）、ＲＮａｓｅ Ｈ活性とプローブとの存在下で、前記第１増幅プライマー及び第２増幅プライマー間のＰＣＲ断片を増幅させる段階と、前記プローブ上の標識からの信号放出のリアルタイム増加を検出する段階と、を含み、前記信号の増加は、ターゲットＤＮＡ内の多形成の存在を示す、ターゲットＤＮＡ内多形成のリアルタイム検出のための方法が開示される。
【００１０】
一様態で、前記プローブ上の標識からの信号放出のリアルタイム増加は、前記ＲＮＡ：ＤＮＡ異型二本鎖内の、プローブのＲＮＡ配列のＲＮａｓｅ Ｈ切断に起因する。
他の具体例において、多形成を有するターゲットＤＮＡの存否について試験するサンプルを提供する段階と、第１増幅プライマーが、前記多形成位置の上流にアニーリングし、第２増幅プライマーは、前記多形成位置の下流にアニーリングする、前記ターゲットＤＮＡにアニーリングすることができる増幅プライマー対を提供する段階と、検出可能な標識、及びＤＮＡ核酸配列及びＲＮＡ核酸配列を含むプローブを提供する段階であり、前記プローブのＲＮＡ核酸配列は、前記多形成位置で、野生型（wild type）ＤＮＡ配列を含むターゲットＤＮＡ配列の選択された部位に完全に相補的であり、前記プローブのＤＮＡ核酸配列は、前記ターゲットＤＮＡ配列の選択された部位に隣接したＤＮＡ配列に実質的に相補的である段階と、前記プローブ内のＲＮＡ配列が、多形成を含むＰＣＲ断片内の相補的なＤＮＡ配列とＲＮＡ：ＤＮＡ異型二本鎖を形成することができる条件下で、増幅ポリメラーゼ活性、増幅緩衝液、ＲＮａｓｅ Ｈ活性とプローブとの存在下で、前記第１増幅プライマー及び第２増幅プライマー間のＰＣＲ断片を増幅させる段階と、前記プローブ上の標識からの信号放出のリアルタイム減少を検出する段階と、を含み、前記信号の減少は、ターゲットＤＮＡ内の多形成の存在を示す、ターゲットＤＮＡ内多形成のリアルタイム検出のための方法が開示される。
【００１１】
さらに他の具体例において、ＲＮＡターゲットを提供する段階と、前記ＲＮＡターゲットのｃＤＮＡにアニーリングすることができる増幅プライマー対を提供する段階であり、第１増幅プライマーは、多形成配列位置の上流にアニーリングし、第２増幅プライマーは、多形成配列位置の下流にアニーリングする段階と、検出可能な標識、及び前記ＲＮＡターゲットのｃＤＮＡに実質的に相補的なＤＮＡ核酸配列及びＲＮＡ核酸配列を含むプローブを提供する段階であり、前記プローブのＲＮＡ核酸配列は、予想（suspected）ＳＮＰ配列位置の相応するｃＤＮＡ配列に完全に相補的である段階と、逆転写酵素（reverse transcriptase）活性、増幅ポリメラーゼ活性、逆転写酵素ＰＣＲ緩衝液、部位特異的（site-specific）ＲＮａｓｅ Ｈ活性とプローブとの存在下、及び前記プローブ内のＲＮＡ配列が、ＲＴ−ＰＣＲ ＤＮＡ断片内の相補的なＤＮＡ配列とＲＮＡ：ＤＮＡ異型二本鎖を形成することができる条件下で、前記第１増幅プライマー及び第２増幅プライマー間の逆転写酵素ＰＣＲ断片を増幅させる段階と、前記プローブ上の標識からの信号放出のリアルタイム増加を検出する段階と、を含み、前記信号の増加は、ＲＮＡターゲットのｃＤＮＡ内の多形成の存在を示す、ＲＮＡターゲット内多形成のリアルタイム検出のための方法が開示される
【００１２】
一様態で、前記プローブ上の標識からの信号放出のリアルタイム増加は、前記ＲＮＡ：ＤＮＡ異型二本鎖内の、プローブのＲＮＡ配列のＲＮａｓｅ Ｈ切断に起因する。
さらに他の具体例において、多形成を有するＲＮＡターゲットについて試験されるサンプルを提供する段階と、前記ＲＮＡターゲットのｃＤＮＡにアニーリングすることができる増幅プライマー対を提供する段階であり、第１増幅プライマーは、多形成位置の上流にアニーリングし、第２増幅プライマーは、多形成位置の下流にアニーリングする段階と、検出可能な標識、及びＤＮＡ核酸配列及びＲＮＡ核酸配列を含むプローブを提供する段階であり、前記プローブのＲＮＡ核酸配列は、多形成位置で、野生型ＤＮＡ配列を含むｃＤＮＡの選択された部位に完全に相補的であり、前記プローブのＤＮＡ核酸配列は、前記ｃＤＮＡの選択された部位に隣接したＤＮＡ配列に実質的に相補的である段階と、逆転写酵素活性、増幅ポリメラーゼ活性、逆転写酵素ＰＣＲ緩衝液、ＲＮａｓｅ Ｈ活性とプローブとの存在下、及び前記プローブ内のＲＮＡ配列が、多形成位置で、野生型ＤＮＡ配列を含むＲＴ−ＰＣＲ ＤＮＡ断片内の相補的な配列とＲＮＡ：ＤＮＡ異型二本鎖を形成することができる条件下で、前記第１増幅プライマー及び第２増幅プライマー間の逆転写酵素ＰＣＲ断片を増幅させる段階と、前記プローブ上の標識からの信号放出のリアルタイム減少を検出する段階と、を含み、前記信号の減少は、ＲＮＡターゲット内の多形成の存在を示す、ＲＮＡターゲット内多形成のリアルタイム検出のための方法が開示される。
【００１３】
さらに他の具体例において、第１増幅プライマーは、多形成位置の上流にアニーリングし、第２増幅プライマーは、多形成位置の下流にアニーリングする、ターゲットＤＮＡにアニーリングすることができる増幅プライマー対と、検出可能な標識、並びにＤＮＡ核酸配列及びＲＮＡ核酸配列を含むプローブであり、前記プローブのＲＮＡ核酸配列は、多形成を含むターゲットＤＮＡ配列の選択された部位に完全に相補的であり、前記プローブのＤＮＡ核酸配列は、前記ターゲットＤＮＡ配列の選択された部位に隣接したＤＮＡ配列に実質的に相補的であるプローブと、増幅ポリメラーゼ活性、増幅緩衝液及びＲＮａｓｅ Ｈ活性とを含む、ターゲットＤＮＡ内多形成のリアルタイム検出のためのキット（kit）が開示される。
【００１４】
さらに他の具体例において、第１増幅プライマーは、多形成位置の上流にアニーリングし、第２増幅プライマーは、多形成位置の下流にアニーリングする、ターゲットＤＮＡにアニーリングすることができる増幅プライマー対と、検出可能な標識、並びにＤＮＡ核酸配列及びＲＮＡ核酸配列を含むプローブであり、前記プローブのＲＮＡ核酸配列は、多形成位置で、野生型ＤＮＡ配列を含むターゲットＤＮＡ配列の選択された部位に完全に相補的であり、前記プローブのＤＮＡ核酸配列は、前記ターゲットＤＮＡ配列の選択された部位に隣接したＤＮＡ配列に実質的に相補的であるプローブと、増幅ポリメラーゼ活性、増幅緩衝液及びＲＮａｓｅ Ｈ活性とを含む、ターゲットＤＮＡ内多形成のリアルタイム検出のためのキットが開示される。
【００１５】
さらに他の具体例において、第１増幅プライマーは、多形成配列（polymorphic sequence）位置の上流にアニーリングし、第２増幅プライマーは、多形成配列位置の下流にアニーリングする、ＲＮＡターゲットのｃＤＮＡにアニーリングすることができる増幅プライマー対と、検出可能な標識、並びにＤＮＡ核酸配列及びＲＮＡ核酸配列を含むプローブであり、前記プローブのＲＮＡ核酸配列は、多形成を含むｃＤＮＡの選択された部位に完全に相補的であり、前記プローブのＤＮＡ核酸配列は、前記ｃＤＮＡの選択された部位に隣接したＤＮＡ配列に実質的に相補的であるプローブと、逆転写酵素活性、増幅ポリメラーゼ活性、逆転写酵素ＰＣＲ緩衝液及びＲＮａｓｅ Ｈ活性とを含む、ＲＮＡターゲット内の多形成のリアルタイム検出のためのキットが開示される。
【００１６】
さらに他の具体例において、第１増幅プライマーは、多形成配列位置の上流にアニーリングし、第２増幅プライマーは、多形成配列位置の下流にアニーリングする、ＲＮＡターゲットのｃＤＮＡにアニーリングすることができる増幅プライマー対と、検出可能な標識、並びにＤＮＡ核酸配列及びＲＮＡ核酸配列を含むプローブであり、前記プローブのＲＮＡ核酸配列は、多形成位置で、野生型ＤＮＡ配列を含むｃＤＮＡの選択された部位に完全に相補的であり、前記プローブのＤＮＡ核酸配列は、前記ｃＤＮＡの選択された部位に隣接したＤＮＡ配列に実質的に相補的であるプローブと、逆転写酵素活性、増幅ポリメラーゼ活性、逆転写酵素ＰＣＲ緩衝液及びＲＮａｓｅ Ｈ活性とを含む、ＲＮＡターゲット内の多形成のリアルタイム検出のためのキットが開示される。
前記多形成は、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ：single nucleotide polymorphism）であってもよい。
【００１７】
前記ターゲットＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ（genomic ＤＮＡ）であってもよい。前記ターゲットＲＮＡは、ゲノムＲＮＡまたはｍＲＮＡ転写体（transcript）であってもよい。
前記プローブのＤＮＡ及びＲＮＡ配列は、共有結合されてもよい。
【００１８】
前記プローブ上の検出可能な標識は、ＦＲＥＴ対のような、蛍光標識（fluorescent label）であってもよい。前記ＰＣＲ断片またはプローブは、固体支持体（solid support）上に結合されたものであってもよい。
【００１９】
前記増幅ポリメラーゼ活性は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであり、前記部位特異的ＲＮａｓｅ Ｈ活性は、熱安定性ＲＮａｓｅ Ｈの活性またはホットスタート（hot start）熱安定性ＲＮａｓｅ Ｈ活性であってもよい。
特定の具体例において、前記逆転写酵素及び増幅ポリメラーゼ活性は、同一の分子で発見される。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、ターゲット核酸で、リアルタイムでＳＮＰの存在を検出する能力を含む多数の利点を有する。前記検出方法は、迅速であり、正確であり、高処理率（high throughput）適用に適する。異なる遺伝子座（genetic loci）でのＳＮＰ検出のための、便利であって、使いやすく、信頼するだけの診断キット（diagnostic kit）がさらに開示される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】サルモネラ（Salmonella）ｉｎｖＡ遺伝子で、野生型ターゲットの等温的検出（isothermal detection）を図示する。正確に対になった場合（野生型プローブ：野生型ターゲット）、蛍光強度の増加が観察されるが、不正確に対になった場合（野生型プローブ：ＳＮＰを含むターゲット）、蛍光強度の増加が観察されない。
【図２】サルモネラｉｎｖＡ遺伝子で、ＳＮＰターゲット（ＴからＧへの塩基変化）の等温的検出を図示する。正確に対になった場合（ＳＮＰプローブ：ＳＮＰターゲット）、蛍光強度の増加が観察されるが、不正確に対になった場合（ＳＮＰプローブ：野生型ターゲット）、蛍光強度の増加が観察されない。
【図３】サルモネラｉｎｖＡ遺伝子で、野生型ターゲットのマルチプレックス・リアルタイム検出（multiplex real time detection）を図示する。同型接合（homozygous）野生型ターゲット、または異型接合（heterozygous）野生型ＳＮＰターゲットの存在時、蛍光強度の増加が観察される。同型接合ＳＮＰターゲットの存在時、蛍光強度の増加が観察されない。
【図４】ＳＮＰ感知型プローブ（ＳＮＰ sensing probe）を使用した、サルモネラｉｎｖＡ遺伝子で、ＳＮＰターゲットのマルチプレックス・リアルタイム検出を図示する。同型接合ＳＮＰターゲットまたは異型接合ＳＮＰ野生型ターゲットの存在時、蛍光強度の増加が観察される。同型接合野生型ターゲットの存在時、蛍光強度の増加が観察されない。
【図５】Ａ１ ｂカゼイン（casein）の等温的検出を図示する。正確に対になった場合（Ａ１プローブ：Ａ１ターゲット）、蛍光強度の増加が観察されるが、不正確に対になった場合（Ａ１プローブ：Ａ２ターゲット）、蛍光強度の増加が観察されない。
【図６】Ａ２ ｂカゼインの等温的検出を図示する。正確に対になったＡ２プローブ：Ａ２ターゲットで蛍光強度の増加が観察されるが、不正確に対になったＡ２プローブ：Ａ１ターゲットの場合蛍光強度の増加が観察されない。
【図７】Ａ１感知型プローブを使用した、Ａ１ ｂカゼインのマルチプレックス・リアルタイム検出を図示する。同型接合Ａ１ターゲットまたは異型接合Ａ１−Ａ２ターゲットの存在時、蛍光強度の増加が観察される。蛍光強度の増加は、同型接合Ａ２ターゲットの存在時には観察されない。
【図８】Ａ２感知型プローブを使用した、Ａ２ ｂカゼインのマルチプレックス・リアルタイム検出を図示する。同型接合Ａ２ターゲットまたは異型接合Ａ１−Ａ２ターゲットの存在時、蛍光強度の増加が観察される。蛍光強度の増加は、同型接合Ａ１ターゲットの存在時には観察されない。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の実施は、取り分けて明示されない場合、当該技術分野内の通常の分子生物学的技法を使用する。かような技法は、熟練技術者に周知であり、文献に十分に説明されている。例えば、Ausubelらによる、すべての補助資料（supplement）を含むCurrent Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc．，NY，N．Y．(1987-2008)；SambrookらによるMolecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring Harbor，N．Y．(1989)を参照する。
【００２３】
取り分けて定義されない場合、本明細書で使用されるすべての技術的用語及び科学的用語は、当該技術分野の通常の技術者によって、一般的に理解されるところと同一の意味を有する。本明細書はまた、本出願の開示内容及び特許請求の範囲の解釈に一助とするための用語の定義を提供する。この定義が他のところでの定義と一致しない場合、本出願で提示された定義が優先される。
【００２４】
用語「多形成（polymorphism）」は、互いに異なるゲノム（genome）または個体の間、または前記ゲノムまたは個体内で、二つ以上の代案的ゲノム配列（genomic sequence）または対立遺伝子（allele）の存在を指す。
【００２５】
用語「多形成の（polymorphic）」は、個体群内で、特定のゲノム配列の２以上の変異体（variant）が発見される状態を指す。
【００２６】
用語「多形成部位（polymorphic site）」は、前記変異が発生する座位（locus）を意味する。多形成部位は、一般的に、２以上の対立遺伝子を有し、それぞれは、選択された個体群内で、有意な頻度で発生する。多形成座位（polymorphic locus）は、１つの塩基対ほど小さく、その場合、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ：single nucleotide polymorphism）とされる。最初に同定された対立遺伝子形態が、任意に基準（reference）、野生型（wild-type）、一般（common）または多数（major）の形態と命名され、他の対立遺伝子形態は、代案的（alternative）、少数（minor）、レア（rare）または変異体（variant）の対立遺伝子と命名される。
【００２７】
用語「遺伝子型（genotype）」は、個体またはサンプルの中に含まれた遺伝子の対立遺伝子（allele）に係わる記述を指す。
【００２８】
用語「単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ：single nucleotide polymorphism）」は、対立遺伝子間に異なる１つのヌクレオチド部位を指す。単一ヌクレオチドは、変化したり（置換）、ポリヌクレオチド配列から除去（欠失）されたり、または付加（挿入）される。挿入ＳＮＭＰまたは欠失ＳＮＰは、翻訳フレームシフト（translational frameshift）を引き起こすことがある。単一ヌクレオチド多型は、遺伝子のコーディング配列（coding sequence）、遺伝子の非コーディング領域（non-coding region）、または遺伝子間の遺伝子間領域（intergenic region）に属することができる。コーディング配列内のＳＮＰは、遺伝子コードの縮退性（degeneracy）により、生産されるタンパク質のアミノ酸配列を必ずしも変化させるものではない。２つの形態がいずれも同一であるポリペプチド配列を引き起こすＳＮＰは、同義的（synonymous）（ときには、沈黙突然変異とされる）と命名されるが、異なるポリペプチド配列が生産される場合、それらは、非同義的（nonsynonymous）である。非同義的変化は、ミスセンス（missense）またはノンセンス（nonsense）であり、ミスセンス変化は、異なるアミノ酸を生成させる一方、ノンセンス変化は、早期ストップコードン（premature stop codon）を引き起こす。「機能的ＳＮＰ（functional ＳＮＰ）」は、遺伝子発現、または遺伝子産物の発現または機能に変化を誘発するＳＮＰであり、従って、可能な臨床的表現型について、ほぼ予測性がある。機能的ＳＮＰによる遺伝子機能の変化は、コーディングされたポリペプチドの変化、ｍＲＮＡ安定性、ＤＮＡまたはＲＮＡに係わる転写因子または翻訳因子の結合性変化などを含む。タンパク質−コーディング領域にないＳＮＰは、遺伝子スプライシング（splicing）、転写因子結合、または非コーディングＲＮＡの配列に対して結果を示すことができる。
【００２９】
一具現例よれば、熟練技術者は、ＳＮＰが、それぞれ染色体内に存在することができるヌクレオチドに該当する２つの代案的対立遺伝子を有するということを理解するであろう。従って、ＳＮＰは、４個のヌクレオチド（Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ）のうち２個のヌクレオチドによって特徴づけられる。その例は、それぞれの染色体上の与えられた位置で、対立形質（allele）Ｃまたは対立形質Ｔを有するＳＮＰである。これは、Ｃ＞ＴまたはＣ／Ｔと表示される。さらに多く発生する対立形質が最初に表示され（その場合、Ｃ）、多数、一般または野生型の対立形質と呼ぶ。さらに少なく発生する代案的対立形質（その場合、Ｔ）を、少数、レアまたは変異体の対立形質と呼ぶ。野生型及び変異体の対立形質は、それぞれ一般対立形質及びレア対立形質とされてもよい。人間は、それぞれの染色体が２個の写本で存在することを意味する二倍体有機体であるので、それぞれの個体は、１つのＳＮＰで、２つの対立形質を有する。この対立形質は、同一な対立形質の２個の写本（ＣＣまたはＴＴ）であったり、または互いに異なる対立形質（ＣＴ）であってもよい。前記ＣＣ、ＣＴ及びＴＴを遺伝子型と呼ぶ。それらのうち、ＣＣ及びＴＴは、同一対立形質の２個の写本を有することを特徴とし、同型接合性（homozygous）遺伝子型とされる。遺伝子型ＣＴは、それぞれの染色体上に異なる対立形質を有し、異型接合性遺伝子型である。同型接合体または異型接合体の遺伝子型を有する個体は、それぞれ同型接合性及び異型接合性とされる。
【００３０】
ＳＮＰの選択
一具体例は、任意の標的核酸配列内の一つ以上のＳＮＰを検出するための新規の方法を提供する。目的遺伝子におけるＳＮＰの位置決定は、ＳＮＰに係わる生物情報データベースを参考することにより、非常に容易に行われる。ｄｂＳＮＰは、生物情報センター（ＮＣＢＩ：National Center for Biotechnology Information）から提供されるＳＮＰデータベースである。ＳＮＰediaは、併合組職から提供されるウィキ様式（wiki-style）データベースである。ＯＭＩＭデータベースは、多形成と、例えば、疾病との関連性を文書形態で開示する一方、ＨＧＶbaseＧ２Ｐは、実質的な要約レベルの関連データを視覚的に質疑することができるようにする。
【００３１】
ＳＮＰに係わる有用な情報は、ヒトゲノム全体にわたし、約５ｋｂごとに１つの情報性ＳＮＰの遺伝子型を究明するための国際ハップマッププロジェクト（International HapMap Project）でも見つけることができる。ヒトＤＮＡ配列変異（単相型（haplotype））の一般的なパターンを決定し、かような情報を公衆領域で自由に利用可能とするために、ナイジェリア、ヨーロッパ及び中国／日本に由来した先祖を有する個体群の遺伝子型を分析した。この情報は、ありふれた疾病及び薬学的反応に影響を及ぼす配列変異体の発見を容易にするであろう。ヒト単相型の製作は、あつらえ型医薬（personalized medicine）のための重要な段階である。
【００３２】
遺伝子型分析のためのプライマーの選択
遺伝子及び関連ＳＮＰが選択されれば、ターゲット核酸配列の遺伝子型分析（genotyping）のためのプライマーオリゴヌクレオチド及びプローブを準備する。
「ターゲットＤＮＡまたはターゲットＲＮＡ（target ＤＮＡ or target ＲＮＡ）」または「ターゲット核酸（targetnucleic acid）」または「ターゲット核酸配列（targetnucleic acid sequence）」は、分析されなければならず、かつ関心ある多形成部位を含む核酸の領域を指す。ターゲット核酸配列は、ＰＣＲ反応及び逆転写酵素ＰＣＲ反応で、増幅のためのテンプレートとして使用される。ターゲット核酸配列は、天然分子及び合成分子をいずれも含んでもよい。例示的な核酸配列は、ゲノムＤＮＡまたはゲノムＲＮＡを含むが、これらに制限されるものではない。
【００３３】
本明細書で使用される、用語「核酸（nucleic acid）」は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを指し、前記オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、変形されたり、または変形された塩基を含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、２個ないし６０個のヌクレオチドを含む一本鎖ヌクレオチド重合体である。ポリヌクレオチドは、２個以上のヌクレオチドを含むヌクレオチド重合体である。ポリヌクレオチドは、第２鎖が第１オリゴヌクレオチドの逆方向相補配列（reverse complement sequence）を有するオリゴヌクレオチドである、アニーリングされたオリゴヌクレオチドを含んだ二本鎖ＤＮＡ、デオキシチミジンを含む一本鎖核酸重合体、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ異型二本鎖（heteroduplex）であってもよい。核酸は、ゲノムＤＮＡ；ｃＤＮＡ；ｈｎＲＮＡ；ｓｎＲＮＡｌ；ｍＲＮＡ；ｒＲＮＡ；ｔＲＮＡ；核酸断片（fragmented nucleic acid）；ミトコンドリアまたは染緑体のような細胞以下の小器官（subcellular organelle）から得られる核酸；及び生物学的サンプル内に存在する微生物、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスから得られる核酸を含むが、これらに制限されるものではない。核酸は、例えば、ＲＮＡ及びＤＮＡの場合のような単一形態の糖モイエティ、または、例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡキメラ（chimera）の場合のような異なる糖モイエティの混合物から構成されてもよい。
【００３４】
本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド（oligonucleotide）」は、「プライマー（primer）」または「ポリヌクレオチド（polynucleotide）」と互換的に使用される。前記用語「プライマー」は、ＰＣＲ反応で、ＤＮＡ合成の開始点として作用するオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、一般的に、約１４ないし約３５ヌクレオチドの長さであり、ターゲット配列の相補的な領域に混成化する。
【００３５】
オリゴヌクレオチドは、当該技術分野に公知された（化学的合成のような）任意の適する方法によって、合成及び製造される。オリゴヌクレオチドはまた、商業的供給先を介して便利に利用可能である。熟練技術者は、ＰＣＲ反応で、目的多形成部位の側面に配置される（flank）プライマーを容易に最適化して識別することができるであろう。商業的に利用可能なプライマーが、特定のＳＮＰについて、特定の目的遺伝子を増幅させるのに使用される。多数のコンピュータプログラム（例えば、Primer−Express）が最適のプライマーセットをデザインするために容易に使用される。提供された（または、登録番号によって公衆によって利用可能な）核酸情報に基づいたプライマー及びプローブが、それによって製造されるということは、当業者に自明であろう。
【００３６】
用語「アニーリング（annealing）」及び「混成化（hybridization）」は、互換的に使用され、二本鎖、三本鎖、またはその他高次構造の形態をもたらす、核酸とは異なる核酸の塩基対相互作用を意味する。特定の具体例において、一次的相互作用は、ワトソン／クリック（Watson／Crick）及びフーグスティーン型水素結合（Hoogsteen-type hydrogen bonding）による塩基特異的相互作用、例えばＡ／Ｔ及びＧ／Ｃである。特定の具体例において、塩基重畳（base-stacking）及び疎水性相互作用が二本鎖安定性にも寄与することができる。「実質的に相補的な（substantially complimentary）」は、アニーリングして安定した二本鎖を形成するのに十分に相補的な配列の２つの核酸鎖を指す。
【００３７】
当業者は、目的多形成部位の側面に配置されるＰＣＲプライマーをいかようにデザインするか分かるであろう。合成オリゴヌクレオチドは、一般的に、約５５℃の融点（ＴＭ）を有する２０ないし２６塩基対の長さである。プライマーデザインのための側面配列（flanking sequence）は、国際ハップマッププロジェクトによって制作された配置ファイル（allocation file）で見つけることができる。このファイルは、観察された対立形質製造及びそれぞれの側面核酸テンプレート製造のための、１００ｂｐのＮＣＢＩによって隠された（ＮＣＢＩ−masked）配列を含むそれぞれのＳＮＰに係わる豊かな情報を含む。
【００３８】
一部具体例において、サンプルは、精製された核酸テンプレート（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、及びそれらの混合物）を含む。サンプルからのＲＮＡの抽出過程及び精製過程は、当該技術分野に周知である。例えば、ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌＴＭ試薬（Invitrogen）抽出法を使用して細胞から分離することができる。その後、例えば、NanodropＴＭ分光光度計（spectrophotometer）及びAgilent ２１００バイオアナライザ（bioanalyzer）を使用し、ＲＮＡの量と質とを決める。
【００３９】
他の具体例において、前記サンプルは、ｐＨ約６ないし約９の溶解緩衝液（lysis buffer）、約０．１２５％ないし約２％の濃度を有する双性イオン洗剤（zwitterionic detergent）、約０．３ないし約２．５ｍｇ／ｍＬの濃度を有するアジ化物（azide）及びプロテイナーゼＫ（proteinase Ｋ）のようなプロテアーゼ（約１ｍｇ／ｍＬ）を使用して、細胞を溶解させて製造された細胞溶解物（cell lysate）である。５５℃で１５分間インキュベーションした後、９５℃で１０分間、前記プロテイナーゼＫを不活性化させ、高効率ＰＣＲ（high efficiency ＰＣＲ）分析または逆転写ＰＣＲ（reverse transcription ＰＣＲ）分析と相溶性がある、タンパク質が実質的に除去された溶解物を得る。
【００４０】
一具現例において、１ｘ溶解試薬は、１２．５ｍＭのトリス（tris）アセテート、トリス−ＨＣｌまたはＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）（ｐＨ＝７‐８）；０．２５％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ、０．３１２５ｍｇ／ｍｌアジ化ナトリウム及び１ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫを含む。
本明細書で使用される用語「溶解物（lysate）」は、溶解された細胞残骸物及び核酸を含む液体相を指す。
【００４１】
本明細書で使用される用語「タンパク質が実質的に除去された（substantially protein free）」は、ほとんどのタンパク質がプロテアーゼ（protease）によるタンパク質分解によって不活性化された溶解物を指す。プロテアーゼは、プロテイナーゼＫを含んでもよい。細胞溶解中でのプロテイナーゼＫの添加は、不活性化されない場合、標的核酸を分解することができる、ヌクレアーゼ（nuclease）を速かに不活性化させる。用語「タンパク質が実質的に除去された」は、不活性化されたタンパク質を除去するための処理を受けもするし、あるいは受けないこともある。
【００４２】
本明細書で使用される用語「細胞（cell）」は、原核細胞または真核細胞を指す。
一具現例において、前記用語「細胞」は、グラム陽性バクテリア、グラム陰性バクテリア、抗酸性（acid−fast）バクテリアなどを含むが、これらに制限されない微生物を指す。特定の具体例において、前記試験される「細胞」は、表面のスワップサンプル採取（swap sampling）を使用して収集することができる。他の具体例において、前記「細胞」は、病原性有機体を指す。
【００４３】
他の具体例において、サンプルは、ウイルス核酸、例えば、レトロウイルス核酸を含む。特定の具体例において、前記サンプルは、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のようなレンチウイルス核酸を含んでもよい。
本明細書で使用される、「双性イオン洗剤（zwitterionic detergent）」は、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ及びバイン誘導体（bine derivative）、例えば、望ましくは、商品名Zwittergent（登録商標）（Calbiochem、San Diego、ＣＡ）及びAnzergent（登録商標）（Anatrace，Ｉｎｃ．Maumee、ＯＨ）下で市販されるスルホバイン（sulfobine）を含むが、これらに制限されない、双性イオン特性を示す（例えば、純電荷を有さず、電気伝導性（conductivity）及び電気泳動性（electrophoretic mobility）を有さず、イオン交換樹脂に結合せず、タンパク質−タンパク質相互作用を破壊する）洗剤を指す。
一具現例において、前記双性イオン洗剤は、下記構造を有する、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネートの略語であるＣＨＡＰＳ（ＣＡＳ番号：７５６２１−０３−３；SIGMA-ALDRICHから入手可能、商品番号Ｃ３０２３−１Ｇ）（米国登録特許第４，３７２，８８８号明細書によって詳細に記述される）である。
【００４４】
【化１】
2013545442.tif 000003
【００４５】
追加的な具体例において、ＣＨＡＰＳは、全組成物において、約０．１２５％ないし約２％重量／体積（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。追加的な具体例において、ＣＨＡＰＳは、全組成物において、約０．２５％ないし約１％ｗ／ｖの濃度で存在する。他の具体例において、ＣＨＡＰＳは、全組成物において、約０．４％ないし約０．７％ｗ／ｖの濃度で存在する。
【００４６】
他の具体例において、前記溶解緩衝液は、ノニデット（Nonidet）、ツイン（Tween）またはトリトンＸ−１００（Triton Ｘ−１００）のような他の非イオン性洗剤を含んでもよい。
【００４７】
本明細書で使用される用語「溶解緩衝液」は、２５℃で約６ないし約９のｐＫａを有する、ｐＨ値を６ないし９に効果的に維持させることができる組成物を指す。本明細書で記述される緩衝液は、一般的に、酵素活性の機能と両立可能であり、生物学的巨大分子がその本来の物理的及び生化学的機能を維持させる生理学的に適する（physiologically compatible）緩衝液である。
【００４８】
溶解緩衝液に添加される緩衝液の例は、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン酸（Tricine）、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン酸（Tris）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、及びアセテート含有緩衝液またはホスフェート含有緩衝液（Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４）などを含むが、これらに制限されるものではない。
【００４９】
本明細書で使用される用語「アジ化物（azide）」は、化学式−Ｎ３で代表される。一具現例において、前記アジ化物は、一般的な殺菌剤と作用するアジ化ナトリウムＮａＮ３（ＣＡＳ番号２６６２８−２２−８；SIGMA−ALDRICHからで購入可能、製品番号：Ｓ２００２−２５Ｇ）である。
【００５０】
本明細書で使用される用語「プロテアーゼ（protease）」は、ペプチド結合を加水分解する（プロテアーゼ活性を有する）酵素である。プロテアーゼはまた、例えば、ペプチダーゼ（peptidase）、プロテイナーゼ（proteinase）、ペプチド加水分解酵素（peptide hydrolase）またはタンパク質分解酵素（proteolytic enzyme）ともされる。本発明による用途のためのプロテアーゼは、ポリペプチド鎖に内部的に作用するエンド型（endo-type）（エンドペプチダーゼ（endopeptidase））であってもよい。一具体例において、前記プロテアーゼは、セリンプロテアーゼであるプロテイナーゼＫ（proteinase Ｋ）（ＥＣ ３．４．２１．６４；Roche Applied Sciencesから入手可能、組み換えプロテイナーゼＫ ５０ Ｕ／ｍｌ（Pichia pastorisから由来）Ｃａｔ．Ｎｏ．０３１１５８８７００１）であってもよい。
【００５１】
プロテイナーゼＫは、タンパク質を消化させ、核酸製剤（nucleic acid preparation）から汚染物質を除去するのに使用される。核酸製剤へのプロテイナーゼＫの添加は、不活性化されない場合、精製中にＤＮＡまたはＲＮＡを分解することができるヌクレアーゼを迅速に不活性化させる。前記酵素は、タンパク質を変性させる化学物質の存在下でも活性を示し、約９５℃の温度で、約１０分間の処理時に不活性化されるので、本出願に非常に適する。
【００５２】
一具現例において、リステリア（Listeria）サルモネラ（Salmonella）及び大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）のような、グラム陽性バクテリア及びグラム陰性バクテリアの溶解も、プロテイナーゼＫ（１ｍｇ／ｍｌ）を含む溶解試薬（lysi sreagent）を必要とする。細胞溶解物中のタンパク質は、５５℃で１５分間、プロテイナーゼＫを処理し、次に、９５℃で１０分間、プロティアナゼＫを不活性化させることにより、消化させることができる。冷却後に、タンパク質が実質的に除去された溶解物は、高効率ＰＣＲ増幅に適する。
【００５３】
プロテイナーゼＫと共に、または前記酵素の代わりに、溶解試薬は、トリプシン（trypsin）、キモトリプシン（chymotrypsin）、エルラスターゼ（elastase）、サブチリシン（subtilisin）、ストレプトグリシン（streptogrisin）、テルミターゼ（thermitase）、アクアリシン（aqualysin）、プラスミン（plasmin）、ククミシン（cucumisin）またはカルボキシペプチダーゼ（carboxypeptidase）Ａ，Ｄ，ＣまたはＹのような、セリンプロテアーゼを含んでもよい。セリンプロテアーゼ以外に、前記溶解溶液は、パパイン（papain）、カルパイン（calpain）またはクロストリパイン（clostripain）のようなシステインプロテアーゼ；ペプシン、キモシン（chymosin）またはカテプシン（cathepsin）のような酸プロテアーゼ；またはプロナーゼ（pronase）、サーモリシン（thermolysin）、コラゲナーゼ（collagenase）、ディスパーゼ（dispase）、アミノペプチダーゼ（aminopeptidase）またはカルボキシペプチダーゼ（carboxypeptidase）Ａ，Ｂ，Ｅ／Ｈ，Ｍ，ＴまたはＵのような、メタロプロテアーゼ（metalloprotease）を含んでもよい。プロテイナーゼＫは、広範囲なｐＨにわたって（ｐＨ４．０−１０．０）安定しており、双性イオン洗剤を含む緩衝液で安定している。
【００５４】
ターゲット核酸配列のＰＣＲ増幅
プライマーが製造された後、核酸増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：polymerase chain reaction）、核酸配列基盤の増幅（ＮＡＳＢＡ：nucleic acid sequence based amplification）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ：ligase chain reaction）及びローリングサークル増幅（ＲＣＡ：rolling circle amplification）を含むが、これらに限定されるものではないさまざまな方法によってなされる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、特異的なターゲットＤＮＡ配列の増幅に最も頻繁に使用される方法である。
【００５５】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、一般的に所望するヌクレオチド配列をインビトロ（in vitro）で増幅させる方法を指す。一般的に、ＰＣＲ法は、所望のターゲット配列を含む反応混合物に、２つ以上の伸張可能なオリゴヌクレオチドプライマーのモル過量を導入することによって行われ、前記ライマーは、二本鎖ターゲット配列の反対鎖に相補的である。前記反応混合物を対象に、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、熱周期（thermal cycling）プログラムを実施し、ＤＮＡプライマーが側面に付着した所望するターゲット配列を増幅させる。
【００５６】
ＰＣＲ技法は、ＰＣＲ：A Practical Approach，M．J．McPhersonら，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、ＰＣＲ Protocols：A Guide to Methods and Applications，Innisら，Academic Press（１９９０）、及びＰＣＲT echnology：Principals and Applications for DNA Amplification，H．A．Erlich，Stockton Press（１９８９）を含む多数の文献に開示されている。ＰＣＲはまた、米国登録特許第４，６８３，１９５号明細書、同第４，６８３，２０２号明細書、同第４，８００，１５９号明細書、同第４，９６５，１８８号明細書、同第４，８８９，８１８号明細書、同第５，０７５，２１６号明細書、同第５，０７９，３５２号明細書、同第５，１０４，７９２号明細書、同第５，０２３，１７１号明細書、同第５，０９１，３１０号明細書及び同第５，０６６，５８４号明細書を含む多数の米国特許でも開示され、それぞれは、参照によって本明細書に挿入される。
【００５７】
用語「サンプル（sample）」は、核酸物質を含む任意の物質を指す。
本明細書で使用される用語「ＰＣＲ断片（ＰＣＲ fragment）」または「逆転写酵素ＰＣＲ断片（reverse transcriptase−ＰＣＲ fragment）」または「アンプリコン（amplicon）」は、特定のターゲット核酸の増幅結果として生産されるポリヌクレオチド分子（または、総称して複数の分子）を指す。ＰＣＲ断片は、常にではないが、一般的には、ＤＮＡ ＰＣＲ断片である。ＰＣＲ断片は、一本鎖または二本鎖であり、または任意の濃度比率を有するこれらの混合物であってもよい。ＰＣＲ断片またはＲＴ−ＰＣＴは、約１００−約５００ｎｔ、またはそれ以上の長さであってもよい。
【００５８】
「緩衝液（buffer）」は、増幅反応のｐＨを調節することにより、増幅反応の一つ以上の成分の安定性、活性及び／または持続性（longevity）を変化させる、増幅反応に添加される化合物である。本発明の緩衝剤（buffering agent）は、ＰＣＲ増幅及び部位特異的ＲＮａｓｅ Ｈ切断活性（site-specific ＲＮａｓｅ Ｈ cleavage activity）と両立可能である。一部の緩衝剤が、当該技術分野で周知であり、トリス、トリシン、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）及び４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を含むが、それらに限定されるものではない。また、ＰＣＲ緩衝液は、一般的に、最大約７０ｍＭ ＫＣｌ及び約１．５ｍＭ以上のＭｇＣｌ２、約５０−２００ｍＭのそれぞれのヌクレオチドｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含む。本発明の緩衝液は、効率的な逆転写酵素ＰＣＲまたはＰＣＲ反応を最適化するための添加物質を含んでもよい。
【００５９】
本明細書で使用される、用語「ヌクレオチド（nucleotide）」は、リボース（ribose）、アラビーノス（arabinose）、キシロース（xylose）とピラノース（pyranose）のような糖、及びそれらの糖類似体の、Ｃ−１’炭素に結合されたヌクレオチド塩基を含む化合物を指す。用語ヌクレオチドはまた、ヌクレオチド類似体を含む。前記糖は、置換または非置換のものである。置換されたリボース糖は、炭素原子のうち１つ以上、例えば、２’−炭素原子が、同一であるか、あるいは異なる、Ｃｌ、Ｆ、−Ｒ、−ＯＲ、−ＮＲ２（前記それぞれのＲは独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはＣ５−Ｃ１４アリールである）またはハロゲン基のいずれかで置換されたものであるリボースを含むが、それらに限定されるものではない。例示的なリボースは、２’−（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシリボース、２’−（Ｃ５−Ｃ１４）アリールオキシリボース、２’，３’−ジデヒドロリボース、２’−デオキシ−３’−ハロリボース、２’−デオキシ−３’−フルオロリボース、２’−デオキシ−３’−クロロリボース、２’−デオキシ−３’−アミノリボース、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルリボース、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシリボース及び２’−デオキシ−３’−（Ｃ５−Ｃ１４）アリールオキシリボース、リボース、２’−デオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、２’−ハロリボース、２’−フルオロリボース、２’−クロロリボース及び２’−アルキルリボース、例えば、２’−Ｏ−メチル、４’−α−アノマー（anomeric）ヌクレオチド、１’−α−アノマーヌクレオチド、２’−４’−及び３’−４’−結合（linked）並びにその他「固定（locked）」または「ＬＮＡ」二環糖変形体（bicyclic sugar modification）を含むが、それらに限定されるものではない（例えば、ＰＣＴ公開出願ＷＯ ９８／２２４８９、ＷＯ ９８／３９３５２及びＷＯ ９９／１４２２６；米国登録特許第６，２６８，４９０号明細書及び同第６，７９４，４９９号明細書を参照）。
【００６０】
添加物質は、組成物中の一つ以上の成分の安定性、活性及び／または持続性を変化させる、組成物に添加される化合物である。特定の具体例において、前記組成物は、増幅反応組成物である。特定の具体例において、添加物は、汚染性酵素を不活性化させ、タンパク質フォールディング（protein folding）を安定化し、かつ／または凝集を低減させる。増幅反応に含まれる例示的な添加物質は、bine、ホルムアミド、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＯＡｃ、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌ、ＮＨ４ＯＡｃ、ＮａＩ、Ｎａ（ＣＯ３）２、ＬｉＣｌ、ＭｎＯＡｃ、ＮＭＰ、トレハロース（trehalose）、デメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：demethylsulfoxide）、グリセロール、エチレングリコール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ：dithiothreitol）、（テルモプラズマ・アリドフィルム（Thermoplasma acidophilum）無機ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）を含むが、それらに限定されるものではない）ピロホスファターゼ（pyrophosphatase）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：bovine serum albumin）、プロピレングリコール、グリシンアミド（glycinamide）、ＣＨＥＳ、PercollＴＭ、アルリントリカルボン酸（aurintricarboxylic acid）、ツイン（Tween）２０、ツイン２１、ツイン４０、ツイン６０、ツイン８５、Ｂｒｉｊ ３０、ＮＰ−４０、トリトンＸ−１００、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、Mackernium、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン−Ｎ−オキシド（ＬＤＡＯ）、Zwittergent ３−１０、Xwittergent ３−１４、Xwittergent ＳＢ ３−１６、Empigen、ＮＤＳＢ−２０、Ｔ４Ｇ３２、大腸菌ＳＳＢ、ＲｅｃＡ、ニッキングエンドヌクレアーゼ（nicking endonuclease）、７−デアザＧ、ｄＵＴＰ、ＵＮＧ、陰イオン洗剤、陽イオン性洗剤、非イオン性洗剤、双性イオン洗剤（zwittergent）、ステロール、浸透物質（osmolyte）、陽イオン、及び増幅効率を変化させることができる任意の他の化学物質、タンパク質、または補助因子を含むが、それらに限定されるものではない。特定の具体例において、２以上の添加物質が増幅反応に含まれる。本発明によれば、添加物質は、ＲＮａｓｅ Ｈの活性を干渉しない場合、プライマーアニーリングの選択性を改善する目的で添加すされる。
【００６１】
本明細書で使用される、用語「熱安定性（thermostable）」は、酵素に適用される場合、昇温条件（例えば、５５℃またはそれ以上）で、その生物学的活性を維持するか、あるいは加熱及び冷却の反復周期後、その生物学的活性を維持する酵素を指す。熱安定性ポリヌクレオチドのポリメラーゼは、ＰＣＲ増幅反応で特に有用である。
【００６２】
本明細書で使用される「増幅ポリメラーゼ活性（amplifying polymerase activity）」は、デオキシリボヌクレオチドの重合化を触媒する酵素活性を指す。一般的に、前記酵素は、核酸テンプレートの配列にアニーリングされたプライマーの３’末端で合成を開始するものであり、前記テンプレート鎖の５’末端方向に進む。特定の具体例において、「増幅ポリメラーゼ活性」は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。
本明細書で使用される熱安定性ポリメラーゼは、熱に比較的安定した酵素であり、それぞれのＰＣＲ周期前に酵素を添加する必要性を除去する。
【００６３】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの非制限的な例は、好熱性バクテリア サーマス・アクアチクス（Thermus aquaticus）（Ｔａｑポリメラーゼ）、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）（Ｔｔｈポリメラーゼ）、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）（ＴｌｉポリメラーゼまたはＶＥＮＴＴＭポリメラーゼ）、ピュロコックス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）（ＰｆｕポリメラーゼまたはＤＥＥＰＶＥＮＴＴＭポリメラーゼ）、ピュロコックス・ウーシー（Pyrococcus woosii）（Ｐｗｏポリメラーゼ）及びその他ピュロコックス種、バチルス・ステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）（Ｂｓｔポリメラーゼ）、スルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）（Ｓａｃポリメラーゼ）、サーモプラズマ・アシドフィルム（Thermoplasma acidophilum）（Ｔａｃポリメラーゼ）、サーマスラバー（Thermus rubber）（Ｔｒｕポリメラーゼ）、サーマス・ブロキアヌス（Thermus brockianus）（ＤＹＮＡＺＹＭＥＴＭポリメラーゼ）ｉ（Ｔｎｅポリメラーゼ）、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritime）（Ｔｍａ）及びサーモトガ（Thermotoga）属のその他種（Ｔｓｐポリメラーゼ）、及びメタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Methanobacterium thermoautotrophicum）（Ｍｔｈポリメラーゼ）から分離されたポリメラーゼを含むが、それらに限定されるものではない。ＰＣＲ反応は、ターゲット配列のさらに効率的な増幅を引き起こす、相互補完的な特性を有する１つ以上の熱安定性ポリメラーゼ酵素を含んでもよい。例えば、高い進行度（processivity）（大きいヌクレオチド断片を複製する能力）を有するヌクレオチドポリメラーゼを、校正（proofreading）能力（ターゲット核酸配列の伸長中にエラーを修正する能力）を有する他のヌクレオチドポリメラーゼに補完することにより、長いターゲット配列を高正確度（fidelity）に複製することができるＰＣＲ反応を制作することができる
。前記熱安定性ポリメラーゼは、その野生型形態で使用することができる。代案として、ＰＣＲ反応を促進させるために、前記ポリメラーゼを酵素の断片を含むか、あるいは有益な特性を提供する突然変異を含むように変形させることができる。一具体例において、前記熱安定性ポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼである。向上した特性を有する多数のＴａｑポリメラーゼ変異体が公知されており、ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭ、ストフェル（Ｓｔｏｆｆｅｌ）短編、ＳｕｐｅｒＴａｑＴＭ、ＳｕｐｅｒＴａｑＴＭ plus、ＬＡ ＴａｑＴＭ、ＬＡｐｒｏ ＴａｑＴＭ及びＥＸ ＴａｑＴＭを含むが、それらに限定されるものではない。他の具体例において、本発明のマルチプレックス増幅反応に使用される熱安定性ポリメラーゼは、ＡｍｐｌｉＴａｑストフェル（Stoffel）断片である。
【００６４】
ＲＮＡターゲット核酸配列の逆転写酵素ＰＣＲ増幅
遺伝子発現研究のために、最も広く使用される技法の中で一つは、ＰＣＲによる増幅用テンプレートとして、ｍＲＮＡ配列に係わる第１鎖ｃＤＮＡ（first-strand ｃＤＮＡ）を使用することである。
【００６５】
用語「逆転写酵素活性（reverse transcriptase activity）」及び「逆転写（reverse transcription）」は、テンプレートとしてＲＮＡ鎖を使用し、ＤＮＡ鎖（すなわち、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ））を合成することができる、ＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼとしての特徴を有するポリメラーゼ種類の酵素活性を指す。
【００６６】
「逆転写酵素ＰＣＲ（reverse transcriptase−ＰＣＲ）」または「ＲＮＡ ＰＣＲ」は、ＤＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼプライマー伸張の多重周期前に、まず一本鎖ＤＮＡ分子を生産するために、ＲＮＡテンプレート及び逆転写酵素、または逆転写酵素活性を有する酵素を使用するＰＣＲ反応である。マルチプレックスＰＣＲは、一般的に、単一反応内に２個以上のプライマーを含め、単一反応で、一種以上の増幅産物を生成するＰＣＲ反応を指す。
【００６７】
例示的な逆転写酵素は、米国登録特許第４、９４３、５３１号明細書に開示されたモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ：Moloney murine leukemia virus）ＲＴ、米国登録特許第５，４０５，７７６号明細書に開示されたＭ−ＭＬＶ−ＲＴの突然変異形態、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ：bovine leukemia virus）ＲＴ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ：Rous sarcoma virus）ＲＴ、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ：avian myeloblastosis virus）ＲＴ、及び米国登録特許第７，８８３，８７１号明細書に開示された逆転写酵素を含むが、それらに制限されるものではない。
【００６８】
終点（end-point）分析またはリアルタイム（real-time）分析によって行われる逆転写酵素ＰＣＲ過程は、２つの別個の分子合成を含む：（ｉ）ＲＮＡテンプレートからのｃＤＮＡの合成、及び（ｉｉ）ＰＣＲ増幅を解した前記新たに合成されたｃＤＮＡの複製。逆転写酵素ＰＣＲと折々係わる技術的問題を処理するための試みとして、前記過程の３種の基本的な段階を考慮した多数のプロトコルが開発された：（ａ）ＲＮＡの変性及び逆方向プライマーの混成化、（ｂ）ｃＤＮＡの合成及び（ｃ）ＰＣＲ増幅。いわゆる、「カップルリングされていない（uncoupled）」逆転写酵素ＰＣＲ過程（例えば、２段階逆転写酵素ＰＣＲ）で、逆転写は、逆転写酵素活性のための最適の緩衝条件を使用した独立的な段階として行われる。ｃＤＮＡ合成に続き、反応物を希釈させ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ活性に最適な条件に、ＭｇＣｌ２及びデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）の濃度を低下させ、標準条件によってＰＣＲを行う（米国登録特許第４，６８３，１９５号明細書及び同第４，６８３，２０２号明細書を参照）。一方、「カップルリングされた（coupled）」ＲＴ ＰＣＲ方法は、逆転写酵素及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ活性に最適化された一般的な緩衝液を使用する。一様態で、逆方向プライマーのアニーリングは、酵素の添加前に行われる独立した段階であり、その次の単一反応容器に添加される。他の様態で、前記逆転写酵素活性は、熱安定性Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼの一成分である。アニーリング及びｃＤＮＡ合成は、Ｍｎ２＋存在下で行われ、その次のＰＣＲは、キレート化剤（chelating agent）によってＭｎ２＋を除去した後、Ｍｇ２＋の存在下で行われる。最後に「連続的（continuous）」方法（例えば、１段階逆転写酵素ＰＣＲ）は、前記３つの逆転写酵素ＰＣＲ段階を１つの連続的反応に統合し、構成成分または酵素の添加のために、反応容器を開くことを避けることができる。連続的逆転写酵素ＰＣＲは、熱安定性Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及びＴｔｈポリメラーゼの逆転写酵素活性を使用する単一酵素システム、及び初期温度が６５℃であるＡＭＶ ＲＴ及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用する２酵素システムとして記述されてきた。ＲＮＡ変性段階は、省略することができる。
【００６９】
特定の具体例において、一つ以上のプライマーを標識化することができる。本明細書において、互換可能に使用される用語「標識（label）」、「検出可能な標識（detectable label）」、あるいは「マーカー（marker）」または「検出可能なマーカー（detectable marker）」は、ヌクレオチド、ヌクレオチドポリマー、または核酸結合因子（nucleic acid binding factor）に付着する任意の化学的モイエティを指し、前記付着は、共有的結合または非共有的結合によるものであってもよい。望ましくは、前記標識は、検出可能であり、本発明の実施者をして、ヌクレオチドまたはヌクレオチドポリマーを検出可能にさせる。検出可能な標識は、発光（luminescent）分子、化学発光（chemiluminescent）分子、蛍光色素、有色分子、放射性同位元素または閃光体（scintillant）を含む。検出可能な標識はまた、（ビオチン、アビジン、ストレプタビジン、ＨＲＰ、タンパク質Ａ（protein Ａ）、タンパク質Ｇ、抗体またはその断片、Ｇｒｂ２、ポリヒスチジン、Ｎｉ２＋、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグのような）任意の有用なリンカ分子、重金属、酵素（例として、アルカリホスファターゼ、ペルキシダーゼ及びルシフェラーゼを含む）、電子供与体／受容体、アクリジニウムエステル（acridinium ester）、色素及び比色気質（calorimetric substrate）を含む。また、表面プラズモン共鳴（surface Plasmon resonance）の場合でのように、質量の変化が検出可能な標識として考慮されると予想される。熟練技術者は、本発明の実施に使用される、前記で言及されていない有用な検出可能な標識を容易に認識するであろう。
【００７０】
１段階逆転写酵素ＰＣＲは、カップルリングされていない逆転写酵素ＰＣＲに比べて、さまざまな利点を提供する。１段階逆転写酵素ＰＣＲは、カップルリングされていない逆転写酵素ＰＣＲに比べて、反応混合物試薬及び核酸産物の取り扱いをさらに少なく必要とし（例えば、２つの反応段階間で、構成成分または酵素の添加のために、反応容器を開くこと）、従って、さらに労動集約的ではなく、工数要求量（required number of person hour）を低減させる。１段階逆転写酵素ＰＣＲはまた、さらに少ない試料を必要とし、汚染危険を低減させる。１段階逆転写酵素ＰＣＲの敏感性及び特異性は、与えられたサンプルのうち、一つあるいはさまざまな遺伝子の発現レベル研究、または病原性ＲＮＡの検出に非常に適すると分かった。一般的に、この過程は、ｃＤＮＡ合成を開始するための遺伝子特異的プライマーの使用に制限された。
【００７１】
かような逆転写酵素ＰＣＲ技法と組み合わされた、オンライン検出によるＰＣＲ反応の動力学測定能は、高い敏感度により、ＲＮＡ写本数の正確であって精密な定量化を可能にした。これは、下記で論じる５’蛍光ヌクレアーゼ分析（fluorogenic nuclease assay）（「ＴａｑＭａｎＴＭ」）またはエンドヌクレアーゼ分析（endonuclease assay）（「CataCleaveＴＭ」）のような蛍光二重標識混成化プローブ（fluorescent dual-labeled hybridization probe）技術による、増幅過程中の蛍光モニタリング、及びＰＣＲ産物の測定を介して逆転写酵素ＰＣＲ産物を検出することによって可能になった。
【００７２】
CataCleaveＴＭプローブを使用したリアルタイムＰＣＲ
増幅後、アンプリコン検出は、手間がかかり、長期間が必要となる。ＰＣＲ過程中に増幅をモニタリングするために、リアルタイム方法が開発された。この方法は、一般的に、新たに合成されたＤＮＡに結合する蛍光標識されたプローブ、または二本鎖ＤＮＡ間に挿入される場合、蛍光放出が増加する色素を使用する。リアルタイム検出方法は、ゲノムＤＮＡまたはゲノムＲＮＡにおいて、ＳＮＰのＰＣＲ検出に適用可能である。
【００７３】
前記プローブは、一般的に、２つの発色団（chromophore）間の蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ：fluorescence resonance energy transfer）によって、ターゲット不在時に、供与者（donor）放出が消光されるようにデザインされる。供与発色団は、励起状態で、受容発色団と近距離にある場合、受容発色団にエネルギーを転移させることができる。かような転移は、常に非放射性であり、双極子−双極子カップルリングを介して発生する。２つの発色団間の距離を十分に増大させる全ての過程は、ＦＲＥＴ効率を低減させ、供与発色団放出が、放射によって（radiatively）検出されるようにするであろう。一般的な供与発色団は、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＶＩＣ、ＪＯＥ、Ｃｙ３、Ｃｙ５及びテキサスレッド（Texas Ｒｅｄ．）を含む。受容発色団は、その励起スペクトルが供与者の放出スペクトルと重畳されるように選択される。かような対の例は、ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡである。また、多様な供与者を消光させることができる非蛍光性受容者が存在する。供与者・受容者ＦＲＥＴ対の他の適切な例が、当業者に公知されているであろう。
【００７４】
ＰＣＲのリアルタイム検出に使用される一般的なＦＲＥＴプローブの例は、分子ビーコン（molecular beacon）（例えば、米国登録特許第５，９２５，５１７号明細書）、ＴａｑＭａｎＴＭプローブ（例えば、米国登録特許第５，２１０，０１５号明細書及び同第５，４８７，９７２号明細書）、及びCataCleaveＴＭプローブ（例えば、米国登録特許第５，７６３，１８１号明細書）を含む。前記分子ビーコンは、非結合状態では、プローブが、供与者及び受容者の発色団が近接した距離にあり、供与者放出が減少する二次構造を形成するようにデザインされたものである一本鎖オリゴヌクレオチドである。適切な反応温度で、前記ビーコンは広がり、アンプリコンに特異的に結合する。広がった後には、供与者発色団及び受容者発色団間の距離が増大してＦＲＥＴが反転され、特殊機器を使用して供与者放出をモニタリングすることができる。ＴａｑＭａｎＴＭ技術及びCataCleaveＴＭ技術は、供与者発色団及び受容者発色団が、ＦＲＥＴを反転させるほどに十分に分離されるようにするのために、使用されるＦＲＥＴプローブが切断されるという点で、分子ビーコンと異なる。
【００７５】
ＴａｑＭａｎＴＭ技術は、５’末端が供与発色団で標識され、３’末端が受容発色団で標識された、一本鎖オリゴヌクレオチド・プローブを使用する。増幅に使用されるＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’のエキソヌクレアーゼ活性を有さなければならない。ＴａｑＭａｎＴＭプローブは、プライマーが結合すると同時に、アンプリコンの一鎖に結合する。ＤＮＡポリメラーゼがプライマーを伸張させながら、前記ポリメラーゼは、結局、結合されているＴａｑＭａｎＴＭプローブと対面するであろう。その時点で、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性は、５’末端から順次に、ＴａｑＭａｎＴＭプローブを分解するであろう。プローブが分解されれば、前記プローブを含むモノヌクレオチドは、反応緩衝液内に放出される。供与者は、受容者から遠くなり、ＦＲＥＴは反転される。プローブ切断を確認するために、供与者からの放出をモニタリングする。ＴａｑＭａｎＴＭが作用する方式のため、特定のアンプリコンは、ＰＣＲの毎周期について、たった１回だけ検出される。ＴａｑＭａｎＴＭターゲット部位を介したプライマーの伸張は、二本鎖産物を生成させ、アンプリコンが後続ＰＣＲ周期で変性されるまで、ＴａｑＭａｎＴＭプローブの追加的な結合を阻む。
【００７６】
その内容が参照によって本明細書に挿入される米国登録特許第５，７６３，１８１号明細書は、（「CataCleaveＴＭ」とする）他のリアルタイム検出方法を開示する。CataCleaveＴＭ技術は、プローブの切断がポリメラーゼ活性を有さない第２酵素によって達成されるという点で、ＴａｑＭａｎＴＭと区別される。CataCleaveＴＭプローブは、例えば、制限酵素またはＲＮａｓｅのような、エンドヌクレアーゼのターゲットである分子内配列を有する。一例として、CataCleaveＴＭプローブは、前記プローブの５’末端及び３’末端がＤＮＡで構成され、切断部位は、ＲＮＡを含むキメラ（chimeric）構造を有する。前記プローブのＤＮＡ配列部分は、両末端または内部が、ＦＲＥＴ対で標識される。ＰＣＲ反応は、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖ＲＮＡ配列部分を特異的に切断させるＲＮａｓｅ Ｈ酵素を含む。切断後、前記プローブの２個の半分は、反応温度で、ターゲットアンプリコンから解離され、反応緩衝液で拡散する。供与者及び受容者が分離することにより、ＦＲＥＴは、ＴａｑＭａｎＴＭプローブと同様の方式で反転され、供与者放出をモニタリングすることができる。切断及び解離は、追加的なCataCleaveＴＭ結合のための部位を再生させる。かような方法で、単一アンプリコンは、プライマーがCataCleaveＴＭプローブ結合部位を介して伸張されるまで、ターゲットとして、または多数回のプローブ切断のために使用される。
【００７７】
CataCleaveＴＭプローブの標識化
用語「プローブ（probe）」は、特異的核酸配列、例えば、ターゲット核酸配列の相補的な領域に、配列特異的に混成化するように考案された、特異的な部分を含むポリヌクレオチドを含む。一具現例において、オリゴヌクレオチド・プローブは、１５ないし６０ヌクレオチドの長さを有する。さらに望ましくは、前記オリゴヌクレオチド・プローブは、１８ないし３０ヌクレオチドの長さを有する。本発明のオリゴヌクレオチド・プローブの具体的な配列及び長さは、それが結合するターゲット・ポリヌクレオチドの性質に部分的に依存する。結合位置及び長さは、特別な具体例において、適切なアニーリング及び溶融特性を達成するように変化させることができる。かようなデザイン選択のための指針は、その内容が参照によって本明細書に挿入される、米国登録特許第５，７６３，１８１号明細書、同第６，７８７，３０４号明細書及び同第７，１１２，４２２号明細書に開示されたＴａｑＭａｎＴＭ分析またはCataCleaveＴＭについて説明する多数の参照文献に見ることができる。
【００７８】
特定の具体例において、前記プローブは、ターゲット核酸配列に対して「実質的に相補的」である。
【００７９】
本明細書で使用される用語「実質的に相補的な（substantially complementary）」は、アニーリングして安定した二本鎖を形成することができるほどに、配列において十分に相補的な２本の核酸鎖を指す。相補性は、完全である必要はない。例えば、２つの核酸間に、任意数のマッチングされない塩基対が存在することができる。しかし、ミスマッチの数が過度に多く、ストリンジェンシーが最も低い（the least stringent）混成化条件でさえも混成化がなされない場合、前記配列は、実質的に相補的な配列ではない。本明細書で、２つの配列が「実質的に相補的である」とされる場合、それは、前記配列が選択された反応条件下で混成化するのに、相互間に十分に相補的であるということを意味する。核酸相補性と、特異度達成に十分な混成化のストリンジェンシー（stringency）との関係は、当該技術分野に周知である。実質的に相補的な二本鎖は、例えば、完全に相補的であるか、あるいは混成化条件が、例えば、ペアリング（pairing）配列及び非ペアリング（non-pairing）配列の区別を可能にするのに十分であり限り、一つあるいは多数のミスマッチを含んでもよい。従って、「実質的に相補的である」配列は、二本鎖領域で、１００，９５，９０，８０，７５，７０，６０，５０％またはそれ未満、または前記範囲間の任意の百分率の塩基対相補性を有する配列を指すことができる。
【００８０】
本明細書で使用される「選択された領域（selected region）」は、プローブのＲＮＡ配列にアニーリングするターゲットＤＮＡまたはターゲットｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列を指す。一具現例において、ターゲットＤＮＡまたはターゲットｃＤＮＡの「選択された領域」は、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５またはそれ以上のヌクレオチド長を有することができる。
【００８１】
本明細書で使用される部位特異的ＲＮａｓｅ Ｈ切断は、ターゲットＤＮＡ配列に完全に（entirely）相補的であり、それと混成化して、ＲＮＡ：ＤＮＡ異型二本鎖を形成する、CataCleaveＴＭプローブ中のＲＮＡモイエティの切断を指す。
【００８２】
前記CataCleaveＴＭプローブにおけるＲＮＡモイエティが、単一ヌクレオチド多型を含み、標的ＤＮＡ配列が、前記多形成の位置に、野生型配列を含む場合、CataCleaveＴＭプローブと、野生型ターゲットＤＮＡ配列との間のＲＮＡ：ＤＮＡ異型二本鎖形成は、前記多形成位置で、単一ヌクレオチドミスマッチをもたらし、これは、ＲＮａｓｅ ＨによるCataCleaveＴＭプローブにおけるＲＮＡモイエティの切断を阻む。
【００８３】
同様に、ターゲットＤＮＡ配列がＳＮＰ配列を含み、CataCleaveＴＭプローブのＲＮＡモイエティが多形成位置に、野生型配列を含む場合、CataCleaveＴＭプローブと、ＳＮＰ配列を含む野生型ターゲットＤＮＡ配列との間のＲＮＡ：ＤＮＡ異型二本鎖形成は、前記多形成位置で、単一ヌクレオチドミスマッチをもたらし、これは、ＲＮａｓｅ ＨによるCataCleaveＴＭプローブにおけるＲＮＡモイエティの切断を阻む。
【００８４】
本明細書で使用されるCataCleaveＴＭプローブの「標識（label）」または「検出可能な標識（detectable label）」は、前記プローブに共有的または非共有的な手段によって付着された蛍光色素（fluorochrome）化合物を含む任意の標識を指す。
【００８５】
本明細書で使用される「蛍光色素（fluorochrome）」は、放出される光よりもさらに短波長の光によって励起された後で光を放出する蛍光化合物を指す。用語「蛍光供与者（fluorescent donorまたはfluorescence donor）」は、本発明で記述される分析試験で測定される光を放出する蛍光色素を指す。さらに特別には、前記蛍光供与者は、蛍光受容者によって吸収される光を提供する。用語「蛍光受容者（fluorescent acceptorまたはfluorescence acceptor）」は、蛍光供与者から放出される光を吸収する第２蛍光色素またはケンチャ（quencher）分子を指す。第２蛍光色素は、蛍光供与者から放出される光を吸収し、前記蛍光供与者から放出される光よりもさらに長波長の光を放出する。ケンチャ分子は、蛍光供与者から放出される光を吸収する。
【００８６】
Alexa ＦｌｕｏｒＴＭ ３５０、Alexa ＦｌｕｏｒＴＭ ４３０、Alexa ＦｌｕｏｒＴＭ ４８８、Alexa ＦｌｕｏｒＴＭ ５３２、Alexa ＦｌｕｏｒＴＭ ５４６、Alexa ＦｌｕｏｒＴＭ ５６８、Alexa ＦｌｕｏｒＴＭ ５９４、Alexa ＦｌｕｏｒＴＭ ６３３、Alexa ＦｌｕｏｒＴＭ ６４７、Alexa ＦｌｕｏｒＴＭ ６６０、Alexa ＦｌｕｏｒＴＭ ６８０、７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボン酸、フルオレセイン（fluorescein）、オレゴングリーン（Oregon Green）４８８、オレゴングリーン５１４、テトラメチルロダミン（tetramethylrhodamine）、ロダミンＸ、テキサスレッド色素（Texas Red dye）、ＱＳＹ ７、ＱＳＹ ３３、Ｄａｂｃｙｌ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０１６６５、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ−Ｘ、ジアルキルアミノクマリン、Ｃｙ５．５、Ｃｙ５、Ｃｙ３．５、Ｃｙ３、ＤＴＰＡ（Ｅｕ３＋）−ＡＭＣＡ及びＴＴＨＡ（Ｅｕ３＋）ＡＭＣＡを含む任意の発光分子、望ましくは、蛍光色素及び／または蛍光ケンチャ（fluorescent quencher）が本発明の実施に使用される。
【００８７】
一具現例において、前記オリゴヌクレオチド・プローブの３’末端ヌクレオチドは、ブロッキングされたり、あるいは核酸ポリメラーゼによる伸張が不可能になるように処理される。かようなブロッキングは、便利であるようには、プローブの末端３’位置にリポータまたはケンチャ分子を付着させることによって行われる。
【００８８】
一具現例において、リポータ分子は、連結モイエティ（linking moiety）によって、プローブの末端３’または末端５’に付着するように誘導された蛍光有機色素である。望ましくは、ケンチャ分子はまた、本発明の具体例よって、蛍光性または非蛍光性である有機色素である。例えば、本発明の望ましい具体例において、ケンチャ分子は蛍光性である。一般的に、ケンチャ分子が蛍光性であるか、あるいは非放射崩壊（non-radiativedecay）によってリポータから転移されたエネルギーを単純に放出するかということとは係わりなく、ケンチャの吸収バンドは、リポータ分子の蛍光放出バンドと実質的に重畳されなければならない。励起されたリポータ分子からエネルギーを吸収するが、エネルギーを放射的に放出しない非蛍光ケンチャ分子は、本出願で発色分子（chromogenic molecule）とする。
【００８９】
例示的なリポータ・ケンチャ対は、フルオレセインを含む、キサンテン（xanthene）色素及びロダミン（rhodamine）色素から選択されてもよい。オリゴヌクレオチドに付着するための結合部位、または結合作用基として使用されるそのフェニルモイエティ上に置換体を有する、前記化合物の多数の適する形態が広く市販されている。他の蛍光化合物の群は、α位置またはβ位置に、アミノ基を有するナフチルアミン（naphthylamine）である。かようなナフチルアミノ化合物に含まれるものとしては、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホネート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネート及び２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホネートがある。その他の色素は、３−フェニル−７−イソシアナトクマリン；９−イソチオシアナトアクリジン及びアクリジンオレンジのようなアクリジン（acridine）；Ｎ−(ｐ−(２−ベンゾオキサゾリル)フェニル）マレイミド、ベンゾオキサジアゾール（benzoxadiazole）、スチルベン（stylbene）、ピレン（pyrene）などを含む。
【００９０】
一具現例において、リポータ及びケンチャ分子は、フルオレセイン色素及びロダミン色素から選択される。
【００９１】
下記参照文献によって例示される、前記リポータまたはケンチャ分子を、オリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端に付着させるための多数の連結モイエティ及び方法が存在する：Eckstein編集、Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９９１）；ZuckermanらによるNucleic acids Research、１５：５３０５−５３２１（１９８７）（オリゴヌクレオチド上の３’チロール基）；SharmaらによるNucleic acids Research、１９：３０１９（１９９１）（３’スルフヒドリル（sulfhydryl））；GiustiらによるＰＣＲ Methods and Applications、２：２２３−２２７（１９９３）及びFungらによる米国登録特許第４，７５７，１４１号（Applied Biosystems、Foster City、Ｃａｌｉｆ．から入手可能な、Ａｍｉｎｏｌｉｎｋ．ＴＭ．IIによる５’ホスホアミノ基）；Stabinskyによる米国登録特許第４，７３９，０４４号（３’アミノアルキルホスホリル基）；AgrawalらによるTetrahedron Letters、３１：１５４３−１５４６（１９９０）（ホスホラミデート連結による付着）；SproatらによるNucleic acids Research、１５：４８３７（１９８７）（５’メルカプト基）；Nelsonら、Nucleic acids Research、１７：７１８７−７１９４（１９８９）（３’アミノ基）など。
【００９２】
ロダミン色素及びフルオレセイン色素はまた、便利であるように、ホスホラミダイトモイエティを含む色素誘導体による固相合成、例えば、Wooらによる、米国登録特許第５，２３１、１９１号明細書、及びHobbs，Ｊｒ．による米国登録特許第４，９９７，９２８号明細書の最後の段階において、オリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシ基に付着する。
【００９３】
固体支持体へのCataCleaveＴＭプローブの付着
一具現例において、オリゴヌクレオチド・プローブは、固体支持体に付着される。異なるプローブが、前記固体支持体に付着され、サンプル中に存在する異なるターゲット配列の同時検出に使用される。異なる蛍光波長を有するリポータ分子が、前記異なるプローブに使用され、それによって、独立的に検出される異なるプローブとの混成化が可能になる。
【００９４】
オリゴヌクレオチド・プローブの固定化のための望ましい固体支持体の種類の例は、制御された多孔性ガラス、ガラスプレート、ポリスチレン、アビジンがコーティングされたポリスチレンビーズセルロース、ナイロン、アクリルアミドゲル、活性化されたデキストラン、制御された多孔性ガラス（ＣＰＧ：controlled poreglass）、ガラスプレート及び高度架橋ポリスチレン（high cross-linked polystyrene）を含む。この固体支持体は、その化学的安定性、作用基化の容易性、及び良好に定義された表面積により、混成化及び診断研究に望ましい。制御された多孔性ガラス（５００Å、１,０００Å）、及び非膨潤性（non-swelling）高度架橋ポリスチレン（１,０００Å）のような固体支持体が、そのオリゴヌクレオチド合成との相溶性に照らして、特に望ましい。
【００９５】
オリゴヌクレオチド・プローブは、多様な方式で、固体支持体に付着される。例えば、プローブは、プローブの３’末端または５’末端のヌクレオチドが、前記固体支持体に付着することにより、固体支持体に付着される。しかし、プローブは、前記プローブを固体支持体から距離をとらせるリンカ（linker）によって、固体支持体に付着される。前記リンカは、３０原子以上の長さを有することが望ましく、さらに望ましくは、５０原子以上の長さを有する。
【００９６】
固体支持体に固定化されるプローブの混成化は、一般的に、前記プローブが固体支持体から３０原子以上、さらに望ましくは、５０原子以上分離していることを必要とする。かような分離を達成するために、リンカは、望ましくは、前記リンカと３’ヌクレオシドとの間に配置されたスペーサ（spacer）を含む。オリゴヌクレオチド合成のために、前記オリゴヌクレオチドを固体支持体から解離させるために、リンカアーム（arm）は、塩基性試薬に分解されるエステル結合によって、前記３’ヌクレオシドの３’−ＯＨに付着する。
【００９７】
オリゴヌクレオチドを固体支持体に付着させるために使用される多様なリンカが、当該技術分野に公知されている。前記リンカは、固体支持体に付着したプローブと標的配列との混成化を著しく干渉しない任意の化合物で構成されてもよい。リンカは、自動化された合成によって、前記リンカに容易に付加されるホモポリマーオリゴヌクレオチドからなる。代案として、作用基化ポリエチレングリコールのようなポリマーが、リンカとして使用される。かようなポリマーは、プローブとターゲット・オリゴヌクレオチドとの混成化を著しく干渉しないから、ホモポリマーオリゴヌクレオチドに比べて望ましい。ポリエチレングリコールは、商業的に利用可能であり、有機性媒質及び水性媒質いずれもに溶解可能であり、作用基化が容易であり、オリゴヌクレオチド合成及び合成後条件で、完全に安定するので特に望ましい。
【００９８】
固体支持体、リンカ及びプローブ間の結合は、望ましくは、高温の塩基性条件下で、塩基保護基を除去する間に切断されない。望ましい結合の例は、カルバメート（carbamate）結合及びアマイド結合を含む。プローブの固定化は、当該技術分野に周知であり、当業者は、固定化条件を決定することができる。
【００９９】
前記方法の一具現例よれば、CataCleaveＴＭプローブを固体支持体に固定化させる。前記CataCleaveＴＭプローブは、検出可能な標識、並びにＤＮＡ核酸配列及びＲＮＡ核酸配列を含み、前記プローブのＲＮＡ核酸配列は、多形成を含むターゲットＤＮＡ配列の選択された部位に完全に相補的であり、前記プローブのＤＮＡ核酸配列は、前記ターゲットＤＮＡ配列の選択された部位に隣接したＤＮＡ配列に実質的に相補的である。その後、前記プローブを、プローブ内のＲＮＡ配列が、前記多形成を含むＰＣＲ断片内の相補的なＤＮＡ配列とＲＮＡ：ＤＮＡ異型二本鎖を形成することができる条件下で、ＲＮａｓｅ Ｈの存在下で、核酸サンプルと接触させる。前記ＲＮＡ：ＤＮＡ異型二本鎖内のＲＮＡ配列のＲＮａｓｅ Ｈ切断は、プローブ上の標識から放出される信号のリアルタイム増加を引き起こし、前記信号の増加は、ターゲットＤＮＡ内の多形成の存在を示す。
【０１００】
前記方法の他の具体例よれば、固体支持体に固定化されたCataCleaveＴＭプローブは、検出可能な標識、並びにＤＮＡ核酸配列及びＲＮＡ核酸配列を含み、前記プローブのＲＮＡ核酸配列は、多形成位置に野生型ＤＮＡ配列を含むターゲットＤＮＡ配列の選択された部位に完全に相補的であり、前記プローブのＤＮＡ核酸配列は、前記ターゲットＤＮＡ配列の選択された部位に隣接したＤＮＡ配列に実質的に相補的である。その後、前記プローブを、プローブ内のＲＮＡ配列が、前記多形成を含むＰＣＲ断片内の相補的なＤＮＡ配列とＲＮＡ：ＤＮＡ異型二本鎖を形成することができる条件下で、ＲＮａｓｅ Ｈの存在下で、核酸サンプルと接触させる。前記ターゲットＤＮＡ配列が多形成を含む場合、前記ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖内の多形成位置でのミスマッチは、前記ＲＮＡ：ＤＮＡ異型二本鎖内のＲＮＡ配列のＲＮａｓｅ Ｈ切断を阻害し、これは、前記プローブ上の標識から放出される信号のリアルタイム減少を引き起こし、前記信号の減少は、ターゲットＤＮＡ内の多形成の存在を示す。
【０１０１】
プローブの固体支持体への固定化は、前記プローブに混成化されたターゲット配列をサンプルから容易に分離させる。後期段階で、前記分離したターゲット配列を固体支持体から分離し、研究者の具体的な必要性により、当該技術分野に周知の方法によって、加工（例えば、精製、増幅）することができる。
【０１０２】
CataCleaveＴＭプローブのＲＮａｓｅ Ｈ切断
ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ−ＤＮＡ混成体内のＲＮＡを加水分解する。子牛胸腺で最初に同定されたＲＮａｓｅ Ｈは、次に、多様な有機体で発見された。実に、ＲＮａｓｅ Ｈ活性は、真核生物及びバクテリアで、普遍的に現れる。ＲＮａｓｅ Ｈは、多様な分子量及び核酸分解（nucleolytic）活性を有するタンパク質科（family）を構成するにもかかわらず、基質要件は、多様なイソタイプ（isotype）において、類似して現れる。例えば、これまで研究されたほとんどのＲＮａｓｅ Ｈは、エンドヌクレアーゼとして機能し、５’ホスフェート末端及び３’ヒドロキシ末端を有する分解産物を生成するために、ｎ二価陽イオン（例えば、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋）を必要とする。
【０１０３】
原核生物で、ＲＮａｓｅ Ｈは、クローニングされ、広くその特性が究明された（Crookeら、（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ、３１２（Ｐｔ２）、５９９−６０８；Limaら、（１９９７）Ｊ ＢｉｏｌＣｈｅｍ、２７２、２７５１３−２７５１６；Limaら、（１９９７）Biochemistry、３６、３９０−３９８；Limaら、（１９９７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７２、１８１９１−１８１９９；Ｌｉｍａら、（２００７）ＭｏｌＰｈａｒｍａｃｏｌ、７１、８３−９１；Limaら、（２００７）Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、７１、７３−８２；Limaら、（２００３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７８、１４９０６−１４９１２；Limaら、（２００３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７８、４９８６０−４９８６７；Itaya，Ｍ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９０、８７、８５８７−８５９１を参照）。例えば、大腸菌ＲＮａｓｅ ＨＩＩは、２１３アミノ酸長を有し、ＲＮａｓｅ ＨＩは、１５５アミノ酸長を有する。大腸菌ＲＮａｓｅ ＨＩＩは、大腸菌ＲＮａｓｅ ＨＩと、ただ１７％だけの相同性を有する。Ｓ．チフィムリウム（Ｓ．typhimurium）からクローニングされたＲＮａｓｅ Ｈは、大腸菌ＲＮａｓｅ ＨＩと、ただ１１個の位置のみ異なり、１５５アミノ酸長を有する（Itaya，Ｍ．及びKondo，Ｋ．、Nucleic acidｓ Ｒｅｓ．、１９９１、１９、４４４３−４４４９）。
多数のウイルス、その他バクテリア及び酵母から、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を示すタンパク質がまたクローニング及び精製された（Wintersberger、Ｕ．Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．、１９９０、４８、２５９−２８０）。多数の場合で、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有するタンパク質は、ＲＮａｓｅ Ｈが他の酵素、一般的にＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端に融合された融合タンパク質であると分かった。前記ＲＮａｓｅ Ｈドメインは、大腸菌ＲＮａｓｅ ＨＩと高いレベルの相同性を有すると一貫して明かかにされたが、他のドメインが相当に多様であるので、融合タンパク質の分子量及び他の特性は、広範囲に異なる。
【０１０４】
高次真核生物で、分子量、二価陽イオンの効果、スルフヒドリル作用剤（sulfhydryl agent）、及び免疫学的交差反応性の差に基づいて、２種類のＲＮａｓｅ Ｈが定義された（Busenら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９７７、７４、２０３−２０８）。ＲＮａｓｅ ＨＩ酵素は、６８−９０ｋＤａ範囲の分子量を有し、Ｍｎ２＋またはＭｇ２＋によって活性化され、スルフヒドリル作用剤に鈍感であると報告された。対照的に、ＲＮａｓｅ ＨＩＩ酵素は、３１−４５ｋＤａ範囲の分子量を有し、Ｍｇ２＋を必要として、スルフヒドリル作用剤に非常に敏感であり、Ｍｎ２＋によって抑制されると報告された（Busen，Ｗ．及びHausen，Ｐ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９７５、５２、１７９−１９０；Kane，Ｃ．Ｍ．、Biochemistry、１９８８、２７、３１８７−３１９６；Busen，Ｗ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８２、２５７、７１０６−７１０８）。
【０１０５】
ＲＮａｓｅ ＨＩＩ特性を有する酵素はまた、ヒト胎盤から、近い相同性をもって精製された（Frankら、Nucleic acidｓ Ｒｅｓ．、１９９４、２２、５２４７−５２５４）。このタンパク質は、約３３ｋＤａの分子量を有し、ｐＨ６．５−１０の範囲、最適ｐＨ８．５−９で活性を有する。この酵素は、Ｍｇ２＋を必要とし、Ｍｎ２＋及びｎ−エチルマレイミドによって抑制される。切断反応の産物は、３’ヒドロキシ末端及び５’ホスフェート末端を有する。
【０１０６】
多様な種で分離したＲＮａｓｅの詳細な比較は、Ohtani Ｎ、Haruki Ｍ、Morikawa Ｍ、Kanaya Ｓ．、Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｅｎｇ．１９９９；８８（１）：１２−９に報告されている。
【０１０７】
本具体例で使用されるＲＮａｓｅ Ｈ酵素の例は、ピュロコックス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）、ピュロコックス・ホリコシ（Pyrococcus horikoshi）、サーモコックス・リトラリス（Thermococcus litoralis）またはサーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）のような、好熱性有機体から分離した熱安定性ＲＮａｓｅ Ｈ酵素を含むが、それらに制限されるものではない。
【０１０８】
本具体例で使用される他のＲＮａｓｅ Ｈ酵素が、例えば、Uemoriによる米国登録特許第７，４２２，８８８号明細書、またはＷalderによる米国特許出願公開第２００９／０３２５１６９号公報に開示されており、その内容は、参照によって本明細書に挿入される。
【０１０９】
一具現例において、前記ＲＮａｓｅ Ｈ酵素は、下記に表示された、Ｐｆｕ ＲＮａｓｅ ＨＩＩ（配列番号１３）のアミノ酸配列と、４０％，５０％，６０％，７０％，８０％，９０％，９５％または９９％の相同性を有する熱安定性ＲＮａｓｅ Ｈである。
【０１１０】
MKIGGIDEAG RGPAIGPLVV ATVVVDEKNI EKLRNIGVKD SKQLTPHERK NLFSQITSIA 60
DDYKIVIVSP EEIDNRSGTM NELEVEKFAL ALNSLQIKPA LIYADAADVD ANRFASLIER 120
RLNYKAKIIA EHKADAKYPV VSAASILAKV VRDEEIEKLK KQYGDFGSGY PSDPKTKKWL 180
EEYYKKHNSF PPIVRRTWET VRKIEESIKA KKSQLTLDKF FKKP（配列番号１３）
【０１１１】
相同性は、例えば、コンピュータプログラムＤＮＡＳＩＳ−Ｍａｃ（Takara Shuzo）、コンピュータアルゴリズムＦＡＳＴＡ（version ３．０；Pearson，Ｗ．Ｒ．ら、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８５：２４４４−２４４８、１９８８）、またはコンピュータアルゴリズムＢＬＡＳＴ（version ２．０、Altschulら、Nucleic acidｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２、１９９７）を使用して決定することができる。
他の具体例において、ＲＮａｓｅ Ｈ酵素は、配列番号１３の５−２０，３３−４４，１３２−１５０及び１５８−１７３位置に該当する、一つ以上の相同性部位（homology region）１−４を有する、熱安定性ＲＮａｓｅ Ｈである。この相同性部位は、ピュロコックス・フリオシス（Pyrococcus furiosis），ピュロコックス・ホリコシ（Pyrococcus horikoshi），サーモコックス・コダカレンシス（Thermococcus kodakarensis），アルケオグルロブス・プロファンダス（Archeoglobus profundus），アルケオグルロブス・フルジダス（Archeoglobus fulgidis），サーモコックス・セレル（Thermococcus celer），サーモコックス・リトラリス（Thermococcus litoralis）ＲＮａｓｅ ＨＩＩポリペプチド配列の配列配置によって定義される。
【０１１２】
相同性部位１：ＧＩＤＥＡＧ ＲＧＰＡＩＧＰＬＶＶ（配列番号２０；配列番号１３の５−２０位置に該当）
相同性部位２：ＬＲＮＩＧＶＫＤ ＳＫＱＬ（配列番号２１；配列番号１３の３３−４４位置に該当）
相同性部位３：ＨＫＡＤＡＫＹＰＶ ＶＳＡＡＳＩＬＡＫＶ（配列番号２２；配列番号１３の１３２−１５０位置に該当）
相同性部位４：ＫＬＫ ＫＱＹＧＤＦＧＳＧＹ ＰＳＤ（配列番号２３；配列番号１３の１５８−１７３位置に該当）
【０１１３】
一具現例において、ＲＮａｓｅ Ｈ酵素は、配列番号２０，２１，２２または２３のポリペプチド配列と、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の配列同一性（sequenceidentity）を有する相同性部位のうち一つ以上を含む熱安定性ＲＮａｓｅ Ｈである。
【０１１４】
他の具体例において、ＲＮａｓｅ Ｈ酵素は、下記に表示されたサーマス・サーモフィルスＲＮａｓｅ ＨＩのアミノ酸配列（配列番号２５）と、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の相同性を有する熱安定性ＲＮａｓｅ Ｈである。
【０１１５】
MNPSPRKRVA LFTDGACLGN PGPGGWAALL RFHAHEKLLS GGEACTTNNR MELKAAIEGL
KALKEPCEVD LYTDSHYLKK AFTEGWLEGW RKRGWRTAEG KPVKNRDLWE ALLLAMAPHR
VRFHFVKGHT GHPENERVDR EARRQAQSQA KTPCPPRAPT LFHEEA（配列番号２５）
【０１１６】
さらに他の具体例において、ＲＮａｓｅ Ｈ酵素は、前記配列番号２５の２３−４８，６２−６９，１１７−１２１及び１４１−１５２位置に該当する相同性部位５ないし８のうち一つ以上を含む熱安定性ＲＮａｓｅ Ｈである。この相同性部位は、ヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae），サーマス・サーモフィリス（Thermus thermophilis），サーマス・アクアティクス（Thermus acquaticus），サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）及びアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＲＮａｓｅ ＨＩポリペプチド配列の配列配置によって定義される。
【０１１７】
相同性部位５：Ｋ＊Ｖ＊ＬＦＴＤＧ＊Ｃ＊ＧＮＰＧ＊ＧＧ＊ＡＬＬＲＹ（配列番号２９；配列番号２５の２３−４８位置に該当）
相同性部位６：ＴＴＮＮＲＭＥＬ（配列番号３０；配列番号２５の６２−６９位置に該当）
相同性部位７：ＫＰＶＫＮ（配列番号３１；配列番号２５の１１７−１２１位置に該当）
相同性部位８：ＦＶＫＧＨ＊ＧＨ＊ＥＮＥ（配列番号３２；配列番号２５の１４１−１５２位置に該当）
【０１１８】
さらに他の具体例において、前記ＲＮａｓｅ Ｈ酵素は、配列番号２９，３０，３１または３２のポリペプチド配列と、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の配列同一性を有する相同性部位４ないし８のうち一つ以上を含む熱安定性ＲＮａｓｅ Ｈである。
【０１１９】
本明細書で使用される「配列同一性（sequence identity）」は、比較範囲にわたってアミノ酸対アミノ酸を基準に、同一であるか、あるいは機能的または構造的に類似した配列の範囲を指す。従って、「配列同一性の百分率（percentage of sequence identity）」は、例えば、比較範囲にわたって最適に配列された２つの配列を比較する段階と、両配列で同一のアミノ酸が存在する位置の数を決定し、マッチする位置の数を得る段階と、マッチされる位置の数を、比較範囲内の全体位置数（すなわち、範囲サイズ）で割る段階と、その結果に１００を乗じて配列同一性の百分率を算出する段階と、によって計算されてもよい。
【０１２０】
特定の具体例において、ＲＮａｓｅ Ｈを変形させ、ホットスタート「誘導性（inducible）」ＲＮａｓｅ Ｈを製造することができる。
【０１２１】
本明細書で使用される用語「変形されたＲＮａｓｅ Ｈ（modified ＲＮａｓｅ Ｈ）」は、ＲＮａｓｅ Ｈのエンドヌクレアーゼ活性の喪失をもたらす抑制因子に、逆にカップルリングしたり、あるいは逆に結合するＲＮａｓｅ Ｈであってもよい。前記ＲＮａｓｅ Ｈから抑制因子の放出または脱カップリング（decoupling）は、前記ＲＮａｓｅ Ｈのエンドヌクレアーゼ活性を完全に、または少なくとも部分的に回復させる。純粋ＲＮａｓｅ Ｈのエンドヌクレアーゼ活性のうち、約３０ないし１００％であるならば、十分である。前記抑制因子は、リガンドまたは化学的変形体であってもよい。前記リガンドは、抗体、アプタマー（aptamer）、受容体、補助因子（cofactor）またはキレート化剤であってもよい。前記リガンドは、ＲＮａｓｅ Ｈ酵素の活性部位に結合し、それによって、酵素活性を抑制したり、あるいは前記ＲＮａｓｅの活性部位から遠く離れた部位に結合することができる。一部具体例において、リガンドは、構造的変化を誘導することができる。前記化学的変形は（例えば、ホルムアルデヒドによる）架橋化またはアシル化である。ＲＮａｓｅ Ｈからの抑制因子の放出または脱カップリングは、サンプルまたはカップルリングされたＲＮａｓｅ Ｈ（不活性）を、約６５℃ないし約９５℃以上の温度に加熱する段階、及び／または前記混合物またはサンプルのｐＨを、約７．０以下に低める段階によって達成される。
【０１２２】
本明細書で使用されるホットスタート「誘導性（inducible）」ＲＮａｓｅ Ｈ活性は、リガンドとの関連性によって調節されるエンドヌクレアーゼ酵素活性を有する、本明細書で記述される変形されたＲＮａｓｅ Ｈを指す。緩和された条件で、ＲＮａｓｅ Ｈエンドヌクレアーゼ酵素活性が活性化される一方、複製が許容されない（non-permissive）条件で、この酵素活性は抑制される。一部具体例において、変形されたＲＮａｓｅ Ｈの酵素活性は、逆転写を行うことができる温度、すなわち、約４２℃で抑制され、ＰＣＲ反応で観察されるさらに上昇した温度、すなわち、約６５℃ないし９５℃では活性化される。かような特性を有する変形されたＲＮａｓｅ Ｈは、「熱誘導性（heat inducible）」であると呼ばれる。
【０１２３】
他の具体例において、変形されたＲＮａｓｅ Ｈの酵素活性は、前記酵素を含む溶液のｐＨを変化させることによって調節される。
【０１２４】
本明細書で使用される「ホットスタート（hot start）」酵素組成物は、複製が許容されない温度、すなわち、約２５℃ないし約４５℃で抑制され、ＰＣＲ反応に適する温度、例えば、約５５℃ないし約９５℃で活性化される。特定の具体例において、「ホットスタート」酵素組成物は、当該技術分野に公知された「ホットスタート」ＲＮａｓｅ Ｈ及び／または「ホットスタート」熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを有することができる。
【０１２５】
ＲＮａｓｅ Ｈ酵素の架橋化は、例えば、ホルムアルデヒドを使用して行われる。一具現例において、熱安定性ＲＮａｓｅ Ｈは、ホルムアルデヒドを使用した、制御されて制限された架橋化を経ることができる。活性状態である変形されたＲＮａｓｅ Ｈを含む、増幅反応組成物を延長された時間、例えば、約１５分間約９５℃またはそれ以上に加熱することによって架橋化は反転され、ＲＮａｓｅ Ｈ活性が回復する。
【０１２６】
一般的に、架橋化度（degree of crosslinking）が低いほど、架橋化反転後、前記酵素のエンドヌクレアーゼ活性が高い。架橋化度は、ホルムアルデヒドの濃度及び架橋化反応の持続時間を変化させることにより、制御することができる。例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ酵素を架橋させるために、約０．２％（ｗ／ｖ）、約０．４％（ｗ／ｖ）、約０．６％（ｗ／ｖ）または約０．８％（ｗ／ｖ）のホルムアルデヒドを使用することができる。０．６％ホルムアルデヒドを使用した約１０分の架橋化反応が、ピュロコックス・フリオサスから由来したＲＮａｓｅ ＨＩＩを不活性化させるのに十分である。
【０１２７】
架橋化されたＲＮａｓｅ Ｈは、約３７℃で、測定可能なエンドヌクレアーゼ活性を示さない。一部の場合、架橋化されたＲＮａｓｅ Ｈの測定可能な部分的再活性化が、ＰＣＲ熱変性温度より低い約５０℃の温度で発生する。かような酵素の意図しない再活性化を阻むために、変形されたＲＮａｓｅ Ｈを再活性化前まで、５０℃未満の温度で保管及び維持することが要求される。
【０１２８】
一般的にＰＣＲは、二本鎖ターゲット配列を熱変性させるため、各周期ごとに、増幅組成物を約９５℃まで加熱しなければならず、これはまた、ＲＮａｓｅ Ｈから不活性化因子（inactivating factor）を放出させ、酵素の活性を部分的に、または完全に回復させるであろう。
【０１２９】
ＲＮａｓｅ Ｈはまた、前記酵素をアシル化剤、例えば、ジカルボン酸によって、リシン残基をアシル化させて変形させることができる。ＲＮａｓｅ Ｈのアシル化は、アシル化緩衝液のうち、ＲＮａｓｅ Ｈの溶液にシスアコニット酸無水物（cis-aconitic anhydride）を添加し、得られた混合物を、約１ないし２０℃で、５ないし３０時間インキュベーションさせることによって行われる。一具現例において、前記アシル化は、約３ないし８℃で、１８ないし２４時間実施される。アシル化緩衝液の種類は、特別に制限されるものではない。一具現例において、前記アシル化緩衝液は、ｐＨ約７．５ないし約９．０を有する。
【０１３０】
アシル化されたＲＮａｓｅ Ｈの活性は、増幅組成物のｐＨを約７．０未満に低下させることにより、回復させることができる。例えば、緩衝剤として、トリス緩衝液が使用される場合、前記組成物を約９５℃まで加熱し、ｐＨを約８．７（２５℃）から約６．５（９５℃）に低めることができる。
【０１３１】
増幅反応組成物で、加熱段階の持続時間は、変形されたＲＮａｓｅ Ｈ、ＰＣＲで使用された緩衝液などによって変わる。しかし、一般的には、増幅組成物を９５℃で約３０秒ないし４分間加熱すれば、ＲＮａｓｅ Ｈ活性の回復に十分である。一具現例において、商業的に利用可能な緩衝液、及び一つ以上の非イオン性洗剤は、使用したとき、２分の加熱後に、ピュロコックス・フリオサスＲＮａｓｅ ＨＩＩの完全な活性が回復する。
【０１３２】
ＲＮａｓｅ Ｈ活性は、当該技術分野に周知の方法を使用して決定される。例えば、第１方法によれば、単位活性（unit activity）は、決められた分析条件で、モル当量のポリチミジル酸（polythymidylic acid）の存在下で、一定モル数の放射性標識されたポリアデニル酸の酸可溶化として定義される（Epicentre Hybridase thermostable ＲＮａｓｅ ＨＩを参照）。第２方法で、前記単位活性は、モル当量のプローブ及び相補的テンプレートＤＮＡを含む反応物の相対蛍光強度の特異的増加として定義される。
【０１３３】
ＳＮＰのリアルタイム検出
ターゲット核酸におけるＳＮＰのリアルタイム検出のためのプローブとして、標識されたオリゴヌクレオチド・プローブを使用することができる。
【０１３４】
CataCleaveＴＭオリゴヌクレオチド・プローブは、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含むＰＣＲアンプリコン内で発見される配列に相補的なＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列を使用して最初に合成された。前記プローブは、例えば、ＦＲＥＴ対、例えば、プローブの一末端にフルオレセイン（fluorescein）、及び他の末端にロダミン（rhodamine）ケンチャ分子を使用して合成されてもよい。前記プローブは、選択されたＳＮＰの位置を含むターゲット核酸配列に、実質的に相補的になるように合成される。
【０１３５】
特定の具体例において、前記プローブのＲＮＡ配列は、野生型配列に相補的な配列を有するように操作することができる。
【０１３６】
他の具体例において、前記プローブのＲＮＡ配列は、ＳＮＰ配列に相補的な配列を有するように操作することができる。
【０１３７】
一具現例において、リアルタイム核酸増幅は、熱安定性核酸ポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ Ｈ活性、ＳＮＰを含むターゲット・ポリヌクレオチドに混成化することができるＰＣＲ増幅プライマー対、及び標識されたCataCleaveＴＭオリゴヌクレオチド・プローブの存在下、ターゲット・ポリヌクレオチドに対して行われる。リアルタイムＰＣＲ反応の間、CataCleaveＴＭオリゴヌクレオチド・プローブと、ＰＣＲアンプリコン内に存在するＳＮＰとの間に形成されたＲＮＡ：ＤＮＡ異型二本鎖プローブのＲＮａｓｅ Ｈ切断は、蛍光ケンチャから蛍光供与者を分離させ、ＰＣＲアンプリコン、及びそれによるターゲットＤＮＡのうちＳＮＰのリアルタイム検出に相応するプローブ蛍光のリアルタイム増大をもたらす。
【０１３８】
特定の具体例において、前記プローブのＲＮＡモイエティは、ターゲットＤＮＡ配列内ＳＮＰ位置に、野生型配列を含む。従って、ＳＮＰを含むＰＣＲアンプリコンとプローブとの混成化後に、ＳＮＰ位置で単一ヌクレオチドミスマッチを有するＲＮＡ：ＤＮＡ異型二本鎖形態は、ＲＮａｓｅ Ｈによって切断されない。
【０１３９】
他の具体例において、前記プローブのＲＮＡモイエティは、ターゲットＤＮＡ配列内のＳＮＰ位置で、相補的なＳＮＰ配列を含む。従って、前記ＳＮＰを含むＰＣＲアンプリコンと前記プローブとの混成化後に、ＲＮａｓｅ Ｈ活性によって切断されるＳＮＰ位置で、ミスマッチを有さないＲＮＡ：ＤＮＡ異型二本鎖が形成される。
【０１４０】
キット
本明細書の開示はまた、ターゲット核酸内ＳＮＰのリアルタイム検出のための一つ以上の試薬を有するパッケージ単位を含むキット形態を提供する。前記キットはまた、下記アイテムのうち一つ以上を含む：緩衝液、使用説明書、及び陽性または陰性の対照物質。キットは、本明細書に記述された方法を実施するのに適する比率に混合した試薬がこめられた容器を含んでもよい。試薬容器は、望ましくは、対象方法を実施するとき、測定段階を省略するための単位含量（unit quantity）に前記試薬を含む。
【０１４１】
また、キットは、熱安定性ポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＳＮＰの位置を含む部位を増幅するために選択されたプライマー、及びリアルタイムＰＣＲ産物にアニーリングし、本明細書に記述された方法によってＳＮＰを検出させる標識されたCataCleaveＴＭオリゴヌクレオチド・プローブを含むが、それに制限されるものではないリアルタイムＰＣＲ用試薬を含んでもよい。キットは、単一遺伝子内のＳＮＰ、または２以上の遺伝子におけるＳＮＰの座位を検出するための試薬を含んでもよい。他の具体例において、前記キット試薬は、生物学的サンプルから、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡを抽出するための試薬を追加して含む。キット試薬はまた、適用可能な場合、逆転写酵素ＰＣＲ分析のための試薬を含んでもよい。
【０１４２】
本明細書で明示された、任意の特許、特許出願、文献またはその他開示内容は、参照によって全体として本明細書に挿入される。参照によって本明細書に挿入されることに指示されたが、本明細書で提示された既存の定義、説明またはその他開示内容と相反する任意の内容またはその一部は、前記統合される内容と本開示内容との間に相反が発生しない範囲においてのみ統合される。
【実施例】
【０１４３】
下記実施例は、本発明による、ＲＮａｓｅ Ｈ酵素組成物を使用する方法を提示する。この実施例で記述された方法の段階は、制限的なものであると意図されるものではない。前記言及されたところ以外の本発明の追加的な目的及び利点は、本発明の範囲を制限すると意図されない下記実施例から自明になるであろう。
【０１４４】
実施例１
サルモネラｉｎｖＡ遺伝子における合成ＳＮＰの等温的検出
ターゲットＤＮＡ配列内で、単一ヌクレオチド配列差を区別するCataCleaveＴＭプローブの能力を検定するために、サルモネラのｉｎｖＡ遺伝子（配列番号３３）内に合成単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を製造した。前記単一ヌクレオチド変化は、サルモネラｉｎｖＡコーディング配列（配列番号３３）の１１６番位置で、ＴをＧに転換させた。ＦＲＥＴ対を生成するために、それぞれ二重標識化した２つの類似した１９ヌクレオチドCataCleaveＴＭプローブを、前記ＳＮＰヌクレオチドを含むｉｎｖＡ部位を横切って塩基対を形成するようにデザインした。野生型特異的プローブｉｎｖ−ＣＣProbe２（配列番号１）は、ｉｎｖＡの野生型に対して完璧な相補性を有し、ＳＮＰ特異的プローブｉｎｖ−ＣＣProbe２−２Ｃ（配列番号２）は、ｉｎｖＡの突然変異形態と完璧な相補性を有している。前記プローブを、CataCleaveＴＭプローブの４個のＲＮＡ塩基のうち、２番目（プローブの５’末端基準）が、ＳＮＰヌクレオチド位置で、塩基対を形成するようにデザインした。２種のＤＮＡオリゴヌクレオチド、野生型特異的ｉｎｖＡプローブに相補的なｉｎｖ２−Target１（配列番号３）、及びＳＮＰ特異的ｉｎｖＡプローブに相補的なｉｎｖ２−Target８（配列番号４）を合成した。前記２つのプローブの単一ヌクレオチドミスマッチを識別する能力を評価するために、等温的処理反応（isothermal processing reaction）を遂行した。反応での各構成成分の最終濃度は、２００ｎＭプローブ、０．４ｎＭターゲット・オリゴヌクレオチド、１０ｍＭトリスアセテートｐＨ８．６、５０ｍＭ酢酸カリウム、２．５ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭ ＤＴＴ及び２．５ｕハイブリダーゼ熱安定性ＲＮａｓｅＧＩ（hybridase thermostable ＲＮａｓｅ ＨＩ）（Epicentre）の通りであった。前記反応物を５５℃で６０分間インキュベーションしながら、毎分蛍光データを収集した。図１は、ｉｎｖ−ＣＣProbe２（配列番号１）が、ｉｎｖ２−Target１（配列番号３）またはｉｎｖ２−Target８（配列番号４）と反応したときに生成される蛍光信号を示している。ｉｎｖ−ＣＣProbe２をｉｎｖ２−Target１とインキュベーションさせた場合、蛍光信号は、線形に増加し、ＲＮａｓｅ ＨＩがオリゴヌクレオチドと完璧に対を形成したプローブを認識及び切断したということを示している。ｉｎｖ−ＣＣProbe２をｉｎｖ２−Target８とインキュベーションさせた場合、蛍光信号は、ほとんど生成されておらず、これは、ミスマッチされたオリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅ ＨＩに対してほぼターゲットとして作用していないということを示唆する。
【０１４５】
図２は、ｉｎｖ−ＣＣProbe２−２Ｃ（配列番号２）を、ｉｎｖ２−Target１（配列番号３）またはｉｎｖ２−Target８（配列番号４）と反応させたときに生成された蛍光信号を示している。蛍光の増加と示された完璧に対になったｉｎｖ２−Target８とインキュベーションさせたとき、ＲＮａｓｅ ＨＩによって、Ｉｎｖ−ＣＣProbe２−２Ｃが切断した。野生型ｉｎｖＡターゲットとインキュベーションしたとき、蛍光信号はほとんど観察されておらず、これは、ミスマッチされた対に対する不良なプローブ切断を示す。
【０１４６】
実施例２
サルモネラｉｎｖＡ遺伝子における合成ＳＮＰのリアルタイムＰＣＲ検出
野生型または（前述の）突然変異型塩基を含む２６７ヌクレオチドのｉｎｖＡ配列を含むプラスミドＤＮＡを合成した。４０ｐｇの野生型プラスミド、突然変異体プラスミド、または前記２つのプラスミドの混合体を、野生型配列または突然変異配列に相補的である、異なるように標識化されたプローブを含んだマルチプレックス・リアルタイムＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。それぞれの構成成分の最終濃度は、８００ｎＭ順方向プライマーサルモネラＦ１（配列番号５）、８００ｎＭ逆方向プライマーｓａｌ−ｉｎｖＲ２（配列番号６）、２００ｎＭ野生型特異的プローブｉｎｖ−ＣＣProbe２（配列番号１）、２００ｎＭ ＳＮＰ特異的プローブｉｎｖ−ＣＣProbe２−２Ｃ（配列番号２）、８０ｕＭそれぞれのｄＮＴＰ、１０ｍＭトリスアセテートｐＨ８．６、５０ｍＭ酢酸カリウム、２．５ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｕプラチナＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Life Technologies）及び２．５ｕハイブリダーゼ熱安定性ＲＮａｓｅ ＨＩ（Epicentre）の通りであった。前記ＰＣＲ反応物を９５℃で２分間インキュベーションさせ、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼを活性化させた後、９５℃で１０秒、及び６０℃で２０秒の周期を４０回遂行した。図３は、ＦＡＭ標識されたｉｎｖ−ＣＣProbe２（配列番号１）から、ＰＣＲの間に生成された蛍光信号を示し、図４は、ＴＹＥ６６５標識されたｉｎｖ−ＣＣProbe２−２Ｃ（配列番号２）から、ＰＣＲの間に生成された蛍光信号を示す。このＰＣＲ反応に係わる蛍光曲線は、それぞれのプローブが、完全に相補的なターゲットの増幅を検出することができ、１つのミスマッチを含むターゲットの増幅は、検出していないということを示す。
【０１４７】
実施例３
ウシｂカゼイン遺伝子のＡ１及びＡ２対立遺伝子の等温的検出
乳牛の牛乳の中には、Ａ２カゼイン及びＡ１ ｂカゼインと呼ばれる、ｂカゼインタンパク質の２種の完全な天然変異体または形態が存在する。Ａ１カゼインとＡ２ ｂカゼインとの差は、６７番位置にある単一アミノ酸である。Ａ１変異体で、塩基はＴであり、Ａ２変異体で、前記塩基はＧである。牛乳中のＡ１変異体ｂカゼインは、前記位置でヒスチジンアミノ酸を有するという点で、全ての哺乳動物のｂカゼインのうちで唯一である。他種の乳は、そのｂカゼイン鎖の同一の位置で、プロリンアミノ酸を有する点で、Ａ２類似体と考えられることができるｂカゼインを含む。水牛、ヤク、ヤギ及びヒトの乳は、いずれもＡ２類似形態のｂカゼインを含む。
【０１４８】
本実施例では、それぞれＦＲＥＴ対を生成するために、二重に標識された２種の類似した１９ヌクレオチドCataCleaveＴＭプローブを、ウシｂカゼイン遺伝子のＡ１／Ａ２ ＳＮＰヌクレオチド位置を横切って塩基対を形成するようにデザインした。Ａ１−ＣＣProbe２−ＲＣ（配列番号７）は、Ａ１対立遺伝子と完全に塩基対を形成し、Ａ２−ＣＣProbe１−ＲＣ（配列番号８）は、Ａ２対立遺伝子と完全に塩基対を形成する。Ａ１−ＣＣProbe２−ＲＣは、前記CataCleaveＴＭプローブの４個のＲＮＡ塩基のうち、最初（プローブの５’末端基準）がＳＮＰヌクレオチド位置で塩基対を形成するようにデザインされた。Ａ１対立遺伝子を示す、Ａ１−Target−ＲＣ（配列番号９）及びＡ２対立遺伝子を示すＡ２−Target−ＲＣ（配列番号１０）の２種ＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成した。前記２つのプローブの単一ヌクレオチド差を識別する能力を評価するために、ＲＮａｓｅ ＨＩを使用して、等温処理反応を行った。反応物のうち、それぞれの構成成分の最終濃度は、２００ｎＭプローブ、０．４ｎＭターゲット・オリゴヌクレオチド、１０ｍＭトリスアセテートｐＨ８．６、５０ｍＭ酢酸カリウム、２．５ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭ ＤＴＴ及び２．５ｕハイブリダーゼ熱安定性ＲＮａｓｅ ＨＩ（Epicentre）の通りであった。前記反応物を５５℃で６０分間インキュベーションしながら、毎分蛍光データを収集した。図５は、Ａ１−ＣＣProbe２−ＲＣ（配列番号７）が、Ａ１−Target−ＲＣ（配列番号９）またはＡ２−Target−ＲＣ（配列番号１０）と反応したときに生成される蛍光信号を示している。Ａ１−ＣＣProbe２−ＲＣをＡ１−Target−ＲＣとインキュベーションさせたとき、蛍光信号は線形に増加し、ＲＮａｓｅ ＨＩが完全に対を形成したオリゴヌクレオチドを認識して切断したということを示している。Ａ１−ＣＣProbe２−ＲＣをＡ２−Target−ＲＣとインキュベーションさせた場合、蛍光信号は、ほとんど生成されておらず、これは、ミスマッチされたオリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅ ＨＩに係わる不良なターゲットであるということを示唆する。図６は、Ａ２−ＣＣProbe１−ＲＣ（配列番号８）を、Ａ１−Target−ＲＣ（配列番号９）またはＡ２−Target−ＲＣ（配列番号１０）と反応させたときに発生する蛍光信号を示している。ＲＮａｓｅ ＨＩによるＡ２−ＣＣProbe１−ＲＣ切断は、Ａ２−ＣＣProbe１−ＲＣをＡ２−Target−ＲＣとインキュベーションさせたときに行われたが、Ａ１−Target−ＲＣとインキュベーションさせた場合に切断は発生しなかった。
【０１４９】
実施例４
ウシｂカゼイン遺伝子のＡ１対立遺伝子及びＡ２対立遺伝子のリアルタイムＰＣＲ検出
CataCleaveＴＭ基盤ＳＮＰ検出を利用した遺伝子型分析のために、３種セットの乳牛（dairy bull）ＤＮＡを使用した。前記３種ＤＮＡは、前もって配列分析によって遺伝子型を分析し、ｂカゼイン遺伝子の３種の可能な遺伝子型、Ａ１／Ａ１、Ａ２／Ａ２及びＡ１／Ａ２を示すということが分かった。Heyenらによって前もって開示されたところにより、オス牛の精液からＤＮＡを抽出した。２００ｎｇのＡ１／Ａ２遺伝子型、Ａ２／Ａ２遺伝子型またはＡ１／Ａ２遺伝子型のゲノムＤＮＡを、異なるように標識したＡ１−ＣＣProbe２−ＲＣ（配列番号７）及びＡ２−ＣＣProbe１−ＲＣ（配列番号８）をいずれも含む、マルチプレックス・リアルタイムＰＣＲ反応物のテンプレートとして使用した。それぞれの構成成分の最終濃度は、８００ｎＭ順方向プライマーＡ２Ｄ−Ｆ（配列番号１１）、８００ｎＭ逆方向プライマーＡ２Ｄ−Ｒ−１５０（配列番号１２）、２００ｎＭ Ａ１−ＣＣProbe２−ＲＣ（配列番号７）、２００ｎＭ Ａ２−ＣＣProbe１−ＲＣ（配列番号８）、８０ｕＭそれぞれのｄＮＴＰ、１０ｍＭトリスアセテートｐＨ８．６、５０ｍＭ酢酸カリウム、２．５ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｕプラチナＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Life Technologies）及び２．５ｕハイブリダーゼ熱安定性ＲＮａｓｅ ＨＩ（Epicentre）の通りであった。前記ＰＣＲ反応物を９５Ｃで２分間インキュベーションさせ、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼを活性化した後、９５℃で１０秒及び６０℃で３０秒の周期を４０回遂行した。図７は、ＴＹＥ５６３標識されたＡ１−ＣＣProbe２−ＲＣ（配列番号７）から、ＰＣＲの間に発生した蛍光信号を示し、図８は、ＴＹＥ６６５標識されたＡ２−ＣＣProbe１−ＲＣ（配列番号８）から、ＰＣＲの間に発生した信号を示す。前記ＰＣＲ反応に係わる蛍光曲線は、それぞれのプローブが完璧に相補的なターゲットの増幅を検出することができ、単一ミスマッチを含むターゲットの増幅は、検出しないということを示唆する。
本明細書で明示された任意の特許、特許出願、文献またはその他開示内容は、参照によって全体として本明細書に挿入される。本明細書に参照によって統合されるが、本明細書で提示された既存の定義、説明またはその他開示内容と相反する任意の内容、またはその一部は、統合された内容と本開示内容との間に相反が発生しない範囲においてのみ統合される。
【０１５０】
配列リスト自由テキスト
添付された配列リスト（配列番号１ないし３３）を参照する。
【図１】
2013545442.tif 000004
【図２】
2013545442.tif 000005
【図３】
2013545442.tif 000006
【図４】
2013545442.tif 000007
【図５】
2013545442.tif 000008
【図６】
2013545442.tif 000009
【図７】
2013545442.tif 000010
【図８】
2013545442.tif 000011
【配列表】
2013545442000001.app
【国際調査報告】
2013545442.tif 000012
2013545442.tif 000013