(57)【要約】  本発明は、Lingo-1、Lingo-2、Lingo-3及びLingo-4から選択されるタンパク質の単量体、及び単量体が立体構造変化を受ける場合にシグナルを放出するプローブによって形成されるカップリング生成物、及び斯かるシステムを使用した、Lingo-1、Lingo-2、Lingo-3及びLingo-4から選択されるタンパク質のリガンドを特定することができるスクリーニング方法に関する。本発明は、分子の検出、分子間の相互作用の検出方法及び分子のスクリーニング方法の分野、及び医薬分野で産業上利用できる。
2013524195.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）Lingo-1、Lingo-2、Lingo-3及びLingo-4から選択されるタンパク質の単量体、及び単量体が立体構造変化を受ける場合に検出可能なシグナルの放出が可能なプローブを含む、第一のカップリング生成物、
ｂ）Lingo-1、Lingo-2、Lingo-3及びLingo-4から選択されるタンパク質の単量体、及び単量体が立体構造変化を受ける場合に検出可能なシグナルの放出が可能なプローブを含む、第二のカップリング生成物、
を含むシステムであって、
第一のカップリング生成物と第二のカップリング生成物とが、単量体間の相互作用によって二量体を形成するとともに、単量体間の相互作用の変化がシグナルを生じる、システム。
【請求項２】
プローブが、GFP（緑色蛍光タンパク質）、YFP（黄色蛍光タンパク質）、増強黄色蛍光タンパク質（eYFP）、eGFP、GFP2、GFP10、RGFP（ウミシイタケ（Renilla）緑色蛍光タンパク質）、YPetから選択される蛍光タンパク質である、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
プローブが、ウミシイタケルシフェラーゼ、RLuc8、ホタルルシフェラーゼ、ガウシアンルシフェラーゼ又はエクオリンから選択されるルシフェラーゼである、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
システムが、生物発光共鳴エネルギー移動システムである、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のシステムの使用であって、Lingo-1、Lingo-2、Lingo-3及びLingo-4から選択されるタンパク質のリガンドを同定するための、使用。
【請求項６】
Lingo-1、Lingo-2、Lingo-3及びLingo-4から選択されるタンパク質のリガンドを同定するための方法であって、
ａ）請求項１〜４のいずれか１項に記載のシステム及び候補分子をインキュベートする工程であって、システムが、
（ｉ）Lingo-1、Lingo-2、Lingo-3及びLingo-4から選択されるタンパク質の単量体、及び単量体が立体構造変化を受ける場合に検出可能なシグナルの放出が可能なプローブ、を含む第一のカップリング生成物、
（ｉｉ）Lingo-1、Lingo-2、Lingo-3及びLingo-4から選択されるタンパク質の単量体、及び単量体が立体構造変化を受ける場合に検出可能なシグナルの放出が可能なプローブ、を含む第二のカップリング生成物、
を含む工程、
ｂ）プローブの少なくとも１つによって放出されるシグナルの変更を検出する工程、
を含むとともに、シグナルの変更が、カップリング生成物の少なくとも１つへの候補分子の結合を示す、方法。
【請求項７】
ハイスループットなスクリーニングシステムを含む、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Lingo-1、Lingo-2、Lingo-3及びLingo-4から選択されるタンパク質の単量体、及び斯かる単量体が立体構造変化を受ける場合にシグナルを放出するプローブを含むカップリング生成物、斯かる生成物をコードする核酸配列、その調製を可能にするベクター、それを含むシステム、及びLingo-1、Lingo-2、Lingo-3及びLingo-4から選択されるタンパク質のリガンドを同定することを可能にするスクリーニング法に関する。
【０００２】
本発明は、分子を検出する方法、分子間の相互作用を検出する方法、及び分子スクリーニングのための方法の分野、及び医療分野において産業上利用できる。
【０００３】
以下の記載において、角付き括弧（［ ］）内の参照番号は、実施例以降に記載の参考文献のリストを参照する。
【背景技術】
【０００４】
神経変性疾患は、特定のニューロンの変性及び神経系の破壊を特徴とする。パーキンソン病及び多発性硬化症は、これらの疾患のうちの２つである。
【０００５】
パーキンソン病は、1000人中1〜2人が罹患する。変性は、特に身体動作の制御に関与する神経伝達物質であるドパミンを生じるドパミン作動性神経を含む。斯かる疾患に対して開発された処置、本質的にはドパミン系薬物及びドパミンアゴニストは、疾患の進行を減速することで斯かる課題の改善が可能であると考えられている。しかしながら、これらの処置は、疾患の治癒は可能でない。
【０００６】
多発性硬化症は、1000人に1人の有病率であり、脳及び脊髄の軸索のミエリンが破壊される自己免疫疾患である。これは、神経流入（nerve influx）の伝導を困難とし、これにより実質的に全生物学的機能に影響する。現在の治療は、免疫抑制剤又は免疫調節物質を必要とする。しかしながら、重複するが、これらの処置は疾患の進行の減速に対応するのみで、治癒には対応していない。
【０００７】
Lingo-1と呼ばれるタンパク質は、これらの２つの疾患に関与する。さらに、Lingo-4タンパク質は、ミエリンに関する疾患に関与する（国際公開第2009/061500号）。Lingo-1は、580個の残基の膜貫通型タンパク質である（シグナルペプチドを除く）。それは、12個のLRR（ロイシンリッチなリピート）モチーフ及びIg（免疫グロブリン）ドメインから成る重要な細胞外領域（516個のアミノ酸）を有する。38個の残基を含む細胞質部分は、EGFR（上皮増殖因子受容体）による残基リン酸化の古典的部位（canonical site）を含む。Lingo-1は、中枢神経系（CNS）の生物学において重要な役割を果たし、神経疾患及び神経変性疾患の治療のための魅力的な標的を構成する、LRRタンパク質のファミリーに属する。
【０００８】
Lingo-1の発現プロファイルは神経特異的であり、CNS、より特にニューロン及びオリゴデンドロサイトで豊富な発現を有する。斯かる膜貫通型タンパク質は、複数の抑制機能: ニューロンの生存、損傷後の軸索及び神経突起の再生及びオリゴデンドロサイトの成熟及びミエリン形成に影響する。
【０００９】
Lingo-1は、NgR1/p75複合体の因子であり、その抑制は神経突起及び軸索成長を促進する。実際、Lingo-1をコードする遺伝子はCarim-Todd等によって2003年にクローン化され（「LRRN6A/LERN1（leucine-rich repeat neuronal protein 1）, a novel gene with enriched expression in limbic system and neocortex」2003, Eur. J; Neurosci. 18 （12）:3167-82, [1]）、2004年にMi等によってLingo-1がNgR1/p75とNgR1/TROYとの受容体複合体の不可欠部分であることが示された（Mi et al.、「LINGO-1 is a component of the Nogo-66 receptor/p75 signaling complex」. 2004、Nat Neurosci. 7（3）:221-8、[2]）。神経細胞膜に位置するこれらの複合体は、RhoAキナーゼの活性化を介して、ミエリン因子の存在下で神経突起及び軸索再生を抑制する（OMGp、Nogo及びMAG）。これは、ラットにおける軸索再生のインビボ（in vivo）の実験モデルで確認されている。斯かるモデルで脊髄は損傷を受け、これはLingo-1の発現の増加及び損傷周囲のオリゴデンドロサイト及びニューロンの強いアポトーシスを反映している。Lingo-1機能拮抗剤である、Lingo-1-Fc（内因性Lingo-1と競合し得るLingo-1の可溶型）での損傷ラットの処理は、運動性の顕著な改善、損傷周囲の軸索の相当の再生及びニューロン及びオリゴデンドロサイトの生存の増大を得ることができる（Ji et al.、「LINGO-1 antagonist promotes functional recovery and axonal sprouting after spinal cord injury」、2006、Mol Cell Neurosci. 33（3）:311-20、[3]）。
【００１０】
さらに、オリゴデンドロサイト又は軸索に発現されたLingo-1は、オリゴデンドロサイト分化及びミエリン形成を抑制する（Mi et al.、「Lingo-1 negatively regulates myelination by oligodendrocytes」、2005、Nature Neuroscience 8: 745- 751、[4]）。これは、その後Lee等（「NGF regulates the expression of axonal LINGO-1 to inhibit oligodendrocyte differentiation and myelination」. 2007、J Neurosci. 27（1）:220-5、[5]）及びZhao等（「An in vitro study on the involvement of LINGO-1 and Rho GTPases in Nogo-A regulated differentiation of oligodendrocyte precursor cells」、2007、Mol Cell Neurosci. 36（2）:260-9、[6]）によって確認された。実際、Lingo-1拮抗剤（Lingo-1-Fc、抗Lingo-1抗体、細胞質ドメインを含まないLingo-1に相当するDN-Lingo-1（ドミナントネガティブ）、Lingo-1 RNAi、Lingo-1ノックアウト）の使用は、オリゴデンドロサイトの分化の増大及び豊富なミエリン鞘（myelin sheet）の形成を誘発するが、一方で全Lingo-1の過剰産生は逆の効果を生じる。Lee等（2007）（[5]）は、さらに軸索中のLingo-1タンパク質の発現が、オリゴデンドロサイトで発現されるLingo-1タンパク質と同程度に、隣接するオリゴデンドロサイトの分化及びミエリン形成で重要な役割を果たすことを示した。軸索におけるLingo-1の発現は、NGF及びその受容体、TrkAによって活性化される。Lingo-1の抑制がミエリン形成に影響する疾患、例えば多発性硬化症で担う役割を試験するために、「MOG誘発性マウス実験的自己免疫性脳脊髄炎」（EAE）と呼ばれる、疾患実験動物モデルが試験されている。斯かるモデルでの抗Lingo-1抗体（Lingo-1拮抗剤）及びLingo-1-ノックアウトマウスの使用は、Lingo-1機能の低下が良好な軸索完全性及びその再ミエリン化の増大と関連することを説明することを可能にした（Mi et al.、「Lingo-1 antagonist promotes spinal cord remyelination and axonal integrity in MOG-induced experimental autoimmune encephalomyelitis」、2007、Nature medicine 13: 1228-1233、[7]）。
【００１１】
さらに、Lingo-1は、ドパミン作動性（DA）ニューロン及び網膜神経節細胞（RGCs）の生存を抑制する。Lingo-1拮抗剤を使用した動物モデル又は細胞培養で行われる一部の試験は、Lingo-1がニューロンの生存、より特に網膜神経節細胞（RGCs）（緑内障で破壊される）の生存（Fu et al.、「Blocking LINGO-1 function promotes retinal ganglion cell survival following ocular hypertension and optic nerve transection」. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2008、49（3）:975-85、[8]; Fu et al.、「Combined effect of brain-derived neurotrophic factor and Lingo-1 fusion protein on long-term survival of retinal ganglion cells in chronic glaucoma」、2009、Neuroscience 162: 375-382、[9]）、小脳ニューロン（Zhao et al.、「Inactivation of glycogen synthase kinase-3beta and up-regulation of LINGO-1 are involved in LINGO-1 antagonist regulated survival of cerebellar granular neurons」、2008、Cell Mol Neurobiol. 28（5）:727-35、[10]）、及びDAニューロン（パーキンソン病に関与）（Inoue et al.、「Inhibition of the leucine-rich repeat protein Lingo-1 enhances survival, structure, and function of dopaminergic neurons in Parkinson's disease models」、2007、PNAS 104: 14430-14435、[11]）で重要な役割を果たすことを示す。パーキンソン病に罹患する患者及びマウス実験モデルのDAニューロンにおいて、Lingo-1が過剰産生されるようである。Lingo-1はこれらのニューロン中でEGFRを抑制し、EGFRはPI3k/Akt経路を活性化するするので、ニューロンの生存におけるLingo-1の作用はPI3k/Akt経路の抑制から生じ得る。
【００１２】
緑内障の動物モデルにおいて、BDNF（脳由来の神経栄養因子）がRGCsの死を遅延させ、RGCsのための重要な生存因子であることが知られている。Fu等（2009）（[9]）は、近頃Lingo-Fc及びBDNFの併用効果がBDNF単独よりはるかに有効であり、RGCsの長期の生存の増大を可能とすることを証明した。Lingo-1はBDNF受容体、TrkBと相互作用し、それを抑制することが可能であるので、斯かる分子機構はRGCsの長期の保護に関与するものとなり得る。
【００１３】
Lingoタンパク質、特にLingo-1の抑制は、神経保護効果を生じミエリン合成を刺激するので、新規な、特にこれらの疾患に対する有利な治療標的を構成する。実験動物モデルでインビトロ（in vitro）及びインビボ（in vivo）で行った実験は、Lingo-1抑制が革新的であり複数の神経系疾患、特にパーキンソン病及び多発性硬化症を治癒するための有望なアプローチであるという仮説を確認した。
【００１４】
Lingoタンパク質、特にLingo-1タンパク質の天然のリガンドは、現在知られていない。よってLingo-1拮抗剤である新規化学分子の同定は、これらの２つの神経系疾患に対する新規治療を開発することが可能となるあろう。しかしながら、Lingo-1リガンドの結合の測定が可能である現在利用可能な方法はない。さらに、自動化できLingo-1のリガンド及び拮抗剤のハイスループットに適合させることができる同定方法は現在存在しない。Lingo-1リガンド又は拮抗剤を同定するためのその唯一の現在の手段は、小脳顆粒状ニューロン（Mi et al.、2004、[2]; Zho at al.、2008、[10]）、網膜神経節細胞（Fu et al.、2009、[9]）での実行、又はオリゴデンドロサイト（Mi et al.、2005、[4]）又は自己免疫性脳脊髄炎（Mi et al.、2007、[7]）又はパーキンソン病（Inoue et al.、2007、[11]）の実験マウスモデルでの実行に面倒な生物学的試験である。これらの試験は、ハイスループットへ適合させることができない。
【００１５】
このため出願人は今回、Lingo、特にLingo-1のリガンド、特に拮抗剤を同定するための、自動化可能で且つハイスループットへ適合させることができる方法の開発を試みた。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、先行技術の欠点を克服しこれらの需要を満たすことが実際可能である。
【００１７】
出願人は驚いたことに、相当の研究の後に、Lingo-1がインビボ（in vivo）で二量体を形成することを観察した。Lingo-1の細胞外部分は四量体化が可能であることは文献に記載されていた（Mosyak et al.、「The structure of Lingo-1 ectodomain, a module implicated in CNS repair inhibition」、2006、J. Biol. Chem. 281: 36378-36390、[12]）。しかし、出願人は今回初めて、全Lingo-1及びLingo-1の膜形態が、インビボ（in vivo）で二量体を形成することを示した。
【００１８】
よって出願人は、Lingo-1、Lingo-2、Lingo-3及びLingo-4から選択されるタンパク質のリガンドを同定するための方法を開発した。それをは容易に自動化させ且つハイスループットに適合させることが可能であり、最も適した抑制剤を発見しそれを治療目的に利用するために、大きな化学分子ライブラリーをスクリーニングすることを可能にする。
【００１９】
斯かる方法は、Lingo、特にLingo-1がリガンドと相互作用する場合に、Lingo-1の二量体の立体構造が変化するという原理に基づく。斯かる同定方法は、この立体構造変化を検出しLingo-1リガンドを同定することが可能である。
【００２０】
本発明の方法は、特に次の:
a）Lingo-1、Lingo-2、Lingo-3及びLingo-4から選択されるタンパク質の単量体及び検出可能なシグナルの放出が可能なプローブによって形成されるカップリング生成物を含むシステム、及び候補分子をインキュベートする工程、
b）プローブの少なくとも１つによって放出される斯かるシグナルの変更を検出するとともに、シグナルの斯かる変更によりカップリング生成物の少なくとも１つへの候補分子の結合を明らかにする工程、
を含む。
【００２１】
本発明は、Lingo-1、Lingo-2、Lingo-3及びLingo-4から選択されるタンパク質の単量体、及び単量体が立体構造変化を受ける場合にシグナルの放出が可能であるプローブを含むカップリング生成物に関する。
【００２２】
本発明の目的に関して、用語「単量体」とは、単一のポリペプチド分子から成るタンパク質を意味する。言い換えれば、それは単一ポリペプチド鎖における原子の三次元配置に存在する。好適には、単量体は二量体の形成が可能である。言い換えれば、単量体は、２つの単量体、すなわち、２つの単量体サブユニットから成る分子を形成するために、互いに結合が可能である。例えば、ホモ二量体、すなわち、互いに結合した同一のタンパク質の２つの単量体とすることができる。あるいは、ヘテロ二量体、すなわち、互いに結合した２つの異なるタンパク質の２つの単量体とすることができる。好適には、二量体は、適切な条件下で、単量体のインビボ（in vivo）での重合によって形成することができる。例えば、これらの条件は、ジスルフィド架橋の形成又は疎水性相互作用の形成に適切とすることができる。
【００２３】
本発明の目的に関して、用語「Lingo-1、Lingo-2、Lingo-3及びLingo-4」とは、実質的に野生型タンパク質の配列を有する任意のタンパク質を意味する。それは、野生型タンパク質の全て又は一部分を有するタンパク質、又は例えば、付加、欠失又は置換による１又は２以上の変異を有するタンパク質とすることができる。それは、ヒト又は非ヒトタンパク質、例えば、マウス、ウマ（equine）、例えば、ウマ（horse）、ブタ、ウサギ、ラット、ヒツジ（ovine）、例えば、ヒツジ（sheep）、ウシ（bovine）、例えば、乳牛、サル（monkey）、例えば、マカクのタンパク質とすることができる。
【００２４】
タンパク質がLingo-1である場合、野生型ヒトタンパク質とすることができ、特に12個のLRR（ロイシンリッチなリピート）モチーフ及びIg（免疫グロブリン）ドメインから成る細胞外領域（516個のアミノ酸）を含む580個の残基、及び38個の残基の細胞質部分から成るタンパク質とすることができる。好適には、Lingo-1単量体の配列は、配列番号1の配列とすることができる。それは、Genbank （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/）に受入番号NP_116197.4で記載の配列とすることができる。それはまた、配列番号5、又はGenbankの配列NM_032808で記載のmRNAに相当するポリヌクレオチド配列に由来するタンパク質とすることができる。
【００２５】
タンパク質がLingo-2である場合、野生型ヒトタンパク質とすることができ、特に606個のアミノ酸から構成され、515個のアミノ酸から構成される細胞外ドメイン、及び40個の残基の細胞質部分を含むタンパク質とすることができる。好適には配列は、配列番号2の配列とすることができる。それは、Genbankで受入番号NP_689783.1で記載される配列とすることができる。それはまた、配列番号 6の配列によって、又はGenbankのNM_152570の配列によって記載されるmRNAに相当するポリヌクレオチド配列に由来するタンパク質とすることができる。
【００２６】
タンパク質がLingo-3である場合、それは野生型ヒトタンパク質とすることができる。好適には配列は、配列番号3の配列とすることができる。それは、Genbankに記載の受入番号 NP_001094861の配列とすることができる。それはまた、配列番号 7の配列又はGenbankのNM_001101391の配列で記載されるmRNAに相当するポリヌクレオチド配列に由来するタンパク質とすることができる。
【００２７】
タンパク質がLingo-4である場合、それは野生型ヒトタンパク質とすることができ、特に593個のアミノ酸から構成することができる。好適には配列は、配列番号4の配列とすることができる。それはまた、配列番号8の配列又はGenbankのNM_001004432の配列（ヒト配列）、又はNP 796224のマウス配列で記載されるmRNAに相当するポリヌクレオチド配列に由来するタンパク質とすることができる。
【００２８】
好適には、タンパク質のリガンドとの単量体又は二量体の相互作用は、単量体及び／又は二量体の物理的特性変化を生じ得る。それは、例えば、単量体及び／又は二量体の空間立体構造とすることができる。
【００２９】
本発明の目的に関して、用語「単量体の立体構造変化」とは、単量体の任意の空間変化を意味する。好適には、斯かる変化は、単量体及び／又は二量体のリガンドとの相互作用から生じ得る。
【００３０】
本発明の目的に関して、用語「シグナルを放出することが可能であるプローブ」とは、単量体の物理的特性が変化を受ける場合に、特に単量体が立体構造変化を受ける場合に、ある効果を生じ得る任意の分子を意味する。好適には、立体構造上高感度の検出が可能な標識とすることができる。好適には、単量体又は二量体とのリガンドの相互作用は、単量体又は二量体において立体構造変化を生じ、斯かる変化は検出可能なシグナルの放出に関与する。
【００３１】
好適には、プローブは、化学的タグ、例えば、抗体、発光分子又は蛍光分子、単量体に組み込まれる断片、例えば、プロテアーゼ切断部位、又は免疫検出可能断片から選択される分子とすることができる。
【００３２】
本発明の目的に関して、用語「発光分子」とは、非熱起源のエネルギーを有する光子の形態で、励起中に吸収されたエネルギーの一部分を放出する特性を有する任意の分子を意味する。よってそれは、低エネルギー状態へ励起された分子の不活性化を含む。言い換えれば、発光分子は、発光を生じるために適切な物質に作用し得る分子である。
【００３３】
発光分子は、例えば、タンパク質、又は化合物とすることができる。好適には、発光タンパク質は、青、黄色又は緑光を放出する特性を有する。タンパク質は、例えば、Kamal等の文献、「Improved donor/acceptor BRET couples for monitoring beta-arrestin recruitment to G protein-coupled receptors」、Biotechnol J. 2009 Sep;4（9）:1337-44、[17]; Kocan M等の、「Demonstration of improvements to the bioluminescence resonance energy transfer (BRET) technology for the monitoring of G protein-coupled receptors in live cells」、J Biomol Screen. 2008 Oct;13（9）:888-98、[18]; Michelini E等の、「Luminescent probes and visualization of bioluminescence」、Methods Mol Biol. 2009;574:1-13、[19]）に記載される、当業者に周知のタンパク質から選択することができる。例えば、発光タンパク質は、ルシフェラーゼとすることができる。ルシフェラーゼは、例えば、国際公開第01/046691号に記載の、当業者に周知の分子から選択可能である。例えば、ウミシイタケルシフェラーゼ、RLuc2、RLuc8、ホタルルシフェラーゼ、ガウシアンルシフェラーゼ又はエクオリン、及びそれらの変異体又は誘導体とすることができる。ウミシイタケルシフェラーゼの場合、配列番号12の配列によってコードされるタンパク質とすることができる。
【００３４】
例えば、発光タンパク質は、ウミシイタケルシフェラーゼとすることができ、単量体はLingo-1とすることができる。斯かる場合、カップリング生成物は、配列番号14のペプチド配列を有することができる。
【００３５】
本発明の目的に関して、用語「シグナル」とは、任意の物理的又は化学的効果を意味する。それは、例えば、発光性シグナル、例えば、蛍光、発光、発色、電気性であるが、このリストに限定するモノではない。
【００３６】
本発明の目的に関して、用語「蛍光分子」とは、光エネルギーを吸収する特性（励起光）及び非常に急速に光子を放出することによって蛍光の形態で急速に放出する特性（放出光）を有する任意の分子を意味する。一旦光子のエネルギーが吸収されると、分子は続いて通常電子的に励起された状態となる。言い換えると、フルオロフォア又は蛍光色素とすることができる。
【００３７】
好適には、発光又は蛍光タンパク質は、青、黄色又は緑色光を放出可能なタンパク質とすることができる。
【００３８】
特に好適には、発光又は蛍光タンパク質は、黄色又は緑色光を放出することが可能な蛍光タンパク質とすることができる。蛍光タンパク質は、例えば、GFP（「緑色蛍光タンパク質」）、YFP（「黄色蛍光タンパク質」）、増強黄色蛍光タンパク質（eYFP）、eGFP、GFP2、GFP10、RGFP（ウミシイタケ緑色蛍光タンパク質）及びYPet、及び国際公開第01/46691号に記載されるそれらの突然変異体又は誘導体から選択できる。eYFPの場合、それは配列番号9の配列によってコードされるタンパク質とすることができる。
【００３９】
例えば、蛍光タンパク質はeYFPとすることができ、単量体はLingo-1とすることができる。斯かる場合、カップリング生成物は、配列番号11のペプチド配列を有することができる。
【００４０】
本発明の目的に関して、用語「カップリング生成物」とは、単量体及びプローブが互いに結合した任意の生成物を意味する。言い換えれば、カップリング生成物は、単量体とプローブとの組み合わせとすることができる。言い換えれば、カップリング生成物は、単量体とプローブとの複合体とすることができる。
【００４１】
好適には、プローブ及び単量体は、生物学的媒体中で安定な１又は２以上の結合を介して結合され得る。言い換えれば、プローブ及び単量体は、カップリング生成物が保存又は生成される媒体中でその間変化しない、１又は２以上の結合を介して結合され得る。好適には、媒体は細胞培地、又はインビトロ（in vitro）又はインビボ（in vivo）の操作と関連して使用される媒体とすることができる。
【００４２】
プローブ及び単量体は、共有結合で結合され得る。これに関して、結合は、互いから別々に生じる２つの電子の共有に由来する２つの原子との間の結合とすることができる。
【００４３】
プローブ及び単量体は、融合タンパク質、すなわち、異なるタンパク質、又はタンパク質の一部の組み合わせを介して得られた人工タンパク質を形成できる。
【００４４】
カップリング生成物は、当業者に周知の技術によって、例えば、カップリング生成物をコードする核酸分子の宿主生物による発現によって、又はインビトロ（in vitro）でのペプチド合成及び化学ライゲーション後のカップリングによって得られる。例えば、カップリング生成物が融合タンパク質の場合、カップリング生成物は、プローブ及び単量体に相当するオープンリーディングフレームを含む遺伝子のDNA組換え、斯かる遺伝子の発現ベクターへの挿入、発現ベクターの宿主細胞への挿入、宿主細胞による対応の融合タンパク質の産生及び融合タンパク質の精製による作成に従って得られる。
【００４５】
本発明はまた、上述のカップリング生成物をコードする、分離及び精製された核酸分子に関する。
【００４６】
本発明の目的に関して、用語「核酸分子」とは、一連のヌクレオチドから成る任意の分子を意味する。それは、例えば、デオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）、メッセンジャーRNA（mRNA）又は相補DNA（cDNA）とすることができる。
【００４７】
本発明の目的に関して、用語「分離」とは、天然環境から分離されることを意味する。好適には、核酸は、組換えDNAテクノロジー、例えば、配列決定、制限酵素での消化、変異誘発、及び発現ベクターへのクローニングと関連して行われる所定の操作を受け得る。
【００４８】
本発明の目的に関して、用語「精製」とは、混入物から実質的に分離されている特徴を意味する。
【００４９】
核酸分子は、上述の発光又は蛍光タンパク質をコードする核酸配列、及び上述の単量体をコードする核酸配列を含むことができる。好適には、核酸分子は、配列番号10の配列（単量体がLingo-1であり、タンパク質がeYFPである）又は配列番号13の配列（単量体がLingo-1であり、タンパク質がウミシイタケルシフェラーゼである）を含むことができる。
【００５０】
核酸分子は、当業者に周知の技術によって得られる。それは、特に人工的に構築でき、化学合成、又は例えば、Lewin B.: Genes VI、De Boeck University、6th edition、Chapter 20、1999に記載される遺伝子工学によって得られる。それは、例えば、プローブ及び単量体に相当するオープンリーディングフレームを含む遺伝子のDNAの組換えによって得られる。例えば、組換えDNAは、特に細菌プラスミド又はバクテリオファージ等の発現ベクターによって、特に細菌等の宿主発現生物中に挿入することができる。
【００５１】
本発明はまた、上述の核酸分子を含む発現ベクターに関する。
【００５２】
本発明の目的に関して、用語「発現ベクター」とは、コード配列を有する核酸分子に転写又はタンパク質への翻訳を可能とする構造を有する任意の分子を意味する。好適には、それは、次の配列: プロモーター、転写開始配列、転写終了配列、ポリアデニル化配列等、選択可能遺伝子、エンハンサー、制御配列及び誘導性配列の少なくとも１つを含むことができる。
【００５３】
ベクターは、例えば、アデノウイルス又はレトロウイルス等のウイルス、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド又はファージミド等の当業者に周知の任意のベクターとすることができる。それは、例えば、プラスミドp3xFlag（Sigma）、pCDNA3（Invitrogen）又はpeYFP-N1（Clontech）等の市販のベクターとすることができる。
【００５４】
このようなベクターは、例えば、Lewin B.: Genes VI、De Boeck University、6th edition、Chapter 20、1999に記載される当業者に周知の技術によって調製できる。
【００５５】
本発明はまた、少なくとも１つの上述の核酸分子又は上述の発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
【００５６】
本発明の目的に関して、用語「宿主細胞」とは、タンパク質をコードする発現ベクターがその中に導入される場合に、タンパク質を産生する能力を有する任意の生物を意味する。好適には、カップリング生成物をコードする発現ベクターがその中に導入される場合に、宿主細胞はカップリング生成物を発現できる。
【００５７】
好適には、宿主細胞は、少なくとも１つの上述のカップリング生成物を発現できる。例えば、宿主細胞は、ウミシイタケルシフェラーゼ及びLingo-1を含むカップリング生成物、又はeYFP及びLingo-1を含むカップリング生成物を発現できる。
【００５８】
好適には、宿主細胞は、２つの核酸分子又は発現ベクターを含むことができる。例えば、宿主細胞は、発光タンパク質及び単量体を含むカップリング生成物をコードする核酸分子、及び蛍光タンパク質及び単量体を含むカップリング生成物をコードする核酸分子を含み且つそれを発現することができる。例えば、宿主細胞は、ウミシイタケルシフェラーゼ及びLingo-1単量体を含むカップリング生成物をコードする核酸分子、及びeYFP及びLingo-1単量体を含むカップリング生成物をコードする核酸分子を含み且つ発現することができる。
【００５９】
好適には、カップリング生成物は、宿主細胞で二量体を形成できる。これは、出願人が、インビボ（in vivo）において、細胞で発現された単量体が二量体を形成することを示したことに起因する。
【００６０】
宿主細胞は、組換えタンパク質の産生に適した、つまり当業者に周知の任意の生物とすることができる。それは、真核生物又は原核生物細胞とすることができる。例えば、YB2/0（ATCC CRL1-662）、CHO-K1（ATCC CCL-61）、例えば、HEK 293（ATCC CRL-1573）、BHK（ATCC CRL-12072）又はCOS （ATCC CRL-1650）、PC12（ATCC CRL-1721）又はSH-SY5Y（ATCC CRL-2266）又はHela（ATCC CCL-2）とすることができる。
【００６１】
宿主細胞は、当業者に周知の技術によって、上述の発現ベクター又は上述の核酸分子の、宿主細胞への挿入によって生成することができる。例えば、文献「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）、Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」 （1987）、John Wiley & Sons、Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載される電気穿孔、又はリン酸カルシウム、「Methods in Electroporation: Gene Pulser/E. coli Pulser System」 Bio-Rad Laboratories （1993）に記載される電気穿孔法、に言及することができる。
【００６２】
宿主細胞は、当業者に周知の任意の適した培地で培養することができる。例えば、DMEM培地（ダルベッコ変法イーグル培地、Invitrogen（登録商標））、HamのF-12培地、イーグル最小必須培地（MEM）、及び神経細胞ベース培地（Neuronal Base Medium）（PAA Laboratories）に言及することができる。
【００６３】
カップリング生成物は、当業者に周知の任意の手段、例えば、免疫精製又はアフィニティークロマトグラフィーによって精製できる。
本発明の第一の対象は、
ａ）上述の、Lingo-1、Lingo-2、Lingo-3及びLingo-4から選択されるタンパク質の単量体、及び単量体が立体構造変化を受ける場合に変更される検出可能なシグナルの放出が可能なプローブを含む第一のカップリング生成物、
ｂ）上述の、Lingo-1、Lingo-2、Lingo-3及びLingo-4から選択されるタンパク質の単量体、及び単量体が立体構造変化を受ける場合に変更される検出可能なシグナルの放出が可能なプローブを含む第二のカップリング生成物、
を含むシステムであると共に、第一のカップリング生成物及び第二のカップリング生成物が二量体を形成し、単量体間の相互作用における変化がシグナル変化を生じるシステムに関する。
【００６４】
本発明の目的に関して、用語「システム」とは、Lingo-1、Lingo-2、Lingo-3及びLingo-4から選択されるタンパク質の単量体、及び検出可能なシグナルを放出することが可能であるプローブによって形成されるカップリングに由来する二量体（すなわち、分子間相互作用のため互いに非常に近接した、２つのサブユニットから構成されるタンパク質の複合体）を意味し、斯かるシグナルは単量体及び／又は二量体が立体構造変化を受ける場合に修飾される。それは例えば、当業者に周知の任意の適した技術、例えば、生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）、TR-FRET（時間分解FRET）又はHTRF（均一時間分解蛍光）による検出に適したシステムである。好適には、それは、生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）による検出システムである。本発明の斯かるシステムは、ドナー/アクセプターカップルを発現している細胞懸濁液、付着細胞の培養物、膜又は組織等の形態とすることができる。
【００６５】
本発明の目的に関して、用語「二量体」とは、２つの単量体から成る任意の分子を意味する。好適には、二量体を構成している単量体間の距離は、150 Å未満、例えば、100 Å未満、好適には75 Å又は50 Å未満である。
【００６６】
本発明の目的に関して、用語「相互作用の変化」とは、単量体間の任意の物理的 又は 構造上変化を意味する。それは、特に単量体の空間又は 立体構造変化とすることができる。好適には、斯かる変化は、リガンドの二量体又は単量体の少なくとも１つへの結合、又は二量体 又は   単量体のの少なくとも１つへのリガンドの近接性に起因しうる。
【００６７】
本発明の目的に関して、用語「リガンド」とは、カップリング生成物に結合する任意の分子を意味する。好適には、斯かる結合は、カップリング生成物が二量体形態の場合に起こり得る。リガンドは、ホルモン、神経伝達物質、化合物、薬物、診断薬、抗体又はペプチド配列とすることができる。それは、完全又は部分（total 又は partial）刺激薬又は完全又は部分拮抗剤とすることができる。好適には、リガンドは単量体又は二量体を、1 μM〜1 pM、好ましくは、1 nM〜1 pMの親和性で結合することが可能とすることができる。好適には、リガンドは、パーキンソン病又は多発性硬化症、緑内障又はミエリンに関係する疾患を治療又は予防できる。
【００６８】
出願人は実際、今回初めて、カップリング生成物、より特に単量体が、特にインビボ（in vivo）で二量体化することを、次に、二量体へのリガンドの結合が二量体において立体構造変化を生じることを示した。
【００６９】
好適には、立体構造変化は、プローブによるシグナルの放出において変化を生じ得る。好適には、シグナルは、任意の適した当業者に周知の技術によって検出され得る。好適には、システムは、生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）システム、TR-FRET（時間分解FRET）又はHTRF（均一時間分解蛍光）による検出に適切となり得る。
【００７０】
例えば、本発明のシステムは、当業者に周知のプロトコールに従って、BRETによる検出と関連して実行できる。例えば、Xu等の「A bioluminescence resonance energy transfer (BRET) system: application to interacting circadian clock proteins」（1999）Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96、151-156 [13]; Angers等の、「Detection of beta 2-adrenergic receptor dimerization in living cells using bioluminescence resonance energy transfer（BRET）」（2000）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3684-3689 [14]に言及することができる。特に、BRETは、RLuc及びLingo-1を含むカップリング生成物、及びeYFP及びLingo-1を含むカップリング生成物によって実行できる。Rlucは、基質、例えば、セレンテラジン又は市販のその誘導体の存在下で青色光を生じる酵素である（Molecular Probes Eugene OR, Biosynth Napierville IL）。空間配向性が適切である場合、eYFPは青色光の一部を吸収し、結果として異なる波長の、黄色の範囲で光を発することが可能である。言い換えれば、セレンテラジンの存在下で、Rluc及びeYFPが十分に互いに近接する場合に、eYFPは黄色光を発する。本発明の目的に関して、用語「十分に近接」とは、150 Å未満、又は100 Å未満、好適には75 Å又は50 Å未満の距離を意味する。Rluc及びeYFPが非常に離れている場合、エネルギーは効率的に移動されず、Rlucの青色光のみ検出される。互いへのRluc及びeYFPの空間配置が、単量体の互いの空間配置に依存するということは、頻繁に生じる。分子が単量体又は二量体に結合する場合、二量体の空間立体構造が変化する。特に、単量体は、互いに近くに移動する又はさらに離れるように移動する。２つの単量体、特にRluc及びeYFPが十分に近接する場合、eYFPはRlucによって放出される青色光の一部を吸収でき、黄色範囲の波長を発することができる。よって、分子が二量体又は単量体に結合するかを検出するのために、セレンテラジンの添加後に、ドナー（Rluc）の波長及びアクセプター（eYFP）の波長での発光効率を測定することによってエネルギー移動効率を測定する。さらに、「アクセプターの発光効率/ドナーの発光効率」比は、BRETを定量化するために算出する。
【００７１】
また、本発明のシステムは、当業者に周知のプロトコールに従って、FRETによる検出と関連して実行できる。例えば、米国特許第7 183 066号（Kroeger et al.、「Constitutive and agonist-dependent homo-oligomerization of the thyrotropin-releasing hormone receptor」（2001）J Biol Chem、276、12736-12743、[20]）に言及することができる。例えば、フルオレセイン/ローダミン又はCFP（シアン蛍光タンパク質）/YFPカップルによって、当業者に周知のドナーフルオロフォア及びアクセプター発色団を使用することができる。
【００７２】
好適には、本発明のシステムは、例えば、Maurel D等、「Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization」 （2008）、Nat Methods（6）:561-7、[21]に記載される当業者に周知のプロトコールに従って、TR-FRETによる検出と関連して実行できる。例えば、時間分解リーディングに基づき、寄生シグナルの一部分を省くことによって、FRETのシグナル・ノイズ比を改善することが可能である。これは、レアアースクリプテート又はキレート等の持続するフルオロフォアの使用を介して可能である。
【００７３】
好適には、本発明のシステムは、当業者に周知のプロトコールに従って、例えばHermand P等の、「Functional adhesiveness of the CX3CL1 chemokine requires its aggregation. Role of the transmembrane domain」（2008） J Biol Chem 283（44）:30225-34; （[22]）、又はWhitfield J等の「High-throughput methods to detect dimerization of Bcl-2 family proteins」（2003）、Anal Biochem、322（2）:170-8 （[23]）に従って、HTRF（商標登録）による検出と関連して実行できる。例えば、ユーロピウムクリプテート等の蛍光ドナー又は紅藻から精製されたフィコビリンタンパク質の色素等の蛍光アクセプター（例えば、XL665）で標識された抗体は、単量体それぞれのタグを認識する。単量体の相互作用は、エネルギー移動、例えば、337 nmでの励起及び665 nmでの放出によって検出される。斯かるシステムは、上述の２つの発現ベクターの細胞への同時形質移入によって得られる。斯かるシステムは、例えば、インビトロ（in vitro）で、例えば、プレート上で実行できる。
【００７４】
本発明の他の対象は、Lingo-1、Lingo-2、Lingo-3及びLingo-4から選択されるタンパク質のリガンドを同定するための、上述のシステムの使用に関する。
【００７５】
本発明の他の対象は、Lingo-1、Lingo-2、Lingo-3及びLingo-4から選択されるタンパク質中の立体構造変化を検出するための上述のシステムの使用に関する。
【００７６】
本発明の他の対象は、Lingo-1、Lingo-2、Lingo-3及びLingo-4から選択されるタンパク質のリガンドを同定するのための方法であって、次の:
a）上述のシステム及び候補分子をインキュベートする工程であって、システムが:
（i）Lingo-1、Lingo-2、Lingo-3及びLingo-4から選択されるタンパク質の単量体、及び斯かる単量体が立体構造変化を受ける場合に変化する検出可能なシグナルの放出が可能なプローブ、を含む第一のカップリング生成物、
（ii）Lingo-1、Lingo-2、Lingo-3及びLingo-4から選択されるタンパク質の単量体、及び斯かる単量体が立体構造変化を受ける場合に変化する検出可能なシグナルの放出が可能なプローブ、を含む第二のカップリング生成物、
を含む工程、
b）プローブの少なくとも１つによって放出されるシグナルを検出する工程、
を含むとともに、シグナルが候補分子のカップリング生成物の少なくとも１つへの結合を明らかにする、方法に関する。
【００７７】
本発明の目的に関して、用語「インキュベートする」とは、第一のカップリング生成物、第二のカップリング生成物及び候補分子をまとめることを意味する。好適には、インキュベーションは、第一及び第二のカップリング生成物の単量体の二量体化が可能な条件下で行う。好適には、インキュベーションは、候補分子がタンパク質のリガンドである場合、単量体の少なくとも１つ又は二量体への候補分子の結合が可能な周知の条件下で行う。用語「候補分子」とは、任意の試験分子を意味する。それは、例えば、タンパク質、ペプチド、化学分子、抗体とすることができるが、このリストに限定するものではない。分子は、例えば、タンパク質ライブラリー、細胞懸濁液、化学ライブラリーに由来することができるが、このリストに限定するモノではない。分子は、Lingo-1、Lingo-2、Lingo-3又はLingo-4のリガンドとすることができる。
【００７８】
好適には、候補分子がタンパク質のリガンドでない場合、二量体の形成に由来するBRETシグナルは、候補分子の付加後に変化を受けない。好適には、斯かる場合、単量体、二量体、プローブ又はカップリング生成物の物理的特性の変化はない。
【００７９】
好適には、リガンドの添加後のBRETシグナルの変化は、経時で、例えば、30分間モニターすることができる。
【００８０】
好適には、候補分子がタンパク質のリガンドである場合、二量体の形成に由来するBRETシグナルは、候補分子の添加後に変化する、例えば、増加又は減少される。好適には、斯かる場合、少なくとも１つの単量体、二量体、プローブ又はカップリング生成物の少なくとも１つの物理的特性の変化が生じる。好適には、候補分子の結合は、少なくとも１つの単量体、二量体、プローブ又はカップリング生成物の立体構造変化を生じる。
【００８１】
好適には、シグナルは、BRET、FRET、TR-FRET又はHTRFシステムと関連して検出され得る。
【００８２】
好適には、本発明の方法は、シグナルが生じることを可能にする基質を添加する工程もまた含む。それは、例えば、セレンテラジン又はセレンテラジン誘導体、例えば、セレンテラジン400a、又はDeepBlueCとすることができる。基質は、当業者に周知の任意の態様で、例えば、外因的に添加する、又は基質をコードする核酸の形態で添加することができる。
【００８３】
好適には、方法は、BRET、FRET、TR-FRET又はHTRFプロセスを実行することに必要な任意の工程又は条件を含むことができる。これらの工程は、当業者に周知であり、シグナルを測定する、放出及び吸収波長を算出する、波長を区別するためにフィルターを使用する、例えば、光電子増倍管又はCDD（電荷結合デバイス）カメラによって波長強度を算出する、エネルギー移動効率を算出する、放出ピークを検出する、及びBRETCount、Mithras（Berthold）、マイクロプレートシンチレーション及び発光カウンター（Berthold、Packard Instruments）等の装置を使用する工程を含むことができる。
【００８４】
方法は、インビトロ（in vitro）又はインビボ（in vivo）で実行できる。好適には、方法は生細胞で実行できる。例えば、方法は、生理的条件下で、安定に又は一過性に形質移入した細胞株で実行できる。
【００８５】
好適には、方法は、細胞膜、任意には予め調製且つ凍結させた細胞膜の調製において、又は精製タンパク質上で実行できる。
【００８６】
好適には、方法は、ハイスループットなスクリーニングシステムもたまた含むことができる。本発明の目的に関して、用語「ハイスループットなスクリーニングシステム」とは、同定方法を促進することが可能である自動化の任意の手段を意味する。それは、当業者に周知の任意の手段とすることができ、例えば、情報テクノロジー、バイオインフォマティクス、ゲノミクス、プロテオミクス、ロボット工学、及び場合によりナノテクノロジーが含まれるが、このリストに限定するモノではない。
【００８７】
好適には、方法には、タンパク質の刺激薬（活性剤）リガンド及び拮抗剤（抑制剤）リガンドを同定することが可能である試験もまた含むことができる。それは、例えば、生物学的試験とすることができる。それは、タンパク質が役割を果たす少なくとも１つのシグナル経路、例えば、Mi等の2005、（[4]）で実行されるオリゴデンドロサイト分化、軸索ミエリン形成への候補分子の影響、又は例えば、Fu等の2009、（[9]）で実行されるドパミン作動性神経及び網膜神経節細胞の生存を同定することが可能である任意の試験とすることができる。
【００８８】
好適には、当該方法は、RhoA又はAktタンパク質キナーゼを含む、下流、細胞シグナル経路が、リガンドによって活性化される又は抑制されるかを決定することを可能にする。リガンドの効果は、例えば、Rho経路（Pierceによって販売されるRhoA試験）又はAkt 経路（Perkinから販売されるAlphaスクリーニングを使用した試験、又はCell Signalingから販売される特異的抗体を使用したウエスタンブロッティング分析）上で試験できる。
【００８９】
好適には、方法は、リガンドが斯かるタンパク質と細胞膜受容体NgR1、EGFR及びTrkBとの間の相互作用を阻害するかを測定することができる。これに関して、Lingo-1とNgR、Lingo-1-EGFR及びLingo-1/TrkBの間の相互作用を測定することができる。
【００９０】
本発明はまた、上記方法を実行するためのキットとも呼ばれる装置に関する。それは、上記の少なくとも１つの相互作用を試験することを可能にする。キットは、方法を実行するために必要なエレメント、例えば、カップリング生成物、基質、BRETシグナルを検出又は測定するための少なくとも１つの手段の全て又は一部を含むことができるが、このリストに限定するモノではない。キットは、例えば、融合タンパク質、例えば、Lingo-1-RLuc、Lingo-1-YFP、Lingo-2-RLuc、Lingo-2-YFP、Lingo-3-RLuc、Lingo-3-YFP、Lingo-4-RLuc、Lingo-4-YFP、NgR-RLuc、NgR-YFP、EGFR-RLuc、EGFR-YFP、TrkB-RLuc及びTrkB-YFPのプラスミド、及び基質、例えば、セレンテラジンを含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図１は、Lingo-1がHEK-293細胞において二量体を形成することを示す免疫共沈降実験を表す。HEK-293細胞は、5 μgのpcDNA3、Lingo-1-HA又はLingo-1-YFPプラスミドが同時形質移入される（表示：+）。免疫共沈降は、抗HA 抗体（パートaを参照：抗HAウエスタンブロット又はWBを示す）又は抗YFP 抗体（パートbを参照：抗YFPウエスタンブロット又はWBを示す）に結合されたアガロースビーズで行う。抗HA 抗体での対応の細胞膜のインキュベーションは、Lingo-HAタンパク質が実際、免疫沈降されたことを示す（a）。２つの免疫活性バンドは、約 120 kDa及び140 kDaで特異的に現れ、免疫沈降物におけるLingo-YFPの存在の証明となる（b）。
【図２】図２は、抗Lingo-1抗体の確認を表す。対照プラスミド、pcDNA3 （mock）、又はHAタグにN末端で融合されたLingo-1タンパク質をコードするプラスミドを形質移入した、HEK-293細胞から生じる細胞可溶化液を、アクリルアミドゲル（8%）上で分析する。抗HA抗体の使用は、80及び100 kDaの２つの免疫活性バンドを検出することが可能であり、それらはおそらく２つの異なるグリコシル化状態に相当する（パートaを参照、抗HAウエスタンブロット又はWBを示す）。これらの同一の２つの免疫活性バンドの存在はまた、細胞可溶化液をLingo-1特異的抗体でインキュベートする場合に観察できる（パートbを参照、抗YFPウエスタンブロット又はWBを示す）。
【図３】図３は、培養下のラット皮質ニューロンにおける、Lingo-1二量体の検出を表す。培養の１２日後に、皮質ニューロンは伸展を生じネットワークを形成する（パートaを参照）。ニューロンを架橋形成剤、DSPで処理する（+DSP）又は処理しない（-DSP）（パートbを参照: 抗Lingo-1ウエスタンブロット又はWB b）。Lingo-1は実際、皮質ニューロンに発現され、これは抗Lingo-1抗体の存在下でウエスタンブロットをインキュベートする場合に90 kDaの免疫活性バンドの存在で証明される（レーン: -DSP）。ニューロンをDSPで処理する場合、さらなる免疫活性バンドが180 kDaに現れ、Lingo-1の二量体形態に相当し、これは単量体の90 kDaにおける消失に起因する（レーン: +DSP）。
【図４】図４は、BRET技術を使用した生細胞中のLingo-1タンパク質の多量体化の検出を表す。HEK-293（パートa及びc）及びSHSY-5Y（パートb及びd）細胞を、固定濃度のドナー（100 ngのLingo-1-RLucプラスミド）及び増加濃度のアクセプター、Lingo-1-YFP又はYFP蛍光タンパク質単独（50 ng〜4000 ngのYFP-N1プラスミド）を形質移入した。生細胞での形質移入の48 時間後に、古フィルター（パートa及びb）及び新フィルター（パートc及びd）のセットを使用して、BRET測定を行う。Lingo-1-RLuc/Lingo-1-YFP生成物（四角）及びLingo-1-RLuc/YFP-N1生成物（丸）に関して、BRETシグナルをmBuで測定する。
【図５】図５は、Lingo-1-RLucとLingo-1-YFPとの相互作用の特異性を表す。HEK-293細胞に、Lingo-1-RLucとLingo-1-YFPの融合タンパク質（一定のドナー/アクセプター比）及び増加濃度の全Lingo-1タンパク質（アミノ酸1〜620、HAでタグをつけた「Lingo-HA」レーン又はそのドミナントネガティブ（アミノ酸1〜577、「DN-HA」レーン）を形質移入する。形質移入48 時間後に、生細胞でのBRET測定（mBu）を行う。HAのタグ付きコンストラクトは、Lingo-1-RLucとLingo-1-YFPとの間で得られるBRETシグナルを有意に減少する（「対照」レーン）（p < 0.001 対  対照、ANOVA、NewMan Keuls）。
【図６】図６は、96ウェルプレート（a）及び384ウェルプレート（b）における、BRET技術を使用した、生細胞におけるLingo-1、Lingo-2、Lingo-3及びLingo-4タンパク質の多量体化の検出を表す。HEK-293細胞に固定濃度のドナー（100 ngのLingo-1-RLuc、Lingo-2-RLuc又はLingo-3-RLuc又はLingo-4-RLucプラスミド）及び増加濃度のアクセプター（50 ng〜4000 ngのLingo-1-YFP、Lingo-2-YFP又はLingo-3-YFP又はLingo-4-YFPプラスミド）を形質移入する。（a）Lingo-2-RLuc/Lingo-2-YFP（丸）、Lingo-3-RLuc/Lingo-3-YFP（三角）及びLingo-4-RLuc/Lingo-4-YFP（菱形）に関してBRETシグナルを測定する（mBU）。（b）Lingo-1-RLuc/Lingo-1-YFPに関してBRETシグナルを測定する（mBU）。形質移入48 時間後に、生細胞でBRET測定を行う。eYFPによって放出される光に関する540 ± 40 nmフィルター及びRLucによって放出される光に関する480 ± 20 nmフィルターを使用して、Bret比をフィルターのセットで算出した。
【図７】図７は、hLingo-1-RLuc又はhLingo-1-YFPを発現している、安定HEK-293細胞株を表す。
【図８】図８は、Lingo-1（DN-Lingo-1）の周知の抑制剤と共に本発明のシステムを使用したスクリーニング試験の妥当性及び特異性を表す。
【図９】図９は、（a、b）本発明のシステムを使用したLingo-1のリガンド候補（二量体化抑制剤）の同定及び妥当性、（c）それにより同定された特異的リガンドB27の効果の動態を表す。
【図１０】図１０は、カウンタースクリーニング試験における、B27の特異性試験（β2アドレナリン受容体、β2ARの二量体化から生じるシグナルの試験）を表す。
【実施例】
【００９２】
材料と方法
1. 細胞
HEK-293（ヒト胚腎臓線維芽細胞、ATCC CRL-1573）及びSH-SY5Y（ヒト神経芽細胞腫、ATCC CRL-2266）細胞株を、ウシ胎仔血清（10%、BioWest、France）、ペニシリン（100 U/ml、Eurobio）、ストレプトマイシン（100 μg/ml、Eurobio、France）及びL-グルタミン（2 mM、Eurobio）を追加したDMEM培地（Dulbecco's修正イーグル培地）中に培養する。一次ニューロン培養物を、E18（胎生期18日）にラット胚の皮質から調製する。ニューロンを、B27（特に、d-ビオチン、ウシ血清アルブミン、脂肪酸不含有、カタラーゼ、L-カルニチンHCl、コルチコステロン、エタノールアミンHCl、D-ガラクトース、グルタチオン、インスリン、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン2HCl、亜セレン酸ナトリウム、スーパーオキシドジスムターゼ、T-3/アルブミン、DL-αトコフェロール、DL-αトコフェロール酢酸、トランスフェリン、ビタミンA酢酸、Gibco（商標登録）から構成される）、ペニシリン（100 U/ml）及びストレプトマイシン（100 μg/ml）を追加した、Neurobasal（登録商標）（Gibco（商標登録）、Invitrogen）、グリシン、L-アラニン、L-アルギニン塩酸塩、L-アスパラギン-H2O、L-システイン、L-ヒスチジン塩酸塩-H2O、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン塩酸塩、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリン、塩化コリン、D-パントテン酸カルシウム、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、チアミン塩酸塩、ビタミンB12、i-イノシトール、塩化カルシウム、硝酸第二鉄、塩化マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸一ナトリウム、硫酸亜鉛、HEPES、フェノールレッドから成る）中で培養する。細胞を、37°C、加湿雰囲気下で、5% CO2でインキュベーター中で培養する。
【００９３】
2.  発現ベクターの作成: ５つの発現ベクターを使用した。
Lingo-1-HA:  ヒトLingo-1タンパク質をコードする配列（620個のアミノ酸、受入番号NP 116197）及びそれに続く赤血球凝集素タグ（HA）を、PCR（「ポリメラーゼ連鎖反応」）によって増幅した。得られた断片を、pcDNA3プラスミド（Invitrogen）に導入した。Lingo-1-HAプラスミドは、配列番号19の配列を有する。
【００９４】
DN-Lingo-1-HA:  Lingoの細胞外部分及びその膜貫通ドメインをコードする配列（アミノ酸1〜577）、それに続く赤血球凝集素タグ（HA）を、PCRによって増幅した。得られた断片を、pcDNA3プラスミド（Invitrogenによって供給され、5446 bpのサイズで、特にサイトメガロウイルスプロモーター、T7配列決定プライマー、アンピシリン耐性遺伝子及びネオマイシン選択遺伝子を有する）中に導入した。
【００９５】
Lingo-1-RLuc:  発光標識（ウミシイタケ（Renilla luciformis）の配列のタグをつけた全ヒトLingo-1タンパク質（620個のアミノ酸）3’を含む。Lingo-1-RLucプラスミドは、配列番号17の配列を有する。
【００９６】
Lingo-1-eYFP: 黄色蛍光標識（eYFP: 増強黄色蛍光タンパク質）の配列でタグをつけた、全ヒトLingo-1タンパク質（620個のアミノ酸）3’をコードする配列を含み、その物理的特性、特にその蛍光強度は、YFPと比較して改善された。Lingo-1-eYFPプラスミドは、配列番号18の配列を有する。
【００９７】
pRLuc-N1: マルチクローニングサイトの下流のウミシイタケルシフェラーゼ（RLuc）のコード配列を含む。このプラスミドは、eYFPの配列を除去しRLucの配列と置換することによって、市販のプラスミドpEYFP-N1から構築した。pRLuc-N1プラスミドは、配列番号15の配列を有する。
【００９８】
Lingo-1-RLucとLingo-1-eYFPとの融合タンパク質を、ウミシイタケルシフェラーゼ（Rluc）又はeYFP蛍光タンパク質のためのコード配列に隣接するマルチクローニングサイトを有する市販の発現ベクター（peYFP-N1、Clonetech）又は研究室で利用可能な発現ベクター（pRLuc-N1）を使用して、従来のサブクローニング技術（制限酵素Sal I、BamH I、NotI、Hind III、EcoR I、Nhe IでのDNA断片又はプラスミドの消化; プラスミド中のDNA断片のライゲーション; DH5αコンピテント細菌、Invitrogenの形質転換）によって得た。
【００９９】
RLucとeYFPとをLingoのヒト形態（620個のアミノ酸、受入番号NP_116197）のC末端と融合することによって、Lingo-1-RLucとLingo-1-eYFPとの融合タンパク質を得た。その終始コドンが欠如するLingo-1の配列を、PCRで増幅した。得られた断片を、peYFP-N1プラスミド（Clontechから供給され、配列番号16の配列）中に導入した。サイズは約4700 bpで、特に、コンストラクトLingo-1-eYFPを得るために、又はコンストラクトLingo-1-Rlucを得るために、pRLuc-N1プラスミド中に、CMVプロモーター、配列5'd[CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG]3'のEGFP-N配列決定プライマー、カナマイシン抵抗性遺伝子、哺乳類細胞の選択のためのネオマイシン抵抗性遺伝子（G418又はジェネテシンと共に）を含む。
【０１００】
3. コンストラクトの形質移入
ウエスタンブロット及び免疫共沈降実験（図1）のために、形質移入脂質: リポフェクタミン（登録商標）LTX（Invitrogen（登録商標））を使用してHEK-293細胞に形質移入する。
【０１０１】
形質移入の前日、細胞をコラーゲンコーティングのディッシュ（１型コラーゲン、Serva）上で、抗生物質を含まない培地に播種する。
【０１０２】
HEK-293細胞に、5 μgの様々なプラスミドを同時形質移入する。形質移入の２日後、0.5%のトリトンX100を含む緩衝液中に細胞を溶解する。形質移入の当日に、Optimem培地（3 ml、Cat No. 31985-047 Gibco（商標登録）、Invitrogen、特にL-グルタミン、2400 mg/Lの炭酸水素ナトリウム、HEPES、ピルビン酸ナトリウム、ヒポキサンチン、チミジン、成長因子、mg/L フェノールレッドから成る）に希釈したプラスミドDNA（5〜10 μg）を、Plus Reagent（登録商標）（10 μl、Cat No. 11514015、Invitrogen（登録商標））の存在下で5分間インキュベートする。リポフェクタミンLTX（20 μl、Cat No. 15338-500、Invitrogen（登録商標））を続いて混合物に添加し、30分間インキュベートする。培地を交換後（7 ml/ディッシュ）、DNAとリポフェクタミンによって形成された複合体を液滴で細胞に添加する。リポフェクタミンの毒性効果を回避するために、形質移入培地を5時間後に除去し、抗生物質を含まないフレッシュな培地と交換する。
【０１０３】
BRET実験のために、コラーゲンで前処理した6ウェルプレートで培養したHEK-293細胞に、リン酸カルシウム技術を使用して一過性に形質移入する。短時間に、プラスミドDNAを塩化カルシウム（2.5 M）と共にリン酸緩衝液（2X BBS、特に50 mM BES（Cat No. B4554、Sigma）、280 mM NaCl、1.5 mM Na2HPO4、から成り、pH 6.95に調製）中に混合する。15分間のインキュベーション後に、得られた沈渣を24時間細胞に適用する。続いて細胞をリンスし、さらに24時間抗生物質を含まない培地でインキュベートする。
【０１０４】
BRET実験のために、コラーゲンで前処理した6ウェルプレートで培養したSH-SY5Y細胞に、形質移入脂質: リポフェクタミン 2000（Cat No. 11668019、Invitrogen（登録商標））を使用して一過性に形質移入する。形質移入の当日に、Optimem培地（500 μl）に希釈したプラスミドDNAを、リポフェクタミン2000（5 μl）と混合し、続いて20分間インキュベートする。培地を交換（ウェルあたり、抗生物質を含まない2 mlのフレッシュな培地）した後、複合体を24時間細胞に適用する。続いて細胞をリンスし、抗生物質を含まない培地でさらに24時間インキュベートする。
【０１０５】
4.  可溶化液の調製、化学架橋形成、ウエスタンブロッティング
化学架橋化を行う場合、溶解前に生細胞上で行う。細胞をPBSでリンスした後、細胞をDSP（Lomant’s Reagent、ジチオビス［スクシンイミジルプロピオナート］、Cat No. 22585、Thermo Scientific）（160 μg/ml、HBSS緩衝液中に希釈）で10分間環境温度でインキュベートする。PBS（「リン酸緩衝生理食塩水」）での３回のリンス後に、細胞を溶解する。溶解は氷上で行う。冷PBSでの３回のリンス後に、細胞を溶解緩衝液（50 mMトリス/HCl、pH 7.5、実験に応じて0.5〜1%のトリトン X100、100 mM NaCl、50 mM NaF、5 mM EDTA、アプロチニンの10 μg/ml、10 mMピロリン酸ナトリウム）中で10分間インキュベートし、プロテアーゼとホスファターゼ抑制剤との混合物をそれに添加する。続いてスクレーパーを使用して細胞を回収し、遠心分離する（22 000 g、4°Cで15分間）。上清を-20°Cで保存し、ゲルに負荷する又は免疫共沈降実験のために直接使用する。これを行うために、細胞可溶化液の定量を抗HA抗体に結合されたアガロースのビーズ（ビーズ40 μl、EZview、Sigma）で4°Cで回転させながら一晩インキュベートする。溶解緩衝液での5回の連続洗浄後に、40 μlの4X Laemmli緩衝液（200 mM トリス、pH 6.8、4% SDS、40% グリセロール、0.5 mM β-メルカプトエタノール、0.02% ブロモフェノールブルー）を添加することによって免疫沈降物を回収する。細胞可溶化液及び免疫沈降物を、続いて8%アクリルアミドゲルに変性且つ還元条件下で負荷する。トリス/グリシン泳動緩衝液中で電気泳動を行い、続いてタンパク質をPVDF Hybond-P細胞膜（Amersham Biosciences）上に移動させる。TBS-T（0.1% Tween 20）-5% スキムミルクの溶液中で細胞膜を1時間飽和させる。一次抗体: 抗Lingo（Lingo-1配列のアミノ酸40〜556に対する抗体; 受入番号AAH11057、Cat No. AF3086、R&Dシステム）を1/1000thで、抗HA（Roche、ラット）を1/5000thで、Living Colors（商標登録）抗体（Clontech）を1/5000thで、環境温度で同一溶液中で2時間インキュベートする。TBS-T（トリス緩衝液生理食塩水- 0.1% Tween 20）中で数回洗浄後に、1/33 000th希釈の過酸化酵素に結合された対応の二次抗体で細胞膜をTBS-T（0.1% Tween 20）-5%スキムミルク中で1時間インキュベートする。再度、数回の洗浄後、細胞膜を基質（SuperSignal West Dura、Pierce）で5分間インキュベートした後、フィルム（CL-Xposure、Amersham Biosciences）上に曝露する。
【０１０６】
5. BRET、発光及び蛍光の測定
形質移入後に生理的緩衝液（Hankの緩衝塩類溶液用HBSS（Cat No. 14025100、Gibco、特に塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、無水リン酸水素ナトリウムから構成される））中で48時間細胞を再懸濁し、96ウェルプレート（ウェルあたり100 000〜200 000個の細胞）又は384ウェルプレート（ウェルあたり20 000〜40 000 細胞）中に分配する。蛍光及び発光の読み取りを、マイクロプレートリーダー、Mithras LB 940（Berthold）上で環境温度で行う。Lingo-1-eYFP、Lingo-2-eYFP、Lingo-3-eYFP又はLingo-4-eYFPコンストラクトの形質移入由来の収率を、480 nmでの励起後に530-540 nmで発光されたeYFPの蛍光の読み取りによって評価する。Lingo-1-RLuc、Lingo-2-RLuc、Lingo-3-RLuc又はLingo-4-RLucコンストラクトの形質移入由来の収率を、セレンテラジン基質（5 μM）の添加の直後に得られた発光の読み取りによって（1 秒）評価する。
【０１０７】
セレンテラジンの添加の直後にBRETシグナルの測定を行う。これにより、Rlucのスペクトル特性に一致し、放出ピーク480 nmを有する生物発光シグナルが出現する。RlucとeYFPとの間の融合タンパク質で起こるエネルギー移動は、530-540 nmが最大放出の、eYFPのスペクトル特性の特徴を有する蛍光シグナルの出現を生じる。「Bret比」は、RLucコンストラクトのみ発現される場合に得られる比の減算後の、RLucによって放出される光の値（480 nm）に対するeYFPによって放出される光の値（530-540 nm）の比と定義される。BRETフィルターの２つのセットを使用した。フィルターの第一のペア（古フィルターと呼ぶ）は、20 nmのバンド幅、60%の光透過率の480 nm フィルター、及び25 nmのバンド幅、60%の光透過率の530 nm フィルターに相当する。フィルターの第二のセット（新フィルターと呼ぶ）は、20 nmのバンド幅、75%の光透過率の480 nmフィルター、及び40 nmのバンド幅、75%の光透過率の540 nmフィルターに相当する。結果はmilliBRET（mBu）に表され、1000を掛けたBret比の値に相当する。
【０１０８】
BRET測定はまた、付着細胞上で行うことができる。斯かる場合、発光読み取り前に基質を15分間プレインキュベートする。
【０１０９】
6. Lingo-1リガンドのスクリーニング方法
ディッシュ（10 cm 直径）で培養したHEK-293細胞に、BRETmaxの約50-60%を達成するためにLingo-1-RLuc（250 ng）及びLingo-1-YFP（1500 ng）を形質移入した。形質移入後に48時間生理的緩衝液（HBSS）で細胞を再懸濁し、96ウェルプレート中の80 μlに分配した（ウェルあたり100 000〜200 000細胞）。
【０１１０】
細胞の添加前に、様々なリガンド（最終濃度20 μMで通常使用される）を、96ウェルプレート中に分配した（10 μl）。
【０１１１】
15分間のインキュベーション後に、セレンテラジンh（Interchim）を添加し（10 μl）、最終濃度5 μMを得た。
【０１１２】
BRET読み取りを、新たなBRETフィルターを使用してマイクロプレートリーダー、Mithras LB 940 （Berthold）上で環境温度で行った。これらの実験は、Lingo-1-RLuc及びLingo-1-YFPを発現している安定株を使用してもまた行われる。
【０１１３】
7. カウンタースクリーニング試験
我々の方法によって同定された斯かる分子の効果の特異性を、β2アドレナリン受容体の二量体の形成から生じているBRETシグナルに基づいて評価した（カウンタースクリーニング試験）。
【０１１４】
このために、HEK-293細胞に、ドナーとして機能するウミシイタケルシフェラーゼとC末端で融合されたβ2アドレナリン受容体（β2AR-RLuc、50 ng）、及びアクセプターとして機能する黄色蛍光タンパク質とC末端で融合された増加濃度のβ2アドレナリン受容体（β2AR-YFP、50〜1000 ng）を形質移入した。形質移入後に、生理的緩衝液（HBSS）中で48 時間細胞を再懸濁し、96ウェルプレートの、80 μl中に分配した（ウェルあたり100 000〜200 000 細胞）。
【０１１５】
細胞の添加前に、96ウェルプレート（10 μl）中に生成物を分配した。
【０１１６】
15分間のインキュベーション後に、セレンテラジンh（Interchim）を添加し（10 μl）、最終濃度5 μMを得た。BRET読み取りを、新たなBRETフィルターを使用してマイクロプレートリーダー、Mithras LB 940（Berthold）上で環境温度で行った。
【０１１７】
実施例 1: LINGO-1はインビボ（IN VIVO）で二量体を形成する。
1/ Lingo-1はHEK-293細胞において二量体を形成する。
HEK-293細胞にまず始めに、HAでタグをつけたLingo-1タンパク質及び蛍光タンパク質、YFPでタグをつけたLingo-1の発現を可能にする、２つのプラスミドを同時形質移入した。免疫共沈降実験から、HAのタグをつけたLingo-1タンパク質が抗HA抗体に結合されたアガロースビーズで免疫沈降される場合（図1a）、YFP-タグをつけたLingo-1タンパク質が免疫共沈降されることが示された（図1b）。これらの結果は、今回初めて、Lingo-1がインビボ（in vivo）で二量体を形成したことを示す。これらの結果はまた、Lingo-1の全細胞及び細胞膜形態は、HEK-293細胞で二量体の形成が可能であることを初めて示す。
【０１１８】
2/ Lingo-1は、ニューロン二量体を形成する。
抗Lingo-1抗体の確認後（図2）、培養下の皮質ニューロンにおける二量体の存在を試験した（図3a）。溶解中に使用される特定の界面活性剤がタンパク質凝集の形成を誘発し、二量体の人工形成を生じることができる場合、細胞の溶解前の化学架橋形成の効果を試験した（図3b）。
【０１１９】
培養の１２日後、皮質ニューロンは伸展を生じネットワークを形成した（図3、パートaを参照）。1%のトリトン X-100を含む緩衝液における溶解前に、ニューロンをアミン官能基レベルで機能する架橋形成剤DSPで処理した（+DSP）、又は未処理（-DSP）とした。Lingo-1は実際、皮質ニューロンに発現され、これはウエスタンブロットが抗Lingo-1抗体の存在下でインキュベートされる場合に、90 kDaにおける免疫活性バンドの存在によって証明される（図3、パートbを参照）。ニューロンをDSPで処理した時、Lingo-1は実際、180 kDaに二量体の形態で現れ（さらなる免疫活性バンドが180 kDaに現れる）、これは90 kDaにおける単量体の消失に起因した（図3、パートbを参照）。
【０１２０】
実施例 2: BRET技術を使用した生細胞におけるLINGO-1タンパク質の多量体化の検出
HEK-293又はSHSY-5Y細胞に、固定濃度のドナー（100 ngのLingo-1-RLucプラスミド）及び増加濃度のアクセプター、Lingo-1-YFP又はYFP蛍光タンパク質単独（50 ng〜4000 ngのプラスミド）を形質移入した。生細胞上での形質移入の48時間後に、古フィルター及び新フィルターのセットを使用してBRET測定を行った。
【０１２１】
Lingo-1-RLuc及びLingo-1-YFPが同時発現された時、２つの細胞型においてシグナルは双曲線に従って増加し漸近線に達したので、Lingo-1の多量体化に相当する古フィルターで観察されたBRETシグナルは明らかに特異的である（図4a及び4bを参照）。さらに、Lingo-1-RlucがYFPタンパク質単独で同時発現された時、BRETシグナルははるかに弱く（< 20 mBU）直線的に増大し（図4a、挿入を参照）; よってこれは非特異的且つランダムな相互作用の出現を証明している。
【０１２２】
これらの結果は、Lingo-1-RLuc及びLingo-1-YFP融合タンパク質は培養下の生細胞において相互作用し二量体（さらには多量体）を形成することが可能であったことを示す。実際、古フィルターで、HEK-293細胞におけるLingo-1-RLuc及びLingo-1-YFPの同時発現後に、非常に強いBRETシグナル（100〜800 mBu）が観察された（図4aを参照）。Lingo-1はもっぱら神経系において発現されるので、Lingo-1はより生理的環境、すなわち、ヒト神経芽細胞腫培養において二量体化が可能であったかもまた検討した（図4bを参照）。再度、古フィルターで、非常に強いBRETシグナル（100〜600 mBu）が観察された。飽和曲線をプロットした時、HEK-293細胞（図4aを参照）及びSH-SY5Y細胞（図4bを参照）のどちらでも、BRETシグナルはいずれもプラトーに達したので、このシグナルは特異的である。つまり、Lingo-1の二量体化は強く且つ特異的なBRETシグナルを誘発した。
【０１２３】
さらに、Lingo-1-RLuc及びLingo-1-YFPを共発現しているHEK-293細胞（図4cを参照）及びSHSY-5Yヒト神経芽細胞腫細胞（図4dを参照）において、新フィルターのセットで同一条件下で行ったBRET測定で得られた結果により、以前の２倍の強度のBRETシグナルで、斯かる試験を最適化することが可能となった。
【０１２４】
実施例 3: LINGO-1-RLucとLingo-1-YFPとの間の相互作用は特異的であり、調節することができる。
HEK-293細胞に、HAでタグをつけたLingo-1-RLucとLingo-1-YFPとの融合タンパク質（ドナー/アクセプター比は、一定のままである）及び増加濃度の全Lingo-1タンパク質（Lingo-1-HA、アミノ酸1〜620）又はそのドミナントネガティブ（DN-HA、アミノ酸1-577）を形質移入した。生細胞上での形質移入後に、BRET測定を48時間行った。HAのタグをつけたコンストラクトは、Lingo-1-RLucとLingo-1-YFPとの間で得られるBRETシグナルを有意に減少した（p < 0.001 vs 対照、ANOVA、NewMan Keuls）。結果は、図5に示す。
【０１２５】
Lingo-1-RLucとLingo-1-YFPタンパク質との間で得られたBRETシグナルは、よって特異的であり調節することができる。実際、HAのタグをつけた全Lingo-1タンパク質（620個のアミノ酸）又はHAのタグをつけたLingo-1のドミナントネガティブ（577個のアミノ酸、タンパク質の細胞質部分を除く）が800 ngで過剰発現された場合、Lingo-1-RLuc及びLingo-1-YFP間で得られるBRETシグナルを有意に減少した（図5a）。さらに、HAのタグをつけたLingo-1タンパク質に増加濃度を添加した場合に（濃度0、200、400、800、1600及び2600 ngのLingo-1-HA）、BRETシグナルは減少し（図5b）、よって抑制曲線のプロットとなった。
【０１２６】
従って、結果はHAのタグをつけたLingo-1タンパク質が、競合によって、Lingo-1-YFPとのLingo-1-RLucの相互作用を阻止することを示す。
【０１２７】
実施例 4：生細胞における、BRET技術を使用したLINGO-1、LINGO-2、LINGO-3及びLINGO-4タンパク質の多量体化の検出
HEK-293細胞に、固定濃度のドナー（100 ngのLingo-1-RLuc、Lingo-2-RLuc又はLingo-3-RLuc又はLingo-4-RLucプラスミド）及び増加濃度のアクセプター、Lingo-2-YFP又はLingo-3-YFP又はLingo-4-YFP（50 ng〜4000 ngのプラスミド）を形質移入した。96ウェル及び384ウェルプレートにおける生細胞上での形質移入の48 時間後に、BRET測定を行った。
【０１２８】
Lingo-2及びLingo-3及びLingo-4の多量体化に相当する、96ウェルプレートで観察されたBRETシグナルは、タンパク質の各ペアに関して双曲線に従って増加し漸近線に達するので、明らかに特異的である（図6aを参照）。
【０１２９】
さらに、結果は、384ウェルプレート測定を行った場合（高/中ハイスループット）、Lingo-1で得られたBRETシグナルは困難なく検出できたことを示す。さらに、Z’の算出（値 p > 0.85）は、試験がどれほどロバスト（robust）であるかを示す（図6b）。
【０１３０】
よって出願人は、各修飾単量体間の発光移動（BRET）を測定することによって、リアルタイムで生細胞において、インビボ（in vivo）における二量体の立体構造変化を検出することが可能であることを示した。さらに、BRET測定は、96ウェルプレートで懸濁液中の付着細胞又は細胞上で行うことができ、高/中ハイスループットに調整可能なことを示した。
【０１３１】
実施例 5: 安定株の作成
高/中ハイスループットBRET測定の再現性を確実にするために、Lingo-1-RLuc又はLingo-1-YFPを発現しているHEK-293細胞の安定株を成長させた。
【０１３２】
HEK-293細胞に、上記の通り、特にネオマイシン抵抗性を運ぶLingo-1-RLuc又はLingo-1-YFPプラスミドを形質移入した。形質移入の48 時間後に、培地への選択抗生物質（濃度2 mg/ml のG-418又はジェネテシン）の添加によって、プラスミドDNAが組み込まれている細胞を選択した。選択の２〜３週間後に、数十の抗生物質耐性クローンを回収した。各クローンを続いて増幅し、Lingo-1発現試験を実行するために十分な量の細胞を得た。この試験は上記の通り、Lingo-1-YFPを発現している細胞のクローンについては蛍光の読み取り、又はLingo-1-RLucを発現している細胞のクローンについてはセレンテラジンの添加後の発光の読み取りから成る。
【０１３３】
結果は、Lingo-1-RLucを発現している試験したクローン（約１００ほどの試験クローン）間では、複数のクローン（例えば、C5、D1及びD2）は十分なレベルでhLingo-1-RLucを発現し（図7a）、固定されたことを示す。さらに、良好な細胞生存率を有し良好な発光シグナルを示すクローンC5は、２０１１年３月３１日に、番号l-4463でCNCM［National Collection of Microorganism Cultures］（Institut Pasteur、Paris）に供託した。
【０１３４】
結果は、クローンY1は十分なレベルでhLingo-1-YFPを発現している、主に良好な細胞生存率で良好な蛍光シグナルを発現していることを示す（図7b）。さらに、クローンY1を、２０１１年３月３１日に、番号I-4462でCNCM（Institut Pasteur、Paris）に供託した。
【０１３５】
同様に、Lingo-1-RLuc及びLingo-1-YFPを共発現しているHEK-293細胞の安定株を成長させる。十分なレベルで２つのタンパク質を共発現しているクローンを固定しCNCMに供託する。
【０１３６】
実施例 6: 本発明のシステムを使用した、LINGO-1リガンドを同定するための方法
本発明の同定方法の確認
HEK-293細胞に、固定濃度のLingo-1-RLuc（250 ng）及びLingo-1-YFP （1500 ng）を形質移入し、BRETmaxの約50-60%を達成した。96ウェルプレートの生細胞上で、形質移入の48 時間後に、新フィルターのセットを使用して、増加濃度のHAのタグをつけた周知のLingo-1抑制剤（0、200、400、800、1600及び2600 ngのDN-Lingo-1-HA）又はLingo-1と相互作用しないHAのタグをつけた神経タンパク質（0、200、400、800、1600及び2600 ngのLarp6-HA）の存在下で、BRET測定を行った。
【０１３７】
結果は、HAのタグをつけた周知のLingo-1抑制剤（DN-Lingo-1-HA）が有意にLingo-1-RLucとLingo-1-YFPタンパク質との間で得られるBRETシグナルを減少したことを示す（図8a）。さらに、結果は、HAのタグ付きLarp6と呼ばれる、Lingo-1と相互作用しない神経タンパク質はBRETシグナルを変更しなかったので、この抑制効果は特異的であったことを示す（図8b）。
【０１３８】
新規Lingo-1二量体化抑制剤: B27の同定及び確認
HEK-293細胞に、固定濃度のLingo-1-RLuc（250 ng）及びLingo-1-YFP（1500 ng）を形質移入し、BRETmaxの約 50-60%を達成した。96ウェルプレートの生細胞上での形質移入の48 時間後に、固定濃度のリガンド（最終濃度20 μM のBDNF、N2、Fsk、pDBU）又はB27（50x B27、Gibco、参照17-504-044、10 μlの純粋溶液）の溶液の存在下で、新フィルターのセットを使用したBRET測定を行った。それらは、Lingo-1-RLucとLingo-1-YFPのタンパク質との間で得られるBRETシグナルの変更が可能である。
【０１３９】
結果：HEK-293細胞でB27化合物が有意にLingo-1の二量体化を減少した、ことを示す（図9a）。B27化合物の効果は、BRETに様々なレベルで、且つB27の様々なバッチ: 抗酸化剤不含有のB27（B27AO）、インスリン不含有のB27（B27ins）又はビタミンA不含有のB27（B27VitA）と共に再現された（図9b）。
【０１４０】
B27の効果の動態研究もまた行い、B27によって生じる減少は徐々に生じ10分後にプラトーに達する（-15%）ことが明らかとなった（図9c）。
【０１４１】
カウンタースクリーニング試験:  B27の特異性
B27の特異性をカウンタースクリーニング試験（β2-アドレナリン受容体、β2ARの二量体化から生じているシグナルの試験）において評価した（この二量体化はAngers等によって以前に記載されている[14]）。
【０１４２】
HEK-293細胞に、（i）β2AR受容体の二量体：ドナーとして機能する、ウミシイタケルシフェラーゼとC末端で融合された、β2アドレナリン受容体（β2AR-RLuc、50 ng）と、アクセプターとして機能する、黄色蛍光タンパク質とC末端で融合された、増加濃度のβ2アドレナリン受容体（β2AR-YFP、100〜2000 ng）、又は（ii）Lingo-1の二量体：ドナーとして機能するLingo-1-RLucと、アクセプターとして機能する増加濃度のLingo-1-YFP（100〜2000 ng）、を形質移入した。形質移入の48時間後に、新フィルターのセットを使用したBRET測定を、96ウェルプレートの生細胞で、固定濃度のB27（50x B27、Gibco、参照17-504-044、10 μlの純粋溶液）の存在下又は不存在下で行った。
【０１４３】
結果は、β2-アドレナリン受容体の二量体化から生じているBRETシグナルがカウンタースクリーニング試験では変更されず（図10b）、一方Lingo-1の二量体化から生じているBRETシグナルは変更された（図10a）ことを示す。
【０１４４】
よって、出願人は、本発明のシステムを使用したスクリーニング法が、Lingo-1の特異的リガンドを同定することが可能であることを示した。
【０１４５】
参考文献
【表１】
2013524195.tif 000003
【表２】
2013524195.tif 000004
【図１】
2013524195.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
2013524195000001.app
【国際調査報告】
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