(57)【要約】  本発明は、乳ガン細胞におけるエストロゲン受容体αの作用機序における新しい見識を提示する。また、本発明は、前記作用機序を修飾するための手段及びツールを提供し、これにより、ガン細胞等のエストロゲン受容体陽性細胞の増殖に影響を及ぼすことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者におけるエストロゲン受容体α陽性ガンを診断するための方法であって：
ａ）  被験者のサンプル中の、前記エストロゲン受容体α(ER-α)の内因性分解ペプチドの濃度を検出する工程であって、前記内因性分解ペプチドは、配列番号２〜２９、または３２〜２２５によって定義される配列のいずれか１つからなり、配列番号２９のフラグメントは、３０３番目位置のリジン（K303）がメチル化リジンである；及び
ｂ）前記被験者のサンプルで得られた前記ペプチド濃度と、健常者における前記ペプチドのコントロール濃度とを比較し、前記被験者のペプチドの濃度が増大していれば、前記被験者は、ER-α陽性ガンである可能性があることを示しているとする工程
を含む方法。
【請求項２】
ER-αの前記内因性分解ペプチドは、P295LMIKRSKK303NSLALSLT311であり、３０３番目位置のリジン（K303）はメチル化リジンである（配列番号２９）、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記内因性分解ペプチドが、配列番号２の配列からなる請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記内因性分解ペプチドは、K268 R269、K303のメチル化、および/またはM286の酸化、及び／又はS282のリン酸化で表される翻訳後修飾の1つ以上を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ER-α陽性ガンは、好ましくは乳ガン、子宮内膜ガン、子宮頸ガン、卵巣ガン、及びヒト乳ガンからなる群より選択され、最も好ましくはヒト乳ガンである請求項1〜4のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルは、好ましくは全血、血漿、血清、乳頭吸引、乳管洗浄、腫瘍の滲出液、腫瘍空洞液、胸水、腹水、腫瘍またはガン細胞周囲の流体、リンパ、及び腫瘍またはガンと接触している他の体液からなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
配列番号２〜２９又は３２〜２２５により定義される配列（ここで、配列番号２９のフラグメントは３０３番目位置のリジン（K303）がメチル化リジンである）のいずれかからなる、単離されたエストロゲン受容体α(ER-α)ペプチド。
【請求項８】
翻訳後修飾：K268、R269、K303のメチル化、および/またはM286の酸化、および／またはS282のリン酸化の１つ以上を有している、請求項7に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の単離されたER-αポリペプチドを含む組成物であって、前記ペプチドは、ウシ血清アルブミン若しくはキーホールリンペットヘモシアニンなどの担体分子に結合している、又は脂質粒子、ナノカプセル、リポソーム、若しくは脂質小胞のような脂質組成物内に含まれていて、さらに必要に応じてさらに医薬賦形剤を含んでもよい組成物。
【請求項１０】
さらにアジュバントを含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
ER-α陽性ガン、好ましくは乳ガン、子宮内膜ガン、子宮頸ガン、卵巣ガン、最も好ましくはヒト乳ガンの治療、又はワクチン接種に用いられる、請求項７若しくは８に記載のポリペプチド、又は請求項９に記載の組成物の使用。
【請求項１２】
請求項７に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１３】
配列番号１と少なくとも90％の一致性を有するポリヌクレオチド配列からなり、より好ましくは配列番号１のポリヌクレオチド配列からなる請求項１２に記載の核酸。
【請求項１４】
ER-α陽性ガン、好ましくは乳ガン、子宮内膜ガン、子宮頸ガン、卵巣ガン、最も好ましくはヒト乳ガンの治療、又はワクチン接種において使用される、請求項１２または請求項１３に記載の核酸分子。
【請求項１５】
請求項７に記載のペプチドを発現する、または請求項１２または１３に記載の核酸分子を含む組換えベクター。
【請求項１６】
ER-α陽性ガン、好ましくは乳ガン、子宮内膜ガン、子宮頸ガン、卵巣ガン、最も好ましくはヒト乳ガンの治療、またはワクチン接種のための、請求項１５に記載の組換えベクター。
【請求項１７】
請求項７若しくは８に記載のポリペプチド、請求項９若しくは１０に記載の組成物、請求項１２若しくは１３に記載の核酸分子、又は請求項１４に記載の組換えベクターを含む宿主細胞であって、前記細胞は、好ましくはほ乳類細胞（例えば、ヒト細胞）、酵母細胞、細菌細胞（例えば大腸菌、サルモネラ属、又はシュードモナス細胞）である宿主細胞。
【請求項１８】
ER-α関連疾患、好ましくは乳ガン、子宮内膜ガン、子宮頚ガン、卵巣ガン、最も好ましくはヒト乳ガンに対する、治療又はワクチン接種のための請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
請求項７又は８に記載のポリペプチドに特異的に結合する精製された結合分子であって、好ましくは抗体、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、ナノボディ、アフィボディ、抗体フラグメント、アプタマー、フォトアプタマー、オリゴヌクレオチド、リポカリン、特異的に相互作用する小分子、分子インプリンティングポリマー（MIPs）、DARPins、アンキリン、特異的に相互作用するタンパク質、ペプチドミメティックス、バイオミメティックス、又はペプチド、及び前記ポリペプチドに特異的に結合するその他の分子。
【請求項２０】
a）請求項１９に記載の結合分子；
b）健常者における、前記結合分子が特異的に結合する対応ペプチド量の参照値；及び
c）前記被験者がER-α陽性ガンであるか否かを結論付けるために、被験者のサンプル中の前記ペプチド量と、健常者のサンプルにおける前記ペプチド量とを比較する手順書
を含む免疫検出キット。
【請求項２１】
ER-α陽性のガン、好ましくは乳ガン、子宮内膜ガン、子宮頸ガン、卵巣ガン、最も好ましくはヒト乳ガンの診断、予測、予後予測、および/またはモニタするためのバイオマーカーとしての、請求項7または8に記載のペプチドの使用。
【請求項２２】
治療有効量の請求項７若しくは８に記載のペプチド、または治療有効量の請求項９若しくは１０に記載の組成物を、前記被験者に投与する工程を含む、ER-α陽性ガンを有する被験者を治療する方法。
【請求項２３】
治療有効量の請求項７もしくは８に記載のペプチド、又は治療有効量の請求項９もしくは１０に記載の組成物を、前記被験者に投与する工程を含む、ER-α陽性ガンの発生に対する被験者へのワクチン接種方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療分野、特に医療の診断や治療の分野に関し、より具体的には、乳ガンなどのガンの診断及び治療における、エストロゲン受容体α(ER-α)から生じる新規な標的ペプチドの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
エストロゲン受容体α(ER-α)は、乳ガン、子宮内膜ガン、子宮頸ガン、卵巣ガン等の様々なガンに関連している。乳ガンのうち、ER-αの陽性状態は、細胞増殖速度が低い等の良好な予後の属性、及び腫瘍分化の組織学的証拠と関連付けられている。診断後の最初の数年の間は、ER-α陽性腫瘍の患者は、再発率が低い傾向にあるが、その後の数年間の高い再発率と相殺され、結果としては、全体的に、予後があまりよくないことを意味する。ER-α陽性ガンであることの有用な側面は、アジュバント設定及びより進行した疾患の双方におけるホルモン療法に対する反応を予測することにある。ER-α陽性ガンについては、予防及び治療を含むいくつかの治療法を利用でき、タモキシフェン、トリフェニルエチレン誘導体は、現在最も普及している治療法である。タモキシフェンは、エストラジオールアンタゴニスト機構を介して、ER-α陽性ガン細胞の増殖を減少させるが、患者はタモキシフェンに対して耐性を持つようになる。また、タモキシフェンは子宮内膜ガンのリスクを増加させる。
【０００３】
ER-αは、一旦適切なホルモン（例えば、１７β-エストラジオール；E2）が結合することにより、標的遺伝子の発現を調節する転写因子となるように、一般に描かれている。しかしながら、過去10年間にわたって行われてきた発見に基づくと、この単純化した考えは、再考されなければならない。なぜなら、エストロゲン調節遺伝子の転写は、実際には、多数のコリプレッサーとコアクチベーターの連続したリクルートと解離を伴う一過性で循環性の機構だからである。これらのコレギュレータは、コグネイトリガンドとして、同程度に、ER-α活性を調節することから、「アクセサリータンパク質」としてではなく、むしろ、歴史的には、特定の遺伝子の産物として、コヒーレントおよび同期化されるイベントを組織化する「マスター遺伝子」と呼ばれる。この見解によれば、コレギュレータの補充を特定的に妨害することができる薬剤の探索は、ER-α関連疾患の新しい治療の道を開く。このような化合物を設計するためには、活性なER-αオリゴマー構造の形成の背後にある分子メカニズムを明確に理解しておく必要がある。
【０００４】
この観点で、我々は、以前、カルモジュリン(CaM)（ギャロら、Mol  Cell  Endocrinol 2007年；268：37-49）の結合部位があるER-αP295-T311アミノ酸配列の調節機能、ER-αの作用機序における主要なコレギュレータの重要な役割を説明した。D-(ヒンジ)とE-(リガンド結合ドメイン; LBD)ドメイン間に位置するP295-T311配列は、受容体の安定性と転写活性の両方に関与しているように見えた。実際には、AF-2a（自律活性化機能）ドメインに位置しているこの短い配列は、リン酸化、アセチル化、SUMO化、モノユビキチン化やメチル化などの様々な翻訳後修飾のためのプラットフォームとして考えることができる（ギャロら参照。Mol  Cell  Endocrinol  2008；291：20-26）。また、このモチーフは、受容体の第三の核局在化シグナルだけでなく、E6-AP-(E6関連タンパク質)媒介ポリユビキチン化（Liら、J Biol Chem 2006；281 :1978-85）を妨害することにより、その受容体のトランス活性化及び安定化の双方を強化するコレギュレータであるＣａＭのためのタンパク質分解部位と結合部位も、含んでいる。驚くべきことに、ER-α-17pペプチドが、ER-α発現乳ガン細胞（ギャロら、Mol  Cell  Endocrinol 2007；268：37-49；ギャロら；Mol  Cell  Endocrinol 2007； 268：37-49；ギャロら、J  Steroid  Biochem  Mol  Biol  2008；109：138−149まで）において、エストロゲン応答を誘発することが示された。エストロゲンの細胞内浸透が必要とされるように見えるが、ER-α-17pが作動するメカニズムは、まだ確立されていない。この点について、ER-αは、他の核内ホルモン受容体と同様に、特に（抗）エストロゲン刺激の不在下では、様々な細胞内区画と標的との間の定常的な転送（constant  trafficking）の対象であることを強調しなければならない。ER-α（核、細胞質、膜関連、翻訳後修飾など）の特定のフォームまたはすべてのフォームが、ER-α-17pの作用機序に関与しているかどうかについて、我々は知らないことを、本明細書で申し添える。我々の研究室の最近の調査で、ER-α-17pが、精製された組換えヒトER-αに結合することを明らかにした（ギャロら、Drug  Design＆Discovery  2007におけるレター；4：346-355）。分子間での相互作用を中断することが、受容体に不活性なコンフォメーションを付与することはもっともらしいと思われる。しかしながら、これらの観察の基礎となるメカニズムは解明されず、例えば、抗ガン剤の設計に使用することができない。
【０００５】
本発明は、この基礎となるメカニズムをさらに調べ、これらの知見に基づいて抗ガン治療のための新たな、興味深い可能性を提供する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、乳ガン細胞をエストラジオール（E2）で処理すると、ER-αタンパク質の内因性ペプチド分解産物/ペプチドが細胞外空間にて検出されることができるという驚くべき観察に基づいてなされている。さらに、本発明者らは、この分解産物/ペプチドに対応する合成ペプチドを用いて、ER-α陽性乳ガン細胞を処理すると、当該乳ガン細胞の増殖を増大させることを確立している。したがって、例えば、内因性ペプチドに特異的に結合する分子を用いることにより、この内因性分解産物/ペプチドを隔離して、E2の存在下での乳ガン細胞の増殖速度を大幅に低下させる。
【０００７】
また、本発明は、エストロゲン受容体陽性（ER-α陽性）疾患を診断するための新しい方法を、一般的に提供する。本発明の方法によって予測可能な疾患は、乳ガン、子宮内膜ガン、子宮頸ガン、卵巣ガン、好ましくは乳ガンのようなER-α陽性のガンである。
【０００８】
特定の実施形態では、本発明は、被験者において、乳ガン、子宮内膜ガン、子宮頸ガン、卵巣ガン、好ましくは乳ガンのような、ER-α関連疾患を診断するための方法を提供する。当該方法は、
ａ）配列番号２−２９又は３２−２２５（ここで配列番号２９で表されるフラグメントは、３０３番目位置のリジン（K303）がメチル化リジンである）によって定義された配列の何れかで構成される、エストロゲン受容体α(ER-α)タンパク質の内因性分解産物/ペプチドの濃度を、被験者のサンプル中で検出する工程；及び
ｂ）被験者のサンプルで得られた前記ペプチド濃度を、健常者における前記ペプチドのコントロール濃度と比較し、前記被験者のペプチド濃度が増大している場合、前記被験者は、ER-α関連疾患に罹患している可能性があることを示しているとする工程
を含む。
【０００９】
特定の実施形態では、検出される分解産物/ペプチドは、全長ER-αタンパク質（遺伝子：ERS1）の配列番号２によって定義されるペプチドである。すなわち、K268RQRDDGEGRGEVGSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLT311。さらにより好ましい実施形態では、検出されたペプチドは、配列番号２によって定義され、以下のような翻訳後修飾を１又は２以上含む：K268、R269、K303のメチル化、および/またはM286の酸化、および/またはS282のリン酸化。
【００１０】
さらに好ましい実施形態では、ER-αの内因性分解産物/ペプチドは、P295LMIKRSKK303NSLALSLT311（配列番号２９）である。当該配列のK303はメチル化リジンである。
【００１１】
好ましい実施形態では、本発明に係る方法は、乳ガン、子宮内膜ガン、子宮頚ガン、卵巣ガン、好ましくは乳ガンからなる群より選択されたER-α陽性ガンを診断するために使用される。
【００１２】
好ましい実施形態において、本発明の方法に用いられるサンプルは、腫瘍細胞またはガン細胞に直接接触または近接している体液又は組織のサンプルであり、例えば血液、腹水、腫瘍やガン細胞などを取り囲む流体などの中に、検出可能な量の、本発明の分泌型のER-αポリペプチドを含んでいるサンプルである。最も好ましいサンプルは、被験者の血清試料である。
【００１３】
さらに、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列からなる、単離された内因性ER-αペプチドまたはそのフラグメント、好ましくは配列番号２のアミノ酸配列からなる単離された内因性のER-αペプチド、最も好ましくは、K268、R269、K303のメチル化、および/またはM286の酸化、および/またはS282のリン酸化といった翻訳後修飾の１又は２以上を含む、単離された内因性ER-αペプチドを含む組成物を提供する。
【００１４】
上記組成物は、配列番号２のアミノ酸配列からなる内因性ER-αペプチド、又は配列番号２の内因性ER-αペプチドのフラグメントで１７個のアミノ酸配列PLMIKRSKKNSLALSLTを少なくとも含むペプチドのいずれかを含むことができる。前記１７個のアミノ酸配列では、K303の残基がメチル化されていてもよい。
【００１５】
あるいは、本発明の組成物は、内因性ER-αポリペプチドの以下のフラグメントのいずれかを含む。そのフラグメントを以下に示す。
【表１】
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上記に挙げた配列のいずれか一つにおいて、K268、R269、K303のメチル化、及び/又はM286の酸化、および/またはS282のリン酸化といった翻訳後修飾の１つ以上が存在することができる。前記配列で用いられている添字は、ER-αの全長アミノ酸配列内において対応する残基の位置を参照している。
【００１６】
前記組成物の具体的な実施形態では、検出される分解産物/ペプチドは、配列番号２により定義されるER-αタンパク質（遺伝子：ERS1）の全長ペプチド（すなわちK268RQRDDGEGRGEVGSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLT311）である。さらにより好ましい実施形態では、検出されるペプチドは、配列番号２により定義され、K268、R269、K303のメチル化、及び/又はM286の酸化および/またはS282のリン酸化といった翻訳後修飾の１つ以上を含む。
【００１７】
前記組成物のさらに好ましい実施形態では、前記ER-αの内因性分解産物/ペプチドは303番目位置（K303）のメチル化リジンを有するP295LMIKRSKK303NSLALSLT311である（配列番号２9）。
【００１８】
さらに好ましい実施形態では、前記組成物は、配列番号32から225までのいずれかで定義される、ER-αの内因性分解産物/ペプチドの抗原性フラグメントを含む。
【００１９】
本発明の組成物は、例えば、ウシ血清アルブミン（BSA）またはキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）のような担体分子に結合していてもよく、または脂質粒子、ナノカプセル、リポソーム、脂質小胞のような脂質組成物内に含まれるようにしてもよい。好ましくは、前記組成物は、薬学的賦形剤を含む。
【００２０】
本発明にかかる組成物は、ER-α陽性ガンに対するワクチン接種に使用することができる。従って、本発明は、本発明にかかる組成物の用途として、ワクチンとしての使用および/またはワクチン接種での使用を提供する。好ましい実施形態では、前記ワクチン接種は、ヒト乳ガンに対するものである。
【００２１】
本発明による組成物は、ER-α陽性ガンの予防または治療のためのワクチンの製造、あるいはエストロゲン受容体ポリペプチドに特異的に結合するガン阻害剤の製造に使用することができる。
【００２２】
本発明は、さらに、ER-α陽性ガン、好ましくは乳ガンの治療に用いる医薬の製造における、本発明の組成物の使用を提供する。
【００２３】
本発明はまた、タンパク質やペプチドなどの代わりに、本明細書で定義される、ER-αの分解産物のペプチドまたはそのフラグメントのいずれかをコードするヌクレオチドを提供する。
【００２４】
本発明は、さらに、本発明の核酸の用途として、DNAワクチン接種を提供する。前記核酸は、本発明のポリペプチド（例えば、配列番号２）を発現する宿主細胞の中へ導入（transfer）される。当該ワクチン接種に対する免疫応答は、例えば、ガン細胞の増殖を減少させるために、誘発される。前記核酸の送達（delivery）は、DNA分子の直接投与によって行うことができ、あるいは遺伝子治療の技術分野で知られている細菌やウイルス発現系を介して行うことができる。
【００２５】
従って、本発明は、配列番号２から29、または32から225で定義された配列を含むペプチドのいずれかをコードする単離された核酸を提供する。好ましい実施形態では、核酸は配列番号によって定義され、配列番号２で定義されたポリペプチドをコードする。
【００２６】
従って、本発明は、本明細書中で定義される核酸について、ER-α陽性のガンを治療するための薬剤またはワクチンの製造における使用、あるいはER-α陽性のガンを治療において用いられる薬剤またはワクチンの製造における使用を提供する。好ましい実施形態では、前記核酸は、RNA、mRNA、DNA、またはcDNAの形態である。
【００２７】
さらに、本発明は、本明細書で定義される（ポリ）ペプチドを発現する組換えベクターを提供する。このような組換えベクターは、また、遺伝子治療に使用することができる。それによって本明細書において定義される前記核酸が、宿主に移送され、該宿主内でコードして、（ポリ）ペプチドを発現させる。これにより、宿主内の前記ポリペプチドに対する免疫応答を惹起する。このような組換えベクターは、ガンを治療するための薬剤またはワクチンの製造に使用することができる、あるいはガンの治療において用いられる医薬又はワクチンの製造において用いられることができる。ワクチン接種を目的としている本発明によれば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡまたはＤＮＡをウイルスを用いて送達（viral  delivery）することも、既知の方法論を用いれば想定範囲内とされる。
【００２８】
さらに、本明細書において定義される核酸を発現する組換え宿主細胞、本明細書で定義されるポリペプチド、又は本明細書で定義されるポリペプチド、又は本明細書で定義される組換えベクター、ガンを治療するための医薬又はワクチンが、本発明により予測され、また、ガン治療のための医薬又はワクチンの製造におけるその使用も同様に、本発明により予測される。
【００２９】
好ましくは、前記宿主細胞は、哺乳動物細胞（例えばヒト細胞）、細菌細胞（例えば大腸菌、サルモネラ属、又はシュードモナス細胞）である。
【００３０】
本発明は、さらに、細胞内でのエストロゲン受容体活性を低下させる方法であって、有効阻害量の、本明細書で定義される阻害剤組成物を前記細胞に提供する工程を含む方法を提供する。
【００３１】
好ましい実施態様では、前記細胞は動物内に含まれ、前記組成物は、前記動物に投与される。好ましくは、前記細胞は動物細胞であり、より好ましくは、前記細胞は、ガン、特に乳ガンを有している動物内に含有される。
【００３２】
本発明はさらに、ガン細胞の増殖を抑制する方法であって、本明細書で定義したER-α受容体の阻害剤の治療有効量を前記ガン細胞に提供する工程を含む方法を提供する。
【００３３】
さらに、本発明は、本明細書で定義されるポリペプチド、本明細書で定義される核酸、本明細書で定義される組換えベクター、又は本明細書で定義される宿主細胞を、被験者に提供するステップを含む、被験者にワクチン接種する方法を提供する。
【００３４】
本発明は、更に、被験者において、ER-α陽性ガンを治療する方法を提供する。当該方法は、下記工程を含む：
（ａ）エストロゲン受容体活性が増大している被験者を同定する工程；及び
（ｂ）治療有効量の、本発明に係るER-αの阻害剤、ER-α-ワクチンまたは組成物を前記被験者に投与する工程。
【００３５】
好ましくは、前記組成物は、静脈内、非経口、経口、局所投与、又は吸入剤、エアロゾルまたはスプレーとしての投与のための薬学的賦形剤に配合される。好ましくは、前記被験者はヒトである。
【００３６】
代替的な実施形態では、動物のER-α陽性ガンを治療する方法は、前記動物に、シクロホスファミド、メトトレキサート、フルオロウラシル、アドリアマイシン、タモキシフェン、ドキソルビシン、エトポシド、ベラパミル、ポドフィロトキシン、これらのアナログまたはその塩のような少なくとも第二の抗ガン剤を投与することを含む。
【００３７】
本発明は、本明細書に定義されているER-αの分解産物/ペプチド、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドに、特異的に結合する結合分子を、さらに提供する。好ましくは、前記結合分子は、配列番号２において定義されているアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する。配列番号２において定義されているアミノ酸配列は、K268、R269、K303のメチル化、および/またはM286の酸化、および/またはS282のリン酸化といった翻訳後修飾の1つ以上を含む。さらなる態様において、前記結合分子は、本明細書で定義した内因性のER-α分解産物/ペプチドのフラグメント、すなわち配列番号１-29、又は32-225によって定義されている配列からなる（ポリ）ペプチドのいずれかに、結合する。
【００３８】
本明細書において想定されている結合分子としては、抗体、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、ナノボディ、アフィボディ、抗体フラグメント、アプタマー、フォトアプタマー、オリゴヌクレオチド、リポカリン、特異的に相互作用する小分子群が挙げられる。
【００３９】
分子インプリンティングポリマー（MIPs）、DARPins、アンキリン、前記ポリペプチドに特異的に相互作用するタンパク質、ペプチドミメティックス、バイオミメテッィクス、又はペプチド、及び前記ポリペプチドに特異的に結合するその他の分子。本発明のバイオマーカーの１つと結合するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体または単鎖抗体またはそのフラグメントの双方が、本発明の方法及びキットにおいて有用である。
【００４０】
このような結合分子はまた、ER-α機能の阻害剤として作用することもできる。
【００４１】
従って、本発明はまた、ガンを治療するためのER-αの阻害剤を含む医薬組成物、またはガンを治療するための医薬の製造におけるER-αの阻害剤の使用も提供する。好ましくは、前記阻害剤は、本明細書で定義される結合分子、例えば、配列番号２によって定義される本発明の内因性のER-α分解産物/ペプチドに特異的に結合する分子、配列番号２によって定義される本発明のポリペプチドに随意に特異的に結合する分子である。配列番号２は、K268、R269、K303のメチル化、および/またはM286の酸化、および/またはS282のリン酸化といった翻訳後修飾の１つ以上含んでいる。  
好ましい実施形態では、前記結合分子は、抗体またはそのフラグメントである。
好ましい実施形態では、前記結合分子は、本明細書で定義される内因性のER-α分解産物/ペプチドのフラグメント、すなわち、配列番号１−29、又は32-225で定義される配列からなる（ポリ）ペプチドのいずれか１つと、特異的に結合する。
【００４２】
本発明の抗体は、あるいは、検出可能な標識が結合していてもよい。
【００４３】
上記で示した阻害剤または結合分子は、独立的に用いることができる。すなわち、医薬組成物においてだけでなく、例えば、本発明の前記ポリペプチドの検出のために、独立して用いることができる。したがって、本発明は、ER-α受容体タンパク質の阻害剤又は結合分子そのままを提供する。本明細書において定義されるER-αの内因性分解産物/ペプチドに特異的に結合する能力、好ましくは配列番号２により定義される、本発明のポリペプチドに随意に特異的に結合する結合力により定義される。ここで、配列番号２は、K268、R269、K303のメチル化、および/またはM286の酸化、および/または S282のリン酸化といった翻訳後修飾の1つ以上を含んでいる。
好ましい実施形態では、前記結合分子は、抗体またはそのフラグメントである。
【００４４】
好ましい実施形態では、前記結合分子は、本明細書で定義される内因性のER-αの分解産物/ペプチドのフラグメント、すなわち、配列番号１〜２９又は３２〜２２５で定義された配列からなる（ポリ）ペプチドのいずれか１つに特異的に結合する。
【００４５】
特に、本発明は、以下のポイントを提供する。
【００４６】
1．被験者におけるエストロゲン受容体α陽性ガンを診断するための方法であって、下記工程を含む：
ａ）被験者のサンプル中の、前記エストロゲン受容体α(ER-α)の内因性分解ペプチドの濃度を検出する工程であって、前記内因性分解ペプチドは、配列番号２〜２９、または３２〜２２５によって定義される配列のいずれか１つからなり、配列番号２９のフラグメントは、３０３番目位置のリジン（K303）がメチル化リジンである；及び
ｂ）前記被験者のサンプルで得られた前記内因性分解ペプチド濃度と、健常者における前記内因性分解ペプチドのコントロール濃度とを比較し、前記被験者のペプチドの濃度が増大していれば、前記被験者は、ER-α陽性ガンである可能性があることを示しているとする工程。
【００４７】
2．ポイント1に記載の方法であって、ER-αの前記内因性分解ペプチドは、P295LMIKRSKK303NSLALSLT311であり、３０３番目位置のリジン（K303）はメチル化リジンである（配列番号２９）である。
【００４８】
3．ポイント１または２に記載の方法であって、前記内因性分解ペプチドは、配列番号２の配列からなる。
【００４９】
4．ポイント１〜３のいずれか１つの方法であって、前記内因性分解ペプチドは、K268、R269、K303のメチル化、および/またはM286の酸化、及び/またはS282のリン酸化といった翻訳後修飾を1以上含む。
【００５０】
5．ポイント１〜４のいずれか１つの方法であって、前記ER-α陽性ガンは、好ましくは、乳ガン、子宮内膜ガン、子宮頸ガン、及び卵巣ガンからなる群より選ばれ、もっとも好ましくはヒト乳ガンである。
【００５１】
6．ポイント１〜５のいずれか１つの方法であって、前記サンプルは、好ましくは、全血、血漿、血清、乳頭吸引、乳管洗浄、腫瘍の滲出液、腫瘍空洞液、胸水、腹水流体、腫瘍またはガン細胞周囲の流体、リンパ、及び腫瘍またはガンと接触している他の体液からなる群より選ばれる。
【００５２】
7．配列番号２〜２９又は３２〜２２５により定義される配列（ここで、配列番号２９のフラグメントは３０３番目位置のリジン（K303）がメチル化リジンである）のいずれかからなる、単離されたエストロゲン受容体α(ER-α)ペプチド。
【００５３】
8．ポイント7に記載の単離されたポリペプチドであって、K268、R269、K303のメチル化、および/またはM286の酸化、および/またはS282のリン酸化といった翻訳後修飾の１つ以上を有している。
【００５４】
9．ポイント７又は８に記載の単離されたER-αポリペプチドを含む組成物であって、前記ペプチドは、ウシ血清アルブミンもしくはキーホールリンペットヘモシアニンなどの担体分子に結合している、又は脂質粒子、ナノカプセル、リポソーム、もしくは脂質小胞のような脂質組成物内に含まれていて、さらに必要に応じて医薬賦形剤を含んでもよい。
【００５５】
10．さらにアジュバントを含むポイント９に記載の組成物。
【００５６】
11．ＥR-α陽性ガン、好ましくは乳ガン、子宮内膜ガン、子宮頚ガン、卵巣ガン、最も好ましくはヒト乳ガンの治療又はワクチン接種に用いられる、ポイント７若しくは８に記載のポリペプチド、又はポイント９若しくは１０に記載の組成物。
【００５７】
12．ポイント７に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
【００５８】
13．ポイント１２に記載の核酸であって、配列番号１と少なくとも90％の一致性を有するヌクレオチド配列からなり、より好ましくは配列番号１のポリヌクレオチド配列からなる。
【００５９】
14．ER-α陽性ガン、好ましくは乳ガン、子宮内膜ガン、子宮頚ガン、卵巣ガン、もっとも好ましくはヒト乳ガンに対する治療又はワクチン接種において使用される、ポイント１２または１３に記載の核酸分子。
【００６０】
15．ポイント７に記載のペプチドを発現する組換えベクター、又はポイント１２もしくは１３に記載の核酸分子を含む組換えベクター。
【００６１】
16．ER-α陽性ガン、好ましくは乳ガン、子宮内膜ガン、子宮頸ガン、卵巣ガン、最も好ましくはヒト乳ガンの治療又はワクチン接種のためのポイント１５に記載の組換えベクター。
【００６２】
17．ポイント７又は８に記載のポリペプチド、ポイント９又は１０に記載の組成物、ポイント１２又は１３に記載の核酸分子、あるいはポイント１４に記載の組換えベクターを含む宿主細胞であって、前記宿主細胞は、好ましくはほ乳類細胞（例えば、ヒト細胞）、酵母細胞、細菌細胞（例えば大腸菌、サルモネラ属、又はシュードモナス細胞）である。
【００６３】
18．ER-α関連疾患、好ましくは乳ガン、子宮内膜ガン、子宮頚ガン、卵巣ガン、最も好ましくはヒト乳ガンに対する治療又はワクチン接種のためのポイント17に記載の宿主細胞。
【００６４】
19．ポイント７または８に記載のポリペプチドに特異的に結合する精製された結合分子であって、好ましくは抗体、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、ナノボディ、アフィボディ、抗体フラグメント、アプタマー、フォトアプタマー、オリゴヌクレオチド、リポカリン、特異的に相互作用する小分子、分子インプリンティングポリマー（MIPs）、DARPins、アンキリン、特異的に相互作用するタンパク質、ペプチドミメティックス、バイオミメティックス、又はペプチド、及び前記ポリペプチドに特異的に結合するその他の分子。
【００６５】
２０．a）ポイント１９に記載の結合分子；
b）健常者における、前記結合分子が特異的に結合する対応ペプチド量の参照値；及び
c）前記被験者がER-α陽性ガンであるか否かを結論付けるために、被験者のサンプル中の前記ペプチド量と、健常者のサンプルにおける前記ペプチド量とを比較する手順書；
を含む免疫検出キット。
【００６６】
21．ER-α陽性のガン、好ましくは乳ガン、子宮内膜ガン、子宮頸ガン、卵巣ガン、最も好ましくはヒト乳ガンの診断、予測、予後予測、および/またはモニタするためのバイオマーカーとしての、ポイント７又は８に記載のポリペプチドの使用。
【００６７】
22．治療有効量のポイント７もしくは８に記載のペプチド、又は治療有効量のポイント９もしくは１０に記載の組成物を、前記被験者に投与する工程を含む、ER-α陽性ガンを有する被験者を治療する方法。
【００６８】
23．治療有効量のポイント７もしくは８に記載のペプチド、又は治療有効量のポイント９もしくは１０に記載の組成物を、前記被験者に投与する工程を含む、ER-α陽性ガンの発生に対する被験者へのワクチン接種方法。
【００６９】
24．ポイント７もしくは８に記載の組成物、ポイント９もしくは１０に記載の組成物、ポイント１２もしくは１３に記載の核酸分子、ポイント１５に記載の組み替えベクター、またはポイント1７に記載の宿主細胞を、それを必要とする被験者に投与する工程、前記被験者の治療に有益な又は相乗可能な他の治療剤と、随意に組み合わせて投与する工程を含む、ER-α陽性ガン、好ましくは乳ガン、子宮内膜ガン、子宮頸ガン、卵巣ガン、最も好ましくはヒトの乳ガンを治療する方法。
【００７０】
25．ポイント７もしくは８に記載の組成物、ポイント９もしくは１０に記載の組成物、ポイント１２もしくは１３に記載の核酸分子、ポイント１５に記載の組換えベクター、またはポイント1７に記載の宿主細胞を、ER-α陽性ガン、好ましくは乳ガン、子宮内膜ガン、子宮頸ガン、卵巣ガン、最も好ましくはヒトの乳ガンの進展に対して、ワクチン接種を必要とする被験者に、前記被験者の治療に有益または相乗することができる他の治療剤と、所望に応じて組み合わせて投与する工程を含む、ワクチン接種方法。
【００７１】
26．ポイント７もしくは８に記載の組成物、ポイント９もしくは１０に記載の組成物、ポイント１２もしくは１３に記載の核酸分子、ポイント１５に記載の組換えベクター、またはポイント1７に記載の宿主細胞の、被験者におけるER-α陽性ガン、好ましくは乳ガン、子宮内膜ガン、子宮頸ガン、卵巣ガン、最も好ましくはヒトの乳ガンを治療するための医薬の製造のための使用。
【００７２】
27．ポイント７もしくは８に記載の組成物、ポイント９もしくは１０に記載の組成物、ポイント１２もしくは１３に記載の核酸分子、ポイント１５に記載の組み替えベクター、またはポイント1７に記載の宿主細胞の、ER-α陽性ガン、好ましくは乳ガン、子宮内膜ガン、子宮頸ガン、卵巣ガン、最も好ましくはヒトの乳ガンの発症に対して、被験者にワクチン接種するための医薬の製造のための使用。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】E2刺激したMCF-7細胞の馴化培地から抽出した内因性ペプチドのMS/MSスペクトル。この内因性ペプチドは、アミノ酸配列K268-T311であり、ER-α-17pの配列（６ｘでチャージされた前駆体：m/z= 823,26）を包含する。
【図２】検出されたペプチド（配列番号２）の配列および翻訳後修飾、並びに前記ペプチドをコードする対応の核酸配列（配列番号１）。
【図３】内因性ペプチドの免疫沈降。この内因性ペプチドは、エストラジオール（10-8Ｍ）、ジエチルスチベストール（10-8Ｍ）、4-OHタモキシフェン（10-7Ｍ）又はフルベストラント（10-7Ｍ）で処理したMCF-7細胞、あるいは処理していないMCF-7細胞（コントロール）の馴化培地から抽出された。
【図４】ER-αの分解産物/ペプチド（配列番号２）に対応する合成ペプチドの存在下または不在下での細胞増殖。ＭＣＦ−７細胞は、ER-α-17p（10-5M）または配列番号２ペプチド（10-5M）とともに、又は伴わずに（コントロール）、培養された。細胞増殖はクリスタルバイオレット染色によって評価された。
【図５】10-11M及び10-12MのE2存在下または不在下で、ER-αの分解産物/ペプチド（配列番号２）のC末端部分に対する抗体（希釈1/100）とともに又は伴わずに、７２時間培養した細胞増殖。細胞増殖は、クリスタルバイオレット染色によって評価された。
【図６】ER-αの転写活性。MVLN細胞（ERE作動型ルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定的にトランスフェクトしたMCF-7；ポンスら、Biotechniques  1990； 9：450-459）を、E2（10-10Ｍ）含有無血清培地、ER-α-17p（10-5Ｍ）含有無血清培地、又は配列番号２のペプチド（10-5Ｍ）含有無血清培地、又はこれらの不含無血清培地（コントロール）で、６時間培養。
【図７】ER-αアイソフォーム１のcDNAコード配列（Genbank  Acc.No.NM_000125（配列番号３））。太字の配列は配列番号１に対応し、配列番号２のペプチドをコードしている。
【図８】ER-αアイソフォーム1のアミノ酸配列（Genbank  Acc.No.  NP_0001 16（配列番号４））は、本発明で同定された配列を示す（配列番号２）。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
本明細書において明示がなければ、本明細書で用いる用語、「１つの」（「a」、「an」）、および 「その」（「the」）は、単数及び複数の双方を包含する。
【００７５】
本明細書で使用する「含む」「備える」「からなる」（「comprises」「comprising」「comprised  of」）は、「包含する」（「including」「includes」「containing」「contains」）と同義であり、包括的またはオープンエンドであり、追加的、非限定的要素、要件、又は工程を排除するものではない。
【００７６】
エンドポイントによる数値範囲の限定は、それぞれの範囲内での全ての数や分割された部分、及び限定しているエンドポイントを包含する。
【００７７】
本明細書で用いられる「約」という用語は、パラメータ、量、時間的継続時間などの、測定可能な値を参照するときは、バリエーションが開示された発明内で適切に実行できる限りは、特定された値及び特定された値からのバリエーション、特に、特定された値の±10％以下、好ましくは±5％以下、より好ましくは±1％以下、さらに好ましくは±０．１％以下に、拡大されることを意味する。修飾された「約」が参照する値は、特定的な開示そのもの、及び好ましい開示でもあることを理解すべきである。
【００７８】
本明細書において引用した全ての文書は、その全体が本明細書中で参考として組み入れられる。
【００７９】
特に指定しない限り、技術的および科学的用語を含む、本発明の開示に使用されるすべての用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を持つ。更なるガイダンスによって、用語の定義は、本発明の教示をより正しく理解するために含まれてもよい。
【００８０】
用語「予測する」（predicting）または「予測」（prediction）、「診断」（diagnosing）または「診断」（diagnosis）、及び「予後予測する」（prognosticating）又は「予後（予測）」（prognosis）は、医療や臨床の現場で一般的であり、よく理解されている。例のみで、限定しないが、「予測する」または「予測」は、一般に、被験者が疾患または症状を（まだ）有しておらず、疾患または症状の事前の宣言、表示、または予告をいう。例えば、被験者における疾患または症状の予測は、例えば、ある期間内又はある年齢までに、被験者が前記疾患又は症状を発症するだろう可能性、見込み、リスクを示すことができる。前記可能性、見込み、リスクは、とりわけ、絶対値、範囲、または統計として示されてもよいし、または適切なコントロール被験者または被験者集団に対して相対的に（例えば、一般的な正常または健康な対象や対象集団に対する相対値のように）示してもよい。したがって、被験者が疾患または症状を発症する前記可能性、見込み、リスクは、適切なコントロールである対象又は対象集団に対して、増加又は減少、あるいは何倍かの増加、何倍かの減少として、便宜的に示すことができる。
【００８１】
用語「診断する」または「診断」は、症状及び徴候、及び／又は様々な診断手順の結果（例えば、診断された疾患または症状の存在、不存在および/または量、１以上のバイオマーカー特徴を知ることなど）に基づいて、被験者における疾患または症状について、認識、決定、又は結論づけるプロセスや行為をいう。
【００８２】
用語「予後予測（する）」や「予後」は、一般に、疾患または症状の回復と見通し（例えば、可能性、期間、及び/又は程度）についての予測をいう。
【００８３】
本明細書で使用する用語「被験者」(subject)または「患者」（patient）は、典型的にはヒトを意味するが、非ヒト動物、好ましくは温血動物、より好ましくは、例えば、非ヒト霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ブタなどの哺乳類に拡大してもよい。
【００８４】
本明細書において使用される用語 「サンプル」または「生物学的サンプル」には、被験者から得られる任意の生物標本が含まれている。サンプルとしては、特に限定しないが、全血、血漿、血清、赤血球、白血球（例えば、末梢血単核細胞）、唾液、尿、便（すなわち、糞便）、涙、汗、皮脂、乳頭吸引、管洗浄液（ductal  lavage）、腫瘍の滲出液、腫瘍空洞液、胸膜滲出液、滑液、髄液、リンパ液、細針吸引液、羊水、他の体液、細胞ライセート、細胞分泌物、炎症液、精液や膣分泌物が含まれる。好ましいサンプルとしては、検出可能な量の本発明の分泌されたER-αのポリペプチドを含むもので、例えば、血液、腹水、腫瘍やガン細胞周囲の流体などである。好ましい実施形態では、前記サンプルは、全血または例えば、血漿、血清、または細胞ペレットなどの血液の一部の成分であってもよい。好ましくは、前記サンプルは、低侵襲の方法により容易に得ることができるものである。あるいは、サンプルは、組織サンプルおよび生検、組織ホモジネートなどであってもよい。
【００８５】
用語「量」（quantity、amount）、「レベル」は同義であり、当該技術分野において一般的によく理解されている。本明細書で使用する用語は、特に、サンプル中の分子又は分析物の絶対量化、あるいはサンプル内の分子又は分析物のある値に対する相対量化、すなわちここで示されている参照値に対するような、ある値に対する相対的量をいう。サンプル中の分子又は分析物の絶対量は、重量又はモル量として、またはより一般的に濃度（例えば、基準体積に対する重量、又は基準体積に対するモル）として便宜的に表される。サンプル中の分子又は分析物の相対量は、ここで示されている参照値に対してのように、ある値に対して増大又は減少、または何倍かの増大、何倍かの減少というように便宜的に表示してもよい。第１のパラメータと第２のパラメータ（例えば、第１の量と第２の量）との間での相対的比較を行うが、前記第１及び第２のパラメータの絶対値をまず決定することを要求するものではない。測定方法は、例えば、前記第１及び第２パラメータ用に、量で表すことができる読み出し情報（例えば、シグナル強度など）を作出してもよい。ここで、前記読み出し情報は、前記パラメータの関数値であり、前記読み出し情報は、第１パラメータ対第２パラメータの相対値を作出するために、読み出し情報を、それぞれのパラメータの絶対値に実際に変換せずに、直接的に比較することができる。
【００８６】
また、ここで教示されるような、ER-αポリペプチドに特異的に結合することができる結合分子を提供する。好ましくは配列番号２、又はK268、R269、K303のメチル化、および/またはM286の酸化、および/またはS282のリン酸化といった翻訳後修飾の1つ以上を含む具体的なフォームに特異的に結合することができる結合分子を提供する。このような結合分子は、とりわけ抗体、アプタマー、フォトアプタマー、タンパク質、ペプチド、ペプチドミメティックスまたは低分子を含むことができる。
【００８７】
本明細書を通して使用される用語「特異的に結合する」とは、ある物質（agent）（ここでは、「特定結合分子」又は「特異的結合分子」とも示される）が、対象とする１以上のタンパク質、ポリペプチド、又はペプチド、又はこれらのフラグメントのような１以上の所望な分子又は分析物に結合することを意味し、実質的には、ランダム又は関係ない他の分子を除外して、ときには実質的に構造的に関係する他の分子を除外して、結合することを意味する。
【００８８】
用語「特異的に結合する」は、分子が意図された標的（単数又は複数）に対して、必ずしも独占的に結合することを必要としない。もしそのような意図した標的に対する親和性が、結合の条件下で、標的でないポリペプチド又は分子に対する親和性よりも、少なくとも２倍以上大きい、好ましくは少なくとも約5倍以上、より好ましくは少なくとも約10倍以上、さらにより好ましくは少なくとも約25倍以上、さらにより好ましくは少なくとも約50倍以上、さらにより好ましくは少なくとも約100倍以上大きいのであれば、例えば、分子が、本発明の１又は複数の標的ポリペプチド、１又は複数のペプチド、及び／又はそのフラグメント、またはそれらの翻訳後修飾されたフォームに特異的に結合されることもあり得るといえる。
【００８９】
好ましくは、結合分子は、意図する標的（複数可）に、親和性定数（KA）がKA≧1×106Ｍ-1、より好ましくはKA≧1×107Ｍ-1、より好ましくはKA≧1×108Ｍ-1、さらに好ましくは、KA≧1×109Ｍ-1、より更に好ましくは、KA≧1×1010Ｍ-1またはKA≧1×1011Ｍ-1で結合することができる。ここで、KA=[SBM_T]／[SBM][T]であり、SBAは特異的結合分子を表し、Ｔは意図した標的を表す。KAの判定は、例えば、平衡透析とScatchardプロット解析を用いてのように、当該技術分野で公知の方法によって行うことができる。
【００９０】
本明細書を通して使用されるような特異的結合分子としては、とりわけ抗体、アプタマー、フォトアプタマー、タンパク質、ペプチド、ペプチドミメティックスまたは低分子が挙げられる。
【００９１】
本明細書において用いられるように、用語「抗体」は、最も広い意味で用いられ、ここで示されるようなER-αポリペプチド又はここで定義されている１つ以上の前記ポリペプチドの翻訳後修飾フォームなどの標的分子に特異的に結合する任意の免疫学的結合分子を一般にいう。この用語は、無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多価（例えば、２価、３価以上）、及び／又は少なくとも２つの無傷モノクローナル抗体から形成されるマルチ特異的抗体（例えば、二つ以上の特異的抗体）、及び所望の生物学的活性（特に、目的の抗原に特異的に結合する能力）を示す限りは抗体フラグメント、さらにはこのようなフラグメントの多価および/または多重特異的複合体にまで拡張する。用語「抗体」は、免疫感作を含む方法によって生成される抗体を含むだけでなく、例えば、目的の抗原上のエピトープに特異的に結合することができる少なくとも１つの相補性決定領域（CDR）で拡張される、組み替えられた発現ポリペプチドのようないずれのポリペプチドも含む。したがって、この用語は、それらが、in vitroまたはin vivoで産生されているかどうかにかかわらず、そのような分子に適用される。
【００９２】
実施形態において、抗体は、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMクラスのいずれであってもよく、好ましくはIgGクラスの抗体である。治療目的のためには、IgG抗体が好ましく、特に被験者において、低い自己免疫応答を誘導するIgG2又はIgG4型が好ましい。
【００９３】
実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体であってもよく、例えば、そこから精製（例えば、アフィニティー精製）された抗血清または免疫グロブリンであってもよい。
【００９４】
別の好ましい実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体の混合物であってもよい。モノクローナル抗体は、特定の抗原、またはより大きな選択性と再現性を有する抗原内の特定のエピトープを標的とすることができる。
【００９５】
たとえば、限定しないが、モノクローナル抗体は、Kohlerらによって1975年に最初に説明されたハイブリドーマ法（ネイチャー256:495）によって作製してもよいし、組換えDNA法（例えば、米国4816567など）によって製造してもよい。また、モノクローナル抗体は、Clacksonらによって1991年に説明されたような技術（ネイチャー352：624から628）や１９９１年にMarksらにより説明された技術（J  Mol  Biol 222：581-597）を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することができる。
【００９６】
さらなる実施形態では、抗体結合分子は、抗体フラグメントであってもよい。「抗体フラグメント」は、完全な抗体の一部を含み、その抗原結合領域または可変領域を含んでいる。抗体フラグメントとしては、例えば、Fab、Fab '、F(ab')2は、FvおよびscFvフラグメント；ジアボディ（didbodies）；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；抗体フラグメント（例えば２つのボディ、３つのボディ、及びマルチボディ）から形成された多価および/または多重特異的抗体が挙げられる。上記名称Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFvなどは、それらの分野で確立された意味を有するものとする。
【００９７】
抗体という用語は、あらゆる動物種、好ましくは脊椎動物種（例えば、鳥類、哺乳類）に由来する、又はこれらに由来する1つ以上の部分を含む抗体を包含する。特に限定しないが、前記抗体は、ニワトリ、七面鳥、ガチョウ、カモ、ホロホロ鳥、ウズラやキジなどに由来してもよい。また、特に限定しないが、前記抗体は、ヒト、マウス（例えば、マウス、ラットなど）、ロバ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、ラクダ属（例えば、フタコブラクダ及びアラブラクダ（Camelus  dromaderius））、ラマ属（llama）（例えば、飼育ラマ（lama  paccos）、リャマやビクーニャ・ラマ）または馬などに由来してもよい。
【００９８】
当業者は、抗体は1つまたは複数のアミノ酸の欠失、付加および/または置換（例えば、保存的置換）がそれぞれの抗原との結合を維持しているのであれば、これらの変更を含むことができることと理解するであろう。抗体はまた、それを構成するアミノ酸残基の1つまたは複数の自然のまたは人工の修飾（例えば、グリコシル化等）を含んでもよい。
【００９９】
組換え抗体またはそのフラグメントの産生方法として、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体ならびにそのフラグメントを産生する方法は、当技術分野でよく知られている（例えば、HarlowおよびLane、「抗体：実験室マニュアル」、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク、1988; HarlowおよびLane、「抗体を用いた：実験室マニュアル」、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク、1999年、ISBN 0879695447；ゾラ編「モノクローナル抗体：技術のマニュアル」、CRCプレス、1987年、ISBN 0849364760；ディーン＆シェパード編、「モノクローナル抗体：実践的アプローチ」オックスフォード大学出版、2000年、ISBN 0199637229；LO編、Methods  in  Molecular  Biology、vol.248、「抗体工学：方法とプロトコル」ヒューマンプレス、2004年、ISBN 1588290921）。
【０１００】
用語「アプタマー」とは、本明細書に示すER-αポリペプチドのような標的分子に特異的に結合することができる一本鎖または二本鎖オリゴDNA、オリゴRNAまたはoligo-DNA/RNAもしくはその類似体、あるいは本明細書で定義されるような、その翻訳後修飾されたフォームの1つ以上をいう。有利には、アプタマーは、それらの標的に対して、かなり高い特異性と親和性（例えば、1×109M-1オーダーのKA）を示すことができる。アプタマーの製造は、とりわけ、米国5270163号特許；Ellington＆Szostak 1990年（Nature 346：818-822）；Tuerk＆Gold、1990年（Science  249：505−510）；またはKlussmann編、「アプタマーハンドブック−機能性オリゴヌクレオチドとその応用」、Wiley−VCH、2006年、ISBN 3527310592に説明されている。これらは、参考として、本明細書に組み込まれる。
【０１０１】
用語「フォトアプタマー」は、標的分子に共有結合又は架橋結合することができる1つ以上の光反応性官能基を含有するアプタマーをいう。
【０１０２】
用語「ペプチドミメティックス」は、対応するペプチドのトポロジー類似体である非ペプチド薬剤をいう。合理的にペプチドのペプチドミメティックスを設計する方法は、当技術分野で知られている。たとえば、硫酸化8量体ペプチドCCK26-33に基づく３つのペプチドミメティックスと１１量体のサブスタンスＰに基づく２つのペプチドミメティックスの合理的設計、並びに関連するペプチドミメティックスの設計原理は、Horwell 1995年（Trends Biotechnol  13：132−134）に記載されている。
【０１０３】
用語「低分子」とは、一般に医薬品で使用されている有機分子に匹敵するサイズの化合物、好ましくは有機化合物をいう。この用語は、生体高分子（例えば、タンパク質、核酸など）を除外している。好ましい低分子有機化合物の範囲は、約5000Da程度まで、例えば、約4000まで、好ましくは2000まで、さらに好ましくは1000Da、例えば、約900、800、700、600、または最大約500Daまでである。好ましい低分子は、本明細書に示すER-αポリペプチドのような標的分子または本明細書で定義する、その翻訳後修飾されたフォームの一つ以上の標的分子に特異的に結合するものである。
【０１０４】
また、動物を免疫することにより、本発明のペプチド（配列番号２）に対して特異的な抗体を調製するための方法を提供する。当該方法は、本明細書で示すER-αポリペプチド（例えば、配列番号２）又は本明細書で定義される翻訳後修飾されたフォームの1つ以上（参照：図2）を用いて（すなわち、免疫感作抗原として使用して）、所望により、存在しているキャリアに付着させて、動物、例えば非ヒト動物を免疫することにより、調製する方法である。あるいは、DNAまたはRNA免疫感作は、本明細書において定義されるヌクレオチド（例えば、配列番号１）を使用して適用することができる。免疫感作及び免疫血清からの抗体試薬の調製は、それ自体はよく知られている。免疫される動物は、任意の動物種、好ましくは温血種、より好ましくは、例えば、鳥類、哺乳類等の脊椎動物種である。特に限定しないが、前記抗体は、ニワトリ、七面鳥、ガチョウ、カモ、ホロホロ鳥、ウズラやキジであってもよい。また、限定しないが、抗体は、ヒト、マウス（例えば、マウス、ラットなど）、ロバ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、ラクダ、ラマや馬であってもよい。用語「提示キャリア（presenting  carrier）」や「キャリア」とは、一般に、第二の分子に結合するとき、後者、通常、追加のＴ細胞エピトープを提供することを通じて、増強した免疫応答をする免疫原性分子を表す。提示キャリアは、（ポリ）ペプチド構造や非ペプチド構造であってもよく、とりわけ、糖鎖、ポリエチレングリコール、ペプチドミメティックス、合成ポリマーなどが挙げられる。限定しないが、例えば、キャリアには、ヒトのB型肝炎ウイルスコアタンパク質、複数C3D、破傷風毒素フラグメントＣや酵母Tyの粒子が挙げられる。
【０１０５】
本明細書で示す免疫感作により得られる又は得られ得る免疫血清は、特に、ここに示すER-αポリペプチド、または本明細書に定義するようなその翻訳後修飾されたフォームの1つ以上に特異的に結合する抗体試薬を生成するのに、有用である。
【０１０６】
また、本発明は、ここに示すER-αポリペプチドに特異的、または本明細書に定義するようなその翻訳後修飾されたフォームの１以上に結合する特異的結合分子を選択する方法を教示する。都合よいことに、このような方法は、所望しない分子と交差反応又は交差結合する結合分子を減少させたり、取り除くことに基づいている。アフィニティークロマトグラフィー、アフィニティー固相抽出、アフィニティー磁気抽出などの種々のアフィニティー分離法により、当該分野で公知の方法により、所望でない結合分子を容易に低減することができる。
【０１０７】
既存の利用可能な、または従来の分離、検出および定量方法のいずれも、ここに示すER-αポリペプチドに特異的、または本明細書に定義するような翻訳後修飾されたフォームの1以上の存在又は不存在の測定（例えば、存在ｖｓ不存在；検出可能な量ｖｓ検出不可能な量とした読み出し）及び／又は定量（例えば、絶対濃度又は相対濃度などの絶対量または相対量である読み出し）に用いられることができる。
【０１０８】
例えば、このような方法は、イムノアッセイ法、質量分析法、またはクロマトグラフィー法、またはこれらの組み合わせであってもよい。
【０１０９】
用語「免疫学的検定」は、一般的にサンプル中の目的とする1以上の分子または分析物を検出するためのような公知の方法をいう。ここで、目的とする分子又は分析物の免疫学的測定の特定は、特異的結合性分子、一般的な抗体、及び目的とする分子又は分析物の間で、特異的に結合することによって、与えられる。
【０１１０】
イムノアッセイ技術は、特に限定しないが、直接ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、間接ELISA、サンドイッチELISA、競合ELISA、多重ELISA、ラジオイムノアッセイ（RIA）、ELISPOT技術、FPIA（蛍光偏光免疫測定法）および当該分野で公知の他の同様の技術を含む。これらのイムノアッセイ法は、当該分野で、例えば、ジョン・R・クラウザー、「ELISA法ガイドブック」第1編、ヒューマンプレス2000年、ISBN 0896037282で知られている。
【０１１１】
限定しないが、更に説明する手段により、直接ELISAは、マイクロウェルプレートのような固体支持体上に固定化されたサンプル中の標的抗原に結合する、標識された一次抗体を採用し、これにより、前記標的抗原を定量する。間接ELISA法は、標的抗原に結合する非標識一次抗体と、抗原が結合した一時抗体を認識し、定量する二次標識抗体を用いる。サンドイッチELISAでは、抗原内の1つの抗原部位に結合する、固定化された「捕捉用」抗体を用いて、サンプルから、標的抗原が捕捉され、結合していない分析物の除去後に、捕捉された抗原が、前記抗原の別の抗原部位と結合する「検出用抗体」を用いて検出される。ここで前記検出抗体は、上記のように直接的又は間接的に検出されることができる。競合ELISAは、一次抗体または標的抗原のいずれか一方であればよい標識された「競合物（competitor）」を使用している。この例では、非標識の固定化された一次抗体が、サンプルと共にインキュベートされ、この反応は平衡になるまで行われ、ついで標識された標的抗原が追加される。後者は、その結合部位がサンプルからの非標識標的抗原によって占有されていない限り、一次抗体に結合するであろう。このように、結合した標識抗原の検出量は、サンプル中の非標識抗原の量に反比例の関係にある。マルチプレックスELISA法により、通常の複数の配列アドレスで、単一のコンパートメント（例えば、マイクロプレートウェル）内での、２つ以上の検体を同時検出する（例えば、Nielsen＆Geierstanger  2004年、J  Immunol  Methods  290：107−20、及びさらなるガイダンスとして、Lingら、2007年、Expert  Rev  Mol  Diagn  7：87−98参照）。理解されるように、ELISA技術での標識は、通常、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼなど）の結合により、その端部は、通常、化学発光、比色または蛍光性としている。
【０１１２】
ラジオイムノアッセイ(RIA)は、競合をベースとする技術であり、既知量の放射性標識（例えば、125Ｉまたは131I標識）された標的抗原を、前記抗原に対する抗原と混合し、ついで、サンプルからの非標識すなわち「コールド」抗原を添加し、入れ替わった標識抗原の量を測定する（例えば、「ラジオイムノアッセイおよび関連技術の概要」、Chard  T編、ガイダンスのためのElsevier  Sciense  1995年、ISBN 0444821198参照）。
【０１１３】
また、質量分析法は、バイオマーカーを測定するのに適している。
【０１１４】
一般に、ぺプチド、好ましくはフラグメンテーション及び／又は選択されたペプチドの（部分的）アミノ酸配列の質量に関する正確な情報を得るための任意の質量分析（MS）(例えば、タンデム質量分析、MS／MS；またはポストソース分解、TOF MS）は、本明細書において有用である。適当なペプチドMSおよびMS／MS技術及びシステムは、それ自体はよく知られている（例えば、Methods  in  Molecular  Biology、Vol．146：「タンパク質及びペプチドの質量分析」、Chapman編、ヒューマナ・プレス2000年、ISBN 089603609x；Biemann 1990年  Methods  Enzymol 193：455−79、またはMethods  in  Enzymology，vol．402、「生物質量分析」Buringame編、アカデミックプレス社2005年、ISBN 9780121828073参照）。これらは本明細書で用いられることができる。
【０１１５】
バイオマーカーペプチドの分析に適したMSの準備、器具やシステムとしては、限定しないが、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（MALDI-TOF）MS、MALDI-TOFポストソースディケイ（PSD）、MALDI-TOF／TOF、表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（SELDI-TOF）MS、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）；ESI-MS／MS；ESI-MS／(MS)n（nはゼロより大きい整数）；ESI 3Dまたはリニア（2D）イオントラップMS；ESIトリプル四重極MS；ESIの四重極直交TOF（Q-TOF）；ESIフーリエ変換MSシステム；シリコン上での脱離／イオン化（DIOS）；二次イオン質量分析法（SIMS）；大気圧化学イオン化質量分析法（APCI-MS）；APCI-MS/MS；APCI−(MS)n；大気圧光イオン化質量分析法（APPI-MS）；APPI-MS／MS；およびAPPI−(MS)nが挙げられる。タンデムMSにおけるペプチドイオンフラグメンテーション（MS／MS）による取り決めは、例えば、衝突誘起解離（CID）のような、当該技術分野において確立された技術を用いて達成することができる。
【０１１６】
実施形態では、質量分析法によるバイオマーカーの検出および定量は、とりわけ上記のような、Kuhnら（2004年、Proteomics4：1175−86）によって、マルチプルリアクションモニタリング（MRM）を伴ってもよい。
【０１１７】
実施形態では、ペプチドのMS分析法は、有利には、例えば、クロマトグラフィー及び下記の明細書中に記載のその他の方法との組み合わせのように、上流のペプチドまたはタンパク質の分離または分別方法と組み合わせて、用いることができる。
【０１１８】
クロマトグラフィーは、また、バイオマーカーを測定するために使用することができる。用語「クロマトグラフィー」は、当該分野で本明細書において用いられるように、また大変有効であるといわれている、化学物質を分離するための方法に拡張する。好ましいアプローチでは、クロマトグラフィーは、液体または気体の移動ストリーム（「移動相」）によって運ばれる化学物質の混合物（検体）が、静止液体または固体の相（「固定相」）上又は周囲を、移動相と固定相（stationary  phase）との間で流れるので、検体の差の分布の結果としての成分に分離されるプロセスをいう。前記固定相は、通常、微細に分解された固体、フィルター材料のシート、又は固体表面にある液体の薄層などであってもよい。クロマトグラフィーは、例えば、アミノ酸、タンパク質、タンパク質又はペプチドのフラグメントなどのような、生物由来の化学的化合物の分離のためにも広く適用可能である。
【０１１９】
本明細書で使用するクロマトグラフィーは、好ましくは、カラム（すなわち、前記固定相がカラムに堆積または充填されている）、好ましくは、液体クロマトグラフィーであり、さらに好ましくはHPLCであってもよい。クロマトグラフィーの細目は、当技術分野でよく知られている。例えば、さらなるガイダンスとして、例えば、M.マイヤー、1998年、ISBNコード：047198373X、及び「実践のHPLC方法論と応用」、Bidlingmeyer B.A.、John  Whiley＆Sons社、1993年を参照。
【０１２０】
クロマトグラフィーの代表的な種類は、限定しないが、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、順相ＨＰＬＣ（NP-HPLC）、逆相ＨＰＬＣ（RP-HPLC）、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー等のイオン交換クロマトグラフィー（IEC）、親水性相互作用クロマトグラフィー（HILIC）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）、ゲルろ過クロマトグラフィーやゲルパーミエーションクロマトグラフィー等のサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）、クロマトフォーカシング、免疫親和性、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー等のアフィニティークロマトグラフィーなどが挙げられる。
【０１２１】
シングル、二次元以上の次元クロマトグラフィーを含む実施形態では、さらなるペプチド分析方法と組み合わせたペプチド分画法、例えば、本明細書の他の箇所で説明されている、ダウンストリーム質量分析と組み合わせて用いてもよい。
【０１２２】
さらに、ペプチドまたはポリペプチドの分離、同定または定量方法は本明細書の開示において、バイオマーカーを測定するために、必要に応じて、上記の分析方法のいずれかと組み合わせて使用することができる。このような方法は、限定されないが、化学的抽出の分割、キャピラリー等電点電気泳動（CIEF）、キャピラリー等速電気泳動（CITP）、キャピラリー電気クロマトグラフィー（CEC）などの等電点電気泳動（IEF）、一次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（2D-PAGE）、キャピラリーゲル電気泳動（CGE）、キャピラリーゾーン電気泳動（CZE）、ミセル動電クロマトグラフィー（MEKC）、フリーフロー電気泳動（FFE）などを含む。
【０１２３】
本明細書に示す様々な態様および実施形態は、さらに、サンプル中で測定された、ここに示すER-αポリペプチドまたはここで定義される翻訳後修飾された１つ以上のフォームの量を、前記ポリペプチド量の参照値と比較することに依拠する。ここで前記参照値は、ER-α関連ガン、より具体的には、ＥＲ-α陽性乳ガンの既知の予測、診断および/または予後予測を表す。
【０１２４】
例えば、個別の参照値は、ER-α関連ガン、より具体的には、ER-α陽性乳ガンのリスクがない又は正常であることに対する、ER-α関連ガン、より具体的には、ER-α陽性乳ガンのリスクの予測（例えば、異常に高いリスク）を表すことができる。他の例では、個別の参照値は、ER-α関連ガン、より具体的には、ER-α陽性乳ガンを有するリスクの度合いが異なることの予測を表してもよい。
【０１２５】
別の例では、個別の参照値は、ER-α関連ガンより具体的にはER-α陽性乳ガンであるとの診断に対して、ER-α関連ガンより具体的にはER-α陽性乳ガンでないとする診断（例えば、健康であるとの診断、またはER-α関連ガンより具体的にはER-α陽性乳ガンから回復したとする診断など）を表すことができる。他の例では、個別の参照値は、ER-α関連ガン、より具体的にはER-α陽性乳ガンの重症度の変化の診断を表してもよい。
【０１２６】
さらに別の例では、個別の参照値は、ER-α関連ガンより具体的にはER-α陽性乳ガンの予後不良に対して、ER-α関連ガンより具体的にはER-α陽性乳ガンの予後良好であることを表してもよい。さらなる例では、ER-α関連ガンより具体的にはER-α陽性乳ガンの様々な好ましい又は好ましくない予後を表してもよい。
【０１２７】
このような比較は、一般に、少なくとも1つの差異の有無、必要に応じて、比較される値またはプロファイル間での異なるサイズの有無を決定するためのいかなる手段を含んでもよい。比較は、目視検査、測定値の算術・統計比較を含んでもよい。このような統計的な比較は、限定しないが、ルールの適用を含む。もし、値又はバイオマーカープロファイルが、少なくとも一つの標準を含む場合、前記値又はバイオマーカープロファイルにおける差異を決めるための比較は、バイオマーカーの測定が、内部標準の測定に相関するように、これらの標準の測定を含んでもよい。
【０１２８】
本明細書に示すER-αポリペプチド又はその翻訳後修飾されたフォームの一つ以上のフォームの量に関する参照値は、他のバイオマーカーに以前採用されていた公知の手順に従って確立されることができる。
【０１２９】
例えば、ER-α関連ガン、特に具体的にはER-α陽性乳ガンの特定の予測、診断および/または予後予測のために、本明細書中で示すER-αポリペプチド又はその翻訳後修飾されたフォームの一つ以上のフォームの量の参照値は、ER-α関連ガン、特に具体的にはER-α陽性乳ガンの特定の予測、診断および/または予後予測で特徴づけられる（すなわち、ER-α関連ガン、特に具体的にはER-α陽性乳ガンの前記予測、診断および/または予後予測される）１個体又は個体集団から採取されたサンプル中の、ER-αポリペプチド又はその翻訳後修飾されたフォームの一つ以上のフォームの量のために確立されることができる。そのような集団には、限定しないが、≧2、≧10、≧100、あるいは数百人以上含まれ得る。
【０１３０】
したがって、例示的な例により、ER-α関連ガン（より具体的にはER-α陽性乳ガン）であるか、ガンでないかを診断するための、本明細書中で示すER-αポリペプチドの量又はその翻訳後修飾されたフォームの一つ以上の量の参照値は、例示的な例の手段を用いて、診断される１個体又は個体の集団からのサンプル中の、ER-αポリペプチド又はその翻訳後修飾されたフォームの一つ以上の量を、（例えば、臨床徴候と症状、イメージング、マンモグラフィ等のような他の適切な決定手段に基づき）それぞれER-α関連ガンを有しているか否かとして決定することにより、確立することができる。
【０１３１】
ある実施形態では、本明細書中で意図された参照値は、本明細書に示すER-αポリペプチド又はその翻訳後修飾されたフォームの一つ以上のフォームの絶対量を示すことができる。別の実施形態において、テストされる被験者から採取されるサンプル中のER-αポリペプチド又はその翻訳後修飾されたフォームの一つ以上のフォームの量は、参照値に対して直接的に決めることができる（例えば、増加又は減少として、あるいは何倍かの増大又は何倍かの減少として）。ここでは、被験者のサンプル中のER-αポリペプチド又はその翻訳後修飾されたフォームの一つ以上のフォームの量を、ER-αポリペプチド又はその翻訳後修飾されたフォームの一つ以上についてそれぞれの絶対量をまず測定する必要なしに、参照値と比較させる（換言すれば、被験者のサンプル中のER-αポリペプチド又はその翻訳後修飾されたフォームの一つ以上のフォームｖｓ参照値の相対量を測定する）という利点がある。
【０１３２】
実施形態では、本方法は、参照値（１つ又は複数）を確立するステップを含んでもよい。実施形態では、本キット及びデバイスは、ER-α関連ガン、より具体的には、ER-α陽性乳ガンの特定の予測、診断、及び／又は予後予測のために、本明細書中で示すＥR-αポリペプチド又はその翻訳後修飾されたフォームの一つ以上のフォームの量の参照値を作成する手段を含んでもよい。このような手段は、例えば、ER-α関連ガン、より具体的には、ER-α陽性乳ガンの特定の予測、診断、及び／又は予後予測によって特徴づけられる１以上の個体からの１つのサンプル（例えば、分離またはプールされたサンプル）を含んでもよい。
【０１３３】
本明細書に示す様々な態様及び実施形態は、さらに、与えられた参照値と、測定された個体のサンプル中の、本明細書中で示すER-αポリペプチド又はその翻訳後修飾されたフォームの少なくとも１つの量との間で、偏差の有無を発見することを伴ってもよい。
【０１３４】
第２の値からの第１の値の「偏差（deviation）」は、いずれかの方向づけ（例えば、第１の値＞第２の値のときは増大、第１の値＜第２の値のときは減少）及び任意の換算にまで、一般に、拡張される。
【０１３５】
例えば、特に限定しないが、偏差は、比較される第２の値に対して第１の値が、少なくとも約10％（約0.9倍以下）、又は少なくとも約20％（約0.8倍以下）、又は少なくとも約３0％（約0.7倍以下）、又は少なくとも約40％（約0.6倍以下）、又は少なくとも約50％（約0.5倍以下）、又は少なくとも約60％（約0.4倍以下）、又は少なくとも約70％（約0.3倍以下）、又は少なくとも約80％（約0.2倍以下）、又は少なくとも90％（約0.1倍以下）減少していることに拡張してもよい。
【０１３６】
例えば、特に限定しないが、偏差は、比較される第２の値に対して第１の値が、少なくとも約10％（約1.1倍以上）、又は少なくとも約20％（約1.2倍以上）、又は少なくとも約30％（約1.3倍以上）、又は少なくとも約40％（約1.4倍以上）、又は少なくとも約50％（約1.5倍以上）、又は少なくとも約60％（約1.6倍以上）、又は少なくとも約70％（約1.7倍以上）、又は少なくとも約80％（約1.8倍以上）、又は少なくとも90％（約1.9倍以上）、又は少なくとも約100％（約2倍以上）、又は少なくとも約150％（約2.5倍以上）、又は少なくとも約200％（約3倍以上）、または少なくとも約500％（約6倍以上）、または少なくとも約700％（約8倍以上）等、増大していることに拡張してもよい。
【０１３７】
好ましくは、偏差は、統計的に有意に観察される変化をいい得る。たとえば、偏差は、与えられた集団における参照値について、誤差の許容範囲外となる、観察される変化（例えば、標準偏差や標準誤差によって、または所定の倍数、例えば、±1xSDまたは±2xSD、又は±1xSEまたは±2xSE）をいい得る。また、偏差は、与えられた集団における値により定義される参照範囲外の値（例えば、前記集団の値の≧40％、≧50％、≧60％、≧70％、≧75％又は≧80％又は≧85％または≧90％、≧95％以上であってもよく、さらには≧100％）もいい得る。
【０１３８】
さらなる態様において、偏差は、観察される変化が所定の閾値又はカットオフ値を超えるかどうかを結論づけることができる。かかる閾値又はカットオフ値は、一般に、当該分野で知られており、予測、診断および／または予後予測の方法の選ばれた感度及び／又は特異性、例えば、少なくとも50％又は少なくとも60％または少なくとも70％または少なくとも80％または少なくとも85％または少なくとも90％または少なくとも95％の感度および/または特異性として、提供される。
【０１３９】
例えば、一実施形態では、被験者からのサンプル中の、本明細書中で示すER-αポリペプチド又はその翻訳後修飾されたフォームの一つ以上のフォームの量の増大した量が、ER-α関連ガン、具体的にはER-α陽性乳ガンでないという予測又は診断を示す、あるいはER-α関連ガン、具体的にはER-α陽性乳ガンの良好な予後を示す参照値と比べて、約1.1倍から3倍の上昇、又は1.5倍から2倍の上昇、好ましくは少なくとも1.1倍の上昇、または少なくとも約1.2倍の上昇、より好ましくは少なくとも約1.3倍の上昇、さらにより好ましくは少なくとも1.4倍の上昇、さらにより好ましくは少なくとも約1.5倍の上昇のときには、被験者はER-α関連ガン、具体的にはER-α陽性乳ガンを有している又は有しているリスクがあること、あるいは被験者におけるER-α関連ガン、具体的にはER-α陽性乳ガンの予後がよくないことを示す。
【０１４０】
被験者からのサンプル中の、本明細書中で示すＥR-αポリペプチド又はその翻訳後修飾されたフォームの一つ以上のフォームの量と、ER-α関連ガン、具体的にはER-α陽性乳ガンについてのある予測、診断及び／又は予後予測を表す参照値との間で、偏差が見出されるとき、その偏差は、前記被験者におけるER-α関連ガン、具体的にはER-α陽性乳ガンについての予測、診断及び／又は予後予測が参照値によって表されるものと異なるとの結論を示す、あるいは当該結論に帰することができる。
【０１４１】
被験者からのサンプル中の、本明細書中で示すER-αポリペプチド又はその翻訳後修飾されたフォームの一つ以上のフォームの量と、ER-α関連ガン、具体的にはER-α陽性乳ガンについてのある予測、診断及び／又は予後予測を表す参照値との間で、偏差が見出されないときには、かかる偏差がないことは、前記被験者におけるER-α関連ガン、具体的には前記被験者におけるER-α陽性乳ガンについての予測、診断及び／又は予後予測が参照値によって表されるものと実質的に同じであるとの結論を示す、あるいは当該結論に帰することができる。
【０１４２】
以前に報告されたER-αの合成ペプチドフラグメントP295-T311は、前記レセプターの活性のための調節因子であるらしい（ギャロら、2007年、Mol  Cell  Endocrinol  268：37-49；ギャロら、2007年、Letters  in  Drug  Design＆Discovery  4：346-355）。我々の研究は、それが実際に受容体の自己阻害剤（auto-inhibitor）モチーフであり、ER-αレセプターにおいて当該モチーフが欠失すると、恒常的な転写活性を生じることを示した（ギャロら、2007年、Mol  Cell  Endocrinol  268：37- 49；ギャロら、268：37-49；ギャロら、2007年、Letters  in  Drug  Design＆Discovery  4：346-355）。したがって、受容体が活性になるためには、このモチーフによって表される抑圧のスイッチをオフにしなければならないようだ（ギャロら、2007年、Letters  in  Drug  Design＆Discovery  4：346-355；Jacquotら、2008年、J  Steroid  Biochem  Mol  Biol 104：1-10）。この原理に一致して、我々は、合成ER-α-17pペプチドで誘導される競合が、ER-αレセプターの転写活性を増大させることを示した（ギャロら、2007年、Mｏｌ  Cell  Endocrinol 268：37-49；ギャロら、2007年、Letters  in  Drug  Design＆Discovery  4：346-355）。同様に、ER-α陽性である乳ガン細胞細胞株の細胞増殖においても増大するが、ER-α陰性の細胞株では増大しない（ギャロら、2007年、Mol  Cell  Endocrinol 268：37-49；ギャロら、2008年、J  Steroid  Biochem  Mol  Biol 109：138-149）。
【０１４３】
エストラジオール(E2)にさらされると、ER-α受容体は急速に、ユビキチン化され、プロテアソームによって分解される（Nawazら、1999年、Proc  Natl  Acad  Sci  USA 96：1858-1862；ＥＩ  Kissiinら、1999年、FEBS Lett 448：160-166）。例えば、MG-132、ラクタシスチン等を用いるプロテアソームの阻害がER-α依存性の転写を減少させるという観察は、前記転写の減少が、最適な転写の確保のために必要であることを提案している（Nawazら、1999年、Proc  Natl  Acad  Sci  USA 96：1858-1862；EI  Kissiinら、1999年、FEBS Lett 448：160-166；Laiosら、2005年、J  Steroid  Biochem  Mol  Biol  94：347-359；ギャロら、2008年、Nucl  Recept  Signal6：ｅ007）。本発明は、前記仮説のプロセスを調整するための役割をになっている内因性ペプチドを同定した。
【０１４４】
エストラジオールで処理したMCF-7ヒト乳ガン細胞株の馴化培地から、ER-αの分解産物ポリペプチド（配列番号２：K268RQRDDGEGRGEVGSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLT311）を本発明において同定した。全長のER-αタンパク質（配列番号３によりコードされ、配列番号４であらわされる）の分解産物である。
【０１４５】
さらに、本発明者らは、前記内因性の分泌されたタンパク質は、K268、R269、K303のメチル化、M286の酸化、S282のリン酸化といった翻訳後修飾を含んでいてもよいことを示すことができた。
【０１４６】
303番目位置のリジンは、高度の乳ガンで変異していることが知られている（Fuquaら、2000年、Cancer  Res  60：4026-4029；Herynkら、2004年、Endocr  Rev  25：869-898；Conwayら2005年、Brest  Cancer  Res：R871-R880）。本発明者らは、これらの修飾は、プロテアソームによるER-α受容体の分解の前に正しく起こると仮定している。そこで我々は、これらの修飾が受容体の機能に大きな影響を及ぼし、乳ガンの診断に重要であるかもしれないと信じる。
【０１４７】
ER-αの分泌された（ポリ）ペプチドは、当初、以下の実施例で示すように、エストラジオールで処理したMCF-7細胞の馴化培地について実施された質量分析により同定した。結果は、ER-α結合抗体（G-20、サンタクルス社）を用いた免疫沈降後に、MCF-7細胞の馴化培地のウェスタンブロット分析によって確認した。図3に示すように、この実験の結果は、エラストジオールが、ここで同定された内因性ペプチドの生産を増大させる一方、4-OHタモキシフェン及びフルベストラントは、その生産を減少させることを示している。また驚くべきことに、ジエチルスチルベストロールは、わずかにポリペプチド産生を減少させる。
【０１４８】
従って、本発明は、前記ER-α受容体の内因性分泌物ペプチド、およびその翻訳後修飾に特異的な抗体を同定するための道を開いた。
【０１４９】
本発明は、本明細書で発見されたメカニズムを用いることにより、プロテアソームの阻害剤の効果の研究を想定している。この観点での典型的なアッセイは、以下の工程を含む：
ａ）プロテアソーム候補モジュレーターの存在下または不在下で、ER-α陽性細胞株及び／またはその馴化培地中での、本発明で同定されたER-αポリペプチドの存在を検出する工程であって、ER-αポリペプチドの量が変化していたら、その薬剤はプロテアソームモジュレーターであることを示す工程。典型的には、用語 「モジュレート（modulating）」には、約5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95あるいは100％の変化さえも含まれる。
【０１５０】
ER-αポリペプチドの量を減少させるモジュレーターは、ER-α陽性ガン、好ましくは乳ガン、子宮内膜ガン、子宮ガン、卵巣ガンなどのER-α関連疾患の治療のために使用することができる。
【０１５１】
本発明では、MCF-7乳ガン細胞株を用いたが、これは当然のことながら、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書で定義されるように、ER-α陽性（または、コントロール実験のための陰性）である他の細胞株は、それぞれのアッセイおよび方法で使用することができる。これらは、上市されている細胞株であってもよいし、又は単離されることもできるし、既存のヒト乳ガンの生検から樹立することもできる。特に限定しないが、ａ）ER-α陽性細胞株：MCF-7、T47D、BT-20など、およびb）ER-α-陰性細胞株：MDA-MB-231、SKBR-3、HS-578Tなどが挙げられる。
【０１５２】
本発明は、本明細書において同定された内因性ペプチドに対応する合成ペプチドを提供し、必要に応じて、翻訳後修飾の1以上も併せて提供する。
【０１５３】
本発明は、さらに、以下の工程を含む、ER-α受容体の阻害剤を同定するための方法を提供する：
ａ）候補阻害剤の存在下および不在下で、本発明によるペプチドと、ER-α陽性細胞を接触させる工程；及び
ｂ）候補阻害剤の存在下および不在下で、エストラジオールが存在するときの前記細胞株のエストラジオール応答性および/または増殖率を分析する工程であって、前記応答及び／又は増殖が減少していると、その候補阻害剤は、実際に阻害剤であることを示しているとする工程。
【０１５４】
本発明はまた、ER-α依存性遺伝子の内因性転写に対するER-αポリペプチドの効果の研究をも想定している。この点での典型的なアッセイは、以下の工程を含む：
a）ER-αポリペプチドを用いて、MCF-7細胞などのER-α発現細胞を処理する工程；
b）前記ER-αポリペプチドに対する応答における、E2、代表的には、プロゲステロン受容体またはTFF1によって調節されることが知られている遺伝子の発現の（ウェスタンブロット、ノーザンブロット、RT-PCR法による）分析工程。
【０１５５】
また、本発明は、レポータ遺伝子のER-α依存性転写に対するER-αポリペプチドの効果の研究を想定している。この点で典型的なアッセイは、以下の工程を含む：
ａ）ER-αを発現する（天然または異所性発現）細胞モデル（酵母または哺乳動物細胞株）でのERE作動性レポータ遺伝子の安定的または一過性のトランスフェクション；
b）ER-αポリペプチドを用いる前記モデルの処理；
c）ER-αポリペプチドの存在下でのレポータ遺伝子の発現の評価（蛍光法（luminometry）または比色法）。
【０１５６】
本発明はまた、ER-αポリペプチドに対して産生された抗体の、ER-α依存性転写についての効果の研究も想定している。この点で典型的なアッセイは、以下の工程を含む：
a）ER-αポリペプチドに対して惹起された抗体を用いて、MCF-7細胞などのER-α発現細胞を処理する工程；
b）前記抗体の存在又は不在下で、E2、典型的にはプロゲステロン受容体またはTFF1により調節されることが知られている遺伝子の発現の差異の（ウェスタンブロット、ノーザンブロットまたはRT-PCR法による）評価工程。
本発明はまた、本発明で同定されたER-αポリペプチドを発現することができるプラスミドの研究も想定している。この点で典型的なアッセイは、以下の工程を含む：
a）このポリペプチドをコードするプラスミドを設計する工程；
b）細菌細胞内で該プラスミドを形質転換し、増殖させる工程；
c）前記プラスミドを、ヒトガン細胞株にトランスフェクションし、ER-α依存性転写の減少又は細胞増殖の基底の減少および/またはE2誘導型の細胞増殖の減少により反映されることができるER-α活性の調節を評価する工程。
典型的には、用語「調節する（modulating）」には、約5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95あるいは100％の変化でさえ、含むことができる。
【０１５７】
ER-αの分解は、ホルモン刺激を増大させることができるエストロゲン様ペプチドの出現を誘発し、これにより、例えば乳ガン細胞のようなER-α関連のガン細胞の増殖を誘発することができるので、本発明は、ER-α-関連ガンまたは疾患（好ましくは乳ガン、卵巣ガン、子宮内膜ガンや子宮頸ガン）に罹患している患者の診断のための新たな手法やツールを提供する。
【０１５８】
本発明の臨床結果は、非常に重要である。なぜなら、それは、ER-α受容体の活性化経路に直接作用することができるからである。ER-α受容体および/またはそのダウンストリーム因子との相互作用から、本発明で定義されるペプチドをブロックすることにより、ホルモン応答性の腫瘍細胞の増殖につながる、ER-α活性化経路を抑制することができる。阻害剤、抗体またはワクチン接種により、前記ER-αペプチドを捕捉することは、ER-α陽性のガンなどのホルモン依存性のガンの新しい有望な治療戦略を構成する。
【０１５９】
本発明は、ER-α関連疾患、そして、いくつかの好ましい実施形態では、ER-α陽性乳ガンを対象とする方法および組成物を提供する。このようなER-α関連疾患としては、例えば、卵巣ガン、子宮内膜、子宮頸ガン、肺ガン、頭頸部ガン、黒色腫、髄膜腫、胸腺腫およびリンパ腫を含む。いくつかの特定の実施形態において、本発明は、乳ガン発症のリスクを有する個体、あるいは乳ガンの治療をすでに受けた又は受けていない個体における、ER-α陽性乳ガンの予防、治療、または予防兼治療に関する。
【０１６０】
先に述べたガン治療は、手術、化学療法、ホルモン療法、放射線、またはこれらの組み合わせを含むことができる。特定の実施形態では、ER-α陽性ガンのために既に治療を受けた個体は、寛解期のガンを持っている。当業者は、再発は、発生元で認められたものと同じタイプのガンであるとは限らないと認識している。よって、特定の実施形態では、ガンを有していたすべての個体は、元の病因にかかわらず、本明細書に記載の方法及び組成物を用いる予防及び治療の候補となる。
【０１６１】
さらに、ガン発症のリスクがある個体又は乳ガンの再発リスクを有する個体は、特に、本明細書に記載の方法および組成物を用いて治療を受けることに適している。当業者は、ライフスタイルや環境要因、遺伝的要因などのガン発症の複数の危険因子を、それぞれの個体について認識する。さらに、当業者は、ガン発症の増大したリスク、特に前ガン的疾病を伴うことを示す、病理組織学及び特定の変異を認識している。通常、ガンは、手術、放射線療法、化学療法、及びホルモン療法の様々な組み合わせによって治療される。
予後予測、さらには治療の選択は、患者の年齢、閉経状態、疾患の病期、原発腫瘍の組織学的および核グレード、エストロゲン受容体APHA（ER-α）とプロゲステロン受容体（PR）の状態、増殖能の測定、およびHER2/neu遺伝子増幅の影響を受けることがある（シンプソンら、2000年）。
【０１６２】
本発明は、配列番号２のアミノ酸配列、好ましくは配列番号２のアミノ酸配列からなるER-αペプチド、最も好ましくはK268、R269、K303のメチル化、および/またはS282のリン酸化といった翻訳後修飾の1以上を含む、単離されたER-α-p44ペプチドを含む組成物を、さらに提供する。
【０１６３】
このペプチドは、内因性タンパク質材料から単離することができ、または宿主細胞における組換え発現を経て合成または製造することができる。
【０１６４】
本発明の組成物中のポリペプチドは、BSAまたはKLHのようなキャリア分子に結合させることができ、または、脂質粒子、ナノカプセル、リポソーム、または脂質小胞などの脂質組成物内に含まれることができる。好ましくは、前記組成物は、薬学的賦形剤を含むことを特徴とする。
【０１６５】
本発明はさらに、配列番号２のアミノ酸配列によって定義されるER-α-p44ペプチドをコードする、（例えば、配列番号１によって定義された）単離された核酸分子を含む、好ましくは前記核酸分子からなる組成物を提供する。前記核酸分子またはポリヌクレオチドは、さらに、細菌、酵母、哺乳動物またはヒト細胞などの宿主細胞において、cDNA、DNA、RNA、mRNAの形態で、または組換え発現のための適当なベクター中で、存在することができる。
【０１６６】
本発明に係る組成物は、腫瘍および/またはガンに対するワクチン接種に使用することができる。従って、本発明は、ワクチンとしての使用および/またはワクチン接種での使用のための、本発明の組成物の使用を提供する。好ましい実施形態では、前記ワクチン接種は、ヒトER陽性ガン、より好ましくは乳ガン、卵巣ガン、子宮内膜ガン、または子宮頸ガンに対する。
【０１６７】
本発明による組成物は、腫瘍および/またはガンを予防または治療するためのワクチンの製造、あるいはガン阻害剤の製造のために使用することができる。
【０１６８】
本発明は、さらに、腫瘍および/またはガン、好ましくは乳ガンの治療に使用するための薬剤またはワクチンの製造における、本発明による組成物の使用を提供する。
【０１６９】
本発明はさらに、ワクチン接種で使用するための本発明に係る核酸又はペプチドの使用を提供する。
【０１７０】
ポリペプチドを用いたワクチン接種は、当技術分野でよく知られている。一般に、ペプチドは、典型的には、例えばBSAまたはKLHのようなキャリア分子に連結又は融合させて、免疫応答を誘発するために1つ以上のアジュバントと組み合わせられる。
【０１７１】
ポリヌクレオチドが用いられる場合には、前記核酸は、本発明のペプチド（例えば、配列番号２）を発現する宿主細胞の中へ、あるいは例えば、ガン増殖を減少させるために、免疫応答が誘発される宿主細胞へ、あるいは前記宿主細胞がアポトーシス作用に代えて、そのペプチドを送達するところへ、導入される。前記核酸の送達は、ＤＮＡ分子の直接投与により、あるいは遺伝子治療の技術分野で知られている細菌やウイルス発現系を介して行うことができる。ＤＮＡワクチン接種の一般的な方法論は、当技術分野でよく知られている。最近では、リンパ節又は樹状細胞への直接のRNA注入は、抗原特異的抗体産生細胞を産生することが示された。
従って、本発明は、本発明によるペプチドをコードする単離された核酸を提供する。好ましい実施形態では、前記核酸は、配列番号２で定義されるペプチドをコードし、配列番号１で同定される。
【０１７２】
したがって、本発明は、腫瘍および/またはガンを治療するための薬剤またはワクチンの製造における本発明の核酸の使用、あるいは腫瘍および/またはガンの治療に用いる医薬やワクチンの製造における前記核酸の使用を提供する。
【０１７３】
さらに、本発明は、本明細書で定義されるER-α-p44ペプチドを発現する組換えベクターを提供する。かかる組換えベクターは、遺伝子治療に使用することができ、これにより前記核酸が宿主に導入され、前記宿主中でエンコードしているペプチドを発現させるために用いられる。
【０１７４】
発現したペプチドは、その後おそらく、ER陽性腫瘍細胞を標的とされている宿主において免疫応答を誘発することができる。
【０１７５】
前記組換えベクターは、ガンを治療するための薬剤またはワクチンの製造に使用することができ、あるいはガンの治療に使用するための薬剤やワクチンの調製に使用することができる。ワクチン接種のための、本発明のポリペプチドをコードするRNAまたはDNAのウイルス送達は、既知の方法論を用いて想定されている。
【０１７６】
さらに、本明細書において定義された核酸、ポリペプチドまたは組換えベクターを発現する組換え宿主細胞は、本発明により想定されており、同様に、ガンを治療するための医薬やワクチンを製造するためのその使用も想定される。
【０１７７】
好ましくは、前記組換え宿主細胞は、ヒト細胞、ガン細胞、またはガン細胞株などの哺乳動物細胞または細胞株、あるいは、前記組換え宿主細胞は、例えば、大腸菌、サルモネラ属、又はシュードモナス細胞などの細菌細胞であってもよい。
【０１７８】
本発明は、さらに、細胞内でのエストロゲン受容体活性を低下させる方法を提供する。かかる方法は、本明細書で定義される阻害剤組成物の有効阻害量を、前記細胞に提供する方法である。
【０１７９】
好ましい実施態様では、前記細胞は、動物内に含まれ、前記組成物は前記動物に投与される。好ましくは、前記細胞は動物細胞であり、より好ましくは前記細胞は、ガン好ましくは乳ガンを有する動物内に含有される。
【０１８０】
本発明はさらに、ガン細胞の増殖を抑制する方法を提供する。かかる方法は、治療有効量の、本明細書で定義したER-α受容体の阻害剤を、前記ガン細胞に提供する工程を含む。
【０１８１】
さらに、本発明は、本明細書で定義されるポリペプチド、本明細書で定義される核酸、本明細書で定義される組換えベクター、本明細書で定義される宿主細胞を、前記被験者に提供する工程を含む方法を提供する。  
【０１８２】
さらに、本発明は、動物内のガン及び／又は腫瘍を治療する方法を提供する。かかる方法は、本発明のワクチン（すなわち、本発明の核酸又はポリペプチドを含んでいる）の治療有効量を前記動物に投与する工程を含む。
【０１８３】
好ましくは、前記組成物を、静脈内、経口、非経口、局所、又は吸入剤、エアロゾルまたはスプレーとしての投与のための薬学的賦形剤に配合される。好ましくは、前記動物はヒトである。
【０１８４】
代替的な実施形態では、動物のER-α陽性ガンを治療する方法は、さらに、少なくとも第二の抗ガン剤、例えばシクロホスファミド、メトトレキサート、フルオロウラシル、アドリアマイシン、タモキシフェン、ドキソルビシン、エトポシド、ベラパミル、ポドフィロトキシン及びこれらの類似体又は塩を、前記動物に投与する工程を含む。
【０１８５】
本発明は、さらに、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する結合分子を提供する。好ましくは、前記結合分子は、配列番号２で定義されるポリペプチド、すなわちK268、R269、K303のメチル化、および／またはS282のリン酸化といった１つ以上の翻訳後修飾を含んでいるポリペプチドに特異的に結合する。前記結合分子としては、ここでは、抗体、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、ナノボディ、アフィボディ、抗体フラグメント、アプタマー、フォトアプタマー、オリゴヌクレオチド、リポカリン、特異的に相互作用する低分子、分子インプリンティングポリマー（MIPs）、DARPins、アンキリンス、特異的に相互作用するタンパク質、ペプチドミメティックス、バイオミメティクスまたはペプチド、及び前記ペプチドに特異的に結合するその他の分子が想定される。本発明のバイオマーカーの１つと結合するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体または単鎖抗体またはそのフラグメントの双方が、本発明の方法及びキットに有用である。
【０１８６】
このような結合分子はまた、ER-α機能の阻害剤として作用することができる。
【０１８７】
従って、本発明はまた、ガンを治療するための、又はガンを治療するための医薬の製造に用いるためのER-αの阻害剤を含む医薬組成物を提供する。好ましくは、前記阻害剤は、配列番号２によって定義される本発明のポリペプチドに特異的に結合する結合分子、必要に応じて、K268、R269、K303のメチル化、および/またはS282のリン酸化の1つ以上の翻訳後修飾を含む配列番号２によって定義される本発明のポリペプチドに特異的に結合する結合分子である。好ましい実施形態では、前記結合分子は、抗体またはそのフラグメントである。
【０１８８】
あるいは、本発明の抗体に、検出可能な標識を結合してもよい。
【０１８９】
上記で示すような阻害剤は、独立的に用いることができる。すなわち、例えば、本発明の前記ポリペプチドの検出のためだけに、医薬組成物内で用いられるものではない。したがって、本発明は、本明細書で定義されるポリペプチドに特異的に結合する能力により定義されるような、ER-α受容体タンパク質の阻害剤、好ましくは配列番号２によって定義され、必要に応じてK268、R269、K303のメチル化、および/またはS282のリン酸化の1つ以上の翻訳後修飾を含む配列番号２により定義される本発明のポリペプチドに特異的に結合する能力により定義されるような、ER-α受容体タンパク質の阻害剤を提供する。好ましい実施形態では、前記結合分子は、抗体またはそのフラグメントである。
【０１９０】
さらに、乳ガンを発症するリスク、又は乳ガンの再発リスクにさらされている個体は、特に本明細書に記載の方法および組成物を用いる治療を受けるのに好適である。当業者は、ライフスタイルや環境要因、遺伝的要因などを含めて、乳ガン発症の複数のリスク要因を、それぞれの個体について認識する。さらに、当業者は、乳ガン発症、特に前ガン病変を有する増大したリスクを示す病理組織学及び特異的変異を認識する。乳ガンは、一般に、手術、放射線療法、化学療法、及びホルモン療法の様々な組み合わせによって治療される。予後予測さらには治療の選択は、患者の年齢、閉経状態、疾患の病期、原発腫瘍の組織学的および核グレード、エストロゲン受容体（ER）およびプロゲステロン受容体（PR）状態、増殖性の測定、およびHER2/neu遺伝子増幅により影響を受けることがある（シンプソンら、2000年）。
【０１９１】
従って、本発明の目的には、個体内の１つ以上のガン細胞の発症や増殖を防止する方法がある。当該方法は、本発明のER-α-44pペプチド、ER-α-44pペプチドをコードする核酸分子を含み、必要に応じて、アジュバントと組み合わせた、ワクチンまたは組成物を、個体に投与する工程を含む。
【０１９２】
本質的には、本明細書で定義した組成物またはワクチンは、ガン細胞上のER-αタンパク質またはそのフラグメントの増殖誘導活性を阻害する意図をもって、本明細書で定義されるER-αタンパク質またはそのフラグメントの分解産物/ペプチドに対する免疫応答を、治療中の個体において誘発させるように用いられる。実施例で示すように、短い合成ER-α-17pペプチド（配列番号２９）及び長い自然発生のER-α-44pポリペプチド（配列番号２）の双方が、ガン細胞の増殖を誘導することができる。したがって、本発明は、44アミノ酸ポリペプチド及び当該ポリペプチドの少なくとも17pペプチド配列を含むフラグメントのいずれも標的とすることを想定するようにみるべきである。これらのフラグメントはいずれも、少なくとも17p活性フラグメントを含むポリペプチドに対する免疫応答を生じるだろう。
【０１９３】
本発明は、エストロゲン受容体-α-関連ガンまたは疾患に罹患している患者の診断のための新規な方法及びツールを提供する。ER-αの分解は、ホルモンの刺激を増幅することができるエストロゲン様ペプチドの出現を引き起こし、これにより、例えばER陽性乳ガン、卵巣ガン、子宮内膜や子宮頸ガン細胞のようなエストロゲン受容体-α-関連ガン細胞が増殖するからである。
【０１９４】
本発明の臨床結果は、非常に重要である。それは、我々が、ER-α受容体の活性化経路に直接作用するようにできるからである。ER-α受容体及び／又はそのダウンストリーム因子群との相互作用から本発明により定義されるペプチドをブロックすることで、ホルモン応答性の腫瘍細胞の増殖につながる、ER-α活性化経路を抑制することができる。阻害剤、抗体による、又はワクチン接種による前記ER-α-ペプチドの捕捉は、ER-α陽性乳ガンなどのホルモン依存性ガンのための新しい有望な治療戦略を構成する。
【０１９５】
本発明は、エストロゲン受容体-α陽性（ER-α陽性）ガンに向けての診断方法を提供し、いくつかの好ましい実施形態では、ER-α陽性乳ガンを対象とする診断方法を提供する。このような、ER-α陽性ガンは、例えば：卵巣ガン、子宮内膜、子宮頸ガン、肺ガン、頭頸部ガン、黒色腫、髄膜腫、胸腺腫およびリンパ腫を含む。いくつかの特定の実施形態においては、本発明は、乳ガン発症のリスクを有する個体、または乳ガンの治療をすでに受けている又は受けていない個体におけるER-α陽性乳ガンの診断に関する。
【０１９６】
前述の乳ガン治療は、手術、化学療法、放射線、またはそれらの組み合わせを含むことができた。特定の実施形態では、ER-α陽性乳ガンに対する治療をすでに受けている個体は、寛解期のガンを有している。再発する乳ガンが、発生元で認められたものと同じタイプのガンであるとは限らないことを当業者は認識している。したがって、特定の実施形態では、乳ガンを有しているすべての個体が、元の病因にかかわらず、本明細書に記載の組成物及び方法を用いる予防及び治療のための候補となる。
【０１９７】
本発明のさらなる目的は、下記工程を含む、抗ガン剤または化合物をスクリーニングする方法にある：
a）ガン細胞を、本発明で同定されたER-αポリペプチドと接触させる工程；
b）前記細胞を、抗ガン剤候補の物質又は化合物と接触させ、前記候補の物質又は化合物の存在下および不在下で、前記細胞の増殖を測定する工程を含み、
前記候物質又は化合物の存在下で細胞増殖が減少していると、それが抗ガン剤であることを示し、前記ガンはER-α-依存型である。
【０１９８】
特定の実施形態では、細胞は、例えば、マウス、ラット、ウサギ等の非ヒト動物であることができる。特定の実施形態において、本方法は、薬理学的に許容される賦形剤の中に、前記化合物を含有させる工程を、さらに含んでもよい。特定の実施形態では、試験動物は、誘導又は非誘導性のエストロゲン受容体α陽性乳ガンを有することができる。
【０１９９】
ER-α受容体の分解は、ホルモン刺激を伝達することができるペプチドを生成し、これにより、ホルモン依存性のガン細胞の増殖を促進する。
【０２００】
患者の血清中でそのようなペプチドを検出することは、前記患者についてホルモン依存性ガン、例えば、乳ガン、子宮内膜、子宮頸部および卵巣ガンなどのエストロゲン依存性疾患が存在することを簡単かつ迅速に評価できるようにする。
【０２０１】
抗体のような任意の種類のターゲティング手段を用いて、又はワクチン接種を通じて、前記ペプチドの標的化、あるいは前記ペプチドの作用モードの終結化（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ）は、前記疾患の新しい治療法の開発を可能にするだろう。
【０２０２】
本発明の別の目的は、下記工程を含む抗ガン物質又は化合物をスクリーニングする方法がある：
a）エストロゲン受容体α陽性乳ガン細胞を、本発明で同定されたER-αポリペプチドと接触させる工程；
b）前記細胞を、抗ガン剤の候補物質又は化合物と接触させ、前記抗がん剤の候補物質又は化合物の存在下又は不在下で前記細胞の増殖を測定する工程を含み、
前記抗ガン剤の候補物質又は化合物の存在下で、前記細胞増殖が減少するときは、当該物質又は化合物が抗ガン剤であることを示し、前記ガンはER-α-依存型である。
【０２０３】
特定の実施形態では、前記細胞は、例えば、マウス、ラット、ウサギ等の非ヒト動物であってもよい。特定の実施形態において、本方法はさらに、薬理学的に許容される賦形剤中に、当該化合物を含有させる工程をさらに含む。特定の実施形態では、試験動物は、誘導され又は誘導されないエストロゲン受容体α陽性乳ガンを有することができる。
【０２０４】
本明細書で定義した組成物の使用は、他の既知の（化学療法）治療、抗ガン治療と組み合わせることができる。
【０２０５】
併用化学療法としては、例えば、シスプラチン（CDDP）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロエタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、エトポシド（VP16）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合分子、タキソール、ゲムシタビン、ナベルビン、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチナ、5 - フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキサート、またはこれらの任意のアナログまたは誘導体、上記のバリアントが挙げられる。化学療法としては、直接ＤＮＡを架橋連結する薬剤、ＤＮＡへのインターカレート剤、及び核酸合成に影響を与えることによって染色体異常や細胞分裂異常を引き起こす薬剤が挙げられる。核酸、特にＤＮＡを直接架橋連結する薬剤は、相乗的な抗腫瘍の組み合わせをもたらすＤＮＡ損傷に帰着することが想定され、本明細書に示される。シスプラチン、および他のＤＮＡアルキル化剤などの薬剤が用いられることができる。ＤＮＡを損傷する薬剤には、また、ＤＮＡ複製、細胞分裂、染色体分離に干渉する化合物も含まれる。これらの化合物としては、例えば、アドリアマイシン（ドキソルビシンとしても知られている）、VP-16（エトポシドとしても知られている）、ベラパミル、ポドフィロトキシンなどが挙げられる。
腫瘍の治療のために臨床の現場で広く使用され、これらの化合物は、静脈内ボーラス注射を介して投与され、投与量の範囲は、アドリアマイシンの場合、２１日間隔で25〜75mg/m2、エトポシドの場合、35〜100mg/m2の静脈内又は経口投与である。
【０２０６】
ER-α受容体の分解は、ホルモン刺激を伝達することができるペプチドを生成し、それによって、ホルモン依存性のガン細胞の増殖を促進する。
【０２０７】
患者の血清中において、このようなペプチドを検出することは、前記患者についてホルモン依存性ガン、例えば乳ガンなどのエストロゲン依存性疾患が存在することを簡単かつ迅速に評価できるようにする。
【０２０８】
抗体などの任意の種類のターゲティング手段を用いて、またはワクチン接種を通じての前記ペプチドの標的化、あるいは前記ペプチドの作用モードの終結化（determining）は、前記疾患の新しい治療法の開発を可能にするであろう。
【０２０９】
二つの核酸またはアミノ酸配列のコンテクストにおいて、本明細書で用いられる用語「配列の一致性（sequence  identity）」又は「一致性」は、特定領域にわたって最大に一致するように並べたときに、２つの配列の残基が同一であることをいう。同類置換（conservative  substitution）において配列が異なるところでは、配列一致性パーセントは、置換の同類特性（conservative  nature）のために、上方調整して修正することができる。このような同類置換によって異なる配列は 、「配列類似性（sequence  similarity）」または「類似性」を有していると言われる。この調整手段は、当業者によく知られている。
【０２１０】
本明細書で用いられる場合、配列一致性の割合は、比較ウィンドウを介して2つの最適に整列された配列を比較することによって決定される値を意味し、ここで比較ウィンドウにおける配列の一部は２つの最適に整列された配列について参照配列（付加又は欠失は含まない）と比較して付加または欠失（すなわちギャップ）を含んでいてもよい。この割合は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中で現れて一致した位置の数となるように、一致した位置の数を決め、比較ウィンドウの位置の総数で一致した数を割り算し、その結果に１００を乗じて配列一致性の割合を得ることにより計算される。
【０２１１】
「配列一致性」は、当該分野で認識されている意味を有し、公開された技術を用いて計算することができる。Computational  Molecular  Biology、Lesk編（オックスフォード大学出版、1988年）；Biocomputing：インフォマティクスとゲノムプロジェクト、スミス編（アカデミックプレス、1993年）、シーケンスデータのコンピュータ解析、パートI、グリフィン＆グリフィン編、（ヒューマナ・プレス、1994年）；分子生物学における配列解析、Von  Heinje編（アカデミックプレス社（1987）年）、配列解析入門、Gribskov＆Devereux編（マクミランストックトンプレス、1991年）；及びCarillo＆Lipton、SIAM J.  Applied  Math.48：1073（1988）参照。一般的に2つの配列間の一致性または類似性を決定するために用いられる方法としては、限定しないが、Guide  To  Huge  Computers、Bishop編（アカデミック・プレス、1994年）及びCarillo＆Lipton（前掲）に開示されている。一致性および類似性を決定する方法は、コンピュータープログラムに集成されている。2つの配列間の一致性と類似性を決定するための好ましいコンピュータープログラム法としては、限定しないが、GCGプログラムパッケージ（Devereuxら、Nucleic  Acids  Research  12：387（1984））；BLASTN、FASTA（Atschulら、J．Mol．Biol  215：403（1990））；及びFASTDB（Brutlagら、Comp．App．Biosci  6：237（1990））が挙げられる。
【０２１２】
本発明の製品、キット又は方法のいずれにより提供され、用いられるヌクレオチドは、好ましくは、少なくとも約80％の配列一致性、又は約85％の配列一致性、または約90％の配列一致性、または約95％の配列一致性、または約96％の配列一致性、または約97％の配列一致性、または約98％の配列一致性、または約99％の配列一致性、あるいは配列番号１で定義されたヌクレオチドと約100％の配列一致性を有する。
【０２１３】
本発明の製品、キット又は方法のいずれかにより提供され、用いられるポリペプチドは、好ましくは、少なくとも約80％の配列一致性、又は約85％の配列一致性、または約90％の配列一致性、または約95％の配列一致性、または約96％の配列一致性、または約97％の配列一致性、または約98％の配列一致性、または約99％の配列一致性、あるいは配列番号２で定義されたアミノ酸配列と約100％の配列一致性でさえも有する。
【実施例】
【０２１４】
本発明の実施形態は、さらに以下の非限定的な実施例によって説明される。
【０２１５】
実施例1：分泌されたER-αタンパク質の内因性の分解産物/ペプチドのin vitroでの検出
本例では、本発明者らは、E2で処理された乳ガン細胞株MCF-7の培地で、ER-α受容体の内因性分解フラグメントを検出し、特徴づけることができた。いずれも質量分析（図１及び図２、表１及び表２）とウェスタンブロッティング（図３）による。
【０２１６】
配列番号３０及び配列番号３１で定義されている全長（アイソフォーム1）ヌクレオチド及びタンパク質配列（図７及び図８参照）に基づくと、検出されるペプチドは、ER-αタンパク質配列のK268-T311部に対応している。分解産物／ペプチドは、図２及び図８（太字下線部分のペプチド）で表されるように、配列番号２（K268RQRDDGEGRGEVGSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLT311）で定義されている。
【０２１７】
これは、プロテアソーム分解産物/ペプチドとしては比較的長い（44残基）タンパク質であり、予期されないことである。
【０２１８】
活性ER-α受容体（すなわち、その標的遺伝子の転写を誘導する受容体）は、主に細胞核に存在するので、本明細書において定義されるポリペプチドが、MCF-7細胞の培地中に分泌されているという事実は意外であった。したがって、核内受容体の分解産物/ペプチドが実際に培地中で検出できることは、興味深い発見である。この発見は、もちろん、分析される被験者の特定のサンプル、すなわち腫瘍またはガン組織に近接または直接接触しているそれらのサンプルについての診断テストへの道を開く。
【０２１９】
この時点で、E2で処理又は処理しなかったコントロール細胞の馴化培地中に、前記ペプチドは存在し得るけれども、我々は当該ペプチドを質量分析によって検出しなかった。いずれの場合においても、本発明のポリペプチドは、正常（すなわち腫瘍でない）細胞において検出されない乃至は大変少ないという事実が、乳ガンのようなガン診断における本発明のER-αポリペプチドの有用性を示している。
【０２２０】
本明細書で定義される、ER-αポリペプチドで発見された特定の翻訳後修飾も予期しなかったことであり、ER-αの活性化及び分解のためのユビキチン化をトリガーするシグナル伝達カスケードの一部であるかもしれない。
【０２２１】
検出されたペプチドは、天然受容体（図2）として、以前に報告されていなかった翻訳後修飾を有している。268番目および303番目のリジンは、アセチル化されると以前に説明され（ポポフら、2007、ステロイド72:221-230）、内因性ペプチド内でのメチル化は、269番目のアルギニンでも同様に見られる。他方、282番目のセリンはリン酸化される。
【０２２２】
材料および方法
馴化培地の調製：
2mMグルタミン、100U/mlのペニシリン、及び100μg/mlのストレプトマイシンを含み、10％ステロイドフリーのウシ胎児血清が添加され、フェノールレッドを含まないEMEM中で、48時間、MCF-7乳ガン細胞株を培養した。フェノールレッド不含血清/抗生物質不含のEMEMで3回洗浄した後、フェノールレッド不含血清/抗生物質不含で、2mMのグルタミンだけを含有するEMEM中に溶解したE2リガンドの存在下または不在で、4時間培養した。
【０２２３】
ペプチドの抽出：
遠心分離後、馴化培地に、アセトニトリル（ACN）及びトリフルオロ酢酸-酢酸（TFA）を添加した（最終濃度はそれぞれ5％及び0.5％）。続いて、試料は、その後C18マイクロカラム（Pierce）及びペプチドを通過しており、ペプチドは、H2O/ACN/TFA：30/70/0.1V/V/Vの溶液を用いて溶出される。このようにして得られたペプチドは、凍結乾燥後、-20℃で保存された。
【０２２４】
LC-MS/MS分析：
凍結乾燥されたサンプルは、1％ギ酸（FA）容量中に再溶解され、前記ペプチドは、質量分析法によって分析される前に、ジップ先端C18マイクロカラム（ミリポア社製）クロマトグラフィーで再精製される。Ultimate3000デュアルクロマトグラフシステム（ダイオネクス社）を用いて分離された。ペプチドを、プレカラム（C18 PepMap  100、5μｍ、100Å、300μm  d.i.、長さ5mm、（ダイオネクス社））にロードし、１５分間、１５μｌ/ｍｉｎの流量で溶剤Ａを用いて脱塩、濃縮した。その後、逆相の極性を備えた分析用カラム（C18 PepMap 100、3μm、100Å、75μm  d.i.、15cm、ダイオネクス社）に、220nL/minの流量で溶出した。用いたグラデーションは、溶媒B（ACN/H2O/AF90/10/0.1、ｖ/ｖ/ｖ）の0〜50％の直線濃度勾配であり、続いて、100％の溶媒Ｂで15分間のアイソクラティック勾配とし、最終的に溶媒A中で、15分でカラムが再平衡化するようにした。負荷回路（loading  circuit）によって生成することができたポリマーは精製カートリッジ（C18 PepMap100、5μm、100Å、1mm  d.i.、長さ15mm、ダイオネクス）により取り除かれる。溶出されたペプチドは、ガラスイオン化キャピラリー（New  Objective社）を備えたナノスプレー源装備タイプのハイブリッド質量分析計LTQ-FTMS（LTQ-FT-ICR質量分析、Thermo  Fischer）で、その場で検出される。その器具は、モードMSで400〜2000Thの質量ガンマ上での、陽性モードにおいて用いられる。結果として得られるデータは、LTQにおける3回のMS/MSと並列に、ICRモジュールのMSモードにおけるフルスキャンとモジュールICRにおける3回のSIMスキャン（前駆体の±5番目）とが交互であるモード「高ダイナミック」で自動的に取得された。すべてのサイクルが完了した後、最も強い３つのペプチドが、35％のエネルギーで、トラップ内にフラグメント化しているために選択される（第4の選択ウィンドウ）。
【０２２５】
結果
同定されたペプチドの結果を図１に示す。本発明によって同定されたER-α分解産物/ペプチドの内因性ペプチド配列を、図２に示す。
【０２２６】
例2：免疫沈降とウェスタンブロット
本発明の内因性のER-α分解産物/ペプチドの高速かつ信頼性の高い検出方法を確立するための原理を証明するために、エストラジオール又は他の関連薬剤で処理した、又は処理していない、MCF-7乳ガン細胞株の馴化培地のウェスタンブロット分析で、我々は、本明細書に開示される内因性ペプチドと重なる部分において、ER-α受容体の一部を認識することが知られているG20の抗体をテストした（図3）。
【０２２７】
アガロースビーズ上に固定化したプロテインG（UltraLink（登録商標）、Pierce）100μｌ(50％)で、前洗浄（4℃で2時間）した後、馴化培地（又はネガティブコントロール用のEMEM）は、抗体G20（サンタクルス）と共に（ネガティブコントロールを除く）、４℃で一晩、培養された。100μl(50％)で固定化タンパクＧ内で抗体を捕捉した後、樹脂を、着色剤なしで、レムリ（Laemmli）バッファ内で5分間85℃に加熱する。タンパク質サンプルは、続いて、トリス−トリジン10％（Invitrogen社製）ゲル上で分離され、そのペプチドは、ニトロセルロース膜（15％メタノール；半乾燥トランスファー（BioRad社製装置；24 V；0.15 mAで15分）に移された。5％ミルクで30分間ブロッキングした後、タンパク質は化学発光（一次抗体：G20（1/500、2時間）、二次抗体：抗ウサギ抗体（ピアース、1/6000；1時間））を用いて検出された。
【０２２８】
実際、これらの予備的な結果は、抗ER-αG20抗体（サンタクルス社）のような抗体は、本明細書に開示されるようなER-α受容体の分解生成物/ペプチドのウェスタンブロット検出に使用可能であることを示している。捕捉用と検出用の双方について、同じG20の抗体を使用することは、実験において、あるバイアスとなったけれども、我々の予備的な結果は、E2を添加することで、分解産物/ペプチドの産生が増加する一方で、4-OHタモキシフェンまたはフルベストラントのいずれか一方を添加することにより、分解産物/ペプチドの産生が減少することを示している（図3）。興味深いことに、ジエチルスチルベストロールを添加すると、同様に本発明のペプチドの産生を減少させるように思われる。これらの結果は図3に示されている。当該ペプチドは、エストラジオール（10-8Ｍ）、ジエチルスチルベストロール（10-8Ｍ）、4-OHタモキシフェン（10-7Ｍ）又はフルベストラント（10-7Ｍ）で、MCF-7細胞を処理又は処理しない（コントロール）馴化培地から抽出された。
【０２２９】
例3：MCF-7乳ガン細胞株における本発明のペプチド（例えば、配列番号２）のin vitroでの増殖効果
本明細書に説明するER-αの分解産物/ペプチドの分泌が、ER-α陽性細胞の増殖に対するエストラジオールの効果をリレー又は増幅できたという原理を証明するために、我々は、この配列（配列番号２）に対応し、且つ翻訳後修飾を含んでいる合成ペプチドを用いて、MCF-7細胞を処理した（図4）。
【０２３０】
ER-α陽性MCF-7乳ガン細胞株を96ウェルプレートに播種した（3000細胞/ウェル）。次いで、10-5MのER-α-17pまたは10-5Mの配列番号２のペプチドで、72時間、細胞を処理又は処理しなかった（コントロール）。細胞増殖は、クリスタルバイオレット染色によって測定した。簡潔に言えば、細胞培養物をPBSで、穏やかに一回洗浄し、 PBS中1％グルタルアルデヒドで固定し（15分、室温）、0.1％クリスタルバイオレットで染色した（ddH2Oでw/ｖ、30分、室温）。余分な染料を、流水（水道水）でそっとすすぎながら除去した後、細胞に結合したクリスタルバイオレットを1％トリトンX-100（ddH2O中のv/v、室温、撹拌下）で抽出し、550nmで分光分析により測定した。
【０２３１】
木炭ストリッピング血清10％を含むEMEM中で、10-5Mの配列番号２のペプチドで、MCF-7細胞を72時間処理すると、コントロール及びＥR-α-17pペプチドよりも高く、顕著に増殖増大を誘導することを示している（図４）。この結果は、配列番号２のペプチドのエストロゲン活性を証明している。
【０２３２】
例4：MCF-7乳ガン細胞株についての本発明のペプチドに対する抗体のin vitroでの抗増殖効果
ここでは、ER-αポリペプチドの産生が、ER-α陽性の乳ガン細胞に関与していることを証明するために、我々はE2及び／又はこのペプチド（ペプチドのER-α-17p）のC末端部に対して形成された抗体の存在下または不在下でのMCF-7細胞の増殖を評価している（図５）。
【０２３３】
ER-α陽性MCF-7乳ガン細胞株を96ウェルプレートに播種した（3000細胞/ウェル）。次いで、10-11Ｍまたは10-12ＭのＥ2を含み、ウサギポリクローナル抗ER-α-17p抗体（Gentaurから）を含んで又は含まずに、1/100に希釈した培地で、72時間、細胞を培養した。細胞増殖は、クリスタルバイオレット染色によって測定した。簡単に言えば、細胞培養物は、PBSで１回、そっと洗浄し、ＰＢＳ中の1％グルタルアルデヒド（15分、室温）で固定し、0.1％クリスタルバイオレット（ddH2Oでw/v、３０分、室温）により染色した。流水（水道水）でそっとすすぐことにより余分な染料を除去した後、細胞に結合したクリスタルバイオレットを、1％トリトンX-100（ddH2Oでv/v；室温、撹拌下）で抽出し、550nmで分光法により測定した。
【０２３４】
これらの予備的な結果は、本明細書で説明されているER-αポリペプチドに対して形成された抗体は、E2が誘導したMCF-7細胞の増殖を低下させ得ることを示している（図５）。
【０２３５】
例5：ER-αの転写活性に対する本発明のペプチド（例えば、配列番号２）のin vitro効果
本明細書で示されているER-αの分解産物/ペプチドの分泌は、ER-αの転写活性に向けて、エストラジオールの効果を伝える又は増強できたという原理を証明するために、我々はMVLN細胞（ERE作動型ルシフェラーゼレポーター遺伝子で安定的にトランスフェクトされているMCF-7；Ponsら、バイオ技術1990; 9:450-459）を、この配列（配列番号２）に対応し且つその翻訳後修飾を含んでいる合成ペプチドを用いて、無血清条件で処理した（図6） 。
【０２３６】
MVLN細胞は、10-10MのE2又は10-5MのER-α-17p又は10-5Mの配列番号２のペプチドとともに、10％木炭ストリッピング血清処理前を含むEMEMで48時間培養した。無血清条件で6時間処理した後、細胞をPBSで2回洗浄した。ルシフェラーゼ活性は、製造元の指示に従ってルシフェラーゼアッセイシステム（Promega）を用いて蛍光法（luminometry）により、細胞ライセート中で測定した。
【０２３７】
予備的な結果は、10-5Mのペプチド（配列番号２）でMVLN細胞を6時間処理すると、ER-αの転写活性の有意な増加を誘導し、当該ER-α転写活性は、コントロール及びER-α-17pペプチドよりも高い（図６）。
【０２３８】
例6：同定された内因性のER-α分解ペプチドのフラグメントの免疫原性の解析。
具体的には、本発明に従って同定された内因性ペプチドまたはそのフラグメントを特定的に検出できる抗体を開発するために、ペプチドの前記親水性、アクセシビリティ、及び抗原性を評価した。いくつかの興味深い可能なエピトープは、以下の表にリストされ、同定されている。したがって、immuneepitope.orgウェブサイトで利用可能抗体エピトープ予測ツールを用いて行われたコンピュータによる解析によるKRQRDDGEGRGEVGSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTペプチドの免疫原性フラグメントのいくつかの例を、以下に示す。
親水性（Parker  親水性アルゴリズム）による：
７アミノ酸ペプチド：
【表２】
2013545969.tif 000003
８アミノ酸ペプチド：
【表３】
2013545969.tif 000004
９アミノ酸ペプチド：
【表４】
2013545969.tif 000005
１０アミノ酸ペプチド：
【表５】
2013545969.tif 000006
アクセシビリティ（Emini表面アクセシビリティ予測）による：
【表６】
2013545969.tif 000007
抗原性（Kolaskar＆Tongaonkar抗原アルゴリズム）による
【表７】
2013545969.tif 000008
これらのペプチドに対する抗体は、標準的な技術によって開発される。
【図１】
2013545969.tif 000009
【図２】
2013545969.tif 000010
【図４】
2013545969.tif 000011
【図５】
2013545969.tif 000012
【図６】
2013545969.tif 000013
【図７】
2013545969.tif 000014
【図８】
2013545969.tif 000015
【図３】
2013545969.tif 000016
【配列表】
2013545969000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年8月16日(2013.8.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
本発明は、本明細書に定義されているER-αの分解産物/ペプチド、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドに、特異的に結合する結合分子を、さらに提供する。好ましくは、前記結合分子は、配列番号２において定義されているアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する。配列番号２において定義されているアミノ酸配列は、K268、R269、K303のメチル化、および/またはM286の酸化、および/またはS282のリン酸化といった翻訳後修飾の1つ以上を含む。さらなる態様において、前記結合分子は、本明細書で定義した内因性のER-α分解産物/ペプチドのフラグメント、すなわち配列番号2-29、又は32-225によって定義されている配列からなる（ポリ）ペプチドのいずれかに、結合する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
従って、本発明はまた、ガンを治療するためのER-αの阻害剤を含む医薬組成物、またはガンを治療するための医薬の製造におけるER-αの阻害剤の使用も提供する。好ましくは、前記阻害剤は、本明細書で定義される結合分子、例えば、配列番号２によって定義される本発明の内因性のER-α分解産物/ペプチドに特異的に結合する分子、配列番号２によって定義される本発明のポリペプチドに随意に特異的に結合する分子である。配列番号２は、K268、R269、K303のメチル化、および/またはM286の酸化、および/またはS282のリン酸化といった翻訳後修飾の１つ以上含んでいる。  
好ましい実施形態では、前記結合分子は、抗体またはそのフラグメントである。
好ましい実施形態では、前記結合分子は、本明細書で定義される内因性のER-α分解産物/ペプチドのフラグメント、すなわち、配列番号2−29、又は32-225で定義される配列からなる（ポリ）ペプチドのいずれか１つと、特異的に結合する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
好ましい実施形態では、前記結合分子は、本明細書で定義される内因性のER-αの分解産物/ペプチドのフラグメント、すなわち、配列番号２〜２９又は３２〜２２５で定義された配列からなる（ポリ）ペプチドのいずれか１つに特異的に結合する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
【図１】E2刺激したMCF-7細胞の馴化培地から抽出した内因性ペプチドのMS/MSスペクトル。この内因性ペプチドは、アミノ酸配列K268-T311であり、ER-α-17pの配列（６ｘでチャージされた前駆体：m/z= 823,26）を包含する。
【図２】検出されたペプチド（配列番号２）の配列および翻訳後修飾、並びに前記ペプチドをコードする対応の核酸配列（配列番号１）。
【図３】内因性ペプチドの免疫沈降。この内因性ペプチドは、エストラジオール（10-8Ｍ）、ジエチルスチベストール（10-8Ｍ）、4-OHタモキシフェン（10-7Ｍ）又はフルベストラント（10-7Ｍ）で処理したMCF-7細胞、あるいは処理していないMCF-7細胞（コントロール）の馴化培地から抽出された。
【図４】ER-αの分解産物/ペプチド（配列番号２）に対応する合成ペプチドの存在下または不在下での細胞増殖。ＭＣＦ−７細胞は、ER-α-17p（10-5M）または配列番号２ペプチド（10-5M）とともに、又は伴わずに（コントロール）、培養された。細胞増殖はクリスタルバイオレット染色によって評価された。
【図５】10-11M及び10-12MのE2存在下または不在下で、ER-αの分解産物/ペプチド（配列番号２）のC末端部分に対する抗体（希釈1/100）とともに又は伴わずに、７２時間培養した細胞増殖。細胞増殖は、クリスタルバイオレット染色によって評価された。
【図６】ER-αの転写活性。MVLN細胞（ERE作動型ルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定的にトランスフェクトしたMCF-7；ポンスら、Biotechniques  1990； 9：450-459）を、E2（10-10Ｍ）含有無血清培地、ER-α-17p（10-5Ｍ）含有無血清培地、又は配列番号２のペプチド（10-5Ｍ）含有無血清培地、又はこれらの不含無血清培地（コントロール）で、６時間培養。
【図７】ER-αアイソフォーム１のcDNAコード配列（Genbank  Acc.No.NM_000125（配列番号３０））。太字の配列は配列番号１に対応し、配列番号２のペプチドをコードしている。
【図８】ER-αアイソフォーム1のアミノ酸配列（Genbank  Acc.No.  NP_0001 16（配列番号３１））は、本発明で同定された配列を示す（配列番号２）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４４】
エストラジオールで処理したMCF-7ヒト乳ガン細胞株の馴化培地から、ER-αの分解産物ポリペプチド（配列番号２：K268RQRDDGEGRGEVGSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLT311）を本発明において同定した。全長のER-αタンパク質（配列番号３０によりコードされ、配列番号３１であらわされる）の分解産物である。
【国際調査報告】
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2013545969.tif 000018
2013545969.tif 000019
2013545969.tif 000020
2013545969.tif 000021
2013545969.tif 000022