(57)【要約】  動物においてＣＥＴＰのｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を低下させる方法、化合物、及び組成物を提供する。更に、動物においてＨＤＬ濃度及び／又はＨＤＬ活性を上昇させるため並びに血漿脂質、血漿グルコース、及びアテローム性プラークを低減するための、方法、化合物、及び組成物を提供する。そのような方法、化合物、及び組成物は、心血管系疾患、代謝性疾患、又はその症状の任意の１又は複数の処置、防止、遅延、又は改善に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＥＴＰを標的とする１０〜３０個のヌクレオシドが連結された長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物に投与することを含み、前記動物においてＣＥＴＰの発現が低下する、動物においてＣＥＴＰの発現を低下させる方法。
【請求項２】
ＣＥＴＰを標的とする１０〜３０個のヌクレオシドが連結された長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物に投与することを含み、前記動物においてＣＥＴＰ活性が低下する、動物においてＣＥＴＰ活性を低下させる方法。
【請求項３】
ＣＥＴＰを標的とする１０〜３０個のヌクレオシドが連結された長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物に投与することを含み、前記動物においてＨＤＬ濃度又はＨＤＬ活性が上昇する、動物においてＨＤＬ濃度又はＨＤＬ活性を上昇させる方法。
【請求項４】
ＣＥＴＰを標的とする１０〜３０個のヌクレオシドが連結された長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物に投与することを含み、前記動物においてＬＤＬ、ＴＧ、又はグルコースの濃度が低下する、動物においてＬＤＬ、ＴＧ、又はグルコースの濃度を低下させる方法。
【請求項５】
ＣＥＴＰを標的とする１０〜３０個のヌクレオシドが連結された長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物に投与することを含み、前記動物においてＬＤＬ／ＨＤＬ比が低下する、動物においてＬＤＬ／ＨＤＬ比を低下させる方法。
【請求項６】
ＣＥＴＰを標的とする１０〜３０個のヌクレオシドが連結された長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物に投与することを含み、前記動物において代謝性又は心血管系の疾患が改善される、動物において代謝性又は心血管系の疾患を改善する方法。
【請求項７】
前記心血管系疾患が、動脈瘤、アンギナ、不整脈、アテローム性動脈硬化症、脳血管疾患、冠動脈心疾患、高血圧、脂質異常症、高脂血症、又は高コレステロール血症である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物が、一本鎖修飾オリゴヌクレオチドからなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記動物がヒトである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物が第１の薬剤であり、第２の薬剤を投与することを更に含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の薬剤及び前記第２の薬剤が共投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２の薬剤がグルコース低下剤である、請求項１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２の薬剤が、ＬＤＬ、ＴＧ、又はコレステロールを低下させる療法である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記投与が、非経口投与を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、前記修飾オリゴヌクレオチドの全体に対する測定で配列番号１〜４のいずれかに少なくとも９０％相補的な核酸塩基配列を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、前記修飾オリゴヌクレオチドの全体に対する測定で配列番号１〜４のいずれかに少なくとも９５％相補的な核酸塩基配列を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、前記修飾オリゴヌクレオチドの全体に対する測定で配列番号１〜４のいずれかに少なくとも１００％相補的な核酸塩基配列を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシド間結合が修飾ヌクレオシド間結合である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ヌクレオシド間結合のそれぞれがホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシドが修飾糖を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
テトラヒドロピラン環でフラノース環が置換された少なくとも１つのテトラヒドロピラン修飾ヌクレオシドを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つのテトラヒドロピラン修飾ヌクレオシドのそれぞれが以下の構造で表される、請求項２１に記載の方法：
【化１】
2013527148.tif 000071
式中、Ｂｘは、保護されていてもよいヘテロ環塩基部分である。
【請求項２３】
少なくとも１つの前記修飾糖が二環式糖である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの修飾糖が、２’−Ｏ−メトキシエチル又は４’−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−２’架橋（式中、ｎは１又は２である）を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシドが修飾核酸塩基を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記修飾核酸塩基が５−メチルシトシンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、２０個の連結されたヌクレオシドからなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、
連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
連結されたヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント；
連結されたヌクレオシドからなる３’ウィングセグメント；
を含み、前記ギャップセグメントが前記５’ウィングセグメントと前記３’ウィングセグメントとの間に位置し、各前記ウィングセグメントの各ヌクレオシドが修飾糖を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、
２０個の連結されたヌクレオシドからなり、
配列番号１〜４のいずれかの同じ長さの部分に相補的な少なくとも８個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有し、
１０個の連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
５個の連結されたヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント；
５個の連結されたヌクレオシドからなる３’ウィングセグメント；
を含み、前記ギャップセグメントが前記５’ウィングセグメントと前記３’ウィングセグメントとの間に位置し、各前記ウィングセグメントの各ヌクレオシドが２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、各シトシンが５−メチルシトシンである、
請求項１〜６に記載の方法。
【請求項３０】
代謝性又は心血管系の疾患を有する動物を処置する方法であって、
ａ．前記代謝性又は心血管系の疾患を有する動物を同定すること；
ｂ．２０個の連結されたヌクレオシドからなり且つ修飾オリゴヌクレオチド全体に対する測定で配列番号１〜４のいずれかに少なくとも９０％相補的な核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を前記動物に治療有効量投与すること
を含み、前記代謝性又は心血管系の疾患を有する動物が処置される、方法。
【請求項３１】
前記動物への前記化合物の投与により、前記動物において代謝性又は心血管系の疾患が軽減される、請求項１、２、３、４、５、６、又は４０に記載の方法。
【請求項３２】
前記代謝性又は心血管系の疾患が、肥満、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、脂質異常症、冠動脈心疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、高脂肪酸血症、メタボリックシンドローム、又はその組合せである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＨＤＬ濃度及び／又はＨＤＬ活性が、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％上昇する、請求項３に記載の方法。
【請求項３４】
動物においてＣＥＴＰの濃度又は活性を低下させるための化合物の使用であって、前記化合物が、配列番号１〜４のいずれかに示されるＣＥＴＰを標的とする１０〜３０個のヌクレオシドが連結された長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む、使用。
【請求項３５】
動物においてＨＤＬ濃度及び／又はＨＤＬ活性を上昇させるための化合物の使用であって、前記化合物が、配列番号１〜４のいずれかに示されるＣＥＴＰを標的とする１０〜３０個のヌクレオシドが連結された長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む、使用。
【請求項３６】
動物においてＬＤＬ、ＴＧ、又はグルコースの濃度を低下させるための化合物の使用であって、前記化合物が、配列番号１〜４のいずれかに示されるＣＥＴＰを標的とする１０〜３０個のヌクレオシドが連結された長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む、使用。
【請求項３７】
動物において代謝性又は心血管系の疾患を処置するための化合物の使用であって、前記化合物が、配列番号１〜４のいずれかに示されるＣＥＴＰを標的とする１０〜３０個のヌクレオシドが連結された長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む、使用。
【請求項３８】
１０〜３０個の連結されたヌクレオシドからなり且つ配列番号４１〜１１４のいずれかの少なくとも８個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物。
【請求項３９】
前記修飾オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基配列が、配列番号１〜４のいずれかに少なくとも９５％相補的である、請求項３８に記載の化合物。
【請求項４０】
前記修飾オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基配列が、配列番号１〜４のいずれかに少なくとも１００％相補的である、請求項３８に記載の化合物。
【請求項４１】
前記修飾オリゴヌクレオチドが一本鎖である、請求項３８に記載の化合物。
【請求項４２】
少なくとも１つのヌクレオシド間結合が、修飾ヌクレオシド間結合である、請求項３８に記載の化合物。
【請求項４３】
前記各ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項４２に記載の化合物。
【請求項４４】
前記少なくとも１つのヌクレオシドが修飾糖を含む、請求項３８に記載の化合物。
【請求項４５】
テトラヒドロピラン環でフラノース環が置換された少なくとも１つのテトラヒドロピラン修飾ヌクレオシドを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記少なくとも１つのテトラヒドロピラン修飾ヌクレオシドのそれぞれが以下の構造で表される、請求項４５に記載の方法：
【化２】
2013527148.tif 000072
式中、Ｂｘは、保護されていてもよいヘテロ環塩基部分である。
【請求項４７】
少なくとも１つの前記修飾糖が二環式糖である、請求項４４に記載の化合物。
【請求項４８】
少なくとも１つの前記修飾糖が、２’−Ｏ−メトキシエチル又は４’−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−２’架橋（式中、ｎは１又は２である）を含む、請求項４４に記載の化合物。
【請求項４９】
．
少なくとも１つの前記ヌクレオシドが修飾核酸塩基を含む、請求項３８に記載の化合物。
【請求項５０】
前記修飾核酸塩基が５−メチルシトシンである、請求項４９に記載の化合物。
【請求項５１】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、
連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
連結されたヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント；
連結されたヌクレオシドからなる３’ウィングセグメント；
を含み、前記ギャップセグメントが前記５’ウィングセグメントと前記３’ウィングセグメントとの間に位置し、各前記ウィングセグメントの各ヌクレオシドが修飾糖を含む、請求項３８に記載の化合物。
【請求項５２】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、
２０個の連結されたヌクレオシドからなり、
１０個の連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、
５個の連結されたヌクレオシドからなる５’ウィングセグメントと、
５個の連結されたヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントと
を含み、前記ギャップセグメントが前記５’ウィングセグメントと前記３’ウィングセグメントとの間に位置し、各前記ウィングセグメントの各ヌクレオシドが２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、各シトシン残基が５−メチルシトシンである、請求項３８に記載の化合物。
【請求項５３】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、２０個の連結されたヌクレオシドからなる、請求項３８に記載の化合物。
【請求項５４】
修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドが、
２０個の連結されたヌクレオシドからなり、
配列番号１〜４のいずれかの同じ長さの部分に相補的な少なくとも８個の連続する核酸塩基を含む核酸残基配列を有し、
１０個の連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、
５個の連結されたヌクレオシドからなる５’ウィングセグメントと、
５個の連結されたヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントと
を含み、前記ギャップセグメントが前記５’ウィングセグメントと前記３’ウィングセグメントとの間に位置し、各前記ウィングセグメントの各ヌクレオシドが２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、各シトシン残基が５−メチルシトシンである、化合物。
【請求項５５】
動物においてＨＤＬ濃度及び／又はＨＤＬ活性を上昇させるための、請求項３８又は５４のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項５６】
動物において代謝性又は心血管系の疾患を処置するための、請求項３８又は５４のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
動物においてＣＥＴＰのｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を低下させるための方法、化合物、及び組成物が提供される。また、動物においてＣＥＴＰに関連する疾患又は状態を軽減するためのＣＥＴＰ阻害剤を含む方法、化合物、及び組成物が提供される。そのような方法、化合物、及び組成物は、例えば、動物において心血管系疾患又は炎症性の症候群又はその症状の任意の１又は複数の処置、防止、遅延、又は改善に有用である。
【背景技術】
【０００２】
高コレステロール血症及び心血管系疾患に関わる危険因子の制御は、学界及び産業界の多くの研究の焦点であった。高濃度の循環血漿低比重リポプロテイン（ＬＤＬ）コレステロールが高コレステロール血症及び心血管系疾患の発達における独立した危険因子として同定されたため、このアテローム生成性のリポプロテイン中で運ばれるコレステロールの濃度を下げることに多くの戦略が向けられた。対照的に、高比重リポプロテイン（ＨＤＬ）は、コレステロール逆転送として知られるプロセスにおいて過剰なコレステロールを末梢組織から肝臓へと運んで胆汁中に排出させることにより、アテローム性動脈硬化症からの血管の保護に重要な役割を果たす（非特許文献１）。末梢細胞からのコレステロールは、ＨＤＬにより取り込まれた後、コレステロイルエステルに変換される。このＨＤＬコレステリルエステルは、肝臓へと逆に輸送されて肝臓に取り込まれるか、超低比重リポプロテイン（ＶＬＤＬ）、中間比重リポプロテイン（ＩＤＬ）、及び低比重リポプロテイン（ＬＤＬ）へと転送され得る（非特許文献１）。
【０００３】
ＨＤＬコレステリルエステルの再分布は、コレステリルエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ及び脂質転送タンパク質ＩＩとしても知られる）により仲介される。このプロセス中、ＣＥＴＰは、ＨＤＬからのコレステリエステルをＶＬＤＬ、ＩＤＬ、及びＬＤＬからのトリグリセリドと交換する中性脂質転送を促進する（非特許文献１）。コレステリルエステル転送タンパク質はヒト及びウサギには存在するが、げっ歯類には存在しない（非特許文献２）。
【０００４】
コレステリルエステル転送タンパク質は、１９８７年にクローニングされ（非特許文献３）、その後、染色体１６ｑ２１にマッピングされた（非特許文献４）。これは、肝臓、脾臓、小腸、脂肪組織、副腎、腎臓、心臓、及び骨格筋で発現され、単球由来マクロファージ、Ｂリンパ球、脂肪細胞、肝細胞等の種々の細胞タイプにより分泌される（非特許文献１）。
【０００５】
コレステリルエステル転送タンパク質ｍＲＮＡには２つのアイソフォーム、すなわち全長型及びエクソン９が欠失したオルタナティブスプライス型が知られている（非特許文献５）。オルタナティブスプライス型は、脂質転送活性のないタンパク質を発現することが実証されており、その発現は、特定の組織内での脂質転送活性を調節するスイッチとなることが示唆されている（非特許文献５）。
【０００６】
ヒトコレステリルエステル転送タンパク質遺伝子を含むげっ歯類を初めとする複数のトランスジェニック動物が遺伝子操作により作製され、概説されている（非特許文献６）。コレステリルエステル転送タンパク質過剰発現とアテローム性動脈硬化症との関係は、リポプロテインの代謝がヒトと全く異なるモデルマウスにおいて非常に複雑であることが証明されている（非特許文献７）。肝臓を仲介したアテローム生成性リポプロテインの取込みが損なわれているモデルマウスでは、ＣＥＴＰ活性はアテローム生成促進的であるが、高トリグリセリド血症及び機能障害性ＨＤＬの存在下では、ＣＥＴＰ活性は有益であり得る（非特許文献７）。
【０００７】
スプライシング異常又はミスセンス変異により生じるコレステリルエステル転送タンパク質の欠損は、コレステリルエステル転送タンパク質の濃度、組成、及び機能に種々の異常を生じさせ、アジアの集団における高αリポプロテイン血症（ＨＡＬＰ）の最も多い原因であると特定されている（非特許文献８）。
【０００８】
コレステロール逆輸送に対するコレステリルエステル転送タンパク質活性の影響が、真性糖尿病におけるコレステロール逆輸送の総説において調べられている（非特許文献９）。
【０００９】
ＬＤＬ及びＶＬＤＬはアテローム生成性であることが知られているので、ＨＤＬからＬＤＬ及びＶＬＤＬへのコレステリルエステルの転送プロセスは有害であり得る（非特許文献１０）。アテローム性動脈硬化症の発生頻度が非常に低いラットにおいてコレステリルエステル転送タンパク質が存在しないこと（非特許文献１０）及びコレステリルエステル転送タンパク質が欠損した日本人対象でＨＤＬ濃度が高く且つ寿命が延びるという観察結果（非特許文献１１）がこの仮説の裏付けとなり得る。一方、コレステリルエステル転送タンパク質レベルが低下した日本人男性の別の研究では、冠動脈心疾患のリスク増加が見出された（非特許文献１２）。
【００１０】
コレステリルエステル転送タンパク質の小分子阻害剤は当該技術分野で良く報告されており、ステロール、多環式の天然産物、ヘテロ環を含む種々の構造的クラスが含まれる（非特許文献１３）。コレステリルエステル転送タンパク質に対する抗体（非特許文献１４；非特許文献１５）及びブタ血漿由来ペプチド（非特許文献１６）も、ヒトコレステリルエステル転送タンパク質の阻害剤として作用することが実証されている。
【００１１】
ＣＥＴＰの小分子阻害剤（ＳＭＩ）は、広く臨床検査されてきており、それらの治験の結果から、薬理、有効性、及び耐用性に対する様々な影響が分かった（非特許文献１７）。開発された初期のＣＥＴＰ  ＳＭＩの１つはトルセトラピブであった。初期の臨床試験で、トルセトラピブはＣＥＴＰの強力な阻害剤であることが見出され、ＬＤＬ／ＨＤＬ比の有益なシフトをもたらした（非特許文献１８）。しかし、処置群における有害事象の増加により、トルセトラピブの開発は第ＩＩＩ相で中止された。トルセトラピブの負の影響は、血圧及び循環アルドステロン濃度の上昇に起因するものであった（非特許文献１９）。更に、トルセトラピブで処置された患者では、ａｐｏＡＩＩの多いＨＤＬが増加し、異化反応が大幅に遅れた（非特許文献２０）。臨床開発中である別の２つのＣＥＴＰ  ＳＭＩ、アナセトラピブ及びダルセトラピブ（Ｄａｌｃｅｔｒａｐｉｂ）（以前のＪＴＴ−７０５）は、血圧及びアルドステロンに対する負の影響を示さず、ＨＤＬ及びＬＤＬの有益なシフトをもたらした（非特許文献２１及び非特許文献２２）。しかし、ＨＤＬの代謝及び排除（ｃｌｅａｒａｎｃｅ）に対するこれらの化合物の効果は、現時点では詳細に説明されていない。アナセトラピブ及びダルセトラピブの第ＩＩＩ相試験の今後の結果から、ＣＥＴＰの小分子阻害が心血管系疾患に対する実用的な治療戦略であるかどうかが示されるであろう。
【００１２】
ヒトコレステリルエステル転送タンパク質のヌクレオチド３２９〜３４９を標的とするホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを用いて、ヒトコレステリルエステル転送タンパク質でトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）セルラインにおけるヒトコレステリルエステル転送タンパク質の発現を阻害した（非特許文献２３）。この研究で、ＬＤＬレセプターリガンドとして作用するＮ，Ｎ−ジパルミチルグリシル−アポリポプロテインＥ（１２９〜１６９）ペプチドにオリゴヌクレオチドをコンジュゲートすることによる、アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを肝臓に標的送達するシステムが開発された（非特許文献２３）。
【００１３】
血漿リポプロテインコレステロール濃度に対するコレステリルエステル転送タンパク質の影響に関するインビボ実験（非特許文献２４）及びウサギにおけるアテローム性動脈硬化症の発達に対するコレステリルエステル転送タンパク質の影響に関するインビボ実験（非特許文献２５）において、コレステリルエステル転送タンパク質の発現を低下させるために、ウサギコレステリルエステル転送タンパク質配列の１４８〜１６８位を標的とした２１マーのアンチセンスオリゴヌクレオチドをアシアロ糖タンパク質−ポリＬリジンキャリア分子と結合させたものが用いられた。これらの調査は、アンチセンスオリゴヌクレオチド−アシアロ糖タンパク質コンジュゲートをウサギに投与することによりＬＤＬ及びＶＬＤＬの血漿濃度を下げることができること（非特許文献２４）並びにウサギにおいてアテローム性動脈硬化症の発生を抑制することができること（非特許文献２５）を結論づけている。
【００１４】
特許文献１は、コレステリルエステル転送タンパク質の発現を阻害することを目的とした、ヒトコレステリルエステル転送タンパク質に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（修飾ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドオリゴヌクレオチドを含む）を開示及び特許請求している（特許文献１）。同特許中に、制御配列を有する５’非翻訳領域を含むヒトコレステリルエステル転送タンパク質遺伝子の転写コンストラクトが更に開示及び特許請求されている（特許文献１）。
【００１５】
特許文献２、特許文献３、及び特許文献４は、ＣＥＴＰを標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチド及びＣＥＴＰを調節する方法を開示している。
【００１６】
現在、コレステリルエステル転送タンパク質の阻害剤には、複数のクラスの小分子、抗体、ペプチド、及び上記で引用したアンチセンス阻害剤の例が含まれる。これらの阻害剤全てのうち、ＣＥＴＰの小分子阻害剤は、クリニック及び研究室で最も広く試験されており、全体的血漿リポプロテイン分布に良い影響を与えることが示されている（非特許文献２１及び非特許文献２２）。しかし、小分子阻害剤で処置された患者で観察された血圧及びアルドステロンに対する潜在的な負の影響並びにＨＤＬ亜種の潜在的な負の変化のため、代替的な手段によりＣＥＴＰ活性を阻害する治療薬剤に対するニーズが依然として存在する（非特許文献１９及び非特許文献２０）。ＣＥＴＰのアンチセンス阻害は、タンパク質への化合物の競合的結合に頼らず、ＣＥＴＰの発現を低下させることにより直接活性を阻害する点で、従来の小分子阻害剤にない固有の利点がある。
【００１７】
アンチセンス化合物は、肝臓、脂肪組織等のＣＥＴＰが発現される組織中に容易に蓄積し（非特許文献２６）、このため、アンチセンス技術はＣＥＴＰの発現及び機能へのターゲティングに比類なく適している。アンチセンス技術は特定の遺伝子産物の発現を低減するための効果的な手段として現れてきており、したがって、ＣＥＴＰを調節するための複数の治療的応用、診断的応用、及び研究的応用において比類なく有用であることが証明され得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】独国特許第１９７３１６０９号明細書
【特許文献２】米国特許出願第０９／９２５，１３９号明細書
【特許文献３】米国特許出願第１１／０３１，８２７号明細書
【特許文献４】国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／２４９１９号明細書
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  ２０００，  １５２９，  ２５７−２７５
【非特許文献２】Ｈｉｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｌｉｐｉｄｏｌ．，  ２０００，  １１，  ５８９−５９６
【非特許文献３】Ｄｒａｙｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  １９８７，  ３２７，  ６３２−６３４
【非特許文献４】Ｌｕｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  １９８７，  １，  ２３２−２３５
【非特許文献５】Ｉｎａｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９９２，  ３１，  ２３５２−２３５８
【非特許文献６】Ｂａｒｔｅｒ  ｅｔ．  ａｌ．，  ＡＴＶＢ，  ２００３，  ２３，  １６０−１６７
【非特許文献７】ｄｅ  Ｇｒｏｏｔｈ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ，  ２００４，  ４５，  １９６７−１９７４
【非特許文献８】Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，  ２０００，  １５２，  ２７１−２８５
【非特許文献９】Ｑｕｉｎｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂ．  Ｒｅｓ．  Ｒｅｖ．，  ２０００，  １６，  ２３７−２５０
【非特許文献１０】Ｃｈｏｎｇ  ａｎｄ  Ｂａｃｈｅｎｈｅｉｍｅｒ，  Ｄｒｕｇｓ，  ２０００，  ６０，  ５５−９３
【非特許文献１１】Ｉｎａｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．，  １９９０，  ３２３，  １２３４−１２３８
【非特許文献１２】Ｉｓｈｉｇａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  （Ｔｏｋｙｏ），  １９９４，  １１６，  ２５７−２６２
【非特許文献１３】Ｓｉｋｏｒｓｋｉ  ａｎｄ  Ｇｌｅｎｎ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｐ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  ２０００，  ３５，  ２５１−２６０
【非特許文献１４】Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，  １９９９，  ４０，  ２０１３−２０２１
【非特許文献１５】Ｓｕｇａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，  ２０００，  ４１，  １２６−１３３
【非特許文献１６】Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １９９８，  １３９１，  １３３−１４４
【非特許文献１７】Ｖｅｒｇｅｅｒ  ａｎｄ  Ｓｔｒｏｅｓ，  Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ．，  ２００９，  １０４，  ３２Ｅ−８Ｅ
【非特許文献１８】ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｔｅｅｇ  ＷＡ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｌｉｐｉｄｏｌ．，  ２００４，  １５（６），  ６３１−６
【非特許文献１９】Ｊｏｙ  ａｎｄ  Ｈｅｇｅｌｅ，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃａｒｄｉｏｌ．，  ２００９，  ２４（４），  ３６４−７１
【非特許文献２０】Ｂｒｏｕｓｓｅａｕ  ＭＥ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，  ２００９，  ５０（７），  １４５６−６２
【非特許文献２１】Ｍａｓｓｏｎ  Ｄ，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ，  ２００９，  １０（９），  ９８０−７
【非特許文献２２】Ｒｅｎｎｉｎｇｓ  ａｎｄ  Ｓｔａｌｅｎｈｏｅｆ，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ，  ２００８，  １７（１０），  １５８９−９７
【非特許文献２３】Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｖａｓｃ．  Ｂｉｏｌ．，  １９９９，  １９，  ２２０７−２２１３
【非特許文献２４】Ｓｕｇａｎｏ  ａｎｄ  Ｍａｋｉｎｏ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９６，  ２７１，  １９０８０−１９０８３
【非特許文献２５】Ｓｕｇａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９８，  ２７３，  ５０３３−５０３６
【非特許文献２６】Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ＳＴ  Ｃｒｏｏｋｅ，  Ｅｄ．，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  ＦＬ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
現在、心血管系の障害及び代謝障害を処置するための許容可能な選択肢が不足している。そこで、本発明は、そのような疾患及び障害を処置するための化合物及び方法を提供することを目的とする。
【００２１】
本願中で引用される全ての文献又は文献の一部、例えば、限定されるものではないが、特許、特許出願、論文、書籍、及び条約の、本明細書で議論されている部分及び全体を、参照により明示的に本明細書に援用する。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、ＲＮａｓｅＨ、ＲＮＡｉ、ｄｓＲＮＡ酵素等のアンチセンス作用機序及び標的分解又は標的占有に基づくその他のアンチセンス機序を介した遺伝子発現及び関連経路の調節に有用なアンチセンス化合物に関する。
【００２３】
本発明は、ＣＥＴＰの発現を阻害してＣＥＴＰに関連する疾患、状態、又はその症状を処置、防止、遅延、又は改善するための方法、化合物、及び組成物に関する。特定の実施形態では、ＣＥＴＰに関連する疾患又は状態は心血管系疾患又は炎症性疾患である。
【００２４】
特定の実施形態では、本発明の化合物又は組成物は、ＣＥＴＰを標的とする（ＣＥＴＰへとターゲティングされた）１０〜３０個のヌクレオシドが連結された長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む。ＣＥＴＰ標的は、配列番号１〜４のいずれか１つから選択される配列を有し得る。ＣＥＴＰを標的とする修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜４の同じ長さの部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）に相補的な少なくとも８個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有し得る。修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有し得る。修飾オリゴヌクレオチドの連続核酸塩基部分は、配列番号１〜４のいずれか１つから選択されるＣＥＴＰ領域の同じ長さの部分に相補的であり得る。
【００２５】
特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ａ）連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；ｂ）連結されたヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント；及びｃ）連結されたヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントを含む。ギャップセグメントは、５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントの間に位置し、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは修飾された糖を含む。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは２０個の連結されたヌクレオシドからなり、ギャップセグメントは１０個の連結されたデオキシヌクレオシドからなり、５’ウィングセグメントは５個の連結されたヌクレオシドからなり、３’ウィングセグメントは５個の連結されたヌクレオシドからなり、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合であり、各シトシンは５−メチルシトシンである。
【００２６】
特定の実施形態では、本明細書に記載のＣＥＴＰを標的とする修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物に投与することを含む、動物においてＣＥＴＰの発現又は活性を低下させる方法が提供される。
【００２７】
特定の実施形態では、本明細書に記載のＣＥＴＰを標的とする修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物に投与することを含む、動物においてＨＤＬ濃度及び／又はＨＤＬ活性を上昇させる方法が提供される。
【００２８】
特定の実施形態では、本明細書に記載のＣＥＴＰを標的とする修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物に投与することを含む、動物においてＬＤＬ、ＴＧ、又はグルコースの濃度を低下させる方法が提供される。
【００２９】
特定の実施形態では、本明細書に記載のＣＥＴＰを標的とする修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物に投与することを含む、動物においてＬＤＬ／ＨＤＬ比を低下させる方法が提供される。
【００３０】
特定の実施形態では、本明細書に記載のＣＥＴＰを標的とする修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物に投与することを含む、動物において心血管系疾患又は代謝性疾患を改善する方法が提供される。
【００３１】
特定の実施形態では、１）心血管系疾患又は代謝性疾患を有する動物を同定すること、及び２）２０個の連結されたヌクレオシドからなり且つ修飾オリゴヌクレオチド全体にわたる測定で配列番号１〜４に少なくとも９０％相補的な核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む治療有効量の化合物を動物に投与することにより、心血管系疾患又は代謝性疾患を有する動物を処置することを含む、心血管系疾患又は代謝性疾患を有する動物を処置する方法が提供される。特定の実施形態では、動物に投与される治療有効量の化合物は、動物において心血管系疾患又は代謝性疾患を軽減する。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
上記の概括的な説明及び以下の詳細な説明はどちらも例示的及び説明的なものでしかなく、特許請求されている発明を制限するものではないと理解されるべきである。本明細書において、特に断りのない限り、単数形の使用は複数を含む。本明細書において、特に断りのない限り、「又は」、「若しくは」、「あるいは」は「及び／又は」を意味する。更に、「含む」という用語及び「含まれる」等の他の形態の使用は、限定するものではない。また、特に断りのない限り、「エレメント」又は「構成要素」等の用語は１ユニットを含むエレメント及び構成要素並びに２以上のサブユニットを含むエレメント及び構成要素の両方を包含する。
【００３３】
本明細書中で使用される項目見出しは構成のみを目的とし、記載されている主題を限定するものと解釈されるべきではない。本願中で引用される全ての文献、文献の一部、例えば、限定されるものではないが、特許、特許出願、論文、書籍、及び条約を、本明細書中で議論されている文献部分及び文献全体について明言的に参照により本明細書に援用する。
【００３４】
定義
特別に定義しない限り、本明細書に記載する分析化学、合成有機化学、並びに薬化学及び製薬化学に関連して用いた命名法、並びに手順及び技術は、当該技術分野で周知の一般に用いられているものである。化学合成及び化学的分析には標準技術を用いることができる。許される場合には、全ての特許、出願、公開出願、及びその他の刊行物、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）等のデータベースを介して入手可能なＧＥＮＢＡＮＫ受託番号及び関連する配列情報、並びに本明細書の開示中で参照されるその他のデータを、本明細書中で議論されている文献部分及び文献全体に関して参照により本明細書に援用する。
【００３５】
特に断りのない限り、以下の用語は以下の意味である。
【００３６】
「２’−Ｏ−メトキシエチル」（２’−ＭＯＥ及び２’−Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３ともいう）とは、フロシル（ｆｕｒｏｓｙｌ）環の２’位のＯ−メトキシ−エチル修飾を意味する。２’−Ｏ−メトキシエチル修飾された糖は修飾糖である。
【００３７】
「２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチド」とは、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含むヌクレオチドを意味する。
【００３８】
「３’標的部位」とは、特定のアンチセンス化合物の最も３’側のヌクレオチドに相補的な、標的核酸のヌクレオチドを意味する。
【００３９】
「５’標的部位」とは、特定のアンチセンス化合物の最も５’側のヌクレオチドに相補的な、標的核酸のヌクレオチドを意味する。
【００４０】
「５−メチルシトシン」とは、５’位に付加されたメチル基で修飾されたシトシンを意味する。５−メチルシトシンは修飾核酸塩基である。
【００４１】
「約」とは、値の±１０％以内を意味する。例えば、「化合物がＣＥＴＰを少なくとも約７０％阻害した」と記載されている場合、これはＣＥＴＰ濃度が６３〜７７％の範囲内で阻害されることを意味する。
【００４２】
「活性薬剤（ａｃｔｉｖｅ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｇｅｎｔ）」とは、個体に投与された時に治療効果を与える医薬組成物中の物質を意味する。例えば、特定の実施形態では、ＣＥＴＰを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが活性薬剤である。
【００４３】
「活性標的領域」又は「標的領域」とは、１又は複数の活性アンチセンス化合物の標的となる領域を意味する。「活性アンチセンス化合物」とは、標的の核酸レベル又はタンパク質レベルを低下させるアンチセンス化合物を意味する。
【００４４】
「脂肪生成」とは、前脂肪細胞からの脂肪細胞の発達を意味する。「脂質生成」とは、脂肪の生産又は形成、脂肪変性又は脂肪浸潤のいずれかを意味する。
【００４５】
「肥満症（Ａｄｉｐｏｓｉｔｙ）又は「肥満（ｏｂｅｓｉｔｙ）」とは、肥満である状態又は除脂肪体重と比べて体脂肪若しくは脂肪組織が過剰量であることを意味する。体脂肪の量には、体全体における脂肪の分布並びに脂肪組織沈着物のサイズ及び質量の両方に関する問題が含まれる。体脂肪分布は、皮下脂肪測定、ウエストとヒップの外周比、又は超音波、コンピュータ断層撮影法、若しくは磁気共鳴画像法等の技術により推定することができる。疾病管理予防センターによれば、肥満度指数（ＢＭＩ）が３０以上の個体が肥満と見なされる。本発明において、「肥満」という用語は、体内に脂肪組織が過剰に蓄積されることにより身体に必要な量を超えて体脂肪が増加している状態を含む。「肥満」という用語は、限定されるものではないが、以下の状態を含む：成人発症型肥満；食事性肥満；内因性又は炎症性の肥満；内分泌性肥満；家族性肥満；高インスリン肥満；過形成―肥大性肥満；性機能低下性肥満；甲状腺機能低下性肥満；生涯肥満；病的肥満；及び外因性肥満。
【００４６】
「同時に投与」とは、両方の薬理学的効果が同時に患者に現れるような任意の様式での２つの薬剤の共投与を意味する。同時投与は、単一の医薬組成物、同じ製剤、又は同じ投与経路で両方の薬剤が投与されることを必要としない。両方の薬剤の効果は同時に発現しなくてもよい。効果は、ある期間重複するだけでよく、同じ期間続く必要はない。
【００４７】
「投与する」とは、動物に薬剤を与えることを意味し、限定されるものではないが、医療従事者による投与及び自己投与を含む。
【００４８】
「薬剤（ａｇｅｎｔ）」とは、動物に投与された時に治療上の利点を与え得る活性物質を意味する。「第１の薬剤」とは、本発明の治療化合物を意味する。例えば、第１の薬剤は、ＣＥＴＰを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。「第２の薬剤」とは、本発明の第２の治療化合物（例えば、ＣＥＴＰを標的とする第２のアンチセンスオリゴヌクレオチド）及び／又は非ＣＥＴＰ治療化合物を意味する。
【００４９】
「改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）」とは、関連する疾患、障害、又は状態の少なくとも１つの指標、兆候、又は症状の軽減を意味する。指標の重度は、当業者に公知の主観的又は客観的尺度により決定することができる。
【００５０】
「動物」とは、ヒト又は非ヒト動物、限定されるものではないが例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、並びに非ヒト霊長類、限定されるものではないが例えばサル及びチンパンジーを意味する。
【００５１】
「アンチセンス活性」とは、標的核酸へのアンチセンス化合物のハイブリダイゼーションに起因する任意の検出可能な又は測定可能な活性を意味する。特定の実施形態では、アンチセンス活性は、標的核酸又はそのような標的核酸によりコードされるタンパク質の量又は発現の低下である。
【００５２】
「アンチセンス化合物」とは、水素結合を介して標的核酸にハイブリダイゼーションすることができるオリゴマー化合物を意味する。本発明において、「アンチセンス化合物」という用語は、本明細書に記載されている化合物の薬学的に許容される誘導体を包含する。
【００５３】
「アンチセンス阻害」とは、アンチセンス化合物非存在下における標的核酸レベル又は標的タンパク質レベルと比べた、標的核酸に相補的なアンチセンス化合物存在下における標的核酸レベル又は標的タンパク質レベルの低下を意味する。
【００５４】
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、標的核酸の対応する領域又はセグメントへのハイブリダイゼーションを可能にする核酸塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。本発明において、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書に記載されている化合物の薬学的に許容される誘導体を包含する。
【００５５】
「ＡｐｏＢ含有リポプロテイン」とは、そのタンパク質構成要素としてアポリポプロテインＢを有する任意のリポプロテインを意味し、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、及びリポプロテイン（ａ）を含むと理解され、一般的に、脂質を下げる薬剤又は療法の標的となり得る。「ＡｐｏＢ−１００−含有ＬＤＬ」とは、ＡｐｏＢ−１００アイソフォームを含有するＬＤＬを意味する。
【００５６】
「アテローム性動脈硬化症」とは、大及び中サイズの動脈に影響する動脈の硬化を意味し、脂肪沈着物の存在を特徴とする。脂肪沈着物は、「アテローム」又は「プラーク」と呼ばれ、これは主にコレステロール及びその他の脂肪、カルシウム、及び瘢痕組織からなり、動脈の内張り（ｌｉｎｉｎｇ）にダメージを与える。
【００５７】
「二環式糖（ｂｉｃｙｃｌｉｃ  ｓｕｇａｒ）」とは、２個の非ジェミナル環原子の架橋により修飾されたフロシル環を意味する。二環式糖は修飾糖である。
【００５８】
「二環式核酸（ｂｉｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」又は「ＢＮＡ」とは、ヌクレオシド又はヌクレオチドのフラノース部分がフラノース環上の２個の炭素原子を連結する架橋を含むことで二環式の環系を形成しているヌクレオシド又はヌクレオチドを意味する。
【００５９】
「キャップ構造」又は「末端キャップ部分」とは、アンチセンス化合物のいずれかの末端に導入された化学修飾を意味する。
【００６０】
「心血管系疾患」又は「心血管系障害」とは、心臓、血管、又は循環に関係する一群の状態を意味する。心血管系疾患の例としては、限定されるものではないが、動脈瘤、アンギナ、不整脈、アテローム性動脈硬化症、脳血管疾患（脳卒中）、冠動脈心疾患、高血圧、脂質異常症、高脂血症、及び高コレステロール血症が含まれる。
【００６１】
「コレステリルエステル転送タンパク質」又は「ＣＥＴＰ」（脂質転送タンパク質ＩＩとしても知られる）とは、任意のＣＥＴＰの核酸又はタンパク質を意味する。
【００６２】
「ＣＥＴＰ発現」とは、ＣＥＴＰをコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡのレベル又はｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質のレベルを意味する。ＣＥＴＰ発現は、ノーザンブロット法又はウェスタンブロット法等の当該技術分野で公知の方法により測定することができる。
【００６３】
「ＣＥＴＰ核酸」とは、ＣＥＴＰをコードする任意の核酸を意味する。例えば、特定の実施形態では、ＣＥＴＰ核酸は、ＣＥＴＰをコードするＤＮＡ配列、ＣＥＴＰをコードするＤＮＡ（イントロン及びエクソンを含むゲノムＤＮＡを含む）から転写されたＲＮＡ配列、及びＣＥＴＰをコードするｍＲＮＡ配列を含む。「ＣＥＴＰ  ｍＲＮＡ」とは、ＣＥＴＰタンパク質をコードするｍＲＮＡを意味する。
【００６４】
「化学的に異なる領域（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｒｅｇｅｉｏｎ）」とは、同じアンチセンス化合物の別の領域と何らかの点で化学的に異なるアンチセンス化合物の領域を意味する。例えば、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチドを有する領域は、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾のないヌクレオチドを有する領域とは化学的に異なる。
【００６５】
「キメラアンチセンス化合物」とは、少なくとも２つの化学的に異なる領域を有するアンチセンス化合物を意味する。
【００６６】
「共投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」とは、個体への２以上の薬剤の投与を意味する。２以上の薬剤は、単一の医薬組成物であってもよく、別々の医薬組成物であってもよい。２以上の薬剤のそれぞれは、同じ投与経路で投与されてもよく、異なる投与経路で投与されてもよい。共投与は、並行投与又は逐次投与を包含する。
【００６７】
「拘束エチル」又は「ｃＥｔ」とは、４’炭素原子と２’炭素原子の間にメチル（メチレンオキシ）（４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’）架橋を含むフラノシル糖を有する二環式ヌクレオシドを意味する。
【００６８】
「コレステロール」とは、全動物組織の細胞膜中に見られるステロール分子である。コレステロールは、動物の血漿中で、超低比重リポプロテイン（ＶＬＤＬ）、中間比重リポプロテイン（ＩＤＬ）、低比重リポプロテイン（ＬＤＬ）、及び高比重リポプロテイン（ＨＤＬ）等のリポプロテインにより輸送される必要がある。「血漿コレステロール」とは、血漿又は血清中に存在する、全てのリポプロテイン（ＶＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ）でエステル化された及び／又はエステル化されていないコレステロールの和を意味する。
【００６９】
「コレステロール吸収阻害剤」とは、食事から得られる外因性コレステロールの吸収を阻害する薬剤を意味する。
【００７０】
「相補性」とは、第１の核酸と第２の核酸の核酸塩基間における対形成能を意味する。特定の実施形態では、第１及び第２の核酸間の相補性は、２つのＤＮＡ鎖間、２つのＲＮＡ鎖間、又はＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖の間のものであり得る。特定の実施形態では、一方の鎖の核酸塩基の一部が、他方の鎖の相補的水素結合塩基にマッチする。特定の実施形態では、一方の鎖上の全核酸塩基が、他方の鎖の相補的水素結合塩基にマッチする。特定の実施形態では、第１の核酸はアンチセンス化合物であり、第２の核酸は標的核酸である。特定のそのような実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドが第１の核酸であり、標的核酸が第２の核酸である。
【００７１】
「連続核酸塩基」とは、互いにすぐ隣接している核酸塩基を意味する。
【００７２】
「交差反応性」とは、１つの核酸配列を標的とするオリゴマー化合物が異なる核酸配列にハイブリダイズできることを意味する。例えば、場合によっては、ヒトＣＥＴＰを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドはマウスＣＥＴＰと交差反応することができる。オリゴマー化合物が、指定の標的以外の核酸配列と交差反応するかどうかは、化合物の非標的核酸配列に対する相補性の程度に依存する。
【００７３】
「治療」とは、健康を回復する方法又は病気に対して処方される処置を意味する。
【００７４】
「冠動脈心疾患（ＣＨＤ）」とは、心臓に血液及び酸素を供給する小血管の狭窄を意味し、これは多くの場合アテローム性動脈硬化症により生じる。
【００７５】
「デオキシリボヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの糖部分の２’位に水素を有するヌクレオチドを意味する。デオキシリボヌクレオチドは、種々の置換基のいずれかで修飾され得る。
【００７６】
「真性糖尿病」又は「糖尿病」とは、不十分なインスリン濃度又はインスリン感受性の低下による代謝異常及び異常に高い血糖（高血糖症）を特徴とする症候群である。特徴的な症状は、高血糖値による過剰な尿生成（多尿症）、排尿増加を補おうとする過剰な渇き及び水分摂取の増加（多飲症）、高血糖の目への影響による視朦、原因不明の体重減少、及び嗜眠である。
【００７７】
「糖尿病性脂質異常症」又は「脂質異常症を伴う２型糖尿病」とは、２型糖尿病、ＨＤＬ−Ｃの減少、トリグリセリドの増加、及び小粒子ＬＤＬ粒子の増加を特徴とする状態を意味する。
【００７８】
「希釈剤」とは、組成物中の、薬理学的活性を有さないが薬学的に必要であるか望ましい成分を意味する。例えば、注射される組成物中の希釈剤は液体、例えば食塩水であり得る。
【００７９】
「脂質異常症」とは、脂質及び／又はリポプロテイン代謝の障害、例えば脂質及び／又はリポプロテインの過剰生成又は欠乏を意味する。脂質異常症は、コレステロール及びトリグリセリド等の脂質並びに低比重リポプロテイン（ＬＤＬ）コレステロール等のリポプロテインの増加により顕在化し得る。
【００８０】
「投薬単位（ｄｏｓａｇｅ  ｕｎｉｔ）」とは、薬剤が提供される形態、例えばピル、錠剤、又は当該技術分野で公知のその他の投薬単位を意味する。特定の実施形態では、投薬単位は、凍結乾燥されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むバイアルである。特定の実施形態では、投薬単位は、再構成されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むバイアルである。
【００８１】
「用量（ｄｏｓｅ）」とは、１回の投与で与えられる又は特定の期間中に与えられる特定の量の薬剤を意味する。特定の実施形態では、用量は、１、２、又はそれ以上のボーラス、錠剤、又は注射で投与され得る。例えば、皮下投与が望ましい特定の実施形態では、所望の用量は、１回の注射に含めることが容易でない体積が必要となるため、所望の用量を達成するために２回以上の注射を用いてもよい。特定の実施形態では、薬剤は、長期間にわたる又は連続的な注入より投与される。用量は、時間、日、週、又は月当たりの薬剤の量として記載され得る。用量は、例えばｍｇ／ｋｇで表され得る。
【００８２】
「有効量」又は「治療有効量」とは、薬剤を必要とする個体において所望の生理学的結果を達成するのに十分な活性薬剤の量を意味する。有効量は、処置される個体の健康及び体調、処置される個体の分類学的群、組成物の処方、個体の医学的状態の評価、並びにその他の関連因子に応じて個体間で変わり得る。
【００８３】
「完全に相補的」又は「１００％相補的」とは、第１の核酸の核酸塩基配列の各核酸塩基が第２の核酸の第２の核酸塩基配列中に相補的な核酸塩基を有することを意味する。特定の実施形態では、第１の核酸はアンチセンス化合物であり、第２の核酸は標的核酸である。
【００８４】
「ギャップマー」とは、ＲＮａｓｅ  Ｈ切断を支援する複数のヌクレオシドを有する内部領域が、１又は複数のヌクレオシドを有する外部領域間に位置し、内部領域を含むヌクレオシドが、外部領域を含むヌクレオシドと化学的に異なる、キメラアンチセンス化合物を意味する。内部領域を「ギャップセグメント」、外部領域を「ウィングセグメント」と呼ぶこともある。
【００８５】
「ギャップ拡張（ｇａｐ−ｗｉｄｅｎｅｄ）」とは、１〜６個のヌクレオシドを有する５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントの間でこれらにすぐ隣接して位置する１２以上の連続する２’−デオキシリボヌクレオシドを有するギャップセグメントを有するキメラアンチセンス化合物を意味する。
【００８６】
「グルコース」とは、エネルギー源及び炎症性中間体として細胞に使用される単糖である。「血漿グルコース」とは、血漿中に存在するグルコースを意味する。
【００８７】
「高比重リポプロテイン−Ｃ（ＨＤＬ−Ｃ）」とは、高比重リポプロテイン粒子に結合したコレステロールを意味する。血清（又は血漿）中のＨＤＬ−Ｃの濃度は通常、ｍｇ／ｄＬ又はｎｍｏｌ／Ｌで定量化される。「ＨＤＬ−Ｃ」及び「血漿ＨＤＬ−Ｃ」とは、それぞれ血清及び血漿中のＨＤＬ−Ｃを意味する。
【００８８】
「ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤」とは、酵素ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の阻害を介して作用する薬剤、例えばアトルバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、及びシンバスタチンを意味する。
【００８９】
「ハイブリダイゼーション」とは、相補的核酸分子のアニーリングを意味する。特定の実施形態では、相補的核酸分子は、アンチセンス化合物及び標的核酸を含む。
【００９０】
「高コレステロール血症」とは、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｐａｎｅｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｇｒａｍ  （ＮＣＥＰ）  ｏｆ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｉｎ  ａｄｕｌｔｓ  （Ａｒｃｈ．  Ｉｎｔ．  Ｍｅｄ．  （１９８８）  １４８，  ３６−３９参照）の指針通り、コレステロール又は循環（血漿）コレステロール、ＬＤＬ−コレステロール、及びＶＬＤＬ−コレステロールの上昇を特徴とする状態を意味する。
【００９１】
「高脂血症」又は「高脂質血症（ｈｙｐｅｒｌｉｐｅｍｉａ）」とは、血清脂質又は循環（血漿）脂質の上昇を特徴とする状態である。この状態は、異常に高濃度の脂質を呈する。循環血液中の脂質画分はコレステロール、低比重リポプロテイン、超低比重リポプロテイン、及びトリグリセリドである。
【００９２】
「高トリグリセリド血症」とは、高いトリグリセリド濃度を特徴とする状態を意味する。
【００９３】
「代謝性又は心血管系の疾患を有する動物を同定する」又は選択する」とは、代謝性疾患、心血管系疾患、又はメタボリックシンドロームを診断された対象を同定又は選択すること；あるいは、代謝性疾患、心血管系疾患、又はメタボリックシンドロームの何らかの症状、例えば、限定されるものではないが、高コレステロール血症、高血糖症、高脂血症、高トリグリセリド血症、高血圧、インスリン抵抗性の上昇、インスリン感受性の低下、通常より多い体重、及び／又は通常より高い体脂肪量、又はその任意の組合せを有する対象を同定又は選択することを意味する。そのような同定は、任意の方法、例えば、限定されるものではないが、標準的な臨床検査又は評価、例えば血清又は循環（血漿）コレステロールの測定、血清又は循環（血漿）血糖の測定、血清又は循環（血漿）トリグリセリドの測定、血圧の測定、体脂肪量の測定、体重の測定等により実現され得る。
【００９４】
「心血管系の転帰の向上」とは、心血管の有害事象の発生又はそのリスクの低減を意味する。心血管有害事象の例としては、限定されるものではないが、死亡、再梗塞、脳卒中、心原性ショック、肺水腫、心停止、及び心房律動異常が含まれる。
【００９５】
「すぐ隣接した（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ  ａｄｊａｃｅｎｔ）」とは、すぐ隣接したエレメント間、例えば領域間、セグメント間、ヌクレオチド間、及び／又はヌクレオシド間に介在するエレメントがないことを意味する。
【００９６】
「個体」又は「対象」又は「動物」とは、処置又は治療に選択されたヒト又は非ヒト動物を意味する。
【００９７】
「誘導する」、「阻害する」、「増強する」、「上昇する」、「増加する」、「低下する」等は、２つの状態間の量的差を示している。例えば、「ＣＥＴＰの活性又は発現を阻害するのに有効な量」とは、処置されたサンプルにおけるＣＥＴＰの活性又は発現のレベルが、処置されていないサンプルにおけるＣＥＴＰの活性又は発現のレベルと異なることを意味する。そのような用語は、例えば、発現レベル及び活性レベルに対して適用される。
【００９８】
「発現又は活性を阻害する」とは、ＲＮＡ又はタンパク質の発現又は活性の低下又は遮断を意味し、必ずしも発現又は活性の完全な消失を示すものではない。
【００９９】
「インスリン抵抗性」とは、脂肪細胞、筋細胞、及び肝臓細胞から正常なインスリン反応を得るのに通常の量のインスリンでは不十分である状態として定義される。脂肪細胞におけるインスリン抵抗性は、貯蔵トリグリセリドの加水分解を引き起こし、血漿中の遊離脂肪酸を増加させる。筋肉中におけるインスリン抵抗性はグルコースの取込みを減らすが、肝臓におけるインスリン抵抗性はグルコースの貯蔵を減らし、どちらの影響も血糖を上昇させる。インスリン抵抗性による高血漿濃度のインスリン及びグルコースはメタボリックシンドローム及び２型糖尿病を招くことが多い。
【０１００】
「インスリン感受性」とは、個体がグルコースをどれだけ効果的に処理するかの尺度である。インスリン感受性の高い個体はグルコースを効果的に処理するが、インスリン感受性の低い個体はグルコースを効果的に処理しない。
【０１０１】
「ヌクレオシド間結合」とは、ヌクレオシド間の化学結合を意味する。
【０１０２】
「静脈内投与」とは、静脈中への投与を意味する。
【０１０３】
「連結されたヌクレオシド」とは、結合された隣接ヌクレオシドを意味する。
【０１０４】
「脂質低下」とは、対象における１種類以上の脂質の低下を意味する。脂質低下は、ある期間にわたり１又は複数の投薬によって起こり得る。
【０１０５】
「脂質低下療法」又は「脂質低下剤」とは、対象において１種類以上の脂質を低減するために対象に与えられる治療レジメンを意味する。特定の実施形態では、脂質低下療法は、対象においてＣＥＴＰ、ＡｐｏＢ、総コレステロール、ＬＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ、ＩＤＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃ、トリグリセリド、小粒子ＬＤＬ粒子、及びＬｐ（ａ）の１又は複数を低減するために与えられる。脂質低下療法の例としては、スタチン、フィブラート、ＭＴＰ阻害剤が含まれる。
【０１０６】
「リポプロテイン」、例えばＶＬＤＬ、ＬＤＬ、及びＨＤＬとは、血清、血漿、及びリンパ中に見られる一群のタンパク質を意味し、脂質輸送に重要である。各リポプロテインの化学的組成は、ＨＤＬでは脂質に対するタンパク質の比率が高いがＶＬＤＬでは脂質に対するタンパク質の比率が低い点で異なる。
【０１０７】
「低比重リポプロテイン−コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）」とは、低比重リポプロテイン粒子中で運搬されているコレステロールを意味する。血清（血漿）中のＬＤＬ−Ｃ濃度は一般的にｍｇ／ｄＬ又はｎｍｏｌ／Ｌで定量化される。「血清ＬＤＬ−Ｃ」及び「血漿ＬＤＬ−Ｃ」とは、それぞれ血清及び血漿中のＬＤＬ−Ｃを意味する。
【０１０８】
「主要危険因子」とは、特定の疾患又は状態に対する高いリスクの一因となる因子を意味する。特定の実施形態では、冠動脈心疾患の主要危険因子として、限定されるものではないが、喫煙、高血圧、低ＨＤＬ−Ｃ、冠動脈心疾患の家族歴、年齢、及び本明細書に開示されているその他の因子が含まれる。
【０１０９】
「代謝障害」又は「代謝性疾患」とは、代謝機能の変化又は障害を特徴とする状態を意味する。「代謝性」及び「代謝」は当該技術分野で周知の用語であり、一般的に、生きた生物内で起こる全範囲の生化学的プロセスを含む。代謝障害には、限定されるものではないが、高血糖症、糖尿病前症、糖尿病（１型及び２型）、肥満、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、及び２型糖尿病による脂質異常症が含まれる。
【０１１０】
「メタボリックシンドローム」とは、代謝起源の脂質及び脂質でない心血管系危険因子のクラスタリングを特徴とする状態を意味する。特定の実施形態では、メタボリックシンドロームは、以下の因子のいずれか３つの存在により同定される：腹囲が男性で１０２ｃｍ超、女性で８８ｃｍ超；血清トリグリセリドが少なくとも１５０ｍｇ／ｄＬ；ＨＤＬ−Ｃが男性で４０ｍｇ／ｄＬ未満、女性で５０ｍｇ／ｄＬ未満；血圧が少なくとも１３０／８５ｍｍＨｇ；及び空腹時血糖が少なくとも１１０ｍｇ／ｄＬ。これらの決定因子は診療により容易に測定可能である（ＪＡＭＡ，  ２００１，  ２８５：  ２４８６−２４９７）。
【０１１１】
「ミスマッチ」又は「非相補的核酸塩基」とは、第１の核酸の核酸塩基が第２又は標的の核酸の対応する核酸塩基と対形成できない場合を意味する。
【０１１２】
「混合型脂質異常症」とは、コレステロールの上昇及びトリグリセリドの上昇を特徴とする状態を意味する。
【０１１３】
「修飾ヌクレオシド間結合」とは、天然のヌクレオシド間結合（すなわちホスホジエステルヌクレオシド間結合）からの置換又は任意の変化を意味する。
【０１１４】
「修飾核酸塩基」とは、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、又はウラシル以外の任意の核酸塩基を意味する。「非修飾核酸塩基」とは、プリン塩基のアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）を意味する。
【０１１５】
「修飾ヌクレオシド」とは、独立して、修飾糖部分又は修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを意味する。
【０１１６】
「修飾ヌクレオチド」とは、独立して、修飾糖部分、修飾ヌクレオシド間結合、又は修飾核酸塩基を有するヌクレオチドを意味する。「修飾ヌクレオシド」とは、独立して、修飾糖部分又は修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを意味する。
【０１１７】
「修飾オリゴヌクレオチド」とは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを意味する。
【０１１８】
「修飾糖」とは、天然糖からの置換又は変化を意味する。
【０１１９】
「モチーフ」とは、アンチセンス化合物中の化学的に異なる領域のパターンを意味する。
【０１２０】
「ＭＴＰ阻害剤」とは、酵素、ミクロソームトリグリセリド転送タンパク質を阻害する薬剤を意味する。
【０１２１】
「天然ヌクレオシド間結合」とは、３’→５’ホスホジエステル結合を意味する。
【０１２２】
「天然糖部分」とは、ＤＮＡ（２’−Ｈ）又はＲＮＡ（２’−ＯＨ）中に見出される糖を意味する。
【０１２３】
「非アルコール性脂肪性肝疾患」又は「ＮＡＦＬＤ」とは、アルコールの過剰摂取（例えばアルコール消費量が２０ｇ／日を超える）によるものでない肝臓の脂肪炎症を特徴とする状態を意味する。特定の実施形態では、ＮＡＦＬＤは、インスリン抵抗性及びメタボリックシンドロームに関連する。ＮＡＦＬＤには、単純な肝細胞中へのトリグリセリド蓄積（脂肪肝）から炎症を伴う脂肪肝（脂肪性肝炎）、線維症、硬変症までにわたる疾患が含まれる。
【０１２４】
「非アルコール性脂肪性肝炎」（ＮＡＳＨ）は、ＮＡＦＬＤがトリグリセリドの沈着から更に進行して起こる。ＮＡＳＨの発症には、壊死、炎症、線維症を誘導できる「ｓｅｃｏｎｄ  ｈｉｔ」が必要である。ｓｅｃｏｎｄ  ｈｉｔの候補は、酸化ストレスの増加を起こす因子及び炎症促進性サイトカインの発現を促進する因子の広いカテゴリーに分類することができる。
【０１２５】
「核酸」とは、単量体ヌクレオチドで構成される分子を意味する。核酸には、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、一本鎖核酸、二本鎖核酸、低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれる。核酸は１分子中にこれらのエレメントの組合せを含んでもよい。
【０１２６】
「核酸塩基」とは、別の核酸の塩基と対形成できるヘテロ環部分を意味する。
【０１２７】
「核酸塩基相補性」とは、別の核酸塩基と塩基対形成できる核酸塩基を意味する。例えば、ＤＮＡでは、アデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）に相補的である。例えば、ＲＮＡでは、アデニン（Ａ）はウラシル（Ｕ）に相補的である。特定の実施形態では、相補的核酸塩基は、その標的核酸の核酸塩基と塩基対形成できるアンチセンス化合物の核酸塩基を意味する。例えば、アンチセンス化合物の特定の位置の核酸塩基が標的核酸の特定の位置の核酸塩基と水素結合を形成することができる場合、そのオリゴヌクレオチドと標的核酸はその核酸塩基対において相補的であると見なされる。
【０１２８】
「核酸塩基配列」とは、如何なる糖、結合、又は核酸塩基修飾とも無関係の、連続核酸塩基の順番を意味する。
【０１２９】
「ヌクレオシド」とは、糖に連結した核酸塩基を意味する。
【０１３０】
「ヌクレオシド模倣物（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃ）」には、オリゴマー化合物の１又は複数の位置で糖又は糖及び塩基並びに必要に応じて結合を置換するために使用される構造が含まれ、例えば、モルホリノ、シクロヘキセニル、シクロヘキシル、テトラヒドロピラニル、ビシクロ、又はトリシクロ糖模倣物、例えば非フラノース糖単位、を有するヌクレオシド模倣物が含まれる。
【０１３１】
「ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基を有するヌクレオシドを意味する。
【０１３２】
「ヌクレオチド模倣物」は、例えばペプチド核酸又はモルホリノ（−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又は他の非ホスホジエステル結合により連結されたモルホリノ）等の、オリゴマー化合物の１又は複数の位置でヌクレオシド及び結合を置換するために使用される構造を含む。
【０１３３】
「オリゴマー化合物」又は「オリゴマー」とは、２種以上のサブ構造を含み且つ核酸分子の領域にハイブリダイズできる高分子構造を意味する。特定の実施形態では、オリゴマー化合物は、オリゴヌクレオシドである。特定の実施形態では、オリゴマー化合物はオリゴヌクレオチドである。特定の実施形態では、オリゴマー化合物はアンチセンス化合物である。特定の実施形態では、オリゴマー化合物はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。特定の実施形態では、オリゴマー化合物はキメラオリゴヌクレオチドである。
【０１３４】
「オリゴヌクレオチド」とは、連結されたヌクレオシドのポリマーを意味し、各ヌクレオシドは互いに独立して修飾されていてもよく、修飾されていなくてもよい。
【０１３５】
「非経口投与」とは、注射又は注入による投与を意味する。非経口投与は、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、腹腔内投与、又は頭蓋内投与、例えば髄腔内投与、又は脳室内投与を含む。投与は、持続投与、慢性投与、短期間投与、又は間欠投与であり得る。
【０１３６】
「ペプチド」とは、アミド結合により少なくとも２個のアミノ酸を連結することにより形成される分子を意味する。ペプチドとは、ポリペプチド及びタンパク質を意味する。
【０１３７】
「薬剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｇｅｎｔ）」とは、個体に投与された時に治療上の利点をもたらす物質を意味する。例えば、特定の実施形態では、ＣＥＴＰを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが薬剤である。
【０１３８】
「医薬組成物」又は「組成物」とは、個体への投与に適した物質の混合物を意味する。例えば、医薬組成物は、１又は複数の活性薬剤及び無菌水溶液を含み得る。
【０１３９】
「薬学的に許容されるキャリア」とは、オリゴヌクレオチドの構造に干渉しない媒体又は希釈剤を意味する。特定のそのようなキャリアは、例えば対象による経口摂取のための錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁液、及びトローチ剤として医薬組成物を製剤化することを可能にする。特定のそのようなキャリアは、注射、注入、又は局所投与用に医薬組成物を製剤化することを可能にする。例えば、薬学的に許容されるキャリアは無菌水溶液であり得る。
【０１４０】
「薬学的に許容される誘導体」は、溶媒和物、水和物、エステル、プロドラッグ、多形、異性体、同位体標識された変種、コンジュゲート、薬学的に許容される塩、及び当該技術分野で公知のその他の誘導体等の本明細書に記載の化合物の誘導体を包含する。
【０１４１】
「薬学的に許容される塩」又は「塩」とは、アンチセンス化合物の生理学的及び薬学的に許容される塩、すなわち元のオリゴヌクレオチドの所望の生物学的活性を保持しており、望ましくない毒性の影響を与えない塩を意味する。「薬学的に許容される塩」又は「塩」という用語は、無機又は有機の酸及び塩基を初めとする薬学的に許容される非毒性の酸又は塩基から調製された塩を含む。本明細書に記載の化合物の「薬学的に許容される塩」は当該技術分野で周知の方法により調製され得る。薬学的に許容される塩の総説については、Ｓｔａｈｌ  ａｎｄ  Ｗｅｒｍｕｔｈ，  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  （Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，  Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ，  ２００２）を参照されたい。アンチセンスオリゴヌクレオチドのナトリウム塩は有用であり、ヒトへの治療的投与によく受け入れられている。したがって、一実施形態では、本明細書に記載の化合物はナトリウム塩の形態である。
【０１４２】
「ホスホロチオエート結合」とは、非架橋酸素原子の１つを硫黄原子で置換することによりホスホジエステル結合が修飾されているヌクレオシド間の結合を意味する。ホスホロチオエート結合は、修飾ヌクレオシド間結合である。
【０１４３】
「部分」又は「一部」とは、核酸の所定の数の連続（すなわち連結された）核酸塩基を意味する。特定の実施形態では、部分又は一部は、標的核酸の所定の数の連続核酸塩基である。特定の実施形態では、部分又は一部は、アンチセンス化合物の所定の数の連続核酸塩基である。
【０１４４】
「防止する」とは、数分から永久までの期間、疾患、障害、又は状態の発症又は発達を遅らせる又は未然に防ぐことを意味する。防止するとは、疾患、障害、又は状態を発達させるリスクを低減することも意味する。
【０１４５】
「プロドラッグ」とは、体内又はその細胞中で内因性の酵素又はその他の化学物質若しくは条件の作用によって活性型（すなわち薬）に変換される不活性型で調製される治療薬剤を意味する。
【０１４６】
「領域」又は「標的領域」は、少なくとも１つの同定可能な構造、機能、又は特徴を有する、標的核酸の部分として定義される。
【０１４７】
「リボヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの糖部分の２’位にヒドロキシを有するヌクレオチドを意味する。リボヌクレオチドは、種々の置換基のいずれかで修飾され得る。
【０１４８】
「第２の薬剤」又は「第２の治療薬剤」とは、「第１の治療薬剤」と併用することができる薬剤を意味する。第２の治療薬剤は、代謝性及び／又は心血管系の疾患を改善、阻害、又は防止する任意の薬剤であり得る。第２の治療薬剤としては、限定されるものではないが、ｓｉＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばＣＥＴＰ又は他の標的を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ得る。第２の薬剤としては更に、抗体（例えば、抗ＣＥＴＰ抗体）、ペプチド阻害剤（例えば、ＣＥＴＰペプチド阻害剤）、コレステロール低下剤、脂質低下剤、血糖低下剤、及び抗炎症剤が含まれ得る。
【０１４９】
「セグメント」は、核酸内の領域のより小さいサブ部分として定義される。例えば、「標的セグメント」は、１又は複数のアンチセンス化合物の標的となる標的核酸のヌクレオチドの配列を意味する。「５’標的部位」とは、標的セグメントの最も５’側のヌクレオチドを意味する。「３’標的部位」とは、標的セグメントの最も３’側のヌクレオチドを意味する。
【０１５０】
本明細書に教示されている「短縮」又は「切断」型のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は標的核酸は、１、２、又はそれ以上のヌクレオシドが欠失している。
【０１５１】
「副作用」とは、所望の効果以外の、処置に起因する生理学的反応を意味する。特定の実施形態では、副作用は、注射部位反応、肝機能検査異常、腎機能異常、肝毒性、腎毒性、中枢神経系異常、ミオパチー、及び倦怠感を含む。例えば、血清中のアミノトランスフェラーゼ濃度の上昇は、肝毒性又は肝機能異常を示し得る。例えば、ビリルビンの上昇は、肝毒性又は肝機能異常を示し得る。
【０１５２】
「一本鎖オリゴヌクレオチド」とは、相補鎖にハイブリダイズしていないオリゴヌクレオチドを意味する。
【０１５３】
「特異的にハイブリダイズできる」とは、所望の効果を誘導するのに十分な程度の相補性をアンチセンスオリゴヌクレオチドと標的核酸との間に有しつつ、特異的結合が望まれる条件下、すなわちインビボアッセイ及び治療処置の場合の生理学的条件下で非標的核酸に対する影響が最低限であるか影響がないアンチセンス化合物を指す。
【０１５４】
「スタチン」とは、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の活性を阻害する薬剤を意味する。
【０１５５】
「対象」とは、処置又は治療法に選択されるヒト又は非ヒト動物を意味する。
【０１５６】
「皮下投与」とは、皮膚の直下での投与を意味する。
【０１５７】
「標的とする」とは、標的核酸に特異的にハイブリダイズして所望の効果を誘導するアンチセンス化合物の設計及び選択プロセスを意味する。
【０１５８】
「標的核酸」、「標的ＲＮＡ」、及び「標的ＲＮＡ転写産物」は全て、アンチセンス化合物の標的となり得る核酸を指す。
【０１５９】
「標的セグメント」とは、アンチセンス化合物の標的となる、標的核酸のヌクレオチドの配列を意味する。「５’標的部位」とは、標的セグメントの最も５’側のヌクレオチドを指す。「３’標的部位」とは、標的セグメントの最も３’側のヌクレオチドを指す。
【０１６０】
「治療的なライフスタイル変化」とは、脂肪／脂肪組織質量及び／又はコレステロールを下げることを意図した食事及びライフスタイルの変化を意味する。そのような変化は心疾患を発達させるリスクを低減することができ、食事から摂取する一日の総カロリー、総脂肪、飽和脂肪、多価不飽和脂肪、一価不飽和脂肪、炭水化物、タンパク質、コレステロール、不溶性繊維についての推奨及び身体活動についての推奨を含み得る。
【０１６１】
「トリグリセリド」又は「ＴＧ」とは、３個の脂肪酸分子と結合したグリセロールからなる脂質又は中性脂肪を意味する。
【０１６２】
「２型糖尿病」（「２型真性糖尿病」、「インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）」、「肥満関連糖尿病」、又は「成人発症型糖尿病」としても知られる）とは、インスリン抵抗性、相対的インスリン欠乏、及び高血糖症を主な特徴とする代謝障害である。
【０１６３】
「処置する」とは、疾患、障害、又は状態を変化又は好転させるために動物に医薬組成物を投与することを意味する。
【０１６４】
「非修飾ヌクレオチド」とは、天然の核酸塩基、糖部分、及びヌクレオシド間結合から構成されるヌクレオチドを意味する。特定の実施形態では、非修飾ヌクレオチドはＲＮＡヌクレオチド（すなわちβ−Ｄ−リボヌクレオシド）又はＤＮＡヌクレオチド（すなわちβ−Ｄ−デオキシリボヌクレオシド）である。
【０１６５】
特定の実施形態
特定の実施形態では、本発明の化合物又は組成物は、ＣＥＴＰを標的とする１０〜３０個のヌクレオシドが連結された長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む。ＣＥＴＰ標的は、配列番号１〜４のいずれか１つから選択される配列を有し得る。
【０１６６】
特定の実施形態では、本発明の化合物又は組成物は、配列番号１〜４の同じ長さの部分に相補的な少なくとも８個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する１０〜３０ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む。
【０１６７】
特定の実施形態では、本発明の化合物又は組成物は、１０〜３０個の連結されたヌクレオシドからなり且つ配列番号１〜４の同じ長さの部分に相補的な少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む。
【０１６８】
特定の実施形態では、本発明の化合物又は組成物は、１０〜３０個の連結されたヌクレオシドからなり得且つ配列番号４１〜１１４のいずれかの少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有し得る。
【０１６９】
特定の実施形態では、以下のアンチセンス化合物又はオリゴヌクレオチドは、ＣＥＴＰ核酸の一領域を標的とし、ＣＥＴＰ  ｍＲＮＡを少なくとも６０％阻害する：配列番号４９、５３、５６、５７、５８、５９、６０、６２、６６、７０、７１、７６、７７、７８、８０、８３、８６、８９、９２、９３、９４、９６、９７、９９、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１３、１１４。
【０１７０】
特定の実施形態では、以下のアンチセンス化合物又はオリゴヌクレオチドは、ＣＥＴＰ核酸の一領域を標的とし、ＣＥＴＰ  ｍＲＮＡを少なくとも６５％阻害する：配列番号４９、５３、５６、５７、５８、５９、６０、６２、６６、７０、７１、７６、７７、７８、８０、８３、８６、８９、９２、９３、９４、９６、９７、９９、１０２、１０５、１０６、１０８、１０９、１１０、１１１、１１３、１１４。
【０１７１】
特定の実施形態では、以下のアンチセンス化合物又はオリゴヌクレオチドは、ＣＥＴＰ核酸の一領域を標的とし、ＣＥＴＰ  ｍＲＮＡを少なくとも７０％阻害する：配列番号４９、５６、５７、５８、５９、６０、６２、６６、７０、７１、７７、８０、８３、８６、９３、９４、９６、９９、１０２、１０５、１０６、１０９、１１０、１１１、１１４。
【０１７２】
特定の実施形態で、以下のアンチセンス化合物又はオリゴヌクレオチドは、ＣＥＴＰ核酸の一領域を標的とし、ＣＥＴＰ  ｍＲＮＡを少なくとも７５％阻害する：配列番号４９、５６、５７、５８、５９、６０、６２、７１、８０、８６、９３、９４、９９、１０２、１０９、１１０、１１４。
【０１７３】
特定の実施形態では、以下のアンチセンス化合物又はオリゴヌクレオチドは、ＣＥＴＰ核酸の一領域を標的とし、ＣＥＴＰ  ｍＲＮＡを少なくとも８０％阻害する：配列番号５７、５８、６２、８０、８６、９４、９９、１０２、１０９、１１０、１１４。
【０１７４】
特定の実施形態では、以下のアンチセンス化合物又はオリゴヌクレオチドは、ＣＥＴＰ核酸の一領域を標的とし、ＣＥＴＰ  ｍＲＮＡを少なくとも８５％阻害する：配列番号５８、６２、８０、８６、１０２、１０９、１１４。
【０１７５】
特定の実施形態では、以下のアンチセンス化合物又はオリゴヌクレオチドは、ＣＥＴＰ核酸の一領域を標的とし、ＣＥＴＰ  ｍＲＮＡを少なくとも９０％阻害する：配列番号５８、１０２、１０９、１１４。
【０１７６】
特定の実施形態では、アンチセンス化合物又はオリゴヌクレオチドはＣＥＴＰ核酸の一領域を標的とする。特定の実施形態では、ＣＥＴＰ核酸を標的とするアンチセンス化合物又はオリゴヌクレオチドは、配列番号１の以下のヌクレオチド領域を標的とし得る：１３２〜１５１、２３９〜２７８、３０３〜４３５、５１１〜５５０、６１４〜６５４、７０３〜７２２、７７３〜８１２、８４５〜９１０、９９６〜１０４７、１０９３〜１１１２、１１６８〜１１８７、１２０８〜１２９７、１３１８〜１３８４、１４０６〜１４２５、１４４６〜１４９３、１５３９〜１７２７、１７６３〜１７８２。
【０１７７】
特定の実施形態では、ＣＥＴＰ核酸の一領域を標的とする化合物又はオリゴヌクレオチドは、その領域の同じ長さの核酸塩基部分に対して相補的な連続核酸塩基部分を有し得る。例えば、そのような部分は、配列番号１の領域１３２〜１５１、２３９〜２７８、３０３〜４３５、５１１〜５５０、６１４〜６５４、７０３〜７２２、７７３〜８１２、８４５〜９１０、９９６〜１０４７、１０９３〜１１１２、１１６８〜１１８７、１２０８〜１２９７、１３１８〜１３８４、１４０６〜１４２５、１４４６〜１４９３、１５３９〜１７２７、１７６３〜１７８２の同じ長さの部分に相補的な少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個の連続する核酸塩基部分であり得る。
【０１７８】
特定の実施形態では、配列番号１の以下のヌクレオチド領域は、アンチセンス化合物又はオリゴヌクレオチドの標的となった場合、少なくとも６０％のＣＥＴＰ阻害を示す：１３２〜１５１、２３９〜２５８、３０３〜３９６、４１６〜４３５、５１１〜５３０、６１４〜６５４、７７３〜８１２、８４５〜８６４、８９１〜９１０、１０２８〜１０４７、１０９３〜１１１２、１１６８〜１１８７、１２３８〜１２９７、１３４３〜１３８４、１４０６〜１４２５、１４７４〜１４９３、１５３９〜１６９７、１７０８〜１７２７、１７６３〜１７８２。
【０１７９】
特定の実施形態では、配列番号１の以下のヌクレオチド領域は、アンチセンス化合物又はオリゴヌクレオチドの標的となった場合、少なくとも６５％のＣＥＴＰ阻害を示す：１３２〜１５１、２３９〜２５８、３０３〜３９６、４１６〜４３５、５１１〜５３０、６１４〜６５４、７７３〜８１２、８４５〜８６４、８９１〜９１０、１０２８〜１０４７、１０９３〜１１１２、１１６８〜１１８７、１２３８〜１２９７、１３４３〜１３８４、１４０６〜１４２５、１４７４〜１４９３、１５３９〜１５９０、１６１３〜１６９７、１７０８〜１７２７、１７６３〜１７８２。
【０１８０】
特定の実施形態では、配列番号１の以下のヌクレオチド領域は、アンチセンス化合物又はオリゴヌクレオチドの標的となった場合、少なくとも７０％のＣＥＴＰ阻害を示す：１３２〜１５１、３０３〜３９６、４１６〜４３５、５１１〜５３０、６１４〜６５４、７９３〜８１２、８９１〜９１０、１０２８〜１０４７、１０９３〜１１１２、１２５８〜１２９７、１３４３〜１３６２、１４０６〜１４２５、１４７４〜１４９３、１５３９〜１５９０、１６３６〜１６９７、１７６３〜１７８２。
【０１８１】
特定の実施形態では、配列番号１の以下のヌクレオチド領域は、アンチセンス化合物又はオリゴヌクレオチドの標的となった場合、少なくとも７５％のＣＥＴＰ阻害を示す：１３２〜１５１、３０３〜３９６、４１６〜４３５、６３５〜６５４、８９１〜９１０、１０９３〜１１１２、１２５８〜１２９７、１４０６〜１４２５、１４７４〜１４９３、１６３６〜１６７５、１７６３〜１７８２。
【０１８２】
特定の実施形態では、配列番号１の以下のヌクレオチド領域は、アンチセンス化合物又はオリゴヌクレオチドの標的となった場合、少なくとも８０％のＣＥＴＰ阻害を示す：３１３〜３５２、４１６〜４３５、８９１〜９１０、１０９３〜１１１２、１２７８〜１２９７、１４０６〜１４２５、１４７４〜１４９３、１６３６〜１６７５、１７６３〜１７８２。
【０１８３】
特定の実施形態では、配列番号１の以下のヌクレオチド領域は、アンチセンス化合物又はオリゴヌクレオチドの標的となった場合、少なくとも８５％のＣＥＴＰ阻害を示す：３３３〜３５２、４１６〜４３５、８９１〜９１０、１０９３〜１１１２、１４７４〜１４９３、１６３６〜１６５５、１７６３〜１７８２。
【０１８４】
特定の実施形態では、配列番号１の以下のヌクレオチド領域は、アンチセンス化合物又はオリゴヌクレオチドの標的となった場合、少なくとも９０％のＣＥＴＰ阻害を示す：３３３〜３５２、１４７４〜１４９３、１６３６〜１６５５、１７６３〜１７８２。
【０１８５】
特定の実施形態では、本発明の化合物又は組成物は修飾オリゴヌクレオチドの塩を含む。
【０１８６】
特定の実施形態では、本発明の化合物又は組成物は、薬学的に許容されるキャリア又は希釈剤を更に含む。
【０１８７】
特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、修飾オリゴヌクレオチドの全体を基準にした測定で配列番号１〜４のいずれか１つに少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％相補的である。
【０１８８】
特定の実施形態では、本発明の化合物は一本鎖修飾オリゴヌクレオチドからなる。
【０１８９】
特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個の連結されたヌクレオシドからなる。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは２０個の連結されたヌクレオシドからなる。
【０１９０】
特定の実施形態では、前記修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシド間結合は、修飾されたヌクレオシド間結合である。特定の実施形態では、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【０１９１】
特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシドは修飾糖を含む。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、テトラヒドロピラン環でフラノース環が置換された少なくとも１つのテトラヒドロピラン修飾ヌクレオシドを含む。特定の実施形態では、各テトラヒドロピラン修飾ヌクレオシドは
【０１９２】
【化１】
2013527148.tif 000002
（式中、Ｂｘは、保護されていてもよいヘテロ環塩基部分である）で表される。特定の実施形態では、少なくとも１つの修飾糖は二環式糖である。特定の実施形態では、少なくとも１つの修飾糖は、２’−Ｏ−メトキシエチル又は４’（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−２’架橋（式中、ｎは１又は２である）を含む。
【０１９３】
特定の実施形態では、前記修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシドは修飾核酸塩基を含む。特定の実施形態では、修飾核酸塩基は５−メチルシトシンである。
【０１９４】
特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ａ）連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；ｂ）連結されたヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント；及びｃ）連結されたヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントを含む。ギャップセグメントは、５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントの間に位置し、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは修飾糖を含む。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは２０個の連結されたヌクレオシドからなり、ギャップセグメントは１０個の連結されたデオキシヌクレオシドからなり、５’ウィングセグメントは５個の連結されたヌクレオシドからなり、３’ウィングセグメントは５個の連結されたヌクレオシドからなり、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合であり、各シトシンは５−メチルシトシンである。
【０１９５】
特定の実施形態では、本発明の化合物又は組成物は、配列番号１〜４のいずれかの同じ長さの部分に相補的な少なくとも８個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する２０個の連結されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、修飾オリゴヌクレオチドは、ａ）１０個の連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；ｂ）５個の連結されたヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント；及びｃ）５個の連結されたヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントを含む。ギャップセグメントは５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントの間に位置し、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合であり、各シトシン残基は５−メチルシトシンである。
【０１９６】
特定の実施形態は、ＣＥＴＰの発現を阻害するための方法、化合物、及び組成物を提供する。
【０１９７】
特定の実施形態は、本明細書に記載の本発明の化合物を動物に投与することを含む、動物においてＣＥＴＰの発現を低下させる方法を提供する。特定の実施形態では、化合物は、ＣＥＴＰを標的とする１０〜３０個のヌクレオシドが連結された長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む。
【０１９８】
特定の実施形態は、本明細書に記載の本発明の化合物を動物に投与することを含む、動物においてＣＥＴＰ活性を低下させる方法を提供する。特定の実施形態では、化合物は、ＣＥＴＰを標的とする１０〜３０個のヌクレオシドが連結された長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む。
【０１９９】
特定の実施形態は、本明細書に記載の本発明の化合物を動物に投与することを含む、動物においてＨＤＬ濃度を上昇させる及び／又はＨＤＬ活性を上昇させる方法を提供する。特定の実施形態では、化合物は、ＣＥＴＰを標的とする１０〜３０個のヌクレオシドが連結された長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ＨＤＬ濃度及び／又はＨＤＬ活性が少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％上昇する。
【０２００】
特定の実施形態は、本明細書に記載の本発明の化合物を動物に投与することを含む、動物においてＬＤＬ、ＴＧ、又はグルコース濃度を低下させる方法を提供する。特定の実施形態では、化合物は、ＣＥＴＰを標的とする１０〜３０個のヌクレオシドが連結された長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む。
【０２０１】
特定の実施形態は、本明細書に記載の本発明の化合物を動物に投与することを含む、動物においてＬＤＬ／ＨＤＬ比を下げる方法を提供する。特定の実施形態では、化合物は、ＣＥＴＰを標的とする１０〜３０個のヌクレオシドが連結された長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む。
【０２０２】
特定の実施形態は、本明細書に記載の本発明の化合物を動物に投与することを含む、動物において代謝性又は心血管系の疾患を防止又は改善する方法を提供する。特定の実施形態では、化合物は、ＣＥＴＰを標的とする１０〜３０個のヌクレオシドが連結された長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、心血管系疾患はアテローム性動脈硬化症である。
【０２０３】
特定の実施形態は、代謝性又は心血管系の疾患を有する動物を処置する方法であって、ａ）代謝性又は心血管系の疾患を有する前記動物を同定する工程、及びｂ）前記動物に修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を治療有効量投与する工程であって、前記修飾オリゴヌクレオチドが、２０個の連結ヌクレオシドからなり且つ前記修飾オリゴヌクレオチドの全体を基準にした測定で配列番号１〜４のいずれかに対して少なくとも９０％相補的な核酸塩基配列を有する、工程、を含む方法を提供する。
【０２０４】
特定の実施形態では、動物に投与される治療有効量の化合物により、動物において代謝性疾患又は心血管系疾患が軽減される。特定の実施形態では、代謝性又は心血管系疾患は、肥満、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、脂質異常症、冠動脈心疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、高脂肪酸血症、メタボリックシンドローム、又はその任意の組合せである。特定の実施形態では、心血管系疾患は、動脈瘤、アンギナ、不整脈、アテローム性動脈硬化症、脳血管疾患、冠動脈心疾患、高血圧、脂質異常症、高脂血症、又は高コレステロール血症である。脂質異常症は高脂血症、高コレステロール血症、又は高トリグリセリド血症であり得る。ＮＡＦＬＤは脂肪肝又は脂肪性肝炎であり得る。糖尿病は、２型糖尿病又は脂質異常症を伴う２型糖尿病であり得る。
【０２０５】
特定の実施形態では、本発明の化合物の投与により、インスリン感受性、肝臓のインスリン感受性、若しくは心血管系の転帰が向上し得るか又はアテローム硬化性プラーク、動脈硬化病変、肥満、グルコース、脂質、グルコース抵抗性、インスリン抵抗性、若しくはこれらの任意の組合せが低減し得る。
【０２０６】
特定の実施形態では、ＣＥＴＰは表１に示されるＧｅｎＢａｎｋ受託番号のいずれか（配列番号１〜６として本明細書に組み込まれている）で表される配列を有する。特定の実施形態では、ＣＥＴＰはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＴ＿０１０４９８．１５のヌクレオチド１０６０９０００〜１０６３３０００（配列番号４として本明細書に組み込まれている）で表されるヒト配列を有する。特定の実施形態では、ＣＥＴＰはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００７８．１（配列番号２として本明細書に組み込まれている）で表されるヒトｍＲＮＡ配列を有する。
【０２０７】
【表１】
2013527148.tif 000003
【０２０８】
特定の実施形態では、動物はヒトである。
【０２０９】
特定の実施形態では、本発明の化合物又は組成物は第１の薬剤として指定される。特定の実施形態では、本発明の方法は、第１及び第２の薬剤を投与することを含む。特定の実施形態では、第１の薬剤及び第２の薬剤は共投与される。特定の実施形態では、第１の薬剤及び第２の薬剤は逐次又は間欠的に共投与される。
【０２１０】
特定の実施形態では、第２の薬剤はグルコース低下剤である。グルコース低下剤には、限定されるものではないが、治療的なライフスタイル変化、ＰＰＡＲアゴニスト、ジペプチジルペプチダーゼ（ＩＶ）阻害剤、ＧＬＰ−１アナログ、インスリン若しくはインスリンアナログ、インスリン分泌促進物質、ＳＧＬＴ２阻害剤、ヒトアミリンアナログ、ビグアニド、αグルコシダーゼ阻害剤、又はその組合せが含まれ得る。グルコース低下剤には、限定されるものではないが、メトホルミン、スルホニル尿素、ロシグリタゾン、メグリチニド、チアゾリジンジオン、αグルコシダーゼ阻害剤、又はその組合せが含まれ得る。スルホニル尿素は、アセトヘキサミド、クロルプロパミド、トルブタミド、トラザミド、グリメピリド、グリピジド、グリブリド、又はグリクラジドであり得る。メグリチニドはナテグリニド又はレパグリニドであり得る。チアゾリジンジオンはピオグリタゾン又はロシグリタゾンであり得る。αグルコシダーゼはアカルボース又はミグリトールであり得る。
【０２１１】
特定の実施形態では、第２の薬剤は脂質低下療法である。特定の実施形態では、第２の薬剤はＬＤＬ低下療法である。特定の実施形態では、第２の薬剤はＴＧ低下療法である。特定の実施形態では、第２の薬剤はコレステロール低下療法である。特定の実施形態では、脂質低下療法は、限定されるものではないが、治療的なライフスタイルの変化、スタチン、フィブラート、又はＭＴＰ阻害剤を含み得る。
【０２１２】
特定の実施形態では、投与は非経口投与を含む。
【０２１３】
特定の実施形態は、動物においてＣＥＴＰを低下させるための本明細書に記載されている化合物の使用を提供する。特定の実施形態では、化合物は、配列番号１〜４のいずれかに示されるＣＥＴＰを標的とする１０〜３０個のヌクレオシドが連結された長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む。
【０２１４】
特定の実施形態は、動物においてＨＤＬ及び／又はＨＤＬ活性を上昇させるための本明細書に記載されている化合物の使用を提供する。特定の実施形態では、化合物は、配列番号１〜４のいずれかに示されるＣＥＴＰを標的とする１０〜３０個のヌクレオシドが連結された長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む。
【０２１５】
特定の実施形態は、動物においてＬＤＬ、ＴＧ、又はグルコース濃度を低下させるための本明細書に記載されている化合物の使用を提供する。特定の実施形態では、化合物は、配列番号１〜４のいずれかに示されるＣＥＴＰを標的とする１０〜３０個のヌクレオシドが連結された長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む。
【０２１６】
特定の実施形態は、動物において代謝性疾患又は心血管系疾患又はその症状の１又は複数の処置、改善、遅延、又は防止のための本明細書に記載されている化合物の使用を提供する。特定の実施形態では、化合物は、配列番号１〜４のいずれかに示されるＣＥＴＰを標的とする１０〜３０個のヌクレオシドが連結された長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む。
【０２１７】
特定の実施形態は、代謝性疾患、心血管系疾患、又はその症状の１又は複数の処置、改善、遅延、又は防止のための医薬の製造における本明細書に記載されている化合物の使用を提供する。特定の実施形態では、化合物は、配列番号１〜４のいずれかに示されるＣＥＴＰを標的とする１０〜３０個のヌクレオシドが連結された長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む。
【０２１８】
特定の実施形態は、本明細書に記載されている代謝性疾患、心血管系疾患、又はその症状の１又は複数を処置、防止、又は改善するためのキットであって、ａ）本明細書に記載の化合物；及び必要に応じてｂ）本明細書に記載の追加的薬剤又は療法を含む、キットを提供する。キットは、キットを使用して代謝性疾患又は心血管系疾患の１又は複数を処置、防止、又は改善するための取扱説明書又はラベルを更に含み得る。
【０２１９】
アンチセンス化合物
オリゴマー化合物には、限定されるものではないが、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチドアナログ、オリゴヌクレオチド模倣物、アンチセンス化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びｓｉＲＮＡが含まれる。オリゴマー化合物は、標的核酸に対して「アンチセンス」であり得、これは、水素結合により標的核酸にハイブリダイゼーションできることを意味する。
【０２２０】
特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、５’から３’への方向で書いた時に、それが標的とする標的核酸の標的セグメントの逆向き相補体を含む核酸塩基配列を有する。特定のそのような実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’から３’への方向で書いた時に、それが標的とする標的核酸の標的セグメントの逆向き相補体を含む核酸塩基配列を有する。
【０２２１】
特定の実施形態では、ＣＥＴＰ核酸を標的とするアンチセンス化合物の長さは１０〜３０ヌクレオチドである。言い換えると、アンチセンス化合物は１０〜３０個の連結核酸塩基である。別の実施形態では、アンチセンス化合物は、８〜８０、１０〜８０、１２〜５０、１５〜３０、１８〜２４、１９〜２２、又は２０個の連結された核酸塩基からなる修飾オリゴヌクレオチドを含む。特定のそのような実施形態では、アンチセンス化合物は、長さが８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、若しくは８０個、又は上記値の任意の２つにより定義される範囲の連結された核酸塩基からなる修飾オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス化合物はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０２２２】
特定の実施形態では、アンチセンス化合物は短縮又は切断された修飾オリゴヌクレオチドを含む。短縮又は切断された修飾オリゴヌクレオチドは、１個のヌクレオシドが、５’末端から欠失していてもよく（５’切断）、中央部分から欠失していてもよく、３’末端から欠失していてもよい（３’切断）。短縮又は切断されたオリゴヌクレオチドは５’末端から２以上のヌクレオシドが欠失していてもよく、中央部分から２以上のヌクレオシドが欠失していてもよく、３’末端から２以上のヌクレオシドが欠失していてもよい。特定の実施形態では、例えば、５’末端から１又は複数のヌクレオシドが欠失しており且つ３’末端から１又は複数のヌクレオシドが欠失しているアンチセンス化合物中で、欠失ヌクレオシドは修飾オリゴヌクレオチド全体に分散していてもよい。
【０２２３】
延長オリゴヌクレオチド中に１個の付加的ヌクレオシドが存在する場合、付加的ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドの５’末端、３’末端、又は中央部分に位置し得る。２以上の付加的ヌクレオシドが存在する場合、例えば２個のヌクレオシドがオリゴヌクレオチドの中央部分、５’末端（５’付加）、又は３’末端（３’付加）に付加されたオリゴヌクレオチドにおいて、付加されたヌクレオシドは互いに隣接してもよい。あるいは、付加されたヌクレオシドは、例えば１又は複数のヌクレオシドが５’末端に付加され、１又は複数のヌクレオシドが３’末端に付加され、且つ／又は１又は複数のヌクレオシドが中央部分に付加されたオリゴヌクレオチドにおいて、アンチセンス化合物の全体に分散し得る。
【０２２４】
活性を消失させることなく、アンチセンスオリゴヌクレオチド等のアンチセンス化合物の長さを長くするか短くすること及び／又はミスマッチ塩基を導入することが可能である。例えば、Ｗｏｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：７３０５−７３０９，  １９９２）は、長さが１３〜２５核酸塩基の一連のアンチセンスオリゴヌクレオチドが卵母細胞注射モデルにおいて標的ＲＮＡに切断を導入する能力を調べている。アンチセンスオリゴヌクレオチドの末端近くに８又は１１個のミスマッチ塩基を有する長さ２５核酸塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ミスマッチを含まないアンチセンスオリゴヌクレオチドより程度は低かったが、標的ｍＲＮＡの特異的切断を方向付けることができた。同様に、１又は３個のミスマッチを有するものを含む１３核酸塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いても標的特異的切断が実現された。
【０２２５】
Ｇａｕｔｓｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ  （Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ９３：４６３−４７１，  Ｍａｒｃｈ  ２００１）は、ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡに１００％の相補性を有し且つｂｃｌ−ｘＬ  ｍＲＮＡに対して３個のミスマッチを有するオリゴヌクレオチドがインビトロ及びインビボでｂｃｌ−２及びｂｃｌ−ｘＬの両方の発現を低下させる能力を実証した。更に、このオリゴヌクレオチドはインビボで強力な抗腫瘍活性を示した。
【０２２６】
Ｍａｈｅｒ  ａｎｄ  Ｄｏｌｎｉｃｋ  （Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．  １６：３３４１−３３５８，  １９８８）では、一連のタンデム型１４核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチド並びに２又は３個のタンデム型アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列で構成されるそれぞれ２８及び４２核酸塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドがヒトＤＨＦＲの翻訳を停止させる能力をウサギ網状赤血球アッセイで調べている。３種類の１４核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドのそれぞれは単独で、２８又は４２核酸塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドほどではないが、翻訳を阻害することができた。
【０２２７】
アンチセンス化合物モチーフ
特定の実施形態では、ＣＥＴＰ核酸を標的とするアンチセンス化合物は、阻害活性の上昇、標的核酸への結合親和性の増大、又は生体内ヌクレアーゼによる分解に対する抵抗性等の特性をアンチセンス化合物に付与するパターン又はモチーフ状に配置された化学的に修飾されたサブユニットを有する。
【０２２８】
キメラアンチセンス化合物は通常、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性の増大、細胞取込みの増加、標的核酸への結合親和性の増大、及び／又は阻害活性の上昇を付与するように修飾された少なくとも１つの領域を含む。キメラアンチセンス化合物の第２の領域が、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞内エンドヌクレアーゼＲＮａｓｅ  Ｈの基質となってもよい。
【０２２９】
ギャップマーモチーフを有するアンチセンス化合物はキメラアンチセンス化合物と見なされる。ギャップマー中、ＲＮａｓａ  Ｈ切断を支援する複数のヌクレオチドを有する内部領域が、内部領域のヌクレオシドとは化学的に異なるヌクレオチドを有する外部領域間に位置する。ギャップマーモチーフを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合、ギャップセグメントが通常エンドヌクレアーゼ切断の基質となり、ウィングセグメントは修飾ヌクレオシドを含む。特定の実施形態では、ギャップマーの領域は、各別個の領域を含む糖部分の種類によって区別される。ギャップマーの領域を区別するために使用される糖部分の種類は、いくつかの実施形態では、β−Ｄ−リボヌクレオシド、β−Ｄ−デオキシリボヌクレオシド、２’−修飾ヌクレオシド（そのような２’−修飾ヌクレオシドには、とりわけ２’−ＭＯＥ及び２’−Ｏ−ＣＨ３が含まれ得る）、及び二環式糖修飾ヌクレオシド（そのような二環式糖修飾ヌクレオシドには４’−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−２’架橋（式中ｎ＝１又はｎ＝２）を有するものが含まれ得る）を含み得る。好ましくは、別個の領域のぞれぞれは同じ糖部分を含む。ウィング−ギャップ−ウィングモチーフはしばしば、「Ｘ−Ｙ−Ｚ」（式中、「Ｘ」は５’ウィング領域の長さを表し、「Ｙ」はギャップ領域の長さを表し、「Ｚ」は３’ウィング領域の長さを表す）で表される。本発明において、「Ｘ−Ｙ−Ｚ」で表されるギャップマーは、５’ウィングセグメント及び３’ウィングセグメントのそれぞれにギャップセグメントがすぐ隣接して位置するような配置である。したがって、５’ウィングセグメントとギャップセグメントの間又はギャップセグメントと３’ウィングセグメントの間には介在ヌクレオチドは存在しない。本明細書に記載されているアンチセンス化合物のいずれもギャップマーモチーフを有し得る。いくつかの実施形態では、Ｘ及びＺが同じであり、別の実施形態では、これらは異なる。好ましい実施形態では、Ｙは８〜１５ヌクレオチドである。Ｘ、Ｙ、又はＺは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又はそれ以上のヌクレオチドのいずれであってもよい。したがって、ギャップマーには、限定されるものではないが、例えば５−１０−５、４−８−４、４−１２−３、４−１２−４、３−１４−３、２−１３−５、２−１６−２、１−１８−１、３−１０−３、２−１０−２、１−１０−１、２−８−２、６−８−６、５−８−５、１−８−１、２−６−２、２−１３−２、１−８−２、２−８−３、３−１０−２、１−１８−２、又は２−１８−２が含まれる。
【０２３０】
特定の実施形態では、「ウィングマー」モチーフとしてのアンチセンス化合物は、ウィング−ギャップ又はギャップ−ウィング配置、すなわちギャップマー配置での上記のＸ−Ｙ又はＹ−Ｚ配置を有する。したがって、ウィングマー配置は、限定されるものではないが、例えば５−１０、８−４、４−１２、１２−４、３−１４、１６−２、１８−１、１０−３、２−１０、１−１０、８−２、２−１３、又は５−１３を含む。
【０２３１】
特定の実施形態では、ＣＥＴＰ核酸を標的とするアンチセンス化合物は、５−１０−５ギャップマーモチーフを有する。
【０２３２】
特定の実施形態では、ＣＥＴＰ核酸を標的とするアンチセンス化合物はギャップ拡張モチーフを有する。
【０２３３】
標的核酸、標的領域、及びヌクレオチド配列
ＣＥＴＰをコードするヌクレオチド配列には、限定されるものではないが、以下のものが含まれる：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ３０１８５．１（本明細書に配列番号１として組み込まれている）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００７８．１（本明細書に配列番号２として組み込まれている）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ８３５７３．１（本明細書に配列番号３として組み込まれている）、又はＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＴ＿０１０４９８．１５のヌクレオチド１０６０９０００〜１０６３３０００（本明細書に配列番号４として組み込まれている）で示される配列。本明細書に含まれる実施例中の各配列番号に示される配列は、糖部分、ヌクレオシド間結合、又は核酸塩基の如何なる修飾についても独立していると理解される。したがって、配列番号により定義されるアンチセンス化合物は、独立して、糖部分、ヌクレオシド間結合、又は核酸塩基への１又は複数の修飾を含み得る。Ｉｓｉｓ番号（Ｉｓｉｓ  Ｎｏ）により記載されるアンチセンス化合物は核酸塩基の配列及びモチーフの組合せを示す。
【０２３４】
特定の実施形態では、標的領域は、標的核酸の構造的に定義される領域である。例えば、標的領域には、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、エクソン、イントロン、エクソン／イントロン接合部、コード領域、翻訳開始領域、翻訳終結領域、又はその他の定義された核酸領域が含まれ得る。ＣＥＴＰの構造的に定義された領域は、ＮＣＢＩ等の配列データベースの受託番号により得ることができ、そのような情報を参照により本明細書に援用する。特定の実施形態では、標的領域は、標的領域内の１つの標的セグメントの５’標的部位から標的領域内の別の標的セグメントの３’標的部位までの配列を含み得る。
【０２３５】
特定の実施形態では、「標的セグメント」は、核酸内の標的領域のより小さなサブ部分である。例えば、標的セグメントは、１又は複数のアンチセンス化合物の標的となる標的核酸のヌクレオチドの配列であり得る。「５’標的部位」とは、標的セグメントの最も５’側のヌクレオチドを指す。「３’標的部位」とは、標的セグメントの最も３’側のヌクレオチドを指す。
【０２３６】
ターゲティングは、所望の効果が生じるようにアンチセンス化合物がハイブリダイズする少なくとも１つの標的セグメントの決定を含む。特定の実施形態では、所望の効果は、ｍＲＮＡ標的核酸レベルの低下である。特定の実施形態では、所望の効果は、標的核酸によってコードされるタンパク質レベルの低下又は標的核酸に関連する表現型の変化である。
【０２３７】
標的領域は１又は複数の標的セグメントを含み得る。標的領域内の複数の標的セグメントが重なっていてもよい。あるいは、それらは重なっていなくてもよい。特定の実施形態では、標的領域内の標的セグメントは約３００以下のヌクレオチドで隔てられている。特定の実施形態では、標的領域内の標的セグメントは、標的核酸上で、２５０、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、若しくは１０ヌクレオチド；約２５０、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、若しくは約１０ヌクレオチド；２５０、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、若しくは１０ヌクレオチド以下；又は約２５０、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、若しくは１０ヌクレオチド以下、又は上記値の任意の２つにより定義される範囲の数のヌクレオチドで隔てられている。特定の実施形態では、標的領域内の標的セグメントは、標的核酸上で、５以下又は約５以下のヌクレオチドで隔てられている。特定の実施形態では、標的セグメントは連続している。本明細書に記載されている５’標的部位又は３’標的部位のいずれかが開始核酸である範囲により定義される標的領域が考えられる。
【０２３８】
好適な標的セグメントは５’ＵＴＲ、コード領域、３’ＵＴＲ、イントロン、エクソン、又はエクソン／イントロン接合部内に見出すことができる。開始コドン又は終止コドンを含む標的セグメントも好適な標的セグメントである。ある好適な標的セグメントは、特に開始コドン又は終止コドン等の特定の構造的に定義される領域を含まないことができる。
【０２３９】
好適な標的セグメントの決定は、標的核酸の配列とゲノム中の他の配列との比較を含み得る。例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて種々の核酸間の類似領域を同定することができる。この比較により、選択された標的核酸以外の配列（すなわち、非標的配列又は標的から離れた配列）に非特異的にハイブリダイズし得るアンチセンス化合物配列の選択を防ぐことができる。
【０２４０】
活性標的領域内のアンチセンス化合物の活性（例えば標的核酸レベルの低下パーセントにより定義される）は様々であり得る。特定の実施形態では、ＣＥＴＰ  ｍＲＮＡレベルの低下がＣＥＴＰタンパク質発現の阻害を示す。ＣＥＴＰタンパク質レベルの低下も標的ｍＲＮＡ発現の阻害を示す。更に、表現型の変化、例えば炎症促進性サイトカイン又はグルコースの濃度低下も、ＣＥＴＰのｍＲＮＡ及び／又はタンパク質発現の阻害を示し得る。
【０２４１】
ハイブリダイゼーション
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアンチセンス化合物とＣＥＴＰ核酸の間でハイブリダイゼーションが起こる。最も一般的なハイブリダイゼーション機構には、核酸分子の相補的核酸塩基間での水素結合（例えば、ワトソン−クリック、フーグスティーン、又は逆フーグスティーン水素結合）が関与する。
【０２４２】
ハイブリダイゼーションは種々の条件下で起こり得る。ストリンジェントな条件下は、配列により異なり、ハイブリダイズされる核酸分子の性質及び組成により決定される。
【０２４３】
配列が標的核酸に特異的にハイブリダイズできるかどうか決定する方法は当該技術分野で周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  Ｅｄ．，  ２００１）。特定の実施形態では、本明細書に記載のアンチセンス化合物はＣＥＴＰ核酸と特異的にハイブリダイズすることができる。
【０２４４】
相補性
アンチセンス化合物及び標的核酸は、アンチセンス化合物の十分な数の核酸塩基が標的核酸の対応する核酸塩基と水素結合して所望の効果（例えば、ＣＥＴＰ核酸等の標的核酸のアンチセンス阻害）を生じさせることができる場合、互いに相補的である。
【０２４５】
アンチセンス化合物は、介在又は隣接するセグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないようにＣＥＴＰ核酸の１又は複数のセグメントにわたってハイブリダイズすることができる（例えば、ループ構造、ミスマッチ、又はヘアピン構造）。
【０２４６】
特定の実施形態では、本明細書に記載のアンチセンス化合物又はその特定の部分は、ＣＥＴＰ核酸、標的領域、標的セグメント、又はその特定の部分に７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％相補的であるか、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％相補的である。アンチセンス化合物の標的核酸との相補性パーセントは、ルーチンな方法を用いて決定することができる。
【０２４７】
例えば、アンチセンス化合物の２０核酸塩基のうちの１８個が標的領域に相補的であってそのため特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物は、９０パーセントの相補性となる。この例では、残りの非相補的核酸塩基は、クラスターを形成してもよく、相補的核酸塩基により散在させられていてもよく、互いに又は相補的核酸塩基と連続していなくてもよい。したがって、長さが１８核酸塩基で、標的核酸に対して完全に相補的な２つの領域に隣接される４個の非相補的核酸塩基を有するアンチセンス化合物は、標的核酸との全体的相補性が７７．８％になるので、本発明の範囲に含まれる。アンチセンス化合物の、標的核酸の一領域との相補性パーセントは、当該技術分野で公知のＢＬＡＳＴプログラム（ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌｓ）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラムを用いてルーチンに決定することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９９０，  ２１５，  ４０３  ４１０；  Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，  １９９７，  ７，  ６４９  ６５６）。パーセント相同性、配列同一性、又は相補性は、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  （Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．，  １９８１，  ２，  ４８２  ４８９）のアルゴリズムを用いるＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、ウィスコンシン州マディソン、ユニバーシティー・リサーチ・パーク）をデフォルトの設定で用いて決定することができる。
【０２４８】
特定の実施形態では、本明細書に記載のアンチセンス化合物又はその特定の部分は、標的核酸又はその特定の部分に完全に相補的（すなわち１００％相補的）である。例えば、アンチセンス化合物は、ＣＥＴＰ核酸、又は標的領域、又は標的セグメント、又はその標的配列に完全に相補的であり得る。本発明において、「完全に相補的」とは、アンチセンス化合物の各核酸塩基が標的核酸の対応する核酸塩基と正確に塩基対形成できることを意味する。例えば、２０核酸塩基のアンチセンス化合物は、長さが４００核酸塩基の標的配列に対して、アンチセンス化合物に対して完全に相補的な標的核酸の対応する２０核酸塩基部分がありさえすれば、完全に（１００％）相補的である。完全に相補的とは、第１及び／又は第２の核酸の特定の部分に言及しても使用され得る。例えば、３０核酸塩基のアンチセンス化合物の２０核酸塩基部分は、長さが４００核酸塩基の標的配列に「完全に相補的」であり得る。３０核酸塩基オリゴヌクレオチドの２０核酸塩基部分は、アンチセンス化合物の２０核酸塩基部分に各核酸塩基が相補的である対応する２０核酸塩基部分を標的配列が有していれば、標的配列に「完全に相補的」である。同時に、アンチセンス化合物の残りの１０核酸塩基も標的配列に相補的であるかどうかに応じて、３０核酸塩基アンチセンス化合物全体が標的配列に完全に相補的であり得る。
【０２４９】
非相補的核酸塩基の位置は、アンチセンス化合物の５’末端又は３’末端であり得る。あるいは、非相補的核酸塩基はアンチセンス化合物の内部の位置にあり得る。２以上の非相補的核酸塩基が存在する場合、これらは、連続（すなわち連結されている）であってもよく、非連続であってもよい。一実施形態では、非相補的核酸塩基はギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドのウィングセグメント中に位置する。
【０２５０】
特定の実施形態では、長さが１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０核酸塩基であるか１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０核酸塩基までであるアンチセンス化合物は、ＣＥＴＰ核酸又はその特定の部分等の標的核酸に対して４個以下、３個以下、２個以下、又は１個以下の非相補的核酸塩基を含む。
【０２５１】
特定の実施形態では、長さが１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０核酸塩基であるか１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０核酸塩基までであるアンチセンス化合物は、ＣＥＴＰ核酸又はその特定の部分等の標的核酸に対して６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、又は１個以下の非相補的核酸塩基を含む。
【０２５２】
本明細書に記載のアンチセンス化合物には、標的核酸の一部に相補的なものも含まれる。本発明において、「一部」又は「部分」とは、標的核酸の領域又はセグメント内の所定の数の連続（すなわち連結された）核酸塩基を指す。「一部」又は「部分」はまた、アンチセンス化合物の所定の数の連続核酸塩基を指すこともある。特定の実施形態では、アンチセンス化合物は標的セグメントの少なくとも８核酸塩基部分に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物は標的セグメントの少なくとも１０核酸塩基部分に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物は標的セグメントの少なくとも１５核酸塩基部分に相補的である。標的セグメントの少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、若しくはそれ以上の核酸塩基部分又はこれらの値の任意の２つにより定義される範囲に相補的なアンチセンス化合物も想定内である。
【０２５３】
同一性
本明細書に記載のアンチセンス化合物は、特定のヌクレオチド配列、配列番号、又は特定のＩｓｉｓ番号で表される化合物の配列、又はその一部に対して所定の同一性パーセントを有してもよい。本発明において、アンチセンス化合物は、同じ核酸塩基対形成能力を有すれば、本明細書に開示されている配列と同一である。例えば、ウラシル及びチミジンはどちらもアデニンと対形成するため、開示されているＤＮＡのチミジンの代わりにウラシルを含むＲＮＡは、ＤＮＡ配列と同一と見なされる。本明細書に記載のアンチセンス化合物の短縮又は延長された形態及び本明細書に記載のアンチセンス化合物と同一でない塩基を有する化合物も想定内である。同一でない塩基は互いに隣接してもよく、アンチセンス化合物全体に分散していてもよい。アンチセンス化合物の同一性パーセントは、比較対象の配列に対して同一の塩基対形成を有する塩基の数を基準に計算される。
【０２５４】
特定の実施形態では、アンチセンス化合物又はその一部は、本明細書に開示されているアンチセンス化合物又は配列番号又はその一部の１又は複数と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である。
【０２５５】
修飾
ヌクレオシドとは塩基と糖が結合したものである。ヌクレオシドの核酸塩基（塩基としても知られる）部分は通常、ヘテロ環塩基部分である。ヌクレオチドとはヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基を更に含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドでは、リン酸基は糖の２’、３’、又は５’ヒドロキシル部分に結合し得る。オリゴヌクレオチドの形成は、隣接するヌクレオシドが互いに共有結合して線状高分子オリゴヌクレオチドが形成されることによる。オリゴヌクレオチド構造内で、リン酸基は通常、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合を形成していると言われる。
【０２５６】
アンチセンス化合物への修飾は、ヌクレオシド間結合、糖部分、又は核酸塩基への置換又は変化を含む。修飾アンチセンス化合物は、例えば細胞取込みの増加、核酸標的への親和性の増大、ヌクレアーゼの存在下における安定性の増大、又は阻害活性の上昇等の所望の特性により、天然型よりも好ましいことが多い。
【０２５７】
化学修飾ヌクレオシドを用いて、その標的核酸への短縮又は切断されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合親和性を増大させることができる。その結果、多くの場合、そのような化学修飾ヌクレオシドを有する、より短いアンチセンス化合物を用いて、同等な結果を得ることができる。
【０２５８】
修飾ヌクレオシド間結合
ＲＮＡ及びＤＮＡの天然のヌクレオシド間結合は３’→５’ホスホジエステル結合である。例えば細胞取込みの増加、標的核酸への親和性の増大、及びヌクレアーゼ存在下での安定性増大等の所望の特性のため、天然のヌクレオシド間結合を有するアンチセンス化合物よりも１又は複数の修飾された（すなわち非天然）ヌクレオシド間結合を有するアンチセンス化合物が選択されることが多い。
【０２５９】
修飾ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドには、リン原子を保持しているヌクレオシド間結合及びリン原子を有さないヌクレオシド間結合が含まれる。代表的なリン含有ヌクレオシド間結合としては、限定されるものではないが、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホロアミダート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、及びホスホロチオエートが含まれる。リン含有結合及びリン非含有結合の調製方法は周知である。
【０２６０】
特定の実施形態では、ＣＥＴＰ核酸を標的とするアンチセンス化合物は１又は複数の修飾ヌクレオシド間結合を含む。特定の実施形態では、修飾ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。特定の実施形態では、アンチセンス化合物の各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【０２６１】
修飾糖部分
本発明のアンチセンス化合物は、糖基が修飾された１又は複数のヌクレオシドを含んでもよい。そのような糖修飾ヌクレオシドは、ヌクレアーゼ安定性の増大、結合親和性の増大、又は何らかのその他の有益な生物学的性質をアンチセンス化合物に付与し得る。特定の実施形態では、ヌクレオシドは、化学修飾されたリボフラノース環部分を含む。化学修飾リボフラノース環の例としては、限定されるものではないが、置換基の付加（５’及び２’置換基；二環式核酸（ＢＮＡ）を形成するための非ジェミナル環原子の架橋を含む）Ｓ、Ｎ（Ｒ）、又はＣ（Ｒ１）（Ｒ）２（Ｒ＝Ｈ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル又は保護基）によるリボシル環酸素原子の置換；及びその組合せが含まれる。化学修飾糖の例としては、２’−Ｆ−５’−メチル置換ヌクレオシド（他の５’，２’−ビス置換ヌクレオシドについては２００８年８月２１日に公開された国際出願公開第２００８／１０１１５７号参照）、２’部位における更なる置換を伴うリボシル環酸素原子のＳによる置換（２００５年６月１６日に公開された米国特許出願第２００５／０１３０９２３号参照）、又はＢＮＡの５’置換（ＬＮＡが例えば５’メチル又は５’−ビニル基で置換されている２００７年１１月２２日に公開された国際出願公開第２００７／１３４１８１号参照）が含まれる。
【０２６２】
修飾糖部分を有するヌクレオシドの例としては、限定されるものではないが、５’−ビニル、５’−メチル（Ｒ又はＳ）、４’−Ｓ、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ３、２’−ＯＣＨ２ＣＨ３、２’−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｆ、及び２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３置換基を含むヌクレオシドが含まれる。２’位の置換基は、アリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ１−Ｃ１０アルキル、ＯＣＦ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、及びＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）（式中、各Ｒｍ及びＲｎは、独立して、Ｈ又は置換若しくは未置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルである）から選択することもできる。
【０２６３】
本発明において、「二環式（ｂｉｃｙｃｌｉｃ）ヌクレオシド」とは、二環式糖部分を含む修飾ヌクレオシドを指す。二環式ヌクレオシドの例としては、限定されるものではないが、４’と２’リボシル環原子の間に架橋を含むヌクレオシドが含まれる。特定の実施形態では、本明細書に記載のアンチセンス化合物は、架橋が４’→２’の二環式ヌクレオシドを含む１又は複数の二環式ヌクレオシドを含む。そのような４’→２’二環式ヌクレオシドの例としては、限定されるものではないが、以下の式のいずれかが含まれる：４’−（ＣＨ２）−Ｏ−２’（ＬＮＡ）；４’−（ＣＨ２）−Ｓ−２’；４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’（ＥＮＡ）；４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’、及び４’−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−Ｏ−２’、及びそのアナログ（２００８年７月１５日に発行された米国特許第７，３９９，８４５号参照）；４’−Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）−Ｏ−２’及びそのアナログ、（２００９年１月８日に公開された国際出願公開第２００９／００６４７８号参照）；４’−ＣＨ２−Ｎ（ＯＣＨ３）−２’及びそのアナログ（２００８年１２月１１日に公開された国際出願公開第２００８／１５０７２９号参照）；４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−２’（２００４年９月２日に公開された米国特許出願公開第２００４／０１７１５７０号参照）；４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’（式中、ＲはＨ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、又は保護基である）（２００８年９月２３日に発行された米国特許第７，４２７，６７２号参照）；４’−ＣＨ２−Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）−２’（Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，２００９，  ７４，  １１８−１３４参照）；並びに４’−ＣＨ２−Ｃ（＝ＣＨ２）−２’及びそのアナログ（２００８年１２月８日に公開された国際出願公開第２００８／１５４４０１号参照）が含まれる。また、例えば、Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．    Ｃｏｍｍｕｎ．，  １９９８，  ４，  ４５５−４５６；Ｋｏｓｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，  １９９８，  ５４，  ３６０７−３６３０；Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．，  ２０００，  ９７，  ５６３３−５６３８；Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．，  １９９８，  ８，  ２２１９−２２２２；Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９８，  ６３，  １００３５−１００３９；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １２９（２６）  ８３６２−８３７９  （Ｊｕｌ．  ４，  ２００７）；Ｅｌａｙａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｎｖｅｎｓ．  Ｄｒｕｇｓ，  ２００１，  ２，  ５５８−５６１；Ｂｒａａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．，  ２００１，  ８，  １−７；Ｏｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．，  ２００１，  ３，  ２３９−２４３；米国特許第７，０５３，２０７号、同第６，２６８，４９０号、同第６，７７０，７４８号、同第６，７９４，４９９号、同第７，０３４，１３３号、同第６，５２５，１９１号��同第６，６７０，４６１号、及び同第７，３９９，８４５号；国際公開第２００４／１０６３５６号、同第１９９４／１４２２６号、同第２００５／０２１５７０号、及び同第２００７／１３４１８１号；米国特許出願公開第２００４／０１７１５７０号（米国特許第７，６９６，３４５号）、同第２００７／０２８７８３１号（米国特許７，５４７，６８４号）、及び同第２００８／００３９６１８号；米国特許出願第１２／１２９，１５４号、同第６０／９８９，５７４号、同第６１／０２６，９９５号、同第６１／０２６，９９８号、同第６１／０５６，５６４号、同第６１／０８６，２３１号、同第６１／０９７，７８７号、及び同第６１／０９９，８４４号；並びに国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６４５９１（国際公開第２００８／１５０７２９号）、同ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６６１５４号（国際公開第２００８／１５４４０１号）、及び同ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６８９２２号（国際公開第２００９／００６４７８号）も参照されたい。上記の二環式ヌクレオシドのそれぞれは、１又は複数の立体化学的糖配置、例えばα−Ｌリボフラノース及びβ−Ｄ−リボフラノースを有するように製造することができる（１９９９年３月２５日に国際公開第９９／１４２２６号として公開されたＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＤＫ９８／００３９３号参照）。
【０２６４】
特定の実施形態では、ＢＮＡヌクレオシドの二環式糖部分は、限定されるものではないが、ペントフラノシル糖部分の４’位と２’位との間に少なくとも１つの架橋を有する化合物を含み、そのような架橋は、以下から独立に選択される１又は２〜４個の連結基を独立に含む：−［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ−、Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、Ｃ（＝ＮＲａ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−Ｓ（＝Ｏ）ｘ−、及びＮ（Ｒａ）−；
式中、
ｘは０、１、又は２であり；
ｎは１、２、３、又は４であり；
各Ｒａ及びＲｂは、独立して、Ｈ、保護基、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ５−Ｃ２０アリール、置換Ｃ５−Ｃ２０アリール、ヘテロ環ラジカル、置換ヘテロ環ラジカル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ５−Ｃ７脂環式ラジカル、置換Ｃ５−Ｃ７脂環式ラジカル、ハロゲン、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＣＯＯＪ１、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、ＣＮ、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）２−Ｊ１）、又はスルホキシル（Ｓ（＝Ｏ）−Ｊ１）であり；
各Ｊ１及びＪ２は、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ５−Ｃ２０アリール、置換Ｃ５−Ｃ２０アリール、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、ヘテロ環ラジカル、置換ヘテロ環ラジカル、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル、又は保護基である。
【０２６５】
特定の実施形態では、二環式糖部分の架橋は、−［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ−、−［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ−Ｏ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−、又は−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−である。特定の実施形態では、架橋は４’−ＣＨ２−２’、４’−（ＣＨ２）２−２’、４’−（ＣＨ２）３−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’、及び４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’−（式中、各Ｒは、独立して、Ｈ、保護基、又はＣ１−Ｃ１２アルキルである）である。
【０２６６】
特定の実施形態では、二環式ヌクレオシドは異性体配置により更に定義される。例えば、４’−２’メチレン−オキシ架橋を含むヌクレオシドは、α−Ｌ配置又はβ−Ｄ配置であり得る。以前に、アンチセンス活性を示すアンチセンスオリゴヌクレオチド中にα−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡが導入されている（Ｆｒｉｅｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２００３，  ２１，  ６３６５−６３７２）。
【０２６７】
特定の実施形態では、二環式ヌクレオシドは、限定されるものではないが、以下に示す（Ａ）α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｂ）β−Ｄ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｃ）エチレンオキシ（４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｄ）アミノオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ、（Ｅ）オキシアミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｆ）メチル（メチレンオキシ）（４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｇ）メチレン−チオ（４’−ＣＨ２−Ｓ−２’）ＢＮＡ、（Ｈ）メチレン−アミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ、（Ｉ）メチル炭素環式（４’−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−２’）ＢＮＡ、及び（Ｊ）プロピレン炭素環式（４’−（ＣＨ２）３−２’）ＢＮＡを含む。
【０２６８】
【化２】
2013527148.tif 000004
式中、Ｂｘは塩基部分であり、Ｒは、独立して、Ｈ、保護基、又はＣ１−Ｃ１２アルキルである。
【０２６９】
特定の実施形態では、二環式ヌクレオシドは式Ｉで表される：
【０２７０】
【化３】
2013527148.tif 000005
式中、
Ｂｘはヘテロ環塩基部分であり；
−Ｑａ−Ｑｂ−Ｑｃ−は、−ＣＨ２−Ｎ（Ｒｃ）−ＣＨ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｃ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒｃ）−、−ＣＨ２−Ｎ（Ｒｃ）−Ｏ−、又は−Ｎ（Ｒｃ）−Ｏ−ＣＨ２であり；
ＲｃはＣ１−Ｃ１２アルキル又はアミノ保護基であり；
Ｔａ及びＴｂはそれぞれ、独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分、又は支持媒体への共有結合である。
【０２７１】
特定の実施形態では、二環式ヌクレオシドは式ＩＩで表される：
【０２７２】
【化４】
2013527148.tif 000006
式中、
Ｂｘはヘテロ環塩基部分であり；
Ｔａ及びＴｂはそれぞれ、独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分、又は支持媒体への共有結合であり；
Ｚａは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換Ｃ２−Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ６アルキニル、アシル、置換アシル、置換アミド、チオール、又は置換チオである。
【０２７３】
一実施形態では、各置換基は、独立して、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、ＯＪｃ、ＮＪｃＪｄ、ＳＪｃ、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊｃ、及びＮＪｅＣ（＝Ｘ）ＮＪｃＪｄ（式中、各Ｊｃ、Ｊｄ、及びＪｅは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、又は置換Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、ＸはＯ又はＮＪｃである）から独立して選択される置換基により一価置換又は多価置換されている。
【０２７４】
特定の実施形態では、二環式ヌクレオシドは式ＩＩＩで表される：
【０２７５】
【化５】
2013527148.tif 000007
式中、
Ｂｘはヘテロ環塩基部分であり；
Ｔａ及びＴｂはそれぞれ、独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分、又は支持媒体への共有結合であり；
ＺｂはＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換Ｃ２−Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ６アルキニル、又は置換アシル（Ｃ（＝Ｏ）−）である。
【０２７６】
特定の実施形態では、二環式ヌクレオシドは式ＩＶで表される：
【０２７７】
【化６】
2013527148.tif 000008
式中、
Ｂｘはヘテロ環塩基部分であり；
Ｔａ及びＴｂはそれぞれ、独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分、又は支持媒体への共有結合であり；
Ｒｄは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、又は置換Ｃ２−Ｃ６アルキニルであり；
各ｑａ、ｑｂ、ｑｃ、及びｑｄは、独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、又は置換Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシル、置換Ｃ１−Ｃ６アルコキシル、アシル、置換アシル、Ｃ１−Ｃ６アミノアルキル、又は置換Ｃ１−Ｃ６アミノアルキルである。
【０２７８】
特定の実施形態では、二環式ヌクレオシドは式Ｖで表される：
【０２７９】
【化７】
2013527148.tif 000009
式中、
Ｂｘはヘテロ環塩基部分であり；
Ｔａ及びＴｂはそれぞれ、独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分、又は支持媒体への共有結合であり；
ｑａ、ｑｂ、ｑｅ、及びｑｆはそれぞれ、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ、置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ、ＯＪｊ、ＳＪｊ、ＳＯＪｊ、ＳＯ２Ｊｊ、ＮＪｊＪｋ、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪｊ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、Ｃ（＝Ｏ）Ｊｊ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）−ＮＪｊＪｋ、又はＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪｊＪｋであるか；
あるいは、ｑｅ及びｑｆが一緒に＝Ｃ（ｑｇ）（ｑｈ）であり；
ｑｇ及びｑｈはそれぞれ独立してＨ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、又は置換Ｃ１−Ｃ１２アルキルである。
【０２８０】
メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡモノマー、アデニン、シトシン、グアニン、５−メチル−シトシン、チミン、及びウラシルの合成及び製造は、そのオリゴマー化及び核酸認識能と共に記載されている（例えば、Ｋｏｓｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，  １９９８，  ５４，  ３６０７−３６３０参照）。ＢＮＡ及びその製造も国際公開第９８／３９３５２号及び同第９９／１４２２６号に記載されている。
【０２８１】
メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、及び２’−チオ−ＢＮＡ、のアナログも製造されている（例えば、Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．，  １９９８，  ８，  ２２１９−２２２２参照）。核酸ポリメラーゼの基質としてオリゴデオキシリボヌクレオチド二本鎖を含むロックドヌクレオシドアナログの製造も記載されている（例えば、Ｗｅｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．の国際公開第９９／１４２２６号参照）。更に、コンホメーションが制限された新規な高親和性オリゴヌクレオチドアナログである２’−アミノ−ＢＮＡの合成も当該技術分野で報告されている（例えば、Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９８，  ６３，  １００３５−１００３９参照）。更に、２’−アミノ−及び２’−メチルアミノ−ＢＮＡが製造されており、相補的ＲＮＡ及びＤＮＡとのその二本鎖の熱安定性が以前に報告されている。
【０２８２】
特定の実施形態では、二環式ヌクレオシドは式ＶＩで表される：
【０２８３】
【化８】
2013527148.tif 000010
式中、
Ｂｘはヘテロ環塩基部分であり；
Ｔａ及びＴｂはそれぞれ、独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分、又は支持媒体への共有結合であり；
各ｑｉ、ｑｊ、ｑｋ、及びｑｌは、独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシル、ＯＪｊ、ＳＪｊ、ＳＯＪｊ、ＳＯ２Ｊｊ、ＮＪｊＪｋ、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪｊ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、Ｃ（＝Ｏ）Ｊｊ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、又はＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪｊＪｋであり；
ｑｉ及びｑｊ又はｑｌ及びｑｋは一緒に、＝Ｃ（ｑｇ）（ｑｈ）（式中、ｑｇ及びｑｈはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、又は置換Ｃ１−Ｃ１２アルキルである）である。
【０２８４】
４’−（ＣＨ２）３−２’架橋を有する１つの炭素環式二環式ヌクレオシド及びアルケニルアナログ、架橋４’−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−２’が報告されている（例えば、Ｆｒｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １９９７，  ２５（２２），  ４４２９−４４４３及びＡｌｂａｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，  ２００６，  ７１，  ７７３１−７７４０参照）。炭素環式二環式ヌクレオシドの合成及び製造並びにそのオリゴマー化及び生化学的研究も報告されている（例えば、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ２００７，  １２９（２６），  ８３６２−８３７９参照）。
【０２８５】
本発明において、「４’−２’二環式ヌクレオシド」又は「４’→２’二環式ヌクレオシド」とはフラノース環の４’位と２’位の間に架橋を含むフラノース環を含む二環式ヌクレオシドを指す。
【０２８６】
本発明において、「単環式ヌクレオシド」とは、二環式糖部分でない修飾糖部分を含むヌクレオシドを指す。特定の実施形態では、ヌクレオシドの糖部分、又は糖部分アナログは、任意の位置で修飾又は置換され得る。
【０２８７】
本発明において、「２’修飾糖」とは２’位で修飾されているフラノシル糖を意味する。特定の実施形態では、そのような修飾として以下から選択される置換基が含まれる：ハライド、例えば、限定されるものではないが、置換及び未置換アルコキシ、置換及び未置換チオアルキル、置換及び未置換アミノアルキル、置換及び未置換アルキル、置換及び未置換アリル、並びに置換及び未置換アルキニル。特定の実施形態では、２’修飾は、限定されるものではないが以下を初めとする置換基から選択される：Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）ＣＨ３、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２（式中、ｎ及びｍは１〜約１０である）。その他の２’置換基を以下から選択することもできる：Ｃ１−Ｃ１２アルキル；置換アルキル；アルケニル；アルキニル；アルカリール；アラルキル；Ｏ−アルカリール又はＯ−アラルキル；ＳＨ；ＳＣＨ３；ＯＣＮ；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ切断基；レポーター基；インターカレーター（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）；並びに薬物動態特性を向上させるための基、アンチセンス化合物の薬力学的特性を向上させるための基、及び同様な特性を有するその他の置換基。特定の実施形態では、修飾ヌクレオシドは２’−ＭＯＥ側鎖を含む（例えば、Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９７，  ２７２，  １１９４４−１２０００参照）。そのような２’−ＭＯＥ置換体は非修飾ヌクレオシド並びに２’−Ｏ−メチル、Ｏ−プロピル、及びＯ−アミノプロピル等のその他の修飾ヌクレオシドと比べて結合親和性が向上していることが報告されている。２’−ＭＯＥ置換基を有するオリゴヌクレオチドがインビボでの使用に有望な特徴を有する遺伝子発現のアンチセンス阻害剤であることも示されている（例えば、Ｍａｒｔｉｎ，  Ｐ．，  Ｈｅｌｖ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ，  １９９５，  ７８，  ４８６−５０４；Ａｌｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｉｍｉａ，  １９９６，  ５０，  １６８−１７６；Ａｌｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓ．，  １９９６，  ２４，  ６３０−６３７；及びＡｌｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  １９９７，  １６，  ９１７−９２６参照）。
【０２８８】
本発明において、「修飾テトラヒドロピランヌクレオシド」又は「修飾ＴＨＰヌクレオシド」とは、通常のヌクレオシド中のペントフラノシル残基の代わりに６員テトラヒドロピラン「糖」（糖代替物（ｓｕｇａｒ  ｓｕｒｒｏｇａｔｅ））が置換挿入されているヌクレオシドを意味する。修飾ＴＨＰヌクレオシドには、限定されるものではないが、当該技術分野でヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、アニトール（ａｎｉｔｏｌ）核酸（ＡＮＡ）、マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）核酸（ＭＮＡ）（Ｌｅｕｍａｎｎ，  ＣＪ．  Ｂｉｏｏｒｇ．  ＆  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  （２００２）  １０：８４１−８５４参照）、フルオロＨＮＡ（Ｆ−ＨＮＡ）と呼ばれるもの、又は式Ｘで表される化合物が含まれる：
式Ｘ：
【０２８９】
【化９】
2013527148.tif 000011
式中、式Ｘで表される前記少なくとも１つのテトラヒドロピランヌクレオシドアナログのそれぞれについて独立して、
Ｂｘはヘテロ環塩基部分であり；
Ｔ３及びＴ４は、それぞれ独立して、テトラヒドロピランヌクレオシドアナログをアンチセンス化合物に連結するヌクレオシド間連結基であるか、Ｔ３及びＴ４の一方が、テトラヒドロピランヌクレオシドアナログをアンチセンス化合物に連結するヌクレオシド間連結基であり、Ｔ３及びＴ４のもう一方が、Ｈ、ヒドロキシル保護基、連結されたコンジュゲート基、又は５’若しくは３’末端基であり；
ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６、及びｑ７は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、又は置換Ｃ２−Ｃ６アルキニルであり；
Ｒ１及びＲ２の一方は水素であり、他方は、ハロゲン、置換又は未置換アルコキシ、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、及びＣＮ（式中、ＸはＯ、Ｓ、又はＮＪ１であり、各Ｊ１、Ｊ２、及びＪ３は、独立して、Ｈ又はＣ１−Ｃ６アルキルである）から選択される。
【０２９０】
特定の実施形態では、ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６、及びｑ７がそれぞれＨである式Ｘの修飾ＴＨＰヌクレオシドが提供される。特定の実施形態では、ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６、及びｑ７の少なくとも１つがＨ以外である。特定の実施形態では、ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６、及びｑ７の少なくとも１つがメチルである。特定の実施形態では、Ｒ１及びＲ２の一方がＦである式Ｘで表されるＴＨＰヌクレオシドが提供される。特定の実施形態では、Ｒ１がフルオロであり且つＲ２がＨであるか、Ｒ１がメトキシであり且つＲ２がＨであるか、あるいはＲ１がメトキシエトキシであり且つＲ２がＨである。
【０２９１】
本発明において、「２’修飾」又は「２’置換」とは、２’位にＨ又はＯＨ以外の置換基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。２’修飾ヌクレオシドには、限定されるものではないが、糖環の２個の炭素原子を連結する架橋が２’炭素と糖環の別の炭素とを連結している二環式ヌクレオシド及びアリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ１−Ｃ１０アルキル、−ＯＣＦ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、又はＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）（式中、各Ｒｍ及びＲｎは、独立して、Ｈ又は置換若しくは未置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルである）等の非架橋型２’置換基を有するヌクレオシドが含まれる。２’修飾ヌクレオシドは、他の修飾を、例えば糖の別の位置及び／又は核酸塩基に、更に含んでもよい。
【０２９２】
本発明において、「２’−Ｆ」とは、２’位にフルオロ基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。
【０２９３】
本発明において、「２’−ＯＭｅ」又は「２’−ＯＣＨ３」、又は「２’−Ｏ−メチル」はそれぞれ、糖環の２’位に−ＯＣＨ３基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。
【０２９４】
本発明において、「ＭＯＥ」又は「２’−ＭＯＥ」、又は「２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３」、又は「２’−Ｏ−メトキシエチル」はそれぞれ、糖環の２’位に−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。
【０２９５】
本発明において、「オリゴヌクレオチド」とは、複数の連結されたヌクレオシドを含む化合物を指す。特定の実施形態では、複数のヌクレオシドの１又は複数が修飾されている。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１又は複数のリボヌクレオシド（ＲＮＡ）及び／又はデオキシリボヌクレオシド（ＤＮＡ）を含む。
【０２９６】
アンチセンス化合物に導入するためにヌクレオシドの修飾に用いることができる多くの他の二環式及び三環式の糖代替物（ｓｕｇａｒ  ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）環系も当該技術分野で周知である（例えば、総説：Ｌｅｕｍａｎｎ，  Ｊ．  Ｃ，  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２００２，  １０，  ８４１−８５４参照）。そのような環系は、活性を上昇させるために種々の更なる置換を受け得る。
【０２９７】
修飾糖の製造方法は当業者に周知である。
【０２９８】
修飾糖部分を有するヌクレオチド中、核酸塩基部分（天然、修飾、又はその組合せ）は適切な核酸標的とのハイブリダイゼーションのために保持される。
【０２９９】
特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、修飾糖部分を有する１又は複数のヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾糖部分は２’−ＭＯＥである。特定の実施形態では、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオチドはギャップマーモチーフ状に配置される。特定の実施形態では、修飾糖部分は二環式ヌクレオシドである。特定の実施形態では、二環式ヌクレオシドは（４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’）架橋を含む。特定の実施形態では、（４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’）二環式ヌクレオチドはギャップマーモチーフのウィング全体に配置される。特定の実施形態では、二環式ヌクレオチドはｃＥｔである。特定の実施形態では、ｃＥｔ二環式ヌクレオチドはギャップマーモチーフのウィング全体に配置される。
【０３００】
修飾核酸塩基
核酸塩基（又は塩基）の修飾又は置換は、天然又は合成の非修飾核酸塩基とは構造的に識別可能であるが、機能的には同等である。天然核酸塩基及び修飾核酸塩基はどちらも水素結合に関わることができる。そのような核酸塩基修飾は、ヌクレアーゼ安定性、結合親和性、又はその他の有益な生物学的性質をアンチセンス化合物に付与することができる。修飾核酸塩基は、合成及び天然の核酸塩基、例えば５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）を含む。５−メチルシトシン置換等の特定の核酸塩基置換は、標的核酸へのアンチセンス化合物の結合親和性を増大させるのに特に有用である。例えば、５−メチルシトシン置換は、核酸二本鎖の安定性を０．６〜１．２℃上昇させることが示されている（Ｓａｎｇｈｖｉ，  Ｙ．Ｓ．，  Ｃｒｏｏｋｅ，  Ｓ．Ｔ．  ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，  Ｂ．，  ｅｄｓ．，  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  １９９３，  ｐｐ．  ２７６−２７８）。
【０３０１】
更なる非修飾核酸塩基としては、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、並びにアデニン及びグアニンのその他のアルキル誘導体、２−プロピル並びにアデニン及びグアニンのその他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシル及びシトシン、並びにピリミジン塩基のその他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、及び６−アゾチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、並びに他の８―置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、並びにその他の５置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン、並びに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンが含まれる。
【０３０２】
ヘテロ環式塩基部分には、プリン又はピリミジン塩基が他のヘテロ環で置換されたもの、例えば７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、及び２−ピリドンも含まれ得る。アンチセンス化合物の結合親和性を増大させるのに特に有用な核酸塩基としては、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、並びにＮ−２、Ｎ−６、及びＯ−６置換プリン、例えば２アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、及び５−プロピニルシトシンが含まれる。
【０３０３】
特定の実施形態では、ＣＥＴＰ核酸を標的とするアンチセンス化合物は１又は複数の修飾核酸塩基を含む。特定の実施形態では、ＣＥＴＰ核酸を標的とするギャップ拡張アンチセンスオリゴヌクレオチドは１又は複数の修飾核酸塩基を含む。特定の実施形態では、修飾核酸塩基は５−メチルシトシンである。特定の実施形態では、各シトシンは５−メチルシトシンである。
【０３０４】
医薬組成物を製剤化するための組成物及び方法
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬組成物又は医薬製剤を製造するために薬学的に許容される活性又は不活性な物質と混合され得る。医薬組成物を製剤化するための組成物及び方法は、いくつかの基準、例えば、限定されるものではないが、投与経路、疾患の程度、又は投与される用量によって異なる。
【０３０５】
ＣＥＴＰ核酸を標的とするアンチセンス化合物は、アンチセンス化合物を好適な薬学的に許容される希釈剤又はキャリアと組み合わせることにより医薬組成物中で使用することができる。
【０３０６】
特定の実施形態では、「医薬キャリア」又は「賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）」は、１又は複数の核酸を動物に送達するための薬学的に許容される溶媒、懸濁剤、又は任意のその他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は液体であっても固体であってもよく、想定する投与形態と共に、核酸及び所定の医薬組成物のその他の構成要素とを組み合わせた時に所望の嵩、粘稠性等が得られるように選択することができる。典型的な医薬キャリアとしては、限定されるものではないが、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、又はヒドロキシプロピルメチルセルロース等）；充填剤（例えば、ラクトース及びその他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、又はリン酸水素カルシウム等）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等）；崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム等）；及び湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）が含まれる。
【０３０７】
本発明の組成物を製剤化するために、非経口又は経口投与に適した、核酸と有害な反応をしない薬学的に許容される有機又は無機賦形剤を用いてもよい。好適な薬学的に許容されるキャリアには、限定されるものではないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が含まれる。
【０３０８】
薬学的に許容される希釈剤には、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。ＰＢＳは、非経口的に送達すべき組成物中での使用に適した希釈剤である。したがって、一実施形態では、ＣＥＴＰ核酸を標的とするアンチセンス化合物及び薬学的に許容される希釈剤を含む医薬組成物が本明細書に記載の方法で使用される。特定の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤はＰＢＳである。特定の実施形態では、アンチセンス化合物はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０３０９】
アンチセンス化合物を含む医薬組成物は、ヒトを初めとする動物に投与された時に生物学的に活性な代謝物質又はその残分を（直接又は間接的に）形成することができる薬学的に許容される塩、エステル、又はそのようなエステルの塩、又はオリゴヌクレオチドを包含する。したがって、例えば、本開示は、アンチセンス化合物の薬学的に許容される塩、プロドラッグ、そのようなプロドラッグの薬学的に許容される塩、及びその他の生物学的等価物にも関する。好適な薬学的に許容される塩には、限定されるものではないが、ナトリウム塩及びカリウム塩が含まれる。
【０３１０】
プロドラッグは、アンチセンス化合物の一端又は両端において付加的ヌクレオシドの導入を含み得、これが体内で内因性ヌクレアーゼにより切断されて活性アンチセンス化合物を形成する。
【０３１１】
コンジュゲートされたアンチセンス化合物
アンチセンス化合物は、得られるアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、又は細胞取込みを向上させる１又は複数の部分又はコンジュゲートに共有結合していてよい。典型的なコンジュゲート基としては、コレステロール部分及び脂質部分が含まれる。更なるコンジュゲート基として、炭水化物、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び色素が含まれる。
【０３１２】
アンチセンス化合物は、例えばヌクレアーゼ安定性等の特性を向上させるために、一般的にアンチセンス化合物の一端又は両端に付加される１又は複数の安定基を有するように修飾されてもよい。安定基には、キャップ構造が含まれる。これらの末端修飾は、末端核酸を有するアンチセンス化合物をエキソヌクレアーゼ分解から保護し、細胞内における送達及び／又は局在化を支援することができる。キャップは、５’末端（５’キャップ）又は３’末端（３’キャップ）に存在し得、又は両端に存在し得る。キャップ構造は、当該技術分野で周知であり、例えば逆方向デオキシ脱塩基キャップ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄｅｏｘｙ  ａｂａｓｉｃ  ｃａｐ）を含む。ヌクレアーゼ安定性を付与するようにアンチセンス化合物の一端又は両端をキャップするために使用することができる更なる３’及び５’−安定基としては、２００３年１月１６日に公開された国際公開第０３／００４６０２号に開示されているものが含まれる。
【０３１３】
細胞培養及びアンチセンス化合物処置
ＣＥＴＰ核酸のレベル、活性、又は発現に対するアンチセンス化合物の効果は、種々の細胞タイプでインビトロで試験することができる。このような分析に使用される細胞タイプは、市販されており（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、バージニア州マナッサス；Ｚｅｎ−Ｂｉｏ社（Ｚｅｎ−Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．）、ノースカロライナ州リサーチ・トライアングル・パーク；クロンティックス社（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、メリーランド州ウォーカーズビル）、細胞は市販の試薬（例えば、インビトロジェン・ライフテクノロジーズ社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カリフォルニア州カールズバッド）を用いてメーカーの使用説明書に従って培養される。例示的な細胞タイプとしては、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、Ｈｕｈ７（肝細胞癌）細胞、初代培養肝細胞、Ａ５４９細胞、ＧＭ０４２８１線維芽細胞、及びＬＬＣ−ＭＫ２細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０３１４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドのインビトロ試験
アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて細胞を処置する方法を本明細書に記載する。これは他のアンチセンス化合物を用いた処置用に適切に改変することができる。
【０３１５】
一般に、細胞が培養液中で約６０〜８０％のコンフルエンシーに達した時点で、細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置する。
【０３１６】
培養細胞中にアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入するために一般的に使用される試薬の１つとして、カチオン性脂質トランスフェクション試薬リポフェクチン（登録商標）（インビトロジェン社、カリフォルニア州カールズバッド）が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）  １（インビトロジェン社、カリフォルニア州カールズバッド）中でリポフェクチン（登録商標）と混合して、所望の終濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリポフェクチン（登録商標）濃度（典型的には、１００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチド当たり２〜１２μｇ／ｍＬ）を得る。
【０３１７】
培養細胞中にアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入するために使用される別の試薬には、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ２０００（登録商標）（インビトロジェン社、カリフォルニア州カールズバッド）が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）  １  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｓｅｒｕｍ  ｍｅｄｉｕｍ（インビトロジェン社、カリフォルニア州カールズバッド）中でＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ２０００（登録商標）と混合して、所望の濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチド及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）濃度（典型的には、１００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチド当たり２〜１２μｇ／ｍＬ）を得る。
【０３１８】
培養細胞中にアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入するために使用される別の試薬には、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（インビトロジェン社、カリフォルニア州カールズバッド）が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）  １  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｓｅｒｕｍ  ｍｅｄｉｕｍ（インビトロジェン社、カリフォルニア州カールズバッド）中でＣｙｔｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）と混合して、所望の濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチド及びＣｙｔｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）濃度（典型的には、１００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチド当たり２〜１２μｇ／ｍＬ）を得る。
【０３１９】
培養細胞中にアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入するために使用される別の試薬には、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（インビトロジェンライフテクノロジーズ社、カリフォルニア州カールズバッド）が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）−１  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｓｅｒｕｍ  ｍｅｄｉｕｍ（インビトロジェンライフテクノロジーズ社、カリフォルニア州カールズバッド）中でＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）と混合して、オリゴヌクレオチドに対するＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）の割合が１００ｎＭ当たり約０．２〜０．８μＬである所望の濃度のオリゴヌクレオチドを得る。
【０３２０】
培養細胞中にアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入するために使用される別の試薬には、ＦｕＧＥＮＥ  ６（ロシュ・ダイアグノスティックス社、インディアナ州インディアナポリス）が含まれる。アンチセンスオリゴマー化合物を１ｍＬの無血清ＲＰＭＩ中でＦｕＧＥＮＥ  ６と混合して、オリゴマー化合物に対するＦｕＧＥＮＥ  ６の割合が１００ｎＭ当たり１〜４μＬである所望の濃度のオリゴヌクレオチドを得た。
【０３２１】
培養細胞中にアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入するために使用される別の技術には、エレクトロポレーション（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  Ｅｄ．，  ２００１）が含まれる。
【０３２２】
細胞は、ルーチンな方法によって、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置される。細胞は通常、アンチセンスオリゴヌクレオチド処置の１６〜２４時間後に回収され、その時点での標的核酸のＲＮＡ又はタンパク質レベルを、当該技術分野で周知の方法及び本明細書に記載の方法により測定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．  ２００１）。一般的に、処置を複数の複製物（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）で行う場合、データは複製物の処置の平均で表される。
【０３２３】
使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度はセルラインによって異なる。特定のセルラインに最適なアンチセンスオリゴヌクレオチド濃度の決定方法は当該技術分野で周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．  ２００１）。  アンチセンスオリゴヌクレオチドは通常、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００（登録商標）（インビトロジェン社、カリフォルニア州カールズバッド）、リポフェクチン（登録商標）（インビトロジェン社、カリフォルニア州カールズバッド）、又はＣｙｔｏｆｅｃｔｉｎ（商標）（ジェンランティス社（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いてトランスフェクトされる場合、１〜３００ｎＭの濃度で使用される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、エレクトロポレーションを用いてトランスフェクトされる場合、より高濃度の６２５〜２０，０００ｎＭで使用される。
【０３２４】
ＲＮＡ単離
ＲＮＡ分析は、全細胞ＲＮＡ又はポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡに対して行われ得る。ＲＮＡ単離方法は当該技術分野で周知である。ＲＮＡは、当該技術分野で周知の方法を用いて、例えばＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬（インビトロジェン社、カリフォルニア州カールズバッド）をメーカーが推奨するプロトコールに従って用いて、調製される。
【０３２５】
標的レベル又は発現の阻害の分析
ＣＥＴＰ核酸のレベル又は発現の阻害は、当該技術分野で公知の種々の方法で調べることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．  ２００１）。例えば、標的核酸レベルは、例えばノーザンブロット解析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、又は定量的リアルタイムＰＣＲにより定量化することができる。ＲＮＡ分析は、全細胞ＲＮＡ又はポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡに対して行うことができる。ＲＮＡの単離方法は当該技術分野で周知である。ノーザンブロット解析も当該技術分野でルーチンである。カリフォルニア州フォスターシティーのＰＥ−アプライドバイオシステムズ社から市販されているＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）  ７６００、７７００、又は７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍをメーカーの取扱説明書に従って用いて、定量的リアルタイムＰＣＲを便利に行うことができる。
【０３２６】
標的ＲＮＡレベルの定量的リアルタイムＰＣＲ分析
ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）  ７６００、７７００、又は７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ−アプライドバイオシステムズ社、カリフォルニア州フォスターシティー）をメーカーの取扱説明書に従って用いる定量的リアルタイムＰＣＲにより、標的ＲＮＡレベルを定量化することができる。定量的リアルタイムＰＣＲの方法は当該技術分野で周知である。
【０３２７】
リアルタイムＰＣＲの前に、単離されたＲＮＡを逆転写酵素（ＲＴ）反応に供し、これにより、その後リアルタイムＰＣＲ増幅の基質として使用される相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が生成される。ＲＴ及びリアルタイムＰＣＲ反応は同じサンプルウェル中で続けて行われる。ＲＴ及びリアルタイムＰＣＲ試薬はインビトロジェン社（カリフォルニア州カールズバッド）から入手する。ＲＴ及びリアルタイムＰＣＲ反応は当業者に周知の方法により行われる。
【０３２８】
リアルタイムＰＣＲにより得られる遺伝子（又はＲＮＡ）標的の量は、シクロフィリンＡ等の発現が一定の遺伝子の発現レベルを用いることにより、あるいはＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）（インビトロジェン社、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて全ＲＮＡを定量化することにより、標準化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅ）することができる。シクロフィリンＡ発現は、標的と同時、多重、又は別個に行われるリアルタイムＰＣＲにより定量化される。全ＲＮＡは、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）  ＲＮＡ定量試薬（インビトロジェン社、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて定量化される。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によるＲＮＡ定量方法はＪｏｎｅｓ，  Ｌ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９９８，  ２６５，  ３６８−３７４）に教示されている。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）の蛍光を測定にはＣＹＴＯＦＬＵＯＲ（登録商標）  ４０００機器（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いる。
【０３２９】
プローブ及びプライマーはＣＥＴＰ核酸にハイブリダイズするように設計される。リアルタイムＰＣＲ用のプローブ及びプライマーの設計方法は、当該技術分野で周知であり、ＰＲＩＭＥＲ  ＥＸＰＲＥＳＳ（登録商標）  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（アプライドバイオシステムズ社、カリフォルニア州フォスターシティー）等のソフトウェアの使用を含み得る。
【０３３０】
ＲＴ、リアルタイムＰＣＲにより得られる遺伝子標的の量は、発現が一定であるＧＡＰＤＨ又はシクロフィリンＡ遺伝子の発現レベルを用いることにより、あるいはＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）（モレキュラー・プローブ社、オレゴン州ユージーン）を用いて全ＲＮＡを定量化することにより標準化した。ＧＡＰＤＨ又はシクロフィリンＡの発現は、標的と同時、多重、又は別個に行われるＲＴ、リアルタイムＰＣＲにより定量化することができる。全ＲＮＡは、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）  ＲＮＡ定量試薬（モレキュラー・プローブ社、オレゴン州ユージーン）を用いて定量化した。
【０３３１】
本明細書に記載の細胞タイプ中におけるＧＡＰＤＨ又はシクロフィリンＡの発現を測定するために使用するプライマー及びプローブを表２に示す。ＰＣＲプローブは、５’末端に共有結合したＪＯＥ若しくはＦＡＭ又は３’末端に共有結合したＴＡＭＲＡ若しくはＭＧＢを有する。ここで、ＪＯＥ又はＦＡＭは蛍光レポーター色素であり、ＴＡＭＲＡ又はＭＧＢは消光色素である。いくつかの細胞タイプでは、異なる種の配列に対して設計されたプライマー及びプローブを用いて発現を測定する。例えば、ヒトＧＡＰＤＨのプライマー及びプローブセットは、サル由来の細胞及びセルラインにおけるＧＡＰＤＨの発現測定に使用することができる。
【０３３２】
【表２】
2013527148.tif 000012
2013527148.tif 000013
【０３３３】
リアルタイムＰＣＲで使用するためのプローブ及びプライマーは、標的特異的配列にハイブリダイズするように設計される。標的特異的ＰＣＲプローブは、５’末端に共有結合したＦＡＭ及び３’末端に共有結合したＴＡＭＲＡ又はＭＧＢを有し得る。ここで、ＦＡＭは蛍光色素であり、ＴＡＭＲＡ又はＭＧＢは消光色素である。
【０３３４】
タンパク質レベルの分析
ＣＥＴＰ核酸のアンチセンス阻害は、ＣＥＴＰタンパク質レベルを測定することにより調べることができる。ＣＥＴＰのタンパク質レベルは、当該技術分野で周知の種々の方法で評価又は定量化することができ、そのような方法としては、例えば免疫沈降、ウェスタンブロット解析（イムノブロッティング）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、定量的タンパク質アッセイ、タンパク質活性アッセイ（例えば、カスパーゼ活性アッセイ）、免疫組織化学、免疫細胞化学、又は蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）が挙げられる。標的に対する抗体は、ＭＳＲＳ抗体カタログ（エアリー社（Ａｅｒｉｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ミシガン州バーミンガム）等の種々の供給元から特定及び入手することができ、あるいは、当該技術分野で周知の従来のモノクローナル又はポリクローナル抗体作製方法により作製することもできる。
【０３３５】
アンチセンス化合物のインビボ試験
アンチセンス化合物、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドを動物中で試験し、ＣＥＴＰの発現を阻害して表現型を変化させる能力を評価する。試験は、通常の動物又は実験用の疾患モデル中で行うことができる。動物への投与では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはリン酸緩衝食塩水等の薬学的に許容される希釈剤中に処方される。投与は、非経口投与経路を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドの投薬量及び投与頻度の計算は、投与経路、動物の体重等の因子により変わる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置期間の後、組織からＲＮＡを単離し、ＣＥＴＰ核酸発現の変化を測定する。ＣＥＴＰタンパク質レベルの変化も測定する。
【０３３６】
特定の適応
特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の１又は複数の医薬組成物の投与を含む個体の処置方法に関する。特定の実施形態では、個体は、炎症性、代謝性、又は心血管系の疾患を有する。
【０３３７】
したがって、本発明は、それを必要とする対象において炎症性、代謝性、又は心血管系の疾患に関連する症状を改善する方法に関する。特定の実施形態では、炎症性、代謝性、又は心血管系の疾患に関連する症状の発症率を低減する方法が提供される。特定の実施形態では、炎症性、代謝性、又は心血管系の疾患に関連する症状の重症度を低減する方法が提供される。そのような実施形態では、方法は、それを必要とする個体に、ＣＥＴＰ核酸を標的とする治療有効量の化合物を投与することを含む。
【０３３８】
特定の実施形態では、ＣＥＴＰ核酸を標的とする治療有効量のアンチセンス化合物の投与と共に、ＣＥＴＰ濃度あるいは炎症性、代謝性、若しくは心血管系、又はＣＥＴＰの発現に関連するその他の疾患のプロセスのマーカーをモニタリングしてアンチセンス化合物の投与に対する個体の反応を決定する。アンチセンス化合物の投与に対する個体の反応は、医師が治療的介入の量及び期間を決定するのに利用される。
【０３３９】
特定の実施形態では、ＣＥＴＰ核酸を標的とするアンチセンス化合物の投与により、ＣＥＴＰの発現が、少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５若しくは９９％、又はこれらの値の任意の２つにより定義される範囲分、低下する。
【０３４０】
特定の実施形態では、ＣＥＴＰを標的とするアンチセンス化合物を含む医薬組成物は、炎症性、代謝性、又は心血管系の疾患に罹患している又はこれらに罹りやすい患者を処置するための医薬の製造に使用される。
【０３４１】
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の連続する核酸塩基部分を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物の投与を含む。
【０３４２】
投与
本発明の化合物又は医薬組成物は、局所的処置が望ましいか、全身処置が望ましいかに応じて、及び処置範囲に応じて、複数の様式で投与することができる。投与は、局所（点眼、並びに膣及び直腸送達等の粘膜を含む）、皮内（皮膚の線維症又は瘢痕の局所的処置のため）、肺（例えば散剤又は噴霧剤の、例えばネブライザーによる、局所的な吸入又は吹送（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）；気管内、鼻腔内、表皮、及び経皮）、経口、又は非経口であり得る。
【０３４３】
特定の実施形態では、本明細書に記載の化合物及び組成物は非経口投与される。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、又は筋肉内の注射又は注入；又は頭蓋内（例えば髄腔内又は脳室内）投与が含まれる。
【０３４４】
特定の実施形態では、非経口投与は注入によるものである。注入は、慢性的であってもよく、持続的であってもよく、短期間であってもよく、間欠的であってもよい。特定の実施形態では、注入される薬剤はポンプで送達される。
【０３４５】
特定の実施形態では、非経口投与は注射によるものである。注射は、注射器又はポンプを用いて送達され得る。特定の実施形態では、注射はボーラス注射である。特定の実施形態では、注射は組織又は臓器に直接投与される。
【０３４６】
特定の実施形態では、非経口、髄腔内、又は脳室内投与用の製剤は、緩衝剤、希釈剤、及びその他の好適な添加剤、例えば、限定されるものではないが、浸透促進剤、キャリア化合物、及びその他の薬学的に許容されるキャリア又は賦形剤を更に含み得る無菌水溶液を含み得る。
【０３４７】
特定の実施形態では、本発明の化合物又は組成物の局所投与用製剤は、限定されるものではないが、製薬用のキャリア、賦形剤、無菌及び無菌でない水溶液、アルコール等の一般的な溶媒の形態の非水性溶液、又は化合物若しくは組成物を含む液体若しくは固体の油性基材の溶液を含み得る。溶液は、緩衝剤、希釈剤、及びその他の好適な添加剤も含んでよい。局所投与用の製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、ドロップ、坐剤、噴霧剤、液剤、及び散剤が含まれ得る。
【０３４８】
特定の実施形態では、本発明の化合物又は組成物の経口投与用製剤には、限定されるものではないが、製薬用のキャリア、賦形剤、散剤又は顆粒剤、マイクロ微粒子、ナノ微粒子、懸濁液、又は水若しくは非水性溶媒の溶液、カプセル剤、ゲルカプセル、サシェ、錠剤、又はミニ錠剤が含まれ得る。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、又は結合剤が望ましいこともある。特定の実施形態では、経口製剤は、１又は複数の浸透促進剤、界面活性剤、及びキレート剤と共に本発明の化合物が投与されるものである。
【０３４９】
投薬
特定の実施形態では、医薬組成物は、投与計画（例えば用量、投与頻度、及び期間）に従って投与され、投与計画は所望の効果が得られるように選択され得る。所望の効果は、例えばＣＥＴＰの低減又はＣＥＴＰに関連する疾患若しくは状態の進行の防止、軽減、改善、又は鈍化であり得る。
【０３５０】
特定の実施形態では、投与計画の変数は、対象中で所望の濃度の医薬組成物が得られるように調整される。投与計画に関して使用される「医薬組成物の濃度」とは、医薬組成物の化合物、オリゴヌクレオチド、又は活性成分に関するものであり得る。例えば、特定の実施形態では、用量及び投与頻度は、医薬組成物の組織濃度又は血漿濃度が所望の効果を得るのに十分な量となるように調整される。
【０３５１】
投薬は処置される疾患状態の重症度及び応答性によって異なり、処置期間は数日から数ヶ月、又は治癒されるまで、又は疾患状態が軽減されるまで、続けられる。投薬は、薬の効力及び代謝によっても異なる。特定の実施形態では、投薬量は、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１００ｍｇ又は０．００１〜６００ｍｇ内の用量であり、毎日、毎週、毎月、毎年に１回又はそれ以上、あるいは２〜２０年毎に１回投与され得る。処置成功後、疾患状態の再発を防止するために患者が維持療法を受けることが望ましいことがあり、維持療法では、オリゴヌクレオチドは、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１００ｍｇの、維持のための用量で、１日に１回又はそれ以上から２０年に１回、あるいは０．００１〜６００ｍｇの用量で、投与される。
【０３５２】
特定の併用療法
特定の実施形態では、本発明の修飾オリゴヌクレオチドを含む第１の薬剤が、１又は複数の第２の薬剤と共投与される。特定の実施形態では、そのような第２の薬剤は、本明細書に記載の第１の薬剤と同じ炎症性、代謝性、又は心血管系の疾患を処置するように設計される。特定の実施形態では、そのような第２の薬剤は、本明細書に記載の第１の薬剤とは異なる疾患、障害、又は状態を処置するように設計される。特定の実施形態では、そのような第２の薬剤は、本明細書に記載の１又は複数の医薬組成物の望ましくない副作用を処置するように設計される。特定の実施形態では、そのような第１の薬剤は、第２の薬剤の望ましくない副作用を処置するように設計される。特定の実施形態では、第２の薬剤は、第１の薬剤の望ましくない影響を処置するように第１の薬剤と共投与される。特定の実施形態では、第２の薬剤は、併用効果が生まれるように第１の薬剤と共投与される。特定の実施形態では、第２の薬剤は、相乗効果が生まれるように第１の薬剤と共投与される。特定の実施形態では、第１及び第２の薬剤の共投与により、独立した治療法として薬剤を投与した時に治療効果又は予防効果を得るのに必要な量よりも少ない投薬量での使用が可能になる。
【０３５３】
特定の実施形態では、第１の薬剤及び１又は複数の第２の薬剤は同時に投与される。特定の実施形態では、第１の薬剤及び１又は複数の第２の薬剤は異なる時点で投与される。特定の実施形態では、第１の薬剤及び１又は複数の第２の薬剤は単一の医薬製剤中に一緒に調製される。特定の実施形態では、第１の薬剤及び１又は複数の第２の薬剤は別個に調製される。
【０３５４】
特定の実施形態では、第２の薬剤には、限定されるものではないが、グルコース低下剤、コレステロール若しくは脂質低下療法、又は抗炎症剤若しくは炎症軽減剤が含まれる。グルコース低下剤としては、限定されるものではないが、治療的なライフスタイルの変化、ＰＰＡＲアゴニスト、ジペプチジルペプチダーゼ（ＩＶ）阻害剤、ＧＬＰ−１アナログ、インスリン又はインスリンアナログ、インスリン分泌促進物質、ＳＧＬＴ２阻害剤、ヒトアミリンアナログ、ビグアニド、αグルコシダーゼ阻害剤、又はその組合せが含まれ得る。グルコース低下剤としては、限定されるものではないが、メトホルミン、スルホニル尿素、ロシグリタゾン、メグリチニド、チアゾリジンジオン、αグルコシダーゼ阻害剤、又はその組合せが含まれ得る。スルホニル尿素は、アセトヘキサミド、クロルプロパミド、トルブタミド、トラザミド、グリメピリド、グリピジド、グリブリド、又はグリクラジドであり得る。メグリチニドはナテグリニド又はレパグリニドであり得る。チアゾリジンジオンはピオグリタゾン又はロシグリタゾンであり得る。αグルコシダーゼはアカルボース又はミグリトールであり得る。コレステロール又は脂質低下療法としては、限定されるものではないが、治療的なライフスタイルの変化、スタチン、胆汁酸封鎖剤、ニコチン酸、及びフィブラートが含まれ得る。スタチンは、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン等であり得る。胆汁酸封鎖剤は、コレセベラム、コレスチラミン、コレスチポール等であり得る。フィブラートは、ゲムフィブロジル、フェノフィブラート、クロフィブラート等であり得る。炎症軽減剤としては、限定されるものではないが、治療的なライフスタイルの変化、ステロイド、又はＮＳＡＩＤが含まれ得る。ステロイドはコルチコステロイドであり得る。ＮＳＡＩＤはアスピリン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、ナプロキセン、ＣＯＸ阻害剤、インドメタシン等であり得る。
【実施例】
【０３５５】
非限定的な開示及び参照による組込み
本発明の特定の化合物、組成物、及び方法を特定の実施形態に従って具体的に説明したが、以下の実施例は本発明の化合物を説明するためだけのものであり、本発明の化合物を限定することは意図されない。本願で引用されている文献それぞれの全体を参照により本明細書に援用する。
【実施例１】
【０３５６】
ＳＷ８７２脂肪肉腫細胞におけるヒトＣＥＴＰ  ｍＲＮＡのアンチセンス阻害
ＣＥＴＰ核酸を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＣＥＴＰ  ｍＲＮＡ転写産物に対する影響についてインビトロで調べた。２４ウェルプレート中で５０，０００細胞／ウェルの密度で培養したＳＷ８７２脂肪肉腫細胞を、リポフェクチン試薬を用いて１５０ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約２４時間後、細胞からＲＮＡを単離し、ＣＥＴＰ  ｍＲＮＡレベルを定量的リアルタイムＰＣＲで測定した。ヒトプライマープローブセット（本明細書中で配列番号３８として表されるフォワード配列ＧＧＣＡＴＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＴＧＴＣ；本明細書中で配列番号３９として表されるリバース配列ＧＧＣＴＣＡＣＧＣＣＴＴＴＧＣＴＧＴＴ；本明細書中で配列番号４０として表されるプローブ配列ＣＧＧＣＴＣＧＡＧＧＴＡＧＴＧＴＴＴＡＣＡＧＣＣＣＴＣ）を用いてＣＥＴＰ  ｍＲＮＡを定量化した。ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルにより測定される全ＲＮＡ含量に基づいてＣＥＴＰ  ｍＲＮＡ転写産物濃度を調整した。ＧＡＰＤＨは、配列番号１０、１１、１３で表される配列のプライマープローブセットを用いて測定した。結果を、未処置対照細胞と比較したＣＥＴＰの阻害パーセントで表す。
【０３５７】
表３中のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−１０−５ギャップマーであって、ギャップセグメントは１０個の２’−デオキシヌクレオシドを含み、各ウィングセグメントは５個の２’−ＭＯＥヌクレオシドを含む。５’ウィングセグメント中の各ヌクレオチド及び３’ウィングセグメント中の各ヌクレオチドは２’−ＭＯＥ修飾を有する。各ギャップマー全体のヌクレオシド間結合はホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各ギャップマー全体のシトシン残基は全て５−メチルシトシンである。「標的開始部位」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの標的となる最も５’側のヌクレオチドを示す。「標的停止部位」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの標的となる最も３’側のヌクレオチドを示す。表３に示される全てのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書で配列番号１（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｍ３０１８５．１）として表されるヒトＣＥＴＰ  ｍＲＮＡを標的とする。
【０３５８】
【表３】
2013527148.tif 000014
2013527148.tif 000015
2013527148.tif 000016
【実施例２】
【０３５９】
ＳＷ８７２脂肪肉腫細胞におけるヒトＣＥＴＰの用量依存的アンチセンス阻害
ＳＷ８７２脂肪肉腫細胞においてＣＥＴＰのインビトロ阻害を示した複数のアンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例１参照）を種々の用量で試験した。細胞を、２４ウェルプレートに５０，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングし、リポフェクチン試薬を用いて濃度５０ｎＭ、１５０ｎＭ、及び３００ｎＭの各アンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約１６時間後、細胞からＲＮＡを単離し、ＣＥＴＰ  ｍＲＮＡレベルを定量的リアルタイムＰＣＲで測定した。ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルにより測定された全ＲＮＡ含量に対してＣＥＴＰ  ｍＲＮＡレベルを標準化した。結果を、未処置対照細胞と比較したＣＥＴＰ阻害パーセントとして表４に示す。
【０３６０】
【表４】
2013527148.tif 000017
【実施例３】
【０３６１】
ＳＷ８７２脂肪肉腫細胞におけるヒトＣＥＴＰの用量依存的アンチセンス阻害
ＳＷ８７２脂肪肉腫細胞においてＣＥＴＰの有意な用量依存的阻害を示したＩＳＩＳ  ３４９５１３及びＩＳＩＳ  ３４９５１７（実施例２参照）を種々の用量で更に試験した。米国特許出願第１１／０３１，８２７号（参照により本明細書に援用する）で最初に開示されたＩＳＩＳ  １７２９１（ＧＡＣＡＡＧＴＧＧＣＴＧＡＴＣＴＧＧＡＴ、６−８−６  ＭＯＥ（配列番号１１５））、ＩＳＩＳ  １７３０２（ＧＣＴＴＧＣＣＴＴＣＴＧＣＴＡＣＡＡＧＣ、６−８−６  ＭＯＥ（配列番号１１６））、及びＩＳＩＳ  １７３０５（ＣＣＡＧＴＧＧＧＣＣＴＴＴＡＧＧＡＴＡＧ、６−８−６  ＭＯＥ（配列番号１１７）も同じ条件下で試験した。細胞を２４ウェルプレートに５０，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングし、リポフェクチン試薬を用いて濃度５０ｎＭ、１５０ｎＭ、及び３００ｎＭの各アンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約１６時間後、細胞からＲＮＡを単離し、ＣＥＴＰ  ｍＲＮＡレベルを定量的リアルタイムＰＣＲで測定した。ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルにより測定した全ＲＮＡ含量に対してＣＥＴＰ  ｍＲＮＡレベルを標準化した。結果を、未処置対照細胞と比較したＣＥＴＰの阻害パーセントとして表５に示す。
【０３６２】
【表５】
2013527148.tif 000018
【実施例４】
【０３６３】
ヒトＣＥＴＰトランスジェニックマウスの初代培養肝細胞におけるヒトコレステリルエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）ｍＲＮＡのアンチセンス阻害
天然フランキング領域により制御されるヒトＣＥＴＰを発現するトランスジェニックマウスは、高コレステロール血症に応答してこの遺伝子の発現が増加する（Ｊｉａｎｇ，  Ｘ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １９９２．  ９０：  １２９０−１２９５）。これらのマウスを以下の実験に用いた。
【０３６４】
ＣＥＴＰ核酸を標的とする及び実施例１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＣＥＴＰ  ｍＲＮＡ転写産物に対する影響についてインビトロで調べた。ｈｕＣＥＴＰトランスジェニックマウスの９６ウェルプレートで１７，５００細胞／ウェルの密度で培養した初代培養肝細胞を、ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ試薬を用いて１００ｎＭ又は２００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約２４時間後、細胞からＲＮＡを単離し、ＣＥＴＰ  ｍＲＮＡレベルを定量的リアルタイムＰＣＲで測定した。ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ濃度により測定される全ＲＮＡ含量に基づいてＣＥＴＰ  ｍＲＮＡ転写産物レベルを調整した。結果を、未処置対照細胞と比較したＣＥＴＰの阻害パーセントとして表６に示す。
【０３６５】
【表６】
2013527148.tif 000019
2013527148.tif 000020
2013527148.tif 000021
【実施例５】
【０３６６】
通常固形飼料食を与えたｈｕＣＥＴＰトランスジェニックマウスにおけるヒトＣＥＴＰのアンチセンス阻害
インビトロで統計的に有意な用量依存的阻害を示したＩＳＩＳ  ３４９５１１（配列番号１０８）、ＩＳＩＳ  ３４９５１２（配列番号１０９）、ＩＳＩＳ  ３４９５１５（配列番号１１２）、及びＩＳＩＳ  ３４９５１７（配列番号１１４）を、インビボでヒトＣＥＴＰ  ｍＲＮＡ転写産物を低減する能力について評価した。
【０３６７】
処置
雄のｈｕＣＥＴＰトランスジェニックマウスを１２時間の明暗サイクルに維持し、通常のマウス固形飼料ピュリーナを自由に摂取させた。実験を開始する前に、研究施設中で動物を少なくとも７日間馴化した。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に調製し、０．２ミクロンのフィルターで濾過滅菌した。オリゴヌクレオチドを注射用の０．９％ＰＢＳに溶解させた。
【０３６８】
マウスを５つの処置群に分けた。最初の４群には、５０ｍｇ／ｋｇの用量で週２回、６週間、ＩＳＩＳ  ３４９５１１、ＩＳＩＳ  ３４９５１２、ＩＳＩＳ  ３４９５１５、又はＩＳＩＳ  ３４９５１７を腹腔内注射した。第５群には食塩水を週２回、６週間、腹腔内注射した。食塩水を注射された群を対照群とし、オリゴヌクレオチド処置群との比較に用いた。
【０３６９】
ＣＥＴＰ  ｍＲＮＡの阻害
最後の投薬の２４時間後、動物を屠殺し、肝臓組織を単離した。肝臓ＲＮＡを単離してＣＥＴＰのリアルタイムＰＣＲ解析を行った。２つのプライマープローブセット、ｈＣＥＴＰ（本明細書で配列番号１１８として表されるフォワード配列ＣＡＧＣＴＧＡＣＣＴＧＴＧＡＣＴＣＴＧＧＴＡＧＡ；本明細書で配列番号１１９として表されるリバース配列ＣＡＧＣＴＴＡＴＧＧＡＡＡＧＡＣＡＧＧＴＡＧＣＡ；本明細書で配列番号１２０として表されるプローブ配列ＴＧＣＧＧＡＣＣＧＡＴＧＣＣＣＣＴＧＡＸ）、及びｈＣＥＴＰ２＿ＬＴＳ００１８２（本明細書で配列番号３８として表されるフォワード配列ＧＧＣＡＴＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＴＧＴＣ；本明細書で配列番号３９として表されるリバース配列ＧＧＣＴＣＡＣＧＣＣＴＴＴＧＣＴＧＴＴ：本明細書で配列番号４０として表されるプローブ配列ＣＧＧＣＴＣＧＡＧＧＴＡＧＴＧＴＴＴＡＣＡＧＣＣＣＴＣＸ）を用いた。これらのプライマープローブセットはＣＥＴＰ  ｍＲＮＡ転写産物の異なる領域を標的とする。表７に示すように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置はＣＥＴＰ  ｍＲＮＡの発現を低下させた。プライマープローブセットを、個々に及びまとめて使用してＣＥＴＰ  ｍＲＮＡ発現を測定したところ、３つの全ての場合で同様な結果が得られた。構成的に発現されるハウスキーピング遺伝子であるマウスシクロフィリンに対してＲＮＡ発現レベルを標準化した。シクロフィリン濃度は表２に記載のプライマープローブセットを用いて測定した。結果を、ＰＢＳ対照と比較したＣＥＴＰ  ｍＲＮＡの阻害パーセントとして表す。
【０３７０】
【表７】
2013527148.tif 000022
【０３７１】
ＣＥＴＰタンパク質の阻害
ＣＥＴＰタンパク質の血漿濃度をＥＬＩＳＡで測定した（アルプコ社（Ａｌｐｃｏ）、ニューハンプシャー州）。結果は、表８に示され、全てのＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドでＣＥＴＰタンパク質レベルの有意な阻害を示している。結果を、ＰＢＳ対照と比較した阻害パーセントで表す。
【０３７２】
【表８】
2013527148.tif 000023
【０３７３】
肝機能
肝機能へのＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの影響を評価するために、自動臨床化学分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００ｅ、ニューヨーク州メルビル）を用いてトランスアミナーゼの血漿濃度を測定した（Ｎｙｂｌｏｍ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｌｃｏｈｏｌ  ＆  Ａｌｃｏｈｏｌｉｓｍ  ３９：  ３３６−３３９，  ２００４；  Ｔｉｅｔｚ  ＮＷ  （Ｅｄ）：  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｓｔｓ，  ３ｒｄ  ｅｄ．  Ｗ．  Ｂ．  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ，  １９９５）。第３週及び第６週のＡＬＴ（アラニントランスアミナーゼ）の血漿濃度を測定した。ＩＵ／Ｌで表した結果を表９に示す。ほとんどのＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、肝臓のトランスアミナーゼプロファイルにより示されるように、マウスで耐容されると見なされた。
【０３７４】
【表９】
2013527148.tif 000024
【０３７５】
体及び臓器の重量
投薬前及び処置期間中定期的に、マウスの体重を測定した。グラムで表した体重を表１０に示す。実験の終わりに測定した肝臓、脾臓、及び腎臓の重量を表１１に示す。
【０３７６】
【表１０】
2013527148.tif 000025
【０３７７】
【表１１】
2013527148.tif 000026
【０３７８】
グルコース濃度
Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩ（ベックマン・コールター社製）を用いてグルコースオキシダーゼ法（Ｌｏｔｔ，  Ｊ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  ２１：  １７５４−１７６０，  １９７５）により血漿グルコース値を測定した。結果を表１２にｍｇ／ｄＬで示す。
【０３７９】
【表１２】
2013527148.tif 000027
【０３８０】
コレステロール及びトリグリセリド濃度
Ｂｌｉｇｈ  ａｎｄ  Ｄｙｅｒの方法（Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．  ａｎｄ  Ｄｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．  Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３７：  ９１１−９１７，  １９５９）により第３週及び第６週に血漿コレステロールを抽出し、オリンパス社製臨床分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００ｅ、ニューヨーク州メルビル）で測定した。ＨＤＬ、ＬＤＬ、及びＶＬＤＬコレステロールをＨＰＬＣにより個々に測定した。市販のトリグリセリドキット（ＤＣＬトリグリセリド試薬；ダイアグノスティックス・ケミカルズ社（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ．）製）を用いてトリグリセリド濃度を測定した。結果を表１３及び１４にｍｇ／ｄＬで示す。ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドで処置されたマウスにおいてＨＤＬ濃度が有意に上昇していた。総コレステロール濃度に対するＨＤＬ濃度の割合を表１５に示す。
【０３８１】
【表１３】
2013527148.tif 000028
【０３８２】
【表１４】
2013527148.tif 000029
【０３８３】
【表１５】
2013527148.tif 000030
【実施例６】
【０３８４】
通常固形飼料食又は高コレステロール食を与えたｈｕＣＥＴＰトランスジェニックマウスにおけるヒトＣＥＴＰのアンチセンス阻害
ＩＳＩＳ  ３４９５１１（配列番号１０８）及びＩＳＩＳ  ３４９５１７（配列番号１１４）を、インビボでヒトＣＥＴＰ  ｍＲＮＡ転写産物を低減させる能力について更に評価した。
【０３８５】
処置
雄のｈｕＣＥＴＰトランスジェニックマウスを１２時間の明暗サイクルに維持した。マウスの群の１つは通常のマウス固形飼料ピュリーナを自由摂取させ、第２群には０．５％高コレステロール固形飼料（ハーラン・テクラッド（Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ）  ＴＤ．９７２３４；ハーランラボラトリーズ社、インディアナ州インディアナポリス）を摂取させた。動物は実験開始前に研究施設内で少なくとも７日間順化させた。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に調製し、０．２ミクロンのフィルターを用いて濾過滅菌した。オリゴヌクレオチドを注射用０．９％ＰＢＳに溶解させた。
【０３８６】
通常固形飼料摂取マウスを３つの処置群に分けた。高コレステロール固形飼料摂取マウスを３つの処置群に分けた。２つの固形飼料摂取群に、ＩＳＩＳ  ３４９５１１又はＩＳＩＳ  ３４９５１７を、５０ｍｇ／ｋｇ、週２回、６週間、皮下注射した。同様に、高コレステロール群に、ＩＳＩＳ  ３４９５１１又はＩＳＩＳ  ３４９５１７を、５０ｍｇ／ｋｇ、週２回、６週間、皮下注射した。固形飼料摂取群の１つ及び高コレステロール固形飼料摂取群の１つに、食塩水を、週２回、６週間皮下注射した。食塩水を注射された群を対照とし、対応するオリゴヌクレオチド処置群をこれに対して比較した。
【０３８７】
ＣＥＴＰ  ｍＲＮＡの阻害
最後の投薬の２４時間後、動物を屠殺し、肝臓組織を単離した。肝臓ＲＮＡを単離し、ＣＥＴＰのリアルタイムＰＣＲ解析を行った。プライマープローブセットｈＣＥＴＰを用いてＣＥＴＰ濃度を測定した。表１６に示すように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置は、ＣＥＴＰ  ｍＲＮＡの発現を低下させた。ＲＮＡ発現レベルはマウスシクロフィリンに対して標準化した。結果を、ＰＢＳ対照と比較したＣＥＴＰ  ｍＲＮＡの阻害パーセントとして表す。通常固形飼料を摂取したマウスと高コレステロール固形飼料を摂取したマウスにおいてＣＥＴＰ  ｍＲＮＡレベルの阻害に差はなかった。
【０３８８】
【表１６】
2013527148.tif 000031
【０３８９】
ＣＥＴＰタンパク質の阻害
ＣＥＴＰタンパク質の血漿濃度をＥＬＩＳＡで測定した（アルプコ社、ニューハンプシャー州）。結果を表１７に示す。結果は、全てのＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドでＣＥＴＰタンパク質レベルの有意な阻害を示している。結果をＰＢＳ対照と比較した阻害パーセントで表す。
【０３９０】
【表１７】
2013527148.tif 000032
【０３９１】
肝機能
肝機能へのＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの影響を評価するために、自動臨床化学分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００ｅ、ニューヨーク州メルビル）を用いてトランスアミナーゼの血漿濃度を測定した（Ｎｙｂｌｏｍ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｌｃｏｈｏｌ  ＆  Ａｌｃｏｈｏｌｉｓｍ  ３９：  ３３６−３３９，  ２００４；  Ｔｉｅｔｚ  ＮＷ  （Ｅｄ）：  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｓｔｓ，  ３ｒｄ  ｅｄ．  Ｗ．  Ｂ．  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ，  １９９５）。第０週、第３週、及び第６週のＡＬＴ（アラニントランスアミナーゼ）及びＡＳＴ（アスパラギン酸トランスアミナーゼ）の血漿濃度を測定した。結果を表１８及び１９にＩＵ／Ｌで表す。
【０３９２】
【表１８】
2013527148.tif 000033
【０３９３】
【表１９】
2013527148.tif 000034
【０３９４】
臓器重量
実験の終わりに肝臓、脾臓、及び腎臓の重量を測定した。結果を表２０に示す。
【０３９５】
【表２０】
2013527148.tif 000035
【０３９６】
グルコース濃度
Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩ（ベックマン・コールター社製）を用いてグルコースオキシダーゼ法（Ｌｏｔｔ  Ｌｏｔｔ，  Ｊ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  ２１：  １７５４−１７６０，  １９７５）により血漿グルコース値を測定した。結果を表２１にｍｇ／ｄＬで示す。
【０３９７】
【表２１】
2013527148.tif 000036
【０３９８】
コレステロール濃度及びトリグリセリド濃度
Ｂｌｉｇｈ  ａｎｄ  Ｄｙｅｒの方法（Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．  ａｎｄ  Ｄｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．  Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３７：  ９１１−９１７，  １９５９）により第３週及び第６週に血漿コレステロールを抽出し、第０週、第３週、及び第６週にオリンパス社製臨床分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００ｅ、ニューヨーク州メルビル）で測定した。ＨＤＬ、ＬＤＬ、及びＶＬＤＬコレステロールをＨＰＬＣで個々に測定した。市販のトリグリセリドキット（ＤＣＬトリグリセリド試薬；ダイアグノスティックス・ケミカルズ社）を用いて、第０週、第３週、及び第６週にトリグリセリド濃度を測定した。ＶＬＤＬ濃度を第６週に測定した。結果を表２２〜２６にｍｇ／ｄＬで示す。
【０３９９】
【表２２】
2013527148.tif 000037
【０４００】
【表２３】
2013527148.tif 000038
【０４０１】
【表２４】
2013527148.tif 000039
【０４０２】
【表２５】
2013527148.tif 000040
【０４０３】
【表２６】
2013527148.tif 000041
【実施例７】
【０４０４】
心血管系疾患モデルマウスにおけるＣＥＴＰのアンチセンス阻害の効果及びニコチン酸を用いた処置とのＨＤＬコレステロール濃度上昇の比較
心血管系疾患のトランスジェニックモデルマウスがアイシス・ファーマシューティカルズ社（ＩＳＩＳ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）で開発され、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１０／２０４３５号（参照により本明細書に援用する）中に更に詳細に説明されている。このモデルマウスは、半接合コピーのヒトコレステリルエステル転送タンパク質（ｈｕＣＥＴＰ＋／−）、半接合コピーのヒトアポリポプロテインＢ（ｈｕＡｐｏＢ＋／−）を有し、マウス低比重リポプロテインレセプター（ｍＬＤＬｒ＋／−）の部分的欠損を有する。このモデルマウスは、高コレステロール血症及び／又は心血管系疾患、例えばアテローム性動脈硬化症及び心疾患の予防及び／又は治療薬剤のスクリーニングに有用である。本実験では、対照としてｈｕＡｐｏＢ＋／−ｈｕＣＥＴＰ−／−ｍＬＤＬｒ＋／−マウスも用いた。
【０４０５】
ＩＳＩＳ  ３４９５１１、ＩＳＩＳ  ３４９５１７、及び１％ニコチン酸がＨＤＬコレステロール濃度を上昇させる有効性を本モデルで評価した。
【０４０６】
処置
雄のトランスジェニックマウスを１２時間の明暗サイクルに維持し、通常マウス固形飼料ピュリーナを自由に摂取させた。動物を実験開始前に研究施設内で少なくとも７日間順化させた。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に調製し、０．２ミクロンのフィルターを用いて濾過滅菌した。オリゴヌクレオチドは注射用０．９％ＰＢＳに溶解させた。
【０４０７】
ｈｕＡｐｏＢ＋／−ｈｕＣＥＴＰ＋／−ｍＬＤＬｒ＋／−マウスをそれぞれ５〜７頭の５つの群に分けた。そのような群の２つに、ＩＳＩＳ  ３４９５１１又はＩＳＩＳ  ３４９５１７を、２５ｍｇ／ｋｇ、週２回、６週間、皮下注射した。マウスの群の１つには、１日１ｋｇ当たり２ｇのニコチン酸を６週間皮下注射し、１％ニコチン酸を含む食餌を摂取させた。マウスの群の１つには、マウスに標的を有することが知られていない対照オリゴヌクレオチドとしてＩＳＩＳ  １４１９２３（ＣＣＴＴＣＣＣＴＧＡＡＧＧＴＴＣＣＴＣＣ、５−１０−５  ＭＯＥギャップマー、配列番号１２１）を皮下注射した。マウスの群の１つには、ＩＳＩＳ  ３４９５１１ＰＢＳを週２回、６週間皮下注射した。食塩水を注射された群を対照群として、オリゴヌクレオチド処置群をこれと比較した。５頭のｈｕＡｐｏＢ＋／−ｈｕＣＥＴＰ−／−ｍＬＤＬｒ＋／−マウスの群に、ＩＳＩＳ  ３４９５１７を２５ｍｇ／ｋｇで週２回、６週間、皮下注射した。この群を、ＣＥＴＰに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果の陰性対照とした。表２７に群を更に説明し、文字Ａ〜Ｆで表し、以下、群をこれらの文字で表す。
【０４０８】
【表２７】
2013527148.tif 000042
【０４０９】
ＣＥＴＰ  ｍＲＮＡの阻害
最後の投薬の２４時間後、動物を屠殺し、肝臓組織を単離した。肝臓ＲＮＡを単離してＣＥＴＰのリアルタイムＰＣＲ解析を行った。プライマープローブセットｈＣＥＴＰを用いてＣＥＴＰ濃度を測定した。表２８に示すように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置（Ｃ群及びＤ群）はＣＥＴＰ  ｍＲＮＡ発現を低下させた。ＲＮＡ発現レベルはマウスシクロフィリンに対して標準化した。結果を、ＰＢＳ対照（Ａ群）と比較したＣＥＴＰ  ｍＲＮＡの阻害パーセントで表す。ニコチン酸で処置されたトランスジェニックマウス（Ｅ群）は、予想通り、阻害データを示さなかった。対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ  １４１９２３も、予想通り、ＣＥＴＰ  ｍＲＮＡの阻害可能性を示さなかった（Ｂ群）。陰性対照（Ｆ群）はＣＥＴＰの低下について試験しなかった。
【０４１０】
【表２８】
2013527148.tif 000043
【０４１１】
コレステロール及びトリグリセリド濃度
Ｂｌｉｇｈ  ａｎｄ  Ｄｙｅｒの方法（Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．  ａｎｄ  Ｄｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．  Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３７：  ９１１−９１７，  １９５９）により第０週、第３週、及び第６週に血漿コレステロールを抽出し、オリンパス社製臨床分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００ｅ、ニューヨーク州メルビル）で測定した。ＨＤＬ及びＬＤＬコレステロールをＨＰＬＣで個々に測定した。市販のトリグリセリドキット（ＤＣＬトリグリセリド試薬；ダイアグノスティックス・ケミカルズ社）を用いて、トリグリセリド濃度を第０週、第３週、及び第６週に測定した。結果を表２９〜３３にｍｇ／ｄＬで示す。
【０４１２】
【表２９】
2013527148.tif 000044
【０４１３】
【表３０】
2013527148.tif 000045
【０４１４】
【表３１】
2013527148.tif 000046
【０４１５】
【表３２】
2013527148.tif 000047
【０４１６】
【表３３】
2013527148.tif 000048
【０４１７】
肝機能
肝機能へのＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの影響を評価するために、自動臨床化学分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００ｅ、ニューヨーク州メルビル）を用いてトランスアミナーゼの血漿濃度を測定した（Ｎｙｂｌｏｍ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｌｃｏｈｏｌ  ＆  Ａｌｃｏｈｏｌｉｓｍ  ３９：  ３３６−３３９，  ２００４；  Ｔｉｅｔｚ  ＮＷ  （Ｅｄ）：  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｓｔｓ，  ３ｒｄ  ｅｄ．  Ｗ．  Ｂ．  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ，  １９９５）。第０週、第３週、及び第６週のＡＬＴ（アラニントランスアミナーゼ）及びＡＳＴ（アスパラギン酸トランスアミナーゼ）の血漿濃度を測定した。結果を表３４及び３５にＩＵ／Ｌで示す。オリゴヌクレオチドの延長投与後にトランスアミナーゼ濃度が変化していなかったことから、ＩＳＩＳオリゴヌクレオチド又はニコチン酸を用いた処置は肝機能に悪影響を与えていなかった。
【０４１８】
【表３４】
2013527148.tif 000049
【０４１９】
【表３５】
2013527148.tif 000050
【０４２０】
体及び臓器の重量
週に１回測定したマウスの体重を表３６に示す。実験の終わりに肝臓、脾臓、及び腎臓の重量を測定した結果を表３７に示す。
【０４２１】
【表３６】
2013527148.tif 000051
【０４２２】
【表３７】
2013527148.tif 000052
【実施例８】
【０４２３】
ｈｕＣＥＴＰトランスジェニックモデルマウスにおけるＩＳＩＳ  ３４９５１７によるＣＥＴＰのアンチセンス阻害の効果
化合物ＩＳＩＳ  ３４９５１７の有効性及び耐容性を評価した。
【０４２４】
処置
雄のトランスジェニックマウスを１２時間の明暗サイクルに維持し、ウェスタン型の食餌（ＴＤ８８１３７；カロリーの４２％が脂肪由来、０．２％コレステロール；ハーランラボラトリーズ社、インディアナ州インディアナポリス）を自由に摂取させた。動物は実験開始前に研究施設内で少なくとも７日間馴化させ、実験期間全体を通してこの食餌を維持した。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に調製し、０．２ミクロンのフィルターで濾過滅菌した。オリゴヌクレオチドは注射用０．９％ＰＢＳに溶解させた。
【０４２５】
それぞれ４〜６頭の２つの群にマウスを分けた。群の１つには、ＩＳＩＳ  ３４９５１７を、２５ｍｇ／ｋｇ、週２回、２週間、皮下注射した。食塩水を注射された群を対照群とし、オリゴヌクレオチド処置群をこれと比較した。
【０４２６】
ＣＥＴＰ  ｍＲＮＡの阻害
最後の投薬の２４時間後、動物を屠殺し、肝臓組織を単離した。肝臓ＲＮＡを単離してＣＥＴＰのリアルタイムＰＣＲ解析を行った。プライマープローブセットｈＣＥＴＰを用いてＣＥＴＰ濃度を測定した。表３８に示されるように、ＩＳＩＳ  ３４９５１７を用いた処置はＣＥＴＰ  ｍＲＮＡ発現を有意に低下させた。ＲＮＡ発現レベルはマウスシクロフィリンに対して標準化した。結果を、ＰＢＳ対照との比較によるＣＥＴＰ  ｍＲＮＡの阻害パーセントで表す。
【０４２７】
【表３８】
2013527148.tif 000053
【０４２８】
ＣＥＴＰタンパク質の阻害
血漿ＣＥＴＰタンパク質レベルをＥＬＩＳＡで測定した（アルプコ社）。表３９に示されるように、ＩＳＩＳ  ３４９５１７を用いた処置はＣＥＴＰタンパク質レベルを有意に低下させた。結果を、ＰＢＳ対照との比較によるＣＥＴＰタンパク質の阻害パーセントで表す。
【０４２９】
【表３９】
2013527148.tif 000054
【０４３０】
ＣＥＴＰ活性の阻害
ＣＥＴＰ活性アッセイキット（ロアー・バイオメディカル社（Ｒｏａｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク）を用いてＣＥＴＰ活性レベルを測定した。表４０に示されるように、ＩＳＩＳ  ３４９５１７を用いた処置はＣＥＴＰ活性を有意に低下させた。結果を、ＰＢＳ対照との比較によるＣＥＴＰ活性の阻害パーセントで表す。
【０４３１】
【表４０】
2013527148.tif 000055
【０４３２】
コレステロール及びトリグリセリド濃度
Ｂｌｉｇｈ  ａｎｄ  Ｄｙｅｒの方法（Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．  ａｎｄ  Ｄｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．  Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３７：  ９１１−９１７，  １９５９）により第６週に血漿コレステロールを抽出し、オリンパス社製臨床分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００ｅ、ニューヨーク州メルビル）で測定した。ＨＤＬ及びＬＤＬコレステロールをＨＰＬＣで個々に測定した。市販のトリグリセリドキット（ＤＣＬトリグリセリド試薬；ダイアグノスティックス・ケミカルズ社、カナダ、シャーロットタウン）を用いて、トリグリセリド濃度を測定した。結果を表４１にｍｇ／ｄＬで示す。ＩＳＩＳ  ３４９５１７を用いた処置では、ＰＢＳ対照と比べて３週目にＨＤＬ濃度が３０％上昇していた。
【０４３３】
【表４１】
2013527148.tif 000056
【０４３４】
肝機能
肝機能へのＩＳＩＳ  ３４９５１７の影響を評価するために、自動臨床化学分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００ｅ、ニューヨーク州メルビル）を用いてトランスアミナーゼの血漿濃度を測定した（Ｎｙｂｌｏｍ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｌｃｏｈｏｌ  ＆  Ａｌｃｏｈｏｌｉｓｍ  ３９：  ３３６−３３９，  ２００４；  Ｔｉｅｔｚ  ＮＷ  （Ｅｄ）：  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｓｔｓ，  ３ｒｄ  ｅｄ．  Ｗ．  Ｂ．  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ，  １９９５）。ＡＬＴ（アラニントランスアミナーゼ）及びＡＳＴ（アスパラギン酸トランスアミナーゼ）の血漿濃度を測定した。結果を表４２にＩＵ／Ｌで示す。ＣＥＴＰオリゴヌクレオチドの延長投与後にトランスアミナーゼ濃度が変化していなかったことから、ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドを用いた処置は肝機能に悪影響を与えていなかった。
【０４３５】
【表４２】
2013527148.tif 000057
【実施例９】
【０４３６】
ｈｕＣＥＴＰトランスジェニックモデルマウスにおけるＩＳＩＳ  ３４９５１７によるＣＥＴＰのアンチセンス阻害の用量反応効果
種々の用量でＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの有効性及び耐容性を評価した。
【０４３７】
処置
雄のトランスジェニックマウスを１２時間の明暗サイクルに維持し、ウェスタン型の食餌（ＴＤ８８１３７；カロリーの４２％が脂肪由来、０．２％コレステロール；ハーランラボラトリーズ社、インディアナ州インディアナポリス）を自由に摂取させた。動物は実験開始前に研究施設内で少なくとも７日間馴化させ、実験期間全体を通してこの食餌を維持した。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に調製し、０．２ミクロンのフィルターで濾過滅菌した。オリゴヌクレオチドを注射用０．９％ＰＢＳに溶解させた。
【０４３８】
３つの群に、ＩＳＩＳ  ３４９５１７を、１．５ｍｇ／ｋｇ／週、５ｍｇ／ｋｇ／週、又は１５ｍｇ／ｋｇ／週で、６週間皮下注射した。別の群には、対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ  １４１９２３を５０ｍｇ／ｋｇ／週で６週間皮下注射した。マウスの群の１つにはＰＢＳを６週間皮下注射した。ＰＢＳを注射された群を対照群とし、処置群をこれと比較した。
【０４３９】
ＣＥＴＰ  ｍＲＮＡの阻害
最後の投薬の２４時間後、動物を屠殺し、肝臓組織を単離した。肝臓ＲＮＡを単離してＣＥＴＰのリアルタイムＰＣＲ解析を行った。プライマープローブセットｈＣＥＴＰ及びｈＣＥＴＰ２＿ＬＴＳ００１８２を個々に用いてＣＥＴＰ濃度を測定した。表４３に示されるように、ＩＳＩＳ  ３４９５１７を用いた処置は、ＣＥＴＰ  ｍＲＮＡ発現を用量依存的に低下させた。両方のプライマープローブセットで同様な結果が得られた。ＲＮＡ発現レベルはマウスシクロフィリンに対して標準化した。結果を、ＰＢＳ対照との比較によるＣＥＴＰ  ｍＲＮＡの阻害パーセントで表す。
【０４４０】
【表４３】
2013527148.tif 000058
【０４４１】
心血管系障害に関係する遺伝子のｍＲＮＡ発現の阻害
肝臓ＲＮＡを単離し、ＡＢＣＡ１、ＡｐｏＡＩ、及びＳＲ−Ｂ１のリアルタイムＰＣＲ解析を行った。ＡＴＰ結合カセットトランスポーターＡＢＣＡ１（ヒトトランスポーターサブファミリーＡＢＣＡのメンバー１）は、コレステロール流出制御タンパク質（ＣＥＲＰ）としても知られ、ヒトでＡＢＣＡ１遺伝子にコードされるタンパク質である（Ｌｕｃｉａｎｉ，  Ｍ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．  １９９４．  ２１：  １５０−９）。このトランスポーターは、細胞のコレステロール及びリン脂質恒常性の主要な制御因子である。アポリポプロテインＡ−Ｉは、ヒトでＡＰＯＡ１遺伝子によりコードされるタンパク質である（Ｂｒｅｓｌｏｗ，  Ｊ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １９８２．  ７９：  ６８６１−５）。アポリポプロテインＡ−Ｉは、血漿中のＨＤＬの主要なタンパク質構成要素である。このタンパク質は、排出のための組織から肝臓へのコレステロール流出を促進する。スカベンジャーレセプタークラスＢ、タイプＩ（ＳＲ−ＢＩ）は、肝臓及び副腎を含む多くの細胞タイプ／組織で見られる膜内在性タンパク質である（Ａｃｔｏｎ，  Ｓ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９９４．  ２６９：  ２１００３−２１００９）。その役割として、肝臓での高比重リポプロテインからのコレステリルエステルの取込みを促進することが最も良く知られている。したがって、３つの遺伝子は全てＨＤＬ制御において役割を有する。
【０４４２】
プライマープローブセットＲＴＳ１２０４（本明細書で配列番号１２２として表されるフォワード配列ＧＧＡＣＴＴＧＧＴＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＣＴ、本明細書で配列番号１２３として表されるリバース配列ＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＣＧＴＣＡＴＴＣＡＡＡＧ、本明細書で配列番号１２４として表されるプローブ配列ＡＧＧＣＣＣＡＧＡＣＣＴＧＴＡＡＡＧＧＣＧＡＡＧＸ、ここでＸはフルオロフォアである）を用いてａｂｃａ１レベルを測定した。プライマープローブセットＲＴＳ１４７３７（本明細書で配列番号１２５として表されるフォワード配列ＡＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＡＡＣＣＧＴＴＡＧＴＣＡ、本明細書で配列番号１２６として表されるリバース配列ＴＡＴＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＧＡＧＴＣＡＡ、本明細書で配列番号１２７として表されるプローブ配列ＣＴＧＣＡＧＧＡＡＣＧＧＣＴＧＧＧＣＣＣＸ、ここでＸはフルオロフォアである）を用いてａｐｏＡ１レベルを測定した。プライマープローブセットｍＳＲＢ−１（本明細書で配列番号１２８として表されるフォワード配列ＴＧＡＣＡＡＣＧＡＣＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴ、本明細書で配列番号１２９として表されるリバース配列ＡＴＧＣＧＡＣＴＴＧＴＣＡＧＧＣＴＧＧ、本明細書で配列番号１３０として表されるプローブ配列ＣＧＴＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＡＧＣＣＴＣＣＡＴＴＸ、ここでＸはフルオロフォアである）を用いてｓｒ−ｂ１レベルを測定した。結果を、ＰＢＳ対照と比較した各発現レベルの上昇又は低下のパーセンテージとして表４４に示す。両方のプライマープローブセットで同様な結果が得られた。ＲＮＡ発現レベルはマウスシクロフィリンに対して標準化した。ＩＳＩＳ  ３４９５１７を用いた処置はＡｐｏＡ１及びＳＲ−Ｂ１レベルを上昇させた。
【０４４３】
【表４４】
2013527148.tif 000059
【０４４４】
ＣＥＴＰタンパク質の阻害
血漿ＣＥＴＰタンパク質レベルをＥＬＩＳＡで測定した（アルプコ社）。結果を、ＰＢＳ対照との比較によるＣＥＴＰタンパク質の阻害パーセントとして表す。表４５に示されるように、ＩＳＩＳ  ３４９５１７を用いた処置はＣＥＴＰタンパク質レベルを有意に低下させた。
【０４４５】
【表４５】
2013527148.tif 000060
【０４４６】
ＣＥＴＰ活性の阻害
ＣＥＴＰ活性アッセイキット（ロアー・バイオメディカル社製）を用いてＣＥＴＰ活性レベルを測定した。表４６に示されるように、ＩＳＩＳ  ３４９５１７を用いた処置は、５０ｍｇ／ｋｇ／週の最大用量でＣＥＴＰ活性を有意に７７％低下させた。
【０４４７】
【表４６】
2013527148.tif 000061
【０４４８】
コレステロール及びトリグリセリド濃度
Ｂｌｉｇｈ  ａｎｄ  Ｄｙｅｒの方法（Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．  ａｎｄ  Ｄｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．  Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３７：  ９１１−９１７，  １９５９）により第６週に血漿コレステロールを抽出し、オリンパス社製臨床分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００ｅ、ニューヨーク州メルビル）で測定した。ＨＤＬ及びＬＤＬコレステロールを個々にＨＰＬＣで測定した。市販のトリグリセリドキット（ＤＣＬトリグリセリド試薬；ダイアグノスティックス・ケミカルズ社製）を用いてトリグリセリド濃度を測定した。結果を表４７〜５１にｍｇ／ｄＬで示す。
【０４４９】
【表４７】
2013527148.tif 000062
【０４５０】
【表４８】
2013527148.tif 000063
【０４５１】
【表４９】
2013527148.tif 000064
【０４５２】
【表５０】
2013527148.tif 000065
【０４５３】
【表５１】
2013527148.tif 000066
【０４５４】
肝機能
肝機能へのＩＳＩＳ  ３４９５１７の影響を評価するために、自動臨床化学分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００ｅ、ニューヨーク州メルビル）を用いてトランスアミナーゼの血漿濃度を測定した（Ｎｙｂｌｏｍ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｌｃｏｈｏｌ  ＆  Ａｌｃｏｈｏｌｉｓｍ  ３９：  ３３６−３３９，  ２００４；  Ｔｉｅｔｚ  ＮＷ  （Ｅｄ）：  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｓｔｓ，  ３ｒｄ  ｅｄ．  Ｗ．  Ｂ．  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ，  １９９５）。ＡＬＴ（アラニントランスアミナーゼ）及びＡＳＴ（アスパラギン酸トランスアミナーゼ）の血漿濃度を測定した。結果を表５２〜５３にＩＵ／Ｌで示す。ＣＥＴＰオリゴヌクレオチドの延長投与後にトランスアミナーゼ濃度が変化していなかったことから、ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドを用いた処置は肝機能に悪影響を与えていなかった。
【０４５５】
【表５２】
2013527148.tif 000067
【０４５６】
【表５３】
2013527148.tif 000068
【０４５７】
グルコース濃度
Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩ（ベックマン・コールター社製）を用いてグルコースオキシダーゼ法（Ｌｏｔｔ，  Ｊ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  ２１：  １７５４−１７６０，  １９７５）により血漿グルコース値を測定した。結果を表５４にｍｇ／ｄＬで示す。
【０４５８】
【表５４】
2013527148.tif 000069
【実施例１０】
【０４５９】
ｈｕＣＥＴＰトランスジェニックＬＤＬレセプターノックアウトモデルマウスにおけるＣＥＴＰのアンチセンス阻害の影響
ヒトＣＥＴＰトランスジェニックマウスでは、血漿中のコレステロールの大部分がＨＤＬに結合しており、このモデルでは、ＣＥＴＰによりＨＤＬからＶＬＤＬ／ＬＤＬに転送されたコレステリルエステル（ＣＥ）がＬＤＬレセプター（ＬＤＬｒ）により急速に排除（ｃｌｅａｒ）される（Ｚｈｏｕ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．  １７６１：  １４８２１４８８，  ２００６）。本実施例で使用するヒトＣＥＴＰトランスジェニックＬＤＬｒノックアウトモデルマウスは心血管系疾患のモデル動物である。このモデルでは、ＬＤＬｒが存在せず、マウスがＬＤＬ経路を介してＣＥを排除することができなくなっているので、ＬＤＬの排除が遅くなっている（Ｐｌｕｍｐ，  Ａ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｖａｓｃ．  Ｂｉｏｌ．  １９：  １１０５−１１１０，  １９９９）。このヒトＣＥＴＰトランスジェニックＬＤＬｒノックアウトマウスは、ＶＬＤＬ及びＬＤＬ中にほとんどのコレステロールが見られるというアテローム生成促進的リポプロテインプロファイルを有するので、ＣＥＴＰのアンチセンス阻害がＨＤＬ組成に与える影響を評価するのに有用である。
【０４６０】
処置
雄のトランスジェニックマウスを１２時間の明暗サイクルに維持し、ウェスタン型の食餌（ＴＤ８８１３７；カロリーの４２％が脂肪由来、０．２％コレステロール；ハーランラボラトリーズ社、インディアナ州インディアナポリス）を自由に摂取させた。動物は実験開始前に研究施設内で少なくとも７日間馴化させ、実験期間全体を通してこの食餌を維持した。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に調製し、０．２ミクロンのフィルターで濾過滅菌した。オリゴヌクレオチドを注射用０．９％ＰＢＳに溶解させた。
【０４６１】
マウスの群の１つには、ＩＳＩＳ  ３４９５１７を１５ｍｇ／ｋｇ／週で６週間皮下注射した。別の群には、対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ  １４１９２３を１５ｍｇ／ｋｇ／週で６週間皮下注射した。マウスの群の１つにはＰＢＳを６週間皮下注射した。ＰＢＳを注射された群を対照群とし、処置群をこれと比較した。
【０４６２】
処置期間の終わりに、血漿サンプルを取り、更に解析した。
【０４６３】
ＨＤＬ組成への影響
ＶＬＤＬ＋ＩＤＬ、ＬＤＬ、及びＨＤＬリポプロテインのサブ画分を相対密度に基づいて超遠心で分離した。全群からプールした血漿サンプルそれぞれ５００μＬを、２ｍＬのベックマン社製Ｑｕｉｃｋ−Ｓｅａｌ遠心管に添加し、臭化カリウム（ＫＢｒ）で密度を１．０１９ｇ／ｍＬに調整した。次いで、サンプルをＢｅｃｋｍａｎ  ＴＬ−１００超遠心機を用いて１００，０００ｒｐｍ、４℃で４時間スピンした。ＶＬＤＬ＋ＩＤＬサブ画分を含む管の上部を回収した。
【０４６４】
底画分を新しい管に回収し、ＫＢｒで密度を再度１．０６３ｇ／ｍｌに調整し、１００，０００ｒｐｍ、４℃で５時間再度スピンしてＬＤＬサブ画分を濃縮した。ＬＤＬサブ画分を含む管の上部を回収した。ＨＤＬサブ画分を濃縮するために、もう一度、底画分を新しい管に入れ、ＫＢｒで密度を今度は１．２１ｇ／ｍｌに調整した。管を１００，０００ｒｐｍ、４℃で６時間スピンした。最後にＨＤＬサブ画分を回収した。全てのリポプロテインサブ画分をＰＢＳに一晩透析して余分なＫＢｒを除いた。
【０４６５】
次いで、ロシュ社（スイス、バーゼル）の酵素アッセイを用いて、サブ画分の総コレステロール及びトリグリセリド（ＴＧ）を調べた。米国和光純薬（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＵＳＡ；バージニア州リッチモンド）の酵素アッセイを用いて、リン脂質（ＰＬ）及び遊離コレステロール（ＦＣ）を測定した。フィッシャーサイエンティフィック社（ペンシルベニア州ピッツバーグ）のＢＣＡアッセイを用いてタンパク質（Ｐｒｏ）濃度を測定した。コレステリルエステル（ＣＥ）を、（総コレステロール−遊離コレステロール）×１．６７（ＣＥは、コレステロール＋脂肪酸であり、１．６７の調整は脂肪酸による質量の増加を考慮している（Ｒｕｄｅｌ  ＬＬ  ｅｔ  ａｌ，  ＪＣＩ  １００  （１）；  ７４−８３））として計算した。Ｓ／Ｃ比は、表面構成要素（Ｐｒｏ、ＦＣ、及びＰＬ）とコア構成要素（ＣＥ及びＴＧ）の比である。
【０４６６】
ＨＤＬ画分中の各構成要素の濃度（％）を表５５に示す。このデータは、このモデルマウスにおいてＣＥＴＰのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害により、ＨＤＬ粒子への及びＨＤＬ粒子からのＣＥＴＰを介した脂質転送が減少することを示している。ＨＤＬに転送されるＴＧが減少したことにより、ＨＤＬのＴＧ構成要素が４６％から１３％に低下し、ＨＤＬ粒子がより小型且つより高密度になった。ＨＤＬから転送されるＣＥが減少したことにより、ＨＤＬのＣＥ構成要素が１７．４％から３８％に上昇した。更に、Ｓ／Ｃ比が上昇しており、このことは、ＣＥＴＰのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害後の、より小型のＨＤＬ粒子へのシフトを示している。したがって、このモデルでは、ＣＥＴＰを介したＨＤＬへのＴＧの転送及びＨＤＬからのＣＥの転送を阻害すると、より小型且つより高密度でＣＥの多いＨＤＬが形成される。
【０４６７】
ＣＥＴＰ阻害後にマウスで形成された、より小型且つより高密度でＣＥの多いＨＤＬの全体組成は、対照マウスで形成される大きくてＴＧの多いＨＤＬよりも、通常の健康なヒトで見られる活性ＨＤＬ粒子に近い（Ｃｈｉｌｄｓ，  Ｋｉｎｚｌｅｒ，  ａｎｄ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，  Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｖｏｌ  ２，  ｐｇ  ２７０７）。対照群で見られるより大きくてＴＧの多いＨＤＬは、高トリグリセリド血症及びメタボリックシンドロームに罹患している患者で見られるものに近い（Ｄｅｃｋｅｌｂａｕｍ  ＲＪ  ＡＴＶＢ  ４：３  ２２５−２３１）。これらの疾患に罹患している患者のＨＤＬは、コレステロールを逆転送する能力の低下及び抗炎症・抗酸化能の低下を示す（Ｂｒｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３５  （２００４）  ２３５−２４０，  Ｋｏｎｔｕｓｈ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ３：３  １４４−１５３）。
【０４６８】
したがって、より小型でより高密度のＨＤＬ、ＣＥの多いＨＤＬ粒子の形成は、活性ＨＤＬ粒子を示すと考えられる。ＨＤＬ活性が上昇すると、コレステロールの運搬及びコレステロールの除去が促進される（Ｓｋｅｇｇｓ，  Ｊ．Ｗ．  ａｎｄ  Ｍｏｒｔｏｎ，  Ｒ．Ｅ．  Ｊ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．  ４３：  １２６４−１２７４，  ２００２）。
【０４６９】
【表５５】
2013527148.tif 000070
【０４７０】
配列表
本願は、電子フォーマットの配列表と共に提出されている。配列表は、２０１１年４月７日に作成されたサイズが６４ＫＢの２０１１０４０７＿ＢＩＯＬ０１３１ＷＯＳＥＱ．ｔｘｔという名称のファイルとして提供されている。電子フォーマットの配列表に含まれる情報の全体を参照により本明細書に援用する。
【配列表】
2013527148000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年4月22日(2013.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物において心血管系疾患または代謝性疾患を改善させる方法において使用するための、CETPを標的とする10〜30個のヌクレオシドが連結された長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物であって、ここで、。
（i）この化合物は、動物におけるHDLレベルまたはHDL活性を増加させ；
（ii）LDL／HDL比が動物において減少され；または
（iii）LDLレベル、TGレベルまたはグルコースレベルが動物において減少される；
である、前記化合物。
【請求項２】
動物において高コレステロール血症、動脈瘤、アンギナ、不整脈、脳血管疾患、冠動脈心疾患、高血圧、脂質異常症、又は高脂血症である心血管系疾患を改善させる方法において使用するための、CETPを標的とする10〜30個のヌクレオシドが連結された長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物。
【請求項３】
肥満、糖尿病、脂質異常症、冠動脈心疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）、高脂肪酸血症、メタボリックシンドローム、又はその組合せである心血管系疾患または代謝性疾患を改善させる方法において使用するための、CETPを標的とする10〜30個のヌクレオシドが連結された長さの修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物。 
【請求項４】
前記心血管系疾患が、高コレステロール血症、動脈瘤、アンギナ、不整脈、アテローム性動脈硬化症、脳血管疾患、冠動脈心疾患、高血圧、脂質異常症、又は高脂血症である、請求項1に記載の化合物。
【請求項５】
心血管系疾患または代謝性疾患が、肥満、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、脂質異常症、冠動脈心疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）、高脂肪酸血症、メタボリックシンドローム、又はその組合せである、請求項1に記載の化合物。
【請求項６】
（i）化合物が、一本鎖修飾オリゴヌクレオチドからなり；
（ii）動物がヒトであり；
（iii）化合物が非経口的投与により動物に投与され；または
（iv）前記修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも1つのヌクレシド間結合が、修飾ヌクレオシド間結合であり、そしてそれぞれのヌクレオシド間結合が場合によりホスホロチオエートヌクレオシド間結合であってもよい；
請求項1に記載の化合物。
【請求項７】
化合物が第1の薬剤であり、第2の薬剤を投与することを更に含み、ここで場合により、
（i）前記第1の薬剤及び前記第2の薬剤が共投与されるか、
（ii）前記第2の薬剤がグルコース低下剤であるか、または
（iii）前記第2の薬剤が、LDL、TG、又はコレステロールを低下させる療法である、請求項1に記載の化合物。
【請求項８】
前記修飾オリゴヌクレオチドが、前記修飾オリゴヌクレオチドの全体に対して測定した場合に、配列番号1〜4のいずれかに少なくとも90％相補的な核酸塩基配列を有する、請求項1に記載の化合物。
【請求項９】
前記修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも1つのヌクレオシドが修飾糖を含み、場合により、
（i）この化合物が、テトラヒドロピラン環でフラノース環が置換された少なくとも1つのテトラヒドロピラン修飾ヌクレオシドを含み、ここで、前記少なくとも1つのテトラヒドロピラン修飾ヌクレオシドのそれぞれが場合により以下の構造で表される：
【化１】
2013527148.tif 000073
式中、Bxは、保護されていてもよいヘテロ環塩基部分である；
（ii）少なくとも1つの前記修飾糖が二環式糖であるか、または
（iii）少なくとも1つの修飾糖が、2'-O-メトキシエチル又は4'-（CH2）n-O-2'架橋（式中、nは1又は2である）を含む、
請求項1に記載の化合物。
【請求項１０】
（i）前記修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも1つのヌクレオシドが修飾核酸塩基を含み、ここで、前記修飾核酸塩基が5-メチルシトシンであってもよい、
（ii）前記修飾オリゴヌクレオチドが、20個の連結されたヌクレオシドからなり、
（iii）前記修飾オリゴヌクレオチドが、
連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
連結されたヌクレオシドからなる5'ウィングセグメント；
連結されたヌクレオシドからなる3'ウィングセグメント；
を含み、前記ギャップセグメントが前記5'ウィングセグメントと前記3'ウィングセグメントとの間に位置し、各前記ウィングセグメントの各ヌクレオシドが修飾糖を含み、または
（iv）前記修飾オリゴヌクレオチドが、
20個の連結されたヌクレオシドからなり、
配列番号1〜4のいずれかの同じ長さの部分に相補的な少なくとも8個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有し、そして
10個の連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
5個の連結されたヌクレオシドからなる5'ウィングセグメント；
5個の連結されたヌクレオシドからなる3'ウィングセグメント；
を含み、前記ギャップセグメントが前記5'ウィングセグメントと前記3'ウィングセグメントとの間に位置し、各前記ウィングセグメントの各ヌクレオシドが2'-O-メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、各シトシンが5-メチルシトシンである、
請求項1に記載の化合物。
【請求項１１】
a．前記代謝性又は心血管系の疾患を有する動物を同定すること；
b．有効量の化合物を前記動物に治療有効量投与すること
を含む、代謝性疾患又は心血管系疾患を有する動物を処置する方法において使用するための、20個の連結されたヌクレオシドからなり、そして修飾オリゴヌクレオチド全体に対して測定した場合に、配列番号1〜4のいずれかに少なくとも90％相補的な核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む、請求項1に記載の化合物。
【請求項１２】
前記HDL濃度及び／又はHDL活性が、少なくとも5％、10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、又は100％上昇する、請求項1に記載の化合物。
【請求項１３】
修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドが、
20個の連結されたヌクレオシドからなり、
配列番号1〜4のいずれかの同じ長さの部分に相補的な少なくとも8個の連続する核酸塩基を含む核酸残基配列を有し、
10個の連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、
5個の連結されたヌクレオシドからなる5'ウィングセグメントと、
5個の連結されたヌクレオシドからなる3'ウィングセグメントと
を含み、前記ギャップセグメントが前記5'ウィングセグメントと前記3'ウィングセグメントとの間に位置し、各前記ウィングセグメントの各ヌクレオシドが2'-O-メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、各シトシン残基が5-メチルシトシンである、前記化合物。
【請求項１４】
動物における心血管系疾患または代謝性疾患を治療する際に使用するための、請求項13に記載の化合物。
【請求項１５】
動物においてHDL濃度及び／又はHDL活性を上昇させる際に使用するための、請求項13に記載の化合物。
【国際調査報告】
2013527148.tif 000074
2013527148.tif 000075
2013527148.tif 000076
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