(57)【要約】  光学セグメンテーションを使用して生体試料中のタンパク発現及び場所をイメージングする方法が提供される。その段階は、生体試料の蛍光画像を取得する段階と、画像を分析し、生体試料内の特異的構造に対応するマスキングパターンを生成する段階と、生体試料上に投射されうるデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）の空間座標にマスキングパターンを変換する段階と、マスク化蛍光画像を得る段階とを含む。さらに、光学セグメンテーションを使用して生体試料中のタンパク発現及び場所をイメージングするための画像分析システムが提供される。【選択図】  図３
2013524261.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体支持体に配置され、蛍光顕微鏡に取り付けられた生体試料の光学セグメンテーションのための方法であって、
所定の波長の光源からの光を生体試料上に送出し、前記光により、前記生体試料が蛍光を発光し、
画像取り込みデバイスを使用して前記生体試料の蛍光画像を取得し、
少なくとも部分的に、フィーチャベース情報又は画素強度情報を利用して前記蛍光画像を分析して、前記生体試料内の特異的構造に対応するマスキングパターンを生成し、
前記マスキングパターンを、再フォーマットされたマスキングパターンに変換して、前記画像取り込みデバイスの前記画像をデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）の空間座標に位置合わせし、
前記デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）を使用して、前記再フォーマットされたマスクパターンを前記生体試料に投射し、前記ＤＭＤが前記光源と前記生体試料との間に配置され、前記再フォーマットされたマスク化パターンが前記生体試料と位置合わせされ、
前記生体試料のマスク化蛍光画像を前記画像取り込みデバイスで取得し、
前記マスク化蛍光画像をデジタル画像に転換する
ことを含む方法。
【請求項２】
前記マスキングパターンを、再フォーマットされたマスキングパターンに変換することが、アフィン変換パラメータを前記マスキングパターンに適用することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記アフィン変換パラメータが較正手順を使用して計算され、前記較正手順が、
目標画像を前記ＤＭＤ上にアップロードし、前記画像を較正試料上に投射し、
前記較正試料上に投射された前記目標画像の較正画像を取得し、
前記較正画像を数を減らして選択して、前記画像取り込みデバイスとデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）の空間座標との間の形状係数を整合させ、再フォーマットされた画像を生成し、
前記再フォーマットされた画像を前記目標画像と位置合わせし、前記アファイン変換パラメータについて解くこと
を含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記数を減らして選択することが、双直線補間及び２Ｄテーパリング関数を前記画像取り込みデバイスからの画像に適用することを含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記アファイン変換の変換パラメータについて解くことが、フーリエ変換演算を画像位置合わせに適用することを含む、請求項３記載の方法。
【請求項６】
前記フーリエ変換演算の大きさが対数極座標空間において表される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記再フォーマットされたマスクパターンを前記生体試料に投射することが、前記生体試料の空間照明を変更することをもたらす、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記生体試料の前記空間照明を変更することが、前記生体試料で見いだされる目標でない外因性蛍光体又は内因性蛍光化合物の励起を減少させることによって画像取り込みデバイスのダイナミックレンジを拡大する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記生体試料の前記空間照明を変更することが、前記マスク化画像の空間境界内での１つ以上のバイオマーカーの光学セグメンテーションを可能にする、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記マスク化蛍光画像をデジタル画像に転換することが、前記再フォーマットされたマスクパターンのポジ又はネガ画像を表す、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記生体試料の蛍光画像を取得することが、前記蛍光画像の信号対雑音比、忠実度、特異性、又はそれらの組合せを向上させるために前記試料を選択的に照明するのに前の画像からの画像情報を使用することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
固体支持体に配置された生体試料の光学セグメンテーションのための画像分析システムであって、
前記生体試料を取り付けるためのステージを有する蛍光顕微鏡と、
前記生体試料を照明し、光が前記蛍光顕微鏡の開口を通り、前記生体試料上に誘導されるように配置された光源と、
前記光源と前記蛍光顕微鏡の前記開口との間に配置されるデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）と、
前記蛍光顕微鏡に取り付けられ、前記生体試料の蛍光画像を取得するように構成された画像取り込みデバイスと、
前記画像取り込みデバイスからの蛍光画像を受け取り、
少なくとも部分的に、フィーチャベース情報又は画素強度情報を利用して前記蛍光画像を分析して、前記生体試料内の特異的構造に対応するマスキングパターンを生成し、
前記マスキングパターンを、再フォーマットされたマスキングパターンに変換して、前記画像取り込みデバイスの前記画像を前記ＤＭＤの空間座標に位置合わせする
ように構成された、デジタル光プロセッサと
を備えるシステム。
【請求項１３】
前記デジタル光プロセッサがアフィン変換パラメータを前記マスキングパターンに適用するように構成される、請求項１２記載のシステム。
【請求項１４】
前記デジタル光プロセッサが、前に分析した１つ以上の試料からのアフィン変換パラメータを記憶するようにさらに構成される、請求項１３記載のシステム。
【請求項１５】
前記前に分析された試料が較正試料からのものである、請求項１４記載のシステム。
【請求項１６】
前記ＤＭＤは、個々のマイクロミラー表面に入射する光が前記蛍光顕微鏡の前記開口の中に又は離れたところに偏向され、その結果、パターン画像が前記生体試料上に投射されうるように構成された２次元ＭＥＭＳミラーアレイである、請求項１２記載のシステム。
【請求項１７】
前記デジタル光プロセッサが、前の画像からの画像情報を使用して前記生体試料の前記照明を制御するようにさらに構成され、前記照明が、前記取り込まれる蛍光画像の信号対雑音比、忠実度、特異性、又はそれらの組合せを向上させる、請求項１２記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体試料の光学セグメンテーション方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子病理学のための一般的な蛍光イメージングシナリオでは、染料を使用して、特異的タンパク又は細胞内コンパートメントに標識する。多くの場合、最も関心のあるタンパクは、低レベルで、及びイメージングのための蛍光リポーターを励起する途中に発現され、組織切片などの生体試料全体が照明され、関心のある目標領域の外側の内在源又は非特異的結合に起因する蛍光放出を生成する。放出光の余分な発生源は雑音信号であり、低発現タンパクを正確に定量化するには、一般に、後処理法によって除去又は排除されなければならない。
【０００３】
構造化照明顕微鏡法（ＳＩＭ）は、照明パターン又はマスクを使用して関心のある特異的細胞領域の照明及び解像度の空間的制御を可能にするそのような後処理法の使用を必要とするイメージング技術である。この方法は、自己蛍光低減、拡張ダイナミックレンジイメージング、及び光学的深さセクショニングのような用途に使用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００８／１４５７２０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、画像取得自体の間に、関心のある特異的領域を目標とするか、又はコントラスト及び信号対雑音比を局所的に向上させるのに使用することができる方法の必要性がある。実時間ＳＩＭプロセスは、後続の照明パターンを調整するために組織画像の前の情報又は特異的フィーチャを使用して試料の蛍光励起及び分析の効率又は特異性を改善することになる。しかし、これを達成するには、取得される画像及び照明マスクが位置合わせされ、その結果、後続の画像取得の間、照明マスクを試料に正確に重ねることができることをプロセスは必要とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、光学セグメンテーションを使用して生体試料中のタンパク発現及び場所をイメージングすることに関する。
【０００７】
したがって、本発明の一実施形態は、固体支持体に配置され、蛍光顕微鏡に取り付けられた生体試料の光学セグメンテーションのための方法を含む。この方法は、所定の波長の光源からの光を生体試料上に送出し、光により、生体試料が蛍光を発光し、画像取り込みデバイスを使用して生体試料の蛍光画像を取得し、少なくとも部分的に、フィーチャベース情報又は画素強度情報を利用して蛍光画像を分析して、生体試料内の特異的構造に対応するマスキングパターンを生成し、このマスキングパターンを、再フォーマットされたマスキングパターンに変換して、画像取り込みデバイスの画像をデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）の空間座標に位置合わせし、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）を使用して、再フォーマットされたマスクパターンを生体試料に投射し、ＤＭＤが光源と生体試料との間に配置され、再フォーマットされたマスク化パターンが生体試料と位置合わせされ、生体試料のマスク化蛍光画像を画像取り込みデバイスで取得し、マスク化蛍光画像をデジタル画像に転換することを含む。
【０００８】
別の実施形態では、本発明は、固体支持体に配置された生体試料の光学セグメンテーションのための画像分析システムを含む。この画像分析システムは、生体試料を取り付けるためのステージを有する蛍光顕微鏡と、生体試料を照明し、光が蛍光顕微鏡の開口を通り、生体試料上に誘導されるように配置された光源と、光源と蛍光顕微鏡の開口との間に配置されるデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）と、蛍光顕微鏡に取り付けられ、生体試料の蛍光画像を取得するように構成された画像取り込みデバイスと、デジタル光プロセッサとを備える。デジタル光プロセッサは、画像取り込みデバイスからの蛍光画像を受け取り、少なくとも部分的に、フィーチャベース情報又は画素強度情報を利用して蛍光画像を分析して、生体試料内の特異的構造に対応するマスキングパターンを生成し、このマスキングパターンを、再フォーマットされたマスキングパターンに変換して、画像取り込みデバイスの画像をＤＭＤの空間座標に位置合わせするように構成される。
【０００９】
本発明のこれら及び他の特徴、態様、及び利点は、図面の全体を通して同様の符号が同様の部分を表す添付図面を参照しながら以下の詳細な説明が読まれるとき一層よく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】「オン」及び「オフ」状態においてマイクロミラー表面に入射する光を示すＤＭＤ動作の概略図である。
【図２】光を誘導するためにＤＭＤデバイスを使用する照明システムによる照明経路を示す概略図である。
【図３】カメラ座標をＤＭＤの座標にマッピングするパラメータを解くのに使用することができる１つの較正ルーチンを示す流れ図である。
【図４】ＤＬＰ座標に一致するようにカメラ画像を較正するのに使用される目標ＤＭＤ画像の顕微鏡写真図である。
【図５】ハニング窓を乗算した後のカメラ画像及びＤＭＤ画像の顕微鏡写真図である。
【図６】ＤＭＤ画像（Ａ）及びカメラ画像（Ｂ）のフーリエ変換の大きさの対数極座標変換の顕微鏡写真図である。
【図７】赤血球が飽和を引き起こす３００ｍｓ露光時間でイメージングされた均一照明の前立腺試料の顕微鏡写真図である。
【図８】前に飽和した領域への励起を低減する照明マスクを使用して、９００ｍｓ露光時間でイメージングされた前立腺試料の顕微鏡写真図である。
【図９】染色細胞核を示す、ＤＡＰＩチャネルでイメージングされた結腸試料（Ａ）、Ｃｙ３バンドで着色するケラチン（Ｂ）、及び照明マスクとしてケラチン画像を使用してＤＡＰＩチャネルでイメージングされた上皮核（Ｃ）の顕微鏡写真図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
従来の蛍光イメージングシステムでは、空間的に均一な光源を使用して関心のある蛍光標識されたバイオマーカーを励起し、それにより、生体試料内で見いだされる外因性蛍光体及び内因性蛍光化合物の両方の励起がもたらされる。しかし、所与のタンパクが、細胞核又は上皮などの特異的細胞領域で主として発現することが知られている場合、この情報を利用して、蛍光励起の効率又は特異性を改善することができる。タンパク発現領域の外側の励起は、まず所与のチャネルの関心のある構造の均一照明の画像を取り込み、この画像を、関心のあるマーカーに対応するチャネルのための照明マスクとして使用することよって避けられる。
【００１２】
本発明は、概して、均一照明の生体試料から得られた情報を使用して、生体試料内の関心のある構造フィーチャを選択的に照明する画像取得法に関する。この方法は、生体試料内の特異的構造に対応するマスキングパターンを生成することを含む。特異的構造は、限定はしないが、細胞膜マーカー、血管マーカー、核染色、腫瘍マーカー、上皮マーカー、又は間質マーカーを含む高発現形態学的信号である。
【００１３】
生成されたマスキングパターンは、少量マーカーが存在すると推定される領域の照明で使用することができる。したがって、この方法は、リポフスチンや赤血球などの試料内の高度放出発生源に関連する問題の幾つかを緩和することによって試料のダイナミックレンジイメージングを拡大するのに使用される。例えば、選択された細胞内組織領域のダイナミックレンジイメージングは、赤血球などの試料内の他の物体の励起を避けながら、必要とされる照明をより多く送ることによって、最適化することができる。言い換えれば、目標とされていない、生体試料内で見いだされる外因性蛍光体及び内因性蛍光化合物の両方の励起を減少させることができる。さらに、形態学的マーカーを使用して設計された照明マスクにより、特異的細胞及び組織構造を対象とした他の生物マーカーの検出を可能にすることができる
幾つかの実施形態では、生体試料は固体支持体に取り付け、生体試料上に投射されるマスキングパターンを使用して分析するための蛍光顕微鏡に配置することができる。生体試料という用語は、生体内又は生体外で得られる生体組織又は流体起源の試料を含む生物学的対象から得られる試料を指す。そのような試料は、限定はしないが、人間を含む哺乳動物から分離された体液（例えば、血液、血漿、血清、又は尿）、臓器、組織、画分及び細胞とすることができる。生体試料は、組織を含む生体試料の切片（例えば、臓器又は組織の断面部分）をさらに含むことができる。生体試料は、生体試料からの抽出物、例えば、生体液（例えば、血液又は尿）からの抗原をさらに含むことができる。
【００１４】
生体試料は原核生物起源又は真核生物起源（例えば、昆虫、原生動物、鳥、魚、爬虫類）のものとすることができる。実施形態によっては、生体試料は哺乳類（例えば、ネズミ、マウス、牛、犬、ロバ、モルモット、又はウサギ）である。幾つかの実施形態では、生体試料は霊長類起源（例えば、チンパンジー又は人間）である。さらに、固体支持体は、生体試料が本明細書で開示する方法によって固定され、続いて検出されうる物品を指す。生体試料は、物理吸着によって、共有結合形成によって、又はそれらの組合せによって固体支持体に固定することができる。固体支持体は、重合体、ガラス、又は金属材料を含むことができる。固体支持体の例には、膜、マイクロタイタ板、ビード、フィルタ、テストストリップ、スライド、カバーガラス、及び試験管が含まれる。
【００１５】
イメージングに先立って、生体試料は、まず、分子マーカー（色素及び抗体）を使用して、蛍光色素又は蛍光体で標識することができる。例えば、細胞核はＤＡＰＩ（ＤＮＡに特異的に結合する蛍光色素）で染色することができるが、一方、組織の他の領域は免疫蛍光法的に標識することができ、関心のある分子は、直接共役した抗体によって、又は主要な二次増幅検出によって目標にされる。赤血球（ＲＢＣ）などの幾つかの構造では、自己蛍光が生じることがある。
【００１６】
マスキングパターンを生成する方法は、所定の波長の光源からの光を生体試料上に送出することを含み、光により、生体試料は蛍光を発光する。幾つかの実施形態では、生体試料は表面の端から端まで均一に照明される。他の実施形態では、前の走査又は同様の試料から得られた画像情報を使用して、試料を選択的に照明することができる。選択的な照明は、後続で取り込まれる広視野蛍光画像の信号対雑音比、忠実度、特異性、又はそれらの組合せを向上させることができる。
【００１７】
画像取り込みデバイスを使用して生体試料の広視野蛍光画像を取り込み、分析のためのデジタル光プロセッサ（ＤＬＰ）に移送することができる。画像は、少なくとも部分的に、フィーチャベース情報又は画素強度情報を使用して分析されて、生体試料内の特異的構造に対応するマスキングパターンが生成される。
【００１８】
マスキングパターンは、広視野蛍光画像をデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）の空間座標に位置合わせするためにＤＬＰを使用して再フォーマットすることができ、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）は、光源とイメージングシステムの照明光学系との間に配置され、取り付けられた生体試料上に再フォーマットされたマスク化画像を投射するのに使用される。画像をＤＭＤ座標に再フォーマットすると、広視野画像とＤＭＤデバイスとの間のアレイ密度の差に関係する画像解像度の変動が除去され、したがって、重ねられた画像の配置が改良される。
【００１９】
ＤＭＤは様々な画素アレイで構成することができる。幾つかの実施形態では、ＤＭＤは、光を照明経路又は液晶デバイスの中に又はそれから離れたところに誘導することができるＭＥＭＳミラーとすることができる。ＭＥＭＳミラー（微小電気機械システム）はリソグラフィで生成されるミラーであり、それは、同様のリソグラフィ技法で生成される集積回路を通して印加される電圧信号で作動される。これらのミラーは、一般に、ミリメートル又は１ミリメートルの数分の１である寸法を有する。幾つかの実施形態では、ＤＭＤを構成するマイクロミラーは、「オン」状態及び「オフ」状態に対応する２つの角度の一方に配置される。状態間を切り替えるために、各ミラーは対角軸のまわりに個々に回転される。各マイクロミラーから反射される光は、図１に示されるように、「オン」状態では顕微鏡の照明光学系に誘導され、又は「オフ」状態では顕微鏡の入口から離れたところに偏向される。
【００２０】
図２は、顕微鏡に取り付けられることになるシステムを通る照明経路を示す本発明の一実施形態の図である。コリメータレンズ４０は、光源（図示せず）からの光を、限定はしないが非球面レンズなどのイメージング要素５０により集束し、光は広帯域ミラー６０からＤＭＤ７０に反射される。ＤＭＤマイクロミラー表面に入射し、顕微鏡対物レンズ８０に誘導される光は、非球面イメージングレンズ９０を通り視野絞り開口１００上に進む。
【００２１】
図２に示される照明経路中で画像を視野絞り上に合焦することによって、試料それ自体に焦点が合っている限り、ＤＭＤパターンは試料上に鮮明にイメージングされる。視野絞りは対物レンズの焦点面と共役であり、そのため、視野絞りと同一平面上にある画像が対物レンズの焦点面に中継ぎされることになる。
【００２２】
カメラで取得された画像をＤＭＤパターンとして使用するために、画像が顕微鏡光学系を通って投射されるときに生じる変倍、平行移動、及びシフトに一致させるのにアフィン変換を適用することができる。アフィン変換は、当初、線上にはあるすべての点が距離の変換及び拡大縮小の後に依然として線上にあり、線分の中間点が変換の後に中間点にとどまるような共線性を保存する任意の変換を指す。
【００２３】
アフィン変換の必要性に加えて、形状係数の不整合があることがある。例えば、ＤＭＤは７６８×１０２４ミラーであるミラーアレイを有することがあり、一方、カメラセンサは１７２８×２３５２画素である画素アレイを有することがある。したがって、ＤＭＤで使用するためにカメラ画像を再フォーマットするプロセスは、最終フォーマットが元のカメラ画像よりも少ない画素を有するのでダウンサンプリングを必要とすることがある。
【００２４】
変換パラメータが分かった後、変換パラメータをカメラで取得された画像に適用して、再フォーマットされた画像を生じさせることができ、それをＤＭＤにアップロードすることができる。再フォーマットされた画像は、顕微鏡を通して投射されるとき試料と正確に位置合わせされることになる。図３は、カメラ座標をＤＭＤの座標にマッピングするアフィンパラメータを解くのに使用することができる１つの較正ルーチンを示す流れ図である。目標の画像は、それぞれパラメータＳ、ｘ、及びｙ、すなわち変倍、回転、ｘシフト、及びｙシフトを解くために元の画像に位置合わせされる。
【００２５】
一実施形態では、図３に示されるように、目標画像がＤＭＤ上にアップロードされ（１）、較正試料上に投射される（２）。試料上のこの目標の画像は顕微鏡カメラにより取得される（３）。次に、試料は、２つの画像の間の形状係数を一致させて再サンプリングしたカメラ画像を生成するために数を減らして選択することができる（４）。再サンプリングされたカメラ画像と目標ＤＭＤ画像とは、位置合わせされ、アファイン変換パラメータ、すなわち、２つの画像間の回転、変倍、及びｘ−ｙ平行移動を解くのに使用される（５及び６）。変換パラメータが計算された後、パラメータは記憶し（７）、同じ顕微鏡カメラ及びＤＭＤを使用する生体試料画像の位置合わせに適用する（８）ことができる。
【００２６】
一実施形態では、較正ルーチンは、変換パラメータのために目標ＤＭＤ画像を使用し、それによって、ＤＭＤ画像は角と直線などの輪郭の明確なフィーチャを使用して、目標と試料平面上のその投射との間の頑健な位置合わせを容易にすることができる。このタイプの較正で使用される較正目標画像が図４に示され、スライドガラスとカバーガラスとの間に押しつけられた高濃度Ｃｙ３色素の薄層からなる。この目標は、Ｃｙ３フィルタセットで観察されるとき蛍光の明るい均一層をもたらした。色素層を薄くすると、ハイコントラストをもつ最良合焦の狭い範囲が保証された。図４は、ＤＭＤ目標画像（Ａ）、位置合わせの前の試料への投射（Ｂ）、及び位置合わせの後の試料への投射（Ｃ）を示す。
【００２７】
物体への目標ＤＭＤ投射が７６８×１０２４画素を有し、カメラの画像が１７２８×２３５２画素を有するとすると、カメラ画像の再サンプリングを使用して、位置合わせの前に２つの画像間の形状係数を一致させるようにすることができる。幾つかの実施形態では、双直線補間を使用して、カメラ画像の非整数座標での画素値が決定される。
【００２８】
幾つかの実施形態では、ハニング窓などの２Ｄテーパリング又はエッジフィルタリング関数を使用することができる。例えば、図４に示されたものなどの画像に２Ｄハニング窓関数を乗算して、画像の外側の５０の画素をゼロまで滑らかに次第に減少させることができる。そのようなテーパ窓は、位置合わせの際に画像フィーチャとして間違えることがあるエッジアーチファクトの存在を避けるのに使用することができる。窓処理の後、目標ＤＭＤ画像と再サンプリングされたカメラ画像とを位置合わせして、アファイン変換パラメータを解くことができる。
【００２９】
２つの画像の間の回転、変倍、及びｘ−ｙ平行移動が与えられたとして、適切な変換を適用してパラメータの各々を系統的に分離し、解くことができる。
【００３０】
幾つかの実施形態では、フーリエ変換を使用することができるが、それは、画像のシフトがそのフーリエ変換の大きさを変更しないからである。したがって、各画像のフーリエ変換の大きさのみを考慮することによって、画像位置合わせは回転と変倍との係数に制限されうる。画像の回転は、そのフーリエ変換の大きさの等しい回転をもたらす。α倍だけ画像を変倍すると、１／α倍だけ変倍されたフーリエ変換の大きさがもたらされる。しかし、これらのパラメータは、多くの場合、フーリエ変換から直接評価することが難しい。別の手法は、フーリエ変換の大きさを対数極座標空間で表すこととすることができる。
【００３１】
対数極座標変換は、画像を半径座標及び角度座標に割り当てるように適用することができ、それにより、変倍と回転はρ軸及びθ軸上の平行移動に本質的に転換される。画像のフーリエ変換の大きさは、
Ｃ＝ｌｏｇ（ａｂｓ（Ｆ（ｃ）））
及び
Ｄ＝ｌｏｇ（ａｂｓ（Ｆ（ｄ）））
であり、ここで、ｃ及びｄは、それぞれ、ハニング窓を乗算した後のカメラ画像及びＤＭＤ画像を表す。画像Ｃ及びＤが図５に示され、上にある行は全画像であり、下の行は拡大区域を示す。
【００３２】
図５で観察されるように、画像ＣはＤの変倍及び回転されたバージョンであり、そのため、極座標変換Ｃｐ及びＤｐは以下の関係式を有し、
Ｃｐ（ρ；θ）＝Ｄｐ（ρ／α，θ−θ’）
ここで、αは変倍係数であり、θ’は度単位の回転である。したがって、回転はθ軸に沿った平行移動に換算される。変倍係数を半径軸に沿った平行移動に換算するために、このρ軸は対数目盛りを使用して表すことができる。その結果は対数極座標画像Ｃｌｐ及びＤｌｐであり、それらは、以下の関係式
Ｃｌｐ（ρ；θ）＝Ｄｌｐ（ｌｏｇ（ρ）−ｌｏｇ（α），θ−θ’）
を有する。
【００３３】
次に、変倍係数は、以下のように対数極座標空間で平行移動ｌｏｇ（ａ）を見いだし、指数化することによって解くことができる。
【００３４】
ａ＝ｅlog(a)
同様に、回転は、ρ軸に沿ったシフトについて解くことによって決定される。対数極座標表現Ｃｌｐ及びＤｌｐが図６に示される。図６は、ＤＭＤ画像（Ａ）及びカメラ画像（Ｂ）のフーリエ変換の大きさの対数極座標変換の顕微鏡写真図である。これらの変換は中心としてフーリエ変換の中心又はＤＣ項を使用しており、したがって、前のフーリエ変換で観察された変倍及び回転をρ軸及びθ軸に沿った平行移動に転換する。
【００３５】
平行移動は、位相相関、すなわち、２つの画像の相対シフトをそれらの位相オフセットに基づいて決定する周波数ドメイン技法を使用して決定することができる。２つの画像ａ及びｂからの位相相関は、まず２つの信号の規格化クロスパワースペクトルを計算することによって決定することができ、
Ｒ＝ＡＢ＊／［ＡＢ＊］
と定義され、ここで、Ａ及びＢは画像ａ及びｂのフーリエ変換である。この場合、ａ及びｂは対数極座標変換Ｃｌｐ及びＤｌｐである。次に、関数ｒがＲの逆フーリエ変換から得られる。横方向シフトは、ｒのピークの水平及び垂直の位置に対応し、
（Δｘ；Δｙ）＝ａｒｇｍａｘ（ｒ）
である。
【００３６】
この技法を使用して、対数極座標プロットにおけるｌｏｇ（ｒ）及びθシフトを解くことができる。同様に、変倍及び回転を適用した後、２つの結果として生じる画像は、単に、ｘ及びｙのシフトの点で異なる。位相相関を適用して、２つの画像のｘ及びｙ平行移動を見いだすことができる。
【００３７】
実験
構造化照明は、市販のＤＭＤ開発基盤のＤＬＰ（登録商標）ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ（商標）４０００（テキサス州、ダラスのＴｅｘａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）を使用して実施された。このモジュールにより、８ビットグレースケール画像をアップロードし、ＸＧＡ解像度（７６８×１０２４画素）で表示することができる。広帯域水銀ランプのＥＸＦＯ  Ｘ−ＣＩＴＥ（登録商標）１２０Ｑ（カナダ、ケベックのＥＸＦＯ  Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｉｎｃ．）がシステムのための照明光源として使用された。液体ライトガイドが、ランプからの出力光をコリメートレンズまで導くのに使用されている。次に、２００ｍｍ焦点距離の非球面がコリメートビームをおよそＤＭＤのサイズ（０．７”の対角線長さ）のスポットに集束する。集束ビームの経路は、まず、ＤＭＤの面上に集束する前に、方向転換ミラーにより適切な角度で方向づけられる。最後に、２”直径の１００ｍｍの非球面ダブルを使用して、ＤＬＰの画像がＯｌｙｍｐｕｓ（登録商標）ＢＸ−５１顕微鏡（ペンシルバニア州、Ｃｅｎｔｅｒ  ＶａｌｌｅｙのＯｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｉｎｃ．）の視野絞り上に中継ぎされる。
【００３８】
Ａ．ダイナミックレンジ拡大
照明強度の空間的な変更を使用して、普通なら検出器を飽和させることになる領域から放出される信号の量を減少させることができる。これが、赤血球を含む前立腺試料を使用して実証され、それが図７に示されるようにＣｙ３チャネルでイメージングされている。赤血球は、カメラのダイナミックレンジを凌駕するのに十分な大きさの強度で蛍光を発し、その結果として、関心のある信号は比較的低い信号対雑音比（ＳＮＲ）のままである。赤血球への励起を低減するマスクを用いて照明した後、集積時間が検出器を飽和させることなく３倍にされた。これが図８に示される。信号領域の０．３５メガ画素区域にわたる平均化により、飽和する均一照明の画像では４３．１の平均画素値が示され、それは構造化照明による同じ領域の９１．９の平均値と比較される。
【００３９】
構造化照明の使用により、飽和を避けながら平均信号において２倍を超える増加がもたらされた。この結果は、強い自己蛍光発生源を取り扱うシステムのダイナミックレンジの有効な増加を実証している。飽和の場合には、均一照明の画像を使用し、飽和画素をゼロに設定することによって照明マスクが形成される。
【００４０】
Ｂ．光学セグメンテーション
生体構造の光学セグメンテーションは、関心のある形態学的フィーチャに対して染色した試料の画像を取得することによって行われる。この画像を処理することによって、照明マスクを生成し、それにより、関心のある構造に対応する領域にのみ励起が到達するようにすることができる。このマスクを異なるチャネルに使用することにより、マスクに対応する生体試料の形態論的構造の空間境界内での任意のバイオマーカーのセグメンテーションが可能になる。これが、上皮対間質細胞核のセグメンテーションに対して様々な組織試料で実証された。
【００４１】
図９は、ケラチン及び細胞核に対して染色された結腸組織、すなわち、ＤＡＰＩチャネルでイメージングされた染色細胞核（Ａ）、Ｃｙ３バンドで着色するケラチン（Ｂ）、及び照明マスクとしてケラチン画像を使用してＤＡＰＩチャネルでイメージングされた上皮核（Ｃ）の例である。ケラチン、すなわち、皮膜組織の多量タンパクがＣｙ３バンドで染色され、細胞核がＤＡＰＩで染色される。皮膜組織のＣｙ３チャネル画像が与えられると、ヒストグラム正規化とそれに続く閾値処理により、上皮組織の２値マップが与えられる。次に、このマップは位置合わせされ、ＤＭＤに送出される。ＤＡＰＩチャネルへの切替え及び上皮照明マスクの適用により、上皮細胞核のみが励振されることになる。
【００４２】
本発明は、分析物検出、組織化学、免疫組織化学、又は免疫蛍光法などの分析、診断、又は予知の用途のために生体試料を使用することに一般に関係する実施形態を含む。幾つかの実施形態では、本明細書で開示された方法は、組織化学、免疫染色、免疫組織化学、免疫測定、又は免疫蛍光法において特に適用可能とすることができる。幾つかの実施形態では、本明細書で開示された方法は、免疫ブロット技法、例えば、ウェスタンブロット、又は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などの免疫測定において特に適用可能とすることができる。
【００４３】
本発明はその趣旨又は本質的特質から逸脱することなく他の特異的形態で具現することができる。したがって、前述の実施形態は、本明細書で説明された本発明に限定するものではなくあらゆる点で例示と見なされるべきである。したがって、本発明の範囲は前述の説明によってではなく添付の特許請求の範囲によって示され、したがって、特許請求の範囲の均等の意味及び範囲内に入るすべての改変はその範囲内に包含されるものである。
【符号の説明】
【００４４】
４０  コリメータレンズ
５０  イメージング要素
６０  広帯域ミラー
７０  デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）
８０  顕微鏡対物レンズ
９０  非球面イメージングレンズ
１００  視野絞り開口
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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