(57)【要約】本発明は、血小板の保存のための新たな方法に関する。特に、本発明は、血小板を１８℃〜２４℃の間の温度で実施されるゼオドレーションに供する段階を含む、方法を提供する。このようにして得られた乾燥血小板は、室温で長期間保存され得る。本発明は、保存された血小板を使用するためのキット及び組成物も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板、特にヒト血小板を保存するための方法であって：
血小板のサンプルを１８℃〜２４℃までの間で実施されるゼオドレーションに供して、乾燥血小板を得るステップ、及び
乾燥血小板を室温で保管するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
血小板のサンプルをゼオドレーションに供する工程が：
血小板のサンプルをチャンバーにロードするステップ；
チャンバー中に含まれる血小板のサンプルを真空下に置くステップ；ならびに
血小板を真空下で乾燥して、１０％以下の相対湿度及び０．６以下の水分活性を有する乾燥血小板を得るステップ、
を含み、
血小板のサンプルを真空下に置くステップ、及び、血小板を乾燥するステップが、血小板の温度を１８℃〜２４℃までの間に維持しながら実施される、請求項１記載の血小板を保存するための方法。
【請求項３】
血小板のサンプルをゼオドレーションに供する工程が：
血小板のサンプルをチャンバーにロードするステップ；
血小板を含むチャンバーの圧力を、７５mbar／分間の速度で５分間未満で７００mbarまで減少させるステップ；
血小板のサンプルを、７００mbarで５分間安定可能にするステップ；
血小板を含むチャンバーの圧力を、７５mbar／分間の速度で７分間未満で７００mbarから２００mbarまで減少させるステップ；
血小板を含むチャンバーの圧力を、少なくとも５mbar／分間の速度で２００mbarから１４５mbarまで減少させるステップ；ならびに
血小板を１４５mbarで約２時間〜約５時間の間乾燥して、１０％以下の相対湿度を有する乾燥血小板を得るステップ、
を含み、
圧力を減少させるステップ、及び、血小板を乾燥するステップが、血小板の温度を１８℃〜２４℃までの間に維持しながら実施される、請求項２記載の血小板を保存するための方法。
【請求項４】
血小板のサンプルの粘度が、血小板に富んだ血漿、血小板アフェレーシス又は洗浄血小板の粘度よりも低くなるように、血小板のサンプルが、血小板、血漿及び血小板添加溶液を含む、請求項１〜３のいずれか一項記載の血小板を保存するための方法。
【請求項５】
ゼオドレーションが、少なくとも１つの血小板保護剤の存在下で実施され、好ましくは、血小板保護剤は、トレハロース、マルトデキストリン、デキストロース、ＨＳＡ、ＰＤＭＳ及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項記載の血小板を保存するための方法。
【請求項６】
血小板保護剤がヒドロゲル含有炭水化物である、請求項５記載の血小板を保存するための方法。
【請求項７】
乾燥血小板を室温で保管することが、１週間超〜少なくとも９ヶ月まで実施される、請求項１〜６のいずれか一項記載の血小板を保存するための方法。
【請求項８】
乾燥血小板を室温で保管することが、光の非存在下及び乾燥大気中で乾燥血小板を保管することを含む、請求項７記載の血小板を保存するための方法。
【請求項９】
乾燥血小板を再水和して、再水和血小板を得るステップをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項記載の血小板を保存するための方法。
【請求項１０】
乾燥血小板を再水和するステップが：
乾燥血小板を湿度勾配に供して、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６５％及びより好ましくは９５％〜１００％の間の相対湿度を有する加湿血小板を得るステップ；ならびに
水を加湿血小板に添加して、再水和血小板を得るステップ、
を含む、請求項９記載の血小板を保存するための方法。
【請求項１１】
血小板のサンプルを、ゼオドレーション前に、アモトサレンＨＣｌの存在下でＵＶＡ照射に供して、血小板のサンプル中に存在するあらゆる病原体を不活性化するステップ；又は
再水和血小板を、アモトサレンＨＣｌの存在下でＵＶＡ照射に供して、再水和血小板中に存在するあらゆる病原体を不活性化するステップ、
をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項記載の血小板を保存する方法。
【請求項１２】
請求項１〜８及び１１のいずれか一項記載の方法によって得られる、乾燥血小板。
【請求項１３】
請求項９〜１１のいずれか一項記載の方法によって得られる、再水和血小板。
【請求項１４】
請求項１２記載の乾燥血小板及び乾燥血小板を含むコンテナを含むキットであって、コンテナは不透明であり、真空下又は不活性ガスの存在下における大気圧下で密封されている、キット。
【請求項１５】
請求項１３記載の再水和血小板及び再水和血小板を無菌条件下で含むコンテナを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１０年４月８日に出願された欧州特許出願番号EP 10 305 358.3の優先権を主張する。この欧州特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
血小板は、外膜ならびに顆粒、濃密体、暗調小管系及びミトコンドリアを含む細胞質を含む、非常に小さな血液の細胞成分である。血小板は、骨髄において産生され、脾臓によって体から除去される前に、循環系において平均９〜１０日間生存する。血小板の主な機能は、止血の維持（過度の失血を防ぐ体の正常な生理的工程）である。止血は、血管内皮への損傷後に、血栓（又は血塊）の形成によって主に達成される。
【０００３】
血小板輸血は、医療分野において（患者に特に、出血のコントロールを支援するために、及び、機能的に欠陥のある血小板を交換するために）広く使用されている。例えば、血小板輸血は、多量の血液を失った外傷患者に、血小板数を減少させ残りの血小板において機能的欠陥を引き起こすことが知られている化学療法を受けている患者に、及び、特定の血小板欠乏疾患（例えば、血小板減少症）を有する患者に施される。
【０００４】
輸血に使用される血小板は、２つのソースに由来し得る：全血の単位に由来する濃縮血小板（これは、ランダムドナー濃縮血小板と称される）、又は、血小板フェレーシス（これは、血小板を除いた血液をドナーに同時再輸液することを伴う、ドナーからの血小板の連続分離に関する技術である）によって単一ドナーから得られる血小板アフェレーシス。
【０００５】
採取又は使用のやり方が何であっても、血小板保存は、全血又は他の血液成分の保管によっては認められない問題がある。実際、血小板の生物学的活性を維持するだけでなく、臨床用途に好適な条件（例えば、細菌汚染の非存在）下で血小板を体から単離した後に、血小板を保存することは困難であることが証明されている。血小板の冷凍は、いくつかの限界に関連している。実際、４℃において、血小板は凝集し、保管の１日後に形態学的変化（これは、生物学的機能障害をもたらす）をする。その結果として、４℃で保管された血小板は、一般的には、機能活性が回復せず、保管によりしばしば損傷し、このことが、輸血後の循環から血小板が取り除かれる原因となる。従って、血小板の保管の標準的な手段は、穏やかに撹拌しながら室温（１８〜２４℃）に置くことである。しかしながら、嫌気性代謝活性に関連する乳酸産生の増加によるｐＨの低下のために、これらの条件下でさえ、保管期間は、３〜５日間に限られている。
【０００６】
標準的な保管条件下において、血小板は、たった数日間の有効期間を有するので、保管期間を延ばすため、及び、保管期間中の血小板機能の消失を減らす又は遅らせるための新たな戦略を考案することに大きな関心がある（Read et al., Mol. Med. Today, 1995, 1: 322-328）。開発された異なるアプローチの１つは、低温保存技術を使用することである。これらの方法は、一般的には、保管後に血小板数の増加を提供する。しかしながら、冷凍温度は、ジメチルスルホキシドなどの低温保存剤を血小板に添加することを必要とする。低温保存剤は細胞毒性であり、典型的には、機能的能力が減少したか、又は機能的能力がない大部分の血小板を残す（Blajchman, Transf. Clin. Biol., 2001, 8: 267-271）。
【０００７】
血小板を保存するための他の試みは、血小板活性化阻害剤（Bode et al., Blood Cells, 1992, 18: 361-380）、血漿遊離血小板保管培地（de Wildt-Eggen et al., Vax Sang, 2003, 84: 256-264）及び血小板添加溶液（Gulliksson, Transfus. Med., 2000, 10: 257-264; van der Meer, Transfus. Clin. Biol., 2007, 14: 522-525）の使用、ならびに、血小板産物（George et al., Blood, 1982, 60: 834-840; McGill et al., J. Lab. Clin. Med., 1987, 109: 127-133）及び血小板代替物（Okamura et al., Bioconj. Chem., 2009, 20: 1958-1965; Okamura et al., Bioconj. Chem., 2005, 16: 1589-1596）の開発を含んでいた。
【０００８】
血小板の保存に関する別の研究方法は、凍結乾燥の使用に着目している（Aster, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 28: 2419-2420; Read et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92: 397-401; Bode et al., Transf. Sci., 2000, 22: 99-105; Bode et al., Art. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol., 2007, 35: 125-133）。しかしながら、この技術は、保護的糖タンパク質（protective glycoproteins）の存在下で保管が実施される場合でさえも、凍結乾燥によって保存される血小板が、輸血後に体内で循環しないので、満足のいく結果をまだ提供していない。
【０００９】
従って、輸血に好適な血小板の保存のための改善された方法に対する大きな必要性がある。特に、血小板の生存性及び生物活性を維持し、細菌増殖の可能性を減少させながら、血小板が長期間保管されることを可能にする保存方法が、非常に望ましい。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、一般的には、血小板の保存のための改善された方法に関する。特に、本発明の方法は、約室温で実施されるゼオドレーション（zeodration）によって血小板を乾燥する段階、及び、得られた乾燥血小板を室温で保管する段階を含む。穏やかな条件下で実施されるこの操作は、血小板が、室温で長期間（すなわち、数ヶ月間〜１年間）保存されることを可能にする。
【００１１】
従って、一態様では、本発明は、血小板、特にヒト血小板を保存するための方法であって：血小板のサンプルを１８℃〜２４℃までの間、特に１８℃〜２２℃までの間で実施されるゼオドレーションに供して、乾燥血小板を得るステップ；及び乾燥血小板を室温で保管するステップを含む、方法を提供する。
【００１２】
ある実施態様では、血小板のサンプルをゼオドレーションに供する段階は：血小板のサンプルをチャンバー（例えば、ゼオドレーター（zeodrator）のチャンバー又は容器）にロードするステップ；チャンバー中に含まれる血小板のサンプルを真空下に置くステップ；ならびに血小板を真空下で乾燥して、１０％以下の相対湿度及び０．６以下の水分活性を有する乾燥血小板を得るステップ、を含む。この方法において、血小板のサンプルを真空下に置くステップ、及び、血小板を乾燥するステップは、血小板の温度を１８℃〜２４℃までの間、特に１８℃〜２２℃までの間に維持しながら実施される。
【００１３】
ある特定の実施態様では、血小板のサンプルをゼオドレーションに供する段階は：血小板のサンプルをチャンバーにロードし、血小板のサンプルを５分間安定させるステップ；血小板を含むチャンバーの圧力を、７５mbar／分間の速度で５分間未満で７００mbarまで減少させ、血小板のサンプルを７００mbarで５分間安定させるステップ；血小板を含むチャンバーの圧力を、７５mbar／分間の速度で７分間未満で２００mbarまで減少させるステップ；血小板を含むチャンバーの圧力を、少なくとも５mbar／分間の速度で２００mbarから１４５mbarまで減少させるステップ；ならびに血小板を１４５mbarで約２時間〜約５時間の間乾燥して、１０％以下の相対湿度及び０．６以下の水分活性を有する乾燥血小板を得るステップ、を含む。この方法において、圧力を減少させるステップ、及び、血小板を乾燥するステップは、血小板の温度を１８℃〜２４℃までの間、特に１８℃〜２２℃までの間に維持しながら実施される。
【００１４】
ある実施態様では、本発明による血小板を保存するための方法において、使用される血小板のサンプルは、血小板及び血漿を含む。ある好ましい実施態様では、血漿中の血小板のサンプルの粘度は、合成培地（例えば、血小板添加溶液）を用いた希釈によって減少される。他の実施態様では、本発明による血小板を保存するための方法において使用される血小板のサンプルは、血漿から血小板を単離することによって得られる。
【００１５】
ある実施態様では、ゼオドレーションは、少なくとも１つの血小板保護剤（すなわち、細胞脱水の公知の悪影響に対する保護を提供する薬剤）の存在下で実施される。血小板保護剤は、ゼオドレーション前に、血小板が置かれる乾燥支持体上でコートされ得る；及び／又は血小板保護剤は、ゼオドレーション前に、血小板のサンプルに添加される；及び／又は血小板保護剤は、乾燥されるべき血小板に取り込まれる。ある好ましい実施態様では、血小板保護剤は、トレハロース、マルトデキストリン、デキストロース及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
【００１６】
本発明による血小板を保存するための方法において、乾燥血小板を室温で保管するステップは、光の非存在下及び乾燥大気中で、真空下又は不活性ガスの存在下における大気圧下のいずれかで実施される。これらの条件下でゼオドレーションされた血小板は、数ヶ月間〜最大１年間保存され得る。
【００１７】
ある実施態様では、本発明による血小板を保存するための方法は、乾燥血小板を再水和して、再水和血小板を得るステップをさらに含む。乾燥血小板を再水和するステップは：乾燥血小板を湿度勾配に供して、加湿血小板を得るステップ；及び水を加湿血小板に添加して、再水和血小板を得るステップ、を含み得る。好ましくは、得られた加湿血小板は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６５％及びより好ましくは９５％〜１００％（例えば、９８〜１００％）の間の相対湿度を有する。好ましくは、得られた再水和血小板は、新鮮血小板もしくは従来の標準手順を使用して保存された血小板の相対湿度と同一又は実質的に同様の相対湿度を有する。
【００１８】
ある実施態様では、血小板のサンプルは、ゼオドレーションを受ける前に、ソラレン、アモトサレンＨＣｌの存在下でＵＶＡ照射に供される。他の実施態様では、再水和血小板は、アモトサレンＨＣｌの存在下でＵＶＡ照射に供される。この光化学処理は、血小板中に存在するあらゆる病原体を不活性化する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、本発明の保存方法を使用して得られる乾燥血小板を提供する。本発明の乾燥血小板は、室温で、好ましくは乾燥大気中及び光の非存在下で、数ヶ月間〜最大１年間の長期間保管され得る。本発明の乾燥血小板は、１０％以下の相対湿度及び０．６以下の水分活性を有する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、本発明の再水和方法に従ってゼオドレーションされた血小板を再水和することによって得られる再水和血小板を提供する。好ましくは、本発明の再水和血小板は、新鮮血小板もしくは従来の標準手順を使用して保存された血小板の相対湿度と同一又は実質的に同様の相対湿度を有する。
【００２１】
さらに別の態様では、本発明は、本発明の乾燥血小板及び乾燥血小板を含むコンテナを含む、キットを提供する。好ましくは、コンテナは、不透明であり、乾燥大気を提供するために密封されている。このキットは、室温で最大１年間保管され得る。本発明は、本発明の再水和血小板及び再水和血小板を無菌条件下で含むコンテナを含む、キットも提供する。
【００２２】
さらに別の態様では、本発明は、本発明の乾燥血小板又は再水和血小板の使用を提供する。ある実施態様では、本発明は、輸血における本発明の再水和血小板の使用を提供する。他の実施態様では、本発明は、血小板に影響を与える障害の診断のためのアッセイ（例えば、フォン・ヴィレブランド病の診断のためのアッセイなど）における乾燥血小板の使用を提供する。さらに他の実施態様では、本発明は、細胞に基づいた治療及び組織工学アプローチにおける、動物血清の代わりとしての本発明の再水和血小板又はその産物の使用を提供する。さらに他の実施態様では、本発明は、創薬又は薬物開発における本発明の再水和血小板の使用を提供する。
【００２３】
本発明のこれらの及び他の目的、利点ならびに特徴は、以下の好ましい実施態様の詳細な説明を読んだ当業者には明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、重要な泡立ち点における異なる添加溶液（すなわち、血小板が懸濁される溶液）の効果を示すグラフである。
【図２Ａ】図２は、減圧のステップ中の血小板機能性を評価するために実施した実験の結果を示す４つのグラフのセットである。誘導因子（基礎）の非存在下、及び、ＡＤＰ又はＴＲＡＰなどの誘導因子の存在下における工程のそれぞれのステップにおいて、ＧｐＩＩｂＩＩＩａ（Ａ）、Ｐセレクチン（Ｂ）、ＣＤ６３（Ｃ）及び結合フィブリノゲン（Ｄ）の活性を測定することによって、機能性を決定した。
【図２Ｂ】図２は、減圧のステップ中の血小板機能性を評価するために実施した実験の結果を示す４つのグラフのセットである。誘導因子（基礎）の非存在下、及び、ＡＤＰ又はＴＲＡＰなどの誘導因子の存在下における工程のそれぞれのステップにおいて、ＧｐＩＩｂＩＩＩａ（Ａ）、Ｐセレクチン（Ｂ）、ＣＤ６３（Ｃ）及び結合フィブリノゲン（Ｄ）の活性を測定することによって、機能性を決定した。
【図２Ｃ】図２は、減圧のステップ中の血小板機能性を評価するために実施した実験の結果を示す４つのグラフのセットである。誘導因子（基礎）の非存在下、及び、ＡＤＰ又はＴＲＡＰなどの誘導因子の存在下における工程のそれぞれのステップにおいて、ＧｐＩＩｂＩＩＩａ（Ａ）、Ｐセレクチン（Ｂ）、ＣＤ６３（Ｃ）及び結合フィブリノゲン（Ｄ）の活性を測定することによって、機能性を決定した。
【図２Ｄ】図２は、減圧のステップ中の血小板機能性を評価するために実施した実験の結果を示す４つのグラフのセットである。誘導因子（基礎）の非存在下、及び、ＡＤＰ又はＴＲＡＰなどの誘導因子の存在下における工程のそれぞれのステップにおいて、ＧｐＩＩｂＩＩＩａ（Ａ）、Ｐセレクチン（Ｂ）、ＣＤ６３（Ｃ）及び結合フィブリノゲン（Ｄ）の活性を測定することによって、機能性を決定した。
【図３Ａ】図３は、ゼオドレーション手順中の血小板の温度変動を示す２つのグラフのセットである。（Ａ）ゼオライトの存在下、及び、ゼオドレーターが空調室に置かれる条件下における乾燥時間関数としての、反応容器、血小板及びゼオライトの温度変動ならびに圧力変動。（Ｂ）９つの異なる実験にわたる手順の再現性。
【図３Ｂ】図３は、ゼオドレーション手順中の血小板の温度変動を示す２つのグラフのセットである。（Ａ）ゼオライトの存在下、及び、ゼオドレーターが空調室に置かれる条件下における乾燥時間関数としての、反応容器、血小板及びゼオライトの温度変動ならびに圧力変動。（Ｂ）９つの異なる実験にわたる手順の再現性。
【図４Ａ】図４は、ゼオドレーション工程の異なる時間における血小板の相対湿度（ＨＲ）（Ａ）及び脱着等温線（Ｂ）の測定を示す２つのグラフのセットであり、これらは、脱水工程が進行性及び均一であることを示している。
【図４Ｂ】図４は、ゼオドレーション工程の異なる時間における血小板の相対湿度（ＨＲ）（Ａ）及び脱着等温線（Ｂ）の測定を示す２つのグラフのセットであり、これらは、脱水工程が進行性及び均一であることを示している。
【図５】図５は、ゼオドレーション工程中の時間関数としての脱水速度の変動を示すグラフである。
【図６】図６は、ゼオドレーション工程中の時間関数としての水分活性の変動を示すグラフである。
【図７】図７は、血小板濃度の関数としての（左）、血小板懸濁液に添加したＨＡＳの濃度の関数としての（中央）、及び、ＨＡＳ又はＰＤＭＳのいずれかでコートしたディッシュに置いた血小板を用いてゼオドレーションを実施する場合の（右）、ゼオドレーション後に回収した血小板の収率を示す３つのグラフのセットである。
【図８Ａ】図８は、ゼオドレーション工程及びそれに続く再水和中のｐＨ（Ａ）ならびに浸透圧（Ｂ）の変動を示す２つのグラフのセットである。
【図８Ｂ】図８は、ゼオドレーション工程及びそれに続く再水和中のｐＨ（Ａ）ならびに浸透圧（Ｂ）の変動を示す２つのグラフのセットである。
【００２５】
ある好ましい実施態様の詳細な説明
上述のように、本発明は、血小板の保存のための改善された方法を提供する。この方法は、約室温（１８〜２４℃）で実施されるゼオドレーションステップ、及び、同様に室温で実施される保存又は保管ステップを含む。穏やかな条件下における血小板の処理は、それらの長期間の保存を可能にし、保存後のそれらの生存性及び機能性を維持する。
【００２６】
Ｉ−血小板のゼオドレーション
本発明による血小板の保存のための方法は、血小板のサンプルを約室温で実施されるゼオドレーション工程に供して、乾燥血小板を得る段階、及び、乾燥血小板を室温で保管又は保存する段階を含む。
【００２７】
血小板
本発明の方法において使用され得る血小板は、ヒト又は別の哺乳動物（例えば、霊長類、イヌ、ネコ、ヤギ、ウマ、ブタ、マウス、ラット、ウサギなど）が起源であり得る。本発明の多くの実施態様では、血小板は、ヒトが起源である。このような実施態様では、血小板は、「ヒト血小板」と称される。ある実施態様では、本発明の方法において使用される血小板は、単一のドナーから得られる。他の実施態様では、血小板は、いくつかのドナー（例えば、２つ以上の異なる同種のドナー）から得られる。「ドナー」という用語は、あらゆる特定の年齢を意味せず、従って、新生児、児童、ティーンエイジャー及び成人を包含する。
【００２８】
ある実施態様では、ドナーの血小板数が評価され得る。同じ又は他の実施態様では、血小板ドナーの血液型（ＡＢＯ抗原、Ｒｈ抗原など）及び／もしくはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）及び／もしくはヒト血小板抗原（ＨＰＡ）が決定されるか、又は公知である。続いて、この情報は、輸血のためのＨＬＡ適合及び／又はクロスマッチ適合血小板の提供を容易にする。しかしながら、他の実施態様では、血小板は、これらの試験が実施されずに採取される。
【００２９】
本発明の方法において使用される血小板は、健常なドナー（例えば、あらゆる特定の病気に罹患していないことが知られているドナー）が起源であり得る。あるいは、血小板は、具体的な疾患又は障害を有するドナーから得られ得る。例えば、血小板は、血小板に影響を与えるか、もしくは血小板に関連する具体的な疾患又は障害（血小板数の減少をもたらす障害（例えば、血小板減少症、ゴーシェ病及び再生不良性貧血）；同種免疫性障害（例えば、胎児母体同種免疫性血小板減少症）；血小板機能障害又は血小板数の減少につながる障害（例えば、ＨＥＬＬＰ症候群、溶血性尿毒症症候群、化学療法、デング熱、α−δ血小板貯蔵プール欠乏症）；血小板数の増加を特徴とする障害（例えば、血小板増加症）；血小板粘着又は血小板凝集の障害（例えば、ベルナール・スーリエ症候群、グランツマン血小板無力症、スコット症候群、フォン・ヴィレブランド病、ハーマンスキー・パドラック症候群及び灰色血小板症候群）；及び血小板代謝の障害（例えば、サイトオキシゲナーゼ（cytooxygenase）活性の誘導又は先天性減少、後天性又は先天性貯蔵プール欠乏症）など）を有すると診断されたドナーから得られ得る。
【００３０】
本発明の方法を使用して保存されるべき血小板は、任意の適切な方法によって得られ得る。従って、血小板は、全血の単位に由来する濃縮血小板（例えば、血小板に富んだ血漿）であり得る。全血は、任意の適切な方法によって（例えば、ヘパリン、ＡＣＤ−Ａ（抗凝血性クエン酸デキストロース）、クエン酸塩又はＥＤＴＡなどの抗凝血剤を含むコンテナへの静脈穿刺によって）又は内在動脈経路からコンテナなどに採取され得る。血小板に富んだ血漿（ＰＲＰ）は、異なる層：赤血球からなる下層、白血球からなる中間層及び血漿から構成される上層の形成をもたらす全血の遠心分離によって得られ得る。単離された血小板は、血小板ペレットの形成をもたらすＰＲＰの遠心分離によって得られ得る。次いで、溶液中で血小板を再懸濁するために、血小板ペレットは、穏やかに撹拌され得る。本発明の保存方法における使用に好適な他の血小板は、血小板フェレーシスによって単一のドナーから得られる血小板アフェレーシスである。
【００３１】
いかなる場合も、本発明の方法において使用されるべき血小板は、国の関連規則又は推奨に従って得られるべきである。
【００３２】
ゼオドレーション前の血小板調製
必要な場合は、ゼオドレーション前に、血小板の生存性及び／又は機能性は、任意の適切な方法を使用して試験され得る。このような方法は、血小板画分のｐＨの測定；乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性の測定（ＬＤＨは、通常は血小板内で活性であるが、それらが膜統合性の喪失を受けた場合に血小板外に漏出する酵素である）；アラキドン酸、エピネフリン、コラーゲン又はアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）などの基質への曝露後の血漿中の血小板凝集を測定する光透過率凝集測定を含むが、これらに限定されない。血小板機能を評価するための他の技術は、全血における高せん断ストレス依存性血小板凝集を測定する血小板機能分析器PFA-lOO（登録商標）；塊強度を評価し、血小板機能の定量分析を提供するThrombelastograph（登録商標）（ＴＥＧ）PlateletMapping（商標）アッセイ；活性化血小板のフィブリノゲン被覆ビーズへの結合能力に基づいて血小板機能を測定するVerifyNow（商標）（アスピリン、Ｐ２Ｙ１２及びＩＩｂ／ＩＩＩａ）アッセイ；ならびに膜糖タンパク質の構造変化及びＰセレクチン及びホスホチジルセリン（phosphotidylserine）の表面発現の決定を通じて血小板活性化の状態を評価するのに使用されるフローサイトメトリー技術を含む。
【００３３】
以下の実施例の節において報告したように、本発明者らは、血漿（血小板の自然環境）中の血小板を使用してゼオドレーションを実施できることを見出した。従って、ある実施態様では、本発明の方法において使用される血小板は、全血から又は血小板フェレーシスドナーから血小板が分離された血漿中に存在する。他の実施態様では、本発明の方法において使用される血小板は、血小板から独立に得られた血漿と混合される。このような血漿は、血小板を提供したドナーから、又は異なる同種のドナーから得られ得る。ゼオドレーションは、血漿から単離され、合成溶液中で再懸濁された血小板でも実施され得る。
【００３４】
また、以下の実施例の節において報告したように、本発明者らは、血小板を含む血漿サンプルの粘度を、好ましくは、ゼオドレーション前に、希釈によって減少すべきであることを見出した。ある好ましい実施態様では、血漿／血小板サンプルの粘度は、合成（すなわち、非天然の）培地を用いた希釈によって減少される。ある実施態様では、本発明の実施において使用され得る合成培地は、好ましくは、注射に好適である。適切な合成培地は、例えば、代替的な血小板懸濁液及び貯蔵培地として数十年間にわたって開発されてきた血小板添加溶液を含む（Ringwald et al., Transf. Med. Rev., 2006, 20: 158-164を参照）。多くの血小板添加溶液が、例えば、U.S. Pat. No. 6,613,566; van der Meer et al., Transf. Med., 2001, 11: 193-197; Gullikson, Transf. Med., 2000, 10: 257-264; Ringwald et al., Vox Sanguinis, 2005, 89: 11-18; Ringwald et al., Transf., 2006, 46: 236-243及びRingwald et al., Transf. Med. Rev., 2006, 20: 158-164に開示されているものに記載されている。このような血小板添加溶液は、一般的には、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム及び酢酸ナトリウムを含む。代替的な血小板添加溶液は、リン酸塩、カリウム及びマグネシウムを含む。Voluven（登録商標）（Fresenius Kabi）（これは、血液量減少（hypovolemy）の場合の潅流において使用される）を含む、本発明の実施における使用に好適な多くの合成培地が市販されているが、これに限定されない。同様に、T-Sol（登録商標）（Baxter Healthcare Corporation）、Composol（登録商標）PS（Fresenius Kabi）、PPS（登録商標）及びPPS+（登録商標）（MacoPharma）ならびにInterSol（Fenwal, Inc.）を含む、多くの適切な血小板添加溶液が市販されているが、これらに限定されない。
【００３５】
ゼオドレーション中にサンプルが真空下に置かれる場合に起こる泡立ち現象により血小板膜が壊れるのを防ぐために、血漿／血小板サンプルの粘度は、減少される。当業者であれば、適切な合成培地（例えば、血小板添加溶液）を選択し、血漿／血小板サンプルに添加すべき合成培地（又は合成培地の混合物）の適切な容量を決定する方法を知っているであろう。これは、例えば、合成培地血漿／血小板サンプルの一連の異なる混合物の泡立ち点（bubbling point）を決定することによって行われ得る（実施例１を参照）。従って、本発明の実施において、所望の結果（すなわち、ゼオドレーション中に泡立ちにより血小板膜が壊れるのを防ぐこと）が達成される限り、合成培地又は合成培地の混合物の任意の容量が、血漿／血小板サンプルに添加され得る。例えば、合成培地の容量は、合成培地／血漿の比が約９０：１０、８０：２０、７０：３０、６０：４０、５０：５０、４０：６０、３０：７０、２０：８０又は１０：９０（ｖｏｌ：ｖｏｌ）であるものであり得る。数に関して本明細書において使用される「約（approximately）」又は「約（about）」という用語は、特に明記しないか、又は文脈から明らかでない限り、一般的には、その数のプラスマイナス１０％の範囲内（その数より大きいか、又は小さい）にある数を含む（このような数が可能値の１００％を超える場合を除く）。
【００３６】
以下の実施例の節に示される実験において、本発明者らは、合成培地／血漿比が５０：５０（ｖｏｌ：ｖｏｌ）であった容量で血漿／血小板サンプルに添加したT-Sol（登録商標）及びVoluven（登録商標）（５０：５０，ｖｏｌ：ｖｏｌ）の混合物を使用して、満足のいく結果を得た。
【００３７】
ゼオドレーション
上記のように、本発明による保存方法は、血小板を約室温で実施されるゼオドレーションに供する段階を含む。本明細書において使用される「ゼオドレーション」という用語は、産物（これは、液体、半液体又は固体であり得る）が、水吸着剤もしくは乾燥培地として使用されるゼオライトの存在下で、真空下で乾燥される脱水又は乾燥法を意味する。本明細書において使用される「ゼオライト」という用語は、その理解される技術的意味を有し、微小孔性アルミノケイ酸塩鉱物を意味する。ゼオドレーションにおいて使用されるゼオライトは、水の選択的吸着を可能にする直径４オングストロームの細孔を有する粒子（例えば、ビーズ）の形態である。実際、この直径は、水分子のサイズをわずかに上回るが、芳香分子、色素分子又は他の揮発性分子などの水よりも大きい任意の分子を捕捉するには小さすぎる。
【００３８】
一般的には、ゼオドレーション中は、乾燥されるべき産物は、チャンバー又は容器（例えば、ゼオドレーターのチャンバー又は容器）にロードされ、真空下に置かれる。減圧条件下では、産物中に存在する水は容易に蒸発し、蒸発後、ゼオライトに吸着される。一般的には、乾燥サイクル中、発熱吸着反応によって産生されるエネルギーは収集され、産物を加熱するのに使用され、それによって水蒸気圧を増加させることによって水分蒸発を促進する。ゼオドレーションは、広範囲の温度（すなわち、約−４０℃〜約＋６０℃の温度）で実施され得る。一般的には、ゼオドレーションは、乾燥されるべき産物に特に適合した又は特に好適な温度で実施される。ゼオドレーションは、産物の分子構造及び官能特性を保存する穏やかな乾燥工程である。それは低エネルギー消費しか要求せず；それは排出物をほとんど産生せず（主に水）；及びウォータートラップとして使用されるゼオライトは長期間（３〜５年間程度）何度も再生され得るので、環境に優しい技術でもある。
【００３９】
ゼオドレーションによる乾燥は、食品業界（特に、ハーブ、果物、野菜、魚、エビ、卵、乳製品、キノコなどの保存のために）ならびに化粧品及び製薬業界（特に、植物の抽出物の保存のために）において主に適用される。ゼオドレーションは、生細胞を乾燥するためにも提案されている（フランス特許出願番号FR 2 836 482 A1を参照）。しかしながら、この場合、ゼオドレーションは、０℃未満の温度を使用して実施された。
【００４０】
対照的に、本発明によれば、ゼオドレーションを使用して血小板を乾燥するステップは、約室温で実施される。換言すれば、ゼオドレーション中の血小板の温度は、室温付近に保たれる。本明細書において使用される「約室温で」という用語は、１８℃〜２４℃まで（例えば、１８℃〜２２℃まで）の範囲の温度を意味する。
【００４１】
本発明によるゼオドレーションは、血小板のサンプルをチャンバー又は容器にロードするステップ、及び、血小板を真空下に置くステップ、続いて血小板を真空下で乾燥するステップを含む。血小板を真空下に置くことは、全工程の間に血小板の温度が１８℃〜２４℃の間に保たれる限り、ならびに、プロトコールが血小板の形状、活性化及び機能性に対してあらゆる永続的な著しい悪影響をもたらさない限り、任意の適切なプロトコールを使用して実施され得る。当業者であれば、これらの目標を達成するためのプロトコールを設計及び開発する方法を知っているであろう（例えば、以下の実施例１を参照）。同様に、血小板を真空下で乾燥するステップは、全工程の間に血小板の温度が１８℃〜２４℃の間に保たれ、使用されるプロトコールが血小板構造損傷をもたらさず、及び、乾燥血小板の最終相対湿度が１０％以下であり、水分活性が０．６以下である限り、任意の適切なプロトコールを使用して実施され得る。
【００４２】
ある好ましい実施態様では、血小板を真空下に置く段階は、血小板を含むチャンバー又は容器の圧力を（ａ）７５mbar／分間の速度で５分間未満で大気圧値から７００mbarまで減少させ、血小板のサンプルを７００mbarで５分間安定させるステップ；（ｂ）７５mbar／分間の速度で７分間未満で７００mbarから２００mbarまで減少させるステップ；及び、次いで（ｃ）少なくとも５mbar／分間の速度で２００mbarから１４５mbarまで減少させるステップを含むプロトコールを使用して実施される。このような好ましい実施態様では、血小板を真空下で乾燥するステップは、１４５mbarの圧力下で、血小板の最終相対湿度が１０％以下になり、血小板の水分活性が０．６以下になるまで血小板が乾燥するのに必要な時間実施される。ある実施態様では、乾燥ステップは、１４５mbarで約２時間〜５時間の間実施される。これらの条件は、３〜４ｘ１０８血小板を乾燥するのに特に好適であることが示されている。当業者であれば、このような条件は、より大量の血小板を乾燥するためには最適化されなければならない可能性があることを認識するであろう。
【００４３】
ある実施態様では、ゼオドレーション中、血小板は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）でコートされたディッシュの上に置かれる。
【００４４】
ある実施態様では、ゼオドレーションは、少なくとも１つの保護剤の存在下で実施される。このような保護剤は、ゼオドレーションに供される前に、血小板のサンプルが置かれる乾燥支持体上でコートされ得る。あるいは又はさらに、保護剤は、ゼオドレーション前に、ゼオドレーションされるべき血小板のサンプルに添加され得るか、又はさらに、それは、血小板に取り込まれ得る。本発明の保存方法における使用に好適な血小板保護剤は、細胞脱水の公知の悪影響（膜不透過化、タンパク質凝集及び変性ならびに細胞間区画の融合を含むが、これらに限定されない）に対する保護を提供する任意の適切な化合物もしくは分子又はそれらの混合物であり得る。血小板保護剤は、好ましくは、脱水培地（すなわち、血小板がゼオドレーションに供される培地）と生体適合性がある。血小板保護剤は、好ましくは、血小板に対して非毒性でもある。保存された血小板が輸血において使用されることが意図される実施態様では、血小板保護剤は、好ましくは、血小板の将来のレシピエントに対して非毒性でもある。血小板保護剤は、任意の作用機序を介してその保護作用を発揮し得る。例えば、血小板保護剤は、血小板膜系のエネルギーレベルを低下させ、それによって、脱水段階の間それを安定化させることによって作用し得る。あるいは又はさらに、血小板保護剤は、脱水培地のガラス転移温度を改変し、それによって、行われるべきガラス化（これが、長期間にわたり、そしてそれ故保管段階の間の安定性を保証する）を可能にすることによって作用し得る。
【００４５】
ある実施態様では、本発明による血小板ゼオドレーションは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下で実施される。
【００４６】
ある実施態様では、本発明による血小板ゼオドレーションは、トレハロース、マルトマルトデキストロース、デキストロース及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される血小板保護剤の存在下で実施される。上述のように、このような血小板保護剤は、乾燥支持体上でコートされ得るか、及び／又はそれは、ゼオドレーション前に、血小板のサンプルに添加され得る；及び／又はそれは、ゼオドレーションされるべき血小板に取り込まれ得る。取り込みは、血小板構造、活性化及び機能性に対して有害でない任意の適切な方法によって実施され得る。例えば、リポソームは、顆粒膜内の糖の浸透を容易にするであろうから、保護剤の血小板への取り込みは、リポソームの使用を介して実施され得る。
【００４７】
他の実施態様では、血小板保護剤は、乾燥ステップ中に血小板構造を支持するのに使用される炭水化物を含むヒドロゲルである。特に、適切なヒドロゲルは、D. Letourneur及び同僚によって開発された生体適合性ヒドロゲルである（WO 2005/053396）。
【００４８】
本発明によるゼオドレーションは、Zeodry+Plus, Millennium Energy S.A. or ZEObiofresh Vacuum Cooling Alternativeによって提案されたものなどの市販のゼオドレーターを含む任意の適切な装置、及び、特に、閉じ込めによるゼオドレーションを可能にする装置を使用して実施され得る（EP 1 740 898を参照）。あるいは、本発明によるゼオドレーションは、特注の装置を使用して実施され得る。例えば、このような装置は、当技術分野において利用可能な記載及び推奨（例えば、FR 2 836 482, FR 2 803 222; FR 2 804 750; FR 2 805 759; EP 1 740 898）に従って製作され得る。
【００４９】
ある実施態様では、ゼオドレーターは、それぞれのゼオドレーション工程の前に、室温で少なくとも１時間放置される。あるいは又はさらに、ゼオドレーターは、例えば、約２０℃の空調室に置かれ得る。
【００５０】
既存のゼオドレーターが室温付近での血小板ゼオドレーションにとって好適になるような改善も、既存のゼオドレーターにもたらされ得る。事実、本発明者らは、ゼオライトと血小板を含む乾燥支持体との間の距離を増加させることによって、及び、サーマルレギュレーションシステムを有するゼオドレーターを実施することによって、血小板を所望の温度範囲で維持しながら、乾燥時間をさらに増加させることが可能であったことを観測した。本発明者らは、ゼオドレーターの真空ポンプを装置のケースの外側に設置することによって、ゼオドレーターの機械の過熱を防ぎ、このことがシステムの熱プロファイルの安定化をもたらすことも観測した。従って、ある実施態様では、本発明の実施において使用されるべきゼオドレーターは、血小板が置かれるべき少なくとも１つの乾燥支持体、及び、少なくとも１つのゼオライト用支持体を含み、これらは同じ筺体又はチャンバー内に設置されるが、互いに離れている。同じ又は他の実施態様では、本発明の実施において使用されるべきゼオドレーターは、サーマルレギュレーションシステムを含む。同じ又はさらに他の実施態様では、本発明による血小板を乾燥するのに使用されるべきゼオドレーターは、装置のケースの外側に設置される真空ポンプを含む。
【００５１】
ＩＩ−ゼオドレーションされた血小板の保管
本発明による血小板の保存のための方法は、血小板を約室温で実施されるゼオドレーション工程に供して、乾燥血小板を得る段階、及び、乾燥血小板を室温で保存する段階を含む。
【００５２】
ゼオドレーションされた血小板の保存又は保管
ゼオドレーション工程の終了後、乾燥血小板は、ゼオドレーターから収集されるか、又は回収される（例えば、乾燥血小板を含むゼオドレーターチャンバーの真空を破壊した後）。次いで、乾燥血小板は、例えば、空調室又は空調チャンバーにおいて室温（すなわち、１８℃〜２４℃の間）で保存され得る。好ましくは、血小板は、光の非存在下及び乾燥大気中（真空下（すなわち、真空下で密封されたコンテナにおいて）、又は、窒素及び／もしくはアルゴンなどの不活性ガス（insert gas）の存在下における大気圧下のいずれか）で保管される。これらの条件下において、ゼオドレーションされた血小板は、１週間超〜少なくとも最大８ヶ月間、好ましくは少なくとも２週間〜最大７ヶ月間、及びより好ましくは少なくとも１ヶ月間〜最大６ヶ月間保存され得る。ある実施態様では、ゼオドレーションされた血小板は、室温で、乾燥大気中及び光の非存在下で、少なくとも１年間保存され得る。
【００５３】
保存され、ゼオドレーションされた血小板
別の態様では、本発明は、室温で保存され得る乾燥血小板を提供し、このような乾燥血小板は、上記のように、新鮮血小板を約室温におけるゼオドレーションに供することによって得られる。ある実施態様では、乾燥血小板は、真空下で密封された不透明なコンテナに含められる。他の実施態様では、乾燥血小板は、不活性ガスの存在下における大気圧下で不透明なコンテナに含められる。
【００５４】
本発明による乾燥血小板は、一般的には、１０％以下の相対湿度を有する。実際、真核細胞は、残留水の量が０．１グラム／乾燥質量グラム以下である場合に、脱水すると言われている（De Castro et al., Nature Biotechnology, 2000, 18: 473）。ある実施態様では、乾燥血小板は、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満又は４％未満の相対湿度を有する。
【００５５】
本発明による乾燥血小板は、一般的には、０．６以下の水分活性を有する。実際、０．６≦の水分活性値を有する産物は、保管中の微生物増殖のリスクを示さない。ある実施態様では、乾燥血小板は、０．５未満、０．４未満又は０．３未満の水分活性を有する。
【００５６】
上述のように、本発明による乾燥血小板は、これらの条件下で、１週間超（例えば、２週間、３週間又は４週間）〜最大１年間（例えば、９ヶ月間、８ヶ月間、７ヶ月間、６ヶ月間、５ヶ月間、４ヶ月間、３ヶ月間又は２ヶ月間）保存され得る。
【００５７】
ＩＩＩ−保存され、ゼオドレーションされた血小板の再水和
本発明によれば、ある実施態様では、使用される前に、ゼオドレーションされた血小板は、再水和工程に供される。再水和は、任意の適切な方法（特に、新鮮血小板又は標準条件下で保存された血小板のものに近い構造特性、生存特性、機能特性及び生物活性特性を血小板にもたらす任意の方法）を使用して実施され得る。
【００５８】
ゼオドレーションされた血小板の再水和
本発明は、ゼオドレーションによって得られた乾燥血小板の再水和のための方法を提供する。この方法は、（ａ）乾燥血小板を湿度勾配に供して、加湿血小板を得るステップ、及び（ｂ）任意の必要な水を加湿血小板に添加して、再水和血小板を得るステップという２つの連続するステップを含む。好ましくは、再水和は、室温で、滅菌大気中及び光の非存在下で実施される。本明細書において使用される「加湿血小板」という用語は、１０％超（例えば、５０％超）、好ましくは６５％又は７５％超、より好ましくは９５％〜１００％の間（例えば、９８〜１００％）の相対湿度を有する血小板を意味する。
【００５９】
乾燥血小板を湿度勾配に供することは、任意の適切な手段によって実施され得る。例えば、乾燥血小板を湿度勾配に供することは、プログラム可能な湿度チャンバーの使用を含み得る。このような湿度チャンバーは、例えば、Secasi Technologies、Ineltec又はFroilaboから市販されている。
【００６０】
再水和の後、血小板は、穏やかに撹拌されながら、室温（１８〜２４℃）で最大３日間保存され得る。しかしながら、多くの実施態様では、再水和血小板は、再水和の後、数分間〜数時間以内に使用される。
【００６１】
再水和血小板
別の態様では、本発明は、本発明の乾燥血小板を再水和することによって得られた再水和血小板を提供する。好ましくは、再水和血小板は、滅菌大気下で提供される。ある実施態様では、再水和血小板は、フラスコに含められる。他の実施態様では、再水和血小板は、袋（例えば、生体適合性のプラスチック袋）に含められる。
【００６２】
使用前の血小板の調製
ある実施態様では、再水和血小板は、ソラレン、アモトサレン塩酸塩の存在下でＵＶＡ照射に供される。Intercept（商標）処理と称されるこの光化学工程は、広範囲のＤＮＡ及びＲＮＡに基づく一本鎖及び二本鎖ウイルス、細菌、寄生生物ならびに血液バンクセッティングにおける血小板濃縮物及び血漿中の白血球を不活性化するために開発された（McCullough et al., Blood, 2004, 104: 1534-1541; Eastman et al., transfusion, 2005, 45: 1459-1463; Snyder et al., Transfusion, 2005, 45: 1864-1875; Pineda et al., Transfusion, 2006, 46: 562-571; Simonsen et al., Transfusion, 2006: 46: 424-433; Slichter et al., Transfusion, 2006, 46: 731-740）。アモトサレンＨＣｌは、光化学的架橋を通じてＲＮＡの複製を遮断することによって感受性病原体の複製を防ぐ。血小板は、機能するのに核酸を必要としないので、架橋工程によって不活性化されず、治療効果を維持する。
【００６３】
本発明の実施において、アモトサレンＨＣｌは再水和血小板に添加され、その混合物は、ＵＶＡ光（３２０〜４００nm）に曝露される。照射は、血小板中に存在する病原体を不活性化するのに十分な時間実施される。
【００６４】
あるいは、この光化学処理は、血小板がゼオドレーションに供される前に、血小板上で実施され得る。従って、ある実施態様では、血小板は、ゼオドレーション前に、アモトサレンＨＣｌの存在下でＵＶＡ照射に供される。
【００６５】
ＩＶ−ゼオドレーションを経て保存された血小板の使用及び適応
本発明によって提供される血小板保存方法は、血小板をより容易に利用可能に、それ故より容易に使用可能にする。本発明の方法を使用して保存された血小板は、新鮮血小板又は一般的な標準手順を使用して保存された血小板と同じ用途を有し得る。従って、本発明の方法に従って保存された血小板は、細胞に基づいた治療における動物血清の代わりとして、輸血において、診断方法において、ならびに、研究及び薬物開発において使用され得る。
【００６６】
血小板輸血
従って、特に、本発明の血小板は、輸血において使用され得る。それらは、多量の血液を失った外傷患者に、血小板数を減少させ残りの血小板において機能的欠陥を引き起こすことが知られている化学療法を受けている患者に、骨髄移植、放射線治療、臓器移植又は心肺バイパスなどの手術を受けている患者に、ならびに、血小板数の減少をもたらす障害（例えば、血小板減少症、ゴーシェ病及び再生不良性貧血）；同種免疫性障害（例えば、胎児母体同種免疫性血小板減少症）；血小板機能障害又は血小板数の減少につながる障害（例えば、ＨＥＬＬＰ症候群、溶血性尿毒症症候群、化学療法、デング熱、α−δ血小板貯蔵プール欠乏症）；血小板数の増加を特徴とする障害（例えば、血小板増加症）；血小板粘着又は血小板凝集の障害（例えば、ベルナール・スーリエ症候群、グランツマン血小板無力症、スコット症候群、フォン・ヴィレブランド病、ハーマンスキー・パドラック症候群及び灰色血小板症候群）；又は血小板代謝の障害（例えば、サイトオキシゲナーゼ活性の誘導又は先天性減少、後天性又は先天性貯蔵プール欠乏症）に罹患している患者に投与され得る。
【００６７】
必要であれば、本発明の再水和血小板を使用する血小板輸血は、一般的な医療行為に従って投与されるべきである。
【００６８】
診断方法
本発明のゼオドレーションされた血小板（すなわち、それらの乾燥形態で）は、固定血小板の標準懸濁液が使用される任意の診断方法において使用され得る。例えば、本発明のゼオドレーションされた血小板は、フォン・ヴィレブランド病の診断のための方法において、凍結乾燥血小板の代わりに使用され得る。このような方法は、リストセチン補因子のレベル及び／又は活性を測定する。リストセチン補因子は、抗生物質リストセチンの存在下で血小板の凝集を促進するフォン・ヴィレブランド因子の特性である。リストセチン補因子活性を評価することは、フォン・ヴィレブランド因子活性を反映すると考えられる活性の定量化を可能にする。このような診断アッセイにおいて、凍結乾燥血小板は、固定血小板の標準懸濁液として使用される。本発明のゼオドレーションされた血小板は、これらのアッセイにおいて有利に使用され得る。
【００６９】
細胞治療における動物血清の代わりとしての血小板及び血小板産物
本発明の血小板及び／又はその産物は、細胞治療及び組織工学アプローチにおける動物血清の代わりとして使用され得る。実際、血小板及び血小板産物（例えば、血小板溶解物）は、細胞に基づいた治療方針に関して、幹細胞（特に、ヒト多能性間葉間質細胞）の増殖及び／又は分化のための動物血清（例えば、ウシ胎仔血清、ウシ胎児血清など）の安全な代替物として使用され得ることが示されている（Doucet et al., J. Cell. Physiol., 2005, 205: 228-236; Vogel et al., Platelets, 2006, 17: 462-469; Bernardo et al., J. Cell. Physiol., 2007, 211: 121-130; Schallmoser et al., Transfusion, 2007, 47: 1436-1446; Zaky et al., J. Tissue Eng. Regen. Med., 2008, 2: 472-481; Prins et al., Tissue Eng. Part A, 2009, 15: 3741-3751; Blande et al., Transfusion, 2009, 49: 2680-2685; Avanzini et al., Haematologica, 2009, 94: 1649-1660; Chevallier et al., Biomaterials, 2010, 31: 270-278）。
【００７０】
研究及び薬物開発のための血小板
本発明の血小板は、それらの生物学的特性、生化学的特性及び／又は生理学的特性を研究するのに、ならびに、それらの活性化機序を調査するのに、ならびに、血小板機能のレギュレーションを理解するのに使用され得る。同様に、血小板機能障害に関連する障害を有する患者から得られ、本発明に従って保存される血小板は、血小板異常又は血小板欠損の研究において有用であり得る。
【００７１】
効果的な抗血小板薬の開発が、利用可能な血小板の不足によって、少なくとも部分的に妨げられている。しかし、他の単一細胞タイプは、血小板と同じようには高い罹患率及び死亡率の原因ではなく、その結果として、それは、治療的介入の主なターゲットの代表的なものである。実際、人口の高齢化及び肥満レベルの増加により心臓血管疾患の臨床的負担は増加に向かっており、新規な抗血小板薬の必要性がなおさら重要である。新鮮血小板又は従来の標準手順を使用して保存された血小板よりも容易に利用可能である本発明の血小板は、新規な治療の開発において有用であり得る。
【００７２】
Ｖ−キット
別の態様では、本発明の血小板を含むキットが提供される。より具体的には、本発明は、異なるセッティングにおいて（例えば、病院において、又は、事故現場もしくは戦争の現場の場所において、又は、診断もしくは実験研究室において、又は、研究施設において）、異なる用途（例えば、輸血、診断、細胞治療、組織工学、研究及び薬物開発）に使用され得るキットを提供する。
【００７３】
従って、ある実施態様では、キットは、本発明によるゼオドレーションされた（すなわち、乾燥された）血小板、及び、ゼオドレーションされた血小板を含むコンテナを含む。好ましくは、コンテナは、不透明であり、真空下又は不活性ガスの存在下における大気圧下のいずれかで密封される。他の実施態様では、キットは、本発明による再水和血小板、及び、再水和血小板を含むコンテナを含む。好ましくは、コンテナは、滅菌条件下で再水和血小板を保存する。このようなキットは、室温で最大１年間保管され得る。
【００７４】
本発明のキットは、ゼオドレーションされた血小板を保存するための説明書、及び／又は、ゼオドレーションされた血小板を再水和するための説明書、及び／又は、再水和血小板を使用するための説明書をさらに含み得る。目的の用途に応じて、キットは、１つ以上の：懸濁緩衝液及び／又は試薬、再水和緩衝液及び／又は試薬、注射緩衝液及び／又は試薬、血小板添加溶液及び／又は試薬、血漿、生理溶液及び／又は試薬、アモトサレンＨＣｌ、再水和手段、ＵＶＡ照射手段ならびに注射手段をさらに含み得る。
【００７５】
本発明のキットに含まれる異なる追加の試薬は、固体（例えば、凍結乾燥）又は液体の形態で供給され得る。本発明のキットは、場合により、個々の緩衝液及び／又は試薬それぞれのための異なるコンテナ（例えば、バイアル、アンプル、試験管、フラスコ又はボトル）を含み得る。それぞれの構成要素は、一般的には、その各コンテナ中で等分されるか、又は濃縮形態で提供されるのが適切であろう。ある手順（例えば、懸濁、再水和、試験）を実行するのに好適な他のコンテナ（例えば、バイアル、アンプル、試験管、フラスコ、ボトル又はアッセイプレート）も提供され得る。キットの個々のコンテナは、好ましくは、商業販売のために厳重な管理下で保管される。
【００７６】
キットは、行政機関によって規定される形式の注意書き（これは、医薬的もしくは生物学的製品の製造、使用又は販売をレギュレーションしている）も含み得る。
【実施例】
【００７７】
以下の実施例は、本発明を行うか、又は実施するのに好ましいいくつかの形態を説明する。しかしながら、実施例は、例示的な目的のためだけのものであり、本発明の範囲を限定することを意味するものではないことが理解されるべきである。さらに、実施例における説明が過去形で示されない限り、残りの明細書のような文章は、実験が実際に実施されたか、又はデータが実際に得られたことを示唆することを意図するものではない。
【００７８】
本研究の目標は、血小板に適用され得る正の温度の下で実施されるゼオドレーションによる乾燥工程を開発することであった。基本的なゼオドレーター（Zeodry+Plus, ref.: 3351）を使用して、研究の第一のステップ（実施例１）を実施し、データの数的記録を可能にするより高機能な高性能ゼオドレーター（Zeodry+Plus, ref.: 3354）を使用して、残りの研究（実施例２）を実施した。
【００７９】
実施例１：ゼオドレーションプロトコールの最適化
１．予備実験
輸血センターにおいて得られた血小板（濃縮血小板及び血小板アフェレーシス）を使用して、予備実験を実施した。このような実験により、（１）血小板をゼオドレーションする段階は、好ましくは、血漿中の血小板を使用して実施されるべきであること、及び（２）血漿／血小板サンプルの粘度は、好ましくは、適切な合成培地を用いた希釈によって減少されるべきであることが示された。
【００８０】
本発明者らは、血漿及び合成培地（例えば、InterSol（登録商標）、T-Sol（登録商標）、Voluven（登録商標）及びこれらの合成培地を異なる割合で混合した物）のいくつかの希釈物を調査した。得られた結果（図１）から、本発明者らは、T-Sol及びVoluvenの混合物（５０：５０ｖｏｌ：ｖｏｌ比）を選択して、血漿／血小板サンプル（５０：５０ｖｏｌ：ｖｏｌ比）を希釈した。
【００８１】
これらの希釈条件下において、ゼオライトの非存在下で、１８℃〜２２℃の間の従来の加熱チャンバー中で乾燥される血小板の形態は、顕著に変化しない。
【００８２】
２．ゼオドレーション実験において得られた予備結果の概要
研究の第一のステップ中に得られた結果により、本発明者らは、血小板に対する減圧及び減温の効果を測定すること、ならびに、ゼオドレーションのための最適化プロトコールを確立することができた。最適化プロトコールは：圧力（Ｐａｔｍ）をｄＰ／ｄｔ１＝２００mbar／分間の速度で２００mbarまで５分間未満に減少させる第一のステップ、圧力をｄＰ／ｄｔ２＝５mbar／分間の最小速度で１４５mbarまで減少させる第ニのステップ、及び次いで、血小板の乾燥中に圧力を１４５mbarで維持する第三のステップを含む。これらの条件の使用を見出して、１８℃〜２２℃の所望の範囲に血小板の温度を維持することが可能となった。
【００８３】
工程のそれぞれのステップにおいて血小板の活性化状態を測定することによって、このプロトコールを確立（及び実証）した。加えて、本発明者らは、生理的誘導剤（例えば、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、コラーゲン及びトロンビンレセプターのペプチド性アゴニスト（ＴＲＡＰ−トロンビンレセプター活性化ペプチド））の存在下で、プロトコールの終了時に血小板機能性を評価した。２つの異なるアプローチ：（１）フローサイトメトリーを使用して、血小板活性化のマーカーを分析すること（これは、機能的レセプター凝集を曝露する、及び、顆粒を放出する血小板の能力についての情報を提供した）；及び（２）血小板凝集計を使用して、血小板凝集を測定すること（これは、血小板の凝集能力それ自体についての情報を提供した）を使用して、この機能性を測定した。
【００８４】
フローサイトメトリー実験において、開始時の血小板のサンプル、及び、プロトコールの終了時に得られた液体画分のサンプルを、血小板活性化のマーカー（ＣＤ６２Ｐ、活性化ＧｐＩＩｂＩＩＩａ、ＣＤ６３及びフィブリノゲン）に特異的な抗体及び活性化誘導因子（８μMの濃度で使用したアデノシン二リン酸−ＡＤＰ；及び５μｇ／mLの濃度で使用したトロンビンレセプター活性化ペプチド−ＴＲＡＰ）と一緒にそれぞれインキュベーションした。光の非存在下で室温で３０分間インキュベーションした後、１／５０希釈（ＰＢＳ  １Ｘ）をし、その後、フローサイトメトリーによって懸濁液を分析した。
【００８５】
得られた結果を図２に示す。それらは、血小板機能性が減圧プロトコールの最初からずっと維持されていること、及び低圧（≧１４５mbar）において、ＡＤＰ又はＴＲＡＰの存在下で、脱顆粒（Ｐセレクチンの発現）及び凝集（活性化ＧｐＩＩｂＩＩＩａの発現）を受ける能力を血小板が保持していることを示している。従って、その後やがて起こるであろう機能性の低下は、脱水効果と関連しているであろう。
【００８６】
血小板凝集計（ソフトウェアAggrolinkに備わっているChronolog-Kordia）を使用して凝集測定を実施し、血小板サンプルにおける光の透過の変化を測定した。血小板懸濁液又は血小板に富んだ血漿（ＰＲＰ）の光学密度は、血小板凝集を増加させることによって減少する：培地はより透明になり、光の透過が増加する。ＰＲＰに関して使用した参照は、血小板に乏しい血漿（ＰＰＰ）であった。減圧プロトコールの終了時に得られた血小板に関して使用した参照は、同じ減圧プロトコールに供したT-Sol／Voluven中で希釈したＰＰＰ（１：１）であった。使用した誘導因子（５、２．５、１．２５及び０．６２５μMのＡＤＰならびに０．８及び１．２μMのコラーゲン）を生理溶液中で希釈し、ハミルトンシリンジを使用してｔ＝０において血小板凝集計キュベット中に注入した。測定コンテナの内容物を撹拌し（１１００rpm）、３７℃で保管した。しかしながら、血小板凝集計が信頼性のある測定を提供するには試験した血小板懸濁液を濃縮しすぎたという事実のために、ここまでに得られた結果は、結論的なものではなかった。追加の実験が進行中である。
【００８７】
実施例２：乾燥時間の決定
乾燥時間（すなわち、乾燥ステップの継続時間）は：（ｉ）工程の成績、（ｉｉ）血小板に適用されるストレスのレベル、及び（ｉｉｉ）工程を工業化前ステップに向けて高めることの実行可能性に関する情報を提供するので、重要なパラメーターである。乾燥時間は、血小板が効果的に保存され、温度工程が１８℃〜２２℃の間に維持されることを可能にしながら、可能な限り短くしなければならない。
【００８８】
最初に、本発明者らは、血小板、ゼオライト及びチャンバーの熱プロファイルを分析した。次いで、使用するべき乾燥時間を決定するために、本発明者らは、血小板の相対湿度を測定した。最後に、ゼオドレーションされた血小板の長期間の保存を評価するために、血小板の水分活性を測定した。
【００８９】
それぞれのアッセイに関して、ゼオドレーターを使用して、圧力及び温度の条件を記録した。産物（T-Sol／Voluven中で希釈したＰＲＰ）の性質及び量は、実施例１で使用したものと同じであった。
【００９０】
１．ゼオライトの存在下における減圧及び脱水
ゼオライトの非存在下で脱水ステップを実施した場合、本発明者らは、血小板を１８℃〜２２℃の温度範囲で２時間よりも短い時間安定的に維持することができた。次いで、目標は、ゼオライトの存在下で乾燥ステップを実施し、血小板温度を１８℃〜２２℃の間で数時間安定的に維持することを可能にする条件を見出すことであった。しかしながら、ゼオライトによる水吸着は、反応容器の温度の改変をもたらすことが期待され得る発熱反応である。実際、本発明者らは、乾燥ステップの開始後約２時間（１３２分間）に２２℃を超える血小板温度の上昇を観測した。
【００９１】
この問題を解決するために、いくつかのステップを行った。ゼオドレーターの機械の過熱がシステムの熱プロファイル破壊をするのを防ぐために、ゼオドレーターのポンプをケースの外側に置いた。さらに、それぞれの試験の前に、ゼオドレーターを室温で少なくとも１時間放置した。加えて、作動中のゼオドレーターの熱平衡が気温に大きく依存していたことを観測したので、ゼオドレーターを空調室に置いた。
【００９２】
これらの条件を使用して得られた結果を図３に示す。それらは、血小板温度を１８℃〜２２℃の間で安定的に維持することができることを示している。
【００９３】
血小板温度を所望の範囲に維持しなければならない乾燥時間をさらに減少させるために、本発明者らは、いくつかの提案をゼオドレーター製造業者に提示した：ゼオライトと乾燥すべき産物（血小板）を含む反応容器又は乾燥支持体との間の距離を増加させること、及びサーマルレギュレーションシステム（加熱及び冷却レギュレーションの両方）を用いてゼオドレーターを実行すること。得られた結果は、２０℃の空調室で改変ゼオドレーターを使用する場合、血小板温度を１８℃〜２２℃の間で必要時間（これは、ゼオドレーションに供した血小板の開始量に依存しており、約２時間〜約５時間まで変わり得る）維持することができることを示していた。
【００９４】
２．相対湿度及び脱水速度進化
乾燥によって血小板を全体的に不活性化するために、最終相対湿度は、１０％未満でなければならない（De Castro et al., Nature Biotechnology, 2000, 18: 473）。
【００９５】
脱水ステップの前に、乾燥支持体を乾燥チャンバー中に９０℃で３０分間置いて、ポリスチレン上に吸着したあらゆる水分を評価した。次いで、プライヤーを使用して乾燥支持体を操作し、乾燥大気（デシケーター（dessicator））中に保管した。実験の直前に、乾燥支持体を室温で３０分間放置した。T-Sol／Voluven中で希釈したＰＲＰ溶液２mLを乾燥支持体に添加し、ＰＲＰサンプルを含む乾燥支持体を重量測定した（ｍｉ）。ＰＲＰサンプルを容器中に置き、ゼオドレーションに異なる時間供した。次いで、サンプルを再び重量測定し（ｍｚ）、乾燥チャンバー中に１１０℃で２４時間置いた。最後に、最終乾燥質量の重量（ｍｆ）を測定した。相対湿度のパーセンテージは、以下の式：
【数１】
2013524784.tif 000002
を使用して計算される。それぞれのステップにおいて、血小板の相対湿度のパーセンテージを測定した。得られた結果を図４Ａに示す。これらの結果から、ゼオドレーションに供される血小板数及びチャンバーのサイズに応じて約２時間〜約５時間の間である乾燥時間（すなわち、１０％未満の最終相対湿度を得るのに必要な時間）を評価することができる。図４Ｂは、脱着等温線（この工程の特徴の１つ）を図示する。曲線は、時間とともにどのような大きな変化も示しておらず、このことは、水分が徐々に排除されることを示している。
【００９６】
１分ごとに評価したミリグラム単位の水分で表される脱水速度を計算することもできる（図５）。大量の利用可能な自由水により、脱水速度は、減圧ステップの開始時に最大になる。２００mbarから、脱水速度は準線形的に減少する：脱水条件は穏やかであり、血小板膜を破壊し得るどのような大幅な水分損失もない。
【００９７】
３．乾燥の検証：活性水分の測定
血小板の十分な保存を確認するために実施した水分活性（Ａｗ）測定は、相対湿度測定に相補的な分析である。吸湿性プローブを用いて平衡相対湿度を測定することによって、純水の水分活性に対するサンプルの水分活性を測定する水分活性メーター（Novasina）を使用して、Ａｗ値を得た。パーセンテージとして表される平衡相対湿度（ＥＲＨ）は、水分活性：
Ａｗ＝ＥＲＨ／１００
と直接的に関連している。
【００９８】
０．６≦のＡｗ値を有する産物は、微生物（細菌、酵母、かび）増殖のリスクを示さない。
【００９９】
Ａｗ測定を実施するのに必要な産物の量（これは、１０回の異なる連続調製（２４０分間の乾燥時間）において得られた乾燥血小板約１グラムである）を、一緒にプールした。２５℃で１０分間実施したＡｗ測定により、０．３０２のＡｗ値が得られた（図６）。この結果は、本発明によるゼオドレーション法を使用して調製した乾燥血小板を、微生物増殖のリスクなしに保管することができることを示唆している。
【０１００】
ハロゲン水分分析器（熱てんびん）を使用して乾燥質量も測定して、得られた結果を確認した。乾燥質量を測定したところ９４．９９％（これは、５．１％の相対湿度に対応する）であり、これは、上記方法によって測定した値と一致している。１０日間保管した脱水血小板は、長期間にわたって湿気を蓄積しなかった。このことは、本発明によるゼオドレーションされた血小板の長期間の保存が実行可能であることをさらに裏付けている。
【０１０１】
４．結論
血小板の保存のための工程のこの開発段階においてさえも、ゼオドレーションの利点は明らかである。ゼオドレーションは、血小板に適応することができるが、これは、この工程が、血小板を保存する温度で実施することができるからである。さらに、（同量の産物を）凍結乾燥するのに数十時間を必要とするのに対して、たった４時間の乾燥時間しか必要としない。加えて、本発明によるゼオドレーション工程において使用される温度及び圧力の条件により、血小板に適用されるストレスのレベルも、凍結乾燥によって適用されるものよりもかなり限定される。
【０１０２】
最良の条件下でゼオドレーションされた血小板を保存するために、ゼオドレーションされた血小板の保管は、好ましくは、光の非存在下及び真空下で実施する。
【０１０３】
実施例３：乾燥により生じる問題に対する解決策
現在のところ、表面張力に関連して、不均一な乾燥の問題が特定されており、解決すべき課題として残っている。
【０１０４】
これは、乾燥支持体をコートするための薬剤を使用することによって（例えば、アルブミン又はＰＤＭＳ（図７）を、血小板が置かれてゼオドレーションされる乾燥支持体をコートするのに使用してもよい）、及び／又は、トレハロース型乾燥支持体を使用することによって、及び／又は、脱水培地と生体適合性がある表面活性剤（界面活性剤）を添加することによって克服することができた。乾燥に関連する問題を解決することは、本研究の第三のステップの目標である。
【０１０５】
１．無水生物工学（Anhydrobiotic Engineering）
２０００年代の初めに現れた生命科学における新たな研究方法である無水生物工学は、生物学的産物の脱水に対する抵抗性を研究及び最適化することを目的とする。一般的には、目標は、浸透圧衝撃、温度及び圧力変動ならびに放射線に対する細胞寛容を改善することである（Huang et al., Method in Enzymology, 2007, 428: 269-277）。血小板の簡単な場合、放射線に対する保護は、不透明で真空下で密封される（血小板用の）コンテナを使用することによって得られるであろう。しかしながら、圧力、温度及び浸透圧ストレスは、血小板活性化に影響を与え得る不可逆的な損傷を生じさせる。
【０１０６】
従って、当技術分野において知られているように（Wolkers et al., Comp. Biochem. Physiol., 2001, 131: 535-543; Clegg et al., Comp. Biochem. Physiol., 2001, 128: 613-624）、解決しなければならない主な問題は、以下に関連している：
−  膜非透過性及び膜固定：（乾燥工程中の）時間関数としての水分含量の減少により、膜リン脂質は、強い分子間相互作用を受けて、二重層を安定化する。従って、血小板活性に必要とされる膜流動性は、失われるか、又は少なくとも大幅に減少される。
−  タンパク質凝集及び変性：同様の理由により、システムのエントロピーは、水の不足によって増加し、存在する水素結合がますます減少するので、タンパク質は構造破壊を受け、凝集する傾向を示す。その結果として、血小板の酵素及びシグナル活性は、大きく減少される。
−  細胞間成分の融合：この因子は、上述の浸透圧変動ならびにタンパク質及び脂質の構造的改変から生じる。しかしながら、血小板区画化は、活性動態及び隣接血小板の動員において重要な役割を果たす。
【０１０７】
脱水中のこれらの悪影響を減少させるいくつかの薬剤が、公知である。輸血目的の血小板の場合、追加の制約が存在する：このような薬剤は、患者への輸血に好適でなければならない。
【０１０８】
２．血小板保護剤の選択
公知の無水保護剤の中で、炭水化物は、本研究の要求に特によく適合している。実際、当技術分野において知られているように（Crowe et al., Ann. Rev. in Physiol., 1998, 60: 73-103; Tunnacliffe et al., Cryobiology, 2001, 43: 124-132）、糖は、以下の２つの原理により、脱水及び保管段階中に、細胞を安定化することができる：
−  水分補充仮説（ＷＲＨ）：多数の利用可能な水素相互作用は、高分子及び膜の安定化を可能にする。水分子が除去されると、空になったホールにそれ自身を非常に素早くかつ特異的に格納することができるアルコール基を付加することが必要となる。糖は、このようなアルコール基を提供する；それらは、膜システムのエネルギーレベルを低下させ、脱水段階中にそれを安定化させる。
−  ガラス化仮説（ＷＲＨ）：すべての水素結合は、培地のガラス化（ガラス転移）を可能にする大規模なネットワークを形成する。このガラス化状態は、長期間にわたり、そしてそれ故保管段階の間の安定化を保証する。
【０１０９】
しかしながら、糖は、無水生物における適用にはまったく好適ではない。分子量と細胞毒性／保護能との間の強い相関関係があるので、２つの特性が重要である：（１）糖のガラス転移温度（Ｔｇ）；及び（２）その分子量（Ｍｗ）。実際、当技術分野において知られているように（Puhlev et al., Cryobiology, 2001, 42: 207-217）、糖の保護能は、そのＭｗが増加すると減少するのに対して、糖の細胞毒性は、その分子量が増加すると増加する。
【０１１０】
３．トレハロースの利点
例えば、トレハロース、マルトデキストロース及びデキストロースを含む異なる糖が、適切であり得る。上述の要件を満たす糖候補の中で、トレハロースは、最も有望なものの１つである。トレハロースは、無水生物及び低温生物学（ｃｒｙｂｉｏｌｏｇｙ）を取り上げている多数の科学論文の主題である（Eroglu et al., Nature Biotechnology, 2000, 18: 163-167）。トレハロースは、以下の利点を示す二糖類（α，α−１，１結合グルコースダイマー−図８Ａを参照）である：
−  それは、容易に溶解できる（６８．９ｇ／２０℃の水１００ｇ）、
−  そのＴｇは、高い（グルコースのＴｇが３１℃であり、サッカロースのＴｇが６５℃であるのに対して、１１０℃）、
−  その分子量は小さく、それは非常に多くの生物において存在する（これは、陽性であることを証明した一連の生体適合性研究をもたらした−トレハロースは非還元糖であり、従って、それは、脱水及び保管段階の間に、アミノ酸又はタンパク質と反応しないであろう）、
−  それは、低ｐＨ、さらに高温でも安定する（他の二糖類とは対照的に、トレハロースは加水分解を受けず、従って、産物中に存在するアミノ酸又はタンパク質との酸化反応−メイラード反応−に関与しないであろう）、
−  それは、産物における表面張力を減少させることができる（従って、その高湿潤性により、それは、十分で均一な脱水を提供し、再水和を容易にするはずである−図８Ｂを参照−Lebret et al., J. Phys. Chem. B, 2005, 109 : 11046-11057）。
【０１１１】
しかしながら、トレハロースは、大きな不利点を示す：その立体障害により、それは、膜を容易に横断しない。それは、限られた量だけであるが、エンドサイトーシスを介して取り込まれ得る。グルコース輸送体は、トレハロース輸送を行うことができない。しかし、最大限の保護を保証するために、細胞外表面及び細胞内容積は、トレハロースでロードされなければならない。
【０１１２】
先験的には、インビトロにおいて適用可能な少なくとも４つのインターナリゼーション技術がある：
−  熱ショック−この工程は、非常に感熱性の細胞に好適であるが、血小板には適用可能ではない、
−  エレクトロポレーション及び超音波−重要な細胞構造変化をもたらすことが知られている工程（S Zhang et al., Cryobiology, 2009, 59:135-140）、
−  コントロールされた多孔性−穿孔剤（ストレプトリシン（streptolysine））が添加され、これが一時的な膜細孔をつくる工程。しかしながら、輸血目的の血小板の場合、この技術は適用可能ではない、ならびに
−  リポソーム−これは、本研究の場合に最も好適な選択肢であると思われる（C. Keil et al., Thromb. Haemost., 2005, 94: 404-411）。目標は、血小板のリン脂質に類似するリン脂質を含む非常に小さなリポソームを合成すること、及び、血小板平均容積を改変しないために、これらのリポソームをトレハロースで高度にロードすることである。
【０１１３】
４．乾燥により生じる他の問題
図７によって示されるように、血小板濃度も、ゼオドレーション工程を最適化するためにコントロールされる必要がある因子であり得る。
【０１１４】
図８は、血小板サンプルのｐＨ（図８Ａ）及び浸透圧（図８Ｂ）が、ゼオドレーション工程中に増加することを示している。ｐＨの増加は、チャンバーに置く血小板の開始サンプルのｐＨを（例えば、ｐＨ７．４の代わりに、ｐＨ６に）下げることによって回避することができた。浸透圧問題は、（１）ＨＳＡを血小板懸濁液に添加すること−塩を高電荷イオンで置換することは、開始浸透圧を減少させるのに役立つ、及び／又は（２）浸透圧の増加を最小化するためにキレート剤を使用することによって解決することができた。
【０１１５】
従って、本発明のある実施態様では、ゼオドレーションチャンバーに置かれる血小板サンプルのｐＨは、下げられる。他の実施態様では、ゼオドレーションチャンバーに置かれる血小板サンプルの浸透圧は、下げられる。さらに他の実施態様では、ゼオドレーションチャンバーに置かれる血小板サンプルのｐＨ及び浸透圧は、下げられる。
【０１１６】
他の実施態様
本明細書において開示される本発明の詳説又は実施の考察から、本発明の他の実施態様は、当業者には明らかであろう。詳説及び実施例は単に例示と考えられ、本発明の真の範囲は、以下の特許請求の範囲によって示されることを意図するものである。
【図１】
2013524784.tif 000003
【図２Ａ】
2013524784.tif 000004
【図２Ｂ】
2013524784.tif 000005
【図２Ｃ】
2013524784.tif 000006
【図２Ｄ】
2013524784.tif 000007
【図３Ａ】
2013524784.tif 000008
【図３Ｂ】
2013524784.tif 000009
【図４Ａ】
2013524784.tif 000010
【図４Ｂ】
2013524784.tif 000011
【図５】
2013524784.tif 000012
【図６】
2013524784.tif 000013
【図７】
2013524784.tif 000014
【図８Ａ】
2013524784.tif 000015
【図８Ｂ】
2013524784.tif 000016
【国際調査報告】
2013524784.tif 000017
2013524784.tif 000018
2013524784.tif 000019