(57)【要約】  体細胞を再プログラミングして誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞を得るための方法を提供する。誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、外胚葉、中胚葉または内胚葉に由来する体細胞に分化できる能力を有する。上記ｉＰＳ細胞、ｉＰＳ細胞を生成及び維持する方法、及びｉＰＳ細胞を使用する方法を提供する。【選択図】図４Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘導多能性幹細胞を製作するための方法であって、
一つまたは複数の体細胞を、羊膜細胞のフィーダー層上で一定時間培養し、該一定時間は体細胞を多能性幹細胞に再プログラミングするのに十分な時間であることを特徴とする、誘導多能性幹細胞を製作するための方法。
【請求項２】
上記羊膜細胞は羊膜上皮細胞、胚体外の間葉系細胞または羊水細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記羊膜上皮細胞は哺乳動物の羊膜上皮細胞であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記哺乳動物の羊膜上皮細胞は霊長類、ブタ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ウサギ及びげっ歯類に由来することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記羊膜上皮細胞は、ヒト羊膜上皮細胞であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記羊膜上皮細胞は、継代培養６代目以内のもの（Ｐ０−Ｐ５）であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
上記羊膜上皮細胞は、新たに分離されたＰ０羊膜上皮細胞であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記体細胞は成熟した体細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
上記体細胞は胚ステージからの体細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
上記体細胞は成人皮膚線維芽細胞（ＡＤＳＦ）、ヒト胚性線維芽細胞（ＨＥＦ）、マウス線維芽細胞（ＭＦ）、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）、ブタ線維芽細胞（ＰＦ）、及びブタ胚性線維芽細胞（ＰＥＦ）からなる群より選ばれたものであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
上記細胞はＫＯ−ＤＭＥＭ培地で培養されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
上記ＫＯ−ＤＭＥＭ培地はβ−ＦＧＦ、ヒト臍帯血清、新生児ウシ血清、胎児ウシ血清及びＬＩＦを含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
上記ＫＯ−ＤＭＥＭ培地は１０ｎｇ／ｍｌβ−ＦＧＦ、５％ヒト臍帯血清及び１２ｎｇ／ｍｌ  ＬＩＦを含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法によって得られた誘導多能性幹細胞。
【請求項１５】
請求項１４に記載の多能性幹細胞を誘導分化することにより得られた体細胞、生殖細胞、組織または器官。
【請求項１６】
（１）対象から体細胞を採取すること、
（２）請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法により、体細胞を多能性幹細胞に再プログラミングすること、
（３）多能性幹細胞の分化を誘導することを含む、幹細胞を用いて治療をする方法。
【請求項１７】
多能性幹細胞の誘導分化は、生体内で行われることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
多能性幹細胞の誘導分化は、生体外で行われることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
分化した細胞を対象に移植することをさらに含むことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
上記幹細胞療法は、再生医療、組織工学療法または動物育種に用いられることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は全般的に細胞生物学分野に係るものである。具体的には、多能性幹細胞の増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）、培養条件及び材料に係り、幹細胞の増殖及び利用を促進するためのものである。
【背景技術】
【０００２】
第三者の理解を助けるために、以下のように説明を提供する。下記説明によって提供された情報または引用されている参考情報を本発明の従来技術とすることはできない。
【０００３】
幹細胞は自己複製能力を有し、無限に分裂することができる。且つ、適切な状況において、異なるタイプの細胞に分化することができる。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は初期胚から樹立されるものであって、長時間にわたり培養することが可能で、同時に生体内に存在するすべての種類の細胞に分化できる多能性能力を維持している。これと比較して、体性幹細胞は発育した器官中で見られるものであって、自身のような細胞または自身よりさらに分化された細胞に分裂する能力を有するものである。
【０００４】
Ｔｈｏｍｓｏｎら（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，８４３，７８０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：７８４４，１９９５）は初めて霊長類動物多能性幹細胞の分離と増殖に成功した。彼らはその後、ヒト胚盤胞から、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）細胞株を得た（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４，  １９９８）。Ｇｅａｒｈａｒｔ及び共同研究者らは胎児生殖腺組織からヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞株を得た（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：１３７２６，  １９９８；Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ６，０９０，６２２）。ｈＥＳ及びｈＥＧ細胞の両方が、多能性幹細胞の望まれた特性を有し、即ちこれらは分化することなく広く培養を続けることができる。これらは正常な核型を持ち、数々なタイプの重要な細胞を生成することができる。
【０００５】
誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）は非多能性細胞（典型的には成体体細胞）から人工的に誘導された多能性幹細胞である。２００６年に、山中らは四つの遺伝子（ＯＣＴ−４、ＳＯＸ２、ｃ−ＭＹＣ、ＫＬＦ４）をマウス線維芽細胞に形質移入してｉＰＳ細胞を得た。次に、ヒト成体体細胞からｉＰＳ細胞を作製した（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ，１３１：８６１−８７２（２００７）；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８：１９１７−１９２０，２００７）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
再生医学分野は、損傷した細胞、組織または器官の、修復、交換または再生を支援するための治療法を網羅したものである。幹細胞に基づいた治療法は、広い範囲の疾病を治療できることが有望視されている。これらの疾病は、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中、骨髄損傷、心臓発作、腎不全、骨粗しょう症、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、火傷及び創傷を含む。しかし、このような治療法の進歩には多くの障碍があり、例えばドナーから得た胚性幹細胞とレシピエントとが免疫的に不適合であることにより、免疫拒絶反応を引き起こす可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は幹細胞を生成するための方法に係るものである。一つの態様において、本発明は誘導多能性幹細胞を取得する方法を提供する。すなわち、羊膜上皮細胞フィーダー層上において、一個または複数個の体細胞を培養して、誘導多能性幹細胞を取得する方法である。一つの実施形態において、羊膜上皮細胞は哺乳類動物の羊膜上皮細胞である。一つの実施形態において、哺乳動物の羊膜上皮細胞は、人、豚、犬、馬、牛、羊及びラットまたはマウスのようなげっ歯類哺乳動物に由来するものである。一つの実施形態において、羊膜上皮細胞はヒト羊膜上皮細胞（ｈＡＥＣ）である。一つの実施形態において、羊膜上皮細胞は培養６代目（Ｐ０−Ｐ５）以内のものである。一つの実施形態において、羊膜上皮細胞は新しく分離されたＰ０羊膜上皮細胞である。
【０００８】
一つの実施形態において、体細胞は成人皮膚線維芽細胞（ＡＤＳＦ）、ヒト胚性線維芽細胞（ＨＥＦ）、マウス線維芽細胞（ＭＦ）、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）、ブタ線維芽細胞（ＰＦ）、ブタ胚性線維芽細胞（ＰＥＦ）からなる群より選ばれるものである。一つの実施形態において、体細胞は成人皮膚線維芽細胞（ＡＤＳＦ）である。
【０００９】
一つの実施形態において、細胞はＫＯ−ＤＭＥＭ培地で培養されている。一つの実施形態において、ＫＯ−ＤＭＥＭ培地はβ−ＦＧＦ（アルカリ性繊維芽細胞成長因子）、ヒト臍帯血清及びＬＩＦ（白血病抑制因子）が含まれる。
【００１０】
例示的な実施形態において、ＫＯ−ＤＭＥＭ培地は１０ｎｇ／ｍｌβ−ＦＧＦ、５％ヒト臍帯血清、新生児ウシ血清、ウシ胎児血清、及び１２ｎｇ／ｍｌＬＩＦで構成されている。
【００１１】
一つの実施形態において、本発明は上記方法によって得られた誘導多能性幹細胞を提供することを開示する。一つの形態において、本発明は多能性幹細胞の分化を誘導することによって得られた体細胞を提供することを開示する。
【００１２】
一つの形態において、本発明は幹細胞療法を提供することを開示する。該方法は、以下を含む。（ａ）対象（ヒトまたは動物）から体細胞を分離、収集する。（ｂ）体細胞を多能性幹細胞に再プログラミングする。（ｃ）多能性幹細胞の分化を誘導する。（ｄ）（ｃ）で分化した細胞を被検体に移植する。いくつかの実施形態では、幹細胞療法は再生医療、組織工学療法および／または動物の繁殖に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ヒト成人皮膚線維芽細胞（ＡＤＳＦ）をヒト羊膜上皮細胞（ｈＡＥＣ）フィーダー層で培養した場合の顕微鏡写真である。７日間後に、外観上、胚性幹細胞に類似している細胞クローンが観察された。
【図２】図２Ａ及び図２ＢはＡＤＳＦ細胞をｈＡＥＣフィーダー層上で７日間培養した後のクローンを幹細胞マーカーで染色した場合の一連の顕微写真である。この結果から、得られた細胞はＯＣＴ−４、ＮＡＮＯＧ、ＳＳＥＡ−４、ＫＬＦ４、Ｃ−ＭＹＣ、ＴＡＲ−８１、ＴＡＲ−６０等の幹細胞特異的マーカーを発現している。
【図３Ａ】図３（Ａ）は７日間培養したＡＤＳＦ−ｉＰＳ細胞におけるマーカーの定量発現を示したチャートである。
【図３Ｂ】図３（Ｂ）は７日間培養したＡＤＳＦ−ｉＰＳ細胞におけるマーカーの定量発現を示したチャートである。
【図３Ｃ】図３（Ｃ）は７日間培養したＡＤＳＦ−ｉＰＳ細胞におけるマーカーの定量発現を示したチャートである。
【図４Ａ】図４（Ａ）は１２日間培養した後の各種細胞における幹細胞マーカーの定量発現を示したチャートである。
【図４Ｂ】図４（Ｂ）は１２日間培養した後の各種細胞における幹細胞マーカーの定量発現を示したチャートである。
【図４Ｃ】図４（Ｃ）は１２日間培養した後の各種細胞における幹細胞マーカーの定量発現を示したチャートである。
【図５】マウス線維芽細胞（ＭＦ）をｈＡＥＣフィーダー層上で培養した場合の顕微鏡写真である。３日間後に、外観上、胚性幹細胞に類似している細胞クローンが観察された。
【図６】ｈＡＥＣフィーダー層で３日間培養したマウス線維芽細胞が形成したクローンにおける幹細胞マーカー染色を示した一連の染色顕微写真である。
【図７】ブタ胚性線維芽細胞（ＰＥＦ）をｈＡＥＣフィーダー層で培養した場合の顕微鏡写真である。
【図８】抗ジゴキシン標識抗体で標識された、マウス染色体におけるセントロメアの顕微鏡写真である。観察されたセントロメアは染色体の頂端に位置し、これはｈＡＥＣ染色体汚染（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）が起きていないことを示している。核型解析：マウスの正常な二倍体の核型を持ち、画像中において全部で４０本の染色体が見られる。
【図９Ａ】図９ＡはｉＰＳ細胞に由来する奇形腫の組織構造の一連の顕微鏡写真である。図９（Ａ）は腺組織（内胚葉）である。
【図９Ｂ】図９ＢはｉＰＳ細胞に由来する奇形腫の組織構造の一連の顕微鏡写真である。図９（Ｂ）は筋肉（中胚葉）である。
【図９Ｃ】図９ＣはｉＰＳ細胞に由来する奇形腫の組織構造の一連の顕微鏡写真である。図９（Ｃ）は皮膚組織（外胚葉）である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の実質的な理解を助けるために、以下に本発明の特定の様式、モード、実施形態、バリエーション及び本発明の特徴について、様々なレベルで詳細に説明する。
【００１５】
本発明の実施において、分子生物学、タンパク質生化学、細胞生物学、免疫学、微生物学及び組み替えＤＮＡにおける多くの従来技術が用いられている。これらの技術は広く知られるものであり、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＩＩ，Ａｎｓｕｂｅｌ，Ｅｄ．（１９９７）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｓ．Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ，Ｇｌｏｖｅｒ，Ｅｄ．（１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｇａｉｔ，Ｅｄ．（１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ＆Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．（１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ＆Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．（１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｅｄ．（１９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８４）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｃａｌｏｓ，Ｅｄｓ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８７）；ａｎｄ  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５，Ｗｕ＆Ｇｒｏｓｓｍａｎ，ａｎｄ  Ｗｕ，Ｅｄｓ．でそれぞれ説明されている。ポリペプチド遺伝子の発現産物の水準（すなわち遺伝子翻訳の水準）を検出し測定する方法は、当技術分野で周知であり、抗体検出及び定量技術のようなポリペプチド検出方法を含む（Ｓｔｒａｃｈａｎ＆Ｒｅａｄ，Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９９９）参照）。
【００１６】
特に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野における当業者が一般的に理解する意味と同じものである。明確に指示しない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されている単数形は複数形を含む。例えば「一個の細胞」は二つまたは二つ以上の細胞のようなものを含む。
【００１７】
本明細書中で使用する用語「アミノ酸」は天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸を含み、同様に、機能が天然に存在するアミノ酸に類似するアミノ酸類似体、及びアミノ酸模倣物を含む。天然アミノ酸は遺伝子コードによってプログラムされるものであり、同様に、後に修飾されたアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシルグルタミン酸及びＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然アミノ酸と基本的に同じ化学構造を有する化合物を指し、すなわちα−炭素原子に一つの水素原子、一つのカルボキシル基、一つのアミノ基及び一つのＲ基が結合しているものであり、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムである。このような類似体は修飾されたＲ基（例えばノルロイシン）または改変されたペプチド骨格を有し、同時に天然に存在するアミノ酸の基本的な化学構造を保持している。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を持つ化合物を指すが、その機能は天然に存在するアミノ酸の機能と類似するものである。アミノ酸は、それらの一般に知られている３つの文字記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨される１文字の記号によって本明細書中で言及することができる。同様に、ヌクレオチドも広く使われている単一の文字コードで参照することができる。
【００１８】
本明細書で使用する用語「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子または抗原結合フラグメントのフレームワーク領域を含むポリペプチドであり、該フレームワーク領域は抗原と特異的に結合して識別するものである。抗体という用語の使用は、抗体全体を含み、単鎖の抗体全体をも含む。用語「抗体」は、二重特異性抗体及び多重特異性抗体を含み、所望の生物活性または機能を示すものであればよい。
【００１９】
本明細書で使用される用語「発現」は、遺伝子をｍＲＮＡ前駆体に転写すること、ｍＲＮＡ前駆体にスプライシングまたはその他の処理を行うことによって成熟ｍＲＮＡを生成すること、ｍＲＮＡの安定性、成熟ｍＲＮＡをタンパク質に翻訳すること（コドンとしての使用及びｔＲＮＡの使用可能性）、及び適切な発現及び機能が必要であれば、翻訳生成物のグリコシル化及び／またはその他の修飾を行うことからなる群から選ばれる一つまたは複数であるが、これに限定されない。
【００２０】
本明細書中で使用される用語「フィーダー細胞」は一種の細胞であり、他種類の細胞と共同培養することができ、その他種類の細胞の成長発育に優れた環境を提供するためのものである。いくつかの実施形態において、体細胞をｉＰＳ細胞に再プログラミングするために、体細胞とフィーダー細胞、例えば羊膜上皮細胞とを一緒に培養する。
【００２１】
本明細書で使用される用語「遺伝子」はＤＮＡセグメントを指し、一つのＲＮＡ生成物の生合成を制御するすべての情報を含み、プロモーター、エクソン、イントロン及びその他の発現制御用非翻訳領域を含む。
【００２２】
本明細書で使用される用語「分離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」は、普通な場合での自然な付随物がなるべく低減された、または好ましくは実質的に完全に除去されていることをいう。よって、用語「分離された細胞」とは、細胞が実質上その他の自然な環境物質（例えばその他の細胞、タンパク質、核酸など）から完全に分離したことをいう。用語「分離された」という用語が核酸及びポリペプチドと一緒となっている場合は、例えば、ＤＮＡ組み換え技術で生産した場合は、核酸またはポリペプチドが細胞物質または培基を実質的に含まないことを意味する。化学合成の場合は、前駆的化学物質またはその他の化学物質を有しないことを意味する。分離された核酸は、典型的に、核酸が抽出された生物における該核酸の隣接の遺伝子配列（すなわち、該核酸の５’末端及び３’末端に位置する配列）を含まない。
【００２３】
本明細書で使用される用語「多能性幹細胞（ＰＳ細胞）」とは、適切な条件下で幾種類かの異なるタイプの細胞の子孫を生成できる細胞である。ＰＳ細胞は三つの胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）に属する子細胞を生成することができる。本分野において許容される実験によれば、例えば、適切な宿主において奇形腫を生成する能力、または三つの胚葉の典型的な組織類型に分化して発現するマーカーが見られる。ＰＳ細胞の定義に含まれるのは様々な種類の胚細胞であり、例えば胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）であり、誘導多能性幹細胞は成体体細胞から再プログラミングされたものである。
【００２４】
明示的に説明した場合を除き、ＰＳ細胞は主要な組織、及びＰＳ細胞の表現型特徴を有する確立された細胞系を含み、及びこのような細胞系の誘導体で、三つの胚葉層のそれぞれの子孫を形成する能力をまだ持っているものを含むと当業者は理解するであろう。ＰＳ細胞培養物は「未分化」または「実質的に未分化」と表現され、幹細胞及びその誘導物のほとんどは未分化細胞の形態的特徴を示すものであり、これらを胚や成体由来の分化細胞と明確に区別することができる。当業者は未分化のＰＳ細胞を容易に識別することができ、通常は二次元顕微鏡下において、高い細胞核／細胞質の比を示し、核小体は明確に見られる。未分化の細胞のコロニーは通常、分化済みの隣接の細胞によって囲まれる。それにもかかわらず、細胞の集団が適切な条件下で培養または継代されても、未分化コロニーは維持され、個々の未分化細胞は、細胞集団においてかなりの割合を構成する。実質的に分化していない培養物は、少なくとも２０％の未分化ＰＳ細胞を含み、少なくとも４０％、６０％、または８０％の未分化ＰＳ細胞を含む。
【００２５】
本明細書で使用される用語「誘導多能性幹細胞」（略称ｉＰＳ細胞）は、ＥＳ細胞と似たような特性を有するものであり、非多能性細胞（典型的には成体体細胞）から人工的に誘導された未分化細胞を含む。
【００２６】
本明細書で使用される用語「再プログラミング」及び文法上同等の表現は、体細胞の分化ステータスを改変させる、または反転させるプロセスをいい、上記体細胞は部分的に、または完全に分化されたものである。体細胞の再プログラミングは、体細胞の分化状態を部分的に、または完全に復帰させるものである。いくつかの実施形態において、体細胞が誘導多能性幹細胞に再プログラミングされたとき、再プログラミングは完了する。しかし、場合によっては再プログラミングが部分的であり、分化レベルがより低い段階に戻る。例を挙げてみれば、一つの最終的に分化した細胞を分化レベルの比較的低い段階に戻し、例えば多能性細胞に戻すことをいう。
【００２７】
本明細書で使用される用語「体細胞」は、任意の非生殖細胞（生殖細胞とは、卵子、精子、またはこのようなもの）をいう。体細胞はそのＤＮＡを次の世代に継承させないものである。典型的に、体細胞は限られた多能性を有し、または多能性を有しない。ここで使用される体細胞は天然に存在するもの、または遺伝子修飾によって得られたものである。
【００２８】
＜総論＞
一つの態様において、本発明はｉＰＳ細胞を得るための方法を提供する。いくつかの実施形態において、該方法は、羊膜上皮細胞のフィーダー層（ＡＥＣｓ）で体細胞を充分な時間をかけて培養し、体細胞を脱分化また再プログラミングさせることを含む。
【００２９】
もう一つの形態において、本発明はｉＰＳ細胞及びこれらのｉＰＳ細胞から分化して得られた体細胞を提供する。ｉＰＳ細胞は、哺乳動物の細胞であり、例えばマウス、ヒト、ラット、ウシ、ヒツジ、馬、ハムスター、マウス、犬、モルモット、またはサルの細胞である。例えば、体細胞の再プログラミングは、患者特異的または疾患特異的多能性幹細胞を生成する機会を提供している。形態、増殖、遺伝子発現、及び奇形腫形成において、ｉＰＳ細胞とＥＳ細胞とを区別することはできない。また、胚盤胞に移植した際、ｉＰＳ細胞は成体キメラを生じさせることができ、これは生殖細胞系の移行（ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）に有能である（Ｍａｈｅｒａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １：５５−７０，２００７；Ｏｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４４８：３１３−１７，２００７；Ｗｅｒｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４４８：３１８−３２４，２００７）。ヒトｉＰＳ細胞はまた、拡張性を有するものであり、形態および増殖において、ヒト胚性幹細胞（ＥＳ）と区別することができない。さらに、これらの細胞はインビトロまたは奇形腫において、三つの胚葉の細胞類型に分化することができる。
【００３０】
本発明の方法のメリットの一つ目は卵子、胚、胚性幹細胞を必要としない状況において、体細胞からｉＰＳ細胞を生成できる点である。メリットの二つ目は、ｉＰＳ細胞は外因性の核酸および／または化学薬品の添加を必要としない状況のもとで、体細胞を誘導してｉＰＳ細胞を生成できることである。メリットの三つ目は、羊膜上皮細胞をフィーダーとし、マイトマイシンＣ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ）を添加しない点である。マイトマイシンＣは誘導多能性細胞の核型の変化を引き起こす可能性があるＤＮＡ損傷剤である。したがって、マイトマイシンＣの使用は、将来の臨床応用への潜在的なリスクが生じる可能性がある。メリットの四つ目は操作が簡単で、制御しやすく、コストが低く、効率が高く、再現性が高いことである。
【００３１】
理論によって制限されることを望まないが、ＡＥＣのフィーダー細胞、またはフィーダー細胞由来の細胞外マトリックスの使用は、多能性を誘導し、幹細胞の増殖を促進するために必要とする１つまたはそれ以上の物質を提供していると信じられている。そのような物質には、細胞によって周囲の培地中に分泌されている、膜結合および／または可溶性細胞生成物が含まれていると考えられる。
【００３２】
＜ＡＥＣ細胞の製造＞
一つの実施形態において、羊膜上皮細胞（ＡＥＣ）は、ｉＰＳ細胞に脱分化する体細胞を誘導する、即ち「再プログラミング」のために体細胞を培養する際のフィーダー層として使用されるものである。ＡＥＣは、受精後約８日目の胞胚の初期内部細胞塊から得られる。用語「羊膜」は、母体と胎児との間の重要な物質輸送用組織であり、胎膜を指す。ＡＥＣは、ヒト、ブタ、ウシ、ヒツジ、マウス、ラットなどの哺乳動物に由来することができる。
【００３３】
適切な実施の形態において、ＡＥＣは、ヒトＡＥＣ（ｈＡＥＣ）である。ｈＡＥＣｓは、ヒト羊膜から入手することができる。当業者は公知の方法で、さらに活性細胞の精製および濃縮を行うことができる。また、羊膜組織の絨毛膜及びその他の胎盤組織を除去する。羊膜層は、鉗子、滅菌メスを使用して、基礎となる絨毛膜層から穏やかに除去することができる。羊膜層は、機械的に分解され、ならびに／または隣接細胞間の接続を弱めることが可能な消化酵素および／またはキレート剤で処理され、個々の細胞の組織懸濁液に分散させる。もう一つの実施形態において、本発明は、胎盤の絨毛膜または脱落膜も、ＡＥＣの由来として使用することができる。
【００３４】
酵素による解離は、任意の数の消化酵素で羊膜層を処理することによって行うことができる。このような酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼおよび／またはヒアルロニダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。一つの実施形態において、分離された羊膜組織は、個々の細胞を解離するためにトリプシンで処理されている。一つの実施形態において、組織のインキュベーションに使用されたトリプシン濃度は約０．０５％である。一つの実施形態において、組織の酵素での消化時間はおおよそ１０−４０ｍｉｎであり、３０ｍｉｎがもっとも適切である。組織はまた、酵素を用いて複数の処理を行うことができる。組織の分離技術は、例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，２ｄ  Ｅｄ．，Ａ．Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７，Ｃｈ．９，ｐｐ．１０７−１２６．を参照することができる。
【００３５】
細胞の懸濁液を調製した後、細胞は、基礎培地に、血清、ホルモン、成長因子、サイトカイン、抗生物質、微量元素および他の添加剤を加えた培地で培養することができる。成長因子とサイトカインは線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）またはオンコスタチンＭを含む。培地中の添加剤は、インスリン、トランスフェリン、セレニウム（ＩＴＳ）、グルコース、インターロイキン６、及び酪酸ナトリウムまたはトリコスタチンＡのようなヒストンデアセチラーゼ阻害剤を含むことができる。
【００３６】
一つの実施形態において、羊膜由来細胞は培地中のＤＭＥＭ培地に移動し、ＤＭＥＭ培養液は１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（５．５μｇ／ｍｌ）、セレニウム（６．７ｎｇ／ｍｌ）およびエタノールアミン（２μｇ／ｍｌ）を含む。さらに、ピルビン酸ナトリウムと非必須アミノ酸（１％）を培地に添加することができる。当業者はまた、一つまたは複数の市販物質を、ＡＥＣの成長をサポートするために、培地への添加、または置換として使用することができる。細胞は冷凍保存をすることができ、解凍時はその機能と生存を保持することができる。
【００３７】
これらの細胞は組織培養皿で、またはフラスコ内に入れて細胞懸濁液で培養することができる。球状の細胞体を形成するものである。組織培養皿上に成長させたとき、表面を静電的または細胞外マトリックス成分で被覆することができる。細胞が接触による阻害を回避し、増殖成長条件を維持するために、培養皿がいっぱいに達する前に継代することができる。
【００３８】
＜体細胞の由来＞
再プログラミングすることができる体細胞の類型については特に限定がない。任意の種類の体細胞を使用することができる。成熟した体細胞が使用できるのと同様に、胚段階の体細胞も使用することができる。体細胞は初代培養細胞または不死化細胞であってもよい。このような細胞は、新たに動物から分離されたものと初代培養細胞（非不死化細胞）である可能性があり、または細胞株（不死化細胞）に由来する可能性がある。一つの実施形態では、体細胞は哺乳動物の細胞である、例えば、ヒト細胞またはマウス細胞である。従来の方法では、異なる器官から公知の方法によって得ることが可能であるが、例えば皮膚、肺、膵臓、肝臓、胃、腸、心臓、生殖器官、膀胱、腎臓、尿道や他の泌尿器官に限らず、またはいかなる活性細胞（ｌｉｖｉｎｇ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）を有する器官または組織、または血液細胞から採取できる。本発明において有用な哺乳類の体細胞は、成体幹細胞、脂肪細胞、間葉系細胞、セルトリ細胞、内皮細胞、顆粒膜上皮細胞、神経細胞、膵島細胞、表皮細胞、上皮細胞、肝細胞、毛包細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（ＢおよびＴリンパ球）、赤血球、マクロファージ、単球、単核細胞、線維芽細胞、心筋細胞、その他の既知の筋肉細胞、及び一般的には、任意の生きている体細胞である。特定の実施形態においては、線維芽細胞が使用されている。本明細書で使用される用語「体細胞」は、また、「成体幹細胞」をも含むことを意図している。成体幹細胞は、特定の組織のあらゆる細胞のタイプを生成することができる細胞である。典型的な成体幹細胞は造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞を含む。
【００３９】
ヒト体細胞の取得するための方法はすでに確立されたものであり、例えばＳｃｈａｎｔｚ  ａｎｄ  Ｎｇ（２００４），Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｗｏｒｌｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｐｔｅ，Ｌｔｄを参照することができる。いくつかの場合において、この方法は例えば生検（例えば皮膚サンプル）、採血などにより組織サンプルを入手する。組織から調製した細胞の初期培養密度は、その特定の組織からの細胞の期待生存率や付着などの変数に基づいて変化する。ヒト体細胞の様々なタイプを獲得するための方法は、以下の例示的な方法を含むが、これらに限られない。
【００４０】
骨髄。ドナーを全身麻酔した後、腹臥位に寝かす。腸骨の後縁から、収集針が直接皮膚に、腸骨の表面を介して骨髄へ挿入され、注射器で骨髄から液を抽出する。体性幹細胞は骨髄の骨形成ゾーンから骨髄細胞を分離することによって濃縮される。単核細胞分画は、その後密度勾配遠心分離により準備、収集される。収集された粗（ｃｒｕｄｅ）単核細胞分画は、その後再プログラミングのために本明細書で記載した方法により培養を行う。
【００４１】
皮膚組織。真皮を含む皮膚組織は、例えば、膝や臀部の裏側から切り取られる。皮膚組織は採取された後、皮膚の内側を下向きにし、０．６％トリプシン／ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ−１２に１％の抗生物質または抗真菌剤を添加し、３７℃で３０分間インキュベーションする。皮膚組織のひっくり返した後、ピンセットで軽く皮膚の内側をスクラブする。はさみを使用して皮膚組織を細かく１ｍｍ四方に切断し、その後１０分間、１２００ｒｐｍで、室温下で遠心分離する。上澄み液を除去し、０．１％トリプシン／ＤＭＥＭ／Ｆ−１２に１％の抗生物質や抗真菌剤を加えた２５ｍｌを、組織の沈殿物に追加する。混合物を３７℃で４０分間、スターラーを用いて２００−３００ｒｐｍで撹拌する。組織の沈殿が完全に消化されることを確認した後、３ｍｌのウシ胎児血清（ＦＢＳ）を追加し、ガーゼ、１００μｍナイロンフィルター、４０μｍナイロンフィルターで順次濾過した。１２００ｒｐｍで室温で１０分間遠心を行い、得られたろ液の上澄み液を除去して、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２に１％の抗生物質や抗真菌剤を加えたもので沈殿物を洗浄し、その後１２００ｒｐｍで１０分間、室温で遠心分離した。こうして得られた細胞画分は、その後再プログラミング前に培養されている。
【００４２】
表皮幹細胞はヒト頭皮組織（０．５−２ｃｍ２またはそれより小さい）から濃縮することができる。ヒト頭皮組織をすすぎ、余分の脂肪組織を除去するためにトリミングした後、小さい片に切断する。これらの組織片を１２．５ｍｇ／ｍｌディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）酵素で処理した後、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で２４時間４℃で消化する。酵素処理後、表皮が真皮から脱落し、毛包が真皮から出てくる。毛包球部及び完全な外根鞘（ＯＲＳ）を顕微鏡下で剥離する。洗浄後の毛包を培養皿中に入れる。細い針で球部（ｂｕｌｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を上部の毛包から剥離する。洗浄後の球部を新しい培養皿中に入れて、ＤＭＥＭ／Ｆ１２及び１０％ウシ胎児血清を含む培基で培養を行った。
【００４３】
骨格筋。結合組織を含む筋肉（例えば、上腕二頭筋や腿部縫工筋の外側頭部など）の表皮をカットして、筋肉組織を摘出する。得られた筋肉全体をハサミまたはメスで細かく切り、０．０６パーセントコラゲナーゼタイプＩＡおよび１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（高グルコース）に懸濁させ、２時間３７℃でインキュベートする。粉砕した筋肉から遠心分離によって細胞を回収し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（高グルコース）に懸濁させる。懸濁液を４０μｍの細孔径と２０μｍの細孔径のマイクロフィルターを通し、得られた細胞画分は、粗精製した未分化幹細胞を含むものであり、ヒト多能性幹細胞の誘導に使用することができる。
【００４４】
脂肪組織。脂肪組織由来の細胞は、当業者に熟知の種々の方法により分離することができる。脂肪組織の採取元の一つは、大網脂肪組織である。人体において、脂肪細胞は、通常、脂肪吸引によって分離されたものである。一つの細胞分離の方法において、脂肪組織は、０．０１％〜０．５％コラゲナーゼ、０．０１％〜０．５％トリプシン、及び／または０．５ｎｇ／ｍｌ−１０ｎｇ／ｍｌディスパーゼ、または有効量のヒアルロニダーゼまたはＤＮａｓｅを含む、約０．０１〜２．０ｍＭ  ＥＤＴＡ中で２５℃〜５０℃で１０ｍｉｎ〜３ｈ処理する。細胞は孔径が２０μｍ〜８００μｍのナイロンまたはチーズクロスの網目を通してろ過される。その後、培養液中の細胞が直接遠心分離またはフィコール、パーコールまたは他の粒子グラデーションを使用して分けられる。細胞は、４−５０℃において１００〜３０００ｇ、１分〜１時間で遠心分離される。こうして得られた脂肪組織由来の細胞画分は、未分化幹細胞を含む粗精製した細胞として本明細書に記載の方法に従って培養を行い、ヒト多能性または多能性幹細胞の誘導に使用することができる。
【００４５】
血液。約５０ｍｌ〜約５００ｍｌの静脈血または臍帯血を採取して、単核細胞分画は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ法によって得る。Ｋａｎｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｋ，ａｎｄ  Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，ｃｈ．７．１．１．−７．１．５，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照すること。単核細胞分画に分離した後、約１ｘ１０７〜１ｘ１０８のヒト末梢血単核細胞を、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び１００単位／ｍｌペニシリンを含むＲＰＭＩ  １６４０培養基に懸濁させて、二回洗浄した後に、細胞を回収する。回収された細胞をＲＰＭＩ  １６４０培基中に懸濁させて、次に１００ｍｍのプラスチック培養皿中に密度が培養皿ごとに１ｘ１０７細胞となるように播種（ｐｌａｔｅｄ）し、３７℃、８％ＣＯ２インキュベータ中で培養する。１０分後、懸濁液中に残った細胞を除去し、ピペット操作により壁に付着している細胞を回収した。その結果、壁に付着していた単核細胞分画は、その後再プログラミング前に培養されている。いくつかの場合では、上記方法によって得られた末梢血または臍帯血由来の壁に付着の細胞は、未分化幹細胞を含む粗精製した細胞として本明細書に記載の方法に従って培養を行い、ヒト多能性または多能性幹細胞の誘導に使用することができる。
【００４６】
末梢血中のマクロファージは、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社，Ｌｅｎａｘａｍ，Ｋａｎｓ．）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加した低グルコースＤＭＥＭ中において単核細胞分画を培養することにより濃縮することができる。マクロファージを増殖させるために、末梢血単核細胞を２ｘ１０６／ｍｌの密度で培養皿中に播種し、１０μｇ／ｍｌ  ＦＮ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）で処理しながら４℃で終夜放置する。細胞を３７℃、５％ＣＯ２の加湿大気中でいかなる追加の増殖因子も使わずに培養する。浮遊細胞を含む培地は３日ごとに変えられる。線維芽細胞の特徴が見られるマクロファージは、再プログラミングに用いることができる。
【００４７】
ｉＰＳ細胞を疾病の治療に用いる場合、患者から分離された体細胞を使用することが望ましい。例えば、疾患に関与する体細胞、または治療に参加する体細胞を使用することができる。
【００４８】
＜体細胞を再プログラミングしてｉＰＳ細胞を得る＞
一つの態様において、本発明はｉＰＳ細胞を生成するために、体細胞を再プログラミングおよび増殖するための方法を提供したものである。羊膜上皮細胞（ＡＥＣ）をフィーダー条件として、細胞が成長して継代の細胞を得ることで、ｉＰＳを得ることができる。例えば、体細胞は、適切な媒体、例えば、ウシ胎児血清で強化されたＤＭＥＭでＡＥＣのフィーダー層上に培養することができる。細胞は、約２−１４日間、典型的には約７日間、または細胞が未分化幹細胞の形態学的特徴を示すまで、培養される。
【００４９】
本方法で使用される培地は、従来の細胞培養のための媒体から選択することができる。血清含有培地は、通常、８０％ＤＭＥＭ培養液、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％非必須アミノ酸、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及び０．１ｍＭβ−メルカプトエタノールで作られる。培地はろ過して、４℃で２週間以内保存できる。無血清培地は８０％ＫＯ  ＤＭＥＭ培養液、２０％血清代替物（Ｇｉｂｃｏ  ＃１０８２８−０２８）、１％非必須アミノ酸、１ｍＭのＬ−グルタミン、および０．１ｍＭβ−メルカプトエタノールを含む。使用直前に、ヒトｂＦＧＦを添加して濃度が４８ｎｇ／ｍＬになるようにする。一つの実施形態において、ＤＭＥＭ培養液中に１０％ウシ胎児血清、ストレプトマイシン、ペニシリン及びグルタミンを含むものが使用される。ヒト血清及び／または臍帯血清を添加することができる。
【００５０】
また、培地中から誘導多能性幹細胞を選択するための方法は、本発明の記述したものに限られず、その他の、公知の手段を適切に用いることができる。例えば、薬剤耐性遺伝子または類似するものを一つのマーカー遺伝子とすることができる。薬剤耐性を指標として、多能性幹細胞を分離誘導することができる。胚性幹細胞に広く使用されている方法によって、当業者は分離した誘導多能性幹細胞の分化と増殖能力を確認することができる。
【００５１】
ｉＰＳ細胞は未分化幹細胞の特性形態学的特徴を持っている。標準的な２次元顕微鏡画像では、ｉＰＳ細胞は平面画像では細胞核／細胞質の比が高く、核小体は明確であり、コンパクトなコロニーを形成し、認識不十分な細胞間結合を有する。細胞株は、標準的なＧ−バンディング手法を用いて公開されたヒト核型と比較することができる。「通常な核型」を有するｉＰＳ細胞を獲得することが望ましく、これは正倍数体であることを意味する。ここにすべてのヒト染色体が存在し、著しい改変がない。ｉＰＳ細胞は、抗体（フローサイトメトリーや免疫細胞化学）または逆転写ＰＣＲによって検出可能な、発現されている細胞マーカーによって特徴付けすることができる。
【００５２】
ＰＣＲ技術はマーカー遺伝子の発現の検出に用いることができる。ｉＰＳ細胞は、任意の数の多能性細胞マーカーを発現することができる。これらの多能性細胞マーカーは、以下を含む：アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ＡＢＣＧ２、ステージ特異的胚抗原−１（ＳＳＥＡ−１）；ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１；Ｔｒａ−２−４９／６Ｅ、ＥＲａｓ／ＥＣＡＴ５、Ｅ−カドヘリン、β−ＩＩＩ−チューブリン、α−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）、線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４）、Ｃｒｉｐｔｏ、Ｄａｘｌ、ジンクフィンガータンパク質２９６（Ｚｆｐ２９６）、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ−１（Ｎａｔ１）、（ＥＳ細胞関連転写物１（ＥＣＡＴ１）、ＥＳＧ１／ＤＰＰＡ５／ＥＣＡＴ２、ＥＣＡＴ３、ＥＣＡＴ６、ＥＣＡＴ７、ＥＣＡＴ８、ＥＣＡＴ９、ＥＣＡＴ１０、ＥＣＡＴ１５−１、ＥＣＡＴ１５−２、Ｆｔｈｌｌ７、Ｓａｌｌ４、未分化胚細胞の転写因子（Ｕｔｆｌ）、Ｒｅｘｌ、ｐ５３遺伝子、Ｇ３ＰＤＨ、ＴＥＲＴを含むテロメラーゼ、サイレントＸ染色体遺伝子、Ｄｎｍｔ３ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＴＲＩＭ２８、Ｆ−ボックスタンパク質１５（Ｆｂｘｌ５）、Ｎａｎｏｇ／ＥＣＡＴ４、ＯＣＴ３  ／４、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４、Ｃ−Ｍｙｃ、Ｅｓｒｒｂ、ＴＤＧＦ１、ＧＡＢＲＢ３、Ｚｆｐ４２、ＦｏｘＤ３、ＧＤＦ３、ＣＹＰ２５Ａ１、多能性発達関連タンパク２（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ２：ＤＰＰＡ２）、Ｔ細胞リンパ腫ブレークポイント１（Ｔｃｌ１）、ＤＰＰＡ３／Ｓｔｅｌｌａ、ＤＰＰＡ４、その他の一般的多能性マーカー、例えば、Ｄｎｍｔ３Ｌ、Ｓｏｘｌ５、Ｓｔａｔ３、Ｇｒｂ２、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、β−カテニンとＢｍｉｌを含むものである。このような細胞はまた、ｉＰＳ細胞が誘導され、そこから分化した細胞の特徴的なマーカーの下方制御によって特徴付けすることができる。例えば、線維芽細胞由来のｉＰＳ細胞は線維芽細胞マーカーＴｈｙ１の下方制御及び／又はＳＳＥＡ−１の上方制御によって特徴付けられるものである。なお、本発明は、本明細書に記載されているマーカーに限定されず、そのような細胞表面マーカー、抗原、および他の遺伝子産物を含む。例えば、ＥＳＴｓ、ＲＮＡ（マイクロＲＮＡとアンチセンスＲＮＡを含む）、ＤＮＡ（遺伝子およびｃＤＮＡを含む）などのマーカー及びこれらの部分を包含する。これらのマーカーの発現を示すそれらのコロニーは、さらに治療への応用または保存用に用いることができる。
【００５３】
増殖ｉＰＳ細胞のもう一つの好ましい特徴は、三つの胚葉の細胞、すなわち内胚葉、中胚葉及び外胚葉の細胞すべてに分化する可能性を有することである。ｉＰＳ細胞多能性はＳＣＩＤマウスの奇形腫形成に用いることができ、三つの胚葉の代表的な組織を調べることによって確認できる。また、多能性はｉＰＳ細胞に非特異的分化をさせることにより（例えば、胚様体を形成する）調べることができ、次に培養で得た細胞のタイプについて免疫細胞化学によって決定することができる。
【００５４】
本明細書に記載の特定のｉＰＳ細胞の集団は、実質的に未分化であり、記載の条件下における多くの培地で継代することができる。継代時に、いくつかの細胞は分化する（特に低密度で単一の細胞として再播種し、または大きなクラスターの形成が可能である場合）。しかし、コンフルエンスに近づいた際、培養物は典型的には大部分が未分化細胞である。
【００５５】
＜多能性幹細胞の遺伝子改変＞
本発明はさらに、一過性または安定した方式で、遺伝子改変されたｉＰＳ細胞を得るためのシステムを提供するものである。細胞は、未分化している状態では所望の特性を付与するために改変することができ、これによってそれが他の細胞に分化する際は所望の特性を有するようにする。または方法を提供し、肯定的または否定的な選択による、特に未分化または分化した表現型の選択に必要な特性を与えるものである。
【００５６】
治療への応用のために、治療用遺伝子を持つ細胞に改変すること、または意図しているレシピエントと組織適合性細胞とすることは、有益であると思われる。遺伝子の改変は、分化後の選別のために細胞を調製するために使用することができる。例えば、未分化細胞特異的プロモーター（例えばＯＣＴ−４プロモーターまたはｈＴＥＲＴプロモーター）の制御下において、ｉＰＳ細胞に薬剤感受性遺伝子、例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（細胞がガンシクロビルに対し感受性を示すようにする）などを形質移入させる。培養で分化が起きた後に、ガンシクロビルで残りの未分化細胞を細胞集落から除去する。
【００５７】
ｉＰＳ細胞の形質移入に適したベクタープラスミドは、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，５７８，４７５；６，０２０，２０２、及び６，０５１，４２９に記載されている脂質／ＤＮＡ複合体が含まれる。ＤＮＡ−脂質複合体の製造に適した試薬は、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃１１６６８０１９）、ＦｕＧＥＮＥTM（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．＃１８１４４４３）；ＬｉｐｏＴＡＸＩTM（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，＃  ２０４１１０）を含む。安定した遺伝子変異を持つｉＰＳ細胞を生産するためのウイルスベクターシステムは、市販のウイルス成分を用いて調製し、アデノウイルス、レトロウイルス、またはレンチウイルスに基づくことができる。ｉＰＳ細胞の遺伝子改変は、遺伝子改変の十分に高い効率を達成する必要があり、望ましくない経路に沿うｉＰＳ細胞の分化を促進しないことが要求される。
【００５８】
遺伝子改変及び薬剤選択（薬剤耐性フィーダー層または無フィーダー培養）によって、変更した表現型を示すコロニーを選択して、それぞれ培養することが可能である。選択されたコロニーを２５−１００個の細胞の小さな塊に分散して、適切な環境において再播種して成長させる。高い比率（最大９０％）で未分化細胞が遺伝子組み換えされているｐＰＳ細胞を培養することができる。
【００５９】
＜増殖したｉＰＳ細胞の用途＞
本発明は、本明細書で記載する方法で生成したｉＰＳ細胞、及びこのような細胞群を提供することを開示している。再プログラミングした細胞は、多くの種類の細胞に分化させることができ、様々な応用と治療における用途を有している。幹細胞の基本的な特性（例えば無限の自己複製能力、及び体中の各種細胞タイプに分化することができる）のため、幹細胞は治療における理想的な選択肢となっている。
【００６０】
よって、一つの態様において、本発明は上記方法でｉＰＳ細胞を製造して、障害および／または疾病の治療または予防に用いる方法について提供する。該方法は対象から体細胞を採取して、体細胞をｉＰＳ細胞に再プログラミングすることを含む。細胞は適切な条件下において、疾病の治療に必要とする細胞タイプを分化するように培養される。分化した細胞を対象に取り入れ、疾病の予防または治療に用いる。
【００６１】
ｉＰＳ細胞は患者に特異的に製作すべきであり、免疫拒絶反応を回避するためである。これによって、現在の移植方法に存在する重大な問題を未然に回避すべきである。例えば、移植組織に対する拒絶反応は、ホストの移植組織に対する拒絶、移植組織のホストに対する拒絶のため起こりうる。例えば、骨髄移植で使用するｉＰＳ細胞は、潜在的な副作用を有する免疫抑制剤の大量使用を回避することができる。
【００６２】
ｉＰＳ細胞は、当技術分野で公知の方法により種々の疾病を治療するために、異なる種類の細胞の数に分化することができる。例えば、ｉＰＳ細胞は造血幹細胞、筋細胞、心筋細胞、肝細胞、軟骨細胞、上皮細胞、尿路細胞、神経細胞などに誘導分化することができる。分化した細胞を患者の体内に戻って移植することで、その後の疾病の予防または治療をすることができる。例えば、神経系統の細胞が必要であれば、ｉＰＳ細胞を、一種または複数種類の神経栄養因子（例えばニューロトロフィン３または脳由来神経栄養因子）及び一個または複数個の分裂促進剤（例えば表皮成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、血小板由来増殖因子、インスリン様成長因子１及びエリスロポエチン）を含む培養液に用いることができる。培養細胞は、必要に応じて、これらが発現するＡ２Ｂ５またはＮＣＡＭマーカーに基づいて分離することができる。神経細胞（成熟したニューロン）、グリア細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイトを含む）の両方を生成する能力を有する神経前駆細胞を得ることができる。また、複製神経前駆細胞は分化細胞群を形成する能力を有する形で取得することができる。ここにおいて、細胞群の少なくとも５％の細胞がチロシン水酸化酵素を発現することができ、チロシン水酸化酵素はドーパミン作動性ニューロンのマーカーである。肝細胞系の細胞が所望される場合、ｉＰＳ細胞は、例えば、ｎ−ブチレートなどのヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下で培養することができる。培養細胞は、同時にまたは連続的に、肝細胞成熟因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）、例えばＥＧＦ、インスリン、およびＦＧＦの存在下で培養することができる。心筋細胞の特徴的なマーカーを発現する細胞が必要な場合は、分化は、ＤＮＡのメチル化に影響するヌクレオチド類似物（例えば、５−ａｚａ−デオキシ−シチジン）、成長因子、骨形態形成タンパク質を入れて、分化を促進させる。これらの細胞は密度に基づく細胞分離によりさらに濃縮され得、クレアチン、カル二チン、タウリンを加えた培地中で維持され得る。
【００６３】
本発明の方法は、神経疾患の治療または予防に使用することができる。このような疾患としては、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、リソソーム蓄積症、多発性硬化症、脊髄損傷などが挙げられる。本発明の方法は、個別の遺伝子の変異の修正に用いることができる。このような遺伝子変異は嚢胞性線維症、血友病、および多くのがん（例えば、乳癌および卵巣癌の発症リスクを高めるＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２の変異に関連付けられるようなもの）などの疾患の主な原因となる。
【００６４】
本発明の方法で生産された細胞は、対象の組織または分化した細胞系の修復や再生に利用することができる。該方法は、本明細書に記載の方法によって得た再プログラミング細胞を対象の体内に入れることを含む。対象は例えば、心筋梗塞、うっ血性心不全、脳卒中、虚血、末梢血管疾患、アルコール性肝疾患、肝硬変、パーキンソン病、アルツハイマー病、糖尿病、癌、関節炎、創傷治癒、免疫不全、再生不良性貧血、貧血、遺伝性疾患または類似の疾患を有し、特定の細胞タイプ／組織の増加や交換、または細胞の脱分化が望まれている。一つの態様において、対象は、組織や臓器に損傷があり、療法は、組織または器官の生物学的機能を高めるために、または組織や臓器に存在する細胞数を増やすのに十分な細胞の投与量を提供している。別の態様において、対象は疾患、障害または状態を持ち、療法は、疾患、障害または状態を改善または安定化するのに十分な細胞の投与量を提供している。さらに別の実施形態では、対象は体内の特定種類の細胞類型、例えば循環血液細胞が不足しており、療法はこのような循環血液細胞を回復させることができる。
【００６５】
本発明の分化細胞はそれを必要とするヒト患者における組織の再生／再構成に使用することができる。適切な方式によって細胞を投入して、それを予期する組織部位に移植させ、機能欠陥区域の再生または再構成をさせる。
【００６６】
一例を挙げると、治療される疾患によっては、神経幹細胞は、直接中枢神経系の実質や髄腔内位置に移植される。移植組織は単一細胞の懸濁液または小さな集合体（細胞密度はμＬあたり２５，０００  ５００，０００個）を用いて作られる。（米国特許５９６８８２９号参照）。神経細胞移植の有効性は、急性脊髄損傷のためのラットモデルで評価することができる（ＭｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：１４１０，１９９９；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：５０，２００２参照）。成功した移植の場合、移植由来細胞を、２〜５週間後に病変部に存在することが見られる。これらはアストロサイト、オリゴデンドロサイト、および／または神経細胞に分化することができる。病変の端から脊髄に沿って移行し、歩行、協調性、体重面において改善が見られる。
【００６７】
心筋細胞の有効性は心臓冷凍損傷（ｃｒｙｏｉｎｊｕｒｙ）の動物モデルによって評価することができ、該モデルは５５％の左心室壁組織が、瘢痕組織になっている（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．６２：６５４，１９９６；Ｓａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．８：２０７４，１９９９，Ｓａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１１８：７１５，１９９９）。治療の成功は、傷の面積を削減し、傷の拡大を制限して、収縮期圧、拡張期圧及び最高圧（ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）によって決められる心機能を改善する。心臓の損傷は、左前下行枝の遠位部に塞栓コイルを使用してモデル化することができ（Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．７：２３９，１９９８）、または冠動脈左前下行枝のライゲーションによって擬制することができる（Ｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２：２８８，２００２）。治療の有効性は、組織および心機能によって評価することができる。本発明に具現化される心筋細胞調製物は、心臓の筋肉を再生し、不十分な心臓機能を治療することに使用することができる（米国特許第５９１９４４９及びＷＯ９９／０３９７３）。
【００６８】
肝臓細胞と肝臓細胞前駆体の、肝臓損傷を修復する能力は動物モデルによって評価することができる。その一例は、腹腔にＤ−ガラクトサミンを注射することによる損傷である（Ｄａｂｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４３：１６０６，１９９３）。肝細胞マーカーの免疫組織化学染色によって治療の有効性を確認することができる。成長組織内の細管構造を形成するかどうかの確認、および肝臓特異的タンパク質の合成の確認で、治療効果を評価することができる。肝臓細胞は治療において、直接注射による投与で治療に使用することができ、患者が突発性肝不全を起こした後に肝臓組織再生をする際に、生物補助装置の一部分として臨時の肝機能を提供することができる。
【００６９】
商業的に販売することを目的に、本発明で製造した細胞は通常、医薬組成物の形態で提供され、等張賦形剤などの補助剤を含むことができ、人体への投与のために無菌条件下で調製されている。細胞成分の医薬製剤中における一般的な原則について、以下を参照すること。Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，ｂｙ  Ｇ．Ｍｏｒｓｔｙｎ＆Ｗ．Ｓｈｅｒｉｄａｎ  ｅｄｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６；ａｎｄ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｅ．Ｄ．Ｂａｌｌ，Ｊ．Ｌｉｓｔｅｒ＆Ｐ．Ｌａｗ，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，２０００。細胞は、配布や臨床使用に適した装置または容器に包装されるべきであり、必要に応じて、組織再生における細胞の使用に関する情報や、治療的に重要な代謝機能を保持すべきである。
【実施例】
【００７０】
以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態についてさらに説明するためのものである。これらの実施例は、請求の範囲によって定義された本発明の内容を、限定するためのものではない。
【００７１】
＜実施例１＞ヒト羊膜上皮細胞の製作
この実施例は、ヒト羊膜上皮細胞（ｈＡＥＣｓ）の調製について記載している。ヒト羊膜は帝王切開の妊婦から得たものである。ヒト羊膜を胎盤上から剥離した後、下にあるスポンジ層及び線維芽細胞層を取り除いた後、羊膜細胞と基底膜ゾーン（ＢＭＺ）（重層上皮の下にある）を含む羊膜を得て、膜上から羊膜細胞を分離した。膜を細かく裁断し、ＲＰＭＩ  １６４０培地の入っている２５０ｍｌのフラスコに入れた。細胞は０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡで３０分間消化させ、二回目は１５分間消化させた。細胞を遠心分離により収集し、６ウェルプレートに播種した。細胞はＤＭＥＭ培養基＋１０％ＦＢＳ（ＰＡＡ  Ａｕｓｔｒｉａ）、及び一般的に細胞培養で使用されている抗生物質を有するものにおいて細胞培養され、３７°Ｃ，５％ＣＯ２で培養した。
【００７２】
＜実施例２＞成人皮膚線維芽細胞（ＡＤＳＦ）の分離
この実施例は成人皮膚線維芽細胞（ＡＤＳＦ）の調製について説明したものである。ＡＤＳＦ細胞を含む成人皮膚組織または瘢痕組織を分離して、冷ＰＢＳ中に置いた。皮膚は約１ｍｍ２大きさの片に切断され、０．２５％トリプシン、０．２ｍｇ／ｍｌＤＮａｓｅＩを含むＰＢＳにおいて３７℃で３０分間培養して、１５％の熱不活化ウマ血清を含むＤＭＥＭで中和した。細胞濃度を約１×１０６／ｍｌに調整して、６ウェルプレートに播種する。細胞は、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
【００７３】
＜実施例３＞マウス線維芽細胞（ＭＦ）の分離
この実施例はマウス線維芽細胞の分離について説明している。無菌条件下において、マウスの耳から採取した組織を、約１ｍｍ３の断片に切断した。組織は、ＰＢＳで２回洗浄し、６ウェルプレートの、ＤＭＥＭ培地中に置かれ、終夜培養した。二日目に、２ｍｌの培地を添加し、プレートの約９０％が細胞で覆われるまで培養を継続した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
【００７４】
＜実施例４＞ブタ胚性線維芽細胞の分離
この実施例は、ブタ胚性線維芽細胞の分離について説明している。無菌条件下において、ブタの胚をＰＢＳで２−３回洗浄した。豚の頭部及び内臓を廃棄して、残りの胚組織を約１ｍｍ３の断片に切断した。ＰＢＳで２回洗浄して、血液細胞を除去した。ＤＭＥＭ培地を加え、組織を３７℃、５％ＣＯ２で終夜培養した。二日目に、６ｍｌの培地を加えて、プレートの約９０％が被覆されるまで培養を継続した。
【００７５】
＜実施例５＞ＡＤＳＦ由来の多能性幹細胞（ＡＤＳＦ−ｉＰＳ）の調製
ＡＤＳＦ細胞は中国福祉会国際平和婦幼保健院（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｅａｃｅ  Ｍａｔｅｒｎｉｔｙ  ａｎｄ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｎａ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）によって提供され、実施例２に記載のように調製した。細胞はｈＡＥＣフィーダー層と共に、ＫＯ−ＤＭＥＭ培地（１０ｎｇ／ｍｌβＦＧＦ、５％ヒト臍帯血清及び１２ｎｇ／ｍｌ  ｈＬＩＦを含む）を使用して培養した。細胞の状態については培養過程を通して観察された。培養は３７°Ｃ、５％ＣＯ２条件下で培養した。その結果は図１に示すとおりである。７日間培養した後に、外観がＥＳ細胞に似たクローンが見られた。
【００７６】
＜実施例６＞マウス線維芽細胞由来の多能性幹細胞の製作
実施例２に記載のようにマウス線維芽細胞を調製した。細胞は、ＫＯ−ＤＭＥＭ培地（１０ｎｇ／ｍｌβＦＧＦ、５％ヒト臍帯血清、１２ｎｇ／ｍｌ  ｈＬＩＦを含む）にｈＡＥＣフィーダー層と共に培養した。細胞の状態については培養過程を通して観察された。培養は３７°Ｃ、５％ＣＯ２条件下で培養した。その結果は図５に示すとおりである。３日間培養した後に、外観がＥＳ細胞に似たクローンが見られた。
【００７７】
＜実施例７＞ブタ胚性線維芽細胞由来の多能性幹細胞の調製
実施例２に記載のようにブタ胚性線維芽細胞を調製した。細胞は、ＫＯ−ＤＭＥＭ培地（１０ｎｇ／ｍｌβＦＧＦ、５％ヒト臍帯血清、１２ｎｇ／ｍｌ  ｈＬＩＦを含む）にｈＡＥＣフィーダー層と共に培養した。細胞の状態については培養過程を通して観察された。培養は３７°Ｃ、５％ＣＯ２、５％Ｏ２条件下で培養した。その結果は図７に示すとおりである。５〜７日間培養した後に、外観がＥＳ細胞に似たクローンが見られた。
【００７８】
＜実施例８＞免疫蛍光アッセイ
この例は免疫蛍光技術を用いることで、ｉＰＳ細胞の幹細胞マーカー遺伝子の発現について分析することを説明している。細胞はＰＢＳで３回洗浄し、室温において２％パラホルムアルデヒドで固定した。ＰＢＳで３回洗浄し、毎回５分間であった。０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で室温において１５ｍｉｎ浸透させた。次に、ＰＢＳで３回洗浄して、毎回５分間であった。５％ＢＳＡで室温において２時間ブロッキングした。ＳＳＥＡ−４、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ−４に対する一次抗体を加え、終夜培養した。ＰＢＳで３回洗浄して、毎回５分間であった。室温下において二次蛍光マーカーで１時間反応させ、標識させた。細胞は室温下において、暗い環境中で、Ｈｏｃｈｅｓｔ染料（１：１０００）と共に、培養した。グリセリン神経節溶解後に陽性細胞が観察される。ＡＤＳＦ−ｉＰＳ細胞の分析の結果は、図２に示すとおりである。ＡＤＳＦ−ｉＰＳ細胞中の陽性幹細胞マーカーは染色されていることがわかる。ＭＦ−ｉＰＳ細胞の分析の結果は、図６に示すとおりである。
【００７９】
＜実施例９＞ｑ−ＰＣＲ技術による遺伝子発現分析
この実施例は、ＲＴ−ＰＣＲ技術を用いてｉＰＳ細胞の幹細胞マーカー遺伝子の発現の分析について説明している。ｍＲＮＡの抽出及びＲＴ−ＰＣＲ法は、製造メーカの指示（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＡＳ−１０５０）に従って行われた。それぞれのマーカー遺伝子に使用したＰＣＲプライマーは表１に示すとおりである。各グループの細胞のｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社のＲｅａｌＰｌｅｘ装置を用いる）のテンプレートとした。ＲＴ−ＰＣＲは２ステップ法によって行い、ターゲットとなるフラグメントの増幅は、１８ｓ  ｒＲＮＡ量の相対的定量方法によって計算した。
【００８０】
【表１】
2013514059.tif 000003
【００８１】
ｉＰＳ細胞マーカー遺伝子発現分析の結果を図３及び４に示す。データは正規化して、コントロールのパーセンテージとして表されている。ＡＤＳＦ−ｉＰＳにおいて、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ＴＥＲＴの発現はｈＡＥＣでの２０倍超である。これらの幹細胞マーカー（ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ、ＫＬＦ−４、ＴＥＲＴ）のｉＰＳ細胞における発現はＥＳより高かったが、ＯＣＴ−４の発現はＥＳより低かった。ＡＤＳＦには、幹細胞マーカーの発現は少ししかない。
【００８２】
これらの実施例の結果は、以下のことを示している。ｈＡＥＣをフィーダー層とするヒト成人皮膚線維芽細胞は適切な培養環境において、幹細胞に類似するクローンに誘導することができる。これらのクローンには、幹細胞マーカーの高い発現が見られた。ｈＡＥＣによって誘導されるＡＤＳＦクローンは、通常の方法を使用する（すなわち、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、ＫＬＦ４を細胞に形質移入する、マウスｉＰＳの場合は２週間、ヒトｉＰＳの場合は４週間）ｉＰＳ細胞よりも早く出現した。さらに、クラスターで取得される細胞の量は通常の方法で得られる量よりもはるかに多かった。このように、本発明の方法は、成人の体細胞組織からのｉＰＳ細胞を生成するのに有用である。
【００８３】
＜実施例１０＞マウスｉＰＳ細胞からの染色体セントロメアの確認
細胞の調製。マウス線維芽細胞から派生した１×１０６の多能性細胞を１００ｍｍ培養皿に播種した。４８時間の培養後、培地を変更して（５ｍＬ）一晩インキュベートした。次に、７０ｎｇ／ｍＬのコルヒチンを添加し、培養を５時間続けた。細胞を回収し、７５ｍＭのＫＣ１で１０〜２０分間処理して、固定液（メタノール：酢酸＝３：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ））で固定した細胞懸濁液を得た。
【００８４】
プライムドｉｎ  ｓｉｔｕ（ＰＲＩＮＳ）標識。染色体を見えるようにするために、固定された中期細胞をスライド上に滴下して１〜４日間熟成する。次に、脱イオンホルムアミドでスライドを２分間変性させ、エタノールシリーズ（７０、９０および１００％）で脱水する。スライドを風乾した後、次の成分を追加した。即ち、バッファ（２０μｌ）、グリセロール（１０μｌ）、ｄＮＴＰ−ｄｉｇ（５μｌ）、順方向プライマー及び逆方向プライマー（５μｌ）、５μｌのＴａｑポリメラーゼ、及び脱イオン水（１５８μｌ）を追加した。プライマーの配列は以下の通りであった。Ｍａｊｏｒ  ｓａｔＤＮＡ：５’−ＧＧＡＣＣＴＧＧＡＡＴＡＴＧＧＣＧＡＧＡＡＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）；ａｎｄ  Ｍｉｎｏｒ  ｓａｔＤＮＡ：５’−ＴＧＡＴＡＴＡＣＡＣＴＧＴＴＣＴＡＣＡＡＡＴＣＣＣＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）。
【００８５】
アニーリング温度で１０分間放置し、それから７２℃に昇温して１２分間伸長させる。スライドを７２℃  ＮＥ溶液中で５ｍｉｎ洗浄した後に取り出す。４＊ＳＳＣ／０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０溶液中で５ｍｉｎ洗浄する。スライドを乾燥してから抗ジゴキシン（Ｄｉｇｏｘｉｎ）標識抗体を滴下、３７℃で３０分間インキュベートした。スライドを取り出してＰＢＳ／０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０で５分間洗浄して空気乾燥した。最後に、ＤＡＰＩを加えて、細胞を蛍光顕微鏡下で観察した。
【００８６】
実験結果は図８に示すとおりである。観察されたセントロメアはいずれも染色体の頂端に位置し、染色体はマウスに由来することを意味している。さらには、ｈＡＥＣヒト羊膜細胞染色体の汚染がないことが示されている。核型の分析によれば、ｉＰＳ細胞は正常な二倍体核型であり、４０本の染色体を有した。
【００８７】
＜実施例１１＞誘導多能性細胞の奇形腫形成
本実施例では、奇形腫を形成するためにｉＰＳ細胞の能力を調べた。ｉＰＳ細胞はマウス皮膚線維芽細胞から、ヒト羊膜上皮細胞の存在下で誘導した。体内での誘導多能性細胞の多能性を調べるために、細胞を免疫不全ヌードマウスの背側腹部に皮下移植した。注射の８週間後、腫瘍の形成が観察された。検査では腫瘍が多種の組織を含み（図９）、腺組織（内胚葉）、筋肉（中胚葉）、皮膚組織（外胚葉）を含むことがわかる。奇形腫の組織構造は、ｉＰＳ細胞が発生多能性を有していることを示した。
【００８８】
特に定義しない限り、使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般的に理解しているものと同じ意味を有する。本明細書で提供されるすべてのヌクレオチド配列は、５’から３’方向で表示されている。
【００８９】
本発明が本明細書において具体的に開示していない、いかなる要素または複数の要素、制限または複数の制限が存在しない状況においても適切に実施することができる。例えば、用語「含む」「からなる」「構成する」は広義的に且つ無制限に理解すべきである。また、本明細書が使用する用語及び表現は、示される特徴または部分的に均等ないかなる物をも排除するものではない。本発明の範囲内で各種変更を行うことを認める。
【００９０】
よって、以下のように理解すべきである。発明は、好ましい実施形態またはいかなる特徴が具体的に開示される。しかし、当業者は、本明細書が含む発明について修正、改善及び変更を加えることができる。このような修正、改善または変更は本発明の範囲内である。本明細書で提供する材料、方法、および実施例は、代表的な好ましい実施形態であり、例示であり、かつ本発明の範囲を限定するものではない。
【００９１】
本文において、本発明は広く、一般的な方法によって説明されている。この概括的な開示内容の範囲内に入るいかなる狭いジャンルまたはサブジャンルも本発明の一部分である。これは、切り取られる材料が具体的に記載されているか否かに関わらず、任意の対象事項を種類から取り除く否定的な制限や但し書きを付した発明の概括的な記載を含む。
【００９２】
なお、本発明の特徴または局面がマーカッシュ群について説明している場合、当業者は、本発明は該マーカッシュ群の要素における、いかなる単独の要素及びサブグループについても言及していることは自明であると理解すべきである。
【００９３】
ここで言及したすべての出版物、特許出願、特許及びその他の参考文献は、全体として参考にすることができ、その範囲はそれぞれ単独で考慮した場合と同じである。矛盾がある場合、本明細書における定義を対照として用いることができる。
【００９４】
その他の実施形態は以下の請求項に沿って展開させることができる。
【図１】
2013514059.tif 000004
【図２】
2013514059.tif 000005
【図３Ａ】
2013514059.tif 000006
【図３Ｂ】
2013514059.tif 000007
【図３Ｃ】
2013514059.tif 000008
【図４Ａ】
2013514059.tif 000009
【図４Ｂ】
2013514059.tif 000010
【図４Ｃ】
2013514059.tif 000011
【図５】
2013514059.tif 000012
【図６】
2013514059.tif 000013
【図７】
2013514059.tif 000014
【図８】
2013514059.tif 000015
【図９Ａ】
2013514059.tif 000016
【図９Ｂ】
2013514059.tif 000017
【図９Ｃ】
2013514059.tif 000018
【配列表】
2013514059000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年6月18日(2012.6.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘導多能性幹細胞を製作するための方法であって、
一つまたは複数の体細胞を、羊膜細胞のフィーダー層上で一定時間培養し、該一定時間は体細胞を多能性幹細胞に再プログラミングするのに十分な時間であることを特徴とする、誘導多能性幹細胞を製作するための方法。
【請求項２】
上記羊膜細胞は羊膜上皮細胞、胚体外の間葉系細胞または羊水細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記羊膜上皮細胞は哺乳動物の羊膜上皮細胞であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記哺乳動物の羊膜上皮細胞は霊長類、ブタ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ウサギ及びげっ歯類に由来することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記羊膜上皮細胞は、ヒト羊膜上皮細胞であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記羊膜上皮細胞は、継代培養６代目以内のもの（Ｐ０−Ｐ５）であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
上記羊膜上皮細胞は、新たに分離されたＰ０羊膜上皮細胞であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記体細胞は成熟した体細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
上記体細胞は胚ステージからの体細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
上記体細胞は成人皮膚線維芽細胞（ＡＤＳＦ）、ヒト胚性線維芽細胞（ＨＥＦ）、マウス線維芽細胞（ＭＦ）、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）、ブタ線維芽細胞（ＰＦ）、及びブタ胚性線維芽細胞（ＰＥＦ）からなる群より選ばれたものであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
上記細胞はＫＯ−ＤＭＥＭ培地で培養されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
上記ＫＯ−ＤＭＥＭ培地はｂＦＧＦ、ヒト臍帯血清、新生児ウシ血清、胎児ウシ血清及びＬＩＦを含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
上記ＫＯ−ＤＭＥＭ培地は１０ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦ、５％ヒト臍帯血清及び１２ｎｇ／ｍｌ  ＬＩＦを含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法によって得られた誘導多能性幹細胞。
【請求項１５】
請求項１４に記載の多能性幹細胞を誘導分化することにより得られた体細胞、生殖細胞、組織または器官。
【請求項１６】
（１）対象から体細胞を採取すること、
（２）請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法により、体細胞を多能性幹細胞に再プログラミングすること、
（３）多能性幹細胞の分化を誘導することを含む、幹細胞を用いて治療をする方法。
【請求項１７】
多能性幹細胞の誘導分化は、生体内で行われることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
多能性幹細胞の誘導分化は、生体外で行われることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
分化した細胞を対象に移植することをさらに含むことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
上記幹細胞療法は、再生医療、組織工学療法または動物育種に用いられることを特徴とする請求項１６に記載の方法。 
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は全般的に細胞生物学分野に係るものである。具体的には、多能性幹細胞の増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）、培養条件及び材料に係り、幹細胞の増殖及び利用を促進するためのものである。
【背景技術】
【０００２】
第三者の理解を助けるために、以下のように説明を提供する。下記説明によって提供された情報または引用されている参考情報を本発明の従来技術とすることはできない。
【０００３】
幹細胞は自己複製能力を有し、無限に分裂することができる。且つ、適切な状況において、異なるタイプの細胞に分化することができる。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は初期胚から樹立されるものであって、長時間にわたり培養することが可能で、同時に生体内に存在するすべての種類の細胞に分化できる多能性能力を維持している。これと比較して、体性幹細胞は発育した器官中で見られるものであって、自身のような細胞または自身よりさらに分化された細胞に分裂する能力を有するものである。
【０００４】
Ｔｈｏｍｓｏｎら（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，８４３，７８０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：７８４４，１９９５）は初めて霊長類動物多能性幹細胞の分離と増殖に成功した。彼らはその後、ヒト胚盤胞から、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）細胞株を得た（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４，  １９９８）。Ｇｅａｒｈａｒｔ及び共同研究者らは胎児生殖腺組織からヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞株を得た（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：１３７２６，  １９９８；Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ６，０９０，６２２）。ｈＥＳ及びｈＥＧ細胞の両方が、多能性幹細胞の望まれた特性を有し、即ちこれらは分化することなく広く培養を続けることができる。これらは正常な核型を持ち、数々なタイプの重要な細胞を生成することができる。
【０００５】
誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）は非多能性細胞（典型的には成体体細胞）から人工的に誘導された多能性幹細胞である。２００６年に、山中らは四つの遺伝子（ＯＣＴ−４、ＳＯＸ２、ｃ−ＭＹＣ、ＫＬＦ４）をマウス線維芽細胞に形質移入してｉＰＳ細胞を得た。次に、ヒト成体体細胞からｉＰＳ細胞を作製した（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ，１３１：８６１−８７２（２００７）；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８：１９１７−１９２０，２００７）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
再生医学分野は、損傷した細胞、組織または器官の、修復、交換または再生を支援するための治療法を網羅したものである。幹細胞に基づいた治療法は、広い範囲の疾病を治療できることが有望視されている。これらの疾病は、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中、骨髄損傷、心臓発作、腎不全、骨粗しょう症、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、火傷及び創傷を含む。しかし、このような治療法の進歩には多くの障碍があり、例えばドナーから得た胚性幹細胞とレシピエントとが免疫的に不適合であることにより、免疫拒絶反応を引き起こす可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は幹細胞を生成するための方法に係るものである。一つの態様において、本発明は誘導多能性幹細胞を取得する方法を提供する。すなわち、羊膜上皮細胞フィーダー層上において、一個または複数個の体細胞を培養して、誘導多能性幹細胞を取得する方法である。一つの実施形態において、羊膜上皮細胞は哺乳類動物の羊膜上皮細胞である。一つの実施形態において、哺乳動物の羊膜上皮細胞は、人、豚、犬、馬、牛、羊及びラットまたはマウスのようなげっ歯類哺乳動物に由来するものである。一つの実施形態において、羊膜上皮細胞はヒト羊膜上皮細胞（ｈＡＥＣ）である。一つの実施形態において、羊膜上皮細胞は培養６代目（Ｐ０−Ｐ５）以内のものである。一つの実施形態において、羊膜上皮細胞は新しく分離されたＰ０羊膜上皮細胞である。
【０００８】
一つの実施形態において、体細胞は成人皮膚線維芽細胞（ＡＤＳＦ）、ヒト胚性線維芽細胞（ＨＥＦ）、マウス線維芽細胞（ＭＦ）、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）、ブタ線維芽細胞（ＰＦ）、ブタ胚性線維芽細胞（ＰＥＦ）からなる群より選ばれるものである。一つの実施形態において、体細胞は成人皮膚線維芽細胞（ＡＤＳＦ）である。
【０００９】
一つの実施形態において、細胞はＫＯ−ＤＭＥＭ培地で培養されている。一つの実施形態において、ＫＯ−ＤＭＥＭ培地はｂＦＧＦ（アルカリ性繊維芽細胞成長因子）、ヒト臍帯血清及びＬＩＦ（白血病抑制因子）が含まれる。
【００１０】
例示的な実施形態において、ＫＯ−ＤＭＥＭ培地は１０ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦ、５％ヒト臍帯血清、新生児ウシ血清、ウシ胎児血清、及び１２ｎｇ／ｍｌＬＩＦで構成されている。
【００１１】
一つの実施形態において、本発明は上記方法によって得られた誘導多能性幹細胞を提供することを開示する。一つの形態において、本発明は多能性幹細胞の分化を誘導することによって得られた体細胞を提供することを開示する。
【００１２】
一つの形態において、本発明は幹細胞療法を提供することを開示する。該方法は、以下を含む。（ａ）対象（ヒトまたは動物）から体細胞を分離、収集する。（ｂ）体細胞を多能性幹細胞に再プログラミングする。（ｃ）多能性幹細胞の分化を誘導する。（ｄ）（ｃ）で分化した細胞を被検体に移植する。いくつかの実施形態では、幹細胞療法は再生医療、組織工学療法および／または動物の繁殖に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ヒト成人皮膚線維芽細胞（ＡＤＳＦ）をヒト羊膜上皮細胞（ｈＡＥＣ）フィーダー層で培養した場合の顕微鏡写真である。７日間後に、外観上、胚性幹細胞に類似している細胞クローンが観察された。
【図２】図２Ａ及び図２ＢはＡＤＳＦ細胞をｈＡＥＣフィーダー層上で７日間培養した後のクローンを幹細胞マーカーで染色した場合の一連の顕微写真である。この結果から、得られた細胞はＯＣＴ−４、ＮＡＮＯＧ、ＳＳＥＡ−４、ＫＬＦ４、Ｃ−ＭＹＣ、ＴＡＲ−８１、ＴＡＲ−６０等の幹細胞特異的マーカーを発現している。
【図３Ａ】図３（Ａ）は７日間培養したＡＤＳＦ−ｉＰＳ細胞におけるマーカーの定量発現を示したチャートである。
【図３Ｂ】図３（Ｂ）は７日間培養したＡＤＳＦ−ｉＰＳ細胞におけるマーカーの定量発現を示したチャートである。
【図３Ｃ】図３（Ｃ）は７日間培養したＡＤＳＦ−ｉＰＳ細胞におけるマーカーの定量発現を示したチャートである。
【図４Ａ】図４（Ａ）は１２日間培養した後の各種細胞における幹細胞マーカーの定量発現を示したチャートである。
【図４Ｂ】図４（Ｂ）は１２日間培養した後の各種細胞における幹細胞マーカーの定量発現を示したチャートである。
【図４Ｃ】図４（Ｃ）は１２日間培養した後の各種細胞における幹細胞マーカーの定量発現を示したチャートである。
【図５】マウス線維芽細胞（ＭＦ）をｈＡＥＣフィーダー層上で培養した場合の顕微鏡写真である。３日間後に、外観上、胚性幹細胞に類似している細胞クローンが観察された。
【図６】ｈＡＥＣフィーダー層で３日間培養したマウス線維芽細胞が形成したクローンにおける幹細胞マーカー染色を示した一連の染色顕微写真である。
【図７】ブタ胚性線維芽細胞（ＰＥＦ）をｈＡＥＣフィーダー層で培養した場合の顕微鏡写真である。
【図８】抗ジゴキシン標識抗体で標識された、マウス染色体におけるセントロメアの顕微鏡写真である。観察されたセントロメアは染色体の頂端に位置し、これはｈＡＥＣ染色体汚染（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）が起きていないことを示している。核型解析：マウスの正常な二倍体の核型を持ち、画像中において全部で４０本の染色体が見られる。
【図９Ａ】図９ＡはｉＰＳ細胞に由来する奇形腫の組織構造の一連の顕微鏡写真である。図９（Ａ）は腺組織（内胚葉）である。
【図９Ｂ】図９ＢはｉＰＳ細胞に由来する奇形腫の組織構造の一連の顕微鏡写真である。図９（Ｂ）は筋肉（中胚葉）である。
【図９Ｃ】図９ＣはｉＰＳ細胞に由来する奇形腫の組織構造の一連の顕微鏡写真である。図９（Ｃ）は皮膚組織（外胚葉）である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の実質的な理解を助けるために、以下に本発明の特定の様式、モード、実施形態、バリエーション及び本発明の特徴について、様々なレベルで詳細に説明する。
【００１５】
本発明の実施において、分子生物学、タンパク質生化学、細胞生物学、免疫学、微生物学及び組み替えＤＮＡにおける多くの従来技術が用いられている。これらの技術は広く知られるものであり、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＩＩ，Ａｎｓｕｂｅｌ，Ｅｄ．（１９９７）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｓ．Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ，Ｇｌｏｖｅｒ，Ｅｄ．（１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｇａｉｔ，Ｅｄ．（１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ＆Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．（１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ＆Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．（１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｅｄ．（１９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８４）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｃａｌｏｓ，Ｅｄｓ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８７）；ａｎｄ  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５，Ｗｕ＆Ｇｒｏｓｓｍａｎ，ａｎｄ  Ｗｕ，Ｅｄｓ．でそれぞれ説明されている。ポリペプチド遺伝子の発現産物の水準（すなわち遺伝子翻訳の水準）を検出し測定する方法は、当技術分野で周知であり、抗体検出及び定量技術のようなポリペプチド検出方法を含む（Ｓｔｒａｃｈａｎ＆Ｒｅａｄ，Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９９９）参照）。
【００１６】
特に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野における当業者が一般的に理解する意味と同じものである。明確に指示しない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されている単数形は複数形を含む。例えば「一個の細胞」は二つまたは二つ以上の細胞のようなものを含む。
【００１７】
本明細書中で使用する用語「アミノ酸」は天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸を含み、同様に、機能が天然に存在するアミノ酸に類似するアミノ酸類似体、及びアミノ酸模倣物を含む。天然アミノ酸は遺伝子コードによってプログラムされるものであり、同様に、後に修飾されたアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシルグルタミン酸及びＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然アミノ酸と基本的に同じ化学構造を有する化合物を指し、すなわちα−炭素原子に一つの水素原子、一つのカルボキシル基、一つのアミノ基及び一つのＲ基が結合しているものであり、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムである。このような類似体は修飾されたＲ基（例えばノルロイシン）または改変されたペプチド骨格を有し、同時に天然に存在するアミノ酸の基本的な化学構造を保持している。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を持つ化合物を指すが、その機能は天然に存在するアミノ酸の機能と類似するものである。アミノ酸は、それらの一般に知られている３つの文字記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨される１文字の記号によって本明細書中で言及することができる。同様に、ヌクレオチドも広く使われている単一の文字コードで参照することができる。
【００１８】
本明細書で使用する用語「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子または抗原結合フラグメントのフレームワーク領域を含むポリペプチドであり、該フレームワーク領域は抗原と特異的に結合して識別するものである。抗体という用語の使用は、抗体全体を含み、単鎖の抗体全体をも含む。用語「抗体」は、二重特異性抗体及び多重特異性抗体を含み、所望の生物活性または機能を示すものであればよい。
【００１９】
本明細書で使用される用語「発現」は、遺伝子をｍＲＮＡ前駆体に転写すること、ｍＲＮＡ前駆体にスプライシングまたはその他の処理を行うことによって成熟ｍＲＮＡを生成すること、ｍＲＮＡの安定性、成熟ｍＲＮＡをタンパク質に翻訳すること（コドンとしての使用及びｔＲＮＡの使用可能性）、及び適切な発現及び機能が必要であれば、翻訳生成物のグリコシル化及び／またはその他の修飾を行うことからなる群から選ばれる一つまたは複数であるが、これに限定されない。
【００２０】
本明細書中で使用される用語「フィーダー細胞」は一種の細胞であり、他種類の細胞と共同培養することができ、その他種類の細胞の成長発育に優れた環境を提供するためのものである。いくつかの実施形態において、体細胞をｉＰＳ細胞に再プログラミングするために、体細胞とフィーダー細胞、例えば羊膜上皮細胞とを一緒に培養する。
【００２１】
本明細書で使用される用語「遺伝子」はＤＮＡセグメントを指し、一つのＲＮＡ生成物の生合成を制御するすべての情報を含み、プロモーター、エクソン、イントロン及びその他の発現制御用非翻訳領域を含む。
【００２２】
本明細書で使用される用語「分離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」は、普通な場合での自然な付随物がなるべく低減された、または好ましくは実質的に完全に除去されていることをいう。よって、用語「分離された細胞」とは、細胞が実質上その他の自然な環境物質（例えばその他の細胞、タンパク質、核酸など）から完全に分離したことをいう。用語「分離された」という用語が核酸及びポリペプチドと一緒となっている場合は、例えば、ＤＮＡ組み換え技術で生産した場合は、核酸またはポリペプチドが細胞物質または培基を実質的に含まないことを意味する。化学合成の場合は、前駆的化学物質またはその他の化学物質を有しないことを意味する。分離された核酸は、典型的に、核酸が抽出された生物における該核酸の隣接の遺伝子配列（すなわち、該核酸の５’末端及び３’末端に位置する配列）を含まない。
【００２３】
本明細書で使用される用語「多能性幹細胞（ＰＳ細胞）」とは、適切な条件下で幾種類かの異なるタイプの細胞の子孫を生成できる細胞である。ＰＳ細胞は三つの胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）に属する子細胞を生成することができる。本分野において許容される実験によれば、例えば、適切な宿主において奇形腫を生成する能力、または三つの胚葉の典型的な組織類型に分化して発現するマーカーが見られる。ＰＳ細胞の定義に含まれるのは様々な種類の胚細胞であり、例えば胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）であり、誘導多能性幹細胞は成体体細胞から再プログラミングされたものである。
【００２４】
明示的に説明した場合を除き、ＰＳ細胞は主要な組織、及びＰＳ細胞の表現型特徴を有する確立された細胞系を含み、及びこのような細胞系の誘導体で、三つの胚葉層のそれぞれの子孫を形成する能力をまだ持っているものを含むと当業者は理解するであろう。ＰＳ細胞培養物は「未分化」または「実質的に未分化」と表現され、幹細胞及びその誘導物のほとんどは未分化細胞の形態的特徴を示すものであり、これらを胚や成体由来の分化細胞と明確に区別することができる。当業者は未分化のＰＳ細胞を容易に識別することができ、通常は二次元顕微鏡下において、高い細胞核／細胞質の比を示し、核小体は明確に見られる。未分化の細胞のコロニーは通常、分化済みの隣接の細胞によって囲まれる。それにもかかわらず、細胞の集団が適切な条件下で培養または継代されても、未分化コロニーは維持され、個々の未分化細胞は、細胞集団においてかなりの割合を構成する。実質的に分化していない培養物は、少なくとも２０％の未分化ＰＳ細胞を含み、少なくとも４０％、６０％、または８０％の未分化ＰＳ細胞を含む。
【００２５】
本明細書で使用される用語「誘導多能性幹細胞」（略称ｉＰＳ細胞）は、ＥＳ細胞と似たような特性を有するものであり、非多能性細胞（典型的には成体体細胞）から人工的に誘導された未分化細胞を含む。
【００２６】
本明細書で使用される用語「再プログラミング」及び文法上同等の表現は、体細胞の分化ステータスを改変させる、または反転させるプロセスをいい、上記体細胞は部分的に、または完全に分化されたものである。体細胞の再プログラミングは、体細胞の分化状態を部分的に、または完全に復帰させるものである。いくつかの実施形態において、体細胞が誘導多能性幹細胞に再プログラミングされたとき、再プログラミングは完了する。しかし、場合によっては再プログラミングが部分的であり、分化レベルがより低い段階に戻る。例を挙げてみれば、一つの最終的に分化した細胞を分化レベルの比較的低い段階に戻し、例えば多能性細胞に戻すことをいう。
【００２７】
本明細書で使用される用語「体細胞」は、任意の非生殖細胞（生殖細胞とは、卵子、精子、またはこのようなもの）をいう。体細胞はそのＤＮＡを次の世代に継承させないものである。典型的に、体細胞は限られた多能性を有し、または多能性を有しない。ここで使用される体細胞は天然に存在するもの、または遺伝子修飾によって得られたものである。
【００２８】
＜総論＞
一つの態様において、本発明はｉＰＳ細胞を得るための方法を提供する。いくつかの実施形態において、該方法は、羊膜上皮細胞のフィーダー層（ＡＥＣｓ）で体細胞を充分な時間をかけて培養し、体細胞を脱分化また再プログラミングさせることを含む。
【００２９】
もう一つの形態において、本発明はｉＰＳ細胞及びこれらのｉＰＳ細胞から分化して得られた体細胞を提供する。ｉＰＳ細胞は、哺乳動物の細胞であり、例えばマウス、ヒト、ラット、ウシ、ヒツジ、馬、ハムスター、マウス、犬、モルモット、またはサルの細胞である。例えば、体細胞の再プログラミングは、患者特異的または疾患特異的多能性幹細胞を生成する機会を提供している。形態、増殖、遺伝子発現、及び奇形腫形成において、ｉＰＳ細胞とＥＳ細胞とを区別することはできない。また、胚盤胞に移植した際、ｉＰＳ細胞は成体キメラを生じさせることができ、これは生殖細胞系の移行（ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）に有能である（Ｍａｈｅｒａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １：５５−７０，２００７；Ｏｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４４８：３１３−１７，２００７；Ｗｅｒｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４４８：３１８−３２４，２００７）。ヒトｉＰＳ細胞はまた、拡張性を有するものであり、形態および増殖において、ヒト胚性幹細胞（ＥＳ）と区別することができない。さらに、これらの細胞はインビトロまたは奇形腫において、三つの胚葉の細胞類型に分化することができる。
【００３０】
本発明の方法のメリットの一つ目は卵子、胚、胚性幹細胞を必要としない状況において、体細胞からｉＰＳ細胞を生成できる点である。メリットの二つ目は、ｉＰＳ細胞は外因性の核酸および／または化学薬品の添加を必要としない状況のもとで、体細胞を誘導してｉＰＳ細胞を生成できることである。メリットの三つ目は、羊膜上皮細胞をフィーダーとし、マイトマイシンＣ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ）を添加しない点である。マイトマイシンＣは誘導多能性細胞の核型の変化を引き起こす可能性があるＤＮＡ損傷剤である。したがって、マイトマイシンＣの使用は、将来の臨床応用への潜在的なリスクが生じる可能性がある。メリットの四つ目は操作が簡単で、制御しやすく、コストが低く、効率が高く、再現性が高いことである。
【００３１】
理論によって制限されることを望まないが、ＡＥＣのフィーダー細胞、またはフィーダー細胞由来の細胞外マトリックスの使用は、多能性を誘導し、幹細胞の増殖を促進するために必要とする１つまたはそれ以上の物質を提供していると信じられている。そのような物質には、細胞によって周囲の培地中に分泌されている、膜結合および／または可溶性細胞生成物が含まれていると考えられる。
【００３２】
＜ＡＥＣ細胞の製造＞
一つの実施形態において、羊膜上皮細胞（ＡＥＣ）は、ｉＰＳ細胞に脱分化する体細胞を誘導する、即ち「再プログラミング」のために体細胞を培養する際のフィーダー層として使用されるものである。ＡＥＣは、受精後約８日目の胞胚の初期内部細胞塊から得られる。用語「羊膜」は、母体と胎児との間の重要な物質輸送用組織であり、胎膜を指す。ＡＥＣは、ヒト、ブタ、ウシ、ヒツジ、マウス、ラットなどの哺乳動物に由来することができる。
【００３３】
適切な実施の形態において、ＡＥＣは、ヒトＡＥＣ（ｈＡＥＣ）である。ｈＡＥＣｓは、ヒト羊膜から入手することができる。当業者は公知の方法で、さらに活性細胞の精製および濃縮を行うことができる。また、羊膜組織の絨毛膜及びその他の胎盤組織を除去する。羊膜層は、鉗子、滅菌メスを使用して、基礎となる絨毛膜層から穏やかに除去することができる。羊膜層は、機械的に分解され、ならびに／または隣接細胞間の接続を弱めることが可能な消化酵素および／またはキレート剤で処理され、個々の細胞の組織懸濁液に分散させる。もう一つの実施形態において、本発明は、胎盤の絨毛膜または脱落膜も、ＡＥＣの由来として使用することができる。
【００３４】
酵素による解離は、任意の数の消化酵素で羊膜層を処理することによって行うことができる。このような酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼおよび／またはヒアルロニダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。一つの実施形態において、分離された羊膜組織は、個々の細胞を解離するためにトリプシンで処理されている。一つの実施形態において、組織のインキュベーションに使用されたトリプシン濃度は約０．０５％である。一つの実施形態において、組織の酵素での消化時間はおおよそ１０−４０ｍｉｎであり、３０ｍｉｎがもっとも適切である。組織はまた、酵素を用いて複数の処理を行うことができる。組織の分離技術は、例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，２ｄ  Ｅｄ．，Ａ．Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７，Ｃｈ．９，ｐｐ．１０７−１２６．を参照することができる。
【００３５】
細胞の懸濁液を調製した後、細胞は、基礎培地に、血清、ホルモン、成長因子、サイトカイン、抗生物質、微量元素および他の添加剤を加えた培地で培養することができる。成長因子とサイトカインは線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）またはオンコスタチンＭを含む。培地中の添加剤は、インスリン、トランスフェリン、セレニウム（ＩＴＳ）、グルコース、インターロイキン６、及び酪酸ナトリウムまたはトリコスタチンＡのようなヒストンデアセチラーゼ阻害剤を含むことができる。
【００３６】
一つの実施形態において、羊膜由来細胞は培地中のＤＭＥＭ培地に移動し、ＤＭＥＭ培養液は１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（５．５μｇ／ｍｌ）、セレニウム（６．７ｎｇ／ｍｌ）およびエタノールアミン（２μｇ／ｍｌ）を含む。さらに、ピルビン酸ナトリウムと非必須アミノ酸（１％）を培地に添加することができる。当業者はまた、一つまたは複数の市販物質を、ＡＥＣの成長をサポートするために、培地への添加、または置換として使用することができる。細胞は冷凍保存をすることができ、解凍時はその機能と生存を保持することができる。
【００３７】
これらの細胞は組織培養皿で、またはフラスコ内に入れて細胞懸濁液で培養することができる。球状の細胞体を形成するものである。組織培養皿上に成長させたとき、表面を静電的または細胞外マトリックス成分で被覆することができる。細胞が接触による阻害を回避し、増殖成長条件を維持するために、培養皿がいっぱいに達する前に継代することができる。
【００３８】
＜体細胞の由来＞
再プログラミングすることができる体細胞の類型については特に限定がない。任意の種類の体細胞を使用することができる。成熟した体細胞が使用できるのと同様に、胚段階の体細胞も使用することができる。体細胞は初代培養細胞または不死化細胞であってもよい。このような細胞は、新たに動物から分離されたものと初代培養細胞（非不死化細胞）である可能性があり、または細胞株（不死化細胞）に由来する可能性がある。一つの実施形態では、体細胞は哺乳動物の細胞である、例えば、ヒト細胞またはマウス細胞である。従来の方法では、異なる器官から公知の方法によって得ることが可能であるが、例えば皮膚、肺、膵臓、肝臓、胃、腸、心臓、生殖器官、膀胱、腎臓、尿道や他の泌尿器官に限らず、またはいかなる活性細胞（ｌｉｖｉｎｇ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）を有する器官または組織、または血液細胞から採取できる。本発明において有用な哺乳類の体細胞は、成体幹細胞、脂肪細胞、間葉系細胞、セルトリ細胞、内皮細胞、顆粒膜上皮細胞、神経細胞、膵島細胞、表皮細胞、上皮細胞、肝細胞、毛包細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（ＢおよびＴリンパ球）、赤血球、マクロファージ、単球、単核細胞、線維芽細胞、心筋細胞、その他の既知の筋肉細胞、及び一般的には、任意の生きている体細胞である。特定の実施形態においては、線維芽細胞が使用されている。本明細書で使用される用語「体細胞」は、また、「成体幹細胞」をも含むことを意図している。成体幹細胞は、特定の組織のあらゆる細胞のタイプを生成することができる細胞である。典型的な成体幹細胞は造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞を含む。
【００３９】
ヒト体細胞の取得するための方法はすでに確立されたものであり、例えばＳｃｈａｎｔｚ  ａｎｄ  Ｎｇ（２００４），Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｗｏｒｌｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｐｔｅ，Ｌｔｄを参照することができる。いくつかの場合において、この方法は例えば生検（例えば皮膚サンプル）、採血などにより組織サンプルを入手する。組織から調製した細胞の初期培養密度は、その特定の組織からの細胞の期待生存率や付着などの変数に基づいて変化する。ヒト体細胞の様々なタイプを獲得するための方法は、以下の例示的な方法を含むが、これらに限られない。
【００４０】
骨髄。ドナーを全身麻酔した後、腹臥位に寝かす。腸骨の後縁から、収集針が直接皮膚に、腸骨の表面を介して骨髄へ挿入され、注射器で骨髄から液を抽出する。体性幹細胞は骨髄の骨形成ゾーンから骨髄細胞を分離することによって濃縮される。単核細胞分画は、その後密度勾配遠心分離により準備、収集される。収集された粗（ｃｒｕｄｅ）単核細胞分画は、その後再プログラミングのために本明細書で記載した方法により培養を行う。
【００４１】
皮膚組織。真皮を含む皮膚組織は、例えば、膝や臀部の裏側から切り取られる。皮膚組織は採取された後、皮膚の内側を下向きにし、０．６％トリプシン／ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ−１２に１％の抗生物質または抗真菌剤を添加し、３７℃で３０分間インキュベーションする。皮膚組織のひっくり返した後、ピンセットで軽く皮膚の内側をスクラブする。はさみを使用して皮膚組織を細かく１ｍｍ四方に切断し、その後１０分間、１２００ｒｐｍで、室温下で遠心分離する。上澄み液を除去し、０．１％トリプシン／ＤＭＥＭ／Ｆ−１２に１％の抗生物質や抗真菌剤を加えた２５ｍｌを、組織の沈殿物に追加する。混合物を３７℃で４０分間、スターラーを用いて２００−３００ｒｐｍで撹拌する。組織の沈殿が完全に消化されることを確認した後、３ｍｌのウシ胎児血清（ＦＢＳ）を追加し、ガーゼ、１００μｍナイロンフィルター、４０μｍナイロンフィルターで順次濾過した。１２００ｒｐｍで室温で１０分間遠心を行い、得られたろ液の上澄み液を除去して、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２に１％の抗生物質や抗真菌剤を加えたもので沈殿物を洗浄し、その後１２００ｒｐｍで１０分間、室温で遠心分離した。こうして得られた細胞画分は、その後再プログラミング前に培養されている。
【００４２】
表皮幹細胞はヒト頭皮組織（０．５−２ｃｍ２またはそれより小さい）から濃縮することができる。ヒト頭皮組織をすすぎ、余分の脂肪組織を除去するためにトリミングした後、小さい片に切断する。これらの組織片を１２．５ｍｇ／ｍｌディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）酵素で処理した後、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で２４時間４℃で消化する。酵素処理後、表皮が真皮から脱落し、毛包が真皮から出てくる。毛包球部及び完全な外根鞘（ＯＲＳ）を顕微鏡下で剥離する。洗浄後の毛包を培養皿中に入れる。細い針で球部（ｂｕｌｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を上部の毛包から剥離する。洗浄後の球部を新しい培養皿中に入れて、ＤＭＥＭ／Ｆ１２及び１０％ウシ胎児血清を含む培基で培養を行った。
【００４３】
骨格筋。結合組織を含む筋肉（例えば、上腕二頭筋や腿部縫工筋の外側頭部など）の表皮をカットして、筋肉組織を摘出する。得られた筋肉全体をハサミまたはメスで細かく切り、０．０６パーセントコラゲナーゼタイプＩＡおよび１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（高グルコース）に懸濁させ、２時間３７℃でインキュベートする。粉砕した筋肉から遠心分離によって細胞を回収し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（高グルコース）に懸濁させる。懸濁液を４０μｍの細孔径と２０μｍの細孔径のマイクロフィルターを通し、得られた細胞画分は、粗精製した未分化幹細胞を含むものであり、ヒト多能性幹細胞の誘導に使用することができる。
【００４４】
脂肪組織。脂肪組織由来の細胞は、当業者に熟知の種々の方法により分離することができる。脂肪組織の採取元の一つは、大網脂肪組織である。人体において、脂肪細胞は、通常、脂肪吸引によって分離されたものである。一つの細胞分離の方法において、脂肪組織は、０．０１％〜０．５％コラゲナーゼ、０．０１％〜０．５％トリプシン、及び／または０．５ｎｇ／ｍｌ−１０ｎｇ／ｍｌディスパーゼ、または有効量のヒアルロニダーゼまたはＤＮａｓｅを含む、約０．０１〜２．０ｍＭ  ＥＤＴＡ中で２５℃〜５０℃で１０ｍｉｎ〜３ｈ処理する。細胞は孔径が２０μｍ〜８００μｍのナイロンまたはチーズクロスの網目を通してろ過される。その後、培養液中の細胞が直接遠心分離またはフィコール、パーコールまたは他の粒子グラデーションを使用して分けられる。細胞は、４−５０℃において１００〜３０００ｇ、１分〜１時間で遠心分離される。こうして得られた脂肪組織由来の細胞画分は、未分化幹細胞を含む粗精製した細胞として本明細書に記載の方法に従って培養を行い、ヒト多能性または多能性幹細胞の誘導に使用することができる。
【００４５】
血液。約５０ｍｌ〜約５００ｍｌの静脈血または臍帯血を採取して、単核細胞分画は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ法によって得る。Ｋａｎｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｋ，ａｎｄ  Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，ｃｈ．７．１．１．−７．１．５，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照すること。単核細胞分画に分離した後、約１ｘ１０７〜１ｘ１０８のヒト末梢血単核細胞を、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び１００単位／ｍｌペニシリンを含むＲＰＭＩ  １６４０培養基に懸濁させて、二回洗浄した後に、細胞を回収する。回収された細胞をＲＰＭＩ  １６４０培基中に懸濁させて、次に１００ｍｍのプラスチック培養皿中に密度が培養皿ごとに１ｘ１０７細胞となるように播種（ｐｌａｔｅｄ）し、３７℃、８％ＣＯ２インキュベータ中で培養する。１０分後、懸濁液中に残った細胞を除去し、ピペット操作により壁に付着している細胞を回収した。その結果、壁に付着していた単核細胞分画は、その後再プログラミング前に培養されている。いくつかの場合では、上記方法によって得られた末梢血または臍帯血由来の壁に付着の細胞は、未分化幹細胞を含む粗精製した細胞として本明細書に記載の方法に従って培養を行い、ヒト多能性または多能性幹細胞の誘導に使用することができる。
【００４６】
末梢血中のマクロファージは、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社，Ｌｅｎａｘａｍ，Ｋａｎｓ．）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加した低グルコースＤＭＥＭ中において単核細胞分画を培養することにより濃縮することができる。マクロファージを増殖させるために、末梢血単核細胞を２ｘ１０６／ｍｌの密度で培養皿中に播種し、１０μｇ／ｍｌ  ＦＮ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）で処理しながら４℃で終夜放置する。細胞を３７℃、５％ＣＯ２の加湿大気中でいかなる追加の増殖因子も使わずに培養する。浮遊細胞を含む培地は３日ごとに変えられる。線維芽細胞の特徴が見られるマクロファージは、再プログラミングに用いることができる。
【００４７】
ｉＰＳ細胞を疾病の治療に用いる場合、患者から分離された体細胞を使用することが望ましい。例えば、疾患に関与する体細胞、または治療に参加する体細胞を使用することができる。
【００４８】
＜体細胞を再プログラミングしてｉＰＳ細胞を得る＞
一つの態様において、本発明はｉＰＳ細胞を生成するために、体細胞を再プログラミングおよび増殖するための方法を提供したものである。羊膜上皮細胞（ＡＥＣ）をフィーダー条件として、細胞が成長して継代の細胞を得ることで、ｉＰＳを得ることができる。例えば、体細胞は、適切な媒体、例えば、ウシ胎児血清で強化されたＤＭＥＭでＡＥＣのフィーダー層上に培養することができる。細胞は、約２−１４日間、典型的には約７日間、または細胞が未分化幹細胞の形態学的特徴を示すまで、培養される。
【００４９】
本方法で使用される培地は、従来の細胞培養のための媒体から選択することができる。血清含有培地は、通常、８０％ＤＭＥＭ培養液、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％非必須アミノ酸、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及び０．１ｍＭβ−メルカプトエタノールで作られる。培地はろ過して、４℃で２週間以内保存できる。無血清培地は８０％ＫＯ  ＤＭＥＭ培養液、２０％血清代替物（Ｇｉｂｃｏ  ＃１０８２８−０２８）、１％非必須アミノ酸、１ｍＭのＬ−グルタミン、および０．１ｍＭβ−メルカプトエタノールを含む。使用直前に、ヒトｂＦＧＦを添加して濃度が４８ｎｇ／ｍＬになるようにする。一つの実施形態において、ＤＭＥＭ培養液中に１０％ウシ胎児血清、ストレプトマイシン、ペニシリン及びグルタミンを含むものが使用される。ヒト血清及び／または臍帯血清を添加することができる。
【００５０】
また、培地中から誘導多能性幹細胞を選択するための方法は、本発明の記述したものに限られず、その他の、公知の手段を適切に用いることができる。例えば、薬剤耐性遺伝子または類似するものを一つのマーカー遺伝子とすることができる。薬剤耐性を指標として、多能性幹細胞を分離誘導することができる。胚性幹細胞に広く使用されている方法によって、当業者は分離した誘導多能性幹細胞の分化と増殖能力を確認することができる。
【００５１】
ｉＰＳ細胞は未分化幹細胞の特性形態学的特徴を持っている。標準的な２次元顕微鏡画像では、ｉＰＳ細胞は平面画像では細胞核／細胞質の比が高く、核小体は明確であり、コンパクトなコロニーを形成し、認識不十分な細胞間結合を有する。細胞株は、標準的なＧ−バンディング手法を用いて公開されたヒト核型と比較することができる。「通常な核型」を有するｉＰＳ細胞を獲得することが望ましく、これは正倍数体であることを意味する。ここにすべてのヒト染色体が存在し、著しい改変がない。ｉＰＳ細胞は、抗体（フローサイトメトリーや免疫細胞化学）または逆転写ＰＣＲによって検出可能な、発現されている細胞マーカーによって特徴付けすることができる。
【００５２】
ＰＣＲ技術はマーカー遺伝子の発現の検出に用いることができる。ｉＰＳ細胞は、任意の数の多能性細胞マーカーを発現することができる。これらの多能性細胞マーカーは、以下を含む：アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ＡＢＣＧ２、ステージ特異的胚抗原−１（ＳＳＥＡ−１）；ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１；Ｔｒａ−２−４９／６Ｅ、ＥＲａｓ／ＥＣＡＴ５、Ｅ−カドヘリン、β−ＩＩＩ−チューブリン、α−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）、線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４）、Ｃｒｉｐｔｏ、Ｄａｘｌ、ジンクフィンガータンパク質２９６（Ｚｆｐ２９６）、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ−１（Ｎａｔ１）、（ＥＳ細胞関連転写物１（ＥＣＡＴ１）、ＥＳＧ１／ＤＰＰＡ５／ＥＣＡＴ２、ＥＣＡＴ３、ＥＣＡＴ６、ＥＣＡＴ７、ＥＣＡＴ８、ＥＣＡＴ９、ＥＣＡＴ１０、ＥＣＡＴ１５−１、ＥＣＡＴ１５−２、Ｆｔｈｌｌ７、Ｓａｌｌ４、未分化胚細胞の転写因子（Ｕｔｆｌ）、Ｒｅｘｌ、ｐ５３遺伝子、Ｇ３ＰＤＨ、ＴＥＲＴを含むテロメラーゼ、サイレントＸ染色体遺伝子、Ｄｎｍｔ３ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＴＲＩＭ２８、Ｆ−ボックスタンパク質１５（Ｆｂｘｌ５）、Ｎａｎｏｇ／ＥＣＡＴ４、ＯＣＴ３  ／４、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４、Ｃ−Ｍｙｃ、Ｅｓｒｒｂ、ＴＤＧＦ１、ＧＡＢＲＢ３、Ｚｆｐ４２、ＦｏｘＤ３、ＧＤＦ３、ＣＹＰ２５Ａ１、多能性発達関連タンパク２（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ２：ＤＰＰＡ２）、Ｔ細胞リンパ腫ブレークポイント１（Ｔｃｌ１）、ＤＰＰＡ３／Ｓｔｅｌｌａ、ＤＰＰＡ４、その他の一般的多能性マーカー、例えば、Ｄｎｍｔ３Ｌ、Ｓｏｘｌ５、Ｓｔａｔ３、Ｇｒｂ２、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、β−カテニンとＢｍｉｌを含むものである。このような細胞はまた、ｉＰＳ細胞が誘導され、そこから分化した細胞の特徴的なマーカーの下方制御によって特徴付けすることができる。例えば、線維芽細胞由来のｉＰＳ細胞は線維芽細胞マーカーＴｈｙ１の下方制御及び／又はＳＳＥＡ−１の上方制御によって特徴付けられるものである。なお、本発明は、本明細書に記載されているマーカーに限定されず、そのような細胞表面マーカー、抗原、および他の遺伝子産物を含む。例えば、ＥＳＴｓ、ＲＮＡ（マイクロＲＮＡとアンチセンスＲＮＡを含む）、ＤＮＡ（遺伝子およびｃＤＮＡを含む）などのマーカー及びこれらの部分を包含する。これらのマーカーの発現を示すそれらのコロニーは、さらに治療への応用または保存用に用いることができる。
【００５３】
増殖ｉＰＳ細胞のもう一つの好ましい特徴は、三つの胚葉の細胞、すなわち内胚葉、中胚葉及び外胚葉の細胞すべてに分化する可能性を有することである。ｉＰＳ細胞多能性はＳＣＩＤマウスの奇形腫形成に用いることができ、三つの胚葉の代表的な組織を調べることによって確認できる。また、多能性はｉＰＳ細胞に非特異的分化をさせることにより（例えば、胚様体を形成する）調べることができ、次に培養で得た細胞のタイプについて免疫細胞化学によって決定することができる。
【００５４】
本明細書に記載の特定のｉＰＳ細胞の集団は、実質的に未分化であり、記載の条件下における多くの培地で継代することができる。継代時に、いくつかの細胞は分化する（特に低密度で単一の細胞として再播種し、または大きなクラスターの形成が可能である場合）。しかし、コンフルエンスに近づいた際、培養物は典型的には大部分が未分化細胞である。
【００５５】
＜多能性幹細胞の遺伝子改変＞
本発明はさらに、一過性または安定した方式で、遺伝子改変されたｉＰＳ細胞を得るためのシステムを提供するものである。細胞は、未分化している状態では所望の特性を付与するために改変することができ、これによってそれが他の細胞に分化する際は所望の特性を有するようにする。または方法を提供し、肯定的または否定的な選択による、特に未分化または分化した表現型の選択に必要な特性を与えるものである。
【００５６】
治療への応用のために、治療用遺伝子を持つ細胞に改変すること、または意図しているレシピエントと組織適合性細胞とすることは、有益であると思われる。遺伝子の改変は、分化後の選別のために細胞を調製するために使用することができる。例えば、未分化細胞特異的プロモーター（例えばＯＣＴ−４プロモーターまたはｈＴＥＲＴプロモーター）の制御下において、ｉＰＳ細胞に薬剤感受性遺伝子、例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（細胞がガンシクロビルに対し感受性を示すようにする）などを形質移入させる。培養で分化が起きた後に、ガンシクロビルで残りの未分化細胞を細胞集落から除去する。
【００５７】
ｉＰＳ細胞の形質移入に適したベクタープラスミドは、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，５７８，４７５；６，０２０，２０２、及び６，０５１，４２９に記載されている脂質／ＤＮＡ複合体が含まれる。ＤＮＡ−脂質複合体の製造に適した試薬は、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃１１６６８０１９）、ＦｕＧＥＮＥTM（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．＃１８１４４４３）；ＬｉｐｏＴＡＸＩTM（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，＃  ２０４１１０）を含む。安定した遺伝子変異を持つｉＰＳ細胞を生産するためのウイルスベクターシステムは、市販のウイルス成分を用いて調製し、アデノウイルス、レトロウイルス、またはレンチウイルスに基づくことができる。ｉＰＳ細胞の遺伝子改変は、遺伝子改変の十分に高い効率を達成する必要があり、望ましくない経路に沿うｉＰＳ細胞の分化を促進しないことが要求される。
【００５８】
遺伝子改変及び薬剤選択（薬剤耐性フィーダー層または無フィーダー培養）によって、変更した表現型を示すコロニーを選択して、それぞれ培養することが可能である。選択されたコロニーを２５−１００個の細胞の小さな塊に分散して、適切な環境において再播種して成長させる。高い比率（最大９０％）で未分化細胞が遺伝子組み換えされているｐＰＳ細胞を培養することができる。
【００５９】
＜増殖したｉＰＳ細胞の用途＞
本発明は、本明細書で記載する方法で生成したｉＰＳ細胞、及びこのような細胞群を提供することを開示している。再プログラミングした細胞は、多くの種類の細胞に分化させることができ、様々な応用と治療における用途を有している。幹細胞の基本的な特性（例えば無限の自己複製能力、及び体中の各種細胞タイプに分化することができる）のため、幹細胞は治療における理想的な選択肢となっている。
【００６０】
よって、一つの態様において、本発明は上記方法でｉＰＳ細胞を製造して、障害および／または疾病の治療または予防に用いる方法について提供する。該方法は対象から体細胞を採取して、体細胞をｉＰＳ細胞に再プログラミングすることを含む。細胞は適切な条件下において、疾病の治療に必要とする細胞タイプを分化するように培養される。分化した細胞を対象に取り入れ、疾病の予防または治療に用いる。
【００６１】
ｉＰＳ細胞は患者に特異的に製作すべきであり、免疫拒絶反応を回避するためである。これによって、現在の移植方法に存在する重大な問題を未然に回避すべきである。例えば、移植組織に対する拒絶反応は、ホストの移植組織に対する拒絶、移植組織のホストに対する拒絶のため起こりうる。例えば、骨髄移植で使用するｉＰＳ細胞は、潜在的な副作用を有する免疫抑制剤の大量使用を回避することができる。
【００６２】
ｉＰＳ細胞は、当技術分野で公知の方法により種々の疾病を治療するために、異なる種類の細胞の数に分化することができる。例えば、ｉＰＳ細胞は造血幹細胞、筋細胞、心筋細胞、肝細胞、軟骨細胞、上皮細胞、尿路細胞、神経細胞などに誘導分化することができる。分化した細胞を患者の体内に戻って移植することで、その後の疾病の予防または治療をすることができる。例えば、神経系統の細胞が必要であれば、ｉＰＳ細胞を、一種または複数種類の神経栄養因子（例えばニューロトロフィン３または脳由来神経栄養因子）及び一個または複数個の分裂促進剤（例えば表皮成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、血小板由来増殖因子、インスリン様成長因子１及びエリスロポエチン）を含む培養液に用いることができる。培養細胞は、必要に応じて、これらが発現するＡ２Ｂ５またはＮＣＡＭマーカーに基づいて分離することができる。神経細胞（成熟したニューロン）、グリア細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイトを含む）の両方を生成する能力を有する神経前駆細胞を得ることができる。また、複製神経前駆細胞は分化細胞群を形成する能力を有する形で取得することができる。ここにおいて、細胞群の少なくとも５％の細胞がチロシン水酸化酵素を発現することができ、チロシン水酸化酵素はドーパミン作動性ニューロンのマーカーである。肝細胞系の細胞が所望される場合、ｉＰＳ細胞は、例えば、ｎ−ブチレートなどのヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下で培養することができる。培養細胞は、同時にまたは連続的に、肝細胞成熟因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）、例えばＥＧＦ、インスリン、およびＦＧＦの存在下で培養することができる。心筋細胞の特徴的なマーカーを発現する細胞が必要な場合は、分化は、ＤＮＡのメチル化に影響するヌクレオチド類似物（例えば、５−ａｚａ−デオキシ−シチジン）、成長因子、骨形態形成タンパク質を入れて、分化を促進させる。これらの細胞は密度に基づく細胞分離によりさらに濃縮され得、クレアチン、カル二チン、タウリンを加えた培地中で維持され得る。
【００６３】
本発明の方法は、神経疾患の治療または予防に使用することができる。このような疾患としては、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、リソソーム蓄積症、多発性硬化症、脊髄損傷などが挙げられる。本発明の方法は、個別の遺伝子の変異の修正に用いることができる。このような遺伝子変異は嚢胞性線維症、血友病、および多くのがん（例えば、乳癌および卵巣癌の発症リスクを高めるＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２の変異に関連付けられるようなもの）などの疾患の主な原因となる。
【００６４】
本発明の方法で生産された細胞は、対象の組織または分化した細胞系の修復や再生に利用することができる。該方法は、本明細書に記載の方法によって得た再プログラミング細胞を対象の体内に入れることを含む。対象は例えば、心筋梗塞、うっ血性心不全、脳卒中、虚血、末梢血管疾患、アルコール性肝疾患、肝硬変、パーキンソン病、アルツハイマー病、糖尿病、癌、関節炎、創傷治癒、免疫不全、再生不良性貧血、貧血、遺伝性疾患または類似の疾患を有し、特定の細胞タイプ／組織の増加や交換、または細胞の脱分化が望まれている。一つの態様において、対象は、組織や臓器に損傷があり、療法は、組織または器官の生物学的機能を高めるために、または組織や臓器に存在する細胞数を増やすのに十分な細胞の投与量を提供している。別の態様において、対象は疾患、障害または状態を持ち、療法は、疾患、障害または状態を改善または安定化するのに十分な細胞の投与量を提供している。さらに別の実施形態では、対象は体内の特定種類の細胞類型、例えば循環血液細胞が不足しており、療法はこのような循環血液細胞を回復させることができる。
【００６５】
本発明の分化細胞はそれを必要とするヒト患者における組織の再生／再構成に使用することができる。適切な方式によって細胞を投入して、それを予期する組織部位に移植させ、機能欠陥区域の再生または再構成をさせる。
【００６６】
一例を挙げると、治療される疾患によっては、神経幹細胞は、直接中枢神経系の実質や髄腔内位置に移植される。移植組織は単一細胞の懸濁液または小さな集合体（細胞密度はμＬあたり２５，０００  ５００，０００個）を用いて作られる。（米国特許５９６８８２９号参照）。神経細胞移植の有効性は、急性脊髄損傷のためのラットモデルで評価することができる（ＭｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：１４１０，１９９９；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：５０，２００２参照）。成功した移植の場合、移植由来細胞を、２〜５週間後に病変部に存在することが見られる。これらはアストロサイト、オリゴデンドロサイト、および／または神経細胞に分化することができる。病変の端から脊髄に沿って移行し、歩行、協調性、体重面において改善が見られる。
【００６７】
心筋細胞の有効性は心臓冷凍損傷（ｃｒｙｏｉｎｊｕｒｙ）の動物モデルによって評価することができ、該モデルは５５％の左心室壁組織が、瘢痕組織になっている（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．６２：６５４，１９９６；Ｓａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．８：２０７４，１９９９，Ｓａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１１８：７１５，１９９９）。治療の成功は、傷の面積を削減し、傷の拡大を制限して、収縮期圧、拡張期圧及び最高圧（ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）によって決められる心機能を改善する。心臓の損傷は、左前下行枝の遠位部に塞栓コイルを使用してモデル化することができ（Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．７：２３９，１９９８）、または冠動脈左前下行枝のライゲーションによって擬制することができる（Ｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２：２８８，２００２）。治療の有効性は、組織および心機能によって評価することができる。本発明に具現化される心筋細胞調製物は、心臓の筋肉を再生し、不十分な心臓機能を治療することに使用することができる（米国特許第５９１９４４９及びＷＯ９９／０３９７３）。
【００６８】
肝臓細胞と肝臓細胞前駆体の、肝臓損傷を修復する能力は動物モデルによって評価することができる。その一例は、腹腔にＤ−ガラクトサミンを注射することによる損傷である（Ｄａｂｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４３：１６０６，１９９３）。肝細胞マーカーの免疫組織化学染色によって治療の有効性を確認することができる。成長組織内の細管構造を形成するかどうかの確認、および肝臓特異的タンパク質の合成の確認で、治療効果を評価することができる。肝臓細胞は治療において、直接注射による投与で治療に使用することができ、患者が突発性肝不全を起こした後に肝臓組織再生をする際に、生物補助装置の一部分として臨時の肝機能を提供することができる。
【００６９】
商業的に販売することを目的に、本発明で製造した細胞は通常、医薬組成物の形態で提供され、等張賦形剤などの補助剤を含むことができ、人体への投与のために無菌条件下で調製されている。細胞成分の医薬製剤中における一般的な原則について、以下を参照すること。Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，ｂｙ  Ｇ．Ｍｏｒｓｔｙｎ＆Ｗ．Ｓｈｅｒｉｄａｎ  ｅｄｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６；ａｎｄ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｅ．Ｄ．Ｂａｌｌ，Ｊ．Ｌｉｓｔｅｒ＆Ｐ．Ｌａｗ，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，２０００。細胞は、配布や臨床使用に適した装置または容器に包装されるべきであり、必要に応じて、組織再生における細胞の使用に関する情報や、治療的に重要な代謝機能を保持すべきである。
【実施例】
【００７０】
以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態についてさらに説明するためのものである。これらの実施例は、請求の範囲によって定義された本発明の内容を、限定するためのものではない。
【００７１】
＜実施例１＞ヒト羊膜上皮細胞の製作
この実施例は、ヒト羊膜上皮細胞（ｈＡＥＣｓ）の調製について記載している。ヒト羊膜は帝王切開の妊婦から得たものである。ヒト羊膜を胎盤上から剥離した後、下にあるスポンジ層及び線維芽細胞層を取り除いた後、羊膜細胞と基底膜ゾーン（ＢＭＺ）（重層上皮の下にある）を含む羊膜を得て、膜上から羊膜細胞を分離した。膜を細かく裁断し、ＲＰＭＩ  １６４０培地の入っている２５０ｍｌのフラスコに入れた。細胞は０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡで３０分間消化させ、二回目は１５分間消化させた。細胞を遠心分離により収集し、６ウェルプレートに播種した。細胞はＤＭＥＭ培養基＋１０％ＦＢＳ（ＰＡＡ  Ａｕｓｔｒｉａ）、及び一般的に細胞培養で使用されている抗生物質を有するものにおいて細胞培養され、３７°Ｃ，５％ＣＯ２で培養した。
【００７２】
＜実施例２＞成人皮膚線維芽細胞（ＡＤＳＦ）の分離
この実施例は成人皮膚線維芽細胞（ＡＤＳＦ）の調製について説明したものである。ＡＤＳＦ細胞を含む成人皮膚組織または瘢痕組織を分離して、冷ＰＢＳ中に置いた。皮膚は約１ｍｍ２大きさの片に切断され、０．２５％トリプシン、０．２ｍｇ／ｍｌＤＮａｓｅＩを含むＰＢＳにおいて３７℃で３０分間培養して、１５％の熱不活化ウマ血清を含むＤＭＥＭで中和した。細胞濃度を約１×１０６／ｍｌに調整して、６ウェルプレートに播種する。細胞は、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
【００７３】
＜実施例３＞マウス線維芽細胞（ＭＦ）の分離
この実施例はマウス線維芽細胞の分離について説明している。無菌条件下において、マウスの耳から採取した組織を、約１ｍｍ３の断片に切断した。組織は、ＰＢＳで２回洗浄し、６ウェルプレートの、ＤＭＥＭ培地中に置かれ、終夜培養した。二日目に、２ｍｌの培地を添加し、プレートの約９０％が細胞で覆われるまで培養を継続した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
【００７４】
＜実施例４＞ブタ胚性線維芽細胞の分離
この実施例は、ブタ胚性線維芽細胞の分離について説明している。無菌条件下において、ブタの胚をＰＢＳで２−３回洗浄した。豚の頭部及び内臓を廃棄して、残りの胚組織を約１ｍｍ３の断片に切断した。ＰＢＳで２回洗浄して、血液細胞を除去した。ＤＭＥＭ培地を加え、組織を３７℃、５％ＣＯ２で終夜培養した。二日目に、６ｍｌの培地を加えて、プレートの約９０％が被覆されるまで培養を継続した。
【００７５】
＜実施例５＞ＡＤＳＦ由来の多能性幹細胞（ＡＤＳＦ−ｉＰＳ）の調製
ＡＤＳＦ細胞は中国福祉会国際平和婦幼保健院（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｅａｃｅ  Ｍａｔｅｒｎｉｔｙ  ａｎｄ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｎａ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）によって提供され、実施例２に記載のように調製した。細胞はｈＡＥＣフィーダー層と共に、ＫＯ−ＤＭＥＭ培地（１０ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦ、５％ヒト臍帯血清及び１２ｎｇ／ｍｌ  ｈＬＩＦを含む）を使用して培養した。細胞の状態については培養過程を通して観察された。培養は３７°Ｃ、５％ＣＯ２条件下で培養した。その結果は図１に示すとおりである。７日間培養した後に、外観がＥＳ細胞に似たクローンが見られた。
【００７６】
＜実施例６＞マウス線維芽細胞由来の多能性幹細胞の製作
実施例２に記載のようにマウス線維芽細胞を調製した。細胞は、ＫＯ−ＤＭＥＭ培地（１０ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦ、５％ヒト臍帯血清、１２ｎｇ／ｍｌ  ｈＬＩＦを含む）にｈＡＥＣフィーダー層と共に培養した。細胞の状態については培養過程を通して観察された。培養は３７°Ｃ、５％ＣＯ２条件下で培養した。その結果は図５に示すとおりである。３日間培養した後に、外観がＥＳ細胞に似たクローンが見られた。
【００７７】
＜実施例７＞ブタ胚性線維芽細胞由来の多能性幹細胞の調製
実施例２に記載のようにブタ胚性線維芽細胞を調製した。細胞は、ＫＯ−ＤＭＥＭ培地（１０ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦ、５％ヒト臍帯血清、１２ｎｇ／ｍｌ  ｈＬＩＦを含む）にｈＡＥＣフィーダー層と共に培養した。細胞の状態については培養過程を通して観察された。培養は３７°Ｃ、５％ＣＯ２、５％Ｏ２条件下で培養した。その結果は図７に示すとおりである。５〜７日間培養した後に、外観がＥＳ細胞に似たクローンが見られた。
【００７８】
＜実施例８＞免疫蛍光アッセイ
この例は免疫蛍光技術を用いることで、ｉＰＳ細胞の幹細胞マーカー遺伝子の発現について分析することを説明している。細胞はＰＢＳで３回洗浄し、室温において２％パラホルムアルデヒドで固定した。ＰＢＳで３回洗浄し、毎回５分間であった。０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で室温において１５ｍｉｎ浸透させた。次に、ＰＢＳで３回洗浄して、毎回５分間であった。５％ＢＳＡで室温において２時間ブロッキングした。ＳＳＥＡ−４、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ−４に対する一次抗体を加え、終夜培養した。ＰＢＳで３回洗浄して、毎回５分間であった。室温下において二次蛍光マーカーで１時間反応させ、標識させた。細胞は室温下において、暗い環境中で、Ｈｏｃｈｅｓｔ染料（１：１０００）と共に、培養した。グリセリン神経節溶解後に陽性細胞が観察される。ＡＤＳＦ−ｉＰＳ細胞の分析の結果は、図２に示すとおりである。ＡＤＳＦ−ｉＰＳ細胞中の陽性幹細胞マーカーは染色されていることがわかる。ＭＦ−ｉＰＳ細胞の分析の結果は、図６に示すとおりである。
【００７９】
＜実施例９＞ｑ−ＰＣＲ技術による遺伝子発現分析
この実施例は、ＲＴ−ＰＣＲ技術を用いてｉＰＳ細胞の幹細胞マーカー遺伝子の発現の分析について説明している。ｍＲＮＡの抽出及びＲＴ−ＰＣＲ法は、製造メーカの指示（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＡＳ−１０５０）に従って行われた。それぞれのマーカー遺伝子に使用したＰＣＲプライマーは表１に示すとおりである。各グループの細胞のｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社のＲｅａｌＰｌｅｘ装置を用いる）のテンプレートとした。ＲＴ−ＰＣＲは２ステップ法によって行い、ターゲットとなるフラグメントの増幅は、１８ｓ  ｒＲＮＡ量の相対的定量方法によって計算した。
【００８０】
【表１】
2013514059.tif 000019
【００８１】
ｉＰＳ細胞マーカー遺伝子発現分析の結果を図３及び４に示す。データは正規化して、コントロールのパーセンテージとして表されている。ＡＤＳＦ−ｉＰＳにおいて、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ＴＥＲＴの発現はｈＡＥＣでの２０倍超である。これらの幹細胞マーカー（ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ、ＫＬＦ−４、ＴＥＲＴ）のｉＰＳ細胞における発現はＥＳより高かったが、ＯＣＴ−４の発現はＥＳより低かった。ＡＤＳＦには、幹細胞マーカーの発現は少ししかない。
【００８２】
＜実施例１０＞マウスｉＰＳ細胞からの染色体セントロメアの確認
細胞の調製。マウス線維芽細胞から派生した１×１０６の多能性細胞を１００ｍｍ培養皿に播種した。４８時間の培養後、培地を変更して（５ｍＬ）一晩インキュベートした。次に、７０ｎｇ／ｍＬのコルヒチンを添加し、培養を５時間続けた。細胞を回収し、７５ｍＭのＫＣ１で１０〜２０分間処理して、固定液（メタノール：酢酸＝３：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ））で固定した細胞懸濁液を得た。
【００８３】
プライムドｉｎ  ｓｉｔｕ（ＰＲＩＮＳ）標識。染色体を見えるようにするために、固定された中期細胞をスライド上に滴下して１〜４日間熟成する。次に、脱イオンホルムアミドでスライドを２分間変性させ、エタノールシリーズ（７０、９０および１００％）で脱水する。スライドを風乾した後、次の成分を追加した。即ち、バッファ（２０μｌ）、グリセロール（１０μｌ）、ｄＮＴＰ−ｄｉｇ（５μｌ）、順方向プライマー及び逆方向プライマー（５μｌ）、５μｌのＴａｑポリメラーゼ、及び脱イオン水（１５８μｌ）を追加した。プライマーの配列は以下の通りであった。Ｍａｊｏｒ  ｓａｔＤＮＡ：５’−ＧＧＡＣＣＴＧＧＡＡＴＡＴＧＧＣＧＡＧＡＡＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）；ａｎｄ  Ｍｉｎｏｒ  ｓａｔＤＮＡ：５’−ＴＧＡＴＡＴＡＣＡＣＴＧＴＴＣＴＡＣＡＡＡＴＣＣＣＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）。
【００８４】
アニーリング温度で１０分間放置し、それから７２℃に昇温して１２分間伸長させる。スライドを７２℃  ＮＥ溶液中で５ｍｉｎ洗浄した後に取り出す。４＊ＳＳＣ／０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０溶液中で５ｍｉｎ洗浄する。スライドを乾燥してから抗ジゴキシン（Ｄｉｇｏｘｉｎ）標識抗体を滴下、３７℃で３０分間インキュベートした。スライドを取り出してＰＢＳ／０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０で５分間洗浄して空気乾燥した。最後に、ＤＡＰＩを加えて、細胞を蛍光顕微鏡下で観察した。
【００８５】
実験結果は図８に示すとおりである。観察されたセントロメアはいずれも染色体の頂端に位置し、染色体はマウスに由来することを意味している。さらには、ｈＡＥＣヒト羊膜細胞染色体の汚染がないことが示されている。核型の分析によれば、ｉＰＳ細胞は正常な二倍体核型であり、４０本の染色体を有した。
【００８６】
＜実施例１１＞誘導多能性細胞の奇形腫形成
本実施例では、奇形腫を形成するためにｉＰＳ細胞の能力を調べた。ｉＰＳ細胞はマウス皮膚線維芽細胞から、ヒト羊膜上皮細胞の存在下で誘導した。体内での誘導多能性細胞の多能性を調べるために、細胞を免疫不全ヌードマウスの背側腹部に皮下移植した。注射の８週間後、腫瘍の形成が観察された。検査では腫瘍が多種の組織を含み（図９）、腺組織（内胚葉）、筋肉（中胚葉）、皮膚組織（外胚葉）を含むことがわかる。奇形腫の組織構造は、ｉＰＳ細胞が発生多能性を有していることを示した。
【００８７】
これらの実施例の結果は、以下のことを示している。ｈＡＥＣをフィーダー層とするヒト成人皮膚線維芽細胞は適切な培養環境において、幹細胞に類似するクローンに誘導することができる。これらのクローンには、幹細胞マーカーの高い発現が見られた。ｈＡＥＣによって誘導されるＡＤＳＦクローンは、通常の方法を使用する（すなわち、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、ＫＬＦ４を細胞に形質移入する、マウスｉＰＳの場合は２週間、ヒトｉＰＳの場合は４週間）ｉＰＳ細胞よりも早く出現した。さらに、クラスターで取得される細胞の量は通常の方法で得られる量よりもはるかに多かった。このように、本発明の方法は、成人の体細胞組織からのｉＰＳ細胞を生成するのに有用である。
【００８８】
特に定義しない限り、使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般的に理解しているものと同じ意味を有する。本明細書で提供されるすべてのヌクレオチド配列は、５’から３’方向で表示されている。
【００８９】
本発明が本明細書において具体的に開示していない、いかなる要素または複数の要素、制限または複数の制限が存在しない状況においても適切に実施することができる。例えば、用語「含む」「からなる」「構成する」は広義的に且つ無制限に理解すべきである。また、本明細書が使用する用語及び表現は、示される特徴または部分的に均等ないかなる物をも排除するものではない。本発明の範囲内で各種変更を行うことを認める。
【００９０】
よって、以下のように理解すべきである。発明は、好ましい実施形態またはいかなる特徴が具体的に開示される。しかし、当業者は、本明細書が含む発明について修正、改善及び変更を加えることができる。このような修正、改善または変更は本発明の範囲内である。本明細書で提供する材料、方法、および実施例は、代表的な好ましい実施形態であり、例示であり、かつ本発明の範囲を限定するものではない。
【００９１】
本文において、本発明は広く、一般的な方法によって説明されている。この概括的な開示内容の範囲内に入るいかなる狭いジャンルまたはサブジャンルも本発明の一部分である。これは、切り取られる材料が具体的に記載されているか否かに関わらず、任意の対象事項を種類から取り除く否定的な制限や但し書きを付した発明の概括的な記載を含む。
【００９２】
なお、本発明の特徴または局面がマーカッシュ群について説明している場合、当業者は、本発明は該マーカッシュ群の要素における、いかなる単独の要素及びサブグループについても言及していることは自明であると理解すべきである。
【００９３】
ここで言及したすべての出版物、特許出願、特許及びその他の参考文献は、全体として参考にすることができ、その範囲はそれぞれ単独で考慮した場合と同じである。矛盾がある場合、本明細書における定義を対照として用いることができる。
【００９４】
その他の実施形態は以下の請求項に沿って展開させることができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３Ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３Ｃ】
2013514059.tif 000020
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４Ａ】
2013514059.tif 000021
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４Ｂ】
2013514059.tif 000022
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４Ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４Ｃ】
2013514059.tif 000023
【国際調査報告】
2013514059.tif 000024
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