(57)【要約】  本発明は、細胞のアポトーシス、特にＦａｓレセプターを介した細胞のアポトーシスを阻害する、ＤＡＸＸおよびＦＡＤＤタンパク質の断片に関する。本発明はまた、前記抗アポトーシス断片の誘導体、前記断片を含むコンジュゲート、前記断片を含む医薬組成物に関し、アポトーシスに関連する疾患および状態の治療または予防における、前記断片、誘導体、コンジュゲートおよびそれらの医薬組成物の医療用途に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
−配列番号１のＤＡＸＸタンパク質の１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４個の連続するアミノ酸残基の断片であって、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む、断片、または
−配列番号８のＦＡＤＤタンパク質の９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７個の連続するアミノ酸残基の断片であって、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む、断片
からなり、細胞のアポトーシスを阻害することが可能であるペプチド。
【請求項２】
ＤＡＸＸタンパク質断片であり、かつ配列番号５または配列番号１７〜４４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ＦＡＤＤタンパク質断片であり、かつ配列番号１２または配列番号９または配列番号４５〜５７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチドのペプチド模倣物。
【請求項５】
細胞透過性ペプチドに連結された、請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項４に記載のペプチド模倣物を含む、コンジュゲート。
【請求項６】
前記ペプチドまたは前記ペプチド模倣物が、リンカーを介して細胞透過性ペプチドに連結されている、請求項５に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
前記細胞透過性ペプチドが、Ｔａｔ、ＲＸＲ、ＢｐｅｐおよびＰｉｐ２ｂからなる群より選択される、請求項５または請求項６に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０または配列番号６１に示されるアミノ酸配列からなる、請求項７に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
有効量の少なくとも１種の請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチドまたは少なくとも１種の請求項４に記載のペプチド模倣物または少なくとも１種の請求項５から８のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、少なくとも１種の薬学的に許容される担体または添加剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１０】
少なくとも１種の追加の生物学的に活性な薬剤をさらに含む、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記少なくとも１種の追加の生物学的に活性な薬剤が、シクロスポリンＡ、ＢＨ４およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ヒトまたは動物の身体の治療方法で使用するための、請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチド、請求項４に記載のペプチド模倣物、請求項５から８のいずれか一項に記載のコンジュゲート、または請求項８から１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ヒトまたは動物の身体において細胞のアポトーシスを阻害する方法で使用するための、請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチド、または請求項４に記載のペプチド模倣物、請求項５から８のいずれか一項に記載のコンジュゲート、または請求項８から１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ヒトまたは動物の身体における、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、脳梗塞、臓器移植、心臓インターベンション（体外循環および一時的血管閉塞）または急性循環動揺（ショック状態）の治療方法で使用するための、請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチド、または請求項４に記載のペプチド模倣物、請求項５から８のいずれか一項に記載のコンジュゲート、または請求項９から１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ヒトまたは動物の身体における虚血、特に心臓虚血、腎臓虚血、虚血性大腸炎、腸間膜虚血、脳虚血、四肢虚血または皮膚虚血の治療方法で使用するための、請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチド、または請求項４に記載のペプチド模倣物、請求項５から８のいずれか一項に記載のコンジュゲート、または請求項９から１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
ヒトまたは動物の身体における再灌流障害の治療方法で使用するための、請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチド、または請求項４に記載のペプチド模倣物、請求項５から８のいずれか一項に記載のコンジュゲート、または請求項９から１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記方法が、前記ヒトまたは動物の身体にシクロスポリンＡおよび／またはＢＨ４を投与するステップをも含む、請求項１２から１６のいずれか一項に記載のペプチド、その誘導体、そのコンジュゲートまたはその医薬組成物。
【請求項１８】
対象においてアポトーシスに関連する疾患または状態を治療する方法であって、
有効量の、少なくとも１種の請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項４に記載のペプチド模倣物または請求項５から８のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたは請求項９から１１のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１９】
シクロスポリンＡ、ＢＨ４およびそれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１種の追加の生物学的に活性な薬剤を前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記アポトーシスに関連する疾患または状態が、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、脳梗塞、臓器移植、心臓インターベンション、急性循環動揺、再灌流障害および虚血からなる群より選択される、請求項１８または１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本特許出願は、２０１０年１１月１８日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／００３１５８に対する優先権を主張し、この出願はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、アポトーシス阻害剤および特に医療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
冠動脈性心疾患は、世界中の主要な死亡原因であり、年間、男性で３８０万人の死亡および女性で３４０万人の死亡を占める。近年のように、集団がより高齢になりかつ合併症（例えば、肥満およびメタボリックシンドローム）がより蔓延してくると、虚血性心疾患により引き起こされる多大な公的医療の負担がさらに増加することが予想される（Ｙｅｌｌｏｎら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，２００７；３５７：１１２１〜１１３５で概説される）。
【０００４】
冠動脈性心疾患は、心筋および周辺組織への適切な血液供給を提供する冠状循環の不全をいう。冠動脈性心疾患の最も一般的な原因は、冠状動脈の壁内のアテローム性プラークの蓄積（即ち、脂肪沈着）である。冠状動脈の閉塞は、心臓への血流を制限し、心筋細胞の虚血（即ち、酸素の欠乏によって二次的に生じる細胞の飢餓）につながり、心筋細胞死を引き起こし得るものであり、これは、心筋梗塞（ＭＩ）または急性心筋梗塞（ＡＭＩ）と呼ばれ、一般に心臓発作として知られている。ＡＭＩは、欧州および米国の両方における死亡の主要原因であり、未だ高頻度（米国では１年に１５０万を上回る新たな症例）であり、障害をもたらす（心不全につながる）疾患である。梗塞サイズは、ＡＭＩ後の心筋の機能回復および死亡率の主要な決定因子である。現在、梗塞サイズを抑制するための最も有効な方法は、可能な限り速やかに冠状動脈形成術または血栓溶解を使用することによって、危険にさらされた心筋を再灌流させること、および抗血小板療法を使用して冠状動脈の再閉塞を予防することである。再灌流、即ち虚血心筋への血流の回復は、血栓を溶解させる血栓溶解治療によって、または経皮的冠状動脈形成術による閉塞した動脈の拡張によって達成される。再灌流は、一般に心筋細胞および心機能の救済に必要である。しかし、再灌流は、「再灌流障害」につながる事象のカスケードを開始させる。これは、バイパス手術中の心筋保護下の心停止からの回復後にも生じる。再灌流障害は、非再灌流現象および心筋気絶（心筋の収縮力の可逆的喪失）につながる不整脈、内皮機能不全を特徴とする。
【０００５】
再灌流障害は、心筋再灌流直前には生存能力があった心臓細胞のアポトーシス死という結果をもたらす。心筋虚血／再灌流の間の、高度に制御された形態の細胞死の関与は、再灌流期における新たな治療の介入につながり得る。しかし、心筋虚血／再灌流の間に関与するアポトーシスシグナル伝達経路は、未だｉｎ  ｖｉｖｏで完全に説明されてはいない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、アポトーシス（即ち、「プログラム細胞死」）を阻害するための、および特に心筋梗塞および再灌流障害を治療するための、新規治療法を見出すことは、心臓機能を保護し、生命を守るための真の挑戦となる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、Ｆａｓシグナル伝達経路を阻害することによって心筋梗塞後の心臓細胞のアポトーシスを減少させることが可能であるという知見に基づく。Ｆａｓレセプターは、ＦａｓＬ（Ｆａｓリガンド）への結合によって三量体化し、ＦＡＦ−１（Ｆａｓ関連因子−１）、ＦＡＤＤ（Ｆａｓ関連デスドメイン）、ＤＡＸＸ（デスドメイン関連タンパク質）、ＦＡＰ−１、ＦＬＡＳＨ（ＦＬＩＣＥ関連巨大分子（ＦＬＩＣＥ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｈｕｇｅ））およびＲＩＰ（レセプター共役タンパク質）などのシグナル伝達アダプターと相互作用するＤＤ（デスドメイン）と呼ばれる細胞質ドメインを介してアポトーシスを誘導する。ＤＡＸＸおよびＦＡＤＤは、Ｆａｓに独立して結合し、別個のアポトーシス経路を活性化する。ＤＡＸＸは、ＪＮＫキナーゼカスケードを活性化することによってＦａｓ媒介性のアポトーシスを増強でき、ｃ−Ｊｕｎなどの転写因子のリン酸化および活性化という結果をもたらす。対照的に、ＦＡＤＤは、シグナル伝達カスパーゼのカスケードを介して、ＣｙｔｏＣ（シトクロム−Ｃ）およびＤｉａｂｌｏとも呼ばれるＳＭＡＣ（カスパーゼの第二のミトコンドリア由来アクチベータ（Ｓｅｃｏｎｄ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  Ｃａｓｐａｓｅｓ））のようなミトコンドリアのアポトーシス促進因子の放出を誘発する。
【０００８】
本発明者らは、ＦａｓレセプターとＤＡＸＸ（配列番号１）またはＦＡＤＤ（配列番号８）との相互作用を阻害することで心筋梗塞後の心臓細胞のアポトーシスが顕著に低下することを示した。さらに、本発明者らは、予想外にも、ＤＡＸＸおよびＦＡＤＤの小断片が、それぞれ全長タンパク質ＤＡＸＸおよびＦＡＤＤの抗アポトーシス能を保持することを見出した。
【０００９】
したがって、本発明は、
−配列番号１のＤＡＸＸタンパク質の１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４個連続するアミノ酸残基の断片であって、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む断片、または
−配列番号８のＦＡＤＤタンパク質の９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７個連続するアミノ酸残基の断片であって、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む断片
からなるペプチドであって、細胞のアポトーシスを阻害することが可能である、ペプチドに関する。
【００１０】
特定の実施形態において、本発明に係る抗アポトーシスペプチドは、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＤＡＸＸタンパク質断片である。他の実施形態において、抗アポトーシスペプチドは、配列番号２１〜４４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるＤＡＸＸ断片である。
【００１１】
他の実施形態において、本発明に係る抗アポトーシスペプチドは、配列番号１２または配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるＦＡＤＤタンパク質断片である。他の実施形態において、抗アポトーシスペプチドは、配列番号４５〜５７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるＦＡＤＤ断片である。
【００１２】
別の態様において、本発明は、本発明に係る抗アポトーシスペプチドのペプチド模倣物に関する。
【００１３】
さらに別の態様において、本発明は、細胞透過性ペプチド（Ｃｅｌｌ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）に連結された、本発明に係る抗アポトーシスペプチドまたはペプチド模倣物を含むコンジュゲートを提供する。細胞透過性ペプチドは、Ｔａｔ、ＲＸＲ、ＢｐｅｐまたはＰｉｐ２ｂであってよい。
【００１４】
特定の実施形態において、細胞透過性ペプチドは、リンカーを介してペプチドまたはペプチド模倣物に連結される。
【００１５】
特定の実施形態において、細胞透過性ペプチドは、Ｔａｔ、ＲＸＲ、ＢｐｅｐおよびＰｉｐ２ｂからなる群より選択される。
【００１６】
特に、特定の好ましい実施形態において、コンジュゲートは、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０または配列番号６１に示されるアミノ酸配列からなる。
【００１７】
さらに別の態様において、本発明は、少なくとも１種の薬学的に許容される担体または添加剤と、有効量の本発明に係る少なくとも１種のペプチドまたは少なくとも１種のペプチド模倣物または少なくとも１種のコンジュゲートとを含む、医薬組成物に関する。
【００１８】
特定の実施形態において、本発明に係る医薬組成物は、少なくとも１種の別の生物学的に活性な薬剤をさらに含む。特に、生物学的に活性な薬剤は、シクロスポリンＡ、ＢＨ４およびそれらの組合せからなる群より選択され得る。
【００１９】
さらに別の態様において、本発明は、ヒトまたは動物の身体の治療方法で使用するための、特にヒトまたは動物の身体において細胞のアポトーシスを阻害する方法で使用するための、本発明に係るペプチド、ペプチド模倣物、コンジュゲートおよび医薬組成物を提供する。
【００２０】
特定の実施形態において、本発明に係るペプチド、ペプチド模倣物、コンジュゲートおよび医薬組成物は、ヒトまたは動物の身体における急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、脳梗塞、臓器移植、心臓インターベンション（体外循環および一時的血管閉塞）または急性循環動揺（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）（ショック状態）の治療方法で使用される。
【００２１】
他の実施形態において、本発明に係るペプチド、ペプチド模倣物、コンジュゲートおよび医薬組成物は、ヒトまたは動物の身体における虚血、特に心臓虚血、腎臓虚血、虚血性大腸炎、腸間膜虚血、脳虚血、四肢虚血または皮膚虚血の治療方法で使用される。
【００２２】
さらに他の実施形態において、本発明に係るペプチド、ペプチド模倣物、コンジュゲートおよび医薬組成物は、ヒトまたは動物の身体における再灌流障害の治療方法で使用される。
【００２３】
関連の態様において、本発明は、有効量の、本発明に係る少なくとも１種のペプチドまたは少なくとも１種のペプチド模倣物または少なくとも１種のコンジュゲートまたは少なくとも１種の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む、対象においてアポトーシスに関連する疾患または状態を治療する方法も提供する。
【００２４】
特定の実施形態において、その方法は、シクロスポリンＡ、ＢＨ４およびそれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１種の追加の生物学的に活性な薬剤を前記対象に投与するステップをさらに含む。
【００２５】
上述のように、これらの治療方法において、アポトーシスに関連する疾患または状態は、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、脳梗塞、臓器移植、心臓インターベンション、急性循環動揺、再灌流障害および虚血からなる群より選択され得る。
【００２６】
本発明のこれらおよび他の目的、利点および特徴は、以下の好ましい実施形態の詳細な説明を読んだ当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、ＳＰＯＴ合成によるＤＡＸＸエピトープの決定を示す図である。（Ａ）ＤＡＸＸのアミノ酸配列を、重複ペプチドアレイ（ペプスキャン；３アミノ酸シフトさせた１５ｍｅｒのペプチド）に切断し、酵素結合ブロットで分析した。黒の長方形は、対応するエピトープ配列による４つの最も明るいスポットを示す。インキュベーション条件：ＦａｓレセプターのＨｉｓタグ化細胞内領域［１０μｇ／ｍｌ］；抗体：抗Ｈｉｓ−（マウス）（Ｓｉｇｍａ  Ｈ１０２９；  １：６，０００）／抗マウス−ＨＲＰ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ４０１２０７；  １：２，０００）、曝露時間：１分間。（Ｂ）１６ｍｅｒのＫＫＳＲＫＥＫＫＱＴＧＳＧＰＬＧ（＝配列番号５のＤＡＸＸｐ）を含むヒトＤＡＸＸ配列の、他の種（マウス、ラット、イヌ（ＣＡＮＦＡ）およびミドリザル（ＣＨＬＡＥ））のＤＡＸＸ配列とのアラインメント。
【図２】図２は、ＳＰＯＴ合成によるＤＡＸＸエピトープ（＝ＤＡＸＸｐ）の最適長の決定を示す図である。（Ａ）ＤＡＸＸｐ−２１１ペプチドおよびＤＡＸＸｐ−２０９ペプチド（それぞれ、配列番号２および配列番号３のもの）を、Ｎ末端、Ｃ末端、およびＮ末端とＣ末端の両方で１アミノ酸残基分ずつ連続的に短くし、酵素結合ブロットを使用して分析した。矢印で示したスポットは、最も高いシグナル強度（ＢＬＵ）を示した。インキュベーション条件：ＦａｓレセプターのＨｉｓタグ化細胞内領域［１０μｇ／ｍｌ］；抗体：抗Ｈｉｓ−（マウス）（Ｓｉｇｍａ  Ｈ１０２９；  １：６，０００）／抗マウス−ＨＲＰ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ４０１２０７；  １：２，０００）、曝露時間：１分間。（Ｂ）最適なＤＡＸＸペプチド配列を決定するための、最も明るいスポットに対応するＤＡＸＸｐ−２１１およびＤＡＸＸｐ−２０９両ペプチド配列のアラインメント。
【図３】図３は、Ｔａｔ−ＤＡＸＸｐおよびＰｉｐ２ｂ−ＤＡＸＸｐのプロテアーゼ能の評価を示す図である。（Ａ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＢｉｏＷｅｓｔ）および（Ｂ）新たに調製したマウス血清（ＭＳ）におけるＴａｔ−ＤＡＸＸｐコンジュゲートおよびＰｉｐ２ｂ−ＤＡＸＸｐコンジュゲートの安定性測定。ペプチドを、２０％血清と共に、３７℃で０時間、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間および４８時間にわたってインキュベートし、５０μｌのインキュベーション混合物を、Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ（５０／５０）中の１０％ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）１００μｌ中で沈殿させた。サンプルを混合し、−２０℃に維持した。沈殿した血清タンパク質を遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、１０分間）によって分離し、上清を逆相ＨＰＬＣによって分析した（ｍＶ＊ｓｅｃでピーク面積を測定）。各条件についてｎ≧２。マウス血清中での２時間のインキュベーション後、７０％を上回るペプチドがまだインタクトであるが、２４時間後には全てのペプチドが分解している。
【図４】図４は、細胞分布がインキュベーション時間に依存することを示す図である。初代心筋細胞を、ＣＦ標識化Ｔａｔ−ＤＡＸＸｐコンジュゲート（緑色蛍光）の１μＭ溶液と共に、１時間、４時間または６時間インキュベートした。細胞核を、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素（青）で染色した。白いバーは１０μｍを示す。１時間のインキュベーション後のＣＦ−Ｔａｔ−ＤＡＸＸｐの細胞内分布により、サイトゾル中の断続的なパターン（これは、エンドサイトーシスによる内在化後の、ペプチドのエンドソーム捕捉の特徴である）が明らかになり、核局在化は検出されなかった。４時間のインキュベーション後、ＣＦ−Ｔａｔ−ＤＡＸＸｐは、エンドソーム小胞から脱出することができるようであり、より拡散性の標識パターンを生じる。さらに、核内蓄積が観察された。より長いインキュベーション時間（６時間）の後、ＣＦ標識化ペプチドは、大きい小胞（白の矢印）中に封入され、細胞から排出された。
【図５ＡＢ】図５ＡＢは、ＣＰＰおよびＣＰＰコンジュゲートの抗アポトーシス活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価を示す図である。（Ａ）Ｃ２Ｃ１２細胞、（Ｂ）初代心筋細胞におけるＤＮＡ断片化のワークフローおよび定量化。データは１００％ＳＴＳに対して正規化した。示されるデータはｎ≧５での平均±ＳＥＭである。細胞を２４ウェルプレートに播種し、一晩増殖させた。次の日、細胞を、ＳＴＳ単独またはＳＴＳ＋１μＭペプチド（ＯｐｔｉＭＥＭ中）と共にインキュベートした（各細胞についてのＳＴＳ濃度およびインキュベーション時間は図中に示す）。その後溶液を除去し、完全培地で置き換え、４０時間さらにインキュベートした。再生期の後、細胞を溶解させ、ＤＮＡ断片化を製造業者の指示（Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ検出ＥＬＩＳＡＰＬＵＳキット−Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に従って検出した。
【図５ＣＤ】図５ＣＤは、ＣＰＰおよびＣＰＰコンジュゲートの抗アポトーシス活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価を示す図である。（Ｃ）Ｈ９ｃ２細胞および（Ｄ）ＮＧ１０８−１５細胞におけるＤＮＡ断片化のワークフローおよび定量化。データは１００％ＳＴＳに対して正規化した。示されるデータはｎ≧５での平均±ＳＥＭである。細胞を２４ウェルプレートに播種し、一晩増殖させた。次の日、細胞を、ＳＴＳ単独またはＳＴＳ＋１μＭペプチド（ＯｐｔｉＭＥＭ中）と共にインキュベートした（各細胞についてのＳＴＳ濃度およびインキュベーション時間は図中に示す）。その後溶液を除去し、完全培地で置き換え、４０時間さらにインキュベートした。再生期の後、細胞を溶解させ、ＤＮＡ断片化を製造業者の指示（Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ検出ＥＬＩＳＡＰＬＵＳキット−Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に従って検出した。
【図６】図６は、初代心筋細胞に対するＴａｔ−ＤＡＸＸｐ配列のバリアントの抗アポトーシス活性を示す図である。図５の説明文に記載のとおり、ＳＴＳに対する抗アポトーシス作用について、ＤＡＸＸｐ配列の種々のアナログ（表２を参照のこと）を評価した（Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ検出ＥＬＩＳＡＰＬＵＳキット−Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）。どのアナログも初代心筋細胞を保護することができず、この事実により、１６ｍｅｒのＤＡＸＸｐが、最も高い心保護効果のための最適な長さと配列とを有することが確認される。
【図７】図７は、Ｃ２Ｃ１２細胞、初代心筋細胞およびＨ９ｃ２に対する抗アポトーシス活性に関する、マウス／ラットＤＡＸＸｐ配列とヒトＤＡＸＸｐ配列との比較を示す図である。ＳＴＳに対する抗アポトーシス作用について、ラットＤＡＸＸｐ配列と同一（図１Ｂを参照のこと）であるＴａｔにコンジュゲートしたマウスＤＡＸＸｐ配列（Ｔａｔ−ｍＤＡＸＸｐ−配列番号６１）をヒト構築物（Ｔａｔ−ＤＡＸＸｐ）と比較した（Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ検出ＥＬＩＳＡＰＬＵＳキット−Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）。使用したＣ２Ｃ１２細胞および初代心筋細胞はマウス由来であり、Ｈ９ｃ２細胞はラット由来であった。全ての細胞において、マウスまたはラットの細胞型であることから、マウスＴａｔ−ｍＤＡＸＸｐ配列の使用による抗アポトーシス効果の増加が観察された。
【図８】図８は、ＦＡＤＤｐ１５および心筋細胞におけるその抗アポトーシス効果の決定を示す図である。（Ａ）ＦＡＤＤのタンパク質配列を、重複ペプチドアレイ（ペプスキャン；３アミノ酸シフトさせた１５ｍｅｒのペプチド）に切断し、酵素結合ブロットを使用して分析した。黒の長方形は、３つの最も明るいスポットを示し、対応するエピトープ配列、スポット番号およびシグナル強度（ＢＬＵ）が下に示される。（Ｂ）ＦＡＤＤｐ−１１のペプチド配列（＝ＦＡＤＤｐ１５＝配列番号９）を、Ｃ末端、Ｎ末端、またはＮ末端とＣ末端の両方で１アミノ酸残基分ずつ連続的に短くし、酵素結合ブロットを使用して分析した。矢印で示したスポットは、最も高いシグナル強度（ＢＬＵ）を示した。最も短いＦＡＤＤエピトープ（配列ＫＲＫＬＥＲＶＱＳを有する９ｍｅｒ（＝ＦＡＤＤｐ＝配列番号１２））は、スポット番号２４に対応した。インキュベーション条件：ＦａｓレセプターのＨｉｓタグ化細胞内領域［１０μｇ／ｍｌ］；抗体：抗Ｈｉｓ−（マウス）（Ｓｉｇｍａ  Ｈ１０２９；１：６，０００）／抗マウス−ＨＲＰ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ４０１２０７；  １：２，０００）、曝露時間：１分間。
【図９】図９は、初代心筋細胞およびＨ９ｃ２細胞における抗アポトーシス活性に関する、ＦＡＤＤｐ構築物とＴａｔ−ＤＡＸＸｐとの比較を示す図である。（Ａ）初代心筋細胞および（Ｂ）Ｈ９ｃ２細胞におけるＤＮＡ断片化の定量化。データは１００％ＳＴＳに対して正規化した。示されるデータはｎ≧５の平均±ＳＥＭである。細胞を２４ウェルプレートに播種し、一晩増殖させた。次の日、細胞を、ＳＴＳ単独またはＳＴＳ＋１μＭペプチド（ＯｐｔｉＭＥＭ中）と共にインキュベートした（ＳＴＳ濃度を図中に、インキュベーション時間を図５中に示す）。その後溶液を除去し、完全培地で置き換え、４０時間さらにインキュベートした。再生期の後、細胞を溶解させ、ＤＮＡ断片化を製造業者の指示に従って検出した（Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ検出ＥＬＩＳＡＰＬＵＳキット−Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）。短いＴａｔ−ＦＡＤＤｐ配列は、Ｔａｔ−ＤＡＸＸｐよりも効果が低いことが見出されたが、より長いＴａｔ−ＦＡＤＤｐ１５は、同等（Ｈ９ｃ２において）または増大した（初代心筋細胞において）抗アポトーシス効果を有した。
【図１０】図１０は、初代心筋細胞およびＨ９ｃ２細胞における、Ｔａｔ−ＤＡＸＸｐおよびＴａｔ−ＦＡＤＤｐ１５単独ならびにそれらの組合せの比較を示す図である。０．５μＭ  Ｔａｔ−ＤＡＸＸｐと０．５μＭ  Ｔａｔ−ＦＡＤＤｐ１５の両方とのインキュベーションは、ペプチド単独１μＭと比較した場合、同じかまたはより高い抗アポトーシス効果をもたらすことが見出された。さらに、１μＭの両ペプチドとのインキュベーションは、両方の細胞種において最も高い保護をもたらし、これにより、Ｔａｔ−ＤＡＸＸｐとＴａｔ−ＦＡＤＤｐ１５との組合せが有望な適用である可能性を示唆している。
【図１１】図１１は、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験プロトコールを示す図である。Ｃ５７Ｂｌ６マウスが、心筋虚血−再灌流（ＩＲ）手術プロトコールを受けた。黒い四角は、マウスが供された虚血の期間を示す。梗塞サイズまたは細胞死の測定を、各プロトコールについて手術の最後に実施した（↑で示す）。ＩＲ６０’：４０分間の虚血、６０分間の再灌流。ＩＲ２４ｈ：４０分間の虚血および２４時間の再灌流。
【図１２】図１２は、ＩＲ６０’に供したマウスにおけるＴａｔ−ＤＡＸＸｐ（１ｍｇ／ｋｇ−ＩＶ）の心保護効果を示す図である。梗塞サイズ（虚血領域（ａｒｅａ  ａｔ  ｒｉｓｋ）の％で）およびＥＬＩＳＡによって決定したヌクレオソーム間ＤＮＡ断片化を、ＩＲ６０’に供し、Ｔａｔ、Ｔａｔ−ＤＡＸＸｐまたはＴａｔ−ｓｃｒＤＡＸＸｐ（１ｍｇ／ｋｇ）ならびにＤＡＸＸｐ（１０ｍｇ／ｋｇ）で処理した（再灌流５分前に静脈内注射（ＩＶ））マウスにおいて定量化した。平均±ＳＥＭを、（Ａ）：虚血領域／ＬＶ重量（左心室）、（Ｂ）：梗塞サイズ（虚血領域の％）および（Ｃ）：ＬＶ組織の虚血部分対非虚血部分における可溶性ヌクレオソームの比に対応する（Ｉ／ＮＩ比）、についてプロットした。統計分析は、複数比較のためのＮｅｕｍａｎ−Ｋｅｕｌｓポスト試験と共にＯｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡを使用して実施した（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア）。対Ｔａｔ−ＤＡＸＸｐでのＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１およびＰ＜０．００１を、それぞれ＊、＊＊および＊＊＊で示した。Ｐ＞０．０５に対してはＰ＝ｎｓ（有意差なし）。
【図１３】図１３は、ＩＲ６０’に供したマウスにおけるＴａｔ−ＤＡＸＸｐおよびＤＡＸＸｐに対する用量反応を示す図である。梗塞サイズ（虚血領域の％）およびＥＬＩＳＡによって決定したヌクレオソーム間ＤＮＡ断片化を、ＩＲ６０’に供し、再灌流５分前に静脈内注射したＴａｔ（１ｍｇ／ｋｇ）、Ｔａｔ−ＤＡＸＸｐ（０．１、１および１０ｍｇ／ｋｇ）またはＤＡＸＸｐ（０．１、１および１０ｍｇ／ｋｇ）で処理したマウスにおいて定量化した。平均±ＳＥＭを、（Ａ）：虚血領域／ＬＶ重量（左心室）、（Ｂ）：梗塞サイズ（虚血領域の％）および（Ｃ）：ＬＶ組織の虚血部分  対  非虚血部分における可溶性ヌクレオソームの比に対応する（Ｉ／ＮＩ比）についてプロットした。
【図１４】図１４は、ＩＲ２４ｈに供したマウスにおけるＴａｔ−ＤＡＸＸｐ（１ｍｇ／ｋｇ−ＩＶ）の心保護効果を示す図である。梗塞サイズ（虚血領域の％）およびＥＬＩＳＡによって決定したヌクレオソーム間ＤＮＡ断片化を、ＩＲ２４ｈに供し、Ｔａｔ、Ｔａｔ−ＤＡＸＸｐまたはＴａｔ−ｓｃｒＤＡＸＸｐ（１ｍｇ／ｋｇ）ならびにＤＡＸＸｐ（１０ｍｇ／ｋｇ）で処理した（再灌流５分前にＩＶ注射）マウスにおいて定量化した。平均±ＳＥＭを、（Ａ）：虚血領域／ＬＶ重量（左心室）、（Ｂ）：梗塞サイズ（虚血領域の％）および（Ｃ）：ＬＶ組織の虚血部分  対  非虚血部分における可溶性ヌクレオソームの比に対応する（Ｉ／ＮＩ比）、についてプロットした。統計分析は、複数比較のためのＮｅｕｍａｎ−Ｋｅｕｌｓポスト試験と共にＯｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡを使用して実施した（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア）。対Ｔａｔ−ＤＡＸＸｐでのＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１およびＰ＜０．００１を、それぞれ＊、＊＊および＊＊＊で示した。Ｐ＞０．０５に対してはＰ＝ｎｓ（有意差なし）。
【図１５】図１５は、ＩＲ２４ｈに供したマウスにおけるＴａｔ−ＤＡＸＸｐおよびＤＡＸＸｐに対する用量反応を示す図である。虚血領域および梗塞サイズ（虚血領域の％）を、ＩＲ２４Ｈに供し、再灌流５分前に静脈内注射したＴａｔ（１ｍｇ／ｋｇ）、Ｔａｔ−ＤＡＸＸｐ（０．１、１および１０ｍｇ／ｋｇ）またはＤＡＸＸｐ（０．１、１および１０ｍｇ／ｋｇ）で処理したマウスにおいて測定した。平均±ＳＥＭを、（Ａ）：虚血領域／ＬＶ重量（左心室）、（Ｂ）：梗塞サイズ（虚血領域の％）についてプロットした。
【図１６】図１６は、心筋におけるＴａｔ−ＤＡＸＸｐ構築物を可視化した図である。マウスに、１ｍｇ／ｋｇのＣＦ−Ｔａｔ−ＤＡＸＸｐ構築物（ＣＦ：カルボキシフルオレセイン）を、再灌流時に注射した。２時間のパラホルムアルデヒド固定（リン酸緩衝液中４％ＰＦＡ）後にビブラトームを用いてＬＶ切片（２０μｍ）を得た。２μｍの共焦点画像は、サイトゾル中のペプチド構築物の存在を示す筋細胞中の緑色標識を明らかに示した。丸印は、数例で観察されたようなＤＡＰＩ陽性核中のペプチド構築物の存在を強調して示す（油浸  ×４０）。
【図１７】図１７は、腎臓移植の間の冷虚血／再灌流障害に関する予備データを示す図である。脳死および長期の冷虚血は、死亡ドナー腎臓移植片由来の移植片の長期成績不良の主な寄与因子であり、拡大基準ドナー（「マージナル臓器（ｍａｒｇｉｎａｌ  ｏｒｇａｎ）」）が使用される場合はさらに影響が大きい。虚血−再灌流（ＩＲ）障害関連の移植組織内感染を標的にすることは、それらの移植組織の成績を改善するための魅力的な概念である。（Ａ）ラットにおける腎臓移植の間の冷虚血／再灌流のワークフロー。２４時間の冷虚血後、腎臓移植片を、標準的な顕微手術技術を使用して、雄性ＬＥＷレシピエント中に同所性移植した。ペプチドを、１ｍｇ／ｋｇの単回のｉ．ｖ注射で、再灌流の直後に注射した。移植の３日後、移植片を、ＲＴ−ＰＣＲ分析のために回収した（ｎ＝３）。（Ｂ）総ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡにし、ＧｅｎｅＡｍｐ  ５７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用した定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲに供した。ＩＣＡＭ−１、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、インターロイキン（ＩＬ）−６およびｂｃｌ−２（Ｍｅｔａｂｉｏｎ、Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ、Ｇｅｒｍａｎｙで合成された）に関するＴａｑｍａｎ−ＰＣＲ反応は、２５μｌの最終容量で実施した。これらの予備データは、Ｔａｔ−ＤＡＸＸｐの存在下では、移植３日後の腎臓移植片において、ＩＦＮ−γおよびＩＣＡＭ−１のｍＲＮＡ発現の減少が生じたことを示している。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
定義
本明細書を通じて、以下の段落で定義するいくつかの用語を使用する。
【００２９】
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、本明細書中で互換的に使用され、その中性（非荷電）形態であるいは塩として、また、未修飾あるいはグリコシル化、側鎖酸化もしくはリン酸化によって修飾されている、多様な長さのアミノ酸配列をいう。特定の実施形態において、アミノ酸配列は全長のネイティブタンパク質である。しかし、好ましい実施形態において、アミノ酸配列は全長タンパク質の断片である。さらに他の実施形態において、アミノ酸配列は、アミノ酸側鎖に結合した他の置換基、例えば、グリコシル単位、脂質またはリン酸などの無機イオン、ならびに鎖の化学的変換に関連する修飾、例えば、スルフヒドリル基の酸化によって修飾されている。したがって、用語「タンパク質」（またはその等価な用語）は、その特定の特性を顕著に変化させない修飾に供された、全長ネイティブタンパク質またはその断片のアミノ酸配列を含む意図である。特に、用語「タンパク質」は、同じ遺伝子によりコードされるが、そのｐＩもしくはＭＷまたはその両方が異なるタンパク質アイソフォーム、即ち、バリアントを包含する。かかるアイソフォームは、そのアミノ酸配列が異なり得る（例えば、選択的スプライシングまたは限定的タンパク質分解の結果として）か、あるいは異なる翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、アシル化、リン酸化）から生じ得る。
【００３０】
用語「アナログ」は、タンパク質またはポリペプチドに関して本明細書中で使用する場合、そのタンパク質またはポリペプチドと類似または同一の機能を保有するが、そのタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列と類似または同一のアミノ酸配列もそのタンパク質またはポリペプチドの構造と類似または同一の構造も必ずしも含む必要のない、ペプチドをいう。好ましくは、本発明において、アナログは、そのタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。特定の好ましい実施形態において、タンパク質のアナログは、そのタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一または少なくとも８５％同一、好ましくは少なくとも９０％同一、最も好ましくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する。
【００３１】
用語「断片」は、タンパク質またはポリペプチドに関して本明細書中で使用する場合、そのタンパク質またはポリペプチドの少なくとも５個の連続するアミノ酸残基かつ３０個未満の連続するアミノ酸残基のアミノ酸配列、例えば、そのタンパク質またはポリペプチドの７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５個の連続するアミノ酸残基、好ましくは、そのタンパク質またはポリペプチドの９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の連続するアミノ酸残基、より好ましくは、そのタンパク質またはポリペプチドの９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７個の連続するアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む、ペプチドをいう。本発明のにおいて、タンパク質またはポリペプチドの断片は、全長タンパク質またはポリペプチドの機能的活性を保持している。
【００３２】
用語「相同」（または「相同性」）は、本明細書中で使用する場合、用語「同一性」と同義であり、２つのポリペプチド分子間の配列類似性をいう。比較される両配列中のある位置が同じアミノ酸残基によって占められる場合、それぞれの分子はその位置で相同である。本明細書中で使用する場合、配列同一性の百分率は、アミノ酸配列間の比較のことであり、比較窓（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｎｄｏｗ）にわたり最適にアラインされた２つの配列を比較することによって決定され、このとき、アミノ酸配列の比較窓中の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのための参照配列（これは付加も欠失も含んでいない）と比較して、付加または欠失（即ちギャップ）を含み得る。百分率は、両配列において同一のアミノ酸残基が存在する位置の個数を測定して一致した位置の個数を得、一致した位置の個数を比較窓中の位置の総数で除算し、その結果に１００を乗じて配列同一性の百分率を得ることによって、算出することができる。あるいは、百分率は、両配列において同一のアミノ酸残基が存在する位置の個数かまたはアミノ酸残基がギャップを伴ってアラインされる位置の個数のいずれかを測定して一致した位置の個数を得、一致した位置の個数を比較窓中の位置の総数で除算し、その結果に１００を乗じて配列同一性の百分率を得ることによって、算出することができる。当業者には、２つの配列をアラインさせるために多数の確立されたアルゴリズムが利用できることが理解される。例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、１９８１、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所的相同性アルゴリズムを使用して、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、１９７０、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性検索法を使用して、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実施を使用して（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、または目視検査を使用して、比較のために最適な配列のアラインメントを実施することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との間での共同事業、（１９９５補遺）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を一般に参照のこと）。パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの例は、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９７７、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３８９〜３４０２中に記載された、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。
【００３３】
相同アミノ酸配列は、同一または類似のアミノ酸配列を共有する。本発明において、類似残基は、参照配列中の対応するアミノ酸残基の保存的置換または「許容された（ａｌｌｏｗｅｄ）点変異」である。参照配列中の残基の「保存的置換」は、例えば、類似のサイズ、形状、電荷、共有結合または水素結合を形成する能力などの化学的特性を有する、対応する参照残基と物理的または機能的に類似した置換である。特に好ましい保存的置換は、Ｄａｙｈｏｆｆらにより規定された「許容された（ａｃｃｅｐｔｅｄ）点変異」についての基準を満たす置換である（「Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、１９７８、Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ、補遺３、２２：３５４〜３５２）。
【００３４】
本発明において、用語「治療」は、疾患または状態の発生を遅延または予防すること、状態の症状の進行、増悪または悪化を減速または停止させること、状態の症状の寛解をもたらすこと、および／あるいは状態を治癒させることを目的とした方法を特徴付けるために使用される。治療は、疾患または状態の発生前に、予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または防止（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）作用のために施されてよい。あるいはまたはさらに、治療は、疾患または状態の開始後に、治療効果のために施されてよい。
【００３５】
本明細書中で使用する場合、用語「対象」は、アポトーシスに関連する疾患または状態に罹患し得るが、その疾患または状態を有していてもいなくてもよい、ヒトまたは動物、特に哺乳動物（例えば、霊長類、イヌ、ネコ、ヤギ、ウマ、ブタ、マウス、ラット、ウサギなど）をいう。本発明の多数の実施形態において、対象はヒトである。かかる実施形態において、対象は「個体」ということも多い。用語「個体」は、特定の年齢を示すものではなく、したがって、この用語は、小児、青年および成人を包含する。
【００３６】
「医薬組成物」は、本明細書において、有効量の本発明のペプチドと、少なくとも１種の薬学的に許容される担体または添加剤とを含むものとして定義される。
【００３７】
本明細書中で使用する場合、用語「有効量」は、その意図した目的（単数または複数）、例えば、細胞、組織、系または対象における所望の生物学的応答または医学的応答をもたらすのに充分な、任意の量のペプチド、化合物、薬剤または組成物をいう。例えば、本発明の特定の実施形態において、目的（単数または複数）は、アポトーシス、例えば、再灌流障害または臓器移植に関連するアポトーシスを阻害、防止もしくは減少させること、および／またはアポトーシスに関連する疾患または状態を予防または治療することであってよい。
【００３８】
用語「薬学的に許容される担体または添加剤」は、活性成分（単数または複数）の生物学的活性の有効性を妨害せず、投与される濃度で宿主に対して顕著に毒性でない、担体媒体をいう。この用語には、溶媒、分散、媒体、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸着遅延剤などが含まれる。医薬上活性な物質のためのかかる媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である（例えば、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ、第１８版、１９９０、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．：Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡを参照のこと）。
【００３９】
特定の好ましい実施形態の詳細な説明
上述のように、本発明は、非常に多様なアポトーシスに関連した疾患または状態の治療および／または予防における治療剤として有用な、抗アポトーシス特性を有するペプチドに関する。
【００４０】
細胞のアポトーシスを阻害するペプチド
本発明のペプチドには、抗アポトーシス活性を示すＤＡＸＸ断片およびＦＡＤＤ断片が含まれる。
【００４１】
用語「ＤＡＸＸ」および「ＤＡＸＸタンパク質」は、本明細書中で互換的に使用される。これらは、細胞死関連タンパク質６（ｄｅａｔｈ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ６）と呼ばれるタンパク質をいい、これはヒトでは、第６染色体の短腕（ｐ）上の位置２１．３に位置するＤＡＸＸ遺伝子（ＲｅｆＳｅｑ（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００１１４１９６９．１）によってコードされる。好ましい実施形態において、ＤＡＸＸは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。しかし、ＤＡＸＸタンパク質は、配列番号１のＤＡＸＸタンパク質のアイソフォームであってよく、したがって、ヒトＤＡＸＸ遺伝子によってコードされる任意のアミノ酸配列を有していてよい。
【００４２】
用語「ＦＡＤＤ」および「ＦＡＤＤタンパク質」は、本明細書中で互換的に使用される。これらは、デスドメインを有するＦａｓ関連タンパク質と呼ばれるタンパク質をいい、これはヒトでは、第１１染色体の長腕（ｑ）上の位置１３．３に位置するＦＡＤＤ遺伝子（ＲｅｆＳｅｑ（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００３８２４．３）によってコードされる。好ましい実施形態において、ＦＡＤＤは、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する。しかし、ＦＡＤＤタンパク質は、配列番号８のＦＡＤＤタンパク質のアイソフォームであってよく、したがって、ヒトＦＡＤＤ遺伝子によってコードされる任意のアミノ酸配列を有していてよい。
【００４３】
本発明者らは、配列番号５（「ＤＡＸＸｐ」）、配列番号６（「ＤＡＸＸｐ−１４」）または配列番号２（「ＤＡＸＸｐ−１５」＝「ＤＡＸＸｐ−２１１」）に示されるアミノ酸配列からなるペプチドは、全てＤＡＸＸタンパク質（配列番号１）の断片であり、Ｆａｓレセプターと相互作用するが、ＤＡＸＸｐだけが細胞のアポトーシスを減少させることが可能であることを示した。同様に、本発明者らは、共にＦＡＤＤタンパク質（配列番号８）の断片である配列番号９（「ＦＡＤＤｐ１５」）および配列番号１２（「ＦＡＤＤｐ」）に示されるアミノ酸配列からなるペプチドが、Ｆａｓレセプターと相互作用し、細胞のアポトーシスを減少させることを見出した。
【００４４】
したがって、特定の実施形態において、本発明に係る抗アポトーシスペプチドは、配列番号５からなる１６個の連続するアミノ酸残基のＤＡＸＸ断片である。別の特定の実施形態において、本発明に係る抗アポトーシスペプチドは、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４個の連続するアミノ酸残基のＤＡＸＸ断片である。好ましくは、かかる抗アポトーシスペプチドは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する：
配列番号１７  （ＫＫＳＲＫＥＫＫＱＴＧＳＧＰＬＧＮ）、
配列番号１８  （ＫＫＳＲＫＥＫＫＱＴＧＳＧＰＬＧＮＳ）、
配列番号１９  （ＫＫＳＲＫＥＫＫＱＴＧＳＧＰＬＧＮＳＹ）、
配列番号２０  （ＫＫＳＲＫＥＫＫＱＴＧＳＧＰＬＧＮＳＹＶ）、
配列番号２１  （ＣＫＫＳＲＫＥＫＫＱＴＧＳＧＰＬＧ）、
配列番号２２  （ＰＣＫＫＳＲＫＥＫＫＱＴＧＳＧＰＬＧ）、
配列番号２３  （ＰＰＣＫＫＳＲＫＥＫＫＱＴＧＳＧＰＬＧ）、
配列番号２４  （ＧＰＰＣＫＫＳＲＫＥＫＫＱＴＧＳＧＰＬＧ）、
配列番号２５  （ＳＧＰＰＣＫＫＳＲＫＥＫＫＱＴＧＳＧＰＬＧ）、
配列番号２６  （ＣＫＫＳＲＫＥＫＫＱＴＧＳＧＰＬＧＮ）、
配列番号２７  （ＣＫＫＳＲＫＥＫＫＱＴＧＳＧＰＬＧＮＳ）、
配列番号２８  （ＣＫＫＳＲＫＥＫＫＱＴＧＳＧＰＬＧＮＳＹ）、
配列番号２９  （ＣＫＫＳＲＫＥＫＫＱＴＧＳＧＰＬＧＮＳＹＶ）、
配列番号３０  （ＰＣＫＫＳＲＫＥＫＫＱＴＧＳＧＰＬＧＮ）、
配列番号３１  （ＰＣＫＫＳＲＫＥＫＫＱＴＧＳＧＰＬＧＮＳ）、
配列番号３２  （ＰＣＫＫＳＲＫＥＫＫＱＴＧＳＧＰＬＧＮＳＹ）、
配列番号３３  （ＰＣＫＫＳＲＫＥＫＫＱＴＧＳＧＰＬＧＮＳＹＶ）、
配列番号３４  （ＰＰＣＫＫＳＲＫＥＫＫＱＴＧＳＧＰＬＧＮ）、
配列番号３５  （ＰＰＣＫＫＳＲＫＥＫＫＱＴＧＳＧＰＬＧＮＳ）、
配列番号３６  （ＰＰＣＫＫＳＲＫＥＫＫＱＴＧＳＧＰＬＧＮＳＹ）、
配列番号３７  （ＰＰＣＫＫＳＲＫＥＫＫＱＴＧＳＧＰＬＧＮＳＹＶ）、
配列番号３８  （ＧＰＰＣＫＫＳＲＫＥＫＫＱＴＧＳＧＰＬＧＮ）、
配列番号３９  （ＧＰＰＣＫＫＳＲＫＥＫＫＱＴＧＳＧＰＬＧＮＳ）、
配列番号４０  （ＧＰＰＣＫＫＳＲＫＥＫＫＱＴＧＳＧＰＬＧＮＳＹ）、
配列番号４１  （ＧＰＰＣＫＫＳＲＫＥＫＫＱＴＧＳＧＰＬＧＮＳＹＶ）、
配列番号４２  （ＳＧＰＰＣＫＫＳＲＫＥＫＫＱＴＧＳＧＰＬＧＮ）、
配列番号４３  （ＳＧＰＰＣＫＫＳＲＫＥＫＫＱＴＧＳＧＰＬＧＮＳ）、および
配列番号４４  （ＳＧＰＰＣＫＫＳＲＫＥＫＫＱＴＧＳＧＰＬＧＮＳＹ）。
【００４５】
特定の実施形態において、本発明に係る抗アポトーシスペプチドは、配列番号１２からなる９個の連続するアミノ酸残基のＦＡＤＤ断片である。別の特定の実施形態において、本発明に係る抗アポトーシスペプチドは、配列番号９からなる１５個の連続するアミノ酸残基のＦＡＤＤ断片である。さらに他の特定の実施形態において、本発明に係る抗アポトーシスペプチドは、配列番号１２を含む、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７個の連続するアミノ酸残基のＦＡＤＤ断片である。好ましくは、かかる抗アポトーシスペプチドは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する：
配列番号４５  （ＫＲＫＬＥＲＶＱＳＧ）、
配列番号４６  （ＫＲＫＬＥＲＶＱＳＧＬ）、
配列番号４７  （ＫＲＫＬＥＲＶＱＳＧＬＤ）、
配列番号４８  （ＫＲＫＬＥＲＶＱＳＧＬＤＬ）、
配列番号４９  （ＲＫＲＫＬＥＲＶＱＳ）、
配列番号５０  ＫＲＫＲＫＬＥＲＶＱＳ）、
配列番号５１  （ＧＫＲＫＬＥＲＶＱＳＧ）、
配列番号５２  （ＧＫＲＫＬＥＲＶＱＳＧＬ）、
配列番号５３  （ＧＫＲＫＬＥＲＶＱＳＧＬＤ）、
配列番号５４  （ＧＫＲＫＬＥＲＶＱＳＧＬＤＬ）、
配列番号５５  （ＶＧＫＲＫＬＥＲＶＱＳＧ）、
配列番号５６  （ＶＧＫＲＫＬＥＲＶＱＳＧＬ）、および
配列番号５７  （ＶＧＫＲＫＬＥＲＶＱＳＧＬＤ）。
【００４６】
上述のように、特定の実施形態において、ＤＡＸＸタンパク質は、配列番号１のＤＡＸＸタンパク質のアイソフォームである。かかる実施形態において、本発明に係る抗アポトーシスペプチドは、配列番号１のＤＡＸＸタンパク質中の配列番号５の断片に対応する、１６個の連続するアミノ酸残基のＤＡＸＸ断片であってよい。
【００４７】
同様に、上述のように、特定の実施形態において、ＦＡＤＤタンパク質は、配列番号８のＦＡＤＤタンパク質のアイソフォームである。かかる実施形態において、本発明に係る抗アポトーシスペプチドは、配列番号８のＦＡＤＤタンパク質中の配列番号１２の断片に対応する、９個の連続するアミノ酸残基のＦＡＤＤ断片であってよく、または配列番号８のＦＡＤＤタンパク質中の配列番号９の断片に対応する、１５個の連続するアミノ酸残基のＦＡＤＤ断片であってよい。
【００４８】
ＤＡＸＸアイソフォームおよびＦＡＤＤアイソフォームは、好ましくは、それぞれ配列番号１および配列番号８と、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％より高い同一性を有するアミノ酸配列を有し、より好ましくは、それぞれ配列番号１および配列番号８と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％より高い同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００４９】
本発明に係るペプチド、ならびにその誘導体およびコンジュゲート（以下を参照のこと）は、細胞のアポトーシス、特に心筋細胞のアポトーシスを阻害、防止および／または減少させることが可能である。この能力は、例えば細胞アポトーシス検出キットを使用して、当業者に公知の任意の適切な方法を使用して評価することができる。細胞のアポトーシスを測定するのに適したキットの例は、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡＰＬＵＳ（登録商標）キット（カタログ番号１１  ７７４  ４２５  ００１、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）である。
【００５０】
本発明に係るペプチドの誘導体
本発明は、本発明に係るペプチドの生物学的に活性な誘導体にも関する。「生物学的に活性な誘導体」とは、細胞のアポトーシスを阻害、防止または減少させるペプチドの能力を保持した本発明のペプチドの任意の誘導体を意味する。
【００５１】
特定の実施形態において、生物学的に活性な誘導体は、化学的および／または生物学的に修飾された、本発明の抗アポトーシスペプチドのアミノ酸配列を有する。
【００５２】
誘導体の例は、本発明に係るペプチドであり、ここで：
−ペプチドの少なくとも１個のアミノ酸残基が、置換または欠失されている、
−少なくとも１個の別のアミノ酸残基が、ペプチド中に挿入されている、および／または
−ペプチドの少なくとも１個のアミノ酸残基が、化学的に変性（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ａｌｔｅｒｅｄ）または誘導体化されている。
【００５３】
好ましくは、本発明に係る生物学的に活性な誘導体は、置換、挿入、欠失、変性または誘導体化からなる群より選択される１個だけまたは２個だけのアミノ酸残基修飾を含む。特定の好ましい実施形態において、生物学的に活性な誘導体は、１個の保存的置換または２個の保存的置換を含む。特定の好ましい実施形態において、本発明に係るＤＡＸＸ断片の誘導体は、配列番号５の外側の（即ち、配列番号５内に含まれていない）アミノ酸残基に影響を与える１個または２個の修飾を示し、本発明に係るＦＡＤＤ断片の誘導体は、配列番号１２の外側の（即ち、配列番号１２内に含まれていない）アミノ酸残基に影響を与える１個または２個の修飾を示す。
【００５４】
適切な「化学的に変性または誘導体化された」アミノ酸には、例えば、プロリンに対する４−ヒドロキシプロリン、リジンに対する５−ヒドロキシリジン、セリンに対するホモセリン、リジンに対するオルニチンなどの、天然に存在するアミノ酸誘導体などが含まれる。他の「化学的に変性または誘導体化された」アミノ酸には、例えば、標識、例えば、フルオレセイン、テトラメチルローダミンまたはシアニン色素Ｃｙ５．５に結合したアミノ酸、または、例えば、アセチル化、アミド化、ホルミル化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化、硫酸化（ｓｕｌｆａｔａｔｉｏｎ）、グリコシル化または脂質化などのひとつもしくは複数の翻訳後修飾を有するアミノ酸残基が含まれる。実際、特定の化学的修飾、特にＮ末端グリコシル化は、ヒト血清中でのペプチド安定性を向上させることが示されている（Ｐｏｗｅｌｌら、Ｐｈａｒｍａ  Ｒｅｓ  １９９３：１０：１２６８〜１２７３）。「化学的に変性または誘導体化された」アミノ酸には、Ｎ−ミリストイル化によって得られた、膜透過性が向上したアミノ酸も含まれる（Ｂｒａｎｄら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １９９６；２７０：Ｃ１３６２〜Ｃ１３６９）。
【００５５】
本発明に係るペプチドの他の誘導体は、前記ペプチドのペプチド模倣物である。ペプチド模倣物は、本発明に係るペプチドと実質的に同じ構造的特徴および／または機能的特徴を有する、合成化合物をいう。模倣物は、合成の非天然アミノ酸アナログから全体的に構成されてもよく、または１個もしくは複数の天然アミノ酸および１個もしくは複数の非天然アミノ酸アナログを含むキメラ分子であってもよい。模倣物はまた、模倣物の活性を破壊しない任意の数の天然アミノ酸の保存的置換を含んでいてよい。本発明に係る試験Ａを使用して、模倣物が必要な活性を有するか否かを決定するために、慣用の試験が使用できる。句「実質的に同じ」は、模倣物またはペプチド模倣物に関して使用する場合、模倣物またはペプチド模倣物が、言及された分子の１つまたは複数の活性または機能、特に細胞のアポトーシスの阻害活性または機能を有することを意味する。ペプチド模倣物を開発するための技術は従来のものである。例えば、ペプチド結合は、元のペプチドに対して、ペプチド模倣物に同様の構造、したがって同様の生物学的活性をとらせる非ペプチド結合または非天然アミノ酸によって置き換えられ得る。さらなる修飾がまた、アミノ酸の化学基を類似の構造の他の化学基で置き換えることによって実施され得る。ペプチド模倣物の開発は、遊離であるかまたはＦａｓレセプターの細胞内領域に結合したかの、元の断片／ペプチドの三次構造を、ＮＭＲ分光法、結晶学および／またはコンピュータを利用した分子モデリングによって決定することによって、支援され得る。可能性のあるペプチド模倣化合物が一旦同定されると、その合成、および細胞のアポトーシスを阻害する能力の分析が行われ得る。
【００５６】
ペプチド模倣物は、非天然の構造成分の任意の組合せを含むことができ、それは、典型的には３つの構造群に由来し、すなわち：天然のアミン結合（「ペプチド結合」）連結以外の残基連結基；天然アミノ酸残基の代わりの非天然残基；二次構造の模倣を誘導する残基（例えば、βターン、γターン、βシート、αヘリックスのコンフォメーション）；またはタンパク質分解に対する抵抗性を付与するその他の変化である。例えば、リジン模倣物は、コハク酸無水物または他のカルボン酸無水物との反応によって生成され得る。リジンおよび他のα−アミノ含有残基模倣物は、イミドエステル、例えば、メチルピコリンイミデート、リン酸ピリドキサール、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソウレア、２，４−ペンタンジオンとの反応、およびグリオキシレートとのトランスアミダーゼ触媒反応によっても、生成され得る。
【００５７】
１個または複数の残基は、逆のキラリティーのアミノ酸（またはペプチド模倣物残基）によっても置き換えられ得る。したがって、Ｌ体（これは、化学成分の構造によって、ＲまたはＳとも呼ばれ得る）の任意の天然に存在するアミノ酸は、Ｄ−アミノ酸とも呼ばれるが、さらにはＲ型またはＳ型とも呼ばれ得る逆のキラリティーののアミノ酸または模倣物で置き換えられ得る。
【００５８】
当業者に理解されるように、本発明のペプチド模倣物は、「化学的に変性または誘導体化された」アミノ酸について本明細書に記載される１つまたは複数の修飾、例えば、標識、または１つもしくは複数の翻訳後修飾もまた含み得る。
【００５９】
ペプチド、誘導体およびペプチド模倣物は、当該分野で公知の任意の方法を使用して産生および単離され得る。ペプチドは、通常の化学的方法を使用して、全体または一部分が合成され得る。ペプチドおよびペプチド模倣物のライブラリーを生成するための技術は周知であり、例えば、マルチピン（ｍｕｌｔｉｐｉｎ）、ティーバッグ（ｔｅａ  ｂａｇ）、スプリット−カップル−ミックス（ｓｐｌｉｔ−ｃｏｕｐｌｅ−ｍｉｘ）技術およびＳＰＯＴ合成が挙げられる。
【００６０】
コンジュゲート
本発明は、細胞透過性ペプチド即ちＣＰＰに連結された、本発明のペプチドまたはその誘導体を含むコンジュゲートにも関する。
【００６１】
実際、本発明に係るペプチドまたはその誘導体の、細胞の原形質膜などの細胞膜を介した取り込みを促進するために、本発明者らは、これらのペプチドまたはその誘導体を「細胞透過性ペプチド」（ＣＰＰ）とコンジュゲートすることが非常に有用であることを示した。ＣＰＰは、膜を横切った輸送を促進するためにカーゴ（ｃａｒｇｏ）にコンジュゲートされ得る周知のペプチドである。ＣＰＰは、例えば、Ｌｅｂｌｅｕ  Ｂ．ら、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ６０（２００８）５１７〜５２９およびＳａｉｄ  Ｈａｓｓａｎｅ  Ｆ．ら、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．（２０１０）６７：７１５〜７２６によって詳細に記載されている。任意のＣＰＰが、本発明に係る断片またはその誘導体の細胞質送達を改善するために使用され得る。
【００６２】
本発明に係るＤＡＸＸ断片もしくはＦＡＤＤ断片またはそれらの誘導体とコンジュゲートされ得るＣＰＰの例には、以下のものが挙げられるがこれらに限定されない：
名称          配列
Ｔａｔ        ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ
ＲＸＲ        ＲＸＲＲＸＲＲＸＲＲＸＲ
Ｂｐｅｐ      ＲＸＲＲＢＲＲＸＲＲＢＲＸＢ
Ｐｉｐ２ｂ    ＲＸＲＲＸＲＲＸＲＩＨＩＬＦＱＮｒＲＭＫＷＨＫ
配列中、
−Ｘ＝アミノヘキシル、β−アラニル、ｐ−アミノベンゾイル、イソニペコチル（ｉｓｏｎｉｐｅｃｏｔｙｌ）または４−アミノブチリル
−Ｂ＝βアラニン
−小文字＝Ｄ−アミノ酸（Ｄ−アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸によって置き換えられていてもよい）。
【００６３】
ＣＰＰは典型的に、カチオン性アミノ酸の一部を隔てる疎水性アミノ酸またはスペーサー基と共に、２個以上のカチオン性アミノ酸を有する。例えば、カチオン性アミノ酸はアルギニン（Ｒ）である。さらに典型的には、ＣＰＰは一般に、少なくとも３個または４個のアルギニン残基を有する。いくつかの実施形態において、ＣＰＰは、５個、６個またはそれ以上のアルギニン残基を含む。
【００６４】
ＣＰＰは典型的に、本発明に係るペプチドまたはその誘導体のＮ末端またはＣ末端に、好ましくはＣ末端に連結される。化学的連結は、例えばジスルフィド結合、チオエーテルまたはチオール−マレイミド連結などの任意の化学結合を介して実施され得る。
【００６５】
特定の実施形態において、本発明に従うペプチドまたは誘導体は、リンカーを介してＣＰＰに連結される。ペプチドまたはその誘導体のＣＰＰへの化学的連結を可能にするものであれば、任意の種類のリンカーが当業者によって使用され得る。ジスルフィド、チオエーテルまたはチオール−マレイミド連結の形成を可能にするＣ末端システイン残基を有するアミノ酸配列を含む種々のリンカーが可能である。本発明に係るペプチドまたはその誘導体をＣＰＰに連結する他の方法としては、オキシムを形成するためのＣ末端アルデヒドの使用が挙げられる。さらに他のリンカーは、クリックケミストリーを使用する。
【００６６】
適切なリンカーの例には、Ｃ、ＢＣ、ＸＣ、ＧＣ、ＢＢＣＣ、ＢＸＣＣ、ＸＢＣ、Ｘ、ＸＸ、Ｂ、ＢＢ、ＢＸおよびＸＢからなる群より選択されるアミノ酸またはアミノ酸配列が含まれるが、これらに限定されず、
配列中、
−Ｘ＝アミノヘキシル、β−アラニル、ｐ−アミノベンゾイル、イソニペコチルまたは４−アミノブチリル
−Ｂ＝βアラニン
である。
【００６７】
適用
本発明は、ヒトまたは動物の身体の治療方法で使用するための、本明細書中に記載されるペプチド、その誘導体およびそのコンジュゲート、ならびに対応する治療方法にも関する。より具体的には、本発明は、細胞のアポトーシスに関連する疾患または状態を治療する方法および／あるいはヒトまたは動物の身体において細胞のアポトーシスを阻害する方法で使用するための、ペプチド、その誘導体およびそのコンジュゲートに関する。本発明はまた、細胞のアポトーシスに関連する疾患もしくは状態を治療する方法および／またはそれを必要とする対象において細胞のアポトーシスを阻害する方法であって、有効量の本発明に係るペプチド、その誘導体および／またはそのコンジュゲートを前記対象に投与するステップを含む、方法を提供する。特定の実施形態において、対象には、少なくとも１種の本発明に係る抗アポトーシスＤＡＸＸペプチドおよび少なくとも１種の本発明に係る抗アポトーシスＦＡＤＤペプチドが投与される。
【００６８】
本明細書中で使用する場合、用語「細胞のアポトーシスに関連する疾患または状態」は、細胞のアポトーシスによって引き起こされる、細胞のアポトーシスを生じる、または細胞のアポトーシスを含む、任意の疾患または臨床状態をいう。特定の実施形態において、疾患または状態は、Ｆａｓレセプター媒介性の細胞のアポトーシスに関連する。用語「細胞のアポトーシスに関連する疾患または臨床状態」は、対象において疾患または臨床状態が存在するために実施される、細胞のアポトーシスを引き起こす、生じる、または誘導する任意の医療処置をも包含する。
【００６９】
したがって、本発明に係るペプチド、その誘導体およびそのコンジュゲート、ならびに治療方法は、ヒトまたは動物の身体における急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、脳梗塞または急性循環動揺（ショック状態）を治療するために、特にこれらの疾患に関連した細胞のアポトーシスを阻害または減少させるために使用され得る。本発明に係るペプチド、その誘導体およびそのコンジュゲート、ならびに治療方法は、臓器移植（例えば、肝臓、心臓、腎臓、膵島および腸移植片）、心臓インターベンション（再灌流治療、体外循環、例えば、心肺バイパス、および一時的な血管閉塞）を受ける対象を治療するために、特に、これらの医療処置によって引き起こされる細胞のアポトーシスを阻害または減少させるためにも、使用され得る。
【００７０】
本発明に係るペプチド、その誘導体およびそのコンジュゲート、ならびに治療方法は、ヒトまたは動物の身体における虚血（例えば、心臓虚血、腎臓虚血、虚血性大腸炎、腸間膜虚血、脳虚血、四肢虚血または皮膚虚血）の治療のために、特に、虚血に関連する細胞のアポトーシスを阻害または減少させるために、使用され得る。
【００７１】
本発明に係るペプチド、その誘導体およびそのコンジュゲート、ならびに治療方法は、再灌流が行われているまたは行われた対象を治療するため、特に、再灌流障害に関連する細胞のアポトーシスを阻害または減少させるために使用され得る。
【００７２】
本発明に係る全てのペプチド、その誘導体およびそのコンジュゲートは、虚血の前および虚血の間に、再灌流の前、再灌流と同時、または再灌流後に投与され得る。
【００７３】
Ｆａｓレセプターを介したアポトーシスは、ヒトの、ウイルス性肝炎、ウィルソン病、アルコール性肝炎、胆汁うっ滞性肝疾患を含む肝臓疾患、および自己免疫疾患に関与することも示されている（例えば、Ｅｈｒｅｎｓｃｈｗｅｎｄｅｒら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．、２００９、６４７：６４〜９３で概説される）。したがって、本発明に係るペプチド、その誘導体およびそのコンジュゲート、ならびに治療方法は、これらの疾患の治療のためにも使用され得る。
【００７４】
本発明に係る治療方法において、ペプチド、その誘導体またはそのコンジュゲートは、他の治療剤、特に、アポトーシス、虚血および／または再灌流障害の治療において使用される薬剤と、組み合わされ得る。特に、アポトーシスの内在性の経路、即ち、ミトコンドリア経路を標的化する薬剤との組合せ治療は、大いに興味深い。したがって、関連の態様において、本発明は、本発明の治療方法において使用するための、他の治療剤、特に、アポトーシス、虚血および／または再灌流障害の治療において使用される薬剤と組み合わせた、ペプチド、その誘導体またはそのコンジュゲートを提供する。一実施形態において、本発明に係る治療方法は、シクロスポリンＡおよび／またはＢＨ４ペプチドを前記ヒトまたは動物の身体に投与するステップもまた含む。実際、シクロスポリンＡは、ミトコンドリアＰＴＰ開口を阻害し、ＡＭＩの患者および動物モデルの両方において梗塞サイズを減少させることが示された（Ｇｏｍｅｚら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．２００９；８３（２）：２２６〜３３；Ｐｉｏｔら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００８；３５９（５）：４７３〜８１；Ｍｅｗｔｏｎら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１０  Ｍａｒ  ２３；５５（１２）：１２００〜５）。抗アポトーシス性Ｂｃｌ−ｘｌタンパク質由来のＢＨ４は、再灌流の時点でＴａｔタンパク質のコンジュゲートとして投与される場合に、虚血−再灌流の間のアポトーシスを減少させるのに有効であることが報告されている（Ｏｎｏら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．２００５、２７（１）：１１７〜１２１；Ｄｏｎｎｉｎｉら、Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ２００９；８（８）：１２７１〜１２７８；Ｂｏｉｓｇｕｅｒｉｎら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ、２０１１、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｃｏｎｒｅｌ．２０１１．０７．０３７）。
【００７５】
本発明に係る治療方法において、全ての化合物（ペプチド、誘導体、コンジュゲート、組合せ産物）は、多数の適切な経路のいずれかを使用して投与されてよく、静脈内、非経口、動脈内、筋内、経口および経鼻が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のペプチド、その誘導体またはそのコンジュゲートの投与は、投与された量が意図した目的のために有効であるような投薬量である。投与経路、製剤（以下を参照のこと）および投与される投薬量は、所望の治療効果、既に存在する場合には治療される状態の重篤度、任意の感染症の存在、患者の年齢、性別、体重および全身の健康状態、ならびに使用されるペプチド、誘導体またはコンジュゲートの効力、バイオアベイラビリティおよびｉｎ  ｖｉｖｏ半減期、併用療法の利用（または利用せず）、ならびに他の臨床因子に依存する。これらの因子は、治療過程において担当医によって容易に決定可能である。
【００７６】
本発明に係る治療は、単回投与または多回投与で構成されてよい。したがって、ペプチド、その誘導体またはコンジュゲートの投与は、所定の期間にわたって一定であるか、または周期的および特定の間隔、例えば、毎時、毎日、毎週（またはその他の日数毎）などであってよい。あるいは、投与は、ある期間にわたる連続送達、例えば、静脈内送達であり得る。
【００７７】
医薬組成物
上述のように、本発明のペプチド、その誘導体またはそのコンジュゲートは、それ自体でまたは医薬組成物として投与され得る。したがって、本発明は、有効量の少なくとも１種の本発明の抗アポトーシスペプチド（またはその誘導体もしくはそのコンジュゲート）と、少なくとも１種の薬学的に許容される担体または添加剤とを含む、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも１種の別の生物学的に活性な薬剤をさらに含む。特定の実施形態において、医薬組成物は、少なくとも１種の本発明に係る抗アポトーシスＤＡＸＸペプチドおよび少なくとも１種の本発明に係る抗アポトーシスＦＡＤＤペプチドを含む。
【００７８】
本発明に係る医薬組成物は、所望の予防効果および／または治療効果を達成するのに有効な、任意の量で、かつ任意の投与経路を使用して、投与され得る。最適な医薬製剤は、投与経路および所望の投薬量に依存して変動し得る。かかる製剤は、投与される活性成分（単数また複数）の物理的状態、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ放出の速度およびｉｎ  ｖｉｖｏクリアランスの速度に影響を与え得る。
【００７９】
本発明の医薬組成物は、投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投薬単位形態で製剤化され得る。表現「単位剤形」は、本明細書中で使用する場合、少なくとも１種の本発明のペプチド（または少なくとも１種のその誘導体またはそのコンジュゲート）および少なくとも１種の薬学的に許容される担体または添加剤の、物理的に別々の単位をいう。しかし、組成物の合計一日投薬量は、正しい医療的判断の範囲内で、担当医によって決定されることが理解されよう。
【００８０】
製剤。注射用調製物、例えば、無菌の注射用の水性または油性の懸濁剤が、適切な分散剤または湿潤剤と懸濁剤とを使用して、公知の技術に従って製剤化され得る。無菌の注射用調製物はまた、非毒性の非経口で許容される賦形剤または溶媒中の無菌の注射用液剤、懸濁剤または乳剤、例えば、２，３−ブタンジオール中の溶液であってもよい。使用され得る許容されるビヒクルおよび溶媒には、水、リンゲル溶液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．および等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の不揮発油が、溶液または懸濁媒体として慣習的に使用される。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激性の不揮発油が使用され得る。オレイン酸などの脂肪酸もまた、注射用製剤の調製において使用され得る。無菌の液体担体は、非経口投与のための無菌の液体組成物において有用である。
【００８１】
注射用製剤は、例えば、細菌保持性（ｂａｃｔｅｒｉａｌ−ｒｅｔａｉｎｉｎｇ）フィルタによる濾過によって、または使用前に、無菌水もしくは他の無菌の注射用媒体中に溶解もしくは分散され得る無菌の固体組成物の形態で無菌化剤を加えることによって、無菌化され得る。無菌の溶液または懸濁液である液体医薬組成物は、例えば、静脈内、筋内、腹腔内または皮下注射によって投与され得る。注射は、単回押すものであっても段階的な注入によるものであってもよい。必要または所望の場合、組成物は、注射の部位での疼痛を軽減するための局所麻酔を含み得る。
【００８２】
活性成分の効果を延長させるために、皮下または筋内注射からの成分の吸収を遅延させることが望ましい場合が多い。非経口投与された活性成分の吸収を遅延させることは、油ビヒクル中に成分を溶解または懸濁させることによって達成され得る。注射用のデポー製剤は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中の活性成分のマイクロカプセル化マトリックスを形成することによって製造される。ポリマーに対する活性成分の比率および使用される特定のポリマーの性質に依存して、成分放出の速度が制御され得る。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が含まれる。注射用のデポー製剤は、身体組織と適合性であるリポソームまたはマイクロエマルジョン中に活性成分を封入することによっても調製され得る。
【００８３】
経口投与のための液体剤形には、薬学的に許容される乳剤、マイクロエマルジョン剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤および加圧組成物が含まれるが、これらに限定されない。有効成分（単数または複数）に加えて、液体剤形は、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、落花生油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステルならびにそれらの混合物などの、当該分野で一般に使用される不活性賦形剤を含み得る。不活性賦形剤に加えて、経口組成物はまた、湿潤剤、懸濁剤、防腐剤、甘味剤、香味剤および芳香剤、増粘剤、顔料、粘度調節剤、安定剤または浸透圧調節剤などの補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）を含み得る。経口投与に適した液体担体の例には、水（上記のような添加物、例えば、セルロース誘導体を含む可能性があり、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム溶液）、アルコール（一価アルコールおよび多価アルコール、例えばグリコールを含む）およびそれらの誘導体、ならびに油（例えば、分画ココナツ油およびラッカセイ油）が含まれる。加圧組成物について、液体担体は、ハロゲン化炭化水素または他の薬学的に許容される噴霧剤であり得る。
【００８４】
経口投与のための固体剤形には、例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤および顆粒剤が含まれる。かかる固体剤形において、本発明のペプチド（またはその誘導体もしくはそのコンジュゲート）は、少なくとも１種の不活性な生理学的に許容される添加剤または担体、例えば、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムおよび以下のうち１種または複数と混合され得る：（ａ）充填剤または増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸）；（ｂ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよびアカシアなど；（ｃ）保湿剤、例えばグリセロール；（ｄ）崩壊剤、例えば、寒天（ａｇａｒ−ａｇａｒ）、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩および炭酸ナトリウム；（ｅ）溶解遅延剤、例えば、パラフィン；吸収加速剤、例えば、第四級アンモニウム化合物；（ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなど；（ｈ）吸収剤、例えば、カオリンおよびベントナイト粘土；および（ｉ）潤滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、ならびにそれらの混合物。固体製剤に適した他の添加剤には、非イオン性およびアニオン性表面改変剤などの表面改変剤が含まれる。表面改変剤の代表例には以下が含まれるがこれらに限定されない：ポロクサマー１８８、塩化ベンザルコニウム、ステアリン酸カルシウム、セトステアリルアルコール、セトマクロゴール乳化ワックス、ソルビタンエステル、コロイド状二酸化ケイ素、リン酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウムおよびトリエタノールアミン。カプセル、錠剤および丸剤の場合、剤形は緩衝剤も含み得る。
【００８５】
類似の種類の固体組成物は、ラクトースまたは乳糖などの添加剤ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどを使用した軟質および硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤としても使用され得る。錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤および顆粒剤の固体剤形は、コーティングおよびシェル、例えば、腸溶コーティング、放出制御コーティングおよび医薬品製剤分野で周知の他のコーティングなどを伴って調製され得る。これらは、任意に乳白剤を含んでよく、活性成分（単数または複数）のみを、また、好ましくは腸管の特定の部分で、任意に遅延した様式で、放出するような組成のものでもあり得る。使用され得る包埋組成物の例としては、ポリマー性物質およびワックスが挙げられる。
【００８６】
特定の実施形態において、本発明の抗アポトーシスペプチド（またはその誘導体もしくはそのコンジュゲート）を、治療が必要な領域、例えば心筋に局所的に投与することが望ましい場合がある。これは、例えば、経皮的冠動脈形成術の間または冠動脈バイパス手術の間の局所注入によって達成され得るが、これに限定されない。
【００８７】
外用投与のために、医薬組成物は、好ましくは、水、グリセロール、アルコール、プロピレングリコール、脂肪アルコール、トリグリセリド、脂肪酸エステルまたは鉱油などの担体を含み得る、ゲル、軟膏、ローションまたはクリームとして製剤化される。他の外用担体には、液体石油、パルミチン酸イソプロピル、ポリエチレングリコール、エタノール（９５％）、ポリオキシエチレンモノラウレート水溶液（５％）、またはラウリル硫酸ナトリウム水溶液（５％）が含まれる。他の材料、例えば、抗酸化剤、保湿剤、粘度安定剤および類似の薬剤が、必要に応じて添加され得る。
【００８８】
さらに、特定の例において、本発明の組成物は、皮膚上、皮膚中または皮膚下に配置される経皮デバイス（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｄｅｖｉｃｅ）内に配置され得ると予想される。かかるデバイスとしては、受動的または能動的放出機構のいずれかによって活性成分を放出する、パッチ、移植片および注射が挙げられる。経皮投与には、身体の表面ならびに上皮および粘膜組織などの身体の管の内層を介した全ての投与が含まれる。かかる投与は、ローション剤、クリーム剤、フォーム剤、パッチ剤、懸濁剤、液剤および坐剤で本発明の組成物を使用して実施され得る。
【００８９】
種々の製剤を製造するための材料および方法は、当該分野で公知であり、本発明を実施するために適している。抗体の送達に適した製剤は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ、第１８版、１９９０、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．：Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ中に見出すことができる。
【００９０】
その他の生物学的に活性な薬剤。特定の実施形態において、本発明のペプチドは、本発明の医薬組成物中の唯一の活性成分である。他の実施形態において、医薬組成物は、１種または複数の生物学的に活性な薬剤をさらに含む。適切な生物学的に活性な薬剤の例には以下が含まれるがこれらに限定されない：抗アポトーシス剤、抗炎症剤、免疫調節剤、鎮痛剤、抗微生物剤、抗細菌剤、抗生剤、抗酸化剤、消毒剤およびそれらの組合せ。
【００９１】
特定の実施形態において、追加の生物学的に活性な薬剤は、シクロスポリンＡ、ＢＨ４およびそれらの組合せからなる群より選択される。
【００９２】
かかる医薬組成物において、本発明の抗アポトーシスペプチド（またはその誘導体もしくはそのコンジュゲート）およびその他の治療剤（単数または複数）は、異なる成分の同時投与、分離投与または連続投与のために１つまたは複数の調製物と組み合わされ得る。より具体的には、本発明の組成物は、ペプチド（またはその誘導体もしくはそのコンジュゲート）および治療剤（単数または複数）が、一緒にまたは互いに独立して投与され得るような方法で、製剤化され得る。例えば、ペプチド（またはその誘導体もしくはそのコンジュゲート）および治療剤は、単一の組成物中で一緒に製剤化され得る。あるいは、これらは、個別に（例えば、異なる組成物および／または容器中で）維持、投与され得る。
【実施例】
【００９３】
以下の実施例は、本発明を構成し、実施するいくつかの好ましい様式を説明する。しかし、実施例は、例示だけを目的としたものであり、本発明の範囲を限定する意味ではないことを理解すべきである。
【００９４】
メンブレン結合型逆ペプチドアレイ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｒｒａｙ）の合成
ペプチドを、Ｎ修飾ＣＡＰＥメンブレン（Ｂｈａｒｇａｖａら、Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ、２００２、１５：１４５）上で合成し、ＭｕｌｔｉＰｅｐ  ＳＰＯＴ−ｒｏｂｏｔ（ＩＮＴＡＶＩＳ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＡＧ、Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって調製した。アレイ設計は、独自のソフトウェアＬＩＳＡ  １．７１を用いて実施した。合成は、標準的なプロトコール［Ｆｒａｎｋ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９２、４８：９２１７）を使用したスポットの決定（ｓｐｏｔ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）から開始し、その後Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）中のＦｍｏｃ−システイン−（Ｔｒｔ）−Ｏｐｆｐ（０．３Ｍ）溶液およびＦｍｏｃ−アラニン−Ｏｐｆｐ（二重カップリング、それぞれ１５分間の反応）のカップリングを行った。ＤＭＦ中のピペリジン（２０％）でのＦｍｏｃ切断後に、ジメチルホルミアミド（ＤＭＦ）中に溶解され、ＥＥＤＱ（１．１当量）で活性化された４−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸（ＨＭＰＡ）（０．６Ｍ溶液）を添加し、サンプルをメンブレン上に直接スポットした（４×カップリング、それぞれ１５分間の反応）。メンブレンを、ＤＭＦ中の無水酢酸（２％）でアセチル化し、ＤＭＦ（５×３分間）、エタノール（２×３分間）およびジエチルエーテル（２×３分間）で洗浄し、最後に風乾した。ＤＭＦ中の１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ、３当量）で活性化したＦｍｏｃ−アミノ酸−ＯＨ（０．４Ｍ）溶液を、メンブレン上にスポットした（４×カップリング、それぞれ１５分間の反応時間）。プロリン、チロシンおよびグルタミンを、１，１’−カルボニルジ（１，２，４−トリアゾール）（ＣＤＴ）で活性化した。Ｆｍｏｃ基をスポットから除去し、標準的なＳＰＯＴ合成プロトコール（Ｆｒａｎｋ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９２、４８：９２１７）を使用し、その後β−アラニンによるＮ末端タグでペプチド配列を完成させた。
【００９５】
標準的なＳＰＯＴ合成のために、Ｆｍｏｃ−ａａ−Ｏｐｆｐを、以下の側鎖保護と共に使用した：Ｅ−、Ｄ−（ＯｔＢｕ）；Ｃ、−Ｓ−、Ｔ−、Ｙ−（ｔＢｕ）；Ｋ−、Ｗ−（Ｂｏｃ）；Ｎ−、Ｑ−、Ｈ−（Ｔｒｔ）；Ｒ−（Ｐｂｆ）。チオエーテル環化のために、全てのペプチドを、ＤＭＦ中、二重カップリング、それぞれ１５分間の反応時間で、ブロモ酢酸２，４−ジニトロフェニルエステル（１Ｍ）でＮ−アシル化した。
【００９６】
メンブレンを、ＤＭＦ（３×３分間）およびジクロロメタン（ＤＣＭ、３×３分間）で洗浄し、乾燥させた。環化を可能にするために、システインのトリチル側鎖保護基を、ＤＣＭ中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、７％）、Ｈ２Ｏ（２％）で切断し（１×５分間）、その後ＤＣＭ中のＴＦＡ（７％）、ＴＩＢＳ（３％）、Ｈ２Ｏ（２％）で切断した。メンブレンを、ＤＣＭ（３×３分間）、ＤＭＦ（２×３分間）およびＤＭＦ（２×３分間）で洗浄した。ペプチドを、２５％水性Ｃｓ２ＣＯ３／ＤＭＦ（１：１）で一晩処理して環化した。メンブレンを、ＤＭＦ（２×３分間）、Ｈ２Ｏ（２×３分間）、エタノール（２×３分間）およびジエチルエーテル（２×３分間）で洗浄し、風乾した。
【００９７】
加水分解および側鎖脱保護は、ＤＣＭ中のＴＦＡ（６０％）、ＴＩＢＳ（３％）およびＨ２Ｏ（２％）での撹拌なしの２．５時間の処理１回と、その後の洗浄ステップ（ＤＣＭ３×３分間、ＤＭＦ３×３分間、エタノール３×３分間、ジエチルエーテル２×３分間）と、その後のＤＣＭ中のＴＦＡ（９０％）、ＴＩＢＳ（３％）およびＨ２Ｏ（２％）での撹拌なしの３０分間とによって行った。メンブレンを、ＤＣＭ（３×３分間）、ＤＭＦ（３×３分間）、エタノール（２×３分間）、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．１Ｍ、２×３分間）、Ｈ２Ｏ（２×３分間）、エタノール（２×３分間）およびジエチルエーテル（２×３分間）で洗浄し、風乾した。
【００９８】
本発明に係る断片の設計および送達
ＤＡＸＸタンパク質（配列番号１）の一次配列を、重複する１５ｍｅｒのペプチド（３アミノ酸シフト）に切断し、全てのペプチド（２４３種のペプチド）を、上記のようにＳＰＯＴ合成によってセルロースメンブレン上で合成した。ペプチドライブラリーを、ＦａｓレセプターのＨｉｓタグ化細胞内領域（Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートした。Ｆａｓとペプチドとの間の相互作用を、抗Ｈｉｓ（マウス）／抗マウス−ＨＲＰのサンドイッチを使用して決定し、シグナルを、図１Ａに示すように、ＬｕｍｉＩｍａｇｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して明らかにした。スポット番号２１１（配列番号２）が最も高いシグナル強度を示すことが見出され、スポット番号２０９、２１０および２１２（それぞれ、配列番号３、配列番号４および配列番号７）は、最小エピトープ配列（ＫＳＲＫＥＫＫＱＴ）を含むことが見出された。
【００９９】
それにもかかわらず、１５ｍｅｒの配列ＫＳＲＫＥＫＫＱＴＧＳＧＰＬＧ（スポット２１１、配列番号２）およびＳＧＰＰＣＫＫＳＲＫＥＫＫＱＴ（スポット２０９、配列番号３）の配列長分析により、これらの配列を図１中に見出される最小エピトープへと任意に短縮することは不可能であることが明らかになった。上述のＳＰＯＴ合成を使用して、ペプチド長の影響を、Ｎ末端、Ｃ末端および両方の方向で所与の配列を短縮することによって分析した（図２Ａ）。最も高いシグナル強度を示したペプチド配列を図２Ｂ中に示す。
【０１００】
ＤＡＸＸペプチドまたはＤＡＸＸｐと呼ばれる１６ｍｅｒのペプチド（ＫＫＳＲＫＥＫＫＱＴＧＳＧＰＬＧ）（配列番号５）に対応する、ＤＡＸＸｐ−２１１とＤＡＸＸｐ−２０９の最大のシグナル強度の組合せ（ｍｅｒｇｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を行った。ＤＡＸＸｐは、重要なｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの抗アポトーシス活性を有することが見出された。
【０１０１】
ドミナントネガティブタンパク質（ＤＡＸＸ−ＤＮ）［Ｒｏｕｂｉｌｌｅら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００７；１１６：２７０９〜２７１７］が、ＤＡＸＸｐ−２１１ペプチドからＤＡＸＸタンパク質のＣ末端まで伸びる領域を包含するという事実に沿えば、ペプチドをＣ末端で伸長させることが可能である（図１Ｂ）。
【０１０２】
ＡＭＩにおける適用
ＣＰＰにコンジュゲートしたまたはしていないＤＡＸＸｐペプチドを、初代心筋細胞においてその抗アポトーシス活性について試験し、全身投与後のマウス手術Ｉ／Ｒモデルにおいて梗塞サイズを減少させる能力について試験した。
【０１０３】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価
第一段階では、表１に列挙したペプチドの細胞取り込みを、フローサイトメトリー測定（ＦＡＣＳ−ＣＦ標識ペプチドを用いる）を使用してマウス心筋細胞の初代細胞培養物において測定し、細胞毒性が存在しないことを確認した。
【０１０４】
【表１】
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【０１０５】
検討したその他のＣＰＰ−ＤＡＸＸｐ誘導体を、以下の表２中に示す。
【０１０６】
【表２】
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【０１０７】
さらに、断片とＦａｓレセプターの細胞内領域との潜在的な相互作用を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、スウェーデン）を使用して結合親和性（Ｋｄ）を測定することによって交差検定した。断片単独またはＣＰＰとコンジュゲートした断片の結合親和性を、表３にまとめる。
【０１０８】
【表３】
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【０１０９】
その後、これらのペプチドがスタウロスポリン誘導性のアポトーシスを阻害する能力を評価した。アポトーシスは、ＤＮＡ断片化を測定するＣｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ検出ＥＬＩＳＡＰＬＵＳキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して決定した。
【０１１０】
殆どの刊行物において、当該分野で現在利用可能な抗アポトーシスペプチドは、アポトーシス誘導の３〜４時間前に投与されており、これは臨床適用にあまり適していない。このために、本研究で使用したプロトコールにおいては、スタウロスポリンと一緒にペプチドを投与した。図５Ｂは、それぞれ、Ｔａｔ−ＤＡＸＸｐを使用して４４％の、および、Ｐｉｐ２ｂ−ＤＡＸＸｐを使用して５５％の初代心筋細胞におけるＤＮＡ断片化の減少を明示している。これは、ＣＰＰ単独でも、Ｔａｔ−ｓｃｒＤＡＸＸｐまたはＴａｔ−ｎｃＤＡＸＸｐ陰性対照でも、観察されなかった。濃縮係数を、供給業者が示したとおりに計算した（処理細胞のＤＮＡ断片化／未処理細胞のＤＮＡ断片化）。結果をより良好に比較するために、ＤＮＡ断片化（濃縮係数によって表される）は、スタウロスポリン処理細胞（＝１００％）と関連付けられている。
【０１１１】
ペプチドの抗アポトーシス効果は、マウスＮＧ１１８−１５（神経細胞のモデル）（図５Ｄ）、マウスＣ２Ｃ１２（筋細胞のモデル）（図５Ａ）およびラットＨ９ｃ２（心臓細胞のモデル）（図５Ｃ）においても分析した。ＮＧ１１８−１５におけるＢｐｅｐ−ＤＡＸＸｐ（６６％の減少）、Ｃ２Ｃ１２におけるＴａｔ−ＤＡＸＸｐ（２４％の減少）、およびＨ９ｃ２におけるＰｉｐ２ｂ−ＤＡＸＸｐ（３１％の減少）を使用において、ＤＮＡ断片化の減少が最大となることが観察された。これは、適切な適用または生物学的状況での、最適なＣＰＰ選択の重要性を明らかに示している。
【０１１２】
さらに、ＦＡＤＤタンパク質（配列番号８）の結合エピトープを、ＤＡＸＸエピトープについて上記したように決定した（詳細については上記を参照のこと）。図８Ａに示すように、ペプチドＦＡＤＤｐ１５（ＶＧＫＲＫＬＥＲＶＱＳＧＬＤＬ；配列番号９）に対応するスポット番号１１は、最も高いシグナル強度を有し、スポット番号１０および１２（配列番号１０および配列番号１１）は、ＦＡＤＤｐ１５と最小エピトープ配列を共に有している。
【０１１３】
【表４】
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【０１１４】
長さを切断したペプチドライブラリーを使用して、ＦＡＤＤｐに対応するＦＡＤＤｐ１５の最小断片を決定した（配列番号１２；ＫＲＫＬＥＲＶＱＳ）（図８Ｂを参照のこと）。心筋細胞において、アポトーシスの減少は、Ｔａｔ−ＦＡＤＤｐのコンジュゲートを使用して３５％、Ｔａｔ−ＦＡＤＤｐ−１５を使用して５７％であった（図９）。
【０１１５】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ評価
第二段階において、ＤＡＸＸｐの心保護効果を、心筋虚血−再灌流のｉｎ  ｖｉｖｏモデルで評価した。急性心筋虚血および再灌流を、可逆的冠動脈閉塞の手術モデルに供したＣ５７Ｂｌ６マウスで実施した。雄性マウス（２２〜２８ｇ）を麻酔し、Ｈａｒｖａｒｄげっ歯類人工呼吸器を使用して気管挿管をにより人工呼吸した。体温を、温度調節した手術台により、３６．８℃と３７．０℃との間に維持した。胸部を、左側方開胸術によって開き、可逆的冠状動脈スネアオクルーダー（ｓｎａｒｅ  ｏｃｃｌｕｄｅｒ）を左冠状動脈の周りに配置した。マウスを、２つの異なる心筋虚血−再灌流手術プロトコールに無作為に割り当てた（図１１）。再灌流の最後に、動脈を再閉塞させ、フタロシアニンブルー色素を左心室腔中に注射し、心筋の非虚血部分を灌流させた。心筋梗塞サイズに対するＤＡＸＸｐの効果を決定するために、ペプチドを、虚血−再灌流の手術プロトコールの間に、再灌流の５分前に静脈内投与した（尾側静脈）。対照群は、ＴａｔまたはＰｉｐ２ｂペプチド（ＣＰＰ単独として）で処理した。１ｍｇ／ｋｇの用量を選択し（μモル濃度の範囲）、０．１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇに対する用量反応も試験した。
【０１１６】
再灌流の最後に、マウスを再麻酔し、冠状動脈結紮を確実に締め付け青の色素を注射し、回収した左心室を、虚血−再灌流障害に対する心保護効果を調査するために、梗塞サイズ測定（ＴＴＣ法、Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ．Ｔｈｒｏｍｂ．、２０００；１０：１８１〜１８７）またはＤＮＡ断片化測定（Ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ検出ＥＬＩＳＡＰＬＵＳキット、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に割り当てた。得られた結果を図１２〜１５に示す。
【０１１７】
Ｔａｔ−ＤＡＸＸｐ（１ｍｇ／ｋｇ）をｉｎ  ｖｉｖｏで静脈内注射した場合、１時間の再灌流後に測定した梗塞サイズは、Ｔａｔペプチド単独に対して５３．４％減少した（Ｐ＜０．０１）（虚血領域は、群間で同等であった；ｐ＝ｎｓ−図１２Ａ）。この心保護は、Ｔａｔ−ＤＡＸＸｐ注射マウス  対  Ｔａｔ注射マウス由来の左心室における、アポトーシスの特徴である特異的ＤＮＡ断片化の急激な減少に相関した（図１２Ｂを参照のこと）。この心保護は、Ｐｉｐ２ｂ−ＤＡＸＸｐまたはＣＰＰ単独でも陰性対照Ｔａｔ−ｓｃｒＤＡＸＸｐでも、観察されなかった（データ掲載せず）。
【０１１８】
図１３は、０．１、１および１０ｍｇ／ｋｇで注射した場合のＴａｔ−ＤＡＸＸｐについての用量反応を示し、１ｍｇ／ｋｇの用量で最大の効果が得られたことを示している。ＤＡＸＸｐ（１０ｍｇ／ｋｇ）注射単独（ＣＰＰなし）は、Ｔａｔ−ＤＡＸＸｐと同程度まで梗塞サイズおよびＤＮＡ断片化の両方を減少させることによって、心筋を保護することができた。
【０１１９】
再灌流の持続時間を１時間から２４時間に延長した場合、Ｔａｔ−ＤＡＸＸｐの心保護効果は維持された（図１４および１５を参照のこと）。
【０１２０】
共焦点画像化により、ＣＦ−Ｔａｔ−ＤＡＸＸｐ（１ｍｇ／ｋｇ）は、左心室中の心筋細胞のサイトゾルおよび核の両方に局在することが明らかになった（図１６）。
【０１２１】
腎移植モデル（ラット）で実施したｉｎ  ｖｉｖｏ評価で得られた予備的な結果により、他の臨床応用においてもＴａｔ−ＤＡＸＸｐ（１ｍｇ／ｋｇ）が虚血−再灌流障害からの保護ができることが示された。
【０１２２】
本出願を通じて、種々の参考文献が、本発明が関与する分野の技術水準を記載している。これらの参考文献の開示は、本明細書中で、参照により本開示中に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図５ＡＢ】
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【図５ＣＤ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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