(57)【要約】【課題】本発明は、極小かつ均一な大きさの酸化鉄系常磁性ナノ粒子の製造方法及びこれを用いるＭＲＩ Ｔ１造影剤に関する。【解決手段】本発明は、常磁性あるいは擬似常磁性を有する酸化鉄系ナノ粒子の製造方法及びこれによって製造される酸化鉄系ナノ粒子、及び常磁性あるいは擬似常磁性酸化鉄ナノ粒子を含むＴ１造影剤に関し、より詳細には、オレイン酸鉄錯体（iron oleate）の熱分解を基礎として４ｎｍ以下の極小かつ均一な大きさの酸化鉄ナノ粒子を製造する方法及びこれにより製造される常磁性あるいは擬似常磁性の酸化鉄系ナノ粒子及び常磁性あるいは擬似常磁性の酸化鉄系ナノ粒子を含むＴ１造影剤に関する。【選択図】図１６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
鉄を中心原子とし、４〜２５の炭素原子（Ｃ４〜Ｃ２５）を含むカルボキシレート基（carboxylate）が前記中心原子に配位子として結合されている鉄錯体を、Ｃ４〜Ｃ２５を含む脂肪酸及びＣ４〜Ｃ２５を含む脂肪族アルコール又はＣ４〜Ｃ２５を含む脂肪族アミンと１５０℃〜３５０℃にて反応させて酸化鉄ナノ粒子を製造する段階を含む酸化鉄ナノ粒子の製造方法。
【請求項２】
製造された酸化鉄ナノ粒子を冷却し、洗浄して得られた沈殿物を有機溶媒に分散させる段階をさらに含む請求項１に記載の酸化鉄ナノ粒子の製造方法。
【請求項３】
酸化鉄ナノ粒子の粒径は４ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載の酸化鉄ナノ粒子の製造方法。
【請求項４】
鉄錯体はＣ１０〜Ｃ２２を含む脂肪酸基が配位子として結合されたことを特徴とする請求項１に記載の酸化鉄ナノ粒子の製造方法。
【請求項５】
鉄錯体はオレイン酸鉄錯体（iron oleate）であることを特徴とする請求項４に記載の酸化鉄ナノ粒子の製造方法。
【請求項６】
脂肪酸及び脂肪族アルコール又は脂肪族アミンは、それぞれ１０〜２２の炭素原子（Ｃ１０〜Ｃ２２）を含むことを特徴とする請求項１に記載の酸化鉄ナノ粒子の製造方法。
【請求項７】
脂肪酸及び脂肪族アルコールは、それぞれオレイン酸（oleic acid）及びオレイルアルコール（oleyl alcohol）であり、脂肪族アミンはオレイルアミン（oleyl amine）であることを特徴とする請求項６に記載の酸化鉄ナノ粒子の製造方法。
【請求項８】
酸化鉄ナノ粒子を製造する段階は、室温から２００〜３１０℃まで５℃／ｍｉｎ以上の昇温速度で加温し、２００〜３１０℃にて５〜６０分間反応することを特徴とする請求項１に記載の酸化鉄ナノ粒子の製造方法。
【請求項９】
昇温速度は１０℃／ｍｉｎ以上であることを特徴とする請求項８に記載の酸化鉄ナノ粒子の製造方法。
【請求項１０】
酸化鉄の大きさは、脂肪酸及び脂肪族アルコール又は脂肪族アミンのモル比を調節することにより調節されることを特徴とする請求項１に記載の酸化鉄ナノ粒子の製造方法。
【請求項１１】
４ｎｍ以下の平均粒径を有し、２０Ｋ以上の温度で常磁性又は擬似常磁性を有し、前記平均粒径±１ｎｍの範囲内の均一な粒径を有する酸化鉄ナノ粒子。
【請求項１２】
請求項１１に記載の酸化鉄ナノ粒子を含む磁気共鳴画像（ＭＲＩ）Ｔ１造影剤。
【請求項１３】
酸化鉄ナノ粒子の表面は、リン脂質ポリエチレングリコール（phospolipid polyethyleneglycol）（phospholipid−ＰＥＧ）、ポリエチレングリコール−ホスフェート（ＰＯ−ＰＥＧ）、モノサッカライドホスフェート若しくはその誘導体、クエン酸又はベタイン（betaine）で親水性に改質されることを特徴とする請求項１２に記載の造影剤。
【請求項１４】
酸化鉄ナノ粒子の表面は、グルコース６−ホスフェート、グルコース６−ホスフェート−エタノールアミン又はグルコース６−ホスフェート−ポリエチレングリコールで改質されることを特徴とする請求項１２に記載の造影剤。
【請求項１５】
ａ）２０Ｋ以上の温度で常磁性あるいは擬似常磁性を有し、
ｂ）粒径は１ｎｍ〜４ｎｍであり、
ｃ）表面は親水性物質で囲まれており、
ｄ）粒子同士の凝集が生じないこと
を特徴とする酸化鉄ナノ粒子。
【請求項１６】
親水性物質は、リン脂質ポリエチレングリコール（phospolipid polyethyleneglycol）、ポリエチレングリコール−ホスフェート（ＰＯ−ＰＥＧ）、グルコース６−ホスフェート、グルコース６−ホスフェート−エタノールアミン、グルコース６−ホスフェート−ＰＥＧ、クエン酸又はベタインである請求項１５に記載の酸化鉄ナノ粒子。
【請求項１７】
請求項１５に記載の酸化鉄ナノ粒子が水に分散されている酸化鉄ナノ粒子コロイド。
【請求項１８】
請求項１６に記載の酸化鉄ナノ粒子が水に分散されている酸化鉄ナノ粒子コロイド。
【請求項１９】
請求項１５に記載の酸化鉄ナノ粒子を含む磁気共鳴画像Ｔ１造影剤。
【請求項２０】
請求項１６に記載の酸化鉄ナノ粒子を含む磁気共鳴画像Ｔ１造影剤。
【請求項２１】
請求項１７に記載の酸化鉄ナノ粒子コロイドを含む磁気共鳴画像Ｔ１造影剤。
【請求項２２】
請求項１８に記載の酸化鉄ナノ粒子コロイドを含む磁気共鳴画像Ｔ１造影剤。
【請求項２３】
鉄を中心原子とし、Ｃ４〜Ｃ２５を含むカルボキシレート基（carboxylate）が配位子として結合されている鉄錯体をＣ４〜Ｃ２５を含む脂肪酸と、３〜３．５℃／ｍｉｎの昇温速度で２９０〜３１０℃にて反応させて酸化鉄ナノ粒子を製造する段階を含む酸化鉄ナノ粒子の製造方法。
【請求項２４】
鉄を中心原子とし、Ｃ４〜Ｃ２５を含むカルボキシレート基（carboxylate）が配位子として結合されている鉄錯体を、Ｃ４〜Ｃ２５を含む脂肪酸と２６５〜２７５℃にて１次反応させた後、３１５〜３２５℃にて２次反応させて酸化鉄ナノ粒子を製造する段階を含む酸化鉄ナノ粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔ１造影剤として使用するための均一な大きさの常磁性あるいは擬似常磁性（pseudo−paramagnetic）酸化鉄系ナノ粒子の製造方法及びこれにより製造される酸化鉄系ナノ粒子、及び前記ナノ粒子を含むＴ１造影剤に関し、より詳細には、オレイン酸鉄（iron oleate）錯体の熱分解を基礎として４ｎｍ以下の極小かつ均一な大きさの酸化鉄ナノ粒子を製造する方法及びこれにより製造される前記酸化鉄系ナノ粒子、及び常磁性あるいは擬似常磁性ナノ粒子を含むＴ１造影剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞染色、細胞分離、生体内のドラッグデリバリー、遺伝子伝達、疾病や異常に対する診断及び治療、分子像（molecular imaging）医学などの生医学分野において様々な種類のナノ粒子を用いた研究が活発に進められている。
【０００３】
このようなナノ粒子の医学的適用が実質的な意味を持つためには、必ず生体外（in vitro）及び生体内（in vivo）の両方から満足するほどの結果を出す必要がある。
【０００４】
即ち、一次的に細胞実験を介して効果が立証されたナノ粒子に対して二次的に動物実験を行うことで、最終的に医学的に適用することができる。
【０００５】
磁気共鳴画像（ＭＲＩ；Magnetic Resonance Imaging）は、磁場中で水素原子のスピンが弛緩される現象を用いて身体の解剖学的、生理学的及び／又は生化学的情報を映像として得る方法であり、現在生きている人間や動物の身体器官を非侵襲的かつリアルタイムで映像化することができる、現在まで最も優れた映像診断装備の一つである。
【０００６】
生命科学や医学分野においてＭＲＩを多様かつ精密に活用するために、外部から物質を注入して映像対照度を増加させる方法を用いるが、このような物質を造影剤とし、超常磁性あるいは常磁性の物質を用いてＭＲＩで見るべき部分の信号の対比を与えて明確に区別できるようにする物質である。
【０００７】
ＭＲＩイメージにおける組職同士の対照度（contrast）は、組職内の水分子の核スピン（nuclear spin）が平衡状態に戻る弛緩作用（relaxation）が組職ごとに異なるため生じる現象であり、造影剤はこのような弛緩作用に影響を及ぼし組職同士の弛緩度の差をひらき、ＭＲＩ信号の変化を誘発して組職同士の対照をより鮮明にする機能を行う。造影剤は特徴と機能、注入対象に応じて活用度と精密度において差が出る。
【０００８】
造影剤を用いて増強された対照は、特定の生体器官と組職の映像信号を周りに比べ高めたり低めることにより、より鮮明に映像化させることができる。ＭＲＩ映像を得るために所望の身体部位の映像信号を周りより相対的に高くする造影剤を「positive」造影剤（Ｔ１造影剤）とし、周りより相対的に低くする造影剤を「negative」造影剤（Ｔ２造影剤）とする。より詳細には、ＭＲＩ造影剤は、常磁性物質の高いスピン（high spin）を用いたＴ１造影剤と、強磁性あるいは超常磁性物質の周りの磁気不均等性を用いたＴ２造影剤とに分けられる。「positive」造影剤は、Ｔ１弛緩、即ち縦弛緩に係る造影剤である。このような縦弛緩は、スピン（spin）のＺ軸方向の磁化成分（Ｍｚ）がＸ軸から加えられたＲＦエネルギーの衝撃を吸収した後、Ｘ−Ｙ平面のＹ軸に整列（align）してからエネルギーを外部に放出して最初の値に戻る過程であり、この現象を「Ｔ１弛緩（Ｔ１ relaxation）」と表現する。Ｍｚが最初の値の６３％まで戻る時までの時間を「Ｔ１弛緩時間（Ｔ１ relaxation time）」とし、Ｔ１弛緩が短いほどＭＲＩの信号は大きくなるため映像獲得時間も短くなる。
【０００９】
「negative」造影剤はＴ２弛緩、即ち横弛緩に係る造影剤である。スピンのＺ軸方向の磁化成分ＭｚがＸ軸から加えられたＲＦエネルギーの衝撃を吸収した後、Ｘ−Ｙ平面のＹ軸に整列（align）してから、自らエネルギーを減衰したり周りのスピンにエネルギーを放出して最初の値に戻ろうとするが、この際Ｘ−Ｙ平面上で均等に拡大したスピン（spin）の成分Ｍｙが指数関数的に減衰する現象を「Ｔ２弛緩（Ｔ２ relaxation）」と表現する。Ｍｙが最初の値の３７％まで減衰するまでの時間を「Ｔ２弛緩時間（Ｔ２ relaxation time）」とし、Ｍｙが時間の経過に伴い減少する時間の関数でＹ軸に設けられた受信コイルを介して測定したものを自由誘導減衰（free induction decay；ＦＩＤ）信号とする。Ｔ２弛緩時間の短い組職はＭＲＩ上で暗く表される。
【００１０】
現在まで商業化されたＭＲＩ造影剤は、常磁性（paramagnetic）化合物が「positive」造影剤として、超常磁性（superparamagnetic）ナノ粒子が「negative」造影剤として使用されている。
【００１１】
現在Ｔ２造影剤としてＳＰＩＯなどの酸化鉄ナノ粒子が使用されているが、Ｔ２造影は陰性造影であり周りに比べて所望する部位が暗くなる造影法を用いるため、対比効果が大きくなく、ブルーミング効果（blooｍing effect）により実際より大きい面積が造影されるという欠点がある。
【００１２】
一方、Ｔ１造影剤は、陽性造影（positive contrast）されて所望の部位の映像が明るく見られる利点を有するが、高スピンを有する物質（high spin material）が使用される。そのため普段４ｆオービタルのホールスピン（hole-spin）が７個であるガドリニウム複合体（complex）が使用されている。しかし、ガドリニウム複合体は、分子量が小さいため血管及び生体内の滞留時間が短すぎて正確な診断が難しく、腎臓機能が劣る人には全身性線維症（Neuphrogenic Systemic Fibrosis）を誘発するため、使用が不可能なものとして最近米国の食品医薬品局（ＦＤＡ）から警告されている。そのため、ガドリニウム複合体の欠点である短い滞留時間、腎臓患者に対する過度な毒性などの問題を解決するＴ１造影剤開発が強く要求される。
【００１３】
Ｔ１造影剤の新しい研究動向として、３ｄオービタルのホールスピンが５個である酸化マンガンナノ粒子を使用した論文（H．B．Na et al．Angew．Chem．Int．Ed．２００７，４６，５３９７）が発表された。
【００１４】
酸化マンガンナノ粒子の長所は、マンガンイオンが有した特徴である優れたＴ１弛緩効果と共にナノ粒子が有した特徴であるターゲット分子を容易に結合することができ、細胞内への注入も容易であるという点である。しかし、酸化マンガンナノ粒子が細胞内にエンドソーム（endosome）として入ると、内部の酸性環境によってマンガンイオンが脱落するが、これによりマンガンイオンが体内に残留すると、カルシウムチャネルを攪乱する問題が発生する可能性がある（L．K．Limbach、et al．Environ．Sci．Technol．２００７，４１，４１５８）。
【００１５】
従って、このような欠点を解消するために、マンガンより生体適合性を有すると共に、５個のホールスピンを有する酸化鉄をＴ１造影剤として用いる方法を提起することができる。
【００１６】
しかし、一般的な酸化鉄（特に、magnetite又はmaghemite）ナノ粒子は超常磁性（superparamagnetic）を有する。この高い磁化度によってＴ２値が増加し、感受率（susceptibility）効果によって信号を歪曲させる問題が生じるためＴ１造影剤としては適しないと報告されている（Y．-w．Jun、et al．J．Am．Chem．Soc．２００５，１２７，５７３２）。
【００１７】
しかし、このような問題点は、酸化鉄ナノ粒子の粒径を調節することにより解決することができる。酸化鉄の大きさが減少するほど粒子が有する磁性が低下し、磁性不均一性（magnetic inhomogeniouty）が減少してＴ１造影剤としての使用が期待される。超常磁性体（superparamagnetic）酸化鉄の粒径を減少させてＴ１弛緩率（ｒ１）が増加した例として米国特許第６,６３８,４９４（発明者：Herbert Pilgrimm）が挙げられる。共沈法で合成され、粒径が１−１０ｎｍであり、平均粒径（ｄ５０：中央値）が２−４ｎｍである酸化鉄ナノ粒子の表面を親水化した場合、Ｔ１弛緩率（ｒ１）が２−５０Ｌ／ｍｍｏｌｏｓｅｃ、ｒ２／ｒ１は５以下を示す。しかし、平均粒径（中央値）は小さいが構成粒子の粒径が１−１０ｎｍで非常に不均一である。酸化鉄粒子が４ｎｍ以上に大きくなる場合Ｔ２効果が急激に上昇する。そのため、平均粒径が小さくても粒径が均一でなければＴ１弛緩率はあまり向上しないため、Ｔ１造影剤として使用するには適しない。
【００１８】
最近の研究では４−６ｎｍの酸化鉄ナノ粒子を用いてＴ１造影剤として応用した研究がある（E．Taboada et al．Langmuir，２００７，２３，４５８３；U．I．Tromsdorf et al．Nano Lett．２００９，９，４４３４）。しかし、粒径が大きいため依然としてＴ２効果が大きく、Ｔ１造影剤として応用するには限界がある。
【００１９】
現在、リンパ節造影剤として臨床試験中であると知られたＣｏｍｂｉｄｅｘＲ（ＡＭＡＧ社製）もまたＴ１造影を研究したことがある。しかし、酸化鉄ナノ粒子の平均粒径が４−６ｎｍと大きく、さらに構成粒子の粒径が均一でないため、Ｔ１効果よりＴ２効果に優れると公知されている（Claire Corot et al．Advanced Drug Delivery Reviews ５８（２００６）１４７１）。
【００２０】
均一な大きさの酸化鉄粒子を製造する方法として熱分解法が挙げられるが、４ｎｍ以下の酸化鉄ナノ粒子を製造するには複雑な条件を要するため商業的な適用には適していない（Jongnam Park、et al．,Nature Mater．,３（２００４），８９１）。
【００２１】
万が一、４ｎｍ以下の酸化鉄ナノ粒子を製造できても原料が高かったり毒性が高くて商業的な意義が低い（Xiaowei Teng、J．Mater．Chem．,１４（２００４），７７４）。
【００２２】
従って、４ｎｍ以下の小さくて均一な大きさの酸化鉄ナノ粒子を再現性高く大量で安く合成しこれを用いるＴ１造影について研究する必要があるが、まだ報告されたものはない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２３】
【特許文献１】米国特許第６,６３８,４９４（発明者：Herbert Pilgrimm）
【非特許文献】
【００２４】
【非特許文献１】H．B．Na et al．Angew．Chem．Int．Ed．２００７，４６，５３９７
【非特許文献２】L．K．Limbach、et al．Environ．Sci．Technol．２００７，４１，４１５８
【非特許文献３】Y．-w．Jun、et al．J．Am．Chem．Soc．２００５，１２７，５７３２
【非特許文献４】E．Taboada et al．Langmuir，２００７，２３，４５８３
【非特許文献５】U．I．Tromsdorf et al．Nano Lett．２００９，９，４４３４
【非特許文献６】Claire Corot et al．Advanced Drug Delivery Reviews ５８（２００６）１４７１
【非特許文献７】Jongnam Park、et al．,Nature Mater．,３（２００４），８９１
【非特許文献８】Xiaowei Teng、J．Mater．Chem．,１４（２００４），７７４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
従来の磁気共鳴Ｔ１造影剤であるガドリニウム複合体は、分子量が少なくて血管及び生体内での滞留時間が短く、腎臓患者に対して過度な毒性を有するという問題がある。酸化鉄ナノ粒子は結晶状であるため粒径が大きく、血管及び生体内での滞留時間を長くすることができ、毒性がほとんどないという長所がある。そのため、これを用いて新しいＴ１造影剤を開発しようとする試みがあったが、通常の酸化鉄は粒径が大き過ぎてＴ１効果よりＴ２効果が著しく高いため、これを解決せずにはＴ１造影に適用することができない。
【００２６】
本発明の目的は、Ｔ１造影剤として使用されることができる大きさが小さく、均一であり、製造方法が容易で大量生産が可能な酸化鉄ナノ粒子の製造方法を提供することにある。
【００２７】
詳細に説明すると、本発明の目的は、従来の酸化鉄が有する超常磁性（superparamagnetic）ではなく、常磁性（paramagnetic）あるいは擬似常磁性（pseudo paramagnetic）を有し、大きさが均一であり（平均粒径±１ｎｍ）、４ｎｍ以下の小さい平均粒径の酸化鉄ナノ粒子の製造方法を提供することにある。
【００２８】
本発明の他の目的は、従来提供することができなかった常磁性（paramagnetic）あるいは擬似常磁性（pseudo paramagnetic）を有し、大きさが均一であり（平均粒径±１ｎｍ）、４ｎｍ以下の極めて小さい平均粒径の酸化鉄ナノ粒子を提供することにある。
【００２９】
本発明のまた他の目的は、前記常磁性あるいは擬似常磁性の酸化鉄ナノ粒子を含む磁気共鳴画像（ＭＲＩ）Ｔ１造影剤を提供することにあり、詳細には、映像を明るくしながらも映像の歪曲がないＴ１造影効果を有し、ナノ粒子の形態で高い細胞内の浸透率及び細胞内の蓄積能力、ターゲット特定造影効果、容易な伝達性、安全な消去、副作用を最小化できる酸化鉄ナノ粒子を含む磁気共鳴Ｔ１造影剤を提供することにある。さらに、従来のＧｄ系Ｔ１造影剤が提供することができなかった血管あるいは生体内での滞留時間があまり短くないＴ１造影剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
本発明者らは、前記問題点を解消するために鋭意研究した結果、オレイン酸鉄（iron oleate）錯体の熱分解を基礎として４ｎｍ以下の極小かつ均一な大きさの酸化鉄ナノ粒子を非常に容易な方法で合成し、これをＴ１造影剤として使用することにより本発明を完成することができた。
【００３１】
即ち、本発明は、ａ）鉄を中心原子とし、４〜２５の炭素原子を含むカルボキシレート基（‘C4 to C25 carboxylate group’）が配位子として結合されている鉄錯体をＣ４〜Ｃ２５を含む脂肪酸及びＣ４〜Ｃ２５を含む脂肪族アルコール又はＣ４〜Ｃ２５を含む脂肪族アミンと１５０℃〜３５０℃にて反応させて酸化鉄ナノ粒子を製造する段階を含む製造方法を提供し、好ましくは、ａ）段階の後、ｂ）前記ナノ粒子を冷却して洗浄した後、沈殿物を有機溶媒に分散させる段階を含む酸化鉄ナノ粒子の製造方法を提供する。
【００３２】
前記製造された酸化鉄ナノ粒子の粒径は４ｎｍ以下であり、常磁性あるいは擬似常磁性を有することを特徴とし、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）Ｔ１造影剤として使用することができる。
【００３３】
前記酸化鉄ナノ粒子を製造する段階で使用されることができる鉄前駆体は、Ｃ１０〜Ｃ２２を含む脂肪酸基が鉄原子に配位子として結合されたものが好ましく、オレイン酸鉄錯体（以下、iron oleate）がより好ましい。
【００３４】
また、酸化鉄ナノ粒子を製造する段階で使用されることができる脂肪酸及び／又は脂肪族アルコール（又は脂肪族アミン）は、好ましくは、Ｃ１０〜Ｃ２２を含む脂肪酸及び／又は脂肪族アルコール（又は脂肪族アミン）を使用することができ、より好ましくは、オレイン酸（oleic acid）及びオレイルアルコール（oleyl alcohol）を使用することができ、脂肪族アミンの場合、オレイルアミン（oleyl amine）を使用することがより好ましい。
【００３５】
一方、前記酸化鉄ナノ粒子を製造する段階の具体的な工程条件は、前記反応物質である鉄錯体、脂肪酸及び脂肪族アルコール混合物（又は脂肪族アミン）を室温から２００〜３１０℃まで５℃／ｍｉｎ以上の昇温速度で加温し、２００〜３１０℃で５〜６０分間反応を行って達成することができる。
【００３６】
また、本発明は、前記製造方法によって製造される酸化鉄ナノ粒子を提供することを他の目的とする。前記酸化鉄ナノ粒子の粒径は４ｎｍ以下であり、常磁性あるいは擬似常磁性を有することを特徴とする。本発明によって製造される酸化鉄ナノ粒子の粒径は、反応物質であるＣ４〜Ｃ２５を含む脂肪酸、及びＣ４〜Ｃ２５を含む脂肪族アルコール（又は脂肪族アミン）が投入されるモル比を調節することにより調節されることができる。
【００３７】
酸化鉄ナノ粒子がその表面上でキャッピングされた反応物質から得た有機物を有するため、ナノ粒子は疎水性であり、ヘキサン、トルエンなどのような無極性有機溶媒によく分散される。
【００３８】
また、本発明は、配位子交換又はカプセル化方法により疎水性ナノ粒子の表面を親水性物質で改質させることで、親水化酸化鉄ナノ粒子を提供する。
【００３９】
本の発明による親水化酸化鉄ナノ粒子は、酸化鉄の表面をポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、リン脂質−ＰＥＧ、ＰＥＧ−ホスフェート、モノサッカライドホスフェート、モノサッカライドホスフェートの誘導体、ベタイン又はクエン酸で改質させることにより得ることができる。
【００４０】
より好ましくは、酸化鉄の表面は、ホスフェート基（phosphate group）又はホスフィンオキシド基（phosphine oxide group）、グルコース６−ホスフェート、グルコース６−ホスフェート−エタノールアミン、グルコース６−ホスフェート−ＰＥＧ、ベタイン又はクエン酸に結合されたＰＥＧを有するＰＥＧ−ホスフェート（ＰＯ−ＰＥＧ）分子で改質されることができる。
【００４１】
また、本発明は、ナノ粒子を水に分散させる親水化酸化鉄ナノ粒子を含むコロイド性溶液を提供する。
【００４２】
また、本発明は、親水化酸化鉄ナノ粒子のコロイド性溶液を含む磁気共鳴画像Ｔ１造影剤を提供する。
【００４３】
また、本発明によると、公知の方法で合成されても酸化鉄ナノ粒子の粒径が４ｎｍ以下である場合、常磁性あるいは擬似常磁性を有することができ、この場合、Ｔ１造影効果が向上されることが分かる。
【００４４】
本発明の他の製造方法は、鉄を中心原子とし、Ｃ４〜Ｃ２５を含むカルボキシレート基（carboxylate）が配位子として結合されている鉄錯体をＣ４〜Ｃ２５を含む脂肪酸と３〜３．５℃／ｍｉｎの昇温速度で２９０〜３１０℃にて反応させて酸化鉄ナノ粒子を製造する段階を含んで酸化鉄ナノ粒子を製造することを特徴とする。また、本発明のまた他の製造方法は、鉄を中心原子とし、Ｃ４〜Ｃ２５を含むカルボキシレート基（carboxylate）が配位子として結合されている鉄錯体をＣ４〜Ｃ２５を含む脂肪酸と２６５〜２７５℃で１次反応させた後、３１５〜３２５℃で２次反応させて酸化鉄ナノ粒子を製造する段階を含んで酸化鉄ナノ粒子を製造することを特徴とする。
【発明の効果】
【００４５】
本発明によると、４ｎｍ以下の均一な大きさの常磁性あるいは擬似常磁性の酸化鉄系ナノ粒子を安い原料を使用して従来の方法より容易な方法で再現性高く大量生産することができ、その大きさも容易に調節することができるという長所がある。
【００４６】
また、前記製造方法によって製造された酸化鉄ナノ粒子は、従来技術に比べサイズ分布が均一であり、造影効果が一定であるという長所を有する。
【００４７】
また、本発明は、常磁性あるいは擬似常磁性酸化鉄ナノ粒子を含むＴ１造影剤を提供することにより、従来技術では不可能であった高いレベルのＴ１対照度を示すことができる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】実施例１の方法で合成された３ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ（Transmission Electron Microscopy）写真であり、（ａ）はＴＥＭ写真であり、（ｂ）は広範囲なＴＥＭ写真であり、（ｃ）はＨＲ−ＴＥＭ（High Resolution−Transmission Electron Microscopy）写真であり、（ｄ）はＳＡＥＤ（Selected Area Electron Diffraction）パターンである。
【図２】実施例１の方法で合成した３ｎｍのナノ粒子のＸＲＤ（X−ray Diffraction）スペクトルである。
【図３】実施例２の方法で合成した２．３ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真である。
【図４】実施例３の方法で合成した１．８ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真である。
【図５】実施例４の方法で合成した３．３ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真である。
【図６】実施例５の方法で合成した３．５ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真である。
【図７】実施例６の方法で合成した１．６ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真である。
【図８】実施例７の方法で合成した２．４ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真である。
【図９】実施例８の方法で合成した３．５ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真である。
【図１０】実施例９の方法で合成した２．３ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真である。
【図１１】（ａ）は実施例１０の方法で合成した２．７ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真であり、（ｂ）は比較例１の方法で合成した酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真であり、（ｃ）は比較例２の方法で合成した酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真である。
【図１２】（ａ）は実施例１の方法で合成された３ｎｍのナノ粒子の５Ｋ、３００ＫにおけるＭ−Ｈ曲線であり、（ｂ）は大きさによるナノ粒子の３００ＫにおけるＭ−Ｈ曲線の変化を示し、（ｃ）は実施例２の方法で合成された２．３ｎｍのナノ粒子のゼロ磁場冷却（Zero field cooling）と磁場冷却（Field cooling）のＭ−Ｔ曲線であり、（ｄ）は実施例１の方法で合成された３ｎｍのナノ粒子のＭ−Ｔ曲線であり、（ｅ）は比較例３の方法で合成された１２ｎｍのナノ粒子のＭ−Ｔ曲線であり、（ｆ）は実施例６の方法で合成された１．６ｎｍのナノ粒子の５Ｋ、３００ＫにおけるＭ−Ｈ曲線であり、（ｇ）は実施例６のナノ粒子のＭ−Ｔ曲線であり、（ｈ）は実施例９で合成された２．３ｎｍのナノ粒子の５Ｋ、３００ＫにおけるＭ−Ｈ曲線である。
【図１３】実施例１３の方法でＰＥＧ−Phosphate（ＰＯ−ＰＥＧ）を用いて水に分散させた３ｎｍのナノ粒子の数平均流体力学的径の分布（数平均１１．８ｎｍ）を示す。
【図１４】大きさ別の酸化鉄ナノ粒子をＰＥＧ−Phosphate（ＰＯ−ＰＥＧ）とPhospolipid ＰＥＧ（リン脂質−ＰＥＧ）で表面改質してから水に分散した分散液のＭＲＩ phantom Ｔ１イメージを示したものであり、２．３ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、７ｎｍをＰＥＧ−Phosphate（ＰＯ−ＰＥＧ）で処理した場合にはそれぞれ２．３Ｐ、３Ｐ、４Ｐ、７Ｐに示し、Phospolipid ＰＥＧ（リン脂質−ＰＥＧ）で処理した場合にはそれぞれ２．３Ｌ、３Ｌ、４Ｌ、７Ｌに示した。
【図１５】３ｎｍのナノ粒子と１２ｎｍのナノ粒子の細胞phantom ＭＲＩの結果であり、（ａ）は３ｎｍのナノ粒子の細胞phantom ＭＲ映像であり、（ｂ）は１２ｎｍのナノ粒子の細胞phantom ＭＲ映像である。
【図１６】通常、Ｔ１造影剤として使用されるガドリニウム複合体（complex）であるGadovistＲ（Bayer Schering社製）に比べて頸動脈、頸静脈、大動脈等が鮮明に造影されることを示すものであり、（ａ）は３ｎｍ粒子のin vivo ＭＲＩの血管造影映像であり、（ｂ）はGadovistＲのin vivo ＭＲＩの血管造影映像である。
【図１７】実施例２０の方法で合成した４ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真である。
【図１８】実施例２１の親水化された酸化鉄ナノ粒子のＭＣＦ−７細胞に対するＭＴＴ assay結果である。
【図１９】実施例２２のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いて酸化鉄ナノ粒子の分子量を分析した結果である。
【図２０】比較例３の方法で合成した１２ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真である。
【図２１】比較例４の方法で合成した１２ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真である。
【図２２】比較例５の方法で合成した７ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真である。
【図２３】比較例６の方法で４ｎｍの酸化鉄ナノ粒子を凝集（aggregate）されるようにカプセル化して陰性染色（negative staining）したＴＥＭ写真である。
【図２４】比較例７の方法で合成した６ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真である。
【図２５】実施例１７に記載のグルコース６−ホスフェートでキャッピングされた３ｎｍのナノ粒子を使用する向上したＭＲＩ血管造影映像である。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
上述の目的、特徴及び長所は、添付の図面を参照して詳細に後述されている詳細な説明によってより明らかになり、それによって本発明が属する技術分野において通常の知識を有した者が本発明の技術的思想を容易に実施することができる。また、本発明を説明する際に使用される技術用語及び科学用語において他の定義がない限り、本発明が属する技術分野において通常の知識を有した者が通常理解している意味を有し、本発明に係わる公知技術に対する具体的な説明が本発明の要旨を不明確にする可能性があると判断される場合、その詳細な説明を省略する。
【００５０】
本発明の目的は、上述の目的に限定されず、言及されていない本発明の他の目的及び長所は、下記の説明及び本発明の実施例により明確に理解することができる。
【００５１】
また、本発明の目的及び長所は、特許請求の範囲に記載の手段及びその組み合わせにより実現することができる。
【００５２】
以下、添付の図面を参照して本発明による好ましい実施例について詳細に説明する。
【００５３】
本発明による酸化鉄系ナノ粒子の製造方法は、ａ）鉄を中心原子とし、４〜２５の炭素原子を含むカルボキシレート基（‘C4 to C25 carboxylate group’、以下前記と同様に定義される）が配位子として結合されている鉄錯体をＣ４〜Ｃ２５を含む脂肪酸（C4 to C25 fatty acid）及びＣ４〜Ｃ２５を含む脂肪族アルコール（C4 to C25 aliphatic alcohol）又はＣ４〜Ｃ２５を含む脂肪族アミン（C4 to C25 aliphatic amine）と１５０℃〜３５０℃にて反応させて酸化鉄ナノ粒子を製造する段階を含むことを特徴とし、好ましくは、前記ａ）段階の後、ｂ）前記酸化鉄ナノ粒子を冷却し、洗浄してから沈殿物を有機溶媒に分散させる段階をさらに含む。
【００５４】
前記酸化鉄ナノ粒子を製造する段階ａ）で使用されることができる鉄前駆体は、Ｃ１０〜Ｃ２２を含む脂肪酸基（C10 to C22 fatty acid group）が鉄原子に配位子として結合されたものが好ましく、鉄に結合される配位子の種類としては、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトオレイン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、アラキドン酸、ベヘン酸などが挙げられ、より好ましくは、前記鉄前駆体としてはオレイン酸鉄錯体（iron oleate）が使用されることができる。
【００５５】
また酸化鉄ナノ粒子を製造する段階で使用されることができる脂肪酸及び脂肪族アルコールとしては、好ましくは、Ｃ１０〜Ｃ２２を含む脂肪酸、Ｃ１０〜Ｃ２２を含む脂肪族アルコール（C10 to C22 aliphatic alcohol）及び／又はＣ１０〜Ｃ２２を含む脂肪族アミン（C10 to C22 aliphatic amine）を使用することができ、脂肪酸としては、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトオレイン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、アラキドン酸、リシノール酸、ベヘン酸などを使用することができ、脂肪族アルコールとしては、ステアリルアルコール（オクタデカノール）、オレイルアルコール、リノレイルアルコール、ヘキサデカノール、パルミトオレインアルコール、テトラデカノール、ドデカノール、アラキドニルアルコール、エイコサノール、ドコサノール、ヘキサデカンジオールなどを使用することができ、脂肪族アミンの場合にはステアリルアミン（オクタデシルアミン）、オレイルアミン、ヘキサデシルアミン、パルミトオレイルアミン、テトラデシルアミン、ドデシルアミン、アラキドニルアミンなどを使用することができる。
【００５６】
より好ましくは、前記脂肪酸及び脂肪族アルコールは、オレイン酸（oleic acid）、及びオレイルアルコール（oleyl alcohol）が使用されることができ、脂肪族アミンはオレイルアミン（oleyl amine）が使用されることができる。
【００５７】
一方、前記酸化鉄ナノ粒子を製造する段階の具体的な工程条件は、前記反応物質である鉄錯体、脂肪酸及び脂肪族アルコール（又は脂肪族アミン）混合物を室温から２００〜３１０℃まで５℃／ｍｉｎ以上の昇温速度で加温して２００〜３１０℃で５〜６０分間反応させて達成することができる。
【００５８】
また、本発明によって製造される酸化鉄ナノ粒子の粒径は４ｎｍ以下であることを特徴とし、以下、本発明による製造方法により製造される酸化鉄の特性について説明する。
【００５９】
図１の（ａ）と（ｂ）は３ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真であり、極小かつ均一な粒子が形成されることが分かる。広範囲なイメージである（ｂ）は、小さい粒子が一部分にのみ集まっているのではなく、広い範囲でも大きい粒子が混合されることなく小さくて均一な粒子のみが存在することを示す。酸化物は金属ナノ粒子に比べて電子密度が低いだけでなく、大きさまで非常に小さいため、粒子が明示的には示されない。また図１の（ｃ）に示されたように、ＴＥＭ電子線のエネルギーによってＨＲ−ＴＥＭで格子構造がよく見えないが、図１の（ｄ）はＥＤ（electron diffraction）パターンを見るとマグネタイト（magnetite）の（３１１、４００）ピークが示される。
【００６０】
図２は３ｎｍのナノ粒子のＸＲＤスペクトルであり、３ｎｍのナノ粒子は小さいため広いピークを示すが、（３１１、４００、４４０）ピークなどがマグネタイト（magnetite）構造であることを示している。Debye−Scherrer式で計算すると３ｎｍが出るが、これにより非常に優れた結晶性を有していることが分かる。
【００６１】
一方、本発明によって製造される酸化鉄ナノ粒子の粒径は、反応物質であるＣ４〜Ｃ２５を含む脂肪酸又はＣ４〜Ｃ２５を含む脂肪族アルコール（又は脂肪族アミン）の投入されるモル比を調節することにより調節されることができる。
【００６２】
本発明によると、酸化鉄ナノ粒子の粒径を調節するために鉄前駆体の濃度を減少させると、より小さい大きさのナノ粒子が形成されることが分かる。
【００６３】
また、反応物である脂肪族アルコール（又は脂肪族アミン）の投入量を増加させるほどより小さい酸化鉄ナノ粒子が合成されることができるが、これは具体的な反応物の種類及び／又は反応条件に応じて異なり得る。
【００６４】
例えば、鉄前駆体としてオレイン酸鉄錯体（iron oleate）を使用する場合、他の工程条件をそのままにして、反応物であるオレイン酸鉄錯体（iron oleate）の濃度を半分に減らすと、さらに小さい大きさのナノ粒子が合成されることを図（初期前駆体濃度０．２Ｍである時に合成した３ｎｍのナノ粒子（図１（ａ））、初期前駆体濃度０．１Ｍである時に合成した２．３ｎｍのナノ粒子（図３））から確認することができ、この結果は反応物である鉄前駆体の量によって酸化鉄ナノ粒子の粒径を調節することができることを示す。
【００６５】
また、脂肪族アルコール（又は脂肪族アミン）と脂肪酸の割合によって大きさが調節される程度を見ると、前記の割合がナノ粒子の粒径の変化にあまり影響を与えないように見えるが、脂肪族アルコールであるオレイルアルコール（oleyl alcohol）をさらに投入するほど粒径が小さくなる。
【００６６】
一方、本発明で使用される脂肪族アルコールの代わりに弱い還元剤である脂肪族アミンを使用しても酸化鉄ナノ粒子を製造することができる。例えば、脂肪族アミンとしてＣ４〜Ｃ２５を含む脂肪族アミン（C4 to C25 aliphatic amine）、好ましくはオレイルアミンが使用されることができる。
【００６７】
脂肪族アルコールの代わりにアルカンジオールを使用しても酸化鉄ナノ粒子を得ることができるが、この場合粒径が４ｎｍ以下の酸化鉄ナノ粒子を得ることができない。
【００６８】
本発明の酸化鉄ナノ粒子の粒径と均一度のためには比較的速い昇温過程が好ましい。好ましい昇温速度は５℃／ｍｉｎ以上であり、さらに好ましくは１０℃／ｍｉｎ以上が好適である。
【００６９】
これは迅速に昇温すると核生成（burst nucleation）がより激しく生じるためであると推測され、均一で小さい酸化鉄ナノ粒子の合成に有利な条件となる。前記のように、前記昇温速度を調節して酸化鉄ナノ粒子の粒径と均一度が調節され、昇温速度を高めることで、より均一で小さい酸化鉄ナノ粒子を製造することができる。ここで、実質的に前記昇温速度は２００℃／ｍｉｎ以下である。
【００７０】
例えば、オレイン酸とオレイルアルコールを使用する場合の酸化鉄ナノ粒子の粒径と昇温速度との関係について説明すると、３．３℃／ｍｉｎ、５℃／ｍｉｎ、１０℃／ｍｉｎ、２０℃／ｍｉｎの異なる昇温速度で反応させることにより酸化鉄ナノ粒子を製造する場合、３．３℃／ｍｉｎ、５℃／ｍｉｎの昇温速度では、４〜６ｎｍ程度の相対的に大きいナノ粒子が混合された不均一な粒子が合成される。一方、１０℃／ｍｉｎの速度で昇温すると３ｎｍ、２０℃／ｍｉｎの速度で昇温すると２．７ｎｍの均一な粒子が合成される。
【００７１】
また、本発明によって製造される酸化鉄ナノ粒子はその粒径が減少すると共に常磁性あるいは擬似常磁性を有するため、Ｔ２弛緩の増加によるＴ１弛緩の干渉を最小化することができ、Ｔ１ ＭＲＩ造影剤として好適であるため、本発明の酸化鉄ナノ粒子をＭＲＩ造影剤に適用することができる。
【００７２】
本発明によって製造される酸化鉄ナノ粒子は他の金属酸化物に比べて毒性が少なくて生体適合性を有する。前記酸化鉄ナノ粒子はその表面をリン脂質−ＰＥＧ、ＰＥＧ−ホスフェート、モノサッカライドホスフェート、モノサッカライドホスフェートの誘導体、ベタイン又はクエン酸で改質することにより、Ｔ１ ＭＲＩ造影剤として使用することができる。より好ましくは、酸化鉄の表面はＰＯ−ＰＥＧ、グルコース６−ホスフェート、グルコース６−ホスフェート−エタノールアミン、グルコース６−ホスフェート−ＰＥＧ又はクエン酸で改質することができる。ナノ粒子上でキャッピングされる物質は、流体力学的径、水の安定性及び毒性に強く影響される。さらに、酸化鉄のコアの大きさが非常に小さい場合、配位子交換後の親水化組成物はＴ２影響を増加させるほど大きくなり得る。従って、親水化層はＴ１ ＭＲＩ造影剤において重要なものである。
【００７３】
酸化鉄ナノ粒子を製造するためにNat．Mater．２００４，４，８９１に記載された方法のように、オレイン酸鉄錯体を熱分解することで酸化鉄ナノ粒子を合成することができる。しかし、前記文献に記載された方法は、鉄錯体をオレイン酸のみを界面活性剤として合成するため、４ｎｍ以下の酸化鉄ナノ粒子を製造するのが難しいという欠点を有している。しかし、本出願人は公知の特許の方法と異なる昇温条件を用いて異なるナノ粒子の生成条件を有することにより４ｎｍ以下の酸化鉄ナノ粒子を合成することができた。ナノ粒子の生成条件を制御するために２つの方法を用いた。
【００７４】
第一に、実施例６、７のように反応中に多数の核を製造する方法で小さい粒径のナノ粒子を合成し、粒子成長の際に粒子一つ当り付着される鉄原子の個数を減少させる方法である。これは反応温度調節により核形成を調節する方法である。しかし、本発明による好ましい製造方法である鉄を中心原子とし、Ｃ４〜Ｃ２５を含むカルボキシレート基（carboxylate）が配位子として結合されている鉄錯体をＣ４〜Ｃ２５を含む脂肪酸及びＣ４〜Ｃ２５を含む脂肪族アルコール又はＣ４〜Ｃ２５を含む脂肪族アミンと１５０℃〜３５０℃にて反応させて酸化鉄ナノ粒子を製造する方法に比べ、温度調節による核形成方法は、正確な調節が難しいため、再現性に優れないという欠点を有することが確認できた。
【００７５】
第二に、実施例８のようにナノ粒子の成長速度を制御する方法を用いて小さい粒径のナノ粒子の合成を試みた。粒子の成長速度を延ばして粒子成長中間の反応段階を確保する方法であり、この方法もまた温度の制御による方法である。しかし、本発明による好ましい製造方法である鉄を中心原子とし、Ｃ４〜Ｃ２５を含むカルボキシレート基（carboxylate）が配位子として結合されている鉄錯体をＣ４〜Ｃ２５を含む脂肪酸及びＣ４〜Ｃ２５を含む脂肪族アルコール又はＣ４〜Ｃ２５を含む脂肪族アミンと１５０℃〜３５０℃にて反応させて酸化鉄ナノ粒子を製造する方法に比べ、温度調節による成長速度制御方法は、全ての反応ごとに成長する時間が同一でないため、粒子の成長速度を正確に制御することができず、収率及び再現性が低下する欠点を有することが確認できた。
【００７６】
下記の実施例でオレイン酸ナトリウム（sodium oleate）、オレイルアルコール（oleyl alcohol）、ジフェニルエーテル（diphenyl ether）はＴＣＩ社で、塩化第二鉄六水和物（iron chloride(3) hexahydrate）、オレイン酸（oleic acid９０％）、１オクタデセン（１−octadecene９０％）、１，２−ヘキサデカンジオール（１，２−hexadecanediol）はAldrich社で、オレイルアミン（oleyl amine）はAcros社で購入した。エタノール、ヘキサンは三田化学で購入した。
【００７７】
ＴＥＭはＪＥＯＬ−２０１０、ＸＲＤはＲｉｇａｋｕ Ｋａ、ＶＳＭはＶＳＭ−ＰＰＭＳで測定し、ＶＳＭのＭ−Ｔは５Ｋ／ｍｉｎで昇温しながら測定した。
【００７８】
オレイン酸鉄錯体（iron oleate complex、‘iron oleate’）は、J．Park et al．Nat．Mater．２００４，４，８９１に記載の方法によりオレイン酸ナトリウム（sodium oleate）と塩化第二鉄（ＦｅＣｌ３）を反応させて製造したものを使用した。詳細には、塩化第二鉄六水和物１０．８ｇとオレイン酸ナトリウム３６．５ｇを水６０ｍＬ、エタノール８０ｍＬ、ヘキサン１４０ｍＬに交ぜて強く攪拌しながら６０℃程度で４時間反応させる。二層に分離された生成物のうち透明な下層を分液漏斗を用いて除去し、残りの褐色の有機層に水を交ぜてからまた水層を除去して残存する水溶性塩を除去する。このような洗浄過程を三回繰り返す。精製された錯体溶液のヘキサン溶媒を蒸発させてオレイン酸鉄錯体を得る。
【００７９】
下記の実施例及び比較例で製造された水の分析において、図１は実施例１の方法で合成された３ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ（Transmission Electron Microscopy）写真であり、（ａ）はＴＥＭ写真であり、（ｂ）は広範囲なＴＥＭ写真であり、（ｃ）はＨＲ−ＴＥＭ（High Resolution−Transmission Electron Microscopy）写真であり、（ｄ）はＳＡＥＤ（Selected Area Electron Diffraction）パターンである。図２は実施例１の方法で合成した３ｎｍのナノ粒子のＸＲＤ（X−ray Diffraction）スペクトルであり、図３は実施例２の方法で合成した２．３ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真であり、図４は実施例３の方法で合成した１．８ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真であり、図５は実施例４の方法で合成した３．３ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真であり、図６は実施例５の方法で合成した３．５ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真であり、図７は実施例６の方法で合成した１．６ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真であり、図８は実施例７の方法で合成した２．４ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真であり、図９は実施例８の方法で合成した３．５ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真であり、図１０は実施例９の方法で合成した２．３ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真であり、図１１の（ａ）は実施例１０の方法で合成した２．７ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真であり、（ｂ）は比較例１の方法で合成した酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真であり、（ｃ）は比較例２の方法で合成した酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真である。図１２の（ａ）は実施例１の方法で合成された３ｎｍのナノ粒子の５Ｋ、３００ＫにおけるＭ−Ｈ曲線であり、（ｂ）は大きさによるナノ粒子の３００ＫにおけるＭ−Ｈ曲線の変化を示し、（ｃ）は実施例２の方法で合成された２．３ｎｍのナノ粒子のゼロ磁場冷却（Zero field cooling）と磁場冷却（Field cooling）Ｍ−Ｔ曲線であり、（ｄ）は実施例１の方法で合成された３ｎｍのナノ粒子のＭ−Ｔ曲線であり、（ｅ）は比較例３の方法で合成された１２ｎｍのナノ粒子のＭ−Ｔ曲線であり、（ｆ）は実施例６の方法で合成された１．６ｎｍのナノ粒子の５Ｋ、３００ＫにおけるＭ−Ｈ曲線であり、（ｇ）は実施例６のナノ粒子のＭ−Ｔ曲線であり、（ｈ）は実施例９で合成された２．３ｎｍのナノ粒子の５Ｋ、３００ＫにおけるＭ−Ｈ曲線である。図１３は実施例１３の方法でＰＥＧ−Phosphate（ＰＯ−ＰＥＧ）を用いて水に分散させた３ｎｍのナノ粒子の数平均流体力学的径の分布（数平均１１．８ｎｍ）を示したものである。図１４は大きさごとの酸化鉄ナノ粒子をＰＥＧ−Phosphate（ＰＯ−ＰＥＧ）とPhospolipid ＰＥＧ（リン脂質−ＰＥＧ）で表面改質してから水に分散した分散液をＭＲＩ phantom Ｔ１イメージを示したものであり、２．３ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、７ｎｍをＰＥＧ−Phosphate（ＰＯ−ＰＥＧ）で処理した場合にはそれぞれ２．３Ｐ、３Ｐ、４Ｐ、７Ｐで示し、Phospolipid ＰＥＧ（リン脂質−ＰＥＧ）で処理した場合にはそれぞれ２．３Ｌ、３Ｌ、４Ｌ、７Ｌで示した。図１５は３ｎｍのナノ粒子と１２ｎｍのナノ粒子の細胞phantom ＭＲＩ結果であり、（ａ）は３ｎｍのナノ粒子の細胞phantom ＭＲ映像であり、（ｂ）は１２ｎｍのナノ粒子の細胞phantom ＭＲ映像であり、図１６は通常Ｔ１造影剤で使用されるガドリニウム複合体（complex）であるGadovistＲ（Bayer Schering社製）に比べて頸動脈、頸静脈、大動脈等が鮮明に造影されることを示し、（ａ）は３ｎｍ粒子のin vivo ＭＲＩ血管造影映像であり、（ｂ）はGadovistＲのin vivo ＭＲＩ血管造影映像である。図１７は実施例２０の方法で合成した４ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真である。図１８は実施例２１の親水化された酸化鉄ナノ粒子のＭＣＦ−７細胞に対するＭＴＴ assay結果である。図１９は実施例２２のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いて酸化鉄ナノ粒子の分子量を分析した結果である。図２０は比較例３の方法で合成した１２ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真である。図２１は比較例４の方法で合成した１２ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真である。図２２は比較例５の方法で合成した７ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真である。図２３は比較例６の方法で４ｎｍの酸化鉄ナノ粒子を凝集（aggregate）されるようにカプセル化して陰性染色（negative staining）したＴＥＭ写真である。図２４は比較例７の方法で合成した６ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真である。図２５は実施例１７に記載のグルコース６−ホスフェートでキャッピングされた３ｎｍのナノ粒子を使用する向上したＭＲＩ血管造影映像である。
【００８０】
（実施例１）
３ｎｍの酸化鉄ナノ粒子の合成
オレイン酸鉄錯体（iron oleate）１．８ｇ（２ｍｍｏｌ）とオレイン酸（oleic acid）０．５７ｇ（２ｍｍｏｌ）、オレイルアルコール（oleyl alcohol）１．６１ｇ（６ｍｍｏｌ）をジフェニルエーテル１０ｇと混合した後、丸底フラスコに入れて１時間程度８０℃で排気させることにより気体を除去する。その後、アルゴンを流して不活性環境を形成した後２５０℃まで１０℃／ｍｉｎで昇温して反応させると、反応が進むにつれて反応物の色が黒色に変わることが確認された。２５０℃まで昇温してから３０分間反応させると３ｎｍのナノ粒子が製造され（図１、図２）、３０分間反応させた後、迅速に冷却してから過量のアセトンで洗浄する。洗浄した後に得られた沈殿物をクロロホルム（chloroform）又はヘキサン（hexane）の有機溶媒に分散させる。
【００８１】
（実施例２）
２．３ｎｍの酸化鉄ナノ粒子の合成
２．３ｎｍのナノ粒子は、オレイン酸（oleic acid）無しに前記オレイン酸鉄錯体（iron oleate）０．９ｇ（１ｍｍｏｌ）とオレイルアルコール（oleyl alcohol）３．２２ｇ（１２ｍｍｏｌ）をジフェニルエーテル１０ｇと混合した後、実施例１と同一の条件下で熱分解して合成する。
【００８２】
（実施例３）
１．８ｎｍの酸化鉄ナノ粒子の合成
１．８ｎｍのナノ粒子は、オレイン酸（oleic acid）無しに前記オレイン酸鉄錯体（iron oleate）０．９ｇ（１ｍｍｏｌ）とオレイルアルコール（oleyl alcohol）３．２２ｇ（１２ｍｍｏｌ）をジフェニルエーテル１０ｇと混合した後、２０℃／ｍｉｎの昇温速度で２００℃まで昇温し、２００℃で３０分間反応させて合成する。それ以外は実施例１と同様にした。
【００８３】
（実施例４）
１−オクタデセンを使用した３．３ｎｍのナノ粒子の合成
オレイン酸鉄錯体１．８ｇ、オレイン酸０．５７ｇ、及びオレイルアルコール１．６ｇを１−オクタデセン１０ｇと混合した後、１０℃／ｍｉｎの昇温速度で２５０℃まで昇温し、２５０℃で３０分間成長させて合成する。それ以外は実施例１と同様にした。
【００８４】
（実施例５）
オレイルアミン（oleyl amine）を使用した３．５ｎｍのナノ粒子の合成
オレイン酸鉄錯体１．８ｇ、オレイン酸０．５７ｇ、及びオレイルアミン１．６ｇをジフェニルエーテル１０ｇと混合した後、１０℃／ｍｉｎの昇温速度で２５０℃まで昇温し、２５０℃で３０分間成長させて合成する。それ以外は実施例１と同様にした。
【００８５】
（実施例６）
１．６ｎｍの酸化鉄ナノ粒子の製造
公知の合成法（Nature mater、３（２００４）、８９１）を参照して従来合成法では見つけることができなかった粒子の成長速度を制限する方法を用いることにより酸化鉄ナノ粒子を合成し、これを遠心分離して小さい酸化鉄ナノ粒子を得た。オレイン酸鉄錯体（iron oleate）の熱分解によりナノ粒子を合成する際の一般的な合成温度は３２０℃であり、この温度で成長が急激に進められが、３００℃では十分なエネルギーが供給されないため成長速度が非常に低下する。従って、３２０℃にて反応を進める際に得られなかった成長段階中の極小のナノ粒子を３００℃にて反応を進めながら得ることができる。
【００８６】
オレイン酸鉄錯体（Fe−oleate）１．８ｇ（２ｍｍｏｌ）とオレイン酸（oleic acid）０．５７ｇ（２ｍｍｏｌ）を１−オクタデセン（１−octadecene）１０ｇと混合した後、丸底フラスコに入れて１時間８０℃で排気させることにより気体を除去する。アルゴンガスを流して不活性雰囲気で形成した後、３００℃まで３．３℃／ｍｉｎで昇温し、３００℃で３０分間反応させてから室温まで迅速に冷却し、室温でエタノールを加えて沈澱させた後、１．６ｎｍの酸化鉄を得た。
【００８７】
（実施例７）
２．４ｎｍの酸化鉄ナノ粒子の製造
実施例６と同様なナノ粒子の成長速度を制限する方法を用いて、２．４ｎｍの酸化鉄ナノ粒子を合成した。
【００８８】
即ち、オレイン酸鉄錯体（Fe−oleate）１．８ｇ（２ｍｍｏｌ）とオレイン酸（oleic acid）０．５７ｇ（２ｍｍｏｌ）を１−オクタデセン（１−octadecene）１０ｇと混合した後、丸底フラスコに入れて１時間８０℃で排気させることにより気体を除去する。アルゴンガスを流して不活性雰囲気を形成した後、３００℃まで３．３℃／ｍｉｎで昇温し、３００℃で３５分間反応させてから室温まで迅速に冷却し、室温でエタノールを加えて沈澱させた後、２．４ｎｍの酸化鉄を得た。
【００８９】
（実施例８）
３．５ｎｍの酸化鉄ナノ粒子の製造
多数の核を製造する方法を用いて公知の合成法（Nature mater、３（２００４）、８９１）を参照し、温度を変化させることにより小さい粒径のナノ粒子の合成を試みた。オレイン酸鉄錯体（Fe−oleate）を熱分解する際に核生成温度は約２７０℃である。これを用いて核生成温度である２７０℃で長く残存することにより多量の核生成を図った。これにより、多量の核を形成した後、粒子一つ当りに付着される鉄原子の個数が減少されて大きさが小くなる。
【００９０】
オレイン酸鉄錯体（Fe−oleate）１．８ｇ（２ｍｍｏｌ）とオレイン酸（oleic acid）０．５７ｇ（２ｍｍｏｌ）を１−オクタデセン（１−octadecene）１０ｇと混合した後、３首丸底フラスコに入れて不活性（inert）雰囲気下で２７０℃まで加熱し、２０分間その温度で放置して合成する。核が生成された後、追加反応を抑制するために、成長温度である３１８℃まで迅速に昇温し、３１８℃で１０分間さらに放置して３．５ｎｍの粒径を有するナノ粒子を合成した。
【００９１】
（実施例９）
２．３ｎｍの酸化鉄ナノ粒子の合成
オレイン酸０．６４ｇと１，２ヘキサデカンジオール０．５９ｇがジフェニルエーテル１５．８１ｇに混合された溶液を７０℃程度で１時間程度排気させて不純物を精製する。アルゴンを流して不活性雰囲気を形成した後、アルゴンガスを止める。鉄ペンタカルボニル（iron pentacarbonyl）０．３ｍｌを注入し、３．３℃／ｍｉｎの速度で２５０℃まで昇温した後、２５０℃で３０分間反応させると、２．３ｎｍのナノ粒子が製造される。それ以外は実施例１と同様にした。
【００９２】
（実施例１０）
昇温速度による粒径及び分布
オレイン酸鉄錯体１．８ｇ、オレイン酸０．５７ｇ、及びオレイルアルコール１．６ｇをジフェニルエーテル１０ｇと混合した後、２０℃／ｍｉｎの昇温速度で２５０℃まで昇温し、２５０℃で３０分間成長させて２．７ｎｍの均一なナノ粒子を合成する。それ以外は実施例１と同様にした。
【００９３】
（実施例１１）
製造された酸化鉄ナノ粒子の物理化学的特性
ナノ粒子の磁性を振動試料磁力計（Vibrating Sample Magnetometer；ＶＳＭ）を用いて測定した。図１２は実施例で合成された２．３、３、１２ｎｍのナノ粒子の磁化度−磁場（magnetization−magnetic field；Ｍ−Ｈ）の曲線を示す。図１２の（ａ）は実施例１の方法で合成された３ｎｍのナノ粒子の５Ｋ、３００ＫにおけるＭ−Ｈ曲線であり、（ｂ）は大きさによるナノ粒子の３００ＫにおけるＭ−Ｈ曲線の変化を示し、（ｃ）は実施例２の方法で合成された２．３ｎｍのナノ粒子のゼロ磁場冷却（Zero field cooling）と磁場冷却（Field cooling）Ｍ−Ｔ曲線であり、（ｄ）は実施例１の方法で合成された３ｎｍのナノ粒子のＭ−Ｔ曲線であり、（ｅ）は比較例３の方法で合成された１２ｎｍのナノ粒子のＭ−Ｔ曲線であり、（ｆ）は実施例６の方法で合成された１．６ｎｍのナノ粒子の５Ｋ、３００ＫにおけるＭ−Ｈ曲線であり、（ｇ）は実施例６の方法で合成された１．６ｎｍのナノ粒子のＭ−Ｔ曲線であり、（ｈ）は実施例９で合成された２．３ｎｍのナノ粒子の５Ｋ、３００ＫにおけるＭ−Ｈ曲線である。
【００９４】
図１２を参照すると、５Ｋにおける１２ｎｍの酸化鉄ナノ粒子は、保磁力（coercivity）と残留磁気（remanent magnetization）を示すフェリ磁性の性質を有する。３ｎｍの酸化鉄ナノ粒子も若干の保磁力と残留磁気を示すフェリ磁性の性質を有するが、２．３ｎｍのナノ粒子では保磁力と残留磁気が表れない。即ち、５Ｋまで常磁性の形態で残っている。これは超常磁性を有する磁性体ナノ粒子で非常に異例的な場合である。これは磁化度−温度（magnetization−temperature；Ｍ−Ｔ）曲線を見ると明確に示されるが、１２ｎｍでは閉鎖温度（blocking temperature）が２００Ｋで示され、３ｎｍの粒子は１０Ｋで示されるが２．５ｎｍの粒子は閉鎖温度が５Ｋまで示されない。閉鎖温度とは超常磁性、強磁及び／又はフェリ磁性の物性が変化する遷移温度であり、粒子の体積に比例するため、粒径が小くなるほど閉鎖温度は低下する。大きさが３ｎｍ以下にまで減少すると、閉鎖温度は５Ｋまで示されず、３ｎｍの粒子は極低温でも常磁性あるいは常磁性と類似した物性を有することが分かる。フェライト（ferrite）構造を有する酸化鉄ナノ粒子でこのような性質が初めて発見されたが、超常磁性と区別するために、常磁性と類似する「擬似常磁性（pseudo−paramagnetic）」とする。３ｎｍ以下の小さい酸化鉄ナノ粒子は超常磁性ナノ粒子や表面の配列されていない（disordered）スピンが粒子のほとんどを占めるため、粒子は常磁性を有するように見える。これは厳密に言えば常磁性ではないが常磁性と類似する挙動を示すため、擬似常磁性と言える。
【００９５】
室温における磁化度−磁場の曲線を重なり合わせて示した（図１２の（ｂ））。粒子の粒径が減少するに伴い磁化度も低下することが分かる。これは粒径が小さいほど異方性エネルギーが小くなってニール緩和（Neel Relaxation）が起きやすく、粒子全体の磁化度値が小さく、ゼーマン（Zeeman）エネルギーが小さくて熱揺動が大きいためであると考えられる。しかし、特異なことは、３ｎｍと２．３ｎｍの小さい変化にもかかわらず磁性の差は非常に大きいことである。これに対する解釈はスピン傾斜効果（spin canting effect）で説明することができる（J．M．D．Coey、Phys．Rev．Lett．１９７１，２７，１１４０）。磁性体ナノ粒子はバルクである時より小さい磁化度を有するが、これは、表面の磁性体原子はバルクの原子と異なる環境にあるため、スピンの方向が全体スピンの方向と異なる角度を有するようになり、これによってスピンが全体的に配列されないため磁化度が小くなるという効果である。Linderothはスピンが傾く表面の厚さを約０．９ｎｍと計算した（S．Lindroth et al．J．Appl．Phys．１９９４，７５，６５８３）。これによると、２．３ｎｍのナノ粒子はスピン傾斜効果による影響を受けないコア部分の割合が粒子全体体積の１．０％であり、３ｎｍのナノ粒子の場合は粒子の６．４％であるため磁化度の差が大きく示される。
【００９６】
Lindrothの計算によると、粒子の全ての部分がスピンが傾く表面によって影響を受ける１．６ｎｍのナノ粒子である場合、室温でのＭ−Ｔグラフが線形関係を示す典型的な常磁性を示している（図１２の（ｆ））。また、５Ｋでも大きい磁場まで飽和されていないことが分かる。
【００９７】
本発明によるナノ粒子はフェライト（ferrite）構造を有した酸化鉄ナノ粒子であるとともに（図２）、超常磁性（superparamagnetic）より常磁性（paramagnetic）あるいは擬似常磁性（pseudoparamagnetic）を有する酸化鉄ナノ粒子であるという独特の物性を有している。そのため、Ｔ１ ＭＲＩ造影剤としての応用が非常に有利である。
【００９８】
（実施例１２）
Phospolipid ＰＥＧ（リン脂質−ＰＥＧ）を用いた酸化鉄ナノ粒子の親水化
実施例１で製造された３ｎｍの酸化鉄ナノ粒子１０ｍｇを１０ｍｌのクロロホルムに分散させた後、Phospholipid−ＰＥＧ{１，２−distearyl−sn−glycero−３−phosphoethanolamine−N[methoxy（polyethylene glycol−２０００）]}１０ｍｇを追加して攪拌してからクロロホルムを徐々に蒸発させた後、水を添加して分散させた。ＤＬＳ（Dynamic Light Scattering）分析結果、流体力学的径１５ｎｍの粒子を得た。
【００９９】
（実施例１３）
ＰＥＧ−Phosphate（ＰＯ−ＰＥＧ）を用いた酸化鉄ナノ粒子の親水化
ＰＯＣｌ３０．１５ｇとpolyethylene glycol methyl ether（Ｍｎ：２０００）６ｇを７ｍｌのTetrahydrofuran（ＴＨＦ）溶液に入れた後、４時間攪拌した。ＴＨＦを除去してＰＥＧ−Phosphate（ＰＯ−ＰＥＧ）を得た。実施例１で製造された３ｎｍの酸化鉄ナノ粒子１０ｍｇと１００ｍｇのＰＥＧ−Phosphate（ＰＯ−ＰＥＧ）をエタノールに混合して密封し、７０℃で４時間攪拌して配位子を置換する。N−Hexaneで三回洗浄してエタノールを蒸発した後、水を添加して水に分散させて流体力学的径１１．７ｎｍの粒子を得た。
【０１００】
（実施例１４）
親水化させた酸化鉄ナノ粒子のＭＲ in vitro弛緩特性
実施例１３、１７、比較例６の方法で親水化させた酸化鉄ナノ粒子のＭＲ造影能力を測定するために、１．６ｎｍ（実施例６）、２．４ｎｍ（実施例７）、３ｎｍ（実施例１）、４ｎｍ（実施例２０）、７ｎｍ（比較例５）の酸化鉄ナノ粒子を０．５、０．２５、０．１３、０．０６３、０．０３１、０．０１６、０．００７８、０．００３９ｍｇ／ｍｌの濃度でファントム（phantom）を準備した。１．５Ｔ ＭＲ映像の場合、ＭＲスキャナ（GE Health care、signa excite）に頭部コイル（head coil）を用いて得た。Ｔ１値はＩＲ−ＦＳＥシーケンス（sequence）を用いて得られ、使用されたパラメータは次の通りである（ＴＲ／ＴＥ／ＴＩ＝４０００ｍｓ／８．４ｍｓ／５０〜４０００ｍｓ）。Ｔ２値はＣＰＭＧシーケンス（sequence）を用いて得られ、使用されたパラメータは次のとおりである（ＴＲ／ＴＥ＝５０００ｍｓ／１６〜２００ｍｓ）。
【０１０１】
４．７Ｔ ＭＲ映像の場合、ＢＧＡ１２グラジエントコイル（gradient coil）（Biospec４７／４０、Bruker Biospin ＭＲＩGmbH）を用いて弛緩性能を評価した。酸化鉄−ＰＬＧＡナノカプセル粉末の鉄濃度をＩＣＰ−ＡＥＳを介して分析した後、これを０．０１Ｍ ＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline、ｐＨ７．４）２、１、０．５、０．２５、０．１２５ｍｇ／ｍｌの濃度で測定し、Ｔ２弛緩時間はＭＳＭＥ（Multi Slice−Multi Echo sequence）パルス系列を用いて測定し、具体的なパラメータは次のとおりである。
【０１０２】
ＴＲ（repetition time）＝１０，０００ｍｓ、ＴＥ（echo time）＝８〜２０４８ｍｓ（８ｍｓ間隔で２５６回）、ＦＯＶ＝６０×４０ｍｍ、Resolution＝０．２３４×０．１５６ｍｍ／ｐｉｘｅｌ、slice thickness＝１ｍｍ、number of acquisition＝１、Matrix size＝１２８×１２８
【０１０３】
下記表１は様々な大きさのナノ粒子の１．５Ｔでｒ１、ｒ２値及びその割合を示したものであり、表１を参照すると、Phospolipid ＰＥＧ（リン脂質−ＰＥＧ）で表面を改質した酸化鉄ナノ粒子の粒径による１．５Tesla phantom ＭＲＩ緩和値を示す。ｒ１値は７ｎｍあたりで最も大きく示されるが、値の差が大きくない反面、粒径が小くなるほどｒ２値が大幅に減少してｒ２／ｒ１値は大幅に減少する。１．６ｎｍの場合１．５Ｔの磁場で１．４７の非常に小さいｒ２／ｒ１値を有する。小さいｒ２／ｒ１値はＴ１ ＭＲＩ造影剤として使用するために好適である。また、表１の比較例６を参照すると、酸化鉄ナノ粒子の直径が４ｎｍであってもこれら粒子同士が凝集している状態（図２３）であれば、ｒ２／ｒ１値が増加し過ぎてＴ１として適しないことが分かる。
【０１０４】
【表１】
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【０１０５】
（実施例１５）
細胞のＭＲ映像
様々な濃度のナノ粒子（０、２５、１００μｇ Ｆｅ／ｍＬ）で培養されたＭＣＦ−７細胞のin vitro Ｔ1秤量されたＭＲ映像を１．５Ｔ ＭＲスキャナで得た。ＰＯ−ＰＥＧでキャッピングされた３ｎｍのナノ粒子２５及び１００μｇ Ｆｅ／ｍＬで標識された細胞でＴ１信号に相当する増加が観察された反面、標識されていない細胞は明るくなかった（図１５の（ａ））。ナノ構造化した物質はエンドソーム（endosome）で一般的にクラスタ（cluster）になるが、３ｎｍのナノ粒子は低い容積異方性により脱イオン数及び細胞環境においてもＴ１造影効果を提供する。反面、細胞phantom Ｔ１秤量されたＭＲ映像で１２ｎｍの粒子で標識された細胞は、はるかに少ない信号増加を示し、さらに、前記細胞は高濃度で暗くなった（図１５（ｂ））。１２ｎｍの酸化鉄ナノ粒子で培養された細胞の弱化したＴ１信号は、大きい磁性ナノ粒子の凝集体の強い磁性モメントから誘導されたsusceptibility効果によるものと考えられる。
【０１０６】
（実施例１６）
表面をＰＯ−ＰＥＧで処理した３ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のin vivo ＭＲ映像
実施例１３によって製造（投入量：２．５ｍｇ Ｆｅ／ｋｇ）された、ＰＯ−ＰＥＧでキャッピングされた３ｎｍの酸化鉄ナノ粒子の注入前後に、３Ｔ ＭＲＩスキャナ上でリストコイル（wrist coil）を使用して、ラット（rat）の動的時間分解ＭＲ血管撮影及び３ｄ−ＦＬＡＳＨ映像を得た。前の造影映像は後の造影映像から抽出され、生成された映像はＯｓｒｉＸ（バージョン３．８．１；３２ビット；ジュネーブのＯｓｉｒｉＸ社）の最大強度の投映（ＭＩＰ）プロトコルを使用して再現した。動的時間分解ＭＲ血管撮影は、１．２４秒の補間臨時解像度及び次のパラメータで得た：フリップ角＝２０、ＥＴＬ＝１、ＴＲ＝３．１ｍｓ、ＴＥ＝１．１３ｍｓ、視野角（ＦＯＶ）＝７５×１４０ｍｍ２、マトリックス＝２５６×１０６、スライス厚／ギャップ＝２．５ｍｍ／０ｍｍ、及びＮＥＸ＝１．３ｄ−ＦＬＡＳＨの映像パラメータは次の通りである。フリップ角＝２５、ＥＴＬ＝１、ＴＲ＝２５ｍｓ、ＴＥ＝５．１ｍｓ、視野角（ＦＯＶ）＝１１０×６５ｍｍ２、マトリックス＝２５６×１６９、スライス厚／ギャップ＝１．０ｍｍ／０ｍｍ、及びＮＥＸ＝２。
【０１０７】
図１６の（ａ）における血管は、Ｔ１秤量されたＭＲ映像により鮮明になり、３ｎｍのナノ粒子が循環系でＴ１弛緩を向上させることができることを立証した。血管の明るい信号は動的時間分解ＭＲ血管撮影で１時間維持することができ（図１６に不図示）、３ｎｍのナノ粒子がＴ１増強された血液プール（pool）ＭＲＩ造影剤として使用されることができることを示す。
【０１０８】
血液プールの映像は臨床的なＭＲ映像において重要であるが、その理由は腫瘍細胞の心筋梗塞、腎不全、アテローム斑、血栓症、及び血管生成を検出することができるためである。長期間の血液プールの映像は定常状態の映像が有利であり、高解像度の映像を得るために重要である。例えば、肺動脈の映像はＵＳＰＩＯ（超小型の常磁性酸化鉄）を使用して定常状態の鮮明な映像を得ることができる。３ｎｍのナノ粒子は、定常状態の映像に対して良好なＴ１造影剤であることができ、その理由は、ナノ粒子の好適な粒径から来由した長い血液半減期を有するためである。
【０１０９】
粒径が大きすぎて細網内皮系による吸収を防止してはならず、小さすぎて粒子が腎臓を通して排出されることを防止してはならない。３ｎｍのナノ粒子とは対照的に、Ｔ１ ＭＲＩ造影剤に一般的に使用されるガドリニウム錯体Ｇａｄｏｖｉｓｔ（Bayer Schering Pharma製）は短い半減期を有する。Ｇａｄｏｖｉｓｔの注入直後、in vivo ＭＲ映像は高い対比効果によって高い造影を示すが、明るい信号は２分内に速やかに消えた（図１６の（ｂ））。
【０１１０】
（実施例１７）
リン酸モノサッカライドを用いた酸化鉄ナノ粒子の親水化改質及びＭＲ in vivo映像
表面上でオレイン酸でキャッピングされた酸化鉄ナノ粒子を実施例１の方法で製造した。３ｎｍの酸化鉄ナノ粒子１００ｍｇをＴＨＦ（テトラヒドロフラン）８ｍｌ中に分散した後、水２ｍｌ中でグルコース６−リン酸ナトリウム塩２００ｍｇの水溶液と混合した。混合した溶液を攪拌させ、６０℃で４時間反応させた。冷却した後、混合溶液のＴＨＦの上部の相が分離され、表面上でグルコース６−ホスフェートでキャッピングされた酸化鉄ナノ粒子の下部の相に水を加えて酸化鉄ナノ粒子の安定したコロイドを製造した。動的光散乱方法（Malvern Zetasizer Nano ZS）を使用して測定された、表面上でグルコース６−ホスフェートを有するナノ粒子の流体力学的径は３．８ｎｍであった。グルコース６−ホスフェートでキャッピングされた３ｎｍのナノ粒子を使用するＭＲ映像を実施例１６によって実行した。
【０１１１】
図２５に示されたように、血管はＴ１秤量されたＭＲ映像上で鮮明になった。血液の明るい信号は２時間維持されることができたが、明るい信号は２４時間後に示されなかった。これは、グルコース６−ホスフェートでキャッピングされた３ｎｍのナノ粒子の組成物が良好なＭＲ血液プール剤であることができることを意味する。
【０１１２】
（実施例１８）
クエン酸を使用する酸化鉄ナノ粒子の親水化の改質
表面上でオレイン酸でキャッピングされた酸化鉄ナノ粒子が実施例１の方法を使用して製造された。３ｎｍの酸化鉄ナノ粒子１００ｍｇをＴＨＦ（テトラヒドロフラン）８ｍｌ中に分散させた後、水２ｍｌ中のクエン酸ナトリウム４００ｍｇの水溶液と混合した。混合した溶液を攪拌させ、６０℃で４時間反応させた。冷却した後、混合溶液のＴＨＦの上部の相が分離され、表面上でクエン酸でキャッピングされた酸化鉄ナノ粒子の下部の相に水を加えて酸化鉄ナノ粒子の安定したコロイドを製造した。動的光散乱方法（Malvern Zetasizer Nano ZS）を使用して測定された、表面上でクエン酸を有するナノ粒子の流体力学的径は１０ｎｍであった。
【０１１３】
（実施例１９）
ベタイン（betaine）を使用する酸化鉄ナノ粒子の親水化の改質
表面上でオレイン酸でキャッピングされた酸化鉄ナノ粒子を実施例１の方法で製造した。３ｎｍの酸化鉄ナノ粒子１５０ｍｇをｎ−ヘキサン２５ｍｌ中に分散させ、エタノール２５ｍｌ中にベタイン（２−（トリメチルアザニウミル（trimethyl azaniumyl））アセテートハイドロクロライド）６００ｍｇと混合した。混合した溶液を攪拌させ、５０℃で８時間反応させた。冷却した後、溶媒を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して配位子交換されたナノ粒子を分離した。配位子交換されたナノ粒子ベタインに水を加えて酸化鉄ナノ粒子の安定したコロイドを製造した。動的光散乱方法（Malvern Zetasizer Nano ZS）を使用して測定された、表面上でベタインを有するナノ粒子の流体力学的径は７ｎｍであった。
【０１１４】
（実施例２０）
４ｎｍの酸化鉄ナノ粒子の合成
実施例６の方法を参照し、粒子成長率を調節して４ｎｍの酸化鉄ナノ粒子を合成した。より具体的に、４ｎｍのナノ粒子を次のように合成した。オレイン酸鉄錯体（iron oleate）１．８ｇ及びオレイン酸０．５７ｇを１−オクタデカン１０ｇと混合した後、１０℃／ｍｉｎで３１８℃まで昇温し、３０分間３１８℃にて反応させてから反応生成物を室温まで迅速に冷却した。その後、室温で冷却された生成物にエタノールを加えて沈殿させた後、４ｎｍの酸化鉄を生成した。
【０１１５】
（実施例２１）
親水化改質された酸化鉄ナノ粒子のＭＴＴ分析（assay）実験
湿潤大気３７℃及び５％ＣＯ２濃度下にて、ヒト乳癌細胞株、即ち、ＭＣＦ−７細胞を、１０％胎児血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（それぞれ１００Ｕ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌ、Gibco社製）を含むダルベッコ（Dulbecco）の改質されたイーグル培地（DMEM、Welgene）上で成長させた。細胞内の吸収を観察するために、ＭＣＦ−７細胞を８−ウェルチャンバースライド（８−well chamber slide）上で接種した後、培養された細胞を３ｎｍ及び１２ｎｍの酸化鉄ナノ粒子それぞれに混合して、ＰＯ−ＰＥＧで表面改質された。２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄してから４％パラホルムアルデヒドを使用して固定させた。共焦点（confocal）のレーザスキャニング顕微鏡（ＬＳＭ５１０、Carl Zeiss、Germany）を使用して蛍光像を得た。
【０１１６】
ナノ粒子の存在下で細胞の生存及び成長を分析するために、３−[４，５−ジメチルチアゾール−２−イル]−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ、Ｓｉｇｍａ）を使用して分析した。ＭＣＦ−７細胞を２００μＬの培地に１日間成長させた。成長させた細胞を、相違する濃度（例えば、０、１．５６、３．１３、６．２５、１２．５、２５、５０及び１００μｇＦｅ／ｍＬ）を有する表面上でＰＯ−ＰＥＧによりキャッピングされた３ｎｍ及び１２ｎｍのナノ粒子それぞれに混合した。混合物を一晩中培養した後、培養された混合物を、ＭＭＴ０．１ｍｇ／ｍｌを含む培地と１時間混合した。その後、培地を除去した後、沈殿されたホルマザン（formazan）をＤＭＳＯに溶解させた。VerseMaxTM マイクロプレート読み取り機（Molecular Devices）を使用して、５４０ｎｍでの吸光度を検出し、細胞生存度を認識した。
【０１１７】
図１８により、４ｎｍ及び１０ｎｍのナノ粒子は両方とも１００ｍｇ Ｆｅ／ｍｌに達する１００％のＭＣＦ−７の細胞生存度を示す。これはＰＯ−ＰＥＧでキャッピングされた二つのナノ粒子が前記濃度に達する細胞毒性を有することができないことを意味する。
【０１１８】
（実施例２２）
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光計
酸化鉄ナノ粒子１０ｍｇ／ｍｌ及びマトリックスとして使用された９−ニトロアントラセン１０ｍｇ／ｍｌをクロロホルム中に溶解した。ナノ粒子及び９−ニトロアントラセンを１：１００の相対比でブレンドした後、混合物の液滴（droplet）をＬＤＩ物質に加えた後、大気中に蒸発させた。物質はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光計（Voyager−DETM STR Biospectrometry Workstation、Applied Biosystems Inc．）に位置させ、レーザ照射させて線形モデル及びカチオン検出モデルそれぞれで５００〜３００，０００Ｄａの範囲でナノ粒子の質量を測定した。図１９は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを使用してナノ粒子の分子量の結果を示す。図１９の（ａ）は１．６ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ映像であり、（ｂ）はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを介して得た１．６ｎｍの酸化鉄の分析結果を示し、ここで、ナノ粒子は９，０００Ｄａの分子量を有し、（ｃ）は２．４ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ映像であり、（ｄ）はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを介して得た２．４ｎｍの酸化鉄の分析結果を示し、ここで、ナノ粒子は６５，０００Ｄａの分子量を有し、（ｅ）は熱重量分析装置（thermogravimetric analysis；ＴＧＡ）を介して１．６ｎｍの酸化鉄ナノ粒子のコア（core）部分の質量分析結果を示し、ここでコア質量は３５．８％であり、これは１．６ｎｍの粒子のそれぞれが３５．８％のコア分画を有しコアの分子量が３，３３０Ｄａであることを意味する。
【０１１９】
（実施例２３）
グルコース６−ホスフェート−エタノールアミンを使用する酸化鉄ナノ粒子の親水化の改質
（実施例２３−１）
グルコース６−ホスフェート−エタノールアミンの合成
グルコース６−ホスフェートナトリウム塩１ｇ、ＥＤＣ（１−エチル−３−[３−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミドハイドロクロライド）０．６８ｇ、及びＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）０．４ｇをＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）緩衝溶液１０ｍｌと混合した。混合した溶液を攪拌させて３０℃で３０分間反応させた。反応させた後、エタノールアミン（２−アミノエタノール）０．２２ｍｌを溶液と混合した後、３０℃で１２時間反応させた。ＭＥＳ緩衝溶液を除去した後、グルコース６−ホスフェート−エタノールアミンを得た。
【０１２０】
（実施例２３−２）
グルコース６−ホスフェート−エタノールアミンを使用する酸化鉄ナノ粒子の親水化の改質
表面上でオレイン酸でキャッピングされた酸化鉄ナノ粒子を実施例１の方法を使用して製造した。３ｎｍの酸化鉄ナノ粒子１００ｍｇをＴＨＦ（テトラヒドロフラン）１０ｍｌ中に分散した後、水２ｍｌの中でグルコース６−ホスフェート−エタノールアミン３００ｍｇの水溶液と混合した。混合した溶液を攪拌させて６０℃で４時間反応させた。冷却した後、混合溶液のＴＨＦの上部の相が分離され、表面上でグルコース６−ホスフェート−エタノールアミンでキャッピングされた酸化鉄ナノ粒子の下部の相に水を加えて酸化鉄ナノ粒子の安定したコロイドを製造した。表面上でグルコース６−ホスフェート−エタノールアミンでキャッピングされた３ｎｍのナノ粒子を使用する流体力学で酸化鉄ナノ粒子の安定したコロイドを製造した。動的光散乱方法（Malvern Zetasizer Nano ZS）を使用して測定された、表面上でグルコース６−ホスフェート−エタノールアミンを有するナノ粒子の流体力学的径は８ｎｍであった。
【０１２１】
（実施例２４）
グルコース６−ホスフェート−ＰＥＧを使用する酸化鉄ナノ粒子の親水化の改質
（実施例２４−１）
グルコース６−ホスフェート−ＰＥＧの合成
グルコース６−ホスフェートナトリウム塩１ｇ、ＥＤＣ（１−エチル−３−[３−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミドハイドロクロライド）０．６８ｇ、及びＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）０．４ｇをＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）緩衝溶液１０ｍｌと混合した。混合した溶液を攪拌させて３０℃で３０分間反応させた。反応させた後、ジエチルアミン０．２３ｍｌを溶液と混合した後３０℃で１２時間反応させた。反応後、前記溶液を、ｍＰＥＧ−ＣＯＯＨ（メトキシ−ポリエチレングリコール−カルボキシル、Ｍｎ：５０００）１７．７５ｇ、ＥＤＣ１．３６１ｇ、及びＮＨＳ０．８１７ｇをＭＥＳ緩衝溶液４０ｍｌと混合して製造されたＥＤＣ活性化されたｍＰＥＧ−ＣＯＯＨ溶液と混合した。混合した溶液を攪拌させ、３０℃で２４時間反応させた。透析過程により副産物を除去した後、ＤＩＷを除去してグルコース６−ホスフェート−ＰＥＧを得た。
【０１２２】
（実施例２４−２）
グルコース６−ホスフェート−ＰＥＧを使用する酸化鉄ナノ粒子の親水化の改質
表面上でオレイン酸でキャッピングされた酸化鉄ナノ粒子を実施例１の方法を使用して製造した。３ｎｍの酸化鉄ナノ粒子１００ｍｇをＴＨＦ（テトラヒドロフラン）１０ｍｌ中に分散させた後、水２ｍｌ中でグルコース６−ホスフェート−ＰＥＧ１ｇの水溶液と混合した。混合した溶液を攪拌させて６０℃で４時間反応させた。冷却した後、混合溶液のＴＨＦの上部の相が分離され、表面上でグルコース６−ホスフェート−ＰＥＧでキャッピングされた酸化鉄ナノ粒子の下部の相に水を加えて酸化鉄ナノ粒子の安定したコロイドを製造した。
表面上でグルコース６−ホスフェート−ＰＥＧでキャッピングされた３ｎｍのナノ粒子を使用する流体力学により酸化鉄ナノ粒子の安定したコロイドを製造した。動的光散乱方法（Malvern Zetasizer Nano ZS）を使用して測定された、表面上でグルコース６−ホスフェート−ＰＥＧを有するナノ粒子の流体力学的径は１４ｎｍであった。
【０１２３】
（比較例１）
昇温速度による粒径及び分布
オレイン酸鉄錯体１．８ｇ、オレイン酸０．５７ｇ、及びオレイルアルコール１．６ｇをジフェニルエーテル１０ｇと混合した後、３．３℃／ｍｉｎの昇温速度で２５０℃まで昇温し、２５０℃で３０分間成長させると、ほぼ６ｎｍのナノ粒子が混合された不均一なナノ粒子を合成する。それ以外は実施例１と同様にした。
【０１２４】
（比較例２）
昇温速度による粒径及び分布
オレイン酸鉄錯体１．８ｇ、オレイン酸０．５７ｇ、及びオレイルアルコール１．６ｇをジフェニルエーテル１０ｇと混合した後、５℃／ｍｉｎの昇温速度で２５０℃まで昇温し、２５０℃で３０分間成長させると、ほぼ６ｎｍのナノ粒子が混合された不均一なナノ粒子を合成する。それ以外は実施例１と同様にした。
【０１２５】
（比較例３）
１２ｎｍのナノ粒子の合成
１２ｎｍのナノ粒子は、「J．Park et al．Nat．Mater ２００４、４、８９１」に開示された方法と同様に合成する。オレイン酸鉄錯体１．８ｇとオレイン酸０．２８ｇを１−オクタデセン（octadecene）１０ｇと混合した後、３．３℃／ｍｉｎの昇温速度で３１８℃まで昇温し、３１８℃で３０分間成長させて合成した。図２０は合成されたナノ粒子を観察したＴＥＭ写真である。
【０１２６】
（比較例４）
ベヘン酸（Behenic acid）を用いた酸化鉄ナノ粒子の合成
バルキー（bulky）な界面活性剤を使用し、立体障害（steric hindrance）によりナノ粒子が大きく成長することを妨害して小さい粒径のナノ粒子を製造した。オレイン酸（oleic acid）より立体障害が大きいベヘン酸（behenic acid）を合成時に添加してナノ粒子が大きく成長することを妨害した。
【０１２７】
合成方法は、オレイン酸鉄錯体１．８ｇとベヘン酸０．３４ｇを１−オクタデセン（octadecene）１０ｇと混合した後、３．３℃／ｍｉｎの昇温速度で３１８℃まで昇温し、３１８℃で３０分間成長させて合成する方法を用いる。合成結果、１２ｎｍの粒径を有する酸化鉄ナノ粒子が観察され、これは立体障害（steric hindrance）が小さいオレイン酸で合成したものと同じ大きさである。その結果、オレイン酸鉄錯体の熱分解法の場合、立体障害（steric hindrance）を用いては酸化鉄ナノ粒子の粒径が調節されないことが分かる。図２１は合成されたナノ粒子を観察したＴＥＭ写真である。
【０１２８】
（比較例５）
７ｎｍの酸化鉄ナノ粒子の合成
７ｎｍのナノ粒子は、オレイン酸鉄錯体１．８ｇとオレイン酸０．５７ｇを１−オクタデセン１０ｇと混合した後、５℃／ｍｉｎの昇温速度で３１８℃まで昇温し、３１８℃で３０分間成長させて合成した。図２２は合成されたナノ粒子を観察したＴＥＭ写真である。
【０１２９】
（比較例６）
４ｎｍの酸化鉄ナノ粒子が凝集されている親水化カプセルの製造
４ｎｍの酸化鉄ナノ粒子（４０ｍｇ）とＰＬＧＡ（poly（lactic−co−glycolic acid））４０ｍｇをエチルアセテート溶液に分散させてからPluronicＲＦ１２７（BASF corporation、difunctional block copolymer）溶液４ｍｌと混合した後、攪拌してカプセル化した。ＴＥＭ観察結果（図８）、多数のナノ粒子が凝集された形態でカプセルに囲まれていることが分かった。ＤＬＳ（Dynamic Light Scattering、Maker：Malven）で測定した流体力学的径（z−average）は１１７ｎｍであった（図２３）。
【０１３０】
（比較例７）
１，２−ヘキサデカンジオール（１，２−hexadecanediol）を用いた合成
オレイン酸鉄錯体１．８ｇ、オレイン酸０．５７ｇ、及び１，２−ヘキサデカンジオール１．５５ｇをジフェニルエーテル１０ｇと混合した後、１０℃／ｍｉｎの昇温速度で２５０℃まで昇温し、２５０℃で３０分間成長させて合成する。それ以外は実施例１と同様にした。ＴＥＭ観察結果、若干不均一な６ｎｍのナノ粒子が合成される。オレイルアルコールの代わりに二つのヒドロキシル（hydroxyl）基を有する１，２−ヘキサデカンジオールで合成すると、低い温で熱分解されるが、４ｎｍの小さい大きさは得ることができなかった（図２４）。
【０１３１】
以上、本発明では特定された事項と限定された実施例及び図面によって説明したが、これは本発明をより全般的に理解するために提供されたものに過ぎず、本発明は前記の実施例に限定されるものではなく、本発明が属する分野において通常の知識を有した者であればこのような記載から様々な修正及び変形を行うことができる。
【０１３２】
従って、本発明の思想は前記実施例に限定されず、後述する特許請求の範囲のみならず本特許請求の範囲と均等かつ等価的な変形がある全てのものは本発明の思想の範疇に属するといえる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年12月6日(2012.12.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鉄を中心原子とし、４〜２５の炭素原子（Ｃ４〜Ｃ２５）を含むカルボキシレート基（carboxylate）が前記中心原子に配位子として結合されている鉄錯体を、Ｃ４〜Ｃ２５を含む脂肪酸及びＣ４〜Ｃ２５を含む脂肪族アルコール又はＣ４〜Ｃ２５を含む脂肪族アミンと１５０℃〜３５０℃にて反応させて酸化鉄ナノ粒子を製造する段階を含む酸化鉄ナノ粒子の製造方法。
【請求項２】
製造された酸化鉄ナノ粒子を冷却し、洗浄して得られた沈殿物を有機溶媒に分散させる段階をさらに含む請求項１に記載の酸化鉄ナノ粒子の製造方法。
【請求項３】
酸化鉄ナノ粒子の粒径は４ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１又は２に記載の酸化鉄ナノ粒子の製造方法。
【請求項４】
鉄錯体はＣ１０〜Ｃ２２を含む脂肪酸基が配位子として結合されたことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の酸化鉄ナノ粒子の製造方法。
【請求項５】
鉄錯体はオレイン酸鉄錯体（iron oleate）であることを特徴とする請求項４に記載の酸化鉄ナノ粒子の製造方法。
【請求項６】
脂肪酸及び脂肪族アルコール又は脂肪族アミンは、それぞれ１０〜２２の炭素原子（Ｃ１０〜Ｃ２２）を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の酸化鉄ナノ粒子の製造方法。
【請求項７】
脂肪酸及び脂肪族アルコールは、それぞれオレイン酸（oleic acid）及びオレイルアルコール（oleyl alcohol）であり、脂肪族アミンはオレイルアミン（oleyl amine）であることを特徴とする請求項６に記載の酸化鉄ナノ粒子の製造方法。
【請求項８】
酸化鉄ナノ粒子を製造する段階は、室温から２００〜３１０℃まで５℃／ｍｉｎ以上の昇温速度で加温し、２００〜３１０℃にて５〜６０分間反応することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の酸化鉄ナノ粒子の製造方法。
【請求項９】
昇温速度は１０℃／ｍｉｎ以上であることを特徴とする請求項８に記載の酸化鉄ナノ粒子の製造方法。
【請求項１０】
酸化鉄の大きさは、脂肪酸及び脂肪族アルコール又は脂肪族アミンのモル比を調節することにより調節されることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の酸化鉄ナノ粒子の製造方法。
【請求項１１】
４ｎｍ以下の平均粒径を有し、２０Ｋ以上の温度で常磁性又は擬似常磁性を有し、前記平均粒径±１ｎｍの範囲内の均一な粒径を有する酸化鉄ナノ粒子。
【請求項１２】
請求項１１に記載の酸化鉄ナノ粒子を含む磁気共鳴画像（ＭＲＩ）Ｔ１造影剤。
【請求項１３】
酸化鉄ナノ粒子の表面は、リン脂質ポリエチレングリコール（phospolipid polyethyleneglycol）（phospholipid−ＰＥＧ）、ポリエチレングリコール−ホスフェート（ＰＯ−ＰＥＧ）、モノサッカライドホスフェート若しくはその誘導体、クエン酸又はベタイン（betaine）で親水性に改質されることを特徴とする請求項１２に記載の造影剤。
【請求項１４】
酸化鉄ナノ粒子の表面は、グルコース６−ホスフェート、グルコース６−ホスフェート−エタノールアミン又はグルコース６−ホスフェート−ポリエチレングリコールで改質されることを特徴とする請求項１２に記載の造影剤。
【請求項１５】
ａ）２０Ｋ以上の温度で常磁性あるいは擬似常磁性を有し、
ｂ）粒径は１ｎｍ〜４ｎｍであり、
ｃ）表面は親水性物質で囲まれており、
ｄ）粒子同士の凝集が生じないこと
を特徴とする酸化鉄ナノ粒子。
【請求項１６】
親水性物質は、リン脂質ポリエチレングリコール（phospolipid polyethyleneglycol）、ポリエチレングリコール−ホスフェート（ＰＯ−ＰＥＧ）、グルコース６−ホスフェート、グルコース６−ホスフェート−エタノールアミン、グルコース６−ホスフェート−ＰＥＧ、クエン酸又はベタインである請求項１５に記載の酸化鉄ナノ粒子。
【請求項１７】
請求項１５又は１６に記載の酸化鉄ナノ粒子が水に分散されている酸化鉄ナノ粒子コロイド。
【請求項１８】
請求項１５又は１６に記載の酸化鉄ナノ粒子を含む磁気共鳴画像Ｔ１造影剤。
【請求項１９】
請求項１７に記載の酸化鉄ナノ粒子コロイドを含む磁気共鳴画像Ｔ１造影剤。
【請求項２０】
鉄を中心原子とし、Ｃ４〜Ｃ２５を含むカルボキシレート基（carboxylate）が配位子として結合されている鉄錯体をＣ４〜Ｃ２５を含む脂肪酸と、３〜３．５℃／ｍｉｎの昇温速度で２９０〜３１０℃にて反応させて酸化鉄ナノ粒子を製造する段階を含む酸化鉄ナノ粒子の製造方法。
【請求項２１】
鉄を中心原子とし、Ｃ４〜Ｃ２５を含むカルボキシレート基（carboxylate）が配位子として結合されている鉄錯体を、Ｃ４〜Ｃ２５を含む脂肪酸と２６５〜２７５℃にて１次反応させた後、３１５〜３２５℃にて２次反応させて酸化鉄ナノ粒子を製造する段階を含む酸化鉄ナノ粒子の製造方法。
【国際調査報告】
2013534893.tif 000029
2013534893.tif 000030