(57)【要約】【課題】ヒトトランスフェリン受容体を標的とし、癌、特にリンパ腫又は白血病の型の癌の治療に対して非常に有望である新規な治療用抗体を提供する。【解決手段】配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５及び配列番号３６より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸配列を備えることを特徴とし、前記アミノ酸配列がヒトトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を標的とする抗体の重鎖（ＣＤＲ−Ｈ）又は軽鎖（ＣＤＲ−Ｌ）の可変ドメインの抗原との相補性を決定する領域（“ＣＤＲ”、相補性決定領域）に相当する分子構造。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子構造であって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５及び配列番号３６より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸配列を備えることを特徴とし、
前記アミノ酸配列がヒトトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を標的とする抗体の重鎖（ＣＤＲ−Ｈ）又は軽鎖（ＣＤＲ−Ｌ）の可変ドメインの抗原との相補性を決定する領域（“ＣＤＲ”、相補性決定領域）に相当する、
分子構造。
【請求項２】
請求項１に記載の分子構造であって、
配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３３及び配列番号３６より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸配列から成ることを特徴とする分子構造。
【請求項３】
請求項１に記載の分子構造であって、
配列番号１から配列番号３６の配列の少なくとも１つが、
配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８より選ばれる１つのアミノ酸配列に含まれることを特徴とし、
配列番号３７から配列番号４８の前記配列それぞれがヒトトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を標的とする抗体の重鎖又は軽鎖の可変ドメインに相当し、
配列番号３７の前記配列が配列番号１、配列番号２及び配列番号３の配列を備え、
配列番号３８の前記配列が配列番号４、配列番号５及び配列番号６の配列を備え、
配列番号３９の前記配列が配列番号７、配列番号８及び配列番号９の配列を備え、
配列番号４０の前記配列が配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２の配列を備え、
配列番号４１の前記配列が配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５の配列を備え、
配列番号４２の前記配列が配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８の配列を備え、
配列番号４３の前記配列が配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１の配列を備え、
配列番号４４の前記配列が配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４の配列を備え、
配列番号４５の前記配列が配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７の配列を備え、
配列番号４６の前記配列が配列番号２８、配列番号２９及び前記配列３０の配列を備え、
配列番号４７の前記配列が配列番号３１、配列番号３２及び配列番号３３の配列を備え、
配列番号４８の前記配列が配列番号３４、配列番号３５及び配列番号３６の配列を備える、
分子構造。
【請求項４】
請求項３に記載の分子構造であって、
配列番号３７から配列番号４８の配列の少なくとも１つが配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４より選ばれる１つのアミノ酸配列に含まれることを特徴とし、
配列番号４９から配列番号５４の前記配列それぞれがヒトトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を標的とする抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメインを備え、
配列番号４９の前記配列が配列番号１０９のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーによって相互に結合された配列番号３７及び配列番号３８の配列を備え、
配列番号５０の前記配列が配列番号１０９のペプチドリンカーによって相互に結合された配列番号３９及び配列番号４０の配列を備え、
配列番号５１の前記配列が配列番号１０９のペプチドリンカーによって相互に結合された配列番号４１及び配列番号４２の配列を備え、
配列番号５２の前記配列が配列番号１０９のペプチドリンカーによって相互に結合された配列番号４３及び配列番号４４の配列を備え、
配列番号５３の前記配列が配列番号１０９のペプチドリンカーによって相互に結合された配列番号４５及び配列番号４６の配列を備え、
配列番号５４の前記配列が配列番号１０９のペプチドリンカーによって相互に結合された配列番号４７及び配列番号４８の配列を備える、
分子構造。
【請求項５】
請求項４に記載の分子構造であって、単量体の形であることを特徴とする分子構造。
【請求項６】
請求項４に記載の分子構造であって、二量体の形であることを特徴とする分子構造。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載の分子構造であって、フラグメントＦｃも備えることを特徴とする分子構造。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載の分子構造であって、抗体又は抗体フラグメントであることを特徴とする分子構造。
【請求項９】
核酸配列であって、請求項１で定義した通りの配列番号１から配列番号３６のアミノ酸配列をそれぞれコードすることと、配列番号５５から配列番号９０の配列によってそれぞれ表されることとを特徴とする核酸配列。
【請求項１０】
ヌクレオチド配列であって、請求項３で定義した通りの配列番号３７から配列番号４８のアミノ酸配列をそれぞれコードすることと、配列番号９１から配列番号１０２の配列によってそれぞれ表されることとを特徴とするヌクレオチド配列。
【請求項１１】
ヌクレオチド配列であって、請求項４で定義した通りの配列番号４９から配列番号５４のアミノ酸配列をそれぞれコードすることと、配列番号１０３から配列番号１０８の配列によってそれぞれ表されることとを特徴とし、
前記配列番号１０３が配列番号１１０のヌクレオチド配列を有するペプチドリンカーによって相互に結合された配列番号９１及び配列番号９２の配列を備え、
前記配列番号１０４が配列番号１１０によって相互に結合された配列番号９３及び配列番号９４の配列を備え、
前記配列番号１０５が配列番号１１０によって相互に結合された配列番号９５及び配列番号９６の配列を備え、
前記配列番号１０６が配列番号１１０によって相互に結合された配列番号９７及び配列番号９８の配列を備え、
前記配列番号１０７が配列番号１１０によって相互に結合された配列番号９９及び配列番号１００の配列を備え、
前記配列番号１０８が配列番号１１０によって相互に結合された配列番号１０及び配列番号１０２の配列を備える、
ヌクレオチド配列。
【請求項１２】
単離核酸分子であって、請求項９から１１のいずれか一項で定義された通りの配列番号５５から配列番号１０８の少なくとも１つのヌクレオチド配列を備えることを特徴とする単離核酸分子。
【請求項１３】
発現ベクターであって、請求項１２に定義された通りの核酸分子を備えることを特徴とする発現ベクター。
【請求項１４】
宿主細胞又は生物であって、請求項１３に定義された通りの発現ベクターを備えることを特徴とする宿主細胞又は生物。
【請求項１５】
医薬組成物であって、請求項１から８のいずれか一項で定義された通りの少なくとも１つの分子構造の治療的有効量を医薬的に許容される担体と組合せて備える組成物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の組成物であって、前記分子構造を使用して１つ又はそれ以上の生物活性分子をベクター化する組成物。
【請求項１７】
請求項１５に記載の組成物であって、前記分子構造を使用して、１つ又はそれ以上の細胞傷害剤及び／又は１つ又はそれ以上の診断目的を持つ薬剤が装入されたリポソーム及び／又はナノ粒子を標的とする組成物。
【請求項１８】
請求項１５から１７のいずれか一項に記載の組成物であって、ＴｆＲの過剰発現を持つ病態の治療における医薬品として使用するための組成物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の組成物であって、前記病態が癌である組成物。
【請求項２０】
請求項１９に記載の組成物であって、前記癌がリンパ腫又は白血病型の癌である組成物。
【請求項２１】
請求項１８に記載の組成物であって、前記病態が自己免疫病態である組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト造血器系腫瘍細胞の細胞死を誘導する、トランスフェリン受容体に対する完全にヒト細胞傷害性の抗体（抗トランスフェリン受容体抗体）の新規なファミリーに関する。
【背景技術】
【０００２】
トランスフェリン（Ｔｆ）は８０ｋＤａの血清蛋白質であり、その役割は溶解鉄を固定することである。それはトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）と結合して、細胞内にエンドサイトーシスにより入り込む。エンドソームの酸性化はコンホメーション変化を引き起こし、それによりサイトゾルに鉄を放出させる。その後、Ｔｆ／ＴｆＲ複合体は細胞膜に再輸送され、そこで生理学的ｐＨに戻ると、Ｔｆ／ＴｆＲ複合体の分離を引き起こす。
【０００３】
ヒトトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、細胞増殖マーカーは、細胞の鉄の吸収及び細胞成長の調節において主要な役割を果たしている。それは、長い間、治療又は診断のアプローチのために、癌（非常に多数の増殖細胞を通じてそれが過剰発現しているため）、脳疾患（血液脳関門を通ってそれが発現しているため）を含む種々の病態に対する興味深い標的として考えられていた。
【０００４】
そのため、この２５年の間、いくつかの抗マウストランスフェリン受容体（ＴｆＲ）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）がハイブリドーマ技術によって開発されてきており、それらのマウス癌モデルに対する抑制効果についてin vitroで、時には in vivoでテストされており（Daniels et al., The transferrin receptor part I or part II, Clin. Immunol., 2006）、あるいは、脳を標的とするための担体としてテストされている（Pardridge, Drug targeting to the brain, Pharm res 24: 1733, 2007）。
【０００５】
理論的には、癌の免疫療法のために細胞傷害性抗マウストランスフェリン受容体モノクローナル抗体（ａｎｔｉ−ＴｆＲ ｍＡｂ）を使用することは、非常に増殖性のある造血器系株のような鉄依存性細胞に誘発される望ましくない効果によって制限する必要がある。
【０００６】
しかしながら、鉄の減少を誘発するｍＡｂ４２／６を用いたフェーズＩの試験は励みになることが判明した。その理由は、該抗体の投与中に患者には副次的効果が認められなかったからである（Brooks et al., Clin Cancer Rea 1: 1259, 1995）。
【０００７】
しかしながら、４２／６抗体を投与した患者に対して癌への反応は認められなかった。この臨床試験の失敗は、患者に免疫応答を開始するヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）が外来性である（マウス）こと、及び繰り返し注入した後に生じる抗体の急速な分解によることが考えられる。
【０００８】
抗ＴｆＲ増殖抑制因子ｍＡｂであるマウス抗体Ａ２４は、in vitroで成人のＴ細胞白血病／リンパ腫の急性及び慢性状態のサンプルに対して活性であり（Moura et al., Blood 103: 1838, 2004; Callens et al., Leukemia 22:42, 2008）、また、マウスのマントル細胞リンパ腫の進行に対しても活性である（Lepelletier et al., Cancer Res 67: 1145, 2007）。ｍＡｂ Ａ２４は、ＴｆＲの自然のリガンド、二価鉄トランスフェリン又はホロトランスフェリン（ｈｏｌｏ−Ｔｆ）を妨害する。Ａ２４は、ｈｏｌｏ−Ｔｆのエンドサイトーシスとそれに続く細胞内への取り込みを減少させる。さらに、ｍＡｂ Ａ２４は、細胞表面へのＴｆＲの戻りを妨害して、ＴｆＲの発現を減少させる。
【０００９】
文献において細胞傷害性として記載された抗ＴｆＲ ｍＡｂモノクローナル抗体の中で、トランスフェリンのＴｆＲへの結合を阻害するものはない。それらの抗増殖性又は細胞傷害性の作用は、ＴｆＲの分解を誘導するいくつかの受容体間の架橋、又はＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介細胞傷害）及びＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）の相互作用から生じる（Daniels et al., The transferrin receptor part I or part II, Clin Immunol., 2006）。ＴｆＲが静止細胞（赤血球株細胞、脳血管内皮細胞、肝細胞、尿細管細胞）の表面に発現することを考えれば、これらの抗体の作用様式は、これらの型の細胞に細胞傷害性を引き起こすのかもしれない。
【００１０】
現在までに存在する全ての抗ＴｆＲ抗体は動物の免疫によって産生された抗体である。したがって、治療剤としては、それらはその使用を制限する重大な免疫原生の特性をもっている。
【００１１】
現時点では、抗ＴｆＲモノクローナル抗体は市場にはない。しかしながら、MAT Biopharmaによる、転移性黒色腫に適用する抗ＴｆＲキメラ抗体の開発の前臨床研究は進行中である。しかしながら、この抗体の抗腫瘍活性は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介細胞傷害）及びＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）を得ることによることが明らかになっている。
【００１２】
現在までに使用されている悪性血液病の治療法は、部分的には、化学療法及びある受容体のチロシンキナーゼ活性に対する薬理阻害剤の使用に基づく。化学療法は病理及び腫瘍のステージとグレードに適合させる。副次的効果は重要であり、治療法の特異性の欠如に付随している。薬理阻害剤はより特異的であることが立証されている。しかし、いくつかの受容体のファミリー又は酵素活性を有する細胞内シグナル分子に結合することによって起こる毒性をもつ。さらに、ある患者においては、突然変異の獲得に関連する治療中に耐性が現れることがわかっている。
【００１３】
非特許文献１の“J. Mol. Biol. (2000), 301, 1149-1161”は、ＳＫＢＲ−３乳癌細胞の内部に取り込まれるが、同様の細胞特異性の正常細胞には取り込まれないファージのバンク由来のヒト単量体ｓｃＦｖフォーマットの抗体について扱っている。非特許文献１に記載された抗体Ｈ７、すなわちより詳しくはフラグメントｓｃＦｖ  Ｈ７（ｓｃＦｖ：“単鎖可変フラグメントフォーマット”）は、トランスフェリン受容体へのトランスフェリンの結合及びＳＫＢＲ−３乳癌細胞の成長を阻害することができる。ＳＫＢＲ−３乳癌細胞との結合に対し、フラグメントｓｃＦｖＨ７は、ホロトランスフェリンと競合的に反応する。
【００１４】
非特許文献２の“Molecular Immunology 44 (2007), 3377-3788”は、in vitroでのｓｃＦｖフォーマットのファージディスプレイにより、ＳＫＢＲ−３乳癌細胞内部に特異的に取り込まれる能力で選択することによって得られた、本出願における特有の実施例として挙げた６つの抗体を示している。
【００１５】
上記６つの抗体は、トランスフェリン受容体と特異的に結合する（前述した非特許文献１の結果に関連して）ことが記載されており、該６つの抗体はＳＫＢＲ−３乳癌細胞増殖を阻害するのに有効であると考えられている。
【００１６】
しかしながら、この想定は非特許文献３の“Cancer Research, vol. 70, no. 13, July 2010”で反論されている。そこでは、前記抗体は前記細胞の増殖を阻害しないと最終的に述べている（p.5500、左欄の最後の段落）。
【００１７】
このように、抗体の決定は、癌のような病態の治療法の探索におけるまだ最初の段階である。次いで、実際には、どの腫瘍細胞株、したがってどの治療への適用に対して、得られた抗体は活性があるのかを決定できることを必要とするが、これは一方で多数の細胞株があり、他方では該抗体の挙動を予測するのが困難であることを考えると、しばしば難しいことがわかっている。
【００１８】
驚くべきことに、本発明者は、本発明に係る抗体がリンパ腫又は白血病の型の癌の治療に対して、また、自己免疫疾患の免疫抑制剤として、又は移植片拒絶の予防に非常に有望であることを発見した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】J. Mol. Biol. (2000), 301, 1149-1161
【非特許文献２】MolecularImmunology 44 (2007), 3377-3788
【非特許文献３】Cancer Research, vol. 70, no. 13, July 2010
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
したがって、本発明の目的の１つは、ヒトトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を標的とし、癌、特にリンパ腫又は白血病の型の癌の治療に対して非常に有望である新規な治療用抗体を提供することである。
【００２１】
本発明の他の目的は、ヒトトランスフェリン受容体を標的とし、自己免疫疾患の治療又は移植片拒絶の予防に使用することができる新規な治療用抗体を提供することである。
【００２２】
本発明の他の目的は、ヒトトランスフェリン受容体を標的とし、生物活性分子、より詳しくはヒトトランスフェリン受容体を過剰発現する腫瘍細胞内の細胞傷害性薬物のベクター化に使用することができる新規な抗体を提供することである。
【００２３】
本発明の他の目的は、ヒトトランスフェリン受容体を標的とし、診断分子、より詳しくは脳イメージングのための診断分子のベクター化に使用することができる新規な治療用抗体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明の新規な抗体は、以下で述べる理由から治療に対して非常に有望である分子であり、上記目的を全て達成できることが証明されている。
【００２５】
実際、本発明の発明者は、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に特異的で、トランスフェリン（Ｔｆ）のトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）への結合を阻害し、したがって細胞から鉄を欠乏させる新規な完全にヒトの細胞傷害性抗体の新規なファミリーを開発した。より詳しくは、本発明の抗体は、細胞内の鉄を減少させ（細胞内部の鉄濃度の下降）、これは細胞表面の該受容体（ＴｆＲ）上の鉄の増加を結果としてもたらす。
【００２６】
本発明のヒト抗体は、特に好ましいことは、in vitro及びin vivoでの造血器系株由来の癌細胞に対する抗増殖性及び細胞傷害性活性を有することである。
【００２７】
本発明は、詳しくは、新規な分子構造であって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５及び配列番号３６より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸配列を備えることを特徴とし、
前記アミノ酸配列がヒトトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を標的とする抗体の重鎖（ＣＤＲ−Ｈ）又は軽鎖（ＣＤＲ−Ｌ）の可変ドメインの抗原との相補性を決定する領域（“ＣＤＲ”、相補性決定領域）に相当する、分子構造である。
【００２８】
分子構造は、本出願で規定する配列番号１〜３６のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、当業者によって調製されるあらゆる構造（たとえば、分子、抗体、抗体フラグメント、その他）を意味すると理解する。
【００２９】
本発明の上記分子構造は、特には、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３３及び配列番号３６より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸配列から成る。
【００３０】
このように特に規定した配列は、ヒトトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を標的とする抗体の各重鎖（ＣＤＲ３−Ｈ）又は軽鎖（ＣＤＲ３−Ｌ）の番号３の位置に配置されたＣＤＲに相当する。
【００３１】
さらに、特には、配列番号３、配列番号９、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２７及び配列番号３３は、“ＣＤＲ３−Ｈ”に相当し、配列番号６、配列番号１２、配列番号１８、配列番号２４、配列番号３０及び配列番号３６は、“ＣＤＲ３−Ｌ”に相当する。
【００３２】
本発明においては、前記分子構造において、配列番号１から配列番号３６の配列の少なくとも１つが、
配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８より選ばれる１つのアミノ酸配列に含まれることを特徴とし、
配列番号３７から配列番号４８の前記配列それぞれがヒトトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を標的とする抗体の重鎖又は軽鎖の可変ドメインに相当し、
配列番号３７の前記配列が配列番号１、配列番号２及び配列番号３の配列を備え、
配列番号３８の前記配列が配列番号４、配列番号５及び配列番号６の配列を備え、
配列番号３９の前記配列が配列番号７、配列番号８及び配列番号９の配列を備え、
配列番号４０の前記配列が配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２の配列を備え、
配列番号４１の前記配列が配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５の配列を備え、
配列番号４２の前記配列が配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８の配列を備え、
配列番号４３の前記配列が配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１の配列を備え、
配列番号４４の前記配列が配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４の配列を備え、
配列番号４５の前記配列が配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７の配列を備え、
配列番号４６の前記配列が配列番号２８、配列番号２９及び前記配列３０の配列を備え、
配列番号４７の前記配列が配列番号３１、配列番号３２及び配列番号３３の配列を備え、
配列番号４８の前記配列が配列番号３４、配列番号３５及び配列番号３６の配列を備える。
【００３３】
さらに本発明においては、前記分子構造において、配列番号３７から配列番号４８の配列の少なくとも１つが配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４より選ばれる１つのアミノ酸配列に含まれることを特徴とし、
配列番号４９から配列番号５４の前記配列それぞれがヒトトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を標的とする抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメインを備え、
配列番号４９の前記配列が配列番号１０９のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーによって相互に結合された配列番号３７及び配列番号３８の配列を備え、
配列番号５０の前記配列が配列番号１０９のペプチドリンカーによって相互に結合された配列番号３９及び配列番号４０の配列を備え、
配列番号５１の前記配列が配列番号１０９のペプチドリンカーによって相互に結合された配列番号４１及び配列番号４２の配列を備え、
配列番号５２の前記配列が配列番号１０９のペプチドリンカーによって相互に結合された配列番号４３及び配列番号４４の配列を備え、
配列番号５３の前記配列が配列番号１０９のペプチドリンカーによって相互に結合された配列番号４５及び配列番号４６の配列を備え、
配列番号５４の前記配列が配列番号１０９のペプチドリンカーによって相互に結合された配列番号４７及び配列番号４８の配列を備える。
【００３４】
上述した配列番号３７から配列番号４８の各種配列は、異なる配列番号１０９の配列を有するペプチドによって相互に結合することもできる。
【００３５】
該ペプチドリンカーのサイズが減少すると、たとえば“二重特異性抗体”型の分子が得られる。しかしながら、ペプチドリンカーのサイズの増大も想定される。
【００３６】
配列番号４９から配列番号５４の各配列は、ヒトトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を標的とする抗体の重鎖及び軽鎖の全ての可変ドメインを規定する。
【００３７】
配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６及び配列番号４７の各配列は、ヒトトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を標的とする抗体の重鎖（ＶＨ）の全ての可変ドメインを規定する。
【００３８】
配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６及び配列番号４８の各配列は、ヒトトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を標的とする抗体の軽鎖（ＶＬ）の全ての可変ドメインを規定する。
【００３９】
配列番号１から配列番号３、配列番号７から配列番号９、配列番号１３から配列番号１５、配列番号１９から配列番号２１、配列番号２５から配列番号２７、及び配列番号３１から配列番号３３の各配列は、ヒトトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を標的とする抗体の重鎖（ＣＤＲ−Ｈ）の可変ドメインの抗原との相補性を決定する領域を規定する。
【００４０】
配列番号４から配列番号６、配列番号１０から配列番号１２、配列番号１６から配列番号１８、配列番号２２から配列番号２４、配列番号２８から配列番号３０、及び配列番号３４から配列番号３６の各配列は、ヒトトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を標的とする抗体の軽鎖（ＣＤＲ−Ｌ）の可変ドメインの抗原との相補性を決定する領域を規定する。
【００４１】
したがって、配列番号１から配列番号５４の配列は、ヒトトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を標的とする抗体の重鎖及び／又は軽鎖の可変ドメインの全体又は一部だけに関連している。
【００４２】
本発明の好ましい態様によれば、前記分子構造は、単量体の形である。
【００４３】
本発明の他の好ましい態様によれば、前記分子構造は、二量体の形である。
【００４４】
本発明のさらに他の好ましい態様によれば、前記分子構造は、フラグメントＦｃも備える。
【００４５】
本発明において、前記分子構造は、抗体又は抗体フラグメントであることが特に好ましい。
【００４６】
本発明において、前記の配列番号４９から配列番号５４の配列は、より正確には、“完全な”抗体ではなく、抗体フラグメントを規定している。これらの配列は、自然の抗体（免疫グロブリン）に発見された定常ドメインを含んでいないからである。
【００４７】
一般的に、重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインの主要な配列の点で、１つの抗体は他の抗体と異なる。定常ドメインの配列は、抗体の所与のクラス又はサブクラスに対して同一である。
【００４８】
したがって、正確に言えば、本発明の主題を規定するために使用される用語“抗体”は、より厳密には“抗体フラグメント”の意味として理解すべきである。
【００４９】
本発明の抗体又は抗体フラグメントは、全てＴｆＲに対して特異的であるが、同じ主要な配列を有しているわけではない（配列番号４９から配列番号５４を参照）。上記抗体は、パラトープ、すなわち、抗原、この場合ＴｆＲ、のエピトープの結合部分とは異なる。
【００５０】
また、本発明は、核酸配列であって、前述した通りの配列番号１から配列番号３６のアミノ酸配列をそれぞれコードし、配列番号５５から配列番号９０の配列によってそれぞれ表されることを特徴とする核酸配列である。
【００５１】
したがって、配列番号５５は、配列番号１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を表す（配列番号２をコードする配列番号５６、配列番号３をコードする配列番号５７、配列番号４をコードする配列番号５８、配列番号５をコードする配列番号５９、配列番号６をコードする配列番号６０、配列番号７をコードする配列番号６１、配列番号８をコードする配列番号６２、配列番号９をコードする配列番号６３、配列番号１０をコードする配列番号６４、配列番号１１をコードする配列番号６５、配列番号１２をコードする配列番号６６、配列番号１３をコードする配列番号６７、配列番号１４をコードする配列番号６８、配列番号１５をコードする配列番号６９、配列番号１６をコードする配列番号７０、配列番号１７をコードする配列番号７１、配列番号１８をコードする配列番号７２、配列番号１９をコードする配列番号７３、配列番号２０をコードする配列番号７４、配列番号２１をコードする配列番号７５、配列番号２２をコードする配列番号７６、配列番号２３をコードする配列番号７７、配列番号２４をコードする配列番号７８、配列番号２５をコードする配列番号７９、配列番号２６をコードする配列番号８０、配列番号２７をコードする配列番号８１、配列番号２８をコードする配列番号８２、配列番号２９をコードする配列番号８３、配列番号８４をコードする配列番号３０、配列番号８５をコードする配列番号３１、配列番号８６をコードする配列番号３２、配列番号８７をコードする配列番号３３、配列番号８８をコードする配列番号３４、配列番号８９をコードする配列番号３５、配列番号９０をコードする配列番号３６）。
【００５２】
また、本発明は、ヌクレオチド配列であって、前述したように、配列番号３７から配列番号４８のアミノ酸配列をそれぞれコードし、配列番号９１から配列番号１０２の配列によってそれぞれ表されるヌクレオチド配列である。
【００５３】
したがって、配列番号９１は、配列番号３７のアミノ酸配列をコードする核酸配列を表す（配列番号３８をコードする配列番号９２、配列番号３９をコードする配列番号９３、配列番号４０をコードする配列番号９４、配列番号４１をコードする配列番号９５、配列番号４２をコードする配列番号９６、配列番号４３をコードする配列番号９７、配列番号４４をコードする配列番号９８、配列番号４５をコードする配列番号９９、配列番号４６をコードする配列番号１００、配列番号４７をコードする配列番号１０１、配列番号４８２をコードする配列番号１０２）。
【００５４】
また、本発明は、ヌクレオチド配列であって、前述した配列番号４９から配列番号５４のアミノ酸配列をそれぞれコードすることと、配列番号１０３から配列番号１０８の配列によってそれぞれ表されることとを特徴とし、
前記配列番号１０３が配列番号１１０のヌクレオチド配列を有するペプチドリンカーによって相互に結合された配列番号９１及び配列番号９２の配列を備え、
前記配列番号１０４が配列番号１１０によって相互に結合された配列番号９３及び配列番号９４の配列を備え、
前記配列番号１０５が配列番号１１０によって相互に結合された配列番号９５及び配列番号９６の配列を備え、
前記配列番号１０６が配列番号１１０によって相互に結合された配列番号９７及び配列番号９８の配列を備え、
前記配列番号１０７が配列番号１１０によって相互に結合された配列番号９９及び配列番号１００の配列を備え、
前記配列番号１０８が配列番号１１０によって相互に結合された配列番号１０及び配列番号１０２の配列を備えており、
配列番号１０３は、配列番号４９のアミノ酸配列をコードする核酸配列を表す（配列番号１０４をコードする配列番号５０、配列番号１０５をコードする配列番号５１、配列番号１０６をコードする配列番号５２、配列番号１０７をコードする配列番号５３、配列番号１０８をコードする配列番号５４）。
【００５５】
また、本発明は、前記した配列番号５５から配列番号１０８の少なくとも１つのヌクレオチド配列を備える単離核酸分子である。
【００５６】
さらに、本発明は、前記した核酸分子を備える発現ベクター、前記した発現ベクターを備える宿主細胞又は生物である。
【００５７】
また、本発明は、前記した少なくとも１つの分子構造の治療的有効量を医薬的に許容される担体と組合せて備える医薬組成物である。
【００５８】
前述したように、該分子構造は抗体又は抗体フラグメントであることが好ましい。
【００５９】
好ましい態様としては、該医薬組成物において、前記分子構造を使用して１つ又はそれ以上の生物活性分子をベクター化する。
【００６０】
本発明の抗体は内部に取り込む特性を有し（実施例１参照）、それにより、上記生物学的活性な分子を、ＴｆＲを過剰発現している癌細胞の内部に運搬するベクターの役割を果たす興味深いツールとなる。
【００６１】
他の好ましい態様としては、前記医薬組成物において、前記分子構造を、１つ又はそれ以上の細胞傷害剤及び／又は１つ又はそれ以上の診断目的を持つ薬剤が装入されたリポソーム（“免疫リポソーム”の形成）又はナノ粒子を標的とするために使用する。
【００６２】
また、本発明は、ＴｆＲの過剰発現を持つ病態の治療における医薬品として使用するための前記医薬組成物である。
【００６３】
ＴｆＲの過剰発現を持つ病態の例としては、癌、特にリンパ腫又は白血病型の癌である。
【００６４】
本発明の好ましい実施態様としては、特には、in vitro及び／又はin vivoで癌細胞に対し、本発明の抗体の抗増殖性及び細胞傷害性の作用により、及び／又は、
癌細胞の死滅を誘導する（鉄を失わせることにより）本発明の抗体で行う、癌に対する治療法である。
【００６５】
本発明は、また、癌細胞の細胞増殖を阻害する及び／又は該細胞死を誘導する方法であって、癌細胞に下記物質を結合させ、それにより癌細胞の増殖の阻害及び／又は癌細胞死を誘導するために、少なくとも以下のうちの１つの物質を患者に投与することを含むことを特徴とする方法である。
前記の分子構造、
前記の医薬品組成物。
【００６６】
本発明は、また、癌の治療方法であって、癌細胞のトランスフェリン受容体に下記物質を結合させ、それにより癌細胞の増殖の阻害及び／又は癌細胞死を誘導するために、少なくとも以下のうちの１つの物質を患者に投与することを含むことを特徴とする方法である。
前記の分子構造、
前記の医薬品組成物。
【００６７】
言及されうる癌細胞の例は、造血器官系細胞である。
【００６８】
ＴｆＲの過剰発現をもつ病態の他の例は、自己免疫病態である。
【００６９】
実際、的確なこの事例では、それらはＴｆＲの過剰発現をもつエフェクター細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】ｓｃＦｖ−３ＴＦ１２の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号４９）及び核酸配列（配列番号１０３）を示す図である。
【図２】ｓｃＦｖ−３ＴＦ２の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号５０）及び核酸配列（配列番号１０４）を示す図である。
【図３】ｓｃＦｖ−３ＧＨ９の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号５１）及び核酸配列（配列番号１０５）を示す図である。
【図４】ｓｃＦｖ−Ｃ３．２の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号５２）及び核酸配列（配列番号１０６）を示す図である。
【図５】ｓｃＦｖ−３ＴＧ９の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号５３）及び核酸配列（配列番号１０７）を示す図である。
【図６】ｓｃＦｖ−３ＧＨ７の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号５４）及び核酸配列（配列番号１０８）を示す図である。
【図７】配列番号４９から配列番号５４の本発明の６つの抗体の特異性を示す図である。
【図８】配列番号４９から配列番号５４の本発明の６つの抗体のエピトープのエピトープマップを示す図である。
【図９】本発明の６つの抗体によるＴｆ／ＴｆＲ結合の阻害を表す図である。
【図１０】本発明の６つの抗体の存在下において、Ｊｕｒｋａｔ細胞に関する増殖試験の結果を示す図である。
【図１１】３ＴＦ１２及び３ＧＨ７の存在下において、いくつかの造血器系細胞の生死判別試験の結果を示す図である。
【図１２】抗体３ＴＦ１２及び３ＧＨ７の単鎖フォーマットが二価フォーマットＦ１２ＣＨ及びＨ７ＣＨに変換される間に得られた結果を示す図である。
【図１３】二価フォーマットの抗増殖効果を示す図である。
【図１４】抗ＴｆＲ Ｆ１２ＣＨ及びＨ７ＣＨによるＲａｊｉ細胞及びＥＲＹ−１細胞の細胞死の誘導を示す図である。
【図１５】抗ＴｆＲ Ｆ１２ＣＨ及びＨ７ＣＨの作用機構を示す図である。
【図１６】抗体Ｆ１２ＣＨのinvivoによる検討結果を示す図である。
【図１７】Ｆ１２ＣＨで処理したヒト血液単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖試験の結果を示す図である。
【図１８】Ｂｏｔ−Ｆｃ及びＦ１２−Ｆｃ抗体のｓｃＦｖ−Ｆｃフォーマットの試験結果を示す図である。
【図１９】二価のｓｃＦｖ−ＦｃフォーマットのＦ１２抗体のＥＲＹ−１細胞の感受性の評価について示す図である。
【図２０】３ＴＦ１２抗体の存在下、ＵＴ−７株の増殖の阻害について示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
図１は、ペプチドリンカーによって重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）が相互に結合された“ｓｃＦｖ−３ＴＦ１２”と呼ばれる本発明の単鎖フラグメントの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号４９）及び核酸配列（配列番号１０３）を示す。
【００７２】
この上の各線は配列番号４９を表し、下の各線は配列番号１０３を表す。
【００７３】
配列番号４９の重鎖の３つの“ＣＤＲ”領域（ＣＤＲ１―ＨからＣＤＲ３―Ｈ、配列番号１から配列番号３）及び軽鎖の３つの“ＣＤＲ”領域（ＣＤＲ１―ＬからＣＤＲ３―Ｌ、配列番号４から配列番号６）は、太字で示され四角で囲まれている。
【００７４】
重鎖（ＶＨ）はアミノ酸番号１からアミノ酸番号１１９を含む（配列番号３７）。
【００７５】
軽鎖（ＶＬ）はアミノ酸番号１３５からアミノ酸番号２４５を含む（配列番号３８）。
【００７６】
前記ペプチドリンカー（配列番号１０９）は１５のアミノ酸の配列番号１２０から１３４を含み、イタリック体で下線を引いて示している（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ）
【００７７】
配列番号１０９をコードする配列番号１１０の核酸配列は、イタリック体で下線を引いて小文字で示している。
【００７８】
図２は、ペプチドリンカーによって重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）が相互に結合された“ｓｃＦｖ−３ＴＦ２”と呼ばれる本発明の単鎖フラグメントの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号５０）及び核酸配列（配列番号１０４）を示す。
【００７９】
この上の各線は配列番号５０を表し、下の各線は配列番号１０４を表す。
【００８０】
配列番号４９の重鎖の３つの“ＣＤＲ”領域（ＣＤＲ１―ＨからＣＤＲ３―Ｈ、配列番号７から配列番号９）及び軽鎖の３つの“ＣＤＲ”領域（ＣＤＲ１―ＬからＣＤＲ３―Ｌ、配列番号１０から配列番号１２）は、太字で示され四角で囲まれている。
【００８１】
重鎖（ＶＨ）はアミノ酸番号１からアミノ酸番号１１８を含む（配列番号３９）。
【００８２】
軽鎖（ＶＬ）はアミノ酸番号１３４からアミノ酸番号２４３を含む（配列番号４０）。
【００８３】
図１で示しているように前記ペプチドリンカー（配列番号１０９）は、アミノ酸番号１１９から１３３にわたる１５のアミノ酸を含む。
【００８４】
図３は、ペプチドリンカーによって重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）が相互に結合された“ｓｃＦｖ−３ＧＨ９”と呼ばれる本発明の単鎖フラグメントの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号５１）及び核酸配列（配列番号１０５）を示す。
【００８５】
この上の各線は配列番号５１を表し、下の各線は配列番号１０５を表す。
【００８６】
配列番号５１の重鎖の３つの“ＣＤＲ”領域（ＣＤＲ１―ＨからＣＤＲ３―Ｈ、配列番号１３から配列番号１５）及び軽鎖の３つの“ＣＤＲ”領域（ＣＤＲ１―ＬからＣＤＲ３―Ｌ、配列番号１６から配列番号１８）は、太字で示され四角で囲まれている。
【００８７】
重鎖（ＶＨ）はアミノ酸番号１からアミノ酸番号１１８を含む（配列番号４１）。
【００８８】
軽鎖（ＶＬ）はアミノ酸番号１３４からアミノ酸番号２４２を含む（配列番号４２）。
【００８９】
図１で示しているように前記ペプチドリンカー（配列番号１０９）は、アミノ酸番号１１９から１３３にわたる１５のアミノ酸を含む。
【００９０】
図４は、ペプチドリンカーによって重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）が相互に結合された“ｓｃＦｖ−Ｃ３．２”と呼ばれる本発明の単鎖フラグメントの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号５２）及び核酸配列（配列番号１０６）を示す。
【００９１】
この上の各線は配列番号５２を表し、下の各線は配列番号１０６を表す。
【００９２】
配列番号５２の重鎖の３つの“ＣＤＲ”領域（ＣＤＲ１―ＨからＣＤＲ３―Ｈ、配列番号１９から配列番号２１）及び軽鎖の３つの“ＣＤＲ”領域（ＣＤＲ１―ＬからＣＤＲ３―Ｌ、配列番号２２から配列番号２４）は、太字で示され四角で囲まれている。
【００９３】
重鎖（ＶＨ）はアミノ酸番号１からアミノ酸番号１１８を含む（配列番号４３）。
【００９４】
軽鎖（ＶＬ）はアミノ酸番号１３４からアミノ酸番号２４３を含む（配列番号４４）。
【００９５】
図１で示しているように前記ペプチドリンカー（配列番号１０９）は、アミノ酸番号１１９から１３３にわたる１５のアミノ酸を含む。
【００９６】
図５は、ペプチドリンカーによって重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）が相互に結合された“ｓｃＦｖ−３ＴＧ９”と呼ばれる本発明の単鎖フラグメントの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号５３）及び核酸配列（配列番号１０７）を示す。
【００９７】
この上の各線は配列番号５３を表し、下の各線は配列番号１０７を表す。
【００９８】
配列番号５３の重鎖の３つの“ＣＤＲ”領域（ＣＤＲ１―ＨからＣＤＲ３―Ｈ、配列番号２５から配列番号２７）及び軽鎖の３つの“ＣＤＲ”領域（ＣＤＲ１―ＬからＣＤＲ３―Ｌ、配列番号２８から配列番号３０）は、太字で示され四角で囲まれている。
【００９９】
重鎖（ＶＨ）はアミノ酸番号１からアミノ酸番号１１７を含む（配列番号４５）。
【０１００】
軽鎖（ＶＬ）はアミノ酸番号１３３からアミノ酸番号２４１を含む（配列番号４６）。
【０１０１】
図１で示しているように前記ペプチドリンカー（配列番号１０９）は、アミノ酸番号１１８から１３２を含む。
【０１０２】
図６は、ペプチドリンカーによって重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）が相互に結合された“ｓｃＦｖ−３ＧＨ７”と呼ばれる本発明の単鎖フラグメントの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号５４）及び核酸配列（配列番号１０８）を示す。
【０１０３】
この上の各線は配列番号５４を表し、下の各線は配列番号１０８を表す。
【０１０４】
配列番号５４の重鎖の３つの“ＣＤＲ”領域（ＣＤＲ１―ＨからＣＤＲ３―Ｈ、配列番号３１から配列番号３３）及び軽鎖の３つの“ＣＤＲ”領域（ＣＤＲ１―ＬからＣＤＲ３―Ｌ、配列番号３４から配列番号３６）は、太字で示され四角で囲まれている。
【０１０５】
重鎖（ＶＨ）はアミノ酸番号１からアミノ酸番号１１９を含む（配列番号４７）。
【０１０６】
軽鎖（ＶＬ）はアミノ酸番号１３５からアミノ酸番号２４３を含む（配列番号４８）。
【０１０７】
図１で示しているように前記ペプチドリンカー（配列番号１０９）は、アミノ酸番号１２０から１３４にわたる１５のアミノ酸を含む。
【０１０８】
図７は、前記した、また、図１〜６に示した配列番号４９から配列番号５４の本発明の６つのＴｆＲに対する抗体の特異性を示している。
【０１０９】
ＬＳ―１７４Ｔ細胞は、示されたホロトランスフェリン（Sigma）の各種濃度において、４℃で１時間インキュベートした。
【０１１０】
抗ＴｆＲ ｓｃＦｖファージ又はＬＳ―１７４Ｔ細胞に存在する受容体ＥｒＢｂ２に対して特異的なコントロールのｓｃＦｖ−Ｆ５ファージの結合は、ファージキャプシドの蛋白質ｐ８（抗Ｍ１３、GEヘルスケア）に対するマウス抗体を用いて定量化し、次いで、マウス免疫グロブリンを認識する蛍光抗体を用いてＦＡＣＳにより測定している。
【０１１１】
ＭＦＩ（％）の表示は、トランスフェリン競合体が不在のときに得られたＭＦＩと比較した平均の蛍光強度（ＭＦＩ）を表す。
【０１１２】
図８は、配列番号４９から配列番号５４の本発明の６つのＴｆＲに対する抗体（抗ＴｆＲ ｓｃＦｖ）のエピトープのエピトープマップを示す。
【０１１３】
ＴｆＲを過剰発現するＬＳ―１７４Ｔ細胞を、１０μｇ／ｍｌの可溶性抗ＴｆＲ抗体又はボツリヌス毒素（Ｂｏｔ）に対するコントロールの抗体の存在下で、４℃で１時間インキュベートした。その後、１０１１ｃｆｕ／ｍｌの抗体ファージ（ｓｃＦｖファージ）を該細胞に４℃で１時間添加した。
【０１１４】
抗ＴｆＲ ｓｃＦｖファージ又は受容体ＥｒＢｂ２に対して特異的なコントロールファージのｓｃＦｖ−Ｆ５の結合は、図７で述べたのと同様の方法で定量化される。
【０１１５】
ＭＦＩ（％）の表示は、トランスフェリン競合体が不在のときに得られたＭＦＩと比較した平均の蛍光強度（ＭＦＩ）を表す。
【０１１６】
図９は、本発明の６つの抗体“抗ＴｆＲ ｓｃＦｖ”によるＴｆ／ＴｆＲ結合の阻害を表す。
【０１１７】
ＬＳ―１７４Ｔ細胞を、２０μｇ／ｍｌ濃度の抗ＴｆＲ ｓｃＦｖ抗体の存在下で、４℃で１時間インキュベートした。その他として、ＴｆＲに特異的でないｓｃＦｖ抗体を使用し、又はＰＢＳ単独でのインキュベーションも行う。次いで、５００ｎＭの蛍光ホロトランスフェリン（Ｔｆ−ＦＩＴＣ）を４℃で１時間添加した。洗浄後、前記細胞に結合した該Ｔｆ−ＦＩＴＣをＦＡＣＳにより測定した。表示は、抗体なしでインキュベートした細胞のＭＦＩと比較したＭＦＩの割合を表す。
【０１１８】
図１０は、本発明の６つの“抗ＴｆＲ ｓｃＦｖ”抗体の存在下において、３日間、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ヒトＴリンパ腫により産生）の増殖試験を示す。
【０１１９】
図１１は、抗ＴｆＲ ｓｃＦｖ、すなわち、３ＴＦ１２及び３ＧＨ７の存在下において、いくつかの造血器系細胞の生死判別試験を示す。
【０１２０】
図１０、１１は、可溶性抗体１０μｇ／ｍｌ含むＲＰＭＩ／ＳＶＦ１０％培地に、９６ウェルプレートに１ウェル当たり５０００のＪｕｒｋａｔ細胞を播種しこれを６回繰り返した。５％ＣＯ２、３７℃の湿度室で３日間、該細胞をインキュベートした。生存細胞の数を、ＭＴＴ試験で測定した（CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell proliferation Assay, Promega）。
【０１２１】
図１２（図１２−ａ、１２−ｂ、１２−ｃ及び１２−ｄ）は、抗体３ＴＦ１２及び３ＧＨ７の単鎖フォーマットが二価フォーマットＦ１２ＣＨ及びＨ７ＣＨに変換される間に得られた結果を示す。
【０１２２】
図１２−ａ及び１２−ｂは、Ｂｉｎ Ｌｉｕ（ＵＣＳＦ）から入手できる細菌発現ベクターｐＳＹＮ−ＨＩＳ−ＣＹＳから二価のｓｃＦｖＣＨ抗体（すなわち、Ｆ１２ＣＨ及びＨ７ＣＨ）の産生を示す。より詳しくは、図１２−ａは、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製された抗体のゲルろ過による溶出推移を示すＦＰＬＣ
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５クロマトグラムを示している。図１２−ｂは、抑制（＋ＤＴＴ）又は非抑制（−ＤＴＴ）条件下で、ゲルろ過後に分離された二量体抗体分画（１５００秒のピークにおける約５５ｋＤａの分画）のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル解析を示している。
【０１２３】
図１２−ｃ及び１２−ｄは、ｈｏｌｏ−ＴｆのＲａｊｉ細胞への結合を阻害する抗体の単量体及び二量体フォーマットの対比を示す。Ｒａｊｉ細胞を示された濃度の単量体抗体（図１２−ｃ）又は二量体抗体（図１２−ｄ）と４℃で１時間インキュベートする。次いで、５００ｎＭｈｏｌｏ−Ｔｆ−ＦＩＴＣを該細胞に４℃、１時間添加する。洗浄後、蛍光をＦＡＣＳで測定する。
【０１２４】
図１３は、二価フォーマットの抗増殖効果を示す。
【０１２５】
図１３−ａにおいては、１０μｇ／ｍｌの二価の可溶性抗体の存在下で数日間、造血器系のいくつかの細胞株をインキュベートしている。細胞生存率をＭＴＴ試験（CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega）（ＯＤ４９０ｎｍ）で定量している。
【０１２６】
図１３−ｂにおいては、ＥＲＹ−１細胞を一価（左側）又は二価（右側）の可溶性抗ＴｆＲ抗体と、示された濃度で３日間インキュベートしている。細胞生存率をＭＴＴ試験で定量している。
【０１２７】
図１４は、抗ＴｆＲ Ｆ１２ＣＨ及びＨ７ＣＨによるＲａｊｉ細胞及びＥＲＹ−１細胞の細胞死の誘導を示す。
【０１２８】
詳しくは、図１４−ａは、ホスファチジルセリンのトランスロケーションのマーキングを示す。Ｒａｊｉ細胞（上図）及びＥＲＹ−１細胞（底図）は、それぞれ４日間、２日間、１０μｇ／ｍｌのＦ１２ＣＨ、Ｈ７ＣＨ及びネガティブコントロールＢｏｔと処理する。該細胞は洗浄した後、ヨウ化プロピディウム（ＰＩ）及びアネキシンＶ−ＦＩＴＣでマーキングした。ポジティブのアネキシンＶ、ネガティブのアネキシンＰＩのマーキングは、アポトーシス細胞に相当し、他方、ポジティブのアネキシンＶ、ポジティブのＰＩのマーキングは、ネクローシス細胞に相当する。
【０１２９】
図１４−ｂは、ミトコンドリア膜の脱分極のマーキングを示す。Ｒａｊｉ細胞（上図）及びＥＲＹ−１細胞（底図）は、図１４−ａと同様にして処理する。洗浄後、該細胞を３，３’−ジヘキシルオキサカルボシアニン（ＤＩＯＣ６）でマーキングする。蛍光強度の低下はミトコンドリア電位の低下と相関している。
【０１３０】
図１５は、抗ＴｆＲ Ｆ１２ＣＨ及びＨ７ＣＨの作用機構を示す。
【０１３１】
図１５−ａの左の図においては、固定又は非固定のＲａｊｉ細胞を、３７℃又は４℃で３時間、５００ｎＭＴｆ−ＦＩＴＣの存在下でインキュベートしている。洗浄後、蛍光をＦＡＣＳで測定している。
【０１３２】
図１５−ａの右の図においては、Ｒａｊｉ細胞は、３時間、５００ｎＭのＴｆ−ＦＩＴＣの存在下でインキュベートする前に、示された濃度で、抗体と３７℃、１時間インキュベートしている。  
【０１３３】
図１５−ｂの左の図においては、Ｒａｊｉ細胞は、４日間、１０μｇ／ｍｌの抗体とインキュベートしている。次いで、Ｔｆ−ＦＩＴＣ（５００ｎＭ）を３７℃、３時間固定し、マーキングする前に、該細胞はグリシンバッファー（グリシン５０ｍＭ、ＮａＣｌ５００ｍＭ、ｐＨ２．８）で洗浄している。
【０１３４】
図１５−ｂの右の図においては、Ｒａｊｉ細胞は、１０μｇ／ｍｌの抗体と４日間インキュベートしている。次いで、蛋白質抽出物を、ｌｙｓｉｓバッファー（Tris-HCl pH7.5 50mM, NaCl 250mM, EDTA pH8 10mM, DTT 1mM, NP40 1%, プロテアーゼ阻害剤（Roche））を用いて得る。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を移動させた後、該蛋白質をニトロセルロース膜に移行させる。ＴｆＲ及びアクチンの発現（後者はゲルバッチのコントロールとして働く）は、抗ＴｆＲマウス抗体（Zymed）及び抗アルファアクチンヤギ抗体（Santa Cruz）を用いて定量化する。検出は２つの酵素ＨＲＰ標識抗体を用いて行う。これらはＴｆＲに対するマウス免疫グロブリン及びアクチンに対するヤギ免疫グロブリンを認識する。
【０１３５】
図１５−ｃの左の図においては、Ｒａｊｉ細胞は、４時間、示された濃度のクエン酸鉄アンモニウム（ＦＡＣ）の存在下、１０μｇ／ｍｌのＦ１２ＣＨ又はＢｏｔ抗体とインキュベートしている。次いで、該細胞は洗浄し、得られた蛋白質抽出物を前記と同様にして得る。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を移動させ、膜に移行させた後、ＴｆＲは、抗ＴｆＲマウス抗体（Zymed）を用いて定量化し、及びアルファチュブリン（ゲルバッチのコントロール）は、抗アルファチュブリンマウス抗体（Santa Cruz）を用いて定量化する。
【０１３６】
図１５−ｃの右の図においては、ＥＲＹ−１細胞を、２５μＭのクエン酸鉄アンモニウム（ＦＡＣ）又は硫酸鉄（ＺｎＳＯ４）の存在下、５μｇ／ｍｌの抗体と処理している。細胞生存性をＭＴＴ試験（CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega）で定量化している。
【０１３７】
図１６は、抗体Ｆ１２ＣＨのin vivoによる検討結果を示している。
【０１３８】
図１６−ａの図においては、胸腺欠損ヌードマウスに４Ｇｙを照射し、その後、２００万のＥＲＹ−１細胞を各動物に皮下注射している。腫瘍が平均体積２００ｍｍ３に達したら、上記マウスを各５匹のマウスが含まれるように３つのカゴに分ける。次いで、容量２００μｌのＰＢＳ又は２００μｇの抗体を含むＰＢＳをＤ０で１週間に２回、腫瘍に対向する各マウスの脇腹の位置に腹腔内に注射している。腫瘍の成長は、公式：体積＝（Π／６）×（長さ＋幅）３）に従って、カリパスで測定している。前記マウスはＤ２５で屠殺している。両グループ間の平均の差については、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験で解析している（＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００５）。  
【０１３９】
図１６−ｂの図においては、除去後に腫瘍が固定され、次いで、ヘマトキシリン−エオシン−サフロン（ＨＥＳ）でマーキングしている。  
【０１４０】
図１６−ｃの図においては、ＦＭＡ３、Ｐ８１５（肥満細胞腫由来のＰ８１５及びＦＭＡ３株）及びＥＲＹ−１細胞を、示された濃度で、４℃で１時間、ビオチン標識されたマウスホロトランスフェリン（Ｔｆｍ）（Rockland）とインキュベートしている。Ｔｆｍの前記細胞に対する結合はフィコエリスリン標識ストレプトアビジン（BD Phamingen）で検出する。洗浄後、蛍光をＦＡＣＳで測定している。
【０１４１】
図１６−ｄの左の図においては、ＦＭＡ３細胞を、５０μｇ／ｍｌの濃度の３ＴＦ１２抗体（単量体）又はＢｏｔ抗体と４℃で１時間インキュベートしている。該抗体の前記細胞に対する結合は３ＴＦ１２及びＢｏｔ抗体のｍｙｃ ｔａｇに対する第二の抗体（抗ｃ−ｍｙｃ、Sigma）、次いで、フィコエリスリン標識マウス抗免疫グロブリン抗体（BD
Pharmingen）を用いて測定している。洗浄後、蛍光をＦＡＣＳで測定している。灰色をつけた曲線は、Ｂｏｔのマーキングの蛍光に相当し、一方、透明な曲線は３ＴＦ１２のマーキングの蛍光に相当する。
【０１４２】
図１６−ｄの右の図においては、ＦＭＡ３細胞を、５０μｇ／ｍｌの濃度のＦＣＨ抗体（二量体）又はＢｏｔ抗体と４℃で１時間インキュベートしている。該抗体の前記細胞に対する結合はＦＣＨ抗体及びＢｏｔ抗体のヒスチジンｔａｇに対する第二の抗体（penta-His antibody,Qiagen）、次いで、フィコエリスリン標識マウス抗免疫グロブリン抗体（BD Pharmingen）を用いて測定している。洗浄後、蛍光をＦＡＣＳで測定している。灰色をつけた曲線は、Ｂｏｔのマーキングの蛍光に相当し、一方、透明な曲線は３ＴＦ１２のマーキングの蛍光に相当する。
【０１４３】
図１７はＦ１２ＣＨで処理したヒト血液単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖試験を示している。該細胞には、ＩＬ−２（５０ｎｇ／ｍｌ）を強化した１０％ＳＶＦを含むＲＰＭＩ培地で、１ウェル当たり２・１０４の細胞を播種している。該細胞は、Ｂｏｔ又はＦ１２ＣＨ抗体（細菌で産生された二量体フォーマット）と、示された濃度で３日間処理している。細胞生存率をＭＴＴ試験（CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega）（ＯＤ４９０ｎｍ）で測定している。
【０１４４】
図１８はＢｏｔ−Ｆｃ及びＦ１２−Ｆｃ抗体のｓｃＦｖ−Ｆｃフォーマットの試験結果を示す。
【０１４５】
図１８（ａ）は、抑制条件及び非抑制条件下で、Ｂｏｔ−Ｆｃ及びＦ１２−Ｆｃ抗体の精製についてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル解析を示している。該ゲルの各ウェル内に１μｇの抗体を堆積させた。
【０１４６】
図１８（ｂ）は、Ｂｏｔ−Ｆｃ（灰色）及びＦ１２−Ｆｃ（黒）抗体によるヒトＨＭＣ１．２（左）とマウスＢａ／Ｆ３（右）細胞の膜のマーキングを表す。
該細胞は、１０μｇ／ｍｌの該抗体と４℃で１時間インキュベートした。ｓｃＦｖ−Ｆｃの前記細胞に対する結合は、ヒトＦｃフラグメントに対するフィコエリスリン（Rockland）標識の第二の抗体（penta-His antibody,Qiagen）を用いて検出した。
【０１４７】
図１８（ｃ）は、ＨＭＣ１．２株の増殖に対するｓｃＦｖ対ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体の２つのフォーマットの影響に関する試験を示す。１０％ＳＶＦを含むＲＰＭＩ培地で、ＨＭＣ１．２細胞（１ウェル当たり１０４、６回繰り返し）に１０μｇ／ｍｌの該抗体（ｓｃＦｖフォーマット又はｓｃＦｖ−Ｆｃフォーマットのいずれか）を播種した。細胞生存率を、６日後（ｓｃＦｖ、左図）及び４日後（右図）にＭＴＴ試験（CellTiter
96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega）（ＯＤ４９０ｎｍ）で測定した。
【０１４８】
図１９は、二価のｓｃＦｖ−ＦｃフォーマットのＦ１２抗体のＥＲＹ−１細胞の感受性の評価について示す。９６ウェルプレートに１ウェル当たり４０００の細胞をＲＰＭＩ／ＳＶＦ１０％培地に播種し、これを６回行った。５％ＣＯ２、３７℃の湿度室で該細胞を４日間、インキュベートした。生存細胞の数を、ＭＴＴ試験で測定した（CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega）。結果を抗体なしのコントロールに対比した生存性％で示した。
【０１４９】
図２０は、３ＴＦ１２抗体の存在下、ＵＴ−７株の増殖の阻害について示す。９６ウェルプレートに１ウェル当たり４０００の細胞を、０、１又は１０μｇ／ｍｌの可溶性抗体を含むＩＭＤＭ／ＳＶＦ１０％／エリスロポイエチン２Ｕ／ｍｌ培地に播種し、これを６回行った。５％ＣＯ２、３７℃の湿度室で該細胞を４日間、インキュベートした。生存細胞の数を、ＭＴＴ試験で測定した（CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega）。結果は、適用した抗体の濃度の関数として、４９０ｎｍの吸収の値を示す。
【実施例】
【０１５０】
以下の実施例は、本発明を表すが限定するものではない。
【０１５１】
実施例１
機能的選択により産生された６つの異なる抗ＴｆＲ抗体
抗ＴｆＲ抗体をｓｃＦｖフォーマット（単鎖可変フラグメントフォーマット）のファージディスプレイによりin vitroで得た。そして、乳癌細胞（ＳＫＢＲ３）の内部に特異的にエンドサイトーシスされる（取り入れられる）能力によって選択した。
【０１５２】
この選択により、分子量が各２８ｋＤａである６つの抗体が得られた。それらは、それぞれ３ＴＦ１２（配列番号４９）、３ＴＦ２（配列番号５０）、３ＧＨ９（配列番号５１）、Ｃ３．２（配列番号５２）、３ＴＧ９（配列番号５３）、及び３ＧＨ７（配列番号５４）である。
【０１５３】
これらの単鎖可変フラグメントフォーマット（ｓｃＦｖ）は一価フラグメントとも呼ばれ、単量体の形態を表す。
【０１５４】
本発明の抗体はＴｆＲに特異的である。各抗ＴｆＲ ｓｃＦｖファージの結合は、ホロトランスフェリンの存在下で用量に依存して阻害される（図７）。それらは似通った又は共通のエピトープを認識する。各抗ＴｆＲ
ｓｃＦｖファージの結合は、可溶性の抗ＴｆＲ ｓｃＦｖの存在下で阻害される（図８）。それらはホロトランスフェリン（ｈｏｌｏ−Ｔｆ）のＴｆＲへの結合部位と重なる。各抗ＴｆＲ
ｓｃＦｖはｈｏｌｏ−ＴｆのＴｆＲへの結合を、多かれ少なかれ顕著に阻害し、３ＴＦ１２及び３ＧＨ７に最大の阻害が認められる（図９）。
【０１５５】
実施例２
抗ＴｆＲ抗体の抗増殖効果及びその作用機構の検討
造血器系由来の癌細胞においては鉄の必要性が増加している。抗ＴｆＲ ｓｃＦｖの存在下、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病由来のＪｕｒｋａｔ株に対し、３日間、増殖試験を行った。
【０１５６】
３ＴＦ１２及び３ＧＨ７抗体だけがＪｕｒｋａｔ株に対し、弱いものの再現性のある抗増殖活性を有している（図１０）。
【０１５７】
また、Ｊｕｒｋａｔ株に対し抗増殖効果を有する抗体、すなわち３ＴＦ１２及び３ＧＨ７は、ＴｆのＴｆＲへの結合を最もよく阻害する。
【０１５８】
この抗増殖効果が抗体か、あるいは使用した細胞株の由来に特有のものであるかを決定するために、造血器系由来の他の５つの癌細胞株の細胞生存性について、１０μｇ／ｍｌの３ＴＦ１２又は３ＧＨ７の存在下、数日間試験した（図１１）。
【０１５９】
試験した細胞型に依存して、顕著な抗増殖効果が観察された（Ｒａｊｉ及びＥＲＹ−１株に対し最大８０％の阻害）。
【０１６０】
抗体の単量体フォーマットから二量体フォーマットへの変化（Ｆ１２ＣＨから３ＴＦ１２、Ｈ７ＣＨから３ＧＨ７）は、ＴｆＲへの抗体の親和性を増大させた。
抗体の二価フォーマットはＴｆＲへのＴｆの阻害を向上させている（図１２−ａから１２−ｄ）。抗増殖効果は向上している。
【０１６１】
二量体、すなわち二価の可変フラグメントの分子量は約５５ｋＤａである。
【０１６２】
フォーマットのこの変化は、全ての試験株に一価のｓｃＦｖの抗増殖効果を増強することができ（図１３）、また、各抗体に対し、ＩＣ５０を低下させることができる（表１）。
【０１６３】
[表１]
単量体又は二量体フォーマットの抗体の存在下で３日間インキュベートされたＥＲＹ−１株の増殖試験によって各抗体に対して得られたＩＣ５０の比較
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【０１６４】
二価のフォーマットの抗体は、抗ＴｆＲ ３ＧＨ７及び３ＴＦ１２の抗増殖効果を向上させる。この効果は試験した全ての株に観察されている（図１３）。
【０１６５】
さらに、抗ＴｆＲ Ｆ１２ＣＨ及びＨ７ＣＨはアポトーシスによる細胞死（ＥＲＹ−１株に）又はオートファジーによる細胞死（Ｒａｊｉ株に）を誘発する（図１４）。
【０１６６】
実際、抗ＴｆＲは、ＥＲＹ−１株に対し、ミトコンドリアルートを通るアポトーシス型の細胞死のきっかけを誘発させる。Ｒａｊｉ株に関しては、処理を施した後、ミトコンドリア電位の低下を招くことなく、ホスファチジルセリンのトランスロケーションが観察される。さらに、処理した細胞の粒度が上昇する（図１４−ａのトップ）。これは、この細胞死の現象が、この細胞株のオートファジーに関係していることを示している。
【０１６７】
本発明者は、これらの抗体の細胞傷害性を担う作用機構を発見した。
【０１６８】
ＴｆのＴｆＲへの結合が抗体により４℃で阻害されることを考慮すると、本発明者は、この阻害が３７℃において維持されるかどうか確認したいと考えた。かくして、ｈｏｌｏ−Ｔｆの内部取り込みが二価の抗ＴｆＲによって動的コンテキストにおいて阻止されるかどうかを知ることが可能となる。
【０１６９】
細胞に関係するＴｆ−ＦＩＴＣは、３７℃で３時間のインキュベーションの後、最初に定量した（図１５−ａの左）。内部に取り込まれたＴｆ−ＦＩＴＣに関するシグナルと単に表面に結合したＴｆ−ＦＩＴＣのシグナルとを区別するために、同じ実験を、前もって固定液中（即席で準備した４％パラホルムアルデヒド又は市販の固定液、ＢＤ）でインキュベートした細胞に繰り返した。固定されていない細胞に関して細胞が固定されると、５０％のシグナルの減少が観察される。したがって、細胞に関連した蛍光の一部は細胞内局在性に対応する。細胞が前もって各種濃度（０．２から２０μｇ／ｍｌ）のＦ１２ＣＨ又はＨ７ＣＨとインキュベートされると、用量依存性のシグナルの阻害が観察される。
【０１７０】
この結果は、抗体Ｆ１２ＣＨ及びＨ７ＣＨは効果的に細胞内へのｈｏｌｏ−Ｔｆの内部取り込みを阻止するという結論を導く。
【０１７１】
本発明者は、次に、癌細胞への抗体Ｆ１２ＣＨ及びＨ７ＣＨの固定が、ＴｆＲの発現レベルを変えるかどうか確認したいと考えた。
【０１７２】
このために、Ｒａｊｉ細胞を１０μｇ／ｌの抗ＴｆＲ Ｆ１２ＣＨ及びＨ７ＣＨと４日間インキュベートする。次いで、該細胞をグリシンバッファー（ｐＨ２）中で洗浄し、細胞表面に結合したｓｃＦｖ抗体を除去した。そして、Ｔｆ−ＦＩＴＣとインキュベートし、細胞表面でのＴｆＲの膜発現を定量化した（図１５−ｂの左）。
【０１７３】
上記処理を施した細胞はＴｆＲを過剰発現することがわかる。同じ細胞から蛋白質抽出物が得られ、ＴｆＲの発現をウェスタンブロッティングで解析すると（図１５−ｂの右）、コントロールの抽出物と比較してこの過剰発現は処理抽出物中にも見出される。したがって、ＴｆＲの発現の全体的な増加がある。
【０１７４】
ＴｆＲの発現は、ＴｆＲのｍＲＮＡに存在するＩＲＥ（鉄応答エレメント）モチーフの存在によって調節されている。これは、細胞中の鉄濃度が低いときにそれを安定化させる。逆に、鉄が過剰な場合は、ＴｆＲのｍＲＮＡは分解し、ＴｆＲはもはや合成されない（Daniels et al., The transferrin receptor part I or part II, Clin Immunol., 2006）。
【０１７５】
この理由のため、本発明者は、抗体Ｆ１２ＣＨ及びＨ７ＣＨの作用に続いて観察されるＴｆＲの過剰発現が該抗体によって誘発される鉄の減少と関係しているのか又は他の機構と関係しているのかを確認したいと考えた。
【０１７６】
このために、Ｒａｊｉ細胞を、可溶性鉄（ＦＡＣ、クエン酸鉄アンモニウム）の存在下、培養培地で種々の濃度のコントロールの抗体Ｂｏｔ及びＦ１２ＣＨ抗体と４日間処理している。
【０１７７】
鉄の存在は、ＴｆＲの発現をいずれのケース（Ｂｏｔ及びＦ１２ＣＨ）でも抑制することがわかる。これはＦ１２ＣＨに対して観察されたＴｆＲの過剰発現が、トランスフェリンのエンドサイトーシスの阻止によって誘発される鉄の減少と確かに関係していることを証明している。
【０１７８】
最後に、本発明者は、該抗体の細胞傷害性が、それらが誘発する鉄の減少と関係しているかどうかを確認したいと考えた。最も感受性のある細胞株（ＥＲＹ−１）を、金属カチオン（鉄又は亜鉛、後者はネガティブコントロールとして使用）で補強した抗体の存在下、３日間処理し、細胞生存性をＭＴＴ試験で定量化した（図１５−ｃの右）。可溶性鉄の外来の供給は、抗体の細胞傷害性を停止させることがわかる。
【０１７９】
結論として、Ｆ１２ＣＨの作用に続いて観察される細胞のＴｆＲの過剰発現は確かにＦ１２ＣＨによって起こる鉄の減少と関係している。
【０１８０】
この機構特性は、前述した他の抗ＴｆＲマウス抗体の作用様式に比較して独特である。実際、本発明の抗体とは対照的に、上記抗体はその細胞傷害性作用を発揮するには多価のフォーマットを必要とし、これは膜レベルにおいてＴｆＲの発現の減少と相関している（IgG A24, (Lepelletier et al., Cancer Res 67: 1145, 2007; Moura et
al., Blood 103: 1838, 2004), IgA 42/6(Taetle et al., Cancer Res 46, 1759-63,
1986), “avidin-fused IgG3” (Ng et al., Blood 108, 2745-54, 2006), IgM R17 208
(Lesley and Schutle, Mol Cell Biol 5, 1814-21, 1985)）。
【０１８１】
このように本発明者は、本発明の抗体が細胞内において鉄の減少を誘発し、これが細胞表面の受容体（ＴｆＲ）の鉄の増加の結果をもたらすことを確認することができた。
【０１８２】
しかしながら、この情報は、どの細胞株に本発明の抗体が活性であるのかを確認するのには、それ自体十分ではない。なぜなら、細胞株が鉄の減少に感受性があるのかどうかを確認することは不可能であるからである。実際、鉄の減少への感受性の大小に対する理由はわかっておらず、特に表面の受容体のレベルに依存していない（前記文献３の図２Ｃ参照）。
【０１８３】
実施例３
異種移植ヒト腫瘍のマウスモデルの検討
抗体Ｆ１２ＣＨ及びＨ７ＣＨが、いくつかの造血器系由来の細胞に対してin vitroで顕著な抗癌作用を有することを上記実施例で示した。
【０１８４】
この抗体Ｆ１２ＣＨの抗癌作用がin vivoで、腫瘍環境で維持されるかどうか確認するため、細胞株ＥＲＹ−１からヌードマウスにおいて皮下異種移植のモデルを開発した。一度、移植が効果を生じると（平均腫瘍体積２００ｍｍ３）、抗体Ｆ１２ＣＨ又はＢｏｔ２００μｇを各動物に１週間に２回注射した。
【０１８５】
腫瘍の成長を２５日間測定して、図１６−ａに示した。
【０１８６】
抗体Ｆ１２ＣＨは、コントロール担体（ＰＢＳバッファーのみの注射）及びアイソタイプのコントロール（同じ条件で産生された非特異的抗体の注射）に比べて腫瘍の成長を遅らせることがわかった。
【０１８７】
処理マウスの腫瘍部分では、繊維症及び前壊死細胞の存在が見られる（図１６−ｂ）。
【０１８８】
１０ｍＭの大きさの濃度で宿主に存在するマウスｈｏｌｏ―ＴｆはヒトＴｆＲに対して増大した反応性を有し（図１６−ｃ）、抗体Ｆ１２ＣＨは、宿主細胞に存在するマウスＴｆＲとの増大した反応性を有する（図１６−ｄ）ことが立証されているため、観察された効果はますます生理学的に関連している。
【０１８９】
このように、これらの抗体を試験するのに使用した動物モデルは、ヒトにおいて抗体Ｆ１２ＣＨの投与中に起こるかもしれない相互作用を反映している。
【０１９０】
使用したフォーマットにおいて、抗体Ｆ１２ＣＨはフラグメントＦｃを失っており、そのため、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介細胞傷害）又はＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）タイプの抗腫瘍反応を引き起こす免疫システムのエフェクターを得ることができないことに注意することは重要である。これは、観察された効果が抗体の作用の様式に特有であることを立証している。
【０１９１】
それらの特有の細胞傷害性の様式、すなわち、ＡＤＣＣ又はＣＤＣタイプの抗体の自然のエフェクター機能とは独立しており、標的細胞表面のＴｆＲの増加に関連した細胞傷害性は、本発明の抗体に対して特に、癌の治療に対して高いポテンシャルをもつ抗体医薬としての有利性を付与する。
【０１９２】
実施例４
活性化した血液単核細胞の増殖に対する抗体の効果
二価フォーマットの抗体３ＴＦ１２及び３ＧＨ７を自己免疫疾患又は、移植片の拒絶に対する予防治療として移植に対しても試験する。
【０１９３】
Ｔ細胞表面のＴｆＲ／ＣＤ７１の発現はＴリンパ球の増殖の活性化及び維持に必須の役割を果たす。抗ＴｆＲ阻害剤抗体は、自己免疫疾患又は移植片の拒絶又は宿主に対する移植片の反応に対する予防の免疫抑制剤として使用することが可能である。
【０１９４】
抗体３ＴＦ１２及び３ＧＨ７のＳＣＦｖＣＨフォーマット（二価、５０ｋＤ、細菌内で産生）の効果を、サイトカインＩＬ−２（“ＰＢＭＣ”）によって活性化されるヒト血液単核細胞の増殖に関して試験した。
【０１９５】
抗体３ＴＦ１２（抗ＴｆＲ）（Ｆ１２ＣＨ）及びＢｏｔ（非特異的）の調製を、同じ条件下で、試験した（図１７参照）。
【０１９６】
用量依存的な活性化ＰＢＭＣの増殖の阻害が抗ＴｆＲ抗体Ｆ１２の存在下で観察される。
【０１９７】
前記抗体が細菌内で産生され、その精製において、存在していたリポ多糖類（ＬＰＳ）の形跡は非特異的Ｂｏｔの存在下におけるＰＢＭＣの増殖の刺激を説明することに留意する。
【０１９８】
このように二量体フォーマットｓｃＦｖＣＨの抗体Ｆ１２は、末梢リンパ球のＩＬ−２依存性増殖を阻害（１０μｇ／ｍｌの濃度で５０％阻害）し、免疫抑制剤として使用しうる。
【０１９９】
実施例５
ｓｃＦｖ−Ｆｃフォーマットの抗体の産生及び各種細胞株に対する効果
本発明者によって使用する二価フォーマット（ｓｃＦｖ−ＣＨ）は、抗体、最初は３ＴＦ１２及び３ＧＨ７の一価のフォーマットの抗増殖効果を顕著に改善させた。しかしながら、この新規なフォーマットが標準のｓｃＦｖフォーマットよりも大きい分子量を有するものの（５５対２８ｋＤ、腎臓ろ過限度により大）、血清中のその半減期はＩｇＧアイソタイプ（アイソタイプＩｇＧ１、２及び３に対し、ヒトで２１から２４日が半減期）の完全な抗体に比べて数時間だけ少ない。
フラグメントＦｃの不在に関係するこの低分子量は、血清の安定性とin vivoで抗体の有効性を制限する（マウスの異種移植モデルに対する効果は観察されている）。
さらに、フラグメントＦｃの存在は、一方で、ＴｆＲに対する結合に加えて、補体カスケードの最初の要素、Ｃｌｑと補体系カスケードを得ることを可能にし、他方では、“ナチュラルキラー”細胞（ＮＫ）のＦｃ受容体及びＡＤＣＣエフェクター機能を媒介するためのマクロファージへの結合を可能にする。鉄の減少から独立した機構により、これは表面に高いレベルのＴｆＲを発現する細胞に対し、抗体の細胞傷害性活性を増大することができる。
【０２００】
抗体Ｈ７及びＦ１２は１１０ｋＤのｓｃＦｖフォーマットで調製され、これはヒトＩｇＧ１のＣＨ２及びＣＨ３定常ドメインのＣ末端にｓｃＦｖフラグメントが融合していることを示している。これらの蛋白質は自然にホモ二量体化し、約１１０ｋＤａ（２×５５ｋＤａ）の二価の分子を形成する。
【０２０１】
ｓｃＦｖフォーマットの抗体を得るため、Ｂｏｔ、３ＴＦ１２及び３ＧＨ７のＶＨ及びＶＬ配列は、ｐＦｕｓｅ−ｈＧ１−Ｂｏｔ−Ｆｃ、ｐＦｕｓｅ−ｈＧ１−Ｆ１２−Ｆｃ及びｐＦｕｓｅ−ｈＧ１−Ｈ７−Ｆｃの構成を得ることを可能とする、ベクターｐＦｕｓｅ−ｈＧ１にサブクローニング（Moutel, S. et al., 2009. A multi-Fc-species system for recombinant
antibody production. BMC. Biotechnol. 9, 14に記載）する。この抗体フォーマットの発現はＣＨＯ細胞のトランスフェクションによりもたらされる。次いで、該細胞は、３日間以上、培地にｓｃＦｖ−ＣＨを分泌する。次いで、蛋白質Ａ−アガロース樹脂で精製し、その後、濃縮される。
【０２０２】
図１８（ａ）は、ｓｃＦｖ−Ｆｃフォーマットの抗体Ｆ１２及びＢｏｔの産生を示している。非抑制条件下では、約１１０ｋＤの抗体の二量体フォーマットを検出している。ＤＴＴの添加により、予測されるように単量体型５５ｋＤに移行する。
【０２０３】
図１８（ｂ）は、ｓｃＦｖ−Ｆｃフォーマットの抗体Ｆ１２がＨＭＣｌ．２細胞（ヒト肥満細胞腫）及びマウスＢａＦ／３細胞（マウスプロＢ造血細胞株）に結合することを示している。コントロールとして、ボツリヌス毒素（Ｂｏｔ）に対する抗体がＨＭＣｌ．２細胞に結合していないことを示している。  
【０２０４】
図１８（ｃ）は、ＨＭＣｌ．２細胞の増殖が、同じ濃度のｓｃＦｖ−Ｆ１２フォーマットをもつ抗体ｓｃＦｖ−Ｆ１２−Ｆｃにより、より高い強度で阻害されることを示している。その非特異的抗体（Ｂｏｔ）の２つのフォーマットは効果がない。
【０２０５】
成長の阻害についての同様の結果が抗体Ｈ７を用いて得られた（図示せず）。
【０２０６】
図１９は、ＥＲＹ−１細胞において、ＩＣ５０はＦ１２抗体の０．１μｇ／ｍｌより低いことを示している。したがって、ｓｃＦｖ−Ｆｃフォーマットは、二価フォーマットｓｃＦｖＣＨと同等（実際にはそれ以上）に効果的である（図１３−ｂ）。
【０２０７】
二価ｓｃＦｖ−Ｆｃフォーマットの抗体Ｆ１２をＵＴ−７株、ヒト赤白血病株に試験した。抗体Ｆ１２の強力な阻害効果（７０％阻害）が１０μｇ／ｍｌの濃度で観察された（図２０）。
【０２０８】
一般的な結論
ＴｆＲの隣接するエピトープを認識し、ＴｆＲの自然のリガンド、ホロトランスフェリンを阻害することができるトランスフェリン受容体に特異的な６つの抗体を、ファージ表面に抗体を提示することにより、受容体により媒介されるエンドサイトーシスにより、生きている癌細胞によりエンドサイトーシスされる能力で選択した。この機能的選択は、ヒト一価抗体（抗ＴｆＲ
ｓｃＦｖ）の６つのフラグメント、すなわち、約２８ｋＤの分子量の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を得ることを可能にした。
【０２０９】
この選択によって得られた機能的リガンド型の上記６つの抗ＴｆＲ ｓｃＦｖ抗体は全て、ＴｆＲに結合する自然なリガンドのホロトランスフェリン（ｈｏｌｏ−Ｔｆ）を妨害する。したがって、それらは全てｈｏｌｏ−ＴｆのＴｆＲへの結合を妨害する。
【０２１０】
ＴｆＲに対して最も高い親和性を有する抗ＴｆＲ ｓｃＦｖフラグメント、すなわち、３ＴＦ１２（配列番号４９）及び３ＧＨ７（配列番号５４）は各種造血器系癌細胞株の増殖を阻害し、特に興味深い抗癌特性を有する。
【０２１１】
抗体３ＴＦ１２及び３ＧＨ７の細胞増殖に対する阻害力は、二価の性質のため、改善された親和性をもつ５５ｋＤの二価の抗体フォーマット、すなわち、Ｆ１２ＣＨ及びＨ７ＣＨを開発することにより向上した。
【０２１２】
このフォーマットの変更（一価から二価への）は、各抗体に関し、ＩＣ５０の向上を可能にした。
【０２１３】
これらの高い親和性をもつ取り込み可能な抗体の細胞傷害性の反応機構は、前述した抗ＴｆＲマウス成長阻害剤モノクローナル抗体のそれとは異なる。
【０２１４】
実際、Ｆ１２ＣＨ及びＨ７ＣＨは、ｈｏｌｏ−Ｔｆの細胞吸収をかなり阻害し、また、アポトーシス及び／又はオートファジーによる細胞死を誘導しつつ、細胞表面のＴｆＲの数の増加を誘導する（それらの分解を増加させることによるその減少の代わりに）。
【０２１５】
これらの特性は、完全なヒトＴｆＲ抗体フラグメントの新規なファミリーが、多数のＴｆＲを発現して永続的に増加する鉄依存性腫瘍の免疫療法に適していると明示することを可能にした。
【０２１６】
本発明の抗体がヒト抗体のバンクから産生されるという事実は非常に有利な点である。なぜなら、それらは、前臨床開発への移行のためヒト化の工程を必要としないからである。
【０２１７】
本発明の６つの抗体（一価又は二価のいずれであれ）は、わずかに異なるエピトープ（各エピトープは自然なリガンドＴｆの結合部位とモチーフを共有する）を標的とすることができ、また、標的に対して異なる親和性を有する。
【０２１８】
その他のこれらの抗体のうちの１つ又は１つ以外の臨床的使用は、特に有利であることを証明することが可能である。なぜなら、それにより、治療で誘発される耐性現象を避けることが可能だからである。
【０２１９】
本発明の抗体は、現在まで開示されていない特有の反応機構により機能する。それらは、細胞表面でＴｆＲを接合させる多価のフォーマットを必要とせずに、癌細胞の鉄を失わせることで細胞死を誘導する。
【０２２０】
さらには、抗体の存在下においてin
vitroで数日間インキュベートすることにより、細胞表面でＴｆＲの増加をもたらす。この観察がin vivoで再現されると、この特有の特性は標的とする細胞の“可視性”を向上させる。
【０２２１】
in vivoで使用される抗体フォーマットは、約５５ｋＤａの二価の二量体ｓｃＦｖである。
【０２２２】
本発明の抗体（一価及び二価の両方）の抗腫瘍特性を増大させるため、完全な抗体を得るためにＦｃフラグメントの添加又は抗体の半減期を増加できるペグ化による、抗体のフォーマットの変更をすることができる。このフォーマットは、ｓｃＦｖＣＨフォーマットの抗体のin vitroでの細胞傷害性の効果を再現する。付加的に、Ｆｃ領域の存在は、免疫系のエフェクターを得て、抗体の抗腫瘍効果を増大させることを可能にする。
【０２２３】
本発明の抗体（一価及び二価フォーマットの両方）は、ＴｆＲに対する特異性、細胞傷害性の特定の様式、及びヒト起源と結びついた低い免疫原性により、癌の治療に高いポテンシャルをもつ治療分子であることを立証している。  
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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