(57)【要約】  （１）即時型Ｔ細胞媒介応答の惹起不全、（２）Ｔ細胞の消耗、Ｔ細胞の無反応もしくはその双方の誘導、または（３）単球、マクロファージ、樹状細胞および／または例えば細胞内病原体を死滅させるのに必要な他のＡＰＣの活性不全から生じる感染または疾患を処置するための方法および組成物。本方法および組成物はＰＤ−１リガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２を同時に阻害することにより、望ましくないＴ細胞阻害の問題を解決する。免疫応答は、異なる親和性で結合するアンタゴニストを提供することによるか、投与される薬剤の用量を変更することによるか、投与計画において間欠的投与を行うことによるか、またそれらの組合せによって、再投与される前にそれが結合されている分子から薬剤の解離をもたらすことにより調節することができる。場合により、免疫系を刺激し、その後その刺激を除去することが特に望ましいことがある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体に、その被験体の腫瘍部位または病原体感染領域においてＩＦＮγ産生細胞を増加させ、かつ、Ｔｒｅｇ細胞を減少させるのに有効な量の免疫調節薬剤を投与することを含んでなる、免疫応答を調節する方法。
【請求項２】
被験体に、その被験体の腫瘍部位または病原体感染領域においてＴｈ１７細胞の数を増加させ、またはＩＬ−１７産生のレベルを高めるのに有効な量の免疫調節薬剤を投与することを含んでなる、免疫応答を調節する方法。
【請求項３】
被験体に、その被験体の腫瘍部位または病原体感染領域においてＰＤ−１陽性細胞の数を減少させるのに有効な量の免疫調節薬剤を投与することを含んでなる、免疫応答を調節する方法。
【請求項４】
免疫調節薬剤が内因性ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２のＰＤ−１への結合を同時に遮断する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
免疫調節薬剤がＰＤ−１と結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
免疫調節薬剤が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７．１、それらの融合タンパク質、ならびにＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の双方と特異的に結合する二重特異性抗体からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
免疫調節薬剤が、in vivo投与後３か月以内にＰＤ−１またはそのリガンドと結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
２種類以上の免疫調節薬剤が投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記感染が、慢性ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、マイコプラズマ感染、寄生虫感染であり、感染の急性期に毒素により媒介される疾患を惹起し、またはその感染はＴ細胞応答の低下を特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ウイルス感染が、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン−バーウイルス、フィロウイルス、ヒトパピローマウイルス、エプスタイン−バーウイルス、インフルエンザウイルス、呼吸器系合胞体ウイルス、脳炎ウイルス、デング熱ウイルス、および乳頭腫ウイルスによる感染である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
寄生虫感染がマラリアまたはリーシュマニアである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
細菌感染が、結核菌（Mycobacterium tuberculosis)、炭疽菌(Bacillus anthracis)、ブドウ状球菌(Staphylococcus)、リステリア(Listeria)、およびクラミジア・トラコマチス(Clamydia trachomatis)からなる群から選択される細菌により引き起こされる、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
疾病に対する免疫応答を増強するために疾病抗原を前記免疫調節薬剤と組み合わせて投与することをさらに含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
免疫調節薬剤がＰＤ−１リガンドの融合タンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＰＤ−１リガンドが、野生型ＰＤ−１リガンドに比べてＰＤ−１に対する親和性が増強されている変異体ＰＤ−１リガンドである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
融合タンパク質が、ＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメイン、またはＰＤ−１と結合し得るその断片を含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
融合タンパク質が配列番号８３のアミノ酸配列を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記免疫調節薬剤とともに、免疫調節剤、Ｔｒｅｇの機能を消耗させる、または阻害する薬剤、および共刺激分子からなる群から選択される付加的活性剤を投与することをさらに含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
付加的活性剤が、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの機能を消耗させる、または阻害する薬剤である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの機能を消耗させる、または阻害する薬剤が、シクロホスファミドである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ＡＰＣを、ＡＰＣにおけるＰＤ−１シグナル伝達を阻害、低減もしくは遮断するか、または罹患もしくは感染細胞の排除を増強するのに有効な量の免疫調節薬剤と接触させることを含んでなる、抗原提示細胞の機能を増強するための請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
腫瘍が、肉腫、黒色腫、リンパ腫、神経芽腫および癌腫からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
被験体の腫瘍部位または病原体感染領域においてＩＦＮγ産生細胞を増加させ、かつ、Ｔｒｅｇ細胞を減少させる免疫調節薬剤を、１以上の疾病抗原と組み合わせて含んでなる、組成物。
【請求項２４】
被験体の腫瘍部位または病原体感染領域においてＩＦＮγ産生細胞を増加させ、かつ、Ｔｒｅｇ細胞を減少させる免疫調節薬剤を、ワクチンと組み合わせて含んでなる、組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は一般に、癌または感染などの疾患、特に、Ｔ細胞の消耗、Ｔ細胞の無反応もしくはその双方を誘導する疾患、または細胞内病原体、例えば、リーシュマニアがＡＰＣ（例えば、単球、樹状細胞、マクロファージ）または上皮細胞上のＰＤ−１リガンドをアップレギュレートすることにより免疫応答を逃れる疾患を処置するための、免疫調節組成物および方法に関する。
【発明の背景】
【０００２】
癌は多大な生理学的および経済的影響を有する。例えば、米国では２００８年に合計１，４３７，１８０の新たな癌症例および５６５，６５０の癌による死亡が発生すると見積もられる(Jemal, A., Cancer J. Clin., 58:71-96 (2008))。米国国立衛生研究所は、２００７年の癌の総費用を２１９２億ドル、すなわち、直接医療費８９０億ドル（全ての衛生経費の総額）；間接的罹病費１８２億ドル（疾病のために失われた生産性の費用）；および間接的死亡費用（早期死亡のために失われた生産性の費用）１１２０億ドルと見積もっている。癌を治療するためにはいくつかの方法があるが、各方法にはその固有の有効性程度ならびに副作用がある。癌を治療するための典型的な方法としては、手術、化学療法、放射線療法および免疫療法がある。
【０００３】
腫瘍細胞を標的とするために患者自身の免疫応答を刺激することは癌治療にとって魅力的な選択肢であり、多くの研究が、免疫応答を誘導するために腫瘍抗原を用いる免疫療法の有効性を証明している。しかしながら、癌免疫療法の治験では免疫応答の誘導と癌の効果的な根絶に相関が見られない場合が多い(Cormier, et al., Cancer J. Sci. Am., 3(1):37-44 (1997); Nestle, et al., Nat. Med., 4(3):328-332 (1998); Rosenberg, Nature, 411(6835):380-384 (2001))。従って、多くの場合の一次抗腫瘍免疫応答にもかかわらず、機能的なエフェクター抗腫瘍Ｔ細胞応答が、良くて弱いという場合が多い。
【０００４】
リンパ球の抗原特異的な活性化および増殖は、共刺激分子由来の正負双方のシグナルによって調節される。最も詳細に特性決定されているＴ細胞共刺激経路はＢ７−ＣＤ２８であり、ここで、Ｂ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）はそれぞれ刺激性ＣＤ２８受容体および阻害的ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）受容体と結びつけることができる。Ｔ細胞受容体を介したシグナル伝達に関して、ＣＤ２８の連結は、Ｔ細胞の抗原特異的増殖を増大させ、サイトカインの産生を増強し、分化およびエフェクター機能を刺激し、Ｔ細胞の生存を増進する(Lenshow, et al., Annu. Rev. Immunol., 14:233-258 (1996); Chambers and Allison, Curr. Opin. Immunol., 9:396-404 (1997);およびRathmell and Thompson, Annu. Rev. Immunol., 17:781-828 (1999))。これに対し、ＣＴＬＡ−４を介したシグナル伝達は、Ｔ細胞増殖、ＩＬ−２産生および細胞周期進行を阻害する負のシグナルを送達すると思われる(Krummel and Allison, J. Exp. Med., 183:2533-2540 (1996);およびWalunas, et al., J. Exp. Med., 183:2541-2550 (1996))。Ｂ７ファミリーの他のメンバーとしては、Ｂ７−Ｈ１(Dong, et al., Nature Med., 5:1365-1369 (1999);およびFreeman, et al., J. Exp. Med., 192:1-9 (2000))、Ｂ７−ＤＣ(Tseng, et al., J. Exp. Med., 193:839-846 (2001);およびLatchman, et al., Nature Immunol., 2:261-268 (2001))、Ｂ７−Ｈ２(Wang, et al., Blood, 96:2808-2813 (2000); Swallow, et al., Immunity, 11:423-432 (1999);およびYoshinaga, et al., Nature, 402:827-832 (l999))、Ｂ７−Ｈ３(Chapoval, et al., Nature Immunol., 2:269-274 (2001))およびＢ７−Ｈ４(Choi, et al., J. Immunol., 171:4650-4654 (2003); Sica, et al., Immunity, 18:849-861 (2003); Prasad, et al., Immunity, 18:863-873 (2003);およびZang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100:10388-10392 (2003))が挙げられる。
【０００５】
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２はＰＤ−１（プログラムされた細胞死−１）のリガンドであり、Ｂ７−Ｈ２はＩＣＯＳのリガンドであり、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４およびＢ７−Ｈ５は、本時点ではまだオーファンリガンドである(Dong, et al., Immunol. Res., 28:39-48 (2003))。
【０００６】
そのリガンドによるＰＤ−１連結の主要な結果は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の下流のシグナル伝達を阻害することである。従って、ＰＤ−１を介したシグナル伝達は、通常、Ｔ細胞に、Ｔ細胞増殖の低下またはＴ細胞活性化における他の減少をもたらす抑制的または阻害的シグナルを与える。ＰＤ−１シグナル伝達は、ＴＣＲに結合されている主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）によって提示されるペプチド抗原に近接したＰＤ−１リガンドへの結合を必要とすると思われる(Freeman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 105:10275-10276 (2008))。ＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞において阻害的シグナル伝達を生じる主要なＰＤ−１リガンドである。
【０００７】
Ｔ細胞はまた、Ｔ調節細胞（Ｔｒｅｇ）によっても阻害される(Schwartz, R., Nature Immunology, 6:327-330 (2005))。Ｔｒｅｇは腫瘍特異的Ｔ細胞免疫を抑制することが知られており、ヒト腫瘍の進行に寄与する可能性がある(Liyanage, U.K., et al., J Immunol, 169:2756-2761 (2002)）。マウスでは、Ｔｒｅｇ細胞の枯渇は、より効率的な腫瘍排除をもたらす(Viehl, C.T., et al., Ann Surg Oncol, 13:1252-1258 (2006))。
【０００８】
従って、本発明の目的は、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２により媒介されるシグナル伝達の双方を遮断し、免疫応答を増強する免疫調節組成物を提供することである。
【０００９】
別の目的は、腫瘍および慢性感染に対して強力なエフェクター応答とＴｒｅｇ応答の低下を誘導する組成物を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、腫瘍部位または病原体感染領域においてＴｈ１７細胞の数を増し、かつ／またはＩＬ−１７産生レベルを高めるための組成物および方法を提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、腫瘍部位または病原体感染領域においてＰＤ−１陽性細胞の数を減少させるための組成物および方法を提供することである。
【００１２】
別の目的は、Ｔ細胞の消耗、Ｔ細胞の無反応、またはその双方を誘導する感染を処置するための組成物および方法を提供することである。
【００１３】
本発明のさらに別の目的は、単球、樹状細胞およびマクロファージを含む抗原提示細胞の細胞内感染を処置するための組成物および方法を提供することである。
【００１４】
本発明の別の目的は、Ｔｒｅｇ応答を調節する組成物を提供することである。
【００１５】
別の目的は、癌または腫瘍を処置するための組成物および方法を提供することである。
【発明の概要】
【００１６】
被験体の腫瘍部位または病原体感染領域においてＩＦＮγ産生細胞を増加させ、かつ、Ｔｒｅｇ細胞を減少させるための組成物および方法が提供される。該組成物は、抗原特異的Ｔ細胞の頻度および／もしくはパーセンテージおよび／もしくは抗原特異的Ｔ細胞の増殖を増大させるか、Ｔ細胞によるサイトカイン産生を増強するか、Ｔ細胞の分化およびエフェクター機能を刺激するか、Ｔ細胞の生存を増進するか、またはＴ細胞の消耗および／または無反応を克服するために使用することができる。好ましい実施態様では、該組成物は、Ｔ細胞において、Ｔ細胞活性に差次的効果を示すＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２により媒介されるシグナル伝達を同時に遮断する。ＰＤ−Ｌ１により媒介されるシグナル伝達を遮断すると、浸潤性ＩＦＮγ産生Ｔ細胞およびＭ１マクロファージの数の増加などの強力なエフェクター細胞応答が誘導される。ＰＤ−Ｌ２により媒介されるシグナル伝達を遮断すると、浸潤性Ｔｒｅｇの数が減る。このＴｒｅｇの減少は、Ｔｈ１７細胞の数を増加させ、ＩＬ−１７産生のレベルを高め、かつまた、ＰＤ−１陽性細胞の数を減少させ得る。従って、２つの独立したＰＤ−１リガンドを同時に遮断すると、２つの異なる有益なＴ細胞活性を増強することができる。好ましい組成物は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２またはそれらの組合せと直接結合し、Ｔ細胞の増殖または活性化などのＴ細胞応答を増加または活性化する免疫調節薬剤を含む。これらの化合物は抗原提示細胞（単球、マクロファージ、樹状細胞、上皮細胞などのＡＰＣ）上で発現されたＰＤ−１リガンドと結合し、そのリガンドとＴ細胞上のＰＤ−１との相互作用を遮断する。
【００１７】
該組成物はＰＤ−Ｌ２タンパク質、その断片、変異体または融合物を含む。好ましい組成物は、被験体においてＴ細胞応答、Ｔ細胞の消耗、Ｔ細胞の無反応、ならびに単球、マクロファージ、樹状細胞およびその他のＡＰＣの活性化、またはこれらの効果の全てを低下させる、または十分なそれらが無いことを克服するのに有効な量の非抗体薬剤（ＰＤ−Ｌ２融合タンパク質（Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ）など）を含む。該組成物はまた、ＰＤ−Ｌ１タンパク質、その断片、変異体または融合物も含む。ＰＤ−Ｌ２およびＰＤ−Ｌ１ポリペプチド、融合タンパク質および断片は、ＰＤ−１の内因性リガンドをＰＤ−１と相互作用しないようにすることによってＴ細胞においてＰＤ−１を介して生じる阻害的シグナル伝達を阻害する、または低下させることができる。他の好ましい組成物は、ＰＤ−１のリガンドと結合し、Ｔ細胞上の内因性ＰＤ−１受容体との結合を妨げるＰＤ−１またはその可溶性断片を含む。ＰＤ−１のこれらの断片は可溶性ＰＤ−１断片とも呼ばれる。好ましい一実施態様は、ＰＤ−１融合タンパク質ＰＤ−１−Ｉｇである。その他の薬剤としては、ＰＤ−Ｌ１と結合し、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を妨げることができるＢ７．１またはその可溶性断片および融合タンパク質が挙げられる。
【００１８】
特定の実施態様では、該組成物は、ＰＤ−１を介した阻害的シグナル伝達を誘導することなく、ＰＤ−１と結合し、それを遮断し、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２などのリガンドの結合を妨げ、それにより、ＰＤ−１により媒介される阻害的シグナルの活性化を妨げるか；（ｉｉ）ＰＤ−１のリガンドと結合し、ＰＤ−１受容体との結合を妨げ、それにより、ＰＤ−１により媒介される阻害的シグナルの活性化を妨げるか、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の組合せである、免疫調節薬剤を含む。
【００１９】
免疫応答は、異なる親和性で（すなわち、必要に応じて高いまたは低い）ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−１およびそれらの組合せと結合するアンタゴニストを提供することによるか、投与される薬剤の用量を変更することによるか、投与計画において間欠的投与を行うことによるか、またそれらの組合せによって、再投与される前にそれが結合されている分子から薬剤の解離をもたらす（プライムおよびブーストを用いる抗原惹起の場合に生じるものと同様）ことにより調節することができる。場合により、免疫系を刺激し、その後その刺激を除去することが特に望ましいことがある。その結合相手に対するアンタゴニストの親和性は解離に必要な期間の決定に使用することができ、高親和性の薬剤は低親和性の薬剤よりも解離にかかる時間が長い。ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−１のいずれかおよびそれらの組合せと結合するか、または同じ分子に異なる親和性で結合する薬剤もまた、免疫刺激の程度を調節するために使用可能である。
【００２０】
免疫調節薬剤およびそれをコードする核酸の治療的使用が提供される。該免疫調節薬剤は、癌または感染性疾患に関連する１以上の症状を処置するために使用することができる。さらに、該免疫調節薬剤は、免疫抑制された被験体の免疫応答を刺激するためにも使用することができる。
【００２１】
さらなる実施態様は、阻害的シグナル伝達を生じることなくＰＤ−１受容体、またはＰＤ−１受容体のリガンド、例えば、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２、またはその双方のリガンド（すなわち、二重特異性薬剤）と結合し、それを遮断する抗体を含む。ＰＤ−Ｌ２およびＰＤ−Ｌ１ポリペプチド、融合タンパク質、ならびに断片はまた、Ｔ細胞またはＡＰＣ上の別の受容体と結合することによってもＴ細胞を活性化し得る。
【００２２】
開示される組成物の治療的使用は、癌の１以上の症状の処置および／または腫瘍免疫の誘導を含む。処置可能な腫瘍細胞の例としては、限定されるものではないが、肉腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、神経芽腫または癌腫細胞が挙げられる。
【００２３】
該組成物はＴ細胞応答を増強し、Ｔ細胞の消耗、Ｔ細胞の無反応、またはその双方を克服する助けをし、ならびに感染または癌により誘導される単球、マクロファージ、樹状細胞およびその他のＡＰＣを活性化する。該免疫調節薬剤で処置可能な代表的感染としては、限定されるものではないが、ウイルス、細菌、寄生虫、原虫または真菌により引き起こされる感染が挙げられる。処置可能なウイルス感染の例としては、限定されるものではないが、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、ヘルペスウイルス、インフルエンザ、エプスタイン−バーウイルス、フィロウイルス、またはヒトパピローマウイルスにより引き起こされる感染が挙げられる。処置可能なその他の感染としては、プラスモジウム(Plasmodium)、マイコプラズマ(Mycoplasma)、結核菌(M. tuberculosis)、炭疽菌(Bacillus anthracis)、ブドウ状球菌(Staphylococcus)およびＣ．トラコマチｓウ(C. trachomitis)により引き起こされるものがある。
【００２４】
該組成物は、ウイルス抗原、細菌抗原、原虫抗原および腫瘍特異的抗原などの１以上の抗原を含有するワクチンと組み合わせて、または交互に投与することができる。該組成物は、被験体において一次免疫応答およびエフェクター細胞応答を増強するためにワクチンとともに有効なアジュバントとして使用することができる。処置される好ましい被験体は免疫系が減弱もしくは抑制されているか、６５歳を超えるか、または２歳未満である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】Ｂ７−ＤＣ−ＩｇがＰＤ−１結合ＥＬＩＳＡにおいてＰＤ−１と結合し、Ｂ７−Ｈ１−Ｉｇ−ＡＰＣの結合を阻害することを示す、対数非標識Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ（ｎＭ）に対するＢ７−Ｈ１−Ｉｇ−ＡＰＣの線グラフである。ＡＰＣ＝アロフィコシアニン。
【図２Ａ】１０日目に１００ｍｇ／ｋｇのサイトキサン（登録商標）（ＣＴＸ）で処置したマウスにおける、腫瘍接種後の日数に対する腫瘍増殖（ｍｍ３）の線グラフである。各グラフの各線は１個体のマウスを表す。
【図２Ｂ】１０日目に１００ｍｇ／ｋｇのＣＴＸで処置した後、１１日目にＢ７−ＤＣ−Ｉｇ（５ｍｇ／ｋｇ）の週２回の投与を始めたマウスにおける、腫瘍接種後の日数に対する腫瘍増殖（ｍｍ３）の線グラフである。各グラフの各線は１個体のマウスを表す。黒い矢印はＢ７−ＤＣ−Ｉｇの投与を表す。
【図２Ｃ】１００ｍｇ／ｋｇのＣＴＸ（黒丸）または１００ｍｇ／ｋｇのＣＴＸと５ｍｇ／ｋｇのＢ７−ＤＣ−Ｉｇ（三角）で処置したマウスにおける、腫瘍移植後の日数に対する腫瘍容積（ｍｍ３）の線グラフである。
【図３】１００ｍｇ／ｋｇのＣＴＸと５ｍｇ／ｋｇのＢ７−ＤＣ−Ｉｇの投与がマウスの腫瘍を根絶することを示す試験計画の概略図である。０日目にマウスに１×１０５のＣＴ２６腫瘍細胞を皮下注射した。１０日目にこれらのマウスに１００ｍｇ／ｍｌのＣＴＸを注射した。１１日目に、週に２回、４週間のＢ７−ＤＣ−Ｉｇ  １００μｇ／マウスを開始した。４５日目に、Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇで処置したマウスの７５％で腫瘍が根絶された。挿入図は、週に２回、４週間、１００ｍｇ／ｍｌのＣＴＸで処置したマウス（破線）および１００ｍｇ／ｍｌのＣＴＸとＢ７−ＤＣ−Ｉｇ  １００μｇ／マウスで処置したマウス（実線）の、接種後の日数に対する長期生存率％のグラフである。
【図４】ＣＴＸ＋Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ処置は腫瘍特異的記憶細胞傷害性Ｔリンパ球を生じることを示す試験計画の概略図である。このグラフは、１００ｍｇ／マウスのＣＴＸおよび１００μｇ／マウスのＢ７−ＤＣ−Ｉｇで処置され、ペプチドで処置されない（黒丸）、５μｇ／ｍｌのオボアルブミン（ＯＶＡ）（黒四角）、５０μｇ／ｍｌのＯＶＡ（黒三角）、５μｇ／ｍｌのＡＨ１、ＣＴ２６特異的ペプチド（クロノ逆三角）、または５００μｇ／ｍｌのＡＨ１（黒の菱形）で処置されたマウスから採取した（ＣＤ８／ＩＦＮγ）陽性脾細胞のパーセントを示す。
【図５】図５Ａ〜Ｄは、１００ｍｇ／ｍｌのＣＴＸ（図５Ａ）、１００ｍｇ／ｍｌのＣＴＸ＋３０μｇのＢ７−ＤＣ−Ｉｇ（図５Ｂ）、１００ｍｇのＣＴＸ＋１００μｇのＢ７−ＤＣ−Ｉｇ（図５Ｃ）、または１００ｍｇ／ｍｌのＣＴＸ＋３００μｇのＢ７−ＤＣ−Ｉｇ（図５Ｄ）で処置したマウスにおける、接種後日数に対する腫瘍増殖（ｍｍ３）の線グラフである。
【図６】図６Ａ〜Ｃは、処置されたＢａｌｂ／ＣマウスにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞のＰＤ−１＋パーセントのグラフである。９〜１１週例のＢａｌｂ／Ｃマウスに１×１０５のＣＴ２６細胞を皮下移植した。９日目に、マウスに１００ｍｇ／ｋｇのＣＴＸをＩＰ注射した。２４時間後の１０日目に、マウスを１００μｇのＢ７−ＤＣ−Ｉｇで処置した。ビヒクル注射対照（黒丸）、ＣＴＸ単独（黒四角）、ＣＴＸ＋Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ（黒三角）またはＢ７−ＤＣ−Ｉｇ単独。マウスに週に２回のＢ７−ＤＣ−Ｉｇ注射を続けた。Ｔ細胞分析のため、１１日目（ＣＴＸの２日後）（図６Ａ）、１６日目（ＣＴＸの７日後）（図６Ｂ）および２２日目（ＣＴＸの１３日後）（図６Ｃ）の試験から、他の群に由来する４個体のマウスを取り出した。
【図７】Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇが、ＰＤ−１とＢ７−Ｈ１の相互作用を遮断することにより免疫抑制を打破することを示す概略図である。Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇは、消耗したＴ細胞上で発現されるＰＤ−１と相互作用し、腫瘍細胞または病原体感染細胞上で発現されるＢ７−Ｈ１の結合を妨げることができる。Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇは、腫瘍部位または病原体感染領域においてＩＦＮγ産生細胞を増加させ、かつ、Ｔｒｅｇ細胞を減少させることができる。
【図８】ボーラスＩＶ注射により１０ｍｇ／ｋｇのＢ７−ＤＣ−Ｉｇを注射した２個体のカニクイザルにおける、投与後の時間（時間）の関数としての血清ヒトＢ７−ＤＣ−Ｉｇの濃度を示す線グラフである。
【図９】０日目に投与後の時間（時間）の関数としての血清ネズミＢ７−ＤＣ−Ｉｇの濃度（μｇ／ｍｌ）を示す線グラフである。
【図１０】１００μｇ、３００μｇまたは９００μｇのネズミＢ７−ＤＣ−Ｉｇを腹腔内注射したマウスにおける、投与回数の関数としてのネズミＢ７−ＤＣ−Ｉｇ（μｇ／ｍｌ）のＣｍａｘまたはＣｍｉｎを示す一連の線グラフである。Ｃｍａｘは各投与の６時間後に測定し、Ｃｍｉｎは各投与から２〜３日後に測定した。各データ点では５個体のマウスを用いた。
【発明の具体的説明】
【００２６】
Ｉ．定義
「単離された」とは、その化合物が天然に存在する場合と異なる環境にある、例えば、ペプチドをそれが天然には見られない濃度まで濃縮することなどによってその天然環境から分離された目的化合物（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのいずれか）を表すことを意味する。「単離された」とは、目的化合物が有意に富化された、かつ／または目的化合物が部分的または有意に精製されたサンプル内にある化合物を含むことを意味する。「有意に」とは、統計学的に有意に大きいことを意味する。
【００２７】
本明細書において「ポリペプチド」とは、修飾（例えば、リン酸化またはグリコシル化）とは無関係に任意の長さのアミノ酸鎖を意味する。
【００２８】
本明細書において「変異体」ポリペプチドは、対応する野生型ポリペプチドのアミノ酸配列に比べて少なくとも１つのアミノ酸配列の変更を含む。
【００２９】
本明細書において「アミノ酸配列の変更」とは、例えば、１以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入であり得る。
【００３０】
本明細書において「ベクター」とは、別のＤＮＡセグメントが、その挿入されたセグメントの複製を生じるように挿入することができるプラスミド、ファージまたはコスミドなどのレプリコンである。本明細書に記載のベクターは発現ベクターであり得る。
【００３１】
本明細書において「発現ベクター」とは、１以上の発現制御配列を含むベクターである。
【００３２】
本明細書において「発現制御配列」とは、別のＤＮＡ配列の転写および／または翻訳を制御および調節するＤＮＡ配列である。
【００３３】
本明細書において「機能的に連結される」とは、発現制御配列が目的のコード配列の発現を有効に制御するように遺伝構築物に組み込まれることを意味する。
【００３４】
本明細書においてポリペプチドの「断片」とは、全長タンパク質のより短いポリペプチドであるポリペプチドの任意のサブセットを意味する。一般に、断片はアミノ酸５個以上の長さである。
【００３５】
本明細書において「価数」とは、一分子当たりに利用可能な結合部位の数を意味する。
【００３６】
本明細書において「保存的」アミノ酸置換とは、置換されたアミノ酸が類似の構造的または化学的特性を有する置換である。
【００３７】
本明細書において「非保存的」アミノ酸置換とは、置換されたアミノ酸の電荷、疎水性または嵩が有意に変化するものである。
【００３８】
本明細書において「宿主細胞」とは、組換え発現ベクターが導入できる原核細胞および真核細胞を意味する。
【００３９】
本明細書において「形質転換される」および「トランスフェクトされる」とは、当技術分野で知られているいくつかの技術によって核酸（例えばベクター）を細胞に導入することを包含する。
【００４０】
本明細書において「抗体」とは、完全分子ならびに抗原結合部位を含むその断片の双方を含むことを意味する。これらには完全抗体のＦｃ断片を欠いたＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が含まれる。
【００４１】
「免疫細胞」とは、免疫応答に役割を果たす造血系起源の細胞を意味する。免疫細胞としては、リンパ球（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）、ナチュラルキラー細胞、ならびに骨髄細胞（例えば、単球、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球および顆粒球）が含まれる。
【００４２】
「Ｔ細胞」とは、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞を意味する。このＴ細胞という用語には、ＴＨ１細胞、ＴＨ２細胞およびＴｈ１７細胞がいずれも含まれる。
【００４３】
「Ｔ細胞傷害性」には、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化によって媒介されるいずれの免疫応答も含まれる。免疫応答の例としては、サイトカイン産生、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖、グランザイムまたはパーフォリン産生、および感染性病原体の排除が挙げられる。
【００４４】
「阻害的シグナル伝達」とは、Ｔ細胞増殖の低減によるものであれ他の任意の阻害機構であれ、Ｔ細胞応答を抑制またはそうでなければ低減する効果を有する内因性ＰＤ−Ｌ１もしくはＰＤ−Ｌ２、または他の任意のリガンドによる、ＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達を意味する。
【００４５】
本明細書において「最大血漿濃度」または「Ｃｍａｘ」とは、哺乳類にある物質（例えば、免疫調節薬剤）を投与した後の、哺乳類血漿中のその物質の最大観測濃度を意味する。
【００４６】
本明細書において「曲線下面積」または「ＡＵＣ」とは、時間に対して血漿中のある物質の濃度をプロットした場合の曲線の下の面積である。ＡＵＣは、ある時間間隔での瞬間濃度の積分値であり、単位は、質量×時間／体積であり、ｎＭ×日のように分子濃度×時間として表すこともできる。ＡＵＣは一般に台形法（例えば、線形、線形対数）によって計算される。ＡＵＣは通常、０から∞の時間で与えられ、他の時間間隔は表記される（例えば、ＡＵＣ（ｔ１，ｔ２）、ここで、ｔ１およびｔ２は時間間隔の開始時間および終了時間である）。従って、本明細書において、「ＡＵＣ０-２４ｈ」は２４時間にわたるＡＵＣを意味し、「ＡＵＣ０-４ｈ」は４時間にわたるＡＵＣを意味する。
【００４７】
本明細書において「加重平均ＡＵＣ」とは、ＡＵＣを、ＡＵＣが計算される時間で割ったものである。例えば、加重平均ＡＵＣ０-２４ｈは、ＡＵＣ０−２４ｈを２４時間で割ったものを表す。
本明細書において「信頼区間」または「ＣＩ」とは、与えられた確率ｐ（ここで、ｐは９０％または９５％ＣＩを表す）に相当する測定値または治験が入る区間であり、算術平均、幾何平均または最小二乗平均のいずれかで計算される。本明細書において、幾何平均は、指数によって逆変換した自然対数変換値の平均であり、最小二乗平均も幾何平均といえる場合といえない場合があるが、固定の効果を用いて分散分析（ＡＮＯＶＡ）モデルから導き出される。
【００４８】
明細書において「変動係数（ＣＶ）」は分散の尺度であり、平均値に対する標準偏差の比として定義される。これは、上記の計算値に１００を掛けることによりパーセンテージ（％）（％ＣＶ）として報告される。
【００４９】
本明細書において「Ｔｍａｘ」とは、ある物質を哺乳類に投与した後の、その物質の最大血漿濃度に達するまでに見られた時間を意味する。
【００５０】
本明細書において「血清または血漿半減期」とは、哺乳類に投与された物質の半分が、通常の生体プロセスによって代謝される、または哺乳類の血清または血漿から排除されるのに必要とされる時間を意味する。
【００５１】
ＩＩ．免疫調節薬剤
本明細書に記載の１以上の免疫調節薬剤を用いて免疫応答を増強することができる。好ましい免疫調節薬剤は、ＰＤ−１とＰＤ−１の内因性リガンドとの間の相互作用を妨害または阻害する。例えば、該免疫調節薬剤はＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１としても知られる）、ＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣとしても知られる）または双方のリガンドがＰＤ−１と相互作用するのを妨害、阻害または遮断する。好ましい免疫調節薬剤は、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の双方とＰＤ−１との相互作用を妨害する。いくつかの実施態様では、ＰＤ−１リガンドは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、樹状細胞またはマクロファージ上のＰＤ−１に結合するのを阻害される。一実施態様では、ＰＤ−１リガンドは、活性化Ｔ細胞上のＰＤ−１と結合するのを阻害される。
【００５２】
好適な免疫調節薬剤としては、限定されるものではないが、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の双方のＰＤ−１への結合を妨げる、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメイン、ＰＤ−Ｌ２の融合タンパク質、およびその変異体が挙げられる。さらなる免疫調節薬剤としては、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の双方のＰＤ−１への結合を妨げる、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメイン、ＰＤ−Ｌ１の融合タンパク質、ＰＤ−Ｌ１の断片およびその変異体が挙げられる。特定の実施態様では、該組成物は、ＰＤ−１を介した阻害的シグナル伝達を誘発することなく、ＰＤ−１と結合する。ＰＤ−１のリガンドと結合し、Ｔ細胞上の内因性ＰＤ−１受容体への結合を妨げることができるＰＤ−１もしくはその可溶性断片、ＰＤ−Ｌ１と結合し、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を妨げることができるＢ７．１もしくはその可溶性断片、または上記のいずれかの組合せ。特定の実施態様では、免疫調節薬剤は腫瘍部位または病原体感染領域においてＩＦＮγ産生細胞を増加させ、Ｔｒｅｇ細胞を減少させる。このＴｒｅｇの減少はＴｈ１７細胞の数を増加させ、ＩＬ−１７産生のレベルを高めることができ、また、ＰＤ−１陽性細胞の数を減少させることができる。該免疫調節薬剤は被験体においてＴ細胞傷害性を高め、被験体において強力な免疫応答を誘導し、被験体においてＴ細胞の消耗およびＴ細胞の無反応を克服することができる。
【００５３】
該免疫調節薬剤はＰＤ−１のリガンドと結合し、リガンドのＰＤ−１への結合を妨害または阻害するか、またはＰＤ−１を介したシグナル伝達に結びつくことなくＰＤ−１と直接結合する。好ましい実施態様では、該免疫調節薬剤はＰＤ−１のリガンドと結合し、それらのリガンドがＰＤ−１を介した阻害的シグナル伝達を誘発するのを低減または阻害する。他の実施態様では、該免疫調節薬剤はＰＤ−１と直接結合し、ＰＤ−１の阻害的シグナル伝達を遮断する。さらに別の実施態様では、該免疫調節薬剤はＰＤ−１受容体以外の受容体と結合することによりＴ細胞を活性化させることができる。
【００５４】
該免疫調節薬剤は小分子アンタゴニストであり得る。「小分子」とは、１００ダルトンを超え、約２，５００ダルトン未満、好ましくは１００〜２０００ダルトンの間、より好ましくは約１００〜約１２５０ダルトンの間、より好ましくは約１００〜約１０００ダルトンの間、より好ましくは約１００〜約７５０ダルトンの間、より好ましくは約２００〜約５００ダルトンの間の分子量を有する小有機化合物を意味する。これらの小分子は多くの場合、１以上の官能基で置換された、環状炭素または複素環式構造および／または芳香族または多環芳香族構造を含む。これらの小分子アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２などのＰＤ−１のリガンドと結合し、そのリガンドがＰＤ−１と相互作用するのを妨げることにより、またはＰＤ−１を介したシグナル伝達を誘発することなくＰＤ−１と直接結合することにより、ＰＤ−１受容体シグナル伝達を低減または妨害する。
【００５５】
さらなる実施態様としては、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１またはＢ７−１ポリペプチド、その変異体および／または断片と結合する抗体が含まれる。
【００５６】
開示される免疫調節薬剤は、好ましくは、哺乳類にin vivo投与した後、３か月、２か月、１か月、３週間、２週間、１週間または５日未満の期間、ＰＤ−１またはそのリガンドと結合する。
【００５７】
Ａ．ＰＤ−Ｌ２に基づく免疫調節薬剤
１．ＰＤ−１と結合する、ＰＤ−Ｌ２に基づく免疫調節薬剤
特定の実施態様では、免疫調節薬剤は免疫細胞上のＰＤ−１と結合し、ＰＤ−１の内因性リガンドがＰＤ−１と相互作用するのを防ぐことにより、阻害的ＰＤ−１シグナル伝達を遮断する。ＰＤ−１シグナル伝達は、ＰＤ−１リガンド（ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１；一般に、ＰＤ−Ｌ１）が免疫シナプス内でＴＣＲ：ＭＨＣ複合体と近接してＰＤ−１と結合する必要があると思われる。よって、ＰＤ−１を介した阻害的シグナル伝達を遮断し、場合により、Ｔ細胞膜上でのＰＤ−１とＴＣＲの同時結合を妨げるタンパク質、抗体または小分子は有用な免疫調節薬剤である。
【００５８】
代表的なポリペプチド免疫調節薬剤としては、限定されるものではないが、ＰＤ−Ｌ２ポリペプチド、その断片、その融合タンパク質、およびその変異体が挙げられる。ＰＤ−１と結合し、ＰＤ−１を介した阻害的シグナル伝達を遮断するＰＤ−Ｌ２ポリペプチドは好ましい実施態様の１つである。他の実施態様としては、ＰＤ−１の天然リガンドが結合して、シグナル伝達を誘発するのを防ぐ免疫調節薬剤が含まれる。ある特定の実施態様では、開示されるＰＤ−Ｌ２ポリペプチドは、免疫シナプスに関してペプチド−ＭＨＣ複合体によるＴＣＲの同時結合が存在しないので、ＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達が低減されているか、またはそれを誘発する能力がないと考えられる。ＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達は、Ｔ細胞の活性化およびＴ細胞の増殖を減衰する負のシグナルを伝達するので、ＰＤ−１のシグナル伝達経路を阻害すれば、そうでなければ減衰される細胞を活性化させることができる。
【００５９】
２．例示的ＰＤ−Ｌ２ポリペプチド免疫調節薬剤
ネズミＰＤ−Ｌ２ポリペプチドは、
【化１】
2013512251.tif 000002
または
【化２】
2013512251.tif 000003
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る。
【００６０】
ヒトＰＤ−Ｌ２ポリペプチドは、
【化３】
2013512251.tif 000004
または
【化４】
2013512251.tif 000005
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る。
【００６１】
非ヒト霊長類（カニクイザル）ＰＤ−Ｌ２ポリペプチドは、
【化５】
2013512251.tif 000006
または
【化６】
2013512251.tif 000007
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る。
【００６２】
配列番号１、３および５はそれぞれシグナルペプチドを含む。
【００６３】
Ｂ．ＰＤ−Ｌ１に基づく免疫調節薬剤
１．ＰＤ−１受容体と結合する、ＰＤ−Ｌ１に基づく免疫調節薬剤
ＰＤ−１受容体と結合する他の免疫調節薬剤としては、限定されるものではないが、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチド、その断片、その融合タンパク質およびその変異体が挙げられる。これらの免疫調節薬剤はＰＤ−１受容体と結合してそれを遮断し、ＰＤ−１受容体を介した阻害的シグナル伝達が低減されているか、またはそれを誘発する能力がない。一実施態様では、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは、免疫シナプスに関してペプチド−ＭＨＣ複合体によるＴＣＲの同時結合が存在しないので、ＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達が低減されているか、またはそれを誘発する能力がないと考えられる。ＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達は、Ｔ細胞の活性化およびＴ細胞の増殖を減衰する負のシグナルを伝達するので、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドを用いてＰＤ−１のシグナル伝達を阻害すれば、そうでなければ減衰される細胞を活性化することができる。
【００６４】
２．例示的ＰＤ−Ｌ１ポリペプチド免疫調節薬剤
ネズミＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは、
【化７】
2013512251.tif 000008
または
【化８】
2013512251.tif 000009
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る。
【００６５】
ヒトＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは、
【化９】
2013512251.tif 000010
または
【化１０】
2013512251.tif 000011
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る。
【００６６】
配列番号７および９はそれぞれシグナルペプチドを含む。
【００６７】
Ｃ．Ｂ７．１およびＰＤ−１に基づく免疫調節薬剤
１．ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２と結合する、Ｂ７．１およびＰＤ−１に基づく免疫調節薬剤
他の有用なポリペプチドとしては、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２などのＰＤ−１リガンドと結合し、内因性ＰＤ−１受容体との結合を妨げ、それにより阻害的シグナル伝達を妨げることができるＰＤ−１受容体タンパク質、またはその可溶性断片、その融合タンパク質、およびその変異体が含まれる。このような断片はまた、場合により天然リガンドとの結合を増大させるＡ９９Ｌ突然変異などの突然変異を含む、ＰＤ−１タンパク質の可溶性ＥＣＤ部分も含む。ＰＤ−Ｌ１はまた、タンパク質Ｂ７．１と結合することも示されている(Butte, et al., Immunity, 27(1): 111-122 (2007); Butte, et al., Mol. Immunol. 45: 3567-3572 (2008))。よって、ＰＤ−Ｌ１リガンドと結合し、内因性ＰＤ−１受容体との結合を妨げ、それにより阻害的シグナル伝達を妨げることができるＢ７．１またはその可溶性断片もまた有用である。
【００６８】
２．例示的Ｂ７．１ポリペプチド免疫調節薬剤
ネズミＢ７．１ポリペプチドは、
【化１１】
2013512251.tif 000012
または
【化１２】
2013512251.tif 000013
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る。
【００６９】
ヒトＢ７．１ポリペプチドは、
【化１３】
2013512251.tif 000014
または
【化１４】
2013512251.tif 000015
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る。
【００７０】
配列番号１１および１３はそれぞれシグナルペプチドを含む。
【００７１】
３．例示的ＰＤ−１ポリペプチド免疫調節薬剤
ヒトＰＤ−１ポリペプチドは、
【化１５】
2013512251.tif 000016
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る。
【００７２】
非ヒト霊長類（カニクイザル）ＰＤ−１ポリペプチドは、
【化１６】
2013512251.tif 000017
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る。
【００７３】
ネズミＰＤ−１ポリペプチドは、
【化１７】
2013512251.tif 000018
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る。
【００７４】
配列番号１５〜１７はそれぞれシグナルペプチドを含む。
【００７５】
Ｄ．ＰＤ−１免疫調節薬剤の断片
該ポリペプチド免疫調節薬剤は全長ポリペプチドであってもよいし、あるいは全長ポリペプチドの断片であってもよい。本明細書において、ポリペプチド免疫調節薬剤の断片とは、全長タンパク質より短いポリペプチドであるポリペプチドの任意のサブセットを意味する。
【００７６】
有用な断片は、それらの天然リガンドと結合する能力を保持するものである。全長ポリペプチドの断片であるポリペプチド免疫調節薬剤は一般に、全長ポリペプチドに比べてその天然リガンドと結合する能力の少なくとも２０パーセント、３０パーセント、４０パーセント、５０パーセント、６０パーセント、７０パーセント、８０パーセント、９０パーセント、９５パーセント、９８パーセント、９９パーセント、１００パーセントを有する、またはさらには１００パーセントを超える。
【００７７】
例えば、ＰＤ−Ｌ２およびＰＤ−Ｌ１の有用な断片は、ＰＤ−１と結合する能力を保持するものである。ＰＤ−Ｌ２およびＰＤ−Ｌ１断片は一般に、全長ＰＤ−Ｌ２およびＰＤ−Ｌ１に比べてＰＤ−１と結合する能力の少なくとも２０パーセント、３０パーセント、４０パーセント、５０パーセント、６０パーセント、７０パーセント、８０パーセント、９０パーセント、９５パーセント、９８パーセント、９９パーセント、１００パーセントを有する、またはさらには１００パーセントを超えるものである。
【００７８】
ポリペプチド免疫調節薬剤の断片は可溶性断片を含む。可溶性ポリペプチド免疫調節薬剤断片は、産生細胞から放出、分泌またはそうでなければ抽出され得るポリペプチドの断片である。ポリペプチド免疫調節薬剤の可溶性断片は、該ポリペプチドの細胞外ドメインの一部または全部を含み、細胞内ドメインおよび／またはトランスメンブランドメインの一部または全部を欠く。一実施態様では、ポリペプチド免疫調節薬剤断片は免疫調節性ポリペプチドの全細胞外ドメインを含む。細胞外ドメインはトランスメンブランドメイン由来の１、２、３、４または５個のアミノ酸を含み得ると考えられる。あるいは、細胞外ドメインはＣ末端、Ｎ末端または双方から取り除かれた１、２、３、４または５個のアミノ酸を有し得る。
【００７９】
一般に、免疫調節性ポリペプチドまたはその断片は、シグナル配列をコードする配列を含む核酸から発現される。このシグナル配列が一般に未熟なポリペプチドから切断されて、シグナル配列を欠く成熟ポリペプチドが生じる。免疫調節性ポリペプチドのこのシグナル配列は、そのポリペプチドの発現レベル、分泌、溶解度または他の特性に影響を与えるために標準的な分子生物学的技術を用いて別のポリペプチドのシグナル配列で置換することができる。免疫調節性ポリペプチドシグナル配列を置換するために用いられるシグナル配列は当技術分野で知られているいずれのものであってもよい。
【００８０】
１．ＰＤ−Ｌ２細胞外ドメイン
ａ．ヒトＰＤ−Ｌ２細胞外ドメイン
一実施態様では、該免疫調節性ポリペプチドは、ヒトＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメインまたはその断片を含む。該免疫調節性ポリペプチドは、
【化１８】
2013512251.tif 000019
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００８１】
別の実施態様では、該免疫調節性ポリペプチドは、ヒトアミノ酸配列：
【化１９】
2013512251.tif 000020
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る。
【００８２】
シグナル配列は成熟タンパク質では除去されると考えられる。さらに、産生中に宿主からのタンパク質の分泌を増強するために他の生物由来のシグナルペプチドを使用することができると考えられる。配列番号１９：
【化２０】
2013512251.tif 000021
は、シグナル配列を含まない配列番号１８のヒトアミノ酸配列を示す。
【００８３】
別の実施態様では、該免疫調節性ポリペプチドは、ヒトＰＤ−Ｌ２のＩｇＶドメインを含む。このポリペプチドは、
【化２１】
2013512251.tif 000022
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００８４】
該免疫調節性ポリペプチドは、ヒトアミノ酸配列：
【化２２】
2013512251.tif 000023
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る（ＰＤ−Ｌ２Ｖとも呼ばれる）。
【００８５】
ｂ．非ヒト霊長類ＰＤ−Ｌ２細胞外ドメイン
一実施態様では、該免疫調節性ポリペプチドは、非ヒト霊長類（カニクイザル）ＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメインまたはその断片を含む。このポリペプチドは、
【化２３】
2013512251.tif 000024
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００８６】
別の実施態様では、該免疫調節性ポリペプチドは、非ヒト霊長類アミノ酸配列：
【化２４】
2013512251.tif 000025
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る。
【００８７】
シグナル配列は成熟タンパク質では除去される。さらに、産生中に宿主からのタンパク質の分泌を増強するために他の生物由来のシグナルペプチドを使用することができる。配列番号２４：
【化２５】
2013512251.tif 000026
は、シグナル配列を含まない配列番号２３の非ヒト霊長類アミノ酸配列を示す。
【００８８】
別の実施態様では、該免疫調節性ポリペプチドは、非ヒト霊長類ＰＤ−Ｌ２のＩｇＶドメインを含む。このポリペプチドは、
【化２６】
2013512251.tif 000027
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００８９】
該免疫調節性ポリペプチドは、非ヒト霊長類アミノ酸配列：
【化２７】
2013512251.tif 000028
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る（ＰＤ−Ｌ２Ｖとも呼ばれる）。
【００９０】
ｃ．ネズミＰＤ−Ｌ２細胞外ドメイン
一実施態様では、該免疫調節性ポリペプチドは、ネズミＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメインまたはその断片を含む。該免疫調節性ポリペプチドは、
【化２８】
2013512251.tif 000029
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００９１】
別の実施態様では、該免疫調節性ポリペプチドは、ネズミアミノ酸配列：
【化２９】
2013512251.tif 000030
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る。
【００９２】
シグナル配列は成熟タンパク質では除去される。さらに、産生中に宿主からのタンパク質の分泌を増強するために他の生物由来のシグナルペプチドを使用することができる。配列番号２９：
【化３０】
2013512251.tif 000031
は、シグナル配列を含まない配列番号２８のネズミアミノ酸配列を示す。
【００９３】
別の実施態様では、該免疫調節性ポリペプチドは、ネズミＰＤ−Ｌ２のＩｇＶドメインを含む。このポリペプチドは、
【化３１】
2013512251.tif 000032
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００９４】
該免疫調節性ポリペプチドは、ネズミアミノ酸配列：
【化３２】
2013512251.tif 000033
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る（ＰＤ−Ｌ２Ｖとも呼ばれる）。
【００９５】
ｄ．ＰＤ−Ｌ２細胞外ドメイン断片
ＰＤ−Ｌ２細胞外ドメインは、シグナルペプチドまたはＰＤ−Ｌ２の推定トランスメンブランドメイン由来の１以上のアミノ酸を含み得る。分泌の際に、切断されるシグナルペプチドのアミノ酸の数は発現系および宿主によって異なり得る。さらに、ＰＤ−１と結合する能力を保持する、Ｃ末端またはＮ末端から１以上のアミノ酸を欠くＰＤ−Ｌ２細胞外ドメインの断片を使用することもできる。
【００９６】
使用可能なネズミＰＤ−Ｌ２の好適な断片の例としては、限定されるものではないが、以下のもの：
配列番号５４の
【化３３】
2013512251.tif 000034
が挙げられる。
【００９７】
ネズミＰＤ−Ｌ２のさらなる好適な断片としては、限定されるものではないが、場合によりシグナルペプチドの１〜５個のアミノ酸がＮ末端に付加された、以下のもの：
配列番号１の
【化３４】
2013512251.tif 000035
が挙げられる。シグナルペプチドは、配列番号１内に含まれるシグナルペプチドを含め、本明細書に開示されるいずれのものであってもよく、または当技術分野で知られているいずれのシグナルペプチドであってもよい。
【００９８】
使用可能なヒトＰＤ−Ｌ２の好適な断片の例としては、限定されるものではないが、以下のもの：
配列番号５７の
【化３５】
2013512251.tif 000036
が挙げられる。
【００９９】
ヒトＰＤ−Ｌ２のさらなる好適な断片としては、限定されるものではないが、場合によりシグナルペプチドの１〜５個のアミノ酸がＮ末端に付加された、以下のもの：
配列番号３の
【化３６】
2013512251.tif 000037
が挙げられる。シグナルペプチドは、配列番号３内に含まれるシグナルペプチドを含め、本明細書に開示されるいずれのものであってもよく、または当技術分野で知られているいずれのシグナルペプチドであってもよい。
【０１００】
使用可能な非ヒト霊長類ＰＤ−Ｌ２の好適な断片の例としては、限定されるものではないが、以下のもの：
配列番号５の
【化３７】
2013512251.tif 000038
が挙げられる。
【０１０１】
非ヒト霊長類ＰＤ−Ｌ２のさらなる好適な断片としては、限定されるものではないが、場合によりシグナルペプチドの１〜５個のアミノ酸がＮ末端に付加された、以下のもの：
配列番号５の
【化３８】
2013512251.tif 000039
が挙げられる。シグナルペプチドは、配列番号５内に含まれるシグナルペプチドを含め、本明細書に開示されるいずれのものであってもよく、または当技術分野で知られているいずれのシグナルペプチドであってもよい。
【０１０２】
ＰＤ−Ｌ２タンパク質はまた、配列番号３（ヒト全長）のアミノ酸２０〜１２１または配列番号２４（細胞外ドメインまたはＥＣＤ）のアミノ酸１〜１０２のＰＤ−１結合断片も含む。その特定の実施態様では、ＰＤ−Ｌ２ポリペプチドまたはＰＤ−１結合断片はまた、配列番号３の残基１１０〜１１４のアミノ酸ＷＤＹＫＹを、または配列番号２４の残基９１〜９５のＷＤＹＫＹを組み込んでいる。限定されない例としては、このようなＰＤ−１結合断片は、配列番号３のアミノ酸２０〜１２１の配列の少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５または少なくとも１００個の連続するアミノ酸を含んでなり、このようなＰＤ−１結合断片のそれぞれの好ましい実施態様は、部分断片として配列番号３の残基１１０〜１１４に見られるアミノ酸ＷＤＹＫＹ、または配列番号２３の残基９１〜９５に見られるＷＤＹＫＹを含んでなる。
【０１０３】
２．ＰＤ−Ｌ１細胞外ドメイン
一実施態様では、変異体ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは細胞外ドメインの全部または一部を含む。ヒトＰＤ−Ｌ１の代表的な細胞外ドメインのアミノ酸配列は、
【化３９】
2013512251.tif 000040
と８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の配列同一性を有し得る。
【０１０４】
ＰＤ−Ｌ１のトランスメンブランドメインは配列番号９の２３９番のアミノ酸で始まる。ＰＤ−Ｌ１の好適な断片は、シグナルペプチド配列、例えば、配列番号９またはその変異体の１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続するアミノ酸、トランスメンブランドメインの１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のアミノ酸、またはその組合せを含み得ると考えられる。
【０１０５】
ネズミＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインは以下のアミノ酸配列：
【化４０】
2013512251.tif 000041
を有する。
【０１０６】
ネズミＰＤ−Ｌ１のトランスメンブランドメインは配列番号７の２４０番のアミノ酸で始まる。ある特定の実施態様では、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは、ネズミＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインを、シグナルペプチドの１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続するアミノ酸、トランスメンブランドメインの１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続するアミノ酸、またはその組合せとともに含む。
【０１０７】
３．Ｂ７．１細胞外ドメイン
ａ．ネズミＢ７．１細胞外ドメイン
一実施態様では、該免疫調節性ポリペプチドは、ネズミＢ７．１の細胞外ドメインまたはその断片を含む。該免疫調節性ポリペプチドは、
【化４１】
2013512251.tif 000042
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【０１０８】
別の実施態様では、該免疫調節性ポリペプチドは、ネズミアミノ酸配列：
【化４２】
2013512251.tif 000043
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る。
【０１０９】
シグナル配列は成熟タンパク質では除去される。さらに、産生中に宿主からのタンパク質の分泌を増強するために、他の生物由来のシグナルペプチドを使用することができる。配列番号３６：
【化４３】
2013512251.tif 000044
は、シグナル配列を含まない配列番号３５のネズミアミノ酸配列を示す。
【０１１０】
別の実施態様では、該免疫調節性ポリペプチドは、ネズミＢ７．１のＩｇＶドメインを含む。このポリペプチドは、
【化４４】
2013512251.tif 000045
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【０１１１】
該免疫調節性ポリペプチドは、ネズミアミノ酸配列：
【化４５】
2013512251.tif 000046
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る（Ｂ７．１Ｖとも呼ばれる）。
【０１１２】
ｂ．ヒトＢ７．１細胞外ドメイン
一実施態様では、該免疫調節性ポリペプチドは、ヒトＢ７．１の細胞外ドメインまたはその断片を含む。該免疫調節性ポリペプチドは、
【化４６】
2013512251.tif 000047
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【０１１３】
別の実施態様では、該免疫調節性ポリペプチドは、ヒトアミノ酸配列：
【化４７】
2013512251.tif 000048
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る。
【０１１４】
シグナル配列は成熟タンパク質では除去される。さらに、産生中に宿主からのタンパク質の分泌を増強するために、他の生物由来のシグナルペプチドを使用することができる。配列番号４１は、シグナル配列を含まない配列番号４０のヒトアミノ酸配列を示す。
【化４８】
2013512251.tif 000049
【０１１５】
別の実施態様では、、該免疫調節性ポリペプチドは、１〜１０個のＣ末端アミノ酸を欠く配列番号４０または配列番号４１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る。
【０１１６】
別の実施態様では、該免疫調節性ポリペプチドは、ヒトＢ７．１のＩｇＶドメインを含む。このポリペプチドは、
【化４９】
2013512251.tif 000050
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【０１１７】
該免疫調節性ポリペプチドは、ヒトアミノ酸配列：
【化５０】
2013512251.tif 000051
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る（Ｂ７．１Ｖとも呼ばれる）。
【０１１８】
ｃ．Ｂ７．１細胞外ドメイン断片
共刺激ポリペプチドドメインとして使用することができるネズミＢ７．１の好適な断片の例としては、限定されるものではないが、以下のもの：
配列番号１１の
【化５１】
2013512251.tif 000052
が挙げられる。
【０１１９】
ネズミＢ７．１のさらなる好適な断片としては、限定されるものではないが、場合によりシグナルペプチドの１〜５個のアミノ酸がＮ末端に付加された、以下のもの：
配列番号１１の
【化５２】
2013512251.tif 000053
が挙げられる。シグナルペプチドは、配列番号１１内に含まれるシグナルペプチドを含め、本明細書に開示されるいずれのものであってもよく、または当技術分野で知られているいずれのシグナルペプチドであってもよい。
【０１２０】
共刺激ポリペプチドドメインとして使用することができるヒトＢ７．１の好適な断片の例としては、限定されるものではないが、以下のもの：
配列番号１３の
【化５３】
2013512251.tif 000054
が挙げられる。
【０１２１】
ヒトＢ７．１のさらなる好適な断片としては、限定されるものではないが、場合によりシグナルペプチドの１〜５個のアミノ酸がＮ末端に付加された、以下のもの：
配列番号１３の
【化５４】
2013512251.tif 000055
が挙げられる。シグナルペプチドは、配列番号１３内に含まれるシグナルペプチドを含め、本明細書に開示されるいずれのものであってもよく、または当技術分野で知られているいずれのシグナルペプチドであってもよい。
【０１２２】
４．ＰＤ−１細胞外ドメイン
ａ．ヒトＰＤ−１細胞外ドメイン
一実施態様では、該免疫調節性ポリペプチドは、ヒトＰＤ−１の細胞外ドメインまたはその断片を含む。推定される細胞外ドメインは、Ｓｗｉｓｓｐｏｒｔ受託番号Ｑ１５１１６のアミノ酸２１付近〜アミノ酸１７０付近に由来する配列を含む。該免疫調節性ポリペプチドは、ヒトアミノ酸配列：
【化５５】
2013512251.tif 000056
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る。
【０１２３】
シグナル配列は成熟タンパク質では除去される。さらに、産生中に宿主からのタンパク質の分泌を増強するために、他の生物由来のシグナルペプチドを使用することができると考えられる。
【０１２４】
別の実施態様では、該免疫調節性ポリペプチドは、ヒトＰＤ−１のＩｇＶドメイン、例えば、アミノ酸３５〜１４５を含む。
【０１２５】
ｂ．非ヒト霊長類ＰＤ−１細胞外ドメイン
一実施態様では、該免疫調節性ポリペプチドは、非ヒト霊長類（カニクイザル）ＰＤ−１の細胞外ドメインまたはその断片を含む。非ヒト霊長類（カニクイザル）ＰＤ−１ポリペプチドは、
【化５６】
2013512251.tif 000057
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る。
【０１２６】
配列番号１６は、アミノ酸１〜２０に由来するシグナル配列を含む。シグナル配列は成熟タンパク質では除去される。さらに、産生中に宿主からのタンパク質の分泌を増強するために、他の生物由来のシグナルペプチドを使用することができる。
【０１２７】
別の実施態様では、該免疫調節性ポリペプチドは、非ヒト霊長類ＰＤ−１のＩｇＶドメインを含む。
【０１２８】
ｃ．ネズミＰＤ−１細胞外ドメイン
該免疫調節性ポリペプチドは、ネズミＰＤ−１の細胞外ドメインまたはその断片を含む。該免疫調節性ポリペプチドは、ネズミアミノ酸配列：
【化５７】
2013512251.tif 000058
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る。
【０１２９】
アミノ酸１〜２０は、成熟タンパク質を精製するために切断されるシグナル配列である。産生中に宿主からのタンパク質の分泌を増強するために、他の生物由来のシグナルペプチドを使用することができる。
【０１３０】
ｄ．ＰＤ−１細胞外ドメイン断片
ＰＤ−１細胞外ドメインは、シグナルペプチドまたはＰＤ−Ｌ２の推定トランスメンブランドメイン由来の１以上のアミノ酸を含み得る。分泌の際に、切断されるシグナルペプチドのアミノ酸の数は発現系および宿主によって異なり得る。さらに、Ｃ末端またはＮ末端から１以上のアミノ酸を欠くＰＤ−１細胞外ドメインの断片を使用することもできる。
【０１３１】
使用可能なネズミまたはヒトＰＤ−１の好適な断片の例としては、限定されるものではないが、以下のもの：
配列番号１５〜１７の
【化５８】
2013512251.tif 000059
が挙げられる。
【０１３２】
Ｅ．変異体
１．変異体ＰＤ−Ｌ２およびＰＤ−Ｌ１免疫調節薬剤
さらなる免疫調節薬剤としては、突然変異誘発されて、その結果、生理学的条件下でＰＤ−１に対する結合が増強されたか、またはＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達を促進する能力が低減されたＰＤ−Ｌ２およびＰＤ−Ｌ１ポリペプチド、ならびにその断片および融合物が含まれる。一実施態様は、ＰＤ−１を活性化し、Ｔ細胞へ阻害シグナルを伝達するポリペプチドの能力を非突然変異ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１に比べて阻害または低減する１以上のアミノ酸置換、欠失または挿入を含む単離されたＰＤ−Ｌ２およびＰＤ−Ｌ１ポリペプチドを提供する。該ＰＤ−Ｌ２およびＰＤ−Ｌ１ポリペプチドはいずれの起源種のものであってもよい。一実施態様では、ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは哺乳類種に由来する。好ましい実施態様では、ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドはヒトまたは非ヒト霊長類起源のものである。
【０１３３】
別の実施態様では、変異型ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは、ＰＤ−１に対して野生型または非変異型ＰＤ−Ｌ２もしくはＰＤ−Ｌ１と同じ結合活性を有するが、ＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達を刺激する能力を持たないか、または非突然変異ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドの１０％未満である。他の実施態様では、該変異型ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは野生型ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１よりもＰＤ−１に対して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはそれを超える結合活性を有し、ＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達を刺激する能力が非突然変異ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドの５０％、４０％、３０％、２０％または１０％未満である。
【０１３４】
変異型ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失または挿入の任意の組合せを有し得る。一実施態様では、単離されたＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１変異型ポリペプチドは、それらのアミノ酸配列が野生型ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９、９９．５または１００％の同一性を有するように、複数のアミノ酸変化を有する。好ましい実施態様では、ＰＤ−Ｌ１変異型ポリペプチドは、野生型ネズミ、非ヒト霊長類またはヒトＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９、９９．５または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【０１３５】
配列同一性％は、コンピュータープログラムまたは直接的配列比較を用いて計算することができる。２配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータープログラム法としては、限定されるものではないが、ＧＣＧプログラムパッケージ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＰおよびＴＢＬＡＳＴＮが挙げられる（例えば、D. W. Mount, 2001, Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 参照）。ＢＬＡＳＴＰおよびＴＢＬＡＳＴＮプログラムはＮＣＢＩおよび他のソースから公的に入手可能である。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性を決定するために使用可能である。
【０１３６】
アミノ酸配列比較のためのパラメーターの例としては以下のものが挙げられる：１）Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol., 48:443-453 (1970))からのアルゴリズム；２）Hentikoff and Hentikoff (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89:10915-10919 (1992))からのＢＬＯＳＳＵＭ６２比較マトリックス、３）ギャップペナルティー＝１２；および４）ギャップレングスペナルティー＝４。これらのパラメーターを用いる有用なプログラムは、「ギャップ」プログラム(Genetics Computer Group, Madison, Wis.)として公的に入手可能である。上述のパラメーターはポリペプチド比較のためのデフォルトパラメーターである（エンドギャップに対するペナルティーは無い）。
【０１３７】
あるいは、ポリペプチド配列同一性は、下式：同一性％＝（同一の残基の数）／（アミノ酸残基のアライメント長）＊１００を用いて計算することができる。この計算では、アライメント長は内部ギャップを含むが、末端ギャップは含まない。
【０１３８】
ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドのアミノ酸置換は「保存的」または「非保存的」であり得る。本明細書において「保存的」アミノ酸置換は、置換されたアミノ酸が類似の構造的または化学的特性を有する置換であり、「非保存的」アミノ酸置換は、置換されたアミノ酸の電荷、疎水性または嵩が有意に変更されるものである。非保存的置換は、（ａ）例えば、シートまたはらせんコンフォメーションのような置換領域におけるペプチド主鎖の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩の維持に対するそれらの効果がより有意に異なる。
【０１３９】
保存的アミノ酸置換の例としては、置換が以下の５群のうち１つに入るものが挙げられる：１）小さな脂肪族、非極性またはやや極性の残基（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）；２）極性、負電荷を有する残基およびそれらのアミド（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ）；極性、正電荷を有する残基（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）；大きな脂肪族、非極性残基（Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ）；および大きな芳香族残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）。非保存的アミノ酸置換の例としては、１）親水性残基（例えば、セリルまたはトレオニル）が疎水性残基（例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニル）から（またはにより）置換される場合；２）システインまたはプロリンが他の残基から（またはにより）置換される場合；３）電気的に陽性の側鎖を有する残基（例えば、リシル、アルギニルまたはヒスチジル）が電気的に陰性の残基（例えば、グルタミルまたはアスパルチル）から（またはにより）置換される場合；または４）嵩高の側鎖を有する残基（例えば、フェニルアラニン）が側鎖を持たない残基（例えば、グリシン）から（またはにより）置換される場合が挙げられる。
【０１４０】
しかしながら、挙げられたアミノ酸位置における置換は、任意のアミノ酸またはアミノ酸類似体を用いて行うことができると理解される。例えば、挙げられた位置における置換は、任意の天然アミノ酸（例えば、アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、アルギニン、システイン、グリシン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、ロイシン、バリン、イソロイシン、リシン、メチオニン、プロリン、トレオニン、セリン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシン）を用いて行うことができる。
【０１４１】
変異型ＰＤ−Ｌ２およびＰＤ−Ｌ１ポリペプチドおよび断片の例は以下の実施例２の表１および２に示されている。これらの表は、これらのポリペプチドのＰＤ−１への低下した結合の増強を生じさせるために突然変異させることができるアミノ酸位置、ならびにＦＡＣＳ分析およびＥＬＩＳＡにより測定される、ＰＤ−１への結合に対する、特異的アミノ酸バリエーションの効果を示す。一実施態様では、変異型ＰＤ−Ｌ２ポリペプチドは、ＰＤ−１への結合の増強をもたらすＳ５８における置換を含む。一実施態様では、ＰＤ−Ｌ２におけるＳ５８置換はセリンからチロシンへの置換である。別の実施態様では、変異型ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは、ＰＤ−１への結合の増強をもたらすＥ５８、Ａ６９および／またはＣ１１３における置換を含む。これらの位置における置換の例としては、限定されるものではないが、Ｅ５６８Ｓ、Ａ６９ＦおよびＣ１１３Ｙが挙げられる。
【０１４２】
本明細書に記載される置換はマウス、非ヒト霊長類およびヒトＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１に関するものであるが、当業者ならば他種（例えば、ラット、ハムスター、モルモット、アレチネズミ、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ヒツジまたはウシ）由来の相同ポリペプチドにおいても、保存されたアミノ酸または相当する位置のアミノ酸に等価の変更を容易に行うことができることを注記しておく。しかしながら、結合は種特異的な成分を有することから、ＰＤ−１アンタゴニストをヒトに投与する場合にはヒトを使用するのが好ましい。
【０１４３】
一実施態様では、開示される単離された変異型ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドはＰＤ−１のアンタゴニストであり、ＰＤ−１を介したシグナル伝達を誘発することなくＰＤ−１と結合してそれを遮断する。ＰＤ−１シグナル伝達によるＴ細胞の減衰を妨げることにより、より多くのＴ細胞を活性化に利用可能とする。Ｔ細胞阻害を妨げると、ＰＤ−１アンタゴニストと接触していないＴ細胞に比べて、Ｔ細胞応答が高まるか、Ｔ細胞の増殖が増大するか、Ｔ細胞によるサイトカインの産生および／または分泌が高まるか、Ｔ細胞の分化およびエフェクター機能が刺激されるか、またはＴ細胞の生存が促進される。この相互作用から生じるＴ細胞応答は一般に、ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドの不在下での応答よりも大きい。ＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドの不在下でのＴ細胞の応答は応答性がないか、またはＰＤ−１アンタゴニストポリペプチドの存在下よりも有意に低いものであり得る。このＴ細胞の応答は、エフェクター（例えば、ＣＴＬまたは抗体産生Ｂ細胞）応答、１以上のエフェクター（例えば、ＣＴＬまたは抗体産生Ｂ細胞）応答を助けるヘルパー応答または抑制的応答であり得る。
【０１４４】
２分子間の結合親和性を測定する方法は技術分野でよく知られている。ＰＤ−１に対する変異型ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドの結合親和性を測定する方法としては、限定されるものではないが、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、表面プラズモン共鳴、蛍光異方性、アフィニティークロマトグラフィーおよび親和性選択−質量分析が挙げられる。
【０１４５】
本明細書に開示される変異型ポリペプチドは全長ポリペプチドであってもよいし、あるいは全長ポリペプチドの断片であってもよい。好ましい断片は、ＰＤ−１と結合するのに有効な細胞外ドメインの全部または一部を含む。本明細書において、断片とは、全長タンパク質より短いポリペプチドであるポリペプチドの任意のサブセットを意味する。
【０１４６】
２．変異型Ｂ７．１およびＰＤ−１免疫調節薬剤
さらなる免疫調節薬剤としては、生理学的条件下でＰＤ−Ｌ２および／またはＰＤ−Ｌ１と結合する能力を保持するか、ＰＤ−Ｌ２および／またはＰＤ−Ｌ１に対する結合が増強されるように改変されたＢ７．１およびＰＤ−１ポリペプチドおよびその断片が含まれる。このような変異型ＰＤ−１タンパク質としては、天然リガンドに対する結合を増強するＡ９９Ｌ突然変異などの突然変異を含むＰＤ−１タンパク質の可溶性ＥＣＤ部分が含まれる(Molnar et al., Crystal structure of the complex between programmed death-1 (PD-1) and its ligand PD-L2, PNAS, Vol. 105, pp. 10483-10488 (29 July 2008))。Ｂ７．１およびＰＤ−１ポリペプチドはいずれの起源種のものであってもよい。一実施態様では、Ｂ７．１またはＰＤ−１ポリペプチドは哺乳類種に由来する。好ましい実施態様では、Ｂ７．１またはＰＤ−１ポリペプチドはヒトまたは非ヒト霊長類起源のものである。
【０１４７】
変異型Ｂ７．１またはＰＤ−１ポリペプチドはアミノ酸置換、欠失または挿入の任意の組合せを有し得る。一実施態様では、単離されたＢ７．１またはＰＤ−１変異型ポリペプチドは、それらのアミノ酸配列が野生型Ｂ７．１またはＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９、９９．５または１００％の同一性を有するように、ある整数のアミノ酸変化を有する。好ましい実施態様では、Ｂ７．１またはＰＤ−１変異型ポリペプチドは、野生型ネズミ、非ヒト霊長類またはヒトＢ７．１またはＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９、９９．５または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【０１４８】
Ｂ７．１またはＰＤ−１ポリペプチドにおけるアミノ酸置換は「保存的」または「非保存的」であり得る。保存的および非保存的置換は上記されている。
【０１４９】
一実施態様では、開示される単離された変異型Ｂ７．１またはＰＤ−１ポリペプチドはＰＤ−１のアンタゴニストであり、ＰＤ−Ｌ２および／またはＰＤ−Ｌ１と結合し、それによりそれらの内因性ＰＤ−１との結合を遮断する。ＰＤ−１シグナル伝達によるＴ細胞の減衰を妨げることにより、より多くのＴ細胞を活性化に利用可能となる。Ｔ細胞阻害を妨げると、免疫調節薬剤と接触していないＴ細胞に比べて、Ｔ細胞応答が高まるか、Ｔ細胞の増殖が増大するか、Ｔ細胞によるサイトカインの産生および／または分泌が高まるか、Ｔ細胞の分化およびエフェクター機能が刺激されるか、またはＴ細胞の生存が促進される。この相互作用から生じるＴ細胞応答は一般に、免疫調節薬剤の不在下での応答よりも大きい。免疫調節薬剤の不在下でのＴ細胞の応答は応答性がないか、または免疫調節薬剤の存在下よりも有意に低いものであり得る。このＴ細胞の応答は、エフェクター（例えば、ＣＴＬまたは抗体産生Ｂ細胞）応答、１以上のエフェクター（例えば、ＣＴＬまたは抗体産生Ｂ細胞）応答を助けるヘルパー応答または抑制的応答であり得る。
【０１５０】
変異型ポリペプチドは全長ポリペプチドであってもよいし、あるいは全長ポリペプチドの断片であってもよい。好ましい断片は、ＰＤ−Ｌ２および／またはＰＤ−Ｌ１と結合するのに有効な細胞外ドメインの全部または一部を含む。本明細書において、断片とは、全長タンパク質より短いポリペプチドであるポリペプチドの任意のサブセットを意味する。
【０１５１】
一実施態様では、
【０１５２】
Ｆ．融合タンパク質
いくつかの実施態様では、免疫調節薬剤は、第一のポリペプチドドメインと第二の標的化ドメインとを含む融合タンパク質である。この融合タンパク質はＴ細胞受容体と結合することができ、かつ／または好ましくはこの融合タンパク質は、例えばＰＤ−１と競合的に結合することによって、Ｔ細胞と結合して、Ｔ細胞への阻害的シグナル伝達を遮断することができる。開示される組成物は、天然阻害リガンドとＰＤ−１との結合を妨害することにより、ＰＤ−１を介したシグナル伝達を有効に遮断する。好適な共刺激ポリペプチドとしては、ＰＤ−１などの阻害的Ｔ細胞シグナル伝達受容体に対する結合親和性が増強または低減された変異型ポリペプチドおよび／またはその断片が含まれる。
【０１５３】
融合タンパク質はまた場合により、第一のポリペプチドドメインを抗原結合ドメインから分離するペプチドまたはポリペプチドリンカードメインを含んでもよい。
【０１５４】
本明細書に開示される融合タンパク質は式Ｉ：
Ｎ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｃ
（式中、「Ｎ」は融合タンパク質のＮ末端を表し、「Ｃ」は融合タンパク質のＣ末端を表し、「Ｒ１」はＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７．１もしくはＰＤ−１ポリペプチドまたは抗原結合標的化ドメインであり、「Ｒ２」は任意選択のペプチド／ポリペプチドリンカードメインであり、「Ｒ３」は標的化ドメインまたは抗原結合標的化ドメインであり、ここで、「Ｒ１」が抗原結合標的化ドメインである場合には、「Ｒ３」はポリペプチドドメインであり、「Ｒ１」がＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７．１またはＰＤ−１ポリペプチド、その断片もしくは変異体である場合には、「Ｒ３」は抗原結合標的化ドメインである）
のものである。好ましい実施態様では、「Ｒ１」はＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７．１またはＰＤ−１ポリペプチドドメインであり、「Ｒ３」は抗原結合標的化ドメインまたは二量体化ドメインである。
【０１５５】
場合により、融合タンパク質はさらに、２以上の融合タンパク質を二量体化または多量体化する働きをするドメインを含む。該融合タンパク質を二量体化または多量体化する働きをするドメインは別個のドメインであってもよいし、あるいはまたその融合タンパク質の他のドメイン（ＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７．１もしくはＰＤ−１ポリペプチドドメイン、抗原結合標的化ドメインまたはペプチド／ポリペプチドリンカードメイン）の１つに含まれていてもよい。
【０１５６】
融合タンパク質は二量体化または多量体化されていてもよい。二量体化または多量体化は二量体化または多量体化ドメインを介して２以上の融合タンパク質間で生じ得る。あるいは、融合タンパク質の二量体化または多量体化は化学的架橋によっても生じ得る。形成される二量体または多量体は、ホモ二量体／ホモ多量体またはヘテロ二量体／ヘテロ多量体であり得る。
【０１５７】
融合タンパク質のモジュール性およびそれらの種々の組合せでの二量体化または多量体化能は、腫瘍細胞の微小環境または免疫調節組織に対する免疫応答を増強する働きをする標的化分子に豊富な選択肢を与える。
【０１５８】
１．抗原結合標的化ドメイン
融合タンパク質はまた抗原結合標的化ドメインを含む。いくつかの実施態様では、標的化ドメインは感染疾患を引き起こす病原体、癌または腫瘍部位に応答したＴ細胞の活性化の調節に関与する免疫組織に特異的な抗原、リガンドまたは受容体と結合する。
【０１５９】
腫瘍／腫瘍関連血管系標的化ドメイン
腫瘍特異的および腫瘍関連抗原を標的化するための抗原、リガンドおよび受容体
一実施態様では、融合タンパク質は、腫瘍細胞により発現される抗原と特異的に結合するドメインを含む。腫瘍により発現される抗原は腫瘍に特異的なものであっても、非腫瘍細胞に比べて腫瘍細胞においてより高いレベルで発現されるものでもよい。腫瘍関連抗原として知られる血清学的に定義されたマーカーなど、癌細胞によって独自に発現されるか、または適当な対照に比べて悪性症状を有する対象において著しく高いレベルで存在する（例えば、統計学的に有意に上昇している）抗原マーカーが特定の実施態様での使用に意図される。
【０１６０】
腫瘍関連抗原としては、例えば、細胞癌遺伝子によりコードされている産物または発現の異常な原癌遺伝子によりコードされている産物（例えば、ｎｅｕ、ｒａｓ、ｔｒｋおよびｋｉｔ遺伝子によりコードされている産物）または増殖因子受容体もしくは受容体様細胞表面分子（例えば、ｃ−ｅｒｂ  Ｂ遺伝子によりコードされている表面受容体）の突然変異型を含み得る。他の腫瘍関連抗原としては、形質転換事象に直接関与すると思われる分子または発癌性形質転換事象に直接関与するとは思われないが腫瘍細胞により発現される分子（例えば、癌胎児性抗原、ＣＡ−１２５、黒色腫(melonoma)関連抗原など）が含まれる（例えば、米国特許第６，６９９，４７５号；Jager, et al., Int. J. Cancer, 106:817-20 (2003); Kennedy, et al., Int. Rev. Immunol., 22:141-72 (2003); Scanlan, et al. Cancer Immun., 4:1 (2004)参照）。
【０１６１】
細胞腫瘍関連抗原をコードする遺伝子としては、細胞癌遺伝子および発現の異常な原癌遺伝子が含まれる。一般に、細胞癌遺伝子は細胞の形質転換に直接関連のある産物をコードし、このためこれらの抗原は免疫療法にとって特に好ましい標的である。例として、発癌性形質転換に関与する細胞表面分子をコードする腫瘍形成ｎｅｕ遺伝子がある。他の例としては、ｒａｓ、ｋｉｔおよびｔｒｋ遺伝子が挙げられる。これらの原癌遺伝子（突然変異を受けて癌遺伝子を形成する正常な遺伝子）の産物は異常な発現を示す（例えば、過剰発現する）ことがあり、この異常な発現は細胞の形質転換に関連する可能性がある。よって、原癌遺伝子によりコードされている産物を標的化することができる。いくつかの癌遺伝子は腫瘍細胞表面で発現される増殖因子受容体分子または増殖因子受容体様分子をコードしている。例として、ｃ−ｅｒｂＢ遺伝子によりコードされている細胞表面受容体がある。他の腫瘍関連抗原が悪性形質転換に直接関与するかもしれないし、関与しないかもしれない。しかしながら、これらの抗原はある特定の腫瘍細胞により発現され、従って、有効な標的となる。いくつかの例として、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１２５（卵巣癌に関連）および黒色腫特異的抗原がある。
【０１６２】
卵巣癌および他の癌腫では、例えば、腫瘍関連抗原は、血清または粘膜分泌物などの容易に得られる体液のサンプル中で検出可能である。このようなマーカーの１つが、血流中にも放出され、血清中で検出可能な癌腫関連抗原であるＣＡ１２５である（例えば、Bast, et al., N. Eng. J. Med., 309:883 (1983); Lloyd, et al., Int. J. Canc., 71:842 (1997)）。卵巣癌および他の癌腫の診断および／または予後プロフィールを得る努力において、血清および他の体液中のＣＡ１２５レベルが、他のマーカー、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、扁平上皮癌抗原（ＳＣＣ）、組織ポリペプチド特異的抗原（ＴＰＳ）、シアリルＴＮムチン（ＳＴＮ）、および胎盤アルカリ性ホスファターゼ（ＰＬＡＰ）のレベルとともに測定されている（例えば、Sarandakou, et al., Acta Oncol., 36:755 (1997); Sarandakou, et al., Eur. J. Gynaecol. Oncol., 19:73 (1998); Meier, et al., Anticancer Res., 17(4B):2945 (1997); Kudoh, et al., Gynecol. Obstet. Invest., 47:52 (1999))。また神経芽腫にも高い血清ＣＡ１２５が伴っている場合があり（例えば、Hirokawa, et al., Surg. Today, 28:349 (1998)）、中でも高いＣＥＡおよびＳＣＣが直腸直腸癌に伴っている場合がある(Gebauer, et al., Anticancer Res., 17(4B):2939 (1997))。
【０１６３】
モノクローナル抗体Ｋ−１との反応性によって定義される腫瘍関連抗原メソテリンは、上皮卵巣腫瘍、子宮頸腫瘍および食道腫瘍を含む扁平上皮癌の大多数ならびに中皮腫に存在する(Chang, et al., Cancer Res., 52:181 (1992); Chang, et al., Int. J. Cancer, 50:373 (1992); Chang, et al., Int. J. Cancer, 51:548 (1992); Chang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:136 (1996); Chowdhury, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:669 (1998))。ＭＡｂ  Ｋ−１を用いた場合、メソテリンは細胞関連腫瘍マーカーとして唯一検出可能であり、卵巣癌患者由来の血清またはＯＶＣＡＲ−３細胞により馴化された培地中には可溶性形態で見られたことはない(Chang, et al., Int. J. Cancer, 50:373 (1992))。しかしながら、構造的に関連のあるヒトメソテリンポリペプチドにはまた、悪性腫瘍を有する患者由来の体液で天然可溶性抗原として検出可能な明瞭に異なるメソテリン関連抗原（ＭＲＡ）ポリペプチドなどの腫瘍関連抗原ポリペプチドも含まれる（ＷＯ００／５０９００参照）。
【０１６４】
腫瘍抗原は細胞表面分子を含み得る。構造が既知で、既知のまたは記載された機能を有する腫瘍抗原としては、以下の細胞表面受容体：ＨＥＲ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ４８７２２）、ＨＥＲ２(Yoshino, et al., J. Immunol., 152:2393 (1994); Disis, et al., Canc. Res., 54:16 (1994); ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０３３６３およびＭ１７７３０)、ＨＥＲ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ２９３３９およびＭ３４３０９）、ＨＥＲ４(Plowman, et al., Nature, 366:473 (1993)；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ０７８６８およびＴ６４１０５)、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ４８７２２およびＫＯ３１９３）、血管内皮細胞増殖因子（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｍ３２９７７）、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０２２３７５、１６８０１４３、Ｕ４８８０１およびＸ６２５６８）、インスリン様増殖因子−Ｉ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ００１７３、Ｘ５６７７４、Ｘ５６７７３、Ｘ０６０４３、欧州特許第ＧＢ２２４１７０３号）、インスリン様増殖因子−ＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０３５６２、Ｘ００９１０、Ｍ１７８６３およびＭ１７８６２）、トランスフェリン受容体（Trowbridge and Omary, Proc. Nat. Acad. USA, 78:3039 (1981)；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０１０６０およびＭ１１５０７）、エストロゲン受容体（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ３８６５１、Ｘ０３６３５、Ｘ９９１０１、Ｕ４７６７８およびＭ１２６７４）、プロゲステロン受容体（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ５１７３０、Ｘ６９０６８およびＭ１５７１６）、卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨ−Ｒ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ３４２６０およびＭ６５０８５）、レチノイン酸受容体（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ１２０６０、Ｍ６０９０９、Ｘ７７６６４、Ｘ５７２８０、Ｘ０７２８２およびＸ０６５３８）、ＭＵＣ−１（Barnes, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86:7159 (1989)；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ６５１３２およびＭ６４９２８）ＮＹ−ＥＳＯ−１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ００３１４９およびＵ８７４５９）、ＮＡ１７−Ａ（ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／４００３９号）、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１（Kawakami, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:3515 (1994)；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０６６５４およびＵ０６４５２）、チロシナーゼ（Topalian, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:9461 (1994)；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ２６７２９；Weber, et al., J. Clin. Invest, 102:1258 (1998)）、Ｇｐ−１００（Kawakami, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:3515 (1994)；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｓ７３００３、Adema, et al., J. Biol. Chem., 269:20126 (1994)）、ＭＡＧＥ(van den Bruggen, et al., Science, 254:1643 (1991))；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ９３１６３、ＡＦ０６４５８９、Ｕ６６０８３、Ｄ３２０７７、Ｄ３２０７６、Ｄ３２０７５、Ｕ１０６９４、Ｕ１０６９３、Ｕ１０６９１、Ｕ１０６９０、Ｕ１０６８９、Ｕ１０６８８、Ｕ１０６８７、Ｕ１０６８６、Ｕ１０６８５、Ｌ１８８７７、Ｕ１０３４０、Ｕ１０３３９、Ｌ１８９２０、Ｕ０３７３５およびＭ７７４８１）、ＢＡＧＥ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ１９１８０；米国特許第５，６８３，８８６号および同第５，５７１，７１１号）、ＧＡＧＥ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０５５４７５、ＡＦ０５５４７４、ＡＦ０５５４７３、Ｕ１９１４７、Ｕ１９１４��、Ｕ１９１４５、Ｕ１９１４４、Ｕ１９１４３およびＵ１９１４２）、任意のＣＴＡクラス受容体（特に、ＳＳＸ２遺伝子によりコードされているＨＯＭ−ＭＥＬ−４０抗原（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ８６１７５、Ｕ９０８４２、Ｕ９０８４１およびＸ８６１７４）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ、Gold and Freedman, J. Exp. Med., 121:439 (1985);ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ５９７１０、Ｍ５９２５５およびＭ２９５４０）およびＰｙＬＴ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０２２８９およびＪ０２０３８）を含む）、ｐ９７（メラノトランスフェリン）(Brown, et al., J. Immunol., 127:539-46 (1981); Rose, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:1261-61 (1986))が含まれる。
【０１６５】
さらなる腫瘍関連抗原としては、前立腺表面抗原（ＰＳＡ）（米国特許第６，６７７，１５７号；同第６，６７３，５４５号）；β−ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンβ−ＨＣＧ(McManus, et al., Cancer Res., 36:3476-81 (1976); Yoshimura, et al., Cancer, 73:2745-52 (1994); Yamaguchi, et al., Br. J. Cancer, 60:382-84 (1989): Alfthan, et al., Cancer Res., 52:4628-33 (1992))；グリコシルトランスフェラーゼβ−１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃ）(Hoon, et al., Int. J. Cancer, 43:857-62 (1989); Ando, et al., Int. J. Cancer, 40:12-17 (1987); Tsuchida, et al., J. Natl. Cancer, 78:45-54 (1987); Tsuchida, et al., J. Natl. Cancer, 78:55-60 (1987));ＮＵＣ１８(Lehmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9891-95 (1989); Lehmann, et al., Cancer Res., 47:841-45 (1987))；黒色腫抗原ｇｐ７５(Vijayasardahi, et al., J. Exp. Med., 171:1375-80 (1990)；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ５１４５５）；ヒトサイトケラチン８；高分子量黒色腫抗原(Natali, et al., Cancer, 59:55-63 (1987); ケラチン１９(Datta, et al., J. Clin. Oncol., 12:475-82 (1994))が含まれる。
【０１６６】
注目される腫瘍抗原としては、悪性症状を有する対象において免疫原性である、当技術分野で「癌／精巣」（ＣＴ）抗原としてみなされている抗原が含まれる(Scanlan, et al., Cancer Immun., 4:1 (2004))。ＣＴ抗原としては、１以上のメンバーを含み、免疫応答を誘導し得る、限定されるものではないが、ＭＡＧＥＡ（ＣＴ１）；ＢＡＧＥ（ＣＴ２）；ＭＡＧＥＢ（ＣＴ３）；ＧＡＧＥ（ＣＴ４）；ＳＳＸ（ＣＴ５）；ＮＹ−ＥＳＯ−１（ＣＴ６）；ＭＡＧＥＣ（ＣＴ７）；ＳＹＣＰ１（Ｃ８）；ＳＰＡＮＸＢ１（ＣＴ１１．２）；ＮＡ８８（ＣＴ１８）；ＣＴＡＧＥ（ＣＴ２１）；ＳＰＡ１７（ＣＴ２２）；ＯＹ−ＴＥＳ−１（ＣＴ２３）；ＣＡＧＥ（ＣＴ２６）；ＨＯＭ−ＴＥＳ−８５（ＣＴ２８）；ＨＣＡ６６１（ＣＴ３０）；ＮＹ−ＳＡＲ−３５（ＣＴ３８）；ＦＡＴＥ（ＣＴ４３）；およびＴＰＴＥ（ＣＴ４４）を含む、少なくとも１９の異なるファミリーの抗原が含まれる
【０１６７】
腫瘍関連または腫瘍特異的抗原を含む標的化され得るさらなる腫瘍抗原としては、限定されるものではないが、α−アクチニン−４、Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質、Ｃａｓｐ−８、β−カテニン、ｃｄｃ２７、ｃｄｋ４、ｃｄｋｎ２ａ、ｃｏａ−１、ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質、ＥＦ２、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質、ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ１１、ｈｓｐ７０−２、ＫＩＡＡＯ２０５、Ｍａｒｔ２、Ｍｕｍ−１、２および３、ネオ−ＰＡＰ、ミオシンクラスＩ、ＯＳ−９、ｐｍｌ−ＲＡＲα融合タンパク質、ＰＴＰＲＫ、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、トリオースリン酸イソメラーゼ、Ｂａｇｅ−１、Ｇａｇｅ  ３、４、５、６、７、ＧｎＴＶ、Ｈｅｒｖ−Ｋ−ｍｅｌ、Ｌａｇｅ−１、Ｍａｇｅ−Ａ１、２、３、４、６、１０、１２、Ｍａｇｅ−Ｃ２、ＮＡ−８８、ＮＹ−Ｅｓｏ−１／Ｌａｇｅ−２、ＳＰ１７、ＳＳＸ−２およびＴＲＰ２−Ｉｎｔ２、ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ  １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５（５８）、ＣＥＡ、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ（ＬＡＧＥ）、ＳＣＰ−１、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、ＰＲＡＭＥ、ｐ５３、Ｈ−Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタイン・バーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２−４、ＣＡ  １９−９、ＣＡ  ７２−４、ＣＡＭ  １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、β−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１６、ＴＡＧＥ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＣＴ７、テロメラーゼ、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、α−フェトタンパク質、１３ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ  １２５、ＣＡ  １５−３（ＣＡ  ２７．２９＼ＢＣＡＡ）、ＣＡ  １９５、ＣＡ  ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼ＫＰ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ＼７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０（Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰおよびＴＰＳが挙げられる。他の腫瘍関連および腫瘍特異的抗原も当業者に知られており、開示される融合タンパク質による標的化に好適である。
【０１６８】
腫瘍新生血管系に関連する抗原
タンパク質治療薬は腫瘍浸透において有効でないので、腫瘍の処置に有効でない可能性がある。腫瘍関連新生血管系は、タンパク質治療薬が腫瘍へ接近し得る容易に接近可能な経路を提供する。別の実施態様では、融合タンパク質は、腫瘍に関連する新生血管系により発現される抗原と特異的に結合するドメインを含む。
【０１６９】
該抗原は腫瘍の新生血管系に特異的であり得るか、または正常な血管系に比べて腫瘍の新生血管系で高いレベルで発現され得る。正常な血管に比べて腫瘍関連新生血管系により過剰発現される抗原の例としては、限定されるものではないが、ＶＥＧＦ／ＫＤＲ、Ｔｉｅ２、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）、エンドグリンおよびα５β３インテグリン／ビトロネクチンが挙げられる。正常な血管系に比べて腫瘍関連新生血管系により過剰発現される他の抗原も当業者に知られており、開示される融合タンパク質による標的化に好適である。
【０１７０】
感染に関する標的化ドメイン
標的化のための抗原、リガンドおよび受容体
一実施態様では、該融合タンパク質は、感染性疾患を引き起こす病原体に応答したＴ細胞の活性化の調節に関与する免疫組織により発現される抗原と特異的に結合するドメインを含む。
【０１７１】
リガンドおよび受容体
一実施態様では、疾病標的化ドメインは、罹患細胞で特異的に発現されるか、または正常組織に比べて罹患細胞で過剰発現される細胞表面抗原もしくは受容体と結合するリガンドである。罹患細胞はまた、増殖および発達に影響を及ぼす微小環境中に多数のリガンドを分泌する。限定されるものではないが、増殖因子、サイトカインおよびケモカイン（上記に示されるケモカインを含む）をはじめとする、罹患細胞により分泌されるリガンドと結合する受容体は、開示される融合タンパク質に用いるのに好適である。罹患細胞により分泌されるリガンドは、分泌されたリガンドと結合する受容体の可溶性断片を用いて標的化することができる。可溶性受容体断片は産生細胞から放出、分泌またはそうでなければ抽出され得る断片ポリペプチドであり、全細胞外ドメインまたはその断片を含む。
【０１７２】
単鎖ポリペプチド抗体
別の実施態様では、疾病関連標的化ドメインは、罹患細胞で特異的に発現されるか、または正常組織に比べて罹患細胞で過剰発現される細胞表面抗原または受容体と結合する単鎖ポリペプチド抗体である。
【０１７３】
Ｆｃドメイン
別の実施態様では、疾病または疾病関連標的化ドメインは、罹患細胞で発現されるＦｃ受容体と結合する免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインである。Ｆｃ領域は、第一の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチドを含む。よって、ＦｃはＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメインとＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメインを意味する。好ましい実施態様では、Ｆｃドメインはヒトまたはネズミ免疫グロブリンに由来する。より好ましい実施態様では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含むヒトＩｇＧ１またはネズミＩｇＧ２ａに由来する。
【０１７４】
一実施態様では、ヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域は、
【化５９】
2013512251.tif 000060
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有する核酸によりコードされる。
【０１７５】
配列番号４４によりコードされるヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域は以下のアミノ酸配列：
【化６０】
2013512251.tif 000061
を有する。
【０１７６】
別の実施態様では、ヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のＦｃドメインは、
【化６１】
2013512251.tif 000062
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有する。
【０１７７】
別の実施態様では、ネズミ免疫グロブリンＣγ２ａ鎖のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域は、
【化６２】
2013512251.tif 000063
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有する核酸によりコードされる。
【０１７８】
配列番号４６によりコードされるネズミ免疫グロブリンＣγ２ａ鎖のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域は以下のアミノ酸配列：
【化６３】
2013512251.tif 000064
を有する。
【０１７９】
一実施態様では、Ｆｃドメインは、腫瘍もしくは腫瘍関連新生血管系で特異的に発現されるか、または正常組織に比べて腫瘍もしくは腫瘍関連新生血管系で過剰発現される特異的Ｆｃ受容体との結合を増強する１以上のアミノ酸挿入、欠失または置換を含み得る。好適なアミノ酸置換は上記のように保存的および非保存的置換を含む。
【０１８０】
非ホジキンリンパ腫またはワルデンストロームマクログロブリン血症に対してリツキシマブ（ＣＤ２０に対するキメラマウス／ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体）で処置された患者における治療転帰は、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに対して明瞭な内因的親和性を有するＦｃγ受容体の対立遺伝子変異体の個々の発現と相関していた。特に、低親和性活性化Ｆｃ受容体ＣＤ１６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）の高親和性対立遺伝子を有する患者はより高い奏功率を示し、非ホジキンリンパ腫の場合には、改善された無進行生存を示した。別の実施態様では、Ｆｃドメインは、低親和性阻害性Ｆｃ受容体ＣＤ３２Ｂ（ＦｃγＲＩＩＢ）との結合を低減し、かつ、低親和性活性化Ｆｃ受容体ＣＤ１６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）との野生型レベルの結合を保持するか、または増強する、１以上のアミノ酸挿入、欠失または置換を含み得る。好ましい実施態様では、Ｆｃドメインは、ＣＤ１６Ａとの結合を増強するアミノ酸挿入、欠失または置換を含む。ＣＤ１６Ａとの結合を増強し、ＣＤ３２Ｂとの結合を低減するヒトＩｇＧ１のＦｃドメインの多数の置換が当技術分野で知られており、Stavenhagen, et al., Cancer Res., 57(18):8882-90 (2007)に記載されている。ＣＤ３２Ｂとの結合が低減され、かつ／またはＣＤ１６Ａとの結合が増強されたヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインの変異体の例はは、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ９２９Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５ＩまたはＰ２９６Ｌ置換を含む。これらのアミノ酸置換はヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインにいずれの組合せで存在してもよい。一実施態様では、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン変異体はＦ２４３Ｌ、Ｒ９２９ＰおよびＹ３００Ｌ置換を含む。別の実施態様では、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン変異体はＦ２４３Ｌ、Ｒ９２９Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５ＩおよびＰ２９６Ｌ置換を含む。
【０１８１】
グリコホスファチジルイノシトールアンカードメイン
別の実施態様では、疾病または疾病関連新生血管系標的化ドメインは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーの翻訳後付加のためのシグナルを与えるポリペプチドである。ＧＰＩアンカーは、多くの真核生物タンパク質のＣ末端に翻訳後に付加される糖脂質構造である。この修飾は細胞膜の外片に付着タンパク質を係留する。ＧＰＩアンカーは、Ｔ細胞に対する提示のために細胞表面にＴ細胞受容体結合ドメインを付着させるのに使用することができる。この実施態様では、ＧＰＩアンカードメインはＴ細胞受容体結合ドメインに対してＣ末端にある。
【０１８２】
一実施態様では、ＧＰＩアンカードメインは、ポリペプチドが真核生物系で発現される場合にＧＰＩアンカーの翻訳後付加のためのシグナルを伝達するポリペプチドである。アンカーの付加はＧＰＩアンカーシグナル配列により決定され、この配列がアンカー付加の部位（ω部位）における小アミノ酸のセットとそれに続く親水性スペーサーからなり、疎水性ストレッチで終わる(Low, FASEB J., 3:1600-1608 (1989))。このシグナル配列の切断がＥＲで起こった後、保存された中央成分(Low, FASEB J., 3:1600-1608 (1989))と可変の末梢部分(Homans et al., Nature, 333:269-272 (1988))を有するアンカーが付加される。ＧＰＩ係留タンパク質のＣ末端は、ホスホエタノールアミン橋を介して保存性の高いコアグリカン、マンノース（α１−２）マンノース（α１−６）マンノース（α１−４）グルコサミン（α１−６）ミオイノシトールに連結される。リン脂質テールはＧＰＩアンカーを細胞膜に付着させる。このグリカンコアは、ホスホエタノールアミン基、マンノース、ガラクトース、シアル酸または他の糖などの側鎖で様々な修飾を行うことができる。第一のマンノース残基に付着されている最も一般的な側鎖は別のマンノースである。グリカンコアの第三のマンノースに付着されているＮ−アセチルガラクトサミン含有多糖などの複合側鎖が哺乳類アンカー構造に見られる。コアグルコサミンの修飾はまれである。タンパク質および起源種によって、ホスホイノシトール環の脂質アンカーはジアシルグリセロール、アルキルアシルグリセロールまたはセラミドである。これらの脂質種は炭素１４〜２８個の範囲で長さが異なり、飽和であっても不飽和であってもよい。多くのＧＰＩアンカーはまた、イノシトール環の２−ヒドロキシルにパルミチン酸などの付加的脂肪酸を含む。この付加的な脂肪酸により、ＧＰＩアンカーはＰＩ−ＰＬＣによる切断に耐性となる。
【０１８３】
ＧＰＩアンカーの付着は、ＧＰＩ翻訳後修飾を行うことができる真核生物系でＧＰＩアンカードメインを含む融合タンパク質を発現させることよって達成することができる。ＧＰＩアンカードメインは腫瘍または腫瘍血管系標的化ドメインとして使用することもできるし、あるいはすでに別の腫瘍または腫瘍血管系標的化ドメインを含む融合タンパク質に追加することもできる。
【０１８４】
別の実施態様では、ＧＰＩアンカー部分は、in vitro酵素的または化学的プロセスによって、単離されたＴ細胞受容体結合ドメインに直接付加される。この実施態様では、ＧＰＩアンカーは、ＧＰＩアンカードメインを必要とすることなくポリペプチドに付加することができる。ＧＰＩアンカー部分は、Ｔ細胞受容体結合ドメインおよび腫瘍または腫瘍血管系標的化ドメインを有する、本明細書に記載の融合タンパク質に付加することができる。あるいは、ＧＰＩアンカーは、腫瘍または腫瘍血管系標的化ドメインをコードする融合相手を必要とすることなく、Ｔ細胞受容体結合ドメインポリペプチドに直接付加することもできる。
【０１８５】
２．ペプチドまたはポリペプチドリンカードメイン
融合タンパク質は場合により、共刺激ポリペプチドドメインを抗原結合標的化ドメインから分離するペプチドまたはポリペプチドリンカードメインを含んでもよい。
【０１８６】
抗体のヒンジ領域
一実施態様では、リンカードメインは免疫グロブリンのヒンジ領域を含む。好ましい実施態様では、このヒンジ領域はヒト免疫グロブリンに由来する。ヒンジが由来し得る好適なヒト免疫グロブリンとしては、ＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＡが挙げられる。好ましい実施態様では、ヒンジ領域はヒトＩｇＧに由来する。
【０１８７】
別の実施態様では、リンカードメインは、上記のような免疫グロブリンのヒンジ領域を含み、さらに１以上の付加的な免疫グロブリンドメインを含む。一実施態様では、付加的ドメインは免疫グロブリンのＦｃドメインを含む。本明細書においてＦｃ領域は、第一の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチドを含む。よって、ＦｃはＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメインとＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメインを意味する。好ましい実施態様では、Ｆｃドメインはヒト免疫グロブリンに由来する。より好ましい実施態様では、ＦｃドメインはＣＨ２およびＣＨ３領域を含むヒトＩｇＧに由来する。
【０１８８】
別の実施態様では、リンカードメインは免疫グロブリンのヒンジ領域と、免疫グロブリン重鎖のＣＨ１ドメインまたは免疫グロブリン軽鎖のＣＬドメインのいずれかを含む。好ましい実施態様では、ＣＨ１またはＣＬドメインはヒト免疫グロブリンに由来する。ＣＬドメインはκ軽鎖またはλ軽鎖のいずれかに由来するものであり得る。より好ましい実施態様では、ＣＨ１またはＣＬドメインはヒトＩｇＧに由来する。
【０１８９】
免疫グロブリンヒンジ領域および他のドメインのアミノ酸配列は当技術分野でよく知られている。
【０１９０】
他のペプチド／ポリペプチドリンカードメイン
他の好適なペプチド／ポリペプチドリンカードメインは、天然または非天然ペプチドまたはポリペプチドを含む。ペプチドリンカー配列は少なくともアミノ酸２個の長さである。好ましくは、ペプチドまたはポリペプチドドメインは可動性のペプチドまたはポリペプチドである。「可動性リンカー」とは、その可動性リンカーの不在下で連結された２つのポリペプチドが持つものよりも、それにより連結された２つのポリペプチドの回転自由度を高めるペプチド結合により連結された２以上のアミノ酸残基を含むペプチドまたはポリペプチドを意味する。このような回転自由度は、可動性リンカーによって各接近標的抗原に連結された２以上の抗原結合部位をより有効とする。可動性ペプチド／ポリペプチドの例としては、限定されるものではないが、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号７４）、Ａｌａ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号７５）、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３（配列番号７６）および（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）４（配列番号７７）が挙げられる。さらなる可動性ペプチド／ポリペプチド配列も当技術分野でよく知られている。
【０１９１】
３．二量体化および多量体化ドメイン
該融合タンパク質は場合により、２以上の融合タンパク質を二量体化または多量体化する働きをする二量体化または多量体化ドメインを含んでもよい。融合タンパク質を二量体化または多量体化する働きをするドメインは個別のドメインであってもよいし、あるいはまた融合タンパク質の他のドメイン（Ｔ細胞共刺激／共阻害受容体結合ドメイン、腫瘍／腫瘍新生血管系抗原結合ドメインまたはペプチド／ポリペプチドリンカードメイン）の１つの中に含まれてもよい。
【０１９２】
二量体化ドメイン
「二量体化ドメイン」とは、少なくとも２つのアミノ酸残基または少なくとも２つのペプチドもしくはポリペプチド（同じまたは異なるアミノ酸配列を持ち得る）の結合によって形成される。これらのペプチドまたはポリペプチドは共有結合および／または非共有結合によって互いに相互作用し得る。好ましい二量体化ドメインは、融合タンパク質相手のシステインと分子間ジスルフィド結合を形成することができる少なくとも１つのシステインを含む。二量体化ドメインは、融合タンパク質相手の間でジスルフィド結合が形成できるように１以上のシステイン残基を含み得る。一実施態様では、二量体化ドメインは１つ、２つ、または３つ〜約１０のシステイン残基を含む。好ましい実施態様では、二量体化ドメインは免疫グロブリンのヒンジ領域である。この特定の実施態様では、二量体化ドメインは融合タンパク質のリンカーペプチド／ポリペプチド内に含まれる。
【０１９３】
さらなる二量体化ドメインの例も当技術分野で知られており、限定されるものではないが、コイルドコイル、アシッドパッチ(acid patches)、ジンクフィンガー、カルシウムハンド、ＣＨ１−ＣＬ対、米国特許第５，８２１，３３３号に記載されている操作された「こぶ(knob)」および／または「突起(protruberance)」を有する「インターフェース」、ロイシンジッパー（例えば、ｊｕｎおよび／またはｆｏｓ由来）（米国特許第５，９３２，４４８号）、ＳＨ２（ｓｒｃホモロジー２）、ＳＨ３（ｓｒｃホモロジー３）(Vidal, et al., Biochemistry, 43, 7336-44 ((2004))、ホスホチロシン結合（ＰＴＢ）(Zhou, et al., Nature, 378:584-592 (1995))、ＷＷ(Sudol, Prog. Biochys. Mol. Bio., 65:113-132 (1996))、ＰＤＺ(Kim, et al., Nature, 378: 85-88 (1995); Komau, et al., Science, 269:1737-1740 (1995))１４−３−３、ＷＤ４０(Hu, et al., J Biol Chem., 273, 33489-33494 (1998))ＥＨ、Ｌｉｍ、イソロイシンジッパー、受容体二量体対（例えば、インターロイキン−８受容体（ＩＬ−８Ｒ）；ならびにインテグリンヘテロ二量体、例えば、ＬＦＡ−１およびＧＰＩＩＩｂ／ＩＩＩａまたはその二量体化領域、二量体リガンドポリペプチド（例えば、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＤＧＦメンバー、および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）(Arakawa, et al., J. Biol. Chem., 269(45): 27833-27839 (1994)およびRadziejewski, et al., Biochem., 32(48): 1350 (1993))が挙げられ、親和性が変更されたこれらのドメインの変異体であってもよい。これらのポリペプチド対は、酵母ツーハイブリッドスクリーン(yeast two hybrid screen)を含む当技術分野で知られている方法によって同定することができる。酵母ツーハイブリッドスクリーンは米国特許第５，２８３，１７３号および同第６，５６２，５７６号に記載されており、双方とも引用することによりそのまま本明細書の一部とされる。相互作用ドメイン対の間の親和性はKatahira, et al., J. Biol. Chem., 277, 9242-9246 (2002)に記載されているものをはじめとする、当技術分野で知られている方法を用いて決定することができる。あるいは、ペプチド配列のライブラリーを、例えばＷＯ０１／００８１４に記載されている方法を用いてヘテロ二量体形成に関してスクリーニングすることもできる。タンパク質−タンパク質相互作用に関する有用な方法はまた米国特許第６，７９０，６２４号にも記載されている。
【０１９４】
多量体化ドメイン
「多量体化ドメイン」とは、３つ以上のペプチドまたはポリペプチドを共有結合および／または非共有結合によって互いに相互作用させるドメインである。好適な多量体化ドメインとしては、限定されるものではないが、コイルドコイルドメインが挙げられる。コイルドコイルは、通常、７つのアミノ酸（ヘプタッドリピート）または１１のアミノ酸（ウンデカドリピート）の配列に、３および４残基の間隔を置いた主として疎水性の残基の連続パターンを有し、組み立てられて（折りたたまれて）多量体らせん束を形成するペプチド配列を意味する。３および４残基おきのやや不規則な分布を含む配列を有するコイルドコイルも意図される。疎水性残基は特に、疎水性アミノ酸Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、ＰｈｅおよびＴｒｐである。主として疎水性とは、残基の少なくとも５０％が記載の疎水性アミノ酸から選択されなければならないことを意味する。
【０１９５】
コイルドコイルドメインはラミニンに由来してもよい。細胞外間隙で、ヘテロ三量体コイルドコイルタンパク質ラミニンは基底膜の形成に重要な役割を果たす。明らかに、多機能オリゴマー構造はラミニン機能に必要である。コイルドコイルドメインはまた、３鎖（ＴＳＰ−１およびＴＳＰ−２）または５鎖（ＴＳＰ−３、ＴＳＰ−４およびＴＳＰ−５）が接続されたトロンボスポンジンに由来してもよいし、または平行５鎖コイルドコイル(Malashkevich ,et al., Science, 274: 761-765 (1996))へと折りたたまれるＣＯＭＰ（ＣＯＭＰｃｃ）(Guo, et at., EMBO J., 1998, 17: 5265-5272)に由来してもよい。
【０１９６】
他のタンパク質に由来するさらなるコイルドコイルドメインおよびポリペプチドの多量体化を媒介する他のドメインも当技術分野で知られており、開示される融合タンパク質で用いるのに好適である。
【０１９７】
４．例示的融合タンパク質
ＰＤ−Ｌ２
好ましい実施態様では、該免疫調節薬剤は、ＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメインの断片が免疫グロブリンＦｃドメインに連結されたＰＤ−Ｌ２融合タンパク質（Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ）である。Ｂ７−ＤＣ−ＩｇはＢ７−Ｈ１およびＢ７−ＤＣのＰＤ−１への結合を遮断する。
【０１９８】
代表的なネズミＰＤ−Ｌ２融合タンパク質は、
【化６４】
2013512251.tif 000065
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有する核酸によりコードされる。
【０１９９】
配列番号７９によりコードされているネズミＰＤ−Ｌ２融合タンパク質は以下のアミノ酸配列：
【化６５】
2013512251.tif 000066
を有する。
【０２００】
シグナル配列を含まない配列番号５３のネズミＰＤ−Ｌ２融合タンパク質のアミノ酸配列は、
【化６６】
2013512251.tif 000067
である。
【０２０１】
代表的なヒトＰＤ−Ｌ２融合タンパク質は、
【化６７】
2013512251.tif 000068
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有する核酸によりコードされる。
【０２０２】
配列番号８２によりコードされているヒトＰＤ−Ｌ２融合タンパク質は以下のアミノ酸配列：
【化６８】
2013512251.tif 000069
を有する。
【０２０３】
シグナル配列を含まない配列番号８３のヒトＰＤ−Ｌ２融合タンパク質のアミノ酸配列は
【化６９】
2013512251.tif 000070
である。
【０２０４】
代表的な非ヒト霊長類（カニクイザル）ＰＤ−Ｌ２融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列：
【化７０】
2013512251.tif 000071
を有する。
【０２０５】
シグナル配列を含まない配列番号８６の非ヒト霊長類（カニクイザル）ＰＤ−Ｌ２融合タンパク質のアミノ酸配列は、
【化７１】
2013512251.tif 000072
である。
【０２０６】
ＰＤ−Ｌ１
別の実施態様では、該免疫調節薬剤は、ＰＤ−Ｌ１の断片が免疫グロブリンＦｃドメインに連結されたＰＤ−Ｌ１融合タンパク質（ＰＤ−Ｌ１−Ｉｇ）である。ＰＤ−Ｌ１−Ｉｇは、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２のＰＤ−１への結合を遮断する。
【０２０７】
代表的なヒトＰＤ−Ｌ１融合タンパク質は、
【化７２】
2013512251.tif 000073
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有する核酸によりコードされる。
【０２０８】
配列番号９１によりコードされているヒトＰＤ−Ｌ１融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列：
【化７３】
2013512251.tif 000074
を有する。
【０２０９】
シグナル配列を含まない配列番号９２のヒトＰＤ−Ｌ１融合タンパク質のアミノ酸配列は、
【化７４】
2013512251.tif 000075
である。
【０２１０】
代表的なネズミＰＤ−Ｌ１融合タンパク質は、
【化７５】
2013512251.tif 000076
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有する核酸によりコードされる。
【０２１１】
配列番号９４によりコードされているネズミＰＤ−Ｌ１融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列：
【化７６】
2013512251.tif 000077
を有する。
【０２１２】
ＰＤ−１
別の実施態様では、該免疫調節薬剤は、ＰＤ−１の断片が免疫グロブリンＦｃドメインに連結されたＰＤ−１融合タンパク質（ＰＤ−１−Ｉｇ）である。ＰＤ−１−Ｉｇは、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２のＰＤ−１への結合を遮断する。
【０２１３】
代表的なＰＤ−１融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列：
【化７７】
2013512251.tif 000078
を有する。
【０２１４】
代表的な非ヒト霊長類（カニクイザル）ＰＤ−１融合タンパク質は、
【化７８】
2013512251.tif 000079
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有する核酸によりコードされる。
【０２１５】
配列番号９６によりコードされている非ヒト霊長類（カニクイザル）ＰＤ−１融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列：
【化７９】
2013512251.tif 000080
を有する。
【０２１６】
Ｂ７．１
別の実施態様では、該免疫調節薬剤は、Ｂ７．１の断片が免疫グロブリンＦｃドメインに連結されたＢ７．１融合タンパク質（Ｂ７．１−Ｉｇ）である。Ｂ７．１はＰＤ−Ｌ１がＰＤ−１に結合するのを遮断する。
【０２１７】
代表的なＢ７．１融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列：
【化８０】
2013512251.tif 000081
を有する。
【０２１８】
５．二機能性タンパク質
二機能性融合タンパク質
好ましい実施態様では、該融合タンパク質がＰＤ−１の２以上のリガンドと結合する。例えば、該融合タンパク質は、ＰＤ−１とＰＤ−１のリガンド、例えば、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２と結合するように操作することができる。さらに別の実施態様では、該融合タンパク質は、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の双方と結合するように操作することができる。
【０２１９】
Ｇ．ＰＤ−１受容体アンタゴニストをコードする単離された核酸分子
免疫調節性ポリペプチド、その断片、その変異体およびその融合タンパク質をコードする単離された核酸配列が開示される。本明細書において「単離された核酸」とは、哺乳類ゲノムにおいてその核酸の一端または両端に通常隣接している核酸をはじめ、哺乳類ゲノムに存在する他の核酸分子から分離された核酸を意味する。
【０２２０】
単離された核酸は、例えば、天然ゲノムにおいてそのＤＮＡ分子にすぐ隣接して通常見られる核酸配列の１つが除去されているか、または存在しない場合のＤＮＡ分子であってもよい。よって、単離された核酸としては、限定されるものではないが、他の配列とは独立した分離分子として存在するＤＮＡ分子（例えば、化学的に合成された核酸、またはＰＣＲもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生成されるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ断片）ならびにベクター、自律的に複製するプラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）に、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた組換えＤＮＡが挙げられる。さらに、単離された核酸としては、ハイブリッドまたは融合核酸の一部である組換えＤＮＡ分子などの操作された核酸が挙げられる。例えば、ｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムライブラリー内の数百から数百万の他の核酸の中に存在する核酸、またはゲノムＤＮＡ制限消化を含むゲルスライスは単離された核酸とはみなさない。
【０２２１】
核酸はセンス配向であってもアンチセンス配向であってもよく、あるいはＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１またはＢ７．１ポリペプチドまたはその変異体をコードする参照配列と相補的であってもよい。参照配列としては、例えば、当技術分野で知られており、上記に述べられているヒトＰＤ−Ｌ２、ヒトＰＤ−Ｌ１またはネズミＰＤ−Ｌ２およびネズミＰＤ−Ｌ１のヌクレオチド配列が含まれる。
【０２２２】
核酸はＤＮＡ、ＲＮＡまたは核酸類似体であり得る。核酸類似体は塩基部分、糖部分またはリン酸主鎖において修飾することができる。このような修飾は例えば、核酸の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解度を改善することができる。塩基部分における修飾としては、デオキシチミジンの代わりにデオキシウリジンを、デオキシシチジンの代わりに５−メチル−２’−デオキシシチジンまたは５−ブロモ−２’−デオキシシチジンを含む。糖部分の修飾としては、リボース糖の２’ヒドロキシルの修飾による２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−アリル糖の形成が挙げられる。デオキシリボースリン酸主鎖は、各塩基部分が６員のモルホリノ環に連結されているモルホリノ核酸、またはデオキシリン酸主鎖がシュードペプチド主鎖で置換され、４つの塩基が保持されているペプチド核酸を生成するように修飾することができる。例えば、Summerton and Weller (1997) Antisence Nucleic Acid Drug Dev. 7:187-195;およびHyrup et al. (1996) Bioorgan. Med. Chem. 4:5-23参照。さらに、デオキシリン酸主鎖は、例えば、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート主鎖、ホスホロアミダイトまたはアルキルホスホトリエステル主鎖で置換することもできる。
【０２２３】
Ｈ．ＰＤ−１受容体アンタゴニストを発現するベクターおよび宿主細胞
上記のものなどの核酸は、細胞で発現させるためにベクターに挿入することができる。本明細書において「ベクター」とは、別のＤＮＡセグメントが、挿入されたセグメントの複製が起こるように挿入され得る、プラスミド、ファージまたはコスミドなどのレプリコンである。ベクターは発現ベクターであり得る。「発現ベクター」とは、１以上の発現制御配列を含むベクターであり、「発現制御配列」とは、別のＤＮＡ配列の転写および／または翻訳を制御および調節するＤＮＡ配列である。
【０２２４】
ベクター中の核酸は１以上の発現制御配列に機能的に連結させることができる。本明細書において「機能的に連結される」とは、発現制御配列が目的のコード配列の発現を有効に制御するように遺伝子構築物に組み込まれることを意味する。発現制御配列の例としては、プロモーター、エンハンサーおよび転写終結領域が挙げられる。プロモーターは、一般に、転写が開始する点の上流１００ヌクレオチド以内（一般に、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始部位付近）のＤＮＡ分子の領域からなる発現制御配列である。コード配列をプロモーターの制御下に置くためには、そのポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位をプロモーターの下流１ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチドの間に置く必要がある。エンハンサーは、時間、場所およびレベルに関して発現特異性を与える。プロモーターとは異なり、エンハンサーは転写部位から様々な距離に位置する場合にも機能し得る。エンハンサーはまた、転写開始部位から下流に位置してもよい。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡへ転写することができ、それがコード配列によりコードされているタンパク質へ翻訳され得る場合に、「機能的に連結され」かつ細胞内の発現制御配列の「制御下」にある。
【０２２５】
好適な発現ベクターとしては、限定されるものではないが、例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルス、タバコモザイクウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスに由来するプラスミドおよびウイルスベクターが挙げられる。多くのベクターおよび発現系がNovagen (Madison, WI)、Clontech (Palo Alto, CA)、Stratagene (La Jolla, CA)およびInvitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA)などの会社から市販されている。
【０２２６】
発現ベクターはタグ配列を含み得る。タグ配列は一般に、コードされているポリペプチドとの融合物として発現される。このようなタグは、カルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかを含むポリペプチド内のいずれの位置にも挿入することができる。有用なタグの例としては、限定されるものではないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン、ｃ−ｍｙｃ、血球凝集素、Ｆｌａｇ（商標）タグ(Kodak, New Haven, CT)、マルトースＥ結合タンパク質およびプロテインＡが挙げられる。一実施態様では、変異型ＰＤ−Ｌ２融合タンパク質は、Ｉｇ重鎖定常領域の１以上のドメインをコードする、好ましくは、ヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域に相当するアミノ酸配列を有する核酸を含むベクター内に存在する。
【０２２７】
発現される核酸を含むベクターを宿主細胞に導入することができる。「宿主細胞」とは、組換え発現ベクターが導入可能な原核細胞および真核細胞を含むものとする。本明細書において「形質転換される」および「トランスフェクトされる」とは、いくつかの技術の１つによって核酸分子（例えばベクター）を細胞に導入することを包含する。特定の技術に限定されるものではないが、これらの技術の多くは当技術分野で十分に確立されている。原核細胞は、例えば、エレクトロポレーションまたは塩化カルシウム媒介形質転換により核酸で形質転換させることができる。核酸は、例えば、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションを含む技術によって哺乳類細胞へトランスフェクトすることができる。宿主細胞（例えば、原核細胞または真核細胞、例えばＣＨＯ細胞）を用いて、例えば、本明細書に記載の免疫調節性ポリペプチドを生産することができる。
【０２２８】
Ｉ．抗体免疫調節薬剤
ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−１のエピトープと反応性のあるモノクローナルおよびポリクローナル抗体が開示されている。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびそれらの製造および使用方法は、Kohler and Milstein, Nature 256:495-497 (1975)；米国特許第４，３７６，１１０号；Hartlow, E. et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988); Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, New York, N.Y. (1980); H. Zola et al., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, 1982に記載されている。
【０２２９】
ＰＤ−１と結合し、ＰＤ−１を介したシグナル伝達を遮断し、かつ、現行使用されているものよりも親和性が低く、投与後３か月、２か月、１か月、３週間、２週間、１週間または数日以内の期間で抗体を解離させる抗体が免疫応答の増強、増進または刺激に好ましい。
【０２３０】
一実施態様は、ＰＤ−Ｌ２リガンドと結合する抗体と架橋されたＰＤ−Ｌ１リガンドと結合し、双方がＰＤ−１と相互作用するのを防ぐ抗体を含んでなる二重特異的抗体を含む。
【０２３１】
別の実施態様は、Ｂ７−Ｈ１などのＰＤ−１のリガンドと結合する抗体と架橋されたＰＤ−１受容体と結合する抗体を含んでなる二重特異的抗体を含む。好ましい実施態様では、このＰＤ−１結合部分は、ＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達を低減または阻害する。あるいは、この抗体は、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の双方に存在するエピトープと結合し、それらがＰＤ−１と相互作用するのを防ぐ。
【０２３２】
イムノアッセイ法は、Coligan, J. E. et al., eds., Current Protocols in Immunology, Wiley-Interscience, New York 1991 (または最新版); Butt, W. R. (ed.) Practical Immunoassay: The State of the Art, Dekker, N.Y., 1984; Bizollon, Ch. A., ed., Monoclonal Antibodies and New Trends in Immunoassays, Elsevier, N.Y., 1984; Butler, J. E., ELISA (Chapter 29), In: van Oss, C. J. et al., (eds), Immunochemistry, Marcel Dekker, Inc., New York, 1994, pp. 759-803; Butler, J. E. (ed.), Immunochemistry of Solid-Phase Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, 1991; Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986; Work, T. S. et al., Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, North Holland Publishing Company, NY, (1978) (Chapter by Chard, T., "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques")に記載されている。
【０２３３】
抗イディオタイプ抗体は例えば、Idiotypy in Biology and Medicine, Academic Press, New York, 1984; Immunological Reviews Volume 79, 1984; Immunological Reviews Volume 90, 1986; Curr. Top. Microbiol., Immunol. Volume 119, 1985; Bona, C. et al., CRC Crit. Rev. Immunol., pp. 33-81 (1981); Jerme, N K, Ann. Immunol. 125C:373-389 (1974); Jerne, N K, In: Idiotypes--Antigens on the Inside, Westen-Schnurr, I., ed., Editiones Roche, Basel, 1982, Urbain, J. et al., Ann. Immunol. 133D:179-(1982); Rajewsky, K. et al., Ann. Rev. Immunol. 1:569-607 (1983)に記載されている。
【０２３４】
これらの抗体は異種、同種異系、同系、またはその改変形態（ヒト化またはキメラ抗体など）であり得る。また、特定の抗体、例えば、抗ＰＤ−Ｌ２抗体のイディオタイプに特異的な抗イディオタイプ抗体も含まれる。「抗体」とは、完全分子、ならびに抗原結合部位を含み、かつ、エピトープと結合することができるその断片の双方を含むことを意味する。これらには、完全抗体のＦｃ断片を欠き、循環からより迅速に排除され、完全抗体よりも低い非特異的組織結合性を持ち得るＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が含まれる(Wahl et al., J. Nuc. Med. 24:316-325 (1983))。また、Ｆｖ断片も含まれる(Hochman, J. et al. (1973) Biochemistry 12:1130-1135; Sharon, J. et al.(1976) Biochemistry 15:1591-1594)。これらの種々の断片は、プロテアーゼ切断または化学的切断などの常法を用いて作製される（例えば、Rousseaux et al., Meth. Enzymol., 121:663-69 (1986)参照）。
【０２３５】
ポリクローナル抗体は、ウサギ、ヤギ、齧歯類などの免疫動物から血清として得られ、それ以上処理することなくそのまま用いてもよいし、あるいは硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーなどの慣例の富化または精製方法を施してもよい。
【０２３６】
免疫原は、完全なＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−１、またはその断片もしくは誘導体を含み得る。好ましい免疫原は、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の全部または一部を含み、ここで、これらの残基はグリコシル化などの翻訳後修飾を含む。細胞外ドメインを含む免疫原は、例えば、慣例の組換え法を用いたクローン化遺伝子の発現または起源細胞からの単離などの当技術分野で知られている種々の方法で生産される。
【０２３７】
モノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975）により紹介された手順およびその改変法（上記参考文献を参照）などの慣例のハイブリドーマ技術を用いて生産され得る。動物、好ましくはマウスを上記のような免疫原に感作させることによりプライムし、プライムした動物に所望の抗体応答を惹起させる。プライムした動物のリンパ節、脾臓または末梢血からのＢリンパ球を、一般にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの融合促進剤の存在下で骨髄腫細胞と融合させる。多くのネズミ骨髄腫細胞系統はいずれもこのような使用に利用可能である：Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−ｋ０Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４またはＨＬ１−６５３骨髄腫系統（ATCC, Rockville, Md.から入手可能）。その後の工程は、融合されてない親骨髄腫細胞とドナーリンパ球細胞がやがて死に至り、ハイブリドーマ細胞だけが生き残るような選択培地で増殖させることを含む。これらをクローニングし、増殖させ、それらの上清を、例えば、ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−Ｌ１融合タンパク質を用いたイムノアッセイ技術によって所望の特異性の抗体が存在するかどうかスクリーニングする。例えば、制限希釈によって陽性クローンをサブクローニングし、モノクローナル抗体を単離する。
【０２３８】
これらの方法に従って生産されたハイブリドーマは、当技術分野で知られている技術（一般に、Fink et al., Prog. Clin. Pathol., 9:121-33 (1984)参照）を用いて、in vitroまたはin vivo（腹水中）で増殖させることができる。一般に、個々の細胞系統を培養で増殖させ、高濃度の単一モノクローナル抗体を含む培養培地を、デカンテーション、濾過または遠心分離によって採取することができる。
【０２３９】
抗体は、通常の多量体構造の代わりに単鎖抗体またはｓｃＦｖとして生産してもよい。単鎖抗体は、着目するＩｇに由来する超可変領域を含み、完全なＩｇよりも小さいながら、天然Ｉｇの抗原結合部位を再形成する(Skerra, A. et al. Science, 240: 1038-1041 (1988); Pluckthun, A. et al. Methods Enzymol. 178: 497-515 (1989); Winter, G. et al. Nature, 349: 293-299 (1991))。好ましい実施態様では、抗体は慣例の分子生物学的技術を用いて生産される。
【０２４０】
ＩＩＩ．製造方法
Ａ．免疫調節性ポリペプチドおよびその変異体の生産方法
単離された免疫調節薬剤またはその変異体は、例えば、化学的合成または宿主細胞での組換え生産によって得ることができる。免疫調節薬剤ポリペプチドを組換え生産するためには、そのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を用いて、細菌または真核生物宿主細胞（例えば、昆虫、酵母または哺乳類細胞）に形質転換、形質導入またはトランスフェクションを行うことができる。一般に、核酸構築物は、免疫調節性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された調節配列を含む。調節配列（本明細書では発現制御配列とも呼ばれる）は一般に遺伝子産物をコードしないが、それらが機能的に連結されている核酸配列の発現に影響を与える。
【０２４１】
ポリペプチドを発現および生産するのに有用な原核生物系および真核生物系は当技術分野でよく知られており、例えば、ＢＬ−２１などの大腸菌(Escherichia coli)株、およびＣＨＯ細胞などの培養哺乳類細胞が挙げられる。
【０２４２】
真核生物宿主細胞では、免疫調節性ポリペプチドを発現させるために多くのウイルスに基づく発現系が利用可能である。ウイルスに基づく発現系は当技術分野でよく知られており、限定されるものではないが、バキュロウイルス、ＳＶ４０、レトロウイルスまたはワクシニアに基づくウイルスベクターが挙げられる。
【０２４３】
免疫調節性ポリペプチドを安定発現する哺乳類細胞系統は、適当な制御エレメントと選択マーカーを備えた発現ベクターを用いて作出することができる。例えば、真核生物発現ベクターｐＣＲ３．１(Invitrogen Life Technologies) およびｐ９１０２３（Ｂ）（Wong et al. (1985) Science 228:810-815参照）は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ−１細胞、ヒト胎児腎臓２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＭＤＣＫ細胞およびヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）での変異型共刺激ポリペプチドの発現に好適である。エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストランまたは他の好適なトランスフェクション法による発現ベクターの導入の後、安定な細胞系統を選択することができる（例えば、Ｇ４１８、カナマイシンまたはハイグロマイシンに対する抗生物質耐性による）。トランスフェクト細胞は、目的のポリペプチドが発現されるように培養することができ、このポリペプチドを例えば、細胞培養上清または溶解細胞から回収することができる。あるいは、免疫調節性ポリペプチドは、（ａ）増幅された配列をｐｃＤＮＡ３(Invitrogen Life Technologies)などの哺乳類発現ベクターに連結し、（ｂ）in vitroにおいてコムギ胚芽抽出液またはウサギ網状赤血球溶解液を用いて転写および翻訳することによって生産することもできる。
【０２４４】
免疫調節性ポリペプチドは、例えば、ＤＥＡＥイオン交換、ゲル濾過およびヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法を用いて単離することができる。例えば、細胞培養上清または細胞質抽出液中の免疫調節性ポリペプチドは、プロテインＧカラムを用いて単離することができる。いくつかの実施態様では、変異型免疫調節性ポリペプチドは、それらのポリペプチドを親和性マトリックスに捕捉させるアミノ酸配列を含むように「操作」することができる。ポリペプチドの精製を助けるために、例えば、ｃ−ｍｙｃ、血球凝集素、ポリヒスチジンまたはＦｌａｇ（商標）(Kodak)などのタグを使用することができる。このようなタグは、カルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかを含むポリペプチド内のいずれの位置にも挿入することができる。有用であり得る他の融合物としては、アルカリ性ホスファターゼなど、ポリペプチドの検出を助ける酵素が挙げられる。共刺激ポリペプチドを精製するのに、イムノアフィニティークロマトグラフィーを使用することもできる。
【０２４５】
変異型ポリペプチドを作出するためにランダム突然変異を導入する方法が当技術分野で知られている。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２と相互作用するペプチドをスクリーニングするためにランダムペプチドディスプレーライブラリーを使用することができる。このようなランダムペプチドディスプレーライブラリーを作出およびスクリーニングするための技術は当技術分野で知られており（Ladner et al.,米国特許第５，２２３，４０９号；Ladner et al.,米国特許第４，９４６，７７８号；Ladner et al.,米国特許第５，４０３，４８４号およびLadner et al.,米国特許第５，５７１，６９８号）、ランダムペプチドディスプレーライブラリーおよびこのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットが市販されている。
【０２４６】
Ｂ．免疫調節性ポリペプチドをコードする単離された核酸分子の生産方法
免疫調節性ポリペプチドをコードする単離された核酸分子は、限定されるものではないが、一般的分子クローニングおよび化学的核酸合成技術を含む標準的技術によって生産することができる。例えば、変異型共刺激ポリペプチドをコードする単離された核酸を得るために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用することができる。ＰＣＲは、標的核酸が酵素的に増幅される技術である。一般に、着目する領域の末端からの、またはそれを超える配列情報を用いれば、増幅される鋳型の反対鎖と配列が同一であるオリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。ＰＣＲを用いて、全ゲノムＤＮＡまたは全細胞ＲＮＡ由来の配列を含め、ＤＮＡならびにＲＮＡから特定の配列を増幅させることができる。プライマーは一般に１４〜４０ヌクレオチドの長さであるが、１０ヌクレオチド〜数百ヌクレオチドの範囲の長さであってもよい。一般的なＰＣＲ技術は、例えば、PCR Primaer: A Laboratory Manual, Dieffenbach and Dveksler編, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995に記載されている。鋳型の供給源としてＲＮＡを用いる場合には、逆転写酵素を用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鎖を合成することができる。単離された核酸を得るために、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、自己持続配列複製または核酸配列に基づく増幅を使用することもできる。例えば、Lewis (1992) Genetic Engineering News 12:1、 Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878、およびWeiss (1991) Science 254:1292-1293参照。
【０２４７】
単離された核酸は、単一の核酸分子として、またはオリゴヌクレオチド系列として化学的に合成することができる（例えば、３’から５’方向への自動ＤＮＡ合成のためのホスホルアミダイト技術を使用）。例えば、所望の配列を含む長いオリゴヌクレオチド（例えば＞１００ヌクレオチド）の１以上の対を合成することができ、各対は短い相補的セグメント（例えば約１５ヌクレオチド）を含むことから、そのオリゴヌクレオチド対がアニーリングされると二重らせんが形成される。ＤＮＡポリメラーゼを用いてそのオリゴヌクレオチドを延長することができ、その結果、オリゴヌクレオチド１対につき１つの二本鎖核酸分子が得られ、次にこれをベクターに連結することができる。また、単離された核酸は突然変異誘発により得ることもできる。免疫調節性ポリペプチドをコードする核酸は、ＰＣＲを介したオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発および／または部位特異的突然変異誘発を含む標準的技術を用いて突然変異させることができる。Short Protocols in Molecular Biology. Chapter 8, Green Publishing Associates and John Wiley & Sons, Ausubel et al編, 1992参照。修飾可能なアミノ酸位置の例としては、本明細書に記載されているものが含まれる。
【０２４８】
ＩＶ．処方物
Ａ．免疫調節薬剤処方物
免疫調節薬剤を含む医薬組成物が提供される。ペプチドまたはポリペプチドを含有する医薬組成物は非経口（筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）もしくは皮下注射）、経皮（受動的に、またはイオン泳動もしくはエレクトロポレーションを使用）、または経粘膜（鼻腔、膣、直腸もしくは舌下）投与経路による投与用であり得る。また、組成物は生浸食性インサートを用いて投与してもよいし、適当なリンパ組織（例えば、脾臓、リンパ節もしくは粘膜に関連するリンパ組織）に直接送達するか、または器官もしくは腫瘍に直接送達してもよい。これらの組成物は各投与経路に適当な投与形で処方することができる。さらに、ペプチドまたはポリペプチドでないＰＤ−１受容体のアンタゴニストを含有する組成物は腸内投与用に処方することができる。
【０２４９】
本明細書において「有効量」または「治療上有効な量」とは、処置される障害の１以上の症状を治療、阻害または緩和するのに、またはそうでなければ所望の薬理学的および／または生理学的作用を提供するのに十分な用量を意味する。厳密な用量は、対象に依存する変数（例えば、年齢、免疫系の健全性など）、疾患および行われる処置などの種々の要因によって異なる。免疫調節薬剤の治療上有効な量は、免疫応答を活性化、増強、増大または持続させ、かつ／またはＴ細胞の消耗および／またはＴ細胞の無応答を克服もしくは緩和し、かつ／または単球、マクロファージ、樹状細胞および他の抗原提示細胞（「ＡＰＣ」）を活性化する。
【０２５０】
好ましい実施態様では、該免疫調節薬剤は、腫瘍モデリングおよびバイオアベイラビリティからの外挿に基づき、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲で投与される。最も好ましい範囲は５〜２０ｍｇ免疫調節薬剤／ｋｇである。一般に、静脈注射または注入では、別の経路によって投与する場合よりも用量は低くなり得る。
【０２５１】
１．非経口投与用処方物
好ましい実施態様では、ペプチドおよびポリペプチドを含有するものを含む開示される組成物は、水溶液で非経口注射によって投与される。処方物はまた懸濁液またはエマルションの形態であってもよい。一般に、有効量のペプチドまたはポリペプチドを含み、場合により薬学上許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または担体を含む医薬組成物が提供される。このような組成物は無菌水、緩衝生理食塩水（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸、リン酸）、ｐＨおよびイオン強度；ならびに場合により、界面活性剤および可溶化剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ８０、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、および保存剤（例えば、Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ、ベンジルアルコール）および増量剤（例えば、ラクトース、マンニトール）などの添加剤を含む。非水性溶媒またはビヒクルの例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（オリーブ油およびコーン油など）、ゼラチン、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルがある。処方物は凍結乾燥させ、使用直前に再溶解／再懸濁させてもよい。処方物は例えば、細菌保持フィルターによる濾過、除菌剤の組成物への配合、組成物の照射または組成物の加熱によって除菌してもよい。
【０２５２】
２．制御送達ポリマーマトリックス
１以上の免疫調節性ポリペプチドまたは免疫調節性ポリペプチドをコードする核酸を含有する組成物は徐放性処方物として投与することができる。徐放性ポリマーデバイスはポリマーデバイス（ロッド、シリンダー、フィルム、ディスク）の移植または注射（微粒子）後に長時間全身への放出を行うことができる。マトリックスは、ペプチドが固体ポリマーマトリックス内に分散されているマイクロスフェア、またはコアがポリマー剤皮とは異なる材料のものであり、そのコア（本質的に液体であっても固体であってもよい）内にペプチドが分散もしくは懸濁されているマイクロカプセルなどの微粒子の形態であってもよい。本明細書で特に定義されない限り、微粒子、マイクロスフェアおよびマイクロカプセルは互換的に用いられる。あるいは、ポリマーは数ナノメートルから４センチメートルの範囲の薄スラブもしくはフィルムとしての鋳物、摩砕もしくは他の標準的な技術によって製造された粉末、またはさらにはヒドロゲルなどのゲルであってもよい。マトリックスはまた、免疫応答を調節するため、免疫不全患者（カテーテルが挿入されている高齢者または未熟児など）における感染予防のため、またはただれ、床ずれ潰瘍などの治癒を促進するために用いられるマトリックスの場合と同様に治癒における補助とするために医療装置の内外に組み込むこともできる。
【０２５３】
非生分解性マトリックスでも生分解性マトリックスでも、免疫調節性ポリペプチドまたはそれらをコードする核酸の送達に使用することができるが、生分解性マトリックスが好ましい。これらは天然ポリマーであっても合成ポリマーであってもよいが、分解および放出特性の特徴付けが良好なために合成ポリマーが好ましい。ポリマーは、放出が望まれる期間に基づいて選択される。直線的放出が最も有用である場合もあるが、パルス放出または「バルク放出(bulk release)」がより有効な結果をもたらす場合もある。ポリマーはヒドロゲル（一般に最大約９０重量％の水を吸収する）の形態であってもよく、場合により多価イオンまたはポリマーで架橋されていてもよい。
【０２５４】
マトリックスは溶媒蒸発、噴霧乾燥、溶媒抽出および当業者に知られている他の方法によって形成させることができる。生浸食性マイクロスフェアは、例えば、Mathiowitz and Langer, J. Controlled Release, 5:13-22 (1987); Mathiowitz, et al., Reactive Polymers, 6:275-283 (1987);およびMathiowitz, et al., J. Appl. Polymer Sci., 35:755-774 (1988)に記載されているような、薬物送達用のマイクロスフェアを作製するために開発されたいずれかの方法を用いて製造することができる。
【０２５５】
徐放性経口処方物が望ましい場合がある。ＰＤ−１阻害的シグナル伝達のアンタゴニストは、拡散または溶脱機構のいずれかによる放出を可能とする不活性マトリックス、例えば、フィルムまたはガム中に配合することができる。また、緩徐崩壊マトリックスを処方物に配合してもよい。別の徐放性形態としては、水を入り込ませて浸透圧作用により単一の小開口部から薬剤を押し出す半透膜に薬剤が封入されるものがある。経口処方物では、放出の場所は胃、小腸（十二指腸、空腸もしくは回腸）または大腸であり得る。好ましくは、この放出は活性剤（もしくは誘導体）の保護によるか、または胃環境を超えて超などへ活性剤を放出させることにより、胃環境の有害な影響を回避する。完全な胃耐性を確保するためには、腸溶コーティング（すなわち、少なくともｐＨ５．０までは不透性）が不可欠である。これらのコーティングは複合フィルムとして、またはBanner Pharmacapsから市販されているものなどのカプセル剤として使用することができる。
【０２５６】
これらのデバイスは移植領域または注射領域を処置するための局所放出用に処方することができ、一般に、全身処置用の用量よりもはるかに低い用量を送達する。これらのデバイスはまた、全身送達用に処方することもできる。これらは移植または皮下注射することができる。
【０２５７】
３．腸内投与用処方物
ＰＤ−１のアンタゴニストはまた、経口送達用にも処方することができる。経口固体投与形は当業者に知られている。固体投与形としては、錠剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤またはロゼンジ剤、カシェ剤、ペレット、粉末もしくは顆粒、またはポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリマー化合物の特定の調製物、もしくはリポソームへの材料の組み込みが挙げられる。このような組成物は本発明のタンパク質および誘導体の物理的状態、安定性、in vivo放出速度、およびin vivoクリアランス速度に影響を及ぼし得る。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第21版(2005, Lippincott, Williams & Wilins, Baltimore, Md. 21201) 889-964頁参照。該組成物は液体形態で調製してもよいし、あるいは乾燥粉末（例えば、凍結乾燥）形態であってもよい。リポソームまたはポリマーカプセル封入を組成物の処方に用いてもよい。Marshall, K. In: Modern Pharmaceutics, G. S. Banker and C. T. Rhodes編 Chapter 10, 1979も参照。一般に、処方物は活性剤と、胃環境中で免疫調節薬剤を保護し、腸でその生物学的に活性な材料を放出する不活性成分を含む。
【０２５８】
薬学上許容されるエマルション、溶液、懸濁液およびシロップを含む経口投与用液体投与形は、不活性希釈剤；湿潤剤、乳化剤および沈殿防止剤などのアジュバント；ならびに甘味剤、香味剤および芳香剤をはじめとする他の成分を含み得る。
【０２５９】
Ｂ．免疫調節薬剤を含むワクチン
ワクチンは感染細胞を排除するために強いＴ細胞応答を必要とする。本明細書に記載されている免疫調節薬剤は、一次免疫応答ならびにエフェクター細胞の活性および数を促進、増大または増強するためにワクチンの成分として投与することができる。ワクチンは、抗原、免疫調節薬剤（またはその供給源）および場合により他のアジュバントおよび標的化分子を含む。免疫調節薬剤の供給源は、開示されるＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２またはＰＤ−１ポリペプチドのいずれか、その融合タンパク質もしくは変異体、これらのポリペプチドのいずれかをコードする核酸、またはこれらのポリペプチドのいずれかを発現するベクターを含む宿主細胞を含む。
【０２６０】
１．抗原
抗原はペプチド、タンパク質、多糖類、糖類、脂質、核酸またはその組合せであり得る。抗原はウイルス、細菌、寄生虫、原虫、真菌、ヒストプラズマ、組織または形質転換細胞に由来するものであり得、全細胞またはその免疫原性成分（例えば、細胞壁成分またはその分子成分）であり得る。
【０２６１】
好適な抗原は当技術分野で知られており、商業的官業および科学ソースから入手可能である。一実施態様では、抗原は完全に不活化された、または弱毒された生物である。これらの生物は、ウイルス、寄生虫および細菌などの感染性生物であってもよい。抗原は腫瘍細胞または、淋病もしくはマラリアなどのウイルスもしくは細胞内病原体に感染した細胞であってもよい。抗原は腫瘍またはウイルスもしくは細菌源に由来する精製された、または部分精製されたポリペプチドであってもよい。抗原は、異種発現系においそのポリペプチド抗原をコードするＤＮＡを発現させることにより産生された組換えポリペプチドであってもよい。抗原は、抗原タンパク質の全部または一部をコードするＤＮＡであってもよい。このＤＮＡはプラスミドＤＮＡなどのベクターＤＮＡの形態であってもよい。
【０２６２】
抗原は単一の抗原として提供されてもよいし、あるいは組合せで提供されてもよい。抗原はまた、ポリペプチドまたは核酸の複合体混合物として提供されてもよい。
【０２６３】
ｉ．ウイルス抗原
ウイルス抗原は、限定されるものではないが、以下のウイルス科：アレナウイルス科、アルテリウイルス科、アストロウイルス科、バキュロウイルス科、バドナウイルス科、バルナウイルス科、ビルナウイルス科、ブロモウイルス科、ブンヤウイルス科、カリシウイルス科、カピロウイルス科、カルラウイルス科、カリモウイルス科、サーコウイルス科、クロステロウイルス科、コモウイルス科、コロナウイルス科（例えば、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルスなどのコロナウイルス）、コルチコウイルス科、シストウイルス科、デルタウイルス、ダイアンソウイルス、エナモウイルス、フィロウイルス科（例えば、マールブルグウイルスおよびエボラウイルス（例えば、ザイール株、レストン株、コートジボワール株またはスーダン株））、フラビウイルス科（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、デング熱ウイルス１、デング熱ウイルス２、デング熱ウイルス３およびデング熱ウイルス４）、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科（例えば、ヒトヘルペスウイルス１、３、４、５および６、ならびにサイトメガロウイルス）、ヒポウイルス科、イリドウイルス科、レビウイルス科、リポスリクスウイルス科、ミクロウイルス科、オルトミクソウイルス科（例えば、Ａ型およびＢ型およびＣ型インフルエンザウイルス）、パポバウイルス科、パラミクソウイルス科（例えば、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルスおよびヒト呼吸器合抱体ウイルス）、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、ライノウイルス、ヘパトウイルスおよびアフトウイルス）、ポックスウイルス科（例えば、ワクシニアウイルスおよびスモールポックスウイルス）、レオウイルス科（例えば、ロタウイルス）、レトロウイルス科（例えば、レンチウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１およびＨＩＶ２）、ラブドウイルス科（例えば、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合抱体ウイルスなど）、トガウイルス科（例えば、風疹ウイルス、デング熱ウイルスなど）、ならびにトリウイルス科のいずれかに由来するウイルスを含む任意のウイルスから単離することができる。好適なウイルス抗原はまた、デングタンパク質Ｍ、デングタンパク質Ｅ、デングＤ１ＮＳ１、デングＤ１ＮＳ２、およびデングＤ１ＮＳ３の全部または一部を含む。
【０２６４】
ウイルス抗原は、乳頭腫ウイルス、ヘルペスウイルス、すなわち、単純ヘルペス１および２；肝炎ウイルス、例えば、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）およびＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス；パラインフルエンザ、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス(cytomeglavirus)、エプスタイン・バーウイルス、ロタウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、ウマ脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、およびリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスなどの特定の株または株の組合せに由来し得る。
【０２６５】
ｉｉ．細菌抗原
細菌抗原は、限定されるものではないが、アクチノミセス属、アナベナ属、バチルス属、バクテロイデス属、デロビブリオ属、ボルデテラ属、ボレリア属、カンピロバクター属、カウロバクター属、クラミジア属、クロロビウム属、クロマチウム属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、サイトファガ属、ディノコッカス属、エシェリキア属、フランシセラ属、ハロバクテリア属、ヘリコバクター属、ヘモフィルス属、Ｂ型ヘモフィルス・インフルエンザ（ＨＩＢ）、ハイフォミクロビウム属、レジオネラ属、レプトスピラ属、リステリア属、Ａ型、Ｂ型およびＣ型髄膜炎球菌、メタノバクテリウム属、球菌属、ミオバクテリウム属、マイコプラズマ属、ミクソコッカス属、ナイセリア属、ニトロバクター属、オシラトリア属、プロクロロン属、プロテウス属、シュードモナス属、ロドスピリルム属、リケッチア属、サルモネラ菌属、赤痢菌属、スピリルム属、スピロヘータ属、ブドウ状球菌属、連鎖球菌属、ストレプトミセス属、スルフォロブス属、サーモプラズマ属、チオバチルス属およびトレポネーマ属、ビブリオ属、およびエルシニア属を含む任意の細菌に由来し得る。
【０２６６】
ｉｉｉ．寄生虫抗原
寄生虫の抗原は、限定されるものではないが、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、ヒストプラズマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、リケッチア・リケッチイ(Rickettsia ricketsii)、発疹熱リケッチア(Rickettsia typhi)、肺炎マイコプラズマ(Mycoplasma pneumoniae)、クラミジア・シッタシ(Chlamydial psittaci)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydial trachomatis)、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、ブルーストリパノソーマ(Trypanosoma brucei)、赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica)、トキソプラズマ・ゴンディ(Toxoplasma gondii)、膣トリコモナス(Trichomonas vaginalis)、およびマンソン住血吸虫(Schistosoma mansoni)などの寄生虫から得ることができる。これらには胞子虫抗原、マラリア原虫抗原、例えば、スポロゾイト周囲タンパク質、スポロゾイト表面タンパク質、肝臓段階抗原、頂端膜関連タンパク質またはメロゾイト表面タンパク質の全部または一部が含まれる。
【０２６７】
ｉｖ．腫瘍抗原
抗原は、限定されるものではないが、α−アクチニン−４、Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質、Ｃａｓｐ−８、β−カテニン、ｃｄｃ２７、ｃｄｋ４、ｃｄｋｎ２ａ、ｃｏａ−１、ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質、ＥＦ２、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質、ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ１１、ｈｓｐ７０−２、ＫＩＡＡＯ２０５、Ｍａｒｔ２、Ｍｕｍ−１、２および３、ネオ−ＰＡＰ、ミオシンクラスＩ、ＯＳ−９、ｐｍｌ−ＲＡＲα融合タンパク質、ＰＴＰＲＫ、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、トリオースリン酸イソメラーゼ、Ｂａｇｅ−１、Ｇａｇｅ３、４、５、６、７、ＧｎＴＶ、Ｈｅｒｖ−Ｋ−ｍｅｌ、Ｌａｇｅ−１、Ｍａｇｅ−Ａ１、２、３、４、６、１０、１２、Ｍａｇｅ−Ｃ２、ＮＡ−８８、ＮＹ−Ｅｓｏ−１／Ｌａｇｅ−２、ＳＰ１７、ＳＳＸ−２、およびＴＲＰ２−Ｉｎｔ２、ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ１７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５（５８）、ＣＥＡ、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ（ＬＡＧＥ）、ＳＣＰ−１、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、ＰＲＡＭＥ、ｐ５３、Ｈ−Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタイン・バーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２−４、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、β−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１６、ＴＡＧＥ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＣＴ７、テロメラーゼ、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、α−フェトタンパク質、１３ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３（ＣＡ ２７．２９＼ＢＣＡＡ）、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼ＫＰ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ＼７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０（Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、およびＴＰＳなどの腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原を含む腫瘍抗原であり得る。また、ＢＣＧなどの腫瘍抗原は、アジュバントに対する免疫刺激剤として使用することもできる。
【０２６８】
２．アジュバント
場合により、ワクチンはアジュバントを含み得る。アジュバントは、限定されるものではないが、以下の１以上であり得る：オイルエマルション（例えば、フロイントのアジュバント）；サポニン処方物；ビロソームおよびウイルス様粒子；細菌および細菌誘導体；免疫刺激性オリゴヌクレオチド；ＡＤＰリボシル化毒素および解毒誘導体；ミョウバン；ＢＣＧ；無機物含有組成物（例えば、アルミニウム塩およびカルシウム塩、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などの無機塩）；生体接着剤および／または粘膜接着剤；微粒子；リポソーム；ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル処方物；ポリホスファゼン；ムラミルペプチド；イミダゾキノロン化合物；および界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノール）。
【０２６９】
アジュバントはまたサイトカイン、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、インターフェロンγ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子などの免疫調節剤も含み得る。変異型ＰＤ−Ｌ２ポリペプチドの他、Ｂ７ファミリーの他のポリペプチドを含む他の共刺激分子を投与してもよい。このようなタンパク質性アジュバントは全長ポリペプチドもしくはその活性断片として、またはプラスミドＤＮＡなどのＤＮＡの形態で提供されてよい。
【０２７０】
ＩＶ．使用方法
本明細書に記載される免疫調節薬剤は、腫瘍部位または病原体感染領域においてＩＦＮγ産生細胞を増加させ、かつ、Ｔｒｅｇ細胞を減少させるために使用することができる。リガンドとＰＤ−１の相互作用を遮断すると、様々な結果が得られる。例えば、ＰＤ−Ｌ１により媒介されるシグナル伝達を遮断すると強力なエフェクター細胞応答が生じ、腫瘍部位または感染部位においてＩＦＮγ産生細胞が増加する。腫瘍部位または感染部位において、ＰＤ−Ｌ２により媒介されるシグナル伝達を遮断すると、浸潤性Ｔｒｅｇの数が減少する。従って、腫瘍部位または病原体感染領域においてＴｒｅｇの抑制機能が低下する。浸潤性Ｔｒｅｇの数の減少はＴｈ１７細胞産生および／またはＩＬ−１７産生の増加をもたらし、ＰＤ−１陽性細胞の数も減少させる。よって、好ましい免疫調節薬剤は、腫瘍部位または病原体感染領域において、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２双方のＰＤ−１との相互作用を遮断し、ＩＦＮγ産生細胞の増加およびＴｒｅｇの減少をもたらす。例示的免疫調節薬剤は、上記のＢ７−ＤＣ−Ｉｇ融合タンパク質である。
【０２７１】
免疫調節性ポリペプチド薬剤およびその変異体、ならびにこれらのポリペプチドおよび融合タンパク質をコードする核酸、または免疫調節性ポリペプチドを発現する細胞は、抗原に対する一次免疫応答を増強するため、ならびにＴ細胞の抗原特異的増殖を増加させるなどのエフェクター細胞機能を増強し、Ｔ細胞によるサイトカイン産生を増大させ、分化を刺激するために使用することができる。免疫刺激性薬剤は癌治療のために使用することができる。
【０２７２】
免疫調節性ポリペプチド薬剤は、それを必要とする被験体に、癌に関連する１以上の症状を処置し、Ｔ細胞の消耗および／またはＴ細胞の無反応を克服する助けをするのに有効な量で投与することができる。Ｔ細胞の消耗またはＴ細胞の無反応の克服は、既知の技術を用いてＴ細胞機能を測定することによって判定することができる。特定の実施態様では、免疫調節性ポリペプチドは、ＰＤ−１を介した阻害的シグナル伝達を誘発することなくＰＤ−１と結合し、かつ、Ｔ細胞共刺激能を保持するように操作される。
【０２７３】
免疫調節性ポリペプチドのin vitro適用は、例えば、免疫機構の基礎研究において、またはＴ細胞機能もしくは例えば受動免疫療法の研究に用いるための活性化Ｔ細胞の産生のために有用であり得る。さらに、免疫調節性ポリペプチドは、Ｔ細胞が得られた被験体において、着目する抗原に対する免疫を試験すべく設計されたin vitroアッセイ（例えば、Ｔ細胞増殖アッセイ）に加えることができる。このようなアッセイに免疫調節性ポリペプチドを添加すると、より強力な、従ってより検出の容易なin vitro応答が得られると考えられる。
【０２７４】
Ａ．免疫増強のための免疫調節薬剤の投与
１．癌の治療
本明細書で提供される免疫調節薬剤は一般に、in vivoおよびex vivoにおいて免疫応答刺激治療薬として有用である。一般に、開示される免疫調節薬剤組成物は、被験体の免疫系が免疫応答を惹起する任意の疾患または障害を有する、またはそれに対して疾病素因を有する被験体の治療に有用である。免疫調節薬剤の、ＰＤ−１シグナル相互作用を阻害または低減する能力はより強力な免疫応答を可能とする。開示される組成物は、Ｔ細胞を伴う免疫応答を刺激または増強するのに有用である。
【０２７５】
開示される免疫調節薬剤は、被験体においてＴ細胞を刺激するのに有効な量の免疫調節薬剤を被験体に投与することにより癌を処置するために、宿主の免疫応答を刺激または増強するのに有用である。提供される組成物および方法で処置可能な癌の種類としては、限定されるものではないが、以下のもの：膀胱癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、鼻咽頭癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、胃癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌および血液性癌が挙げられる。
【０２７６】
本明細書では処置可能な悪性腫瘍は腫瘍が由来する組織の胚起源に応じて分類される。癌腫は、皮膚または内部器官および腺の上皮下層などの内胚葉または外胚葉組織に起源する腫瘍である。肉腫（発生頻度は低い）は、骨、脂肪および軟骨などの中胚葉結合組織に由来する。白血病およびリンパ腫は、骨髄の造血系細胞の悪性腫瘍である。白血病は単細胞として増殖するが、リンパ腫は腫瘍塊として増殖する傾向がある。悪性腫瘍は身体の多くの器官または組織で見られ、癌を形成し得る。
【０２７７】
２．感染症の治療
免疫調節薬剤は一般に、in vivoおよびex vivoにおいて免疫応答刺激治療薬として有用である。好ましい実施態様において、これらの組成物は、Ｔ細胞の消耗またはＴ細胞の無応答が既に起こり、長期にわたって宿主に感染を残存させる感染症を治療するのに有用である。治療される感染の例としては、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、またはヒト乳頭腫ウイルスにより引き起こされる慢性感染である。他の感染も免疫調節薬剤を用いて治療可能であると考えられる。開示される組成物はワクチンの一部としても有用である。好ましい実施態様では、治療または予防される疾患の種類は、細菌、ウイルス、原虫、蠕虫、または細胞内に侵入する、すなわち細胞傷害性Ｔリンパ球により攻撃される、他の微生物病原体により引き起こされる慢性感染性疾患である。
【０２７８】
ヒトおよび動物モデルにおける慢性感染は、宿主免疫応答の、機能的なＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞集団の生成および維持不全に関連し、その結果として、感染を中和するための抗体応答も不十分となる。この機能の欠損はＴ細胞の消耗と呼ばれる。Ｔ細胞の無応答は、リンパ球が抗原と遭遇した後に内因的に機能的に不活化されるが、長期間、低応答状態で生存を維持するという耐性機構である。慢性感染を処置するための１つの方法は、消耗したＴ細胞を活性化すること、または被験体におけるＴ細胞の消耗を逆転させるとともにＴ細胞の無応答を克服することである。Ｔ細胞の消耗の逆転は、ＰＤ−１とそのリガンドＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）およびＰＤ−Ｌ２（ＰＤ−Ｌ２）の間の相互作用に干渉することによって達成することができる。急性の、多くの場合致死的な、病原体の作用は、毒素、またはその毒素により引き起こされる損傷の前に十分な免疫応答を惹起することができない他の因子によって媒介され得る。これは、ＰＤ−１とそのリガンドの間の相互作用に干渉し、より有効で迅速な免疫応答を可能とすることにより克服され得る。
【０２７９】
ウイルス感染は主としてＴ細胞により排除されるので、感染力のあるウイルス病原体のより迅速な、または十分な排除が動物またはヒト被験体に有益となる状況では、Ｔ細胞活性の増強が治療上有用である。よって、免疫調節薬剤は、限定されるものではないが、免疫不全（例えば、ＨＩＶ）、乳頭腫（例えば、ＨＰＶ）、ヘルペス（例えば、ＨＳＶ）、脳炎、インフルエンザ（例えば、ヒトＡ型インフルエンザウイルス）、および風邪（例えば、ヒトライノウイルス）ウイルス感染を含む、局所または全身ウイルス感染の処置のために投与することができる。例えば、免疫調節薬剤組成物を含む医薬処方物は、ヘルペス病巣または帯状疱疹または性器疣贅などのウイルス性皮膚疾患を処置するために局所投与することができる。免疫調節性組成物の医薬処方物はまた、限定されるものではないが、ＡＩＤＳ、インフルエンザ、風邪または脳炎を含む全身性ウイルス性疾患を処置するためにも投与することができる。
【０２８０】
治療可能な代表的感染としては、限定されるものではないが、アクチノミセス属、アナベナ属、バチルス属、バクテロイデス属、デロビブリオ属、ボルデテラ属、ボレリア属、カンピロバクター属、カウロバクター属、クラミジア属、クロロビウム属、クロマチウム属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、サイトファガ属、ディノコッカス属、エシェリキア属、フランシセラ属、ハロバクテリア属、ヘリコバクター属、ヘモフィルス属、Ｂ型ヘモフィルス・インフルエンザ（ＨＩＢ）、ヒストプラズマ属、ハイフォミクロビウム属、レジオネラ属、リーシュマニア属、レプトスピラ属、リステリア属、Ａ型、Ｂ型およびＣ型髄膜炎球菌、メタノバクテリウム属、球菌属、ミオバクテリウム属、マイコプラズマ属、ミクソコッカス属、ナイセリア属、ニトロバクター属、オシラトリア属、プロクロロン属、プロテウス属、シュードモナス属、ロドスピリルム属、リケッチア属、サルモネラ菌属、赤痢菌属、スピリルム属、スピロヘータ属、ブドウ状球菌属、連鎖球菌属、ストレプトミセス属、スルフォロブス属、サーモプラズマ属、チオバチルス属およびトレポネーマ属、ビブリオ属、エルシニア属、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、ヒストプラズマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、リケッチア・リケッチイ(Rickettsia ricketsii)、発疹熱リケッチア(Rickettsia typhi)、肺炎マイコプラズマ(Mycoplasma pneumoniae)、クラミジア・シッタシ(Chlamydial psittaci)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydial trachomatis)、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)、ブルーストリパノソーマ(Trypanosoma brucei)、赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica)、トキソプラズマ・ゴンディ(Toxoplasma gondii)、膣ト
リコモナス(Trichomonas vaginalis)およびマンソン住血吸虫(Schistosoma mansoni)を含む微生物により引き起こされる感染が挙げられる。
【０２８１】
Ｂ．ワクチンにおける免疫調節薬剤の使用
免疫調節薬剤は単独で投与してもよいし、あるいは他の任意の好適な処置と組み合わせて投与してもよい。一実施態様では、免疫調節薬剤は上記のようなワクチン組成物とともに、またはワクチン阻害剤の成分として投与することができる。ワクチン組成物の好適な成分は上記されている。開示される免疫調節薬剤はワクチン投与前、ワクチン投与と同時、またはワクチン投与後に投与することができる。一実施態様では、免疫調節薬剤組成物はワクチン投与と同時に投与される。
【０２８２】
免疫調節薬剤組成物は、被験体において次に感染性病原体に曝された際に耐性を付与する予防ワクチンとともに投与してもよいし、あるいはウイルスに感染した被験体におけるウイルス抗原などの既存の抗原に対する被験体の免疫応答を誘発または増強するために使用できる治療ワクチンとともに投与してもよい。
【０２８３】
予防的、治療的または脱感作免疫応答の所望の結果は、当技術分野でよく知られている原理に従い、疾患によって異なり得る。例えば、感染性病原体に対する免疫応答は感染性病原体の定着および複製を完全に防ぐことができ、「無菌免疫(sterile immunity)」および疾病症状の不在に影響を及ぼす。しかしながら、感染性病原体に対するワクチンは、それが症状の数、重篤度または持続期間を軽減するか、症状を有する集団中の個体数を少なくするか、または感染性病原体の伝染を軽減すれば、有効であると見なせる。同様に、癌、アレルゲン、または感染性病原体に対する免疫応答は疾患を完全に治療する場合、症状を緩和する場合、または疾患に対する全体的な治療的介入の一面である場合がある。
【０２８４】
免疫調節薬剤は、少なくとも１つの成分抗原または抗原組成物に対し、免疫調節性ポリペプチドを用いずに対応する組成物で得られるエフェクター細胞応答に比べて向上したエフェクター細胞応答（ＣＤ４Ｔ細胞免疫応答など）を誘導する。「向上したエフェクター細胞応答」とは、ワクチン組成物の投与後にヒト患者で得られる、免疫調節性ポリペプチドを用いずに同じ組成物の投与後に得られるものよりも高いエフェクター細胞応答（ＣＤ４細胞応答など）を意味する。例えば、ヒト患者において免疫調節薬剤、好ましくはＰＤ−Ｌ２−Ｉｇと抗原調製物を含有する免疫原組成物を投与した際に、アジュバントを含まないその抗原調製物を含有する免疫原組成物の投与後に誘導される応答に比べて高いＣＤ４Ｔ細胞応答が得られる。このような処方物は有利には、ＭＨＣクラスＩＩ分子により提示される抗原エピトープを検出することができる抗抗原エフェクター細胞応答を誘導するために用いられる。
【０２８５】
この向上したエフェクター細胞応答は、免疫刺激されていない患者、すなわち、その抗原に対して血清陰性である患者で得ることができる。この血清陰性は、患者がその抗原に直面したことがない（いわゆる「ナイーブ」患者）か、あるいはまた、かつて遭遇したその抗原に応答できなかった結果であり得る。この向上したエフェクター細胞応答は、高齢者、一般に６５歳以上、または高リスクな医学的状態を有する６５歳より若い成人（「高リスク」成人）、または２歳未満の小児などの免疫不全被験体で得られるのが好ましい。
【０２８６】
向上したエフェクター細胞応答は、以下のサイトカインのいずれかを産生する細胞：（１）少なくとも２つの異なるサイトカイン（ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７）を産生する細胞、（２）少なくともＣＤ４０Ｌと別のサイトカイン（ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮγ、ＩＬ−１７）を産生する細胞、（３）少なくともＩＬ−２と別のサイトカイン（ＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮγ、ＩＬ−１７）を産生する細胞、（４）少なくともＩＦＮγと別のサイトカイン（ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−１７）を産生する細胞、（５）少なくともＴＮＦ−αと別のサイトカイン（ＩＬ−２、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１７）を産生する細胞、および（６）ＩＬ−１７と別のサイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１７）を産生する細胞の数を測定することにより評価することができる。
【０２８７】
向上したエフェクター細胞応答は、ワクチン組成物の投与後の、上記サイトカインのいずれかを産生する細胞の量が、免疫調節性ポリペプチドを含まない組成物を投与した場合よりも多い際に存在する。一般に、上記の５つの条件のうち少なくとも１つ、好ましくは２つが満たされる。好ましい実施態様では、５つのサイトカイン（ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７）総てを産生する細胞は、ワクチン接種群では非ワクチン接種群よりも多い数で存在する。
【０２８８】
免疫原組成物は、皮内、粘膜、例えば、鼻内、経口、筋肉内、または皮下などのいずれの好適な送達経路によって投与してもよい。当技術分野では他の送達経路もよく知られている。免疫原組成物には筋肉内送達経路が好ましい。皮内送達はもう１つの好適な経路である。皮内送達には、例えば短針デバイスなどの任意の好適なデバイスが使用可能である。皮内ワクチンはまた、針の皮膚への有効侵入長を制限するデバイスにより投与してもよい。また、液体ジェット式注射器によって、または角質層を穿孔し、真皮に達するジェットを生じる針によって、液体ワクチンを真皮へ送達するジェット式注射デバイスを使用することもできる。ジェット式注射デバイスは当技術分野で既知である。皮膚の外層から真皮へと粉末形態のワクチンを加速化するために圧縮ガスを用いる弾道粉末／粒子送達デバイスも使用可能である。さらに、通常のシリンジを皮内投与の従来のＭａｎｔｏｕｘ法で使用することもできる。
【０２８９】
もう１つの好適な投与経路は皮下経路である。皮下送達には、例えば、従来の針などの好適な任意のデバイスを使用することができる。好ましくは、無針ジェット式注射器が用いられる。無針注射器は当技術分野で既知である。より好ましくは、このデバイスには液体ワクチン処方物が予め充填されている。
【０２９０】
あるいは、ワクチンは鼻腔内投与される。一般に、ワクチンは鼻咽頭領域に、好ましくは肺へ吸入されずに、局所投与される。ワクチン処方物を、肺に入ることなく、または実質的に入ることなく鼻咽頭領域へ送達する鼻腔内送達デバイスを用いるのが望ましい。ワクチンの鼻腔内投与に好ましいデバイスはスプレーデバイスである。鼻腔スプレーデバイスは市販されている。ネブライザーは肺へ容易に吸入され得る極めて微細なスプレーを生じるので、鼻粘膜に十分に到達しない。従って、ネブライザーは好ましくない。鼻腔用に好ましいスプレーデバイスは、デバイスの性能が、使用者がかける圧力に依存しないデバイスである。これらのデバイスは圧力閾値デバイスとして知られる。閾値圧力がかけられた場合にのみノズルから液体が放出される。これらのデバイスは規則的な液滴サイズを有するスプレーを達成することを容易とする。本発明とともに用いるのに好適な圧力閾値デバイスは当技術分野で公知であり、市販されている。
【０２９１】
好ましい鼻腔デバイスは、１〜２００μｍ、好ましくは１０〜１２０μｍの範囲の液滴（液体として水を用いて測定）を生じる。１０μｍを下回ると吸入のリスクがあるので、１０μｍ未満の液滴が約５％を超えないことが望ましい。１２０μｍを超える液滴も、小さい液滴と同様に拡散しないので、１２０μｍを超える液滴が約５％を超えないことが望ましい。
【０２９２】
二用量送達(bi-dose delivery)は、ワクチンとともに用いるための鼻腔内送達系のもう１つの特徴である。二用量デバイスは、単回ワクチン用量の２つの分割用量を含み、１つの分割用量は各鼻孔に投与するためのものである。一般に、この２つの分割用量は単一のチャンバー内に存在し、このデバイスの構成は単一の分割用量を一度に効率的に送達することを可能とする。あるいは、ワクチンの投与に一用量デバイスを用いてもよい。
【０２９３】
免疫原組成物は数日、数週間または数ヶ月の期間にわたって２回以上で与えることができる。一実施態様では、異なる投与経路が用いられ、例えば、最初に筋肉内投与を行い、場合により免疫調節薬剤を含有し得る追加免疫組成物を、例えば皮内、皮下、または鼻腔内などの異なる経路により投与することができる。
【０２９４】
免疫原組成物により付与された向上したエフェクター細胞応答は１回の投与の後に得られるのが理想的であり得る。この単回用量アプローチは、バイオテロリストの攻撃および流行を含む、急速に進行する大発生状況に極めて適切である。ある特定の状況では、特に、高齢者集団、または特定の抗原に対して初めてワクチン接種される年少の小児（９歳未満）では、２用量の同じ組成物を投与することが有益であり得る。同じ組成物の２回目の用量（やはり、最初のワクチン接種用の組成物とみなされる）は、進行中の一次免疫応答中に投与することができ、初回投与から十分な期間が置かれる。一般に、組成物の２回目の投与は、未応答または応答が不十分な個体において免疫系の刺激を助けるために、初回投与の数週間、または約１か月、例えば、２週間、３週間、４週間、５週間、または６週間後に投与される。
【０２９５】
特定の実施態様では、免疫原組成物の投与は、代わりにまたはその上に、アジュバントを含む免疫原組成物を投与した患者において、アジュバントを含まない組成物で免疫された個体において誘導されたＢ記憶細胞応答に比べて向上したＢ記憶細胞応答を誘導する。向上したＢ記憶細胞応答は、in vitro分化の刺激により測定される、抗原遭遇時に抗体分泌形質細胞へと分化し得る末梢血Ｂリンパ球の頻度の増加を意味するものとする（実施例の節、例えば、Ｅｌｉｓｐｏｔ Ｂ細胞記憶の方法を参照）。
【０２９６】
さらに別の実施態様では、免疫原組成物は一次免疫応答ならびにＣＤ８Ｔ細胞応答を増強する。初回ワクチン接種用の免疫原組成物の１回用量を投与すると、良好な血清保護がもたらされ、アジュバントを含まない処方物で得られるものに比べて、特定の抗原に対して向上したＣＤ４Ｔ細胞またはＣＤ８Ｔ細胞免疫応答が誘導される。この結果、全体的な罹患率および死亡率が引き下げられ、また、肺炎および他のインフルエンザ様疾患のための緊急入院が防げる。この方法により、アジュバントを含まない処方物で誘導される応答に比べて、より長い時間持続する、例えば、初回ワクチン接種後なお１年存在するＣＤ４Ｔ細胞応答を誘導することができる。
【０２９７】
好ましくは、無刺激被験体で得られる向上したＣＤ４Ｔ細胞免疫応答などのＣＤ４Ｔ細胞免疫応答は、交差反応性ＣＤ４Ｔヘルパー応答の誘導を含む。特に、交差反応性ＣＤ４Ｔ細胞の量が増える。「交差反応性」ＣＤ４応答とは、例えばインフルエンザ株の間で共有されているエピトープを標的化するＣＤ４Ｔ細胞を意味する。
【０２９８】
この用量の免疫調節薬剤はヒトにおいて抗原に対する免疫応答を増強する。特に、好適な免疫調節薬剤量は、アジュバントを含まない組成物に比べて、または別の免疫調節薬剤量のアジュバントを含む組成物に比べて、組成物の免疫能を向上させるものである。通常、免疫原組成物の用量は約０．５ｍｌ〜約１ｍｌの範囲である。一般的なワクチン用量は０．５ｍｌ、０．６ｍｌ、０．７ｍｌ、０．８ｍｌ、０．９ｍｌ、または１ｍｌである。好ましい実施態様では、ワクチン組成物１ｍｌ当たりに終濃度５０μｇの免疫調節薬剤、好ましくはＰＤ−Ｌ２−Ｉｇ、またはワクチン用量０．５ｍｌ当たり２５μｇが含まれる。他の好ましい実施態様では、ワクチン組成物１ｍｌ当たり終濃度３５．７μｇまたは７１．４μｇの免疫調節薬剤が含まれる。具体的には、０．５ｍｌのワクチン用量は、１用量当たり２５μｇまたは５０μｇの免疫調節薬剤を含む。さらに別の実施態様では、この用量は１００μｇ以上である。免疫原組成物は通常、一元放射免疫拡散法（ＳＲＤ）(J. M. Wood et al.: J. Biol. Stand. 5 (1977) 237-247、 J. M. Wood et al., J. Biol. Stand. 9 (1981) 317-330)により測定した場合、１５μｇの抗原成分を含む。
【０２９９】
被験体に免疫原組成物を再接種することができる。一般に、再接種は初回接種の少なくとも６か月後、好ましくは８〜１４か月後、より好ましくは１０〜１２か月後前後で行われる。
【０３００】
再接種用の免疫原組成物（追加免疫組成物）は、不活化されているか、または生きた状態で弱毒されている、いずれの種類の抗原調製物も含み得る。それは、初回接種用に用いた免疫原組成物と同じ種類の抗原調製物、例えば、スプリットインフルエンザウイルスまたはそのスプリットインフルエンザウイルス抗原調製物、完全ビリオン、精製サブユニットワクチンまたはビロソームを含み得る。あるいは、追加免疫組成物は、初回接種用に用いたものと別の種類の抗原、すなわち、スプリットインフルエンザウイルスまたはそのスプリットインフルエンザウイルス抗原調製物、完全なビリオン、精製サブユニットワクチン、またはビロソームを含み得る。
【０３０１】
ウイルスに対するワクチンに関して、使用する場合、追加免疫組成物は一般に次のウイルスシーズン、例えば、最初の免疫原組成物のおよそ１年後に投与する。追加免疫組成物はまた、その後毎年（３回目、４回目、５回目の接種など）与えてもよい。追加免疫組成物は初回接種に用いた組成物と同じであってよい。
【０３０２】
好ましくは、再接種は以下のいずれか、好ましくは２つまたは総てを誘導する：免疫調節薬剤を含まない抗原調製物での初回接種の後に誘導される同等の応答に比べて（ｉ）抗原調製物に対する向上したエフェクター細胞応答、または（ｉｉ）向上したＢ細胞記憶応答、または（ｉｉｉ）向上した体液性応答。好ましくは、免疫調節薬剤を含有する免疫原性抗原調製物を再接種した後に誘導される免疫応答は、アジュバントを含まない組成物を再接種した後に誘導される対応する応答よりも高い。
【０３０３】
免疫原組成物は一価または多価、すなわち、二価、三価または四価であり得る。好ましくは、その免疫原組成物は三価または四価である。多価とは、一般に異なる種または株からの抗原の供給源の数を意味する。ウイルスに関しては、少なくとも１つの株がパンデミック大発生に関連するか、またはパンデミック大発生に関連する可能性がある。
【０３０４】
Ｃ．標的化抗原提示細胞
別の実施態様は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を１以上の開示される免疫調節薬剤と、ＡＰＣにおけるＰＤ−１シグナル伝達を阻害、低減または遮断するのに有効な量で接触させることを提供する。ＡＰＣにおけるＰＤ−１シグナル伝達の遮断は、細胞内病原体または細胞内病原体に感染した細胞の排除を増強するＡＰＣを活性化する。
【０３０５】
Ｄ．併用療法
免疫調節薬剤組成物はそれを必要とする被験体に単独で、または１以上の付加的治療薬と組み合わせて投与することができる。付加的治療薬は処置される症状、障害、または疾患に基づいて選択される。例えば、免疫調節薬剤は免疫応答を増強または促進する働きをする１以上の付加的薬剤と同時に投与することができる。
【０３０６】
好ましい実施態様では、付加的治療薬は、シクロホスファミドである。シクロホスファミド（ＣＰＡ、ＣｙｔｏｘａｎまたはＮｅｏｓａｒ）は、オキサアザホスホリン(oxazahosphorine)薬であり、類似体としては、イフォスファミド（ＩＦＯ、Ｉｆｅｘ）、ペルホスファミド、トロホスファミド(trophosphamide)（トロホスファミド(trofosfamide)；Ｉｘｏｔｅｎ）、ならびにその薬学上許容される塩、溶媒和物、プロドラッグおよび代謝産物が挙げられる（参照によりその全内容が本明細書の一部とされる米国特許出願第２００７０２０２０７７号）。イフォスファミド（ＭＩＴＯＸＡＮＡＯ）はシクロホスファミドの構造類似体であり、その作用機序はシクロホスファミドと同一または実質的に同様であると考えられている。ペルホスファミド（４−ヒドロペルオキシシクロホスファミド）およびトロホスファミドもまた、シクロホスファミドに構造的に関連のあるアルキル化剤である。例えば、ペルホスファミドはＤＮＡをアルキル化し、それにより、ＤＮＡ複製、ならびにＲＮＡおよびタンパク質合成を阻害する。宿主毒性の軽減しつつ選択性および応答を改善する試みで、新たなオキサアザホスホリン誘導体が設計され、評価された(Ref. Liang J, Huang M, Duan W, Yu XQ, Zhou S. Design of new oxazaphosphorine anticancer drugs. Curr Pharm Des. 2007;13(9):963-78. Review)。これらにはマホスファミド（ＮＳＣ３４５８４２）、グルホスファミド（Ｄ１９５７５、β−Ｄ−グルコシルイソホスホルアミドマスタード）、Ｓ−（−）−ブロモホスファミド（ＣＢＭ−１１）、ＮＳＣ６１２５６７（アルドホスファミドペルヒドロチアジン）およびＮＳＣ６１３０６０（アルドホスファミドチアゾリジン）が含まれる。マホスファミドは、４−ヒドロキシ−ＣＰＡの化学的に安定な４−チオエタンスルホン酸塩であるオキサアザホスホリン類似体である。グルホスファミドは、ＩＦＯのアルキル化代謝産物であるイソホスホルアミドマスタードがβ−Ｄ−グルコース分子にグルコシド結合されたＩＦＯ誘導体である。さらなるシクロホスファミド類似体が、"Cyclophosphamide analogs useful as anti-tumor agents"と題された米国特許第５，１９０，９２９号（参照によりその全内容が本明細書の一部とされる）に記載されている。
【０３０７】
さらなる治療薬としては、調節性Ｔリンパ球（Ｔ−ｒｅｇ）の活性および／または数を低減する薬剤、好ましくは、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））、抗ＴＧＦβまたはイマチニブ（ＧＬＥＥＶＡＣ（登録商標））が含まれる。挙げられている処置計画はまた、アジュバントの投与も含む。他の付加的治療薬としては、有糸分裂阻害剤（例えば、パクリタキソール）、アロマターゼ阻害剤（例えば、レトロゾール）、血管新生阻害剤（ＶＥＧＦ阻害剤、例えば、アバスチン(Aavastin)、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）、アントラサイクリン、オキサリプラチン、ドキソルビシン、ＴＬＲ４アンタゴニストおよびＩＬ−１８アンタゴニストが含まれる。
【０３０８】
Ｅ．結合特性の調節
免疫調節薬剤の結合特性は、投与される用量および用量計画に関連する。ＭＤＸ−１１０６などの既存の抗体免疫調節薬剤は、単回投与後少なくとも３か月間、Ｔ細胞上のＰＤ−１分子の６０〜８０％の持続的占有を示す(Brahmer, et al. J. Clin. Oncology, 27:(155) 3018 (2009))。好ましい実施態様では、開示される免疫調節薬剤は、免疫細胞上でより短期の、またはより低いＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２／ＰＤ−１分子の占有を示す、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２／ＰＤ−１に対する結合特性を持つ。例えば、開示される免疫調節薬剤は一般に、単回用量の投与の１週間、２週間、３週間またはさらには１か月後に、免疫細胞上のＰＤ−１分子に５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０％(of 50%)未満の占有率を示す。他の実施態様では、開示される免疫調節薬剤は、ＰＤ−１に対して、ＭＤＸ−１１０６よりも低い結合親和性を有する。ＭＤＸ−１１０６などの抗体に関して、ＰＤ−Ｌ２−Ｉｇ融合タンパク質は、その受容体に対して比較的低い親和性を有し、従って、比較的速い解離速度を有するはずである。
【０３０９】
他の実施態様では、免疫調節薬剤は、次の投与までに消失される、周期的増強免疫応答を惹起するために数日、数週間または数ヶ月の期間にわたって間欠的に投与され、これは免疫応答を誘導するか、免疫応答を刺激するか、または免疫応答を増強するために働き得る。
【０３１０】
別の態様では、哺乳類に少なくとも１種類の免疫調節薬剤（該免疫調節薬剤は約１０ｎｇ／ｍＬの最大血漿濃度をもたらす）を含んでなる組成物を投与することを含んでなる、免疫応答を調節する方法が提供される。いくつかの態様では、免疫調節薬剤はＡＭＰ−２２４である。ＡＭＰ−２２４は、例えば、１．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇおよび／または４５ｍｇ／ｋｇの用量で、ボーラス投与として投与される。別の態様では、ＡＭＰ−２２４は、約１週間の期間で、約１８，０００μｇ／ｍＬ〜約２５，０００μｇ／ｍＬ×日のＡＵＣ値を有する。さらに別の態様では、免疫調節薬剤の半減期は約５〜１０日である。
【０３１１】
本発明はまた、疾病の処置のための薬剤の製造における少なくとも１種類の免疫調節薬剤の使用を提供し、該少なくとも１種類の免疫調節薬剤は、少なくとも１種類の免疫調節薬剤の最大血漿濃度を少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬとし、該少なくとも１つの免疫調節薬剤の曲線下面積値を、１週間の期間で少なくとも約１８，０００μｇ／ｍＬ〜約２５，０００μｇ／ｍＬ×日とするように投与するために処方される。一実施態様では、本発明は、最大血漿濃度を少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬとするように投与するために処方されたＡＭＰ−２２４の使用を提供する。
【実施例】
【０３１２】
本発明は、以下の非限定的実施例を参照すればさらに理解される。
【０３１３】
実施例１  Ｂ７−ＤＣおよびＢ７−Ｈ１のＰＤ−１受容体結合部位の突然変異誘発分析
材料および方法：
マウスおよび細胞系統：
雌Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスはNational Cancer Institute (Frederick, MD)から購入した。ＰＤ−１−欠損（ＰＤ−１−／−）マウスは従前に記載されているように作出した(Nishimura, et al., Int. Immunol., 10:1563-1572 (1998))。融合タンパク質を分泌する安定にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞クローンを、１％透析済みウシ胎仔血清（ＦＢＳ；HyClone, Logan, UT）を添加したＣＨＯ−ＳＦ  ＩＩ培地(Invitrogen Life Technologies)で維持した。リンパ球およびＣＯＳ細胞は、１０％ＦＢＳ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、および１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシンを添加したダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Invitrogen Life Technologies）で増殖させた。
【０３１４】
部位特異的突然変異誘発：
Ｂ７−ＤＣ−ＩｇおよびＢ７−Ｈ１−Ｉｇの総ての変異体を、鋳型としてＢ７−ＤＣ−Ｉｇ  ｃＤＮＡを用い、二段階ＰＣＲ法を用いて構築した。オーバーラップオリゴヌクレオチドプライマーを所望の突然変異をコードするように合成し、２つのフランキング５’および３’プライマーを、それぞれＥｃｏＲ  ＩおよびＢｇｌ  ＩＩ制限部位を含むように設計した。まず、これらのｃＤＮＡの適当な領域を、対応するオーバーラップするフランキングプライマーを用いて増幅した。フランキング５’および３’プライマーを用い、オーバーラップする配列を有する断片を融合し、増幅した。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲ  ＩおよびＢｇｌ  ＩＩで消化し、ＥｃｏＲ  Ｉ／Ｂｇｌ  ＩＩで消化したｐＨＩｇベクターに連結した。目的の突然変異が導入されたことを確認するため、各変異体を、ABI Prism 310 Genetic Analyzerを用いて配列決定した。プラスミドをＣＯＳ細胞にトランスフェクトし、無血清上清を回収し、in vitro結合アッセイに用いるか、またはＢＩＡｃｏｒｅ分析および機能アッセイのためにプロテインＧカラムで単離した。
【０３１５】
Ｉｇ融合タンパク質：
マウスＩｇＧ２ａのＦｃ部分に連結されたマウスＰＤ−１の細胞外ドメイン（ＰＤ−１−Ｉｇ）を含有する融合タンパク質を、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞で生産し、従前に記載されているように（Wand, et al.前掲）、プロテインＧアフィニティーカラムにより単離した。マウス脾細胞から全ＲＮＡを単離し、Ｂ７−ＤＣ  ｃＤＮＡを逆転写ＰＣＲにより得た。ネズミＢ７−ＤＣ−ＩｇおよびＢ７−Ｈ１−Ｉｇは、ＣＯＳ細胞を、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２−ＣＨ３部分にインフレームで連結されたマウスＢ７−ＤＣの細胞外ドメインを含んだキメラｃＤＮＡを含有するプラスミドで一時的にトランスフェクトすることにより作製した。ヒトＢ７−ＤＣ−ＩｇおよびＢ７−Ｈ１−Ｉｇは、ＣＯＳ細胞を、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２−ＣＨ３部分にインフレームで連結されたヒトＢ７−ＤＣの細胞外ドメインを含んだキメラｃＤＮＡを含有するプラスミドで一時的にトランスフェクトすることにより作製した。これらのトランスフェクトＣＯＳ細胞を無血清ＤＭＥＭで培養し、濃縮した上清を最初の結合アッセイのためのＩｇ融合タンパク質源として用いた。これらのＩｇタンパク質をさらに、従前に記載されているように（Wand, et al.前掲）、ＢＩＡｃｏｒｅ分析および機能アッセイのためにプロテインＧカラムで単離した。
【０３１６】
分子モデリング：
ヒトＢ７−Ｈ１（ｈＢ７−Ｈ１）、マウスＢ７−Ｈ１（ｍＢ７−Ｈ１）、ヒトＢ７−ＤＣ（ｈＢ７−ＤＣ）およびマウスＢ７−ＤＣ（ｍＢ７−ＤＣ）のＩｇ  Ｖ型ドメインの分子モデルを、ＣＤ８０／ＣＴＬＡ−４およびＣＤ８６／ＣＴＬＡ−４複合体の構造に見られるように、ヒトＣＤ８０およびＣＤ８６のＸ線座標に基づいた相同性（または比較的）モデリングによって作成した。まず、ＣＤ８０およびＣＤ８６のＶ−ドメインを最適に重ね合わせ、この重ね合わせに基づいてＢ７ファミリーメンバーの配列をアラインした。この重ね合わせおよび最初のアライメントは、ＭＯＥの配列−構造アライメント関数(Molecular Operating Environment, Chemical Computing Group, Montreal, Quebec, Canada)を用いて行った。次に、このアライメントを、Ｉｇコンセンサス部分を一致させ、標的配列において保存されている他の疎水性残基をＸ線構造のコア部分にマッピングするために手動で調整した。従って、アラインされた配列中の対応する残基は、ほぼ等しい空間的位置を持つと推定される。このような構造情報を考慮に入れることは、一般に、この場合のように同一性が低い場合に、配列同一性単独より信頼性の高いアライメント基準となる。アラインされた領域において、２つの構造鋳型ＣＤ８０およびＣＤ８６に対して比較されるＢ７配列の平均同一性はおよそ１６％に過ぎない。モデル構築の基礎としたこの構造指向型配列アラインメントの最終型を図５に示す。アライメントの後、これらの４つのモデルのコア領域を、ＭＯＥを用いて構造鋳型から自動的に組み立て、ループ領域における挿入および欠失を、セグメントマッチング法(Levitt, J. Mol. Biol., 226:507-533 (1992);およびFechteler, et al., J. Mol. Biol., 253:114-131 (1995))を適用することでモデル化した。側鎖置換は、高分解タンパク質データバンク構造(Ponder and Richards, J. Mol. Biol., 193:775-791 (1987);およびBerman, et al., Nucl. Acids Res., 28:235-242 (2000))に見られる好ましいロタマーコンフォメーションを用いて行った。各場合において、２０の中間モデルを作成し、平均座標を計算し、得られた構造に、各モデルの分子内接触および立体化学が合理的となるまで、タンパク質力場(Engh and Huber, Ada Cryst., A47:392-400 (1991))を用いてエネルギーの最小化を行った。溶媒接近面の計算 (Connolly, J. Appl. Cryst., 16:548-558 (1983))を含む、これらのモデルの図形解析および残基マッピング研究を、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ(Accelrys, San Diego, California)を用いて行った。
【０３１７】
ＥＬ１ＳＡ：
Ｂ７−ＤＣ−ＩｇおよびＢ７−Ｈ１−Ｉｇに特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡを確立した。マイクロタイタープレートを４℃で一晩、２ｆｉｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ(Sigma, St. Louis, MO)でコーティングした。ウェルを１時間、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ中、１０％ＦＢＳ）でブロッキングし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で洗浄した。ＣＯＳ細胞の培養上清を加え、室温で２時間インキュベートした。標準曲線を作成するため、既知濃度の単離されたＢ７−ＤＣ−Ｉｇ単独を各プレートの個々のウェルに加えた。十分に洗浄した後、１：２０００希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ(TAGO, Inc., Burlingame, CA)を加え、次に、ＴＭＢ基質で現像し、その後、０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止させた。マイクロタイタープレートリーダーで４０５ｍｍにて吸光度を測定した。変異型融合タンパク質の濃度は、Ｂ７−ＤＣ−ＩｇおよびＢ７−Ｈ１−Ｉｇの標準曲線の直線範囲と比較することにより求めた。３反復のウェルから得られたデータを採集したところ、平均からの標準偏差は１０％未満であった。実験は少なくとも３回繰り返した。
【０３１８】
変異型および野生型Ｂ７−ＤＣ−ＩｇおよびＢ７−Ｈ１−Ｉｇ融合ポリペプチドのＰＤ−１結合能を、捕捉ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。組換えＰＤ−１Ｉｇ融合タンパク質を４℃で一晩、５μｇ／ｍｌでマイクロタイタープレートにコーティングした。これらのプレートをブロッキングし、洗浄し、ＣＯＳ細胞培養培地を加え、室温で２時間インキュベートした。十分に洗浄した後、ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ、次いでＴＭＢ基質を加え、４０５ｍｍで吸光度を測定した。
【０３１９】
フローサイトメトリー：
ヒト胚腎臓２９３細胞をＰＤ−１  ＧＦＰベクター（全長マウスＰＤ−１  ｃＤＮＡのＣ末端にインフレームでＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質ｃＤＮＡ）を融合させることにより構築した）でトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後に細胞を回収し、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）バッファー（ＰＢＳ、３％ＦＢＳ、０．０２％ＮａＮ３）中で等量の融合タンパク質（４５分間氷上でＣＯＳ細胞培養培地中、野生型Ｂ７−ＤＣ−ＩｇおよびＢ７−Ｈ１−Ｉｇを用いて用量決定を行った）とともにインキュベートした。ヒトＩｇを含有する無関連の融合タンパク質を陰性対照として用いた。これらの細胞を洗浄し、フルオレセインイソチオシアネート（ＰＥ）結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ(BioSource, Camarillo, CA)とともにさらにインキュベートし、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒ(Becton Dickinson, Mountain View, CA)にてＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウエア(Becton Dickinson)を用いて解析した。ＧＦＰ陽性細胞のゲートのＦＬ１により設定した。
【０３２０】
表面プラズモン共鳴分析：
単離された野生型および変異型Ｂ７−ＤＣポリペプチドの親和性をＢＩＡｃｏｒｅ（商標）３０００装置(Biacore AB, Uppsala, Sweden)にて分析した。融合タンパク質以外の試薬は総て購入し、予め濾過し、ＢＩＡｃｏｒｅから脱気した。実験は総て、２５℃で、ランニングバッファーとして０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）を用いて行った。簡単に述べると、まず、ＰＤ−１Ｉｇを、ＢＩＡｃｏｒｅプロトコールに従ったアミンカップリングによりＣＭ５センサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ）に固定化した。ＣＭ５チップのフローセルを、１：１  ＥＤＣ：ＮＨＳ［Ｎ−エチル−Ｎ’−（ジエチルアミノプロピル）カルボジイミド：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド］混合物を７分間、２０μｇ／ｍｌのＰＤ−１−Ｉｇを１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）に希釈して１０μｌ／分で注入することにより誘導体化した。ＰＤ−１−Ｉｇを２０００ＲＵで固定化した。その後、残っている活性化カルボキシル基を１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．５）でブロッキングした。対照フローセルは、ＰＤ−１−Ｉｇの代わりにランニングバッファー単独を用いて上記と同様に作製した。融合タンパク質をランニングバッファーで３．７５、７．５，１５、３０および６０μｇ／ｍｌの濃度系に希釈した。これらのタンパク質を流速２０μｌ／分で３分間注入し、解離データを得るためにバッファーをその表面に５分間流した。フローセルは１０ｍＭのＮａＯＨのパルス、３０秒１回により再生した。データ解析はＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエアパッケージ３．１(BIAcore)を用いて行った。
【０３２１】
結果：
Wang, et al., J. Exp. Med., 197(9):1083-91 (2003)に開示されているように、分子モデルを補助として、Ｂ７−ＤＣおよびＢ７−Ｈ１のＶ−ドメインの重要な残基をスキャンした。ＢＥＤ面およびＡ’ＧＦＣＣ’Ｃ”面双方の保存残基および非保存残基を部位特異的突然変異誘発のために選択した。これらのマウス分子の残基を、次に、選択された突然変異型タンパク質の機能的研究が可能となるように変異させた。得られたの変異型ポリペプチドの結合の特徴を、ＰＤ−１との結合に関して特異的なＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析により評価した。合計１７のｍＢ７−ＤＣ変異体および２１のｍＢ７−Ｈ１変異体を作製し、検定した。結果を表１および２にまとめる。ｍＢ７−ＤＣおよびｍＢ７−Ｈ１内の特定の残基は、それらの突然変異がＦＡＣＳにより少なくとも５０％の結合低下が起こった場合、またはＥＬＩＳＡにより少なくとも１桁の低下が起こった場合にのみ、リガンド−受容体の相互作用に重要であるとみなした。
【０３２２】
これらの残基の約半数が突然変異すると、ｍＰＤ−１に対する結合が著しく消失した。特に、ｍＢ７−ＤＣ残基のＥ７１、Ｉ１０５、Ｄ１１１およびＫ１１３が、ｍＰＤ１に対する結合に重要であることが確認された。ｍＢ７−Ｈ１では、確認された残基はＦ６７、Ｉ１１５、Ｋ１２４およびＩ１２６であった。ｍＢ７−ＤＣにおける残基Ｓ５８、ならびにｍＢ７−Ｈ１におけるＥ５８、Ａ６９およびＣ１１３の突然変異は、ＥＬＩＳＡにより判定した場合、ｍＰＤ−１に対する結合を増強した。従って、これらの残基は受容体−リガンド相互作用に少なくとも近接しているはずであり、ある程度の置換耐性を持つだけでなく、結合相互作用に最適化されている可能性がある。
【０３２３】
また、ヒトＢ７−ＤＣの変異体を、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析を用い、ＰＤ−１に対する結合に関して検定した。ｈＢ７−ＤＣ残基Ｋ１１３およびＤ１１１の突然変異は、ＰＤ−１に対する結合に関して重要であることが確認された。
【０３２４】
【表１】
2013512251.tif 000082
【０３２５】
【表２】
2013512251.tif 000083
【０３２６】
実施例２：Ｂ７−ＤＣ−ＩｇはＰＤ−１との結合に関してＢ７−Ｈ１と競合する
まず、Ｂ７−Ｈ１−Ｉｇをアロフィコシアニン（ＡＰＣ）と結合させた。種々の濃度の非標識Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇを、まず、ＰＤ−１を構成的に発現するＣＨＯ細胞系統とともにインキュベートした後、このプローブおよび細胞混合物にＢ７−Ｈ１−Ｉｇ−ＡＰＣを加えた。図１は、加えた非標識Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ競合物の濃度（ｘ軸）の関数としての、Ｂ７−Ｈ１−Ｉｇ−ＡＰＣの中央蛍光強度（ＭＦＩ）（ｙ軸）を示す。非標識Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇの濃度が上昇するにつれ、ＣＨＯ細胞に結合するＢ７−Ｈ１−Ｉｇ−ＡＰＣの量は減り、このことはＢ７−ＤＣがＰＤ−１との結合に関してＢ７−Ｈ１と競合することを示す。
【０３２７】
実施例３：シクロホスファミドとＢ７−ＤＣ−Ｉｇの組合せは腫瘍特異的記憶細胞傷害性Ｔリンパ球を生成する
９〜１１週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスに、１．０×１０５のＣＴ２６結腸直腸腫瘍細胞を皮下移植した。腫瘍移植１０日後に、マウスに１００ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドを与えた。Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ処置を１日後の１１日目に開始した。マウスに、１００μｇのＢ７−ＤＣ−Ｉｇ、１週間に２用量、４週間で合計８用量の処置を施した。ＣＴＸ＋Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ処置計画を施したマウスの７５％で４４日目に定着腫瘍が根絶されたが、対照のＣＴＸ単独群のマウスは総て腫瘍増殖の結果死に至ったか、または腫瘍がＩＡＣＵＣにより認可されたサイズを超えたことから安楽死させた。
【０３２８】
上記の実験から定着したＣＴ２６結腸直腸腫瘍が根絶されたマウスに、４４日目と７０日目に１×１０５のＣＴ２６細胞を再負荷した。再負荷からの腫瘍増殖は見られず、それらのマウスがシクロホスファミドとＢ７−ＤＣ−Ｉｇの組合せ処置から長期の抗腫瘍免疫を発達させたことが示唆される。ビヒクル対照群のマウスは総て腫瘍を発達させた。このことから、定着腫瘍に対するこの処置の有効性およびＢ７−ＤＣ−Ｉｇ組合せ処置が腫瘍抗原に対して記憶応答をもたらしたことが証明された。
【０３２９】
上記の実験から定着したＣＴ２６結腸直腸腫瘍が根絶されたマウスに、４４日目に２．５×１０５のＣＴ２６細胞を再負荷した。７日後、マウス脾臓を単離した。マウス脾細胞をゴルジ遮断薬(BD BioScience)の存在下、５または５０μｇ／ｍＬのオボアルブミン（ＯＶＡ）またはＡＨ１ペプチドで６時間パルス処理した。ＣＤ８＋／ＩＦＮγ＋Ｔ細胞を評価することにより、記憶Ｔエフェクター細胞を分析した。
【０３３０】
図２Ａ〜Ｃは、シクロホスファミド（ＣＴＸまたはサイトキサン（登録商標））とＢ７−ＤＣ−Ｉｇの組合せがマウスにおいて定着ＣＴ２６腫瘍（結腸癌腫）の根絶をもたらしたという実験結果を示す。図２Ａは、１０日目に１００ｍｇ／ｋｇのＣＴＸで処置したマウスにおける腫瘍負荷後の日数に対する腫瘍容積（ｍｍ３）を示し、図２Ｂは、１０日目にＣＴＸで処置した１日後にＢ７−ＤＣ−Ｉｇの投与を開始したマウスにおける腫瘍負荷後の日数に対する腫瘍容積（ｍｍ３）を示す。各群の各ラインは１個体のマウスを表す。黒い矢印はＢ７−ＤＣ−Ｉｇ投与を示す。図２Ｃは、２Ａおよび２Ｂのマウスの平均腫瘍容積を示す。
【０３３１】
図３は、ＣＴＸとＢ７−ＤＣ−Ｉｇの組合せがマウスにおいて定着ＣＴ２６腫瘍（結腸癌腫）の根絶をもたらし、ＣＴ２６の再負荷から保護したという実験結果を示す。ＣＴＸおよびＢ７−ＤＣ−Ｉｇで処置し、腫瘍接種４４日後に腫瘍増殖が見られないことが判明したマウスに腫瘍を再負荷した。その後、このマウスに７０日後にも再負荷を行った。これらの再負荷マウスに１００日までに腫瘍増殖を示したものは無かった。
【０３３２】
実施例４：ＣＴＸおよびＢ７−ＤＣ−Ｉｇ処置は腫瘍特異的記憶ＣＴＬをもたらした
図４は、ＣＴＸおよびＢ７−ＤＣ−Ｉｇ処置が腫瘍特異的記憶ＣＴＬの生成をもたらしたことを示す。上記のように、ＣＴＸおよびＢ７−ＤＣ−Ｉｇ処置後に定着ＣＴ２６皮下腫瘍が根絶されたマウスに、５０日目にＣＴ２６細胞を再負荷した。７日後、脾細胞を単離し、無関連のペプチドであるオボアルブミンまたはＣＴ２６特異的ペプチドであるＡＨ１のいずれかでパルスした。細胞をまず抗ＣＤ８抗体で染色した後、抗ＩＦＮγ抗体で細胞内染色を行い、その後、ＦＡＣＳ分析を行った。
【０３３３】
図５は、マウスにおける定着ＣＴ２６腫瘍の根絶に対する、ＣＴＸと組み合わせた種々の用量のＢ７−ＤＣ−Ｉｇの効果を示す。９〜１１週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスに１．０×１０５のＣＴ２６細胞を皮下移植した。９日目に、マウスに１００ｍｇ／ｋｇのＣＴＸを注射した。１０日目に始め、マウスを３０、１００または３００μｇのＢ７−ＤＣ−Ｉｇで週２回、４週間処置した。腫瘍増殖を週に２回測定した。
【０３３４】
実施例５：Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ投与計画におけるＣＴＸは腫瘍微小環境においてＰＤ−１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の有意な低下をもたらす
図６Ａ〜Ｃは、ＣＴＸおよびＢ７−ＤＣ−Ｉｇ投与計画でマウスを処置すると腫瘍微小環境においてＰＤ−１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の有意な低下をもたらされるという実験結果を示す。９〜１１週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスに１×１０５のＣＴ２６細胞を皮下移植した。９日目に、マウスに１００ｍｇ／ｋｇのＣＴＸをＩＰ注射した。１０日目に始め、マウスを１００μｇのＢ７−ＤＣ−Ｉｇで週２回、４週間処置した。ビヒクル注射対照、ＣＴＸ単独、ＣＴＸ＋Ｂ７−ＤＣ−ＩｇまたはＢ７−ＤＣ−Ｉｇ単独の４群とした。Ｔ細胞分析のため、１１日目（ＣＴＸの２日後）、１６日目（ＣＴＸの７日後）および２２日目（ＣＴＸの１３日後）の試験から４個体のマウスを取り出した。図６Ａは、ＣＴＸ＋Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ処置群では、ＣＴＸ注射の２日後に、ＰＤ−１＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞が若干減少したことを示す。図６Ｂは、ＣＴＸ＋Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ処置群およびＢ７−ＤＣ−Ｉｇ単独群で、ＣＴＸ注射の７日後に、ＰＤ−１＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞が有意に減少したことを示す。図６Ｃは、ＣＴＸ注射の１３日後に、ＣＴＸ＋Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ処置群では、ＰＤ−１＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞が有意に減少し、Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ単独群では若干減少したことを示す。
【０３３５】
図７は、Ｂ７−ＤＣ−ＩｇがＰＤ−１とＢ７−Ｈ１の相互作用を遮断することによりどのように免疫抑制を打破するかの概略図を示す。Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇは、消耗したＴ細胞上で発現されるＰＤ−１と相互作用してＢ７−Ｈ１の結合を妨げることができ、ＩＦＮγ産生細胞を増加させることができる。さらに、Ｂ７−ＤＣ−ＩｇとＰＤ−１の結合はＰＤ−Ｌ２の結合を妨げ、腫瘍部位または病原体感染領域においてＴｒｅｇ細胞を減少させることができる。
【０３３６】
実施例６：カニクイザルにおける薬物動態学
方法および材料
いくつかの標準的な毒性および免疫毒性エンドポイント（すなわち、ケージの隅にいるかどうかの観察、体重、臨床検査、血液検査、サイトカイン放出、および免疫表現型検査）を組み込んだパイロット試験を、Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇを用いたカニクイザルで行った。２匹のサル（雄１匹、雌１匹）に１０ｍｇ／ｋｇのＢ７−ＤＣ−ＩｇをＩＶボーラス注射により投与した。注射２時間後および４時間後、ならびにその後２８日間、１日に２回、ケージの隅にいるかどうかを記録したところ、異常は見られなかった。体重は投与前と試験１日目、８日目および１５日目に測定したが、違いは見られなかった（図８）。
【０３３７】
【表３】
2013512251.tif 000084
【０３３８】
結果
図８は、非線形回帰分析を用いて入力したＩＶボーラスを用いた２コンパートメントオープン薬物動態モデルへのデータの当てはめを示す。Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇの半減期は５〜１０日であった。
【０３３９】
実施例７  ネズミＢ７−ＤＣ−Ｉｇの単回投与の薬物動態
方法および材料
単回Ｐ投与後の健康マウスの血漿中のネズミＢ７−ＤＣ−Ｉｇレベルを評価するために試験を行った。予備試験において、０日目に、ＢＡＬＢ／ｃマウスに１００、３００または９００μｇのネズミＢ７−ＤＣ−Ｉｇ（１．５、５および４５ｍｇ／ｋｇに相当する）をＩＰ注射し、種々の時点でＥＬＩＳＡにより、全身循環中のネズミＢ７−ＤＣ−Ｉｇレベルを分析した。
【０３４０】
結果
ＥＬＩＳＡアッセイの結果を図９に示す。消失半減期は９００μｇ用量では３．５日、２つの低用量では６．０日と評価された。上記の用量応答および頻度試験とともに、ネズミＢ７−ＤＣ−Ｉｇの血漿レベルをネズミＢ７−ＤＣ−ＩｇのＩＰ投与６時間後（Ｔｍａｘに相当）と次の投与の直前（Ｔｍｉｎに相当）に測定した。この試験を２回行った。
【０３４１】
実施例８  ネズミＢ７−ＤＣ−Ｉｇの反復投与薬物動態
方法および材料
実施例７にまとめた用量レベルおよび頻度試験とともに、ネズミＡＭＰ−２２４の血漿濃度を、２回の独立した試験で、各投与の前後に測定した。
【０３４２】
結果
図１０および表４に示されるように、ネズミＡＭＰ−２２４の血漿濃度は投与される用量に依存する。ほとんどの群で、ネズミＡＭＰ−２２４の濃度は、１週間に２回投与した場合に各投与に伴って上昇する。
【０３４３】
【表４】
2013512251.tif 000085
【図１】
2013512251.tif 000086
【図２Ａ】
2013512251.tif 000087
【図２Ｂ】
2013512251.tif 000088
【図２Ｃ】
2013512251.tif 000089
【図５】
2013512251.tif 000090
【図６】
2013512251.tif 000091
【図８】
2013512251.tif 000092
【図９】
2013512251.tif 000093
【図１０】
2013512251.tif 000094
【図３】
2013512251.tif 000095
【図４】
2013512251.tif 000096
【図７】
2013512251.tif 000097
【配列表】
2013512251000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年10月2日(2012.10.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
別の実施態様では、該免疫調節性ポリペプチドは、ヒトアミノ酸配列：
【化１９】
2013512251.tif 000098
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
シグナル配列は成熟タンパク質では除去されると考えられる。さらに、産生中に宿主からのタンパク質の分泌を増強するために他の生物由来のシグナルペプチドを使用することができると考えられる。配列番号２０：
【化２０】
2013512251.tif 000099
は、シグナル配列を含まない配列番号１９のヒトアミノ酸配列を示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
シグナル配列は成熟タンパク質では除去される。さらに、産生中に宿主からのタンパク質の分泌を増強するために他の生物由来のシグナルペプチドを使用することができる。配列番号２５：
【化２５】
2013512251.tif 000100
は、シグナル配列を含まない配列番号２４の非ヒト霊長類アミノ酸配列を示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
シグナル配列は成熟タンパク質では除去される。さらに、産生中に宿主からのタンパク質の分泌を増強するために他の生物由来のシグナルペプチドを使用することができる。配列番号３０：
【化３０】
2013512251.tif 000101
は、シグナル配列を含まない配列番号２９のネズミアミノ酸配列を示す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
使用可能なネズミＰＤ−Ｌ２の好適な断片の例としては、限定されるものではないが、以下のもの：
配列番号５６の
【化３３】
2013512251.tif 000102
が挙げられる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
使用可能なヒトＰＤ−Ｌ２の好適な断片の例としては、限定されるものではないが、以下のもの：
配列番号６０の
【化３５】
2013512251.tif 000103
が挙げられる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
２．ＰＤ−Ｌ１細胞外ドメイン
一実施態様では、変異体ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは細胞外ドメインの全部または一部を含む。ヒトＰＤ−Ｌ１の代表的な細胞外ドメインのアミノ酸配列は、
【化３９】
2013512251.tif 000104
と８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の配列同一性を有し得る。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０５】
ネズミＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインは以下のアミノ酸配列：
【化４０】
2013512251.tif 000105
を有する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
３．Ｂ７．１細胞外ドメイン
ａ．ネズミＢ７．１細胞外ドメイン
一実施態様では、該免疫調節性ポリペプチドは、ネズミＢ７．１の細胞外ドメインまたはその断片を含む。該免疫調節性ポリペプチドは、
【化４１】
2013512251.tif 000106
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
別の実施態様では、該免疫調節性ポリペプチドは、ネズミアミノ酸配列：
【化４２】
2013512251.tif 000107
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
シグナル配列は成熟タンパク質では除去される。さらに、産生中に宿主からのタンパク質の分泌を増強するために、他の生物由来のシグナルペプチドを使用することができる。
配列番号３７：
【化４３】
2013512251.tif 000108
は、シグナル配列を含まない配列番号３６のネズミアミノ酸配列を示す。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
別の実施態様では、該免疫調節性ポリペプチドは、ネズミＢ７．１のＩｇＶドメインを含む。このポリペプチドは、
【化４４】
2013512251.tif 000109
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
該免疫調節性ポリペプチドは、ネズミアミノ酸配列：
【化４５】
2013512251.tif 000110
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る（Ｂ７．１Ｖとも呼ばれる）。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
ｂ．ヒトＢ７．１細胞外ドメイン
一実施態様では、該免疫調節性ポリペプチドは、ヒトＢ７．１の細胞外ドメインまたはその断片を含む。該免疫調節性ポリペプチドは、
【化４６】
2013512251.tif 000111
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
別の実施態様では、該免疫調節性ポリペプチドは、ヒトアミノ酸配列：
【化４７】
2013512251.tif 000112
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１４】
シグナル配列は成熟タンパク質では除去される。さらに、産生中に宿主からのタンパク質の分泌を増強するために、他の生物由来のシグナルペプチドを使用することができる。配列番号４２は、シグナル配列を含まない配列番号４１のヒトアミノ酸配列を示す。
【化４８】
2013512251.tif 000113
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１５】
別の実施態様では、該免疫調節性ポリペプチドは、１〜１０個のＣ末端アミノ酸を欠く配列番号４１または配列番号４２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
別の実施態様では、該免疫調節性ポリペプチドは、ヒトＢ７．１のＩｇＶドメインを含む。このポリペプチドは、
【化４９】
2013512251.tif 000114
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１７】
該免疫調節性ポリペプチドは、ヒトアミノ酸配列：
【化５０】
2013512251.tif 000115
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る（Ｂ７．１Ｖとも呼ばれる）。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２２】
４．ＰＤ−１細胞外ドメイン
ａ．ヒトＰＤ−１細胞外ドメイン
一実施態様では、該免疫調節性ポリペプチドは、ヒトＰＤ−１の細胞外ドメインまたはその断片を含む。推定される細胞外ドメインは、Ｓｗｉｓｓｐｏｒｔ受託番号Ｑ１５１１６のアミノ酸２１付近〜アミノ酸１７０付近に由来する配列を含む。該免疫調節性ポリペプチドは、ヒトアミノ酸配列：
【化５５】
2013512251.tif 000116
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７４】
一実施態様では、ヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域は、
【化５９】
2013512251.tif 000117
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有する核酸によりコードされる。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７５】
配列番号４６によりコードされるヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域は以下のアミノ酸配列：
【化６０】
2013512251.tif 000118
を有する。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７６】
別の実施態様では、ヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のＦｃドメインは、
【化６１】
2013512251.tif 000119
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有する。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７７】
別の実施態様では、ネズミ免疫グロブリンＣγ２ａ鎖のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域は、
【化６２】
2013512251.tif 000120
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有する核酸によりコードされる。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７８】
配列番号４９によりコードされるネズミ免疫グロブリンＣγ２ａ鎖のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域は以下のアミノ酸配列：
【化６３】
2013512251.tif 000121
を有する。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９０】
他のペプチド／ポリペプチドリンカードメイン
他の好適なペプチド／ポリペプチドリンカードメインは、天然または非天然ペプチドまたはポリペプチドを含む。ペプチドリンカー配列は少なくともアミノ酸２個の長さである。好ましくは、ペプチドまたはポリペプチドドメインは可動性のペプチドまたはポリペプチドである。「可動性リンカー」とは、その可動性リンカーの不在下で連結された２つのポリペプチドが持つものよりも、それにより連結された２つのポリペプチドの回転自由度を高めるペプチド結合により連結された２以上のアミノ酸残基を含むペプチドまたはポリペプチドを意味する。このような回転自由度は、可動性リンカーによって各接近標的抗原に連結された２以上の抗原結合部位をより有効とする。可動性ペプチド／ポリペプチドの例としては、限定されるものではないが、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号５１）、Ａｌａ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号５２）、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３（配列番号５３）および（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）４（配列番号５４）が挙げられる。さらなる可動性ペプチド／ポリペプチド配列も当技術分野でよく知られている。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９８】
代表的なネズミＰＤ−Ｌ２融合タンパク質は、
【化６４】
2013512251.tif 000122
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有する核酸によりコードされる。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９９】
配列番号５５によりコードされているネズミＰＤ−Ｌ２融合タンパク質は以下のアミノ酸配列：
【化６５】
2013512251.tif 000123
を有する。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２００】
シグナル配列を含まない配列番号５６のネズミＰＤ−Ｌ２融合タンパク質のアミノ酸配列は、
【化６６】
2013512251.tif 000124
である。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０１】
代表的なヒトＰＤ−Ｌ２融合タンパク質は、
【化６７】
2013512251.tif 000125
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有する核酸によりコードされる。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０２】
配列番号５８によりコードされているヒトＰＤ−Ｌ２融合タンパク質は以下のアミノ酸配列：
【化６８】
2013512251.tif 000126
を有する。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０３】
シグナル配列を含まない配列番号５９のヒトＰＤ−Ｌ２融合タンパク質のアミノ酸配列は
【化６９】
2013512251.tif 000127
である。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０４】
代表的な非ヒト霊長類（カニクイザル）ＰＤ−Ｌ２融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列：
【化７０】
2013512251.tif 000128
を有する。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０５】
シグナル配列を含まない配列番号６１の非ヒト霊長類（カニクイザル）ＰＤ−Ｌ２融合タンパク質のアミノ酸配列は、
【化７１】
2013512251.tif 000129
である。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０７】
代表的なヒトＰＤ−Ｌ１融合タンパク質は、
【化７２】
2013512251.tif 000130
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有する核酸によりコードされる。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０８】
配列番号６３によりコードされているヒトＰＤ−Ｌ１融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列：
【化７３】
2013512251.tif 000131
を有する。
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０９】
シグナル配列を含まない配列番号６４のヒトＰＤ−Ｌ１融合タンパク質のアミノ酸配列は、
【化７４】
2013512251.tif 000132
である。
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１０】
代表的なネズミＰＤ−Ｌ１融合タンパク質は、
【化７５】
2013512251.tif 000133
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有する核酸によりコードされる。
【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１１】
配列番号６６によりコードされているネズミＰＤ−Ｌ１融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列：
【化７６】
2013512251.tif 000134
を有する。
【手続補正４０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１３】
代表的なＰＤ−１融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列：
【化７７】
2013512251.tif 000135
を有する。
【手続補正４１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１４】
代表的な非ヒト霊長類（カニクイザル）ＰＤ−１融合タンパク質は、
【化７８】
2013512251.tif 000136
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有する核酸によりコードされる。
【手続補正４２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１５】
配列番号６９によりコードされている非ヒト霊長類（カニクイザル）ＰＤ−１融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列：
【化７９】
2013512251.tif 000137
を有する。
【手続補正４３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１７】
代表的なＢ７．１融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列：
【化８０】
2013512251.tif 000138
を有する。
【手続補正４４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体に、その被験体の腫瘍部位または病原体感染領域においてＩＦＮγ産生細胞を増加させ、かつ、Ｔｒｅｇ細胞を減少させるのに有効な量の免疫調節薬剤を投与することを含んでなる、免疫応答を調節する方法。
【請求項２】
被験体に、その被験体の腫瘍部位または病原体感染領域においてＴｈ１７細胞の数を増加させ、またはＩＬ−１７産生のレベルを高めるのに有効な量の免疫調節薬剤を投与することを含んでなる、免疫応答を調節する方法。
【請求項３】
被験体に、その被験体の腫瘍部位または病原体感染領域においてＰＤ−１陽性細胞の数を減少させるのに有効な量の免疫調節薬剤を投与することを含んでなる、免疫応答を調節する方法。
【請求項４】
免疫調節薬剤が内因性ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２のＰＤ−１への結合を同時に遮断する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
免疫調節薬剤がＰＤ−１と結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
免疫調節薬剤が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７．１、それらの融合タンパク質、ならびにＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の双方と特異的に結合する二重特異性抗体からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
免疫調節薬剤が、in vivo投与後３か月以内にＰＤ−１またはそのリガンドと結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
２種類以上の免疫調節薬剤が投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記感染が、慢性ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、マイコプラズマ感染、寄生虫感染であり、感染の急性期に毒素により媒介される疾患を惹起し、またはその感染はＴ細胞応答の低下を特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ウイルス感染が、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン−バーウイルス、フィロウイルス、ヒトパピローマウイルス、エプスタイン−バーウイルス、インフルエンザウイルス、呼吸器系合胞体ウイルス、脳炎ウイルス、デング熱ウイルス、および乳頭腫ウイルスによる感染である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
寄生虫感染がマラリアまたはリーシュマニアである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
細菌感染が、結核菌（Mycobacterium tuberculosis)、炭疽菌(Bacillus anthracis)、ブドウ状球菌(Staphylococcus)、リステリア(Listeria)、およびクラミジア・トラコマチス(Clamydia trachomatis)からなる群から選択される細菌により引き起こされる、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
疾病に対する免疫応答を増強するために疾病抗原を前記免疫調節薬剤と組み合わせて投与することをさらに含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
免疫調節薬剤がＰＤ−１リガンドの融合タンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＰＤ−１リガンドが、野生型ＰＤ−１リガンドに比べてＰＤ−１に対する親和性が増強されている変異体ＰＤ−１リガンドである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
融合タンパク質が、ＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメイン、またはＰＤ−１と結合し得るその断片を含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
融合タンパク質が配列番号６０のアミノ酸配列を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記免疫調節薬剤とともに、免疫調節剤、Ｔｒｅｇの機能を消耗させる、または阻害する薬剤、および共刺激分子からなる群から選択される付加的活性剤を投与することをさらに含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
付加的活性剤が、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの機能を消耗させる、または阻害する薬剤である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの機能を消耗させる、または阻害する薬剤が、シクロホスファミドである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ＡＰＣを、ＡＰＣにおけるＰＤ−１シグナル伝達を阻害、低減もしくは遮断するか、または罹患もしくは感染細胞の排除を増強するのに有効な量の免疫調節薬剤と接触させることを含んでなる、抗原提示細胞の機能を増強するための請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
腫瘍が、肉腫、黒色腫、リンパ腫、神経芽腫および癌腫からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
被験体の腫瘍部位または病原体感染領域においてＩＦＮγ産生細胞を増加させ、かつ、Ｔｒｅｇ細胞を減少させる免疫調節薬剤を、１以上の疾病抗原と組み合わせて含んでなる、組成物。
【請求項２４】
被験体の腫瘍部位または病原体感染領域においてＩＦＮγ産生細胞を増加させ、かつ、Ｔｒｅｇ細胞を減少させる免疫調節薬剤を、ワクチンと組み合わせて含んでなる、組成物。
【国際調査報告】
2013512251.tif 000139
2013512251.tif 000140
2013512251.tif 000141
2013512251.tif 000142