(57)【要約】  本発明は、化学的加水分解、より詳細には、ペプチドおよびタンパク質などの加水分解に不安定な結合を保有する化学的基質の加水分解を容易にする分子インプリントポリマー(MIP)を調製する方法に関する。したがって、本発明は、加水分解活性を保有するように設計されたMIP、そのようなMIPを調製するための方法およびMIPの用途を対象とする。
2013501108.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミド基またはエステル基を加水分解するための分子インプリントポリマー(MIP)を調製するための方法であって、
(i)ポケット形成部分と共有結合する4面体の化学的部分を含む分子テンプレートを調製するステップと、
(ii)分子テンプレートおよびポロジェンの存在下でモノマーおよび架橋剤を重合させるステップと、
(iii) (ii)において形成されるポリマーから、テンプレート、またはその一部を分離し、MIPを得るステップと
を含む方法。
【請求項２】
トリプシンの触媒活性を模倣する分子インプリントポリマー(MIP)を調製するための方法であって、
(i) (a)ポケット形成部分と共有結合する4面体の化学的部分、および
(b)セリン様部分(slp)と共有結合するヒスチジン様部分(hlp) (前記hlpまたはslpは、フリーラジカル重合性基を持つ)
を含む分子テンプレートを調製するステップと、
(ii)遊離酸基が、hlpと水素結合を形成することができるように、ポロジェンの存在下で架橋剤および分子テンプレートと共に遊離酸基(または、その保護された形態)を有するモノマーを重合させるステップと、
(iii) (ii)から形成されるポリマーから、テンプレート、またはその一部を分離し、MIPを得るステップと
を含む方法。
【請求項３】
4面体の化学的部分が、
【化１】
2013501108.tif 000083
(式中、R1は、水素、またはC1〜C6アルキルから選択される)
から選択される、請求項1または請求項2に記載の方法。
【請求項４】
4面体の化学的部分が、式
【化２】
2013501108.tif 000084
(式中、
R1は、水素、およびC1〜C2アルキルから選択され、
X1は、O、S、および置換されていてもよいアルキレンから選択される)
のホスホネートである、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ポケット形成部分が、リシンまたはアルギニンのアミノ酸側鎖を構造的に模倣する分子足場である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ポケット形成部分が、アミノまたはグアニジン部分(または、その保護された形態)を含む、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
ポケット形成部分と共有結合する4面体の化学的部分が、式
【化３】
2013501108.tif 000085
(式中、
Xは、P、As、およびSbから選択され、
R1は、水素およびC1〜C2アルキルから選択され、
PFは、置換されていてもよいアルキル、保護されていてもよいアミノ、保護されていてもよいグアニジノ、N-含有ヘテロ環、およびN-含有ヘテロアリールから選択されるポケット形成部分である)
により表される、請求項1または請求項2に記載の方法。
【請求項８】
PFについての置換されていてもよいアルキル基が、
【化４】
2013501108.tif 000086
(式中、
nは、0〜6から選択され、
Yは、保護されていてもよいアミノ、保護されていてもよいグアニジノ、N-含有ヘテロ環、およびN-含有ヘテロアリールから選択され、
Tは、置換されていてもよいC1〜C3アルキル、置換されていてもよいアシルアミノ、置換されていてもよいオキシアシルアミノ、置換されていてもよいアミノアシルオキシ、置換されていてもよいアミノアシル、置換されていてもよいオキシアシル、置換されていてもよいアシルオキシ、置換されていてもよいアミノアシルオキシ、置換されていてもよいアシルアミノ、置換されていてもよいアシルイミノオキシ、置換されていてもよいオキシアシルイミノ、置換されていてもよいスルフィニルアミノ、置換されていてもよいスルホニルアミノ、置換されていてもよいオキシスルフィニルアミノ、置換されていてもよいオキシスルホニルアミノおよび置換されていてもよいオキシアシルオキシから選択される)
から選択される、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
nが、0〜4から選択される、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
nが、4である、請求項8に記載の方法。
【請求項１１】
Yが、アミノまたはグアニジノである、請求項8から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
Yが、
【化５】
2013501108.tif 000087
またはそれらの置換誘導体から選択される、請求項8から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ポケット形成部分と共有結合する4面体の化学的部分が、式
【化６】
2013501108.tif 000088
(式中、
nは、0〜6から選択され、(好ましくは、nは、0〜4である)
Yは、
【化７】
2013501108.tif 000089
またはそれらの置換誘導体から選択され、
R1は、水素およびC1〜C2アルキルから選択され、
Tは、-NHC(X')O-R2、-OC(X')O-R2、-CR3R4R5、-CR3R4C(X')O-R2およびペプチド残基から選択され、
R2は、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいアリールアルキル、置換されていてもよいヘテロアリール、および置換されていてもよいヘテロシクリルから選択され、
X'は、SまたはOであり、
R3およびR4は、独立して、水素およびC1〜C3アルキルから選択され、
R5は、置換されていてもよいアリールまたは置換されていてもよいアリールアルキルから選択される)
により表される、請求項1または請求項2に記載の方法。
【請求項１４】
ポケット形成部分と共有結合する4面体の化学的部分が、式
【化８】
2013501108.tif 000090
(式中、フェニルおよび/またはフタルイミド基は、独立して、1〜4個の置換基でさらに置換されていてよい)
により表される、請求項1または請求項2に記載の方法。
【請求項１５】
分子テンプレートが、式(I)
Y-L-X-O-Z (I)
(式中、
Yは、保護されていてもよいアミノ、保護されていてもよいグアニジン、N-含有ヘテロ環、およびN-含有ヘテロアリールから選択され、
Lは、置換されていてもよいC1〜C5アルキレンから選択される二価の連結基を表し、
Xは、4面体原子が、リン、ヒ素、アンチモン、ホウ素、ケイ素、硫黄またはセレンから選択される4面体の化学部分であり、
Zは、ヒスチジン様部分(hlp)と共有結合するセリン様部分の残基(rslp)を表す)
により表される、請求項1または請求項2に記載の方法。
【請求項１６】
Xが、
【化９】
2013501108.tif 000091
(式中、R1は、水素およびC1〜C2アルキルから選択される)
から選択され、
Lが、
【化１０】
2013501108.tif 000092
(式中、
nは、0〜4から選択され、
Tは、置換されていてもよいC1〜C3アルキル、置換されていてもよいオキシアシルアミノ、置換されていてもよいアミノアシルオキシ、置換されていてもよいアミノアシル、置換されていてもよいオキシアシル、置換されていてもよいアシルオキシ、および置換されていてもよいオキシアシルオキシから選択される)
から選択され、
Yが、
【化１１】
2013501108.tif 000093
またはそれらの置換誘導体から選択される、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
Xが、
【化１２】
2013501108.tif 000094
(式中、R1は、水素およびC1〜C2アルキルから選択される)
であり、
Lが、
【化１３】
2013501108.tif 000095
(式中、
nは、0〜4から選択され、
Tは、置換されていてもよいオキシアシルアミノを表す)
から選択され、
Yが、
【化１４】
2013501108.tif 000096
またはそれらの誘導体から選択される、請求項15に記載の方法。
【請求項１８】
式(I)中の
【化１５】
2013501108.tif 000097
が、
【化１６】
2013501108.tif 000098
(式中、フェニルおよび/またはフタルイミド基は、独立して、1〜4個の置換基でさらに置換されていてよい)
により表される、請求項15に記載の方法。
【請求項１９】
-O-Z部分を、
【化１７】
2013501108.tif 000099
(式中、mは、0〜4から選択される整数である)
から選択することができる、請求項15から18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
hlp部分を、
【化１８】
2013501108.tif 000100
またはそれらの置換誘導体により表すことができる、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
hlpまたはslpが、フリーラジカル重合性基を持つ、請求項15から19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
-O-Zが一緒に、
【化１９】
2013501108.tif 000101
またはそれらの置換誘導体を表すことができる、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
モノマーが、メタクリル酸である、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
架橋剤が、EDMAである、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ポロジェンが、アセトン、アセトニトリル、クロロホルム、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド(DMF)、酢酸エチル、エタノール、メタノールおよびジメチルスルホキシド(DMSO)、ならびにそれらの混合物から選択される、請求項1から24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
MIPが、初めにテンプレート分子をポリマーと共有結合的に連結させることにより調製される、請求項1から25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
重合ステップが、フリーラジカル重合により行われる、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
MIPが、ビーズの形態である、請求項26または請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
モノマーに対するテンプレートの比が、約1:1である、請求項26に記載の方法。
【請求項３０】
式(I)
Y-L-X-O-Z (I)
(式中、
Yは、保護されていてもよいアミノ、保護されていてもよいグアニジン、N-含有ヘテロ環、およびN-含有ヘテロアリールから選択され、
Lは、置換されていてもよいC1〜C5アルキレンから選択される二価の連結基を表し、
Xは、
【化２０】
2013501108.tif 000102
から選択される4面体の化学部分であり、
Zは、
【化２１】
2013501108.tif 000103
またはそれらの置換誘導体(式中、mは、0〜4の整数である)から選択される、ヒスチジン様部分(hlp)と共有結合するセリン様部分の残基(rslp)を表す)
により表される化合物。
【請求項３１】
Lが、
【化２２】
2013501108.tif 000104
(式中、
nは、0〜4から選択され、
Tは、置換されていてもよいC1〜C3アルキル、置換されていてもよいオキシアシルアミノ、置換されていてもよいアミノアシルオキシ、置換されていてもよいアミノアシル、置換されていてもよいオキシアシル、置換されていてもよいアシルオキシ、および置換されていてもよいオキシアシルオキシから選択される)から選択され、
Yが、
【化２３】
2013501108.tif 000105
またはそれらの置換誘導体から選択される、請求項30に記載の化合物。
【請求項３２】
Xが、
【化２４】
2013501108.tif 000106
(式中、R1は、水素およびC1〜C2アルキルから選択される)
であり、
Lが、
【化２５】
2013501108.tif 000107
(式中、
nは、0〜4から選択され、
Tは、置換されていてもよいオキシアシルアミノを表す)
から選択され、
Yが、
【化２６】
2013501108.tif 000108
またはそれらの誘導体から選択される、請求項30または31に記載の化合物。
【請求項３３】
式(I)中の
【化２７】
2013501108.tif 000109
が、
【化２８】
2013501108.tif 000110
(式中、フェニルおよび/またはフタルイミド基は、独立して、1〜4個の置換基でさらに置換されていてよい)
により表される、請求項30から32のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３４】
請求項1から29のいずれか一項に記載の方法により得られるMIP。
【請求項３５】
空洞の表面上に
(a)少なくとも1つのヒドロキシル部分、
(b)少なくとも1つのイミダゾール部分、および
(c)少なくとも1つのカルボキシル部分
を包含する空洞を含む架橋モノマー単位により特徴付けられるMIP。
【請求項３６】
少なくとも1つのヒドロキシル部分が、
【化２９】
2013501108.tif 000111
(式中、nは、独立して、0〜4を表す)
から選択される、請求項35に記載のMIP。
【請求項３７】
少なくとも1つのイミダゾール部分が、
【化３０】
2013501108.tif 000112
から選択される、請求項35に記載のMIP。
【請求項３８】
少なくとも1つのカルボキシル部分が、
【化３１】
2013501108.tif 000113
(式中、各nは、独立して、0〜4を表す)
から選択される、請求項35に記載のMIP。
【請求項３９】
少なくとも1つのヒドロキシル部分および少なくとも1つのイミダゾール部分が、共有結合しており、好ましくは、式(II)
【化３２】
2013501108.tif 000114
により表される、請求項35に記載のMIP。
【請求項４０】
少なくとも1つのヒドロキシル部分および少なくとも1つのイミダゾール部分が、式(IIa)
【化３３】
2013501108.tif 000115
により表される、請求項39に記載のMIP。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、化学的加水分解、より詳細には、ペプチドおよびタンパク質などの加水分解に不安定な結合を有する化学的基質の加水分解を容易にする分子インプリントポリマー(MIP)を調製する方法に関する。したがって、本発明は、加水分解活性を有するように設計されたMIP、そのようなMIPを調製するための方法およびMIPの使用を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
セリンプロテアーゼ(セリンエンドペプチダーゼとしても知られている)は、活性部位のアミノ酸のうちの1つがセリンであるプロテアーゼである。
【０００３】
酵素のこのファミリーは、単細胞生物と複合生物の両方で、および真核生物と原核生物の両方で見いだされる。
【０００４】
セリンプロテアーゼは、構造的相同性に基づくスーパーファミリーにグループ分けされ、次いで、類似の配列を持つファミリーにさらにサブグループ分けされる。
【０００５】
ヒトおよび他の哺乳動物で見いだされる主要なスーパーファミリーは、キモトリプシン様、スブチリシン様、α/βヒドロラーゼ、およびシグナルペプチダーゼクランを包含する。
【０００６】
セリンプロテアーゼは、哺乳動物において、元来は消化酵素であったが、進化して、血液凝固、免疫系、および炎症において機能を果たすようにもなった。
【０００７】
キモトリプシン様クランの3つの最も研究されたセリンプロテアーゼは、キモトリプシン、トリプシン、およびエラスターゼである。3つの酵素はすべて、膵腺房細胞により合成され、小腸において分泌され、ペプチド結合の加水分解を触媒する役割を担っている。これらの酵素は、構造が類似しているが、切断されているペプチド結合に関して異なり、この結合は、切れやすい結合と呼ばれる。大部分の酵素と同様に、キモトリプシン、トリプシン、およびエラスターゼの各々は、それらが触媒する反応に極めて特異的である。各々は、切断部位を取り囲むアミノ酸残基の側鎖に基づいて、ポリペプチド鎖の異なる領域を標的とする。
【０００８】
キモトリプシンは、かさ高い(bulky)疎水性アミノ酸残基に続くペプチド結合を切断する役割を担っている。そのような残基は、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンを包含する。
【０００９】
トリプシンは、正に帯電したアミノ酸残基(好ましくは、リシンおよび/またはアルギニン)に続くペプチド結合を切断する役割を担っている。キモトリプシンの疎水性ポケットを有する代わりに、ポケットの根元にアスパラギン酸残基が存在する。その結果、これは、切断されることになる基質ペプチド上のアルギニンおよびリシンなどの正に帯電した残基と相互作用することができる。
【００１０】
エラスターゼは、アラニン、グリシン、およびバリンなどの小さな中性アミノ酸残基に続くペプチド結合を切断する役割を担っている。これらのアミノ酸残基は、肉において結合組織の多くを形成する。「トリプシン」および「キモトリプシン」内にあるポケットは、バリンおよびスレオニンで部分的に占有され、それを単なる凹部にして、これらのより小さなアミノ酸残基を収容することができる。
【００１１】
酵素のキモトリプシン様クランおよびスブチリシン様クランにおける触媒機構の主な構成要素は、「触媒トライアド」と呼ばれる。トライアドは、触媒作用が起こる酵素の活性部位に位置し、すべてのセリンプロテアーゼ酵素において保存されている。トライアドは、3つの必須アミノ酸:ヒスチジン(His 57)、セリン(Ser 195)およびアスパラギン酸(Asp 102)からなる配位構造である。互いに極めて近くに位置するため、これら3つの鍵となるアミノ酸は、各々、プロテアーゼの切断能力において役割を果たす。
【００１２】
定序機構は、いくつかの中間体が生成される触媒作用中に起こる。ペプチド切断が関わる触媒作用において、基質が結合し(例えば、切断されるポリペプチド)、生成物が放出され(ペプチドのN末端「半分」)、別の基質が結合し(この場合には、水)、別の生成物が放出される(ペプチドのC末端「半分」)。
【００１３】
トライアド中の各アミノ酸は、このプロセスにおいて特定の仕事を行い、これは、図1中のスキームにより図示される。セリンは、求核試薬として作用し、基質の切れやすいペプチド結合のカルボニル炭素を攻撃することができる-OH基を有している。ヒスチジン窒素上の電子対は、セリン-OH基から水素を受けとる能力を有し、このようにして、ペプチド結合の攻撃を調整する。一方、アスパラギン酸上のカルボキシル基も、ヒスチジンと水素結合を形成し、上に述べられている電子対をさらに電気的陰性にする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Protecting Groups in Organic Synthesis、Greene T W、Wiley- Interscience、New York、1981
【非特許文献２】「Comprehensive organic transformations: a guide to functional group preparations」Larock R. C.による、New York、VCH Publishers, Inc. 1989
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
このような酵素の触媒能力は、しばらくの間は産業において用いられてきたが、プロテアーゼは、大部分の他の酵素と同様に、温度およびpHに敏感である。産業的プロセス(例えば、バイオレメディエーション)は、pHおよび温度回復性の遺伝子改変された微生物を利用することが多い。しかしながら、そのような微生物の使用は、それらが環境中に偶発的または意図的に放出されることがあれば問題になりうることが危惧される。このようにして、そのような生物工学の応用は、これらの環境への懸念に対処するための追加対策を必要とする。したがって、そのような酵素の非生物学的模倣体を調製することは有益かつ望ましいであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、アミド結合およびエステル結合を効果的に加水分解する、より詳細には、酵素的なアミド結合触媒作用を模倣することができる分子インプリントポリマー(MIP)を設計することができるという発見に基づいている。そのようなMIPは、例えば、タンパク質/ペプチド工場流出排水の処理における使用にとっての有意な潜在力を有する。例えば、皮革加工における硬化および鞣し中に、タンパク質と脂肪の両方が皮から除去される。そのようなプロセスのタンパク質/ペプチド副成物(排水)は、典型的には、生体有害性と見なされ、したがって、処理するための主要な経費になることがある。
【００１７】
上に記載されているプロセスの一部により生み出される排水のタンパク質成分の消化は、高温におけるアルカリ塩溶液またはアルカリ性プロテアーゼ酵素により達成することができるが、そのような処理プロセスは、毒性のまたは潜在的に生体有害性の材料の使用にも悩まされている。
【００１８】
他の産業への応用は、洗浄剤(洗濯および食器洗い)、食品(乳製品を包含する)、パン焼き、パルプおよび紙加工における使用、ならびに繊維産業および生物工学産業における酵素の使用も包含する。また、酵素を使用する応用の多くにおいて、フィードストックおよび反応条件の化学的性質は、資本支出をも増加させる酵素の再利用を可能にすることができないことが多い。
【００１９】
本発明のMIPは、再利用可能であり、化学的および生物学的に安定なポリマー触媒を提供することに加えて、これらの化学的/酵素的プロセスに対するより安全かつ経済的な代替策を提供する。
【００２０】
分析的タンパク質化学およびプロテオミクスの分野において、プロテアーゼは、タンパク質の部位特異的な溶液中タンパク質分解のため、または固定化酵素によるそれらのオンカラムタンパク質分解のために使用される。その場合、得られるペプチドは、高速液体クロマトグラフィーを使用して分離され、質量分析法で同定される。タンパク質の溶液中タンパク質分解において用いられる酵素が普通は回収されないのは、それらが自己分解を受けることがあるからである。オンカラムタンパク質分解において使用される酵素は、溶液中でのプロセスにおいて使用される酵素と比較して自己分解を受けにくいが、それらの寿命は、それらの化学的および生物学的不安定性(他のプロテアーゼに対するそれらの脆弱性を包含する)によって依然として限定され、このようにして、そのようなカラムの寿命を制限する。ビーズの形態であってよい本発明のMIPは、バッチインキュベーションプロセスにおいて酵素の代替物として使用することができ、MIPは、このプロセスが終了した後で回収される。
【００２１】
本発明のMIPは、機能的要件に応じて、制御された剛性または柔軟性を持ち、いかなる特定の基質に対しても特異的であるように合わせて作ることができる空洞を含有するポリマーを製造するように可変レベルの架橋で設計することができる。MIPは、一般的に、対象の分子(テンプレートとも呼ばれる)の可塑性の鋳型、鋳造物またはポケットと考えられることがあり、認識は、ポケットの形状およびポケット内の化学的機能性に基づいている。テンプレート分子を使用し、テンプレート化合物に対して特異的であるか、類似の化学構造を有する他の分子に対して選択的であるMIPを調製することができる。本発明のMIPは、高い選択性および特異性を有するポリマーネットワークに基づいている。本発明のMIPは、温度、極端なpH、溶媒、および分解または変性に対する増強された抵抗性の有益性を提供する。
【００２２】
したがって、一態様において、本発明は、アミド基またはエステル基を加水分解するための分子インプリントポリマー(MIP)を調製するための方法であって、
(i)ポケット形成部分と共有結合している4面体の化学的部分を含む分子テンプレートを調製するステップと、
(ii)分子テンプレートおよびポロジェンの存在下でモノマーおよび架橋剤を重合させるステップと、
(iii) (ii)において形成されるポリマーから、テンプレート、またはその一部を分離し、MIPを得るステップ
とを含む方法を提供する。
【００２３】
さらなる態様において、本発明は、トリプシンの触媒活性を模倣する分子インプリントポリマー(MIP)を調製するための方法であって、
(i) (a)ポケット形成部分と共有結合している4面体の化学的部分、および
(b)セリン様部分(slp)と共有結合しているヒスチジン様部分(hlp) (前記hlpまたはslpは、フリーラジカル重合性基を持つ)を含む分子テンプレートを調製するステップと、
(ii)遊離酸基が、hlpと水素結合を形成することができるように、ポロジェンの存在下で架橋剤および分子テンプレートと共に遊離酸基(または、その保護された形態)を有するモノマーを重合させるステップと、
(iii) (ii)から形成されるポリマーから、テンプレート、またはその一部を分離し、MIPを得るステップ
とを含む方法を提供する。
【００２４】
トリプシンの活性を模倣する上記態様において、ポケット形成部分は、アミノまたはグアニジノ部分(または、その保護された形態)を含むことが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】セリンプロテアーゼHis-Ser-Aspトライアドのアミド加水分解の触媒機構の説明。
【図２】(A) PTSPA-インプリントポリマーおよび(B) PTSPA-非インプリントポリマーのSEM画像。ポリマーは、EDMA架橋剤と共にポロジェニック溶媒としてのクロロホルムを使用して調製した。SEM画像は、15kVの加速電圧および20,000倍の倍率で取得した。
【図３】1対2の4-VIモノマー対DVB架橋剤比を使用して調製した(A) TSPA-1インプリントポリマーおよび(B) TSPA-1非インプリントポリマー、1対9の4-VI対DVB架橋剤比を使用して調製した(C) TSPA-4インプリントポリマーおよび(D) TSPA-4非インプリントポリマーのSEM画像。ポリマーは、ポロジェニック溶媒としてアセトニトリルを使用して調製した。SEM画像は、20,000倍の倍率で取得した。
【図４】(A) TSPA-5インプリントポリマーおよび(B) TSPA-5非インプリントポリマーのSEM画像。ポリマーは、ポロジェニック溶媒としてのアセトニトリルおよび1対9の4-VI対EDMA架橋剤比を使用して調製した。SEM画像は、20,000倍の倍率で取得した。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明に関して使用されるような「分子インプリントポリマー」または「MIP」という用語は、(i)それらを持つ基質のアミドおよび/またはエステル基を加水分解することができる少なくとも1つの予め組織化された反応性部分、ならびに(ii)アミドおよび/またはエステル加水分解を容易にするような配向で前記アミドおよび/またはエステル基を持つ基質を整列させるか収容する空洞または「ポケット部分」を有する分子鋳型様ポリマー構造を指す。
【００２７】
本発明のMIPは、分子テンプレートおよびポロジェンの存在下でモノマーおよび架橋剤を重合させることにより形成させることができる。
【００２８】
適当なモノマーは、メタクリル酸メチル、他のメタクリル酸アルキル(メタクリル酸エチル、メタクリル酸プロピル、メタクリル酸ブチル、メタクリル酸イソブチルなど)、アクリル酸アルキル、アリルまたはアリールアクリレートおよびメタクリレート、シアノアクリレート、スチレン、メチルスチレン、酢酸ビニルを包含するビニルエステル、塩化ビニル、メチルビニルケトン、塩化ビニリデン、アクリルアミド、メタクリルアミド、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、2-アセトアミドアクリル酸;メタクリル酸2-(アセトアセトキシ)エチル  1-アセトキシ-1,3-ブタジエン;2-アセトキシ-3-ブテンニトリル;4-アセトキシスチレン;アクロレイン;アクロレインジエチルアセタール;アクロレインジメチルアセタール;アクリルアミド;2-アクリルアミドグリコール酸;2-アクリルアミド-2-メチルプロパンスルホン酸;アクリル酸;アクリル酸無水物;アクリロニトリル;塩化アクリロイル;(R)-α-アクリロキシ-β,β'-ジメチル-g-ブチロラクトン;N-アクリロキシスクシンイミドN-アクリロキシトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン;塩化N-アクリロリル;N-アクリロイルピロリジノン;N-アクリロイル-トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン;メタクリル酸2-アミノエチル;N-(3-アミノプロピル)メタクリルアミド;(o、mまたはp)-アミノ-スチレン;メタクリル酸t-アミル;メタクリル酸2-(1-アジリジニル)エチル;2,2'-アゾビス-(2-アミジノプロパン);2,2'-アゾビスイソブチロニトリル;4,4'-アゾビス-(4-シアノ吉草酸);1,1'-アゾビス-(シクロヘキサンカルボニトリル);2,2'-アゾビス-(2,4-ジメチルバレロニトリル);4-ベンジルオキシ-3-メトキシスチレン;2-ブロモアクリル酸;4-ブロモ-1-ブテン;3-ブロモ-3,3-ジフルオロプロパン;6-ブロモ-1-ヘキセン;3-ブロモ-2-メタクリロニトリル;2-(ブロモメチル)アクリル酸;8-ブロモ-1-オクテン;5-ブロモ-1-ペンテン;cis-1-ブロモ-1-プロペン;β-ブロモスチレン;p-ブロモスチレン;ブロモトリフルオロエチレン;(±)-3-ブテン-2-オール;1,3-ブタジエン;1,3-ブタジエン-1,4-ジカルボン酸;3-ブテナールジエチルアセタール;1-ブテン;3-ブテン-2-オール;クロロギ酸3-ブテニル;2-ブチルアクロレイン;N-t-ブチルアクリルアミド;アクリル酸ブチル;(o,m,p)-ブロモスチレン;アクリル酸t-ブチル;(R)-カルボン;(S)-カルボン;(-)-酢酸カルビル;cis3-クロロアクリル酸;2-クロロアクリロニトリル;2-クロロエチルビニルエーテル;2-クロロメチル-3-トリメチルシリル-1-プロペン;3-クロロ-1-ブテン;3-クロロ-2-クロロメチル-1-プロペン;3-クロロ-2-メチルプロペン;2,2-ビス(4-クロロフェニル)-1,1-ジクロロエチレン;3-クロロ-1-フェニル-1-プロペン;m-クロロスチレン;o-クロロスチレン;p-クロロスチレン;酢酸1-シアノビニル;1-シクロプロピル-1-(トリメチルシロキシ)エチレン;2,3-ジクロロ-1-プロペン;2,6-ジクロロスチレン;1,3-ジクロロプロペン;2,4-ジエチル-2,6-ヘプタジエナール;1,9-デカジエン;1-デセン;1,2-ジブロモエチレン;1,1-ジクロロ-2,2-ジフルオロエチレン;1,1-ジクロロプロペン;2,6-ジフルオロスチレン;ジヒドロカルベオール;(±)-ジヒドロカルボン;(-)-酢酸ジヒドロカルビル;3,3-ジメチルアクリルアルデヒド;N,N'-ジメチルアクリルアミド;3,3-ジメチルアクリル酸;3,3-ジメチルアクリロイルクロリド;2,3-ジメチル-1-ブテン;3,3-ジメチル-1-ブテン;メタクリル酸2-ジメチルアミノエチル;2,4-ジメチル-2,6-ヘプタジエン-1-オール;2,4-ジメ��ル-2,6-ヘプタジエナール;2,5-ジメチル-1,5-ヘキサジエン;2,4-ジメチル-1,3-ペンタジエン;2,2-ジメチル-4-ペンテナール;2,4-ジメチルスチレン;2,5-ジメチルスチレン;3,4-ジメチルスチレン;ジビニルベンゼン;1,3-ジビニルテトラメチルジシロキサン;8,13-ジビニル-3,7,12,17-テトラメチル-21H,23H-ポルヒン;8,13-ジビニル-3,7,12,17-テトラメチル-21H,23H-プロピオン酸;8,13-ジビニル-3,7,12,17-テトラメチル-21H,23H-プロピオン酸二ナトリウム塩;3,9-ジビニル-2,4,8,10-テトラオラスピロ[5,5]ウンデカン;ジビニル二塩化スズ;1-ドデセン;3,4-エポキシ-1-ブテン;2-エチルアクロレイン;アクリル酸エチル;2-エチル-1-ブテン;(±)-2-エチルヘキシルアクリレート;(±)-2-エチルヘキシルメタクリレート;2-エチル-2-(ヒドロキシメチル)-1,3-プロパンジオールトリアクリレート;2-エチル-2-(ヒドロキシメチル)-1,3-プロパンジオールトリメタクリレート;エチルビニルエーテル;エチルビニルケトン;エチルビニルスルホン;(1-エチルビニル)トリブチルスズ;m-フルオロスチレン;o-フルオロスチレン;p-フルオロスチレン;メタクリル酸グリコール(メタクリル酸ヒドロキシエチル);1,6-ヘプタジエン;1,6-ヘプタジエン酸;1,6-ヘプタジエン-4-オール;1-ヘプテン;1-ヘキセン-3-オール;1-ヘキセン;ヘキサフルオロプロペン;ジアクリル酸1,6-ヘキサンジオール;1-ヘキサデセン;1,5-ヘキサジエン-3,4-ジオール;1,4-ヘキサジエン;1,5-ヘキサジエン-3-オール;1,3,5-ヘキサトリエン;5-ヘキセン-1,2-ジオール;5-ヘキセン-1-オール;アクリル酸ヒドロキシプロピル;3-ヒドロキシ-3,7,11-トリメチル-1,6,10-ドデカトリエン;イソプレン;2-イソプロペニルアニリン;クロロギ酸イソプロペニル;ジメタクリル酸4,4'-イソプロピリデン;3-イソプロピル-α,α-ジメチルベンゼンイソシアネート;イソプレゴール;イタコン酸;塩化イタコナリル;アクリル酸鉛(II);(±)-:リナロール;酢酸リナリル;p-メンタ-1,8-ジエン;p-メンタ-6,8-ジエン-2-オール;メチレンアミノアセトニトリル;メタクロレイン;[3-(メタクリロイルアミノ)-プロピル]トリメチルアンモニウムクロリド;メタクリルアミド;メタクリル酸;メタクリル酸無水物;メタクリロニトリル;塩化メタクリロイル;2-(メタクリロイルオキシ)エチルアセトアセテート;(3-メタクリロキシプロピル)トリメトキシシラン;2-(メタクリロキシ)エチルトリメチルアンモニウムメチルスルフェート;2-メトキシプロペン(イソプロペニルメチルエーテル);アクリル酸メチル-2-(ブロモメチル);5-メチル-5-ヘキセン-2-オン;N,N'-メチレンビスアクリルアミド;2-メチレングルタロニトリル;2-メチレン-1,3-プロパンジオール;3-メチル-1,2-ブタジエン;2-メチル-1-ブテン;3-メチル-1-ブテン;3-メチル-1-ブテン-1-オール;2-メチル-1-ブテン-3-イン;2-メチル-1,5-ヘプタジエン;2-メチル-1-ヘプテン;2-メチル-1-ヘキセン;3-メチル-1,3-ペンタジエン;2-メチル-1,4-ペンタジエン;(±)-3-メチル-1-ペンテン;(±)-4-メチル-1-ペンテン;(±)-3-メチル-1-ペンテン-3-オール;2-メチル-1-ペンテン;α-メチルスチレン;t-α-メチルスチレン;t-β-メチルスチレン;3-メチルスチレン;メチルビニルエーテル;メチルビニルケトン;メチル-2-ビニルオキシラン;4-メチルスチレン;メチルビニルスルホン;4-メチル-5-ビニルチアゾール;ミルセン;t-β-ニトロスチレン;3-ニトロスチレン;1-ノナデセン;1,8-ノナジエン;1-オクタデセン;1,7-オクタジエン;7-オクテン-1,2-ジオール;1-オクテン;1-オクテン-3-オール;1-ペンタデセン;1-ペンテン;1-ペンテン-3-オール;t-2,4-ペンテン酸;1,3-ペンタジエン;1,4-ペンタジエン;1,4-ペンタジエン-3-オール;4-ペンテン-1-オール;4-ペンテン-2-オール;4-フェニル-1-ブテン;フェニルビニルスルフィド;スルホン酸フェニルビニル;2-プロペン-1-スルホン酸ナトリウム塩;フェニルビニルスルホキシド;1-フェニル-1-(トリメチルシロキシ)エチレン;プロペン;サフロール;スチレン(ビニルベンゼン);4-スチレンスルホン酸ナトリウム塩;塩化スチレンスルホニル;3-スルホプロピルアクリレートカリウム塩;3-スルホプロピルメタクリレートナトリウム塩;テトラクロロエチレン;テトラシアノエチレン;テトラメチルジビニルシロキサン;trans3-クロロアクリル酸;2-トリフルオロメチルプロペン;2-(トリフルオロメチル)プロペン酸;2,4,4'-トリメチル-1-ペンテン;3,5-ビス(トリフルオロメチル)スチレン;2,3-ビス(トリメチルシロキシ)-1,3-ブタジエン;1-ウンデセン;酢酸ビニル;ビニル酢酸;4-ビニルアニソール;9-ビニルアントラセン;ベヘン酸ビニル;安息香酸ビニル;酢酸ビニルベンジル;ビニルベンジルアルコール;塩化3-ビニルベンジル;3-(ビニルベンジル)-2-クロロエチルスルホン;4-(ビニルベンジル)-2-クロロエチルスルホン;N-(p-ビニルベンジル)-N,N'-ジメチルアミン;4-ビニルビフェニル(4-フェニルスチレン);ビニルブロミド;2-ビニルブタン;ビニルブチルエーテル;9-ビニルカルバゾール;ビニルカルビノール;ビニルセチルエーテル;ビニルクロロアセテート;クロロギ酸ビニル;クロトン酸ビニル;ビニルシクロヘキサン;4-ビニル-1-シクロヘキセン;4-ビニルシクロヘキセンジオキシド;ビニルシクロペンテン;ビニルジメチルクロロシラン;ビニルジメチルエトキシシラン;ビニルジフェニルホスフィン; 2-エチルヘキサン酸ビニル;ビニル2-エチルヘキシルエーテル;ビニルエーテルケトン;ビニルエチレン;ビニルエチレン鉄トリカルボニル;ビニルフェロセン;ギ酸ビニル;ビニルヘキサデシルエーテル;フッ化ビニリデン;1-ビニルイミダゾール;ヨウ化ビニル;ラウリン酸ビニル;ビニルマグネシウムブロミド;ビニルメシチレン;ビニル2-メトキシエチルエーテル;ビニルメチルジクロロシラン;ビニルメチルエーテル;ビニルメチルケトン;2-ビニルナフタレン;5-ビニル-2-ノルボルネン;ペラルゴン酸ビニル;酢酸ビニルフェニル;ビニルホスホン酸,ビス(2-クロロエチル)エステル;プロピオン酸ビニル;4-ビニルピリジン;2-ビニルピリジン;1-ビニル-2-ピロリジノン;2-ビニルキノリン;1-ビニルシラトラン;ビニルスルホン;ビニルスルホン(ジビニルスルホン);ビニルスルホン酸ナトリウム塩;o-ビニルトルエン;p-ビニルトルエン;ビニルトリアセトキシシラン;ビニルトリブチルスズ;ビニルトリクロリド;ビニルトリクロロシラン;ビニルトリクロロシラン(トリクロロビニルシラン);ビニルトリエトキシシラン;ビニルトリエチルシラン;ビニルトリフルオロアセテート;ビニルトリメトキシシラン;ビニルトリメチルノニルエーテル;ビニルトリメチルシラン;臭化ビニルトリフェニルホスホニウム(臭化トリフェニルビニルホスホニウム);ビニルトリス-(2-メトキシエトキシ)シラン;ビニル2-バレレート(vinyl 2-valerate)などから選択することができる。
【００２９】
トリプシン様セリンプロテアーゼを模倣する態様に関連して、下記のモノマーが好ましい:2-アセトアミドアクリル酸;2-アクリルアミドグリコール酸;2-アクリルアミド-2-メチルプロパンスルホン酸;アクリル酸;2-ブロモアクリル酸;2-(ブロモメチル)アクリル酸;1,3-ブタジエン-1,4-ジカルボン酸;cis3-クロロアクリル酸;3,3-ジメチルアクリル酸;1,6-ヘプタジエン酸;イタコン酸;メタクリル酸;4-メチル-5-ビニルチアゾール;2-プロペン-1-スルホン酸ナトリウム塩;4-スチレンスルホン酸ナトリウム塩;3-スルホプロピルアクリレートカリウム塩;3-スルホプロピルメタクリレートナトリウム塩;trans3-クロロアクリル酸;2-(トリフルオロメチル)プロペン酸;ビニル酢酸;ビニルホスホン酸およびビニルスルホン酸ナトリウム塩。
【００３０】
キモトリプシン様またはエラスターゼ様活性を模倣することを意図するさらなる実施形態において、上記の好ましいモノマーも、追加の下記モノマーと共に望ましいであろう:メタクリル酸メチル、他のメタクリル酸アルキル(メタクリル酸エチル、メタクリル酸プロピル、メタクリル酸ブチル、メタクリル酸イソブチルなど)、アクリル酸アルキル、アリルまたはアリールアクリレートおよびメタクリレート、スチレン、メチルスチレン、酢酸ビニルを包含するビニルエステル、メチルビニルケトン、4-アセトキシスチレン;アクロレインジエチルアセタール;アクロレインジメチルアセタール;メタクリル酸t-アミル;4-ベンジルオキシ-3-メトキシスチレン;β-ブロモスチレン;p-ブロモスチレン;3-ブテナールジエチルアセタール;1-ブテン;2-ブチルアクロレイン;N-t-ブチルアクリルアミド;アクリル酸ブチル;(o,m,p)-ブロモスチレン;アクリル酸t-ブチル;(R)-カルボン;(S)-カルボン;(-)-カルビルアセテート;2-クロロメチル-3-トリメチルシリル-1-プロペン;3-クロロ-1-ブテン;3-クロロ-2-メチルプロペン;3-クロロ-1-フェニル-1-プロペン;m-クロロスチレン;o-クロロスチレン;p-クロロスチレン;酢酸1-シアノビニル;2,6-ジクロロスチレン;2,6-ジフルオロスチレン;ジヒドロカルベオール;(±)-ジヒドロカルボン;(-)-ジヒドロカルビルアセテート;2,3-ジメチル-1-ブテン;3,3-ジメチル-1-ブテン;メタクリル酸2-ジメチルアミノエチル;2,4-ジメチルスチレン;2,5-ジメチルスチレン;3,4-ジメチルスチレン;1-ドデセン;アクリル酸エチル;2-エチル-1-ブテン;(±)-2-エチルヘキシルアクリレート;(±)-2-エチルヘキシルメタクリレート;m-フルオロスチレン;o-フルオロスチレン;p-フルオロスチレン;1-ヘキセン;4-メチルスチレン;1-ペンテン;2,4,4'-トリメチル-1-ペンテン;2-ビニルブタン;プロピオン酸ビニル;o-ビニルトルエン;およびp-ビニルトルエン。
【００３１】
アクリレート末端か、さもなければ不飽和のウレタン、カーボネート、およびエポキシドも使用することができる。不飽和カーボネートの一例は、アリルジグリコールカーボネート(CR-39)である。不飽和エポキシドは、アクリル酸グリシジル、メタクリル酸グリシジル、アリルグリシジルエーテル、および1,2-エポキシ-3-アリルプロパンを包含するが、それらに限定されるものではない。
【００３２】
一実施形態において、モノマーは、メタクリル酸であることが好ましい。
【００３３】
適当な架橋剤は、二、三および四官能性アクリレートまたはメタクリレート、ジビニルベンゼン(DVB)、エチレングリコールジメタクリレート(EGDMAまたはEDMA)およびエチレングリコールジアクリレートを包含するアルキレングリコールおよびポリアルキレングリコールジアクリレートおよびメタクリレート、ビニルまたはアリルアクリレートまたはメタクリレート、ジアリルジグリコールジカーボネート(diallyldiglycol dicarbonate)、マレイン酸ジアリル、フマル酸ジアリル、イタコン酸ジアリル、シュウ酸ジビニル、マロン酸ジビニルなどのビニルエステル、コハク酸ジアリル、イソシアヌル酸トリアリル、ビス-フェノールAまたはエトキシル化ビス-フェノールAのジメタクリレートまたはジアクリレート、ヘキサメチレンビスアクリルアミドまたはヘキサメチレンビスメタクリルアミドを包含するメチレンまたはポリメチレンビスアクリルアミドまたはビスメタクリルアミド、ジ(アルケン)三級アミン、トリメチロールプロパントリアクリレート、ペンタエリスリトールテトラアクリレート、ジビニルエーテル、ジビニルスルホン、フタル酸ジアリル、トリアリルメラミン、メタクリル酸2-イソシアナトエチル、アクリル酸2-イソシアナトエチル、アクリル酸3-イソシアナトプロピル、メタクリル酸1-メチル-L-2-イソシアナトエチル、アクリル酸1,1-ジメチル-2-イソシアナトエチル、テトラエチレングリコールジアクリレート、テトラエチレングリコールジメタクリレート、トリエチレングリコールジアクリレート、トリエチレングリコールジメタクリレート、ヘキサンジオールジメタクリレート、ヘキサンジオールジアクリレートなどから選択することができる。
【００３４】
一実施形態において、架橋剤は、EDMAであることが好ましい。
【００３５】
モノマーおよび架橋剤は、同じであってよい。しかしながら、モノマーおよび架橋剤は、異なることが好ましい。
【００３６】
ある実施形態において、モノマーは、メタクリル酸であり、架橋剤は、EDMAである。
【００３７】
重合ステップは、得られるMIP全体に多孔性構造を保証する少なくとも1つのタイプのポロジェンの存在下でも行われる。
【００３８】
本発明の方法において使用するのに適しているポロジェンは、水素結合相互作用を促進するか容易にするものおよび疎水性相互作用を促進するか容易にするものを包含する。これらのタイプのポロジェンの組合せも使用することができる。
【００３９】
水素結合機能を容易にするポロジェンは、アセトン、アセトニトリル、クロロホルム、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド(DMF)および酢酸エチルを包含する。ポロジェンは、典型的には、エタノール、メタノールまたはジメチルスルホキシド(DMSO)などの極性溶媒との混合物として利用されることがある。
【００４０】
疎水性相互作用を容易にするポロジェンは、アセトニトリル、アセトン、酢酸エチル、DMF、エタノール、メタノール、DMSOまたはそれらの組合せの水性混合物を包含する。
【００４１】
分子テンプレートは、ポケット形成部分と共有結合している4面体の化学的部分を含む。本発明者らは、4面体の化学的部分を持つテンプレート分子が、セリンプロテアーゼ基質、具体的には、トリプシンの基質の遷移状態の有効な模倣体として機能することを発見した。この4面体の化学的部分は、
【００４２】
【化１】
2013501108.tif 000003
【００４３】
(式中、R1は、水素、またはC1〜C6アルキルから選択される)から選択されることが好ましい。
【００４４】
R1は、線状C1〜C6アルキル基であることが好ましい。
【００４５】
好ましい実施形態において、4面体の化学的部分は、4面体のホスホネート、より好ましくは、式
【００４６】
【化２】
2013501108.tif 000004
【００４７】
(式中、
R1は、水素およびC1〜C2アルキルから選択され、
X1は、O、S、および、任意選択で置換されたアルキレン(好ましくは、C1〜C3アルキレン)から選択される)のホスホネートである。
【００４８】
4面体の化学的部分は、分子テンプレートのポケット形成部分と共有結合している。ポケット形成部分は、適当には、MIP内への基質の収容を可能にするように設計される。したがって、ポケット形成部分は、望ましいアミドおよび/またはエステルを持つ基質またはアミド基を持つ基質の少なくとも部分を構造的に模倣するいかなる適当な分子足場(molecular scaffold)であってもよい。
【００４９】
第2の態様に関連して、MIPが、トリプシンの触媒活性を模倣する場合、ポケット形成部分は、リシンまたはアルギニンのアミノ酸側鎖を構造的に模倣する分子足場である。したがって、好ましい態様において、ポケット形成部分は、アミノまたはグアニジン部分(または、その保護された形態)を含む。
【００５０】
本発明の第1の態様と第2の態様に関連して、一実施形態において、ポケット形成部分と共有結合している4面体の化学的部分が、式
【化３】
2013501108.tif 000005
【００５１】
(式中、
Xは、P、As、およびSbから選択され、
R1は、水素およびC1〜C2アルキルから選択され、
PFは、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で保護されたアミノ、任意選択で保護されたグアニジノ、N-含有ヘテロ環、およびN-含有ヘテロアリールから選択されるポケット形成部分である)により表される。
【００５２】
PFのための好ましい任意選択で置換されたアルキル基は、
【００５３】
【化４】
2013501108.tif 000006
【００５４】
(式中、
nは、0〜6から選択され、
Yは、任意選択で保護されたアミノ、任意選択で保護されたグアニジノ、N-含有ヘテロ環、およびN-含有ヘテロアリールから選択され、
Tは、任意選択で置換されたC1〜C3アルキル、任意選択で置換されたアシルアミノ、任意選択で置換されたオキシアシルアミノ、任意選択で置換されたアミノアシルオキシ、任意選択で置換されたアミノアシル、任意選択で置換されたオキシアシル、任意選択で置換されたアシルオキシ、任意選択で置換されたアミノアシルオキシ、任意選択で置換されたアシルアミノ、任意選択で置換されたアシルイミノオキシ、任意選択で置換されたオキシアシルイミノ、任意選択で置換されたスルフィニルアミノ、任意選択で置換されたスルホニルアミノ、任意選択で置換されたオキシスルフィニルアミノ、任意選択で置換されたオキシスルホニルアミノおよび任意選択で置換されたオキシアシルオキシから選択される)を包含する。
【００５５】
ある実施形態において、nは、0〜4から選択される。
【００５６】
さらなる実施形態において、nは、4である。
【００５７】
さらなる実施形態において、Yは、アミノまたはグアニジノである。
【００５８】
さらなる実施形態において、Yは、アミノまたはグアニジノであり、nは、4である。
【００５９】
さらなる実施形態において、Yは、機能性モノマーと水素結合/イオン対を形成することができるN-含有ヘテロ環またはN-含有ヘテロアリールである。
【００６０】
別の実施形態において、Yは、
【００６１】
【化５】
2013501108.tif 000007
【００６２】
またはそれらの置換誘導体から選択される。
【００６３】
好ましい実施形態において、ポケット形成部分と共有結合している4面体の化学的部分は、式
【００６４】
【化６】
2013501108.tif 000008
【００６５】
(式中、
nは、0〜6から選択され、(好ましくは、nは、0〜4である)
Yは、
【００６６】
【化７】
2013501108.tif 000009
【００６７】
またはそれらの置換誘導体から選択され、
R1は、水素およびC1〜C2アルキルから選択され、
Tは、-NHC(X')O-R2、-OC(X')O-R2、-CR3R4R5、-CR3R4C(X')O-R2およびペプチド残基から選択され、
R2は、任意選択で置換されたアリール、任意選択で置換されたアリールアルキル、任意選択で置換されたヘテロアリール、および任意選択で置換されたヘテロシクリルから選択され、
X'は、SまたはOであり、
R3およびR4は、独立して、水素およびC1〜C3アルキルから選択され、
R5は、任意選択で置換されたアリールまたは任意選択で置換されたアリールアルキルから選択される)により表される。
【００６８】
好ましい実施形態において、
nは、0〜4から選択され、
Yは、
【００６９】
【化８】
2013501108.tif 000010
【００７０】
またはそれらの置換誘導体から選択され、
R1は、メチルまたはエチルであり、
Tは、-NHC(O)O-R2であり、
R2は、任意選択で置換されたアリール、および任意選択で置換されたアリールアルキルから選択される。
【００７１】
さらにより好ましい実施形態において、ポケット形成部分と共有結合している4面体の化学的部分は、式
【００７２】
【化９】
2013501108.tif 000011
【００７３】
(式中、フェニルおよび/またはフタルイミド基は、独立して、1〜4個の置換基でさらに置換されていてよい)により表される。
【００７４】
適当な置換基は、C1〜C3アルキル、C1〜C3アルコキシ、ハロゲン、チオ、ニトロ、アリール、アリールオキシ、およびアリールアルコキシを包含することができる。
【００７５】
上の実施形態において、フェニルおよびフタルイミド基は、置換されていないことが好ましい。
【００７６】
別の好ましい実施形態において、分子テンプレートは、
(a)ポケット形成部分と共有結合している4面体の化学的部分、および
(b)セリン様部分(slp)と共有結合しているヒスチジン様部分(hlp)
を含む。
【００７７】
したがって、好ましい実施形態において、分子テンプレートは、式(I)
Y-L-X-O-Z (I)
(式中、
Yは、任意選択で保護されたアミノ、任意選択で保護されたグアニジン、N-含有ヘテロ環、およびN-含有ヘテロアリールから選択され、
Lは、任意選択で置換されたC1〜C5アルキレンから選択される二価の連結基を表し、
Xは、4面体原子が、リン、ヒ素、アンチモン、ホウ素、ケイ素、硫黄またはセレンから選択される4面体の化学部分であり、
Zは、ヒスチジン様部分(hlp)と共有結合しているセリン様部分の残基(rslp)を表す)により表される。
【００７８】
したがって、さらなる態様において、本発明は、式(I)の新規化合物を提供する。
【００７９】
式(I)化合物に関連して、下記の定義のうちの1つまたは複数が当てはまる:
(a) Xは、
【００８０】
【化１０】
2013501108.tif 000012
【００８１】
(式中、R1は、水素およびC1〜C2アルキルから選択される)から選択される;
(b) Lは、
【００８２】
【化１１】
2013501108.tif 000013
【００８３】
(式中、
nは、0〜4から選択され、
Tは、任意選択で置換されたC1〜C3アルキル、任意選択で置換されたオキシアシルアミノ、任意選択で置換されたアミノアシルオキシ、任意選択で置換されたアミノアシル、任意選択で置換されたオキシアシル、任意選択で置換されたアシルオキシ、および任意選択で置換されたオキシアシルオキシから選択される)から選択される。
(c) Yは、
【００８４】
【化１２】
2013501108.tif 000014
【００８５】
またはそれらの置換誘導体から選択される。
【００８６】
下記のさらなる定義のうちの1つまたは複数は、(a)〜(c)のうちのいずれか1つと共に当てはまる:
(d) Xは、
【００８７】
【化１３】
2013501108.tif 000015
【００８８】
(式中、R1は、水素およびC1〜C2アルキルから選択される)である;
(e) Lは、
【００８９】
【化１４】
2013501108.tif 000016
【００９０】
(式中、
nは、0〜4から選択され、
Tは、任意選択で置換されたオキシアシルアミノを表す)から選択され、
(f) Yは、
【００９１】
【化１５】
2013501108.tif 000017
【００９２】
またはそれらの誘導体から選択される。
【００９３】
上の(e)に関連して、Tは、-NHC(O)O-R2 (R2は、任意選択で置換されたアリールアルキル、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたシクロアルキル、任意選択で置換されたヘテロアリール、または任意選択で置換されたヘテロシクリルから選択される)であることが好ましい。
【００９４】
さらにより好ましい実施形態において、
式(I)中の
【００９５】
【化１６】
2013501108.tif 000018
【００９６】
は、
【００９７】
【化１７】
2013501108.tif 000019
【００９８】
により表される。
【００９９】
上の実施形態/定義に関連して、セリン様部分(slp)は、形成されたMIPに、求核試薬として作用することができるヒドロキシル(-OH)基を運ぶいずれかの化学的部分により表すことができる。さらに、ヒスチジン様部分(hlp)は、slpの-OH基から水素を受けとり、このようにして、求核攻撃に対して基を活性化することができる窒素原子を持つ化学的部分により表すことができる。
【０１００】
ある実施形態において、および式(I)の化合物に関して、slpは、
【０１０１】
【化１８】
2013501108.tif 000020
【０１０２】
(式中、mは、0〜4から選択される整数である)から選択することができる-O-Z-部分により表される。
【０１０３】
したがって、上から、式(I)の化合物において、Zと接続しているO原子は、求核試薬として作用することができる形成されたMIPに運ばれるヒドロキシ基の一部を形成することを理解するであろう。したがって、セリン様部分の「残基」(rslp)への言及は、このO原子を除いたセリン様部分(slp)を指す。
【０１０４】
hlp部分は、
【０１０５】
【化１９】
2013501108.tif 000021
【０１０６】
またはそれらの置換誘導体により表すことができる。
【０１０７】
したがって、上の(a)〜(f)に関連して、さらなる定義が当てはまる:
(g) -O-Zは、一緒に、
【０１０８】
【化２０】
2013501108.tif 000022
【０１０９】
またはそれらの置換誘導体(式中、mは、0〜4の整数である)を表すことができる。
【０１１０】
(g)に関連して、-O-Zは、一緒に、
【０１１１】
【化２１】
2013501108.tif 000023
【０１１２】
またはそれらの置換誘導体を表すことが好ましい。
【０１１３】
好ましい実施形態において、hlpまたはslpは、フリーラジカル重合性基を持つ。重合性基は、任意選択で置換されたアルケニルであることが好ましい。
【０１１４】
したがって、上の(a)〜(f)に関して、下記のさらなる定義が当てはまる:
(h) -O-Zは、一緒に、
【０１１５】
【化２２】
2013501108.tif 000024
【０１１６】
(式中、
mは、0〜4の整数であり、
R5およびR6のうちの一方は、任意選択で置換されたアルケニルであり、もう一方は、水素である)を表すことができる。
【０１１７】
R6基は、任意選択で置換されたアルケニルであり、R5は、水素であることが好ましい。
【０１１８】
さらにより好ましい実施形態において、R6は、エテニルである。したがって、別の実施形態において、本発明は、
(i) -O-Zが、一緒に、
【０１１９】
【化２３】
2013501108.tif 000025
【０１２０】
またはそれらの置換誘導体を表すことができることを企図する。
【０１２１】
-O-Zは、一緒に、
(j)
【０１２２】
【化２４】
2013501108.tif 000026
【０１２３】
またはそれらの置換誘導体を表すことができることが好ましい。
【０１２４】
したがって、上から、式(I)の化合物の好ましい実施形態において、Zは、ヒスチジン様部分(hlp)と共有結合しているセリン様部分の残基(rslp)を表し、前記hlpまたはslp(または、rslp)は、フリーラジカル重合性基を持つことを観察することができる。
【０１２５】
本発明のテンプレート分子は、当技術分野において知られている合成化学方法論により調製することができる。
【０１２６】
逆合成解析で、4面体部分は、鍵となる中間体または反応剤ビルディングブロックと考えることができる。例えば、適当に置換された4面体分子、例えば、ホスフェート、アルソネートなどのエステルからテンプレートを体系的に構築することにより合成を始めることができる。したがって、適当な4面体分子は、PO(OR')3、AsO(OR')3またはSbO(OR')3 (式中、R'は、フェニルまたは低級アルキル基であってよい)を包含することができる。
【０１２７】
様々なタイプのリン酸エステルを、オキシ塩化リン(OPCl3)の、数多くのアルコールとの反応により、または様々なリン酸トリアルキルの酸化により作成することができる。
【０１２８】
式(I)の化合物の製造のために、求電子性ヘテロ原子(例えば、リン酸エステル中のP)を、適当な求核試薬と反応させることができる。代替方法として、標準的なカップリング反応も、例えば、光延反応条件下で、用いることができる。さらなる代替案として、塩基の存在下での適当な脱保護は、反応性のホスホニウム中間体の製造につながり、次いで、適当に反応性の求電子試薬、例えば、アルキルハロゲン化物、またはアシルハロゲン化物と反応させることができる。
【０１２９】
上に記載されている反応中に、多くの部分が保護される必要がある。適当な保護基は、産業において良く知られており、Protecting Groups in Organic Synthesis、Greene T W、Wiley- Interscience、New York、1981などの多くの参考文献に記載されている。
【０１３０】
式(I)の他の化合物およびそれらの誘導体は、既存の置換基の付加、除去または改変により調製することができる。このことは、「Comprehensive organic transformations: a guide to functional group preparations」Larock R. C.による、New York、VCH Publishers, Inc. 1989に記載されているものなどの産業において良く知られている官能基相互変換のための標準的な技法を使用することにより達成されうる。
【０１３１】
官能基相互変換の例は、CH3OH中で触媒金属シアン化物、例えば、NaCNの有無にかかわらず、HNR*R**と共に加熱することによる-CO2CH3からの-C(O)NR*R**;ピリジン中での例えば、ClC(O)Rでの-OHからの-OC(O)R;アルキルイソチオシアネートまたはチオシアン酸での-NHRからの-NC(S)NR*R**;クロロギ酸アルキルでの-NHRからの-NRC(O)OR*;イソシアネート、例えば、HN=C=OまたはRN=C=Oでの処理による-NHRからの-NRC(O)NR* R**;ピリジン中でのClC(O)R*での処理による-NHRからの-NRC(O)R*;アルコール中で加熱することによるH3NR+OAc-での-C(NR*R**)SRからの-C(=NR)NR*R**;不活性溶媒、例えば、アセトン中でのR-Iでの-C(S)NR* R**からの-C(NR*R**)SR; HNR*R**での-C(S)NH2からの-C(S)NR*R** (式中、R*またはR**は、水素ではない);無水アルコール中で加熱することによるNH2CNでの-C(=NR*R**)-SRからの、代替方法として、EtOH中でのBrCNおよびNaOEtでの処理による-C(=NH)-NR*R**からの-C(=NCN)-NR*R**;(RS)2C=NCNでの処理による-NHR*からの-NR-C(=NCN)SR;ピリジン中で加熱することによるClSO2Rでの処理による-NHR*からの-NR**SO2R;ローソン試薬[2,4-ビス(4-メトキシフェニル)-1,3,2,4-ジチアジホスフェタン-2,4-ジスルフィド]での処理による-NR*C(O)Rからの-NR*C(S)R;無水トリフルオロメタンスルホン酸および塩基での-NHRからの-NRSO2CF3、Na(Hg)およびHCl/EtOHでの-CH(NH2)C(O)OR*からの-CH(NH2)CHO; SOCl2、次いで、CH2N2、次いで、H2O/Ag2Oでの処理による-C(O)OHからの-CH2C(O)OH; PhMgX/HX、次いで、無水酢酸、次いで、CrO3での処理による-CH2C(O)OCH3からの-C(O)OH; R**CO3HによるC(O)R*からのR-OC(O)R*; Na/R*OHでの-C(O)OR*からの-CCH2OH;チュガーエフ反応による-CH2CH2OHからの-CH=CH2;クルチウス反応による-C(O)OHからの-NH2; TsCl/塩基、次いで、H2Oでの-C(O)NHOHからの-NH2;デス-マーチンペルヨージナン試薬またはCrO3/aqH2SO4/acetoneを使用することによる-CHCHOHCHRからの-CHC(O)CHR; CrO2Cl2での-C6H5CH3からの-C6H5CHO; SnCl2/HClでの-CNからの-CHO; PCl5での-C(O)NHRからの-CN; N2H4/KOHでの-C(O)Rからの-CH2Rである。
【０１３２】
式(I)の化合物の調製において、好ましい中間体および分子テンプレートは、式(Ia)
Y-L-X-OH (Ia)
(式中、変数Y、L、およびXは、本明細書において前に定義されている通りである)により表される。
【０１３３】
好ましい実施形態において、中間体/テンプレートは、式
【０１３４】
【化２５】
2013501108.tif 000027
【０１３５】
(式中、変数Y、T、R'、およびnは、本明細書において前に定義されている通りである)の化合物である。
【０１３６】
本発明のMIPは、共有結合分子インプリンティングおよび非共有結合分子インプリンティングと一般的に呼ばれる2つの相異なるアプローチにより調製することができる。
【０１３７】
第1のアプローチにおいて、テンプレート分子は、重合性基(好ましくは、フリーラジカル重合性基)と共有結合しており、重合後、共有結合は切断され、ポリマー鋳型からテンプレート分子(または、その一部)を放出する。第2のアプローチにおいて、重合性モノマーは、非共有結合相互作用(イオン性、立体的、静電的、および水素結合相互作用など)に基づいてテンプレート分子の周りにそれら自体を配置し、重合後、非共有結合しているテンプレート(または、その一部)は、抽出される。
【０１３８】
好ましい実施形態において、モノマーは、最終MIPが、hlpに相対的に近いところにある少なくとも1つの遊離カルボン酸基を与えられるように、エチレン性の不飽和カルボン酸(または、その保護された形態)である。そのような配置において、モノマーの遊離カルボン酸基は、トリプシン反応性トライアドのアスパラギン酸を模倣している。
【０１３９】
しかしながら、別の実施形態において、テンプレート分子自体が、テンプレート分子がポリマー鋳型から分離されるとすぐにMIP中に保持される適当に位置するカルボン酸基を包含することができる。
【０１４０】
重合ステップは、フリーラジカル条件下で行われることが好ましいが、当業者は、カチオン重合性またはアニオン重合性であるモノマーを選択することができることを理解しているであろう。可能なフリーラジカル条件に関して、いかなるUVまたは熱的に活性なフリーラジカル開始剤も用いることができる。UV開始剤および熱開始剤の例は、過酸化ベンゾイル、過酸化アセチル、過酸化ラウロイル、アゾビスイソブチロニトリル(AIBN)、過酢酸t-ブチル、過酸化ジクミル、過酸化ジt-ブチル、t-ブチルヒドロペルオキシド、ビス(イソプロピル)ペルオキシ-ジカーボネート、ベンゾインメチルエーテル、2,2'-アゾビス(2,4-ジメチルバレロニトリル)、過オクタン酸三級ブチル、過酸化フタロイル、2,2-ジエトキシアセトフェノン、およびペルオキシピバル酸三級ブチル、1-ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン、2,2-ジメトキシ-2-フェニル-アセトフェノン、およびフェノチアジン、およびジイソプロピルキサントゲンジスルフィドを包含する。
【０１４１】
本発明のMIP内の認識部位の質は、重合段階において形成されるモノマー-テンプレート相互作用の性質および程度の直接的な結果である。この理由から、本発明のMIPの調製は、増強された触媒活性を持つMIPを得るために初めからある種の仕様を考慮に入れなければならない。1つのそのような考慮は、テンプレート分子とモノマーの間の好ましいモル比の決定である。非共有結合インプリンティングプロセスにおいて、重合に先立って機能性モノマーとテンプレート分子の間に形成される安定なコンプレックスの数は、通常、極めて低い。したがって、非共有結合インプリンティング手順におけるテンプレート分子に対して過剰量のモノマーの添加は、テンプレートと機能性モノマーの間の安定なコンプレックスの形成に反応平衡をずらすために好ましい。したがって、好ましい実施形態において、テンプレート:モノマー比は、1:10である。
【０１４２】
しかしながら、ポロジェニック溶媒中でのテンプレート分子の溶解性は、過剰量のテンプレート分子の使用を制限することが多い。非共有結合インプリンティングプロセスにおいて、ブロックポリマーフォーマットでMIPを製造するための好ましい溶媒対モノマー(機能性モノマーおよび架橋性モノマー)比は、5:5〜7:3の間である。したがって、特定の溶媒対モノマー比の溶液中でのテンプレートの量は、最大テンプレート溶解性に基づいて決定されるであろう。他方、共有結合インプリンティングアプローチにおいて、テンプレートは、重合性の機能性モノマーと化学的に結合している。したがって、共有結合インプリンティング手順におけるモノマーに対するテンプレートの比は、1:1である。
【０１４３】
また、MIPの物理的性質(例えば、剛性など)は、架橋剤の性質および量に左右されるであろう。一実施形態において、架橋剤に対するモノマーのモル比範囲は、約1:2〜1:10である。特定のインプリンティング系についての最終のかつ望ましいモノマー対架橋剤比は、多孔性、表面積、細孔サイズ、細孔容積などの得られるポリマーの形態学的特性、ならびにテンプレート分子に対するそれらの選択性因子および負荷能力因子にも基づいて決定される。適切なモノマー対架橋剤比の決定は、特定のポロジェニック溶媒中でのそれらの溶解性にも部分的に依存する。
【０１４４】
ある実施形態において、ビーズとしてのMIPの製造を可能にするモノマー:架橋剤比を選択することが好ましい。分子インプリンティング分野における仕事の大部分は、マクロ多孔性ブロックフォーマットでのポリマーの製造に依存してきたが、それらは、手かまたは機械で、その後に破砕され、粉砕され、篩い分けされる。その後、極めて小さな粒子は、溶媒中での懸濁後に微分沈降により除去される。さらに、粉砕および篩い分けは、遅いプロセスであり、粒子サイズおよび形状の制御がどちらかといえば制限されて不規則形状の粒子を生み出す。これらの理由から、これは、より大規模な製造にとって適切かつ好ましいプロセスではない。対照的に、インプリントポリマービーズフォーマットの直接的な製造は、迅速であり、ほぼ定量的な収率の使用可能な粒子を与える。ビーズは、物理的にいっそう堅牢であり、縁の鋭い破砕された断片よりも、取扱中の断片化および微粉生成が低い傾向にある。さらに、ビーズの製造は、UVで開始される重合をスケールアップし、粒子の回収および洗浄の容易さによって再利用するために貴重なテンプレート分子を回収する能力などの一部の操作上の利点を提供する。ビーズは、ポロジェン対モノマー比の高希釈、すなわち、>19:1における沈殿重合手順により調製される。ビーズは、ペルフルオロスルホンアミドエチル(perfluorosulphonamidoethyl)アクリレート主鎖を持つグラフトコポリマーなどの水と不混和性であるフルオロカーボン液体およびメトキシポリエチレングリコール中での懸濁重合によっても調製される。
【０１４５】
共有結合MIPからのテンプレートの分離は、当業者に適当であると知られているいずれかの手段により達成することができる。手段は、酸加水分解、塩基加水分解、還元(NaBH4またはLiAlH4を使用する)、弱酸での洗浄(金属配位結合を除去するため)および可逆的ウレタン結合を除去するための熱切断を包含するが、それらに限定されるものではない。
【０１４６】
したがって、さらなる態様において、本発明は、上に記載されている方法により調製されるMIPを提供する。
【０１４７】
ある実施形態において、MIPは、
空洞の表面上に
(i)少なくとも1つのヒドロキシル部分、
(ii)少なくとも1つのイミダゾール部分、および
(iii)少なくとも1つのカルボキシル部分を包含する空洞を含む架橋モノマー単位により特徴付けられる。
【０１４８】
少なくとも1つのヒドロキシル部分は、
【０１４９】
【化２６】
2013501108.tif 000028
【０１５０】
(式中、nは、独立して、0〜4を表す)から選択することができる。
【０１５１】
少なくとも1つのイミダゾール部分は、
【０１５２】
【化２７】
2013501108.tif 000029
【０１５３】
から選択することができる。
【０１５４】
少なくとも1つのカルボキシル部分は、
【０１５５】
【化２８】
2013501108.tif 000030
【０１５６】
(式中、各nは、独立して、0〜4を表す)から選択することができる。
【０１５７】
式中、*は、空洞の表面上の接続点を表している。
【０１５８】
好ましい実施形態において、少なくとも1つのヒドロキシル部分および少なくとも1つのイミダゾール部分は、共有結合しており、式(II)
【０１５９】
【化２９】
2013501108.tif 000031
【０１６０】
により表されることが好ましい。
【０１６１】
より好ましい実施形態において、少なくとも1つのヒドロキシル部分および少なくとも1つのイミダゾール部分は、式(IIa)
【０１６２】
【化３０】
2013501108.tif 000032
【０１６３】
により表される。
【０１６４】
さらなる実施形態において、少なくとも1つのヒドロキシル部分および少なくとも1つのイミダゾール部分は、(II)または(IIa)から選択され、カルボキシル部分は、イミダゾール部分との水素結合相互作用に影響するように空間的に配向される。
【０１６５】
化学的定義:
「アルキル」は、直鎖状または分岐状であってよく、好ましくは、1〜10個の炭素原子、または、より好ましくは、1〜6個の炭素原子を有する一価アルキル基を指す。そのようなアルキル基の例は、メチル、エチル、n-プロピル、iso-プロピル、n-ブチル、iso-ブチル、n-ヘキシルなどを包含する。
【０１６６】
「アルキレン」は、好ましくは、1〜10個の炭素原子、より好ましくは、1〜6個の炭素原子を有する二価アルキル基を指す。そのようなアルキレン基の例は、メチレン(-CH2-)、エチレン(-CH2CH2-)、およびプロピレン異性体(例えば、-CH2CH2CH2-および-CH(CH3)CH2-)などを包含する。
【０１６７】
「アリール」は、好ましくは、6〜14個の炭素原子を有する、単一の環(例えば、フェニル)または複数の縮合環(例えば、ナフチルまたはアントリル)を有する不飽和芳香族炭素環式基を指す。アリール基の例は、フェニル、ナフチルなどを包含する。
【０１６８】
「アリールオキシ」は、アリール基が、上に記載されている通りである基アリール-O-を指す。
【０１６９】
「アリールアルキル」は、好ましくは、アルキレン部分に1〜10個の炭素原子を、アリール部分に6〜10個の炭素原子を有する-アルキレン-アリール基を指す。そのようなアリールアルキル基は、ベンジル、フェネチルなどにより例示される。
【０１７０】
「アリールアルコキシ」は、アリールアルキル基が、上に記載されている通りである基アリールアルキル-O-を指す。そのようなアリールアルコキシ基は、ベンジルオキシなどにより例示される。
【０１７１】
「アルコキシ」は、アルキル基が、上に記載されている通りである基アルキル-O-を指す。例は、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、iso-プロポキシ、n-ブトキシ、tert-ブトキシ、sec-ブトキシ、n-ペントキシ、n-ヘキソキシ、1,2-ジメチルブトキシなどを包含する。
【０１７２】
「アルケニル」は、直鎖状または分岐状であってよく、好ましくは、2〜10個の炭素原子、より好ましくは、2〜6個の炭素原子を有し、少なくとも1個、好ましくは、1〜2個の炭素〜炭素二重結合を有する一価アルケニル基を指す。例は、エテニル(-CH=CH2)、n-プロペニル(-CH2CH=CH2)、iso-プロペニル(-C(CH3)=CH2)、ブタ-2-エニル(-CH2CH=CHCH3)などを包含する。
【０１７３】
「アシル」は、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルが、本明細書に記載されている通りである基H-C(O)-、アルキル-C(O)-、シクロアルキル-C(O)-、アリール-C(O)-、ヘテロアリール-C(O)-、およびヘテロシクリル-C(O)-を指す。
【０１７４】
「オキシアシル」は、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルが、本明細書に記載されている通りである基アルキル-OC(O)-、シクロアルキル-OC(O)-、アリール-OC(O)-、ヘテロアリール-OC(O)-、およびヘテロシクリル-OC(O)-を指す。
【０１７５】
「アミノ」は、各R''が、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルであり、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルの各々が、本明細書に記載されている通りである基-NR''R''を指す。
【０１７６】
「アミノアシル」は、各R''が、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルであり、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルの各々が、本明細書に記載されている通りである基-C(O)NR''R''を指す。
【０１７７】
「アシルアミノ」は、各R''が、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルであり、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルの各々が、本明細書に記載されている通りである基-NR''C(O)R''を指す。
【０１７８】
「アシルオキシ」は、アルキル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルが、本明細書に記載されている通りである基-OC(O)-アルキル、-OC(O)-アリール、-OC(O)-ヘテロアリール、および-OC(O)-ヘテロシクリルを指す。
【０１７９】
「アミノアシルオキシ」は、R''が、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルであり、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルの各々が、本明細書に記載されている通りである基-OC(O)NR''-アルキル、-OC(O)NR''-シクロアルキル、-OC(O)NR''-アリール、-OC(O)NR''-ヘテロアリール、および-OC(O)NR''-ヘテロシクリルを指す。
【０１８０】
「オキシアシルアミノ」は、R''が、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルであり、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルの各々が、本明細書に記載されている通りである基-NR''C(O)O-アルキル、-NR''C(O)O-アリール、-NR''C(O)O-ヘテロアリール、および-NR''C(O)O-ヘテロシクリルを指す。
【０１８１】
「オキシアシルオキシ」は、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルが、本明細書に記載されている通りである基-OC(O)O-アルキル、-O-C(O)O-アリール、-OC(O)O-ヘテロアリール、および-OC(O)O-ヘテロシクリルを指す。
【０１８２】
「アシルイミノ」は、各R''が、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルであり、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルの各々が、本明細書に記載されている通りである基-C(NR'')-R''を指す。
【０１８３】
「アシルイミノオキシ」は、各R''が、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルであり、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルの各々が、本明細書に記載されている通りである基-O-C(NR'')-R''を指す。
【０１８４】
「オキシアシルイミノ」は、各R''が、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルであり、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルの各々が、本明細書に記載されている通りである基-C(NR'')-OR''を指す。
【０１８５】
「シクロアルキル」は、好ましくは、3〜10個の炭素原子を組み入れている、単一の環式環または複数の縮合環を有する環式アルキル基を指す。そのようなシクロアルキル基は、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロオクチルなどの単一の環構造、またはアダマンタニル、インダニル、1,2,3,4-テトラヒドロナフタレニルなどの複数の環構造を包含する。
【０１８６】
「ハロ」または「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを指す。
【０１８７】
「ヘテロアリール」は、芳香族性についてのヒュッケル基準を満たし(すなわち、4n+2個のπ電子を含有する)、好ましくは、環内に2〜10個の炭素原子ならびに酸素、窒素、セレン、および硫黄から選択される1〜4個のヘテロ原子を有する(硫黄、セレンおよび窒素のオキシドを包含する)一価芳香族ヘテロ環式基を指す。そのようなヘテロアリール基は、単一の環(例えば、ピリジル、ピロリルもしくはそれらのN-オキシドまたはフリル)または複数の縮合環(例えば、インドリジニル、ベンゾイミダゾリル、クマリニル、キノリニル、イソキノリニルまたはベンゾチエニル)を有することができる。例えば、R2またはR'が、1個または複数の環ヘテロ原子を有する任意選択で置換されたヘテロアリールである場合、ヘテロアリール基は、C-CまたはC-ヘテロ原子結合、特に、C-N結合を通じて本発明の化合物のコア分子と連結させることができることが理解されるであろう。
【０１８８】
「ヘテロシクリル」は、単一の環または複数の縮合環、好ましくは、環内に1〜8個の炭素原子および窒素、硫黄、酸素、セレンまたはリンから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する一価の飽和または不飽和の基を指す。最も好ましいヘテロ原子は、窒素である。例えば、R2またはR'が、1個または複数の環ヘテロ原子を有する任意選択で置換されたヘテロシクリルである場合、ヘテロシクリル基は、C-CまたはC-ヘテロ原子結合、特に、C-N結合を通じて本発明の化合物のコア分子と連結させることができることが理解されるであろう。
【０１８９】
ヘテロシクリル基およびヘテロアリール基の例は、オキサゾール、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソオキサゾール、イソチアゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドリン、フタルイミド、1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン、4,5,6,7-テトラヒドロベンゾ[b]チオフェン、チアゾール、チアジアゾレス、オキサジアゾール、オキサトリアゾール、テトラゾール、チアゾリジン、チオフェン、ベンゾ[b]チオフェン、モルホリノ、ピペリジニル、ピロリジン、テトラヒドロフラニル、トリアゾールなどを包含するが、それらに限定されるものではない。
【０１９０】
「チオ」は、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルが、本明細書に記載されている通りである基アルキル-S-、シクロアルキル-S-、アリール-S-、ヘテロアリール-S-およびヘテロシクリル-S-を指す。
【０１９１】
「スルフィニルアミノ」は、R''が、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルであり、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルの各々が、本明細書に記載されている通りである基アルキル-S(O)-NR''-、シクロアルキル-S(O)-NR''-、アリール-S(O)-NR''-、ヘテロアリール-S(O)-NR''-およびヘテロシクリル-S(O)-NR''-を指す。
【０１９２】
「スルホニルアミノ」は、R''が、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルであり、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルの各々が、本明細書に記載されている通りである基アルキル-S(O)2-NR''-、シクロアルキル-S(O)2-NR''-、アリール-S(O)2-NR''-、ヘテロアリール-S(O)2-NR''-およびヘテロシクリル-S(O)2-NR''-を指す。
【０１９３】
「オキシスルフィニルアミノ」は、R''が、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルであり、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルの各々が、本明細書に記載されている通りである基アルキルO-S(O)-NR''-、シクロアルキルO-S(O)-NR''-、アリールO-S(O)-NR''-、ヘテロアリールO-S(O)-NR''-およびヘテロシクリルO-S(O)-NR''-を指す。
【０１９４】
「オキシスルホニルアミノ」は、R''が、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルであり、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルの各々が、本明細書に記載されている通りである基アルキルO-S(O)2-NR''-、シクロアルキルO-S(O)2-NR''-、アリールO-S(O)2-NR''-、ヘテロアリールO-S(O)2-NR''-およびヘテロシクリルO-S(O)2-NR''-を指す。
【０１９５】
本明細書において、「任意選択で置換された」とは、ある基が、ヒドロキシル、アシル、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルケニルオキシ、アルキニル、アルキニルオキシ、アミノ、アミノアシル、チオ、アリールアルキル、アリールアルコキシ、アリール、アリールオキシ、カルボキシル、アシルアミノ、シアノ、ハロゲン、ニトロ、ホスホノ、スルホ、ホスホリルアミノ、ホスフィニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルオキシ、オキシアシル、オキシム、オキシムエーテル、ヒドラゾン、オキシアシルアミノ、オキシスルホニルアミノ、アミノアシルオキシ、トリハロメチル、トリアルキルシリル、ペンタフルオロエチル、トリフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメタンチオ、トリフルオロエテニル、モノ-およびジ-アルキルアミノ、モノ-およびジ-(置換アルキル)アミノ、モノ-およびジ-アリールアミノ、モノ-およびジ-ヘテロアリールアミノ、モノ-およびジ-ヘテロシクリルアミノ、ならびにアルキル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルなどから選択される異なる置換基を有する非対称の二置換アミンなどから選択される1つまたは複数の基でさらに置換されているかそれらと縮合して(縮合した多環式基を形成するように)いてもしていなくてもよく、固体支持体材料との結合を包含することもある(例えば、ポリマー樹脂上に置換されている)ことを意味すると解釈される。例えば、「任意選択で置換されたアミノ」基は、アミノ酸およびペプチド残基を包含することができる。任意選択で置換されたアルコキシの場合、「任意選択で置換された」という用語は、1個または複数の飽和炭素原子が、O、S、NHなどのヘテロ原子またはヘテロ基で置換されていてもよいことを示すことができる。例えば、任意選択で置換されたアルコキシ基は、-O-CH2CH2-O-CH2CH2OHまたは他の長さのポリエチレングリコールなどの基により表しうる。
【０１９６】
次に、本発明は、下記の実施例において記載されるであろう。実施例は、決して本発明を制限すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１９７】
1)テンプレートの合成:
A) [Cbz-Lys(Pht)P(OMe)(Ph-Im)]テンプレート(1)のレポーション(reportion)
【０１９８】
【化３１】
2013501108.tif 000033
【０１９９】
(i) Cbz-Lys(Pht)P(OMe)(OH) (2)の合成
望ましい標的(1)化合物を得るため、一次ステップは、スキーム2 (化32)に図示されているように、達成されたジフェニル-(1-(N-ベンジルオキシカルボニルアミノ)-5-フタルイミド)ペンチルホスホネート[Cbz-Lys(Pht)P(OPh)2] (12)の合成とした。Cbz-Lys(Pht)P(OMe)(OH) (2)の調製は、Cbz-Lys(Pht)P(OPh)2 (12)化合物のエステル交換と、続く、部分的モノ加水分解での2ステップ合成で達成した。合成は、出発材料として市販の5-アミノ-1-ペンタノール(6)および無水フタル酸(7)を使用した。
【０２００】
【化３２】
2013501108.tif 000034
【０２０１】
化合物(8)は、5分にわたって160℃にてマイクロ波中で出発材料(6)および(7)を加熱することにより合成し、100%収率で高純度の予想生成物(8)を得た。化合物(8)を、PCCでそのそれぞれのアルデヒド誘導体(9)に酸化した後、Cbz-Lys(Pht)P(OPh)2 (12)の製造は、酢酸(AcOH)中でカルバミン酸ベンジル(10)亜リン酸トリフェニル(11)を使用して達成した。
【０２０２】
そのジメチルホスホン酸エステル(13)へのCbz-Lys(Pht)P(OPh)2 (12)のエステル交換は、フッ化カリウム(KF)およびメタノールの存在下で行った。この手順は、試薬を添加し、一夜にわたって23℃にて撹拌するものであった。溶媒の蒸発と後処理後、灰色がかった白色の結晶(13)を、酢酸エチルおよびヘキサンから再結晶し、88%収率で白色の結晶として望ましい生成物を製造した。最終ステップにおいて、(13)の選択的部分加水分解は、2-ブタノン中で臭化リチウム(LiBr)を使用して達成し、52%収率で生成物(2)を製造した。しかしながら、この選択的部分加水分解のための弱塩基性の1,4-ジアザビシクロ-[2.2.2.]オクタン(DABCO)の使用は、反応が67%収率および高純度で進行して(2)を製造することを可能にした。代替のマイクロ波ベースの合成アプローチとして、(13)の効果的なモノ加水分解も達成した。この方法は、反応時間を大幅に(ヒートブロックを使用して還流状態で一夜にわたってからマイクロ波加熱で30分へ)短縮したばかりでなく、生成物収率を75%まで改善した。さらに、この手順におけるDABCOの使用が有利であるのは、強塩基性試薬が使用された場合に起こされることがある、他の保護基が関わるいかなる他の副反応も行わないからである(フタルイミド基は、NaOHと共に還流する場合に適合していない)。
【０２０３】
(ii)重合性基(4)の合成
セリン(ヒドロキシ)およびヒスチジン(イミダゾール)残基の模倣体を包含した2-(2'-ヒドロキシ-5'-エテニルフェニル)イミダゾール(4)の合成は、知られている合成反応(6)に部分的に基づき、新しい手順により達成した。出発材料としてp-ブロモサリチルアルデヒドおよびグリオキサール(三量体四水和物)を使用する4ステップ合成で製造される望ましい吸湿性化合物(4)は、薄いベージュ色の固体として得られた。
【０２０４】
(iii) [Cbz-Lys(Pht)P(OMe)(Ph-Im)]テンプレート(1)の合成
光延反応(7〜9)と呼ばれるトリフェニルホスフィン塩とのアゾジカルボン酸ジエチル(DEAD)を包含する異なるアプローチおよびカップリング剤を、テンプレート(1)の合成で使用した。しかしながら、BOP(5)を使用して行ったカップリング反応も、望ましい生成物を与えた。反応は、23℃にて窒素下で無水ジクロロメタン(CH2Cl2)中で1当量添加のCbz-Lys(Pht)P(OMe)(OH) (2)、2-(2'-ヒドロキシ-5'-エテニルフェニル)イミダゾール(4)およびBOP (5)を2当量のトリエチルアミン(TEA)と共に撹拌することにより行った。カップリング手順は、スキーム3 (化33)で表される。
【０２０５】
(1)の合成の重要な態様は、試薬の連続添加の必要性であることが分かった。先ず、Cbz-Lys(Pht)P(OMe)(OH) (2)を、室温にて無水CH2Cl2に懸濁した。これに、TEAを、Cbz-Lys(Pht)P(OMe)(OH) (2)の酸部分を脱プロトン化するために添加し、澄明な均一溶液(14)を製造した。BOP (5)を添加した後、溶液を、15分にわたって室温にて撹拌し、BOP断片からのベンゾトリアゾリル(15)イオンの解離と、結果として、ホスホニウム中間体(16)を達成させた。続いて、CH2Cl2に溶かした2-(2'-ヒドロキシ-5'-エテニルフェニル)イミダゾール(4)を溶液に添加した場合に、ヘキサメチルリン酸アミド(17)が、ホスホニウム中間体(16)から消え、一方、(4)がエステル化され、望ましいCbz-Lys(Pht)P(OMe)(Ph-Im) (1)が製造された。
【０２０６】
反応の進行は、HPLC、LC-ESI-MSおよびESI-MSによりモニターし、それらは、それぞれ、629.2、135.1および180.2 [M+H]+としてm/z値を持つ望ましいCbz-Lys(Pht)P(OMe)(Ph-Im) (1)生成物を、ベンゾトリアゾリル(15)イオンおよびヘキサメチルリン酸アミド(17)副産物と共に示した。HPLC分析に基づき、反応は、ピーク強度のさらなる変化が観察されない46時間後に終了させた。この手順により行われた反応は、生成物変換が、HPLCおよびESI-MSにより評価されるように反応の1時間以内に検出されたため極めて有効であった。HR-MSおよびNMR帰属に基づき、この研究でのCbz-Lys(Pht)P(OMe)(Ph-Im) (1)の調製が確認された。化合物Cbz-Lys(Pht)P(OMe)(Ph-Im) (1)は、吸湿性かつ不安定であることが判明したことから、重合の次のステップで直ちに使用した。
【０２０７】
【化３３】
2013501108.tif 000035
【０２０８】
(iv) [Cbz-Lys(Pht)-OH] (3)の合成
Cbz-Lys(Pht)-OH (3)の合成、スキーム4 (化34)は、5-フタルイミド-1-ペンタノール(8)の調製について記載されているアミノ保護方法で達成した。この実験において、市販の(1-(N-ベンジルオキシカルボニルアミノ)-5-アミノ)ペンチル-カルボン酸(18)および無水フタル酸(7)を混ぜ、マイクロ波機器を使用して5分にわたって150℃にて加熱した。非晶質生成物Cbz-Lys(Pht)-OH (3)は、元素分析およびNMRスペクトルに基づいて100%収率で得られた。
【０２０９】
【化３４】
2013501108.tif 000036
【０２１０】
2)ポリマーの合成:
ポリマーの調製は、共有結合インプリンティング手順と非共有結合インプリンティング手順の両方により達成された。共有結合インプリンティング手順において、Cbz-Lys(Pht)P(OMe)(Ph-Im) (1)を、重合性テンプレート分子として使用し、一方、Cbz-Lys(Pht)P(OMe)(OH) (2)を、非共有結合インプリンティング手順における非重合性テンプレート分子として使用した。非共有結合手順により調製されるポリマーについては、様々な異なるインプリンティング技法を調べ、触媒的に効率的なポリマーを製造した。
【０２１１】
さらに、触媒的に増強されたポリマーを製造するためのテンプレートとしての遷移状態類似体(TSA)の有効性を評価するため、基底状態類似体(GSA)ポリマーも、テンプレートとしてCbz-Lys(Pht)-OH (3)化合物を使用して合成した。インプリントポリマーのために使用されるような類似の重合技法を応用し、テンプレートが存在しない非インプリントポリマーを調製し、インプリントポリマーの触媒評価における対照ポリマーとして使用した。形態、表面積および多孔性に関するポリマーの物理的特徴を検討し、得られたポリマーの機能性および形態に対する具体的なインプリンティングテンプレート、架橋剤およびポロジェンの使用の結果を評価した。
【０２１２】
(i)テンプレートCbz-Lys(Pht)P(OMe)(Ph-Im) (1)を使用する重合性遷移状態ホスホネート類似体-分子インプリントポリマー(PTSPA-インプリントポリマー) (22)の合成
PTSPA-インプリントポリマー(22)の合成は、酵素トリプシン中に見いだされる触媒トライアド(Asp-His-Ser)に基づいた。調製は、スキーム5 (化35) (ジグザグの線は、ポリマー鎖単位を表す)に示されているように、重合性テンプレートCbz-Lys(Pht)P(OMe)(Ph-Im) (1)とモノマーメタクリル酸(MAA) (19)の間の水素結合イオン対相互作用を通じて、共有結合インプリンティング方法により行った。
【０２１３】
【化３５】
2013501108.tif 000037
【０２１４】
重合は、クロロホルム(CHCl3)中で機能性モノマーとしてのMAA (19)および架橋剤としてのEDMA (20)に重合性テンプレートCbz-Lys(Pht)P(OMe)(Ph-Im) (1)を添加することにより行った。開始剤2,2'-アゾビスイソブチロニトリル(AIBN)を添加した後、フリーラジカル重合を、ヒートブロックパラレル合成装置を使用して65℃にて開始させた。反応の1時間以内に、ポリマーの小さな凝集体が形成され、2時間以内にブロックモノリシックポリマーに進んだ。反応を24時間にわたって続け、確実に重合を完了させた。次いで、インプリントポリマー(21)を、乳鉢および乳棒を使用して破砕し、得られたポリマー粒子を篩い分けした。30〜90ミクロンの間の粒子サイズが得られ、インプリンティングが、共有結合インプリンティング技法を使用して行われたことから、ポリマーを、Cbz-Lys(Pht)P(OMe)(OH) (2)としてPTSPA-インプリントポリマーのホスホネート部分のエステル結合を切断するために極端な抽出条件においた。抽出技法は、100mLのCHCl3/CH3OH (1:1、v/v)にインプリントポリマーを懸濁すること、一夜にわたって23℃にて撹拌すること、24時間にわたるメタノール中でのソックスレー抽出を包含した。続く抽出手順において、ポリマーを、24時間にわたって60℃にて撹拌しながら1M NaOH/CH3OH (1:1、v/v) 100mLで処理した。次いで、ポリマーを、中性pHが得られるまでMilli-Q水で洗浄し、続いて、CH3OHですすぎ、空気乾燥した。この手順により調製されたPTSPA-インプリントポリマー(22)は、スキーム5 (化35)に示されているように、ポリマー空洞内に特異的配向で活性アミノ酸模倣体のすべてを含有していた。
【０２１５】
(ii)「対照」機能性テンプレートとしてN-ベンゾイル-2-(2'-ベンゾキシ-5'-エテニルフェニル)イミダゾール(23)を使用するPTSPA-非インプリントポリマー(PTSPA-非インプリントポリマー) (26)の合成
PTSPA-インプリントポリマー(22)重合技法を利用し、対応するPTSPA-非インプリントポリマー(26)の調製は、「対照」機能性テンプレート(すなわち、テンプレート内に4面体の化学的部分のない)としてN-ベンゾイル-2-(2'-ベンゾキシ-5'-エテニルフェニル)イミダゾール(23)を使用して達成された。PTSPA-非インプリントポリマーの合成は、スキーム6 (化36)に示されているように達成された。
【０２１６】
【化３６】
2013501108.tif 000038
【０２１７】
インプリンティング後、ブロックポリマー(24)を破砕し、粉砕し、篩い分けし、ベンゾイル基を切断するために化学的に処理し、対照PTSPA-非インプリントポリマー(26)を製造した。この非インプリントポリマーの抽出プロセスは、PTSPA-インプリントポリマー(22)について使用されたのと類似した技法を使用して行った。化合物(23)は、それが、PTSPA-インプリントポリマー(22)において見いだされるような類似の活性基(Asp-His-Ser)を生成することから、PTSPA-非インプリントポリマー(26)を調製するための対照テンプレートとして使用した。PTSPA-インプリントポリマー(22)内で確立されたインプリンティング効果は、具体的に、PTSPA-インプリントポリマー(22)およびPTSPA-非インプリントポリマー(26)の加水分解アッセイ中に決定することができる。
【０２１８】
(iii)テンプレートCbz-Lys(Pht)P(OMe)(OH) (2)を使用する遷移状態ホスホネート類似体-分子インプリントポリマー(TSPA-インプリントポリマー) (30)の合成
TSPA-インプリントポリマー(30)の合成は、非共有結合重合アプローチを利用して行った。インプリンティングプロセス中のテンプレート-モノマー相互作用は、スキーム7 (化37)に概略が説明されているように、テンプレートCbz-Lys(Pht)P(OMe)(OH) (2)のホスホリル基とモノマー4-ビニルイミダゾール(4-VI)(27)の窒素原子の間の水素結合イオン対相互作用により支配されていると考えられた。この重合において、架橋剤DVB (28)を最初に使用した。
【０２１９】
【化３７】
2013501108.tif 000039
【０２２０】
インプリンティングプロセスは、アセトニトリル(ACN)中でテンプレートCbz-Lys(Pht)P(OMe)(OH) (2)を添加し、窒素下で23℃にて撹拌することにより行った。モノマー4-VI (27)を添加すると、懸濁されたテンプレートCbz-Lys(Pht)P(OMe)(OH) (2)は溶け始め、均一溶液が徐々に形成された。65℃にて一夜にわたる重合後、得られたポリマー粒子を、ACN、リン酸緩衝液(pH10)およびCH3OHで洗浄し、Cbz-Lys(Pht)P(OMe)(OH) (2)テンプレートを除去した。同じインプリンティング技法を使用し、対応するTSPA-非インプリントポリマーも、テンプレート分子の存在なしで調製した。
【０２２１】
(iv)基底状態カルボン酸類似体-分子インプリントポリマー(GSCA-インプリントポリマー)(32)の合成
GSCA-インプリントポリマー(32)は、スキーム8 (化38)が描いているように、架橋剤としてのEDMA (28)およびモノマーとしての4-VI (27)を使用して調製した。GSCA-インプリントポリマー(32)の調製は、Table 1 (表1)に概略が説明されているように、TSPA-5インプリントポリマーの調製について使用されているのと類似したインプリンティング技法および比を使用して行った。GSCA-インプリントポリマー(32)を製造するためのこのインプリントポリマー(31)からのテンプレート抽出は、TSPA-インプリントポリマーについて使用されているのと類似した抽出手順を使用して行った。
【０２２２】
【化３８】
2013501108.tif 000040
【０２２３】
モノマー/架橋剤比の効果
得られたポリマーの加水分解活性および選択性における架橋剤の効果を研究するため、様々なポリマーを、列挙された比がTable 1 (表1)に示しているように、重合プロセスにおける架橋剤DVB(28)の組成を変えることにより調製した。
【０２２４】
【表１】
2013501108.tif 000041
【０２２５】
インプリントポリマーの加水分解活性および触媒活性における異なる架橋剤の効果を研究するため、TSPA-インプリントポリマーを、架橋剤としてEDMA (20)を使用しても合成した。望ましいインプリントポリマー技術を達成するため、重合手順における過剰の架橋剤の利用を用い、剛性の物理的特性を持つポリマーにつなげた。結果として、剛性に関するポリマーの物理的特性は、重合プロセスにおいて使用される架橋剤量の増加に伴って比例的に増加すると仮定された。本研究において、得られたポリマーの間のそのような物理的な差が立証された。例えば、より少量の架橋剤DVB (28)が、TSPA-1および-2ポリマーの調製に使用された場合、得られたポリマーは、ビーズとして得られた。この方法が望ましいは、活性部位変形につながることがあるポリマーミリングを回避したからである。他方、架橋剤DVBの量が、TSPA-3および-4についてのように増加した場合、得られたポリマーは、よりコンパクトか凝集した形態で得られ、粉砕を必要とした。
【０２２６】
TSPA-3ポリマー(インプリントおよび非インプリント)は、ブロックモノリスとして得られたが、それらは、TSPA-4ポリマーと比較してあまり剛性でないことが判明したことにも注目することができる。このことは、使用された架橋剤のより低い量によるとされた。得られたポリマーの物理的粘性に関して、EDMA (20)の使用は、DVB (28) (すなわち、TSPA-4)の使用よりも低い剛性を持つポリマー(すなわち、TSPA-5)をもたらした。ある程度の柔軟性を持って製造されるインプリントポリマーが望ましいのは、効率的なテンプレート除去のための抽出溶媒の接近性を容易にすることができるからである。さらに、再結合中のポリマーマトリックスにおける分析物分子の透過を増強することができる。このようにして、EDMA (20)を利用して調製された場合のその増強された柔軟性(粉砕する場合にTSPA-4より剛性でない)を持つTSPA-5インプリントポリマーは、架橋剤としてDVB (28)を使用して調製されたTSPA-4インプリントポリマーより容易に接近可能な触媒の属性を有していた。
【０２２７】
テンプレートの抽出および定量化
PTSPA-、TSPA-およびGSCA-インプリントポリマーから抽出されるテンプレートの量を決定するため、標準較正曲線を、Figure 2 (化39)が示すように、異なる濃度のCbz-Lys(Pht)P(OMe)(OH) (2)およびCbz-Lys(Pht)-OH (3)を使用して確立させた。テンプレートCbz-Lys(Pht)P(OMe)(OH) (2)およびCbz-Lys(Pht)-OH (3)の標準試料は、ACN/CH3OH (9:1、v/v)を使用して調製し、分析は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により行った。高い比のモノマー対テンプレート分子をインプリントポリマーの合成において使用したことから、テンプレートは、定量的にインプリントされたと仮定された。
【０２２８】
【化３９】
2013501108.tif 000042
【０２２９】
PTSPA-インプリントポリマーから抽出されるテンプレート
インプリントポリマーからの抽出テンプレートの割合は、Table 2 (表2)に示されている。データが示すように、94%超のテンプレート除去がPTSPA-インプリントポリマーについて達成された。PTSPA-インプリントポリマーからの6%のテンプレートなどの残りの比率は、小さな比のテンプレートが、依然としてインプリントポリマーと結合しているかインプリントポリマー中に完全に包埋されており、適用されたテンプレート抽出方法の下で除去されなかった可能性を示唆している。共有結合インプリンティングアプローチを使用するエステル結合により調製されるPTSPA-インプリントポリマーからの有効なテンプレート切断は、インプリントポリマーの水性塩基(NaOH)処理により行われ、最高のテンプレート除去(>86%)は、ポリマーがNaOH/CH3OH (1M、1:1、v/v)で処理された場合に達成された。
【０２３０】
【表２】
2013501108.tif 000043
【０２３１】
テンプレート除去の成功は別として、NaOHの使用は、いかなる他の結合にも影響を及ぼすことなくホスホネート部分のエステル様結合における適切なテンプレートの切断を容易にするためにも価値があった。例えば、酸性条件下では、ベンジルオキシカルボニル(Cbz)基が容易に切断され、切断されたテンプレートの分析および定量化をより困難にした可能性がある。ESI-MSによるPTSPA-インプリントポリマーからの抽出された切断テンプレートのさらなる分析も、切断されたホスホネート部分Cbz-Lys(Pht)P(OMe)(OH) (2)が、m/z=459.2 [M-H]として検出されたことから、予想された結合におけるテンプレート切断の成功を証明した。
【０２３２】
TSPA-インプリントポリマーからのテンプレート抽出
TSPA-インプリントポリマーからのテンプレート抽出も、インプリントポリマーの様々な溶媒処理により行った。TSPA-インプリントポリマーシリーズから、得られた最高テンプレート除去は、それぞれTSPA-1およびTSPA-2インプリントポリマーから81および77%であった。TSPA-4インプリントポリマー中のDVB (28)量が、TSPA-1インプリントポリマーに関して4.5倍増加した場合、抽出テンプレートの量は、55%まで減少した。この減少は、ポリマーの物理的特性が、重合プロセス中に使用される架橋剤の量により影響を受けることから、ポリマーの調製において使用される架橋剤のより高い量に直接対応していた。
【０２３３】
TSPA-インプリントポリマーから除去されるテンプレートの量は、抽出プロセスにおいて使用される溶媒のタイプに左右されることも判明した。例えば、TSPA-インプリントポリマーから抽出されるテンプレートの量は、メタノールが、アセトニトリルかまたはリン酸緩衝液と比較して抽出溶媒として使用された場合により高かった。より多くのテンプレート分子を除去するためのメタノールの有効性の1つの理由は、テンプレートが効果的にポリマーマトリックス外へ拡散することを可能にする、メタノール中でのインプリントポリマーの驚くほど高い膨潤(空洞の開口)であった。メタノール中でのテンプレートCbz-Lys(Pht)P(OMe)-(OH)] (2)の溶解性は、アセトニトリルにおけるより高いことから、この特性は、メタノールによるTSPA-1インプリントポリマーからのテンプレート除去のより高い比率も説明することができる。テンプレート抽出溶媒として使用されるリン酸緩衝液は、テンプレート分子を溶かすのに効率的であるが、インプリントポリマーからテンプレートを抽出するその能力は、あまり効果的でないことが判明したことに注目することは興味深い。架橋剤EDMAで調製されたインプリントポリマー(TSPA-5インプリントポリマー)から除去されるテンプレートの量は、DVB調製のTSPA-4インプリントポリマーから除去される量と比較してより高いことが判明した。この差の1つの理由は、これらのポリマーの疎水性の差に起因していたかもしれず、架橋剤EDMAは、より良い良好な浸潤性および迅速な物質移動につながる。さらに、架橋剤EDMAにより調製されるポリマーは、DVB架橋剤により調製されるポリマーと比較してより高い膨潤能力を示した。結果として、溶媒へのポリマーのインプリント部位の接近性は、より高かった。
【０２３４】
GSCA-インプリントポリマーからのテンプレート抽出
GSCA-インプリントポリマーの場合、約75%のテンプレートが除去された。GSCA-インプリントポリマーは、類似の架橋剤組成およびTSPA-5インプリントポリマーのために使用されたのと同じテンプレート抽出技法を使用して調製されたが、GSCA-インプリントポリマーから抽出されるテンプレートの量は、10%高かった。これらのインプリントポリマーの調製において使用される架橋剤の量とは別に、テンプレート抽出の量は、テンプレートとポリマー官能基の間で形成される化学結合の性質により影響を受けるであろう。テンプレートと機能性モノマーの間の会合定数は、ポリマーから抽出されるテンプレートの量を決定するのに主要な役割を果たす。ホスホン酸は、それらのカルボン酸対応物より有意に酸性である。この理由から、TSPA-インプリントポリマーにおける[Cbz-Lys(Pht)P(OMe)(OH)] (2)のホスホン酸部分およびモノマー4-VI (27)の会合定数は、GSCA-インプリントポリマーにおける4-VI (27)モノマーについてのカルボン酸ベースのCbz-Lys(Pht)-OH (3)テンプレートの会合定数より高いであろう。[Cbz-Lys(Pht)P(OMe)(OH)] (2)のホスホリル部分のより高い酸性度は、GSCA-インプリントポリマー中で形成されるCbz-Lys(Pht)-OH (3)のカルボン酸部分と比較して塩基性4-VI (27)とのより強い水素結合イオン対相互作用を促進し、このようにして、TSPA-5インプリントポリマーと比較してGSCA-インプリントポリマーからのテンプレート分子除去のより高い割合を説明しうる。
【０２３５】
BET表面積およびポロシメトリー分析を使用するポリマーの特徴付け
インプリントポリマーの特徴付けは、表面積および多孔性の決定を可能にするBETにより達成された。インプリントポリマーは、マクロ多孔性ポリマーとして分類することができる。用語マクロ多孔性は、ポリマーが、多孔性である事実を強調するが、細孔サイズに関して詳細な形態学的特性を暗示しないために使用された。しかしながら、多孔性材料は、それぞれ>50nm、2〜50nmから<2nmまでの範囲である細孔サイズ直径を持つマクロ-、メソ-、およびミクロ多孔性としてそれらの細孔の特徴に従ってカテゴリー化することができる(11)。調製されたインプリントおよび非インプリントポリマーについて得られる表面積は、TSPA-4ポリマーを除いて、それぞれ134〜308および179〜301m2/gの範囲に見いだされた。上で説明されているようなサイズ分類に基づき、ポリマーは、圧倒的にメソ多孔性であった。表面積および細孔容積から、下で議論されるように、調製されたポリマーの多くの新規な特徴が見いだされた。
【０２３６】
ポリマーの形態学的特性に対するテンプレートの効果
BET分析を使用する表面積決定に基づき、架橋剤としてEDMA (20)を利用して調製される非インプリントポリマーは、それらの対応するインプリントポリマーと比較してわずかに高い表面積を有することが判明した。この結果は、DVBベースの合成されたポリマーについては逆転され、インプリントポリマーは、対応する非インプリントポリマーより高い表面積を示した。細孔容積に関して、Table 3 (表3)およびFigure 3 (化40)に図示されているように、インプリントポリマーと非インプリントポリマーの間に明確な差は見いだされなかった。
【０２３７】
【表３】
2013501108.tif 000044
【０２３８】
ポリマーの形態学的特性に対する架橋剤の効果
反応温度ならびにポロジェンの量およびタイプの他に、インプリントポリマーの表面積および多孔性を制御する最も有効な変数は、重合プロセスにおいて使用される架橋剤の量である。架橋剤EDMAで調製されるポリマー(PTSPA、TSPA-5およびGSCA)は、架橋剤の量が、架橋剤DVBを使用して調製されるいずれのポリマーと比較してもポリマー1グラム当たりのより高い表面積を有する物理的特性を持つ表面形態に大きな影響を及ぼすことを立証した。PTSPA、TSPA-5およびGSCAポリマーの調製において使用されるEDMAの量は、TSPA-1および2ポリマーの調製において使用されるDVBの量より有意に高かったが、EDMAベースのポリマー(すなわち、PTSPA、TSPA5およびGSCA)について得られる表面積は、より高いことが判明した。ポリマーの剛性は、架橋剤の量の増加に併せて増加したが、このようにして、表面積と細孔容積を共に、より合理的に変えることができる。
【０２３９】
TSPAポリマーの調製における架橋剤の量の効果に関して、結果は、TSPA-1、TSPA-2、TSPA-3およびTSPA-4についての値が、Figure 3 (化40)およびTable 3 (表3)で示しているように、表面積と細孔容積が共に、TSPA-ポリマー調製におけるDVBの含有量の増加に併せて減少することを示した。したがって、使用されるDVBの量が小さいほど、細孔容積は大きくなり、由来するポリマーの表面積は高くなる。
【０２４０】
【化４０】
2013501108.tif 000045
【０２４１】
さらに、表面積と細孔容積の間の関係が、TSPAベースのポリマーから抽出されるテンプレートの量のそれと共に発見された。例えば、低含有量のDVBを利用して調製された高い表面積および細孔容積を持つポリマー(すなわち、TSPA-1およびTSPA-2インプリントポリマー)からは、より低い表面積およびより低い細孔容積を有する高含有量のDVBで調製されたインプリントポリマー(すなわち、TSPA-4インプリントポリマー)と比較して、より高い割合のテンプレートを除去することができた。EDMAで調製されるポリマー(PTSPA、TSPA-5およびGSCA-インプリントポリマー)については、高い比率のテンプレート除去が達成された。これらのEDMAベースのインプリントポリマーは、より高い細孔容積および大きな表面積を有することも分かった。このようにして、得られるより高い表面積は、特に、EDMAベースのインプリントポリマーについて、抽出溶媒によるインプリント部位へのより良い接近性によってこれらのインプリントポリマーからの高い比率のテンプレート除去につながる。
【０２４２】
ポリマーの形態学的特性に対するポロジェンのタイプの効果
クロロホルムベースのポリマー(PTSPAポリマー)またはACNベースの調製ポリマー(TSPA-5ポリマー)の間に大きな細孔容積差は見いだされなかった。
【０２４３】
SEM分析によるポリマーの特徴付け
SEMモードでの電子顕微鏡検査は、試料の表面特徴の高分解能画像を生み出すことができる強力な手順である。SEM画像の評価に基づき、本発明の一部として調製されたポリマーの独特の形態学的な差に注目した。図2中のSEM画像が示すように、PTSPA-インプリントポリマーは、相対的に滑らかな表面を示したそれぞれの非インプリントポリマーと比較して粗い表面を有するように見えた。ポリマー間のこの差は、テンプレートによるインプリンティング効果に帰することができる。
【０２４４】
TSPAポリマーの場合、SEM画像は、ポリマーが、PTSPAポリマーと形態学的に異なることを明らかにした。PTSPAポリマーの表面は、形態学的により密集しかつより滑らかに見え、一方、TSPAポリマーは、図3および図4に示されているように、クラスター化または凝固した球状粒子からなるように見えた。TSPAポリマーの独特な差は、ポリマー中のDVB含有量の増加に伴うポリマー稠密度の増加であった。上に記載されているように、架橋剤含有量を増加させることは、TSPAポリマーの表面積を減少させることが分かった。この効果は、得られるポリマー粒子の凝集の促進に帰することができる。図3中のSEM画像から、凝集および稠密度に関するインプリントポリマーと非インプリントポリマーの両方の形態は、DVB架橋剤含有量が増加した場合に増加するように見えることが分かる。したがって、BET知見とSEM知見は共に、異なるTSPAポリマーにおける架橋剤DVBの様々な比の影響に関して一致していた。
【０２４５】
ポリマーの物理的特性に対する架橋剤の効果に関して、SEM画像における独特の形態学的な差は、それぞれDVBおよびEDMA架橋剤で調製されたTSPA-4およびTSPA-5ポリマーについて観察された。TSPA-5ポリマーは、図3(CおよびD)および図4中のSEM画像が示すように、TSPA-4ポリマーより多孔性であるように見えた。本明細書においてEDMAで調製されるポリマーは、DVBベースのポリマーとは違って、あまりクラスター化せずあまり密集性でなかった。架橋剤DVBは、架橋剤EDMAよりも明らかにかなりの疎水性の性質である。この理由から、合成されたポリマーは、様々な膨潤度で得られた。溶媒ACNおよびヘキサンを使用して調製されるポリマーの形態に対するポロジェンの影響は、ビーズ様構造を生み出し、一方、塩素化溶媒は、両タイプのポリマー(PTSPAおよびTSPA)について非晶質ポリマー材料をもたらし、例えば、クロロホルムで調製されるPTSPAポリマーは、非晶質粘性で得られ、一方、溶媒としてのACNで調製されたTSPAポリマーは、ビーズ様の特徴を有していた。
【０２４６】
3)インプリントポリマーの触媒活性の評価
酵素により行われる触媒反応は、これまでは触媒として小化学分子を使用して再現されてきた。ニトロフェニルエステルを、開示されているMIPの新たなポリマー触媒についての検討における基質として用いた。p-ニトロフェニルエステル基質の選択は、予想生成物、p-ニトロフェノール(PNP)の同定および定量化のその簡単さのためであった。触媒インプリントポリマーについての加水分解活性評価は、PNPを検出するためのHPLCを使用して行った。
【０２４７】
最初の検討は、合成されたインプリントポリマーが、標的p-ニトロフェニルエステル基質を加水分解することができるかどうかを確立することを目的とした。さらに、インプリントポリマーの加水分解効率に対する架橋剤のタイプおよび量の影響に対する洞察を得る試みにおいて、さらなる加水分解研究を、異なるタイプの架橋剤を組み入れることにより調製されるインプリントポリマーについて行った。新規インプリントポリマー、PTSPA-インプリントポリマーおよびTSPA-インプリントポリマーの加水分解評価、ならびにそれらの対応する非インプリントポリマー(対照として)の加水分解活性との比較を、スキーム9 (化41)が示すように、基質としてN-ベンジルオキシカルボニル-L-リシンp-ニトロフェニル塩酸塩(Cbz-L-Lys-ONp.HCl) (33)を使用して確立した。様々なインプリントポリマーまたは非インプリントポリマーと共に基質をインキュベートした後の予想生成物PNP (35)の評価および確認は、下記の基準の下で、HPLCおよび液体クロマトグラフィー質量分析法(LC-MS)により達成された:
・標的基質Cbz-L-Lys-ONp.HCl (33)を捕捉するポリマーの能力;
・基質(33)を切断する(加水分解する)潜在力、および
・スキーム9 (化41)に示されているように最終生成物を放出する能力。
【０２４８】
【化４１】
2013501108.tif 000046
【０２４９】
計測器
UV-可視分光光度法は、通常、特定の試料の分析において即時結果を与えるが、HPLCアッセイは、感度およびマイクロリットル容積の試料を分析する能力が必要である場合にある種の利点を有する。しかしながら、HPLCにより行われる試料分析は、通常、分離および同定の質を高めるために様々な前提条件を必要とする。HPLCによる試料分析において注意深い考慮を必要とする主要な因子は、分析されることになる特定の化合物についての溶離溶媒およびカラムの適切性である。さらに、良好な分解能で短い時間フレーム内でのすべての分析物の溶離も、特に、反応の時間ベースの同定および定量分析が主な目的である場合に非常に重要である。加水分解反応の評価は、経時的実験に基づくことから、試料ピークの良好な分解能での迅速な溶離が不可欠であり、このようにして、下記のHPLC動作条件およびパラメーターが、効率的かつ適切であることが判明した:
【０２５０】
加水分解活性を評価するための一般手順
ポリマー(インプリントポリマーまたは非インプリントポリマー)に基質Cbz-L-Lys-ONp.HCl (33)溶液を添加するのに先立って、ポリマー粒子を、2つの理由からアセトニトリルでプレコンディショニングした(平衡化した)。第1の理由は、あらゆるエアポケットを除去し、ポリマーネットワークに対する基質の完全な接近を可能にすることであった。第2の理由は、存在する可能性のあるあらゆる微細粒子を除去することであった。ACN/CH3OH (4.8:0.2、v/v) 5mLに溶かした基質Cbz-L-Lys-ONp.HCl (33)をポリマーと共にインキュベートした後、試料のアリコート(100μL)を、異なる時間間隔で取り出し、遠心分離(Biofuge Heraeus、10,000rpm、5分)にかけ、加水分解評価を、HPLCに上清10μLを注入することにより行った。PNP (35)は、この研究における予想生成物のうちの1つであることから、それを「リポーター」として使用した。触媒インプリントポリマーが関わるエステル基質の大部分の加水分解アッセイにおいて、通常は、酸性生成物よりは、フェノール生成物が、検出モニタリングのために選択されてきた。これは、PNPが、良好な脱離基であるためであり(13)、このようにして、PNPは、いかなる生成物阻害も課することなく触媒インプリントポリマーから放出されると予想される(14)。この結論は、検出される唯一の切断生成物がPNP (35)であったように、本研究においても確認された。
【０２５１】
切断生成物の同定および特徴付け
Figure 7 (化42)中のHPLCクロマトグラムに基づく加水分解活性評価の例が示すように、PTSPAポリマー(インプリントポリマーまたは非インプリントポリマー)により基質Cbz-L-Lys-ONp.HCl (33)から切断された生成物PNP (35)は、参照PNPと同じ保持時間(2.69分)で検出された。このことは、この研究において使用される移動相およびHPLCパラメーターが、それぞれ満足なピーク分離保持時間を持つ「リポーター」PNP (35)および基質Cbz-L-Lys-ONp.HCl (33)の溶離に有効であることを証明した。加水分解活性に関して、PTSPA-インプリントポリマーは、対応するPTSPA-非インプリントポリマーと比較して顕著な加水分解効力を示した。
【０２５２】
Figure 7 (化42)に示されているクロマトグラフプロファイルから分かるように、大量の基質減少は、PTSPA-非インプリントポリマーで生成されたものと比較して、基質をPTSPA-インプリントポリマーと共にインキュベートした場合に起きた。この結果は、PTSPA-インプリントポリマー内に作成された空洞が、成功裏に達成されるその後の加水分解のために、例外的な嵌合で基質Cbz-L-Lys-ONp.HCl (33)を収容したことを裏付けている。
【０２５３】
【化４２】
2013501108.tif 000047
【０２５４】
非インプリントポリマーは、テンプレートの存在なしに調製されたが、ポリマー組み立て中の偶発事象は、触媒活性に必要とされる必要な三次元配置にわずかな官能基を持ち込むことができる。このようにして、低レベルの基質切断が非インプリントポリマーで認められた(Figure 7 (化42)、IV)。ポリマー材料の化学的性質のため、非特異的吸着部位は、非インプリント材料において常に存在するであろう。これらの場合、重合は、重合剤が一緒に添加される場合に起こるランダムかつ速度論的プロセスである。ポリマーの巨大分子構築を形成するための重合の過程において、モノマー中の官能基の一部がまとめられ、独特の構造配置を形成することがある。ポリマー鎖が配置する異なる道のりの制御がないことから、ポリマーマトリックス内の様々な度合いの接近性を持つ多くの潜在的結合部位が形成することがある。非インプリントポリマー内のこれらの結合部位の会合定数は、基質切断に適しているやり方で位置するわずかなこれらの結合部位によって変わるであろう。しかしながら、これらの部位は、特定の分析物に対して非特異的であることから、非インプリントポリマーは、選択的でなく(すなわち、形状およびサイズ)基質と結合しかつ切断することができる。したがって、非インプリントポリマーにより得られる生成物PNPは、その構造配置が偶然に起こった一部の非特異的官能基の存在が基質(33)の結合と一部の切断を可能にすることにより、偶然に支配される加水分解活性を持つ非特異的重合の結果である。しかしながら、この配置は、異なる速度論的特性(すなわち、結合親和性および速度定数)を有するポリマーにつながる。
【０２５５】
【化４３】
2013501108.tif 000048
【０２５６】
クロマトグラフの証拠とは別に、放出PNPのさらなる同定は、関連UVスペクトルの比較によっても提供された。Figure 8 (化43)中のUVスペクトルが示すように、放出生成物PNP (35)と標準PNP分析物のスペクトル間の良好な相関関係が達成された。インプリントポリマーによるCbz-L-Lys-ONp.HCl (33)の加水分解は、成功裏に達成された。LC-MSで行われた関連加水分解活性評価において、PTSPA-インプリントポリマーによる基質Cbz-L-Lys-ONp.HCl (33)の加水分解切断の成功が見いだされた。Figure 9a (化44) (I)中の全イオンクロマトグラム(TIC)が示すように、生成物PNP (35)および残った基質Cbz-L-Lys-ONp.HCl (33)が検出された。クロマトグラム(I)から、基質および切断PNPが、それぞれ8.25および8.60分に溶離したことが分かる。生成物PNPは、クロマトグラム(II)に示されているように、参照PNP (8.38分)のそれと類似した時間窓で溶離した。
【０２５７】
【化４４】
2013501108.tif 000049
【０２５８】
【化４５】
2013501108.tif 000050
【０２５９】
TICピークの対応するMSスペクトルも、Figure 9b (化45) (I)および(II)に示されているように、それぞれ生成物PNP (35)と残った基質Cbz-L-Lys-ONp.HCl (33)の両方についての138.15 [M-H]-および402.26 [M+H]-の予想分子質量を示した。さらに、切断PNP (III)のUVスペクトルは、参照PNP (IV)と類似した構成要素で得られる。このようにして、これらの分析から、保持時間、MSおよびUVスペクトル結果に基づく参照PNPによる放出生成物PNP (35)の同定が確認され、基質Cbz-L-Lys-ONp.HCl (33)を加水分解するPTSPA-インプリントポリマーの能力が成功裏に証明された。
【０２６０】
PTSPA-インプリントポリマーのインプリンティング効果の評価
加水分解活性評価は、基質を、異なるインプリントポリマーおよび非インプリントポリマーと共にインキュベートした後、異なる時間間隔(15秒と30分の間)で行った。加水分解活性評価の典型的な例は、Figure 10 (化46)に示されている。基質Cbz-L-Lys-ONp.HCl (33)を、PTSPA-インプリントポリマーと共にインキュベートした場合の放出PNP (35)の量は、PTSPA-非インプリントポリマーで得られる量より明らかに高い。
【０２６１】
【化４６】
2013501108.tif 000051
【０２６２】
Figure 10 (化46)から、PTSPA-インプリントポリマーにより達成される基質の生成物への変換が極めて迅速であったことが明らかであり、切断生成物PNP (35)の大部分がインプリントポリマー-基質相互作用の15秒以内に得られる。対照的に、PTSPA-非インプリントポリマーについては、たとえインキュベーション時間が30分まで延長された場合であっても、わずかな加水分解活性が検出されたに過ぎなかった。したがって、PTSPA-インプリントポリマーについて得られる迅速かつ顕著な触媒効率は、PTSPA-インプリントポリマーの合成における適当なテンプレートしての化合物(I)の有益性を明確に証明した。
【０２６３】
加水分解反応は、30分にわたってモニターされたが、初期の15秒後にインプリントポリマーにより生成される追加のPNP (35)の量は、グラフ中のプラトーが示すようにわずかであった。この可能な理由は、インプリントポリマーにおける接近可能な活性部位の飽和であったかもしれず、部位の大部分は、インキュベーションの最初の15秒ですでに占有される。それ故に、インプリントポリマーの飽和は、極めて迅速な速度論で達せされる。そのような効果は、この研究におけるPTSPA-インプリントポリマーの速い飽和に帰することができる。
【０２６４】
インプリントポリマー(PTSPAとTSPAの両方)の観察された加水分解活性は、天然のタンパク質分解酵素に匹敵する触媒プロセスを示した。タンパク質分解酵素により行われる反応は、標的基質を加水分解する場合に極めて迅速であることが知られている。加えて、初期に放出された生成物の量が、反応時間に対してプロットされた場合、初期バーストと呼ばれる直線が、初期反応中に得られた。酵素が、定常状態速度としても知られている安定な触媒速度に達する場合、グラフの形状は、直角双曲線になる。これは、Figure 10 (化46)中の生成物PNP (35)について得られるプロットで観察される。このようにして、インプリントポリマーは、トリプシンについて観察される典型的な触媒的特徴を生み出す実力があった。データから、触媒作用の速度、放出生成物の量と、基質に対するインプリントポリマーの親和性も決定することが可能であった。
【０２６５】
データ解釈のために使用されるミカエリス-メンテン速度論
酵素学の主要部分として、酵素により行われる化学反応の速度を、ミカエリス-メンテンプロットを使用することにより、速度論から決定することができる。テンプレートとしての遷移状態類似体に基づく、新たなアプローチの見本としてのインプリントポリマーは、トリプシンの酵素活性をまねるために調製されたことから、ミカエリス-メンテンプロットを適用して放出生成物PNP (35)についての関連する速度論的パラメーターを誘導し、基質Cbz-L-Lys-ONp.HCl (33)についてのインプリントポリマーの結合効率を特徴付けることが必要であった。ミカエリス-メンテンプロットから、インプリントポリマーの全体的な触媒活性を、下記の速度論的パラメーターを使用して決定することができる:
-  最大触媒速度(Vmax)は、ポリマーによる基質化合物の加水分解の最大速度を指し、μmol/mL/分で表される:
-  ミカエリス-メンテン定数(Km)は、Vmax値が、最大半量である場合の基質の濃度を表す。このようにして、この条件下では(Vmax/2)、触媒の半分が、基質と複合体形成され、観察される反応速度は、最大可能速度の半分である。基質に対する受容体の親和性は、一般に、会合定数または結合定数(Ka)により記載される。KmをKaと関連付けることにより、基質についての触媒の親和性を決定することができる。定義により、解離定数(Kd)は、Kmにとってのアナログである(15)。Kaは、Kdの逆プロセスであり、1/Kdとして表される。Kdは、Kmとほぼ類似していることから、同じルールを当てはめることができる(Ka=1/Km)。より低いKm値は、より高い結合親和性を示すが、Kmは、酵素が、ESが形成した後にその反応をいかに良く行うかの尺度でもあることから、Kaとは特徴的に異なることを留意することが重要である。触媒がいかに速く基質と相互作用するかを示す速度論的定数は、KaについてはkonおよびKdについてはkoffにより記載することができる。Kaは、kon/koffであることから、高いKaは、速いポリマー-基質相互作用を示す;
-  ターンオーバー数(kcat)は、単位ポリマー当たりの時間単位当たりの生成物に変換される基質分子の最大数を表し、この研究ではμmol/mL/分/ポリマーで表されるであろう、最後に
-  加水分解反応を行い、ポリマーが、いかに迅速にその触媒活性を行うかを決定することを可能にするポリマーの効率(kcat/Km)。kcat/Kmは、全体的な特異性または異なる基質に対するインプリントポリマーの優先度も示す。
【０２６６】
PTSPAおよびTSPA-インプリントポリマーによる加水分解の速度論
適切な測定単位(すなわち、μmol/mL)で、異なるインプリントポリマーおよび非インプリントポリマーとのCbz-L-Lys-ONp.HCl (33)のインキュベーション中の放出PNP生成物の量を定量化するため、Figure 11 (化47)に示されているような標準較正曲線を、PNP標準品を使用してプロットした。いかなるポリマーも存在しない場合の基質Cbz-L-Lys-ONp.HCl (33)の自発的加水分解は、ほとんどの場合に、たとえ延長された時間(すなわち、>100日)後でも、生成物PNP (35)の形成が検出されないことから、この検討では無視された。
【０２６７】
【化４７】
2013501108.tif 000052
【０２６８】
PTSPA-インプリントポリマーの触媒活性
すべてのポリマーの触媒活性を、4つの異なる濃度(1、2、3および4μmol/mL)の基質Cbz-L-Lys-ONp.HCl (33)を使用して検討した。PTSPA-インプリントポリマーおよび非インプリントポリマーによる(33)の加水分解後の放出生成物PNP (35)について構築されたミカエリス-メンテンプロットは、Figure 12 (化48)に示されている。プロットから、PTSPAインプリントポリマーの触媒速度は、23℃(I)と37℃(II)の両方においてPTSPA-非インプリントポリマーと比較して著しく高い。このようにして、この結果は、このインプリントポリマー内に作成される機能性空洞が、基質Cbz-L-Lys-ONp.HCl (33)を加水分解する高い能力を持っていたことの現れである。
【０２６９】
PTSPAポリマーについて得られる速度論的値は、Table 4 (表4)に示されている。これらのデータから、両温度における基質Cbz-L-Lys-ONp.HCl (33)の加水分解におけるPTSPA-インプリントポリマーの効力は、Vmax、Km、Ka、kcatおよびkcat/Km値により示されるように比較非インプリントポリマーより明らかに良かった。23℃において、PTSPA-インプリントポリマーについてのVmax値は、PTSPA-非インプリントポリマーより14倍超高かった。さらに、PTSPA-非インプリントポリマーと比較してPTSPA-インプリントポリマーの5倍高いKa (高い結合親和性)は、PTSPA-インプリントポリマー内の結合性空洞が、はるかに多く基質と結合することができることを確認した。37℃における平行触媒活性分析において、類似の触媒的傾向が見いだされ、PTSPA-インプリントポリマーのVmaxは、対応する非インプリントポリマーより9倍高く得られ、Kaは、3倍高かった。Km値から、インプリントポリマー-基質平衡、それ故に、高いKaは、著しく低い基質濃度において達したことは明らかである。したがって、基質分子に対するこのインプリントポリマーの結合強度は、非インプリントポリマーより著しく高かった。さらにこのインプリントポリマーにより達成される高いKa、それ故に、高いkonは、その非インプリントポリマーと比較して速い速度で基質と結合するこのポリマーの能力を立証している。
【０２７０】
【化４８】
2013501108.tif 000053
【０２７１】
【表４】
2013501108.tif 000054
【０２７２】
kcat値が、Vmaxの値と直接相関しているのは、基質を生成物に変換するポリマーの適性は、加水分解研究において使用されるポリマーの量当たりのVmaxの値に基づいているからである。結果として、23℃と37℃の両方におけるPTSPA-インプリントポリマーの生成物ターンオーバー(kcat)能力は、それぞれ非インプリントポリマーより14倍および9倍超高かった。
【０２７３】
PTSPA-インプリントポリマーのkcat/Kmは、23℃において非インプリントポリマーより74倍高く得られ、一方、この値は、反応が37℃において行われた場合に27倍高かった(PTSPA-非インプリントポリマーを上回るPTSPA-インプリントポリマー)。これらの結果は、基質を望ましい生成物に変換するこれらの新しいクラスのインプリントポリマーの例外的な触媒効率を例証する追加の確証である。酵素が関わる触媒作用活性は、反応が、異なる温度条件で行われる場合に影響を受けることが知られている。しかしながら、この原則に基づき、37℃におけるポリマーについての加水分解活性の性能は、Figure 13 (化49)中のVmaxの比(PTSPA-インプリントポリマー/PTSPA-非インプリントポリマー)から検証されるように、インプリントポリマーの触媒作用能力を低下させることが分かった。23℃における触媒速度は、37℃におけるより1.6倍超大きかった。それ故に、この結果は、熱の使用が、活性部位における機能性結合基の一部を歪めたことを示唆した。
【０２７４】
【化４９】
2013501108.tif 000055
【０２７５】
kcat/Kmの比(PTSPAインプリントポリマー/PTSPA非インプリントポリマー)により評価される加水分解効率の視点から、23℃におけるPTSPA-インプリントポリマーの加水分解性能は、37℃におけるより2.7倍有効であることも判明した。このようにして、これらの触媒速度評価に基づき、残りのポリマーによる加水分解活性評価は、23℃において行った。グリーンケミストリー原則のうちの1つは、周囲温度における反応の性能が、エネルギー関連の環境的および経済的な影響の最小化にとって重要な基準であることを述べている(16)。それ故に、23℃においてより良く行うためのPTSPA-インプリントポリマーの驚くべき能力は、このインプリントポリマーの潜在力がエネルギー効率の良い触媒として見なされることを示している。
【０２７６】
様々なTSPA-インプリントポリマーの触媒活性
上に例示されているように、様々なTSPAポリマーの合成は、異なる組成の架橋剤DVB (28)のモノマー4-VI (27)との重合前混合物を使用して達成された。様々なTSPAポリマーが関わるこの加水分解アッセイにおいて、ミカエリス-メンテンプロット(Figure 14 (化50))も、TSPA-1インプリントポリマーを除いて、それらの対応する非インプリントポリマーと比較してTSPA-インプリントポリマーについてより高い触媒速度を示した。
【０２７７】
【化５０】
2013501108.tif 000056
【０２７８】
【表５】
2013501108.tif 000057
【０２７９】
それらの対応する非インプリンポリマーと比較してTSPA-インプリントポリマーのより高い触媒速度能力を評価することを可能にする様々な速度論的パラメーターも決定された。Table 5 (表5)とFigure 15 (化50)の両方に示されるように、それらの対応する非インプリンポリマーを上回るTSPA-インプリントポリマーの触媒速度(Vmax)が、インプリントポリマーの合成において使用されるDVB (28)対4-VI (27) モノマーの比の増加に伴って比例的に改善されることは明らかであった。
【０２８０】
基質結合受容体が関わるKa値は、いかに効果的に受容体が基質と結合するかに左右される。一部の受容体は、それらの最大複合体形成に達するか、基質で完全に飽和されるために高い基質濃度を必要とすることがある。この研究において、様々なKm値を持つ最大反応速度は、自由溶液状態で起きることがあるものと異なる基質分子についてのポリマーの結合効率と共に、TSPA-1、-3および-4が関わるポリマーについては触媒作用反応のための基質濃度に左右された。Ka値に基づき、TSPA-非インプリントポリマーは、それらの対応するインプリンポリマーと比較して下記の順序TSPA-3>TSPA-1>TSPA-4で低い基質濃度(低いKm値)においてより高い基質結合傾向を有することが分かった。さらに、高いKa値は、これらの非インプリンポリマーの基質結合速度(kon)が、それらのインプリンポリマーより速かったことも示している。しかしながら、反応速度の場合、非インプリンポリマーは、評価されたVmaxまたはkcat値のようにそれらの対応するインプリンポリマーのいずれよりも明らかに有効でなかった。したがって、これらの結果は、非インプリントポリマー中の部位が、高い基質結合親和性を有することもあるが、それらの特異的基質切断部位の欠如によって、これらのポリマーがインプリントポリマーと同じように効果的に基質を生成物に変換することが不可能であることを示している。対照的に、基質分子で完全に複合体形成されるか飽和に達する対応するインプリントポリマーについては、相対的に高い基質濃度が必要とされた。このことは、結果として、それらのKm値をより高くした。
【０２８１】
【化５１】
2013501108.tif 000058
【０２８２】
結果から明らかなように、TSPAベースのポリマーの触媒活性は、架橋剤(DVB) (28)対モノマー、4-VI (27)比を重合プロセスにおいて増加させた場合に改善された。上に記載されているように、TSPA-1およびTSPA-2ポリマーのために使用された量に対するTSPA-3およびTSPA-4ポリマーにおいて使用された(DVB) (28)の量は、より高かった。同時に、触媒速度も改善され、TSPA-3およびTSPA-4インプリントポリマーについてのVmax値は、それらの対応する非インプリントポリマーより、それぞれ2.13および4.96倍高かった。それ故に、これらの値は、TSPA-3および-4非インプリントポリマーにおいて作成される結合部位が、比較インプリントポリマーにおいて形成されるものとかなり異なることを示している。
【０２８３】
たとえVmaxに関するかなりの触媒速度改善が、それらのそれぞれの非インプリントポリマーを上回ってTSPA-3およびTSPA -4インプリントポリマーで起きたとしても(Figure 15 (化51))、これらの値は、PTSPA-インプリントポリマーにより得られる値と比較してより低かった。PTSPA-インプリントポリマーとTSPA-インプリントポリマーは共に、官能基として組み入れられるイミダゾール部分で調製されたが、TSPAおよびPTSPAインプリントポリマーの空洞内に存在する触媒基の構造的特徴および機能性は異なる。
【０２８４】
PTSPA-インプリントポリマーの優れた触媒活性は、多くの因子に関して合理化することができる。例えば、ポリマー空洞において所定の配置および正しい配向でトリプシンのそれら(すなわち、Asp、HisおよびSer)を模倣するすべての必要な機能性部分の存在は、単一の活性基(すなわち、イミダゾール)を含有するに過ぎないTSPA-インプリントポリマーと比較してPTSPA-インプリントポリマーの例外的に高い触媒活性の理由として帰することができる。したがって、PTSPA-インプリントポリマーの加水分解活性は、天然酵素トリプシンの触媒機構とより密接に関連している。PTSPA-インプリントポリマーの増強された触媒活性についての他の可能性は、テンプレートが抽出された後に存在する触媒的に活性な部位の大きな数であったこととも考えられる。テンプレート抽出値が上で示しているように、PTSPA-インプリントポリマーから除去されるテンプレートの量は、いずれのTSPA-インプリントポリマーから除去される量と比較してもより高かった。したがって、この結果は、PTSPA-インプリントポリマーにおいて生成される空洞部位の数がより高いことの現れであり、このインプリントポリマーの増強された触媒能力を指摘している。PTSPA-インプリントポリマーの表面積および細孔容積も、TSPA-3および-4インプリントポリマーにおけるものより高かった。このようにして、PTSPA-インプリントポリマー中の接近可能な結合部位数は、より高かった。最後に、架橋剤のタイプも、このインプリントポリマーの高い触媒活性に効果があった可能性もある。PTSPAおよびTSPA-インプリントポリマーは、モノマーの機能性および重合手順に関して異なっていたが、PTSPA-インプリントポリマーの合成における架橋剤としてのEDMA (20)の使用は、PTSPA-インプリントポリマーの最適な触媒活性の恐らく別の理由であった可能性もある。したがって、EDMAを用いることにより、PTSPA-インプリントポリマーの製造は、優れた加水分解性能をもたらす活性な結合部位へのより良い基質接近性と共に達成することができる。これらの属性のすべての影響は、先行技術から予想することはできなかった。
【０２８５】
TSPA-インプリントポリマーの触媒活性に対するEDMAの影響
インプリントポリマーの全体的性能の最適化における鍵となる因子は、インプリントポリマー調製において使用される架橋剤のタイプの適切な選択である。架橋剤としてEDMA(20)を利用するTSPA-5ポリマーの調製を、DVB (28)ベースのTSPA-4ポリマーの調製のために使用されたのと類似したモノマー対架橋剤比(1対9)を使用して行った。TSPA-4ポリマーとTSPA-5ポリマーの両方についてのミカエリス-メンテンプロットおよび速度論的データは、それぞれFigure 16 (化52)およびTable 6 (表6)に示されている。
【０２８６】
Table 6 (表6)中の速度論的値(Vmaxまたはkcat)は、TSPA-5インプリントポリマーの触媒速度が、対応する非インプリントポリマーより13.4倍高いことを示している。これらの結果に基づき、TSPA-5インプリントポリマーは、TSPA-インプリントポリマーシリーズからの最も触媒として実力のあるポリマーである。例えば、TSPA-5のVmax比(インプリントポリマー/非インプリントポリマー)は、Figure 17 (化53)に示されているように、比較TSPA-4ポリマーより2.7倍大きい。
【０２８７】
大部分のTSPA-インプリントポリマーと同様に、TSPA-5インプリントポリマーも、KmおよびKa値から評価されるように、その対応する非インプリントポリマーよりかなり高い基質濃度において飽和されることが分かった。その強い結合親和性にもかかわらず、TSPA-5非インプリントポリマーは、基質から生成物変換に無効であったことは明らかである。このようにして、この結果は、効率的触媒作用が起こるためのポリマー中の特異的切断部位の重要性を立証する主要な因子でもある。
【０２８８】
【化５２】
2013501108.tif 000059
【０２８９】
【表６】
2013501108.tif 000060
【０２９０】
TSPA-5インプリントポリマーについてのKm値は、TSPA-5非インプリントポリマーについてより3倍超高かったが、そのkcat/Km値は、3.8倍高かった。それ故に、この結果は、このインプリントポリマーの触媒能力のより大きい証拠である。TSPA-4を上回るTSPA-5インプリントポリマーのより高い触媒速度(Vmax)は、架橋剤としてのEDMA (20)の使用に直接帰することができる。インプリントポリマーの合成における架橋剤DVB (28)の利用が有利であるのは、DVBが、化学的に安定で非加水分解性試薬であるからである。しかしながら、ポリマー柔軟性に関して、この研究においてTSPA-5インプリントポリマーにより達成された増強された触媒活性は、下記の特性を持つこのインプリントポリマーを製造するEDMA架橋剤の使用に帰することができる:
-  より良い柔軟性、それ故に、ポリマー内の基質物質移動速度の効率を高める;
-  明確な触媒部位または構造的により良く配置された機能性の結合性空洞。このことは、TSPA-4および-5ポリマーのVmax値を比較することによりさらに証明することができる。Table 6 (表6)中の値が示すように、TSPA-4非インプリントポリマーと比較して、TSPA-5非インプリントポリマーについての有意に低いVmax値が達成された。それ故に、このことは、起こったTSPA-5ポリマーによる基質の切断が、テンプレート分子により生成される特異的部位によるのが望ましくかつ達成されたことを立証している。
-  ポリマー(グラム)当たりのより高い表面積。前に記載されているように、ポリマー1単位当たりの高い表面積は、ポリマーの接近性を改善する。BETアッセイから、TSPA-4ポリマーとTSPA-5ポリマーの間の独特の物理的特性の差は明らかであり、TSPA-5ポリマーは、より高い表面積とポリマー(グラム)当たりの細孔容積の両方を保有している。このようにして、この特徴は、より良い触媒性能を示すTSPA-5インプリントポリマーにとっての主要な因子でもあり、最後に
-  大量のテンプレート除去によるTSPA-4インプリントポリマーと比較したTSPA-5中の結合部位のより大きな数。このことは、結果として、このインプリントポリマー中の利用可能な活性切断部位の量を増加させた。
【０２９１】
【化５３】
2013501108.tif 000061
【０２９２】
その非インプリントポリマーと比較したTSPA-5インプリントポリマーの触媒活性は、架橋剤EDMA(TSPA-5インプリントポリマー)の利用により改善されたが、この研究における触媒活性データは、PTSPA-インプリントポリマーが、より良いポリマー触媒であることを明確に証明した。このようにして、その空洞内のすべての官能基の存在とは別に、TSPA-インプリントポリマーと比較してPTSPA-インプリントポリマーの優れた触媒能力は、PTSPA-インプリントポリマーの合成において使用される新規なインプリンティング手順にさらに帰することができるということを結論づけることができる。このようにして、共有結合重合技法は、非共有結合重合手順により達成される複数のまたは不均一な部位と比較してより一様な(均一な)結合部位を持つ空洞をもたらすように見える。このようにして、共有結合重合アプローチにより生成される空洞は、この場合、触媒作用により適していることがある。この仕事において、共有結合インプリンティング技法で調製されるPTSPA-インプリントポリマーで得られるより高い触媒速度は、これらの主張と一致した。
【０２９３】
それらの加水分解および触媒性能におけるポリマーの多孔性および表面積の効果
BETデータが示したように、インプリントポリマーとそれらの対応する非インプリントポリマーの間の表面積かまたは多孔性に有意差は見いだされなかった。したがって、この結果は、明らかに得られるインプリントポリマーの触媒活性が、インプリントポリマーおよび非インプリントポリマーの形態学的特性自体よりむしろテンプレートのインプリンティング効果の結果であることを示した。しかしながら、架橋剤のタイプおよび量の効果を、得られたポリマーの触媒活性と比較することにより、良好な相関関係が得られた。例えば、EDMA (20)ベースのインプリントポリマー(PTSPAおよびTSPA-5ポリマー)は、ポリマー(グラム)当たりのより高い表面積およびより高い多孔容積を有し、DVB (28)で調製したポリマーと比較してそれらのより良い触媒性能と関連していることが判明した。このことは、ポリマーの粒子当たりで高い表面積または大きな細孔容積を有することが、基質に接近可能なポリマー中の活性部位の数を増強することを示した。結果として、これらのインプリントポリマーにより切断される基質の量は増加した。DVBで調製したポリマーの場合、表面積および多孔性は、特に、より高い割合のDVBで調製されたTSPA-4ポリマーについて、より低いことが判明した。しかしながら、TSPA-4インプリントポリマーは、Vmax値から評価されるように、より低い量のDVBで調製され、高い表面積および多孔性も保有するTSPA-インプリントポリマー(すなわち、TSPA-1または2)と比較してより良い触媒であった。したがって、ポリマー間の物理的特性差は、得られたインプリントポリマーの触媒活性における架橋剤の影響を示した。TSPAポリマーの調製において使用されるDVBの量により変化した多孔性効果は、特に、TSPA-非インプリントポリマーとの関連で証明された。DVBを増加させると、TSPA-非インプリントポリマー(すなわち、TSPA-4非インプリントポリマー)の多孔性は低下した。結果として、非特異的結合部位へのこのTSPA-4非インプリントポリマーの接近性は低下した。
【０２９４】
インプリントポリマーの触媒速度増強におけるTSAテンプレートの評価
テンプレートを合成するための構造モデルとしてのTSAテンプレートは、本発明開示に記載されている触媒的インプリントポリマーの調製のために開発された。TSA有機リンテンプレートベースのインプリントポリマーの独特のかつ驚くべき触媒適性は、インプリントポリマーが合成された様式の直接的結果と考えられる。本発明開示に記載されている研究において、TSAテンプレートの構造配置は、基質のGSに関連するTSAテンプレートより基質の4面体TSとより相関性のあることが判明した。したがって、触媒インプリントポリマーを合成するための幾何的に4面体のTSテンプレートの必要性が実証され、幾何的に平面のテンプレートを持つ比較インプリントポリマーの調製が達成された。この理由から、GSCA-インプリントポリマーの合成は、幾何的に平面のテンプレート(3)、および架橋剤としてのEDMAを利用して行われた。EDMAの選択は、TSPA-5インプリントポリマーの加水分解活性により証明されたようなより良い触媒活性を持つインプリントポリマーを製造するその能力の理由から行われた。GSCA-インプリントポリマーによる基質Cbz-L-Lys-ONp.HCl (33)の加水分解は、PTSPAおよびTSPA-インプリントポリマーの加水分解活性研究のために使用されたものと類似した加水分解手順を使用して行った。
【０２９５】
Figure 18 (化54)中のグラフは、GSCA-インプリントポリマーが、テンプレート除去研究により立証されているように、TSPA-5インプリントポリマーより多くの利用可能な活性部位を有していたにもかかわらず(Table 2 (表2)を参照)、TSPA-5インプリントポリマーと比較してGSCA-インプリントポリマーのより低い触媒速度の典型的なミカエリス-メンテンプロットを示している。Table 7 (表7)中のデータが示すように、TSPA-5インプリントポリマーの最大触媒速度(Vmax)は、GSCA-インプリントポリマーのそれより5倍超高いことが判明した。このようにして、この結果は、有機リンベースのテンプレートを使用する4面体TS実体により作成される空洞部位が、TSPA-5インプリントポリマーの高い触媒速度の主要な理由であったことの強力な証拠である。kcat/Kmに関して、TSPA-5インプリントポリマーは、GSCA-インプリントポリマーと比較してTSPA-5インプリントポリマーについて得られる相対的に高いKm値によってあまり効率的でなかった(GSCA-インプリントポリマーより1.18倍低い)。しかしながら、Vmax結果に基づき、この研究は、触媒として有効なインプリントポリマーを調製するためのテンプレートとしてのTSA(すなわち、テンプレート(2))の重要性を証明した。
【０２９６】
【化５４】
2013501108.tif 000062
【０２９７】
得られた結果は、触媒として有効なインプリントポリマーの製造における、相補的TS幾何学を持つ空洞を作成するためのホスホネートベースのテンプレートの重要性を示している。4面体ホスホネート化合物のTSA方法を使用するTSPA-5インプリントポリマーについて実証された優れた触媒効率は、基質中のカルボニル部分に対するかまたは生成物中のホスホネートテンプレートの構造的相違に起因する。対照的に、平面のカルボン酸テンプレートは、基質Cbz-L-Lys-ONp.HCl (33)に対する構造的幾何学類似性を有し、GSCA-インプリントポリマーについて得られる小さなVmaxは、触媒プロセス中の一部の加水分解阻害の結果であったとも考えられる。TSPA-5インプリントポリマーとGSCA-インプリントポリマーが共に、2項に記載されているようなポリマーの単位当たりの類似した表面積および多孔性を有することは強調する価値がある。したがって、これらのポリマーにより得られる触媒活性は、インプリントポリマーの物理的特性の差よりはむしろインプリントポリマー中に作成される構造的空洞の直接的な結果である。
【０２９８】
【表７】
2013501108.tif 000063
【０２９９】
4)インプリントポリマーの選択性の評価
【０３００】
【化５５】
2013501108.tif 000064
【０３０１】
この検討については、N-(ベンジルオキシカルボニル)-D-フェニル-アラニンp-ニトロフェニル(Cbz-D-Phe-ONp) (36)を、スキーム10 (化55)に示されているように潜在的に加水分解されることがある非標的基質として使用した。
【０３０２】
Cbz-D-Phe-ONp (36)のような基質は、フェニルベースの残基に対するこの酵素の選択性によってバルク液体状態で酵素キモトリプシンにより容易に加水分解することができる。したがって、基質Cbz-D-Phe-ONp) (36)の使用は、インプリントポリマーの基質選択性の程度が証明されることを可能にした。基質(36)の加水分解評価は、実験の項に記載されているように、基質Cbz-L-Lys-ONp.HCl (33)の加水分解において使用されたものに類似した加水分解手順に従って行った。
【０３０３】
切断生成物の同定および特徴付け
Figure 19 (化56) (IIIおよびIV)中のクロマトグラムプロファイルが示すように、PTSPA-インプリントポリマーと共に非標的基質Cbz-D-Phe-ONp (36)をインキュベートした後の切断PNP (35)の量は、TSPA-インプリントポリマー(例えば、TSPA-2インプリントポリマーFigure 19 (化56) (IV))と比較して明らかにわずかであった。
【０３０４】
【化５６】
2013501108.tif 000065
【０３０５】
たとえ基質を30分にわたってPTSPA-インプリントポリマーと共にインキュベートしても、多量の切断PNP (35)は検出されなかったFigure 19 (化56) (III)。それ故に、この結果は、PTSPA-インプリントポリマー内に形成される空洞部位が、極めて特異的であり、顕著な基質選択性を持ち、一方、非標的基質(36)の収容および切断に適している部位数は、極めてわずかであったことを示している。
【０３０６】
加水分解反応の速度論的評価
非標的基質Cbz-D-Phe-ONp (36)についてのインプリントポリマーの触媒活性は、Figure 20 (化57)に描かれているような典型的なミカエリス-メンテンプロットで表される。これらのプロットから、PTSPA-インプリントポリマーについて得られる触媒速度は、TSPAインプリントポリマーと比較して無視できるほどであったことは明らかである。このようにして、この結果は、この非標的基質(36)についてのPTSPA-インプリントポリマーの触媒能力が無効であったことを示した。この結果は、Table 8 (表8)に示されているような関連する速度論的パラメーターによってもさらに裏付けられる。
【０３０７】
【化５７】
2013501108.tif 000066
【０３０８】
Table 8 (表8)中のデータが示すように、非標的基質Cbz-D-Phe-ONp (36)を加水分解するPTSPA-インプリントポリマーのVmaxおよびkcat値は、それぞれ0.02μmol/mL/分および0.4×10-3μmol/mL/分/mgに過ぎなかった。さらにKm値から、基質(36)によるこのインプリントポリマーの飽和は、より高い基質濃度において起きたことは明らかである。加水分解研究において使用される基質濃度にもかかわらず、このインプリントポリマーの結合親和性は、Ka値から決定することができるように極めて低かった。それ故に、これらの結果は、この基質に対するPTSPA-インプリントポリマーの弱い結合親和性の極めて重要な証拠であった。さらに、PTSPA-インプリントポリマーについて得られるkcat/Km量(0.13×10-3分/ポリマー(mg))は、この基質についてのインプリントポリマーの弱い効率を立証する主要な因子である。
【０３０９】
TSPA-インプリントポリマーが関わる平行触媒作用研究において、非標的基質についてのこれらのインプリントポリマーの触媒特性の特徴付けを可能にする多様な速度論的値が得られた。Figure 20 (化57)中のプロットおよびTable 8 (表8)中の速度論的値から、TSPA-インプリントポリマーの中でTSPA-3インプリントポリマーの触媒速度が最も低く、基質Cbz-D-Phe-ONp (36)についてのこのインプリントポリマーの弱い触媒効力を立証している。TSPA-3インプリントポリマーのVmaxおよびkcat/Km値は、TSPA-2インプリントポリマーについて達成されるものより、それぞれ1.81および1.40倍低かった。TSPA-2インプリントポリマーと比較して非標的基質についてのTSPA-3インプリントポリマーのより低い触媒速度は、その調製における過剰のDVBの使用(TSPA-2インプリントポリマーの合成において使用される量より1.67倍高い)に起因し、結合部位の構造的完全性を指している。その低い触媒速度値にもかかわらず、TSPA-3インプリントポリマーが、TSPA-2インプリントポリマーと比較して相対的に低い基質濃度において高いKa値(低いKm値から決定することができるように)を有することに注目するのは興味深い。TSPA-2インプリントポリマーより低い基質濃度において飽和されることになるTSPA-3インプリントポリマーについて、その非標的基質との結合性会合は、より強かったに違いない。これが起こるためには、TSPA-3インプリントポリマー中の非特異的結合部位の構造配置は、TSPA-2インプリントポリマーとは違って、切断より基質(36)結合に適している方法で形成されたに違いない。TSPA-2インプリントポリマーについて得られる高いKm値は、この基質によるこのインプリントポリマーの飽和、それ故に、最大Kaが、他のインプリントポリマーより高い基質濃度において起きることを示した。
【０３１０】
【表８】
2013501108.tif 000067
【０３１１】
TSPA-4インプリントポリマーが関わる別の速度論的分析において、異なる結果が見いだされた。このインプリントポリマーは、TSPA-2および-3インプリントポリマーと比較して過剰の架橋剤で調製されたが、低い基質濃度において高い結合親和性で驚くほど高い触媒速度(Vmax)が得られた。Table 8 (表8)中の値が示すように、TSPA-4インプリントポリマーについてのVmax値は、TSPA-2およびTSPA-3インプリントポリマーより、それぞれ1.38および2.50倍高く得られた。さらに、その高いkcat値と組み合わせたその極めて低いKm値(1.61μmol/mL)は、すべての評価されたインプリントポリマーの中で最も高い値(8.07×10-3分/ポリマー(mg))でTSPA-4インプリントポリマーの得られた効率(kcat/ Km)を取得させた。前に解明されたように、インプリントポリマーの合成におけるモノマーに対するより高い量の架橋剤の利用は、インプリントポリマー内に高度に規定された空洞を生成すると予想される。このようにして、TSPA-4インプリントポリマーの合成において使用される架橋剤の量を考慮すると、非標的基質Cbz-D-Phe-ONp (36)についてのその触媒活性は、TSPA-2および-3インプリントポリマーと比較してより低いことが予想された。このようにして、この結果は、高い割合の架橋剤の使用にもかかわらず、このTSPA-4インプリントポリマー中の基質(36)切断に利用可能な非特異的部位の数が、TSPA-2およびTSPA-3インプリントポリマー中のそれらより高いことを示した。
【０３１２】
異なるタイプの架橋剤で調製されるポリマーによる非標的基質(36)の加水分解が関わるさらなる研究において、注目すべき触媒活性差も見いだされた。この評価は、それぞれ架橋剤DVB (28)および(EDMA) (20)を使用して調製されるTSPA-4およびTSPA-5インプリントポリマーの触媒速度を比較した。上に示されているように、これらのインプリントポリマーは、同じ架橋剤対モノマーモル比(9対1)で調製された。しかしながら、触媒速度に関して、Figure 21 (化58)に示されるように、およびTable 9 (表9)中のデータから、TSPA-5インプリントポリマーは、TSPA-4インプリントポリマーと比較してこの非標的基質についての触媒効力は低く、TSPA-5インプリントポリマーのVmax値とkcat値は共に、28倍低かった。さらに、この基質(36)についてのこのインプリントポリマーの触媒効率は、kcat/Km値から評価されるように、比較TSPA-4インプリントポリマーより8.5倍低かった。
【０３１３】
【化５８】
2013501108.tif 000068
【０３１４】
【表９】
2013501108.tif 000069
【０３１５】
この加水分解研究における異なるTSPA-インプリントポリマーの使用にもかかわらず、様々な速度論的値により説明されるように、PTSPA-インプリントポリマーは、いずれのTSPA-インプリントポリマーと比較しても非標的基質(36)にとって最も触媒として無効なポリマーであったことが立証された。Figure 22 (化59)が示すように、PTSPA-インプリントポリマーの触媒速度は、たとえTSPA-インプリントポリマーのシリーズから触媒として最も有効でないTSPA-3インプリントポリマーと対比した場合でも13倍低いVmax値でこの基質(36)についてはより小さかった。このようにして、この結果は、PTSPA-インプリントポリマーにおいて生成される機能性の結合性空洞が、非標的基質を収容し、続いて、それを加水分解することにあまり適合していなかったことの強力な証拠である。
【０３１６】
この研究から、構造的に異なる非標的基質(36)についてのインプリントポリマーの触媒活性が異なったことは明らかである。しかしながら、インプリントポリマーの選択性を決定するためには、触媒速度および効率に関するそれらの特徴付けは不可欠であった。この分析は、標的リシンベースの基質(33)について得られる様々な速度論的値を非標的フェニルアラニンベースの基質(36)について得られるそれと比較することにより達成された。
【０３１７】
【化５９】
2013501108.tif 000070
【０３１８】
インプリントポリマーの触媒選択性の評価
ミカエリス-メンテンプロット(Figure 23 (化60))に基づく選択性評価は、非標的基質Cbz-D-Phe-ONp (36)と比較した標的基質Cbz-L-Lys-ONp.HCl (33)についてのインプリントポリマーの触媒優先性と共に、独特の高い触媒速度を示した。このようにして、これらのインプリントポリマー内に作成される空洞は、効果的に達成されることになる得られる高い触媒速度にとって、標的基質(33)のサイズおよび形状との構造的相補性を持つ基質にとって極めて選択的であった。
【０３１９】
Table 10 (表10)およびFigure 24 (化61)に示されるような標的リシンおよび非標的フェニルアラニン基質のVmax値の比(Cbz-L-Lys-ONp.HCl (33)/Cbz-D-Phe-ONp (36))に基づき、TSPA-インプリントポリマーと比較したPTSPA-インプリントポリマーの選択性は、より大きかった。上で強調されているように、インプリントポリマーの触媒ターンオーバー速度(kcat)評価は、使用されるポリマーの量当たりのVmaxの値に基づいた。結果として、標的基質Cbz-L-Lys-ONp.HCl (33)を予想生成物PNP (35)に変換するPTSPA-インプリントポリマーのターンオーバー速度は、基質Cbz-D-Phe-ONp (36)についてのそれより146倍高かった。さらに、kcat/Km値から評価されるような標的基質についてのPTSPA-インプリントポリマーの761倍高い触媒効率は、このインプリントポリマーの顕著な特異性ばかりでなく、非標的基質(36)を上回る優先性における標的基質(33)についてのその極めて迅速な触媒効力も証明した。
【０３２０】
【化６０】
2013501108.tif 000071
【０３２１】
標的基質についてのPTSPA-インプリントポリマーの結合親和性は、非標的基質と比較して有意に強い(Ka=5.15倍)ことが分かった。さらに、より低いKm (Km=5分の1)値は、標的基質によるPTSPA-インプリントポリマーの飽和が、非標的基質によるより比較的低い濃度において起こることを示した。それ故に、このインプリントポリマーは、標的基質を触媒する時により有効であった。
【０３２２】
TSPAポリマーから、TSPA-3インプリントポリマーは、最も基質選択的触媒であることが判明した。Table 10 (表10)中の値が特定したように、標的基質(33)についてのTSPA-3の触媒速度(Vmax)は、非標的基質(36)より20倍高く、標的基質についてのこのインプリントポリマーの高い優先性を証明した。類似の分析に基づき、標的基質についてのTSPA-2、TSPA-4およびTSPA-5インプリントポリマーの触媒速度(選択性)は、非標的基質(36)についてより、それぞれ8.15、4.05および4.57倍高かった。TSPA-インプリントポリマーは、選択性効率(kcat/Km)値から評価されるように標的基質についての相当の優先性を示したが、これらの値は、対応するVmax値と比較した場合に変化した。例えば、Vmax値に基づき、TSPA-3インプリントポリマーは、最も選択的なインプリントポリマーであった。しかしながら、kcat/Km値によれば、このインプリントポリマーは、標的基質について最も低い選択性であった。この1つの理由は、選択性効率(kcat/Km)を計算する場合に得られかつ使用されるKmの変動する値であった可能性もある。したがって、唯一のパラメーター、優先的に、Vmaxを使用してTSPA-インプリントポリマーの選択性を示すことが好ましいのは、その値が、Kmデータに左右されないからである。
【０３２３】
【表１０】
2013501108.tif 000072
【０３２４】
【化６１】
2013501108.tif 000073
【０３２５】
上で注目されているように、対応する非インプリントポリマーと比較したTSPA-インプリントポリマーの触媒活性は、インプリントポリマーの合成において使用される架橋剤DVB (28)の量と比例して増加することが判明した。しかしながら、この選択性分析において、Vmax値は、TSPA-インプリントポリマーが標的基質(33)に対する最大の選択性を有するためには、重合手順において使用される架橋剤DVBの量が、ある量に保たれることを必要とすることを示した。インプリントポリマーの合成におけるより高い含有量のDVBの利用は、非標的基質(36)を加水分解する場合にかなり高い触媒速度活性を持つインプリントポリマーをもたらし、それ故に、その基質選択性を低下させた。
【０３２６】
TSPA-4インプリントポリマーと比較して改善されたTSPA-5インプリントポリマーの選択性は、架橋剤EDMAの使用に直接帰することができる。以前に論議されたように、より高いポリマー(グラム)当たりの表面積を保有するインプリントポリマーへの基質接近性は、より高いことが予想される。しかしながら、この研究において、TSPA-インプリントポリマー、特に、TSPA-3および-4インプリントポリマーと比較してより高い表面積を有するにもかかわらず、架橋剤EDMAで調製されるPTSPA-インプリントポリマーの特異性は、より高いことが判明した。それ故に、この結果は、たとえPTSPA-インプリントポリマーの機能性結合部位の接近性が高くても、非標的基質(36)についてのその触媒効果は、極めて小さいことを示した。同様に、架橋剤EDMAで調製されるTSPA-5インプリントポリマーは、VmaxおよびKcat/Km値が示したように、比較TSPA-4インプリントポリマーと比較してより高い表面積およびより良い基質特異性を有していた。特にPTSPA-インプリントポリマーにより示される顕著な選択性は、これらのインプリントポリマー内に作成される空洞が、インプリントポリマーの空洞のサイズおよび形状と構造的に適合する基質のみを収容するように十分に規定されていることを示した。PTSPAインプリントポリマーおよびTSPA-5インプリントポリマーの増強された選択性は、架橋剤EDMAの使用に大部分を帰することができる。
【０３２７】
TSPA-3インプリントポリマーは、すべてのTSPA-インプリントポリマーのうちで最高の選択性を示したが、その基質識別能力は、それぞれVmaxおよびKcat/Km値から判断されるように、PTSPA-インプリントポリマーより7および16倍低かった。それ故に、TSPA-インプリントポリマーについて達成されるより低い基質選択性は、TSPA-インプリントポリマーが、生成物PNP (35)の続く放出のために非標的基質Cbz-D-Phe-ONp (36)を捕捉および収容しやすいことの現れであった。
【０３２８】
TSPA-インプリントポリマーは、テンプレートに関して過剰量の機能性モノマーを利用して調製された。それ故に、非選択的結合部位の存在により引き起こされるTSPA-インプリントポリマーの低い選択性の一因となる1つの主要因子であった可能性もある。したがって、PTSPA-インプリントポリマーの例外的に高い選択性の鍵となる理由は、共有結合インプリンティングアプローチを通じて達成されるポリマーマトリックス中のより良い結合部位の確立であると考えられた。この推定に基づき、TSPA-インプリントポリマー内に生成される特異的結合部位の数は、極めて低かったことは明らかである。したがって、このことは、PTSPA-インプリントポリマーと比較したTSPA-インプリントポリマーのより弱い触媒活性の1つの理由の可能性もある。
【０３２９】
5)実験的テンプレート合成
一般手順
融点は、SMP3 (Midland、ON、Canada)融点測定装置を使用して記録した。
【０３３０】
マイクロ波オーブン試料は、Smith SynthesiserまたはBiotage Milestone Microsynth HPR3600 (Uppsala、Sweden)マイクロ波を使用して合成した。反応は、密封石英容器中で行った。
【０３３１】
核磁気共鳴(NMR)分光学試料は、AC 200、DPX 300およびDRX 400 Bruker Biospin P/L (Sydney、Australia)分光計を使用して分析した。すべての1H NMRスペクトルは、200、300または400MHzの動作周波数で記録し、結果は、XWINNMR 3.5ソフトウェアを使用して処理した。スペクトルは、一般的に、特に指定のない限り、内部標準(0.00p.p.m.)としてのテトラメチルシラン(TMS)と共にジューテロクロロホルム(CDCl3)溶液として実行した。各共鳴は、p.p.m.、多重性、カップリング定数(J Hz)、およびプロトン数で、測定される参照ピーク(化学シフト(δ))に対して報告した。多重性の割当ては、(s)一重線、(d)二重線、(t)三重線、(q)四重線、または多重線(m)として示され、適切な場合に(b)幅広い、が前に付けられる下記の慣習に従った。13C NMRスペクトルは、動作周波数50、75および100MHzで記録した。31P NMRスペクトルは、動作周波数121MHzで記録し、外部標準としてのリン酸(H3PO4、80%)を基準とした。
【０３３２】
分析用高速液体クロマトグラフィー(HPLC)は、Agilent 1100 DAD Detector (220、300および375nmにおける吸光度を測定する)を備えたAgilent 1100 Series (Agilent Technologies、Waldbronn、Germany)高速液体クロマトグラフィー機器で行った。試料分析のための流速およびシステム温度は、それぞれ1mL/分および25℃とした。試料分析は、4.6×150mm内径(i.d.)のZorbax RP C-18カラムおよびLuna Phenyl-Hexyl (Phenomenex、5μm)、4.6×150mm i.d.カラムを使用して行った。すべてのシステム制御およびデータ収集は、Agilent 2D ChemStationソフトウェアで行った。
【０３３３】
低分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)は、正イオンモードまたは負イオンモードで記録した。電子衝撃イオン化(EI)スペクトル(m/z)は、Hewlett Packard Trio-1分光計および検出器(Palo alto、CA、USA)で記録した。マイクロマスプラットフォームMSは、コーン電圧35eVで200℃において動作させた。M+またはM-は、分子イオンを示す。
【０３３４】
精密質量または高分解能-質量分析測定(HR-MS)は、メタノール(CH3OH)中で行い、高分解能の分析用エレクトロスプレー源を備え、ヨウ化ナトリウムクラスターを使用して較正されたBruker BioApex 4.7 Tesla FT-ICR (Billerica、MA、USA)機器かまたは参照質量補正付きのAgilent G1969A LC-TOFシステムおよびAgilent 1100 Series LCで記録した。
【０３３５】
分析用液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)は、Gilson 215/819インジェクターモジュール、306グラジエントポンプ、およびAgilent 1100ダイオードアレイ検出器を備えたGilson (Middleton、WI、USA)機器で行った。分子は、200〜500nmのUV照射およびMicromass (Manchester、UK) ZMD質量分析計で検出した。ソースへの吸い込み流は、フロスプリッターで制限し(100μL/分)、機器全体は、Mass Lynx v3.5ソフトウェア(Micromass)により制御した。
【０３３６】
ガスクロマトグラフィー-質量分析(GC-MS)は、スプリットモードで、Agilent 6890 GC (Agilent Technologies、Waldbronn、Germany)、MSD-Agilent 5973、キャピラリーカラムタイプHP-5MS (30m×250μm×0.25μm)付きオートインジェクター-7683を使用して行った。
【０３３７】
微量分析は、Campbell Microanalytical Laboratory、University of Otago (Dunedin、New Zealand)により行った。
【０３３８】
赤外スペクトル(IR)は、液膜としてBruker Equinox 55 (Billerica、MA、USA)で記録した。赤外は、s (強い)、m (中程度)またはw (弱い)として指定され、適切な場合にb (幅広い)が前に付けられる吸収の強度(νmax)と共に波数(cm-1)で記録した。
【０３３９】
薄層クロマトグラフィー(TLC)は、UV光による検出でシリカゲル60 F-254 (Merck、Darmstadt、Germany)プレートで行った。化合物の検出は、254nmにおけるUV光とした。
【０３４０】
フラッシュカラムクロマトグラフィーは、Merckシリカゲル(Merck、Darmstadt、Germany) 60、0.063〜0.200mm (230〜240メッシュ)を使用して行った。溶離液混合物は、容積対容積比(v/v)として表される。
【０３４１】
クーゲルロール蒸留は、高真空ポンプに接続されたBuchi GKR-50バルブツーバルブ装置を使用して行った。
【０３４２】
溶媒および試薬
すべての溶媒は、試薬級であり、購入したまま使用した。無水溶媒が必要とされた場合には、標準的な精製および乾燥技法を適用した。テトラヒドロフラン(THF)は、窒素下でベンゾフェノンおよびナトリウムワイヤー上で蒸留し、4Åモレキュラーシーブ上で保存した。ジクロロメタン(CH2Cl2)およびトルエンは、水素化カルシウムから蒸留し、4Åモレキュラーシーブ上で保存した。CH3OHは、4Åモレキュラーシーブ上で保存した。トリエチルアミン(TEA)は、4Åモレキュラーシーブ上で保存した。ジエチルエーテル(Et2O)は、ナトリウムワイヤー上で保存し、使用に先立って新鮮なナトリウムワイヤーおよびベンゾフェノンから蒸留した。
【０３４３】
5-フタルイミド-1-ペンタノール(8)の合成
【０３４４】
【化６２】
2013501108.tif 000074
【０３４５】
5-アミノ-1-ペンタノール(1.00g、9.7mmol)を、無水フタル酸(1.44g、9.7mmol)と混ぜ、マイクロ波オーブン中で150℃にて5分にわたって照射した。反応混合物を真空中で乾燥すると、黄色の粘稠な油として生成物5-フタルイミド-1-ペンタノール(8)が得られた(2.26g、100%)。
1H NMR (300MHz, CDCl3): δ 1.36〜1.47 (m, 2H, H3)、1.58〜1.80 (m, 4H, H2およびH4)、3.63 (t, J 6.5Hz, 2H, H1)、3.69 (t, J 7.2Hz, 2H, H5)、7.69〜7.73 (m, 2H, Pht)、7.82〜7.85 (m, 2H, Pht)。
13C NMR (50MHz, CDCl3): δ 18.50 (C3)、24.18 (C4)、34.27 (C2)、31.89 (C5)、56.18 (C1)、117.14、125.99、127.96 (Pht)、165.32 (CO)。
HR-MS (ESI+) 実測値: m/z 234.1129 C13H16NO3 (M+H)+の計算値は234.1130であり、実測値m/z 256.0950 C13H15NO3Na (M+Na)+の計算値は256.0950。
【０３４６】
5-フタルイミド-1-ペンタナール(9)の合成
【０３４７】
【化６３】
2013501108.tif 000075
【０３４８】
方法1  還流冷却器を備えた100mLの丸底フラスコ中で、クロロクロム酸ピリジニウム(PCC) (1.85g、8.6mmol)を、無水CH2Cl2 (12mL)に懸濁した。無水CH2Cl2 (3mL)中の5-フタルイミド-1-ペンタノール(8) (1.00g、4.3mmol)を、PCCの撹拌した黄色の混合物に一度に加え、1.5時間にわたって23℃にて撹拌した。混合物に乾燥エチルエーテル(12mL)を加えた後、クロム塩を、黒色のタルトガム(tart gum)として沈殿させ、不溶の残渣を、Et2O (2×10mL)で洗浄した。Et2O溶液を混ぜ合わせ、次いで、溶離液として乾燥Et2Oを使用してシリカゲルの短いパッドを通過させた。溶媒を、減圧下でロータリーエバポレーターにより蒸発させ、5-フタルイミド-1-ペンタナール(9)を、無色の粘稠な油として得た(0.36g、36%)。
1H NMR (300MHz, CDCl3): δ 1.66〜1.79 (m, 4H, H3およびH4)、2.54 (t, J 6.3Hz, 2H, H2)、3.74 (t, J 7.8Hz, 2H, H5)、7.70〜7.76 (m, 2H, Pht)、7.82〜7.88 (m, 2H, Pht)、9.78(s, 1H, CHO)。
【０３４９】
方法2  還流冷却器を備えた100mLの丸底フラスコ中で、PCC (1.85g、8.6mmol)を、無水CH2Cl2 (12mL)に懸濁した。無水CH2Cl2 (3mL)中の5-フタルイミド-1-ペンタノール(8) (1.00g、4.3mmol)を、PCCの撹拌した黄色の混合物に一度に加え、1.5時間にわたって還流状態で加熱した。混合物に乾燥エチルエーテル(12mL)を加えた後、クロム塩を、黒色のタルトガムとして沈殿させ、不溶の残渣を、Et2O (2×10mL)で洗浄した。Et2O溶液を混ぜ合わせ、次いで、溶離液として乾燥Et2Oを使用してシリカゲルの短いパッドを通過させた。溶媒を蒸発させ、5-フタルイミド-1-ペンタナール(9)を、無色の粘稠な油として得た(0.46g、46%)。
1H NMR (300MHz, CDCl3): δ 1.65〜1.76 (m, 4H, H3およびH4)、2.48 (t, J 6.3Hz, 2H, H2)、3.68 (t, J 7.8Hz, 2H, H5)、7.67〜7.71 (m, 2H, Pht)、7.80〜7.96 (m, 2H, Pht)、9.73 (s, 1H, CHO)。
13C NMR (50MHz, CDCl3): δ 18.58 (C3)、24.10 (C4)、34.43 (C5)、40.41 (C2)、127.26, 136.86, 138.92 (Pht)、168.43 (CO)、201.90 (C1)。
MS (ESI+) m/z 232.1 (M+H)+。
【０３５０】
ジフェニル-(1-(N-ベンジルオキシカルボニルアミノ)-5-フタルイミド)ペンチルホスホネート(12)の合成
酢酸(4mL)を、(9) (0.35g、1.5mmol)、亜リン酸トリフェニル(0.31g、1.0mmol)およびカルバミン酸ベンジル(0.15g、1.0mmol)の混合物に加えた。溶液を、1時間にわたって85〜90℃にて撹拌した。次いで、溶媒および副成物(フェノールとして)を、沸騰水浴中でロータリーエバポレーターを使用して除去した。赤褐色の油状残渣をCH3OHに溶かし、-20℃にて一夜にわたって放置した。ジフェニル-(1-(N-ベンジルオキシカルボニルアミノ)-5-フタルイミド)ペンチルホスホネート(12)が白色の固体として得られ、濾過により集めた(0.24g、40%)。
【０３５１】
【化６４】
2013501108.tif 000076
【０３５２】
TLC Rf=0.8 CHCl3/CH3OH (9:1、v/v)。
融点  111〜114℃。
1H NMR (200MHz, CDCl3): δ 1.42〜1.97 (m, 6H, H2-H4)、3.62 (t, J 7.8Hz, 2H, H5)、4.33〜4.54 (m, 1H, H1)、4.95〜5.24 (m, 3H, CbzのCH2およびNH)、7.04〜7.30 (m, 15H, Ar-H)、7.63〜7.69 (m, 2H, Pht)、7.74〜7.84 (m, 2H, Pht)。
31P NMR (121.5MHz, CDCl3): δ 17.91 (s)。
MS (ESI+) m/z 599.3 (M+H)+。
【０３５３】
ジメチル-(1-(N-ベンジルオキシカルボニルアミノ)-5-フタルイミド)ペンチルホスホネート(13)の合成
【０３５４】
【化６５】
2013501108.tif 000077
【０３５５】
フッ化カリウム(KF) (1.52g、26.2mmol)を、CHCl3 (10mL)およびCH3OH (58mL)中の(6) (1.57g、2.6mmol)の溶液に加えた。透明な溶液を、23℃にて一夜にわたって撹拌した。溶媒蒸発後、黄白色の固体残留物を酢酸エチル(25mL)に溶かし、NaOH (1M)で洗浄してフェノール副成物を除去した。次いで、試料を塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム(MgSO4)上で乾燥した。溶媒蒸発後、粘稠な黄色の油生成物を集めた。粗生成物を、酢酸エチル/ヘキサン(1:1、v/v)から結晶化させると、白色の固体として純粋なジメチル-(1-(N-ベンジルオキシカルボニルアミノ)-5-フタルイミド)ペンチルホスホネート(13)が得られた(1.10g、88%)。
TLC Rf=0.46 CHCl3/CH3OH (9:1、v/v)。
融点  92〜95℃。
IR: νmax (液膜、cm-1): 3258w (NH)、1701s (CO)、1400〜1600s (芳香族化合物)および1190m (PO)。
1H NMR (200MHz, CDCl3): δ 1.39〜1.97 (m, 6H, H2-H4)、3.58〜3.71 (m, 8H, PO(CH3)2)、4.00〜4.09 (m, 1H, H1)、4.95〜5.06 (m, 2H, CbzのCH2)、5.20 (d, 1H, NH)、7.32 (bs, 5H, Ar-H)、7.60〜7.63 (m, 2H, Pht)、7.73〜7.76 (m, 2H, Pht)。
13C NMR (100MHz, CDCl3); δ 22.87 (d, 2JCP 32.8Hz, C2)、27.94, (C3)、29.20 (C4)、37.35 (C5)、47.12 (d, 1JCP 156.3Hz, C1)、53.08 (d, 2JCP 7.1Hz, OCH3)、53.21 (d, 2JCP 7.1Hz, OCH3)、67.22 (CH2-Ar)、123.23, 128.05, 128.21, 128.54, 132.18, 133.91, (ArおよびPht)、156.08 (d, 2JCP 5.5Hz, PhtのCOO)、168.43 (CbzのCO)。
31P NMR (121.5MHz, CDCl3): δ 27.57 (s)。
MS (ESI+) m/z 475.2 (M+H)+および497.2 (M+Na)+.
HR-MS (ESI+) 実測値: m/z 475.1634 C23H28N2O7P (M+H)+の計算値は475.1634であり、m/z 497.1436 C23H27N2O7PNa (M+Na)+の計算値は497.1454。
微量分析C23H27N2O7Pの計算値: C 58.23, H 5.74, N 5.90％。実測値: C 58.38, H 5.48, N 5.93％。
【０３５６】
メチル-(1-(N-ベンジルオキシカルボニルアミノ)-5-フタルイミド)ペンチルホスホネート(2)の合成
【０３５７】
【化６６】
2013501108.tif 000078
【０３５８】
方法1  ジメチル-(1-(N-ベンジルオキシカルボニルアミノ)-5-フタルイミド)ペンチルホスホネート(13) (0.1g、0.21mmol)を2-ブタノン(0.5mL)に溶かした。溶液に、臭化リチウム(LiBr) (0.02g、0.2mmol)を一緒に加えた。混合物を還流状態で撹拌すると、白色の固体生成物が10分以内に形成された。反応物を、1時間にわたって還流したままにし、溶媒を蒸発させ、残留白色リチウム塩をEt2Oで洗浄した。CH2Cl2 (2mL)に塩を懸濁した後、HCl (1M)を滴加してpHを1に調整した。黄色の溶液に、塩化ナトリウム(NaCl) (0.08g)を加え、続いて、酢酸エチルを使用して抽出した。MgSO4上で有機相を乾燥した後、溶媒を蒸発させ、粗メチル-(1-(N-ベンジルオキシカルボニルアミノ)-5-フタルイミド)ペンチルホスホネート(2)を白色の固体として得た(0.051g、50%)。
融点  161〜164℃。
1H NMR (200MHz, CDCl3にCD3ODを数滴): δ 1.39〜1.71 (m, 6H, H2-H4)、3.58〜3.70 (m, 5H, H5およびP-(OCH3))、4.-7〜4.10 (m, 1H, H1)、5.01〜5.09 (m, 3H, CbzのOCH2およびNH)、7.28 (bs, 5H, Ar)、7.63〜7.66 (m, 2H, Pht)、7.77〜7.79 (m, 2H, Pht)。
MS (ESI+) m/z 461.3 (M+H)+および483.2 (M+Na)+。
【０３５９】
方法2  アセトン/トルエン  (1:1、v/v) 5mL中の1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン(DABCO) (0.08g、0.7mmol)の溶液に、ジメチル-(1-(N-ベンジルオキシカルボニルアミノ)-5-フタルイミド)ペンチルホスホネート(13) (0.20g、0.4mmol)を加え、混合物を、5時間にわたって還流状態で加熱した。溶媒蒸発後、黄色の粘稠な油を、酢酸エチルを使用して5% HCl (2×10mL)から抽出した。有機層を水と、続いて、塩水で洗浄し、MgSO4上で乾燥した。溶媒蒸発後、白色の固体生成物が得られた。純粋なメチル-(1-(N-ベンジルオキシカルボニルアミノ)-5-フタルイミド)ペンチルホスホネート(2)は、酢酸エチルおよびヘキサン(1:1、v/v)で白色の固体生成物を洗浄した後に得られた(0.13g、67%)。
融点  160〜163℃。
1H-NMR (200MHz, CDCl3にCD3ODを数滴): δ 1.42〜1.87 (m, 6H, H2-H4)、3.63〜3.77 (m, 5H, H5およびP-(OCH3))、4.08〜4.11 (m, 1H, H1)、5.01〜5.34 (m, 3H, CbzのOCH2およびNH)、7.68 (s, 5H, Ar)、7.60〜7.68 (m, 2H, Pht)、7.78〜7.81 (m, 2H, Pht)。
MS (ESI+) m/z 461.2 (M+H)+および483.2 (M+Na)+。
【０３６０】
方法3  アセトン/トルエン  (1:1、v/v) 5mL中のDABCO (0.04g、0.4mmol)の溶液に、ジメチル-(1-(N-ベンジルオキシカルボニルアミノ)-5-フタルイミド)ペンチルホスホネート(13) (0.1g、0.2mmol)を加え、混合物を、マイクロ波を使用して10分間にわたって120〜125℃の間で照射した。溶媒蒸発後、黄色の粘稠な油を、酢酸エチルを使用して5% HCl (2×5mL)から抽出した。有機層を水と、続いて、塩水で洗浄し、MgSO4上で乾燥した。溶媒蒸発後、白色の固体生成物が得られた。純粋なメチル-(1-(N-ベンジルオキシカルボニルアミノ)-5-フタルイミド)ペンチルホスホネート(2)は、酢酸エチルおよびヘキサン(1:1、v/v)で白色の固体を洗浄することにより得られた。(0.07g、75%)。
TLC Rf=0.77 CHCl3/CH3OH (9:1、v/v)。
融点  160〜163℃。
IR: νmax (液膜、cm-1): 3225bs (OH)および3033w (NH)、1769s (CO)、1608m (NH-CO)、1400〜1600s (芳香族化合物)および1026m (PO)。
1H NMR (400MHz, CDCl3にCD3ODを数滴): δ 1.34〜1.79 (m, 6H, H2-H4)、3.57〜3.63 (m, 5H, H5およびP-(OCH3)、3.87〜3.94 (m, 1H, H1)、4.89〜5.06 (m, 3H, CbzのOCH2およびNH)、7.24 (bs, 5H, Ar-H)、7.60〜7.62 (m, 2H, Pht)、7.72〜7.74 (m, 2H, Pht)。
13C-NMR (75MHz, CD3OD入りCDCl3); δ 22.96 (d, 2JCP 13.2Hz, C2)、27.87(C3)、28.92 (C4)、37.45 (C4)、47.44 (d, 1JCP 176.1Hz, C1)、52.44 (d, 2JCP 6.7Hz, OCH3)、66.97 (CH2-Ar)、123.18、127.76、128.03、128.40、132.97、134.07、136.34 (ArおよびPht)、156.79 (d, 2JCP 5.8Hz, COO)、168.69 (CO)。
31P NMR (121.5MHz, CDCl3): δ 27.57 (s)。
MS (ESI+) m/z 461.2 (M+H)+および483.2 (M+Na)+。
HR-MS (ESI+) 実測値: m/z 461.1474 C22H26N2O7P (M+H)+の計算値は461.1478であり、483.1288 C22H25N2O7PNa (M+Na)+の計算値は483.1297。
微量分析C22H25N2O7Pの計算値: C 57.39, H 5.47, N 6.08％。実測値: C 57.56, H 5.64, N 6.10％。
【０３６１】
4-ビニルイミダゾール(27)の合成
【０３６２】
【化６７】
2013501108.tif 000079
【０３６３】
ウロカニン酸(0.25g、1.81mmol)を、バルブツーバルブ(クーゲルロール)蒸留装置を使用して220〜225℃の間で加熱した。蒸留は、低真空圧で行った。予想4-ビニル-イミダゾール(27)生成物を、粘稠な油として受器中に蒸留し、冷却するとゆっくりと結晶化して白色の結晶として得られた(0.08g、47%)。
融点  81〜84℃。
1H NMR (400MHz, DMSO): δ 4.99 (d, J 10.8Hz, 1H, ビニル)、5.58 (d, J 17.5Hz, 1H, ビニル)、6.56 (dd, J 10.8Hzおよび17.5Hz, 1H, ビニル) 7.20 (s, 1H, H5)、7.60 (s, 1H, H2)、3.75 (bs, 1H, H1)。
ESI (EI+) m/z 95.9 (M+H)+。
【０３６４】
メチル、2-(2'-イミダゾリル)-4-エテニルフェニル(1-(N-ベンジルオキシカルボニルアミノ)-5-フタルイミド)ペンチルホスホネート(1)の合成
【０３６５】
【化６８】
2013501108.tif 000080
【０３６６】
無水CH2Cl2 (6mL)中のメチル-(1-(N-ベンジルオキシカルボニル-アミノ)-5-フタルイミド)ペンチルホスホネート(2) (0.18g、0.38mmol)に、TEA (110μL、1.22mmol)を窒素下で加えた。この混合物に、ヘキサフルオロリン酸ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス(ジメチルアミノ)ホスホニウム(BOP) (0.14g、0.38mmol)を加え、反応混合物を、10分にわたって23℃にて撹拌した。乾燥CH2Cl2 (1mL)に2-(2'-ヒドロキシ-5'-エテニルフェニル)イミダゾール(4) (0.07g、0.38mmol)の重合性基を溶かした後、黄色の溶液を、上の混合物に加え、撹拌した。反応進行は、HPLCによりモニターした。反応の1時間以内に、生成物の有意な変換がHPLCにより検出された。試料を、ESI-MSにより分析しても、予想生成物が副成物(ヘキサメチルリン酸アミド)と一緒に、それぞれMS (EI+) m/z 629.5 (M+H)+、(M+Na)+ 651.4および180.2(ヘキサメチルリン酸アミド+H)+に検出された。反応物を、合計で46時間にわたって進行したままにし、続いて、塩水、飽和重炭酸ナトリウム水溶液および1M HCl溶液で混合物を洗浄した。MgSO4上で有機相を乾燥し溶媒を除去した後、残留する油を、酢酸エチル/ヘキサン(1:1、v/v)を使用するフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。溶媒を除去した後、吸湿性の生成物メチル、2-(2'-イミダゾリル)-4-エテニルフェニル(1-(N-ベンジルオキシカルボニルアミノ)-5-フタルイミド)ペンチルホスホネート(1)が、黄色の泡として得られた(0.16g、66%)。
1H-NMR (300MHz, CDCl3): δ 1.34〜1.94 (m, 6H, H2-H4)、3.58〜3.61 (m, 5H, H5およびP-(OCH3)、3.85〜4.05 (m, 1H, H1)、4.98 (bs, 2H, CbzのCH2)、5.08 (d, 1H, J 10.8Hz, 1H, ビニル)、5.57 (d, 1H, J 17.6Hz, ビニル)、6.83 (dd, J 17.5および10.8Hz, 1H, ビニル)、6.76〜7.18 (m, 10H, PhIm)、7.60〜7.68 (m, 2H, Pht)、7.78〜7.81 (m, 2H, Pht)。
13C-NMR (75MHz, CDCl3にMD3ODを数滴); δ 23.32 (d, 2JCP 12.5Hz, C2)、28.09 (C3)、30.06 (C4)、37.60 (C5)、47.94 (d, 1JCP 151.3Hz, C1)、52.17 (d, 2JCP 5.7, OCH3) 66.68 (CbzのCH2)、108.54, 110.56, 112.69 112.67, (ビニル)、110.56および111.16 (C2-Ar) 117.94および118.30 (C6-Ar)、123.09 (Pht)、125.03 (C3'およびC4')、127.64, 127.87, 128.31 (CbzのAr)、129.34 (C3-Ar)、129.55 (C4-Ar)、130.10 (C5-Ar) 131.98 (Pht)、133.90 (Pht)、135.10 (ビニル)、136.47 (CbzのAr)、140.87, 142.12 (C1')、155.18 (d, 2JCP 9.1Hz, C1-Ar)、156.82 (d, 3JCP 6.1Hz, CbzのCOO)、168.52 (PhtのCO)。
IR νmax (液膜、cm-1): 3465s (NH)、1708s (CO)、1688s (NH-CO)、1400〜1600s (芳香族化合物)および1084m (PO)。
31P NMR (121.5MHz, CDCl3): δ 26.40 (s)。
ESI (EI+) m/z 629.5 (M+H)+, 651.4 (M+Na)+。
HR-MS (ESI+) 実測値: m/z 629.2160 C33H33N4O7P (M+H)+の計算値は629.2165。
【０３６７】
この化合物(1)は、保存時に不安定性を示し、反復分析で一貫した元素分析値をもたらさなかった。
【０３６８】
(1-(N-ベンジルオキシカルボニルアミノ)-5-フタルイミド)ペンチルカルボン酸(3)の合成
【０３６９】
【化６９】
2013501108.tif 000081
【０３７０】
(1-(N-ベンジルオキシカルボニルアミノ)-5-アミノ)ペンチルカルボン酸(25) (0.25g、0.89mmol)を、無水フタル酸(0.13g、0.89mmol)と混ぜた。混合物を、マイクロ波オーブンを使用して160℃にて5分にわたって照射した。次いで、試料を真空中で乾燥すると、ガラス状粘性を持つ薄黄色の固体として(1-(N-ベンジルオキシカルボニルアミノ)-5-フタルイミド)ペンチルカルボン酸(3)生成物が得られた(0.37g、100%)。
1H NMR (200MHz, D2O): δ 1.26〜1.70 (m, 6H, H2-H4)、3.67 (t, 2H, J 7.2Hz, H5)、
4.23 (bs, 1H, H1)、5.07 (s, 2H, CbzのCH2)、7.38 (bs, 5H, Ar-H)、7.72〜7.73 (m, 2H, Pht)、7.83〜7.83 (m, 2H, Pht)。
13C-NMR (75MHz, D2O); δ 23.00、28.61、32.56 (C2-C4)、37.98 (C5)、54.14 (C1)、67.69 (CbzのCH2)、123.84、128.67、128.75、129.06、129.10、132.67、134.52、136.81 (ArおよびPht)、156.76 (CbzのCO-)、169.07 (CO-Pht)、176.59 (COOH)。
IR:νmax (液膜、cm-1): 3051bs (OH)、1769s (CO)および1400〜1600s (芳香族化合物)。
MS (ESI-) m/z 409.3 (M-H)-。
HR-MS (ESI+) 実測値: m/z 411.1555および433.1376 C22H23N2O6 (M+H)+の計算値は411.1556であり、C22H23N2O6Na (M+Na)+の計算値は433.1375。
微量分析C22H25N2O7の計算値: C 64.38, H 5.40, N 6.83％。実測値: C 64.24, H 5.43, N 6.89％。
【０３７１】
6) ポリマー(インプリントポリマーおよび非インプリントポリマー)の合成およびそれらの触媒評価
脱イオン水は、Milli-Q H2O精製システム(Millipore Bedford、MA、USA.)からとし、0.2μm細孔サイズのNylon 66膜フィルター(Alltech Assoc.、Deerfield、IL、U.S.A.)で濾過した。ポリマーは、Precision Eforming LLC、ステンレススチールW/ニッケルメッシュ150 3310-3 ANSI/ASTM E 161 (Cortland、NY、USA)を使用して篩い分けした。
【０３７２】
合成装置  ポリマーの調製は、Mettler ToledoミニブロックパラレルXT合成装置(Columbia、MD、USA)を使用して行った。
【０３７３】
PTSPA-インプリントポリマー(22)の合成
100mLの試験管中で、(Cbz-Lys(Pht)P(OMe)(Ph-Im)) (1) (0.08g、0.13mmol)をCHCl3 (5mL)に溶かした。この溶液に、メタクリル酸(MAA) (19) (0.22mL、2.60mmol)、エチレンジメタクリレート(EDMA) (20) (4.42mL、23.40mmol)および2,2'-アゾビスイソブチロニトリル(AIBN) (0.04g、0.24mmol)を加えた。ミニブロックパラレル合成装置に管を入れた後、溶液を、10分にわたって混合物を通して窒素を泡立てることによりパージした。熱重合を、24時間にわたって65℃にて行い、白色のブロックポリマー(21)を製造した。乳棒および乳鉢を使用してポリマーを粉砕した後、30〜90マイクロメートルの間の粒子分画を、2つの標準的な篩を使用して集めた。
【０３７４】
触媒として活性なポリマー(22)を製造するためのテンプレート抽出は、下記のステップを使用して達成された:
-  ポリマーを、一夜にわたって室温にてCHCl3/CH3OH (1:1、v/v) 100mL中で撹拌し、濾過した;
-  次いで、ポリマーを、ソックスレー抽出円筒濾紙中に移し、一夜にわたってメタノール(100mL)で抽出し、濾過した;
-  次いで、ポリマーを、1M NaOH/CH3OH (1:1、v/v) 100mLに懸濁し、テンプレートを、24時間にわたって60℃にて抽出し、最後に、
-  ポリマーを、濾液の7のpHが得られるまで蒸留水で洗浄し、続いて、CH3OHで最後にすすいだ。
【０３７５】
PTSPA-非インプリントポリマー(26)の合成
100mLの試験管中で、N-ベンゾイル-2-(2'-ベンゾキシ-5'-エテニルフェニル)イミダゾール(23) (0.05g、0.13mmol)をCHCl3 (5mL)に溶かし、この溶液に、MAA (19) (0.22mL、2.60mmol)、EDMA (20) (4.42mL、23.40mmol)およびAIBN (0.04g、0.24mmol)を加えた。管を、ミニブロックパラレル合成装置に入れた後、溶液を、10分にわたって混合物を通して窒素を泡立てることによりパージした。熱重合を、24時間にわたって65℃にて行い、白色のブロックポリマー(24)を製造した。ポリマーを粉砕した後(乳棒および乳鉢を使用して)、30〜90マイクロメートルの間の粒子分画を、2つの標準的な試験用の篩を使用して集めた。ブランク対照ポリマー(26)を製造するためのテンプレート抽出は、PTSPA-インプリントポリマー(22)の調製に記載されているのと同じ手順を使用して達成された。
【０３７６】
架橋剤としてDVBを使用するTSPA-インプリントポリマー(30)の合成。
100mLの試験管中で、(Cbz-Lys(Pht)P(OMe)(OH)) (2) (0.07g、0.15mmol)をACN (1.1mL)に懸濁し、4-ビニルイミダゾール(4-VI) (27) (0.14g、1.50mmol)を加え、溶液を撹拌した。均一溶液に、DVB (28) (0.43mL、3.00mmol)およびAIBN (0.04g、0.24mmol)を加えた。管を、ミニブロックパラレル合成装置に入れた後、溶液を、10分にわたって混合物を通して窒素を泡立てることによりパージした。熱重合を、24時間にわたって65℃にて行い、白色のポリマービーズ(29)を得た。テンプレート除去は、ACN (100mL)、リン酸緩衝液(100mL、20mM、pH10)およびメタノール(100mL)によるポリマーの引き続く洗浄により達成された。次いで、インプリントポリマー(30)を、24時間にわたって60℃にてオーブン乾燥した。
【０３７７】
架橋剤としてDVBを使用するTSPA-非インプリントポリマーの合成
100mLの試験管中で、4-VI (27) (0.14g、1.5mmol)をACN (1.1mL)に懸濁した。これに、DVB (28) (0.43mL、3.00mmol)およびAIBN (0.04g、0.24mmol)を加えた。ミニブロックパラレル合成装置に管を入れた後、溶液を、10分にわたって窒素でパージした。熱重合を、24時間にわたって65℃にて行い、白色のポリマービーズを得た。ポリマーを、ACNですすぎ、24時間にわたって60℃にてオーブン乾燥した。この方法を使用し、異なるTSPA-インプリントポリマーおよび非インプリントポリマーを、上に指定されているように、様々な濃度のDVB (28)を利用して調製した。
【０３７８】
架橋剤としてEDMAを使用するTSPA-インプリントポリマー(30)の合成
100mLの管中で、Cbz-Lys(Pht)P(OMe)(OH) (2) (0.07g、0.15mmol)をACN (1.1mL)に加えた。懸濁液に、4-VI (27) (0.14g、1.50mmol)を加え、溶液を室温にて撹拌すると、均一溶液が得られた。この溶液に、AIBN (0.04g、0.24mmol)およびEDMA (20) (2.55mL、13.50mmol)を加えた。ミニブロックパラレル合成装置に管を入れた後、溶液を、10分にわたって窒素を泡立てることによりパージした。熱重合を、24時間にわたって65℃にて行うと、白色のポリマービーズが得られた。次いで、白色のポリマービーズを、テンプレート抽出のためにACN (100mL)、リン酸緩衝液(100mL、20mM、pH10)およびメタノール(100mL)で洗浄した。次いで、TSPA-インプリントポリマーを、24時間にわたって60℃にてオーブン乾燥した。
【０３７９】
架橋剤としてEDMAを使用するGSCA-インプリントポリマー(32)の合成
100mLの管中で、テンプレートとしての(Cbz-Lys(Pht)-OH) (3) (0.06g、0.15mmol)およびACN (1.1mL)を加えた。懸濁液に、4-VI (27) (0.14g、1.50mmol)を加え、溶液を室温にて撹拌すると、均一溶液が得られた。混合物に、AIBN (0.04g)およびEDMA (20) (2.55mL、13.50mmol)を加えた。管を、ミニブロックパラレル合成装置に入れた後、溶液を、10分にわたって窒素を泡立てることによりパージした。次いで、混合物を、24時間にわたって65℃にて加熱すると、白色のポリマービーズ(31)が得られた。得られたポリマーを、テンプレート抽出のためにACN (100mL)、リン酸緩衝液(100mL、20mM、pH10)およびメタノール(100mL)で洗浄した。次いで、得られたポリマー(32)を、24時間にわたって60℃にてオーブン乾燥した。
【０３８０】
異なるインプリントポリマーおよび非インプリントポリマーでのCbz-L-Lys-ONp.HCl (33)についての加水分解研究
インプリントポリマー(50mg)に、ACN (0.5mL)を加え、不均一な試料を、平衡のために10分にわたって撹拌した。ポリマーを、遠心分離により遠沈させた後、上清を、マイクロピペットを使用する注意深い吸引により除去した。湿ったポリマーに、ACN/CH3OH (4.8:0.2、v/v) 5mLに溶かした基質Cbz-L-Lys-ONp.HCl (33) (1μmol/mL)を加え、混合物を室温にて撹拌した。異なる時間間隔で(最初の1.5分にわたって15秒毎に、続いて、5分にわたって1分毎に、次いで、10、20および30分で)、小アリコート(0.1mL)を取り出し、遠心分離し、水性0.1% TFA/ACN (60:40、v/v)を使用する定組成溶離モードによる分析用HPLCおよび300nmにおけるUV検出により分析した。この手順を使用し、異なるインプリントポリマーおよび非インプリントポリマーでの様々な濃度(2、3および4μmol/mL)における基質Cbz-L-Lys-ONp.HCl (33)の加水分解を決定した。
【０３８１】
LC-MSによるインプリントポリマー加水分解生成物の検討
PTSPA-インプリントポリマー(22)と共に基質Cbz-L-Lys-ONp.HCl (33)をインキュベートする前後に、LC-MS分析を、1ml/分の流速で水性ギ酸(0.05%)からなる溶離液AおよびCH3OHからなる溶離液Bを用いるグラジエント溶離を使用して行った(Table 11 (表11))。同じ条件を使用し、標準PNPも参照として分析した。
【０３８２】
【表１１】
2013501108.tif 000082
【０３８３】
異なるインプリントポリマーおよび非インプリントポリマーでの基質Cbz-D-Phe-ONp (36)の加水分解
ポリマー(50mg)に、ACN (0.5mL)を加え、懸濁液を、平衡のために30分にわたって撹拌した。ポリマーを、遠心分離により遠沈させた後、上清を、マイクロピペットを使用する注意深い吸引により除去した。湿ったポリマーに、ACN/CH3OH (4.8:0.2、v/v) 5mLに溶かしたZ-D-Phe-ONp (36) (1μmol/mL)を加え、混合物を室温にて撹拌した。異なる時間間隔で(最初の1.5分にわたって15秒毎に、続いて、5分にわたって1分毎に、次いで、10、20および30分で)、小アリコート(0.1mL)を取り出した。遠心分離後、上清を、300nmにおけるUV検出付きの分析用HPLCで分析した。この研究において、0.1%水性TFA/ACN (70:30、v/v)からなる定組成移動相を使用した。この手順を使用し、異なる濃度(2、3および4μmol/mL)の基質Z-D-Phe-ONp (36)を、異なるインプリントポリマーおよび非インプリントポリマーと共にインキュベートした後で分析した。
【０３８４】
いかなる先行刊行物(または、それに由来する情報)、または知られているいかなる事項への本明細書における言及も、先行刊行物(または、それに由来する情報)または知られている事項が、本明細書が関係する試みの分野における共通一般常識の一部を形成することの了解もしくは承認またはいかなる形態の示唆とは解釈されず、またされるべきではない。
【０３８５】
本明細書および後に続く特許請求の範囲を通して、文脈が他の意味を要求していない限り、「含む(comprise)」という単語、ならびに「含む(comprises)」および「含むこと(comprising)」などの変形形態は、いかなる他の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群の除外でなく、記述されている整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群の包含を意味することが理解されるであろう。
【図２（Ａ）】
2013501108.tif 000116
【図２（Ｂ）】
2013501108.tif 000117
【図３（Ａ）】
2013501108.tif 000118
【図３（Ｂ）】
2013501108.tif 000119
【図３（Ｃ）】
2013501108.tif 000120
【図３（Ｄ）】
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【図４（Ａ）】
2013501108.tif 000122
【図４（Ｂ）】
2013501108.tif 000123
【図１】
2013501108.tif 000124
【国際調査報告】
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