(57)【要約】  本発明は、新規クラスの４Ｓ−イオタ−カラギーナンスルファターゼを用いたイオタ−カラギーナンのアルファ−カラギーナン変換方法に関する。本発明は更に、前記変換方法によって得られたカラギーナンに関する。本発明は特に農産食品、医薬、及び美容産業に応用される。
2013542726.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のペプチド配列：
ＮＧＱＦＤＮＴＶＩＶＦＴＳＤＮＧＧＫ（配列番号１）、
ＦＤＱＴＦＱＶＧＤＮＴＲ（配列番号２）、及び
ＥＴＥＹＩＴＤＧＬＳＲ（配列番号３）
を有するペプチドを含む酵素により、イオタ−カラビオースモチーフをアルファ−カラビオースモチーフに変換する酵素触媒作用を含む、イオタ−カラギーナンのアルファ−カラギーナン変換方法。
【請求項２】
前記酵素のペプチド配列が、
ＭＴＦＮＫＫＶＳＴＬＬＷＧＴＬＩＡＩＳＶＧＮＡＳＡＡＤＡＧＱＳＫＡＤＥＳＮＥＫＰＮＩＬＦＶＬＡＤＤＬＧＹＮＤＶＧＦＮＧＳＴＤＩＫＴＰＮＬＤＧＬＡＫＮＧＭＴＦＤＡＡＹＶＡＨＰＦＣＧＰＳＲＡＡＩＭＴＧＲＹＰＨＫＩＧＡＱＦＮＬＰＥＤＮＳＮＶＧＶＳＡＤＥＬＦＩＡＱＴＭＫＳＡＧＹＦＴＧＡＭＧＫＷＨＬＧＥＡＳＥＹＨＰＮＫＨＧＦＤＥＦＹＧＦＬＧＧＧＨＮＹＦＰＥＱＦＥＡＡＹＮＫＲＶＡＱＧＭＴＮＩＮＭＹＬＴＰＬＥＨＮＧＫＥＶＲＥＴＥＹＩＴＤＧＬＳＲＥＡＶＮＦＶＤＫＡＡＡＫＫＫＰＦＦＬＹＬＡＹＮＡＰＨＶＰＬＱＡＫＥＥＤＭＡＭＦＳＱＩＫＤＫＫＲＲＴＹＡＧＭＶＹＡＶＤＲＧＶＧＲＩＶＥＱＬＫＫＮＧＱＦＤＮＴＶＩＶＦＴＳＤＮＧＧＫＬＧＱＧＡＮＮＹＰＬＫＥＧＫＧＳＶＱＥＧＧＦＲＴＰＭＬＶＨＷＰＫＨＭＫＡＧＳＲＦＳＨＰＶＬＡＬＤＬＹＰＴＦＡＧＬＧＧＡＶＬＰＥＤＫＫＬＤＧＫＤＩＷＡＤＩＱＡＮＴＡＰＨＫＤＥＦＩＹＶＬＲＨＲＮＧＹＳＤＡＡＡＲＲＮＱＦＫＡＶＫＮＨＮＤＤＷＫＬＹＮＩＡＱＤＩＳＥＤＮＤＩＳＡＱＨＰＤＩＬＲＤＭＶＳＳＭＥＳＷＳＷＮＮＱＱＰＫＷＦＨＱＳＡＥＧＡＱＷＲＬＫＡMＰＲＦＤＱＴＦＱＶＧＤＮＴＲＳＮＳＫＫＧＨ（配列番号４）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素が４Ｓ−イオタ−カラギーナンスルファターゼである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素が、前記酵素をコードする核酸及び／又は前記酵素をコードする核酸配列を含むベクターを含む宿主細胞により産生される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規クラスの４Ｓ−イオタ−カラギーナンスルファターゼを用いたイオタ−カラギーナンのアルファ−カラギーナン変換方法に関する。本発明は更に、前記変換方法によって得られたカラギーナンに関する。
【０００２】
本発明は特に農産食品、医薬、及び美容産業に応用される。
【０００３】
以下の説明中、角括弧（［］）中の参照は本文の最後に提示した参考文献一覧への参照である。
【背景技術】
【０００４】
カラギーナンは、海洋紅藻類の細胞壁から抽出される硫酸化ガラクタンである。カラギーナンは、アルファ（１−３）結合及びベータ（１−４）結合で交互に連結されたひと続きのＤ−ガラクトシドで構成される。これらのアニオン性多糖は主に、アルファ（１−３）位で連結されたガラクトース残基上の３，６アンヒドロ架橋の有無によって及びそれらの硫酸化の程度によって識別される。例えば、産業的に最も利用されているカラギーナンに見られる３種類の二糖繰り返し単位（カラビオースモチーフと呼ばれる）は、１個（カッパ−カラビオース）、２個（イオタ−カラビオース）、又は３個の硫酸基（ラムダ−カラビオース）が存在することによって特徴付けられる（図１）。カラギーナンは主にカラビオースモチーフで構成され得、例えば、藻類のカッパフィカス・アルベレッチー（Kappaphycus alvarezzi）から得られるカッパ−カラギーナンは約９０％のカッパ−カラビオースモチーフ及び１０％のイオタ−カラビオースで構成される。ユーシューマ・デンチキュラタム（Eucheuma denticulatum）から抽出されるイオタ−カラギーナンは、８５％のイオタ−カラビオース単位及び１５％のカッパ−カラビオース単位で構成される。
【０００５】
カラビオース単位に関する組成は、非常に変化に富み得、藻類の植物学的起源に主に依存し得る。カッパ−カラギーナンという用語は、多糖にカッパ−カラビオースモチーフが豊富である場合及び基準としてしばしば用いられるＫ．アルベレッチー（K.alvarezzi）のカッパ−カラギーナン（非特許文献１）［１］にその物理化学的特性が類似している場合に用いられる。
【０００６】
カッパ／イオタ−ハイブリッドカラギーナンの中間構造の全範囲が、多糖の植物学的起源に従って記載されている（図２；前述の非特許文献１）［１］。また、藻類の細胞壁に存在するカラギーナンの種類は藻類の成長段階にも関連し得る。実際、コンドラス・クリスプス（Chondrus crispus）の場合、配偶体にはカッパ／イオタ−カラギーナンが豊富だが、胞子体は主にラムダ−カラギーナンを含む。時期及び藻類の生長に影響を与え得る全ての環境的要因（照明、温度、塩等）もカラギーナンの構造及び組成に影響する。したがって、起源及び／又は抽出手順に応じて、カッパ−、イオタ−、及びラムダ−カラギーナンタイプの幅広い構造が観察され得る。
【０００７】
これらの多糖は固有の流体力学的特性を有し、農産食品、医薬、及び美容産業において、テクスチャリング剤（ｔｅｘｔｕｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）として用いられている。これらの多糖は、その高い構造多様性によって説明することができる幅広い機能的特性を有する。カッパ−及びイオタ−カラギーナンはイオン依存性及び熱依存性ゲルを形成する特性を有する。カッパ−カラギーナンはカリウムの存在下で強固なゲルを形成し、イオタ−カラギーナンはカルシウムの存在下で、柔軟で弾力のあるゲルを形成する。カラギーナンの
化学構造の高い多様性及びそれらの天然のハイブリッド性が、各藻類抽出物に特徴的な機能的特性を付与している。
【０００８】
年間に約５００００トンのカラギーナンが販売されている（非特許文献２）［２］。しかし、利用されるカラギーナンのトン数は、利用可能な紅藻類の量に制限されている。現在、２種の紅藻類、すなわちカッパフィカス・アルベレッチー（Kappaphycus alvarezzi）及びユーシューマ・デンチキュラタム（Eucheuma denticulatum）が広く培養されており、これらから、それぞれカッパ−及びイオタ−カラギーナンが抽出される。多数の野生の藻類（培養されたものではない）も、それらのカッパ／イオタ−ハイブリッド性カラギーナンが非常に有利な機能的特性を示すため、大量に収集されている。しかし、これらの藻類１トンは、１トンの培養藻類の２倍又は１０倍も高価である。
【０００９】
更に、各産業的応用は、１種又は複数種の紅藻類から得られるカラギーナンの抽出物に対応している。あらゆる分野の産業上のニーズを満足する解決策は主にカラギーナンの調合（混合）にある（前述の非特許文献２）［２］。
【００１０】
したがって、培養藻類からハイブリッドカラギーナンを得ることを可能にする生物工学的プロセスは経済的収益性が高い。藻類供給源への依存がより少ないという利点があり、紅藻類のバイオマスの利用及び品質向上の新たな展望を開くものである。
【００１１】
そこで、カラギーナンの化学構造、ひいては物理化学的特性を制御するために、本発明者らは、カラギーナンの構造を修飾及び修正できる酵素の精製及び生産に着手した。所望の修飾は、イオタ−カラギーナンを、カッパ−若しくはアルファ−カラギーナン又はカッパ／イオタ型若しくはイオタ／アルファ型カラギーナンのハイブリッド構造に変換するスルファターゼと呼ばれる酵素による、カラギーナンの脱硫酸化からなる（図３）。そこで、彼らは、カラギナーゼを先に作用させることなくポリマーに直接作用できるカラギーナンスルファターゼの存在を実証した。彼らは、アミドヒドラーゼのファミリーに属し、イオタ−カラギーナンの４位での特異的脱硫酸化（ＳＯ３−基の除去）によりイオタ−カラギーナンをアルファ−カラギーナンに変換する、最初の４Ｓ−イオタ−カラギーナンスルファターゼをシュードアルテロモナス・カラゲーノボラ（Pseudoalteromonas carrageenovora）の細菌集団から精製することに成功した（特許文献１）［３］。最初の４Ｓ−イオタ−カラギーナンスルファターゼに対する戦略と同じ戦略を用いて、本発明者らは、シュードアルテロモナス・アトランティカ（Pseudoalteromonas atlantica）から、ホルミルグリシン依存性スルファターゼのファミリーに属する第２の４Ｓ−イオタ−カラギーナンスルファターゼを精製することに成功した。彼らはまず、前記タンパク質の３つのペプチド、ＮＧＱＦＤＮＴＶＩＶＦＴＳＤＮＧＧＫ（配列番号１）、ＦＤＱＴＦＱＶＧＤＮＴＲ（配列番号２）、及びＥＴＥＹＩＴＤＧＬＳＲ（配列番号３）を決定することに成功した。これらは、ＴｒＥＭＢＬライブラリーとの比較により、その遺伝子（Ｐａｔｌ＿０８８９）がスルファターゼに分類されるＰ．アトランティカ（P. atlantica）T6cのＱ１５ＸＨ３タンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＪＤ  ＡＢＧ３９４１５．１；非特許文献３）［４］との対応を示した。
【００１２】
したがって、４Ｓ−イオタ−カラギーナンスルファターゼは、カラギーナンの「ハイブリッド性」を調整することを可能にし得る。したがって、イオタ−カラギーナンに作用するスルファターゼはいずれも、ペプチド配列の点だけでなく生化学的特性の点でも異なる天然には非常に少ないアルファ−及びイオタ／アルファ−カラギーナンの製造を可能にするため、重要な技術革新となり得る。しかし、最も広く研究されているスルファターゼは動物起源の多糖であるヘパリンに作用する酵素であるため、カラギーナンに作用するスルファターゼは公知のその他のスルファターゼに対して相同性を示さない可能性があると考えられていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】仏国特許出願第０９／５２６４２号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Bixler et al., Food Hydocolloids, 15: 619-630, 2001
【非特許文献２】Bixler and Porse, J. Appl. Phycol., 2010, online
【非特許文献３】Copeland et al., Protein JD ABG 39415. 1，2006
【発明の概要】
【００１５】
したがって、先行技術の欠陥、欠点、及び障害を克服するためにカラギーナンの硫酸化のモチーフを修飾する酵素を精製すること、特に、前記酵素を用いてカラギーナンの「ハイブリッド性」を制御することにより、コストを下げ、そのようにして得られるカラギーナンの供給及び機能的特性を制御できるようにする方法に対する現実のニーズが存在する。
【００１６】
本発明者らは、全く予期されなかったことに、同定された第２の４Ｓ−イオタ−カラギーナンスルファターゼ（Ｑ１５ＸＨ３）がイオタ−カラビオースモチーフをアルファ−カラビオースモチーフに変換できることを実証した。イオタ−カラビオースモチーフは、他のカラビオースモチーフも含み得るオリゴ糖又は多糖中に存在し得る。
【００１７】
したがって、本発明の主題は、以下のペプチド配列：
ＮＧＱＦＤＮＴＶＩＶＦＴＳＤＮＧＧＫ（配列番号１）、
ＦＤＱＴＦＱＶＧＤＮＴＲ（配列番号２）、及び
ＥＴＥＹＩＴＤＧＬＳＲ（配列番号３）
を有するペプチドを含む酵素により、イオタ−カラビオースモチーフをアルファ−カラビオースモチーフに変換する酵素触媒作用を含む、イオタ−カラギーナンのアルファ−カラギーナン変換方法である。
【００１８】
「イオタ−及びアルファ−カラギーナン」という表現は、本発明では、例えば溶液、部分的ゲル化溶液、又はゲルに含まれる、イオタ−及びアルファ−カラギーナン並びに／又はイオタ−及びアルファ−ハイブリッドカラギーナンを意味すると理解される。したがって、純粋なイオタ−カラギーナンは自身の電荷でゲル化するが、イオタ−ニュー−カラギーナン及びオリゴ−イオタ−カラギーナン等のハイブリッドカラギーナンはあまりゲル形成しない。
【００１９】
本発明の方法の特定の実施形態によれば、前記酵素は以下のペプチド配列を有する：
ＭＴＦＮＫＫＶＳＴＬＬＷＧＴＬＩＡＩＳＶＧＮＡＳＡＡＤＡＧＱＳＫＡＤＥＳＮＥＫＰＮＩＬＦＶＬＡＤＤＬＧＹＮＤＶＧＦＮＧＳＴＤＩＫＴＰＮＬＤＧＬＡＫＮＧＭＴＦＤＡＡＹＶＡＨＰＦＣＧＰＳＲＡＡＩＭＴＧＲＹＰＨＫＩＧＡＱＦＮＬＰＥＤＮＳＮＶＧＶＳＡＤＥＬＦＩＡＱＴＭＫＳＡＧＹＦＴＧＡＭＧＫＷＨＬＧＥＡＳＥＹＨＰＮＫＨＧＦＤＥＦＹＧＦＬＧＧＧＨＮＹＦＰＥＱＦＥＡＡＹＮＫＲＶＡＱＧＭＴＮＩＮＭＹＬＴＰＬＥＨＮＧＫＥＶＲＥＴＥＹＩＴＤＧＬＳＲＥＡＶＮＦＶＤＫＡＡＡＫＫＫＰＦＦＬＹＬＡＹＮＡＰＨＶＰＬＱＡＫＥＥＤＭＡＭＦＳＱＩＫＤＫＫＲＲＴＹＡＧＭＶＹＡＶＤＲＧＶＧＲＩＶＥＱＬＫＫＮＧＱＦＤＮＴＶＩＶＦＴＳＤＮＧＧＫＬＧＱＧＡＮＮＹＰＬＫＥＧＫＧＳＶＱＥＧＧＦＲＴＰＭＬＶＨＷＰＫＨＭＫＡＧＳＲＦＳＨＰＶＬＡＬＤＬＹＰＴＦＡＧＬＧＧＡＶＬＰＥＤＫＫＬＤＧＫＤＩＷＡＤＩＱＡＮＴＡＰＨＫＤＥＦＩＹＶＬＲＨＲＮＧＹＳＤＡＡＡＲＲＮＱＦＫＡＶＫＮＨＮＤＤＷＫＬＹＮＩＡＱＤＩＳＥＤＮＤＩＳＡＱＨＰＤＩＬＲＤＭＶＳＳＭＥＳＷＳＷＮＮＱＱＰＫＷＦＨＱＳＡＥＧＡＱＷＲＬＫＡＭＰ
ＲＦＤＱＴＦＱＶＧＤＮＴＲＳＮＳＫＫＧＨ（配列番号４）。
【００２０】
本発明の方法の特定の実施形態によれば、前記酵素は４Ｓ−イオタ−カラギーナンスルファターゼである。例えば、これは、配列番号４と少なくとも３０％の配列同一性、好ましくは配列番号４と少なくとも５０％の配列同一性、最も好ましくは配列番号４と少なくとも８０％の配列同一性を示す配列を有する４Ｓ−イオタ−カラギーナンスルファターゼであり得る。
【００２１】
本発明の方法の特定の実施形態によれば、酵素は、前記酵素をコードする核酸及び／又は前記酵素をコードする核酸配列を含むベクターを含む宿主細胞によって産生される。
【００２２】
「宿主細胞」という表現は、本発明では、原核細胞又は真核細胞を意味すると理解される。組換え細胞の発現に一般的に用いられる宿主細胞としては、特に、大腸菌又はバチルス等の細菌の細胞、サッカロミセス・セレビシエ等の酵母の細胞、アスペルギルス・ニガー等の真菌の細胞、昆虫の細胞、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＰＥＲ−Ｃ６細胞株等の哺乳動物（特にヒト）の細胞が含まれる。原核細胞及び真核細胞の形質転換、例えばリポフェクション、エレクトロポレーション、ヒートショック、又は化学的方法は、当業者に周知の技術である。当業者であれば、形質転換する細胞に応じて、選択された宿主細胞中に核酸を導入して発現させるのに必要な手段を容易に決定することができる。したがって、発現ベクター及び宿主細胞への発現ベクターの導入方法は、選択された宿主細胞に従って選択される。発現ベクター又は核酸で形質転換される宿主細胞は、対応するポリペプチドを安定的に発現する。当業者は、例えばウェスタンブロット法を用いて、宿主細胞がポリペプチドを安定的に発現していることを容易に調べることができる。
【００２３】
「ベクター」という表現は、本発明では、所定の宿主細胞中における核酸配列の発現及び／又は分泌のためのベクターを意味すると理解される。これらは、例えば、核酸配列に加えて発現に必要な手段を含むプラスミド又はウイルス起源のベクターであり得る。これらの手段には、例えば、プロモーター、翻訳の開始及び終結のシグナル、並びに転写制御のための適切な領域が含まれ得る。発現ベクターは更に、複製オリジン、マルチクローニングサイト、エンハンサー、クローニング中に産生されるポリペプチドと同時性で（in phase）融合され得るシグナルペプチド、及び１又は複数の選択マーカー等のその他のエレメントも含み得る。
【００２４】
「核酸」という表現は、本発明では、特にｃＤＮＡ分子及びｍＲＮＡ分子を含むＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子の両方を意味すると理解される。核酸は、二本鎖形態であってもよく、（例えば発現ベクターに含まれる核酸の場合）、一本鎖形態であってもよい（例えばプローブ又はプライマーの場合）。
【００２５】
本発明の方法によって得られ得るカラギーナンも本発明の主題である。
【００２６】
本発明の方法の特定の実施形態によれば、出発カラギーナンがその構造中にイオタ−カラビオースモチーフを有していれば、得られるカラギーナンはアルファ−カラビオースモチーフを有する。例えば、Ｅ．デンチキュラタム（E. denticulatum）から抽出されたカラギーナンのイオタ−カラビオースモチーフ（８５％イオタ−カラビオース及び１５％カッパ−カラビオース）は、８５％アルファ−カラビオース及び１５％カッパ−カラビオースを有するカラギーナンに変換され得る。この酵素反応は制御され得、イオタ−カラビオースからアルファ−カラビオースへの変換率は０〜１００％で異なり得る。得られるカラギーナンの流体力学的特性は変換率によって異なる。
【００２７】
手引きとして提供する添付の図面により図解される以下の実施例を読むことで、その他
の利点も当業者に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、産業的に利用される３つの主要なカラギーナン（カッパ（κ）、イオタ（ι）、及びラムダ（λ））の繰り返しモチーフの化学構造を示す。
【図２】図２は、紅藻類供給源に対するカッパ／イオタ−ハイブリッドカラギーナン組成を示す（Bixler et al., 2001、前述）［１］。
【図３】図３は、４Ｓ−及び２Ｓ−イオタ−カラギーナンスルファターゼによって触媒される酵素反応のダイアグラムである。
【図４】図４は、陰イオン交換クロマトグラフィーステップ（Ｑ  セファロース  ファスト  フロー（Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ））で回収した複数の画分のコロイドクーマシーブルー染色された電気泳動ゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す。５５ｋＤａタンパク質を矢印で示す。
【図５】図５は、シュードアルテロモナス・アトランティカ（Pseudoalteromonas atlantica） T6cタンパク質（Ｑ１５ＸＨ３）のアミノ酸配列を示す。太字：質量分析法により決定された３つのペプチド配列。イタリック及び下線：システインの翻訳後修飾の印。囲み字：触媒アミノ酸であるリジン（Ｋ）及びヒスチジン（Ｈ）を含む、触媒部位のアミノ酸。
【図６】図６は、Ｐ．アトランティカ（P. atlantica）中の新規４Ｓ−イオタ−カラギーナンスルファターゼ（Ｑ１５ＸＨ３）の遺伝子のゲノム環境を示す。
【図７】図７は、シュードアルテロモナス・アトランティカ（Pseudoalteromonas atlanticaからの精製タンパク質（Ｑ１５ＸＨ３）（Ａ）及びインキュベートしたイオタ−カラギーナン（Ｂ）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【実施例】
【００２９】
実施例１：シュードアルテロモナス・アトランティカ（Pseudoalteromonas atlantica）から得られた新規４Ｓ−イオタ−カラギーナンスルファターゼの同定
シュードアルテロモナス・アトランティカ（Pseudoalteromonas atlantica）のカラギーナンスルファターゼ活性のスクリーニング
ゲノムが完全に解読されている（http://genome.jgi-psf.org/finished_microbes/pseat/pseat.home.html）海洋細菌シュードアルテロモナス・アトランティカ（Pseudoalteromonas atlantica） T6c（ＡＴＣＣ  Ｔ６ｃ／ＢＡＡ−１０８７株）を用いてスクリーニングを行った。
【００３０】
細菌培養
カッパ−カラギーナン（カッパフィカス・アルベレッチー（Kappaphycus alvarezii）、ＣＰケルコ社製、Ｘ６９１３、１ｇ／ｌ）、イオタ−カラギーナン（ユーシューマ・デンチキュラタム（Eucheuma denticulatum）、Ｈ０３００５８−５３４、１ｇ／ｌ）、又はラムダ−カラギーナン（ギガルチナ・スコッツベルギイ（Gigartina skottsbergii）の胞子体、ＣＰケルコ社製、Ｘ７０５５）の存在下、ゾベル（Ｚｏｂｅｌｌ）培地［バクトペプトン（Ｂａｃｔｏｐｅｐｔｏｎｅ）（アムレスコ社（Ａｍｒｅｓｃｏ）製）５ｇ／ｌ、酵母エキス（ＢＤ、自己消化酵母細胞エキス（Ｅｘｔｒａｃｔ  ｏｆ  Ａｕｔｏｌｙｓｅｄ  Ｙｅａｓｔ  ｃｅｌｌｓ））１ｇ／ｌ、脱塩水で１ｌに調製したろ過海水８００ｍｌ］中で培養した海洋細菌シュードアルテロモナス・アトランティカ（Pseudoalteromonas atlantica）を用いて細菌抽出物を調製した。
【００３１】
一次前培養では、−８０℃で保存したＰ．アトランティカ（P. atlantica）のグリセロールから１０ｍｌのゾベル（Ｚｏｂｅｌｌ）培地を接種した。ニューブランズウィック（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）型のシェーカーを用いて１８℃、１８０ｒｐｍで３６時間インキュベートした。二次前培養では、カラギーナンの１つ（カッパ、イオタ、又はラム
ダ）を５０ｍｇ含む５０ｍｌのゾベル（Ｚｏｂｅｌｌ）培地を、６６０ｎｍでの吸光度が０．１になるように約１ｍｌの一次前培養を接種した。この二次前培養を６６０ｎｍでの光学濃度が１〜１．２に達するまで、すなわち約８時間、１８℃でインキュベートした。最後の培養では、前と同じカラギーナンを含む９５０ｍｌのゾベル（Ｚｏｂｅｌｌ）培地に二次前培養液５０ｍｌを接種し、１８℃で３６時間インキュベートした。
【００３２】
培養上清から細菌ペレットを分離するために、細菌培養液を６２００ｇ、４℃で２０分間遠心分離した。
【００３３】
細菌抽出物の調製
硫酸アンモニウムで９０％飽和させて沈殿させることにより、培養上清を濃縮する（サンプル１００ｍｌ当たり硫酸アンモニウム６１．５ｇ）。遠心（２５分間、１００００ｒｐｍ）後に得られたペレットを、５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．３）溶液中に戻す。次いで、これを膜（スペクトラ／ポア、ＭＷＣＯ  ３５００Ｄａ）を用いて５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．３）に対して透析する。
【００３４】
ｐＨ８．３の５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌバッファー（シグマ社製）に細菌ペレットを再懸濁した。次いで、細胞をフレンチプレス中で溶解させ、得られた溶解物を２７０００ｇで２時間４５分間超遠心した。得られた上清にアンチプロテアーゼ（コンプリート、ＥＤＴＡフリー、ロシュ社製）の錠剤の半分を加えた。
【００３５】
次いで、４℃で一晩撹拌しながらｐＨ８．５の５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌバッファーに対して抽出物を透析した（スペクトラ／ポア、ＭＷＣＯ  ３５００Ｄａ）。
【００３６】
放出された硫酸塩のアッセイ
細菌抽出物存在下で種々のカラギーナンをインキュベートした後に放出された硫酸塩の量を測定することにより、スルファターゼ活性の産生を評価した。アッセイは、濃縮した培養上清及び細菌ペレットを用いて行った。分析した各サンプルについて、酵素抽出物を予め１００℃で約１５分間失活させた後、同様な方法でブランクを用意した。
【００３７】
ミリＱ水（ミリポア社製）で反応培地を２倍希釈した後、カットオフが１０ｋＤａのマイクロコン（アミコン）中で遠心した。この遠心は、３３００ｇ、室温で９０分間行った。次いで、得られたろ液を、ダイオネクス社（Ｄｉｏｎｅｘ）のシステムを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ：高性能陰イオン交換クロマトグラフィー）でアッセイした。２０μｌのサンプルを自動インジェクター（ＡＳ３０００、サーモ社製）を用いて注入した。ＡＧ−１  １プレカラム（４×５０ｍｍ、ダイオネクス社製）を取り付けたイオン−パックＡＳ１  １カラム（４×２００ｍｍ、ダイオネクス社製）を用いて、サンプル中に存在する陰イオンの分離を行った。１２ｍＭ  ＮａＯＨに関してシステムを平衡化した。流速１ｍｌ／分（ＧＰ４０ポンプ、ダイオネクス社製）でＮａＯＨ均一濃度勾配を用いて溶出を行った。電流１９８ｍＡで作動するＡＳＲＳ  ウルトラ−ＩＩサプレッサー（４ｍｍ、ダイオネクス社製）を取り付けたＥＤ４０検出器（ダイオネクス社製）を用いた電気伝導度測定により、陰イオンの検出を行った。データの取得及び処理に用いたソフトウェアはクロメレオン（Ｃｈｒｏｍeｌeｏｎ）６．８ソフトウェアである。較正曲線を用い、硫酸塩ピークの面積を百万分率（ｐｐｍ）に変換した。サンプルとブランクの値の間の差から、酵素による脱硫酸化反応中に放出された硫酸塩の量（ｐｐｍ）が得られた。結果を以下の表１に示す。
【００３８】
【表１】
2013542726.tif 000003
【００３９】
新規４Ｓ−イオタ−カラギーナンスルファターゼの精製及びタンパク質配列
細菌抽出物の調製
スルファターゼ活性を有する、イオタ−カラギーナンで誘導した培養液から得られた及び前述したように得られた細菌ペレットを、ｐＨ７．５の５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌバッファー（シグマ社製）に再懸濁した。次いで、フレンチプレスを用いて細胞を溶解し、得られた溶解物を２７２００ｇで２時間４５分間超遠心した。タンパク質の分解を抑えるために、得られた上清にアンチプロテアーゼ（コンプリート、ＥＤＴＡフリー、ロシュ社製）の錠剤の半分を加えた。
【００４０】
抽出物から小サイズ分子（特に遊離硫酸塩）を除去するために、抽出物を４℃で一晩撹拌しながら５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）に対して透析した（スペクトラ／ポア、ＭＷＣＯ  ３５００Ｄａ）。
【００４１】
精製
イオタ−カラギーナンに作用するスルファターゼの精製実験を行った。精製ステップはアクタ精製システム（Ａｋｔａ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて行った。
【００４２】
溶解物を、５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）で事前に平衡化した弱陰イオン交換クロマトグラフィーカラム  ＤＥＡＥセファロース  ファスト  フロー（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）（ＧＥヘルスケア社製−４５×１ｃｍ）に入れた。スーパーループ（又はインジェクションループ）を用いてサンプル（約３５ｍｌ）を流速２ｍｌ／分でロードした。次いで、２８０ｎｍでの吸光度が無視できるほど小さくなるまで、樹脂をこの同じバッファーで洗浄した。タンパク質の溶出は分割した漸増する０〜１ＭのＮａＣｌ勾配（１０カラム体積の０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌ及び２カラム体積の５００ｍＭ〜１Ｍ  ＮａＣｌ）で流速２ｍｌ／分にて行った。体積５．５ｍｌの回収画分を、イオタ−カラギーナンを脱硫酸化する能力について試験した。
【００４３】
次いで、最大のスルファターゼ活性を含む画分を、４℃で撹拌しながら５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）に対して４８時間透析した（スペクトラ／ポア膜、ＭＷＣＯ  ３５００Ｄａ）。この画分１ｍｌを、５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）で予め平衡化した強陰イオン交換樹脂Ｑファストフロー（Ｑ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）（ＧＥヘルスケア社製−ハイトラップ（Ｈｉｔｒａｐ）  １ｍｌ）に入れた。樹脂をこの同じバッファーで洗浄し、以下のようにした０〜１Ｍの漸増ＮａＣｌ勾配でタンパク質を溶出した：１５カラム体積の０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌ及び５カラム体積の５００ｍＭ〜１Ｍ  ＮａＣｌ、流速１ｍｌ／分。スルファターゼ活性を測定するために、回収画分１ｍｌをイオタ−カラギーナン存在下でインキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で画分の純度の程度を可視化した。
【００４４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥポリアクリルアミドゲル電気泳動（バイオラッド社製、クライテリオン（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ）ＸＴ  １２％ビス−トリス）で活性画分の純度を分析した。１５μｌのサンプルに、２％ＳＤＳ（アムレスコ社製）と、５％β−メルカプトエタノール（９８％、シグマ社製）と、２０％グリセロール（カルロエルバ社（ＣａｒｌｏＥｒｂａ）製）と、６２．５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）と、０．５％ブロモフェノールブルー（シグマ社製）とを含む５μｌのローディングバッファーを加えた。次いで、タンパク質を変性させるためにサンプルを沸騰温度で３分間加熱した。次いで、混合物２０μｌをゲルにアプライした。サイズマーカー（バイオラッド社製、プレシジョン  プラス  プロテイン（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ））５μｌをアプライして、１０〜２５０ｋＤａのタンパク質分子量を評価できるようにした。２００ｍＭ  ＭＯＰＳ（シグマ社製）と、２５０ｍＭ  トリス（ｐＨ８．１）と、５ｇ／ｌ  ＳＤＳとで構成される泳動バッファー中で、室温、（１つのゲルにつき）１１０ボルトで、２時間泳動を行った。コロイドクーマシーブルー染色を用いてゲルの可視化を行った（Candiano et al., Electrophoresis, 25(9): 1327-1333, 2004）［５］。精製タンパク質の分子量は約５５ｋＤａと推定された（図４）。
【００４５】
タンパク質及び核酸配列
ゲルからタンパク質バンドを切り出し、トリプシンで消化して、得られたペプチドを、ナント（Ｎａｎｔｅｓ）のＩＮＲＡにある「バイオポリマー（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）」ＲＩＯプラットフォームで質量分析法によりシークエンシングした。決定された３つの配列［ＮＧＱＦＤＮＴＶＩＶＦＴＳＤＮＧＧＫ（配列番号１）、ＦＤＱＴＦＱＶＧＤＮＴＲ（配列番号２）、及びＥＴＥＹＩＴＤＧＬＳＲ（配列番号３）］をＴｒＥＭＢＬライブラリーと比較した。３つのペプチドは、その遺伝子（Ｐａｔｌ＿０８８９）がスルファターゼに分類されるシュードアルテロモナス・アトランティカ（Pseudoalteromonas atlantica） T6c（Copeland et al., 2006、前述）［４］のＱ１５ＸＨ３タンパク質（図５、配列番号４）に１００％対応する。このタンパク質は、システインをホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に変換するために必要な１２アミノ酸のコンセンサス配列（Ｃ／Ｓ−Ｘ−Ｐ−Ｓ／Ｘ−Ｒ−ＸＸＸ−Ｌ／Ｘ−Ｇ／Ｘ−Ｒ／Ｘ、配列番号５）及び保存配列（Ｇ−Ｙ／Ｖ−Ｘ−Ｓ／Ｔ−ＸＸＸ−Ｇ−Ｋ−Ｘ−Ｘ−Ｈ、配列番号６）中に存在する触媒アミノ酸を有する。新規スルファターゼの遺伝子のゲノム環境は、このタンパク質がイオタ−カラギーナンの分解に関与することを示している（図６）。実際、Ｑ１５ＸＨ３の遺伝子は、他のスルファターゼ（Ｑ１５ＸＨ３に４１％の同一性を有するＱ１５ＸＧ７を含む）を含む遺伝子クラスター中に位置し、クラスター中、２個は未知のタンパク質であるが、特にクエン酸回路（糖の酸化）及びＤ−ガラクトース代謝のための複数の遺伝子が明確に同定されている。このクラスター中に存在するスルファターゼの機能は、おそらく、イオタ−及び／又はアルファ−カラギーナンの脱硫酸化に関連付けられる。
【００４６】
スルファターゼ活性
スルファターゼ活性を測定するために、アッセイする１００μｌのサンプルを、５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）中１％のイオタ−カラギーナン（ＣＰケルコ社製、Ｎｏ．１２５６）溶液１００μｌに接触させた。酵素反応はウォーターバス中で３４℃にて４８時間行った。各サンプルについて、酵素抽出物を予め１００℃で１５分間失活させ、同様な条件でブランクを用意した。
【００４７】
切断された硫酸基の位置、及び、結果として酵素加水分解中に形成された生成物の同定をＮＭＲで行った。この分析では、３００μｌの細菌抽出物の存在下で７００μｌの１％イオタ−カラギーナン（ＣＰケルコ社製、Ｎｏ．１２５６）をインキュベートすることにより脱硫酸化反応を行った。反応混合物をウォーターバス中で３４℃にて７２時間インキ
ュベートした後、凍結乾燥した。次いで、サンプルをＤ２Ｏ中で２回交換した後、７００μｌの９９．９７％Ｄ２Ｏに再度溶解し、適切な濃度である１０ｍｇ／ｍｌにした。ＮＭＲ部門（ブレストのブルターニュ・オクシダンタル大学）により、ブルカー  アバンセ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ）ＤＲＸ  ５００分光光度計を用いて１Ｈ  ＮＭＲスペクトルが７０℃で記録された。カラギーナンのアノマープロトンはおよそ５〜５．６ｐｐｍに特徴的な化学シフト（ｄ）を示す。結果は、純粋なタンパク質によるイオタ−カラギーナンの脱硫酸化によってアルファ−カラギーナンが生成することを示しており（図７Ａ）、これは最初の精製４Ｓ−イオタ−カラギーナンスルファターゼの場合と同様であるが、最初の精製４Ｓ−イオタ−カラギーナンスルファターゼの分子量は１１５ｋＤａであった（仏国特許出願第０９／５２６４２号、前述）［３］。
【００４８】
したがって、イオタ−カラギーナンをアルファ−カラギーナンに変換できる新規スルファターゼが同定された。これは、アミドヒドラーゼのファミリーに属する、これまでに公知の唯一の４Ｓ−イオタ−カラギーナンスルファターゼとは識別可能である。
【００４９】
新規カラギーナンスルファターゼ（Ｑ１５ＸＨ３）の配列は、これがＦＧｌｙ−スルファターゼのファミリーに属することを示している。このＦＧｌｙ−スルファターゼは、炭水化物に作用する他の酵素を含むこのファミリーの最初のカラギーナンスルファターゼである。グリコサミノグリカン（すなわちヘパリン）及びセレブロシドに作用するスルファターゼを説明した。
【００５０】
参照文献一覧
1. Bixler et al., Food Hydocolloids, 15: 619-630, 2001
2. Bixler and Porse, J. Appl. Phycol., 2010, online
3. French patent application FR 09/52642
4. Copeland et al., “Complete sequence of Pseudoalteromonas atlantica T6c”, EMBL ACCESSION No. CP000388, PROTEINJD ABG39415.1, 2006
5. Candiano et al., Electrophoresis, 25(9): 1327-1333, 2004
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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