(57)【要約】  本発明は、遺伝子組み換えパラミクソウイルス、このパラミクソウイルスを含む医薬組成物、腫瘍性疾患の治療および／または予防的治療のための遺伝子組み換えパラミクソウイルスの使用、ならびに腫瘍性疾患の治療または予防的治療のための医薬組成物の製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型（ｗｔ）と比較して、Ｆ遺伝子内に少なくとも第１の遺伝子組み換えを含み、Ｐ遺伝子内に少なくとも第２の遺伝子組み換えを含むことを特徴とする、遺伝子組み換えパラミクソウイルス。
【請求項２】
前記第１の遺伝子組み換えの結果として親和性が拡張されることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。
【請求項３】
前記第２の遺伝子組み換えの結果として親和性が制限されることを特徴とする、請求項１または２に記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。
【請求項４】
遺伝子組み換えセンダイウイルス（ＳｅＶ）であることを特徴とする、先行する請求項のいずれかに記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。
【請求項５】
前記第１の遺伝子組み換えによってＳｅＶ  ｗｔプロテアーゼ切断部位をコードするヌクレオチド配列が遍在性プロテアーゼ切断部位をコードするヌクレオチド配列と置き換えられることを特徴とする、請求項４に記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。
【請求項６】
前記遍在性プロテアーゼ切断部位がニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）のＦ遺伝子に由来することを特徴とする、請求項５に記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。
【請求項７】
前記ＳｅＶ  ｗｔプロテアーゼ切断部位がアミノ酸配列ＶＰＱＳＲ（配列番号５）を含み、かつ／または前記遍在性プロテアーゼ切断部位がアミノ酸配列ＲＲＱＫＲ（配列番号６）を含むことを特徴とする、請求項５または６に記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。
【請求項８】
前記第２の遺伝子組み換えによって、Ｐ遺伝子のヌクレオチド配列にコードされる非構造アクセサリータンパク質の少なくとも１つが修飾されることを特徴とする、先行する請求項のいずれかに記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。
【請求項９】
前記第２の遺伝子組み換えによって、前記非構造アクセサリータンパク質の少なくとも１つが転写不可能となっていることを特徴とする、請求項８に記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。
【請求項１０】
前記第２の遺伝子組み換えによって、前記非構造アクセサリータンパク質の少なくとも１つにおいて開始コドンが機能破壊されていることを特徴とする、請求項９に記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。
【請求項１１】
前記非構造アクセサリータンパク質が、Ｃ’、Ｃ、Ｙ１、Ｙ２、ＶおよびＷから成る群より選択されることを特徴とする、請求項８〜１０のいずれかに記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。
【請求項１２】
前記第２の遺伝子組み換えによって、少なくともＣ（Ｃおよび／またはＣ’）タンパク質ならびにＹ（Ｙ１および／またはＹ２）タンパク質が修飾され、好ましくは機能破壊されていることを特徴とする、請求項１１に記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。
【請求項１３】
前記第２の遺伝子組み換えによって、少なくともＣ（Ｃおよび／またはＣ’）タンパク質、Ｖタンパク質ならびにＷタンパク質が修飾され、好ましくは機能破壊されていることを特徴とする、請求項１１に記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。
【請求項１４】
前記第２の遺伝子組み換えによって、少なくともＣ（Ｃおよび／またはＣ’）タンパク質、Ｖタンパク質、Ｗタンパク質ならびにＹ（Ｙ１および／またはＹ２）タンパク質が修飾され、好ましくは機能破壊されていることを特徴とする、請求項１１に記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。
【請求項１５】
野生型（ｗｔ）と比較して少なくとも１つの導入遺伝子を含むことを特徴とする、先行する請求項のいずれかに記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。
【請求項１６】
前記導入遺伝子が自殺遺伝子、もしくはそれ以外の細胞死誘導遺伝子または免疫刺激遺伝子であることを特徴とする、請求項１５に記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルスと薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする、医薬品組成物。
【請求項１８】
腫瘍性疾患、好ましくは固形腫瘍の増殖、より好ましくは肝細胞癌の進行を治療および／または予防的に治療するための、請求項１〜１６のいずれかに記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルスの使用。
【請求項１９】
（１）請求項１〜１６のいずれかに記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルスを提供すること、および（２）前記遺伝子組み換えパラミクソウイルスを薬学的に許容される担体を用いて製剤化することを含むことを特徴とする、腫瘍性疾患、好ましくは固形腫瘍の増殖、より好ましくは肝細胞癌の進行の治療および／または予防的治療のための医薬組成物を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組み換えパラミクソウイルス、このパラミクソウイルスを含む医薬組成物、腫瘍性疾患の治療および／または予防的治療のための遺伝子組み換えパラミクソウイルスの使用、ならびに腫瘍性疾患の治療または予防的治療のための医薬組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
統計的に、ヨーロッパ人の３人に１人は、一生のうちにがんを発症する。ドイツでは、毎年約３９万５千人ががんになるが、うち約１９万５千人が女性であり、約２０万人が男性である。これらの症例のほとんどが、６０歳を過ぎてから発症している。
【０００３】
固形腫瘍は、今もなお臨床腫瘍学における大きな課題である。個々の腫瘍性疾患の予後を大きく改善するには、集学的概念を組み込んだ新しい治療原則を確立すること以外に方法はほとんどない。
【０００４】
このような新しい治療原則の１つは、腫瘍の治療のために増殖型ウイルスを適用することに関するものである。このアプローチはウイルス療法または腫瘍崩壊と呼ばれている。正常な柔組織細胞における複製は抑制されているものの、種々の腫瘍細胞において選択的に複製を引き起こすような腫瘍崩壊特性を有するウイルスは多数存在する。現在、ウイルス療法用の複数の薬剤が臨床試験に供されている。
【０００５】
パラミクソウイルス科のウイルスは非常に興味深い。エンベロープウイルスであるこの科の重要なメンバーは、アビュラウイルス属のニューカッスル病ウイルス、モルビリウイルス属の麻疹ウイルス、およびレスピロウイルス属のセンダイウイルスである。
【０００６】
パラミクソウイルスのゲノムは、一本鎖マイナス鎖ＲＮＡ（すなわち遺伝子または読み枠（ＯＲＦ）をアンチセンスにコードするＲＮＡ分子）を含む。センダイウイルスでは、ＲＮＡゲノムにおいて３’頭部領域から順にウイルス遺伝子Ｎ（ヌクレオカプシド）、Ｐ（リン酸化）、Ｍ（マトリクス）、Ｆ（膜融合）、ＨＮ（赤血球凝集素／ノイラミニダーゼ）およびＬ（巨大）が続き、次いで５’尾部領域が来る。
【０００７】
Ｎ、ＰおよびＬタンパク質は、ゲノムＲＮＡによってコードされた遺伝子の発現、およびＲＮＡの自己複製に必要である。ＨＮタンパク質は、特定の細胞型への感染を助ける。いわゆるマトリクスタンパク質（Ｍ）は、ウイルス粒子中に存在する膜に関係している構造タンパク質である。
【０００８】
Ｆタンパク質は、初感染および隣接する細胞へのウイルスの拡大に必要な細胞膜融合を引き起こすことにより、感染の中心的機能を果たす。このタンパク質は、不活性な前駆体Ｆ０としてウイルス感染細胞内で合成され、宿主細胞の細胞膜に由来するウイルスの脂質エンベロープに固定される。Ｆ０は、トリプターゼ「クララ」によって活性なサブユニットＦ１およびＦ２へと切断されるが、このトリプターゼ「クララ」は、ネズミやマウスの呼吸器に存在し、気管支上皮細胞から分泌される。Ｆ１およびＦ２は細胞膜を融合させる能力を有し、この能力を用いてウイルスによる宿主の感染を開始する。したがって、Ｆ０の切断は、センダイウイルスの伝染性および病原性の明確な決定要因である。また、利用できるプロテアーゼが限られていることは、マウスにおけるセンダイウイルスの感染を呼吸器のみにとどめ、全身感染を引き起こさないための重要な決定要因である。
【０００９】
ＫｉｎｏｈらによるＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ａｎｄ  ｌｙｓｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎｓｅｓ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１，１１３７−１１４５（２００４）では、腫瘍性疾患を治療するための遺伝子組み換えセンダイウイルスの使用が提案されている。遺伝子組み換えの原理は、ウイルスのＦタンパク質に対する人工的切断部位の導入である。腫瘍特異的マトリクスメタロプロテイナーゼは、この切断部位を認識して切断することができる。そのため、組み換えウイルスの腫瘍特異的複製が可能となる。さらに、既知の遺伝子組み換えセンダイウイルスは、ウイルスＭタンパク質中に欠失を含み、その結果、細胞と細胞とが接触して融合する場合を除いてウイルスの拡大が不可能となり、子孫ウイルスの放出が阻害される。この組み換えセンダイウイルスも、欧州特許第１５０５１５４号明細書に開示されている。
【００１０】
ＫｉｎｏｈらによるＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ａｎｄ  ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ  ｆｏｒ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｈｕｍａｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１６，３９２−４０３（２００９）には、ウイルスＦタンパク質中に短縮されたアミノ酸を有し、その結果融合活性の増加が見込まれる遺伝子組み換えセンダイウイルスが記載されている。さらに、このウイルスＦタンパク質は、いわゆる「ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）感受性配列」（ＳＧＲＳ）を含む。この配列の存在により、多種の腫瘍において、腫瘍特異的プロテアーゼによるＦ０の切断および活性化を通じたウイルスの複製が可能となる。
【００１１】
Ｅｌａｎｋｕｍａｒａｎらによってオンライン出版されたＴｙｐｅ  Ｉ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ−Ｄｉｓｅａｓｅ−Ｖｉｒｕｓ  ｆｏｒ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２０１０）では、抗がん剤としての組み換えニューカッスル病ウイルス（ｒＮＤＶ）の使用が提案されており、このウイルスは、Ｖタンパク質中に突然変異を含む「ｒＢＣ−Ｅｄｉｔ」と呼ばれるウイルス、またはＦタンパク質中に突然変異を含む「ｒＬａＳｏｔａ  Ｖ．Ｆ．」と呼ばれるウイルスのいずれかである。
【００１２】
米国特許第２００９／０１７５８２６号明細書では、腫瘍崩壊剤としての組み換えニューカッスル病ウイルス（ｒＮＤＶ）の使用が示唆されており、この組換えウイルスは、腫瘍細胞株においてアポトーシスを引き起こす導入遺伝子を含む。
【００１３】
しかしながら、当技術分野でこれまでに述べられた腫瘍崩壊ウイルスについて、その有用性が証明されたわけではない。有効であるという明確な証拠に基づいた臨床応用については、今後の実証が待たれる。特に、これまで当技術分野で使用されてきた腫瘍崩壊ウイルスには、かなりの程度で非腫瘍細胞にも感染し、これらの細胞を破壊するという短所がある。このような理由で、これまでに使用されてきた腫瘍崩壊ウイルスを臨床応用に使用することはできない。また、個々のウイルスシステムがどの腫瘍性疾患に対して効を奏すかは明らかになっていない。そのため、これまで使用されてきた腫瘍崩壊ウイルスは、臨床応用には使用できない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
このような背景下、本発明の基をなす目的は、これまでに使用されてきた腫瘍崩壊ウイルスの短所の大部分を回避することができる、改善された腫瘍崩壊ウイルスを提供することである。特に、腫瘍細胞内で複製して細胞を破壊することができるが、非腫瘍細胞内での複製は強く抑制され、その結果、疫学的安全性が十分に満たされるような腫瘍崩壊ウイルスを提供する必要がある。
【００１５】
上記の目的は、遺伝子組み換えパラミクソウイルス、好ましくは、野生型（ｗｔ）と比較してＦ遺伝子内に少なくとも第１の遺伝子組み換えを含み、Ｐ遺伝子内に少なくとも第２の遺伝子組み換えを含む遺伝子組み換えセンダイウイルス（ＳｅＶ）を提供することによって達成される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】センダイウイルスのゲノムの構造を示す。
【図２】センダイウイルスのｃＤＮＡを有するｐＳＶＶ１０プラスミドの構造を示す。
【図３】Ｐ遺伝子内の非構造アクセサリー遺伝子の読み枠（ＯＲＦ）を示す。
【図４】クローニングベクターｐＳＬ１１８０へのサブクローン化を示す。
【図５】突然変異誘発ＰＣＲの原理を示す。
【図６】突然変異誘発ＰＣＲ後に突然変異の確認を行うためのプライマースキームを示す。
【図７】再クローニングのステップ１を示す。ここでは、変異したＳｐｈＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントがｐＳＬ１１８０  Ｓｐｈ１−Ｅｃｏ  ｐＳＶＶ１０クローニングベクターから切り出され、センダイウイルスベクターｐＶＶ１３に移植される。
【図８】再クローニングのステップ２を示す。Ｍ、Ｆ、ＨＮのＯＲＦを欠いた上記のｐＳＶＶ１３ベクターに、ｐＲＳ  Ｉｄ−Ｅ  Ｆｍから得られたこれらの領域を修飾されたＦ切断部位とともにＥｃｏＲＩによって移植した。生じたベクターは変異したＰ／Ｃ領域およびＮＤＶから得られた遍在性Ｆ切断部位を含む。
【図９】ベロ細胞由来産生細胞および肝癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｕＨ７、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５）における本発明のウイルスの複製を示す。
【図１０】非腫瘍細胞（ＭＲＣ−５：ヒト線維芽細胞、ＰＨＨ：初代ヒト肝細胞）における本発明のウイルスの複製を示す。
【図１１】ｉｎ  ｖｉｖｏにおける本発明のウイルスの増幅を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明によれば、「パラミクソウイルス」はパラミクソウイルス科のウイルスおよびそれらの増殖によって生じたウイルスを指す。パラミクソウイルスは、レスピロウイルス属、ルブラウイルス属、アビュラウイルス属およびモルビリウイルス属を含むパラミクソウイルス亜科ならびにニューモウイルス属およびメタニューモウイルス属を含むニューモウイルス亜科を包含する。パラミクソウイルスの分類についての詳細は、たとえばＫｎｅｉｐｅらによるＦｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第５版，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００７）に記載されている。
【００１８】
本発明者らの見出した限り、本発明の好ましい実施形態によれば、基本的にはセンダイウイルスのすべてのウイルス株が本発明による組み換えに適したウイルス株であると言える。センダイウイルスのうち特に適した株は、「Ｆｕｓｈｉｍｉ」「Ｈａｒｒｉｓ」「Ｚ株」「Ｏｈｉｔａ」「Ｈａｍａｍａｔｓｕ」「Ｃａｎｔｅｌｌ」および「５２」である。
【００１９】
本発明者らは、Ｆ遺伝子またはＦタンパク質の遺伝子を組み換えて特定のプロテアーゼによる制限をなくすることにより、腫瘍組織内でウイルスが効率的に拡大し、幅広い種類の腫瘍の感染が可能となることを初めて突き止めた。
【００２０】
センダイウイルスのＦ遺伝子のヌクレオチド配列は、添付の配列表の配列番号１で示され、その遺伝子番号は１４８９７７５である。センダイウイルスのＦタンパク質のアミノ酸配列は、添付の配列表の配列番号２で示され、そのデータベースアクセス番号はＢＡＡ２４３９０．１またはＮＰ＿０５６８７７である。
【００２１】
本発明者らはまた、Ｐ遺伝子またはＰタンパク質における第２の遺伝子組み換えによりウイルスが弱毒化することを突き止めた。Ｐ遺伝子内の遺伝子組み換えまたは突然変異によって、Ｃ’、Ｃ、Ｙ１およびＹ２遺伝子またはタンパク質の読み枠がシフトする。しかしながら、Ｐタンパク質は完全に元のままの状態で残る。
【００２２】
センダイウイルスのＰ遺伝子のヌクレオチド配列は、添付の配列表の配列番号３で示される。Ｐタンパク質のアミノ酸配列は、添付の配列表の配列番号４で示され、そのデータベースアクセス番号はＢＡＡ２４３８６．１およびＡＡＢ０６２７９である。
【００２３】
Ｐ遺伝子は、Ｃ’、Ｃ、Ｙ１、Ｙ２、ＶおよびＷと呼ばれるいくつかの非構造アクセサリータンパク質をコードする。これらのタンパク質は、オーバーラップした読み枠の「ＲＮＡの編集」によって作製される。非構造アクセサリータンパク質の正確な機能については、その詳細が完全に解明されているわけではないが、インターフェロンシステム等の、感染細胞の持つ非特異的防御システムと相互作用できることが推測されている。
【００２４】
本発明に従って組み換えられたパラミクソウイルスは、野生型ウイルスとは対照的に、腫瘍組織内で非依存的に複製して組織を破壊し、特定の腫瘍細胞型への特異性は見られない。驚くべきことに、本発明のウイルスは、ヒト初代肝細胞や線維芽細胞等の非腫瘍細胞においては、非常に限定的な複製しかできない。その結果、本発明のウイルスは非腫瘍細胞と比較すると非常に高い選択性で腫瘍細胞に感染する。そのため正常組織の損傷は顕著に減少し、ウイルスによる治療の範囲は広くなる。
【００２５】
本発明によれば、「遺伝子組み換え」とは、本発明のパラミクソウイルスにおけるゲノム、遺伝子情報またはコードされたタンパク質の、好ましくは標的を定めて行われる野生型からの変更を言い、これはたとえば標的突然変異誘発により導入できる。
【００２６】
好ましいさらなる発展形態によれば、第１の遺伝子組み換えは、ウイルスの親和性が拡張されるように設計される。
【００２７】
この方策には、本発明のウイルスが、たとえば少数の組織または腫瘍細胞においてのみ発現されるような特定のプロテアーゼに依存しなくなるという利点がある。これに関連して、たとえば野生型センダイウイルスは、気管支上皮細胞においてのみ発現されるトリプターゼに依存しており、そのため気管支上皮細胞以外には感染できない。Ｋｉｎｏｈら（２００９；上記引用文献）により記載されたウイルスはマトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）に依存し、そのためＭＭＰを発現する腫瘍細胞以外には感染できない。対照的に、本発明によるさらに発展したウイルスは、Ｆ遺伝子内の第１の遺伝子組み換えにより、あらゆる腫瘍細胞に感染して溶解させることができる。
【００２８】
さらに好ましい実施形態によれば、第２の遺伝子組み換えは、親和性が制限されるように設計される。
【００２９】
この方策には、ウイルスの安全性が向上しかつ副作用は顕著に低減するという利点がある。本発明のウイルスは腫瘍細胞を選択的に溶解させるが、正常細胞に対してはまったく溶解させないか、あるいはごくわずかしか溶解させない。本発明者らは、Ｐ遺伝子（すなわち非構造タンパク質）において標的を定めた遺伝子組み換えを行うことによって、ウイルスが腫瘍細胞に狙いを定めて複製するような効果を溶解対象である細胞における反応に対して及ぼすことができることを突き止めた。このアプローチは、Ｋｉｎｏｈら（２００９；上記引用文献）が記載したような、構造タンパク質をコードするＭ遺伝子の欠失によって不完全ウイルス粒子を合成させるというアプローチとは異なるものである。このようなアプローチは、溶解活性の低減にもつながる。驚くべきことに、腫瘍細胞のみを溶解対象とする本発明のウイルスの溶解活性は非常に高い。
【００３０】
Ｆ遺伝子内の第１の遺伝子組み換えによってＳｅＶ  ＷＴプロテアーゼ切断部位をコードするヌクレオチド配列（アミノ酸配列ＶＰＱＳＲ（配列番号５）を含む）が遍在性プロテアーゼ切断部位をコードするヌクレオチド配列と置き換えられることが好ましく、該遍在性プロテアーゼ切断部位をコードするヌクレオチド配列は、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）のＦ遺伝子（アミノ酸配列ＲＲＱＫＲ（配列番号６）を含む）に由来することが好ましい。
【００３１】
本発明による、Ｆタンパク質内のタンパク質分解性ＳｅＶ−ＷＴプロテアーゼ切断部位の修飾は、野生型から特定のプロテアーゼによる制限をなくするものである。このＦタンパク質は、結果として遍在性プロテアーゼによって切断できるようになり、マウスの呼吸器にのみ存在するような特定のプロテアーゼや、さらには腫瘍産生性プロテアーゼへの依存から解放される。その結果、この遺伝子組み換えウイルスは、より幅広い種類の腫瘍に使用することができる一方、耐性発現のリスクは顕著に低減されている。
【００３２】
本発明のさらなる好ましい発展形態によれば、Ｐ遺伝子内の第２の遺伝子組み換えによってＰ遺伝子にコードされる非構造アクセサリータンパク質の修飾が起き、好ましくは該アクセサリータンパク質のうち少なくとも１つが転写不能となり、さらに好ましくは開始コドンの機能破壊により転写不能となる。
【００３３】
これらの方策には、本発明によって組み換えられたウイルスが、非悪性細胞および正常な組織における複製が顕著に抑制されることによって弱毒化されるという利点がある。その結果、本発明のウイルスは、腫瘍細胞により的確に狙いを定めて感染し、それらを溶解させることができる。
【００３４】
非構造アクセサリータンパク質は、Ｃ’、Ｃ、Ｙ１、Ｙ２、ＶおよびＷから成る群から選択されることが好ましく、Ｐ遺伝子内の第２の遺伝子組み換えによって、好ましくは少なくともＣ’／ＣおよびＹ１／Ｙ２タンパク質、さらに好ましくは少なくともＣ’／Ｃ、ＶおよびＷタンパク質、さらに好ましくは少なくともＣ’／Ｃ、Ｖ、ＷおよびＹ１／Ｙ２タンパク質が修飾され、それぞれ機能破壊されていることが好ましい。
【００３５】
本発明者らがモデルシステムで見出した限り、上記のように組み換えられたウイルスは、腫瘍細胞選択性が非常に高く、非腫瘍細胞における複製能は非常に低い。
【００３６】
センダイウイルスのＣ’遺伝子のヌクレオチド配列は、添付の配列表の配列番号７で示され、その遺伝子番号はＡＢ００５７９６．１である。センダイウイルスのＣ’タンパク質のアミノ酸配列は、添付の配列表の配列番号８で示され、そのデータベースアクセス番号はＢＡＡ２４３９４である。
【００３７】
センダイウイルスのＣ遺伝子のヌクレオチド配列は、添付の配列表の配列番号９で示される。センダイウイルスのＣタンパク質のアミノ酸配列は、添付の配列表の配列番号１０で示され、そのデータベースアクセス番号はＢＡＡ２４３９６である。
【００３８】
センダイウイルスのＶ遺伝子のヌクレオチド配列は、添付の配列表の配列番号１１で示される。センダイウイルスのＶタンパク質のアミノ酸配列は、添付の配列表の配列番号１２で示され、そのデータベースアクセス番号はＢＡＡ２００２１である。
【００３９】
センダイウイルスのＷ遺伝子のヌクレオチド配列は、添付の配列表の配列番号１３で示される。センダイウイルスのＷタンパク質のアミノ酸配列は、添付の配列表の配列番号１４で示され、そのデータベースアクセス番号はＡＡＸ０７４４４である。
【００４０】
センダイウイルスのＹ１遺伝子のヌクレオチド配列は、添付の配列表の配列番号１５で示される。センダイウイルスのＹ１タンパク質のアミノ酸配列は、添付の配列表の配列番号１６で示され、そのデータベースアクセス番号はＢＡＡ２４３８８である。
【００４１】
センダイウイルスのＹ２遺伝子のヌクレオチド配列は、添付の配列表の配列番号１７で示される。センダイウイルスのＹ１タンパク質のアミノ酸配列は、添付の配列表の配列番号１８で示され、そのデータベースアクセス番号はＡＡＸ０７４４９である。
【００４２】
好ましいさらなる一実施形態によれば、本発明のウイルスは、野生型（ｗｔ）のウイルスと比較して少なくとも１つの導入遺伝子を含み、この導入遺伝子は、好ましくは自殺遺伝子、またはそれ以外の細胞死誘導遺伝子もしくは免疫刺激遺伝子である。
【００４３】
この方策には、感染した腫瘍細胞の破壊の激化に寄与する導入遺伝子の産物として、本発明のウイルスの細胞毒性が増強されるという利点がある。抗腫瘍効果のある導入遺伝子もまた、包含される。
【００４４】
このような背景下、本発明のさらなる主題は、本発明の遺伝子組み換えパラミクソウイルスと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
【００４５】
薬学的に許容される担体は、従来技術、たとえばＢａｕｅｒらによるＬｅｈｒｂｕｃｈ  ｄｅｒ  Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｓｃｈｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ，  Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｌｉｃｈｅ  Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ｍｂＨ  Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ（１９９９）、ＫｉｂｂｅらによるＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）等に包括的に記載されている。前記刊行物の内容は、本発明の開示に含まれる。上記の医薬品組成物が細胞増殖抑止剤等のさらなる補助的薬剤や活性薬剤を含んでもよいことは言うまでもない。
【００４６】
本発明のさらにまた別の主題は、腫瘍性疾患、好ましくは固形腫瘍の増殖、より好ましくは肝細胞癌の進行を治療および／または予防的に治療するための、本発明の遺伝子組み換えパラミクソウイルスの使用に関する。
【００４７】
肝細胞癌は年間１００万人の割合で発生しており、世界的に最も多く見られる悪性腫瘍の１つである。切除および肝移植による根治治療が可能な症例はごくわずかである。これまでのところ、試験したどの化学療法に対しても明らかな耐性が見られたため、信頼できる代替治療概念は存在しない。このようなニーズは、本発明によって効果的に満たされる。
【００４８】
本発明のさらにまた別の主題は、腫瘍性疾患、好ましくは固形腫瘍の増殖、より好ましくは肝細胞癌の進行の治療および／または予防的治療のための医薬組成物を製造する方法に関し、該方法は（１）本発明の遺伝子組み換えパラミクソウイルスを提供すること、および（２）前記遺伝子組み換えパラミクソウイルスを薬学的に許容される担体を用いて製剤化することを含む。
【００４９】
上述した特徴および以下で説明する特徴が、具体的に示す組合せに限定されず、本発明の範囲から逸脱しない他の組合せまたは単独で使用できることは理解されるであろう。
【００５０】
以下、本発明を実施例により説明し、本発明のさらなる特徴、利点、および特性を明らかにする。添付の図面を参照されたい。
【実施例】
【００５１】
１．  センダイウイルスのゲノムの構成
センダイウイルスは、約１５ｋｂのゲノムを有するマイナス鎖ＲＮＡウイルスである。そのゲノムの構成を図１に示す。６つの構造タンパク質の遺伝子は、３’−Ｎ−Ｐ−Ｍ−Ｆ−ＨＮ−Ｌ−５’の順序でウイルスゲノムＲＮＡ上に配置されている。最初の遺伝子の前には５４のヌクレオチドを含むリーダー領域（ｌｄ）があり、最後の遺伝子の後には５７ヌクレオチド長のトレーラー領域（ｔｒ）が続く。各遺伝子の下の数字は、ｂｐで表した各遺伝子の長さに相当する。各遺伝子の転写において、該ウイルスのポリメラーゼは、遺伝子開始モチーフ（ＧＳ）と呼ばれる、３’末端に位置する保存配列からｍＲＮＡの合成を開始し、次いで非翻訳領域（ＵＴＲ）、ウイルス遺伝子の読み枠（ＯＲＦ）と進み、最後に遺伝子終止モチーフ（ＧＥ）でｍＲＮＡの合成を停止する。２つの発現ユニット間には、ｍＲＮＡには組み込まれない３ｂｐの保存された遺伝子間モチーフ（Ｉ）が見られる。
【００５２】
本発明の基礎は、いわゆるｐＳＶＶ１０プラスミド、より正確にはセンダイウイルスＦｕｓｈｉｍｉ株、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１０５のｃＤＮＡをコードする１９．７７４ｂｐのｐＳＶＶ１０ＩｄＧＦＰＭＦＨＮプラスミドの形態で提供される。このプラスミドを図２に示す。
【００５３】
２．  Ｐ遺伝子によってコードされるアクセサリータンパク質の詳細な説明
センダイウイルスのアクセサリータンパク質Ｃ’、Ｃ、Ｙ１、Ｙ２、ＶおよびＷは、Ｐ遺伝子によってコードされる。Ｃタンパク質およびＹタンパク質のＯＲＦは＋１塩基分ずつシフトしている。Ｖタンパク質およびＷタンパク質は、いわゆる編集部位（ＥＳ）に挿入されているＧタンパク質の数に応じて作製される。アクセサリー遺伝子を有するＰ−ＯＲＦ配列領域を図３に示す。数字は、ＰＳＶＶ１０ベクター内の位置である。
【００５４】
３．  突然変異誘発プラスミド内でのサブクローン化
アクセサリータンパク質の遺伝子に点変異を挿入するために、突然変異誘発ＰＣＲを行った。しかしながら、この方法に使用できるのはサイズが８ｋｂまでのプラスミドに限られる。センダイウイルスのゲノムのＰ／Ｖ／Ｃ領域は、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩによってセンダイウイルスベクターｐＳＶＶ１０（１９７７４ｂｐ）からクローニングベクターｐＳＬ１１８０（３４２２ｂｐ）中にサブクローン化した。これを実施するため、ｐＳＶＶ１０（図２）とｐＳＬ１１８０の両ベクターを酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩで消化し、ｐＳＶＶ１０（２２５４ｂｐ）内の突然変異の対象となる上記領域をｓＰＬ１１８０（３３０３ｂｐ）のベクターバックボーンにライゲートした。生じたクローニングプラスミドｐＳＬ１１８０  ＳｐｈＩ−Ｅｃｏ  ｐＳＶＶ１０のサイズは５５５７ｂｐであった（図４参照）。
【００５５】
４．  突然変異誘発
標的を定めた変異によってアクセサリー遺伝子Ｃ’、Ｃ、Ｙ１およびＹ２の転写を防止することが必要である。編集部位の変異には、それ以上の編集を起こさせなくする効果もある。以下の概略図に、ｐＳＬ１１８０のクローニング関連領域を、すべての遺伝子開始部位、編集部位とともに示す（配列番号１９）。
2013524798.tif 000002
【００５６】
アクセサリータンパク質の遺伝子の開始配列を機能的に破壊する一方、Ｐ読み枠のアミノ酸には変化をもたらさない３種のプライマーを設計した。
2013524798.tif 000003
2013524798.tif 000004
突然変異誘発ＰＣＲにおいて、これらのプライマーを用いて以下の変異が生成した。
2013524798.tif 000005
【００５７】
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標）社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キットを使用することにより、サイズが８ｋｂまでのプラスミドに対し、３ステップで標的を定めた点変異を挿入することが可能となる。第１のステップでは、それぞれ異なる点変異を含むミスマッチプライマーが反応に付され、変性したテンプレートの１本鎖にアニールする。このとき、すべてのプライマーが同一のテンプレート鎖に結合するよう注意しなければならない。ＰｆｕＴｕｒｂｏポリメラーゼは、プライマーから相補的配列の伸長を開始するが、プライマー自体を置き換えることはない。新たに生成したＤＮＡ鎖には、変異と１本鎖の突出末端（いわゆる「ニック」）とが組み込まれる。このニックは、ブレンド酵素の構成要素によって適切に置き換えられる。
【００５８】
第２のステップでは、ＤｐｎＩを用いた消化を行い、メチル化またはヘミメチル化されたＤＮＡを特異的に消化する。大腸菌内で増幅されたプラスミドはｄａｍ−メチル化されている。そのため親テンプレートは消化されるが、ＰＣＲで生成した変異を含むコピーは消化されない。
【００５９】
最後のステップにおいて、ｓｓＤＮＡはＸＬ１０−Ｇｏｌｄウルトラコンピテントセル内に形質転換され、生体内でｄｓＤＮＡに変換される。ここで、プラスミドを該細菌から単離し、シークエンシングにより挿入された変異の分析を行うことができる。突然変異誘発ＰＣＲの原理を図５に示す。
【００６０】
突然変異誘発分析は、以下のように構成される（表１）。
【表１】
2013524798.tif 000006
【００６１】
突然変異誘発ＰＣＲは、従来のＰＣＲと似ているが、伸長時間だけが非常に長い。これは、ベクター全体の相補鎖を形成する必要があることによる。したがって、伸長時間はベクターによって異なる。１ｋｂ当たり２分間であり、ここでｐＳＶＶ１０から得る５．５ｋｂ以下のｐＳＬ１１８０＋Ｅｃｏ−ＳｐｈＩ断片は伸長時間１１分間に相当する（表２参照）。
【表２】
2013524798.tif 000007
【００６２】
増幅直後にＤｐｎＩ制限酵素（１０Ｕ／μｌ）１μｌをＰＣＲ分析に加えてピペットで再懸濁し、短時間の遠心分離を行った後、３７℃で消化させた。生じたｓｓＤＮＡをＸＬ１０−Ｇｏｌｄウルトラコンピテントセルに形質転換し、Ｍｉｎｉｐｒｅｐを用いてｄｓＤＮＡに変異したプラスミドとして該細菌から単離した（表３参照）。
【表３】
2013524798.tif 000008
５．  シークエンシング
生じた変異プラスミドに変異が正確に挿入されているかどうかを確認した。変異領域全体を含むプライマースキームを図６に示す。上部の数字はオリジナルのベクターｐｓＶＶ１０（〜１９ｋｂ）における位置情報を表し、下部の数字はｐＳＬ１１８０＋ｐＳＶＶ１０クローニングベクター（〜５．５ｋｂ）における位置情報を表す。
【００６３】
６．  センダイウイルス全体をコードするベクターへの変異配列の再クローニング
変異させた配列領域は、再クローニングすることによってセンダイウイルスの完全なｃＤＮＡ配列を有するベクターに戻す必要があった。げっ歯動物の呼吸器においてトリプターゼ「クララ」によってのみ活性化される切断部位の代わりに遍在性Ｆ切断部位を有するウイルスを作製するため、ベクターｐＲＳ  Ｉｄ−ＥＧＦＰ  Ｆｍｕｔ（１９９５８ｂｐ，Ｓａｓｃｈａ  Ｂｏｓｓｏｗ，ＭＰＩミュンヘン）のｅｃｏ−ｅｃｏ領域を使用した。これは、ヌクレオチド配列（ＧＴＴＣＣＡＣＡＧＴＣＧＡＧＡ；配列番号３３）を有する、センダイウイルスのＦタンパク質中の切断部位の代わりに、配列（ＣＧＴＣＧＴＣＡＧＡＡＧＡＧＡ；配列番号３４）を有する、ニューカッスル病ウイルスのＦタンパク質の遍在性切断部位を含むものである。
【００６４】
まず、ｐＳＬ１１８０  Ｓｐｈ１−Ｅｃｏ  ｐＳＶＶ１０クローニングベクターから異なる変異ＳｐｈＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを切り出し、センダイウイルスベクターｐＳＶＶ１３へと移植した。このベクターは、ｐＳＶＶ１０と類似しているが、Ｆ遺伝子およびＨＮ遺伝子領域を欠いている。次いで、ＥｃｏＲＩを用いて、このベクターに、欠失しているＦ遺伝子およびＨＮ遺伝子領域としてｐＲＳ  Ｉｄ−ＥＧＦＰ  ＦｕｔのＦ遺伝子における修飾された切断部位を移植した。生じたベクターをｐＳｅＶｍｕｔと呼ぶ。「レスキュー」法を用いたＢＳＲ−Ｔ７細胞へのトランスフェクションによって、機能性センダイウイルスを作製した。再クローニングのステップ１を図７に、またステップ２を図８に示す。
【００６５】
７．  組み換えセンダイウイルスの作製
パラミクソウイルス科のための「レスキュー」法によって、遺伝子組み換えウイルスを作製することができる。ＢＳＲ−Ｔ７は構成的にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する細胞であるが、ヘルパープラスミドおよびセンダイウイルスのｃＤＮＡをコードするプラスミドを、リポフェクションによってこの細胞に共導入した。Ｔ７プロモーターによって制御されるこれらのプラスミドは細胞内で転写され、いくつかのステップを経てウイルスタンパク質およびウイルスのマイナス鎖ＲＮＡゲノムを生じ、機能性ウイルスを生成する。
【００６６】
ＢＳＲ−Ｔ７細胞（６ウェルプレートの各ウェルにつき３×１０５個）を播種し、３７℃で一晩培養した。トランスフェクションのために、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｆｕｇｅｎｅ６の量はＤＮＡ１μｇ当たり２μｌに相当）を含むＤＭＥＭ２００μｌをバイアルに入れ、５分間インキュベートした。表４に記載のＤＮＡ成分を加えた後、さらなるインキュベーションステップを室温で２５分間実施する。
【表４】
2013524798.tif 000009
【００６７】
前記ＢＳＲ−Ｔ７細胞をＤＭＥＭで２回洗浄し、次いで１．８ｍｌのＤＭＥＭ培地＋２％ＦＣＳを加える。インキュベートしたトランスフェクション混合物を撹拌下で滴下し、細胞を３３℃で３日間培養した。次いで、トランスフェクトしたＢＳＲ−Ｔ７細胞を１回につき１ｍｌのＤＭＥＭで３回洗浄し、残存するプラスミドを除去した。ここへ１ｍｌの新鮮ＤＭＥＭ培地＋２％ＦＣＳを加え、新たに生成したウイルスを１日後に回収した。
【００６８】
ベロ細胞にトランスフェクトして増幅させる前に、ウイルスを含む上清を室温、３００ｒｐｍで４分間遠心分離した。４日前に調製（播種：３．５ｃｍのディッシュ１枚当たり細胞２×１０５個；目標：感染日に３．５ｃｍのディッシュ１枚当たり細胞約１０６個）したベロ細胞をＤＭＥＭで２回洗浄し、撹拌下（１５分毎）、３３℃で１時間かけて１００〜５００μｌのＢＳＲ−Ｔ７上清（培地を含む吸着量〜５００μｌ）を用いて感染させた。接種材料を除去し、細胞をＤＭＥＭで２回洗浄した後、培地を毎日交換しながら１ｍｌの培地中、３３℃で２〜５日間インキュベートした。ウイルスにコードされたマーカータンパク質としてのｅＧＰＦが蛍光顕微鏡によって検出された時点で、培養上清を除去した。この最初の継代ウイルスを用いて、さらに規模を拡大して継代（第２、第３継代）を作製した。ウイルスの子孫の力価をＴＣＩＤ５０法によって定量した。
【００６９】
本発明に従って、以下の遺伝子修飾または組み換えを受けたセンダイウイルスを作製した。
ａ）ＳｅＶ  Ｆｍｕｔ：ＮＤＶ切断部位を有するセンダイウイルスＦｕｓｈｉｍｉ株
ｂ）ＳｅＶ  Ｆｍｕｔ  ｄＶ：さらにＶ遺伝子およびＷ遺伝子に変異を有するａ株
ｃ）ＳｅＶ  Ｆｍｕｔ  ｄＣ：さらにＣ遺伝子およびＣ’遺伝子に変異を有するａ株
ｄ）ＳｅＶ  Ｆｍｕｔ  ｄＣｄＹ：さらにＣ遺伝子およびＣ’遺伝子ならびにＹ１遺伝子およびＹ２遺伝子に変異を有するａ株
ｅ）ＳｅＶ  Ｆｍｕｔ  ｄＣｄＶ：さらにＣ遺伝子およびＣ’遺伝子ならびにＶ遺伝子およびＷ遺伝子に変異を有するａ株
ｆ）ＳｅＶ  Ｆｍｕｔ  ｄＣｄＹｄＶ：さらにＣ遺伝子およびＣ’遺伝子、Ｖ遺伝子およびＷ遺伝子、ならびにＹ１遺伝子およびＹ２遺伝子に変異を有するａ株
【００７０】
８．  組み換えセンダイウイルスの特性決定
作製した組み換えセンダイウイルスについて、いくつかのレベルで広く特性決定を行った。ウイルスの複製は、形質転換されていないベロ細胞由来産生細胞、および腫瘍細胞、具体的には肝癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｕＨ７、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５）、および数種類の非腫瘍細胞、具体的にはヒト線維芽細胞株ＭＲＣ５や様々な提供者から得た初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）等を用いて分析した。
【００７１】
増殖曲線
１．  １２のウェルに１×１０５個の細胞（５００μｌ中）（ベロ細胞、肝癌細胞、ＭＲＣ  ５、ＰＨＨを使用し、いずれも１×１０５個から開始）を用意
２．  増殖
３．  培地を除去、ＰＢＳで１回洗浄
４．  ２５０μｌのＯｐｔｉＭＥＭを添加
５．  ウイルスをＯｐｔｉＭＥＭ（ＭＯＩ  ０．０５）で希釈
６．  細胞に希釈したウイルスを添加
７．  ６種のＳｅＶ変異体すべてを用いて感染（残った希釈物は凍結させ、開始値としての滴定を行う）
８．  ３７℃で１時間かけて感染
９．  細胞をＰＢＳで２回洗浄
１０．  １ｍｌの新鮮培地（ＤＭＥＭ  ５％ＦＣＳ）を添加
１１．  ２４、４８、７２、９６時間後（感染開始からの時間）に上清中のウイルスを除去し、−８０℃で保存（各２００μｌ）
ａ．  培地で注意深く２回洗浄
ｂ．  １０００ｍｌの培地（ＤＭＥＭ  ５％ＦＣＳ）を添加し、細胞をこすり取る
１２．  溶解物を−８０℃で凍結
１３．  滴定のため融解
ａ．  ３７℃の水浴に２分間
ｂ．  １０〜１５秒間のボルテックス
ｃ．  小型遠心分離機で３０００×ｇを２分間
１４．  遠心分離
１５．  ベロ細胞における滴定（ＴＣＩＤ５０）
ｄ．  ウイルス希釈物を調製（１本目は常に希釈しない）
ｅ．  ９６ウェルプレートに添加（プレートに常に新鮮培地を用意し４℃に調整）
ｆ．  細胞をトリプシン処理
ｇ．  ２×１０４個／９６ウェルとなるよう細胞を数えて添加
ｈ．  ３日後に力価を評価
【００７２】
図９に、ベロ細胞由来産生細胞および肝癌細胞における本発明のウイルスの複製を示す。生成した組み換えウイルスがいずれもベロ細胞由来産生細胞において非常によい複製能を示し、いずれも同等の力価を備え、ＴＣＩＤ５０／ｍｌが１０７〜１０８であることがわかる。
【００７３】
ウイルス粒子の滴定は、独立した３回の分析を繰り返して行った。その平均値および標準偏差を示す（ＩＯ＝接種材料）。
【００７４】
肝細胞癌の３種のヒト標準細胞株、ＨｕＨ７、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、およびＨｅｐ３Ｂにおいて、組み換えウイルスはいずれも腫瘍細胞内で非常によい複製能を示すことがわかった。したがって、本発明の組み換えウイルスの腫瘍崩壊作用に不可欠な要件の１つは満たされる。
【００７５】
ヒト線維芽細胞株ＭＲＣ−５および数人の異なる提供者から得た初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）を、代表的な非腫瘍細胞として分析した。結果を図１０に示す。分析した変異体の腫瘍崩壊の強度は、アクセサリータンパク質における欠失に依存する。欠失が１つのみのウイルス（ＳｅＶ  Ｖ  Ｆｍｕｔ  ｄＣ，ＳｅＶ  Ｖ  Ｆｍｕｔ  ｄＶ）は、正常細胞における複製能を中程度に失ったに過ぎなかったが、２つ以上の欠失を有するウイルス（ＳｅＶ  Ｆｍｕｔ  ｄＣｄＹ，  ＳｅＶ  Ｆｍｕｔ  ｄＣｄＶ，ＳｅＶ  Ｆｍｕｔ  ｄＣｄＹｄＶ）は、肝癌細胞（すなわち腫瘍細胞）において効率的に複製し、該細胞を破壊するものの、正常細胞への感染はほとんど観察されない。
【００７６】
ウイルス粒子の滴定は、独立した３回の分析を繰り返して行った（ＰＨＨは、異なる３人の提供者から得た）。その平均値および標準偏差を示す（ＩＯ＝接種材料）。
【００７７】
さらに実験を行いｉｎ  ｖｉｖｏでのウイルスの拡大を分析した。
１．  ５×１０６個のＨｕＨ７腫瘍細胞を、Ｂａｌｂ  ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスの右脇腹に皮下注入した。
２．  腫瘍の容積が少なくとも１００ｍｍ３に達した後、ＰＢＳ１００μｌ中のセンダイウイルスを腫瘍内へ投与した。
３．  ウイルスの注射から２日後に、マウスを犠死させ、腫瘍を摘出した。
４．  腫瘍の一部をＴｉｓｓｕｅ  Ｔａｃｋに包埋し、凍結させ、クリオトームを用いて薄切した。ウイルスによって発現されたＧＦＰを、蛍光顕微鏡で直接検出した。
５．  腫瘍の別の部分をパラフィン包埋し、ＧＦＰを特異的抗ＧＦＰ抗体によって検出した。
【００７８】
結果を図１１に示す。腫瘍細胞が組み換えウイルスＳｅＶ  Ｆｍｕｔに感染し、ウイルスがそこから拡大できることが、生体内で実証された。この結果から、所望の通り、生体内の肺以外にある腫瘍組織において複製可能であることが確認できる。ＳｅＶ  Ｆｍｕｔウイルスは、ヒト肝細胞癌異種移植組織（ＨｕＨ７）において増殖可能であるが、Ｄ５２ウイルス（Ｆｕｓｈｉｍｉ野生型変異体）は、腫瘍内へのウイルス投与後、高度に制限されて局所に留まる。
【００７９】
９．  結論
本発明者らは、野生型と比較してＦ遺伝子およびＰ遺伝子内に組み換えを有する様々な組み換えセンダイウイルスを用いて、抗腫瘍療法においてそれらを腫瘍崩壊ウイルスとして使用できることを実証できた。
【００８０】
以下の配列を一覧として記載する。
配列番号１：  ＳｅＶ（Ｏｈｉｔａ株）  Ｆ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号２：  ＳｅＶ（Ｏｈｉｔａ株）  Ｆタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３：  ＳｅＶ（Ｏｈｉｔａ株）  Ｐ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号４：  ＳｅＶ（Ｏｈｉｔａ株）  Ｐタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５：  ＳｅＶ−ＷＴ  プロテアーゼ切断部位のアミノ酸配列
配列番号６：  ＮＤＶ  Ｆタンパク質のプロテアーゼ切断部位のアミノ酸配列
配列番号７：  ＳｅＶ（Ｏｈｉｔａ株）  Ｃ’遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号８：  ＳｅＶ（Ｏｈｉｔａ株）  Ｃ’タンパク質のアミノ酸配列
配列番号９：  ＳｅＶ（Ｏｈｉｔａ株）  Ｃ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号１０：  ＳｅＶ（Ｏｈｉｔａ株）  Ｃタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１１：  ＳｅＶ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ株）  Ｖ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号１２：  ＳｅＶ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ株）  Ｖタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１３：  ＳｅＶ（Ｃａｎｔｅｌｌ株）  Ｗ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号１４：  ＳｅＶ（Ｃａｎｔｅｌｌ株）  Ｗタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１５：  ＳｅＶ（Ｏｈｉｔａ株）  Ｙ１遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号１６：  ＳｅＶ（Ｏｈｉｔａ株）  Ｙ１タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１７：  ＳｅＶ（５２株）  Ｙ２遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号１８：  ＳｅＶ（５２株）  Ｙ２タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１９：  ｐＳＬ１１８０のクローニング領域のヌクレオチド配列
配列番号２０：  ＰＣＲプライマー１のヌクレオチド配列
配列番号２１：  Ｐ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号２２：  変異したＰ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号２３：  変異したＣ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号２４：  ＰＣＲプライマー２のヌクレオチド配列
配列番号２５：  Ｐ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号２６：  Ｙ１遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号２７：  変異したＹ１遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号２８：  ＰＣＲプライマー３のヌクレオチド配列
配列番号２９：  Ｐ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号３０：  変異したＰ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号３１：  変異したＶ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号３２：  変異したＷ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号３３：  ＳｅＶ  Ｆ遺伝子の切断部位のヌクレオチド配列
配列番号３４：  ＮＤＶ  Ｆ遺伝子の切断部位のヌクレオチド配列
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2013524798.tif 000016
【図９】
2013524798.tif 000017
【図１０】
2013524798.tif 000018
【図１】
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【図１１】
2013524798.tif 000020
【配列表】
2013524798000001.app
【国際調査報告】
2013524798.tif 000021
2013524798.tif 000022
2013524798.tif 000023
2013524798.tif 000024
2013524798.tif 000025
2013524798.tif 000026
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