(57)【要約】  本発明は治療用FVIII抗体に関する。特に、本発明は、FVIIIの循環半減期を延長する能力を有するFVIII抗体に関する。本発明はさらに、血友病Aの処置および予防におけるそのような抗体の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化ヒト第VIII因子に結合する能力を有するモノクローナル第VIII因子抗体であって、活性化第VIII因子との結合によりA2ドメインの解離を低下させ、vWF結合に干渉しない抗体。
【請求項２】
トロンビン活性化を加速しない、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
A2ドメインに結合する、請求項1または2のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４】
A3ドメインに結合する、請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
ペプチド断片407〜428(配列番号15)および/または591〜602(配列番号16)と同一の、または重複するエピトープに結合する、請求項1から2のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
ペプチド断片1965〜1976(配列番号17)と同一の、または重複するエピトープに結合する、請求項1に記載の抗体。
【請求項７】
4F143抗体との結合と競合する、請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号11、配列番号12、および配列番号13からなるリストから選択されるCDR配列の1つまたは複数と少なくとも95%の同一性を有する1つまたは複数のCDR配列を含む、請求項1に記載の抗体。
【請求項９】
配列番号9と少なくとも95%の同一性を有するVL配列、および配列番号10と少なくとも95%の同一性を有するVH配列を含む、請求項5に記載の抗体。
【請求項１０】
血友病Aの処置のための薬剤としての、請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１１】
血友病Aの処置のための第VIII因子分子と組み合わせての、請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１２】
請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体を含む医薬組成物。
【請求項１３】
請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体、および第VIII因子分子を含む医薬組成物。
【請求項１４】
皮下投与用である、請求項12から13のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
請求項1から9のいずれか一項に記載の抗体を作製する方法であって、そのような抗体をコードする宿主細胞の、前記抗体を発現するのに適した条件下でのインキュベーションを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血友病Aの処置に関する。特に、本発明は、治療用第VIII因子抗体、ならびに血友病Aの処置のための第VIII因子抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
血友病Aは、凝固第VIII因子(FVIII)活性の欠乏または機能障害により引き起こされる遺伝性出血障害である。臨床症状は、最初の止血に関してではなく(血餅の形成は正常に起こる)、血餅が次のトロンビン形成の欠損により不安定である。
【０００３】
血友病Aは、血液から単離されるか、または組換え的に産生されるかのいずれかの凝固因子FVIIIの静脈内注射により現在、処置されている。処置はオンデマンドかまたは予防的かのいずれかであり得る。最近の発表データは、予防がオンデマンド処置よりかなり有利であることを裏付けている。これらには、出血頻度の低下、および血友病性関節症を発症するリスクの減少が挙げられ、それらのどちらも患者にとってより良い生活の質をもたらす。しかしながら、予防は、患者にとって事実上症状が出ない生活を可能にするが、末梢静脈中の頻繁な注射を、典型的には週に3回、必要とし、そのことは、痛みを伴い、面倒であり、かつ時間がかかることが知られている。加えて、頻回の静脈穿刺が、幼児において常に可能とは限らない。よって、より頻度の少ない投与および/または、例えば皮下投与などのより便利かつ安全な経路による投与をサポートする製造物が、より大きい程度で、定期的な予防処置を可能にするであろう。
【０００４】
wt FVIIIの活性化を増強する能力を有するFVIII抗体は、米国特許出願第20090297503号に開示されている。しかしながら、この抗体は、wt FVIIIのvWFとの結合を損なうことも示されている。第VIII因子の循環半減期がvWF結合により何倍も高くなるため、FVIII:vWF結合の障害は、一般的には望ましくないと考えられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願第20090297503号
【特許文献２】WO09108806
【特許文献３】WO0331464
【特許文献４】EP0319315
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Wardら、(1989) Nature 341:544〜546頁
【非特許文献２】Birdら、(1988) Science 242:423〜426頁
【非特許文献３】Hustonら、(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879〜5883頁
【非特許文献４】Hol-liger, P.ら、(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444〜6448頁
【非特許文献５】Poljak, R. J.ら、(1994) Structure 2:1121〜1123頁
【非特許文献６】Harlowら、Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、(1988)
【非特許文献７】Colliganら編、Current Protocols in Immunology、Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience、N.Y.、(1992、1993)
【非特許文献８】Muller、Meth. Enzymol. 92:589〜601頁(1983)
【非特許文献９】Fay (1991) JBC、266:8957〜8962頁
【非特許文献１０】Lamphear (1992) JBC, 267:3725〜3730頁
【非特許文献１１】Fay (1992) JBC 267:13246〜13250頁
【非特許文献１２】Fay (1993) JBC 268:17861〜17866頁
【非特許文献１３】Fay (1996) JBC 271:6027〜6032頁
【非特許文献１４】Parker (2007) JBC 281:13922〜13930頁
【非特許文献１５】Parker (2007) Biochemistry 46:9737〜9742頁
【非特許文献１６】Fay PJ (2004) Blood Reviews、18:1〜15頁
【非特許文献１７】Grahamら、J. Gen. Virol. 36:59〜72頁、1977
【非特許文献１８】WaechterおよびBaserga、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:1106〜1110頁、1982
【非特許文献１９】UrlaubおよびChasin、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216〜4220頁、1980
【非特許文献２０】Cell、33:405頁、1983
【非特許文献２１】Somatic Cell and Molecular Genetics 12:555頁、1986
【非特許文献２２】KohlerおよびMilstein (1975) Nature 256:495頁
【非特許文献２３】WalesおよびEngen、Mass Spectrom. Rev. 25、158頁(2006)
【非特許文献２４】Weisら、J. Am. Soc. Mass Spectrom、17、1700頁(2006)
【非特許文献２５】Ngo, Jacky Chi Ki、Huang, Mingdong、Roth, David A.、Furie, Barbara C.、Furie, Bruce、Crystal Structure of Human Factor VIII: Implications for the Formation of the Factor IXa-Factor VIIIa Complex、Structure (Cambridge、MA、United States)(2008)、16(4)、597〜606頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、血友病Aを患っている患者において、頻度の少ない投与をサポートし、かつ/または内因性FVIIIの活性を増強し、その結果として凝血促進性応答を増強する能力がある治療の必要性が当技術分野においてある。内因性FVIIIを有する患者には、軽度型から中等度型を患っている血友病A患者、および重度患者のいくらかの割合が含まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、活性化ヒト第VIII因子に結合する能力を有するモノクローナル第VIII因子抗体であって、活性化第VIII因子との結合によりA2ドメインの解離を低下または抑制し、vWF結合に干渉しない抗体に関する。本発明はさらに、そのような分子の治療的使用に関する。
【０００９】
そのような抗体は、FVIIIa/FIXa複合体の寿命を延長することに有用であり得、その結果として、より多くのトロンビンが生成され、それゆえ、血餅形成が改善される。したがって、そのような抗体は、血友病Aを患っており、かつ軽度および中等度の血友病Aを有する患者ならびに重度血友病Aを有する患者の一部などの内因性FVIIIを完全に欠いているわけではない患者の処置に適している。任意で、そのような抗体は、第VIII因子補充療法と組み合わせて用いられてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】機能的色素生産性一次スクリーニングアッセイからの結果を示す図である。解離時間なしの一つの媒体対照(Max)、および7.5分間の解離時間での媒体対照(Min)がアッセイウィンドウを規定した。試料のうちのいくつかは、アッセイにおけるMinより下の活性によって証明されるように、FVIII活性を阻害した。興味深いことに、試料のかなりの割合が、解離時間なしの対照(Max)より大きい程度でFVIIIを安定化することができた。
【図２Ａ】FVIIIと共にリン脂質が加えられ(リン脂質依存性)、またはFIXa/FX混合物と共にリン脂質が加えられ(リン脂質非依存性)、5つの異なる濃度(0〜50nM)で、4つの異なる解離時点(0〜25分間)において試験された抗体を示す図である。測定されたシグナル(405nmにおける吸光度)は、解離後の残存するFVIIIa活性に比例する。2つの反応条件の比較により、抗体の大部分が、リン脂質の存在下でFVIIIaを安定化することができるが、FVIIIa減衰中、リン脂質の非存在下でのFVIIIa安定化の程度はより小さいことが示されている。たいていの抗体について、FVIIIaの最大安定化は、最低の抗体濃度においてさえも観察される。一つの例外は、4F136であり、それは、最低の抗体濃度において安定化がより低く、相対的に低い親和性相互作用を示している。
【図２Ｂ】図2A参照。
【図３】活性化FVIIIまたはFVIII S289Lの時間依存性自発的減衰に対する4F143の効果を示す図である。0.3nMにおけるFVIIIを、室温、pH7.4において40nMトロンビンで30秒間、急速に活性化し、続いて、ヒルジンを添加して、トロンビンを不活性化した。指示された時点において、減衰混合物をFIXa/リン脂質へ希釈し、FX活性化の初速度を、1分あたりの405nmにおけるミリ吸光度単位(mAU/分)として決定した。(A)4F143の結合は、リン脂質の非存在下において自発的解離に対抗してFVIIIaを安定化させなかった。リン脂質の非存在下で、FVIIIaの活性化中およびその後の減衰中、20nM 4F143抗体の非存在下(●)かまたは存在下(▲)のいずれかで、反応を実施した。(B)リン脂質の存在下での4F143によるFVIIIaの有意な安定化。安定化は、トロンビン活性化前のFVIIIと抗体の前もっての会合には依存しない。10μMリン脂質の存在下、FVIII活性化中および減衰中に反応を実施した。記号は、(●)抗体の存在なし、(▲)FVIIIa活性化中および減衰中に20nM 4F143が存在する、および(▼)FVIIIa減衰中に20nM 4F143が存在することを示す。(C)4F143は、およそ、抗体の非存在下でwt FVIIIaについて観察されたレベルまで、FVIIIa S289Lの解離速度を遅くすることができる。10μMリン脂質の存在下、FVIIIまたはFVIII S289Lの活性化中および減衰中に反応を実施した;(●、■)抗体の存在なし、(◆)FVIII S289L活性化中および減衰中に20nM 4F143が存在する。
【図４】固相結合アッセイにおけるFVIIIの固定化vWFとの結合に対する抗体の効果を示す図である。(A)抗体の非存在下における0.05nM〜6.4nMのFVIIIでのvWFの滴定。1部位結合モデルによるデータの分析により、0.29±0.01nMの見かけの解離定数(Kd)が生じ、それは、発表された値(Vlotら、1995)とよく一致している。結果は、平均値±標準偏差(n=4)として示されている。(B)FVIIIのvWFとの結合に対する抗体の効果を、抗体の非存在下で、vWFとの最大半量の結合を与える単一のFVIII濃度(0.8nM)において調べた。抗体濃度は、0nMから162nMまでの範囲であり、その最大濃度は、FVIII-抗体相互作用について測定されたKdより2桁以上大きかった(Table 2(表2)参照)。結合したFVIIIを、非重複エピトープを認識する抗FVIII抗体を用いて検出した。試験された抗体のいずれも、FVIIIのvWFとの相互作用に影響を及ぼすことは見出されなかった。結果は、平均値±標準偏差(n=2)として示されている。
【図５】FVIIIのトロンビンによる活性化に対する抗体の効果を示す図である。100nM FVIIIの1nMトロンビンによる活性化を、100nMのESH5(◆)、ESH8(○)、moAb216(□)、4F143(▲)、4F50 (▼)、もしくは4F140(■)の存在下または非存在下(●、点線)において37℃で行った。指示された時点において、過剰量のヒルジンの添加によりFVIIIのさらなる活性化をクエンチし、FVIII活性化の程度を、遊離A1サブユニットの量としてrpHPLCによって定量化した。ESH5、ESH8、およびmoAb216は全て、FVIIIの活性化を加速することが見出されたが、4F143、4F50、および4F140については活性化速度の増加は観察されなかった。
【図６】質量分析法によりモニターされるHXが、4F143および4F41結合に関与するFVIIIの領域を同定することを示す図である。(A)ペプチド断片アミノ酸407〜428(配列番号15)、YKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFに対応する質量/電荷スペクトル([M+H]+ = 549.5128、z = 5)、(B)ペプチド断片アミノ酸591〜602(配列番号16)、IQRFLPNPAGVQに対応する質量/電荷スペクトル([M+H]+ = 670.3730、z = 2)、両方とも4F143のFVIIIとの結合のエピトープの一部であることが同定されている、(C)ペプチド断片1965〜1976(配列番号17)、VRKKEEYKMALYに対応する質量/電荷スペクトル(m/z = 524.9335、z= 3)、4F41のFVIIIとの結合のエピトープの一部であることが同定されている。全てのスペクトルについて、上部パネルは、非重水素化対照を示し、中央および下部パネルは、それぞれ、mAbの非存在下または存在下においてD2Oとの30秒間の内部交換(in-exchange)後のペプチドを示す。
【図７】4F143の存在下におけるFVIIIの代表的なペプチドの水素交換の時間プロットを示す図である。FVIIIペプチドの重水素取り込み(Da)は、4F143の非存在下(■)または存在下(□)において対数尺度で時間に対してプロットされている。残基アミノ酸392〜403および429〜436にわたるペプチドは、4F143との複合体形成によって影響されないFVIIIの領域を代表する。残基アミノ酸407〜428および415〜428にわたるペプチドは、4F143の結合エピトープの一部であるFVIIIの領域を代表する。
【図８】4F143の存在下においてHX分析されたFVIIIのペプチドの配列適用範囲を示す図である。一次配列(成熟ナンバリングを使用)は、同定された両方のエピトープ領域、すなわち、配列(A)アミノ酸407〜428および(B)アミノ酸591〜602について、(水平バーとして示された)HX分析されたペプチドの上に示されている。4F143の存在下および非存在下のどちらにおいても類似した交換パターンを示すペプチドは、白抜き(□)で示され、4F143結合後に重水素取り込みの低下を示すペプチドは黒色に塗られている(■)。
【図９】4F41の存在下におけるFVIIIの代表的なペプチドの水素交換の時間プロットを示す図である。FVIIIペプチドの重水素取り込み(Da)は、4F41の非存在下(■)または存在下(□)において対数尺度で時間に対してプロットされている。残基アミノ酸1963〜1972、1963〜1974、および1965〜1976にわたるペプチドは、4F41の結合エピトープの一部であるFVIIIの領域を代表し、重水素交換速度の変化が、短いインキュベーション時間、すなわち、10秒間および30秒間で観察されている。残基アミノ酸1984〜1988に渡るペプチドは、4F41との複合体形成により影響されないFVIIIの領域を代表する。
【図１０】4F41の存在下および非存在下においてHX分析されたFVIIIのペプチドの配列適用範囲を示す図である。一次配列(成熟ナンバリングを使用)は、(水平バーとして示された)HX分析されたペプチドの上に示されている。4F41の存在下および非存在下のどちらにおいても類似した交換パターンを示すペプチドは、白抜き(□)で示され、4F41結合後に短いインキュベーション時間、すなわち、<100秒間で重水素取り込みの低下を示すペプチドは黒色に塗られている(■)。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
定義:
第VIII因子抗体:本発明による第VIII因子抗体は、活性化第VIII因子に結合する能力を有し、さらに、好ましくは、トロンビン活性化前と活性化後の両方において、第VIII因子に結合する能力を有する。本発明による抗体はさらに、例えば、1つまたは複数の側基をコンジュゲートした第VIII因子分子などの修飾型第VIII因子変異体に結合する能力を有してもよい。本発明による抗体はさらに、第VIII因子を含み、任意で側基をコンジュゲートした、融合タンパク質に結合する能力を有してもよい。本発明による抗体はさらに、血友病A患者に見出されるもの、または例えば、Bドメイン切断型/欠失型第VIII因子、vWFとの結合能力が減少した第VIII因子、様々な分子(例えば、LRPなど)に結合する改変した能力を有する第VIII因子変異体などのアミノ酸欠失、置換、および/または付加を含む第VIII因子変異体(任意で側基をコンジュゲートしていてもよく、任意で融合タンパク質の一部であってもよい)に結合する能力を有してもよい。本発明による抗体は、換言すれば、第VIII因子活性を有するいかなる第VIII因子変異体にも結合する。本発明による抗体は、典型的には、wt FVIIIの循環半減期と比較して有意に長い循環半減期を有してもよい。本発明による抗体はさらに、例えば、通常、IV投与より用いるのが便利かつ簡単である投与型である皮下に、投与することができる。
【００１２】
本明細書で用いられる場合、用語「抗体」または「第VIII因子抗体」は、第VIII因子および/またはFVIIIaに特異的に結合する能力を有する免疫グロブリン分子およびその断片を指すことが意図される。完全長抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された、2つの重(H)鎖および2つの軽(L)鎖である4つのポリペプチドを含む。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書ではHCVRまたはVHと略する)および重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、3つのドメイン、CH1、CH2、およびCH3で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書ではLCVRまたはVLと略する)および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、1つのドメイン、CLで構成される。VH領域およびVL領域は、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変の領域へさらに細分することができ、その超可変領域の間に、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる、より保存されている領域が組み入れられている。各VHおよびVLは、3つのCDRおよび4つのFRで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端へ以下の順序で配置されている:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。したがって、本発明による抗体の定義内には、第VIII因子に特異的に結合する能力を保持する抗体の1つまたは複数の断片もある。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって実行することができることが示されている。用語「抗体」内に含まれる結合断片の例には、(i)Fab断片、VLドメイン、VHドメイン、CLドメイン、およびCH1ドメインからなる一価断片;(ii)F(ab)2断片およびF(ab’)2断片、ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む二価断片;(iii)VHドメインおよびCH1ドメインからなるFd断片;(iv)抗体の単一のアームのVLドメインおよびVHドメインからなるFv断片;(v)VHドメインからなるdAb断片(Wardら、(1989) Nature 341:544〜546頁);ならびに(vi)単離された相補性決定領域(CDR)が挙げられる。さらに、Fv断片の2つのドメイン、VLおよびVHは、別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え方法を用いて、VL領域とVH領域が対になって一価分子(一本鎖Fv(scFv)として知られている;例えば、Birdら、(1988) Science 242:423〜426頁:およびHustonら、(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879〜5883頁参照)を形成する単一のタンパク質鎖としてそれらを作製することを可能にする合成リンカーによって、連結することができる。そのような一本鎖抗体はまた、本発明によれば、用語「第VIII因子抗体」内に含まれることを意図される。ダイアボディなどの他の型の一本鎖抗体もまた用語「第VIII因子抗体」に含まれる。ダイアボディは二価であり、VHドメインおよびVLドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現しているが、同じ鎖上のその2つのドメイン間の対形成を可能にするのには短すぎるリンカーを用いて、それにより、それらのドメインが別の鎖の相補性ドメインと対形成するように強制し、2つの抗原結合部位を生じる二特異性抗体である(例えば、Hol-liger, P.ら、(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444〜6448頁; Poljak, R. J.ら、(1994) Structure 2:1121〜1123頁参照)。
【００１３】
本明細書で用いられる場合、用語「ヒト抗体(複数可)」とは、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する本発明による第VIII因子抗体を意味する。本発明のヒト第VIII因子抗体は、例えばCDR、特にCDR3において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基(例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発により、またはインビボでの体細胞突然変異により導入された突然変異)を含んでもよい。
【００１４】
この関連における用語「ヒト化抗体」は、ヒトスキャフォールドへグラフト化されている、本発明による第VIII因子抗体由来のCDR配列を指す。したがって、本発明による第VIII因子抗体は、例えば、ヒト抗体またはヒト化抗体であってもよい。
【００１５】
本明細書で用いられる場合、用語「エピトープ」は、抗体が結合する抗原上の任意の抗原性決定基を意味する。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学活性のある表面群からなり、通常、特異的な3次元構造的特性、および特異的な電荷特性を有する。
【００１６】
本明細書で用いられる場合、用語「免疫反応する」または「免疫反応すること」とは、10-4M未満の解離定数Kdでの抗体のそのエピトープとの任意の結合を意味する。用語「免疫反応する」または「免疫反応すること」は、必要な場合には、用語「特異的に結合する」と相互交換可能に用いられる。エピトープは、FVIII:FVIII抗体結合後に抗体によって覆われるFVIII分子のアミノ酸配列における1つもしくは複数の領域、および/または個々のアミノ酸残基を指すことが多い。例えば「エピトープ」の小区分または領域と重複している領域へ結合する抗体もまた、その抗体が、FVIIIエピトープ内のアミノ酸の少なくとも1個、好ましくは少なくとも2個、より好ましくは少なくとも3個、より好ましくは少なくとも4個、最も好ましくは少なくとも5〜10個との非共有結合性相互作用を形成し、またはそれらを覆うと言うことができる限り、このエピトープへ結合する抗体とみなされる。
【００１７】
本明細書で用いられる場合、用語「親和性」は、抗体のエピトープとの結合の強度を意味する。抗体の親和性は、解離定数Kdによって測られ、その解離定数は、[Ab]×[Ag]/[Ab-Ag](式中、[Ab-Ag]は抗体-抗原複合体のモル濃度であり、[Ab]は結合していない抗体のモル濃度であり、[Ag]は結合していない抗原のモル濃度である)と定義される。親和定数Kaは、1/Kdによって定義される。モノクローナル抗体の特異性および親和性を競合阻害によって決定するための好ましい方法は、Harlowら、Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、(1988)、Colliganら編、Current Protocols in Immunology、Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience、N.Y.、(1992、1993)、およびMuller、Meth. Enzymol. 92:589〜601頁(1983)に見出すことができ、それらの文献は参照により本明細書に完全に組み入れられている。
【００１８】
同時投与:本発明による第VIII因子抗体は、血液由来であるかまたは組換え技術を用いて産生されるかのいずれでもよい治療用第VIII因子と共に同時投与することができる。同時投与は、両方の型の治療用タンパク質を含む医薬製剤のIV投与によって実施されてもよい。同時投与はまた、治療用第VIII因子分子を含む医薬組成物のIV投与、および本発明による第VIII因子抗体を含む組成物のIVまたは皮下投与によって実施されてもよい。同時投与は、同時か、または約1分から1カ月まで、1時間から1日まで、もしくは1日から1週間の間隔のいずれでも行うことができる。任意でFVIII分子またはFVIII変異体/誘導体との同時投与としての形をとる、本発明による抗体の投与は、例えば、毎日1回、毎週1回、隔週1回、2週間おきに1回、または毎月1回、実施されてもよい。
【００１９】
第VIII因子分子:FVIII/第VIII因子は、主に肝細胞によって産生される、大きく、複雑な糖タンパク質である。ヒトFVIIIは、シグナルペプチドを含む2351個のアミノ酸からなり、相同性によって定義されるような、数個の異なるドメインを含有する。3つのAドメイン、唯一のBドメイン、および2つのCドメインがある。ドメインの順序は、NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOHと記載することができる。FVIIIは、血漿中、B-A3境界で分離した2つの鎖として循環する。その鎖は、二価金属イオン結合によって連結されている。A1-A2-B鎖は重鎖(HC)と呼ばれ、A3-C1-C2は軽鎖(LC)と呼ばれる。
【００２０】
FVIIIは、フォンビルブランド因子(VWF)と会合して循環する。VWFは、FVIIIについての担体としての役割を果たす大きな多量体糖タンパク質であり、血管壁の成分への正常な血小板接着に必要とされる。VWFとの複合体におけるFVIIIの血漿中半減期は約12時間である。
【００２１】
FVIIIは、トロンビンまたはFXaによりHCおよびLCにおける切断によって活性化され、その切断によりVWFからFVIIIaが放出される。この過程は、イオン性相互作用によってA3-C1-C2軽鎖に非共有結合性に連結されたA1ドメインおよびA2ドメインからなるヘテロ三量体分子を生成する。FVIIIa分子は、自発的A2サブユニット解離および同時に生じる補因子活性の喪失の結果として本質的に不安定である(参考文献: Fay (1991) JBC、266:8957〜8962頁; Lamphear (1992) JBC, 267:3725〜3730頁; Fay (1992) JBC 267:13246〜13250頁; Fay (1993) JBC 268:17861〜17866頁; Fay (1996) JBC 271:6027〜6032頁; Parker (2007) JBC 281:13922〜13930頁; Parker (2007) Biochemistry 46:9737〜9742頁)。解離は、約2分間の半減期で起こり、FVIIIa/FIXa複合体の下方制御についての主な生理機構であるように思われる(Fay PJ (2004) Blood Reviews、18:1〜15頁)。FVIIIaはまた、重鎖における追加の部位でFVIIIaを切断する活性化プロテインC(APC)である、抗凝固性セリンプロテアーゼによって不活性化することができる。しかしながら、この経路の生理的関連性は、軽微であるように思われる(Fay PJ (2004) Blood Reviews、18:1〜15頁)。
【００２２】
「天然FVIII」は、配列番号1(アミノ酸1〜2332)に示されているような完全長ヒトFVIII分子である。Bドメインは、配列番号1におけるアミノ酸741〜1648に及ぶ。
配列番号1:
ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
【００２３】
本発明による第VIII因子抗体と共に同時投与される「第VIII因子分子」は、血漿から単離された第VIII因子、および/または組換え第VIII因子であってもよい。本発明による第VIII因子抗体と共に同時投与される第VIII因子分子は、例えば、Bドメイン切断型第VIII因子分子であってもよく、その分子において、例えば、その残りのドメインが、配列番号1におけるアミノ酸1〜740位および1649〜2332位に示されているような配列と密接に対応する(ただし、残基1670〜1684の間のvWF結合領域内に例えば1つまたは複数の変化があってもよい)。本発明による第VIII因子抗体と共に同時投与されるBドメイン切断型分子は、配列番号1に示された配列からわずかに異なってもよく、残りのドメイン(すなわち、3つのAドメインおよび2つのCドメイン)は、例えばvWF結合能力を低下させるために突然変異を導入することができるという事実により、配列番号1に示されているようなアミノ酸配列(アミノ酸1〜740および1649〜2332)から、わずかに、例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、もしくは10個のアミノ酸が、異なってもよく、あるいは、約1%、2%、3%、4%、もしくは5%、異なってもよいことを意味する。さらに、例えば、LRP、様々な受容体、他の凝固因子、細胞表面などの様々な他の成分との第VIII因子の結合能力を改変するために分子中の他の場所でアミノ酸改変(置換、欠失など)が導入されること、グリコシル化部位の導入および/または破壊などは、理にかなっている。
【００２４】
本発明による第VIII因子抗体と共に同時投与される第VIII因子分子は、第VIII因子活性を有し、その活性とは、凝固カスケードにおいてFVIIIと機能的に類似する、または等しい様式で、機能し、活性化血小板上でFIXaとの相互作用を介してFXaの形成を誘導し、血餅の形成を支援する能力を意味する。その活性は、例えば、血餅分析、内因性トロンビン生成能分析などの当技術分野においてよく知られた技術によってインビトロで評価することができる。本発明による第VIII因子抗体と同時投与される第VIII因子分子は、天然ヒトFVIIIのFVIII活性の少なくとも約10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、および100%またはさらに100%より多いFVIII活性を有する。
【００２５】
A2サブユニットの解離の低下/抑制は、A2サブユニットの活性化FVIIIからの解離速度が、抗体の存在下で測定される場合、FVIIIのFVIIIaへの活性化から例えば5分後、10分後、15分後、20分後、または25分後、例えばwtFVIIIの解離速度(任意で、対照抗体の存在下で)と比較して、低下している状況を指す。本発明による抗体は、10%以上、好ましくは15%以上、より好ましくは20%以上、より好ましくは25%以上、より好ましくは30%以上、より好ましくは35%以上、より好ましくは40%以上、より好ましくは45%以上、より好ましくは50%以上、より好ましくは55%以上、より好ましくは60%以上、より好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、最も好ましくは90%以上のA2ドメインの解離の低下を生じる。そのような性質は、実施例4および他の箇所(Fayら、(1996) JBC、271:6027〜6032頁;Parkerら、(2006) JBC、281:13922〜13930頁)で記載されているような機能的減衰アッセイにおいて決定することができる。アッセイは、FVIIIのトロンビンによる活性化後の時間の関数として、FVIIIaの補因子活性を測定する。FVIIIaの補因子活性は、適切なリン脂質表面および第IXa因子の存在下で、FXのFXaへの変換を刺激するその能力として測定される。
【００２６】
Bドメイン:第VIII因子におけるBドメインは、配列番号1におけるアミノ酸741〜1648に及ぶ。Bドメインは、数個の異なる部位で切断され、循環血漿FVIII分子において大きな不均一性がもたらされる。重くグリコシル化されたBドメインの正確な機能はわかっていない。わかっていることは、そのドメインが、凝固カスケードにおいてFVIII活性にとって必要ではないということである。この明らかな機能の欠如は、Bドメイン欠失型/切断型FVIIIが、完全長の天然FVIIIについて見られるものと同一のインビボ性質を有するようにみえるという事実によって裏付けされる。
【００２７】
Bドメイン切断型/欠失型第VIII因子分子:内因性完全長FVIIIは、一本鎖の前駆分子として合成される。分泌前に、その前駆体は、重鎖と軽鎖へ切断される。組換えBドメイン欠失型FVIIIは、2つの異なるストラテジーから産生することができる。Bドメインを含まない重鎖、および軽鎖のいずれも、2つの異なるポリペプチド鎖として個々に合成され(2鎖ストラテジー)、またはBドメイン欠失型FVIIIが、単一の前駆ポリペプチド鎖として合成され(単鎖ストラテジー)、その前駆ポリペプチド鎖が、完全長FVIII前駆体と同じ様に、重鎖と軽鎖へ切断される。
【００２８】
Bドメイン欠失型FVIII前駆ポリペプチドにおいて、重鎖部分および軽鎖部分は、通常、リンカーによって分離している。Bドメイン欠失型FVIIIにおいて免疫原性エピトープを導入するリスクを最小限にするために、リンカーの配列は、好ましくはFVIII Bドメイン由来である。最低限として、リンカーは、Bドメイン欠失型FVIII前駆ポリペプチドを重鎖と軽鎖へ切断するプロテアーゼの認識部位を含まなければならない。完全長FVIIIのBドメインにおいて、アミノ酸1644〜1648は、この認識部位を構成する。Bドメイン欠失型FVIIIの活性化においてリンカーの除去をもたらすトロンビン部位は、重鎖に位置する。したがって、リンカーのサイズおよびアミノ酸配列が、トロンビン活性化による残りのFVIII分子からのそれの除去に影響する可能性は低い。Bドメインの欠失/切断は、FVIIIの産生に有利である。とは言っても、Bドメインの一部を、生産性を低下させることなくリンカー中に含めることができる。Bドメインの生産性に対する負の効果は、Bドメインの任意の特定のサイズまたは配列に起因するものではなかった。
【００２９】
本発明による第VIII因子抗体と同時投与することができるBドメイン切断型/欠失型第VIII因子変異体は、1つまたは複数のO-グリコシル化部位を含有してもよい。しかしながら、好ましい実施形態によれば、その分子は、切断されたBドメイン中のたった1つのO連結型オリゴ糖を含む  -  その例は、WO09108806の図7に開示されたBDD-FVIII 40KDa PEG(O-グリカン)分子であり、Bドメインのアミノ酸配列は、SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR(配列番号2)である。O連結型グリカンは、例えば、WO0331464の方法に記載されているように、第VIII因子分子を様々な側基とコンジュゲートするために用いられてもよい。
【００３０】
本発明による第VIII因子抗体と同時投与される第VIII因子分子は、(例えば、WO0331464に開示されているように)いくつかのN連結型オリゴ糖を含み、これらのそれぞれは、同様に、側基の付着のためのアンカーとしての役割を果たす可能性がある。
【００３１】
wt FVIII分子内のBドメインの長さは、約907アミノ酸である。本発明による第VIII因子抗体と同時投与される第VIII因子分子内の切断型Bドメインの長さは、例えば、約10アミノ酸から約700アミノ酸まで、例えば、約12〜500アミノ酸、12〜400アミノ酸、12〜300アミノ酸、12〜200アミノ酸、15〜100アミノ酸、15〜75アミノ酸、15〜50アミノ酸、15〜45アミノ酸、20〜45アミノ酸、20〜40アミノ酸、または20〜30アミノ酸など、約10アミノ酸から約800アミノ酸まで変化し得る。切断型Bドメインは、重鎖および/もしくは軽鎖の断片、ならびに/またはwt FVIII分子中に見出されない人工的に導入された配列を含んでもよい。用語「Bドメイン切断型」および「Bドメイン欠失型」は、本明細書で交換可能に用いられてもよい。
【００３２】
フォンビルブランド因子(vWF):vWFは、血漿中に存在する大きな単量体/多量体糖タンパク質であり、内皮(のバイベル-パラーデ小体)、巨核球(血小板のα-顆粒)、および内皮下結合組織中に構成的に産生される。その主要な機能は、他のタンパク質、特に第VIII因子との結合であり、それは、創傷部位への血小板粘着において重要である。
【００３３】
第VIII因子は、循環中、vWFに結合しており、同時に不活性である;第VIII因子は、vWFに結合していない場合、迅速に分解し、またはクリアランスされる。本発明による抗体は、vWFのFVIIIまたはFVIII変異体との結合に干渉しない。vWF結合への非干渉は、本発明の関連において、抗体-FVIII相互作用についての測定される解離定数より10倍高い抗体濃度などのFVIII飽和を保証する抗体の濃度において、好ましくは0%、または2%未満、もしくは5%未満、もしくは10%未満、もしくは15%未満、もしくは20%未満、もしくは25%未満、もしくは30%未満のvWFとの結合の低下として定義される。vWF:FVIII結合を測定するために用いることができるアッセイは、例えば実施例5に開示されている。
【００３４】
用語「vWFを結合する能力の低下」とは、本明細書では、本発明による第VIII因子抗体と同時投与される第VIII因子変異体を含むことを意図され、vWFを結合する能力は、少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは約100%、減少する。FVIIIのvWFとの結合は、固相アッセイによるか、または表面プラズモン共鳴を用いる固定化vWFとの直接的結合としてかのいずれでも測定され得る。vWFとの結合に関与する第VIII因子における領域は、EP0319315に開示されているように、残基1670〜1684に及ぶ領域である。この領域に関わる第VIII因子点突然変異体および/または欠失突然変異体は、vWFに結合する能力を改変することは認識されている。本発明による特に好ましい点突然変異の例には、以下の点突然変異の1つまたは複数を含む変異体が挙げられる:Y1680F、Y1680R、Y1680N、およびE1682T、およびY1680C。本発明による抗体と共に同時投与されるFVIII変異体が、vWFに結合する能力に関して改変されている場合には、そのようなFVIII変異体は、好ましくは、例えば、PEG、脂肪酸誘導体、アルブミンなどの延長基(protracting group)を用いて延長される。
【００３５】
本発明による抗体、および本発明による第VIII因子抗体と同時投与することができる組換え第VIII因子タンパク質を産生するための適切な宿主細胞は、好ましくは、その分子がフォールディング中ならびに翻訳後修飾、例えば、グリコシル化および硫酸化中に正しく処理されることを保証するために哺乳類起源である。本発明を実施するにおいて、細胞は、哺乳類細胞、より好ましくは樹立哺乳類細胞系であり、それには、非限定的に、CHO細胞系(例えば、ATCC CCL 61)、COS-1細胞系(例えば、ATCC CRL 1650)、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞系、およびHEK293細胞系(例えば、ATCC CRL 1573;Grahamら、J. Gen. Virol. 36:59〜72頁、1977)が挙げられる。好ましいBHK細胞系は、tk- ts13 BHK細胞系(WaechterおよびBaserga、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:1106〜1110頁、1982)であり、以下、BHK 570細胞と呼ぶ。BHK 570細胞系は、American Type Culture Collection、12301 Parklawn Dr.、Rockville、MD 20852からATCCアクセッション番号CRL 10314により入手できる。tk- ts13 BHK細胞系もまた、ATCCからアクセッション番号CRL 1632より入手できる。好ましいCHO細胞系は、ATCCからアクセッション番号CCl61により入手できるCHO K1細胞系、ならびに細胞系CHO-DXB11およびCHO-DG44である。
【００３６】
他の適切な細胞系には、非限定的に、ラットHep I(ラット肝細胞腫;ATCC CRL 1600)、ラットHep II(ラット肝細胞腫;ATCC CRL 1548)、TCMK(ATCC CCL 139)、ヒト肺(ATCC HB 8065)、NCTC 1469(ATCC CCL 9.1);DUKX細胞(CHO細胞系)(UrlaubおよびChasin、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216〜4220頁、1980)(DUKX細胞はまたDXB11細胞とも呼ばれる)、およびDG44(CHO細胞系)(Cell、33:405頁、1983、およびSomatic Cell and Molecular Genetics 12:555頁、1986)が挙げられる。3T3細胞、Namalwa細胞、骨髄腫細胞および骨髄腫細胞の他の細胞との融合体もまた有用である。いくつかの実施形態において、細胞は突然変異体または組換え細胞であってもよく、例として、由来する細胞型と定性的または定量的に異なる範囲の、タンパク質の翻訳後修飾を触媒する酵素(例えば、グリコシルトランスフェラーゼおよび/もしくはグリコシダーゼなどのグリコシル化酵素、またはプロペプチドなどのプロセシング酵素)を発現する細胞である。DUKX細胞(CHO細胞系)は特に好ましい。
【００３７】
現在好ましい細胞は、HEK293、COS、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、および骨髄腫細胞、特に、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である。
【００３８】
改変された循環半減期:本発明による第VIII因子抗体の単独での、または治療用第VIII因子分子と組み合わせての投与は、結果として、内因性第VIII因子の循環半減期の延長、または治療用第VIII因子と組み合わせた内因性第VIII因子の半減期の延長、または治療用第VIII因子分子の半減期の延長を生じ得る。循環半減期は、好ましくは少なくとも10%、好ましくは少なくとも15%、好ましくは少なくとも20%、好ましくは少なくとも25%、好ましくは少なくとも30%、好ましくは少なくとも35%、好ましくは少なくとも40%、好ましくは少なくとも45%、好ましくは少なくとも50%、好ましくは少なくとも55%、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも65%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、好ましくは少なくとも100%、より好ましくは少なくとも125%、より好ましくは少なくとも150%、より好ましくは少なくとも175%、より好ましくは少なくとも200%、最も好ましくは少なくとも250%または300%、増加する。さらにより好ましくは、そのような分子は、少なくとも400%、500%、600%、またはさらに700%増加している循環半減期を有する。
【００３９】
側鎖/測基:第VIII測基は、例えば、PEG分子などの親水性ポリマー、例えば、脂肪酸などの主に疎水性の分子、ペプチド起源の分子などを含んでもよい。測基は、通常、リンカーを介して第VIII因子にコンジュゲートしている。そのようなコンジュゲートした第VIII因子分子は、本発明による第VIII因子抗体と同時投与されてもよい。
【００４０】
医薬組成物:医薬組成物は、本明細書では好ましくは、例えば、すぐに使える滅菌水性組成物、または例えば、水もしくは水性緩衝液中に再構成することができる乾燥滅菌組成物などの非経口投与に適した、任意で第VIII因子分子と組み合わせて、本発明による第VIII因子抗体を含む組成物を包含することを意図される。本発明による組成物は、様々な薬学的に許容される賦形剤、安定剤などを含んでもよい。
【００４１】
そのような組成物における追加の成分には、湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、充填剤、張性調節剤、キレート化剤、金属イオン、油性媒体、タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチン、またはタンパク質)、および双性イオン(例えば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リシン、およびヒスチジンなどのアミノ酸)を挙げることができる。そのような追加の成分は、もちろん、本発明の医薬製剤の全体的な安定性に悪影響を及ぼすべきではない。非経口投与は、シリンジ、任意でペン型シリンジを用いて、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内注射により実施されてもよい。あるいは、非経口投与は、注入ポンプを用いて実施することができる。さらなる選択肢は、鼻腔用または肺用スプレーの形をとるFVIII抗体化合物の投与のための溶液または懸濁液であり得る組成物である。なおさらなる選択肢として、本発明のFVIII化合物を含有する医薬組成物はまた、例えば無針注射による、もしくはパッチ、任意でイオン泳動的パッチからの経皮投与に、または経粘膜、例えば、頬側の投与に適応してもよい。
【００４２】
本明細書で用いられる場合、用語「処置」とは、医学療法を必要としている任意のヒトまたは他の動物の対象の医学療法を指す。前記対象は、医師による理学的検査を受けていることが予想され、その医師は、前記の特定の処置を用いることが前記ヒトまたは他の動物の対象の健康にとって有益であることを示す暫定的または確定的診断を下している。前記処置のタイミングおよび目的は、対象の健康の現状により、個体によって異なり得る。したがって、前記処置は、予防的、緩和的、対症的、および/または治癒的であり得る。
【００４３】
実施形態のリスト
本発明は、以下の非限定的実施形態を含む:
実施形態1:活性化ヒト第VIII因子に結合する能力を有するモノクローナル第VIII因子抗体であって、活性化第VIII因子との結合によりA2ドメインの解離を低下させ、vWF結合に干渉しない抗体。
実施形態2:A2サブユニット会合の低下が、リン脂質表面の非存在下または存在下で起こる、実施形態1に記載の抗体。
実施形態3:活性化第VIII因子分子からのA2サブユニット解離の低下が、リン脂質表面の存在下で増強される、実施形態1に記載の抗体。
実施形態4:この抗体の投与が結果として、血小板の存在下でトロンビン活性化の増加を生じる、実施形態2または3に記載の抗体。
実施形態5:トロンビン活性化を加速しない、実施形態1〜4のいずれか1つに記載のモノクローナル抗体。
実施形態6:A2ドメインに結合する、実施形態1〜5のいずれか1つに記載の抗体。
実施形態7:A3ドメインに結合する、実施形態1〜5のいずれか1つに記載の抗体。
実施形態8:配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号11、配列番号12、および配列番号13からなるリスト、または配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号21、配列番号22、および配列番号23からなるリストから選択されるCDR配列の1つ、2つ、3つ、4つ、または5つと少なくとも95%の同一性、より好ましくは少なくとも96%の同一性、より好ましくは少なくとも97%の同一性、より好ましくは少なくとも98%の同一性、より好ましくは少なくとも99%の同一性、または最も好ましくは100%の同一性を有する1つ、2つ、3つ、4つ、または5つのCDR配列を含む、実施形態1〜6のいずれか1つに記載の抗体。
実施形態9:前記抗体のCDR配列が、以下のCDR配列:配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号11、配列番号12、および配列番号13、または配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号21、配列番号22、および配列番号23と少なくとも95%の同一性、好ましくは少なくとも96%の同一性、好ましくは少なくとも97%の同一性、好ましくは少なくとも98%の同一性、好ましくは少なくとも99%の同一性、最も好ましくは100%の同一性を有する、実施形態8に記載の抗体。
実施形態10:配列番号10または配列番号20と少なくとも95%の同一性、好ましくは少なくとも96%の同一性、好ましくは少なくとも97%の同一性、好ましくは少なくとも98%の同一性、最も好ましくは100%の同一性を有するVL配列、および配列番号9または配列番号15と少なくとも95%の同一性、好ましくは少なくとも96%の同一性、好ましくは少なくとも97%の同一性、好ましくは少なくとも98%の同一性、最も好ましくは100%の同一性を有するVH配列を含む、実施形態8〜9のいずれか1つに記載の抗体。
実施形態11:ペプチド断片407〜428(配列番号15)および/または591〜602(配列番号16)と同一の、または重複するエピトープに結合する、実施形態1〜10のいずれか1つに記載の抗体。
実施形態12:ペプチド断片1965〜1976(配列番号17)と同一の、または重複するエピトープに結合する、実施形態1〜10のいずれか1つに記載の抗体。
実施形態13:4F143抗体との結合と競合する、実施形態1〜12のいずれか1つに記載の抗体。
実施形態14:実施形態1〜13のいずれか1つに記載の抗体をコードするDNA配列を含むDNA分子。任意で、このDNA分子は、発現ベクター内に包埋される。
実施形態14A:実施形態14に記載のDNA分子を含む宿主細胞。
実施形態15:軽度、中等度、または重度の血友病Aなどの血友病Aの処置のための薬剤としての、実施形態1〜13のいずれか1つに記載の抗体の使用。
実施形態16:実施形態1〜13のいずれか1つに記載の抗体および任意で薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
実施形態17:実施形態1〜13のいずれか1つに記載の抗体、および第VIII因子分子、および任意で薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。実施形態16または17のいずれか1つに記載の医薬組成物は、皮下投与用であってもよい。
実施形態18:実施形態1〜13のいずれか1つに記載の抗体を作製する方法であって、そのような抗体をコードするDNA分子を含む宿主細胞の、前記抗体を発現するのに適した条件下でのインキュベーションを含む方法。
実施形態19:血友病性疾患の処置の方法であって、それを必要としている患者に、実施形態1〜13のいずれか1つに記載の分子の治療有効量を、任意で第VIII因子分子と組み合わせて投与することを含む方法。実施形態1〜13のいずれか1つに記載の分子は、実施形態16または17に記載の医薬組成物の形をとってもよい。
【００４４】
(実施例)
タンパク質  -  Bドメイン欠失型第VIII因子(FVIII)を、他の箇所で記載されているように(Thimら、2010)、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞において組換え的に調製した。組換えヒルジン(Rydelら、1990)を、pET-26b(+) (Novagen、San Diego、CA)へクローン化し、標準ニッケルニトリロ三酢酸(Ni-NTA)クロマトグラフィーを用いて、導入されたLeuGln(His)6-タグによって、大腸菌における周辺質発現後、精製した。
【００４５】
(実施例1)
抗体産生  -  本発明のモノクローナル抗体(mAb)は、通常のモノクローナル方法、例えば、KohlerおよびMilstein (1975) Nature 256:495頁の標準体細胞雑種技術を含む様々な技術によって産生することができる。基本的には体細胞雑種手順が好ましいが、モノクローナル抗体の産生のための他の技術、例えば、Bリンパ球のウイルス形質転換または発癌性形質転換、ヒトまたは他の種(マウス、ウサギ、ラット、モルモット)の抗体遺伝子のライブラリーを用いるファージディスプレイ技術を用いることができる。
【００４６】
RBF、Balb/c、NMRICF1、またはFVIII欠損マウスを、マウスモノクローナル抗体の免疫化および産生のために用いた。免疫化のための抗原として、FVIIIを、トロンビンであらかじめ活性化しておくか、またはプロ補因子(pro-cofactor)の形かのいずれかで用いた。マウスの背中に皮下注射した。FVIII(20μg)を、1回目の注射としてフロイント完全アジュバントと混合した。その後の免疫化において、フロイント不完全アジュバントを、同じ濃度の抗原と共に用いた。最後の免疫化から10日後、マウス由来の眼血液を、FVIII特異的抗体についてELISAを用いてスクリーニングした。陽性血清力価を有するマウスを、最初の免疫化に用いられたFVIII変異体の10μgで静脈内注射によりブーストし、3日後、屠殺した。脾臓を無菌的に取り出し、単細胞懸濁液へと分散させた。脾臓細胞と骨髄腫細胞(FOX、X63、SP2/0)の融合を、PEG方法により、または電気融合法により行った。
【００４７】
プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを用いてモノクローナル抗体を精製した。
【００４８】
ハイブリドーマ上清における安定化抗FVIIIa抗体の検出(一次スクリーニング)  -  抗FVIIIa抗体のFVIIIaを安定化する能力を、以下のように、機能的色素生産性一次スクリーニングアッセイにおいて評価した:30μlの抗FVIII上清を96ウェルSpectramaxマイクロタイタープレートへ移し、続いて、20μlの1.04nM FVIIIを加えた。その後、20μlの14nMトロンビン(Roche、Germany)を加え、室温で5分間、インキュベートして、FVIIIを活性化させた。インキュベーション後、50ATU/mlヒルジンおよび162.5μM 25:75 PS:PCリン脂質(Rossix、Sweden)を含有する20μlを加えることによって、トロンビンを不活性化した。その後、活性化FVIIIを、室温で7.5分間、解離させておき、続いて、残存するFVIIIa活性を定量化した。この目的を達成するために、1.3 nM FIXaと162.5 nM FX(Enzyme Research、USA)の40μlの混合物を加え、室温で5分間、インキュベートし、続いて、920μMにおけるFXa基質S-2765(Chromogenix、Sweden)の100μlを加えた。室温で5分間のインキュベーション後、25μl 1Mクエン酸(Merck、Germany)、pH3を加えて、反応を停止した。405nmにおける吸光度を、Envisionプレートリーダー(PerkinElmer、USA)において測定し、参照波長として620nmにおける吸光度を用いた。以下の3つの媒体対照をアッセイに含めた:1;解離時間なし(最大活性)、2;7.5分間の解離時間(最小活性)、3;7.5分間の解離時間およびFVIIIが緩衝液に置き換えられている(バックグラウンド)。最初の2つの対照試料は、アッセイウィンドウを規定し、3番目の対照は、全ての測定値から減算された。図1におけるデータは、FVIIIを自発的解離に対抗して安定化させる抗FVIII上清の能力を実証している。
【００４９】
ハイブリドーマ上清における安定化抗FVIIIa抗体の検出(二次スクリーニング)  -  一次スクリーニングからの抗FVIIIa上清を、数個の時点で、かつ2つの抗体濃度においてFVIIIa減衰に対するそれらの効果を評価するために、二次の時間経過アッセイで再スクリーニングした。アッセイを以下のとおり実施した:15μlまたは30μlの抗FVIII上清を96ウェルSpectramaxマイクロタイタープレートへ移し、続いて、20μlの1.04nM FVIIIを加えた。トロンビン(14nMの20μl;Roche、Germany)を加え、室温で5分間、インキュベートして、FVIIIを活性化させた。活性化後、50ATU/mlヒルジンおよび162.5μM 25:75 PS:PCリン脂質(Rossix、Sweden)を含有する20μlを加えることによって、トロンビンを不活性化した。その後、活性化FVIIIを、室温で7.5分間、15分間、および25分間、解離させておいた。1.3 nM FIXaと162.5nM FX(Enzyme Research、USA)の40μlの混合物を加え、室温で5分間、インキュベートし、続いて、100μlの920μM S-2765色素生産性FXa基質S-2765(Chromogenix、Sweden)を加えることにより、残存するFVIIIa活性を測定した。5分後、25μl 1Mクエン酸(Merck、Germany)、pH3を加えて、反応を停止した。405nmにおける吸光度を、Envisionプレートリーダー(PerkinElmer、USA)において測定し、参照波長として620nmにおける吸光度を用いた。アッセイにおけるFVIIIの依存性を検証するために媒体対照をアッセイに含めた。対照は、7.5分間の解離時間をもち、FVIIIの代わりに緩衝液が加えられた。
【００５０】
機能的色素生産性スクリーニングアッセイにおける精製抗FVIII mAbの特性  -  精製された抗FVIIIa抗体を、動態学的FVIIIa減衰に対するそれらの効果、ならびにリン脂質の存在および抗体濃度への依存性を評価するために、時間経過アッセイにおいて、異なる濃度で、かつリン脂質存在下または非存在下で試験した。アッセイは以下のとおり実施した:30μlの精製抗FVIII抗体を96ウェルSpectramaxマイクロタイタープレートへ移し、続いて、20μlの1.04nM FVIII(リン脂質非依存性)を、または代わりに、1.04nM FVIIIおよび162.5μM 25:75 PS:PCリン脂質(Rossix、Sweden)を含有する20μl(リン脂質依存性)を加えた。トロンビン(14nMの20μl;Roche、Germany)を加え、室温で5分間、インキュベートして、FVIIIを活性化させた。インキュベーション時間後、20μlの50ATU/mlヒルジンを加えることによって、トロンビンを不活性化した。その後、活性化FVIIIを、室温で7.5分間、15分間、25分間、解離させておいた。1.3 nM FIXaと162.5nM FX(Enzyme Research、USA)の40μlの混合物(リン脂質依存性)を、または代わりに、1.3nM FIXaと162.5nM FX(Enzyme Research、USA)と81.25μM 25:75 PS:PCリン脂質(Rossix、Sweden)とを含有する40μlの混合物(リン脂質非依存性)を加え、室温で5分間、インキュベートし、続いて、100μlの920μM S-2765色素生産性FXa基質(Chromogenix、Sweden)を加えることにより、残存するFVIIIa活性を測定した。室温で5分後、25μl 1Mクエン酸(Merck、Germany)、pH3を加えて、反応を停止した。405nmにおける吸光度を、Envisionプレートリーダー(PerkinElmer、USA)において測定し、参照波長として620nmにおける吸光度を用いた。アッセイにおけるFVIIIの依存性を検証するために媒体対照をアッセイに含めた。対照は、7.5分間の解離時間をもち、FVIIIの代わりに緩衝液が加えられた。図2におけるデータは、7.5分間、15分間、および25分間のインキュベーション時間にわたる自発的解離に対抗してFVIIIを安定化させる抗FVIII上清の能力、ならびに観察された安定化効果の全てがFVIII依存性であることを実証している。
【００５１】
(実施例2)
抗体のエピトープ結合  -  Biacore 3000装置(GE Healtcare、Uppsala、Sweden)においてタンデムブロッキングアッセイ(Abdicheら、2009)を用いるFVIIIとの競合結合を実施することにより、抗体をエピトープビンに割り当てた。アッセイは、C2ドメインを認識する固定化非干渉抗体(4F30)によるチップ上へのFVIIIの配向捕獲、続いてFVIIIの飽和を保証するためのそれぞれ200nMにおける一次抗体および二次抗体の逐次結合を含む3ステップからなった。重複するエピトープは、二次抗体が、一次抗体結合後に結合することができないこととして観察され、抗体をエピトープビンへ分類するために用いられた。
【００５２】
10mM酢酸緩衝液、pH5.0中50μg/mlでのFVIII捕獲抗体(4F30)を、製造会社(GE Healtcare、Uppsala、Sweden)により記載されているように、標準NHS/EDCカップリング化学反応を用いてCM5チップのフローセル1および2に固定化した。最終カップリングレベルは10kRUであった。その後の結合実験を、25℃、ランニング緩衝液(10mM HEPES、150mM NaCl、5mM CaCl2、0.005%Tween 20、pH7.4)中5μ/分の流速で、オンライン参照減算(online reference subtraction)のためにフローセル1を用いて実施した。FVIIIは、フローセル2にわたって4nMを2分間、注射することにより400RUのレベルで捕獲された。これに続いて、両方のフローセルにわたる200nM一次抗体注入への3分間の暴露、および最後に、200nM二次抗体の同一の注入を行った。各結合実験の終わりに、10mMグリシン、pH2.0の2分間のパルスによって再生を実施した。全工程を、4F136(不十分なFVIII親和性のため、一次抗体として用いることができなかった)を除くTable 1(表1)に列挙された抗体の全ての対での順列について繰り返した。
【００５３】
これらの交差競合研究に基づいて、抗体は、クラス1およびクラス2と表示される2つのエピトープビンに分類することができた。クラス1に属するメンバーは、4F143、4F50、4F140、および4F136であり、一方、クラス2は、4F11、4F41、および4F17に代表された(Table 1(表1))。2つのクラスにわたる抗体間の競合は観察されなかったが、各クラス内のメンバーは、FVIII結合に関して相互排他的であり、部分的または完全に重複するエピトープを示している。
【００５４】
【表１】
2013542188.tif 000002
【００５５】
(実施例3)
FVIIIについての親和性  -  FVIIIの抗体との結合の動態を、Biacore 3000装置を用いる表面プラズモン共鳴によって決定した。各抗体を、製造会社により記載されているように、ウサギ抗マウスIgG抗体(GE Healthcare、Uppsala、Sweden)でコーティングされたCM5チップのフローセル2に70〜110RUのレベルで捕獲した。動態分析を、参照としてフローセル1を用いて、25℃、ランニング緩衝液中30μl/分の流速で実施した。0nMから40nMまでのFVIIIの2倍段階希釈溶液を分析した。ランニング緩衝液中のフローセルの3分間の平衡後、150μl FVIIIを注射した。解離相は9分間続き、10mMグリシン、pH1.7の3分パルスで再生を実施した。得られた、参照を減算したセンサーグラムは、1:1のLangmuir結合モデルによく適合し、その結合モデルにより、BIAevaluation 4.1ソフトウェア(GE Healthcare、Uppsala、Sweden)を用いて会合速度定数(kon)および解離速度定数(koff)、ならびに平衡解離定数(Kd=koff/kon)の推定が可能になった。
【００５６】
【表２】
2013542188.tif 000003
【００５７】
(実施例4)
FVIIIaの安定化  -  FVIIIaの自発的解離に対する抗体の効果を、本質的には他の箇所で記載されているように(Fayら、1996;Parkerら、2006)、機能的減衰アッセイにおいて測定した。200μlの体積におけるFVIII(0.36nM)の活性化を、40nMの最終トロンビン濃度まで20μlのヒトα-トロンビン(American Diagnostica、Stamford、CT、USA)と混合することにより実行した。30秒間の活性化後、20μlの組換えヒルジン(300nM)を加えて、トロンビンを阻害し、生成されたFVIIIaを規定の期間、減衰させておいた。残留するFVIIIaを、FXのFXaへの変換を支援するその能力を測定することにより定量化した。25:75 PS:PCリン脂質ベシクル(Haematologic Technologies Inc.、Essex Junction、VT、USA)を含有する60μlの血漿由来FXIa(American Diagnostica)にFVIIIa減衰混合物(20μl)を移し、Xase複合体を構築し、15秒間のインキュベーション後、20μlのヒト血漿由来FX(Enzyme Research Laboratories、South Bend、IN、USA)を加えた。FX活性化中の最終濃度は、それぞれ、10nM(FIXa)、25μM(リン脂質)、および150nM(FX)であった。FX活性化を30秒間、進行させ、その後に、等量のクエンチ緩衝液(20mM HEPES、150mM NaCl、200mM EDTA、10mM Triton X-100、pH7.4)への希釈により反応を停止させ、生成されたFXaを、0.4mM S-2765色素生産性基質の存在下で、405nmにおける吸光度の増加を時間とともに測定することにより、測定した(Chromogenix、Instrumentation Laboratory Company、Bedford、MA、USA)。全ての実験を、96ウェルプレート(Nunc、Denmark)内で20mM HEPES、150mM NaCl、5mM CaCl2、5mg/ml BSA、pH7.4の緩衝液中、室温で、迅速な混合を確実にするために振盪させながら、実施した。指示がある場合、10μMリン脂質および/もしくは20nM抗体を、FVIIIもしくはヒルジンと共に加え、または活性化後にwt FVIIIより約4倍速く自発的に解離することが示されている変異体FVIII S289L(Pipeら、2001)にFVIIIを置き換えた。
【００５８】
これらの実験からの結果(図3)は、4F143および他のクラス1の抗体が、リン脂質表面の存在に厳密に依存する機構により自発的FVIIIa解離の速度を遅くすることを実証している。トロンビン活性化前のFVIIIと抗体の前もっての会合は、安定化に必要とされない。FVIII S289L変異体の部分的〜完全な救出が観察される。抗体の存在下または非存在下での最初の時点でのFX活性化の類似した速度は、抗体が、選択された実験条件下でFXのFXaへの変換の速度に影響しないことを示している。
【００５９】
(実施例5)
FVIIIのvWFとの相互作用に対する抗体の効果  -  FVIIIのフォンビルブランド因子(vWF)との結合に対する抗体の効果を固相競合アッセイにより研究し、そのアッセイにおいて、vWFでコーティングされたウェルを、添加される抗体の異なる濃度においてFVIIIに曝した(Layetら、1992;Ganzら、1991;Vlotら、1995)。Nunc MaxiSorpマイクロタイタープレートウェル(Nunc、Denmark)を、20mMイミダゾール、150mM NaCl、10mM CaCl2、pH7.3中の1μg/mlのvWF(American Diagnostica製のFVIIIを含まないvWF)で、4℃で一晩、コーティングし、その後、10mg/mlウシ血清アルブミンおよび0.02%(v/v)Tween 80を追加した同じ緩衝液(ブロッキング緩衝液)で1時間、ブロッキングした。コーティングされたウェルを、0〜162nMの抗体の存在下で、0.05nMから6.4nMまでの範囲の濃度へブロッキング緩衝液中に希釈された100μl FVIIIと、室温で1時間、インキュベートした;最大濃度は、FVIII-抗体相互作用についての測定されたKd(Table 2(表2)参照)を有意に超える。ブロッキング緩衝液での頻回の洗浄後、720〜740領域を認識する3.33nMビオチン化モノクローナル抗FVIII抗体1F5を、100μlの体積のブロッキング緩衝液において加え、15分間、インキュベートした。ウェルを洗浄し、ペルオキシダーゼコンジュゲート化ストレプトアビジン(xx)を100μlブロッキング緩衝液において加え、存在するビオチンに15分間、結合させた。ブロッキング緩衝液での頻回の洗浄後、結合したFVIIIを、ペルオキシダーゼにより処理されるTMB (100μl TMB Plus、KEM-EN-TEC Diagnostics、Denmark)の量として定量化した。5分後、等量の2Mリン酸の添加により反応を停止し、形成された生成物の量を、SpectraMaxプレートリーダーにおいて450nmにおける吸光度により定量化した。
【００６０】
図4に示されているように、試験された抗体(4F143、4F140、または4F50)のいずれも、FVIIIの抗体での本質的に完全な飽和を保証する濃度においてさえも、FVIIIのvWFとの相互作用に影響を及ぼさなかった。
【００６１】
(実施例6)
FVIIIのトロンビンによる活性化に対する抗体の効果  -  FVIIIの活性化補因子への変換は、トロンビンまたは第Xa因子(前者が生理活性剤を表す可能性が最も高い(Pietersら、1989))により触媒される、重鎖および軽鎖における3つの部位でのタンパク質限定加水分解によって起こる。軽鎖におけるR1689での切断は、酸性A3領域を遊離し、FVIIIのvWFからの解離を引き起こす。重鎖の切断は、ドメイン間領域内のA2-B接合部(R740)およびA1-A2接合部(Arg372)、それぞれにおいて起こる。後者部位におけるタンパク質分解は、FVIIIが補因子活性を獲得するのに必須であり、50kDaのA1サブユニットの生成によりモニターすることができる(Fay、2004;Nogamiら、2005)。最近、抗FVIII抗体が、FVIIIのタンパク質分解性活性化を加速することが記載された(Takeyamaら、2010)(US 20090297503)。加えて、本発明者らは、(Griffinら、1986)によって最初に記載され、かつAmerican Diagnostica Inc.(Stamford、CT、USA)から入手できる、よく知られたモノクローナル抗FVIII抗体ESH5およびESH8もまた、トロンビンによるFVIII活性化を加速することを見出している。本発明由来の抗体のFVIII活性化の動態に対する効果を決定するために、逆相HPLCによりA1サブユニット生成をモニターするタンパク質分解性アッセイを用いた。FVIIIaの自発的減衰に対抗しての抗体媒介による安定化に起因するいかなる交絡効果も避けるために、時間の関数としてFVIIIa活性を定量化する伝統的な機能アッセイを支持して、この特定のアッセイを選択した。
【００６２】
FVIII(100nM)の1nMトロンビン(Haematologic Technologies、Essex Junction、VT、USA)による活性化を20mM HEPES、150mM NaCl、5mM CaCl2、0.01% (v/v)Tween 80、pH7.4緩衝液中、37℃で実施した。規定の間隔をおいて、200nMのヒルジンの添加により、活性化をクエンチした。クエンチされた試料を氷上で冷却し、その後、生成された軽鎖の量を定量化するためにrpHPLCにより分析した。時間経過研究により、ヒルジンの添加がFVIIIのさらなる活性化を効果的に阻止することが実証された。
【００６３】
FVIII軽鎖を、Vydac C18カラム(3.2×250mm、5μm、300Å)上への34%溶媒B中10〜20μlの注射により定量化した。移動相は、0.09%(v/v)トリフルオロ酢酸を含有する水(溶媒A)、および0.09%(v/v)トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル(溶媒B)からなる。1ml/分の流速で15分間かけて34%から65%までの溶媒Bの直線的勾配により分離を達成した。カラムを40℃に維持し、溶出FVIIIaサブユニットを、280nmでの励起および340nmでの発光を有する蛍光によって検出および定量化した。トロンビン活性化により調製された規定量のFVIIIaの注射により作成された標準曲線に基づいてピーク領域をモル濃度へ変換した。A1サブユニットを表すピークを、発表された手順(LapanおよびFay、1997)に従って調製された単離FVIIIaサブユニットの溶出時間から同定した。
【００６４】
図5に示されているように、ESH5およびESH8(American Diagnostica Inc、Stamford、CT、USA)が、トロンビンによるFVIIIの活性化を加速することが見出された。同様に、moAb216が、発表された研究(Takeyamaら、2010)(US 20090297503)に一致して、FVIII活性化を加速することが見出されたが、4F143、4F50、および4F140について加速は観察されなかった。
【００６５】
(実施例7)
血友病A血漿におけるトロンビン産生に対する抗体の効果  -  洗浄した血小板を記載されているように(Lismanら、2005)調製し、血友病A血漿(George King Bio-Medical Inc)へ150,000血小板/μlの最終密度まで加えた。80μlの血小板含有血漿を、マイクロタイターウェル中で5μl再脂質付加組織因子(Innovin、Dade、約0.12pM組織因子に対応する最終希釈1:50000)と混合し、Flouroskan Ascentプレートリーダー(Thermo Electron Corporation)において37℃で10分間、予熱した。野生型FVIIIもしくは変異体(2.7nM、0.9nM、0.3nM、0.1nM、0.033nM、0.011nM、0.0037nM、および0.0012nMの最終濃度)、または50nM 4F143抗体と同時製剤化された野生型FVIIIを15μl、加えた。CaCl2(最終濃度16.7mM)と混合された蛍光発生基質(Z-Gly-Gly-Arg-AMC、Bachem、最終濃度417nM)を20μl、加え、その後、1時間連続して蛍光(390nmでの励起および460nmでの発光)を測定した。記載されているように(Hemkerら、2003)、蛍光シグナルをα2-マクログロブリン結合トロンビン活性について補正し、キャリブレータおよびThrombinoscopeソフトウェア(Synapse BV)を用いることによりトロンビン濃度へ変換した。0.011nM FVIIIで得られたトロンビン活性の最大レベル(Table 3(表3))を、Thrombinoscopeソフトウェアによって測定した。以下のとおり、トロンビン産生の最大速度を、Thrombinoscopeソフトウェアから得られたパラメータから計算した:トロンビン産生の最大速度=トロンビン活性の最大レベル/(ピークトロンビン活性までの時間-遅延時間)。トロンビン産生の両方のパラメータは、抗体4F143が0.1nM FVIIIのトロンビン産生を増強したことを示している。
【００６６】
【表３】
2013542188.tif 000004
【００６７】
(実施例8)
HX-MSによるFVIIIa安定化mAbのFVIII上のエピトープマッピング  -  HX-MSテクノロジーは、タンパク質の水素交換(HX)を質量分析法(MS)により容易に追跡できることを利用している。水素を含有する水性溶媒を、重水素を含有する水性溶媒で置き換えることにより、タンパク質における所定の部位での重水素原子の取り込みが1Daの質量の増加を生じる。この質量増加は、交換反応のクエンチした試料において質量分析法により時間の関数としてモニターすることができる。重水素標識情報は、クエンチ条件下でのペプシン消化により、かつ生じたペプチドの質量増加に従って、タンパク質における領域へ亜局在化させることができる。
【００６８】
HX-MSの一つの用途は、タンパク質-タンパク質複合体形成後の水素交換の低下の領域を同定することにより分子相互作用に関与する部位を探索することである。通常、結合界面は、溶媒の立体的排除による水素交換の著しい低下によって明らかにされる。タンパク質-タンパク質複合体形成は、それぞれの結合パートナーの存在下および非存在下でいずれかのタンパク質メンバーに取り込まれた重水素の総量を時間の関数として測定することにより、HX-MSによって簡単に検出され得る。HX-MS技術は、天然の成分、すなわち、タンパク質および抗体またはFab断片を用い、溶液中で実施される。したがって、HX-MSは、インビボの条件を模倣する可能性を提供する(HX-MSテクノロジーに関する最近の概説として、WalesおよびEngen、Mass Spectrom. Rev. 25、158頁(2006)を参照)。
【００６９】
器具およびデータ記録  -  全てのタンパク質について、実験前に、pH7.3に調整された、20mMイミダゾール、10mM CaCl2、150mM NaClへ緩衝液交換を行った。HX実験は、LeapShellソフトウェア(Leap Technologies Inc.)によって操作されるLeapロボット(H/D-x PAL; Leap Technologies Inc.)により自動化され、そのロボットは、重水素交換反応の開始、反応時間の管理、クエンチ反応、UPLCシステムへの注射、および消化時間の管理を実施した。Leapロボットは、緩衝液貯蔵およびHX反応のために20℃に維持され、タンパク質の貯蔵およびクエンチ溶液のために2℃に維持された、それぞれの温度制御スタックを2つ備えていた。Leapロボットはさらに、ペプシンカラム、プレカラム、および分析カラムを保持する冷却Trio VSユニット(Leap Technologies Inc.)、ならびに1℃におけるLCチュービングバルブおよびスイッチングバルブを内蔵した。スイッチングバルブは、HPLCからMicrobore UHPLCスイッチバルブ(Cheminert、VICI AG)へアップグレードしている。インラインペプシン消化について、0.15pmol FVIIIを含有する100μLのクエンチした試料を負荷し、Poroszyme(登録商標)固定化ペプシンカートリッジ(2.1×30mm (Applied Biosystems))に、200μL/分(0.1%ギ酸:CH3OH 95:5)のアイソクラチック流速を用いて通した。生じたペプチドをVanGuardプレカラムBEH C18 1.7μm(2.1×5mm (Waters Inc.))上に捕捉し、脱塩した。その後、バルブを切り換え、プレカラムインラインを分析カラム、UPLC-BEH C18 1.7μm (2.1×100mm(Waters Inc.))と共に配置し、AQUITY UPLCシステム(Waters Inc.)から150μL/分で送達される15〜40% Bの9分間のグラジエントを用いてペプチドを分離した。移動相は、A:水中0.1%ギ酸、およびB: CH3CN中0.1%ギ酸からなった。ESI MSデータおよびエネルギー上昇(MSE)実験は、Q-Tof Premier MS (Waters Inc.)を用いて陽イオンモードにおいて得られた。ロイシン-エンケファリンがロックマス(m/z 556.2771における[M+H]+イオン)として用いられ、データは、連続体モードで収集された。
【００７０】
データ分析  -  消化性ペプチドを、MSE方法(Waters Inc.)を用いて別々の実験において同定した。MSEデータを、BiopharmaLynx 1.2 (version 017)を用いて処理した。HX-MS生データファイルを、連続ロックマス補正に供した。データ分析、すなわち、重水素化ペプチドの重心決定、および内部交換曲線のプロットを、HX-Express ((Version Beta); Weisら、J. Am. Soc. Mass Spectrom、17、1700頁(2006))を用いて行った。
【００７１】
4F143および4F41のエピトープマッピング  -  アミド水素/重水素交換(HX)を、4F143または4F41のいずれかの非存在下または存在下で、30μMの濃度のFVIII溶液の、対応する重水素化緩衝液、すなわち、D2O、98%D2O最終、pH7.3(非補正値)中に調製された20mMイミダゾール、10mM CaCl2、150mM NaClへの調製によって開始した。全てのHX反応は、20℃で実行され、FVIIIの抗体での飽和を保証するために過剰量のFVIII mAb(4.5μM)の非存在下または存在下で、3μM FVIIIを含有した。10秒間から2時間46分40秒間(10,000秒間)までの範囲の適切な時間間隔で、HX反応のアリコートを、等量の氷冷クエンチング緩衝液1.35M TCEP(Tris(2-カルボキシエチル)-ホスフィンハイドロクロライド(Calbiochem(登録商標)、EMD Chemicals inc.))によってクエンチし、結果として、2.6(非補正値)の最終pHを生じた。4F143エピトープを同定する生データの例は図6Aに示されている。
【００７２】
4F143エピトープ  -  FVIIIの一次配列の82%を網羅する412個のペプチドの重水素取り込み速度(HX時間経過)を、4F143の存在下または非存在下で、8つの時点、すなわち、10秒目、30秒目、100秒目、300秒目、1,000秒目、3,000秒目、および10,000秒目においてモニターした(図6A、図7、図8)。
【００７３】
4F143の存在下または非存在下での観察された交換パターンは、以下の2つの群に分けられ得る:ペプチドの一つの群は、4F143の結合によって影響されない交換パターンを示し(図7(アミノ酸392〜403および429〜436))、それはペプチドの98.2%を構成する。対照的に、FVIII消化性ペプチドのもう一つの群は、4F143との複合体形成後の交換からの保護を示し(図7)、それは消化性ペプチドの1.7%を含む。例えば、30秒目のD2Oとの交換において、4F413結合後に領域アミノ酸407〜428において約1個のアミドが交換から保護されている(図6A、図7)。2つの領域が、4F413結合後に保護を示すことが見出され、一つの領域は、残基アミノ酸407〜428、414〜428、415〜428、416〜428、および406〜431にわたる5つの消化性ペプチドを含み、別の領域は、残基アミノ酸591〜602および593〜597にわたる2つの消化性ペプチドを含む。2つのエピトープ領域は、両方ともFVIIIのA2サブドメイン内に見出される。
【００７４】
重複ペプチドによる交換保護の相対的量の比較により、配列アミノ酸407〜428および591〜602(成熟ナンバリングを使用)内に見出される、4F143との複合体形成後に影響したFVIIIの領域を狭めることが可能になった。
【００７５】
遊離FVIII対4F143との複合体形成におけるFVIIIのHX結果を比較することによって、2つのエピトープ領域に含まれる消化性ペプチドについて相対的交換保護率を決定した。
【００７６】
配列アミノ酸407〜428内のエピトープ領域について、残基アミノ酸414〜428、415〜428、416〜428にわたるペプチドについて同定された相対的交換保護は、同等のレベルであり、残基アミノ酸406〜431、407〜428にわたるペプチドについて決定された相対的レベルの約50%であることが見出された。
【００７７】
配列アミノ酸591〜602内のエピトープ領域について、残基アミノ酸593〜597にわたるペプチドについて同定された相対的交換保護が、残基アミノ酸591〜602にわたるペプチドについて決定された相対的保護レベルの約40%であることが見出された。
【００７８】
配列アミノ酸407〜428および591〜602にわたる2つのエピトープ領域は、FVIIIの発表された結晶構造へドッキングさせた場合、構造的に接近していることが見出されている(Ngo, Jacky Chi Ki、Huang, Mingdong、Roth, David A.、Furie, Barbara C.、Furie, Bruce、Crystal Structure of Human Factor VIII: Implications for the Formation of the Factor IXa-Factor VIIIa Complex、Structure (Cambridge、MA、United States)(2008)、16(4)、597〜606頁)。
【００７９】
4F41エピトープ  -  FVIIIの一次配列の82%を網羅する412個のペプチドのHX時間経過を、4F41の存在下および非存在下で、8つの時点、すなわち、10秒目、30秒目、100秒目、300秒目、1,000秒目、3,000秒目、および10,000秒目においてモニターした(図6B、図9、図10)。
【００８０】
4F41の存在下または非存在下での観察された交換パターンは、以下の2つの群に分けられ得る:ペプチドの一つの群は、4F41の結合によって影響されない交換パターンを示し(図9)、それはペプチドの99.3%を構成する;第2の群は、4F41との複合体形成後の交換からの保護を示し(図9)、それは消化性ペプチドの0.7%を含む。
【００８１】
重複消化性ペプチドの研究により、FVIIIのドメインA3に見出される配列アミノ酸1965〜1970(成熟ナンバリング使用)内に限局される、同定されたエピトープ領域の亜局在化が可能になった。短いインキュベーション時間、すなわち、10秒間および30秒間で、検出可能な重水素取り込みレベルの有意な低下を示す3つのペプチドが同定された。これは明らかに、それらが、エピトープ内に位置していることを示している。これらのペプチドは、それぞれ、配列アミノ酸1963〜1972、1963〜1974、1965〜1976にわたる。
【００８２】
(実施例9)
マウス抗FVIII 4F143および4F50モノクローナル抗体のクローニングおよびシークエンシング  -  この実施例は、マウスの抗FVIII抗体4F143の重鎖および軽鎖の配列のクローニングおよびシークエンシングを記載する。全RNAを、Qiagen製のRNeasy-Mini Kitを用いてハイブリドーマ細胞から抽出し、cDNA合成の鋳型として用いた。Clontech製のSMARTer(商標) RACE cDNA増幅キットを用いて5’-RACE反応においてcDNAを合成した。その後のHCおよびLC配列の標的増幅を、Phusion Hot Startポリメラーゼ(Finnzymes)およびフォワードプライマーとしてSMARTer(商標) RACEキット内に含まれるユニバーサルプライマーミックス(UPM)を用いるPCRによって実施した。以下の配列を有するリバースプライマーをHC(VHドメイン)増幅に用いた:
5’-CCCTTGACCAGGCATCCCAG-3’(配列番号3)
以下の配列を有するリバースプライマーをLC増幅に用いた:
5’-GCTCTAGACTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG-3’(配列番号4)
【００８３】
PCR産物をゲル電気泳動によって分離し、GE Healthcare Bio-Sciences製のGFX PCR DNA & Gel Band Purification Kitを用いて抽出し、Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kitおよび化学的コンピテントTOP10 E.coli(Invitrogen)を用いてシークエンシングのためにクローン化した。Applied Biosystems製のAmpliTaq Gold Master MixおよびM13uni/M13revプライマーを用いて、選択されたコロニーにコロニーPCRを実施した。コロニーPCRクリーンアップを、ExoSAP-IT酵素ミックス(USB)を用いて実施した。M13uni(-21)/M13rev(-29)シークエンシングプライマーを用いて、MWG Biotech、Martinsried Germanyにおいてシークエンシングを実施した。配列を分析し、VectorNTIプログラムを用いてアノテートした。全てのキットおよび試薬は、製造会社の使用説明書に従って用いられた。
【００８４】
抗FVIII 4F143
単一の固有のマウスκ型LCおよび単一の固有のマウスHC、サブクラスIgG1を同定した。核酸配列およびアミノ酸配列は下記に挙げており、リーダーペプチド配列は含まれていない。
【００８５】
抗FVIIIa 4F143 VHアミノ酸配列(配列番号5)(シグナルペプチド配列は省略されており、CDR1(配列番号6)、CDR2(配列番号7)、およびCDR3(配列番号8)はそれぞれ、下線が引かれている):
1 QIQFVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGYTFT NYGMNWVKQA PGKGLKWMGW
51   INSYTGEPTY ADDFKGRFAF SLETSASTAY LQINNLKNED TATYFCARGA
101  SYAMDYWGQG TSVTVSS
【００８６】
抗FVIIIa 4F143 VH核酸配列(配列番号9)(シグナルペプチドは省略されている):
5’-
CAGATCCAGTTCGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTATACCTTCACAAACTATGGAATGAACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACTCCTACACTGGAGAGCCAACATATGCTGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGCAAGAGGGGCTTCTTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
【００８７】
抗FVIIIa 4F143 VLアミノ酸配列(配列番号10)(シグナルペプチド配列は省略されており、CDR1(配列番号11)、CDR2(配列番号12)、およびCDR3(配列番号13)はそれぞれ、下線が引かれている):
1    DVQITQSPSY LAASPGETIT INCRASKSIS KYLAWYQEKP VKTNKLLIYS
51   GSTLQSGIPS RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAMYYCQQ HYEYPLTFGA
101  GTKLELKR
【００８８】
抗FVIIIa 4F143 VL核酸配列(シグナルペプチドは省略されている) (配列番号14):
5’-
GATGTCCAGATAACCCAGTCTCCATCTTATCTTGCTGCATCTCCTGGAGAAACCATTACTATTAATTGCAGGGCAAGTAAGAGCATTAGCAAATATTTAGCCTGGTATCAAGAGAAACCTGTGAAAACTAATAAGCTTCTTATCTACTCTGGATCCACTTTGCAATCTGGAATTCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAATGTATTACTGTCAACAGCATTATGAATACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGG
【００８９】
抗FVIII 4F50
単一の固有のマウスκ型LCおよび単一の固有のマウスHC、サブクラスIgG1を同定した。核酸配列およびアミノ酸配列は下記に挙げており、リーダーペプチド配列は含まれていない。
【００９０】
抗FVIIIa 4F50 VHアミノ酸配列(配列番号15)(シグナルペプチド配列は省略されており、CDR1(配列番号16)、CDR2(配列番号17)、およびCDR3(配列番号18)はそれぞれ、下線が引かれている):
1 QIQFVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGYTFT NYGMNWVKQA PGKGLKWMGW
51   INSYTGEPTY ADDFKGRFDF SLETSASTAY LQINNLKNED TATYFCARGA
101  SYAMDHWGQG TSVTVSS
【００９１】
抗FVIIIa 4F50 VH核酸配列(配列番号19)(シグナルペプチドは省略されている):
5’-
CAGATCCAGTTCGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTATACCTTCACAAACTATGGAATGAACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACTCCTACACTGGAGAGCCAACATATGCTGATGACTTCAAGGGACGGTTTGACTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGCAAGAGGGGCTTCTTATGCTATGGACCACTGGGGTCAAGGAACCTCTGTCACCGTCTCCTCA
【００９２】
抗FVIIIa 4F50 VLアミノ酸配列(配列番号20)(シグナルペプチド配列は省略されており、CDR1(配列番号21)、CDR2(配列番号22)、およびCDR3(配列番号23)はそれぞれ、下線が引かれている):
1    DVQITQSPSY LAASPGETIS INCRASKSIS KYLAWYQEKP VKTNKLLIYS
51   GSTLQSGIPS RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAMYYCQQ HYEYPLTFGA
101  GTKLELKR
【００９３】
抗FVIIIa 4F50 VL核酸配列  (配列番号24) (シグナルペプチドは省略されている):
5’-
GATGTCCAGATAACCCAGTCTCCATCTTATCTTGCTGCATCTCCTGGAGAAACCATTAGTATTAATTGCAGGGCAAGTAAGAGCATTAGCAAATATTTAGCCTGGTATCAAGAGAAACCTGTGAAAACTAATAAGCTTCTTATCTACTCTGGATCCACTTTGCAATCTGGAATTCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAATGTATTACTGTCAACAGCATTATGAATACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGG
［参考文献］
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図１０】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図７】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2013542188.tif 000023
2013542188.tif 000024
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