(57)【要約】  本発明は、ヒトＩＩ型コラーゲンに対する抗体、ヒトＩＩ型コラーゲン抗体をコードするポリペプチド及びポリヌクレオチド又はこれらの断片、並びに、これらの製造及び使用方法に関する。
2013542722.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖可変領域（ＶＨ領域）及び軽鎖可変領域（ＶＬ領域）を含む、ヒトＩＩ型コラーゲンに結合する単離モノクローナル抗体又はその断片であって、前記ＶＨ領域は、
ｉ．配列番号８、１４及び２０；
ｉｉ．配列番号９、１５及び２１；
ｉｉｉ．配列番号９、１５及び２２；
ｉｖ．配列番号９、１５及び２３；
ｖ．配列番号９、１５及び２４；
ｖｉ．配列番号９、１５及び２５；
ｖｉｉ．配列番号９、１５及び２６；
ｖｉｉｉ．配列番号９、１５及び２７；
ｉｘ．配列番号９、１５及び２８；
ｘ．配列番号１０、１６及び２９；
ｘｉ．配列番号１１、１７及び３０；
ｘｉｉ．配列番号１２、１８及び３１；又は
ｘｉｉｉ．配列番号１３、１９及び３２、に示されるような重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）配列を含み、並びに、
前記ＶＬ領域は、
ｘｉｖ．配列番号３３、４２及び４６；
ｘｖ．配列番号３４、４２及び４７；
ｘｖｉ．配列番号３５、４３及び４８；
ｘｖｉｉ．配列番号３６、４４及び４９；
ｘｖｉｉｉ．配列番号３７、４２及び５０；
ｘｉｘ．配列番号３８、４２及び５１；
ｘｘ．配列番号３５、４４及び５２；
ｘｘｉ．配列番号３９、４２及び５３；
ｘｘｉｉ．配列番号４０、４５及び５４；又は
ｘｘｉｉｉ．配列番号４１、４２及び５５、に示されるような軽鎖ＣＤＲ  １、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）配列を含む、単離モノクローナル抗体又はその断片。
【請求項２】
ＶＨ領域及びＶＬ領域を含む、ヒトＩＩ型コラーゲンに結合する単離モノクローナル抗体又はその断片であって、前記ＶＨ領域は、配列番号５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７又は６８に示される配列を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ領域は、配列番号６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、５又は７に示される配列を有するアミノ酸配列を含む、単離モノクローナル抗体又はその断片。
【請求項３】
ＶＨ領域及びＶＬ領域を含む、ヒトＩＩ型コラーゲンに結合する単離抗体であって、前記ＶＨ領域は、配列番号９、１５及び２８に示されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列を含み、前記ＶＬ領域は、配列番号３９、４２及び５３に示されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列を含む、単離抗体。
【請求項４】
ＶＨ領域及びＶＬ領域を含む、ヒトＩＩ型コラーゲンに結合する単離モノクローナル抗体又はその断片であって、前記ＶＨ領域は、配列番号１１、１７及び３０に示されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列を含み、前記ＶＬ領域は、配列番号３４、４２及び４７に示されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列を含む、単離モノクローナル抗体又はその断片。
【請求項５】
前記抗体がＦａｂ断片を含む、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項６】
配列番号５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７又は６８に示されるアミノ酸配列を含む、単離抗体重鎖可変領域。
【請求項７】
配列番号６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５又は７６に示されるアミノ酸配列を含む、単離抗体軽鎖可変領域。
【請求項８】
請求項６に記載の抗体重鎖可変領域をコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項７に記載の抗体軽鎖可変領域をコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１１に記載の宿主細胞を培養する工程と、前記宿主細胞によって産生された抗体を回収する工程とを含む、ヒトＩＩ型コラーゲンに結合する抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ヒトＩＩ型コラーゲン抗体、抗ヒトＩＩ型コラーゲン抗体又はこれらの断片をコードするポリペプチド及びポリヌクレオチド、並びにこれらの製造及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節軟骨の破壊を引き起こす疾患及び状態は、特に老年人口層を考慮した場合に、公衆衛生上の重大な問題を提起している。関節リウマチ（ＲＡ）及び変形性関節症（ＯＡ）などの関節炎における、関節軟骨の劣化には、多数の機序が関与している。ＲＡは最も一般的な炎症性関節炎であり、女性では３％及び男性では１％が発症する。ＯＡ、すなわち、非炎症性関節症は、最も一般的な関節症であり、早期退職及び機能障害の原因としては心血管疾患に次いで二番目である。
【０００３】
関節の慢性疾患のほとんどの処置は概して全身性のものである。関節を標的とした局所的薬物投与は、有効性の増加、副作用の減少、投与スケジュールの改善、及び原価削減などのいくつかの利点を有し得る。
【０００４】
糖質コルチコイド、ヒアルロン酸注射溶液、ＮＳＡＩＤ又は他の小分子などの現行の局所治療薬は、関節に注射した場合に、半減期が比較的短く、かつ全身に分布する（Ｇｅｒｗｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ，５８：２２６〜４２，２００６；Ｌｉｎｄｅｎｈａｙｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，３５：３５５〜６３，１９９７）。治療薬は、関節に対する標的剤とカップリングさせて関節に定着させることができる。（Ｒｏｔｈｅｎｆｌｕｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ７：２４８〜５４，２００８；ＷＯ０５／０９７０７３；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．７，０６７，１４４）。しかしながら、この治療法では、治療薬は場合によりリポソームなどの送達賦形剤と共に関節内注射する必要があり、これにより治療の複雑さが増し及び関節表面が磨耗する可能性が出てくる。
【０００５】
したがって、効率的に送達を行い、かつ送達後に関節において治療薬を定着させるために、更なる賦形剤を開発する必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一態様は、重鎖可変領域（ＶＨ領域）及び軽鎖可変領域（ＶＬ領域）を含む、ヒトＩＩ型コラーゲンに結合する単離モノクローナル抗体又はその断片であり、ＶＨ領域は、
ｉ．配列番号８、１４及び２０；
ｉｉ．配列番号９、１５及び２１；
ｉｉｉ．配列番号９、１５及び２２；
ｉｖ．配列番号９、１５及び２３；
ｖ．配列番号９、１５及び２４；
ｖｉ．配列番号９、１５及び２５；
ｖｉｉ．配列番号９、１５及び２６；
ｖｉｉｉ．配列番号９、１５及び２７；
ｉｘ．配列番号９、１５及び２８；
ｘ．配列番号１０、１６及び２９；
ｘｉ．配列番号１１、１７及び３０；
ｘｉｉ．配列番号１２、１８及び３１；又は
ｘｉｉｉ．配列番号１３、１９及び３２、に示されるような重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）配列を含み、並びに、
ＶＬ領域は、
ｘｉｖ．配列番号３３、４２及び４６；
ｘｖ．配列番号３４、４２及び４７；
ｘｖｉ．配列番号３５、４３及び４８；
ｘｖｉｉ．配列番号３６、４４及び４９；
ｘｖｉｉｉ．配列番号３７、４２及び５０；
ｘｉｘ．配列番号３８、４２及び５１；
ｘｘ．配列番号３５、４４及び５２；
ｘｘｉ．配列番号３９、４２及び５３；
ｘｘｉｉ．配列番号４０、４５及び５４；又は
ｘｘｉｉｉ．配列番号４１、４２及び５５、に示されるような軽鎖ＣＤＲ  １、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）配列を含む。
【０００７】
本発明の別の態様は、ＶＨ領域及びＶＬ領域を含む、ヒトＩＩ型コラーゲンに結合する単離モノクローナル抗体又はその断片であり、ＶＨ領域は、配列番号５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７又は６８に示される配列を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、５又は７に示される配列を有するアミノ酸配列を含む。
【０００８】
本発明の別の態様は、ＶＨ領域及びＶＬ領域を含む、ヒトＩＩ型コラーゲンに結合する単離抗体であり、ＶＨ領域は、配列番号９、１５及び２８に示されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号３９、４２及び５３に示されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列を含む。
【０００９】
本発明の別の態様は、ＶＨ領域及びＶＬ領域を含む、ヒトＩＩ型コラーゲンに結合する単離モノクローナル抗体又はその断片であり、ＶＨ領域は、配列番号１１、１７及び３０に示されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号３４、４２及び４７に示されるようなＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列を含む。
【００１０】
本発明の別の態様は、配列番号５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７又は６８に示されるアミノ酸配列を含む単離抗体重鎖可変領域である。
【００１１】
本発明の別の態様は、配列番号６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５又は７６に示されるアミノ酸配列を含む単離抗体軽鎖可変領域である。
【００１２】
本発明の別の態様は、本発明の抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域をコードする単離ポリヌクレオチドである。
【００１３】
本発明の別の態様は、少なくとも１つの本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。
【００１４】
本発明の別の態様は、本発明のベクターを有する宿主細胞である。
【００１５】
本発明の別の態様は、本発明の宿主細胞を培養する工程と、宿主細胞によって産生された抗体を回収する工程と、を含む、ヒトＩＩ型コラーゲンに結合する抗体の製造方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】デノボｐＩＸライブラリの産生のためのヒトスキャフォールド。Ｃｈｏｔｈｉａに従い残基番号を付与した。ＣＤＲ配列には下線を付した。
【図２】ヒトＩＩ型コラーゲンに結合するＦａｂの重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列。野生型ヒトスキャフォールドとは異なる残基が示されている。Ｘは、野生型と比較した場合に、配列内で欠失している残基を示す。
【図３】ヒト及びラットＩ型及びＩＩ型コラーゲンに対するＦａｂの交差反応性。
【図４】ヒト軟骨に対する抗ＩＩ型コラーゲンＦａｂの結合。
【図５】変形性関節症の関節における抗ＩＩ型コラーゲンＦａｂの定着。*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１；対照ＣＮＴＯ  ４２３４との比較。ＣＮＴＯ  ３６３１の注射後１０分及び１時間の時点での計数（conut）は、読み取るには高過ぎた。
【図６】変形性関節症滑液における抗ＩＩ型コラーゲンＦａｂの定着。*Ｐ＜０．０５、**；Ｐ＜０．０１；対照ＣＮＴＯ  ４２３４との比較。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書に引用する、特許及び特許出願を含むがそれらに限定されない刊行物はすべて、それらがあたかも本明細書に完全に記載されているのとまったく同様に本願に援用するものである。
【００１８】
別段の規定がない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されている意味と同一の意味を有する。本明細書に記載されているのと同様又は同等のあらゆる組成物及び方法を本発明を実施又は試験するために使用することが可能であるが、代表的な組成物及び方法を本明細書に記載する。
【００１９】
用語「抗体」は、抗体全体及びそれらの任意の断片を包含する。抗体断片は、抗体重鎖又は軽鎖のいずれか由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）、可変領域、定常領域又はフレームワーク領域などといった、免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含む。抗体は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）2、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ又は二重特異性抗体であり得る。抗体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体、ヒト化抗体、若しくはヒト抗体、二量体、四量体、又は多量体であってもよい。上述の抗体断片の構造、並びに抗体及びその断片の調製及び使用技術は、当該技術分野において周知である（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ  １９８７〜２００１；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２nd  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９；Ｃｏｌｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ  １９９４〜２００１；Ｃｏｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ，１９９７〜２００１；Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５〜４９７，１９７５；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，８６：１００２９〜３３，１９８９；米国特許第４，８１６，５６７号）。例えば、マウスｍＡｂは、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７，１９７５のハイブリドーマ法によって製造することができる。キメラｍＡｂは、米国特許第４，８１６，５６７号に開示されている方法により、調製することができる。ヒト以外のドナー由来の免疫グロブリン（通常はマウス）から誘導されたＣＤＲと、１以上のヒト免疫グロブリンから誘導された、抗体分子のその他の免疫グロブリン領域とを有するヒト化ｍＡｂを、米国特許第５，２２５，５３９号に開示されるような当業者には周知の方法によって調製することができる。ヒト化に有用なヒトフレームワーク配列は当業者であれば関連するデータベースから選別することができる。場合により、ヒト化ｍＡｂには、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８６：１００２９〜１００３２，１９８９及びＨｏｄｇｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：４２１，１９９１に開示されているものなどの技術を用い、結合親和性が保存されるようフレームワーク支持残基を変化させるなどして、更なる改変を組み込むことができる。
【００２０】
ヒト以外の配列を全く有さない完全なヒトｍＡｂは、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６〜８５９，１９９４、Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５〜８５１，１９９６、及びＭｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６〜１５６，１９９７に参照される方法により、ヒト免疫グロブリンのトランスジェニックマウスから調製することができる。ヒトｍＡｂはまた、ファージディスプレイライブラリを元に、例えば、Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７〜８６，２０００；及びＫｒｅｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２５４：６７〜８４  ２００１に参照される技術によって調製及び最適化することができる。抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、及びｄＡｂ断片を、抗体の切断又は遺伝子組み換え操作により生成してもよい。例えば、ペプシンなどの酵素により抗体を処理することで、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片を生成することもできる。
【００２１】
免疫グロブリンは、重鎖の定常領域のアミノ酸配列をもとに、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つの大きなクラスに分類することができる。ＩｇＡ及びＩｇＧは、イソ型のＩｇＡ1、ＩｇＡ2、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4へと更に細かく分類される。
【００２２】
抗体の可変領域は、領域内に「抗原結合部位」が３つ存在している「フレームワーク」領域からなる。抗原結合部位は、様々な用語を使用して定義される：（ｉ）配列可変性に基づく相補性決定領域（ＣＤＲ）が、ＶＨ内に３つ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）及びＶＬ内に３つ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）存在する（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｋａｂａｔ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２：２１１〜２５０，１９７０；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）。（ｉｉ）「高頻度可変領域」すなわち「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」が、ＶＨ内に３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ内に３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）存在する。この領域は、抗体可変ドメインであり、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７，１９８７）により定義される構造中で、高頻度可変性を示す。他の用語としては、「ＩＭＧＴ−ＣＤＲ」（Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐａｒａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５〜７７，２００３）及び「特異性決定残基使用法（Specificity Determining Residue Usage）」（ＳＤＲＵ）（Ａｌｍａｇｒｏ，Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１７：１３２〜１４３，２００４）が挙げられる。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）は、抗原結合部位の標準化番号及び定義を提供する。各ＣＤＲ、ＨＶ、及びＩＭＧＴの表記間の対応についてはＬｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐａｒａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５〜７７，２００３に述べられている。
【００２３】
「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」は、可変領域において、抗原結合部位として定義されている配列以外の配列である。フレームワークは、通常、それぞれの可変領域において、３つの抗原結合部位のための骨格を生成する、４つの領域、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ３に分割される。抗原結合部位が上述のような種々の用語によって定義され得ることから、フレームワークの正確なアミノ配列は、抗原結合部位がどのように定義されるかによって異なる。
【００２４】
本明細書で使用するとき、用語「ヒトＩＩ型コラーゲンに結合する抗体」は、実施例２に記載の方法に従って１０μｇ／ｍＬのヒトＩＩ型コラーゲンでコーティングされたプレートを使用するＥＬＩＳＡアッセイにおいて、１μｇ／ｍＬ以下のＥＣ５０をもってヒトＩＩ型コラーゲンに結合する抗体を指す。
【００２５】
本明細書で使用するとき、用語「ヒトＩＩ型コラーゲン」又はｈｕＣｏｌＩＩは、軟骨から単離されたヒトＩＩ型コラーゲンを指す。ヒトＩＩ型コラーゲンは、プロコラーゲンα  Ｃｏｌ２Ａ１鎖（配列番号７９）として合成される。プロコラーゲン分子は、細胞外マトリックス中に分泌され、そこで原繊維を生成する。原繊維形成は、特異的なタンパク質分解酵素によるＣ−及びＮ−プロペプチドの除去を伴う。原繊維ｈｕｃｏｌＩＩのプロセシングは周知である。
【００２６】
用語「ベクター」は、生体系内で複製され得る、又はこうした系間を移動し得る、ポリヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは典型的に、生体系においてこれらのポリヌクレオチドの複製又は維持を促進するように機能する複製起点、ポリアデニル化シグナル又は選択マーカーなどの配列を含有する。このような生体系の例としては、細胞、ウイルス、動物、及び植物を挙げることができ、及びベクターを複製することのできる生物学的構成成分を利用して再構成された生体系を挙げることができる。ベクターを構成するポリヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子又はこれらのハイブリッド分子であってもよい。
【００２７】
「発現ベクター」という用語は、生体系又は再構成された生体系において、その発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドの翻訳を指示するために使用することができるベクターを意味する。
【００２８】
用語「ポリヌクレオチド」は、糖−リン酸骨格又は他の等価な共有結合様式により共有結合しているヌクレオチド鎖からなる分子を意味する。二本鎖及び一本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡが、ポリヌクレオチドの典型例である。
【００２９】
「ポリペプチド」又は「タンパク質」という用語は、ペプチド結合により連結されポリペプチドを生成する少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を意味する。５０個未満のアミノ酸からなる小さなポリペプチドは「ペプチド」と呼ばれる場合もある。
【００３０】
本明細書では、以下の通りの一般的なアミノ酸１文字表記及び３文字表記を用いる。
【００３１】
【表１】
2013542722.tif 000003
【００３２】
発明の構成
本発明は、ヒトＩＩ型コラーゲンに結合するモノクローナル抗体を提供する。これらの抗体は、研究試薬、診断試薬、及び賦形剤として有用であり、例えば、関節に治療薬を送達するための賦形剤として有用である。
【００３３】
本発明は、新規の抗原結合部位及びヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリに由来する免疫グロブリン鎖を提供する。
【００３４】
本発明の一実施形態は、重鎖可変領域（ＶＨ領域）及び軽鎖可変領域（ＶＬ領域）を含む、ヒトＩＩ型コラーゲンに結合する単離モノクローナル抗体又はその断片であり、表１に示すように、ＶＨ領域は、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）配列を含み、ＶＬ領域は、軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）配列を含む。
【００３５】
【表２】
2013542722.tif 000004
【００３６】
表１に示される重鎖及び軽鎖配列（配列番号８〜７６）において同類置換を有する抗体は、本発明の範囲内に包含される。同類置換は、抗体の特性に悪影響を与えないものであれば、フレームワーク領域内又は抗原結合部位内に存在させてよい。置換は、例えば安定性又は親和性といった抗体の特性を向上させるために行うことができる。同類置換により、このような修飾が行われた分子と類似した機能特性及び化学特性を有する分子が生成される。アミノ酸置換の例を表２に示す。更に、アラニン・スキャニング変異導入法としてこれまでに報告されているように（ＭａｃＬｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ．６４３：５５〜６７、１９９８；Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５：１〜２４、１９９８）、ポリペプチド内の任意の天然の残基をアラニンで置換することもできる。アミノ酸置換は、例えばＰＣＲによる変異導入（米国特許第４，６８３，１９５号）によって行うことができる。例えばランダム（ＮＮＫ）コドン又は例えば１１のアミノ酸（ＡＣＤＥＧＫＮＲＳＹＷ）をコードするＤＶＫコドンのような、非ランダムコドンを用い、周知の方法を使用して変異体のライブラリを作成することができる。得られた変異体は、実施例に記載の通りに、ヒトＩＩ型コラーゲンに対する結合性について特性評価することができ、又は、周知の方法を用い、安定性などの他の特性について特性評価することができる。
【００３７】
【表３】
2013542722.tif 000005
【００３８】
他の実施形態では、本発明は、ＶＨ領域及びＶＬ領域を含む、ヒトＩＩ型コラーゲンに結合する単離モノクローナル抗体又はその断片を提供し、ＶＨ領域は、配列番号５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７又は６８に示される配列を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、５又は７に示される配列を有するアミノ酸配列を含む。
【００３９】
実施例で説明する実施形態は、１つは重鎖に由来し、１つは軽鎖に由来する１対の可変領域を有しているが、当業者であれば代替的な実施形態は、重鎖又は軽鎖の可変領域を単独で有してもよいということを認識するであろう。単独の可変領域を用い、例えばヒトＩＩ型コラーゲンに対し結合能をもつ二重特異性の抗原結合断片を生成することができる第二の可変性領域について、スクリーニングを行うことができる。こうしたスクリーニングは、例えば国際公開第９２／０１０４７号に開示される、コンビナトリアルな調製を階層的に二重に行う手法を用い、ファージディスプレイ法によるスクリーニングにより実施できる。このアプローチでは、Ｈ鎖又はＬ鎖のいずれかのクローンを含む個別のコロニーを用いて、他方の鎖（Ｌ又はＨ）をコードするクローンの完全なライブラリに感染させ、得られた２鎖特異的抗原結合ドメインを上記に述べたようなファージディスプレイ法に基づいて選別する。
【００４０】
別の態様では、本発明は、重鎖については配列番号５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７又は６８、並びに、軽鎖については配列番号６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８及び７９で示されるようなアミノ酸配列を含む単離抗体重鎖及び軽鎖を提供する。
【００４１】
本発明の別の態様は、本発明の抗体又はその補体のいずれかをコードする単離ポリヌクレオチドである。特定の代表的なポリヌクレオチドを本明細書に開示するが、遺伝コードの縮重又は所与の発現系におけるコドンの好ましさを考慮すると、本発明の抗体をコードする他のポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドは、周知の方法により調製される。これらの方法としては、限定されるものではないが、天然資源からの単離（天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合）、あるいはオリゴヌクレオチドを用いる（すなわち部位特異的）変異導入による調製、ＰＣＲを用いる変異導入による調製、及び化学的遺伝子合成による調製が挙げられる。
【００４２】
本発明の代表的な抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ又はＩｇＭアイソタイプを有し得る。更に、本発明の抗体は、グリコシル化、異性化、又は脱グリコシル化などの反応によって、あるいはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分の付加（ペグ化）及び脂質化などの非天然の共有結合修飾などの反応によって翻訳後修飾してもよい。このような修飾は、生体内あるいは生体外で行われてもよい。例えば、本発明の抗体はポリエチレングリコールと複合（ＰＥＧ化）することによって薬物動態特性を向上させることができる。複合は当業者に既知の方法によって行うことができる。治療用抗体をＰＥＧと複合させると、機能は低下せずに薬物動態が向上されることが示されている。（Ｄｅｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８７：３８２〜３９０，２０００；Ｋｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  １５：４０９〜４１８，２００４；Ｌｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １６：１０６〜１１９，２００１；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１６：７６１〜７７０，２００３）。
【００４３】
本発明の抗体の薬物動態特性は、当業者に既知の技術によりＦｃ修飾を行うことで向上させることができる。抗体の「Ｆｃ」は、抗原に対する抗体の結合性に直接的には関与しないものの、種々のエフェクター機能を示す。抗体「Ｆｃ」は、周知の用語であり、抗体のパパイン開裂に基づいて定義される。抗体のＦｃは、補体活性化、Ｃ１ｑ結合、及びＦｃ受容体結合に応じたＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）及びＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）に直接関与する。補体活性化（ＣＤＣ）は、ＩｇＧ抗体のほとんどのサブクラスのＦｃに、補体因子Ｃ１ｑが結合することにより開始される。補体系に対する抗体の作用は具体的な条件によって異なるが、Ｃ１ｑへの結合は、Ｆｃ内の所定の結合部位により生じる。このような結合部位は、最先端技術において既知であり、例えば、Ｂｏａｋｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２８２：７４２〜４３，１９７９；Ｌｕｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：２５５５〜６０，１９８１；Ｂｒｕｎｈｏｕｓｅ  ａｎｄ  Ｃｅｂｒａ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：９０７〜１７，１９７９；Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２８８：３３８〜４４，１９８０；Ｔｈｏｍｍｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７：９９５〜１００４，２０００；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８〜８４，２０００；Ｈｅｚａｒｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７５：１２１６１〜６８，２００１；Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８６：３１９〜２４，１９９５；欧州特許第０３０７４３４号により報告されている。このような結合部位は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１及びＰ３２９である（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付与）。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３の抗体は、通常、補体活性化及びＣ１ｑ結合を示すが、一方、ＩｇＧ４は補体系を活性化せず、Ｃ１ｑに結合しない。
【００４４】
本発明の抗体は、定常鎖がヒト由来であるという点で特徴付けられる。このような定常鎖は周知であり、例えば、Ｋａｂａｔにより説明されている（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８，２１４〜１８，２０００を参照されたい）。例えば、有用なヒト重鎖定常領域は、配列番号７７を含む。例えば、有用なヒト軽鎖定常領域は、配列番号７８のκ−軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。
【００４５】
本発明の抗体は、約１０-6以下、１０-7以下、１０-8以下、１０-9以下、１０-10以下、１０-11以下又は１０-12Ｍ以下のＫdでヒトＩＩ型コラーゲンに結合し得る。ヒトＩＩ型コラーゲンに対する抗体の親和性は、任意の好適な方法を使用して実験により測定することができる。このような方法は、当業者に既知のＢｉａｃｏｒｅ又はＫｉｎＥｘＡ装置、ＥＬＩＳＡ又は競合的結合アッセイを利用し得る。
【００４６】
本発明の別の実施形態は、本発明のポリヌクレオチドを少なくとも１つ含むベクターである。本発明の重鎖及び軽鎖可変ドメインは、プロモーター、翻訳開始領域、定常領域、３’非翻訳領域、ポリアデニル化末端及び転写末端の配列と組み合わされて、発現ベクターコンストラクトを生成する。重鎖及び軽鎖発現コンストラクトは、単一ベクター内に組み合わせて、宿主細胞内に共導入、連続導入又は別個に導入し、その後、宿主細胞を融合して、両方の鎖を発現する単一宿主細胞を生成することができる。
【００４７】
本発明の別の実施形態は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。このような宿主細胞は、真核細胞、細菌細胞、植物細胞又は古細菌細胞であってよい。真核細胞の例としては、哺乳動物、昆虫、鳥類又は他の動物由来のものが挙げられる。哺乳動物真核細胞としては、ＳＰ２／０（ＡＴＣＣ（アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＣＲＬ−１５８１）、ＮＳ０（ＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ），Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ，ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６４６）及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８０）マウス細胞株などのハイブリドーマ又はミエローマなどの不死化細胞株が挙げられる。ヒトミエローマ細胞株の一例としては、Ｕ２６６（ＡＴＴＣ  ＣＲＬ−ＴＩＢ−１９６）が挙げられる。他の有用な細胞株としては、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−６１）、又はＤＧ４４などの、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞に由来するものが挙げられる。
【００４８】
本発明の別の実施形態は、本発明の宿主細胞を培養する工程と、宿主細胞によって産生された抗体を回収する工程と、を含む、ヒトＩＩ型コラーゲンに結合する抗体を製造する方法である。抗体を製造して精製する方法は、当該技術分野で周知である。
【００４９】
本発明の使用
本発明の抗体は、研究試薬として、並びに、関節などのヒトＩＩ型コラーゲンを発現する部位に対する治療薬分子の送達剤として、有用である。
【００５０】
変形性関節症、関節リウマチ、傷害による関節炎及びこれらに類するものなどの関節炎は、一般的な炎症状態であり、抗炎症性タンパク質及び治療薬分子を局所的送達及び関節定着させることで効果が得られるであろう。
【００５１】
関節定着性を改善する目的で、治療薬分子を本発明の抗体に結合させることもできる。治療薬分子は、タンパク質又は化合物であり得る。成長因子、サイトカイン及び抗炎症剤、コラーゲンの増殖及び修復を誘導するタンパク質、並びに、タンパク質分解による関節組織の破壊を阻止する小分子などが代表的な治療薬分子である。治療用タンパク質は、周知の組み換え方法を用い、本発明の抗コラーゲン抗体又はその断片と結合させて、融合タンパク質として生成することができる。例えば、治療用タンパク質のＮ末端は、アミド結合又はペプチドリンカーにより本発明の抗体のＣ末端に直接結合させることができる。代表的な融合コンストラクトは、例えば、米国特許第５１１６９６４号、同第５７０９８５９号、国際公開第０４／００２４１７号及び同第０５／０８１６８７号に記載されている。治療薬分子はまた、当該技術分野において周知の化学的架橋を用いて、例えば、ヒドラゾン又はセミカルバゾン結合により、本発明の抗体に結合させてもよい。
【００５２】
場合により、本発明の抗体は、治療薬分子と結合させて、活性成分として有効量の治療薬分子を製薬学的に許容され得るキャリア中に含有する製薬学的組成物として調製することもできる。用語「キャリア」は、活性化合物と共に投与される希釈剤、助剤、賦形剤、又は溶媒のことを指す。こうした医薬用賦形剤は、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などの、石油、動物、植物又は合成物由来の水及び油などの液体であってよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを使用することができる。これらの溶液は滅菌液であり、粒子状物質を含まない。これらの溶液は、従来の公知の滅菌法（例えば濾過）によって滅菌することができる。組成物には、生理学的条件に近づけるために必要とされるｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤などの製薬学的に許容され得る補助物質を含有させることができる。こうした製薬学的組成物に含まれる本発明の薬剤濃度は、重量にして約０．５％未満、通常は約１％又は少なくとも約１％から、最大で１５又は２０％までと大きく異なってよく、選択される投与方法に従って、主として必要とされる用量、液体の体積、粘度などに基づいて選択される。非経口的に投与可能な組成物を調製する方法は周知のものであり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」（１５ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）に、より詳細に記載されている。
【００５３】
本発明の抗体は、保存の際に凍結乾燥させ、使用前に好適なキャリアに溶解させることができる。この手法は、これまでに、従来の免疫グロブリン及びタンパク製剤に有効であることが示されており、周知の凍結乾燥及び溶解法を用いることができる。
【００５４】
ここで、以下の具体的及び非限定的な実施例を参照して、本発明を説明する。
【実施例】
【００５５】
（実施例１）
ＩＩ型コラーゲンに結合するｍＡｂの同定
ヒトＩＩ型コラーゲンに結合するＦａｂを、デノボｐＩＸファージディスプレイライブラリ（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３９７：３８５〜３９６，２０１０；国際公開第２００９０８５４６２（Ａ１）号；米国特許出願番号第１２／５４６８５０号）から選別した。ライブラリは、ヒト生殖系列ＶＨ遺伝子ＩＧＨＶ１−６９*０１、ＩＧＨＶ３−２３*０１、及びＩＧＨＶ５−５１*０１、並びにヒト生殖系列ＶＬκ遺伝子Ｏ１２（ＩＧＫＶ１−３９*０１）、Ｌ６（ＩＧＫＶ３−１１*０１）、Ａ２７（ＩＧＫＶ３−２０*０１）、及びＢ３（ＩＧＫＶ４−１*０１）を多様化させて生成した。完全なＶＨ及びＶＬドメインを構築するにあたって、ＩＧＨＶ遺伝子を、Ｈ３ループによりヒトＩＧＨＪ−４ミニ遺伝子で組み換え、ＩＧＫＶ遺伝子をＩＧＫＪ−１ミニ遺伝子により組み換えた。多様化に際し、重鎖及び軽鎖可変領域内の、タンパク質抗原及びペプチド抗原と高頻度に接していると同定されるＨ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３ループ周辺の対応する位置を選別した。選別した位置の配列多様性は、それぞれのＩＧＨＶ又はＩＧＬＶ遺伝子に含まれるＩＧＨＶ又はＩＧＬＶ生殖系列遺伝子ファミリーにおいて各位置に見られる残基に制限した。長さがアミノ酸７〜１４個分の単鎖〜中鎖型の合成ループを用い、Ｈ３ループにおける多様性をもたらした。Ｈ３ループにおけるアミノ酸分布は、ヒト抗体において観察されるアミノ酸変異を模倣するよう設計された。ライブラリ設計の詳細は、Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３９７：３８５〜３９６，２０１０に記載されている。生成したライブラリにおけるＶＨ  Ｈ１及びＨ２の多様性を表４に示す。表４はＨ３に関し、表５はＶＬ  Ｌ１、Ｌ２及びＬ３に関し示す。ライブラリを生成するために利用したスキャフォールドは、これらのヒトＶＨ及びＶＬ遺伝子由来に従って命名した。多様性をもたらすために構築し使用したＶＨ及びＶＬスキャフォールドの配列を、配列番号１〜７で示す。（３〜２３：配列番号１；１〜６９：配列番号２；５〜５１：配列番号３；Ｏ１２：配列番号４；Ｌ６：配列番号５；Ｌ２７：配列番号６；Ｂ３：配列番号７）（図１）。スクリーニングにあたって、３つの重鎖ライブラリを、４種の生殖系列軽鎖又は生殖系列軽鎖ライブラリと組み合わせ、２４のユニークなＶＨ：ＶＬの組み合わせを生成した。
【００５６】
【表４】
2013542722.tif 000006
*残基の番号付与はＫａｂａｔに従っている
【００５７】
Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）上に１０μｇ／ｍＬ（溶媒は１×コラーゲン希釈緩衝液（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ））で精製ヒトＩＩ型コラーゲン（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ、＃２０１５、３Ｍグアニジン、ＤＥＡＥ−セルロース及びＮａ2ＨＰＯで処理、０．５ｍｇ／ｍＬ溶液（溶媒は０．０５Ｍの酢酸））をコーティングして用い、ライブラリをパニングした。ライブラリを３％ミルク（溶媒はＴＢＳＴ）により室温にて１時間ブロッキングした。１００μＬの各ライブラリを重鎖と組み合わせて６種のＨＶ：ＨＬライブラリ対を生成し、ヒトＩＩ型コラーゲンでコーティングしかつプレブロッキング処理（３％ミルク（溶媒はＴＢＳＴ）により１時間）したプレートに入れた。１時間のインキュベーション後、ウェルをＴＢＳＴ及びＰＢＳでそれぞれ５回ずつ洗浄した。２００μＬのＭＣ１０６１  Ｆ’ｃｅｌｌ（ＯＤ600約１．０）をウェルに加え３７℃にて３０分おき、その後、感染した細胞を２ｘＹＴ（Ｃａｒｂ／Ｇｌｕ）プレート上に蒔き、
【００５８】
【表５】
2013542722.tif 000007
【００５９】
３７℃にて一晩静置した。一晩増殖させたコロニーをプレートからこすり取り、プレート当たり２ｍＬの２ｘＹＴ（Ｃａｒｂ／Ｇｌｕ／２０％グリセロール）に播種した。５０ｍＬの再懸濁したバクテリアを用い、２０ｍＬ培養物を２ｘＹＴ（Ｃａｒｂ）に播種し、バクテリアの残りを凍結した。培養物を３７℃にてＯＤ600  ０．５〜１．０まで増殖させ、その後、１ｍＬのヘルパーファージＶＣＳＭ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２００２５１）を培養液に約１０：１の感染多重度にて添加し、振盪せずに３７℃にて３０分にわたってインキュベートした。培養液にカナマイシン及びＩＰＴＧを添加し、３０℃にて一晩増殖させた。ファージを２％  ＰＥＧ／０．２５Ｍ  ＮａＣｌで沈殿させ、１ｍＬのＰＢＳに再懸濁した。ＰＥＧ沈殿させたファージの五分の一を使用して、パニングの次工程を行い、残りのファージは−２０℃にて保存した。
【００６０】
この選別サイクルを４回繰り返した。最後の選別サイクル後に、コロニーをこすり取って２ｍＬの２ｘＹＴ  Ｃａｒｂ／Ｇｌｕ／２０％グリセロールに播種し、１００μＬの細胞懸濁液を用いプラスミドＤＮＡを単離した。ｐＩＸをＮｈｅ１／ＳｐｅＩ消化及び単離ＤＮＡのセルフライゲーションにより切除した。ライゲーション後、ＤＮＡをエレクトロコンピテントＭＣ１０６１  Ｆ’ｃｅｌｌに電気穿孔し、２ｘＹＴ  Ｃａｒｂ／Ｇｌｕ上に播種し単一コロニーを生成させた。
【００６１】
【表６】
2013542722.tif 000008
*残基の番号付与はＫａｂａｔに従っている
【００６２】
（実施例２）
他のコラーゲンとのｃｏｌ  ＩＩ  ｍＡｂの交差反応性
最初のパニングから得られた、ヒトＩＩ型コラーゲンに結合するＦａｂを、ヒトＩ型、ＩＶ型及びＶ型コラーゲン、並びにラットＩ型及びＩＩ型コラーゲンとの交差反応性についてスクリーニングした。
【００６３】
Ｆａｂライセートの調製
ｐＩＸを切除した形質転換物からコロニーを採取し、２ｘＹＴ  Ｃａｒｂで増殖させた。翌日、５０μＬの飽和培養液を使用して、ウェル当たり４００μＬの２ｘＹＴ  Ｃａｒｂを含有させた発現プレートに播種し、このプレートで３７℃にて６時間にわたって増殖させた。１ｍＭのＩＰＴＧを添加してＦａｂ発現を誘導し、このプレートを３０℃にて一晩静置した。翌日、発現誘導を行ったＦａｂ培養液を２０００ｒｐｍにて１０分に遠心沈降させ、清澄なライセートを以降のアッセイに使用した。
【００６４】
ＥＬＩＳＡ
製造業者の指示に従い、Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、１０μｇ／ｍＬのヒトＩ型コラーゲン（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ）、ヒトＩＩ型コラーゲン（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ）、ラットＩ型コラーゲン（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ）、ラットＩＩ型コラーゲン（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ）で、又は５μｇ／ｍＬのヒトＩＶ型コラーゲン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）若しくはヒトＶ型コラーゲン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）で、又は１μｇ／ｍＬの抗Ｆｄ（結合部位）（すべて溶媒はＰＢＳ）でコーティングした。ウェルをＴＢＳＴで３回洗浄し、２００ｍＬの３％ミルク（溶媒はＴＢＳＴ）で１時間ブロッキングした。コーティングしたＥＬＩＳＡプレートのウェルに１００μＬのＦａｂライセートを加え、室温にて１時間インキュベートした。ウェルを３回洗浄し、その後、ＰＢＳで１：５０００希釈した１００μＬの抗κ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を添加した。これらのプレートを室温にて１時間にわたってインキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗浄し、ＢＭ化学発光ＥＬＩＳＡ基質（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）で発光させた。ヒトＩ型、ＩＶ型若しくはＶ型コラーゲン又はラットＩ型コラーゲンに結合せずに、ヒト及びラットのＩＩ型コラーゲンに結合したクローンを配列決定し、ユニークなクローンを更に特徴付けた。図３は、更なる特徴付けのために選別した１３のクローンについてのＥＬＩＳＡデータを示す。Ｆａｂの配列は、図２及び表１に示す。
【００６５】
（実施例３）
ヒト軟骨に対するＣｏｌ  ＩＩ  ｍＡｂの結合
Ｆａｂの小規模精製
２ｘＹＴ  Ｃａｒｂで（ただし、Ｆａｂ  ５５１−３の発現ではＴｕｒｂｏＢｒｏｔｈ（Ａｔｈｅｎａ  ＥＳ）を使用した）、大腸菌に１ｍＭのＩＰＴＧにより３０℃にて一晩Ｆａｂ発現を誘導した。発現誘導したバクテリアを４５００ｒｐｍで３０分遠心しペレット化し、この細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を添加した溶解緩衝液（２０ｍＭトリス（ｐＨ  ８．５）、３５０ｍＭのＮａＣｌ、７．５ｍＭのイミダゾール）に再懸濁し、マイクロフルイダイザーに２回通して破砕した。この細胞可溶化物に対し１０，０００ｒｐｍにて１０分の遠心処理を２回行い、清澄化した。溶解緩衝液で平衡化したＴａｌｏｎレジン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）２ｍＬを、清澄化させた可溶化物に添加した。各回毎に溶出緩衝液（１５０ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのトリス（ｐＨ  ８．５））を用い、５分間のインキュベートを２回行なって、結合していたＦａｂを溶出させ、２０ｍＭのトリス（ｐＨ  ８．５）で透析した。透析したＦａｂを、Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂（ＱＦＦ樹脂；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い更に精製し、実験に使用した。
【００６６】
軟骨結合アッセイ
ヒト軟骨を変形性関節症患者から得た（Ｎｏｒｔｈｌａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。まず軟骨を微粉砕し、プロテアーゼ阻害剤を添加したＰＢＳに懸濁し、これを懸濁液として４℃で保存した。軟骨に対する結合性を試験するために、３％ミルクを含有させた９７．５μＬのＴＢＳＴに、データ点当たり２．５μＬの軟骨懸濁液を添加し、混合液を室温にて１時間に振盪させた。真空マニホールドを用い、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  ＨＴＳプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、軟骨に対するＦａｂの結合性を試験した。簡潔には、予め湿らせたＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎプレートに１００μＬの懸濁液を加え、減圧して軟骨をウェルフィルターに沈着させ、その後、ウェルをＴＢＳＴで２回洗浄した。２．４μｇのＦａｂをそれぞれ１００μＬのＰＢＳウェルに溶解させたものをウェルに加え、室温にて１時間にわたってインキュベートした。ウェルをＴＢＳＴで３回洗浄した後、抗κ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）をウェルに加えた。１時間のインキュベーション後、ウェルをＰＢＳＴで洗浄し、ＢＭ化学発光ＥＬＩＳＡ基質（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を添加し、得られた軟骨断片の懸濁液を、発光検出するために黒色ウェルのＥＬＩＳＡプレートに移した。１３のＦａｂすべてが軟骨に対する結合性を示した（図４）。
【００６７】
（実施例４）
Ｃｏｌ  ＩＩに対するｍＡｂ親和性
ＥＬＩＳＡ
上述のＥＬＩＳＡアッセイを用い、Ｆａｂを選別するためのＥＣ５０値を得た。このアッセイでは、１０ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬの濃度範囲のＦａｂ溶液１００マイクロリットルをそれぞれウェルに加えた。ＥＣ５０値は表６に示す。
【００６８】
Ｂｉａｃｏｒｅ
ヒト及びラットのＩＩ型コラーゲンに対して標準的な方法を用い、Ｂｉａｃｏｒｅ結合動態試験を実施した（表６ｂ）。
【００６９】
【表７】
2013542722.tif 000009
【００７０】
【表８】
2013542722.tif 000010
【００７１】
（実施例５）
抗ＩＩ型コラーゲンｍＡｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏで関節に定着する。
２つの抗ＩＩ型コラーゲンＦａｂ（３２３−Ｇ１（ＣＮＴＯ  ３６３１）及び１６９−３１（ＣＮＴＯ  ４０９３）、並びに、細胞外マトリックス成分に結合しなかった対照ｍＡｂ（ＣＮＴＯ  ４２３４）をヨウ素標識し、半月板切除したラットの膝に注射して、コラーゲンに対するｍＡｂの結合性が、関節滞留時間にもたらす影響について評価した。Ｆａｂは、Ｎａ125Ｉ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）及びヨウ素−ＧＥＮチューブ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、同位体標識した。ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて遊離ヨウ素を除去し、Ａｍｉｃｏｎウルトラ遠心濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；１０，０００  ＭＷＣＯ）を用いてＦａｂを２．２ｍｇ／ｍＬに濃縮した。ヨウ素標識後、ＩＩ型コラーゲンに対する結合性についてＦａｂを試験したところ、ヨウ素標識による明らかな障害はまったく観察されなかった。
【００７２】
３２匹のオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの、右及び左の後肢に対し半月板切開を行った。これらのラットには２〜４％のイソフルラン麻酔薬で麻酔を施し、内側側副靭帯を切開し、半月板を切開して、裂傷の模擬実験を行った。以降３週間で変形性関節症様の関節損傷が生じた。手術の２１日後、125Ｉで標識したＦａｂを関節内注射した。ラットには、５μＬの関節内注射を行い右及び左の膝関節中に１１μｇの試験物質を受容させた。４つの時点（注射の１０分後、１時間後、６時間後及び２４時間後）でラットを安楽死させ、両方の膝（bot knees）から滑液洗浄液及び膝関節を回収した。各サンプルの放射活性を測定した。分当たり計数（ｃｐｍ）を、それぞれの対応するＦａｂを注射しなかった場合の値と比較して、定着％を（例えば、注射量の割合として）計算した。３２３−Ｇ１（ＣＮＴＯ  ３６３１）及び１６９−３１（ＣＮＴＯ  ４０９３）は、どちらも膝関節（図５）及び滑液（図６）の中に対照抗体よりも長く定着した。それぞれ注射の６時間後及び２４時間後に、Ｆａｂ  ３２３−Ｇ１の約６０％及び３２％、並びに、Ｆａｂ  １６９−３１の６０％及び１８％が、膝に定着していた（関節及び滑液の定着を合わせて）。対照Ｆａｂは１７％及び５％が定着した。したがって、本発明の抗体は、関節に存在するタンパク質に対し結合することから、関節への定着は増加を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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