(57)【要約】  本発明は、ＲＧＤ配列を免疫特異的に認識するヒト化抗体を提供する。これらの抗体のいくつかはＲＧＤタンパク質の生物学的機能を阻害し、それによって癌、例えば癌細胞の増殖および転移、および炎症疾患、例えば慢性関節リウマチ、骨関節炎、肝炎、子宮内膜症、気管支喘息、線維症、糖尿病、動脈硬化症、多発性硬化症、肉芽腫、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎およびクローン病）、自己免疫疾患などを含めたＲＧＤタンパク質と関係がある様々な障害または疾患に対する治療効果を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＧＤ配列を免疫特異的に認識するヒト化抗体またはその抗原結合断片であって、
（ｉ）ＶＨを含むＨ鎖であって、前記ＶＨが配列番号９２、９４または９６のアミノ酸配列を含むＨ鎖、または
（ｉｉ）ＶＬを含むＬ鎖であって、前記ＶＬが配列番号９８または１００のアミノ酸配列を含むＬ鎖、または
（ｉｉｉ）前述の（ｉ）および（ｉｉ）の両方を含むヒト化抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
前記ＶＨが配列番号９１、９３または９５のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号９７または９９のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
前記ＶＨが配列番号９４のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号１００のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
前記Ｈ鎖が配列番号２５または２７のアミノ酸配列を含み、前記Ｌ鎖が配列番号２９または３１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
前記Ｈ鎖が配列番号２５のアミノ酸配列を含み、前記Ｌ鎖が配列番号３１のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
配列番号９２、９４または９６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項７】
前記ヌクレオチド配列が配列番号９１、９３または９５のヌクレオチド配列を有する、請求項６に記載の単離核酸分子。
【請求項８】
配列番号９８または１００のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項９】
前記ヌクレオチド配列が配列番号９７または９９のヌクレオチド配列を有する、請求項８に記載の単離核酸分子。
【請求項１０】
配列番号２５または２７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項１１】
前記ヌクレオチド配列が配列番号２４または２６のヌクレオチド配列を有する、請求項１０に記載の単離核酸分子。
【請求項１２】
配列番号２９または３１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項１３】
前記ヌクレオチド配列が配列番号２８または３０のヌクレオチド配列を有する、請求項１０に記載の単離核酸分子。
【請求項１４】
前記核酸分子が１つまたは複数の制御エレメントに作動可能に連結した、請求項６または８または両方に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１５】
前記核酸分子が１つまたは複数の制御エレメントに作動可能に連結した、請求項１０または１２または両方に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載のベクターを含む単離宿主細胞。
【請求項１７】
ヒト化抗体またはその抗原結合断片を調製するための方法であって、ヒト化抗体またはその抗原結合断片が発現されるような条件下で請求項１６に記載の宿主細胞を培養すること、および発現したヒト化抗体を回収することを含む方法。
【請求項１８】
細胞接着を阻害するための組成物であって、請求項１から５のいずれか一項に記載のヒト化抗体または抗原結合断片を含む組成物。
【請求項１９】
細胞との細胞外マトリックスタンパク質の結合に干渉するための組成物であって、請求項１から５のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片を含む組成物。
【請求項２０】
前記組成物がＲＧＤタンパク質と関係がある障害または疾患の治療または診断に使用される、請求項１８または１９に記載の組成物。
【請求項２１】
ＲＧＤタンパク質と関係がある障害または疾患を予防または治療するための方法であって、有効量の請求項１から５のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片を、その必要性がある対象に投与することを含む方法。
【請求項２２】
試験サンプル中のＲＧＤタンパク質を検出するための方法であって、試験サンプル中のＲＧＤタンパク質との、請求項１から５のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片の結合をアッセイすることを含む方法。
【請求項２３】
ＲＧＤタンパク質と関係がある障害または疾患をｉｎ  ｖｉｖｏで診断するための方法であって、有効量の請求項１から５のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片を、検査する対象に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願を通じて、いくつかの参照文献を本明細書で参照する。これらの参照文献の開示は、参照によってそれらの全容を本出願中にここで組み込む。
【０００２】
本発明は、細胞外マトリックスタンパク質のアミノ酸配列ＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）を免疫特異的に認識するヒト化抗体、ならびに癌、炎症疾患、自己免疫疾患、感染疾患、骨疾患などを含めた様々な疾患または障害用のそれらの治療および診断用途に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞接着は多細胞生物の生命を維持する際に重要な役割を果たす。多細胞生物の細胞接着は、細胞−細胞外マトリックス（本明細書では以後「ＥＣＭ」と略す）接着および細胞間接着に分類される。細胞−ＥＣＭ接着はインテグリンによって仲介され、かつ細胞間接着はカドヘリン、クラウジンおよびネクチンによって仲介されることが解明されている。
【０００４】
インテグリンなどの膜貫通型接着タンパク質は細胞−ＥＣＭ接着を構成する。インテグリンがα鎖とβ鎖のヘテロ二量体を形成することが報告されている。少なくとも１８種（types）の鎖、８種のβ鎖および２４種のαβヘテロ二量体がこれまでに同定され確認されている。それぞれの種類のインテグリンが、特異的リガンドを認識することが知られている。インテグリンを含めた膜貫通型接着タンパク質は、細胞接着以外に、ＥＣＭから細胞への細胞内シグナル伝達、ならびに増殖、移動性および分化の制御と関係がある（F.G Giancotti, et al., Science, 285, 1028-1032, 1999）。
【０００５】
多くのタンパク質は、コラーゲン（Ｉ−ＸＩＸ型など）、非コラーゲン性糖タンパク質（オステオポンチン（ＯＰＮ）、ビトロネクチン、フィブロネクチン、フォンヴィレブランド因子、ラミニン、テナシン、フィブリノゲン、トロンボスポンジンなど）、エラスチンおよびプロテオグリカンに分類されるＥＣＭタンパク質として知られている。これらのＥＣＭタンパク質は対応するインテグリンと結合し、細胞内シグナル伝達経路を活性化して、細胞骨格系、移動性、増殖、分化などを制御する。ＥＣＭタンパク質結合インテグリンは、ＥＣＭタンパク質の種類（type）に応じて特異的シグナルを送ることにより、これらのシグナル活性化経路を制御する。ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）配列は多くのＥＣＭタンパク質の細胞接着領域において一般に観察され、インテグリンと結合することによって様々な機能を示すようである。ＥＣＭタンパク質のＲＧＤ配列は薬剤標的であり得ると予想されており、いくつかの低分子化合物および人工ペプチドが提供されている。
【０００６】
いくつかの型のインテグリン、α３β１インテグリン、α５β１インテグリン、α８β１インテグリン、ανβ１インテグリン、ανβ３インテグリン、ανβ５インテグリン、ανβ６インテグリン、ανβ８インテグリンなどは、ＲＧＤ配列と結合することが知られている。α５β１インテグリンとその特異的リガンドフィブロネクチンの間の相互作用は、インテグリン仲介シグナル伝達の機構を調べるために明らかにされており、α５β１インテグリンは細胞接着および細胞移動だけでなく、細胞分化および細胞死亡率も制御することが報告される（S.M.Frisch et al., Curr.Opin.Cell Biol., 9, 701-706, 1997）。α５β１インテグリンは腫瘍細胞において高度に発現され、癌の悪性化と関係があることも示されている。それぞれのインテグリン仲介シグナルはＥＣＭタンパク質の結合に応じて異なる。例えば、増殖因子による刺激はフィブロネクチン結合内皮細胞の増殖を活性化するが、ラミニン−１結合内皮細胞の増殖は阻害する。さらに、ラミニン−１０／１１からα３β１インテグリンに伝わるシグナルはフィブロネクチンからα５β１インテグリンに伝わるシグナルと異なり、癌細胞の移動性を有意に高め（J.Gu et al., J.Biol.Chem., 276, 27090-27097, 2001）、血清飢餓によるアポトーシスを有意に回避する（J.Gu et al., J.Biol.Chem., 277, 19922-19928、2002）。ＲＧＤ配列結合αｖインテグリンの高発現は破骨細胞および新生血管において観察されており、ＲＧＤ配列およびαｖインテグリンの阻害は骨粗しょう症および癌に関する治療薬剤の標的として予想されている。α５β１インテグリンは腫瘍細胞において高度に発現され、癌の悪性化と関係があることが示されている。これらの発見から、抗α５β１インテグリン抗体（ボロシマブ）、抗α４インテグリン抗体（ナタリズマブ）、抗αｖβ３インテグリン抗体（ビタキシン）が、インテグリンとＥＣＭタンパク質の間の相互作用を阻害するアンタゴニスト抗インテグリン抗体薬剤として開発されている。
【０００７】
一方、コラーゲン、オステオポンチン（ＯＰＮ）、ビトロネクチン、フィブロネクチン、フォンヴィレブランド因子、ラミニン、テナシン、フィブリノゲンおよびトロンボスポンジンなどのいくつかのＥＣＭタンパク質は、ＲＧＤ配列を含むことが知られている。さらに、数種のウイルスおよび数種の細菌は、細胞と接着するためにＲＧＤ配列を有することが知られている。ＯＰＮは、骨中に多量に含有されるカルシウムとの結合性を有する酸性糖タンパク質である。ＯＰＮは、細胞接着、細胞移動、腫瘍形成、免疫応答および補体仲介細胞溶解において重要な役割を果たすことが報告される。ＯＰＮノックアウトマウスおよび抗ＯＰＮ中和抗体の結果は、ＯＰＮが肝炎、慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患、および癌の転移と関係があることを示す。したがって、ＥＣＭタンパク質と細胞の結合の阻害剤は、骨粗しょう症または癌の治療に使用することができることが予想される。したがって、インテグリンを標的化する前述のアンタゴニスト薬剤以外に、インテグリンの結合パートナーであるＥＣＭタンパク質を標的化するアンタゴニスト薬剤が開発されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
インテグリンとのＲＧＤ配列仲介相互作用を阻害する低分子、ＯＰＮに対する抗体、およびインテグリンに対する抗体などの薬剤は開発されているが、ＲＧＤ配列を特異的に認識する抗体に関する報告は存在しない。ＲＧＤ配列はＥＣＭタンパク質中の保存配列の１つなので、ＲＧＤ配列を特異的に認識する抗体はヒトと治療モデル動物の両方において影響を有すると予想され、したがって治療剤の開発に非常に重要な活性成分として考えられる。したがって、ＲＧＤ配列を特異的に認識する抗体が必要とされている。以前、本発明者らは、ＲＧＤ配列を免疫特異的に認識しハイブリドーマクローン３３Ｅ１０および３５Ｂ６（それぞれ寄託受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１０４４０およびＦＥＲＭＢＰ−１０４４１）によって産生されるマウスモノクローナル抗体を単離した。本明細書では、ハイブリドーマクローンの名称は、クローンによって産生されるモノクローナル抗体の名称として交互に使用する。全てのこれらのマウス抗ＲＧＤ抗体はＩｇＧ１アイソタイプであった。これらのモノクローナル抗体は、オステオポンチンなどのＥＣＭタンパク質のＲＧＤ配列との結合によって、ＥＣＭと細胞の間でＲＧＤ配列によって仲介される結合に干渉することを観察した。したがって、これらの抗ＲＧＤ抗体は、例えば癌、例えば癌細胞の増殖または転移、および炎症疾患、例えば慢性関節リウマチ、骨関節炎、感染疾患、肝炎、気管支喘息、線維症、糖尿病、動脈硬化症、多発性硬化症、肉芽腫、および炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎およびクローン病）、自己免疫疾患、骨粗しょう症などの、ＲＧＤ配列関連疾患に対して治療または診断効果を示すと予想される。
【０００９】
しかしながら、これらのモノクローナル抗体はマウス起源なので、ヒトにおけるそれらの免疫原性が原因で考えられる悪影響が、ヒトにおける診断または治療用途へのそれらの直接施用を妨げている。免疫原性を低減するために、本発明者らは、前記ヒト化抗体が由来する原型マウス抗ＲＧＤ抗体によって示される活性に相当する、生物活性を有するヒト化抗体を調製した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって、本発明は、ＲＧＤ配列を免疫特異的に認識するヒト化抗体またはその抗原結合断片を提供し、前記抗体は部分的に非ヒト起源に由来し部分的にヒト起源に由来する抗原結合領域を含む。本発明の一態様では、本発明のヒト化抗体またはその抗原結合断片は、３３Ｅ１０および３５Ｂ６モノクローナル抗体などの非ヒト供給源（ドナー）に由来する相補性決定領域（本明細書では以後「ＣＤＲ」と略す）、およびヒト供給源に由来するフレームワーク領域（本明細書では以後「ＦＲ」と略す）（アクセプター）を含む。前記ヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ＲＧＤ配列とそのリガンドの間の結合を阻害することができる。
【００１１】
本発明の一態様では、ＲＧＤ配列を免疫特異的に認識する前記ヒト化抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）ヒトＨ鎖の可変領域（本明細書では以後「Ｖ領域」と略す）に由来する少なくとも１つのＨ鎖ＦＲ（本明細書では以後「ＦＲＨ」と略す）、およびＲＧＤ配列を免疫特異的に認識する非ヒト抗体のＣＤＲＨの少なくとも１つに由来する少なくとも１つのＨ鎖ＣＤＲ（本明細書では以後「ＣＤＲＨ」と略す）を含む重鎖（本明細書では以後「Ｈ鎖」と略す）、または（ｉｉ）ヒトＬ鎖のＶ領域に由来する少なくとも１つのＬ鎖ＦＲ（本明細書では以後「ＦＲＬ」と略す）、およびＲＧＤ配列を免疫特異的に認識する非ヒト抗体のＣＤＲＬの少なくとも１つに由来する少なくとも１つのＬ鎖ＣＤＲ（本明細書では以後「ＣＤＲＬ」と略す）を含む軽鎖（本明細書では以後「Ｌ鎖」と略す）、または前述の（ｉ）および（ｉｉ）の両方を含む。
【００１２】
本発明の好ましい態様では、本発明のヒト化抗体またはその抗原結合断片は、（ｉ）ＶＨを含むＨ鎖であって、前記ＶＨが配列番号９２、９４または９６のアミノ酸配列を含むＨ鎖、または（ｉｉ）ＶＬを含むＬ鎖であって、前記ＶＬが配列番号９８または１００のアミノ酸配列を含むＬ鎖、または（ｉｉｉ）前述の（ｉ）および（ｉｉ）の両方を含む。本発明の別の態様では、本発明の前記ヒト化抗体またはその抗原結合断片は、配列番号９１、９２または９３のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号９７または９９のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。
【００１３】
本発明の好ましい態様では、前記ＶＨが配列番号９１、９２または９３のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号９７または９９のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。
【００１４】
本発明の別の態様では、前記ＶＨが配列番号９４のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号１００のアミノ酸配列を含む。
【００１５】
本発明の別の態様では、前記Ｈ鎖が配列番号２５または２７のアミノ酸配列を含み、前記Ｌ鎖が配列番号２９または３１のアミノ酸配列を含む。
【００１６】
本発明のさらなる態様では、前記Ｈ鎖が配列番号２５のアミノ酸配列を含み、前記Ｌ鎖が配列番号３１のアミノ酸配列を含む。
【００１７】
本発明は、ＲＧＤ配列を免疫特異的に認識する本発明のヒト化抗体またはその抗原結合断片のＨ鎖またはＬ鎖、または両方をコードするヌクレオチド配列を含むベクター、例えば発現ベクターをさらに提供する。このようなベクターでは、本発明のヌクレオチド配列は、１つまたは複数の制御エレメントに作動可能に連結することができる。本発明のヌクレオチド配列は、ＣＤＲが由来する非ヒトドナー抗体に固有のシグナルペプチド、または異種起源のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。
【００１８】
さらに、本発明は、本発明の核酸分子を含むベクターを含む、本発明の核酸分子を含む宿主細胞を提供する。本発明の一態様では、本発明は、本発明のヒト化Ｈ鎖をコードする第一の核酸分子および本発明のヒト化Ｌ鎖をコードする第二の核酸分子を含む単離宿主細胞を提供し、前記第一および第二の核酸分子は、生物学的に機能性がある本発明のヒト化抗体またはその抗原結合断片が発現されるような形式で、それぞれ制御エレメントに作動可能に連結する。
【００１９】
本発明は、本発明のヒト化抗体またはその抗原結合断片を調製するための方法であって、ヒト化抗体またはその抗原結合断片が発現されるような条件下で本発明の宿主細胞を培養すること、および生成したヒト化抗体を回収することを含む方法をさらに提供する。
【００２０】
本発明は、本発明のヒト化抗体またはその抗原結合断片の少なくとも１つを含む組成物をさらに提供する。さらに本発明は、本発明のヒト化抗体またはその抗原結合断片の少なくとも１つ、および薬学的に許容される担体を含む、ＲＧＤタンパク質と関係がある障害または疾患を予防または治療するための医薬組成物を提供する。前記組成物のいずれかは、障害または疾患を相加的または相乗的に改善することができる別の活性化合物をさらに含むことができる。前記活性化合物には、抗炎症性化合物、化学療法化合物などがあるが、これらだけには限られない。前記活性化合物は、低分子化合物および抗体またはその抗原結合断片、ヒトα４インテグリン特異的抗体またはヒトα９インテグリン特異的抗体なども含む。
【００２１】
別の態様では、本発明は、ＲＧＤタンパク質と関係または関与がある障害または疾患を予防または治療するための方法を提供し、前記方法は本発明のヒト化抗体またはその抗原結合断片の少なくとも１つを予防または治療有効量、その必要性がある対象に投与することを含む。このような用途のため、本発明のヒト化抗体またはその抗原結合断片を、ヒト化抗体またはその抗原結合断片の生物学的効果を高める治療成分と結合させることが可能である。このような治療成分の例には、別の抗体、細胞増殖抑制または細胞致死性である細胞毒素、放射性元素、および／または抗炎症剤、抗生物質を含めた他の治療剤などがある。
【００２２】
さらに別の態様では、本発明は、ＲＧＤタンパク質と関係または関与がある対象中の障害または疾患を診断するための方法を提供し、前記方法は診断有効量の本発明のヒト化抗体またはその抗原結合断片を、検査する対象に投与することを含む。このような診断用途のため、本発明のヒト化抗体を、放射性元素などの検出可能マーカーで標識することができる。
【００２３】
３．１．定義
本明細書で使用する用語「抗体」は、所望の抗原またはＲＧＤ配列などの所望の配列と免疫特異的に結合することができる抗体分子を指し、これは抗体分子全体を包含し、抗体の抗原結合断片を含んだ抗体の断片を包含することができる。
【００２４】
本明細書で使用する用語「抗原結合断片」は、標的ポリペプチド、タンパク質または配列、特にＲＧＤ配列と免疫特異的に結合する能力を保持する抗体の任意の断片を指し、これは単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合Ｆｖｓ、および標的ポリペプチド、タンパク質または配列と特異的に結合するＶＬおよび／またはＶＨまたはＣＤＲのいずれかを含有する断片を含む。したがって、ヒト化抗体のこのような抗原結合断片は、部分または完全長ヒト定常領域を含むかまたは含まない可能性がある。前に記載した抗体断片を得るための様々な方法は当技術分野でよく知られている。
【００２５】
本明細書で使用する用語「免疫特異的に認識する」は、標的ポリペプチド、タンパク質または配列、特にヒトＲＧＤ配列と特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の能力を指す。このような抗体が、他のポリペプチドまたはタンパク質と非特異的に結合することはない。しかしながら、標的ポリペプチドまたはタンパク質（例えば、ＲＧＤタンパク質）と免疫特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、他の抗原と交差反応する可能性がある。例えば、ヒトＲＧＤタンパク質を免疫特異的に認識する本発明のヒト化抗体またはその抗原結合断片は、マウスＲＧＤタンパク質と交差反応する可能性がある。ＲＧＤタンパク質を免疫特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片は、他の抗原と交差反応しないことが好ましい。
【００２６】
本明細書で使用する用語「ヒト供給源由来」または「非ヒト供給源由来」は、そのアミノ酸配列がそれぞれヒト抗体または非ヒト抗体の対応する部分に由来する抗体部分を指す。
【００２７】
本明細書で使用する用語「アクセプター配列」は、通常非ヒト抗体であるドナー抗体由来のＣＤＲに関するアクセプターとして働くヒト抗体ＶＨまたはＶＬ由来のＦＲの、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を指す。
【００２８】
本発明を例示する目的で、図１〜２７は現在好ましい形態を反映する。しかしながら、本発明が図１〜２７中に示す通りの形に限られないことは理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】推定アミノ酸配列と共に示すマウス３３Ｅ１０ＶＨｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す図である。アミノ酸残基は一文字コードで示す。シグナルペプチド配列は斜字体である。成熟ＶＨのＮ末端アミノ酸残基（Ｅ）には二重下線を引く。Kabat et al.（Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, ＮＩＨ公開番号９１−３２４２、米国厚生省、１９９１）の定義に従うＣＤＲ配列には下線を引く。
【図２】推定アミノ酸配列と共に示すマウス３３Ｅ１０ＶＬｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す図である。アミノ酸残基は一文字コードで示す。シグナルペプチド配列は斜字体である。成熟ＶＬのＮ末端アミノ酸残基（Ｄ）には二重下線を引く。Kabat et al.（1991）の定義に従うＣＤＲ配列には下線を引く。
【図３】推定アミノ酸配列と共に示すＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位（下線）と隣接する設計３３Ｅ１０ＶＨ遺伝子のヌクレオチド配列を示す図である。アミノ酸残基は一文字コードで示す。シグナルペプチド配列は斜字体である。成熟ＶＨのＮ末端アミノ酸残基（Ｅ）には二重下線を引く。Kabat et al.（1991）の定義に従うＣＤＲ配列には下線を引く。イントロン配列は斜字体である。
【図４】推定アミノ酸配列と共に示すＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩ部位（下線）と隣接する設計３３Ｅ１０ＶＬ遺伝子のヌクレオチド配列を示す図である。アミノ酸残基は一文字コードで示す。シグナルペプチド配列は斜字体である。成熟ＶＬのＮ末端アミノ酸残基（Ｄ）には二重下線を引く。Kabat et al.（1991）の定義に従うＣＤＲ配列には下線を引く。イントロン配列は斜字体である。
【図５】キメラおよびヒト化３３Ｅ１０抗体用の発現ベクター（集合的に「発現ベクター」）の概略構造を示す図である。頂上部のＳａｌＩ部位から時計回りに進み、プラスミドは、抗体重鎖遺伝子の転写を開始するためのヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）主要即時初期プロモーターおよびエンハンサー（ＣＭＶプロモーター）で始まる重鎖転写単位を含有する。ＣＭＶプロモーターに、ＶＨエクソン、ＣＨ１を含むヒトγ−１重鎖定常領域を含有するゲノム配列、ヒンジ、介在イントロンを有するＣＨ２およびＣＨ３エクソン、およびＣＨ３エクソンの後にポリアデニル化部位が続く。重鎖遺伝子配列の後、軽鎖転写単位が、ＣＭＶプロモーターで始まり、ＶＬエクソン、およびそれに先行するイントロンの一部分を有するヒトｋａｐｐａ鎖定常領域エクソン（ＣＬ）を含有するゲノム配列、およびＣＬエクソン後のポリアデニル化部位が続く。次いで軽鎖遺伝子に、ＳＶ４０初期プロモーター（ＳＶ４０プロモーター）、大腸菌（E.coli）キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ）、およびＳＶ４０ポリアデニル化部位（ＳＶ４０ポリ（Ａ）部位）を含有するセグメントが続く。最後に、プラスミドは、細菌複製起点（ｐＵＣｏｒｉ）およびβ−ラクタマーゼ遺伝子（βラクタマーゼ）を含むプラスミドｐＵＣ１９の一部分を含有する。関連制限酵素部位の位置をこの図中に示す。
【図６】３３Ｅ１０ＶＨ、ヒト化３３Ｅ１０（Ｈｕ３３Ｅ１０）ＶＨおよびヒトアクセプターＵ０３４００（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号）のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。アミノ酸残基は一文字コードで示す。配列の上の数字はKabat et al.（1991）に従う位置を示す。Kabat et al.（Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, ＮＩＨ公開番号９１−３２４２、米国厚生省、１９９１）によって定義されたＣＤＲ配列には下線を引く。二重下線を引いた残基はＣＤＲと接触したと予想し、マウス残基はヒト化型でこれらの位置に保持された。Ｕ０３４００中のＣＤＲ残基はこの図中では省略する。
【図７】３３Ｅ１０ＶＬ、ヒト化３３Ｅ１０（Ｈｕ３３Ｅ１０）ＶＬおよびヒトアクセプターＸ７２４５２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号）のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。アミノ酸残基は一文字コードで示す。配列の上の数字はKabat et al.（1991）に従う位置を示す。Kabat et al.（1991）によって定義したＣＤＲ配列には下線を引く。Ｘ７２４５２中のＣＤＲ残基はこの図中では省略する。
【図８】Ｈｕ３３Ｅ１０ＶＨ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチドを示す図である。
【図９】Ｈｕ３３Ｅ１０ＶＬ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチドを示す図である。
【図１０】Ｈｕ３３Ｅ１０ＶＨ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチドを示す図である。矢印はそれぞれのオリゴヌクレオチドの位置および方向（５’から３’）を示す。アミノ酸残基は一文字コードで示す。
【図１１】Ｈｕ３３Ｅ１０ＶＬ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチドを示す図である。矢印はそれぞれのオリゴヌクレオチドの位置および方向（５’から３’）を示す。アミノ酸残基は一文字コードで示す。
【図１２】推定アミノ酸配列と共に示すＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位（下線）と隣接するＨｕ３３Ｅ１０ＶＨ１遺伝子のヌクレオチド配列を示す図である。アミノ酸残基は一文字コードで示す。シグナルペプチド配列は斜字体である。成熟ＶＨのＮ末端アミノ酸残基（Ｅ）には二重下線を引く。Kabat et al.（1991）の定義に従うＣＤＲ配列には下線を引く。イントロン配列は斜字体である。
【図１３】推定アミノ酸配列と共に示すＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩ部位（下線）と隣接するＨｕ３３Ｅ１０ＶＬ１遺伝子のヌクレオチド配列を示す図である。アミノ酸残基は一文字コードで示す。シグナルペプチド配列は斜字体である。成熟ＶＬのＮ末端アミノ酸残基（Ｄ）には二重下線を引く。Kabat et al.（1991）の定義に従うＣＤＲ配列には下線を引く。イントロン配列は斜字体である。
【図１４】推定アミノ酸配列と共に示すＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩ部位（下線）と隣接するＨｕ３３Ｅ１０ＶＬ６遺伝子のヌクレオチド配列を示す図である。シグナルペプチドコード領域中のスプライシングドナー部位を排除するためのサイレント突然変異には二重下線を引く。アミノ酸残基は一文字コードで示す。シグナルペプチド配列は斜字体である。成熟ＶＬのＮ末端アミノ酸残基（Ｄ）には二重下線を引く。Kabat et al.（1991）の定義に従うＣＤＲ配列には下線を引く。イントロン配列は斜字体である。
【図１５Ａ−Ｂ】ｈＯＰＮ５−ＢＳＡとキメラおよびヒト化３３Ｅ１０ＩｇＧｌ／κ抗体の結合のＥＬＩＳＡ分析を示す図である。精製Ｃｈ３３Ｅ１０、Ｈｕ３３Ｅ１０−ＶＨｌ／ＶＬ６、Ｈｕ３３Ｅ１０−ＶＨ５／ＶＬ６およびＨｕ３３Ｅ１０−ＶＨ７／ＶＬ６（図１５Ａ）ならびにＣｈ３３Ｅ１０およびＨｕ３３Ｅ１０−ＶＨ７．８／ＶＬ６（図１５Ｂ）を、１００μｇ／ｍｌで始めて連続２倍希釈で、ｈＯＰＮ５−ＢＳＡとの結合に関して様々な濃度において試験した。実験は二連で実施した。
【図１６】推定アミノ酸配列と共に示すＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位（下線）と隣接するＨｕ３３Ｅ１０ＶＨ５遺伝子のヌクレオチド配列を示す図である。アミノ酸残基は一文字コードで示す。シグナルペプチド配列は斜字体である。Kabat et al.（1991）の定義に従うＣＤＲ配列には下線を引く。イントロン配列は斜字体である。二重下線を引いたアミノ酸残基はＶＨ１との違いを示す。
【図１７】推定アミノ酸配列と共に示すＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位（下線）と隣接するＨｕ３３Ｅ１０ＶＨ７遺伝子のヌクレオチド配列を示す図である。アミノ酸残基は一文字コードで示す。シグナルペプチド配列は斜字体である。Kabat et al.（1991）の定義に従うＣＤＲ配列には下線を引く。イントロン配列は斜字体である。二重下線を引いたアミノ酸残基はＶＨ１との違いを示す。
【図１８】推定アミノ酸配列と共に示すＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位（下線）と隣接するＨｕ３３Ｅ１０ＶＨ７．８遺伝子のヌクレオチド配列を示す図である。アミノ酸残基は一文字コードで示す。シグナルペプチド配列は斜字体である。Kabat et al.（1991）の定義に従うＣＤＲ配列には下線を引く。イントロン配列は斜字体である。二重下線を引いたアミノ酸残基はＶＨ１との違いを示す。
【図１９】３３Ｅ１０ＶＬ、Ｈｕ３３Ｅ１０ＶＬｖ２およびヒトアクセプターＭ２９４６７（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号）のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。アミノ酸残基は一文字コードで示す。配列の上の数字はKabat et al.（1991）に従う位置を示す。Kabat et al.（1991）によって定義したＣＤＲ配列には下線を引く。二重下線を引いた残基はＣＤＲと接触したと予想し、マウス残基はヒト化型でこれらの位置に保持された。Ｍ２９４６７中のＣＤＲ残基はこの図中では省略する。
【図２０】推定アミノ酸配列と共に示すＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩ部位（下線）と隣接するＨｕ３３Ｅ１０ＶＬｖ２遺伝子のヌクレオチド配列を示す図である。アミノ酸残基は一文字コードで示す。シグナルペプチド配列は斜字体である。成熟ＶＬのＮ末端アミノ酸残基（Ｄ）には二重下線を引く。Kabat et al.（1991）の定義に従うＣＤＲ配列には下線を引く。イントロン配列は斜字体である。
【図２１Ａ−Ｂ】ｈＯＰＮ５−ＢＳＡとＣｈ３３Ｅ１０およびＨｕ３３Ｅ１０−ＶＨ７／ＶＬｖ２ＩｇＧｌ／κ抗体の結合のＥＬＩＳＡ分析を示す図である。精製Ｃｈ３３Ｅ１０およびＨｕ３３Ｅ１０−ＶＨ７／ＶＬｖ２抗体を、２００μｇ／ｍｌ（図２１Ａ）または１００μｇ／ｍｌ（図２１Ｂ）で始めて連続２倍希釈で、ｈＯＰＮ５−ＢＳＡとの結合に関して様々な濃度において試験した。二連での２つの独立した実験の結果を示す（図２１Ａおよび２１Ｂ）。
【図２２】Ｈｕ３３Ｅ１０重鎖および軽鎖ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅および配列決定に使用したオリゴヌクレオチドの配列を示す図である。
【図２３】推定アミノ酸配列と共に示すＮＳ０−Ｈｕ３３Ｅ１０−４およびＮＳ０−Ｈｕ３３Ｅ１０−６において発現されるＶＨ７およびγ−１重鎖定常領域に関するコード領域のヌクレオチド配列を示す図である。アミノ酸残基は一文字コードで示す。終結コドンは「・」によって示す。
【図２４】推定アミノ酸配列と共に示すＮＳ０−Ｈｕ３３Ｅ１０−５において発現されるＶＨ７．８およびγ−１重鎖定常領域に関するコード領域のヌクレオチド配列を示す図である。アミノ酸残基は一文字コードで示す。終結コドンは「・」によって示す。
【図２５】推定アミノ酸配列と共に示すＮＳ０−Ｈｕ３３Ｅ１０−４およびＮＳ０−Ｈｕ３３Ｅ１０−５において発現されるＶＬ６およびｋａｐｐａ軽鎖定常領域に関するコード領域のヌクレオチド配列を示す図である。アミノ酸残基は一文字コードで示す。終結コドンは「・」によって示す。
【図２６】推定アミノ酸配列と共に示すＮＳ０−Ｈｕ３３Ｅ１０−６において発現されるＶＬｖ２およびｋａｐｐａ軽鎖定常領域に関するコード領域のヌクレオチド配列を示す図である。アミノ酸残基は一文字コードで示す。終結コドンは「・」によって示す。
【図２７】ヒト化抗ＯＰＮ抗体が、ｈＯＰＮ５−ＢＳＡとＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓの接着を阻害したことを示す図である。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ（４×１０４細胞／ウェル）を、様々な濃度の抗体、ヒトＩｇＧ、Ｃｈ３３Ｅ１０、ＥＪ３−１−１（Ｈｕ３３Ｅ１０−ＶＨ７．８／ＶＬ６）、Ｒ３−１（Ｈｕ３３Ｅ１０−ＶＨ７／ＶＬ６）、ＳＰ２−１（Ｈｕ３３Ｅ１０−ＶＨ７／ＶＬｖ２）、およびｍ３３Ｅ１０の存在下において、ｈＯＰＮ５−ＢＳＡ（２ｍｇ／ｍｌ）でプレコーティングした９６ウェルプレートに接着させた。データは三連の実験の平均として表す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
５．１  ＲＧＤ配列に対する抗体の調製
ＲＧＤ配列を免疫特異的に認識する抗体は、当技術分野で知られている任意の適切な方法によって作製することができる。
【００３１】
ＲＧＤタンパク質またはペプチドは本発明の細胞接着「ＲＧＤ」配列（本明細書では以後「ＲＧＤペプチド」と略す）を含み、または（１）ＲＧＤタンパク質を発現するヒトＥＣＭに由来、またはこれらのＥＣＭが存在する全組織に由来してよく、（２）細菌、酵母、動物細胞などの細胞系などへのトランスフェクションによるＲＧＤタンパク質またはＲＧＤペプチドをコードするＤＮＡ（好ましくはｃＤＮＡ）の発現によって得られる組換えタンパク質またはペプチドであってよく、または（３）合成タンパク質またはペプチドであってよい。
【００３２】
本発明で抗原として使用するＲＧＤペプチドは、免疫処置によってＲＧＤ配列に対する抗体を産生することができる。ＲＧＤペプチドは、マウスＥＣＭタンパク質の細胞接着配列であるＲＧＤペプチドアミノ酸配列ＣＶＤＶＰＮＧＲＧＤＳＬＡＹＧＬＲ（配列番号７１）を含む。ＲＧＤタンパク質またはＲＧＤペプチドは、ＯＰＮ、ビトロネクチン、フィブロネクチン、フォンヴィレブランド因子、コラーゲン、ラミニン、テナシン、フィブリノゲン、トロンボスポンジン、およびこれらの断片を含むＲＧＤなどを含む。アミノ酸の置換、欠失、修飾および付加などの人為的または天然変異を、タンパク質またはペプチドがＲＧＤ−配列を含む限り、前記タンパク質または前記ペプチドに施すことができる。変異体タンパク質またはペプチドは、複数のアミノ酸、好ましくは１〜１０個のアミノ酸、およびより好ましくは１〜数個（例えば、１〜５個）のアミノ酸が置換、欠失、修飾、付加または挿入されたアミノ酸配列を含むことができる。
【００３３】
本明細書では、ＲＧＤペプチドは、少なくとも約５個のアミノ酸、好ましくは約５〜５０個のアミノ酸、およびより好ましくは約１０〜２０個のアミノ酸を含む。本発明における抗原としてのＲＧＤタンパク質またはＲＧＤペプチドは、化学合成法、細胞培養法、遺伝子組換え法およびその適切な変形などの、当技術分野でよく知られている方法を使用することによって産生することができる。例えば、ＲＧＤペプチドは、適切にプロテアーゼでＥＣＭタンパク質を切断することによって得ることができる。ＲＧＤタンパク質またはＲＧＤペプチドは、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ、サルおよびヒトなどの哺乳動物に由来してよい。当技術分野でよく知られている任意の方法を、抗ＲＧＤ抗体の調製に使用することができるＲＧＤタンパク質またはＲＧＤペプチドの調製に使用することができる。
【００３４】
変異体ポリペプチドを生成するための方法の例には、合成オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発法（ギャップデュプレックス法）、硝酸塩または亜硝酸塩を用いた処理によるアトランダムな点突然変異の導入を含む点突然変異誘発法、Ｂａｌ３１酵素、または他の酵素を用いた欠失変異体の調製を含む方法、カセット突然変異誘発法、リンカースキャニング法、ミスインコーポレーション法、ミスマッチプライマー法、ＤＮＡセグメント合成法などがある。
【００３５】
ＲＧＤペプチドは、チログロビン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）またはウシグロブリン、好ましくはチログロビンなどの、他の生体高分子と結合させることが可能である。生体高分子にＲＧＤペプチドを結合させるための方法は、活性エステル基およびマレイミド基を有する結合試薬などのカップリング試薬を使用することによって（活性エステル基はタンパク質またはペプチドのアミノ基と結合し、マレイミド基はタンパク質またはペプチドのチオール基と結合する、S.yoshirake et al., Eur.J.Biochem., 101, 395-399, 1979）、混成無水物法（B.F.Erlanger et al., J.Biol. Chem., 234, 1090-1094, 1954）を使用することによって、または活性エステル法（A.E.Karu et al., J.Agric.Food Chem., 42, 301-309, 1994）を使用することによって実施することができる。生体高分子にＲＧＤペプチドを結合させるための方法は、カップリング試薬を使用することによって実施することが好ましい。
【００３６】
抗原として、ＲＧＤタンパク質またはＲＧＤペプチドを過剰発現する細胞自体を使用することもできる。ＲＧＤタンパク質またはＲＧＤペプチドを過剰発現する細胞は、当技術分野でよく知られている組換えＤＮＡ技術によって調製することができる。
【００３７】
前に記載したように調製した適切な抗原を使用して、ＲＧＤ配列に特異的な抗体は、当技術分野でよく知られている様々な方法によって調製することができる。ＲＧＤ配列に対するポリクローナル抗体は、当技術分野でよく知られている様々な手順によって産生することができる。例えば、対象の抗原を、ウサギ、マウス、ラットなどだけには限られないが、これらを含めた様々な宿主動物に投与して、抗原に特異的なポリクローナル抗体を含有する抗血清の産生を誘導することができる。フロイント（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニックポリマー、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールなどの表面活性物質、およびＢＣＧ（カルメットゲラン桿菌（Bacille Calmette-Guerin）およびコリネバクテリウムパルバム（Corynebacterium parvum）などのヒトにおそらく有用なアジュバントだけには限られないが、これらを含めた様々なアジュバントを使用して、宿主の種類に応じて免疫応答を増大することができる。このようなアジュバントも当技術分野でよく知られている。
【００３８】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換えおよびファージディスプレイ技術、またはこれらの組合せの使用を含めた、当技術分野で知られている広く様々な技術を使用することによって調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野で知られており例えば（いずれもその全容を参照によって本明細書に組み込む）Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.1988); Hammerling, et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, pp.563-681 (Elsevier, N.Y, 1981)中で教示された技法を含めた、ハイブリドーマ技法を使用することによって産生することができる。本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限られない。用語「モノクローナル抗体」は単一クローンに由来する抗体を指し、それが産生される方法に限られず、任意の真核生物、原核生物またはファージクローンを含む。
【００３９】
ハイブリドーマ技術を使用して特異的抗体を産生しスクリーニングするための方法は通常のことであり、当技術分野でよく知られている。非制限的な例では、対象の抗原またはこのような抗原を発現する細胞でマウスを免疫処置することができる。免疫応答を検出した後、例えば、抗原に特異的な抗体をマウス血清中で検出した後、マウスの脾臓を採取し脾臓細胞を単離した。次いで脾臓細胞は、よく知られている技法によって任意の適切なミエローマ細胞（例えば、Ｐ３Ｕ１、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１、Ｐ３ＮＳ１−Ａｇ４、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−６５３など）と融合させる。ハイブリドーマを選択し、限界希釈によってクローニングする。次いでハイブリドーマクローンを、当技術分野で知られている方法によって、抗原と結合することができる抗体を分泌する細胞に関してアッセイする。高レベルの抗体を一般に含有する腹水は、陽性ハイブリドーマクローンをマウスに腹腔内接種することによって生成することができる。
【００４０】
特異的エピトープを認識する抗体断片は知られている技法によって作製することができる。例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、パパイン（Ｆａｂ断片産生用）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片産生用）などの酵素を使用して、免疫グロブリン分子のタンパク質分解切断によって産生することができる。Ｆ（ａｂ’）２断片は完全Ｌ鎖、およびＨ鎖のＶ領域、ＣＨ１領域およびヒンジ領域を含有する。
【００４１】
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、抗体の合成に関して当技術分野で知られている任意の方法によって、特に化学合成によって、または好ましくは組換え発現技法によって産生することができる。
【００４２】
抗体をコードするヌクレオチド配列は、当業者が入手可能な任意の情報から得ることができる（すなわちＧｅｎｂａｎｋ、文献から、または通常のクローニングおよび配列分析によって）。特定の抗体またはそのエピトープ結合断片をコードする核酸を含有するクローンが入手可能ではないが、抗体分子またはそのエピトープ結合断片の配列が知られている場合、免疫グロブリンをコードする核酸を、配列の５’末端とハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用したＰＣＲ増幅によって、または特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用したクローニングによって、化学合成して、または適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、またはそこから作製したｃＤＮＡライブラリー、または任意の組織、もしくは抗体発現用に選択したハイブリドーマ細胞などの抗体を発現する細胞から単離した核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ）から得て、例えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡクローンを同定することができる。ＰＣＲにより作製した増幅核酸遺伝子は、当技術分野でよく知られている任意の方法を使用して、次いで複製可能クローニングベクターにクローニングすることができる。
【００４３】
５．２  組換え抗体の調製
抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作に関して当技術分野でよく知られている方法、例えば組換えＤＮＡ技法、部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲなどを使用することによって操作することができる（例えば、いずれもその全容を参照によって本明細書に組み込む、Sambrook et al., 上記、およびAusubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY中に記載された技法を参照）。抗体にはエピトープ結合ドメイン領域または任意の部分にアミノ酸の置換、欠失および／または挿入などの突然変異を導入して、生物活性を向上または低減することができる。
【００４４】
抗体をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターは、抗体またはその抗原結合断片の組換え発現に使用することができる。抗体またはその抗原結合断片の産生用の、抗体分子、抗体またはその一部分のＨ鎖および／またはＬ鎖をコードするヌクレオチド配列を含むベクターは、前のセクションで論じたように当技術分野でよく知られている技法を使用して組換えＤＮＡ技術によって産生することができる。当業者によく知られている方法を使用して、抗体またはその抗原結合断片、コード配列、ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技法、合成技法、およびｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子組換えを含む。ＶＨ、ＶＬ、ＶＨとＶＬの両方、ＶＨおよび／またはＶＬの抗原結合断片、または抗体の１つまたは複数のＣＤＲをコードするヌクレオチド配列は、発現用のこのようなベクターにクローニングすることができる。このような配列は、原型抗体に固有または異種であり得るシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドと融合することができる。次いでこのように調製した発現ベクターを、抗体の発現に適した宿主細胞に導入することができる。したがって本発明は、ＲＧＤ配列を免疫特異的に認識するヒト化抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を含む。
【００４５】
宿主細胞は本発明の２つの発現ベクターでコトランスフェクトすることができ、この場合第一のベクターはＨ鎖由来ポリペプチドをコードし第二のベクターはＬ鎖由来ポリペプチドをコードする。２つのベクターは、Ｈ鎖およびＬ鎖ポリペプチドの等しい発現を可能にする同一の選択可能マーカー、または両プラスミドの維持を確実にするための異なる選択可能マーカーを含有することができる。あるいは、Ｈ鎖およびＬ鎖ポリペプチドの両方をコードし発現することができる、１つのベクターを使用することができる。Ｈ鎖およびＬ鎖のコード配列はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含むことができる。
【００４６】
本発明の他の態様では、当技術分野で知られている様々なファージディスプレイ法を使用して抗体を作製することもできる。ファージディスプレイ法では、機能的抗体ドメインを、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保持するファージ粒子の表面上に提示する。本発明の特定の態様では、このようなファージを利用して、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現されるＦａｂおよびＦｖまたはジスルフィド結合安定化Ｆｖなどの抗原結合ドメインを提示することができる。対象の抗原と結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて、例えば標識抗原または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉した抗原を使用して、選択または同定することができる。これらの方法中で使用するファージは、典型的にはｆｄおよびＭ１３を含めた繊維状ファージである。抗原結合ドメインは、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかとの組換え融合タンパク質として発現される。本発明の免疫グロブリン、またはその断片を作製するために使用することができるファージディスプレイ法の例には、その各々を参照によってそれらの全容を本明細書に組み込む、Brinkman et al., J.Immunol.Methods, 182: 41-50, 1995; Ames et al., J.Immunol.Methods, 184: 177-186, 1995; Kettleborough et al., Eur.J.Immunol., 24: 952-958, 1994; Persic et al., Gene, 187: 9-18, 1997; Burton et al., Advances in Immunology, 57: 191-280, 1994、ＰＣＴ出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４、ＰＣＴ出願ＷＯ９０／０２８０９、ＷＯ９１／１０７３７、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９５／１５９８２、ＷＯ９５／２０４０１、ならびに米国特許第５，６９８，４２６号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，８２１，０４７号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６，６３７号、同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２７号、同第５，７３３，７４３および同第５，９６９，１０８号中に開示された方法がある。
【００４７】
前述の参照文献中に記載されたように、ファージ選択後、例えば以下で詳細に記載するように、ファージ由来の領域をコードする抗体を単離し、これらを使用してヒト抗体、または任意の他の望ましい断片を含めた完全抗体を作製し、哺乳動物細胞、昆虫細胞、宿主細胞、酵母、および細菌を含めた任意の望ましい宿主中で発現させることが可能である。例えば、（その各々を参照によってそれらの全容を本明細書に組み込む）ＰＣＴ公開ＷＯ９２／２２３２４、Mullinax et al., BioTechniques, 12(6): 864-869, 1992およびSawai et al., AJRI, 34: 26-34, 1995およびBetter et al., Science, 240: 1041-1043, 1988中に開示された方法などの当技術分野で知られている方法を使用して、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ）２断片を組換えによって産生するための技法を利用することもできる。単鎖Ｆｖおよび抗体を産生するために使用することができる技法の例には、米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号、Huston et al., Methods in Enzymology, 203: 46-88, 1991; Shu et al., PNAS, 90: 7995-7999, 1993およびSkerra et al., Science, 240: 1038-1040, 1988中に記載された技法がある。
【００４８】
本発明の抗体分子を前に記載した任意の方法によって産生した後、次いでそれを、免疫グロブリン分子の精製に関して当技術分野で知られている任意の方法によって、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特にプロテインＡまたはプロテインＧ精製後の特異的抗原に対する親和性によって、およびサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、差次的溶解度によって、またはタンパク質を精製するための、任意の他の標準的技法によって精製することができる。さらに、本発明の抗体またはその断片を、本明細書に記載する異種ポリペプチド配列または当技術分野で知られている他の配列と融合させて、精製を容易にすることができる。
【００４９】
ヒトにおける抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ用途およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出アッセイを含めた、いくつかの用途に関して、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を使用することが好ましい可能性がある。キメラ抗体およびヒト化抗体は以下のセクション５．３中で詳細に論じる。
【００５０】
他の化合物または異種ポリペプチドと融合または結合した抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏイムノアッセイにおいて、精製法（例えば、親和性クロマトグラフィー）、およびｉｎ  ｖｉｖｏ治療または診断用途において使用することができる。例えば、参照によってそれらの全容を本明細書に組み込む、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／２１２３２、ＥＰ４３９，０９５、Naramura et al., Immunol.Lett., 39: 91-99, 1994、米国特許第５，４７４，９８１号、Gillies et al., PNAS, 89: 1428-1432, 1992、およびFell et al., J.Immunol., 146: 2446-2452, 1991を参照。例えば、知られている方法または市販のキット（例えば、ビオチン標識、ＦＩＴＣ標識、ＡＰＣ標識）を使用して様々な方法で、抗体を標識することができる。別の例として、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体の生物学的効果を高める治療成分に、抗体を結合させることが可能である。このような治療成分の例には、別の抗体、細胞増殖抑制または細胞致死性である細胞毒素、放射性元素、および／または抗炎症剤、抗生物質を含めた他の治療剤などがある。本発明では、ヒト化抗ＲＧＤ抗体を別の抗体と結合させて二重特異性抗体を形成することが可能である。別の例として、本発明のヒト化抗体を、ｉｎ  ｖｉｖｏ診断用途に、放射性元素などの検出可能マーカーで標識することができる。
【００５１】
５．３  キメラおよびヒト化抗体
キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子、マウスモノクローナル抗体に由来するＶ領域およびヒト免疫グロブリン由来の定常領域を有する抗体などである。キメラ抗体を産生するための方法は当技術分野で知られている。例えば、参照によってそれらの全容を本明細書に組み込む、Morrison, Science, 229: 1202, 1985; Oi et al., BioTechniques, 4: 214 1986; Gillies et al., J. Immunol.Methods, 125: 191-202, 1989、米国特許第５，８０７，７１５号、同第４，８１６，５６７号、および同第４，８１６，３９７号を参照。
【００５２】
ヒト化抗体は、望ましい抗原と結合し、非ヒト種由来の１つまたは複数のＣＤＲおよびヒト免疫グロブリン分子由来の１つまたは複数のＦＲを含有するＶ領域を含む分子である。非ヒト抗体をヒト化するための典型的な方法は、いずれもその全容を参照によって本明細書に組み込む、Queen et al., 1989, Proc.Natl.Acad. Sci.USA86: 10029-10033および米国特許第５，５８５，０８９号および同第５，６９３，７６２号による参照文献、Riechmann et al., Nature, 332: 323, 1988による参照文献、およびTsurushita et al., Methods 36: 69-83, 2005による参照文献などの、様々な参照文献中に記載されている。例えば、Tsurushita et al.（2005、上記、本明細書では以後「Tsurushita」）による参照文献は、Queen et al.（1989、上記）により本来開発された抗体−ヒト化法に基づく、マウスモノクローナル抗体をヒト化するための実用的で有益なプロトコールを与える。Tsurushita中に開示された一般的プロトコールは以下で簡潔に要約する。
【００５３】
５．３．１  ヒト化抗体を調製するための一般的プロトコール
マウスＶ遺伝子のクローニングおよび配列決定
様々な方法が、標的マウスモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングするのに利用可能である。例えば、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ増幅キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ）またはＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を使用した５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）法が一般に使用されている。５’ＲＡＣＥ用の遺伝子特異的プライマーは、それがＶＨおよびＶＬのすぐ下流に結合することができるように、標的モノクローナル抗体のＨ鎖およびＬ鎖のアイソタイプに基づいて調製することができる。したがって、５’ＲＡＣＥプライマーは、γ１、γ２ａ、γ２ｂまたはγ３などのマウスにおけるそれぞれの亜型に特異的であるように設計することができる。あるいは、全ての亜型に共通なプライマーを、亜型間のコンセンサスまたは非常に相同的な領域に基づいて設計することができる。Tsurushita中では、以下の５’ＲＡＣＥプライマーが例として開示される：
（ｉ）５’−ＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＴＧＡＴＧＧ−（配列番号８２）（マウスγ１、γ２ａ、γ２ｂおよびγ３Ｈ鎖のクローニング用）
（ｉｉ）５’−ＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣ−（配列番号８３）（マウスｋＬ鎖のクローニング用）。
【００５４】
ＰＣＲ増幅したＶ領域遺伝子断片は、例えばＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してプラスミドベクターに直接クローニングすることができ、それらのＤＮＡ配列を決定することができる。得られた配列は、例えばモデル２４１プロテインシークエンサー（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ、ＣＡ）を使用して、例えばそれらのコードアミノ酸配列と、Ｎ末端アミノ酸配列決定により決定した標的モノクローナル抗体の配列を比較することによって確認しなければならない。典型的には、例えばエドマン分解による、標的抗体のＮ末端における少なくとも１５〜２０アミノ酸残基の決定は、クローニングＤＮＡ配列の真正を確認するのに十分である。Tsurushitaは、マウスにおける２つの最も一般的なＮ末端アミノ酸の１つであるグルタミンがＮ末端アミノ酸であるとき、それがピログルタミンに変換されてＮ末端における配列決定を阻害する可能性があることを警告する。その場合、Ｎ末端を脱保護して配列を得ることが必要である。
【００５５】
Ｖ領域の三次元モデリング
ＶＨおよびＶＬの配列に基づいて、ＣＤＲの立体配座構造を維持するのにおそらく重要である標的抗体のフレームワーク残基を、例えばR.Levy et al., 1989, Biochemistry28: 7168-7175によって記載された方法によって、およびB.Zilber et al., 1990, Biochemistry29: 10032-10041によって記載された方法によって最初に同定する。典型的には、ＶＨおよびＶＬのそれぞれは１４個の構造上有意なセグメントに分けられ、これらは免疫グロブリンスーパーファミリーのドメイン構造を含むβ鎖およびループ様構造である。標的抗体由来の各セグメントのアミノ酸配列を、ＰＤＢデータベースにおける知られている構造の対応する抗体セグメントと合わせる（H.M.Berman et al., 2000, Nucleic Acids Res.28: 235-342参照）。多重配列アラインメントによって、標的セグメントのそれぞれと最高の配列相同性を有する対応するセグメントを選択し、Ｖ領域の三次元モデルを構築する。構造を最適化するために、このモデルを多サイクルの共役勾配法によるエネルギー最小化に施す（例えば、ENCADを使用して、またはPress et al., 1990, "Numerical Recipes, Cambridge University Press, Cambridgeによって記載されたように、Weiner et al., 1981, J.Comp.Chem.2: 287-303によるAMBER、BioMolecularModellingで利用可能な3D-JIG-SAW、またはCancer Research UKによって運営される「BMM」ウェブサイト、またはSwiss Institute of Bioinformatics, Genevaによって運営されるExPASy Proteomics Serverウェブサイトで利用可能なSWISS-MODEL）。
【００５６】
ヒトフレームワークの選択
Ｖ領域の構造のモデル化と並行して、それぞれマウスＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡクローニングから推定したアミノ酸配列を、データベース、例えばＫａｂａｔデータベース（Johnson et al., 2000, Nucleic Acids Res.28: 214-218を参照）、ＧｅｎＢａｎｋなどにおけるヒトＶ領域の配列と比較する。マウスの配列と少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも９５％同一の全体配列同一率を有するヒトＦＲは、例えばＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Gusfield, 1997, "Algorithms on Strings, Trees, and Sequences", Cambridge University Press, Cambridgeによる）、またはＢＬＡＳＴ（Karlin et al., 1990, Proc.Natl.Acad.Sci.USA87: 2264-2268による）などを使用して検索することができる。これらのヒトの配列は、ｃＤＮＡベースおよびタンパク質由来配列に基づいてよいが、しかしながら、生殖細胞系の使用が好ましいことが多い。ｃＤＮＡベース、タンパク質由来配列の体細胞超突然変異と関係がある潜在的免疫原性を排除する際に、それが有用である可能性があるからである。代替では、Queen et al.（1989、上記）中に記載されたように、コンセンサスフレームワーク配列の使用によって、ｃＤＮＡベースまたはタンパク質由来配列から得たフレームワーク中のこのような超突然変異残基を同定し除去することもできる。生殖細胞系ＶＨセグメントをアクセプターフレームワークとして使用する場合、１５および１６ではなく第１４染色体上にコードされるＶＨセグメントを使用しなければならない。第１４染色体上のセグメントのみが機能的ＶＨを生成するからである。
【００５７】
ヒト化Ｖ領域の設計
Queen et al.（1989、上記）によれば、ＣＤＲの約４〜６Å以内のフレームワークアミノ酸を同定することが必要である。これらの残基は、正確なＣＤＲ構造を支えるおそらく重要なフレームワーク残基であると考えられるからである。このようなプロセスは、原子座標からの原子間距離を計算する国立科学財団（ＮＳＦ）によって運営されるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｆｒｅｅｗａｒｅウェブサイトで利用可能なＲＡＳＭＯＬなどのコンピュータプログラムを使用して、またはコンピュータモデルの手検測によって実施することができる。重要なフレームワーク位置におけるアミノ酸がマウスドナー配列とヒトアクセプター配列の間で異なる場合、マウスドナーのそれらを通常ヒト残基に置換する。しかしながら、このような残基がＣＤＲ構造を支持するのに最小の貢献度を有する場合、対応するヒト残基を典型的に使用する。さらに、選択したヒトアクセプターが、Ｖ領域配列の約１０〜２０％未満に生じる「異常な」アミノ酸を含有する場合、それらは親和性成熟中の体細胞超突然変異の結果である可能性があり、ドナー残基と置換してヒトにおける潜在的免疫原性を回避しなければならない。
【００５８】
さらに、潜在的Ｎ−結合型グリコシル化シグナルの残基などの他の因子を注意深く考慮して、ヒト化Ｖ領域を設計する必要がある（詳細に関してはTsurushitaを参照）。
【００５９】
ヒト化抗体は、治療用途に必要とされるかまたはそのために排除されるエフェクター機能に応じて、ヒト抗体、またはその変異体のヒトκもしくはλＬ鎖、および／またはγ１、γ２、γ３、γ４、μ、α１、α２、δ、もしくはεＨ鎖由来のヒト定常領域またはその一部分を含有することができる。例えば、突然変異を含有する定常領域のＦｃ部分を本発明のキメラもしくはヒト化抗体のＶ領域と融合して、Ｆｃ受容体と抗体の結合を低減する、および／または補体を固定するその能力を低減することができる（例えば、Winter et al., ＧＢ２，２０９，７５７Ｂ、Morrison et al., ＷＯ８９／０７１４２、Morgan et al., ＷＯ９４／２９３５１を参照）。抗体分子のこのような操作は、セクション５．２中に記載したように組換えＤＮＡ技術によって実施することができる。
【００６０】
生成するキメラまたはヒト化抗体は、非ヒトドナー抗体と同じ特異性、および非ヒトドナー抗体の親和性と同等またはその少なくとも約１／３、少なくとも約１／２、もしくは少なくとも約２／３の親和性を有することが好ましい。別の態様では、生成するキメラまたはヒト化抗体は、少なくとも約１×１０７Ｍ−１、好ましくは少なくとも約１×１０８Ｍ−１、および最も好ましくは少なくとも約１×１０９Ｍ−１の親和性定数を有する。
【００６１】
前に記載した一般的プロトコール以外に、例えば、いずれもその全容を参照によって本明細書に組み込む、ＣＤＲ移植（ＥＰ２３９，４００；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７、米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号）、ベニアリング（veneering）またはリサーフィシング（resurfacing）（ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６、Padlan, Molecular Immunology, 28(4/5): 489-498, 1991; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6): 805-814, 1994; Roguska et al., Proc Natl. Acad.Sci.USA, 91: 969-973, 1994）、および鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を含めた、当技術分野で知られている様々な技法を使用して、抗体をヒト化することができる。
【００６２】
５．３．２．薬剤としてヒト化抗体を調製するための追加的考慮事項
薬剤としてヒト化抗体を与えるため、効率良く一貫した生成系をしたがって調製する必要がある。例えば、ヒト化抗体に適した発現ベクターはＨ鎖およびＬ鎖配列を挿入することによって調製し、発現ベクターでトランスフェクトした高生産性細胞系は、作業用細胞バンク（ＷＣＢ）の安定した半永久的供給源として働く、マスター細胞バンク（ＭＣＢ）の種細胞として得ることができる。次いで、ヒト化抗体は、ＷＣＢ由来の作業用細胞を培養し培養培地を回収することによって調製することができる。
【００６３】
適切な制御遺伝子を有する様々な発現ベクターを、このような生成細胞系の調製に使用することができる。宿主細胞として、哺乳動物タンパク質の発現に一般に使用される細胞をヒト化抗体の発現に使用することができる。このような宿主細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＳＰ２／０−Ａｇｌ４．１９細胞、ＮＳＯ細胞などがあるが、これらだけには限られない。ヒト化抗体の生産性は、発現ベクターと宿主細胞の最良の組合せを選択することによって最大にすることができる。さらに、宿主細胞によるヒト化抗体の発現を最適化することができるように、培養培地の組成を調べて、様々な無血清培養培地およびサプリメントから適切な培地を選択しなければならない。
【００６４】
有効性および最終収率に基づいて、宿主細胞によって産生されるヒト化抗体を、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどを含めた、当技術分野でよく知られている様々な方法を使用して培養上清から精製することができる。
【００６５】
５．４  医薬組成物および治療用途
本発明は、ＲＧＤ配列を免疫特異的に認識する前に記載したヒト化抗体またはその抗原結合断片を含む、医薬組成物を提供する。活性成分として本発明のヒト化抗体を含む医薬組成物は、癌、例えば癌細胞の増殖または転移、および炎症疾患、例えば慢性関節リウマチ、骨関節炎、肝炎、気管支喘息、線維症、糖尿病、動脈硬化症、多発性硬化症、肉芽腫、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎およびクローン病）、自己免疫疾患などだけには限られないが、これらを含めたＲＧＤタンパク質と関係がある障害または疾患を予防および／または治療するための作用物質として使用することができる。
【００６６】
本発明のヒト化抗体を含む医薬組成物を使用して、臓器移植後の慢性拒絶反応、および例えば全身性自己免疫疾患、エリテマトーデス、ブドウ膜炎、ベーチェット病、多発性筋炎、増殖性糸球体腎炎、サルコイドーシスなどの自己免疫疾患を治療することもできる。
【００６７】
本発明のヒト化抗体を含む、前に記載した障害もしくは疾患を予防または治療するための予防および／または治療剤は低い毒性を有し、経口的または非経口的に、適切な溶媒中に混合することにより液体調製物として直接、または適切な剤形の医薬組成物としてヒトに投与することができる。
【００６８】
前に記載した投与に使用する医薬組成物は、前述の抗体またはその塩、および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含有する。このような組成物は、経口または非経口投与に適した剤形で与えられる。
【００６９】
用量は、投与する対象の年齢および大きさ、標的疾患、状態、投与の経路などに応じて変わる可能性がある。例えば成人患者において慢性関節リウマチを予防および／または治療するために抗体を使用するとき、通常約０．０１〜約２０ｍｇ／体重１ｋｇ、好ましくは約０．１〜約１０ｍｇ／体重１ｋｇ、およびより好ましくは約０．１〜約５ｍｇ／体重１ｋｇの一回用量で、１日当たりおよそ１〜５回、好ましくは１日当たりおよそ１〜３回、本発明の抗体を静脈内投与することが有益である。他の非経口投与および経口投与では、前に与えた用量に対応する用量で抗体を投与することができる。状態が特に重度であるとき、状態に応じて用量を増大することができる。
【００７０】
様々な送達系、例えばリポソーム、マイクロ粒子、マイクロカプセルへの封入、変異ウイルスを発現することができる組換え細胞、受容体仲介エンドサイトーシスが知られており、これらを使用して本発明の医薬組成物を投与することができる（例えば、Wu and Wu, 1987, J.Biol.Chem.262: 4429 4432を参照）。導入の方法には、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口投与があるが、これらだけには限られない。化合物は任意の好都合な経路によって、例えば注入またはボーラス注射によって、上皮または皮膚粘膜内側（例えば、経口粘膜、直腸および腸粘膜など）を介した吸収によって投与することができ、他の生物活性剤と一緒に投与することができる。投与は全身性または局所であってよい。例えば、吸入器または噴霧器、および製剤とエアロゾル剤を使用することによって、肺投与を利用することもできる。
【００７１】
本発明の一態様では、治療の必要がある領域へ局所的に、本発明の医薬組成物を投与することが望ましい可能性がある。これは、例えばかつ非制限的に、外科手術中の局所注入、例えば外科手術後に創傷包帯を併用した局所施用によって、注射によって、カテーテルによって、座薬によって、鼻腔スプレーによって、インプラントによって（前記インプラントは多孔性、非多孔性、またはシアラスティック膜などの膜、またはファイバーを含めたゼラチン質材料である）実施することができる。本発明の一態様では、投与は部位（または感染前部位）感染組織への直接注射による投与であってよい。
【００７２】
本発明の別の態様では、医薬組成物を小胞、特にリポソームで送達することができる（Langer, 1990, Science249: 1527-1533; Treat et al., Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein and Fidler(eds.), Liss, New York, pp.353-365(1989); Lopez-Berestein、既出、pp.317-327を参照、既出を一般に参照）。
【００７３】
本発明のさらに別の態様では、医薬組成物を徐放システムで送達することができる。本発明の一態様では、ポンプを使用することができる（Langer、上記、Sefton, 1987, CRC Crit.Ref.Biomed.Eng. 14: 201; Buchwald et al., 1980, Surgery88: 507; およびSaudek et al., 1989, N.Engl.J.Med.321: 574を参照）。本発明の別の態様では、ポリマー物質を使用することができる（Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida(1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem. 23: 61(1983)を参照、Levy et al., 1985, Science228: 190; During et al., 1989, Ann.Neurol.25: 351; Howard et al., 1989, J.Neurosurg. 71: 105も参照）。本発明のさらに別の態様では、徐放システムを組成物の標的の近くに置くことができ、したがってごくわずかな全身用量を必要とする（例えば、Goodson, Medical Applications of Controlled Release、上記、vol.2, pp.115-138(1984)を参照）。他の徐放システムはLanger（Science249: 1527-1533（1990））による総説中で論じられている。
【００７４】
経口投与用の組成物の例には、固体または液体剤形、具体的には、錠剤（ドラジェおよびフィルムコーティング錠を含む）、ピル、顆粒、粉末調製物、カプセル（軟質カプセルを含む）、シロップ、乳濁液、縣濁液などがある。このような組成物は公に知られている方法によって製造され、製剤の分野で従来使用されている小胞、希釈剤または賦形剤を含有する。錠剤用の小胞または賦形剤の例は、ラクトース、スターチ、スクロース、ステアリン酸マグネシウムなどである。
【００７５】
注射用調製物は、静脈内、皮下、皮内および筋肉内注射、点滴など用の剤形を含むことができる。これらの注射用調製物は、公に知られている方法によって調製することができる。注射用調製物は、例えば注射に従来使用される滅菌水性媒体または油状媒体中に、前に記載した抗体またはその塩を溶解、縣濁または乳化することによって調製することができる。注射用水性媒体として、例えば、アルコール（例えば、エタノール）、多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）などの適切な可溶化剤、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加生成物）］などと組合せて使用することができる、生理食塩水、グルコースおよび他の補助剤などを含有する等張液が存在する。油状媒体として、例えば、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどの可溶化剤などと組合せて使用することができる、ゴマ油、ダイズ油などが利用される。このように調製した注射用調製物は、適切なアンプル中に充填することが好ましい。直腸投与に使用する座薬は、前述の抗体またはその塩と従来の座薬基剤を混合することによって調製することができる。
【００７６】
前に記載した経口または非経口用途の医薬組成物は、活性成分の投与に適合させるのに適した単位用量の剤形に調製することが有利である。このような単位用量の剤形には、例えば、錠剤、ピル、カプセル、注射（アンプル）、座薬などがある。含有される前述の抗体の量は、特に注射の形で単位用量の剤形当たり一般に約５〜５００ｍｇであり、前述の抗体は他の剤形に関して約５〜１００ｍｇおよび約１０〜２５０ｍｇ含有されることが好ましい。
【００７７】
製剤化が前に記載した抗体と何らかの悪い相互作用を引き起こさない限り、前に記載したそれぞれの組成物は他の活性成分をさらに含有することができる。
【００７８】
本発明はさらに、活性成分としてＲＧＤ配列結合機能性分子（例えば、インテグリンなど）を含む細胞および／または組織再構築用の阻害剤および／または促進剤、およびＲＧＤタンパク質発現細胞および／または組織（例えば、腫瘍細胞、好中球、平滑筋など）とＲＧＤタンパク質結合機能性分子を接触させることを含む、細胞および／または組織の再構築を阻害および／または促進するための方法に関する。このような治療剤における活性成分の投与、薬剤調製などに関する用量、方法は、本発明のヒト化抗体を含む医薬品の前述の記載を参照することによって適切に決定することができる。
【００７９】
前に記載したように、本発明は、ＲＧＤタンパク質と関係があるかまたはそれらに関与する障害もしくは疾患を予防または治療するための方法であって、少なくとも１つの本発明のヒト化抗体を有効量、その必要性がある対象に投与することを含む方法をさらに提供する。
【００８０】
５．５  診断用途
本発明のヒト化抗体を含む医薬組成物は、癌、例えば癌細胞の増殖または転移、および炎症疾患、例えば慢性関節リウマチ、骨関節炎、肝炎、気管支喘息、線維症、糖尿病、癌転移、動脈硬化症、多発性硬化症、肉芽腫などの診断薬として、または臓器移植後の慢性拒絶反応、全身性自己免疫疾患、エリテマトーデス、ブドウ膜炎、ベーチェット病、多発性筋炎、増殖性糸球体腎炎、サルコイドーシスなどの自己免疫疾患の診断薬として使用することができる。本発明のヒト化抗体はＲＧＤ配列を特異的に認識することができ、したがってこれらを使用して、試験流体中のＲＧＤタンパク質の定量化、特にサンドイッチイムノアッセイ、競合アッセイ、イムノメトリー、ネフェロメトリーなど、免疫染色などによる定量化を可能にすることができる。これらの免疫法を本発明のアッセイ法に適用する際に、何らかの特定条件、手順などを言及することは必要とされない。当技術分野で通常の技術的考慮事項を従来の条件および手順に加えることによって、アッセイシステムを構築することで十分である。これらの一般的な技術的意義の詳細に関しては、総説、教本などを参照することができる。
【００８１】
前に記載したように、本発明の抗体を使用することによって、高感度でＲＧＤタンパク質を定量化することができる。本発明のヒト化抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＲＧＤタンパク質を定量化するための方法を適用することによって、ＲＧＤタンパク質と関係がある様々な疾患を診断するのに特に有用である。例えば、ＲＧＤタンパク質の発現レベルの増大または低下を検出する場合、人が現在ＲＧＤタンパク質と関係がある疾患、例えば癌または炎症疾患に罹患している可能性が非常に高い、または人が将来これらの疾患に罹患する可能性が非常に高いと診断することができる。したがって、本発明は、対象における、ＲＧＤタンパク質と関係があるかまたはそれらに関与する障害もしくは疾患を診断するための方法であって、本発明のヒト化抗体の少なくとも１つまたは両方を有効量、その必要性がある対象に投与することを含む方法も提供する。このようなｉｎ  ｖｉｖｏ診断に必要とされる用量は診断用途に必要とされる用量未満であってよく、通常の手順に従い当業者によって決定することができる。
【００８２】
本発明のヒト化抗体は、試験サンプル（例えば、体液などの試験流体、組織など）中に存在するＲＧＤタンパク質を特異的に検出するために使用することもできる。ヒト化抗体は、ＲＧＤタンパク質の精製用の抗体カラムの調製、精製時にそれぞれの分画中に含有されるＲＧＤタンパク質の検出、または試験する細胞中のＲＧＤタンパク質の挙動の分析に使用することもできる。
【００８３】
本明細書の配列表中の配列識別番号は以下の配列を示す。
【００８４】
［配列番号１］
これはマウス３３Ｅ１０およびヒト３３Ｅ１０と共通のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列を示す。
【００８５】
［配列番号２］
これはマウス３３Ｅ１０およびヒト３３Ｅ１０と共通のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列を示す。
【００８６】
［配列番号３］
これはマウス３３Ｅ１０およびヒト３３Ｅ１０と共通のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を示す。
【００８７】
［配列番号４］
これはマウス３３Ｅ１０およびヒト３３Ｅ１０と共通のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列を示す。
【００８８】
［配列番号５］
これはマウス３３Ｅ１０およびヒト３３Ｅ１０と共通のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列を示す。
【００８９】
［配列番号６］
これはマウス３３Ｅ１０およびヒト３３Ｅ１０と共通のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を示す。
【００９０】
［配列番号７］
これはＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位と隣接するシグナルペプチドおよびイントロン配列をコードする配列を含むＨｕ３３Ｅ１０ＶＨ５遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【００９１】
［配列番号８］
これはシグナルペプチドを含むＨｕ３３Ｅ１０ＶＨ５遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
【００９２】
［配列番号９］
これはＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位と隣接するシグナルペプチドおよびイントロン配列をコードする配列を含むＨｕ３３Ｅ１０ＶＨ７遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【００９３】
［配列番号１０］
これはシグナルペプチドを含むＨｕ３３Ｅ１０ＶＨ７遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
【００９４】
［配列番号１１］
これはＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位と隣接するシグナルペプチドおよびイントロン配列をコードする配列を含むＨｕ３３Ｅ１０ＶＨ７．８遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【００９５】
［配列番号１２］
これはシグナルペプチドを含むＨｕ３３Ｅ１０ＶＨ７．８遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
【００９６】
［配列番号１３］
これはＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩ部位と隣接するシグナルペプチドおよびイントロン配列をコードする配列を含むＨｕ３３Ｅ１０ＶＬ６遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【００９７】
［配列番号１４］
これはシグナルペプチドを含むＨｕ３３Ｅ１０ＶＬ６遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
【００９８】
［配列番号１５］
これはＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩ部位と隣接するシグナルペプチドおよびイントロン配列をコードする配列を含むＨｕ３３Ｅ１０ＶＬｖ２遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【００９９】
［配列番号１６］
これはシグナルペプチドを含むＨｕ３３Ｅ１０ＶＬｖ２遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
【０１００】
［配列番号１７］
これはＨｕ３３Ｅ１０重鎖および軽鎖ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅および配列決定に使用したオリゴヌクレオチド［ＣＭＶ２］を示す。
【０１０１】
［配列番号１８］
これはＨｕ３３Ｅ１０重鎖および軽鎖ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅および配列決定に使用したオリゴヌクレオチド［ＪΝΤ０２６］を示す。
【０１０２】
［配列番号１９］
これはＨｕ３３Ｅ１０重鎖および軽鎖ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅および配列決定に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＴ０８０］を示す。
【０１０３】
［配列番号２０］
これはＨｕ３３Ｅ１０重鎖および軽鎖ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅および配列決定に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＴ０８２］を示す。
【０１０４】
［配列番号２１］
これはＨｕ３３Ｅ１０重鎖および軽鎖ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅および配列決定に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＴ０８４］を示す。
【０１０５】
［配列番号２２］
これはＨｕ３３Ｅ１０重鎖および軽鎖ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅および配列決定に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＴ０９７］を示す。
【０１０６】
［配列番号２３］
これはＨｕ３３Ｅ１０重鎖および軽鎖ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅および配列決定に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＴ０９８］を示す。
【０１０７】
［配列番号２４］
これはＮＳ０−Ｈｕ３３Ｅ１０−４およびＮＳ０−Ｈｕ３３Ｅ１０−６において発現されるＶＨ７およびγ−１重鎖定常領域に関するコード領域のヌクレオチド配列を示す。
【０１０８】
［配列番号２５］
これはＮＳ０−Ｈｕ３３Ｅ１０−４およびＮＳ０−Ｈｕ３３Ｅ１０−６において発現されるＶＨ７およびγ−１重鎖定常領域に関するコード領域のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
【０１０９】
［配列番号２６］
これはＮＳ０−Ｈｕ３３Ｅ１０−５において発現されるＶＨ７．８およびγ−１重鎖定常領域に関するコード領域のヌクレオチド配列を示す。
【０１１０】
［配列番号２７］
これはＮＳ０−Ｈｕ３３Ｅ１０−５において発現されるＶＨ７．８およびγ−１重鎖定常領域に関するコード領域のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
【０１１１】
［配列番号２８］
これはＮＳ０−Ｈｕ３３Ｅ１０−４およびＮＳ０−Ｈｕ３３Ｅ１０−５において発現されるＶＬ６およびｋａｐｐａ軽鎖定常領域に関するコード領域のヌクレオチド配列を示す。
【０１１２】
［配列番号２９］
これはＮＳ０−Ｈｕ３３Ｅ１０−４およびＮＳ０−Ｈｕ３３Ｅ１０−５において発現されるＶＬ６およびｋａｐｐａ軽鎖定常領域に関するコード領域のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
【０１１３】
［配列番号３０］
これはＮＳ０−Ｈｕ３３Ｅ１０−６において発現されるＶＬｖ２およびｋａｐｐａ軽鎖定常領域に関するコード領域のヌクレオチド配列を示す。
【０１１４】
［配列番号３１］
これはＮＳ０−Ｈｕ３３Ｅ１０−６において発現されるＶＬｖ２およびｋａｐｐａ軽鎖定常領域に関するコード領域のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
【０１１５】
［配列番号３２］
これは３３Ｅ１０ＶＬのアミノ酸配列を示す。
【０１１６】
［配列番号３３］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＬｖ２のアミノ酸配列を示す。
【０１１７】
［配列番号３４］
これはマウス３３Ｅ１０ＶＨｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【０１１８】
［配列番号３５］
これはマウス３３Ｅ１０ＶＨｃＤＮＡのヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
【０１１９】
［配列番号３６］
これはマウス３３Ｅ１０ＶＬｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【０１２０】
［配列番号３７］
これはマウス３３Ｅ１０ＶＬｃＤＮＡのヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
【０１２１】
［配列番号３８］
これはＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位と隣接するシグナルペプチドおよびイントロン配列をコードする配列を含む設計３３Ｅ１０ＶＨ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【０１２２】
［配列番号３９］
これはシグナルペプチドを含む設計３３Ｅ１０ＶＨ遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
【０１２３】
［配列番号４０］
これはＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩ部位と隣接するシグナルペプチドおよびイントロン配列をコードする配列を含む設計３３Ｅ１０ＶＬ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【０１２４】
［配列番号４１］
これはシグナルペプチドを含む設計３３Ｅ１０ＶＬ遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
【０１２５】
［配列番号４２］
これは３３Ｅ１０ＶＨのアミノ酸配列を示す。
【０１２６】
［配列番号４３］
これはヒト化３３Ｅ１０（Ｈｕ３３Ｅ１０）ＶＨ１のアミノ酸配列を示す。
【０１２７】
［配列番号４４］
これは３３Ｅ１０ＶＬのアミノ酸配列を示す。
【０１２８】
［配列番号４５］
これはヒト化３３Ｅ１０（Ｈｕ３３Ｅ１０）ＶＬ１のアミノ酸配列を示す。
【０１２９】
［配列番号４６］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＨ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＪ２２０］を示す。
【０１３０】
［配列番号４７］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＨ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＪ２０６］を示す。
【０１３１】
［配列番号４８］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＨ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＪ２０７］を示す。
【０１３２】
［配列番号４９］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＨ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＪ２０８］を示す。
【０１３３】
［配列番号５０］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＨ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＪ２０９］を示す。
【０１３４】
［配列番号５１］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＨ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＪ２１０］を示す。
【０１３５】
［配列番号５２］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＨ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＪ２１１］を示す。
【０１３６】
［配列番号５３］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＨ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＪ２１２］を示す。
【０１３７】
［配列番号５４］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＨ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＪ２１３］を示す。
【０１３８】
［配列番号５５］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＨ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＪ２１４］を示す。
【０１３９】
［配列番号５６］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＨ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＪ２１５］を示す。
【０１４０】
［配列番号５７］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＨ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＪ２１６］を示す。
【０１４１】
［配列番号５８］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＨ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＪ２１７］を示す。
【０１４２】
［配列番号５９］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＨ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＪ２１８］を示す。
【０１４３】
［配列番号６０］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＨ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＪ２１９］を示す。
【０１４４】
［配列番号６１］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＨ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＪ２２１］を示す。
【０１４５】
［配列番号６２］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＬ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＪ１１６］を示す。
【０１４６】
［配列番号６３］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＬ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＪ１９３］を示す。
【０１４７】
［配列番号６４］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＬ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＪ１９４］を示す。
【０１４８】
［配列番号６５］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＬ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＪ１９５］を示す。
【０１４９】
［配列番号６６］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＬ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＪ１９６］を示す。
【０１５０】
［配列番号６７］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＬ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＪ１９７］を示す。
【０１５１】
［配列番号６８］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＬ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＪ１９８］を示す。
【０１５２】
［配列番号６９］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＬ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＪ１９９］を示す。
【０１５３】
［配列番号７０］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＬ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＪ２００］を示す。
【０１５４】
［配列番号７１］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＬ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＪ２０１］を示す。
【０１５５】
［配列番号７２］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＬ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＪ２０２］を示す。
【０１５６】
［配列番号７３］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＬ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＪ２０３］を示す。
【０１５７】
［配列番号７４］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＬ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＪ２０４］を示す。
【０１５８】
［配列番号７５］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＬ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＪ２０５］を示す。
【０１５９】
［配列番号７６］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＬ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＪ１０１］を示す。
【０１６０】
［配列番号７７］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＬ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド［ＪＮＪ１１７］を示す。
【０１６１】
［配列番号７８］
これはＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位と隣接するシグナルペプチドおよびイントロン配列をコードする配列を含むＨｕ３３Ｅ１０ＶＨ１遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【０１６２】
［配列番号７９］
これはシグナルペプチドを含むＨｕ３３Ｅ１０ＶＨ１遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
【０１６３】
［配列番号８０］
これはＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩ部位と隣接するシグナルペプチドおよびイントロン配列をコードする配列を含むＨｕ３３Ｅ１０ＶＬ１遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【０１６４】
［配列番号８１］
これはシグナルペプチドを含むＨｕ３３Ｅ１０ＶＬ１遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
【０１６５】
［配列番号８２］
これは５’ＲＡＣＥプライマーのヌクレオチド配列を示す。
【０１６６】
［配列番号８３］
これは５’ＲＡＣＥプライマーのヌクレオチド配列を示す。
【０１６７】
［配列番号８４］
これはＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’プライマーのヌクレオチド配列を示す。
【０１６８】
［配列番号８５］
これは３３Ｅ１０ＶＨ３’プライマーのヌクレオチド配列を示す。
【０１６９】
［配列番号８６］
これは３３Ｅ１０ＶＬ３’プライマーのヌクレオチド配列を示す。
【０１７０】
［配列番号８７］
これは３３Ｅ１０ＶＨ５’プライマーのヌクレオチド配列を示す。
【０１７１】
［配列番号８８］
これは３３Ｅ１０ＶＨ３’プライマーのヌクレオチド配列を示す。
【０１７２】
［配列番号８９］
これは３３Ｅ１０ＶＬ５’プライマーのヌクレオチド配列を示す。
【０１７３】
［配列番号９０］
これは３３Ｅ１０ＶＬ３’プライマーのヌクレオチド配列を示す。
【０１７４】
［配列番号９１］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＨ５遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【０１７５】
［配列番号９２］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＨ５遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
【０１７６】
［配列番号９３］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＨ７遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【０１７７】
［配列番号９４］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＨ７遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
【０１７８】
［配列番号９５］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＨ７．８遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【０１７９】
［配列番号９６］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＨ７．８のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
【０１８０】
［配列番号９７］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＬ６遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【０１８１】
［配列番号９８］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＬ６遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
【０１８２】
［配列番号９９］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＬｖ２遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【０１８３】
［配列番号１００］
これはＨｕ３３Ｅ１０ＶＬｖ２遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
【実施例】
【０１８４】
以下の実施例は、ＲＧＤ配列を免疫特異的に認識するモノクローナル抗体の調製、モノクローナル抗体のＶ領域の配列決定、これらの抗体のエピトープマッピングおよび他の特徴付け、およびこのような抗体のキメラ化およびヒト化、ならびに生成したキメラおよびヒト化抗体の特徴付けを例示する。これらの実施例は、本発明の範囲を制限するものとして解釈するべきではない。
【０１８５】
６．１．マウス３３Ｅ１０可変領域遺伝子のクローニングおよび配列決定
マウス３３Ｅ１０ハイブリドーマ細胞を、７．５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃において、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）を含有するＴＩＬ培地Ｉ（Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、群馬、日本）中で増殖させた。全ＲＮＡ（total RNA）は、供給者のプロトコールに従いＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して約３×１０６個のハイブリドーマ細胞から抽出した。オリゴｄＴプライマー処理ｃＤＮＡは、供給者のプロトコールに従いＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して合成した。３３Ｅ１０重鎖および軽鎖に関する可変領域ｃＤＮＡは、マウスγ−１およびｋａｐｐａ鎖定常領域とそれぞれアニーリングする３’プライマー、およびＧｅｎｅＲａｃｅｒキット中に供給されたＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’プライマー（５’−ＣＧＡＣＴＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＡ−３’（配列番号８４））を使用して、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。重鎖可変領域（ＶＨ）のＰＣＲ増幅用に、３’プライマーは配列５’−ＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧ−３’（配列番号８５）を有する。軽鎖可変領域（ＶＬ）のＰＣＲ増幅用に、３’プライマーは配列５’−ＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣ−３’（配列番号８６）を有する。増幅したＶＨおよびＶＬｃＤＮＡは配列決定用にｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。可変領域のＤＮＡ配列決定はＴｏｃｏｒｅ（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）で実施した。数個の重鎖および軽鎖クローンを配列決定し、典型的なマウス重鎖および軽鎖可変領域と相同的な独自の配列を同定した。３３Ｅ１０ＶＨおよびＶＬの推定アミノ酸配列と共にコンセンサスｃＤＮＡ配列をそれぞれ図１および２中に示す。
【０１８６】
６．２．キメラ３３Ｅ１０ＩｇＧ１／κ抗体の構築
３３Ｅ１０ＶＨをコードする遺伝子を、鋳型として３３Ｅ１０ＶＨｃＤＮＡ、５’プライマーとして５’−ＧＧＧＡＣＴＡＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＴＴＧＴＧＧＣＴＧＡＡＣＴＧＧＡＴＴ−３’（配列番号８７）（ＳｐｅＩ部位に下線を引く）、および３’プライマーとして５’−ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＡＡＧＴＴＡＧＧＡＣＴＣＡＣＣＴＧＣＡＧＡＧＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＧＡＧＴＣＣＣ−３’（配列番号８８）（ＨｉｎｄＩＩＩ部位に下線を引く）（図３）を使用してＰＣＲによって、スプライスドナーシグナルおよび適切な隣接制限酵素部位を含むエクソンとして作製した。同様に、３３Ｅ１０ＶＬをコードする遺伝子を、鋳型として３３Ｅ１０ＶＬｃＤＮＡ、５’プライマーとして５’−ＧＧＧＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＴＧＴＴＡＧＧＣＴＧＴＴＧ−３’（配列番号８９）（ＮｈｅＩ部位に下線を引く）、および３’プライマーとして５’−ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＴＴＧＧＡＴＴＣＴＡＣＴＴＡＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＣＴＣＣ−３’（配列番号９０）（ＥｃｏＲＩ部位に下線を引く）（図４）を使用してＰＣＲによって、スプライスドナーシグナルおよび適切な隣接制限酵素部位を含むエクソンとして作製した。３３Ｅ１０ＶＨおよびＶＬエクソンのスプライスドナーシグナルは、それぞれマウス生殖細胞ＪＨ３およびＪＫ１配列に由来した（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, ＮＩＨ公開番号９１−３２４２、米国厚生省、１９９１）。ＰＣＲ増幅断片はＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用してゲル精製し、（ＶＨに関して）ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩまたは（ＶＬに関して）ＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、キメラ３３Ｅ１０ＩｇＧｌ／κ抗体の産生用にヒトγ−１およびｋａｐｐａ定常領域を保持する哺乳動物発現ベクターにクローニングした。生成した発現ベクター、ｐＣｈ３３Ｅ１０の概略構造は図５中に示す。
【０１８７】
６．３．ヒト化３３Ｅ１０ＶＨおよびＶＬ遺伝子の作製
３３Ｅ１０可変領域のヒト化を、Queen et al.（Proc.Natl.Acad.Sci.USA86: 10029-10033、1989）によって概説されたように実施した。最初に、３３Ｅ１０可変領域の三次元分子モデルをコンピュータプログラムの助力によって構築した。次に、ヒト可変領域配列に対する相同性検索に基づいて、３３Ｅ１０ＶＨと高い相同性を有するＵ０３４００（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号）のヒトＶＨアミノ酸配列を、ヒト化３３Ｅ１０ＶＨのフレームワークを得るためのアクセプターとして選択した。同様に、Ｘ７２４５２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号）のヒトＶＬアミノ酸配列を３３Ｅ１０ＶＬのヒト化用のアクセプターとして選択した。
【０１８８】
三次元モデルが相補性決定領域（ＣＤＲ）との有意な接触を示したフレームワーク位置において、マウス３３Ｅ１０可変領域由来のアミノ酸残基をヒトフレームワーク残基に置換した。これは位置３０および４８で実施してヒト化３３Ｅ１０（Ｈｕ３３Ｅ１０）ＶＨ１を作製した（図６）。軽鎖に関しては、Ｈｕ３３Ｅ１０ＶＬ１を作製するのに置換を必要としなかった（図７）。３３Ｅ１０、設計Ｈｕ３３Ｅ１０およびヒトアクセプターアミノ酸配列のアラインメントは、ＶＨに関しては図６中およびＶＬに関しては図７中に示す。
【０１８９】
Ｈｕ３３Ｅ１０ＶＨ１およびＶＬ１のそれぞれをコードする遺伝子を、哺乳動物発現ベクターへの後のクローニング用に、シグナルペプチド、スプライスドナーシグナル、および適切な制限酵素部位を含むエクソンとして設計した。Ｈｕ３３Ｅ１０ＶＨ１およびＶＬ１エクソンのスプライスドナーシグナルは、それぞれヒト生殖細胞ＪＨ３およびＪｋ１配列に由来した（Kabat et al., 1991）。マウス３３Ｅ１０ＶＬ１遺伝子のシグナルペプチド配列は、ＳＩＧ−Ｐｒｅｄシグナルペプチド予想ソフトウェア（http: //bmbpcu36.leeds.ac.uk/prot_analysis/Signal.html）によって正確な切断の最適下限であったことを示した。したがって、ＳＩＧ−Ｐｒｅｄソフトウェアによって有効かつ正確に切断されると予想されたマウスモノクローナル抗体３５Ｂ６（Ｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）のＶＬ遺伝子のシグナルペプチドを、Ｈｕ３３Ｅ１０ＶＬ１エクソンにおいて使用した。Ｈｕ３３Ｅ１０ＶＨ１エクソン中のシグナルペプチド配列は対応するマウス３３Ｅ１０ＶＨ配列に由来した。ＳＩＧ−Ｐｒｅｄソフトウェアは、Ｈｕ３３Ｅ１０ＶＨ１遺伝子のシグナルペプチドが有効かつ正確に切断されることを示した。
【０１９０】
Ｈｕ３３Ｅ１０ＶＨ１およびＶＬ１遺伝子を、He et al.（J.Immunol.160: 1029-1035、1998）によって概説されたＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して、数個の重複合成オリゴヌクレオチドプライマーの延長およびＰＣＲ増幅によって構築した。Ｈｕ３３Ｅ１０ＶＨ１およびＶＬ１遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチドは、それぞれ図８および９中に列挙する。Ｈｕ３３Ｅ１０ＶＨ１およびＶＬ１遺伝子におけるオリゴヌクレオチドの位置は、それぞれ図１０および１１中に示す。ＰＣＲ増幅断片はＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲル精製し、配列決定用にｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。（ＶＨに関して）ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩまたは（ＶＬに関して）ＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩでの消化後、Ｈｕ３３Ｅ１０ＶＨ１およびＶＬ１遺伝子を、ヒトＩｇＧ１／κ型の産生用に哺乳動物発現ベクター中の対応する部位にサブクローニングした。生成した発現ベクター、ｐＨｕ３３Ｅ１０−１の概略構造は図５中に示す。推定アミノ酸配列と共に得られたＨｕ３３Ｅ１０ＶＨ１およびＶＬ１遺伝子のヌクレオチド配列は、それぞれ図１２および１３中に示す。
【０１９１】
６．４．キメラおよびヒト化３３Ｅ１０抗体の発現
キメラおよびヒト化３３Ｅ１０ＩｇＧ１／κ抗体のそれぞれを安定的に産生する細胞系を得るために、発現ベクターｐＣｈ３３Ｅ１０およびｐＨｕ３３Ｅ１０−１をそれぞれ、マウスミエローマ細胞系ＮＳ０（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＵＫ）の染色体に導入した。７．５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃において、ＮＳ０細胞を１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥ培地中で増殖させた。ＮＳ０細胞への安定したトランスフェクションは、Bebbington et al.（Bio/Technology10: 169-175、1992）中に記載されたエレクトロポレーションによって実施した。トランスフェクション前に、それぞれの発現ベクターはＦｓｐＩを使用して線状化した。約１０７個の細胞を１０μｇの線状化プラスミドでトランスフェクトし、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥ培地中に縣濁し、数枚の９６ウェルプレートに平板培養した。２４〜４８時間後、選択培地（１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥ培地、ＨＴ培地サプリメント（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、０．２５ｍｇ／ｍｌキサンチンおよび１μｇ／ｍｌミコフェノール酸）を施した。選択開始後約１０日で、培養上清を抗体産生に関してアッセイした。
【０１９２】
培養上清中のｐＣｈ３３Ｅ１０およびｐＨｕ３３Ｅ１０−１から発現した組換え抗体（それぞれＣｈ３３Ｅ１０およびＨｕ３３Ｅ１０−ＶＨ１／ＶＬ１）の発現レベルをサンドウィッチＥＬＩＳＡによって測定した。典型的な実験では、ＰＢＳに溶かした１００μｌ／ウェルの１／２，０００希釈ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃγ鎖特異的ポリクローナル抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）で４℃において一晩、ＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、洗浄バッファー（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で洗浄し、３００μｌ／ウェルのブロッキングバッファー（２％のスキムミルクおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で室温において１時間ブロッキングした。洗浄バッファーで洗浄した後、ＥＬＩＳＡバッファー（１％のスキムミルクおよび０．０２５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）に適切に希釈した１００μｌ／ウェルのサンプルをＥＬＩＳＡプレートに施した。ヒトミエローマ血清（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）から精製したヒトＩｇＧ１／κ抗体または精製Ｃｈ３３Ｅ１０を標準として使用した。室温で２時間ＥＬＩＳＡプレートをインキュベートし洗浄バッファーで洗浄した後、１００μｌ／ウェルの１／２，０００希釈ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトｋａｐｐａ鎖ポリクローナル抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）を使用して、結合した抗体を検出した。室温で１時間のインキュベーションおよび洗浄バッファーでの洗浄後、発色現像は１００μｌ／ウェルのＡＢＴＳ基質を加えることによって実施し、１００μｌ／ウェルの２％シュウ酸で停止させた。吸光度は４０５ｎｍで読み取った。
【０１９３】
高レベルのＣｈ３３Ｅ１０（ＮＳＯ−Ｃｈ３３Ｅ１０２Ｃ１１；Ｌ４−２Ｃ１１とも呼ばれる）を産生するＮＳ０安定トランスフェクタントの１つを、ハイブリドーマＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して無血清培地中での増殖に適合させ、約１０６／ｍｌの密度までローラーボトル中で増殖させ、６ｍｇ／ｍｌのＵｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｅｄ  Ｓｏｙ  Ｈｙｄｒｏｌｙｚａｔｅ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  カタログ番号９６８５７）を供給し、細胞生存率が５０％未満になるまでさらに増殖させた。遠心分離および濾過後、培養上清をプロテイン−Ａセファロースカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に充填した。抗体を０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）で溶出する前に、カラムをＰＢＳで洗浄した。１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）での中和後、溶出抗体のバッファーを透析によってＰＢＳに交換した。抗体濃度は２８０ｎｍにおける吸光度を測定することによって決定した（１ｍｇ／ｍｌ＝１．４ＯＤ）。
【０１９４】
Ｃｈ３３Ｅ１０を発現するＮＳ０安定トランスフェクタントは容易に得たが、ｐＨｕ３３Ｅ１０−１で安定的にトランスフェクトしたＮＳ０トランスフェクタントはいずれも、Ｈｕ３３Ｅ１０−ＶＨ１／ＶＬ１をあまり産生しないことが分かった。重鎖および軽鎖ｍＲＮＡの分析によって、ＶＬ１遺伝子のシグナルペプチドコード領域中の偶然生成したスプライスドナー部位のためＶＬコード領域を欠く、異常な軽鎖ｍＲＮＡの存在が明らかになった。この問題を解決するため、シグナルペプチドコード領域中のスプライスドナー部位を、オーバーラップエクステンションＰＣＲ法を使用して部位特異的突然変異誘発によって排除した（Higuchi, R., PCR Technology. Principles and Applications for DNA Amplification.Erlich, H.A., ed.pp.61-70, Stockton Press, New York, 1989）。生成した変異Ｈｕ３３Ｅ１０ＶＬ遺伝子、ＶＬ６の配列は図１４中に示す。ＶＬ領域のアミノ酸配列はＶＬ１とＶＬ６遺伝子の間で互いに同一である。ＶＬ６遺伝子は発現ベクターｐＨｕ３３Ｅ１０−１中のＶＬ１に交換してｐＨｕ３３Ｅ１０−２を作製した。ｐＨｕ３３Ｅ１０−２で安定的にトランスフェクトし高レベルの組換え抗体（Ｈｕ３３Ｅ１０−ＶＨ１／ＶＬ６）を産生したＮＳ０細胞は、前に記載した方法によって得た。ｐＨｕ３３Ｅ１０−２で安定的にトランスフェクトしたＮＳ０細胞では、異常な軽鎖ｍＲＮＡは観察しなかった。高レベルのＨｕ３３Ｅ１０−ＶＨ１／ＶＬ６を産生するＮＳ０安定トランスフェクタントの１つ（ＮＳ０−Ｈｕ３３Ｅ１０−２＃２２）を適合させ、ハイブリドーマＳＦＭ中で増殖させ、培養上清は前に記載したようにＨｕ３３Ｅ１０−ＶＨ１／ＶＬ６の精製に使用した。
【０１９５】
６．５．Ｈｕ３３Ｅ１０−ＶＨｌ／ＶＬ６の特徴付け
ｈＯＰＮ５−ＢＳＡとＣｈ３３Ｅ１０およびＨｕ３３Ｅ１０−ＶＨｌ／ＶＬ６ＩｇＧ１／κ抗体の結合をＥＬＩＳＡによって調べた。抗原として、ウシ血清アルブミンと結合した合成オリゴペプチド（Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ；Ｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅにより提供された）（ｈＯＰＮ５−ＢＳＡ）を使用した。典型的な実験では、０．２ＭのＮａ２Ｃ０３バッファー（ｐＨ９．４）に溶かした１００μｌ／ウェルの１μｇ／ｍｌのｈＯＰＮ５−ＢＳＡで４℃において一晩、ＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、洗浄バッファーで洗浄し、３００μｌ／ウェルのブロッキングバッファーで室温において１時間ブロッキングした。洗浄バッファーで洗浄した後、ＥＬＩＳＡバッファーに適切に希釈したサンプルを１００μｌ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートに施した。４℃において一晩ＥＬＩＳＡプレートをインキュベートし洗浄バッファーで洗浄した後、１００μｌ／ウェルの１／２，０００希釈ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトγ鎖ポリクローナル抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）を使用して、結合した抗体を検出した。室温で１時間のインキュベーションおよび洗浄バッファーでの洗浄後、発色現像は１００μｌ／ウェルのＡＢＴＳ基質を加えることによって実施し、１００μｌ／ウェルの２％シュウ酸で停止させた。吸光度は４０５ｎｍで読み取った。
【０１９６】
図１５Ａ中に示すように、Ｈｕ３３Ｅ１０−ＶＨ１／ＶＬ６は、Ｃｈ３３Ｅ１０よりｈＯＰＮ５−ＢＳＡとの結合に関して約１００倍弱かった。
【０１９７】
６．６．Ｈｕ３３Ｅ１０ＶＨ５、ＶＨ７およびＶＨ７．８の作製および特徴付け
どのヒト化ＶＨ１およびＶＬ６遺伝子がＨｕ３３Ｅ１０−ＶＨｌ／ＶＬ６の抗原結合親和性の消失の原因であるかを確認するために、１つがマウスＶＨおよびヒト化ＶＬ６（ＭｏＨｕ３３Ｅ１０）からなり、および他方がヒト化ＶＨ１およびマウスＶＬ（ＨｕＭｏ３３Ｅ１０）からなる、２つの組換えＩｇＧ１／κ抗体を作製した。ＭｏＨｕ３３Ｅ１０およびＨｕＭｏ３３Ｅ１０抗体の分析によって、Ｈｕ３３Ｅ１０−ＶＨ１／ＶＬ６の親和性の消失は大部分はＶＨ１遺伝子に原因があり、部分的にはＶＬ１遺伝子に原因があったことが分かった（ここでデータ示す）。
【０１９８】
ＶＨ１遺伝子の予備突然変異分析に基づくと、位置７３〜７７におけるアミノ酸は、抗原結合親和性を維持するのに重要である懸念があった（データ示さず）。オーバーラップエクステンションＰＣＲ法（Higuchi, 1989）を使用し部位特異的突然変異誘発によって構築したＶＨ１遺伝子の３つの変異体（ＶＨ５、ＶＨ７およびＶＨ７．８）は、さらなる分析用に選択した。ＶＨ１と比較して、位置７７におけるＩｌｅはＶＨ５中のＳｅｒ（図６および１６）、ＶＨ７中では位置７６におけるＳｅｒおよび位置７７におけるＩｌｅはそれぞれＡｓｎおよびＳｅｒ（図６および１７）、およびＶＨ７．８中では位置７４におけるＳｅｒ、位置７６におけるＳｅｒおよび位置７７におけるＩｌｅはそれぞれＡｌａ、ＡｓｎおよびＳｅｒに置換した（図６および１８）。
【０１９９】
ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したＶＨ５、ＶＨ７およびＶＨ７．８遺伝子のそれぞれをｐＨｕ３３Ｅ１０−２においてＶＨ１に置換して、それぞれ発現ベクターｐＨｕ３３Ｅ１０−３、ｐＨｕ３３Ｅ１０−４およびｐＨｕ３３Ｅ１０−５を構築した。ｐＨｕ３３Ｅ１０−３、ｐＨｕ３３Ｅ１０−４およびｐＨｕ３３Ｅ１０−５のそれぞれで安定的にトランスフェクトしたＮＳ０細胞はセクション４中に記載したように生成した。Ｈｕ３３Ｅ１０−ＶＨ５／ＶＬ６を産生するＮＳＯ−Ｈｕ３３Ｅ１０−３＃６５、Ｈｕ３３Ｅ１０−ＶＨ７／ＶＬ６を産生するＮＳ０−Ｈｕ３３Ｅ１０−４５Ｄ３（Ｒ３−１５Ｄ３とも呼ばれる）、およびＨｕ３３Ｅ１０−ＶＨ７．８／ＶＬ６を産生するＮＳ０−Ｈｕ３３Ｅ１０−５１Ｅ５（ＥＪ３−３１Ｅ５とも呼ばれる）をハイブリドーマＳＦＭ中での増殖に適合させ、ローラーボトル中で増殖させた。Ｈｕ３３Ｅ１０−ＶＨ５／ＶＬ６、Ｈｕ３３Ｅ１０−ＶＨ７／ＶＬ６およびＨｕ３３Ｅ１０−ＶＨ７．８／ＶＬ６抗体は、セクション４中に記載したようにプロテインＡカラムを使用して対応する培養上清から精製した。
【０２００】
ｈＯＰＮ５−ＢＳＡとＨｕ３３Ｅ１０−ＶＨ５／ＶＬ６、Ｈｕ３３Ｅ１０−ＶＨ７／ＶＬ６およびＨｕ３３Ｅ１０−ＶＨ７．８／ＶＬ６抗体の結合は、セクション５中に記載したようにＥＬＩＳＡによってＣｈ３３Ｅ１０の結合と比較した。ｈＯＰＮ５−ＢＳＡとＨｕ３３Ｅ１０−ＶＨ５／ＶＬ６の親和性はＨｕ３３Ｅ１０−ＶＨ１／ＶＬ６と比較したとき若干向上したが、それはＣｈ３３Ｅ１０の親和性よりさらに一層弱かった（図１５Ａ）。ｈＯＰＮ５−ＢＳＡとのＨｕ３３Ｅ１０−ＶＨ７／ＶＬ６の結合親和性は、Ｃｈ３３Ｅ１０より３〜４倍弱かった（図１５Ａ）。Ｈｕ３３Ｅ１０−ＶＨ７．８／ＶＬ６の親和性は、この実験中Ｃｈ３３Ｅ１０の親和性より約３倍低かった（図１５Ｂ）。反復実験中、Ｈｕ３３Ｅ１０−ＶＨ７／ＶＬ６とＨｕ３３Ｅ１０−ＶＨ７．８／ＶＬ６は、ｈＯＰＮ５−ＢＳＡとの結合に関して互いに同様に挙動した。
【０２０１】
６．７．Ｈｕ３３Ｅ１０ＶＬｖ２の作製および特徴付け
ＶＬ１遺伝子の予備突然変異分析によって、Ｈｕ３３Ｅ１０−ＶＨ１／ＶＬ６の結合親和性の消失に貢献するいかなる特定のフレームワークアミノ酸残基も確認することはできなかったが（データ示さず）、ＶＬ１遺伝子は部分的には親和性消失の原因であることが疑われた。ＶＬ１遺伝子をさらに特徴付ける代わりに、異なるヒトフレームワークに基づく新たなヒト化３３Ｅ１０ＶＬ（ＶＬｖ２）を設計した（図１９）。ＶＬｖ２用に、Ｍ２９４６７のヒトアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号）をアクセプターとして選択した。ＣＤＲとの有意な相互作用が予想された位置２２および３７では、マウス３３Ｅ１０ＶＬのアミノ酸残基はヒト化型で保持された。ＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩ部位と隣接するＨｕ３３Ｅ１０ＶＬｖ２遺伝子（図２０）はＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で合成された。ＶＬ６遺伝子とＶＬｖ２遺伝子は、同じシグナルペプチド配列およびスプライスドナーシグナルを共有する（図１４および２０）。
【０２０２】
ＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化したＨｕ３３Ｅ１０ＶＬｖ２遺伝子をｐＨｕ３３Ｅ１０−４においてＶＬ１に置換して、新たな発現ベクターｐＨｕ３３Ｅ１０−６を構築した。Ｈｕ３３Ｅ１０−ＶＨ７／ＶＬｖ２ＩｇＧ１／κを産生するためにｐＨｕ３３Ｅ１０−６で安定的にトランスフェクトしたＮＳ０細胞は、セクション４中に記載したように生成した。トランスフェクタントの１つ、ＮＳ０−Ｈｕ３３Ｅ１０−６Ｉ−１５（ＳＰ２−１Ｉ−１５とも呼ばれる）を適合させ、ハイブリドーマＳＦＭ中で増殖させ、Ｈｕ３３Ｅ１０−ＶＨ７／ＶＬｖ２抗体は、セクション４中に記載した手順を使用して培養上清から精製した。
【０２０３】
ｈＯＰＮ５−ＢＳＡとＨｕ３３Ｅ１０−ＶＨ７／ＶＬｖ２の結合は、セクション５中に記載したようにＥＬＩＳＡによって分析した。２つの独立した実験の結果を図２１中に示す。両方の実験において、Ｈｕ３３Ｅ１０−ＶＨ７／ＶＬｖ２の結合親和性はＣｈ３３Ｅ１０の結合親和性の２倍以内であった。
【０２０４】
６．８．ＮＳ０安定トランスフェクタントの特徴付け
ＰＣＲマイコプラズマ検出セット（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  ＵＳＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＴ）を用いた試験によって、ＮＳ０−Ｃｈ３３Ｅ１０２Ｃ１１、ＮＳ０−Ｈｕ３３Ｅ１０−４５Ｄ３、ＮＳ０−Ｈｕ３３Ｅ１０−５１Ｅ５およびＮＳ０−Ｈｕ３３Ｅ１０−６−Ｉ−１５はいずれも、マイコプラズマの存在に関して陰性であったことを示した。
【０２０５】
それぞれＮＳ０−Ｈｕ３３Ｅ１０−４５Ｄ３、ＮＳ０−Ｈｕ３３Ｅ１０−５１Ｅ５およびＮＳ０−Ｈｕ３３Ｅ１０−６−Ｉ−１５において産生されたＨｕ３３Ｅ１０−ＶＨ７／ＶＬ６、Ｈｕ３３Ｅ１０−ＶＨ７．８／ＶＬ６およびＨｕ３３Ｅ１０−ＶＨ７／ＶＬｖ２ＩｇＧｌ／κ抗体の重鎖および軽鎖の真正を、ｃＤＮＡ配列決定によって確認した。全ＲＮＡはＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してこれらの細胞から抽出し、オリゴｄＴプライマー処理ｃＤＮＡは、供給者のプロトコールに従いＲＴ−ＰＣＲ用のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ第一鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して合成した。γ−１重鎖のコード領域は、プライマーとしてＣＭＶ２およびＪＮＴ０９８（図２２）ならびにＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼを使用しＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ断片はゲル精製し、プライマーとしてＣＭＶ２、ＪＮＴ０８２、ＪＮＴ０９７およびＪＮＴ０９８を用いて配列決定に施した（図２２）。同様に、ｋａｐｐａ軽鎖のコード領域はＣＭＶ２およびＪＮＴ０２６を使用して増幅し（図２２）、ゲル精製したＤＮＡ断片はプライマーとしてＣＭＶ２、ＪＮＴ０２６、ＪＮＴ０８０およびＪＮＴ０８４を用いて配列決定に施した（図２２）。重鎖および軽鎖コード領域に関して得た配列は、ＮＳ０−Ｈｕ３３Ｅ１０−４５Ｄ３、ＮＳ０−Ｈｕ３３Ｅ１０−５１Ｅ５およびＮＳ０−Ｈｕ３３Ｅ１０−６−Ｉ−１５安定トランスフェクタントのそれぞれに関する発現ベクター中の対応する配列と完全に一致した。Ｈｕ３３Ｅ１０ＶＨ７およびＶＨ７．８からなるγ−１重鎖の全コード領域に関する配列は、それぞれ図２３および２４中に示す。Ｈｕ３３Ｅ１０ＶＬ６およびＶＬｖ２からなるｋａｐｐａ軽鎖の全コード領域に関する配列は図２５および２６中に示す。
【０２０６】
さらに、ＮＳ０−Ｃｈ３３Ｅ１０２Ｃ１１において産生されたＣｈ３３Ｅ１０ＩｇＧ１／κ抗体のＶＨおよびＶＬ領域の真正を、ｃＤＮＡ配列決定によって確認した。全ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡ合成は前に記載したように実施した。ＶＨコード領域は、プライマーとしてＣＭＶ２およびＪＮＴ０８２ならびにＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを使用しＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ断片はゲル精製し、プライマーとしてＣＭＶ２およびＪＮＴ０８２を用いて配列決定に施した。同様に、ＶＬコード領域はＣＭＶ２およびＪＮＴ０２６を使用して増幅し、ゲル精製したＤＮＡ断片はプライマーとしてＣＭＶ２およびＪＮＴ０２６を用いて配列決定に施した。得られたＶＨおよびＶＬ領域のヌクレオチド配列は、ｐＣｈ３３Ｅ１０発現ベクター中の対応する配列と完全に一致した（それぞれ図３および４）。
【０２０７】
６．９．結論
ｈＯＰＮ５−ＢＳＡに対するＨｕ３３Ｅ１０−ＶＨ７／ＶＬｖ２ＩｇＧ１／κの親和性は、Ｃｈ３３Ｅ１０ＩｇＧ１／κの親和性の３倍以内であったと決定した。
【０２０８】
６．１０．細胞接着阻害アッセイ
図２７は、ヒト化抗ＯＰＮ抗体が、ｈＯＰＮ５−ＢＳＡとＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓの接着を阻害したことを示す。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓヒト乳癌細胞系はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から得て、１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ中で培養した。９６ウェルプレートは３７℃において１時間ｈＯＰＮ５−ＢＳＡ（２μｇ／ｍｌ）でコーティングし、次に室温において１時間０．５％ＢＳＡで処理した。ヒト免疫グロブリンＧ１ｋａｐｐａ、Ｃｈ３３Ｅ１０、Ｈｕ３３Ｅ１０−ＶＨ７．８／ＶＬ６（ＥＪ３−１−１）、Ｈｕ３３Ｅ１０−ＶＨ７／ＶＬ６（Ｅ３−１）、Ｈｕ３３Ｅ１０−ＶＨ７／ＶＬｖ２（ＳＰ−２）、およびマウス３３Ｅ１０抗体を０．２５％ＢＳＡ、ＤＭＥＭ中に溶かし、１００μｌ／ｍｌで始めて様々な濃度で処理し、３７℃において２０分間連続２倍希釈した。２×１０４個のＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞をそれぞれのウェルに加えた。３７℃で１時間のインキュベーション後、培地を除去し、（３７℃まで温めた）温かいＰＢＳで軽く二回洗浄した。接着細胞は固定し、２０％メタノールに溶かした０．５％クリスタルバイオレットで染色し、２０％酢酸で溶かした。吸光度は５９０ｎｍで測定した。抗体を加えずに、阻害率はこの吸光度で標準化した。
【０２０９】
７．寄託
マウス抗ＲＧＤモノクローナル抗体を産生する３３Ｅ１０および３５Ｂ６として本明細書に示すハイブリドーマは、微生物の寄託に関するブダペスト条約に従い、２００５年１０月２７日に茨城県つくば市東１−１−１中央第６（郵便番号：３０５−８５６６）に位置する産業技術総合研究所の特許生物寄託センターに寄託され、それぞれ受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１０４４０およびＦＥＲＭＢＰ−１０４４１を与えられ、これらはいずれもその全容を参照によって本明細書に組み込む。
【産業上の利用可能性】
【０２１０】
本発明のヒト化モノクローナル抗体は、ＲＧＤタンパク質の機能を阻害して、癌、例えば癌細胞の増殖または転移、および炎症疾患、例えば慢性関節リウマチ、骨関節炎、肝炎、気管支喘息、線維症、糖尿病、癌転移、動脈硬化症、多発性硬化症、肉芽腫、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎およびクローン病）、自己免疫疾患などに対する治療効果を示す。本発明の抗ＲＧＤ抗体と抗インテグリン抗体の両方を含む医薬組成物は、癌および炎症性疾患に対してより改善された治療効果を発揮する。
【０２１１】
具体的な実施形態を本明細書で例示および記載してきたが、様々な他のおよび／または均等な履行を、本発明の範囲から逸脱せずに、記載し示した具体的な実施形態に置き換えることができることは、当業者によって理解されよう。本出願は、本明細書で論じる具体的な実施形態の任意の適合または変形を含むと考えられる。したがって、本発明は特許請求の範囲およびその均等物によってのみ制限されると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ−Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ−Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
2013505702000001.app
【国際調査報告】
2013505702.tif 000029
2013505702.tif 000030