(57)【要約】  本発明は、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)に対してレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)を用いて牛、特に雌牛および未経産雌牛にワクチン接種するための組成物、それらの使用および方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
レプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)に対して免疫応答を引き起こすことができるレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)を含む免疫原性組成物。
【請求項２】
レプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)が死菌である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
牛伝染性鼻気管炎(IBR)ウイルス、牛ウイルス性下痢(BVD)1型および2型、パラインフルエンザ3型(PI3)ウイルスおよび牛RSウイルス(BRSV)からなる群から選択される1以上の改変生ウイルス(MLV)をさらに含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
免疫応答が、被験体におけるレプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)による感染を防御し、その罹患率を減少させ、かつ/またはその重症度を減少させる、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
被験体がウシ属動物である、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
ウシ属動物が雌牛または未経産雌牛である、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
レプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)に対する防御免疫応答を引き起こすことができるレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)を含むワクチン。
【請求項８】
レプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)が死菌である、請求項７に記載のワクチン。
【請求項９】
牛伝染性鼻気管炎(IBR)ウイルス、牛ウイルス性下痢(BVD)1型および2型、パラインフルエンザ3型(PI3)ウイルスおよび牛RSウイルス(BRSV)からなる群から選択される1以上の改変生ウイルス(MLV)をさらに含む、請求項７に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
免疫応答が、被験体におけるレプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)による感染を防御し、その罹患率を減少させ、かつ/またはその重症度を減少させる、請求項７に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
被験体がウシ属動物である、請求項１０に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
ウシ属動物が雌牛または未経産雌牛である、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
被験体におけるレプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)による感染を防御し、その罹患率を減少させ、かつ/またはその重症度を減少させる方法であって、被験体に免疫原性組成物を投与することを含む前記方法において、免疫原性組成物がレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)を含む前記方法。
【請求項１４】
レプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)が死菌である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
牛伝染性鼻気管炎(IBR)ウイルス、牛ウイルス性下痢(BVD)1型および2型、パラインフルエンザ3型(PI3)ウイルスおよび牛RSウイルス(BRSV)からなる群から選択される1以上の改変生ウイルス(MLV)をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
免疫応答が、被験体におけるレプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)による感染を防御し、その罹患率を減少させ、かつ/またはその重症度を減少させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
被験体がウシ属動物である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ウシ属動物が雌牛または未経産雌牛である、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)(Leptospira borgpetersenii serovar hardjo (type hardjo-bovis))に対してレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)(Leptospira interrogans serovar hardjo (type hardjoprajitno))を用いて牛、特に雌牛および未経産雌牛にワクチン接種するための組成物、それらの使用および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
レプトスピラ症は、世界で最も一般的な人獣共通疾患である。レプトスピラ症は、大部分の哺乳動物がかかり、世界全体にわたって牛における生殖障害の重大な原因である(Faine et al., 1999; Heath and Johnson, 1994 を参照のこと)。レプトスピラ菌はグラム陰性の薄いらせん菌であり、少なくとも12の病原性種および4つの腐生種に分類され、250を超える病原性血清型を有する。この菌は、好ましくは塩基性の土壌(pH7.2〜8.0)中の環境で、暖かく湿潤な環境において最大6ヶ月まで生存することができる。この菌は、乾燥条件または極端に寒い条件ではほとんど生存しない(Faine et al., 1999; Heath and Johnson, 1994 を参照のこと)。
病原性種は、維持宿主の尿細管の慢性感染症として維持され、疾患をほとんど引き起こさない場合もある。感染症は、感染尿との直接接触または感染尿で汚染された飼料もしくは寝わらを介した接触によって生じる。牛においては、本疾患の一般の減少には、生殖障害、虚弱子牛、流産、死産、ミイラ化および無乳が含まれる。尿中へのこの菌の排出は、長期間行われる場合がある。レプトスピラ(Leptospira)血清型ハージョ(hardjo)、ポモナ(pomona)およびグリポティフォーサ(grippotyphosa)による感染からのレプトスピラ血症によって直接に腎障害が生じ得る(Faine et al., 1999; Heath and Johnson, 1994; Ellis, 1994 を参照のこと)。
【０００３】
牛は、レプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)(LHP)およびレプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)(LHB)の主な維持宿主保菌動物である。LHPは主としてヨーロッパにおいて見られるが、世界の大半において、レプトスピラ症の最も一般的な原因はLHBである。LHBは、アメリカ合衆国において今日までに牛から単離された唯一のハージョ血清型である(Bolin, et. al., 1989(a).)。
レプトスピラ血清型ハージョ、カニコーラ(canicola)、ポモナ、グリポティフォーサおよびイクテロヘモラジア(icterohaemorrhagiae)を含む全細胞不活化レプトスピラワクチンによるワクチン接種は、牛のレプトスピラ症の広がりを食い止めるための基本的手段である。ワクチンの製造コストは、ワクチンの製剤化に用いられる成分の型(単数または複数)および数に直接に関連するため、ワクチンの有効性を損ねないでワクチンの成分数を減らすことが望ましい。本明細書において、ワクチンに血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)を含有せずにレプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)に対する防御を提供するワクチンならびに関連する方法および使用が記載される。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、当該技術分野での欠陥を克服するための免疫原性組成物、ワクチンならびに関連する方法および使用を提供する。本組成物、方法および使用は、レプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)を用いてワクチン接種することによって、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)による感染を防御し、その罹患率を減少させ、かつ/またはその重症度を減少させる。
本発明の免疫原性組成物およびワクチンは、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)に対して免疫応答を引き起こすことができるレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)菌(単数または複数)を含む。好ましくは、レプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)は死菌(単数または複数)である。
【０００５】
本発明の免疫原性組成物およびワクチンは、牛伝染性鼻気管炎(IBR)ウイルス、牛ウイルス性下痢(BVD)1型および2型、パラインフルエンザ3型(PI3)ウイルスおよび牛RSウイルス(BRSV)からなる群から選択される1以上の改変生ウイルス(MLV)をさらに含むことができる。好ましい免疫原性組成物およびワクチンは、死滅レプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)、改変生牛伝染性鼻気管炎(IBR)ウイルス、改変生牛ウイルス性下痢(BVD)1型および改変生BVD2型の混合剤、例えば認可された市販混合剤、Express FP(登録商標)3 VL5(Boehringer Ingelheim Vetmedica社、セントジョセフ)を含む。本発明の免疫原性組成物およびワクチンは、改変生牛RSウイルス(BRSV)または死滅カンピロバクター・フィタス(Campylobacter Fetus)、ヘモフィルス・ソムナスならびにレプトスピラ血清型カニコーラ、グリポティフォーサ、ハージョ、イクテロヘモラジアおよびポモナのいずれかの混合剤を含むこともできる。
【０００６】
本発明の免疫原性組成物およびワクチンは、被験体におけるレプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)による感染を防御し、その罹患率を減少させ、かつ/またはその重症度を減少させる。好ましくは、被験体はウシ属動物であり、より好ましくはウシ属動物は雌牛または未経産雌牛であり、最も好ましくは前記ウシ属動物は未経産雌牛である。
本明細書に記載の少なくとも1以上のレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)菌(単数または複数)を含む本発明の免疫原性組成物は、薬学的または獣医学的に許容される担体、アジュバントまたはそれらの組み合わせなどの生理学的に許容されるビヒクルをさらに含むことができる。
本明細書で提供されるレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)菌のいずれかまたは本明細書で提供される1以上のレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)菌(単数または複数)を含む任意の免疫原性組成物は、医薬として、好ましくはワクチンまたは免疫原性組成物として、最も好ましくはレプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)感染症に対する被験体の予防または治療のために使用することができる。
【０００７】
本明細書で用いられる組成物に生理学的に許容される公知の滅菌注射用溶液を組み込むことができることは当業者には明らかであろう。注射剤または輸液のためのすぐ使える(ready-to-use)溶液を調製するための水性等張溶液、例えば生理食塩水または血漿タンパク質溶液は容易に入手できる。さらに、本発明の免疫原性およびワクチン組成物は、獣医学的に許容される担体、希釈剤、等張剤、安定剤またはアジュバントを含むことができる。
本発明はまた、本発明の組成物の使用に加えて、被験体におけるレプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)による感染を防御し、その罹患率を減少させ、かつ/またはその重症度を減少させるための方法であって、被験体に免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む前記方法において、免疫原性組成物またはワクチンがレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)を含む前記方法を提供する。
【０００８】
本発明の方法および本発明の組成物の使用は、限定するものではないが、被験体におけるレプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)感染症に対する免疫応答を引き起こすための方法または使用であって、本明細書に記載の1以上のレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)菌(単数または複数)を含む免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含む前記方法または使用を含む。好ましくは、免疫応答は、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)の2以上の血清型または株に対して引き起こされる。本発明の組成物は、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)感染症を治療あるいは予防するために使用することができる。好ましくは、このような免疫応答は、1以上のレプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)莢膜型の感染症と関連する、またはそれによって引き起こされる1以上の臨床徴候の罹患率または重症度を減少させる。
【０００９】
本明細書においては、本発明の組成物を投与することができる適切な被験体およびそれを必要とする被験体は、ウイルス性、微生物性、寄生虫性、原生動物性、細菌性または真菌性の感染症、疾患または状態の予防薬または治療薬のいずれかを必要とする動物およびヒトを含む。本発明の組成物または方法の使用によって免疫応答が促進される動物は、ブタ類、ウシ属動物、家禽(例えばニワトリ、カモ、ガチョウもしくは七面鳥)ヤギおよびヒツジなどの家畜ならびにマウス、ウサギ、イヌ、ネコおよびウマなどの飼い慣らされた動物を含む。好ましい動物はウシ属動物を含み、最も好ましくは雌牛および未経産雌牛を含む。
【００１０】
本発明はまた、本発明の組成物の使用に加えて、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)感染症と関連するか、またはそれを引き起こす1以上の臨床徴候の罹患率または重症度を減少させるための方法であって、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)感染症の臨床徴候の罹患率または重症度が、本明細書に記載の免疫原性組成物を投与されなかった被験体に対して、少なくとも10%、好ましくは少なくとも20%、よりさらに好ましくは少なくとも30%、よりさらに好ましくは少なくとも50%、よりさらに好ましくは少なくとも70%、最も好ましくは100%減少されるように、本明細書に記載の1以上のレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)菌(単数または複数)および好ましくは担体分子を含む本発明の免疫原性組成物を投与するステップを含む前記方法を提供する。
【００１１】
さらなる側面によれば、本発明はまた、本発明の組成物の使用に加えて、本明細書に記載の1以上のレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)を含む本発明の免疫原性組成物を投与するステップを含む、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)感染症の予防のための方法にも関する。
本発明の他の側面は、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)の少なくとも1つの血清型、より好ましくはレプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)の2以上の血清型に対して免疫応答を誘導する1以上のレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)菌(単数または複数)を製造する方法を提供する。本方法は、本明細書に開示されたレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)菌(単数または複数)の1以上をコードし発現する形質転換発現ベクターを培養することを含む。発現された菌(単数または複数)は、発現微生物によって保持されるかまたは培地中に分泌される。レプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)への免疫応答を誘導することができるレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)菌を製造するのに十分な条件下で発現が行われる。
【００１２】
本発明の組成物の製造方法は、さらに、1以上のレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)菌(単数または複数)および担体分子と、薬学的または獣医学的に許容される担体、アジュバントまたはそれらの組み合わせなどの生理学的に許容されるビヒクルとを混合することを含むことができる。ビヒクル、アジュバントまたは組み合わせの選択は、送達経路、個人的な好みおよび特に動物種によって決定されることは当業者には明らかであろう。
他の側面において、本発明は、本発明の組成物の使用に加えて、被験体におけるレプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)感染症を診断する方法を提供する。本方法および使用は、1以上のレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)菌(単数または複数)を提供し;1以上のレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)菌(単数または複数)と被験体から得られた試料とを接触させ;その試料中で1以上のレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)菌(単数または複数)と結合することができる抗体が検出された場合に、その被験体がレプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)感染症にかかっていることが確認されることを含む。
【００１３】
本発明はまた、1以上のレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)菌(単数または複数)および場合により担体分子を含む免疫原性組成物;免疫原性組成物を収納するための容器;1組の印刷した使用説明書;ならびに免疫原性組成物を動物に投与することができるディスペンサーを含むキットを提供する。1以上のレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)菌(単数または複数)および担体分子は、場合により、いっしょに収納することもできるし、別々の化合物として収納することもできる。別々に供給される場合は、1以上のレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)菌(単数または複数)と担体分子を混合または混和する手段および必要に応じて印刷した使用説明書もまた提供される。
本発明はまた、1組の印刷した使用説明書;1以上のレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)菌(単数または複数)を含む本明細書で提供される免疫原性組成物を動物に投与することができるディスペンサー;ならびに、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)感染症と関連する少なくとも1つの疾患に対して動物に効果的に免疫性を与えるレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)菌(単数または複数)の少なくとも1つを含む、動物にワクチン接種するためのキットを提供する。好ましくは、1以上のレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)菌(単数または複数)は、本明細書で提供される菌から選択される。本発明のキットは、さらに、獣医学的に許容される担体、アジュバントまたはそれらの組み合わせを含むことができる。
【００１４】
本発明のキットにおけるディスペンサーは、その内容物を液滴で投与することができ、該キットに含まれる本明細書に記載のレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)菌(単数または複数)を含むその免疫原性組成物は、動物の皮下、鼻腔内、皮内または筋肉内に投与するとき、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)感染症の少なくとも1つの臨床徴候の重症度を減少させることができる。好ましくは、臨床徴候の重症度は、未処置の感染動物と比較して、少なくとも10%、好ましくは少なくとも20%、よりさらに好ましくは少なくとも30%、よりさらに好ましくは少なくとも50%、よりさらに好ましくは少なくとも70%、最も好ましくは100%減少される。
レプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)によって引き起こされる感染症の治療または予防のための本発明の組成物の方法および使用もまた開示される。本方法および使用は、被験体にレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)菌(単数または複数)の有効量を投与することを含み、ここで前記治療または予防は、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)感染症の徴候を減少させること、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)感染症の臨床徴候の重症度または罹患率を減少させること、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)感染症から被験体の死亡率を減少させることならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される。
本発明の組成物は、さらに、獣医学的に許容される担体、アジュバントまたはそれらの組み合わせを含む。このような組成物は、ワクチンとして使用することができ、弱毒ワクチン、不活化ワクチンまたはそれらの組み合わせを含むことができる。このようなワクチンは、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)感染症と関連する少なくとも1つの疾患または臨床症状に対する防御免疫学的応答を誘導する。
【００１５】
本明細書で用いられる組成物に生理学的に許容される公知の滅菌注射用溶液を組み込むことができることは当業者には明らかであろう。注射剤または輸液のためのすぐ使える溶液を調製するための水性等張溶液、例えば生理食塩水または血漿タンパク質溶液は容易に入手できる。さらに、本発明の免疫原性およびワクチン組成物は、薬学的または獣医学的に許容される担体、希釈剤、等張剤、安定剤またはアジュバントを含むことができる。
本発明の方法および使用はまた、本発明の組成物と獣医学的に許容される担体、アジュバントまたはそれらの組み合わせとを混合することを含むことができる。担体、アジュバントまたは組み合わせの選択は、送達経路、個人的な好みおよび特に動物種によって決定されることは当業者には明らかであろう。
本発明はまた、動物のレプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)感染症の重症度を減少させるための本発明の方法または使用であって、レプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)菌(単数または複数)を含む組成物を動物に投与することを含む前記方法または使用を提供する。
レプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)によって引き起こされる感染症の治療または予防のための本発明の方法および本発明の組成物の使用もまた開示される。本方法は、本発明のレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)菌(単数または複数)の有効量を動物に投与することを含む。
【００１６】
好ましい投与経路は、皮下、鼻腔内、皮内および筋肉内を含む。本発明の組成物は、2以上の用量で投与することができ、他の投与経路によって投与することもできることは、当業者には明らかであろう。例えば、このような他の経路は、皮下、皮内、静脈内、血管内、動脈内、腹腔内、髄腔内、気管内、心臓内に、乳腺葉内、脊髄内、肺内または腟内を含む。治療の所望の持続期間および有効性に応じて、本発明に記載の組成物は、1回または数回、また断続的に、例えば毎日、数日間、数週間または数か月間、種々の用量で投与することができる。
本発明はまた、1組の印刷した使用説明書;ワクチンを動物に投与することができるディスペンサー;ならびに、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)と関連する少なくとも1つの疾患に対して動物に効果的に免疫性を与える少なくとも1つの死滅レプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)菌(単数または複数)を含む、動物にワクチン接種するためのキットを提供する。本発明のキットは、さらに、獣医学的に許容される担体、アジュバントまたはそれらの組み合わせを含むことができる。
本発明のキットにおけるディスペンサーは、その内容物を液滴で投与することができ、該キットに含まれる分離株は、動物の鼻腔内、経口、皮内または筋肉内に投与するとき、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)感染症の少なくとも1つの臨床徴候の重症度を減少させることができる。キットによっては、該分離株は、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)感染症の少なくとも1つの臨床徴候の重症度を減少させることもできる。好ましくは、臨床徴候の重症度は、未処置の感染動物と比較して少なくとも10%減少されている。
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の発明の詳細な説明によって明らかとなるであろう。しかしながら、発明の詳細な説明および実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者にはこの発明の詳細から本発明の精神および範囲の範囲内の種々の変更および改変が明らかとなることから、例示としてのみ提供されることを理解すべきである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)による感染の重症度を防御し、その罹患率を減少させ、かつ/またはその重症度を減少させる免疫原性組成物、ワクチン、および、レプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)を用いてワクチン接種することによって、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)による感染の重症度を防御し、その罹患率を減少させ、かつ/またはその重症度を減少させる方法およびレプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョの使用を提供する。
本発明は、LHBのチャレンジに対して防御する、2つの異なる混合ワクチンのLHP成分の能力を明らかにする。チャレンジの結果として、チャレンジ後の培養結果は、2つのワクチン処置群(群1および群2、実施例1)におけるワクチン接種された未経産雌牛のどちらも、感染症を有することを示さなかった(表2および6、実施例1を参照のこと)。これらの結果は、未経産雌牛の100%が感染したプラセボ対照ワクチン接種動物とは際立って対照的であった(表2、3および5、実施例1を参照のこと)。
ここで報告した結果とは対照的に、以前の研究では、ワクチン接種動物がLHBでチャレンジされた場合、LHPを含むワクチンは、尿中排出または尿路感染症に対する優れた防御を示さなかったことを報告している。本ワクチンの製造に用いたハージョの血清型における微妙な差異によって、本ワクチンによって提供される防御レベルを一部分説明することができる。このような区別は、原分離株(original isolate)における差異ならびに、増殖および継代接種の方法に基づいて引き起こされた差異を含むことができる。
【００１８】
当該技術分野では、ワクチンによって提供される防御レベルは、ワクチンに含まれる微生物の血清型/株の特質ばかりでなく、存在する場合は、ワクチンの製剤に用いられているアジュバントにもまた左右されると理解される。本明細書においては、用いられたワクチンはアジュバント(単数または複数)を含んでいた。さらにまた、株の製造に用いられた増殖条件および不活化条件もまた、ワクチンによって提供される有効性に影響し得る。アジュバント製剤と併用する血清型の差異およびワクチンのための微生物処理は、防御免疫応答を誘導するワクチンの能力に影響し得る。組み合わされたこれらの要素の全部または一部によって、他の発明の以前の失敗と本発明の成功を説明することができる。
改変生ウイルス/LHPバクテリン混合剤および死滅ウイルス/LHPバクテリン混合剤の両方を用いたワクチン接種によって、LHBのチャレンジ後に、尿中排出の予防ばかりでなく、尿路感染症およびコロニー形成の予防ももたらした。この試験の結果は、LHBによるチャレンジ誘発尿路感染症およびコロニー形成ならびに付随する尿中排出に対して試験ワクチンのL.ハージョ(L. hardjo)成分が極めて効果的であることを示している。
【００１９】
特記しない限り、本発明の実施には、分子生物学、微生物学、組換えDNA技術、タンパク質化学および免疫学の慣用法を用いるが、これらは当該分野の技術の範囲内である。このような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II and III, Second Edition (1989); DNA Cloning, Vols. I and II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R. K. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986); Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984);Methods In Enzymologyシリーズ(S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Protein purification methods - a practical approach (E.L.V. Harris and S. Angal, eds., IRL Press at Oxford University Press);およびHandbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications)を参照のこと。
【００２０】
本発明を詳細に述べる前に、本発明は、特定の細菌培養物またはプロセスパラメータに限定されず、そのようなものとして、もちろん変更し得ることが理解されなければならない。同様に、本明細書で用いられる用語法は、本発明の特定の実施形態を記述することのみを目的としたものであって、限定するものではないこともまた理解されなければならない。本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる場合、単数形“ある(a)”、“ある(an)”および“その(the)”は、特記しない限り、複数指示対象を含む事に注意しなければならない。従って、例えば、"ある(a)ワクチン"とは、2以上の抗原の混合物を含み、"ある(an)免疫原性組成物"とは2以上の免疫原性ワクチン成分の混合物を含むなどである。
【００２１】
定義
特記しない限り、本明細書で用いられるすべての学術用語は、出願時点での、本発明が属する当該技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。用語の意味および範囲は明確でなければならない。しかしながら、潜在的多義性の事象において、本明細書で提供される定義は、任意の辞書または別段の定義に優先する。さらにまた、文脈上別段の必要がなければ、単数用語は複数であることを含むこととし、複数用語は、単数であることを含むこととする。本明細書においては、特記しない限り、“または(or)”の使用は、“および/または”を意味する。さらにまた、用語“含んでいる(including)”ならびに“含む(includes)”および“含んでいた(included)”などの他の語形の使用は限定するものではない。本明細書で言及したすべての特許および公報は、参照により本願に組み込まれる。
【００２２】
“疾患に対する防御”、“感染防御免疫”、“機能免疫”および同様な句は、本発明の1以上の治療用組成物またはそれらの組み合わせの投与によって生じる、疾患または感染症に暴露された非免疫被験体で予想されるよりも有害作用が少ない、疾患または状態に対する応答を意味する。すなわち、感染症の有害作用の重症度は、ワクチン接種された被験体においてより減少している。感染症は、ワクチン接種された被験体において、減少され、遅延され、そして場合により完全に予防されることができる。本明細書においては、感染症の完全な予防を意味する場合は、そのことは具体的に述べられる。完全な予防が述べられない場合は、その用語は不完全な予防を含む。
本明細書においては、“臨床徴候の罹患率および/または重症度の減少”または“臨床症状の減少”は、限定するものではないが、ある群における感染した被験体数の減少、感染症の臨床徴候を示す被験体数の減少もしくは排除または、野生型感染症と比較して1以上の被験体に存在する任意の臨床徴候の重症度の減少を意味する。例えば、それは、当然、病原体負荷、病原体排出の任意の減少、病原体感染症の減少またはマラリアの徴候を示す任意の臨床徴候の減少を指す。好ましくは、これらの臨床徴候は、本発明の治療用組成物を投与する1以上の被験体において、本組成物を投与せず感染する被験体と比較して少なくとも10%減少される。より好ましくは、臨床徴候は、本発明の組成物を投与する被験体において、少なくとも20%、好ましくは少なくとも30%、より好ましくは少なくとも40%、aよりさらに好ましくは少なくとも50%減少される。
【００２３】
本明細書においては、用語“防御の増強”は、限定するものではないが、それぞれ、被験体のワクチン接種群における、被験体のワクチン非接種対照群に対する、感染性病原体、好ましくはレプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)による感染症と関連する1以上の臨床症状の統計的に有意な減少を意味する。用語“臨床症状の統計的に有意な減少”は、限定するものではないが、感染性病原体のチャレンジ後に、被験体のワクチン接種群における少なくとも1つの臨床症状の罹患率が、ワクチン非接種対照群よりも、少なくとも10%、好ましくは20%、より好ましくは30%、よりさらに好ましくは50%、よりさらに好ましくは70%低いことを意味する。
“長期持続性防御”は、少なくとも3週間、より好ましくは少なくとも3、4、5、6または7ヶ月間、よりさらに好ましくは8、9、10、11または12ヶ月間、よりさらに好ましくは13、14、15、16、17または18ヶ月間、最も好ましくは19ヶ月間以上持続する“有効性の改善”を指すものとする。家畜の場合は、動物が食肉として市場で売られる平均年齢までその長期持続性防御が持続することが最も好ましい。未経産雌牛または雌牛の場合は、その動物が繁殖をやめ、市場で売られる平均年齢まで長期持続性防御が持続することが最も好ましい。
【００２４】
“免疫原性組成物または免疫組成物”とは、宿主において、その組成物に対する細胞性または抗体性免疫応答での免疫学的応答を誘導する少なくとも1つのレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)またはそれらの免疫原性部分を含む組成物または物質のことを言う。本発明の好ましい実施形態において、免疫原性組成物は免疫応答を誘導する。より好ましくは、免疫原性組成物は、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)感染症の臨床徴候の1以上に対して感染防御免疫を与える。
"免疫応答"または“免疫学的応答”は、限定するものではないが、目的組成物またはワクチンに対する細胞性および/または抗体性免疫応答の発生を意味する。通例、免疫応答または免疫学的応答は、限定するものではないが、以下の効果の1以上を含む:対象とする組成物またはワクチンに含まれる抗原(単数または複数)に特異的に向けられる抗体、B細胞、ヘルパーT細胞、サプレッサーT細胞、および/または細胞傷害性T細胞の産生または活性化。好ましくは、宿主は、新規感染症に対する耐性が増強されるように、かつ/または疾患の臨床的重症度が減少されるように、治療または防御免疫学的(記憶)応答のいずれかを示す。このような防御は、症状数の減少、症状の重症度または、病原体の感染症と関連する症状の1以上の欠如、例えばウイルス血症の開始の遅延、ウイルス持続感染の減少、全ウイルス量の減少および/またはウイルス排出の減少で証明される。
【００２５】
本明細書においては、“特異的免疫反応性の”とは、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)感染症に特徴的な抗原は認識するが、厳密なチャレンジ対照に特徴的な抗原には反応しない免疫反応性タンパク質またはポリペプチドのことを言う。
本明細書において、“薬学的または獣医学的に許容される担体”は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、アジュバント、安定化剤、希釈剤、防腐薬、抗菌剤および抗真菌薬、等張剤、吸着遅延剤などを含む。いくつかの好ましい実施形態、特に凍結乾燥免疫原性組成物の実施形態において、本発明に使用するための安定化剤は、凍結乾燥またはフリーズドライのための安定剤を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態において、本発明の免疫原性組成物はアジュバントを含む。本明細書において、“アジュバント”は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、サポニン、例えばQuil A、QS-21(Cambridge Biotech社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals社、バーミンガム、アラバマ州)、油中水型乳剤、水中油型乳剤、水中油中水型乳剤を含むことができる。乳剤は、特に、軽質流動パラフィン油(欧州薬局方タイプ);イソプレノイド油、例えばスクアランまたはスクアレン;アルケン、特にイソブテンまたはデセンのオリゴマー化によって得られるオイル;直鎖アルキル基を含む酸またはアルコールのエステル、より具体的には植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ(カプリラート/カプラート)、グリセリルトリ(カプリラート/カプラート)またはプロピレングリコールジオレアート;分枝鎖脂肪酸またはアルコールのエステル、特にイソステアリン酸エステルに基づくことができる。これらのオイルは、乳剤を形成させるために、乳化剤と組み合わせて用いられる。乳化剤は、好ましくは非イオン性界面活性剤であり、特にソルビタン、マンニド(例えばアンヒドロマンニトールオレアート)、グリコール、ポリグリセロール、プロピレングリコールとオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸またはヒドロキシステアリン酸とのエステル(これらは場合によりエトキシル化されている)ならびにポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレン共重合体ブロック、特にプルロニック製品、特にL121である。Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.), JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995) and Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997) を参照のこと。例示的なアジュバントは、“Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach”(M. Powell and M. Newman編), Plenum Press, 1995 の147ページに記載されているSPT乳剤および同書の183ページに記載されている乳剤MF59である。
【００２７】
アジュバントのさらなる例は、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーおよび、無水マレイン酸とアルケニル誘導体の共重合体から選択される化合物である。好都合なアジュバント化合物は、特に糖またはポリアルコールのポリアルケニルエーテルで架橋されたアクリル酸またはメタクリル酸のポリマーである。これらの化合物は、用語カルボマー(Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996)によって公知である。当業者は、少なくとも3、好ましくは8以下のヒドロキシル基を有し、その少なくとも3つのヒドロキシルの水素原子が、少なくとも2炭素原子を有する不飽和脂肪族ラジカルによって置換されているポリヒドロキシル化化合物で架橋されたアクリルポリマーを記載している米国特許第2,909,462号を指摘することもできる。好ましいラジカルは、2〜4炭素原子を含むラジカルであり、例えばビニル、アリルおよび他のエチレン性不飽和基である。不飽和ラジカルは、それ自身、他の置換基、例えばメチルを含むことができる。カルボポル(Carbopol);(BF Goodrich社、オハイオ州、米国)の名称で販売されている製品は特に適切である。カルボポルは、アリルスクロースまたはアリルペンタエリスリトールで架橋されている。それらの中では、カルボポル974P、934Pおよび971Pを挙げることができる。カルボポル971Pの使用が最も好ましい。無水マレイン酸とアルケニル誘導体との共重合体の中では、無水マレイン酸とエチレンとの共重合体である共重合体EMA(Monsanto社)がある。これらのポリマーの水への溶出は酸溶液を生じ、この溶液は、免疫原性組成物、免疫学的組成物またはワクチン組成物自身が組み込まれるアジュバント溶液を提供するために、好ましくは生理学的なpHに中和される。
【００２８】
さらなる適切なアジュバントは、限定するものではないが、とりわけ、リビアジュバントシステム(Ribi社)、ブロック共重合体(CytRx社、アトランタ、ジョージア州)、SAF-M(Chiron社、エメリービル、カリフォルニア州)、モノホスホリル脂質A、アブリジン脂質-アミンアジュバント、E.コリ(E. coli)由来(組換え他)の熱不安定性エンテロトキシン、コレラ毒素、IMS 1314もしくはムラミルジペプチドまたは天然に存在するサイトカイン、組換えサイトカインまたはそれらのアナログまたは内因性サイトカイン放出の刺激薬を含む。
アジュバントは、1用量当たり約100μg〜約10mgの量で、好ましくは1用量当たり約100μg〜約10mgの量で、より好ましくは1用量当たり約500μg〜約5mgの量で、よりさらに好ましくは1用量当たり約750μg〜約2.5mgの量で、最も好ましくは1用量当たり約1mgの量で加えることができることが期待される。あるいは、アジュバントは、最終製品の容量パーセントで、約0.01〜50%の濃度で、好ましくは約2%〜30%の濃度で、より好ましくは約5%〜25%の濃度で、よりさらに好ましくは約7%〜22%の濃度で、最も好ましくは10%〜20%の濃度であることができる。
【００２９】
“希釈剤”は、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどを含むことができる。等張剤は、特に、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを含むことができる。安定剤は、特に、アルブミンおよびエチレンジアミン四酢酸のアルカリ塩を含む。
“安全性”とは、細菌ワクチンのビルレンスへの復帰可能性、臨床的に重要な副作用、例えば持続性全身疾患またはワクチン投与部位における許容できない炎症を含むが限定されない、ワクチン接種後のワクチン接種動物における有害な結果が存在しないことを言う。
【００３０】
本明細書において、用語“ワクチン接種”もしくは“ワクチン接種する”またはそれらの異形は、限定するものではないが、動物に投与された場合に、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)に対する動物の免疫応答を直接または間接に誘導する、または誘導することができる、本発明の免疫原性組成物の投与を含むプロセスを意味する。
本発明との関係において、“死亡率”とは、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)感染症によって引き起こされる死のことを言い、その感染症が重篤なため苦痛を予防し人道的な死を与えるために動物を安楽死させる場合を含む。
“弱毒化”は、病原体のビルレンスを低下させることを意味する。本発明において、“弱毒化”は“非病原性の(avirulent)”と同義である。本発明において、弱毒化細菌は、ビルレンスが低下され、それによってレプトスピラ症の臨床徴候を引き起こさずに標的哺乳動物において免疫応答を誘導することができる細菌であるが、それはまた、非弱毒化レプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)に感染し、弱毒化細菌を投与されていない動物の“対照群”と比較して、弱毒化レプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)に感染した動物の臨床徴候の罹患率または重症度が低下されていることを意味することもできる。ここでは、用語“減少する/減少される”は、上記で定義した対照群と比較しての少なくとも10%、好ましくは25%、よりさらに好ましくは50%、よりさらに好ましくは60%、よりさらに好ましくは70%、よりさらに好ましくは80%、よりさらに好ましくは90%、最も好ましくは100%の減少を意味する。従って、弱毒化非病原性レプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)株は、改変生レプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)菌を含む免疫原性組成物に組み込むのに適した株である。
【００３１】
本明細書においては、“有効用量”は、限定するものではないが、抗原が投与される動物において臨床症状の減少を引き起こす免疫応答を誘導するかまたはそれを誘導することができる抗原の量を意味する。
本明細書において、用語“有効量”は、組成物との関係において、動物における疾患の感染または発生の罹患率または重症度を減少させる免疫応答を誘導することができる免疫原性組成物の量を意味する。特に、有効量は、1用量当たりのコロニー形成単位(CFU)のことを言う。あるいは、治療剤との関係において、用語“有効量”は、疾患または障害の進行を予防し、疾患または障害の軽減を引き起こし、疾患または障害と関連する1以上の症状の再発、発生、開始または進行を予防し、他の治療または治療剤の予防または治療を促進または改善する、疾患または障害またはそれらの1以上の症状の重症度または持続期間を減少または改善するのに十分な治療剤の量のことを言う。
本明細書において、用語“レプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)に対する免疫反応性”は、そのペプチドまたは断片が、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)に対して免疫学的応答を誘導することを意味する。
【００３２】
B.アジュバント
本明細書で提供される1以上のレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)を含む免疫原性組成物の免疫原性をさらに高めるために、1以上のアジュバントをさらに含むことができる。
アジュバントは、前述の技術または当該技術分野で公知の技術のいずれかで精製することができる。好ましい精製技術は、W. Clark Still et al, J. Organic Chemistry, 43, 2923-2925 (1978)に記載されているシリカゲルクロマトグラフィー、特に"フラッシュ"(迅速)クロマトグラフ技術である。しかしながら、HPLCを含む他のクロマトグラフ法をアジュバントの精製に用いることができる。アジュバントを精製するために結晶化を用いることもできる。合成によって分析純度の製品が直接に得られる場合は、精製は必要ではない。
本発明のワクチン組成物は、アジュバント添加組成物(adjuvanted composition)を製造するための公知の技術に従って適切な滅菌条件下でレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)とアジュバントとを物理的に混合することによって製造される。レプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)とアジュバントとの複合体形成は、長鎖アルキル化合物アジュバント上に存在する正電荷に静電的に誘引されるコンジュゲート上の負の正味電荷の存在によって促進される。
アジュバントは、1用量当たり約100μg〜約10mgの量で、好ましくは1用量当たり約100μg〜約10mgの量で、より好ましくは1用量当たり約500μg〜約5mgの量で、よりさらに好ましくは1用量当たり約750μg〜約2.5mgの量で、最も好ましくは1用量当たり約1mgの量で添加することができることが期待される。あるいは、アジュバントは、最終生成物の容量パーセントで、約0.01%〜75%の濃度で、好ましくは約2%〜30%の濃度で、より好ましくは約5%〜25%の濃度で、よりさらに好ましくは約7%〜22%の濃度で、最も好ましくは10%〜20%の濃度のものであることができる。
【００３３】
C.生理学的に許容されるビヒクル
本発明のワクチン組成物は、他の医薬ポリペプチド組成物に用いる技術と同様な技術を用いて製剤化することができる。従って、アジュバントおよびレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)は、凍結乾燥形で保存し、投与前に生理学的に許容されるビヒクルで再構成させて懸濁液を生成させることができる。あるいは、アジュバントおよびコンジュゲートは、ビヒクル中で保存することもできる。好ましいビヒクルは滅菌溶液であり、特に、滅菌緩衝液、例えばリン酸緩衝化生理食塩水である。免疫原性組成物の免疫学的有効性が改善される、ビヒクル中でアジュバントとコンジュゲートを混合する任意の方法が適切である。
本発明のワクチンの単回投与の容量は変えることができるが、一般に、従来のワクチンで一般に用いられる範囲内である。単回投与の容量は、上記のコンジュゲートおよびアジュバントの濃度で、好ましくは約0.1ml〜約3ml、、好ましくは約0.2ml〜約1.5ml、より好ましくは約0.2ml〜約0.5mlである。
本発明のワクチン組成物は、任意の便利で適切な手段で投与することができる。
【００３４】
D.製剤
レプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)を含む免疫原性組成物は、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)に対する予防接種のためのワクチンとして使用することができる。生理学的に許容されるビヒクル中に免疫原性組成物を含むワクチンは、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)による感染の治療または予防のために、動物、好ましくは牛、好ましくは雌牛、最も好ましくは未経産雌牛に免疫性を与える方法に有用である。
免疫原性組成物を用いる予防接種によって、本発明の免疫原性組成物に対して生成された抗体は、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)の感染症を治療または予防するための受動免疫療法および抗イディオタイプ抗体生成に使用することができる。
本組成物が投与される被験体は、好ましくは、限定するものではないが、雌牛、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽(例えばニワトリ)、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウスおよびラットを含む動物であり、最も好ましくは、動物は雌牛または未経産雌牛である。
【００３５】
本発明の製剤は、1以上の免疫原性組成物またはそれに対する抗体および生理学的に許容されるビヒクルの有効な免疫量(immunizing amount)を含む。ワクチンは、1以上の免疫原性組成物および生理学的に許容されるビヒクルの有効な免疫量を含む。この製剤は、投与方法に適したものでなければならない。
免疫原性組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤またはpH緩衝化剤を含むこともできる。免疫原性組成物は、液体溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、ピル、カプセル、持続放出製剤または粉末剤であることができる。経口製剤は、標準的な担体、例えば医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含むことができる。
【００３６】
E.有効用量
本明細書に記載の化合物は、レプトスピラ症関連疾患を治療するために、治療的有効用量で被験体に投与することができる。この用量は、ワクチンが投与される宿主ばかりでなく、その宿主の要素、例えばサイズ、体重および年齢にも左右される。
製剤に用いられる本発明の免疫原性コンジュゲートまたは抗体の正確な量は、投与経路および被験体の性質(例えば種、年齢、サイズ、疾患の病期/レベル)によって左右され、標準的な臨床技術に従って、医師の判断および各被験体の環境に従って決定されなければならない。有効な免疫量は、被験体のレプトスピラ・ボルグペテルセニイ血清型ハージョ(遺伝子型ハージョボビス)感染症を治療または予防するために十分な量である。有効用量は、動物モデル試験系由来の用量反応曲線から外挿することもでき、0.001mg/kgから100mg/kgまで様々であることができる。
化合物の毒性および治療効果は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的方法、例えばLD50(その集団の50%致死用量)およびED50(その集団の50%有効用量)を測定する方法によって測定することができる。毒性効果と治療効果の用量比は治療係数であり、これは比LD50/ED50で表すことができる。治療係数が大きい化合物が好ましい。中毒性副作用を示す化合物を用いることもできるが、非感染細胞への起こりうる障害を最少限にし、それによって副作用を軽減するために、このような化合物が罹患組織部位を標的とするデリバリーシステムを設計することを考慮すべきである。
【００３７】
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、動物、特に牛に使用するための用量範囲の処方に用いることができる。このような化合物の用量は、好ましくは、ほとんど毒性のないED50を含む循環濃度範囲内に位置する。この用量は、用いられる剤形および利用される投与経路に依存してこの範囲内で様々であることができる。本発明の方法に使用される任意の化合物のために、初めに、細胞培養アッセイから治療的有効用量を推定することができる。細胞培養において決定されたIC50(すなわち、症状の最大の2分の1の抑制を達成する試験化合物の濃度)を含む循環血漿中濃度範囲を達成するための用量を動物モデルにおいて処方することができる。このような情報は、被験体において有用な用量をより正確に決定するために用いることができる。血漿中濃度は、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【００３８】
組成物の免疫原性は、当該技術分野で公知の任意のイムノアッセイの使用によって、組成物での予防接種後に被験体の免疫応答をモニタリングすることによって決定することができる。体液性(抗体)応答および/または細胞性免疫の生成は、免疫応答の徴候で確かめることができる。被験体は、動物例えばブタ、マウス、ハムスター、イヌ、ネコ、ウサギ、雌牛、ウマ、ヒツジ、家禽(例えばニワトリ、カモ、ガチョウおよび七面鳥)ならびにヒトを含むことができる。
被験体の免疫応答は、種々のアプローチ、例えば、公知の技術、例えば、酵素免疫抗体法(ELISA)、イムノブロット、免疫沈降などによりアッセイされる、得られた免疫血清の免疫原性コンジュゲートに対する反応性;または、感染症病原体レベル、例えば、細菌レベル(例えば、被験体からの試料の培養によって)をアッセイするための当該技術分野で公知の任意の方法または当該技術分野で公知の他の技術によって測定される、病原体による感染症からの免疫宿主の防御および/または免疫宿主における病原体による感染症による症状の軽減によって分析することができる。感染症病原体レベルは、免疫グロブリンが向けられる抗原のレベルを測定することによっても測定することができる。感染症病原体レベルの低下または感染症の症状の改善は、組成物が有効であることを示す。
【００３９】
動物またはヒトにおけるin vivoでの使用の前に、所望の治療または予防効果に関して本発明の治療薬をin vitroで試験することができる。例えば、特定の治療剤が必要であるかどうかを決定するために使用することができるin vitroアッセイは、細胞株からの適切な細胞または、特定の疾患または障害を有する被験体から培養された細胞が治療剤に暴露されるかまたは他の方法で投与され、その治療剤の前記細胞に対する効果が観察されるin vitro細胞培養アッセイを含む。
あるいは、治療剤は、感染症病原体による感染症に感受性が高いが感染症病原体に感染していない細胞(被験体または培養細胞株のいずれかから培養された)に治療剤を接触させ、感染症病原体にこの細胞を暴露し、次いで、治療剤に接触された細胞の感染率が治療剤に接触されなかった細胞の感染率よりも低いかどうかを測定することによってアッセイされることができる。感染症病原体による細胞の感染は、当該技術分野で公知の任意の方法によってアッセイされることができる。
さらに、治療の前、最中または後に、適切な時間間隔で、動物モデルまたはヒト被験体において抗体が向けられる分子のレベルを測定することによって治療剤をアッセイすることができる。該分子の量の変化の有り無しを見出すことができ、被験体に対する治療剤の効果を関連づけることができる。該分子のレベルは、当該技術分野で公知の任意の方法によって測定することができる。
【００４０】
本発明の方法および組成物を用いる、レプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)による動物のワクチン接種後に、当該技術分野で公知の任意の結合アッセイを用いて、得られた抗体と特定の分子との結合を評価することができる。これらのアッセイは、特定の抗原に対する、より高い親和性または特異性を示す抗体を選択するために行うこともできる。
【００４１】
F.検出および診断法
本発明のレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)組成物の使用から得られる抗体またはそれらの結合部分は、試料におけるレプトスピラの存在を検出するのに有用である。この検出法は、本発明のレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)に対して作られた単離された抗体またはそれらの結合部分を提供し、単離された抗体またはそれらの結合部分に、レプトスピラをある量含むことが疑われる試料を加え、レプトスピラに結合した単離された抗体またはそれらの結合部分を含む複合体の存在を検出するステップを含む。
【００４２】
本発明のレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)組成物の使用から得られた抗体またはそれらの結合部分は、試料におけるレプトスピラの存在を検出するのにも有用である。この検出法は、レプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)に対して作られた単離された抗体またはそれらの結合部分を提供し、単離された抗体またはそれらの結合部分にレプトスピラのある量を含むことが疑われる試料を加え、レプトスピラに結合している単離された抗体またはそれらの結合部分を含む複合体の存在を検出するステップを含む。
【００４３】
結合ペアのメンバーである特定の分子に結合する免疫グロブリン、特に抗体(およびそれらの機能的に活性な断片)は、本明細書に記載されるように、診断および予測に用いることができる。種々の実施形態において、本発明は、結合ペアのメンバーおよび臨床応用におけるこのような測定の使用を提供する。本発明における免疫グロブリンは、例えば生体試料における抗原の検出に用いることができ、それによって、被験体は、その免疫グロブリンが結合する分子の異常なレベルおよび/またはこのような分子の異常形の存在に関して試験されることができる。"異常なレベル"とは、疾患を有さない被験体またはその身体の一部からの類似した試料中に存在するレベルかまたはそれに存在することを示す標準レベルに対して増加または減少していることを意味する。本発明の抗体はまた、診断または予測技術に使用するためのキットにおける試薬として含まれることもできる。
【００４４】
一側面において、レプトスピラに免疫特異的に結合する本発明のレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)組成物の使用から得られた抗体は、レプトスピラ感染症の診断、予測またはスクリーニングに用いることができる。
他の側面において、本発明は、レプトスピラ感染症またはそれに対する免疫の存在を診断またはスクリーニングする方法であって、被験体において被験体由来の試料に対する抗体免疫特異的結合を測定することを含む前記方法において、抗体がレプトスピラペプチドに免疫特異的に結合し、感染症病原体を有さない被験体からの類似した試料における前記免疫特異的結合レベルに対する前記免疫特異的結合レベルの増加がS.スイス(S.suis)の存在を示す前記方法を提供する。
【００４５】
レプトスピラペプチドまたはそのアンタゴニストの存在を検出するための適切なアッセイの例は、限定するものではないが、ELISA、ラジオイムノアッセイ、ゲル内拡散沈降反応アッセイ、免疫拡散法アッセイ、凝集アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインAイムノアッセイまたは免疫電気泳動アッセイを含む。
特定の分子のイムノアッセイは、一般的には、検出可能に標識した抗体の存在下で、試料、例えば生体液、組織抽出物、新たに採取した細胞または培養細胞溶解物をインキュベートし、当該分野で公知のいくつかの技術のいずれかによって結合抗体を検出することを含む。
所定の抗体の結合活性は、公知の方法に従って測定することができる。当業者は、ルーチン試験を用いることによって各測定のための適切かつ最適のアッセイ条件を決定することができる。
【００４６】
本発明のさらなる側面は、LHBの検出または測定のための診断キットに関する。1以上の容器に抗レプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)抗体および、場合によりこの抗体に対して標識された結パートナーを含む診断用途のためのキットが提供される。あるいは、抗レプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)抗体を標識(検出可能なマーカー、例えば化学発光、酵素、蛍光性または放射性部分で)することもできる。従って、本発明は、抗レプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)抗体および対照免疫グロブリンを含む診断キットを提供する。特定の実施形態において、容器の前述の化合物の1つは検出可能に標識されていることができる。キットは、場合により、標準品または対照として使用するために、キットの抗体によって認識されるレプトスピラ・インターロガンス血清型ハージョ(遺伝子型ハージョプラジトノ)の所定量を容器内にさらに含むことができる。
【００４７】
G.被験体への投与
好ましい投与経路は、限定するものではないが、血管内および筋肉内を含む。本発明の組成物は、1または2以上の用量で投与することもできるし、他の投与経路で投与することもできることは、当業者には明らかであろう。例えば、このような他の経路は、経口、皮内、鼻腔内、皮下、皮内、静脈内、動脈内、腹腔内、鞘内、気管内、心内、小葉内、脊髄内、肺内および膣内を含む。治療の所望の持続期間および有効性に応じて、本発明の組成物は、1回または数回、また断続的に、例えば毎日、数日間、数週間または数か月間、種々の用量で投与することができる。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態を明らかにするために以下の実施例が含まれる。以下の実施例に開示された技術は、本発明の実施が十分に機能するように本発明者によって見出された技術を表し、従ってその実施のための好ましい方法を構成するとみなすことができることは、当業者には明らかであろう。しかしながら、本開示を考慮すれば、開示された特定の実施形態において多くの変更が可能であり、なお本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様な結果が得られることは、当業者には明らかであろう。
【実施例】
【００４９】
材料および方法
動物。牛に関係するすべての手順は、Animal Care and Use Committee at Rural Technologies Incorporated (RTI)に承認された。ワクチン接種の10日前に、55頭の6ヶ月齢ホルスタイン種未経産雌牛がドライロット飼育施設に到着した。すべての動物は健常であり、レプトスピラに対するワクチン接種を有さず、血清学的レプトスピラ顕微鏡下凝集試験(Microscopic Agglutination Test :MAT)によって、レプトスピラ(ポモナ、ハージョ、グリポティフォーサ、ブラタスラバ(brataslava)、カニコーラおよびイクテロヘモラジア(icterohemorrhagiae))の6つの血清型に対して血清学的に陰性であった。さらに、全55頭の動物は、免疫組織化学(IHC)試験によって、牛ウイルス性下痢ウイルス(BVDV)に対して刻耳陰性であった。本研究のワクチン接種およびチャレンジ部分に最低限50頭の動物が利用可能であり、かつチャレンジ材料の継代接種のために2頭の動物が利用可能であることを確実にするために、最初に55頭の動物を入手した。
【００５０】
動物の飼養・収容。到着後、150フィート(ft)コンクリート製フェンスライン飼槽を備えた33,750平方フィート(sq ft)ドライロットに動物の群れを収容した。チャレンジ前に、大きさがおおよそ4,080sq ftのフープバーン(hoop barn)に動物の群れを移動させた。このフープバーン施設は、飼槽ラインスペースが100ftであり、ヘッドロックおよび2つの自動給水器を備える。すべての動物に年齢に応じた穀物レーションを与え、牧草の干し草および水は自由に摂取させた。さらに、この動物を働かせる日には、飼料を利用してヘッドロックに未経産雌牛を誘った。
【００５１】
マスキング(盲検化)。チャレンジ後の臨床評価を行う研究者および/または被指名者は、処置群への個々の割り付けに対して盲検化した。試験所の職員による血清、尿および組織試料の試験もまた、処置群割り付けに対して盲検化した。
動物登録、無作為化および動物観察。最初のワクチン接種の前の処置群への動物の割り付けは、完全な無作為分布に基づいた。Microsoft(登録商標)Excelによって提供されたAnalysis ToolPakにおけるRandom Numbers Generatorを用いて、未経産雌牛を処置群に割り付けた。0日目に、53頭の動物を3つの処置群の1つに無作為に割り付けた(表1)。2頭の未経産雌牛をチャレンジ継代接種動物として無作為に選択した。試験の最後に、登録した未経産雌牛を、既述のようにRandom Numbers Generatorを用いて2つの剖検日の内の1つに無作為に割り付けた。
【００５２】
B.処置群
以下のウイルス/バクテリン混合ワクチンを本研究に用いた(表1):
表1.処置群、動物の頭数およびワクチンの投与量
2013544886.tif 000002
【００５３】
処置群1:ワクチン接種動物に、改変生ウイルスである牛伝染性鼻気管炎ウイルス-牛ウイルス性下痢症ウイルス-パラインフルエンザ3型ウイルス-RSウイルスワクチン(Bovine Rhinotracheitis-Virus Diarrhea-Parainfluenza 3-Respiratory Syncytial Virus Vaccine, Modified Live Virus)からなる改変生混合剤(Modified Live Combination Product)、カンピロバクター・フェタス-レプトスピラ・カニコーラ-グリポティフォーサ-ハージョ-イクテロヘモラジア-ポモナバクテリン(Campylobacter Fetus-Leptospira Canicola-Grippotyphosa-Hardjo-Icterohaemorrhagiae-Pomona Bacterin)(認可された市販混合剤、Express FP(登録商標)5 VL5、Boehringer Ingelheim Vetmedica社、セントジョセフ、ミズーリ州)を投与した。
【００５４】
処置群2:ワクチン接種動物に、死滅ウイルスである牛伝染性鼻気管炎ウイルス-牛ウイルス性下痢症ウイルス-パラインフルエンザ3型ウイルス-RSウイルスワクチン(Bovine Rhinotracheitis-Virus Diarrhea-Parainfluenza3-Respiratory Syncytial Virus Vaccine,Killed Virus)からなる死滅ウイルス混合剤(Killed Virus Combination Product)、カンピロバクター・フェタス-ヘモフィルス・ソムナス-レプトスピラ・カニコーラ-グリポティフォーサ-ハージョ-イクテロヘモラジア-ポモナバクテリン(Campylobacter Fetus-Haemophilus Somnus-Leptospira Canicola-Grippotyphosa-Hardjo-Icterohaemorrhagiae-Pomona Bacterin)(認可されていない実験混合剤、Boehringer Ingelheim Vetmedica社、セントジョセフ、ミズーリ州)を投与した。
【００５５】
処置群3:プラセボワクチン接種対照群に、牛伝染性鼻気管炎ウイルス-牛ウイルス性下痢症ウイルス-パラインフルエンザ3型ウイルス-RSウイルスワクチン(Bovine Rhinotracheitis-Virus Diarrhea-Parainfluenza3-Respiratory Syncytial Virus Vaccine)からなる改変生ウイルス(認可された市販混合剤、Express FP(登録商標)5、Boehringer Ingelheim Vetmedica社、セントジョセフ、ミズーリ州)を投与した。
【００５６】
処置群1および処置群3のワクチン接種に用いた製品は、完全に市場に出ている市販品である。第2群のワクチン接種に用いた製品は、本研究に特別に使用するために製造された実験用の一続きの製品であった。すべてのワクチン接種は、皮下(SC)経路で行った。試験ワクチンおよびプラセボは、ワクチン接種の間隔に21日を用い、表1に示すようにそれぞれ2mlまたは5mlを用いて2回投与した。用いた試験ワクチンは、L.ハージョ成分の微生物最少免疫投与量に対して製剤化された。すべての残りの成分は、通常の放出用量レベルかまたはそれ以上のレベルでまとめて処理された。
【００５７】
動物の健康診断。すべての動物は獣医によって診察され、試料採取前の0日目に健常であると判断された。
【００５８】
ワクチン接種。本明細書に記載のように、処置群1、2および3の動物は、ワクチン接種後(PV)の0日目および21日目にワクチン接種された。いずれの動物においても、ワクチン接種後の副作用は見られなかった。
【００５９】
血液試料採取。PVの0、21、35、43、105、112、119、126、133、140、147、154および160日目にすべての動物から頸静脈穿刺によって血液試料を採取した。チューブは、日付およびその動物の識別(ID)番号を付したラベルを貼り、処理のために試験所に返却した。試料は室温で凝固させ、800xgで15分間遠心分離し、次いで小分けにした。
【００６０】
顕微鏡下凝集試験(Microagglutination Test : MAT)。血清試料を前述のように処理し、レプトスピラMAT試験のためにアリコートをSouth Dakota State University Animal Disease Research and Diagnostic Laboratory(SDSU ADRDL)に提出し、レプトスピラ・カニコーラ、グリポティフォーサ、ハージョ、イクテロヘモラジア、ブラチスラバ(bratislava)およびポモナに対する抗体応答を測定した。公知のレプトスピラの生培養物に等しい量の希釈血清を加え、反応時間の終わりに凝集に関してこの混合物を顕微鏡観察することによってこの試験を行った。試験ウェル内のレプトスピラ菌の少なくとも50%の凝集を示す最高の血清希釈倍率を終点力価とした。SDSU ADRDL MAT手順に基づき、MAT終点力価>100を陽性とみなした。L.ハージョMATには、LHP株を用いた。
【００６１】
尿採取。PVの0、105、112、119、126、133、140、147、154および160日目に、各未経産雌牛から50mLコニカルバイアル2つに尿を採取した。中間尿を排尿中に試料を採取した。各未経産雌牛にフロセミド500mg(Furocemide、Vedco社、セントジョセフ、ミズーリ州)を静脈内(IV)に投与した後に試料を採取した。採取後、各バイアルの外側を消毒し、動物のID番号のラベルを貼り、レプトスピラ培養処理のためRTI試験所に輸送した。
【００６２】
尿培養。培養によって尿中のレプトスピラ菌を検出するためにこの尿試料を用いた。簡潔に言えば、各未経産雌牛からの尿1mLを輸送培地に10-2希釈まで1:10段階希釈した。各希釈溶液から100μLおよび300μLの試料量をEllis(80/40)培地に接種し、29℃で最長2ヶ月間インキュベートした。レプトスピラ増殖の徴候に関して培養を顕微鏡観察した。増殖陽性を示す培養試料は、暗視野顕微鏡検査によってレプトスピラであることが確定された。2ヶ月間の観察後に増殖を示さなかった培養は陰性であるとみなした。
【００６３】
腎臓の培養。安楽死の直後に各未経産雌牛から両方の腎臓を摘出した。各腎臓当たりの組織の合計おおよそ1cm2/1グラムの組織試料を採取した。腎臓表面上の窪みの色の薄い部位を特徴とする腎臓の疑わしい部位が注目された場合、それらの部位から組織試料を得た。疑わしい部位が見られなかった場合、試料は、各腎臓から無作為に採取した。各腎臓試料をホモジナイズし、その腎臓ホモジネートを増殖培地で希釈し、29℃で最長2ヶ月間インキュベートした。レプトスピラ増殖の徴候に関して培養を顕微鏡観察した。増殖陽性を示す培養試料は、暗視野顕微鏡検査によってレプトスピラであることを確定した。2ヶ月間の観察後に増殖を示さなかった培養は陰性であるとみなした。
【００６４】
C.チャレンジ相の調製
動物。PV試験日25日目において、チャレンジ接種物の調製に用いる2頭の未処置の未経産雌牛(#29および48)を、チャレンジのために同じ施設の別の建物に移動させた。これらの動物を残りの群と同じレーションで維持し、牧草の干し草を自由摂取させた。水は自由に与えた。
【００６５】
チャレンジ材料。チャレンジに用いたLHB203株は、最初はNational Animal Disease Center(エームズ、アイオワ州)から得た。この株については前述した。Bolin, et. al., 1989(a); Bolin et al., 1989(b);およびBolin et al., 1991 を参照のこと。
【００６６】
チャレンジの手はず。PV試験日25日目、26日目および27日目に、2頭の継代接種未経産雌牛をチャレンジした。各チャレンジ日に、接種物1.0mlに含まれる新しく培養したLHB培養物おおよそ1.4x107個で各未経産雌牛の眼内にチャレンジした。動物を囲いのある狭い通路に拘束し、その頭を頭絡で動かないようにした。下まぶたを引き下ろして結膜嚢を露出させ、動物の眼内にチャレンジした。各嚢に、一時に1つの眼に、0.5mLの容量のチャレンジ材料を滴下し、チャレンジ材料の投与後60秒間、各まぶたを閉じさせたままにした。
感染症の進行を追跡するために、第1チャレンジ後0日目、15日目、23日目、28日目、36日目、42日目および51日目に、2頭の継代接種未経産雌牛から血液試料および尿試料を得た。2頭の動物から採取した尿試料については、微生物の存在に関して試験した。未経産雌牛#48に関する培養については、チャレンジ後第3週から始まって、剖検に至るまで続けて、尿中でレプトスピラ菌陽性であった。未経産雌牛#29に関する尿培養については、チャレンジ後第6週および第7週でレプトスピラ菌陽性であった。
第1チャレンジ後51日目で、バルビツレート(Euthanasia 6 Grain、Vedco社、セントジョセフ、ミズーリ州)の静注での過量投与によって動物#29および#48を人道的に安楽死させた。
【００６７】
動物から腎臓を摘出し、処理およびレプトスピラ単離のためにRTI試験所に輸送した。未経産雌牛#48の各腎臓から疑わしい病変を採取し、計量し、ホモジナイズして培地に加えた。未経産雌牛#29からの腎臓では疑わしい病変が見出されなかったため、無作為に切片を摘出し、計量し、ホモジナイズして培地に加えた。腎臓ホモジネートを増殖培地で希釈し培養した。本明細書に記載されるように、尿と同一条件下で腎臓の培養を行った。
未経産雌牛#48から剖検時に採取した腎臓試料は、培養陽性であり、一方、未経産雌牛#29からのものは陰性であった。チャレンジ接種物を調製するために、新しい増殖培地に陽性腎臓の培養物を継代接種した。チャレンジ接種物は、微生物の増殖および運動性を測定するために毎週チェックした。運動性が高く、おおよそ106微生物/mLを含む接種物1mlですべての試験動物の3回のチャレンジに十分な培養物が利用可能である場合、そのチャレンジ接種物は用意ができているとみなした。培養物のレプトスピラとの一致は、暗視野顕微鏡検査によって確定された。
【００６８】
実施例１  未経産雌牛におけるワクチン接種の有効性およびチャレンジ
本研究の目的は、LHBでの毒性チャレンジに対して市販5種混合ワクチンのLHP成分の有効性を評価することであった。有効性は、1)腎感染症/コロニー形成の減少および2)チャレンジ株の尿中排出の減少に基づいた。治療薬は、改変生ウイルス(MLV)およびバクテリン混合ワクチン(認可された市販混合剤、Express FP(登録商標)3 VL5、Boehringer Ingelheim Vetmedica社、セントジョセフ)(群1)、死滅ウイルスバクテリン混合ワクチン(認可されていない実験混合剤、Boehringer Ingelheim Vetmedica社、セントジョセフ、ミズーリ州)(群2)ならびに、レプトバクテリン(lepto bacterin)なしで改変生ウイルスワクチンでワクチン接種されたプラセボ対照群(認可された市販混合剤、Express FP(登録商標)5、Boehringer Ingelheim Vetmedica社、セントジョセフ、ミズーリ州)(群3)を含む。
チャレンジ後の、尿中および剖検時の腎組織における微生物回復(recovery)に基づいて、ワクチン接種未経産雌牛と対照未経産雌牛との比較によって有効性を決定した。各変数に関して、予防分率および対応する95%信頼限界が構築された。
【００６９】
手順
ワクチン接種。上記で概説したように、PVの0日目および21日目に、処置群1、2および3における動物がワクチン接種された。いずれの動物においても、ワクチン接種後の副作用は見られなかった。
【００７０】
チャレンジ。前述のように、2頭の動物のチャレンジ継代接種相に続いて、RTI試験所においてLHB203株が増殖され、チャレンジに用いられた。PVの105日目、106日目および107日目に、新しい材料を血球計で計数し、それぞれがチャレンジ材料1mLをおおよそ106レプトスピラ菌/mLで含む3mLシリンジに分注した。さらに、チャレンジ後の試料をRTI試験所に返却し、血球計で計数した。前述のように、これらのアリコートを、群1、2および3の未経産雌牛の眼内にチャレンジするために用いた。簡潔に言えば、動物を拘束し、下まぶたを引き下ろして結膜嚢を露出させ、動物の眼内にチャレンジした。各嚢に、一時に1つの眼に、0.5mLの容量のチャレンジ材料を滴下した。チャレンジ材料の投与後60秒間、各まぶたを閉じさせたままにした。
【００７１】
チャレンジ後観察。チャレンジ日から剖検日まで、一般臨床徴候に関して毎日1回動物を観察した。
血液試料および尿試料採取。チャレンジの直前およびチャレンジ後7日目〜55日目(DPC)に毎週、すべての動物から頸静脈穿刺によって血液試料を採取した。これらの試料を前述のように処理し、アリコートをレプトスピラMAT試験のためにSDSU ADRDLに提出した。DPC0日目から55日目まで毎週1回、各動物から50mLコニカルバイアル2つに尿を採取した。試料を前述のように採取した。前述のように、培養によって尿中のレプトスピラ菌を検出するために尿試料を用いた。
【００７２】
動物の処分および組織試料採取。PVの161日目および162日目(DPCの56日目および57日目)に、動物(n=53)を剖検および組織試料採取のためにSDSU ADRDLに輸送した。未経産雌牛のおおよそ半分を161日目に剖検に無作為に割り付け、残りの半分を162日目に剖検に割り付けた。バルビツレートの静注での過量投与によって動物を人道的に安楽死させた。安楽死の直後に、各枝肉から両方の腎臓を摘出した。疑わしい病変を腎臓から採取した。疑わしい病変が観察されなかった場合は、腎臓から無作為な試料を採取した。試料を計量し、ホモジナイズして培地に加えた。既述のように、尿と同一条件下で組織培養を行った。
【００７３】
統計解析。53頭の動物を処置群に(未経産雌牛21頭を群1および群2に両方に、動物11頭を群3(プラセボ対照群)に)無作為に割り付けた。PV0日目、PV105日目(DPC0日目)、PV112日目(DPC7日目)、PV119日目(DPC14日目)、PV126日目(DPC21日目)、PV133日目(DPC28日目)、PV140日目(DPC35日目)、PV147日目(DPC42日目)、PV154日目(DPC49日目)およびPV160日目(DPC55日目)での微生物回復に関して尿試料を評価した。剖検後の微生物回復に関して腎臓組織試料を評価した。
【００７４】
予防分率を用いて、ワクチン群と対照群との間で尿中排出および腎臓の培養の微生物回復を比較した。尿中排出に関する微生物回復は、(1)研究中の少なくとも1つの陽性尿培養物の存在または任意の試験日における無(0)陽性尿培養物と定義した。腎臓組織試料に関する微生物回復は、(1)陽性腎臓の培養物または陰性(0)腎臓の培養物と定義した。
推定予防分率(pf)は、リスク比の補集合として算出され、以下で定義された:pf=1-(y2/n2)/(y1/n1)/n1)(式中、y2は処置群における感染頭数("現存数"または1)であり、n2は処置群における総数であり、ylは対照群における感染頭数("現存数"または1)であり、n1は対照群における総数である)。
【００７５】
標準的統計値に基づいてリスク比の正確な95%信頼区間を算出し、2つの片側検定を反対にするためにStatXact(登録商標)8.0を用いた。予防分率の信頼限界は、リスク比の信頼限界の補集合または[1-U、1-L]である。StatXact(登録商標)8.0によって算出された対応する両側値が報告された。予防分率(preventive fraction)0(Ho)の直接確率検定のP値は、StatXact"によって提供されるリスク比=1の直接確率検定のP値と同じである。予防分率が0.0%とは大きく異なっている(p<0.05)場合には、全95%信頼区間は0.0%を超える。
【００７６】
0.05のp値を用いてすべての仮説試験を行った。比較される群内の感染動物頭数(("現存数"または1)に関するゼロまたはゼロに近い値は、変動しやすい信頼限界およびp値をもたらしうる。
【００７７】
結果
顕微鏡下凝集試験結果。レプトスピラ・カニコーラ、グリポティフォーサ、ハージョ、イクテロヘモラジアおよびポモナに対する抗体応答を測定するために、MAT試験のために、PVの0日目、21日目、35日目および43日目に、群1、2および3においてすべての登録した未経産雌牛から血液試料を採取した。両方のワクチン接種群において、第2ワクチン接種後の14日目および21日目に、ワクチン接種された未経産雌牛の40〜75パーセントにおいてL.カニコーラ、グリポティフォーサ、イクテロヘモラジアおよびポモナ血清型に対する一過性のワクチン接種後MAT血清学的反応が検出された(データは示さず)。ワクチン接種者の24パーセント未満において、第2ワクチン接種後14日目のみにおいてL.ハージョに対する一過性の陽性MAT血清学的反応が観察された。すべてのワクチン未接種対照は、チャレンジ日まで、すべての血清型に対して陰性のままであった。
【００７８】
L.カニコーラ、グリポティフォーサ、ハージョ、イクテロヘモラジアおよびポモナに対する抗体応答を測定するために、MAT試験のために、DPCの0日目、7日目、14日目、21日目、28日目、35日目、42日目、49日目および55日目に、群1、2および3におけるすべての登録した未経産雌牛からチャレンジ後血液試料を採取した。本試験の終わりまで、すべての動物において、L.カニコーラ、グリポティフォーサ、イクテロヘモラジアおよびポモナに対して、チャレンジ後MAT抗体応答が陰性のままであった。本研究の終わりまで、群1および群2からのすべてのワクチン接種された未経産雌牛において、L.ハージョに対するチャレンジ後MAT結果は陰性のままであった。しかしながら群3対照未経産雌牛において、14DPCによって11頭のうち9頭が、21DPCによって11頭のうち11頭が(100%)が、チャレンジ後MAT抗体応答が明らかであった。ワクチン未接種対照におけるピークMAT力価は、800(未経産雌牛11頭のうち7頭)〜1600(未経産雌牛11頭のうち4頭)の範囲であった(データは示さず)。
【００７９】
尿中排出結果。ワクチン接種された未経産雌牛(群1および群2)から採取したすべての尿試料からのすべてのチャレンジ前および後の尿培養は、レプトスピラ菌の増殖に関して陰性であった(表2)。このことは、最低限2回のチャレンジ後試料で100%が陽性尿培養(表2および3)を示したプラセボ対照未経産雌牛(群3)とは対照的であった(表3)。範囲は、2〜6陽性培養/未経産雌牛であった(表3)。尿中排出は、群3プラセボ対照未経産雌牛において、DPC21日目に最初に検出され、DPC35日目およびDPC49日目において、最も多い頭数の動物の排出が見られた(表3)。
【００８０】
表2.すべての未経産雌牛からのチャレンジ後尿結果の概要
2013544886.tif 000003
【００８１】
表3.群3(対照)チャレンジ後尿培養および腎臓組織培養結果
2013544886.tif 000004
【００８２】
表３．表３続き
2013544886.tif 000005
0=陰性;1=陽性
【００８３】
プラセボ対照と比較して各ワクチン群の尿中排出の算出された予防分率は1.0000(100%)であった。対応する正確な95%信頼区間は[0.8389、1.0000]または[83.9%、100%]であった(表4および5)。2つのワクチン群において任意の陽性尿培養を示す動物はなく、対照群において、すべての動物は少なくとも2つの陽性尿培養を示した(表2および3)。
【００８４】
表4.微生物回復の存在に関する予防分率および正確な95%信頼限界
2013544886.tif 000006
【００８５】
表5.微生物回復の存在の頻度および割合(%)
2013544886.tif 000007
【００８６】
腎臓の培養結果。すべてのワクチン接種された未経産雌牛(群1および群2)腎組織は、レプトスピラ菌単離に関して陰性であったが(表6)、対照群における未経産雌牛11頭の内10頭は、腎組織からの陽性レプトスピラ菌培養を示した(表3および6)。
【００８７】
表6.群1、2および3からの腎臓の培養結果の概要
2013544886.tif 000008
【００８８】
対照群と比較した各ワクチン群の腎臓組織培養試料結果から算出された予防分率は1.0000(100%)であった。対応する正確な95%信頼区間は[0.8349、1.0000]、または[83.5%、100%]であった(表4および5)。2つのワクチン群において任意の陽性培養結果を示す未経産雌牛はなく(表6)、対照群において、未経産雌牛11頭の内10頭は陽性の腎臓の培養結果を示した(表3および6)。
【００８９】
結論
血清学的MAT結果は、すべての血清型に関して、ワクチン接種動物の一部において、第2ワクチン接種後に一過性のセロコンバージョンを示している。すべての群におけるすべての動物は、チャレンジ時においてすべての血清型に関してMATで陰性だった(データは示さず)。チャレンジ後3週間で、チャレンジに対する応答およびチャレンジ微生物で生じた感染で、すべてのプラセボ対照動物はL.ハージョに対してMAT陽性であった。LHBでの動物のチャレンジは、ワクチン接種動物においてL.ハージョに対する既往MAT血清学的反応を誘導しなかったが、プラセボ対照の100%(11頭中11頭)がチャレンジ後に陽性MAT結果を示した。チャレンジ後各週ごとに56日目まで、採取した尿試料からの培養を用いてチャレンジ微生物を回復した。プラセボ対照動物(群3)のそれぞれは、最低限2つの尿試料試験培養陽性を示すが、これは少なくとも7日間の排出を示している。プラセボ対照における排出の持続期間は7日間〜35日間の範囲である。群3において、未経産雌牛11頭の内1頭は2回の試料採取日で排出し;11頭の内4頭は、4回の試料採取日で排出し;11頭の内2頭は、6回の試料採取日で排出した。ワクチン接種動物のいずれにおいても、任意の尿試料から微生物が回復されなかった。この培養結果に基づいて、L.ハージョバクテリンを用いるワクチン接種は、チャレンジ微生物の尿中排出を完全に予防した。
【００９０】
チャレンジ微生物回復を測定するために、剖検時に採取した腎臓試料もまた培養した。プラセボ対照の11頭の内10頭(90.9%)からの腎組織は、チャレンジ微生物の回復に陽性であった。ワクチン接種された未経産雌牛(群1および群2)のいずれからも、任意の腎組織からチャレンジ微生物が回復されなかった。培養結果に基づけば、L.ハージョバクテリンでのワクチン接種は、チャレンジ微生物による腎臓感染/コロニー形成を完全に予防した。
【００９１】
改変生混合剤または死滅ウイルス混合剤のいずれかでワクチン接種された未経産雌牛のLHBでのチャレンジは、L.ハージョに対する既往MAT血清学的反応を誘導しなかったが、プラセボ対照の100%(11頭中11頭)は、チャレンジ後、陽性MAT結果を示した。これらの結果は、プラセボ対照の未経産雌牛が活動性感染の結果として血清学的MAT応答を引き起こしたことを示した。この結果は、ワクチン接種動物におけるチャレンジ後のMAT血清学的反応の非存在とは際立って対照的であった。ワクチン接種動物におけるMAT血清学的反応の欠如は、チャレンジ微生物の複製が、少なくとも既往血清学的反応を誘導するのに十分な程度にこれらのワクチン接種動物において存在しなかったことを示すことができる。レプトスピラワクチン接種動物におけるチャレンジ後の既往血清学的反応の欠如(Trueba et al., 1990; Bolin and Alt, 2001)も報告されており、免疫原のエピトープへのIgGのブロッキング効果またはBリンパ球受容体への負のフィードバック効果の可能性が議論されており、従って二次抗体応答を予防する(Trueba et al., 1990)。歴史的には、主として、動物モデルにおいて、レプトスピラリポ多糖に対する抗体を用いる受動的防御研究に基づいて、L.ハージョに対する感染防御免疫は抗体性であると考えられた(Jost et al., 1986; Masuzawa et al., 1990)。しかしながら、チャレンジ時に高力価の抗LPS抗体を有する動物のチャレンジを含む研究は、L.ハージョでのチャレンジに対して防御されなかった(Bolin et al., 1989(b); Bolin et al., 1991)。LHB203株でのチャレンジに対する防御を提供するワクチンを用いる、牛で行った研究は、CD4およびλδTリンパ球を含む強力なワクチン接種後Th1型免疫応答の誘発は、チャレンジに対するワクチン誘発防御と関連することをができることを示した(Naiman, et al., 2001; Naiman, et al., 2002)。あるいは、ワクチン接種動物におけるTh1細胞性免疫応答によって提供される強力な防御記憶側面は、チャレンジ微生物の複製を予防することが可能かも知れない。結果は、既往抗体ベースの応答の誘発をもたらすと考えられる、ワクチン接種/チャレンジ動物の免疫系による認識に利用可能な不十分な抗原である可能性もある。
【００９２】
ここで報告した結果は、LHB2038株でのチャレンジに対する一価のレプトスピラワクチンによって提供される防御を報告したワクチン研究と同様である。これらの研究に用いられたレプトスピラワクチンは、LHB93U株から調製されたことが報告されているのに対し、ここで報告した本研究のワクチンの調製に用いられる株はLHPであった。血清学的には同一であるが、遺伝的に異なった血清型ハージョの2つのタイプが存在する(Ellis, et al., 1986; Djordjevic, et. al., 1993; Thiermann et al., 1986; Skilbeck and Davies, 1989)。ここで報告した結果と対照的に、以前の研究は、ワクチン接種動物がLHBでチャレンジされる場合、LHPを含むワクチンは、尿中排出または腎感染症に対する優れた防御を示さなかったことが報告されている(Bolin, et. al., 1989(a); Bolin et al., 1989(b); Bolin et al., 1991; Bolin and Alt, 2001)。ワクチンの製造に用いられるハージョの血清型における微妙な差異は、一部分において、このワクチンによって提供される防御レベルを説明することができる。このような区別は、原分離株における差異ならびに、増殖および継代接種の方法に基づいて誘導された差異を含むことができる。ワクチンによって提供される防御レベルは、ワクチンに含まれる微生物の血清型/株の特質ばかりでなく、もしあれば、ワクチンの製剤に用いられているアジュバントにもまた左右されるであろう。本明細書においては、用いられたワクチンはアジュバント(単数または複数)を含んでいた。さらにまた、株の製造に用いられた増殖条件および不活化条件もまた、ワクチンによって提供される有効性に影響し得る。アジュバント製剤と併用する血清型の差異およびワクチンのための微生物加工は、防御免疫応答を誘導するワクチンの能力に影響し得る。
【００９３】
改変生ウイルス/LHPバクテリン混合剤および死滅ウイルス/LHPバクテリン混合剤の両方を用いたワクチン接種によって、LHBのチャレンジ後に、尿中排出の予防ばかりでなく、腎感染症およびコロニー形成の予防ももたらした。この試験の結果は、LHBによるチャレンジ誘発腎感染症およびコロニー形成ならびに付随する尿中排出に対して試験ワクチンのL.ハージョ成分が極めて効果的であることを示している。
【００９４】
本明細書において開示および請求されている組成物および方法のすべては、本開示を踏まえて過度の実験を要することなく製造し実施することができる。好ましい実施形態を参照して本発明の組成物および方法を説明してきたが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、組成物および方法ならびに本明細書に記載の方法ステップまたはステップの順序に変更を加えることができることは当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的および生理学的に関連した特定の薬剤は、本明細書に記載の薬剤と置き換えることができ、同時に、同じか同様な結果が得られることは明らかであろう。当業者に明らかな、すべてのこのような類似した代用品および改変は、以下の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神、範囲および概念の範囲内であると考えられる。
【００９５】
引用文献
以下の引用文献は、それらが本明細書の記載を補う例示的な手順または他の詳細を提供する範囲に限り、具体的に参照により本願に組み込まれる。
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5.Bolin CA, Zuerner RL, Trueba G.  Effect of vaccination with a pentavalent leptospiral vaccine containing Leptospira interrogans serovar hardjo type hardjo-bovis on they hardjo-bovis infection of cattle.  Am J Vet Res. 50:2004-2008, 1989(b).
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【国際調査報告】
2013544886.tif 000009
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