(57)【要約】側坐核または線条体のコリン作動性介在ニューロンの分極状態を制御するために使用される、光応答性オプシンタンパク質の使用を通じて、個体における少なくとも１つの報酬関連行動を妨害するための組成物および方法が、本明細書で提供される。
2013545458.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
側坐核または線条体におけるコリン作動性介在ニューロンの細胞膜上で発現された光応答性オプシンタンパク質を含む非ヒト動物であって、前記タンパク質は、光に応答性であり、前記介在ニューロンが前記光で照射される時、前記介在ニューロンの膜過分極を誘発することが可能であり、前記タンパク質の前記照射は、前記動物の少なくとも１つの報酬関連行動を妨害する、非ヒト動物。
【請求項２】
前記光応答性オプシンタンパク質は、前記コリン作動性介在ニューロンの前記細胞膜を過分極化する、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項３】
前記光応答性オプシンタンパク質は、ＮｐＨＲ、ＢＲ、ＡＲ、およびＧｔＲ３から成る群より選択される、請求項２に記載の非ヒト動物。
【請求項４】
ＮｐＨＲは、ＮｐＨＲ２．０、ＮｐＨＲ３．０、およびＮｐＨＲ３．１から成る群より選択される、請求項３に記載の非ヒト動物。
【請求項５】
前記報酬関連行動は、薬物関連嗜癖行動である、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項６】
前記薬物は、コカインである、請求項５に記載の非ヒト動物。
【請求項７】
前記光応答性オプシンタンパク質は、配列番号１に示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の非ヒト動物。
【請求項８】
側坐核または線条体の横断面を含む脳切片であって、光応答性オプシンタンパク質は、コリン作動性介在ニューロンの細胞膜上で発現され、前記タンパク質は、光に応答性であり、前記介在ニューロンが前記光で照射される時、前記介在ニューロンの膜過分極を誘発することが可能であり、前記タンパク質の前記照射は、報酬関連脳機能を妨害する、脳切片。
【請求項９】
個体における報酬関連行動を妨害するための方法であって、光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、前記個体に投与することを含み、前記光応答性オプシンタンパク質は、前記個体の側坐核または線条体におけるコリン作動性介在ニューロンの細胞膜上で発現され、前記タンパク質は、光に応答性であり、前記介在ニューロンが前記光で照射される時、前記介在ニューロンの膜過分極を誘発することが可能であり、それにより、前記光によって前記タンパク質を活性化することが、前記個体における少なくとも１つの報酬関連行動を妨害する、方法。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチドは、ベクターである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ベクターは、ＡＡＶベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＨＳＶベクター、およびレンチウイルスベクターから成る群より選択されるウイルスベクターである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記光応答性オプシンタンパク質は、前記コリン作動性介在ニューロンの前記細胞膜を過分極化する、請求項１１に記載の非ヒト動物。
【請求項１３】
前記光応答性オプシンタンパク質は、ＮｐＨＲ、ＢＲ、ＡＲ、およびＧｔＲ３から成る群より選択される、請求項１２に記載の非ヒト動物。
【請求項１４】
ＮｐＨＲは、ＮｐＨＲ２．０、ＮｐＨＲ３．０、およびＮｐＨＲ３．１から成る群より選択される、請求項１３に記載の非ヒト動物。
【請求項１５】
前記報酬関連行動は、薬物関連嗜癖行動である、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬物は、コカインである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記個体は、ヒトである、請求項９〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記個体は、非ヒト動物である、請求項９〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
個体における薬物嗜癖を治療するための方法であって、光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、前記個体に投与することを含み、前記光応答性オプシンタンパク質は、前記個体の側坐核または線条体におけるコリン作動性介在ニューロンの細胞膜上で発現され、前記タンパク質は、光に応答性であり、前記介在ニューロンが前記光で照射される時、前記介在ニューロンを過分極化することが可能であり、それにより、前記光によって前記タンパク質を活性化することは、前記個体における少なくとも１つの報酬関連行動を妨害し、前記個体は、薬物を摂取することをもはや所望しない、方法。
【請求項２０】
前記薬物嗜癖は、コカイン嗜癖である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリヌクレオチドは、ベクターである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ベクターは、ＡＡＶベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＨＳＶベクター、およびレンチウイルスベクターから成る群より選択されるウイルスベクターである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記個体は、ヒトである、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記個体は、非ヒト動物である、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
自然な報酬関連行動および／または報酬学習に関与する構造のコリン作動性ニューロンを標的とするために構成される刺激の源を提供することと、前記刺激の源を活性化することによって、アセチルコリンの放出を制御することと、を含む、方法。
【請求項２６】
前記構造は、側坐核および背側線条体のうちの少なくとも１つを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記刺激の源を活性化することが、コリン作動性ニューロンにおいて発現される光応答性オプシンを活性化することによって、アセチルコリンの放出を変更することを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記刺激の源を活性化することが、前記コリン作動性ニューロンの近くに位置付けられた１つ以上の電極を通じて電気パルスを適用することによって、アセチルコリンの放出を変更することを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記刺激の源を活性化することが、前記コリン作動性ニューロンに近接する場所で薬物を放出することによって、アセチルコリンの放出を変更することを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記制御するステップは、前記コリン作動性ニューロンによって、アセチルコリンの放出を抑制することを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記物質の嗜癖特性を、側坐核のコリン作動性ニューロンを前記物質に曝露することによって査定することと、前記物質への曝露後に、前記側坐核のコリン作動性ニューロンの活性を監視することと、を含む、方法。
【請求項３２】
前記嗜癖物質に対する処理の効果を、側坐核のコリン作動性ニューロンの前記物質への曝露に関連して前記処理を適用することによって査定することと、前記物質への曝露後に、側坐核のコリン作動性ニューロンの活性を監視することと、を含む、方法。
【請求項３３】
物質依存症に対する治療の効果を査定するための方法であって、前記方法は、動物に条件反応を教示しながら、前記動物の側坐核のコリン作動性ニューロンを興奮させることによって、動物において物質依存性を人工的に誘発することと、前記治療を適用することによって、前記治療の効果を査定することと、前記動物の前記条件反応を監視することによって、前記治療の適用を査定することと、を含む、方法。
【請求項３４】
一連のコリン作動性ニューロンと、薬物を前記一連のコリン作動性ニューロンに提供するための薬物送達デバイスと、前記一連のコリン作動性ニューロンに提供されている前記薬物に応答した、前記一連のコリン作動性ニューロンの活性を査定するための監視デバイスと、を含むシステム。
【請求項３５】
前記一連のコリン作動性ニューロンが光応答性オプシンを含み、かつ前記光応答性オプシンを活性化することによって前記コリン作動性ニューロンを興奮させるための光学送達系を更に含む、請求項３４に記載のシステム。
【請求項３６】
前記監視デバイスは、アセチルコリンの放出を監視することによって、前記一連のコリン作動性ニューロンの活性を査定するように更に構成される、請求項３４に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、その開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１０年１１月５日出願の米国仮出願第６１／４１０，６９２号に対して優先権を請求する。
【０００２】
本願は、それらの細胞膜上で光応答性オプシンタンパク質を発現する動物細胞を含む組成物、およびそれを使用して、動物における報酬関連条件付けに関連する１つ以上の行動に影響を及ぼすために、側坐核または背側線条体の超小型回路に存在するコリン作動性介在ニューロンを選択的に過分極化する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
物質乱用および依存性は、世界中で社会に降り懸かる重大な問題である。世界薬物報告２００８によれば、世界人口の約５％が不法薬物を使用し、世界人口の約0.６％において、薬物使用は問題である。米国において、２００６年の薬物使用と健康に関する薬物乱用・精神衛生サービス局の（ＳＡＭＨＳＡの）全米調査によれば、２３６０万人の１２歳以上の人々が、不法薬物またはアルコール乱用問題に対する治療を必要とした（１２歳以上の人々の９．６パーセント）。これらのうち、２５０万人のみ、つまり治療を必要とした人々の１０．８パーセントが、専門施設でそれを受容した。物質乱用および依存性は、世界中で生産的な人的資源の莫大な損失をもたらし、治療支援、保険金の支払い、ならびに予防および脱嗜癖プログラムに対する出費の点から、政府および社会に費用を課す。
【０００４】
光遺伝学は、機能している無処置の生体系とペースを保つために必要とされる時間精度（ミリ秒の時間スケール）で、自由に移動しているほ乳類および他の動物の体内でさえも、生体組織の標的細胞内の具体的な事象を制御するために使用される、遺伝的および光学的方法の組み合わせである。光遺伝学の特徴は、具体的な標的機構の使用を通じて細胞型分解能を維持しながら、ニューロン膜電位の時間的に正確な操作を可能にする、標的神経細胞の原形質膜への高速光応答性オプシンチャネルまたはポンプタンパク質の導入である。神経系の機能を調べるために使用することができる微生物オプシンの中には、照射される時に膜過分極を推進するために使用される、ハロロドプシン（ＮｐＨＲ）がある。わずか２〜３年の間に、光遺伝学の分野は、具体的な細胞型が、生体内の神経回路等の生物組織の機能にどのように貢献するかという基本的な科学的理解を更に深めてきた。また、臨床側では、光遺伝学によって動かされた研究が、ほ乳類の行動の根底にある神経学的機構への洞察につながってきた。
【０００５】
これらの前進にもかかわらず、物質乱用および依存性（嗜癖）等の、複雑なヒトの行動の根底にある神経生理学的基質は、脳の特異的な領域がこれらの行動において果たす役割に関する先端情報にもかかわらず、理解不十分なままである。例えば、側坐核（ＮＡｃ）は、腹側線条体の主要部を形成するニューロンの集合である。ＮＡｃは、報酬、快楽、笑い、嗜癖、攻撃、恐怖、およびプラセボ効果において重要な役割果たすと考えられている。アセチルコリンは、重要かつ幅広く研究される神経伝達物質であり、それは多様な受容体および標的細胞に作用する。いくつかの生体内の薬理学的アプローチは、ＮＡｃにおけるコリン作動性伝達が、報酬学習行動に要求されることを示している。ＮＡｃ内のコリン作動性介在ニューロンは、それらが局所神経細胞集団の１％未満を構成するが、それでもなお、それらがＮＡｃの全体を通じて突出し、その既知のコリン作動性入力のみを提供するため、特に興味深い。当該コリン作動性受容体は、局在的に発現され、ニコチン性およびムスカリン性薬理学的アゴニストは、中型有棘ニューロン（ＭＳＮ、局所神経集団の９５％超に相当し、ＮＡｃの出力を構成する）に対する複雑な影響を行使することができる。しかしながら、ＮＡｃ生理学または報酬関連行動のいずれの側面に対する、コリン作動性介在ニューロンの正味の影響（あるとすれば）は、未知である。
【０００６】
したがって、物質依存性等の報酬関連行動においてＮＡｃ内のコリン作動性介在ニューロンが果たす因果的役割の調査を可能にするであろう、ツールが必要とされる。嗜癖の根底にある神経経路を理解することは、かかる障害を有する患者を治療するための薬理学的療法の発見およびスクリーニングを補助する一助となり得る他、薬物嗜癖の個体の脳内でこれらの行動を妨害するためにかかるツールを使用する可能性を開く。
【０００７】
本明細書の全体を通じて、出版物（例えば、科学論分）、特許出願、特許等を参照し、その全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００８】
個体の側坐核または線条体のコリン作動性介在ニューロンの膜分極状態を変化させることが可能な、安定的に発現された光応答性オプシンタンパク質の使用を介して、個体における報酬関連行動を妨害するための組成物および方法が、本明細書に提供され、ここで側坐核または線条体のコリン作動性介在ニューロンの膜分極状態の変化は、動物における１つ以上の報酬関連行動を妨害する。いくつかの実施形態では、報酬関連行動は、嗜癖関連行動である。他の実施形態では、嗜癖関連行動は、コカイン嗜癖である。
【０００９】
したがって、いくつかの態様では、動物の側坐核または線条体におけるコリン作動性介在ニューロンの細胞膜上で発現された光応答性オプシンタンパク質を含む非ヒト動物が、本明細書に提供され、ここでタンパク質は、光に応答性であり、介在ニューロンが光で照射される時、介在ニューロンの膜過分極を誘発することが可能であり、オプシンの照射は、動物の少なくとも１つの報酬関連行動を妨害する。
【００１０】
他の態様では、側坐核または線条体の横断面を含む脳切片が、本明細書に提供され、ここで光応答性オプシンタンパク質は、コリン作動性介在ニューロンの細胞膜上で発現され、タンパク質は、光に応答性であり、介在ニューロンが光で照射される時、介在ニューロンの膜過分極を誘発することが可能であり、タンパク質の照射は、報酬関連脳機能を妨害する。
【００１１】
いくつかの態様では、光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、個体に投与することを含む、個体における報酬関連行動を妨害するための方法が、本明細書に提供され、ここで光応答性オプシンタンパク質は、個体の側坐核または線条体におけるコリン作動性介在ニューロンの細胞膜上で発現され、タンパク質は、光に応答性であり、介在ニューロンが光で照射される時、介在ニューロンの膜過分極を誘発することが可能であり、それにより、光によってタンパク質を活性化することは、個体における少なくとも１つの報酬関連行動を妨害する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、個体の側坐核または線条体に投与される。
【００１２】
依然として他の態様では、光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、個体に投与することを含む、個体における薬物嗜癖を治療するための方法が、本明細書に提供され、ここで光応答性オプシンタンパク質は、個体の側坐核または線条体におけるコリン作動性介在ニューロンの細胞膜上で発現され、タンパク質は、光に応答性であり、介在ニューロンが光で照射される時、介在ニューロンを過分極化することが可能であり、それにより、光によってタンパク質を活性化することは、個体における報酬関連行動を妨害し、個体は、薬物を摂取することをもはや所望しない。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、個体の側坐核または線条体に投与される。
【００１３】
本開示の態様は、本明細書に記載されるように、生存動物における強化された行動の制御または特徴付けに関する。本開示は、これらの文脈において必ずしも限定されないが、本発明の種々の態様は、これらのおよび他の文脈を使用して例の考察を通じて理解されてもよい。
【００１４】
本開示の実施形態は、快楽的および／または強化された行動に関連する、特別に標的とされた回路を対象とする。より特定の実施形態は、報酬記憶、快感消失、嗜癖、および／または強化された行動に関連および対応する、具体的な回路標的の間の関連を識別するための、神経回路に対する時空間的な制御に関する。
【００１５】
本開示の特定の実施形態は、側坐核（ＮＡｃ）または背側線条体を含むが、これらに必ずしも限定されない、自然な報酬関連行動に関与するおよび／または報酬学習のための構造内の、標的細胞の抑制を対象とする。特定の例では、ＮＡｃ内の具体的なコリン作動性ニューロンを標的とすることは、これらのコリン作動性ニューロンによってアセチルコリンの放出を妨害するのに特によく適している。かかる神経抑制は、標的とされる神経抑制に有効であり得、他の行動の強化、例えば、欲求性または嫌悪性反応に対する所望されない効果を低減または排除し得ることが発見されている。本開示の態様は、時間的、空間的、および／または細胞型に特異的である、刺激に関する。ある種の実施形態では、この抑制は、神経回路の細胞内の光応答性オプシンの発現を伴う、光遺伝学的システムを使用して行われる。他の実施形態では、抑制は、直接的電気刺激を使用して行うことができる。依然として他の実施形態は、時間的に正確な医薬品の使用を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
種々の例示的実施形態は、以下の説明および添付図面を考慮して、より完全に理解されてもよい。
【図１】ＮＡｃのＣｈＡＴ介在ニューロンにおけるＣｈＲ２およびｅＮｐＨＲ３．０の特異性、膜標的、および機能性を図示する。（Ａ）Ｃｒｅ依存性ＡＡＶ（ｅＮｐＨＲ３．０−ｅＹＦＰまたはＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）−ｅＹＦＰのいずれかを発現する）を、ＮＡｃの内側部の中へ注射した。（Ｂ）注射された切片の共焦点画像は、４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で共染色された、ｅＹＦＰ発現のＣｈＡＴ抗体との共局在化を示す。（Ｃ）ＹＦＰを発現したニューロンの９１．３±１．３％はまた、ＣｈＡＴ抗体に対して染色され（ｎ＝４１８）、ＣｈＡＴ抗体に対して染色されたニューロンの９３．５±２．８％はまた、ＹＦＰを発現した（ｎ＝４１３）。エラーバーはＳＥＭを示す。（Ｄ）高倍率図は、ＣｈＡＴ抗体で共染色された、ｅＮｐｈＲ３．０−ｅＹＦＰ（左）およびＣｈＲ２−ｅＹＦＰ（右）の膜局在性を明らかにする。（Ｅ）ＣｈＲ２−ｅＹＦＰ発現ＣｈＡＴニューロンにおける電流注射によって誘発される膜電位変化。ＶＭ＝−４８ｍＶ。電流段階：−６０、−２０、＋２０ｐＡ。（Ｆ）ｅＮｐＨＲ３．０−ｅＹＦＰ発現ＣｈＡＴニューロンにおける１秒の５８０ｎｍ光によって誘発される膜電位変化（ピーク過分極：−１０３ｍＶ）。ＶＭ＝−４９ｍＶ。（差し込み図）集団平均化ピーク過分極（平均±標準誤差：−８３．８±１１．９ｍＶ、ｎ＝４）。（Ｇ）４７０ｎｍパルス列（５ミリ秒パルス幅、１０Ｈｚ）によって誘発される、ＣｈＲ２−ｅＹＦＰ発現ＣｈＡＴニューロンにおける連続活動電位。（Ｈ）異なる刺激周波数でのＣｈＲ２−ｅＹＦＰ発現ＣｈＡＴニューロンにおける活動電位の発生についての平均成功確率（ｎ＝４、平均±標準誤差、４７０ｎｍパルス列、５ミリ秒パルス幅）。
【図２】ＣｈＡＴの介在ニューロン光遺伝学的光活性化が、抑制性電流の周波数を増加させ、ＭＳＮ発火を抑制することを図示する。（Ａ）ＣｈＲ２−ｅＹＦＰで形質導入されたＣｈＡＴニューロンを、脳切片中、青色光（４７０ｎｍ）で活性化し、近くのＭＳＮ（ｅＹＦＰ−細胞）を、全細胞パッチクランプした。（Ｂ）（左）自発的シナプス電流を、ＣｈＡＴニューロンにおいてＣｈＲ２−ｅＹＦＰを発現する、切片中のＭＳＮにおいて観察した。（中央）シナプス電流は、４７０ｎｍ光パルスに応答して、周波数が増加した（５ミリ秒パルス幅、１０Ｈｚ）。（右）これらの電流は、ＧＡＢＡＡ受容体アンタゴニストＳＲ−９５５３１（５ｍＭ））によって遮断されたため、ＩＰＳＣと見なす。２，３−ジヒドロキシ−６−ニトロ−７−スルファモイルベンゾ［ｆ］キノキサリン−２，３−ジオン（ＮＢＱＸ）（５ｍＭ）および（ＲＳ）−３−（２−カルボキシピペラジン−４−イル）−プロピル−１−ホスホン酸（ＲＳ−ＣＰＰ）（５μΜ）が全ての実験において存在した。（Ｃ）光パルス（青色縦線バー）およびＳＲ−９５５３１（黒色バー）の効果を示す、このＭＳＮについてのＩＰＳＣ周波数の時間経過。（Ｄ）光パルス（ｎ＝６）に対する時間の関数としての、光オン期間中のＩＰＳＣ周波数における平均百分率増加（光オフ期間のそれに対して正規化）。青色破線は、一連の光パルスを示し、エラーバーは、標準誤差を表示する。（Ｅ）光パルスは、ＩＰＳＣの周波数を５２５．８±１５４．３％増加させた（ｎ＝６、Ｐ＝０．０１、対応のある両側検定）一方で、自発的ＩＰＳＣの平均振幅は、２１．３±２８．９％変化した（Ｐ＞０．０５）。（Ｆ）オプトロード（ｏｐｔｒｏｄｅ）（タングステン電極に結合された光ファイバー）を、生体内で、ＣｈＡＴ細胞中、ＣｈＲ２−ｅＹＦＰを発現したＮＡｃの中に、定位的に位置付けた。（Ｇ）（最上部）青色光刺激によって抑制される、絶縁ユニットの電圧痕跡。（中央）各活動電位が点によって表される、５回の光刺激の反復に対する同じユニットの応答を表示するラスタープロット。（底部）同じユニットについての経時的な発火率の平均および標準誤差。（Ｈ）光刺激によって抑制された対興奮させられた、部位の分率。（Ｉ）光によって抑制された（左、ｎ＝１６のうち１３）または興奮させられた（右、ｎ＝１６のうち３）部位についての、光刺激に対する応答の時間経過の集団要約。実線は、時間の関数としての、部位にわたる平均発火率を表し、各点は、個々の部位の平均発火率を表す。全ての発火率は、光刺激前に、平均±標準誤差率に対して正規化される。（Ｆ〜Ｉ）光刺激の持続期間、１０秒；パルス持続期間、５ミリ秒；波長、４７０範囲；周波数、１０Ｈｚ。光刺激のエポックは、破線によって表される。
【図３】ＣｈＡＴ介在ニューロンの光遺伝学的光抑制が、生体内でＭＳＮ発火を強化することを図示する。（Ａ）（最上部）ＣｈＡＴ介在ニューロンのｅＮｐＨＲ３．０での光遺伝学的光抑制によって興奮させられた、絶縁ユニットの電圧痕跡（生体内のＮＡｃから記録）。（中央）各活動電位が点によって表される、５回の光刺激の反復に対する同じユニットの応答を表示するラスタープロット。（底部）同じユニットについての経時的な発火率の平均および標準誤差。（Ｂ）ウェーブレット分析は、（Ａ）の場合と同じユニットについての、周波数および時間の関数（５回の反復にわたる平均）として発火の電力を明らかにする。（Ｃ）光刺激によって抑制された対興奮させられた、部位の分率。（Ｄ）（Ａ）と同じように、光刺激によって抑制されたユニットについて。（Ｅ）光によって抑制された（左、ｎ＝１７のうち１３）または興奮させられた（右、ｎ＝１７のうち４）部位についての、光刺激に対する応答の時間経過の集団要約。実線は、時間の関数としての、部位にわたる平均発火率を表し、各点は、個々の部位の平均発火率を表す。全ての発火率は、光刺激前に、平均±標準誤差値に対して正規化される。（Ａ〜Ｅ）光刺激の持続期間、１５秒（一定照射）；波長、５６０ｎｍ。光刺激のエポックは、バーによって表される。
【図４】ＣｈＡＴ介在ニューロンが、切片中、コカインによって活性化され得、生体内コカイン条件付けのために要求されることを図示する。（Ａ）ＣｈＡＴニューロンにおける自発的活動電位の周波数は、コカイン（５μΜ）の浴液適用の１０分後に増加した。ＡＣＳＦ、人工脳脊髄液。（Ｂ）このＣｈＡＴニューロンについての経時的な発火率。水平灰色バー、コカインの適用；垂直点線、（Ａ）および（Ｃ）において詳細に例証される時点である、コカイン適用の１０分後。（Ｃ）ベースライン発火率（コカイン適用前の２．５分間にわたって平均化）を、コカイン注入後の率（コカイン適用発生の１０〜１２．５分後で平均化；灰色バー、コカインを受容している細胞；白色バー、ＡＣＳＦのみを受容している対照細胞；Ｐ＜０．００５、コカイン前対コカイン後のコカイン処置群についての対応のある両側検定；Ｐ＜０．０５、コカインまたはビヒクル後のコカイン対対照細胞を比較する、対応のない両側検定）と比較した、ＣｈＡＴニューロンにおける発火の、コカイン誘発型増加を例証する集団データ。（Ｄ）ｅＮＡｃの内側部を照射するために二重ファイバーが挿入された、両側性カニューレ系の略図。（左差し込み図）（Ｈ）で使用された全てのマウスについての、カニューレ軌道のエンドポイント。（右差し込み図）Ｃｒｅ依存性ｅＮｐＨＲ３．０−ｅＹＦＰを注射されたＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ＋マウスのＮＡｃにおけるｅＹＦＰ発現。（Ｅ）コカインＣＰＰ（Ｈ）についての条件付けパラダイム。マウスを、ｅＮｐＨＲ３．０（波長：５９０ｎｍ）でのＣｈＡＴ細胞抑制と共に、腹腔内コカイン（２０ｍｇ／ｋｇ）で条件付けした。（Ｆ）コカイン条件付け後の試験日（３日目）の、代表的なＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ＋およびＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ−マウスからの追跡データ。前日（２日目）に、マウスは、一方の左室内でコカインおよび光を受容した一方で、他方においては、それらは、食塩水を受容した。（ＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ＋マウスではなく）ＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ−マウスは、条件付けされた部屋への嗜好を示した。（Ｇ）（左）コカインＣＰＰ（コカインおよび光での条件付け）の３日目対１日目中の、条件付けされた室内における時間の倍率変化。ＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ＋およびＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ−同腹子の比較；双方の場合もＣｒｅ依存性ｅＮｐＨＲ３．０を注射された（ｎ＝１０  ＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ＋、ｎ＝１２  ＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ−、両側ｔ検定についてＰ＜０．０１、３つのコホート）。（右）光単独での条件付けについての（コカインなし、ｎ＝９  ＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ、ｎ＝７  ＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ、両側ｔ検定についてＰ＞０．０５、３つのコホート）、３日目対１日目中の、条件付けされた室内における時間の倍率変化。エラーバーは標準誤差を示す。ｎ．ｓ．、有意差なし。（Ｈ）ウイルス注射（Ｃｒｅ依存性ｅＮｐＨＲ３．０）および光刺激ＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ＋、ならびにオープンフィールドにおけるＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ−マウス（ｎ＝１０  ＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ＋、ｎ＝１０  ＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ−、両側ｔ検定についてＰ＞０．０５、３つのコホート）の速度。（Ｉ）（Ｈ）と同じように、オープンフィールドにおける軌道長について（ｎ＝１０  ＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ＋、ｎ＝１０  ＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ−、両側ｔ検定についてＰ＞０．０５、３つのコホート）。（Ｊ）（Ｈ）と同じように、オープンフィールドの中心における時間について（ｎ＝１０  ＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ＋、ｎ＝１０  ＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ、両側ｔ検定についてＰ＞０．０５、３つのコホート）。（Ａ〜Ｊ）＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００５。
【図５】切片中および生体内の、ＣｈＡＴの介在ニューロン光遺伝学的光活性化を図示する。（Ａ）：各痕跡が光パルスと揃えられた、図２Ｂの場合と同じＭＳＮについての１５個の電流痕跡のオーバーレイ。いくつかのＩＰＳＣは、光パルスに対して時間的に同期していない一方で、多くは、光パルス発生の約８ミリ秒後のレイテンシと時間的に同期している。（Ｂ）：同じニューロンについての光パルスに対する時間の関数としてのＩＰＳＣ出現。中空バーは、光刺激中に記録されたＩＰＳＣの数に対応する。灰色バーは、同じ時間的整列を使用してベースライン（光刺激前）中に記録されたＩＰＳＣの数に対応する。このニューロンについて、より顕著な同期性の増加に加えて、ＩＰＳＣ周波数における非同期性の強化が明白である。（Ｃ）：図２Ｄの大きさを変更された提示、光オフ期間に対する光オンの間の光パルスに対する時間の関数としてのＩＰＳＣ周波数における集団平均化百分率増加を表示する（ｎ＝６）。集団にわたって、より顕著な同期性の増加に加えて、ＩＰＳＣ周波数における非同期性の強化が明白である。パネルＡ〜Ｃについてのパルスパラメータ：４７０ｎｍ、５ミリ秒パルス持続期間、１０Ｈｚ。（Ｄ）：１００Ｈｚ（底部、４７０ｎｍ光、１０秒の総刺激持続期間）ではなく、１０Ｈｚ（最上部）でパルスされた青色光刺激を追跡する、集団発火（恐らくＣｈＲ２を発現するＣｈＡＴ細胞によって発生される）を示す、生体内記録からの電圧痕跡。
【図６】ＣｈＡＴニューロン抑制が、コカインの不在下で、ＣＰＰに影響を及ぼすことなく、コカインＣＰＰを妨害することを図示する。（Ａ）：コカインＣＰＰ、図４Ｇ（左パネル）と同じデータであるが、倍率変化よりむしろ差異としてプロットされる。左：条件付け後対条件付け前の、コカイン条件付け室内の時間の差異。（ｎ＝１０  ＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ＋、ｎ＝１２  ＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ−、両側ｔ検定についてｐ＜０．０１、３つのコホート）。右：条件付け後対条件付け前の、コカイン条件付け室への嗜好における差異（ここで嗜好は、条件付けされた室内対条件付けされていない室内で費やされた時間の差異として定義される）（ｎ＝１０  ＣｂＡＴ：：Ｃｒｅ＋、ｎ＝１２  ＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ−、両側ｔ検定についてｐ＜０．０１、３つのコホート）。（Ｂ）：図４Ｇ（右パネル）と同じデータおよびＡと同じデータ提示である、コカインなしのＣＰＰ（両パネルについて、ｎ＝９  ＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ＋、ｎ＝７  ＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ−、両側ｔ検定についてｐ＞０．０５、３つのコホート）。
【図７】ニコチン性受容体拮抗作用が、ＭＳＮにおいて記録されたＣｈＡＴ介在ニューロン誘発型ＩＰＳＣを減少させることを図示する。（Ａ）：光なし、光パルス（４７０ｎｍ、１０Ｈｚ、５ミリ秒パルス幅）、および１０μΜメカミラミンを伴う同一の光パルスの条件下での、急性切片調製物中の典型的なＭＳＮからの代表的なＩＰＳＣ掃引。（Ｂ）：光提示前、光提示を伴う、および光とメカミラミンまたはビヒクルのいずれかとを伴う、ＭＳＮＳの集団からの、Ａにあるように記録されたＩＰＳＣの要約グラフ。光は、ＩＰＳＣ周波数を、３．４＋／−１．３Ｈｚから１０．１＋／−１．２Ｈｚまで、安定的に増加させた（ｐ＜０．０５、ｎ＝７、対応のあるｔ検定）一方で、メカミラミンは、この増加を５．１＋／−１．８Ｈｚまで低減した（同じ細胞内の光単独と比較してｐ＜０．０５、対応のあるｔ検定、ビヒクル対照と比較してｐ＜０．０５、ｎ＝５、対応のないｔ検定）。
【図８】様々なコカイン−ＣＰＰパラメータにわたる、ＣｈＡＴ介在ニューロンの変調を図示する。（Ａ）：ＣｈＡＴ介在ニューロンのｅＮｐＨＲ３．０媒介型抑制中の、コカインＣＰＰについての用量反応曲線コカインＣＰＰは、腹腔内２０ｍｇ／ｋｇの標準的な報酬用量について、ＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ＋マウスにおいて有意に減少させられるが（ｐ＜０．０１）、他の濃度では、不安を惹起するか、または不十分であると考えられる（５９０ｎｍ光、一定照射、下記の表２を参照されたい）。（Ｂ）：ＣｈＲ２でのＣｈＡＴニューロンの刺激は、それ自体では場所嗜好を駆動しない。（４７０ｎｍ光、５ミリ秒パルス幅、３０秒毎に１０秒の１０Ｈｚ刺激、ｎ＝４、ｐ＞０．０５両側ｔ検定）。（Ｃ）：１０ＨｚでＣｈＲ２によるＣｈＡＴニューロンの刺激は、腹腔内１０ｍｇ／ｋｇコカインについて、コカインによる場所嗜好を有意に変調しない。（４７０ｎｍ光、５ミリ秒パルス幅、コカイン条件付け中に一定の１０Ｈｚ刺激、ＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ＋ｎ＝６、ＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ−ｎ＝６、ｐ＞０．０５両側ｔ検定）。（Ｄ）：１０ＨｚでＣｈＲ２によるＣｈＡＴニューロンの刺激は、腹腔内２０ｍｇ／ｋｇコカインについて、コカインによる場所嗜好を有意に変調しない（４７０ｎｍ光、５ミリ秒パルス幅、コカイン条件付け中に一様の１０Ｈｚ刺激、ＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ＋ｎ＝４、ＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ−ｎ＝３、ｐ＞０．０５両側ｔ検定）。
【図９】ｅＮｐｈＲ３．０でのＣｈＡＴ介在ニューロンの抑制が、前後関係上のまたは聴覚合図による恐怖条件付けを損なわないことを図示する。（Ａ）：すくみ状態で費やされた時間百分率を、標準的な前後関係上の恐怖条件付けパラダイムにおいて定量化した。「ベースライン」は、第１のトーンショックペアリング（ｔｏｎｅｓｈｏｃｋ  ｐａｉｒｉｎｇ）に続く３０秒間を指す。「即座」は、第２の（および最後の）トーンショックペアリング直後の３０秒間を指す。「前後関係」は、条件付けセッションの翌日の、同じ前後関係に対するすくみを指す。ＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ＋マウスは、強化された即座および前後関係のすくみを示した。（ｎ＝９  ＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ＋、ｎ＝８  ＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ−、両側ｔ検定、即座および前後関係のすくみについてＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ＋とＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ−とを比較してｐ＜０．０５）。（Ｂ）：聴覚合図による恐怖条件付けパラダイムについての、すくみ状態で費やされた時間百分率。「プレトーン（Ｐｒｅ−ｔｏｎｅ）」は、新たな前後関係における、トーンの発生の２．５分前を指し、「トーン」は、トーン中の２．５分間を指す（ｎ＝９  ＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ＋、ｎ＝８  ＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ−、両側ｔ検定、ＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ＋とＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ−とを比較してｐ＞０．０５）。
【図１０】本開示の実施形態と一致する、側坐核（ＮＡｃ）または背側線条体を制御するためのシステムを図示する。
【図１１】本開示の実施形態と一致する、アセチルコリンの放出を制御するためのフロー図を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、とりわけ、側坐核または背側線条体のコリン作動性介在ニューロン細胞の電気膜電位を選択的に変化させることによって、個体における報酬関連行動を妨害するための組成物および方法を提供する。本発明は、光応答性オプシンイオンポンプタンパク質を用いた側坐核のコリン作動性介在ニューロン細胞の選択的過分極が、薬物嗜癖の動物モデルにおける報酬追求行動を妨害するという、発明者らの発見に基づく。
【００１８】
本開示は、種々の修正および代替形態に従うが、それらの詳細は、一例として図面に示されており、詳細に説明される。しかしながら、本開示を説明される特定の実施形態に限定することを意図しないと理解されたい。逆に、請求項で定義される態様を含む、本開示の範囲内に入る全ての修正、同等物、および代替案を対象とすることを意図する。
【００１９】
一般的技術
本発明の実践は、特に指示されない限り、当業者に周知である、分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、免疫学、生理学、ならびに病態生理学薬物嗜癖および報酬関連行動の従来の技術を用いる。かかる技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，２００１），（共同で「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」と称される）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ２００１）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（共同で「Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ」と称される）、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ＆Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．，１９８７）、ならびにＧｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）等の文献において十分に説明される。他の有用な参考文献には、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ；Ｊ．Ｉｓｓｅｌｅａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．）、およびＡｄｄｉｃｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ．，２０１０；Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）が含まれる。
【００２０】
定義
本明細書で使用される時、「報酬関連行動」は、行動を強化するプロセス、すなわち、行動を行った直後またはすぐ後の刺激の送達または出現によって、しばしば快楽的な反応の形態で、特定の行動の率、確率、または強度を増加させる何らかのものである。報酬関連行動には、食物の獲得、性行動、賭博行動、および／または薬物関連の嗜癖行動が含まれる可能性があるが、それらに限定されない。
【００２１】
「薬物関連嗜癖行動」は、強迫的な物質使用からもたらされる行動であり、物質への明らかな依存性を特徴とする。嗜癖関連行動の症候は、（ｉ）薬物の使用の圧倒的な関与、（ｉｉ）その供給の確保、および（ｉｉｉ）離脱後の再発の高い確率である。
【００２２】
本明細書で言及される時、「薬物」または「麻酔」という用語は、アヘンおよびヘロイン等のオピオイド、メタンフェタミン、コカイン（ベンゾイルメチルエクゴニン）、ケタミン、ＭＤＭＡ（３，４−メチレンジオキシメタンフェタミン、別名「エクスタシー」）、リゼルギン酸ジエチルアミド（ＬＳＤ）、またはカンナビノイドを含むことが意図される。加えて、麻酔は、アルコール、ニコチン、または任意の他の規制物質を含むことが意図される。
【００２３】
「個体」は、ヒトを含む哺乳動物である。ほ乳類は、家畜、スポーツ用動物、ペット、霊長類、マウス、およびラットを含むが、それらに限定されない。個体はまた、イヌおよびネコを含むが、それらに限定されない、伴侶動物も含む。いくつかの態様では、個体は、ほ乳類等のヒトではない動物である。別の態様では、個体は、ヒトである。
【００２４】
本明細書で使用される時、薬物、化合物、または薬学的組成物の「有効投薬量」または「有効量」は、有益なまたは所望の結果を達成するのに十分な量である。予防的使用のために、有益なまたは所望の結果は、危険性を排除することもしくは低減すること、重症度を減らすこと、または疾患、その合併症、および疾患の発達中に呈する中間病理学的表現型の、生化学的、組織学的、および／もしくは行動的症状を含めて、疾患の発症を遅延させること等の結果を含む。治療的使用のために、有益なまたは所望の結果は、疾患からもたらされる１つ以上の症状を減少させること、疾患を患う者の生活の質を増加させること、疾患を治療するために要求される他の薬の用量を減少させること、標的とすることを介して等で別の薬の効果を強化すること、疾患の進行を遅延させること、および／または生存を延長すること等の臨床結果を含む。有効投薬量は、１つ以上の投与として投与することができる。本発明の目的のために、薬物、化合物、または薬学的組成物の有効投薬量は、直接または間接的のいずれかで、予防的または治療的処置を遂行するために十分な量である。臨床文脈において理解されるように、薬物、化合物、または薬学的組成物の有効投薬量は、別の薬物、化合物、または薬学的組成物と併せて達成されても、されなくてもよい。故に、「有効投薬量」は、１つ以上の治療剤を投与する前後関係において考慮されてもよく、１つ以上の他の薬剤と併せて、望ましい結果が達成され得るかまたは達成される場合、単一の薬剤が有効量で与えられることを考慮されてもよい。
【００２５】
本明細書で使用される時、「治療」または「治療すること」は、好ましくは臨床結果を含む、有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果には、次のうちの１つ以上が含まれるが、それらに限定されない：疾患からもたらされる症状を減少させること、疾患を患う者の生活の質を増加させること、疾患を治療するために要求される他の薬の用量を減少させること、疾患の進行を遅延させること、および／または個体の生存を延長すること。
【００２６】
本明細書で使用される時、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、特に指示がない限り、複数形の指示対象を含む。
【００２７】
本明細書の全体を通じて挙げられる全ての最大数値制限は、全てのより低い数値制限が本明細書で明示的に書かれたかのように、かかるより低い数値制限を含むことが意図される。本明細書の全体を通じて挙げられる全ての最小数値制限は、全てのより高い数値制限が本明細書で明示的に書かれたかのように、かかるより高い数値制限を含む。本明細書の全体を通じて挙げられる全ての数値範囲は、かかるより広い数値範囲内に入る全てのより狭い数値範囲が、本明細書で明示的に書かれたかのように、かかるより狭い数値範囲を含む。
【００２８】
側坐核
側坐核（ａｓａｃｃｕｍｂｅｎｓ  ｎｕｃｌｅｕｓ）または中隔側坐核（ｎｕｃｌｅｕｓ  ａｃｃｕｍｂｅｎｓ  ｓｅｐｔｉ）としても知られる、側坐核（ｎｕｃｌｅｕｓ  ａｃｃｕｍｂｅｎ）（ＮＡｃ）は、腹側線条体の主要部を形成するニューロンの集合である。それは、報酬、快楽、笑い、嗜癖、攻撃、恐怖、およびプラセボ効果において重要な役割果たすと考えられている。側坐核において見出される主な神経細胞型は、中型有棘ニューロン（ＭＳＮ）である。これらのニューロンによって産生される神経伝達物質は、中枢神経系の主要な抑制性神経伝達物質のうちの１つである、ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）である。ＭＳＮはまた、側坐核の主要な投射または出力ニューロンである。側坐核におけるニューロンの９５％は、中型有棘ＧＡＢＡ作動性の投射ニューロンであるが、脳のこの領域における細胞の約１％を構成する、大型無棘コリン作動性介在ニューロン等の、他の神経型もまた見出される。
【００２９】
アセチルコリン（ＡＣｈ）は、最終的に神経伝達物質として知られるようになった、生化学物質のクラスの最初に発見されたメンバーであった。中枢神経系において、ＡＣｈは、感覚および運動処理、睡眠、痛覚、気分、ストレス反応、注意、覚醒、記憶、動機、ならびに報酬等の、様々な身体機能に重要である。別の神経伝達物質、ドーパミン（ＤＡ）もまた、ＮＡｃにおいて見出され、その放出は、興奮薬の報酬効果を媒介する必要不可欠な事象である（Ｓｏｆｕｏｇｌｕ＆Ｍｏｏｎｅｙ，２００９，ＣＮＳ  Ｄｒｕｇｓ，２０（１１）：９３９−９５２）。コリン作動性介在ニューロンは、側坐核においてＡＣｈを放出する。ＭＳＮの活性は、コリン作動性制御およびドーパミン作動性制御の両方によって変調することができ、それは刺激される受容体亜型に応じて興奮性または抑制性であり得、すなわち、Ｄ１ドーパミン作動性およびＭ１  ｍＡＣｈＲは、興奮性である一方で、Ｄ２ドーパミン作動性およびＭ４  ｍＡＣｈＲは、抑制性である（Ｃａｌａｂｒｅｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ，２００６，５（１１）：９７４−８３）。コリン作動性介在ニューロンは、腹側被蓋野（ＶＴＡ）からドーパミン作動性入力を、および主に前頭前皮質、海馬、および扁桃体からグルタミン酸作動性入力を受容する（Ｓｏｆｕｏｇｌｕ＆Ｍｏｏｎｅｙ，２００９，ＣＮＳ  Ｄｒｕｇｓ，２０（１１）：９３９−９５２）。理論に拘束されることなく、コリン作動性介在ニューロン上のこのＤＡおよびグルタミン酸塩収束は、ＤＡ媒介型報酬がグルタミン酸塩媒介型学習および前後関係情報に関連する機構を提供し得ると考えられる（Ｂｅｒｌａｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．２００３；１２０（４）：１１４９−５６）。したがって、コリン作動性介在ニューロンは、報酬シグナルの前後関係上適切な行動への翻訳を調節すると考えられる。
【００３０】
一般的に乱用される薬物および自然の報酬は、ＮＡｃにおける神経伝達物質の細胞外濃度を変化させる相互作用を共有する（Ｄｉ  Ｃｈｉａｒａ＆Ｉｍｐｅｒａｔｏ，１９８８，ＰＮＡＳ，８５（１４）：５２７４−８、Ｐｈａｕｓ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ，１９９９，９（６）：７５１−８）。更に、ＮＡｃの病変は、種々の刺激薬およびアヘン剤の報酬効果を減少させることが示されている（Ｋｅｌｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｅｈａｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１９８９  １０３（６）：１３２７−３４）。それにもかかわらず、それは、それが報酬関連行動の報酬状態において果たす役割についての最も強固な証拠を提供してきた、ＮＡｃ中への麻酔の直接的微小注入を包含する実験であった。例えば、嗜癖の齧歯類モデルは、ＮＡｃ中に直接、アンフェタミン（ドーパミン放出薬剤）、コカイン（ドーパミン再取り込み阻害剤）、およびノミフェンシン（ドーパミン再取り込み阻害剤）等の麻薬を容易に自己投与することになるが、それにより、ドーパミンがＮＡｃにおいて、報酬および動機に基づく行動を調節するための重要な役割を果たすことが実証される（Ｃａｒｌｅｚｏｎ＆Ｔｈｏｍａｓ，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２００９；５６（Ｓｕｐｐｌ  １）：１２２−１３２）。
【００３１】
しかしながら、とりわけ物質乱用および依存性（嗜癖）等の報酬関連行動に関して、ドーパミン等の神経伝達物質の入力に応答した、これらの複雑なほ乳類行動を媒介することにおける、ＮＡｃの細胞自体によって果たされる役割は、依然として不明確である。また、ＮＡｃを通じて報酬関連行動を引き起こす際の、神経伝達物質ドーパミンおよびアセチルコリンによって果たされる特異的な役割も未知である。報酬は、行動を強化するプロセス、すなわち、提示される時、行動が強度を増す原因となる何らかのものである。報酬は、値個体が対象物、行動的作用（ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ａｃｔ）、または内部の生理状態に帰する正値を説明するための使用上の概念である。自然の報酬には、摂食、交配、および闘争等の、種の生存のために必要なものが含まれる。ＮＡｃは、薬物嗜癖、性依存症、および賭博嗜癖まで様々な、これらのタイプの報酬関連行動のうちの多くに関連してきた。
【００３２】
光応答性オプシンタンパク質
本明細書では、個体における少なくとも１つの報酬関連行動を妨害するために、個体の側坐核および線条体におけるコリン作動性ニューロンを選択的に過分極化するための、光遺伝学的ベースの組成物および方法が提供される。光遺伝学とは、機能している無処置の生体系とペースを保つために必要とされる時間精度（ミリ秒の時間スケール）で、自由に移動しているほ乳類および他の動物の体内でさえも、生体組織の標的細胞内の具体的な事象を制御するために使用される、遺伝的および光学的方法の組み合わせを指す。光遺伝学は、具体的な標的機構の使用を通じて細胞型分解能を維持しながら、ニューロン膜電位の時間的に正確な操作を可能にする、標的神経細胞の原形質膜への高速光応答性オプシンチャネルまたはポンプタンパク質の導入を必要とする。
【００３３】
本発明で使用され得る光応答性オプシンは、光によってニューロンにおける過分極を誘発するオプシンと、光によってニューロンにおける脱分極を誘発するオプシンとを含む。オプシンの例は、下記の表１および２に示される。
表１：可視スペクトルにわたる細胞活性の抑制のための識別されたオプシンを示す：
【表１】
2013545458.tif 000003
表２：可視スペクトルにわたる興奮および変調のための識別されたオプシンを示す：
【表２】
2013545458.tif 000004
【００３４】
本明細書で使用される時、光応答性オプシン（ＮｐＨＲ、ＢＲ、ＡＲ、ＧｔＲ３、Ｍａｃ、ＣｈＲ２、ＶＣｈＲ１、ＤＣｈＲ、およびＣｈＥＴＡ等）は、自然発生タンパク質および機能的変異形、断片、断片を含む融合タンパク質、または完全長タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、除去されてもよい。変異形は、自然発生タンパク質配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちのいずれかで同一である、アミノ酸配列を有してもよい。機能的変異形は、自然発生タンパク質と同じまたは同様の過分極機能または脱分極機能を有してもよい。
【００３５】
強化細胞内輸送アミノ酸モチーフ
本開示は、ほ乳類細胞の原形質膜への輸送を強化する、１つ以上のアミノ酸配列モチーフの追加によって、細胞において発現される光応答性オプシンタンパク質の修飾を提供する。進化的により単純な生物に由来する構成要素を有する、光応答性オプシンタンパク質は、ほ乳類細胞によって発現されない、または耐えられなくてもよく、あるいはほ乳類細胞において高レベルで発現される時に低下した細胞内局在性を示してもよい。その結果として、いくつかの実施形態では、細胞において発現される光応答性オプシンタンパク質は、シグナルペプチド、小胞体（ＥＲ）移行シグナル、膜輸送シグナル、および／またはＮ末端ゴルジ移行シグナルから成る群より選択される、１つ以上のアミノ酸配列モチーフに融合させることができる。ほ乳類細胞の原形質膜への光応答性オプシンタンパク質輸送を強化する、１つ以上のアミノ酸配列モチーフは、光応答性オプシンタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、またはＮおよびＣ末端の両方に融合させることができる。随意で、光応答性オプシンタンパク質および１つ以上のアミノ酸配列モチーフは、リンカーによって分離されてもよい。いくつかの実施形態では、光応答性オプシンタンパク質は、細胞原形質膜へのタンパク質の輸送を強化する輸送シグナル（ｔｓ）の追加によって修飾することができる。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来することができる。他の実施形態では、輸送シグナルは、アミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶを含むことができる。
【００３６】
細胞の原形質膜への光応答性オプシンタンパク質の輸送を強化することができる、追加的なタンパク質モチーフは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１２／０４１，６２８号で説明されている。いくつかの実施形態では、タンパク質の中のシグナルペプチド配列を削除するか、または異なるタンパク質からのシグナルペプチド配列と置換することができる。
【００３７】
光応答性クロライドポンプ
本明細書で提供される方法のいくつかの態様では、光応答性クロライドポンプのハロロドプシンファミリーの１つ以上のメンバーは、側坐核または線条体のコリン作動性介在ニューロンの原形質膜上で発現される。
【００３８】
いくつかの態様では、側坐核または線条体のコリン作動性介在ニューロンの神経細胞の原形質膜上で発現される、該１つ以上の光応答性クロライドポンプタンパク質は、ナトロノモナス・パラオニスに由来することができる。いくつかの実施形態では、光応答性クロライドポンプタンパク質は、琥珀色光ならびに赤色光に応答することができ、光応答性クロライドポンプタンパク質が琥珀色または赤色光で照射される時に、介在ニューロンにおける過分極電流を仲介することができる。光応答性クロライドポンプを活性化することができる光の波長は、約５８０〜６３０ｎｍであり得る。いくつかの実施形態では、光は、約５９０ｎｍの波長にあり得るか、または光は、約６３０ｎｍよりも大きい（例えば、約７４０ｎｍ未満）波長を有することができる。別の実施形態では、光は、約６３０ｎｍの波長を有する。いくつかの実施形態では、光応答性クロライドポンプタンパク質は、光の連続パルスに曝露された時に、少なくとも約９０分にわたって神経細胞膜を過分極化することができる。いくつかの実施形態では、光応答性クロライドポンプタンパク質は、配列番号１に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、アミノ酸配列を含むことができる。加えて、光応答性クロライドポンプタンパク質は、光に対する感受性を増加もしくは減少させ、光の特定の波長に対する感受性を増加もしくは減少させ、および／または細胞の原形質膜の分極状態を調節する光応答性タンパク質の能力を増加もしくは減少させるように、天然アミノ酸配列に導入される置換、削除、および／または挿入を含むことができる。いくつかの実施形態では、光応答性クロライドポンプタンパク質は、１つ以上の保存アミノ酸置換を含有する。いくつかの実施形態では、光応答性タンパク質は、１つ以上の非保存アミノ酸置換を含有する。天然アミノ酸配列に導入される置換、削除、および／または挿入を含む、光応答性タンパク質は、光に応答して、神経細胞の原形質膜を過分極化する能力を好適に保持する。
【００３９】
加えて、他の態様では、光応答性クロライドポンプタンパク質は、配列番号１に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、コアアミノ酸配列と、小胞体（ＥＲ）移行シグナルとを含むことができる。このＥＲ移行シグナルは、コアアミノ酸配列のＣ末端に融合させることができ、またはコアアミノ酸配列のＮ末端に融合させることができる。いくつかの実施形態では、ＥＲ移行シグナルは、リンカーによってコアアミノ酸配列に結合される。リンカーは、長さで約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００個のうちのいずれかであるアミノ酸を含むことができる。リンカーは更に、例えば、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質であるが、それらに限定されない、蛍光タンパク質を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＥＲ移行シグナルは、アミノ酸配列ＦＸＹＥＮＥを含むことができ、Ｘは、任意のアミノ酸となり得る。別の実施形態では、ＥＲ移行シグナルは、アミノ酸配列ＶＸＸＳＬを含むことができ、Ｘは、任意のアミノ酸となり得る。いくつかの実施形態では、ＥＲ移行シグナルは、アミノ酸配列ＦＣＹＥＮＥＶを含むことができる。
【００４０】
他の態様では、本明細書で提供される光応答性クロライドポンプタンパク質は、細胞膜上で発現される光応答性タンパク質を含むことができ、タンパク質は、配列番号１に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、コアアミノ酸配列と、輸送シグナル（例えば、原形質膜への光応答性クロライドポンプタンパク質の輸送を強化することができる）とを含む。輸送シグナルは、コアアミノ酸配列のＣ末端に融合させることができ、またはコアアミノ酸配列のＮ末端に融合させることができる。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、長さで約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００個のうちのいずれかであるアミノ酸を含むことができる、リンカーによって、コアアミノ酸配列に結合することができる。リンカーは更に、例えば、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質であるが、それらに限定されない、蛍光タンパク質を含んでもよい。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来することができる。他の実施形態では、輸送シグナルは、アミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶを含むことができる。
【００４１】
いくつかの態様では、光応答性クロライドポンプタンパク質は、配列番号１に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、コアアミノ酸配列と、ＥＲ移行シグナル、シグナルペプチド、および膜輸送シグナルから成る群より選択される、ほ乳類細胞の原形質膜への輸送を強化する、少なくとも１つの（１つ、２つ、３つ、またそれを超える等）アミノ酸配列モチーフとを含むことができる。いくつかの実施形態では、光応答性クロライドポンプタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドと、Ｃ末端ＥＲ移行シグナルと、Ｃ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端ＥＲ移行シグナルおよびＣ末端輸送シグナルは、リンカーによって結合することができる。リンカーは、長さで約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００個のうちのいずれかであるアミノ酸を含むことができる。リンカーはまた、例えば、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質であるが、それらに限定されない、蛍光タンパク質を更に含むこともできる。いくつかの実施形態では、ＥＲ移行シグナルは、輸送シグナルよりもＣ末端に位置することができる。他の実施形態では、輸送シグナルは、ＥＲ移行シグナルよりもＣ末端に位置することができる。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、アミノ酸配列ＭＴＥＴＬＰＰＶＴＥＳＡＶＡＬＱＡＥを含む。別の実施形態では、光応答性クロライドポンプタンパク質は、配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００４２】
更に、他の態様では、光応答性クロライドポンプタンパク質は、配列番号１に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、コアアミノ酸配列を含むことができ、配列番号１のＮ末端シグナルペプチドは、削除または置換される。いくつかの実施形態では、他のシグナルペプチド（他のオプシンからのシグナルペプチド等）を使用することができる。光応答性タンパク質は更に、本明細書に記載されるＥＲ移行シグナルおよび／または膜輸送シグナルを含むことができる。いくつかの実施形態では、光応答性クロライドポンプタンパク質は、配列番号３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００４３】
また、本明細書では、配列番号１に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、コアアミノ酸配列と、ＥＲ移行シグナルと、膜輸送シグナルとを含む、光応答性タンパク質等の、本明細書に記載される光応答性クロライドイオンポンプタンパク質のうちのいずれかをコードするポリヌクレオチドも提供される。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２および配列番号３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸をコードする、配列を含む。ポリヌクレオチドは、発現ベクター（本明細書に記載されるウイルスベクター等であるが、それに限定されない）の中にあってもよい。ポリヌクレオチドは、ＮＡｃまたは線条体のコリン作動性ニューロンにおける光応答性クロライドイオンポンプタンパク質の発現に使用されてもよい。
【００４４】
いくつかの実施形態では、光応答性オプシンタンパク質は、配列番号１に示される配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、ＮｐＨＲオプシンタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＮｐＨＲオプシンタンパク質は更に、小胞体（ＥＲ）移行シグナルおよび／または膜輸送シグナルを含む。例えば、ＮｐＨＲオプシンタンパク質は、配列番号１に示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列と、小胞体（ＥＲ）移行シグナルとを含む。いくつかの実施形態では、配列番号１に示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列は、リンカーを通じてＥＲ移行シグナルに結合される。いくつかの実施形態では、ＥＲ移行シグナルは、アミノ酸配列ＦＸＹＥＮＥを含み、Ｘは、任意のアミノ酸となり得る。別の実施形態では、ＥＲ移行シグナルは、アミノ酸配列ＶＸＸＳＬを含み、Ｘは、任意のアミノ酸となり得る。いくつかの実施形態では、ＥＲ移行シグナルは、アミノ酸配列ＦＣＹＥＮＥＶを含む。いくつかの実施形態では、ＮｐＨＲオプシンタンパク質は、配列番号１に示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列と、ＥＲ移行シグナルと、膜輸送シグナルとを含む。他の実施形態では、ＮｐＨＲオプシンタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで、配列番号１に示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列と、ＥＲ移行シグナルと、膜輸送シグナルとを含む。他の実施形態では、ＮｐＨＲオプシンタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで、配列番号１に示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列と、膜輸送シグナルと、ＥＲ移行シグナルとを含む。いくつかの実施形態では、膜輸送シグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列から導出される。いくつかの実施形態では、膜輸送シグナルは、アミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶを含む。いくつかの実施形態では、膜輸送シグナルは、リンカーによって、配列番号１に示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列に結合される。いくつかの実施形態では、膜輸送シグナルは、リンカーを通じてＥＲ移行シグナルに結合される。リンカーは、長さで約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００個のうちのいずれかであるアミノ酸を含んでもよい。リンカーは更に、例えば、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質であるが、それらに限定されない、蛍光タンパク質を含んでもよい。いくつかの実施形態では、光応答性オプシンタンパク質は更に、Ｎ末端シグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、光応答性オプシンタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、光応答性オプシンタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。
【００４５】
光応答性クロライドポンプタンパク質に関係付けられる更なる開示は、米国特許出願公開第２００９／００９３４０３号および第２０１０／０１４５４１８号、ならびに国際特許出願第ＰＣＴ/ＵＳ２０１１／０２８８９３号で見出すことができ、それらの各々の開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００４６】
光応答性プロトンポンプ
本明細書で提供される組成物および方法のいくつかの態様では、１つ以上の光応答性プロトンポンプが、側坐核または線条体のコリン作動性介在ニューロンの原形質膜上で発現される。
【００４７】
いくつかの実施形態では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、青色光に応答することができ、かつグィラルディア・セータに由来することができ、プロトンポンプタンパク質は、細胞が青色光で照射される時に、過分極電流を仲介することが可能となり得る。光は、約４５０から約４９５ｎｍの間の波長を有することができ、または約４９０ｎｍの波長を有することができる。別の実施形態では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、配列番号４に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、アミノ酸配列を含むことができる。光応答性プロトンポンプタンパク質は、追加的に、光に対する感受性を増加もしくは減少させ、光の特定の波長に対する感受性を増加もしくは減少させ、および／または細胞の原形質膜の分極状態を調節する光応答性プロトンポンプタンパク質の能力を増加もしくは減少させるように、天然アミノ酸配列に導入される置換、削除、および／または挿入を含むことができる。加えて、光応答性プロトンポンプタンパク質は、１つ以上の保存アミノ酸置換および／または１つ以上の非保存アミノ酸置換を含有することができる。天然アミノ酸配列に導入される置換、削除、および／または挿入を含む、光応答性プロトンポンプタンパク質は、光に応答して、神経細胞の原形質膜を過分極化する能力を好適に保持する。
【００４８】
本明細書で開示される方法の他の態様では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、配列番号４に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、コアアミノ酸配列と、シグナルペプチド、ＥＲ移行シグナル、および膜輸送シグナルから成る群より選択される、ほ乳類細胞の原形質膜への輸送を強化する、少なくとも１つの（１つ、２つ、３つ、またそれを超える等）アミノ酸配列モチーフとを含むことができる。いくつかの実施形態では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドと、Ｃ末端ＥＲ移行シグナルとを含む。いくつかの実施形態では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドと、Ｃ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドと、Ｃ末端ＥＲ移行シグナルと、Ｃ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｃ末端ＥＲ移行シグナルと、Ｃ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端ＥＲ移行シグナルおよびＣ末端輸送シグナルは、リンカーによって結合される。リンカーは、長さで約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００個のうちのいずれかであるアミノ酸を含むことができる。リンカーは更に、例えば、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質であるが、それらに限定されない、蛍光タンパク質を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＥＲ移行シグナルは、輸送シグナルよりもＣ末端に位置する。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、ＥＲ移行シグナルよりもＣ末端に位置する。
【００４９】
また、本明細書では、配列番号４に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、コアアミノ酸配列を含む、光応答性プロトンポンプタンパク質等の、本明細書に記載される光応答性プロトンポンプタンパク質のうちのいずれかをコードする単離ポリヌクレオチドも提供される。また、本明細書では、配列番号４に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、コアアミノ酸配列を含む、光応答性プロトンポンプタンパク質等の、本明細書に記載されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、発現ベクター（本明細書に記載されるウイルスベクター等）も提供される。ポリヌクレオチドは、神経細胞内の光応答性オプシンタンパク質の発現に使用されてもよい（例えば、ＮＡｃまたは線条体のコリン作動性介在ニューロン）。
【００５０】
光応答性プロトンポンプタンパク質に関係付けられる更なる開示は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２８８９３号で見出すことができ、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５１】
光応答性チャネルタンパク質
本明細書で提供される方法のいくつかの態様では、光応答性イオンチャネルのチャネルロドプシンファミリーの１つ以上のメンバーは、側坐核または線条体のコリン作動性介在ニューロンの原形質膜上で発現される。
【００５２】
いくつかの態様では、光活性化カチオンチャネルタンパク質は、コナミドリムシに由来することができ、カチオンチャネルタンパク質は、細胞が光で照射される時に、細胞内の脱分極電流を仲介することが可能となり得る。別の実施形態では、光応答性カチオンチャネルタンパク質は、配列番号５に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、アミノ酸配列を含むことができる。コナミドリムシに由来する光応答性カチオンチャネルタンパク質を活性化するために使用される光は、約４６０〜約４９５ｎｍの波長を有することができるか、または約４７０ｎｍの波長を有することができる。加えて、光は、少なくとも約１００Ｈｚの強度を有することができる。いくつかの実施形態では、１００Ｈｚの強度を有する光を用いたコナミドリムシに由来する光応答性カチオンチャネルの活性化は、光応答性カチオンチャネルを発現するニューロンの脱分極誘発型シナプス枯渇を引き起こすことができる。光応答性カチオンチャネルタンパク質は、追加的に、光に対する感受性を増加もしくは減少させ、光の特定の波長に対する感受性を増加もしくは減少させ、および／または細胞の原形質膜の分極状態を調節する光応答性カチオンチャネルタンパク質の能力を増加もしくは減少させるように、天然アミノ酸配列に導入される置換、削除、および／または挿入を含むことができる。加えて、光応答性カチオンチャネルタンパク質は、１つ以上の保存アミノ酸置換および／または１つ以上の非保存アミノ酸置換を含有することができる。天然アミノ酸配列に導入される置換、削除、および／または挿入を含む光応答性カチオンチャネルタンパク質は、光に応答して、神経細胞の原形質膜を脱分極化する能力を好適に保持する。
【００５３】
他の実施形態では、光応答性カチオンチャネルタンパク質は、タンパク質のレチナール結合ポケットの全体を通した主要位置に具体的なアミノ酸置換を有することができる、段階機能オプシン（ＳＦＯ）タンパク質または安定化段階機能オプシン（ＳＳＦＯ）タンパク質となり得る。いくつかの実施形態では、ＳＦＯタンパク質は、配列番号５のアミノ酸残基Ｃ１２８に突然変異を有することができる。他の実施形態では、ＳＦＯタンパク質は、配列番号５の中にＣ１２８Ａ突然変異を有する。他の実施形態では、ＳＦＯタンパク質は、配列番号５の中にＣ１２８Ｓ突然変異を有する。別の実施形態では、ＳＦＯタンパク質は、配列番号５の中にＣ１２８Ｔ突然変異を有する。いくつかの実施形態では、ＳＦＯタンパク質は、配列番号６または配列番号７に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、アミノ酸配列を含むことができる。
【００５４】
他の実施形態では、光応答性カチオンチャネルタンパク質は、ボルボックス・カルテリのＶＣｈＲ１タンパク質およびコナミドリムシからのＣｈＲ１タンパク質に由来するＣ１Ｖ１キメラタンパク質となり得て、タンパク質は、ＣｈＲ１の第１および第２の膜貫通ヘリックスによって置換される、少なくとも第１および第２の膜貫通ヘリックスを有する、ＶＣｈＲ１のアミノ酸配列を含み、光に応答し、細胞が光で照射される時に、細胞内の脱分極電流を仲介することが可能である。加えて、いくつかの実施形態では、本発明は、置換または変異アミノ酸配列を含む、ポリペプチドを含むことができ、変異ポリペプチドは、前駆体Ｃ１Ｖ１キメラポリペプチドの特徴的な光応答性質を保持するが、また、いくつかの具体的な態様では、変化させられた性質を保有してもよい。例えば、本明細書に記載される変異光応答性Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質は、動物細胞内または動物細胞原形質膜上の両方での増加したレベルの発現、光の異なる波長、特に赤色光に曝露された時の変化させられた応答性、および／または特質の組み合わせを示すことができ、それにより、キメラＣ１Ｖ１ポリペプチドは、低い脱感作、高速脱活性化、他の光応答性カチオンチャネルを用いた最低限の相互活性化のための低い紫色光活性化、および／または動物細胞中での強力な発現という特性を保有する。いくつかの実施形態では、Ｃ１Ｖ１タンパク質は、配列番号８、９、１０、または１１に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、アミノ酸配列を含むことができる。
【００５５】
光応答性カチオンチャネルタンパク質に関係付けられる更なる開示は、米国特許出願公開第２００７／００５４３１９号ならびに国際特許出願公開第ＷＯ２００９／１３１８３７号および第ＷＯ２００７／０２４３９１号で見出すことができる。ＳＦＯまたはＳＳＦＯタンパク質に関係付けられる更なる開示は、国際特許出願公開第ＷＯ２０１０／０５６９７０号ならびに米国仮特許出願第６１／４１０，７０４号および第６１／５１１，９０５号で見出すことができる。Ｃ１Ｖ１キメラカチオンチャネルならびに同チャネルの突然変異体に関係付けられる更なる開示は、米国仮特許出願第６１／４１０，７３６号、第６１／４１０，７４４号、および第６１／５１１，９１２号で見出すことができる。具体的な光応答性オプシンタンパク質に関係付けられる上述の参考文献の各々の開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００５６】
ポリヌクレオチド
本開示はまた、本明細書に記載される光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドも提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、上述の核酸を含むベクターである。いくつかの実施形態では、本開示の光応答性オプシンタンパク質をコードする核酸は、プロモータに作動可能に連結される。プロモータは、当該技術分野で周知である。コリン作動性介在ニューロンにおいて機能する任意のプロモータを、本開示の光応答性オプシンタンパク質および／またはその任意の変異形の発現に使用することができる。具体的な動物細胞における光応答性オプシンタンパク質またはその変異形の発現を駆動するのに有用である、開始制御領域またはプロモータは、多数あり、当業者に周知である。これらの核酸を駆動することが可能な事実上いかなるプロモータも使用することができる。いくつかの実施形態では、光応答性タンパク質の発現を駆動するために使用されるプロモータは、コリン作動性介在ニューロンにおける導入遺伝子の強固な発現を駆動することが可能である、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）プロモータであり得る（例えば、Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２７，９８１７−９８２３（２００７）を参照されたい）。
【００５７】
また、本明細書では、本明細書に記載される光応答性オプシンタンパク質またはその任意の変異形をコードするヌクレオチド配列を含む、ベクターが提供される。本発明により投与することができるベクターはまた、ベクターのポリヌクレオチドから転写された時に標的動物細胞の原形質膜上で光応答性タンパク質の蓄積をもたらす、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む、ベクターも含む。使用されてもよいベクターは、限定なしに、レンチウイルス、ＨＳＶ、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。レンチウイルスは、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、およびＥＩＡＶを含むが、それらに限定されない。レンチウイルスは、ＶＳＶ、狂犬病、Ｍｏ−ＭＬＶ、バキュロウイルス、およびエボラを含むが、それらに限定されない、他のウイルスの外膜タンパク質を伴う偽型であってもよい。かかるベクターは、当該技術分野での標準方法を使用して調製されてもよい。
【００５８】
いくつかの実施形態では、ベクターは、組み換えＡＡＶベクターである。ＡＡＶベクターは、安定した部位特有の様態で、感染する細胞のゲノムに統合することができる、比較的小さいサイズのＤＮＡウイルスである。それらは、細胞成長、形態、または分化にいずれの影響も誘発することなく、広範囲の細胞に感染することができ、ヒトの病理に関与するように思われない。ＡＡＶゲノムは、クローン化され、配列決定され、特徴付けられている。それは、約４７００個の塩基を包含し、ウイルスの複製起点としての機能を果たす、約１４５個の塩基の逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域を各端に含有する。残りのゲノムは、ウイルス複製およびウイルス遺伝子の発現に関与するｒｅｐ遺伝子を含有するゲノムの左側部分、およびウイルスのカプシドタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を含有するゲノムの右側部分といった、カプシド形成機能を担持する２つの必須領域に分けられる。
【００５９】
ＡＡＶベクターは、当該技術分野での標準方法を使用して調製されてもよい。任意の血清型のアデノ随伴ウイルスが好適である（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗ，ｐｐ．１６５−１７４  ｏｆ“Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ”Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．（１９８８）、Ｒｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３：１，１９７４、Ｐ．Ｔａｔｔｅｒｓａｌｌ“Ｔｈｅ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ”  Ｉｎ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ（ＪＲ  Ｋｅｒｒ，ＳＦ  Ｃｏｔｍｏｒｅ．ＭＥ  Ｂｌｏｏｍ，ＲＭ  Ｌｉｎｄｅｎ，ＣＲ  Ｐａｒｒｉｓｈ，Ｅｄｓ．）ｐ５−１４，Ｈｕｄｄｅｒ  Ａｒｎｏｌｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ（２００６）、およびＤＥ  Ｂｏｗｌｅｓ，ＪＥ  Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，ＲＪ  Ｓａｍｕｌｓｋｉ“Ｔｈｅ  Ｇｅｎｕｓ  Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ”（ＪＲ  Ｋｅｒｒ，ＳＦ  Ｃｏｔｍｏｒｅ．ＭＥ  Ｂｌｏｏｍ，ＲＭ  Ｌｉｎｄｅｎ，ＣＲ  Ｐａｒｒｉｓｈ，Ｅｄｓ．）ｐ１５−２３，Ｈｕｄｄｅｒ  Ａｒｎｏｌｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ（２００６）を参照されたく、それらの各々の開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。ベクターを精製するための方法は、例えば、米国特許第６，５６６，１１８号、第６，９８９，２６４号、および第６，９９５，００６号、ならびに第ＷＯ／１９９９／０１１７６４号（標題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｈｉｇｈ  Ｔｉｔｅｒ  Ｈｅｌｐｅｒ−ｆｒｅｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＡＡＶ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」）で見出すことができ、それらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。ハイブリッドベクターの調製は、例えば、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２７０９１号に記載されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。生体外および生体内で遺伝子を導入するためのＡＡＶに由来するベクターの使用が説明されている（例えば、国際特許出願公開第９１／１８０８８号および第ＷＯ９３／０９２３９号、米国特許第４，７９７，３６８号、第６，５９６，５３５号、および第５，１３９，９４１号、ならびに欧州特許第０４８８５２８号を参照されたく、それらの全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。これらの出版物は、ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子が削除され、関心遺伝子によって置換される、種々のＡＡＶ由来構築物、および生体外で（クラスタ細胞に）または生体内で（生物に直接）関心遺伝子を導入するためのこれらの構築物の使用を説明する。本発明による複製欠損組み換えＡＡＶは、２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域が両側に並ぶ、関心の核酸配列を含有するプラスミド、およびＡＡＶカプシド形成遺伝子（ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）を担持するプラスミドを、ヒトヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）に感染した細胞株に共同導入することによって調製することができる。次いで、産生されるＡＡＶ組み換え型は、標準技法によって純化される。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本発明の方法において使用するためのベクター（複数可）は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５，ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、およびＡＡＶ１６を含むが、それらに限定されないＡＡＶウイルス粒子）中でキャプシド形成される。したがって、本発明は、本明細書に記載されるベクターのうちのいずれかを含む、組み換えウイルス粒子を含む（組み換えポリヌクレオチドを含有するため組み換え型である）。かかる粒子を生成する方法は、当該技術分野において既知であり、米国特許第６，５９６，５３５号に記載され、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００６１】
光応答性オプシンタンパク質の送達
いくつかの態様では、本明細書で開示される光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶ１ベクター）は、定位固定注射（例えば、Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７３：３４２４３４２９，１９９９、Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９７：３４２８−３４３２，２０００、Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３：２１９−２２３，１９９３、およびＡｌｉｓｋｙ＆Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１：２３１５−２３２９，２０００を参照されたく、それらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）または蛍光透視法によるもの等の当該技術分野において既知の神経外科技法を使用した、針、カテーテル、または関連デバイスを使用して、側坐核または線条体のコリン作動性介在ニューロンに直接送達することができる。
【００６２】
他の態様では、光応答性オプシンタンパク質のうちのいずれかは、トランスジェニック動物の側坐核または線条体のコリン作動性介在ニューロンにおいて発現させることができる。例えば、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）プロモータの制御下でＣｒｅ−リコンビナーゼを使用して、トランスジェニックマウス株を用いることができる。次いで、光応答性オプシン遺伝子を担持するＣｒｅ誘発性アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを、ＮＡｃ中に定位的に注射することができる。
【００６３】
イオン脂質またはポリマーを用いたトランスフェクション、エレクトロポレーション、光学トランスフェクション、インペールフェクション、または遺伝子銃を介する等であるが、それらに限定されない、光応答性タンパク質をコリン作動性介在ニューロンへ送達する他の方法も使用することができる。
【００６４】
光源
ニューロンにおいて発現される光応答性タンパク質を活性化するための波長を有する光を適用することが可能である任意のデバイスが、ニューロンを脱分極化するおよび／または過分極化するために使用されてもよい。例えば、１つ以上のニューロンの膜電圧に影響を及ぼすためにイオンチャネルおよび／またはイオン性ポンプを活性化するための光送達デバイスが使用されてもよい。光送達デバイスは、脳の標的領域に光刺激を提供するように構成することができる。光送達デバイスは、基部、基部に取り付けられたカニューレガイド、およびカニューレガイドを介して基部に取り付けられた１つ以上の光導管を備えてもよい。基部は、光導管から、側坐核または線条体等の標的組織領域に光を送達するように位置付けられた１つ以上の光送達ポートを備えてもよい。光導管は光ファイバーであってもよく、ファイバーの近位端は光学的光源に取り付けられ、遠位端は光送達ポートと連通している。光学的光源は、連続光および／またはパルス光を提供することが可能であり得、所定のパルス周期で光を提供するようにプログラム可能であり得る。光送達デバイスは、所望されるように、例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０個等の任意の数の光導管を有してもよい。光導管は、各々が、同じまたは異なる波長の光を担持してもよい。送達された光は、黄色、緑色、または青色光等の４５０ｎｍ〜６００ｎｍの波長を有してもよい。光送達デバイスは、所望されるように、例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０個等の任意の数の光送達ポートを有してもよい。いくつかの変形においては、光導管と同じ数の光送達ポートが存在してもよい一方で、他の変形においては、異なる数の光導管および光送達ポートが存在してもよい。例えば、２つ以上の光送達ポートに光を伝達する単一の光導管が存在してもよい。代替的にまたは追加的に、単一の光導管が、単一の光送達ポートに接続されてもよい。カニューレガイドは、光導管を光送達ポートに固定して揃える一助となるように構成されてもよい。いくつかの実施形態では、光送達デバイスは、個体における少なくとも１つの報酬関連行動を妨害するために、光を側坐核または線条体に送達するように構成される。光送達デバイスまた、神経活動を測定するために構成され得る１つ以上の測定電極を備えてもよい。例えば、測定電極は、ニューロンが刺激に応答するときに、膜電位（例えば、活動電位）および／または１つ以上のニューロンの膜を横切る電流における変化を記録してもよい。いくつかの変形においては、測定電極は、１つ以上のニューロンの光刺激に対する電気的応答を測定してもよい。測定電極は、細胞外電極または細胞内電極であってもよい。
【００６５】
他の態様では、光送達デバイスは、外部電源への物理的な繋留を要求しない植え込み型光源であり得る。植え込み型光源は、内側本体を備えることができ、内側本体は、電源であるように構成される光を発生するための少なくとも１つの手段を有する。いくつかの実施形態では、電源は、光発生手段に電力供給するための内部バッテリとなり得る。別の実施形態では、植え込み型光源は、光発生手段に電力供給するための外部源から無線で伝達された電磁エネルギーを受信するための、外部アンテナを備えることができる。無線で伝達された電磁エネルギーは、電波、マイクロ波、または植え込み型光源の光発生手段に電力供給するために外部源から伝達され得る任意の他の電磁エネルギー源であり得る。一実施形態では、光発生手段は、半導体または当該技術分野において既知の他のプロセスを使用して発生される集積回路によって制御される。
【００６６】
いくつかの態様では、光手段は、発光ダイオード（ＬＥＤ）であり得る。いくつかの実施形態では、ＬＥＤは、青色および／または緑色光を発生することができる。他の実施形態では、ＬＥＤは、琥珀色、黄色、および／または青色光を発生することができる。いくつかの実施形態では、いくつかのマイクロＬＥＤが、植え込み型光源の内側本体内に埋め込まれる。他の実施形態では、光発生手段は、固体レーザーダイオードであるか、または光を発生することが可能である任意の他の手段である。光発生手段は、光源に近位の神経の原形質膜上で発現される光応答性タンパク質を活性化するのに十分な強度を有する光を発生することができる。いくつかの実施形態では、光発生手段によって発生されるＮＡｃまたは線条体のコリン作動性介在ニューロンに到達する光の強度は、約０．０５ｍＷ／ｍｍ２、０．１ｍＷ／ｍｍ２、０．２ｍＷ／ｍｍ２、０．３ｍＷ／ｍｍ２、０．４ｍＷ／ｍｍ２、０．５ｍＷ／ｍｍ２、約０．６ｍＷ／ｍｍ２、約０．７ｍＷ／ｍｍ２、約０．８ｍＷ／ｍｍ２、約０．９ｍＷ／ｍｍ２、約１．０ｍＷ／ｍｍ２、約１．１ｍＷ／ｍｍ２、約１．２ｍＷ／ｍｍ２、約１．３ｍＷ／ｍｍ２、約１．４ｍＷ／ｍｍ２、約１．５ｍＷ／ｍｍ２、約１．６ｍＷ／ｍｍ２、約１．７ｍＷ／ｍｍ２、約１．８ｍＷ／ｍｍ２、約１．９ｍＷ／ｍｍ２、約２．０ｍＷ／ｍｍ２、約２．１ｍＷ／ｍｍ２、約２．２ｍＷ／ｍｍ２、約２．３ｍＷ／ｍｍ２、約２．４ｍＷ／ｍｍ２、約２．５ｍＷ／ｍｍ２、約３ｍＷ／ｍｍ２、約３．５ｍＷ／ｍｍ２、約４ｍＷ／ｍｍ２、約４．５ｍＷ／ｍｍ２、約５ｍＷ／ｍｍ２、約５．５ｍＷ／ｍｍ２、約６ｍＷ／ｍｍ２、約７ｍＷ／ｍｍ２、約８ｍＷ／ｍｍ２、約９ｍＷ／ｍｍ２、または約１０ｍＷ／ｍｍ２のうちのいずれかの強度を有する（これらの数の間の値を含む）。
【００６７】
いくつかの態様では、光発生手段は、外部コントローラによって外部から起動することができる。外部コントローラは、伝送コイルに載置することができる、発電機を備えることができる。外部コントローラのいくつかの実施形態では、電力を発電機に提供するために、バッテリをそれに接続することができる。スイッチを発電機に接続することができ、個人が発電機を手動で起動または動作停止することを可能にする。いくつかの実施形態では、スイッチを起動させると、発電機は、外部コントローラ上の伝送コイルと植え込み型光源の外部アンテナとの間の電磁結合を通じて、光源上の光発生手段に電力を提供することができる。伝送コイルは、植え込み型光源の外部アンテナに近位にあるとき、光発生手段に電力を供給するためおよび植え込み型光源に１つ以上の制御シグナルを伝送するために、植え込み型光源の外部アンテナとの電磁結合を確立することができる。いくつかの実施形態では、外部コントローラの伝送コイルと植え込み型光源の外部アンテナとの間の電磁結合は、高周波磁気インダクタンス結合であり得る。高周波磁気インダクタンス結合が使用される時に、電波の動作周波数は、約１から２０ＭＨｚの間を含めた、これらの数の間の任意の値を含むことができる（例えば、約１ＭＨｚ、約２ＭＨｚ、約３ＭＨｚ、約４ＭＨｚ、約５ＭＨｚ、約６ＭＨｚ、約７ＭＨｚ、約８ＭＨｚ、約９ＭＨｚ、約１０ＭＨｚ、約１１ＭＨｚ、約１２ＭＨｚ、約１３ＭＨｚ、約１４ＭＨｚ、約１５ＭＨｚ、約１６ＭＨｚ、約１７ＭＨｚ、約１８ＭＨｚ、約１９ＭＨｚ、または約２０ＭＨｚ）。しかしながら、受光器、赤外線、または生物医学テレメトリーシステム等の他の結合技法が使用されてもよい（例えば、Ｋｉｏｕｒｔｉ，“Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｌｅｍｅｔｒｙ：Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｉｍｐｌａｎｔｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｅｘｔｅｒｎａｌ  Ｗｏｒｌｄ，Ｏｐｔｉｃｏｎ１８２６，（８）：Ｓｐｒｉｎｇ，２０１０を参照されたい）。
【００６８】
光源を含む、光刺激デバイスの例は、国際特許出願第ＰＣＴ/ＵＳ０８／５０６２８号および第ＰＣＴ/ＵＳ０９／４９９３６号、ならびにＬｌｅｗｅｌｌｙｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１６（１０）：１６１−１６５で見出すことができ、それらの各々の開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００６９】
コリン作動性介在ニューロンにおいて発現される光応答性オプシン
動物の側坐核または線条体におけるコリン作動性介在ニューロンの細胞膜上で発現された光応答性オプシンタンパク質を含む非ヒト動物が、本明細書に提供され、ここでタンパク質は、光に応答性であり、介在ニューロンが光で照射される時、介在ニューロンの膜分極状態を変化させることが可能であり、オプシンの照射は、動物の少なくとも１つの報酬関連行動を妨害する。いくつかの実施形態では、光応答性タンパク質は、本明細書に記載されるＮｐＨＲ、ＢＲ、ＡＲおよびＧｔＲ３から成る群より選択される。例えば、本明細書に記載されるＮｐＨＲタンパク質のうちのいずれかは、標的ニューロンの細胞膜上で発現されてもよい。いくつかの実施形態では、報酬関連行動は、薬物関連嗜癖行動である。薬物は、オピオイド（例えば、アヘンおよびヘロイン）、メタンフェタミン、コカイン、ケタミン、ＭＤＭＡ（３，４−メチレンジオキシメタンフェタミン）、リゼルギン酸ジエチルアミド、カンナビノイド、アルコール、ニコチン、または任意の他の規制物質等であるが、それらに限定されない、任意の嗜癖薬物であり得る。一実施形態では、薬物は、コカインである。別の実施形態では、報酬関連行動は、コカイン嗜癖である。
【００７０】
また、本明細書では、側坐核または線条体を含む脳組織切片も提供され、ここで光応答性オプシンタンパク質は、側坐核のコリン作動性介在ニューロンの細胞膜上で発現され、タンパク質は、光に応答性であり、介在ニューロンが光で照射される時、介在ニューロンの膜分極状態を変化させることが可能であり、タンパク質の照射は、少なくとも１つの報酬関連行動を妨害する。いくつかの実施形態では、脳組織切片は、本明細書に記載される非ヒト動物から採取された培養組織切片である。いくつかの実施形態では、光応答性タンパク質は、側坐核のコリン作動性介在ニューロンの膜を過分極化することが可能であり、それは本明細書に記載されるＮｐＨＲ、ＢＲ、ＡＲおよびＧｔＲ３から成る群より選択される。例えば、本明細書に記載されるＮｐＨＲタンパク質のうちのいずれかは、標的ニューロンの細胞膜上で発現されてもよい。他の実施形態では、光応答性タンパク質は、側坐核のコリン作動性介在ニューロンの膜を脱分極化することが可能であり、それは本明細書に記載されるＣｈＲ２、ＳＦＯ、ＳＳＦＯ、およびＣ１Ｖ１から成る群より選択される。
【００７１】
本発明の方法
いくつかの態様では、光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、個体に投与することを含む、個体における報酬関連行動を妨害するための方法が、本明細書に提供され、ここで光応答性オプシンタンパク質は、個体の側坐核または線条体におけるコリン作動性介在ニューロンの細胞膜上で発現され、タンパク質は、光に応答性であり、介在ニューロンが光で照射される時、介在ニューロンの膜過分極を誘発することが可能であり、それにより、光によってタンパク質を活性化することは、個体における少なくとも１つの報酬関連行動を妨害する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、個体の側坐核または線条体に投与される。いくつかの実施形態では、光応答性タンパク質は、本明細書に記載されるＮｐＨＲ、ＢＲ、ＡＲおよびＧｔＲ３から成る群より選択される。例えば、本明細書に記載されるＮｐＨＲタンパク質のうちのいずれかは、標的ニューロンの細胞膜上で発現されてもよい。いくつかの実施形態では、報酬関連行動は、薬物関連嗜癖行動である。薬物は、オピオイド（例えば、アヘンおよびヘロイン）、メタンフェタミン、コカイン、ケタミン、ＭＤＭＡ（３，４−メチレンジオキシメタンフェタミン）、リゼルギン酸ジエチルアミド、カンナビノイド、アルコール、ニコチン、または任意の他の規制物質等であるが、それらに限定されない、任意の嗜癖薬物であり得る。一実施形態では、薬物は、コカインである。別の実施形態では、報酬関連行動は、コカイン嗜癖である。いくつかの実施形態では、個体は、非ヒト動物である。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、光応答性オプシンタンパク質に作動可能に連結されるプロモータ（例えば、ＣｈＡＴプロモータ）を更に含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ベクターである。
【００７２】
報酬関連行動の妨害を測定するための方法は、多くあり、当該技術分野で周知である（例えば、Ａｄｄｉｃｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ．，２０１０；Ｗｉｌｅｙ−  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を参照されたい）。例えば、コカイン嗜癖および薬物関連嗜癖行動の妨害は、場所嗜好条件付け（ＣＰＰ、環境的場所（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｐｌａｃｅ）としても知られる）の条件付けを使用することによって査定することができる。ＣＰＰは、正または負の報酬に関連付けられている環境刺激に対する嗜好を評価するために、動物研究において一般的に使用される技法である。技法は、薬物の嗜癖の可能性を決定するためにしばしば使用される。手順は、種々の合図（例えば、触覚、視覚、および／または嗅覚）を含有する特有の環境中の配置と対になって、動物に正の刺激（例えば、食物、神経伝達物質、または乱用薬物の効果）が提示される、複数のトライアルを伴う。後に正常な状態で試験された時、アプローチおよび以前に正の刺激関連付けられた小部屋で費やされた時間量は、嗜好の指標および報酬学習のスケールとしての機能を果たす。
【００７３】
他の態様では、光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、個体に投与することを含む、個体における薬物嗜癖を治療するための方法が、本明細書に提供され、ここで光応答性オプシンタンパク質は、個体の側坐核または線条体におけるコリン作動性介在ニューロンの細胞膜上で発現され、タンパク質は、光に応答性であり、介在ニューロンが光で照射される時、介在ニューロンを過分極化することが可能であり、それにより、光によってタンパク質を活性化することは、個体における報酬関連行動を妨害し、個体は、薬物を摂取することをもはや所望しない。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、個体の側坐核または線条体に投与される。いくつかの実施形態では、光応答性タンパク質は、本明細書に記載されるＮｐＨＲ、ＢＲ、ＡＲおよびＧｔＲ３から成る群より選択される。例えば、本明細書に記載されるＮｐＨＲタンパク質のうちのいずれかは、標的ニューロンの細胞膜上で発現されてもよい。いくつかの実施形態では、報酬関連行動は、薬物関連嗜癖行動である。薬物は、オピオイド（例えば、アヘンおよびヘロイン）、メタンフェタミン、コカイン、ケタミン、ＭＤＭＡ（３，４−メチレンジオキシメタンフェタミン）、リゼルギン酸ジエチルアミド、カンナビノイド、アルコール、ニコチン、または任意の他の規制物質等であるが、それらに限定されない、任意の嗜癖薬物であり得る。一実施形態では、薬物は、コカインである。別の実施形態では、報酬関連行動は、コカイン嗜癖である。いくつかの実施形態では、個体は、非ヒト動物である。別の実施形態では、個体は、ヒトである。いくつかの実施形態では、個体は、薬物を使用することの正の強化経験をもはや経験しない。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、光応答性オプシンタンパク質に作動可能に連結されるプロモータ（例えば、ＣｈＡＴプロモータ）を更に含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ベクターである。
【００７４】
例示的実施形態
本開示は、生存動物における強化された行動の制御または特徴付けに有用であると考えられる。本発明の具体的な適用は、生存動物における嗜癖および他の強化された行動の査定を促進する。本明細書で開示される例示的な実施形態の多くの態様は、この分野における以前の開発に関し、またそれらに大いに基づいているため、以下の考察は、かかる以前の開発を要約して、実装形態の詳細および修正が導き出される元となり得る基盤および根底にある教示の確固たる理解を提供する。次の考察は、この文脈に関連して、かつ参照により本明細書に組み込まれる参考文献中のその教示と共に、提供される。本発明は、必ずしもかかる適用に限定されるわけではないが、本発明の種々の態様は、この前後関係を使用して、種々の例の考察を通じて理解されてもよい。
【００７５】
図１０は、本開示の実施形態と一致する、側坐核（ＮＡｃ）または背側線条体を制御するためのシステムを図示する。刺激の源１０２は、標的場所１０６に連結１０４される。この標的場所は、ＮＡｃまたは背側線条体にまたはその近くに位置し、例えば、図示される場所は、一般にＮＡｃと揃っているが、必ずしもそのように限定されない。
【００７６】
本開示の実施形態と一致して、刺激の源１０２は、光学的光源を含むことができる。光学的光源は、標的場所１０６に（例えば、ファイバー光学を使用して）光学的に連結される。標的場所１０６は、光刺激に応答する細胞を含むように構成される。これらの細胞は、イオンポンプ（例えば、ＮｐＨＲおよびＮｐＨＲ変異形）および／またはイオンチャネル（例えば、ＣｈＲ２／ＣｈＲ１およびＣｈＲ２／ＣｈＲ１変異形）を含むが、それらに限定されない、光応答性オプシンを発現する細胞を含むことができる。
【００７７】
本開示の種々の他の実施形態と一致して、刺激の源１０２は、薬物／薬理学的送達デバイスを含むことができる。送達デバイスは、標的場所に（例えば、送達管腔を使用して）結合される。
【００７８】
本開示のある種の実施形態は、刺激の源を使用して、自然な報酬関連行動および／または報酬学習に関与する構造（例えば、ＮＡｃまたは背側線条体）のコリン作動性ニューロンを標的とすることを対象とする。刺激の源１０２は、構造内のアセチルコリンの放出を制御する刺激を提供する。ある種の実施形態では、この制御は、他の行動、例えば、欲求性または嫌悪性反応の強化に顕著に影響を及ぼすことなく、物質乱用の嗜癖特性を妨害するのに特に有用であり得る、局在化された時空間的な様態で遂行される。刺激は、いくつかの異なる刺激の源から提供することができる。非限定的例としては、コリン作動性ニューロンにおいて発現される光応答性オプシンを活性化すること、コリン作動性ニューロンの近くに位置付けられた１つ以上の電極を通じて電気パルスを適用すること、コリン作動性ニューロンに近接する場所で薬物を放出すること、コリン作動性ニューロンに近接する場所に磁場を適用すること、および／またはこの理解に基づく外科的改変が挙げられる。
【００７９】
図１１は、本開示の実施形態と一致する、アセチルコリンの放出を制御するためのフロー図を図示する。報酬ベースの事象２０２は、報酬関連行動の査定もしくは制御についておよび／または報酬学習についての根拠を提供する。それに限定されないが、報酬ベースの事象２０２は、患者への嗜癖物質の導入であり得る。制御指示２０４は、時間的属性、空間的場所、および／または細胞型のうちの１つ以上によって定義され得る標的の関数として、どのように刺激の源２０６が刺激２０８を適用するかを決定する。刺激２０８は、アセチルコリンの放出２１０に対する変化をもたらす。次いで、刺激の効果を監視２１２することができる。監視を使用して、制御指示を調整し、それにより、意図される結果のために刺激を微調整することができる。本明細書で考察される種々の実施形態は、かかるプロセスに関連して（またはそれに加えて）使用され得る更なる例を提供する。
【００８０】
本開示の実施形態は、物質の嗜癖特性の査定を対象とする。特別に標的とされた神経細胞構造における（またはそれに由来する）コリン作動性ニューロンの活性の制御および／または監視を使用して、物質の嗜癖性質を予測することができる。例えば、側坐核のコリン作動性ニューロンを、研究中の物質に曝露することができる。次いで、側坐核のコリン作動性ニューロンの活性を、物質への曝露後に監視する。この監視には、電気活性（例えば、活動電位／発火）および／またはアセチルコリンの放出が含まれ得るが、それらに限定されない。
【００８１】
本開示の他の実施形態と一致して、嗜癖物質に対する処理の効果を査定することができる。例えば、可能性のある治療を、側坐核のコリン作動性ニューロンの物質への曝露に関連して使用することができる。側坐核のコリン作動性ニューロンの活性を処理に関連して監視して、その有効性を査定することができる。
【００８２】
本開示の実施形態によれば、物質依存症に対する治療の効果は、動物に条件反応を教示しながら、動物の側坐核のコリン作動性ニューロンを興奮させることによって、動物において物質依存性を人工的に誘発することによって査定される。処理の効果は、次いで処理を適用し、患者の条件反応を監視することによって査定される。
【００８３】
本開示の態様は、一連のコリン作動性ニューロンと、薬物を一連のコリン作動性ニューロンに提供するための薬物送達デバイスと、一連のコリン作動性ニューロンに提供されている薬物（ｄｒａｇｓ）に応答した、一連のコリン作動性ニューロンの活性を査定するための監視デバイスとを含む、システムの実施形態を対象とする。ある種の実施形態と一致して、一連のコリン作動性ニューロンは、光応答性オプシンを含み、そのシステムは、光応答性オプシンを活性化することによって、コリン作動性ニューロンを興奮させるための光学送達系を更に含む。
【００８４】
本開示の種々の実施形態と一致して、神経回路に対する制御は、抑制または興奮を含むことができ、それは各々、協調された発火、および／または外部回路入力に対する修飾された感受性を含むことができる。例えば、抑制は、イオンポンプ（例えば、ＮｐＨＲおよびＮｐＨＲ変異形）等の光応答性オプシンを使用して遂行することができる。かかるイオンポンプは、ニューロンの膜電位をその閾値電圧から離れて移動させて、活動電位を止めるかまたは抑制する。別の例では、興奮は、イオンチャネル（例えば、ＣｈＲ２およびＣｈＲ２変異形）等の光応答性オプシンを使用して遂行することができる。かかるイオンチャネルは、膜電位が閾値電圧の方向に移動するおよび／またはそれを通り過ぎる原因となり得、それにより、活動電位を興奮させるかまたは助長する。種々の実施形態と一致して、光応答性オプシンを使用して、ニューロンの静止電位を、外部回路入力に対するその感受性を増加または減少させるように、（一時的に）偏移することができる。これらの種々の選択肢はまた、組み合わせて使用することもできる。
【００８５】
本開示の種々の実施形態は、時間的神経回路に対する制御を測定可能なメトリクスと相関させる、光遺伝学的システムまたは方法に関する。例えば、特定の記憶機能は、神経障害に関連する可能性がある。光遺伝学的システムは、その選択的制御のために患者の内の神経回路を標的とする。光遺伝学的システムは、神経障害に関連するメトリクス（例えば、症状）について、患者を監視することを伴う。この様態で、光遺伝学的システムは、神経回路、その機能、および／または神経障害についての詳細な情報を提供することができる。
【００８６】
本開示の実施形態は、報酬関連行動および／または報酬学習に関連する神経構造に対する制御が、報酬関連行動に関連する記憶獲得および回想の妨害と組み合わせて使用される、組み合わされた解決策（複数可）を対象とする。例えば、コカイン嗜癖は、神経構造がコカインに曝露される時に、報酬関連行動および／または報酬学習に関連する神経構造を抑制することによって、研究および／または治療することができる。更に、コカインに関連する記憶獲得は、コカインが患者に導入される時に妨害することができる。コカイン使用に関連する記憶回想はまた、例えば、コカイン使用に関連する触発事象に応答して妨害することもできる。コカインが例として提示されているが、かかる解決策（複数可）の適用は、そのようには限定されない。記憶妨害に関する実施形態および実験結果は、これ以降でより詳細に考察される。
【００８７】
本開示の実施形態は、嗜癖ベースまたは恐怖ベースの記憶等の、記憶獲得、回想、および／または記憶反応と情動反応との間の関連を妨害することを対象とする。特定の実施形態では、具体的な神経回路は、その中での光応答性オプシンの発現を通じて標的とされる。神経回路の機能は、神経回路の機能を抑制することができる（例えば、ＮｐＨＲまたはＮｐＨＲ変異形を使用して）、発現されたオプシンの活性化によって妨害される。他の実施形態では、具体的な神経回路は、電極（複数可）を具体的な神経回路の近くに植え込むことによって標的とされる。神経回路の機能は、電気シグナルの電極（複数可）への適用を通じて妨害される。他の実施形態では、具体的な神経回路は、速効性医薬品を具体的な神経回路の近くに送達するデバイスを植え込むことによって標的とされる。神経回路の機能は、速効性医薬品を放出し、それにより具体的な神経回路の機能を抑制する、デバイスの作動を通じて妨害される。
【００８８】
ある種の実施形態では、この妨害は、記憶作成中に実施することができる。他の実施形態では、この妨害は、記憶回想前または記憶回想中に実施することができる。これは、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）等の、記憶回想を伴う精神または神経障害記憶に特に有用であり得る。ある種の実施形態と一致して、妨害は、妨害に対して提示されるおよび／または制御される、記憶触発事象または他の外部刺激に応答して触発され得る。例えば、妨害は、触発に応答するように条件付けされた、動物／患者への記憶に対する触発の導入に応答して提供することができる。別の例では、患者は、妨害を能動的に触発し得る。例えば、患者は、ＰＴＳＤに関連する記憶を経験している時に妨害を触発してもよい。本開示の他の実施形態は、記憶獲得、回想、および／または記憶反応と情動反応との間の関連を助長することを対象とする。例えば、発現されたオプシンを使用して、内因性刺激に対する神経回路の感受性を増加させることができる（例えば、本明細書で考察される安定化された段階機能オプシン（ＳＳＦ０）を使用して）。助長は、記憶の獲得、形成または回想を強化するために提供することができる。これを使用して、回路の役割を確認するか、記憶障害に関連する障害を治療することができる。背側ＣＡ１海馬回路の（時間的）妨害は、前後関係上の恐怖記憶獲得を予防するのに有効であることが発見されている。本明細書と一致して、優勢な神経ネットワーク理論は、記憶固定のプロセスが、海馬と皮質との間の接続における短期的修飾により開始し、それにより海馬が、記憶自体を保管するよりもむしろ、完全な記憶に寄与する関連のある皮質の部位を活性化することが可能となることを示唆する。これらの皮質の痕跡が反復的に共活性化される間、それらの間の接続における段階的な長期持続性変化は、最終的にこれらの接続が、いかなる海馬の関与も伴わずに記憶を支持するのに十分なほど強力になるまで生じる。驚くべきことに、背側ＣＡ１海馬回路の妨害は、皮質の再構築が生じたと考えられる後であっても、恐怖記憶の回想を遮断するのに有効であることが発見されている。
【００８９】
複数の実験的実施形態の考察を含む次の考察は、これらおよび他の実施形態のいくつかの例を提示する。これらの例は、しかしながら、限定するようには意図されない。１つのかかる実施形態は、レンチウイルスベクターの産生に関係する。このレンチウイルスベクターは、興奮性グルタミン酸作動性ニューロンに対して選択的な、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＨａ（ＣａＭＫＩＩａ）プロモータの制御下で、強化された黄色蛍光タンパク質（ｅＮｐＨＲ３．１−ＥＹＦＰ）にフレーム内で融合される、光活性化可能なｅＮｐＨＲ３．１をコードする遺伝子を担持する。ｅＮｐＨＲ３．１は、内因性Ｎ末端シグナルペプチドが削除された、ｅＮｐＨＲ３．０の切頭バージョンであり、光電流およびそれがニューロン内で誘発する過分極の両方においてｅＮｐＨＲ３．０と同様である。ＣａＭＫＩＩａ：：ｅＮｐＨＲ３．１の定位送達は、その背側セグメント全体を網羅する、ＣＡ１特異的発現をもたらした。トランスフェクトされた領域内において、ＣａＭＫＩＩａ細胞の９４％がｅＮｐＨＲ３．１を発現し、プロモータは、完全な特異性を提供し、つまり、全てのｅＮｐＨＲ３．１−ＥＹＦＰ細胞もまた、ＣａＭＫＩＩａ陽性であった（図１Ｂ）。麻酔されたマウスにおけるオプトロード記録により、興奮性ＣＡ１ニューロンの連続緑色（５６１ｎｍ）光照射が、発火振幅に影響を及ぼすことなくことなく、時間的に正確かつ可逆的様態で、発火を強力に抑制した（７３％減少）ことが確認された。光遺伝学的抑制がまた、領域特異的様態で、ＦＣによって誘発される神経活動を遮断し得ることを実証するために、両側性連続緑色光を、背側ＣＡ１を標的として、二重カニューレを通じて挿入された２つの光ファイバーを介して訓練中に送達し、シナプス活性化マーカーｃＦｏｓについて染色した。ｅＮｐＨＲ３．１発現マウスは、ＦＣに関与する２つの他の脳領域、つまり扁桃体外側基底部（ＢＬＡ）および前帯状皮質（ＡＣＣ）ではなく、ＣＡ１において特異的に、低減されたｃＦｏｓ発現を示した。
【００９０】
光遺伝学的抑制は、両側性連続緑色光を、特化されたＦＣ室において訓練中の自由に移動しているマウスに投与することによって、認知機能を変調することが示された。訓練中、マウスを前後関係Ａに導入し、次いでトーン、続いて足部ショックを、連続両側性光送達下で２回提示した。恐怖記憶を次いで、翌日に光なしで査定した。訓練中の背側ＣＡ１の光遺伝学的抑制は、前後関係上の恐怖獲得を予防した。光遺伝学的抑制の効果は、マウスを同じ前後関係で光投与を用いずに再訓練し、翌日に再び試験することによって、可逆的であることが示された。ｅＮｐＨＲ３．１発現マウスは、訓練中に光が何ら投与されなかった時、無処置の前後関係上の記憶を示した。背側ＣＡ１の光遺伝学的抑制はまた、記憶回想を干渉することが示された。同じマウスを、今度は回想中に光送達を用いて再試験し、前日に存在した記憶が、照射下では回想のために利用不可能となったことが見出された。
【００９１】
恐怖獲得および恐怖発現機構は、マウスのトーンの記憶についての異なる前後関係における同じマウスの試験を通じて、影響を受けない可能性が高いことが示された。ｅＮｐＨｒ３．１発現マウスは、訓練中の光抑制後の無処置の聴覚合図による恐怖記憶獲得、ならびに試験中の照射を用いた無処置の合図による恐怖回想を示した。空間探索と前後関係上の恐怖獲得との間の相関を使用して、条件付け室の探索時間を、光刺激下での訓練中に測定した。有意な差異は、ｅＮｐＨＲ３．１発現マウスとそれらの対照との間で何ら見出されなかった。ＣＡ１光遺伝学的抑制は、マウスを、それらのオープンフィールド探索について、光投与を用いて試験したとき、抗不安効果を有さないと考えられる。経路の長さ、速度、またはフィールドの中央で費やされた時間（不安の徴候としての機能を果たす）のパーセントにおける有意な差異は、ｅＮｐＨＲ３．１発現マウスと対照マウスとの間で何ら見出されなかった。
【００９２】
ｅＮｐＨＲが異なる脳構造において発現される時に、光遺伝学的抑制が異なる行動的表現型をもたらし得るかどうかを試験するために、マウスに、ＣａＭＫＩＩａ：：ｅＮｐＨＲ３．０−ＥＹＦＰを担持するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ５）を、ＢＬＡ中に両側性で注射した。恐怖自体の獲得、すなわち嫌悪性刺激と任意の中性刺激との間の関連、ならびに扁桃体に依存する最近の恐怖および遠隔の恐怖の発現、およびＢＬＡの光遺伝学的活性化は、刺激から恐怖を誘発するのに十分であった。ＢＬＡの光遺伝学的抑制は、前後関係上のＦＣ獲得および聴覚合図によるＦＣ獲得の両方を干渉することが示された。
【００９３】
したがって、本開示の実施形態は、細胞型および領域特異的様式での第３世代のｅＮｐＨＲの導入、ならびに獲得および最近の記憶回想の両方の干渉のためのＣＡ１光遺伝学的抑制の使用を対象とする。
【００９４】
本開示の実施形態はまた、遠隔記憶回想における海馬の役割についての現在の理解を精密化するための、かかる態様の使用を対象とする。本開示の実験的実施形態と一致して、マウスの群を訓練し、次いで４週間後に試験した。回想中のＣＡＩ活動停止が、遠隔の恐怖記憶を（完全に）遮断すると思われることが示された。この回想の干渉はまた、マウスを翌日に照射を用いずに再試験した時、それらが対照と同様に恐怖を示すように思われたため、可逆的であることが示された。ｅＮｐＨｒ３．１発現マウスは、合図試験中の照射を用いた無処置の遠隔聴覚合図による恐怖記憶回想を示し、それらの恐怖発現機構が無処置に留まることを示唆している。驚くべきことに、これは、遠隔の恐怖記憶における海馬の関与を示唆する。
【００９５】
本開示の実施形態はまた、反復した回想および再固定化後に、長期的記憶をリアルタイムで予防することによって、遠隔の恐怖回想に可逆的に影響を及ぼす、ＣＡ１抑制の能力（光遺伝学的または別の方法で）を対象とする。マウスの別の群を訓練し、次いでそれら５週間後に試験して、記憶痕跡の持続性を（訓練および試験の両方において光を用いずに）検証することによって、実験結果を得た。同様の成果が、両群で見出された。翌日に、同じマウスを照射下で試験し、ｅＮｐＨＲ３．１群は、嫌悪性記憶を回想することができないように思われた。この効果は、翌日、光送達を伴わずに試験された時、ｅＮｐＨＲ３．１発現マウスが無処置の前後関係上の記憶を示したため、可逆的であることが示された。更に、マウスがすでに嫌悪性前後関係を回想し、恐怖を示した後、恐怖応答は、光が再び送達されるや否や、試験トライアルの最中からそれ以後、迅速に止んだ。
【００９６】
本開示の実施形態は、それにより、記憶がすでに想起された後であっても、遠隔の恐怖を引き起こす記憶をリアルタイムで可逆的に干渉することを対象とする。これは、例えば、不穏な記憶が、例えば、ＰＴＳＤ患者において、同じ脳構造で保管される他の記憶に永久的に影響を及ぼすことなく、それが現れる時に停止され得る場合の、治療的処置に特に有用であり得る。
【００９７】
遠隔記憶にアクセスする際の海馬の明らかな直接関与は、無処置の海馬が依然として記憶痕跡の既定の活性化因子であるという驚くべき知見を示唆する。実験的試験を行って、抑制の時間的性質および／または分解能の効果を決定した。遠隔記憶実験を、試験（前のように）の持続期間中のみの正確な照射、または光を試験の３０分前に、次いで試験の全体を通じて連続的に投与する、持続的な光曝露のいずれかを用いて反復した。正確な光遺伝学的抑制は、遠隔記憶想起を有意に抑制した一方で、持続的な抑制は、遠隔記憶想起に対して何ら有意な効果を有さなかった。持続群のマウスを、翌日に正確な光投与（試験中のみ）を用いて再試験したとき、それらは、抑制された恐怖回想を示した。同じマウスから調製された切片中のｅＮｐＨＲ３．１陽性細胞上の全細胞パッチ記録が、発火を抑制するｅＮｐＨＲの能力が３０分の期間全体を通じて同程度に留まり、また可逆的であったことを示したため、持続的な光投与の効果の欠如は、経時的なｅＮｐＨＲ３．１による減少した抑制、または持続的な光曝露に起因する細胞健康の低減に帰するとは考えられない。このデータは、その不活性化を補償するのに十分な時間を与えられる時、記憶痕跡は、他の脳構造によって依然として想起され得るため、無処置の海馬が、遠隔記憶痕跡の既定の活性化因子である一方で、記憶痕跡は、海馬において保管されないことを示唆する。
【００９８】
本開示の実施形態は、前帯状皮質（ＡＣＣ）の抑制を通じた遠隔記憶の抑制を対象とする。実験を、ＣａＭＫＩＩａ：：ｅＮｐＨＲ３．０−ＥＹＦＰウイルスによりＡＣＣを標的とすることによって行い、ＡＣＣ光遺伝学的抑制を訓練した１日後および１ヶ月後の両方の光遺伝学的抑制の試験効果は、最近の記憶に対して何ら明らかな効果を有さなかったが、遠隔記憶を有意に損なった。まとめて、これらの知見は、最も効率的な方法で皮質の再構築に従って、記憶痕跡を活性化することでさえも、依然として海馬を伴うことを示唆する。
【００９９】
海馬は、皮質に連続入力を提供すると考えられる。したがって、実験を行って、入力が回想タスクと無関係であっても、妨害された遠隔回想が、海馬から皮質へのこの入力の急落の副産物であるのかどうかを決定した。別の主要な皮質の入力源である、嗅球（ＯＢ）を、ＣａＭＫＩＩａ：：ｅＮｐＨＲ３．０−ＥＹＦＰウイルスにより標的とし、光遺伝学的抑制の効果を、最近の恐怖回想中および遠隔の恐怖回想中の両方で試験した。ＯＢ光遺伝学的抑制は、いずれの時点でも記憶回想に対して何ら有意な効果を有さず、皮質中へのさもなければ無関係な興奮性入力の急落が、回想を干渉するのに十分でないことを示唆している。遠隔記憶が想起される時、それらは再固定化のために利用可能となり、それによりそれらは妨害に対して感受性となるが、これはまた痕跡を強化する場合がある。本開示の態様は、再固定化前および後、またはそれがすでに想起された後にリアルタイムで、遠隔の恐怖を引き起こす記憶をリアルタイムで可逆的に活動停止することによって、繰り返される不穏な記憶が、それが現れる時に停止され得る、ＰＴＳＤ患者のための療法に関する。
【０１００】
本開示の別の実施形態と一致して、乱用薬物に関係付けられる記憶を抑制して、薬物追求行動を低減することができる。他の実施形態は、記憶プロセスにおける特異的神経集団の役割を研究し、それらの根底にある神経回路のより精密な時間的、遺伝的、および空間的解析を可能にするための、異なる脳領域の光遺伝学的変調によって、認知に即座に影響を及ぼす能力を対象とする。
【０１０１】
本発明の具体的な態様は、神経科学のために適合させられた微生物オプシン遺伝子を使用した記憶切り換えに関し、それは無処置のほ乳類の脳内の具体的な細胞型におけるミリ秒時間スケールの膜電位変化への光パルス列への変換を可能にする（例えば、チャネルロドプシン（ＣｈＲ２）、ボルボックスチャネルロドプシン（ＶＣｈＲ１）、およびハロロドプシン（ＮｐＨＲ））。ＣｈＲ２は、単細胞緑色藻類コナミドリムシに由来するロドプシンである。本明細書で使用される「ロドプシン」という用語は、少なくとも２つのビルディングブロック、オプシンタンパク質、および通常網膜性（レチナールデヒド）である共有結合補因子を含む、タンパク質である。ロドプシンＣｈＲ２は、元々はクラミドモナスゲノム中のクラミオプシン（Ｃｈｌａｍｙｏｐｓｉｎ）−４（Ｃｏｐ４）と名付けられた、チャネルオプシン−２（Ｃｈｏｐ２）というオプシンに由来する。１つの脱分極チャネルロドプシンであるＣｈＲ２の時間的特性としては、活性化および不活性化が速いという動態が挙げられ、それはタイミングが正確な活動電位列の発生をもたらす。
【０１０２】
長い時間スケールの活性化を追求する用途については、チャネルロドプシンの通常は速いオフの動態を遅くすることが可能であることが見出されている。例えば、チャネルロドプシンのある種の実装形態は、事実上、脱分極が所望される時間全体にわたって１ｍＷ／ｍｍ２の光を適用し、それは所望されるものよりも少ない可能性がある。本明細書における考察の多くは、ＣｈＲ２を対象とする。別途定めのない限り、本３０発明は、いくつかの同様の変異形を含む。例としては、Ｃｈｏｐ２、ＣｈＲ２−３１０、Ｃｈｏｐ２−３１０、およびボルボックスチャネルロドプシンが挙げられるが、それらに限定されない（ＶＣｈＲ１）。ＶＣｈＲ１についての更なる詳細については、“Ｒｅｄ−ｓｈｉｆｔｅｄ  ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｆａｓｔ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ，”Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｊｕｎｅ  ２００８，１１（６）：６３１−３．Ｅｐｕｂ  ２００８  Ａｐｒ  ２３を参照することができ、それは、参照により本明細書に完全に組み込まれる。他の実装形態では、同様の修飾を、他のオプシン分子に対して行うことができる。例えば、修飾／突然変異を、ＣｈＲ２またはＶＣｈＲ１変異形に対して行うことができる。更に修飾された変異形を、光で活性化されたイオンポンプと組み合わせて使用することができる。
【０１０３】
本発明の実施形態は、自然発生配列の比較的小規模なアミノ酸変異形を含む。一例では、変異形は、自然発生配列のタンパク質配列に対して約７５％よりも大きく相同である。他の変異形においては、相同性は、約８０％よりも大きい。なおも他の変異形は、約８５％よりも大きい、９０％よりも大きい、または更には約９３％〜約９５％もしくは約９８％と同程度に高い相同性を有する。この文脈における相同性  は、配列類似性または同一性を意味し、このうち同一性が好ましい。この相同性は、配列分析の分野で既知の標準的な技法を使用して決定することができる。本発明の実施形態の組成物は、本明細書で提供されるタンパク質および核酸配列を含み、それは約５０％よりも大きく相同、提供される配列に対して約５５％よりも大きく相同、提供される配列に対して約６０％よりも大きく相同、提供される配列に対して約６５％よりも大きく相同、提供される配列に対して約７０％よりも大きく相同、提供される配列に対して約７５％よりも大きく相同、提供される配列に対して約８０％よりも大きく相同、提供される配列に対して約８５％よりも大きく相同、提供される配列に対して約９０％よりも大きく相同、または提供される配列に対して約９５％よりも大きく相同である変異形を含む。
【０１０４】
本明細書で使用される時、標的細胞の刺激とは、一般に、細胞の特性の変更を説明するために使用される。例えば、標的細胞の刺激は、標的細胞の脱分極または分極につながる可能性がある、細胞膜の特性における変化をもたらす場合がある。特定の例では、標的細胞は、ニューロンであり、刺激は、ニューロンによるインパルス（活動電位）の発生を促進または抑制することによって、インパルスの伝達に影響を及ぼす。
【０１０５】
光応答性オプシンに関する更なる詳細については、“Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｔｈｅｒｅｔｏ”と題される、Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈらに対するＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／０５６９７０号を参照することができ、それは、参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【０１０６】
本開示の実施形態は、標的とされる集団の興奮性における、双安定の変化の実装形態を対象とする。これには、二重変異ＣｈＲ２−Ｃ１２８Ｓ／Ｄ１５６Ａが含まれるが、必ずしもそれに限定されない。この二重変異ＣｈＲ２−Ｃ１２８Ｓ／Ｄ１５６Ａは、培養海馬ニューロンにおいて忍容性が良好であることが見出されており、青色光の単一の短いパルスによる迅速な段階様の活性化、および緑色または黄色光による脱活性化という必須のＳＦＯ特性を保存した。特に、４４５ｎｍでのＣｈＲ２−Ｃ１２８Ｓ／Ｄ１５６Ａピークの活性化スペクトル。第２の脱活性化ピークは、３９０〜４００ｎｍで見出され、その脱活性化は５９０ｎｍ脱活性化ピークと比較してより速いが完成度が低かった。ＣｈＲ２−Ｃ１２８Ｓ／Ｄ１５６Ａを発現する細胞中のピーク光電流は、強固であり、ＣｈＲ２−Ｄ１５６Ａのそれらに匹敵することが見出された（それぞれ、標準誤差２３１．０８±３１．１９、ｎ＝９細胞および標準誤差３２０．９６±７８．２６、ｎ＝７細胞）。
【０１０７】
個々にトランスフェクトされ、パッチクランプされたニューロンを次に、４７０ｎｍ光の１００ｍｓパルスにより活性化し、電流減衰が細胞ランダウンに帰することがないよう、非常に長い記録にわたって確実にするために、各細胞を持続的な５９０ｎｍ光パルスにより特有の間隔で脱活性化して、各時点における残りのＳＦＯ電流の大きさを決定した。驚くべきことに、ＣｈＲ２−Ｃ１２８Ｓ／Ｄ１５６Ａを発現するニューロンは、いずれかの単一の変異体のみを発現する細胞からのものよりも安定であった持続性の光電流をもたらした。単一指数的減衰曲線を、Ｉ脱活性化／Ｉ活性化の比率に経時的に当てはめることにより、ＣｈＲ２−Ｃ１２８Ｓ／Ｄ１５６Ａについて２９．３分間の自発的な減衰時定数が明らかとなり、Ｃ１２８およびＤ１５６突然変異がＣｈＲ２の開口状態の減衰を遅延されるように相乗的に作用することを示している。
【０１０８】
複雑なほ乳類行動への予期される適用のために要求される改善と一致して、二重変異ＳＦＯ電流の有意な部分は、単一の光活性化パルス後、最大２０分間依然として存在した。これらの驚くほどに遅い減衰動態に基づいて、二重変異遺伝子は、ＳＦＯ（安定化された段階機能オプシン）遺伝子と称される。ＳＳＦＯはまた、活性タンパク質に対する省略表現としても使用される。双方の残基は、ＣｈＲ２チャネル閉鎖（ゲート開閉）に関与する可能性が高く、双方の突然変異は、チャネルの開口状態の構成を安定化する可能性が高い。理論に制限されることなく、本開示の態様は、ＳＳＦＯが光サイクル進行において完全に遮断され得、したがって光サイクル操作により可能な最大の安定性を代表し得るという発見に関する。例えば、ＣｈＲ２−Ｃ１２８ＸおよびＣｈＲ２−Ｄ１５６Ａとは対照的に、ＳＳＦＯ光サイクルは、この変異体において到達されなかった後期の光サイクル段階で光サイクルを分離する可能性が高い追加的な不活性な脱プロトン化副産物にアクセスするようには思われず、それが今度はＳＳＦＯの信頼性を、親の単一の突然変異よりも生体内での反復使用のために更に高める。
【０１０９】
本開示の実施形態は、ＳＳＦＯの光に対する感度を対象とする。例えば、遅い減衰定数を有するチャネルロドプシンは、事実上光子積分器として作用する。これは、光遺伝学的回路変調に対する感度がより高く侵襲性のより低いアプローチに特に有用であり得、それは依然として、光パルス長の変調を介した標的神経集団への容易に滴定可能な作用を有する。並はずれて低い光強度（８ｐＷ／ｍｍ２と同程度に低い）であっても、数百ピコアンプの全細胞光電流は、ＳＳＦＯを発現するニューロンから得ることが可能であることが発見されており、それは照射の時間全体の間に４７０ｎｍ光に応答して単一指数的動態で増加した。他の態様は、両対数スケール上の活性化光のべき数と線形相関する、活性化時定数の使用に関し、それはべき法則関係の指標であり、ＳＳＦＯが、その経時的な総光子曝露を光電流の唯一の行列式とする、純粋な積分器であることを示唆している。例えば、と考えられている。光電流が所与の準最大の活性化（Ｔまでの時間（ｔｉｍｅ  ｔｏ  Ｔ））に到達するのに要求される膜領域当たりの光子の数は、活性化光のべき数に関わらず一定である。
【０１１０】
本開示の例示的な実施形態は、ＣｈＲ２配列を全く含有せず、個々にはよく発現しない２つのオプシン遺伝子に由来し、かつ本明細書でＣ１Ｖ１と称される、ハイブリッドＣｈＲ１／ＶＣｈＲ１キメラの使用に関する。本開示の実施形態はまた、Ｋｉｒ２．１チャネルに由来する膜輸送シグナルの追加を通じたＶＣｈＲ１の膜標的の改善に関する。ＶＣｈＲ１−ＥＹＦＰを発現する培養ニューロンからの共焦点画像により、ＣｈＲ２と比較して高い割合の細胞内タンパク質が明らかとなり、したがって、ＶＣｈＲ１の膜標的を改善するために、我々は、Ｋｉｒ２．１チャネルに由来する膜輸送シグナルを追加した。このＶＣｈＲ１−ｉｓ−ＥＹＦＰの膜標的は、ＶＣｈＲ１−ＥＹＦＰと比較して若干強化されたが、ＶＣｈＲ１ｔｓ−ＥＹＦＰを発現する培養海馬ニューロンから記録された平均光電流は、ＶＣｈＲＪ−ＥＹＦＰのそれよりも若干大きいにすぎなかった。したがって、本開示の実施形態は、ヘリックスを他のＣｈＲからの対応するヘリックスと交換することによって修飾されるＶＣｈＲ１に関する。例えば、ヘリックス１および２がＣｈＲ１からの相同セグメントと置換された２つのキメラにおいて、強固な改善が発見されている。スプライス部位がヘリックス２および３（ＣｈＲ１残基Ａ１ａ１４５における）の間の細胞内ループにあるか、またはヘリックス３（ＣｈＲ１残基Ｔｒｐ１６３における）内にあるかに関わらず、結果として得られたキメラは、両方とも強固に発現され、同様に強化された光電流およびスペクトル特性を示したことが発見された。ＣｈＲ１は、ごくわずかに発現されるにすぎず、ほとんどのほ乳類の宿主細胞の膜に不十分に統合されるため、この結果は予想外であった。結果として得られるハイブリッドＣｈＲ１／ＶＣｈＲ１キメラは、本明細書でＣ１Ｖ１と称される。
【０１１１】
本開示の態様は、培養海馬ニューロンにおけるＣ１Ｖ１の発現に関する。実験的試験は、いくつかの驚くべきかつ有用な結果を示しており、それはこれ以降でより詳細に考察される。Ｃ１Ｖ１−ＥＹＦＰは、ＶＣｈＲ１−ＥＹＦＰと比較して驚くほどに改善された平均蛍光を示す。Ｃ１Ｖ１を発現するニューロンにおける全細胞光電流は、ＶＣｈＲ１−ＥＹＦＰおよびＶＣｈＲ１−ｔｓ−ＥＹＦＰのそれらよりもはるかに大きく、イオン選択性は、ＣｈＲ２およびＶＣｈＲ１のそれと同様であった。Ｃ１Ｖ１とＹＦＰとの間のＫｉｒ２．１輸送シグナルの追加は、光電流を追加的に４１％更に強化した（Ｃ１Ｖ１−ｔｓＥＹＦＰ平均光電流は極度に大きく、野生型（ＷＴ）ＶＣｈＲ１よりも１０倍近く大きい）。平均蛍光レベルは、測定された光電流にほぼ合致し（それぞれ、ＶＣｈＲ１−ＥＹＦＰ、ＶＣｈＲ１−ｔｓ−ＥＹＦＰ、Ｃ１Ｖ１−ＥＹＦＰ、およびＣ１Ｖ１−ｔｓ−ＥＹＦＰについて、平均蛍光９．３±１、１９．６±３．４、１９．８±２．８、および３６．３±３．８）、光電流サイズにおける増加が、ほ乳類ニューロンにおけるこれらのチャネルの改善された発現から主にもたらされたことを示唆している。総計の神経細胞体の蛍光（積分ピクセル密度として測定された）は、異なる構築物（ＶＣｈＲ１、ＶＣｈＲ１−ｔｓ−ＥＹＦＰ、Ｃ１Ｖ１、Ｃ１Ｖ１−ｔｓ−ＥＹＦＰ）にわたる、個々に記録された／撮像された細胞中の光電流サイズと線形相関した。これは（理論に制限されることなく）、Ｃ１Ｖ１の増加した光電流が、ニューロンにおける機能的発現変化からもたらされることを示唆する。
【０１１２】
本開示の種々の実施形態は、速い減衰定数を有するオプシンに関する。この特性は、例えば、内因性コンダクタンスを最低限に干渉する、光パルス当たりの単一の発火を触発する、および／または光パルス列中のプラトー電位を最小化するために、発火に対する正確な制御を提供するのに特に有用であり得る。実験結果は、Ｃ１Ｖ１−ｔｓ−ＥＹＦＰにおいて記録された光誘発型光電流が、ＶＣｈＲ１の時定数と同様の時定数で減衰したことを示唆する。本開示の態様は、したがって、光サイクル動態の改善、低減された不活性化、および／または可能性のある更なる赤方偏移吸収のための発色団領域における修飾を対象とする。
【０１１３】
一実施形態は、対応するＣｈＥＴＡ突然変異Ｅ１６２Ｔを対象とし、その実験による示唆は、加速された光サイクル（例えば、ほぼ３倍）を提供する（Ｇｕｎａｙｄｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｕｌｔｒａｆａｓｔ  ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２０１０を参照することができ、それは参照により本明細書に完全に組み込まれる）。驚くべきことに、この突然変異は、作用スペクトル浅色を５３０ｎｍに偏移することが示された一方で、ＣｈＲ２または他の微生物ロドプシンにおける類似した突然変異は、赤方偏移を引き起こした。
【０１１４】
別の実施形態は、グルタミン酸塩１２２のスレオニンへの突然変異（Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ）を対象とする。実験的試験は、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔが、ＣｈＲ２の４６％不活性化と比較して２６％のみ不活性化されることを示し、加えて、スペクトルは、５４６ｎｍに更に赤方偏移された。
【０１１５】
本開示の別の実施形態は、Ｅ１２２ＴおよびＥ１６２Ｔ突然変異の両方を含むＣ１Ｖ１の二重変異体を対象とする。実験的試験は、電流の不活性化が、Ｅ１２２Ｔ変異体よりも更に低く、光サイクルが、Ｅ１６２Ｔと比較してより速いことを示している。これは、個体の突然変異の多数の有用な特性が二重変異体において一緒に保存されることを示唆する。
【０１１６】
本開示の実施形態は、ニューロンにおける種々の光応答性オプシンの発現を含む。ニューロンにおけるＣ１Ｖ１オプシン遺伝子の実験的試験を、Ｃ１Ｖ１−ｔｓ−ＥＹＦＰをコードするレンチウイルスベクターおよび本明細書で考察される種々の点突然変異の組み合わせを生成することによって行った。オプシンを次いで、培養海馬ニューロンにおいて発現させ、同一の刺激条件下（２ｍｓパルス、５４２ｎｍ光、５．５ｍＷ／ｍｍ２）で全細胞光電流を記録した。Ｃ１Ｖ１、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２Ｔ、およびＣ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔを発現する細胞中の光電流は、全て強固であり、ＣｈＲ２−Ｈ１３４Ｒの光電流よりも大きい傾向があった。実験はまた、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔを発現する細胞からと、ＣｈＲ２Ｈ１３４Ｒを発現する細胞からとの、積分神経細胞体のＹＦＰ蛍光および光電流の比較も含んだ。驚くべきことに、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔ細胞は、同等の蛍光レベルで、ＣｈＲ２Ｈ１３４Ｒ細胞よりも強力な光電流を示した。これは、Ｃ１Ｖ１が、ＣｈＲ２−Ｈ１３４Ｒと比較して、より高い単位コンダクタンスを保有する可能性があることを示唆する。試験結果は、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔの動態が、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ  Ｅ１６２Ｔの動態よりも遅いこと、およびＣ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔを発現する細胞が、二重変異体を発現する細胞よりも、赤色光（６３０ｎｍ）に対してより強力に応答したことを示唆する。これは、赤色光に応答した光遺伝学的発火を発生するのに特に有用であり得る。
【０１１７】
本開示の種々の実施形態と一致して、同じ超小型回路内に存在する抑制性および／または興奮性ニューロンは、種々のオプシンの導入により標的とされる。実験的試験を、培養海馬ニューロンにおけるＣａＭＫＩＩａプロモータの下で別個に発現されたＣ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２ＴおよびＣｈＲ２−Ｈ１３４Ｒによって行った。Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔを発現する細胞は、紫色光パルス（４０５ｎｍ）ではなく、２ｍｓ緑色光パルス（５６０ｎｍ）に応答して発火した。対照的に、ＣｈＲ２−Ｈ１３４Ｒを発現する細胞は、２ミリ秒５６１ｎｍ光パルスではなく、２ミリ秒４０５ｎｍ光パルスに応答して発火した。
【０１１８】
本開示の種々の実施形態は、生体脳切片内の２つの神経集団の独立した活性化に関する。実験的試験を、ｍＰＦＣｏｆＰＶ：：ＣｒｅマウスにおけるＣａＭＫＩＩａ−Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔｔｓ−ｅＹＦＰおよびＥＦｌａ−ＤＩＯ−ＣｈＲ２−Ｈ１３４Ｒ−ＥＹＦＰによって行った。非発現ＰＹＲ細胞中で、４０５ｎｍ光パルスは、ＰＶ細胞の直接的活性化に起因して、強固で速い抑制性シナプス後電流（ＩＰＳＣ）を触発した一方で、５６１ｎｍ光パルスは、局所抑制性ニューロンのＣ１Ｖ１発現錐体細胞駆動から生じる予想された長潜時多シナプス性ＩＰＳＣのみを触発した。
【０１１９】
上述されるまたは図に示される種々の実施形態は、一緒におよび／または他の様態で実装されてもよい。図面／図に示される項目のうちの１つ以上はまた、特定の用途に従って有用であるように、より分離されたもしくは統合された様態で実装するか、またはある種の場合において除去するおよび／もしくは作動不可能であると見なすことができる。本明細書の説明に照らして、当業者であれば、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、それらに対する多くの変更が行われてもよいことを認識するであろう。
【実施例】
【０１２０】
神経伝達物質アセチルコリンを用いるニューロンは、広範囲にわたるが、比較的稀有であり、その細胞体および突起は、ほ乳類脳の大部分を通じてわずかに分布している。種々のアセチルコリン受容体の薬理学的変調は、多数の脳プロセスに影響を及ぼすことが知られるが、受容体型および標的細胞集団に対する薬物特異性の限界に起因してしばしば副作用を伴い、その結果、回路機能および行動におけるコリン作動性ニューロンの最終的な因果的役割は、不明確であった。模範的な場合において、側坐核（ＮＡｃ）の巨大コリン作動性介在ニューロンは、構造的に特有で、低密度に分配されたニューロンの群であり、その機能は、生体組織中でまたは行動している動物においてこれらの細胞を正確に活性化または不活性化する実験能力不足に起因して、定義し難いままである。本明細書において、我々は、自由に移動しているほ乳類の行動、生体内電気生理学、および切片生理学の設定において、複数の光学制御技術を統合して、これらのニューロンの機能を、高い細胞および時間精度での直接的興奮または抑制によって因果的に探索した。著しいことに、局所神経集団のごく僅かな（＜１％）分率に相当するにもかかわらず、我々は、ＮＡｃにおけるコリン作動性ニューロンが優性な制御役割を有し、周囲の回路における活性の強力な双方向の変調を行使していることを見出した。更に、我々は、これらのニューロンが、コカインによって直接的に活性化されたこと、および自由に行動している哺乳動物において、コカイン曝露中にこの薬物誘発型活性をサイレンシングすることがコカイン報酬を妨害したことを見出した。重要なことに、コリン作動性介在ニューロンの操作は、それ自体嫌悪性でなく、これらの固有の細胞が、ＮＡｃ回路に対するそれらの強力な影響を介して、乱用薬物と関連のある快楽的行動を具体的に実装することにおいて役割を果たすことを示唆している。
【０１２１】
アセチルコリンは、莫大に多様な受容体および標的細胞（１〜８）に作用する、重要で幅広く研究される神経伝達物質である。先駆的な薬理学的および遺伝的研究は、多数の生物学的プロセスに及ぼす、ムスカリン性およびニコチン性アセチルコリン受容体の個々の亜型の複雑でしばしば相反する影響を解明してきたが（９〜１５）、学習、記憶、注意、および報酬におけるこれらのニューロンの仮設的な重要性にも関わらず（１６〜２２）、いずれの研究も、ＣＮＳ組織内のコリン作動性ニューロン自体の因果的役割という根本的に特有の課題を未だに解決していない。以前の調査は、特異性および時間的分解能による難題に起因する可能性が高い、矛盾した知見をもたらしているため、かかる課題に取り組むことは、生体ほ乳類組織内のコリン作動性ニューロンの選択的および時間的に正確な制御（活性化および抑制）に対する新規のパラダイムを要求するであろう。例えば、洗練された生体内薬理学的アプローチは、ＮＡｃ（コカイン等の薬物に対する自然な報酬関連行動および反応に関与する構造（２７〜３３））におけるコリン作動性伝達が、報酬学習のために要求されることを報告しているが（２３〜２６）、ｆＮＡｃ内のコリン作動性介在ニューロンの分子アブレーションの新規の研究は、代わりに、強化された報酬学習を報告している（３４）。ＮＡｃ内のこれらのコリン作動性介在ニューロンは、それらが局所神経集団の１％未満を構成するが（３５）、それでもなおＮＡｃ全体を通じて突出し、その唯一既知のコリン作動性入力を提供するため（３６、３７）、特に興味深い。当該コリン作動性受容体は、局在的に発現され、ニコチン性およびムスカリン性薬理学的アゴニストは、中型有棘ニューロン（ＭＳＮ、局所神経集団の９５％超に相当し、ＮＡｃの出力を構成する）に対する複雑な影響を行使することができるが（３８〜４１）、ＮＡｃ生理学または行動のいずれの側面に対する、極めて稀有なコリン作動性介在ニューロンの正味の影響（あるとすれば）は、他の脳領域と同様に、未知である。
【０１２２】
実施例１：側坐核のコリン作動性介在ニューロンにおける光応答性オプシンタンパク質の発現  
我々は、高い時間的分解能および高い細胞型特異性の両方を用いて、これらの細胞中の活動電位発火を選択的に駆動または遮断することによって、この課題を解決するために、光遺伝学的アプローチ（４２〜４４）に着手した。微生物オプシン遺伝子をコリン作動性介在ニューロンにおいて特異的に発現させるために、我々は、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）プロモータ下でＣｒｅリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウス株を用いた（４５）。我々は、ＮＡｃ中に（図１Ａ）、強化黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）（４６、４７）に対するコード配列を伴ってフレーム内で融合された、オプシン遺伝子を担持するＣｒｅ誘発性アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを定位的に注射した。オプシン遺伝子は、青色光ゲートカチオンチャネルチャネルロドプシン−２（ＣｈＲ２）（４８、４９）または黄色光ゲート第３世代クロライドポンプハロロドプシン（ｅＮｐＨＲ３．０）（５０）のいずれかをコードした。
【０１２３】
材料および方法
対象
ＢＡＣトランスジェニックコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）：：Ｃｒｅマウスを、ＧＥＮＳ  ＡＴ（原液名：Ｔｇ（Ｃｈａｔ−ｃｒｅ）２４Ｇｓａｔ／Ｍｍｃｄ）（Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２７，９８１７−９８２３（２００７））から得、Ｃｈａｒｌｅｓ  ＲｉｖｅｒからのＣ５７ＢＬ６マウスと交配させた。実験的マウスは、Ｃｒｅ（＋／−）に対する異型接合、あるいは制御同腹子（−／−）のずれかであった。マウスを、逆行の１２時間明／暗サイクルで維持されたコロニーで群飼し、餌および水を随意に与えた。実験プロトコルは、実験動物の管理と使用に関する、国立衛生研究所の指針のガイダンスを満たすために、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＩＡＣＵＣによって認可された。
【０１２４】
ウイルス産生
前述のように（Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４、１０８０−１０８４（２００９）、Ｓｏｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５９、６９８−７０２（２００９））、Ｃｒｅ誘発性組み換えＡＡＶベクターは、オプシン（ＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）またはｅＮｐＨＲ３．０のいずれか）が逆配向でｌｏｘ部位の間に挿入された、２対の不適合なｌｏｘ部位（ｌｏｘＰおよびｌｏｘ２７２２）を担持するＤＮＡカセットに基づいた。この二重フロックス（ｄｏｕｂｌｅ−ｆｌｏｘｅｄ）逆オプシンカセットを、発現を強化するためのｐＥＦ−１αプロモータおよびＷｏｏｄｃｈｕｃｋ肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）を担持すするＡＡＶ２−ＭＣＳベクターのバージョン中にクローン化した。Ｃｒｅ誘発性ＣｈＲ２  ＡＡＶ構築物、ならびにｅＮｐＨＲ３．０  導入遺伝子の完全なマップは、ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｇｒｏｕｐ／ｄｌａｂ／ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｉｎｆｏ．ｈｔｍｌにて入手可能である。組み換えＡＡＶベクターを、ＡＡＶ５コートタンパク質で血清型別し、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａにてウイルスベクターコアによってパッケージングした。最終ウイルス濃度は、ＣｈＲ２ウイルスについて３×１０１２粒子／ｍＬ、およびＮｐＨＲ３．０ウイルスについて１．５×１０１２粒子／ｍＬであった。
【０１２５】
定位ウイルス注射、カニューレ／パッチコード植え込み、および光送達
マウスを、ケタミン／キシラジンで麻酔し（６０μＬ／マウス、８０ｍｇ／ｍＬケタミンおよび１２ｍｇ／ｍＬキシラジンの混合物の使用）、次いで定位ヘッド器具中に配置した。手術を、生理学実験のために４〜６週齢マウスに、および行動実験のために８〜１２週齢マウスに行った。眼が乾燥することを予防するように、眼軟膏を塗布した。頭皮の正中切開、続いて開頭術を行い、次いで、ウイルスを、１０μＬシリンジおよび３４ゲージ金属針を用いて注射した。注射量および流速（０．１５μＬ／分で１μＬ）を注入ポンプによって制御した。各ＮＡｃは、２回の注射（注射１：ＡＰ１．１５ｍｍ、ＭＬ０．８ｍｍ、ＤＶ−４．８ｍｍ、注射２：ＡＰ１．１５ｍｍ、ＭＬ０．８ｍｍ、ＤＶ−４．２ｍｍ）を受容した。ウイルス注射および線維位置を、事実上殻全体が刺激されるように選定した。マウスの殻の小さいサイズを考慮すると、ウイルス拡散および光を内殻に完全に限定することは不可能であり、コアの内側部を含めた（前交連に対して内側）。注射後、針を更に５分間定置に残し、次いで非常にゆっくりと回収した。行動実験のために、マウスに両側性で注射し、次いで１．５ｍｍの中心間距離を有する両側カニューレを、注射部位の上部に配置した（ＡＰ  １．１５ｍｍ、ＤＶ  ３．８ｍｍ）。行動中の神経活動を操作するために、ファイバーがカニューレの末端を超えて２００〜３００μｍ突出するようにカニューレを通じて挿入された２つの３００μｍ直径光ファイバー（０．３７Ｎ．Ａ．）を通じて、光を両側性で送達した。
【０１２６】
免疫組織化学
ＣｈＡＴニューロンにけるオプシン発現の特異性を決定するために、最初にＰＢＳを用いて、次いでリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中に溶解させた４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて、マウスを、ボタナシア（ｂｅｕｔｈａｎａｓｉａ）で麻酔し、経心的に灌流させた。脳を除去し、４％ＰＦＡ中に一晩４℃で後固定し、次いでＰＢＳ中の３０％ショ糖中で平衡化した。４０μｍ厚の冠状片を、凍結ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ）上で調製し、凍結保護物質中（ＰＢＳ中２５％グリセロールおよび３０％エチレングリコール）４℃で保管した。自由に浮動する薄片をＰＢＳ中で洗浄し、次いで３０分間、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｔｘ１００）および３％正常ロバ血清（ＮＤＳ）中でインキュベートした。切片を、４℃で一晩、３％ＮＤＳ（ヤギ抗ＣｈＡＴ  １：２００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中の一次抗体を用いてインキュベートした。薄片を次いでＰＢＳで洗浄し、２時間室温で二次抗体（Ｃｙ３またはＣｙ５に共役させたロバ抗ヤギ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてインキュベートした。切片を次いで洗浄し、ＤＡＰＩ（１：５０，０００）を用いて２０分間インキュベートし、再び洗浄し、ＰＶＡ−ＤＡＢＣＯでスライド上に載置した。共焦点蛍光画像を、レーザー走査型顕微鏡上で、５Ｘもしくは１０Ｘ空気対物、または４０Ｘ油浸対物を使用して得た。
【０１２７】
結果
我々は、この生体内標的化戦略の特異性および機能性を検証し、ｅＹＦＰ発現が、ＣｈＡＴを発現したニューロンに対して高度に特異的であることを見出し、更に、ＣｈＡＴを発現したニューロンの大多数はまた、ｅＹＦＰも発現した（図１Ｂ，Ｃ）。任意の所与の細胞がＣｈＡＴ介在ニューロンであるという前試験確率は非常に低く、したがって稀有な標的化の漏れでさえも標的化特異性を劇的に減少させたであろうため、観察された特異性は、そのようなまばらな神経集団について特に印象的であった。双方のオプシンは、ＣｈＡＴニューロンの表面膜上で発現され（図１Ｄ）、標的ニューロンは、背側線条体におけるコリン作動性介在ニューロンの以前に確立された応答に対応する様態で、電流注射に対して応答した（図１Ｅ）（５１）。背側線条体生理学と更に一致するように、静止電位および入力抵抗の両方は、ＣｈＡＴニューロン（ＹＦＰ＋ニューロン）について、ＭＳＮ（ＹＦＰ−ニューロンとして識別される、表Ｓ１、ＶＭについてｐ＜１０−４およびＲｉｎｐｕｔについてｐ＝０．００４、両側ｔ検定）よりも高かった。最後に、ｅＮｐＨＲ３．０は、莫大な過分極を駆動し（図１Ｆ；平均±標準誤差：−８３．８±１１．９ｍＶ、ｎ＝４）、ＣｈＲ２は、最大２０〜３０Ｈｚの発火を確実に駆動したため（図１Ｇ、Ｈ）、双方のオプシンは、ＣｈＡＴ細胞において強力に機能的であった。
表３：ＣｈＲ２−ｅＹＦＰを発現するＣｈＡＴニューロンの、およびフルオロフォアを発現しなかったＭＳＮの、脳切片中の膜電圧（ＶＭ）および入力抵抗（ＲＩＮＰＵＴ）。ＶＭおよびＲＩＮＰＵＴの両方は、ＣｈＡＴニューロンについて、ＭＳＮよりも高かった。（ＶＭについてｐ＝０．００００３、ＲＩＮＰＵＴについてｐ＝０．００２、両側ｔ検定、平均±標準誤差）
【表３】
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【０１２８】
実施例２：コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）介在ニューロン脱分極の効果
ＣｈＡＴ介在ニューロンは、生体内において持続的に活性であると考えられるが（３〜１０Ｈｚ（５２、５３））、まばらなＣｈＡＴ細胞中のこの種の遅い活性が、局所回路活性または行動に影響を及ぼすことに関与し得る様子（または更に関与し得るかどうか）は、謎のままである。我々は、光遺伝学的制御を生かして、薄片電気生理学、生体内電気生理学、および自由移動行動の組み合わせを用いて、この課題に取り組んだ。
【０１２９】
材料および方法
急性脳切片生理学
冠状脳切片を、ウイルスを事前（切片作製の２週間よりも前）に注射した成体マウスから、標準的な技法を使用して、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物実験委員会によって認可されたプロトコルに厳格に従って調製した。冠状切片２５０μｍ厚を、１３５ｍＭ  ＮＭＤＧ、１ｍＭ  ＫＣｌ、１．２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２０ｍＭコリンビカルボナート、１０ｍＭブドウ糖、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する、氷冷Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＮＭＤＧ）ベースの切断溶液中、サファイア刃を使用するビブラトームで切断した。切片を、それ以降、１１９ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２６．２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３および１１ｍＭブドウ糖を含有する、人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）中で維持した。切片を、ＡＣＳＦ中で、３０分間３７℃で、およびそれ以降、室温で維持した。ＡＣＳＦに、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２で一定して気泡を注入し、全ての実験のために３４℃まで加熱した。ニューロンを、ｅＹＦＰを可視化するためにＤＩＣ光学およびフィルターセットの両方を装着した正立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭ−ＬＦＳＡ）上で、４０倍水浸漬対物および電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラを使用して可視化した。ニューロンから全細胞記録を、１２０ｍＭグルコン酸カリウム、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  Ｎａ−ＡＴＰ、および０．２ｍＭ  Ｎａ−ＧＴＰ（ｐＨ７．３、２９０ｍＯｓｍ／Ｌ）を含有する電極溶液を使用して行った。ＩＰＳＣを記録する実験においては、ＫＣｌを使用してグルコン酸カリウムを置き換えた。ピペット抵抗は３〜５ΜΩであり、記録を、直列抵抗補償を用いずに行った。膜電位は、液界電位からもたらされる誤差に対して補正した。電圧クランプ実験についての保持電位（ＶＭ）は、−７０ｍＶであった。次の薬剤を示されるように添加した：５μΜ  ＳＲ−９５５３１、５μΜ  ２，３−ジヒドロキシ−６−ニトロ−７−スルファモイル−ベンゾ（Ｆ）キノキサリン（ＮＢＱＸ）、５μΜ（Ｒ，Ｓ）−ＣＰＰ、メカミラミン（１０μΜ）、５μΜコカイン塩酸塩。５μΜのコカイン濃度を、複数の基準によって注意深く選定した。最初に、それは以前の切片作業の選定と一致していた（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４９，１８５−１９４（２００５））。第２に、有意に高い濃度は、局所麻酔効果をもたらすであろう（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４９，１８５−１９４（２００５））。最後に、マウスにおけるコカイン薬物動態の研究によれば、行動実験で使用されたレベルに匹敵して、１０ｍｇ  ｋｇの腹腔内注射は、脳内で１５分後に４．７μΜのコカインを産出し、２０ｍｇ／ｋｇは、９．４μΜを産出するであろう（Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ５３，２７９−２８４（１９８０））。光電流を、光学スイッチを使用して、３００Ｗキセノンランプおよび４７０±２０ｎｍまたは５８０±２０ｎｍいずれかのバンドパスフィルターを用いて誘発させた。検体における光パワーは、１１．５２ｍＷｍＭ−２（４７０ｎｍ）または１０．６４ｍＷｍＭ−２（５８０ｎｍ）であった。電流を２ｋＨｚでフィルターし、５０ｋＨｚでデジタル化し、ｐＣｌａｍｐ１０ソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用してディスクに記録した。データは、平均±平均値の標準誤差として表され、統計的有意性を、適宜、対応のあるまたは対応のないｔ検定を使用して決定した。ＭＳＮにおけるＩＰＳＣ測定については（図２Ｂ〜Ｅおよび図５Ａ〜Ｂ）、光を用いずに１０回反復し、その後、光を用いて１０回反復前した。各反復は、５秒間の長さであり、５秒間の休息期間によって分離された。細胞切片中のＣｈＡＴのコカイン応答を試験するために（図４Ａ〜Ｃ）、全細胞記録を、発火の上昇が図４に要約されるように可変であったが、対照条件における発火の典型的なランダウンと対照をなした、内殻の腹側部分から得た。探査的研究は、コアおよび殻中のその他の場所におけるＣｈＡＴ細胞がコカインに対して応答性がより低かったことを示唆した。
【０１３０】
生体外オプトロード記録
同時光刺激および細胞外電気的記録を、以前に記載されたように行った（Ｇｒａｄｉｎａｒｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２７，１４２３１−１４２３８（２００７））。オプトロードは、電極の先端がファイバーを超えて３００〜５００μｍ突出した、光ファイバー（３００μｍコア直径、０．３７Ｎ．Ａ．）に接着されたタングステン電極（１ΜΩ、０．００５ｉｎ、パリレン絶縁）からなっていた。電極を、ＮＡｃを通じておよそ１００μｍの増分で低下させ、光学応答を、各増分につき記録した。光ファイバーは４７３ｎｍまたは５６０ｎｍレーザーに連結させた。パワー密度は、双方の波長について、ファイバー先端で約１４０ｍＷ／ｍｍ２であり、それは、４７０ｎｍ光について約７〜１７ｍＷ／ｍｍ２および５６０ｎｍ光について約１０〜２２ｍＷ／ｍｍ２である、電極の先端における密度に対応した。シグナルを増幅し、バンドパスフィルター（３００Ｈｚ低域カットオフ、１０ｋＨｚ高域カットオフ）処理した後、デジタル化およびディスクへの記録を行った。各部位につき、５回の刺激反復を提示し、保存した。各刺激エポックは、各反復の開始時間の間で８０〜９０秒間の回復期間を用いながら１０〜１５秒間持続し、各反復について５０秒のデータをディスクに記録した。
【０１３１】
結果
最初に、ＭＳＮにおけるシナプス後電流を、急性ＮＡｃ切片において、図１にあるように標的とされた、ＣｈＲ２−ｅＹＦＰを発現するＣｈＡＴ細胞の光遺伝学的光刺激中に監視した（ＣｈＲ２−ｅＹＦＰ非発現細胞）（図２Ａ）この設定においてＣｈＡＴニューロンを刺激することにより、ＭＳＮにおいて記録されたγ−アミノ酪酸Ａ型（ＧＡＢＡＡ）受容体媒介型抑制性シナプス後電流（ＩＰＳＣ）の周波数は強固に増加された（図２ＢおよびＣ）。誘発抑制性電流は、一般に、６ｍｓのモダルレイテンシ（ｍｏｄａｌ  ｌａｔｅｎｃｙ）を伴って光パルスと同期し（図２Ｄ）、非同期性ＩＰＳＣのより小さい強化を伴った（図５Ａ〜Ｃ）。全ての記録された細胞にわたって、ＭＳＮにおいて観察されたＩＰＳＣの平均周波数は、ＣｈＡＴニューロンの光刺激中に５２５．８±１５４．３％増加した（ｎ＝７、平均±標準誤差、Ｐ＝０．０１、対応のあるｔ検定）一方で、平均ＩＰＳＣ振幅は、影響を受けなかった（Ｐ＞０．０５、対応のあるｔ検定、ｎ＝７、図２Ｅ）。この効果は、ニコチン性アンタゴニストメカミラミンによって減弱された（図７、ｎ＝５、Ｐ＜０．０５、対応のあるｔ検定）。
【０１３２】
次に、抑制性電流周波数におけるこれらの劇的な変化が、生体内でＭＳＮ発火における変化に変換されるかどうかおよびその様子が問われた。我々は、生体内のＣｈＡＴ介在ニューロンの光遺伝学的活性化中のＮＡｃにおけるオプトロードにより、細胞外で神経活動を記録した（図２Ｆ）。単一のユニットが絶縁されなかった部位において、我々は、１００Ｈｚではなく１０Ｈｚで光刺激を追跡した、神経集団発火を観察し（図５Ｄ）、それは電極の近傍においてまばらであるが同期性に活性化されたＣｈＡＴ細胞にわたる集団発火を表す可能性が高い。これらの集団発火とは対照的に、ＮＡｃにおける絶縁ユニットは、光遺伝学的光刺激に対して顕著に異なる応答を示した。切片中のＭＳＮにおける、ＩＰＳＣ周波数の観察された増加と一致して、我々は、生体内で、生体内ＣｈＡＴ細胞（代表的な細胞、図２Ｇ）の刺激中にバックグラウンド発火のプラウド抑制（ｐｒｏｕｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を観察した。集団にわたって、最も有意に変調された部位は、バックグラウンド発火の抑制を示したが、発火の増加により応答したものは少数であり（図２ＨおよびＩ）、それはＣｈＡＴニューロン駆動中の、より広範なＭＳＮ集団によって以前に行使された、ＭＳＮの間の既知の反回性抑制および抑制からの対応する放出と一致する。
【０１３３】
実施例３：コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）介在ニューロンの過分極の効果
次に、生体内Ｃｒｅ依存性ｅＮｐＨＲ３．０発現を用いて、ＣｈＡＴ介在ニューロンを特異的に抑制することの結果を探索した。
【０１３４】
材料および方法
マウス、オプトロード記録、および脳切片を、上記のように調製した。
【０１３５】
結果
ＣｈＡＴニューロン興奮で観察されたものとは対照的に、ＮＡｃニューロンの発火は、典型的に、ＣｈＡＴ細胞の光遺伝学的抑制によって、ＭＳＮにおいて高い可能性で増加した。代表的な細胞は図３Ａに示される）。パワースペクトル分析により、これらの生体内記録において、約４Ｈｚの発火パターンにおけるストライキング周波数ピークが明らかとなった（図３Ｂ）。要約データは、図３Ｃに提示される。有意に変調された部位の集団にわたって、ほとんどのニューロンは、ＣｈＡＴニューロンの光遺伝学的抑制によって興奮させられた（ｎ＝１７）。我々は、稀有な推定ＣｈＡＴ介在ニューロンから単一ユニット記録を得ることができ、それはｅＮｐＨＲ３．０によって完全にシャットダウンされ（図３Ｄ）、ＣｈＡＴ介在ニューロン（３７）の長い活動電位持続期間特性を示した（この細胞については２．０ｍｓであるが、我々の記録におけるＭＳＮについての発火持続期間は１．１〜１．７ｍｓの範囲であった）。要約データ（図３Ｅ）は、全ての記録された部位についての興奮および抑制の力学を示し、それは興奮の優性パターンを例証している（発火は、光によって興奮させられた部位において１３０．５＋／−１７．５％増加した）。まとめると、ＣｈＡＴニューロンの体内光遺伝学的興奮および抑制からの結果は、切片生理学からの我々の知見と一致し、これらの稀有な細胞についての、ＮＡｃにおける局所回路活性を制御することにおける驚くほどに強力な役割を指摘している。
【０１３６】
実施例４：自由に移動しているマウスにおける報酬行動に対するコリン作動性介在ニューロン操作の効果
この強力なＮＡｃ制御機構が、自由に移動しているマウスにおける側坐依存性報酬行動と関連するかどうかを試験することを決定した。急性ＮＡｃ切片におけるこれらの識別されたＣｈＡＴニューロンの活性に対する、急性投与されたコカインの最初の効果を試験した。次に、ｅＮｐＨＲ３．０を使用して、動物が環境とコカインを関連付けることを学習する、コカイン場所嗜好条件付け（ＣＰＰ）の報酬関連行動における、ＣｈＡＴ細胞のこのコカイン誘発型活性またはベースライン活性のいずれかにおける因果的役割について試験した。
【０１３７】
材料および方法
場所嗜好条件付け
全ての行動実験を、動物の暗（活動）サイクル中のウイルス注射の４〜６週間後に行った。場所嗜好条件付け（ＣＰＰ）プロトコルは、不偏の、平衡のとれた場所嗜好の以前の報告からのものと同様であった（Ｂａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｂｉｏｂｅｈａｖ  Ｒｅｖ  １９，３９−５１（１９９５））。ＣＰＰ器具は、一方の側面のコンパートメントが２３ｃｍ×２６ｃｍの寸法で、黒色壁および格子の床を備え、中央コンパートメントが２３ｃｍ×１１ｃｍの寸法で、透明プレキシガラス壁およびプレキシガラス床を備え、他方の側面のコンパートメントが２３ｃｍ×２６ｃｍの寸法で、白色壁および穴のあいた金属床を備えた、長方形の部屋からなっていた。各試験日のマウス位置を、ビデオトラッキングシステムを使用して監視した。床は、マウスが特定の部屋に対する平均ベースライン偏りを示さないように選択し、ある部屋への強力な初期嗜好を有する（１日目に部屋の中で費やされた差異が５分間を超える）いずれのマウスも排除した。ＣＰＰ試験は、次のものからなっていた。１日目、各マウスを中央室に配置し、器具全体を２０分間自由に探索させた（前試験）。２日目は、条件付けからなっていた。朝に、各マウスを、側面室のうちの一方に閉じ込め、午後に、他方の側面室に同じ期間にわたって閉じ込めた。コカインＣＰＰ実験のために、対象に腹腔内コカイン注射を受容させた（別途明記されない限り２０ｍｇ／ｋｇ）後、一方の部屋に配置した一方で、対象に同等量の腹腔内食塩水注射を受容させた後、他方の部屋に配置した。（この濃度のコカインは、対照動物において１日の訓練で強固な条件付けを可能にし、光遺伝学的介入を促進する）。マウスに、それらがコカイン注射と対になった部屋を探索した２０分間中、黄色光または青色光のいずれかを受容させた一方で、それらに、他方の部屋を探索している時に光を発光していない「模造の」ファイバーを接続した。青色光（４７０ｎｍ）の強度を、ファイバー先端で１４０〜２００ｍＷ／ｍｍ２のパワー密度を発生するように選定したが、それはＮＡｃの中央における約４〜７ｍＷ／ｍｍ２のパワー密度に対応するはずである。黄色光（５９０ｎｍ）の強度を、ファイバー先端で７０〜１４０ｍＷ／ｍｍ２のパワー密度が存在するように選定したが、それはＮＡｃの中央における約３．５〜７ｍＷ／ｍｍ２のパワー密度に対応するはずである。３日目、１日目と全く同様に、マウスを中央室に配置し、器具全体を２０分間自由に探索させた（後試験）。コカインを伴わなかったＣＰＰ実験を同一に行ったが、コカインまたは食塩水の腹腔内注射を省略したことを例外とする。
【０１３８】
オープンフィールド
オープンフィールド試験を、オープンプラスチックアリーナで行った（５０ｃｍ長さ×５０ｃｍ幅×４０ｃｍ深さ）。マウスを、部屋の中心に個々に配置し、３分間自由に探索させた。自動ビデオトラッキングシステム（Ｖｉｅｗｅｒ  ＩＩ，ＢｉＯｂｓｅｒｖｅ）を使用して、フィールドの中心および周辺両方における活動を測定した。中心における時間は、マウスが、オープンフィールドの中心３５×３５ｃｍ領域で費やした時間を指す。
【０１３９】
恐怖条件付け
恐怖条件付け器具は、ショック発生器およびスクランブラに配線された格子床を備え、音響室によって囲まれた、正方形条件付けケージ（１８×１８×３０ｃｍ）からなっていた。部屋の最上部を、ファイバーのための開口部を導入することによって、訓練中に光送達を可能にするように修正した。全てのマウスに、訓練中、連続黄色光を受容させたが、翌日の試験中には受容させなかった（５９０ｎｍ、ＣＰＰ実験の場合と同じパワー密度）。恐怖条件付けを誘発するために、マウスをケージに１２０秒間配置し、純粋なトーン（２．９ｋＨｚ）を次いで２０秒間再生し、続いて即座に２秒間の足部ショック（０．５ｍＡ）を行った。この手順を反復し、第２のショックの３０秒後、マウスをそれらのホームケージに戻した。すくみ（完全な不動）を、条件付け日の最初のトーン前に３０秒間定量化して、ベースラインすくみを査定し、同様に条件付け日の最後のショック直後に３０秒定量化して、即座のすくみを査定した。前後関係上のおよび聴覚合図による恐怖条件付けを、条件付けの翌日に査定した。前後関係上の恐怖条件付けを試験するために、マウスを元の条件付けケージに配置し、すくみを５分間測定した。聴覚合図による恐怖条件付けを試験するために、マウスを、異なる前後関係、すなわちプレキシガラス床を備えるピラミッド形のケージに配置した。新規の環境の影響に対する対照として、すくみをこの新たなケージ中で２．５分間測定し、次いで２．９ｋＨｚトーンを２．５分間再生し、その間、条件付けされたすくみを測定した。
【０１４０】
結果
腹側内側ＮＡｃ  ＣｈＡＴ細胞中で、コカインは、自発的発火を顕著に増加させることが見出された（代表的なＣｈＡＴニューロンは、図４、ＡおよびＢに示される）。要約データにより、コカインが、ＣｈＡＴニューロンにおいて、１０分時点で発火率を０．６０±０．４１Ｈｚから１．７４±０．５６Ｈｚまで増加させた一方で（ｎ＝７、Ｐ＜０．００５、対応のあるｔ試験）、ビヒクルのみを受容する細胞の対照群においては、発火率は、同じ時間枠にわたって０．６９±０．２４Ｈｚから０．０９±０．０９Ｈｚまで減少したことが明らかとなった（ｎ＝６、２つの群を比較してＰ＜０．０５、両側ｔ検定）（図４Ｃ）。
【０１４１】
我々は、次に、ｅＮｐＨＲ３．０を使用して、動物が環境をコカインと関連付けることを学習する、場所嗜好条件付け（ＣＰＰ）の報酬関連行動における、このコカイン誘発型活性、またはＣｈＡＴ細胞のベースライン活性のいずれかの因果的役割を試験した。ウイルスを注射し、カニューレを両側性で植え込みして（図４Ｄ）、コカイン曝露中のＣｈＡＴニューロンをサイレンシングした後（図４Ｅ）、我々は、ＣｈＡＴ細胞中でｅＮｐＨＲ３．０を発現したマウスが、同じウイルス、手術、および光送達プロトコルを受容したそれらの対照（Ｃｒｅリコンビナーゼ陰性）同腹子が示したものよりも有意に低いコカイン誘発型場所嗜好条件付け（ＣＰＰ）を示したことを見出した［２０ｍｇ／ｋｇ腹腔内（ｉｐ）、図４ＦおよびＧ；ｎ＝１０  ＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ＋、ｎ＝１２  ＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ−（左パネル）、両側ｔ検定についてＰ＜０．０１、３つのコホート、図６Ａもまた参照されたい。我々は、コカインの不在下で、ＣｈＡＴ細胞を抑制する行動的効果を何ら観察せず、ＣｈＡＴニューロン抑制は、ｅＮｐＨＲ３．０単独での条件付けが場所嗜好に影響を及ぼさなかったように、それ自体、嫌悪性でなかった（図４Ｇ、右パネル、ｎ＝９  ＣｈＡＴ：：Ｃｒｅ＋、ｎ＝７  ＣｈＡＴ：Ｃｒｅ−、両側ｔ検定についてＰ＞０．０５、３つのコホート、図６Ｂ、コカイン用量反応曲線について図８Ａもまた参照されたい）。１０ＨｚのＣｈＲ２による細胞の活性化は、それ自体で場所嗜好を駆動するのに、またはコカイン場所嗜好を強化するのに十分でなく（１０および２０ｍｇ／ｋｇ腹腔内、図８Ｂ〜Ｄ、表４）、ＣｈＡＴ細胞抑制からの我々のデータは、代わりにこれらの細胞の必要性を実証した。最後に、対照実験において、我々は、ＣｈＡＴニューロン抑制がそれ自体、オープンフィールドにおける移動度または不安に対して何ら効果を有さないこと（図４ＨおよびＪ）、ならびに前後関係上のおよび聴覚合図による恐怖条件付けが、ＣｈＡＴ細胞の抑制によって妨害されないこと（図９）を見出した。
表４：ＣｈＡＴニューロンの抑制（ｅＮｐｈＲ３．０での）がコカイン曝露と対にされた時の、コカイン場所嗜好パラダイム（種々のコカイン濃度について）の試験日に、コカインと対にされた側面上で費やされた総時間。
【表４】
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【０１４２】
考察
まとめて、ＣｈＡＴニューロン集団の特異的および急性光遺伝学的制御からのこれらの結果は、自由に移動している哺乳動物において、局所回路活性を制御することおよび報酬関連行動を実施することにおける、これらの稀有かつまばらに分布したニューロンについての強力な役割を指摘する。ＣｈＡＴ介在ニューロンの急性サイレンシングが、薬物の不在下で、場所嗜好に影響を及ぼすことなく薬物関連学習を妨害するという事実は、この超小型回路に対する制御を使用して、一般に欲求性または嫌悪性反応に影響を及ぼすことなく、乱用薬物の嗜癖特性を選択的に妨害することが可能であるという興味深い可能性、つまり莫大な臨床的便益となる可能性を示唆する。興味深いことに、行動的結果は、コリン作動性介在ニューロンの慢性から生じる結論を支持しないが（３４）、代わりに、ＮＡｃにおけるより速いがより低い細胞標的型の薬理学的変調から生じる解釈とより一致している（２３〜２６）。コリン作動性介在ニューロンのアブレーションは、ＮＡｃにおけるドーパミンの代償性増加等の間接的な効果につながる可能性があり、それが今度はコカイン報酬を強化する可能性がある。実際、急性操作と慢性操作との間の基本的な差異は、ニコチンにおける急性増加（恐らく、コリン作動性受容体に作用する）が、ドーパミンにおける対応する急性増加を引き起こす（５４、５５）一方で、ドーパミンまたはアセチルコリンレベルにおける慢性変化が、例えば、パーキンソン病のドーパミン枯渇において見られるような（５７）、他の神経変調物質のレベルにおける対向する変化を引き起こすことができる（５６）という知見等の、脳内のアセチルコリン／ドーパミンバランスの我々の理解における、臨床的に関連する明らかな矛盾を説明し得る。
【０１４３】
このアプローチの速さおよび特異性は、神経系の他の領域においても同様に、健康なおよび罹患した神経回路の両方における、アセチルコリンニューロンの因果的役割の解明を可能にし得る。例えば、線条体に対して突出するドーパミンニューロンとよく類似して（５８、５９）、背側線条体におけるＣｈＡＴ介在ニューロンは、報酬および報酬を予測する刺激についての情報を担持すると考えられる（６０）。かかる刺激は、しばしば興奮性の活性バーストに先行しかつそれが後に続く、霊長類における線条体の持続性で活性なニューロンの活性における短い休止を発生する（１６、１７）。背側線条体と腹側線条体との間の構造的相同性は、ＮＡｃについて本明細書で概説されるものと同様の原則が、背側線条体におけるＣｈＡＴ細胞活性に拡張し得ることを示唆し、それは実際に当てはまるように思われる（Ｅｎｇｌｉｓｈら、添付の原稿）。これらの結果は、ＮＡｃにおけるこれらの細胞の活性が、強力な時間的に同期した抑制を駆動し、報酬学習行動を制御するという我々の知見と合わせて、ＣｈＡＴニューロンが、ほ乳類脳内の回路活性および行動の多方面にわたる神経変調調節のための、強力な制御ノードとしての機能を果たすことを示唆する。
【０１４４】
本発明を純粋に例示することを目的とし、したがって、決して本発明を限定すると見なされるべきではない、実施例はまた、上記で論議される本発明の態様および実施形態を説明および詳述する。先述の実施例および詳細な説明は、限定ではなく例証として提供される。本明細書で引用される出版物、特許出願、および特許は、各個別出版物、特許出願、または特許が、参照することにより組み込まれると特異的および個別に示されたかのように、参照することにより本明細書に組み込まれる。具体的には、本明細書で引用される全ての出版物は、本発明と関連して使用され得る組成物および方法を説明および開示する目的で、参照することにより本明細書に明示的に組み込まれる。先述の発明は、理解を明確にする目的で、例証および一例として、いくらか詳細に説明されているが、本発明の教示に照らして、添付の請求項の精神または範囲から逸脱することなく、ある変更および修正が行われてもよいことが、当業者に容易に明らかとなるであろう。
【０１４５】
参考文献
1. S. Ikemoto, R. A. Wise, Neuropharmacology 47 Suppl 1, 190-201 (2004).
2. J. Changeux, C. R. Biol 332, 421-425 (2009).
3. M. P. Kilgard, M. M. Merzenich, Science 279, 1714-1718 (1998).
4. J. S. Bakin, N. M. Weinberger, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 93, 11219-11224 (1996).
5. M. E. Hasselmo, L. M. Giocomo, I MoL Neurosci 30, 133-135 (2006).
6. U. Maskos, Br. J. Pharmacol 153 Suppl 1, S438-445 (2008).
7. M. R. Picciotto et al., Nature 391, 173-177 (1998).
8. J. M. Fellous, T. J. Sejnowski, Hippocampus 10, 187-197 (2000).
9. J. P. Changeux et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol 61, 343-362 (1996).
10. J. P. Changeux et al., Brain Res. Brain Res. Rev 26, 198-216 (1998).
11. A. Kamsler, T. J. McHugh, D. Gerber, S. Y. Huang, S. Tonegawa, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 107, 1618-1623 (2010).
12. S. J. Moore, D. C. Cooper, N. Spruston, Neuron 61, 287-300 (2009).
13. P. H. Tiesinga, J. M. Fellous, J. V. Jose, T. J. Sejnowski, Hippocampus 11, 251-274 (2001).
14. B. J. Everitt, T. W. Robbins, Annu. Rev. Psychol. 48, 649-684 (1997).
15. Z. Wang et al., Neuron 50, 443-452 (2006).
16. G. Morris, D. Arkadir, A. Nevet, E. Vaadia, H. Bergman, Neuron 43, 133-143 (2004).
17. T. Aosaki et al, J. Neurosci 14, 3969-3984 (1994).
18. M. L. Furey, P. Pietrini, J. V. Haxby, W. C. Drevets, Neuropsychopharmacology 33, 913-923 (2008).
19. S. G. Anagnostaras et al., Nat. Neurosci 6, 51-58 (2003).
20. S. Ikemoto, B. S. Glazier, J. M. Murphy, W. J. McBride, Physiol. Behav 63, 811-814 (1998).
21. M. J. Williams, B. Adinoff, Neuropsychopharmacology 33, 1779-1797 (2008).
22. A. Vale-Martinez, M. G. Baxter, H. Eichenbaum, Eur. I Neurosci 16, 983-998 (2002).
23. V. Zachariou et al., Neuropsychopharmacology 24, 576-589 (2001).
24. W. E. Pratt, R. C. Spencer, A. E. Kelley, Behay. Neurosci 121, 1215-1223 (2007).
25. J. A. Crespo, K. Sturm, A. Saria, G. Zernig, J. Neurosci 26, 6004-6010 (2006).
26. W. E. Pratt, A. E. Kelley, Behay. Neurosci 118, 730-739 (2004).
27. F. E. Pontieri, G. Tanda, F. Orzi, G. Di Chiara, Nature 382, 255-257 (1996).
28. M. B. Kelz et al., Nature 401, 272-276 (1999).
29. B. T. Chen, F. W. Hopf, A. Bonci, Ann. N. Y. Acad. Sci 1187, 129-139 (2010).
30. R. A. Wise, NIDA Res. Monogr 50, 15-33 (1984).
31. A. A. Grace, C. R. Gerfen, G. Aston-Jones, Adv. Pharmacol 42, 655-670 (1998).
32. T. W. Robbins, K. D. Ersche, B. J. Everitt, Ann. N. Y. Acad. Sci 1141, 1-21 (2008).
33. E. J. Nestler, G. K. Aghajanian, Science 278, 58-63 (1997).
34. T. Hikida et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 98, 13351 -13354 (2001).
35. V. V. Rymar, R. Sasseville, K. C. Luk, A. F. Sadikot, J. Comp. Neurol 469, 325-339 (2004).
36. J. M. Tepper, J. P. Bolam, Curr. Opin. Neurobiol 14, 685-692 (2004).
37. F. Zhou, C. J. Wilson, J. A. Dani, J. Neurobiol 53, 590-605 (2002).
38. F. Zhou, C. Wilson, J. A. Dani, Neuroscientist 9, 23-36 (2003).
39. T. KoOs, J. M. Tepper, J. Neurosci 22, 529-535 (2002).
40. M. de Rover, J. C. Lodder, K. S. Kits, A. N. M. Schoffelmeer, A. B. Brussaard, Eur. J. Neurosci 16, 2279-2290 (2002).
41. N. Uchimura, R. A. North, J. Physiol. (Lond.) 422, 369-380 (1990).
42. Y. Zhang, T. G. Oertner, Nat. Methods 4, 139-141 (2007).
43. F. Zhang et al., Nat Protoc 5, 439-456 (2010).
44. A. R. Adamantidis, F. Zhang, A. M. Aravanis, K. Deisseroth, L. de Lecea, Nature 450, 420424 (2007).
45. S. Gong et al., .1 Neurosci 27, 9817-9823 (2007).
46. H. Tsai et al., Science 324, 1080-1084 (2009).
47. D. Atasoy, Y. Aponte, H. H. Su, S. M. Stemson, I Neurosci 28, 7025-7030 (2008).
48. G. Nagel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 100, 13940-13945 (2003).
49. E. S. Boyden, F. Zhang, E. Bamberg, G. Nagel, K. Deisseroth, Nat. Neurosci 8, 1263-1268 (2005).
50. V. Gradinaru et al., Cell 141, 154-165 (2010).
51. Y. Kawaguchi, J. Neurosci 13, 4908-4923 (1993).
52. C. J. Wilson, H. T. Chang, S. T. Kitai, J. Neurosci 10, 508-519 (1990).
53. H. Inokawa, H. Yamada, N. Matsumoto, M. Muranishi, M. Kimura, Neuroscience (2010) www.ncbi.nlm.nih.gov.laneproxy.stanford.edu/pubmed/20371269.
54. M. Nisell, M. Marcus, G. G. Nomikos, T. H. Svensson, J Neural Transm 104, 1-10 (1997).
55. R. Exley, M. A. Clements, H. Hartung, J. M. Mcintosh, S. J. Cragg, Neuropsychopharmacology 33, 2158-2166 (2008).
56. A. Hrabovska et al., Chem. Biol. Interact 183, 194-201 (2010).
57. B. G. Hoebel, N. M. Avena, P. Rada, Curr Opin Pharmacol 7, 617-627 (2007).
58. W. Schultz, J Neurophysiol 80, 1-27 (1998).
59. W. Pan, R. Schmidt, J. R. Wickens, B. I. Hyland, J. Neurosci 25, 6235-6242 (2005).
60. M. Kimura, J. Rajkowski, E. Evarts, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 81, 4998-5001 (1984).
【図１】
2013545458.tif 000007
【図２ｉ】
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【図２ｉｉ】
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【図３】
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【図４ｉ】
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【図４ｉｉ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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