(57)【要約】  本発明は、トバモウイルス、特に２つの商業的に重要な病原性トバモウイルス、すなわちキュウリ緑斑モザイクウイルス（ＣＧＭＭＶ）およびキュウリ果実斑点モザイクウイルス（ＣＦＭＭＶ）に対する全般的な抵抗性を付与するキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）ゲノム中の遺伝子座に遺伝的に連鎖し、該遺伝子座を同定することができる分子マーカーに関する。本発明はさらに、トバモウイルス、特に２つの商業的に重要な病原性トバモウイルス、すなわちキュウリ緑斑モザイクウイルス（ＣＧＭＭＶ）およびキュウリ果実斑点モザイクウイルス（ＣＦＭＭＶ）に対する抵抗性を有するキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）、植物、植物の部分および果実を提供するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性キュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）を提供するための方法であって、
ａ）第一のキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）を選択する工程であって、前記選択する工程が、キュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性を付与する遺伝子エレメントの存在を、前記第一のキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）のゲノムを鋳型として使用する分子増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）アッセイにおいて分子増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）プライマーである配列番号１および配列番号２を使用して２４５〜２４７塩基対の核酸増幅断片を検出することによって確かめることを含む工程と、
ｂ）同定した前記キュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性を付与する遺伝子エレメントを第二のキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）に導入し、それによって前記第二のキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）にキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性を付与する工程であって、前記導入する工程が、前記第二のキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）のゲノムを鋳型として使用する分子増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）アッセイにおいて分子増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）プライマーである配列番号１および配列番号２を使用して２４５〜２４７塩基対の核酸増幅断片を検出することを含む工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記方法が、前記第二のキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）をキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）に暴露することを含む工程（ｃ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸増幅断片が２４６ｂｐである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
キュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）におけるキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性を付与する遺伝子エレメントの存在を確かめるための配列番号１および／または配列番号２の使用。
【請求項５】
キュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性を付与する遺伝子エレメントを含むキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性キュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）であって、前記キュウリ植物における前記キュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性を付与する遺伝子エレメントの存在が、前記キュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）のゲノムを核酸増幅のための鋳型として用いる分子増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）アッセイにおいて分子増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）プライマーである配列番号１および配列番号２を使用して２４５〜２４７塩基対の核酸増幅断片によって特徴づけられる、キュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性キュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）。
【請求項６】
前記核酸増幅断片が２４６塩基対である、請求項５に記載の植物。
【請求項７】
アクセッション番号４１６３５の下でＮＣＩＢＭに寄託されているキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）である、請求項５または６に記載の植物。
【請求項８】
アクセッション番号４１６３５の下でＮＣＩＢＭに寄託されているキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）である、キュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性キュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか一項に記載の植物に由来する植物、植物の部分、組織、細胞および／または種子。
【請求項１０】
キュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）にキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性を与えるための、請求項５〜９のいずれか一項に記載の植物、植物の部分、組織、細胞および／または種子の使用。
【請求項１１】
前記抵抗性が、キュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性およびキュウリ緑斑モザイクウイルス（ＣＧＭＭＶ）抵抗性である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記抵抗性が、キュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性、キュウリ緑斑モザイクウイルス（ＣＧＭＭＶ）抵抗性およびキュウリ果実斑点モザイクウイルス（ＣＦＭＭＶ）抵抗性である、請求項１０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性キュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）、キュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性キュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）を提供するための方法、該方法において使用するための分子マーカー、ならびに本発明のキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性キュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）に由来するまたは該植物から生じる植物、植物の部分、組織、細胞および／または種子に関する。
【背景技術】
【０００２】
キュウリ植物、すなわち植物種ククミス・サティヴス（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）の植物は、メロンおよびスカッシュ（ｓｑｕａｓｈ）のような科の成員も含むウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）に属する。この植物の食用果実は一般にキュウリと称される。
【０００３】
キュウリは通常、円筒形で表皮が緑色の果実であり、約９６％が水分から成る。以前から栽培されてきた、Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．とも称されるキュウリ植物は、世界中で重要な園芸作物である。キュウリは一般に未熟期に収穫され、ピクルス産業または生鮮市場のために使用され得る。
【０００４】
キュウリ葉脈黄化ウイルスは、ＣＶＹＶとも略され、ポティウイルス科（Ｐｏｔｙｖｉｒｉｄａｅ）のイポモウイルス属（Ｉｐｏｍｏｖｉｒｕｓ）に属する。一般に長さ７４０〜８００ｎｍ、幅１５〜１８ｎｍの棒状粒子を備える、かなり不安定なウイルスである。ＣＶＹＶのウイルス核酸は二本鎖ＲＮＡから成ることが報告されている。
【０００５】
このウイルスは、主としてウリ科の植物に限定される狭い宿主範囲を有する。この科は、キュウリ、スカッシュ（カボチャ（ｐｕｍｐｋｉｎｓ）を含む）、メロンおよびスイカのような経済的に重要な作物を含む。ＣＶＹＶ感染は一般にキュウリの生産において重要な問題であるが、スカッシュ、ズッキーニ、スイカおよびメロンの生産も影響を受ける。
【０００６】
ＣＶＹＶは一般に、タバココナジラミ（Ｂｒｅｍｉｓｉａ  ｔａｂａｃｉ）というコナジラミによって伝播される。ＣＶＹＶ感染植物は一般に、葉脈の黄化または葉脈の透化および成長阻害を示し、これに対応する収穫量の減少を伴う。ＣＶＹＶ感染はまた、植物の死を引き起こし得る。
【０００７】
従って、作物が汚染された場合、ＣＶＹＶは作物において壊滅的な影響を及ぼし得る。例えば、コナジラミのいない環境で苗を育てること、または、例えば農薬を用いた処理による感染の予防は、一般に費用がかかり、および／または環境に対して好ましくない。加えて、これらの方法は必ずしも満足のいく結果を与えるとは限らない。
【０００８】
キュウリ緑斑モザイクウイルスは、ＣＧＭＭＶとも略され、ウリ科植物の深刻な病害を引き起こすトバモウイルス属のＲＮＡウイルスである。ＣＧＭＭＶの株は、英国および欧州から最初に報告された。ウイルスはすべての組織中に存在し、ウイルスは労働者の手、衣類、ナイフおよび他の道具によって急速に伝播され、加えて種子伝染性である。ウイルス汚染を防除するために種子の熱処理が一般的に使用される。ＣＧＭＭＶはまた、表面の水を介して拡散することができる。葉の黄化、斑紋および下方への屈曲の病徴が報告されているが、おそらく最も重要なのは中等度から重度の果実の斑紋と変形に関する報告である。果実のかかる斑紋および変形は、感染した作物を即座に商品にならないものにし得る。
【０００９】
キュウリ緑斑モザイクウイルスは、おそらくキュウリ作物に感染する最も広範で有名なトバモウイルスである。ＣＧＭＭＶは、オランダ、スペイン、ギリシャおよびインドなどのキュウリ生産地域において世界的な問題である。収穫量の損失は１５％にも上り得る。
【００１０】
キュウリ果実斑点モザイクウイルスは、ＣＦＭＭＶとも略され、キュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）に重大な経済的損害を生じさせるトバモウイルスの別の科の成員である。キュウリ果実斑点モザイクウイルス（ＣＦＭＭＶ）感染の病徴は、一般に比較的進んだ成長段階で果実および頂葉で最初に認識される。葉の病徴は、重度のモザイク、葉脈緑帯および黄斑を含む。完全に発育した植物は、植物の崩壊を招く重度の萎凋症状を示す場合がある。温室内での急速なウイルスの広がりは、深刻な作物損失をもたらし得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
キュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）におけるキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）によって引き起こされる経済的損害を考慮して、キュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性キュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）を提供することが、数ある目的の中でも特に、本発明の１つの目的である。
【００１２】
さらに、キュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性キュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）を提供するための方法および手段を提供することが、数ある目的の中でも特に、本発明の１つの目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記の目的は、数ある目的の中でも特に、付属の特許請求の範囲の請求項１で述べる方法により、本発明によって達成される。
【００１４】
具体的には、上記の目的は、数ある目的の中でも特に、キュウリ葉脈黄化ウイルスまたはＣＶＹＶに抵抗性のキュウリ植物またはＣｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．を提供するための方法であって、
ａ）第一のキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）を選択する工程であり、前記選択が、キュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性を付与する遺伝子エレメントの存在を、前記第一のキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）のゲノムを鋳型として用いる分子増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）アッセイにおいて分子増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）プライマーである配列番号１および配列番号２を使用して、２４５〜２４７塩基対、好ましくは２４６塩基対の核酸増幅断片を検出することによって確認することを含む工程と、
ｂ）同定したキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性を付与する遺伝子エレメントを第二のキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）に導入し、それによって前記第二のキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）にキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性を付与する工程であり、前記導入が、前記第二のキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）のゲノムを鋳型として用いる分子増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）アッセイにおいて分子増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）プライマーである配列番号１および配列番号２を使用して２４５〜２４７塩基対、好ましくは２４６塩基対の核酸増幅断片を検出することを含む工程と
を含む方法により、本発明によって達成される。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明によれば、プライマー配列番号１は、核酸配列：
５’−ＧＡＣ  ＴＧＣ  ＧＴＡ  ＣＣＡ  ＡＴＴ  ＣＧＴ−３’
を含み、
プライマー配列番号２は、核酸配列：
５’−ＧＡＴ  ＧＡＧ  ＴＣＣ  ＴＧＡ  ＧＴＡ  ＡＣＡ  Ｃ−３’
を含む。
【００１６】
キュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性を付与する遺伝子エレメントの存在を示す本発明の核酸増幅断片は、一般に当技術分野では、本発明のキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性を付与する遺伝子エレメントに遺伝的に連鎖する増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）マーカーと称され、本明細書では交換可能に、２４５〜２４７塩基対、好ましくは２４６塩基対の核酸サイズを有するマーカーＥ２２／Ｍ４８−Ｆ−２４６と称される。
【００１７】
２４５〜２４７塩基対、好ましくは２４６塩基対の本発明の核酸増幅断片、およびそれにより本発明のキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性を付与する遺伝子エレメントは、ＰＣＲなどの植物ゲノム材料のための任意の適切な増幅技術を用いて同定または検出することができる。
【００１８】
特に好ましい実施形態では、２４５〜２４７塩基対、好ましくは２４６塩基対の本発明の核酸増幅断片、およびそれにより本発明のキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性を付与する遺伝子エレメントは、当技術分野で分子増幅断片長多型（ＡＬＦＰ、Ｖｏｓ，Ｐ．，Ｈｏｇｅｒｓ，Ｒ，Ｂｌｅｅｋｅｒ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．１９９５．ＡＦＬＰ：ａ  ｎｅｗ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２３（２１）：４４０７−４４１４；Ｚａｂｅａｕ，Ｍ  ａｎｄ  Ｐ．Ｖｏｓ．１９９３．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ．欧州特許庁、公開第ＥＰ０５３４８５８Ａ１号）と称される核酸増幅技術を用いて同定または検出される。
【００１９】
増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）は、オランダ国のＫｅｙｇｅｎｅによって１９９０年代前半に開発された、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく遺伝子フィンガープリンティング技術である。簡単に述べると、ＡＦＬＰは、制限酵素を用いてゲノムＤＮＡを消化し、続いて制限断片の末端に相補的二本鎖アダプターを連結する。この制限断片の一部を、次に、アダプターおよび制限部位断片に相補的な２つのプライマーを使用して増幅する。この断片は、オートラジオグラフィー法または蛍光法によって変性ポリアクリルアミドゲル上で可視化される。
【００２０】
このことは、一般に、異なる大きさの多数の核酸増幅断片の可視化をもたらす。例えば、罹病性植物および抵抗性植物から得た核酸増幅断片を比較することにより、マーカーとも称される、両方の＋表現型の間を識別できる核酸増幅断片を同定できる。
【００２１】
本発明の場合、本発明の抵抗性遺伝子座に遺伝的に連鎖し、それを同定することができる、ＡＦＬＰマーカーＥ２２／Ｍ４８−Ｆ−２４６と称される特異的ＡＦＬＰマーカーが、２４５〜２４７ｂｐ、好ましくは２４６ｂｐの核酸増幅断片の存在によって同定された。このマーカーは、多くの識別不能の他のＡＦＬＰ増幅断片の中で、抵抗性個体においてのみ存在し、罹病性個体には存在しなかった。
【００２２】
第一のキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）において本発明のキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性を付与する遺伝子エレメントを同定するための、ＡＦＬＰプライマー配列番号１および配列番号２を使用したキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）のＡＦＬＰ分析は、本発明のＡＦＬＰマーカーＥ２２／Ｍ４８−Ｆ−２４６とサイズの相違が小さな第二の核酸増幅断片を生成できることに留意すべきである。本発明によれば、このより大きな核酸増幅断片は、本発明のキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性を付与する遺伝子エレメントに遺伝的に連鎖せず、それを同定することができない。
【００２３】
言い換えると、本発明の第一のキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）は、ＡＦＬＰおよびＡＦＬＰプライマー配列番号１および配列番号２を使用して分析した場合、示された大きさの本発明のＡＦＬＰ  Ｅ２２／Ｍ４８−Ｆ−２４６マーカーを生成しなければならないが、加えて、より大きなサイズ、すなわち２４８〜２５０ｂｐ、例えば２４８塩基対の第二の核酸増幅断片も生成することができる。
【００２４】
本発明による第一のキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）は、本発明のキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性を付与する遺伝子エレメントによって付与され、かつ、上述した核酸増幅断片によって同定できる、キュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）に対する抵抗性表現型を有する任意のキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）であり得る。
【００２５】
本発明の第一のキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）の選択は、本質的に、分子生物学技術を用いたこの植物における本発明のキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性を付与する遺伝子エレメントの検出を含む。
【００２６】
第一のキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）において本発明のキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性を付与する遺伝子エレメントを同定、確認または検出した後、その遺伝子エレメントを第二おキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）に導入し、それによって前記第二のキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）にキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性を付与する。
【００２７】
好ましくは、キュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性を付与する遺伝子エレメントの導入は、第一のキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）と第二のキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）を従来のように交配し、その後第二のキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）と戻し交配することのような従来の育種法を含む。しかし、かかる従来の育種法は、好ましくは第二のキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）における本発明の抵抗性遺伝子座の維持を確かめるために、分子生物学技術を用いて支援される。
【００２８】
好ましい実施形態では、第二のキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）は、キュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）罹病性の商業品種である。本発明のキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性遺伝子座をこの植物に導入することにより、他の商業的に価値のある高品質の遺伝子型および表現型特性を維持しつつ、経済的価値の高いキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）が提供される。
【００２９】
最も好ましい実施形態では、本発明の方法は、第一のキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）のキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性遺伝子座が追加された第二のキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）の遺伝子型を有するキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）を提供する。
【００３０】
本発明の方法の好ましい実施形態では、本発明の方法は、前記第二のキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）をキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）に暴露し、それによって前記ウイルスに対する抵抗性を確かめることを含む工程（ｃ）を含む。
【００３１】
本発明のキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性遺伝子座を同定するための配列番号１および配列番号２を含むプライマーの能力を考慮して、本発明の１つの態様は、キュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）においてキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性を付与する遺伝子エレメントの存在を確かめるための配列番号１および／または配列番号２の使用に関する。
【００３２】
本発明の方法によって得られる植物は、キュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）に対して抵抗性であり、従って、キュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）罹病性植物に比べて、高い収穫量を提供することなどの経済的利点を有する。
【００３３】
従って、本発明は、もう１つの態様によれば、キュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性を付与する遺伝子エレメントを含むキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性キュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）に関し、前記キュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）における前記キュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性を付与する遺伝子エレメントの存在は、前記キュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）のゲノムを核酸増幅のための鋳型として用いる分子増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）アッセイにおいて分子増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）プライマー配列番号１および配列番号２を使用して、２４５〜２４７塩基対、好ましくは２４６塩基対の核酸増幅断片によって特徴づけられる。
【００３４】
本発明のこの態様の好ましい実施形態では、植物は、その種子がアクセッション番号ＮＣＩＢＭ４１６３５の下でＮＣＩＢＭに寄託されているキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）である。
【００３５】
特に好ましい実施形態によれば、本発明は、その種子がアクセッション番号ＮＣＩＢＭ４１６３５の下でＮＣＩＢＭに寄託されているキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）である、キュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性キュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）に関する。
【００３６】
本発明は植物それ自体に限定されるものではなく、本発明の植物に由来する植物、植物の部分、組織、細胞および／または種子、ならびに他のキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）にキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性を与えるためのそれらの使用にも関することが理解されるべきである。
【００３７】
上記使用の好ましい態様によれば、キュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性を提供するまたは示すことに加えて、本発明の植物、またはそれから得られるもしくはそれから生じる植物もしくは部分は、キュウリ緑斑モザイクウイルス（ＣＧＭＭＶ）抵抗性も提供し、好ましくはキュウリ緑斑モザイクウイルス（ＣＧＭＭＶ）抵抗性およびキュウリ果実斑点モザイクウイルス（ＣＦＭＭＶ）抵抗性も提供する。
【実施例１】
【００３８】
［キュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性を付与する遺伝子エレメント］
（イントロダクション）
この実施例では、キュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性を付与する遺伝子エレメントに遺伝的に連鎖する質的形質遺伝子座（ＱＴＬ）を、オランダ国ヴァーヘニンゲン（Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ）のＫｅｙｇｅｎｅ  Ｎ．Ｖ．，によって実施されたバルクＱＴＬ分析（ＢＱＡ）を用いて抵抗性キュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）において同定した。キュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性についてのマーカーを開発するための集団を選択した。合計９６のＡＦＬＰプライマーの組合せを、「極端な表現型」を示す個体を含む２つのプールでスクリーニングした。その後、５つの候補マーカーを抵抗性個体および罹病性個体で検証した。
【００３９】
（マーカーの同定および検証）
植物の葉材料を得た。被検集団を提供するための１１３６６系統×ＯＫ５６１集団、供与親１１３６６系統の近交系および集団の親系統。ＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩ／ＭｓｅＩ鋳型を作製した。プライマーの組合せＥ１４／Ｍ５９を用いて植物の試験フィンガープリントを作製した。
【００４０】
（ＢＳＡおよび個体での検証）
合計９６のプライマーの組合せを、１０の「極端な抵抗性」個体を含むプールおよび１０の「極端な罹病性」個体を含むプールでスクリーニングすることによってＢＱＡを実施した。このスクリーニングは以下の候補マーカーの同定をもたらした。
Ｅ１４／Ｍ５８  Ｆ  １６９  Ｐ２、および
Ｅ２２／Ｍ４８  Ｆ  ２４８／２４６（２対立遺伝子）
その後これらのマーカーを検証した。この検証に基づき、同定された候補マーカーがトバモウイルス抵抗性に連鎖することが判明した。
【００４１】
（集団での候補マーカーの検証）
９６のプライマーの組合せをスクリーニングし、その後マーカーを検証した後、１つの推定上のＱＴＬが同定できた。同定されたＱＴＬが実際に別個のＱＴＬであるかどうかを判定するため、連鎖解析を実施した。マーカー（Ｅ１４／Ｍ５８  Ｆ  １６９  Ｐ２および２対立遺伝子マーカーＥ２２／Ｍ４８  Ｆ  ２４８／２４６）を、集団からの４６のさらなる個体でスクリーニングした。
【００４２】
マーカーデータセットを作製し、検証のマーカーデータセットと統合させた。この解析に基づき、４つのマーカーは実際に１つのＱＴＬに連鎖すると結論することができた。
【００４３】
ＷｉｎＱＴＬＣａｒｔｏｇｒａｐｈｅｒを用いたマーカーの分析
表現型と遺伝子型との間の相関を判定するため、ソフトウエアパッケージＷｉｎＱＴＬＣａｒｔｏｇｒａｐｈｅｒを使用してマーカーデータセットを解析した。単一マーカー分析（ＳＭＡ）のために１２のＬＯＤ値を計算した。区間マッピング（ＩＭ）のために、表現型データに関して１０００回の並べ替えを実施することによって９５％信頼性閾値を計算し、ＬＯＤ０．９と決定した。ＬＯＤ値およびパーセンテージ説明分散（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ  ｅｘｐｌａｉｎｅｄ  ｖａｒｉａｎｃｅｓ）をこのＱＴＬに関して計算した（ＬＯＤ：９、説明分散：４９．５）。
【００４４】
（結論）
キュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性についてのＱＴＬを同定するため、ＢＱＡを実施した。合計９６のプライマーの組合せを、１０の「極端な抵抗性」個体のバルクおよび１０の「極端な罹病性」個体のバルクでスクリーニングした。候補マーカー（そのうちの１つは２対立遺伝子である）を、「極端な抵抗性」個体および「極端な罹病性」個体ならびに集団の他の個体で検証した。ＢＱＡアプローチを使用することによってＱＴＬ領域を同定した。ＴｅｓｔＰＣ（約５つのマーカー）に基づき、抵抗性供与親１１３６６系統の３０の近交系において異質性は同定されなかった。
【実施例２】
【００４５】
［分子マーカーを利用したキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性キュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）の同定］
（分子分析）
罹病性、すなわち、ウイルス感染の１つ以上の病徴を示す個体キュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）および抵抗性個体キュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）の両方から、標準的なプロトコルを用いてゲノム材料を単離した。
【００４６】
その後、適切な制限酵素（ＥｃｏＲＩ／ＭｓｅＩ）を用いてこのゲノム材料を消化し、アダプターを連結した後、プライマー対、５−ＧＡＣ  ＴＧＣ  ＧＴＡ  ＣＣＡ  ＡＴＴ  ＣＧＴ−３’および５’−ＧＡＴ  ＧＡＧ  ＴＣＣ  ＴＧＡ  ＧＴＡ  ＡＣＡ  Ｃ−３’またはプライマー対、５’−ＧＡＣ  ＴＧＣ  ＧＴＡ  ＣＣＡ  ＡＴＴ  ＣＡＴ−３’および５−ＧＡＴ  ＧＡＧ  ＴＣＣ  ＴＧＡ  ＧＴＡ  ＡＣＧ  Ｔ−３’を使用したＡＦＬＰ核酸増幅に供した。生じた増幅産物を、サイズ決定のためにゲル電気泳動によって分離した。個々のキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）のゲノム中のＡＦＬＰマーカーの存在を、不在（−）または存在（＋）として検出した。
【００４７】
具体的には、ＡＦＬＰマーカーＥ１４／Ｍ５８−Ｆ−１６９（本発明には含まれない、プライマー対、５’−ＧＡＣ  ＴＧＣ  ＧＴＡ  ＣＣＡ  ＡＴＴ  ＣＡＴ−３’および５−ＧＡＴ  ＧＡＧ  ＴＣＣ  ＴＧＡ  ＧＴＡ  ＡＣＧ  Ｔ−３’）が存在する場合は、約１６９ｂｐのバンドが認められた。ＡＦＬＰマーカーＥ２２／Ｍ４８−Ｆ−２４８（本発明には含まれない、プライマー対、５−ＧＡＣ  ＴＧＣ  ＧＴＡ  ＣＣＡ  ＡＴＴ  ＣＧＴ−３’および５’−ＧＡＴ  ＧＡＧ  ＴＣＣ  ＴＧＡ  ＧＴＡ  ＡＣＡ  Ｃ−３’）が存在する場合は、約２４８ｂｐのバンドが認められた。約２４６ｂｐの推定サイズを有するＡＦＬＰマーカーＥ１４／Ｍ４８−Ｆ−２４６（本発明に含まれる、プライマー対、５’−ＧＡＣ  ＴＧＣ  ＧＴＡ  ＣＣＡ  ＡＴＴ  ＣＧＴ−３’および５’−ＧＡＴ  ＧＡＧ  ＴＣＣ  ＴＧＡ  ＧＴＡ  ＡＣＡ  Ｃ−３’）は、抵抗性表現型と遺伝的に相関した。結果を以下の表１に要約する。
【００４８】
【表１】
2013505002.tif 000002
【００４９】
表１は、試験したすべてのキュウリ植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）におけるキュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性表現型が、分子ＡＦＬＰマーカーＥ２２／Ｍ４８−Ｆ−２４６の存在と遺伝的に連鎖することを明らかに示す。従って、このマーカーを検出することは、キュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性を付与する遺伝子エレメントまたはＱＴＬの存在を示す。
【実施例３】
【００５０】
キュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性を付与する遺伝子エレメントの存在を示すマーカーＥ２２／Ｍ４８−Ｆ−２４６は、付加的に、キュウリ緑斑モザイクウイルス（ＣＧＭＭＶ）抵抗性を付与する遺伝子エレメントおよび／またはキュウリ果実斑点モザイクウイルス（ＣＦＭＭＶ）抵抗性を付与する遺伝子エレメントの存在を示す
キュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）抵抗性植物を、キュウリ緑斑モザイクウイルス（ＣＧＭＭＶ）抵抗性およびキュウリ果実斑点モザイクウイルス（ＣＦＭＭＶ）抵抗性に関しても試験した。驚くべきことに、試験したすべてのＣＶＹＶ抵抗性植物が、ＯＫ５６１×１１３６６系統分離ＤＨ集団についての以下に提示する表２に示すように、キュウリ葉脈黄化ウイルス（ＣＶＹＶ）、キュウリ緑斑モザイクウイルス（ＣＧＭＭＶ）およびキュウリ果実斑点モザイクウイルス（ＣＦＭＭＶ）に対する明白な多面的抵抗性も示した。示されているすべての抵抗性（Ｒで示す）植物は、マーカーＥ２２／Ｍ４８−Ｆ−２４６に対して陽性であり、マーカーＥ１４／Ｍ５８−Ｆ−１６９およびＥ２２／Ｍ４８−Ｆ−２４８について陰性であった。逆もまた同様であり、示されているすべての罹病性（Ｓで示す）植物は、マーカーＥ２２／Ｍ４８−Ｆ−２４６について陰性であり、マーカーＥ１４／Ｍ５８−Ｆ−１６９およびＥ２２／Ｍ４８−Ｆ−２４８について陽性であった。
【００５１】
【表２】
2013505002.tif 000003
【００５２】
表中のスコアは、ＣＧＭＭＶ、ＣＦＭＭＶおよびＣＶＹＶ抵抗性の間の連鎖が明白であり、従って多面的効果であることを示す。
【００５３】
【表３】
2013505002.tif 000004
【００５４】
表３は、組換え体が全く認められなかったので、ＣＧＭＭＶ抵抗性系統は常にＣＶＹＶ抵抗性であるが、ＣＶＹＶ系統は必ずしもＣＧＭＭＶ抵抗性ではないことを明らかに示す。従って、マーカーＥ２２／Ｍ４８−Ｆ−２４６は、ＣＶＹＶおよびＣＧＭＭＶ抵抗性の両方を示すが、ＣＧＭＭＶ抵抗性およびマーカーＥ２２／Ｍ４８−Ｆ−２４６に連鎖しない他のＣＶＹＶ抵抗性が存在する。
【国際調査報告】
2013505002.tif 000005