(57)【要約】  本発明は、シス３、４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン及び実質的に鏡像異性体的に純粋なその組成物を提供する。これらの誘導体は、（＋）−（４Ｓ、５Ｒ）−３、４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン、（−）−（４Ｓ、５Ｒ）−３、４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン、及びそれらの塩および結晶を含む。本出願はさらに、開示された化合物及び組成物を、ＰＰＡＲγ活性化、ＧＰＲ１２０活性化、炎症抑制及び、ＰＰＡＲγ変調に応じる症状、ＧＰＲ１２０変調に応じる症状及び糖尿病などの代謝障害を治療するための化合物又は組成物を提供する。
2013542225.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造：
【化１２】
2013542225.tif 000034
を持つ、（＋）−（４Ｓ、５Ｒ）−３、４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン又はその塩、又はその結晶。
【請求項２】
請求項１に記載の、（＋）−（４Ｓ、５Ｒ）−３、４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オンの塩であり、前記塩が、カリウム、アルミニウム、カルシウム、銅、グアニジニウム、鉄、リチウム、マグネシウム、ナトリウム、亜鉛、シンコニジン、シンコニン及びジエタノールアミン塩からなる群から選択される、塩。
【請求項３】
請求項２に記載の塩であり、前記カリウム塩が以下の構造：
【化１３】
2013542225.tif 000035
を持つ、塩。
【請求項４】
請求項３に記載の塩であり、前記結晶が、単斜晶系空間群Ｐ２１２１２を持ち、単位セル長さがａ＝２３．３１１０（９）Ａ（オングストローム）、ｂ＝２８．９０５２（１２）Ａ、β＝９０°、ｃ＝１３．６８４５（５）Ａ及びγ＝９０°である、塩。
【請求項５】
請求項４に記載の塩であり、前記結晶が、表２に定められる３次元原子座標を持つ、塩。
【請求項６】
請求項１に記載の実質的に鏡像異性体的に純粋な（＋）−（４Ｓ、５Ｒ）−３、４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン又はその塩、又はその結晶。
【請求項７】
請求項１に記載の実質的に鏡像異性体的に純粋な（＋）−（４Ｓ、５Ｒ）−３、４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン又はその塩、又はその結晶、及び薬学的に許容されるキャリアとの医薬組成物。
【請求項８】
請求項７に記載の医薬組成物であり、選択に記載の結晶を含む、医薬組成物。
【請求項９】
ＰＰＡＲγ変調に応じる症状を治療するための方法であり、対象体の必要に応じて前記対象体に請求項７に記載の医薬組成物の治療的有効量を投与することを含む、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であり、前記症状が、糖尿病及び肥満からなる群から選択される、方法。
【請求項１１】
ＧＰＲ１２０変調に応じる症状を治療するための方法であり、対象体の必要に応じて前記対象体に請求項７に記載の医薬組成物の治療的有効量を投与することを含む、方法。
【請求項１２】
代謝障害を治療するための方法であり、対象体の必要に応じて前記対象体に請求項７に記載の医薬組成物の治療的有効量を投与することを含む、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であり、前記代謝障害が糖尿病である、方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法であり、前記医薬組成物の投与が、グルコース及び／又は脂質レベルの減少をもたらす、方法。
【請求項１５】
対象体の炎症を抑制するための方法であり、前記対象体に請求項７に記載の医薬組成物の治療的有効量を投与することを含む、方法。
【請求項１６】
対象体の炎症に伴う症状を治療するための方法であり、前記対象体に必要に応じて請求項７に記載の医薬組成物の治療的有効量を投与することを含む、方法。
【請求項１７】
結晶性（＋）−（４Ｓ、５Ｒ）−３、４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オンカリウム（１：１）塩。
【請求項１８】
結晶性（−）−（４Ｓ、５Ｒ）−３、４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オンカリウム（１：１）塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３、４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン誘導体、実質的に純粋な鏡像異性体組成物及び関連応用に関する。本出願は、米国仮特許出願第６１／４０８５７２号（２０１０年１０月３０日）、米国仮特許出願第６１／４４８１５０号（２０１１年３月１日）、米国仮特許出願第６１／５０８４３４号（２０１１年７月１５日）の優先権を主張する出願であり、これらの内容は図面も含めて参照されて本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
アルファ酸のほとんどは（−）−フムロンである。（−）−フムロンの絶対構造は既に報告されており（Ｄｅ  Ｋｅｕｋｅｌｅｉｒｅ  １９７０）、同様に、（−）−フムロンから誘導される、シス及びトランスイソ−アルファ酸の絶対構造帰属も報告されている（Ｄｅ  Ｋｅｕｋｅｌｅｉｒｅ  １９７１）。
【０００３】
所謂「還元イソ−アルファ酸」−シス及びトランス−アルファ酸の両方から誘導される還元生成物−はさらに分類される。この追加の分類は、飽和の位置と程度に依存する。Ｃ６位置カルボニルのみからヒドロキシへの還元から得られる化合物の分類は、ローイソ−アルファ酸としてまとめて参照される（ＲＩＡＡ）。テトラヒドロイソ−アルファ酸（ＴＨＩＡＡ）は、両方のイソプレニル基のみが飽和されるこれらの化合物をまとめて参照する。同様に、ヘキサヒドロ−イソ−アルファ酸（ＨＩＡＡ）は、Ｃ６及び両方のイソプレニル基の飽和を含むイソ−アルファ酸の還元誘導体をまとめて意味する。シス及びトランスジアステレオマーの存在に加えて、前記３つの分類のそれぞれに、種々の短−鎖脂肪酸が対応するフロログルシノールの生合成経路に取り込まれる結果として、種々の同族体が存在する（Ｗａｎｇ  ２００８）。前記フロログルシノールは、アルファ酸の共通の前駆体であり、これはイソ−アルファ酸への前駆体であり、これはさらに前記還元アルファ酸イソ−酸の前駆体となる。
【０００４】
最近、前記還元イソ−アルファ酸は、試験管内およびマウスモデルでの様々な肥満、脂質異常症、及び炎症の治療において有益な効果を有することが示される。ローイソ−アルファ酸の同族体及び立体異性体の混合物−ＲＩＡＡと参照される−は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）−刺激成熟３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞での抗炎症性活性、及び３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞分化での脂肪合成活性を示した（Ｂａｂｉｓｈ  ２０１０）。
【０００５】
テトラヒドロイソ−アルファ酸−ＴＨＩＡＡと参照−の同族体及び立体異性体の混合物は、脾臓チロシンキナーゼ（Ｓｙｋ）、ブルトンチロシンキナーゼ（Ｂｔｋ）、フォスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）及びグリコゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）が、インビトロでのβ−カテニンリン酸化同様の活性を示した。さらに、ＴＨＩＡＡは、破骨細胞形成を抑制し、これはＲＡＷ２６４．７細胞の破骨細胞への転移減少とＴＲＡＰ活性減少により示され、かつ１Ｌ−１β−活性化プロスタグランジンＥ２、マトリクスメタロプロテインキナーゼ３、ＩＬ−６、ＩＬ−８及びＲＡＳＦにおける単球走化性タンパク質１を抑制する。さらには、コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）マウスでは、この同じ同族体及び立体異性体混合物（即ちＴＨＩＡＡ）が、関節炎指数を大きく減少させ、骨、関節及び軟骨劣化を低減させた。これらのマウスの血清ＩＬ−６血清はまた、ＴＨＩＡＡで処理される場合用量依存性を示した。
【０００６】
これらの知見と一致して、また、ＲＩＡＡ及びＴＨＩＡＡはそれぞれ、リポ多糖刺激ＲＡＷ２６４．７マクロファージでのプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）産生を阻害し、同様に誘導性シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）タンパク質発現を阻害することが報告されている（Ｋｏｎｄａ  ２０１０）。これに加えて、この混合物のそれぞれ、即ちＲＩＡＡ及びＴＨＩＡＡは、それぞれ、用量依存的に、ＮＦ−κＢ核転位及び存在量の減少が報告されている（Ｔｒｉｐｐ  ２００９）。
【０００７】
ＲＩＡＡ及びＴＨＩＡＡの異質性が、前記ＲＩＡＡ又はＴＨＩＡＡ混合物のいずれかに存在する種々の同族体及び立体異性体の関係について、それらの個々の理解、従って生物学的活性又は知識を得ることを妨害している。さらにＲＩＡＡ及びＴＨＩＡＡに存在する多くの化合物間の相乗作用の可能性は、全部ではないものの、これらの混合物の生物学的活性の多くに関与している可能性がある。
【０００８】
これらの個々について種々の同族体及び立体異性体間の関係及び従って相対的な生物学的活性についての理解及び知識を得るためには、対象とされる化合物が、実質的に鏡像異性体的に純粋な化合物として得られること、及びそれらの個々の生物学的活性が、実質的に及び鏡像異性体的に純粋な形で測定されることが必要である。この必要性は、異なる分子の混合物からなる全ての不均一物質の生物学的活性が、前記不均一物質を含む異なる分子の組成パーセント、立体化学、構造及び他の性質に依存することからくるものである。この理由のために、医薬組成物での使用及び治療のために実質的に鏡像異性体的に純粋な還元イソ−アルファ酸誘導性を製造し精製するための必要性が存在する。
【０００９】
この必要性に加えて、実質的に及び鏡像異性体的に純粋な化合物を、医薬開発で通常遭遇する種々の工程のために好適な形で製造する必要がまた存在する。潜在的な薬物候補物の純粋な結晶形の製造は医薬開発において有利である。１つの利点は、薬物候補物の化学的及び物理的性質の特徴付けの改良である。アモルファス形に比較して結晶形がより好ましい薬物動態性を持ち、しばしばより容易に扱うことが可能である、ということは特別めずらしいことではない。改良された貯蔵安定性はさらなる利点であり、しばしば結晶形に伴う。潜在的薬物候補物の結晶形に本来的な物理的性質は、具体的な薬学的活性成分を選択する上で重要なファクタの一つである。一例は、前記潜在的な薬物の、製造、貯蔵及び使用のための好適な組成物への処方である。具体的には、結晶固体の粉砕前後での流動性は、前記薬物候補物をプロセスし投与剤形製造をする際の扱い方法に影響を与える。粉砕固体形の粒子が容易に流動しない場合に、処方科学者はこの困難を相殺するために製剤開発に努力するであろう。これはしばしば、コロイド二酸化ケイ素、タルク及び澱粉や三塩基性リン酸カルシウムなどの滑剤の使用を含む。潜在的な薬物化合物のさらなる固体性質は水溶性液体への溶解速度である。特定の結晶形態に伴う物理的性質は、本来的に、その空間配置、かつ前記結晶形態の単位セルを含む個々の分子の特異的配置に依存する。特異的な結晶形態は、アモルファス形又はその他の形態とは一般的に異なる特異的な熱性質を持つ。
【００１０】
多形態の熱性質は、キャピラリー融点、熱重量分析（ＴＧＡ）及び示差熱分析（ＤＳＣ）などの技術を用いて測定される。これらの測定の結果は、多形態の存在を識別して同定し、及びお互いを識別するために使用される。１つの具体的な多形態は一般的に区別される結晶学的及び分光学的性質を持ち、これらは種々の技術、例えば限定されるものでないが、粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）、単結晶Ｘ線結晶解析及び赤外線分光方法を含む種々の技術で検出され得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｄｅ  ｅｕｋｅｌｅｉｒｅ  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２６：３８５（１９７０）
【非特許文献２】Ｄｅ  Ｋｅｕｋｅｌｅｉｒｅ  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２７：４９３９（１９７１）
【非特許文献３】Ｗａｎｇ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １４８：１２５４（２００８）
【非特許文献４】Ｂａｂｉｓｈ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｆｏｏｄ  １３：５３５（２０１０）
【非特許文献５】Ｋｏｎｄａ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ６２：１６８３（２０１０）
【非特許文献６】Ｔｒｉｐｐ  Ａｃｔａ  Ｈｏｒｔ  （ＩＳＨＳ）８４８：２２１（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、３、４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン（「ＫＤＴ５００」）誘導体、実質的に純粋な鏡像異性体組成物及びこれらの誘導体を含む医薬組成物を提供することを課題とする。
【００１３】
実施態様では、
ここで提供される前記ＫＤＴ５００誘導性は、式Ｉで定められる構造を持つ（＋）−（４Ｓ、５Ｒ）−３、４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン（「（＋）−ＫＤＴ５００」）、式ＩＩで定められる構造を持つ（−）−（４Ｒ、５Ｓ）−３、４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン（「（−）−ＫＤＴ５００」）から選択される。
【００１４】
【化１】
2013542225.tif 000003
式Ｉ
【００１５】
【化２】
2013542225.tif 000004
式ＩＩ
実施態様では、ここで提供される前記ＫＤＴ誘導体、前記（＋）−ＫＤＴ５００又は（−）−ＫＤＴ５００の塩である。実施態様では、これらの誘導体は無機又は有機塩であり、限定されるものではないが、前記（＋）−ＫＤＴ５００又は（−）−ＫＤＴ５００の、カリウム、アルミニウム、カルシウム、銅、グアニジウム、鉄、リチウム、マグネシウム、ナトリウム、亜鉛、シンコニジン、シンコニン及びジエタノールアミンの塩を含む。これらの実施態様において、前記誘導体は、式ＩＩＩで定められる構造を持つ（＋）−ＫＤＴ５００のカリウム塩（「（＋）−ＫＤＴ５０１」）であり得る。
【００１６】
【化３】
2013542225.tif 000005
式ＩＩＩ
これらの実施態様において、ここで提供されるＫＤＴ５００誘導体は、前記（＋）−ＫＤＴ５００又は（−）−ＫＤＴ５００又はそれらの塩の結晶である。これらの実施態様で、前記誘導体は、（＋）−ＫＤＴ５０１の結晶であり、これらの実施態様では、前記誘導体は、単斜晶系空間群Ｐ２１２１２を持ち、単位セル寸法が、ａ＝２３．３１１０（９）Ａ（オングストローム）、α＝９０°、ｂ＝２８．９０５２（１２）Ａ、β＝９０°、ｃ＝１３．６８４５（５）Ａ、及びγ＝９０°を持つ。実施態様において、前記結晶は表２から４に定められる１以上の性質を持つ。
【００１７】
ここで、実施態様において、前記ＫＤＴ５００誘導体の実質的に純粋な鏡像異性体組成物が提供される。実施態様では、これらの実質的に鏡像異性体的に純粋な組成物は、（＋）−ＫＤＴ５００又は（−）−ＫＤＴ５００又はそれらの塩の結晶である。
【００１８】
ここで実施態様において、ここで提供される実質的に鏡像異性体的に純粋なＫＤＴ５００誘導体及び１以上の薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物が提供される。実施態様では、これらの実質的に鏡像異性体的に純粋な医薬組成物は、（＋）−ＫＤＴ５００又は（−）−ＫＤＴ５００又はそれらの塩、又はそれらの結晶を含む。
【００１９】
ここで実施態様では、ここで提供される前記ＫＤＡ５００誘導体又は組成物を用いてインビトロ又はインビボで、脂質合成、脂肪合成の誘導、ＰＰＡＲγの活性化又はＧＰＲ１２０の活性化をさせる方法が提供される。実施態様では、前記組成物は、ＫＤＴ５００誘導体及び１以上の薬学的に許容されるキャリアを含む、実質的に鏡像異性体的に純粋な医薬組成物である。実施態様では、前記方法は、対象体で必要に応じて、低減した合成、低減した脂肪合成又は低減したＰＰＡＲγ又はＧＰＲ１２０活性に伴う症状を処置するために使用される。
【００２０】
ここで実施態様では、対象物に必要に応じて、ＰＰＡＲγ変調に応じる症状を治療する方法、ＧＰＲ１２０変調による症状を治療する方法、代謝傷害治療、炎症防止、又は炎症に伴う症状を治療するために、前記対象物に、ここで提供される１以上のＫＤＴ誘導体またその組成物の治療有効量を投与することで治療することが提供される。これらの実施態様で、前記誘導体は、ここで提供される実質的に鏡像異性体的に純粋な医薬組成物により投与される。実施態様では、ＰＰＲＡＲγ変調に応じる症状は、ＩＩ型糖尿病、高インシュリン血症、メタボリックシンドローム、非アルコール性脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪肝炎、自己免疫疾患又は増殖性疾患である。実施態様では、前記代謝傷害は糖尿病である。実施態様では、前記ここで提供される化合物の投与は、グルコース及び／又はトリグリセリドレベルを含む脂質の減少を生じることとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、（＋）−ＫＤＴ５０１の立体化学構造を示す。単位セルからのカリウムイオン及び水分子は省略されている。
【図２】図２は、非対称性単位について（＋）−ＫＤＴ５０１のＯＲＴＥＰ図を示す。
【図３】図３は、（＋）−ＫＤＴ５０１のＸＲＰＤ回折図を示す。
【図４】図４は、（＋）−ＫＤＴ５０１のＴＧ／ＤＴＡ熱図を示す。
【図５】図５は、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞での脂質合成での（＋）−ＫＤＴ５０１の効果を示す。ポジティブコントロールとしてロシグタリゾンを用いた。
【図６】図６は、ＴＨＰ−１細胞での、（＋）−ＫＤＴ５０１の、ＴＮＦ−α−（Ａ）及びＬＰＳ−（Ｂ）介在ＭＭＰ−９発現レベルへの効果を示す。データは、４回実験の平均±ＳＤを表す。
【図７】図７は、ＴＨＰ−１細胞での、（＋）−ＫＤＴ５０１の、ＴＮＦ−α−（Ａ）及びＬＰＳ−（Ｂ）介在ＩＬ−１β発現レベルへの効果を示す。データは、４回実験の平均±ＳＤを表す。
【図８】図８は、  ＴＨＰ−１細胞での、（＋）−ＫＤＴ５０１の、ＴＮＦ−α−（Ａ）及びＬＰＳ−（Ｂ）介在ＭＰＣ−１発現レベルへの効果を示す。データは、４回実験の平均±ＳＤを表す。
【図９】ＴＨＰ−１細胞での、（＋）−ＫＤＴ５０１の、ＴＮＦ−α−（Ａ）及びＬＰＳ−（Ｂ）介在ＲＡＮＴＥＳ発現レベルへの効果を示す。データは、４回実験の平均±ＳＤを表す。
【図１０】ＴＨＰ−１細胞での、（＋）−ＫＤＴ５０１の、ＴＮＦ−α−（Ａ）及びＬＰＳ−（Ｂ）介在ＭＩＰ−１α発現レベルへの効果を示す。データは、４回実験の平均±ＳＤを表す。
【図１１】図１１は、（＋）−ＫＤＴ５０１の、ＲＡＳＦでのＩＬ−１β介在ＰＧＥ２レベルへの影響を示す。
【図１２】図１２は、（＋）−ＫＤＴ５０１の、ＲＡＳＦでのＩＬ−１β介在ＭＭＰ１３レベルへの影響を示す。
【図１３】図１３は、（＋）−ＫＤＴ５０１の、ＰＰＡＲγへの影響を示す。ロジグリタゾン及びテルミサリンがポジティブコントロールが使用された。
【図１４】図１４は、（＋）−ＫＤＴ５０１の、ＰＰＡＲα活性への効果を示す。ＧＷ５９０７３５がポジティブコントロールとして使用され、ロジグリタゾンがネガティブコントロールとして使用された。
【図１５】図１５は、（＋）−ＫＤＴ５０１の、ＰＰＡＲδ活性への効果を示す。ＧＷ５９０７３５がポジティブコントロールとして使用され、ロジグリタゾンがネガティブコントロールとして使用された。
【図１６】図１６は、（＋）−ＫＤＴ５０１及び（−）−ＫＤＴ５０１の、ＰＰＡＲγ、性への効果を示す。ロジグリタゾンがポジティブコントロールとして使用された。
【図１７】図１７は、（＋）−ＫＤＴ５０１のＧＰＲ１２０活性への効果を示す。データは、平均±２回測定の標準偏差を表す。ＤＨＡ、ＥＰＡ及びα−ＬＡがコントロールとして使用された。
【図１８】図１８は、（＋）−ＫＤＴ５０１及び（−）−ＫＤＴ５０１の、無細胞アッセイでのＤＡＰＫ１活性への効果を示す。
【図１９】図１９は、ＺＤＦラットでの血中グルコースへのＫＤＴ５０１の効果を示す。
【図２０】図２０は、ＺＤＦラットでの血中トリグリセリドへのＫＤＴ５０１の効果を示す。
【図２１】図２１は、ＤＩＯマウスでの血中グルコースへのＫＤＴ５０１の効果を示す。
【図２２】図２２は、ＤＩＯマウスでの血中インスリンへのＫＤＴ５０１の効果を示す。
【図２３】図２３、ＤＩＯマウスでのＨｂＡ１ＣレベルへのＫＤＴ５０１の効果を示す。
【図２４】図２４は、ＤＩＯマウスでの脂肪量へのＫＤＴ５０１の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の以下の記載は本発明の種々の実施態様を説明することだけが意図される。従って、記載される具体的な変形例は本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。当業者に明らかなことは、種々の均等物、変更及び改変は、本発明の範囲から外れることなく実施され得ることであり、理解されるべきことは、かかる均等な実施態様はここに含まれる、ということである。
【００２３】
ここで開示されるように、シス３、４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン（「（＋）−ＫＤＴ５００」）誘導体が合成され、精製され特徴付けされる。従って、ここで実施態様で提供されるものは、ＫＤＴ５００誘導体及びその塩であり、前記塩の結晶を含む。ここでまた、これらの誘導性及び塩及びその結晶、及び実質的に鏡像異性体的に純粋な組成物を含む組成物が提供される。
【００２４】
ここで使用される用語「塩」は、全ての薬学的に許容される塩であり、例えば、カリウム、アルミニウム、カルシウム、銅、グアナジウム、鉄、リチウム、マグネシウム、ナトリウム及び亜鉛を含む無機塩基塩及び、シンコニジオン、シンコニン及びジエタノールアミン塩などの有機塩基塩を含む。薬学的に許容される塩のさらなる例及び本発明による製造は、例えばＢｅｒｇｅ  Ｊの「Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ６６：１（１９７７）」に見出され得る。
【００２５】
実施態様では、前記ＫＤＴ５００誘導体は、ここでは式Ｉ又は式ＩＩで定められる構造を持つ。
【００２６】
【化４】
2013542225.tif 000006
式Ｉ
【００２７】
【化５】
2013542225.tif 000007
式ＩＩ
式Ｉ及び式ＩＩの化合物は、（＋）−（４Ｓ、５Ｒ）−３、４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン（以下、「（＋）−ＫＤＴ５００」とする）、及び（−）−（４Ｒ、５Ｓ）−３、４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン（以下、「（−）−ＫＤＴ５００」とする）のそれぞれを表す。従って、好ましい実施態様では、ここで提供されるＫＤＴ５００誘導体は（＋）−ＫＤＴ５００又は（−）−ＫＤＴ５００である。
【００２８】
実施態様では、ここで提供されるＫＤＴ５００誘導体はＫＤＴ５００の塩である。ＫＤＴ５００の塩は、限定されるものではないが、ＫＤＴ５００のカリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩、鉄塩、ナトリウム塩、銅塩、グアナジウム塩、シンコニジン塩及びシンコニン塩である。例えばＫＤＴ５００の塩は、式ＩＩＩで定められる、（＋）−（４Ｓ、５Ｒ）−３、４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オンカリウム塩（以下、「（＋）−ＫＤＴ５０１」とする）である。
【００２９】
【化６】
2013542225.tif 000008
式ＩＩＩ
他の実施態様では、ここで提供されるＫＤＴ５００はＫＤＴ５００又はＫＤＴ５０１を含むその塩の結晶である。これらの実施態様では、（＋）−ＫＤＴ５０１の結晶は、単斜晶系空間群Ｐ２１２１２を持ち、単位セル寸法が、ａ＝２３．３１１０（９）Ａ（オングストローム）、α＝９０°、ｂ＝２８．９０５２（１２）Ａ、β＝９０°、ｃ＝１３．６８４５（５）Ａ、及びγ＝９０°を持つ。この（＋）−ＫＤＴ５０１の結晶形は、ここで「結晶（＋）−ＫＤＴ５０１」と参照される。
【００３０】
実施態様では、結晶（＋）−ＫＤＴ５０１は、表２に定められる３つの寸法の原子座標を持ち、結合距離及び結合角は表３に示され、及び／又は異方性変位パラメータは表４に示され、ここで前記異方性変位ファクタ指数は次の形を取る、
−２π２［ｈ２ａ＊２Ｕ１１＋．．．＋２ｈｋａ＊ｂ＊Ｕ１２］。
【００３１】
ここで実施態様では、ここで提供される１以上のＫＤＴ５００誘導体を含む組成物が提供される。これらの実施態様では、前記組成物は実質的に鏡像異性体的に純粋である。ここで使用される用語「実質的に鏡像異性体的に純粋」とは、前記組成物中の９０％以上の特定の化合物が第１の鏡像異性体形であり、１０％以下が第２の鏡像異性体形であることを意味する。例えば、前記組成物中に実質的に鏡像異性体的に純粋な（＋）−ＫＤＴ５００中に、前記組成物中に９０％以上のＫＤＴ５００は（＋）−ＫＤＴ５００であり、１０％以下が（−）−ＫＤＴ５００である。実施態様では、前記化合物の前記「第１の鏡像異性体形」は前記鏡像異性体形の塩及び結晶形を含む。例えば、実質的に鏡像異性体的純粋な（＋）−ＫＤＴ５００では、前記組成物中の９０％以上のＫＤＴ５００が、（＋）−ＫＤＴ５００又はその塩又はそれらの結晶であり、一方１０％以下が（−）−ＫＤＴ５００又はその塩又はそれらの結晶である。実施態様では、実質的に鏡像異性体的純粋な組成物は、組成物の第１の鏡像異性体形を９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９５％又は９９．９９％以上含み得る。
【００３２】
実施態様では、（＋）−ＫＤＴ５００の組成物が提供される。この実施態様では、前記組成物は実質的に鏡像異性体的に純粋である。この実施態様では、前記組成物中の（＋）−ＫＤＴ５００のあるパーセントで、（＋）−ＫＤＴ５００の塩又はそれらの結晶形である。この実施態様では、前記組成物中の（＋）−ＫＤＴ５００の全てが塩又はそれらの結晶形である。従って、ここでは、実質的に鏡像異性体的に純粋な（＋）−ＫＤＴ５００の塩又は結晶の組成物が提供される。他の実施態様では、前記組成物中の（＋）−ＫＤＴ５００は全く塩又は結晶形ではない。
【００３３】
実施態様では、（＋）−ＫＤＴ５００の組成物が提供される。この実施態様では、前記組成物は実質的に鏡像異性体的に純粋である。この実施態様では、前記組成物中の（−）−ＫＤＴ５００のパーセントは、（−）−ＫＤＴ５００の塩又はそれらの結晶形である。この実施態様では、前記組成物中の（−）−ＫＤＴ５００の全てが塩又はそれらの結晶形である。従って、ここでは、実質的に鏡像異性体的に純粋な（−）−ＫＤＴ５００の塩又は結晶の組成物が提供される。他の実施態様では、前記組成物中の（−）−ＫＤＴ５００は全く塩又は結晶形ではない。ここで、実施態様では、ここで提供される前記ＫＤＴ５００誘導体の１以上及び１以上の薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物が提供される。実施態様では、前記医薬組成物は実質的に鏡像異性体的に純粋である。この実施態様では、前記実質的に鏡像異性体的に純粋な医薬組成物は、（＋）−ＫＤＴ５００、（−）−ＫＤＴ５００、それらの塩又は結晶を含む。ここで使用される「薬学的に許容されるキャリア」とは薬学的に許容される物質、組成物又は担体を意味し、これは対象となる化合物をある組織、器官又は身体の部分から他の組織、器官又は身体の部分へ担持又は輸送する際に関与する。かかるキャリアは、例えば、液体又は固体フィラー、希釈剤、賦形剤、溶媒、カプセル化剤、安定化剤又はこれらの組み合わせを含む。前記キャリアのそれぞれの成分は、それが前記組成物の他の含有物と適合し、遭遇し得る全ての組織、器官又は身体部分にとって好適であるという点で「薬学的に許容される」ことがが必要であり、これは、毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性又はその治療効果を過度に超える全ての症状のリクスを負うものであってはならない。
【００３４】
ここで提供される組成物で使用される薬学的に許容されるキャリアの例は限定されるものではないが、（１）ラクトース、グルコース、スクロース又はマンニトールなどの糖；（２）コーンシロップ及びジャガイモ澱粉などの澱粉；（３）ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース及びセルロースアセテートなどのセルロース及びその誘導体；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）ココアバター及び座薬ワックスなどの賦形剤；（９）ピーナッツ油、綿実油、べに花油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及びダイズ油などの油；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール；（１２）オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル；（１３）寒天又は炭酸カルシウムなどの崩壊剤；（１４）水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）無発熱性物質水；（１７）等張生理食塩水；（１８）リンガー溶液；（１９）エチルアルコール及びプロパンアルコールなどのアルコール；（２０）リン酸緩衝液；（２１）パラフィン；（２２）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール又はラウリル硫酸ナトリウムなどの潤滑剤；（２３）着色剤；（２４）コロイド二酸化ケイ素、タルク及び澱粉又は三塩基性リン酸カルシウムなどの滑剤；及び（２５）アセトンなどの医薬組成物に適用されるその他の非毒性適合性物質が、含まれる。実施態様では、ここで使用される前記薬学的に許容されるキャリアは、水溶性キャリアであり、例えば生理食塩水などである。他の実施態様では、前記薬学的に許容されるキャリアは極性溶液、例えばアセトン及びアルコールである。
【００３５】
ここで提供される医薬組成物はさらに、生理学的条件に適合されるために必要となる１以上の薬学的に許容される他の物質を含み得る。例えば組成物は、１以上のｐＨ調節剤、緩衝剤又は毒性調節剤であり、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどである。
【００３６】
ここで提供される医薬組成物は好適な剤形に製剤され得るものであり、例えば、カプセル、カッシェ、ピル、錠剤、トローチ（着香基材、例えばスクロース及びアカシア又はトラガカントを用いて）、粉末、顆粒、水溶性又は非水溶性液体中の溶液又は懸濁物として、水中油又は油中水液体乳化物として、エリキシル剤又はシロップ剤、又はトローチ（ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシアなどの不活性基材を用いて）及び／又はうがい剤などであり、これらは活性成分として所定量のＫＤＴ５００誘導体を含む。実施態様では、前記組成物は、徐放性剤、例えば徐放性カプセルとして製剤され得る。ここで使用される「徐放性剤」は、投与直後というよりはある時間にわたり活性成分を放出する輸送製剤を意味する。他の実施態様では、前記組成物は、迅速放出剤として製剤化され得る。
【００３７】
錠剤は、圧縮又は形成で製造され、場合により１以上の追加成分を含む。圧縮錠剤は、バインダー（例えばゼラチンやヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば澱粉グリコレートナトリウム又はクロスリンクカルボキシメチルセルロースナトリウム）、表面活性剤又は分散剤などである。成形錠剤は、実質的に鏡像異性体的に純粋な粉末ＫＤＴ５００誘導体又はさらに不活性希釈剤で湿らせた混合物を好適な装置で成形することで得られる。錠剤、及び他の固体投与形、例えば糖衣錠、カプセル、ピル及び顆粒は、場合により製薬分野でよく知られている腸溶性コーティング及び他のコーティングなどのコーティングシェルを持つように製造される。これらはまた、使用されるＫＤＴ５００誘導体のゆっくりとした制御された放出を与えるために、例えば望ましい放出プロフィルを与えるための種々の比率のヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマー性マトリクス、リポソーム及び／又は未クロスフェアを使用するように製剤され得る。これらは、例えば細菌保持フィルターを通じて濾過すること、又は使用の直前に殺菌水又は他の殺菌注射可能な媒体に溶解し得る殺菌固体組成物の形で殺菌剤を導入することで殺菌され得る。これらの組成物はまた、場合により溶解抑制剤を含み、ＫＤＴ５００誘導体を、胃腸系のある部分でのみ又は優位に、場合により遅延させるように放出させる組成物であり得る。使用され得る埋め込み組成物の例は、ポリマー性物質及びワックスである。前記ＫＤＴ塩５００誘導体は、適切な場合に、前記の賦形剤の１以上を含むミクロカプセル形状であってよい。
【００３８】
ここで提供される前記組成物中のＫＤＴ５００誘導体の含有量は変化し得る。濃度は、選択された具体的な投与方法及び必要な生理学的システムに応じて、液体容積、粘性、体重などに基づき選択される。実施態様では、ここで提供される組成物中のＫＤＴ５００誘導体の濃度は、重量／容積％で、約０．０００１％から１００％、約０．００１％から約５０％、約０．０１％から約３０％、約０．１％から約２０％、約１％から約１０％であり得る。
【００３９】
さらに、ここで提供されるＫＤＴ５００誘導体を分析、合成、精製及び／又は結晶化する方法が、同様にここで提供される実質的に鏡像異性体的に純粋なＫＤＴ５００組成物の分析、合成、精製及び／又は結晶化する方法が提供される。
【００４０】
実施態様では、ここで提供される合成方法はＫＤＴ５００誘導体の単一の鏡像異性体を与える。例えば、前記合成方法は、（＋）−ＫＤＴ５００のみ、又は（−）−ＫＤＴ５００のみ与える。実施態様では、前記合成方法は、ＫＤＴ５００誘導体の鏡像異性体混合物を与える。これらの実施態様では、１以上の続く分離及び／又は精製ステップが実施されて、単一の鏡像異性体を単離し、又はここで提供される実質的に鏡像異性体的に純粋な組成物を与える。
【００４１】
ここで提供される前記合成及び精製において、（＋）−ＫＤＴ５００及び／又は（−）−ＫＤＴ５００は、出発物質としてルプロンを用いて合成される（例えば、以下実施例１１参照）。この合成／精製方法では、ルプロンは最初に、還元的脱アルキル化によりテトラヒドロ−デオキシフムロンへ変換され、テトラヒドロ−デオキシフムロンは、不斉酸化により鏡像異性体的に純粋なテトラヒドロ−フムロン（（＋）及び／又は（−））に変換される。得られる鏡像異性体は精製され、鏡像異性体及びジアステレオマー選択性異性化により、対応するシスイソ−フムロンへ変換される。
【００４２】
他の実施態様では、（＋）−ＫＤＴ５００及び／又は（−）−ＫＤＴ５００は、出発物質としてデオキシフムロンを用いて合成され得る（例えば以下の実施例１２参照）。実施態様では、デオキシフムロンは最初に、不斉酸化により、（＋）−フムロン及び／又は（−）−フムロンへ変換される。前記（＋）−フムロンは、鏡像異性体及びジアステレオマー選択性異性化により、対応する鏡像異性体的に純粋な（−）−シスイソフムロンへ変換され、ついで水素化によりさらに（−）−ＫＤＴ５００へ変換される。前記（−）−フムロンは、鏡像異性体及びジアステレオマー選択性異性化により、対応する鏡像異性体的に純粋な（＋）−シスイソフムロンへ変換され、ついで水素化によりさらに（＋）−ＫＤＴ５００へ変換される。
【００４３】
他の実施態様では、鏡像異性体的に純粋な（＋）−フムロン及び（−）−フムロンは、ラセミ体（±）−フムロンから精製され得る（例えば以下の実施例１３参照）。他の実施態様では、鏡像異性体的に純粋な（＋）−テトラヒドロフムロン及び（−）−テトラヒドロフムロンは、ラセミ体（±）−テトラヒドロフムロンから精製され得る（例えば以下の実施例１３参照）。
【００４４】
ここで開示されるように、（＋）−ＫＤＴ５０１は、３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞での脂質合成及び脂肪合成における効果が評価された。（＋）−ＫＤＴ５０１は、用量依存的に脂質合成及び脂肪合成両方を誘導することが見出された。３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞は、前脂肪細胞再生、脂肪細胞分化及びインスリン感受性効果についての研究を可能にする（Ｆａｓｓｈａｕｅｒ  ２００２；Ｌｉ  ２００２；Ｒａｚ  ２００５）。脂肪細胞中の脂質取得を促進する物はインスリン感受性を改善することが報告されている。１つの仮説は、脂肪酸が血漿から脂肪細胞へ導入されることは、筋肉内の脂肪酸の相対的な減少を生じ、グルコース取り込みの改善を伴う、ということである（Ｍａｒｔｉｎ  １９９８）。筋肉及び肝臓での遊離脂肪酸のインスリン脱感作効果は、チアゾリジンジオン処置の結果として低減される。インビトロでのこれらは、臨床的に確認された（Ｂｏｄｅｎ  １９９７；Ｓｔｕｍｖｏｌｌ  ２００２）。
【００４５】
（＋）−ＫＤＴ５０１及び（−）−ＫＤＴ５０１は共に、ＰＰＡＲγ、ＳＣＮ２Ａ及びＡＧＴＲ２への結合について、これらのターゲットについてアゴニストリガンドの存在下で競争的に評価された。両方の分子が、これらのアゴニストリガンドの存在下で全ての３つのターゲットへの結合性が示され、（＋）ＫＤＴ５０１は全ての３つのターゲットについてより高い親和性を示した。前記ターゲットのうち、（＋）ＫＤＴ５０１はＰＰＡＲγに最も高い親和性を持って結合した。（＋）−ＫＤＴ５０１及び（−）−ＫＤＴ５０１はついで、そのＰＰＡＲ活性への効果について評価された。両方の化合物もＰＰＡＲγ活性を増加させたが、ＰＰＡＲα又はＰＰＡＲδ活性はほとんどないか全く効果はなかった。しかしＰＰＡＲγへの（＋）−ＫＤＴ５０１の効果は、全ての濃度で（−）−ＫＤＴ５０１の少なくとも３倍であり、これは（＋）−ＫＤＴ５０１がＰＰＡＲγ活性化剤として実質的により効果的であることを示唆する。ＰＰＡＲγは、脂肪合成、グルコースホメオスタシス及びインスリン感作でのマスター調節因子であり、チアゾリジンジオンの分子ターゲットであり、これは細胞をインスリン感作性にし、肝臓、脂肪組織及び骨格筋での抗糖尿病効果を持つ。
【００４６】
ここで提供されるＫＤＴ５００の脂質合成、脂肪合成及びＰＰＡＲγ活性誘導可能性に基づき、脂質合成誘導、脂肪合成誘導及び／又はＰＰＡＲγ活性化のための方法が提供され、同様にＰＰＡＲγ変調に応じる症状を治療するための方法であって、対象体に、必要に応じて、ここで提供される１以上のＫＤＴ５００誘導体又はその実質的に鏡像異性体的に純粋な医薬組成物の治療有効量を投与することで治療する方法が提供される。ＰＰＡＲγ変調に応じる症状の例は、例えば、グルコース及びエネルギーホメオスタシスを改善することで治療可能な症状を含み、限定されるものではないが、タイプＩＩ糖尿病、肥満、高インスリン血症、メタボリックシンドローム、非アルコール性脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、自己免疫傷害及び増殖性傷害を含む。
【００４７】
前記の通り、既に同定されたＰＰＡＲγアゴニストは前記炎症性応答を抑制することが示されている。ＰＰＡＲγは、脂質代謝のターゲット遺伝子の転写を活性化するだけでなく、炎症性遺伝子発現を抑制する（Ｐａｓｃｕａｌ  ２００５）。ＰＰＡＲγアゴニストによる炎症性応答抑制は、抗糖尿病及び抗アテローム性動脈硬化症と密接に関連する。炎症におけるＫＤＴ５０１の役割を評価するために、（＋）−ＫＤＴ５０１が、種々のＴＮＦ−α−、ＬＰＳ−及びＩＬ−１β−介在炎症因子の発現抑制性を評価した。（＋）−ＫＤＴ５０１は、ＴＨＰ−１細胞中のＭＭＰ−９、ＩＬ−１β、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ及びＭＩＰ−１αのＴＮＦ−α−及びＬＰＳ−介在発現を抑制し、関節リウマチ滑膜線維芽細胞（ＲＡＳＦ）細胞中でのＩＬ−１β−介在ＰＧＥ２及びＭＭＰ−１３の発現を抑制することが見出された。加えて、（＋）−ＫＤＴ５０１及び（−）−ＫＤＴ５０１とも、ＤＡＰＫ１活性を抑制することが見出され、かつ（＋）−ＫＤＴ５０１が最も大きい親和性を持つことが見出された。
【００４８】
ＫＤＴ５０１がインスリン感作及びグルコース制御を改善し、同様に前炎症性シグナルを低減させることは、インスリンシグナル系及び炎症経路間の相互作用に影響を与えることが示唆される。この活性化の１つの可能な機構は、Ｇタンパク質結合レセプターの刺激を介してのものである。この可能性を評価するために、（＋）−ＫＤＴ５０１の、ω３脂肪酸感作Ｇ−タンパク質レセプターＧＰＲ１２０の活性化への影響が試験された。ＧＰＲ１２０の活性化はインスリン感作を改善し、ＮＦ−κＢ経路を抑制することで炎症を低減させる（Ｏｈ  ２０１０；Ｔａｌｕｋｄａｒ  ２０１１）。ＧＰＲ１２０はまた、腸Ｌ細胞のＧＬＰ−１分泌を介在すること、及び脂肪細胞で脂質合成を増加させることが示され、これらは共に抗糖尿病効果に寄与している。（＋）−ＫＤＴ５０１は、３０．３μＭのＥＣ５０値でＧＰＲ１２０に作動することが見出され、（＋）−ＫＤＴ５０１がＧＰＲ１２０活性化を介して部分的にその脂質合成効果に影響を与えることが示唆される。
【００４９】
ここで提供される前記ＫＤＴ５００のＧＰＲ１２０活性の誘導性に基づき、ＧＰＲ１２０変調に応じる症状を治療する方法であって、対象体に必要に応じて、ここで提供されるＫＤＴ５００誘導体又はその実質的に鏡像異性体的に純粋な医薬組成物の治療有効量を投与することで治療する方法ががここで提供される。さらに、ここで提供されるＫＤＴ５００のＧＰＲ１２０及びＰＰＡＲγ活性誘導性及び種々のＴＮＦ−α−、ＬＰＳ−及びＩＬ−１β−介在炎症因子の発現抑制性に基づき、炎症を抑制するための方法であって、対象体に必要に応じて、ここで提供されるＫＤＴ５００誘導体又はその実質的に鏡像異性体的に純粋な医薬組成物の治療有効量を投与することで治療する方法ががここで提供される。また、炎症に伴い種々の症状及び／又は炎症性因子ＭＭＰ−９、ＩＬ−１β、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＰＧＥ２及び／ＭＭＰ−１３の１以上のレベルの上昇に伴う症状を治療する方法であって、対象体に必要に応じて、ここで提供されるＫＤＴ５００誘導体又はその実質的に鏡像異性体的に純粋な医薬組成物の治療有効量を投与することで治療する方法がここで提供される。かかる症状は、例えば、アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化プラーク不安定性、例えば、関節リウマチ、軟骨分解、変形性関節症などの自己免疫疾患、アレルギー症状、例えば、ＨＩＶ／ＡＩＤＳなどの免疫不全、腎症、腫瘍、糖尿病などが含まれる。
【００５０】
ここで開示したように、（＋）−ＫＤＴ５０１が、糖尿病モデルラットでのグルコース及び脂質レベルの変更可能性を評価された。２００ｍｇ／ｋｇの一日一回投与で、（＋）−ＫＤＴ５０１は大きくグルコースレベルを低下させることが見出された。この減少は、メトフォルミン処理のラットよりもずっと大きく、ピオグリタゾンを処置したラットと同様であった。同様に、（＋）−ＫＤＴ５０１は、ピオグリタゾンで観察されるほとんど同じ程度のトリグリセリドレベルを低下させることが見出された。
【００５１】
モデルマウスで、（＋）−ＫＤＴ５０１の一日２回投与は、全循環血中グルコース及びインスリンのレベルを低減することに効果があり、経口投与許容試験（ＯＧＴＴ）でグルコース及びインスリンの濃度−時間曲線面積（ＡＵＣ）を減少させ、かつ食餌誘導肥満マウスの脂肪量を減少させることに効果が見られた。糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）のパーセントでの減少傾向がまた前記ＤＩＯマウスで３０日期間をこえて観察された。
【００５２】
ここで提供されるＫＤＴ５００誘導体の、モデルマウス及びモデルラットでの循環グルコース、トリグリセリド及びインスリンレベル低下性に基づき、代謝傷害の治療の方法であって、ここで提供されるＫＤＴ５００誘導体又はその実質的に鏡像異性体的に純粋な医薬組成物の治療有効量を投与することで治療する方法がここで提供される。ここで使用される「代謝障害」とは、ホメオスタシスの代謝制御の傷害を生じる全ての条件を意味する。代謝障害の例は、例えば、糖尿病、高脂質血症、体重増加、インスリン耐性、脂質異常症、高コレステロール血症を含む。実施態様では、タイプＩ及びＩＩ糖尿病を含む糖尿病治療のための方法が提供され、対象体に必要に応じて、ここで提供されるＫＤＴ５００誘導体又はその実質的に鏡像異性体的に純粋な医薬組成物の治療有効量を投与することで治療する方法がここで提供される。同様に、実施態様では、グルコース及び／又は脂質レベルを低減するための方法が提供され、対象体に必要に応じて、ここで提供されるＫＤＴ５００誘導体又はその実質的に鏡像異性体的に純粋な医薬組成物の治療有効量を投与することで治療する方法がここで提供される。実施態様では、ＫＤＴ５００誘導体又はその組成物の投与は、血中グルコースレベルの低減及び／又はトリグリセリドレベルの低減をもたらす。実施態様では、ＫＤＴ５００誘導体又はその組成物の投与は、例えば全コレステロールやＬＤＬレベルを含む１以上のさらなる脂質レベルの低減をもたらす。
【００５３】
ここで提供される方法の実施態様では、対象体は、哺乳類であり、この実施態様では前記対象体は人である。「必要な場合の対象体」とは、ＰＰＡＲγ変調又は代謝障害に応じた症状を診断された対象体、ＰＰＡＲγ変調又は代謝障害に応じた１以上の症状を示す又は示した対象体、１以上の遺伝又は環境的因子に基づきＰＰＡＲγ変調又は代謝障害に応じる条件が進展する可能性のある対象体、を意味する。
【００５４】
ここで使用される用語「治療」、「処置」とは、前記条件を防止し、前記条件の進展の設定又は速度を遅くし、前記条件の進展リスクを低減し、前記条件に伴う症状の進展を防止又は遅らせ、前記条件に伴う症状を低減又は停止させ、前記条件の完全な又は部分的な回復を生じさせること、又はこれらの組み合わせを意味する。
【００５５】
ここで使用されるＫＤＴ５００誘導体又は医薬組成物の「治療的に有効量」とは、対象体に望ましい治療効果を起こす組成物の量を意味する。正確な治療有効量は、所与の対象体での治療有効性として最も効果的結果を生じる組成物の量である。この量は多くの因子に依存し、限定されるものではないが、治療組成物の特徴（例えば活性、薬物力学、薬物動力学及び生体適合性などを含む）、対象体の生理学的条件（例えば年齢、性、疾患タイプ及び段階、一般的身体条件、所与の投与量への応答及び医薬のタイプなどが含まれる）、前記組成物中の薬学的に許容されるキャリアの性質、及び投与経路などが、含まれる。臨床及び薬学分野の当業者は、通常試験を行なって治療的有効量を決定することができ、例えば対象体の化合物投与への応答を監視し、それにより投与量を調節するころで決定することができる。さらなる案内としてはＲｅｍｉｎｇｔｏｎの「Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（ＵＳＩＰ）、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、２００５」を参照でき、この内容は参照されて本明細書に援用する。
【００５６】
実施態様では、ここで提供されるＫＤＴ５００誘導体の治療的有効量は、一日当たり対象体へ、約１０−１０ｇから約１００ｇ、約１０−１０ｇから約１０−３ｇ、約１０−９ｇから約１０−６ｇ、約１０−６ｇから約１００ｇ、約０．００１ｇから約１００ｇ、０．０１ｇから約１０ｇ又は０．１ｇから約１ｇの活性成分（即ちＫＤＴ５００誘導体）から選択される。実施態様では、ＫＤＴ誘導性５００誘導体又は組成物の治療的有効量は、対象体の体重に基づき計算され得る。例えば実施態様では、治療的有効量は、対象体について一日当たり、活性成分（即ちＫＤＴ誘導性５００誘導体）の、約１００ｍｇ／ｋｇ以上、約１５０ｍｇ／ｋｇ以上、約２００ｍｇ／ｋｇ以上、約２５０ｍｇ／ｋｇ以上又は約３００ｍｇ／ｋｇ以上であり得る。
【００５７】
実施態様では、ここで提供される組成物は一日一回以上投与され得る。他の実施態様では、前記組成物は一日一回よりも少なく投与され得る。例えば、前記組成物は一週間に一回投与、一月に一回又は数ヶ月に一回投与され得る。ここで提供される組成物の投与は、前もって決定された具体的な治療期間にわたり実施され得るし、又は無期限で実施され得るし、又は具体的な治療目標に到達するまで実施され得る。例えば、投与は、グルコース及び／又は脂質レベルが既定の閾値へ到達するまで実施され得る。実施態様では、投与周期は治療期間にわたり変更可能である。例えば、対象体は、ある治療目標に合致するように治療期間にわたりより少ない周期で投与を受け得る。
【００５８】
ここで開示される化合物及び組成物は、対象体に、全ての知られる技術、これには限定されるものではないが、経口、エアロゾル、腸、鼻、眼、非経口又は経皮（例えば局所クリーム又は軟膏、パッチ）で輸送され得る。「非経口」とは、一般的に、眼窩下、注入、動脈内、嚢内、心臓内、皮内、筋肉内、腹腔内、肺内、脊髄内、胸骨内、髄腔内、子宮内、静脈内、くも膜下、被膜下、皮下又は経粘膜、または経気管を含む、注射に関連付けられている投与経路を指す。非経口投与可能な組成物の製造方法は、当該技術分野の当業者には明らかであり、より詳細には次の刊行物に記載されてる：「Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２１ｓｔ  ｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．（２００５）」。組成物はまた、ボーラス、剤又はペーストとして投与され得る。
【００５９】
実施態様では、ここで提供される１以上のＫＤＴ５００誘導体又はその実質的に鏡像異性体的に純粋な組成物を含むキットが提供される。実施態様では、前記キットは、用量及び投与指示書などの使用説明書を含む。実施態様では、前記キットは、ＰＰＡＲγ又はＧＰＲ１２０変調に応じる症状を治療するため、糖尿病、グルコース及び／又は脂質レベル減少などの代謝障害を治療するため、炎症抑制のため、又は必要な対象体の炎症に伴う症状を治療するために使用され得る。
【００６０】
実施態様では、ここで提供されるＫＤＴ５００誘導体及び実質的に鏡像異性体的に純粋なＫＤＴ５００誘導体組成物は、着香剤として使用され得る。この実施態様では、前記化合物は苦味香料剤として使用され得る。［００８１］
次の例は、請求された発明をよりよく説明するために提供されるものであり、本発明の範囲を制限するためではない。具体的な材料が記載されるが、これは本発明を説明するためであり、限定することを意図するものではない。当業者は、本発明の範囲から外れることなく容易に均等な手段又は反応物を開発することができる。理解されるべきことは、本発明の範囲にあって、かつ多くの変更が、ここで記載される手順において可能である、ということである。そのような変更もまた本発明の範囲内に含まれることが、本発明者により意図される。
【実施例】
【００６１】
実施例１：  実質的に鏡像異性体的に純粋な（＋）−及び（−）−ＫＤＴ誘導性５００誘導体の結晶化及び特徴付け
（＋）−ＫＤＴ５０１の結晶化（（Ｓｃｈｅｍｅ）スキーム１）：
ホップ処理で得られた１００ｇのシス主体テトラヒドロ−イソアルファ酸を、高速液体向流クロマトグラフ（ＨＳＣＣＣ）を用いて報告された手順で精製した（Ｄａｈｌｂｅｒｇ  ２０１０）。ＨＰＬＣ及びＵＶピーク面積分から、得られた生成物は９０％を超えるＫＤＴ５００が含まれていることを示した。前記精製材料を、１当量のカリウム塩（例えばＫＯＨ）と反応させて（＋）−ＫＤＴ５０１へ変換し、数回脱色されるまで再結晶させた。充分な均一性に到達した後、前記（＋）−ＫＤＴ５０１はさらに、Ｘ線回折実験に十分な寸法を持つ（＋）−ＫＤＴ５０１の結晶を得るために再結晶させた。
【００６２】
【化７】
2013542225.tif 000009
スキームＩ
水（４５０μｌ）及び（＋）−ＫＤＴ５０１（４９．５ｍｇ）を４ｍＬのバイアルに入れ、バイアルをキャップで封止し、溶解するまで熱加熱ブロック（７０℃）で加熱した。この溶液を２時間で３５℃へ冷却させた。この時間に、結晶のインシチュ形成が観察された。混合物を室温（２２℃）に８時間静置し、この時点でさらに結晶の形成が観察された。Ｘ線分析に好適な個々の結晶を識別し、注意深く溶液から取り出し、台に置いてＸ線回折分析装置に設置した。
【００６３】
（＋）−ＫＤＴ５０１の結晶構造の分解能
無色ブロック（寸法０．３７ｘ０．３０ｘ０．２８ｍｍ３）をオイルを用いてガラスキャピラリー上に付けた。データは、−１６３℃で、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＰＥＸ  １１単結晶Ｘ−線回折計で、Ｍｏ−放射で収集された。全ての設定で、結晶−検出器距離は４０ｍｍであり、暴露時間は１度当たり１０秒であった。スキャン幅は０．５°であった。データ収集は、θで２５°で９８．４％完了であった。全部で６８２１１（合わせて）反射を収集し、前記指数をカバーし、ｈ＝−２６から２８、ｋ＝−３４から３４、ｌ＝−１６から１４であった。１６６８１反射は対称性非依存であり、Ｒｉｎｔ＝０．０３８６は、前記データが良好であることを示した（平均品質０．０７）。指数付け及び単位せる精密化は、単純斜方格子を示した。空間群は、Ｐ２１２１２（Ｎｏ．１８）であることが分かった。
【００６４】
データは、ＡＰＥＸ２ソフトウェアパッケージ（Ｂｒｕｋｅｒ  ２００７  ＡＰＥＸ２（ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．３４Ａ）、ＳＡＩＮＴ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．３４Ａ）、ＳＡＤＡＢＳ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２００７／４）、ＢｒｕｋｅｒＡＸＳ  Ｉｎｃ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）内のＳＡＩＮＴ、ＳＡＤＡＢＳを用いて統合してスケール化された。
【００６５】
直接方法（ＳＨＥＬＸＳ；  Ｓ１Ｒ９７（Ａｌｔｏｍａｒｅ  Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｃｒｙｓｔ  ３２：１１５（１９９９）、Ａｌｔｏｍａｒｅ  Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｃｒｙｓｔ  ２６：３４３（１９９３））による解析は、予想された構造と適合する完全な重原子位相モデルを生成した。前記構造は、ＳＨＥＬＸＬ９７（Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ、”ＳＨＥＬＸＬ−９７：Ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ、”Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ  （１９９７）；Ｍａｃｋａｙ”ＭａＸｕｓ：  ａ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｒｏｍ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｄａｔａ、”Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｌａｓｇｏｗ”、  Ｓｃｏｔｌａｎｄ（１９９７））を用いて差フーリエ合成により完了した。散乱因子は、Ｗａａｓｍａｉｒ及びＫｉｒｆｅｌｂの（Ｗａａｓｍａｉｅｒ  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ａ５１：４１６（１９９５）」から得た。水素原子は、幾何学的に理想化位置に置き、Ｃ−Ｈ距離を０．９５から１．００オングストロームの範囲で親原子上に構成させた。異方性熱パラメータＵｅｑは、ＣＨについて親原子Ｕｅｑの１．２Ｕｅｑ及びメチル基の場合親原子Ｕｅｑの１．５Ｕｅｑとして固定した。全ての非水素原子は、異方性的に全マトリクス最小二乗方法で精密化した。（＋）−ＫＤＴ５０１の結晶構造は図１に示されている。結晶データは表１に示され、３つの原子配置は表２に与えられ、結合長及び角度は表３に示され、異方性変位パラメータ（ここで、前記異方性変位因子は、式−２：π２［ｈ２ａ＊２Ｕ１１＋．．．２ｈｋａ＊ｂ＊Ｕ１２］である）は表４に示される。
【００６６】
（＋）−ＫＤＴ５０１結晶形について前記非対称性単位セルは、４つのカリウムカチオンが配位する４つの（＋）−ＫＤＴ５０１分子からなる。２つのカリウムカチオンは酸素で架橋され、非配列水分子が前記他の２つの配位している。有機基のケトンは、カリウムカチオンに配位し、最密充填を生じる。（＋）−ＫＤＴ５０１の非対称性単位は図２に示される。絶対配置は、類似の散乱から得られた（絶対構造パラメータ＝０．０４（４））。
【００６７】
（＋）−ＫＤＴ５０１のＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）及び熱分析：
ＸＲＰＤ分析を、Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｘｐｅｒｔ  Ｐｒｏ回折計を用いて、Ｃｕ−Ｘ線管及びＰｉｘｃｅｌ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍにより実施した。等温サンプルは透過モードで分析され、低密度ポリエチレンフィルムの間に保持した。ＸＲＰＤ回折は、（＋）−ＫＤＴ５０１が結晶であることを示した（図３参照）。
【００６８】
熱重量／示差熱分析（ＴＧ／ＤＴＡ）：
熱分析はＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｄｉａｍｏｎｄで実施した。較正標準はインジウム及びスズであった。サンプルはアルミニウムサンプル皿にいれ、ＴＧ炉に挿入し正確に秤量した。サンプルは３０℃から３００℃に、窒素気流中で、１０℃／分の昇温速度で加熱した。炉の温度はサンプル分析前に３０℃で平衡化させた。
【００６９】
ＴＧ／ＤＴＡ熱グラム（図４）は、１．３７％の重量減少を示し、これはいくらかの溶媒の損失を示し、水和物又は溶媒和物を示した。１４５℃の融解発熱とは別に他の熱現象は見られなかった。
【００７０】
実施例２：  ３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞での脂質合成への（＋）−ＫＤＴ５０１の効果：
脂質合成への（＋）−ＫＤＴ５０１の効果を３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で評価した。
【００７１】
マウス３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、  ＭＤ）は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；  ＡＴＣＣ）を追加したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、  ＭＤ）中で維持した。前脂肪細胞として、３Ｔ３−Ｌ１細胞は線維芽細胞の外観であった。これは培地中で、コンフルーエントな単層を形成するまで増殖し、その後細胞−細胞接触によりＧ０／Ｇ１増殖停止を起こした。続いて３−イソブチル−メチルキサンタン、デキサメタゾン及び２日間のインスリンの高投与により、コンフルーエント後の有糸分裂クローン増殖を始め、細胞周期を出て、脂肪細胞特異的遺伝子を発現し始めた。分化誘導のほぼ５日後、細胞は特徴的な脂質で満たされた脂肪細胞表現型を表した。
【００７２】
細胞は、２４−ウェルプレートに密度約１．５ｘ１０６細胞で播種し、２日間コンフルーエントに成長させた。細胞を、（＋）−ＫＤＴ５０１（２５、１２．５、６．２５及び３．２５μＭ）、ロシグリタゾン（１０μＭ、ポジティブコントロール；Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ａｎｎ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＩ）又はＤＭＳＯ（ネガティブコントロール）を０日目で処理した。この初期処理後、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＤ（高グルコース）、０．５ｍＭメチルイソブチルキサンチン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、０．５μＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）及び１０μｇ／ｍＬインスリン（Ｓｉｇｍａ）からなる分化培地を添加後、細胞は分化して脂肪細胞となった。２日後、培地を、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中１０μｇ／ｍＬインスリンからなる増殖培地へ変えた。さらに２日後、培地を、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭからなる維持培地に変えた。細胞を、ＤＭＳＯ中の（＋）−ＫＤＴ５０１又はロシグリタゾンで、成熟相の間２日毎に処理した（６日／７日）。新たに培地を添加する場合は、新たな試験物質も添加した。
【００７３】
顕微鏡観察は０日目及び２日毎に試験期間行い、脂肪細胞形態への前脂肪細胞分化を評価した。
細胞内脂質はＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色で定量化した。前記媒体を８日／９日後に、細胞層を動かさないように注意して捨てた。１０％ホルマリンを添加し、１５分インキュベートし、前記プレートを６０％イソプロパノールで洗浄し室温で１０分間乾燥した。３００μＬのＯｉｌ  ｒｅｄ  Ｏ溶液（６０％エタノール中０．３６％；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を添加し、室温で１０分間インキュベートした。プレートを７０％エタノールで洗浄し、次に水で２回洗浄した。色素は１００％イソプロパノール２００μＬで２０分間抽出した。１５０サンプルを９６ウェルプレートに移し、プレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．）を用いて５３０ｎｍで吸収を測定した。ブランクとして１００％イソプロパノールを用いた。結果は図５にまとめた。６．２５、１２．５及び２５μＭで（＋）−ＫＤＴ５０１は、統計学的に有意に、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞内で脂質合成を増加させた。観察された増加は、ロジグリタゾンで観察されるものと同等であった。
【００７４】
実施例３：  ＴＨＰ−１細胞でのＴＮＦ−α−及びＬＰＳ−介在炎症因子への（＋）−ＫＤＴ５０１の効果：
（＋）−ＫＤＴ５０１の抗炎症性を人単球細胞ＴＨＰ−１を用いて評価した。
【００７５】
ＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）は、製造者の指示書に従い１０％血清の存在下でＲＰＭＩ１６４０で維持した。細胞を種々の濃度（５０、２５、１２．５及び１２５μＭ）で（＋）−ＫＤＴ５０１と１時間インキュベートし、その後ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）又はＥ．ＣｏｌｉＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で一晩（１６から２０時間）処理した。媒体中のＭＭＰ−９レベルをＥＬＩＳＡキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて測定し、サイトカインは、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ  ＭＡＰヒトサイトカイン／ケモカインキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて測定した。分析物はＬｕｍｉｎｅｘ１００（ＴＭ）ＩＳを用いて定量化した。データは、５−パラメータロジスティクス法を用いて分析した。
【００７６】
結果は図６から１０に示される。（＋）−ＫＤＴ５０１は、ＴＮＦ−α及びＬＰＳ−誘導の、ＭＭＰ−９発現（図６）、ＩＬ−１β発現（図７）、ＭＣＰ−１発現（図８）、ＲＡＮＴＥＳ発現（図９）及びＭＩＰ−１α発現（図１０）を用量依存的に抑制した。
【００７７】
実施例４：  ＲＡＳＦでのＩＬ−１β介在炎症因子への（＋）−ＫＤＴ５０１の効果
（＋）−ＫＤＴ５０１の抗炎症性を、関節リウマチ滑膜線維芽細胞（ＲＡＳＦ）で評価した。
【００７８】
人ＲＡＦＳ細胞（Ａｓｔｅｒａｎｄ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）を培養し、１０％ウシ胎児血清の存在下ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培地中に維持した。細胞は２４ウェルプレートに、ウェル当たり１ｘ１０４細胞の密度で再培養し、２日で７０から８０％をコンフルーエントに到達させた。最終濃度０．１％ＤＭＳＯで無血清培地中のコンフルーエント細胞を、種々の濃度（５０、２５、１２．５及び６．２５μＭ）で（＋）−ＫＤＴ５０１と１時間インキュベートし、その後ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）で２０から２４時間刺激した。培地中のＭＭＰ−１３レベルは、ＥＬＩＳＡキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を、及びＰＧＥ２レベルは免疫アッセイキット（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いて測定した。
【００７９】
結果は図１１及び１２に示される。
（＋）−ＫＤＴ５０１は、ＩＬ−１β誘導ＰＧＥ２（図１１）及びＭＭＰ−１３（図１２）発現を阻害した。
【００８０】
実施例５：  ＫＤＴ５０１の、ＰＰＡＲγ、ＳＣＮ２Ａ及びＡＧＴＲ２への競合結合：
（＋）−ＫＤＴ５０１の、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ（ＰＰＡＲγ）、電位依存性ナトリウムチャネルタイプＩＩ（ＳＣＮ２Ａ）、およびアンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩＩ（ＡＧＴＲ２）への競合結合を、アゴニストとして、ロシグリタゾン、ベラトリジン、およびアンジオテンシン−ＩＩそれぞれの存在下で評価した。
【００８１】
ＰＰＡＲγについては、細胞膜ホモジネート（８μｇタンパク質）を、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）を含む緩衝液中で、（＋）−ＫＤＴ５０１の存在下又は不存在下で、５ｎＭ［３Ｈ］ロジグリタゾンと４℃で１２０分間インキュベートし、非特異的結合は１０μＭのロジグリタゾンの存在下で決定した。
【００８２】
ＳＣＮ２Ａについては、大脳皮質の細胞膜ホモジネート（２００μｇタンパク質）を、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ／Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１３０ｍＭの塩化コリン、５．４ｍＭのＫＣｌ、０．８ｍＭのＭｇＳＯ４、１ｇ／ｌのグルコース、０．０７５ｇ／ｌのサソリ毒及び０．１％ＢＳＡを含む緩衝液中で、（＋）−ＫＤＴ５０１の存在下又は不存在下で、１０ｎＭの［３Ｈ］バトラコトキシニンと２２℃で６０分間インキュベートし、非特異的結合は３００μＭのヴェラトリジンの存在下で決定した。
【００８３】
ＡＧＴＲ２については、細胞膜ホモジネート（５μｇタンパク質）を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ及び０．１％のＢＳＡを含む緩衝液中で、（＋）−ＫＤＴ５０１の存在下又は不存在下で、０．０１ｎＭの［１２５Ｉ］ＣＧＰ４２１１２Ａ（アンジオテンシン−ＩＩレセプター型ＩＩアゴニスト）と３７℃で２４０分間インキュベートし、非特異的結合は１μＭのアンジオテンシンＩＩの存在下で決定した。
【００８４】
インキュベートに続いてサンプルは、９６ウェル細胞回収装置（（Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ、Ｐａｃｋａｒｄ）で、真空下迅速に、０．３％ＰＥＩで前浸漬させ数回氷冷した５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌで洗浄したガラスファイバフィルター（ＧＦ／Ｂ、Ｐａｃｋａｒｄ）で濾過した。前記フィルターを乾燥し、シンチレーション計数装置（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ、Ｐａｃｋａｒｄ）で、シンチレーションカクテル（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ０、Ｐａｃｋａｒｄ）を用いて放射性を計数した。
【００８５】
結果は表５にまとめた。（＋）−ＫＤＴ５０１は、アゴニストリガンドの存在下で、これら全てのターゲットへの結合性を示し、ＰＰＡＲγについて最も高い親和性を示した。
【００８６】
【表１】
2013542225.tif 000010
結合実験を、（＋）−ＫＤＴ５０１の代わりに（−）−ＫＤＴ５０１を用いて上と同様に繰り返した。この結果は表６にまとめられている。（＋）−ＫＤＴ５０１と同様に、（−）−ＫＤＴ５０１は、アゴニストリガンドの存在下、全ての３つのターゲットへの結合性を示した。しかし、（−）−ＫＤＴ５０１の全ての３つのターゲットについてのＩＣ５０及びＫｉは（＋）−ＫＤＴ５０１よりも高かった。
【００８７】
【表２】
2013542225.tif 000011
実施例６：  ＰＰＡＲ活性へのＫＤＴ５０１の効果：
ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ及びＰＰＡＲγ活性への（＋）−ＫＤＴ５０１の機能効果が、ＰＰＡＲレポーターアッセイ（ＩＮＤＩＧＯ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＰＡ）を用いて評価された。このアッセイは、非人哺乳類細胞遺伝子組換えを用いて、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ及びＰＰＡＲγの恒常的高レベル発現を与え、かつ適切なＰＰＡＲに特異的なルシフェラーゼレポート遺伝子を含む。アゴニスト結合による活性化に続いて、ＰＰＡＲはルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を誘導する。従って、ルシフェラーゼ活性は、アゴニスト処理細胞でのＰＰＡＲ活性を測定するための１つの代わりとなる。
【００８８】
レポーター細胞は、ウェル当たり１００μＬで９６ウェルプレートに播種し、種々の濃度（２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６及び０．７８μＭ）で１００μＬの（＋）−ＫＤＴ５０１をそれぞれのウェルに添加した。ＰＰＡＲγアッセイについては、ポジティブコントロールとして、ロシグリタゾン（１、０．５、０．２５、０．１２５、０．０６３及び０．０３１μＭ）及びテルミサルタン（１０、５、２．５、１．２５及び０．６２５μＭ）が使用された。ＰＰＡＲαアッセイについては、ＧＷ５９０７３５（１０、５、１、０．５、０．２５、０．１２５、０．０６３及び０．０３１μＭ）がポジティブコントロールとして、及びロジグリタゾン（１、０．５、０．２５、０．１２５、０．０６３及び０．０３１μＭ）がネガティブコントロールとして使用された。ＰＰＡＲδについては、ＧＷ０４７２（１、０．５、０．２５、０．１２５、０．０６２５、０．０３１、０．０１６及び０．００８μＭ）がポジティブコントロールとして、及びロジグリタゾン（１、０．５、０．２５、０．１２５、０．０６３及び０．０３１μＭ）がネガティブコントロールとして使用された。０．１％ＤＭＳＯがまた、それぞれのアッセイでネガティブコントロールとして使用プレートは、５％ＣＯ２下で３７℃で湿度制御インキュベーター内で２０時間インキュベートされる。インキュベート後、細胞培地を捨て、細胞は、１００μＬのルシフェラーゼ検出試薬で１５分間処理された。プレートは発光計測装置（Ｖｉｃｔｏｒ２、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて分析された。平均相対光単位（ＲＬＵ）及び標準偏差はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて分析された。
【００８９】
ＰＰＡＲγでは、ポジティブアゴニストコントロール（ロジグリタゾン）は予想のようにＰＰＡＲγの活性を増加した。テルミサルタン、ＰＰＡＲγの知られている部分アゴニストもまた、ＰＰＡＲγ活性を増加させた。（＋）−ＫＤＴ５０１は統計的に有意にＰＰＡＲγ活性を増加し、これは部分的ＰＰＡＲγアゴニストとしての活性と整合する（図１３）。（＋）−ＫＤＴ５０１は、ＰＰＡＲα及びＰＰＡＲδ活性へはほとんど又は全く効果を示さなかった（図１４）。
【００９０】
ＰＰＡＲ活性アッセイは、（＋）−ＫＤＴ５０１（１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６及び０．７８μＭ）及び（−）−ＫＤＴ５０１（２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６及び０．７８μＭ）の両方を用いて上のように繰り返した。（−）−ＫＤＴ５０１はＰＰＡＲγ活性を増加したが、（＋）−ＫＤＴ５０１よりも有意に低かった（図１６）。両方の化合物の結果を表７にまとめた。
【００９１】
【表３】
2013542225.tif 000012
実施例７：  ＧＰＲ１２０レセプター活性への（＋）−ＫＤＴ５０１の効果：
ＧＰＲ１２０レセプター活性への（＋）−ＫＤＴ５０１の効果が、安定してＧＰＲ１２０を発現するＣＨＯ−Ｋ１／ＧＰＲ１２０／Ｇαｌ５細胞を用いて評価した。ＧＰＲ１２０活性は細胞内カルシウム応答により測定した。
【００９２】
ＣＨＯ−Ｋ１／ＧＰＲ１２０／Ｇαｌ５細胞は、最適細胞健康を維持するために規則的に継代し、１０％ウシ胎児血清、２００μｇ／ｍＬゼオシン、および１００μｇ／ｍｌ／ｍＬのハイグロマイシンを補充したハムＦ１２で培養した。細胞は、実験の開始の１８時間前に、成長培地の２０μＬにウェル当たり２０、０００細胞の密度で３８４ウェル黒壁、透明底プレートに播種し、３７℃／５％ＣＯ２で維持した。細胞はカルシウム−４で負荷され、そしてベースライン蛍光測定値は、蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）を用いて１秒から２０秒で得られた。２０秒で、（＋）−ＫＤＴ５０１（５ｘ最終濃度）をリーダープレートに添加し、蛍光シグナルを１００秒間（２１秒から１２０秒）モニターし、α−リノレイン酸（ＬＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）及びドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）をコントロールとして用いた。
【００９３】
データ取得及び分析はＳｃｒｅｅｎＷｏｒｋｓ（ｖｅｒｓｉｏｎ３．１）を用いて行いエクセルへ移した。最初の２０秒の平均蛍光値はベースライン値として計算された。相対蛍光単位（ＡＲＦＵ）強度値は、最大蛍光単位（２１から１２０秒）から前記ベースライン値を引いて計算された。アンタゴニストの用量応答曲線は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４を用いて、４パラメータロジスチック式Ｙ＝Ｂｏｔｔｏｍ＋（Ｔｏｐ−Ｂｏｔｔｏｍ）／（ｌ＋１０＾（（ＬｏｇＩＣ５０−Ｘ）＊ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ））（ここでＸは濃度の対数及びＹは応答である）を用いてフィッティングした。
【００９４】
（＋）−ＫＤＴ５０１は、ＥＣ５０値が３０．３μＭを持つＧＰＲ１２０アゴニスト活性を示した。α−ＬＡが、ＤＨＡ及びＥＰＡ）についてのＥＣ５０値は、それぞれ３６．１μＭ、３５．３μＭ及び１１６．９μＭであった。
【００９５】
実施例８：  ＤＡＰＫ１活性へのＫＤＴ５０１の効果：
（＋）−ＫＤＴ５０１及び（−）−ＫＤＴ５０１の、死亡−関連タンパク質キナーゼ１（ＤＡＰＫ１）活性への効果を評価した。
【００９６】
人ＤＡＰＫ１を、８ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．０、０．２ｍＭのＥＤＴＡで、２５０μＭのＺＩＰタンパク質基質（（ＫＫＬＮＲＴＬＳＦＡＥＰＧ）、１０ｍＭのＭｇＯＡｃ及び［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（必要な比活性は約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）とインキュベートした。種々の濃度（１００、３０、１０、１、０．３、０．１、０．０３及び０．０１μＭ）で（＋）−ＫＤＴ５０１又は（−）−ＫＤＴ５０１を前記の反応混合物に添加した。反応は、ＭｇＡＴＰ混合物の添加により開始させた。室温で４０分間インキュベート後、反応を３％リン酸溶液を添加して停止させた。１０μＬの反応混合物をＰ３０フィルターマットにスポットし、５分間７５ｍＭのリン酸で５分間５回洗浄し、メタノールで１回洗浄した後乾燥させてシンチレーション計数装置で測定した。
【００９７】
結果は図１８に示される。（＋）−ＫＤＴ５０１及び（−）−ＫＤＴ５０１は、用量依存的にＤＡＰＫ１活性を阻害した。（＋）−ＫＤＴ５０１及び（−）−ＫＤＴ５０１について計算されたＩＣ５０は、それぞれ２．６５μＭ、４０．９μＭであり、これら２つの化合物は約１５倍差であることを示す。このデータは、（＋）−ＫＤＴ５０１は、（−）−ＫＤＴ５０１よりもより効果的にＤＡＰＫ１を阻害することを示唆する。
【００９８】
実施例９：  糖尿病モデルラットでのグルコース及びトリグリセリドレベルへの（＋）−ＫＤＴ５０１の効果：
グルコースレベル１７５から３００ｍｇ／ｄＬを持つ６４週齢雄のＺｕｃｋｅｒ糖尿病性脂肪（ＺＤＦ）ラットを無作為に８つの投与グループ：（１）担体のみ（０．５％メチルセルロース（重量／体積）、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０（重量／体積）；ネガティブコントロール）、（２）（＋）−ＫＤＴ５０１の２５ｍｇ／ｋｇ、（３）（＋）−ＫＤＴ５０１の５０ｍｇ／ｋｇ、（４）（＋）−ＫＤＴ５０１の１００ｍｇ／ｋｇ、（５）（＋）−ＫＤＴ５０１の２００ｍｇ／ｋｇ、（６）メトフォルミンの２００ｍｇ／ｋｇ（ポジティブコントロール）、（７）メトフォルミンの２００ｍｇ／ｋｇ及び（＋）−ＫＤＴ５０１の１００ｍｇ／ｋｇ、及び（８）ピオグリタゾン３０ｍｇ／ｋｇ（ポジティブコントロール）、に分けた。薬物は経口で一日２回で３３日投与した。
【００９９】
最も最近の体重測定値に基づき計算された投与後動物は無作為的に週に一度秤量された。血液サンプルは、無作為に先立つ３日前、無作為の際、及び処置を開始後１５日及び２９日尾の血液から収集された。この血液サンプルは、グルコメータを用いて全血液グルコース評価を行い、同様に血液トリグリセリドレベルを測定するために使用された。身体組成はｑＮＭＲで、処置の開始後２日及び２９日で試験された。経口グルコース許容試験（ＯＧＴＴ）は、処置の開始後３１日及び３２日で実施した。ラットはＯＧＴＴに先立ち一晩経過させ、グルコース及びインスリンについて尾の血液収集が、前−グルコースボーラス及び後−グルコースボーラス１５、３０、６０及び１２０分で実施された。グルコースボーラスは体重１ｋｇ当たり２ｇのデキストロースであった。３３日目で、心臓穿刺を、ＰＫ分析のために行った。
【０１００】
全血液グルコースの結果は図１９に示される。予想の通り、ネガティブコントロールラットは、この研究の経過にわたり全血液グルコースレベルは有意にかつ一定に増加することを示した。ピオグリタゾンを受けたポジティブコントロールラットは、グルコースレベルの大きな減少を示し、一方メトフォルミンを受けたポジティブコントロールラットはグルコースレベルのやや増加を示した。（＋）−ＫＤＴ５０１を、投与量２５、５０又は１００ｍｇ／ｋｇで受けたラットは、ネガティブコントロールラットで見られたものとほとんど同じグルコースレベルを示した。しかし（＋）−ＫＤＴ５０１を、投与量２００ｍｇ／ｋｇで受けたラットはグルコースレベルの有意な減少を示し、これはメトフォルミンコントロールラットで見られたものよりもずっと大きく、ピオグリタゾンコントロールラットのものとほとんど同じ程度であった。
【０１０１】
トリグリセリドレベルの結果は図２０に示される。メトフォルミンを受けたラットは、ネガティブコントロールラットに対して１５日及び２９日目でトリグリセリドレベルが増加し、一方ピオグリタゾンを受けたラットは有意に減少したことが示された。（＋）−ＫＤＴ５０１を、投与量２５、５０又は１００ｍｇ／ｋｇで受けたラットは、ネガティブコントロールラットで見られたものとほとんど同じトリグリセリドレベルを示した。しかし（＋）−ＫＤＴ５０１を、投与量２００ｍｇ／ｋｇで受けたラットはトリグリセリドレベルの有意な減少を示し、これはピオグリタゾンコントロールラットで見られたものと同じ程度であった。
【０１０２】
実施例１０：  高脂肪食餌誘導肥満（ＤＩＰ）モデルマウスでの、グルコース、インスリン、ヘモグロビンＡ１Ｃ（ＨｂＡ１Ｃ）及び脂肪量への（＋）−ＫＤＴ５０１の効果：
１４週齢雄マウスを無作為に７つの投与グループ、それぞれのグループに１６動物となるように分けた：（１）担体のみ（０．５％メチルセルロース（重量／体積）、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０（重量／体積）、ネガティブコントロール）、（２）（＋）−ＫＤＴ５０１の２５ｍｇ／ｋｇ）、（３）（＋）−ＫＤＴ５０１の５０ｍｇ／ｋｇ）、（４）（＋）−ＫＤＴ５０１の１００ｍｇ／ｋｇ）、（５）（＋）−ＫＤＴ５０１の２００ｍｇ／ｋｇ）、（６）メトフォルミン２００ｍｇ／ｋｇ（ポジティブコントロール）及び（７）ピオグリタゾン３０ｍｇ／ｋｇ（ポジティブコントロール）である。薬物は３０日間、一日２回経口で投与した。
【０１０３】
最も最近の体重測定値に基づき計算された投与後動物は無作為的に週に一度秤量された。マウスは、高脂肪食餌（４０％Ｋｃａｌ）（ＴＤ９５２１７；  Ｃｏｖａｎｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ、ＩＮにより調製）を維持した。体成分はｑＮＭＲで、処置の開始後５日及び２８日目に試験した。血液は処置の開始後２９日目に収集され、ヘモグロビンＡ１Ｃ（ＨｂＡ１Ｃ）レベルが測定された。経口グルコース許容試験（ＯＧＴＴ）は処置の開始後３０日目に実施した。ラットはＯＧＴＴに先立ち一晩経過させ、グルコース及びインスリンについて尾の血液収集が、前−グルコースボーラス及び後−グルコースボーラス１５、３０、６０及び１２０分で実施された。グルコースボーラスは体重１ｋｇ当たり２ｇのデキストロースであった。
ＯＧＴＴ結果は、曲線下面積（ＡＵＣ）測定及びＤｕｎｎｅｔｔ試験により評価した。
【０１０４】
ＯＧＴＴからの結果は図２１に示される。ピオグリタゾン又はメトフォルミンを受けたポジティブコントロールマウスは有意にグルコースレベルの減少が見られた。同様に、（＋）−ＫＤＴ５０１を投与量１００又は２００ｍｇ／ｋｇで受けたマウスはグルコースレベルの有意な減少を示した。
【０１０５】
ＯＧＴＴからのインスリン結果は図２２に示される。ピオグリタゾン又はメトフォルミンを受けたポジティブコントロールマウスは、有意なインスリンレベルの減少を示した。同様に、（＋）−ＫＤＴ５０１を投与量２００ｍｇ／ｋｇで受けたマウスはインスリンレベルの有意な減少を示した。
【０１０６】
ＨｂＡ１Ｃの結果は図２３に示される。ＨＢＡ１Ｃでの有意な差が、担体のみのネガティブコントロール及びメトフォルミン投与グループとの間に見られた。（＋）−ＫＤＴ５０１の投与は、ＨｂＡ１Ｃ阻害傾向を示した。
【０１０７】
脂肪量の結果は図２４に示される。メトフォルミンを受けたポジティブコントロールマウスは脂肪量の減少を示し、ピオグリタゾンを受けたポジティブコントロールマウスは差を示さなかった。投与量１００ｍｇ／ｋｇ又は２００ｍｇ／ｋｇでの（＋）−ＫＤＴ５０１投与は、ネガティブコントロールマウスに対して脂肪量において有意な差を示した。
【０１０８】
実施例１１：  ルプロンから（＋）−ＫＤＴ５００又は（−）−ＫＤＴ５００の不斉合成：
【０１０９】
【化８】
2013542225.tif 000013
スキームＩＩ
ステップＩ：ルプロン（ＩＩ）からテトラヒドロデオキシフムロン（ＩＶ）の合成：
ルプロンの１０％メタノール溶液（重量／体積）を調製した。触媒量の濃ＨＣｌ（水溶液）及び１０％Ｐｄ／Ｃを添加する。得られた混合物を３時間水素雰囲気下（１．１気圧）で撹拌し、反応をＨＰＬＣで監視する。反応が完了後、触媒を濾過して除き、濾液を真空下濃縮してテトラヒドロデオキシフムロン（ＶＩ）が得られ、これはさらに精製することなく次の反応に使用され得る。
【０１１０】
ステップ２Ａ：テトラヒドロデオキシフムロン（ＶＩ）から（−）−テトラヒドロフムロン（（−）−ＸＩ）の不斉合成：。
【０１１１】
選択的方法２Ａ（ｉ）：テトラヒドロデオキシフムロン（ＶＩ）から（−）−テトラヒドロフムロン（（−）−ＸＩ）の不斉合成。
【０１１２】
テトラヒドロデオキシフムロン（ＶＩ）の１４％（重量／体積）無水テトラヒドロフラン溶液を調製し、アセトン／ドライアイス浴を用いて−７８℃へ冷却する。
ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（１．２当量）を冷却して、前記（ＶＩ）の溶液に滴下する。この溶液をカニューレを介して、２．２当量のＣｕ（ＣＨ３ＣＮ）４ＰＦ６と２．３当量のジアミンリガンドから得られるＴＨＦ中の［（−）−スパルテイン］２−Ｃｕ２−Ｏ２錯体］へ−７８℃でアルゴン雰囲気下で移す。得られる混合物を−７８℃又は望ましい温度で１６時間撹拌する。反応を、５重量％水溶性硫酸の４容積で停止させる。混合物を酢酸エチルで抽出（３回）し、酢酸エチルを合わせて５％硫酸、水および塩化ナトリウムで洗浄し硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空で濃縮する（Ｄｏｎｇ  ２００８）。
【０１１３】
選択的方法２Ａ（ｉｉ）：テトラヒドロデオキシフムロン（ＶＩ）から（−）−テトラヒドロフムロン（（−）−ＸＩ）の不斉合成。
【０１１４】
テトラヒドロデオキシフムロン（ＶＩ）を（−）−テトラヒドロフムロン（（−）−ＸＩ）へ変換し得る好適なＰ４５０変異酵素を、米国特許第７７０４７１５及びそれに引用された文献に記載されるように構築し精製する。通常反応は、５００μＬの１００ｍＭのｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．２中の１から４μＭ精製Ｐ４５０ヘムドメイン酵素及び１から２ｍＭのテトラヒドロデオキシフムロン（ＶＩ）を含む。次のものが組み合わされる：７１３μＬの精製水、２００μＬの０．１００Ｍのｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．２、ＤＭＳＯ中の１００ｍＭの最終濃度（１ｍＭの最終濃度）となる２μＬのテトラヒドロデオキシフムロン（ＶＩ）。
【０１１５】
反応は、１から１０ｍＭのＨ２Ｏ２を添加することで開始され、最大変換をＨＰＬＣで監視する。反応は、７．５μＬの６ＭＨＣｌを添加して停止させる。（−）−テトラヒドロフムロン（（−）−ＸＩ）は、既に説明した抽出処理及び精製により得られる。
【０１１６】
選択的方法２Ａ（ｉｉｉ）：テトラヒドロデオキシフムロン（ＶＩ）から（−）−テトラヒドロフムロン（（−）−ＸＩ）の不斉合成。
【０１１７】
テトラヒドロデオキシフムロン（ＶＩ）から（−）−テトラヒドロフムロン（（−）−ＸＩ）へ変換可能な微生物変換が、米国特許出願公開第２０１０／０１４４５４７号及びその引用文献により得られる。この微生物は、以下の発酵条件によりテトラヒドロデオキシフムロン（ＶＩ）の存在で成長する：３０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む５００ｍｌのＬＢ培地。ＯＤ６００が１．０の細胞を最終的にＯＤ６００が５．０となるように濃縮し、１ｍＭＩＰＴＧで誘導する。テトラヒドロデオキシフムロン（ＶＩ）を添加し、最終濃度を１ｍＭ及び４ｍＭにする。異なる時点で、培養サンプルを集め、遠心分離し、濾過し、及びＨＰＬＣへ導入して（５μＬ）、最大変換を決定する。最大変換を決定した後、ブロスをｐＨ２．０に酸性とし、酢酸エチルで抽出し、乾燥後ヘキサンに再溶解させる。（−）−テトラヒドロフムロン（（−）−ＸＩ）は、上で説明した抽出処理及び精製により得られる。
【０１１８】
ＬＢ、Ｆ１又はＴＢなどの種々の発酵培地が当該技術分野で知られており、これらは、使用され得るものであり、また、ＬＢ、ＴＢ及びＦ１媒体を含むここで開示された本発明の実施態様で使用され得る。さらに、Ａ．テレウス及びＭ．ピロススなどの有機体を成長させる媒体はまた、当該技術分野で知られている（例えばＭｉｙａｋｅ  ２００６；Ｈａｊｊａｊ  ２００１を参照）。
【０１１９】
ステップ２Ｂ：テトラヒドロデオキシフムロン（ＶＩ）から（＋）−テトラヒドロフムロン（（＋）−ＸＩ）の不斉合成。
【０１２０】
選択的方法２Ｂ（ｉ）：テトラヒドロデオキシフムロン（ＶＩ）から（＋）−テトラヒドロフムロン（（＋）−ＸＩ）の不斉合成。
【０１２１】
テトラヒドロデオキシフムロン（ＶＩ）の１４％（重量／体積）無水テトラヒドロフラン溶液を調製し、アセトン／ドライアイス浴を用いて−７８℃へ冷却する。ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（１．２当量）を冷却して、前記（ＶＩ）の溶液に滴下する。この溶液をカニューレを介して、２．２当量のＣｕ（ＣＨ３ＣＮ）４ＰＦ６と２．３当量のジアミンリガンドから得られるＴＨＦ中の［（＋）−スパルテイン］２−Ｃｕ２−Ｏ２錯体］へ−７８℃でアルゴン雰囲気下で移す。得られる混合物を−７８℃又は望ましい温度で１６時間撹拌する。反応を、５重量％水溶性硫酸の４容積で停止させる。混合物を酢酸エチルで抽出（３回）し、酢酸エチルを合わせて５％硫酸、水および塩化ナトリウムで洗浄し硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空で濃縮する（Ｄｏｎｇ  ２００８）。
【０１２２】
選択的方法２Ｂ（ｉｉ）：テトラヒドロデオキシフムロン（ＶＩ）から（−）−テトラヒドロフムロン（（−）−ＸＩ）の不斉合成。
【０１２３】
テトラヒドロデオキシフムロン（ＶＩ）を（−）−テトラヒドロフムロン（（−）−ＸＩ）へ変換し得る好適なＰ４５０変異酵素を、米国特許第７７０４７１５及びそれに引用された文献に記載されるように構築し精製する。通常反応は、５００μＬの１００ｍＭのｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．２中の１から４μＭ精製Ｐ４５０ヘムドメイン酵素及び１から２ｍＭのテトラヒドロデオキシフムロン（ＶＩ）を含む。次のものが組み合わされる：７１３μＬの精製水、２００μＬの０．１００Ｍのｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．２、ＤＭＳＯ中の１００ｍＭの最終濃度（１ｍＭの最終濃度）となる２μＬのテトラヒドロデオキシフムロン（ＶＩ）。
【０１２４】
反応は、１から１０ｍＭのＨ２Ｏ２を添加することで開始され、最大変換をＨＰＬＣで監視する。反応は、７．５μＬのの６ＭのＨＣｌを添加して停止させる。（＋）−テトラヒドロフムロン（（＋）−ＸＩ）は、既に説明した抽出処理及び精製により得られる。
【０１２５】
選択的方法２Ａ（ｉｉｉ）：テトラヒドロデオキシフムロン（ＶＩ）から（＋）−テトラヒドロフムロン（（＋）−ＸＩ）の不斉合成。
【０１２６】
テトラヒドロデオキシフムロン（ＶＩ）から（＋）−テトラヒドロフムロン（（＋）−ＸＩ）へ変換可能な微生物変換が、米国特許出願公開第２０１０／０１４４５４７号及びその引用文献により得られる。この微生物は、以下の発酵条件によりテトラヒドロデオキシフムロン（ＶＩ）の存在で成長する：３０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む５００ｍｌのＬＢ培地。ＯＤ６００が１．０の細胞を最終的にＯＤ６００が５．０になるように濃縮し、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導する。テトラヒドロデオキシフムロン（ＶＩ）を添加し、最終濃度を１ｍＭ及び４ｍＭにする。異なる時点で、培養サンプルを集め、遠心分離し、濾過し、及びＨＰＬＣへ導入して（５μＬ）、最大変換を決定する。最大変換を決定した後、ブロスをｐＨ２．０に酸性とし、酢酸エチルで抽出し、乾燥後ヘキサンに再溶解させる。（＋）−テトラヒドロフムロン（（＋）−ＸＩ）は、上で説明した抽出処理及び精製により得られる。
【０１２７】
ＬＢ、Ｆ１又はＴＢなどの種々の発酵培地が当該技術分野で知られており、これらは、使用され得るものであり、また、ＬＢ、ＴＢ及びＦ１媒体を含むここで開示された本発明の実施態様で使用され得る。さらに、Ａ．テレウス及びＭ．ピロススなどの有機体を成長させる媒体はまた、当該技術分野で知られている（例えばＭｉｙａｋｅ  ２００６；Ｈａｊｊａｊ  ２００１を参照）。
【０１２８】
ステップ３Ａ：（−）−テトラヒドロフムロン（（−）−ＸＩ）から（＋）−ＫＤＴ５００５００の不斉合成。
【０１２９】
（−）−テトラヒドロフムロン（（−）−ＸＩ）の５０％（重量／体積）水溶液を調製し、密閉容器中で撹拌しつつ８５℃に加熱する。ＭｇＳＯ４（０．６当量）を添加し、続いてさらに５分撹拌する。密閉容器へ、ＫＯＨ溶液（３８．２５％重量／体積）、１．０当量）を撹拌しながら滴下する。ＨＰＬＣで異性化が完了するまで反応温度をさらに３時間８５℃に維持する。（＋）−ＫＤＴ５００の遊離酸は、２容積のイソプロパノール、２容積の水及び１当量のＨ２ＳＯ４を反応溶液に添加することで形成される。この混合物を、十分均一になるまで混合し、ここで２容積のジクロロメタンを反応混合物を抽出するために使用する。有機抽出物を真空下で濃縮し、ヘキサンに再溶解し、ＮａＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮し、０．０７０ミリバールで一晩乾燥させる。最終生成物は、（＋）−ＫＤＴ５００の遊離酸である。さらなる精製は、エピマー化、クロマトグラフ、錯体化及び／又は結晶化により実施し得る。
【０１３０】
ステップ３Ｂ：（＋）−テトラヒドロフムロン（（＋）−ＸＩ）から（−）−ＫＤＴ５００の不斉合成。
【０１３１】
（＋）−テトラヒドロフムロン（（＋）−ＸＩ）の５０％（重量／体積）水溶液を調製し、密閉容器内で撹拌しつつ８５℃に加熱する。ＭｇＳＯ４（０．６当量）を添加し、続いてさらに５分撹拌する。密閉容器へ、ＫＯＨ溶液（３８．２５％重量／体積）、１．０当量）を撹拌しながら滴下する。ＨＰＬＣで異性化が完了するまで反応温度をさらに３時間８５℃に維持する。（−）−ＫＤＴ５００の遊離酸は、２容積のイソプロパノール、２容積の水及び１当量のＨ２ＳＯ４を反応溶液に添加することで形成される。この混合物を、十分均一になるまで混合し、ここで２容積のジクロロメタンを反応混合物を抽出するために使用する。有機抽出物を真空下で濃縮し、ヘキサンに再溶解し、ＮａＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮し、０．０７０ミリバールで一晩乾燥させる。最終生成物は、（−）−ＫＤＴ５００５００の遊離酸である。さらなる精製は、エピマー化、クロマトグラフ、錯体化及び／又は結晶化により実施し得る。
【０１３２】
実施例１２：デオキシフムロンから（＋）−ＫＤＴ５００又は（−）−ＫＤＴ５００の不斉合成。
【０１３３】
【化９】
2013542225.tif 000014
スキームＩＩＩ
ステップ１Ａ：デオキシフムロン（Ｉ）から（−）−フムロン（（−）−ＩＶ）の不斉合成。
【０１３４】
選択的方法１Ａ（ｉ）：デオキシフムロン（Ｉ）から（−）−フムロン（（−）−ＩＶ）の不斉合成。
【０１３５】
無水テトラヒドロフラン中のデオキシフムロン（Ｉ）の１４％（重量／体積）を調製し、アセトン／ドライアイス浴で−７８℃に冷却する。ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（１．２当量）を冷却して、前記（ＶＩ）の溶液に滴下する。この溶液をカニューレを介して、２．２当量のＣｕ（ＣＨ３ＣＮ）４ＰＦ６と２．３当量のジアミンリガンドから得られるＴＨＦ中の［（−）−スパルテイン］２−Ｃｕ２−Ｏ２錯体］へ−７８℃でアルゴン雰囲気下で移す。得られる混合物を−７８℃又は望ましい温度で１６時間撹拌する。反応を、５重量％水溶性硫酸の４容積で停止させる。混合物を酢酸エチルで抽出（３回）し、酢酸エチルを合わせて５％硫酸、水および塩化ナトリウムで洗浄し硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空で濃縮する（Ｄｏｎｇ  ２００８）。
【０１３６】
選択的方法１Ａ（ｉｉ）：デオキシフムロン（Ｉ）から（−）−フムロン（（−）−ＩＶ）の不斉合成。
【０１３７】
デオキシフムロン（Ｉ）を（−）−フムロン（（−）−ＩＶ）へ変換し得る好適なＰ４５０変異酵素を、米国特許第７７０４７１５及びそれに引用された文献に記載されるように構築し精製する。通常反応は、５００μＬの１００ｍＭのｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．２中の１から４μＭ精製Ｐ４５０ヘムドメイン酵素及び１から２ｍＭのデオキシフムロン（Ｉ）を含む次のものが組み合わされる：７１３μＬの精製水、２００μＬの０．１００Ｍのｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．２、ＤＭＳＯ中の１００ｍＭの最終濃度（１ｍＭの最終濃度）となる２μＬのテトラヒドロデオキシフムロン（Ｉ）。
【０１３８】
反応は、１から１０ｍＭのＨ２Ｏ２を添加することで開始され、最大変換をＨＰＬＣで監視する。反応は、７．５μＬのの６ＭのＨＣｌを添加して停止させる。（−）−フムロン（（−）−ＩＶ）は、既に説明した抽出処理及び精製により得られる。
【０１３９】
選択的方法１Ａ（ｉｉｉ）：デオキシフムロン（Ｉ）から（−）−フムロン（（−）−ＩＶ）の不斉合成。
【０１４０】
デオキシフムロン（Ｉ）から（−）−フムロン（（−）−ＩＶ）へ変換可能な微生物変換が、米国特許出願公開第２０１０／０１４４５４７号及びその引用文献により得られる。この微生物は、以下の発酵条件によりデオキシフムロン（Ｉ）の存在で成長する：３０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む５００ｍｌのＬＢ培地。ＯＤ６００が１．０の細胞を最終的にＯＤ６００が５．０に濃縮し、１ｍＭＩＰＴＧで誘導する。デオキシフムロン（Ｉ）を添加し、最終濃度を１ｍＭ及び４ｍＭにする。異なる時点で、培養サンプルを集め、遠心分離し、濾過し、及びＨＰＬＣへ導入して（５μＬ）、最大変換を決定する。最大変換を決定した後、ブロスをｐＨ２．０に酸性とし、酢酸エチルで抽出し、乾燥後ヘキサンに再溶解させる。（−）−フムロン（（−）−ＩＶ）は、上で説明した抽出処理及び精製により得られる。
【０１４１】
ＬＢ、Ｆ１又はＴＢなどの種々の発酵培地が当該技術分野で知られており、これらは、使用され得るものであり、また、ＬＢ、ＴＢ及びＦ１媒体を含むここで開示された本発明の実施態様で使用され得る。さらに、Ａ．テレウス及びＭ．ピロススなどの有機体を成長させる媒体はまた、当該技術分野で知られている（例えばＭｉｙａｋｅ  ２００６；Ｈａｊｊａｊ  ２００１を参照）。
【０１４２】
ステップ１Ｂ：デオキシフムロン（Ｉ）から（＋）−フムロン（（＋）−ＩＶ）の不斉合成。
【０１４３】
選択的方法１Ｂ（ｉ）：デオキシフムロン（Ｉ）から（＋）−フムロン（（＋）−ＩＶ）の不斉合成。
【０１４４】
デオキシフムロン（Ｉ）の１４％（重量／体積）無水テトラヒドロフラン溶液を調製し、アセトン／ドライアイス浴を用いて−７８℃へ冷却する。ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（１．２当量）を冷却して、前記（Ｉ）の溶液に滴下する。この溶液をカニューレを介して、２．２当量のＣｕ（ＣＨ３ＣＮ）４ＰＦ６と２．３当量のジアミンリガンドから得られるＴＨＦ中の［（＋）−スパルテイン］２−Ｃｕ２−Ｏ２錯体］へ−７８℃でアルゴン雰囲気下で移す。得られる混合物を−７８℃又は望ましい温度で１６時間撹拌する。反応を、５重量％水溶性硫酸の４容積で停止させる。混合物を酢酸エチルで抽出（３回）し、酢酸エチルを合わせて５％硫酸、水および塩化ナトリウムで洗浄し硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空で濃縮する（Ｄｏｎｇ  ２００８）。
【０１４５】
選択的方法１Ｂ（ｉｉ）：デオキシフムロン（Ｉ）から（＋）−フムロン（（＋）−ＩＶ）の不斉合成。
【０１４６】
デオキシフムロン（Ｉ）を（＋）−フムロン（（＋）−ＩＶ）へ変換し得る好適なＰ４５０変異酵素を、米国特許第７７０４７１５及びそれに引用された文献に記載されるように構築し精製する。通常反応は、５００μＬの１００ｍＭのｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．２中の１から４μＭ精製Ｐ４５０ヘムドメイン酵素及び１から２ｍＭのデオキシフムロン（Ｉ）を含む。次のものが組み合わされる：７１３μＬの精製水、２００μＬの０．１００Ｍのｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．２、ＤＭＳＯ中の１００ｍＭの最終濃度（１ｍＭの最終濃度）となる２μＬのデオキシフムロン（Ｉ）。
【０１４７】
反応は、１から１０ｍＭのＨ２Ｏ２を添加することで開始され、最大変換をＨＰＬＣで監視する。反応は、７．５μＬの６ＭＨＣｌを添加して停止させる。（＋）−フムロン（（＋）−ＩＶ）は、既に説明した抽出処理及び精製により得られる。
【０１４８】
選択的方法１Ａ（ｉｉｉ）：デオキシフムロン（Ｉ）から（＋）−フムロン（（＋）−ＩＶ）の不斉合成。
【０１４９】
デオキシフムロン（Ｉ）から（＋）−フムロン（（＋）−ＩＶ）へ変換可能な微生物変換が、米国特許出願公開第２０１０／０１４４５４７号及びその引用文献により得られる。この微生物は、以下の発酵条件により（＋）−フムロン（（＋）−（ＶＩ）の存在で成長する：３０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む５００ｍｌのＬＢ培地。ＯＤ６００が１．０の細胞を最終的にＯＤ６００が５．０となるように濃縮し、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導する。テトラヒドロデオキシフムロン（ＶＩ）を添加し、最終濃度を１ｍＭ及び４ｍＭにする。異なる時点で、培養サンプルを集め、遠心分離し、濾過し、及びＨＰＬＣへ導入して（５μＬ）、最大変換を決定する。最大変換を決定した後、ブロスをｐＨ２．０に酸性とし、酢酸エチルで抽出し、乾燥後ヘキサンに再溶解させる。（＋）−フムロン（（＋）−ＩＶ）は、上で説明した抽出処理及び精製により得られる。
【０１５０】
ＬＢ、Ｆ１又はＴＢなどの種々の発酵培地が当該技術分野で知られており、これらは、使用され得るものであり、また、ＬＢ、ＴＢ及びＦ１媒体を含むここで開示された本発明の実施態様で使用され得る。さらに、Ａ．テレウス及びＭ．ピロススなどの有機体を成長させる媒体はまた、当該技術分野で知られている（例えばＭｉｙａｋｅ  ２００６；Ｈａｊｊａｊ  ２００１を参照）。
【０１５１】
ステップ２Ａ：（−）−フムロン（（−）−ＩＶ）から（＋）−シスイソフムロン（（＋）−ＶＩＩＩ）の不斉合成（ＲＴＰ：Ｋ００８−４９）。
【０１５２】
９８．９ｍｇの（−）−フムロン（（−）−ＩＶ））を１７０μＬの水に希釈し、キャップ付きの４ｍＬバイアル中で撹拌しながら８５℃に加熱した。１９．８ｍｇ（０．６当量）のＭｇＳＯ４を添加し、撹拌を５分間続けた。３８．２５％（重量／体積）ＫＯＨ溶液の３１μＬ（１．０３当量）を溶液に添加し、反応を続く３時間、８５℃で進行させ、その後ＨＰＬＣで反応終了を判断した。得られた生成物を、（＋）−シスイソフムロン（（＋）−ＶＩＩＩ）の遊離酸又はＭｇ塩のいずれかを生成させるために使用した。
【０１５３】
（＋）−シスイソフムロン（（＋）−ＶＩＩＩ）の遊離酸は、前記反応混合物に、０．５ｍＬのイソプロパノール、０．５ｍＬの水及び１当量のＨ２ＳＯ４を添加して形成させた。この混合物を十分均一になるまで混合し、０．５ｍＬのジクロロメタンを用いて反応混合物から３回抽出した。有機抽出物を合わせて真空化で濃縮し、ヘキサンに再溶解し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空化で濃縮し、０．０７０ミリバールで一晩乾燥させて、（＋）−シスイソフムロン（（＋）−ＶＩＩＩ）の遊離酸を得た。
【０１５４】
（＋）−シスイソフムロン（（＋）−ＶＩＩＩ）のＭｇ塩は、前記反応混合物を加熱から除去し、酢酸エチル０．５ｍＬ添加して十分溶解するまで撹拌することで形成した。０．５ｍＬの水を水溶液に添加して水層と有機層に分離し、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル抽出を更に２回行い、抽出物を真空下濃縮し、０．０７０ミリバールで一晩乾燥した。最終生成物は、少量の塩不純物を含む（＋）−シスイソフムロン（（＋）−ＶＩＩＩ）Ｍｇ塩であった。さらに精製は、エピメリ化、結晶化及び／又は錯体化して全ての（−）−トランスイソフムロンを除去することで実施され得る。
【０１５５】
ステップ２Ｂ：（＋）−フムロン（（＋）−ＩＶ）から（−）−シスイソフムロン（（−）−ＶＩＩＩ）の不斉合成。
【０１５６】
１４３１ｍｇの（＋）−フムロン（（＋）−ＩＶ））を１ｍＬの水に希釈し、キャップ付きの４ｍＬバイアル中で撹拌しながら８５℃に加熱した。２７３ｍｇ（０．６当量）のＭｇＳＯ４を添加し、撹拌を５分間続けた。３８．２５％（重量／体積）ＫＯＨ溶液の４３０μＬ（１．０当量）を溶液に添加し、反応を続く６時間、８０℃で進行させ、その後ＨＰＬＣで反応終了を判断した。得られた生成物を、（−）−シスイソフムロン（（−）−ＶＩＩＩ）の遊離酸又はＭｇ塩のいずれかを生成させるために使用した。この場合、反応混合物を溶液のまま維持し、直接以下ステップ３Ｂにより（−）ＫＤＴ５００を取得した。
【０１５７】
（−）−シスイソフムロン（（−）−ＶＩＩＩ）の遊離酸は、前記反応混合物に、２容量のイソプロパノール、２容量の水及び１当量のＨ２ＳＯ４を添加して形成させた。この混合物を十分均一になるまで混合し、２容量のジクロロメタンを用いて反応混合物から３回抽出した。有機抽出物を合わせて真空化で濃縮し、ヘキサンに再溶解し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空化で濃縮し、０．０７０ミリバールで一晩乾燥させて、（−）−シスイソフムロン（（−）−ＶＩＩＩ）の遊離酸を得た。
【０１５８】
（−）−シスイソフムロン（（−）−ＶＩＩＩ）のＭｇ塩は、前記反応混合物を加熱から除去し、２容量の酢酸エチル添加して十分溶解するまで撹拌することで形成した。２容量の水を水溶液に添加して水層と有機層に分離し、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル抽出を更に２回行い、抽出物を真空下濃縮し、０．０７０ミリバールで一晩乾燥し、最終生成物は、少量の塩不純物を含む（−）−シスイソフムロン（（−）−ＶＩＩＩ）Ｍｇ塩であった。さらに精製は、エピメリ化、結晶化及び／又は錯体化して全ての（＋）−トランスイソフムロンを除去することで実施され得る。
【０１５９】
ステップ３Ａ：（＋）−シスイソフムロン（（＋）−ＶＩＩＩ）から（＋）−ＫＤＴ５００の合成（ＲＴＰ：Ｋ００８−５０）。
【０１６０】
前記乾燥した（＋）−シスイソフムロン（（＋）−ＶＩＩＩ）の９６．３ｍｇを１ｍＬのメタノールに溶解した。３．１ｍｇ（０．３当量）のＭｇＯを添加し、反応混合物を５分間撹拌した。３０ｍｇの１０％Ｐｄ／Ｃを溶液に添加し撹拌を再開した。水素雰囲気下で水素ガスの泡を溶液に導入した。４５分後、反応の終了をＨＰＬＣで判断し、撹拌を停止し、バイアルを開いて水素雰囲気を除去した。１当量の硫酸を反応混合物び添加し（ｐＨ約１）、反応混合物を０．２ｍｍシリンジフィルターを通して濾過した。反応容器及びフィルターを２回酢酸エチルで洗浄した。濾液を真空下濃縮し、ヘキサンに再溶解し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、綿ピペットで濾過し、真空下濃縮し、０．０７０ミリバールで一晩乾燥した。５８．１ｍｇの（＋）−ＫＤＴ５００が生成された。さらなる精製は、クロマトグラフ及び再結晶により実施された。
【０１６１】
ステップ３Ｂ：（−）−シスイソフムロン（（−）−ＶＩＩＩ）から（−）−ＫＤＴ５００の合成。
【０１６２】
ステップ２Ｂの反応混合物（（−）−シスイソフムロン約１．４ｇ）を１０ｍＬのメタノールに溶解し、２５６ｍｇのＭｇＯを添加し、反応混合物を５分間撹拌した。
前記溶液を濾過し２つの等しい容積の保存液に分けた。３４ｍｇのＭｇＯを「反応１」へ添加し、次に２００ｍｇの１０％Ｐｄ／Ｃを添加し、撹拌を再開した。水素雰囲気下で水素ガスの泡を溶液に導入した。１時間後、反応の終了をＨＰＬＣで判断し、撹拌を停止し、バイアルを開いて水素雰囲気を除去した。１当量の硫酸を反応混合物に添加し（ｐＨ約１）、反応混合物を０．２ｍｍシリンジフィルターを通して濾過した。反応容器及びフィルターを２回酢酸エチルで洗浄した。濾液を真空下濃縮し、ヘキサンに再溶解し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、綿ピペットで濾過し、真空下濃縮し、０．０７０ミリバールで一晩乾燥した。両方の反応の組み合わせから、９３３．５ｍｇの（−）−ＫＤＴ５００が生成された。さらなる精製は、クロマトグラフ及び再結晶により実施された。
【０１６３】
実施例１３：  （−）−フムロン及びデオキシフムロンそれぞれから、（＋）−フムロン及び（−）−フムロンの製造。
【０１６４】
【化１０】
2013542225.tif 000015
スキームＩＶ
ステップ１：ラセミ（±）−フムロン（ＩＩＩ）の合成。
【０１６５】
選択的方法１Ａ：（−）−フムロン（（−）−ＩＶ）から（±）−フムロン（ＩＩＩ）の合成。
【０１６６】
純粋な（−）−フムロンをピネン又は他の好適な溶媒（不活性高沸点アルカン、例えばリモネン、トリメチルヘキサン）に溶解して３から１０％溶液を形成した。この溶液を加圧チューブに入れ、アルゴン又は窒素でパージして酸素を除去し、密閉して、１から２時間１２５から１４５℃に加熱した。反応物を室温に戻し、溶媒を真空で除去して、必要な場合には上で説明したようにラセミ（±）−フムロン（ＩＩＩ）を精製する。
【０１６７】
選択的方法１Ｂ：デオキシフムロン（Ｉ）からラセミ（±）−フムロン（ＩＩＩ）の合成。
【０１６８】
デオキシフムロン（Ｉ）をメタノールに完全に溶解させ、１当量の酢酸鉛を溶液に添加し、触媒量の１０％ＰＤ／Ｃ（０．１当量）を添加した。溶液を撹拌し空気を吹き込んだ。約４時間後、鉛塩を濾過して分離し、さらに濾液に酢酸鉛を添加し、ラセミ（±）−フムロン（ＩＩＩ）が鉛塩として完全に回収されることを保証する。全ての鉛塩（カナリア黄色）を集め、メタノール中に懸濁し、次いで溶液中に硫酸を添加した。硫酸鉛が不溶性沈澱として生成し、これを遠心分離で除去した。均一なメタノール溶液をヘキサン及び水から抽出した（それぞれ約２容量）。ヘキサンに抽出されたラセミ（±）−フムロン（ＩＩＩ）を真空下濃縮してたラセミ（±）−フムロン（ＩＩＩ）の遊離酸の形で得た。
【０１６９】
ステップ２Ａ：ラセミ（±）−フムロン（ＩＩＩ）から（−）−フムロン（（−）−ＩＶ）の精製。
【０１７０】
ラセミ（±）−フムロン（ＩＩＩ）をメタノール（１０％、重量／体積）及び１Ｒ、２Ｒ−４−シクロヘキサン−１、２−ジアミン（１０％重量／体積）のメタノール溶液をそれぞれ調製した。両方の溶液を当量で混合し（約体積で３：１）、メタノールを蒸発させ、残渣を最小量の２−プロパノール（他の溶媒も使用可能であり、例えばｔ−ブチルメチルエーテル、アセトニトリル、酢酸エチル又はベンゼン）に再溶解させる。結晶が形成され、これは（−）−フムロン（ＩＶ）のアミン塩からなり、一方（＋）−フムロン（（＋）−ＩＶ）は溶液中に残った。結晶を濾過して乾燥し、ヘキサン及び水溶性硫酸と混合して、（−）−フムロン（（−）−ＩＶ）の遊離酸を生成させた。ヘキサン層を分離し、塩水で洗浄し硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させて、キラルＨＰＬＣで示されるように（−）−フムロン（（−）−ＩＶ）を得た。
【０１７１】
ステップ２Ｂ：ラセミ（±）−フムロン（ＩＩＩ）から（＋）−フムロン（（＋）−ＩＶ）の精製。
【０１７２】
ラセミ（±）−フムロン（ＩＩＩ）をメタノール（１０％、重量／体積）及び１Ｓ、２Ｓ−４−シクロヘキサン−１、２−ジアミン（１０％重量／体積）のメタノール溶液をそれぞれ調製される。両方の溶液を当量で混合し（約体積で３：１）、メタノールを蒸発させ、残渣を最小量の２−プロパノール（他の溶媒も使用可能であり、例えばｔ−ブチルメチルエーテル、アセトニトリル、酢酸エチル又はベンゼン）に再溶解させる。結晶が形成され、これは（＋）−フムロン（（＋）−ＩＶ）のアミン塩からなり、一方（−）−フムロン（（−）−ＩＶ）は溶液中に残る。結晶を濾過して乾燥し、ヘキサン及び水溶性硫酸と混合して、（＋）−フムロン（（＋）−ＩＶ）の遊離酸を生成させる。ヘキサン層を分離し、塩水で洗浄し硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させて、キラルＨＰＬＣで示されるように（＋）−フムロン（（＋）−ＩＶ）を得る。
【０１７３】
実施例１４：  テトラヒドロデオキシフムロンから、（＋）−テトラヒドロフムロン及び（−）−テトラヒドロフムロンの製造。
【０１７４】
【化１１】
2013542225.tif 000016
スキームＶ
ステップ１：テトラヒドロデオキシフムロン（ＶＩ）からラセミ（±）−テトラヒドロフムロン（ＩＸ）の合成。
【０１７５】
テトラヒドロデオキシフムロン（ＶＩ）の１０％（重量／体積）酢酸溶液を調製し、触媒量の硫酸を溶液に添加した。溶液を撹拌し、過酸化水素の３０％（重量／重量）溶液の１当量を滴下した。２時間後、反応の完了をＨＰＬＣで判断し、水及びジクロロメタンを添加した。ジクロロメタンで（±）−テトラヒドロフムロン（ＩＸ）を抽出し、真空下濃縮し、（±）−テトラヒドロフムロン（ＩＸ）を遊離酸の形で得た。
【０１７６】
ステップ２Ａ：ラセミ（±）−テトラヒドロフムロン（ＩＸ）から（−）−テトラヒドロフムロン（（−）−ＸＩ）の精製。
【０１７７】
ラセミ（±）−テトラヒドロフムロン（ＩＸ）をメタノール（１０％、重量／体積）及び１Ｒ、２Ｒ−４−シクロヘキサン−１、２−ジアミン（１０％重量／体積）のメタノール溶液をそれぞれ調製した。両方の溶液を当量で混合し（約体積で３：１）、メタノールを蒸発させ、残渣を最小量の２−プロパノール（他の溶媒も使用可能であり、例えばｔ−ブチルメチルエーテル、アセトニトリル、酢酸エチル又はベンゼン）に再溶解させる。結晶が形成され、これは（−）−テトラヒドロフムロン（（−）−ＩＶ）のアミン塩からなり、一方（＋）−テトラヒドロフムロン（（＋）−ＸＩ）は溶液中に残った。結晶を濾過して乾燥し、ヘキサン及び水溶性硫酸と混合して、（−）−テトラヒドロフムロン（（−）−ＸＩ）の遊離酸を生成させた。ヘキサン層を分離し、塩水で洗浄し硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させて、キラルＨＰＬＣで示されるように（−）−テトラヒドロフムロン（（−）−ＸＩ）を得た。
【０１７８】
ステップ２Ｂ：  ラセミ（±）−テトラヒドロフムロンから（＋）−テトラヒドロフムロン（（＋）−ＸＩ）の精製。
【０１７９】
ラセミ（±）−テトラヒドロフムロン（ＩＸ）をメタノール（１０％、重量／体積）及び１Ｓ、２Ｓ−４−シクロヘキサン−１、２−ジアミン（１０％重量／体積）のメタノール溶液をそれぞれ調製される。両方の溶液を当量で混合し（約体積で３：１）、メタノールを蒸発させ、残渣を最小量の２−プロパノール（他の溶媒も使用可能であり、例えばｔ−ブチルメチルエーテル、アセトニトリル、酢酸エチル又はベンゼン）に再溶解させる。結晶が形成され、これは（＋）−テトラヒドロフムロン（（＋）−ＸＩ）のアミン塩からなり、一方（−）−テトラヒドロフムロン（（−）−ＸＩ）は溶液中に残る。結晶を濾過して乾燥し、ヘキサン及び水溶性硫酸と混合して、（＋）−テトラヒドロフムロン（（＋）−ＸＩ）の遊離酸を生成させる。ヘキサン層を分離し、塩水で洗浄し硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させて、キラルＨＰＬＣで示されるように（＋）−テトラヒドロフムロン（（＋）−ＸＩ）を得る。
【０１８０】
実施例１５：  追加のＫＤＴ５００塩の製造。
【０１８１】
カルシウム（ＩＩ）塩（「ＫＤＴ５０５」）の製造。
【０１８２】
水（１０００μＬ）及びＫＤＴ５００のカリウム塩（８８．２ｍｇ）を４ｍＬバイアルに加え、次いで水１２０μＬ中の２６．６ｍｇの塩化カルシウムを添加した。混合物を１時間撹拌し、沈澱を濾過して分離し、１ｍＬの水で４回洗浄し、高真空下で乾燥して６．９ｍｇの生成物を得た。前記生成物は融点１２５．１℃、水含有量は１．２８ＫＦであった。
【０１８３】
マグネシウム（ＩＩ）塩（「ＫＤＴ５０６」）の製造。
【０１８４】
水（１２００μＬ）及びＫＤＴ５００のカリウム塩（５０．１ｍｇ）を４ｍＬバイアルに加え、次いで水２００μＬ中の７．８ｍｇの硫酸マグネシウム（０．５３当量）を添加した。混合物を１時間撹拌し、沈澱を濾過して分離し、１ｍＬの水で２回洗浄し、高真空下で乾燥して４７ｍｇの生成物を得た。前記生成物は融点１３０．０℃、水含有量は１．２７ＫＦであった。
【０１８５】
亜鉛（ＩＩ）塩（「ＫＤＴ５０７」）の製造。
【０１８６】
水（１３００μＬ）及びＫＤＴ５００のカリウム塩（８４．７ｍｇ）を４ｍＬバイアルに加え、次いで水３００μＬ中の３１．６ｍｇの硫酸亜鉛６水和物（０．５３当量）を添加した。混合物を１時間撹拌し、沈澱を濾過して分離し、１ｍＬの水で２回洗浄し、高真空下で乾燥して７１．６ｍｇの生成物を得た。前記生成物は融点１３４．７℃、水含有量は２．２４ＫＦであった。
【０１８７】
鉄（ＩＩＩ）塩（「ＫＤＴ５０８」）の製造。
【０１８８】
水（１０００μＬ）及びＫＤＴ５００のカリウム塩（６１．９ｍｇ）を４ｍＬバイアルに加え、次いで水３００μＬ中の４３．４ｍｇの塩化鉄（ＩＩＩ）６水和物（０．５３当量）を添加した。混合物を１時間撹拌し、沈澱を濾過して分離し、１ｍＬの水で２回洗浄し、高真空下で乾燥して７１．６ｍｇの生成物を得た。前記生成物は融点７２．９℃、水含有量は１．０７ＫＦであった。
【０１８９】
ナトリウム（Ｉ）塩（「ＫＤＴ５０９」）の製造。
【０１９０】
水（１０００μＬ）及びＫＤＴ５００のカリウム塩（１０９．５ｍｇ）を４ｍＬバイアルに加え、次いで１ＭのＮａＯＨ水溶液（３００μＬ、１．００当量）を添加した。混合物を蒸させ高真空下で乾燥した。
前記生成物は融点１１３．９℃、水含有量は１．１５ＫＦであった。
【０１９１】
銅（ＩＩ）塩（「ＫＤＴ５１０」）の製造。
【０１９２】
水（１０００μＬ）及びＫＤＴ５００のカリウム塩（１０９．５ｍｇ）を４ｍＬバイアルに加え、次いで１ＭのＮａＯＨ水溶液（３００μＬ、１．００当量）を添加した。混合物を蒸させ高真空下で乾燥した。前記生成物は融点１０４．９℃、水含有量は１．１８ＫＦであった。
【０１９３】
グアニジニウム塩（「ＫＤＴ５１１」）の製造。
【０１９４】
水（１０００μＬ）及びＫＤＴ５００のカリウム塩（１０９．５ｍｇ）を４ｍＬバイアルに加え、次いで１ＭのＮａＯＨ水溶液（３００μＬ、１．００当量）を添加した。混合物を蒸させ高真空下で乾燥した。前記生成物は融点１０４．８℃、水含有量は０．９４ＫＦであった。
【０１９５】
前記記載は本発明の種々の実施態様を説明するだけのものである。前記説明された具体的な例は本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。当業者には、本発明の範囲から外れることなく種々の均等物、変更及び修正がなされ得ることは理解されることであり、理解されるべきことはかかる均等な実施態様もここに含まれる、ということである。ここで引用される全ての参考文献は参照されて本明細書に援用される。
【０１９６】
（参考文献）
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年8月27日(2012.8.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造：
【化１２】
2013542225.tif 000060
を持つ、（＋）−（４Ｓ、５Ｒ）−３、４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン又は（＋）−（４Ｓ、５Ｒ）−３、４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オンの塩の結晶。
【請求項２】
請求項１に記載の、（＋）−（４Ｓ、５Ｒ）−３、４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オンの塩であり、前記塩が、カリウム、アルミニウム、カルシウム、銅、グアニジニウム、鉄、リチウム、マグネシウム、ナトリウム、亜鉛、シンコニジン、シンコニン及びジエタノールアミン塩からなる群から選択される、塩。
【請求項３】
＋）−（４Ｓ、５Ｒ）−３、４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オンのカリウム塩であり、以下の構造：
【化１３】
2013542225.tif 000061
を持つ、塩。
【請求項４】
請求項３に記載の塩であり、前記結晶が、単斜晶系空間群Ｐ２１２１２を持ち、単位セル長さがａ＝２３．３１１０（９）Ａ（オングストローム）、ｂ＝２８．９０５２（１２）Ａ、β＝９０°、ｃ＝１３．６８４５（５）Ａ及びγ＝９０°である、塩。
【請求項５】
請求項４に記載の塩であり、前記結晶が、表２に定められる３次元原子座標を持つ、塩。
【請求項６】
鏡像異性体的純度が９６％以上である組成物である、実質的に鏡像異性体的に純粋な（＋）−（４Ｓ、５Ｒ）−３、４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン又はその塩、又はその結晶。
【請求項７】
請求項６に記載の組成物及び薬学的に許容されるキャリアを含む実質的に鏡像異性体的に純粋な医薬組成物。
【請求項８】
請求項７に記載の医薬組成物であり、選択に記載の結晶を含む、医薬組成物。
【請求項９】
ＰＰＡＲγ変調に応じる症状を治療するための方法であり、対象体の必要に応じて前記対象体に請求項７に記載の医薬組成物の治療的有効量を投与することを含む、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であり、前記症状が、糖尿病及び肥満からなる群から選択される、方法。
【請求項１１】
ＧＰＲ１２０変調に応じる症状を治療するための方法であり、対象体の必要に応じて前記対象体に請求項７に記載の医薬組成物の治療的有効量を投与することを含む、方法。
【請求項１２】
代謝障害を治療するための方法であり、対象体の必要に応じて前記対象体に請求項７に記載の医薬組成物の治療的有効量を投与することを含む、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であり、前記代謝障害が糖尿病である、方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法であり、前記医薬組成物の投与が、グルコース及び／又は脂質レベルの減少をもたらす、方法。
【請求項１５】
対象体の炎症を抑制するための方法であり、前記対象体に請求項７に記載の医薬組成物の治療的有効量を投与することを含む、方法。
【請求項１６】
対象体の炎症に伴う症状を治療するための方法であり、前記対象体に必要に応じて請求項７に記載の医薬組成物の治療的有効量を投与することを含む、方法。
【請求項１７】
結晶性（＋）−（４Ｓ、５Ｒ）−３、４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オンカリウム（１：１）塩。
【請求項１８】
結晶性（−）−（４Ｓ、５Ｒ）−３、４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オンカリウム（１：１）塩。
【国際調査報告】
2013542225.tif 000062