(57)【要約】  本発明は、分取スケールの精製でのイオン対試薬の有用性を実証する。より詳細には、本開示は、より純粋な所望の最終生成物を可能にするＲＰ分取線形クロマトグラフィーにおけるイオン対試薬の使用に関する。本開示は、イオン対試薬がポリペプチドの所望の純度に対する劇的な効果を有することを示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの関連不純物を有する混合物からポリペプチドを精製するためのクロマトグラフィーの方法であって、約５％−約８５％の範囲の濃度を有する有機修飾剤と組み合わせた約０．０１％−約２％の範囲の濃度を有するイオン対試薬でのＲＰ−ＨＰＬＣを用いるステップを含む、前記方法。
【請求項２】
最も好ましくはイオン対試薬および有機修飾剤が、それぞれ約０．０５％−約１％および約８％−約６５％の範囲の濃度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
イオン対試薬が、ヘキサンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、ペンタフルオロプロパン酸、トリエチルアミンおよびヘプタフルオロ酪酸を含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
有機修飾剤が、アセトニトリル、エタノール、メタノールおよびイソプロピルアルコールを含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ポリペプチドが、インスリン類似体、エプチフィバチドおよびアトシバンを含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
インスリン類似体が、アスパルト、リスプロおよびグラルギンである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つの関連不純物を有する混合物からポリペプチドを精製するためのクロマトグラフィーの方法であって、以下のステップ：
ａ）約５％−約８５％の有機修飾剤で平衡化した、シリカ（Ｃ４−Ｃ１８）ベースのレジンをＲＰ−ＨＰＬＣカラムに詰める；
ｂ）ポリペプチド混合物をカラム上に約１８０ｃｍ／ｈｒ−約３６０ｃｍ／ｈｒの流量でローディングする；
ｃ）約５％−約８５％の範囲の濃度を有する有機修飾剤と組み合わせた約０．０５％−約１％の範囲の濃度を有するイオン対試薬でカラムを洗浄する、および；
ｄ）カラムから精製ポリペプチドを溶出するために約１０％−約７０％の線形勾配を実行する
を含む、前記方法。
【請求項８】
シリカレジンが、好ましくはＣ８である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
クロマトグラフィー精製が、約２．５−約８．５の範囲のｐＨで実行される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
レジンが、約５μ−約４０μの、好ましくは、約７μ−約２０μのおよび、および最も好ましくは約１０μ−約１３μの範囲の粒径を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
レジンビーズが、約５０Å−約２０００Å、好ましくは約１００Å−約５００Åの範囲の、および最も好ましくは１２０Åの孔径を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
ポリペプチドの純度が、約９０％−約１００％の範囲、好ましくは少なくとも９９％である、請求項１−１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
約９０％−約１００％の範囲の純度を有する、請求項１−１２のいずれか一項に記載の方法により得られるインスリン類似体。
【請求項１４】
少なくとも９８％の純度で精製された、精製アスパルト。
【請求項１５】
少なくとも９９％の純度で精製された、精製グラルギン。
【請求項１６】
少なくとも９７％の純度で精製された、精製リスプロ。
【請求項１７】
約９０％−約１００％の範囲の純度を有する、請求項１−１２のいずれか一項に記載の方法により得られるポリペプチド。
【請求項１８】
少なくとも９９．１４％の純度で精製された、精製アトシバン。
【請求項１９】
少なくとも９４％の純度で精製された、精製エプチフィバチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、分取スケール（preparative scale）の精製におけるイオン対試薬の有用性を実証する。より詳細には、本開示は、高純度な所望の最終生成物を可能にする逆相分取クロマトグラフィーにおけるイオン対試薬の使用に関する。本開示は、イオン対試薬がポリペプチドの所望の純度に対する劇的な効果を有することを示す。
【背景技術】
【０００２】
本開示の背景および先行技術：
多数の異なるクロマトグラフィーの方法が、純度および収率に関し所望の最終結果を得るために適用される。逆相クロマトグラフィーは、用いられる最も強力な精製方法である。逆相液体クロマトグラフィー（「ＲＰ−ＬＣ」）および逆相高速液体クロマトグラフィー（「ＲＰ−ＨＰＬＣ」）は、合成または組み換え法により製造されたペプチドおよびタンパク質などの分子を精製するために、一般的に用いられる。ＲＰ−ＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣ法は、近接な関連不純物を効率的に分離することができ、多くの多様な分子を精製するために用いられてきている（Lee et al., "Preparative HPLC," 8th Biotechnology Symposium, Pt. 1, 593-610 (1988)）。さらに、ＲＰ−ＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣは、分子、とくに、工業スケールでタンパク質を精製するために、成功的に用いられている（Olsen et al., 1994, J. Chromatog. A, 675, 101）。
【０００３】
分析方法開発におけるトリエチルアミン（ＴＥＡ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ヘキサンスルホン酸（ＨＳＡ）などのイオン対試薬の使用およびタンパク質ピーク分解能に対するその効果は周知である、Shayne Cox Gad；Handbook of Pharmaceutical Biotechnology。イオン対試薬は、固定相の表面上に電位を与える電気二重層を作り出す炭化水素鎖を介して固定相に吸着する。このため、タンパク質／ペプチド分子は、移動相の電解質イオンとのイオン交換、およびまた逆相固定相との吸着効果の両方を受ける（Frederick F. Cantwell et al., 1984, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Volume 2, Pages 153-164）。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、タンパク質およびペプチドの分取スケールでの精製における、イオン対試薬の使用に関する。
より詳細には、本開示は、ＲＰ−ＨＰＬＣ分取線形クロマトグラフィーにおけるＨＳＡおよびＴＥＡの使用に関する。
【０００５】
ＲＰ−ＨＰＬＣで用いられるイオン対試薬は、イオン化可能な基を有する長い炭化水素鎖を本質的に含む。これらの分子は、移動相において、タンパク質／ペプチドの表面電荷とイオン対合する。このイオン対合のため、イオン対試薬の炭化水素鎖に起因するペプチド／タンパク質の疎水性が増加する。この相互作用は、表面電荷に依存する。混合物の異なるタンパク質は異なる表面電荷を有し、それゆえ、タンパク質ピークの間の分解能を改善する固定相へと特異的に結合する。吸着されたイオン対試薬は、固定相の表面上の官能基への電荷特異性を発揮する。このため、同じ電荷は遠ざけられ、それゆえ、混合物における様々なタンパク質の選択性を変化させる。
【０００６】
従来のクロマトグラフィーにおいて、カラム上へのローディング（loading）が増加するにつれて、不純物と対象である所望のタンパク質との間の分解能が低下することが観察されてきている。溶出の間のタンパク質バンドは併合する傾向があり、分取の純度および収率に関し、クロマトグラフィーの性能に影響を及ぼす。本開示は、タンパク質の製造能力に対する鍵である、この問題を回避する。分析的検出のためにカラム上に注入されたタンパク質を超えるカラム上へのより高いローディングは方法開発のために重要であり、所定の方法のコストおよび収率を決定付ける。本開示は、タンパク質のローディングが増加した後でさえ、イオン対試薬がタンパク質の純度において劇的な効果を有することを示す。本開示は、クロマトグラフィー段階の収率を改善する際のイオン対合の使用を実証する。
【０００７】
本開示の目的
本開示の主要な目的は、混合物からポリペプチドを精製するためのクロマトグラフィーの方法を獲得することである。
本開示のもう１つの主要な目的は、アスパルト（Aspart）、グラルギン（Glargine）およびリスプロ（Lispro）などのインスリン類似体を獲得することである。
本開示のさらにもう１つの主要な目的は、アトシバン（Atosiban）およびエプチフィバチド（Eptifibatide）などの精製ポリペプチドを獲得することである。
【０００８】
本開示の概要
それゆえ、本発明は、少なくとも１つの関連不純物を有する混合物からのポリペプチドの精製のためのクロマトグラフィーの方法であって、約５％−約８５％の範囲の濃度を有する有機修飾剤（organic modifier）と組み合わせた約０．０１％−約２％の範囲の濃度を有するイオン対試薬でのＲＰ−ＨＰＬＣを用いるステップを含む、前記クロマトグラフィーの方法；少なくとも１つの関連不純物を有する混合物からのポリペプチドの精製のためのクロマトグラフィーの方法であって、ａ）約５％−約８５％の有機修飾剤で平衡化した、シリカ（Ｃ４−Ｃ１８）ベースのレジンをＲＰ−ＨＰＬＣカラムに詰める、ｂ）ポリペプチド混合物をカラム上に約１８０ｃｍ／ｈｒ−約３６０ｃｍ／ｈｒの流量でローディングする、ｃ）約５％−約８５％の範囲の濃度を有する有機修飾剤と組み合わせた約０．０５％−約１％の範囲の濃度を有するイオン対試薬でカラムを洗浄する、およびｄ）カラムから精製ポリペプチドを溶出するために約１０％−約７０％の線形勾配（linear gradient）を実行するステップを含む、前記クロマトグラフィーの方法；上記の方法により得られた、約９０％−約１００％の範囲の純度のインスリン類似体；少なくとも９８％の純度で精製された精製アスパルト；少なくとも９９％の純度で精製された精製グラルギン；少なくとも９７％の純度で精製された精製リスプロ；上記の方法により得られた約９０％−１００％の範囲の純度のポリペプチド、少なくとも９９．１４％の純度で精製された精製アトシバン；および少なくとも９４％の純度で精製された精製エプチフィバチドに関する。
【０００９】
本開示の詳細な説明
本開示は、少なくとも１つの関連不純物を有する混合物からのポリペプチドの精製のためのクロマトグラフィーの方法であって、約５％−約８５％の範囲の濃度を有する有機修飾剤と組み合わせた約０．０１％−約２％の範囲の濃度を有するイオン対試薬でのＲＰ−ＨＰＬＣを用いるステップを含む、前記クロマトグラフィーの方法に関する。
本開示の一態様において、最も好ましくは、イオン対試薬および有機修飾剤は、それぞれ、約０．０５％−約１％および約８％−約６５％の範囲の濃度を有する。
【００１０】
本開示のもう１つの態様において、イオン対試薬は、ヘキサンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、ペンタフルオロプロパン酸、トリエチルアミンおよびヘプタフルオロ酪酸を含む群から選択される。
本開示のさらにもう１つの態様において、有機修飾剤は、アセトニトリル、エタノール、メタノールおよびイソプロピルアルコールを含む群から選択される。
本開示のまたもう１つの態様において、ポリペプチドは、インスリン類似体、エプチフィバチドおよびアトシバンを含む群から選択される。
本開示のまたもう１つの態様において、インスリン類似体は、アスパルト、リスプロおよびグラルギンである。
【００１１】
本開示はまた、少なくとも１つの関連不純物を有する混合物からのポリペプチドの精製のためのクロマトグラフィーの方法であって、ａ）約５％−約８５％の有機修飾剤で平衡化した、シリカ（Ｃ４−Ｃ１８）ベースのレジンをＲＰ−ＨＰＬＣカラムに詰める、ｂ）ポリペプチド混合物をカラム上に約１８０ｃｍ／ｈｒ−約３６０ｃｍ／ｈｒの流量でローディングする、ｃ）約５％−約８５％の範囲の濃度を有する有機修飾剤と組み合わせた約０．０５％−約１％の範囲の濃度を有するイオン対試薬でカラムを洗浄する、およびｄ）カラムから精製ポリペプチドを溶出するために約１０％−約７０％の線形勾配を実行するステップを含む、前記クロマトグラフィーの方法に関する。
【００１２】
本開示の１つの態様において、シリカレジンは、好ましくはＣ８である。
本開示のもう１つの態様において、クロマトグラフィー精製は、約２．５−約８．５の範囲のｐＨで実行される。
本開示のさらに１つの態様において、レジンは、約５μ−約４０μ、好ましくは、約７μ−約２０μ、および最も好ましくは約１０μ−約１３μの範囲の粒径を有する。
本開示のまたもう１つの態様において、約５０Å−約２０００Å、好ましくは約１００Å−約５００Åの範囲の、および最も好ましくは１２０Åの孔径を有する。
本開示のまたもう１つの態様において、ポリペプチドの純度は、約９０％−約１００％の範囲、好ましくは少なくとも９９％である。
【００１３】
本開示はさらに、約９０％−約１００％の範囲の純度の、上記の方法で得られるインスリン類似体に関する。
本開示はまた、少なくとも９８％の純度で精製された精製アスパルトに関する。
本開示はまた、少なくとも９９％の純度で精製された精製グラルギンに関する。
本開示はまた、少なくとも９７％の純度で精製された、精製リスプロに関する。
本開示はまた、約９０％−約１００％の範囲の純度の、上記の方法で得られた精製ポリペプチドに関する。
本発明はまた、少なくとも９９．１４％の純度で精製された、精製アトシバンに関する。
本開示はまた、少なくとも９４％の純度で精製された、精製エプチフィバチドに関する。
【００１４】
本開示は、ポリペプチドのＲＰ−ＨＰＬＣ分取線形クロマトグラフィーにおける、トリエチルアミン、トリフルオロ酢酸、ヘキサンスルホン酸、ペンタフルオロプロパン酸などのイオン対試薬の使用に関する。より詳細には、本開示は、インスリン類似体およびペプチドの逆相分取線形クロマトグラフィーを通してのイオン対試薬の使用に関する。
本開示のもう１つの目的および利点は、タンパク質のローディングが増加した後でさえも所望のタンパク質の純度が増加することである。
【００１５】
用語の定義：
本明細書において他に定義しない限り、本開示に関連して用いられる科学的および技術的用語は、当業者に一般的に理解される意味を有する。さらに、文脈において他に要求されない限り、単数の用語は複数を含み、および複数の用語は単数を含む。本開示の方法および技術は、一般的に、業界で周知の従来の方法に従って実行される。
【００１６】
用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、「ペプチド」は、アミノ酸のポリマーに言及し、特定の長さの生成物に言及しない；それゆえ、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質は、ポリペプチドの定義内に含まれる。これらのポリペプチドの化学的または発現後修飾は特定の態様として含んでもまたは除外してもよいが、この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾に言及せず、または除外もしない。それゆえ、例えば、グリコシル基、アセチル基、リン酸基、脂質基などの共有結合を含むポリペプチドへの修飾は、用語ポリペプチドにより明示的に包含される。さらに、これらの修飾を有するポリペプチドは、本開示に含まれるまたは除外される個々の種として特定されてもよい。１つの態様において、分子は、ポリペプチドまたはそれらの関連する類似体またはその誘導体である。好ましい態様によると、ポリペプチドは、アスパルト、リスプロおよびグラルギンなどのインスリン類似体から選択される。好ましくは、ポリペプチドは環状ペプチドである。もう１つの好ましい態様によれば、ポリペプチドは非環状ペプチドである。またもう１つの好ましい態様において、ポリペプチドは、エプチフィバチド、および、アトシバンを含む群から選択される。
【００１７】
用語「インスリン類似体」は、ポリペプチド鎖内の１つまたは２つ以上のアミノ酸が代替のアミノ酸で置換された、および／または１つまたは２つ以上のアミノ酸が欠失された、または１つまたは２つ以上の追加のアミノ酸がポリペプチド鎖へと付加された、上で定義される「インスリン」の任意の形態を包含することが意図される。インスリン類似体は、アスパルト、リスプロおよびグラルギンを含む群から選択される。
【００１８】
インスリンアスパルトは、即効性の、非経口血中ブドウ糖降下薬である。アスパルトは、Ｂ２８位のアミノ酸プロリンのアスパラギン酸による単一の置換を除き、通常のヒトインスリンと同種であり、組み換えＤＮＡ技術により製造される。
インスリングラルギンは、インスリンＡ鎖上の２１位のアミノ酸アスパラギンがグリシンにより置換され、および２つのアルギニンがＢ鎖のＣ末端へと付加されている点で、ヒトインスリンと異なる。インスリングラルギンはまた、即効性の、非経口血中ブドウ糖降下剤であるヒトインスリン類似体である。
インスリンリスプロは、即効性の、非経口血中ブドウ糖降下剤である、ヒトインスリン類似体である。化学的に、Ｌｙｓ（Ｂ２８）、Ｐｒｏ（Ｂ２９）ヒトインスリン類似体であり、インスリンＢ鎖上の２８および２９位におけるアミノ酸が逆転される際に作製される。
【００１９】
アトシバン−合成ペプチドは、ホルモンオキシトシンおよびバソプレッシンの阻害剤である。それは、オキシトシン受容体拮抗薬であり、早期陣痛の急性発症の処置において効果的である。それは、子宮オキシトシン受容体におけるオキシトシンの競合拮抗薬であり、および早期陣痛の処置における新規の子宮収縮療法として開発されてきている。アトシバンはまた、ＡＤＨ（抗利尿ホルモン）と呼ばれる。
エプチフィバチドは、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤クラスの抗血小板薬である。それは、サウスイースタンピグミーガラガラヘビ（southeastern pygmy rattlesnake）の毒において発見されるタンパク質由来の環状ヘプタペプチドである。いわゆるアルギニン−グリシン−アスパルタット−模倣薬（arginin-glycin-aspartat-mimetics）のクラスに属し、可逆的に血小板に結合する。
【００２０】
用語「クロマトグラフィー」は、混合物における対象の検体が、混合物における個々の溶質が移動相の影響下で固定相から遊走する速度における、または結合および溶出プロセスにおける違いの結果として、混合物中の他の溶質から分離されるプロセスに言及する。
本明細書中で用いられる用語「高速液体クロマトグラフィー」は、カラムの詰め込みで用いられる粒子（固定相）が小さく（３−５０ミクロン）、および選択されたサイズからの変動がなく均一であるクロマトグラフィーの方法に言及する。かかるクロマトグラフィーは、典型的には、相対的に高い（およそ５００−３５００ｐｓｉ）圧力を用いる。
【００２１】
用語「不純物」は、対象のタンパク質と同一の性質を共有しない、任意の生成物に言及する。不純物は主に、関連する生成物である。イオン対試薬を用いることによる原料インスリンアスパルトにおいて標的とされてきた不純物は、Ｄｅｓ  ｌｅａｄｅｒ  ｄｅｓ  Ｂアルギニンインスリンアスパルト前駆体であった。これは、Ｂ鎖のＣ末端に５アミノ酸の伸長を有する点でインスリンアスパルトとは異なり、該５アミノ酸は、酸性ｐＨにおいてアスパルトに対してさらなる正の電荷を有することを示すＡｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐである。
【００２２】
「イオン対試薬」は、通常、逆帯電したイオンとのイオン対を形成するイオン化合物に言及する。通常、ＲＰ−ＨＰＬＣで用いられるイオン対試薬は、一定の疎水性を発揮する炭化水素鎖を含有するため、イオン対試薬は逆相カラム上に保持されることができる。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ヘキサンスルホン酸（ＨＳＡ）、ペンタフルオロプロパン酸（ＰＦＰＡ）、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、ヘプタフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）などを含んでもよい、タンパク質とイオン対を形成できる典型的なイオン対試薬が、本開示において用いられてもよい。
【００２３】
詳細には、本開示は、好ましい態様において例示される、ＲＰ−ＨＰＬＣ分取線形クロマトグラフィーにおけるＨＳＡおよびＴＥＡの使用に言及する。ＨＳＡは、スルホン酸（ＳＯ３−）官能基との６Ｃの長さの炭化水素鎖で構成される構造を有する。ペプチド／タンパク質のｐＩ値より本質的に下の、酸性ｐＨにおいて、タンパク質表面に存在するリシン、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸の全ての官能性アミノ基は、プロトン化のため、正に帯電するであろう。ＨＳＡのＳＯ３−基は、６Ｃの長さの炭化水素側鎖により示される誘起効果に起因するＯ原子上の高い電子密度のため、低いｐＨにおいてでさえイオン型で存在する。ＳＯ３−基は、タンパク質構造上の正に帯電された基を特異的に標的とするであろう。ＨＳＡとペプチドの間の相互作用は、タンパク質３Ｄ構造における、極めて小さい（miniscule）および可逆的な立体配座の変化をもたらすであろう。このことにより、ＲＰクロマトグラフィーの間にいくつかの不純物の選択性における変化がもたらされる。ＨＳＡは、分析ＲＰクロマトグラフィーにおけるタンパク質ピークの分解能を改善するものとして、非常によく知られている。ところが本開示において、ＨＳＡが分取クロマトグラフィーにおける収率および純度レベルを改善するのにもまた役立つことが観察されてきた。
【００２４】
周知のイオン対試薬としてのトリエチルアミン（ＴＥＡ）は、緊密なバンドの形態でタンパク質を溶出し、そしてこの性質は、ＲＰクロマトグラフィーの収率および純度を改善するために、より高いローディング（分取ローディング）において現在採用されている。
【００２５】
「有機修飾剤」は、低濃度において検体分子が固定相に結合するのを援助し、そして高濃度でそれを溶出するのを援助する、ＲＰクロマトグラフィーにおいて用いられる非極性溶媒である。アセトニトリル、イソプロピルアルコール、エタノール、メタノール、ジメチルホルムアミドなど、さまざまな有機修飾剤が本開示において用いられる。
「デスオクタ（Desocta）」は、プロセスにおけるトリプシン処理ステップの間に産生される不純物に関連する生成物である。それは、インスリンおよびその類似体のＢ鎖のＣ末端にかけて８アミノ酸が欠失することを特徴とする。
【００２６】
０．８５ＲＲＴ、０．９ＲＲＴ、１．０５ＲＲＴおよび１．０７ＲＲＴは、反応中間体の中に産生される生成物関連不純物であり、プロセスの間に幾分か産生される。アトシバンの製造方法に関連する複数の反応ステップのために、これらの不純物が形成される。
０．８６ＲＲＴ、１．２２ＲＲＴ、１．８ＲＲＴおよび２．１ＲＲＴは、エプチフィバチドの製造方法に関連する複数の反応ステップのために形成される不純物である。それらは典型的には反応中間体であり、プロセスの間に幾分か産生される。生成物へと転換するのを防ぐ保護基を有する中間体が存在しうる。
【００２７】
本開示は、９０％−１００％の範囲の実質的に純粋なインスリン類似体およびペプチドを得るためのイオン対試薬の使用に関する。インスリン類似体は、アスパルト、リスプロおよびグラルギンからなる群から選択されてもよい。タンパク質またはペプチドは、アトシバンおよびエプチフィバチドである。
プロセスがＲＰ−ＨＰＬＣに基づく、少なくとも０．０５％−１％（ｗ／ｖ）のイオン対試薬を使用することは、本開示の目的である。最も好ましくは、イオン対試薬は、０．０５％−１％（ｗ／ｖ）の範囲で用いられる。
【００２８】
広い側面において、本開示は以下のステップ：対象の検体に結合することができる固定相を保つための平衡化、次いで検体を含有する原料または不純な材料が固定相を通過するローディング、を含む、対象のタンパク質を精製するために用いられるイオン対合の使用に関する。試料は、約１８０−３６０ｃｍ／ｈｒの流量でロードされる。用いられる勾配は、精製される試料ペプチドに対して変動する。
【００２９】
本プロセスの第１のステップは、逆相液体クロマトグラフィーカラム上に混合物をローディングすることにより、分子をそれらを含む混合物から精製することを含む。好ましくは、カラムは約５−４０μ、より好ましくは約１０−４０μ、および最も好ましくは約１０−１３μの粒径を有する媒体が詰め込まれる。好ましくは、カラムは、約１００−２０００オングスロトーム、より好ましくは約１００−５００オングストロームの孔径を有する。本開示の文脈において、カラムに詰め込まれるレジンの孔径は、１２０オングストロームである。
これに次いで、洗浄して結合しない分子を除去し、固定相から結合した検体を溶離し、そして再生して所定の溶出条件で溶離しない任意の強く結合した分子を除去する。５％−６５％のアセトニトリル、イソプロピルアルコール、エタノール、メタノール、ジメチルホルムアミドなどのさまざまな有機修飾剤が、平衡化および洗浄のために用いられる。精製は、２．５−８．５の範囲のｐＨで実行される。
【００３０】
カラムの媒体は、重合体ベースのレジン媒体、シリカベースの媒体、またはメタクリル酸塩媒体を含む、任意の好適な媒体であってもよい。
本開示の１つの側面は、実質的に純粋なタンパク質およびペプチドを得るための、ＰＲ−ＨＰＬＣ分取線形クロマトグラフィーにおける、イオン対試薬の使用にある。タンパク質とイオン対を形成できる典型的なイオン対試薬は、本開示において用いられてもよく、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ヘキサンスルホン酸（ＨＳＡ）、ペンタフルオロプロパン酸（ＰＦＰＡ）、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、ヘプタフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）などを含んでもよい。
【００３１】
詳細には、本開示は、好ましい態様に例示される、ＲＰ分取線形クロマトグラフィーにおける、ＨＳＡおよびＴＥＡの使用に関する。ＨＳＡは、スルホン酸（ＳＯ３−）官能基を有する、６Ｃの長さの炭化水素鎖で構成される構造を有する。ペプチド／タンパク質のｐＩより本質的に低い、酸性ｐＨにおいて、タンパク質構造の表面に存在するリシン、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸の全ての官能アミノ基は、プロトン化のため正に帯電するであろう。ＳＯ３−基は、タンパク質構造上の正に帯電された基を特異的に標的とするであろう。ＨＳＡが表面電荷と相互作用すると、ＨＳＡのヘキシル基は、タンパク質の表面に曝露され、その疎水性を増加させるであろう。さまざまなペプチドとのＨＳＡの相互作用の範囲は、その選択性における変化をもたらすであろう。ＨＳＡは、分析ＲＰクロマトグラフィーにおけるタンパク質ピークの分解能を改善するものとして、非常によく知られている。ところが本開示において、ＨＳＡが、同様に分取クロマトグラフィーにおける収率および精製レベルを改善させることに役立つことが観察されてきた。
【００３２】
トリエチルアミン（ＴＥＡ）はまた、ＨＳＡと同様にして、タンパク質表面上の負に帯電した部分とのＴＥＡイオン対を機能させ、そしてタンパク質の疎水性を増加させる。
本開示のもう１つの目的は、対象のタンパク質と非常に密接に関連し、そして精製における主要な懸念であった不純物の選択性を変化させるのに役立つイオン対試薬の使用に関する。
不純物は、主要な関連する生成物である。イオン対試薬を用いる、インスリンアスパルト原料において対象とされてきた不純物は、Ｄｅｓ  ｌｅａｄｅｒ  ｄｅｓ  Ｂアルギニンインスリンアスパルト前駆体であった。これは、Ｂ鎖のＣ末端における５アミノ酸の伸長を有する点でインスリンアスパルトと異なり、該５アミノ酸は、ＨＳＡに対する標的となるであろう、酸性ｐＨにおいてアスパルトに対してさらなる正の帯電を有することを示すＡｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐである。インスリングラルギンにおいて、ＨＳＡはインスリングラルギンよりもさらなる正の帯電を有するため、インスリングラルギン前駆体を分離するのに役立つ。
【００３３】
本開示のさらにもう１つの側面は、タンパク質のローディングが増加した後でさえ所望のタンパク質の純度が増加することである。
本開示の効果的な性能は、用いられるクロマトグラフィーマトリックス、効率的な精製のためのバッファーのｐＨ値およびイオン強度の正しい組み合わせの個別化を要する。緩衝系のｐＨは、化合物の疎水性と組み合わされる分離に影響を及ぼす。クロマトグラフィー分離の異なるステップにおいて起因されるｐＨにおける変化は、カラムにおける化合物の移動性に影響を及ぼす。
【００３４】
本開示の具体的な実施態様の前述の記載は、説明および記載の目的のために提示される。それらは、包括的であること、または開示されるとおりの形態に限定することを意図しない。上の教示の観点から、さまざまな変更および変化形が可能である。さらに、多くの変更が、特別な状況、材料、対象の組成物、プロセス、プロセスステップまたはステップを本開示の対象、精神および範囲に対応させるためになされてもよい。全てのかかる修飾は、本明細書に添付の特許請求の範囲内にあると意図される。
【００３５】
本願の技術は、以下の例を用いてさらに詳述される。しかし、実施例は、開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
以下の例を本開示の態様をさらに説明するために提供するが、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。それらは用いられるかもしれない典型であるが、当業者に公知の他の手順、方法または技術が代替的に用いられてもよい。
説明の目的のみのために提供され、そして本開示の範囲を限定することを意図しない以下の具体例を参照することにより、より完全な理解を得ることができる。
【００３６】
例：
対照１
〜７５％の純度のインスリンアスパルト原料を精製水で１０倍に希釈し、そしてＩＰＡを添加して最終濃度５％とした。原料混合物を、Kromasil（登録商標）（１００Å−１３μ−Ｃ８）カラム上で精製した。移動相Ａは２５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０であり、そして移動相Ｂはイソプロピルアルコールであった。２０カラム容積にわたる、移動相Ａ中における、１５％−１８％の移動相Ｂの勾配溶出。デスオクタインスリンアスパルトの分離が観察されたが、ｄｅｓｌｅａｄｅｒ  ｄｅｓ−Ｂアルギニンインスリンアスパルト前駆体分離は達成されなかった。全体の純度は、〜９０％となった。
【００３７】
例１
〜７０％の純度のインスリンアスパルト原料を精製水で１０倍に希釈し、そしてＩＰＡを添加して最終濃度５％とした。原料混合物を、Kromasil（登録商標）（１００Å−１３μ−Ｃ８）カラム上で精製した。移動相Ａは２５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０中の１％ヘキサンスルホン酸（ＨＳＡ）（ｗ／ｖ）であり、そして、移動相Ｂはイソプロピルアルコールであった。２０カラム容積にわたる、移動相Ａ中における、１８％−２２％の移動相Ｂの勾配溶出。ＨＳＡの添加により、デスオクタインスリンアスパルトが除去され、そしてまた、〜２．７７％のレベルから０．２７％未満へのｄｅｓｌｅａｄｅｒ  ｄｅｓＢ−アルギニンインスリンアスパルト前駆体の低下がまた観察され、そして達成された全体の純度は〜９７．８５％である。
【００３８】
対照２
〜７５％の純度のインスリンアスパルト原料を精製水で１０倍に希釈し、そしてエチルアルコールを添加して最終濃度１０％とした。原料混合物を、Kromasil（登録商標）（１００Å−１３μ−Ｃ８）カラム上で精製した。移動相Ａは２５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０中の２５ｍＭ硫酸アンモニウムであり、そして移動相Ｂはエチルアルコールであった。２０カラム容量にわたる、移動相Ａ中における、２６％−３２％の移動相Ｂの勾配溶出。ｄｅｓｌｅａｄｅｒ  ｄｅｓＢ−アルギニンインスリンアスパルトインスリンは、〜２％のレベルから１％へと低下した。デスオクタインスリンアスパルト不純物が完全に除去され、そしてモノグリコシル化インスリンアスパルトが〜３％から１．３％へと低下した。達成された全体の純度は、〜９４％である。
【００３９】
例２
純度〜７５％のインスリンアスパルト原料を精製水で１０倍に希釈して、そしてエチルアルコールを添加して最終濃度１０％とした。原料混合物を、Kromasil（登録商標）（１００Å−１３μ−Ｃ８）カラム上で精製した。移動相Ａは２５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０中の２５ｍＭ硫酸アンモニウム中の１％ヘキサンスルホン酸（ＨＳＡ）（ｗ／ｖ）であり、移動相Ｂはエチルアルコールであった。２０カラム容量にわたる、移動相Ａ中の２５％−３５％の移動相Ｂの勾配溶出。ＨＳＡの添加により、ｄｅｓｌｅａｄｅｒ  ｄｅｓＢ−アルギニンインスリンアスパルト前駆体を〜３％のレベルから０．３％未満へと低下させた。デスオクタインスリンアスパルトが完全に除去され、そしてモノグリコシル化インスリンアスパルトレベルを〜２％から０．３％へと低下させた。達成された全体の純度は、〜９８％である。
【００４０】
対照３
〜６７％の純度のインスリンアスパルト原料を精製水で１０倍に希釈し、そしてメチルアルコールを添加して最終濃度１０％とした。原料混合物を、Kromasil（登録商標）（１００Å−１３μ−Ｃ８）カラム上で精製した。移動相Ａは２５０ｍＭ酢酸アンモニウム中の２５ｍＭ硫酸アンモニウムであり、そして移動相Ｂはメチルアルコールであった。２０カラム容量にわたる、移動相Ａ中の４５％−５５％の移動相Ｂの勾配溶出。ｄｅｓｌｅａｄｅｒ  ｄｅｓＢ−アルギニンインスリンアスパルト前駆体が、〜２％のレベルから１％未満へと低下した。モノグリコシル化インスリンアスパルト不純物は、いかなる顕著な低下をも示さなかった。低下は２％から１．５％へとであった。デスオクタインスリンアスパルトは、〜１０％から〜２％未満へと低下した。達成された全体の純度は、〜８９％である。
【００４１】
例３
〜６７％の純度のインスリンアスパルト原料を精製水で１０倍に希釈し、そしてメチルアルコールを添加して最終濃度１０％とした。原料混合物を、Kromasil（登録商標）（１００Å−１３μ−Ｃ８）カラム上で精製した。移動相Ａは２５０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ４．０中の２５ｍＭ硫酸アンモニウム中の１％ヘキサンスルホン酸（ＨＳＡ）（ｗ／ｖ）であり、そして移動相Ｂはメチルアルコールであった。２０カラム容量にわたる、移動相Ａ中の５５％−６５％の移動相Ｂの勾配溶出。ＨＳＡの添加により、ｄｅｓｌｅａｄｅｒ  ｄｅｓＢ−アルギニンインスリンアスパルト前駆体を〜２％のレベルから１％未満へと精製した。モノグリコシル化インスリンアスパルト不純物は、３％から０．５％未満へと低下した。デスオクタインスリンアスパルトは、〜１０％から〜２％未満へと低下した。達成された全体の純度は、〜９２％である。
【００４２】
例４
〜６７％の純度のインスリンアスパルト原料を精製水で１０倍に希釈し、そしてメチルアルコールを添加して最終濃度１０％とした。原料混合物を、Kromasil（登録商標）（１００Å−１３μ−Ｃ８）カラム上で精製した。移動相Ａは２５０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ４．０中の２５ｍＭ硫酸アンモニウム中の１％ヘキサンスルホン酸（ＨＳＡ）（ｗ／ｖ）であり、そして移動相Ｂはメチルアルコールであった。５カラム容量にわたる、移動相Ａ中の２０％−５０％の移動相Ｂ、次いで２０カラム容量にわたる移動相Ａ中の５５％−６５％移動相Ｂの勾配溶出。ＨＳＡの添加により、ｄｅｓｌｅａｄｅｒ  ｄｅｓＢ−アルギニンインスリンアスパルト前駆体を〜２％のレベルから１％未満へと、およびモノグリコシル化不純物を〜３％から０．６％へと精製した。デスオクタインスリンアスパルトは、〜１０％から〜２％未満へと低下した。達成された全体の純度は、〜９２％である。
【００４３】
例５
〜６７％の純度のインスリンアスパルト原料を精製水で１０倍に希釈し、そしてメチルアルコールを添加して最終濃度１０％とした。原料混合物を、Kromasil（登録商標）（１００Å−１３μ−Ｃ８）カラム上で精製した。移動相Ａは２５０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ３．５中の２５ｍＭ硫酸アンモニウム中の１％ヘキサンスルホン酸（ＨＳＡ）（ｗ／ｖ）であり、そして移動相Ｂはメチルアルコールであった。２０カラム容量にわたる、移動相Ａ中の５５％−６０％の移動相Ｂの勾配溶出。ＨＳＡの添加により、モノグリコシル化アスパルトを〜３％のレベルから０．４％未満へと精製した。デスオクタインスリンアスパルトは、〜１０％から〜１％未満へと低下した。達成された全体の純度は、〜９０％である。
【００４４】
対照６
〜９４％の純度の部分的に精製されたインスリングラルギン材料を精製水で３倍に希釈し、そしてメチルアルコールを添加して最終濃度１０％とした。原料混合物を、Kromasil（登録商標）（１００Å−１３μ−Ｃ８）カラム上で精製した。移動相Ａは１００ｍＭ硫酸アンモニウム、ｐＨ４．０であり、そして移動相Ｂはメチルアルコールであった。２０カラム容量にわたる、移動相Ａ中の５１％−５９％の移動相Ｂの勾配溶出。インスリングラルギン前駆体レベルは、〜２．０％から１．２％へと低下され、そしてＤｅｓＢ３２−Ｒインスリングラルギンは低下しなかった。達成された全体の純度は、〜９７．５％である。
【００４５】
例６
〜９４％の純度の部分的に精製されたインスリングラルギン材料を精製水で３倍に希釈し、そしてメチルアルコールを添加して最終濃度１０％とした。原料混合物を、Kromasil（登録商標）（１００Å−１３μ−Ｃ８）カラム上で精製した。移動相Ａは１００ｍＭ硫酸アンモニウム、ｐＨ４．０中の０．５％ヘキサンスルホン酸（ＨＳＡ）（ｗ／ｖ）であり、移動相Ｂはメチルアルコールであった。２０カラム容量にわたる、移動相Ａ中の５１％−５９％の移動相Ｂの勾配溶出。ＨＳＡの添加により、インスリングラルギン前駆体は〜２．５％のレベルから０．８％未満へと、およびＤｅｓＢ３２−Ｒは０．７％から０．２％未満へと精製された。達成された全体の純度は、〜９９．２％である。
【００４６】
例７
〜７７％の純度の部分的に精製されたインスリンリスプロ材料を精製水で３倍に希釈し、そしてアセトニトリルを添加して最終濃度１０％とした。原料混合物を、Kromasil（登録商標）（１００Å−１３μ−Ｃ８）カラム上で精製した。移動相Ａは２０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１００ｍＭトリス、ｐＨ８．５中の１％トリエチルアミン（ＴＥＡ）（ｖ／ｖ）であり、そして移動相Ｂはアセトニトリルであった。２５カラム容量にわたる、移動相Ａ中の２４％−３０％の移動相Ｂの勾配溶出。ＴＥＡの添加により、ｄｅｓｌｅａｄｅｒ  ｄｅｓＢ−アルギニンインスリンリスプロ前駆体１５％のレベルを１％未満へと精製した。達成された全体の純度は、〜９７．５％である。
【００４７】
対照８
１ステップの精製後のアトシバン原料は、〜９５％の純度である。第１のステップの溶出プールを最終溶媒濃度が５％となるように希釈する。それから、ロード物を、Ｄａｉｓｏ（１２０Å−１０μ−Ｃ８）カラム上で精製する。移動相Ａは５０ｍＭ酢酸であり、そして移動相Ｂはアセトニトリルであった。１５カラム容量にわたる、移動相Ａ中の９％−１２％の移動相Ｂの勾配溶出を実行した。達成された純度は〜９６％であり、１．０５ＲＲＴ不純物のみの完全な除去を示した。０．８５ＲＲＴおよび０．９ＲＲＴ不純物は、いかなる低下をも示さなかった。
【００４８】
例８
１ステップの精製後のアトシバン原料は、〜９５％の純度である。第１ステップの溶出プールを、最終溶媒濃度が５％となるように希釈する。それから、ロード物を、Ｄａｉｓｏ（１２０Å−１０μ−Ｃ８）カラム上で精製する。移動相Ａは５０ｍＭ酢酸中の０．０５％ヘキサンスルホン酸（ＨＳＡ）（ｗ／ｖ）であり、そして移動相Ｂはアセトニトリルであった。２５カラム容量にわたる、移動相Ａ中の１０％−１７％の移動相Ｂの勾配溶出を実行した。ＨＳＡの添加により、純度を９８．６％にまで増加させ、０．８５ＲＲＴ、０．９０ＲＲＴ、１．０５ＲＲＴおよび１．０７ＲＲＴ不純物の完全な除去を示した。
【００４９】
対照９
１ステップの精製後のアトシバン原料は、〜９５％の純度である。第１のステップの溶出プールを、最終溶媒濃度が５％となるように希釈する。それから、ロード物を、Ｄａｉｓｏ（１２０Å−１０μ−Ｃ８）カラム上で精製する。移動相ＡはｐＨ８．０の５０ｍＭのリン酸バッファーであり、そして移動相Ｂはアセトニトリルであった。２５カラム容量にわたる、移動相Ａ中の１８％−２４％の移動相Ｂの勾配溶出を実行した。達成された純度は９８．５％であった。０．９７ＲＲＴは、〜１．７％から〜０．６％へと低下した。０．９５ＲＲＴ不純物は除去されず、１．０５ＲＲＴおよび１．０７ＲＲＴ不純物は〜０．８％から〜０．３％へと低下した。
【００５０】
例９
１ステップの精製後のアトシバン原料は、〜９５％の純度である。第１のステップの溶出プールを、最終濃度が５％となるように希釈する。ロード物を、Ｄａｉｓｏ（１２０Å−１０μ−Ｃ８）カラム上で精製する。移動相ＡはｐＨ８．０の５０ｍＭリン酸バッファー中の０．２％トリエチルアミン（ＴＥＡ）（ｖ／ｖ）であり、そして移動相Ｂはアセトニトリルであった。２５カラム容量にわたる、移動相Ａ中の２０％−２４％の移動相Ｂの勾配溶出を実行した。ＴＥＡの添加により、純度は９９．１４％へと増加し、０．９５ＲＲＴ、０．９７ＲＲＴ不純物の完全な除去ならびに１．０５ＲＲＴおよび１．０７ＲＲＴ不純物の５０％の低下を示した。
【００５１】
例１０
原料エプチフィバチドは、〜５８％の純度である。ロード物を、５０ｍＭの酢酸および５％アセトニトリル中に原料を溶解させることにより調製する。それから、ロード物を、Ｄａｉｓｏ（１２０Å−１０μ−Ｃ８）カラム上で精製する。移動相Ａは０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＥＡ）（ｖ／ｖ）であり、そして移動相Ｂはアセトニトリルであった。２５カラム容量にわたる、移動相Ａ中の８％−１４％の移動相Ｂの勾配溶出を実行した。ＴＥＡの添加により、純度は９４％へと増加し、０．８６ＲＲＴ、１．２２ＲＲＴ、１．８ＲＲＴおよび２．１ＲＲＴ不純物の完全な除去を示した。
【００５２】
本開示の好ましい態様が開示された。しかし当業者は、ある程度の変更は本開示の教示の範囲内にあるものと理解するであろう。したがって、以下の特許請求の範囲は、本開示の真の範囲および内容を決定するものと理解されるべきである。
【手続補正書】
【提出日】平成23年6月14日(2011.6.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
約２．５−約８．５の範囲のｐＨで、少なくとも１つの関連不純物を有する混合物からインスリン類似体、アトシバンまたはエプチフィバチドを精製するためのクロマトグラフィーの方法であって、以下のステップ：
ａ）約５％−約８５％の有機修飾剤で平衡化した、シリカ（Ｃ４−Ｃ１８）に基づくレジンをＲＰ−ＨＰＬＣカラムに詰める；
ｂ）インスリン類似体、アトシバンまたはエプチフィバチド混合物をカラム上に約１８０ｃｍ／ｈｒ−約３６０ｃｍ／ｈｒの流量でローディングする；
ｃ）約２．５−約８．５の範囲のｐＨで、約５％−約８５％の範囲の濃度を有する有機修飾剤と組み合わせた約０．０５％−約１％の範囲の濃度を有するイオン対試薬でカラムを洗浄する、および；
ｄ）カラムから精製インスリン類似体、アトシバンまたはエプチフィバチドを溶出するために約１０％−約７０％の線形勾配を実行する
を含む、前記方法。
【請求項２】
インスリン類似体が、アスパルト、リスプロおよびグラルギンを含む群から選択される、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
シリカレジンが、好ましくはＣ８である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
レジンが、約５μ−約４０μの、好ましくは、約７μ−約２０μの、および最も好ましくは約１０μ−約１３μの範囲の粒径を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
レジンビーズが、約５０Å−約２０００Å、好ましくは約１００Å−約５００Åの範囲の、および最も好ましくは１２０Åの孔径を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
イオン対試薬が、ヘキサンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、ペンタフルオロプロパン酸、トリエチルアミンおよびヘプタフルオロ酪酸を含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
有機修飾剤が、アセトニトリル、エタノール、メタノールおよびイソプロピルアルコールを含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
インスリン類似体、アトシバンまたはエプチフィバチドの純度が、約９０％−約１００％の範囲、好ましくは少なくとも９９％である、請求項１−７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
約９０％−約１００％の範囲の純度を有する、請求項１−８のいずれか一項に記載の方法により得られるインスリン類似体、アトシバン、エプチフィバチド。
【請求項１０】
少なくとも９８％の純度で精製された、精製アスパルト。
【請求項１１】
少なくとも９９％の純度で精製された、精製グラルギン。
【請求項１２】
少なくとも９７％の純度で精製された、精製リスプロ。
【請求項１３】
少なくとも９９．１４％の純度で精製された、精製アトシバン。
【請求項１４】
少なくとも９４％の純度で精製された、精製エプチフィバチド。
【国際調査報告】
2013501773.tif 000002
2013501773.tif 000003
2013501773.tif 000004
2013501773.tif 000005
2013501773.tif 000006