(57)【要約】  ホスホ脂質又はホスホノ脂質に共有結合した窒素でへテロシクリル置換されたオキソアデニン分子を含む新規の脂質付加オキソアデニンは、インターフェロンα又はそのほかの免疫賦活性サイトカインの誘導剤であることが示される。該化合物は、免疫賦活剤及びアジュバントとして有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の構造を有する化合物：
【化１】
2013501730.tif 000012
（式中、
Ｒ１は、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルキルアミノ、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ３〜６シクロアルキルＣ１〜６アルキル、Ｃ３〜６シクロアルキルＣ１〜６アルキルアミノ、Ｃ３〜６シクロアルキルＣ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アルコキシＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシＣ１〜６アルキルアミノ、Ｃ１〜６アルコキシＣ１〜６アルコキシから成る群から選択され、任意に、ヒドロキシル、アミノ、チオ、ヒドラジノ、ヒドラジド、アジド、アセチレニル、カルボキシル又はマレイミドの基によって末端置換され、
ｎは、０又は１〜６の整数であり、
Ｈｅｔは、４員環、５員環又は６員環の飽和複素環であり、式中、
Ｘ、Ｙは、ＣＨ又はＮ、且つＸとＹの少なくとも一方が窒素原子であり、
Ｑは、Ｏ、ＮＨ又は共有結合であり、
Ｚは、Ｏ、ＣＨ２、ＣＦ２又は共有結合であり、
Ｗは、Ｏ、Ｓであり、
ｍは、０又は１〜６の整数であり、
ｐは、１又は２の整数であり、
ｑは、０又は整数１であり、
Ａは、
【化２】
2013501730.tif 000013
であり、
Ｒ２は、Ｈ又は直鎖、分枝鎖若しくは不飽和のＣ４〜Ｃ２４アルキル若しくはアシルであり、
Ｒ３は、直鎖、分枝鎖又は不飽和のＣ４〜Ｃ２４アルキル又はアシルである）、又は薬学上許容可能なその塩。
【請求項２】
式ＩＩの構造を有する化合物：
【化３】
2013501730.tif 000014
（式中、
Ｒ１は、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルキルアミノ、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ３〜６シクロアルキルＣ１〜６アルキル、Ｃ３〜６シクロアルキルＣ１〜６アルキルアミノ、Ｃ３〜６シクロアルキルＣ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アルコキシＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシＣ１〜６アルキルアミノ、Ｃ１〜６アルコキシＣ１〜６アルコキシから成る群から選択され、
ｎは、０又は１〜６の整数であり、
Ｘは、ＣＨ又はＮであり、
Ｑは、Ｏ、ＮＨ、又は共有結合であり、
Ｚは、Ｏ、ＣＨ２、ＣＦ２又は共有結合であり、
Ｗは、Ｏ、Ｓであり；
ｍは、０又は１〜６の整数であり、
ｐは、１又は２の整数であり、
ｑは、０又は整数１であり、
Ｒ２は、Ｈ又は直鎖、分枝鎖若しくは不飽和のＣ４〜Ｃ２４アルキル若しくはアシルであり、
Ｒ３は、直鎖、分枝鎖又は不飽和のＣ４〜Ｃ２４アルキル又はアシルである）、又は薬学上許容可能なその塩。
【請求項３】
式ＩＸの構造を有する化合物：
【化４】
2013501730.tif 000015
（式中、
Ｒ１は、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルキルアミノ、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アルコキシＣ１〜６アルキルアミノ、Ｃ１〜６アルコキシＣ１〜６アルコキシから成る群から選択され、
ｎは、０又は１〜２の整数であり、
Ｘは、ＣＨ又はＮであり、
Ｑは、Ｏ、ＮＨ又は共有結合であり、
ｍは、０又は１〜２の整数であり、
ｑは、０であり、
Ｒ２は、Ｈ又は直鎖、分枝鎖若しくは不飽和のＣ４〜Ｃ２４アルキル若しくはアシルであり、
Ｒ３は、直鎖、分枝鎖又は不飽和のＣ４〜Ｃ２４アルキル又はアシルである）、又は薬学上許容可能なその塩。
【請求項４】
Ｒ１が、Ｃ１〜６アルコキシ、又はＣ１〜６アルコキシＣ１〜６アルキルであり、
Ｑが、Ｏ，ＮＨであり、
ｍが、０又は１〜２の整数であり、
ｑが、０であり、
Ｒ２が、Ｈ又は直鎖、分枝鎖若しくは不飽和のＣ４〜Ｃ２４アルキル若しくはアシルであり、
Ｒ３が、直鎖、分枝鎖又は不飽和のＣ４〜Ｃ２４アルキル又はアシルである、請求項３の化合物、又は薬学上許容可能なその塩。
【請求項５】
（Ａ１）
【化５】
2013501730.tif 000016
（Ａ２）
【化６】
2013501730.tif 000017
及び（Ａ３）
【化７】
2013501730.tif 000018
から成る群から選択される化合物、又は薬学上許容可能なその塩。
【請求項６】
以下の構造
【化８】
2013501730.tif 000019
を有する化合物又は薬学上許容可能なその塩。
【請求項７】
以下の構造
【化９】
2013501730.tif 000020
を有する化合物又は薬学上許容可能なその塩。
【請求項８】
以下の構造
【化１０】
2013501730.tif 000021
を有する化合物又は薬学上許容可能なその塩。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物を投与することを含む、哺乳類で自然免疫の応答を誘導する方法。
【請求項１０】
前記応答が１型ＩＦＮを誘導することを含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記応答が、炎症誘発性サイトカインを増大することを含む請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
自然免疫の応答を誘導する方法、１型ＩＦＮの応答を誘導する方法、又は炎症誘発性サイトカインを増大する方法にて使用するための請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のアジュバント化合物、その調製方法、それを含有する組成物及びワクチンアジュバントとしてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物ワクチンの精製と単純化、及びワクチンの製造性と安全性を改善するための合成と組換えのサブユニット抗原の使用は、結果的にワクチンの効能の低下を生じる。このことは、ワクチンの活性及び合成と組換えのエピトープの弱い免疫原性を強化するためのアジュバントと抗原との同時投与に関する研究を導いている。アジュバントは、ワクチン抗原への液性の免疫応答及び又は細胞が介在する免疫応答を高める添加剤である。しかしながら、ワクチンアジュバントの設計は、免疫系機能に関与する分子メカニズムの複雑な性質のために歴史的に難しいものとなっている。微生物構成成分の添加は適応免疫応答を高めることが長く知られているが、ごく最近になって、たとえば、上皮細胞や樹状細胞のような免疫監視に関与する細胞上のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、いわゆる「病原体関連パターン」又はＰＡＭＰを介してこれら微生物産物の多数に関与することが示された。多数のワクチンアジュバント及び独立型の免疫調節剤がＴＬＲファミリーのメンバーと相互作用すると思われる。
【０００３】
ヒトで特定されている既知の１０のＴＬＲのうち、５つは細菌の構成成分の認識に関連し（ＴＬＲ１，２，４，５，６）、他の４つ（ＴＬＲ３、７，８，９）は、細胞質区画に拘束され、ウイルスＲＮＡ（ＴＬＲ３，７，８）と非メチル化ＤＮＡ（ＴＬＲ９）の検知に関与すると思われる（Iwasaki, A., Nat Immunol 2004, 5, 987）。ＴＬＲの活性化は、細胞内シグナル伝達経路を調節し、たとえば、ＭｙＤ８８、ＴＲＩＦ、ＴＩＲＡＰ及びＴＲＡＭのような細胞内アダプター分子との相互作用を介して遺伝子発現をもたらす（Akira, S. Nat Rev Immunol 2004, 4, 499; Takeda, K. Semin Immunol 2004, 16, 3）。これらのアダプター分子は、炎症性サイトカイン／ケモカイン及びＩ型インターフェロン（ＩＦＮα／β）の発現を差次的に調節することができ、それは、抗原特異的な液性の免疫応答及び細胞が介在する免疫応答の優先的な向上をもたらす（Zughaier, S. Infect Immun 2005, 73, 2940）。液性免疫は、細菌性病原体に対する防御の主要系列であり、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の誘導は、ウイルス性疾患及び癌の場合の防御免疫に決定的であると思われる。
【０００４】
ＴＬＲ７及びＴＬＲ８の活性化の場合、天然の（Ｕ及び／又はＧが豊富な）ウイルスｓｓＲＮＡリガンドの２，３の異なった部類の小分子模倣体が特定されている。これらには、酸化されたグアノシン代謝体（オキソグアノシン）に関連する特定の抗ウイルス化合物が挙げられ、それは、ＴＬＲ７（Heil, F. Eur J Immunol 2003, 33, 2987; Hemmi, 2002）、及びＴＬＲ７及び／又はＴＬＲ８に関わり合うアデニンの誘導体と主として相互作用する。これら化合物の免疫刺激能は、ＴＬＲ／ＭｙＤ８８依存性のシグナル伝達経路、及びＩＬ−６とＩ型（特にインターフェロン−α）とＩＩ型インターフェロンを含むサイトカインの産生に起因すると考えられている。ＴＬＲ７又はＴＬＲ８の活性化は、樹状細胞上での共刺激分子（たとえば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６）及びクラスＩとＩＩのＭＨＣ分子の上方調節をもたらす。ＤＣは、抗原の取り込みとＴリンパ球への提示に関与する免疫系の主細胞である。ＴＬＲ７を優先的に発現する形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）は、専門的にインターフェロン−αを産生する細胞であるが、ｍＤＣはＴＬＲ８のみを発現する。ｍＤＣ上のＴＬＲ８の活性化は、たとえば、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γのような炎症誘発性サイトカインの優先的な産生と細胞介在性の免疫（ＣＭＩ）をもたらす。ＴＬＲ７作動薬はＩＦＮ−αとＩＦＮ調節性のサイトカインを生成するのにさらに有効であるが、ＣＤ４＋調節性（Ｔｒｅｇ）の細胞機能の反転をもたらすＴＬＲ８作動薬は、ＴＮＦ−αやＩＬ−１２のような炎症誘発性サイトカインの誘導にさらに有効であることが示され、それは、ＴＬＲ８の活性化がＣＭＩ又はＴｈ１型免疫応答を誘導するはずである一方で、ＴＬＲ７の活性化が抗体反応（Ｔｈ２型応答）にさらに重要であってもよいことを示唆している（Gordon J Immunol 2005, 1259）。
【０００５】
かなり注目を浴びているＴＬＲ活性のあるアデニン誘導体の部類の１つはオキソアデニンである。オキソアデニンは通常、アデニン環（８−ケト／オキソ互変異性体形態で示されることが多い）の８位でヒドロキシル基、２位と９位で種々の置換基、及び４位で非置換の芳香族アミノ基を含有する。イミダゾキノリンのようなそのほかのＩＦＮ誘導性のアデニン誘導体と同様に、非置換の芳香族アミノ基はＩＦＮ誘導活性に必須であると考えられる。イミダゾキノリンに関連する特定の副作用を克服するように当初開発されたオキソアデニンの多くは、試験管内及び生体内でのＩＦＮ誘導活性に関してイミキモドやレシキモドのような原型のイミダゾキノリンよりもかなり強力であるが、イミダゾキノリンの主な臨床的な副作用である嘔吐活性を欠くことが示されている。たとえば、オキソアデニンＳＭ３６０３２０は、現在ＨＣＶに対する前臨床開発中であり、ＩＦＮ非依存性のメカニズムを介すると同様にＩ型ＩＦＮの産生によってヒト肝細胞におけるＨＣＶの複製を抑制することが示されている（Lee PNAS 2006, 103, 1828）。それでもなお、オキソアデニンの部類はイミダゾキノリンよりも良好な全体的な毒性／生物活性の特性を示すと思われる事実にもかかわらず、ＳＭ３６０３２０の種々の経路によるマウスへの投与は、肥満細胞によって放出される炎症性サイトカインが部分的に介在する全身性の疾病反応をもたらす（Hayashi Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2008, 295, R123）。実際、ＴＬＲ７作動薬の大きな免疫的な「足跡」は一般に、多くの場合で毒性に関わる懸念と臨床試験の延期をも招いている（Strominger Brain Res Bull 2001, 55, 445; Schmidt Nat Biotech 2007, 25, 825）。
【０００６】
現在開発中のＴＬＲ７／８作動薬のほとんどが毒性特性を示すことが多く、不安定であり、及び／又は実体のない免疫刺激効果を有するので、ＴＬＲ７及び／又はＴＬＲ８を活性化する有効で且つ安全なワクチンアジュバントの発見及び開発は、既存の及び新規のワクチンの安全性及び有効性を改善するのに必須である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Lee PNAS 2006, 103, 1828
【非特許文献２】Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2008, 295, R123
【非特許文献３】Brain Res Bull 2001, 55, 445;
【非特許文献４】Nat Biotech 2007, 25, 825
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本明細書で我々は、単独で投与した際、又は抗原とのデポー製剤で投与した際、免疫細胞への取り込みを促進し、エンドソームのＴＬＲ７／８の活性化と抗原提示を高めるような方法で、ホスホ脂質又はホスホノ脂質に共有結合した窒素へテロシクリル置換のオキソアデニンを含む新規の脂質付加オキソアデニンを記載する。本発明の化合物での高い免疫応答はおそらく、エンドソームのＴＬＲ７及び／又はＴＬＲ８又はそのほかの分子受容体との式（Ｉ）の化合物の直接的な相互作用、及び／又はＴＬＲ７及び／又はＴＬＲ８又はそのほかの分子受容体による酵素作用の後の活性のある代謝体の相互作用による。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の化合物は、インターフェロン−α及びそのほかの免疫賦活性サイトカインの誘導剤であることが示されており、感染性疾患及び癌の治療的な又は予防的な治療にてワクチン抗原にアジュバントとして使用されると、既知のサイトカイン誘導剤に比べて改善された活性−毒性の特性を持ち得る。また、これらの化合物は新規である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１はＩＦＮα、ＩＬ−１２ｐ７０及びＩＦＮγの産生を示す図である。
【図２】図２はＴＮＦα、ＩＬ−６及びＩＬ−１０の産生を示す図である。
【図３】図３はＭＣＰ−１の産生を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本出願の全体を通して、化合物、組成物及び方法に関する種々の実施形態を参照する。記載される種々の実施形態は、種々の例証となる例を提供するのであって、代替種の記載として解釈されるべきではない。むしろ、本明細書で提供される種々の実施形態は、重なり合う範囲であってもよいことが言及されるべきである。本明細書で議論される実施形態は単に説明するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００１２】
本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本明細書及びそれに続く特許請求の範囲では、以下の意味を有するように定義されるべきである多数の用語を参照する。
【００１３】
「アルキル」は、１〜１４の炭素原子、一部の実施形態では１〜６の炭素原子を有する一価の飽和脂肪族ヒドロカルビル基を指す。「Ｃｘ〜Ｃｙアルキル」はｘ〜ｙの炭素原子を有するアルキル基を指す。この用語には、例証として、たとえば、メチル（ＣＨ３−）、エチル（ＣＨ３ＣＨ２−）、ｎ−プロピル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２−）、イソプロピル（（ＣＨ３）２ＣＨ−）、ｎ−ブチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、イソブチル（（ＣＨ３）２ＣＨＣＨ２−）、ｓｅｃ−ブチル（（ＣＨ３）（ＣＨ３ＣＨ２）ＣＨ−）、ｔ−ブチル（（ＣＨ３）３Ｃ−）、ｎ−ペンチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、及びネオペンチル（（ＣＨ３）３ＣＣＨ２−）のような直鎖及び分枝鎖のヒドロカルビル基が挙げられる。
【００１４】
「アルコキシ」は、アルキルが本明細書で定義される−Ｏ−アルキル基を指す。アルコキシには、例として、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ及びｎ−ペントキシが挙げられる。
【００１５】
「アシル」は、Ｈ−Ｃ（Ｏ）−基、アルキル−Ｃ（Ｏ）基及びアルケニル−Ｃ（Ｏ）基を指す。
【００１６】
「アミノ」は、Ｒ４が独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、ヘテロアリール及び複素環から選択される−ＮＨＲ４基を指す。
【００１７】
「シクロアルキル」は、３〜１４の炭素原子の環ヘテロ原子を含まない飽和又は部分飽和の環状基を指す。
【００１８】
特に指示されない限り、本明細書で明白に定義されない置換基の命名は、官能基の終点部分を命名し、その後連結点に向かって隣接官能基が続くことによって達せられる。たとえば、置換基「アリールアルキルオキシカルボニル」は（アリール）−（アルキル）−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−基を指す。上記の定義が許容不能な置換パターン（たとえば、５つのフルオロ基で置換されるメチル）を含めることを意図しないことが理解される。そのような許容不能な置換パターンは当業者に周知である。
【００１９】
本発明の化合物は、ホスホ脂質基又はホスホノ脂質基に共有結合した窒素へテロシクリル置換のオキソアデニンを含むアジュバント分子である。本発明の化合物は一般に式（Ｉ）によって記載され：又は薬学上許容可能なその塩である；
【化１】
2013501730.tif 000002
【００２０】
式中、
Ｒ１＝Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルキルアミノ、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ３〜６シクロアルキルＣ１〜６アルキル、Ｃ３〜６シクロアルキルＣ１〜６アルキルアミノ、Ｃ３〜６シクロアルキルＣ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アルコキシＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシＣ１〜６アルキルアミノ、Ｃ１〜６アルコキシＣ１〜６アルコキシ；及び任意で、ヒドロキシル、アミノ、チオ、ヒドラジノ、ヒドラジド、アジド、アセチルエニル、カルボキシル又はマレイミドの基によって末端置換されたもの；
ｎ＝０〜６
Ｈｅｔは、４員環、５員環又は６員環の置換された窒素複素環であり、式中、
Ｘ、Ｙ＝ＣＨ又はＮ、且つＸとＹの少なくとも一方が窒素原子であり、
Ｑ＝Ｏ、ＮＨ又は共有結合、
Ｚ＝Ｏ、ＣＨ２、ＣＦ２又は共有結合、
Ｗ＝Ｏ、Ｓ
ｍ＝０〜６
ｐ＝１又は２
ｑ＝０又は１
Ａ＝
【化２】
2013501730.tif 000003
【００２１】
式中、
Ｒ２＝Ｈ又は飽和若しくは不飽和のＣ４〜Ｃ２４アルキル若しくはアシル
Ｒ３＝飽和又は不飽和のＣ４〜Ｃ２４アルキル又はアシル。
【００２２】
好まれる一実施形態では、本発明の化合物は、式ＩＩによって一般に記載され；又は薬学上許容可能なその塩である；
【化３】
2013501730.tif 000004
【００２３】
式中、
Ｒ１＝Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルキルアミノ、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ３〜６シクロアルキルＣ１〜６アルキル、Ｃ３〜６シクロアルキルＣ１〜６アルキルアミノ、Ｃ３〜６シクロアルキルＣ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アルコキシＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシＣ１〜６アルキルアミノ、Ｃ１〜６アルコキシＣ１〜６アルコキシ；分枝鎖又は非分枝鎖；
ｎ＝０〜６、
Ｘ＝ＣＨ又はＮ、
Ｑ＝Ｏ、ＮＨ、又は共有結合、
Ｚ＝Ｏ、ＣＨ２、ＣＦ２又は共有結合、
Ｗ＝Ｏ、Ｓ
ｍ＝０〜６
ｐ＝１又は２
ｑ＝０又は１
Ｒ２＝Ｈ又は飽和若しくは不飽和のＣ４〜Ｃ２４アルキル若しくはアシル
Ｒ３＝飽和又は不飽和のＣ４〜Ｃ２４アルキル又はアシル。
【００２４】
本発明の化合物は、（１）好適に保護された窒素へテロシクリルアルキルブロミドＩＶによるＩＩＩのアルキル化、（２）酸性条件下でＶのＮ保護基及びＯ保護基の同時脱保護、並びに（３）ｍ＝０でＱ＝単結合の本発明の化合物ＶＩＩＩを得るためのＶＩ（ｍ＝０でＱ＝単結合）のＮ−複素環置換基の直接ホスファチジル化、又は代わりにｍ＝２〜６でＱ＝Ｏ又はＮＨの本発明の化合物ＶＩＩＩを得るための、Ｎ−又はＯ−保護のアミノ又はヒドロキシアルキルブロミドによるＶＩのアルキル化とその後の脱保護とＶＩＩによるＯ又はＮ−ホスファチジル化のいずれか、によって、スキーム１の一実施形態で示されるように既知のオキソアデニン中間体から調製される。
【化４】
2013501730.tif 000005
【００２５】
スキーム１
さらなる一態様では、本発明は、式ＩＸの構造を有する化合物、又は薬学上許容可能なその塩を含み、
【化５】
2013501730.tif 000006
【００２６】
式中、
Ｒ１は、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルキルアミノ、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アルコキシＣ１〜６アルキルアミノ、Ｃ１〜６アルコキシＣ１〜６アルコキシから成る群から選択され；
ｎは、０〜２であり、
Ｘは、ＣＨ又はＮであり、
Ｑは、Ｏ、ＮＨ又は共有結合であり、
ｍは、０〜２であり、
ｑは、０であり、
Ｒ２は、Ｈ又は飽和若しくは不飽和のＣ４〜Ｃ２４アルキル若しくはアシルであり、
Ｒ３は、飽和又は不飽和のＣ４〜Ｃ２４アルキル又はアシルである。
【００２７】
別の態様では、本発明は、式ＩＸの構造を有する化合物、又は薬学上許容可能なその塩を含み、
式中、
Ｒ１は、Ｃ１〜６アルコキシであり、
ｎは、０〜２であり、
Ｘは、ＣＨ又はＮであり、
Ｑは、Ｏ、ＮＨであり、
ｍは、０〜２であり、
ｑは、０であり、
Ｒ２は、Ｈ又は飽和若しくは不飽和のＣ４〜Ｃ２４アルキル若しくはアシルであり、
Ｒ３は、飽和又は不飽和のＣ４〜Ｃ２４アルキル又はアシルである。
【実施例】
【００２８】
実施例１（化合物Ａ１）
６−アミノ−２−ブトキシ−９−［Ｎ−（２−（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ）エチル）−４−ピペリジニルメチル］−８−ヒドロキシプリン（化合物（ＩＩ）、Ｒ１＝ｎ−ブトキシ、ｎ＝１、Ｘ＝ＣＨ、Ｑ＝Ｏ、Ｚ＝Ｏ、Ｗ＝Ｏ、ｍ＝２、ｐ＝１、Ｒ１＝Ｒ２＝ｎ−Ｃ１５Ｈ３１ＣＯ）の調製
【化６】
2013501730.tif 000007
【００２９】
（１）無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、５．５ｍＬ）中の６−アミノ−２−ブトキシ−８−メトキシプリン（０．５５ｇ）の溶液に炭酸カリウム（０．６５ｇ）を加え、得られた反応混合物を６０℃で１時間加熱した。追加のＤＭＦ（１．５ｍＬ）を用いて１，１−ジメチルエチル４−（ブロモメチル）−１−ピペリジンカルボキシレート（０．５ｇ）を加え、残留ブロミドを転移させ、反応混合物を５０℃にて３時間撹拌した。室温にて１６時間後、５０℃での加熱をさらに５時間続け、反応を完了させた。次いで水を加え、得られた混合物を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）で３回抽出した。合わせた有機抽出物を水で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮した。ＭｅＯＨ−ＣＨＣｌ３（勾配溶出；１：９９→２．５：９７．５）によるシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィによって、黄色固形物として０．６４ｇ（９４％）の１，１−ジメチルエチル４−［６−アミノ−２−ブトキシ−８−メトキシ−プリン−９−イル］メチル−１−ピペリジンカルボキシレートを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ５．１４（ｓ，２Ｈ），４．２７（ｔ，２Ｈ），４．１１（ｓ，３Ｈ），３．８１（ｄ，２Ｈ），２．６５（ｍ，２Ｈ），２．０３（ｍ，１Ｈ），１．７７（ｐ，３Ｈ），１．５７−１．４５（ｍ，１４Ｈ），１．２６−１．１７（ｍ，２Ｈ），０．９７（ｔ，３Ｈ）。
【００３０】
（２）上記（１）で調製した化合物（０．６３ｇ）のＭｅＯＨ（１６ｍＬ）溶液にジオキサン中の４．０ＭのＨＣｌ（５．３ｍＬ）を加えた。室温にて４．５時間撹拌した後、反応混合物を濃縮し、高真空下で乾燥させた。ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（勾配溶出９０：１０：１→７５：２５：１）によるシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィによって、白色固形物として０．４０４ｇ（８５％）の塩酸６−アミノ−２−ブトキシ−９−（４−ピペリジニルメチル）−８−ヒドロキシプリンを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ４．８４（ｓ，５Ｈ），４．２７（ｔ，２Ｈ），３．７９（ｄ，２Ｈ），３．４０（ｄ，２Ｈ），２．９６（ｔ，２Ｈ），２．２１（ｍ，１Ｈ），１．９２（ｄ，２Ｈ），１．７５（ｍ，２Ｈ），１．６０−１．４７（ｍ，４Ｈ），１．００（ｔ，３Ｈ）。
【００３１】
（３）上記（２）で調製した化合物（１．２４ｇ）のＤＭＦ（１２．６ｍＬ、０．２５Ｍ）溶液に、Ｋ２ＣＯ３（１．７４ｇ）を加えた。得られた混合物を６０℃で１時間加熱し、２−ブロモエトキシ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラン（０．８１ｍＬ）で処理し、次いで５０℃にて１８時間加熱した。冷却した反応混合物の反応を水で止め、分液漏斗に移し、ＥｔＯＡｃによって３回抽出した。合わせた有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮した。シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィによって、白っぽい固形物として１．２５ｇ（８３％）の６−アミノ−２−ブトキシ−９−［Ｎ−（２−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）エチル）−４−ピペリジニルメチル−］−８−ヒドロキシプリンを得た。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３−ＣＤ３ＯＤ，４００ＭＨｚ）：δ４．２６（ｍ，４Ｈ），３．７５（ｍ，４Ｈ），３．３６（ｍ，２Ｈ），２．９６（ｍ，２Ｈ），２．５４（ｔ，２Ｈ），１．９２（ｂｓ，１Ｈ），１．７３（ｍ，２Ｈ），１．６６（ｍ，２Ｈ），１．４０−１．５１（ｍ，５Ｈ），０．９８（ｔ，３Ｈ），０．８９（ｍ，９Ｈ），０．０６（ｓ，６Ｈ）。
【００３２】
（４）上記（３）で調製した化合物（２．７４ｇ）のＭｅＯＨ（４１ｍＬ）溶液にジオキサン中４．０ＭのＨＣｌ（５．７ｍＬ）を加えた。室温にて０．５時間撹拌した後、反応混合物を濃縮し、高真空下で乾燥させた。ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（勾配溶出９０：１０：１→７５：２５：１）によるシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィによって、白色固形物として２．２９ｇ（１００％）の塩酸６−アミノ−２−ブトキシ−９−（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−４−ピペリジニルメチル）−８−ヒドロキシプリンを得た。１ＨＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，４００ＭＨｚ）：δ４．５３（ｔ，２Ｈ），３．８７（ｍ，４Ｈ），３．６６（ｄ，２Ｈ），３．２２（ｍ，２Ｈ），３．０１（ｔ，２Ｈ），２．２１（ｍ，１Ｈ），１．９８（ｄ，２Ｈ），１．８１（ｍ，２Ｈ），１．６８（ｍ，２Ｈ），１．５２（ｍ，２Ｈ），１．０１（ｔ，３Ｈ）。
（５）ピリジン（６．４ｍＬ）中の上記（４）で調製した化合物（５１ｍｇ）とホスホン酸水素１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセリル（９３ｍｇ、化合物Ｖ１、Ｒ１＝Ｒ２＝パルミトイル）の溶液を塩化ピバロイル（０．０４７ｍＬ）で処理し、得られた反応混合物を室温で６時間撹拌した。次いでピリジン／水中のヨウ素（１２９ｍｇ）の溶液を加え、反応混合物を室温で１時間撹拌し、ＣＨＣｌ３で希釈し、次いで１ＭのＮａ２Ｓ２Ｏ５によって反応を止めた。水性層をＣＨＣｌ３で２回抽出し、合わせた有機層を１Ｍのホウ酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ８）で洗浄した。有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮した。ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ−Ｅｔ３Ｎ（勾配溶出９０：１０：１→７５：２５：１）によるシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィによって、白っぽい固形物として３８ｍｇ（３０％）の６−アミノ−２−ブトキシ−９−［Ｎ−（２−（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ）エチル）−４−ピペリジニルメチル］−８−ヒドロキシプリンを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３−ＣＤ３ＯＤ，４００ＭＨｚ）：δ５．１７（ｂｓ，１Ｈ），４．３２（ｄｄ，１Ｈ），４．２０−４．０９（ｍ，５Ｈ），３．９８（ｂｒｔ，２Ｈ），３．６９（ｂｒ  ｄ，３Ｈ），３．２３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），１．８６（ｂｒ  ｓ，４Ｈ），１．６９（ｍ，２Ｈ），１．５３（ｂｒ  ｓ，４Ｈ），１．４２（ｄｄ，２Ｈ），１．２０（ｍ，４８Ｈ），０．９１（ｔ，３Ｈ），０．８３（ｔ，６Ｈ）；ＨＲＭＳ［Ｍ−Ｈ］−Ｃ５２Ｈ９４Ｎ６Ｏ１０Ｐ：計算値９９３．６７６８，観察値９９３．６７８２。
【００３３】
実施例２（化合物Ａ２）
６−アミノ−２−ブトキシ−９−［Ｎ−（２−（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホルアミド）エチル）−４−ピペリジニルメチル］−８−ヒドロキシプリン（化合物（ＩＩ）、Ｒ１＝ｎ−ブトキシ、ｎ＝１、Ｘ＝ＣＨ、Ｑ＝ＮＨ、Ｚ＝Ｏ、Ｗ＝Ｏ、ｍ＝２、ｐ＝１、Ｒ１＝Ｒ２＝ｎ−Ｃ１５Ｈ３１ＣＯ）の調製
【化７】
2013501730.tif 000008
【００３４】
（１）実施例１−（３）で記載したのと同様に、Ｋ２ＣＯ３の存在下でＤＭＦ（１．１ｍＬ）中にて、実施例１−（２）で調製した化合物を２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）エチルブロミド（６７ｍｇ）によってアルキル化し、白っぽい固形物として８４ｍｇ（６７％）の１，１−ジメチルエチル４−［６−アミノ−２−ブトキシ−８−メトキシ−プリン−９−イル］メチル−１−ピペリジニルエチルアミニルカルボキシレートを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３−ＣＤ３ＯＤ，４００ＭＨｚ）：δ４．２５（ｔ，２Ｈ），３．７３（ｄ，２Ｈ），３．３８（ｍ，２Ｈ），３．２０（ｍ，２Ｈ），２．８９（ｍ，２Ｈ），２．４４（ｍ，２Ｈ），１．９７（ｔ，３Ｈ），１．７５（ｍ，２Ｈ），１．６６（ｍ，２Ｈ），１．４２−１．５１（ｍ，１１Ｈ），０．９７（ｔ，３Ｈ）。
【００３５】
（２）実施例１−（４）で記載したのと同様に、上記（１）で調製した化合物（８３ｍｇ）をジオキサン中４ＮのＨＣｌによってＮ−脱保護して白っぽい固形物として５８ｍｇ（７４％）の二塩酸６−アミノ−２−ブトキシ−９−［Ｎ−（２−アミノエチル）４−ピペリジニルメチル］−８−ヒドロキシプリンを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：δ４．１５（ｔ，２Ｈ），３．５８（ｄ，２Ｈ），２．８８（ｔ，２Ｈ），２．８１（ｄ，２Ｈ），２．４６（ｔ，２Ｈ），１．９１（ｔ，２Ｈ），１．７９（ｍ，１Ｈ），１．６４（ｍ，２Ｈ），１．５２（ｍ，２Ｈ），１．３９（ｄｄ，２Ｈ），１．２８（ｍ，２Ｈ），０．９１（ｔ，３Ｈ）。
【００３６】
（３）ホスホン酸水素１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセリル（１６７ｍｇ；化合物Ｖ１、Ｒ１＝Ｒ２＝パルミトイル）のピリジン（１１．３ｍＬ）溶液をクロロトリメチルシラン（０．０８７ｍＬ）とトリエチルアミン（０．１２６ｍＬ）で処理し、得られた反応混合物を室温で０．５時間撹拌した。上記（２）で調製した化合物（３７ｍｇ）とトリエチルアミン（０．１２６ｍＬ）のピリジン（２．３ｍＬ）懸濁液を反応混合物に加え、次いでヨウ素（７５ｍｇ）を加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌し、濃縮し、トルエンと共に２回共蒸発した。ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ−Ｅｔ３Ｎ（勾配溶出９０：１０：１→７５：２５：１）によるシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィによって、橙色のガラス状固形物として３９ｍｇ（１８％）の６−アミノ−２−ブトキシ−９−［Ｎ−（２−（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホルアミド）エチル）−４−ピペリジニルメチル］−８−ヒドロキシプリンを得た。Ｒｆ（ＣＨＣｌ３−ＣＨ３ＯＨ−Ｈ２Ｏ−ＮＨ４ＯＨ）＝０．６８。
【００３７】
実施例３（化合物Ａ３）
６−アミノ−２−ブトキシ−９−［１−（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホルアミド）−４−ピペラジニルエチル］−８−ヒドロキシプリン（化合物（ＩＩ）、Ｒ１＝ｎ−ブトキシ、ｎ＝２、Ｘ＝Ｎ、Ｑ＝単結合、Ｚ＝Ｏ、Ｗ＝Ｏ、ｍ＝０、ｐ＝１、Ｒ１＝Ｒ２＝ｎ−Ｃ１５Ｈ３１ＣＯ）の調製
【化８】
2013501730.tif 000009
【００３８】
（１）実施例１−（１）で記載したのと同様に、Ｋ２ＣＯ３の存在下でＤＭＦ中にて、１，１−ジメチルエチル４−（ブロモエチル）−１−ピペラジンカルボキシレート（１２０ｍｇ）によって６−アミノ−２−ブトキシ−８−メトキシプリン（１３１ｍｇ）をアルキル化し、淡黄色の固形物として１２４ｍｇ（７４％）の１，１−ジメチルエチル４−［６−アミノ−２−ブトキシ−８−メトキシ−プリン−９−イル］エチル−１−ピペラジンカルボキシレートを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３−ＣＤ３ＯＤ，４００ＭＨｚ）：δ５．６６（ｄ，２Ｈ），４．２５（ｔ，２Ｈ），４．０５（ｔ，２Ｈ），４．１０（ｓ，３Ｈ），３．３５（ｂｓ，４Ｈ），２．７１（ｔ，２Ｈ），２．４６（ｂｓ，４Ｈ），１．７６（ｍ，２Ｈ），１．４８（ｍ，２Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ），０．９６（ｔ，３Ｈ）。
【００３９】
（２）実施例１−（２）で記載したのと同様に、上記（１）で調製した化合物（１２４ｍｇ）をジオキサン中４．０ＭのＨＣｌによってＮ−脱保護し、白っぽい固形物として８７ｍｇ（７７％）の塩酸６−アミノ−２−ブトキシ−９−（４−ピペラジニルエチル）−８−ヒドロキシプリンを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，４００ＭＨｚ）δ４．２６（ｔ，２Ｈ），３．９６（ｍ，２Ｈ），３．１１（ｍ，５Ｈ），２．７８（ｍ，７Ｈ），１．７３（ｍ，２Ｈ），１．４８（ｍ，２Ｈ），１．３８（ｍ，１Ｈ），０．９８（ｔ，３Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ  １６１．８，１５５．６，１５０．８，１４９．７，１００．１，６８．８，５５．９，５０．８，４４．２，３７．７，３１．９，２０．１，１４．１；ＨＲＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋Ｃ１５Ｈ２５Ｎ７Ｏ２：計算値３３６．２１３６，観察値３３６．２１４８。
【００４０】
（３）実施例２−（３）で記載したのと同様に、上記（２）で調製した化合物（２８８ｍｇ）をホスホン酸水素１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセリル（５１８ｍｇ）によってホスファチジル化し、黄褐色の固形物として３１３ｍｇ（４６％）の６−アミノ−２−ブトキシ−９−［１−（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホルアミド）−４−ピペラジニルエチル］−８−ヒドロキシプリンを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３−ＣＤ３ＯＤ，４００ＭＨｚ）：δ５．１１（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），４．２８（ｄ，１Ｈ），４．１２−４．０１（ｍ，５Ｈ），３．７６（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），３．６０−２．６０（ｍ，１１Ｈ），２．２１（ｍ，４Ｈ），１．６５（ｍ，２Ｈ），１．４９（ｍ，４Ｈ），１．３９（ｑ，２Ｈ），１．１７（ｍ，４８Ｈ），０．８８（ｔ，３Ｈ），０．８１（ｔ，６Ｈ）；ＨＲＭＳ［Ｍ−Ｈ］-Ｃ５０Ｈ９２Ｎ７Ｏ９Ｐ：計算値９６４．６６１６，観察値９６４．６６００。
【００４１】
我々は、マウスにおける免疫応答の種々の側面を促進するＴＬＲ７リガンドの能力を評価した。自然免疫を具体的に検討して脂質付加したＴＬＲ７化合物が固有のケモカイン及び炎症誘発性のサイトカインを誘導することができるかどうかを結論付けた。この自然免疫の応答は、病原体に対する最初の非特異的な防御を生体に提供する。これらの固有のケモカイン及びサイトカインの中で、Ｉ型のＩＦＮは、生き残り、分化及び記憶の進展に関して未感作のＣＤ８Ｔ細胞のプログラムに必要とされると考えられる。マウスでの研究はまた、炎症の程度及び持続時間は、Ｔ細胞が記憶特性を獲得する速度を調節することを示唆している。
【００４２】
実施例４：ＴＬＲ７−ＤＰＰＣリポソームの調製
クロロホルム中１０ｍｇ／ｍＬの脂質付加ＴＬＲ７−ＬＡ１を１０．４ｍＬ、丸底ガラスバイアルに移した。このバイアルに１００ｍｇ／ｍＬでクロロホルムに可溶化したＤＰＰＣを１８．４ｍＬ加えた。５ｍｇ／ｍＬでクロロホルムに可溶化した脂質付加ＴＬＲ７−Ｌ化合物Ａ３を丸底ガラスバイアルに移した。このバイアルに１００ｍｇ／ｍＬでクロロホルムに可溶化したＤＰＰＣを２０ｍＬ加えた。穏やかな減圧下でＢｕｃｈｉ  Ｒｏｔａｖａｐｏｒにてクロロホルムを蒸発させた。真空下のデシケータにて少なくとも一晩、得られた膜をさらに乾燥させた。その後、事前に６０℃に加熱した５０ｍＭのＰＯ４−１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７）の緩衝液を用いて軌道振盪器（最大速度：２５０ｒｐｍ）にて脂質膜をゆっくり水和した。
【００４３】
再懸濁の完了後、さらにリン脂質水和を高めるために膨潤工程を実施したが、それは、室温にて調製物をインキュベートすることから成る。次いで、ロータ／固定子ホモゲナイザー（Ｘ６２０ＣＡＴ）を用い、８０００ｒｐｍにて１２分間、懸濁液を予備ホモジネートした。
【００４４】
次いで微細流動化チャンバーを約４０℃で保持しながら、６バールにて微細流動化装置（モデル１１０Ｓ−シリアル９０１８１−Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて微細流動化を実施した。ＰＥＳフィルター（ＧＤ／Ｘ０．２μｍ、２５ｍｍ、Ｗｈａｔｍａｎ）にて無菌濾過を達成した。
【００４５】
実施例５：２００８０６７２：ＳＩＶ−ｐ２７モデル−ＤＰＰＣリポソーム−Ａ３及びＡ１
脂質付加分子Ａ３及びＡ１を生体内で評価した。表１に要約したＳＩＶ−ｐ２７含有の製剤を用いて６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６メスのマウス（１０匹／群）にワクチン接種した。マウスは、１４日間離して２回、５０μＬの筋肉内注射を受け、以下に示すように初回と追加の後、様々な時点で採血した。
【表１】
2013501730.tif 000010
【００４６】
ＴＬＲ７作動薬と所有権のあるＡＳ０１Ｂアジュバント（ＱＳ２１＋ＭＰＬ）を含有する製剤によって誘導された自然免疫及び獲得免疫を相当するＡＳ０１Ｂ含有製剤と空のＤＰＰＣリポソームによって誘導したものとも比較した。
【表２】
2013501730.tif 000011
【００４７】
ＡＳ０１Ｂ参照群とＴＬＲ７−Ｌ含有製剤で免疫した群との間でサイトカインの異なった分析結果が認められた。注射の直後（３時間）、ＤＰＰＣリポソーム内で製剤化したＴＬＲ７−Ｌ双方で免疫したマウスの血清にてＩＦＮ−αが用量依存的に検出された（図１）。ＴＬＲ７−ＬがＤＯＰＳ／ＤＯＰＣ−リポソームで製剤化された場合、そのような血清のＩＦＮαの固有の反応は認められなかった（データは示さず）。
【００４８】
製剤にＡ３又はＡ１が存在する場合、たとえば、ＴＮＦ−αやＩＬ−６のようなそのほかの炎症性サイトカインが増えたが、Ａ１の方がＡ３よりも強力だった（図２）。双方の化合物の存在下でケモカインＭＣＰ−１も増えた（図３）。全体では、これらのデータは、ＴＬＲ７−Ｌ脂質付加分子は、ＭＰＬ／ＱＳ２１に基づいた製剤と組み合わせた場合、Ｉ型ＩＦＮを誘導し、炎症誘発性のサイトカイン反応を高めるのに有効であることを示している。
【００４９】
ここで使用したＴＬＲ７−Ｌ分子は、ＡＳ０１参照群と比べて適応的なＴ細胞応答をさらに高めることはなかった。
【図１】
2013501730.tif 000022
【図２】
2013501730.tif 000023
【図３】
2013501730.tif 000024
【国際調査報告】
2013501730.tif 000025