(57)【要約】  本発明は、オリゴヌクレオチドを有する脂質ナノ粒子を形成するためのコレステロールおよびＰＥＧ−脂質などの他の脂質成分と組み合わせて使用され得る新規なカチオン性脂質を提供する。本発明の目的は、肝臓内低脂質レベルの結果、向上した有効性とともに低肝臓毒性を示すカチオン性脂質骨格を提供することである。本発明では、ｓｉＲＮＡのインビボ送達の効率および耐容性を向上させるために、１つの短い脂質鎖を有する低分子量カチオン性脂質を使用する。【選択図】図１
2013545723.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ａ：
【化１】
2013545723.tif 000033
（式中：
Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、ヘテロシクリルおよびポリアミンから選択され、ここで、前記アルキル、ヘテロシクリルおよびポリアミンは、Ｒ’から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよく、あるいはＲ１およびＲ２は、これらが結合している窒素と一体となって、該窒素に加えてＮ、ＯおよびＳから選択される１個または２個のさらなるヘテロ原子を含むものであってもよい４〜７員の単環式複素環を形成していてもよく、前記単環式複素環は、Ｒ’から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよく；
Ｒ３は、Ｈおよび（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択され、前記アルキルはＲ’から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよく；
Ｒ’は、独立して、ハロゲン、Ｒ”、ＯＲ”、ＳＲ”、ＣＮ、ＣＯ２Ｒ”およびＣＯＮ（Ｒ”）２から選択され；
Ｒ”は、独立して、Ｈおよび（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択され、ここで、前記アルキルはハロゲンおよびＯＨで置換されていてもよく；
ｎは、０、１、２、３、４または５であり；
Ｌ１およびＬ２は、独立して、Ｃ３〜Ｃ２４アルキルおよびＣ３〜Ｃ２４アルケニルから選択され、前記アルキルおよびアルケニルは、Ｒ’から選択される１つ以上の置換基で置換されていてもよい）
のカチオン性脂質またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体。
【請求項２】
Ｒ１およびＲ２が各々メチルであり；
Ｒ３がＨであり；
ｎが０であり；
Ｌ１が、Ｃ３〜Ｃ２４アルキルおよびＣ３〜Ｃ２４アルケニルから選択され；
Ｌ２が、Ｃ３〜Ｃ９アルキルおよびＣ３〜Ｃ９アルケニルから選択される、
請求項１に記載の式Ａのカチオン性脂質またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体。
【請求項３】
Ｒ１およびＲ２が各々メチルであり；
Ｒ３がＨであり；
ｎが０であり；
Ｌ１が、Ｃ３〜Ｃ９アルキルおよびＣ３〜Ｃ９アルケニルから選択され；
Ｌ２が、Ｃ３〜Ｃ２４アルキルおよびＣ３〜Ｃ２４アルケニルから選択される、
請求項１に記載の式Ａのカチオン性脂質またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体。
【請求項４】
Ｒ１およびＲ２が各々メチルであり；
Ｒ３がＨであり；
ｎが１であり；
Ｌ１が、Ｃ３〜Ｃ２４アルキルおよびＣ３〜Ｃ２４アルケニルから選択され；
Ｌ２が、Ｃ３〜Ｃ９アルキルおよびＣ３〜Ｃ９アルケニルから選択される、
請求項１に記載の式Ａのカチオン性脂質またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体。
【請求項５】
Ｒ１およびＲ２が各々メチルであり；
Ｒ３がＨであり；
ｎが２であり；
Ｌ１が、Ｃ３〜Ｃ２４アルキルおよびＣ３〜Ｃ２４アルケニルから選択され；
Ｌ２が、Ｃ３〜Ｃ９アルキルおよびＣ３〜Ｃ９アルケニルから選択される、
請求項１に記載の式Ａのカチオン性脂質またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体。
【請求項６】
（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］ウンデカン−２−アミン（化合物１）；
（２Ｓ）−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］ウンデカン−２−アミン（化合物２）；
（２Ｓ）−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］ドデカン−２−アミン（化合物３）；
（２Ｒ）−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］ドデカン−２−アミン（化合物４）；
（２Ｓ）−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］デカン−２−アミン（化合物５）；
（２Ｓ）−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］ノナン−２−アミン（化合物６）；
（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］トリデカン−２−アミン（化合物７）；
（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］ノナン−２−アミン（化合物８）；
（２Ｒ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］ドデカン−２−アミン（化合物９）；
（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］ドデカン−２−アミン（化合物１０）；
（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］デカン−２−アミン（化合物１１）；および
（２Ｓ，１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−（オクチルオキシ）ヘニコサ−１２，１５−ジエン−２−アミン（化合物１２）；
（２Ｒ，１２Ｚ，１５Ｚ）−１−（デシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘニコサ−１２，１５−ジエン−２−アミン（化合物１３）；
（２Ｒ，１２Ｚ，１５Ｚ）−１−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘニコサ−１２，１５−ジエン−２−アミン（化合物１４）；
（２Ｒ，１２Ｚ，１５Ｚ）−１−（ヘキサデシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘニコサ−１２，１５−ジエン−２−アミン（化合物１５）；
（２Ｒ，１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−（ウンデシルオキシ）ヘニコサ−１２，１５−ジエン−２−アミン（化合物１６）；
Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−｛［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］メチル｝ウンデカン−１−アミン（化合物１７）；
Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−｛［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］メチル｝ドデカン−１−アミン（化合物１８）；ならびに
（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−（｛８−［（１Ｒ，２Ｒ）−２−｛［（１Ｓ，２Ｓ）−２−ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］オクチル｝オキシ）トリデカン−２−アミン（化合物１９）；
から選択されるカチオン性脂質またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体。
【請求項７】
脂質ナノ粒子の調製のための請求項１に記載のカチオン性脂質の使用。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドの送達のための脂質ナノ粒子中の一成分としての請求項１に記載のカチオン性脂質の使用。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである、請求項５に記載の使用。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡである、請求項５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内取込みおよびエンドソームからの脱出を助長するため、ならびにインビトロおよびインビボの両方において標的ｍＲＮＡをノックダウンするための、オリゴヌクレオチドを有する脂質ナノ粒子を形成するためのコレステロールおよびＰＥＧ−脂質などの他の脂質成分と組み合わせて使用され得る新規なカチオン性脂質に関する。
【背景技術】
【０００２】
カチオン性脂質、ならびにオリゴヌクレオチド、特にｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの送達のための脂質ナノ粒子におけるカチオン性脂質の使用は、これまでにも開示されている。脂質ナノ粒子、ならびにオリゴヌクレオチド、特にｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの送達のための脂質ナノ粒子の使用は、これまでにも開示されている。オリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ）ならびにオリゴヌクレオチドの合成は、これまでにも開示されている（米国特許出願：特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４および特許文献５ならびにＰＣＴ特許出願：特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２および特許文献１３参照）。また、非特許文献１（２０１０年１月１７日オンライン公開；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．ｌ６０２）も参照のこと。
【０００３】
他のカチオン性脂質は、米国特許出願：特許文献１４、特許文献１５、特許文献１６、特許文献１７、特許文献１８、特許文献１９、特許文献２０および特許文献２１に開示されている。
【０００４】
ＣＬｉｎＤＭＡおよびＤＬｉｎＤＭＡなどの従来からのカチオン性脂質は肝臓へのｓｉＲＮＡ送達に使用されているが、送達効率が最適でないとともに、高用量では肝臓毒性という欠点を有する。本発明の目的は、肝臓内低脂質レベルの結果、向上した有効性とともに低肝臓毒性を示すカチオン性脂質骨格を提供することである。本発明では、ｓｉＲＮＡのインビボ送達の効率および耐容性を向上させるために、１つの短い脂質鎖を有する低分子量カチオン性脂質を使用する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／００８３７８０号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００６／０２４０５５４号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００８／００２００５８号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００９／０２６３４０７号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００９／０２８５８８１号明細書
【特許文献６】国際公開第２００９／０８６５５８号パンフレット
【特許文献７】国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレット
【特許文献８】国際公開第２００９／１３２１３１号パンフレット
【特許文献９】国際公開第２０１０／０４２８７７号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第２０１０／０５４３８４号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第２０１０／０５４４０１号パンフレット
【特許文献１２】国際公開第２０１０／０５４４０５号パンフレット
【特許文献１３】国際公開第２０１０／０５４４０６号パンフレット
【特許文献１４】米国特許出願公開第２００９／０２６３４０７号明細書
【特許文献１５】米国特許出願公開第２００９／０２８５８８１号明細書
【特許文献１６】米国特許出願公開第２０１０／００５５１６８号明細書
【特許文献１７】米国特許出願公開第２０１０／００５５１６９号明細書
【特許文献１８】米国特許出願公開第２０１０／００６３１３５号明細書
【特許文献１９】米国特許出願公開第２０１０／００７６０５５号明細書
【特許文献２０】米国特許出願公開第２０１０／００９９７３８号明細書
【特許文献２１】米国特許出願公開第２０１０／０１０４６２９号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｅｍｐｌｅ  Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、オリゴヌクレオチドを有する脂質ナノ粒子を形成するためのコレステロールおよびＰＥＧ−脂質などの他の脂質成分と組み合わせて使用され得る新規なカチオン性脂質を提供する。本発明の目的は、肝臓内低脂質レベルの結果、向上した有効性とともに低肝臓毒性を示すカチオン性脂質骨格を提供することである。本発明では、ｓｉＲＮＡのインビボ送達の効率および耐容性を向上させるために、１つの短い脂質鎖を有する低分子量カチオン性脂質を使用する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】マウスにおけるＬＮＰ（化合物１）の有効性の図である。
【図２】ラットにおけるＬＮＰ（化合物１）の有効性の図である（ＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡ）。
【図３】ラット肝臓におけるカチオン性脂質（化合物１）レベルの図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の種々の態様および実施形態は、オリゴヌクレオチド、特にｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを任意の標的遺伝子に送達するための脂質ナノ粒子に有用な新規なカチオン性脂質の実用性に関するものである（米国特許出願：米国特許出願公開第２００６／００８３７８０号明細書、同第２００６／０２４０５５４号明細書、同第２００８／００２００５８号明細書、同第２００９／０２６３４０７号明細書および同第２００９／０２８５８８１号明細書ならびにＰＣＴ特許出願：国際公開第２００９／０８６５５８号パンフレット、同第２００９／１２７０６０号パンフレット、同第２００９／１３２１３１号パンフレット、同第２０１０／０４２８７７号パンフレット、同第２０１０／０５４３８４号パンフレット、同第２０１０／０５４４０１号パンフレット、同第２０１０／０５４４０５号パンフレットおよび同第２０１０／０５４４０６号パンフレット参照）。また、Ｓｅｍｐｌｅ  Ｓ．Ｃ．ら，Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１０年１月１７日オンライン公開；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．ｌ６０２）も参照のこと。
【００１０】
本発明のカチオン性脂質は、オリゴヌクレオチド、具体的にはｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの送達のための脂質ナノ粒子に有用な成分である。
【００１１】
本発明の第１の実施形態において、カチオン性脂質は、式Ａ：
【００１２】
【化１】
2013545723.tif 000003
（式中：
Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、ヘテロシクリルおよびポリアミンから選択され、ここで、前記アルキル、ヘテロシクリルおよびポリアミンは、Ｒ’から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよく、あるいはＲ１およびＲ２は、これらが結合している窒素と一体となって、該窒素に加えてＮ、ＯおよびＳから選択される１個または２個のさらなるヘテロ原子を含むものであってもよい４〜７員の単環式複素環を形成していてもよく、前記単環式複素環は、Ｒ’から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよく；
Ｒ３は、Ｈおよび（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択され、前記アルキルはＲ’から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよく；
Ｒ’は、独立して、ハロゲン、Ｒ”、ＯＲ”、ＳＲ”、ＣＮ、ＣＯ２Ｒ”およびＣＯＮ（Ｒ”）２から選択され；
Ｒ”は、独立して、Ｈおよび（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択され、ここで、前記アルキルはハロゲンおよびＯＨで置換されていてもよく；
ｎは、０、１、２、３、４または５であり；
Ｌ１およびＬ２は、独立して、Ｃ３〜Ｃ２４アルキルおよびＣ３〜Ｃ２４アルケニルから選択され、前記アルキルおよびアルケニルは、Ｒ’から選択される１つ以上の置換基で置換されていてもよい）
またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体。
【００１３】
第２の実施形態において、本発明は、
Ｒ１およびＲ２が各々メチルであり；
Ｒ３がＨであり；
ｎが０であり；
Ｌ１が、Ｃ３〜Ｃ２４アルキルおよびＣ３〜Ｃ２４アルケニルから選択され；
Ｌ２が、Ｃ３〜Ｃ９アルキルおよびＣ３〜Ｃ９アルケニルから選択される、
式Ａを有する化合物またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体を特色とする。
【００１４】
第３の実施形態において、本発明は、
Ｒ１およびＲ２が各々メチルであり；
Ｒ３がＨであり；
ｎが０であり；
Ｌ１が、Ｃ３〜Ｃ９アルキルおよびＣ３〜Ｃ９アルケニルから選択され；
Ｌ２が、Ｃ３〜Ｃ２４アルキルおよびＣ３〜Ｃ２４アルケニルから選択される、
式Ａを有する化合物またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体を特色とする。
【００１５】
第４の実施形態において、本発明は、
Ｒ１およびＲ２が各々メチルであり；
Ｒ３がＨであり；
ｎが１であり；
Ｌ１が、Ｃ３〜Ｃ２４アルキルおよびＣ３〜Ｃ２４アルケニルから選択され；
Ｌ２が、Ｃ３〜Ｃ９アルキルおよびＣ３〜Ｃ９アルケニルから選択される、
式Ａを有する化合物またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体を特色とする。
【００１６】
第５の実施形態において、本発明は、
Ｒ１およびＲ２が各々メチルであり；
Ｒ３がＨであり；
ｎが２であり；
Ｌ１が、Ｃ３〜Ｃ２４アルキルおよびＣ３〜Ｃ２４アルケニルから選択され；
Ｌ２が、Ｃ３〜Ｃ９アルキルおよびＣ３〜Ｃ９アルケニルから選択される、
式Ａを有する化合物またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体を特色とする。
【００１７】
具体的なカチオン性脂質は、
（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］ウンデカン−２−アミン（化合物１）；
（２Ｓ）−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］ウンデカン−２−アミン（化合物２）；
（２Ｓ）−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］ドデカン−２−アミン（化合物３）；
（２Ｒ）−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］ドデカン−２−アミン（化合物４）；
（２Ｓ）−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］デカン−２−アミン（化合物５（Ｃｏｍｏｕｎｄ））；
（２Ｓ）−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］ノナン−２−アミン（化合物６）；
（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］トリデカン−２−アミン（化合物７）；
（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］ノナン−２−アミン（化合物８）；
（２Ｒ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］ドデカン−２−アミン（化合物９）；
（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］ドデカン−２−アミン（化合物１０）；
（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］デカン−２−アミン（化合物１１）；および
（２Ｓ，１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−（オクチルオキシ）ヘニコサ−１２，１５−ジエン−２−アミン（化合物１２）；
（２Ｒ，１２Ｚ，１５Ｚ）−１−（デシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘニコサ−１２，１５−ジエン−２−アミン（化合物１３）；
（２Ｒ，１２Ｚ，１５Ｚ）−１−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘニコサ−１２，１５−ジエン−２−アミン（化合物１４）；
（２Ｒ，１２Ｚ，１５Ｚ）−１−（ヘキサデシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘニコサ−１２，１５−ジエン−２−アミン（化合物１５）；
（２Ｒ，１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−（ウンデシルオキシ）ヘニコサ−１２，１５−ジエン−２−アミン（化合物１６）；
Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−｛［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］メチル｝ウンデカン−１−アミン（化合物１７）；
Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−｛［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］メチル｝ドデカン−１−アミン（化合物１８）；ならびに
（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−（｛８−［（１Ｒ，２Ｒ）−２−｛［（１Ｓ，２Ｓ）−２−ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］オクチル｝オキシ）トリデカン−２−アミン（化合物１９）
またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体である。
【００１８】
別の実施形態において、開示したカチオン性脂質は脂質ナノ粒子の調製に有用である。
【００１９】
別の実施形態において、開示したカチオン性脂質は、オリゴヌクレオチドの送達のための脂質ナノ粒子に有用な成分である。
【００２０】
別の実施形態において、開示したカチオン性脂質は、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの送達のための脂質ナノ粒子に有用な成分である。
【００２１】
別の実施形態において、開示したカチオン性脂質は、ｓｉＲＮＡの送達のための脂質ナノ粒子に有用な成分である。
【００２２】
本発明のカチオン性脂質は、不斉中心、キラル軸およびキラル面（Ｅ．Ｌ．ＥｌｉｅｌおよびＳ．Ｈ．Ｗｉｌｅｎ，Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４，第１１１９〜１１９０頁に記載）を有するものであってもよく、ラセミ化合物、ラセミ混合物として、および個々のジアステレオマーとして存在し、可能なすべての異性体およびその混合物（例えば、光学異性体）は、本発明に含まれる。また、本明細書に開示したカチオン性脂質は互変異性体として存在するものであってもよく、たとえ一方の互変異性体構造しか図示していない場合であっても、両方の互変異性形態が本発明の範囲に包含されることを意図する。
【００２３】
本発明のカチオン性脂質における置換基および置換パターンは、当業者により、容易に入手可能な出発物質から当該技術分野で知られた手法ならびに以下に示す方法によって容易に合成され得る化学的に安定なカチオン性脂質が得られるように選択され得ることは理解されよう。置換基それ自体が１つより多くの基で置換されている場合、安定な構造がもたらされる限り、このような多数の基は同じ炭素上にあっても異なる炭素上にあってもよいことは理解されよう。
【００２４】
当業者により、容易に入手可能な出発物質から当該技術分野で知られた手法によって容易に合成され得る化学的に安定なカチオン性脂質が得られるように、１個以上のＳｉ原子が本発明のカチオン性脂質に組み込まれることがあり得ることは理解されよう。
【００２５】
式Ａの化合物において、原子は天然状態の同位体存在度を示すものであってもよく、１個以上の原子において、同じ原子番号を有するが原子量または質量数は自然界に主として見られる原子量または質量数と異なる特定の同位体を人為的に富化したものであってもよい。本発明は、式Ａの化合物の適当なあらゆる同位体異型形態を含むことを意図する。例えば、水素（Ｈ）の異なる同位体形態としては、プロチウム（１Ｈ）およびジューテリウム（２Ｈ）が挙げられる。プロチウムは、自然界に主として見られる水素の同位体である。ジューテリウムの富化により、特定の治療上の利点（インビボ半減期の増大もしくは必要投薬量の低減など）がもたらされ得るか、または生物学的試料の特性評価のための標準として有用な化合物が得られ得る。式Ａに含まれる同位体富化された化合物は、必要以上に実験を行うことなく、当業者によく知られた慣用的な手法によって、または本明細書のスキームおよび実施例に記載のものと同様のプロセスによって、適切な同位体富化試薬および／または中間体を用いて調製され得る。
【００２６】
本明細書で用いる場合、「アルキル」は、指定された数の炭素原子を有する直鎖、環状または分枝型の飽和脂肪族炭化水素を意図する。
【００２７】
本明細書で用いる場合、「アルケニル」は、指定された数の炭素原子を有する直鎖、環状または分枝型の不飽和脂肪族炭化水素を意味し、限定されないが、ジエン、トリエンおよびテトラエン不飽和脂肪族炭化水素が挙げられる。
【００２８】
環状「アルキル」または「アルケニルの例としては、
【００２９】
【化２】
2013545723.tif 000004
が挙げられる。
【００３０】
本明細書で用いる場合、「ヘテロシクリル」または「複素環」は、Ｏ、ＮおよびＳからなる群より選択される１〜４個のヘテロ原子を含む４〜１０員の芳香族または非芳香族複素環を意味し、二環式基を包含する。したがって、「ヘテロシクリル」としては、以下のもの：ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾフラザニル、ベンゾピラゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、カルバゾリル、カルボリニル、シンノリニル、フラニル、イミダゾリル、インドリニル、インドリル、インドラジニル、インダゾリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ナフトピリジニル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、オキサゾリン、イソオキサゾリン、オキセタニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドピリジニル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノオキサリニル、テトラヒドロピラニル、テトラゾリル、テトラゾロピリジル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、アゼチジニル、１，４−ジオキサニル、ヘキサヒドロアゼピニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ジヒドロベンゾイミダゾリル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾチオフェニル、ジヒドロベンゾオキサゾリル、ジヒドロフラニル、ジヒドロイミダゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソオキサゾリル、ジヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジアゾリル、ジヒドロオキサゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジヒドロキノリニル、ジヒドロテトラゾリル、ジヒドロチアジアゾリル、ジヒドロチアゾリル、ジヒドロチエニル、ジヒドロトリアゾリル、ジヒドロアゼチジニル、メチレンジオキシベンゾイル、テトラヒドロフラニル、およびテトラヒドロチエニル、ならびにそのＮ−オキシドが挙げられ、これらはすべて、Ｒ”から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよい。
【００３１】
本明細書で用いる場合、「ポリアミン」は、２つ以上のアミノ基を有する化合物を意味する。例としては、プトレシン、カダベリン、スペルミジン、およびスペルミンが挙げられる。
【００３２】
本明細書で用いる場合、「ハロゲン」はＢｒ、Ｃｌ、ＦおよびＩを意味する。
【００３３】
式Ａの一実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｈおよび（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択され、ここで、前記アルキルはＲ’から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよく、あるいはＲ１およびＲ２は、これらが結合している窒素と一体となって、該窒素に加えてＮ、ＯおよびＳから選択される１個または２個のさらなるヘテロ原子を含むものであってもよい４〜７員の単環式複素環を形成していてもよく、前記単環式複素環はＲ’から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよい。
【００３４】
式Ａの一実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｈ、メチル、エチルおよびプロピルから選択され、ここで、前記メチル、エチルおよびプロピルは、Ｒ’から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよく、あるいはＲ１およびＲ２は、これらが結合している窒素と一体となって、該窒素に加えてＮ、ＯおよびＳから選択される１個または２個のさらなるヘテロ原子を含むものであってもよい４〜７員の単環式複素環を形成していてもよく、前記単環式複素環はＲ’から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよい。
【００３５】
式Ａの一実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｈ、メチル、エチルおよびプロピルから選択される。
【００３６】
式Ａの一実施形態において、Ｒ１およびＲ２は各々メチルである。
【００３７】
式Ａの一実施形態において、Ｒ３はＨおよびメチルから選択される。
【００３８】
式Ａの一実施形態において、Ｒ３はＨである。
【００３９】
式Ａの一実施形態において、Ｒ’はＲ”である。
【００４０】
式Ａの一実施形態において、Ｒ”は、独立して、Ｈ、メチル、エチルおよびプロピルから選択され、ここで、前記メチル、エチルおよびプロピルは、１つ以上のハロゲンおよびＯＨで置換されていてもよい。
【００４１】
式Ａの一実施形態において、Ｒ”は、独立して、Ｈ、メチル、エチルおよびプロピルから選択される。
【００４２】
式Ａの一実施形態において、ｎは０、１または２である。
【００４３】
式Ａの一実施形態において、ｎは０または１である。
【００４４】
式Ａの一実施形態において、ｎは０である。
【００４５】
式Ａの一実施形態において、Ｌ１は、Ｃ３〜Ｃ２４アルキルおよびＣ３〜Ｃ２４アルケニル（これらはハロゲンおよびＯＨで置換されていてもよい）から選択される。
【００４６】
式Ａの一実施形態において、Ｌ１は、Ｃ３〜Ｃ２４アルキルおよびＣ３〜Ｃ２４アルケニルから選択される。
【００４７】
式Ａの一実施形態において、Ｌ１は、Ｃ３〜Ｃ２４アルケニルから選択される。
【００４８】
式Ａの一実施形態において、Ｌ１は、Ｃ１２〜Ｃ２４アルケニルから選択される。
【００４９】
式Ａの一実施形態において、Ｌ１はＣ１８アルケニルである。
【００５０】
式Ａの一実施形態において、Ｌ１は、
【００５１】
【化３】
2013545723.tif 000005
である。
【００５２】
式Ａの一実施形態において、Ｌ１はＣ８アルキルである。
【００５３】
式Ａの一実施形態において、Ｌ２は、Ｃ３〜Ｃ２４アルキルおよびＣ３〜Ｃ２４アルケニル（これらはハロゲンおよびＯＨで置換されていてもよい）から選択される。
【００５４】
式Ａの一実施形態において、Ｌ２は、Ｃ３〜Ｃ２４アルキルおよびＣ３〜Ｃ２４アルケニルから選択される。
【００５５】
式Ａの一実施形態において、Ｌ２はＣ３〜Ｃ２４アルケニルから選択される。
【００５６】
式Ａの一実施形態において、Ｌ２はＣ１２〜Ｃ２４アルケニルから選択される。
【００５７】
式Ａの一実施形態において、Ｌ２はＣ１９アルケニルである。
【００５８】
式Ａの一実施形態において、Ｌ２は
【００５９】
【化４】
2013545723.tif 000006
である。
【００６０】
式Ａの一実施形態において、Ｌ２は、Ｃ３〜Ｃ９アルキルおよびＣ３〜Ｃ９アルケニル（これらはハロゲンおよびＯＨで置換されていてもよい）から選択される。
【００６１】
式Ａの一実施形態において、Ｌ２は、Ｃ５〜Ｃ９アルキルおよびＣ５〜Ｃ９アルケニル（これらはハロゲンおよびＯＨで置換されていてもよい）から選択される。
【００６２】
式Ａの一実施形態において、Ｌ２は、Ｃ７〜Ｃ９アルキルおよびＣ７〜Ｃ９アルケニル（これらはハロゲンおよびＯＨで置換されていてもよい）から選択される。
【００６３】
式Ａの一実施形態において、Ｌ２は、Ｃ３〜Ｃ９アルキルおよびＣ３〜Ｃ９アルケニルから選択される。
【００６４】
式Ａの一実施形態において、Ｌ２は、Ｃ５〜Ｃ９アルキルおよびＣ５〜Ｃ９アルケニルから選択される。
【００６５】
式Ａの一実施形態において、Ｌ２は、Ｃ７〜Ｃ９アルキルおよびＣ７〜Ｃ９アルケニルから選択される。
【００６６】
式Ａの一実施形態において、Ｌ２はＣ３〜Ｃ９アルキルである。
【００６７】
式Ａの一実施形態において、Ｌ２はＣ５〜Ｃ９アルキルである。
【００６８】
式Ａの一実施形態において、Ｌ２はＣ７〜Ｃ９アルキルである。
【００６９】
式Ａの一実施形態において、Ｌ２はＣ９アルキルである。
【００７０】
式Ａの一実施形態において、「ヘテロシクリル」は、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、イミダゾールまたはピペラジンである。
【００７１】
式Ａの一実施形態において、「単環式ヘテロシクリル」は、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、イミダゾールまたはピペラジンである。
【００７２】
式Ａの一実施形態において、「ポリアミン」は、プトレシン、カダベリン、スペルミジンまたはスペルミンである。
【００７３】
一実施形態において、「アルキル」は、指定された数の炭素原子を有する直鎖飽和脂肪族炭化水素である。
【００７４】
一実施形態において、「アルケニル」は、指定された数の炭素原子を有する直鎖不飽和脂肪族炭化水素である。
【００７５】
本発明は、遊離形態の式Ａのカチオン性脂質、ならびにその薬学的に許容され得る塩および立体異性体を含む。本明細書において例示した具体的な単離されたカチオン性脂質のいくつかは、アミンであるカチオン性脂質のプロトン化された塩である。用語「遊離形態」は非塩形態のアミンであるカチオン性脂質をいう。包含される薬学的に許容され得る塩には、本明細書に記載した具体的なカチオン性脂質について例示した単離された塩だけでなく、遊離形態の式Ａのカチオン性脂質の典型的なあらゆる薬学的に許容され得る塩も包含される。記載した具体的な塩であるカチオン性脂質の遊離形態は、当該技術分野で知られた手法を用いて単離され得る。例えば、遊離形態は、その塩を、希釈した適当な塩基水溶液（希釈した水性ＮａＯＨ、炭酸カリウム、アンモニアおよび重炭酸ナトリウムなど）で処理することにより再生させたものであり得る。遊離形態は、そのそれぞれの塩形態と特定の物性（極性溶媒中への溶解性など）が幾分異なり得るが、その酸と塩基の塩は、その他の点では、本発明の解釈上、そのそれぞれの遊離形態と薬学的に等価である。
【００７６】
本発明のカチオン性脂質の薬学的に許容され得る塩は、塩基性または酸性の部分を含む本発明のカチオン性脂質から、慣用的な化学的方法によって合成され得る。一般的に、塩基性のカチオン性脂質の塩は、イオン交換クロマトグラフィー、または遊離塩基を化学量論量もしくは過剰の所望の塩形成無機酸もしくは有機酸と適当な溶媒中もしくは種々の溶媒の組合せ中で反応させることのいずれかによって調製される。同様に、酸性化合物の塩は、適切な無機塩基または有機塩基との反応によって形成される。
【００７７】
したがって、本発明のカチオン性脂質の薬学的に許容され得る塩は、塩基性の本発明のカチオン性脂質を無機酸または有機酸と反応させることにより形成される本発明のカチオン性脂質の慣用的な無毒性の塩を包含する。例えば、慣用的な無毒性の塩としては、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸など）から得られるもの、ならびに有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ−安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）など）から調製される塩が挙げられる。
【００７８】
本発明のカチオン性脂質が酸性である場合、好適な「薬学的に許容され得る塩」は、薬学的に許容され得る無毒性の塩基（例えば、無機塩基および有機塩基）から調製される塩をいう。無機塩基から得られる塩としては、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、第二マンガン塩、第一マンガン、カリウム、ナトリウム、亜鉛などが挙げられる。特に好ましいのは、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、カリウムおよびナトリウムの塩である。薬学的に許容され得る無毒性の有機塩基から得られる塩としては、第１級、第２級および第３級アミン、置換アミン（天然に存在する置換アミンを含む）、環状アミン、および塩基性イオン交換樹脂、例えば、アルギニン、ベタイン  カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチル−モルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リシン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン  トリプロピルアミン、トロメタミンなどの塩が挙げられる。
【００７９】
上記の薬学的に許容され得る塩および他の典型的な薬学的に許容され得る塩の調製は、Ｂｅｒｇら，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９７７：６６：１−１９により充分に記載されている。
【００８０】
また、生理学的条件下では本化合物内の脱プロトン化された酸性部分（カルボキシル基など）がアニオン性となることがあり得、そのため、この電子電荷によって分子内で、プロトン化またはアルキルされた塩基性部分（第４級窒素原子など）のカチオン電荷に対するバランスが崩れることがあり得るため、本発明のカチオン性脂質は、分子内（ｉｎｔｅｒｎａｌ）塩または両性イオンとなる可能性があることに注意されたい。
【実施例】
【００８１】
ここに示す実施例は、本発明のさらなる理解の補助を意図するものである。具体的な使用材料、種および条件は、さらなる実例を意図するものであって、本発明の妥当な範囲を限定するものではない。カチオン性脂質の合成に使用した試薬は、市販のもの、または当業者によって容易に調製されるもののいずれかである。
【００８２】
新規な本カチオン性脂質の合成は、エピクロロヒドリン（ｉ）（一般スキーム１）を出発物質とする線形プロセスである。エポキシドの開環、脂質アルコキシドを用いた閉環によりエポキシエーテル中間体ｉｉが得られる。このエポキシドに対するグリニャール付加により第２級アルコール中間体ｉｉｉが得られる。アジドを用いた光延反転の後、還元することにより、第１級アミン中間体ｖが得られる。還元的アミノ化により第３級アミン誘導体ｖｉが得られる。
【００８３】
一般スキーム１
【００８４】
【化５】
2013545723.tif 000007
エピクロロヒドリン（ｉ）を出発物質とする新規な本カチオン性脂質の択一的な合成を一般スキーム２に示す。エポキシドの開環、脂質グリニャールを用いた閉環によりエポキシド中間体ｖｉｉが得られる。このエポキシドに対するアルコキシド付加により第２級アルコール中間体ｉｉｉが得られる。アジドを用いた光延反転の後、還元することにより第１級アミン中間体ｖが得られる。還元的アミノ化により第３級アミン誘導体ｖｉが得られる。
【００８５】
一般スキーム２
【００８６】
【化６】
2013545723.tif 000008
ホモログ化カチオン性脂質ｘ（一般スキーム３）の合成は、デス・マーチンペルヨージナンを用いた中間体ｉｉｉのケトンｖｉｉへの酸化から始める。このケトンのニトリルｖｉｉｉへの変換はＴＯＳＭＩＣを用いて行われる。このニトリルを水素化アルミニウムリチウムで還元すると第１級アミンｉｘが得られる。還元的アミノ化によりカチオン性脂質ｘが得られる。
【００８７】
一般スキーム３
【００８８】
【化７】
2013545723.tif 000009
二重（ｄｏｕｂｌｙ）ホモログ化カチオン性脂質ｘｉｉｉの合成はケトンｖｉｉから始める。ピーターソンオレフィン化により不飽和アミドｘｉが生成される。Ｌ−セレクトリドを用いた共役還元によりアミドｘｉｉが得られる。このアミドを水素化アルミニウムリチウムで還元するとカチオン性脂質ｘｉｉｉが得られる。
【００８９】
一般スキーム４
【００９０】
【化８】
2013545723.tif 000010
（２Ｓ）Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］ウンデカン−２−アミン（化合物１）
【００９１】
【化９】
2013545723.tif 000011
２５０ｍＬ容丸底（ｒｂ）フラスコに、磁気撹拌バー、テトラブチルアンモニウムブロミド（ＴＢＡＢ，２．７２ｇ，８．４ｍｍｏｌ）、リノレイルアルコール（２２５ｇ，８８４ｍｍｏｌ）、および水酸化ナトリウム（５０．７ｇ，１．２ｍｏｌ）を仕込み、次いで、氷浴中で冷却した。（Ｓ）−エピクロロヒドリン（１５６ｇ，１．６９ｍｏｌ）を２時間にわたってゆっくり添加し、次いで周囲温度まで昇温させ、一晩撹拌した。２５９ｍＬのヘキサンを添加し、１５分間撹拌し、次いで混合物を濾過し、有機層を真空濃縮した。生成物を０から１０％までの酢酸エチル／ヘキサン勾配を用いて３３０ｇシルカカラムで精製し、（２Ｒ）−２−｛［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］メチル｝オキシランを得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ｍＨｚ）δ  ０．９０−０．８６（ｍ，３Ｈ）、１．２９（ｓ，１６Ｈ）、１．５５−１．６４（ｍ，２Ｈ）、２．００−２．０７（ｍ，４Ｈ）、２．５８−２．６１（ｍ，１Ｈ）、２．７４−２．８０（ｍ，３Ｈ）、３．１２−３．１５（ｍ，１Ｈ）３．３４−３．５２（ｍ，３Ｈ）、３．６７−３．７２（ｄｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ，１Ｈ）５．３０−５．３５（ｍ，４  Ｈ）；ＨＲＭＳ（ｍ＋１）計算値３２３．２８７２，実測値３２３．２９５１。
【００９２】
【化１０】
2013545723.tif 000012
エポキシド（１５ｇ，４６．５ｍｍｏｌ）をＴＨＦに溶解させ、窒素流下で０℃まで冷却した。オクチルグリニャール（２５．６ｍＬ  ２Ｍ溶液，５１．２ｍｍｏｌ）を滴下し、次いで、マイクロ波で１２０℃にて１時間加熱した。析出物を濾別し、溶媒を真空にてエバポレートした。粗製油状物を直接シリカゲルカラムに負荷し、０から１０％までの勾配（ヘキサン−酢酸エチル）で溶出し、（２Ｒ）−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］ウンデカン−２−オールを得た。ＬＣ／ＭＳ（ｍ＋１）＝４３７．６。
【００９３】
【化１１】
2013545723.tif 000013
トリフェニルホスフィン（１４．４ｇ，５５ｍｍｏｌ）をＴＨＦに溶解させ、窒素下で０℃まで冷却した。ジ−ｔｅｒｔブチルアゾジカルボキシレート（１３．７ｇ，５９．５ｍｍｏｌ）をゆっくり添加し、反応液を３０分間撹拌した。次いで、アルコール（２０ｇ，４５．８ｍｍｏｌ）を滴下し、１０分間撹拌し、次いで、ジフェニルホスホリルアジド（１５．ｌｇ，５５ｍｍｏｌ）を添加し、一晩撹拌し、周囲温度まで昇温させた。反応液を真空内でエバポレートして乾固させ、直接シリカゲルカラムに負荷し、０から１０％までの酢酸エチル／ヘキサン勾配で溶出し、（２Ｓ）−２−アジドウンデシル（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルエーテルを得、これを、特性評価せずに、直接、次の反応に持ち越した。
【００９４】
【化１２】
2013545723.tif 000014
トリフェニルホスフィン（４．５４ｇ，１７．３ｍｍｏｌ）とアジド（８ｇ，１７．３ｍｍｏｌ）をＴＨＦに溶解させた。反応混合物を３μｗチューブに分け、各々に１２０℃で１時間、放射線照射した。各チューブ内ではかなり圧力が上昇するため、注意を払わなければならない。ＬＣにより、ホスホイミン中間体への１００％変換が示された。各チューブに約３ｍＬの水を添加し、反応液に１２０℃で１０分間放射線照射した。反応混合物を合わせ、濃縮して有機溶媒を除去した。ヘキサンを添加してホスフィンオキシドを析出させ、これを、焼結（ｃｉｎｔｅｒｅｄ）ガラス漏斗に通して濾過した。次いで、溶媒を真空除去した。粗製生成物をＨＰＬＣを用いて精製した（３０分間泳動，６０から１００％までの水／アセトニトリル勾配）。合わせたＨＰＬＣ画分を重炭酸ナトリウムで中和し、真空内でエバポレートした。純粋な生成物を水／ヘキサン間に分配した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空内でエバポレートし、（２Ｓ）−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］ウンデカン−２−アミン（２）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ｍＨｚ）δ  ０．８８−０．８７（ｍ，６Ｈ）、１．２５−１．２９（ｓ，３２Ｈ）、１．５４−１．５４（ｍ，２Ｈ）、２．０３−２．０５（ｍ，４Ｈ）、２．２３（ｓ，２Ｈ）、２．７５−２．７６（ｍ，２Ｈ）、２．９６（ｍ，１Ｈ）、３．１３−３．１８（ｍ，１Ｈ）、３．３８−３．４５（ｍ，３Ｈ）、５．３１−５．３８（ｍ，４Ｈ）；ＬＣ／ＭＳ（ｍ＋１）＝４３６．７。
【００９５】
【化１３】
2013545723.tif 000015
第１級アミン（３．５ｇ，８ｍｍｏｌ）をＴＨＦに溶解させ、ホルムアルデヒド（３．２６ｇ，４０．２ｍｍｏｌ）を添加した後、トリアセトキシボロヒドリド（５．１ｇ，２４．１ｍｍｏｌ）を添加した。反応液を周囲温度で１５分間撹拌した。ＬＣ／ＭＳにより生成物への１００％変換が示された。塩基性になるまで１Ｍ  ＮａＯＨを添加し、ヘキサンで抽出し、水で洗浄した。有機層を保持し、溶媒を真空除去した。６０から１００％までの水／アセトニトリルで３０分間の勾配を用いてＣ８  ＨＰＬＣで精製した。画分を合わせ、重炭酸ナトリウムを添加し、有機部分を真空内でエバポレートした。生成物を水／ヘキサン間に分配し、有機部分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空内でエバポレートし、（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］ウンデカン−２−アミン（１）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ｍＨｚ）δ  ０．８８−０．８７（ｍ，６Ｈ）、１．２８５（ｓ，３３Ｈ）、１．５５（ｍ，２Ｈ）、１．８０（ｍ，１Ｈ）、２．００−２．０５（ｓ，４Ｈ）、２．２９−２．３１（２Ｈ）、２．５０（ｍ，１Ｈ）、２．７６−１．７７（ｍ，２Ｈ）、３．３６−３．５１（ｍ，６Ｈ）、５．３４−５．３６（ｍ，４Ｈ）；ＬＣ／ＭＳ（ｍ＋１）＝４６４．９。
【００９６】
化合物３〜１１は新規なカチオン性脂質であり、上記の一般スキーム１に従って調製した。
【００９７】
【表１】
2013545723.tif 000016
（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］ウンデカン−２−アミン（化合物１２）
【００９８】
【化１４】
2013545723.tif 000017
丸底フラスコに、磁気撹拌バー、シアン化銅（１．４５ｇ，１６．２ｍｍｏｌ）、エピクロロヒドリン（１５ｇ，１６２ｍｍｏｌ）を仕込み、窒素をパージした。ＴＨＦを添加し、この溶液を−７８℃まで冷却し、リノレイルグリニャール（６８．８ｇ，１９５ｍｍｏｌ）をゆっくり添加した。グリニャールの添加後、反応液を周囲温度まで昇温させた。反応液を飽和塩化アンモニウム溶液クエンチし、エーテルで抽出した。有機部分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空にてエバポレートした。中間体のクロロアルコールをフラッシュクロマトグラフィーによって精製した（シリカ，０から３５％までの酢酸エチル／ヘキサン）。このアルコールをＴＨＦに溶解させ、固体のＮａＯＨペレットとともに周囲温度で１６時間撹拌し、次いでＮａＯＨを濾別し、有機層を水で洗浄した。有機部分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空内でエバポレートし、（２Ｓ）−２−［（１０Ｚ，１３Ｚ）−ノナデカ−１０，１３−ジエン−１−イル］オキシランを得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ｍＨｚ）δ  ０．８７−０．９０（ｍ，３Ｈ）、１．２７−１．５２（ｍ，２２Ｈ）、２．０１−２．１９（ｍ，４Ｈ）、２．４０−２．４６（ｍ，１Ｈ）、２．７１−２．７６（ｍ，３Ｈ）、２．８９−２．９１（ｍ，１Ｈ）、５．３０−５．３６（ｍ，４Ｈ）；ＬＣ／ＭＳ（ｍ＋Ｈ＋アセトニトリル）＝３４９．５。
【００９９】
【化１５】
2013545723.tif 000018
アルコール（２．５５ｇ，１９．６ｍｍｏｌ）をＤＣＭに溶解させ、０℃まで冷却した。この溶液に塩化スズ（１．６３ｍｍｏｌ，１．６３ｍＬの１Ｍ溶液）を添加した。エポキシド（５ｇ，１６．３ｍｍｏｌ）を反応混合物に滴下し、反応液を０℃で１時間熟成させた。反応液を真空内でエバポレートし、ヘキサンに溶解させ、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し（０から２０％までの酢酸エチル／ヘキサン）、（２Ｒ，１２Ｚ，１５Ｚ）−１−（オクチルオキシ）ヘニコサ−１２，１５−ジエン−２−オールを得た。ＬＣ／ＭＳ（ｍ＋Ｈ）＝４３７．６。
【０１００】
【化１６】
2013545723.tif 000019
このアルコールを、化合物１で記載のようにして最終化合物１２へと持ち越した。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ｍＨｚ）δ  ０．８５−．０９１（ｍ，６Ｈ）、１．２７２（ｓ，３４Ｈ）、１．４６（ｍ，１Ｈ）、１．５７（ｍ，１Ｈ）、１．６５（ｓ，４Ｈ）、２．０１−２．０８（３Ｈ）、２．３０（ｍ，６Ｈ）、２．５２（ｍ，１Ｈ）、２．７５−２．７９（ｍ，２Ｈ）、３．２９−３．４（ｍ，２Ｈ）、３．４６−３．５１（ｄｄ，Ｊ＝９．７６Ｈｚ，１Ｈ）、５．３０−５．３９（ｍ，４Ｈ）；ＬＣ／ＭＳ（ｍ＋Ｈ）＝４６４．７。
【０１０１】
化合物１３〜１６は新規なカチオン性脂質であり、上記の一般スキーム２に従って調製した。
【０１０２】
【表２】
2013545723.tif 000020
Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−｛［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］メチル｝ウンデカン−１−アミン（化合物１７）
【０１０３】
【化１７】
2013545723.tif 000021
アルコールｉｉｉ（１５ｇ，３４．３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５０ｍＬ）溶液に、デス・マーチンペルヨージナン（１４．６ｇ，３４．３ｍｍｏｌ）を添加し、反応液を周囲温度で１６時間撹拌した。固形物を濾過し、濾液を水／ＤＣＭ間に分配した。有機部分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空にてエバポレートした。フラッシュクロマトグラフィーによって精製し（シリカ，０から１５％までの酢酸エチル／ヘキサン）、ケトンｖｉｉを得た。ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝４３５．６。
【０１０４】
【化１８】
2013545723.tif 000022
ケトンｖｉｉ（１０ｇ，２３．０ｍｍｏｌ）のＤＭＥ（４０ｍＬ）溶液に、ＴＯＳＭＩＣ（５．８ｇ，２９．９ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を０℃まで冷却した。この冷却溶液にカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（４６ｍｍｏｌ，４６ｍＬの１Ｍ  ｔＢｕＯＨ溶液）を滴下した。３０分後、反応液をヘキサンと水間に分配した。有機部分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空にてエバポレートした。フラッシュクロマトグラフィーによって精製し（シリカ，０から１０％までの酢酸エチル／ヘキサン）、ニトリルｖｉｉｉを得た。ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝４４６．６。
【０１０５】
【化１９】
2013545723.tif 000023
ニトリルｖｉｉｉ（４．６ｇ，１０．４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２５ｍＬ）溶液に、水素化アルミニウムリチウム（０．８ｇ，２０．７ｍｍｏｌ）を周囲温度で添加した。反応液を硫酸ナトリウム十水和物溶液でクエンチし、固形物を濾過した。濾液を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空内でエバポレートし、粗製のアミンｉｘを得、これを、直接、次の反応に持ち越した。ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝４５０．６。
【０１０６】
【化２０】
2013545723.tif 000024
アミンｉｘ（４．７ｇ，１０．３ｍｍｏｌ）とホルムアルデヒド（２．５ｇ，３１．１ｍｍｏｌ）を含むＴＨＦ（２５ｍＬ）の溶液をナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（６．６ｇ，３１．１ｍｍｏｌ）で周囲温度にて処理した。１５分間熟成後、反応液を１Ｍ水酸化ナトリウムでクエンチし、水とヘキサン間に分配した。有機部分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空にてエバポレートした。分取用逆相クロマトグラフィーによって精製し（Ｃ８カラム，アセトニトリル／水勾配）、化合物１７を得た。ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝４７９．６．１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ｍＨｚ）δ  ５．３６（ｍ，４Ｈ）、３．３８（ｍ，３Ｈ）、３．２６（ｍ，１Ｈ）、２．７５（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）、２．２２（ｍ，１Ｈ）、２．１９（ｓ，６Ｈ）、２．０４（ｍ，５Ｈ）、１．７１（ｍ，１Ｈ）、１．５４（ｍ，２Ｈ）、１．２８（ｍ，３２Ｈ）、０．８３（ｍ，６Ｈ）。
Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−｛［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］メチル｝ドデカン−１−アミン（化合物１８）
【０１０７】
【化２１】
2013545723.tif 000025
シリルアミド（１２．４ｇ，７８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５０ｍＬ）溶液を−７８℃まで冷却し、ｎＢｕＬｉ（６２．４ｍｍｏｌ，２５ｍＬの２．５Ｍ溶液）で処理し、１０分間熟成させた。この溶液に、ケトンｖｉｉ（１２ｇ，２７．６ｍｍｏｌ）を少量に分けて（乾燥ＴＨＦ中）移した。反応液を１５分間熟成させ、次いで周囲温度まで昇温させ、重炭酸ナトリウム溶液でクエンチし、水とヘキサン間に分配した。有機部分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空内でエバポレートし、アミドｘｉを得た。ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝５０５．６。
【０１０８】
【化２２】
2013545723.tif 000026
アミドｘｉ（７ｇ，１３．９ｍｍｏｌ）を、マイクロ波バイアル内でＬ−セレクトリド（５５．６ｍｍｏｌ，５５．６ｍＬの１Ｍ溶液）で処理した。反応液を密封し、マイクロ波反応セット内で７０℃にて１６時間、放射線照射した。次いで、反応液をジクロロメタンで希釈し、沸騰発泡が停止するまで注意深く過ホウ酸ナトリウム固体を添加することによってクエンチした。固形物を濾過し、濾液を真空内でエバポレートし、ｘｉｉを得た。ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝５０７．６。
【０１０９】
【化２３】
2013545723.tif 000027
アミドｘｉｉ（７ｇ，１３．８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３０ｍＬ）溶液に、水素化アルミニウムリチウム（ｌ．ｌｇ，２７．７ｍｍｏｌ）を添加した。反応液を硫酸ナトリウム十水和物溶液でクエンチし、固形物を濾過した。有機部分を真空内でエバポレートし、生成物を分取用逆相クロマトグラフィーによって精製し（Ｃ８カラム，アセトニトリル／水勾配）、化合物１８を得た。ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝４９３．６．１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ｍＨｚ）δ  ５．３８（ｍ，４Ｈ）、３．３８（ｍ，２Ｈ）、３．２６（ｍ，２Ｈ）、２．７８（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．２５（ｍ，８Ｈ）、２．０４（ｍ，４Ｈ）、１．５６（ｍ，４Ｈ）、１．２９（ｍ，３２Ｈ）、０．８９（ｍ，６Ｈ）。
（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（８−｛２−［（２−ペンチルシクロプロピル）メチル］シクロプロピル｝オクチル）オキシ］トリデカン−２−アミン（化合物１９）
【０１１０】
【化２４】
2013545723.tif 000028
ジエン（２４ｇ，５１．６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（ｌ００ｍＬ）溶液を−１５℃まで冷却した。この溶液に、ジエチル亜鉛（３１０ｍｍｏｌ，３１０ｍＬの１Ｍ溶液）を添加した後、ジヨードメタン（２５ｍＬ，３１０ｍｍｏｌ）を添加し、反応液を１６時間熟成させ、この間、ゆっくり周囲温度まで昇温させた。反応液を塩化アンモニウム溶液でクエンチし、水とジクロロメタン間に分配した。有機部分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空にてエバポレートした。フラッシュクロマトグラフィーによって精製し（シリカ，０から２５％までの酢酸エチル／ヘキサン）、ビス−シクロプロパン中間体ｘｉｖを得た。ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝４９３．６。
【０１１１】
【化２５】
2013545723.tif 000029
化合物ｘｉｖを、上記の化合物１で概要を示したようにして最終化合物１９へと持ち越した。ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝５２０．８。
【０１１２】
化合物２０は、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，２８，１７２−１７６、国際公開第２０１０／０４２８７７号パンフレット、同第２０１０／０４８５３６号パンフレット、同第２０１０／０８８５３７号パンフレット、および同第２００９／１２７０６０号パンフレットに記載のＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡである。
【０１１３】
【化２６】
2013545723.tif 000030
化合物２１は、国際公開第２０１０／０５４４０１号パンフレット、および同第２０１０／１４４７４０号パンフレットに記載のＭＣ３である。
【０１１４】
【化２７】
2013545723.tif 000031
ＬＮＰ組成物
以下の本発明の脂質ナノ粒子組成物（ＬＮＰ）：
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ５６．６／３８／５．４；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ６０／３８／２；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ６７．３／２９／３．７；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ４９．３／４７／３．７；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ５０．３／４４．３／５．４；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ  ４０／４８／２／１０；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ／ＤＳＰＣ  ４０／４８／２／１０；および
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ／ＤＳＰＣ  ５８／３０／２／１０
は、オリゴヌクレオチド、具体的にはｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの送達に有用である。
ＬＮＰプロセスの説明：
脂質ナノ粒子（Ｌｉｐｉｄ  Ｎａｎｏ−Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＬＮＰ））は、衝突噴流プロセスによって調製される。この粒子は、アルコールに溶解させた脂質を、クエン酸バッファーに溶解させたｓｉＲＮＡと混合することにより形成される。ｓｉＲＮＡに対する脂質の混合比は、脂質が４５〜５５％およびｓｉＲＮＡが６５〜４５％を目標にする。脂質溶液は、本発明の新規なカチオン性脂質、ヘルパー脂質（コレステロール）、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＭＧ）脂質およびＤＳＰＣを、アルコール（例えば、エタノール）中に５〜１５ｍｇ／ｍＬ（目標９〜１２ｍｇ／ｍＬ）の濃度で含むものにする。脂質の比率は、カチオン性脂質が２５〜９８（目標３５〜６５）のモルパーセント範囲を有し、ヘルパー脂質は０〜７５（目標３０〜５０）のモルパーセント範囲を有し、ＰＥＧ脂質は１〜１５（目標１〜６）のモルパーセント範囲を有し、ＤＳＰＣは０〜１５（目標０〜１２）のモルパーセント範囲を有するようにする。ｓｉＲＮＡ溶液は、１種類以上のｓｉＲＮＡ配列を、クエン酸ナトリウム緩衝塩溶液（３．５〜５の範囲のｐＨを有する）中に０．３〜１．０ｍｇ／ｍＬの（目標０．３〜０．９ｍｇ／ｍＬ）の濃度範囲で含むものにする。この２つの溶液を１５〜４０℃（目標３０〜４０℃）の範囲の温度まで加熱し、次いで、衝突噴流混合機内で混合すると、即座にＬＮＰが形成される。Ｔ字部内径（ｔｅｅＩＤ）は０．２５〜１．０ｍｍの範囲であり、総流速は１０〜６００ｍＬ／分にする。流速とチューブ内径の組合せは、ＬＮＰの粒径を３０〜２００ｎｍに制御する効果を有する。次いで、この溶液を緩衝溶液と高ｐＨで、１：１〜１：３（ｖｏｌ：ｖｏｌ）（だが１：２（ｖｏｌ：ｖｏｌ）を目標にする）の範囲の混合比で混合する。この緩衝溶液を１５〜４０℃（目標３０〜４０℃）の範囲の温度にする。混合ＬＮＰを３０分間〜２時間保持した後、アニオン交換濾過工程を行う。インキュベーション中の温度は１５〜４０℃（目標３０〜４０℃）の範囲にする。インキュベーション後、この溶液を０．８ｕｍフィルターに通して濾過する（アニオン交換分離工程を含む）。このプロセスでは、１ｍｍ  ＩＤ〜５ｍｍ  ＩＤの範囲のチューブ内径および１０〜２０００ｍＬ／分の流速が使用される。ＬＮＰは濃縮され、限外濾過プロセスによってダイアフィルトレーションされ、このとき、アルコールが除去され、クエン酸バッファーが最終バッファー溶液（リン酸緩衝生理食塩水など）と交換される。限外濾過プロセスには、タンジェンシャルフロー濾過形式（ＴＦＦ）が使用される。このプロセスでは、３０〜５００ＫＤの公称分子量カットオフ範囲の膜が使用される。膜形式は、中空繊維であってもフラットシートカセットであってもよい。適正な分子量カットオフを用いたＴＦＦプロセスにより、ＬＮＰが保持液中に保持され、濾液または透過液中にアルコール；クエン酸バッファー；および最終バッファー廃物が含有される。ＴＦＦプロセスは、初期濃度からｓｉＲＮＡ濃度１〜３ｍｇ／ｍＬまでの多工程プロセスである。濃縮後、ＬＮＰ溶液を最終バッファーに対して１０〜２０容量でダイアフィルトレーションしてアルコールを除去し、バッファー交換を行う。次いで、この物質をさらに１〜３倍に濃縮する。ＬＮＰプロセスの最終工程は、濃縮ＬＮＰ溶液の滅菌濾過および生成物のバイアル封入である。
解析手順：
１）ｓｉＲＮＡ濃度
ｓｉＲＮＡ二本鎖の濃度は、強アニオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＳＡＸ−ＨＰＬＣ）により、２９９６  ＰＤＡ検出器を備えたＷａｔｅｒｓ  ２６９５  Ａｌｌｉａｎｃｅシステム（Ｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ  ＭＡ）を用いて測定される。ＬＮＰ（あるいは、ＲＮＡｉ送達媒体（ＲＤＶ）とも称する）を、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理して全ｓｉＲＮＡを遊離させ、ＳＡＸ分離により、Ｄｉｏｎｅｘ  ＢｉｏＬＣ  ＤＮＡＰａｃ  ＰＡ  ２００（４×２５０ｍｍ）カラムを用いて解析する（２５４ｎｍでＵＶ検出）。移動相は、Ａ：２５ｍＭ  ＮａＣｌＯ４，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，２０％ＥｔＯＨ，ｐＨ７．０と、Ｂ：２５０ｍＭ  ＮａＣｌＯ４，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，２０％ＥｔＯＨ，ｐＨ７．０を０分から１５分までの線形勾配で構成し、流速を１ｍｌ／分とする。ｓｉＲＮＡ量は、ｓｉＲＮＡ標準曲線との比較によって求められる。
２）封入速度
蛍光試薬ＳＹＢＲ  ＧｏｌｄをＲＮＡ定量に使用し、ＲＤＶの封入速度をモニタリングする。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とともに、またはなしでＲＤＶを使用し、遊離ｓｉＲＮＡおよび全ｓｉＲＮＡの量を調べる。アッセイは、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５ｅマイクロプレート分光測光器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）製）を用いて行う。試料を４８５ｎｍで励起し、蛍光放射を５３０ｎｍで測定した。ｓｉＲＮＡ量は、ｓｉＲＮＡ標準曲線との比較によって求められる。
【０１１５】
封入速度＝（１−遊離ｓｉＲＮＡ／全ｓｉＲＮＡ）×１００％
３）粒径および多分散性
１μｇのｓｉＲＮＡを内包しているＲＤＶを、１×ＰＢＳで最終容量３ｍｌまで希釈する。試料の粒径および多分散性を、動的光散乱法によりＺｅｔａＰＡＬＳ機器（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いて測定する。散乱強度は、Ｈｅ−Ｎｅレーザーを用いて２５℃にて９０°の散乱角で測定する。
４）ゼータ電位の解析
１μｇのｓｉＲＮＡを内包しているＲＤＶを、１ｍＭのＴｒｉｓバッファー（ｐＨ７．４）で最終容量２ｍｌまで希釈する。試料の電気泳動移動度をＺｅｔａＰＡＬＳ機器（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＮＹ）（電極および光源としてＨｅ−Ｎｅレーザーを有する）を用いて調べる。ゼータ電位の計算には、スモルコフスキー限界を想定する。
５）脂質の解析
個々の脂質濃度を、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により、コロナ荷電化粒子検出器（ＣＡＤ）（ＥＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ，Ｃｈｅｌｍｓｆｏｒｄ，ＭＡ）を備えたＷａｔｅｒｓ  ２６９５  Ａｌｌｉａｎｃｅシステム（Ｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ  ＭＡ）を用いて測定する。ＲＤＶ内の個々の脂質を、ＣＡＤを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ１８（５０×４．６ｍｍ，１．８μｍ粒径）カラムを用いて６０℃で解析する。移動相は、Ａ：０．１％ＴＦＡ（Ｈ２Ｏ中）とＢ：０．１％ＴＦＡ（ＩＰＡ中）で構成する。勾配は、６０％の移動相Ａと４０％の移動相Ｂで時間０から１．００分のとき４０％の移動相Ａと６０％の移動相Ｂまで；４０％の移動相Ａと６０％の移動相Ｂで１．００から５．００分まで；４０％の移動相Ａと６０％の移動相Ｂで５．００分から１０．００分のとき２５％の移動相Ａと７５％の移動相Ｂまで；２５％の移動相Ａと７５％の移動相Ｂで１０．００分から１５．００分のときに５％の移動相Ａと９５％の移動相Ｂまで；および５％の移動相Ａと９５％の移動相Ｂで１５．００から２０．００分のときに６０％の移動相Ａと４０％の移動相Ｂまで変化させ、流速は１ｍｌ／分にする。個々の脂質濃度は、ＲＤＶ内の全脂質成分での標準曲線と比較して二次曲線フィットにより求める。各脂質のモル百分率を、その分子量に基づいて計算する。
【０１１６】
上記のＬＮＰプロセスを使用し、以下の比率の具体的なＬＮＰを特定した。
【０１１７】
【化２８】
2013545723.tif 000032
実施例１
マウスでの有効性のインビボ評価
化合物１〜１２を使用したすぐ上に示した公称組成のＬＮＰを、インビボ有効性について評価した。ｓｉＲＮＡは、ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼ遺伝子（受託番号Ｍ１５０７７）のｍＲＮＡ転写物を標的化するものである。ルシフェラーゼｓｉＲＮＡの一次配列と化学修飾パターンは上記に示している。インビボルシフェラーゼモデルには、ホタルルシフェラーゼコード配列がすべての細胞内に存在するトランスジェニックマウスを使用する。ＲＯＳＡ２６−ＬｏｘＰ−Ｓｔｏｐ−ＬｏｘＰ−Ｌｕｃ（ＬＳＬ−Ｌｕｃ）トランスジェニックマウス（Ｄａｎａ  Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから実施許諾を得た）を、最初に組換えＡｄ−Ｃｒｅウイルス（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてＬＳＬ配列を除去することにより、ルシフェラーゼ遺伝子が発現されるように誘導する。該ウイルスの臓器向性の性質のため、尾静脈注射によって送達すると、発現は肝臓に限定される。肝臓内ルシフェラーゼ発現レベルを、ルシフェリン基質（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の投与後にＩＶＩＳ撮像装置（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を用いて光出力を測定することにより定量する。ＲＤＶの投与前に投与前発光レベルを測定する。ルシフェリン（ＰＢＳ中（１５ｍｇ／ｍＬ））を１５０μＬの容量で腹腔内（ＩＰ）注射する。４分間のインキュベーション期間後、マウスをイソフルランで麻酔し、ＩＶＩＳ撮像装置内に置く。ＲＤＶ（ｓｉＲＮＡを含有）（ＰＢＳビヒクル中）を０．２ｍＬの容量で尾静脈注射した。最終用量レベルを０．１〜０．５ｍｇ／ｋｇ  ｓｉＲＮＡの範囲とした。対照としてＰＢＳビヒクル単独を投与した。投与の４８時間後、上記の方法を用いてマウスの画像を撮影した。ルシフェリンの光出力の変化は、ルシフェラーゼのｍＲＮＡレベルと直接的に相関しており、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ活性の間接的は尺度を表す。インビボ有効性の結果を投与前発光レベルに対する発光阻害％として示す。ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ  ＲＤＶを全身投与すると、ルシフェラーゼ発現が用量依存的様式で減少した。ＲＤＶを内包している化合物１を投与したマウスでは、ＲＤＶ含有オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（ＯＣＤ）カチオン性脂質の場合よりも大きな有効性が観察された（図１）。ＯＣＤは既知であり、国際公開第２０１０／０２１８６５号パンフレットに記載されている。
【０１１８】
実施例２
ラットでの有効性および毒性のインビボ評価
該化合物を上記の公称組成で用いたＬＮＰを、インビボ有効性ならびにアラニンアミノトランスフェラーゼおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの増大について、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）雌ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ）において評価した。ｓｉＲＮＡは、ＡｐｏＢ遺伝子（受託番号ＮＭ０１９２８７）のｍＲＮＡ転写物を標的化するものである。ＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡの一次配列と化学修飾パターンは上記に示している。ＲＤＶ（ｓｉＲＮＡを含有）（ＰＢＳビヒクル中）を１〜１．５ｍＬの容量で尾静脈注射した。注入速度はおよそ３ｍｌ／分にする。各投与群には５匹のラットを使用した。ＬＮＰ投与後、ラットを、通常の飼料と水を存在させたケージ内に入れる。投与の６時間後、食糧をケージから除く。ＬＮＰ投与の２４時間後、動物の剖検を行う。ラットをイソフルラン下で５分間麻酔し、次いで、イソフルランの送達を継続しながらノーズコーン内に入れることにより、放血が完了するまで麻酔下に維持する。大静脈からの血液を、２３ゲージのバタフライ型静脈穿刺セットを用いて収集し、血清化学解析のために血清分離器バキュテイナーにアリコートに分ける。切除した肝臓の尾状葉の円筒形切片（ｐｕｎｃｈ）を作製し、ｍＲＮＡ解析のためにＲＮＡＬａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）内に入れる。保存した肝臓組織をホモジナイズし、ＱｉａｇｅｎビーズミルおよびＱｉａｇｅｎ  ｍｉＲＮＡ−Ｅａｓｙ  ＲＮＡ単離キットを製造業者の使用説明書に従って用いて全ＲＮＡを単離した。肝臓ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。メッセージを精製ＲＮＡから、ラットＡｐｏＢの市販のプローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＲＮ０１４９９０５４＿ｍｌ）を用いて増幅した。ＰＣＲ反応は、９６ウェル高速ブロックを有するＡＢＩ  ７５００機器で行った。ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルをハウスキーピングＰＰＩＢ（ＮＭ０１１１４９）ｍＲＮＡに対して標準化する。ＰＰＩＢ  ｍＲＮＡレベルは、ＲＴ−ＰＣＲにより、市販のプローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓカタログ番号Ｍｍ００４７８２９５＿ｍｌ）を用いて測定した。結果をＡｐｏＢ  ｍＲＮＡ／ＰＰＩＢ  ｍＲＮＡ比として示す。ｍＲＮＡのデータはすべて、ＰＢＳ投与対照に相対して示したものである。血清ＡＬＴおよびＡＳＴ解析はＳｉｅｍｅｎｓ  Ａｄｖｉａ  １８００  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒで、Ｓｉｅｍｅｎｓアラニンアミノトランスフェラーゼ（カタログ番号０３０３９６３１）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（カタログ番号０３０３９６３１）試薬を用いて行った。ＲＤＶを内包している化合物１を投与したラットにおいて、ＲＤＶを内包しているカチオン性脂質ＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡ（化合物２０）またはＭＣ３（化合物２１，図２）の場合よりも、同様の有効性が観察された。さらに、３ｍｇ／ｋｇ  ＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡ（化合物２０）で処置した４匹のラットのうち３匹は４８時間生存できず、３ｍｇ／ｋｇ  ＭＣ３（化合物２１）で処置した４匹のラットのうち２匹は４８時間生存できなかった。１０ｍｇ／ｋｇ  化合物１で処置した４匹のラットのうち１匹は投与後４８時間目に生存していた。
【０１１９】
実施例３
ラット肝臓内カチオン性脂質レベルの測定
肝臓組織を２０ｍｌ容バイアル内に量り入れ、９ｖ／ｗの水中でＧｅｎｏＧｒｉｎｄｅｒ  ２０００（ＯＰＳ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，１６００ストローク／分，５分間）を用いてホモジナイズした。各組織ホモジネートの５０μＬアリコートを３００μＬの抽出／タンパク質析出溶媒（５００ｎＭの内部標準を含有する５０／５０のアセトニトリル／メタノール）と混合し、プレートを遠心分離して析出し、タンパク質を沈降させた。次いで、２００μＬ容量の各上清みを９６ウェルプレートの別々のウェルに移し、１０μＬの試料をＬＣ／ＭＳ−ＭＳによって直接解析した。
【０１２０】
既知量の該化合物（ｏｍｐｏｕｎｄ）のメタノールストック溶液を未処理のラット肝臓ホモジネート（９容量の水／肝臓重量）にスパイクすることにより、標準を調製した。各標準／肝臓ホモジネートのアリコート（５０μＬ）を３００μＬの抽出／タンパク質析出溶媒（５００ｎＭの内部標準を含有する５０／５０のアセトニトリル／メタノール）と混合し、プレートを遠心分離して析出し、タンパク質を沈降させた。２００μＬ容量の各上清みを９６ウェルプレートの別々のウェルに移し、１０μＬの各標準をＬＣ／ＭＳ−ＭＳによって直接解析した。
【０１２１】
肝臓ホモジネートから調製および抽出した標準に対する絶対定量を、ＡＰＩ  ４０００トリプル四重極質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に連結したＡｒｉａ  ＬＸ−２  ＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。各操作では、総量１０μＬの試料をＢＤＳ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  Ｃ８  ＨＰＬＣカラム（Ｔｈｅｒｍｏ，５０×２ｍｍ，３μｍ）に周囲温度でインジェクションした。
【０１２２】
移動相Ａ：９５％Ｈ２Ｏ／５％メタノール／１０ｍＭギ酸アンモニウム／０．１％ギ酸  移動相Ｂ：４０％メタノール／６０％ｎ−プロパノール／１０ｍＭギ酸アンモニウム／０．１％ギ酸  流速は０．５ｍＬ／分とし、勾配溶出プロフィールは以下のとおり：８０％Ａで０．２５分間保持、１００％Ｂまで１．６分間にわたって線形漸増、１００％Ｂで２．５分間保持、次いで、８０％Ａに戻して１．７５分間保持とした。全操作時間は５．８分間であった。ＡＰＩ  ４０００ソースパラメータは、ＣＡＤ：４、ＣＵＲ：１５、ＧＳ１：６５、ＧＳ２：３５、ＩＳ：４０００、ＴＥＭ：５５０、ＣＸＰ：１５、ＤＰ：６０、ＥＰ：１０とした。ＲＤＶを内包している化合物１を投与したラットでは、肝臓内レベルは、ＲＤＶを内包しているカチオン性脂質ＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡ（化合物２０）またはＭＣ３（化合物２１，図３）の場合よりも低かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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