(57)【要約】細胞接着阻害剤の制御放出のための、架橋された組換えゼラチン組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物であって、以下：
（ａ）少なくとも１種類の細胞接着阻害剤；および
（ｂ）架橋された組換えゼラチンヒドロゲルマトリックス、当該組換えゼラチンは架橋前に少なくとも０．３ｍｍｏｌ／ｇのリシンおよび／またはヒドロキシリシン残基および架橋後に少なくとも０．１５ｍｍｏｌ／ｇの遊離アミンを含む；
を含む、前記組成物。
【請求項２】
細胞接着阻害剤（単数または複数）が、アルギネート、コンドロイチン硫酸（chondroitan sulfate）、デルマタン硫酸、デキストラン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸（heparin sulfate）、ケラチン硫酸、およびペントースポリサルフェート（pentose polysulfate）からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
細胞接着阻害剤がデキストラン硫酸、ペントサンポリサルフェートまたはそれらの混合物である、前記の請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４】
組換えゼラチンヒドロゲルマトリックス中で、当該組換えゼラチンが架橋前に少なくとも０．４０ｍｍｏｌ／ｇのリシンおよび／またはヒドロキシリシン残基を含む、前記の請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
組換えゼラチンヒドロゲルマトリックス中で、当該組換えゼラチンが架橋前に少なくとも０．８０ｍｍｏｌ／ｇのリシンおよび／またはヒドロキシリシン残基を含む、前記の請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
組換えゼラチンヒドロゲルマトリックス中で、当該組換えゼラチンが架橋前に少なくとも０．３ｍｍｏｌ／ｇのリシン残基を含む、前記の請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
組換えゼラチンが少なくとも１個のＲＧＤモチーフを含む、前記の請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
組換えゼラチンが７より上の等電点を有する、前記の請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
組換えゼラチンが少なくとも５０ｋＤａの分子量を有する、前記の請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
組換えゼラチンが１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩を用いて架橋される、前記の請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
以下：
（ａ）０．１〜８重量パーセントの少なくとも１種類の細胞接着阻害剤；ならびに
（ｂ）９２〜９９．９重量パーセントの架橋された組換えゼラチンヒドロゲルマトリックス、ここで当該組換えゼラチンは架橋前に少なくとも０．３ｍｍｏｌ／ｇのリシン残基および架橋後に少なくとも０．１５ｍｍｏｌ／ｇの遊離アミンを含む；
を含む、前記の請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
細胞接着の防止における使用のための、前記の請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
線維症の予防における使用のための、前記の請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物を調製するための方法であって、以下：
（ａ）組換えゼラチンおよび細胞接着阻害剤（単数または複数）を混合して混合物を得る；そして
（ｂ）当該混合物を架橋する；
を含む、前記方法。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物を調製するための方法であって、以下：
（ａ）組換えゼラチンを架橋してヒドロゲルマトリックスを与える；そして
（ｂ）当該ヒドロゲルマトリックスを細胞接着阻害剤（単数または複数）と接触させる；
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞接着阻害剤を含む架橋された組換えゼラチンヒドロゲル組成物に、これらの組成物を作る方法およびそのような組成物の使用を通して細胞接着を阻害する方法に関する。これらのヒドロゲル組成物は、細胞接着阻害剤のそのような阻害を必要とする部位への送達に有用である。
【背景技術】
【０００２】
人体において外傷または創傷が生じた場合、身体はその外傷を修復してその創傷を閉じる機構を通して自然に反応する。これらの機構の多くは有効であり、有益である。そのような有益な修復の例は、皮膚に対するひっかき傷、軽い裂傷、および軽い火傷に反応する表皮の再生である。しかし、重い外傷、例えば手術を含む状況では、その身体の修復機構は結果として瘢痕組織の過剰成長をもたらし得る。これは手術性癒着（surgical adhesions）のような深刻な合併症につながり得る。
【０００３】
手術性癒着は腹部手術の後に頻繁に起こり、一般に瘢痕のできた組織の隣接する組織への結合として記述される。腹部手術の後の癒着の発生率は、多数の手術で累積する。有害な瘢痕形成の臨床的に重要な例は、硬膜外線維症で起こる。この病気は腰椎椎弓切除および椎間板切除の後の繰り返し起きる腰痛につながる(Cauchoix et al., 1978, Spine 3:256-259; Jackson, 1971, J. Bone Joint Surg. 53B:409-616; Pheasant, 1985, Orthop. Clin. North Am. 6:319-329; Yong-Hing et al., 1980, Spine 5:59-64)。この病気では、組織瘢痕形成が神経根の可動性を制限し、それはしばしば以前の椎間板ヘルニアと同じ部位における繰り返し起きる根性痛と相関してきた(Benoist, M. et al., 1980, Spine 5:432-436)。
【０００４】
細胞接着と関係する問題を受けて、そのような接着の形成を防ぐために様々な方法、例えば手術を完了させる前に手術部位付近の器官の周囲に微細なファブリックの防壁を適用することが提案されてきた。
【０００５】
本明細書にその全体を援用するＲｏｕｆａらへの米国特許第５，６０５，９３８号は、特定の陰イオン性ポリマーの瘢痕形成、特に手術性癒着の阻害剤としての使用を開示している。Ｒｏｕｆａらはさらに、これらの陰イオン性ポリマーは有害な治癒プロセスと関係する細胞の侵入も阻害する（すなわち、線維芽細胞の侵入を阻害する）ことを開示している。そうして、治癒プロセスを制御し、線維症を予防する。
【０００６】
Ｒｏｕｆａらは、阻害性陰イオン性ポリマーの、阻害もしくは制御活性が望まれる部位での固定（anchoring）における特定の接着性タンパク質の使用を開示している。これらの接着性タンパク質は一般に、実質的な量のジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）およびヒドロキシル含有アミノ酸残基を含有するタンパク質、例えばムラサキイガイ、フジツボ、またはカキからのフィブリンに基づく生成物またはポリフェノール接着タンパク質の断片である。
【０００７】
Ｚｏｎｇらへの米国特許出願第ＵＳ２００７−０１６６２２号は、その有効構成要素の送達へのよりよい制御を達成するための、架橋された求電子性および求核性ポリエチレングリコール分子を含む架橋されたマトリックスの使用を開示している。それらは、結果としてその陰イオン性ポリマーに都合のよい時間放出プロフィールをもたらすこのマトリックス中でのその陰イオン性ポリマーの捕捉（entrapment）を開示している。そのマトリックスは別の架橋されていないキャリヤー物質を含んでいてもよく、キトサン、コラーゲンまたはゼラチンのキャリヤー物質としての使用が開示されている。
【０００８】
しかし、細胞接着阻害剤を組み込むこれらの組成物、特にその有効構成要素の制御された送達を向上させる組成物のさらなる向上が望ましい。本発明はこれを達成する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第５，６０５，９３８号
【特許文献２】米国特許出願第ＵＳ２００７−０１６６２２号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Cauchoix et al., 1978, Spine 3:256-259
【非特許文献２】Jackson, 1971, J. Bone Joint Surg. 53B:409-616
【非特許文献３】Pheasant, 1985, Orthop. Clin. North Am. 6:319-329
【非特許文献４】Yong-Hing et al., 1980, Spine 5:59-64
【非特許文献５】Benoist, M. et al., 1980, Spine 5:432-436
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一般的な定義
用語“含む”は、述べられた部分、工程または構成要素の存在を明記するものとして解釈されるべきであるが、１種類以上の追加の部分、工程または構成要素の存在を除外しない。
【００１２】
不定冠詞“ａ”または“ａｎ”による要素への言及は、その要素の１個、および１個のみが存在することを文脈が明確に要求しない限り、その要素の１個より多くが存在する可能性を除外しない。従って、不定冠詞“ａ”または“ａｎ”は通常は“少なくとも１個”を意味する。
【００１３】
用語“タンパク質”または“ポリペプチド”または“ペプチド”は互換的に用いられ、特定の作用様式、大きさ、三次元構造または由来に関係なく、アミノ酸の鎖からなる分子を指す。
【００１４】
“ゼラチン”は、由来が伝統的な方法により抽出されたものであろうと組み換えもしくは生合成によるものであろうと、あらゆるゼラチンを、またはゼラチンの少なくとも１種類の構造的および／または機能的特徴を有するあらゆる分子を指す。ゼラチンは現在、動物（例えばウシ、ブタ、齧歯類、ニワトリ、ウマ、魚の）源、例えば骨および組織由来のコラーゲンからの抽出により得られている。その用語は、ゼラチン生成物中に含まれる１種類より多くのポリペプチドの組成物、およびそのゼラチン物質に寄与している個々のポリペプチドの両方を含む。従って、本発明に関連して用いられる際の組換えゼラチンという用語は、ゼラチンポリペプチドを含む組換えゼラチン物質、および個々のゼラチンポリペプチドの両方を含む。
【００１５】
それにゼラチンが由来し得るポリペプチドは、コラーゲン類、プロコラーゲン類、およびコラーゲンの少なくとも１種類の構造的および／または機能的特徴を有する他のポリペプチドのようなポリペプチドである。そのようなポリペプチドには、単一のコラーゲン鎖、もしくはコラーゲンホモ三量体もしくはヘテロ三量体、または少なくとも１個のコラーゲン性ドメイン（すなわち、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙが高レベルで繰り返す領域により特性付けられるドメイン、ここでＸおよびＹは独立してあらゆるアミノ酸である）を含有するそのあらゆる断片、誘導体、オリゴマー、ポリマー、もしくはサブユニットが含まれ得る。その用語は、天然に見られない操作された配列、例えば変更されたコラーゲン配列、例えば欠失、付加、置換、または他の変化により天然に存在するコラーゲン配列から変更されている配列を特に意図する。そのような配列は、適切な変更されたコラーゲンポリヌクレオチドコンストラクト等から得ることができる。
【００１６】
本明細書で記述される際の“架橋剤”は、クロスリンカーを含む組成物を指す。本明細書で用いられる際の“クロスリンカー”は、有機性分子中に共有結合性の分子内および分子間架橋を導入することができる反応性化合物を指す。
【００１７】
“ヒドロゲル”は、実質的な量の水を含むポリマー鎖の網状構造を指す。適用、すなわち、その有効薬剤の望まれる放出プロフィールおよびそのヒドロゲルが受けることになる機械的応力に応じて、いくつかのタイプのヒドロゲルを用いることができる。例えば、非常に堅く弾性のないヒドロゲルは４０〜６０％の水を含有し、弾性があるがなお堅いヒドロゲルは６０〜８５％の水を含有し、軟らかく非常に弾性があるヒドロゲルは８５〜９９％の水を含有する。
【００１８】
用語“組織接着”、“瘢痕形成”、“線維症”および“線維芽細胞の侵入”は、特定の手術手順の医学的に有益な目的に有害であると考えられ、従って制御する必要がある生物学的治癒プロセスを指す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、以下でより完全に記述される。しかし、この発明は多くの異なる形で具体化することができ、本明細書で述べるような態様に限定されると解釈するべきではない。
本発明は、組成物であって、以下：
（ａ）少なくとも１種類の細胞接着阻害剤；および
（ｂ）架橋された組換えゼラチンヒドロゲルマトリックス、ここで、その組換えゼラチンは架橋前に少なくとも０．３ｍｍｏｌ／ｇのリシンおよび／またはヒドロキシリシン残基および架橋後に少なくとも０．１５ｍｍｏｌ／ｇの遊離アミンを含む；
を含む組成物を提供する。
【００２０】
本発明の組成物は一般に、架橋されたヒドロゲルマトリックス、および化学的に、または物理的にのどちらかでその架橋されたヒドロゲルマトリックスと会合している少なくとも１種類の細胞接着阻害剤を含む。その細胞接着阻害剤は、生物学的物質の別の生物学的物質または非生物学的物質への接着を阻害するのに有効なあらゆる薬剤であることができる。好ましくは、その細胞接着阻害剤は線維症を抑制するのに有効な薬剤である。
【００２１】
本発明における細胞接着阻害剤として特に有用なのは、瘢痕形成、特に手術性癒着を抑制するのに有効であることが知られている、そして線維症全般を抑制するのに有効であることも知られている生体適合性陰イオン性ポリマーである。そのようなポリマーは、線維芽細胞の侵入を阻害し、そうして治癒プロセスを制御する、および線維症を予防するのに有用である。そのポリマーは、グリア細胞の侵入、骨成長、および神経突起成長を抑制するのにも有用である。
【００２２】
当技術において多数の生体適合性陰イオン性ポリマーが知られており、これらのポリマーのいずれも本発明の組成物中で用いることができる。好ましくは、その細胞接着阻害剤（単数または複数）は、アルギネート；コンドロイチン硫酸（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）、デルマタン硫酸、デキストラン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸（ｈｅｐａｒｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）、ケラタン硫酸、およびペントサンポリサルフェートからなる群より選択される。上記の陰イオン性ポリマーは、単独で、またはあらゆる組み合わせで一緒に、のどちらで用いてもよい。従って、本発明の組成物において、その細胞接着阻害剤には上記の陰イオン性ポリマーの内の１種類が含まれることができる。あるいは、その細胞接着阻害剤には上記の陰イオン性ポリマーの内の２種類以上が含まれることができる。さらに、その細胞接着阻害剤には、上記の陰イオン性ポリマーの内の１種類以上が、細胞接着を阻害するのに有用であることが知られている１種類以上の追加の薬剤との組み合わせで含まれることができる。その細胞接着阻害剤はデキストラン硫酸、ペントサンポリサルフェートまたはそれらの混合物であるのが好ましい。
【００２３】
その阻害剤にはさらに、その陰イオン性ポリマーの内の１種類以上の二糖類が含まれることができる。さらに、その阻害剤には、その陰イオン性ポリマーの内の１種類以上が含まれるグリコサミノグリカン類およびプロテオグリカン類が含まれることができる。
【００２４】
本発明における使用のための陰イオン性ポリマーは天然源から得ることができ（例えばプロテオグリカン類）、天然に見付かるまま、または精製して用いることができる。加えて、その陰イオン性ポリマーは合成により、例えば化学的誘導体化により調製することができる。例えば、そのポリグルコースポリマーデキストランは、硫酸中で煮沸すること、およびクロロスルホン酸でエステル化することにより処理してデキストラン硫酸を生成することができる。生体適合性陰イオン性ポリマーは、商業的供給源から容易に入手することができる。
【００２５】
その細胞接着阻害剤は、本発明の組成物中に、細胞接着を少なくとも部分的に阻害するのに十分な量で存在するべきである。
細胞接着阻害剤に加えて、上記で記述したように、本発明の組成物はさらに架橋された組換えゼラチンヒドロゲルマトリックスを含む。そのヒドロゲルマトリックスは、その細胞接着阻害剤に関する都合のよい放出プロフィールを促進するのに特に有用である。従って、そのヒドロゲルマトリックスは、細胞接着阻害が必要とされている部位へのその細胞接着阻害剤の送達のために、そのような送達をその特定の使用に必要とされるように遅延する、または延長することができるように配合することができる。一般に、制御放出のためのヒドロゲルは、２段階の放出プロフィールを示す。急速な拡散放出の第１相は、インビボの導入の少し後である。第２相では、体内でのそのヒドロゲルのゆっくりとした生分解により引き起こされるゆっくりとした持続放出がある。
【００２６】
細胞接着の阻害に関して、その第１相の拡散放出を低減し、その第２相においてより長い期間にわたるよりゆっくりとした放出を有するのが望ましい。本発明のヒドロゲルマトリックスは、その細胞接着阻害剤の放出がより遅く、しかしより長い期間にわたって維持され、そのような期間が調節可能であるように配合される。
【００２７】
本発明の発明者らは、驚くべきことに、組換えゼラチンが架橋前にリシンおよび／またはヒドロキシリシン残基を多く含み、それが架橋後に少なくとも０．１５ｍｍｏｌ／ｇの遊離アミン基を保持している架橋された組換えゼラチンヒドロゲルは、上記で言及した望ましい放出プロフィールを達成するのに有益であることを見出した。好ましくは、その組換えゼラチンヒドロゲルマトリックスにおいて、その組換えゼラチンは架橋前に少なくとも０．３ｍｍｏｌ／ｇのリシン残基を含む。
【００２８】
これは、定められた量の遊離アミンを保持するゼラチンペプチドを含む架橋されたヒドロゲルを用いることの特別の利益に言及していない先行技術における教示とは対照的である。さらに、Ｚｏｎｇらへの公開された米国特許出願第ＵＳ２００７−０１６６２２号は、その有効構成要素の送達へのよりよい（beter）制御を達成するための、架橋された求電子性および求核性ポリエチレングリコール分子を含む架橋されたマトリックスの使用を教示している。しかし、ポリエチレングリコールは敏感な対象においてアナフィラキシーにつながり得る補体経路を活性化する(Hamad I et al., Mol Immunol. 2008 Dec; 46(2):225-32)という証拠があるため、生体材料の使用は合成ポリエチレングリコールよりも望ましい。さらに、Ｚｏｎｇらの組成物は、細胞接着阻害剤をそのヒドロゲルのマトリックス内に捕捉してその有効構成要素の送達への制御を達成するために、この薬剤の存在下でのそのヒドロゲルの架橋を必要とする。本発明のヒドロゲルは、別々に調製した後にそれを接着阻害剤と組み合わせることができる。
【００２９】
架橋されたヒドロゲル組成物を製造するために動物組織から調製されたゼラチンを用いることは、いくつかの問題を有する。主な不都合な点は、投与の際に、その細胞接着阻害剤の放出が線形とはほど遠く、必要とされる延長された放出を示さないことである。この最適未満の放出プロフィールは一般にその天然由来のポリマーの不均一な性質、すなわち、それらの非常に広い分子量分布および動物由来の不純物の存在の可能性に起因すると考えられる。後者はヒトにおける使用のための安全性に関して重要性が増しつつある。本発明は、先行技術のこれらの不都合な点を回避することに向けられている。
【００３０】
組換えゼラチンの使用は、従来法で製造される動物源からのゼラチンと比較して医学的に有益である。安全性の問題、例えば免疫原性、例えば抗原性およびアレルゲン性応答の可能性に関する懸念が生じている。現在用いられている動物由来のゼラチン混合物を完全に特性付ける、精製する、または再現することができないことは、医薬および医学界で進行中の関心事である。抽出および精製のプロセスの結果もたらされる、細菌汚染およびエンドトキシンの負荷（loads）に関してさらなる安全性の懸念が存在する。組み換えにより製造されたゼラチンは、これらの問題に対する１つの解決法である。さらに、組み換え技術は、優れた特徴、例えば低い免疫原性、向上した細胞付着、最適な等電点および制御された生分解性（それらに限定されない）を有するゼラチン様タンパク質の設計を可能にする。その組換えゼラチンの構造および大きさにおける単分散の性質、または言い換えれば均一性は、その架橋されたヒドロゲルのメッシュサイズおよびその結果としてもたらされる細胞接着阻害剤の放出速度が均一であると考えられることを意味し、それは大いに望ましい。ＥＰ  ０９２６５４３、ＥＰ  １０１４１７６およびＷＯ  ０１／３４６４６、ならびに特にＥＰ  ０９２６５４３およびＥＰ  １０１４１７６の実施例は、組換えゼラチンおよびメチロトローフ（methylotrophic）酵母、特にピキア・パストリス（Picha pastoris）を用いるそれらの製造法を記述している。
【００３１】
組換えゼラチンの別の重要な利点は、そのアミノ酸配列を操作して特定の特徴を作り出すことができることである。現在操作することができる特徴の例は、（ｉ）架橋可能なアミノ酸の量（例えば（ヒドロキシ）リシンの量）、（ｉｉ）糖鎖付加のパターン（例えば、特定の三つ組におけるスレオニンおよび／またはセリンアミノ酸の非存在は、結果として糖鎖付加の非存在をもたらす）、（ｉｉｉ）その組換えゼラチンの大きさ、（ｉｖ）その組換えゼラチンの電荷密度を修正することができ（例えば、荷電したアミノ酸、例えばアスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）またはリシン（Ｌｙｓ）を導入する、または取り除くことができる）、従って線維症阻害剤の放出プロフィールに影響を及ぼすことができる、または（ｖ）その生分解性を、メタロプロテアーゼ類のための切断部位の存在または非存在により修正することができる。
【００３２】
上記で言及したように、組換えゼラチンの１つの重要な特徴は、架橋可能なアミノ酸の量、例えば（ヒドロキシ）リシン基の量、ならびにアスパラギン酸およびグルタミン酸に由来するカルボン酸基の量である。
【００３３】
好ましい態様において、本発明は、組換えゼラチンヒドロゲルマトリックス中でその組換えゼラチンが架橋前に少なくとも０．４０ｍｍｏｌ／ｇ、より好ましくは少なくとも０．６０ｍｍｏｌ／ｇ、特に少なくとも０．８０ｍｍｏｌ／ｇのリシンおよび／またはヒドロキシリシン（好ましくはリシン）残基を含む組成物を提供する。
【００３４】
明らかに、より多くの架橋可能な基が利用可能ならば、架橋の量は原理的により少ない架橋可能な基が存在する状況と比較してより高いことが可能である。架橋可能な基の下限は、まだ結果としてゲルの形成をもたらすことができる量である。架橋可能な基の量は原理的に、生理的条件（ｐＨ７．４、３７℃および３００ｍＯｓｍ／Ｌ）におけるそのもつれた（entangled）／架橋されたゼラチンの網状構造の平均“孔径”の尺度であるメッシュサイズも決定する。最後に、架橋された基の量は、形成された制御放出組成物の生分解性を決定する。組換えゼラチンを用いることにより、架橋可能な基の量に影響を及ぼし、そうしてそのゲルのメッシュサイズおよび生分解性を操作することができる。
【００３５】
架橋後に本発明のヒドロゲル中に存在する０．１５ｍｍｏｌ／ｇの遊離アミン基は、架橋の間に反応しなかったリシンおよびヒドロキシリシン残基を含んでいてよい。本発明の発明者らは、その架橋されたヒドロゲルマトリックス中の保持された遊離アミン残基は、細胞接着阻害剤として用いられる陰イオン性ポリマーのよりよい制御可能な放出プロフィールをもたらすことを見出した。理論により束縛されるわけではないが、これらのよりよい制御可能な放出プロフィールは、拡散放出を遅くし、結果としてより持続されたゆっくりとした放出をもたらす、線維症阻害剤として用いられる陰イオン性ポリマーと架橋されたゼラチンヒドロゲルの正に荷電した遊離アミンの間の静電的相互作用により説明することができる。ゼラチンヒドロゲル中の遊離アミンを増加させる他の方法、例えば化学修飾または他のポリマー、例えばポリリシンの添加は、類似の方式でその放出プロフィールに影響を及ぼす可能性があるが、本発明のヒドロゲルの生体適合性および免疫原性（immungenicity）の欠如への望まれない副作用をもたらす可能性がある。
【００３６】
ヒドロゲル中の遊離アミンの量は、当技術で既知のあらゆる方法により決定することができる。好ましくは、ヒドロゲル中の遊離アミンの量はＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）法（例えばGilbert and Kim, J. Biomed. Matter. Res. 24, 1221, 1990を参照）を用いて決定される。
【００３７】
本発明のさらなる態様において、その組換えゼラチンはＲＧＤモチーフに富むゼラチンである。この発明中の文脈における用語“ＲＧＤに富むゼラチン”は、そのゼラチン状ポリペプチドが分子あたりのアミノ酸の総数の百分率として計算されるある特定のレベルのＲＧＤモチーフおよびＲＧＤのより均一な分布を有することを意味する。この発明の文脈におけるＲＧＤに富むゼラチンはＷＯ  ０４／０８５４７３およびＷＯ  ０８／１０３０４１において記述されており、それを参照により本明細書に援用する。好ましくは、その組換えゼラチンは少なくとも１個、より好ましくは少なくとも３個、特に少なくとも５個のＲＧＤモチーフを含む。
【００３８】
別のさらなる態様において、本発明の組成物中で用いられる組換えゼラチンは、５より上の等電点、好ましくは６より上の等電点、より好ましくは７より上の等電点を有する組換えゼラチンである。架橋されてヒドロゲルを形成するゼラチンの等電点を調節することにより、特に陰イオン性ポリマーの場合に、細胞接着阻害剤の誘引または反発を達成することができる。
【００３９】
別のさらなる態様において、本発明の組成物中で用いられる組換えゼラチンは、少なくとも２５ｋＤａの、より好ましくは少なくとも３５ｋＤａの、最も好ましくは少なくとも５０ｋＤａの分子量を有する。
【００４０】
本発明の架橋されたヒドロゲルの重要な特徴は、ヒドロゲルの形成において用いられるポリマーが生分解性であるべきであり、従ってその線維症阻害剤の放出の後にそれの除去のための侵襲的な外科的方法を必要としないことである。さらに、生分解性はその組成物中で用いられる細胞接着阻害剤（特に線維症阻害剤）のゆっくりとした放出における別の重要な要素である。経験的に、組換えゼラチンが天然のゼラチンの分解を引き起こす機構と同じ機構により分解されるのかどうかは明らかではない。天然のゼラチンおよびコラーゲンは人体内でプロテアーゼ、より具体的にはマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）により分解される。マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は亜鉛依存性のエンドペプチダーゼである。そのＭＭＰはメトジンシンスーパーファミリーとして知られるプロテイナーゼのより大きなファミリーに属する。全体として、それらは全ての種類の細胞外マトリックスタンパク質を分解することができるが、いくつかの生理活性分子も処理することができる。ＭＭＰの重要なグループはコラゲナーゼである。これらのＭＭＰは、三重らせん状線維性コラーゲンを分解して特徴的な３／４および１／４断片にすることができる。これらのコラーゲンは骨および軟骨の主な構成要素であり、ＭＭＰはそれらを分解することができる唯一の既知の哺乳類の酵素である。伝統的に、コラゲナーゼは：ＭＭＰ−１（間質コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−８（好中球コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−１３（コラゲナーゼ３）およびＭＭＰ−１８（コラゲナーゼ４）である。ＭＭＰの別の重要なグループは、ゼラチナーゼにより形成される。これらのＭＭＰの主な基質はＩＶ型コラーゲンおよびゼラチンであり、これらの酵素はその触媒ドメインの中に挿入された追加のドメインの存在により区別される。このゼラチン結合領域は亜鉛結合モチーフのすぐ前に位置しており、その触媒ドメインの構造を乱さない別個の折りたたみ単位を形成する。このサブグループの２つのメンバーは：ＭＭＰ−２（７２ｋＤａゼラチナーゼ、ゼラチナーゼ−Ａ）およびＭＭＰ−９（９２ｋＤａゼラチナーゼ、ゼラチナーゼ−Ｂ）である。しかし、国際特許出願第ＷＯ／２００８１０３０４５号は、ＭＭＰのための既知の切断部位を含まない組換えゼラチンはヒトのマトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ１）により酵素的に分解可能であったことを開示している。どうやら、予想されるよりもっと多くのタイプの組換えゼラチンが分解され得るようである。従って、組換えゼラチンを含む架橋されたヒドロゲルは、細胞接着の防止のための組成物において望ましい、必要とされるゆっくりとした生分解を示す。
【００４１】
本発明の組成物のヒドロゲルの調製は、当技術におけるあらゆる既知の方法により実施することができる。適切な架橋剤は、当技術で既知の架橋剤、例えば以下のものから選択される化学的クロスリンカーである：アルデヒド化合物、例えばホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒド、カルボジイミド、ジ−アルデヒド、ジ−イソシアネート、ケトン化合物、例えばジアセチルおよびクロロペンタンジオン、ビス（２−クロロエチル尿素）、２−ヒドロキシ−４，６−ジクロロ−１，３，５−トリアジン、米国特許第３，２８８，７７５号で開示されている反応性ハロゲン含有化合物、米国特許第４，０６３，９５２号および米国特許第５，５２９，８９２号で開示されている、ピリジン環がサルフェートまたはアルキルサルフェート基を有するカルバモイルピリジニウム化合物、ジビニルスルホン類、および同様のもの、ならびにＳ−トリアジン誘導体、例えば２−ヒドロキシ−４，６−ジクロロ−ｓ−トリアジン。好ましい態様において、本発明の組成物のヒドロゲルを調製するための方法は、水溶性カルボジイミドを用いて架橋することにより実施される。さらにもっと好ましい態様において、その組換えゼラチンは１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣまたはＥＤＡＣ）を用いて架橋される。架橋反応条件はどの架橋剤を用いるかによって異なり、当業者には周知であろう。
【００４２】
本発明に従う組成物は、細胞接着の防止における使用に適したものであるのが好ましい。本発明に従う組成物は、線維症の予防における使用に適したものであるのが特に好ましい。
【００４３】
本発明に従う好ましい組成物は、以下のものを含む；
（ａ）０．１〜８重量パーセントの少なくとも１種類の細胞接着阻害剤；ならびに
（ｂ）９２〜９９．９重量パーセントの架橋された組換えゼラチンヒドロゲルマトリックス、ここでその組換えゼラチンは架橋前に少なくとも０．３ｍｍｏｌ／ｇのリシン残基および架橋後に少なくとも０．１５ｍｍｏｌ／ｇの遊離アミンを含む。
【００４４】
本発明に従う組成物は、当業者に既知であろうあらゆる方法により調製されてよい。好ましくは、本発明に従う組成物は、以下：
（ａ）その組換えゼラチンおよびその細胞接着阻害剤（単数または複数）を混合して混合物を得る；そして
（ｂ）その混合物を架橋する
を含む方法により調製される。
【００４５】
本発明の組成物は、好ましくは以下：
（ａ）その組換えゼラチンを架橋してヒドロゲルマトリックスを与える；そして
（ｂ）そのヒドロゲルマトリックスを細胞接着阻害剤（単数または複数）と接触させる
を含む方法によっても調製されてよい。
【００４６】
本発明は以下の限定的でない実施例において説明され、ここで、別途明記しない限り、全ての部および百分率は重量によるものである。
【実施例】
【００４７】
本発明の実施例を、付随する図において図説する。
図１は、様々な架橋された組換えゼラチンからのデキストラン硫酸の放出の速度を示す。
【００４８】
曲線１は、実施例１ａのヒドロゲルによる放出プロフィールを示す。
曲線２は、実施例１ｃのヒドロゲルによる放出プロフィールを示す。
曲線３は、実施例１ｂのヒドロゲルによる放出プロフィールを示す。
【００４９】
実施例１
様々なクロスリンカーを用いる架橋された組換えゼラチンの調製
これらの実施例において用いられた組換えゼラチンはＣＢＥ３であり、それはＷＯ２００８１０３０４１において開示された。この組換えゼラチンの分子量は約５１２００ダルトンである。
【００５０】
実施例１ａ
ヘキサメチレンジイソシアネート（ＨＭＤＩＣ）の架橋剤としての使用
ＣＢＥ３のスポンジを、ＣＢＥ３の１％水溶液をｐＨ１０で凍結乾燥することにより調製した。そうして得られたスポンジを、０．００７５％のＨＭＤＩＣを含有するエタノール中に周囲温度で２４時間浸すことにより架橋した。残留したクロスリンカーを、過剰量の純粋なエタノール中で３回洗浄することにより除去した。乾燥させた後、そのスポンジをシュレッダー（Ｒｅｔｓｃｈ  ＺＭ１）によりすり潰して（mashed）小さい破片にして、乾燥粉末（粒径＜４００μｍ）を得た。
【００５１】
実施例１ｂ
１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）の架橋剤としての使用
ＣＢＥ３の１０％水溶液を、塩酸の添加によりｐＨ４．７に調節し、５０％  ＥＤＣの水溶液を１ｇ  ＥＤＣ溶液／ｇ  ゼラチンの比率で添加することにより架橋した。架橋反応を周囲温度で２４時間進行させた。結果として得られたゲルを水で希釈し、Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ（登録商標）を用いて１０分間すり潰した（ＩＫＡ  Ｔ１０，Ｓ１０Ｎ８Ｇプローブ）。次いでそのゲルを純粋なエタノール中で沈殿させ、デカントし、純粋なエタノールで３回洗浄した。その物質を真空オーブン中で４０℃で乾燥させて、乾燥粉末を得た。
【００５２】
実施例１ｃ
ホルムアルデヒドの架橋剤としての使用
ＣＢＥ３の１０％水溶液を、１Ｍ水酸化ナトリウムを用いてｐＨ１０に調節し、続いてホルムアルデヒドのメタノール中における溶液（１２．３Ｍ）の添加（０．１４ｍｌ  ｇ／ｇ  ゼラチン）により架橋した。結果として得られたゲルを純粋なエタノール中で沈殿させ、デカントし、純粋なエタノールで３回洗浄した。その物質を真空オーブン中で４０℃で乾燥させて、乾燥粉末を得た。
【００５３】
実施例２
ゲル調製プロセス
実施例１ａ、１ｂおよび１ｃで記述したように調製した、架橋された組換えゼラチンの粉末（１ｇ）を、２％デキストラン硫酸（平均ＭＷ  ４０，０００）を含有するｐＨ７．４の等張なホスフェート緩衝液９ｍｌ中で分散させた。結果として得られた分散液を１２１℃で１５分間オートクレーブして３種類のヒドロゲルを得た。
【００５４】
ゼラチンヒドロゲルからのデキストラン硫酸の放出
ゼラチンヒドロゲルからのデキストラン硫酸の放出を、ＷＯ２００７／０１６６２２において記述されている方法に従って測定した。ヒドロゲル（１ｇ）を５０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水中で分散させた。そのフラスコに栓をして、３７℃で穏やかに渦を巻くように混ぜた（swirled）。０、３、７、および２４時間の時点で分割量（aliquots）を取り出し、０．２μｍフィルターを通して濾過した。デキストラン硫酸を全く含有しない同じ架橋されたゼラチンを用いたゲルを用いることにより、ブランクを得た。濾過した分割量中のデキストラン硫酸濃度を、硫黄測定に基づくＩＣＰ−ＯＥＳにより定量化した。ブランクの値を引くことにより、データを補正した。
【００５５】
結果
異なるように架橋されたゼラチンのゲルの放出パターンを図１に示す。デキストラン硫酸の放出がそのゼラチンを架橋するために用いられた薬剤のタイプに強く依存することは図１から明らかである。例えば、ＥＤＣで架橋された組換えゼラチンゲルは、拡散によりデキストラン硫酸の１０％未満を放出する。ここで、インビボでのデキストラン硫酸の放出は主にそのヒドロゲルの（加水分解的および酵素的）分解によるであろうと思われる。対照的に、ＨＭＤＩＣで架橋されたヒドロゲルに関して、その拡散放出は２４時間後に７０％まで完了している。興味深いことに、そのデキストラン硫酸の残りの３０％は拡散によっては放出されず、従ってインビボにおいて分解により放出されるであろうと考えられる。ホルムアルデヒドで架橋されたゲルからのデキストラン硫酸の放出は、ＨＭＤＩＣで架橋されたゲルとＥＤＣで架橋されたゲルの中間である。
【００５６】
架橋の前および後のアミンのレベルを、ＴＮＢＳ法（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸、例えばGilbert and Kim, J. Biomed. Matter. Res. 24, 1221, 1990を参照）を用いて決定した。いくつかの特徴的なゲルに関して得られた値を表１に示す。
【００５７】
【表１】
2013512746.tif 000002
【００５８】
結論として、目的に合わせた（tailored）架橋後の遊離アミン基の含有量を有する架橋された組換えゼラチンヒドロゲルを用いることにより、細胞接着阻害剤の望まれるタイプの放出パターンを得ることができることが示された。
【手続補正書】
【提出日】平成23年11月23日(2011.11.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物であって、以下：
（ａ）少なくとも１種類の細胞接着阻害剤、ここで当該細胞接着阻害剤（単数または複数）は、アルギネート、コンドロイチン硫酸（chondroitan sulfate）、デルマタン硫酸、デキストラン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸（heparin sulfate）、ケラチン硫酸、およびペントースポリサルフェート（pentose polysulfate）からなる群より選択される；および
（ｂ）架橋された組換えゼラチンヒドロゲルマトリックス、ここで当該組換えゼラチンは架橋前に少なくとも０．３ｍｍｏｌ／ｇのリシンおよび／またはヒドロキシリシン残基および架橋後に少なくとも０．１５ｍｍｏｌ／ｇの遊離アミンを含む；
を含む、前記組成物。
【請求項２】
細胞接着阻害剤が、デキストラン硫酸、ペントサンポリサルフェートまたはそれらの混合物である、前記の請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３】
組換えゼラチンヒドロゲルマトリックス中で、当該組換えゼラチンが架橋前に少なくとも０．４０ｍｍｏｌ／ｇのリシンおよび／またはヒドロキシリシン残基を含む、前記の請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４】
組換えゼラチンヒドロゲルマトリックス中で、当該組換えゼラチンが架橋前に少なくとも０．８０ｍｍｏｌ／ｇのリシンおよび／またはヒドロキシリシン残基を含む、前記の請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
組換えゼラチンヒドロゲルマトリックス中で、当該組換えゼラチンが架橋前に少なくとも０．３ｍｍｏｌ／ｇのリシン残基を含む、前記の請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
組換えゼラチンが少なくとも１個のＲＧＤモチーフを含む、前記の請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
組換えゼラチンが７より上の等電点を有する、前記の請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
組換えゼラチンが少なくとも５０ｋＤａの分子量を有する、前記の請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
組換えゼラチンが１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩を用いて架橋される、前記の請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
以下：
（ａ）０．１〜８重量パーセントの少なくとも１種類の細胞接着阻害剤、ここで当該細胞接着阻害剤（単数または複数）は、アルギネート、コンドロイチン硫酸（chondroitan sulfate）、デルマタン硫酸、デキストラン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸（heparin sulfate）、ケラチン硫酸、およびペントースポリサルフェート（pentose polysulfate）からなる群より選択される；ならびに
（ｂ）９２〜９９．９重量パーセントの架橋された組換えゼラチンヒドロゲルマトリックス、ここで当該組換えゼラチンは架橋前に少なくとも０．３ｍｍｏｌ／ｇのリシン残基および架橋後に少なくとも０．１５ｍｍｏｌ／ｇの遊離アミンを含む；
を含む、前記の請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
細胞接着の防止における使用のための、前記の請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
線維症の予防における使用のための、前記の請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物を調製するための方法であって、以下：
（ａ）組換えゼラチンおよび細胞接着阻害剤（単数または複数）を混合して混合物を得る、ここで当該細胞接着阻害剤（単数または複数）は、アルギネート、コンドロイチン硫酸（chondroitan sulfate）、デルマタン硫酸、デキストラン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸（heparin sulfate）、ケラチン硫酸、およびペントースポリサルフェート（pentose polysulfate）からなる群より選択される；そして
（ｂ）当該混合物を架橋する；
を含む、前記方法。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物を調製するための方法であって、以下：
（ａ）組換えゼラチンを架橋してヒドロゲルマトリックスを与える；そして
（ｂ）当該ヒドロゲルマトリックスを細胞接着阻害剤（単数または複数）と接触させる、ここで当該細胞接着阻害剤（単数または複数）は、アルギネート、コンドロイチン硫酸（chondroitan sulfate）、デルマタン硫酸、デキストラン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸（heparin sulfate）、ケラチン硫酸、およびペントースポリサルフェート（pentose polysulfate）からなる群より選択される；
を含む、前記方法。
【国際調査報告】
2013512746.tif 000003
2013512746.tif 000004