(57)【要約】本発明は、ｄｓＲＮＡ、例えばＤｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ）試薬の利用を介して、ＡＲ標的ＲＮＡおよびタンパク質レベルを減少させるために有用な化合物、組成物および方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一および第二核酸鎖を含む、単離二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記第一鎖が長さにして１５〜３５ヌクレオチドであり、前記ｄｓＲＮＡの前記第二鎖が長さにして１９〜３５ヌクレオチドであり、前記第二オリゴヌクレオチド鎖は、前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入される時に、ＡＲ標的遺伝子発現を減少させるために、前記第二オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９ヌクレオチドにそって、表１３から選択される、標的ＡＲ  ｃＤＮＡ配列に十分に相補的である、単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項２】
少なくとも２５塩基対の二本鎖領域を含む、請求項１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項３】
前記第二オリゴヌクレオチド鎖が、その３’末端にて、１〜５一本鎖ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項４】
前記第一鎖が、長さにして２５〜３５ヌクレオチドである、請求項１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項５】
前記第二鎖が、長さにして２５〜３５ヌクレオチドである、請求項１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項６】
前記第二オリゴヌクレオチド鎖が、前記第二オリゴヌクレオチド鎖長の最大で２７ヌクレオチドにそって、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００００４４．２およびＮＭ＿００１０１１６４５．１からなる群より選択される標的ＡＲ  ｃＤＮＡ配列に相補的である、請求項１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項７】
第一オリゴヌクレオチド鎖の３’末端での第一ヌクレオチド（位置１）から開始して、位置１、２および／または３が、修飾ヌクレオチドによって置換される、請求項１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項８】
前記第一鎖の前記３’末端と、前記第二鎖の前記５’末端が平滑末端を形成する、請求項１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項９】
前記第一鎖が長さにして２５ヌクレオチドであり、前記第二鎖が長さにして２７ヌクレオチドである、請求項１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１０】
前記第二鎖が、配列番号：１６４、１６６、１７４、１７７、１７９、１９７５、１９８４、１９８６、１９８７、１９９２、１９９４、１９９８、２２４、２０７４、１２８３、２１３６、２４６、２２０４、２２２０、２２２７、２２３０、２２３５および２２３９からなる群より選択される配列を含む、請求項１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１１】
前記第一鎖が、配列番号：１１、１３、２１、２４、２６、１５７０、１５７９、１５８１、１５８２、１５８７、１５８９、１５９３、７１、１６６９、１２２０、１７３１、９３、１７９９、１８１５、１８２２、１８２５、１８３０および１８３４からなる群より選択される配列を含む、請求項１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１２】
表２、３、５、７、９および１１にて示したＤｓｉＲＮＡ試薬からなる群より選択された一組の第一鎖／第二鎖配列からなる、請求項１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１３】
前記第一および第二鎖それぞれが、少なくとも２６ヌクレオチドの長さを持つ、請求項１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１４】
前記第一鎖の前記３’末端の前記修飾ヌクレオチド残基が、デオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドおよび蛍光分子からなる群より選択される、請求項７に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１５】
第一オリゴヌクレオチド鎖の前記３’末端の位置１がデオキシリボヌクレオチドである、請求項７に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１６】
前記３’オーバーハングの前記ヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである、請求項１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１７】
前記３’オーバーハングの前記修飾ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである、請求項１６に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１８】
前記３’オーバーハングのすべてのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、請求項１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１９】
前記第一および第二ヌクレオチド鎖の１つまたは両方が、５’リン酸塩を含む、請求項１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項２０】
前記修飾ヌクレオチド残基が、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−ブリッジ、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’ブリッジ、２’−ＬＮＡ、２’−アミノおよび２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）からなる群より選択される、請求項１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項２１】
前記３’オーバーハングが、長さにして１〜３ヌクレオチドである、請求項１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項２２】
前記３’オーバーハングが、長さにして１〜２ヌクレオチドである、請求項１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項２３】
前記３’オーバーハングが、長さにして２ヌクレオチドであり、前記３’オーバーハングの前記修飾ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチドである、請求項１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項２４】
前記第一オリゴヌクレオチド鎖の５’末端ヌクレオチド残基に相補的である、前記第二鎖のヌクレオチド残基から開始して、前記第二オリゴヌクレオチド鎖が交互修飾および未修飾ヌクレオチド残基を含む、請求項１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項２５】
前記第一オリゴヌクレオチド鎖の５’末端ヌクレオチド残基に相補的である、前記第二鎖のヌクレオチド残基から開始して、前記第二オリゴヌクレオチド鎖が、位置１８から前記第二オリゴヌクレオチド鎖の５’末端までの全ての位置で未修飾ヌクレオチド残基を含む、請求項１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項２６】
前記第一および前記第二鎖のそれぞれが、少なくとも２６、多くとも３０ヌクレオチドである長さを含む、請求項１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項２７】
前記ｄｓＲＮＡが、Ｄｉｃｅｒによって前記細胞中に内因的に開裂される、請求項１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項２８】
標的遺伝子の発現を減少させるために十分な前記単離二本鎖核酸の量が、前記細胞の環境中、１ナノモルまたはそれ以下、２００ピコモルまたはそれ以下、１００ピコモルまたはそれ以下、５０ピコモルまたはそれ以下、２０ピコモルまたはそれ以下、１０ピコモルまたはそれ以下、５ピコモルまたはそれ以下、２ピコモルまたはそれ以下および１ピコモルまたはそれ以下からなる群より選択される、請求項１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項２９】
前記単離ｄｓＲＮＡが、１ナノモルまたはそれ以下の細胞環境中での効果的な濃度で、哺乳動物細胞内でｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイした時に、標的ＡＲ遺伝子発現を減少させることにおいて、前記標的ＡＲ  ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９ヌクレオチドに対して指向した単離２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも、大きな強度を有する、請求項１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項３０】
前記単離ｄｓＲＮＡが、２００ピコモルまたはそれ以下、１００ピコモルまたはそれ以下、５０ピコモルまたはそれ以下、２０ピコモルまたはそれ以下、１０ピコモルまたはそれ以下、５ピコモルまたはそれ以下、２ピコモルまたはそれ以下および１ピコモルまたはそれ以下からなる群より選択された、細胞環境中での効果的な濃度で、哺乳動物細胞内でｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイした時に、標的ＡＲ遺伝子発現を減少させることにおいて、前記標的ＡＲ  ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９ヌクレオチドに対して指向した単離２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも、大きな強度を有する、請求項１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項３１】
前記単離ｄｓＲＮＡが、前記二本鎖核酸を哺乳動物に導入した時に、少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも８０〜９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％からなる群より選択される量（％で表示）まで、ＡＲ標的遺伝子発現を減少させるために、標的ＡＲｃＤＮＡ配列に十分に相補的である、請求項１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項３２】
前記第一および第二鎖が、化学的リンカーによって連結する、請求項１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項３３】
前記第一鎖の前記３’末端と、前記第二鎖の前記５’末端が、化学的リンカーによって連結する請求項１に記載の単離二本鎖核酸。
【請求項３４】
前記第二または第一鎖のヌクレオチドが、Ｄｉｃｅｒ開裂の方向を指示する修飾ヌクレオチドで置換される、請求項１に記載の単離二本鎖核酸。
【請求項３５】
デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’、３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’、３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’、３’−ジデヒドロ−２’、３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’、３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）の一リン酸ヌクレオチドおよび２’、３’−ジデヒドロ−２’、３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）の一リン酸ヌクレオチド、４−チオウラシル、４−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、５−（３−アミノアリル）−ウラシル、２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−アミノリボヌクレオチド、２’−フルオロリボヌクレオチドおよびロック核酸からなる群より選択される修飾核酸を含む、請求項１に記載の単離二本鎖核酸。
【請求項３６】
リン酸塩、ホスホロチオエートおよびホスホトリエステルからなる群より選択されるリン酸骨格修飾を含む請求項１に記載の単離二本鎖核酸。
【請求項３７】
モルホリノ核酸およびペプチド核酸（ＰＮＡ）からなる群より選択される修飾を含む、請求項１に記載の単離二本鎖核酸。
【請求項３８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで哺乳動物細胞を、前記細胞中の標的ＡＲ遺伝子の発現を減少させるのに十分な量で、請求項１の単離ｄｓＲＮＡと接触させることを含む、哺乳動物細胞内の標的ＡＲ遺伝子の発現を減少させるための方法。
【請求項３９】
標的ＡＲ遺伝子発現が、少なくとも１０％、少なくとも５０％および少なくとも８０〜９０％からなる群より選択される量（％で表示）まで減少する、請求項３８の方法。
【請求項４０】
ＡＲｍＲＮＡレベルが、前記細胞を前記ｄｓＲＮＡに接触させてから少なくとも８日後、少なくとも９０％の量（％で表示）まで減少する、請求項３８の方法。
【請求項４１】
ＡＲｍＲＮＡレベルが、前記細胞を前記ｄｓＲＮＡに接触させてから少なくとも１０日後、少なくとも７０％の量（％で表示）まで減少する、請求項３８の方法。
【請求項４２】
請求項１の単離ｄｓＲＮＡを、哺乳動物内の標的ＡＲ遺伝子の発現を減少させるのに十分な量で、哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物中の標的ＡＲ遺伝子の発現を減少させる方法。
【請求項４３】
前記単離ｄｓＲＮＡを、１マイクログラム〜５ミリグラム／前記哺乳動物のキログラム／日、１００マイクログラム〜０．５ミリグラム／キログラム、０．００１〜０．２５ミリグラム／キログラム、０．０１〜２０マイクログラム／キログラム、０．０１〜１０マイクログラム／キログラム、０．０１〜５マイクログラム／キログラムおよび０．１〜２．５マイクログラム／キログラムからなる群より選択される用量で投与する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記単離ｄｓＲＮＡが、１ナノモルまたはそれ以下の細胞環境中での効果的な濃度で、哺乳動物細胞内でｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイした時に、標的ＡＲ遺伝子発現を減少させることにおいて、前記標的ＡＲ  ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９ヌクレオチドに対して指向した単離２１ｍｅｒのｉＲＮＡよりも、大きな強度を有する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記投与段階が、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、点滴、皮下注射、経皮、エアロゾル、直腸、膣、局所、経口および吸入伝達からなる群より選択された様式を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
細胞を、前記細胞の増殖を阻害するのに十分な量の請求項１に記載の単離ｄｓＲＮＡと接触させることを含む、増殖を選択的に阻害するための方法。
【請求項４７】
前記細胞が対象の腫瘍細胞である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞が、前立腺癌細胞である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞が、２２Ｒｖ１およびＶＣａＰからなる群より選択される前立腺癌である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞が、Ａ５４９腺癌ヒト肺胞癌細胞である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞が哺乳動物前立腺癌である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
前記細胞がヒト細胞である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５４】
前記ｄｓＲＮＡが、前記ｄｓＲＮＡを、少なくとも１０％、少なくとも５０％および少なくとも８０〜９０％からなる群より選択される量（％で表示）まで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて哺乳動物細胞内に導入する時に、標的ＡＲ  ＲＮＡレベルを減少させるのに十分な量で存在し、前記ｄｓＲＮＡが、１ナノモルまたはそれ以下の細胞環境中での効果的な濃度で、哺乳動物細胞内でｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイした時に、標的ＡＲ遺伝子発現を減少させることにおいて、前記標的ＡＲ  ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９ヌクレオチドに対して指向した単離２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも、大きな強度を有する、請求項７１の単離ｄｓＲＮＡを含む製剤。
【請求項５５】
前記効果的な量が、前記細胞の環境中、１ナノモルまたはそれ以下、２００ピコモルまたはそれ以下、１００ピコモルまたはそれ以下、５０ピコモルまたはそれ以下、２０ピコモルまたはそれ以下、１０ピコモルまたはそれ以下、５ピコモルまたはそれ以下、２ピコモルまたはそれ以下および１ピコモルまたはそれ以下からなる群より選択される、請求項５４に記載の製剤。
【請求項５６】
前記ｄｓＲＮＡが、前記ｄｓＲＮＡを、少なくとも１０％、少なくとも５０％および少なくとも８０〜９０％からなる群より選択される量（％で表示）まで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて哺乳動物細胞内に導入する時に、標的ＲＮＡレベルを減少させるのに十分な量で存在し、前記ｄｓＲＮＡが、１ナノモルまたはそれ以下の細胞環境中での効果的な濃度で、哺乳動物細胞内でｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイした時に、標的ＡＲ遺伝子発現を減少させることにおいて、前記標的ＡＲ  ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９ヌクレオチドに対して指向した単離２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも、大きな強度を有する、請求項２の単離ｄｓＲＮＡを含む製剤。
【請求項５７】
前記効果的な量が、１マイクログラム〜５ミリグラム／前記哺乳動物のキログラム／日、１００マイクログラム〜０．５ミリグラム／キログラム、０．００１〜０．２５ミリグラム／キログラム、０．０１〜２０マイクログラム／キログラム、０．０１〜１０マイクログラム／キログラム、０．０１〜５マイクログラム／キログラムおよび０．１〜２．５マイクログラム／キログラムからなる群より選択される用量である、請求項５６の単離ｄｓＲＮＡを含む製剤。
【請求項５８】
請求項１の単離ｄｓＲＮＡを含む哺乳動物細胞。
【請求項５９】
請求項１の単離ｄｓＲＮＡと、薬理学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項６０】
請求項１の単離ｄｓＲＮＡと、その利用のための取扱説明書を含むキット。
【請求項６１】
第一および第二核酸鎖を含む、単離二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）から本質的になるＡＲ阻害活性を有する組成物であって、前記第一鎖が長さにして１５〜３５ヌクレオチドであり、前記ｄｓＲＮＡの前記第二鎖が長さにして１９〜３５ヌクレオチドであり、前記第二オリゴヌクレオチド鎖は、前記二本鎖核酸が哺乳動物内に導入される時に、ＡＲ標的遺伝子発現を減少させるために、前記第二オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９ヌクレオチドにそって、表１３から選択される、標的ＡＲ  ｃＤＮＡ配列に十分に相補的である、組成物。
【請求項６２】
少なくとも２５塩基対の二本鎖領域を含む、請求項６１の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項６３】
前記第二オリゴヌクレオチド鎖が、その３’末端にて１〜５一本鎖ヌクレオチドを含む、請求項６１の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項６４】
前記第一鎖が、長さにして２５〜３５ヌクレオチドである、請求項６１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項６５】
前記第二鎖が、長さにして２５〜３５ヌクレオチドである、請求項６１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項６６】
前記第二オリゴヌクレオチド鎖が、前記第二オリゴヌクレオチド鎖長の最大で２７ヌクレオチドにそって、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００００４４．２およびＮＭ＿００１０１１６４５．１からなる群より選択される標的ＡＲｃＤＮＡ配列に相補的である、請求項６５に記載の組成物。
【請求項６７】
対象中のＡＲ関連疾患または障害を治療するため、または予防するための方法であって、前記対象中の前記ＡＲ関連疾患または障害を治療する、または予防するために十分な量で、対象に請求項１の単離ＲＮＡと薬理学的に許容可能な担体を投与し、それによって前記対象中の前記ＡＲ関連疾患または障害を治療する、または予防することを含む、方法。
【請求項６８】
前記ＡＲ関連疾患または障害が、結腸直腸癌および肝細胞癌である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
第一および第二核酸鎖を含む、単離二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡは平滑末端を含み、第一および第二オリゴヌクレオチド鎖はそれぞれ同じ数のヌクレオチド残基からなり、最大で３５ヌクレオチドの長さであり、前記第二オリゴヌクレオチド鎖は、前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入される時に、ＡＲ標的遺伝子発現を減少させるために、前記第二オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９ヌクレオチドにそって、表１３から選択される、標的ＡＲｃＤＮＡ配列に十分に相補的である、単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項７０】
少なくとも２５塩基対で第二本鎖領域を含む請求項６９に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項７１】
前記第一および前記第二鎖のそれぞれが、少なくとも２５〜３５ヌクレオチドである長さを持つ、請求項６９に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項７２】
ｄｓＲＮＡが細胞環境中に１ナノモル未満の濃度で標的遺伝子の発現を減少させることのできる請求項６９に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項７３】
前記第一および前記第二鎖のそれぞれが、少なくとも２６ヌクレオチドである長さを持つ、請求項６９に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項７４】
前記第一および第二鎖はそれぞれ、長さが２６〜３０ヌクレオチドである請求項６９に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項７５】
前記第一および第二鎖はそれぞれ、長さが２７ヌクレオチドである請求項６９に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項７６】
前記第二鎖が配列番号１６４、１６６、１７４、１７７、１７９、１９７５、１９８４、１９８６、１９８７、１９９２、１９９４、１９９８、２２４、２０７４、１２８３、２１３６、２４６、２２０４、２２２０、２２２７、２２３０、２２３５および２２３９からなる群より選択される配列を含む請求項６９に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項７７】
前記第一鎖が配列番号４５１７、４５１９、４５２７、４５３０、４５３２、４８７６、４８８５、４８８７、４８８８、４８９３、４８９５、４８９９、４５７７、４９７５、４７７８、５０３７、４５９９、５１０５、５１２１、５１２８、５１３１、５１３６および５１４０からなる群より選択される配列を含む請求項６９に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項７８】
表２、３、５、７、９および１１に示すＤｓｉＲＮＡ薬剤からなる群より選択される一組の第一／第二鎖の配列を含む請求項６９に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項７９】
第一および第二核酸鎖を含む単離二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡが平滑末端を含み、前記第一および第二オリゴヌクレオチド鎖はそれぞれ、同数のヌクレオチド残基からなり、長さにして最大３５ヌクレオチドであり、前記第一鎖の前記３’末端の最後および最後から二番目の残基と、前記第二鎖の前記５’末端の最後と最後から二番目の残基が、１つまたはそれ以上のミスマッチ塩基対を形成し、前記第二オリゴヌクレオチド鎖は、前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入される時に、ＡＲ標的遺伝子発現を減少させるために、前記第二オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９ヌクレオチドにそって、表１３から選択される標的ＡＲｃＤＮＡ配列に十分に相補的であるｄｓＲＮＡ。
【請求項８０】
少なくとも２５塩基対の二本鎖領域を含む請求項７９に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項８１】
前記第一および第二鎖はそれぞれ、長さが２５〜３５ヌクレオチドである請求項７９に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項８２】
前記第一鎖が配列番号３７９４、３７９６、３８０４、３８０７、３８０９、４１５３、４１６２、４１６４、４１６５、４１７０、４１７２、４１７６、３８５４、４２５２、４０５５、４３１４、３８７６、４３８２、４３９８、４４０５、４４０８、４４１３および４４１７からなる群より選択される配列を含む請求項７９に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項８３】
第一および第二核酸鎖を含む、単離二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）から本質的になる、ＡＲ阻害活性を有する組成物であって、前記ｄｓＲＮＡが平滑末端を含み、前記第一および第二オリゴヌクレオチド鎖のそれぞれが、同数のヌクレオチド残基からなり、長さにして最大３５ヌクレオチドであり、前記第一鎖の前記３’末端の最後および最後から二番目の残基と、前記第二鎖の前記５’末端の最後と最後から二番目の残基が、１つまたは２つのミスマッチ塩基対を形成し、前記第二オリゴヌクレオチド鎖は、前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入される時に、ＡＲ標的遺伝子発現を減少させるために、前記第二オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９ヌクレオチドにそって、表１３から選択される、標的ＡＲ  ｃＤＮＡ配列に十分に相補的である、組成物。
。
【請求項８４】
少なくとも２５塩基対の二本鎖領域を含む、請求項８３に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項８５】
前記第一および第二鎖はそれぞれ、長さが２５〜３５ヌクレオチドである請求項８３に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項８６】
（ａ）センス領域およびアンチセンス領域であり、前記センス領域および前記アンチセンス領域が一緒に、１５〜３５塩基対からなる二本鎖領域を形成し、前記アンチセンス領域が、表１３より選択される配列の相補体である配列を含む、および（ｂ）０〜２の３’オーバーハング領域であり、各オーバーハング領域は、長さにして６またはそれより少ないヌクレオチドである、からなる単離ｄｓＲＮＡ分子。
【請求項８７】
前記二本鎖領域が１９〜３５塩基対からなる請求項８６に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項８８】
前記二本鎖領域が２５〜３５塩基対からなる請求項８６に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項８９】
前記二本鎖領域が２５〜３０塩基対からなる請求項８６に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項９０】
（ａ）センス領域およびアンチセンス領域であり、前記センス領域および前記アンチセンス領域が一緒に、１９〜２３塩基対からなる二本鎖領域を形成し、前記アンチセンス領域が、表１３より選択される配列の相補体である配列を含む、および（ｂ）０〜４のオーバーハング領域であり、各オーバーハング領域は、長さにして６またはそれより少ないヌクレオチドである、からなる単離ｓｉＲＮＡ分子。
【請求項９１】
第一および第二核酸鎖と、少なくとも２５塩基対の二本鎖領域を含む、単離二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記第一鎖の長さは２５〜３４ヌクレオチドであり、前記第二鎖の長さは２６〜３５ヌクレオチドであり、３‘末端に１〜５単一鎖ヌクレオチドを含み、前記第二オリゴヌクレオチド鎖は、前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入される時に、ＡＲ標的遺伝子発現を減少させるために、前記第二オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９ヌクレオチドにそって、配列番号３０７〜４５９、８２６〜９１５、１０２４〜１０７７、１３１２〜１３７４、２３１１〜２７１５および３６２２〜３６６９からなる群より選択される、標的ＡＲ  ｃＤＮＡ配列に十分に相補的である、単離二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）。
【請求項９２】
前記第二オリゴヌクレオチド鎖は、最大で２７ヌクレオチドの長さに沿って、配列番号３７６６、３７６８および３７７０からなる群より選択される標的ＡＲ  ｃＤＮＡに十分に相補的である請求項９１の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項９３】
第一オリゴヌクレオチド鎖の３’末端で第一ヌクレオチド（位置１）から開始し、位置１、２および／または３が修飾ヌクレオチドで置換される請求項９１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項９４】
前記第一鎖の３’末端および前記第二鎖の５’末端が平滑末端を形成する請求項９１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項９５】
前記第一鎖の長さが２５ヌクレオチドであり、および前記第二鎖の長さが２７ヌクレオチドである請求項９１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項９６】
第二鎖が配列番号１５４〜３０６、７９６〜８２５、９７０〜１０２３、１２４９〜１３１１、１９０６〜２３１０および３５７４〜３６２１からなる群より選択される配列を含む請求項９１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項９７】
第一鎖が配列番号１〜１５３、７６６〜７９５、９１６〜９６９、１１８６〜１２４８、１５０１〜１９０５および３５２６〜３５７３からなる群より選択される配列を含む請求項９１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項９８】
表９に示すＤｓｉＲＮＡ薬剤から成る群より選択される一組の第一／第二鎖の配列を含む、請求項９１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項９９】
第一鎖および第二鎖はそれぞれ、長さが少なくとも２６ヌクレオチドである請求項９１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１００】
前記第一鎖の前記３’末端の前記修飾ヌクレオチド残基が、デオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドおよび蛍光分子からなる群より選択される請求項９３に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１０１】
第一オリゴヌクレオチド鎖の前記３’末端の位置１がデオキシリボヌクレオチドである請求項９３に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１０２】
前記３’オーバーハングの前記ヌクレオチドが修飾ヌクレオチドを含む請求項９１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１０３】
前記３’オーバーハングの前記修飾ヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである請求項１０２に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１０４】
前記３’オーバーハングのヌクレオチドがいずれも修飾ヌクレオチドである請求項９１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１０５】
第一および第二オリゴヌクレオチド鎖の一つまたは双方が５’リン酸塩を含む請求項９１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１０６】
前記修飾ヌクレオチド残基が、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−ブリッジ、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’ブリッジ、２’−ＬＮＡ、２’−アミノおよび２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）からなる群より選択される、請求項９１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１０７】
前記３’オーバーハングの長さが１〜３ヌクレオチドである請求項９１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１０８】
前記３’オーバーハングの長さが１〜２ヌクレオチドである請求項９１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１０９】
３’オーバーハングの長さが２ヌクレオチドであり、前記３’オーバーハングの前記修飾ヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチドである請求項９１に記載の単離ｄｓＲＮＡ
。
【請求項１１０】
第二オリゴヌクレオチド鎖が前記第一オリゴヌクレオチド鎖の５’末端ヌクレオチド残基と相補的である前記第二鎖のヌクレオチド残基から開始し、交互修飾および非修飾ヌクレオチド残基を含む請求項９１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１１１】
第二オリゴヌクレオチド鎖が、前記第一オリゴヌクレオチド鎖の５’末端ヌクレオチド残基に相補的である第二鎖の残基から開始し、前記第二オリゴヌクレオチド鎖の位置１８から５’末端までのどの位置にも非修飾ヌクレオチド残基を含む請求項９１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１１２】
第一および第二鎖はそれぞれ長さが少なくとも２６、最大でも３０ヌクレオチドである請求項９１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１１３】
前記ｄｓＲＮＡがＤｉｃｅｒによって前記細胞中に内因的に開裂する請求項９１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１１４】
標的遺伝子の発現を減少させるために十分な前記単離二本鎖核酸の量が、前記細胞の環境中、１ナノモルまたはそれ以下、２００ピコモルまたはそれ以下、１００ピコモルまたはそれ以下、５０ピコモルまたはそれ以下、２０ピコモルまたはそれ以下、１０ピコモルまたはそれ以下、５ピコモルまたはそれ以下、２ピコモルまたはそれ以下および１ピコモルまたはそれ以下からなる群より選択される、請求項９１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１１５】
前記単離ｄｓＲＮＡが、１ナノモルまたはそれ以下の細胞環境中での効果的な濃度で、哺乳動物細胞内でｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイした時に、標的ＡＲ遺伝子発現を減少させることにおいて、前記標的ＡＲ  ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９ヌクレオチドに対して指向した単離２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも、大きな強度を有する、請求項９１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１１６】
前記単離ｄｓＲＮＡが、細胞環境中、２００ピコモルまたはそれ以下、１００ピコモルまたはそれ以下、５０ピコモルまたはそれ以下、２０ピコモルまたはそれ以下、１０ピコモルまたはそれ以下、５ピコモルまたはそれ以下、２ピコモルまたはそれ以下および１ピコモルまたはそれ以下からなる群より選択される細胞環境中での効果的な濃度で、哺乳動物細胞内でｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイした時に、標的ＡＲ遺伝子発現を減少させることにおいて、前記標的ＡＲｃＤＮＡの同一の少なくとも１９ヌクレオチドに対して指向した単離２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも、大きな強度を有する、請求項９１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１１７】
前記単離ｄｓＲＮＡが、前記二本鎖核酸を哺乳動物細胞に導入した時に、少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも８０〜９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％からなる群より選択される量（％で表示）まで、ＡＲ標的遺伝子発現を減少させるために、標的ＡＲ  ｃＤＮＡ配列に十分に相補的である、請求項９１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１１８】
前記第一および第二鎖が、化学的リンカーによって連結する、請求項９１に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１１９】
前記第一鎖の前記３’末端と、前記第二鎖の前記５’末端が、化学的リンカーによって連結する請求項９１に記載の単離二本鎖核酸。
【請求項１２０】
前記第二または第一鎖のヌクレオチドが、Ｄｉｃｅｒ開裂の方向を指示する修飾ヌクレオチドで置換される、請求項９１に記載の単離二本鎖核酸。
【請求項１２１】
デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’、３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’、３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’、３’−ジデヒドロ−２’、３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’、３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）の一リン酸ヌクレオチドおよび２’、３’−ジデヒドロ−２’、３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）の一リン酸ヌクレオチド、４−チオウラシル、５−ヨードウラシル、５−（３−アミノアリル）−ウラシル、２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−アミノリボヌクレオチド、２’−フルオロリボヌクレオチドおよびロック核酸からなる群より選択される修飾核酸を含む、請求項９１に記載の単離二本鎖核酸。
【請求項１２２】
リン酸塩、ホスホロチオエートおよびホスホトリエステルからなる群より選択されるリン酸骨格修飾を含む請求項９１に記載の単離二本鎖核酸。
【請求項１２３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで哺乳動物細胞を、前記細胞中の標的ＡＲ遺伝子の発現を減少させるのに十分な量で、請求項９１の単離ｄｓＲＮＡと接触させることを含む、哺乳動物細胞内の標的ＡＲ遺伝子の発現を減少させるための方法。
【請求項１２４】
標的ＡＲ遺伝子発現が、少なくとも１０％、少なくとも５０％および少なくとも８０〜９０％からなる群より選択される量（％で表示）まで減少する、請求項１２３の方法。
【請求項１２５】
ＡＲ  ｍＲＮＡレベルが、前記細胞を前記ｄｓＲＮＡに接触させてから少なくとも８日後に、少なくとも９０％の量（％で表示）まで減少する、請求項１２３の方法。
【請求項１２６】
ＡＲ  ｍＲＮＡレベルが、前記細胞を前記ｄｓＲＮＡに接触させてから少なくとも１０日後に、少なくとも７０％の量（％で表示）まで減少する、請求項１２３の方法。
【請求項１２７】
請求項９１の単離ｄｓＲＮＡを、哺乳動物内の標的ＡＲ遺伝子の発現を減少させるのに十分な量で、前記哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物中の標的ＡＲ遺伝子の発現を減少させる方法。
【請求項１２８】
前記単離ｄｓＲＮＡを、１マイクログラム〜５ミリグラム／前記哺乳動物のキログラム／日、１００マイクログラム〜０．５ミリグラム／キログラム、０．００１〜０．２５ミリグラム／キログラム、０．０１〜２０マイクログラム／キログラム、０．０１〜１０マイクログラム／キログラム、０．０１〜５マイクログラム／キログラムおよび０．１〜２．５マイクログラム／キログラムからなる群より選択される用量で投与する、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記単離ｄｓＲＮＡが、１ナノモルまたはそれ以下の細胞環境中での効果的な濃度で、哺乳動物細胞内でｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイした時に、標的ＡＲ遺伝子発現を減少させることにおいて、前記標的ＡＲｃＤＮＡの同一の少なくとも１９ヌクレオチドに対して指向した単離２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも、大きな強度を有する、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３０】
前記投与段階が、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、点滴、皮下注射、経皮、エアロゾル、直腸、膣、局所、経口および吸入伝達からなる群より選択された様式を含む、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３１】
細胞を、前記細胞の増殖を阻害するのに十分な量の請求項９１に記載の単離ｄｓＲＮＡと接触させることを含む、細胞の増殖を選択的に阻害するための方法。
【請求項１３２】
前記細胞が対象の腫瘍細胞にある、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞である、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３４】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３５】
前記ｄｓＲＮＡが、少なくとも１０％、少なくとも５０％および少なくとも８０〜９０％からなる群より選択される量（％で表示）まで、前記ｄｓＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏにて哺乳動物細胞内に導入する時に、標的ＡＲ  ＲＮＡレベルを減少させるのに効果的な量で存在し、前記ｄｓＲＮＡが、１ナノモルまたはそれ以下の細胞環境中での効果的な濃度で、哺乳動物細胞内でｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイした時に、標的ＡＲ遺伝子発現を減少させることにおいて、前記標的ＡＲ  ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９ヌクレオチドに対して指向した単離２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも、大きな強度を有する、請求項９１の単離ｄｓＲＮＡを含む製剤。
【請求項１３６】
前記効果的な量が、前記細胞の環境中、１ナノモルまたはそれ以下、２００ピコモルまたはそれ以下、１００ピコモルまたはそれ以下、５０ピコモルまたはそれ以下、２０ピコモルまたはそれ以下、１０ピコモルまたはそれ以下、５ピコモルまたはそれ以下、２ピコモルまたはそれ以下および１ピコモルまたはそれ以下からなる群より選択される、請求項１３５に記載の製剤。
【請求項１３７】
前記ｄｓＲＮＡが、前記ｄｓＲＮＡを、少なくとも１０％、少なくとも５０％および少なくとも８０〜９０％からなる群より選択される量（％で表示）まで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて哺乳動物細胞内に導入する時に、標的ＲＮＡレベルを減少させるのに十分な量で存在し、前記ｄｓＲＮＡが、１ナノモルまたはそれ以下の細胞環境中での効果的な濃度で、哺乳動物細胞内でｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイした時に、標的ＡＲ  ＲＮＡレベルを減少させることにおいて、前記標的ＡＲ  ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９ヌクレオチドに対して指向した単離２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも、大きな強度を有する、請求項９１の単離ｄｓＲＮＡを含む製剤。
【請求項１３８】
前記効果的な量が、１マイクログラム〜５ミリグラム／前記哺乳動物のキログラム／日、１００マイクログラム〜０．５ミリグラム／キログラム、０．００１〜０．２５ミリグラム／キログラム、０．０１〜２０マイクログラム／キログラム、０．０１〜１０マイクログラム／キログラム、０．０１〜５マイクログラム／キログラムおよび０．１〜２．５マイクログラム／キログラムからなる群より選択される用量である、請求項１３７の単離ｄｓＲＮＡを含む製剤。
【請求項１３９】
請求項９１に記載の単離ｄｓＲＮＡを含む哺乳動物細胞。
【請求項１４０】
請求項９１の単離ｄｓＲＮＡおよび薬理学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項１４１】
請求項９１の単離ｄｓＲＮＡと、その利用のための取扱説明書を含むキット。
【請求項１４２】
第一および第二核酸鎖と、少なくとも２５塩基対の二本鎖領域を含む、単離二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）から本質的になるＡＲ阻害活性を有する組成物であって、前記第一鎖が長さにして２５〜３４ヌクレオチドであり、前記ｄｓＲＮＡの前記第二鎖が長さにして２６〜３５ヌクレオチドであり、その３’末端にて１〜５一本鎖ヌクレオチドを含み、前記第二オリゴヌクレオチド鎖は、前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入される時に、ＡＲ標的遺伝子発現を減少させるために、前記第二オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９ヌクレオチドにそって、配列番号：３０７〜４５９、８２６〜９１５、１０２４〜１０７７、１３１２〜１３７４、２３１１〜２７１５および３６２２〜３６６９からなる群から選択される、標的ＡＲ  ｃＤＮＡ配列に十分に相補的である、組成物。
【請求項１４３】
前記ｄｓＲＮＡの第二オリゴヌクレオチド鎖が、前記第二オリゴヌクレオチド鎖長の最大２７ヌクレオチドにそって、配列番号：３７６６、３７６８および３７７０からなる群より選択される標的ＡＲ  ｃＤＮＡ配列に相補的である、請求項１４２に記載の組成物。
【請求項１４４】
対象中のＡＲ関連疾患または障害を治療するため、または予防するための方法であって、前記対象中の前記ＡＲ関連疾患または障害を治療する、または予防するために十分な量で、対象に請求項９１の単離ＲＮＡおよび薬理学的に許容可能な担体を投与し、それによって前記対象中の前記ＡＲ関連疾患または障害を治療する、または予防することを含む、方法。
【請求項１４５】
前記ＡＲ関連疾患または障害が、前立腺癌である、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
第一および第二核酸鎖と、少なくとも２５塩基対の二本鎖領域を含む、単離二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡは平滑末端を含み、前記第一および第二オリゴヌクレオチド鎖はそれぞれ同じ数のヌクレオチド残基からなり、および長さは最大で３５ヌクレオチドであり、前記第二オリゴヌクレオチド鎖は、前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入される時に、ＡＲ標的遺伝子発現を減少させるために、前記第二オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９ヌクレオチドにそって、配列番号：３０７〜４５９、８２６〜９１５、１０２４〜１０７７、１３１２〜１３７４、２３１１〜２７１５および３６２２〜３６６９からなる群から選択される、標的ＡＲ  ｃＤＮＡ配列に十分に相補的である、単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１４７】
前記ｄｓＲＮＡが、細胞の環境中１ナノモル未満の濃度で、標的遺伝子発現を減少可能である、請求項１４６に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１４８】
前記第一および前記第二鎖がそれぞれ、少なくとも２６ヌクレオチドである長さを持つ、請求項１４６に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１４９】
前記第一および前記第二鎖がそれぞれ、２６〜３０ヌクレオチドである長さを持つ、請求項１４６に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１５０】
前記第一および前記第二鎖がそれぞれ、２７ヌクレオチドである長さを持つ、請求項１４６に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１５１】
前記第二鎖が、配列番号：１５４〜３０６、７９６〜８２５、９７０〜１０２３、１２４９〜１３１１、１９０６〜２３１０および３５７４〜３６２１からなる群より選択される配列を含む、請求項１４６に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１５２】
前記第一鎖が、配列番号：３７８４〜５２２９からなる群より選択される配列を含む、請求項１４６に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１５３】
表５に示したＤｓｉＲＮＡ試薬からなる群より選択される一組の第一鎖／第二鎖配列を含む、請求項１４６に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１５４】
第一および第二核酸鎖と、少なくとも２５塩基対の二本鎖領域を含む、単離二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡが平滑末端を含み、前記第一および第二オリゴヌクレオチド鎖がそれぞれ、同数のヌクレオチド残基からなり、長さにして最大３５ヌクレオチドであり、前記第一鎖の前記３’末端の最後および最後から二番目の残基と、前記第二鎖の前記５’末端の最後と最後から二番目の残基が、１つまたはそれ以上のミスマッチ塩基対を形成し、前記第二オリゴヌクレオチド鎖は、前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入される時に、ＡＲ標的遺伝子発現を減少させるために、前記第二オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９ヌクレオチドにそって、配列番号：３０７〜４５９、８２６〜９１５、１０２４〜１０７７、１３１２〜１３７４、２３１１〜２７１５および３６２２〜３６６９からなる群から選択される、標的ＡＲ  ｃＤＮＡ配列に十分に相補的である、単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１５５】
前記第一鎖が、配列番号：３７８４〜４５０６からなる群より選択される配列を含む、請求項１５４に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項１５６】
第一および第二核酸鎖と、少なくとも２５塩基対の二本鎖領域を含む、単離二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）から本質的になるＡＲ阻害活性を有する組成物であって、前記ｄｓＲＮＡが平滑末端を含み、前記第一および第二オリゴヌクレオチド鎖がそれぞれ、同数のヌクレオチド残基からなり、長さにして最大３５ヌクレオチドであり、前記第一鎖の前記３’末端の最後および最後から二番目の残基と、前記第二鎖の前記５’末端の最後と最後から二番目の残基が、１つまたはそれ以上のミスマッチ塩基対を形成し、前記第二オリゴヌクレオチド鎖は、前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入される時に、ＡＲ標的遺伝子発現を減少させるために、前記第二オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９ヌクレオチドにそって、配列番号：３０７〜４５９、８２６〜９１５、１０２４〜１０７７、１３１２〜１３７４、２３１１〜２７１５および３６２２〜３６６９からなる群から選択される、標的ＡＲ  ｃＤＮＡ配列に十分に相補的である、組成物。
【請求項１５７】
（ａ）センス領域およびアンチセンス領域であり、前記センス領域および前記アンチセンス領域が一緒に、１９〜３５塩基対からなる二本鎖領域を形成し、前記アンチセンス領域が、配列番号：６１３〜７６５、８８６〜９１５、１１３２〜１１８５、１４３８〜１５００および３１２１〜３７６５からなる群より選択される配列の相補体である配列を含む、および（ｂ）０〜２の３’オーバーハング領域であり、各オーバーハング領域は、長さにして６またはそれ以下のヌクレオチドである、からなる単離ｄｓＲＮＡ分子。
【請求項１５８】
前記二本鎖領域が、２５〜３５塩基対からなる、請求項１５７に記載の単離ｄｓＲＮＡ分子。
【請求項１５９】
（ａ）センス領域およびアンチセンス領域であり、前記センス領域および前記アンチセンス領域が一緒に、１９〜２３塩基対からなる二本鎖領域を形成し、前記アンチセンス領域が、配列番号：６１３〜７６５、８８６〜９１５、１１３２〜１１８５、１４３８〜１５００および３１２１〜３７６５からなる群より選択される配列の相補体である配列を含む、および（ｂ）０〜４の３’オーバーハング領域であり、各オーバーハング領域は、長さにして６またはそれ以下のヌクレオチドである、からなるｓｉＲＮＡ分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連明細書の相互参照）
本明細書は、「二本鎖ＲＮＡによるアンドロゲン受容体の特異的阻害に対する方法と化合物」という表題の２０１０年６月７日に申請された、米国仮特許出願第６１／３６１，７５９号明細書の優先権、ならびに３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）下の利益を請求する。
【０００２】
本発明は、アンドロゲン受容体（ＡＲ）遺伝子発現および／または活性の調節に応答する特性、疾患および状態の研究、診断および処置のための化合物、組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＡＲは、細胞分割、アポトーシスおよび血管新生に関与する無数の遺伝子を制御するために、前立腺細胞中の転写因子としても機能する、リガンド活性型ステロイドホルモン受容体である（Ｃｏｍｐａｇｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２：ｅ１００６）。前立腺癌は、まずアンドロゲン−依存性であり、したがって、ＡＲ活性化を減少または排除する治療に応答性である。とりわけ、アンドロゲンの効果を操作する目的の種々のアプローチが、前立腺癌の治療において効果的であることが明確に示されてきた。歴史的に、睾丸摘出およびエストロゲンの投与がまず、有益な効果を持つとして示唆された。しかしながら、前立腺癌癌はそのような治療から免れることが多く、再発する（Ｈｅｉｎｌｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｎｇ，Ｅｎｄｃｒ  Ｒｅｖ  ２５：２７６−３０８）。
【０００４】
ゴナドトロピン−放出ホルモンアゴニスト（ＧｎＲＨアゴニスト）および抗アンドロゲン類が、多数の設定において、安全で効果的であることが示されてきており、初期手術または放射線治療後の再発のリスクが高い患者、またはこれらの手順から再発した患者の標準の処置となってきた（Ｓｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓａｗｙｅｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２３：８２５３−８２６１；Ｂａｌｔｏｇｉａｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２６：１８５−１９１；  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  （２００８）．Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｉｎ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１．２００８，１−４４；Ｂｈａｎｄａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２３：８２１２−８２１８；  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｏｐｔｉｏｎｓ  ＆  Ｐｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００６）．Ｒｅｃｅｎｔ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｈｏｒｍｏｎａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ．１−２２；Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．ＢＪＵ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，９５：  ７４３−４７９；Ｕｓｅ  ｏｆ  ５−ａｐｌｈａ−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ：  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ２００８  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｓｕｍｍａｒｙ，（２００９，Ｍａｙ）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，５：１２７−１２９；Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  ａｎｄ  Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ．ＢＪＵ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  ９５：２２−２８；Ｋｏｌｔｚ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｌｌｈａｍｍｅｒ．Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｂｌｏｃｋａｄｅ：  ｗｏｒｔｈ  ａ  ｓｅｃｏｎｄ  ｌｏｏｋ．１−１７）。多くの研究が、内分泌物操作を受けている患者における耐性の発達を評価してきており、内分泌物療法で見られた耐性の可能性ある理由には、アンドロゲン受容体の発現の増加、アンドロゲン受容体の感受性の増加、および存在している阻害剤に感受性ではない細胞によるアンドロゲンの局所産出の増加が含まれることが明らかである。最近、抗アンドロゲン類は、前立腺癌を標準的な治療方法に耐性のある患者に活性を示し、さらには、「去勢−耐性」前立腺癌であると思われる患者における本受容体の役割を確認している。その腫瘍が標準療法に奏功できない患者においてさえ、本標的に対して指向するｄｓＲＮＡ試薬による直接のアンドロゲン受容体の阻害は能動的なものでなければならず、伝統的な療法に対して耐性のある前立腺癌を特徴とするアンドロゲン受容体発現の増加のため、疾患の初期の段階よりも、耐性的な癌を持つ対象においてより活性であり得ることが明らかである。
【０００５】
２５〜３５ヌクレオチドの鎖長を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）試薬が、哺乳動物細胞における標的遺伝子配列の効果的な阻害剤として記述されてきた（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第２００５／０２４４８５８号明細書および米国特許第２００５／０２７７６１０号明細書）。そのような長さのｄｓＲＮＡ試薬が、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路のＤｉｃｅｒ酵素によって処理されると信じられており、そのような薬剤が、「Ｄｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡ」（「ＤｓｉＲＮＡ」）試薬と呼ばれる。ＤｓｉＲＮＡ試薬のさらなる改変構造がすでに記述された（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第２００７／０２６５２２０号明細書）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）を含む組成物、およびそれらの調製するための方法を指向する。本発明のｄｓＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは哺乳動物対象中いずれかで、細胞内の標的ＡＲ遺伝子の発現を減少可能である。よりとりわけ、本発明は、効果的かつ非常に強力なＡＲ阻害試薬として働き、長期間の阻害効果を任意に有する構造と改変パターンを持つ、Ｄｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡ（「ＤｓｉＲＮＡｓ」）を指向する。そのような効果が最近、ＫＲＡＳ標的転写産物に対して指向するＤｓｉＲＮＡｓに関して文書とされたように（米国特許第１２／７５４，４２７号明細書を参照のこと）、多くのそのようなＤｓｉＲＮＡｓが、標的特異的阻害強度と、同一の標的ＲＮＡに対して指向した２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡｓに対して有意に増強された有効性を有する。
【０００７】
１つの様態において、本発明は、第一および第二核酸鎖を含む単離された二本鎖リボヌ核酸（ｄｓＲＮＡ）を提供し、そこで第一差は長さにして１５〜３５ヌクレオチド、第二鎖は長さにして１９〜３５ヌクレオチドであり、そこで第二オリゴヌクレオチド鎖は、二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入された時に、ＡＲ標的遺伝子発現を減少させるために第二オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９ヌクレオチドにそって、表１３の標的ＡＲ  ｃＤＮＡ配列に十分に相補的である。特定の実施形態において、単離されたｄｓＲＮＡは、少なくとも２５塩基対の二本鎖領域を有する。１つの実施形態において、単離されたｄｓＲＮＡの第二鎖は、第二鎖の３’末端にて第一鎖の１〜５ヌクレオチド一本鎖オーバーハングを含む。他の実施形態において、第一鎖は長さにして２５〜３５ヌクレオチドである。さらなる実施形態において、第二鎖は長さにして２５〜３５ヌクレオチドである。任意に、第二オリゴヌクレオチド鎖は、第二オリゴヌクレオチド鎖長の多くとも２７ヌクレオチドにそって、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００００４４．２またはＮＭ＿００１０１１６４５．１の標的ＡＲ  ｃＤＮＡ配列に相補的である。
【０００８】
１つの実施形態において、第一オリゴヌクレオチド鎖の３’末端での第一ヌクレオチド（位置１）から開始して、位置１、２および／または３が、改変されたヌクレオチドによって置換される。特定の実施形態において、第一鎖の３’末端の改変されたヌクレオチド残基は、デオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドまたは蛍光分子である。関連した実施形態において、第一オリゴヌクレオチド鎖の３’末端の位置１はデオキシリボヌクレオチドである。
【０００９】
さらなる実施形態において、第一鎖の３’末端と、第二鎖の５’末端は平滑末端を形成する。
【００１０】
他の実施形態において、第一鎖は長さにして２５ヌクレオチドであり、第二鎖は長さにして２７ヌクレオチドである。
【００１１】
１つの実施形態において、第二鎖は、配列番号：１６４、１６６、１７４、１７７、１７９、１９７５、１９８４、１９８６、１９８７、１９９２、１９９４、１９９８、２２４、２０７４、１２８３、２１３６、２４６、２２０４、２２２０、２２２７、２２３０、２２３５および２２３９の配列を含む。
【００１２】
他の実施形態において、第一鎖は、配列番号：１１、１３、２１、２４、２６、１５７０、１５７９、１５８１、１５８２、１５８７、１５８９、１５９３、７１、１６６９、１２２０、１７３１、９３、１７９９、１８１５、１８２２、１８２５、１８３０および１８３４を含む。
【００１３】
さらなる実施形態において、ｄｓＲＮＡは、表２、３、５，７、９および１１のＤｓｉＲＮＡ試薬に関して示したような、第一鎖／第二鎖配列の対を含む。
【００１４】
１つの実施形態において、各第一および第二鎖は、少なくとも２６ヌクレオチドの長さを持つ。
【００１５】
他の実施形態において、３’オーバーハングのヌクレオチドは、改変されたヌクレオチドを含む。任意に、３’オーバーハングの改変されたヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである。関連する実施形態において、３’オーバーハングのすべてのヌクレオチドが、改変されたヌクレオチドである。
【００１６】
さらなる実施形態において、１つまたは両方の第一および第二オリゴヌクレオチド鎖は、５’リン酸を含む。
【００１７】
他の実施形態において、ｄｓＲＮＡの改変されたヌクレオチド残基は、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−ブリッジ、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−ブリッジ、２’−ＬＮＡ、２’−アミノまたは２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）である。
【００１８】
１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡの３’オーバーハングは、長さにして１〜３ヌクレオチドである。任意に３’オーバーハングは、長さにして１〜２ヌクレオチドである。関連する実施形態において、３’オーバーハングは長さにして２ヌクレオチドであり、３’のオーバーハングの改変されたヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル改変リボヌクレオチドである。
【００１９】
さらなる実施形態において、第二オリゴヌクレオチド鎖は、第一オリゴヌクレオチド鎖の５’末端ヌクレオチド残基に対して相補的である第二鎖のヌクレオチド残基から開始して、交互改変および非改変ヌクレオチド残基を含む。他の実施形態において、第二オリゴヌクレオチド鎖は、第一オリゴヌクレオチド鎖の５’末端ヌクレオチド残基に対して相補的である第二鎖のヌクレオチド残基から開始して、第二オリゴヌクレオチド鎖の位置１８から５’末端までの全ての位置で、非改変ヌクレオチドを含む。
【００２０】
他の実施形態において、各第一および第二鎖は、少なくとも２６および多くて３０ヌクレオチドの長さを持つ。
【００２１】
１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒによって細胞内で内因的に開裂される。
【００２２】
さらなる実施形態において、標的遺伝子の発現を減少させるのに十分な単離された二本鎖核酸の量は、細胞の環境において、１ナノモルまたはそれ以下、２００ピコモルまたはそれ以下、１００ピコモルまたはそれ以下、５０ピコモルまたはそれ以下、２０ピコモルまたはそれ以下、１０ピコモルまたはそれ以下、５ピコモルまたはそれ以下、２ピコモルまたはそれ以下、または１ピコモルまたはそれ以下である。
【００２３】
さらなる実施形態において、単離されたｄｓＲＮＡは、哺乳動物細胞内で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて１ナノモルまたはそれ以下、２００ピコモルまたはそれ以下、１００ピコモルまたはそれ以下、５０ピコモルまたはそれ以下、２０ピコモルまたはそれ以下、１０ピコモルまたはそれ以下、５ピコモルまたはそれ以下、２ピコモルまたはそれ以下、または１ピコモルまたはそれ以下の細胞環境中、効果的な濃度にてアッセイされた時に、標的ＡＲ遺伝子発現を減少させることにおいて、標的ＡＲ  ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９のヌクレオチドを指向した、単離された２１ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡよりも大きな強度を持つ。
【００２４】
他の実施形態において、単離されたｄｓＲＮＡは、二本鎖核酸が哺乳動物内に導入された時に、少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも８０〜９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％まで、ＡＲ標的遺伝子発現を減少させるために、標的ＡＲ  ｃＤＮＡ配列に十分相補的である。
【００２５】
さらなる実施形態において、第一および第二鎖は、化学架橋剤によって連結する。関連した実施形態において、第一鎖の３’末端と第二鎖の５’末端が、化学架橋剤によって連結する。
【００２６】
１つの実施形態において、第二または第一鎖のヌクレオチドは、Ｄｉｃｅｒ開裂の方向を指示する、改変されたヌクレオチドで置換される。
【００２７】
他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’、３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）のヌクレオチド一リン酸塩、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）と２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）のヌクレオチド一リン酸塩、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、５−（３−アミノアリル）−ウラシル、２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−アミノリボヌクレオチド、２’−フルオロリボヌクレオチドまたはロックされた核酸である、改変されヌクレオチドを持つ。
【００２８】
さらなる実施形態において、ｄｓＲＮＡはリン酸塩、ホスホロチオエート、またはホスホトリエステルホスフェート骨格改変を持つ。さらなる実施様態において、ｄｓＲＮＡはモルホリノ核酸またはオリゴヌクレオチド、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。
【００２９】
１つの実施形態において、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて哺乳動物細胞を、細胞内で標的ＡＲ遺伝子の発現を減少させるのに十分な量で、記述したような単離されたｄｓＲＮＡと接触させることを含む、哺乳動物における標的ＡＲ遺伝子の発現を減少させるための方法を提供する。
【００３０】
１つの実施形態において、標的ＡＲ遺伝子発現は、すくなくとも１０％、少なくとも５０％または少なくとも８０〜９０％まで減少する。他の実施形態において、標的ＡＲ  ｍＲＮＡレベルは、細胞がｄｓＲＮＡに接触してから少なくとも８日後に、少なくとも９０％減少する。さらなる実施形態において、ＡＲ  ｍＲＮＡレベルは、細胞がｄｓＲＮＡに接触してから少なくとも１０日後に、少なくとも７０％減少する。
【００３１】
さらなる実施形態において、本発明は、記述したような単離されたｄｓＲＮＡを、哺乳動物中の標的ＡＲ遺伝子の発現を減少させるのに十分な量で、哺乳動物に投与することによって、哺乳動物中の標的ＡＲ遺伝子の発現を減少させるための方法を提供する。
【００３２】
１つの実施形態において、単離されたｄｓＲＮＡは、１マイクログラム〜５ミリグラム／哺乳動物キログラム／日、１００マイクログラム〜０．５ミリグラム／キログラム、０．００１〜０．２５ミリグラム／キログラム、０．０１〜２０マイクログラム／キログラム、０．０１〜１０マイクログラム／キログラム、０．１０〜５マイクログラム／キログラム、または０．１〜２．５マイクログラム／キログラムの投与量で投与される。
【００３３】
他の実施形態において、単離されたｄｓＲＮＡは、１ナノモルまたはそれ以下の細胞の環境下効果的な濃度で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて哺乳動物細胞内でアッセイした時に、標的ＡＲ遺伝子発現を減少させることにおいて、標的ＡＲ  ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９ヌクレオチドを指向した、単離された２１マーｓｉＲＮＡよりも大きな強度を有する。
【００３４】
さらなる実施形態において、投与段階には、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、点滴、皮下注射、経皮、エアゾル、腸、膣、局所、経口または吸入伝達が含まれる。
【００３５】
さらなる実施形態において、本発明は、細胞の増殖を阻害するのに十分な量で、細胞を記述したような単離ｄｓＲＮＡと接触させることによって、細胞の増殖を選択的に阻害するための方法を提供する。
【００３６】
１つの実施形態において、細胞は対象の腫瘍細胞である。任意に、細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞、例えば前立腺癌細胞（例えば２２Ｒｖ１またはＶＣａＰ）または腺癌細胞（例えばＡ５４９）または他の癌細胞である。特定の実施形態において、細胞は哺乳動物の前立腺細胞である。関連する実施形態において、細胞はヒト細胞である。
【００３７】
さらなる実施形態において、本発明は、記述したような単離されたｄｓＲＮＡを含む処方を提供し、そこで、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡがｉｎ  ｖｉｔｒｏにて哺乳動物に導入された時に、少なくとも１０％、少なくとも５０％または少なくとも８０〜９０％まで、標的ＡＲ  ＲＮＡレベルを減少させるために効果的な量で存在し、ｄｓＲＮＡは、１ナノモルまたはそれ以下の細胞の環境下、効果的な濃度で、哺乳動物細胞内でｉｎ  ｖｉｔｒｏにてアッセイした時に、標的ＡＲ  ＲＮＡレベルを減少することにおいて、標的ＡＲ  ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９ヌクレオチドを指向した、単離された２１マーｓｉＲＮＡよりも大きな強度を有する。
【００３８】
１つの実施形態において、効果的な量は、細胞の環境中、１ナノモルまたはそれ以下、２００ピコモルまたはそれ以下、１００ピコモルまたはそれ以下、５０ピコモルまたはそれ以下、２０ピコモルまたはそれ以下、１０ピコモルまたはそれ以下、５ピコモルまたはそれ以下、２ピコモルまたはそれ以下、または１ピコモルまたはそれ以下である。
【００３９】
他の実施形態において、本発明は、記述したような単離されたｄｓＲＮＡを含む処方を提供し、そこでｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡが哺乳動物対象の細胞内に導入された時に、少なくとも１０％、少なくとも５０％または少なくとも８０〜９０％まで、標的ＲＮＡを減少させる効果的な量で存在し、ｄｓＲＮＡは１ナノモルまたはそれ以下の細胞の環境下での効果的な濃度で、哺乳動物細胞内でｉｎ  ｖｉｔｒｏにてアッセイした時に、標的ＡＲ  ＲＮＡレベルを減少させることにおいて、標的ＡＲ  ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９ヌクレオチドを指向した、単離された２１マーｓｉＲＮＡよりも大きな強度を有する。
【００４０】
１つの実施形態において、効果的な量は、１マイクログラム〜５ミリグラム／哺乳動物キログラム／日、１００マイクログラム〜０．５ミリグラム／キログラム、０．００１〜０．２５ミリグラム／キログラム、０．０１〜２０マイクログラム／キログラム、０．０１〜１０マイクログラム／キログラム、０．１０〜５マイクログラム／キログラム、または０．１〜２．５マイクログラム／キログラムの投与量である。
【００４１】
さらなる実施形態において、本発明は、記述したような単離されたｄｓＲＮＡを含む哺乳動物細胞を提供する。
【００４２】
本発明の他の実施形態は、記述したような単離されたｄｓＲＮＡと、薬理学的に許容可能な担体を含む薬理学的組成物を提供する。本発明のさらなる実施形態は、記述したような単離されたｄｓＲＮＡと、その利用のための説明書を含むキットを提供する。
【００４３】
さらなる様態において、本発明は、第一および第二核酸鎖を含む、単離された二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）から本質的になる、ＡＲ阻害活性を有する組成物を提供し、そこで第一鎖は長さにして１５〜３５ヌクレオチドであり、第二鎖は長さにして１９〜３５ヌクレオチドであり、第二オリゴヌクレオチド鎖は、二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入された時に、ＡＲ標的遺伝子発現を減少させるために、第二オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９ヌクレオチドにそって、表１３の標的ＡＲ  ｃＤＮＡ配列に十分に相補的である。
【００４４】
他の実施形態において、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡおよび／またはｄｓＲＮＡ含有組成物と薬理学的担体を、対象中のＡＲ関連疾患または障害を治療するため、または予防するために十分な量で、対象に投与することによって、対象中のＡＲ関連疾患または障害を治療するまたは予防するための方法を提供する。関連する実施形態において、ＡＲ関連疾患または障害は、前立腺癌または腺癌である。
【００４５】
他の様態において、本発明は、第一および第二核酸鎖を含む、単離された二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を提供し、そこでｄｓＲＮＡは平滑末端を含み、各第一および第二オリゴヌクレオチド鎖は、同数のヌクレオチド残基からなり、長さにして多くて３５ヌクレオチドであり、第二オリゴヌクレオチド鎖は、二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入された時に、ＡＲ標的遺伝子発現を減少させるために、第二オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９ヌクレオチドにそって、表１３の標的ＡＲ  ｃＤＮＡ配列に十分に相補的である。
【００４６】
１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、細胞の環境において、１ナノモル以下の濃度で、標的遺伝子発現を減少可能である。他の実施形態において、各第一および第二鎖は、少なくとも２６ヌクレオチドである長さを持つ。関連した実施形態において，各第一および第二鎖は、２６〜３０ヌクレオチドである長さを持つ。任意に各第一および第二鎖は、２７ヌクレオチドである長さを持つ。
【００４７】
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡの第二鎖は、配列番号：１６４、１６６、１７４、１７７、１７９、１９７５、１９８４、１９８６、１９８７、１９９２、１９９４、１９９８、２２４、２０７４、１２８３、２１３６、２４６、２２０４、２２２０、２２２７、２２３０、２２３５および２２３９から選択される配列を含む。関連した実施形態において、ｄｓＲＮＡの第一鎖は、配列番号：４５１７、４５１９、４５２７、４５３０、４５３２、４８７６、４８８５、４８８７、４８８８、４８９３、４８９５、４８９９、４５７７、４９７５、４７７８、５０３７、４５９９、５１０５、５１２１、５１２８、５１３１、５１３６および５１４０から選択される配列を含む。さらなる実施形態において、ｄｓＤＮＡは、表２、３、５、７、９および１１から選択される、第一鎖と相当する第二鎖の組を含む。
【００４８】
本発明の他の様態は、第一および第二核酸鎖を含む単離された二本鎖リボ核酸（ｓｄＲＮＡ）を提供し、そこでｄｓＲＮＡは平滑末端を含み、第一および第二オリゴヌクレオチド鎖それぞれは、同数のヌクレオチド残基からなり、長さにして多くて３５ヌクレオチドであり、第一鎖の３’末端の最後および最後から二番目の残基と、第二鎖の前記５’末端の最後および最後から二番目の残基が、１つまたは２つのミスマッチに基づく対を形成し、第二オリゴヌクレオチド鎖は、二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入された時に、ＡＲ標的遺伝子発現を減少させるために、第二オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９ヌクレオチドにそって、表１３の標的ＡＲ  ｃＤＮＡ配列に十分に相補的である。
【００４９】
１つの実施形態において、第一鎖は、配列番号：３７９４、３７９６、３８０４、３８０７、３８０９、４１５３、４１６２、４１６４、４１６５、４１７０、４１７２、４１７６、３８５４、４２５２、４０５５、４３１４、３８７６、４３８２、４３９８、４４０５、４４０８、４４１３および４４１７の配列を含む。
【００５０】
さらなる様態において、本発明は、第一および第二核酸鎖を含む、単離された二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）から本質的になる、ＡＲ阻害活性を有する組成物を提供し、前記ｄｓＲＮＡは平滑末端を含み、第一および第二オリゴヌクレオチドそれぞれは、同数のヌクレオチド残基からなり、長さにして多くて３５ヌクレオチドであり、第二オリゴヌクレオチド鎖は、二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入された時に、ＡＲ標的遺伝子発現を減少させるために、第二オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９ヌクレオチドにそって、表１３の標的ＡＲ  ｃＤＮＡ配列に十分に相補的である。
【００５１】
他の様態において、本発明は、センス領域およびアンチセンス領域からなる単離されたｄｓＲＮＡ分子を提供し、そこでセンス領域およびアンチセンス領域は一緒に、１５〜３５塩基対からなる二本鎖領域を形成し、アンチセンス領域は、表１３の配列の相補的体である配列を含み、単離されたｄｓＲＮＡはさらに、各オーバーハング領域が、長さにして６またはそれ以下のヌクレオチドである、０〜２の３’オーバーハング領域を含む。任意に、二本鎖領域は、１９〜３５塩基対からなる。特定の実施形態において、二本鎖領域は、２５〜３０塩基対からなる。さらなる実施形態において、二本鎖領域は２５〜３０塩基対からなる。
【００５２】
さらなる様態において、本発明は、センス領域およびアンチセンス領域からなるｓｉＲＮＡ分子を提供し、そこでセンス領域およびアンチセンス領域は一緒に、１９〜２３塩基対からなる二本鎖領域を形成し、アンチセンス領域は、表１３の配列の相補体である配列を含み、単離されたｄｓＲＮＡはさらに、各オーバーハング領域が、長さにして６またはそれ以下のヌクレオチドである、０〜４のオーバーハング領域を含む。
【００５３】
特定の様態において、本発明は、効果的かつ非常に強力なＡＲ阻害剤試薬として働き、任意に延長された阻害効果期間を有する、構造および改変パターンを持つ、Ｄｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡｓ（「ＤｓｉＲＮＡｓ」）を指向する。多数のそのようなＤｓｉＲＮＡｓは、同一の標的ＲＮＡに指向した１９〜２３塩基対二本鎖核酸（例えば２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡｓ）に対して有意に増強された、標的特異的な阻害強度と有効性を有する。特定のそのような実施形態において、そのようなＤｓｉＲＮＡは、１ｎＭまたはそれ以下の濃度で好適に処方された時に、その中に含まれる１９、２０、２１、２２または２３塩基対配列よりも、哺乳動物細胞内のＡＲ標的遺伝子発現を減少させる際により強力である。
【００５４】
さらなる様態において、本発明は、第一および第二核酸鎖と、少なくとも２５塩基対の二本鎖領域を含む単離された二本鎖リボヌ核酸（ｄｓＲＮＡ）を提供し、そこで第一鎖は長さにして２５〜３４ヌクレオチドであり、第二鎖は長さにして２６〜３５ヌクレオチドであり、かつその３’末端にて１〜５の一本鎖ヌクレオチドを含み、そこで第二オリゴヌクレオチド鎖は、二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入された時に、ＡＲ標的遺伝子発現を減少させるために第二オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１５ヌクレオチドにそって、配列番号：３０７〜４５９、８２６〜９１５、１０２４〜１０７７、１３１２〜１３７４、２３１１〜２７１５または３６２２〜３６６９の標的ＡＲ  ｃＤＮＡ配列に十分に相補的である。任意に、第二オリゴヌクレオチド鎖は、第二オリゴヌクレオチド鎖長さの多くて２７ヌクレオチドにそって、配列番号：３７６６、３７６８または３７７０の標的ＡＲ  ｃＤＮＡ配列に相補的である。
【００５５】
１つの実施形態において、第一オリゴヌクレオチド鎖の３’末端での第一ヌクレオチド（位置１）から開始して、位置１、２および／または３が、改変されたヌクレオチドによって置換される。特定の実施形態において、第一鎖の３’末端の改変されたヌクレオチド残基は、デオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドまたは蛍光分子である。関連した実施形態において、第一オリゴヌクレオチド鎖の３’末端の位置１はデオキシリボヌクレオチドである。
【００５６】
さらなる実施形態において、第一鎖の３’末端と、第二鎖の５’末端は平滑末端を形成する。
【００５７】
他の実施形態において、第一鎖は長さにして２５ヌクレオチドであり、第二鎖は長さにして２７ヌクレオチドである。
【００５８】
１つの実施形態において、第二鎖は、配列番号：１５４〜３０６、７９６〜８２５、９７０〜１０２３、１２４９〜１３１１、１９０６〜２３１０および３５７４〜３６２１の配列を含む。
【００５９】
他の実施形態において、第一鎖は、配列番号：１〜１５３、７６６〜７９５、９１６〜９６９、１１８６〜１２４８、１５０１〜１９０５および３５２６〜３５７３の配列を含む。
【００６０】
さらなる実施形態において、ｄｓＲＮＡは、表９のＤｓｉＲＮＡ試薬に関して示したような、第一鎖／第二鎖配列の対を含む。
【００６１】
１つの実施形態において、各第一および第二鎖は、少なくとも２６ヌクレオチドの長さを持つ。
【００６２】
他の実施形態において、３’オーバーハングのヌクレオチドは、改変されたヌクレオチドを含む。任意に、３’オーバーハングの改変されたヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである。関連する実施形態において、３’オーバーハングのすべてのヌクレオチドが、改変されたヌクレオチドである。
【００６３】
さらなる実施形態において、１つまたは両方の第一および第二オリゴヌクレオチド鎖は、５’リン酸を含む。
【００６４】
他の実施形態において、ｄｓＲＮＡの改変されたヌクレオチド残基は、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−ブリッジ、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−ブリッジ、２’−ＬＮＡ、２’−アミノまたは２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）である。
【００６５】
１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡの３’オーバーハングは、長さにして１〜３ヌクレオチドである。任意に３’オーバーハングは、長さにして１〜２ヌクレオチドである。関連する実施形態において、３’オーバーハングは長さにして２ヌクレオチドであり、３’のオーバーハングの改変されたヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル改変リボヌクレオチドである。
【００６６】
さらなる実施形態において、第二オリゴヌクレオチド鎖は、第一オリゴヌクレオチド鎖の５’末端ヌクレオチド残基に対して相補的である第二鎖のヌクレオチド残基から開始して、交互改変および非改変ヌクレオチド残基を含む。他の実施形態において、第二オリゴヌクレオチド鎖は、第一オリゴヌクレオチド鎖の５’末端ヌクレオチド残基に対して相補的である第二鎖のヌクレオチド残基から開始して、第二オリゴヌクレオチド鎖の位置１８から５’末端までの全ての位置で、非改変ヌクレオチドを含む。
【００６７】
他の実施形態において、各第一および第二鎖は、少なくとも２６および多くて３０ヌクレオチドの長さを持つ。
【００６８】
１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒによって細胞内で内因的に開裂される。
【００６９】
さらなる実施形態において、標的遺伝子の発現を減少させるのに十分な単離された二本鎖核酸の量は、細胞の環境において、１ナノモルまたはそれ以下、２００ピコモルまたはそれ以下、１００ピコモルまたはそれ以下、５０ピコモルまたはそれ以下、２０ピコモルまたはそれ以下、１０ピコモルまたはそれ以下、５ピコモルまたはそれ以下、２ピコモルまたはそれ以下、または１ピコモルまたはそれ以下である。
【００７０】
さらなる実施形態において、単離されたｄｓＲＮＡは、哺乳動物細胞内で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて１ナノモルまたはそれ以下、２００ピコモルまたはそれ以下、１００ピコモルまたはそれ以下、５０ピコモルまたはそれ以下、２０ピコモルまたはそれ以下、１０ピコモルまたはそれ以下、５ピコモルまたはそれ以下、２ピコモルまたはそれ以下、または１ピコモルまたはそれ以下の細胞環境中、効果的な濃度にてアッセイされた時に、標的ＡＲ遺伝子発現を減少させることにおいて、標的ＡＲ  ｃＤＮＡの同一の少なくとも１５のヌクレオチドを指向した、単離された２１マーｓｉＲＮＡよりも大きな強度を有する。
【００７１】
他の実施形態において、単離されたｄｓＲＮＡは、二本鎖核酸が哺乳動物内に導入された時に、少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも８０〜９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％まで、ＡＲ標的遺伝子発現を減少させるために、標的ＡＲ  ｃＤＮＡ配列に十分相補的である。
【００７２】
さらなる実施形態において、第一および第二鎖は、化学架橋剤によって連結する。関連した実施形態において、第一鎖の３’末端と第二鎖の５’末端が、化学架橋剤によって連結する。
【００７３】
１つの実施形態において、第二または第一鎖のヌクレオチドは、Ｄｉｃｅｒ開裂の方向を指示する、改変されたヌクレオチドで置換される。
【００７４】
他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’、３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）のヌクレオチド一リン酸塩、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）と２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）のヌクレオチド一リン酸塩、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、５−（３−アミノアリル）−ウラシル、２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−アミノリボヌクレオチド、２’−フルオロリボヌクレオチドまたはロックされた核酸である、改変されヌクレオチドを含む。
【００７５】
さらなる実施形態において、ｄｓＲＮＡはリン酸塩、ホスホロチオエート、またはホスホトリエステルホスフェート骨格改変を持つ。
【００７６】
１つの実施形態において、本発明は、細胞内の標的ＡＲ遺伝子の発現を減少させるのに十分な量で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて哺乳動物細胞を、記述されたような単離ｄｓＲＮＡと接触させることを含む、哺乳動物細胞内の標的ＡＲ遺伝子の発現を減少させるための方法を提供する。
【００７７】
１つの実施形態において、標的ＡＲ遺伝子発現は、少なくとも１０％、少なくとも５０％、または少なくとも８０〜９０％まで減少する。他の実施形態において、標的ＡＲ  ｍＲＮＡレベルは、細胞をｄｓＲＮＡと接触させた少なくとも８日後に、少なくとも９０％減少する。さらなる実施形態において、ＡＲ  ｍＲＮＡレベルは、細胞をｄｓＲＮＡと接触させた少なくとも１０日後に、少なくとも７０％まで減少する。
【００７８】
さらなる実施形態において、本発明は、哺乳動物中の標的ＡＲ遺伝子の発現を減少させるために十分な量で、哺乳動物に対して、記述したような単離したｄｓＲＮＡを投与することによって、哺乳動物中の標的ＡＲ遺伝子の発現を減少させるための方法を提供する。
【００７９】
１つの実施形態において、単離したｄｓＲＮＡを、１マイクログラム〜５ミリグラム／哺乳動物キログラム／日、１００マイクログラム〜０．５ミリグラム／キログラム、０．００１〜０．２５ミリグラム／キログラム、０．０１〜２０マイクログラム／キログラム、０．０１〜１０マイクログラム／キログラム、０．１０〜５マイクログラム／キログラム、または０．１〜２．５マイクログラム／キログラムの投与量で投与する。
【００８０】
他の実施形態において、単離ｄｓＲＮＡは、１ナノモルまたはそれ以下の細胞の環境下での効果的な濃度で、哺乳動物細胞内でｉｎ  ｖｉｔｒｏにてアッセイした時に、標的ＡＲ遺伝子発現を減少させることにおいて、標的ＡＲ  ｃＤＮＡの同一の少なくとも１５ヌクレオチドを指向した、単離された２１マーｓｉＲＮＡよりも大きな強度を有する。
【００８１】
さらなる実施形態において、投与段階には、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、点滴、皮下注射、経皮、エアゾル、腸、膣、局所、経口または吸入伝達が含まれる。
【００８２】
さらなる実施形態において、本発明は、細胞の増殖を阻害するのに十分な量で、細胞を記述したような単離ｄｓＲＮＡの量と接触させることによって、細胞の増殖を選択的に阻害するための方法を提供する。
【００８３】
１つの実施形態において、細胞は対象の腫瘍細胞である。任意に、細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞である。関連する実施形態において、細胞はヒト細胞である。
【００８４】
さらなる実施形態において、本発明は、記述したような単離されたｄｓＲＮＡを含む処方を提供し、そこで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて哺乳動物に導入された時に、ｄｓＲＮＡは、少なくとも１０％、少なくとも５０％または少なくとも８０〜９０％まで、標的ＡＲ  ＲＮＡレベルを減少させるのに効果的な量で存在し、ｓｄＲＮＡは１ナノモルまたはそれ以下の細胞の環境下での効果的な濃度で、哺乳動物細胞内でｉｎ  ｖｉｔｒｏにてアッセイした時に、標的ＡＲ  ＲＮＡレベルを減少させることにおいて、標的ＡＲ  ｃＤＮＡの同一の少なくとも１５ヌクレオチドを指向した、単離された２１マーｓｉＲＮＡｓよりも大きな強度を有する。
【００８５】
１つの実施形態において、効果的な量は、細胞の環境中、１ナノモルまたはそれ以下、２００ピコモルまたはそれ以下、１００ピコモルまたはそれ以下、５０ピコモルまたはそれ以下、２０ピコモルまたはそれ以下、１０ピコモルまたはそれ以下、５ピコモルまたはそれ以下、２ピコモルまたはそれ以下、または１ピコモルまたはそれ以下である。
【００８６】
他の実施形態において、本発明は、記述したような単離されたｄｓＲＮＡを含む処方を提供し、そこでｄｓＲＮＡは、哺乳動物対象の細胞内に導入された時に、ｄｓＲＮＡが少なくとも１０％、少なくとも５０％または少なくとも８０〜９０％まで、標的ＲＮＡレベルを減少させる効果的な量で存在し、ｄｓＲＮＡは１ナノモルまたはそれ以下の細胞の環境下での効果的な濃度で、哺乳動物細胞内でｉｎ  ｖｉｔｒｏにてアッセイした時に、標的ＡＲ  ＲＮＡレベルを減少させることにおいて、標的ＡＲ  ｃＤＮＡの同一の少なくとも１５ヌクレオチドを指向した、単離された２１マーｓｉＲＮＡよりも大きな強度を有する。
【００８７】
１つの実施形態において、効果的な量は、１マイクログラム〜５ミリグラム／哺乳動物キログラム／日、１００マイクログラム〜０．５ミリグラム／キログラム、０．００１〜０．２５ミリグラム／キログラム、０．０１〜２０マイクログラム／キログラム、０．０１〜１０マイクログラム／キログラム、０．１０〜５マイクログラム／キログラム、または０．１〜２．５マイクログラム／キログラムの投与量である。
【００８８】
さらなる実施形態において、本発明は、記述したような単離されたｄｓＲＮＡを含む哺乳動物細胞を提供する。
【００８９】
本発明の他の実施形態は、記述したような単離されたｄｓＲＮＡと、薬理学的に許容可能な担体を含む薬理学的組成物を提供する。本発明のさらなる実施形態は、記述したような単離されたｄｓＲＮＡと、その利用のための説明書を含むキットを提供する。
【００９０】
さらなる様態において、本発明は、第一および第二核酸鎖と、少なくとも２５塩基対の二本鎖領域を含む、単離された二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）から本質的になる、ＡＲ阻害活性を有する組成物を提供し、そこで第一鎖は長さにして２５〜３４ヌクレオチドであり、第二鎖は長さにして２６〜３５ヌクレオチドであり、その３’末端にて１〜５の一本鎖ヌクレオチドを含み、第二オリゴヌクレオチド鎖は、二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入された時に、ＡＲ標的遺伝子発現を減少させるために、第二オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１５ヌクレオチドにそって、配列番号：３０７〜４５９、８２６〜９１５、１０２４〜１０７７、１３１２〜１３７４、２３１１〜２７１５または３６２２〜３６６９の標的ＡＲ  ｃＤＮＡに十分相補的である。
【００９１】
他の実施形態において、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡおよび／またはｄｓＲＮＡ含有組成物と薬理学的担体を、対象中のＡＲ−関連疾患または疾病を治療するため、または予防するために十分な量で、対象に投与することによって、対象中のＡＲ−関連疾患または疾病を治療するまたは予防するための方法を提供する。関連する実施形態において、ＡＲ−関連疾患または疾病は、前立腺癌である。
【００９２】
他の様態において、本発明は、第一および第二核酸と、少なくとも２５塩基対の二本鎖領域を含む、単離された二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を提供し、そこで、ｄｓＲＮＡは平滑末端を含み、各第一および第二オリゴヌクレオチド鎖は、同数のヌクレオチド残基からなり、長さにして多くて３５ヌクレオチドであり、そこで第二オリゴヌクレオチドは、二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入された時に、ＡＲ標的遺伝子発現を減少させるために、第二オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１５ヌクレオチドにそって、配列番号：３０７〜４５９、８２６〜９１５、１０２４〜１０７７、１３１２〜１３７４、２３１１〜２７１５または３６２２〜３６６９の標的ＡＲ  ｃＤＮＡ配列に十分に相補的である。
【００９３】
１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、細胞の環境下、１ナノモル以下の濃度で、標的遺伝子発現を減少可能である。他の実施形態において、各第一および第二鎖は、少なくとも２６ヌクレオチドである長さを持つ。関連実施形態において、各第一および第二鎖は、２６〜３０ヌクレオチドの長さを持つ。任意に、各第一および第二鎖は、２７ヌクレオチドである長さを持つ。
【００９４】
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡの第二鎖には、配列番号：１５４〜３０６、７９６〜８２５、９７０〜１０２３、１２４９〜１３１１、１９０６〜２３１０および３５７４〜３６２１から選択された配列が含まれる（任意に、第二鎖は、配列番号：１５４〜３０６、７９６〜８２５、９７０〜１０２３、１２４９〜１３１１、１９０６〜２３１０および３５７４〜３６２１から選択される配列である）。関連実施形態において、ｄｓＲＮＡの第一鎖には、配列番号：３７８４〜５２２９から選択された配列が含まれる（任意に、第一鎖は、配列番号：３７８４〜５２２９から選択された配列である）。さらなる実施形態において、ｄｓＲＮＡは、表５〜８から選択された、第一鎖と相当する第二鎖の組を含む。
【００９５】
本発明の他の様態は、第一および第二核酸と、少なくとも２５塩基対の二本鎖領域を含む、単離された二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を提供し、そこで、ｄｓＲＮＡは平滑末端を含み、各第一および第二オリゴヌクレオチド鎖は、同数のヌクレオチド残基からなり、長さにして多くて３５ヌクレオチドであり、第一鎖の３’末端の最後および最後から二番目の残基と、第二鎖の５’末端の最後および最後から二番目の残基が、１つまたは２つのミスマッチに基づく対を形成し、第二オリゴヌクレオチドは、二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入された時に、ＡＲ標的遺伝子発現を減少させるために、第二オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１５ヌクレオチドにそって、配列番号：３０７〜４５９、８２６〜９１５、１０２４〜１０７７、１３１２〜１３７４、２３１１〜２７１５または３６２２〜３６６９の標的ＡＲ  ｃＤＮＡ配列に十分相補的である。
【００９６】
１つの実施形態において、第一鎖は、配列番号：３７８４〜４５０６の配列を含む。
【００９７】
さらなる様態において、本発明は、第一および第二核酸鎖と、少なくとも２５塩基対の二本鎖領域を含む単離された二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）から本質的になるＡＲ阻害活性を有する組成物を提供し、そこで前記ｄｓＲＮＡは平滑末端を含み、第一および第二オリゴヌクレオチド鎖それぞれは、同数のヌクレオチド残基からなり、長さにして多くて３５ヌクレオチドであり、第二オリゴヌクレオチドは、二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入された時に、ＡＲ標的遺伝子発現を減少させるために、第二オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１５ヌクレオチドにそって、配列番号：３０７〜４５９、８２６〜９１５、１０２４〜１０７７、１３１２〜１３７４、２３１１〜２７１５または３６２２〜３６６９の標的ＡＲ  ｃＤＮＡ配列に十分相補的である。
【００９８】
他の様態において、本発明は、センス領域およびアンチセンス領域からなる単離されたｄｓＲＮＡ分子を提供し、そこでセンス領域およびアンチセンス領域は一緒に、１９〜３５塩基対からなる二本鎖領域を形成し、アンチセンス領域は、配列番号：６１３〜７６５、８８６〜９１５、１１３２〜１１８５、１４３８〜１５００または３１２１〜３７６５の相補体である配列を含み、単離されたｄｓＲＮＡはさらに、各オーバーハング領域が、長さにして６またはそれ以下のヌクレオチドである、０〜２の３’オーバーハング領域を含む。任意に、二本鎖領域は、２５〜３５塩基対からなる。
【００９９】
さらなる様態において、本発明は、センス領域およびアンチセンス領域からなるｓｉＲＮＡ分子を提供し、そこでセンス領域およびアンチセンス領域は一緒に、１９〜２３塩基対からなる二本鎖領域を形成し、アンチセンス領域は、配列番号：６１３〜７６５、８８６〜９１５、１１３２〜１１８５、１４３８〜１５００または３１２１〜３７６５の配列の相補体である配列を含み、単離されたｄｓＲＮＡはさらに、各オーバーハング領域が、長さにして６またはそれ以下のヌクレオチドである、０〜４のオーバーハング領域を含む。
【０１００】
本発明は、形質、疾患および疾病の維持または発達を仲介する、ＡＲ遺伝子発現経路または他の細胞性工程に関与する遺伝子の発現および／または活性の調節に応答する、形質、疾患および疾病に関連している化合物、組成物および方法も指向する。とりわけ、本発明は、ＡＲ遺伝子発現に対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を仲介可能なＤｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡｓ（ＤｓｉＲＮＡｓ）のような、Ｄｉｃｅｒ酵素によって処理されうる小核酸分子に関する。そのような抗ＡＲ  ＤｓｉＲＮＡｓは、例えば、癌および／または他の増殖性疾患、疾病または状態のような、対象中のＡＲの調節に応答可能な形質、疾患および疾病の治療のための組成物を提供することにおいて、有用である。抗ＡＲ  ＤｓｉＲＮＡの有効性、強度、毒性および他の効果を、増殖性疾患の１つまたはそれ以上の動物モデルで試験可能である（増殖性疾患の典型的な好適な動物モデルを以下に列記している）。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】図１は、「ＡＲ−７７０」標的部位として本明細書を引用した、ＡＲ  ＲＮＡ中の部位を標的としている例示ＤｓｉＲＮＡ試薬の構造を示している。上部ケース＝未改変ＲＮＡ、下部ケース＝ＤＮＡ、太字＝ミスマッチ塩基対ヌクレオチド、矢頭は、予想されたＤｉｃｅｒ酵素開裂部位を示唆している。点線は、標的化ＡＲ配列内の予想されたＡｒｇｏｎａｕｔｅ２（Ａｇｏ２）開裂部位に相当するセンス鎖（トップ鎖）配列を示唆している。
【図２】図２は、示唆したＤｓｉＲＮＡに対して観察されたヒトＡＲ阻害効果のヒストグラムである。「Ｐ１」は相１を示し、「Ｐ２」は相２を示す。相１において、ＤｓｉＲＮＡを、２２Ｒｖ１細胞の環境中１ｎＭで試験した。相２において、ＤｓｉＲＮＡを、２２Ｒｖ１細胞の環境中、１ｎＭ、０．３ｎＭおよび０．１ｎＭにて試験した。個々のバーは、三重に観察された平均ヒトＡＲレベルを表し、標準誤差とともに示している。ヒトＡＲレベルをＨＰＲＴおよびＳＦＲＳ９レベルに対して標準化した。
【図３】図３は、示唆したＤｓｉＲＮＡに対して観察されたヒトＡＲ阻害効果のヒストグラムである。「Ｐ１」は相１を示し、「Ｐ２」は相２を示す。相１において、ＤｓｉＲＮＡを、２２Ｒｖ１細胞の環境中１ｎＭで試験した。相２において、ＤｓｉＲＮＡを、２２Ｒｖ１細胞の環境中、１ｎＭ、０．３ｎＭおよび０．１ｎＭにて試験した。個々のバーは、三重に観察された平均ヒトＡＲレベルを表し、標準誤差とともに示している。ヒトＡＲレベルをＨＰＲＴおよびＳＦＲＳ９レベルに対して標準化した。
【図４】図４は、示唆したＤｓｉＲＮＡに対して観察されたマウスＡＲ阻害効果のヒストグラムを示している。「Ｐ１」は相１を示し、「Ｐ２」は相２を示す。相１において、ＤｓｉＲＮＡを、ＬＭＴＫ−細胞の環境中１ｎＭで試験した。相２において、ＤｓｉＲＮＡを、ＬＭＴＫ−細胞の環境中、１ｎＭ、０．３ｎＭおよび０．１ｎＭにて試験した。個々のバーは、三重に観察された平均マウスＡＲレベルを表し、標準誤差とともに示している。マウスＡＲレベルをＨＰＲＴおよびＲｐｌ２３レベルに対して標準化した。
【図５】図５は、示唆したＤｓｉＲＮＡに対して観察されたマウスＡＲ阻害効果のヒストグラムを示している。「Ｐ１」は相１を示し、「Ｐ２」は相２を示す。相１において、ＤｓｉＲＮＡを、ＬＭＴＫ−細胞の環境中１ｎＭで試験した。相２において、ＤｓｉＲＮＡを、ＬＭＴＫ−細胞の環境中、１ｎＭ、０．３ｎＭおよび０．１ｎＭにて試験した。個々のバーは、三重に観察された平均マウスＡＲレベルを表し、標準誤差とともに示している。マウスＡＲレベルをＨＰＲＴおよびＲｐｌ２３レベルに対して標準化した。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、ＤｓｉＲＮＡ−仲介ＡＲタンパク質ノックダウンが、ＡＲ転写産物内の標的化ＡＲ部位の局所と相関したことを示している。図６Ａは、ＡＲ転写産物の長いおよび短い形態両方に相当するタンパク質が、ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡ  ＡＲ−２２２４およびＡＲ−２２１３によって投与から２４時間後および４８時間後において効果的にノックダウンされ、一方でＡＲ転写産物の長い形態に相当するタンパク質のみが、ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡ  ＡＲ−３５１８およびＡＲ−３２４２によって効果的にノックダウンされたことを示している。図６Ｂは、２２Ｒｖ１細胞中に発現したＡＲ  ｍＲＮＡ中のＤｓｉＲＮＡ  標的位置を描写している。
【図７−１】図７−１は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭにて、それぞれヒトＡ５４９中の３２ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡｓにわたり、６つの異なる改変パターンに関する効果データを示している棒グラフを表している。
【図７−２】図７−２は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭにて、それぞれヒトＡ５４９中の３２ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡｓにわたり、６つの異なる改変パターンに関する効果データを示している棒グラフを表している。
【図７−３】図７−３は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭにて、それぞれヒトＡ５４９中の３２ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡｓにわたり、６つの異なる改変パターンに関する効果データを示している棒グラフを表している。
【図７−４】図７−４は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭにて、それぞれヒトＡ５４９中の３２ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡｓにわたり、６つの異なる改変パターンに関する効果データを示している棒グラフを表している。
【図７−５】図７−５は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭにて、それぞれヒトＡ５４９中の３２ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡｓにわたり、６つの異なる改変パターンに関する効果データを示している棒グラフを表している。
【図７−６】図７−６は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭにて、それぞれヒトＡ５４９中の３２ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡｓにわたり、６つの異なる改変パターンに関する効果データを示している棒グラフを表している。
【図７−７】図７−７は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭにて、それぞれヒトＡ５４９中の３２ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡｓにわたり、６つの異なる改変パターンに関する効果データを示している棒グラフを表している。
【図７−８】図７−８は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭにて、それぞれヒトＡ５４９中の３２ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡｓにわたり、６つの異なる改変パターンに関する効果データを示している棒グラフを表している。
【図７−９】図７−９は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭにて、それぞれヒトＡ５４９中の３２ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡｓにわたり、６つの異なる改変パターンに関する効果データを示している棒グラフを表している。
【図７−１０】図７−１０は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭにて、それぞれヒトＡ５４９中の３２ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡｓにわたり、６つの異なる改変パターンに関する効果データを示している棒グラフを表している。
【図７−１１】図７−１１は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭにて、それぞれヒトＡ５４９中の３２ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡｓにわたり、６つの異なる改変パターンに関する効果データを示している棒グラフを表している。
【図７−１２】図７−１２は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭにて、それぞれヒトＡ５４９中の３２ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡｓにわたり、６つの異なる改変パターンに関する効果データを示している棒グラフを表している。
【図７−１３】図７−１３は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭにて、それぞれヒトＡ５４９中の３２ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡｓにわたり、６つの異なる改変パターンに関する効果データを示している棒グラフを表している。
【図７−１４】図７−１４は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭにて、それぞれヒトＡ５４９中の３２ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡｓにわたり、６つの異なる改変パターンに関する効果データを示している棒グラフを表している。
【図７−１５】図７−１５は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭにて、それぞれヒトＡ５４９中の３２ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡｓにわたり、６つの異なる改変パターンに関する効果データを示している棒グラフを表している。
【図７−１６】図７−１６は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭにて、それぞれヒトＡ５４９中の３２ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡｓにわたり、６つの異なる改変パターンに関する効果データを示している棒グラフを表している。
【図７−１７】図７−１７は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭにて、それぞれヒトＡ５４９中の３２ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡｓにわたり、６つの異なる改変パターンに関する効果データを示している棒グラフを表している。
【図７−１８】図７−１８は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭにて、それぞれヒトＡ５４９中の３２ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡｓにわたり、６つの異なる改変パターンに関する効果データを示している棒グラフを表している。
【図７−１９】図７−１９は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭにて、それぞれヒトＡ５４９中の３２ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡｓにわたり、６つの異なる改変パターンに関する効果データを示している棒グラフを表している。
【図７−２０】図７−２０は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭにて、それぞれヒトＡ５４９中の３２ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡｓにわたり、６つの異なる改変パターンに関する効果データを示している棒グラフを表している。
【図７−２１】図７−２１は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭにて、それぞれヒトＡ５４９中の３２ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡｓにわたり、６つの異なる改変パターンに関する効果データを示している棒グラフを表している。
【図７−２２】図７−２２は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭにて、それぞれヒトＡ５４９中の３２ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡｓにわたり、６つの異なる改変パターンに関する効果データを示している棒グラフを表している。
【図７−２３】図７−２３は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭにて、それぞれヒトＡ５４９中の３２ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡｓにわたり、６つの異なる改変パターンに関する効果データを示している棒グラフを表している。
【図７−２４】図７−２４は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭにて、それぞれヒトＡ５４９中の３２ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡｓにわたり、６つの異なる改変パターンに関する効果データを示している棒グラフを表している。
【図７−２５】図７−２５は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭにて、それぞれヒトＡ５４９中の３２ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡｓにわたり、６つの異なる改変パターンに関する効果データを示している棒グラフを表している。
【図７−２６】図７−２６は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭにて、それぞれヒトＡ５４９中の３２ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡｓにわたり、６つの異なる改変パターンに関する効果データを示している棒グラフを表している。
【図７−２７】図７−２７は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭにて、それぞれヒトＡ５４９中の３２ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡｓにわたり、６つの異なる改変パターンに関する効果データを示している棒グラフを表している。
【図７−２８】図７−２８は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭにて、それぞれヒトＡ５４９中の３２ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡｓにわたり、６つの異なる改変パターンに関する効果データを示している棒グラフを表している。
【図７−２９】図７−２９は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭにて、それぞれヒトＡ５４９中の３２ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡｓにわたり、６つの異なる改変パターンに関する効果データを示している棒グラフを表している。
【図７−３０】図７−３０は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭにて、それぞれヒトＡ５４９中の３２ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡｓにわたり、６つの異なる改変パターンに関する効果データを示している棒グラフを表している。
【図７−３１】図７−３１は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭにて、それぞれヒトＡ５４９中の３２ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡｓにわたり、６つの異なる改変パターンに関する効果データを示している棒グラフを表している。
【図７−３２】図７−３２は、０．１ｎＭ（平行アッセイ）および１ｎＭにて、それぞれヒトＡ５４９中の３２ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡｓにわたり、６つの異なる改変パターンに関する効果データを示している棒グラフを表している。
【図８】図８は、例示ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡ、ＡＲ−２８１３が、モック−および対照ＤｓｉＲＮＡ−標的化マウスと比較して、ＡＲ−２８１３を投与したマウスの肺組織中でＡＲレベルを効果的に減少させたことを表しているヒストグラムを表す（示したようなＡＲレベルの各３つのパラレルｑＰＣＲアッセイに対する結果を示している）。
【図９】図９は、示した投与後、２４時間（１日）時点および４８時間（２日）時点で、ＡＲ−２８１３  ＤｓｉＲＮＡの投与が、ヒト前立腺癌細胞下部２２Ｒｖ１中で、ＡＲ  ｍＲＮＡ（下パネル）とタンパク質（上パネル）両方の効果的な阻害を産出したことを示している。
【図１０】図１０は、ＡＲ  ｍＲＮＡレベルの減少に関する、Ａ５４９細胞（腺癌ヒト肺胞基底上皮細胞）でアッセイした５つのＤｓｉＲＮＡに対する用量応答曲線を示している。ＩＣ５０値を、各アッセイしたＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡに対して計算した。ＡＲ−２８１３−Ｍ２５（ＩＣ５０＝２１ｐＭ）、ＡＲ−２８１５−Ｍ１２（ＩＣ５０＝０．７ｐＭ）、ＡＲ−２８７４−Ｍ１２（ＩＣ５０＝０．４ｐＭ）、ＡＲ−３５１８−Ｍ１２（ＩＣ５０＝０．０８６ｐＭ）およびＡＲ−３５９９−Ｍ２５（ＩＣ５０＝１．５７ｐＭ）。
【図１１】図１１は、ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡｓ（本明細書で、ＡＲ−２８１３  ＤｓｉＲＮＡ）が、２２Ｒｖ１（ヒト前立腺癌）細胞に投与した後、細胞増殖を阻害したことを示している。
【図１２】図１２は、ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡ（本明細書で、ＡＲ−３５９９およびＡＲ−２８１３  ＤｓｉＲＮＡ、そこでアンチセンス（ガイド）鎖は、図７で示したように、Ｍ２５主食パターンを持つ）が、ＶＣａＰ（ヒト前立腺癌）細胞への投与後に、細胞増殖を阻害したことを示している。細胞増殖値を、ＤｓｉＲＮＡの形質移入仲介投与５日後にアッセイした。
【図１３】図１３は、４つの特異的なＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡ（ＡＲ−２８１５−Ｍ１２、ＡＲ−２８７４−Ｍ１２、ＡＲ−３５１８−Ｍ１２およびＡＲ３５９９−Ｍ２５）がそれぞれ、ＰＢＳ−または対照オリゴヌクレオチド処置対照と比較して、少なくとも８０％（特定の場合で、少なくとも９０％または９５％）まで正常肝臓組織中のＡＲ  ｍＲＮＡ発現を減少させたことを示している。ＤｓｉＲＮＡを、ＩｎＶｉｖｏＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）２．０トランスフェクション試薬中で処方し、１日目および４日目で、ｉ．ｖ．注射によって、１０ｍｇ／ｋｇにて、２ヶ月齢ｎｕ／ｎｕオスマウス（ｎ＝７）に投与し、第二用量の投与後４８時間で組織を回収した。
【図１４】図１４は、生理食塩水−または対照オリゴヌクレオチド治療対照と比較して、ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡ（ＡＲ−２８１５−Ｍ１２およびＡＲ３５９９−Ｍ２５）が、少なくとも８０％（１つの場合で、少なくとも９０％）まで正常肝臓組織中のＡＲ  ｍＲＮＡ発現を減少させたことを示している。ＤｓｉＲＮＡを液体処方「ＤＬ１」中に処方し、０時間、４８時間および９６時間の時点での、３連続用量で、静脈内注射によって、５ｍｇ／ｋｇにてマウスに投与し、最終用量の投与４８時間後に組織を回収した。
【発明を実施するための形態】
【０１０２】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにてＡＲ遺伝子のレベルおよび／または発現を減少可能な、二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）を含む組成物、それらを調製するための方法を指向する。ｄｓＲＮＡの鎖の１つは、標的化ＡＲ転写産物の破壊および／または転写阻害を指向可能な１９〜３５ヌクレオチドの範囲の長さを持つヌクレオチド配列の領域を含む。
【０１０３】
定義
他に定義しない限り、本明細書で使用するところの全ての技術および科学的語句が、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を持つ。以下の参照は、本発明内で使用される多くの語句の一般的な定義を当業者に提供する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ  ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，１９８８）；Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  （１９９１）；  ａｎｄ  Ｈａｌｅ  ＆  Ｍａｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用するように、以下の語句は、他の特定しない限り、以下のそれらに帰する意味を持つ。
【０１０４】
本発明は、ＡＲ発現を調節（たとえば阻害）可能な１つまたはそれ以上のＤｓｉＲＮＡ分子を特徴とする。本発明のＤｓｉＲＮＡｓは任意に、ＡＲ誤調節に関連した疾患または疾病（例えば腫瘍形成および／または増殖など）の維持または発達に関連した他の遺伝子および／または遺伝子産物のモジュレータとの組み合わせで使用可能である。本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬は、一般的に「ＡＲ」として以下で列挙し、本明細書に対して引用する、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００００４４．２（ヒトＡＲ、長版）、ＮＭ＿００１０１１６４５．１（ヒトＡＲ、短版）およびＮＭ＿０１３４７６．３（マウスＡＲ）によって引用されたｃＤＮＡ配列に相当するもののように、ＡＲ  ＲＮＡｓを調節する。
【０１０５】
本発明の種々の様態および実施形態の以下の記述が、典型的ＡＲ  ＲＮＡｓに対する参照で提供され、一般的にＡＲと本明細書で引用される。しかしながら、そのような参照は、例示のみであると意味され、本発明の種々の様態および実施形態はまた、変異体ＡＲ  ＲＮＡｓまたはさらなるＡＲスプライスバリアントのような、他のＡＲ  ＲＮＡｓも指向する。特定の様態および実施形態がまた、治療に対して標的化されうる表現型効果（例えば腫瘍形成および／または増殖など）を産出するために、その誤調節が、ＡＲのものと関連して働く（またはＡＲ調節に効果を与えたか、または与える）遺伝子を含む、ＡＲ経路に関与する他の遺伝子も指向する。そのようなさらなる遺伝子は、ＡＲ標的化ＤｓｉＲＮＡｓの利用に関して本明細書で記述されたＤｓｉＲＮＡおよび方法を用いて標的化可能である。したがって、他の遺伝子のそのような阻害剤の阻害および効果を、本明細書で記述したように実施可能である。
【０１０６】
語句「ＡＲ」は、ＡＲタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドをコードしている核酸配列を意味する（例えば、ＡＲ  Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００００４４．２、ＮＭ＿００１０１１６４５．１およびＮＭ＿０１３４７６．３の配列のような、ＡＲ転写産物）。特定の実施形態において、語句「ＡＲ」はまた、他のＡＲイソフォーム、変異体ＡＲ遺伝子、ＡＲ遺伝子のスプライスバリアント、およびＡＲ遺伝子多型のような、他のＡＲコード配列を含むことも意味する。語句「ＡＲ」は、ＡＲ遺伝子／転写産物のポリペプチド遺伝子産物、例えば、ＡＲ  Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００００４４．２、ＮＭ＿００１０１１６４５．１およびＮＭ＿０１３４７６．３によってコードされたもののような、ＡＲタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドを意味するために使用される。
【０１０７】
本明細書で使用するところの、「ＡＲ関連疾患または障害」は、変化したＡＲ発現、レベルおよび／または活性に関連すると本技術分野で公知の疾患または疾病を意味する。とりわけ、「ＡＲ−関連疾患または疾病」は、癌および／または増殖性疾患、状態または疾病を含む。典型的「ＡＲ関連疾患または障害」は前立腺癌である。  
【０１０８】
本明細書で使用するところの「増殖性疾患」または「癌」によって、単独または他の治療との組み合わせで、白血病、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、および慢性リンパ性白血病、カポジ肉腫のようなＡＩＤＳ関連癌、乳癌、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、繊維肉腫、巨細胞腫、アダマンチノーマおよび脊索腫のような骨癌、髄膜腫、膠芽細胞腫、下級星状細胞腫、オリゴデンドロサイトーマ、下垂体腫瘍、神経鞘腫および転移脳腫瘍のような脳腫瘍、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、アデノーマ、扁平上皮癌、喉頭癌、胆嚢および胆管癌、網膜芽腫のような網膜の癌、食道癌、胃癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、子宮癌、甲状腺癌、精巣癌、子宮内膜腺癌、メラノーマ、結腸直腸癌、肺癌、膀胱癌、前立腺癌、（非小細胞肺癌を含む）肺癌、膵臓癌、肉腫、腎芽細胞腫、子宮頸癌、頭頸部癌、皮膚癌、鼻咽腔癌、脂肪肉腫、上皮性腫瘍、腎細胞癌、胆嚢腺癌、耳下腺癌、子宮内膜肉腫、多剤耐性癌のような種々のリンパ腫を含む頭頸部癌、および腫瘍血管形成に関連した新血管形成、黄斑変性（例えば湿／乾ＡＭＤ）、角膜血管新生、糖尿病性レチオパシー、血管新生緑内障、近視性変性のような増殖性疾患および状態、および再狭窄および多発性嚢胞腎のような他の増殖性疾患および状態、細胞または組織内での疾患関連遺伝子発現の調節に応答可能な他の癌または増殖性疾患、状態、形質、遺伝型または表現型を含む、本技術分野で公知のように、制御されていない細胞増殖または複製によって特徴付けられる疾患、状態、形質、遺伝型または表現型を意味する。
【０１０９】
特定の実施形態において、ＡＲ標的配列のｄｓＲＮＡ−仲介阻害を査定する。そのような実施形態において、ＡＲ  ＲＮＡレベルは、任意に、そのような抗−ＡＲ  ｄｓＲＮＡが存在しないことに対する、本発明の抗−ＡＲ  ｄｓＲＮＡの存在におけるＡＲレベルの比較を介して、本技術分野で認識された方法（例えばＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロット、発現アレイなど）によって査定可能である。特定の実施形態において、抗−ＡＲ  ｄｓＲＮＡの存在下のＡＲレベルを、賦形剤のみの存在下、関連しない標的ＲＮＡに対して指向したｄｓＲＮＡの存在下、または任意の治療のない状態で、観察したものと比較する。
【０１１０】
ＡＲタンパク質のレベルを査定可能であること、ＡＲタンパク質のレベルが、異なる条件下、ＡＲ  ＲＮＡレベルおよび／またはｄｓＲＮＡが、ＡＲ発現を阻害する程度に直接的または間接的いずれかで関連することがまた認識され、したがってＡＲタンパク質レベルを査定する本技術分野で認識されている方法（例えばウエスタンブロット、免疫沈降、他の抗体に基づく方法など）もまた、本発明のｄｓＲＮＡの阻害効果を試験するために使用可能である。
【０１１１】
選択された対照と比較して、本発明の抗ＡＲ  ｄｓＲＮＡがシステム（例えば、細胞フリーのｉｎ  ｖｉｔｒｏシステム）、細胞、組織または生命体に投与された時に、ＡＲ  ＲＮＡ（またはＡＲタンパク質が評価された時に、ＡＲタンパク質レベル）における統計学的に有意な減少が見られた場合に、本発明の抗ＡＲ  ｄｓＲＮＡが、「ＡＲ阻害活性」を有すると見なされる。実験値と、実施された複数アッセイ数の分布によって、（％または絶対値のいずれかとして）ＡＲ  ＲＮＡにおけるどんな減少レベルが、（本技術分野で公知の統計学的有意差を決定する標準の方法によって査定されたように）統計学的に有意と判断するかのパラメータが決定づけられる傾向にある。しかしながら、特定の実施形態において、「ＡＲ阻害活性」は、システム、細胞、組織または生命体におけるＡＲのレベルにおける減少の％または絶対レベルに基づいて定義される。例えば、特定の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡは、好適な対照に対して見られるＡＲレベルに対して、本発明のＤｓｉＲＮＡの存在下で、ＡＲ  ＲＮＡにおいて、少なくとも５％減少または少なくとも１０％減少が観察される場合に、ＡＲ阻害活性を有すると見なされる。（例えば、特定の実施形態において、対照に対して、ＡＲレベルにおける例えば５％または１０％の減少が観察される場合に、組織および／または対象中のｉｎ  ｖｉｖｏ  ＡＲレベルが、本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬によって阻害されると見なされうる。）特定の他の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡは、ＡＲ  ＲＮＡレベルが、選択された対照に対して、少なくとも１５％まで、選択された対照に対して、少なくとも２０％まで、選択された対照に対して、少なくとも２５％まで、選択された対照に対して、少なくとも３０％まで、選択された対照に対して、少なくとも３５％まで、選択された対照に対して、少なくとも４０％まで、選択された対照に対して、少なくとも４５％まで、選択された対照に対して、少なくとも５０％まで、選択された対照に対して、少なくとも５５％まで、選択された対照に対して、少なくとも６０％まで、選択された対照に対して、少なくとも６５％まで、選択された対照に対して、少なくとも７０％まで、選択された対照に対して、少なくとも７５％まで、選択された対照に対して、少なくとも８０％まで、選択された対照に対して、少なくとも８５％まで、選択された対照に対して、少なくとも９０％まで、選択された対照に対して、少なくとも９５％まで、選択された対照に対して、少なくとも９６％まで、選択された対照に対して、少なくとも９７％まで、選択された対照に対して、少なくとも９８％まで、選択された対照に対して、少なくとも９９％まで減少するのが観察される場合に、ＡＲ阻害活性を持つと見なされる。いくつかの実施形態において、ＡＲの完全阻害が、ＡＲ阻害活性をもつと見なされるために、ＤｓｉＲＮＡに対して要求される。特定のモデル（例えば細胞培養）において、ＤｓｉＲＮＡは、好適な対照に対して、ＡＲレベルの少なくとも５０％減少が観察される場合に、ＡＲ阻害活性を有すると見なされる。特定の他の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、好適な対照に対して、ＡＲレベルの少なくとも８０％減少が観察される場合に、ＡＲ阻害活性を有すると見なされる。
【０１１２】
特定の例の方法によって、以下の実施例において、一連のＤｓｉＲＮＡｓ標的化ＡＲを、そのような細胞の環境下、およびトランスフェクション試薬（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＲＮＡｉＭＡＸ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下、１ｎＭ濃度にて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにてヒト２２Ｒｖ１またはマウスＬＭＴＫ−細胞中のＡＲ  ｍＲＮＡレベルを減少させる能力に関して試験した。以下の実施例中ＡＲ阻害活性はまず、アッセイした条件下、ＡＲ  ｍＲＮＡレベルの少なくとも７０％減少に効果があると観察されたＤｓｉＲＮＡｓに対してまずみなした。ＡＲ阻害活性は、同一または同様のアッセイおよび条件が使用された時でさえ、以下の実施例に対して使用したものとくらべて、より厳しいか、より厳しくない条件下のいずれかで、ｄｓＲＮＡに帰することも企図される。例えば、特定の実施形態において、試験した本発明のｄｓＲＮＡは、ＡＲ  ｍＲＮＡレベルにおいて、好適な対照に対して、少なくとも１０％減少、少なくとも２０％減少、少なくとも３０％減少、少なくとも４０％減少、少なくとも５０％減少、少なくとも６０％減少、少なくとも７５％減少、少なくとも８０％減少、少なくとも８５％減少、少なくとも９０％減少、少なくとも９５％減少が、細胞環境下、１ｎＭ  ｄｓＲＮＡ濃度またはそれ以下で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて哺乳動物細胞内で観察された場合に、ＡＲ阻害活性を有するとみなされる。
【０１１３】
本発明の二本鎖ＲＮＡがＡＲ阻害活性を有するかどうかを決定するための他の評価項目の利用も企図される。特に、１つの実施形態において、ＡＲ  ｍＲＮＡレベルを査定することに加えて、またはそれとは別に、（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにて、哺乳動物細胞を接触させた４８時間後にて）試験したｄｓＲＮＡの、ＡＲタンパク質レベルを減少させる能力を査定し、試験したｄｓＲＮＡが、好適な対照と比べて、ＡＲタンパク質レベルにて、少なくとも１０％減少、少なくとも２０％減少、少なくとも３０％減少、少なくとも４０％減少、少なくとも５０％減少、少なくとも６０％減少、少なくとも７０％減少、少なくとも７５％減少、少なくとも８０％減少、少なくとも８５％減少、少なくとも９０％減少、少なくとも９５％減少が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにて、アッセイした二本鎖ＲＮＡに接触させた哺乳動物内で観察される場合に、ＡＲ阻害活性を有するとみなされる。企図されたさらなる評価項目には、例えばＡＲレベルの減少に関する表現型−例えば、より詳細に本明細書の他の場所で記述したような、腫瘍または癌細胞レベルの増殖を停止させること、または減少させることを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて接触させた哺乳動物細胞株の増殖の減少および／またはｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍の増殖の減少の査定が含まれる。
【０１１４】
ＡＲ阻害活性をまた、なにが、投与した濃度、および投与後の時間間隔にしたがって調整したＡＲ阻害活性を有するｄｓＲＮＡを構成するかという査定で、時間（間隔）にわたり、濃度範囲（強度）にわたり評価可能でもある。したがって、特定の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡは、ＡＲ活性において少なくとも５０％の減少が、投与が観察され、存続した後、２時間、５時間、１０時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日またはそれ以上の期間で観察される場合に、ＡＲ阻害活性を有すると見なす。さらなる実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡは、例えば本明細書で記述したようなＡＲ阻害活性に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ内で、細胞の環境中、１ｎＭまたはそれ以下、５００ｐＭまたはそれ以下、２００ｐＭまたはそれ以下、１００ｐＭまたはそれ以下、５０ｐＭまたはそれ以下、２０ｐＭまたはそれ以下、１０ｐＭまたはそれ以下、１０ｐＭまたはそれ以下、５ｐＭまたはそれ以下、２ｐＭまたはそれ以下、または１ｐＭまたはそれ以下の濃度にて、ＡＲ阻害活性（例えば特定の実施形態において、少なくとも５０％のＡＲ阻害）が観察された場合、強力なＡＲ阻害試薬であると見なす。特定の実施形態において、本発明の強力なＡＲ阻害ｄｓＲＮＡは、効果的な伝達賦形剤（例えば効果的な脂質ナノ粒子処方）中で対象に投与した時に、１０ｍｇ／ｋｇまたはそれ以下の処方された濃度にて、ＡＲ阻害活性（例えば特定の実施形態において、少なくとも２０％のＡＲレベルの減少）を可能なものとして定義される。好ましくは、本発明の強力なＡＲ阻害ｄｓＲＮＡは、効果的な伝達賦形剤中対象に投与された時に、５ｍｇ／ｋｇまたはそれ以下の処方された濃度にて、ＡＲ阻害活性（例えば特定の実施形態において、少なくとも５０％のＡＲレベルの減少）を可能なものとして定義される。より好ましくは、本発明の強力なＡＲ阻害ｄｓＲＮＡは、効果的な伝達賦形剤中対象に投与された時に、５ｍｇ／ｋｇまたはそれ以下の処方された濃度にて、ＡＲ阻害活性（例えば特定の実施形態において、少なくとも５０％のＡＲレベルの減少）を可能なものとして定義される。任意に、本発明の強力なＡＲ阻害ｄｓＲＮＡは、効果的な伝達賦形剤中対象に投与された時に、２ｍｇ／ｋｇまたはそれ以下、または１ｍｇ／ｋｇまたはそれ以下の処方された濃度にて、ＡＲ阻害活性（例えば特定の実施形態において、少なくとも５０％のＡＲレベルの減少）を可能なものとして定義される。
【０１１５】
特定の実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡの強度を、特定のレベルの標的遺伝子ノックダウンを達成するために必要な標的細胞の細胞質内に存在する、ｄｓＲＮＡのコピー数に対する参照で決定する。例えば、特定の実施形態において、強力なｄｓＲＮＡは、１０００またはそれ以下のＲＩＳＣ−ロードアンチセンス鎖のコピー数／細胞にて標的細胞の細胞質内に存在した場合に、標的ｍＲＮＡの５０％またはそれより大きなノックダウンを引き起こしうるものである。より好ましくは、強力なｄｓＲＮＡは、５００またはそれ以下のＲＩＳＣ−ロードアンチセンス鎖のコピー数／細胞にて標的細胞の細胞質内に存在した場合に、標的ｍＲＮＡの５０％またはそれより大きなノックダウンを引き起こしうるものである。任意に、強力なｄｓＲＮＡは、３００またはそれ以下のＲＩＳＣ−ロードアンチセンス鎖のコピー数／細胞にて標的細胞の細胞質内に存在した場合に、標的ｍＲＮＡの５０％またはそれより大きなノックダウンを引き起こしうるものである。
【０１１６】
さらなる実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡの強度は、同一の標的遺伝子内の同一の標的配列を指向した１９〜２３マー  ｄｓＲＮＡに対する参照で定義可能である。例えば、相当する１９〜２３マー  ｄｓＲＮＡに対して増強した強度を有する本発明のＤｓｉＲＮＡは、強度差の検出を許容するのに十分低い濃度（例えば、本明細書で記述したようなｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ中、細胞の環境中１ｎＭまたはそれ以下の、細胞の環境中１００ｐＭまたはそれ以下、細胞の環境中１０ｐＭまたはそれ以下、細胞の環境中１ｎＭまたはそれ以下のトランスフェクション濃度。とりわけ強度差は、用量応答曲線を産生し、ＤｓｉＲＮＡ／ｄｓＲＮＡに関連したＩＣ５０値を同定する目的のための濃度範囲−例えば０．１ｐＭ〜１０ｎＭにわたり、そのようなアッセイを実施することを介してもっともよく検出可能である）にて、本明細書で記述したｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでアッセイした時に、相当する１９〜２３マー  ｄｓＲＮＡと比較して、さらに５％またはそれ以上、さらに１０％またはそれ以上、さらに２０％またはそれ以上、さらに３０％またはそれ以上、さらに４０％またはそれ以上、さらに５０％またはそれ以上まで標的遺伝子を減少させるＤｓｉＲＮＡでありうる。
【０１１７】
ＡＲ阻害レベルおよび／またはＡＲレベルはまた、間接的にアッセイしてもよく、例えば、ＰＳＡレベルにおける減少、または対象中のポリープまたは腫瘍の大きさまたは数の減少の測定を、本発明の二本鎖核酸のＡＲレベルおよび／またはＡＲ阻害効果を査定するために使用してよい。
【０１１８】
特定の実施形態において、語句「から本質的になる」は、本発明の抗−ＡＲ  ｄｓＲＮＡｓの参照にて使用される。いくつかのそのような実施形態において、「から本質的になる」は、ＡＲ阻害活性の少なくとも特定のレベル（例えば、少なくとも５０％のＡＲ阻害活性）を有する本発明のｄｓＲＮＡを含む、およびまた、ｄｓＲＮＡのＡＲ阻害活性に有意に影響を与えない１つまたはそれ以上のさらなる構成要素および／または改変も含む組成物を意味する。例えば、特定の実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡおよび／または組成物のｄｓＲＮＡ−関連構成要素の改変が、単離において、本発明のｄｓＲＮＡに対して、３％以上、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上まで（任意にＡＲ阻害活性の強度または間隔を含む）ＡＲ阻害活性を変えない場合、組成物は、本発明のｄｓＲＮＡ「から本質的になる」。特定の実施形態において、組成物は、ＡＲ阻害活性のより劇的な減少（例えば有効性、間隔および／または強度において、８０％減少、９０％減少など）が、さらなる構成要素または改変の存在下で発生し、そこでまだＡＲ阻害活性が、さらなる構成要素および／または改変の存在下、有意に上昇しない（例えばＡＲ阻害活性の観察されたレベルが、本発明の単離されたｄｓＲＮＡに対して観察されたものの１０％以内である）場合でさえ、本発明のｄｓＲＮＡから本質的になると見なされる。
【０１１９】
本明細書で使用するところの、語句「ｄｓＲＮＡが、哺乳動物細胞内で、１ナノモルまたはそれ以下の前記細胞の環境下の効果的な濃度にて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにてアッセイした時に、少なくともＸ％までＡＲ  ｍＲＮＡレベルを減少させる」は、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎＴＭＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）の存在下、１ナノモルまたはそれ以下のトランスフェクション濃度にて、製造業者の取扱説明書にそってアッセイした時に、少なくともＸ％まで、ＨｅＬａ細胞集団の天然のＡＲ  ｍＲＮＡレベルを減少させるためのｄｓＲＮＡに対する要求を意味する。そのようなＨｅＬａ細胞は、ＡＴＣＣより入手され、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）を含むＤＭＥＭ（ＨｙＣｌｏｎｅ）中、３７℃、５％  ＣＯ２下で維持する。ＡＲ  ｍＲＮＡレベルをついで、トランスフェクション後２４時または４８時でアッセイし、本明細書の他の場所で記述したような適切な対照に関して、％阻害を査定する。特定の実施形態において、そのようなアッセイのＨｅＬａ細胞を、ＨｅｐＧ２、ＨＣＴ１１６、ＨｕＨ７または他の細胞株で置換する。
【０１２０】
本明細書で使用するところの語句「核酸」は、一本鎖または二本鎖形状での、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたは改変されたヌクレオチドおよびそれらのポリマーを意味する。本語句は、合成、天然に存在するおよび天然に存在せず、参照核酸と同様の結合特性を持ち、参照ヌクレオチドと同様の様式で代謝される、公知のヌクレオチド類似体、または改変された骨格残基または結合を含む核酸を企図する。そのような類似体の例には、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルリン酸塩、キラル−メチルリン酸塩、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡｓ）が含まれるが、これらに限定はされない。
【０１２１】
本明細書で使用するところの「ヌクレオチド」は、天然塩基（標準）および本技術分野でよく知られている改変塩基を持つものを含み、本技術分野で認識されたように使用される。そのような塩基は一般的に、ヌクレオチド糖部位の１’位に位置している。ヌクレオチドは一般的に、塩基、糖およびリン酸基を含む。ヌクレオチドは、糖、リン酸および／または塩基部位にて改変されないか、改変されうる（ヌクレオチド類似体、改変ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準ヌクレオチドおよびその他として交互に引用される、例えば本明細書にて参考文献によってすべて組み込まれている、Ｕｓｍａｎ  ａｎｄ  ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ、上記；  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，  国際ＰＣＴ特許第９２／０７０６５号パンフレット；Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，国際ＰＣＴ特許第ＷＯ  ９３／１５１８７号パンフレット；Ｕｈｌｍａｎ  ＆  Ｐｅｙｍａｎ、上記を参照のこと）。Ｌｉｍｂａｃｈ，ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２１８３，１９９４によって要約されたような、本技術分野で公知の改変核酸塩基の種々の例が存在する。核酸分子内に導入可能な塩基改変の非限定例のいくつかは、ヒポキサンチン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン類（例えば５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン類（例えばリボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば５−ブロモウリジン）または６−アザピリミジン類または６−アルキルピリミジン類（例えば６−メチルウリジン）、プロピンおよびその他（Ｂｕｒｇｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１４０９０，１９９６；Ｕｈｌｍａｎ  ＆  Ｐｅｙｍａｎ，上記）が挙げられる。本様態において、「改変塩基」は、１'位でのアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルまたはそのそれらの等価物以外のヌクレオチド塩基を意味する。
【０１２２】
本明細書で使用するところの「改変ヌクレオチド」は、ヌクレオシド、ヌクレオ塩基、ペントース環またはリン酸基への１つまたはそれ以上の改変を持つヌクレオチドを意味する。例えば、改変ヌクレオチドは、アデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、ウリジン一リン酸およびシチジン一リン酸を含むリボヌクレオチド類、およびデオキシアデノシン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシチミジン一リン酸およびデオキシシチジン一リン酸を含むデオキシリボヌクレオチド類を除外する。改変には、メチルトランスフェラーゼのような、ヌクレオチドを改変する酵素による改変の結果である、天然に発生するものが含まれる。改変ヌクレオチドにはまた、合成または天然に発生しないヌクレオチドが含まれる。ヌクレオチドにおける合成または天然に存在しない改変には、２’改変、例えば２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−ブリッジ、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−ブリッジ、２’−ＬＮＡ、および２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）を持つもの、または塩基類似体を含むものが含まれる。本明細書のために記述されたような、２’−改変ヌクレオチドに関連して、「アミノ」によって、２’−ＮＨ２または２’−Ｏ−ＮＨ２が意味され、改変されてよく、または改変されなくてよい。そのような改変基は、例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，６７２，６９５号明細書およびＭａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，２４８，８７８号明細書にて記述されている。
【０１２３】
本明細書の核酸分子に関して、改変は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の１つまたは両方の鎖上のパターンで、これらの試薬上に存在しうる。本明細書で使用するところの「交互位置」は、すべての他のヌクレオチドが改変されたヌクレオチドであるか、または定義された長さのｄｓＲＮＡの鎖にわたるすべての改変されたヌクレオチド間で改変されていないヌクレオチド（例えば、改変されていないリボヌクレオチド）が存在する（例えば５’−ＭＮＭＮＭＮ−３’、３’−ＭＮＭＮＭＮ−５’、式中Ｍは改変されたヌクレオチドであり、Ｎは改変されていないヌクレオチドである）パターンを意味する。改変パターンは、例えば本明細書で記述したような、位置ナンバリング慣例にしたがって、５’または３’末端いずれかの第一ヌクレオチド位置から開始する（特定の実施形態において、位置１は、本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬の推定されるＤｉｃｅｒ開裂事象に続く鎖の終末残基に関して指定される。したがって位置１はいつも、本発明の前処理試薬の３’末端または５’末端残基を構成しない）。交互位置での改変されたヌクレオチドのパターンは、鎖の全長で走ってよいが、しかし特定の実施形態で、それぞれ、少なくとも２、３、４、５、６または７つの改変されたヌクレオチドを含む、少なくとも４、６、８、１０、１２、１４ヌクレオチドが含まれる。本明細書で使用するところの、「位置の交互対」は、２つの連続した改変されたヌクレオチドが、ｄｓＲＮＡの鎖の定義された長さにわたり、２つの連続した改変されていないヌクレオチドによって分離されるパターンを意味する（例えば、５’−ＭＭＮＮＭＭＮＮＭＭＮＮ−３’、３’−ＭＭＮＮＭＭＮＮＭＭＮＮ−５’、式中Ｍは改変されたヌクレオチドであり、Ｎは改変されていないヌクレオチドである）。改変パターンは、本明細書で記述したもののような、位置ナンバリング慣例にしたがって、５’または３’末端いずれかでの、第一ヌクレオチド位置から開始する。交互位置における改変されたヌクレオチドのパターンは、鎖の全長を走ってよいが、好ましくは、それぞれ、少なくとも４、６、８、１０、１２または１４の改変されたヌクレオチドを含む、少なくとも８、１２、１６、２０、２４、２８ヌクレオチドが含まれる。上記改変パターンは例示であり、本発明の範囲における制限は意図しないことが強調される。
【０１２４】
本明細書で使用するところの「塩基類似体」は、核酸二本鎖に組み込むことが可能な改変されたヌクレオチド中のヌクレオチド糖部位の１’位（または核酸二本鎖内に組み込むことが可能なヌクレオチド糖部位置換中の等価の位置）に位置するヘテロ環状部位を意味する。本発明のｄｓＲＮＡｓにおいて、塩基類似体は一般的に、一般的塩基グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）を除く、プリンまたはピリミジン塩基のいずれかである。塩基類似体は、ｄｓＲＮＡｓ中他の塩基または塩基類似体と二本鎖となりうる。塩基類似体には、本発明の化合物および方法にて有用なもの、たとえば、参考文献によって本明細書に組み込まれている、Ｂｅｎｎｅｒに付与された米国特許第５，４３２，２７２号明細書および第６，００１，９８３号明細書、およびＭａｎｏｈＡＲａｎに付与された米国公開第２００８０２１３８９１号明細書に開示されたものが含まれる。塩基の非限定例には、ハイポキサンチン（Ｉ）、キサンチン（Ｘ）、３β−Ｄ−リボフラノシル−（２，６−ジアミノピリミジン）（Ｋ）、３−β−Ｄ−リボフラノシル−（１−メチル−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５，７（４Ｈ，６Ｈ）−ジオン）（Ｐ）、イソ−シトシン（ｉｓｏ−Ｃ）、イソ−グアニン（ｉｓｏ−Ｇ）、１−β−Ｄ−リボフラノシル−（５−ニトロインドール）、１−β−Ｄ−リボフラノシル−（３−ニトロピロール）、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン、４−チオ−ｄＴ、７−（２−チエニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（Ｄｓ）およびピロール−２−カルボアルデヒド（Ｐａ）、２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン（Ｓ）、２−オキソピリジン（Ｙ）、ジフルオロトリル、４−フルオロ−６−メチルベンズイミダゾール、４−メチルベンゾイミダゾール、３−メチルイソカルボスチリリル、５−メチルイソカルボスチリリルおよび３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリル、７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、イミジゾピリジニル、９−メチル−イミジゾピリジニル、ピローロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイソカルボシチリリル、プロピニル−７−アザインドリル、２，４，５−トリメチルフェニル、４−メチルインドリル、４，６−ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベンジル、テトラセニル、ペンタセニルおよびそれらの構造誘導体（Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５９：７２３８−７２４２（１９９４）；Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２８（１５）：２９１１−２９１４（２０００）；Ｍｏｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１９：２０５６−２０５７（１９９７）；Ｍｏｒａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：２３２３−２３２４（１９９９）；Ｇｕｃｋｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８：８１８２−８１８３（１９９６）；Ｍｏｒａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２（６）：１００１−１００７（２０００）；ＭｃＭｉｎｎ  ｅｔ  ａ��．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１１５８５−１１５８６（１９９９）；Ｇｕｃｋｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６３：９６５２−９６５６（１９９８）；Ｍｏｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４：１０５０６−１０５１１（１９９７）；Ｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．，１：１９７−２０６（２００２）；Ｓｈｉｂａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．，１：１６０５−１６１１（２００１）；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２（３２）：７６２１−７６３２（２０００）；Ｏ'Ｎｅｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６７：５８６９−５８７５（２００２）；Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１７：１０４３４−１０４４２（１９９５）；および米国特許第６，２１８，１０８号明細書）が含まれる。塩基類似体はまたユニバーサル塩基であってよい。
【０１２５】
本明細書で使用するところの「ユニバーサル塩基」は、核酸二本鎖中に存在する場合に、二本鎖ヘリックス構造（例えばリン酸骨格の構造）を変化させずに、１つ以上の型の塩基と反対に位置可能な、改変ヌクレオチド中のヌクレオチド糖部位の１’位、またはヌクレオチド糖部位置換基中の等価位置に位置するヘテロ環状部位を意味する。さらに、ユニバーサル塩基は、存在する一本鎖核酸の、その中で標的核酸に対して二本鎖とする能力を破壊しない。ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸の、標的核酸を二本鎖とする能力を、当業者に理解される方法（例えば、ＵＶ吸収、円偏光二色性、ゲルシフト、一本鎖ヌクレアーゼ感受性など）によってアッセイ可能である。さらに、二本鎖形成が観察された条件は、二本鎖安定性または形成を決定するために変化してよく、融解温度（Ｔｍ）が、核酸二本鎖の安定性と相関するので、例えば温度が変化してよい。標的核酸に実際相補的である参照一本鎖核酸と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、相補的核酸と形成された核酸二本鎖よりも低いＴｍを持つ標的核酸と一緒に二本鎖を形成する。しかしながら、ユニバーサル塩基が単一ミスマッチを産出するために塩基で置換された参照一本鎖核酸と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、ミスマッチした塩基を持つ核酸と形成された二本鎖よりも、より高いＴｍを持つ標的核酸と二本鎖を形成する。
【０１２６】
いくつかのユニバーサル塩基は、塩基対形成条件下、ユニバーサル塩基と、すべての塩基グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）間で水素結合を形成することによって塩基対化可能である。ユニバーサル塩基は、ただ１つの単一相補塩基と塩基対を形成する塩基ではない。二本鎖内で、ユニバーサル塩基は、水素結合を形成しなくてよく、また二本鎖の反対の鎖上、それと反対の各Ｇ、Ｃ、Ａ、ＴおよびＵと１つの水素結合または１つ以上の水素結合を形成してよい。好ましくは、ユニバーサル塩基は、二本鎖の反対の鎖上で、それと反対の塩基と相互作用しない。二本鎖において、ユニバーサル塩基間の塩基対化は、リン酸骨格の二本ヘリックス構造を変えずに発生する。ユニバーサル塩基はまた、スタッキング相互作用によって、同一の核酸鎖上の隣接ヌクレオチド中の塩基と相互作用してもよい。そのようなスタッキング相互作用は、とりわけ、ユニバーサル塩基が、二本鎖の反対の鎖上で、それとは反対に位置する塩基と、任意の水素結合を形成しない条件下で、二本鎖を安定化させる。ユニバーサル−結合ヌクレオチドの非限定例には、イノシン、１−β−Ｄ−リボフラノシル−５−ニトロインドール、および／または１−β−Ｄ−リボフラノシル−３−ニトロピロールが含まれる（Ｑｕａｙ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第２００７０２５４３６２号、Ｖａｎ  Ａｅｒｓｃｈｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎ  ａｃｙｃｌｉｃ  ５−ｎｉｔｒｏｉｎｄａｚｏｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ａｓ  ａｍｂｉｇｕｏｕｓ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９５  Ｎｏｖ  １１；２３（２１）：４３６３−７０；Ｌｏａｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，３−Ｎｉｔｒｏｐｙｒｒｏｌｅ  ａｎｄ  ５−ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ  ａｓ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ＰＣＲ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９５  Ｊｕｌ  １１；２３（１３）：２３６１−６；Ｌｏａｋｅｓ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ，５−Ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ  ａｓ  ａｎ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９４  Ｏｃｔ  １１；２２（２０）：４０３９−４３）。
【０１２７】
本明細書で使用するところの「ループ」は、特定の一本鎖ヌクレオチド領域の側面の相補領域が、相補領域間の一本鎖ヌクレオチド領域が、二本鎖形成またはワトソン−クリック塩基対化から除外される方法でハイブリッド形成する、核酸の一本鎖によって形成される構造を意味する。ループは、任意の長さの一本鎖ヌクレオチド領域である。ループの例には、ヘパリン、ステムループまたは伸長ループのような構造中に存在する、対になっていないヌクレオチドが含まれる。
【０１２８】
本明細書で使用するところの、ｄｓＲＮＡの文脈中の「伸長ループ」は、一本鎖ループ、および加えて、１、２、３、４、５、６または２０までの塩基対またはループの側面の二本鎖を意味する。伸長ループ中、５’側上のループの側面に存在するヌクレオチドは、３’側上でループの側面に存在するヌクレオチドと二本鎖を形成する。伸長ループはヘアピンまたはステムループを形成してよい。
【０１２９】
本明細書で使用するところの、ｄｓＲＮＡの文脈中の「テトラループ」は、隣接するワトソン−クリックハイブリッド形成ヌクレオチドの安定性に寄与する、安定二次構造を形成する４つのヌクレオチドからなるループ（一本鎖領域）を意味する。理論に制限されることなしに、テトラループは、スタッキング相互作用によって、隣接するワトソン−クリック塩基対を安定化させてよい。加えて、テトラループ中の４つのヌクレオチド間の相互作用には、非ワトソン−クリック塩基対化、スタッキング相互作用、水素結合、および接触相互作用が含まれるが、これらに限定はされない（Ｃｈｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９０  Ａｕｇ  １６；３４６（６２８５）：６８０−２；Ｈｅｕｓ  ａｎｄ  ＰＡＲｄｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１  Ｊｕｌ  １２；２５３（５０１６）：１９１−４）。テトラループは、４つの無作為塩基からなる単一モデルループ配列から推測されるものよりも高い隣接二本鎖融解温度（Ｔｍ）における増加を与える。例えば、テトラループは、長さにして少なくとも２塩基対の二本鎖を含むヘアピンに、１０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４中、少なくとも５５℃の融解温度を与えうる。テトラループには、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、改変ヌクレオチドおよびそれらの混合物が含まれてよい。ＲＮＡテトラループの例には、テトラループのＵＮＣＧファミリ−（例えばＵＵＣＧ）、テトラループのＧＮＲＡファミリー（例えばＧＡＡＡ）、およびＣＵＵＧテトラループが含まれる（Ｗｏｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９０  Ｎｏｖ；８７（２１）：８４６７−７１；Ａｎｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９１  Ｎｏｖ  １１；１９（２１）：５９０１−５）。ＤＮＡテトラループの例には、テトラフープのｄ（ＧＮＮＡ）ファミリー（例えば、ｄ（ＧＴＴＡ）、テトラループのｄ（ＧＮＲＡ））ファミリー、テトラループのｄ（ＧＮＡＢ）ファミリー、テトラループのｄ（ＣＮＮＧ）ファミリー、テトラフープのｄ（ＴＮＣＧ）ファミリー（例えばｄ（ＴＴＣＧ））が含まれる。（Ｎａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１（４８），１４２８１−１４２９２，２００２．；ＳＨＩＮＪＩ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｉｐｐｏｎ  Ｋａｇａｋｋａｉ  Ｋｏｅｎ  Ｙｏｋｏｓｈｕ  ＶＯＬ．７８ｔｈ；ＮＯ．２；ＰＡＧＥ．７３１（２０００）．）。
【０１３０】
本明細書で使用するところの語句「ｓｉＲＮＡ」は、各鎖が、ＲＮＡ、ＲＮＡ類似体（類）またはＲＮＡおよびＤＮＡを含む二本鎖核酸を意味する。ｓｉＲＮＡは、１９〜２３ヌクレオチドを含み、または２１ヌクレオチドを含む。ｓｉＲＮＡは典型的には、ｓｉＲＮＡ中の二本鎖領域が１７〜２１ヌクレオチド、または１９ヌクレオチドを含むように、各鎖の３’末端上に２ｂｐオーバーハングを持つ。典型的には、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、ＡＲ遺伝子／ＲＮＡの標的配列と十分相補的である。
【０１３１】
本発明の抗−ＡＲ  ＤｉＲＮＡは、少なくとも２５ヌクレオチドの鎖長を有する。したがって、特定の実施形態において、抗−ＡＲ  ＤｓｉＲＮＡは、１つのオリゴヌクレオチド配列、長さにして少なくとも２５ヌクレオチドであり、３５または５０まででしかない、またはそれ以上のヌクレオチドである、第一位配列を含む。ＲＮＡの本配列は、長さにして２６〜３５、２６〜３４、２６〜３３、２６〜３２、２６〜３１、２６〜３０、２６〜２９ヌクレオチドでありうる。本配列は、長さにして２７または２８ヌクレオチドでありえ、長さにして２７ヌクレオチドであり得る。ＤｓｉＲＮＡ試薬の第二配列は、真核細胞の細胞質内のような、生物学的状態下第一配列にアニールする配列でありうる。一般的に、第二オリゴヌクレオチド配列は、第一オリゴヌクレオチドと少なくとも１９の相補塩基対を持ち、より典型的には、第二オリゴヌクレオチド配列は、第一オリゴヌクレオチド配列と、２１またはそれ以上の相補塩基対を持ち、または２５以上の相補塩基対を持つ。１つの実施形態において、第二配列は、第一配列と同一の長さであり、ＤｓｉＲＮＡ試薬は平滑末端である。他の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ試薬の末端は１つまたはそれ以上のオーバーハングを持つ。
【０１３２】
特定の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ試薬の第一および第二オリゴヌクレオチド配列は、化学的に合成可能で、典型的に化学的に合成される別のオリゴヌクレオチド鎖上に存在する。幾つかの実施形態において、両方の鎖は、長さにして２６〜３５ヌクレオチドである。他の実施形態において、両方の鎖は、長さにして、２５〜３０または２６〜３０である。１つの実施形態において、両方の鎖は、長さにして２７ヌクレオチドであり、完全に相補的であり、平滑末端を持つ。本発明の特定の実施形態において、抗−ＡＲ  ＤｓｉＲＮＡの第一および第二配列は、別のＲＮＡオリゴヌクレオチド（鎖）上に存在する。１つの実施形態において、１つまたは両方のオリゴヌクレオチド鎖は、Ｄｉｃｅｒに対する基質として働くことが可能である。他の実施形態において、少なくとも１つの改変が、遺伝子発現を阻害することにおいて、二本鎖ＲＮＡ構造の有効性を最大化する方向で、Ｄｉｃｅｒが二本鎖ＲＮＡ構造に結合することを促進して存在する。本発明の特定の実施形態において、抗−ＡＲ  ＤｓｉＲＮＡ試薬は、第一鎖（センス鎖）の３’末端で平滑末端を有し、第二鎖（アンチセンス鎖）の３’末端で３’オーバーハングを有する抗−ＡＲ  ＤｓｉＲＮＡと、異なる長さの２つのオリゴヌクレオチド鎖からなる。ＤｓｉＲＮＡはまた、１つまたはそれ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）塩基置換基を含んでもよい。
【０１３３】
２つの別のオリゴヌクレオチドを含む好適なＤｓｉＲＮＡ組成物は、化学結合基によって、それらのアニーリング領域外で化学的に連結可能である。多くの好適な化学連結基が、本技術分野で公知であり、使用可能である。好適な基は、ＤｓｉＲＮＡにおけるＤｉｃｅｒ活性を妨げず、標的遺伝子から転写されたＲＮＡの指向性破壊と干渉しない。あるいは、２つの別のオリゴヌクレオチドは、ヘアピン構造が、ＤｓｉＲＮＡ組成物を作製している２つのオリゴヌクレオチドのアニーリングに際して産出されるように、第三オリゴヌクレオチドによって連結可能である。ヘアピン構造は、ＤｓｉＲＮＡ上のＤｉｃｅｒ活性を妨げず、標的ＲＮＡの指向性破壊を干渉しない。
【０１３４】
本明細書で使用するように、標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列（例えばＡＲ  ｍＲＮＡ）に「十分に相補的な」配列を持つｄｓＲＮＡ、例えばＤｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、ｄｓＲＮＡが、ＲＮＡｉ機構（例えばＲＩＳＣ複合体）または工程によって、標的ＲＮＡ（ｃＤＮＡ配列が列挙される場合、列挙されたｃＤＮＡ配列に相当するＲＮＡ配列）の崩壊を引き起こすのに十分な配列を持つことを意味する。ｄｓＲＮＡ分子は、すべてのアンチセンス鎖残基が、標的配列中の残基に相補的であるようにデザイン可能である。あるいは、前記分子の安定性を増加させるため、および／または処理活性を増強するために、分子内に置換を実施可能である。置換は、鎖内で実施可能であり、または鎖の末端での残基に対して実施可能である。特定の実施形態において、置換および／または修飾は、ＤｓｉＲＮＡ試薬内の特定の残基で実施する。そのような置換および／または修飾には、例えば、ＤｓｉＲＮＡ試薬のセンス鎖の３’末端位置からナンバリングした時に、位置１、２および３の１つまたはそれ以上の残基でのデオキシ−修飾、およびＤｓｉＲＮＡ試薬のアンチセンス鎖の３’末端残基での２’−Ｏ−アルキル（例えば２’−Ｏ−メチル）修飾の導入が含まれ、そのような修飾はまた、アンチセンス鎖の３’部分のオーバーハング位置にて、および活性ｓｉＲＮＡ試薬を形成するように処理されるＤｓｉＲＮＡ試薬の領域内に含まれる、ＤｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の他の残基にて実施される。先の修飾は、例として提供され、任意の様式で制限する意図はない。本発明の抗−ＡＲ  ＤｓｉＲＮＡ試薬にて実施可能な修飾および置換のさらなる記述を含む、好ましいＤｓｉＲＮＡ試薬の構造のさらなる考慮を以下に見ることができる。
【０１３５】
本明細書で使用するように、標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列（例えばＡＲ  ｍＲＮＡ）に「十分に相補的な」配列を持つｄｓＲＮＡは、ＤｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡがＲＮＡｉ機構（例えばＲＩＳＣ複合体）または工程によって標的ＲＮＡ（ｃＤＮＡが列挙される場合、列挙されたｃＤＮＡ入れつん移送補的なＲＮＡ配列）の破壊を引き起こすために十分な配列を持つことを意味する。例えば、ＲＡＮｉ機構または工程によって、標的ＲＮＡの破壊を引き起こすための、標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列に「十分相補的な」ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ活性の適切なアッセイ（例えば、以下実施例２にて記述したようなｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ）中の、標的ＲＮＡのレベルにおける検出可能な減少を引き起こすｄｓＲＮＡとして同定可能であり、またはさらなる実施例において、ＲＮＡｉ機構または工程によって、標的ＲＮＡの破壊を引き起こすための標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡに十分相補的なｄｓＲＮＡを、ｄｓＲＮＡ活性の適切なアッセイ中の、標的ＲＮＡのレベルにおける、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の減少を産出するｄｓＲＮＡとして同定可能である。さらなる実施例において、ＲＮＡｉ機構または工程によって標的ＲＮＡの破壊を引き起こすための、標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列に十分相補的なｄｓＲＮＡは、細胞または生命体における標的ＲＮＡまたはタンパク質レベルに関して、阻害活性の特定のレベルの期間の査定に基づいて同定可能である。例えば、ＲＮＡｉ機構または工程によって標的ＲＮＡの破壊を引き起こすための、標的ＲＮＡ配列またはｃＤＮＡに十分相補的なｄｓＲＮＡは、細胞または生命体への前記ｄｓＲＮＡの投与少なくとも４８時間後に、少なくとも２０％まで、標的ｍＲＮＡレベルを減少可能なｓｄＲＮＡとして同定可能である。好ましくは、ＲＮＡｉ機構または工程によって標的ＲＮＡの破壊を引き起こすための、標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列に十分相補的なｄｓＲＮＡは、細胞または生命体への前記ｄｓＲＮＡの投与少なくとも７２時間後に、少なくとも４０％まで、細胞または生命体への前記ｄｓＲＮＡの投与少なくとも４、５または７日後に、少なくとも４０％まで、細胞または生命体への前記ｄｓＲＮＡの投与少なくとも４８時間後に、少なくとも５０％まで、細胞または生命体への前記ｄｓＲＮＡの投与少なくとも７２時間後に、少なくとも５０％まで、細胞または生命体への前記ｄｓＲＮＡの投与少なくとも４、５または７日後に、少なくとも５０％まで、細胞または生命体への前記ｄｓＲＮＡの投与少なくとも４８時間後に、少なくとも８０％まで、細胞または生命体への前記ｄｓＲＮＡの投与少なくとも７２時間後に、少なくとも８０％まで、細胞または生命体への前記ｄｓＲＮＡの投与少なくとも４、５または７日後に、少なくとも８０％まで、標的ｍＲＮＡレベルを減少可能な��ｄＲＮＡとして同定可能である。
【０１３６】
ｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖のすべての残基が、標的分子内の残基に相補的であるようにデザイン可能である。あるいは、置換を、分子の安定性を増加させ、および／または処理活性を増強するために、前記分子内で実施可能である。置換は、鎖内にて実施可能であり、または鎖の末端での残基にて実施可能である。特定の実施形態において、置換および／または改変は、ＤｓｉＲＮＡ試薬内の特定の残基にて実施される。そのような置換および／または改変には、例えばＤｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端位置からナンバリングした場合、位置１、２および３の残基の１つまたはそれ以上でのデオキシ−改変、ＤｓｉＲＮＡ試薬のアンチセンス鎖の３’末端残基での、２’−Ｏ−アルキル（例えば２’−Ｏ−メチル）改変の導入が含まれ、そのような改変はまた、アンチセンス鎖の３’末端のオーバーハング位置、および活性ｓｉＲＮＡ試薬を形成するために処理されるＤｓｉＲＮＡ試薬の領域内に含まれるＤｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の交互残基にて実施される。以上の改変は、例として提供され、任意の様式にて制限の意図はない。本発明の抗−ＡＲ  ＤｓｉＲＮＡ試薬において実施可能な改変および置換のさらなる記述を含む、好ましいＤｓｉＲＮＡ試薬の構造のさらなる考慮を以下で見ることが可能である。
【０１３７】
第一配列が、本明細書の第二配列に関して「本質的に相補的である」として引用される場合、２つの配列は完全に相補的であってよく、またはそれらの根本的な適用にもっとも関連のある状態下、ハイブリッド形成する能力を維持したまま、それらはハイブリッド形成に際して、１つまたはそれ以上に、しかし一般的に４、３または２以下のミスマッチ塩基を形成してよい。しかしながら、２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリッド形成に際して、１つまたはそれ以上の一本鎖オーバーハングを形成するようにデザインされる場合、そのようなオーバーハングは、相補性の決定に関して、ミスマッチとして見なされるものではない。例えば、より長いオリゴヌクレオチドが、より短いオリゴヌクレオチドに対して完全に相補的である２１ヌクレオチドの配列を含む場合、長さにして２１ヌクレオチドの１つのオリゴヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡと、長さにして２３ヌクレオチドの他のオリゴヌクレオチドがまた、本発明の目的に対して、「完全に相補的である」としてまた引用されてよい。
【０１３８】
本明細書で使用する、語句「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」は、以上で定義したような、２つの逆平行および本質的に相補的な核酸鎖を含む二本鎖構造を持つ、リボ核酸分子の複合体を意味する。二本鎖構造を形成する２つの鎖は、１つのより長いＲＮＡ分子の異なる位置であってよく、別々のＲＮＡ分子であってよい。別々のＲＮＡ分子の場合、そのようなｄｓＲＮＡはしばしば、ｓｉＲＮＡ（「短い干渉ＲＮＡ」）またはＤｓｉＲＮＡ（「Ｄｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡｓ」）として引用される。２つの鎖が１つのより長い分子の一部分である場合、したがって二本鎖構造を形成する１つの鎖の３’末端と、個々の他の鎖の５’末端間のヌクレオチドの連鎖によって連結される場合、連結しているＲＮＡ鎖は、「ヘアピンループ」、「短ヘアピンＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」として引用される。２つの鎖が、二本鎖構造を形成する１つの鎖の３’末端と、個々の他の鎖の５’末端間のヌクレオチドの連鎖以外の方法によって共有的に連結する場合、連結している構造は、「リンカー」として引用される。ＲＮＡ鎖は、同一または異なる数のヌクレオチドを持ってよい。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡのもっとも短い鎖中のヌクレオチドの数マイナス二本鎖中に存在する任意のオーバーハングである。二本鎖構造に加えて、ｄｓＲＮＡは、１つまたはそれ以上のヌクレオチドオーバーハングを含んでよい。加えて、本明細書で使用するところの「ｄｓＲＮＡ」には、多重ヌクレオチドにおける本質的改変を含み、本明細書で開示されたか、本技術分野で公知のすべての型の改変を含む、リボヌクレオチド、ヌクレオシド間結合、末端基、キャップおよび共役部位への化学的改変が含まれうる。ｓｉＲＮＡ−またはＤｓｉＲＮＡ−型分子内で使用されるような、任意のそのような改変は、本明細書および請求項の目的に対して、「ｄｓＲＮＡ」によって包含される。
【０１３９】
語句「二本鎖領域」は、ワトソン−クリック塩基対化または相補的であるか、または本質的に相補的であるオリゴヌクレオチド鎖間の二本鎖に対して許容する他の様式のいずれかによって、互いに塩基対を形成する２つの相補的であるか、または本質的に相補的なオリゴヌクレオチド中の領域を意味する。例えば、２１ヌクレオチドユニットを持つオリゴヌクレオチド鎖は、２１ヌクレオチドユニットを持つオリゴヌクレオチドは、２１ヌクレオチドユニットの他のオリゴヌクレオチドと塩基対化可能であり、「二本鎖領域」が１９塩基対からなるように、各鎖上の１９塩基のみが、相補的であるか、本質的に相補的である。残りの塩基対は、例えば、５’および３’オーバーハングとして存在する。さらに、二本鎖領域内で、１００％相補性は、必要ではなく、本質的な相補性が二本鎖領域内で許容可能である。本質的な相補性は、生物学的条件下でアニーリング可能であるような、鎖間の相補性を意味する。２つの鎖が、生物学的条件下でアニーリング可能であるかどうかを実験的に決定するための技術が、本技術分野でよく公知である。あるいは、２つの鎖を、それらが互いにアニールするかどうかを決定するために、合成し、生物学的条件下で一緒に加えることが可能である。
【０１４０】
多数の塩基にわたり塩基対を形成する一本鎖核酸が、「ハイブリッドする」と呼ばれる。ハイブリッド形成は、生理学的および生物学的に関連のある条件（例えば、細胞内：ｐＨ７．２、１４０ｍＭカリウムイオン、細胞外ｐＨ７．４、１４５ｍＭナトリウムイオン）下で典型的に決定される。ハイブリッド形成条件は一般的に、一価カチオンと生物学的に許容可能な緩衝液を含み、二価カチオン、複合体アニオン、例えばグルタミン酸カリウムからのグルタミン酸、スクロースのような非荷電種、および試料中の水の活性を減少させるための不活性ポリマー、例えばＰＥＧを含んでよく、または含まなくてよい。そのような条件には、塩基対が形成される条件が含まれる。
【０１４１】
ハイブリッド形成は、二本鎖を形成している一本鎖核酸を乖離させるために必要な温度、すなわち（融解温度、Ｔｍ）によって測定される。ハイブリッド形成条件はまた、塩基対が形成されうる条件である。種々の厳密性条件を使用して、ハイブリッド形成を決定可能である（Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．ａｎｄ  Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９；Ｋｉｍｍｅｌ．Ａ．Ｒ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７を参照のこと）。厳密性温度条件は通常、少なくとも約３０℃の、より好ましくは少なくとも約３７℃、最も好ましくは少なくとも約４２℃の温度を含む。長さにして５０塩基対以下であると予想されるハイブリッドに対するハイブリッド形成温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）の５〜１０℃下であるべきであり、そこでＴｍは、以下の等式にしたがって決定される。長さにして１８塩基対以下のハイブリッドに対して、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の＃）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の＃）。長さにして１８〜４９塩基対のハイブリッドに対して、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、式中Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、［Ｎａ＋］はハイブリッド形成緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣ＝０．１６５Ｍに対する［Ｎａ＋］）。例えば、ハイブリッド形成決定緩衝液を表１に示す。
【０１４２】
【表１】
2013534424.tif 000003
【０１４３】
ハイブリッド形成条件における有用な変化が、当業者に簡単に理解されるであろう。ハイブリッド形成技術は、当業者によく公知であり、例えば、Ｂｅｎｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６：１８０，１９７７）；Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｈｏｇｎｅｓｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ７２：３９６１，１９７５）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ２００１）；Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋにて記述されている。
【０１４４】
本明細書で使用するところの、「オリゴヌクレオチド鎖」は、一本鎖核酸分子である。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、改変ヌクレオチド（例えば２’改変を持つヌクレオチド、合成塩基類似体など）またはそれらの混合物を含んでよい。そのような改変オリゴヌクレオチドは、例えば細胞取込の増強、ヌクレアーゼの存在下での安定性の増加のような特性のために、天然の形態に対して好ましい。
【０１４５】
本明細書で使用するところの語句「リボヌクレオチド」は、天然および合成、非改変および改変リボヌクレオチドを包含する。改変には、糖部分に対する、塩基部分に対する、および／またはオリゴヌクレオチド中のリボヌクレオチド間の結合に対する変化が含まれる。本明細書で使用するところの語句「リボヌクレオチド」はとりわけ、２’リボース環位置にて、単一プロトン基を有するヌクレオチドである、デオキシリボヌクレオチドを除外する。
【０１４６】
本明細書で使用するところの語句「デオキシリボヌクレオチド」は、天然および合成、非改変および改変デオキシリボヌクレオチドを包含する。改変には、糖部分に対する、塩基部分に対する、および／またはオリゴヌクレオチド中のデオキシリボヌクレオチド間の結合に対する変化が含まれる。本明細書で使用するところの語句「デオキシリボヌクレオチド」にはまた、ｄｓＲＮＡ試薬のＤｉｃｅｒ開裂を許容しない改変リボヌクレオチド、例えば、そのような残基の結合においてＤｉｃｅｒ開裂が発生することを許容しない、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ホスホロチオエート−改変リボヌクレオチド残基なども含まれる。
【０１４７】
本明細書で使用するところの語句「ＰＳ−ＮＡ」は、ホスホロチオエート−改変ヌクレオチド残基を意味する。語句「ＰＳ−ＮＡ」はしたがって、ホスホロチオエート−改変リボヌクレオチド（「ＰＳ−ＲＮＡｓ」」）およびホスホロチオエート−改変デオキシリボヌクレオチド（「ＰＳ−ＤＮＡｓ」）両方を包含する。
【０１４８】
本明細書で使用するところの「Ｄｉｃｅｒ」は、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ−含有分子、例えば二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはプレ−ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を、通常３’末端に２塩基オーバーハングを持つ、二本鎖核酸断片１９〜２５ヌクレオチド長に開裂する、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩファミリー内のエンドリボヌクレアーゼを意味する。本発明のｄｓＲＮＡに関して、本発明の試薬のｄｓＲＮＡ領域によって形成される二本鎖は、Ｄｉｃｅｒによって認識され、二本鎖の少なくとも１つの鎖上Ｄｉｃｅｒ基質である。Ｄｉｃｅｒは、ＲＮＡ干渉経路中の第一段階を触媒し、結果として、標的ＲＮＡの分解となる。ヒトＤｉｃｅｒのタンパク質配列が、参考文献によって本明細書で組み込まれた、登録番号ＮＰ＿０８５１２４下、ＮＣＢＩデータベースにて提供される。
【０１４９】
Ｄｉｃｅｒ「開裂」は、以下のように決定される（例えば、Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １８：１８７-２００（２００８）を参照のこと）。Ｄｉｃｅｒ開裂アッセイにおいて、ＲＮＡ二本鎖（１００ｐｍｏｌ）を、１ユニットの組換え体ヒトＤｉｃｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）あり、またはなしで、２０μＬの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２中、３７℃にて１８〜２４時間インキュベートする。試料を、Ｐｅｒｆｏｒｍａ  ＳＲ９６−穴プレート（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて脱塩する。Ｄｉｃｅｒでの前処理および後処理二本鎖ＲＮＡｓの電子噴霧イオン化液体クロマトグラフィー質量分析（ＥＳＩ−ＬＣＭＳ）を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ  ＴＳＱ７０００、Ｘｃａｌｉｂｕｒデータシステム、ＰｒｏＭａｓｓデータ処理ソフトウェアおよびＰａｒａｄｉｇｍ  ＭＳ４  ＨＰＬＣ（Ｍｉｃｈｒｏｍ  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）からなるＯｌｉｇｏ  ＨＴＣＳシステム（Ｎａｖａｔｉａ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ：Ｈａｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）を用いて実施する。本アッセイにおいて、Ｄｉｃｅｒ開裂が、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％のＤｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡ（すなわち２５〜３０ｂｐ、ｄｓＲＮＡ、好ましくは２６〜３０ｂｐ  ｄｓＲＮＡ）が、より短いｄｓＲＮＡ（例えば、１９〜２３ｂｐ  ｄｓＲＮＡ、好ましくは２１〜２３ｂｐ  ｄｓＲＮＡ）に開裂される場で発生する。
【０１５０】
本明細書で使用するところの「Ｄｉｃｅｒ開裂部位」は、ＤｉｃｅｒがｄｓＲＮＡ（例えば、本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬のｄｓＲＮＡ領域）を開裂する部位を意味する。Ｄｉｃｅｒは、典型的にｄｓＲＮＡｓのセンスおよびアンチセンス鎖両方を開裂する、２つのＲＮａｓｅＩＩＩドメインを含む。ＲＮａｓｅＩＩＩドメインとＰＡＺドメイン間の平均距離が、産出する短い二本鎖核酸断片の長さを決定し、この距離は、変化可能である（Ｍａｃｒａｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１１：１９５−８）。図１で示すように、Ｄｉｃｅｒは、アンチセンス鎖の３’末端から除去された、２１番目と２２番目のヌクレオチド間の部位にて、そしておよびセンス鎖の５’末端より除去された、２１番目と２２番目のヌクレオチド間の相当する部位で、２ヌクレオチド３’オーバーハングを持つアンチセンス鎖を有する、本発明の特定の二本鎖リボ核酸を開裂すると考案される。図１にて描写したものと異なる、ｄｓＲＮＡ分子に対する考案された、および／または一般的なＤｉｃｅｒ開裂部位が、Ｍａｃｒａｅ  ｅｔ  ａｌ．にて記述されたものを含む、本技術分野で認識される方法を介して、同様に同定されうる。図１で描写したＤｉｃｅｒ開裂事象が、２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡを産出する一方で、ｄｓＲＮＡ（例えばＤｓｉＲＮＡ）のＤｉｃｅｒ開裂が結果として、長さにして１９〜２３ヌクレオチドのＤｉｃｅｒ−処理ｓｉＲＮＡ長の産出となりうることが留意される。実際、特定の実施形態において、二本鎖ＤＮＡ領域は、２１マーではなく、典型的に非優先１９マーまたは２０マーｓｉＲＮＡの一般的なＤｉｃｅｒ切除を指向する目的のために、ｄｓＲＮＡ内に含まれてよい。
【０１５１】
本明細書で使用するところの、「オーバーハング」は、ｄｓＲＮＡの５’末端または３’末端にて１つまたはそれ以上の遊離末端を持つ二本鎖の文脈において、対になっていないヌクレオチドを意味する。特定の実施形態において、オーバーハングは、アンチセンス鎖またはセンス鎖上の３’または５’オーバーハングである。いくつかの実施形態において、オーバーハングは、１〜６ヌクレオチド、任意に１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、３〜６、３〜５、３〜４、４〜６、４〜５、５〜６ヌクレオチド、または１、２、３、４、５または６ヌクレオチドの長さを持つ３’オーバーハングである。
【０１５２】
本発明のｄｓＲＮＡは、二本鎖構造を形成するためにハイブリッド形成するのに十分相補的である２つのＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡの１つの鎖（アンチセンス鎖）は、ＡＲ標的遺伝子の発現の間に形成されたｍＲＮＡの配列から誘導された、標的配列に本質的に相補的な、一般的には完全に相補的な相補性の領域を含み、他の鎖（センス鎖）は、アンチセンス鎖に相補的な領域を含み、それによって２つの鎖は、好適な条件下で混合した時に、ハイブリッド形成し、二本鎖構造を形成する。一般的に、二本鎖構造は、長さにして１５〜３５、任意に２５〜３０、２６〜３０、１８〜２５、１９〜２４または１９〜２１塩基対である。同様に、標的配列に相補的な領域は、長さにして、１５〜３５、任意に１８〜３０、２５〜３０、１９〜２４または１９〜２１ヌクレオチドである。本発明のｄｓＲＮＡはさらに、１つまたはそれ以上の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含んでよい。（一般的に長さにして少なくとも２５塩基対の）ＤｓｉＲＮＡｓおよびｓｉＲＮＡｓ（特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡｓの二本鎖構造は、２０〜２３、任意に特に２１塩基対）を含む、長さにして１５〜３５塩基対の二本鎖構造を含むｄｓＲＮＡｓが、ＲＮＡ干渉を誘導することにおいて効果的であり得ることが同定されてきた（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  ２０：６８７７−６８８８）。また、２０塩基対より短い二本鎖を有するｄｓＲＮＡｓも同様に効果的であり得ることが同定されてきた（例えば１５、１６、１７、１８または１９塩基対）。特定の実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡは、１９ヌクレオチドまたはそれ以上の長さの少なくとも１つの鎖を含みうる。特定の実施形態において、以下の表１０の配列の１つに相補的な配列マイナス１つまたは両方の末端上の２〜３個のヌクレオチドを含む、より短いｄｓＲＮＡｓが、以上で、および表２〜５および７〜１０にて記述したｄｓＲＮＡｓと比較して同様に効果的であり得ることが合理的に予想されうる。したがって、表１０の配列の１つに十分相補的な、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の連ヌクレオチドの部分配列を含み、完全配列を含むｄｓＲＮＡから最高５、１０、１５、２０、２５または３０％阻害まで、本発明で記述したようなアッセイにて、ＡＲ標的遺伝子の発現を阻害するそれらの能力において異なるｄｓＲＮＡｓが、本発明によって企図される。１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡｓの少なくとも１つの末端が、１〜５、任意に１〜４、特定の実施形態において、１または２ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを持つ。少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを持つ特定のｄｓＲＮＡ構造は、ｄｓＲＮＡ分子の両方の間端にて、塩基対形成平滑末端を有する同等のものと比較して、優れた阻害特性を有する。
【０１５３】
本明細書で使用するところの語句「ＲＮＡ処理」は、以下でより詳細に記述されている（以下「ＲＮＡ処理」項目を参照のこと）ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはＲＮａｓｅ  Ｈ経路の構成要素（例えばＤｒｏｓｈａ、Ｄｉｃｅｒ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２または他のＲＩＳＣエンドリボヌクレアーゼおよびＲＮａｓｅＨ）によって達成される処理活性を意味する。本語句は、ＲＮＡの５’キャッピングの転写後工程と、非−ＲＩＳＣまたは非−ＲＮａｓｅ  Ｈ−仲介工程を介したＲＮＡの分解からはっきり区別される。ＲＮＡのそのような「分解」は、種々の形態、例えば脱アデニル化（３’ポリ（Ａ）テールの除去）、および／または１つまたはそれ以上の種々のエンド−またはエキソ−ヌクレアーゼ（例えばＲＮａｓｅＩＩＩ、ＲＮａｓｅＰ、ＲＮａｓｅＴ１、ＲＮａｓｅＡ（１、２、３、４／５）、オリゴヌクレオチダーゼなど）による、ＲＮＡの本体の部分または全てのヌクレアーゼ消化、を取り得る。
【０１５４】
「相同配列」によって、遺伝子、遺伝子転写産物および／または非コードポリヌクレオチドのような、１つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列によって共有されるヌクレオチド配列を意味する。例えば、相同配列は、サイトカインおよびその相当する受容体のような、遺伝子ファミリーの異なるメンバー、異なるタンパク質エピトープ、異なるタンパク質イソフォームまたは完全に相違する遺伝子のような、関連するが異なるタンパク質をコードしている２つまたはそれ以上の遺伝子によって共有されるヌクレオチド配列でありうる。相同配列は、非コードＤＮＡまたはＲＮＡ、制御配列、イントロン、および転写制御または調節の部位のような、２つまたはそれ以上の非コードポリヌクレオチドによって共有されるヌクレオチド配列でありうる。相同配列はまた、１つ以上のポリヌクレオチド配列によって共有される保存配列領域を含みうる。相同性は、部分相同配列（例えば９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％など）もまた本発明で企図されるので、完全相同性（例えば１００％）である必要はない。実際、本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬のデザインおよび利用は、本明細書で記述したＤｓｉＲＮＡ試薬と完全な相補性を有するＡＲの標的ＲＮＡｓに対してのみでなく、前記ＤｓｉＲＮＡ試薬に対して例えばただ９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％などだけの相補的である配列を有するＡＲ  ＲＮＡｓに対しての、そのようなＤｓｉＲＮＡ試薬を利用する可能性も企図する。同様に、本発明の本明細書で記述されたＤｓＲＮＡ試薬は、前記ＤｓｉＲＮＡ試薬と標的ＡＲ  ＲＮＡ、例えばＡＲの特定の対立バリアント（例えば増強された治療的対象の対立遺伝子）間の相補性の程度を増強するために、当業者によって簡単に変更されうる。実際、標的ＡＲ配列に関する挿入、欠損および単一点変異を持つＤｓｉＲＮＡ試薬配列がまた、阻害に対して効果的であり得る。あるいは、ヌクレオチド類似体置換または挿入を持つＤｓｉＲＮＡ試薬配列が阻害に対して効果的であり得る。
【０１５５】
配列同一性は、本技術分野で公知の配列比較および整列アルゴリズムによって決定してよい。２つの核酸配列の（または２つのアミノ酸配列の）パーセント同一性を決定するために、配列を比較の目的で整列させる（例えばギャップを、最適配列のために、第一配列または第二配列中に導入可能である）。相当するヌクレオチド（またはアミノ酸）位置でのヌクレオチド（またはアミノ酸残基）をついで比較する。第一配列中の位置が、第二配列中の相当する位置と同様の残基によって占有される場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、配列によって共有された同一の位置の数の関数であり（すなわち％相同性＝同一位置の＃／位置．時間．１００の総＃）、任意に、導入されたギャップの数および／または導入されたギャップの長さに対するスコアにペナルティーをかす。
【０１５６】
配列の比較と、２つの配列間の配列パーセント同一性の決定を、数学的アルゴリズムを用いて実施可能である。１つの実施形態において、整列は、十分な同一性をもって整列させた整列の特定の部分にわたり、しかし低度の同一性を持つ部分にはわたらず（すなわち局所配列）産出された。配列の比較のために使用した局所整列アルゴリズムの好ましい、非限定例は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−７７にてのように改変された、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−６８のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）内に組み込まれる。
【０１５７】
他の実施形態において、整列が最適化されるギャップ整列は、適切なギャップを導入することによって形成され、パーセント同一性が、整列した配列の長さにわたり決定される（すなわちギャップ整列）。比較の目的のために、ギャップ整列を得るために、ギャップＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２にて記述したように使用可能である。他の実施形態において、整列が最適化されるグローバル整列が、適切なギャップを導入することによって形成され、パーセント同一性が、整列した配列の全長にわたり決定される（すなわちグローバル整列）。配列のグローバル比較のために利用される数学的アルゴリズムの好ましい、非限定例は、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列整列ソフトウェアパッケージの一部である、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）内に組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する時に、ＰＡＭ１２０ウェイト残基表、１２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーを使用可能である
【０１５８】
ＤｓｉＲＮＡアンチセンス鎖およびＡＲ  ＲＮＡ配列の部分間の８０％より大きな配列同一性、例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性が好ましい。あるいは、ＤｓｉＲＮＡは、ＡＲ  ＲＮＡの一部とハイブリッド形成可能なヌクレオチド配列（またはオリゴヌクレオチド配列）として機能的に定義してよい（例えば、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１２〜１６時間の５０℃または７０℃ハイブリッド形成と続く洗浄）。さらなる好ましいハイブリッド形成条件には、１×ＳＳＣ中７０℃、または１×ＳＳＣ中５０℃、５０％ホルムアミドでのハイブリッド形成と、続く０．３×ＳＳＣ中７０℃での洗浄、または４×ＳＳＣ中７０℃、または４×ＳＳＣ中５０℃、５０％ホルムアミドでのハイブリッド形成と、続く１×ＳＳＣ中６７℃での洗浄が含まれる。長さにして５０塩基対以下であると見込まれるハイブリッドに対するハイブリッド形成温度は、当該ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５〜１０℃低いべきであり、Ｔｍは以下の等式にしたがって決定される。長さにして１８塩基対より少ないハイブリッドに対して、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の＃）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の＃）。長さにして１８〜４９塩基対のハイブリッドに対して、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、式中Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、［Ｎａ＋］はハイブリッド形成緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣ＝０．１６５Ｍに対する［Ｎａ＋］）。ポリヌクレオチドハイブリッド形成に対する厳密性条件のさらなる例が、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，９および１１章、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，項目２．１０および６．３〜６．４にて提供される。等しいヌクレオチド配列の長さは、少なくとも１０、１２、１５、１７、２０、２２、２５、２７または３０塩基であってよい。
【０１５９】
「保存配列領域」によって、ポリヌクレオチド内の１つまたはそれ以上の領域のヌクレオチド配列が、世代間で、または１つの生物学的システム、対象または生命体から、他の生物学的システム、対象または生命体までで有意に変化しないことを意味する。ポリヌクレオチドは、コードおよび非コードＤＮＡおよびＲＮＡ両方を含みうる。
【０１６０】
「センス領域」によって、ＤｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス領域に対して相補性を持つＤｓｉＲＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。さらに、ＤｓｉＲＮＡ分子のセンス領域は、標的核酸配列と相同性を持つ核酸配列を含みうる。
【０１６１】
「アンチセンス領域」によって、標的核酸配列に対して相補性を持つＤｓｉＲＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。さらに、ＤｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス領域は、ＤｓｉＲＮＡ分子のセンス領域に対して相補性を持つ核酸配列を含む。
【０１６２】
本明細書で使用するところの「アンチセンス鎖」は、標的ＲＮＡのものに対して相補的な配列を持つ、一本鎖核酸分子を意味する。アンチセンス鎖が、塩基類似体で改変されたヌクレオチドを含む場合、その全長にわたり相同的である必要はないが、少なくとも標的ＲＮＡにハイブリッドしなければならない。
【０１６３】
本明細書で使用するところの「センス鎖」は、アンチセンス鎖のものに対して相補的な配列を持つ、一本鎖核酸分子を意味する。アンチセンス鎖が、塩基類似体で改変されたヌクレオチドを含む場合、センス鎖は、アンチセンス鎖の全長にわたり相補的である必要はないが、しかしアンチセンス鎖と少なくとも二本鎖を形成しなければならない。
【０１６４】
本明細書で使用するところの「ガイド鎖」は、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ−含有分子の一本鎖核酸分子を意味し、結果としてＲＮＡ干渉となる、標的ＲＮＡのものと十分相補的である配列を持つ。ＤｉｃｅｒによるｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ−含有分子の開裂後、ガイド鎖の断片が、ＲＩＳＣに結合したままとなり、ＲＩＳＣ複合体の一成分として標的ＲＮＡに結合し、ＲＩＳＣによって標的ＲＮＡの開裂を促進する。本明細書で使用するように、ガイド鎖は、連続一本鎖核酸を意味する必要はなく、好ましくはＤｉｃｅｒによる開裂の部位で、不連続性を含んでよい。ガイド鎖はアンチセンス鎖である。
【０１６５】
本明細書で使用するところの「パッセンジャー鎖」は、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ−含有分子のオリゴヌクレオチド鎖を意味し、ガイド鎖のものと相補的である配列を持つ。本明細書で使用するように、パッセンジャー鎖は、連続一本鎖核酸を意味する必要はなく、好ましくはＤｉｃｅｒによる開裂の部位で、不連続性を含んでよい。パッセンジャー鎖はセンス鎖である。
【０１６６】
「標的核酸」によって、その発現、レベルまたは活性が調整されるべきである核酸配列を意味する。標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡでありうる。ＡＲを標的とする試薬に関して、特定の実施形態において、標的核酸はＡＲ  ＲＮＡでありうる。ＡＲ  ＲＮＡ標的部位はまた、相当するｃＤＮＡ配列によって区別しないで参照されうる。ＡＲのレベルはまた、ＡＲの上流効果器の標的化を介して標的化されてよく、または調整されたまたは誤調節されたＡＲの効果がまた、ＡＲシグナル伝達経路中のＡＲの下流の分子の標的化によって調整されてもよい。
【０１６７】
「相同性」によって、核酸が、伝統的なワトソン−クリック、または他の非伝統的な型のいずれかによって、他の核酸配列と水素結合を形成可能であることを意味する。本発明の核酸分子に関して、その相補的な配列との核酸分子に対する結合自由エネルギーは、核酸の関連ある機能、例えばＲＮＡｉ活性を進めることを許容するのに十分である。核酸分子に対する結合自由エネルギーの決定が、本技術分野でよく公知である（例えば、Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，ＣＳＨ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩ  ｐｐ．１２３−１３３；Ｆｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：９３７３−９３７７；Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３−３７８５を参照のこと）。パーセント相補性は、第二核酸配列と水素結合を形成可能な（例えばワトソン−クリック塩基対化）核酸分子中の連続残基の割合を示唆する（例えば１０ヌクレオチドを持つ第二核酸配列に対して対となる、第一オリゴヌクレオチド中の合計１０ヌクレオチドのうち５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドが、それぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および１００％相同性を表す）。「完全に相補的」は、核酸配列の連続残基の全てが、第二核酸配列中の同一の数の連続残基と水素結合することを意味する。１つの実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子は、１つまたはそれ以上の標的核酸分子またはそれらの部分に対して相補的である、１９〜３０（例えば１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０またはそれ以上）のヌクレオチドを含む。
【０１６８】
１つの実施形態において、ＡＲ遺伝子発現を下方制御または減少させる本発明のＤｓｉＲＮＡ分子を、対象または生命体内のＡＲ−関連疾患または疾病（例えば癌）を治療する、予防するまたは減少させるために使用する。
【０１６９】
本発明の１つの実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子の各配列は、独立して、長さにして２５〜３５ヌクレオチド、特定の実施形態において、長さにして２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５ヌクレオチドである。他の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡ二本鎖は独立して、２５〜３０塩基対（例えば２５、２６、２７、２８、２９または３０）を含む。他の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子の１つまたはそれ以上の鎖は、標的（ＡＲ）核酸分子に相補的である、１９〜３５ヌクレオチド（例えば、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５）を独立して含む。特定の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子は、長さにして２５〜３４ヌクレオチド（例えば長さにして２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４ヌクレオチド、任意に全てのそのようなヌクレオチドは、反対の鎖の同種ヌクレオチドと塩基対を形成する）の二本鎖ヌクレオチドの長さを有する。（本発明の典型的ＤｓｉＲＮＡ分子を図１および以下に示す。
【０１７０】
本明細書で使用するところの「細胞」は、その通常の生物学的意味において使用され、全多細胞生物を意味せず、例えば特にヒトを意味しない。細胞は、生命体、例えば鳥類、植物およびヒト、ウシ、ヒツジ、類人猿、サル、ブタ、イヌおよびネコのような哺乳動物中に存在しうる。細胞は、原核生物（例えば細菌細胞）または真核生物（例えば哺乳動物または植物細胞）でありうる。細胞は、体細胞または生殖細胞由来、全能細胞または多能性細胞、分裂細胞または非分裂細胞でありうる。細胞はまた、配偶子または胚、幹細胞または完全に分化した細胞から分化してよく、または含んでよい。特定の様態内で、語句「細胞」は、本明細書の１つまたはそれ以上の単離されたｄｓＲＮＡ分子を含むヒト細胞のような特に哺乳動物細胞を意味する。特定の様態において、細胞は、結果として標的核酸のＲＮＡ干渉となる、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ−含有分子を有し、ＲＮＡｉに対して必要とされるタンパク質およびタンパク質複合体、例えばＤｉｃｅｒおよびＲＩＳＣを含む。
【０１７１】
特定の実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡｓ（「
ＤｓｉＲＮＡ」）である。ＤｓｉＲＮＡｓは、ｄｉｃｅｒ基質ではない阻害核酸（「非ＤｓｉＲＮＡｓ」）と比較して、特定の利点を有しうる。そのような利点には、非ＤｓｉＲＮＡに対して、ＤｓｉＲＮＡの効果の期間の増強、ならびに各阻害核酸が好適に処方され、同一の濃度で、哺乳動物細胞内の阻害活性に関して査定される時、非ＤｓｉＲＮＡ（例えば１９〜３２マーｓｉＲＮＡと比較して、ＤｓｉＲＮＡの阻害活性の増強が含まれるが、これらに限定はされない（後者のシナリオの場合、ＤｓｉＲＮＡは、非−ＤｓｉＲＮＡよりもより強力なものとして同定されうる）。非−ＤｓｉＲＮＡに対するＤｓｉＲＮＡの強度の増強の検出はしばしば、結果としてＤｉｓＲＮＡが、標的ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）におけるおよそ３０〜７０％のノックダウン活性を誘発することとなる、処方された濃度（例えばｄｓＲＮＡのトランスフェクション濃度）でほとんど簡単に達成される。活性ＤｓｉＲＮＡに関して、そのようなノックダウン活性のレベルは、ほとんどの場合、１ｎＭまたはそれ以下の好適に処方されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ哺乳動物細胞ＤｓｉＲＮＡｓトランスフェクション濃度で達成され、特定の例において、２００ｐＭまたはそれ以下、１００ｐＭまたはそれ以下、５０ｐＭまたはそれ以下、２０ｐＭまたはそれ以下、１０ｐＭまたはそれ以下、５ｐＭまたはそれ以下、または１ｐＭまたはそれ以下のＤｓｉＲＮＡトランスフェクション濃度で観察される。実際、標的ＲＮＡの３０〜７０％ノックダウンが観察される正確な濃度のＤｓｉＲＮＡｓ間の変動に起因して、効果的な濃度の範囲にわたる、ＤｓｉＲＮＡｓおよび非ＤｓｉＲＮＡｓの阻害活性の査定を介した、ＩＣ５０曲線の構築が、非ＤｓｉＲＮＡ阻害試薬に対するＤｓｉＲＮＡの強度の増強を検出するための好ましい方法である。
【０１７２】
特定の実施形態において、（Ｄｉｃｅｒ開裂前、最初に形成されたような状態での）ＤｓｉＲＮＡは、その中に含まれる１９、２０、２１、２２または２３塩基対配列よりも、哺乳動物細胞中のＡＲ標的遺伝子発現を減少させることにおいて、より強力である。特定のそのような実施形態において、ｄｉｃｅｒ開裂前のＤｓｉＲＮＡは、その中に含まれる１９〜２１マーよりもより強力である。任意に、ｄｉｃｅｒ開裂前のＤｓｉＲＮＡは、（それによって、ｄＴｄＴオーバーハングを持つ２１ヌクレオチド鎖長を有するｓｉＲＮＡを形成する）対称ｄＴｄＴオーバーハングで合成される、その中に含まれた１９塩基対二本鎖よりも強力である。特定の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、本発明のＤｓｉＲＮＡに対して列挙される２１ヌクレオチド標的配列の少なくとも１５ヌクレオチドを標的とする、１９〜２３マーｓｉＲＮＡ（例えばｄＴｄＴオーバーハングを持つ１９塩基対二本鎖）よりも強力である（理論に結びつける希望はなしに、ＤｓｉＲＮＡに対するそのような標的部位の同一性は、ＤｓｉＲＮＡに対するＡｇｏ２開裂部位の同定を介して同定される。いったんＤｓｉＲＮＡのＡｇｏ２開裂部位がＤｓｉＲＮＡに対して決定されたらば、任意の他の阻害ｄｓＲＮＡに対するＡｇｏ２開裂部位の同定が実施され、それらのＡｇｏ２開裂部位を整列可能であり、それによって多数のｄｓＲＮＡｓに対する予想された標的ヌクレオチド配列の整列が決定される）。特定の関連した実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、本発明のＤｓｉＲＮＡに対して列挙される２１ヌクレオチド標的配列の少なくとも２０ヌクレオチドを標的とする、１９〜２３マーｓｉＲＮＡよりも強力である。任意に、ＤｓｉＲＮＡは、本発明のＤｓｉＲＮＡに対して列挙される同一の２１ヌクレオチド標的配列を標的とする、１９〜２３マーｓｉＲＮＡよりも強力である。特定の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、本発明のＤｓｉＲＮＡに対して列挙される同一の２１ヌクレオチド標的配列を標的とする、任意の２１マーｓｉＲＮＡよりも強力である。任意に、ＤｓｉＲＮＡは、本発明のＤｓｉＲＮＡに対して列挙される同一の２１ヌクレオチド標的配列を標的とする、任意の２１または２２マーｓｉＲＮＡよりも強力である。特定の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、本発明のＤｓｉＲＮＡに対して列挙される同一の２１ヌクレオチド標的配列を標的とする任意の２１、２２または２３マーｓｉＲＮＡより強力である。以上で言及するように、そのような強度査定は、１ｎＭまたはそれ以下の濃度で、好適に処方された（例えば適切なトランスフェクト試薬で処方された）ｄｓＲＮＡｓにおいてもっとも効果的に実施される。任意に、ＩＣ５０査定を、効果的な阻害濃度の範囲にわたる活性を評価するために実施し、それによって、そのようにアッセイされたｄｓＲＮＡｓの相対強度のしっかりとした比較が許容される。
【０１７３】
本発明のｄｓＲＮＡ分子は、直接加えられ、または脂質（例えばカチオン性脂質）と複合体化、リポソーム内にパッケージ、または標的細胞または組織に伝達可能である。核酸または核酸複合体を、バイオポリマー内へのそれらの組み込みあり、またはなしで、直接皮膚適用、経皮適用、または注射を介して、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、関連する組織に局所投与可能である。特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、図１で示す配列と、以下の典型構造を含む。そのような核酸分子の実施例は、これらの図および典型構造にて定義した構造から本質的になる。さらに、そのような試薬を、ＤｓｉＲＮＡ試薬の改変パターン化の以下の記述にしたがって改変する場合、図１にて記述された構造物の化学的に改変された形態、および以下の典型構造を、図１および以下の典型構造のＤｓｉＲＮＡ試薬に対して記述した全ての使用において利用可能である。
【０１７４】
他の様態において、本発明は、本発明の１つまたはそれ以上のＤｓｉＲＮＡを含む哺乳動物細胞を提供する。１つまたはそれ以上のＤｓｉＲＮＡ分子は独立して、同一または異なる部位を標的とすることが可能である。
【０１７５】
「ＲＮＡ」は、少なくとも１つの、好ましくは少なくとも４、８および１２リボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。少なくとも４、８または１２ＲＮＡ残基は連続してよい。「リボヌクレオチド」によって、β−Ｄ−リボフラノース部位の２’位でヒドロキシル基を持つヌクレオチドを意味する。本語句には、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的に精製したＲＮＡのような単離ＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え体産出ＲＮＡ、ならびに１つまたはそれ以上のヌクレオチドの添加、欠損、置換および／または変更によって、天然に存在するＲＮＡとは異なる変更ＲＮＡが含まれる。そのような変更には、例えばＲＮＡの１つまたはそれ以上のヌクレオチドでの、ＤｓｉＲＮＡの末端または内部へのような、非ヌクレオチド物質の添加が含まれる。本発明のＲＮＡ分子中のヌクレオチドはまた、天然に存在しないヌクレオチドまたは化学的に合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのような、非標準ヌクレオチドも含みうる。これらの変更ＲＮＡｓは、類似体または天然に存在するＲＮＡの類似体として引用可能である。
【０１７６】
「対象」によって、移植された細胞のドナーまたはレシピエントまたは細胞それら自身である、生命体を意味する。「対象」はまた、本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬を投与可能な生命体を意味する。対象は、ヒトまたはヒト細胞を含む、哺乳動物または哺乳動物細胞でありうる。
【０１７７】
語句「薬理学的に許容可能な担体」は、治療薬剤の投与のための担体を意味する。典型的な担体には、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびこれらの混合物が含まれる。経口で投与される薬物に対して、薬理学的に許容可能な担体には、不活性希釈液、分散剤、結合剤、潤滑剤、甘味剤、香味料、着色料および保存料などのような、薬理学的に許容可能な賦形剤が含まれるが、これらに限定はされない。好適な不活性希釈液には、炭酸ナトリウムおよびカリウム、リン鎖ナトリウムおよびカリウムおよびラクトースが含まれ、トウモロコシデンプンおよびアルギン酸が好適な分散剤である。結合剤には、デンプンおよびゼラチンが含まれてよく、潤滑剤は存在するのであれば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクが一般的である。望むのならば、胃腸管での吸収を遅延させるために、錠剤を一ステアリン酸塩グリセリルまたは二ステアリン酸塩グリセリルのような物質でコートしてよい。開示されたｄｓＲＮＡｓの薬理学的に許容可能な担体は、リポソーム、カプシド、カプソイド、ポリマー性ナノカプセルまたはポリマー性ミクロカプセルのようなミセル構造であってよい。
【０１７８】
ポリマー性ナノカプセルまたはマイクロカプセルは、カプセル封入されたか、または結合したｄｓＲＮＡの細胞内への伝達および放出を促進する。これらには、とりわけポリブチルシアノアクリレートを含む、ポリマー性および単量体物質が含まれる。物質および製造法の要約が発行されている（Ｋｒｅｕｔｅｒ，１９９１を参照のこと）。ポリマー化／ナノ粒子産出段階で、単量体および／または多量体前駆体から形成されるポリマー性物質は、ナノ粒子を製造する領域の当業者が通常の技術にしたがって好適に選択してよいポリマー性物質の分子量および分子量分布であるように、先行技術から本質的に公知である。
【０１７９】
本発明の種々の方法には、本明細書で「適切な対照」として互換的に引用される、「好適な対照」に対して、値、レベル、特徴、特性、性質などを比較することを含む段階が含まれる。「好適な対照」または「適切な対照」は、比較の目的のために有用な、当業者によく知られた対照または標準である。１つの実施形態において、「好適な対照」または「適切な対照」は、本明細書で記述したような、ＲＮＡｉ法を実施する前に決定される、値、レベル、特徴、特性、性質などである。例えば、転写率、ｍＲＮＡレベル、翻訳率、タンパク質レベル、生物学的活性、細胞特徴または性質、遺伝子型、表現型などを、本発明のＲＮＡサイレンシング試薬（例えばＤｓｉＲＮＡ）を細胞または生命体内に導入する前に決定可能である。他の実施形態において、「好適な対照」または「適切な対照」は、細胞または生物内で決定される値、レベル、特徴、特性、性質など、例えば正常な特質を示している対照または正常細胞または生命体である。また他の実施形態において、「好適な対照」または「適切な対照」は、前もって定義された値、レベル、特徴、特性、性質などである。
【０１８０】
語句「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、その業界で認識された意味を持ち、例えば、精製された試薬または抽出物、例えば細胞抽出物を含む。語句「ｉｎ  ｖｉｖｏ」はまた、その業界で認識された意味を持ち、例えば、生細胞、例えば不死化細胞、初代細胞、細胞株および／または生命体内の細胞を含む。
【０１８１】
本明細書で使用するところの「治療」または「治療すること」は、治療薬剤（例えばＤｓｉＲＮＡ試薬またはそれをコードしているベクターまたはトランスジーン）の、疾患または疾病を、または疾患または疾病の症状を治癒させる、直す、緩和する、軽減する、変化させる、治療する、改善する、改良するまたは影響を与える目的で、疾病をもつ患者への適用または投与、または治療薬剤の患者からの単離した組織または細胞株への適用または投与として定義される。語句「治療」または「治療する」はまた、予防的に薬剤を投与する文脈でも使用される。語句「効果的用量」または「効果的投与量」は、望む効果を達成するか、または少なくとも部分的に達成するために十分な量として定義される。語句「治療的に効果的な用量」は、疾患をすでに患っている患者における疾患またはその合併症を治癒する、または少なくとも部分的に停止させるのに十分な量として定義される。語句「患者」には、予防的または治療的治療いずれかを受けるヒトまたは他の哺乳動物対象が含まれる。
【０１８２】
抗−ＡＲ  ＤｓｉＲＮＡ試薬の構造
特定の実施形態において、本発明の抗−ＡＲ  ＤｓｉＲＮＡ試薬は以下の構造を持つことができる。
【０１８３】
１つのそのような実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０１８４】
【化１】
2013534424.tif 000004
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡおよび「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインである。関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０１８５】
【化２】
2013534424.tif 000005
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡおよび「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
【０１８６】
本発明のＤｓｉＲＮＡは、広範囲の改変パターン（例えば、２’−Ｏ−メチルＲＮＡパターン、例えば伸長ＤｓｉＲＮＡ試薬内）を持ちうる。本発明のＤｓｉＲＮＡｓの第二鎖の特定の改変パターンを以下に示す。
【０１８７】
１つの実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
【０１８８】
【化３】
2013534424.tif 000006
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
【０１８９】
【化４】
2013534424.tif 000007
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
【０１９０】
他のそのような実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０１９１】
【化５】
2013534424.tif 000008
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
【０１９２】
【化６】
2013534424.tif 000009
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
【０１９３】
他のそのような実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
【０１９４】
【化７】
2013534424.tif 000010
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
【０１９５】
【化８】
2013534424.tif 000011
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
【０１９６】
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０１９７】
【化９】
2013534424.tif 000012
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
【０１９８】
【化１０】
2013534424.tif 000013
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０１９９】
【化１１】
2013534424.tif 000014
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
【０２００】
【化１２】
2013534424.tif 000015
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡおよび「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
【０２０１】
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
【０２０２】
【化１３】
2013534424.tif 000016
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２０３】
【化１４】
2013534424.tif 000017
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
【０２０４】
【化１５】
2013534424.tif 000018
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２０５】
【化１６】
2013534424.tif 000019
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
【０２０６】
他の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
【０２０７】
【化１７】
2013534424.tif 000020
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
【０２０８】
【化１８】
2013534424.tif 000021
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２０９】
【化１９】
2013534424.tif 000022
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２１０】
【化２０】
2013534424.tif 000023
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
【０２１１】
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２１２】
【化２１】
2013534424.tif 000024
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
【０２１３】
【化２２】
2013534424.tif 000025
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２１４】
【化２３】
2013534424.tif 000026
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２１５】
【化２４】
2013534424.tif 000027
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
【０２１６】
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２１７】
【化２５】
2013534424.tif 000028
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
【０２１８】
【化２６】
2013534424.tif 000029
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２１９】
【化２７】
2013534424.tif 000030
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２２０】
【化２８】
2013534424.tif 000031
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
【０２２１】
他の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２２２】
【化２９】
2013534424.tif 000032
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
【０２２３】
【化３０】
2013534424.tif 000033
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２２４】
【化３１】
2013534424.tif 000034
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２２５】
【化３２】
2013534424.tif 000035
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
【０２２６】
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２２７】
【化３３】
2013534424.tif 000036
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
【０２２８】
【化３４】
2013534424.tif 000037
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２２９】
【化３５】
2013534424.tif 000038
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２３０】
【化３６】
2013534424.tif 000039
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
【０２３１】
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２３２】
【化３７】
2013534424.tif 000040
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
【０２３３】
【化３８】
2013534424.tif 000041
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２３４】
【化３９】
2013534424.tif 000042
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２３５】
【化４０】
2013534424.tif 000043
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
【０２３６】
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２３７】
【化４１】
2013534424.tif 000044
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
【０２３８】
【化４２】
2013534424.tif 000045
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２３９】
【化４３】
2013534424.tif 000046
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２４０】
【化４４】
2013534424.tif 000047
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
【０２４１】
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２４２】
【化４５】
2013534424.tif 000048
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
【０２４３】
【化４６】
2013534424.tif 000049
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２４４】
【化４７】
2013534424.tif 000050
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２４５】
【化４８】
2013534424.tif 000051
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
【０２４６】
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２４７】
【化４９】
2013534424.tif 000052
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
【０２４８】
【化５０】
2013534424.tif 000053
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２４９】
【化５１】
2013534424.tif 000054
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２５０】
【化５２】
2013534424.tif 000055
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
【０２５１】
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２５２】
【化５３】
2013534424.tif 000056
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
【０２５３】
【化５４】
2013534424.tif 000057
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２５４】
【化５５】
2013534424.tif 000058
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２５５】
【化５６】
2013534424.tif 000059
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
【０２５６】
他の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２５７】
【化５７】
2013534424.tif 000060
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
【０２５８】
【化５８】
2013534424.tif 000061
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２５９】
【化５９】
2013534424.tif 000062
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２６０】
【化６０】
2013534424.tif 000063
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
【０２６１】
他の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２６２】
【化６１】
2013534424.tif 000064
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
【０２６３】
【化６２】
2013534424.tif 000065
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２６４】
【化６３】
2013534424.tif 000066
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２６５】
【化６４】
2013534424.tif 000067
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
【０２６６】
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２６７】
【化６５】
2013534424.tif 000068
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
【０２６８】
【化６６】
2013534424.tif 000069
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２６９】
【化６７】
2013534424.tif 000070
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２７０】
【化６８】
2013534424.tif 000071
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
【０２７１】
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２７２】
【化６９】
2013534424.tif 000072
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
【０２７３】
【化７０】
2013534424.tif 000073
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２７４】
【化７１】
2013534424.tif 000074
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２７５】
【化７２】
2013534424.tif 000075
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
【０２７６】
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２７７】
【化７３】
2013534424.tif 000076
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
【０２７８】
【化７４】
2013534424.tif 000077
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２７９】
【化７５】
2013534424.tif 000078
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２８０】
【化７６】
2013534424.tif 000079
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
【０２８１】
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２８２】
【化７７】
2013534424.tif 000080
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
【０２８３】
【化７８】
2013534424.tif 000081
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２８４】
【化７９】
2013534424.tif 000082
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２８５】
【化８０】
2013534424.tif 000083
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
【０２８６】
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２８７】
【化８１】
2013534424.tif 000084
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
【０２８８】
【化８２】
2013534424.tif 000085
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２８９】
【化８３】
2013534424.tif 000086
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２９０】
【化８４】
2013534424.tif 000087
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
【０２９１】
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２９２】
【化８５】
2013534424.tif 000088
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
【０２９３】
【化８６】
2013534424.tif 000089
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２９４】
【化８７】
2013534424.tif 000090
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２９５】
【化８８】
2013534424.tif 000091
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
【０２９６】
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２９７】
【化８９】
2013534424.tif 000092
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは
【０２９８】
【化９０】
2013534424.tif 000093
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０２９９】
【化９１】
2013534424.tif 000094
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０３００】
【化９２】
2013534424.tif 000095
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
【０３０１】
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０３０２】
【化９３】
2013534424.tif 000096
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０３０３】
【化９４】
2013534424.tif 000097
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。他の関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０３０４】
【化９５】
2013534424.tif 000098
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０３０５】
【化９６】
2013534424.tif 000099
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
【０３０６】
以上の改変パターンをまた、例えば、以下記述した伸長ＤｓｉＲＮＡ構造およびミスマッチおよび／またはほころびたＤｓｉＲＮＡ構造内に組み込むことも可能である。
【０３０７】
他の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ開裂を正しい方向にするように働く、１〜３ミスマッチ残基を有する等しい長さを持つ鎖を含む（とりわけ、３’−末端残基からナンバリングした時に、ＤｓｉＲＮＡの第一鎖上の位置１、２または３の１つまたはそれ以上が、第一および第二鎖が互いにアニールする時に、第二鎖上の５’末端領域の相当する残基とミスマッチする）。２つの末端ミスマッチ残基を持つ典型的２７マーＤｓｉＲＮＡ試薬を示し、
【０３０８】
【化９７】
2013534424.tif 000100
式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｍ」＝鎖がアニールする時、他の相補的鎖の相当する「Ｍ」残基と対を形成しない（水素結合しない）核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは非天然または改変核酸）。そのような試薬の任意の残基は任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーでありえ、上記非対称試薬に関して示したように、下（第二）鎖の３’−末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーの交互位置が、上記「平滑／ほつれ」ＤｓｉＲＮＡ試薬中でも使用可能である。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
【０３０９】
特定のさらなる実施形態において、本発明は、推定されるセンス鎖Ｄｉｃｅｒ開裂部位の３’と、推定されるアンチセンス鎖Ｄｉｃｅｒ開裂部位の相当する５’に位置する、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の領域内に１つまたはそれ以上の塩基対化デオキシリボヌクレオチドを有するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に対する組成物を提供する。本発明の組成物は、前駆体分子であるｄｓＲＮＡを含み、すなわち本発明のｄｓＲＮＡが、活性小干渉核酸（ｓｉＲＮＡ）を産出するようにｉｎ  ｖｉｖｏで処理される。ｄｓＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒによって、ＲＩＳＣ内に組み込まれる活性ｓｉＲＮＡに処理される。
【０３１０】
特定の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬は、以下の典型的構造を持ちうる（任意の以下の典型的構造は、例えば、上記構造の下鎖改変パターンと組み合わせ可能であることに留意のこと−１つの特定の実施例において、任意の上記構造中で示した下鎖改変パターンが、任意の以下の構造の下鎖の２７のほとんどの３’残基に適用される。他の特定の実施例にて、下鎖の２３のほとんどの３’残基における、任意の上記構造にて示した下鎖改変パターンが、任意の以下の構造の下鎖の２３のほとんどの３’残基に適用される）。
【０３１１】
１つのそのような実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、以下を含み（典型的「右伸長」、「ＤＮＡ伸長」ＤｓｉＲＮＡ）、
【０３１２】
【化９８】
2013534424.tif 000101
式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、特定の実施形態において、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、および「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
【０３１３】
関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、以下を含み、
【０３１４】
【化９９】
2013534424.tif 000102
式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、特定の実施形態において、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、および「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
【０３１５】
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、以下を含み、
【０３１６】
【化１００】
2013534424.tif 000103
式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、特定の実施形態において、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡおよび「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖にそって交互残基で局在する。
【０３１７】
他のそのような実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、以下を含み、
【０３１８】
【化１０１】
2013534424.tif 000104
式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、特定の実施形態において、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡおよび「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖にそって交互残基で局在する。
【０３１９】
他のそのような実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、以下を含み、
【０３２０】
【化１０２】
2013534424.tif 000105
式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、特定の実施形態において、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡおよび「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖にそって交互残基で局在する。
【０３２１】
他の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、以下を含み、
【０３２２】
【化１０３】
2013534424.tif 000106
式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、特定の実施形態において、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡおよび「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８または１〜１０であり、少なくとも１つのＤ１Ｎが上鎖中に存在し、下鎖中の相当するＤ２Ｎと塩基対を形成する。任意にＤ１ＮとＤ１Ｎ＋１は、相当するＤ２ＮとＤ２Ｎ＋１と塩基対を形成し、Ｄ１Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１、Ｄ１Ｎ＋２は、相当するＤ２Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１およびＤ１Ｎ＋２などと塩基対を形成するなどである。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖にそって交互残基で局在する。
【０３２３】
本明細書で描写した構造において、センス鎖またはアンチセンス鎖いずれかの５’末端が任意にリン酸基を含む。
【０３２４】
他の実施形態において、ＤＮＡ：ＤＮＡ−伸長ＤｓｉＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ開裂を正しい方向にするように働く、１〜３ミスマッチ残基を有する等しい長さを持つ鎖を含む（とりわけ、３’−末端残基からナンバリングした時に、ＤｓｉＲＮＡの第一鎖上の位置１、２または３の１つまたはそれ以上が、第一および第二鎖が互いにアニールする時に、第二鎖上の５’末端領域の相当する残基とミスマッチする）。２つの末端ミスマッチ残基を持つ典型的ＤＮＡ：ＤＮＡ−伸長ＤｓｉＲＮＡ試薬を示し、
【０３２５】
【化１０４】
2013534424.tif 000107
式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｍ」＝鎖がアニールする時、他の相補的鎖の相当する「Ｍ」残基と対を形成しない（水素結合しない）核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは非天然または改変核酸）、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜１５、または任意１〜８であり、「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。そのような試薬の任意の残基は任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーでありえ、上記非対称試薬に関して示したように、下（第二）鎖の３’−末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーの交互位置が、上記「平滑／ほつれ」ＤｓｉＲＮＡ試薬中でも使用可能である。１つの実施形態において、上鎖（第一鎖）はセンス鎖であり、下鎖（第二鎖）はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。非対称／オーバーハング試薬に関して上で示したものと平行である改変およびＤＮＡ：ＤＮＡ伸長パターンもまた、そのような「平滑／ほつれ」試薬内に組み込むことが可能である。
【０３２６】
１つの実施形態において、伸長したＤｓｉＲＮＡ試薬が、ｄｓＲＮＡ構造中の塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドの存在を必要としない、Ｄｉｃｅｒ開裂の特定の方向を介して機能するようにモデル化された部位に位置するデオキシリボヌクレオチドを含むように提供される。そのような分子の典型的な構造を示し、
【０３２７】
【化１０５】
2013534424.tif 000108
式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、特定の実施形態において、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。以上の構造は、Ｄｉｃｅｒが、その第一処理後形態として、最小２１マーの二本鎖を開裂するようにさせるようにモデルとする。上記構造の下鎖癌チセンスである実施形態において、アンチセンス鎖の５’末端の最後および最後から二番目の残基で２つのデオキシリボヌクレオチド残基が存在することが、的外れの効果を減少させるのを助けうる（先行研究が、的外れの効果を減少させるために、アンチセンス鎖の５’末端から少なくとも最後から二番目の２’−Ｏ−メチル修飾を示したように。例えば、米国特許第２００７／０２２３４２７号明細書を参照のこと）。
【０３２８】
１つの実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、以下を含み（典型的「左伸長」、「ＤＮＡ伸長」ＤｓｉＲＮＡ）、
【０３２９】
【化１０６】
2013534424.tif 000109
式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、特定の実施形態において、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、および「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
【０３３０】
関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０３３１】
【化１０７】
2013534424.tif 000110
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマー、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８または１〜１０。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
【０３３２】
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０３３３】
【化１０８】
2013534424.tif 000111
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマー、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８または１〜１０。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡ。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖にそって交互残基で局在する。
【０３３４】
他のそのような実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０３３５】
【化１０９】
2013534424.tif 000112
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマー、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８または１〜１０。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡ。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖にそって交互残基で局在する。
【０３３６】
他のそのような実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０３３７】
【化１１０】
2013534424.tif 000113
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡ、および「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８または１〜１０。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖にそって交互残基で局在する。
【０３３８】
他のそのような実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０３３９】
【化１１１】
2013534424.tif 000114
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡ、および「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８または１〜１０。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。「Ｙ」は、特定の実施形態において、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインである。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖にそって交互残基で局在する。
【０３４０】
他のそのような実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０３４１】
【化１１２】
2013534424.tif 000115
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡ、および「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８または１〜１０であり、そこで少なくとも１つのＤ１Ｎが上鎖中に存在し、下鎖中の相当するＤ２Ｎと塩基対を形成する。任意にＤ１ＮとＤ１Ｎ＋１は、相当するＤ２ＮとＤ２Ｎ＋１と塩基対を形成し、Ｄ１Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１、Ｄ１Ｎ＋２は、相当するＤ２Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１およびＤ１Ｎ＋２などと塩基対を形成するなどである。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖にそって交互残基で局在する。
【０３４２】
関連実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
【０３４３】
【化１１３】
2013534424.tif 000116
を含み、式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｙ」は、特定の実施形態において、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８または１〜１０であり、そこで少なくとも１つのＤ１Ｎが上鎖中に存在し、下鎖中の相当するＤ２Ｎと塩基対を形成する。任意にＤ１ＮとＤ１Ｎ＋１は、相当するＤ２ＮとＤ２Ｎ＋１と塩基対を形成し、Ｄ１Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１、Ｄ１Ｎ＋２は、相当するＤ２Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１およびＤ１Ｎ＋２などと塩基対を形成するなどである。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記スキーム中で本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖にそって交互残基で局在する。
【０３４４】
他の実施形態において、ＤＮＡ：ＤＮＡ−伸長ＤｓｉＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ開裂を正しい方向にするように働く、１〜３ミスマッチ残基を有する等しい長さを持つ鎖を含む（とりわけ、３’−末端残基からナンバリングした時に、ＤｓｉＲＮＡの第一鎖上の位置１、２または３の１つまたはそれ以上が、第一および第二鎖が互いにアニールする時に、第二鎖上の５’末端領域の相当する残基とミスマッチする）。２つの末端ミスマッチ残基を持つ典型的ＤＮＡ：ＤＮＡ−伸長ＤｓｉＲＮＡ試薬を示し、
【０３４５】
【化１１４】
2013534424.tif 000117
式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｍ」＝鎖がアニールする時、他の相補的鎖の相当する「Ｍ」残基と対を形成しない（水素結合しない）核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは非天然または改変核酸）、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜１５、または任意１〜８であり、「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。そのような試薬の任意の残基は任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーでありえ、上記非対称試薬に関して示したように、下（第二）鎖の３’−末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーの交互位置が、上記「平滑／ほつれ」ＤｓｉＲＮＡ試薬中でも使用可能である。１つの実施形態において、上鎖（第一鎖）はセンス鎖であり、下鎖（第二鎖）はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。対称／オーバーハング試薬に関して上で示したものと平行である改変およびＤＮＡ：ＤＮＡ伸長パターンもまた、そのような「平滑／ほつれ」試薬内に組み込むことが可能である。
【０３４６】
１つの実施形態において、伸長したＤｓｉＲＮＡ試薬が、ｄｓＲＮＡ構造中の塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドの存在を必要としない、Ｄｉｃｅｒ開裂の特定の方向を介して機能するようにモデル化された部位に位置するデオキシリボヌクレオチドを含むように提供される。そのような分子の典型的な構造を示し、
【０３４７】
【化１１５】
2013534424.tif 000118
または
【０３４８】
【化１１６】
2013534424.tif 000119
式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、特定の実施形態において、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態において、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
【０３４９】
上記構造の下鎖癌チセンス鎖である任意の以上の実施形態において、アンチセンス鎖の５’末端の最後および最後から二番目の残基での２つのデオキシリボヌクレオチド残基の位置が、的外れの効果を減少させるのを助けうる（先行研究が、的外れの効果を減少させるために、アンチセンス鎖の５’末端から少なくとも最後から二番目の２’−Ｏ−メチル修飾を示したように。例えば、米国特許第２００７／０２２３４２７号明細書を参照のこと）。
【０３５０】
特定の実施形態において、上記構造の「Ｄ」残基には、少なくとも１つのＰＳ−ＤＮＡまたはＰＳ−ＲＮＡが含まれる。任意に、上記構造の「Ｄ」残基には、Ｄｉｃｅｒ開裂を阻害する少なくとも１つの改変されたヌクレオチドが含まれる。
【０３５１】
上記「ＤＮＡ−伸長」ＤｓｉＲＮＡ試薬は、「左伸長」または「右伸長」のいずれかとして分類される一方で、単一の試薬内で左および右伸長ＤＮＡ−含有配列両方を含むＤｓｉＲＮＡ試薬（例えば、コアｄｓＲＮＡ構造を取り囲む両側面がｄｓＤＮＡ伸長である）をまた、「右伸長」および「左伸長」試薬に関して本明細書で記述したものと同様の様式で、産出し、使用可能である。
【０３５２】
いくつかの実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡはさらに、ＤＮＡ：ＤＮＡ−伸長ＤｓｉＲＮＡ試薬のセンスおよびアンチセンス鎖を連結する結合部位またはドメインを含む。任意に、そのような結合部位ドメインは、センス鎖の３’末端と、アンチセンス鎖の５’末端を連結する。結合部位は、オリゴメチレンジオールリンカー、オリゴエチレングリコールリンカー、または他の本技術分野で認識されるリンカー部位のような、化学的（非ヌクレオチド）リンカーでありうる。あるいは、リンカーは、任意に伸長ループおよび／またはテトラループを含む、ヌクレオチドリンカーでありうる。
【０３５３】
１つの実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ試薬は、２５塩基対長を持つセンス鎖と、１〜４塩基３’−オーバーハング（例えば１塩基３’オーバーハング、２塩基３’−オーバーハング、３塩基３’−オーバーハングまたは４塩基３’−オーバーハング）を持つ２７塩基対長を持つセンス鎖を持つ、非対称構造を持つ。他の実施形態において、本ＤｓｉＲＮＡ試薬は、センス鎖の３’末端にて、２つのデオキシヌクレオチドをさらに含む、非対称構造を持つ。
【０３５４】
他の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ試薬は、２５塩基対長を持つアンチセンス鎖と、１〜４塩基３’−オーバーハング（例えば１塩基３’オーバーハング、２塩基３’−オーバーハング、３塩基３’−オーバーハングまたは４塩基３’−オーバーハング）を持つ２７塩基対長を持つセンス鎖を持つ、非対称構造を持つ。他の実施形態において、本ＤｓｉＲＮＡ試薬は、アンチセンス鎖の３’末端にて、２つのデオキシヌクレオチドをさらに含む、非対称構造を持つ。
【０３５５】
本発明の典型的ＡＲ標的化ＤｓｉＲＮＡ試薬は以下を含む。
【０３５６】
表２
【０３５７】
【表２】
2013534424.tif 000120
【０３５８】
【表３】
2013534424.tif 000121
【０３５９】
【表４】
2013534424.tif 000122
【０３６０】
【表５】
2013534424.tif 000123
【０３６１】
【表６】
2013534424.tif 000124
【０３６２】
【表７】
2013534424.tif 000125
【０３６３】
【表８】
2013534424.tif 000126
【０３６４】
【表９】
2013534424.tif 000127
【０３６５】
【表１０】
2013534424.tif 000128
【０３６６】
【表１１】
2013534424.tif 000129
【０３６７】
【表１２】
2013534424.tif 000130
【０３６８】
【表１３】
2013534424.tif 000131
【０３６９】
【表１４】
2013534424.tif 000132
【０３７０】
【表１５】
2013534424.tif 000133
【０３７１】
【表１６】
2013534424.tif 000134
【０３７２】
【表１７】
2013534424.tif 000135
【０３７３】
【表１８】
2013534424.tif 000136
【０３７４】
【表１９】
2013534424.tif 000137
【０３７５】
【表２０】
2013534424.tif 000138
【０３７６】
【表２１】
2013534424.tif 000139
【０３７７】
【表２２】
2013534424.tif 000140
【０３７８】
【表２３】
2013534424.tif 000141
【０３７９】
【表２４】
2013534424.tif 000142
【０３８０】
【表２５】
2013534424.tif 000143
【０３８１】
【表２６】
2013534424.tif 000144
【０３８２】
【表２７】
2013534424.tif 000145
【０３８３】
【表２８】
2013534424.tif 000146
【０３８４】
【表２９】
2013534424.tif 000147
【０３８５】
【表３０】
2013534424.tif 000148
【０３８６】
【表３１】
2013534424.tif 000149
【０３８７】
表３
【０３８８】
【表３２】
2013534424.tif 000150
【０３８９】
【表３３】
2013534424.tif 000151
【０３９０】
【表３４】
2013534424.tif 000152
【０３９１】
【表３５】
2013534424.tif 000153
【０３９２】
【表３６】
2013534424.tif 000154
【０３９３】
【表３７】
2013534424.tif 000155
【０３９４】
【表３８】
2013534424.tif 000156
【０３９５】
【表３９】
2013534424.tif 000157
【０３９６】
【表４０】
2013534424.tif 000158
【０３９７】
【表４１】
2013534424.tif 000159
【０３９８】
【表４２】
2013534424.tif 000160
【０３９９】
【表４３】
2013534424.tif 000161
【０４００】
【表４４】
2013534424.tif 000162
【０４０１】
【表４５】
2013534424.tif 000163
【０４０２】
【表４６】
2013534424.tif 000164
【０４０３】
【表４７】
2013534424.tif 000165
【０４０４】
【表４８】
2013534424.tif 000166
【０４０５】
【表４９】
2013534424.tif 000167
【０４０６】
【表５０】
2013534424.tif 000168
【０４０７】
【表５１】
2013534424.tif 000169
【０４０８】
【表５２】
2013534424.tif 000170
【０４０９】
【表５３】
2013534424.tif 000171
【０４１０】
【表５４】
2013534424.tif 000172
【０４１１】
【表５５】
2013534424.tif 000173
【０４１２】
【表５６】
2013534424.tif 000174
【０４１３】
【表５７】
2013534424.tif 000175
【０４１４】
【表５８】
2013534424.tif 000176
【０４１５】
【表５９】
2013534424.tif 000177
【０４１６】
【表６０】
2013534424.tif 000178
【０４１７】
【表６１】
2013534424.tif 000179
【０４１８】
以上の表２〜３の、および以下表５〜１２の各ＤｓｉＲＮＡに対する推定される２１ヌクレオチド標的配列を、表４に示す。
【０４１９】
表４
【０４２０】
【表６２】
2013534424.tif 000180
【０４２１】
【表６３】
2013534424.tif 000181
【０４２２】
【表６４】
2013534424.tif 000182
【０４２３】
【表６５】
2013534424.tif 000183
【０４２４】
【表６６】
2013534424.tif 000184
【０４２５】
【表６７】
2013534424.tif 000185
【０４２６】
【表６８】
2013534424.tif 000186
【０４２７】
【表６９】
2013534424.tif 000187
【０４２８】
【表７０】
2013534424.tif 000188
【０４２９】
【表７１】
2013534424.tif 000189
【０４３０】
【表７２】
2013534424.tif 000190
【０４３１】
【表７３】
2013534424.tif 000191
【０４３２】
【表７４】
2013534424.tif 000192
【０４３３】
【表７５】
2013534424.tif 000193
【０４３４】
【表７６】
2013534424.tif 000194
【０４３５】
【表７７】
2013534424.tif 000195
【０４３６】
以上表２および３、および以下表５〜１２内で、下線残基は、２’−Ｏ−メチル残基を示唆し、ＵＰＰＥＲ  ＣＡＳＥはリボヌクレオチド類を示唆し、下ケースはデオキシリボヌクレオチドを意味する。以上表２、３および以下９〜１２のＤｓｉＲＮＡ試薬は、平滑末端を有する２５／２７マー試薬である。以上表２、３および以下９〜１２の試薬の構造および／または改変パターンを、上記遺伝的配列構造に対して簡単に適合可能であり、例えば、第二鎖の３’オーバーハングを伸長させるか、または短縮させることが可能であり、第二鎖の２’−Ｏ−メチル化を第二鎖の５’末端まで伸長させることが可能であり、任意に交互部位でなどである。そのような改変をもつ２５／２７マーＤｓｉＲＮＡｓをまた、上記ＤｓｉＲＮＡ試薬から簡単にデザイン可能であり、ＡＲ発現の機能的阻害剤としても予想されるので、そのようなさらなる改変は任意である。同様に、以下表５〜８の試薬の、２７マー「平滑／ほつれ」および「平滑／平滑」ＤｓｉＲＮＡ構造および／または改変パターンを、例えばそのような構造に対するアンチセンス鎖の改変パターンの適用、および／またはそのような配列の上記遺伝的構造への適用のために、上記遺伝的配列構造に簡単に適用可能である。
【０４３７】
特定の実施形態において、各２７ヌクレオチドの独立した鎖長を有する２７マーＤｓｉＲＮＡｓを、本明細書の表２、３および９〜１２にて示した、非対称「２５／２７」構造と同一のＡＲ転写物内の部位の標的化のために、デザインし、合成する。典型的「２７／２７」ＤｓｉＲＮＡｓは、以下表５および６のＤｓｉＲＮＡに関して示したような「平滑／ほつれ」構造で、または以下表７および８のＤｓｉＲＮＡｓに関して示したような「平滑／平滑」構造で、任意にデザインされる。
【０４３８】
表５
【０４３９】
【表７８】
2013534424.tif 000196
【０４４０】
【表７９】
2013534424.tif 000197
【０４４１】
【表８０】
2013534424.tif 000198
【０４４２】
【表８１】
2013534424.tif 000199
【０４４３】
【表８２】
2013534424.tif 000200
【０４４４】
【表８３】
2013534424.tif 000201
【０４４５】
【表８４】
2013534424.tif 000202
【０４４６】
【表８５】
2013534424.tif 000203
【０４４７】
【表８６】
2013534424.tif 000204
【０４４８】
【表８７】
2013534424.tif 000205
【０４４９】
【表８８】
2013534424.tif 000206
【０４５０】
【表８９】
2013534424.tif 000207
【０４５１】
【表９０】
2013534424.tif 000208
【０４５２】
【表９１】
2013534424.tif 000209
【０４５３】
【表９２】
2013534424.tif 000210
【０４５４】
【表９３】
2013534424.tif 000211
【０４５５】
【表９４】
2013534424.tif 000212
【０４５６】
【表９５】
2013534424.tif 000213
【０４５７】
【表９６】
2013534424.tif 000214
【０４５８】
【表９７】
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【０４５９】
【表９８】
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【０４６０】
【表９９】
2013534424.tif 000217
【０４６１】
【表１００】
2013534424.tif 000218
【０４６２】
【表１０１】
2013534424.tif 000219
【０４６３】
【表１０２】
2013534424.tif 000220
【０４６４】
【表１０３】
2013534424.tif 000221
【０４６５】
【表１０４】
2013534424.tif 000222
【０４６６】
【表１０５】
2013534424.tif 000223
【０４６７】
【表１０６】
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【０４６８】
【表１０７】
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【０４６９】
【表１０８】
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【０４７０】
【表１０９】
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【０４７１】
【表１１０】
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【０４７２】
【表１１１】
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【０４７３】
【表１１２】
2013534424.tif 000230
【０４７４】
【表１１３】
2013534424.tif 000231
【０４７５】
【表１１４】
2013534424.tif 000232
【０４７６】
【表１１５】
2013534424.tif 000233
【０４７７】
【表１１６】
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【０４７８】
【表１１７】
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【０４７９】
【表１１８】
2013534424.tif 000236
【０４８０】
【表１１９】
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【０４８１】
【表１２０】
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【０４８２】
【表１２１】
2013534424.tif 000239
【０４８３】
【表１２２】
2013534424.tif 000240
【０４８４】
【表１２３】
2013534424.tif 000241
【０４８５】
【表１２４】
2013534424.tif 000242
【０４８６】
【表１２５】
2013534424.tif 000243
【０４８７】
【表１２６】
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【０４８８】
【表１２７】
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【０４８９】
【表１２８】
2013534424.tif 000246
【０４９０】
【表１２９】
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【０４９１】
【表１３０】
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【０４９２】
【表１３１】
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【０４９３】
【表１３２】
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【０４９４】
【表１３３】
2013534424.tif 000251
【０４９５】
【表１３４】
2013534424.tif 000252
【０４９６】
【表１３５】
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【０４９７】
【表１３６】
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【０４９８】
【表１３７】
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【０４９９】
【表１３８】
2013534424.tif 000256
【０５００】
【表１３９】
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【０５０１】
【表１４０】
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【０５０２】
【表１４１】
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【０５０３】
【表１４２】
2013534424.tif 000260
【０５０４】
【表１４３】
2013534424.tif 000261
【０５０５】
【表１４４】
2013534424.tif 000262
【０５０６】
【表１４５】
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【０５０７】
【表１４６】
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【０５０８】
【表１４７】
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【０５０９】
【表１４８】
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【０５１０】
【表１４９】
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【０５１１】
【表１５０】
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【０５１２】
【表１５１】
2013534424.tif 000269
【０５１３】
【表１５２】
2013534424.tif 000270
【０５１４】
【表１５３】
2013534424.tif 000271
【０５１５】
【表１５４】
2013534424.tif 000272
【０５１６】
【表１５５】
2013534424.tif 000273
【０５１７】
【表１５６】
2013534424.tif 000274
【０５１８】
【表１５７】
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【０５１９】
【表１５８】
2013534424.tif 000276
【０５２０】
【表１５９】
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【０５２１】
【表１６０】
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【０５２２】
【表１６１】
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【０５２３】
【表１６２】
2013534424.tif 000280
【０５２４】
【表１６３】
2013534424.tif 000281
【０５２５】
【表１６４】
2013534424.tif 000282
【０５２６】
【表１６５】
2013534424.tif 000283
【０５２７】
【表１６６】
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【０５２８】
【表１６７】
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【０５２９】
【表１６８】
2013534424.tif 000286
【０５３０】
【表１６９】
2013534424.tif 000287
【０５３１】
表６
【０５３２】
【表１７０】
2013534424.tif 000288
【０５３３】
【表１７１】
2013534424.tif 000289
【０５３４】
【表１７２】
2013534424.tif 000290
【０５３５】
【表１７３】
2013534424.tif 000291
【０５３６】
【表１７４】
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【０５３７】
【表１７５】
2013534424.tif 000293
【０５３８】
【表１７６】
2013534424.tif 000294
【０５３９】
表７
【０５４０】
【表１７７】
2013534424.tif 000295
【０５４１】
【表１７８】
2013534424.tif 000296
【０５４２】
【表１７９】
2013534424.tif 000297
【０５４３】
【表１８０】
2013534424.tif 000298
【０５４４】
【表１８１】
2013534424.tif 000299
【０５４５】
【表１８２】
2013534424.tif 000300
【０５４６】
【表１８３】
2013534424.tif 000301
【０５４７】
【表１８４】
2013534424.tif 000302
【０５４８】
【表１８５】
2013534424.tif 000303
【０５４９】
【表１８６】
2013534424.tif 000304
【０５５０】
【表１８７】
2013534424.tif 000305
【０５５１】
【表１８８】
2013534424.tif 000306
【０５５２】
【表１８９】
2013534424.tif 000307
【０５５３】
【表１９０】
2013534424.tif 000308
【０５５４】
【表１９１】
2013534424.tif 000309
【０５５５】
【表１９２】
2013534424.tif 000310
【０５５６】
【表１９３】
2013534424.tif 000311
【０５５７】
【表１９４】
2013534424.tif 000312
【０５５８】
【表１９５】
2013534424.tif 000313
【０５５９】
【表１９６】
2013534424.tif 000314
【０５６０】
【表１９７】
2013534424.tif 000315
【０５６１】
【表１９８】
2013534424.tif 000316
【０５６２】
【表１９９】
2013534424.tif 000317
【０５６３】
【表２００】
2013534424.tif 000318
【０５６４】
【表２０１】
2013534424.tif 000319
【０５６５】
【表２０２】
2013534424.tif 000320
【０５６６】
【表２０３】
2013534424.tif 000321
【０５６７】
【表２０４】
2013534424.tif 000322
【０５６８】
【表２０５】
2013534424.tif 000323
【０５６９】
【表２０６】
2013534424.tif 000324
【０５７０】
【表２０７】
2013534424.tif 000325
【０５７１】
【表２０８】
2013534424.tif 000326
【０５７２】
【表２０９】
2013534424.tif 000327
【０５７３】
【表２１０】
2013534424.tif 000328
【０５７４】
【表２１１】
2013534424.tif 000329
【０５７５】
【表２１２】
2013534424.tif 000330
【０５７６】
【表２１３】
2013534424.tif 000331
【０５７７】
【表２１４】
2013534424.tif 000332
【０５７８】
【表２１５】
2013534424.tif 000333
【０５７９】
【表２１６】
2013534424.tif 000334
【０５８０】
【表２１７】
2013534424.tif 000335
【０５８１】
【表２１８】
2013534424.tif 000336
【０５８２】
【表２１９】
2013534424.tif 000337
【０５８３】
【表２２０】
2013534424.tif 000338
【０５８４】
【表２２１】
2013534424.tif 000339
【０５８５】
【表２２２】
2013534424.tif 000340
【０５８６】
【表２２３】
2013534424.tif 000341
【０５８７】
【表２２４】
2013534424.tif 000342
【０５８８】
【表２２５】
2013534424.tif 000343
【０５８９】
【表２２６】
2013534424.tif 000344
【０５９０】
【表２２７】
2013534424.tif 000345
【０５９１】
【表２２８】
2013534424.tif 000346
【０５９２】
【表２２９】
2013534424.tif 000347
【０５９３】
【表２３０】
2013534424.tif 000348
【０５９４】
表８
【０５９５】
【表２３１】
2013534424.tif 000349
【０５９６】
【表２３２】
2013534424.tif 000350
【０５９７】
【表２３３】
2013534424.tif 000351
【０５９８】
【表２３４】
2013534424.tif 000352
【０５９９】
特定の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬は、第一鎖の、たとえば少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、または少なくとも２６の残基が、第二鎖の相当する残基に相補的であることを要求する。特定の関連実施形態において、第二鎖の相当する残基に相補的なこれらの第一鎖残基は任意に連続残基である。
【０６００】
本明細書で使用するところの「ＤｓｉＲＮＡｍｍ」は、ＤｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖によって形成された二本鎖の１、２、３または４つのミスマッチ塩基対を含む、「ミスマッチ耐性領域」を持つＤｓｉＲＮＡを意味し、そこでそのようなミスマッチは、ＤｓｉＲＮＡのいずれかの末端の２つの末端塩基対間で横たわっている（およびしたがって末端塩基対を含まない）場所で、ＤｓｉＲＮＡ内に位置する。ミスマッチ塩基対は、相当する標的核酸の推定されるＡｇｏ２切断部位の局所に関して本明細書で定義した、「ミスマッチ−耐性領域」内に局在する。ミスマッチ耐性領域は、標的鎖の推定Ａｇｏ２切断部位「の上流」に局在する。本文脈中の「上流」は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ二本鎖の５’−のほとんどの部位として理解され、５’はＤｓｉＲＮＡ二本鎖のセンス鎖の方向を意味する。したがって、ミスマッチ耐性領域は、標的核酸の推定Ａｇｏ２切断部位に相当するセンス（パッセンジャー）鎖上の塩基の上流であり（図１）、あるいは、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス（ガイド）鎖に対していう場合、ミスマッチ耐性領域は、標的核酸の推定Ａｇｏ２切断部位に相補的な塩基の下流に位置すると記述することも可能であり、すなわち、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖の３’のほとんどの部分と記述可能である（アンチセンス鎖の位置１は、アンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドである、図１を参照のこと）。
【０６０１】
１つの実施形態において、例えば図１にて描写したようなナンバリングで、ミスマッチ耐性領域は、二本鎖のセンス鎖の５’末端で開始したヌクレオチドからナンバリングした場合、塩基対３〜９の間、または塩基対３〜９を含んで位置する。したがって、本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍは、右手伸長ＤｓｉＲＮＡのセンス鎖の位置３、４、５、６、７、８または９のいずれか１つにおいて、単一のミスマッチ塩基対を有する（位置１は、センス鎖の５’末端ヌクレオチドであり、位置９は、センス鎖配列に相当する標的ＡＲ  ＲＮＡ配列の推定Ａｇｏ２切断部位の５’に接したセンス鎖のヌクレオチド残基である）。特定の実施形態において、センス鎖の位置３、４、５、６、７、８または９の任意の位置で、ミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍに対して、アンチセンス鎖の相当するミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するだけでなく、ＤｓｉＲＮＡｍｍ標的ＡＲ  ＲＮＡ配列ともミスマッチ塩基対を形成する（したがって、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列間の相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ内のミスマッチ塩基対にて中断され、相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的ＡＲ  ＲＮＡ配列間で同様に中断される）。他の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖配列の相当するヌクレオチドとミスマッチ塩基対を形成するだけでなく、その相当する標的ＡＲ  ＲＮＡ配列ヌクレオチドとも塩基対を形成する（したがって、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列間の相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ内のミスマッチ塩基対にて中断され、また相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的ＡＲ  ＲＮＡ配列間で維持される）。
【０６０２】
上述したように、ミスマッチ耐性領域（ミスマッチ領域）内で単一のミスマッチ塩基対を有する本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍ（例えば、センス鎖の位置３、４、５、６、７、８または９のいずれか１つにてミスマッチヌクレオチド残基をもつＤｓｉＲＮＡｍｍ）はさらに、１、２または３つのさらなるミスマッチ塩基対を含みうる。好ましい実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのこれらの１、２または３つのさらなるミスマッチ塩基対は、センス鎖の位置３、４、５、６、７、８および／または９にて（そしてアンチセンス鎖の相当する残基にて）発生する。１つのさらなるミスマッチ塩基対が、ＤｓｉＲＮＡｍｍ内に存在する１つの実施形態において、センス鎖の２つのミスマッチ塩基対が、例えば（アンチセンス鎖の相当するヌクレオチド残基にて発生もするミスマッチとともに）センス鎖の位置４および位置６両方のヌクレオチドで発生しうる。
【０６０３】
２つのミスマッチ塩基対を有するＤｓｉＲＮＡｍｍ試薬において、ミスマッチは、連続して発生可能である（例えば、センス鎖ヌクレオチド配列にそった連続位置にて）。あるいは、アンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖のヌクレオチドが、アンチセンス鎖配列と塩基対を形成するヌクレオチドによって散在可能である（例えば、位置４および５ではなく、位置３および６にてミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍに関して、センス鎖位置３および６のミスマッチ残基は、アンチセンス鎖の相当する残基とマッチした塩基対を形成する２つのヌクレオチドによって散在される）。例えば、相当するアンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する（センス鎖のミスマッチ耐性領域内に局在する）センス鎖の２つの残基が、これらのミスマッチ塩基対間に局在する、０、１、２、３、４または５のマッチ塩基対で発生可能である。
【０６０４】
３つのミスマッチ塩基対を有する特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ試薬において、ミスマッチは、連続して発生可能である（例えば、センス鎖ヌクレオチド配列にそって三重に）。あるいは、アンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖のヌクレオチドが、アンチセンス鎖配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在可能である（例えば、位置５、６および７ではなく、位置３、４および８にてミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍに関して、センス鎖位置３および４のミスマッチ残基は、互いに隣接し、センス鎖位置４および８のミスマッチ残基は、アンチセンス鎖の相当する残基とマッチした塩基対を形成する３つの残基によって散在される）。例えば、相当するアンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する（センス鎖のミスマッチ耐性領域内に局在する）センス鎖の３つの残基が、これらのミスマッチ塩基対の任意の２つの間に局在する、０、１、２、３または４のマッチ塩基対で発生可能である。
【０６０５】
４つのミスマッチ塩基対を有する特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ試薬に関して、ミスマッチは、連続して発生可能である（たとえば、センス鎖ヌクレオチド配列にそって四重に）。あるいは、アンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖のヌクレオチドが、アンチセンス鎖配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在可能である（例えば、位置４および６ではなく、位置３、５、７および８にてミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍに関して、センス鎖位置７および８のミスマッチ残基は、互いに隣接し、センス鎖位置３および５のミスマッチ残基は、アンチセンス鎖の相当する残基とマッチした塩基対を形成する１つの残基によって散在される。同様に、センス鎖位置５および７のミスマッチ残基がまた、アンチセンス鎖の相当する残基と、マッチした塩基対を形成する１つのヌクレオチドによっても散在される）。例えば、相当するアンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する（センス鎖のミスマッチ耐性領域内に局在する）センス鎖の４つの残基が、これらのミスマッチ塩基対の任意の２つの間に局在する、０、１、２または３のマッチ塩基対で発生可能である。
【０６０６】
例えば図１でまた描写したようなナンバリングで、他の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍは、ＤｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の位置１７，１８、１９、２０、２１、２２または２３の任意の１つにて、単一のミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有するミスマッチ耐性領域を含む（位置１はアンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドであり、位置１７は、アンチセンス鎖配列に十分相補的な標的ＡＲ  ＲＮＡ配列の推定Ａｇｏ２切断部位のアンチセンス鎖中の３’（下流）隣接であるアンチセンス鎖のヌクレオチド残基である）。特定の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖に関して、アンチセンス鎖の位置１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３の任意でミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍに対して、アンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖配列とのみミスマッチ塩基対を形成するのみでなく、ＤｓｉＲＮＡｍｍ標的ＡＲ  ＲＮＡ配列ともミスマッチ塩基対を形成する（したがって、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列間の相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ内のミスマッチ塩基対にて中断され、相補性は同様に、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的ＡＲ  ＲＮＡ配列間で中断される）。他の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖配列の相当するヌクレオチドとミスマッチ塩基対を形成するだけでまた、その相当する標的ＡＲ  ＲＮＡ配列ヌクレオチドと塩基対を形成する（したがって、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列間の相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ内のミスマッチ塩基で中断し、また相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的ＡＲ  ＲＮＡ配列間で維持される）。
【０６０７】
以上で記述したように、ミスマッチ耐性領域内で単一ミスマッチ塩基対を有する本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍ（例えば、アンチセンス鎖の位置１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３にてミスマッチヌクレオチド残基を持つＤｓｉＲＮＡｍｍ）はさらに、１、２または３つのさらなるミスマッチ塩基対を含みうる。好ましい実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのこれらの１、２または３つのさらなるミスマッチ塩基対が、アンチセンス鎖の位置１７、１８、１９、２０、２１、２２および／または２３で（そしてセンス鎖の相当する残基にて）発生する。１つのさらなるミスマッチ塩基対がＤｓｉＲＮＡｍｍ内に存在する１つの実施形態において、アンチセンス鎖の２つのミスマッチ塩基対が、（センス鎖の相当するヌクレオチド残基にてまた発生しているミスマッチを持って）アンチセンスの位置１８および位置２０両方のヌクレオチドで発生しうる。
【０６０８】
２つのミスマッチ塩基対を有するＤｓｉＲＮＡｍｍ試薬において、ミスマッチは連続して（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿った連続位置にて）発生しうる。あるいは、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、センス鎖配列と塩基対形成するヌクレオチドによって散在されうる（例えば位置１８および１９ではなく、位置１７および２０でミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍに対して、アンチセンス鎖位置１７および２０のミスマッチ残基が、センス鎖の相当する残基とマッチ塩基対を形成する２つのヌクレオチドによって散在する）。例えば、相当するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する（センス鎖のミスマッチ耐性領域内に局在する）アンチセンス鎖の２つの残基は、これらのミスマッチ塩基対間に局在する０、１、２、３、４、５、６または７マッチ塩基対で発生可能である。
【０６０９】
３つのミスマッチ塩基対を有する特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ試薬に関して、ミスマッチは連続して起こりうる（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列にそって三重に）。あるいは、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドが、センス鎖配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在可能である（例えば、位置１９、２０および２１ではなく、位置１７、１８および２２にてミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍに関して、アンチセンス鎖位置１７および１８のミスマッチ残基は、互いに隣接し、一方アンチセンス鎖位置１８および１２２のミスマッチ残基は、センス鎖の相当する残基とマッチした塩基対を形成する３つの残基によって散在される）。例えば、相当するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する（アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に局在する）アンチセンス鎖の３つの残基が、これらのミスマッチ塩基対の任意の２つの間に局在する、０、１、２、３、４、５または６のマッチ塩基対で発生可能である。
【０６１０】
４つのミスマッチ塩基対を有する特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ試薬に関して、ミスマッチは、連続して発生可能である（たとえば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列にそって四重に）。あるいは、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドが、センス鎖配列と塩基対を形成するヌクレオチドによって散在可能である（例えば、位置１９および２１ではなく、位置１８、２０、２２および２３にてミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍに関して、アンチセンス鎖位置２２および２３のミスマッチ残基は、互いに隣接し、一方アンチセンス鎖位置１８および２０のミスマッチ残基は、センス鎖の相当する残基とマッチした塩基対を形成する１つの残基によって散在される−同様に、アンチセンス鎖位置２０および２２のミスマッチ残基がまた、センス鎖の相当する残基とマッチ塩基対を形成する１つのヌクレオチドによって散在される）。例えば、相当するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する（アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に局在する）アンチセンス鎖の４つの残基が、これらのミスマッチ塩基対の任意の２つの間に局在する、０、１、２、３、４または５のマッチ塩基対で発生可能である。
【０６１１】
明確化の理由のために、上記ＤｓｉＲＮＡｍｍ試薬内のミスマッチヌクレオチド残基の配置を、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンスまたはアンチセンス鎖いずれかの５’末端残基に関してナンバリングする。アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域（ミスマッチ領域）内に配置される位置のナンバリングが、推定Ａｇｏ２開裂部位に対するセンスまたはアンチセンス鎖の５’末端の近位での変動をもってシフト可能である。したがって、アンチセンス鎖またはセンス鎖いずれか内の好ましいミスマッチ部位の配置をまた、推定Ａｇｏ２切断部位に対して、そのようなミスマッチの許容される近位として同定可能でもある。したがって、１つの好ましい実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖のミスマッチヌクレオチドの位置は、相当する標的ＡＲ  ＲＮＡ配列の推定Ａｇｏ２開裂部位の５’（上流）直近に配置されるセンス鎖のヌクレオチド残基である。他の好ましい実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖のミスマッチヌクレオチドは、推定Ａｇｏ２開裂部位の２ヌクレオチド５’（上流）、推定Ａｇｏ２開裂部位の３ヌクレオチド５’（上流）、推定Ａｇｏ２開裂部位の４ヌクレオチド５’（上流）、推定Ａｇｏ２開裂部位の５ヌクレオチド５’（上流）、推定Ａｇｏ２開裂部位の６ヌクレオチド５’（上流）、推定Ａｇｏ２開裂部位の７ヌクレオチド５’（上流）、推定Ａｇｏ２開裂部位の８ヌクレオチド５’（上流）または推定Ａｇｏ２開裂部位の９ヌクレオチド５’（上流）に局在するセンス鎖のヌクレオチド残基にて位置する。
【０６１２】
典型的単一ミスマッチ−含有２５／２７マーＤｓｉＲＮＡｓ（ＤｓｉＲＮＡｍｍ）は、以下の構造を含む（そのようなミスマッチ−含有構造はまた、本明細書で示した他の典型的ＤｓｉＲＮＡ構造内に組み込んでもよい）。
【０６１３】
【化１１７】
2013534424.tif 000353
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡおよび「Ｍ」＝鎖がアニールする時に、他の相補的鎖の相当する「Ｍ」残基と塩基対（水素結合）を形成しない核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは天然に存在しないまたは改変核酸）。そのような試薬の任意の残基は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーでありえ、−以上で示したように、下（第二）鎖の３’−末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡの交互配置をまた、以上のＤｓｉＲＮＡｍｍ試薬中で使用可能でもある。上記ミスマッチ構造に関して、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
【０６１４】
特定の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡは、ＤｓｉＲＮＡの２つの鎖内のミスマッチ塩基対として必ずしも存在しない、標的ＡＲ  ＲＮＡ配列に関して存在するミスマッチを含みうる−したがって、ＤｓｉＲＮＡは、ＤｓｉＲＮＡの第一および第二鎖間で完全な相補性を有してよく、また（特定の実施形態において、有効性および／または強度および／または効果の期間を促進することにおいて有益であり得る）標的ＡＲ  ＲＮＡに関してミスマッチ残基を有する。ミスマッチが、アンチセンス鎖と標的ＡＲ  ＲＮＡ配列間で発生する、特定の実施形態において、ミスマッチの位置が、標的領域の推定Ａｇｏ２切断部位の５’に局在したセンス鎖の配列に相当する位置で、アンチセンス内で配置される−例えば標的配列の推定Ａｇｏ２切断部位に相補的であるアンチセンス残基の３’に対して、アンチセンス鎖内に位置するアンチセンス鎖残基。
【０６１５】
標的配列に関する単一ミスマッチ残基を持つ典型的２５／２７マーＤｓｉＲＮＡｓは以下の構造を含む。
【０６１６】
【化１１８】
2013534424.tif 000354
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡおよび「Ｅ」＝鎖がアニールする時に、他の相補的（標的）鎖の相当する「Ａ」ＲＮＡ残基と塩基対（水素結合）を形成せず、また任意に相当する「Ｂ」残基と塩基対形成する（「Ｂ」残基はまた、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは天然に存在しないまたは改変核酸）核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは天然に存在しないまたは改変核酸）。そのような試薬の任意の残基は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーでありえ、−以上で示したように、下（第二）鎖の３’−末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡの交互配置をまた、以上のＤｓｉＲＮＡ試薬中で使用可能でもある。
【０６１７】
以上で例示した構造に加えて、本発明のＤｓｉＲＮＡはまた、標的ＡＲ  ＲＮＡ配列とさらなるミスマッチを形成する、１、２または３のさらなる残基を有しうる。そのようなミスマッチは連続であってよく、または標的ＡＲ  ＲＮＡ配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在しうる。マッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在される場合、ミスマッチ残基は、そのようなミスマッチ形成残基間の１、２、３、４、５、６、７または８塩基対形成ヌクレオチドの間隔にて単一鎖内で互いに離れて隔たりうる。
【０６１８】
上記ＤｓｉＲＮＡｍｍ試薬に対してのように、（また相当するセンス鎖ヌクレオチドとミスマッチを形成してよく、または形成しなくてよい）標的ＡＲ  ＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖ヌクレオチドに関して、ＤｓｉＲＮＡｓ内の好ましい配置が、ＤｓｉＲＮＡの推定Ａｇｏ２切断部位に相補的なアンチセンス鎖配列の３’（下流）に局在するアンチセンス鎖領域内である（たとえば、図１において、推定Ａｇｏ２切断部位の３’であるアンチセンス鎖の領域が、ミスマッチ形成残基に関して好ましく、図１にて示した２５／２７マー試薬に対するアンチセンス鎖の位置１７〜２３に局在する）。したがって、１つの実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖の（標的ＡＲ  ＲＮＡ配列に関する）ミスマッチヌクレオチドの位置が、相当する標的ＡＲ  ＲＮＡ配列の推定Ａｇｏ２開裂部位のアンチセンス鎖配列内の３’（下流）直近に局在するアンチセンス鎖のヌクレオチド残基である。他の好ましい実施形態において、（標的ＡＲ  ＲＮＡ配列に関する）ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖のミスマッチヌクレオチドは、相当する推定Ａｇｏ２開裂部位の２ヌクレオチド３’（下流）、相当する推定Ａｇｏ２開裂部位の３ヌクレオチド３’（下流）、相当する推定Ａｇｏ２開裂部位の４ヌクレオチド３’（下流）、相当する推定Ａｇｏ２開裂部位の５ヌクレオチド３’（下流）、相当する推定Ａｇｏ２開裂部位の６ヌクレオチド３’（下流）、相当する推定Ａｇｏ２開裂部位の７ヌクレオチド３’（下流）、相当する推定Ａｇｏ２開裂部位の８ヌクレオチド３’（下流）または相当する推定Ａｇｏ２開裂部位の９ヌクレオチド３’（下流）に局在するアンチセンス鎖のヌクレオチド残基にて位置する。
【０６１９】
アンチセンス鎖の２つのミスマッチ形成ヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡ試薬において（ミスマッチ形成ヌクレオチドは、標的ＡＲ  ＲＮＡ配列に関してミスマッチ形成している）、ミスマッチは連続して発生しうる（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列にそって連続した位置で）。あるいは、標的ＡＲ  ＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、標的ＡＲ  ＲＮＡ配列と塩基対形成するヌクレオチドによって散在されうる（例えば、図１で示した２５／２７マー試薬のアンチセンス鎖の５’末端（位置１）から開始して）位置１８および１９ではなく、位置１７および２０でミスマッチ形成ヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡに関して、センス鎖位置１７および２０のミスマッチ残基が、標的ＡＲ  ＲＮＡ配列の相当する残基とマッチした塩基対を形成する２つのヌクレオチドによって散在する）。例えば、相当する標的ＡＲ  ＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成する（アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に位置する）アンチセンス鎖の２つの残基は、これらのミスマッチ形成塩基対間に局在する（標的ＡＲ  ＲＮＡ配列に関する）０、１、２、３、４または５つのマッチした塩基対で発生しうる。
【０６２０】
（標的ＡＲ  ＲＮＡ配列に関してミスマッチを形成している）３つのミスマッチ形成塩基対を有する特定のＤｓｉＲＮＡに関して、ミスマッチ形成ヌクレオチドは、連続して発生しうる（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列にそって三重に）。あるいは、標的ＡＲ  ＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドが、標的ＡＲ  ＲＮＡ配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在可能である（例えば、位置１９、２０および２１ではなく、位置１７、１８および２２にてミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡに関して、アンチセンス鎖位置１７および１８のミスマッチ残基は、互いに隣接し、一方アンチセンス鎖位置１８および２２のミスマッチ形成残基は、標的ＡＲ  ＲＮＡ配列の相当する残基とマッチした塩基対を形成する３つの残基によって散在される）。例えば、相当する標的ＡＲ  ＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成する（アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に局在する）アンチセンス鎖の３つの残基が、これらのミスマッチ塩基対の任意の２つの間に局在する、０、１、２、３または４のマッチ塩基対で発生可能である。
【０６２１】
（標的ＡＲ  ＲＮＡ配列に関してミスマッチを形成している）４つのミスマッチ形成塩基対を有する特定のＤｓｉＲＮＡに関して、ミスマッチ形成ヌクレオチドは、連続して発生しうる（例えば、センス鎖ヌクレオチド配列にそって四重に）。あるいは、標的ＡＲ  ＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドが、標的ＡＲ  ＲＮＡ配列と塩基対を形成するヌクレオチドによって散在可能である（例えば、位置１８および２０ではなく、位置１７、１９、２１および２２にてミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡに関して、アンチセンス鎖位置２１および２２のミスマッチ残基は、互いに隣接し、一方アンチセンス鎖位置１７および１９のミスマッチ形成残基は、標的ＡＲ  ＲＮＡ配列の相当する残基とマッチした塩基対を形成する１つの残基によって散在される−同様に、アンチセンス鎖位置１９および２１のミスマッチ形成残基はまた、標的ＡＲ  ＲＮＡの相当するヌクレオチドとマッチした塩基対を形成する１つのヌクレオチドによって散在される）。例えば、相当する標的ＡＲ  ＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成する（アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に局在する）アンチセンス鎖の４つの残基が、これらのミスマッチ塩基対の任意の２つの間に局在する、０、１、２または３のマッチ塩基対で発生可能である。
【０６２２】
上記ＤｓｉＲＮＡｍｍと他のＤｓｉＲＮＡ構造を、ＤｓｉＲＮＡｍｍとＤｓｉＲＮＡ試薬の特定の構造を例示するために記述する。上記ＤｓｉＲＮＡｍｍとＤｓｉＲＮＡ構造のデザインを、例えば以下に示した他のＤｓｉＲＮＡ構造のＤｓｉＲＮＡｍｍ形態を産出するために適合可能である。以上で例示したように、ＤｓｉＲＮＡｓはまた、ＤｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列間の単一ミスマッチ（または２、３または４ミスマッチ）を有するようにデザイン可能であり、また任意に、ＤｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖配列間の完全な相補性を維持可能である。
【０６２３】
以下で例示するＤｓｉＲＮＡ試薬はまた、それらの二本鎖および／または標的ＡＲ  ＲＮＡ−整列構造内に、挿入／欠損（ｉｎ／ｄｅｌ）構造を有しうる。したがって、本発明のＤｓｉＲＮＡｓは、例えば、ミスマッチおよび／またはミスマッチ形成塩基対の位置に関して以上で記述したそれらの局所に相当する、そのようなｉｎ／ｄｅｌヌクレオチドの配置に対して最適な局所で、標的ＡＲ  ＲＮＡ配列と比較したアンチセンス配列、および／またはセンス鎖配列と比較したアンチセンス配列中、ｉｎ／ｄｅｌ変化を有するようにデザイン可能である。
【０６２４】
本発明のＤｓｉＲＮＡｓは、Ｄｉｃｅｒによって処理され、ＲＩＳＣへ積み込むガイド鎖配列から自由であるようにモデル化されるので、センス鎖の３’−末端領域／アンチセンス鎖の５’−末端領域内でミスマッチを許容可能である。そのようなミスマッチを持つ本発明の典型的ＤｓｉＲＮＡ構造には、以下が含まれ、
【０６２５】
【化１１９】
2013534424.tif 000355
式中「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡおよび「Ｉ」および「Ｊ」＝互いに塩基対（水素結合）を形成しない核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは天然に存在しないまたは改変核酸）で、また任意に「Ｊ」は、標的ＲＮＡ配列ヌクレオチド「Ｈ」に相補的である。そのような試薬の任意の残基は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーでありえ、−以上で示したように、下（第二）鎖の３’−末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡの交互配置−または任意の上記メチル化パターン−をまた、以上のＤｓｉＲＮＡ試薬中で使用可能でもある。上記ミスマッチはまた、本発明のＤｓｉＲＮＡｓ内で組み合わせ可能である。
【０６２６】
以下の構造において、そのようなミスマッチは、非対称ＡＲ−７７０  ＤｓｉＲＮＡ（新規に導入されたミスマッチ残基はイタリック体である）内に導入される。
ＡＲ−７７０  ２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝（５’末端より）センス鎖の２２
【０６２７】
【化１２０】
2013534424.tif 000356
任意に、センス鎖の位置２２のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｕ」または「Ｇ」である。
【０６２８】
ＡＲ−７７０  ２５／２７マーＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２３
【０６２９】
【化１２１】
2013534424.tif 000357
任意に、センス鎖の位置２３のミスマッチ「Ｇ」残基は、あるいは「Ａ」または「Ｃ」である。
【０６３０】
ＡＲ−７７０  ２５／２７マーＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２４
【０６３１】
【化１２２】
2013534424.tif 000358
任意に、センス鎖の位置２４のミスマッチ「ｇ」残基は、あるいは「ａ」または「ｃ」である。
【０６３２】
ＡＲ−７７０  ２５／２７マーＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２５
【０６３３】
【化１２３】
2013534424.tif 000359
任意に、センス鎖の位置２５のミスマッチ「ｃ」残基は、あるいは「ｔ」または「ｇ」である。
【０６３４】
ＡＲ−７７０  ２５／２７マーＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の１
【０６３５】
【化１２４】
2013534424.tif 000360
任意に、アンチセンス鎖の位置１のミスマッチ「Ｇ」残基は、あるいは「Ａ」または「Ｃ」である。
【０６３６】
ＡＲ−７７０  ２５／２７マーＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の２
【０６３７】
【化１２５】
2013534424.tif 000361
任意に、アンチセンス鎖の位置２のミスマッチ「Ｃ」残基は、あるいは「Ｇ」または「Ｕ」である。
【０６３８】
ＡＲ−７７０  ２５／２７マーＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の３
【０６３９】
【化１２６】
2013534424.tif 000362
任意に、アンチセンス鎖の位置３のミスマッチ「Ｃ」残基は、あるいは「Ｕ」または「Ｇ」である。
【０６４０】
ＡＲ−７７０  ２５／２７マーＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の４
【０６４１】
【化１２７】
2013534424.tif 000363
任意に、アンチセンス鎖の位置４のミスマッチ「Ｕ」残基は、あるいは「Ａ」または「Ｃ」である。
【０６４２】
さらなる実施例として、そのようなミスマッチは、非対称ＡＲ−２８１３、ＡＲ−２８１５およびＡＲ−３５９９  ＤｓｉＲＮＡに導入される（新規に導入されたミスマッチ残基はイタリック体である）。
【０６４３】
ＡＲ−２８１３  ２５／２７ｍｅｒＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝（５’−末端から）センス鎖の２２
【０６４４】
【化１２８】
2013534424.tif 000364
任意に、センス鎖の位置２２のミスマッチ「Ｃ」残基は、あるいは「Ａ」または「Ｇ」である。
【０６４５】
ＡＲ−２８１３  ２５／２７ｍｅｒＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２３
【０６４６】
【化１２９】
2013534424.tif 000365
任意に、センス鎖の位置２３のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｕ」である。
【０６４７】
ＡＲ−２８１３  ２５／２７ｍｅｒＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２４
【０６４８】
【化１３０】
2013534424.tif 000366
任意に、センス鎖の位置２４のミスマッチ「ｃ」残基は、あるいは「ｔ」または「ｇ」である。
【０６４９】
ＡＲ−２８１３  ２５／２７ｍｅｒＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２５
【０６５０】
【化１３１】
2013534424.tif 000367
任意に、センス鎖の位置２５のミスマッチ「ｃ」残基は、あるいは「ｔ」または「ｇ」である。
【０６５１】
ＡＲ−２８１３  ２５／２７マーＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の１
【０６５２】
【化１３２】
2013534424.tif 000368
任意に、アンチセンス鎖の位置１のミスマッチ「Ｃ」残基は、あるいは「Ａ」または「Ｇ」である。
【０６５３】
ＡＲ−２８１３  ２５／２７ｍｅｒＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の２
【０６５４】
【化１３３】
2013534424.tif 000369
任意に、アンチセンス鎖の位置２のミスマッチ「Ｃ」残基は、あるいは「Ｇ」または「Ａ」である。
【０６５５】
ＡＲ−２８１３  ２５／２７ｍｅｒＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の３
【０６５６】
【化１３４】
2013534424.tif 000370
任意に、アンチセンス鎖の位置３のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｕ」または「Ｇ」である。
【０６５７】
ＡＲ−２８１３  ２５／２７ｍｅｒＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の４
【０６５８】
【化１３５】
2013534424.tif 000371
任意に、アンチセンス鎖の位置４のミスマッチ「Ｃ」残基は、あるいは「Ｕ」または「Ｇ」である。
【０６５９】
ＡＲ−２８１５  ２５／２７ｍｅｒＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝（５’−末端から）センス鎖の２２
【０６６０】
【化１３６】
2013534424.tif 000372
任意に、センス鎖の位置２２のミスマッチ「Ｃ」残基は、あるいは「Ｕ」または「Ｇ」である。
【０６６１】
ＡＲ−２８１５  ２５／２７ｍｅｒＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２３
【０６６２】
【化１３７】
2013534424.tif 000373
任意に、センス鎖の位置２３のミスマッチ「Ｃ」残基は、あるいは「Ｇ」または「Ｕ」である。
【０６６３】
ＡＲ−２８１５  ２５／２７ｍｅｒＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２４
【０６６４】
【化１３８】
2013534424.tif 000374
任意に、センス鎖の位置２４のミスマッチ「ａ」残基は、あるいは「ｔ」または「ｃ」である。
【０６６５】
ＡＲ−２８１５  ２５／２７ｍｅｒＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２５
【０６６６】
【化１３９】
2013534424.tif 000375
任意に、センス鎖の位置２５のミスマッチ「ａ」残基は、あるいは「ｔ」または「ｇ」である。
【０６６７】
ＡＲ−２８１５  ２５／２７ｍｅｒＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の１
【０６６８】
【化１４０】
2013534424.tif 000376
任意に、アンチセンス鎖の位置１のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｕ」または「Ｃ」である。
【０６６９】
ＡＲ−２８１５  ２５／２７ｍｅｒＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の２
【０６７０】
【化１４１】
2013534424.tif 000377
任意に、アンチセンス鎖の位置２のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｇ」または「Ｕ」である。
【０６７１】
ＡＲ−２８１５  ２５／２７ｍｅｒＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の３
【０６７２】
【化１４２】
2013534424.tif 000378
任意に、アンチセンス鎖の位置３のミスマッチ「Ｃ」残基は、あるいは「Ｇ」または「Ａ」である。
【０６７３】
ＡＲ−２８１５  ２５／２７ｍｅｒＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の４
【０６７４】
【化１４３】
2013534424.tif 000379
任意に、アンチセンス鎖の位置４のミスマッチ「Ｃ」残基は、あるいは「Ｇ」または「Ａ」である。
【０６７５】
ＡＲ−３５９９  ２５／２７ｍｅｒＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝（５’−末端から）センス鎖の２２
【０６７６】
【化１４４】
2013534424.tif 000380
任意に、センス鎖の位置２２のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｕ」または「Ｇ」である。
【０６７７】
ＡＲ−３５９９  ２５／２７ｍｅｒＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２３
【０６７８】
【化１４５】
2013534424.tif 000381
任意に、センス鎖の位置２３のミスマッチ「Ｃ」残基は、あるいは「Ｇ」または「Ａ」である。
【０６７９】
ＡＲ−３５９９  ２５／２７ｍｅｒＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２４
【０６８０】
【化１４６】
2013534424.tif 000382
任意に、センス鎖の位置２４のミスマッチ「ｃ」残基は、あるいは「ａ」または「ｇ」である。
【０６８１】
ＡＲ−３５９９  ２５／２７ｍｅｒＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２５
【０６８２】
【化１４７】
2013534424.tif 000383
任意に、センス鎖の位置２５のミスマッチ「ｃ」残基は、あるいは「ａ」または「ｇ」である。
【０６８３】
ＡＲ−３５９９  ２５／２７ｍｅｒＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の１
【０６８４】
【化１４８】
2013534424.tif 000384
任意に、アンチセンス鎖の位置１のミスマッチ「Ｃ」残基は、あるいは「Ｕ」または「Ｇ」である。
【０６８５】
ＡＲ−３５９９  ２５／２７ｍｅｒＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の２
【０６８６】
【化１４９】
2013534424.tif 000385
任意に、アンチセンス鎖の位置２のミスマッチ「Ｃ」残基は、あるいは「Ｇ」または「Ｕ」である。
【０６８７】
ＡＲ−３５９９  ２５／２７ｍｅｒＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の３
【０６８８】
【化１５０】
2013534424.tif 000386
任意に、アンチセンス鎖の位置３のミスマッチ「Ｃ」残基は、あるいは「Ｕ」または「Ｇ」である。
【０６８９】
ＡＲ−３５９９  ２５／２７ｍｅｒＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の４
【０６９０】
【化１５１】
2013534424.tif 000387
任意に、アンチセンス鎖の位置４のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｕ」または「Ｃ」である。
以上で記したように、そのようなミスマッチの導入は、本明細書で記述した任意のＤｓｉＲＮＡｓ上で実施可能である。
【０６９１】
そのようなＤｓｉＲＮＡ構造のミスマッチは、例えばセンス鎖の３’末端４ヌクレオチド／アンチセンス鎖５’末端４ヌクレオチド内に２、３または４ミスマッチを有するＤｓｉＲＮＡを産出するために混合可能である。
【０６９２】
実際、センス鎖の３’末端残基／アンチセンス鎖の５’末端残基にてＤｓｉＲＮＡ内に導入可能な配列の柔軟性に関して、特定の実施形態において、本発明の非対称ＤｓｉＲＮＡの配列要求を以下の（典型的なＡＲ−７７０  ＤｓｉＲＮＡ配列に関して示した）（ミニマリスト）構造で表すことが出来る。
【０６９３】
【化１５２】
2013534424.tif 000388
式中ｎ＝１〜５、１〜１０、１〜２０、１〜３０、１〜５０、または１〜８０またはそれ以上。
ＡＲ−７７０標的：
【０６９４】
【化１５３】
2013534424.tif 000389
【０６９５】
ＡＲ標的目標はまた、その相補的標的部位が、規定された標的部位と重なる、１つまたはそれ以上の種々のオリゴヌクレオチドによって標的とされる部位であり得る。例えば、典型的ＡＲ−２８１３ＤｓｉＲＮＡに関して、ＡＲ配列に重なり、わずかばかり補正されたＡＲ配列を標的としている特定のＤｓｉＲＮＡｓが、ＡＲ−２８０８のものと同様の活性レベルを示しうる（特に、図２のＡＲ−２８１５およびＡＲ２８０８  ＤｓｉＲＮＡを参照のこと。したがって、特定の実施形態において、デザインされた標的配列領域は、広く重なっている配列を有している一連のＤｓｉＲＮＡｓによって効果的に標的とされる（例えばＡＲ−２８１３部位の周辺のＤｓｉＲＮＡｓを考慮する場合、より包括的なＡＲ標的配列が、例えば５’−ＣＣＣＡＧＣＣＧＣＡＡＴＧＣＣＴＧＡＴＣＴＧＴＧＧＡＧＡＴＧＡＡＧＣ−３’（配列番号：３７８３）として引用されえ、そこで任意のＤｓｉＲＮＡ（例えば、ＡＲ−２８０８、ＡＲ２８０９、ＡＲ−２８１０、ＡＲ−２８１１、ＡＲ−２８１２、ＡＲ−２８１３、ＡＲ−２８１４およびＡＲ−２８１５）から選択されるＤｓｉＲＮＡｓのみが、そのような配列領域内のサブ配列を標的とし、また全配列は、そのような一連のＤｓｉＲＮＡｓに対する実行可能な標的と考慮可能である。
【０６９６】
さらに、および／またはあるいは、センス鎖の３’末端４ヌクレオチド／アンチセンス鎖の５’末端４ヌクレオチド内のミスマッチを、以上で記述したように、他のミスマッチ耐性位置にて位置するミスマッチと混合可能である。
【０６９７】
特定のＡＲ配列の標的化を介して、ＡＲレベルの阻害剤として、上記Ｄｉｃｅｒ基質試薬（ＤｓｉＲＮＡｓ）の本同定を考慮して、本明細書で記述したものと同様の構造を持つＤｓｉＲＮＡｓがまた、配列番号：３７６６、配列番号：３７６８または配列番号：３７７０のＡＲ配列内、またはそれらの変異体（例えば、配列番号：３７６６、配列番号：３７６８または配列番号：３７７０の配列に対して、８０％同一性、９０％同一性、９５％同一性、９６％同一性、９７％同一性、９８％同一性、９９％同一性またはそれ以上の同一性を有する標的配列）内の他の配列を標的とするように合成可能である。
【０６９８】
抗−ＡＲ  ＤｓｉＲＮＡデザイン／合成
２５〜３５ヌクレオチド、とりわけ２５〜３０ヌクレオチドのより長いｄｓＲＮＡ種（ＤｓｉＲＮＡｓ）が、１９〜２３マーｓｉＲＮＡ試薬と比較して、活性の強度および期間に関して、予期せぬ効果的な結果を与えることが、実験的にわかってきた。ｄｓＲＮＡ処理機構の根本的な理論にとらわれずに、より長いｄｓＲＮＡ種が細胞の細胞質中のＤｉｃｅｒ酵素に対する基質として働くことが考えられる。本発明のｄｓＲＮＡをより短い区画に分割することに加えて、Ｄｉｃｅｒは、分割されたｄｓＲＮＡから由来する一本鎖分割産物の、標的遺伝子ＡＲ（またはＡＲ−関連疾患または疾病と関連する他の遺伝子）から由来する細胞質ＲＮＡ（例えばＡＲ  ＲＮＡ）の崩壊に関与するＲＩＳＣ複合体内への導入を促進すると考えられる。先行する研究（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第２００７／０２６５２２０号明細書）は、ＤｉｃｅｒによるｄｓＲＮＡ種（特にＤｓｉＲＮＡ試薬）の開裂性が、ｄｓＲＮＡ種の活性の強度および期間の増加と一致することを示した。
【０６９９】
特定の好ましい抗−ＡＲ  ＤｓｉＲＮＡ試薬を、プレスクリーンした集団から選択した。ＤｓｉＲＮＡｓのデザインは任意に、配列の領域に広がっている可能性のある多数のＤｓｉＲＮＡ試薬の推定有効性／効率のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ査定にて実施する予測スコアリングアルゴリズムの利用を含みうる。より最近の「ｖ３」アルゴリズムは、本技術分野ですでに利用可能なｓｉＲＮＡスコアリングアルゴリズムに関する理論的に改善されたアルゴリズムを表すけれども、そのようなスコアリングアルゴリズムのデザインに関する情報は、例えば、Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００６，７：５１６）で見ることができる（例えば「ｖ３」および「ｖ４」スコアリングアルゴリズムは、ヒト配列中の任意のバイアスに依存していない機械学習アルゴリズムである。さらに、「ｖ３」および「ｖ４」アルゴリズムは、Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．にて記述されたデバイスのような、より古い「ｖ２」アルゴリズムからのものよりも、複数倍大きいデータ組から由来する）。
【０７００】
本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬の第一および第二オリゴヌクレオチドは、完全に相補的であることを必要としない。実際、１つの実施形態において、センス鎖の３’−末端は、１つまたはそれ以上のミスマッチを含む。１つの様態において、２つのミスマッチが、センス鎖の３’末端に組み込まれる。他の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡは、それぞれが長さにおいて２７ヌクレオチドであり、互いにアニールした時に、センス鎖の３’末端（アンチセンス鎖の５’末端）上に平滑筋末端と２つのヌクレオチド末端を持つ、２つのＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ分子である。（特に３’−センス／５’−アンチセンス位置での）ミスマッチまたは熱力学的安定性の減少の利用が、おそらくｓｉＲＮＡのＲＩＳＣへの進入とともに発生する速度制限巻き戻し段階に影響を与えることによって、アンチセンス鎖のＲＩＳＣへの進入を促進するまたは有利に働かせるために提案されてきた（Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｅｌｌ  １１５：１９９−２０８；Ｋｈｖｏｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｅｌｌ  １１５：２０９−２１６）。したがって、末端塩基組成物は、活性２１マーｓｉＲＮＡ二本鎖を選択するためのデザインアルゴリズムに含まれてきた（Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３２：９３６−９４８；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：３２６−３３０）。本実施形態のｄｓＲＮＡのＤｉｃｅｒ開裂で、ミスマッチを含む小さな最終末端配列が、アンチセンス鎖と対を形成しないままであるか（３’−オーバーハングの一部となる）、または最終２１−マーｓｉＲＮＡを完全に開裂して除去されるか、いずれかである。これらの「ミスマッチ」はしたがって、ＲＩＳＣの最終ＲＮＡ組成物中のミスマッチとして持続しない。Ｄｉｃｅｒ基質のセンス鎖の３’−末端での塩基ミスマッチまたは区画の不安定化がおそらくＤｉｃｅｒによる処理を促進することによって、ＲＮＡｉ中の合成二本鎖の強度を改善したという発見が、２５〜３０マーｄｓＲＮＡｓのデザインと利用を記述している過去の働きの驚くべき発見であった（また本明細書で「ＤｓｉＲＮＡｓ」と呼ぶ。米国特許第２００５／０２７７６１０号明細書、第２００５／０２４４８５８号明細書および第２００７／０２６５２２０号明細書）。
【０７０１】
抗−ＡＲ  ＤｓｉＲＮＡの修飾
二本鎖ＲＮＡｓ（「ｄｓＲＮＡｓ」）の効果を阻害する１つの主要な因子は、ヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡｓ（例えばｓｉＲＮＡｓおよびＤｓｉＲＮＡｓ）の分解である。３’−エキソヌクレアーゼは、血清中に存在する第一ヌクレアーゼ活性であり、アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドの３’−末端の改変が、分解を防止するために重要である（Ｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ  Ｄｅｖ，１：１４１−１５１）。ＲＮａｓｅ−Ｔファミリーヌクレアーゼは同定され、ｓｉＲＮＡｓの制御および分解に関与する３’から５’エキソヌクレアーゼ活性を持つＥＲＩ−１と呼ばれた（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎａｔｕｒｅ  ４２７：６４５−６４９；Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，３９０：６７５−６７９）。この遺伝子はまた、マウス内でのＴｈｅｘ１（ＮＭ＿０２０６７）またはヒト内でのＴＨＥＸ１（ＮＭ＿１５３３３２）として知られ、ヒストンｍＲＮＡの分解に関与し、またｓｉＲＮＡｓ中の３’−オーバーハングの分解を仲介するが、二本鎖ＲＮＡを分解しない（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２８１：３０４４７−３０４５４）。したがって、本発明のＤｓｉＲＮＡｓを含む、ｄｓＲＮＡｓの３’−末端−安定化が安定性を改善すると予測することが合理的である。
【０７０２】
ＸＲＮ１（ＮＭ＿０１９００１）は、Ｐ−体中に存在し、ｍｉＲＮＡによって標的化されたｍＲＮＡの分解に関与してきた５’から３’エキソヌクレアーゼであり（Ｒｅｈｗｉｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，ＲＮＡ  １１：１６４０−１６４７）、またｓｉＲＮＡによって指向されるような内部開裂によって開始される分解を完了するのに関与しうる。ＸＲＮ２（ＮＭ＿０１２２５５）は、核ＲＮＡ処理に関与する異なる５’から３’エキソヌクレアーゼである。
【０７０３】
ＲＮａｓｅ  Ａは、ＲＮＡｓを分解する哺乳動物における主要なエンドヌクレアーゼ活性である。ｓｓＲＮＡに対して特異的であり、ピリミジン塩基の３’−末端で開裂する。ＲＮａｓｅ  Ａ開裂と一致するｓｉＲＮＡ分解産物は、血清中でのインキュベーション後、質量分析によって検出可能である（Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｓｙｓｔ  ３：４３〜５０）。３’−オーバーハングは、ＲＮａｓｅ分解に対するｓｉＲＮＡの感受性を増強する。血清からのＲＮａｓｅ  Ａの枯渇が、ｓｉＲＮＡｓの分解を減少させ、この分解が配列優先傾向を見せ、末端上でポリＡ／Ｕ配列を持つ配列に対してより悪い（Ｈａｕｐｅｎｔｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００６  Ｂｉｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７１：７０２−７１０）。このことは、二本鎖のより安定性の低い領域が、「呼吸をし」え、ＲＮａｓｅ  Ａによる分解に対して利用可能な一時的な一本鎖種を提供することを示唆している。ＲＮａｓｅ  Ａ阻害剤を血清に加え、ｓｉＲＮＡ寿命および強度を改善可能である（Ｈａｕｐｅｎｔｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｉｎｔ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １２１：２０６−２１０）。
【０７０４】
２１マー中、ホスホロチオエートまたはボラノホスフェート改変が、ヌクレオチド内リン酸結合を直接安定化させる。ボラノホスフェート改変ＲＮＡｓは、ヌクレアーゼ耐性が高く、サイレンシング試薬として強力であり、比較的無毒性である。ボラノホスフェート改変ＲＮＡｓは、標準の化学合成方法を用いて製造できず、代わりにｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）によって作製される（Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３２：５９９１−６０００；Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３４：２７７３−２７８１）。ホスホロチオエート（ＰＳ）改変は、任意の望む位置で、ＲＮＡ二本鎖中簡単に配置可能であり、標準の化学合成方法を用いて作製可能である。ＰＳ改変は、用量依存毒性を示し、それにより、ほとんどの研究者は、ｓｉＲＮＡｓ内への組み込みの制限を推奨し、ヌクレアーゼからの保護が最も重要な３’−末端が好まれる（Ｈａｒｂｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  １３：８３−１０５；Ｃｈｉｕ  ａｎｄ  Ｒａｎａ，２００３，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  １０：５４９−５６１；  Ｂｒａａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：７９６７−７９７５；  Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１：５８９−５９５）。より広範囲なＰＳ改変が、強力なＲＮＡｉ活性と両立可能であるが、しかし（２’−Ｏ−メチルＲＮＡのような）糖改変の利用がよりすぐれている可能性がある（Ｃｈｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３４２：９１９−９２７）。
【０７０５】
種々の置換基を、一般的に二本鎖安定性（Ｔｍ）を増加させ、ヌクレアーゼ耐性を大きく改善可能な、リボースの２’−位置に配置可能である。２’−Ｏ−メチルＲＮＡは、哺乳動物リボソームＲＮＡｓおよび転写ＲＮＡｓにて見られる、天然に存在する改変である。ｓｉＲＮＡｓ中の２’−Ｏ−メチル改変が公知であるが、二本鎖内の改変塩基の実際の位置が、強度を保つために重要であり、ＲＮＡに対する２’−Ｏ−メチルＲＮＡの完全な置換は、ｓｉＲＮＡを不活性化する。例えば、交互２’−Ｏ−メチル塩基を使用するパターンは、改変されていないＲＮＡと等価の強度を持ち得、血清中極めて安定である（Ｃｈｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３４２：９１９−９２７；Ｃｚａｕｄｅｒｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１：２７０５−２７１６）。
【０７０６】
２’−フルオロ（２’−Ｆ）改変はまた、ｄｓＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡおよびＤｓｉＲＮＡ）機能と両立可能であり、（試薬コストおよび利用可能性のため）最も一般的にはピリジン部位に位置し、プリン位置にて２’−Ｏ−メチル改変と組み合わせ可能であり、２’−Ｆプリンが利用でき、使用可能である。この種類の非常に改変された二本鎖は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて、ＲＮＡｉの強力なトリガーでありえ（Ａｌｌｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４８：９０１−９０４；Ｐｒａｋａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４８：４２４７−４２５３；Ｋｒａｙｎａｃｋ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，２００６，ＲＮＡ  １２：１６３−１７６）、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用した時に、活性の性能を改善し、期間を延長可能である（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４１：  １３４９−１３５６；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３：１００２−１００７）。非常に強力で、ヌクレアーゼ安定である、交互２’−Ｆおよび２’−Ｏ−Ｍｅ塩基を含む平滑１９マーの二本鎖が、Ａｌｌｅｒｏｎによって教示された。このデザインにおいて、交互２’−Ｏ−Ｍｅ残基は、Ｃｚａｕｄｅｒｎａによって使用されたものと同一のパターンで配置されるが、しかし残りのＲＮＡ残基は２’−Ｆ改変塩基に変換される。Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙによって使用された、非常に強力な、ヌクレアーゼ耐性のｓｉＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、非常に強力な、ヌクレアーゼ耐性ｓｉＲＮＡを使用した。２’−Ｏ−Ｍｅ  ＲＮＡおよび２’−Ｆ  ＲＮＡに加えて、この二本鎖は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、逆脱塩基残基、および３’−末端ＰＳヌクレオシド内結合を含む。広範囲の改変は、特定の利点を持つ一方で、二本鎖のより制限された改変もまた、ｉｎ  ｖｉｖｏ性能を改善し、製造がより単純で、よりコストがかからない。Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００４，  Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１７３−１７８）は、ｉｎ  ｖｉｖｏで二本鎖を使用し、主に２つの２’−Ｏ−Ｍｅ  ＲＮＡ塩基および制限された３’−末端ＰＳヌクレオシド内結合を持つＲＮＡであった。
【０７０７】
ロック核酸（ＬＮＡｓ）は、ｄｓＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡおよびＤｓｉＲＮＡ）を安定させるために使用可能な異なる種類の２’−改変である。強度を維持するＬＮＡ組み込みのパターンは、２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｆ−塩基よりも制限され、そのように制限された改変が好ましい（Ｂｒａａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：７９６７−７９７５；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１：３１８５−３１９３；Ｅｌｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３：４３９−４４７）。制限された組み込みでさえ、ＬＮＡ改変の利用は、ｉｎ  ｖｉｖｏにてｄｓＲＮＡの性能を改善可能であり、標的効果特性を変えるか、改善しうる（Ｍｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ６：８３３−８４３）。
【０７０８】
細胞内または生動物内に導入された合成核酸は、「外来」として認識され、免疫応答を引き起こしうる。免疫刺激は、劇的に実験結果を変化させ、細胞死を導きさえする的外れの効果の主な種類を構成する。生来の免疫システムには、これらの応答を仲介するＤＮＡおよびＲＮＡととりわけ相互作用する受容体分子の集団が含まれ、その幾つかは、細胞質内に局在し、その幾つかはエンドソーム内に存在する（Ｍａｒｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，２００５，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３：１３９９−１４０５；Ｓｃｈｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １４：４６３−４７０）。カチオン性脂質またはリポソームによるｓｉＲＮＡｓの伝達は、ｓｉＲＮＡを、細胞質およびエンドソーム区画両方へ曝露させ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ両方で、１型インターフェロン（ＩＦＮ）応答を引き起こすリスクを最大化する（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３：１００２−１００７；Ｓｉｏｕｄ  ａｎｄ  Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，２００３，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３１２：１２２０−１２２５；Ｓｉｏｕｄ，２００５，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３４８：１０７９−１０９０；Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３３０：  ７５５−７５９）。細胞内に転写されたＲＮＡｓは免疫原性が少なく（Ｒｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｌ  ２４：５６６−５７１）、脂質に基づく方法を用いて伝達した時に免疫原性である合成ＲＮＡｓは、ｉｎ  ｖｉｖｏでさえ、機械的方法によって細胞内に導入された時に、免疫刺激を逃れる（Ｈｅｉｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：  １５７９−１５８２）。しかしながら、脂質に基づく伝達方法は一般的で、効果的で、広く使用される。とりわけ、全ての細胞型が存在し、免疫応答が産出されるリスクが最も高いｉｎ  ｖｉｖｏ適用に対して、免疫応答を防止するためのいくつかの一般的な戦略が必要である。化学的に改変したＲＮＡｓの利用が、これらの問題のほとんどまたはすべてを解決しうる。
【０７０９】
特定の実施形態において、改変がＡＲ阻害活性を有することからＤｓｉＲＮＡ試薬を阻害しない限り、改変を本発明の抗ＡＲ  ＤｓｉＲＮＡ中に含められる。１つの実施形態において、１つまたはそれ以上の改変が、ＤｓｉＲＮＡ試薬のＤｉｃｅｒ処理を増強するように実施される（ＤｓｉＲＮＡのＤｉｃｅｒ処理を測定するためのアッセイが上記されている）。第二実施形態において、１つまたはそれ以上の改変が、より効果的なＡＲ阻害となるように実施される（本明細書で記述したように。ＤｓｉＲＡＮのＡＲ阻害／ＡＲ阻害活性は、ＲＮＡレベルを測定するため、またはＡＲポリペプチドレベルを測定するための本技術分野で認識されている方法を介してアッセイ可能であり、そのようなレベルは、たとえばＡＲ  ｍＲＮＡレベルの査定の代わりに、または加えて査定されるべきである）。第三の実施形態において、１またはそれ以上の改変が、より大きなＡＲ阻害活性を支持するように実施される（ＡＲ阻害活性を決定する方法は上記されている）。第四の実施形態において、１つまたはそれ以上の改変が、細胞に伝達されるべき各ＤｓｉＲＮＡ試薬分子あたりのＡＲ阻害活性がより強力な強度となるように実施される（ＡＲ阻害活性の強度が上記されている）。改変は、配列内の３’−末端領域、５’−末端領域にて、３’−末端領域と５’−末端領域両方にて、または例えば種々の位置で組み入れることが可能である。以上で記した制限を考慮して、改変の数および組み合わせをＤｓｉＲＮＡ試薬内に組み込むことが可能である。多数の改変が存在する場合、それらは同一であるか、または異なってよい。塩基、糖部位、リン酸骨格およびそれらの組み合わせに対する改変が企図される。いずれかの５’−末端がリン酸化可能である。
【０７１０】
リン酸骨格に対して企図される改変の例には、メチルホスフェート、ホスホロチオエート、およびアルキルホスホトリエステルのようなホスホトリエステル改変などを含むリン酸塩が含まれる。糖部位に対して企図される改変の例には、２’−Ｏ−メチルのような２’−アルキルピリミジン、２’−フルオロ、アミノおよびデオキシ改変などが含まれる（例えば、Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１：５８９−５９５を参照のこと）。塩基に対して企図される改変の例には、脱塩基糖２−Ｏ−アルキル改変ピリミジン類、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシルおよび５−（３−アミノアルキル）−ウラシルなどが含まれる。ロック核酸またはＬＮＡ’ｓも組み込むことが可能である。多くの他の改変が公知であり、以上の基準を満足させる限り使用可能である。改変の例はまた、米国特許題５，６８４，１４３号明細書、第５，８５８，９８８号明細書および第６，２９１，４３８号明細書、および米国特許第２００４／０２０３１４５  Ａ１号明細書に開示されている。他の改変は、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ  （２０００，  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  １０：２９７−３１０），Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（２０００，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  １０：１１７−２１）、Ｒｕｓｃｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  １０：３３３−３４５）、Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  １１：３１７−２５）、Ｖｏｒｏｂｊｅｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００１，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  １１：７７−８５）にて開示されている。
【０７１１】
企図される１つまたはそれ以上の改変をいずれかの鎖内に組み込むことが可能である。ＤｓｉＲＮＡ試薬中の改変の位置は、より強力な強度および安定性の授与、毒性の減少、Ｄｉｃｅｒ処理の増強および免疫応答の最小化を含む、ＤｓｉＲＮＡ試薬の特徴に大きく影響を与えうる。１つの実施形態において、アンチセンス鎖またはセンス鎖、または両方の鎖が、１つまたはそれ以上の２’−Ｏ−メチル改変ヌクレオチドを持つ。他の実施形態において、アンチセンス鎖は、２’−Ｏ−メチル改変ヌクレオチドを含む。他の実施形態において、アンチセンス鎖は、２’−Ｏ−メチル改変ヌクレオチドからなる３’オーバーハングを含む。アンチセンス鎖はまた、さらなる２’−Ｏ−メチル改変ヌクレオチドを含みうる。
【０７１２】
本発明の特定の実施形態において、抗−ＡＲ  ＤｓｉＲＮＡ試薬は、１つまたはそれ以上の以下の特徴を持つ。（ｉ）ＤｓｉＲＮＡ試薬は非対称であり、例えばアンチセンス鎖上に３’オーバーハングを持つ、および（ｉｉ）ＤｓｉＲＮＡ試薬は、活性ｓｉＲＮＡへのｄｓＲＮＡのＤｉｃｅｒ結合と処理の方向を指向するために、センス鎖上に改変３’末端を持つ。本実施形態にしたがって、ｄｓＲＮＡ中最も長い鎖は、２５〜３５ヌクレオチド（例えば２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５ヌクレオチド）を含む。特定のそのような実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ試薬は、センス鎖が２５〜３４ヌクレオチドを含み、センス鎖の３’末端が、アンチセンス鎖の５’末端と平滑末端を形成し、一方アンチセンス鎖が２６〜３５ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖の３’末端上にオーバーハングを形成するように非対称である。１つの実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ試薬は、センス鎖が２５〜３８ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が２５〜３０ヌクレオチドを含むように非対称である。したがって、得られたｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端上にオーバーハングを持つ。オーバーハングは、１〜４ヌクレオチド、例えば２ヌクレオチドである。センス鎖はまた５’リン酸を持ちうる。
【０７１３】
他の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ試薬のセンス鎖を、センス鎖の３’末端に位置する好適な修飾因子によりＤｉｃｅｒ処理のために改変し、すなわちＤｓｉＲＮＡ試薬が、Ｄｉｃｅｒ結合および処理の方向を指向するようにデザインされる。好適な修飾因子には、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドなど、および蛍光分子などのような立体的に込み入った分子が含まれる。アシクロヌクレオチドは、ｄＮＭＰｓ中に通常存在する２’−デオキシリボフラノシル糖の代わりに、２−ヒドロキシエトキシメチル基を置換する。他のヌクレオチド修飾因子には、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’、３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’、３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’、３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、および３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）の一リン酸ヌクレオチド、２’、３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）および２’、３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）が含まれうる。１つの実施形態において、デオキシヌクレオチドを修飾因子として使用する。ヌクレオチド修飾因子を使用する時に、１〜３ヌクレオチド修飾因子、または２ヌクレオチド修飾因子を、センス鎖の３’末端上のリボヌクレオチドの代わりに使用する。立体的に込み入った分子を使用する場合、それらは、アンチセンス鎖の３’末端にてリボヌクレオチドに接続する。したがって、鎖の長さは、修飾因子の組み込みにともなって変化しない。他の実施形態において、本発明は、アンチセンス鎖のＤｉｃｅｒ処理の方向を指向するために、ＤｓｉＲＮＡ試薬中の２つのＤＮＡ塩基を置換することを企図する。本発明のさらなる実施形態において、２つの末端ＤＮＡ塩基を、センス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端上で、二本鎖の平滑末端を形成しているセンス鎖の３’−末端上の２つのリボヌクレオチドの代わりに使用し、２つのヌクレオチドＲＮＡオーバーハングは、アンチセンスの３’−末端に位置する。これは、平滑末端上にＤＮＡ、オーバーハング末端上にＲＮＡ塩基を持つ、非対称組成物である。
【０７１４】
本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬のセンスおよびアンチセンス鎖は、細胞の細胞質中で見られる条件のような、生物学的条件下でアニールする。さらに、ＤｓｉＲＮＡ試薬の、とりわけアンチセンス鎖の、１つの配列の一領域が、少なくとも１５（特定の実施形態において、１９）ヌクレオチドの配列長を持ち、そこでこれらの残基は、（例えば、アンチセンス鎖の３’末端に隣接する２１−ヌクレオチド領域中）アンチセンス鎖の３’末端に隣接し、標的ＡＲ  ＲＮＡのヌクレオチド配列に十分相補的である。
【０７１５】
さらに、ＤｓｉＲＮＡ試薬構造は、Ｄｉｃｅｒの開裂から産出されるオリゴヌクレオチド区画が、遺伝子発現を阻害することにおいてもっとも効果的であるオリゴヌクレオチドの部分であり得ることを確かにするために最適化可能である。例えば、本発明の１つの実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ試薬構造の２７−ｂｐオリゴヌクレオチドが合成され、そこで予想される遺伝子発現を阻害する２１〜２２−ｂｐ区画が、アンチセンス鎖の３’末端上に局在する。アンチセンス鎖の５’−末端上に局在する残りの塩基は、Ｄｉｃｅｒによって開裂され、捨てられる。この開裂された部分は均一であるか（すなわち標的配列の配列に基づく）、または不均一であり、核酸鎖を伸長するために加えられる。
【０７１６】
ＤｓｉＲＮＡ試薬はまた、１つまたはそれ以上の以下のさらなる特徴を持ちうる。（ａ）アンチセンス鎖は、典型的に２１マーから右シフトを持つ（例えば、ＤｓｉＲＮＡは、ＤｓｉＲＮＡ内の推定Ｄｉｃｅｒ開裂部位の５’まで伸長するアンチセンス鎖ヌクレオチドの長さを含み、そのようなアンチセンス鎖ヌクレオチドは、センス鎖中の推定Ｄｉｃｅｒ開裂の３’を伸長しているセンス鎖の相当するヌクレオチドと塩基対を形成する）、（ｂ）鎖は、完全に相補的でなくてよい、すなわち鎖は、単一のミスマッチ塩基対を含んでよい（ミスマッチ塩基対を有するＤｓｉＲＮＡのＡＲ阻害活性が、十分なレベルで維持される（例えばミスマッチ塩基対を有しない相当するＤｓｉＲＮＡと比較して、少なくとも５０％ＡＲ阻害活性またはそれ以上、少なくとも６０％ＡＲ阻害活性またはそれ以上、少なくとも７０％ＡＲ阻害活性またはそれ以上、少なくとも８０％ＡＲ阻害活性またはそれ以上、少なくとも９０％ＡＲ阻害活性またはそれ以上または少なくとも９５％ＡＲ阻害活性またはそれ以上を維持する）という条件で、特定の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡｓは、１、２、３、４または５またはそれ以上のミスマッチ塩基対を有する。特定の実施形態において、ミスマッチ塩基対は、ＤｓｉＲＮＡのアンチセンスとセンス鎖の間に存在する。いくつかの実施形態において、ミスマッチ塩基対は、アンチセンス鎖と標的ＲＮＡ間に存在する（または存在すると予想される）。特定の実施形態において、アンチセンス鎖残基と、想定Ａｇｏ２開裂部位の標的ＲＮＡ配列中３’に局在する標的ＲＮＡ内の相当する残基間でのミスマッチ塩基対の存在が維持され、本発明のＤｓｉＲＮＡのＡＲ阻害活性を増強してもよい）、（ｃ）ロック核酸のような塩基改変が、センス鎖の５’末端に含まれてよい。「典型的」２１マーｓｉＲＮＡは、従来の技術を用いてデザインされる。１つの技術において、種々の部位が、平行して、または試薬の１つが効果的であるという希望とともに、同一の標的に特異的な種々の異なるｓｉＲＮＡ二本鎖を含むプール中で一般に試験される（Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５５２：２４７−２５２）。他の技術は、活性ＲＮＡｉ効果器分子を得る可能性を増加させるためのデザインルールおよびアルゴリズムを使用する（Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｅｌｌ  １１５：１９９−２０８；Ｋｈｖｏｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｅｌｌ  １１５：  ２０９−２１６；Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３２：９３６−９４８；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：３２６−３３０；Ｋｒｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：４２２３０−４２２３９；Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３２（ウェブ発行）：Ｗ１３０−１３４；Ｂｏｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３９２：７３−９６）。ｓｉＲＮＡのハイスループット選別もまた開発されてきた（米国特許第２００５．００４２６４１  Ａ１号明細書）。潜在的標的部位をまた、二次構造予測によって解析可能である（Ｈ��ａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３（３）：  ｅ３０）。ついで、この２１マーを、２１マーの５’末端上に３〜９のさらなるヌクレオチドを含めるために、右シフトをデザインするために使用する。これらのさらなるヌクレオチドの配列は制限されない。１つの実施形態において、追加したリボヌクレオチドは、標的遺伝子の配列に基づく。本実施形態においてさえ、標的配列とアンチセンスｓｉＲＮＡ間の完全な相補性は要求されない。
【０７１７】
本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬の第一および第二オリゴヌクレオチドは、完全な相補性を要求されない。これらは、生物学的条件下でアニールするのに、また標的配列に対して十分相補的なｓｉＲＮＡを産出するＤｉｃｅｒに対する基質を提供するのに十分相補的である必要があるのみである。ロック核酸またはＬＮＡ’ｓが当業者によく公知である（Ｅｌｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３：４３９−４４７；Ｋｕｒｒｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：１９１１−１９１８；Ｃｒｉｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：２４３５−２４４３；Ｂｒａａｓｃｈ  ａｎｄ  Ｃｏｒｅｙ，  ２００１，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ８：１−７；Ｂｏｎｄｅｎｓｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６：２６８７−２６９５；Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：５６３３−５６３８）。１つの実施形態において、ＬＮＡをセンス鎖の５’末端に組み込む。他の実施形態において、ＬＮＡを、アンチセンス鎖上に３’オーバーハングを含むようにデザインされた二本鎖中のセンス鎖の５’末端に組み込む。
【０７１８】
特定の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬は、２５−塩基対長を持つセンス鎖と、２塩基３’−オーバーハングを持つ２７−塩基対長を持つアンチセンス鎖の非対称構造を持つ。他の実施形態において、非対称構造を持つこのＤｓｉＲＮＡ試薬はさらに、２つのリボヌクレオチドの代わりに、センス鎖の３’末端にて２−デオキシヌクレオチドを含む。
【０７１９】
２つの別々のオリゴヌクレオチドを含む、特定のＤｓｉＲＮＡ試薬組成物が、三次構造によって連結可能である。三次構造は、ＤｓｉＲＮＡ試薬上のＤｉｃｅｒ活性を阻害せず、標的遺伝子から転写されたＲＮＡの指向崩壊を干渉しない。１つの実施形態において、三次構造は、化学結合基であってよい。多くの好適な化学結合基が本技術分野で公知であり、使用可能である。あるいは、三次構造は、ヘアピン構造が、ｄｓＲＮＡ組成物を作製している２つのオリゴヌクレオチドのアニーリングに際して産出されるような様式で、ＤｓｉＲＮＡ試薬の２つのオリゴヌクレオチドを結合させるオリゴヌクレオチドであってよい。ヘアピン構造は、ＤｓｉＲＮＡ試薬上のＤｉｃｅｒ活性を阻害せず、ＡＲ  ＲＮＡの指向崩壊を干渉しない。
【０７２０】
特定の実施形態において、本発明の抗−ＡＲ  ＤｓｉＲＮＡ試薬は、Ｄｉｃｅｒによるその処理を増強する種々の特徴を持つ。そのような実施形態にしたがって、ＤｓｉＲＮＡ試薬は、ｓｉＲＮＡを産出するためにＤｉｃｅｒによって有され、以下の特徴の少なくとも１つを有すように十分な長さを持つ。（ｉ）ＤｓｉＲＮＡは非対称である、例えばセンス鎖上に３’オーバーハングを持つ、および（ｉｉ）ＤｓｉＲＮＡ試薬は、活性ｓｉＲＮＡへのｄｓＲＮＡのＤｉｃｅｒ結合と処理の方向を指向するために、アンチセンス鎖上に改変３’末端を持つ。これらの実施形態にしたがって、ＤｓｉＲＮＡ中最も長い鎖は、２５〜３５ヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、センス鎖は２５〜３０ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は２５〜２８ヌクレオチドを含む。したがって、得られるｄｓＲＮＡは、センス鎖の３’末端上にオーバーハングを持つ。オーバーハングは、２ヌクレオチドのような、１〜４ヌクレオチドである。アンチセンス鎖は、５’リン酸を持ってもよい。
【０７２１】
特定の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ試薬のセンス鎖を、センス鎖の３’末端に位置する好適な修飾因子によるＤｉｃｅｒ処理のために改変し、すなわちＤｓｉＲＮＡ試薬が、Ｄｉｃｅｒ結合および処理の方向を指向するようにデザインされる。好適な修飾因子には、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドなど、および蛍光分子などのような立体的に込み入った分子が含まれる。アシクロヌクレオチドは、ｄＮＭＰｓ中に通常存在する２’−デオキシリボフラノシル糖の代わりに、２−ヒドロキシエトキシメチル基を置換する。他のヌクレオチド修飾因子には、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’、３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’、３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’、３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、および３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）の一リン酸ヌクレオチド、２’、３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）および２’、３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）が含まれうる。１つの実施形態において、デオキシヌクレオチドを修飾因子として使用する。ヌクレオチド修飾因子を使用する時に、１〜３ヌクレオチド修飾因子、または２ヌクレオチド修飾因子を、センス鎖の３’末端上のリボヌクレオチドの代わりに使用する。立体的に込み入った分子を使用する場合、それらは、アンチセンス鎖の３’末端にてリボヌクレオチドに接続する。したがって、鎖の長さは、修飾因子の組み込みにともなって変化しない。他の実施形態において、本発明は、アンチセンス鎖のＤｉｃｅｒ処理の方向を指向するために、ＤｓｉＲＮＡ試薬中の２つのＤＮＡ塩基を置換することを企図する。さらなる本発明において、２つの末端ＤＮＡ塩基を、センス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端上で、二本鎖の平滑末端を形成している２つのリボヌクレオチドの代わりに３’−末端上に配置し、２ヌクレオチドＲＮＡオーバーハングをアンチセンス鎖の３’末端上に配置する。これは、平滑末端上にＤＮＡ、オーバーハング末端上にＲＮＡ塩基を持つ、非対称組成物である。
【０７２２】
特定の他の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ試薬のアンチセンス鎖を、アンチセンス鎖の３’末端に位置する好適な修飾因子によるＤｉｃｅｒ処理のために改変し、すなわちＤｓｉＲＮＡ試薬が、Ｄｉｃｅｒ結合および処理の直接の方向を指向するようにデザインされる。好適な修飾因子には、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドなど、および蛍光分子などのような立体的に込み入った分子が含まれる。アシクロヌクレオチドは、ｄＮＭＰｓ中に通常存在する２’−デオキシリボフラノシル糖の代わりに、２−ヒドロキシエトキシメチル基を置換する。他のヌクレオチド修飾因子には、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’、３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’、３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’、３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、および３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）の一リン酸ヌクレオチド、２’、３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）および２’、３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）が含まれうる。１つの実施形態において、デオキシヌクレオチドを修飾因子として使用する。ヌクレオチド修飾因子を使用する時に、１〜３ヌクレオチド修飾因子、または２ヌクレオチド修飾因子を、アンチセンス鎖の３’末端上のリボヌクレオチドの代わりに使用する。立体的に込み入った分子を使用する場合、それらは、アンチセンス鎖の３’末端にてリボヌクレオチドに接続する。したがって、鎖の長さは、修飾因子の組み込みにともなって変化しない。他の実施形態において、本発明は、Ｄｉｃｅｒ処理の方向を指向するために、ｄｓＲＮＡ試薬中の２つのＤＮＡ塩基を置換することを企図する。さらなる発明において、２つの末端ＤＮＡ塩基を、センス鎖の５’末端とアンチセンス鎖の３’末端上で、二本鎖の平滑末端を形成している２つのリボヌクレオチドの代わりにアンチセンス鎖の３’−末端上に配置し、２ヌクレオチドＲＮＡオーバーハングをセンス鎖の３’末端上に配置する。これはまた、平滑末端上にＤＮＡ、オーバーハング末端上にＲＮＡ塩基を持つ、非対称組成物である。
【０７２３】
センスおよびアンチセンス鎖は、細胞の細胞質中で見られる条件のような、生物学的条件下でアニールする。さらに、ｄｓＲＮＡ試薬の、とりわけアンチセンス鎖の、１つの配列の一領域が、少なくとも１９ヌクレオチドの配列長を持ち、そこでこれらのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端に隣接し、標的ＡＲ  ＲＮＡのヌクレオチド配列に十分相補的である。
【０７２４】
さらに、ＤｓｉＲＮＡ試薬構造は、Ｄｉｃｅｒの開裂から産出されるオリゴヌクレオチド区画が、遺伝子発現を阻害することにおいてもっとも効果的であるオリゴヌクレオチドの部分であり得ることを確かにするために最適化可能である。例えば、本発明の１つの実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ試薬構造の２７−ｂｐオリゴヌクレオチドが合成され、そこで予想される遺伝子発現を阻害する２１〜２２−ｂｐ区画が、アンチセンス鎖の３’末端上に局在する。アンチセンス鎖の５’−末端上に局在する残りの塩基は、Ｄｉｃｅｒによって開裂され、捨てられる。この開裂された部分は均一であるか（すなわち標的配列の配列に基づく）、または不均一であり、核酸鎖を伸長するために加えられる。
【０７２５】
米国特許出願公開第２００７／０２６５２２０号明細書は、２７マーＤｓｉＲＮＡｓが、化学改変がない場合でさえ、相当する２１マーｓｉＲＮＡ組成物に対して、血清中での改善された安定性を示すことを開示している。５’リン酸塩の添加と組み合わせた時に、以上で詳述したようなパターンで、アンチセンス鎖中の２’−Ｏ−メチルＲＮＡの挿入のような、ＤｓｉＲＮＡの改変が、ＤｓｉＲＮＡ試薬の安定性を改善可能である。合成ＲＮＡ二本鎖中のすべての鎖への５’−リン酸塩の添加が、ヌクレアーゼ安定性の程度の制御を与えるための、高額でない、生理学的方法でありうる。
【０７２６】
本発明のｄｓＲＮＡ試薬の化学改変パターンは、そのような試薬の有効性を増強するためにデザインする。したがってそのような改変は、ｄｓＲＮＡの強度の減少を避けるため、ＤｓｉＲＮＡ試薬のＤｉｃｅｒ処理との干渉を避けるため、ｄｓＲＮＡ試薬の生物学的流体中の安定性を改善するため（ヌクレアーゼ感受性を減少させるため）、または生来免疫システムによる検出を阻害する、または回避するためにデザインする。そのような改変はまた、毒性であることを避けるため、および本発明の即時ｄｓＲＮＡ試薬の製造コストの増加を避けるため、またはその簡便さに影響を与えるためにもデザインされる。
【０７２７】
ＡＲ生物学および生化学
ＮＲ３Ｃ４（核受容体サブファミリー３、グループＣ、メンバー４）としても知られるＡＲは、アンドロゲンホルモン（テストステロンまたはジヒドロテストステロン：Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｔａｍ．Ｈｏｒｍ．５５：３０９−５２）の細胞質結合によって活性化され、結果としてＡＲの核転座となる、核受容体である（Ｗａｒｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５８（４）：７８２−９７）。核受容体のうち、ＡＲがプロゲステロン受容体にもっとも近く関連し、より高用量のプロゲスチン類がＡＲを阻害することが示されてきた（Ｂａｒｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２３８３）：４４３−５９；Ｒａｕｄｒａｎｔ  ａｎｄ  Ｒａｂｅ，Ｄｒｕｇｓ  ６３（５）：４６３−９２）。アンドロゲン制御遺伝子は、男性性表現型の発現と維持のために重要である。
【０７２８】
アンドロゲン受容体の２つのイソフォーム（ＡおよびＢ）が同定されてきた（Ｗｉｌｓｏｎ  ａｎｄ  ＭｃＰｈａｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１（４）：１２３４−８）。ＡＲ−Ｂは１１０ｋＤａ全長形態であり、一方でＡＲ−Ａは全長形態のＮ−末端のｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質分解の結果である、８７ｋＤａタンパク質である。（したがって、ＡＲ−Ａは全長形態ＡＲ−Ｂの最初の１８７アミノ酸を欠く；Ｇｒｅｇｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ２７：３０９−１９）。
【０７２９】
他の核受容体と同様に、アンドロゲン受容体は、構造中んおモジュールであり、Ｎ−末端からＣ−末端まで、以下の機能的ドメインからなる。
【０７３０】
Ｎ−末端制御ドメインは、完全リガンド活性化転写活性のために必要な、残基１０１および３７０の間の活性化機能１（ＡＦ−１）（Ｊｅｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：７３４１−６）、構造性活性（結合したリガンドなしの活性）に関与する、残基３６０および４８５の間の活性化機能５（ＡＦ−５）、（ＦＸＸＬＦモチーフ、式中Ｆ＝フェニルアラニン、Ｌ＝ロイシンおよびＸ＝任意のアミノ残基、を含む）残基１〜３６含有二量化表面、および分子内で両方がＬＢＤと相互作用する（Ｓｃｈａｕｆｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２：９８０２−７、Ｋｌｏｋｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２７（５）：１８２３−４３；ｖａｎ  Ｒｏｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７７（１）：６３−７２）３７０〜４９４頭尾相互作用（Ｌａｎｇｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（５０）：２９９８３−９０；Ｂｅｒｒｅｖｏｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２（８）：１１７２−８３；Ｄｕｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１８（９）：２１３２−５０）；
【０７３１】
ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）；
【０７３２】
ＤＢＤにそって、ＤＢＤをＬＢＤと連結する柔軟な領域である、ヒンジ領域で、本領域は、リガンド依存核局在化シグナルを含む（Ｋａｋｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４９：３９６０）；
【０７３３】
アゴニスト誘導活性（結合したアゴニストの存在下での活性）に関与する活性化機能２（ＡＦ−２）、分子内でＮ−末端ＦＸＸＦＬモチーフに、または（ＬＸＸＬＬまたは好ましくはＦＸＸＦＬモチーフを含む；Ｄｕｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１８（９）：２１３２−５０）コアクティベータータンパク質いずれかに結合する、ＡＦ−２、およびリガンド依存核輸出シグナル（Ｓａｐｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（４３）：４１９９８−２００５）を含むリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）；および
【０７３４】
Ｃ−末端ドメイン。
【０７３５】
公知のヒトおよびマウスＡＲ  ｃＤＮＡおよびポリペプチド配列には以下が含まれる。
【０７３６】
【化１５４】
2013534424.tif 000390
【０７３７】
【化１５５】
2013534424.tif 000391
【０７３８】
【化１５６】
2013534424.tif 000392
【０７３９】
【化１５７】
2013534424.tif 000393
【０７４０】
【化１５８】
2013534424.tif 000394
【０７４１】
【化１５９】
2013534424.tif 000395
【０７４２】
マウス野生型ＡＲ配列（配列番号：３７７０）；Ｍｕｓ筋肉Ｃ５７ＢＬ／６  ＡＲ転写産物；ＧｅｎｅＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿０１３４７６．３）
【０７４３】
【化１６０】
2013534424.tif 000396
【０７４４】
【化１６１】
2013534424.tif 000397
【０７４５】
【化１６２】
2013534424.tif 000398
【０７４６】
ＤｓｉＲＮＡ  ＡＲ阻害活性を査定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
細胞フリー系でのＲＮＡｉを繰り返すｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、ＡＲ  ＲＮＡ配列（類）を標的化しているＤｓｉＲＮＡ構造物を評価し、したがって、ＤｓｉＲＮＡのＡＲ特異的遺伝子阻害活性（またＡＲ阻害活性として本明細書で引用する）を査定可能である。アッセイには、ＡＲ  ＲＮＡに対して指向したＤｓｉＲＮＡ試薬との利用に適合した、Ｔｕｓｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３，３１９１−３１９７およびＺａｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３によって記述されたシステムが含まれる。合胞体胚盤葉から由来したＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ抽出物を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにてＲＮＡｉ活性を再構築するために使用する。標的ＲＮＡは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いる選択されたＡＲ発現プラスミドからのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を介して、または化学合成を介して産出される。センスおよびアンチセンスＤｓｉＲＮＡ鎖（例えば各２０μＭ）を、９０℃にて１分間、ついで３７℃にて１時間（１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、２ｍＭ酢酸マグネシウムのような）緩衝液中でのインキュベーションによってアニールし、ついで溶解緩衝液（例えば１００ｍＭ  酢酸カリウム、ｐＨ７．４での３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、２ｍＭ酢酸マグネシウム）中で希釈する。アニーリングをＴＢＥ緩衝液中アガロースゲル上のゲル電気泳動によってモニタし、臭化エチジウムで染色可能である。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ溶解物を、脱塩素化し、溶解した酵母糖蜜寒天上で回収したＯｒｅｇｏｎ  Ｒハエからの０〜２時間齢胚を用いて調製する。溶解物を遠心し、上清を単離する。アッセイには、５０％溶解物［ｖｏｌ／ｖｏｌ］、ＲＮＡ（１０〜５０ｐＭ最終濃度）、およびＤｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ最終濃度）を含む１０％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］溶解緩衝液を含む反応混合物が含まれる。反応混合液はまた、１０ｍＭリン酸クレアチン、１０ｕｇ／ｍｌクレアチンホスホキナーゼ、１００ｕｍ  ＧＴＰ、１００ｕＭ  ＵＴＰ、１００ｕＭ  ＣＴＰ、５００ｕＭ  ＡＴＰ、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．１Ｕ／μＬ  ＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）および１００ｕＭの各アミノ酸を含む。酢酸カリウムの最終濃度を１００ｍＭに調節する。反応を氷上でプレアセンブルし、ＲＮＡを加える前１０分間、２５℃にてプレインキュベートし、２５℃にてさらに６０分間インキュベートする。反応を４容量の１．２５×Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）でクエンチする。標的ＲＮＡ開裂をＲＴ−ＰＣＲ解析または本技術分野で公知の他の方法によってアッセイし、ＤｓｉＲＮＡが反応より除外された対照反応と比較する。
【０７４７】
あるいは、アッセイのために内部標識した標的ＲＮＡを、［アルファ−３２Ｐ］ＣＴＰの存在下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって調製し、スピンクロマトグラフィーによるＧ５０Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムを通し、さらなる精製なしに標的ＲＮＡとして使用する。任意に、標的ＲＮＡは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を用いて、５’−３２Ｐ−末端標識する。アッセイを、上記のように実施し、標的ＲＮＡとＲＮＡｉによって産出される特定のＲＮＡ開裂産物を、ゲルの自動写真上で可視化する。開裂の割合を、無傷の対照ＲＮＡ、またはＤｓｉＲＮＡなしの対照反応からのＲＮＡ、およびアッセイによって産出された開裂産物を表すバンドのＰＨＯＳＰＨＯＲ  ＩＭＡＧＥＲ（登録商標）（自動写真）定量によって決定する。
【０７４８】
１つの実施様態において、本アッセイを、ＤｓｉＲＮＡ仲介ＲＮＡｉ開裂に対するＡＲ  ＲＮＡ標的中の標的部位を決定するために使用し、そこで多数のＤｓｉＲＮＡ構造物を、例えば標識化標的ＲＮＡの電気泳動またはノザンブロットによって、ならびに本技術分野でよく公知の他の方法論によってアッセイ反応を解析することで、ＡＲ  ＲＮＡ標的のＲＮＡｉ仲介開裂に関して選別する。
【０７４９】
特定の実施形態において、好適な対照に対して、本発明のＤｓｉＲＮＡは、例えばＡＲレベルにおける５０％減少がシステム、細胞、組織または生命体にて観察された場合、ＡＲ阻害活性を持つと見なされる。本発明のＤｓｉＲＮＡのＡＲ阻害活性の決定に対するさらなる境界および限界が以上に記述されている。
【０７５０】
抗−ＡＲ  ＤｓｉＲＮＡ試薬の共役と伝達
特定の実施形態において、本発明は、ＡＲ−関連疾患または疾病、またはＡＲ−関連疾患または疾病を発達させるリスクを持つ患者を治療するための方法に関する。そのような実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、ＡＲ−関連疾患または疾病を制御するための新規治療薬剤として働きうる。方法には、本発明の薬理学的組成物を患者（例えばヒト）に投与し、それによって、ＡＲ  ＲＮＡの発現、レベルおよび／または活性が減少することが含まれる。ＡＲ  ＲＮＡによってコードされたポリペプチドの発現、レベルおよび／または活性がまた、前記ＤｓｉＲＮＡがＡＲ転写産物の非コード領域に対して指向する場合（例えば標的化５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ配列）でさえ、本発明のＤｓｉＲＮＡによって減少しうる。それらの高い特異性のために、本発明のＤｓｉＲＮＡは、任意に多型対立遺伝子が個々および／または集団内で存在する対立遺伝子特異的様式にて、細胞および組織のＡＲ配列を特に標的化可能である。
【０７５１】
ＡＲ−関連疾患または疾病の治療において、ＤｓｉＲＮＡを、ＡＲの他の脱制御を示している、および／または対象の細胞または組織、例えばＡＲレベルの減少に対して標的化された対象の細胞または組織との接触に持ち込むことが可能である。例えば、ＡＲ  ＲＮＡ配列の全てまたは部分に、本質的に同一のＤｓｉＲＮＡを、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏいずれかで、そのような細胞との接触に持ち込むか、またはそのような細胞内へ導入してよい。同様に、ＡＲ  ＲＮＡ配列のすべてまたは一部に本質的に同一のＤｓｉＲＮＡを、ＡＲ−関連疾患または疾病を持つ、または発達させるリスクの対象に直接投与してよい。
【０７５２】
本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬の治療的利用は、多数の異なるＤｓｉＲＮＡ試薬配列を含むＤｓｉＲＮＡ試薬の処方の利用を含みうる。例えば、２またはそれ以上、３またはそれ以上、４またはそれ以上、５またはそれ以上などの本明細書で記述した試薬を、例えばＡＲ  ＲＮＡの多数の異なる領域を標的とする、または標的ＡＲ  ＲＮＡのみでなく、標的、例えばＡＲ−関連疾患または疾病と関連した細胞性標的遺伝子も標的とする処方を産出するように組み合わせることができる。本発明のＤｓｉＲＮＡをまた、ＤｓｉＲＮＡ試薬のいずれかの鎖が、２つまたはそれ以上のＡＲ  ＲＮＡの領域を独立して標的するように、またはＤｓｉＲＮＡ試薬の鎖の１つが、本技術分野で公知のＡＲの細胞性標的遺伝子を標的とするように構築してもよい。
【０７５３】
標的核酸分子の１つ以上の領域を標的とする多機能ＤｓｉＲＮＡ分子の利用がまた、ＡＲ  ＲＮＡレベルおよび発現の強力な阻害剤を提供可能である。例えば、本発明の単一多機能ＤｓｉＲＮＡ構造物が、ＡＲ−７７０とＡＲ−２９４７部位両方を同時に標的としえ、さらにおよび／またはあるいは、本発明の単一または多機能薬剤を、他に対して、ＡＲの１つのスプライスバリアントを選択的に標的とするためにデザイン可能である。
【０７５４】
したがって、本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬は個々に、または他の薬剤との組み合わせまたは併せて、ＡＲ−関連疾病または疾患を治療する、阻害する、減少させるまたは予防するために使用可能である。例えば、ＤｓｉＲＮＡ分子を、治療に好適な条件下、単独で、または１つまたはそれ以上の薬剤との組み合わせで、対象に投与可能であり、当業者にとって明白な他の適切な細胞に投与可能である。
【０７５５】
ＤｓｉＲＮＡ分子をまた、対象または生体中のＡＲ−関連疾患または疾病を治療する、阻害する、減少させるまたは予防するための他の公知の治療との組み合わせで使用可能である。例えば、記述した分子を、本技術分野で公知のように、対象または生体内のＡＲ−関連疾患または疾病を治療する、阻害する、減少させるまたは予防するために、１つまたはそれ以上の公知の化合物、治療または手順と組み合わせて使用可能である。
【０７５６】
本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬は、他の部位（例えばペプチドのような非核酸部位）、有機化合物（例えば染料、コレステロールなど）と（例えばそのセンスまたはアンチセンス鎖のその５’または３’末端で）共役可能であり、または共役していなくてよい。この方法でＤｓｉＲＮＡ試薬を改変することは、相当する非共役ＤｓｉＲＮＡ試薬と比較して細胞取込を改善し、得られるＤｓｉＲＮＡ試薬誘導体の細胞標的化活性を増強してよく、細胞内のＤｓｉＲＮＡ試薬誘導体をトレースするために有用であり、または相当する非共役ＤｓｉＲＮＡ試薬と比較してＤｓｉＲＮＡ試薬誘導体の安定性を改善する。
【０７５７】
核酸を導入する方法、ベクターおよび宿主細胞
本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬を、直接細胞に（すなわち細胞内に）導入してよく、または空洞、間質腔内、生命体の循環中に細胞外で導入してよく、経口で導入してよく、または核酸を含む溶液中細胞または生命体を浴させることによって導入してよい。血管または血管外循環、血液またはリンパ系、および脳脊髄液が、核酸を導入してよい部位である。
【０７５８】
本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬を、核酸を含む溶液の注射、核酸によって覆われた粒子の照射、核酸溶液中の細胞または生命体の浸漬、または核酸の存在下での細胞膜の電気泳動を含む、本技術分野で公知の核酸伝達方法を用いて導入可能である。脂質仲介担体伝達、化学仲介伝達、リン酸カルシウムのようなカチオン性リポソームトランスフェクションなどのような核酸を細胞に導入するための本技術分野で公知の他の方法を使用してよい。核酸を、以下の活性、細胞による核酸取込を増強する、または標的ＡＲ  ＲＮＡの阻害を増加させる、の１つまたはそれ以上を達成する他の成分と一緒に導入してよい。
【０７５９】
標的ＡＲ  ＲＮＡを持つ細胞は、生殖系または体性、分化全能性または多能性、分裂または非分裂、柔組織または上皮、不死化または形質導入などからであってよい。細胞は、幹細胞または分化細胞であってよい。分化した細胞型には、脂肪細胞、繊維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、ニューロン、グリア細胞、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、抗酸球、好塩基球、マスト細胞、白血球、顆粒球、ケラチノサイト、コンドロサイト、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞、内分泌または外分泌腺の細胞が含まれる。
【０７６０】
特定の標的ＡＲ  ＲＮＡ配列と、伝達されたＤｓｉＲＮＡ試薬物質の用量に依存して、本工程は、ＡＲ  ＲＮＡに対して部分的または完全な機能の欠損を提供しうる。標的細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％またはそれ以上でのＲＮＡレベルまたは発現（ＡＲ  ＲＮＡ発現またはコードされたポリペプチド発現いずれか）の減少または欠損が例である。ＡＲ  ＲＮＡレベルまたは発現の阻害は、ＡＲ  ＲＮＡまたはＡＲ  ＲＮＡ−コードタンパク質のレベルにおける不在（または観察可能な減少）を意味する。特異性は、細胞の他の遺伝子における明かな効果なしに、ＡＲ  ＲＮＡを阻害する能力を意味する。阻害の結果は、細胞または生命体の外部特性の試験によって、またはＲＮＡ溶液ハイブリッド形成、ヌクレアーゼ保護、ノザンハイブリッド形成、逆転写、マイクロアレイでの遺伝子発現モニタリング、抗体結合、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロッティング、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、他の免疫アッセイ、および蛍光活性化細胞解析（ＦＡＣＳ）のような生化学的技術によって確認可能である。本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬による標的ＡＲ  ＲＮＡ配列の阻害は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏいずれかで、ＡＲ−関連疾患または疾病の発達／進行、例えば腫瘍形成、増殖、転移などにおける、そのようなＤｓｉＲＮＡ試薬の投与の効果に基づいて測定可能でもある。腫瘍または癌細胞レベルの処置および／または減少には、腫瘍または癌細胞レベルの増殖の停止または減少、例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％またはそれ以上の減少が含まれ、また細胞、組織または対象への本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬の投与を介して達成可能である癌細胞レベルにおける、対数言語、例えば１０倍、１００倍、１０００倍、１０５倍、１０６倍、１０７倍減少で測定可能もある。
【０７６１】
細胞株または全生命体でのＲＮＡ仲介阻害に関して、そのタンパク質産物が簡単にアッセイされる、レポーターまたは薬物体制遺伝子の発現を測定可能である。そのようなレポーター遺伝子には、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、ベータグルコロニダーゼ（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、グリーンフルオレセントタンパク質（ＧＦＰ）、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、オクトパインシンターゼ（ＯＣＳ）およびそれらの誘導体が含まれる。多数の選別可能なマーカーが利用可能であり、アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ヒグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキセート、ホスフィノリシン、プロマイシンおよびテトラサイクリンに対する耐性を供与する。アッセイに依存して、遺伝子発現の量の定量により、本発明にしたがって処理されない細胞と比較して、１０％、３３％、５０％、９０％、９５％または９９％以上である阻害の程度が決定可能である。
【０７６２】
より低用量の注射物質、およびＲＮＡサイレンシング薬剤の投与後のより長い時間が、結果として、より小さな細胞画分における阻害となりうる（例えば少なくとも標的細胞の１０％、２０％、５０％、７５％、９０％または９５％）。細胞内での遺伝子発現の定量化は、標的ＡＲ  ＲＮＡの蓄積または標的タンパク質の翻訳のレベルにて同様の量の阻害を示しうる。例として、阻害の効率を、細胞内の遺伝子産物の量を査定することによって決定してよく、ＲＮＡは、阻害ＤｓｉＲＮＡのために使用した領域の外側にヌクレオチド配列を持つハイブリッド形成プローブで検出してよく、または翻訳されたポリペプチドは、その領域のポリペプチド配列に対して作製された抗体で検出してよい。
【０７６３】
ＤｓｉＲＮＡ試薬は、少なくとも１つのコピー／細胞の伝達を許容する量で導入してよい。より大きな用量（例えば少なくとも５、１０、１００、５００または１０００コピー／細胞）の物質が、より効果的な阻害を産出し得、より低い用量がまた特定の適用のために有用であり得る。
【０７６４】
薬理学的組成物
特定の実施形態において、本発明は、本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬を含む薬理学的組成物を提供する。ＤｓｉＲＮＡ試薬試料は、好適に処方され、それが存在する場合に、十分な試料の部分が、遺伝子サイレンシングを誘導するために細胞内に入ることを許容する任意の方法によって細胞の環境内に導入可能である。ｄｓＲＮＡに関する多くの処方は、本技術分野で公知であり、ｄｓＲＮＡが標的細胞内に入り、働くことができる限り使用可能である。例えば、米国特許出願公開第２００４／０２０３１４５  Ａ１明細書および第２００５／００５４５９８  Ａ１号明細書を参照のこと。例えば、本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬を、リン酸緩衝食塩水溶液、リポソーム、ミセル構造およびカプシドのような緩衝溶液中に処方可能である。カチオン性脂質でのＤｓｉＲＮＡ試薬の処方を、ＤｓｉＲＮＡ試薬の細胞内へのトランスフェクションを促進するために使用可能である。例えば、リポフェクチン（米国特許第５，７０５，１８８号明細書）のようなカチオン性脂質、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリリシン（ＰＣＴ国際特許公開第９７／３０７３１号明細書）のようなポリカチオン性分子を使用可能である。好適な脂質には、すべて製造業者の取扱説明書にしたがって使用可能な、オリゴフェクタミン、リポフェクタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＮＣ３８８（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  ＰｈＡＲｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏ．）、またはＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）が含まれる。
【０７６５】
そのような組成物には典型的に、核酸分子と薬理学的に許容可能な担体が含まれる。本明細書で使用するところの語句「薬理学的に許容可能な担体」には、薬理学的投与に適合可能な食塩水、溶媒、分散培地、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。補助的な活性化合物もまた組成物内に組み込むことができる。
【０７６６】
薬理学的組成物を、その意図する投与経路に適用するように処方する。投与経路の例には、非経口、例えば静脈内、皮膚内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（局所）、経粘膜および腸投与が含まれる。非経口、皮膚内または皮下適用のために使用される溶液および懸濁液には、以下の構成要素が含まれる。注射のための水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような無菌希釈液、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン類のような抗菌剤、アスコルビン酸または二硫化ナトリウムのような抗酸化剤、エチレンジアミンテトラ酢酸のようなｃ２２Ｒｖ１ｔｉｎｇ薬剤、酢酸、クエン酸またはリン酸のような緩衝液および塩化ナトリウム、デキストロースのような張力の調節のための薬剤。ｐＨを、塩酸または水酸化ナトリウムのような塩または塩基で調節可能である。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックからなるアンプル、使い捨てシリンジまたは多重用量バイアル内に同封可能である。
【０７６７】
注射可能な利用のために好適な薬理学的組成物には、無菌水溶液（水溶性である場合）または分散液、および無菌注射可能な溶液または分散液の即興調整のための無菌粉末が含まれる。静脈内投与のために、好適な担体には、生理学的食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ．ＴＭ．（ＢＡＳＦ、ＰＡＲｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。全ての場合で、組成物は無菌でなければならず、簡単にシリンジ注入可能な程度まで流動的であるべきである。製造および保存の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌のような微生物の共雑活性に対して防止されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレンングリコールなど）、およびこれらの好適な混合液を含む、溶媒または分散培地でありうる。適切な流動性が、例えば、レシチンのようなコーティングの利用によって、分散液の場合、要求される粒子の大きさの維持によって、および界面活性剤の利用によって、維持可能である。微生物の活性の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成可能である。多くの場合、組成物中の等張剤、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコール類、塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射可能組成物の吸収の延長を、組成物内に、吸収を遅延させる試薬、例えばアルミニウム一ステアリン酸およびゼラチンを加えることによって達成可能である。
【０７６８】
無菌注射可能溶液は、要求された量で活性化合物を、要求されたように、１つまたは以上で列挙した成分の組み合わせとともに、選択された溶媒中に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製可能である。一般的に、分散液は、基礎分散培地と、以上で列記した要求された他の成分を含む、無菌賦形剤内に活性化合物を組み込むことによって調製する。無菌注射可能溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、吸引乾燥と、その先に無菌濾過した溶液から活性成分＋任意のさらなる望む成分の粉末を産出する凍結乾燥である。
【０７６９】
経口組成物は一般的に、不活性希釈液または食用担体を含む。経口治療投与の目的のために、活性化合物を、賦形剤と組み込み、錠剤、トローチまたは例えばゼラチンカプセルのようなカプセルの形態で使用可能である。経口組成物はまた、マウスウォッシュとしての利用のために流体賦形剤を用いて調製可能である。薬理学的に適合可能な結合剤、および／またはアジュバント物質を、組成物の部分として含めることが可能である。錠剤、ピル、カプセル、トローチなどは、任意の以下の成分、微晶質性セルロース、ガムトラガカントまたはゼラチンのような結合剤、デンプンまたはラクトースのような賦形剤、アルギン酸、プリモゲルまたはトウモロコシデンプンのような崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓのような潤滑油、二酸化コロイドシリコーンのような流動促進剤、スクロースまたはサッカリンのような甘味剤、またはペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香味料のような香味料、または同様の性質の化合物を含んでよい。
【０７７０】
吸入による投与のために、化合物を、好適な高圧ガス、例えば二酸化炭素のような気体、またはネブライザーを含む、加圧容器またはディスペンサーからのエアゾルスプレーの形状で伝達する。そのような方法には、米国特許第６，４６８，７９８号明細書に記述されたものが含まれる。
【０７７１】
全身投与がまた、経粘膜または経皮法によって可能でもある。経粘膜または経皮投与のために、浸潤されるべきバリアに対して適切な浸潤剤が処方内で使用される。そのような浸潤剤は一般的に本技術分野で公知であり、例えば、経粘膜投与のために、合成洗剤、胆汁酸およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、経鼻スプレーまたは座薬の利用を通して実施可能である。経皮投与のために、活性化合物を、本技術分野で一般的に公知の軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔｓ）、軟膏（ｓａｌｖｅｓ）、ジェルまたはクリーム内に処方する。
【０７７２】
化合物をまた、（例えばココアバターまたは他のグリセリド類のような従来の座薬基体で）座薬、または腸伝達のための停留かん腸の形態で調製可能である。
【０７７３】
化合物はまた、ＭｃＣａｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔｕｒｅ，４１８（６８９３），３８−９（流体力学トランスフェクション）；Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０（１０），１００６−１０（ウイルス仲介伝達）；またはＰｕｔｎａｍ  （１９９６），Ａｍ．Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｙｓｔ．ＰｈＡＲｍ．５３（２），１５１−１６０，ｅｒｒａｔｕｍ  ａｔ  Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｙｓｔ．Ｐｈａｒｍ．５３（３），３２５（１９９６）にて記述された方法を含むが、これらに限定はされない、本技術分野で公知の方法を用いてトランスフェクションまたは感染によって投与可能である。
【０７７４】
化合物をまた、ＤＮＡワクチンのような核酸試薬の投与に好適な方法によって投与可能である。これらの方法には、遺伝子銃、生物注入器、および皮膚パッチならびに米国特許第６，１９４，３８９号明細書にて開示されたマイクロ粒子ＤＮＡワクチン技術のようなニードルフリー方法、および米国特許第６，１６８，５８７号明細書にて開示されたような粉末形状ワクチンによる哺乳動物経皮ニードルフリーワクチン化が含まれる。さらに、とりわけＨａｍａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，８８（２），２０５−１０．Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、例えば、米国特許第６，４７２，３７５号明細書にて記述されたような）で開示されたように、経鼻伝達が可能であり、マイクロカプセル化も利用可能である。（例えば、米国特許第６，４７１，９９６号明細書にて記述されたような）生物分解性、標的化可能マイクロ粒子伝達システムもまた使用可能である。
【０７７５】
１つの実施形態において、活性化合物を、インプラントおよびマイクロカプセル化伝達系を含む、放出制御処方のような、体からの急速な消失に対して化合物を保護する担体で調製する。酢酸エチレンビニル、ポリアンヒドリド類、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル類およびポリ酢酸のような生物分解性、生物適合性ポリマーを使用可能である。そのような処方は、標準技術を用いて調製可能である。物質はまた、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販されており入手可能である。（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染した細胞を標的化したリポソームを含む）リポソーム懸濁液を、薬理学的に許容可能な担体として使用可能でもある。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号明細書にて記述されたような、当業者に公知の方法にしたがって調製可能である。
【０７７６】
そのような化合物の毒性および治療効果を、例えばＬＤ５０（５０％集団が致死する用量）およびＥＤ５０（５０％集団中の治療的に効果的な用量）を決定するために、細胞培養液または実験動物における標準薬理学的手順によって決定可能である。毒性および治療効果の間の用量比が、治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０で表すことが可能である。高い治療指数を表す化合物が好ましい。毒性副作用を表す化合物を使用してよい一方で、感染していない細胞への可能性のあるダメージを最小化し、それによって副作用を減少させるために、影響を受けた組織の部位へ、そのような化合物を標的化する伝達系をデザインすることに注意が払われるべきである。
【０７７７】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータを、ヒトにおける使用のための用量の範囲を定式化することにおいて使用可能である。そのような化合物の用量は、好ましくは毒性がほとんどないか、全くないＥＤ５０を含む循環濃度範囲内にある。用量は、使用する用量形態および利用した投与経路に依存して、この範囲内で変化してよい。本発明の方法にて使用される化合物に対して、治療的に効果的な用量は、細胞培養アッセイからまず推定可能である。用量を、細胞培養液中で測定したようなＩＣ５０（すなわち、症状の半最大阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む、循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにて定式化してよい。そのような情報を、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用可能である。血漿中のレベルを、例えば高性能液体クロマトグラフィーによって測定してよい。
【０７７８】
本明細書で定義したように、治療的に効果的な量の核酸分子（すなわち効果的用量）は、選択した核酸に依存する。例えば、ＤｓｉＲＮＡ試薬をコードしているプラスミドを選択した場合、およそ１ｐｇ〜１０００ｍｇの範囲の単一投与用量を投与してよく、いくつかの実施形態において、１０、３０、１００または１０００ｐｇ、または１０、３０、１００または１０００ｎｇ、または１０、３０、１００または１０００μｇ、または１０、３０、１００または１０００ｍｇを投与してよい。いくつかの実施形態において、１〜５ｇの組成物を投与可能である。組成物は、２日に一回を含む、１またはそれ以上の回数／日〜１またはそれ以上の回数／週投与可能である。当業者は、疾患または疾病の重症度、先行治療、対象の一般的健康および／または年齢、他の疾患の存在を含むが、限定はしない、特定の要因が、対象を効果的に処置するために要求される用量およびタイミングに影響を与えうることを理解するであろう。さらに、治療的に効果的な量のタンパク質、ポリペプチド、または抗体での対象の治療には、単一治療が含まれてよく、または好ましくは一連の治療が含まれてよい。
【０７７９】
本発明の核酸分子は、例えば、Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）上記にて記述されたものを含むが、限定はされない、本技術分野で公知の方法を用いて、発現構造物、例えばウイルスベクター、レトロウイルスベクター、発現カセット、またはプラスミドウイルスベクター内に挿入可能である。発現構造物は、例えば、吸入、経口、静脈注射、局所投与によって（米国特許第５，３２８，４７０号明細書を参照のこと）、または定位注射によって（例えばＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，３０５４−３０５７）対象に伝達可能である。伝達ベクターの薬理学的調製物には、適切な希釈液中のベクターが含まれてよく、伝達賦形剤が埋め込まれる徐放マトリックスを含んでよい。あるいは、完全な伝達ベクター、例えばレトロウイルスベクターを、組換え体細胞から完全なまま産出可能である場合、薬理学的調製物は、遺伝子伝達系を産出する１つまたはそれ以上の細胞を含みうる。
【０７８０】
発現構造物は、適切な発現系での使用のために好適な構造物であってよく、本技術分野で公知のような、レトロウイルスベクター、直線発現カセット、プラスミドおよびウイルスまたはウイルス由来ベクターを含むが、限定はされない。そのような発現構造物には、１つまたはそれ以上の誘導可能なプロモーター、Ｕ６  ｓｎＲＮＡプロモーターまたはＨ１  ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターのような、ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター系、または本技術分野で公知の他のプロモーターを含んでよい。構造物は、ｓｉＲＮＡの１つまたは両方の鎖を含みうる。両方の鎖を発現している発現構造物にはまた、両方の鎖を連結しているループ構造が含まれてよく、または各鎖は、同一の構造物内の別々のプロモーターから別々に転写されうる。各鎖はまた、別々の発現構造物、例えばＴｕｓｃｈｌ（２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０：５００５−５０５）から転写可能でもある。
【０７８１】
細胞の環境内にＤｓｉＲＮＡ試薬を導入する方法が、細胞の型、およびその環境の構成に依存しうることが理解可能である。例えば、細胞が液体内でみられる時に、１つの好ましい処方は、リポフェクタミン中のような液体処方でであり、ＤｓｉＲＮＡ試薬を細胞の液体環境に直接加えることが可能である。脂質処方をまた、静脈内、筋肉内または腹腔内注射によって、または経口で、または吸入または本技術分野で公知のような他の方法によって動物に投与可能である。処方が、哺乳動物、とりわけヒトのような動物内への投与のために好適である場合、処方はまた薬理学的に許容可能である。オリゴヌクレオチドを投与するための薬理学的に許容可能な処方が公知であり、利用可能である。いくつかの例において、ＤｓｉＲＮＡ試薬を緩衝液または生理食塩水溶液中で処方し、処方したＤｓｉＲＮＡ試薬を、卵母細胞での研究でのように、直接細胞内に注入することが好ましい可能性がある。ＤｓｉＲＮＡ試薬二本鎖の直接注射もまた実施されうる。ｄｓＲＮＡ（例えばＤｓｉＲＮＡ試薬）を導入する好適な方法に関して、米国特許公開第２００４／０２０３１４５  Ａ１号明細書を参照のこと。
【０７８２】
好適な量のＤｓｉＲＮＡ試薬を導入しなければならず、これらの量は、標準の方法を用いて実験的に決定可能である。典型的には、細胞の環境中の効果的な濃度の個々のＤｓｉＲＮＡ試薬種は、５０ナノモルまたはそれ以下、１０ナノモルまたはそれ以下であり、または１ナノモルまたはそれ以下の濃度での組成物を使用可能である。他の実施形態において、２００ピコモルまたはそれ以下、１００ピコモルまたはそれ以下、５０ピコモルまたはそれ以下、２０ピコモルまたはそれ以下、および１０ピコモルまたはそれ以下、５ピコモルまたはそれ以下、２ピコモルまたはそれ以下、または１ピコモルまたはそれ以下の濃度を用いる方法を、多くの環境で使用可能である。
【０７８３】
ＤｓｉＲＮＡ試薬組成物が処方され、それによって十分な量のＤｓｉＲＮＡ試薬が細胞内に入り、その効果を発揮するという条件で、細胞が生きることが出来る細胞外マトリックスにＤｓｉＲＮＡ試薬組成物を添加することによって方法を実施可能である。例えば、液体培養液または細胞増殖培地のような液体中、組織外植片中、または哺乳動物、とりわけヒトのような動物を含む全生命体中に存在する細胞での利用に方法が従う。
【０７８４】
ＡＲ  ＲＮＡのレベルまたは活性は、本技術分野で公知の、または後に開発される好適な方法によって決定可能である。標的ＲＮＡおよび／または標的遺伝子の発現を測定するために使用する方法が、標的遺伝子の性質に依存しうることが理解可能である。例えば、標的ＡＲ  ＲＮＡ配列が、タンパク質をコードする場合、語句「発現」は、ＡＲ遺伝子（ゲノムまたは外来委由来のいずれか）から由来する、タンパク質またはＡＲ  ＲＮＡ／転写産物を意味しうる。そのような例において、標的ＡＲ  ＲＮＡの発現を、ＡＲ  ＲＮＡ／転写産物の量を直接測定することによって、またはＡＲタンパク質の量を測定することによって決定可能である。タンパク質を、染色または免疫ブロッティングによって、またはタンパク質が測定可能な反応を触媒する場合、反応速度を測定することによってのような、タンパク質アッセイにて測定可能である。すべてのそのような方法が、本技術分野で公知であり、使用可能である。標的ＡＲ  ＲＮＡレベルが測定されるべきである場合、ＲＮＡレベルを検出するための本技術分野で認識された方法を使用可能である（例えばＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロッディングなど）。本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬にてＡＲ  ＲＮＡｓを標的化することにおいて、対象、組織中、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏいずれかでの、細胞中の、または細胞抽出物中の、ＡＲ  ＲＮＡまたはタンパク質のレベルを減少させることにおける、ＤｓｉＲＮＡ試薬の有効性の測定をまた、ＡＲ−関連表現型（例えば癌または腫瘍形成、増殖、転移、拡散などのような、たとえば疾患または疾病）の減少の程度を決定するために使用可能でもある。上記測定は、細胞、細胞抽出物、組織、組織抽出物または他の好適な供給源物質上で実施可能である。
【０７８５】
ＡＲ  ＲＮＡの発現が、減少したかどうかの決定は、ＲＮＡレベルにおける変換を正確に検出可能な好適な方法によってでありうる。典型的には、決定は、それによって、少なくとも一部の当該ＤｓｉＲＮＡ試薬が細胞質に入るように細胞の環境内へ、消化していないＤｓｉＲＮＡを導入し、ついで標的ＲＮＡのレベルを測定することによって実施される。同様の測定を、同一の未処理細胞上で行い、それぞれの測定から得られた結果を比較する。
【０７８６】
ＤｓｉＲＮＡ試薬は、薬理学的に効果的な量のＤｓｉＲＮＡ試薬と、薬理学的に許容可能な担体を含む、薬理学的組成物として処方可能である。薬理学的、または治療的に効果的な量は、意図する薬理学的、治療または予防結果を産出するのに効果的なＤｓｉＲＮＡ試薬の量を意味する。語句「薬理学的に効果的な量」および「治療的に効果的な量」または単に「効果的な量」は、意図する薬理学的、治療または予防結果を産出するのに効果的なＲＮＡの量を意味する。例えば、当該臨床治療が、疾患または疾病に関連した測定可能なパラメータにおいて、少なくとも２０％の減少が見られた時に、効果的と認識され、当該疾患または疾病の治療に対する薬物の治療的に効果的な量は、当該パラメータにおける少なくとも２０％減少に影響を与えるのに必要な量である。
【０７８７】
本発明の好適な処方された薬理学的組成物を、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、空路（エアゾル）、腸、膣および（バッカルおよびサブリンガルを含む）局所投与を含む、非経口経路によってのような、本技術分野で公知の方法によって投与可能である。いくつかの実施形態において、薬理学的組成物は、静脈または非経口内点滴または注射によって投与される。
【０７８８】
一般に、ｄｓＲＮＡの好適な用量ユニットは、０．００１〜０．２５ミリグラム／レシピエントの体重キログラム／日の範囲、０．０１〜２０マイクログラム／レシピエントの体重キログラム／日の範囲、０．０１〜１０マイクログラム／レシピエントの体重キログラム／日の範囲、０．０１〜５マイクログラム／レシピエントの体重キログラム／日の範囲、０．１〜２．５マイクログラム／レシピエントの体重キログラム／日の範囲である。ｄｓＲＮＡを含む薬理学的組成物は、１日一回投与可能である。しかしながら、治療薬剤はまた、一日を通して適切な間隔で投与される、２、３、４、５、６またはそれ以上のサブ用量を含む用量ユニットで投与されうる。この場合、各サブ用量に含まれるｄｓＲＮＡは、総合一日用量ユニットを達成するために相応により小さくなければいけない。用量ユニットはまた、例えば数日間隔にわたり、ｄｓＲＮＡの持続および一定放出を提供する従来の徐放処方を用いて、数日にわたる単一用量に対して合成可能である。徐放製剤が本技術分野でよく公知である。本実施形態において、用量ユニットは、相当する複数の毎日用量を含む。処方に関係なく、薬理学的組成物は、処置されている動物またはヒト中の標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量で、ｄｓＲＮＡを含まなければいけない。組成物は、ｄｓＲＮＡの複数ユニットの合計が、一緒に十分な容量を含む方法で合成可能である。
【０７８９】
ヒトに対する好適な用量範囲を処方するために、データを細胞培養アッセイと動物研究から得ることができる。本発明の組成物の用量は、毒性がほとんどまたは全くない、（公知の方法によって決定したような）ＥＤ５０を含む、循環濃度の範囲内である。用量は、使用した用量および利用した投与経路に依存して、この範囲内で変化してよい。本発明の方法にて使用する化合物に対して、治療的に効果的な用量は、細胞培養アッセイよりまず推定可能である。細胞培養中で決定したような、ＩＣ５０（すなわち、症状の半最大阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む化合物の循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルにて用量を定式化してよい。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用可能である。血漿中のｄｓＲＮＡのレベルを、標準方法によって、例えば高性能液体クロマトグラフィーによって測定してよい。
【０７９０】
薬理学的組成物は、投与のための取扱説明書とともに、キット、容器、パックまたはディスペンサー内に含まれてよい。
【０７９１】
治療方法
本発明は、ＡＲ（例えばＡＲ転写産物および／またはＡＲタンパク質レベルの誤調節および／または上昇）によって、全体としてまたは部分的に引き起こされる、またはＡＲを選択的に標的化することを介して処置可能な疾患または疾病のリスクのある（または受けやすい）対象を治療する予防的および治療的両方の方法を提供する。
【０７９２】
本明細書で使用するところの「治療」または「治療すること」は、疾患または疾病、疾患または疾病の症状、または疾患に向かう傾向を治癒させる、治す、緩和する、軽減する、変化させる、治療する、改善する、好転させるまたは影響を与えるための目的で、疾患または疾病、疾患または疾病の症状、または疾患または疾病に向かう傾向を持つ患者への治療的薬剤（例えばＤｓｉＲＮＡ試薬またはそれをコードしているベクターまたはトランスジーン）の投与、またはそのような患者から単離した組織または細胞株への治療薬剤の適用または投与として定義される。
【０７９３】
１つの様態において、本発明は、対象に治療薬剤（例えばＤｓｉＲＮＡ試薬またはそれをコードしているベクターまたはトランスジーン）を投与することによって、対象中で、（例えばＡＲ発現の阻害を介して対象内での形質転換事象の開始を防止することを含む）上記のような疾患または疾病を予防するための方法を提供する。疾患に対してリスクを有する対象を、例えば、本明細書で記述したような診断または予後アッセイの１つまたは組み合わせによって同定可能である。予防的薬剤の投与は、例えば対象中の癌の検出、または疾患または疾病の症状特徴の顕在化の前に実施可能であり、それによって疾患または疾病が予防され、あるいはその進行が遅延する。
【０７９４】
本発明の他の様態は、対象を治療的に治療する方法、すなわち疾患または疾病の症状の開始を変更することに関する。これらの方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、ＤｓｉＲＮＡ試薬とともに細胞を培養することによって）、あるいはｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば対象にＤｓｉＲＮＡ試薬を投与することによって）で実施可能である。
【０７９５】
治療の予防的および治療的両方の方法に関して、そのような治療はとりわけ、ファーマコジェノミクスの領域から得られた知識に基づいてあつらえ、または改変してよい。本明細書で使用するところの「ファーマコジェノミクス」は、遺伝子シークエンシング、統計学的遺伝学、および臨床試験および市場における薬物に対する遺伝子発現解析のような、ゲノミクス技術の適用を意味する。よりとりわけ、本語句は、どのようにして患者の遺伝子が、彼または彼女の薬物に対する応答を決定するか（例えば、患者の「薬物応答表現型」または「薬物応答遺伝子型」）の研究を意味する。したがって、本発明の他の様態は、個々の薬物応答遺伝子型にしたがって、本発明の標的ＡＲ  ＲＮＡ分子または標的ＡＲ  ＲＮＡモジュレータいずれかでの個々の予防的または治療的治療をあつらえるための方法を提供する。ファーマコジェノミクスは、臨床医または医師が、治療より最も利益を得る患者へ、予防的または治療的処置を標的化し、毒性薬物関連副作用を経験する患者の治療を避けることを可能にする。
【０７９６】
治療薬剤を、選択した動物モデルで試験可能である。例えば、本明細書で記述したようなＤｓｉＲＮＡ試薬（またはそれをコードしている発現ベクターまたはトランスジーン）は、前記試薬での治療の有効性、毒性または副作用を決定するために、動物モデルにて使用可能である。あるいは、試薬（例えば治療薬剤）を、そのような試薬の作用機序を決定するために、動物モデルにて使用可能である。
【０７９７】
ＡＲ  ｍＲＮＡレベルと発現の下方調節を評価するために有用なモデル
細胞培養
本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬を、ｉｎ  ｖｉｖｏにて、例えば以下の手順を用いて、開裂活性に対して試験可能である。本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬によって標的化されたＡＲ  ｃＤＮＡ内のヌクレオド配列を、以上のＡＲ配列中で示す。
【０７９８】
本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬を、ＡＲ  ＲＮＡおよびＡＲタンパク質阻害の程度を決定するために、２２Ｒｖ１または他の哺乳動物細胞を用いて、細胞培養液中で試験可能である。ＤｓｉＲＮＡ試薬（例えば図１および上述構造を参照のこと）を、本明細書で記述したように、ＡＲ標的に対して選択する。ＡＲ  ＲＮＡ阻害は、たとえば、培養２２Ｒｖ１細胞、または培養液中の他の形質転換されたか、形質転換されていない哺乳動物細胞への、好適なトランスフェクション薬剤によるこれらの試薬の伝達後に測定する。標的ＡＲ  ＲＮＡの相対量を、増幅のリアルタイムＰＣＲモニタリングを用いて、アクチンまたは他の適切な対照に対して測定する（例えばＡＢＩ７７００ＴＡＱＭＡＮ（登録商標））。比較を、関係しない標的、または同一の総長および化学式を持つが、各位置において無作為に置換された無作為化ＤｓｉＲＮＡ対照、または単に適切な賦形剤処理または未処理対照に対して実施したオリゴヌクレオチド配列の混合物に対して実施する。第一および第二リード試薬を、標的に対して選択し、最適化を実施した。トランスフェクション試薬濃度を選択した後に、阻害のＲＮＡ経時変化を、リードＤｓｉＲＮＡ分子で実施する。
【０７９９】
ＴＡＱＭＡＮ
2013534424.tif 000399
（登録商標）（増幅のリアルタイムＰＣＲモニタリング）とｍＲＮＡのライトサイクラー定量化
総ＲＮＡを、例えば大規模抽出のためにＡｍｂｉｏｎ  Ｒｎａｑｕｅｏｕｓ  ４−ＰＣＲ精製キット、または９６−ウェルプレートに対してＰｒｏｍｅｇａ  ＳＶ９６を用いて、ＤｓｉＲＮＡ伝達に続く細胞から調製する。Ｔａｑｍａｎ解析のために、二重標識化プローブを、例えば５’末端にて共有結合したレポーター色素ＦＡＭまたはＶＩＣと３’末端に共役したクエンサー色素ＴＡＭＡＲＡで合成した。ＰＣＲ増幅を、例えば１０μＬ総ＲＮＡ、１００ｎＭフォワードプライマー、１００ｍＭリバースプライマー、１００ｍＭ  プローブ、１×ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ反応緩衝液（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、５．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００μＭ各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、０．２Ｕ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．０２５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および０．２Ｕ  Ｍ−ＭＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）からなる５０μＬ反応液を用いて、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  配列検出器上で実施する。温度サイクル条件は、４８℃にて３０分間、９５℃にて１０分間、続いて９５℃にて１５秒間と６０℃にて１分間の４０サイクルからなる。標的ＡＲ  ｍＲＮＡレベルの定量を、連続希釈総細胞ＲＮＡ（３００、１００、３０、１０ｎｇ／ｒｘｎ）から産出した標準に対して測定し、例えば、平行または同一チューブＴａｑＭａｎ反応中いずれかでの３６Ｂ４  ｍＲＮＡに対して標準化する。
【０８００】
ウエスタンブロッディング
細胞タンパク質抽出物を、（例えばＲＩＰＡ緩衝液を使用して）標準マイクロ調製技術を用いて調製可能である。細胞タンパク質抽出物を、４〜１２％  Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅポリアクリルアミドゲル上で走らせ、膜上に移す。非特異的結合を、例えば５％不脂肪ミルクとの１時間のインキュベーションにて阻害し、続いて４℃にて１６時間一次抗体でインキュベーション可能である。洗浄に続いて、二次抗体を、例えば室温にて１時間（１：１０，０００希釈）適用し、シグナルを、ＶｅｒｓａＤｏｃイメージングシステム上で検出する。
【０８０１】
種々の細胞培養系において、カチオン性脂質が、培養液中の細胞に対するオリゴヌクレオチドのバイオアベイラビリティを増強することが示されてきた（Ｂｅｎｎｅｔ，  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，４１，１０２３−１０３３）。１つの実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子を、細胞培養実験のために、カチオン性脂質と複合体化する。ＤｓｉＲＮＡとカチオン性脂質混合物を、細胞への添加の直前に、血清を含まないＯｐｔｉｍＭＥＭ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）中で調製する。ＯｐｔｉＭＥＭを室温（約２０〜２５℃）まで温め、カチオン性脂質を最終の望む濃度まで加える。ＤｓｉＲＮＡ分子をＯｐｔｉＭＥＭに、望む濃度まで加え、溶液を希釈したＤｓｉＲＮＡに加え、１５分間室温にてインキュベートする。用量応答実験において、ＲＮＡ複合体を、カチオン性脂質の添加前に、ＯｐｔｉＭＥＭ内に連続希釈する。
【０８０２】
動物モデル
抗−ＡＲ  ＤｓｉＲＮＡ試薬の有効性を、動物モデルにおいて評価してよい。本技術分野で公知のような癌および／または増殖性疾患、状態または疾病の動物モデルを、抗−ＡＲ  ＤｓｉＲＮＡｓの有効性、強度、毒性などの評価のために使用可能である。増殖性疾患の好適な動物モデルには、例えばプロト癌遺伝子（例えばＭｙｅ、Ｓｒｃ）の機能を得る、および／または腫瘍抑制タンパク質（例えばｐ５３、Ｒｂ）の機能の欠損を持つトランスジェニック齧歯類（例えばマウス、ラット）、または新生物形成を促進するＤＮＡ変化を誘導する照射または化学突然変異原誘発物質に曝露した齧歯類が含まれる。多くのそのような動物モデルは、例えばＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡから市販されている。これらの動物モデルは、本発明の組成物のアッセイのための、供給源細胞または組織として使用してよい。そのようなモデルはまた、治療的利用に向かってＡＲ遺伝子発現を調節することにおいて、本発明のＤｓｉＲＮＡ組成物の有効性の前臨床評価のための使用のために使用または適合可能である。
【０８０３】
細胞培養モデルでのように、ほとんどのＡＲ−関連マウス腫瘍異種移植片が、ＡＲタンパク質を発現する癌細胞から由来したものである。ＡＲを調節することの抗腫瘍効果の研究に関連する前立腺癌の異種移植片マウスモデルが種々のグループによって記述されてきた（Ｃｏｍｐａｇｎｏ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２：ｅ１００６、指数関数的に去勢耐性腫瘍が増殖しているマウスへの抗−ＡＲ  ｓｉＲＮＡ注射の研究；Ｄｅｈｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８：５４６９−７７、２２Ｒｖ１  ＰＣａ細胞株中の前立腺癌療法耐性を仲介する構成的に活性なＡＲの同定；Ａｚｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．３９１：１０７５−９、ＬＮＣａＰおよび２２Ｒｖ１ヒト前立腺癌細胞中のｓｉＲＮＡ標的化ＡＲの研究）。これらのモデルの利用は、抗−ＡＲによるＡＲ発現の阻害が、動物における腫瘍増殖の阻害を引き起こすことを示唆した。
【０８０４】
そのようなモデルを、ＡＲレベル、発現、腫瘍／癌形成、増殖、拡散、他のＡＲ−関連表現型、疾患または疾病の発達などを阻害する本発明のＤｓｉＲＮＡ分子の有効性を評価することにおいて使用可能である。これらのモデルおよび他を同様に、前臨床設定にて、本発明のＤｉｓＲＮＡ分子の安全性／毒性および有効性を評価するために使用可能である。
【０８０５】
本発明のＡＲ標的化ＤｓｉＲＮＡの評価のために有用な動物モデル系の特異的な例には、野生型マウス、および同所性または皮下ＬＮＣａＰまたは２２Ｒｖ１異種移植片腫瘍モデルマウスが含まれる。ｉｎ  ｖｉｖｏ実験における例において、本発明のＤｓｉＲＮＡを、そのようなマウスモデルに、１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で尾静脈注射するか、または繰り返し用量を、単一用量ＩＣ５０レベルで投与し、臓器（例えば前立腺、肝臓、腎臓、肺、膵臓、結腸、皮膚、脾臓、骨髄、リンパ節、乳腺脂肪体など）を、最終用量の投与２４時間後に回収する。そのような臓器をついで、使用するモデルに依存して、マウスおよび／またはヒトＡＲレベルに関して評価する。活性期間も最終ＤｓｉＲＮＡ投与後１、４、７、１４、２１またはそれ以上で試験可能である。
【０８０６】
本発明の実施は、他に指摘しない限り、当業者の技術内である、化学、分子生物学、微生物学、組換え体ＤＮＡ、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養およびトランスジェニック生物学の従来の技術を使用する。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｕｐｄａｔｅｓ）；Ｇｌｏｖｅｒ，１９８５，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）；Ａｎａｎｄ，１９９２；Ｇｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｆｉｎｋ，１９９１；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ｊａｋｏｂｙ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ，１９７９；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；Ｒｉｏｔｔ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８８；Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）；Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｍ．，Ｔｈｅ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｂｏｏｋ．Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ），（４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｏｒｅｇｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，２０００）を参照のこと。
【０８０７】
他に定義しない限り、本明細書で使用したすべての技術および化学的語句は、本発明の属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同一の意味を持つ。本明細書で記述したものと同様の、または等価の方法および物質を、本発明の実施または試験で使用可能であり、好適な方法および物質が以下で記述されている。すべての発行物、特許明細書、特許、および本明細書で言及された他の参考文献が、その全てが参考文献によって組み込まれている。矛盾する場合、定義を含む本明細書が制御する。さらに、物質、方法および実施例は、例示のみであり、制限であるという意図はない。
【０８０８】
（実施例）
本発明は、任意の様式で本発明の例示の方法を提供し、制限する意図はない、以下の実施例を参照して記述される。本技術分野でよく公知の標準技術、または以下で特に記述される技術を使用した。
実施例１
【０８０９】
抗−ＡＲ  ＤｓｉＲＮＡデザイン
好ましい抗−ＡＲ  ＤｓｉＲＮＡ試薬を、プレスクリーンしたＤｓｉＲＡの集団から選択した。ＤｓｉＲＮＡのデザインは、配列の一領域に広がる、多数の可能性あるＤｓｉＲＮＡの予想された活性／有効性のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ評価を実施する、予測スコアリングアルゴリズムの利用が任意に含まれうる。
実施例２
【０８１０】
二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドの調製とアッセイ
オリゴヌクレオチド合成および精製
ＤｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡメッセージ中の種々の部位、例えば本明細書で記述したＲＮＡ配列内の標的配列に相互作用するようにデザイン可能である。本例示薬剤において、２つの標的ＡＲ配列が選択された。各ＤｓｉＲＮＡ分子の１つの鎖の配列は、以上で記述した標的ＡＲ部位配列と相補的であった。ＤｓｉＲＮＡ分子は、本明細書で記述した方法を用いて化学的に合成した。一般に、ＤｓｉＲＮＡ構造物を、１９〜２３マーｓｉＲＮＡｓに対して記述したような固相オリゴヌクレオチド合成法を用いて合成した（例えば、Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，８０４，６８３号明細書；第５，８３１，０７１号明細書；第５，９９８，２０３号明細書；第６，１１７，６５７号明細書；第６，３５３，０９８号明細書；第６，３６２，３２３号明細書；第６，４３７，１１７号明細書；第６，４６９，１５８；  Ｓｃａｒｉｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，１１１，０８６号明細書；第６，００８，４００号明細書；第６，１１１，０８６号明細書を参照のこと）。
【０８１１】
個々のＲＮＡ鎖を合成し、標準の方法にしたがってＨＰＬＣ精製した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）。例えば、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを、標準技術（Ｄａｍｈａ  ａｎｄ  Ｏｌｇｉｖｉｅ，  １９９３，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２０：  ８１−１１４；  Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２３：  ２６７７−８４）を用いて、固相ホスホロアミダイト化学反応を用いて合成し、脱保護し、ＮＡＰ−５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）上で脱塩した。オリゴマーを、１５分間段階直線勾配を用いて、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｑ  ｃｏｌｕｍｎ  （１．０  ｃｍ  ｘ  ２５  ｃｍ；  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  Ｎ．Ｊ．）上のイオン交換高性能液体クロマトグラフィー（ＩＥ−ＨＰＬＣ）を用いて精製した。勾配は、９０：１０  緩衝液Ａ：Ｂ〜５２：４８  緩衝液Ａ：Ｂで変化し、ここで緩衝液Ａは１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５であり、緩衝液Ｂは１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５、１Ｍ  ＮａＣｌである。試料を２６０ｎｍでモニタし、全長オリゴヌクレオチド種に相当するピークを回収し、プールし、ＮＡＰ−５カラム上で脱塩し、凍結乾燥した。
【０８１２】
各オリゴマーの精度を、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＰＡＣＥ  ５０００  （Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，  Ｃａｌｉｆ．）上でのキャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって決定した。ＣＥキャピラリーは、１００μｍ内径を持ち、ｓｓＤＮＡ  １００Ｒ  Ｇｅｌ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を含む。典型的に、約０．６ｎｍｏｌのオリゴヌクレオチドをキャピラリー内に注入し、４４４Ｖ／ｃｍの電場中で走らせ、２６０ｎｍでのＵＶ吸収によって検出した。変性Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ−７Ｍ−尿素ランニング緩衝液をＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒから購入した。オリゴリボヌクレオチドを、以下に記述する実験での使用のために、ＣＥによって査定したように、少なくとも９０％純度で得た。化合物同一性を、製造業者の推奨プロトコールにしたがって、Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ．ＴＭ．Ｂｉｏｓｐｅｃｔｏｍｅｔｒｙ  Ｗｏｒｋ  Ｓｔａｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）上での、マトリックス補助レーザー吸収イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析によって確認した。しばしば０．２％の予測分子量内で、すべてのオリゴマーの比較分子量を得た。
【０８１３】
二本鎖の調製
一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）オリゴマーを、例えば１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５からなる二本鎖緩衝液中１００μＭ濃度で、再懸濁した。相補的センスおよびアンチセンス鎖を等モル量で混合し、例えば５０μＭ二本鎖の最終溶液を得た。試料をＲＮＡ緩衝液（ＩＤＴ）中５’間１００℃まで熱し、使用の前に室温まで冷却した。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）オリゴマーを−２０℃で保存した。一本鎖ＲＮＡオリゴマーを、凍結乾燥または−８０℃にてヌクレアーゼフリーの水中で保存した。
【０８１４】
命名法
一貫性のために、以下の命名法を本明細書で使用した。二本鎖に与えた名前は、オリゴマーの長さと、オーバーハングの有無を示唆する。「２５／２７」は、２５塩基センス鎖と、２−塩基３’−オーバーハングを含む、２７塩基アンチセンス鎖を持つ非対称二本鎖である。「２７／２５」は、２７塩基センス鎖と２５塩基アンチセンス鎖を持つ非対称二本鎖である。
【０８１５】
細胞培養およびＲＮＡトランスフェクション
２２Ｒｖ１細胞を、ＡＴＣＣより得、５％ＣＯ２下、３７℃にて、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）を含むＲＰＭＩ（ＨｙＣｌｏｎｅ）中で維持した。ＬＭＴＫ−細胞をＡＴＣＣより得、５％ＣＯ２下、３７℃にて、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）を含むＤＭＥＭ（ＨｙＣｌｏｎｅ）中で維持した。ＲＮＡトランスフェクションのために、細胞を、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）を用いて、製造業者の取り扱い説明書にしたがって、１ｎＭまたは０．１ｎＭの最終濃度で、示唆したようなＤｓｉＲＮＡｓでトランスフェクトした。簡単に記すと、各ＤｓｉＲＮＡのストック溶液の一部を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、容量８７．５μＬとした。ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎＴＭ  ＲＮＡｉＭＡＸを、ＯｐｔｉＭＥＭ中に８７．５μまで希釈した。得られた１５０μＬ混合液を、５０μＬ／ウェルにて、９６ウェルプレートの個々のウェルに三重で加え、ＲＴにて２０分間インキュベートして、ＤｓｉＲＮＡ：ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＲＮＡｉＭＡＸ複合体を形成させた。一方、２２Ｒｖ１細胞をトリプシン処理し、培地中に再懸濁させた。最後に、各細胞懸濁液１００μＬを各ウェル加え（最終用量１５０μＬ）、プレートを２４時間インキュベーター内に配置した。
【０８１６】
ＡＲ阻害の評価
ＡＲ標的遺伝子ノックダウンを、値をＨＰＲＴおよびＳＦＲＳ９ハウスキーピング遺伝子に対して、そして対照ＤｓｉＲＮＡｓでのトランスフェクションに対して標準化して、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した。
【０８１７】
ＲＮＡ単離および解析
培地を吸引し、総ＲＮＡをＳＶ９６キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて抽出した。およそ１００ｎｇの総ＲＮＡを、製造業者の取扱説明書にしたがって、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴおよびランダムヘキサマーを用いて逆転写した。典型的に、得られたｃＤＮＡの１／６を、ＡＲ遺伝子、およびヒト遺伝子ＨＰＲＴ−１およびＳＦＲＳ９両方に特異的なプライマーとプローブを用いて、ｑＰＣＲによって解析した。ＡＢＩ７７００を、増幅反応のために使用した。各試料を三重で試験した。相対ＡＲ  ＲＮＡレベルを、ＨＰＲＴ１およびＳＦＲＳ９  ＲＮＡレベルに対して標準化し、対照ＤｓｉＲＮＡｓで処理した対照試料中で得たＲＮＡレベルと比較した。
【０８１８】
２２Ｒｖ１細胞中のタンパク質とｍＲＮＡノックダウンの評価
２２Ｒｖ１細胞を、１０％ＦＢＳ（ＰＳなし）を含むＲＰＭＩ培地中、４００，０００細胞／ウェルの密度にて、６ウェルプレート中に播き、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて対照またはＡＲ  ＤｓｉＲＮＡｓで形質移入した。２４および４８時間後、細胞をＰＢＳにて洗浄し、ウエスタンブロット法のためにＴｒｉｔｏｎタンパク質溶解緩衝液中、ＲＮＡ抽出のためにＲＮＡ溶解緩衝液中いずれかで溶解した。
【０８１９】
ウエスタンブロット法によるＡＲタンパク質の定量
ウエスタンブロット法のために、細胞をＰＢＳで洗浄し、０．０５ｍｌの６倍の試料還元緩衝液を含む０．３ｍｌ溶解緩衝液で溶解した。１５μｌの本混合液をついで、４〜２０％Ｔｒｉｓ  Ｇｌｙｃｉｎｅゲル上にのせ、ウエスタン免疫ブロット法にかけた。ＡＲ（Ｎ２０）に対する一次抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（サンタクルーズ，カリフォルニア州）より得、アルファ−チューブリンに対する抗体を、Ｓｉｇｍａ（セントルイス，ミズーリ州）から得た。蛍光標識化二次抗体Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのタンパク質マーカーの分子量ラダーを、各ゲル上に走らせた。ＡＲとα−チューブリンバンドを、ブロット上のそれらの移動にしたがって一時的に同定した。タンパク質バンド強度の定量化を、販売会社の推奨に従い、ＶｅｒｓａＤｏｃ  Ｉｍａｇｉｎｇシステム４０００  ＭＰおよびＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ  １−Ｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて実施した。ハウスキーピングタンパク質、α−チューブリンを、定量化のための内部標準として使用した。
【０８２０】
多重化ｑＰＣＲを介したＡＲ  ｍＲＮＡの定量化
総ＲＮＡを、ＳＶ９６  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）取扱説明書にしたがって抽出し、ｃＤＮＡを、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ；Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒ  ａｎｄ  ａ  Ｈｅａｔｉｎｇ  Ｓｔｅｐ  ｏｆ  ５'  ＠７０  ０Ｃを用いる）を用いて作製した。ｑＰＣＲを、ＢＩＯ−ＲＡＤ  ｉＱ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｐｏｗｅｒｍｉｘと、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＴａｑＭａｎ（登録商標）  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ）からの相当するプライマープローブ組を用いて実施した。ＧＡＰＤＨまたはＲＰＬ２３ハウスキーピング遺伝子を内部標準として使用した。
実施例３
【０８２１】
ＡＲのＤｓｉＲＮＡ阻害−一次スクリーン
ＡＲを標的としているＤｓｉＲＮＡ分子を、上述のようにデザインして合成し、阻害有効性に関して２２Ｒｖ１細胞中で試験した。トランスフェクションのために、アニールしたＤｓｉＲＮＡを、５０μｌ／ウェルの容量で、トランスフェクション試薬（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎＴＭ  ＲＮＡｉＭＡＸ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、室温にて２０分間インキュベートした。２２Ｒｖ１（ヒト）またはＬＭＴＫ−（マウス）細胞をトリプシン処理し、培地中に再懸濁し、ウェルに加え（１００μＬ／ウェル）、１５０μｌの容量で、１ｎＭの最終ＤｓｉＲＮＡ濃度を得た。各ＤｓｉＲＮＡトランスフェクション混合液を、三重ＤｓｉＲＮＡ処理のために３ウェルに加えた。細胞を３７℃にて２４時間、ＤｓｉＲＮＡトランスフェクション混合液の継続存在下、インキュベートした。２４時間の時点で、ＲＮＡを処理した細胞の各ウェルから調製した。トランスフェクション混合液を含む上清をまず除去して捨て、ついで細胞を溶解し、各ウェルからＲＮＡを調製した。処理後の標的ＡＲ  ＲＮＡレベルを、値を対照から得られた値に対して標準化して、ＡＲ標的遺伝子に対してｑＲＴ−ＰＣＲによって評価した。三重のデータを平均し、％エラーを各処置に対して決定した。標準化データをグラフにし、対照との比較で、活性ＤｓｉＲＮＡｓによる標的ｍＲＮＡの減少を決定した。
【０８２２】
試験の一次段階で、ＡＲ阻害有効性に対して試験したＡＲ標的化ＤｓｉＲＮＡは以下を含んだ。
【０８２３】
表９
【０８２４】
【表２３５】
2013534424.tif 000400
【０８２５】
【表２３６】
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【０８２６】
【表２３７】
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【０８２７】
【表２３８】
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【０８２８】
【表２３９】
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【０８２９】
【表２４０】
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【０８３０】
【表２４１】
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【０８３１】
【表２４２】
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【０８３２】
【表２４３】
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【０８３３】
【表２４４】
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【０８３４】
【表２４５】
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【０８３５】
【表２４６】
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【０８３６】
【表２４７】
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【０８３７】
【表２４８】
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【０８３８】
【表２４９】
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【０８３９】
【表２５０】
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【０８４０】
【表２５１】
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【０８４１】
【表２５２】
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【０８４２】
【表２５３】
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【０８４３】
【表２５４】
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【０８４４】
【表２５５】
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【０８４５】
【表２５６】
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【０８４６】
【表２５７】
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【０８４７】
【表２５８】
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【０８４８】
【表２５９】
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【０８４９】
【表２６０】
2013534424.tif 000425
【０８５０】
【表２６１】
2013534424.tif 000426
【０８５１】
【表２６２】
2013534424.tif 000427
【０８５２】
【表２６３】
2013534424.tif 000428
【０８５３】
【表２６４】
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【０８５４】
【表２６５】
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【０８５５】
【表２６６】
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【０８５６】
【表２６７】
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【０８５７】
【表２６８】
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【０８５８】
【表２６９】
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【０８５９】
【表２７０】
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【０８６０】
【表２７１】
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【０８６１】
【表２７２】
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【０８６２】
【表２７３】
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【０８６３】
【表２７４】
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【０８６４】
表１０
【０８６５】
【表２７５】
2013534424.tif 000440
【０８６６】
【表２７６】
2013534424.tif 000441
【０８６７】
【表２７７】
2013534424.tif 000442
【０８６８】
【表２７８】
2013534424.tif 000443
【０８６９】
【表２７９】
2013534424.tif 000444
【０８７０】
表１１
【０８７１】
【表２８０】
2013534424.tif 000445
【０８７２】
【表２８１】
2013534424.tif 000446
【０８７３】
【表２８２】
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【０８７４】
【表２８３】
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【０８７５】
【表２８４】
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【０８７６】
【表２８５】
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【０８７７】
【表２８６】
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【０８７８】
【表２８７】
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【０８７９】
【表２８８】
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【０８８０】
【表２８９】
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【０８８１】
【表２９０】
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【０８８２】
【表２９１】
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【０８８３】
【表２９２】
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【０８８４】
【表２９３】
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【０８８５】
【表２９４】
2013534424.tif 000459
【０８８６】
【表２９５】
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【０８８７】
【表２９６】
2013534424.tif 000461
【０８８８】
【表２９７】
2013534424.tif 000462
【０８８９】
【表２９８】
2013534424.tif 000463
【０８９０】
【表２９９】
2013534424.tif 000464
【０８９１】
【表３００】
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【０８９２】
【表３０１】
2013534424.tif 000466
【０８９３】
【表３０２】
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【０８９４】
【表３０３】
2013534424.tif 000468
【０８９５】
【表３０４】
2013534424.tif 000469
【０８９６】
【表３０５】
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【０８９７】
【表３０６】
2013534424.tif 000471
【０８９８】
【表３０７】
2013534424.tif 000472
【０８９９】
【表３０８】
2013534424.tif 000473
【０９００】
【表３０９】
2013534424.tif 000474
【０９０１】
【表３１０】
2013534424.tif 000475
【０９０２】
【表３１１】
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【０９０３】
【表３１２】
2013534424.tif 000477
【０９０４】
【表３１３】
2013534424.tif 000478
【０９０５】
【表３１４】
2013534424.tif 000479
【０９０６】
【表３１５】
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【０９０７】
【表３１６】
2013534424.tif 000481
【０９０８】
【表３１７】
2013534424.tif 000482
【０９０９】
【表３１８】
2013534424.tif 000483
【０９１０】
【表３１９】
2013534424.tif 000484
【０９１１】
表１２
【０９１２】
【表３２０】
2013534424.tif 000485
【０９１３】
【表３２１】
2013534424.tif 000486
【０９１４】
【表３２２】
2013534424.tif 000487
【０９１５】
【表３２３】
2013534424.tif 000488
【０９１６】
【表３２４】
2013534424.tif 000489
【０９１７】
本実施例において、４５６の非対称ＤｓｉＲＮＡ（試験したＤｓｉＲＮＡは、２５／２７ｍｅｒ構造を有する）を構築し、１ｎＭの濃度でのそのようなＤｓｉＲＮＡｓの存在下インキュベートしたヒト２２Ｒｖ１およびマウスＬＭＴＫ−細胞中のＡＲ阻害有効性に関して試験した。試験した４５６の非対称ＤｓｉＲＮＡには、以上表２および３から選択したＤｓｉＲＮＡのサブセット、ならびにヒトＡＲ、マウスＡＲまたは両方内の特定の配列を標的としてデザインした対照ＤｓｉＲＮＡのさらなる組が含まれた。４５６すべての試験した非対称ＤｓｉＲＮＡｓの配列および構造を、表９および１０にて以上で示している。以上図２および３でのように、以上表９〜１２の下線を引いたヌクレオチド残基は、２’−Ｏ−メチル改変残基を示唆し、リボヌクレオチド残基をＵＰＰＥＲ  ＣＡＳＥとして示しており、一方デオキシリボヌクレオチド残基を下場合として示している。
【０９１８】
１ｎＭでのヒトヒト２２Ｒｖ１およびマウスＬＭＴＫ−細胞中の上記４５６のＡＲ標的化ＤｓｉＲＮＡｓのアッセイは、表１３および１４にて示した、以下のＡＲ阻害有効性を明らかにした。ＡＲレベルを、ＡＲ転写産物内の位置で配置されたｑＰＣＲアッセイを用いて決定した（ヒト２２Ｒｖ１細胞実験に対して、確実なｑＰＣＲアッセイは、ＡＲ３３８２−３５５４アンプリコン（Ｙａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ）のものである。マウスＬＭＴＫ−細胞実験に対して、対となるｑＰＣＲアッセイを実施し、「Ｍｍ  ＡＲ  １５５４−１６６７（ＦＡＭ）」および「Ｍｍ  ＡＲ  ２４１３−２５２８（Ｙａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ）」とした）。
【０９１９】
表１３
【０９２０】
【表３２５】
2013534424.tif 000490
【０９２１】
【表３２６】
2013534424.tif 000491
【０９２２】
【表３２７】
2013534424.tif 000492
【０９２３】
【表３２８】
2013534424.tif 000493
【０９２４】
【表３２９】
2013534424.tif 000494
【０９２５】
【表３３０】
2013534424.tif 000495
【０９２６】
【表３３１】
2013534424.tif 000496
【０９２７】
【表３３２】
2013534424.tif 000497
【０９２８】
【表３３３】
2013534424.tif 000498
【０９２９】
表１４
【０９３０】
【表３３４】
2013534424.tif 000499
【０９３１】
【表３３５】
2013534424.tif 000500
【０９３２】
【表３３６】
2013534424.tif 000501
【０９３３】
【表３３７】
2013534424.tif 000502
【０９３４】
【表３３８】
2013534424.tif 000503
【０９３５】
【表３３９】
2013534424.tif 000504
【０９３６】
【表３４０】
2013534424.tif 000505
【０９３７】
【表３４１】
2013534424.tif 000506
【０９３８】
以上表１３で示したように、ヒト２２Ｒｖ１細胞内で試験した４０８の非対称ＤｓｉＲＮＡｓのうち１５５が、１ｎＭにて、２２Ｒｖ１細胞内で、ヒトＡＲの７０％以上の減少を示した。これらの１５５のＤｓｉＲＮＡｓのうち、６０が、１ｎＭにて２２Ｒｖ１細胞内で、ヒトＡＲレベルの８０％またはそれ以上の減少を示した。以上表１４にて示したように、細胞の環境中、１ｎＭにてマウスＬＭＴＫ−細胞中のマウスＡＲレベルを阻害可能な多数の非対称ＤｓｉＲＮＡをまたそのようなアッセイ中に同定した。
実施例４
【０９３９】
ＡＲのＤｓｉＲＮＡ阻害−二次スクリーン
以上の実験の７２の非対称ＤｓｉＲＮＡｓを、ついで二次アッセイで試験し（「相２」）、そのようなアッセイは、図２〜５にてヒストグラムの形態で示した。特に、以上で試験した４５６から選択した７２の非対称ＤｓｉＲＮＡｓを、を、ヒト２２Ｒｖ１細胞の環境中１ｎＭ、０．３ｎＭおよび０．１ｎＭにて、ヒトＡＲの阻害に関して査定した（図２および３）。これらの７２非対称ＤｓｉＲＮＡｓをまた、マウスＬＭＴＫ−細胞の環境中１ｎＭ、０．３ｎＭおよび０．１ｎＭにて、マウスＡＲの阻害に関して査定した（図４および５）。図２および３にて示すように、明かな数の非対称ＤｓｉＲＮＡｓが、２２Ｒｖ１細胞の環境中でアッセイした時に、サブナノモル濃度にて、強いヒトＡＲ阻害有効性を再現可能に示した。さらに、図４および５で示すように、多数のこれらの非対称ＤｓｉＲＮＡｓがまた、マウスＬＭＴＫ−細胞の環境中でアッセイした時に、１ｎＭ、３００ｐＭおよび１００ｐＭにて、強いマウスＡＲ阻害有効性を示した。（一方、ヒトＡＲ特異的、およびマウスＡＲ特異的阻害非対称ＤｓｉＲＮＡｓ両方をまた同定した。）
実施例５
【０９４０】
その他の好ましいＤｓｉＲＮＡによるＡＲの阻害
示したようにセンスおよびアンチセンス鎖配列を有し、ＡＲ野生型配列（および適用可能な場合、バリアント配列）を標的化している表２および３で示した残りのＤｓｉＲＮＡ分子を、以上で記述したようにデザインおよび合成し、２２Ｒｖ１胞（および任意に、マウスＬＭＴＫ−細胞）中で、以上実施例３および４で記述したように阻害有効性に関して試験した。これらのＤｓｉＲＮＡ試薬の、ＡＲ発現を阻害する能力を任意に、相当するＡＲ標的配列指向２１マーｓｉＲＮＡｓと比較して査定した（本明細書で記述したＡＲ  ｄｓＲＮＡ試薬の２１ヌクレオチド標的配列を、以上表４で示している）。以上表２および３の、有意な数の残っている選択したＤｓｉＲＮＡ試薬が、ＡＲ阻害剤としての有効性を示すと予測され、細胞の環境中、１ｎＭ、３００ｐＭおよび１００ｐＭ濃度にて試験する。これらの追加ＤｓｉＲＮＡｓおよび本明細書で試験したＤｓｉＲＮＡｓをまた、同族２１マーｓｉＲＮＡ試薬と比べて、ＡＲ標的のレベルを減少させることにおける有効性の測定を介して決定したように、同族ｓｉＲＮＡｓをしのぐ能力に関しても試験する。そのような阻害効果の期間をまた、試験した０．１ｎＭ、０．３ｎＭ、１ｎＭおよび５ｎＭの濃度で、投与後２４時間および４８時間で試験する。本発明のＤｓｉＲＮＡｓを、それによって効果の強度および／または期間の測定を介して決定したように、それらの同族２１マーｓｉＲＮＡをしのぐ能力に関して試験する。
【０９４１】
任意に、以上表５〜８にて示したＤｓｉＲＮＡ分子をまた同様に合成し、試験する。
実施例６
【０９４２】
２２Ｒｖ１ヒト前立腺癌細胞内のＡＲタンパク質のＡＲ標的化ＤｓｉＲＮＡ−仲介ノックダウン
ＡＲ転写産物のＤｓｉＲＮＡ−仲介ノックダウンがまた、有意なＡＲポリペプチドノックダウンを産出したことを確かめるために、ＡＲタンパク質レベルを、ＡＲを発現しているＤｓｉＲＮＡ−処理２２Ｒｖ１細胞中で試験した。図６Ａで示すように、ＤｓｉＲＮＡ−仲介ＡＲタンパク質ノックダウンが、効果的であることが示され、ＡＲ転写産物内の標的としたＡＲ部位の位置と相関することが示された。（図６Ｂ中で略図的に描写されたような）ＡＲ転写産物の長および短形態両方に相当するＡＲポリペプチドが、ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡ  ＡＲ−２２２４およびＡＲ−２２１３の投与から２４時間および４８時間後の両方で、効果的にノックダウンされた。反対に、ＡＲ転写産物の長形態に相当するＡＲポリペプチドのみが、ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡ  ＡＲ−３５１８およびＡＲ−３２４２によって効果的にノックダウンされた（ＡＲ−２２２４およびＡＲ−２８１３  ＤｓｉＲＮＡは、ＡＲ転写産物の長および短形態両方に対して指向し、一方で、ＡＲ−３５１８およびＡＲ−３２４２  ＤｓｉＲＮＡは、ＡＲ転写産物の長形態内にのみ含まれる配列に特異的であった）。これらのデータは、ＡＲ転写産物を阻害することにおいて効果的であると示されたＤｓｉＲＮＡがまた、ＡＲポリペプチドレベルの効果的な阻害剤でもあること、およびＡＲ転写産物の長および短形態両方を標的としているか、ＡＲ転写産物の長形態のみに特異的であるＤｓｉＲＮＡが、ＡＲポリペプチドノックダウンの相当する選択性を示したことを立証した。
実施例７
【０９４３】
ＡＲ標的化ＤｓｉＲＮＡの修飾形態が、ＡＲレベルをｉｎ  ｖｉｔｒｏで減少させる
３２のＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡ（ＡＲ−７２４、ＡＲ−７３０、ＡＲ−７６０、ＡＲ７７０、ＡＲ−７７５、ＡＲ−１２１０、ＡＲ−２２２４、ＡＲ−２７２０、ＡＲ−２８０８、ＡＲ−２８１３、ＡＲ−２８１５、ＡＲ−２８１９、ＡＲ−２８７４、ＡＲ−２８９７、ＡＲ−２９３４、ＡＲ−３５１８、ＡＲ−３５４８、ＡＲ−３５７６、ＡＲ−３５９９、ＡＲ−３６１７、ＡＲ−３６３５、ＡＲ−３６４１、ＡＲ−３７５９、ＡＲ−３７６２、ＡＲ−３７６７、ＡＲ−３７７１、ＡＲ−３８３７、ＡＲ−３８４４、ＡＲ−３８５３、ＡＲ−３８６９、ＡＲ−３９４８  ａｎｄ  ＡＲ−ｍ２４２２）を、図７−１〜７−３２で略図で示したように、２’−Ｏ−メチル改変パターンで調製した。３２ＤｓｉＲＮＡ配列のそれぞれに対して、それぞれの６改変パターンを有するＤｓｉＲＮＡｓを、Ａ５４９細胞の環境中、０．１ｎＭ（平行アッセイにて）および１．０ｎＭ濃度にて、ヒトＡ５４９細胞中のＡＲ阻害に関してアッセイした。これらの実験の結果を、図７−１〜７−３２にてヒストグラムとして示す。一般に、３２のＤｓｉＲＮＡ配列は、ガイド鎖の２’−Ｏ−メチル改変の程度が増加するように、ＡＲ阻害有効性を減少させる傾向を示した。しかしながら、試験したほとんどすべてのＤｉＲＮＡ配列に関して、改変パターンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて有意なＡＲ阻害有効性をＤｓｉＲＮＡが維持するように同定可能であった。また、多くのＤｓｉＲＮＡｓ（例えば、ＡＲ−２９３４、ＡＲ−３５１８、ＡＲ−３７５９、ＡＲ−３７７１、ＡＲ−３９４８）が、試験した最も高く改変した状態においてさえも、強力なＡＲ阻害有効性を示したことに注目すべきであった。これらのデータは、そのようなＤｓｉＲＮＡｓを安定化させるのに、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏにて対象に治療的に投与した時の、そのようなＤｓｉＲＮＡの免疫原性の減少させるために十分な修飾レベルを有する、効果的なＤｓｉＲＮＡ配列を同定することが可能でありうる。
【０９４４】
特定の実施形態において、本発明は、以下の１つまたはそれ以上から選択されたＤｓｉＲＮＡを提供する。
【０９４５】
表１３
【０９４６】
【表３４２】
2013534424.tif 000507
上記改変ＤｓｉＲＮＡアッセイにて試験した表１３のＤｓｉＲＮＡのうち、ＡＲ−７２４、ＡＲ−７３０、ＡＲ−７６０、ＡＲ−７７０、ＡＲ−７７５、ＡＲ−２７２０、ＡＲ−２８０８、ＡＲ−２８１５、ＡＲ−２８１９、ＡＲ−３５７６、ＡＲ−３５９９、ＡＲ−３７５９、ＡＲ−３７６２、ＡＲ−３７６７およびＡＲ−３７７１が、改変された時でさえ、強く効果的なＤｓｉＲＮＡ配列であることを示した（そして、ＡＲ−７６０、ＡＲ−７７５、ＡＲ−２８１５、ＡＲ−３５７６、ＡＲ−３５９９、ＡＲ−３７５９、ＡＲ−３７６２、ＡＲ−３７６７およびＡＲ−３７７１が、試験した全ての改変条件下、非常に効果的なＡＲの阻害剤であることが観察された）。特定の関連実施形態において、選択されたＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡは、ＡＲ−２８１３、ＡＲ−２８１５およびＡＲ−３５９９（および任意にＡＲ−２８１５およびＡＲ−３５９９）である。
実施例８
【０９４７】
肺組織中のＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
ｉｎ  ｖｉｖｏにてＡＲに対して指向したＤｓｉＲＮＡの活性を試験するために、ＣＤ１オスマウスにＡＲ−２８１３を投与した。マウスを、５％グルコース（対照賦形剤）、対照ＤｓｉＲＮＡ  ＳＣＲ２、またはＡＲ−２８１３いずれかで、尾静脈注射によって処置した。ＤｓｉＲＮＡを、ＩｎＶｉｖｏＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）ＴＭ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）中に処方し、１０ｍｇ／ｋｇ体重／投与の用量で投与した（１日投与しない日を挟んで２日間で投与した）。最後の投与から３日後、動物を安楽死させ、肺を回収した。ＲＮＡ発現解析のために、ＲＮＡを、Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）ＳＶ９６  ＲＮＡ単離キットを用いて、肺組織溶解物から単離した。ＲＮＡを逆転写し、ついでＴａｑｍａｎ定量ＰＣＲを、ＡＲおよび標準化のためにハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに特異的なプライマーおよびプローブ組を用いて、多重で、ＢｉｏＲａｄ  ＣＦＸ９６上で実施した。結果の確認のために、ＡＲに対して、３つの異なるｑＰＣＲアッセイを使用した（ＡＲ９６１、ＡＲ１５５４およびＡＲ２と命名）。
【０９４８】
図８に示すように、ＡＲ−２８１３  ＤｓｉＲＮＡは、回収した肺組織中のＡＲのｉｎ  ｖｉｖｏノックダウンの顕著な有効性を示した。特に、ＡＲ  ＲＮＡレベルが、対照肺試料と比較して、およそ５０〜８０％まで、ＡＲ−２８１３投与動物のアッセイした肺組織中で減少した。したがって、ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡは、肺組織において、ｉｎ  ｖｉｖｏにて、強力かつ有効的な阻害剤であることが示された。
実施例９
【０９４９】
ヒト２２Ｒｖ１前立腺癌細胞およびＡ５４９腺癌細胞中、ＡＲ発現をノックダウンしたＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡに対して計算したＩＣ５０値
上の表６は、ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡが、ＡＲを発現しているＤｓｉＲＮＡ−処理２２ｒＶ１細胞中、ＡＲ転写産物およびポリペプチド両方のノックダウンを産出したことを確認した。活性ＡＲ−２８１３  ＤｓｉＲＮＡを用いて、そのようなノックダウンと関連したＩＣ５０値の同定するために、上記結果を確認し、拡張した。そのような実験を実施するために、脂質トランスフェクション試薬ＲＮＡｉＭＡＸとＡＲ−２８１３  ＤｓｉＲＮＡまたはモック処理の用量曲線濃度を使用して、２２Ｒｖ１細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏでトランスフェクトした。形質移入から２日後、細胞を溶解し、タンパク質発現を、抗ＡＲ−抗体、または対照として抗−α−チューブリン抗体を用いるウエスタン解析によって決定した。図９にて示すように、多重ＡＲタンパク質が２２Ｒｖ１細胞中で検出され、全長ＡＲ（上バンド）と、本細胞株中の変異からの結果である頂短ＡＲタンパク質（下バンド）を表している。ＤｓｉＲＮＡ−仲介ＡＲタンパク質ノックダウンが、２２Ｒｖ１細胞へのＤｓｉＲＮＡ投与１日および２日後両方で、ＡＲポリペプチドの長および短形態両方に対して効果的であることが示された（上パネル）。ＡＲ長形態ポリペプチド阻害（第１日目５４．６ｐＭ、第２日目５ｐＭ）、およびＡＲ短形態ポリペプチド阻害（１日目８６．８ｐＭおよび２日目１３．６ｐＭ）両方に関連したＩＣ５０値を計算し、これは、ＡＲ−２８１３  ＤｓｉＲＮＡの阻害試薬としての明かな強度を示唆している。ＡＲ−２８１３  ＤｓｉＲＮＡはまた、ＡＲ  ｍＲＮＡレベルを劇的に阻害することが確認された（例えば、アッセイした濃度のＤｓｉＲＮＡに依存して、少なくとも５０％または８０％以上までの減少）。
【０９５０】
ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡがまた、Ａ５４９（腺癌ヒト肺胞上皮）細胞中のＡＲ  ｍＲＮＡ発現を阻害することもわかった。図１０の用量応答曲線にて示した様に、多数のＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡが、Ａ５４９細胞中、ＡＲ発現の強力な阻害剤であることが観察された。特に、Ａ５４９細胞を、示した様な用量曲線濃度のＡＲ−標的化とともに処方したＤｓｉＲＮＡを脂質トランスフェクション試薬ＲＮＡｉＭＡＸを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにてトランスフェクトした。トランスフェクション２日後、溶解細胞を溶解し、総ＲＮＡをＳＶ９６  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて抽出した。ｃＤＮＡをＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、ランダムプライマーと５’＠７０℃の加熱段階を、利用を用いて作成した。ｑＰＣＲを、ｉＱ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｐｏｗｅｒｍｉｘおよび相当するプライマープローブ組（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて実施した。ＩＣ５０値を、各以下のアッセイしたＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡに対して計算した：ＡＲ−２８１３−Ｍ２５（ＩＣ５０＝２１ｐＭ）、ＡＲ−２８１５−Ｍ１２（ＩＣ５０＝０．７ｐＭ）、ＡＲ−２８７４−Ｍ１２（ＩＣ５０＝０．４ｐＭ）、ＡＲ−３５１８０Ｍ１２（ＩＣ５０＝０．０８６ｐＭ）およびＡＲ−３５９９−Ｍ２５（ＩＣ５０＝１．５７ｐＭ）。
実施例１０
【０９５１】
ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡは、前立腺癌細胞株中の腫瘍細胞増殖を阻害した。
ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡが、ＡＲを発現すると公知の癌細胞中の細胞増殖に影響を与えうるかどうかを明らかにするために、ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡを前立腺癌細胞株２２Ｒｖ１（図１１）およびＶＣａＰ（図１２）に与えた。図１１にて示すように、ヒト前立腺癌細胞株２２Ｒｖ１細胞の、ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡ  ＡＲ−２８１３での形質移入により、対照ＤｓｉＲＮＡで形質移入したそのような細胞と比較して、２２Ｒｖ１細胞中の細胞増殖の劇的な（少なくとも５０％）阻害を産出した（そのような実験において、２２Ｒｖ１細胞を、ＲＮＡｉＭＡＸを用いてＤｓｉＲＮＡで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて５時間形質移入し、形質移入から６日後、細胞の増殖を細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定した）。そのような結果を拡張して、図１２は、修飾されたＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡ（特に、図７で示した様に、アンチセンス（ガイド）鎖修飾パターン「Ｍ２５」を持つ、ＡＲ−３５９９およびＡＲ−２８１３  ＤｓｉＲＮＡ）は、そのような細胞への投与後、ＶＣａＰ（ヒト前立腺癌）細胞増殖を強力に阻害した（これらの実験において、細胞増殖値を、ＤｓｉＲＮＡの形質移入仲介から投与５日後に査定した）。明らかに、ＡＲ  ＤｓｉＲＮＡでのＶＣａＰ細胞の処理が、３０ｐＭ程度低い形質移入の濃度にて、ＶＣａＰ前立腺癌細胞株の増殖を阻害した（ＡＲ−３５９９−Ｍ２５に関して、細胞増殖が、３０ｐＭ濃度にて、少なくとも５０％まで阻害された）。したがって、ＤｓｉＲＮＡは、前立腺癌細胞増殖の驚くべき強力な阻害剤であることが観察された。
実施例１１
【０９５２】
肝臓組織中のＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
ｉｎ  ｖｉｖｏにて、ＡＲに対して指向したＤｓｉＲＮＡの活性をさらに試験するために、２ヶ月齢ｎｕ／ｎｕオスマウス（ｎ＝７）に、ＩｎＶｉｖｏＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）２．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に処方したＡＲ  ＤｓｉＲＮＡを注射し、１日目および４日目に１０ｍｇ／ｋｇ（ｉｖ）の用量で投与した。各７匹のマウスの３つのさらなる群（ＰＢＳ、未処理またはＨＰＲＴ１対照ＤｓｉＲＮＡを投与した）を対照群として本研究に含めた。肝臓組織を、第二用量の投与から４８時間後に回収し、後の利用のために、溶液（ＲＮＡｓｅ  Ｅａｓｙ）中に保存した。少量の肝臓組織を、５００μｌのＱＩＡｚｏｌ溶解緩衝液中でホモジナイズし、５００μｌのクロロホルムと混合し、遠心した。１００μｌの上水層をＡＶ９６結合プレートに移し、ＲＮＡをＳＶ９６  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて抽出した。ｃＤＮＡを、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、ランダムプライマーと５’＠７０℃の加熱段階を、利用を用いて作製した。ｑＰＣＲを、ｉＱ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｐｏｗｅｒｍｉｘ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ）からの相当するプライマープローブ組を用いて実施した。ＧＡＰＤＨ、ハウスキーピング遺伝子を、定量の内部標準として使用した。
【０９５３】
図１３に示すように、４つの異なるＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡ（ＡＲ−２８１５−Ｍ１２、ＡＲ−２８７４−Ｍ１２、ＡＲ−３５１８−Ｍ１２およびＡＲ３５９９−Ｍ２５）それぞれが、未処理、ＰＢＳ−または対照オリゴヌクレオチド−処理対照と比較して、少なくとも８０％（特定の場合、少なくとも９０％または９５％）まで、正常肝臓組織中のＡＲ  ｍＲＮＡ発現を減少させた。
【０９５４】
ｉｎ  ｖｉｖｏノックダウン結果が、図８および１３にて示した結果を得るために使用した、ＩｎＶｉｖｏＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）トランスフェクション試薬以外の液体製剤で達成可能かどうかを確認するため、およびそのような製剤が、ｉｎ  ｖｉｖｏにて移植された腫瘍細胞中のＡＲ発現を阻害するかどうかを評価するために、ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡを、異なる液体処方「ＤＬ１」および「ＤＬ２」中に処方し、そのように処方したＤｓｉＲＮＡをついて、肝臓中に移植された腫瘍細胞中、および正常肝臓組織中のＡＲのｉｎ  ｖｉｖｏノックダウンに対して査定した。特にＨ４６０腫瘍を、皮下でマウスに移植し、２週間増殖させた。腫瘍がおよそ〜３００ｍｍ３であった時に開始し、５ｍｇ／ｋｇの三用量を４８時間間隔で静脈内投与した。ＤｓｉＲＮＡを液体に基づく製剤ＤＬ１またはＤＬ２中で処方した。ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡｓ  ＡＲ２８１３−Ｍ１２およびＡＲ３５９９−Ｍ２５を本研究で試験した。一方、２つのさらなる群の各８匹マウス（食塩水またはＨＰＲＴ１  ＤｓｉＲＮＡを投与）を、対照群として本研究に加えた。肝臓組織を最終用量の投与から４８時間後に回収し、すぐに凍結した。凍結した組織を粉状にし、小さな部分の肝臓組織を、５００μｌのＱＩＡｚｏｌ溶解緩衝液中でホモジナイズし、５００μｌのクロロホルムと混合し、遠心した。１００μｌの上水層をＳＶ９６結合プレートに移し、ＲＮＡをＳＶ９６  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて抽出した。ｃＤＮＡを、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、ランダムプライマーと５’＠７０℃の加熱段階を、利用を用いて作製した。ｑＰＣＲを、ｉＱ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｐｏｗｅｒｍｉｘ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ）からの相当するプライマープローブ組を用いて実施した。ＧＡＰＤＨ、ハウスキーピング遺伝子を、定量の内部標準として使用した。図１４にて示したように、ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡ（ＡＲ−２８１５−Ｍ１２およびＡＲ３５９９−Ｍ２５）が、正常肝臓組織中のＡＲ  ｍＲＮＡ発現を、食塩水−または対照オリゴヌクレオチド−処理対照と比較して、少なくとも８０％まで（ＡＲ３５９９−Ｍ２５に関して、少なくとも９０％まで）減少させた。
【０９５５】
したがって、ＡＲ−標的化ＤｓｉＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏにて肝臓組織中のＡＲの強力かつ効果的な阻害剤であることが示された。
実施例１２
【０９５６】
適応症
ＡＲ研究における現在の知識により、ＡＲ活性をアッセイするための方法、および研究、診断および治療利用のために、ＡＲ発現を制御可能な化合物に対する必要性が示される。本明細書で記述したように、本発明の核酸分子を、ＡＲレベルに関連した疾患状態を診断するために、アッセイ中で使用可能である。さらに、核酸分子を、ＡＲ誤調節、レベルなどに関連する疾患状態を処置するために使用可能である。
【０９５７】
ＡＲ発現調節に関連可能な特定の疾患および疾病には、単独または他の治療との組み合わせで、癌および／または増殖性疾患、状態または疾病、および細胞または組織中のＡＲのレベルに関連する、または応答しうる他の疾患、状態または疾病が含まれるが、限定はされない。ＡＲ発現調節に関連した特定の変性および疾患状態には、例えば前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、膵臓癌および乳癌が含まれるが、限定はされない。
【０９５８】
ゲムシタビンおよびシクロホスファミドは、本発明の核酸分子（例えばＤｓｉＲＮＡ分子）と組み合せ可能、または併用可能な化学治療剤の非限定例である。当業者は、抗癌化合物および治療のような、他の薬剤を同様に、本発明の核酸分子（例えばＤｓｉＲＮＡ分子）と簡単に混合可能であり、したがって本発明の範囲内であることを認識するであろう。そのような化合物および治療は、本技術分野で公知であり（たとえば、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １  ａｎｄ  ２、ｅｄｓ  Ｄｅｖｉｔａ，Ｖ．Ｔ．，Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｓ．、ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＵＳＡを参照のこと）、抗葉酸類、フルオロピリミジン類、シタラビン、プリン類似体、アデノシン類似体、アムサクリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤類、アントラピラゾール類、レチノイド類、ブレオマイシン、アントラサイクリン類、マイトマイシンＣ、ダクチノマイシンおよびミトラマイシンのような抗生物質類、ヘキサメチルメラミン、デカルバジン、１−アスペルギナーゼ、白金類似体、窒素マスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、イホスファミド、４−ヒドロペルオキシシクロホスファミド、ニトロソウレア、チオテパのようなアルキル化剤、ビンカアルカロイド類、エピポドフィロトキシン類、タキソールのような植物由来化合物、タモキシフェン、放射線治療、手術、栄養補助剤、遺伝子治療、３Ｄ−ＣＲＴのような放射療法、リシン、モノクローナル抗体Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎのような免疫毒素療法などが含まれるが、これらに限定はされない。組み合わせ療法のために、本発明の核酸を２つの方法のうち１つで調製する。第一に、試薬を、静脈内投与のための溶液中の、リポソーム内にカプセル封入した本発明の核酸と、イホスファミドの混合液のような、核酸と化学療法剤の調製において物理的に混合し、そこで両方の薬剤は、治療的に効果的な濃度で存在する（例えば１０００〜１２５０ｍｇ／ｍ２／日を伝達するための溶液中のイホスファミドと、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日を伝達するための同一の溶液中の本発明のリポソーム結合核酸）。あるいは、試薬を、それらそれぞれの効果的な用量で別々に、しかし同時に投与する（例えば、１０００〜１２５０ｍｇ／ｍ２／ｄ  イホスファミドと０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日  本発明の核酸）。
【０９５９】
業者は、本明細書で記述した疾患および状態を治療するために使用する他の化合物および治療を、本発明の核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）と同様に混合可能であり、したがって本発明の範囲内であることを理解するであろう。
実施例１３
【０９６０】
ＤｓｉＲＮＡに関する血清安定性
ＤｓｉＲＮＡ試薬の血清安定性を、３７℃にて種々の時間間隔（〜２４時間）の間、５０％ウシ胎児血清中でのＤｓｉＲＮＡ試薬のインキュベーションを介して査定する。血清を抽出し、核酸を、２０％非変性ＰＡＧＥ上で分離し、Ｇｅｌｓｔａｒ染色によって可視化可能である。ヌクレアーゼ分解からの保護の相対レベルを、（任意に修飾ありおよびなしで）ＤｓｉＲＮＡｓに関して査定する。
実施例１４
【０９６１】
ＡＲ遺伝子発現の下方制御を評価するための、追加細胞培養モデルの利用
抗−ＡＲ試薬での処置の後のＡＲ仲介効果を見るために、種々の評価項目が細胞培養モデルで使用されてきた。表現型評価項目には、細胞増殖の阻害、ＲＮＡ発現、およびＡＲタンパク質発現の減少が含まれる。ＡＲ変異が、特定の腫瘍細胞の増殖の増加に直接関連するので、細胞増殖アッセイに対する増殖評価項目は、スクリーンとして使用可能である。本評価項目を測定可能な種々の方法が存在する。ＤｓｉＲＮＡでの細胞の処置後、細胞を増殖させ（典型的に５日間）、その後細胞生存能力、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の細胞ＤＮＡ内への取込および／または細胞密度を測定する。細胞密度のアッセイは、（Ｓｙｔｏ（登録商標）１３またはＣｙＱｕａｎｔ（登録商標）のような）市販されている蛍光核酸鎖を用いることによって、９６−ウェルフォーマットで実施可能である。第二の、確認評価項目として、ＡＲタンパク質発現のレベルにおけるＤｓｉＲＮＡ−仲介減少を、ＡＲ特異的ＥＬＩＳＡを用いて評価可能である。
実施例１５
【０９６２】
ＡＲ誤調節のマウスモデルにおける、抗ＡＲ  ＤｓｉＲＮＡ有効性の評価
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイから選んだ抗−ＡＲ  ＤｓｉＲＮＡをさらに、例えば異種移植片および以上で引用したような他の動物モデルを含む、マウスモデルにてさらに試験可能である。１つの例において、誤調節された（例えば上昇した）ＡＲレベルを有するマウスに、流体力学尾静脈注射を介して、本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬を投与する。３〜４匹のマウス／群（試験した特定のＤｓｉＲＮＡ試薬に基づき分割）に、５０μｇまたは２００μｇのＤｓｉＲＮＡを注射する。ＡＲ  ＲＮＡのレベルを、ＲＴ−ｑＰＣＲを用いて評価する。さらに、またはあるいは、ＡＲのレベル（例えばＡＲタンパク質レベルおよび／または癌細胞／腫瘍形成、増殖または拡散）を、本技術分野で認識される方法を用いて評価可能であり、またはＡＲの誤調節に関連する表現型（例えば腫瘍形成、増殖、転移など）を、（任意にＡＲ転写産物またはＡＲタンパク質レベルの測定のための代理として）モニタする。そのような動物モデルにおける活性ＤｓｉＲＮＡを、標準の化学療法との組み合わせで続けて試験可能でもある。
実施例１６
【０９６３】
診断利用
本発明のＤｓｉＲＮＡ分子を、種々の適用、例えば臨床、工業、環境、農業および／または研究設定にて、分子標的（例えばＲＮＡ）の同定においてのような、種々の診断適用で使用可能である。ＤｓｉＲＮＡ分子のそのような診断利用には、再構築ＲＮＡｉ系を利用すること、例えば、細胞溶解物または部分的に精製した細胞溶解物を用いることが含まれる。本発明のＤｓｉＲＮＡ分子は、疾患細胞内の遺伝的ドリフトおよび変異を試験するための診断ツールとして使用可能である。ＤｓｉＲＮＡ活性と、標的ＡＲ  ＲＮＡの構造間の近い関係により、標的ＡＲ  ＲＮＡの塩基対形成と三次元構造を変化させる、ＡＲ分子の領域における変異の検出が許容される。本発明にて記述された多重ＤｓｉＲＮＡ分子を用いることによって、ＲＮＡ構造およびｉｎ  ｖｉｔｒｏかつ細胞および組織内での機能に対して重要である、ヌクレオチド変化をマッピング可能である。標的ＡＲ  ＲＮＡのＤｓｉＲＮＡ分子での開裂を、遺伝子発現を阻害し、ＡＲ−関連疾患または疾病の進行における、特定の遺伝子産物の役割を定義するために使用可能である。この様式において、他の遺伝的標的を、疾患の重要なメディエータとして定義可能である。これらの実験は、組み合わせ療法（例えば異なる遺伝子を標的とした多重ＤｓｉＲＮＡ分子、公知の低分子阻害剤と結合したＤｓｉＲＮＡ分子、またはＤｓｉＲＮＡ分子および／または他の化学または生物学的物質と組み合わせでの断続的な治療）の可能性を提供することによって、疾患進行のよりよい治療を導きうる。本発明のＤｓｉＲＮＡ分子の他のｉｎ  ｖｉｔｒｏ利用が本技術分野でよく公知であり、疾患または関係状態と関連したＲＮＡｓの存在の検出が含まれる。そのようなＲＮＡは、標準の方法、例えば蛍光共鳴放射移動（ＦＲＥＴ）を用いて、ＤｓｉＲＮＡでの治療後、開裂産物の存在を測定することによって検出する。
【０９６４】
特定の例において、標的ＡＲ  ＲＮＡの野生型または変異体または多型形態のみを開裂するＤｓｉＲＮＡ分子をアッセイのために使用する。第一ＤｓｉＲＮＡ分子（すなわち、標的ＡＲ  ＲＮＡの野生型形態のみを開裂するもの）を使用して、試料中に存在する野生型ＡＲ  ＲＮＡを同定し、第二ＤｓｉＲＮＡ分子（すなわち標的ＲＮＡの変異体または多型形態のみを開裂するもの）を使用して、試料中の変異体または多型ＡＲ  ＲＮＡを同定する。反応対照として、野生型、および変異体または多型ＡＲ  ＲＮＡ両方の合成基質が、両方のＤｓｉＲＮＡ分子によって開裂され、反応中相対ＤｓｉＲＮＡ有効性と、「非標的化」ＡＲ  ＲＮＡ種の開裂がないことを示す。合成基質からの開裂産物がまた、試料集団中の野生型および変異体ＡＲ  ＲＮＡｓの解析のために、サイズマーカーを産出するために働く。したがって、各解析は、２つのＤｓｉＲＮＡ分子、２つの基質および１つの未知の試料を必要とし、６つの反応にあわせる。開裂産物の存在を、各ＡＲ  ＲＮＡの全長および開裂断片を、ポリアクリルアミドゲルの１つのレーン内で解析可能であるように、ＲＮａｓｅ保護アッセイを用いて決定する。変異体または多型ＡＲ  ＲＮＡｓの発現、および標的細胞内のＡＲ−関連表現型変化の推定リスクへの洞察を得るために結果を定量化する必要は完全にはない。そのタンパク質産物が、表現型（すなわち疾患相関／関連）の発達において暗示されるＡＲｍＲＮＡの発現が、リスクを確立するのに十分である。比較可能な特定の活性のプローブを、両方の転写産物のために使用する場合、ＡＲ  ＲＮＡレベルの定性的比較が十分であり、初期診断のコストを減少させる。より高い変異体または多型形態の野生型に対する比が、ＡＲ  ＲＮＡレベルを定性的または定量的に比較するかどうかのより高いリスクと比例する。
【０９６５】
本明細書で言及されたすべての特許および発行物は、本発明が属する技術分野の当業者のレベルの指標である。本明細書で引用したすべての参考文献は、各参考文献が、その全てが個々に参考文献によって組み込まれたのと同様の程度まで、参考文献によって組み込まれている。
【０９６６】
当業者は、本発明が目的を実施するためによく適合することを簡単に理解し、言及した結果および利点ならびにその中の固有のものを得る。好ましい実施形態の代表例として本明細書で記述する方法および組成物は例示であり、本発明の範囲を制限する意図はない。そこでの変化および他の利用が当業者に対して存在し、本発明の精神の範囲内で企図され、請求項の範囲によって定義される。
【０９６７】
種々の置換および改変を、本発明の範囲および精神から逸脱せずに本明細書で開示された本発明に対して実施可能であることが、当業者に簡単に理解されるであろう。したがって、そのような追加実施形態は、本発明および続く請求項の範囲内である。本発明は、ＲＮＡｉ活性を仲介するために、改善された活性をもつ核酸構造物を産出することに対して、本明細書で記述した化学的改変の種々の組み合わせおよび／または置換を試験することを当業者に教示する。そのような改善された活性は、改善された安定性、改善されたバイオアベイラビリティ、および／またはＲＮＡｉ仲介細胞応答の改善された活性を含みうる。したがって、本明細書で記述した特定の実施形態は、限定ではなく、当業者は、本明細書で記述した改変の特定の組み合わせが、改善されたＲＮＡｉ活性を持つＤｓｉＲＮＡ分子を同定することに対して、不必要な実験なしに試験可能であることを簡単に理解可能である。
【０９６８】
本明細書で例示的に記述された発明は、本明細書で特に開示されていない、任意の要素または要素類、制限または制限類なしに好適に実施可能である。したがって、例えば、本明細書各例において、任意の語句「含む」、「から本質的になる」および「からなる」は、他の２つの語句いずれかに置換してよい。使用された語句および表現は、制限の語句ではなく記述の語句として使用され、示し、記述した特徴の任意の等価物またはその部分を除外するそのような語句および発現の利用において意図しておらず、種々の改変が、請求された本発明の目的の範囲内である可能性が認識される。したがって、本発明が、好ましい実施形態によって特に開示されているけれども、本明細書で開示されたコンセプトの任意の特徴、改変およびバリエーションが、当業者によって頼られてよいこと、およびそのような改変およびバリエーションが、記述ならびに付随する請求項によって定義されたように、本発明の範囲内であると考慮されることが理解されるべきである。
【０９６９】
さらに、本発明の特徴または様態が、Ｍａｒｋｕｓｈグループまたは他の代替グルーピングにて記述される場合、当業者は、本発明がＭａｒｋｕｓｈグループまたは他のグループの任意の個々のメンバー、またはメンバーのサブグループに関してそれによって記述もされることを理解されうる。
【０９７０】
本発明を記述する文脈中（特に続く請求項の文脈中）語句「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」ならびに同様の参照は、本明細書の他で指摘するか、または文脈によって明確に矛盾しない限り、単数および複数両方をカバーすると理解されるべきである。語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「持つ（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、他に言及しない限り、無制限語句として構築されるべきである（すなわち、「含むが、限定されない」と意味する）。本明細書の値の範囲の口述は単に、本明細書で他に指摘しない限り、その範囲内にある各別々の値を個々に引用する簡潔にした方法として供給する意図があり、各別々の値は、本明細書で個々に引用されるものとして、本明細書内に組み込まれる。本明細書で記述されたすべての方法を、本明細書他に引用しない限り、または文脈において明確に他に矛盾しない限り、好適な順番で実施可能である。任意の、そしてすべての例、または本明細書で定義される例示的言語（「たとえば「のような」）の利用は、単に本発明をよりよく例示する意図であり、他に請求しない限り、本発明の範囲における制限を提起するものではない。明細書中言及がないものは、本発明の実施に必須であるような、任意の非請求要素を示唆しているとして構成されるべきである。
【０９７１】
本発明の実施形態が本明細書で記述されており、本発明を実施するために本発明者等に公知の最適な様式が含まれる。これらの実施形態のバリエーションが、以下の記述を読むことに際して、当業者に明確になり得る。
【０９７２】
本発明者らは、当業者が、適切にそのようなバリエーションを利用することを期待しており、本発明に関して、本明細書で特に記述したもの以外で実施されるべきと意図している。したがって、本発明は、適用可能な法律によって許可されるように、本明細書に付随する請求項にて引用された対象のすべての改変および等価物を含む。さらに、全ての可能性あるそれらのバリエーションにおける任意上記要素の任意の組み合わせが、本発明で他に指摘されない限り、または文脈によって明確に矛盾しない限り、本明細書によって企図される。当業者は、ただ通常の実験を使用して、本明細書で記述される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または究明することが出来る。そのような等価物は、以下の請求項によって企図される意図がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図７−７】
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【図７−８】
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【図７−９】
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【図７−１０】
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【図７−１１】
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【図７−１２】
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【図７−１３】
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【図７−１４】
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【図７−１５】
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【図７−１６】
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【図７−１７】
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【図７−１８】
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【図７−１９】
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【図７−２０】
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【図７−２１】
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【図７−２２】
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【図７−２３】
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【図７−２４】
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【図７−２５】
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【図７−２６】
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【図７−２７】
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【図７−２８】
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【図７−２９】
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【図７−３０】
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【図７−３１】
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【図７−３２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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