(57)【要約】  哺乳動物細胞における脱メチル化を調節するための方法、組成物およびキットが提供される。候補薬剤を、哺乳動物細胞におけるゲノムＤＮＡ脱メチル化の調節における活性についてスクリーニングするための方法、組成物およびキットも提供される。これらの方法、組成物およびキットは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）および体細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製することにおいて、および、癌およびゲノム刷り込みにおける欠損から生じる障害を含めたヒトの障害を治療するために使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞におけるゲノムＤＮＡメチル化の量を減少させる方法であって、
前記哺乳動物細胞を、ゲノムＤＮＡメチル化が減少するような条件下で、有効量の、シチジンデアミナーゼ（ＣＤ）活性を促進する１種または複数種の薬剤と接触させるステップを含む方法。
【請求項２】
ＣＤ活性を促進する１種または複数種の薬剤が活性化誘導性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）ポリペプチドまたはＡＩＤポリペプチドをコードする核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣＤ活性を促進する１種または複数種の薬剤がアポリポタンパク質Ｂ  ＲＮＡ編集触媒成分（ＡＰＯＢＥＣ）ポリペプチドまたはＡＰＯＢＥＣペプチドをコードする核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記哺乳動物細胞を、選択されるタンパク質と接触させるステップをさらに含み、ＣＤ活性を促進する１種または複数種の薬剤がｔｅｔタンパク質をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記接触させるステップが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記接触させる哺乳動物細胞が、脱メチル化を許容する体細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
接触させる哺乳動物細胞が、前記接触させるステップの後に人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞になる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記脱メチル化を許容する体細胞を、ｉＰＳ細胞への運命を促進する１種または複数種の因子と接触させるステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
接触させる哺乳動物細胞が、脱メチル化を許容する体細胞の細胞系譜とは異なる細胞系譜の体細胞になる、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記脱メチル化を許容する体細胞を、所望の体細胞運命を促進する１種または複数種の因子と接触させるステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
接触させる哺乳動物細胞が多能性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
多能性幹細胞が、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖幹（ＥＧ）細胞、および人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
作製される細胞が体細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記多能性細胞を、所望の体細胞運命を促進する１種または複数種の因子と接触させるステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記接触させるステップが、ゲノムＤＮＡ脱メチル化療法を必要とする対象において実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が癌細胞であり、前記対象が、癌に罹患している対象である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
候補薬剤を、細胞におけるゲノムＤＮＡ脱メチル化活性の調節における活性についてスクリーニングする方法であって、
細胞の集団を、有効量の、シチジンデアミナーゼ（ＣＤ）活性を促進する薬剤と接触させるステップと、
候補薬剤と接触させた細胞を、シチジンデアミナーゼ活性を促進する薬剤と接触させたが候補薬剤と接触させていない細胞の集団と比較するステップであって、
第１の亜集団と第２の亜集団との間の特性の違いにより、候補薬剤がゲノムＤＮＡ脱メチル化活性を調節することが示されるステップと
を含む方法。
【請求項１８】
ＣＤ活性を促進する薬剤が、ＡＩＤペプチドまたはＡＩＤペプチドをコードする核酸である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１の細胞の集団が腫瘍細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
腫瘍細胞におけるゲノムの脱メチル化を調節する候補薬剤が、癌における腫瘍成長を調節する薬剤である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１の細胞の集団が、体細胞またはＥＳ細胞と体細胞から作製された異核共存体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
体細胞におけるゲノムの脱メチル化を調節する候補薬剤が、体細胞の多能性の誘導を調節する薬剤である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
シチジンデアミナーゼのＤＮＡ脱メチル化活性の調節における活性を有するタンパク質を同定するための方法であって、
細胞の集団を、シチジンデアミナーゼをコードする配列を含む核酸と接触させるステップと、
前記細胞の粗タンパク質抽出物からシチジンデアミナーゼを免疫沈降させるステップと、
前記免疫沈降物を質量分析に供するステップとを含み、
質量分析によって同定された１種または複数種のタンパク質が、前記シチジンデアミナーゼの脱メチル化活性に欠かせないものである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
米国特許法第１１９条（ｅ）に準じて、本出願は、２０１０年１２月１８日出願の米国仮特許出願第６１／２８４，５１９号の出願日について優先権を主張する；その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府の権利
本発明は、国立保健研究機構（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）から授与されたＡＧ００９５２１およびＡＧ０２４９８７の下、政府支援で行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、哺乳動物細胞におけるゲノムＤＮＡ脱メチル化を誘導するための方法および組成物、ならびに、候補薬剤を、哺乳動物細胞におけるゲノムＤＮＡ脱メチル化の調節における活性についてスクリーニングするための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
いくつかの因子を導入することによって体細胞の核を多能性に、または別の細胞系譜の体細胞に再プログラミングすることにより、再生医療の分野における主要なブレイクスルーである、患者に特異的な人工多能性細胞（ｉＰＳ）および患者に特異的な体細胞の生成が可能になった。しかし、これらのプロセスには時間がかかり（２〜３週間）、非同期的であり、頻度が低く（＜０．１％）（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｋ．ら（２００７）Ｃｅｌｌ  １３１：８６１〜７２；Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｋ．＆Ｙａｍａｎａｋａ、Ｓ．（２００６）Ｃｅｌｌ  １２６：６６３〜７６；Ｗｅｒｎｉｇ、Ｍ．ら（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  ４４８：３１８〜２４；Ｗｅｒｎｉｇ、Ｍ．ら（２００８）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌを参照されたい）、ＤＮＡ脱メチル化がネックになっている（Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ、Ｔ．Ｓ．ら（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  ４５４、４９〜５５）。したがって、哺乳動物細胞におけるＤＮＡ脱メチル化を調節する機構を解明すること、および脱メチル化を促進する薬剤を同定することは、臨床および研究の興味の対象である。本発明は、これらの問題を解決するものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｒａｉ、Ｋ．ら（２００８）「ＤＮＡ  ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  Ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ｔｈｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｏｆ  ａ  Ｄｅａｍｉｎａｓｅ、ａ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ、ａｎｄ  Ｇａｄｄ４５」Ｃｅｌｌ  １３５：１２０１〜１２１２（ゼブラフィッシュにおけるＤＮＡ脱メチル化の基礎をなす機構についての記載を見いだすことができる。）
【発明の概要】
【０００６】
哺乳動物細胞における脱メチル化を調節するための方法、組成物およびキットが提供される。これらの方法、組成物およびキットは、細胞運命の再プログラミングを導くことにおいて、例えば、体細胞から人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）を作製することにおいて、および体細胞を、別の細胞運命に向け直すことにおいて使用される。体細胞は、例えば、メチル化の欠損から生じる、またはそれによって悪化するヒトの障害、例えば、癌および異常なゲノム刷り込みに関連する障害の治療において使用するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、およびｉｎ  ｖｉｖｏで作製することができる。候補薬剤を、哺乳動物細胞におけるゲノムＤＮＡ脱メチル化の調節における活性についてスクリーニングするための方法、組成物およびキットも提供される。
【０００７】
本発明の一態様では、哺乳動物細胞におけるゲノムＤＮＡメチル化の量を減少させるための方法であって、対象とする遺伝子（複数可）の発現を制御するプロモーター領域におけるヌクレオチドのメチル化を減少させることを含む方法が提供される。方法は、最初の哺乳動物細胞を、有効量の、シチジンデアミナーゼ（ＣＤ）活性を促進する薬剤と接触させるステップを含み、例えば、哺乳動物細胞は、脱メチル化を許容する体細胞を含めた体細胞である。
【０００８】
一部の実施形態では、ＣＤ活性を促進する薬剤は、活性化誘導性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）ポリペプチドまたはＡＩＤポリペプチドをコードする核酸である。一部の実施形態では、ＣＤ活性を促進する薬剤は、アポリポタンパク質Ｂ  ＲＮＡ編集触媒成分（ＡＰＯＢＥＣ）ポリペプチドまたはＡＰＯＢＥＣポリペプチドをコードする核酸である。一部の実施形態では、細胞を表５のポリペプチドとも接触させる。ある特定の実施形態では、表５のポリペプチドは、メチル化シトシンのヒドロキシル化メチルシトシンへの変換を促進する薬剤、例えば、ｔｅｔタンパク質、例えば、ｔｅｔ１またはｔｅｔ２である。一部の実施形態では、接触させるステップをｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施する。
【０００９】
一部の実施形態では、最初の哺乳動物細胞は、体細胞、例えば、脱メチル化を許容する体細胞である。一部のそのような実施形態では、作製される細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）である。一部の実施形態では、方法は、体細胞を、ｉＰＳ細胞への運命を促進する１種または複数種の因子と接触させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、作製される細胞は、出発細胞とは異なる系列の体細胞である。一部のそのような実施形態では、方法は、体細胞を、所望の体細胞運命を促進する１種または複数種の因子と接触させるステップをさらに含む。
【００１０】
一部の実施形態では、最初の細胞は、多能性幹細胞、例えば、脱メチル化を許容する多能性幹細胞である。一部のそのような実施形態では、多能性幹細胞から作製される細胞は、体細胞である。一部のそのような実施形態では、方法は、多能性幹細胞を、所望の体細胞運命を促進する１種または複数種の因子と接触させるステップをさらに含む。
【００１１】
一部の実施形態では、接触させるステップは、ｉｎ  ｖｉｖｏで、ゲノムＤＮＡ脱メチル化療法を必要とする対象において実施される。一部のそのような実施形態では、最初の細胞は、腫瘍細胞、例えば、脱メチル化を許容する腫瘍細胞であり、対象は、癌に罹患している対象である。他のそのような実施形態では、最初の細胞は、形質転換されていない体細胞、例えば、脱メチル化を許容する体細胞である。
【００１２】
本発明の一態様では、候補薬剤を、細胞においてゲノムＤＮＡ脱メチル化活性を調節する活性についてスクリーニングする方法が提供される。そのような方法では、細胞の第１の集団を、有効量の、シチジンデアミナーゼ（ＣＤ）活性を促進する薬剤とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる。次いで、この集団の亜集団を候補薬剤と接触させ、一方、第２の集団、すなわち、対照集団は、候補薬剤と接触させない。次いで、候補薬剤と接触させた亜集団の特性を、候補薬剤と接触させなかった細胞の亜集団の特性と比較し、第１の亜集団と第２の亜集団との間の細胞の特性の違いにより、候補薬剤が細胞におけるゲノムＤＮＡ脱メチル化活性を調節することが示される。
【００１３】
一部の実施形態では、ＣＤ活性を促進する薬剤は、ＡＩＤポリペプチドまたはＡＩＤポリペプチドをコードする核酸である。一部の実施形態では、第１の集団の細胞は、腫瘍細胞、すなわち腫瘍由来の細胞である。ある特定の実施形態では、腫瘍細胞におけるゲノムＤＮＡ脱メチル化を調節する候補薬剤は、癌における腫瘍成長を調節する薬剤である。
【００１４】
一部の実施形態では、第１の集団の細胞は、体細胞、またはＥＳ細胞と体細胞から作製された異核共存体である。一部の実施形態では、体細胞のＤＮＡのゲノムＤＮＡ脱メチル化を調節する候補薬剤は、体細胞のｉＰＳ細胞化の誘導を調節する薬剤である。
【００１５】
本発明の一態様では、シチジンデアミナーゼのＤＮＡ脱メチル化活性の調節における活性があるタンパク質を同定するための方法が提供される。そのような方法では、細胞の集団を、シチジンデアミナーゼをコードする配列を含む核酸と接触させ、シチジンデアミナーゼを細胞の粗タンパク質抽出物から沈殿させ、免疫沈降物を質量分析に供し、ここで、質量分析によって同定された１種または複数種のタンパク質は、シチジンデアミナーゼの脱メチル化活性に欠かせないものである。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、ＡＩＤまたはＡＰＯＢＥＣである。一部の実施形態では、同定されるタンパク質は、表５のタンパク質である。
【００１６】
本発明は、以下の詳細な説明を付属図と併せて読むと最もよく理解される。本特許または出願のファイルは、カラーで製作された少なくとも１つの図面を含有する。カラーの図面（複数可）を伴う本特許または特許出願公開のコピーは、要請し、必要な料金を支払えば、特許庁により提供されるであろう。一般的な実施に従って、図のさまざまな特徴は一定の縮尺ではないことが強調される。それどころか、さまざまな特徴の次元は、明瞭にするために任意に拡大または縮小されている。図面には、以下の図が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】マウスＥＳ細胞×ヒト線維芽細胞の異核共存体の単離および特徴付けを示す図である。ａ、異核共存体の融合スキームである。ＧＦＰ＋マウスＥＳ細胞（ｍＥＳ）をＤｓＲｅｄ＋ヒト初代線維芽細胞（ｈＦｂ）と２：１の比率で共培養し、次いで、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用して融合した。ｂ、ＧＦＰ＋ｍＥＳ、ＤｓＲｅｄ＋ｈＦｂ、および融合の２日後に選別したＧＦＰ＋ＤｓＲｅｄ＋異核共存体（第１の選別異核共存体）のＦＡＣＳプロファイルである。異核共存体集団をさらに再選別して（第２の選別異核共存体）、集団の約８０％の濃縮（濃縮）にし、分析した。異核共存体を単離するために使用した選別ゲートが示されている。ｃ、融合の２日後に２回選別し、サイトスピンしたＧＦＰ＋とＤｓＲｅｄ＋の異核共存体の代表的な画像が示されている。異核共存体の核は、別個のままであり、融合していない。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（青色）は核を示し、示されている異核共存体は３つの明るいマウスの核および１つの均一に染色されたヒトの核を有する。スケールバー＝５０μｍ。ｄ、ＧＦＰ＋ＤｓＲｅｄ＋異核共存体を融合の２日後に２回選別し、サイトスピンし、Ｋｉ−６７（青色）について染色して細胞分裂を評価した。ＧＦＰ蛍光によって示される異核共存体は、Ｋｉ−６７（青色）について陰性である２つの別個の核（矢印）、それとは対照的に、Ｋｉ−６７について陽性に染色された単核細胞（矢じり）を有する。スケールバー＝５０μｍ。ｅ、融合の１日後、２日後および３日後に選別し、サイトスピンした異核共存体を、Ｋｉ−６７染色に基づいてスコア化し、９８（±２）％の異核共存体が非分裂性であった（平均±標準誤差、ｐ＜０．０５）。ｆ、ＧＦＰ−ＥＳ細胞を使用して生成した異核共存体（補足的な方法を参照されたい）を、融合の１日後にヒト線維芽細胞マーカーであるＴｈｙ１．１を使用して濃縮し、サイトスピンし、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８を使用してＢｒｄＵ（緑色）および核（青色）について染色した。示されている異核共存体（矢印）は、３つの均一に染色されたヒトの核および１つの明るい点状のマウスの核を有し、ＢｒｄＵについて陰性であった。対照的に、示されたヒト単核細胞（矢じり）は、ＢｒｄＵについて陽性に染色される。スケールバー＝５０μｍ。ｇ、融合の１日後、２日後および３日後に濃縮し、サイトスピンした異核共存体を、核およびＢｒｄＵの染色に基づいてスコア化した。異核共存体の９４（±３）％においてＤＮＡ複製は起こらなかった（平均±標準誤差、ｐ＜０．０５）。
【図２】単一細胞レベルでの異核共存体におけるヒト線維芽細胞の多能性遺伝子の発現の時間経過を示す図である。ａ、Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＧＡＰＤＨに対するヒト特異的なプライマーを、０日目の融合していない共培養物、および融合の１日後、２日後および３日後に単離した異核共存体（ｍＥＳＸｈＦｂ）のＲＴ−ＰＣＲのために使用した。ｈＯｃｔ４およびｈＮａｎｏｇはどちらも、異核共存体試料において上方制御され、異核共存体におけるヒト線維芽細胞核の再プログラミングの急速な開始が示されている。ｂ、リアルタイムＰＣＲを使用して、融合の１日後、２日後および３日後に単離した異核共存体におけるＯｃｔ４（灰色）およびＮａｎｏｇ（黒色）の上方制御を、ヒト特異的なプライマーを使用して評価した（平均±標準偏差）。融合していない共培養物は、０日目の対照としての機能を果たし、ｈＯｃｔ４およびｈＮａｎｏｇの発現を、ｈＧＡＰＤＨの発現に対して正規化した。０日目ならびに１日目、２日目および３日目に、ｈＯｃｔ４の遺伝子発現とｈＮａｎｏｇの遺伝子発現の間に統計的有意差が観察された（＊は、ｐ＜０．０３を示す）。示されているデータは、３つの独立した融合実験からのものである。ｃ、異核共存体集団における再プログラミングの効率を評価するための単一の異核共存体のネステッドＰＣＲ。融合の３日後に異核共存体を８０％まで濃縮し、単一細胞として単離した。示されている通り、単一の異核共存体に対して、ＧＡＰＤＨ（Ｇ）、Ｏｃｔ４（Ｏ）およびＮａｎｏｇ（Ｎ）に対するヒト特異的なプライマーを使用して直接逆転写およびネステッドＰＣＲを同時に行った。単回の融合実験で分析された１２個の異核共存体が示されている。２つの追加的な融合実験で分析された１０個の異核共存体および３１個の異核共存体が図７に示されている。ｄ、Ｏｃｔ４のみを発現している異核共存体ならびにＯｃｔ４とＮａｎｏｇの両方を発現している異核共存体の割合は７０±１３％であり、これにより、高い割合の異核共存体が多能性への再プログラミングを開始することが示されている。示されているデータは、３つの独立した融合実験の概要である（平均±標準偏差）。
【図３】異核共存体における、ヒト線維芽細胞の多能性遺伝子のプロモーターにおけるＤＮＡ脱メチル化の時間経過を示す図である。ａ、異核共存体におけるヒトＯｃｔ４プロモーターおよびヒトＮａｎｏｇプロモーターのメチル化状態のバイサルファイト配列決定分析。異核共存体におけるヒトＯｃｔ４プロモーターおよびヒトＮａｎｏｇプロモーターはどちらも、融合の１日後、２日後および３日後に、共培養した対照と比較して急速かつ進行性のＤＮＡ脱メチル化を示す。白い丸は非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを示し、黒い丸はメチル化ＣｐＧジヌクレオチドを示す。ｂ、融合後の、異核共存体におけるヒトＯｃｔ４プロモーターのパーセント脱メチル化により、脱メチル化が３日目に８０％まで進行性に増加したことが示されている。ｃ、融合後の、異核共存体におけるヒトＮａｎｏｇプロモーターのパーセント脱メチル化により、脱メチル化が３日目に５６％まで進行性に増加したことが示されている。各時点で、２から３の独立した実験において少なくとも１０クローンを分析した；代表的な１０クローンが示されている。
【図４】異核共存体において、ヒト線維芽細胞の多能性への再プログラミングを開始するためのＡＩＤ依存性のＤＮＡ脱メチル化の必要性を示す図である。ａ、リアルタイムＰＣＲによって評価した、ｓｉＲＮＡ処理に供した異核共存体におけるＡＩＤおよびヒト多能性遺伝子の発現。ｓｉ−１、ｓｉ−２、ｓｉ−３およびｓｉ−４は、ＡＩＤを対象とする別個のｓｉＲＮＡである。融合の２日後に単離した異核共存体を、ｓｉ−３およびｓｉ−４で処理し、３日目に単離した異核共存体を、ｓｉ−１およびｓｉ−２で処理した。マウスＡＩＤ転写物およびヒトＡＩＤ転写物の総レベルを、変性プライマーのセットを使用して評価し、一方、ｈＯｃｔ４およびｈＮａｎｏｇに対してヒト特異的なプライマーを使用した。遺伝子発現を、ＡＩＤの発現についてはＧＡＰＤＨ（変性プライマー）に対して、ヒトＯｃｔ４の発現およびヒトＮａｎｏｇの発現についてはｈＧＡＰＤＨに対して内部で正規化した。次いで、試料を、対応する、対照ｓｉＲＮＡで処理した２日目の試料または３日目の試料に対して正規化し、代表的なｓｉ対照（１００％）が示されている。ｓｉ−３、ｓｉ−４、ｓｉ−１、およびｓｉ−２で処理した異核共存体におけるＡＩＤの発現は、対照と比較して低下した。４種のｓｉＲＮＡ全てによるＡＩＤのノックダウンにより、多能性遺伝子であるｈＯｃｔ４およびｈＮａｎｏｇの発現が遮断された。ｂ、融合の２日目および３日目に、ｓｉ−３／ｓｉ−４およびｓｉ−１／ｓｉ−２によってＡＩＤをノックダウンした際のヒトＯｃｔ４プロモーターおよびヒトＮａｎｏｇプロモーターは、それぞれ、メチル化されたままであり、これは、脱メチル化が阻害されたことを示し、異核共存体におけるＤＮＡ脱メチル化および核の再プログラミングにおけるＡＩＤの役割を裏づけている。ｃ、ｓｉ−３／ｓｉ−４、およびｓｉ−１／ｓｉ−２によってＡＩＤをノックダウンした際のヒトＯｃｔ４プロモーターおよびヒトＮａｎｏｇプロモーターでのパーセント脱メチル化により、それらのそれぞれの、ｓｉ対照で処理した対照試料の２日目および３日目と比較して、脱メチル化が遮断されたことが示された。ｄ、ヒトＡＩＤは、線維芽細胞における重度にメチル化されたヒトＮａｎｏｇ遺伝子およびヒトＯｃｔ４遺伝子のプロモーターに動員される。ｍＥＳおよびｈＦｂにおいて、抗ＡＩＤ抗体を用いてクロマチン免疫沈降を行った。バックグラウンドのＩｇＧシグナルと比較したＡＩＤの占有率が示されている（平均±標準誤差）。ｈＦｂならびに陽性対照としてｍＥＳ、ＣμおよびＣｄｘ２において、それぞれ有意なＡＩＤの結合が検出された（ｐ＜０．０２）。ｈＯｃｔ４およびｈＮａｎｏｇのメチル化プロモーターへのＡＩＤの結合は、ヒト線維芽細胞において有意であった（ｐ＜０．０２）が、マウスＥＳ細胞における非メチル化Ｏｃｔ４プロモーターおよび非メチル化Ｎａｎｏｇプロモーターへの有意な結合は観察されなかった。ｅ、異核共存体における多能性への再プログラミングにおけるＡＩＤ依存性のＤＮＡ脱メチル化のモデル。デアミナーゼＡＩＤと一緒に作用し得る哺乳動物のＤＮＡデメチラーゼ複合体（Ｘ、Ｙ、およびＺ）の他の推定上の構成成分は、まだ同定されていない。
【図５】異核共存体の生成、ｓｉＲＮＡノックダウン、ｈＡＩＤ過剰発現、およびレスキュー実験のためのスキームを示す図である。
【図６】ＢｒｄＵ実験のための異核共存体のＴｈｙ１．１濃縮を示す図である。ａ、ヒト線維芽細胞に対するＴｈｙ１．１の特異性。ａ（パネル上部）に示されているように、ＧＦＰ＋マウスＥＳ細胞はヒト特異的なＴｈｙ１．１抗体に結合しないが、ｄｓＲｅｄ＋ヒト線維芽細胞の１００％がＴｈｙ１．１（パネル下部）に結合し、これは、Ｔｈｙ１．１をヒト線維芽細胞に対する細胞表面マーカーとして特異的に使用することができることを示している。ｂ、Ｔｈｙ１．１抗体を使用した異核共存体の濃縮。ビオチン化したＴｈｙ１．１を使用して、ＰＥＧ処理したｍＥＳ共培養物およびｈＦｂ共培養物を標識し、ストレプトアビジン磁気ビーズを使用してヒト線維芽細胞および異核共存体（ｍＥＳＸ  ｈＦｂ）について濃縮した。ｂ（左下）に示されているように、濃縮前にはＰＥＧ処理したｍＥＳ共培養物およびＦｂ共培養物に０．１〜１％の異核共存体が存在するが、磁気ビーズ濃縮後には、Ｔｈｙ１．１陽性の異核共存体および線維芽細胞は、それぞれ１０％および８０％であった。
【図７】異核共存体はＤＮＡ複製を行わないことを示す図である。ＧＦＰ−（非ＧＦＰ）のＥＳ細胞およびヒト線維芽細胞を使用して生成した異核共存体を、融合の１日後に、ヒト線維芽細胞マーカーであるＴｈｙ１．１を使用して濃縮し（補足的な方法を参照されたい）、サイトスピンし、ＢｒｄＵ（緑色の）および核（青色）についてＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８を用いて染色した。示されている異核共存体（矢印）は、３つの均一に染色されたヒト核および１つの明るい点状のマウスの核を有し、ＢｒｄＵについては陰性であり、これは、異核共存体においてＤＮＡ複製がないことを示している。対照的に、示されている単核細胞（矢じり）は、ＢｒｄＵについて陽性に染色される。磁性ストレプトアビジンビーズは、免疫蛍光による画像において小さな黒い丸として細胞の表面上に見ることができる。スケールバー＝５０ミクロン。
【図８】種間の異核共存体における多能性遺伝子の活性化を試験するためのヒト特異的なプライマーの検証についての図である。ａ、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇに対して設計したヒト特異的なプライマーは、ヒトＥＳ細胞（ｈＥＳ）由来のヒト転写物を選択的に増幅するが、マウスＥＳ細胞（ｍＥＳ）由来のＯｃｔ４転写物およびＮａｎｏｇ転写物は検出しない。ｂ、ヒトＯｃｔ４プロモーターおよびヒトＮａｎｏｇプロモーターのメチル化状態を評価するために設計したヒトおよびバイサルファイトに特異的なプライマーにより、ｈＦｂからのみ産物が増幅され、ｍＥＳからは増幅されなかった。ｃ、単一の異核共存体におけるヒトＧＡＰＤＨ、Ｏｃｔ４転写物およびＮａｎｏｇ転写物の発現を評価するために設計したネステッドＰＣＲのプライマーの種特異性。ヒトＧＡＰＤＨプライマーを用いるとｈＥＳ細胞とヒト初代線維芽細胞（ｈＦｂ）の両方で産物が検出されるが、ｍＥＳでは産物は検出されない、ヒトＯｃｔ４転写物およびヒトＮａｎｏｇ転写物は、ｈＥＳ細胞のみで検出され、ｈＦｂまたはｍＥＳでは産物は検出されない。
【図９】共培養した対照における、ある期間にわたるヒト多能性遺伝子の発現。０日目および３日目の、マウスＥＳ細胞およびｈＦｂの融合していない共培養物を、多能性遺伝子であるＯｃｔ４およびＮａｎｏｇに対するヒト特異的なプライマーを使用してリアルタイムＰＣＲによって分析した。遺伝子発現の倍率変化を得るために、遺伝子発現をｈＧＡＰＤＨおよび０日目の対照に対して正規化した。データにより、ｈＯｃｔ４およびｈＮａｎｏｇの発現が０日目から３日目まで変化しないままであることが示されている。
【図１０】異核共存体におけるヒト多能性遺伝子の活性化および発現を示すグラフである。多能性遺伝子であるＥｓｓｒｂ、ＴＤＧＦ１、Ｓｏｘ２ならびに細胞周期制御因子であるＫｌｆ４およびｃ−ｍｙｃに対するヒト特異的なプライマーを、０日目の融合していない共培養物および融合の２日後に単離した異核共存体（ｍＥＳＸ  ｈＦｂ）のリアルタイムＰＣＲのために使用した。遺伝子発現の倍率変化を得るために、遺伝子発現をｈＧＡＰＤＨおよび０日目の対照に対して正規化した。異核共存体の試料においてＥｓｓｒｂ、ＴＤＧＦ１およびｃ−ｍｙｃが誘導された。ヒト線維芽細胞においてすでに発現されているＳｏｘ２はそれ以上増加せず、Ｅｓｓｒｂと相互に交換することができることが公知である（Ｆｅｎｇ、Ｂ．ら（２００９）Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１、１９７〜２０３）Ｋｌｆ４もそれ以上増加しない。
【図１１】単一の異核共存体における再プログラミングの効率を示す図である。図２ｃにおいて、単一の融合実験から得られた１２個の異核共存体からの結果が示されている。本図には、２つの追加的な独立した融合実験から得られた異核共存体における多能性遺伝子の発現が示されている（それぞれｎ＝１０および３１）。３つの独立した実験の結果の概要および統計値は図２ｄに示されている。
【図１２】相対的なＡＩＤ  ｍＲＮＡの発現を示す図である。ＡＩＤの転写レベルを、Ｂ−リンパ球細胞系（Ｒａｍｏｓ）、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳ）およびヒト線維芽細胞（ｈＦｂ）においてリアルタイムＰＣＲによって評価した。転写レベルをＧＡＰＤＨに対して正規化する。Ｒａｍｏｓ、ｍＥＳ、およびｈＦｂにおけるＡＩＤの発現の比率は、およそ１００：１５：５である。
【図１３】ＡＩＤ標的配列を対象とするｓｉＲＮＡ：ヒトおよびマウスについてのアラインメントを示す図である。ヒト（配列番号１０５〜配列番号１１４）およびマウス（配列番号１１５〜配列番号１２４）のＡＩＤ  ｍＲＮＡにおけるｓｉＲＮＡ標的配列およびそれらの対応する標的、ならびにＡＩＤ転写物に沿ったそれらの相対的な位置が示されている。標的配列の上にミスマッチ（＊）が示されている。
【図１４】マウスＥＳ細胞およびヒト線維芽細胞におけるＡＩＤノックダウンの効力を示すグラフである。ｓｉＲＮＡトランスフェクションの３日後にマウスＥＳ細胞およびヒト線維芽細胞におけるＡＩＤのノックダウンをリアルタイムＰＣＲによって評価した。ＡＩＤ  ｓｉ−１、ＡＩＤ  ｓｉ−２、ＡＩＤ  ｓｉ−３およびＡＩＤ  ｓｉ−４は、ＡＩＤを対象とする別個のｓｉＲＮＡであり（図１３に示されている配列）、それらにより、マウスＥＳ細胞におけるＡＩＤの転写（ＧＡＰＤＨに対して正規化した）が、それぞれ、トランスフェクションの３日後に、対照ｓｉＲＮＡと比較して８１（±１３）％、７９（±１２）％、７０（±８）％、および９９（±０．１）％低下した。ヒト線維芽細胞では、ＡＩＤ  ｍＲＮＡのレベルは、ｓｉＲＮＡ１、ｓｉＲＮＡ２、ｓｉＲＮＡ３およびｓｉＲＮＡ４によって、それぞれ４６（±１１）％、７２（±２３）％、９９（±０．１）％および９９（±０．１）％低下した。
【図１５】マウスＥＳ細胞におけるＡＩＤタンパク質およびノックダウンの検出を示す図である。ａ、マウスＥＳ細胞全体の溶解物２ｍｇからの免疫沈降後のＡＩＤタンパク質の検出。１％のインプット（２０μｇ）をローディングした。ｂ、ｓｉ−１でトランスフェクトした３日後の濃縮されたマウスＥＳ細胞溶解物（１７０μｇ）におけるＡＩＤタンパク質レベルの検出。α−チューブリンは、ローディング対照として示されている。ｃ、α−チューブリンに対して正規化されたＡＩＤタンパク質レベルの定量化。ｓｉ−１で処理したＥＳ細胞におけるＡＩＤタンパク質レベルは、ｓｉ対照試料と比較して１２％まで低下した。
【図１６】異核共存体におけるヒトＯｃｔ４プロモーターおよびヒトＮａｎｏｇプロモーターについて収集されたバイサルファイト配列データを示す図である。合計３３０クローンについて配列決定した。
【図１７】ヒトＡＩＤの過剰発現によって異核共存体における再プログラミングの開始は加速されないことを示す図である。融合の１日後の異核共存体の線維芽細胞における、ヒトＡＩＤ（ｈＡＩＤ）の一過性の過剰発現を伴う、またはそれを伴わない、ヒトＯｃｔ４プロモーターおよびヒトＮａｎｏｇプロモーターのメチル化状態についてのバイサルファイト配列決定分析（図５）。ａ、ｈＡＩＤレベルをリアルタイムＰＣＲによって評価し、２つの別々の融合実験において、１日目の異核共存体において、それぞれ２倍および４倍に上方制御されることが見いだされた。ｂ、ｄ、ヒトＯｃｔ４プロモーターおよびヒトＮａｎｏｇプロモーターのＤＮＡ脱メチル化の程度は、ｈＡＩＤが過剰発現されても増加しない。２つの独立した融合実験について同様の結果が得られた。白い丸は、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを示し、黒い丸は、メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを示す。２つの独立した融合実験において少なくとも１０クローンを分析した；代表的な１０クローンが示されている。ｃ、ｅ、融合の１日後に、ｈＡＩＤの一過性の過剰発現を伴う、またはそれを伴わない、異核共存体におけるヒトＯｃｔ４プロモーターおよびヒトＮａｎｏｇプロモーターにおいて観察されたパーセント脱メチル化。Ｏｃｔ４プロモーターおよびＮａｎｏｇプロモーターにおけるＤＮＡ脱メチル化は、ｈＡＩＤが過剰発現していても増加しない。
【図１８】ヒトＡＩＤの過剰発現により、異核共存体におけるＡＩＤが一過性にノックダウンされている間、再プログラミングの開始がレスキューされることを示す図である。ｓｉ−ＲＮＡターゲティングＡＩＤ（ｓｉ−１）でトランスフェクトした異核共存体において過剰発現しているヒトＡＩＤ（ｈＡＩＤ）によってレスキュー実験を行った（図５参照）。ａ、ｈＡＩＤレベルを、リアルタイムＰＣＲによって評価し、２つの別々の融合実験において、２日目の異核共存体において、それぞれ２．５倍および４倍に上方制御されることが見いだされた。ｂ、ヒト特異的なプライマーを使用したリアルタイムＰＣＲによって評価された通り、ｈＡＩＤの過剰発現により、２日目の異核共存体において、対照と比較して多能性遺伝子であるｈＯｃｔ４の発現が部分的にレスキューされ、ｈＮａｎｏｇ遺伝子発現が完全にレスキューされる。発現レベルを、同じ２日目の試料においてｈＧＡＰＤＨに対して正規化し、次いで０日目の対照に対して正規化する。ｃ、ｄ、融合の２日後に単離した異核共存体を、ヒトＯｃｔ４プロモーターおよびヒトＮａｎｏｇプロモーターのメチル化状態についてバイサルファイト配列決定分析に供した。どちらのプロモーターも脱メチル化を示し、これは、ＡＩＤの下方制御によって引き起こされる再プログラミングの遮断は、ｈＡＩＤの過剰発現により、Ｎａｎｏｇプロモーターの脱メチル化の完全なレスキューおよびＯｃｔ４プロモーターの脱メチル化の部分的なレスキューを伴って克服される。Ｏｃｔ４プロモーターの脱メチル化は、７２％の対照レベルと比較すると、８％脱メチル化（ｓｉ−１）から２２％脱メチル化（ｈＡＩＤ＋ｓｉ−１）までレスキューされる。Ｎａｎｏｇプロモーターの脱メチル化は、３１％脱メチル化（ｓｉ−１）から５１％脱メチル化（ｈＡＩＤ＋ｓｉ−１）までレスキューされる。４７％の対照レベルと比較すると、完全なレスキューが観察される。
【図１９】バイサルファイト特異的配列決定およびＣｈＩＰアッセイにおいて調査したＣｐＧ密度を示すヒトＯｃｔ４プロモーター（配列番号１２５）およびヒトＮａｎｏｇプロモーター（配列番号１２６）のマップである。バイサルファイト特異的なアンプリコンの配列が示されている。ヒトＯｃｔ４プロモーターおよびヒトＮａｎｏｇプロモーターにおけるＣｐＧ部位が肉太活字で示されている。ＣｈＩＰプライマーの適用範囲の領域（リアルタイムＰＣＲのアンプリコン）が示されている。ＡＴＧ開始コドンからの距離が示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本方法および組成物について記載する前に、本発明は記載されている特定の方法または組成物に限定されず、それ自体は当然変動することが理解されるべきである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書において使用される用語法は、特定の実施形態を記載するためだけのものであり、限定的なものではないことも理解される。
【００１９】
さまざまな値が提供される場合、文脈によりそうでないことが明確に規定されない限り、下限の単位の１０分の１まで、その範囲の上限と下限の間に入る値のそれぞれも、明確に開示されていると理解される。任意の明示された値、または明示された範囲の間に入る値および任意の他の明示された値、またはその明示された範囲の間に入る値のより小さな範囲のそれぞれが本発明の範囲内に包含される。これらのより小さな範囲の上限と下限は、それぞれ独立に、その範囲に含めることができる、またはその範囲から排除することができ、そのより小さな範囲に限界のいずれかが含まれる、どちらの限界も含まれない、またはどちらの限界も含まれる各範囲も、本発明に包含され、明示された範囲内の任意の明確に排除される限界に支配される。明示された範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれか、またはその両方を除く範囲も、本発明に包含される。
【００２０】
別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と類似した、またはそれと等しい任意の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、一部の潜在的な好ましい方法および材料がここに記載されている。本明細書で言及されている全ての刊行物が、引用されている刊行物に関連して方法および／または材料を開示し記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。矛盾がある範囲では、組み込まれた刊行物の開示のいずれにも本開示が取って代わることが理解される。
【００２１】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される、単数形「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、および「ｔｈｅ（その）」は、文脈によりそうでないことが明確に規定されない限り、複数の指示対象を包含することに留意しなければならない。したがって、例えば、「細胞」への言及は、複数のそのような細胞を包含し、「ペプチド」への言及は、１種または複数種のペプチドおよびその等価物、例えば、当業者に公知のポリペプチドなどへの言及を包含する。
【００２２】
本明細書で考察されている刊行物は、単に、本出願の出願日より前のそれらの開示について提供されている。本明細書における全ては、本発明が、先行発明の理由でそのような刊行物に先立つ権限がないことの容認であると解釈されるべきではない。さらに、提供されている刊行物の日付は、それぞれ独立に確認する必要があり得る実際の刊行物の日付とは異なる可能性がある。
【００２３】
定義
哺乳動物細胞における脱メチル化を調節するための方法、組成物およびキットが提供される。候補薬剤を、哺乳動物細胞におけるゲノムＤＮＡ脱メチル化活性のレベルの調節における活性についてスクリーニングするための方法、組成物およびキットも提供される。これらの方法、組成物およびキットは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）および体細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製することにおいて、および、癌およびゲノム刷り込みにおける欠損から生じる障害を含めたヒトの障害をｉｎ  ｖｉｖｏで治療するために使用される。これらの、または他の本発明の目的、利点および特徴は、以下に十分に記載されている組成物および方法の詳細を読めば、当業者には明白になるであろう。
【００２４】
「ＤＮＡメチル化」または単に「メチル化」は、ＤＮＡにメチル基が付加されることを意味する。ＤＮＡにメチル基が付加される反応は、酵素のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）によって触媒される。脊椎動物では、ＤＮＡメチル化は、一般には、ヌクレオチドシトシンにおいて、通常ＣｐＧ部位（シトシン−リン酸−グアニン部位；すなわち、ＤＮＡ配列においてシトシンのすぐ次にグアニンが続く場所）で起こる。これにより、シトシンが、本明細書では互換的に「５−メチルシトシン」「５−ｍｅＣ」、および「メチル化シトシン」と称される５−メチルシトシンに変換される。付加されたメチル基により、シトシンの構造が、その塩基対合の性質が変化することなく変化する。「ＧＣリッチ」領域（すなわち、約６５％のＣＧ残基でできている）であるＣｐＧ配列およびＣｐＧアイランドのメチル化の程度は、多くの場合、遺伝子の転写活性に関連し、高度にメチル化されたＣｐＧアイランドを含有するプロモーターは一般にはサイレントであり、非メチル化ＣｐＧアイランドおよびあまりメチル化されていないＣｐＧアイランドを含有するプロモーターは、一般には活性である。
【００２５】
「ＤＮＡ脱メチル化」または単に「脱メチル化」は、ＣｐＧ配列がメチル化ＣｐＧ配列から非メチル化ＣｐＧ配列に変換されることを意味する。
【００２６】
「ＤＮＡ脱メチル化を許容する細胞」または「脱メチル化を許容する細胞」は、そのＣｐＧ配列をメチル化ＣｐＧ配列から非メチル化ＣｐＧ配列に変換することができる細胞を意味する。細胞に５−ｍｅＣｐＧリッチヌクレオチド配列を含むＤＮＡベクターを提供すること、および、ベクターによって供給されたヌクレオチド配列を、例えば、バイサルファイト配列決定またはメチラーゼ感受性制限エンドヌクレアーゼ消化によって回収し分析してそのヌクレオチド配列のＣｐＧ配列が脱メチル化されているかどうかを決定して、細胞において活性化誘導性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２０６６１）をコードするｃＤＮＡを過剰発現させることによって細胞が脱メチル化を許容するかどうかを決定することができる。
【００２７】
「シチジンデアミナーゼ活性」または「ＣＤ活性」は、リボース環（シチジン）またはデオキシリボース環（デオキシシチジン）に付着しているシトシンヌクレオシドまたは５−メチルシトシンヌクレオシドからアミン基が除去される酵素経路の活性を意味する。シトシンからアミン基が除去されることにより、ヌクレオシドがウラシルに変換され、一方、５−メチルシトシンからアミン基が除去されることにより、ヌクレオシドがチミンに変更される。例えば、以下の略図を参照されたい：
【００２８】
【化１】
2013514779.tif 000002
【００２９】
「多能性幹細胞」または「多能性細胞」は、生物体において全種類の細胞に分化する能力を有する細胞を意味する。多能性細胞は、奇形腫を形成し得、生きている生物体において外胚葉組織、中胚葉組織、または内胚葉組織の一因となっている。多能性幹細胞の例は、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖幹（ＥＧ）細胞、および人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。
【００３０】
「胚性幹細胞」または「ＥＳ細胞」は、ａ）自己再生することができ、ｂ）生物体において分化して全種類の細胞を産生することができ、かつｃ）発生中の生物体の胞胚の内部細胞塊に由来する細胞を意味する。ＥＳ細胞は、生物体において全種類の細胞に分化する能力を維持させながら、長期にわたって培養することができる。培養物中で、ＥＳ細胞は、一般には、大きな核細胞質比、明確な境界および目立った核を有する平らなコロニーとして成長する。さらに、ＥＳ細胞は、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、およびアルカリホスファターゼを発現するが、ＳＳＥＡ−１は発現しない。ＥＳ細胞を生成し、特徴づける方法の例は、例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，０２９，９１３号、米国特許第５，８４３，７８０号、および米国特許第６，２００，８０６号において見ることができる。
【００３１】
「胚性生殖幹細胞」、「胚性生殖細胞」または「ＥＧ細胞」は、ａ）自己再生することができ、ｂ）生物体において分化して全種類の細胞を産生することができ、かつｃ）生殖細胞および生殖細胞前駆体、例えば、始原生殖細胞に由来する、すなわち、精子および卵子になる細胞を意味する。胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）は、上記の胚性幹細胞と同様の性質を有すると考えられている。ＥＧ細胞を生成し、特徴づける方法の例は、例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，１５３，６８４号；Ｍａｔｓｕｉ、Ｙら、（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７０：８４１；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ、Ｍ．ら（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１１３；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ、Ｍ．ら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：１３７２６；およびＫｏｓｈｉｍｉｚｕ、Ｕ．ら（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２２：１２３５において見ることができる。
【００３２】
「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳ細胞」は、ａ）自己再生することができ、ｂ）生物体において分化して全種類の細胞を産生することができ、かつｃ）体細胞に由来する細胞を意味する。ｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞様の形態を有し、大きな核細胞質比、明確な境界および目立った核を有する平らなコロニーとして成長する。さらに、ｉＰＳ細胞は、これらに限定されないが、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１、ＴＤＧＦ  １、Ｄｎｍｔ３ｂ、ＦｏｘＤ３、ＧＤＦ３、Ｃｙｐ２６ａ１、ＴＥＲＴ、およびｚｆｐ４２を含めた当業者に公知の１種または複数種の重要な多能性マーカーを発現する。ｉＰＳ細胞を生成し、特徴づける方法の例は、例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、出願番号：ＵＳ２００９００４７２６３、ＵＳ２００９００６８７４２、ＵＳ２００９０１９１１５９、ＵＳ２００９０２２７０３２、ＵＳ２００９０２４６８７５、およびＵＳ２００９０３０４６４６において見ることができる。
【００３３】
「体細胞」は、実験的な操作をしなければ、普通は生物体において全種類の細胞を生じさせない、生物体における任意の細胞を意味する。言い換えれば、体細胞は、自然には体の３つの胚葉、すなわち、外胚葉、中胚葉および内胚葉の全ての細胞を生成しない、十分に分化した細胞である。例えば、体細胞は、神経細胞と神経前駆細胞の両方を含み、神経前駆細胞は、中枢神経系の全部または一部の細胞型を自然に生じさせることができ得るが、中胚葉系列または内胚葉系列の細胞を生じさせることはできない。
【００３４】
「再プログラミング因子」は、細胞に作用して転写を変化させ、それによって細胞を多能性に再プログラミングする生物活性因子の１種または複数種、すなわち、混合物を意味する。細胞に再プログラミング因子を提供する、すなわち細胞を再プログラミング因子と接触させる本発明の方法では、これらの再プログラミング因子は、個々に、または単一の組成物として、すなわち、再プログラミング因子を予備混合した組成物として細胞に提供することができる。因子は、同じモル比で、または異なるモル比で提供することができる。因子は、本発明の細胞を培養する過程において、一回または多数回提供することができる。
【００３５】
「再プログラミングの効率」は、細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物の、別の細胞型の細胞を生じるように再プログラムされる能力を意味する。薬剤、例えば、シチジンデアミナーゼ活性を促進する薬剤の存在下で増強された再プログラミング効率を示す細胞は、その薬剤と接触させた場合に、その薬剤と接触させなかった細胞と比較して、別の細胞型の細胞を生じる増強された能力を示す。増強されるとは、細胞培養物が、薬剤と接触させなかった細胞培養物の能力の少なくとも５０％、約１００％、約２００％、約３００％、約４００％、約６００％、約１０００％、約２０００％、少なくとも約５０００％の、新しい細胞型を生じさせる能力を有することを意味する。言い換えれば、細胞培養物により、薬剤と接触させていない細胞の集団によって産生される新しい細胞型の細胞の約１．５倍、約２倍、約３倍、約４倍、約６倍、約１０倍、約２０倍、約３０倍、約５０倍、約１００倍、約２００倍を超える新しい細胞型の細胞が産生される。本出願の一部の実施形態では、再プログラミングの効率を増強する薬剤は、所望の細胞運命を獲得する間に活性になることが当技術分野で公知であるプロモーターにおけるＤＮＡメチル化の量を、例えば、薬剤がない場合に観察されるＤＮＡメチル化の量と比較して１．５分の１以下、すなわち、約１．５分の１、約２分の１、約３分の１、約４分の１、約６分の１、または約１０分の１またはそれ未満に減少させる薬剤である。本出願の一部の実施形態では、再プログラミングの効率を増強する薬剤は、所望の細胞運命を獲得する間に活性になることが当技術分野で公知であるプロモーターによって調節される遺伝子の転写量を、例えば、薬剤がない場合に観察される転写量と比較して約１．５倍以上、すなわち、約１．５倍、約２倍、約３倍、約４倍、約６倍、または約１０倍またはそれ以上増加させる薬剤である。
【００３６】
「プロモーター配列」は、細胞においてＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域である。本発明を明確にする目的において、プロモーター配列は、その３’末端に転写開始部位が結合し、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するために必要な最小数の塩基またはエレメントを含むように上流（５’方向）に伸長している。プロモーター配列内に、転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメインが見いだされる。真核生物のプロモーターは、多くの場合、常にではないが、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有する。誘導性プロモーターを含めた種々のプロモーターを使用して、本発明の種々のベクターを駆動することができる。プロモーター配列からの転写活性は、プロモーターがメチル化されている程度によって調節することができる。
【００３７】
「治療」、「治療すること」などの用語は、本明細書では、一般に、所望の薬理的効果および／または生理的効果を得ることを意味するように使用される。効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に予防するという点で予防的であってよく、かつ／または、疾患および／または疾患に起因する有害作用を部分的または完全に治癒させるという点で治療的であってよい。「治療」は、本明細書で使用される場合、哺乳動物における疾患の任意の治療を包含し、（ａ）疾患の素因があり得るが、今のところはまだそれを有すると診断されていない対象において疾患が生じることを予防すること；（ｂ）疾患を抑制すること、すなわち、その発生を制止すること；または（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患の退縮を引き起こすことを含む。治療剤は、疾患または害が発症する前、その間、またはその後に投与することができる。進行中の疾患を治療し、その治療により患者の望ましくない臨床症状を安定させる、または低減することが特に興味深い。そのような治療は、患部組織の機能が完全に喪失する前に行うことが望ましい。本主題の療法は、疾患の症候性の段階、およびある場合では疾患の症候性の段階後に施されることが望ましい。
【００３８】
「個体」、「対象」、「宿主」および「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され、診断、治療、または療法が望まれる任意の哺乳動物の対象、特に、ヒトを指す。
【００３９】
シチジンデアミナーゼ（ＣＤ）活性を促進する薬剤
哺乳動物細胞におけるメチル化の量を調節するための方法、組成物およびキットが提供される。本発明の一態様では、哺乳動物細胞におけるゲノムＤＮＡメチル化の量を、細胞を、シチジンデアミナーゼ活性を促進する１種または複数種の薬剤と接触させることによって減少させる。上記の通り、シチジンデアミナーゼ（ＣＤ）活性は、ＤＮＡまたはＲＮＡにおけるシトシンまたは５−メチルシトシンからアミノ基を除去する酵素活性である。本出願において使用されるシチジンデアミナーゼ活性を促進する薬剤の例は、シチジンデアミナーゼのＡＩＤ／ＡＰＯＢＥＣクラスのポリペプチドおよび断片、ならびにこれらのポリペプチドおよび断片をコードする核酸である。
【００４０】
活性化誘導性シチジンデアミナーゼは、ＡＩＤ、ＡＩＣＤＡ、ＡＲＰ２、ＣＤＡ２、またはＨＩＧＭ２とも称され、適応性の体液性免疫系におけるその役割について最もよく知られているシチジンデアミナーゼであり、免疫グロブリン遺伝子座のＤＮＡにおけるシトシン残基を脱アミノ化して、抗体遺伝子の多様化を強化する（免疫グロブリンＶ遺伝子の体細胞超変異および遺伝子変換ならびにＩｇＣ遺伝子のスイッチ組換え）。「ＡＩＤ遺伝子産物」、「ＡＩＤポリペプチド」、「ＡＩＤペプチド」、および「ＡＩＤタンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、ネイティブな配列のＡＩＤポリペプチド、ＡＩＤポリペプチド変異体、ＡＩＤポリペプチド断片およびキメラＡＩＤポリペプチドを指す。ＡＩＤポリペプチドおよびそれをコードする核酸のネイティブな配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２０６６１（配列番号１、配列番号２）において見ることができる。
【００４１】
アポリポタンパク質Ｂ  ＲＮＡ編集触媒成分タンパク質は、ＡＰＯＢＥＣタンパク質とも称され、シチジンを脱アミノ化するタンパク質のファミリーである。「ＡＰＯＢＥＣ遺伝子産物」、「ＡＰＯＢＥＣポリペプチド」、「ＡＰＯＢＥＣペプチド」、および「ＡＰＯＢＥＣタンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、ＡＰＯＢＥＣポリペプチド、ＡＰＯＢＥＣポリペプチド変異体、ＡＰＯＢＥＣポリペプチド断片およびキメラのＡＰＯＢＥＣポリペプチドのネイティブな配列を指す。ＡＰＯＢＥＣファミリーの始祖メンバーであるＡＰＯＢＥＣ１は、シトシン６６６６を脱アミノ化してウラシルにし、それによって中途終止コドンを創出し、短縮されたアポリポタンパク質Ｂポリペプチド鎖の組織特異的な産生を強化することによってアポリポタンパク質Ｂ  ＲＮＡを編集する複合体の触媒成分である。ＡＰＯＢＥＣ１ポリペプチドおよびそれをコードする核酸のネイティブなヒト配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１６４４（配列番号３、配列番号：４）において見ることができる。ＡＰＯＢＥＣ３ファミリーのメンバー（ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３ＧおよびＡＰＯＢＥＣ３Ｈ）は、レトロウイルスの感染を制限する先天性免疫経路において、レトロウイルスの第１の鎖ｃＤＮＡ複製中間体においてシトシンを脱アミノ化すること、またはウイルスのゲノムに致死的な超変異を生じさせることによって役割を果たし；ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ（ＫＡ６、ＡＲＰ８、ＭＧＣ７４８９１、およびＢＫ１５０Ｃ２．４．ｍＲＮＡとしても公知である）のネイティブなヒト配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１４５２９８．５（アイソフォームａ）（配列番号５、配列番号６）およびＮＭ＿００１００６６６６．１（アイソフォームｂ）（配列番号７、配列番号８）において見ることができ；ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（ＡＲＰ９、ＣＥＭ１５、ＭＤＳ０１９、ＦＬＪ１２７４０、ｂＫ１５０Ｃ２．７およびｄＪ４９４Ｇ１０．１としても公知である）のネイティブなヒト配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２１８２２．２（配列番号９、配列番号１０）において見ることができ；ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ（ＡＲＰ１０としても公知である）のネイティブなヒト配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１６６００３．１（アイソフォーム１）（配列番号１１、配列番号１２）、ＮＭ＿１８１７７３．３（アイソフォーム２）（配列番号１３、配列番号１４）ＮＭ＿００１１６６００２．１（アイソフォーム３）（配列番号１５、配列番号１６）、ＮＭ＿００１１６６００４．１（アイソフォーム４）（配列番号１７、配列番号１８）において見ることができる。シチジンデアミナーゼのＡＰＯＢＥＣファミリーの他のメンバーとしては、そのネイティブなヒト配列が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００６７８９（配列番号１９、配列番号２０）において見ることができるＡＰＯＢＥＣ２（ＡＲＰ１およびＡＲＣＤ１としても公知である）；そのネイティブなヒト配列が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１４５６９９．３（配列番号２１、配列番号２２）において見ることができるＡＰＯＢＥＣ３（Ｐｈｏｒｂｏｌｉｎ１、ＡＲＰ３、ＰＨＲＢＮ、およびｂＫ１５０Ｃ２．１としても公知である）；そのネイ��ィブなヒト配列が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４９００（配列番号２３、配列番号２４）において見ることができるＡＰＯＢＥＣ３Ｂ（ＡＲＰ４、ＡＲＣＤ３、ＰＨＲＢＮＬ、ＡＰＯＢＥＣ１Ｌ、ＦＬＪ２１２０１、ｂＫ１５０Ｃ２．２およびＤＪ７４２Ｃ１９．２としても公知である）；そのネイティブなヒト配列が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１４５０８．２（配列番号２５、配列番号２６）において見ることができるＡＰＯＢＥＣ３Ｃ（ＰＢＩ、ＡＲＰ５、ＡＲＤＣ２、ＡＲＤＣ４、ＡＰＯＢＥＣ１Ｌ、ＭＧＣ１９４８５、およびｂＫ１５０Ｃ２．３としても公知である）；およびそのネイティブなヒト配列が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１５２４２６．３（配列番号２７，配列番号２８）において見ることができるＡＰＯＢＥＣ３Ｄ（ＡＲＰ６、ＡＰＯＢＥＣ３Ｅ、およびＡＰＯＢＥＣ３ＤＥとしても公知である）が挙げられる。
【００４２】
シチジンデアミナーゼのＡＩＤ／ＡＰＯＢＥＣクラスおよびタンパク質のこのクラスの間で保存されているドメインに関するより多くの情報は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｏｎｔｉｃｅｌｌｏ、Ｓ．Ｇ．ら（２００５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙおよび  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ２２（２）３６７〜３７７において見ることができる。
【００４３】
一部の実施形態では、ＣＤ活性、したがって、ゲノムＤＮＡ脱メチル化を促進する薬剤は、ＡＩＤポリペプチドである。ＡＩＤポリペプチドは、シチジンの脱アミノ化を促進するＡＩＤ配列を含むポリペプチドである。ＡＩＤポリペプチドは、ＡＩＤの完全なポリペプチド配列またはシチジンデアミナーゼ活性を有するＡＩＤの断片、例えば、Ｃ末端の１０アミノ酸を抜いた全長のポリペプチド（Ｂａｒｒｅｔｏら（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １２（２）：５０１〜８）に対して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含んでよい。そのような断片は、当業者が当技術分野で周知の一般的な生化学的技法および遺伝学的技法を使用して容易に同定可能である。全長のＡＩＤまたはそのシチジンデアミナーゼ活性ドメインのポリペプチド配列に対して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸、およびこれらの核酸を含むベクターも、本発明に包含される。
【００４４】
一部の実施形態では、ＣＤ活性、したがって、ゲノムＤＮＡ脱メチル化を促進する薬剤は、ＡＰＯＢＥＣポリペプチドである。ＡＰＯＢＥＣポリペプチドは、シチジンの脱アミノ化を促進するＡＰＯＢＥＣ配列を含むポリペプチドである。ＡＰＯＢＥＣポリペプチドは、ＡＰＯＢＥＣの完全なポリペプチド配列またはシチジンデアミナーゼ活性を有するＡＰＯＢＥＣの断片に対して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含んでよい。そのような断片は、当業者が当技術分野で周知の一般的な生化学的技法および遺伝学的技法を使用して容易に同定可能である。全長のＡＰＯＢＥＣポリペプチドまたはそれらのシチジンデアミナーゼ活性ドメインのいずれかのポリペプチド配列に対して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸、およびこれらの核酸を含むベクターも、本発明に包含される。
【００４５】
上記の通り、本発明において使用するために適した薬剤は、シチジンデアミナーゼタンパク質のＡＩＤ／ＡＰＯＢＥＣクラスのポリペプチドおよび断片、ならびにこれらのポリペプチドおよび断片をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、ＣＤ活性を促進する１種または複数種の薬剤は、核内作用性の非組み込み型ポリペプチドである。言い換えれば、対象細胞を、ＣＤ活性を促進するポリペプチド（「ＣＤ活性ポリペプチド」）と接触させ、核内で作用させる。非組み込み型とは、ポリペプチドが対象細胞、すなわち脱メチル化活性を促進することが望まれる細胞のゲノム内に組み込まれないことを意味する。
【００４６】
ＣＤ活性ポリペプチドの細胞膜を渡る輸送を促進するために、ＣＤ活性ポリペプチド配列をポリペプチド浸透性ドメインに融合することができる。いくつもの浸透性ドメインが当技術分野で公知であり、ペプチド、ペプチド模倣薬、および非ペプチド担体を含めた本発明の核内作用性の非組み込み型ポリペプチドにおいて使用することができる。例えば、浸透性ペプチドは、ペネトラチンと称されるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの転写因子であるＡｎｔｅｎｎａｐａｅｄｉａの第３のアルファヘリックス由来であってよい。別の例として、浸透性ペプチドは、例えば、天然に存在するｔａｔタンパク質のアミノ酸４９〜５７を含み得るＨＩＶ−１ｔａｔ基本領域アミノ酸配列を含む。他の浸透性ドメインとしては、ポリアルギニンモチーフ、例えば、ＨＩＶ−１ｒｅｖタンパク質のアミノ酸３４〜５６の領域、ノナアルギニン、オクタアルギニンなどが挙げられる。（例えば、移行ペプチドおよびペプトイドの教示に関して参照により本明細書に明確に組み込まれる、Ｆｕｔａｋｉら（２００３）Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ．２００３  Ａｐｒ；４（２）：８７〜９６；およびＷｅｎｄｅｒら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ、２０００年１１月２１日；９７（２４）：１３００３〜８；米国特許出願公開第２００３０２２０３３４号；同第２００３００８３２５６号；同第２００３００３２５９３号；および同第２００３００２２８３１号を参照されたい）。ノナアルギニン（Ｒ９）配列は、特徴づけられているより効率的なＰＴＤの１つである（Ｗｅｎｄｅｒら２０００；Ｕｅｍｕｒａら２００２）。
【００４７】
ＣＤ活性ポリペプチドは、当技術分野で公知の従来の方法を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成によって調製することができる。種々の市販の合成装置、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｃｋｍａｎなどによる自動合成機が利用可能である。合成機を使用することによって、天然に存在するアミノ酸を非天然アミノ酸で置換することができる。特定の配列および調製様式は、利便性、経済的側面、必要な純度などによって決定される。シチジンデアミナーゼ活性ポリペプチドを無細胞系において調製する他の方法としては、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第６１／２７１，０００号において教示されている方法が挙げられる。
【００４８】
ＣＤ活性ポリペプチドは、組換え合成の従来の方法に従って単離し、精製することもできる。発現宿主の溶解物を調製し、その溶解物を、ＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、または他の精製技法を使用して精製する。ほとんどの場合、使用される組成物は、産物の調製およびその精製の方法に関連する汚染物質に関して、少なくとも２０重量％、通常、少なくとも約７５重量％、好ましくは少なくとも約９５重量％、および治療のためには、通常少なくとも約９９．５重量％の所望の産物を含む。通常、百分率は、総タンパク質量に基づく。ＣＤ活性ポリペプチドは、組換えによって、直接だけでなく、異種ポリペプチド、例えば、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的な切断部位を有するポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても作製することができる。発現ベクターは、通常、選択マーカーとも称される選択遺伝子を含有する、この遺伝子は、選択培地中で成長させる形質転換された宿主細胞の生存または成長に必要なタンパク質をコードする。
【００４９】
当技術分野において公知の方法によって精製した後、標準のタンパク質形質導入方法によってＣＤ活性ポリペプチドを対象細胞に提供する。ある場合では、タンパク質形質導入方法は、細胞を担体および少なくとも１つの精製したＣＤ活性ポリペプチドを含有する組成物と接触させることを含む。適切な担体およびそれらを使用するための方法の例としては、これらに限定されないが、米国特許第６，８４１，５３５号に記載のＣｈａｒｉｏｔ（商標）（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ、Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）；Ｂｉｏｐｏｒｔ（商標）（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＧｅｎｏｍｅＯＮＥ（Ｃｏｓｍｏ  Ｂｉｏ  Ｃｏ．、Ｌｔｄ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）、およびＰｒｏｔｅｏＪｕｉｃｅ（登録商標）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）などの市販の試薬、または例えば、米国特許出願第１０／１３８，５９３号に記載のナノ粒子タンパク質形質導入試薬が挙げられる。
【００５０】
他の実施形態では、ＣＤ活性を促進する１種または複数種の薬剤は、ＣＤ活性ポリペプチドをコードする核酸である。ＣＤ活性ポリペプチドをコードする核酸を対象細胞に提供するために使用されるベクターは、一般には、核酸の発現を駆動するため、すなわち、転写を活性化するために適したプロモーターを含む。これは、遍在的に作用するプロモーター、例えば、ＣＭＶ−β−アクチンプロモーター、または誘導性プロモーター、例えば特定の細胞集団において活性なプロモーターまたはテトラサイクリンなどの薬物が存在することに反応するプロモーターなどを含んでよい。転写活性化とは、標的細胞において転写が基礎レベルを少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、通常少なくとも約１０００倍超えて増加することを意味する。さらに、核酸を提供するために使用するベクターは、後で除去しなければならない遺伝子を含んでよく、その際は、例えば、Ｃｒｅ／Ｌｏｘなどのリコンビナーゼ系、または、例えば、ＴＫ、ｂｃｌ−ｘｓなどのヘルペスウイルスなどの選択毒性を可能にする遺伝子を含めることによって該遺伝子が破壊されて発現される細胞を用いる。
【００５１】
ＣＤ活性ポリペプチドをコードする核酸は、対象細胞に直接提供することができる。言い換えれば、細胞を、ＣＤ活性ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターと、ベクターが細胞に取り込まれるように接触させる。電気穿孔、塩化カルシウムトランスフェクション、およびリポフェクションなどの、細胞を核酸ベクターと接触させるための方法は当技術分野で周知である。このように核酸を送達するベクターは、通常、エピソームとして、例えば、プラスミドまたはミニサークルＤＮＡとして維持される。
【００５２】
あるいは、核酸は、ウイルスによって対象細胞に提供することができる。言い換えれば、細胞を、ＣＤ活性ポリペプチドをコードする核酸を含むウイルス粒子と接触させる。そのような方法には、レトロウイルス、例えば、レンチウイルスが特に適している。一般に使用されるレトロウイルスベクターは「不完全である」、すなわち、増殖性感染のために必要なウイルスタンパク質を産生することができない。もっと正確に言えば、ベクターの複製には、パッケージング細胞系において成長させることが必要である。対象とする核酸を含むウイルス粒子を生成するために、核酸を含むレトロウイルスの核酸をパッケージング細胞系によってウイルスカプシド中にパッケージする。異なるパッケージング細胞系からは、カプシド中に組み入れられる異なる外被タンパク質がもたらされ、この外被タンパク質により、ウイルス粒子の細胞に対する特異性が決定される。外被タンパク質は、狭宿主性、広宿主性および異種栄養性の少なくとも３種類のものである。狭宿主性外被タンパク質、例えば、ＭＭＬＶを用いてパッケージしたレトロウイルスは、大部分のマウスおよびラット細胞型に感染することができ、これは、ＢＯＳＣ２３（Ｐｅａｒら（１９９３）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９０：８３９２〜８３９６）などの狭宿主性パッケージング細胞系を使用することによって生成される。広宿主性外被タンパク質、例えば、４０７０Ａ（Ｄａｎｏｓら、上記）を担持するレトロウイルスは、ヒト、イヌおよびマウスを含めた大部分の哺乳動物細胞型に感染することができ、これは、ＰＡ１２（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３１〜４３７）；ＰＡ３１７（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５〜２９０２）；ＧＲＩＰ（Ｄａｎｏｓら（１９８８）ＰＮＡＳ  ８５：６４６０〜６４６４）などの広宿主性パッケージング細胞系を使用することによって生成される。異種栄養性外被タンパク質、例えば、ＡＫＲ  ｅｎｖを用いてパッケージしたレトロウイルスは、マウスの細胞以外の大部分の哺乳動物細胞型に感染することができる。適切なパッケージング細胞系を使用して、対象細胞がパッケージされたウイルス粒子の標的になることを確実にすることができる。シチジンデアミナーゼ活性を促進するポリペプチドをコードする核酸を含むレトロウイルスベクターをパッケージング細胞系に導入する方法およびパッケージング系によって生成されるウイルス粒子を採取する方法は当技術分野で周知である。
【００５３】
本発明の方法では、哺乳動物細胞におけるゲノムＤＮＡメチル化の量を、有効量の、ＣＤ活性を促進する１種または複数種の薬剤と接触させることによって減少させる。細胞におけるゲノムＤＮＡメチル化を減少させるために十分な薬剤の量は、細胞におけるＣＤ活性を促進するために十分な薬剤の量、すなわち、細胞におけるシトシンおよび５−メチルシトシンからのアミノ基の除去を促進するために十分な量である。この量は、シトシンヌクレオシドまたは５−メチルシトシンヌクレオシドの、それぞれウラシルヌクレオシドまたはチミンヌクレオシドへの変換を測定する当技術分野で公知のいくつものアッセイによって経験的に決定することができ、ここで、細胞におけるゲノムＤＮＡメチル化の量を減少させるための薬剤の有効量は、５％以上、すなわち、５％、１０％、２０％、４０％、６０％、８０％、または１００％のシトシンまたは５−メチルシトシンの、ウラシルまたはチミンへの変換を誘導する量である。例えば、ｄＣのｄＵ（デオキシウラシル）への脱アミノ化の程度は、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＢｒａｎｓｔｅｉｔｔｅｒ、Ｒ．ら（（２００３）ＰＮＡＳ  １００（７）：４１０２〜４１０７）に記載のウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）および脱プリン部位エンドヌクレアーゼ（ＡＰＥ）を使用することによってアッセイすることができる。そのようなアッセイでは、５’末端を３２Ｐで標識したＤＮＡ基質またはＲＮＡ基質（例えば、１００ｎＭ）を、シチジンデアミナーゼ活性を促進する薬剤と一緒にインキュベートする。次いで、相補ＤＮＡ鎖を基質とアニーリングさせ、その後、ＵＤＧおよびＡＰＥと一緒にインキュベートする。インキュベートした後、反応を終了させ、反応生成物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分離し、ホスフォイメージングによって可視化し、ここで、標識された末端からシチジンまでの長さに対応する短い放射性生成物が存在することにより、シチジンにおけるＣＤ活性を反映する、元のシチジンにおける切れ目が示される。別の例として、ｄＣの脱アミノ化は、同様にＢｒａｎｓｔｅｉｔｔｅｒ、Ｒ．ら、上記に記載されているプライマー伸長のジデオキシヌクレオチドによる終結を使用することによって検出することができる。そのようなアッセイでは、ＣＤ活性を促進する薬剤と反応するＤＮＡ基質またはＲＮＡ基質を３倍過剰の１８−ｍｅｒ３２Ｐ−標識プライマーとアニーリングさせ、３種のｄＮＴＰと、それに加えて２’，３’−ジデオキシアデノシン（ｄｄＡ）三リン酸または２’，３’−ジデオキシグアノシン（ｄｄＧ）三リン酸のいずれかの存在下でＴ７シーケナーゼを使用することによってプライマーを伸長する。基質−伸長プライマー複合体を熱変性させ、分離した鎖を相補ＤＮＡ鎖とアニーリングさせ、上記のＵＤＧおよびＡＰＥと一緒にインキュベートする。反応生成物を変性ＰＡＧＥによって分離し、ホスフォイメージングによって可視化し、ここで、脱アミノ化効率は、ｄｄＡミックスを用いた伸長反応から、Ｃ鋳型における、およびＣ鋳型を通り越した組み込まれたバンドの強度と比較したＣ／Ｕ鋳型の逆のバンドの強度の比として算出する。効率は、ｄｄＧミックスを用いた���長反応からも、鋳型Ｃを通り越した組み込まれたバンドの強度の、Ｃ鋳型における、およびＣ鋳型を通り越した組み込まれたバンドの強度に対する比として算出することができる。このように、ＣＤ活性を促進する薬剤を同定することができ、有効量の、ＣＤ活性を促進する薬剤を経験的に決定することができる。
【００５４】
ゲノムＤＮＡメチル化の量を減少させるために十分である薬剤の有効量は、その薬剤で処理した後のＤＮＡメチル化の程度をアッセイすることによっても決定することができる。細胞におけるゲノムＤＮＡ脱メチル化の量を減少させる薬剤の有効量は、ＤＮＡ配列内のメチル化ＣｐＧ配列の数の、１．５分の１以上への低下、すなわち、１．５分の１、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１、または２０分の１またはそれ以下への低下を誘導する量である。ＣｐＧ配列のメチル化の状態をアッセイするためのいくつかの方法、例えば、制限エンドヌクレアーゼ消化およびバイサルファイト配列決定が当技術分野で周知である。制限エンドヌクレアーゼ消化では、５−メチルシトシンを含有するＣｐＧ配列（例えば、ＣｍｅＣＧＧ）を、制限酵素Ｈｐａｌｌによる切断に対する５−メチルシトシンを含有する配列の抵抗性によって、非メチル化シトシンを含有するＣｐＧ配列（ＣＣＧＧ）と区別することができる。対照的に、メチル化ＣｐＧ配列および非メチル化ＣｐＧ配列は、制限酵素Ｍｓｐｌによって同等によく消化される。このことに基づいて、ゲノムＤＮＡを、ａ）ＣｐＧ配列の位置およびｂ）これらの配列が非メチル化（すなわち、Ｈｐａｌｌ制限に対して感受性が高い）配列であるか、またはメチル化（すなわち、Ｈｐａｌｌ制限に対して抵抗性である）配列であるかを決定するために、別々の反応においてＭｓｐｌおよびＨｐａｌｌを用いた制限エンドヌクレアーゼ消化に供することができる。バイサルファイト配列決定では、ＤＮＡをバイサルファイトで処理することにより、シトシン残基がウラシルに変換されるが、５−メチルシトシン残基は影響されないままである；したがって、バイサルファイト処理により、ＤＮＡ配列に、個々のシトシン残基のメチル化状態に応じた特異的な変化が導入され、これにより、ＤＮＡのセグメントのメチル化状態に関する単一のヌクレオチド分解情報がもたらされる。そのメチル化の状態についてアッセイすることができるゲノムＤＮＡの領域の例としては、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＲＢ１、ＣＤＫＮ２ＡＩＮＫ４Ａ、ＣＤＫＮ２ＡＡＲＦ、ＣＤＨ１、ＣＤＨ１３、ＴＩＭＰ３、ＶＨＬ、ＭＬＨ１、ＭＧＭＴ、ＢＲＣＡ１、ＧＳＴＰ１、ＳＭＡＲＣＡ３、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＳＯＣＳ１、ＥＳＲ１、ＤＡＰＫ１のプロモーター領域が挙げられる。アッセイすることができるゲノムＤＮＡの他の領域は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｏｓｔｅｌｌｏ、Ｊ．Ｆ．ら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２５：１３２〜１３８、Ｓｏｎｇ、Ｆ．ら、（２００５）ＰＮＡＳ  １０２：３３３６〜３３４１、およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｋ．Ｄ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：５９７〜６１０に記載されている。
【００５５】
細胞におけるゲノムＤＮＡメチル化の量を減少させるために十分である薬剤の有効量は、細胞におけるメチル化感受性遺伝子の発現の変化をアッセイすることによって決定することもできる。メチル化感受性遺伝子は、発現レベルがそれらのプロモーターのメチル化の状態に対して感受性である遺伝子である。
【００５６】
いくつかの遺伝子のプロモーターにおけるＣｐＧ配列のメチル化の増加は、メチル化感受性遺伝子プロモーターの転写活性の低下およびメチル化感受性遺伝子の発現の低下を伴う可能性があり、一方、これらの遺伝子のプロモーターにおけるＣｐＧ配列の脱メチル化は、メチル化感受性遺伝子プロモーターの転写活性の増加およびこれらの遺伝子の発現の増加を伴う可能性がある。有効量の、メチル化感受性遺伝子プロモーターの脱メチル化を促進する薬剤により、その遺伝子の発現の少なくとも約２倍の増加が誘導される。細胞とＣＤ活性を促進する薬剤を接触させた後の遺伝子発現レベルの変化は、細胞を薬剤と接触させる前、およびその後に、遺伝子のＲＮＡレベルおよび／またはタンパク質レベルを、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、ウエスタンブロットハイブリダイゼーションまたはＥＬＩＳＡによって測定することによってアッセイすることができる。メチル化感受性遺伝子は当技術分野で周知であり、それらとしては、例えば、前の段落において列挙されているものなどの遺伝子が挙げられる。
【００５７】
細胞
本発明の方法において使用するために適した細胞は、ヒト、霊長類、家畜動物、農場動物、および動物園の動物、実験動物または愛玩動物、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ラット、マウスなどを含めた任意の哺乳動物細胞であってよい。細胞におけるゲノムＤＮＡ脱メチル化活性の量の増加が示された本発明の複数の態様では、細胞は、脱メチル化を許容する細胞であることが好ましい。脱メチル化を許容する細胞は、それらのＣｐＧ配列がメチル化ＣｐＧ配列から非メチル化ＣｐＧ配列に変換され得る細胞である。細胞が脱メチル化を許容するかどうかは、細胞において活性化誘導性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）をコードするｃＤＮＡを過剰発現させ、細胞にＣｐＧリッチＤＮＡを保有するベクターを提供し、外因的に供給されたＣｐＧリッチＤＮＡを回収し、例えば、バイサルファイト配列決定またはメチラーゼ特異的制限エンドヌクレアーゼ消化によって、メチル化の程度について分析することによって決定することができる。
【００５８】
方法において使用するための対象とする細胞が脱メチル化を許容しない（ｎｏｔ  ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ  ｔｏ  ｄｅｍｅｔｙｌａｔｉｏｎ）、すなわち、脱メチル化を許容しない（ｄｅｍｅｔｙｌａｔｉｏｎ−ｉｍｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ）細胞であると決定された場合では、脱メチル化を許容しない細胞を、有効量の、メチル化シトシンのヒドロキシル化メチルシトシンへの変換を促進する１種または複数種の薬剤、Ｇ：Ｔミスマッチ特異的な修復活性を促進する１種または複数種の薬剤、および／または成長停止およびＤＮＡ損傷誘導性の４５（ＧＡＤＤ４５）活性を促進する１種または複数種の薬剤と接触させることによって、脱メチル化を許容する細胞になるように誘導することができる。
【００５９】
メチル化シトシンのヒドロキシル化メチルシトシンへの変換を促進する薬剤は、脱アミノ化のためにメチル化核酸を刺激する。メチル化シトシンのヒドロキシル化メチルシトシンへの変換を促進する薬剤の例は、ｔｅｔタンパク質のポリペプチドおよび断片、すなわち、ｔｅｔ１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ０３０６２５．２；配列番号２９および配列番号３０）、およびｔｅｔ２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００１１２７２０８．１配列番号３１および配列番号３２（アイソフォームａ）；およびＧｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０１７６２８．３、配列番号３３および配列番号３４（アイソフォームｂ））、ならびにこれらのポリペプチドをコードする核酸である。
【００６０】
Ｇ：Ｔミスマッチ特異的な修復活性を促進する薬剤は、Ｇ／Ｔミスマッチからのチミン部分の除去およびこれらのチミン部分のシトシン部分との交換を促進する薬剤である。Ｇ：Ｔミスマッチ特異的な修復活性を促進する薬剤の例は、メチル結合ドメインタンパク質（メチル−ＣｐＧ結合ドメインポリペプチドとしても公知である）およびタンパク質チミンＤＮＡグリコシラーゼ（ＴＤＧ）のポリペプチドおよび断片、ならびにこれらのポリペプチドをコードする核酸である。
【００６１】
メチル結合ドメインタンパク質は、メチル−ＣｐＧ結合ドメインのそれぞれにおける存在によって関連づけられる核タンパク質である。タンパク質のこのクラスには：ＭＥＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、およびＭＢＤ４の５つのメンバーがある。特に興味深いのは、メチルＣｐＧ部位でのＤＮＡ修復において機能することができる、細菌のＤＮＡ修復酵素とのタンパク質配列の類似性を有するメンバー、例えば、ＭＢＤ４である。細胞を、脱メチル化に許容的になるように誘導することにおいて使用されるＭＢＤ４ポリペプチドおよびそれらをコードする核酸は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３９２５．１（配列番号３５および配列番号３６）においてその配列を見ることができるＭＥＤ１としても公知のヒトＭＢＤ４のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００６２】
チミンＤＮＡグリコシラーゼ（ＴＤＧ）タンパク質は、５−メチルシトシンおよびシトシンの自発的な脱アミノ化によって引き起こされる遺伝子の突然変異に対する細胞防御において、Ｇ／Ｔミスマッチからチミン部分を除去し、グアニンとの誤対合からウラシル部分および５−ブロモウラシル部分を除去することによって中心的な役割を果たす酵素である。細胞を、脱メチル化に許容的になるように誘導することにおいて使用されるＴＤＧポリペプチドおよびそれらをコードする核酸は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３２１１．４（配列番号３７および配列番号３８）においてその配列を見ることができるヒトＴＤＧのアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００６３】
成長停止およびＤＮＡ損傷誘導性の４５（ＧＡＤＤ４５）タンパク質は、ストレス性の成長停止の状態およびＤＮＡ損傷剤処理の後にレベルが増加するタンパク質である。細胞を、脱メチル化に許容的になるように誘導することにおいて使用されるＧＡＤＤ４５ポリペプチドおよびそれらをコードする核酸は、ヒトＧＡＤＤ４５α（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１９２４．２（配列番号３９および配列番号４０）、ＧＡＤＤ４５β（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１５６７５．２（配列番号４１および配列番号４２）、またはＧＡＤＤ４５γ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００６７０５．３（配列番号４３および配列番号４４）のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００６４】
Ｇ：Ｔミスマッチ特異的な修復活性を促進する薬剤（複数可）およびＧＡＤＤ４５活性を促進する薬剤（複数可）は、上記のＣＤ活性を促進する薬剤を提供するための方法によって、ポリペプチドまたはそれらのポリペプチドをコードする核酸として提供することができる。細胞は、シチジンデアミナーゼ活性を促進する１種または複数種の薬剤と接触させることと並行して、上記の方法によって脱メチル化に許容的になるように誘導することができる。あるいは、まず、細胞を脱メチル化に許容的にし、次いでＣＤ活性を促進する１種または複数種の薬剤と接触させることができる。
【００６５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法および使用
本発明の一部の方法では、細胞を、ＣＤ活性を促進する１種または複数種の薬剤とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる。これらの実施形態において対象とする、脱メチル化を許容する哺乳動物細胞、および脱メチル化を許容するように誘導することができる哺乳動物細胞としては、多能性幹細胞、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、胚性生殖細胞；体細胞、例えば、線維芽細胞、造血細胞、ニューロン、筋肉細胞、骨細胞、血管内皮細胞、腸細胞など、およびそれらの系列が限られた前駆体および前駆物質；ならびに、当技術分野において周知であり、下記の実施例に記載されている、２種類以上の細胞の融合物である異核共存体が挙げられる。細胞は、樹立細胞系由来であってよい、または、初代細胞であってよく、「初代細胞」、「初代細胞系」、および「初代培養物」は、本明細書では、対象に由来し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて培養の限られた数の継代、すなわち、分裂にわたって成長させることができる細胞および細胞培養物を指すために互換的に使用される。例えば、初代培養物は、０回、１回、２回、４回、５回、１０回、または１５回、しかし危機段階を経るには満たない回数継代することができる培養物である。一般には、本発明の初代細胞系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて１０回の継代未満維持される。
【００６６】
対象細胞は、新生児、若年者または成人由来であってよい新鮮細胞または凍結細胞から、および皮膚、筋肉、骨髄、末梢血、臍帯血、脾臓、肝臓、膵臓、肺、腸、胃、および他の分化した組織を含めた組織から単離することができる。組織は、生きているドナーからの生検またはアフェレーシスによって得ることができる、または死亡したもしくは瀕死のドナーから死亡の約４８時間以内に得ることができる、または新鮮に凍結させた組織、死亡の約１２時間以内に凍結させ、約−２０℃未満、通常およそ液体窒素の温度（−１９０℃）で無制限に維持した組織から得ることができる。組織から細胞を単離するために、分散または懸濁のために適切な溶液を使用することができる。そのような溶液は、一般に、低濃度、一般に５〜２５ｍＭの許容できる緩衝液と併せて、ウシ胎仔血清または他の天然に存在する因子を補充することが都合よい、平衡塩類溶液、例えば、通常の生理食塩水、ＰＢＳ、ハンクス平衡塩類溶液などである。都合のよい緩衝液としては、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液などが挙げられる。
【００６７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでシチジンデアミナーゼ活性を促進する１種または複数種の薬剤と接触させる細胞は、薬剤（複数可）の存在下で約３０分間〜約２４時間、例えば、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、１２時間、１６時間、１８時間、２０時間、または約３０分間から約２４時間までの任意の他の時間インキュベートすることができ、これを約毎日〜約４日ごと、例えば、１．５日ごと、２日ごと、３日ごと、または約毎日から約４日ごとまでの任意の他の頻度で繰り返すことができる。薬剤（複数可）は、１回または複数回、例えば、１回、２回、３回、または４回以上対象細胞に提供することができ、各接触事象の後、細胞を薬剤（複数可）と一緒にいくらかの時間、例えば、１６〜２４時間インキュベートしておき、その後、培地を新鮮な培地と交換し、細胞をさらに培養する。
【００６８】
本発明の一部の方法では、ＣＤ活性を促進する薬剤と接触させる、脱メチル化を許容する細胞は、脱メチル化を許容する体細胞である。これらの方法のいくつかでは、脱メチル化を許容する体細胞を、異なる細胞系譜の体細胞になるように再プログラムする。言い換えれば、本発明の方法を使用して、ある系列の体細胞から別の系列の体細胞への変換を促進することができる。異なる系列の体細胞は、当技術分野で周知のマーカーおよび形態によって容易に同定可能である。
【００６９】
脱メチル化を許容する体細胞を、ＣＤ活性を促進する薬剤と接触させる一部の方法では、脱メチル化を許容する体細胞を、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞になるように再プログラムする。言い換えれば、作製される細胞は、ｉＰＳ細胞である。上記の通り、ｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞様の形態（例えば、大きな核細胞質比、明確な境界および目立った核を有する平らなコロニーとして成長する）が、体細胞に由来する多能性幹細胞である。
【００７０】
本発明の一部の方法では、ＣＤ活性を促進する薬剤と接触させる脱メチル化を許容する細胞は、多能性幹細胞、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。これらの方法では、脱メチル化を許容する多能性幹細胞を、体細胞になるように再プログラムする。言い換えれば、本発明の方法を使用して、多能性幹細胞の体細胞へのプログラミングを促進することができる。体細胞の例としては、外胚葉系（例えば、神経および線維芽細胞）、中胚葉系（例えば、心筋細胞）、または内胚葉（例えば、膵臓細胞）系由来の任意の分化細胞が挙げられる。体細胞は、１種または複数種の：膵ベータ細胞、神経幹細胞、神経（例えば、ドーパミン作動性神経）、乏突起膠細胞、乏突起膠細胞前駆細胞、肝細胞、肝幹細胞、星状膠細胞、ミオサイト、造血細胞、心筋細胞などであってよい。上に示されている通り、多能性幹細胞に由来する体細胞は、最終分化細胞であってよい、またはそれらは、特定の系列の細胞を生じることができてよい。例えば、多能性細胞は、種々の多分化能細胞型、例えば、神経幹細胞、心臓幹細胞、または肝幹細胞に分化させることができる。次いで、幹細胞は、新しい細胞型にさらに分化させることができ、例えば、神経幹細胞は、神経に分化させることができ；心臓幹細胞は、心筋細胞に分化させることができ；肝幹細胞は、肝細胞に分化させることができる。そのような方法によって作製される体細胞は、上記の通り、当技術分野で周知の特定の細胞系列のマーカーおよび形態によって、そのようなものとして容易に同定可能である。
【００７１】
脱メチル化を許容する細胞の他の細胞型への再プログラミングを促進するために、脱メチル化を許容する細胞を、細胞の再プログラミングを促進する１種または複数種の薬剤と接触させる追加的なステップを実施することができる。このステップは、脱メチル化を許容する細胞を、ＣＤ活性を促進する薬剤と接触させる前、脱メチル化を許容する細胞を、ＣＤ活性を促進する薬剤と接触させると同時に、または脱メチル化を許容する細胞を、ＣＤ活性を促進する薬剤と接触させた後で実行することができる。細胞の再プログラミングを促進する薬剤は、ポリペプチド、核酸薬剤、または小分子薬剤であってよい。このステップにおいて提供することができる薬剤の例としては、これらに限定されないが、ＧＳＫ−３阻害剤、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１など（Ｌｉ、Ｗ．ら（２００９）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、Ｅｐｕｂ  Ｏｃｔ．１６  ２００９，）；ＨＤＡＣ阻害剤、例えば、バルプロ酸など（その開示が参照により本明細書に組み込まれるＨｕａｎｇｆｕ、Ｄ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２６（７）７９５〜７９７；およびＵＳ２００９０１９１１５９に記載）；ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、例えば、Ｇ９ａヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、例えば、ＢＩＸ−０１２９４、など（Ｓｈｉ、Ｙら（２００８）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ３（５）：５６８〜５７４）；ジヒドロピリジン受容体のアゴニスト、例えば、ＢａｙＫ８６４４、など（Ｓｈｉ、Ｙら（２００８）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ３（５）：５６８〜５７４）；およびＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤、例えば、ＲｅｐＳｏｘなど（ｌｃｈｉｄａ、ＪＫ．ら（２００９）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ５（５）：４９１〜５０３）が挙げられる。このステップにおいて提供することができる薬剤の他の例としては、再プログラミング因子が挙げられる。上記の通り、再プログラミング因子は、細胞に作用して転写を変化させ、それによって細胞を新しい細胞運命に再プログラミングする生物活性因子である。
【００７２】
ある細胞系譜の体細胞の、別の細胞系譜の体細胞への再プログラミングを促進する薬剤の多数の例が当技術分野で公知であり、そのいずれも、本発明において使用することができる。これらとしては、例えば、筋肉に特異的な性質を色素細胞、神経細胞、脂肪細胞、肝細胞および線維芽細胞内に誘導する再プログラミング因子ＭＹＯＤ（筋原性因子１；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２４７８．４およびＮＰ＿００２４６９．２）、例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ、Ｈ．Ｗ．らＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：５４３４〜５４３８；Ｄａｖｉｓ、Ｒ．Ｌ．ら（１９８７）Ｃｅｌｌ  ５１  ：９８７〜１０００；Ｓｃｈａｆｅｒ、Ｂ．Ｗ．ら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：４５４〜８）を参照されたい；ＮＥＵＲＯＧ３（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３、ＮＧＮ３；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２０９９９．２およびＮＰ＿０６６２７９．２）、ＰＤＸ１（膵臓および十二指腸ホメオボックス１；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号．ＮＭ＿０００２０９．３およびＮＰ＿０００２００．１）および組み合わせて、ｉｎ  ｖｉｖｏで膵臓の外分泌細胞を機能性β細胞に効率的に変換することができるＭａｆＡ（ｖ−ｍａｆ筋腱膜線維肉腫癌遺伝子ホモログＡ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿２０１５８９．２およびＮＰ＿９６３８８３．２）、例えば、Ｚｈｏｕ、Ｑ．ら（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  ４５５：６２７〜３２）を参照されたい；およびＢ細胞において単独で、または線維芽細胞においてＰｕ．１（脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロウイルス組み込み癌遺伝子、ＳＰＩ１；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０８０５４７．１、ＮＰ＿００１０７４０１６．１、ＮＭ＿００３１２０．２およびＮＰ＿００３１１１．２）と組み合わせてマクロファージ特性を誘導する、Ｃ／ＥＢＰａ（ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合性タンパク質、アルファ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ００４３６４．３およびＮＰ＿００４３５５．２）、例えば、Ｂｕｓｓｍａｎｎ、Ｌ．Ｈ．ら（２００９）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ５：５５４〜６６；Ｆｅｎｇ、Ｒ．ら（２００８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５：６０５７〜６２；Ｘｉｅ、Ｈ．ら（２００４）Ｃｅｌｌ  １１７：６６３〜７６）を参照されたい、が挙げられる。他の薬剤としては、ＩＬ２受容体（ＩＬ受容体２ＡおよびＩＬ受容体２Ｂ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００４１７．２、ＮＰ＿０００４０８．１、ＮＭ＿０００８７８．２およびＮＰ＿０００８６９．１）およびＧＭ−ＣＳＦ受容体（コロニー刺激因子２受容体、アルファ（ＣＳＦ２ＲＡ）およびコロニー刺激因子２受容体、ベータ（ＣＳＦ２ＲＢ）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１６１５２９．１、ＮＰ＿００１１５５００１．１、ＮＭ＿０００３９５．２、およびＮＰ＿０００３８６．１）、委任リンパ球前駆細胞において骨髄の変換を誘導する、例えば、Ｋｏｎｄｏ、Ｍ．ら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：３８３〜６）を参照されたい、が挙げられる。上に列挙されているＧｅｎＢａｎｋ受託番号に記載の薬剤、ならびにこれらのポリペプチドをコードする核酸のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドは、本発明の方法において、ある脱メチル化を許容する細胞系譜の体細胞の、別の細胞系譜の体細胞への再プログラミングを促進する薬剤として使用される。
【００７３】
体細胞のｉＰＳ細胞への再プログラミングを促進する薬剤の多数の例が当技術分野で公知であり、そのいずれも、本発明において使用することができ、例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２００９００４７２６３号、ＵＳ２００９００６８７４２、ＵＳ２００９０１９１１５９、ＵＳ２００９０２２７０３２、ＵＳ２００９０２４６８７５、およびＵＳ２００９０３０４６４６を参照されたい。これらとしては、例えば、再プログラミング因子Ｏｃｔ３／４、（ＰＯＵクラス５ホメオボックス１（ＰＯＵ５Ｆ１）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２６９２およびＮＭ＿００２７０１）；Ｓｏｘ２（性決定領域Ｙボックス２タンパク質；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３０９７およびＮＭ＿００３１０６）：Ｋｌｆ４（クルッペル様因子４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４２２６およびＮＭ＿００４２３５）；ｃ−Ｍｙｃ（骨髄細胞腫症ウイルス癌遺伝子ホモログ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２４５８およびＮＭ＿００２４６７）；Ｎａｎｏｇ（Ｎａｎｏｇホメオボックス；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０７９１４１およびＮＭ＿０２４８６５）；およびＬｉｎ−２８（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＬｉｎ−２８ホモログ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０７８９５０およびＮＭ＿０２４６７４）が挙げられる。上に列挙されているＧｅｎＢａｎｋ受託番号に記載の薬剤のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびにこれらのポリペプチドをコードする核酸は、本発明の方法において、脱メチル化を許容する体細胞の、ｉＰＳ細胞への再プログラミングを促進する薬剤として使用される。
【００７４】
多能性幹細胞の、体細胞への再プログラミングを促進する薬剤の多数の例は当技術分野で公知であり、そのいずれも、本発明において使用することができる。例えば、神経幹細胞は、多能性細胞を、ＮＯＧ（ｎｏｇｇｉｎ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５４５０．４およびＮＰ＿００５４４１．１）または他の骨形成タンパク質アンタゴニスト（Ｉｔｓｙｋｓｏｎら、（２００５）、Ｍｏｌ、Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、３０（１）：２４〜３６）の存在下で浮遊凝集体として培養することによって、または多能性細胞を浮遊液中で、増殖因子、例えば、ＦＧＦ−２（線維芽細胞増殖因子２、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）としても公知である；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２００６．４およびＮＰ＿００１９９７．５）、例えば、Ｚｈａｎｇら、（２００１）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９）：１１２９〜１１３３を参照されたい、の存在下で培養して凝集体を形成することによって生成することができる。ある場合では、ＦＧＦ−２を含有する無血清培地中で凝集体を培養する。別の例では、ＦＧＦ−２を含む無血清培地の存在下で多能性細胞をマウス間質細胞系、例えばＰＡ６と共培養する。さらに別の例では、ＦＧＦ−２を含有する無血清培地に多能性細胞を直接移して分化を直接誘導する。
【００７５】
多能性細胞に由来する神経幹は、神経、乏突起膠細胞、または星状膠細胞に分化させることができる。多くの場合、神経幹細胞を生成するために用いる条件は、神経、乏突起膠細胞、または星状膠細胞を生成するためにも使用することができる。例えば、ドーパミン作動性ニューロンへの分化を促進するために、多能性細胞またはそれに由来する神経幹細胞を、無血清条件下でＰＡ６マウス間質細胞系と共培養することができる。例えば、Ｋａｗａｓａｋｉら、（２０００）Ｎｅｕｒｏｎ、２８（１）：３１４０を参照されたい。他の方法も記載されており、例えば、Ｐｏｍｐら、（２００５）、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２３（７）：９２３〜３０；米国特許第６，３９５，５４６号、例えば、Ｌｅｅら、（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１８：６７５〜６７９を参照されたい。多能性細胞またはそれに由来する神経幹細胞の乏突起膠細胞への分化は、例えば、多能性細胞または神経幹細胞を間質細胞と共培養することによって（例えば、Ｈｅｒｍａｎｎら（２００４）、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１７（Ｐｔ１９）：４４１１〜２２を参照されたい）、または多能性細胞または神経幹細胞を、インターロイキン（ＩＬ）−６受容体（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００５６５．２およびＮＰ＿０００５５６．１）、またはその誘導体がＩＬ−６サイトカイン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００６００．３およびＮＰ＿０００５９１．１）またはその誘導体に連結している融合タンパク質の存在下で培養することによって促進することができる。乏突起膠細胞は、当技術分野で公知の他の方法によって多能性細胞から生成することもできる。例えば、Ｋａｎｇら、（２００７）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５、４１９〜４２４を参照されたい。星状膠細胞は、多能性細胞またはそれに由来する神経幹細胞から、例えば、ｂＦＧＦおよびＥＧＦ（上皮増殖因子；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１９６３．３およびＮＰ＿００１９５４．２）を伴う神経形成培地の存在下で多能性細胞または神経幹細胞を培養することによって作製することもできる。例えば、Ｂｒｕｓｔｌｅら、（１９９９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８５：７５４〜７５６を参照されたい。
【００７６】
多能性細胞は、当技術分野で公知の方法によって膵ベータ細胞に分化させることができる。例えば、Ｌｕｍｅｌｓｋｙら、（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９２：１３８９〜１３９４；Ａｓｓａｄｙら、（２００１）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、５０：１６９１〜１６９７；Ｄ’Ａｍｏｕｒら、（２００６）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２４：１３９２〜１４０１．；Ｄ’Ａｍｏｕｒら、（２００５）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１５３４〜１５４１。方法は、多能性細胞を、アクチビンＡ（インヒビン、ベータＡ（ＩＮＨＢＡ）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２１９２．２およびＮＰ＿００２１８３．１）を補充した無血清培地中で培養し、その後、オールトランスレチノイン酸を補充した無血清培地の存在下で培養し、その後、ｂＦＧＦおよびニコチンアミドを補充した無血清培地の存在下で培養することを含んでよい。例えば、Ｊｉａｎｇら、（２００７）、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、４：３３３〜４４４。他の例では、方法は、多能性細胞を、無血清培地、アクチビンＡ、およびＷｎｔタンパク質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５４３０、ＮＭ＿００３３９１、ＮＭ＿００４１８５、ＮＭ＿０３０７５３、ＮＭ＿０３３１３１、ＮＭ＿０３０７６１、ＮＭ＿００３３９２、ＮＭ＿０３２６４２、ＮＭ＿００６５２２、ＮＭ＿００４６２５、ＮＭ＿０５８２３８、ＮＭ＿０５８２４４、ＮＭ＿００３３９３、ＮＭ＿００３３９５、ＮＭ＿００３３９６、ＮＭ＿０２５２１６、ＮＭ＿００３３９４、Ｗｎｔ−１１ＮＭ＿００４６２６、およびＮＭ＿０１６０８７）の存在下で、約０．５日から約６日間まで、例えば、約０．５日、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間培養し；その後、約０．１％から約２％まで、例えば、０．２％のＦＢＳおよびアクチビンＡの存在下で約１日から約４日間まで、例えば、約１日、２日間、３日間、または４日間培養し；その後、２％のＦＢＳ、ＦＧＦ１０（線維芽細胞増殖因子１０、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４４６５．１およびＮＰ＿００４４５６．１）、ＫＡＡＤ−シクロパミン（ケト−Ｎ−アミノエチルアミノカプロイルジヒドロシンナモイルシクロパミン）およびレチノイン酸の存在下で約１日から約５日間まで、例えば、１日、２日間、３日間、４日間、または５日間培養し、；その後、１％のＢ２７、ガンマセレクターゼ阻害剤およびエクステンジン−４（ｅｘｔｅｎｄｉｎ−４）と一緒に約１日から約４日間、例えば、１日、２日間、３日間、または４日間培養し；最後に、１％のＢ２７、エクステンジン−４、ＩＧＦ−１、およびＨＧＦの存在下で約１日から約４日間、例えば、１日、２日間、３日間、または４日間培養することを含む。
【００７７】
多能性細胞から肝細胞または肝幹細胞を分化させることができる。例えば、多能性細胞を酪酸ナトリウムの存在下で培養することにより、肝細胞を生成することができる。例えば、Ｒａｍｂｈａｔｌａら、（２００３）、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １２：１〜１１を参照されたい。別の例では、肝細胞は、多能性細胞を、血清を含まない培地中、アクチビンＡの存在下で培養し、その後、細胞をＦＧＦ４（線維芽細胞増殖因子−４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２００７．２およびＮＰ＿００１９９８．１）およびＢＭＰ２（骨形成タンパク質−２；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２００．２およびＮＰ＿００１１９１．１）中で培養することによって作製することができる。例えば、Ｃａｉら、（２００７）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４５（５）：１２２９〜３９。例示的な実施形態では、多能性細胞を、アクチビンＡの存在下で約２日間から約６日間まで、例えば、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、または約６日間培養し、次いで、多能性細胞を、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１０４２７．４およびＮＰ＿０３４５５７．３）の存在下で約５日間から約１０日間まで、例えば、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、または約１０日間培養することによって肝細胞または肝幹細胞に分化させる。
【００７８】
多能性細胞は、心筋細胞に分化させることもできる。骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達を阻害することにより、心筋細胞（または心筋細胞）の生成をもたらすことができる。例えば、Ｙｕａｓａら、（２００５）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２３（５）：６０７〜１１を参照されたい。したがって、例示的な実施形態では、多能性細胞をＮＯＧ（ｎｏｇｇｉｎ）の存在下で約２日間から約６日間まで、例えば、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、または約６日間培養し、その後、胚葉体を形成させ、胚葉体を約１週間から約４週間、例えば、約１週間、約２週間、約３週間、または約４週間培養する。他の例では、心筋細胞は、多能性細胞を、ＬＩＦ（白血病抑制因子；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２３０９．３およびＮＰ＿００２３００．１）の存在下で培養することによって、または多能性細胞を当技術分野で公知の他の方法に供してＥＳ細胞から心筋細胞を生成することによって生成することができる。例えば、Ｂａｄｅｒら、（２０００）、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、８６：７８７〜７９４、Ｋｅｈａｔら、（２００１）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０８：４０７〜４１４；Ｍｕｍｍｅｒｙら、（２００３）、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１０７：２７３３〜２７４０。
【００７９】
多能性細胞から他の細胞種を生成する方法の例としては：（１）脂肪細胞を生成するために、多能性細胞を、レチノイン酸、ＬＩＦ、甲状腺ホルモンおよびインスリンの存在下で培養すること（例えば、Ｄａｎｉら、（１９９７）、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．、１１０：１２７９〜１２８５）；（２）軟骨細胞を生成するために、多能性細胞を、ＢＭＰ２またはＢＭＰ４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２０２．３、ＮＰ＿００１１９３．２、ＮＭ＿１３０８５０．２、ＮＰ＿５７０９１１．２、ＮＭ＿１３０８５１．２、およびＮＰ＿５７０９１２．２）の存在下で培養すること（例えば、Ｋｒａｍｅｒら、（２０００）、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．、９２：１９３〜２０５）；（３）多能性細胞を、平滑筋を生成するための条件下で培養すること（例えば、Ｙａｍａｓｈｉｔａら、（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ、４０８：９２〜９６）；（４）ケラチノサイトを生成するために、多能性細胞を、ベータ−１インテグリン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２２１１．３およびＮＰ＿００２２０２．２）の存在下で培養すること（例えば、Ｂａｇｕｔｔｉら、（１９９６）、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、１７９：１８４〜１９６）；（５）マクロファージを生成するために、多能性細胞を、ＩＬ３（インターロイキン−３；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００５８８．３およびＮＰ＿０００５７９．２）およびＣＳＦ１（コロニー刺激因子、マクロファージ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００７５７．４、ＮＰ＿０００７４８．３）の存在下で培養すること（例えば、Ｌｉｅｓｃｈｋｅおよび  Ｄｕｎｎ（１９９５）、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔ．、２３：３２８〜３３４）；（６）肥満細胞を生成するために、多能性細胞を、ＩＬ−３およびＳＣＦ（造血幹細胞因子、ｋｉｔリガンドとしても公知の幹細胞因子；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００８９９．３およびＮＰ＿０００８９０．１）の存在下で培養すること（例えば、Ｔｓａｉら、（２０００）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７：９１８６〜９１９０）；（７）メラニン形成細胞を生成するために、多能性細胞を、デキサメタゾンおよびＳＣＦの存在下で培養すること（例えば、Ｙａｍａｎｅら、（１９９９）、Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．、２１６：４５０〜４５８）；（８）骨芽細胞を生成するために、多能性細胞を、デキサメタゾン、レチノイン酸、アスコルビン酸、ベータ−グリセロリン酸の存在下で胎児のマウス骨芽細胞と共培養すること（例えば、Ｂｕｔｔｅｒｙら、（２００１）、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．、７：８９〜９９）；（９）骨芽細胞を生成するために、多能性細胞を、骨形成性の因子の存在下で培養すること（例えば、Ｓｏｔｔｉｌｅら、（２００３）、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、５：１４９〜１５５）；（１０）骨格筋細胞を生成するために、多能性細胞においてインスリン様増殖因子−２を過剰発現させ、その細胞をジメチルスルホキシドの存在下で培養すること（例えば、Ｐｒｅｌｌｅら、（２０００）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２７７：６３１〜６３８を参照されたい）；（１１）多能性細胞を、白色血液細胞を生成するための条件に供すること；または、（１２）造血前駆��胞を生成するために、多能性細胞を、ＢＭＰ４ならびに：ＳＣＦ、ＦＬＴ３（ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４１１９．２およびＮＰ＿００４１１０．２）、ＩＬ−３、ＩＬ−６（インターロイキン６；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ＿０００６００．３およびＮＰ＿０００５９１．１）、およびＣＳＦ３（コロニー刺激因子、顆粒球；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００７５９．２およびＮＰ＿０００７５０．１）の１つまたは複数の存在下で培養すること（例えば、Ｃｈａｄｗｉｃｋら、（２００３）、Ｂｌｏｏｄ、１０２：９０６〜９１５を参照されたい）が挙げられる。
【００８０】
上に列挙されているＧｅｎＢａｎｋ受託番号に記載の薬剤のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびにこれらのポリペプチドをコードする核酸は、本発明の方法において、多能性細胞の体細胞への再プログラミングを促進する薬剤として使用される。
【００８１】
細胞の再プログラミングを促進する薬剤は、これらに限定されないが、ＣＤ活性を促進する薬剤について上記されている方法を含めた当技術分野で周知の方法によって、脱メチル化を許容する細胞に提供することができる。薬剤は、個別に、または単一の組成物として、すなわち、薬剤の予備混合した組成物として提供することができる。薬剤は、同時に、または違う時間に逐次的に対象細胞に加えることができる。一部の実施形態では、少なくとも２種の薬剤のセット、例えば、Ｏｃｔ３／４ポリペプチドおよびＳｏｘ２ポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、３種の薬剤のセット、例えば、Ｏｃｔ３／４ポリペプチド、Ｓｏｘ２ポリペプチド、およびＫｌｆ４ポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、４種の薬剤のセット、例えば、Ｏｃｔ３／４ポリペプチド、Ｓｏｘ２ポリペプチド、Ｋｌｆ４ポリペプチド、およびｃ−Ｍｙｃポリペプチドを提供する。ＣＤ活性を促進する薬剤（複数可）と同様に、薬剤（複数可）は、対象細胞に１回または複数回提供することができ、各接触事象の後、細胞を薬剤と一緒にいくらかの時間、例えば、１６〜２４時間インキュベートしておき、その後、培地を新鮮な培地と交換し、細胞をさらに培養する。
【００８２】
脱メチル化を許容する細胞を、ＣＤ活性を促進する薬剤（複数可）と接触させた後、所望の細胞の成長を促進するために、接触させた細胞を培養する。細胞を培養して上記のｉＰＳ細胞または体細胞の特定の型の成長を促進するための方法、上記の体細胞の特定の型のｉＰＳ細胞クローンまたはクローンを単離するための方法、およびそれらの細胞クローンの細胞を培養して上記のｉＰＳ細胞または体細胞の特定の型の成長を促進する方法は当技術分野で周知であり、そのいずれも、本発明において、再プログラムされた脱メチル化を許容する細胞から所望の細胞を成長させ、単離し、再培養するために使用することができる。
【００８３】
細胞を、ＣＤ活性を促進する薬剤（複数可）と接触させることによって脱メチル化を許容する細胞培養物の細胞におけるゲノムＤＮＡメチル化の量を減少させることにより、脱メチル化を許容する細胞の、所望の細胞型への再プログラミングの効率が、ＣＤ活性を促進する薬剤が存在しない場合に観察される効率と比較して増加する。言い換えれば、体細胞および細胞培養物は、再プログラミングを促進することが当技術分野で公知の因子の存在下でＣＤ活性を促進する１種または複数種の薬剤と接触させた場合に、ＣＤ活性を促進する１種または複数種の薬剤と接触させなかった細胞と比較して所望の細胞型を生じさせるための能力が増強されることが実証されている。増強されるとは、体細胞培養物が、ＣＤ活性を促進する薬剤と接触させなかった細胞の集団の所望の細胞型を生じさせる能力の少なくとも約５０％、約１００％、約２００％、約３００％、約４００％、約６００％、約１０００％、少なくとも約２０００％の、所望の細胞型を生じさせる能力を有することを意味する。言い換えれば、脱メチル化を許容する細胞の培養物により、ＣＤ活性を促進する１種または複数種の薬剤と接触させていない脱メチル化を許容する細胞の集団によって産生される所望の細胞型の細胞数の約１．５倍、約２倍、約３倍、約４倍、約６倍、約１０倍、約２０倍、約３０倍、約５０倍、約１００倍、約２００倍が産生される。再プログラミングの効率は、所望の細胞型を獲得すると脱メチル化された状態になることが当技術分野で公知のプロモーターにおけるメチル化の量をアッセイすることによって決定することができる。そのような場合では、それらのプロモーターにおけるメチル化の量が、ＣＤ活性を促進する薬剤が存在しない場合に観察されたメチル化の量の約１．５分の１、約２分の１、約３分の１、約４分の１、約６分の１、約１０分の１未満である場合に、ＣＤ活性を促進する薬剤が存在することに起因する再プログラミングの効率の増強が観察される。その代わりにまたはそれに加えて、再プログラミングの効率は、所望の細胞系を獲得するとより高度に発現されることが当技術分野で公知の遺伝子の発現レベルをアッセイすることによって決定することができる。そのような場合では、これらの遺伝子の発現レベルが、ＣＤ活性を促進する薬剤が存在しない場合に観察される発現レベルよりも約１．５倍、約２倍、約３倍、約４倍、約６倍、約１０倍大きい場合に、ＣＤ活性を促進する薬剤が存在することに起因する再プログラミングの効率の増強が観察される。
【００８４】
上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法によって再プログラムされた脱メチル化を許容する細胞から得られる細胞は、疾患（例えば、遺伝的欠陥）を治療するための療法として使用することができる。特に、上記の方法によって脱メチル化を許容する体細胞から得られる体細胞および上記の方法によって多能性幹細胞体細胞から得られる体細胞は、広範囲の疾患または障害に罹患している対象に、例えば、レシピレントにおいて分化している細胞または分化した細胞を再構成する、または補うために移入することができる。同様に、脱メチル化を許容する体細胞から得られる人工多能性幹細胞を、広範囲の疾患または障害に罹患している対象に移入することができる、または、それらをｉｎ  ｖｉｔｒｏで種々の細胞系譜の体細胞に分化させ、次いで広範囲の疾患または障害に罹患している対象に移入することができる。これらに限定されないが、多能性細胞を分化させる方法を含めた、多能性細胞をより特殊化した細胞型に分化させる方法は多数あり、これらを、上記の通り、幹細胞、特にＥＳ細胞を、体細胞になるように再プログラムするために使用することができる。
【００８５】
療法は、疾患の原因を治療することを対象としてよい；あるいは、療法は、疾患または状態の影響を治療するものであってよい。例えば、由来細胞は、対象の傷害部位に、またはその近くに移入することができる；または細胞は、細胞が傷害部位に移動する、またはそこに向かうことができるように対象に導入することができる。移入された細胞は、損傷を受けた、または傷害を受けた細胞と有利に置き換え、対象の全体的な状態の改善を可能にすることができる。ある場合には、移入された細胞により、組織再生または修復が刺激され得る。
【００８６】
ある場合では、由来細胞または由来細胞の亜集団は、対象に移入する前に精製または単離することができる。ある場合では、所望の細胞型に特異的な１種または複数種のモノクローナル抗体を細胞集団と一緒にインキュベートし、結合した細胞を単離する。他の場合では、細胞の所望の亜集団に細胞型に特異的なプロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を発現させ、次いで、それを用いて由来細胞またはその亜集団を精製または単離する。
【００８７】
ある場合では、種々の目的で、例えば、機能喪失突然変異を有する遺伝子を置き換えるため、マーカー遺伝子を提供するためなどに、遺伝子を、対象に移入する前に脱メチル化を許容する細胞またはそれに由来する細胞に導入することができる。あるいは、アンチセンスｍＲＮＡまたはリボザイムを発現させるベクターを導入し、それによって望ましくない遺伝子の発現を遮断する。遺伝子療法の他の方法は、薬物耐性遺伝子を導入して、正常な前駆細胞が利点を有することを可能にし、選択圧、例えば、多数の薬物耐性遺伝子（ＭＤＲ）、またはｂｃｌ−２などの抗アポトーシス遺伝子に供することである。種々の当技術分野で公知の技法、例えば、上記の通り、電気穿孔、カルシウム沈降ＤＮＡ（ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ  ＤＮＡ）、融合、トランスフェクション、リポフェクション、感染などを用いて、標的細胞に核酸を導入することができる。ＤＮＡを導入する特定の様式は、本発明の実施には重大ではない。
【００８８】
遺伝子改変された脱メチル化を許容する細胞またはそれに由来する細胞を有することを立証するために、種々の技法を使用することができる。細胞のゲノムは制限されている可能性があり、増幅して、または増幅せずに使用する。ポリメラーゼ連鎖反応；ゲル電気泳動；制限分析；サザンブロット、ノーザンブロット、およびウエスタンブロット；配列決定などは、全て使用することができる。種々の条件下で細胞を成長させて、細胞が、導入されたＤＮＡを発現する能力を維持しながら骨髄系列の全てに成熟化可能なことを確実にすることができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける種々の試験を使用して、確実に細胞の多能性の能力（ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ）が維持されるようにすることができる。
【００８９】
対象への治療の施行数は変動し得る。誘導された細胞および／または分化した細胞の対象への導入は、一回の事象であってよいが、ある特定の状況では、そのような治療によって引き出される改善は限られた期間にわたるものであり、持続的な一連の反復治療が必要になる可能性がある。他の場合では、効果が観察される前に細胞を多数回投与することが必要になり得る。正確なプロトコールは、疾患または状態、疾患の病期および治療されている個々の対象のパラメータに左右される。
【００９０】
細胞は、以下の経路のいずれかによって対象に導入することができる：非経口的経路、静脈内経路、動脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、経皮的経路、気管内経路、腹腔内経路、または脊髄液内経路。
【００９１】
神経疾患または神経障害に罹患している対象には、特に、本発明の方法によって得られる細胞を利用する療法が有益であり得る。いくつかの手法では、神経性の状態、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、脳梗塞、脊髄損傷、または他の中枢神経系障害を治療するために、神経幹細胞または神経系細胞を傷害部位に移植することができる。例えば、Ｍｏｒｉｚａｎｅら、（２００８）、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．、３３１（１）：３２３〜３２６；Ｃｏｕｔｔｓおよび  Ｋｅｉｒｓｔｅａｄ（２００８）、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２０９（２）：３６８〜３７７；Ｇｏｓｗａｍｉおよび  Ｒａｏ（２００７）、Ｄｒｕｇｓ、１０（１０）：７１３〜７１９を参照されたい。パーキンソン病を治療するために、ドーパミン作用性ニューロンをパーキンソン病の対象の線条体に移植することができる。多発性硬化症を治療するために、乏突起膠細胞または乏突起膠細胞の前駆体をＭＳに罹患している対象に移入することができる。本発明の方法によって得られる細胞は、脳および脊髄を修復するために、病変へのそれらの移動を標的にすることができる手掛かりに反応するように遺伝子工学で操作することもできる。例えば、Ｃｈｅｎら、（２００７）、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｖ．、３（４）：２８０〜２８８。
【００９２】
神経性障害以外の疾患も、本発明の方法によって生成される細胞を利用する療法によって治療することができる。虚血性心筋症、伝導疾患、および先天性欠損などの変性心疾患には、心筋細胞またはそれらの前駆物質を移植することが有効であり得る。例えば、Ｊａｎｓｓｅｎｓら、（２００６）、Ｌａｎｃｅｔ、３６７：１１３〜１２１を参照されたい。
【００９３】
膵島細胞（またはランゲルハンス島の初代細胞）を糖尿病（例えば、糖尿病、１型）に罹患している対象に移植することができる。例えば、Ｂｕｒｎｓら、（２００６）Ｃｕｒｒ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．、２：２５５〜２６６を参照されたい。一部の実施形態では、本発明の方法によって得られる膵ベータ細胞を糖尿病（例えば、１型糖尿病）に罹患している対象に移植することができる。
【００９４】
他の例では、本発明の方法によって得られる肝細胞または肝幹細胞を、肝疾患、例えば、肝炎、硬変症、または肝不全に罹患している対象に移植する。
【００９５】
本発明の方法によって得られる造血細胞または造血幹細胞（ＨＳＣ）を血液の癌、または他の血液障害または免疫障害に罹患している対象に移植することができる。造血細胞またはＨＳＣによって治療される可能性がある血液の癌の例としては：急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ホジキン病、多発性骨髄腫、および非ホジキンリンパ腫が挙げられる。多くの場合、そのような疾患に罹患している対象は、急速に分裂している血液細胞を死滅させるために放射線治療および／または化学療法薬による治療を受けなければならない。本発明の方法によって得られるＨＳＣをこれらの対象に導入することは、細胞の枯渇した貯蔵を再充填させるのに役立ち得る。
【００９６】
ある場合では、本発明の方法によって得られる造血細胞またはＨＳＣは、癌と直接戦うためにも使用することができる。例えば、同種異系のＨＳＣの移植は、腎癌の治療において見込みがあることが示されている。例えば、Ｃｈｉｌｄｓら、（２０００）、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍ編、３４３：７５０〜７５８を参照されたい。一部の実施形態では、本発明の方法によって得られる同種異系のＨＳＣ、または自己のＨＳＣでさえ、腎癌または他の癌を治療するために対象に導入することができる。
【００９７】
本発明の方法によって得られる造血細胞またはＨＳＣは、血液細胞以外の細胞または組織、例えば、筋肉、血管、または骨を生成または修復するためにも対象に導入することができる。そのような治療は、多数の障害に対して有用であり得る。
【００９８】
ある場合では、本発明の方法によって得られる細胞を免疫無防備状態の動物、例えば、ＳＣＩＤマウスに移入し、分化させる。移植された細胞は、分化細胞型と腫瘍細胞の混合物を形成し得る。対象とする特異的な分化細胞型は、系列特異的なマーカーを使用することによって、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または他の選別方法、例えば、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）によって、腫瘍細胞から離して選択し、精製することができる。次いで、疾患または状態を治療するために分化細胞を対象（例えば、自己の対象、ＨＬＡが一致した対象）に移植することができる。疾患または状態は、造血障害、内分泌欠乏、神経変性障害、脱毛、または本明細書に記載の他の疾患または状態であってよい。
【００９９】
本発明の方法によって得られる細胞は、任意の生理的に許容される培地に投与することができる。本発明の方法によって得られる細胞は、単独で、または、例えば、それらが移植された組織におけるそれらの成長および／または組織化を支持するために、適切な基質またはマトリックスと一緒に提供することができる。通常、少なくとも１×１０５個、好ましくは１×１０６個以上の細胞を投与する。細胞は、注射、カテーテルなどによって導入することができる。細胞は、液体窒素の温度で凍結させ、長期間貯蔵することができ、解凍して使用することができる。凍結させる場合、細胞は通常１０％のＤＭＳＯ、５０％のＦＣＳ、４０％のＲＰＭＩ１６４０培地中で貯蔵する。解凍したら、前駆細胞の増殖および分化に関連する増殖因子および／または間質細胞を使用することによって細胞を増やす。
【０１００】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける方法および使用
一部の実施形態では、例えば、ゲノムＤＮＡ脱メチル化療法を必要とする対象において、脱メチル化を許容する細胞を、ＣＤ活性を促進する１種または複数種の薬剤とｉｎ  ｖｉｖｏで接触させる。
【０１０１】
ポリペプチド、小分子および核酸を対象に投与するためのいくつもの当技術分野において周知の方法のいずれかによって、細胞を、ＣＤ活性を促進する薬剤（複数可）とｉｎ  ｖｉｖｏで接触させることができる。薬剤は、種々の製剤に組み込むことができる。より詳細には、薬剤は、適切な薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせることによって、医薬組成物に処方することができ、また、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル剤、ミクロスフェア、およびエアロゾル剤などの固体の形態、半固体の形態、液体の形態または気体の形態の調製物に処方することができる。そのようなものとして、シチジンデアミナーゼ活性を促進する薬剤（複数可）の投与は、経口投与、頬側投与、直腸投与、非経口投与、腹腔内投与、皮内投与、経皮投与、気管内（ｉｎｔｒａｃｈｅａｌ）投与などを含めた種々のやり方で実現することができる。活性薬剤は、投与後に全身にわたってよい、または局部投与、壁内投与を使用すること、もしくは埋め込み部位で活性用量を保持するために作用する移植片を使用することによって局所的にすることができる。活性薬剤は、即時活性用に処方することができる、または、持続的放出用に処方することができる。
【０１０２】
いくつかの状態、特に、中枢神経系の状態のために、薬剤を、血液脳関門（ＢＢＢ）を渡るように処方することが必要であり得る。血液脳関門（ＢＢＢ）を通って薬物送達するための１つの戦略は、マンニトールもしくはロイコトリエンなどの浸透性の手段によって、またはブラジキニンなどの血管作動性物質を使用することによって生化学的に、ＢＢＢを破壊することを伴う。特異的な薬剤を脳腫瘍にターゲティングするためにＢＢＢ開口を使用する可能性も１つの選択肢である。組成物を血管内注射によって投与する場合、ＢＢＢ破壊剤は本発明の治療用組成物と同時投与することができる。ＢＢＢを通過させる他の戦略は、カベオリン１に媒介されるトランスサイトーシス、グルコース担体およびアミノ酸担体などの担体に媒介される輸送体、インスリンまたはトランスフェリンの受容体媒介性トランスサイトーソイス、およびｐ−糖タンパク質などの活性な流出輸送体を含めた内在性の輸送系の使用を伴ってよい。活性な輸送部分を本発明において使用するための治療用化合物とコンジュゲートして、血管の内皮壁を渡る輸送を容易にすることもできる。あるいは、ＢＢＢの反対側への治療用薬剤の薬物送達は、局所送達、例えば、くも膜下腔内送達、例えば、オンマイヤーレザバー（Ｏｍｍａｙａ  ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）を通る（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２２２，９８２号および同第５，３８５，５８２号を参照されたい）；ボーラス注射、例えば、シリンジによって、例えば、硝子体内または頭蓋内に；連続な注入、例えば、対流を伴うカニューレ挿入によって（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２００７０２５４８４２号を参照されたい）；または、薬剤が可逆的に添付されているデバイスを埋め込むこと（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２００８００８１０６４号および同第２００９０１９６９０３号を参照されたい）によってよい。
【０１０３】
投与するべきＣＤ活性を促進する薬剤（複数可）の有効量または有効用量を算出することは当業者の技術の範囲内であり、当業者にとっては常套的である。言うまでもなく、投与するべき最終的な量は、投与経路および治療される障害または状態の性質に左右される。
【０１０４】
医薬に含めるために、ＣＤ活性を促進する薬剤（複数可）を商業的な市販の供給源から得ることができる。一般的な提案として、用量当たりの非経口的に投与する化合物の薬学的有効量の総量は、用量反応曲線によって測定することができる範囲内になる。
【０１０５】
治療的投与のために使用されるＣＤ活性を促進する薬剤（複数可）は、滅菌しなければならない。滅菌は、滅菌濾過膜（例えば、０．２μｍの膜）を通して濾過することによって容易に実現される。治療用組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針で穴をあけることができる止め栓を有するバイアル内に置く。ＣＤ活性を促進する薬剤（複数可）は、普通は、単位用量容器または多回用量容器、例えば、密封したアンプルまたはバイアル内で、水溶液として、または再構成するための凍結乾燥製剤として貯蔵する。凍結乾燥製剤の例として、１０ｍＬのバイアルを５ｍｌの滅菌濾過した化合物１％（ｗ／ｖ）水溶液で満たし、生じた混合物を凍結乾燥する。輸液は、凍結乾燥した化合物を、注射用静菌水を用いて再構成することによって調製する。
【０１０６】
医薬組成物は、所望の製剤に応じて、動物またはヒトに投与するための医薬組成物を処方するために一般に使用される、ビヒクルと定義される、薬学的に許容できる無毒性の担体または希釈剤を含んでよい。希釈剤は、組み合わせの生物活性に影響を及ぼさないように選択する。そのような希釈剤の例は、蒸留水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳ、リンゲル液、ブドウ糖溶液、およびハンクス液である。さらに、医薬組成物または製剤は、他の担体、アジュバント、または非毒性、非治療的、非免疫原性の安定剤、賦形剤なども含んでよい。組成物は、生理的条件に近づけるための追加的な物質、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤、湿潤剤および界面活性剤などをも含んでよい。
【０１０７】
組成物は、例えば抗酸化剤などの任意の種々の安定化剤も含んでよい。医薬組成物がポリペプチドを含む場合、ポリペプチドは、ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏにおける安定性を増強する、またはそうでなければその薬理学的性質を増強する（例えば、ポリペプチドの半減期を増加させる、その毒性を低下させる、溶解性または取り込みを増強する）種々の周知の化合物と複合させることができる。そのような修飾剤または複合剤の例としては、硫酸、グルコン酸、クエン酸およびリン酸が挙げられる。組成物のポリペプチドは、それらのｉｎ  ｖｉｖｏ属性を増強する分子と複合させることもできる。そのような分子としては、例えば、炭水化物、ポリアミン、アミノ酸、他のペプチド、イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン）、および脂質が挙げられる。
【０１０８】
投与の種々の型に適している製剤に関する別の手引きは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ．、第１７版（１９８５）において見ることができる。薬物送達ための方法についての簡単な総説については、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７〜１５３３（１９９０）を参照されたい。
【０１０９】
医薬組成物は、予防的な治療および／または治療的な治療のために投与することができる。活性成分の毒性および治療効果は、細胞培養物および／または実験動物において標準の薬学的手順に従って決定することができ、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に対して治療的に有効な用量）を決定することを含む。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。大きな治療的指標を示す化合物が好ましい。
【０１１０】
細胞培養試験および／または動物試験から得られたデータを、ヒトに対してさまざまな投与量を処方することにおいて使用することができる。活性成分の投与量は、一般には、ＥＤ５０を含むさまざまな循環濃度の範囲内に並び、毒性は低い。投与量は、使用する剤形および利用する投与経路に応じてこの範囲内で変動してよい。
【０１１１】
医薬組成物を処方するために使用する構成成分は、高純度のものであることが好ましく、潜在的に有害な汚染物質を実質的に含まない（例えば、少なくともＮａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｏｄ（ＮＦ）グレード、一般に、少なくとも分析グレード、より一般には少なくとも医薬グレード）。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用するための組成物は、通常滅菌される。所与の化合物を使用する前に合成しなければならない限りでは、生じた生成物は、一般には、合成プロセスまたは精製プロセスの間に存在する可能性がある任意の潜在的に毒性の薬剤、特に、任意の内毒素を実質的に含まない。非経口投与するための組成物も滅菌され、実質的に等張性であり、ＧＭＰ条件下で製造される。
【０１１２】
特定の患者に与えるべき有効量の治療用組成物は、種々の因子に左右され、そのいくつかは患者によって異なる。有能な臨床医は、必要に応じて、疾患状態の進行を停止または逆転させるために、患者に投与するための有効量の治療剤を決定することができる。ＬＤ５０動物データ、および薬剤に関して入手可能な他の情報を利用して、臨床医は、投与経路に応じて、個人に対する最大の安全用量を決定することができる。例えば、治療用組成物が投与される流体が大きいことを考慮すると、静脈内投与する用量は、くも膜下腔内投与する用量よりも高くてよい。同様に、体から急速に取り除かれる組成物は、治療的な濃度を維持するために、高用量で、または反復用量で投与することができる。有能な臨床医は、通常の技術を利用して、常套的な臨床試験の過程で特定の治療薬の投与量を最適化することができる。
【０１１３】
本方法を用いて治療することができる哺乳動物種としては、イヌおよびネコ；ウマ；ウシ；ヒツジなど、ならびに霊長類、特に、ヒトが挙げられる。動物モデル、特に小さな哺乳動物、例えば、マウス、ウサギなどを実験的調査のために使用することができる。他の使用としては、活性な脱メチル化シグナル伝達の存在下で特異的な効果を調査することが望ましい調査が挙げられる。
【０１１４】
本発明の方法は、併用療法においても使用される。例えば、いくつもの薬剤、例えば、化学療法剤、キナーゼ阻害剤、アンジオスタチン、エンドスタチン、ＶＥＧＦ阻害剤などが癌の治療において有用であり得る。本発明のＣＤ活性を促進する薬剤（複数可）とこれらの他の薬剤を組み合わせて使用することは、個々の薬物について必要な投与量が低減すること、および異なる薬物の相補的な効果という利点を有し得る。
【０１１５】
上記の通り、本発明は、ヒト患者などの哺乳動物の治療において、ゲノムＤＮＡ脱メチル化療法を必要とする対象に使用される。そのような対象の例は、プロモーターが高メチル化されていることによって異常にサイレンシングされた遺伝子に関連する状態に罹患している対象である。そのような状態を特徴とする疾患に罹患している患者には、係属中の特許請求された発明治療プロトコールが大いに有益である。
【０１１６】
そのような状態の１つの例は癌である。いくつもの遺伝子、すなわち、メチル化感受性遺伝子が、癌では異常に高メチル化され、サイレンシングされていることが公知である。これらとしては、細胞周期制御に関与する遺伝子（例えば、ＲＢ１、ＣＤＫＮ２ＡＩＮＫ４Ａ、ＣＤＫＮ２ＡＡＲＦ）、腫瘍細胞の浸潤に関与する遺伝子（例えば、ＣＤＨ１、ＣＤＨ１３、ＴＩＭＰ３、ＶＨＬ）、ＤＮＡ修復に関与する遺伝子（例えば、ＭＬＨ１、ＭＧＭＴ、ＢＲＣＡ１、ＧＳＴＰ１）、クロマチンリモデリングに関与する遺伝子（例えばＳＭＡＲＣＡ３）、細胞シグナル伝達に関与する遺伝子（例えば、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＳＯＣＳ１）、転写に関与する遺伝子（例えば、ＥＳＲ１）、およびアポトーシスに関与する遺伝子（例えば、ＤＡＰＫ１）が挙げられる。したがって、本発明の方法および組成物は、癌、例えば、神経膠腫、髄芽腫、結腸癌、結腸直腸癌、乳癌、または白血病に罹患している対象における腫瘍成長および癌の進行を阻害することにおいて使用される。「癌」という用語は、一般には、哺乳動物における、細胞の成長／増殖が調節されていないことを特徴とする生理的状態を指す。癌の例としては、これらに限定されないが、細胞腫、リンパ腫、芽細胞種、および白血病が挙げられる。癌のより詳細な例としては、これらに限定されないが、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、非小細胞癌（ＮＳＣＬＣ）を含めた肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸部癌、子宮内膜癌、前立腺癌、結腸直腸癌、腸のカルチノイド、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、肝癌（肝細胞癌）、肝芽腫、食道癌、肺腺癌、中皮腫、滑膜肉腫、骨肉腫、頭頸部扁平上皮癌、若年性鼻咽腔血管線維腫、脂肪肉腫、甲状腺癌、黒色腫、基底細胞癌（ＢＣＣ）、髄芽腫およびデスモイドが挙げられる。特定の癌と上記の対象とする遺伝子のメチル化状態との間の相関は、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＲｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｋ．Ｄ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：５９７〜６１０において見ることができる。
【０１１７】
腫瘍成長および癌の進行を阻害するためのＣＤ活性を促進する薬剤（複数可）の有効量は、上述のメチル化感受性遺伝子の１種または複数種の発現を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば２倍以上増加させ、かつ／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける癌細胞の増殖速度またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍の増殖阻害に測定可能な低下をもたらす量である。例えば、好ましい成長阻害剤は、腫瘍成長を、適切な対照と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、好ましくは約２０％〜約５０％、さらに好ましくは、５０％超（例えば、約５０％〜約１００％）阻害し、対照は、一般には、試験されているシチジンデアミナーゼ活性を促進する薬剤（複数可）で処理していない癌細胞である。薬剤を体重１ｋｇ当たり約１μｇから約１００ｍｇまでで投与することにより、腫瘍サイズまたは細胞増殖が抗体を最初に投与してから約５日〜３ヶ月以内、好ましくは約５〜３０日以内に低下した場合、その薬剤はｉｎ  ｖｉｖｏにおいて成長阻害性である。特定の態様では、腫瘍サイズは、療法を開始した時のそのサイズと比較して低下する。
【０１１８】
本発明の方法によって治療することができる、プロモーターが高メチル化されていることによって異常にサイレンシングされた遺伝子に関連する状態の別の例は、異常なゲノム刷り込みに関連する状態である。ゲノム刷り込みでは、特定の遺伝子は、由来する親（ｐａｒｅｎｔ  ｏｆ  ｏｒｉｇｉｎ）に特異的な様式で発現している。ゲノム刷り込みは、刷り込まれた遺伝子が、母親から受け継がれた対立遺伝子からのみ発現されるか、または父親から受け継がれた対立遺伝子からのみ発現される、古典的なメンデル遺伝と無関係の遺伝プロセスである。ゲノム刷り込みは、遺伝子の配列を変化させることなく単一対立遺伝子性遺伝子発現を実現するためにメチル化およびヒストン修飾を必要とする。これらの後成的な目印は、生殖系列において確立され、生物体の全ての体細胞全体を通して維持される。
【０１１９】
本発明の方法によって治療可能な、異常なゲノム刷り込みに関連するいくつもの状態が同定されている。例えば、胎児および出生後の過成長、器官の肥大、腫瘍リスクの増加、および顔面の異常を特徴とするベックウィズ−ヴィーデマン症候群では、ＩＧＦ２／Ｈ１９刷り込み制御領域１における母系対立遺伝子の新規のメチル化が観察される。精神遅滞、肥満、低身長、および行動上の問題を特徴とするプラダー・ウィリー症候群では、ＰＷＳ遺伝子の父系対立遺伝子の新規のメチル化が観察される。腎臓の副甲状腺ホルモン抵抗性を特徴とする偽性副甲状腺機能低下症１Ｂ型では、ＮＥＳＰ５５の母系対立遺伝子の新規のメチル化が観察される。本発明の方法は、これらの遺伝子座における脱メチル化を促進し、それによって適切な遺伝子発現を回復すること使用される。
【０１２０】
本発明の方法によって治療することができる、プロモーターが高メチル化されていることによって異常にサイレンシングされた遺伝子に関連する状態の別の例は、反復不安定性（ｒｅｐｅａｔ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ）疾患に関連する状態である。これらの疾患では、反復配列が拡大することにより、それらの配列の近くの遺伝子の発現に影響を及ぼす異常なメチル化が生じる。本発明の方法によって治療可能な反復不安定性に関連するいくつもの状態が同定されている。例えば、精神遅滞、巨睾丸症、および自閉症的行動を特徴とする脆弱Ｘ症候群では、ＦＭＲＩ遺伝子の５’ＵＴＲのＣＧＧ反復が拡大することにより、５’ＵＴＲ配列が新規にメチル化され、ＦＭＲＩ遺伝子が異常にサイレンシングされる。別の例として、肢および顔面の筋肉の衰弱および消耗、筋緊張症、ならびに白内障を特徴とする筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ１）では、ＤＭＰＫ遺伝子のＵＴＲ内のＣＴＧ反復が拡大することにより、拡大したＣＴＧ反復の近くのＣｐＧアイランドが新規にメチル化され、それによって今度はＳＩＸ５遺伝子が攪乱され、サイレンシングされる。本発明の方法は、これらの遺伝子座における脱メチル化を促進し、それによって適切な遺伝子発現を回復することに使用される。
【０１２１】
スクリーニング方法。
本明細書に記載の方法は、候補薬剤を、脱メチル化を調節する活性についてスクリーニングするための有用なシステムを提供する。そのために、ＣＤ活性を促進する薬剤が、脱メチル化を増強することに対する強力な効果を有することが示されている。ＣＤ活性を阻害する薬剤を、脱メチル化が起こっている細胞を含む細胞培養物系に加えることにより、この脱メチル化活性が強力に抑制され、したがって、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇなどのメチル化感受性遺伝子の転写活性プロモーターの量が低下する。この脱メチル化活性の抑制ならびにその後の、これらのプロモーターにおけるメチル化の増加および転写活性のサイレンシングは、早ければ、脱メチル化している細胞を、ＣＤ活性を阻害する薬剤と接触させた１日後に観察され得、３日目までにこれらのメチル化感受性遺伝子がほぼ完全にサイレンシングされる。
【０１２２】
生物学的に活性な薬剤を求めるスクリーニングアッセイでは、細胞、通常細胞培養物を、ＣＤ活性を促進する薬剤の存在下で、対象とする薬剤と接触させ、候補薬剤の効果を、アウトプットパラメータ、例えばメチル化ＣｐＧ配列の量、メチル化感受性遺伝子の発現などを上記の方法によってモニターすることによって評価する。
【０１２３】
パラメータは、細胞の数量化できる構成成分、特に、望ましくはハイスループットシステムにおいて正確に測定することができる構成成分である。パラメータは、細胞表面決定基、受容体、タンパク質、またはそのコンフォメーションの修飾または翻訳後修飾、脂質、炭水化物、有機分子または無機分子、核酸、例えば、ｍＲＮＡ、ＤＮＡなどを含めた任意の細胞構成成分または細胞産物、またはそのような細胞構成成分に由来する部分、またはそれらの組み合わせであってよい。大部分のパラメータにより定量的な読み取りがもたらされるが、ある場合には、半定量的な結果または定性的な結果が許容される。読み取りは、単一の決定値を含んでよい、または、平均値、中央値もしくは分散などを含んでよい。特徴的に、多数の同じアッセイから、各パラメータについてさまざまなパラメータの読み取り値が得られる。変動性が予測され、試験パラメータのセットのそれぞれについてのさまざまな値は、単一の値をもたらすために使用される一般的な統計学的方法を用いた標準の統計学的な方法を使用して得られる。
【０１２４】
例えば、薬剤を、脱メチル化活性を促進する活性について、例えば、候補薬剤を、ＣＤ活性を促進する薬剤の存在下で細胞培養物に加えることによってスクリーニングすることができる。観察されるメチル化の量が減少すること、例えば、メチル化感受性遺伝子のプロモーターまたは外因的に供給された５−ｍｅＣｐＧリッチ核酸の５−メチルシトシンの数が、候補薬剤が存在しない培養物において観察されるものに対して、例えば、１．５分の１、２分の１、３分の１またはそれ以下に減少することにより、候補薬剤が脱メチル化を促進する薬剤であったことが示される。そのような実施形態では、細胞は、脱メチル化を許容する細胞であってよい、または、脱メチル化を許容しない細胞であってよい。
【０１２５】
あるいは、例えば、候補薬剤を、ＣＤ活性を促進する薬剤の存在下で細胞培養物に加えることによって、脱メチル化活性を抑制する活性について薬剤をスクリーニングすることができる。観察されるメチル化の量、例えば、メチル化感受性遺伝子のプロモーターまたは外因的に供給された５−ｍｅＣｐＧリッチ核酸の５−メチルシトシンの数が、候補薬剤が存在しない培養物において観察されるものと比較して、全く減少しないこと、またはほんの少量しか減少しないことにより、候補薬剤が脱メチル化を抑制する薬剤であったことが示される。そのような実施形態では、培養細胞は、脱メチル化を許容する細胞である。
【０１２６】
スクリーニングの対象とされる候補薬剤としては、多数の化学的クラス、主として有機金属分子を含み得る有機分子、無機分子、遺伝子配列などを包含する既知化合物および未知化合物が挙げられる。本発明の重要な態様は、毒性試験などを含めた、候補薬物の評価である。
【０１２７】
候補薬剤は、構造的な相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含む有機分子を含み、一般には少なくともアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基を含み、しばしば、官能性化学基の少なくとも２つを含む。候補薬剤は、多くの場合、上記の官能基の１つまたは複数で置換された環式炭素または複素環式構造および／または芳香族または多芳香族の構造を含む。候補薬剤は、ペプチド、ポリヌクレオチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造的な類似体またはそれらの組み合わせを含めた生体分子の中にも見いだされる。薬理活性のある薬物、遺伝的活性のある分子などが包含される。対象とする化合物としては、化学療法剤、ホルモンまたはホルモンアンタゴニストなどが挙げられる。本発明に適した医薬品の例は、「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」Ｇｏｏｄｍａｎおよび  Ｇｉｌｍａｎ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、（１９９６）、第９版に記載されているものである。毒素、生物戦剤および化学戦剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｗａｒｆａｒｅ  ａｇｅｎｔ）も包含される。例えば、Ｓｏｍａｎｉ、Ｓ．Ｍ．（編）「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｗａｒｆａｒｅ  Ａｇｅｎｔｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２）を参照されたい。
【０１２８】
スクリーニングの対象とされる候補薬剤としては、核酸、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス分子、またはｍｉＲＮＡをコードする核酸、またはポリペプチドをコードする核酸も挙げられる。核酸を標的細胞に移入するために有用な多くのベクターが利用可能である。ベクターは、エピソームとして、例えば、プラスミド、ミニサークルＤＮＡ、サイトメガロウイルス、アデノウイルスなどのウイルス由来のベクターとして維持することができる、またはベクターは、相同組換えまたはランダムな組み込みによって標的細胞のゲノムに組み込むことができる。例えば、ＭＭＬＶ、ＨＩＶ−１、ＡＬＶなどのレトロウイルス由来のベクター。ベクターは、対象細胞に直接提供することができる。言い換えれば、多能性細胞を、対象とする核酸を含むベクターと、ベクターが細胞に取り込まれるように接触させる。
【０１２９】
電気穿孔、塩化カルシウムトランスフェクション、およびリポフェクションなどの、細胞を核酸ベクターと接触させるための方法は当技術分野で周知である。あるいは、対象とする核酸は、ウイルスによって対象細胞に提供することができる。言い換えれば、多能性細胞を、対象とする核酸を含むウイルス粒子と接触させる。本発明の方法には、レトロウイルス、例えば、レンチウイルスが特に適している。一般に使用されるレトロウイルスベクターは、「不完全である」、すなわち、増殖性感染のために必要なウイルスタンパク質を産生することができない。もっと正確に言えば、ベクターの複製には、パッケージング細胞系において成長させることが必要である。対象とする核酸を含むウイルス粒子を生成するために、核酸を含むレトロウイルスの核酸をパッケージング細胞系によってウイルスカプシド中にパッケージする。異なるパッケージング細胞系からは、カプシド中に組み入れられる異なる外被タンパク質がもたらされ、この外被タンパク質により、ウイルス粒子の細胞に対する特異性が決定される。外被タンパク質は、狭宿主性、広宿主性および異種栄養性の少なくとも３種類のものである。狭宿主性外被タンパク質、例えば、ＭＭＬＶを用いてパッケージしたレトロウイルスは、大部分のマウスおよびラット細胞型に感染することができ、これは、ＢＯＳＣ２３などの狭宿主性パッケージング細胞系を使用することによって生成される（Ｐｅａｒら（１９９３）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９０：８３９２〜８３９６）。広宿主性外被タンパク質、例えば、４０７０Ａ（Ｄａｎｏｓら、上記）を担持するレトロウイルスは、ヒト、イヌおよびマウスを含めた大部分の哺乳動物細胞型に感染することができ、これは、ＰＡ１２（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３１〜４３７）；ＰＡ３１７（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５〜２９０２）；ＧＲＩＰ（Ｄａｎｏｓら（１９８８）ＰＮＡＳ  ８５：６４６０〜６４６４）などの広宿主性パッケージング細胞系を使用することによって生成される。異種栄養性外被タンパク質、例えば、ＡＫＲ  ｅｎｖを用いてパッケージしたレトロウイルスは、マウスの細胞以外の大部分の哺乳動物細胞型に感染することができる。適切なパッケージング細胞系を使用して、対象ＣＤ３３＋分化体細胞がパッケージされたウイルス粒子の標的になることを確実にすることができる。再プログラミング因子をコードする核酸を含むレトロウイルスベクターをパッケージング細胞系に導入する方法、およびパッケージング系によって生成されるウイルス粒子を採取する方法は当技術分野で周知である。
【０１３０】
対象とする核酸を対象細胞に提供するために使用するベクターは、一般には、対象とする核酸の発現を駆動する、すなわち、転写を活性化するために適したプロモーターを含む。これは、遍在的に作用するプロモーター、例えば、ＣＭＶ−ｂ−アクチンプロモーター、または誘導性プロモーター、例えば特定の細胞集団において活性なプロモーターまたはテトラサイクリンなどの薬物が存在することに反応するプロモーターなどを含んでよい。転写活性化とは、標的細胞において転写が基礎レベルを少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、通常少なくとも約１０００倍超えて増加することを意味する。さらに、対象細胞に再プログラミング因子を提供するために使用するベクターは、後で除去しなければならない遺伝子を含んでよく、その際は、例えば、Ｃｒｅ／Ｌｏｘなどのリコンビナーゼ系、または、例えば、ＴＫ、ｂｃｌ−ｘｓなどのヘルペスウイルスなどの選択毒性を可能にする遺伝子を含めることによって該遺伝子が破壊されて発現される細胞を用いる。
【０１３１】
スクリーニングの対象とされる候補薬剤としては、ポリペプチドも挙げられる。そのようなポリペプチドは、場合によって、生成物の溶解性を増加させるポリペプチドドメインと融合することができる。ドメインは、定義済みのプロテアーゼ切断部位、例えば、ＴＥＶプロテアーゼによって切断されるＴＥＶ配列を通じてポリペプチドに連結することができる。リンカーは、１つまたは複数の可動性の配列、例えば、１個から１０個までのグリシン残基も含んでよい。一部の実施形態では、融合タンパク質の切断は、生成物の溶解性を維持する緩衝液中、例えば、０．５Ｍから２Ｍまでの尿素の存在下、溶解性を増加させるポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの存在下などで行う。対象とするドメインとしては、エンドソーム溶解性（ｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｔｉｃ）ドメイン、例えば、インフルエンザＨＡドメイン；および作製に役立つ他のポリペプチド、例えば、ＩＦ２ドメイン、ＧＳＴドメイン、ＧＲＰＥドメインなどが挙げられる。
【０１３２】
候補ポリペプチド薬剤を、凝集のシグナル伝達を細胞内で阻害するその能力についてアッセイする場合、ポリペプチドは、ポリペプチド浸透性ドメインと融合した対象とするポリペプチド配列を含んでよい。いくつもの浸透性ドメインが当技術分野で公知であり、ペプチド、ペプチド模倣薬、および非ペプチド担体を含めた本発明の非組み込み型のポリペプチドにおいて使用することができる。例えば、浸透性ペプチドは、ペネトラチンと称され、アミノ酸配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫを含む、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの転写因子であるＡｎｔｅｎｎａｐａｅｄｉａの第３のアルファヘリックス由来であってよい。別の例として、浸透性ペプチドは、例えば、天然に存在するｔａｔタンパク質のアミノ酸４９〜５７を含み得るＨＩＶ−１ｔａｔ基本領域アミノ酸配列を含む。他の浸透性ドメインとしては、ポリアルギニンモチーフ、例えば、ＨＩＶ−１ｒｅｖタンパク質のアミノ酸３４〜５６の領域、ノナアルギニン、オクタアルギニンなどが挙げられる。（例えば、移行ペプチドおよびペプトイドの教示に関して参照により本明細書に明確に組み込まれる、Ｆｕｔａｋｉら（２００３）Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ．２００３年４月；４（２）：８７〜９６；およびＷｅｎｄｅｒら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ２０００年１１月２１日；９７（２４）：１３００３〜８；米国特許出願公開第２００３０２２０３３４号；同第２００３００８３２５６号；同第２００３００３２５９３号；および同第２００３００２２８３１号を参照されたい）。ノナアルギニン（Ｒ９）配列は、特徴づけられているより効率的なＰＴＤの１つである（Ｗｅｎｄｅｒら２０００；Ｕｅｍｕｒａら２００２）。
【０１３３】
候補ポリペプチド薬剤を、凝集のシグナル伝達を細胞外で阻害するその能力についてアッセイする場合、ポリペプチドは、安定性が改善されるように処方することができる。例えば、ペプチドをペグ化することができ、ポリエチレンオキシ基により、血流中の寿命が増強される。追加的な機能性をもたらすため、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける安定性を増加させるために、ポリペプチドを別のポリペプチドと融合することができる。一般に、そのような融合パートナーは、安定な血漿タンパク質であり、それにより、例えば、融合物として存在するとポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ血漿内半減期が延長され、具体的には、そのような安定な血漿タンパク質は免疫グロブリン定常ドメインである。安定な血漿タンパク質が通常多量体の形態、例えば、免疫グロブリンまたはリポタンパク質で見いだされ、その中の同じポリペプチドまたは異なるポリペプチド鎖が、通常ジスルフィド結合および／または非共有結合して集合した多鎖ポリペプチドを形成しているほとんどの場合、ポリペプチドを含有する本明細書の融合物も、安定な血漿タンパク質前駆物質と実質的に同じ構造を有する多量体として作製し、使用する。これらの多量体が含むポリペプチド薬剤は同種のものである、または、これらの多量体は２種以上のポリペプチド薬剤を含有してよい。
【０１３４】
候補ポリペプチド薬剤は、原核細胞によって又は真核生物から産生することができ、ほどくこと、例えば、熱変性、ＤＴＴ低下などによってさらに加工し、当技術分野で公知の方法を使用してさらに再び折りたたむことができる。一次配列を変化させない対象とする修飾としては、ポリペプチドの化学的な誘導体化、例えば、アシル化、アセチル化、カルボキシル化、アミド化などが挙げられる。グリコシル化の修飾、例えば、ポリペプチドのグリコシル化パターンを、その合成およびプロセシングの間に、またはさらなるプロセシングステップにおいて修飾することによって；例えば、ポリペプチドを、哺乳動物のグリコシル化酵素または脱グリコシル酵素などのグリコシル化に影響を及ぼす酵素に曝露させることによって行われる修飾も包含される。リン酸化されたアミノ酸残基、例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホスレオニンを有する配列も包含される。ポリペプチドは、それらのタンパク質分解に対する耐性を改善するため、または溶解特性を最適化するため、またはそれらを治療剤としてより適切にするために、通常の分子生物学的技法および合成化学を使用して修飾することができる。そのようなポリペプチドの類似体としては、天然に存在するＬ−アミノ酸以外の残基、例えば、Ｄ−アミノ酸または天然に存在しない合成のアミノ酸を含有するものが挙げられる。アミノ酸残基の一部または全部をＤ−アミノ酸で置換することができる。
【０１３５】
候補ポリペプチド薬剤は、当技術分野で公知の従来の方法を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成によって調製することができる。種々の市販の合成装置、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｃｋｍａｎなどによる自動合成機が利用可能である。合成機を使用することによって、天然に存在するアミノ酸を非天然アミノ酸で置換することができる。特定の配列および調製様式は、利便性、経済的側面、必要な純度などによって決定される。あるいは、候補ポリペプチド薬剤は、組換え合成の従来の方法に従って単離し、精製することができる。発現宿主の溶解物を調製し、溶解物を、ＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、または他の精製技法を使用して精製することができる。ほとんどの場合、使用される組成物は、産物の調製およびその精製の方法に関連する汚染物質に関して、少なくとも２０重量％、通常、少なくとも約７５重量％、好ましくは少なくとも約９５重量％、および治療のためには、通常少なくとも約９９．５重量％の所望の産物を含む。通常、百分率は、総タンパク質量に基づく。
【０１３６】
ある場合では、スクリーニングされる候補ポリペプチド薬剤は抗体である。「抗体」または「抗体部分」という用語は、エピトープに適合し、それを認識する特定の形状を有する任意のポリペプチド鎖含有分子構造を含むものとし、ここで、１つまたは複数の非共有結合性の相互作用により、分子構造とエピトープとの間の複合体が安定化する。所与の構造の特異的または選択的な適合およびその特異的なエピトープは、時には、「鍵と鍵穴」適合と称される。典型的な抗体分子は、免疫グロブリンであり、全ての供給源、例えば、ヒト、げっ歯類、ウサギ、雌ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、他の哺乳動物、ニワトリ、他のトリなど由来の全種類の免疫グロブリン、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤなどが、「抗体」であるとみなされる。本発明において利用される抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかである。抗体は、一般には、細胞が培養されている培地中に提供される。
【０１３７】
候補薬剤を含めた化合物は、合成化合物または天然化合物のライブラリーを含めた多種多様な供給源から得られる。例えば、ランダム化されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含めた、生体分子を含めた多種多様な有機化合物のランダムな合成および指向性合成のための多数の手段が利用可能である。あるいは、細菌の抽出物、真菌の抽出物、植物の抽出物および動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが利用可能である、または容易に作製される。さらに、天然の、または合成的に作製したライブラリーおよび化合物は、従来の化学的手段、物理的手段および生化学的手段によって容易に修飾され、また、それを使用して、組み合わせのライブラリーを作製することができる。公知の薬理薬剤（ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｇｅｎｔ）を、例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化（ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などの直接的またはランダムな化学修飾に供して構造類似体を作製することができる。
【０１３８】
候補薬剤は、通常、薬剤を欠く細胞と併せて、少なくとも１つ、通常複数の細胞試料に加えることによって、その生物活性についてスクリーニングする。薬剤に反応したパラメータの変化を測定し、結果を、参照培養物と比較すること、例えば、薬剤の存在下と非存在下で比較すること、他の薬剤を用いて得られた参照培養物と比較することなどによって評価する。
【０１３９】
薬剤は、溶液に都合よく加えられる、または培養物中の細胞の培地に対して容易に可溶性の形態である。薬剤は、フロースルーシステムで、断続的または連続的な流れとして加えることができる、あるいは、化合物のボーラスを、単独でまたは増加的に、別の静的な溶液に加える。フロースルーシステムでは、２つの流体を使用し、一方は生理的に中性の溶液であり、他方は加えた試験化合物と同じ溶液である。第１の流体を、細胞を通過させ、その後、第２の流体を通過させる。単一溶液法では、試験化合物のボーラスを細胞の周囲の培地の体積に加える。培地の構成成分の全体的な濃度は、ボーラスを加えることによって、またはフロースルー法における２つの溶液間で有意に変化するべきではない。
【０１４０】
さまざまな濃度に対する示差的な反応を得るために、異なる薬剤の濃度を用いて複数のアッセイを平行して実行することができる。当技術分野で公知の通り、薬剤の有効濃度の決定には、一般には１：１０、または他のｌｏｇ尺度の、希釈によって生じるさまざまな濃度を用いる。必要であれば、第２の一連の希釈を用いて濃度をさらに細かく区分することができる。一般には、これらの濃度の１つは陰性対照としての機能を果たす、すなわち、ゼロ濃度または薬剤の検出レベルを下回る濃度、または表現型における検出可能な変化を生じさせない薬剤の濃度またはそれを下回る濃度である。
【０１４１】
選択マーカーの存在を数量化するために種々の方法を利用することができる。例えば、ＤＮＡメチル化の状態を、例えば、特定のＣｐＧ配列において測定するために、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を実施して内在性ＤＮＡを単離することができ、次いで、それを制限エンドヌクレアーゼＨｐａｌｌで消化して脱メチル化の程度を決定することができる、またはバイサルファイト配列決定を行うことができる。存在する分子の量を測定するために、例えば、メチル化感受性遺伝子の発現を測定する場合、都合のよい方法は、分子を、蛍光性、発光性、放射性、酵素的に活性などであり得る検出可能部分、特に、高い親和性を有するパラメータへの結合に特異的な分子で標識することである。蛍光部分は、実質的にあらゆる生体分子、構造、または細胞型を標識するために容易に利用可能である。免疫蛍光部分は、特定のタンパク質だけでなく、特異的なコンフォメーション、切断産物、またはリン酸化のような部位修飾にも結合するように誘導することができる。個々のペプチドおよびタンパク質は、自己蛍光するように、例えば、それらを細胞内で緑色蛍光タンパク質キメラとして発現させることによって遺伝子工学で操作することができる（概説について、Ｊｏｎｅｓら（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１２）：４７７〜８１を参照されたい）。
【０１４２】
例えば上記のものなどのスクリーニングは、特定の生物系における脱メチル化の調節における活性を有する薬剤を同定するために合わせてあつらえることができる。例えば、腫瘍細胞において、細胞周期、腫瘍−細胞浸潤、ＤＮＡ修復、クロマチンリモデリング、細胞シグナル伝達、転写およびアポトーシスを調節する遺伝子などのメチル化感受性遺伝子のプロモーターの脱メチル化を促進する薬剤は、これらの遺伝子の脱メチル化を促進すること、したがって、腫瘍においてこれらの遺伝子を発現させることに使用し、それによって、癌細胞の増殖および腫瘍成長を阻止することができる。別の例として、体細胞またはＥＳ細胞と体細胞の異核共存体における多能性遺伝子であるＯｃｔ４およびＮａｎｏｇなどのメチル化感受性遺伝子のプロモーターにおける脱メチル化を促進する薬剤は、ｉＰＳ細胞を作製するための公知の方法において多能性に関連する遺伝子の脱メチル化を促進することに使用することができる。いくつかのそのような場合、例えば、体細胞では、これらの方法は、スクリーニングする目的で、ｉＰＳ表現型をさらに促進するために、細胞に再プログラミング因子を提供するステップを含んでよい。
【０１４３】
キットを提供することができ、キットは、本明細書に記載のように、ＣＤ活性を促進する１種または複数種の薬剤および細胞を、脱メチル化を許容するように誘導するための試薬を含む。対象とする組み合わせは、１種または複数種のＡＩＤポリペプチドもしくはＡＰＯＢＥＣポリペプチド、またはそれらのペプチドをコードする核酸を含むベクターおよび再プログラミングを促進する１種または複数種の薬剤を含んでよい。キットは、対象の細胞におけるＤＮＡメチル化の状態を決定するために適した試薬をさらに含んでよい。キットは、チューブ、緩衝液など、および使用説明書も含んでよい。
【実施例】
【０１４４】
以下の実施例は、本発明をどのように行い、使用するかについての完全な開示および記載を当業者に提供するために提示され、出願人らが彼らの発明とみなすものの範囲を限定するものではなく、また、以下の実験が、実施した全ての実験または唯一の実験であることを示すものでもない。使用される数字（例えば、量、温度など）に関して正確さを確実にするための努力がなされているが、いくらかの実験的な誤差および偏差が考慮されるべきである。別段の指定のない限り、部分は重量による部分であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は、大気または大気付近の圧力である。
【実施例１】
【０１４５】
核の多能性への再プログラミングに必須である新規の初期制御因子を同定するために、我々は、体細胞の分化した状態を維持することに固有の原理の解明において有用であることが立証された異核共存体の我々の以前の経験を活用した。特に、これらの以前の我々の研究およびその他の研究により、ヒト細胞の「最終分化した」状態は固定されておらず、変化させることができ、他の分化した状態に典型的な以前はサイレントであった遺伝子の発現が誘導されることが示された（Ｂｌａｕ、Ｈ．Ｍ．ら（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３２、１１７１〜８０１；Ｂａｒｏｎ、Ｍ．Ｈ．＆Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．（１９８６）Ｃｅｌｌ  ４６、５９１〜６０２；Ｗｒｉｇｈｔ、Ｗ．Ｅ．（１９８４）Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １５１、５５〜６９；Ｓｐｅａｒ、Ｂ．Ｔ．＆Ｔｉｌｇｈｍａｎ、Ｓ．Ｍ．（１９９０）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０、５０４７〜５４；Ｃｈｉｕ、ＣＰ．＆Ｂｌａｕ、Ｈ．Ｍ．Ｒ（１９８４）Ｃｅｌｌ  ３７、８７９〜８７）。我々は、（１）再プログラミングは、全てのＥＳ細胞因子の存在下で起こり、（２）再プログラミングの開始は、融合と同時に開始され、（３）再プログラミングは、融合した非分裂細胞において評価され、かつ（４）種差により融合した細胞型の転写物が区別されるので、異核共存体を用いて、機構を解明し、多能性への再プログラミングの開始において役割を有する新規の遺伝子を同定することができると推論した。
【０１４６】
材料および方法
フローサイトメトリーによる異核共存体の生成および単離。ＧＦＰ＋マウスＥＳ細胞およびＤｓＲｅｄ＋ヒト胎児の肺の初代線維芽細胞を、以前に記載されている通りレトロウイルス構築物を用いた形質導入によって生成し（Ｐａｌｅｒｍｏ、Ａ．ら（２００９）Ｆａｓｅｂ  Ｊ）、融合して非分裂性の、多核異核共存体を形成した。細胞をまず、ＥＳ培地中で１２時間共培養し、次いで、ＰＥＧ１５００（Ｒｏｃｈｅ）を用いて３７℃で２分間処理し、その後ＤＭＥＭで４回連続的に洗浄した。ＥＳ培地を洗浄した後に交換し、その後１２時間ごとに交換した。ＧＦＰ＋／ＤｓＲｅｄ＋異核共存体をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ  ＳＥ、ＢＤ）によって２回選別し、遺伝子発現およびメチル化について解析した。
【０１４７】
免疫蛍光法。異核共存体を２．５％ｖ／ｖのヤギ血清および１ｍＭのＥＤＴＡを伴うＰＢＳ中で２回選別し、９００ｒｐｍで５分間サイトスピンした。サイトスピンしたＧＦＰ＋／ＤｓＲｅｄ＋異核共存体をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色し、画像化した。抗体染色のために、サイトスピンした細胞を固定し、透過処理し、ＰＢＳ中２０％のＦＢＳを使用してブロッキングした。細胞を、一次抗体マウス抗Ｋｉ−６７（Ｄａｋｏ  Ｄｅｎｍａｒｋ  Ａ／Ｓ）と一緒に、ブロッキング緩衝液中１：１００希釈で１時間インキュベートし、ＰＢＳ中で３回すすぎ、次いで、ヤギ抗マウスＣａｓｃａｄｅ  ｂｌｕｅ二次抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と一緒に１：５００希釈で３０分間インキュベートし、３回すすぎ、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇを用いて封入し、画像化した。画像を、落射蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｐｌａｎ２；Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ、Ｉｎｃ．）、Ｆｌｕａｒ２０×／０．７５対物レンズまたは４０×／０．９０対物レンズ、およびデジタルカメラ（ＯＲＣＡ−ＥＲ  Ｃ４７４２−９５；Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）を使用して取得した。取得するために使用したソフトウェアはＯｐｅｎＬａｂ４．０．２（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ）であった。
【０１４８】
ＰＥＧ誘導性融合の３時間後にＢｒｄＵをｍＥＳ共培養物およびｈＦｂ共培養物に加えた。標識化および抗体染色を、ＢｒｄＵ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｉ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して行った。
【０１４９】
遺伝子発現の解析。ＲＮＡを、ＥＳ細胞、線維芽細胞、および融合後またはＲＮｅａｓｙ  ｍｉｃｒｏキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してｓｉＲＮＡ処理した後、違う時間に２回選別した異核共存体から調製した。各試料について全ＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して逆転写した。逆転写された材料をＧｏ  ＧｒｅｅｎＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＰＣＲに供した。Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＧＡＰＤＨの発現を解析するためのヒト特異的なプライマーを設計した。ｓｉＲＮＡ処理実験においてＡＩＤおよびＧＡＰＤＨに対して使用したプライマーにより、ヒト転写物とマウス転写物の両方を増幅して異核共存体におけるＡＩＤおよびＧＡＰＤＨの総レベルを評価した。ＲＴ−ＰＣＲおよび定量的ＰＣＲのために使用するヒト特異的なプライマーは、：ｈＯｃｔ４  Ｆ  ５’−ＴＣＧＡＧＡＡＣＣＧＡＧＴＧＡＧＡＧＧＣ−３’（配列番号４５）、Ｒ−５’−ＣＡＣＡＣＴＣＧＧＡＣＣＡＣＡＴＣＣＴＴＣ−３’（配列番号４６）；ｈＮａｎｏｇ  Ｆ  ５’−ＣＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＡＡＣＣＴＣＡＧＣＴＡＣ−３’（配列番号４７）、Ｒ  ５’−ＧＣＣＴＴＣＴＧＣＧＴＣＡＣＡＣＣＡＴＴ−３’（配列番号４８）；ｈＧＡＰＤＨ  Ｆ  ５’−ＴＧＴＣＣＣＣＡＣＴＧＣＣＡＡＣＧＴＧＴＣＡ−３’（配列番号４９）、Ｒ  ５’−ＡＧＣＧＴＣＡＡＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＴＧＧＧＴ−３’（配列番号５０）である。ｓｉＲＮＡ処理後のノックダウンを評価するための非種特異的なプライマー配列は、以下の通りである：ＧＡＰＤＨ  Ｆ  ５’−ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ−３’（配列番号５１）、Ｒ  ５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’（配列番号５２）；ＡＩＤ  Ｆ  ５’−ＡＡＡＡＴＧＴＣＣＧＣＴＧＧＧＣＴＡＡＧ−３’（配列番号５３）、Ｒ  ５’−ＡＧＧＴＣＣＣＡＧＴＣＣＧＡＧＡＴＧＴＡＧ−３’（配列番号５４）。
【０１５０】
リアルタイムＰＣＲ。リアルタイムＰＣＲを、ＡＢＩ  ７９００ＨＴ  リアルタイムＰＣＲシステムを使用して、Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。試料を９４℃で２分間、４０×（９４℃で２０秒間、５８℃で４５秒間）でサイクルにかけた。
【０１５１】
【表１】
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【０１５２】
単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ。単一の異核共存体をＦＡＣＳ（ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ  ＳＥ、ＢＤ）によって直接選別して、９μｌ一定分量のＲＴ−ＰＣＲ溶解緩衝液を含有するＰＣＲチューブに入れた。緩衝液の構成成分は、市販のＲＴ−ＰＣＲ緩衝液（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＲＮアーゼ阻害剤（Ｐｒｏｔｅｃｔｏｒ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、Ｒｏｃｈｅ）および０．１５％のＩＧＥＰＡＬ界面活性剤（Ｓｉｇｍａ）を含んだ。短パルスで急速回転させた後、ＰＣＲ−チューブをすぐに衝撃凍結し、その後の分析のために−８０℃で貯蔵した。
【０１５３】
二段階マルチプレックスネステッド単一細胞ＲＴ−ＰＣＲのために、細胞溶解物を、まず、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＧＡＰＤＨに対するヒトおよび遺伝子に特異的なプライマー対を用いて逆転写した（表２、外部プライマー；図５ｂ）。簡単に述べると、同じＰＣＲ細胞−溶解チューブに、遺伝子特異的なプライマー対およびＲＮアーゼ阻害剤を含有するＲＴ−ＰＣＲ反応混合物を加えることによって、ＲＴ−ＰＣＲを行った。第１ラウンドＰＣＲおよび第２ラウンドＰＣＲならびにより大きな特異性を確実にするネステッドＲＴ−ＰＣＲ用のイントロンスパニングプライマーセットを設計し、使用することによって、ゲノム産物を排除した。第１のステップでは、５５℃で３０分間逆転写反応を行い、その後９４℃で２分間のステップを行った。その後に、以下の通りＰＣＲ増幅を３０サイクル行った：９４℃で３０秒間；５８℃で３０秒；６８℃で３０秒間。最終的なＰＣＲステップにおいて、反応産物を６８℃で３分間インキュベートした。完了した反応産物を４℃で貯蔵した。
【０１５４】
ＰＣＲプロトコールの第２のステップにおいて、第１のステップからの完了したＲＴ−ＰＣＲ反応産物を水で１：１希釈した。これらの反応産物の１パーセントを、ＰＣＲの第２ラウンドのために複製して新しい反応チューブに移し、ＰＣＲの第２ラウンドを遺伝子のそれぞれについて別々に、より大きな特異性のためにネステッド遺伝子特異的な内部プライマーを使用して、総反応容積２０μｌで行った（Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  Ｓｕｐｅｒ−Ｍｉｘ  ＨＦ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。以下の通りＰＣＲ増幅を３０サイクル行った：９４℃で３０秒間；５８℃で３０秒間；６８℃で３０秒間。最終的なＰＣＲステップにおいて、反応産物を６８℃で３分間インキュベートした。完了した反応産物を４℃で貯蔵した。次いで、第２ラウンドのＰＣＲ産物を反応容積の５分の１および１．４％アガロースゲルを用いてゲル電気泳動に供した。
【０１５５】
【表２】
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【０１５６】
ＤＮＡメチル化解析。ＦＡＣＳで選別した異核共存体（細胞２，０００〜１０，０００個）を２０μｌのＰＢＳ中に収集した。ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡを抽出した。Ｅｐｉｔｅｃｔ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してバイサルファイト処理を行った。ヒトおよびバイサルファイトに特異的なプライマーを使用して、ヒトＯｃｔ４プロモーターおよびヒトＮａｎｏｇプロモーターの領域についてのネステッドＰＣＲを行った（表３）。試料を、９４℃で２分間、３０×（９４℃で２０秒間、６１℃で３０秒間、６８℃で３０秒間）の第１の、ネステッドＰＣＲのサイクルにかけた。バイサルファイトに特異的なＰＣＲ増幅の第２ラウンドからのＰＣＲ産物を、以前に記載されている通りクローニングし、配列決定した（Ｚｈａｎｇ、Ｆ．ら（２００７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０４、４３９５〜４００）。
【０１５７】
【表３】
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【０１５８】
ｓｉＲＮＡトランスフェクション。ｓｉＲＮＡトランスフェクションのために、ＥＳ細胞および初代線維芽細胞を、トランスフェクトする前日に５０〜６０％集密に播いた。ｓｉｌｍｐｏｒｔｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）をトランスフェクトした。
【０１５９】
クロマチン免疫沈降。クロマチン免疫沈降を、表４で提供されるプライマーを使用して、Ｄａｈｌおよび  Ｃｏｌｌａｓ（（２００８）Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ３、１０３２〜４５）によって以前に記載されている通り行った。ＣｈＩＰデータは、入力ＤＮＡに対して正規化されたものとして提示され、エラーバーは標準誤差（ｓｅｍ）を示す。
【０１６０】
【表４】
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【０１６１】
統計分析。データは、平均±標準誤差として示されている。スチューデントのｔ検定を用いた群間の比較は両側分布を仮定している。
【０１６２】
異核共存体のＴｈｙ１．１（ＣＤ９０）濃縮。ＰＥＧで処理したＧＦＰ−（非ＧＦＰ）ｍＥＳとＤｓＲｅｄ＋ｈＦｂの共培養物をトリプシン処理し、ＦＡＣＳ緩衝液３ｍＬに再懸濁させた。細胞を、ビオチンマウス抗ヒトＣＤ９０（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と一緒に、１：５０００希釈で、室温で３０分間インキュベートした。細胞を１回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液３ｍＬに再懸濁させ、１０μｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｂｉｎｄｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と一緒に室温で３０分間インキュベートした。ビーズを磁気分離によって除去し、２回洗浄し、濃縮された異核共存体をサイトスピンした。
【０１６３】
免疫沈降およびウエスタンブロット。マウスＥＳ細胞を、ＩＰ緩衝液（２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、１ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、３５０ｍＭのＮａＣＩ、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のグリセロール、１０μＭのＺｎＣＩに溶解させた。細胞全体の溶解物を室温で３０分間予め清澄化（ｐｒｅ−ｃｌｅａｒ）し、その後、ＡＩＤをプルダウンした。簡単に述べると、細胞溶解物、次いでＡＩＤを、ウサギポリクローナルＡＩＤ抗体と架橋結合したＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｐｌｕｓ  Ａｇａｒｏｓｅ  ｂｅａｄｓ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してプルダウンした。細胞溶解物２ｍｇから免疫沈降を行った。
【０１６４】
ｍＥＳにおけるＡＩＤタンパク質ノックダウンを可視化するために、ｓｉ対照  またはｓｉ−１でトランスフェクトした３日後に細胞溶解物を回収した。これらの試料中のＡＩＤの検出を、細胞全体の溶解物１７０μｇから、抗マウス−ＡＩＤ（Ｌ７Ｅ７、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：５００希釈）を用いて行った。膜を取り除き、抗マウスα−チューブリン（Ｓｉｇｍａ、１：２０，０００希釈）を用いてローディング対照を探索した。ＡＩＤの免疫沈降を同じＬ７Ｅ７抗体を用いて検出した。
【０１６５】
結果
種間の異核共存体を作製するために、ＧＦＰレポーター遺伝子を形質導入したマウス胚性幹細胞（ｍＥＳ）を、ＤｓＲｅｄレポーター遺伝子を形質導入した初代ヒト線維芽細胞（ｈＦｂ）と共培養し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用して融合した（図１ａ；図５のスキーム）。融合ＧＦＰ＋ＤｓＲｅｄ＋異核共存体は、ＦＡＣＳによって容易に選別され（図１ｂ）、蛍光顕微鏡を用いて同定され、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２またはＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８を用いて可視化すると明瞭に染色されたヒトおよびマウスの核を含有した（それぞれ図１ｃおよび図１ｆ）。ＰＥＧ融合の効率は低いので（０．６〜１．０％）、ＧＦＰ＋ＤｓＲｅｄ＋異核共存体を２回選別し、８０％の純度まで濃縮した（図１ｂ）。増殖している細胞にのみ存在する核タンパク質であるＫｉ−６７に対する抗体を使用して、融合後にアッセイした３日間にわたって、異核共存体の９８（±２）％において細胞分裂が起こらなかったことを決定した（図１ｄ、ｅ）。さらに、同じ期間にわたって、異核共存体の９４（±４）％においてＢｒｄＵ標識は検出されず、これは、ＤＮＡ複製が起こらなかったことを示している（図１ｆ、ｇ；図６；図７）。遺伝子の投与量および各細胞型が寄与するタンパク質の割合により、体細胞における核の再プログラミングの方向が決定されるので、多能性の状態への再プログラミングを支持するために、ＥＳ細胞が線維芽細胞に数でまさる（２：１）ようにインプット細胞の比率を歪めた。
【０１６６】
ヒト線維芽細胞においてＥＳ細胞特異的な遺伝子が誘導されたかどうかを決定するために、ヒトＯｃｔ４およびヒトＮａｎｏｇの誘導を、種特異的プライマーを使用して、遍在するＧＡＰＤＨと比較してアッセイした（図８）。融合の１日後、２日後および３日後に選別した異核共存体から単離したｍＲＮＡを半定量ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲによって評価した（図２ａ、ｂ）。使用した０日目の対照は、（ａ）単独のヒト線維芽細胞；（ｂ）ｍＥＳとｈＦｂのＰＥＧ前、融合していない共培養物；または（ｃ）ＰＥＧおよび融合の効果に対する対照としてＰＥＧで処理したヒト線維芽細胞のいずれかであった。上記の０日目の対照は全て同様の結果を生じた。異核共存体におけるヒトＯｃｔ４転写物およびヒトＮａｎｏｇ転写物の両方の誘導は、早ければ融合の１日後にはっきり見えたが（図２ａ、ｂ）、対照でははっきり見えず（図９）、これは、２つの重要なヒト多能性遺伝子の発現の開始は、異核共存体において急速であることを示している。１日目までに、同じ試料におけるヒトＯｃｔ４およびヒトＮａｎｏｇの発現（ＧＡＰＤＨに対して正規化された）は、融合していない共培養した対照（０日目）に対して５倍に増加し、２日目および３日目に１０倍で持続された（図２ｂ）。ヒト特異的プライマーを用いて、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇに加えて、他の重要な多能性遺伝子が誘導されたかどうかを、リアルタイムＰＣＲを使用して決定した。ＥＳ細胞の自己再生を維持するために不可欠であり、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇの標的になることが示されているＥｓｓｒｂ（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ、Ｂ．ら（２００４）Ｂｌｏｏｄ  １０３、２９５６〜６４）およびＴＤＧＦ１（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ、Ｂ．ら（２００４）Ｂｌｏｏｄ  １０３、２９５６〜６４）（クリプト（ｃｒｉｐｔｏ））は、融合の２日後の異核共存体において、それぞれ３倍および２．５倍に上方制御されることが見いだされた（図１０）。ヒト線維芽細胞においてすでに発現されているＳｏｘ２およびそのプロモーターは、マウス線維芽細胞における所見と一致して、融合前に広範囲にわたって脱メチル化されており；その発現は、融合後に増加しなかった。機能的に、Ｅｓｓｒｂと相互に交換することができるＫｌｆ４（Ｆｅｎｇ、Ｂ．ら（２００９）Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１、１９７〜２０３）の発現は、融合の２日後の異核共存体において変化しなかった（図１０）。
【０１６７】
融合後のヒト線維芽細胞における核の再プログラミングの効率を評価するために、単一のＦＡＣＳで選別した異核共存体を３種のヒト転写物、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、およびＧＡＰＤＨ（対照）について、いずれの場合にも２セットのヒト特異的なプライマーを用いて、ネステッドＲＴ−ＰＣＲによって解析した（図２ｃ）。マウスＥＳ細胞（対照）ではヒト遺伝子産物は全く検出されず、ヒト線維芽細胞（対照）ではヒトＧＡＰＤＨのみが検出された（図８）。対照的に、３つの独立した融合実験から融合の３日後に単回のＦＡＣＳで選別した異核共存体の７０％でヒトＯｃｔ４とヒトＮａｎｏｇの両方が発現され（図２ｃ、ｄ；図１１）、これは、高い割合の異核共存体で多能性への再プログラミングが開始されたことを示している。このことは、例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｋ．ら（２００７）Ｃｅｌｌ  １３１、８６１〜７２；Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｋ．＆Ｙａｍａｎａｋａ、Ｓ．（２００６）Ｃｅｌｌ  １２６、６６３〜７６；Ｗｅｒｎｉｇ、Ｍ．ら（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  ４４８、３１８〜２４；ａｎｄ  Ｗｅｒｎｉｇ、Ｍ．ら（２００８）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌにおいて観察された、２〜３週間の集団全体のｉＰＳ細胞（＜０．１％）における、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇの発現の遅く非能率的な誘導と著しい対照をなす。
【０１６８】
ＤＮＡ脱メチル化は、線維芽細胞のｉＰＳ細胞への再プログラミングの主要な限定ステップであることが示されているので、異核共存体におけるヒトＯｃｔ４プロモーターおよびヒトＮａｎｏｇプロモーターの脱メチル化の時間経過および程度を対照と比較して解析した。融合の１日後、２日後および３日後に異核共存体からＤＮＡを単離し、バイサルファイト変換に供した。ヒトＯｃｔ４プロモーターおよびヒトＮａｎｏｇプロモーターを、ヒトおよびバイサルファイトに特異的なプライマーを用いてＰＣＲによって増幅し（表３、図８）、産物をクローニングし、配列決定した。ヒトＯｃｔ４プロモーターおよびヒトＮａｎｏｇプロモーターにおけるＤＮＡ脱メチル化が明白であり、３日を通して増加した（図３ａ）。対照的に、βグロビンＨＳ２遺伝子座は、全体を通してメチル化されたままであり、これは、ＤＮＡ脱メチル化が特異的であったことを示している。ヒトＯｃｔ４プロモーターおよびヒトＮａｎｏｇプロモーターにおける脱メチル化ＣｐＧ部位の時間経過および進行性の蓄積（図３ｂ、ｃ）は、リアルタイムＰＣＲを用いて同じ３日間にわたって観察された転写物の蓄積の進行性の増加（図２ｂ）に匹敵した。特に、ヒト体細胞における多能性遺伝子のプロモーターの脱メチル化および活性化は、Ｋｉ−６７またはＢｒｄＵによって標識されていない場合に起こる（図１ｅ、ｇ）；したがって、脱メチル化は活性であり、細胞分裂およびＤＮＡ複製と無関係である。
【０１６９】
哺乳動物の多能性の生殖細胞において検出され（Ｍｏｒｇａｎ、Ｈ．Ｄ．ら（２００４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９、５２３５３〜６０）、ゼブラフィッシュにおける受精後の活性なＤＮＡ脱メチル化に関係づけられる（Ｒａｉ、Ｋ．ら（２００８）Ｃｅｌｌ  １３５、１２０１〜１２）ので、ＡＩＤの発現について、リアルタイムＰＣＲを用いてマウスＥＳ細胞およびヒト線維芽細胞をアッセイした。体細胞におけるＡＩＤの発現は、一般にＢリンパ球に限られると考えられているが、ヒト線維芽細胞ならびにマウスＥＳ細胞において、Ｂ−リンパ球細胞系であるＲａｍｏｓと比較して非常にレベルが低下してはいるが（それぞれ５％および１５％）、ＡＩＤ  ｍＲＮＡが検出された（図１２）。これらの細胞におけるＡＩＤの役割を調査するために、マウスおよびヒトＡＩＤ  ｍＲＮＡのレベルを、ＡＩＤコード領域内の異なる配列に対する３種の別個の非オーバーラップｓｉＲＮＡ、および、オフターゲットの効果を除外し、結果がＡＩＤに特異的であることを確実にするために、ＡＩＤの非コード３’ＵＴＲに特異的な第４のｓｉＲＮＡをトランスフェクトすることによって一過性にノックダウンした（図１３）。ＡＩＤコード領域と５０％同一である第５のｓｉＲＮＡを対照（ｓｉ対照）として使用した。ノックダウンの程度およびタイミングを、ｓｉＲＮＡ−１、ｓｉＲＮＡ−２、ｓｉＲＮＡ−３およびｓｉＲＮＡ−４により、ＡＩＤの転写が、トランスフェクションの３日後に対照ｓｉＲＮＡと比較してそれぞれ８１（±１３）％、７９（±１２）％、７０（±８）％、および９９（±０．１）％低下した対照マウスＥＳ細胞においてまず確認した（図１４、上部）。免疫沈降、その後にウエスタンブロットを使用するとマウスＥＳ細胞においてＡＩＤタンパク質が検出され、同様に濃縮されたＥＳ細胞溶解物全体においてもＡＩＤタンパク質が検出された（図１５）。ＥＳ細胞溶解物におけるｓｉＲＮＡ１によるＡＩＤノックダウンを検証し、対照タンパク質レベルが８８％低下したことはｍＲＮＡが８１％低下したこととよく相関した（図１５）。ヒト線維芽細胞では、ＡＩＤの転写は、ｓｉＲＮＡ１、ｓｉＲＮＡ２、ｓｉＲＮＡ３およびｓｉＲＮＡ４により、それぞれ４６（±１１）％、７２（±２３）％、９９（±０．１）％および９９（±０．１）％低下した（図１４、下部）。これらのデータは、ＥＳ細胞および線維芽細胞の両方において、ＡＩＤが存在し、４つの別個のｓｉＲＮＡによって効率的に低下させることができることを示している。
【０１７０】
ＡＩＤノックダウンに供した異核共存体における再プログラミングの開始を評価するために、ＧＡＰＤＨと比較したＯｃｔ４およびＮａｎｏｇの発現をリアルタイムＰＣＲによって評価した。異核共存体実験のために、融合の２４時間前にマウスＥＳ細胞とヒト線維芽細胞の両方にｓｉＲＮＡをトランスフェクトした（スキームについては図５を参照されたい）。異核共存体において、リアルタイムＰＣＲによって持続性のＡＩＤのノックダウンが検出された。ｓｉＲＮＡ１およびｓｉＲＮＡ２を使用すると、ＡＩＤは、融合の３日後に、対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした異核共存体と比較して７７（±６）％および３５（±２）％低下した（図４ａ）。ｓｉＲＮＡ３および４ｓｉＲＮＡにより、異核共存体においてより強力なノックダウンが引き起こされ、ＡＩＤは、融合の２日後に、ｓｉＲＮＡ対照と比較して９６（±１）％、および８９（±３）％低下した（図４ａ）。著しく、Ｏｃｔ４の発現は、ｓｉＲＮＡ１およびｓｉＲＮＡ２を使用すると、融合の３日後に、対照ｓｉＲＮＡと比較して０．９（±０．６）％および９（±２）％まで低下した（図４ａ）。同様に、ｓｉＲＮＡ１およびｓｉＲＮＡ２を使用すると、Ｎａｎｏｇの発現は、融合の３日後に、ｓｉＲＮＡ対照と比較して１．５（±０．４）％および１．５（±０．１）％まで著しく低下した（図４ａ）。ｓｉＲＮＡ３およびｓｉＲＮＡ４の存在下で、Ｏｃｔ４の発現は、融合の２日後に、ｓｉＲＮＡ対照と比較して８（±２）％および４（±３）％まで低下し、一方、Ｎａｎｏｇの発現は１９（±１２）％および７（±４）％まで低下した。ここで使用した４種のｓｉＲＮＡ全ては、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇの発現を少なくとも８０％遮断することにおいて同様の効果を有した。これらの知見は、３５％ノックダウンにより、９６％ノックダウンに匹敵する多能性遺伝子の誘導の阻害が導かれたので、ＡＩＤの効果は非常に投与量感受性であることを示している。まとめると、これらのデータは、ここで使用したＡＩＤに対する４種のｓｉＲＮＡ全てが、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇの活性化を少なくとも８０％遮断することにおいて同様に強力な効果を有したことを示している。
【０１７１】
プロモーターの脱メチル化に対するＡＩＤの効果を評価するために、異核共存体におけるヒトＯｃｔ４プロモーターおよびヒトＮａｎｏｇプロモーターのＣｐＧのメチル化状態をアッセイした。ｓｉＲＮＡ１およびｓｉＲＮＡ２を使用してＡＩＤノックダウンに供した３日目の異核共存体では、ヒトＯｃｔ４プロモーターにおけるＣｐＧ脱メチル化の程度は、対照の８２％と比較してそれぞれ２６％および６％まで低下した（図４ｂ、ｃ）。Ｎａｎｏｇプロモーターについて、ＣｐＧの脱メチル化は、対照の５３％脱メチル化と比較して、それぞれ２４％および２５％まで低下した（図４ｂ、ｃ）。ｓｉＲＮＡ３およびｓｉＲＮＡ４を使用すると、Ｏｃｔ４プロモーターにおけるＣｐＧの脱メチル化の程度は、２日目の対照試料における７２％と比較してそれぞれ１８％および８％まで低下し、一方、Ｎａｎｏｇプロモーターについては、ＣｐＧの脱メチル化の程度は、対照における４８％と比較してそれぞれ３％および＜１％まで低下した（図４ｂ、ｃ）。ｓｉＲＮＡノックダウン実験の全てについてのバイサルファイト配列決定データの概要が図１６に示されている。ＡＩＤがノックダウンされるとＯｃｔ４プロモーターおよびＮａｎｏｇプロモーターの脱メチル化が低下することに対応して、Ｏｃｔ４転写物およびＮａｎｏｇ転写物の誘導が、２日目および３日目に、対照と比較して少なくとも８０％低下した（図４ａ）。これらのデータは、プロモーターの脱メチル化が、これらの２つの多能性遺伝子の発現に欠かせないこと、およびＡＩＤが、体細胞の再プログラミングにおいて、哺乳動物のＤＮＡが脱メチル化されるために必要であることを示している。
【０１７２】
再プログラミングを開始するためのＡＩＤの必要性をさらに調査するために、異核共存体において、ｓｉＲＮＡノックダウンによって引き起こされるＤＮＡ脱メチル化の遮断をレスキューするその能力を試験した。ＡＩＤレベルを増加させることによってｓｉＲＮＡノックダウンが克服されるかどうかを試験するために、マウスＥＳ細胞において、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトする前にｈＡＩＤを一過性に過剰発現させた（図５のスキームを参照されたい）。２つの別々の実験において、ｈＡＩＤを、ＡＩＤ  ｓｉＲＮＡが存在しない異核共存体における対照と比較して２倍または４倍過剰発現させた場合、融合の１日後にプロモーターの脱メチル化または再プログラミングは加速されなかった（図１７）。これは、おそらく、異核共存体では起こるまでに少なくとも１日が必要になり得る、ヒトＯｃｔ４プロモーターの脱メチル化のカイネティクス、または再プログラミングを加速するためにｈＡＩＤと協調して働く追加的な因子がないことに起因し得る。しかし、ｓｉＲＮＡ−１による一過性のノックダウンを受けている異核共存体において、すなわち、ｓｉＲＮＡの存在下でｈＡＩＤを過剰発現させると、Ｎａｎｏｇプロモーターの脱メチル化が完全にレスキューされ、遺伝子が発現され、また、Ｏｃｔ４プロモーターの脱メチル化が部分的にレスキューされ、遺伝子が発現された（図１８）。これらのデータは、追加されたｈＡＩＤは機能性であり、ｓｉＲＮＡのどんな非特異的な効果も除外することを示しており、さらに、多能性への再プログラミングの開始時のＤＮＡ脱メチル化におけるＡＩＤの特異的かつ不可欠な役割を確認している。
【０１７３】
ヒトＯｃｔ４プロモーターおよびヒトＮａｎｏｇプロモーターのＤＮＡ脱メチル化におけるＡＩＤの役割をさらに検証するために、抗ＡＩＤ抗体を用いてクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）実験を行うことにより、ＡＩＤがそれらのプロモーター領域に特異的に結合するかどうかを試験した。ＣｈＩＰ実験において評価したプロモーター領域は、バイサルファイト配列決定によってＣｐＧの脱メチル化について分析された（図４ｄ；図１９）Ｏｃｔ４プロモーター領域およびＮａｎｏｇプロモーター領域の範囲内になるように設計した。ヒト線維芽細胞では、ＣｈＩＰ解析により、ヒトＯｃｔ４プロモーター（６倍）およびヒトＮａｎｏｇ（８倍）プロモーターの両方に対するＡＩＤの有意な結合が示された（図４ｄ）。したがって、ＡＩＤは、線維芽細胞において、再プログラミングの間に脱メチル化を受けるヒトＯｃｔ４およびヒトＮａｎｏｇの重度にメチル化されたプロモーター領域に結合する。対照として、ＩｇＭ定常領域（Ｃμ）のプロモーターへのＡＩＤの結合は、予測通り有意であったが（Ｏｋａｚａｋｉ、Ｉ．Ｍ．ら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１６、３４０〜５）、線維芽細胞において発現されるＴｈｙ１．１への結合は観察されなかった。
【０１７４】
線維芽細胞と対照的に、マウスのＯｃｔ４およびＮａｎｏｇのプロモーター領域では、おそらく、これらのプロモーターが発現され、脱メチル化されているので、ＥＳ細胞におけるＡＩＤタンパク質は高レベルであるにもかかわらず、ＡＩＤの結合は観察されなかった（図４ｄ）。対照として、未分化のＥＳ細胞では発現されていない遺伝子であるＣｄｘ２のプロモーターにおいてＡＩＤの結合が検出されたが、以前報告された通り、ｐ５３プロモーターでは検出されなかった。まとめると、これらの所見により、ＤＮＡ脱メチル化におけるＡＩＤの直接関与、なならびに多能性への再プログラミングの開始を導くヒトのＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４の持続的発現についての強力な裏付けがもたらされる。
【０１７５】
考察
ＤＮＡ脱メチル化は、遺伝子サイレンシングを克服し、時間的にかつ空間的に制御された哺乳動物の遺伝子の発現を誘導するために不可欠であるが、何年も取り組まれているにもかかわらず、コンセンサスな哺乳動物のＤＮＡデメチラーゼは未だ同定されていない。５メチル−シトシンＤＮＡグリコシラーゼによるＤＮＡ脱メチル化の証拠が、植物体において示されているが（Ｇｏｎｇ、Ｚ．ら（２００２）Ｃｅｌｌ  １１１、８０３〜１４；Ｃｈｏｉ、Ｙ．ら（２００２）Ｃｅｌｌ  １１０、３３〜４２）、チミンＤＮＡグリコシラーゼ（ＴＤＧ）またはメチル−ＣｐＧ−結合性ドメインタンパク質４（Ｍｂｄ４）などの哺乳動物の相同体では比較に適した機能が示されていない（Ｃｏｒｔａｚａｒ、Ｄ．ら（２００７）ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ（Ａｍｓｔ）６、４８９〜５０４；Ｍｉｌｌａｒ、Ｃ．Ｂ．ら（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７、４０３〜５）。
【０１７６】
ＡＩＤは、Ｂ細胞における抗体多様性の生成、ＲＮＡの編集および抗ウイルス（性）の反応における役割が確立されているシトシンデアミナーゼのファミリーに属する（ＡＩＤ、サブグループＡｐｏｂｅｃ１、Ａｐｏｂｅｃ２およびＡｐｏｂｅｃ３）（Ｃｏｎｔｉｃｅｌｌｏ、Ｓ．Ｇ．ら（２００７）Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９４、３７〜７３）。ＡＩＤおよびＡｐｏｂｅｃ１はどちらも前駆体生殖細胞、卵母細胞および初期胚において発現され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで頑強な５−メチルシトシンデアミナーゼ活性を有し（Ｍｏｒｇａｎ、Ｈ．Ｄ．ら（２００４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９、５２３５３〜６０）、塩基除去ＤＮＡ修復（ＢＥＲ）経路によって修復されるＴ−Ｇミスマッチをもたらし、理論的に複製を伴わないＤＮＡ脱メチル化を導き得る。最近、ゼブラフィッシュの胚において、ＡＩＤは、シトシンの脱アミノ化に影響を及ぼし、Ｍｂｄ４による塩基除去を導く、Ｍｂｄ４およびＧａｄｄ４５ａとの三者間タンパク質複合体のメンバーであると意味づけられた（Ｒａｉ、Ｋ．ら（２００８）Ｃｅｌｌ  １３５、１２０１〜１２）。第３の構成成分であるＧａｄｄ４５ａは酵素活性を欠き、アフリカツメガエルの卵母細胞における修復に媒介されるＤＮＡ脱メチル化および遺伝子活性化におけるその役割については、まだ議論が続いている（Ｂａｒｒｅｔｏ、Ｇ．ら（２００７０  Ｎａｔｕｒｅ  ４４５、６７１〜５；Ｊｉｎ、Ｓ．Ｇ．ら（２００８）ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ  ４、ｅ１００００１３）。
【０１７７】
本明細書において提供されるデータにより、ＡＩＤを活性な哺乳動物細胞におけるＤＮＡ脱メチル化に関連づける証拠がもたらされ、ＡＩＤ依存性のＤＮＡ脱メチル化が、ヒト線維芽細胞における多能性の誘導に必要な早期の後成的な変化であることが実証されている。異核共存体においてＡＩＤをノックダウンすることにより、線維芽細胞核におけるヒトＯｃｔ４プロモーターおよびヒトＮａｎｏｇプロモーターのＤＮＡ脱メチル化が妨げられた。これと一貫して、ヒト体性線維芽細胞において、ＡＩＤ依存性のＤＮＡ脱メチル化が低下すると、これらの多能性因子の発現および核の多能性への再プログラミングの開始が阻害され、これにより、ＡＩＤが、再プログラミングの開始に決定的な調節因子であることの強力な証拠がもたらされる。ＡＩＤの低下の阻害性の効果は、ｈＡＩＤの過剰発現によりレスキューされ、Ｎａｎｏｇに対しては完全なレスキューが観察され、Ｏｃｔ４に対しては部分的なレスキューが観察された。さらに、ヒト線維芽細胞において、サイレントなメチル化されたＯｃｔ４プロモーターおよびＮａｎｏｇプロモーターにおいてＡＩＤの結合が観察されたが、マウスＥＳ細胞における活性な、非メチル化Ｏｃｔ４プロモーターおよび非メチル化Ｎａｎｏｇプロモーターでは観察されず、これは、ＤＮＡ脱メチル化におけるＡＩＤの特異的な役割を実証している。
【０１７８】
本発明で実現された高効率の異核共存体における再プログラミングにより、ｉＰＳ細胞の生成を導く安定な再プログラミングの第１の公知のマーカーであるＯｃｔ４およびＮａｎｏｇを含めた５つの多能性遺伝子の誘導に欠かせない調節因子を発見することが可能になった。ここで、異核共存体プラットフォームを、（ａ）ＡＩＤと一緒に働いて活性なＤＮＡ脱メチル化を媒介する可能性がある哺乳動物のＤＮＡ脱メチル化複合体（グリコシラーゼおよび他のＤＮＡ修復酵素）の他の構成成分を解明するため（図４ｅ）、（ｂ）細胞融合後にすぐに発現されるヒト遺伝子についてスクリーニングすることによって核の再プログラミングの追加的な調節因子についての不偏の検索を行うために活用することができる。今後の研究により、ＡＩＤの単独での、またはこれらの他の分子と併せての発現によりｉＰＳ細胞の生成が加速されるかどうかが示されるであろう。
【実施例２】
【０１７９】
ＡＩＤの潜在性相互作用物質を同定し、哺乳動物のＤＮＡ脱メチル化を調整する機能性分子プレーヤーについて理解するために、質量分析を使用した。以下のＡＩＤ構築物を使用した：１）ｐＨＡＧＥ−ＳＴＥＭＣＣＡレンチウイルスベクターにクローニングした、タンパク質のＮ末端に２つのタンデムなＦＬＡＧタグを含有するヒトＡＩＤ、および２）ｐＨＡＧＥ−ＳＴＥＭＣＣＡレンチウイルスベクターにクローニングした、タンパク質のＣ末端も２つのタンデムなＦＬＡＧタグを含有するヒトＡＩＤ。その後、これらの構築物を含有するウイルスを使用してマウス胚性幹細胞（ＣＧＲ８）に感染させ、Ｆｌａｇ−ヒトＡＩＤを過剰発現している安定な細胞系を選択した。対照として、２×ＦＬＡＧタグのみを含有するレンチウイルスベクターを使用した。
【０１８０】
ＡＩＤを発現している安定なＥＳ細胞系、および対照の２×Ｆｌａｇを、ＦＬＡＧタグに対する抗体を使用してＡＩＤタンパク質を免疫沈降させるために、細胞質抽出物および核抽出物に分画した。生じた複合体を質量分析に供した。分析において、ＡＩＤは最も豊富なタンパク質であることが見いだされ、ＡＩＤに随伴するいくつもの独特のタンパク質が同定された（表５）。
【０１８１】
【表５−１】
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【０１８２】
【表５−２】
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【０１８３】
【表５−３】
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【０１８４】
【表５−４】
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【０１８５】
【表５−５】
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【０１８６】
上記では、ただ単に本発明の原理が例示されている。当業者は本明細書においてはっきりとは記載されていない、または示されていないが、本発明の原理を具体化し、その主旨および範囲内に含まれる種々の取り合わせを考案することができることが理解されよう。さらに、本明細書において列挙されている全ての例および条件付きの言葉は、主に、読者が本発明の原理および当技術分野を推進するために出願人らが提供する概念を理解するために役立つことが意図され、そのような具体的に列挙された実施例および条件に限定されないと解釈されるべきである。さらに、本明細書において、本発明の原理、態様および実施形態ならびにその特定の実施例が列挙されている全ての記載は、それらの構造的等価物と機能的等価物の両方を包含するものとする。さらに、そのような等価物は、現在公知の等価物と今後開発される等価物、すなわち、構造にかかわらず、同じ機能を実施する、開発される任意の要素の両方を包含するものとする。本発明の範囲は、したがって、本明細書に示され、記載されている例示的な実施形態に限定されるものではない。もっと正確に言うと、本発明の範囲および主旨は、添付の特許請求の範囲によって具体化される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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