(57)【要約】  本発明は，核酸配列特異的検出を含む，クラミジア・トラコマチス由来の遺伝物質を検出する方法を提供する。必要に応じて，内部コントロールとしてペクトバクテリウム・アトロセプティカム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）由来の遺伝物質と共に，特異的なプライマー及びプローブを使用し，さらに関連する産生物及びキットを使用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸配列の配列特異的検出を含む，クラミジア・トラコマチス由来の遺伝物質をサンプル中で検出する方法であって，
前記核酸配列は，以下の配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）又はその相補鎖に含まれる少なくとも１０個の連続するヌクレオチド残基を含み，
前記配列は，最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換によりさらに変異可能である，
検出方法。
2013514076.tif 000080
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって，前記配列特異的検出は，核酸ハイブリダイゼーションステップを行うことを含む，方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって，前記配列特異的検出は，核酸ハイブリダイゼーションステップに続いて核酸ハイブリダイゼーションを検出するステップを行うことを含む，方法。
【請求項４】
請求項２又は請求項３に記載の方法であって，前記核酸配列は，前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に含まれる少なくとも１５個の連続するヌクレオチド残基を含む，方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって，
以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４又はその相補鎖に含まれる少なくとも１５個の連続するヌクレオチド残基を含む核酸配列とクラミジア・トラコマチス由来の遺伝物質とのハイブリダイゼーションを含み，
前記配列は，最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換によりさらに変異可能である，
方法。
2013514076.tif 000081
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって，
以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５又はその相補鎖を有する核酸配列とクラミジア・トラコマチス由来の遺伝物質とのハイブリダイゼーションを含み，
前記配列は，最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換によりさらに変異可能である，
方法。
2013514076.tif 000082
【請求項７】
請求項２又は請求項３に記載の方法であって，
以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４又はその相補鎖に含まれる少なくとも１０個の連続するヌクレオチド残基を含む核酸プローブとクラミジア・トラコマチス由来の遺伝物質とのハイブリダイゼーションを含み，
前記配列は最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換によりさらに変異可能であり，
前記核酸プローブは小溝結合剤分子部分（ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ  ｂｉｎｄｅｒ  ｍｏｉｅｔｙ）を含むか，又はＬＮＡである，
方法。
2013514076.tif 000083
【請求項８】
請求項１から請求項７のいずれかに記載の方法であって，
前記配列特異的検出方法は，核酸を増幅した後，ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ），転写媒介増幅，核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ），ヘリカーゼ依存性増幅，リコンビナーゼポリメラーゼ増幅，鎖置換増幅，又はループ媒介等温増幅を用いて検出を行う，方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって，
前記配列特異的検出方法は，前記ポリメラーゼ連鎖反応を含む，方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって，
前記ポリメラーゼ連鎖反応は，フォワードＰＣＲプライマー及びリバースＰＣＲプライマーの使用を含み，
ａ）前記フォワードＰＣＲプライマーは，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５から選択される１７個から３４個の連続するヌクレオチド残基を含む核酸配列を有し，かつ
ｂ）前記リバースＰＣＲプライマーは，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６から選択される１５個から３１個の連続するヌクレオチド残基を含む核酸配列を有するか，又は
前記フォワードＰＣＲプライマーは，前記ｂ）で定義されるリバースプライマーの相補鎖である核酸配列を有し，かつ
前記リバースＰＣＲプライマーは，前記ａ）で定義されるフォワードプライマーの相補鎖である核酸配列を有するものであり，
前記配列は，最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換によりさらに変異可能である，
方法。
2013514076.tif 000084
2013514076.tif 000085
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって，
前記フォワードＰＣＲプライマーは，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８，又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示される配列を有する核酸を含み，
前記リバースＰＣＲプライマーは，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示される配列を有する核酸を含む，
方法。
2013514076.tif 000086
2013514076.tif 000087
【請求項１２】
請求項９又は請求項１１に記載の方法であって，
前記ポリメラーゼ連鎖反応は，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４又はその相補鎖に含まれる１８個から２８個の核酸残基を含む核酸配列を有する核酸プローブの使用を含み，
前記配列は，最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換によりさらに変異可能である，
方法。
2013514076.tif 000088
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって，
前記核酸プローブは，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示される核酸配列を有する，方法。
2013514076.tif 000089
【請求項１４】
請求項９に記載の方法であって，
前記ポリメラーゼ連鎖反応は，フォワードＰＣＲプライマー及びリバースＰＣＲプライマーの使用を含み，
ａ）前記フォワードＰＣＲプライマーは，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５から選択される１２個から２９個，又は１９個から２９個の連続するヌクレオチド残基を含む核酸配列を有し，かつ
ｂ）前記リバースＰＣＲプライマーは，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６から選択される１５個から３１個の連続するヌクレオチド残基を含む核酸配列を有するか，又は
前記フォワードＰＣＲプライマーは，前記ｂ）で定義されるリバースプライマーの相補鎖である核酸配列を有し，かつ
前記リバースＰＣＲプライマーは，前記ａ）で定義されるフォワードプライマーの相補鎖である核酸配列を有するものであり，
前記配列は，最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換によりさらに変異可能であり，
前記プライマーは，小溝結合剤分子部分を含むか，又はＬＮＡｓである，
方法。
2013514076.tif 000090
2013514076.tif 000091
【請求項１５】
フォワードＰＣＲプライマーであって，
以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５から選択される１７個から３４個のヌクレオチド残基を含む核酸配列を有し，
前記配列は，最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換によりさらに変異可能である，
フォワードＰＣＲプライマー。
2013514076.tif 000092
【請求項１６】
請求項１５に記載のフォワードＰＣＲプライマーであって，
以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８，又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示される配列を含む，
フォワードＰＣＲプライマー。
2013514076.tif 000093
【請求項１７】
リバースＰＣＲプライマーであって，
以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６から選択される１５個から３１個のヌクレオチド残基を含む核酸配列を有し，
前記配列は，最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換によりさらに変異可能である，
リバースＰＣＲプライマー。
2013514076.tif 000094
【請求項１８】
請求項１７に記載のリバースＰＣＲプライマーであって，
以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示される核酸配列を有する，リバースＰＣＲプライマー。
2013514076.tif 000095
【請求項１９】
核酸プローブであって，
以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４又はその相補鎖に示される１８個から２８個の核酸残基を含む核酸配列を有し，
前記配列は，最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換によりさらに変異可能である，
核酸プローブ。
2013514076.tif 000096
【請求項２０】
請求項１９に記載の核酸プローブであって，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示される核酸配列を有する，核酸プローブ
2013514076.tif 000097
【請求項２１】
フォワードＰＣＲプライマーであって，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５から選択される１９個から２９個の連続する核酸残基を含む核酸配列を有し，前記配列は，最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換によりさらに変異可能であるフォワードＰＣＲプライマー，又は
リバースＰＣＲプライマーであって，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６から選択される１６個から２６個の連続する核酸残基を含む核酸配列を有し，前記配列は，最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換によりさらに変異可能であるリバースＰＣＲプライマー，又は
核酸プローブであって，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４又はその相補鎖に示される１３個から２３個の連続する核酸残基を含む核酸配列を有し，前記配列は，最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換によりさらに変異可能である核酸プローブであり，
前記フォワードＰＣＲプライマー，前記リバースＰＣＲプライマー，及び前記核酸プローブは，小溝結合剤分子部分を含むか，又はＬＮＡｓである，
フォワードＰＣＲプライマー，リバースＰＣＲプライマー，又は核酸プローブ。
2013514076.tif 000098
2013514076.tif 000099
2013514076.tif 000100
【請求項２２】
電気化学的に活性な標識に結合した，
請求項１５，請求項１６又は請求項２１に記載のフォワードＰＣＲプライマー，
請求項１７，請求項１８又は請求項２１に記載のリバースＰＣＲプライマー，又は
請求項１９，請求項２０又は請求項２１に記載の核酸プローブ。
【請求項２３】
請求項１５，請求項１６又は請求項２１に記載のフォワードＰＣＲプライマー，及び請求項１７，請求項１８又は請求項２１に記載のリバースＰＣＲプライマーを含む，
ＰＣＲ成分。
【請求項２４】
請求項２３に記載のＰＣＲ成分であって，
請求項１９，請求項２０又は請求項２１に記載の核酸プローブをさらに含む，
ＰＣＲ成分。
【請求項２５】
請求項２３又は請求項２４に記載のＰＣＲ成分であって，
内部ポジティブコントロールとして使用する，ペクトバクテリウム・アトロセプティカム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）由来のゲノムＤＮＡをさらに含む，
ＰＣＲ成分。
【請求項２６】
請求項２５に記載のＰＣＲ成分であって，
前記ペクトバクテリウム・アトロセプティカム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）は菌株ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６７２である，
ＰＣＲ成分。
【請求項２７】
請求項２３から請求項２６のいずれかに記載のＰＣＲ成分であって，
第２のフォワードＰＣＲプライマー及び第２のリバースＰＣＲプライマーを含み，
前記プライマーは，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８又はその相補鎖の核酸配列内に存在する標的核酸配列とハイブリダイズするように設計されており，
前記配列は，最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換によりさらに変異可能である，
ＰＣＲ成分。
2013514076.tif 000101
【請求項２８】
請求項２７に記載のＰＣＲ成分であって，
ａ）前記第２のフォワードＰＣＲプライマーは，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９から選択される１３個から２３個の連続する核酸残基を含む核酸配列を有し，かつ
ｂ）前記第２のリバースＰＣＲプライマーは，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０から選択される１５個から２５個の連続する核酸残基を含む核酸配列を有するか，又は
前記第２のフォワードＰＣＲプライマーは，前記ｂ）で定義されるリバースプライマーの相補鎖である核酸配列を有し，かつ
前記第２のリバースＰＣＲプライマーは，前記ａ）で定義されるフォワードプライマーの相補鎖である核酸配列を有するものであり，
前記配列は，最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換によりさらに変異可能である，
ＰＣＲ成分。
2013514076.tif 000102
2013514076.tif 000103
【請求項２９】
請求項２８に記載のＰＣＲ成分であって，
前記第２のフォワードＰＣＲプライマーは，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示される配列を有する核酸を含み，
前記第２のリバースＰＣＲプライマーは，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示される配列を有する核酸を含む，
ＰＣＲ成分。
2013514076.tif 000104
【請求項３０】
請求項２７に記載のＰＣＲ成分であって，
前記第２のフォワードＰＣＲプライマー又は前記リバースＰＣＲプライマーは，下記で定義されない場合は請求項項２９に記載のものであり，
前記プライマーの少なくとも１つは，
ａ）以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９から選択される８個から１８個の連続する核酸残基を含む核酸配列を有する，第２のフォワードＰＣＲプライマー，及び
ｂ）以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０から選択される１０個から２０個の連続する核酸残基を含む核酸配列を有する，第２のリバースＰＣＲプライマーであり，
前記配列は，最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換によりさらに変異可能であり，
前記プライマーは，小溝結合剤分子部分を有するか，又はＬＮＡ（ＬＮＡｓ）である，
ＰＣＲ成分。
2013514076.tif 000105
2013514076.tif 000106
【請求項３１】
請求項２５から請求項３０のいずれかに記載のＰＣＲ成分であって，
前記ポリメラーゼ連鎖反応は，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３又はその相補鎖に示される１８個から２８個の核酸残基を含む核酸配列を有する第２の核酸プローブの使用を伴い，
前記配列は，最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換によりさらに変異可能である，
ＰＣＲ成分。
2013514076.tif 000107
【請求項３２】
請求項３１に記載のＰＣＲ成分であって，
前記核酸プローブは，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に示される核酸配列を有する，ＰＣＲ成分。
2013514076.tif 000108
【請求項３３】
請求項２５から請求項３０のいずれかに記載のＰＣＲ成分であって
前記ポリメラーゼ連鎖反応は，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３又はその相補鎖に示される１３個から２３個の核酸残基を含む核酸配列を有する第２の核酸プローブの使用を伴い，
前記配列は，最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換によりさらに変異可能であり，
前記核酸プローブは，小溝結合剤分子部分を有するか，又はＬＮＡである，
ＰＣＲ成分。
2013514076.tif 000109
【請求項３４】
請求項２３から請求項３３のいずれかに記載のＰＣＲ成分，及び
請求項１から請求項１４のいずれかに記載の方法を実施するための説明書を含むキット。
【請求項３５】
ペクトバクテリウム・アトロセプティカム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）の染色体に含まれる核酸配列の配列特異的検出を含む，ペクトバクテリウム・アトロセプティカム由来の遺伝物質をサンプル中で検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む，アッセイの産物，アッセイの使用，及びアッセイの方法に関する。具体的には，クラミジア・トラコマチスのアッセイ及びＰＣＲの改良したコントロールに関する。
【背景技術】
【０００２】
クラミジア・トラコマチスは偏性細胞内のヒト病原体である。クラミジア感染症は一般的な性感染症であり，その細菌によって，男性と女性の両方で多数の病状を引き起こす可能性がある。臨床的症状は尿道炎，直腸炎，トラコーマ，不妊症，前立腺炎，精巣上体炎，子宮頸管炎，骨盤内炎症性疾患（ＰＩＤ）及び子宮外妊娠などである。またこれは，新生児への病原体でもあり，目や肺の感染症を引き起こす可能性もある。
【０００３】
クラミジア・トラコマチス感染症は，世界中の最も一般的な性的感染症の一つである。米国では，２〜３万人がクラミジアに感染していると推定されている。イギリスでは，性的に活発な２５歳未満の若い世代の１０人に１人がクラミジアに感染していると推定されている。
【０００４】
クラミジア・トラコマチス感染症は，例えば，ドキシサイクリンなどのテトラサイクリンや，アジスロマイシンなどのマクロライド+の抗生物質によって良好に治療することができる。適切な治療が適時に行われるように，クラミジア・トラコマチスによる感染を正確に診断する必要がある。英国など一部の国では，クラミジアスクリーニングの国家プログラムが開始されている。
【０００５】
クラミジアの感染単位は，基本小体（ＥＢ）である。ＥＢは胞子様小体（“ｓｐｏｒｅ−ｌｉｋｅ”  ｂｏｄｙ）として機能し，その目的は宿主細胞の外側の非支持的環境でクラミジアの生存を可能にすることである。ＥＢは，感受性宿主細胞に付着し，エンドサイトーシスされるまで，代謝的に不活性であると考えられている。クラミジア・トラコマチスは，例えば，ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの核酸増幅法により検出可能である。ＰＣＲは，感染された細胞とＥＢｓの両方から核酸を増幅する可能性を有している。クラミジア・トラコマチスは，単一コピーとして存在する染色体と，ＥＢあたり６から１０コピー存在するプラスミドの両方に遺伝物質を含んでいる。歴史的に，プラスミドは，ＥＢあたり複数のコピーが存在し，プラスミドベースの標的を検出することによってより大きな感度が得られると推定されることから，核酸増幅検査の好ましい標的として使用されている。しかし，プラスミドの核酸増幅検査の検出システムは，クラミジア・トラコマチスのスウェーデン変異体が発見されたことを受けて，その適合性に疑問が生じている。スウェーデン変異体が，そのプラスミドに３７７塩基対の欠失を含むことから，スウェーデン変異型クラミジア・トラコマチスに直面した場合に，欠失領域を標的とした検出システムでは偽陰性の結果をもたらすことになる。
【０００６】
本発明は，染色体遺伝子が一般的に突然変異が少ないことから，また，ある特定の状況ではプラスミドが完全に失われる可能性があることから，クラミジア・トラコマチス染色体に存在する配列を検出するアッセイが，潜在的により安定しているという認識に基づいている。染色体標的が細胞ごとに単一コピーとしてのみ存在するため，染色体に存在する遺伝子を標的とすることは，不利になることが予想される場合がある。しかし本発明者らは，驚くべきことに，染色体標的がプラスミド標的に匹敵する検出限界（ＬＯＤ）を提供できることを見いだした。
【０００７】
核酸増幅検査（ＮＡＡＴｓ）
複数の核酸増幅検査（ＮＡＡＴ）方法が本発明の使用に適し，利用できる。それらは，周知のＰＣＲ，リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ），鎖置換増幅（ＳＤＡ），リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ），転写媒介増幅，核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ），ヘリカーゼ依存性増幅，ループ媒介等温増幅などである。培養をベースにしたＣ．トラコマチス検出法は，ＮＡＡＴ法に取って代わっている。その理由として，特に培養をベースにする方法は，哺乳動物細胞又は組織培養の使用を必要とするというさらなる複雑さを伴うためである。ＮＡＡＴ法は例えば，酵素により１つ以上の標的配列を増幅させ，高感度な配列特異的方法で核酸を検出する。
【０００８】
ＮＡＡＴｓのさらなる詳細については，以下の参考文献を参照されたい。これらは参照により本明細書に組み込まれる。
核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）について，
Ｃｏｍｐｔｏｎ  Ｊ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｎａｔｕｒｅ  １９９１  ：３５０（６３１３）：９１−２；
転写媒介増幅について，
Ｗｒｏｂｌｅｗｓｋｉ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  Ｖａｒｉｏｕｓ  Ｇｅｎｉｔａｌ  Ｓｐｅｃｉｍｅｎ  Ｔｙｐｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ．  Ｊ．Ｃｌｉｎ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００６：４４（９）：３３０６−３３１２；
リガーゼ連鎖反応について，
Ｗｉｅｄｍａｎｎ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  （ＬＣＲ）  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．
ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １９９４  ３（４）Ｓ５１−６４；
ＤＮＡのループ媒介等温増幅について，
Ｎｏｔｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ．
Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．  ２０００  ２３  （１２）：Ｅ６３；
ヘリカーゼ依存性増幅について，
Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｅｌｉｃａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．  ２００４  ５（８）  ７９５−８００；
鎖置換増幅について，
Ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  −  ａｎ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．  Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．
Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９９２．  ２０（７）  １６９１−１６９６；
リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）について，
ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｍａｄｅ  Ｓｉｍｐｌｅ  （Ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ）．Ｈｏｆｆ．  Ｍ．  
Ｐｕｂｌｉｃ  Ｌｉｂｒ．  Ｓｉｃ．  ２００６：  ４（７）：  ｅ２２２；  ａｎｄ  ａｌｓｏ  ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ７２７０９８１．
【０００９】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
ＰＣＲは，耐熱性ポリメラーゼ酵素を利用し，反応の温度条件を循環させることにより，１つ以上の標的配列の増幅を含む高感度な配列特異的に核酸を検出する方法である。
【００１０】
最も単純な形式では，ＰＣＲ反応は３つの段階を繰り返す。ｉ）約９０℃から１００℃の温度で起こる変性段階。この高温で，二本鎖ＤＮＡを変成又は“融解（ｍｅｌｔｓ）”させ，一本鎖ＤＮＡを形成させる。ｉｉ）５０℃から６５℃の典型的な温度でのプライマーのアニーリング。このステップでは，フォワード及びリバースプライマーを，溶液中に存在するいずれかの標的の相補領域とハイブリダイズさせる。ｉｉｉ）通常，５０℃から８０℃で起こる伸長。これはポリメラーゼ連鎖反応において，溶液中でデオキシヌクレオチド三リン酸の活性によりプライマーの３’末端を伸長させる。通常，このサイクルを２５回から４５回行う。特定のＰＣＲのプロトコルに従って，アニーリングステップと伸長ステップは，サンプルが９０℃から１００°Ｃ，その後５０°Ｃから８０°Ｃの間隔で２つのステップのプログラムを繰り返すことで，１つにまとめてもよい。理論的計算では，３０サイクルのＰＣＲ反応により単一の標的分子を２６８，４３５，４５６倍に増幅できることを示している。増幅反応の効率の悪さから，実際の増幅はこれより少なくなる可能性はあるが，それにもかかわらず，ＰＣＲ反応は通常，検出がさらに容易にできるレベルまで，単一又は非常に少ない数の標的分子を数百万倍に増幅することができる。ＰＣＲ反応は，例えば，好熱性細菌のサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から単離されたＴａｑポリメラーゼの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに依存している。他の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ，例えばパイロコッカス・フリオサスから単離されたＰｆｕポリメラーゼを，Ｔａｑポリメラーゼの代わりに使用することもできる。これは，Ｔａｑポリメラーゼには見られないプルーフリーディング活性を有する，忠実度の高い酵素である。
【００１１】
ポリメラーゼ連鎖反応の概説は，ほとんどの分子生物学のテキスト，例えばＢｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社発行のＯｌｄ及びＰｒｉｍｒｏｓｅによる“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  −  Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”に記載されており，これは参照として本明細書に組み込まれる。様々な“ＰＣＲ形式”が複数存在する。基本的な要件として，ＰＣＲ反応は，標的配列の両側にハイブリダイズするように設計されたフォワードプライマーとリバースプライマーを必要とする。２つのプライマーの間に挟まれた配列に関して増幅反応が起こる。増幅したＰＣＲ産物の検出は，単に二本鎖核酸の存在を検出する非特異的方法で行ってもよい（例えば，エチジウムブロマイド又はＳＹＢＲグリーンなどの二本鎖ＤＮＡインターカレート色素を用いて）。あるいは，例えば検出前に反応産物の電気泳動を行い，産物のおおよその分子量を分析することによって産物の半特異的検出を行ってもよい。また，配列特異的検出法が複数存在し，これらは，一般的に増幅領域への配列特異的核酸プローブのハイブリダイゼーションを含むものや，核酸ポリメラーゼの核酸エキソヌクレアーゼ活性を利用して標的配列の増幅に付随するプローブの分解を測定する方法がある。ＰＣＲベースによる病原体の検出方法は，通常多くの日数をかける培養やインキュベーションを含む従来の方法よりも速い結果が得られる利点を提供する。ＰＣＲの結果は数時間以内に入手することができる。
【発明の概要】
【００１２】
本発明の第１の側面では，核酸配列の配列特異的検出を含む，クラミジア・トラコマチス由来の遺伝物質をサンプル中で検出する方法が提供される。前記核酸配列は，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はその相補鎖に含まれる少なくとも１０個の連続するヌクレオチド残基を含む。
【００１３】
【化１】
2013514076.tif 000002
この配列は最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換によりさらに変異させてもよい。
【００１４】
本発明の第２の側面では，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５から選択される１７個から３４個の連続するヌクレオチド残基を含む核酸配列を有するフォワードＰＣＲプライマーが提供される。
【００１５】
【化２】
2013514076.tif 000003
この配列は最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換によりさらに変異させてもよい。
【００１６】
あるいは，そのプライマーのアニーリング温度を上昇させるステップがとられる場合には，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に由来するプライマーの配列は，より短くてもよい（好ましくは長さが１２個から２２個又は１９個から２９個の残基）。
【００１７】
本発明の第３の側面では，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６から選択される１５個から３１個の連続するヌクレオチド残基を含む核酸配列を有するリバースＰＣＲプライマーが提供される。
【００１８】
【化３】
2013514076.tif 000004
この配列は最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換によりさらに変異させてもよい。
【００１９】
あるいは，そのプライマーのアニーリング温度を上昇させるステップがとられる場合には，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に由来するプライマーの配列は，より短くてもよい（好ましくは長さが１０個から２０個又は１６個から２６個の残基）。
【００２０】
本発明の第４の側面では，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４又はその相補鎖に示される１８個から２８個のヌクレオチド残基を含む核酸配列を有する核酸プローブが提供される。
【００２１】
【化４】
2013514076.tif 000005
この配列は最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換によりさらに変異させてもよい。
【００２２】
あるいは，そのプローブのアニーリング温度を上昇させるステップがとられる場合には，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に由来するプローブの配列は，より短くてもよい（好ましくは長さが１３個から２３個の残基）。
【００２３】
本発明の第５の側面では，本発明のフォワードＰＣＲプライマー及びリバースＰＣＲプライマーを含むＰＣＲ成分が提供される。
【００２４】
本発明の第６の側面では，本発明のＰＣＲ成分，及び本発明の方法を実施するための説明書を含むキットが提供される。
【００２５】
本発明の第７の側面では，ペクトバクテリウム・アトロセプティカム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）の染色体に含まれる核酸配列の配列特異的な検出を含む，ペクトバクテリウム・アトロセプティカムに由来する遺伝物質をサンプル中で検出する方法が提供される。
【００２６】
本発明の第８，９及び１０の側面では，それぞれ，本発明の第５の側面の“第２のフォワードＰＣＲプライマー”として定義されるフォワードＰＣＲプライマーが提供され；本発明の第５の側面の“第２のリバースＰＣＲプライマー”として定義されるリバースＰＣＲプライマーが提供され；本発明の第５の側面の“第２のＰＣＲプローブ”として定義されるＰＣＲプローブが提供される。
【００２７】
また本発明は，本発明の第８，９及び１０の側面に係るフォワードＰＣＲプライマー，リバースＰＣＲプライマー又はＰＣＲプローブのいずれか１つ以上とＰＣＲ反応の１つ以上のさらなる成分を組み合わせたＰＣＲ成分を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１ａから図１ｃは，実施例に記載されているように，プラスミド標的アンプリコン３，５，及び７に対して行った検出限界（ＬＯＤ）決定実験の結果を示している。
【図２】図２ａから図２ｃは，実施例で記載されているように，プラスミド標的アンプリコン９，１７，及び１８に対して行った検出限界（ＬＯＤ）決定実験の結果を示している。図２ｄは，実施例で記載されているように，染色体アンプリコン１７の［Ｍｇ２＋］最適化実験の結果を示している。
【図３】図３は，実施例８に記載の１７の染色体アンプリコンの実験の結果を示している。
【図４−５】図４は，デュプレックスＰＣＲによって産生されたクラミジア・トラコマチスのアンプリコンの電気化学的検出による内部コントロール（ＩＣ）のプライマー及びＤＮＡの結果を示している（実施例９）。エラーバーはＳＤ（ｎ＝３）を示している。４つのグループの各バーの記載は，図５と同様である。“ＭＥ１７プライマー＋２０ｐｇのＩＣ  ＤＮＡ”は，各グループの４つの内の最初のバーに対応している。“ＭＥ１７プライマー；ＩＣ  ＤＮＡなし”は，各グループの４つの内の２番目のバーを指している。“ＭＥ１７及びＩＣプライマー＋２００μｇのＩＣ  ＤＮＡ”は，各グループの４つの内の３番目のバーを指している。“ＭＥ１７及びＩＣプライマー；ＩＣ  ＤＮＡなし”は，各グループの４つの内の４番目のバーを指している。
【図６】図６ａは，内部コントロールのプライマーセットを含まないクラミジア・トラコマチスの増幅産物のゲル電気泳動を示している。レーン１＝１００ｂｐラダー，レーン２からレーン４＝１００００ＩＦＵ反応（ＩＦＵ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）；レーン５からレーン７＝１０００ＩＦＵ／反応，レーン８からレーン１０＝１００ＩＦＵ／反応，レーン１１からレーン１３＝１０ＩＦＵ／反応，レーン１４からレーン１６＝１ＩＦＵ／反応。図６ｂは図６ａと同様であるが，レーン１＝１００ｂｐラダーであり，レーン２からレーン４ではＩＦＵ／反応はなかった。
【図７】図７ａと図７ｂは図６ａと図６ｂと同様であるが，内部コントロールのプライマーセットを含む反応である。
【図８】図８は，クラミジア・トラコマチス（ＣＴ，各ペアの最初のバー）のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９のプライマーと，内部コントロール（ＩＣ，各ペアの２番目のバー）のプライマーセットによりデュプレックスに増幅したサンプルの電気化学的検出の結果を示している。２００ｐｇの内部コントロールＤＮＡを，すべてのケースで加えている。エラーバーはＳＤ（ｎ＝３）を示している。
【図９】図９は，実施例１０に記載の比較デュプレックス実験（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｄｕｐｌｅｘ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）の結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
定義
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
背景技術の段落で説明したように，ＰＣＲは，インビトロでの酵素的複製によってＤＮＡのセグメントを増幅するために分子生物学分野において広く使われている技術である。反応が進行するにつれて，以前の複製によって産生されたＤＮＡは，後の複製の鋳型として使用される。これにより連鎖反応を引き起こし，ＤＮＡ鋳型が指数関数的又はほぼ指数関数的に増幅する。ＰＣＲは，単一の又は非常に少ないコピーの核酸を桁違いに増幅することができ，数百万以上のコピーの産生により容易に検出が可能になる。基本的なＰＣＲのセットアップは，以下の成分を必要とする。ｉ）増幅させるＤＮＡ鋳型又はＤＮＡ標的；ｉｉ）標的領域の５’末端でＤＮＡ領域に相補的なフォワードプライマーと，標的領域の３’末端でＤＮＡ領域に相補的なリバースプライマーの１対のプライマー；ｉｉｉ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ，例えばＴａｑポリメラーゼ；ｉｖ）デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ），これらはＤＮＡポリメラーゼが新しいＤＮＡ鎖を合成するのに欠かせない要素として使用される；ｖ）適当な緩衝液；ｖｉ）マグネシウムイオン又は他の適当なカチオン；ｖｉｉ）一価カリウムイオン又は他の適当なカチオン。
【００３０】
例えば，多数の異なるＰＣＲが存在する場合，マルチプレックスＰＣＲは，単一の試料容器内の複数の標的を同時に増幅する。またマルチプレックスＰＣＲは，最大１２セットのプライマーの独立した作用を含む，デュプレックス及びトリプレックスＰＣＲ反応（ｄｕｐｌｅｘ  ａｎｄ  ｔｒｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）を含む。
【００３１】
ネストＰＣＲ法は，ＰＣＲ増幅反応の特異性を高めるために使用することができる技術である。２つのプライマーセットが２つの連続反応に使用される。最初に１対のプライマーにより，完全には特異的でない方法でＤＮＡ産物を産生する。それにもかかわらず，最初の反応は標的配列の例を増加させる。第２の反応はより特異的で，最初のプライマーセット内にネストされた配列を増幅する。
【００３２】
定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）はサンプル中の特定量の標的ＤＮＡを測定又は推定するのに使用される。標準的なＰＣＲプロセスは，ある状況下ではほぼ定量的であるが，正確に定量的なＰＣＲの目的は，産生量の真の指数関数的増加期でのみ増幅反応を実行するか又は増幅反応の結果を考慮することによって，その後の増幅の定常期を回避することである。指数関数的増幅期における産生量は，標的の初期量に大抵比例する。サーモサイクラーは増幅中に産生量をモニタリングすることができるように開発されている。現在使用されている一つの方法は，増幅進行時に，増幅産物の量を測定するために，ＳＹＢＲグリーンなどの蛍光色素，又はＴａｑＭａｎＴＭ（登録商標）システムのような蛍光体を含むＤＮＡプローブを使用する，定量的リアルタイムＰＣＲである。
【００３３】
ホットスタートＰＣＲは，プライマーが低温で非特異的な場所に結合するか，又はさらに互いに結合することによって起こり得る問題を回避することができる。ホットスタートＰＣＲは，非特異的なプライマーの結合を防止又は低減する十分に高い反応温度の時に，ハイブリダイゼーションするプライマーのみを解離させる原理に基づいている。この技術は手動で行うことができ，例えば，ポリメラーゼを加える前又はプライマーを加える前に反応成分を変性温度，例えば９７℃に加熱する。あるいは，特殊なシステムが開発されており，これは例えば，温度の上昇で解離することになる不活性型の１つ以上の成分を結合させることにより，温度が上昇するまで反応を阻害する。
【００３４】
逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は，ＲＮＡを増幅するために使用される方法であり，ＰＣＲ反応に先立って逆転写酵素による反応で，ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する。２つの反応は十分に両立でき，同一のチューブ内で実行することができ，同一の熱サイクル装置で実施することができる。
【００３５】
メチル化特異的ＰＣＲ（又はＭＳＰ）は，重亜硫酸ナトリウムで標的ＤＮＡを前処理することを含み，これにより，非メチル化シトシン単位を，ＤＮＡプライマーによってチミンとして認識されるウラシルに変換する。２つの増幅は，修飾鋳型と被修飾鋳型を区別するプライマーセットにより，修飾ＤＮＡ上で行われる。一方のプライマーセットは，ＤＮＡのシトシンを認識し，事前に非メチル化したＤＮＡを増幅し，他のセットは，ＤＮＡのウラシル又はチミンを認識し，メチル化した標的を増幅する。２つの増幅の相対的な割合を用いて，メチル化の程度に関する情報が得られる。
【００３６】
発明の詳細な説明
クラミジア標的配列の選択
クラミジア・トラコマチスは，染色体とプラスミドの両方に遺伝情報を含んでいる。クラミジア・トラコマチスのプラスミドは，８個のオープンリーディングフレームを含み，それが複数のコピー数に存在するため，先行技術の検出方法であるＮＡＡＴにとって好ましい標的である。しかしながら本発明者らは，これらのオープンリーディングフレームの多くが非常に多くの変異性を有することを明らかにした。少なくとも一塩基多型（ＳＮＰｓ）が，オープンリーディングフレーム２，４，７及び８で検出された。オープンリーディングフレーム１及び３では，挿入と欠失の両方を含むことが示された。したがって，本発明の核酸検出のための標的配列は，クラミジア・トラコマチスの染色体の配列からもたらされるべきであると考えた。クラミジアの染色体に見られ，本明細書では第１７染色体の配列として言及するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で同定される推定遺伝子が，本発明の方法の使用に最も適していることを発見した。その理由として，クラミジア・トラコマチス分離株間の変異性がわずかであり，非クラミジア分離株との相同性レベルが低く，そして驚くべきことに，単一のコピー数にもかかわらずＰＣＲアッセイにより検出することができ，少なくともプラスミド標的と同様の良好さで有利な検出限界（ＬＯＤ）を有するためである。本発明の好ましい側面で使用するＰＣＲプライマーの選択の詳細については，実施例に記載されている。
【００３７】
第１７染色体の配列は，仮定上の膜結合性タンパク質であることが示唆されているが（仮定上の膜結合タンパク質となるように第１７染色体の配列を提案しているが），まだ正式な名前は与えられていない。生物としての機能は，本発明に係る証明された使用適合性に関する限り，重要ではない。
【００３８】
本発明の第１の側面では，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はその相補鎖に示される少なくとも１０個の連続する核酸残基を含む核酸配列の配列特異的な検出を含む，クラミジア・トラコマチス由来の遺伝物質をサンプル中で検出する方法が提供される。
【００３９】
【化５】
2013514076.tif 000006
この配列は，最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換によりさらに変異させてもよい。
【００４０】
ある態様では，核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の少なくとも１５個の連続する核酸残基を含むことが好ましい。
【００４１】
ある好ましい態様では，１個，２個，３個又は４個の残基欠失，残基置換又は残基付加があってもよい。
ある好ましい態様では，残基置換は残基欠失又は残基付加よりも好ましい。ある好ましい態様では，置換，欠失又は残基付加は存在しない。さらなる変異に関する同様の好ましい特徴は，本発明の他のすべての側面に適用される。
【００４２】
好ましくは，配列特異的検出は，核酸ハイブリダイゼーションのステップを行うことを含む。
【００４３】
好ましくは，配列特異的検出は，核酸ハイブリダイゼーションのステップに続いて核酸ハイブリダイゼーションを検出するステップを含む。
【００４４】
核酸ハイブリダイゼーションの検出
核酸ハイブリダイゼーションを検出する方法は，非配列特異的に核酸ハイブリダイゼーションを検出する方法を含む。これらの方法は，例えばエチジウムブロマイドやＳＹＢＲグリーンなどの核酸インターカレート色素の使用を含む。これらの色素は，二本鎖核酸に結合した時に蛍光シグナルを増加させ，標準的な蛍光検出システムによって検出することができる。代替的な態様では，核酸ハイブリダイゼーションの検出方法は，例えば標識プローブなどの配列特異的な方法でもよい。１つ以上の標識プローブが，配列特異的に標的配列にハイブリダイズされてもよく，（例えば，ＤＮＡアレイ又は“チップ”上に）固定化された相補的な配列とハイブリダイゼーションした後に，標的配列が検出されてもよい。核酸プローブは，蛍光的に，放射的に，酵素的に，あるいは本発明の特定の好ましい態様である電気化学的に標識されてもよい。電気化学的標識は，本明細書に開示されている電気化学的な標識を用いることが特に好ましい。
【００４５】
ある好ましい態様では，クラミジア・トラコマチスに由来する遺伝物質をサンプル中で検出する方法は，クラミジア・トラコマチスに由来する遺伝物質と以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４又はその相補鎖に含まれる少なくとも１５個の連続する核酸残基を有する核酸配列とのハイブリダイゼーションを含む。
【００４６】
【化６】
2013514076.tif 000007
この配列は最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換により変異させてもよい。ある態様では，１個，２個，３個又は４個の残基付加，残基欠失又は残基置換が存在する。
【００４７】
ある好ましい態様では，本方法はクラミジア・トラコマチス由来の遺伝物質と以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５内の配列又はその相補鎖を含む核酸配列とのハイブリダイゼーションを含む。
【００４８】
【化７】
2013514076.tif 000008
この配列は最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換により変異させてもよい。
【００４９】
ある好ましい態様では，さらなる変異は上記で定義したとおりである。
【００５０】
ある好ましい態様では，配列特異的検出は，核酸の増幅に続いて行われ，ＰＣＲ，転写媒介増幅，核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ），ヘリカーゼ依存性増幅，リコンビナーゼポリメラーゼ増幅，鎖置換増幅又はループ媒介性等温増幅により検出される。核酸の増幅の後に配列特異的検出を行う検出方法によって，より高い感受性と特異性を得ることができる。
【００５１】
好ましくは，配列特異的検出方法はＰＣＲによる核酸の増幅に続いて行われる。
【００５２】
ポリメラーゼ連鎖反応
ポリメラーゼ連鎖反応は，フォワードＰＣＲプライマー及びリバースＰＣＲプライマーの使用を含む。本発明の第一の側面のある好ましい態様では，ポリメラーゼ連鎖反応は，以下のＰＣＲフォワードプライマー及びリバースＰＣＲプライマーの使用を含む。
【００５３】
ａ）前記フォワードＰＣＲプライマーは，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５から選択される１７個から３４個（例えば２４個から３４個）の連続するヌクレオチド残基を含むヌクレオチド配列を有する。
【００５４】
【化８】
2013514076.tif 000009
【００５５】
ｂ）前記リバースＰＣＲプライマーは，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６から選択される１５個から３１個（例えば２１個から３１個）の連続するヌクレオチド残基を含む核酸配列を有する。
【００５６】
【化９】
2013514076.tif 000010
【００５７】
あるいは前記フォワードＰＣＲプライマーは，上記ｂ）で部分的に定義されたリバースプライマーの相補鎖である核酸配列を含み，前記リバースＰＣＲプライマーは，上記ａ）で部分的に定義されたフォワードプライマーの相補鎖である核酸配列を有する。ここで，これらの配列は，最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換により変異させてもよい。
【００５８】
例えば前記ポリメラーゼ連鎖反応は，以下のＰＣＲフォワードプライマー及びリバースＰＣＲプライマーの使用を含んでもよい。
【００５９】
ａ）前記フォワードＰＣＲプライマーは，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２から選択される１７個から２７個の連続するヌクレオチド残基を含む核酸配列を有する。
【００６０】
【化１０】
2013514076.tif 000011
ｂ）前記リバースＰＣＲプライマーは，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３から選択される１５個から２５個の連続するヌクレオチド残基を含む核酸配列を有する。
【００６１】
【化１１】
2013514076.tif 000012
【００６２】
あるいは前記フォワードＰＣＲプライマーは，上記ｂ）で部分的に定義されたリバースプライマーの相補鎖である核酸配列を含み，前記リバースＰＣＲプライマーは，上記ａ）で部分的に定義されたフォワードプライマーの相補鎖である核酸配列を含む。この配列は，最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換により変異させてもよい。
【００６３】
さらなる変異は上記のように定義されてもよい。ある態様では，フォワードＰＣＲプライマーは，本発明の第２の態様について定義されているものでもよく，リバースＰＣＲプライマーは，本発明の第３の態様について定義されているものでもよい。
【００６４】
ある好ましい態様では，フォワードＰＣＲプライマーは，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８，又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に記載される配列を有する核酸を含み，リバースＰＣＲプライマーは，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に記載される配列を有する核酸を含む。
【００６５】
【化１２】
2013514076.tif 000013
【００６６】
【化１３】
2013514076.tif 000014
【００６７】
ある態様では，ＰＣＲプライマーの片方又は両方は，ハイブリダイゼーションの検出を支援するために標識されてもよい。標識は，蛍光標識，放射性標識，酵素活性標識又は電気化学的活性標識でもよい。プライマーと標識は，ハイブリダイゼーション後，又はＰＣＲ反応に用いるＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性による分解後にそれらの検出可能なシグナルが増加するように配置させてもよい。例えば，消光分子部分（ｑｕｅｎｃｈｅｒ  ｍｏｉｅｔｙ）が付加されたＰＣＲプライマーに標識を付着させてもよい。ＰＣＲプライマーの分解により，消光分子部分と標識は互いに分離し，標識上の消光分子部分の消光活性は減少することになる。
【００６８】
核酸プローブ
プローブ
配列特異的な方法でＰＣＲ反応の産物を検出するために，核酸プローブを使用してもよい。通常，このようなプローブは，プライマーがアニールする位置の中間地点で標的配列にアニーリングするように設計されている。プローブは検出を支援するために，例えばフルオロフォア，放射性標識，電気化学的活性標識又は酵素標識で標識してもよい。標識は，直接核酸に結合させるか又はリンカー分子部分（ｌｉｎｋｅｒ  ｍｏｉｅｔｙ）によって結合させてもよい。本発明のプローブは，特にＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ型が適している。ＴａｑＭａｎは，ライフテクノロジーズ社から入手可能なリアルタイム定量ＰＣＲ法である。ＴａｑＭａｎ型では，増幅の実験段階中にＰＣＲ産物の蓄積がリアルタイムに測定される。これは，しきい値サイクル，すなわち，シグナルのしきい値レベルが検出されるＰＣＲサイクル数を測定するために行われる。ＴａｑＭａｎ型のＰＣＲプローブは，蛍光標識され，２つのプライマーの間に位置するＤＮＡ鋳型内の約２０個から６０個のヌクレオチドのセグメントに相補的である。ＴａｑＭａｎシステムの使用に適する蛍光標識は，６−カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ）又はテトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）などである。ＴａｑＭａｎプローブは，通常，フルオロフォアなどで標識され，さらに，例えばテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）などの消光分子で標識される。フルオロフォアと消光物質との間の近接は，蛍光色素の蛍光を阻害する。しかし，ＰＣＲ反応のプライマー伸長段階中に，Ｔａｑポリメラーゼが示す５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により，既に鋳型にアニールされたプローブ部分を分解し，プローブから蛍光色素を解離する。蛍光色素が消光物質に近接していないことで，消光効果が減少し，蛍光色素によって生じる蛍光シグナルが増加し，検出されることになる。
【００６９】
本発明のある態様では，ポリメラーゼ連鎖反応は，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４又はその相補鎖に示される１８個から２８個の核酸残基を含む核酸配列を有する核酸プローブの使用を含む。
【００７０】
【化１４】
2013514076.tif 000015
この配列は，上記で定義される最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換によりさらに変異させてもよい。
【００７１】
好ましくは，核酸プローブは以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示される核酸配列を有する。
【００７２】
【化１５】
2013514076.tif 000016
【００７３】
ある態様では，核酸プローブは，例えば蛍光的に，放射性的に，酵素的に標識されてもよく，最も好ましくは電気化学的活性標識で標識されてもよい。本明細書に開示されている電気化学的活性標識が特に好ましい。
【００７４】
本発明の第２の側面では，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５から選択される１７個から３４個（例えば，２４個から３４個）の連続するヌクレオチド残基を含む核酸配列を有するフォワードＰＣＲプライマーが提供される。
【００７５】
【化１６】
2013514076.tif 000017
この配列は，上記で定義されるように必要に応じて，最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換によりさらに変異させてもよい。
【００７６】
ある態様では，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２から選択される１７個から２７個の連続するヌクレオチド残基を含む核酸配列を有するフォワードＰＣＲプライマーが提供される。
【００７７】
【化１７】
2013514076.tif 000018
この配列は，上記で定義されるように必要に応じて，最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換によりさらに変異させてもよい。
【００７８】
ある態様では，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０から選択される２４個から３４個の連続するヌクレオチド残基を含む核酸配列を有するフォワードＰＣＲプライマーが提供される。
【００７９】
【化１８】
2013514076.tif 000019
この配列は，上記で定義されるように必要に応じて，最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換によりさらに変異させてもよい。
【００８０】
ある態様では，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１から選択される２４個から２４個の連続するヌクレオチド残基を含む核酸配列を有するフォワードＰＣＲプライマーが提供される。
【００８１】
【化１９】
2013514076.tif 000020
この配列は，上記で定義されるように必要に応じて，最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換によりさらに変異させてもよい。
【００８２】
ある態様では，核酸配列は，１８個から２６個，１９個から２５個，２０個から２４個，２１個から２３個，最も好ましくは２２個の残基，又は２５個から３３個，２６個から３２個，２７個から３１個，２８個から３０個，最も好ましくは２９個の残基を含む。ある好ましい態様では，フォワードＰＣＲプライマーは，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８，又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示される配列を有する核酸を含む。
【００８３】
【化２０】
2013514076.tif 000021
【００８４】
本発明の第３の側面では，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６から選択される１５個から３１個（例えば２１個から３１個）の連続するヌクレオチド残基を含む核酸配列を有するリバースＰＣＲプライマーが提供される。
【００８５】
【化２１】
2013514076.tif 000022
この配列は，上記で定義されるように必要に応じて，最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換によりさらに変異させてもよい。
【００８６】
ある態様では，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３から選択される１５個から２５個の連続するヌクレオチド残基を含む核酸配列を有するリバースＰＣＲプライマーが提供される。
【００８７】
【化２２】
2013514076.tif 000023
この配列は，上記で定義されるように必要に応じて，最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換によりさらに変異させてもよい。
【００８８】
ある態様では，核酸配列は，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６から選択される２２個から３０個の連続するヌクレオチド残基を含む。より好ましくは２３個から２９個，より好ましくは２４個から２８個，より好ましくは２５個から２７個，最も好ましくは２６個の連続するヌクレオチド残基を含む。
【００８９】
ある態様では，核酸配列は，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３から選択される１６個から２４個の連続するヌクレオチド残基を含む。より好ましくは１７個から２３個，より好ましくは１８個から２２個，より好ましくは１９個から２１個，最も好ましくは２０個の連続するヌクレオチド残基を含む。
【００９０】
ある態様では，残基付加，残基欠失，及び残基置換の数と種類は，フォワードＰＣＲプライマーに関して上記で定義されるとおりでもよい。
【００９１】
ある好ましい態様では，リバースＰＣＲプライマーは，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示される核酸配列を有する。
【００９２】
【化２３】
2013514076.tif 000024
【００９３】
本発明の第４の側面では，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４又はその相補鎖に示される１８個から２８個の核酸残基を含む核酸配列を有する核酸プローブが提供される。
【００９４】
【化２４】
2013514076.tif 000025
この配列は，最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換によりさらに変異させてもよい。
【００９５】
残基付加，残基欠失，残基置換の数と種類は，本発明のプライマーに関して上記で定義されるとおりでもよい。ある好ましい態様の核酸プローブは，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４から選択される１８個から２７個の残基，１９個から２６個の残基，２０個から２５個の残基，２１個から２４個の残基，２２個から２３個の残基，最も好ましくは２３個の残基を含む。
【００９６】
ある好ましい態様では，本発明の核酸プローブは以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で示される核酸配列を有する。
【００９７】
【化２５】
2013514076.tif 000026
【００９８】
本発明の第５の側面では，本発明のフォワードＰＣＲプライマー及びリバースＰＣＲプライマーを含むＰＣＲ成分が提供される。ある好ましい態様では，ＰＧＲ成分はさらに本発明の核酸プローブを含む。
【００９９】
内部コントロール（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）
一般的に，ＰＣＲアッセイ又は同様のアッセイの内部コントロールは，一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドで構成される。これらは簡単に製造することができ，サンプルキャリア上に固定化できるか又はＰＣＲ反応の成分に付加することができる。しかしながら，本発明の方法は，基本小体又は臨床的に由来するクラミジア含有物質を精製し，それらからゲノムＤＮＡを精製することを含むサンプル調製ステップから行ってもよい。複数の市販のＤＮＡ精製方法及びキット，例えばＰｒｏｍｅｇａ社のＷｉｚａｒｄシステムが利用できる。これらの細菌融解及びＤＮＡの精製方法は，カオトロピック塩を含むＤＮＡ溶液の使用を含み，例えばシリカベースのメンブレンに結合させ，その後，残融解物を除去し，狭雑物を洗浄する。精製された細菌ゲノムＤＮＡは，その後下流検出アッセイ（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ），例えば本発明の第１の側面のアッセイで使用するメンブレンから回収される。このような精製方法では，短い一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドベースの内部コントロール配列は，ほとんど同時精製されない。例えば，Ｐｒｏｍｅｇａ社のＷｉｚａｒｄキットの精製プロトコルでは，５０ｋｂサイズのカットオフを有することを明言している。そのため発明者は，サンプルに含まれるクラミジアゲノムＤＮＡと同時精製する内部コントロールを提供することが有利であることに気付いた。可能な解決策は，クラミジアからゲノムＤＮＡを単離するのに必要な単離条件で同様に融解する別の細菌種由来のゲノムＤＮＡを内部コントロールとして使用することである。安全性の考慮により，内部コントロールの原料は，理想的には非病原性細菌に由来する必要がある。また，それは通常，容易にヒトから発見すべきではなく，研究室で容易に培養する必要がある。本発明は内部コントロールとして，ペクトバクテリウム・アトロセプティカム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）に由来するゲノムＤＮＡの使用を含む。これは，Ｐ．アトロセプティカムが培養可能であり，広く利用でき，容易にＤＮＡを単離でき，クラミジアに由来するそれと同時精製されるためである。それは１つだけ染色体を持っており，固有の種を表わす多くの遺伝子を持っている。さらに，この種（これは温帯地域でジャガイモの軟腐病と黒脚病を引き起こす植物病原体である）がヒトに感染したという報告例はなく，解剖学的部位，又は臨床サンプルで発見されることがほとんどないことを意味している。誤解を避けるために，ペクトバクテリウム・アトロセプティカム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）は旧名，エルウィニア・カロトヴォラ・サブスピーシーズ・アトロセプティカ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ  ｓｕｂｓｐ．ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃａ）であることに留意すべきである。本発明の第５の側面のある好ましい態様では，ＰＣＲ成分は，内部ポジティブコントロールとして使用するペクトバクテリウム・アトロセプティカム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）由来のゲノムＤＮＡをさらに含む。好ましくは，それは菌株ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６７２である。
【０１００】
本発明のＰＣＲ成分は，好ましくは第２のフォワードＰＣＲプライマーと第２のリバースＰＣＲプライマーを含み，前記プライマーは，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８又はその相補鎖の核酸配列内に存在する核酸配列とハイブリダイズするように設計されている。
【０１０１】
【化２６】
2013514076.tif 000027
この配列は，本発明の第１又は第２の側面のＰＣＲプライマーに関して上記した数と種類について定義されるように，最大５個以上の残基付加，残基欠失，又は残基置換によりさらに変異させてもよい。
【０１０２】
第２のフォワードＰＣＲプライマーは，好ましくは以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９から選択される１３個から２３個の連続する核酸残基を含む核酸配列を有する。
【０１０３】
【化２７】
2013514076.tif 000028
【０１０４】
第２のリバースＰＣＲプライマーは，好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０から選択される１５個から２５個の連続する核酸残基を含む核酸配列を有する。
【０１０５】
【化２８】
2013514076.tif 000029
【０１０６】
あるいは，前記第２のフォワードＰＣＲプライマーは，上記で定義されるリバースプライマーの相補鎖である核酸配列を有し，前記第２のリバースＰＣＲプライマーは，上記で定義されるフォワードプライマーの相補鎖である核酸配列を有する。この配列は，本発明の第１又は第２の側面のプライマーに関して数や種類が定義されるように，最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換で変異させてもよい。第２のフォワードＰＣＲプライマーは，好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９から選択される１４個から２２個，より好ましくは１５個から２１個，より好ましくは１６個から２０個，より好ましくは１７個から１９個，最も好ましくは１８個の連続する核酸残基を含む。
【０１０７】
第２のリバースＰＣＲプライマーは，好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０から選択される１６個から２４個，より好ましくは１７個から２３個，より好ましくは１８個から２２個，より好ましくは１９個から２１個，最も好ましくは２０個の連続する核酸残基を含む。
【０１０８】
ある好ましい態様では，第２のフォワードＰＣＲプライマーは，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示される核酸配列を有し，第２のリバースＰＣＲプライマーは，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に示される配列を有する。
【０１０９】
【化２９】
2013514076.tif 000030
【０１１０】
ある態様のＰＣＲ成分は，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３又はその相補鎖に示される１８個から２８個，より好ましくは１９個から２７個，より好ましくは２０個から２６個，より好ましくは２１個から２５個，より好ましくは２２個から２４個，最も好ましくは２３個の核酸残基を含む核酸配列を有する第２の核酸プローブを含む。
【０１１１】
【化３０】
2013514076.tif 000031
この配列は，本発明の第３の側面の第１の核酸プローブに関して上記種類及び数が定義されるように，最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換で変異させてもよい。
【０１１２】
ある好ましい態様では，核酸プローブは，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４で示される核酸配列を有する。
【０１１３】
【化３１】
2013514076.tif 000032
【０１１４】
また本発明は，クラミジア・トラコマチスを検出する産物や方法を欠く場合の，ペクトバクテリウム・アトロセプティカム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）を含む内部コントロールに関連する産物や方法にも関連する（すなわち，本発明は，クラミジア・トラコマチス由来の核酸以外の核酸を検出するために使用される内部コントロールをも提供する）。特に，本発明は，ペクトバクテリウム・アトロセプティカムのゲノムＤＮＡ内に存在する標的核酸配列とハイブリダイズするように設計されたフォワードＰＣＲプライマーと第２のＰＣＲプライマーを意図している。好ましくは，これらのプライマーは，以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８又はその相補鎖の核酸配列内に存在する標的核酸配列とハイブリダイズするように設計されている。
【０１１５】
【化３２】
2013514076.tif 000033
この配列は，本明細書の他の部分で定義されているように，最大５個の残基付加，残基欠失，又は残基置換によりさらに変異させてもよい。
【０１１６】
第２のフォワードＰＣＲプライマーと第２のリバースＰＣＲプライマーのさらなる特徴は，好ましくは本発明の他の側面に関して本明細書で定義されているとおりでもよい。また，本発明は，本発明の他の側面に関して定義されている特徴を有するペクトバクテリウム・アトロセプティカム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）の内部ポジティブコントロールを検出する核酸プローブも意図している。さらに，本発明は，ペクトバクテリウム・アトロセプティカムのプライマーと任意のプローブの使用，及び本発明の他の方法に関して本明細書で開示されたいずれかの特徴を組み込むことを含む，ペクトバクテリウム・アトロセプティカムを含む内部ポジティブコントロールからのシグナルを検出する方法も意図している。ペクトバクテリウム・アトロセプティカムを含む内部ポジティブコントロールからのシグナルを検出する方法は，本明細書で定義されるように，好ましくはカオトロピック塩及び必要に応じてシリカベースのメンブレンを用いて全てのペクトバクテリウム・アトロセプティカム細菌細胞を融解することを含む，ペクトバクテリウム・アトロセプティカム由来のゲノムＤＮＡを取得する方法から始める。
【０１１７】
キット
本発明の第６の側面では，本発明の第５の側面のＰＣＲ成分，又は第８，第９もしくは第１０の側面のＰＣＲプライマーもしくはＰＣＲプローブ，及び本発明の第１の側面の方法を実施するための説明書を含むキットが提供される。キットは，例えば，サンプル容器，パッケージング，ＰＣＲ酵素，増幅前駆体，サンプルチューブ又は検出器具などのさらなる構成要素を含んでもよい。
【０１１８】
内部ポジティブコントロール
ある好ましい態様では，本発明の第５の側面のＰＣＲ成分は，内部ポジティブコントロールとして使用するペクトバクテリウム・アトロセプティカム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）に由来するゲノムＤＮＡをさらに含む。検出方法は，本発明の他の側面に関して本明細書に記載されているとおりでもよく，又は本発明の他の側面に関して本明細書に記載の化合物もしくは産物の使用を含んでもよい。
【０１１９】
本発明の第７の側面では，ペクトバクテリウム・アトロセプティカム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）の染色体に含まれる核酸配列の配列特異的検出を含む，ペクトバクテリウム・アトロセプティカムに由来する遺伝物質をサンプル中で検出する方法が提供される。前記方法は，本発明の他の側面に関して開示されるいずれかの特徴を組み込んでもよく，必要に応じてサンプルからペクトバクテリウム・アトロセプティカムのゲノムＤＮＡ（必要に応じて内部コントロールとしてサンプルに注入される）を抽出することをさらに含んでもよい。前記抽出は，関係のある第２の微生物（例えば病原性微生物）からのゲノムＤＮＡの抽出に付随して行われてもよい。
【０１２０】
本発明の第８の側面；第９の側面；及び第１０の側面では，それぞれ，本発明の第５の側面の“第２のフォワードＰＣＲプライマー”として定義されるフォワードＰＣＲプライマーが提供され；本発明の第５の側面の“第２のリバースＰＣＲプライマー”として定義されるリバースＰＣＲプライマーが提供され；本発明の第５の側面の“第２のＰＣＲプローブ”として定義されるＰＣＲプローブが提供される。
【０１２１】
また，本発明は，ＰＣＲ反応の１つ以上のさらなる成分を組み合わせた，本発明の第８，第９又は第１０の側面のフォワードＰＣＲプライマー，リバースＰＣＲプライマー又はＰＣＲプローブのいずれか１つ以上を含むＰＣＲ成分を提供する。
【０１２２】
本発明の第１の側面から第６の側面に関連して記載される好ましい又は任意の特徴は，必要に応じて本発明の第７の側面から第１０の側面に組み込んでもよく，また，本発明の他の側面に組み込んでもよい。
【０１２３】
標識
プローブ及び／又はプライマーは，検出を支援するために標識に結合させてもよい。その標識は，放射性，酵素活性，蛍光活性又は電気化学的活性でもよい。クラミジア・トラコマチス由来の核酸を検出するための化合物及び内部ポジティブコントロール由来の核酸を検出するための化合物が存在する態様，又は２つの核酸を同時に検出する方法が存在する態様では，内部ポジティブコントロールの検出及びクラミジア・トラコマチスに由来する核酸の検出に使用される標識は，好ましくは互いに区別することができ，例えば，それらは異なる蛍光色素であってもよく，電気化学的に区別可能な活性を提供する異なる電気化学的に活性な薬剤又は電気化学的な標識であってもよい。
【０１２４】
本発明は，電気化学的に標識したプローブ及び／又はプライマーの使用が特に適している。特に電気化学的標識は，金属−炭素環のπ錯体（ｍｅｔａｌｌｏ−ｃａｒｂｏｃｙｃｌｉｃ  ｐｉ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ），つまり部分的又は完全に非局在化したπ電子を有する有機錯体を含むものであってもよい。適当なマーカーは，これらの２つの炭素環が平行するサンドイッチ化合物，さらにベント型サンドイッチ化合物（ｂｅｎｔ  ｓａｎｄｗｉｃｈｅｓ）（角度型化合物（ａｎｇｕｌａｒ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ））とモノシクロペンタジエニル（ｍｏｎｏｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｄｉｅｎｙｌｓ）を含む。好ましくは，電気化学的に活性なマーカーはメタロセニル標識であり，より好ましくはフェロセニル標識である。
【０１２５】
本発明のプローブに使用されるフェロセニル標識及びメタロセニル標識は，Ｎ置換フェロセン又はメタロセンカルボキサミドが有益である。標識分子部分（ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）を構成するフェロセン環又はメタロセン環は，置換されていなくてもよい。必要に応じて，フェロセン環又はメタロセン環は１個以上の置換基で置換されてもよく，この機能及び位置はフェロセン分子又はメタロセン分子（ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ  ｏｒ  ｍｅｔａｌｌｏｃｅｎｅ  ｍｏｉｅｔｙ）のレドックス特性に望ましい影響を及ぼすように選択される。フェロセン環又はメタロセン環は，標識の電気化学的感度を本質的に減少させない別の環状置換基で，付加的又は代替的に置換されてもよい。フェロセンカルボキシサミド基又はメタロセンカルボキサミド基は，カルボキサミドの窒素を介してヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドと結合していてもよい。ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドへの結合は，好ましくはリン酸基又はヌクレオチド塩基を介する。結合方法は共に，いずれかのヌクレオチドを介して，標識をオリゴヌクレオチドの長さに沿って付着させることができる。しかし，結合がリン酸基を介している場合は，そのような結合がオリゴヌクレオチドのワトソン・クリックハイブリダイゼーションを立体的に妨げることや，ヌクレアーゼ活性に影響を及ぼすことの可能性を最小限にするために，３’末端又は５’末端リン酸基を介することが望ましい。ワトソン・クリックの塩基対合を伴わない塩基領域を介する結合は，このような塩基対合の分裂が起こりにくいことが予測される。したがって，塩基を介する結合は，末端以外のヌクレオチド部位で標識することがより適している。標識されたオリゴヌクレオチドは，オリゴヌクレオチドと標識分子部分の間にリンカー分子分子（ｌｉｎｋｅｒ  ｍｏｉｅｔｙ）を有してもよい。好ましくは，標識されたオリゴヌクレオチドは，リンカー分子でオリゴヌクレオチドに結合したフェロセニル標識を有している
【０１２６】
任意の適当なリンカー分子を使用してもよい。適当なリンカー分子は，直鎖状又は分岐鎖状でかつ飽和又は不飽和の脂肪族炭素鎖を含んでもよい。リンカー分子は，４個から２０個，好ましくは６個から１６個，より好ましくは８個から１４個，特に１２個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状の脂肪族鎖が有利である。アルキレン鎖は，任意の置換基で置換されてもよく，あるいは任意の原子又は分子部分（ｍｏｉｅｔｙ）により中断されてもよいが，これらの任意の置換基，原子及び分子部分が，標識の電気化学的感度を本質的に低下させないことを条件とする。本発明で使用可能なフェロセニル標識の具体例は，式Ｉから式ＩＩＩがある。式Ｉａから式ＩＩＩａの分子は，対応するフェロセニル標識で標識されたオリゴヌクレオチドである。式ＩＶはヌクレオチド塩基を介して結合できるフェロセニル標識の一例を示し，説明の都合上，式ＩＶにアミノ修飾チミン塩基が含まれている。
【０１２７】
【化３３】
2013514076.tif 000034
【０１２８】
【化３４】
2013514076.tif 000035
【０１２９】
【化３５】
2013514076.tif 000036
【０１３０】
【化３６】
2013514076.tif 000037
【０１３１】
【化３７】
2013514076.tif 000038
【０１３２】
【化３８】
2013514076.tif 000039
【０１３３】
【化３９】
2013514076.tif 000040
【０１３４】
【化４０】
2013514076.tif 000041
【０１３５】
フェロセン標識プローブは，任意の適当な方法で調製されてもよい。例として，オリゴヌクレオチドは末端アミノ基を有する遊離基の導入により修飾されたヌクレオチドでもよい。このようなアミノ修飾ヌクレオチドの具体例は，式Ｖの修飾ヌクレオチドである。そして，アミノ修飾ヌクレオチドとフェロセンカルボン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（式ＶＩ）の反応によりフェロセンが取り込まれ，フェロセン標識されたオリゴヌクレオチドが得られる。
【０１３６】
【化４１】
2013514076.tif 000042
【０１３７】
【化４２】
2013514076.tif 000043
【０１３８】
代替的方法では，フェロセン標識されたオリゴヌクレオチドは，オリゴヌクレオチドの固相合成の過程でフェロセン部分を付加することにより調製されてもよい。フェロセン標識は，以下に説明する２つの一般的方法により，固相合成中にオリゴヌクレオチドに導入することができる。初めに，オリゴヌクレオチドの３’末端でのオリゴヌクレオチドの付加は，適当な樹脂を用いる必要がある。そのような樹脂は，フェロセン誘導体で標識される。オリゴヌクレオチド５’末端又は内部部位でのフェロセンの付加は，固相支持体に結合したオリゴヌクレオチドとカップリングするのに適するカップリング試薬，例えば式ＩＸ又は式Ｘで示されるような，フェロセニル誘導ホスホラミダイトを用いる必要がある。
【０１３９】
【化４３】
2013514076.tif 000044
【０１４０】
【化４４】
2013514076.tif 000045
【０１４１】
ある具体的な態様では，電気化学的に活性な標識は以下の化合物であってもよい。
【０１４２】
【化４５】
2013514076.tif 000046
【０１４３】
式中，
Ｍｃは，メタロセニル基であって，各環は独立して置換されていても置換されていなくてもよく，
前記メタロセニル基は，鉄，クロム，コバルト，オスミウム，ルテニウム，ニッケル及びチタンからなる群から選択される金属イオンＭを含み，
Ｒ’は，Ｈ又は低級アルキルであり，
Ｘは，ＮＲ’又はＯのいずれかであり，
Ａｒは，置換又は非置換のアリール基であり，
ｎは，０又は１であり，
Ｌは，リンカー分子であり，
ｍは，０又は１であり，
Ｒは，標識される分子部分（ｍｏｉｅｔｙ）を示している。
【０１４４】
Ｍｃ基は，低級アルキル基（例えば，Ｃ１からＣ４アルキル基），もしくはヒドロキシ基，ハロ基，シアノ基，オキソ基，アミノ基，エステル基，アミド基，他のメタロセン基で置換された低級アルキル基，又は低級アルケニル基，もしくはヒドロキシ基，ハロ基，シアノ基，オキソ基，アミノ基，エステル基，アミド基，他のメタロセン基で置換された低級アルケニル基，又はアリール基，もしくはヒドロキシ基，ハロ基，シアノ基，オキソ基，アミノ基，エステル基，アミド基，他のメタロセン基で置換されたアリール基から選択される１つ以上の基で置換されてもよい。前記他のメタロセン基は，本発明の分子中のＭｃ基の総数が好ましくは４つを超えないことを除いて，Ｍｃ基と同様の方法で置換されてもよい。好ましくは，Ｍｃ基は置換されない。
【０１４５】
好ましくは，Ｍは，鉄，オスミウム，又はルテニウムから選択されるイオンである。最も好ましくは，Ｍは鉄イオンである。Ｍが鉄イオンである場合，Ｍｃはフェロセンである。
【０１４６】
好ましくは，低級アルキル基はＣ１からＣ４のアルキル基である。好ましくは，Ｒ’は，Ｈである。各Ｒ’は，他のＲ’とは別個の固有性を有する。
【０１４７】
好ましくは，ＸはＮＨである。
【０１４８】
Ａｒ基は，低級アルキル基（例えば，Ｃ１〜Ｃ４アルキル基），もしくはヒドロキシ基，ハロ基，シアノ基，オキソ基，アミノ基，エステル基，アミド基で置換された低級アルキル基，又は低級アルケニル基，もしくはヒドロキシ基，ハロ基，シアノ基，オキソ基，アミノ基，エステル基，アミド基で置換された低級アルケニル基，又はアリール基，もしくはヒドロキシ基，ハロ基，シアノ基，オキソ基，アミノ基，エステル基，アミド基で置換されたアリール基から選択される１つ以上の置換基で置換されてもよい。好ましくは，Ａｒ基は置換されない。
【０１４９】
好ましくは，ｎ＝１であり，ｍ＝１である。
【０１５０】
適当なリンカー分子Ｌは直鎖状又は分岐鎖状でかつ，飽和又は不飽和の脂肪族鎖を含んでもよい。リンカー分子は，４個から２０個，好ましくは６個から１６個，より好ましくは８個から１４個，特に１２個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐鎖状の脂肪族鎖であることが有利である。アルキレン鎖は，任意の置換基で置換されてもよく，任意の原子又は基（ｍｏｉｅｔｙ）で中断されてもよいが，これらの任意の置換基，原子及び分子部分は，標識の電気化学的感度を本質的に低下させないことを条件とする。
【０１５１】
本発明の化合物は複数のメタロセン基を含む。本発明の化合物において，メタロセン基は，他の電気化学的に活性なマーカーで置換されてもよい。本化合物は，電気化学的に活性であるか，又は部分開裂後に電気化学的に活性になるものでもよい。
【０１５２】
好ましくは，標識される分子部分は，アミノ酸，ヌクレオチド，オリゴヌクレオチド，ポリヌクレオチド，ヌクレオシド，糖質，炭水化物，ペプチド，タンパク質，又はこれらの分子のいずれかの誘導体である。好ましい態様において，Ｒはヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドである。ヌクレオチドは，アデノシン，チミジン，グアノシン，シチジン，又はウリジンから選択されてもよい。好ましくは，ヌクレオチドは，ヌクレオチドのリボース基又はデオキシリボース基に付着する基を介して，例えば，２’位，３’位，５’位に付着させる。最も好ましくは，ヌクレオチドは，３’位又は５’位に，例えば，５’位に付着させる。好ましくは，２’位，３’位，又は５’位での付着は酸素原子又は窒素原子を介する。
【０１５３】
標識試薬は，直接又はリンカーを介して付着させてもよい。リンカーは，初めに標識試薬又は標識される分子に付着させてもよい。リンカーを標識される分子に最初に付着させる場合，リンカーは，例えば標識反応を支援するアミノ基又はチオール基などの基を含む。ここではアミノ基が好ましい。
【０１５４】
ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは，好ましくは３’末端又は５’末端に標識させる。オリゴヌクレオチドは，標識反応を支援するようにアミノ修飾されてもよい。アミノ修飾オリゴヌクレオチドは，標準的な方法で合成してもよく，例えば，Ｏｓｗｅｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（サウスアンプトン，ＵＫ）などから商業的に幅広く入手可能である。アミノ修飾オリゴヌクレオチドは，リンカーモチーフと組み合わせてもよく，例えば，５’アミノへキシル基もしくは３’アミノへキシル基，又は５’−Ｃ１２アミノ基の付加により修飾されてもよい。標識される分子は好ましくはリンカーを含む。
【０１５５】
オリゴヌクレオチドの場合，分子のオリゴヌクレオチド部分の配列は，分子が相補的な標的配列とハイブリダイズできるようなものであることが好ましく，したがって，例えば本明細書に開示される核酸の検出法又は定量方法（ｑｕａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）の１つである分子生物学的手法においてプローブとして使用できることが好ましい。
【０１５６】
本発明の標識された生物学的分子は，消化又は非消化のいずれかの状態で電気化学的に活性である。理想的には，電気化学的な活性の程度は消化の程度に応じて変化する。
【０１５７】
式ＶＩＩＩは，新規な電気化学的に活性なマーカーが付着したオリゴヌクレオチドのありうる態様を図示したものである。式ＶＩＩＩの分子は，５’−アミノへキシル修飾オリゴヌクレオチドと式ＶＩＩで示される分子との反応で得ることができる。
【０１５８】
【化４６】
2013514076.tif 000047
【０１５９】
【化４７】
2013514076.tif 000048
【０１６０】
４−（３’−フェロセニルレイド）−１−安息香酸のＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステルの詳細と，オリゴヌクレオチドを標識するための前記化合物の使用の詳細は，実施例７及び実施例８に提供されている。しかし，当業者には，そのような標識がオリゴヌクレオチドの適当な位置に付着し，その付着がオリゴヌクレオチドの５’末端に限定されないことが理解できるだろう。上記の電気化学的な標識の合成及び付着の詳細に関しては，ＥＰ１４８１０８３を参照されたい。これは，参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６１】
短プライマー及び短プローブの使用
ハイブリダイゼーションに関する，本発明のすべての側面のある態様において，特にプライマーのアニーリング温度を上昇させるステップがとられる場合には，プライマー及びプローブは上記で特定したのものよりも短くてもよい（出願人は特に上記した長さ及び範囲よりも短い長さの１，２，３，４，又は５個のヌクレオチド残基を意図している）。
【０１６２】
短プライマー及び短プローブの使用は，小溝結合剤分子部分（ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ  ｂｉｎｄｅｒ  ｍｏｉｅｔｉｅｓ）及びＬＮＡ（ｌｏｃｋ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）（固定化核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）又はＬＮＡｓとしても知られている）を利用することによって容易になり，プライマー及びプローブの熱安定性を向上させ，あるいはプライマー又はプローブのアニーリング温度を上昇させる。上記で開示される全ての側面と，また上記に開示されるようなプローブ及びプライマーと組み合わせて，本発明の一部としてそのような修飾を使用することを意図しているが，上記で特定されるものから５残基短縮したオリゴヌクレオチドの長さと範囲とを組み合わせることも意図している。すべての側面において本発明は短プライマー及び短プローブの使用を意図している。これは，小溝結合剤分子部分及び／又はＬＮＡを本明細書に記載のプライマー及びプローブと併用することで熱安定性を容易に向上させる。本明細書に記載のプライマー及びプローブは，小溝結合剤分子部分及び／又はＬＮＡの使用により熱安定性を向上させる専用のプライマー及びプローブほど，小溝結合剤分子部分及び／又はＬＮＡの使用により熱安定性を向上させない。
【０１６３】
固定化核酸（Ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）
ＬＮＡの最近の評論についてはＤｅｖｏｒ  （２００５）  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｂｕｌｌｅｔｉｎ  “Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  （ＬＮＡｓ）”及びそれらの参考文献を参照されたい（これらは参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１６４】
ＬＮＡは，１つ以上の修飾ＲＮＡ又はＤＮＡヌクレオチド残基を（通常のＤＮＡ又はＲＮＡ残基と共に）組み込んだ核酸である。修飾残基における過剰な共有結合性架橋は，２’炭素と３’炭素をつなぎ，通常Ａ型ＲＮＡ及びＤＮＡに見られるような，３’−ｅｎｄｏの立体配座にリボース糖を“固定（ｌｏｃｋｓ）”する。
【０１６５】
用語ＬＮＡは，一部又はすべての残基位置で固定化残基を組み込んだすべての核酸が含まれる。固定化は，糖部分（ｓｕｇａｒ  ｍｏｉｅｔｙ）の２’炭素と３’炭素をつなぐ任意の化学的架橋によって達成してもよい。好ましくは，固定化は２’−Ｏ，４’−Ｃメチレン結合により達成される。
【０１６６】
ＬＮＡｓは，対応するＤＮＡ又はＲＮＡオリゴマーと比較して融解温度を約５℃上昇させても，向上した熱安定性を示す。融解温度を上昇させるため，ＬＮＡプライマー及びプローブがヘアピン構造を形成し，効率的なＰＣＲ反応に悪影響を及ぼすリスクが増大する。したがって，優れたプライマー及びプローブの設計は，より一層不可欠となり，本願における，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５，６，７，１１，１２，及び１４のもので，必要に応じて各末端から１，２，３，４，又は５個の残基を短縮させたものに対応するＬＮＡプライマー及びプローブが，特に好ましい。
【０１６７】
ＬＮＡｓは容易に調製することができ，複数の業者が市販している。
【０１６８】
小溝結合剤分子部分（Ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｉｅｓ；ＭＧＢ）
本発明は，そのすべての側面において，ＭＧＢに結合した核酸プローブ及びプライマー（ＬＮＡプローブ及びプライマーを含む）に関連している。
【０１６９】
ＭＧＢは，プローブ又はプライマーと標的の間で形成する二重らせんの副溝に結合する等軸晶構造の基である。それらは二本鎖領域を安定させ，融解温度を上昇させ，プローブ／プライマーの特性を向上させ，より短いプローブ／プライマーの使用を可能にする。ＭＧＢと結合方法の詳細については，Ｋａｔｙａｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ２８（２）：６５５−６６１，及びその中の参考文献を参照されたい。これらは参照により本明細書に組み込まれる。小溝結合剤分子部分は容易に調製し，プライマー及びプローブに付着させることができ，複数の業者が市販している。
【０１７０】
サンプル
本発明の様々な側面において，サンプルは組織及び体液などの臨床サンプルを含み，血漿，血清，分泌物，精液，精漿，涙液や唾液に限られない。また，用語“サンプル”は，臨床サンプルの誘導体を含み，例えば，ろ過，凝固，消毒，放射線照射又は分離したサンプル，及び使用した医療器具又は被験者にあらかじめ接触した包帯材も含む。前記被験者は，好ましくはヒトである。
【実施例】
【０１７１】
本発明を以下の非限定的な実施例を挙げて説明する。
【実施例１】
【０１７２】
実施例１  ＰＣＲプライマーの選択
染色体のアンプリコン及びプライマーのＢｌａｓｔｎ解析
クラミジア・トラコマチスの１８個の染色体アンプリコンを同定するＢｌａｓｔｎ解析を行った。解析したすべてのアンプリコンは，染色体アンプリコン１８がクラミジア・ムリダルムに類似性を示したのを除いて，クラミジア・トラコマチス以外少しもヒットを示さなかった。プライマーセットは，他の種といくつかの類似性を示した。これはそのような短い配列を用いて類似性探索を行ったためと予想される。しかし，排他性テストを実施すればこれが重要であるか否かが明らかになる。
【実施例２】
【０１７３】
実施例２  対称ＰＣＲを用いたプライマーの初期テスト
プラスミド標的
プラスミドのアンプリコン（増幅産物）１，３，４，５，６，７及び８用のプライマーセットを得た。これらのプライマーセットをスクリーニングするために，表１のそれぞれのプライマーについて，反応あたり１００００ＥＢｓを用いる対称ＰＣＲ反応を３重にセットアップした。      
【０１７４】
［表１］
対称ＰＣＲ反応のセットアップ
2013514076.tif 000049
【０１７５】
３重のそれぞれのプライマーセットにネガティブ反応を含ませた。ＰＣＲの反応条件は以下のとおりであった。
１，９４°Ｃを１分
２，９４℃を３０秒
３，５８℃を３０秒
４，７２℃を１分
５，手順２から４を３９サイクル繰り返す
６，７２℃を３分
７，１６°Ｃで保持
【０１７６】
ＰＣＲに続いて，それぞれの産物の１０μＬを，Ｓａｆｅｖｉｅｗで染色した２％アガロースゲルに注入した。電気泳動し，ＵＶ光によりゲルを可視化した後，ゲル上に存在するバンドによって示されるように，全てのプライマーセットが，テストした条件下で標的領域を増幅させることが判明した。プラスミドアンプリコン３，５及び７に関する３つのプライマーセットが，最高のバンド強度を与えた。ネガティブ反応はバンドを示さなかった。
【０１７７】
染色体標的
アンプリコン１，５，９，１７及び１８用のプライマーセットを得た。これらのプライマーセットをスクリーニングするために，上記表１のそれぞれのプライマーについて，反応あたり１００００ＥＢｓを用いる対称ＰＣＲ反応を３重にセットアップした。それぞれのプライマーセットについて，ネガティブ反応を３重に含めた。ＰＣＲの反応条件は上記のとおりであった。
【０１７８】
ＰＣＲに続いて，それぞれの産物の１０μＬを，Ｓａｆｅｖｉｅｗで染色した２％アガロースゲルに注入した。電気泳動し，ＵＶ光によりゲルを可視化した後，ゲル上に存在するバンドによって示されるように，全てのプライマーセットが，テストした条件下で標的領域を増幅させることが判明した。アンプリコン９及び１９の染色体プライマーセットが最高のバンド強度を与え，残りのセットはやや弱い強度を示し，染色体アンプリコン１７はその他のものよりもわずかに優れていた。
【実施例３】
【０１７９】
実施例３  非対称ＰＣＲ及び電気化学検出を用いた検出限界（ＬｏＤ）テスト
プラスミド標的
非対称ＰＣＲとそれに続く適切なアンプリコン特異的プローブの付加，Ｔ７エキソヌクレアーゼによる消化，及び電気化学的な終点検出にプラスミドのプライマーセット３，５，７を使用して，クラミジア・トラコマチスＥＢｓのＬＯＤを測定する実験を行った。下記の表２に従って，反応あたり１０倍に希釈した１０００００ＥＢｓから１ＥＢｓを用いる非対称ＰＣＲ反応を，それぞれのプライマーについて３重にセットアップした。
【０１８０】
［表２］
非対称ＰＣＲ反応のセットアップ
2013514076.tif 000050
【０１８１】
３重のそれぞれのプライマーセットにネガティブ反応を含ませた。ＰＣＲ反応条件は実施例１で述べたとおりである。
【０１８２】
ＰＣＲに続いて，２０μＬの反応液を，下記の表３の５μＬのマスターミックス（ｍａｓｔｅｒｍｉｘ）に加えた。
【０１８３】
［表３］
電気化学的検出マスターミックス
2013514076.tif 000051
【０１８４】
反応は３７℃で２０分間インキュベートした。インキュベーション後，２５μＬのすべてを，以下のＡｕｔｏｌａｂパラメータ（Ａｕｔｏｌａｂ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）を用いてボルタンメトリーで測定した。
前処理  条件付け電位（Ｖ）：０，持続時間：０，析出電位：０，持続時間：０，平衡時間：０，
測定  測定後の細胞：Ｘ，変調時間（＞＝０．００２５）：０．０４，間隔時間（＞＝０．１０５）：０．１，
電位  初期：−０．１，終期：０．５，ステップ：０．００３，振幅変調：０．０４９９５，待機電位（Ｖ）：０，
前処理  しきい値での停止平衡（Ｓｔｏｐ  ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ）：なし，平衡しきい値（Ａ）：０．０５，
その他  スキャン数：１
【０１８５】
それぞれのケースで，１５０から２５０ｍＶのピーク高さを記録した。
【０１８６】
プラスミドアンプリコン３，５，及び７に関して得られた電気化学的データは，それぞれ図１ａ，図１ｂ，及び図１ｃに示されている。エラーバーはＳＤ（ｎ＝３）を示す。
【０１８７】
得られたネガティブ値は“ピークなし（ｎｏ  ｐｅａｋ）”の陰性（ｎｅｇａｔｉｖｅ）であった。プラスミドアンプリコン３及び７に関して，３つとも再現性を盛って陽性を示したが，プラスミドアンプリコン５に関しては，３つの内の１つだけが陽性を示した。したがって，この段階でプラスミドアンプリコン５を除去し，上記のように再度３重にプラスミドアンプリコン３及び７の実験を繰り返した。これらの結果は，上記で得られたものに非常に類似していた。
【０１８８】
プラスミドアンプリコン７は持続的なピーク高さを示し，プラスミドプライマーセットとして使用するのが最も適していると考えられるが，クラミドフィラ・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）についても非対称ＰＣＲ，Ｔ７エキソヌクレアーゼの消化，及び電気化学的検出による排他性の実験を行った。プラスミドアンプリコン７のプライマーセットは，クラミドフィラ・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対して陽性シグナル（平均８８．０５ｎＡ）をもたらしたため，クラミジア・トラコマチス特異的プライマーセットとして使用するには不向きであることが判明した。プラスミドアンプリコン３のプライマー及びプローブのセットは，陽性シグナルを示さなかったため，プラスミドクラミジア・トラコマチスの検出のための最有力候補として選定した。
【０１８９】
染色体標的
非対称ＰＣＲとそれに続く適切なアンプリコン特異的プローブの付加，Ｔ７エキソヌクレアーゼによる消化，及び電気化学的な終点検出で染色体アンプリコン９，１７及び１８のプライマーセットを使用した場合に，Ｃ．トラコマチスＥＢｓのＬＯＤを測定する実験を行った。上記表２に従って，反応あたり１０倍に希釈した１０００００から１ＥＢｓを用いる非対称ＰＣＲ反応を，それぞれのプライマーセットについて３重にセットアップした。ＰＣＲ後，２０μＬの反応液を，上記表３に示される５μＬのマスターミックスに加えた。反応は３７℃で２０分間インキュベートした。インキュベーション後，２５μＬのすべてを，上記のパラメータを使用してボルタンメトリーで測定した。それぞれのケースで，１５０から２５０ｍＶのピーク高さを記録した。
【０１９０】
染色体アンプリコン９，１７，及び１８に関して得られた電気化学的データはそれぞれ図２ａ，図２ｂ，及び図２ｃに示されている。エラーバーはＳＤ（ｎ＝３）を示す。データポイントは，得られたネガティブ値の平均を示している。
【０１９１】
上記で得られたデータは，テストした全てのアンプリコンについて，反応あたり１０００ＥＢｓ未満の使用まではピーク高さが減少しないことが示された。このレベルに続いて反応あたり１００ＥＢでは，染色体アンプリコン８及び１８のピーク高さは約半分に減少する。染色体アンプリコン１７については，この減少はやや小さくなっている。染色体アンプリコン９のデータは，反応あたり１０ＥＢｓでのピーク高さがネガティブサンプルに見られるものと類似していることを示している。これらのデータは，ローエンドでの差異に関して，染色体アンプリコン１７が染色体アンプリコン１８よりも優れた性能を有し，これらのアンプリコンは共に染色体のアンプリコン９よりも高い性能を有することを示している。
【０１９２】
ローエンドでの検出を向上させるために，本発明者が使用する好ましい方法の１つは，ＭｇＣｌ２の濃度を変化させることである。この実験は，反応ごとに０．５ｍＭずつ増加させた２．０ｍＭから５．０ｍＭの最終ＭｇＣｌ２濃度と，１００００のＥＢｓを使用して非対称ＰＣＲを行い，次いでプローブの付加，Ｔ７による消化及び電気化学的測定を行った。得られたデータは，５．０ｍＭの最終ＭｇＣｌ２濃度が，テストした条件下で最大のピーク高さを得ることを示した。このＭｇＣｌ２濃度がすべてのＥＢレベルにわたって適用されることを確認するために，第２のＬＯＤ実験を，５．０ｍＭのＭｇＣｌ２を用いて染色体アンプリコン１７で行った。結果は，図２ｄに示されている。エラーバーはＳＤ（ｎ＝３）を示す。データポイントは，得られたネガティブ値の平均を示している。
【０１９３】
データは，反応あたり１０００ＥＢｓで，５．０ｍＭのＭｇＣｌ２を用いてＰＣＲを行う場合，反応当たり１００００又は１０００００ＥＢｓの場合と比較して，最適な性能がもたらされることを示している。１０００ＥＢｓに次いで，１ＥＢではピークの高さは５４．９７ｎＡの平均値まで減少する。これらをもとに，染色体アンプリコン１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のプライマー及びプローブセットを，クラミジア・トラコマチス染色体標的検出の最有力候補として選定した。フォワード及びリバースプライマーとプローブの配列は，それぞれ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６，７，及び５に示されている。
【実施例４】
【０１９４】
実施例４  排他性と包括性の検証
イントロダクション
クラミジアアッセイはクラミジア・トラコマチスにのみ高い特異性を有し，他の種の細菌や他の生物とは交差反応性が見られないことが必要である。実施例１から実施例３で説明したプライマー及びプローブの設計段階で，生物情報学的に交差反応がなかったことが示されたが，実際の微生物菌株を用いて実証する必要があった。
【０１９５】
これとは反対に，このアッセイがクラミジア・トラコマチスの生殖器血清型の１５種全てを検出できることを示し，さらに他の血清型（眼又は関節炎の病気を引き起こすもの）が，アッセイのプライマーセットで増幅できることも確認する必要があった。
【０１９６】
細菌パネル由来のＤＮＡサンプルを，プラスミドとゲノムプライマーの両方に対してテストし，ＰＣＲとプローブ−Ｔ７の終点検出により特異性（排他性）を検証した。
【０１９７】
次に，包括性を検証するために，クラミジア・トラコマチス血清型の１５種すべてを（ＥＢｓとして）採取し，そのＤＮＡを抽出し，精製し，定量化した。その後，すべての血清型が同様のＬＯＤを有していることを証明するために，プラスミド及びゲノムプライマーセットを用いてＤＮＡのコピーを３重にテストし，続いてプローブ−Ｔ７エキソヌクレアーゼによる終点検出を行った。
【０１９８】
排他性テスト
イントロダクションで記載したＤＮＡ群について，ゲノムプライマーセットを２重にテストした。ＰＣＲとプローブ−Ｔ７の検出後に，シグナルのピーク高さの出力を測定した。テストごとにＰＣＲコントロールを用いて，数回に分けてテストを行った。
【０１９９】
染色体アンプリコン１７の結果
染色体アンプリコン１７を標的にするプライマー及びプローブを，ゲノムＤＮＡ群に対してテストした。２重実験の結果を以下に示す。
【０２００】
【表Ａ】
2013514076.tif 000052
【０２０１】
【表Ｂ】
2013514076.tif 000053
【０２０２】
【表Ｃ】
2013514076.tif 000054
【０２０３】
【表Ｄ】
2013514076.tif 000055
【０２０４】
【表Ｅ】
2013514076.tif 000056
【０２０５】
【表Ｆ】
2013514076.tif 000057
【０２０６】
【表Ｇ】
2013514076.tif 000058
【０２０７】
【表Ｈ】
2013514076.tif 000059
【０２０８】
【表Ｉ】
2013514076.tif 000060
【０２０９】
【表Ｊ】
2013514076.tif 000061
【０２１０】
総体的結論−排他性
プライマーセットは共に交差反応を示さず，クラミジアアッセイに非常に特異的であることが示された。
【０２１１】
包括性テスト
１５種のＣ．トラコマチス血清型（Ａ，Ｂ，Ｂａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｊ，Ｋ，Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３）から得られたＥＢｓを融解し，そのＤＮＡを精製し，定量化した。上記したプライマーとプローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６，７，及び５）を使用するＰＣＲ反応における包括性について，各血清型の５００００，５００，５０，又は５つのゲノムコピーをテストした。プローブ−Ｔ７を使用して終点検出した後，シグナルのピーク高さを測定した。
【０２１２】
染色体アンプリコン１７の包括性の結果
［表Ｋ］
2013514076.tif 000062
【０２１３】
【表Ｌ】
2013514076.tif 000063
【０２１４】
【表Ｍ】
2013514076.tif 000064
【０２１５】
総体的結論−包括性
ゲノムのアンプリコン１７のプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）とプローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）によりすべての血清型を増幅させ，５コピーの血清型Ｄ，Ｊ，及びＫを除いて電気化学的に検出することができた。ゲノムのアンプリコン１７のプライマー及びプローブセットを用いた血清型Ｇも同様に記録され，５０コピーのＤ，Ｊ及びＫは増幅できることを示している。
【実施例５】
【０２１６】
実施例５−内部コントロールとして使用するペクトバクテリウム・アトロセプティカム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）標的遺伝子の同定及び特有性
ＮＣＢＩ  ＰｕｂＭｅｄのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＰｕｂＭｅｄ／）から，５．０６４Ｍｂのペクトバクテリウム・アトロセプティカム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）ゲノム（アクセッション番号：ＢＸ９５０８５１）をダウンロードした。ペクトバクテリウム・アトロセプティカムゲノムは，仮定的遺伝子や，遺伝子名，機能及び遺伝子位置などで十分にアノテートされている。調査のために３つの遺伝子を選択した。
【０２１７】
これらは，ｒｆａＨ（長さ４８９ｂｐの塩基対位置２３０１４４で，リバース方向から開始し，転写活性化タンパク質をコードする）と，ｍｇｓＡ（長さ４５８ｂｐの塩基対位置２００８７４６で，リバース方向から開始し，メチルグリオキサールシンターゼ（ｍｅｔｈｙｌｇｌｏｘａｌ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードする）と，長さ３８７ｂｐの塩基対位置１４３６１０で，リバース方向から開始し，仮定上のタンパク質（ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ），ＨＰ１をコードし，指定する遺伝子である。すべてのヌクレオチドコレクションから選別するＮＣＢＩ’Ｂｌａｓｔｅｎプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＡＧＥ＝Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ＆ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｂｌａｓｔｎ＆ＭＥＧＡＢＬＡＳＴ＝ｏｎ＆ＢＬＡＳＴ＿ＰＲＯＧＲＡＭＳ＝ｍｅｇａＢｌａｓｔ＆ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＳＨＯＷ＿ＤＥＦＡＵＬＴＳ＝ｏｎ）を利用した遺伝子の照合により，見つかった唯一のヒットは，ペクトバクテリウム・アトロセプティカム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）自身であり，つまり，これらの遺伝子領域を増幅するために設計したプライマーは，細菌に限らず，他の属の領域を増幅しないことが判明した。
【０２１８】
プライマー／プローブの設計
クローン・マネージャー・プログラム（Ｃｌｏｎｅ  Ｍａｎａｇｅｒ  ｐｒｏｇｒａｍ）により，ゲノムから完全長遺伝子の配列を選択した。プログラムのプライマー設計機能により，最適な長さ２０塩基（許容範囲１８塩基から２２塩基）のプライマーセットを選択し，それぞれの遺伝子から９０ｂｐから１５０ｂｐの産物を増幅した。それぞれのプライマーに適用される判定基準は，ＧＣ％が５０％から６０％であること，Ｔｍが５０℃から８０℃であること，３’末端で３マッチ（ｍａｔｃｈ）未満であること，隣接する相同塩基が７個未満であること，５’末端対３’末端の安定性が１．２ｋｃａｌよりも大きいか又は同等であること，３’末端で少なくとも１つのＧ又はＣを有すること，４塩基未満で実行すること，ジヌクレオチド反復が３個未満であること，及び５５℃のアニーリング温度でヘアピンにならないことである。これらの基準に基づいて，３つのプライマーセットを見出し，ｒｆａＨから１２４ｂｐ，ｍｇｓＡから９１ｂｐ及びＨＰ１から９８ｂｐを増幅した。５０％から６０％のＧＣ％，３２℃から１００℃のＴｍ，５未満の隣接する相同塩基，４塩基未満の実行，３個未満のジヌクレオチド反復，及び４２℃のアニーリング温度でヘアピンにならないことの基準を用いて，クローン・マネージャー・プログラムにより一本鎖ＤＮＡプローブを設計した。
【０２１９】
プライマー／プローブテスト
標的配列の初期増幅
アクセッション番号ＢＡＡ−６７２の寄託されたＡＴＣＣ細菌に対応するペクトバクテリウム・アトロセプティカム菌株ＳＣＲＩ１０４３のゲノムＤＮＡのＰＣＲについて，３つのプライマーセットをテストした。下記の表４に示される反応条件と下記の表５に示されるサイクリング条件により，対称ＰＣＲを行った。
【０２２０】
［表４］
対称ＰＣＲテストの反応条件
2013514076.tif 000065
【０２２１】
［表５］
ＰＣＲのサイクリング条件
2013514076.tif 000066
【０２２２】
熱サイクリング後，増幅したＰＣＲ産物の１０μｌを１．５％アガロースゲルに注入した。電気泳動後，このゲルをＵＶ光下で撮影した。対照として１００ｂｐのＤＮＡラダーを使用するために，すべてのプライマーセットにより，これらの条件下で所望の産生物を増幅した。同一のＰＣＲ反応及びサイクリング条件下，様々な量のペクトバクテリウム・アトロセプティカムゲノムＤＮＡで，検出限界の実験を３重に行った。２ｎｇ（３６６，４６８コピー）から総ＤＮＡ量の２ｐｇ（３６６ゲノムコピー）のテストしたすべてのレベルでｒｆａＨを増幅するのに対して，２ｎｇから２００ｆｇ（３７ゲノムコピー）のすべてのレベルでｍｇｓＡ及びＨＰ１を検出することが判明した。適切にネガティブコントロールを含めた。
【実施例６】
【０２２３】
実施例６  対称及び非対称の増幅と電気化学的プローブによる検出
３つのプローブ配列のそれぞれにフェロセン標識し電気化学的プローブを合成した。対照ＰＣＲ条件（上記表５参照）又は下記の表６に示される反応条件の非対照ＰＣＲ条件下において，ｒｆａＨ，ｍｇｓＡ，及びＨＰ１のプライマーセットにより，２ナノグラムのペクトバクテリウム・アトロセプティカムゲノムのＤＮＡを３重に増幅した。それぞれの増幅条件に設定したそれぞれのプライマーについて，ネガティブコントロール（水のみ）を３重に加えた。
【０２２４】
［表６］
非対称ＰＣＲテストの反応条件
2013514076.tif 000067
＊  過剰なプライマーは，ｒｆａＨリバース，ｍｇｓＡフォワード，及びＨＰ１リバースである。
【０２２５】
対称ＰＣＲについてのみ，各反応容量の１０μｌを１．５％アガロースゲルに注入し，ＰＣＲ産物のサイズを可視化した。これにより，ＰＣＲ産物の存在を確認した。
【０２２６】
下記の表７に示すように，それぞれのアンプリコンに特異的な１４から１５１のプローブ用に適切なマスターミックスを作成した。
【０２２７】
［表７］
電気化学検出用マスターミックス
2013514076.tif 000068
【０２２８】
５μＬの適切なプローブミックスを，２０μＬのＰＣＲ産物に加え，混合物を３７℃で２０分間インキュベートした。インキュベーション後，以下のＡｕｔｏｌａｂパラメータを用いて，電気化学的電位を電気化学的に測定した。
前処理  条件付け電位（Ｖ）：０，持続時間：０秒，析出電位：０，持続時間：０，平衡時間：０，
測定  測定後のセル：Ｘ，変調時間（＞＝０．００２５）：０．０４，間隔時間（＞＝０．１０５）：０．１，
電位  初期：−０．１，終期：０．５，ステップ：０．００３，振幅変調：０．０４９９５，待機電位（Ｖ）：０，
前処理  しきい値での停止平衡（Ｓｔｏｐ  ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ）：なし，平衡しきい値（Ａ）：０．０５，
その他  スキャン数：１
【０２２９】
電気化学的測定値から得られた平均値（ｎ＝３）のデータを下記の表８に示す。
【０２３０】
［表８］
それぞれのアンプリコン／プローブセットで得られた電気化学的データの一覧
2013514076.tif 000069
【０２３１】
表８に示すデータは，ＨＰ１プローブによって得られたピーク高さ，平均ピーク高さ６１１．３３ｎＡ，がテストしたすべての他のものより高かったことを明らかにしている。これはネガティブの平均ピーク高さ５３．７と共に，ポジティブシグナルとネガティブシグナルの最大限の差異をもたらしている。非対称条件におけるポジティブＨＰ１サンプルのピーク位置は同一であり，非対称条件におけるネガティブＨＰ１サンプルは低い標準偏差と変動係数をもたらした。ｍｇｓＡのアンプリコン／プローブセットは，乏しい差異を示し，ｒｆａＨのアンプリコン／プローブセットは良好な差異を示したが，これはＨＰ１セットで見られるほどのものではなかった。したがって，内部コントロール目的として，ＨＰ１プライマー／プローブセットを選択した。選択したフォワードプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に対応している。選択したリバースプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に対応している。選択したプローブは，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に対応している。
【実施例７】
【０２３２】
実施例７  内部コントロールのプローブ及びプライマーセットにおける排他性の検証
イントロダクション
内部コントロールアッセイは高い特異性を有し，被験者サンプルに存在する他のＤＮＡ，例えばヒトＤＮＡ及び感染性微生物の核酸などと交差反応を起こさないことが必要である。
【０２３３】
ＰＣＲ，プローブＴ７エキソヌクレアーゼの終点検出により特異性（排他性）をテストするために，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４として示されるプローブ配列と内部コントロールプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１及び１２）に対して細菌パネル由来のＤＮＡサンプルをテストした。
【０２３４】
結果に記載されているように，ＤＮＡ群に対してゲノムのプライマーセットを２重にテストした。ＰＣＲ及びプローブＴ７エキソヌクレアーゼ検出後，シグナルの出力によりピーク高さを測定した。テストごとにＰＣＲコントロールを用いて，数回に分けてテストを行った。
【０２３５】
内部コントロールの結果
ゲノムＤＮＡ群に対して，ペクトバクテリウム・アトロセプティカムを標的にするプライマー及びプローブをテストした。２重実験の結果を以下に示す。
【０２３６】
【表Ｎ】
2013514076.tif 000070
【０２３７】
【表Ｏ】
2013514076.tif 000071
【０２３８】
【表Ｐ】
2013514076.tif 000072
【０２３９】
【表Ｑ】
2013514076.tif 000073
【０２４０】
【表Ｒ】
2013514076.tif 000074
【実施例８】
【０２４１】
実施例８  クラミジア・トラコマチスに対する染色体アンプリコン１７のプライマー及びプローブセットのさらなるテスト
以下を組み合わせてＰＣＲマスターミックスを作成した。
【０２４２】
【表Ｓ】
2013514076.tif 000075
【０２４３】
マスターミックスを１２．５μＬのアリコートに分割した。Ｃ・トラコマチスの１０００ＥＢｓ，１００ＥＢｓ，１０ＥＢｓ，及び１ＥＢｓから抽出したＤＮＡを１２．５μＬ量加えた。次いで，ＵＤＧ活性及び変性するためにサンプルをインキュベートし，続いて下記のようにＰＣＲを行った。
【０２４４】
【表Ｔ】
2013514076.tif 000076
【０２４５】
０．８ＵのＴ７エキソヌクレアーゼ及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５の配列を有する９μＭ（最終反応濃度）の特異的プローブを用いて，増幅したサンプルを検出標的として以下のアッセイを行った。それぞれのサンプルでアッセイを３重に行った。下記を組み合わせることにより検出ミックス（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｍｉｘ）を作成した。
【０２４６】
【表Ｕ】
2013514076.tif 000077
【０２４７】
以下のＡｕｔｏｌａｂパラメータを用いて新しい電極でボルタンメトリー分析を行う前に，１．３２５μ１のそれぞれの検出ミックスを，１１．１７５μ１の増幅サンプルに３重に加え，３７℃で２０分間置いた。
前処理  条件付け電位（Ｖ）：０，持続時間：０，析出電位０，継続時間：０，平衡時間：０，
測定  測定後のセル：Ｘ，変調時間（＞＝０．００２５）：０．０４，間隔時間（＞＝０．１０５）：０．１，
電位  初期：−０．１，終期：０．５，ステップ：０．００３，振幅変調：０．０４９９５，待機電位（Ｖ）：０，
前処理  しきい値での停止平衡（Ｓｔｏｐ  ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ）：なし，平衡しきい値（Ａ）：０．０５，
その他  スキャン数：１
【０２４８】
およそ１５０から２００ｍＶのピーク高さ及び正確なピーク位置を記録した。結果は図３に示されている。
【０２４９】
上記実験が，単一のチューブ内で２つの標的を検出するために，クラミジア・トラコマチスと内部コントロールの反応をそれぞれのプローブで同時に行うデュプレックスＰＣＲｓ（ｄｕｐｌｅｘ  ＰＣＲｓ）の試験ではなかったことから，上記実験データは，開示されるプライマー，プローブ及び方法が“シングレックス（ｓｉｎｇｌｅｘ）”反応に用いられる場合に有利であることを証明している。さらに以下の実施例を行った。
【実施例９】
【０２５０】
実施例９  デュプレックス試験１
方法の概要
標的検体ＤＮＡのほかに第２の検体に特異的なプライマーセットを加えて，上記詳述した最適化“シングレックス（ｓｉｎｇｌｅｘ）”反応を共に繰り返した。
【０２５１】
結果
デュプレックス反応混合物（ｄｕｐｌｅｘ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘ）の何かが，クラミジア標的の電気化学的なピーク高さを低減させることが判明した。この効果は，図４に見られる。この実験は，内部コントロールのプライマーセットの存在下及び非存在下で，かつ２００ｐｇの内部コントロールのＤＮＡがある場合とない場合とで，ＭＥ１７クラミジア染色体のプライマーセットにより行った。図４は，内部コントロールのプライマーセットの存在下でのＣ・トラコマチスの増幅，及び内部コントロールのＤＮＡが存在しない単独での増幅が，Ｃ．トラコマチスのプローブによる検出で得られる電気化学的なシグナルに悪影響を与えることを明確に示している。内部コントロールのアンプリコンを電気化学的に検出するために，内部コントロールのプローブを用いて同様の実験を行った。得られたデータは，図５に示されている。
【０２５２】
図５では，内部コントロールのプライマーと２００ｐｇの染色体内部コントロールの標的分子を含む“シングレックス（ｓｉｎｇｌｅｘ）”ＰＣＲの予想される内部コントロールの電気化学的なシグナルが，通常観察される１０００ｎＡを越えるピーク高さよりも劇的に減少していることが示されている。他のデュプレックスアッセイでは標的染色体ＤＮＡと内部コントロールとの間で干渉が観察されないことを考えると，これらのデータは興味深かった。総合すると，これらのデータは，Ｃ・トラコマチス又は内部コントロールのプライマーセットのいずれかがＣ・トラコマチス／内部コントロールのデュプレックスアッセイで機能していないことを指摘している。これらのデータを確認するために，内部コントロールのプライマーセットがある場合とない場合とで，Ｃ・トラコマチスを増幅させる対照ＰＣＲを行い，検出方法としてアガロースゲル電気泳動の実験を行った。ゲルの写真が図６ａ及び図６ｂ（Ｃ・トラコマチスのプライマーセットのみ）と，図７ａ及び図７ｂ（Ｃ・トラコマチス及び内部コントロールのプライマーセット）に示されている。
【０２５３】
内部コントロールのプライマーセットが他の同一のＰＣＲ反応に含まれている場合，１０００ＩＦＵ／反応レベルまでのみ検出でき，内部コントロールのプライマーセットが，Ｃ・トラコマチスＩＦＵｓの増幅効率を３ｌｏｇ低下させることを示した（ゲル電気泳動による測定）。
【０２５４】
内部コントロールのプライマーがＣ・トラコマチスの検出を妨害することを証明するために，アガロースゲル電気泳動により検出したアンプリコンでさらなる対称ＰＣＲ実験を行った。この実験では，内部コントロールのフォワードプライマーの存在下でＣ・トラコマチスを増幅させた場合に，増幅産物の正確な分子量を，Ｃ・トラコマチスの１０ＩＦＵ／反応レベルまで観測できることを示した。しかし，Ｃ・トラコマチスの増幅において，内部コントロールのリバースプライマーを含む場合には，Ｃ・トラコマチスの増幅の検出限界は，１００００ＩＦＵ／反応にまで増加した。また，ゲルの写真は，ゲル上の低分子量の濃いバンドが示すように，内部コントロールのリバースプライマーとＣ・トラコマチスのプライマーセットを組み合わせるＰＣＲ条件下では，強力なプライマーダイマーを形成することを示唆している。
【０２５５】
内部コントロールのリバースプライマーと，Ｃ・トラコマチスのフォワード及びリバースプライマーのバイオインフォマティクス分析により，アガロースゲル上でプライマーダイマーが観察されたことから，内部コントロールのフォワードプライマーとＣ・トラコマチスのリバースプライマーの両方の３’末端の５つの末端塩基が相補的であり，デュプレックス増幅による性能は乏しいことを示した。配列相同性を以下に示す。
【０２５６】
【化４８】
2013514076.tif 000078
配列相同性は，熱サイクル中のプライマーダイマーの形成によって，内部コントロールのリバースプライマーを含むデュプレックス反応ではＣ・トラコマチスの乏しい増幅及び検出を考慮することが仮定される。
【０２５７】
３’の相同性を除去するようにプライマーを再設計することなく，プライマーを設計することを決定した。内部コントロールのプライマーセットが他のＤＮＡ標的を用いる既存のデュプレックスアッセイで十分に作用することから，Ｃ・トラコマチスのリバースプライマーを再設計することを決定した。塩基を付加した後，増加するリバースプライマーのＴｍ値にＣ・トラコマチスのフォワードプライマーを修正した。新規なＣ・トラコマチスのフォワード及びリバースプライマーは以下の配列を有していた。
【０２５８】
【化４９】
2013514076.tif 000079
【０２５９】
ＣＴフォワードプライマーの５’末端に付加した７つの付加塩基対は，Ｃ・トラコマチス染色体のＤＮＡ鎖の連続する５’の配列になることを意図しており，そのようにプライマーを設計した。しかし，７つの付加塩基が実際には混在物に相補的であったことを意味するように，プライマー設計に誤差があった。それにもかかわらず，これは，それぞれのプライマーのＴｍｓを互いに近づけると同時に，“旧（ｏｌｄ）”Ｃ・トラコマチスのフォワードプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）であらかじめ観察された性能を維持するという目的を達成しているように思われる。
【０２６０】
７つの相補的な塩基の代わりに，フォワードプライマーの５’末端に誤ってこれらに非相補的な７つの塩基を付加したが，内部コントロールのＤＮＡとフォワードプライマー及びリバースプライマーによるデュプレックス反応により，Ｃ・トラコマチスのプライマーテストを進めた。最初に，対称ＰＣＲによりプライマーの適合性をチェックし，産生したアンプリコンをアガロースゲル電気泳動により分析した。驚くべきことに，この実験は，新規なＣ・トラコマチスのフォワード及びリバースプライマーが，図６ａ／ｂで観察されたものと同等の，１ＩＦＵの検出限界をもたらすことを示した。この反応混合物に内部コントロールのプライマーを加えた時，電気泳動による検出限界は１０ＩＦＵｓにわずかに増加した（電気化学的実験では１ＩＦＵを検出することが示されている）。これは図７ａ／ｂで観察されたものと比較して向上している。さらなる実験において，Ｃ・トラコマチス及び内部コントロールのプライマーセットの２つの標的染色体ＤＮＡをデュプレックス反応により非対照的に増幅させる性能をテストし，続いて，電気化学的な検出を行った。これらのデータは，図８に示されている。
【０２６１】
図８に示すデータは，既存の内部コントロールのプライマーセットと組み合わせた場合の修飾されたＣ・トラコマチスのプライマーセットが，デュプレックスＰＣＲにより，標的との同時増幅及び電気化学的検出を可能にすることを証明している。
【実施例１０】
【０２６２】
実施例１０  デュプレックス試験２
標的ＤＮＡ（１８ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）と完全に相補的な伸長したＣ・トラコマチスのフォワードプライマーの性能を評価するために追加実験を行った。
【０２６３】
結果
好ましい内部コントロールと共にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９のリバースプライマー及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のプローブをデュプレックスＰＣＲ反応に使用した時，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７のフォワードプライマーと同様の機能を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８のフォワードプライマーを発見した。図９は，３種類のＰＣＲマスターミックス（ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘｅｓ）によるデュプレックス実験の比較を示している。“ＣＴ”はＣ・トラコマチスの値を示し，“ＩＣ”は内部コントロールの値を示し，“ＩＦＵ”は感染単位を示している。
【０２６４】
内部コントロールの反応は，終始，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１及び１２のプライマーとＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のプローブを使用した。
【０２６５】
Ｃ・トラコマチス反応に関して，マスターミックスＡには，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６及び７のプライマーとＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のプローブを使用し，１００００ＩＦＵから１０００ＩＦＵの検出限界を示した。
【０２６６】
Ｃ・トラコマチス反応に関して，マスターミックスＢには，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７及び１９のプライマーとＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のプローブを使用し，１０ＩＦＵから１ＩＦＵの検出限界を示した。
【０２６７】
Ｃ・トラコマチス反応に関して，マスターミックスＣには，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８及び１９のプライマーとＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のプローブを使用し，１０ＩＦＵから１ＩＦＵの検出限界を示した。
【０２６８】
実施例９及び実施例１０に示されるデータは，Ｃ・トラコマチスのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７及び１８のフォワードプライマーとＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９のリバースプライマーを用いる核酸増幅反応が，内部コントロールの核酸との使用及びデュプレックス反応における本発明の増幅に特に適していることを証明している。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７の配列を有するプライマーの良好な性能は，その配列が標的に不完全に相補的であることを考えれば特に驚くべきことである。
【０２６９】
【図１ａ】
2013514076.tif 000110
【図１ｂ】
2013514076.tif 000111
【図１ｃ】
2013514076.tif 000112
【図２ａ】
2013514076.tif 000113
【図２ｂ】
2013514076.tif 000114
【図２ｃ】
2013514076.tif 000115
【図２ｄ】
2013514076.tif 000116
【図３】
2013514076.tif 000117
【図４】
2013514076.tif 000118
【図５】
2013514076.tif 000119
【図６ａ】
2013514076.tif 000120
【図６ｂ】
2013514076.tif 000121
【図７ａ】
2013514076.tif 000122
【図７ｂ】
2013514076.tif 000123
【図８】
2013514076.tif 000124
【図９】
2013514076.tif 000125
【配列表】
2013514076000001.app
【国際調査報告】
2013514076.tif 000126
2013514076.tif 000127
2013514076.tif 000128