(57)【要約】  本発明は、Ａ１１９６に変異を含む１６Ｓ  ｒＲＮＡと、Ｃ１１９５及び／又はＡ１１９７に変異をさらに含む１６Ｓ  ｒＲＮＡと、（ｉ）Ｃ１１９５Ａ及びＡ１１９６Ｇ；又は（ii）Ｃ１１９５Ｔ、Ａ１１９６Ｇ、及びＡ１１９７Ｇ；又は（iii）Ａ１１９６Ｇ及びＡ１１９７Ｇを含む１６Ｓ  ｒＲＮＡとに関する。本発明は、そのような１６Ｓ  ｒＲＮＡを含むリボソーム及びその使用に関する。
2013514799.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ１１９６に変異を含む１６Ｓ  ｒＲＮＡ。
【請求項２】
変異がＡ１１９６Ｇである、請求項１に記載の１６Ｓ  ｒＲＮＡ。
【請求項３】
Ｃ１１９５及び／又はＡ１１９７に変異をさらに含む、請求項１又は２に記載の１６Ｓ  ｒＲＮＡ。
【請求項４】
（ｉ）Ｃ１１９５Ａ及びＡ１１９６Ｇ；又は
（ii）Ｃ１１９５Ｔ、Ａ１１９６Ｇ、及びＡ１１９７Ｇ；又は
（iii）Ａ１１９６Ｇ及びＡ１１９７Ｇ
を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の１６Ｓ  ｒＲＮＡ。
【請求項５】
Ａ５３１Ｇ及びＵ５３４Ａをさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載の１６Ｓ  ｒＲＮＡ。
【請求項６】
クアドラプレットコドンを翻訳することができ、請求項１〜５のいずれかに記載の１６Ｓ  ｒＲＮＡを含むリボソーム。
【請求項７】
少なくとも１つのクアドラプレットコドンを含むｍＲＮＡの翻訳における、請求項１〜６のいずれかに記載の１６Ｓ  ｒＲＮＡの使用。
【請求項８】
実質的に本明細書に記載されている、１６Ｓ  ｒＲＮＡ、リボソーム、細胞又は方法。
【請求項９】
添付図を参照した、請求項８に記載の１６Ｓ  ｒＲＮＡ、リボソーム、細胞又は方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クアドラプレットコドンの翻訳のためのリボソームに関する。
【背景技術】
【０００２】
６４のトリプレットコドンのそれぞれが、天然のアミノ酸又はポリペプチド終止をコードするのに使用されているので、新規の空白コドンが細胞遺伝コード拡張に必要である。原則として、クアドラプレットコドンは２５６の空白コドンを提供し得るであろう。
【０００３】
インビトロシステムにおいて(Hohsaka, T. & Sisido, M. Incorporation of non-natural amino acids into proteins. Curr Opin Chem Biol 6, 809-15 (2002)、Ohtsuki, T., Manabe, T. & Sisido, M. Multiple incorporation of non-natural amino acids into a single protein using tRNAs with non-standard structures. FEBS Lett 579, 6769-74 (2005)、Murakami, H., Hohsaka, T., Ashizuka, Y. & Sisido, M. Site-directed incorporation of p-nitrophenylalanine into streptavidin and site-to-site photinduced electron transfer from a pyrenyl group to a nitrophenyl group on the protein framework. Journal of the American Chemical Society 120, 7520-7529 (1998))、及び事前にアミノアシル化されたｔＲＮＡの移入を介して、限定されたインビボシステムにおいて(Rodriguez, E. A., Lester, H. A. & Dougherty, D. A. In vivo incorporation of multiple unnatural amino acids through nonsense and frameshift suppression. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 8650-5 (2006)、Monahan, S. L., Lester, H. A. & Dougherty, D. A. Site-specific incorporation of unnatural amino acids into receptors expressed in mammalian cells. Chemistry and Biology 10, 573-580 (2003))、化学量論的にアミノアシル化された拡張アンチコドンｔＲＮＡが、４塩基コドンに反応して、非常に低効率で非天然アミノ酸を組み込むのに用いられてきた。これが当技術分野における問題である。
【０００４】
一事例において、平凡な２つのアミノ酸を低効率でコードするのに、一般化できないアプローチで、４塩基サプレッサー及びアンバーコドンが用いられている(Anderson, J. C. et al. An expanded genetic code with a functional quadruplet codon. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 7566-71 (2004))。実際、天然のリボソームがクアドラプレットコドンを解読する際の非効率性は、遺伝コード拡張のためのそれらの有用性を厳しく制限するものであり、当技術分野における問題となっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Hohsaka, T. & Sisido, M. Incorporation of non-natural amino acids into proteins. Curr Opin Chem Biol 6, 809-15 (2002)
【非特許文献２】Ohtsuki, T., Manabe, T. & Sisido, M. Multiple incorporation of non-natural amino acids into a single protein using tRNAs with non-standard structures. FEBS Lett 579, 6769-74 (2005)
【非特許文献３】Murakami, H., Hohsaka, T., Ashizuka, Y. & Sisido, M. Site-directed incorporation of p-nitrophenylalanine into streptavidin and site-to-site photinduced electron transfer from a pyrenyl group to a nitrophenyl group on the protein framework. Journal of the American Chemical Society 120, 7520-7529 (1998)
【非特許文献４】Rodriguez, E. A., Lester, H. A. & Dougherty, D. A. In vivo incorporation of multiple unnatural amino acids through nonsense and frameshift suppression. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 8650-5 (2006)
【非特許文献５】Monahan, S. L., Lester, H. A. & Dougherty, D. A. Site-specific incorporation of unnatural amino acids into receptors expressed in mammalian cells. Chemistry and Biology 10, 573-580 (2003)
【非特許文献６】Anderson, J. C. et al. An expanded genetic code with a functional quadruplet codon. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 7566-71 (2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、従来技術に伴う問題を克服しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、クアドラプレットコドンを翻訳する新規の技術的能力を有するリボソームを産生するために、あるリボソーム構成要素に変異導入した。変異は、１６Ｓ  ｒＲＮＡに集中させた。本発明によって産生されたリボソームは、時々、クアドラプレットリボソーム又はＱ−リボソーム（ＲｉｂｏＱ）と呼ばれる。
【０００８】
一態様では、本発明は、Ａ１１９６に変異を含む１６Ｓ  ｒＲＮＡに関する。
【０００９】
一態様では、本発明は、Ａ１１９６に変異と、Ｃ１１９５Ｔ、Ａ１１９７Ｇ、Ｃ１１９５Ａから選択される少なくとも１つのさらなる変異とを含む１６Ｓ  ｒＲＮＡに関する。
【００１０】
別の態様では、本発明は、Ｃ１１９５及び／又はＡ１１９７に変異をさらに含む、上述の１６Ｓ  ｒＲＮＡに関する。
【００１１】
別の態様では、本発明は、
（ｉ）Ｃ１１９５Ａ及びＡ１１９６Ｇ；又は
（ii）Ｃ１１９５Ｔ、Ａ１１９６Ｇ、及びＡ１１９７Ｇ；又は
（iii）Ａ１１９６Ｇ及びＡ１１９７Ｇ
を含む、上述の１６Ｓ  ｒＲＮＡに関する。
【００１２】
別の態様では、本発明は、クアドラプレットコドンを翻訳することができるリボソームであって、上述の１６Ｓ  ｒＲＮＡを含むリボソームに関する。
【００１３】
別の態様では、本発明は、少なくとも１つのクアドラプレットコドンを含むｍＲＮＡの翻訳における、上述の１６Ｓ  ｒＲＮＡの使用に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
一態様では、本発明は、Ａ１１９６に変異を含む１６Ｓ  ｒＲＮＡに関する。
【００１５】
適切には、変異がＡ１１９６Ｇである。
【００１６】
別の態様では、本発明は、Ｃ１１９５及び／又はＡ１１９７に変異をさらに含む、上述の１６Ｓ  ｒＲＮＡに関する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、
（ｉ）Ｃ１１９５Ａ及びＡ１１９６Ｇ；又は
（ii）Ｃ１１９５Ｔ、Ａ１１９６Ｇ、及びＡ１１９７Ｇ；又は
（iii）Ａ１１９６Ｇ及びＡ１１９７Ｇ
を含む、上述の１６Ｓ  ｒＲＮＡに関する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、Ａ５３１Ｇ及びＵ５３４Ａをさらに含む、上述の１６Ｓ  ｒＲＮＡに関する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、クアドラプレットコドンを翻訳することができるリボソームであって、上述の１６Ｓ  ｒＲＮＡを含むリボソームに関する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、少なくとも１つのクアドラプレットコドンを含むｍＲＮＡの翻訳における、上述の１６Ｓ  ｒＲＮＡの使用に関する。
【００２１】
適切には、Ａ１１９６に変異を含む本発明の１６Ｓ  ｒＲＮＡは、Ａ１１９６Ｇを含む。この特定の変異は、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、及びＱ４など、本明細書で例示される好ましい１６Ｓ  ｒＲＮＡのそれぞれに共通であり、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、及びＱ４はすべて、Ａ１１９６Ｇ（すなわち、位置１１９６におけるＧ）を保持する。
【００２２】
適切には、本発明の１６Ｓ  ｒＲＮＡは、Ａ１１９７に変異をさらに含む。適切には、Ａ１１９７に変異を含む本発明の１６Ｓ  ｒＲＮＡは、Ａ１１９７Ｇを含む。この特定の変異は、Ｑ１、Ｑ２、及びＱ３など、本明細書で例示される好ましい１６Ｓ  ｒＲＮＡの７５％に共通であり、Ｑ１、Ｑ２、及びＱ３はすべて、Ａ１１９７Ｇ（すなわち、位置１１９７におけるＧ）を保持する。
【００２３】
適切には、本発明の１６Ｓ  ｒＲＮＡは、Ａ１１９６に変異及びＡ１１９７に変異を含む。最も適切には、本発明の１６Ｓ  ｒＲＮＡは、Ａ１１９６Ｇ及びＡ１１９７Ｇを含む。Ｑ１、Ｑ２、及びＱ３のそれぞれは、変異のこの組合せを含む。
【００２４】
適切には、本発明の１６Ｓ  ｒＲＮＡは、Ｃ１１９５に変異を含み得る。この変異は、Ｃ１１９５Ｔ又はＣ１１９５Ａであり得る。適切には、Ｃ１１９５変異を含む本発明の１６Ｓ  ｒＲＮＡは、Ａ１１９６ＧなどのＡ１１９６変異も含む。適切には、本発明の１６Ｓ  ｒＲＮＡがＡ１１９７Ｇを含む場合、それはＣ１１９５Ｔも含む。適切には、本発明の１６Ｓ  ｒＲＮＡがＡ１１９６Ｇ及びＡ１１９７Ｇを含む場合、それはＣ１１９５Ｔも含む。適切には、本発明の１６Ｓ  ｒＲＮＡがＡ１１９６Ｇを含み、Ａ１１９７で野生型である（すなわち、位置１１９７がＡ）場合、それはＣ１１９５Ａも含む。
【００２５】
さらなる変異は、存在していても、存在していなくてもよい。
【００２６】
Ｒｉｂｏ−Ｘ及びＲｉｂｏ−Ｑ
本明細書におけるＲｉｂｏ−Ｑ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ配列は、開始１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列である、Ｒｉｂｏ−Ｘから調製された。Ｒｉｂｏ−Ｘは、当業者によく知られている公表されている１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列である。より詳細には、Ｒｉｂｏ−Ｘは、野生型と比較して、２つの置換、すなわちＡ５３１Ｇ及びＵ５３４Ａを有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を指す。したがって、適切には、本明細書に記載の各Ｒｉｂｏ−Ｑ１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列は、本明細書に論じるそれぞれのさらなる変異又は置換に加えて、Ａ５３１Ｇ及びＵ５３４Ａを保持している。文脈が別段のことを示さない限り、本発明の１６Ｓ  ｒＲＮＡはそれぞれ、論じられている任意の他の変異に加えて、Ａ５３１Ｇ及びＵ５３４Ａを保持していることを想定するべきである。したがって、適切には、本発明の各１６Ｓ  ｒＲＮＡは、野生型と比較して、少なくとも３つの変異、すなわちＡ１１９６、Ａ５３１Ｇ、及びＵ５３４Ａ、最も適切には、Ａ１１９６Ｇ、Ａ５３１Ｇ、及びＵ５３４Ａを含む。
【００２７】
さらなる詳細が必要である場合には、Ｒｉｂｏ−Ｘは、国際出願ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００４５６２号明細書（国際公開第２００８／０６５３９８号パンフレットとして公開されている）で徹底的に論じられている。この文献を参照により、明示的にＲｉｂｏ−Ｘ１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列の詳細について、特に本明細書に組み込む。Ｒｉｂｏ−Ｘ１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列は、本発明のＲｉｂｏ−Ｑ１６Ｓ  ｒＲＮＡがそれから派生する及び／又は産生される「背景」配列又は親配列である。
【００２８】
適切には、本発明の１６Ｓ  ｒＲＮＡは、Ａ１１９６Ｇ及びＡ１１９７Ｇを含む（Ｒｉｂｏ−Ｑ１、Ｒｉｂｏ−Ｑ２、Ｒｉｂｏ−Ｑ３）。
【００２９】
適切には、本発明の１６Ｓ  ｒＲＮＡは、Ｃ１１９５Ｔ、Ａ１１９６Ｇ、及びＡ１１９７Ｇを含む（Ｒｉｂｏ−Ｑ３）。
【００３０】
適切には、本発明の１６Ｓ  ｒＲＮＡは、Ｃ１１９５Ｔ及びＡ１１９６Ｇを含む（Ｒｉｂｏ−Ｑ４）。
【００３１】
一実施形態では、本発明の１６Ｓ  ｒＲＮＡは、野生型の１６Ｓ  ｒＲＮＡの配列、並びにＡ５３１Ｇ、Ｕ５３４Ａ、Ａ１１９６Ｇ、及びＡ１１９７Ｇからなる（Ｒｉｂｏ−Ｑ１）。
【００３２】
一実施形態では、本発明の１６Ｓ  ｒＲＮＡは、野生型の１６Ｓ  ｒＲＮＡの配列、並びにＡ５３１Ｇ、Ｕ５３４Ａ、Ａ１１９６Ｇ、及びＡ１１９７Ｇ、並びに最大８までのさらなる変異／置換からなる（Ｒｉｂｏ−Ｑ２）。
【００３３】
一実施形態では、本発明の１６Ｓ  ｒＲＮＡは、野生型の１６Ｓ  ｒＲＮＡの配列、並びにＡ５３１Ｇ、Ｕ５３４Ａ、Ｃ１１９５Ｔ、Ａ１１９６Ｇ、及びＡ１１９７Ｇからなる（Ｒｉｂｏ−Ｑ３）。
【００３４】
一実施形態では、本発明の１６Ｓ  ｒＲＮＡは、野生型の１６Ｓ  ｒＲＮＡの配列、並びにＡ５３１Ｇ、Ｕ５３４Ａ、Ｃ１１９５Ｔ、及びＡ１１９６Ｇからなる（Ｒｉｂｏ−Ｑ４）。
【００３５】
本発明は、クアドラプレット解読リボソームの進化を介した、複数の非天然アミノ酸のコード化に関する。
【００３６】
定義
「直交性（orthogonal）」という用語が本明細書で使用される場合、それは、他の核酸と協働する能力が天然の内因性核酸とは異なる核酸、例えばｒＲＮＡ又はｍＲＮＡを指す。直交性ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ及びｔＲＮＡは、効率的に協働する適合群（関連群（cognate group））となる。例えば、直交性ｒＲＮＡは、リボソームの一部である場合、天然の内因性ｍＲＮＡではなく、適合している関連する直交性ｍＲＮＡを効率的に翻訳する。単純にするために、直交性ｒＲＮＡを含むリボソームを本明細書では「直交性リボソーム」と呼び、直交性リボソームは、機能が関連する直交性ｍＲＮＡを効率的に翻訳する。
【００３７】
直交性コドン又は直交性ｍＲＮＡコドンは、機能が関連する直交性リボソームによってのみ翻訳されるか、又は機能が関連する直交性リボソームによって、天然の内因性リボソームによるよりも効率的に翻訳されるか、又は異なって翻訳される、直交性ｍＲＮＡ内のコドンである。直交性は、Ｏと短縮表記される（Ｏ−ｍＲＮＡのＯのように）。
【００３８】
したがって、一例として、直交性リボソーム（Ｏ−リボソーム）・直交性ｍＲＮＡ（Ｏ−ｍＲＮＡ）対は、内因性リボソームによる翻訳を指示しないリボソーム結合部位を含有するｍＲＮＡと、直交性ｍＲＮＡを効率的且つ特異的に翻訳するが、細胞性ｍＲＮＡを認めうるほどに翻訳しない直交性リボソームとで構成される。
【００３９】
本明細書で例えば「進化した直交性リボソーム」という表現に適用される場合、「進化した」は、多様化及び選択を介した分子の機能の発展を指す。例えば、本明細書に記載の手順に従って、所望の位置で多様化されたｒＲＮＡ分子のライブラリーを選択にかけることができる。この選択過程によって、進化したｒＲＮＡが得られる。
【００４０】
本明細書で使用される場合、Ｏ−ｍＲＮＡ  Ｏ−リボソーム対に関するコンテクストで使用される場合、「ｍＲＮＡ」という用語は、天然の野生型リボソームによってではなく、機能が関連するＯ−リボソームによって効率的に翻訳される直交性コドンを含むｍＲＮＡを指す。加えて、それは、野生型リボソームではなく、Ｏ−リボソームによる翻訳の開始を効率的に媒介する変異体リボソーム結合部位（とりわけ、ＡＵＧ開始コドンから、ＡＵＧ開始コドンに対して−１３上流までの配列）を含みうる。ｍＲＮＡの残りの部分は様々でありえ、それによって、上記リボソーム結合部位の下流に任意のタンパク質のコード配列を配置することによって、内因性リボソームによってではなく、直交性リボソームによって効率的に翻訳されるｍＲＮＡがもたらされる。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「ｒＲＮＡ」という用語は、Ｏ−ｍＲＮＡ  Ｏ−リボソーム対に関するコンテクストで使用される場合、上記ｒＲＮＡが直交性ｒＲＮＡであり、それを含有するリボソームが直交性リボソームであるように、すなわち、それが機能が関連する直交性ｍＲＮＡのみを効率的に翻訳するように変異導入されたｒＲＮＡを指す。野生型リボソームのｒＲＮＡの１次、２次及び３次構造は、極めてよく知られており、様々な保存構造の機能も同様である（ステム−ループ、ヘアピン、ヒンジなど）。Ｏ−ｒＲＮＡは、通常、１６Ｓ  ｒＲＮＡ内に、翻訳過程中のｔＲＮＡ結合の原因となる変異を含んでいる。それは、スモールｒＲＮＡサブユニットの３’領域にも、翻訳の開始及びｍＲＮＡのリボソーム結合部位との相互作用の原因となる変異を含みうる。
【００４２】
細胞内における「Ｏ−ｒＲＮＡ」の発現は、この用語が本明細書で使用される場合、上記細胞に対して非毒性である。毒性は、細胞死によって、又はその代わりに、「Ｏ−ｍＲＮＡ」を発現しない細胞に対する、増殖速度の８０％以上の低減によって判定される。Ｏ−ｒＲＮＡの発現は、好ましくは、Ｏ−ｒＲＮＡをもたない同様な細胞の増殖に対して５０％未満、好ましくは２５％未満、より好ましくは１０％未満の増殖の低減を有し、さらにより好ましくは、増殖を全く減速させない。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「より効率的に翻訳する」及び「より効率的に翻訳を媒介する」という用語は、所与のＯ−ｍＲＮＡが機能が関連するＯ−リボソームによって、少なくとも２５％、より効率的に、好ましくは、同じ細胞又は細胞型で野生型のリボソーム又は非同族の（non-cognate）Ｏ−リボソームによってＯ−ｍＲＮＡが翻訳される効率の少なくとも２倍、３倍、４倍若しくは８倍、又はそれ以上に効率的に翻訳されることを意味する。ひとつの評価基準として、例えば、少なくとも１つの直交性コドンを用いた、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードするＯ−ｍＲＮＡの、天然のリボソーム又は非同族の直交性リボソームによる翻訳に対して、翻訳効率を評価できる。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「に対応する」という用語は、ヌクレオチド配列に関して使用される場合、１分子内、例えば１６Ｓ  ｒＲＮＡ内の所与の配列が、別の分子、例えば別の種の１６Ｓ  ｒＲＮＡにおける同じ位置にあることを意味する。「同じ位置にある」とは、Tatusova及びMaddenによって記載され（1999, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol. Lett. 174:247-250）、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ，the U.S. National Center for Biotechnology Information）から入手できるＢＬＡＳＴ配列アラインメントアルゴリズム「BLAST 2 Sequences」を用いてアラインメントした際に、「対応する」配列が相互にアラインメントされることを意味する。いかなる疑義も回避するため、ＢＬＡＳＴバージョン２．２．１１（ＮＣＢＩウェブサイトで利用可能、又は代わりに上記サイトからダウンロード可能）を以下のデフォルトパラメータ、すなわち、プログラム、blastn；一致による得点、１；不一致によるペナルティー、−２；ギャップ開始ペナルティー及びギャップ伸長ペナルティー、それぞれ５及び２；ギャップ×ドロップオフ、５０；期待値１０．０；ワードサイズ１１；フィルター有りを用いて使用した。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「選択マーカー」という用語は、対応する選択剤の添加によって、集団内における、その遺伝子配列をコード及び発現する細胞の選択を可能にする遺伝子配列を指す。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「リボソーム結合部位でｍＲＮＡと相互作用する配列を含む領域」は、翻訳開始中のｍＲＮＡと物理的に、例えば塩基対合又は他の相互作用によって相互作用する、１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端近傍のヌクレオチドを含む配列領域を指す。上記「領域」は、リボソーム結合部位でｍＲＮＡ内のヌクレオチドと塩基対合又は他の方法で物理的に相互作用するヌクレオチド、及びそのようなヌクレオチドの５’側又は３’側にある５ヌクレオチド以内のヌクレオチドを含有している。シャイン−ダルガノヘリックスの副溝の近傍で、リボソームとｍＲＮＡとの間に形成されるバルジを形成する、大腸菌１６Ｓ  ｒＲＮＡのヌクレオチド７２２及び７２３に対応する塩基も、この「領域」内に含有されている。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「多様化された」という用語は、ライブラリー内の個々のメンバーによって、所与の部位における配列が異なることを意味する。多様性を導入する方法は、当業者によく知られており、所与の部位にランダムな多様性を導入することも、完全にはランダムでない多様性を導入することもできる。「完全にランダム」とは、所与のヌクレオチドが、Ｇ、Ａ、Ｔ又はＣのいずれでも（又は、ＲＮＡでは、Ｇ、Ａ、Ｕ及びＣのうちのいずれでも）ありうることを意味する。「完全にはランダムでない」とは、所与の部位を、Ｇ、Ａ、Ｔ（ＲＮＡではＵ）又はＣの全てではないが、複数の異なったヌクレオチドが占めうること、例えば、所与の部位で、多様性によって、Ｕ若しくはＣではなく、Ｇ若しくはＡのいずれかが可能となる場合、又はＣではなく、Ｇ、Ａ若しくはＵのいずれかが可能となる場合を意味する。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「リボソーム結合部位」という用語は、翻訳の開始時にリボソームが結合する、ｍＲＮＡの領域を指す。本明細書における定義では、原核細胞ｍＲＮＡの「リボソーム結合部位」は、シャイン−ダルガノコンセンサス配列と、ＡＵＧ開始コドンに対して−１３から＋１までのヌクレオチドとを含有している。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「非天然アミノ酸」は、タンパク質中に天然で存在する２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を指す。非限定的な例には、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ−プロパルギル−フェニルアラニン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃｂ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、チロシンアミノ酸の非天然類似体；グルタミンアミノ酸の非天然類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体；セリンアミノ酸の非天然類似体；トレオニンアミノ酸の非天然類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、ホウ酸、ボロン酸、リン酸、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケト、又はアミノ置換アミノ酸、又はこれらの組合せ；光励起性架橋物質を有するアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光アミノ酸；金属結合性アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；フォトケージドアミノ酸及び／又は光異性化可能なアミノ酸；ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学的に切断可能なアミノ酸又は光切断可能なアミノ酸；延長された側鎖を有するアミノ酸；毒性基を含有するアミノ酸；糖置換アミノ酸；炭素連結された糖を含有するアミノ酸；酸化還元活性なアミノ酸；ａ−ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸；ａ，ａ二置換アミノ酸；ｂ−アミノ酸；プロリン又はヒスチジン以外の環状アミノ酸、及びフェニルアラニン、チロシン又はトリプトファン以外の芳香族アミノ酸が含まれる。
【００５０】
国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００２６３７号パンフレットは、Ｏ−ｍＲＮＡ内のリボソーム結合部位がＯ−リボソームに特異的に結合する直交性リボソーム／ｍＲＮＡ対の産生について記載している。
【００５１】
簡潔には、細菌のリボソームは、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳に関与するｒＲＮＡ及びタンパク質の２．５ＭＤａ複合体である（The Ribosome, Vol. LXVI. (ColdSpring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor,  New York; 2001)。ｍＲＮＡと、リボソームの３０Ｓサブユニットとの相互作用は、翻訳における初期の事象であり（Laursen, B.S., Sorensen, H.P., Mortensen, K.K. & Sperling-Petersen, H.U., Microbial Mal Biol Rev 69, 101-123 (2005)）、最初のコドン（Wikstrom, P.M., Lind, L.K., Berg, D.E. & Bjork, G.R., J Mol Biol 224, 949-966 (1992)）、リボソーム結合配列（シャイン−ダルガノ（ＳＤ，Shine-Dalgarno）配列を含める（Shine, J. & Delgarno, L., Biochem J 141, 609-615 (1974)、Steitz, J.A. & Jakes, K., Proc Natl Acad Sci USA 72, 4734-4738 (1975)、Yusupova, G.Z., Yusupov, M.M., Cate, J.H. & Noller, H.F., Cell 106, 233-241 (2001)））、及びこれらの配列間の間隔（Chen, H., Bjerknes, M., Kumar, R. & Jay, E., Nucleic Acids Res 22, 4953-4957 (1994)）を含めた、遺伝子の発現を制御する、ｍＲＮＡのいくつかの特徴が知られている。特定の場合には、ｍＲＮＡ構造（Gottesman, S. et al. in The Ribosome, Vol. LXVI (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; 2001)、Looman, A.C., Bodlaender, J., de Gruyter, M., Vogelaar, A. & van Knippenberg, P.H., Nucleic Acids Res 14, 5481-5497 (1986)、Liebhaber, S.A., Cash, F. & Eshleman, S.S., J Mo1 Biol 226, 609-621 (1992)）、又は代謝産物の結合（Winkler, W., Nahvi, A. & Breaker, R.R., Nature 419, 952-956 (2002)）が翻訳の開始に影響を与え、まれな場合では、ｍＲＮＡは、ＳＤ配列なしで、翻訳されうるが、これらの配列の翻訳は効率が悪く(Laursen, B.S., Sorensen, H.P., Mortensen, K.K. & Sperling-Petersen, H.U., Microbiol Mol Biol Rev 69, 101-123 (2005))代替の開始経路を介して動作する（Laursen, B.S., Sorensen, H.P., Mortensen, K.K. & Sperling Petersen, H.U. Initiation of protein synthesis in bacteria. Microbial Mol Biol Rev 69, 101-123 (2005)）。細菌遺伝子の圧倒的多数では、ｍＲＮＡのＳＤ領域が翻訳効率の主要決定因子である。古典的なＳＤ配列であるＧＧＡＧＧは、アンチシャイン−ダルガノ（ＡＳＤ，Anti Shine Delgarno）として知られているＣＣＵＣＣという配列を含有する、１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端領域とのＲＮＡ−ＲＮＡ塩基対合を介して相互作用する。大腸菌では、約４１２２の翻訳開始点があり（Shultzaberger, R.K., Bucheimer, R.E., Rudd, K.E. & Schneider, T.D., J Mol Biol 313, 215-228 (2001)）、これらは、ＳＤ様配列とＡＵＧ開始コドンとの間の間隔、ＳＤ様配列とリボソームとの間の相補性の度合い、及び１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端における、ｍＲＮＡが相互作用する配列の正確な領域が相違している。したがって、このリボソームは、ただの古典的なシャイン−ダルガノ（ＳＤ）配列よりは複雑なセットの配列からの翻訳を推進させる。明快にするために、１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端に結合すると考えられているｍＲＮＡ配列をＳＤ配列と呼び、ＧＧＡＧＧという特定の配列を古典的なＳＤ配列と呼ぶ。
【００５２】
ＳＤ配列内の変異は、しばしば急速な細胞溶解及び細胞死をもたらす（Lee, K., Holland-Staley, CA. & Cunningham, P.R., RNA 2, 1270-1285 (1996)、Wood, T.K. & Peretti, S.W., Biotechnol. Bioeng. 38, 891-906 (1991)）。そのような変異体リボソームは、細胞性の翻訳を誤調節するものであって、直交性ではない。ＡＳＤ領域内での変異に対する、細胞が生存するかどうかの感受性は、ＡＳＤ内の単一の変化でさえ、プロテオーム合成の破局的且つ全体的な誤調節を介して、細胞死へと導きうるという観察によって強調される（Jacob, W.F., Santer, M. & Dahlberg, A.E., Proc Natl Acad Sci USA 84, 4757-4761 (1987)）。ｒＲＮＡにおける他の変異は、機能的なリボソームのプロセシング又は構築における機能不全をもたらしうる。
【００５３】
国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ２００６／０２６３７号パンフレットは、野生型のリボソーム及びｍＲＮＡに関して、複製された大腸菌リボソームｍＲＮＡ対の分子特異性を、複数の直交性リボソーム直交性ｍＲＮＡ対を産生するのに適合させる方法を記載している。これらの対では、リボソームが直交性ｍＲＮＡのみを効率的に翻訳し、直交性ｍＲＮＡは、細胞性リボソームの効率的な基質ではない。そこに記載されている、内因性ｍＲＮＡを翻訳しない直交性リボソームは、細胞遺伝子発現を妨げずに、所望の機能が関連するｍＲＮＡの特異的な翻訳を可能にする。これらの直交性対の相互作用のネットワークが予測及び決定され、転写後にブール論理で細胞をプログラムするのに直交性リボソームｍＲＮＡ対を使用できることが示されている。
【００５４】
国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ２００６／０２６３７号パンフレットは、直交性翻訳機構の進化に関する正及び負の選択を行うための機構を記載している。この選択方法は、複数の直交性リボソームｍＲＮＡ対（Ｏ−リボソーム  Ｏ−ｍＲＮＡ）を進化させるのに適用される。機能が関連する及び非同族の、Ｏ−リボソームとＯ−ｍＲＮＡとの相互作用のネットワークに関する、成功した予測も記載されている。
【００５５】
本発明者らは、ここに、リボソームの分子解読特性を拡張する、新規の、さらに改変された直交性リボソームと、そのようなＯ−リボソームを産生する方法とを提供する。詳細には、本発明者らは、より効率的にクアドラプレットコドンを解読する直交性リボソームを進化させる。
【００５６】
本発明者らは、合成の遺伝コード拡張の効率を強化する進化した直交性リボソームを開示する。本発明者らは、直交性リボソームと直交性ｍＲＮＡとで構成された細胞モジュールを提供する。これらの対は、大腸菌（Escherichia coli）における天然のリボソーム−ｍＲＮＡ対と、独立的ではあるが平行して機能する。直交性リボソームはプロテオームを合成せず、天然のリボソームとは異なったｔＲＮＡ解読ルールを用いて動作するように分枝させることができる。ここで、本発明者らは、生細胞内の直交性ｍＲＮＡのコンテクスト内に配置されたクアドラプレットコドンなど、コドンの効率的で高フィデリティーな解読のための直交性リボソーム（ｒｉｂｏ−Ｑ）の進化を実証する。本発明者らは、ｒｉｂｏ−Ｑ、直交性ｍＲＮＡ及び直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ対を組み合わせて、大腸菌における部位特異的な非天然アミノ酸取込みの効率を実質的に増大させる。これは、複数の部位で非天然アミノ酸を取り込むタンパク質の効率的な合成を有利に可能にし、且つ／又は、例えば、タンパク質機能をインビボで探索するために非天然アミノ酸の取込みを用いた実験における、末端欠失タンパク質の機能及び／若しくは表現型への影響を最小にする。
【００５７】
直交性コドン
本発明者らは、直交性ｍＲＮＡコドンを翻訳できる進化したリボソームを記述する。これは、このリボソームが、普遍的な遺伝コードではなく直交性遺伝コードであるコードに従ってｍＲＮＡ情報を解釈することを意味する。これは、コードの相違によってクロストークが排除されている細胞内に存在する２つの別々の遺伝系を有する可能性、又はどのコードがそれを翻訳するのに用いられているかに従って異なったポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子の可能性を含めた多くの可能性を導入するものである。
【００５８】
直交性遺伝コードをそれから構築できる直交性コドンは、普遍的なトリプレットコード以外のコードである。以下の表１に普遍的遺伝コードを示す。
【００５９】
【表１】
2013514799.tif 000003
【００６０】
このコードにおけるある種の変異は天然に存在している。例えば、ミトコンドリアは、ＵＧＡを、鎖終止コドンとして用いるのではなく、トリプトファン（Trp）をコードするのに用いる。加えて、
ほとんどの動物ミトコンドリアは、ＡＵＡをイソロイシンではなくメチオニンに用いており、
全ての脊椎動物のミトコンドリアは、ＡＧＡ及びＡＧＧを鎖終止コドンとして用いており、
酵母ミトコンドリアは、ＣＵで始まる全てのコドンをロイシンではなく、トレオニンに割り当てる（ロイシンは、細胞質ゾルのｍＲＮＡ内と同じように、依然としてＵＵＡ及びＵＵＧによってコードされている）。
植物ミトコンドリアは普遍的コードを用いており、これは、被子植物がミトコンドリア遺伝子を極めて容易にそれらの核に移行させるのを可能にしてきた。
【００６１】
核内遺伝子では、普遍的コードへの違反ははるかにまれである。少数の単細胞真核生物は（それらの３つの終止コドンのうち）１つ又は２つの終止コドンを代わりにアミノ酸に用いていることが見出されている。
【００６２】
大多数のタンパク質は、たとえ、これらのうちの一部は後に、例えばリン酸化によって化学的に改変されうるとしても、上記に示した２０種のアミノ酸から構築されている。
【００６３】
しかし、標準的な２０種の１つではないアミノ酸が伸長中のポリペプチドにｔＲＮＡによって挿入される２つの場合が天然で見出されている。
【００６４】
セレノシステイン。このアミノ酸はＵＧＡによってコードされている。ＵＧＡは依然として鎖終止コドンとして使用されるが、翻訳機構は、いつＵＧＡコドンを終止コドンではなくセレノシステインに使用するべきか判別できる。このコドン使用法は、ある種の古細菌、真正細菌、及び動物で見出されている（ヒトは、セレニウムを含有する２５種の異なったタンパク質を合成する）。
【００６５】
ピロリシン。古細菌の一員で見出された１遺伝子において、ＵＡＧによってこのアミノ酸がコードされている。翻訳機構がＵＡＧに遭遇した場合に、ピロリシンを有するｔＲＮＡを挿入するべきか、又は翻訳を停止するべきかを、それがいかにして知るかはまだ知られていない。
【００６６】
本発明の目的では、上記の全てを普遍的遺伝コードの一部であると考える。
【００６７】
本発明は、自然界で以前に知られていたものではなく、直交性ｍＲＮＡ／ｒＲＮＡ対のコンテクストで開発及び使用される新規なコードを可能にする。
【００６８】
直交性リボソームの選択
直交性リボソーム直交性ｍＲＮＡ対又は直交性分子の他の対を同定するための選択アプローチは、Ｏ−ｍＲＮＡ内の直交性コドンの翻訳に関する選択を必要とする。この選択は、Ｏ−ｍＲＮＡを発現する細胞が、それを発現しないもの、又はより低い効率で発現するもののなかから選択されるような、正の選択が有利である。
【００６９】
多数の様々な正の選択剤が使用できる。最も一般的な選択戦略は、抗生物質存在下での条件的な生存を用いたものである。これらの正の選択のうち、抗生物質であるクロラムフェニコールと組み合わせたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子が最も有用なものの１つであると判明している。当技術分野で知られている他のもの、とりわけ、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン又はストレプトマイシン耐性なども使用できる。
【００７０】
Ｏ−ｍＲＮＡ／Ｏ−ｒＲＮＡ対は、機能が関連する直交性リボソームが翻訳できる直交性転写産物、例えばＣＡＴを宿主細胞内で産生するのに使用し、それによって、上記転写産物によってコードされているポリペプチドの発現の極めて高感度な制御を可能にすることができる。したがって、それらの対は、例えば、直交性ｍＲＮＡが所望のポリペプチドをコードするそのような対をコードする核酸を細胞に導入することによって、所望のポリペプチドを産生するのに用いることができる。直交性リボソームによる直交性ｍＲＮＡの翻訳は、所望のポリペプチドの産生をもたらす。直交性ｍＲＮＡ直交性リボソーム対をコードする細胞の中で産生されるポリペプチドは非天然アミノ酸を含有できると企図されている。
【００７１】
ここに記載する方法は、Ｏ−ｍＲＮＡがＯ−ｒＲＮＡによって翻訳される直交性コドンを含む種における、直交性ｍＲＮＡ直交性ｒＲＮＡ対の選択に適用できる。したがって、これらの方法は、この作用機序が保存されている原核生物種及び真核生物種全体にわたって広範に適用できる。１６Ｓ  ｒＲＮＡの配列は多くの細菌種が知られており、それ自体、細菌種相互の進化上の関係を定義する進化系統樹を作成するのに使用されてきた（例えば、Ludwig & Schleifer, 1994, FEMS Microbiol. Rev. 15: 155-73で概説されている；Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Volumes 1 and 2, Springer, George M. Garrity, ed.も参照）。リボソームデータベースプロジェクトII（Cole JR, Chai B, Farris RJ, Wang Q, Kulam SA, McGarrell DM, Garrity GM, Tiedje JM, Nucleic Acids Res, (2005) 33(Database Issue):D294-D296. doi: 10.1093/nar/gki038）は、リリース９．２８（０５年６月１７日）で、オンライン分析ツールと共に、１５５７０８の、アラインメント及びアノテーションされた１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を提供している。
【００７２】
進化系統樹は、例えばClustalW配列アラインメントアルゴリズムで１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列及び近隣結合法を用いて構築される。１つの種でそのセットを相互に対して直交性にする所与のセットの変異（１６Ｓ  ｒＲＮＡ及びｍＲＮＡ内のコドンにおける）が別の種で同様な効果を有する見込みを、進化系統樹を用いて見積もることができる。したがって、例えば、腸内細菌科の一員（例えば大腸菌）でｍＲＮＡ／１６Ｓ  ｒＲＮＡ対を相互に対して直交性にする変異は、進化系統樹上の異なった科の一員より、同じ科（例えばサルモネラ属（Salmonella））の別の一員で直交性ｍＲＮＡ／直交性リボソーム対をもたらす可能性がより高いであろう。
【００７３】
複数の細菌種が極めて近縁である一部の場合では、１つの種で直交性分子をもたらす１６Ｓ  ｒＲＮＡ変異及びｍＲＮＡ変異に対応する変異を、近縁の種に導入して、その近縁種で直交性ｍＲＮＡ直交性ｒＲＮＡ対を生成することが可能でありうる。複数の細菌種が極めて近縁である場合（例えば大腸菌とサルモネラ属諸種）でも、１つの種から近縁種に直接的に直交性１６Ｓ  ｒＲＮＡ及び直交性ｍＲＮＡを導入して、機能的な直交性ｍＲＮＡ直交性リボソーム対をその近縁種で得ることが可能でありうる。
【００７４】
別法では、直交性ｍＲＮＡ直交性リボソーム対の同定が望まれている種が、１セットの対が既に選択されている種と近縁でない場合（例えば、それらが同じ系統学的な科に属さない場合）、本明細書に記載の選択法を用いて、所望の種で直交性ｍＲＮＡ直交性リボソーム対を生成することができる。簡潔には、変異導入された直交性１６Ｓ  ｒＲＮＡ分子のライブラリーを調製することができる。その後、そのライブラリーを選択された種に導入することができる。本明細書に記載の通り、１又は複数の直交性コドンを用いて、選択されたポリペプチドをコードする配列を含む１又は複数のＯ−ｍＲＮＡ配列を生成することができる（この細菌種は選択剤の活性に感受性でなければならないが、これは当業者によって容易に判定されることである）。その後、Ｏ−ｍＲＮＡと対をなす直交性リボソームを同定するために、上記Ｏ−ｒＲＮＡライブラリーを含む細胞に上記Ｏ−ｍＲＮＡライブラリーを導入し、それに続いて、正の選択マーカーを発現する細胞を得るための正の選択を行うことができる。
【００７５】
本明細書に記載の方法は、病原細菌に加えて、工業用及び農業用に重要な細菌を含めた広範な細菌における翻訳又は他の過程を方向付けるのに有用な分子の同定に適用できる。病原細菌は当業者によく知られており、１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列のみではなく、多数のｍＲＮＡコード配列も含めた配列情報は、GenBankなどの公共データベースで利用可能である。一般的であるが、非限定的な例には、例えば、サルモネラ属諸種、クロストリジウム属（Clostridium）諸種、例えばボツリヌス菌（Clostridium botulinum）及びウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）諸種、例えば黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）；カンピロバクター属（Campylobacter）諸種、例えばカンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、エルシニア属（Yersinia）諸種、例えばペスト菌（Yersinia pestis）、エンテロコリチカ菌（Yersinia enterocolitica）及び仮性結核菌（Yersinia pseudotuberculosis）、リステリア属（Listeria）諸種、例えばリステリア菌（Listeria monocytogenes）、ビブリオ属諸種、例えばコレラ菌（Vibrio cholerae）、腸炎ビブリオ菌（Vibrio parahaemolyticus）及びビブリオ・バルニフィカス（Vibrio vulnificus）、セレウス菌（Bacillus cereus）、エロモナス属（Aeromonas）諸種、例えばエロモナス腸炎原因菌（Aeromonas hydrophila）、赤痢菌属（Shigella）諸種、ストレプトコッカス属（Streptococcus）諸種、例えば化膿性レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）、大便レンサ球菌（Streptococcus faecalis）、フェシウム菌（Streptococcus faecium）、肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・デュランス（Streptococcus durans）及びストレプトコッカス・アヴィウム（Streptococcus avium）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、クレブシエラ属（Klebsiella）諸種、エンテロバクター属（Enterobacter）諸種、プロテウス属（Proteus）諸種、シトロバクター属（Citrobacter）諸種、好気菌属（Aerobacter）諸種、プロビデンシア属（Providencia）諸種、ナイセリア属（Neisseria）諸種、例えば淋菌（Neisseria gonorrhea）及び髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、ヘモフィルス属（Haemophilus）諸種、例えばインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、ヘリコバクター属（Helicobacter）諸種、例えばピロリ菌（Helicobacter pylori）、ボルデテラ属（Bordetella）諸種、例えば百日咳菌（Bordetella pertussis）、セラチア属（Serratia）諸種、並びに大腸菌の病原種、例えば腸内毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ，Enterotoxigenic E. coli）、腸病原性大腸菌（ＥＰＥＣ，enteropathogenic E. coli）及び腸管出血性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＥＨＥＣ，enterohemorrhagic E. coli）が含まれる。
【００７６】
終結因子１／アンバーコドン
末端欠失タンパク質に比した完全長タンパク質合成の効率を最大にするには、所望の遺伝子の発現への、終結因子１（ＲＦ−１）媒介鎖終止の影響を最小にするのが有利であろう。
【００７７】
天然のリボソームとは異なり、直交性リボソームはプロテオームを合成する原因とはならず、それゆえ、天然のリボソームでは致死又はドミナントネガティブ効果を引き起こす高度に保存されたｒＲＮＡでの変異に対して寛容性がある。したがって、ＲＦ−１結合の低減に向けて、直交性リボソームが有利なことに進化している可能性がある。
【００７８】
本発明者らは、生細胞内の直交性ｍＲＮＡのコンテクスト内に配置されたクアドラプレットコドンの、効率的且つ高フィデリティーな解読のための、直交性リボソーム（ｒｉｂｏ−Ｑ）の合成的進化を開示する。ｒｉｂｏ−Ｑは、大腸菌における部位特異的な非天然アミノ酸の取込み効率を有利に有意に増大させるように、直交性ｍＲＮＡ及び直交性アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ対と好ましくは組み合わせることができる。この効率の増大は、複数の部位で非天然アミノ酸を組み込むタンパク質を合成することを可能にし、インビボでの末端欠失タンパク質の機能及び表現型への影響を最小限にする。これは、例えば非天然アミノ酸を取り込むタンパク質の製造で、明らかな産業適用及び有用性を有する。
【００７９】
細菌の形質転換
本明細書に記載の方法は、細菌への外来性又は外因性核酸の導入に依存している。外因性核酸を用いた細菌の形質転換の方法、及び、とりわけ、外因性核酸を取り込む能力を細胞に与える方法は、当技術分野でよく知られている。例えば、大腸菌などのグラム陰性菌は、塩化カルシウム又は塩化ルビジウムなどの多価陽イオン薬剤での処理によって、形質転換能が与えられる。グラム陽性菌は、ペプチドグリカン層を除去し、それによってプロトプラストを形成させるために、分解酵素と共にインキュベートすることができる。プロトプラストをＤＮＡ及びポリエチレングリコールと共にインキュベートすれば、細胞融合と、それに伴うＤＮＡの取込みとを得る。これらの例の両方において、ＤＮＡが直鎖上であれば、それはヌクレアーゼに感受性となる傾向があり、それゆえ、形質転換は、共有結合閉環状ＤＮＡを使用した場合に最も効率的である。別法では、形質転換を改善するために、ヌクレアーゼ欠失細胞（ＲｅｃＢＣ−株）を用いることができる。
【００８０】
細菌細胞に核酸を導入するには、エレクトロポレーションもよく知られている。例えば大腸菌などのグラム陰性菌のエレクトロポレーションを行う方法はよく知られているが、とりわけエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）などのグラム陽性菌のエレクトロポレーションに関してもよく知られており、例えば、Dunny et al., 1991, Appl. Environ. Microbiol. 57: 1194-1201に記載されている。
【００８１】
インビボにおけるデザイナーアミノ酸の遺伝学的にプログラムされた取込みは、タンパク質の特性を分子的精度で仕立てることを可能にする(Xie, J. & Schultz, P. G. A chemical toolkit for proteins--an expanded genetic code. Nat Rev Mol Cell Biol 7, 775-82 (2006))。メタノコックス・ヤンナシイ（Methanococcus jannaschii）チロシル−ｔＲＮＡシンセターゼ／ｔＲＮＡＣＵＡ（ＭｊＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ）(Steer, B. A. & Schimmel, P. Major anticodon-binding region missing from an archaebacterial tRNA synthetase. J Biol Chem 274, 35601-6 (1999)、Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L. & Schultz, P. G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 11020-4 (2002))、及びメタノサルシナ・バーケリ（Methanosarcina barkeri）ピロリジル−ｔＲＮＡシンセターゼ／ｔＲＮＡＣＵＡ（ＭｂＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ）(Srinivasan, G., James, C. M. & Krzycki, J. A. Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: charging of a UAG-decoding specialized tRNA. Science 296, 1459-62 (2002)、Polycarpo, C. et al. An aminoacyl-tRNA synthetase that specifically activates pyrrolysine. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 12450-4 (2004)、Neumann, H., Peak-Chew, S. Y. & Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Nat Chem Biol 4, 232-4 (2008))の直交性した対は、大腸菌内のアンバーコドンに反応して、さまざまな非天然アミノ酸を組み込むように進化した(Xie, J. & Schultz, P. G. A chemical toolkit for proteins--an expanded genetic code. Nat Rev Mol Cell Biol 7, 775-82 (2006)、Neumann, H., Peak-Chew, S. Y. & Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Nat Chem Biol 4, 232-4 (2008)、Nguyen, D. P. et al. Genetic encoding and labeling of aliphatic azides and alkynes in recombinant proteins via a pyrrolysyl-tRNA Synthetase/tRNA(CUA) pair and click chemistry. J Am Chem Soc 131, 8720-1 (2009))。しかし、普遍的な遺伝コードにおけるあらゆるトリプレットコドンがプロテオームの合成をコードするのに用いられているので、合成の遺伝コード拡張の可能性は、通常、一度に一つのタイプの非天然アミノ酸の低効率の取込みに限定される。複数の異なる非天然アミノ酸をタンパク質内に効率的にコードするためには、ｉ）空白コドン、及びii）非天然アミノ酸を認識し、新規のコドンを解読する互いに直交性したアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対が必要とされる。ここで、本発明者らは、一連のクアドラプレットコドン及びアンバーコドンを効率的に解読する直交性リボソーム(Rackham, O. & Chin, J. W. A network of orthogonal ribosome x mRNA pairs. Nat Chem Biol 1, 159-66 (2005)、Wang, K., Neumann, H., Peak-Chew, S. Y. & Chin, J. W. Evolved orthogonal ribosomes enhance the efficiency of synthetic genetic code expansion. Nat Biotechnol 25, 770-7 (2007))（ｒｉｂｏＱ１）を合成進化させ、それが特異的に翻訳する、直交性ｍＲＮＡ上のいくつかの空白コドンを提供する(Rackham, O. & Chin, J. W. A network of orthogonal ribosome x mRNA pairs. Nat Chem Biol 1, 159-66 (2005))。互いに直交性したアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対を作製して、これらをｒｉｂｏＱ１に組み合わせることによって、本発明者らは、直交性ｍＲＮＡ上の２つの新規の空白コドンに反応した、異なる非天然アミノ酸の取込みを指示する（図５）。このコードを用いて、本発明者らは、コードされたアジド及びアルキン含有アミノ酸のバイオ直交性型付加環化(Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V. & Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl 41, 2596-9 (2002))を介した、特異的な酸化還元非感受性のナノスケールタンパク質架橋の形成を遺伝学的に指示する。使用されるシンセターゼ／ｔＲＮＡ対は、多数の非天然アミノ酸を組み込むように進化している(Xie, J. & Schultz, P. G. A chemical toolkit for proteins--an expanded genetic code. Nat Rev Mol Cell Biol 7, 775-82 (2006)、Neumann, H., Peak-Chew, S. Y. & Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Nat Chem Biol 4, 232-4 (2008)、Nguyen, D. P. et al. Genetic encoding and labeling of aliphatic azides and alkynes in recombinant proteins via a pyrrolysyl-tRNA Synthetase/tRNA(CUA) pair and click chemistry. J Am Chem Soc 131, 8720-1 (2009))ので、このアプローチを用いて、２００を超える非天然アミノ酸の組合せをコードすることが可能であろう。ｒｉｂｏ−Ｑ１は一連のクアドラプレットコドンを独立して解読するので、この研究は、細胞における非天然ポリマーのコードされた合成及び合成進化のための基礎をなす技術を提供する。
【００８２】
リボソームは、拡張アンチコドンｔＲＮＡを解読するために、拡張アンチコドンｔＲＮＡをその解読センターに収容しなければならない(Atkins, J. F. & Bjork, G. R. A gripping tale of ribosomal frameshifting: extragenic suppressors of frameshift mutations spotlight P-site realignment. Microbiol Mol Biol Rev 73, 178-210 (2009)、Stahl, G., McCarty, G. P. & Farabaugh, P. J. Ribosome structure: revisiting the connection between translational accuracy and unconventional decoding. Trends Biochem Sci 27, 178-83 (2002))。天然のリボソームは、クアドラプレット解読の効率が非常に悪く、クアドラプレット解読に向けた進化もできない（図６）。それは、プロテオームの誤読を増大させるであろう。対照的に、直交性リボソーム(Rackham, O. & Chin, J. W. A network of orthogonal ribosome x mRNA pairs. Nat Chem Biol 1, 159-66 (2005))は、直交性メッセージに特異的に向けられたものであって、プロテオームを合成する原因とならず、原理的に、直交性メッセージ上のクアドラプレットコドンを効率的に解読するように進化させ得る。クアドラプレット解読を強化する進化した直交性リボソームを発見するために、本発明者らは、最初に、ｒｉｂｏ−Ｘ（直交性メッセージ上でアンバーコドンを効率的に解読するように以前に進化した直交性リボソーム(Wang, K., Neumann, H., Peak-Chew, S. Y. & Chin, J. W. Evolved orthogonal ribosomes enhance the efficiency of synthetic genetic code expansion. Nat Biotechnol 25, 770-7 (2007))）の１６Ｓ  ｒＲＮＡにおける１１の飽和変異誘発ライブラリーを作製した（併せて、これらのライブラリーは、解読センター内で結合したｔＲＮＡの１２Å以内にある１２７ヌクレオチドをカバーしている(Selmer, M. et al. Structure of the 70S ribosome complexed with mRNA and tRNA. Science 313, 1935-42 (2006))）（図７）。本発明者らは、直交性ｍＲＮＡ上のアンバーコドンを効率的に解読する能力を維持しながら、クアドラプレットコドンを効率的に解読する能力を獲得し、それによって、その直交性リボソーム上で解読できる追加コドンの数が最大になる、進化した直交性リボソームを発見することを望んでいたので、本発明者らは、ライブラリー作製の出発点としてｒｉｂｏ−Ｘを用いた。
【００８３】
拡張アンチコドンｔＲＮＡを用いて効率的にクアドラプレットコドンを解読する直交性リボソームを選択するために、本発明者らは、各Ｏ−リボソームライブラリーをレポーターコンストラクト（Ｏ−ＣＡＴ（ＡＡＧＡ１４６）／ｔＲＮＡＳｅｒ２ＵＣＵＵ）と組み合わせた。このレポーターは、Ｏ−リボソーム(Wang, K., Neumann, H., Peak-Chew, S. Y. & Chin, J. W. Evolved orthogonal ribosomes enhance the efficiency of synthetic genetic code expansion. Nat Biotechnol 25, 770-7 (2007))、インフレームのＡＡＧＡクアドラプレットのコドン、及びｔＲＮＡＳｅｒ２ＵＣＵＵ（大腸菌セリル−ｔＲＮＡシンセターゼによってアミノアシル化され、ＡＡＧＡコドンを解読する、ｔＲＮＡＳｅｒ２の設計されたバリアント(Wang, K., Neumann, H., Peak-Chew, S. Y. & Chin, J. W. Evolved orthogonal ribosomes enhance the efficiency of synthetic genetic code expansion. Nat Biotechnol 25, 770-7 (2007)、Magliery, T. J., Anderson, J. C. & Schultz, P. G. Expanding the genetic code: selection of efficient suppressors of four-base codons and identification of "shifty" four-base codons with a library approach in Escherichia coli. J Mol Biol 307, 755-69 (2001))）によって特異的に翻訳されるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含有している。ｔＲＮＡＳｅｒ２ＵＣＵＵが効率的にＡＡＧＡコドンを解読して、リーディングフレームを回復する場合にのみ、直交性ｃａｔ遺伝子がインフレームで読まれ、クロラムフェニコール抵抗性を与える。クローンは、ｒｉｂｏ−Ｘを含有する細胞を殺すクロラムフェニコール濃度で生き残り、ｃａｔレポーターは４つの異なる配列を有する。クローンｒｉｂｏ−Ｑ４は、Ｃ１１９５Ａ及びＡ１１９６Ｇにおける二重変異を有し、ｒｉｂｏ−Ｑ３は、Ｃ１１９５Ｔ、Ａ１１９６Ｇ、及びＡ１１９７Ｇにおける三重変異を有し、ｒｉｂｏ−Ｑ２及びｒｉｂｏ−Ｑ１は、Ａ１１９６Ｇ及びＡ１１９７Ｇにおける二重変異を有し、ｒｉｂｏ−Ｑ２は、さらに８つのプログラムされていない変異を有する。解読センター全体が変異導入されたが、選択された変異は空間的に局在しており、解読センターにおける拡張アンチコドン：コドン相互作用を収容しているのかもしれない（図１ａ）。進化していないリボソームに代わってｒｉｂｏ−Ｑリボソームによってｃａｔ遺伝子が翻訳される場合、ｔＲＮＡｓｅｒ２ＵＣＵＵ及び２つのＡＧＧＡコドンを有するｃａｔを含有する細胞のクロラムフェニコール抵抗性は大いに強化される（図１ｂ、ｃ）。実際、ｒｉｂｏＱリボソームによって読まれる２つのＡＧＧＡコドンを含有する細胞のクロラムフェニコール抵抗性は野生型ｃａｔ遺伝子の抵抗性に接近するものである。これは、ｒｉｂｏＱ１によるクアドラプレットコドン解読の効率が、トリプレット解読の効率に接近するものであり、進化していないリボソームよりはるかに大きいものであり得ることを示唆する。クアドラプレット解読効率の増強は、様々なクアドラプレットコドンーアンチコドン相互作用について維持されている（図８）。
【００８４】
天然リボソームは、高いフィデリティー（fidelity）でトリプレットコドンを解読する（１コドン当たり１０−２〜１０−４エラーの範囲のエラー頻度が報告されている(Khazaie, K., Buchanan, J. H. & Rosenberger, R. F. The accuracy of Q beta RNA translation. 1. Errors during the synthesis of Q beta proteins by intact Escherichia coli cells. Eur J Biochem 144, 485-9 (1984)、Laughrea, M., Latulippe, J., Filion, A. M. & Boulet, L. Mistranslation in twelve Escherichia coli ribosomal proteins. Cysteine misincorporation at neutral amino acid residues other than tryptophan. Eur J Biochem 169, 59-64 (1987)、Kramer, E. B. & Farabaugh, P. J. The frequency of translational misreading errors in E. coli is largely determined by tRNA competition. Rna 13, 87-96 (2007))）。進化した直交性リボソーム及び前駆体リボソームについて、トリプレット解読及びクアドラプレット解読のフィデリティーを明確に比較するために、本発明者らは、２つの独立した方法：その遺伝子内にシステインコドンを含有していないタンパク質内への３５Ｓシステインの取込み(Wang, K., Neumann, H., Peak-Chew, S. Y. & Chin, J. W. Evolved orthogonal ribosomes enhance the efficiency of synthetic genetic code expansion. Nat Biotechnol 25, 770-7 (2007))、及び二重ルシフェラーゼシステムのバリアント(Wang, K., Neumann, H., Peak-Chew, S. Y. & Chin, J. W. Evolved orthogonal ribosomes enhance the efficiency of synthetic genetic code expansion. Nat Biotechnol 25, 770-7 (2007)、Kramer, E. B. & Farabaugh, P. J. The frequency of translational misreading errors in E. coli is largely determined by tRNA competition. Rna 13, 87-96 (2007))を用いた（図９）。本発明者らは、トリプレット及びクアドラプレット解読の翻訳フィデリティーが、進化したリボソーム（ｒｉｂｏ−Ｑ１）及び進化していない野生型リボソームについて同じであること、並びにコドンーアンチコドン相互作用の４番目の塩基がすべてのリボソームによって等しく良く識別されることを見出す（図９）。
【００８５】
ｒｉｂｏ−Ｘの強化されたアンバー解読特性がｒｉｂｏ−Ｑ１で維持されていることを実証するために、本発明者らは、直交性リボソーム及び以前に進化させたｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニルｔＲＮＡシンセターゼ／ｔＲＮＡＣＵＡ対(Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L. & Schultz, P. G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 11020-4 (2002))（ＢｐａＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ）を用いて、直交性ｍＲＮＡ上のアンバーコドンに反応して、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｂｐａ、１）を組換えＧＳＴ−ＭＢＰ融合体に組み込む効率を比較した（図２）。Ｒｉｂｏ−Ｑ１及びｒｉｂｏ−Ｘは、直交性ｍＲＮＡ中のアンバーコドンに反応して、匹敵する高い効率で１を組み込む（図２ａにおけるレーン４＆６とレーン１０＆１２を比較）。Ｒｉｂｏ−Ｘ及びｒｉｂｏ−Ｑ１は、アンバー抑制を介して、１を組み込むのが、野生型リボソームより実質的に効率的である（図２ａにおけるレーン４＆６とレーン２、及びレーン１０＆１２とレーン８を比較）。
【００８６】
クアドラプレットコドンに反応して、非天然アミノ酸を組み込むためのｒｉｂｏ−Ｑ１の有用性を実証するために、本発明者らは、ｒｉｂｏ−Ｑ１又は野生型リボソームを用いて、クアドラプレットコドンに反応して、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（ＡｚＰｈｅ、２）を、組換えＧＳＴ−ＭＢＰ融合体に組み込む効率を比較した。２の取込みを指示するために、本発明者らは、ＡｚＰｈｅＲＳ＊／ｔＲＮＡＵＣＣＵ対（以下に記載のように、２の取込みのために、ＭｊＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ対に由来するｐＡｚＰｈｅＲＳ−７／ｔＲＮＡＣＵＡ対のバリアント(Chin, J. W. et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. J Am Chem Soc 124, 9026-7 (2002))）を用いた。本発明者らは、ｒｉｂｏ−Ｑ１が、クアドラプレットコドンに反応した２の取込みの効率を実質的に増強すること、及び２つのクアドラプレットコドンに反応した２の取込みを初めて可能にすることさえ見出す（図２ｂにおけるレーン２＆６とレーン４＆８を比較）。２の取込みの部位とフィデリティーを、適切なトリプティックペプチドのタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）断片化シリーズの分析によってさらに確認した（図１１）。
【００８７】
組換えタンパク質における複数の異なる非天然アミノ酸の取込みにｒｉｂｏ−Ｑ１を利用するために、本発明者らは、互いに直交したアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ／ｔＲＮＡ対を必要とした。本発明者らは、それぞれが様々な非天然アミノ酸を組み込むように以前に進化している(Xie, J. & Schultz, P. G. A chemical toolkit for proteins--an expanded genetic code. Nat Rev Mol Cell Biol 7, 775-82 (2006)、Neumann, H., Peak-Chew, S. Y. & Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Nat Chem Biol 4, 232-4 (2008)、Nguyen, D. P. et al. Genetic encoding and labeling of aliphatic azides and alkynes in recombinant proteins via a pyrrolysyl-tRNA Synthetase/tRNA(CUA) pair and click chemistry. J Am Chem Soc 131, 8720-1 (2009)、Mukai, T. et al. Adding l-lysine derivatives to the genetic code of mammalian cells with engineered pyrrolysyl-tRNA synthetases. Biochem Biophys Res Commun 371, 818-22 (2008))、ＭｂＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ対(Srinivasan, G., James, C. M. & Krzycki, J. A. Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: charging of a UAG-decoding specialized tRNA. Science 296, 1459-62 (2002)、Polycarpo, C. et al. An aminoacyl-tRNA synthetase that specifically activates pyrrolysine. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 12450-4 (2004))及びＭｊＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ対(Steer, B. A. & Schimmel, P. Major anticodon-binding region missing from an archaebacterial tRNA synthetase. J Biol Chem 274, 35601-6 (1999))が、それらのアミノアシル化の特異性において互いに直交性していることを実証した（図１２）。本発明者らは、一般に適用可能な一連の指向性の進化ステップによって、ＭｊＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ対に由来する、ＡｚＰｈｅＲＳ＊／ｔＲＮＡＵＣＣＵ対を作製した（図１３〜１５）。ＭｂＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ対及びＡｚＰｈｅＲＳ＊／ｔＲＮＡＵＣＣＵ対は、互いに直交している。すなわち、それらは、異なるコドンを解読し、異なるアミノ酸を用い、それらのアミノアシル化の特異性において直交している（図１６）。
【００８８】
単一タンパク質内への２つの有用な非天然アミノ酸の同時取込みを実証するために、本発明者らは、大腸菌で、ＭｂＰｙｌＲＳ／ＭｂｔＲＮＡＣＵＡ対、ＡｚＰｈｅＲＳ＊ｔＲＮＡＵＣＣＵ対、及びｒｉｂｏ−Ｑ１を組み合わせた。本発明者らは、２（ＡｚＰｈｅ）及びＮ６−［（２−プロピニルオキシ）カルボニル］−Ｌ−リジン（ＣＡＫ、４、ＭｂＰｙｌＲＳの効率的な基質であることを本発明者らが最近発見した(Nguyen, D. P. et al. Genetic encoding and labeling of aliphatic azides and alkynes in recombinant proteins via a pyrrolysyl-tRNA Synthetase/tRNA(CUA) pair and click chemistry. J Am Chem Soc 131, 8720-1 (2009))）を含有する完全長ＧＳＴ−カルモジュリンを、直交性遺伝子内のＡＧＧＡ及びＵＡＧコドンに反応して産生させるのにこれらの構成要素を用いた（図３）。完全長タンパク質の産生は、両方の非天然アミノ酸の添加を必要とした。本発明者らは、遺伝学的にプログラムされた部位における２及び４の取込みを、両方の非天然アミノ酸を含有する単一のトリプティック断片のＭＳ／ＭＳ配列決定によってさらに確認した（図３）。
【００８９】
非天然アミノ酸の組合せを介して、創発的な特性がタンパク質にプログラムできることの実証を始めるために、本発明者らは、銅触媒のヒュスゲン[２＋３]環化付加反応（「クリック反応」）(Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V. & Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl 41, 2596-9 (2002))を介した、トリアゾール化合物架橋の形成を遺伝学的に指示した。本発明者らは、最初に、カルモジュリン内の位置１及び１４９に２及び４をコードした（図４）。これらの位置にアジド（２）及びアルキン（４）を組み込むカルモジュリンをＣｕ（Ｉ）と５分間インキュベートした後、本発明者らは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでより迅速に移動するタンパク質バンドを観察する。ＭＳ／ＭＳ配列決定は、このより速い移動バンドが、２と４の間のバイオ直交した環化付加反応の産物から生じることを明確に確認する。本発明者らの結果は、ナノメートルスケールのタンパク質構造を特異的に制約するのに用いることができる新規クラスの非対称的な酸化還元非感受性の架橋の遺伝学的にプログラムされた近接加速を実証する。組換えタンパク質の既存のタンパク質環化方法(Camarero, J. A., Pavel, J. & Muir, T. W. Chemical Synthesis of a Circular Protein Domain: Evidence for Folding-Assisted Cyclization. Angewandte Chemie - International Edition 37, 347-349 (1998)、Scott, C. P., Abel-Santos, E., Wall, M., Wahnon, D. C. & Benkovic, S. J. Production of cyclic peptides and proteins in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 13638-43 (1999))と異なって、これらの架橋は、末端に配置するのみでなく、タンパク質内の空間的に適合するいかなる部位にもコードすることができる。固相ペプチド合成によってペプチドで利用できる化学的に多様な環化方法(Li, P. & Roller, P. P. Cyclization strategies in peptide derived drug design. Curr Top Med Chem 2, 325-41 (2002))とは対照的に、これらの架橋は、本質的にはいかなるサイズのタンパク質内にもコードすることができる。天然の治療用タンパク質及びホルモンにおけるジスルフィド結合の重要性、ペプチドステープリング戦略の有用性(Walensky, L. D. et al. Activation of apoptosis in vivo by a hydrocarbon-stapled BH3 helix. Science 305, 1466-70 (2004))、ペプチド環化の重要性(Trauger, J. W., Kohli, R. M., Mootz, H. D., Marahiel, M. A. & Walsh, C. T. Peptide cyclization catalysed by the thioesterase domain of tyrocidine synthetase. Nature 407, 215-8 (2000))、並びに天然化学連結によって環化されたタンパク質の安定性の改善(Camarero, J. A., Pavel, J. & Muir, T. W. Chemical Synthesis of a Circular Protein Domain: Evidence for Folding-Assisted Cyclization. Angewandte Chemie - International Edition 37, 347-349 (1998))を考慮すると、これらの架橋のコーディングを指向的な進化方法と組み合わせることによって利用できるタンパク質機能の増進を調査するのは興味深い。非天然アミノ酸の取込みのために報告されている多数のバリアントＭｊＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ及びＭｂＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ対(Xie, J. & Schultz, P. G. A chemical toolkit for proteins--an expanded genetic code. Nat Rev Mol Cell Biol 7, 775-82 (2006)、Neumann, H., Peak-Chew, S. Y. & Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Nat Chem Biol 4, 232-4 (2008)、Nguyen, D. P. et al. Genetic encoding and labeling of aliphatic azides and alkynes in recombinant proteins via a pyrrolysyl-tRNA Synthetase/tRNA(CUA) pair and click chemistry. J Am Chem Soc 131, 8720-1 (2009))（ここ��報告するステップを用いた適切なアンチコドン変換の後に）をｒｉｂｏ−Ｑ１と組み合わせて、組換えタンパク質内の２００超のアミノ酸の組合せをコードすることが可能である。
【００９０】
実験(方法の概要)
クローニング、部位特異的変異導入、及びライブラリー構築のための方法は、補足の材料に記載されている。ｒｉｂｏ−Ｘ９を発見する戦略の改変を用いて、クアドラプレットサプレッサーを求めて、リボソームライブラリーをスクリーニングした。
【００９１】
すべてのタンパク質発現実験において、適切な抗生物質及び非天然アミノ酸を補ったＬＢ培地を用いて、大腸菌ｇｅｎｅｈｏｇｓ又はＤＨ１０Ｂを用いた。タンパク質は、公表されている標準的なプロトコールを用いて、アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
【００９２】
進化したＯ−リボソームの翻訳フィデリティーは、３５Ｓ標識されたシステインの誤取込みによって測定した(Wang, K., Neumann, H., Peak-Chew, S. Y. & Chin, J. W. Evolved orthogonal ribosomes enhance the efficiency of synthetic genetic code expansion. Nat Biotechnol 25, 770-7 (2007))。簡潔には、３５Ｓシステインの存在下に、Ｏ−リボソームによってＧＳＴ−ＭＢＰを産生させた。タンパク質を精製し、トロンビン（ＧＳＴとＭＢＰの間のリンカーを切断する）で切断し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びホスホイメージングによって分析した。改変二重ルシフェラーゼアッセイを用いて、Ｏ−リボソームの翻訳フィデリティーを測定した(Wang, K., Neumann, H., Peak-Chew, S. Y. & Chin, J. W. Evolved orthogonal ribosomes enhance the efficiency of synthetic genetic code expansion. Nat Biotechnol 25, 770-7 (2007))。このアッセイにおける不活性化ミスセンス変異を含有するルシフェラーゼ変異体からのルミネッセンスが、リボソームの翻訳不正確性の尺度である。ＤＬＲをＯ−リボソームによって翻訳し、寒冷下で抽出し、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Promega社製）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。
【００９３】
タンパク質のＬＣ／ＭＳ／ＭＳは、NextGen Science社（Ann Arbor, USA）が行った。タンパク質を、クマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切り出し、トリプシンで消化し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析した。総タンパク質質量は、ＥＳＩ−ＭＳによって得た。精製タンパク質を１０ｍＭ重炭酸アンモニウムｐＨ７．５中に透析し、１％ギ酸を含む５０％メタノール中に１：１に混合し、総質量を陽イオンモードで決定した。
【００９４】
５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８．３中の精製タンパク質への環化反応を、１ｍＭアスコルビン酸、１ｍＭ  ＣｕＳＯ４、及び２ｍＭバトフェナントロリンの存在下で、室温で５分間行った。すべての方法の詳細は、補足の材料において見出すことができる。
【００９５】
定義
「含む（comprises）」（含む（comprise）、含むこと（comprising））という用語は、当技術分野における正常な意味を有し、すなわち、述べられた特徴又は特徴の群が含まれるが、この用語は、いかなる他の述べられた特徴又は特徴の群が存在することも除外しないと理解するべきである。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】直交性クアドラプレット解読リボソームの選択及び特性分析を示す図である。ａ．クアドラプレット解読リボソーム内の変異は、拡張アンチコドンｔＲＮＡによって潜在的に占有される空間に近い構造的クラスターを形成する。選択されたヌクレオチドを赤で示す。ｂ．Ｒｉｂｏ−Ｑは、クアドラプレットコドンのｔＲＮＡ解読を実質的に強化する。Ｏ−ｃａｔ（ＡＧＧＡ１０３、ＡＧＧＡ１４６）遺伝子内のＡＧＧＡコドンの解読のｔＲＮＡｓｅｒ２ＵＣＣＵ依存性増強を、漸増濃度のクロラムフェニコール（Ｃｍ）における生存によって測定した。ｃ．ｂの通り、但し、アセチル化クロラムフェニコール（ＡｃＣｍ）の直接的薄層クロマトグラフィーによってＣＡＴ酵素活性を測定する。ｒｉｂｏ−Ｘ（Ｒｘ）、ｒｉｂｏ−Ｑ１−４（Ｑ１−Ｑ４）、及びＯ−リボソーム（Ｏ）
【図２】ｒｉｂｏ−Ｑ１存在化における、アンバーコドン及びクアドラプレットコドンに反応した、非天然アミノ酸の取込みの強化を示す図である。ａ．Ｒｉｂｏ−Ｑ１は、ｒｉｂｏ−Ｘと同じように効率的にＢｐａ（ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン）を組み込む。ゲル全体は図１０に示されている。ｂ．Ｒｉｂｏ−Ｑ１は、ＡｚＰｈｅＲＳ＊／ｔＲＮＡＵＣＣＵを用いて、ＡＧＧＡクアドラプレットコドンに反応する効率ＡｚＰｈｅ（ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン）を強化する。ＧＳＴ−ＭＢＰ対ＧＳＴの比率を示すゲル並びに単一及び二重のＡｚＰｈｅ取込みのＭＳ／ＭＳスペクトルを図１１に示す。（ＵＡＧ）ｎ又は（ＡＧＧＡ）ｎは、ｇｓｔとｍａｌＥとの間のアンバーコドン又はＡＧＧＡコドンの数（ｎ）を示す。
【図３】直交性翻訳を介した、単一タンパク質中におけるアジド及びアルキンのコーディングを示す図である。ａ．２つの非天然アミノ酸を含有するＧＳＴ−ＣａＭ−Ｈｉｓ６（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼカルモジュリンｈｉｓ６融合体）の発現。カルモジュリン（ＣａＭ）の位置１にＡＧＧＡコドンを含有し、位置４０にアンバーコドンを含有するＧＳＴ−ＣａＭ−Ｈｉｓ６融合体を産生する直交性遺伝子が、ＡｚＰｈｅＲＳ＊／ｔＲＮＡＵＣＣＵ及びＭｂＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡの存在下において、ｒｉｂｏ−Ｑ１によって翻訳された。ゲル全体は図１７に示されている。ｂ．ＧＳＴ−ＭＢＰのリンカー領域への、２つの異なる非天然アミノ酸の取込みのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析（２はＹ＊と表示されており、４はＫ＊と表示されている）。
【図４】Ｃｕ（Ｉ）触媒のヒュスゲン［３＋２］−環化付加を介した、カルモジュリンの遺伝学的に指示された環化を示す図である。ａ．２及び４の取込みの部位を示すカルモジュリンの構造並びにそれらのトリアゾール化合物産物。画像は、Pymol（www.pymol.org）及びｐｄｂ−ファイル４ＣＬＮを用いて作成した。ｂ．ＧＳＴ−ＣａＭ−Ｈｉｓ６  １ＡｚＰｈｅ  １４９ＣＡＫはＣｕ（Ｉ）触媒で特異的に環化する。ＡｚＰｈｅは２、Ｔｙｒはチロシン、ＢｏｃＫは３、ＣＡＫは４である。レーン１及び２は別々のゲルからのものである。ｃ．ＬＣ／ＭＳ／ＭＳはトリアゾール化合物形成を確認する。架橋を含有する二重荷電されたペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトル（ｍ／ｚ＝１２２６．６０９２、これは、架橋されたペプチドについて予測された質量の１．８ｐｐｍ以内である）。
【図５】直交性遺伝コードを合成するための戦略を示す図である。相互に直交した２対（ＭｂＰｙｌＲＳ／ＭｂｔＲＮＡＣＵＡ及びＭｊＡｚＰｈｅＲＳ＊／ｔＲＮＡＵＣＣＵ）を、進化した直交性リボソーム（Ｒｉｂｏ−Ｑ）と組み合わせることで、直交性ｍＲＮＡ（Ｏ−ｍＲＮＡ）上のＵＡＧコドン及びＡＧＧＡコドンを解読して、遺伝的にコードされた部位に２つの異なる非天然アミノ酸を含有するタンパク質を産生することができるシステムが作製される。ＵＡＧは、ＭｂＰｙｌＲＳ／ＭｂｔＲＮＡＣＵＡによって、４（ＣＡＫ）又は３（ＢｏｃＬｙｓ）として解読され、一方、ＡＧＧＡは２として解読される。
【図６】直交性クアドラプレット解読リボソームの進化を示す図である。天然のリボソーム（灰色）及び前駆体直交性リボソーム（緑色）は、トリプレットアンチコドンを有するｔＲＮＡを利用して、それぞれ、ｗｔ−ｍＲＮＡ（黒色）及び直交性ｍＲＮＡ（紫色）の両方におけるトリプレットコドンを解読する。拡張アンチコドンｔＲＮＡ（赤色）を用いたクアドラプレットコドンの解読は、両方のリボソームで低効率（薄灰色の矢）である。直交性リボソームの合成進化は、変異体（オレンジ色パッチ）の直交性リボソームが、拡張アンチコドンｔＲＮＡを用いて、直交性ｍＲＮＡ上のクアドラプレットコドンをより効率的に解読する進化したシナリオへと導く。直交性リボソームは天然のｍＲＮＡを読まず、天然のリボソームは改変されていないので、天然のｍＲＮＡ上の拡張アンチコドンｔＲＮＡの解読は影響を受けない。
【図７】リボソーム解読センターの包括的変異誘発を示す図である。  Ａ．結合したｔＲＮＡ及びｍＲＮＡを伴ったリボソームの小サブユニットの構造。ｔＲＮＡアンチコドンのステムループが、Ａ部位（黄色）、Ｐ部位（シアン）、及びＥ部位（濃紺）に結合している。ｍＲＮＡを紫色で示す。１６ＳリボソームＲＮＡを緑色、リボソームタンパク質を灰色で示す。１１のライブラリーで変異の標的にされた、解読センター内の１１８残基をオレンジ色で示す（この図は、Pymol v0.99（www.pymol.org）及びＰＤＢ  ＩＤ  ２Ｊ００を用いて作成した）。Ｂ．大腸菌１６ＳリボソームＲＮＡの二次構造（www.rna.ccbb.utexas.edu）。変異の標的にされるヌクレオチドをオレンジ色にして示す。
【図８】Ｒｉｂｏ−Ｑが、異なったクアドラプレットコドンのｔＲＮＡ依存的な解読を強化することを示す図である。Ｒｉｂｏ−Ｘ、Ｒｉｂｏ−Ｑ１−４、及びＯ−リボソームは、pRSF-O-rDNAベクターから産生された。Ｏ−ｃａｔ（ＵＡＧＡ１０３、ＵＡＧＡ１４６）中のＵＡＧＡコドンの解読のｔＲＮＡｓｅｒ２ＵＣＵＡ依存的な増強、Ｏ−ｃａｔ（ＣＣＣＵ１０３、ＣＣＣＵ１４６）中のＣＣＣＵコドンの解読のｔＲＮＡｓｅｒ２ＡＧＧＧ依存的な増強、及びＯ−ｃａｔ（ＡＡＧＡ１４６）中のＡＡＧＡコドンの解読のｔＲＮＡｓｅｒ２ＵＣＵＵ依存的な増強を、漸増濃度のクロラムフェニコールにおける生存によって測定した。pRSF-O-rDNAベクター及び対応するＯ−ｃａｔベクターを、ＧｅｎｅＨｏｇｓ細胞内へと同時形質転換した。形質転換細胞を、２％グルコースを含有するＳＯＢ培地中で１時間回復させ、２００ｍｌのＬＢ−ＧＫＴ（２％グルコース、２５μｇ  ｍｌ−１カナマイシン、及び１２．５μｇ  ｍｌ−１テトラサイクリンを含有するＬＢ培地）に播種するのに用いた。終夜培養（３７℃、２５０ｒ．ｐ．ｍ．、１６時間）の後、２ｍＬの細胞を遠心法（３０００ｇ）によってペレットにし、等容積のＬＢ−ＫＴ（１２．５μｇ  ｍｌ−１カナマイシン及び６．２５μｇ  ｍｌ−１テトラサイクリンを含有するＬＢ培地）で３回洗浄した。再懸濁したペレットを、１８ｍｌのＬＢ−ＫＴに播種するのに用い、この結果得られた培養物をインキュベートした（３７℃、２５０ｒ．ｐ．ｍ．の振盪、９０分間）。Ｏ−ｒＲＮＡをコードしたプラスミドの発現を誘導するために、２ｍｌの培養物を１８ｍｌのＬＢ−ＩＫＴ（１．１ｍＭイソプロピル−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、１２．５μｇ  ｍｌ−１カナマイシン、及び６．２５μｇ  ｍｌ−１テトラサイクリンを含有するＬＢ培地）に添加し、４時間インキュベートした（３７℃、２５０ｒ．ｐ．ｍ．）。５０μｇ  ｍｌ−１クロラムフェニコールを補ったＬＢ−ＩＫＴ寒天（１ｍＭ  ＩＰＴＧ、１２．５μｇ  ｍｌ−１カナマイシン、及び６．２５μｇ  ｍｌ−１テトラサイクリンを含有するＬＢ寒天）上にアリコート（２５０μｌ、６００ｎｍの光学濃度（ＯＤ６００）＝１．５）をプレーティングし、インキュベートした（３７℃、４０時間）。
【図９】進化したリボソームの翻訳フィデリティーが天然のリボソームのものに匹敵することを示す図である。Ａ．３５Ｓ−システインの誤取込みによって測定されたトリプレット解読の誤読頻度は、ｒｉｂｏ−Ｑ１、ｒｉｂｏ−Ｑ３−Ｑ４、ｒｉｂｏ−Ｘ、進化していない直交性リボソーム、及び野生型のリボソームで区別がつかない。GST-MBPを35Sシステインの存在下で各リボソームによって合成し、グルタチオンセファロース上で精製し、トロンビンで消化した。左のパネルは、トロンビン消化産物のクマシー染色を示す。アノテーションのないバンドは、主としてトロンビン調製物から生じる。右のパネルは、Stormホスファーイメジャーを用いて画像化した同じゲルのタンパク質の３５Ｓ標識化を示す。レーン１〜６は、示されているリボソーム（Ｐ１Ｐ２プロモーターからｒＲＮＡをドライブするpSC101*コンストラクトからリボソームＲＮＡが産生される）及びpO-gst-malE（直交性リボソーム用）又はpgst-malE（野生型リボソーム用）を含有する細胞から得られた精製タンパク質のトロンビン切断反応を示す。サイズマーカーは、着色スタンダード(Bio-Rad社製161-0305)である。この方法で測定される、ｒｉｂｏ−Ｑリボソームによって翻訳されたコドン１つあたりの誤りの頻度は、１×１０−３未満であった。前駆体直交性リボソーム、ｒｉｂｏ−Ｘ及び野生型リボソームを用いた対照実験は、本発明者らがそれらのフィデリティーに同じ限界を設定することを可能にした。この限界は、３５Ｓ誤取込みを用いた以前に測定した誤り頻度（１コドンあたり４×１０−３の誤り）と比較することが好ましい(Rice, J. B., Libby, R. T. & Reeve, J. N. Mistranslation of the mRNA encoding bacteriophage T7 0.3 protein. J Biol Chem 259, 6505-10 (1984))。Ｂ．二重ルシフェラーゼ（dual-luciferase）アッセイで測定される、トリプレット解読におけるｒｉｂｏ−Ｑ１の翻訳フィデリティーは、進化していないリボソームのものに匹敵する。この系では、Ｃ末端ホタルルシフェラーゼが、必須リジン残基をコードするコドンＫ５２９（ＡＡＡ）で変異導入されている。変異遺伝子の発現から生じるホタルルシフェラーゼ活性を野生型のホタルルシフェラーゼと比較し、発現のいかなる可変性も、同時翻訳されるＮ末端ウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼの活性を用いて正規化することによって、この変異体コドンがｔＲＮＡＬｙｓ（ＵＵＵ）によって誤読される程度を決定する。以前の研究は、この系で測定されたホタルルシフェラーゼ活性が、コードされた変異を含有している、より豊富なタンパク質から生じる低い活性ではなく、主として、変異体コドンに反応してリジンを誤取込みした少量のタンパク質の合成の結果生じることを実証している(Kramer, E. B. & Farabaugh, P. J. The frequency of translational misreading errors in E. coli is largely determined by tRNA competition. Rna 13, 87-96 (2007))。ｒｉｂｏ−Ｑ１のフィデリティーを検査する実験では、pSC101*-ribo-Q1、並びにpO-DLR及びそのコドン５２９バリアントを含有する細胞からの溶解物をアッセイした。対照実験は、pSC101*-O-ribosome、並びにｐＯ−ＤＬＲ及びそのコドン５２９バリアントを含有する細胞からの溶解物を用いた。Ｃ．ｒｉｂｏ−Ｑのクアドラプレット解読フィデリティーは、進化していないリボソームのものに匹敵する。効率は、Ｎ末端ウミシイタ���ルシフェラーゼ及びＣ末端ホタルルシフェラーゼを有する二重ルシフェラーゼコンストラクト（Ｒｅｎ−ＦＦ）を用いて決定した。レポーターは、２つのルシフェラーゼの間のリンカーにクアドラプレットＡＧＧＡコドンを含むように変異導入された（Ｒｅｎ−ＡＧＧＡ−ＦＦ）。Ｒｅｎ−ＡＧＧＡ−ＦＦを、非同族のアンチコドンＳｅｒ２Ａ  ｔＲＮＡ（ＵＣＵＡ又はＡＧＧＧ）及びｒｉｂｏ−Ｑ又はＯ−リボソームのいずれかと共にＤＨ１０Ｂ細胞内に形質転換した。Ｒｅｎ−ＡＧＧＡ−ＦＦのリードスルー効率は、ホタルルミネッセンス／ウミシイタケルミネッセンスの比率を取ることによって、測定した。このデータを、ｔＲＮＡの存在下でＲｅｎ−ＦＦコンストラクトを用いた場合の同じホタル／ウミシイタケ比で割った（調査中のＡＧＧＡコドンの外にある部位へのｔＲＮＡの影響について正規化するため）。これらの非同族ｔＲＮＡによる解読のレベルを、機能が関連するｔＲＮＡによる解読の分率として得るために、これらのデータを、ＵＣＣＵアンチコドンを有する機能が関連するＳｅｒ２Ａ  ｔＲＮＡを用いた同じ実験から得られたデータと比較した。データは少なくとも４つの試行の平均を表す。エラーバーは標準偏差を表す。Ｄ  クアドラプレット解読における４番目の塩基の特異性。Ｏ−リボソーム、許容部位におけるクアドラプレットコドンを有する、直交性ｒｂｓの制御下にあるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの遺伝子、及び大腸菌Ｓｅｒ２Ａ  ｔＲＮＡＵＣＣＵの示された組合せを発現する大腸菌ＤＨ１０Ｂに、漸増量のクロラムフェニコールの存在下で増殖するそれらの能力について得点を付けた。活性の分率は、ｍＲＮＡ中の機能が関連するコドンと特定のｏ−リボソームとを含有する組合せに対する、細胞の最大Ｃｍ抵抗性である。
【図１０】ｒｉｂｏ−Ｘの強化されたアンバー解読を維持した状態で、単一及び二重のＵＡＧコドンに反応して、ｒｉｂｏ−Ｑ１がＢｐａＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ依存的な非天然アミノ酸の取込み効率を強化することを示す図である。同一条件下でグルタチオンセファロースから精製された等容積のタンパク質が各レーンに添加されている。直交性リボソームは、pSC101*-ribo-X、pSC101*-ribo-Q1から産生されている。Ｂｐａ、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン（１）。ＢｐａＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ対は、６コピーのＭｊｔＲＮＡＣＵＡを含有するpSUPBpaから産生されている。（ＵＡＧ）ｎは、Ｏ−ｇｓｔ（ＵＡＧ）ｎｍａｌＥ又はｇｓｔ（ＵＡＧ）ｎｍａｌＥ内のｇｓｔとｍａｌＥとの間のアンバー終止コドンの数（ｎ）を表す。ＧＳＴに対するＧＳＴ−ＭＢＰの比率は、ＲＦ−１媒介終止に対するアンバー抑制の効率を反映する。完全長ＧＳＴ−ＭＢＰのバンドを示すこのゲルの一部は、本文の図２に示されている。
【図１１】Ｒｉｂｏ−Ｑ１が、ＡＧＧＡクアドラプレットコドンに反応したＡｚＰｈｅＲＳ＊／ｔＲＮＡＵＣＣＵ非天然アミノ酸取込みの効率を強化することを示す図である。Ａ．Ｒｉｂｏ−Ｑ１はpSC101*-ribo-Q1から産生される。ＡｚＰｈｅ、２．５ｍＭ  ２。ＡｚＰｈｅＲＳ＊／ｔＲＮＡＵＣＣＵ対は、単一コピーのＭｊｔＲＮＡＵＣＣＵを含有するpDULE AzPheRS*/ｔＲＮＡUCCUから産生される。（ＡＧＧＡ）ｎは、Ｏ−ｇｓｔ（ＡＧＧＡ）ｎｍａｌＥ又はｇｓｔ（ＡＧＧＡ）ｎｍａｌＥ内のｇｓｔとｍａｌＥとの間のクアドラプレットコドンの数（ｎ）を表す。ＧＳＴに対するＧＳＴ−ＭＢＰの比率は、フレームシフト抑制の効率を反映する。完全長ＧＳＴ−ＭＢＰのバンドを示すこのゲルの一部は、本文の図２に示されている。Ｂ＆Ｃ。それぞれ１つ又は２つのＡｚＰｈｅｓを組み込むトリプシン断片のＭＳ／ＭＳスペクトル。
【図１２】ＭｂＰｙｌＲＳ／ＭｂｔＲＮＡＣＵＡ及びＭｊＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ対は、それらのアミノアシル化特異性が相互に直交していることを示す図である。Ａ．ＭｂＰｙｌＲＳ／ＭｂｔＲＮＡＣＵＡ（ライム）及びＭｊＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ（灰色）の解読ネットワーク、並びにその非天然アミノ酸を組み込む誘導体。特有の非天然アミノ酸が、シンセターゼのそれぞれによって特異的に認識され、その機能が関連するｔＲＮＡをアミノアシル化するのに使用される。本発明者らは、ＭｂＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ対(Srinivasan, G., James, C. M. & Krzycki, J. A. Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: charging of a UAG-decoding specialized tRNA. Science 296, 1459-62 (2002)、Polycarpo, C. et al. An aminoacyl-tRNA synthetase that specifically activates pyrrolysine. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 12450-4 (2004)、Hao, B. et al. A new UAG-encoded residue in the structure of a methanogen methyltransferase. Science 296, 1462-6 (2002))及びＭｊＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ対がそれらのアミノアシル化特異性において互いに直交しているかどうか尋ねた。本発明者らの実験は、２つのアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ／ｔＲＮＡＣＵＡ対の間に交差アシル化（灰色の矢）がないことを実証する（シンセターゼとｔＲＮＡの異なった組合せを用いて、ｍｙｏ４ＴＡＧＨｉｓ６におけるアンバーコドンを解読することによって示される通り、下記参照）。しかし、両方のｔＲＮＡとも、アンバーコドンに反応してそれらのアミノ酸の取込みを指示する。Ｂ．大腸菌ＤＨ１０Ｂは、pMyo4TAG-His6で形質転換された。pMyo4TAG-His6は、位置４のアンバーコドン及びＣ末端ヘキサヒスチジンタグを有するマッコウクジラミオグロビンの遺伝子と、ＭｂｔＲＮＡＣＵＡ又はＭｊｔＲＮＡＣＵＡのいずれかのための発現カセットとを保持するプラスミドである。ＭｂＰｙｌＲＳ又はＭｊＴｙｒＲＳは、それぞれpBKPylS又はpBKMjTyrRSで提供した。ＭｂＰｙｌＲＳを発現する細胞には、シンセターゼの基質として１０ｍＭ  ３（ＢｏｃＬｙｓ）を与えた。細胞によって産生されたミオグロビン−Ｈｉｓ６を、Ｎｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーによって精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、クマシー染色又はＨｉｓ６タグに対するウエスタンブロットで検出した。
【図１３】クアドラプレットコドンに反応した２の遺伝学的コーディングを示す図である。Ａ．ＭｊＡｚＰｈｅＲＳは、その機能が関連するアンバー抑制ｔＲＮＡＣＵＡを２でアミノアシル化する。２つの互いに直交したｔＲＮＡが解読するコドンを区別するため、及びクアドラプレットコドンに反応して非天然アミノ酸を取込むための対を作製するために、本発明者らは、ＭｊｔＲＮＡＣＵＡのアンチコドンをＣＵＡからＵＣＣＵに改変して、ＭｊｔＲＮＡＵＣＣＵを作製した。この後、結果として得られたｔＲＮＡＵＣＣＵは、もはや親ＭｊＡｚＰｈｅＲＳの基質ではない。ＭｊｔＲＮＡＵＣＣＵをアミノアシル化するＡｚＰｈｅＲＳ−７のバージョンを作製するために、本発明者らは、このｔＲＮＡのアンチコドンを認識する親シンセターゼ内の６つの残基（Ｙ２３０、Ｃ２３１、Ｐ２３２、Ｆ２６１、Ｈ２８３、Ｄ２８６）を同定し(Kobayashi, T. et al. Structural basis for orthogonal tRNA specificities of tyrosyl-tRNA synthetases for genetic code expansion. Nat Struct Biol 10, 425-32 (2003))、これらの残基をすべての可能な組合せへと変異導入して、１０８の可能なシンセターゼ変異体のライブラリーを作製した。ＭｊｔＲＮＡＵＣＣＵを特異的にアミノアシル化するＡｚＰｈｅＲＳ変異体を選択するために、本発明者らは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼレポーター（pREP JY(UCCU)、pREP YC-JYCUA(Santoro, S. W., Wang, L., Herberich, B., King, D. S. & Schultz, P. G. An efficient system for the evolution of aminoacyl-tRNA synthetase specificity. Nat Biotechnol 20, 1044-8 (2002))に由来する）を作製した。このレポーターは、位置１１１、さまざまなアミノ酸の取込みを許容する部位に４塩基コドンＡＧＧＡを含有している。ＡｚＰｈｅＲＳ／ＭｊｔＲＮＡＵＣＣＵの非存在下又は存在下では、このレポーターは、低レベル（３０〜５０μｇ  ｍｌ−１）のクロラムフェニコール抵抗性を与える。本発明者らは、ＭｊｔＲＮＡＵＣＣＵとの組合せにおいて、pREP JY(UCCU)上のＡＧＧＡコドンに反応して、特異的に２の取込みを指示するシンセターゼバリアントを、１５０μｇ  ｍｌ−１のクロラムフェニコール上で選択した。本発明者らは、２４のシンセターゼ／ｔＲＮＡＵＣＣＵ対を、２及びpREP JY(UCCU)の存在下における、それらのクロラムフェニコール抵抗性によって特徴付けた。７つの最良のシンセターゼ／ｔＲＮＡＵＣＣＵの組合せは、２及びpREP JY(UCCU)を含有する細胞に、２５０〜３５０μｇ  ｍｌ−１のクロラムフェニコール抵抗性を与える（図１４）。２の非存在下において、本発明者らは、いくつかのシンセターゼについて、バックグランドレベル（３０μｇ  ｍｌ−１）の抵抗性しか観察しなかった。これは、シンセターゼ／ＭｊｔＲＮＡＵＣＣＵ対が、クアドラプレットコドンＡＧＧＡに反応して、特異的に２の取込みを指示することを示す。これらの７つのクローンの配列決定は、類似してはいるが、同じではない変異を明らかにした（図１４）。Ｂ．ライブラリー設計。その機能が関連するｔＲＮＡ（オレンジ）に結合したＭｊＴｙｒＲＳ（灰色）の構造。ライブラリーで変異導入される、アンチコドンを認識するシンセターゼの残基、及び天然のアンチコドンの塩基（Ｇ３４、Ｕ３５、Ａ３６）が青色で示されている（図は、Pymol、www.pymol.org、及びｐｄｂファイル１Ｊ１Ｕを用���て作成された）。Ｃ．ＡｚＰｈｅＲＳ＊−２／ＭｊｔＲＮＡＵＣＣＵ対によるｍｙｏ４（ＡＧＧＡ）−ｈｉｓ６からの完全長ミオグロビンの産生は２の存在に依存している。このテキストの残りでは、本発明者らは、簡便のため、ＭｊＡｚＰｈｅＲＳ＊−２をＭｊＡｚＰｈｅＲＳ＊と呼ぶ。ＭｊＡｚＰｈｅＲＳ＊／ｔＲＮＡＵＣＣＵは、ミオグロビン遺伝子内に配置されたＡＧＧＡコドンを効率的に抑制する。それぞれ位置４のアンバーコドン又はＡＧＧＡコドン、及びＣ末端ヘキサヒスチジンタグを有するマッコウクジラミオグロビンの遺伝子と、ＭｊｔＲＮＡＣＵＡ又はＭｊｔＲＮＡＵＣＣＵのいずれかの発現カセットとを保持するプラスミドである、pMyo4TAG-His6又はpMyo4AGGA-His6で大腸菌ＤＨ１０Ｂを形質転換した。ＭｊＡｚＰｈｅＲＳ又はＭｊＡｚＰｈｅＲＳ＊は、それぞれpBKMjAzPheRS又はpBKMjAzPheRS*で提供された。シンセターゼのための基質として２．５ｍＭ  ２を細胞に与えた。細胞によって産生されたミオグロビン−Ｈｉｓ６を、Ｎｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーによって精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、クマシー染色で検出した。Ｄ．ＭｊＡｚＰｈｅＲＳ＊／ｔＲＮＡＵＣＣＵは、２で特異的にＡＧＧＡコドンを解読する。２．５ｍＭ  ２の存在下における、Ｍｙｏ４（ＡＧＧＡ）及びＭｊＡｚＰｈｅＲＳ＊／ｔＲＮＡＵＣＣＵを発現する細胞から精製されたミオグロビン−Ｈｉｓ６への２の取込みをＥＳＩ−ＭＳで分析した。観察されたピーク（１８４５７．７５Ｄａ）の質量は、単一の２を含有するミオグロビンの計算された質量に対応している（１８４５６．２Ｄａ）。
【図１４】選択されたＭｊＡｚＰｈｅＲＳ＊バリアントのアミノ酸依存的成長を示す図である。pBK MjAzPheRS-7上に構築されたライブラリーからの単離株及びpREP JY(UCCU)（ＭｊｔＲＮＡＵＣＣＵ及び位置Ｄ１１１のＡＧＧＡコドンを有するクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする）で大腸菌ＤＨ１０Ｂを同時形質転換した。細胞は、１ｍＭ  ２の存在下又は非存在下で５時間育て、非天然アミノ酸を含む、又は含まない、２５μｇ  ｍｌ−１カナマイシン、１２．５μｇ  ｍｌ−１テトラサイクリン及び示された濃度のクロラムフェニコールを含有するＬＢアガープレート上に刺した。３７℃で１８時間の後にプレートを写真撮影した。ＡＧＧＡコドンに反応して、チロシン、２、及びプロパルギル−Ｌ−チロシン（図１５）を組み込むための変異の配列決定は、共通の変異Ｙ２３０Ｋ、Ｃ２３１Ｋ、及びＰ２３２Ｋを有するが、位置Ｆ２６１、Ｈ２８３、及びＤ２８６における多岐にわたる変異を有するクローンを明らかにする。これは、アミノ酸２３０、２３１、及び２３２がアンチコドンに対する親和性及び特異性を与えること、並びに２６１、２８３、及び２８６はアミノ酸アイデンティティーとアンチコドンのアイデンティティーを共役させ得ることを示唆する。
【図１５】選択されたＭｊＰｒＴｙｒＲＳ＊バリアントのアミノ酸依存的成長を示す図である。ＭｊＰｒＴｙｒＲＳ上に構築されたライブラリーからの単離株を用いて、図１４におけるように大腸菌ＤＨ１０Ｂを形質転換し、非天然アミノ酸依存性の成長があるかどうか試験した。ＭｊＰｒＴｙｒＲＳとの比較に変異を下記の表に示す。
【図１６】ＭｂＰｙｌＲＳ／ＭｂｔＲＮＡＣＵＡとＭｊＡｚＰｈｅＲＳ＊／ｔＲＮＡＵＣＣＵの対が、異なった特有のコドンに反応して、異なった非天然アミノ酸を組み込むことを示す図である。Ａ．直交した２対（ＭｂＰｙｌＲＳ／ＭｂｔＲＮＡＣＵＡ及びＭｊＡｚＰｈｅＲＳ＊／ｔＲＮＡＵＣＣＵ）は、２つの異なったアミノ酸（Ｎ６−［（ｔｅｒｔ−ブチルオキシ）カルボニル］−Ｌ−リジン及び２）でｍＲＮＡ中の２つの異なったコドン（ＵＡＧ及びＡＧＧＡ）を解読する。ＭｂＰｙｌＲＳは、ＭｊｔＲＮＡＵＣＣＵをアミノアシル化せず、ＭｂｔＲＮＡＣＵＡは、ＭｊＡｚＰｈｅＲＳ＊の基質とならない。Ｂ．ＭｂＰｙｌＲＳ／ＭｂｔＲＮＡＣＵＡ及びＭｊＡｚＰｈｅＲＳ＊／ｔＲＮＡＵＣＣＵの異なった組合せによる、マッコウクジラミオグロビンの遺伝子の位置４における機能が関連するコドンの抑制。図６Ｃにおける記載のように、大腸菌ＤＨ１０ＢをpMyo4TAG-His6又はpMyo4AGGA-His6で形質転換した。細胞に、それぞれＭｂＰｙｌＲＳ（pBKPylS上）又はＭｊＡｚＰｈｅＲＳ＊（pBKMjPheRS*上）及び２．５ｍＭ  Ｎ６−［（ｔｅｒｔ−ブチルオキシ）カルボニル］−Ｌ−リジン又は５ｍＭ  ２を提供した。細胞によって産生されたミオグロビン−Ｈｉｓ６を、Ｎｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーによって精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、クマシー染色で検出した。本発明者らは、ＭｂＰｙｌＲＳ対を用いて、ＵＡＧコドンに反応した、弱い取込みを見る。この取込みは、以前に観察されたように、ＭｊＡｚＰｈｅＲＳ＊の存在とは独立しており、富栄養培地中の大腸菌シンセターゼによるｔＲＮＡの低レベルのバックグランドアシル化の結果として生じる。
【図１７】直交した翻訳を介した、単一タンパク質におけるアジド及びアルキンのコーディングを示す図である。Ａ．２つの非天然アミノ酸を含有するＧＳＴ−ＣａＭ−Ｈｉｓ６の発現。大腸菌ＤＨ１０Ｂを４つのプラスミドで形質転換した：pCDF PylST（ＭｂＰｙｌＲＳ及びＭｂｔＲＮＡＣＵＡを発現する）、pDULE AzPheRS* ｔＲＮＡUCCU（ＭｊＡｚＰｈｅＲＳ＊／ｔＲＮＡＵＣＣＵをコードする）、pSC101*ribo-Q1、及びp-O-gst-CaM-His61AGGA 40UAG（カルモジュリン（ＣａＭ）の位置１のＡＧＧＡコドン及び位置４０のアンバーコドンを含有する、直交性リボソームによって翻訳されたＧＳＴ−ＣａＭ−Ｈｉｓ６融合体）。プラスミドを維持するための抗生物質、並びに示されている通り、２．５ｍＭ  ４及び／又は５ｍＭ  ２を含有するＬＢ培地中で細胞を育てた。細胞を採取し、溶解し、タンパク質をＧＳＨビーズ上で精製した。結合したタンパク質を、１０ｍＭ  ＧＳＨを含むＰＢＳ中に溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。このゲルの一部が、本文の図３に示されている。この方法によって、最大０．５ｍｇ／Ｌまでの収率で、完全長タンパク質が産生された。
【図１８】補表１：この研究で用いられたオリゴヌクレオチドを示す図である。
【００９７】
これより、本発明を例示によって説明する。これらの実施例は、例示的なものと意図されており、添付の特許請求の範囲を限定するものとは意図されていない。
【００９８】
［実施例］
プラスミド構築
以前に記載されているｇｓｔ−ｍａｌＥタンパク質発現ベクターpgst-malE及びpO-gst-malE9は、それぞれ野生型リボソーム及び直交性リボソームによって翻訳される。これらのベクターを鋳型として用いて、ｇｓｔとｍａｌＥオープンリーディングフレームとの間のリンカー領域に１つ又は２つのクアドラプレットコドンを含有するバリアントを構築した。
【００９９】
ｇｓｔと、ｍａｌＥ（pgst(AGGA)malE及びpO-gst(AGGA)malE）との間に単一のＡＧＧＡクアドラプレットコドンを含有するベクターを作製するために、プライマーＧＭｘ１ＡＧＧＡｆ及びＧＭｘ１ＡＧＧＡｒ（この研究で用いられたすべてのプライマーは補表１に記載されている）を用いて、QuikChange変異誘発（Stratagene社製）によって、ｇｓｔとｍａｌＥとの間のリンカー内のＴｙｒコドン、ＴＡＣをＡＧＧＡに変えた。二重ＡＧＧＡ変異体を求めて、本発明者らは、さらに、プライマーＧＭｘ２ＡＧＧＡｆ及びＧＭｘ２ＡＧＧＡｒを用いたクイックチェンジ（quick change）ＰＣＲによって、ｍａｌＥ内の４番目のコドンをＧＡＡからＡＧＧＡに変異させて、ベクターpgst(AGGA)2malE及びpO-gst(AGGA)2malEを作製した。質量分析用のタンパク質発現に用いられたベクターpO-gst-malE(Y252AGGA)は、その中で、ＭＢＰのＹ１７のコドンがＡＧＧＡに変異されており、プライマーＭＢＰＹ１７ＡＧＧＡｆ及びＭＢＰＹ１７ＡＧＧＡｒを用いたQuikchange変異誘発（Stratagene社）によって作製された。
【０１００】
選択されたＯ−リボソームの構成的産生のためのベクターを作製するために、クアドラプレット解読能を直交性リボソームに与える、pRSF-OrDNA内の変異を、pSC101ベースのＯ−ｒＲＮＡ発現ベクターに移した。pSC101*-ribo-Xを鋳型として用いて、プライマーｓｃ１０１Ｑｒ並びにｓｃ１０１Ｑ１ｆ（Ｒｉｂｏ−Ｑ１用）、ｓｃ１０１Ｑ３ｆ（Ｒｉｂｏ−Ｑ３用）、及びｓｃ１０１Ｑ４ｆ（Ｒｉｂｏ−Ｑ４用）を用いた酵素的逆ＰＣＲによって、１６Ｓ  ｒＤＮＡ中に変異を導入した。
【０１０１】
pDULE AzPheRS* ｔＲＮＡUCCU（ＭｊｔＲＮＡＵＣＣＵ及びＭｊＡｚＰｈｅＲＳ＊のための遺伝子を含有し、それぞれｌｐｐプロモーターの制御下にある）は、Quikchangeによって、ＭｊｔＲＮＡＣＵＡのアンチコドンをＵＣＣＵに変え、制限酵素Nde I及びStu IでpBK MjAzPheRS*-2を切断することによって得られるＭｊＡｚＰｈｅＲＳ＊−２遺伝子の、pDULE MjBPARS ＭｊｔＲＮＡＵＣＣＵ上の同じ部位への連結を介して、ＭｊＢＰＡ−ＲＳのＯＲＦをＭｊＡｚＰｈｅＲＳ＊−２に取り替えることによって作製した。pCDF PylST（構成的プロモーターからＭｂＰｙｌＲＳ及びＭｂｔＲＮＡＣＵＡを発現するプラスミド）は、ＭｂＰｙｌＲＳ及びＭｂｔＲＮＡＣＵＡの発現カセットを含有するＰＣＲ産物を、pCDF DUET-1（Novagen）のBam HI及びSal I又はSal I及びNot I部位にクローニングすることによって作製した。上記ＰＣＲ産物は、pBK PylRS及びpREP PylTの適切な領域を増幅することによって入手した。
【０１０２】
ＧＳＴとＣａＭの融合体をコードするプラスミドは、p-O-gst-malE内のＭＢＰのＯＲＦをヒトＣａＭで置き換えることによって作製した。ＣａＭの遺伝子をpET3-CaM（K. Nagaiより寄贈）から、プライマーＣａｍＥｃｏｆ及びＣａｍＨ６Ｈｉｎｄｒ（Ｃ末端Ｈｉｓ６タグを付加する）を用いたＰＣＲによって増幅し、pO-gst-malEのEco RI及びHind III部位にクローニングした。プライマーＣａＭ１ａｇｇａｆ及びＣａＭ１ａｇｇａｒを用いた後続ラウンドのQuikchange変異誘発によって、ＣａＭのメチオニン−１をＡＧＧＡに変異させた（同時に、ＧＳＴとＣａＭとの間のリンカーの一部を除去する）。第２ラウンドの変異誘発で、プライマーＣａＭＫ１４９ＴＡＧｆ及びＣａＭＫ１４９ＴＡＧｒを用いて、位置１４９にアンバーコドンを導入した。立体障害のある対照を作製するために、プライマーＣａＭ４０ｔａｇｆ及びＣａＭ４０ｔａｇｒを用いる代わりに、アンバーコドンを位置４０に挿入した。
【０１０３】
リボソームライブラリー及びクアドラプレット解読レポーターの構築
pTrcRSF-O-ribo-Xを鋳型として用いた酵素的逆ＰＣＲによって、１１の異なる１６Ｓ  ｒＤＮＡライブラリーを構築した(Rackham, O. & Chin, J. W. A network of orthogonal ribosome x mRNA pairs. Nat Chem Biol 1, 159-66 (2005)、Stemmer, W. P. & Morris, S. K. Enzymatic inverse PCR: a restriction site independent, single-fragment method for high-efficiency, site-directed mutagenesis. Biotechniques 13, 214-20 (1992))。この結果得られたpRSF-O-rDNAライブラリーは、１６Ｓ  ｒＲＮＡ上の規定の領域内に７〜１３ヌクレオチドの変異を有し、補足の表１中のライブラリー構築プライマーを用いた複数ラウンドの酵素的逆ＰＣＲによって構築された。各ライブラリーは、１０９超の多様性を有し、９９％超のカバー度を確実にしている。１１のライブラリーで変異導入されたヌクレオチドにはオーバラップがあり、全体として、それらはリボソームのＡ部位における解読センターの全表面をカバーする。
【０１０４】
直交性リボソームによるクアドラプレット解読のレポーターを作製するために、本発明者らは、以前に記載されているO-cat(UAGA146)/ｔＲＮＡ(UAGA)ベクターを鋳型として用いた(Wang, K., Neumann, H., Peak-Chew, S. Y. & Chin, J. W. Evolved orthogonal ribosomes enhance the efficiency of synthetic genetic code expansion. Nat Biotechnol 25, 770-7 (2007))。このベクターは、ｌｐｐプロモーター及びｒｒｎＣの転写ターミネータ上に大腸菌ｔＲＮＡＳｅｒ２のバリアントを含有している。上記ｔＲＮＡは、直交性リボソーム結合部位の下流にあるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）遺伝子内に、改変アンチコドンと、セリン１４６のためのセレクターコドンを有する。Ｓｅｒ１４６は必須であり、取込みのフィデリティーを確実にする保存された触媒セリン残基である。O-cat(AAGA 103 AAGA146)/ｔＲＮＡ(UCUU)を作製するために、位置１４６及び１０３にＡＡＧＡコドンを導入し、プライマーＣＡＴ１４６ＡＧＧＡｆ、ＣＡＴ１４６ＡＧＧＡｒ、及びＣＡＴ１０３ＡＧＧＡｆ、ＣＡＴ１０３ＡＧＧＡｒを用いたQuikchange変異誘発によって、ｔＲＮＡのアンチコドンをＵＣＵＵに変換した。クアドラプレットコドンＡＧＧＡ、ＣＣＣＵを含有するＯ−ｃａｔレポーター（プライマーＣＡＴ１４６ＣＣＣＵｆ、ＣＡＴ１４６ＣＣＣＵｒ、並びにＣＡＴ１０３ＣＣＣＵｆ及びＣＡＴ１０３ＣＣＵｒを用いる）及び対応するｔＲＮＡ（Ｓｅｒ２ＡＧＧＡｆ、Ｓｅｒ２ＡＧＧＡｒ、Ｓｅｒ２ＣＣＣＵｆ、及びＳｅｒ２ＣＣＣＵｒ）も、Quikchange変異誘発によって作製した。単一のクアドラプレットセレクターコドンを含有するレポーターは、ベクター構築過程における中間体であった。Ｏ−ｃａｔ遺伝子を有するが、ｔＲＮＡを欠くベクターは、Ｏ−ｃａｔ内のコドンに変異導入するクイックチェンジ（Quik change）プライマーＣＡＴ１４６ＡＡＧｆ、ＣＡＴ１４６ＡＧＧＡｒ、ＣＡＴ１０３ＡＧＧＡｆ、ＣＡＴ１０３ＡＧＧＡｒ、ＣＡＴ１４６ＣＣＣＵｆ、ＣＡＴ１４６ＣＣＣＵｒ、ＣＡＴ１０３ＣＣＣＵｆ、及びＣＡＴ１０３ＣＣＣＵｒを用いて、Ｏ−ｃａｔ（ＵＡＧＡ１４６）を鋳型として用いて作製した。Ｏ−ｃａｔ（ＵＡＧＡ１４６）は、ｔＲＮＡカセットを含有していない。
【０１０５】
クアドラプレット解読が強化されている直交性リボソームの選択
クアドラプレット解読が改善されているＯ−リボソームを選択するために、エレクトロポレーションによって、Ｏ−ｃａｔ（ＡＡＧＡ１４６）を含有しているGeneHog大腸菌（Invitrogen社製）細胞を各pRSF-O-rDNAライブラリーで形質転換させた。形質転換細胞を、２％グルコースを含有するＳＯＢ培地中で１時間回復させ、２００ｍｌのＬＢ−ＧＫＴ（２％グルコース、２５μｇ  ｍｌ−１カナマイシン、及び１２．５μｇ  ｍｌ−１テトラサイクリンを含有するＬＢ培地）に播種するのに用いた。終夜培養（３７℃、２５０ｒ．ｐ．ｍ．、１６時間）の後、２ｍＬの細胞を遠心法（３０００ｇ）によってペレットにし、等容積のＬＢ−ＫＴ（１２．５μｇ  ｍｌ−１カナマイシン及び６．２５μｇ  ｍｌ−１テトラサイクリンを含有するＬＢ培地）で３回洗浄した。再懸濁したペレットを、１８ｍｌのＬＢ−ＫＴに播種するのに用い、この結果得られた培養物をインキュベートした（３７℃、２５０ｒ．ｐ．ｍ．の振盪、９０分間）。Ｏ−ｒＲＮＡをコードしたプラスミドの発現を誘導するために、２ｍｌの培養物を１８ｍｌのＬＢ−ＩＫＴ（１．１ｍＭイソプロピル−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、１２．５μｇ  ｍｌ−１カナマイシン、及び６．２５μｇ  ｍｌ−１テトラサイクリンを含有するＬＢ培地）に添加し、４時間インキュベートした（３７℃、２５０ｒ．ｐ．ｍ．）。アリコート（２５０ｍｌ、６００ｎｍの光学濃度（ＯＤ６００）＝１．５）を連続希釈し、異なる濃度（それぞれ、７５μｇ  ｍｌ−１、１００μｇ  ｍｌ−１、１５０μｇ  ｍｌ−１及び２００μｇ  ｍｌ−１、）のクロラムフェニコールを補ったＬＢ−ＩＫＴ寒天（１ｍＭ  ＩＰＴＧ、１２．５μｇ  ｍｌ−１カナマイシン、及び６．２５μｇ  ｍｌ−１テトラサイクリンを含有するＬＢ寒天）上にプレーティングし、インキュベートした（３７℃、４０時間）。
【０１０６】
クアドラプレット解読が強化している進化した直交性リボソームの特性分析
Ｏ−ｃａｔ（ＡＡＧＡ１４６）／ｔＲＮＡｓｅｒ２（ＵＣＵＵ）レポータープラスミド由来の、選択されたpRSF-O-rDNAプラスミドを分離するために、選択されたクローンからの総プラスミドＤＮＡを精製し、NotI制限エンドヌクレアーゼで消化し、それでDH10B大腸菌を形質転換させた。個々の形質転換体を、カナマイシン寒天及びテトラサイクリン寒天にレプリカプレーティングし、レポーターからのpRSF-O-rDNAのプラスミド分離を制限消化及びアガロースゲル分析によって確認した。
【０１０７】
選択された１６Ｓ  ｒＤＮＡクローンのクアドラプレット解読活性を定量化するために、選択されたpRSF-O-rDNAプラスミドを、Ｏ−ｃａｔ（ＡＧＧＡ１０３、ＡＧＧＡ１４６）／ｔＲＮＡｓｅｒ２（ＵＣＣＵ）と同時に形質転換した。細胞を回復させ（ＳＯＢ、２％グルコース、１時間）、１０ｍＬのＬＢ−ＧＫＴに播種するのに用い、これをインキュベートした（１６時間、３７℃、２５０ｒ．ｐ．ｍ．）。この結果得られた培養物１ｍｌを、９ｍｌのＬＢ−ＫＴに播種するのに用い、これをインキュベートした（９０分、３７℃、２５０ｒ．ｐ．ｍ．）。ＬＢ−ＫＴ培養物１ｍｌを、９ｍｌのＬＢ−ＩＫＴ培地に播種するのに用い、これをインキュベートした（３７℃、２５０ｒ．ｐ．ｍ．、４時間）。個々のクローンを９６ウェルブロックに移し、０〜５００μｇ  ｍｌ−１の濃度のクロラムフェニコールを含有しているＬＢ−ＩＫＴ寒天プレート上に９６ウェル用のピンツールを用いて整列させた。プレートをインキュベートさせた（３７℃、１６時間）。本発明者らは、他のクアドラプレットコドン−アンチコドン対についても同様な実験を行った。
【０１０８】
インビトロＣＡＴアッセイ用の可溶性細胞溶解物を抽出するために、誘導されたＬＢ−ＩＫＴ培養物各１ｍｌを３０００ｇの遠心法によってペレットにした。細胞ペレットを５００μｌの洗浄用緩衝液（４０ｍＭ  Tris−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）で３回、５００μｌの溶解用緩衝液（２５０ｍＭ  Tris−ＨＣｌ、ｐＨ７．８）で１回洗浄した。２００μｌの溶解用緩衝液中の細胞を、ドライアイス／エタノール中での瞬間冷凍及びそれに続く５０℃ウォーターバス内での急速解凍５サイクルによって溶解させた。細胞破片を遠心法（１２０００ｇ、５分）によって溶解物から除去し、上側１５０μｌの上清を２０℃で凍結させた。溶解物中のＣＡＴ活性をアッセイするために、１０μｌの可溶性細胞抽出物を２．５μｌのFAST CAT Green（デオキシ）基質（Invitrogen社製）と混合し、プレインキュベートした（３７℃、５分）。２．５μｌの９ｍＭアセチル−ＣｏＡ（Sigma社製）を添加し、インキュベートした（３７℃、１時間）。氷冷酢酸エチルの添加（２００ｌ、ボルテックス２０秒間）によって反応を停止させた。水相及び有機相を遠心法（１２０００ｇ、１０分）によって分離し、上側１００μｌの酢酸エチル層を収集した。収集された溶液１μｌを、クロロホルム：メタノール（８５：１５ｖｏｌ／ｖｏｌ）中の薄層クロマトグラフィー用シリカゲル薄層クロマトグラフィープレート（Merck社製）上にスポット添加した。空間的に分離された基質及び産物の蛍光を、ホスファーイメジャー（Storm 860、Amersham Biosciences社製）を用いて、それぞれ４５０ｎｍ及び５２０ｎｍの励起波長及び発光波長で可視化及び定量化した。
【０１０９】
ｇｓｔ−ｍａｌＥ融合体の小規模の発現及び精製
プラスミドの適切な組合せを含有する大腸菌を、５０ｍｌの終夜培養物からペレットにし（３０００ｇ、１０分間）、８００μｌのNovagen BugBusterタンパク質抽出試薬（１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche社製）、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍｇ  ｍｌ−１リゾチーム（Sigma社製）、１ｍｇ  ｍｌ−１ＤＮａｓｅ  Ｉ（Sigma社製）を補った）中に再懸濁及び溶解し、インキュベートした（６０分、２５℃、１０００ｒ．ｐ．ｍ．）。溶解物を遠心法（６分、２５０００ｇ、２℃）によって清澄化した。溶解物からのＧＳＴ含有タンパク質をバッチで５０μｌのグルタチオンセファロースビーズ（GE Healthcare社製）に結合させた（１時間、４℃）。ビーズを１ｍｌのＰＢＳで３回洗浄し、その後、６０μｌの１×ＳＤＳゲル添加緩衝液中で１０分間、８０℃で加熱することによって溶離を行った。全ての試料を１０％のBis-Trisゲル（Invitrogen社製）で分析した。
【０１１０】
直交性クアドラプレット解読リボソームの翻訳フィデリティーの測定
３５Ｓ−システイン誤取込み：pO-gst-malE及びpSC101*-O-ribosome、pO-gst-malE及びpSC101*-ribo-X、pO-gst-malE及びpSC101*-ribo-Q、又はpgst-malEのいずれかを含有する大腸菌をＬＢ培地（最終濃度３ｎＭの３５Ｓ−システイン（１０００Ｃｉ  ｍｍｏｌ−１）、７５０μＭメチオニン、２５μｇ  ｍｌ−１アンピシリン、及び１２．５μｇ  ｍｌ−１カナマイシンで補った）中において０．１のＯＤ６００に再懸濁し、細胞をインキュベートした（３．５時間、３７℃、２５０ｒ．ｐ．ｍ．）。この結果得られた培養物１０ｍＬをペレットにし（５０００ｇ、５分間）、２回洗浄し（洗浄１回あたりの１ｍＬ  ＰＢＳ）、１％Triton-Xを含有する溶解用緩衝液１ｍＬに再懸濁し、インキュベートし（３０分、３７℃、１０００ｒ．ｐ．ｍ．）、氷上で上下にピペッティングすることによって溶解させた。清澄化された細胞抽出物を１００μｌのグルタチオンセファロースビーズに結合させ（１時間、４℃）ビーズをペレットにし（５０００ｇ、１０秒間）、１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した。ビーズを１０ｍＬのポリプロピレンカラム（Biorad社製）に添加し、洗浄（３０ｍＬのＰＢＳ；１０ｍＬの０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５×ＰＢＳ；３０ｍＬのＰＢＳ）した後、１０ｍＭのグルタチオンを補った１ｍＬのＰＢＳで溶離を行った。精製されたＧＳＴ−ＭＢＰを１２．５単位のトロンビンで１時間消化し、ＧＳＴ断片及びＭａｌＥ断片を産生させた。反応物を１５％トリクロロ酢酸で沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに添加し、ＧＳＴ、ＭＢＰ、及びトロンビンを分離し、InstantBlue（Expedeon社製）で染色した。ＧＳＴ及びＭＢＰタンパク質バンド中の３５Ｓ活性を、Stormホスホルイメージャー（Molecular Dynamics社製）及びImageQuant（GE Healthcare社製）を用いて、デンシトメトリーによって定量化した。検査したリボソームそれぞれのコドンあたりのエラー頻度を、以下の通りに測定した。ＧＳＴは４つのシステインコドンを含有しており、したがって、ＧＳＴから生じる１秒あたりの計測数（ｃ.ｐ.ｓ.，counts per second）を４で割ると、Ａ、すなわちシステインの定量的な取込みあたりのｃ．ｐ．ｓ．を得る。ＭＢＰはシステインコドンを含有していないが、非システインコドンでの誤取込みがＢ  ｃ.ｐ.ｓを与える。ＧＳＴ及びＭＢＰは等モル量で存在するので、（Ａ／Ｂ  ４１０は、１残基のシステインが誤取込みされるために翻訳されるアミノ酸の数Ｃを与える。ここで、４１０は、ＭＢＰを含有するトロンビン切断断片中のアミノ酸の数である。２０種のアミノ酸全ての誤取込みの頻度がシステインのものと同じであると仮定すると、誤取込み１回あたりに翻訳されるコドンの数はＣ／２０であり、（Ｃ／２０）−１によって１コドンあたりのエラー頻度が得られる。
【０１１１】
二重ルシフェラーゼアッセイ：既に特性分析されたpO-DLRは、直交性リボソーム結合部位に、５’側のウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒ−ｌｕｃ）と、３’側のホタルルシフェラーゼ（Ｆ−ｌｕｃ）との間の遺伝子融合体を含有している(Wang, K., Neumann, H., Peak-Chew, S. Y. & Chin, J. W. Evolved orthogonal ribosomes enhance the efficiency of synthetic genetic code expansion. Nat Biotechnol 25, 770-7 (2007))。pO-DLR及びそのＫ５２９コドン変種は、pSC101*-O-ribosome又はpSC101*-ribo-Q1を有する大腸菌内に導入して形質転換を行った。示されている場合、個々の実験で指定される、変異導入されたアンチコドンを有する追加大腸菌Ｓｅｒ２Ａ  ｔＲＮＡがプラスミドp15A-ｔＲＮＡ-Ser2A上で供給された。この場合、追加のプラスミドを維持するために、２５μｇ  ｍｌ−１のテトラサイクリンをすべての培養培地に添加した。ＡＧＧＡコドンを認識するサプレッサーｔＲＮＡを用いた実験では、Ａで始まるコドンが後に続く、天然のＡＧＧコドンを、プライマーＤＬＲ９５２ＡＡＧｘｆ及びＤＬＲ９５３ＡＧＧｘｒを用いた、QuikChangeによって、pO-DLRのリンカー領域から除去した。
【０１１２】
アンピシリン（５０μｇ  ｍｌ−１）及びカナマイシン（２５μｇ  ｍｌ−１）を補った２ｍＬのＬＢ中で、個々のコロニーをインキュベートし（３７℃、２５０ｒ．ｐ．ｍ．、３６時間）、ペレットにし（５０００ｇ、５分間）、氷冷ミリポア水で洗浄し、３００μＬの（１ｍｇ  ｍｌ−１リゾチーム、１ｍｇ  ｍｌ−１ＤＮａｓｅ  Ｉ、１０ｍＭ  Tris（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に再懸濁した。細胞を氷上で２０分間インキュベートし、ドライアイス上で凍結させ、氷上で解凍させた。二重ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Promega社製）を用いて、この抽出物の１０μｌ試料をホタルルシフェラーゼ（Ｆ−ｌｕｃ）及びウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒ−ｌｕｃ）の活性に関してアッセイした。Orionマイクロプレートルミノメーター（Berthold Detection Systems社製）を用いて、リボソームレポーターの各組合せを、４つの独立した培養からアッセイし、以前の記載の通りにデータを分析した。報告している誤差は標準偏差である。
【０１１３】
Ｒｉｂｏ−Ｑ１によるｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（２）取込みの質量分析による特性分析
p-O-gst-malE(Y252AGGA)、pSC101*Ribo-Q1、及びpDULE-AzPheRS*tRNAUCCUを含有する大腸菌ＤＨ１０Ｂを質量分析用のタンパク質を産生するのに用いた。タンパク質を２．５ｍＭ  ２の存在下で発現させ、グルタチオン上で精製した。精製されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、Instant Blue（Expedeon社製）で染色し、完全長ＧＳＴ−ＭＢＰを含有するバンドをＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（NextGen Science社製）による分析のために切り出した。試料を６０℃にてＤＴＴで還元し、室温に冷却した後、ヨードアセトアミドでアルキル化した。次いで、試料をトリプシンで消化し（３７℃、４時間）、ギ酸の添加によって反応を停止させた。試料を、ThermoFisher社製LTQ Orbitrap XL上でのナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析した。３０μｌの加水分解産物を５ｍｍ  ７５μｍ  ＩＤ  Ｃ１２（Jupiter Proteo、Phenomenex社製）ベント付きカラムに１０μｌ  ｍｉｎ−１の流速で添加した。勾配溶出は、１５ｃｍ  ７５μｍ  ＩＤ  Ｃ１２カラムに、３００ｎｌ  ｍｉｎ−１にて、１時間の勾配で行った。質量分析計をデータ依存モードで作動させ、イオンをＭＳ／ＭＳ用に選択した。Orbitrap MSスキャンを６００００  ＦＷＨＭの分解能で行った。Mascot（www.matrixscience.com）を用いてＭＳ／ＭＳデータの検索を行った。
【０１１４】
クアドラプレット解読ＭｊＡｚＰｈｅＲＳの進化
ｐＢＫ  ＭｊＡｚＰｈｅＲＳ−７(Chin, J. W. et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. J Am Chem Soc 124, 9026-7 (2002))（カナマイシン抵抗性プラスミド、ＧｌｎＲＳプロモーター及びターミネータ上にＭｊＡｚＰｈｅＲＳ−７を含有している）を鋳型として使用して、アンチコドンを認識するＭｊＡｚＰｈｅＲＳの領域のライブラリーを作製した。２ラウンドの酵素的逆ＰＣＲで、残基Ｙ２３０、Ｃ２３１、Ｐ２３２、Ｆ２６１、Ｈ２８３、及びＤ２８６のコドンをＮＮＫにランダム化し、１０８変異体クローンのライブラリーを作製した。pREP JY(UCCU)は、QuikChange変異誘発（Stratagene社製）によって、pREP YC-JYCUA(Santoro, S. W., Wang, L., Herberich, B., King, D. S. & Schultz, P. G. An efficient system for the evolution of aminoacyl-tRNA synthetase specificity. Nat Biotechnol 20, 1044-8 (2002))中のＭｊｔＲＮＡＣＵＡのアンチコドンをCUCUAAAからCUUCCUAAに変え、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子内のアンバーコドンをＡＧＧＡに変えることによって作製した。このプラスミドを保有する大腸菌ＤＨ１０Ｂを変異体ライブラリーで形質転換し、１ｍＭ  ２を補ったＬＢ−ＫＴ（２５μｇ  ｍｌ−１のカナマイシン及び１２．５μｇ  ｍｌ−１のテトラサイクリンを補ったＬＢ培地）中で増殖させた。１ｍＭ  ２及び５０〜２５０μｇ  ｍｌ−１の範囲の濃度のクロラムフェニコールを含有するＬＢ−ＫＴプレート上に１０９の細胞をプレーティングした。インキュベーション（３６時間、３７℃）の後、個々のクローンを、０〜２５０μｇ  ｍｌ−１クロラムフェニコールの存在下、１ｍＭ  ２の存在下及び非存在下における、ＬＢ−ＫＴプレート上での２依存性増殖について試験した。アミノ酸依存性の増殖を示すクローンからのプラスミドのDNAを単離し、pREP JY(UCCU)を除去するために、Hind IIIで消化した。カナマイシン抵抗性プラスミドの形質転換及び再単離の後、DNAの配列決定を行った。
【０１１５】
他のアミノ酸を組み込むクアドラプレット解読対を選択するために、適切な開始鋳型及び非天然アミノ酸を用いて、上記の手順を反復した。
【０１１６】
ＭｂＰｙｌＲＳ／ＭｂｔＲＮＡＣＵＡ及びＭｊＴｙｒＲＳ／ＭｊｔＲＮＡＣＵＡの相互直交性の調査
ＭｂＰｙｌＲＳの、ＭｊｔＲＮＡＣＵＡをアミノアシル化する能力を試験するために、ＧｌｎＲＳプロモーター及びターミネータの制御下にＭｂＰｙｌＲＳをコードするpBK MbPylRS、並びに位置４にアンバーコドンを有するマッコウクジラミオグロビン及びＭｊｔＲＮＡＣＵＡを発現するpMyo4TAG-His6で、大腸菌ＤＨ１０Ｂを形質転換した。細胞をＬＢ−ＫＴ中、３７℃で、終夜、増殖させた。終夜培養を、１０ｍＭ  Ｎ６−［（ｔｅｒｔ−ブチルオキシ）カルボニル］−Ｌ−リジン（ＢｏｃＬｙｓ、３）を補った新たなＬＢ−ＫＴ（５０ｍｌ）に１：５０で接種した。３７℃、３時間の後、０．２％アラビノースの添加によってタンパク質発現を誘導した。さらに３時間の後、細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄した。プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche社製）、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、並びに約１ｍｇ  ｍｌ−１リゾチーム及び０．１ｍｇ  ｍｌ−１ＤＮＡｓｅ  Ｉを補った、１ｍｌのＮｉ洗浄緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／Ｃｌ、２０ｍＭイミダゾール（imidiazole）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．０）中、２５℃で振盪することによって、タンパク質を抽出した。抽出液を遠心分離（５分、２５０００ｇ、４℃）で清澄化し、５０μｌ  Ｎｉ２＋−ＮＴＡビーズを補って、撹拌しながら、４℃で１時間インキュベートした。ビーズをバッチで３回、１ｍｌＮｉ洗浄緩衝液で洗浄し、２００ｍＭイミダゾールを補った１００μｌの試料緩衝液で溶出を行った。同族対相互又はＭｊＴｙｒＲＳとＭｂｔＲＮＡＣＵＡとの間におけるアミノアシル化活性を試験するために、適切なプラスミド（pBK MjTyrRS又はpBK MbPylRS及びpMyo4TAG-His6又はpMyo4TAG-His6-PylT）及び非天然アミノ酸（３又は無し）を用いて類似の実験を行った。タンパク質を４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、Instant Blueで染色した。
【０１１７】
クアドラプレット抑制AzPheRS*の特性分析
適切なpBKプラスミド及び２．５ｍＭ  ２を用いて、pMyo4TAG-His6又はpMyo4AGGA-His6からのミオグロビンの発現及び精製を、上記の通りに行った。タンパク質を４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１１８】
ＥＳＩ質量分析による、ＡｚＰｈｅＲＳ＊でpMyo4AGGA-His6から産生されたＭｙｏ４ＡｚＰｈｅの特性分析
ミオグロビンは、本質的には上述の通り、しかし、１ｌスケールでプラスミドpBK AzPheRS*及びpMyo4AGGA-His6を用いて、大腸菌ＤＨ１０Ｂで発現させた。プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche社製）、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍｇ  ｍｌ−１リゾチーム、及び０．１ｍｇ  ｍｌ−１ＤＮＡｓｅ  Ｉを補った３０ｍｌＮｉ洗浄緩衝液中、２５℃で振盪することによって、タンパク質を抽出した。遠心分離（１５分、３８０００ｇ、４℃）によって抽出物を清澄化し、０．３ｍｌ  Ｎｉ２＋−ＮＴＡビーズを補って、撹拌させながら４℃で１時間インキュベートした。ビーズをカラム内に注ぎ込み、４０ｍｌＮｉ洗浄緩衝液で洗浄した。結合したタンパク質を、２００ｍＭイミダゾールを含有する同じ緩衝液の０．５ｍｌ画分中に溶出させ、透析によって、１０ｍＭ炭酸アンモニウム、ｐＨ７．５に再緩衝化した。５０μｌの試料を、１％ギ酸を含む５０％メタノール中に１：１に混合し、総質量をエレクトロスプレーイオン化を用いたＬＣＴ飛行時間質量分析計（Micromass社製）で決定した。試料を１０μｌ  ｍｉｎ−１で注入し、較正を、陽イオンモードでウマ心臓ミオグロビンを用いて行った。５０回のスキャンを平均し、多重荷電されたタンパク質の質量スペクトルを、MassLynxバージョン４．１（Micromass社製）を用いてデコンボリューションすることによって分子質量を得た。野生型ミオグロビンの理論上の質量は、Protparam（http://us.expasy.org/tools/protparam.html）を用いて計算し、２の理論上の質量を手動で調整した。
【０１１９】
ＧＳＴ−ＭＢＰ  ２３４ＡｚＰｈｅ  ２３９ＣＡＫのＭＳ／ＭＳ分析
大腸菌ＤＨ１０ＢをpDULE AzPheRS*/ｔＲＮＡUCCU及びpCDF PylSTで形質転換し、対数期までＬＢーＳＴ（２５μｇ  ｍｌ−１スペクチノマイシン及び１２．５μｇ  ｍｌ−１テトラサイクリン）中で増殖させた。エレクトロコンピテント細胞を調製し、直交性リボソームの構成的発現用プラスミド（pSC101*Ribo-Q）及びp-O-gst(234AGGA 239TAG)malEで形質転換した。形質変換の回収物を、ＬＢ−ＡＫＳＴ（５０μｇ  ｍｌ−１アンピシリン、１２．５μｇ  ｍｌ−１カナマイシン、２５μｇ  ｍｌ−１スペクチノマイシン、及び１２．５μｇ  ｍｌ−１テトラサイクリンを含有するＬＢ培地）を接種するのに用いた。培養物を３７℃で飽和状態まで培養し、主培養物を１：５０で接種するのに用いた。細胞を３７℃で終夜増殖させ、遠心分離によって採取し、−２０℃で保存した。ＧＳＴ−ＭＢＰタンパク質を、２．５ｍＭの各ＡｚＰｈｅ（２）及びＣＡＫ（４）を用いて、１００ｍｌのスケールで発現させた。上述の通りにタンパク質を抽出及び精製した。ＰＢＳでビーズを洗浄した後に、５０ｍＭβ−メルカプトエタノールを含有する１００μｌの１×試料緩衝液中で、５分間、８０℃に加熱することによって、タンパク質を溶離させた。タンパク質試料を４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、Instant Blueで染色した。完全長ＧＳＴ−ＭＢＰを含有するバンドを切除し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析（NextGen Science社による）用に提出した。
【０１２０】
ＧＳＴ  ＣａＭ  Ｈｉｓ６  １ＡｚＰｈｅ  １４９ＣＡＫの環化
大腸菌ＤＨ１０Ｂを、上述の通り、発現プラスミドp-O-gst-CaM-His61AGGA 149UAG又はp-O-gst-CaM-His6 1AGGA 40UAGを用いて、４つのプラスミドで順次に形質転換した。タンパク質を、上述の通り、５ｍＭ  ２及び２．５ｍＭ  ４を用いて、０．５Ｌスケールで発現させた。細胞を抽出し、ＧＳＴ  ＣａＭ  Ｈｉｓ６を、ミオグロビン−Ｈｉｓ６について記載の通りに精製し、５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ８．３に対して透析を行った。環化反応を行うために、１６０μｌのタンパク質試料を、５ｍＭアスコルビン酸、５ｍＭ  ＣｕＳＯ４、及び１０ｍＭバソフェナントロリンの新しい溶液４０μｌと混合した。反応物を４℃でインキュベートし、４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１２１】
質量分析によって環化産物を分析するために、本発明者らは、後続の分析が容易になるように、非天然アミノ酸の取込み部位周辺に追加のトリプシン切断部位を導入した。したがって、点変異Ｑ４Ｋ及びＭ１４６Ｋ（p-O-gst-CaM-His6 1AGGA 149UAGにおけるＡＧＧＡコドンに対する付番）、並びにＴＡＧコドンの後に直接続くＧ３ＫリンカーをQuikChangeによって導入した。タンパク質は、非常に類似した収率で、上記の通り、発現、精製、及び環化された。続いて、環化されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切り出し、質量分析による分析用に提出した（NextGen Sciences社、Ann Arbor, USA）。
【０１２２】
（参考文献）
1  Xie, J. & Schultz, P. G. A chemical toolkit for proteins--an expanded genetic code. Nat Rev Mol Cell Biol 7, 775-82 (2006)
2  Steer, B. A. & Schimmel, P. Major anticodon-binding region missing from an archaebacterial tRNA synthetase. J Biol Chem 274, 35601-6 (1999)
3  Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L. & Schultz, P. G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 11020-4 (2002)
4  Srinivasan, G., James, C. M. & Krzycki, J. A. Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: charging of a UAG-decoding specialized tRNA. Science 296, 1459-62 (2002)
5  Polycarpo, C. et al. An aminoacyl-tRNA synthetase that specifically activates pyrrolysine. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 12450-4 (2004)
6  Neumann, H., Peak-Chew, S. Y. & Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Nat Chem Biol 4, 232-4 (2008)
7  Nguyen, D. P. et al. Genetic encoding and labeling of aliphatic azides and alkynes in recombinant proteins via a pyrrolysyl-tRNA Synthetase/tRNA(CUA) pair and click chemistry. J Am Chem Soc 131, 8720-1 (2009)
8  Rackham, O. & Chin, J. W. A network of orthogonal ribosome x mRNA pairs. Nat Chem Biol 1, 159-66 (2005)
9  Wang, K., Neumann, H., Peak-Chew, S. Y. & Chin, J. W. Evolved orthogonal ribosomes enhance the efficiency of synthetic genetic code expansion. Nat Biotechnol 25, 770-7 (2007)
10  Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V. & Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl 41, 2596-9 (2002)
11  Hohsaka, T. & Sisido, M. Incorporation of non-natural amino acids into proteins. Curr Opin Chem Biol 6, 809-15 (2002)
12  Ohtsuki, T., Manabe, T. & Sisido, M. Multiple incorporation of non-natural amino acids into a single protein using tRNAs with non-standard structures. FEBS Lett 579, 6769-74 (2005)
13  Murakami, H., Hohsaka, T., Ashizuka, Y. & Sisido, M. Site-directed incorporation of p-nitrophenylalanine into streptavidin and site-to-site photinduced electron transfer from a pyrenyl group to a nitrophenyl group on the protein framework. Journal of the American Chemical Society 120, 7520-7529 (1998)
14  Rodriguez, E. A., Lester, H. A. & Dougherty, D. A. In vivo incorporation of multiple unnatural amino acids through nonsense and frameshift suppression. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 8650-5 (2006)
15  Monahan, S. L., Lester, H. A. & Dougherty, D. A. Site-specific incorporation of unnatural amino acids into receptors expressed in mammalian cells. Chemistry and Biology 10, 573-580 (2003)
16  Anderson, J. C. et al. An expanded genetic code with a functional quadruplet codon. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 7566-71 (2004)
17  Atkins, J. F. & Bjork, G. R. A gripping tale of ribosomal frameshifting: extragenic suppressors of frameshift mutations spotlight P-site realignment. Microbiol Mol Biol Rev 73, 178-210 (2009)
18  Stahl, G., McCarty, G. P. & Farabaugh, P. J. Ribosome structure: revisiting the connection between translational accuracy and unconventional decoding. Trends Biochem Sci 27, 178-83 (2002)
19  Selmer, M. et al. Structure of the 70S ribosome complexed with mRNA and tRNA. Science 313, 1935-42 (2006)
20  Magliery, T. J., Anderson, J. C. & Schultz, P. G. Expanding the genetic code: selection of efficient suppressors of four-base codons and identification of "shifty" four-base codons with a library approach in Escherichia coli. J Mol Biol 307, 755-69 (2001)
21  Khazaie, K., Buchanan, J. H. & Rosenberger, R. F. The accuracy of Q beta RNA translation. 1. Errors during the synthesis of Q beta proteins by intact Escherichia coli cells. Eur J Biochem 144, 485-9 (1984)
22  Laughrea, M., Latulippe, J., Filion, A. M. & Boulet, L. Mistranslation in twelve Escherichia coli ribosomal proteins. Cysteine misincorporation at neutral amino acid residues other than tryptophan. Eur J Biochem 169, 59-64 (1987)
23  Kramer, E. B. & Farabaugh, P. J. The frequency of translational misreading errors in E. coli is largely determined by tRNA competition. Rna 13, 87-96 (2007)
24  Chin, J. W. et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. J Am Chem Soc 124, 9026-7 (2002)
25  Mukai, T. et al. Adding l-lysine derivatives to the genetic code of mammalian cells with engineered pyrrolysyl-tRNA synthetases. Biochem Biophys Res Commun 371, 818-22 (2008)
26  Camarero, J. A., Pavel, J. & Muir, T. W. Chemical Synthesis of a Circular Protein Domain: Evidence for Folding-Assisted Cyclization. Angewandte Chemie - International Edition 37, 347-349 (1998)
27  Scott, C. P., Abel-Santos, E., Wall, M., Wahnon, D. C. & Benkovic, S. J. Production of cyclic peptides and proteins in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 13638-43 (1999)
28  Li, P. & Roller, P. P. Cyclization strategies in peptide derived drug design. Curr Top Med Chem 2, 325-41 (2002)
29  Walensky, L. D. et al. Activation of apoptosis in vivo by a hydrocarbon-stapled BH3 helix. Science 305, 1466-70 (2004)
30  Trauger, J. W., Kohli, R. M., Mootz, H. D., Marahiel, M. A. & Walsh, C. T. Peptide cyclization catalysed by the thioesterase domain of tyrocidine synthetase. Nature 407, 215-8 (2000)
31  Stemmer, W. P. & Morris, S. K. Enzymatic inverse PCR: a restriction site independent, single-fragment method for high-efficiency, site-directed mutagenesis. Biotechniques 13, 214-20 (1992)
32  Santoro, S. W., Wang, L., Herberich, B., King, D. S. & Schultz, P. G. An efficient system for the evolution of aminoacyl-tRNA synthetase specificity. Nat Biotechnol 20, 1044-8 (2002)
33  Rice, J. B., Libby, R. T. & Reeve, J. N. Mistranslation of the mRNA encoding bacteriophage T7 0.3 protein. J Biol Chem 259, 6505-10 (1984)
34  Hao, B. et al. A new UAG-encoded residue in the structure of a methanogen methyltransferase. Science 296, 1462-6 (2002)
35  Kobayashi, T. et al. Structural basis for orthogonal tRNA specificities of tyrosyl-tRNA synthetases for genetic code expansion. Nat Struct Biol 10, 425-32 (2003)
【０１２３】
上記明細書中で参照されたすべての出版物を、参照により本明細書に組み込む。本発明の範囲から逸脱していない、記載した本発明の態様及び実施形態の様々な改変及び変形が当業者には明らかであろう。特定の好ましい実施形態に関して本発明を説明したが、特許請求の範囲に記載した通りの本発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定するべきでないことを理解するべきである。実際、記載されている、本発明を実行するための形態の様々な改変形態が当業者には明らかであり、そのような改変形態も、添付されている特許請求項の範囲に包含されるものとする。
【図１】
2013514799.tif 000004
【図２】
2013514799.tif 000005
【図３】
2013514799.tif 000006
【図４】
2013514799.tif 000007
【図５】
2013514799.tif 000008
【図６】
2013514799.tif 000009
【図７】
2013514799.tif 000010
【図８】
2013514799.tif 000011
【図９】
2013514799.tif 000012
【図１０】
2013514799.tif 000013
【図１１】
2013514799.tif 000014
【図１２】
2013514799.tif 000015
【図１３】
2013514799.tif 000016
【図１４】
2013514799.tif 000017
【図１５】
2013514799.tif 000018
【図１６】
2013514799.tif 000019
【図１７】
2013514799.tif 000020
【図１８−１】
2013514799.tif 000021
【図１８−２】
2013514799.tif 000022
【図１８−３】
2013514799.tif 000023
【図１８−４】
2013514799.tif 000024
【図１８−５】
2013514799.tif 000025
【図１８−６】
2013514799.tif 000026
【配列表】
2013514799000001.app
【国際調査報告】
2013514799.tif 000027
2013514799.tif 000028
2013514799.tif 000029
2013514799.tif 000030