(57)【要約】  分子コーミング、又は特別のデザインを有するプローブ（特に、核酸プローブ）による他の核酸伸長法を用いる、感染した真核細胞、組織又は体液におけるDNAウイルスのゲノム又はウイルス由来DNAの存在をインビトロで検出する方法である。ウイルス感染した細胞、組織又は体液におけるゲノムウイルスDNAのポリヌクレオチド又はウイルス由来DNAのポリヌクレオチドの存在を追跡することによって、抗ウイルス療法の効果をインビトロでモニターする方法である。分子コーミング及びDNAハイブリダイゼーションを用いるウイルスの感染形態の検出である。これらの方法を実行するのに使用されるプローブを含むキットと、このプローブを含む組成物である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料における感染性ウイルスのポリヌクレオチドを検出する方法であって、
該方法は、
前記試料からポリヌクレオチドを分離すること、抽出すること、又は、それ以外に、得ることと、
前記ポリヌクレオチドを分子コーミングして、伸長したポリヌクレオチドを形成することと、
前記伸長したポリヌクレオチドを、感染性ポリヌクレオチド配列を認識する、1以上のプローブに接触させることと、
コーミングされた試料に対するプローブのハイブリダイゼーションを検出することによって、感染性ウイルスのポリヌクレオチドを検出することと、
を含む、
前記方法。
【請求項２】
前記生体試料が、ヒト、ヒト以外の哺乳動物、又は鳥類から得られる、組織試料、細胞、血清、血液、CSF、又は滑液試料である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが、ヒト、ヒト以外の哺乳動物、又は鳥類の組織、細胞、血清、血液、CSF、又は滑液試料から抽出される、感染性又は非感染性ウイルスDNAである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、ヒト、ヒト以外の哺乳動物、又は鳥類のDNA、エピソーム、又は体液に組み込まれる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドが、二本鎖DNAのウイルスのウイルスDNAに結合する、1以上のプローブによって検出される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドが、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、肝炎ウイルス、又はレトロウイルスのDNAに結合する、1以上のプローブによって検出される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記1以上のプローブが、少なくとも1kbのウイルスのゲノムDNAに結合する、1組のプローブを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記1以上のプローブが、ウイルスゲノムの種々の部分若しくはセグメント、又は再編成された断片の識別を可能にするために選択された、種々の標識によって標識される、少なくとも2組のプローブを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも2組のプローブが、HSVゲノム又はHIVゲノムの5〜100%を網羅する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
哺乳動物の細胞、組織若しくは体液における感染性ウイルスのポリヌクレオチド配列若しくはゲノムウイルスのポリヌクレオチド配列を検出するか、又は同定する方法であって、該方法は、分子コーミングを用いて、細胞、組織若しくは体液における感染性ウイルスのポリヌクレオチド若しくはゲノムウイルスのポリヌクレオチドの存在若しくは量を検出することを含む、前記方法。
【請求項１１】
感染性ウイルスのポリヌクレオチド配列又はゲノムウイルスのポリヌクレオチド配列を定量化する方法であって、該方法は、分子コーミングを用いて、感染していない対照試料又はそれ以外の種々の時点で得られる同様の試料と比較して、細胞、組織又は体液における感染性ウイルスのポリヌクレオチド又はゲノムウイルスのポリヌクレオチドの量を検出することを含む、前記方法。
【請求項１２】
哺乳動物細胞におけるウイルスの存在若しくはウイルスの複製、若しくはウイルスゲノムの再編成を検出するか、又は追跡する方法であって、該方法は、細胞、組織若しくは体液における潜伏ウイルスDNA若しくは複製ウイルスDNA若しくは再編成されたウイルスDNAの存在のために、分子コーミングすることを含む、前記方法。
【請求項１３】
抗ウイルス療法の効果を評価する方法であって、
該方法は、
分子コーミングを用いて、対象から得られる試料における感染性ウイルスDNA又はゲノムウイルスDNAの存在、編成又は量を検出することと、
抗ウイルス剤によって前記対象を治療することと、
分子コーミングを用いて、前記対象における感染性ウイルスDNA又はゲノムウイルスDNAの存在、編成又は量を再評価することと、
を含む、
前記方法。
【請求項１４】
請求項１〜８記載のいずれかに記載の方法の手段を行うことを含む、請求項９〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
HSVゲノム又はHIVゲノムの5〜100%を網羅する、1組のプローブ。
【請求項１６】
分子コーミング装置及び／又は試薬と、
コーミングされたDNA分子におけるゲノムウイルスDNAを検出するか、又は同定するための、感染性ウイルスポリヌクレオチドに結合する1以上のプローブと、
場合により、1以上の細胞、組織又は体液試料と、
場合により、感染性配列を検出するか、又は分類するためのソフトウェアと、
を含む、
分子コーミングを行うためのキット。
【請求項１７】
生体物質HSV-B4 (CNCM I-4298)、HSV-B19 (CNCM I-4299)、HSV-Sc54 (CNCM I-4300)、又はHSV-P4 (CNCM I-4301)。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、感染性ウイルスDNA配列若しくは病原性DNA配列のための特別に設計したプローブと組み合わせて、分子コーミング(Molecular Combing)及び／又はDNA伸長を用いる、対象又は患者から得られるウイルス宿主細胞、組織又は体液における感染性ウイルスDNA又は他の感染性DNA配列若しくは病原性DNA配列の存在を、簡単、迅速、かつ正確に検出する方法に関する。また、本発明は、ウイルスに感染した試験患者のウイルス感染した細胞、組織又は体液におけるゲノムウイルスのポリヌクレオチドの存在を追跡することによって、抗ウイルス療法の効果をインビトロでモニターする方法に関する。さらに、本発明は、DNAハイブリダイゼーションに基づく感染性ウイルスの検出に関する。さらにまた、本発明は、本発明の方法を実行するのに使用されるプローブを含むキットと、前記プローブを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の説明）
（分子コーミング(Molecular Combing)）
分子コーミング法は、種々の特許及び科学技術刊行物に開示されており、例えば、米国特許第6,303,296号、国際公開公報第9818959号、国際公開公報第0073503号、米国特許出願公開第2006/257910号、米国特許出願公開第2004/033510号、米国特許第6,130,044号、米国特許第6,225,055号、米国特許第6,054,327号、国際公開公報第2008/028931号、国際公開公報第2010/035140号、並びに、Michalet, Ekongらの文献1997、Herrick, Michalet らの文献2000、Herrick, Stanislawskiらの文献2000、Gad, Auriasらの文献2001、Gad, Caux-Moncoutierらの文献2002、Gad, Klingerらの文献2002、Herrick, Junらの文献2002、Pasero, Bensimonらの文献2002、Gad, Biecheらの文献2003、LebofskyとBensimonの文献2003、Herrick, Contiらの文献2005、LebofskyとBensimonの文献2005、Lebofsky, Heilig らの文献2006、Patel, Arcangioliらの文献2006、Rao, Contiらの文献2007、及びSchurra とBensimonの文献2009（下記の引用文献を参照のこと）に開示されている。これらの参考文献に記載されている、技術、供給品及び設備（具体的には、分子コーミングに属するか、又は関連するもの）は、上で引用する刊行物を参照することにより本明細書中に組み込まれる。
【０００３】
Bensimonらの米国特許第6,303,296号は、DNA伸長手順を開示し、Lebofskyらの国際公開公報第2008/028931号は、ゲノム配列の検出を開示し、Lebofskyらの国際公開公報第2010/035140 A1号は、核酸伸長及び分子コーミングに基づく、ヒト染色体4及び10上のD4Z4縦列反復配列の解析方法を開示する。
【０００４】
分子コーミングは、個々の核酸分子の直接的な視覚化を可能にする方法であり、子宮頸癌細胞株におけるmycの位置及び特定のヒトパピローマウイルス(Papillomavirus)(HPV)配列、並びに、以前に特性評価されたMYC/パピローマウイルス(HPV18)アンプリコンにおける、特に、その複製起点（Herrickらの文献、Cancer Res. 65(4): 1174-1179 2005）における複製動力学に関する研究に良好に用いられている。この方法を用いる、腫瘍細胞における核酸再編成及び増幅は、癌転帰に関連していた。Herrickらは、N-myc及びc-myc遺伝子に特異的なプローブによって、培養腫瘍細胞株IC1、IC2、IC4及びIC5からコーミングされた核酸を調査し、全長HPV-18及びHPV-44（約7.8kb）を含むHPV核酸を検出した。Contiらの文献、Genes, Chromosomes & Cancer 46: 724-734 (2007)は、特定のHPV-18核酸配列を含むHPV/MYCアンプリコンにおける起源の活性化について検討し、IC1腫瘍細胞株からの分子コーミングによって伸長されたDNAにおける起源の活性及びフォークの移動を解析した。Contiらは、遺伝子再編成及び増幅を、HPV及びMYC核酸配列の両方に関与するメカニズムに焦点を置く癌細胞の特質であることを確認する。これらの両研究は、感染性ゲノムウイルスの核酸ではなく、癌遺伝子としてHPV核酸配列が作用する、培養腫瘍細胞を使用した。
【０００５】
培養バーキットリンパ腫細胞株から得られるエピソーム及び組込みエプスタインバーウイルス(Epstein-Barr virus) DNAは、コーミングされたDNAでのFISHによって特性評価された（Reisingerらの文献、Int. J. Cancer 118: 1603-1608 (2006)）。Reisingerの目的は、ウイルスゲノムのゲノム組織を検討し、理解し、そして試み、感染真核細胞におけるEBVのエピソームの組込み形態を識別することであった。培養バーキットリンパ腫細胞株のDNAは、分子コーミングによって伸長され、末端反復(TR)配列と内部反復1(IR1)配列の間の領域ではなく、ゲノム配列を網羅する、EBV特異性DNAプローブによって調査された。
【０００６】
また、Reisingerらの文献、及びHerrickらの文献は、ウイルスDNAのこの特定領域内の再編成の識別を可能にする、種々の色‐蛍光アレイを発生させることができる、種々のハプテンによって標識したプローブ集合（probe sets）を使用して、ウイルスゲノムの再編成を検出する方法を記載していない。これらの2つの参考文献は、組織又は体液ではなく、培養細胞におけるウイルスDNAの検出について記載する。
【０００７】
対照的に、本発明では、分子コーミングによって感染性粒子におけるウイルスDNAの構造を解析するために、標準抽出手順を改良し、ウイルス粒子からウイルスDNAを抽出する。さらに、本発明は、分子コーミングによる解析と適合性があり、また、感染角膜におけるHSV DNAの感染形態の存在を検出させる、角膜等の固体組織からの高分子量のDNAの抽出方法を開発する。これらの2つの方法は、本発明以前に記載されていない。
【０００８】
伸長核酸、特に、ウイルスDNA又はゲノムDNAは、直線鎖及び平行鎖で固定された核酸を提供し、適切な表面（例えば、表面処理されたスライドガラス）上で制御される伸長因子によって行われるのが好ましい。伸長後、例えば蛍光顕微鏡検査法によって検出可能な配列特異性プローブをハイブリダイズすることができる（Lebofsky, Heiligらの文献2006）。したがって、特定の配列は、単一の分子レベルで直接視覚化することができる。蛍光シグナルの長さ及び／又はこれらの数、及びスライド上のこれらの間隔は、プローブのサイズ及び相対的な間隔の直接的な読み取りを提供する。しかしながら、これまで、この方法を用いて、感染真核細胞におけるウイルスの感染形態、又は、哺乳動物の流体中に含まれる細胞若しくは組織に感染する、ウイルス配列若しくは誘発された突然変異ウイルス配列のゲノムを検出できることは示されなかった。
【０００９】
（ウイルスの構造とゲノム）
ヒトの疾患を生ずるウイルスは、エンベロープの存在、カプシドの型、ゲノムの性質（二本鎖又は一本鎖のDNA又はRNA）、サイズ、及び標的細胞に基づく、7つのグループに分類される（国際ウイルス分類委員会(International Committee on Taxonomy of Viruses)、http://_www.ictvonline.org；最終アクセス2011年4月7日）。エンベロープDNAウイルス(enveloped DNA virus)には、ポックスウイルス(poxvirus)、ヘルペスウイルス(herpesvirus)、及びヘパドナウイルス(hepadnavirus)が含まれる。非エンベロープグループ(nonenveloped group)には、アデノウイルス(adenovirus)、パポバウイルス(papovavirus)、及びパルボウイルス(parvovirus)が含まれる。
【００１０】
莫大な種々のゲノムの構造は、ウイルス種間で調べることができる。実際、何百万もの種々の型のウイルスが存在する（BreitbartとRohwerの文献2005）が、これらの約5,000のみが詳細に記載されているにすぎない（Dimmock, Easton らの文献2007）。ウイルスゲノムは、一本鎖又は二本鎖である。一本鎖ゲノムは、対でない核酸からなり、これは、真っ二つに割れた梯子の半分に類似する。RNAウイルスはすべて、二本鎖のレオウイルス(reovirus)を除いて、一本鎖である。一本鎖ゲノムは、2つの相補的な一対の核酸からなり、これは、梯子に類似する。DNAウイルスはすべて、パルボウイルスを除いて、二本鎖であり、これには一本鎖DNAがある。ヘパドナウイルス科(Hepadnaviridae)に属するもの等の一部のウイルスは、部分的に二本鎖及び部分的に一本鎖のゲノムを含む（CollierとOxfordの文献2006）。
【００１１】
ウイルスゲノムは、ポリオーマウイルス(polyomavirus)のように、円形であるか、又はアデノウイルスのように、線状である（Fields, Knipeらの文献2007）。核酸の型は、ゲノムの形状と無関係である。RNAウイルスの中で、ゲノムは、ビリオン内の別々の部分に分割されることが多く、これは、分節(segmented)と呼ばれる。各分節は、1つのタンパク質をコードすることが多く、これらは、通常、1つのカプシドで共にみられる。すべての分節は、ブロムモザイクウイルス(brome mosaic virus)によって示されるように、感染性の全体的なウイルスが、同じビリオンにある必要はない（CollierとOxfordの文献2006）。
【００１２】
RNA又は一本鎖DNAを有するウイルスにおいて、鎖は、プラスセンス（プラス鎖と呼ばれる）又はマイナスセンス（マイナス鎖と呼ばれる）のいずれかであると考えられ、これらは、ウイルスのメッセンジャーRNA (mRNA)に相補的か否かに依存する（Fields, Knipeらの文献2007）。プラスセンスウイルスRNAは、ウイルスmRNAと同一であり、そのため、宿主細胞によって即座に翻訳することができる。マイナスセンスウイルスRNAは、mRNAに相補的であり、そのため、翻訳前に、RNAポリメラーゼによってプラスセンスRNAに変換される必要がある。DNA命名法は、ウイルスmRNAのコード鎖がmRNAに相補的であり(-)、また、非コード鎖がmRNAのコピーである(+)点で、RNA命名法に類似する。レトロウイルス（HIVを含む）と呼ばれる一部の一本鎖RNAウイルスは、酵素逆転写酵素によって宿主細胞中で複製して、そのRNAゲノムからDNAを産生する。その後、DNAは、インテグラーゼ酵素によって宿主のゲノムに組み込まれる。ウイルスゲノム又はプロウイルスは、感染細胞のゲノムに残存し、宿主細胞のDNAの一部としてその後複製する。
【００１３】
ゲノムサイズは、デルタ肝炎ウイルス(HDV)での1.7kbから、ポックスウイルスでの309kbまで、種々の種類又は種のウイルス間で大幅に変化する。複製する場合、RNAウイルスは、高い誤差率のために、一般に、DNAウイルスよりも小さいゲノムサイズであり、最大サイズの上限がある。この上限を超えて、複製する場合のゲノムにおける誤差によって、ウイルスは有用でなくなるか、又は競合しなくなる。これを補うために、ゲノムが小さな分子に分割され、それによって、誤差の可能性を低下させる場合、RNAウイルスは、多くの場合、分節ゲノムを有する。対照的に、DNAウイルスは、一般に、これらの複製酵素の高い忠実性により、大きなゲノムを有する（PressingとReanneyの文献1984）。
【００１４】
ウイルスは、種々のメカニズムによって生じる遺伝的変化を受ける場合がある。DNA又はRNAにおける個別の塩基が他の塩基に突然変異する場合、最初の過程は、遺伝的浮動と呼ばれる。これらの点突発変異のほとんどは、「静かである」。これは、点突発変異が、遺伝子がコードするが、抗ウイルス剤に対する抵抗等の進化の利点を付与しない、タンパク質を変化させないことを意味する。ウイルスのゲノムに大きな変化がある場合、抗原不連続変異が生じる（Pan, Liらの文献2007）。これは、組換え又は再集合の結果であり得る。これが、インフルエンザウイルス（HampsonとMackenzieの文献2006）によって生じる場合、世界的流行病が生じ得る。RNAウイルスは、同じ種のウイルスの擬似種又は群としてであるが、わずかに異なるゲノムヌクレオシド配列で存在することが多い。かかる擬似種は、自然淘汰の主たる標的である（Metznerの文献2006）。第二に、分節ゲノムもまた進化の利益を付与する。すなわち、分節ゲノムを有するウイルスの種々の株を混ぜ、遺伝子を組み合わせて、特有の新しい特性を有する子孫ウイルスを作出することができる。これは、再集合又はウイルスセックス(viral sex)と呼ばれる（Goudsmitの文献1998）。そして、DNAの鎖が破壊され、その後、種々のDNA分子の末端に連結する過程である、遺伝子組換えが発生し得る。これは、ウイルスが細胞に同時に感染する場合に生じ、ウイルスの進化に関する研究では、組換えが、研究された種で広がっていることを示している（WorobeyとHolmesの文献1999）。組換えは、RNAウイルス及びDNAウイルスで共に一般的である（Umeneの文献1999；Lukashevの文献2005）。
【００１５】
HSVは、約150nmから200nmの径を有する、大きなウイルスである。HSVは、糖タンパク質スパイクを含む、ゆったりとしたエンベロープで包囲される（Wildy, Russellらの文献1960）。他のエンベロープウイルスのように、ヘルペスウイルスは、有機溶媒又は洗浄剤によって失活する傾向があり、宿主の身体の外部で不安定である。20面体のカプシドは、一部のウイルスのタンパク質紡錘体の周辺で曲がる、二本鎖DNAのコアを収容する。1988年に最初に発表されたHSV-1 17株のゲノム配列は、各鎖において152,261の残基を含む（Genbank登録番号：NC_001806.1；2011年4月7日最終アクセス）（McGeoch, Dalrympleらの文献1988）。HSVゲノムは、2つの共有結合で連結したセグメントである、長い(L)領域と短い(S)領域からなると考えられる（Roizmanの文献1979）。L領域は、一対の逆方向の反復エレメント（RLと命名し、末端コピー及び内部コピーを特に、TRL及びIRLという）によって側面に位置する特有の配列(UL)からなる（Wadsworth, Jacobらの文献1975）。同様に、S領域は、IRS、US及びTRSからなる。RLエレメント及びRSエレメントの配列は、400の塩基対(bp)直接反復がゲノム末端にある以外は、明確であり、このコピーの少なくとも1つは、末端コピーの反対方向の、L領域及びS領域の連結部でみられる（Roizmanの文献1979；DavisonとWilkieの文献1981）。それぞれの末端は、3'-ヒドロキシル基のない、1つの突出する残基を有する（MocarskiとRoizmanの文献1982）。HSV DNAの調製物は、等モル量の4つの配列配向異性体を含み、UL及びUSはそれぞれ、L配列とS配列の間の連結に関して2つの可能性のある配向のうちの1つで独立している（Hayward, Jacobらの文献1975； BatailleとEpsteinの文献1997）。1つの異性体は、プロトタイプと特定される（Roizmanの文献1979）。HSV-1 DNAは、68.3%のG+Cの塩基組成を有する（McGeoch, Dalrympleらの文献1988）。G+C含量は、ゲノム全体で一定ではない。すなわち、6.6-kbp RSエレメントは、平均から最も顕著に離れ、79.5%のG+C含量である（McGeoch, Dolanらの文献1986）。HSV-2のゲノムは、完全にシークエンスされていないが、わずかに高いG+C含量にもかかわらず、HSV-1のゲノムに非常に類似する。
【００１６】
多くのウイルスのゲノムポリヌクレオチド配列が、当業者に周知であり、Fields, B. N., D. M. Knipeらの文献(2007)、「フィールズのウイルス学(Fields' Virology)」(Philadelphia, Wolters kluwer/Lippincott Williams & Wilkins)；及び、http:// www._ ncbi.nlm.nih.gov/genomes/genlist.cgi?taxid=10239&type=5&name=Virusesで利用可能なNCBIウイルスゲノムデータベース（最終アクセス2011年4月7日)を、参照することにより組み込まれる。
【００１７】
（ウイルス病因）
多くの型のウイルスの病原体が認識される。ウイルス感染に関する近年の総説において、１つは、Fieldsら（Fields, Knipeらの文献2007）について言及することができ、これは、引用により本明細書中に組み込まれる。ウイルスに汚染された大気を呼吸する、汚染された食品を食べる過程を通じて、又はウイルスに感染した人と性的接触を持つことによって、ウイルスが身体に侵入する場合に、ウイルス感染が起こる。また、ウイルス感染は、虫さされによっても起こり得る。ウイルス感染では、ウイルスが繁殖するために、身体の細胞の内部に侵入する。その後、ウイルスは、他の細胞に伝播し、この過程を繰り返す。ウイルス感染のこの過程は、ウイルス感染及び個々の因子の型に依存して特性と重症度が異なる、種々の症状を生ずる。ウイルス感染の一般的な症状には、疲労、インフルエンザのような症状及び熱が含まれる。
【００１８】
風邪等の多くの型のウイルス感染は、一般に、健康な人において、自己限定的である。これは、ウイルス感染が、一時期疾病を生じ、その後、疾病が消散し、症状が消えることを意味する。しかしながら、一部の人々には、ウイルス感染の重篤な合併症を発症する危険性がある。さらに、HIV/AIDS等の特定の型のウイルス感染は、自己限定的でなく、重篤な合併症を生じ、及び／又は最終的に致命的になり得る。重篤な損傷の一例として、麻疹ウイルス感染の一部の形態は、脳の炎症をもたらし、結果的に、恒久的な脳外傷をもたらす。
【００１９】
種々のウイルス感染又はウイルス疾患を生ずる多くの型のウイルスが存在する。例えば、風邪又は上気道感染症を生じ得る、200を超える種々のウイルスが存在する。他の一般的なウイルスには、インフルエンザ又は流感を生ずるインフルエンザウイルスが含まれる。エプスタインバーウイルス及びサイトメガロウイルスは、伝染性単核症を生じ、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)は、帯状疱疹及び水痘を生じ、また、HIVはAIDSを生ずる。
【００２０】
ウイルスには、生物体に疾患をもたらす種々のメカニズムがあり、これは、主として、ウイルス種に依存する。細胞レベルのメカニズムには、主として、細胞溶解、細胞破砕、及びその後の細胞死が含まれる。多細胞生物では、多くの細胞が死ぬ場合、すべての生物体は、影響を受け始める。ウイルスは、健全なホメオスタシスの破壊をもたらし、疾患を生ずるが、これらは、生物体内に比較的無害で存在することもできる。一例には、唇ヘルペスを生ずる単純ヘルペスウイルス(HSV)の人体内の休止状態に残存する能力が含まれる。これは潜伏と呼ばれ（Margolis, Elfmanらの文献2007）、腺熱を生ずるEBV及びVZVを含む、すべてのヘルペスウイルスの特性である。ほとんどの人々は、これらの型のHSVの少なくとも1つに感染している（WhitleyとRoizmanの文献2001）。しかしながら、ウイルスの存在によって、エルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)等の病原菌に対する免疫を高めることができるので、これらの潜伏ウイルスは、時に有益である場合がある（Barton, Whiteらの文献2007）。一方、潜伏水痘感染は、帯状疱疹と呼ばれる疾患としてその後の生活で再発する。
【００２１】
一部のウイルスは、生涯にわたる感染症又は慢性感染症を生じ、ウイルスは、宿主の防衛機構があるにもかかわらず、身体に複製し続ける（BertolettiとGehringの文献2007）。これは、B型肝炎及びC型肝炎ウイルス感染において一般的である。これらは、感染性ウイルスの蓄積の役割を果たすので、慢性的に感染した人々には、キャリアとして知られている。高い割合のキャリアを有する個体では、該疾患は風土性であると考えられている（Rodrigues, Deshmukhらの文献2001）。急性細胞溶解ウイルス感染とは対照的に、この持続性は、宿主生物体と適合する相互作用を意味する。
【００２２】
HSV-1感染は、ウイルス感染の1つの例である。HSVは、むずむずする発疹をもたらす、一部のヘルペス感染の傾向について命名された。HSVは、そのメンバーに、熱性疱疹及び生殖器感染症の原因である、単純ヘルペス1型及び2型；水痘及び帯状疱疹の原因である、VZV；唾液腺及び他の内臓に影響を与える、サイトメガロウイルス(CMV)；リンパ組織の感染に関連する、EBV；並びに、一部の最近同定されたウイルス(HSV-6、HSV-7、及びHSV-8)が含まれる、大きなファミリーの一般名である。該ファミリーの顕著な特徴は、ウイルス潜伏及び再発性感染の傾向である。
【００２３】
口語で疱疹（ヘルペス）と呼ばれることが多いHSV感染は、通常、粘膜を標的とする。ウイルスは、膜面の割れ目又は切れ目から侵入し、その後、すぐ近くの基底細胞及び上皮細胞に増殖する。これは、炎症、浮腫、細胞溶解、及び特徴のある薄壁の小胞の形成を生ずる。HSVの主な疾患は、顔の疱疹（口、眼及び咽頭）、性器ヘルペス、新生児ヘルペス、並びに播種性疾患である。それ以外に、単純ヘルペス又は唇ヘルペスとして知られている口唇ヘルペスは、最も一般的な再発性HSV-1感染症である。小胞は、通常、唇のムコ‐皮膚結合、又は隣接した皮膚で出現する。ヘルペス性角膜炎（眼ヘルペスとも呼ばれる）は、潜伏ウイルスが、三叉神経の下顎枝よりも眼に感染する、眼の伝染性炎症である。予備症状は、眼の砂っぽい感じ、結膜炎、鋭い痛み、及び光に対する敏感性である。一部の患者は、同様に、枝状の角膜の傷又は不透明な角膜の傷を患う。事例の25%から50%において、角膜炎は、再発性で、かつ慢性であり、また、視覚を妨害し得る。
【００２４】
90%を超える事例で無症候性である、一次感染（Liesegangらの文献1989）は、唾液の感染粒子との接触の結果として口腔粘膜で起こる。感染直後、線状のウイルスゲノムは、円形になり、DNA複製は、起源で開始する（総説：BoehmerとLehmanの文献1997）。DNA複製は、最初、シータメカニズムによって進行し、その後、シグマ又はローリングサークル様式に切り替わって、長いヘッド・トゥ・テイルコンカテマー(head-to-tail concatemer)を産生する。相同組換え、配列媒介性ゲノム異性化(sequence-mediated genome isomerization)、及び他の事象から発生する複数のDNA複製フォークは、分岐DNA中間体の広範囲なネットワークの形成をもたらす。そして、これらの構造体は、単位長ゲノムに分割され、予めアセンブルされたカプシドに詰められる。それにもかかわらず、全長の標準HSV-1ウイルスDNAよりも短いDNA分子は、これらが分裂/パッケージングシグナルを含む場合、核カプシド内でカプシド形成するようになる（(Vlazny, Kwongらの文献1982）。しかしながら、標準ウイルスゲノムよりも顕著に短いHSV-1ゲノムを含むカプシドは、感染性ではない。
【００２５】
上皮組織での複製後、ウイルスは、潜伏するようになる前に、ニューロンで増殖する。1型HSVは、初めに、三叉神経又は第5脳神経に侵入し、2型HSVが、通常、腰仙部の脊髄神経幹の神経中枢で潜伏するようになるときにおいて、口腔領域に広範囲な神経支配を有する。熱、UV放射、ストレス、又は機械的損傷等の種々のトリガー因子に従って、ウイルスは、体表面に移動し、多くの場合、以前の感染と同じ部位で、局所的な皮膚又は膜障害をもたらす。潜伏HSV-1の主要な位置が、顔の感覚的な神経支配の原因である、三叉神経節であるので、再発のほとんどは、眼又は唇である。一般大衆におけるHSV-1の血清有病率は、24.5%〜67%であり、また、再発性口唇ヘルペスを経験する陽性被験者は、30%〜70%である（Liesegangの文献2001）。実際、死後組織でのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いる近年の研究が、少なくとも60歳の年齢の人のほぼ100%で、三叉神経節に存在する複数のHSV-1ゲノムコピーを有することを示した（Wang, Lauらの文献2005）ので、ほぼすべての人が潜在的にHSV-1感染事象を示し得る。眼、特に角膜は、HSV-1感染が2番目に起こる箇所である。ヘルペス性角膜炎の罹患率は、149/100,000であり、毎年、100,000人の住民当たり30を超える新しい事象がある（Labetoulle, Auquierらの文献2005）。一旦、眼がヘルペス感染によって臨床的な影響を受けた場合、再発の割合は、2年以内の追跡調査で23%であり、5年以内の追跡調査で40%である（Wilhelmus, Costerらの文献1981；Liesegangの文献1989）。視覚的な予後は、特に、深部の角膜感染（実質性角膜炎）で悪く、5年後の追跡調査において、20/40未満の視力に達する影響を受けた眼は、最大60%である（Kabra, Lalithaらの文献2006）。結果として、HSV-1は、世界中の盲目の主因である。低開発国では、HSV-1の眼の感染は、角膜クリニックで治療する患者の約10%を占め（Pramod, Rajendranらの文献1999）、最近30年間において、局所用又は口腔用抗ウイルス剤の使用にもかかわらず、単純ヘルペス性角膜炎も、世界のほとんどの先進地域における感染性角膜混濁の中で依然として最も多い原因であり（groupの文献1998）、角膜移植を受ける患者の約10%を占める（Leger, Larroqueらの文献2001）。さらに、近年移植された角膜におけるHSV-1再活性化の自然的危険は、外科手術後の最初の1年で約25%であり（Lomholt, Baggesenらの文献1995）、移植失敗（移植での清浄化なし）での約33%は、角膜におけるHSV-1ゲノムの存在に関連することを示した（Cockerham, Bijwaardらの文献2000）。これらのデータは、HSV-1が、何故、依然として角膜移植片失敗の主因であり、再移植の全事例の約22%を占めるかについて説明する。
【００２６】
潜伏及び再発性感染の臨床的合併症は、加齢、癌化学療法、又は免疫防御を損なう他の条件によってより重篤になる。HSVは、AIDS患者間で最も一般的で、かつ最も重篤な日和見感染性ウイルスである（RamaswamyとGerettiの文献2007）。このグループのおよそ95%は、皮膚、粘膜、腸の反復性の発作、及びこれらのウイルスによる眼疾患を経験する。
【００２７】
ヒト免疫不全ウィルス(HIV)は、後天性免疫不全症候群(AIDS)を生ずるレンチウイルス(lentivirus)（レトロウイルスファミリーのメンバー）であり（Weissの文献1993；Douek, Roedererらの文献2009）、ヒトの症状において、免疫系が機能しなくなり始め、生命の危険がある日和見感染をもたらす。HIVによる感染は、血液、精液、膣液、尿道球腺液、又は母乳の移動によって生じる。これらの体液内では、HIVは、感染免疫細胞内の遊離ウイルス粒子及びウイルスの両方として存在する。4つの主な感染ルートは、無防備性交渉、汚染された注射針、母乳、及び出産による感染した母親からその幼児への感染（垂直感染）である。HIVの血液製剤のスクリーニングは、主として、先進国の輸血又は感染血液製剤から感染を排除している。
【００２８】
ヒトにおけるHIV感染症は、世界保健機構(WHO)によって世界的に流行であると考えられている。1981年におけるその発見から2006年まで、AIDSは、2500万人を超える人を殺した。HIVは、世界の人口の約0.6%に感染する。2005年には、AIDS単独で、概算で生命を奪われた2.4〜3.3百万人のうち、570,000を超える人が子供であった。抗レトロウイルス療法は、死亡率及びHIV感染症の罹患率を共に低減する。
【００２９】
HIVは、ヘルパーT細胞（CD4+T細胞に特異的である）、マクロファージ、及び樹状細胞等のヒト免疫系において主に重要な細胞に感染する。HIV感染症は、3つの主なメカニズムを介して、低レベルのCD4+T細胞をもたらす。すなわち、第1のメカニズムは、感染細胞のウイルスを殺す指示であり；第2メカニズムは、感染細胞のアポトーシスの割合の増加であり；そして、第3メカニズムは、感染細胞を認識するCD8細胞傷害性リンパ球による、感染CD4+T細胞を殺すことである。CD4+T細胞数が臨界レベルより下で減少する場合、細胞性免疫は失われ、また、身体は、日和見感染に対して、次第に影響を受けやすくなる。
【００３０】
HIV-1に感染したほとんどの人々は、最終的に、発症したAIDSを治療せずに放置し、免疫系の進行性不全に関連する日和見感染又は悪性腫瘍で最終的に死亡する（Lawnの文献2004）。HIVは、ウイルス、宿主及び環境要因による影響を受ける可変率でAIDSに進行する。この大部分は、HIV感染10年以内にAIDSに進行し、一部は、すぐに進行し、一部は、AIDS進行まで非常に時間が長くかかる（Buchbinder, Katzらの文献1994; 2000）。抗レトロウイルス剤による治療は、HIVに感染した人々の平均寿命を上昇させ、HIVが診断可能なAIDSに進行した後であっても、抗レトロウイルス療法による平均生存期間は、2005年時点で5年を超えると推定された（Schneider, Gangeらの文献2005）。抗レトロウイルス療法をしない場合、AIDSに罹患する人は、一般に、1年以内に死亡する（Morgan, Maheらの文献2002）。
【００３１】
（ウイルス感染の診断及び治療）
ウイルス疾患は、種々の臨床的手法及び検査室手法によって診断される。これらには、症状の臨床評価、細胞又は動物培養物におけるウイルス単離、及びウイルスの抗体についての血清試験が含まれる。ウイルス感染の診断をすることは、症状を含む、十分な個人及び家族病歴をとり、身体検査を完了することにより開始する。季節性インフルエンザ等の一部のウイルス感染の診断は、病歴及び身体に基づいて行ってもよい。完全血球算定等の血液検査を行ってもよい。完全血球算定は、白血球(WBC)を含む、種々の型の血球の数を測定する。種々の型のWBCは、ウイルス感染等の感染過程時において、特徴的な形で数が増加する。また、培養物試験も行ってもよい。この試験は、ウイルスに感染した疑いのある身体領域から少量の試料を採取し、該試料を増殖させ、疾患を生ずる微生物の型を決定することを必要とする。培養物で試験する一般的な試料には、喉からのもの、血液、及び肺からの唾液が含まれる。また、診断試験には、脊髄穿刺と呼ばれる腰椎穿刺も含まれてもよく、これは、針によって、背骨から脳脊髄液(CSF)の少量の試料を回収することを含む。CSFの試料は、白血球、及び、ウイルス性髄膜炎等の、背骨又は脳に存在し得る他のウイルス感染の徴候について試験される。一部のウイルス感染の診断を支援するために、X線を行ってもよい。これには、ウイルス性肺炎の疑わしい事例のために、胸部X線をとることが含まれてもよい。ウイルス感染に伴って生じ得るか、又は二次細菌感染等の同様の症状を生じ得る、他の疾患を除外するか、又は確認するために、追試を行ってもよい。
【００３２】
HSV感染は、症状の臨床評価、細胞又は動物培養物の単離、及びHSVの抗体についての血清試験を含む、種々の臨床的手法及び検査室手法によって診断される。口又は外陰部の粘膜上の小さく、痛く、水泡状になる傷、リンパ節症、及び浸出物は、単純ヘルペスの一般的な診断症状である。更なる診断のサポートは、ギムザ(Giemsa)、ライト(Wright)（ツァンク(Tzanck)前処理とも呼ばれる）、又はパパニコロー(Papanicolaou (Pap))法により染色したかかる傷の基部からの剥離表皮を検査することによって、利用可能である。多核細胞、巨大細胞、及び原子核内の好酸性封入体の存在は、ヘルペス感染の証明を支援し得る。しかしながら、この方法は、HSV-1、HSV-2、又は他のヘルペスウイルス間を識別せず、これは、より特異的な亜型分類を必要とする。さらに、実験室培養及び特定の試験は、免疫抑制された新生児患者、及び重篤で播種したヘルペス感染新生児患者の診断にとって不可欠である。組織又は流体の試料は、サル腎臓又はヒトの胚の腎臓組織培養物等の一次細胞株に導入され、その後、24〜48時間以内に、細胞変性効果について観察する。蛍光抗体を用いる試料若しくは細胞培養物、又はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による、特定のプローブ又は増幅を用いる、DNAの検出における直接的な試験は、HSV-1、HSV-2、及び密接に関連するHSV間で識別することができるが、試料中にみられる前記ウイルスのゲノムが無傷であるか又は感染性があることを確認する有用なツールではない。血清学的解析は、一次感染に有用であるが、感染再発におけるHSVに対する抗体力価が通常増加しないので、これは、再発性の疾患には決定的でない。
【００３３】
複数の薬剤が、HSV感染の治療に利用可能である。アシクロビルは、無毒性で、HSVに対して高度に特異的である、現在までに開発された中で最も有効な療法である。ファムシクロビル及びバラシクロビルは、代替的な薬剤である。生殖器及び口腔の傷に適用される局所用薬剤は、感染の長さを縮め、ウイルスの出芽を低減する。全身治療は、ヘルペス性角膜炎及び播種性ヘルペス等の重篤な合併症に利用可能である。新しい証拠は、1年に6ヶ月間で採用された経口的なアシクロビルの1日量が、再発性性器ヘルペスを防ぐのに有効になり得ることを示す。メントール、樟脳及び局所麻酔薬を含む、処方箋不要の唇ヘルペス薬剤は、痛みを少なくし、二次細菌感染に対して保護し得るが、これらは、おそらく、ウイルス感染の進行に影響を与えない。唇ヘルペスを抑制する一部の保護は、アミノ酸リジンから得て、再発の最も早い段階に、経口的に採用することができる。しかしながら、現在の治療は、DNAマトリックスの負荷を低減せず、そのため、更なるウイルス再活性化の危険性を低減することができない。理想的には、HSV-1感染に対する最終兵器は、細胞に永続的に存在し、感受性の問題を回避し、可能であれば、ウイルスゲノムの負荷を低減する。エンドヌクレアーゼの作用によってウイルスDNAを排除する目的で、新しい抗ウイルス療法は、開発中である。
【００３４】
角膜におけるHSVのウイルスDNAの検出は、涙流体（Fukuda, Deaiらの文献2008）、角膜の剥離表皮（El-Aal, El Sayedらの文献2006）、及び健全な人及び疾患患者の角膜外植片ボタン（Crouse, Pflugfelder らの文献1990）で、PCRに基づく方法（Llorente, Hidalgoらの文献1998；Gonzalez-Villasenorの文献1999；Kessler, Muhlbauerの文献2000；O'Neill, Wyattらの文献2003；Kimura, Ihiraらの文献2005；Namvar, Olofssonらの文献2005；StrickとWaldの文献2006；Susloparov, Susloparovらの文献2006；Engelmann, Petzoldらの文献2008；Sugita, Shimizuらの文献2008；Tanaka, Kogawaらの文献2009；Wada, Mizoguchiらの文献2009；Yu, Shiらの文献2009）、又は感染細胞でのDNA/DNAハイブリダイゼーション（Nago, Hayashiらの文献1988；KotroniasとKapranosの文献1998）を用いて、行われている。しかしながら、これらの方法は、単一解析における感染細胞での感染性HSVゲノムの検出及び特性評価の両方が可能でない。
【００３５】
HSVは、ウイルス疾患の１つの型であり、大規模な範囲のHSV感染の診断技術が、種々の特許及び刊行物に開示されている。例えば、欧州特許第0139416号、欧州特許第0263025号、国際公開公報第0202131号、国際公開公報第2004036185号、並びに、Matsumoto, Yamadaらの文献1992、KotroniasとKapranosの文献1998、Kessler, Muhlbauerらの文献 2000、Namvar, Olofssonらの文献2005、Susloparovらの文献2006、 Sugita, Shimizuらの文献2008、及びYu, Shiらの文献2009に開示されている。
【００３６】
HSV感染症の診断の最も信頼できる方法は、測定用のウイルスを単離することであるが、この方法は、培養細胞を必要とし、測定に数日必要とする。また、免疫学的方法もあるが、これらは、特に、潜伏期に、多くは信頼性が低く、行うのが困難である。多くのPCRに基づく方法は、従来の手段よりも可能な限り、感度を高める及び結果が出るまでの時間を速くするために開発されているが、これらの方法は、すべてのHSVゲノムの解析をすることができず、前記ウイルスの完全なゲノムが試験されないので、ウイルスのヌクレオチド配列を含む試料の感染性を予測することができない。細胞インサイチュハイブリダイゼーション（Nago, Hayashiらの文献1988；KotroniasとKapranosの文献1998）、又はドットブロットDNA-DNAハイブリダイゼーション（Matsumoto, Yamadaらの文献1992）において、HSVゲノム検出の直接法が報告されているが、これらの方法は、HSVの型を決定することができない。HSV疾患の迅速で、感度が高く、特異的な診断が必須である、事例が存在する。したがって、HSVの診断を支援する迅速で感度が高いツールを開発するという、臨床的必要性がある。また、HSV感染分類のためのツールの必要性も残っている。ウイルス感染に関与する特定の原因菌の迅速な識別は、短期間内での適切な療法を決定するために使用することができる情報を提供する。
【００３７】
細胞溶解又は潜伏感染後のHSV-1ゲノムの形態の解析は、Gardellaらのゲル電気泳動システムによって行われている（Gardella, Medveczkyらの文献1984）。これらのゲルでは、円形分子は、対応する線状形態よりも低い移動性を特徴的に示し、また、これは、潜伏するヘルペスウイルスゲノムのエピソームの形態の検出を可能にした。しかしながら、この方法は、感染した細胞又は組織のHSVゲノムの異性体間で識別しない。パルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)等の他の方法は、HSV DNA複製のメカニズムに対する洞察を提供するために使用されている（Severini, Morganらの文献1994）。この類の試験は、非常に多くの時間を要し、すべての事例で、サザンブロッティングを必要とし、放射能、長い移動時間及び／又は露光時間の操作を示唆する。
【００３８】
多数の検出方法及び分析方法が報告されている他のウイルスは、HIV-1及びHIV-2を含むヒト免疫不全ウィルス（又はHIV）である。HIV-1 RNAのコピーの数によって測定される、血漿中のHIV-1負荷は、臨床実務で広く使用される主な研究室用のマーカーである。高いウイルス負荷は、HIV-1感染した個体におけるAIDSへの急速な進行に直接関係する。また、高活性抗レトロウイルス療法(HAART)の効果も、血漿中のHIV-1負荷を測定することによって評価される。血漿中のHIV-1負荷が、一般に、血漿ml当たりのHIV-1 RNAの50のコピーである、商用分析の検出限界以下に留まる場合、患者は、HAARTによって良好に治療されると考えられる。しかしながら、臨床的な成功にもかかわらず、HAARTは、主として、潜伏感染した休止CD4+細胞を含む種々のウイルスリザーバの持続性により、ウイルスを根絶することができない（Hermankova, Silicianoらの文献2003年；Siliciano,Kajdasらの文献2003）。近年の研究は、血漿中のHIV-1 RNAが検出不能な場合であっても、ウイルス増殖及び進化が共に一部の患者に継続し、それ以外に、療法が、良好であると考えられることを示した（Frenkel, Wangらの文献2003；Havlir, Strainらの文献2003；Ramratnam, Ribeiroらの文献2004；Chun, Nickleらの文献2005；Tobin, Learnらの文献2005）。薬剤耐性型HIV-1株の発生の結果のよるHAARTの失敗は、一般的な問題である（del Rioの文献2006）。したがって、末梢血単核球(PBMC)におけるその分子マーカーの研究によって、HIV-1の残存複製(residual replication)の特性評価に特別の注意を払うことが必要である。特に、細胞関連HIV-1 RNA及びプロウイルスDNAの量は、定量化する必要がある。これらのうち、プロウイルスDNAの量は、潜伏感染した細胞のプールのサイズに反映し得る。しかしながら、細胞のHIV-1 RNA/DNAレベルと治療結果の関係に関する組織的研究は、HAART下におけるPBMC中の非常に低いコピー数のHIV-1 RNA/DNAによって妨げられる。したがって、HIV-1 RNA/DNAの細胞形態の定量化のための高感度の方法の開発が不可欠である。
【００３９】
実時間逆転写PCR (RT-PCR)は、一般に、細胞におけるHIV-1 RNA/DNAの定量化のための好ましい方法である（Douek, Brenchleyらの文献2002；Fischer, Joosらの文献2004）。しかしながら、精度及び特異性にもかかわらず、TaqMan検出化学作用を用いるシングルステップ実時間RT-PCR法は、全細胞RNA/DNAの情況における反応当たりのHIV-1 RNA/DNA標的の100未満のコピーを確実に定量化することができない（Espy, Uhlらの文献2006）。これは、HAART下における患者のPBMC物質が研究される場合、特に、臨床物質の制限量が分析に利用可能な場合、偽陰性の結果をもたらす可能性を誘発する。HIV-1 RNA/DNAを検出するためにSYBRグリーンに基づく検出化学作用を用いる方法は、感度が高い（Espy, Uhlらの文献2006）が、DNA結合染料が配列特異的に結合しないので、偽陽性の結果の傾向がある。反応当たり1つの分子の理論的な検出限界で、入れ子PCRは、実時間PCRよりも感度が高い方法であると考えられる。しかしながら、半定量的データしか、この方法で示すことができない。さらに、これは、労働集約型で、多くの時間を要する試験手順を必要とする。対照的に、以下に記載するように、本発明者らは、分子コーミングが、特有の事象の検出を可能にし、また、患者の感染細胞におけるHIVプロウイルスDNAの検出及び定量化のための高感度の方法として、用いることができることを発見した。
【００４０】
ウイルス感染を診断するために、抗原検出分析の使用は、特に、モノクローナル抗体に基づく分析において、増加にある。DNA又はRNAに対する特定のプローブを使用する、迅速な核酸検出方法又は増幅方法は、複数のウイルスに対する他の選択肢である。これらは、感度が高いため、単一の感染細胞のウイルス核酸をおそらく検出することができるという長所を有する。例えば、多くの場合、他の方法によって検出不能なわずかな量のDNAの酵素的増幅を可能にするPCR法は、HSV（Rowley, Whitleyらの文献1990）、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)（Ou, Kwokらの文献1988）、及びヒトパピローマウイルス(HPV)（Shibata, Arnheimらの文献1988）等の複数のウイルス剤のゲノムの一部の検出に広く使用されている。
【００４１】
PCRの顕著な限界は、検出される完全なゲノムの一貫性を確認することができず、そのため、試験試料でみられる完全な感染性ウイルスゲノムの特性評価の基準になり得ないことである。したがって、結果が、検出されたウイルスのポリヌクレオチドが感染性か否かについて示さないので、PCRは、感染性ウイルス粒子に対する抗ウイルス療法の効率を試験するのに必要な特異性も欠く。血清学的方法は、染色体組込みウイルスゲノムDNA等の感染性ウイルスのポリヌクレオチドを直接検出せず、検出前に、対象がウイルスに対して免疫反応すること、又は十分な量のウイルス抗原が試料中に含まれることを必要とする。
【００４２】
（ウイルス癌遺伝子の検出、及びウイルスによるプロト癌遺伝子の活性化）
多くの癌は、ウイルス感染から生じる。これは、鳥類等の動物だけでなく、ヒトにおいてもとりわけ該当する。世界中の、WHO国際癌研究機関(International Agency for Research on Cancer)は、2002年において、20%のヒトの癌が、7つの異なるウイルスのうちの1つにより10〜15%が生じる感染によって、生じると推定した（Carrillo-Infante, Abbadessaらの文献2007）。しかしながら、ヒト又は動物の少数が感染後に癌に進行する（Carrillo-Infante, Abbadessaらの文献2007）。腫瘍ウイルスには種々の形態がある。HPV（子宮頸癌）、B型肝炎ウイルス（肝臓癌）、及びEBV（リンパ腫の一種）等のDNAゲノムを有するウイルス、並びにC型肝炎ウイルス(HCV)のようなRNAゲノムを有するウイルスは、DNAゲノム及びRNAゲノムを共に有するレトロウイルスのように、癌を生じ得る（ヒトT-リンパ親和性ウイルス及びB型肝炎ウイルスは、一本鎖と二本鎖DNAウイルスの混合物として正常に複製するだけでなく、レトロウイルス複製成分を有する）。
【００４３】
直接的な腫瘍発生ウイルスのメカニズムは、宿主細胞（急性形質転換ウイルス）への付加的なウイルス腫瘍発生遺伝子の挿入、又はゲノム（遅延性形質転換ウイルス(slowly-transforming virus)）に既に既存する腫瘍発生遺伝子（プロト癌遺伝子）を増強することのいずれかを含む（総説：Parsonnetの文献1999）。急性形質転換ウイルスでは、ウイルス粒子は、ウイルス癌遺伝子(v-onc)と呼ばれる過活動の癌遺伝子をコードする遺伝子を有し、また、v-oncが発現されるとすぐに、感染細胞が形質転換される。対照的に、遅延性形質転換ウイルスでは、ウイルスゲノムは、特に、レトロウイルスの必須の部分である、ウイルスゲノム挿入として、宿主ゲノム中のプロト癌遺伝子付近で挿入される。ウイルスプロモーター又は他の転写調節エレメントは、次に、そのプロト癌遺伝子の過剰発現を生じ、次には、抑制されない細胞の増殖を誘導する。ウイルスゲノム挿入がプロト癌遺伝子に特異的でなく、そのプロト癌遺伝子の付近での挿入の可能性が低いので、遅延性形質転換ウイルスは、既にウイルス癌遺伝子を有する、急性形質転換ウイルスと比較して、非常に長い腫瘍潜伏性を有する。
【００４４】
細胞に感染し、円形のエピソーム又はプラスミドとして持続する場合、一部のウイルスは腫瘍発生性であり、宿主細胞DNA（エプスタインバーウイルス及びカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス）と独立して複製する。また、間接的なウイルスの癌原性も存在し、これは、HCV誘発性肝臓癌の事例にあるように、感染の数十年間に生じる慢性の非特異性炎症に関与する。これらの2つのメカニズムは、生物学と疫学で異なる。すなわち、直接的な腫瘍ウイルスは、細胞を癌にさせる少なくとも1つのタンパク質又はRNAを発現する、すべての腫瘍細胞で少なくとも1つのウイルスコピーを有する。外来ウイルス抗原は、これらの腫瘍中で発現し、結果的に、AIDS又は臓器移植患者等の免疫抑制される人は、これらの型の癌の非常に高い危険性がある。
【００４５】
（ウイルスベクターの使用に基づく遺伝子療法又は細胞療法）
遺伝子の有害な突然変異対立遺伝子が、機能的なものと交換される場合、遺伝子療法は、遺伝病等の疾患を治療する、個体の細胞及び組織への遺伝子の挿入を含む。該方法は、依然として、初期にあるが、これは、一部の成功によって使用されている。ウイルスベクターは、一般に、組織（遺伝子療法）又は細胞（細胞療法）にかかる遺伝物質を科学的に送達することによって使用されるツールである。これらのウイルスベクターは、主として、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、又はヘルペスウイルス由来である（総説：Thomas, Ehrhardtらの文献2003）。
【００４６】
これらの宿主の遺伝物質は、DNAの形態であるが、レンチウイルス又はレトロウイルス中の遺伝物質は、RNA分子の形態である。ウイルスのこれらの分類のゲノムは、感染した組織又は細胞で移動する関心を惹く遺伝子配列の挿入によって、改良することができる。野生型ウイルスのように、組換えウイルスは、一部の酵素（すなわち、逆転写酵素及びインテグラーゼ）と共に、そのRNAを細胞に組み込む。組換えウイルスからのこのRNA分子は、そのRNA分子からDNAコピーを生産し、その後、宿主細胞の遺伝物質に組み込むことができる。このDNAコピーが生産され、宿主細胞の核において遊離した後、これは、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。すなわち、これは、インテグラーゼと呼ばれるウイルス中に有する別の酵素によって、細胞中の染色体に挿入される。この宿主細胞が後で分割すると、その子孫はすべて、新しい遺伝子を含む。
【００４７】
レンチウイルス又はレトロウイルスの使用において生じ得る、遺伝子療法の問題のうちの1つは、インテグラーゼ酵素が、宿主のゲノムにおける任意の位置に、ウイルスの遺伝物質を挿入するということである。これは、無作為に、遺伝物質を染色体に押し込む。遺伝物質が、宿主細胞の元の遺伝子のうちの1つの中心に挿入される場合、この遺伝子は分裂する（挿入突然変異）。遺伝子が1つの調節型の細胞分裂を生ずる場合、制御されない細胞分裂（すなわち、癌）が生じ得る。この問題は、一本鎖のホーミングエンドヌクレアーゼの利用（Grizot, Smithらの文献2009）によって、又は特定の染色体部位への組込み部位を案内する、遺伝子座制御領域等の特定の配列を含めること（Zhou, Zhaoらの文献2007）によって、最近検討され始めている。
【００４８】
アデノウイルスは、これらの遺伝物質を二本鎖DNAの形態で有するウイルスである。これらは、ヒトにおいて、呼吸器、腸、及び眼の感染を生ずる（特に、風邪）。これらのウイルスが宿主細胞に感染する場合、これらは、宿主にDNA分子を組み込む。アデノウイルスの遺伝物質は、宿主細胞の遺伝物質に組み込まれる。DNA分子は、宿主細胞の核において遊離したままで放置され、また、この余剰のDNA分子における命令は、まるで別の遺伝子のように転写される。ただ一つの相違は、細胞の子孫が余剰の遺伝子を有さないように、細胞が細胞分裂を経る場合、これらの余剰の遺伝子が反復されないということである。パルボウイルスファミリーのアデノ随伴ウイルス(AAV)は、一本鎖DNAのゲノムを有する小さなウイルスである。野生型AAVは、約100%の確実性で、染色体19上の特定部位に遺伝物質を挿入することができる（HuserとHeilbronnの文献2003）。しかし、組換えAAVは、ウイルス遺伝子を含まず、そして、治療遺伝子すら含まず、ゲノムに組み込まれない。その結果、宿主細胞のゲノムへの組込みの欠如は、癌の進行を防ぐが、アデノウイルスベクター又はAAVのいずれかによる治療は、増殖する細胞集団における再投与を必要とする。
【００４９】
ヘルペスウイルスは、他のウイルスベクターに対するこれらの特定の長所により、遺伝子導入ベクターとして一般に使用される。HSV由来ベクターの特有の特徴は、外来DNAの長い配列を有することを可能にするウイルス粒子の非常に高度の遺伝子組換能、ウイルスゲノムの遺伝的複雑性、腫瘍崩壊活性を有する種々の型の弱毒化ベクターの発生を可能にすること、及び、HSVベクターによる侵入能と、遺伝子組換えが強くかつ長期に発現し得る、知覚神経節からのニューロン中の生涯無毒性の潜伏感染の定着能である。異なる3つの分類のベクターは、HSV由来であり得る。すなわち、複製可能弱毒化ベクター、複製不能組換えベクター、及びアンプリコンとして知られている、欠損ヘルパー依存ベクターである。複製欠損HSVベクターは、1以上の前初期遺伝子（例えば、相補性細胞株によってトランスに提供されるICP4）の欠失によって作出される。腫瘍崩壊HSVベクターは、癌の有望な治療剤である。かかるHSVに基づくベクターは、神経膠腫、黒色腫及び卵巣癌患者で試験されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００５０】
本発明者らは、驚くべきことに、特別に設計したプローブ又はプローブ集合（sets of probes）と組み合わせて、分子コーミング及び／又はDNA伸長法によって、感染性ウイルスDNA又は他の病原性遺伝子を有する対象を診断、検出、又はモニターすることができることを発見した。これらの診断の適用は、公知の培養細胞株から容易に得られるDNA試料で一般に分子コーミングを行った先行技術において、知られていない。分子コーミングは、過去に、染色体分析について適用されているが、ウイルス感染の診断又は試料中の他の病原性ポリヌクレオチドの検出に、本方法又は本方法の適応物を有用に適用できることは、過去に認識されなかった。一方、本発明者らは、驚くべきことに、ウイルス感染した対象の生体試料から直接得られるDNAを、分子コーミング法及び活性のある、これらの試料で検出された感染性ウイルスDNAによって評価できることを発見した。これらの方法は、ウイルス感染のための既存の診断方法に関連する問題の多くを克服し、ウイルス感染した対象又は患者の感染性ウイルスのポリヌクレオチドの検出及びモニタリングための、好都合で、迅速かつ正確な方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００５１】
（発明の概要）
本発明は、少なくとも、5%、10%、25%、50%、75%で結合することができる、特異的なプローブ（特に、感染性ポリヌクレオチド配列又は病原性ポリヌクレオチド配列の80〜100%に結合する、プローブ集合）と組み合わせて、分子コーミング及び／又はDNA伸長法を用いる、対象又は患者の試料において、ウイルスゲノム配列を含む、感染性ポリヌクレオチド配列又は病原性ポリヌクレオチド配列を検出するための、信頼性があり、簡単で、迅速で、かつ安価な方法を提供する。本発明の方法は、インビトロで実行される。
【００５２】
本発明者らは、分子コーミングが、(i) 感染角膜における感染性単純ヘルペスウイルスDNA等の、感染した哺乳動物の細胞、組織又は体液におけるウイルスDNA又はウイルス起源DNAを検出及び定量化し、(ii) 感染した哺乳動物の細胞組織又は体液で生じるウイルスの複製及びウイルスゲノムの再編成を追跡し、及び(iii) 感染した細胞、組織又は体液中に含まれる感染性ウイルスのポリヌクレオチドを同定する、強力な方法であることを発見した。
【００５３】
感染した細胞又は組織におけるウイルスを検出するための先行技術と異なり、本発明の分子コーミング法は、同時に行うことができ、多重の時間消費及び高価な手順を必要としない。本発明の方法は、感染性ウイルス若しくは感染性ウイルスのポリヌクレオチドの量、又は感染した哺乳動物の細胞若しくは組織におけるウイルスの複製に対する、抗ウイルス療法の効果若しくは効能を定量化するか、又はそれ以外に評価することによって、抗ウイルス療法の効果を決定するのに有用な、細胞又は組織におけるウイルス汚染又は感染を検出する診断ツールとして、容易に適用可能である。本発明者らは、分子コーミングが、PCRに基づく方法を含む、ウイルス感染を検出するか、又は診断するための過去の方法に関連する問題の多くを克服することを発見し、そのために、容易で迅速な方法を提供する。本発明の具体的な実施態様には、次に示すものが含まれる。
【００５４】
生体試料におけるウイルスゲノム又は感染性ウイルスのポリヌクレオチドを検出する方法であって、前記試料から、ポリヌクレオチドを単離すること、抽出すること、又は、それ以外に得ること；と、前記ポリヌクレオチドを分子コーミングして、伸長したポリヌクレオチドを形成すること；と、伸長したポリヌクレオチドを、感染性ウイルスのポリヌクレオチド配列又はゲノムウイルスのポリヌクレオチド配列を認識する、1以上のプローブに接触させること；と、コーミングされた試料に対するプローブのハイブリダイゼーションを検出することと、を含む、前記方法。ポリヌクレオチドは、感染性ゲノムウイルスDNA若しくは感染性非ゲノムウイルスDNA、癌遺伝子若しくはプロト癌遺伝子であってもよく、対象の染色体に組み込まれてもよく、又はエピソーム若しくは遺伝子組換えDNAであってもよい。重要なことには、すべてのウイルスゲノム又はすべての感染性ウイルスDNAの検出は、感染に関連する。例えば、ヘルペス性角膜炎のHSV原因物質に関して、細胞において完全な感染性ゲノムの存在を示し、そして、感染細胞に部分的か又は完全に発生できることが必要である。
【００５５】
生体試料は、一般に、対象又は患者から直接得られ、組織、細胞試料、血液、CSF、滑液試料、又は他の流体の生体試料から構成され得る。伸長又は分子コーミングのためのDNA分子若しくは繊維は、生体試料から抽出することができる。試料は、生存しているか又は生存していない対象から得てもよい。対象には、ヒト、畜牛(cattle)、ウシ属の動物(bovine)、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、及びヒト以外の霊長類等のヒト以外の哺乳動物；ニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ダチョウ、エミュー、又は他の鳥類等の鳥類；爬虫類、両生類、及び他の動物を含む、ウイルス疾患にかかりやすい動物が含まれる。
【００５６】
伸長されたか、又はコーミングされたDNA分子は、感染性ゲノム若しくは生物学的に活性のあるゲノム、感染性ウイルス、癌遺伝子、又はプロト癌遺伝子DNAを同定するのに適切な1以上のプローブに接触させる。DNAウイルスの検出において、1以上のプローブ、好ましくは、ウイルスゲノムの80〜100%、又は介在するサブ範囲若しくは値を網羅する、1組のプローブが利用される。DNAウイルスは、一本鎖か又は二本鎖であり得る。代表的なDNAウイルスには、単純ヘルペスウイルス(HSV) 1型及び2型、パピローマウイルス、及びB型肝炎ウイルス等の肝炎ウイルス等のヘルペスウイルスが含まれる。また、HIV等のレトロウイルス（好ましくは、宿主染色体にプロウイルスとして組み込まれた、レトロウイルス）に結合する、プローブも、同様の方法で選択され、好ましくは、プロウイルスゲノムの80〜100%を網羅する、1組のプローブが利用される。
【００５７】
プローブは、既に感染性であることが知られているウイルス株のゲノムの少なくとも5%、好ましくは80〜100%に対応することができるか、又は、特定の種類のウイルスの複製、繁殖若しくは病原性にとって不可欠であることが知られている遺伝子の組合せを包含するように、設計することができる。
【００５８】
前記プローブは、HSV-1 (NC_001806.1)（配列番号15）、HSV-2 (NC_001798.1)（配列番号16）、HIV1 (NC_001802.1)（配列番号17）、HIV2 (NC_001722.1)（配列番号18）、HBV (NC_003977.1)（配列番号19）、HPV16 (NC_001526.2)（配列番号20）、HPV18 (X05015.1)（配列番号21）、HPV31 (J04353.1)（配列番号22）、HPV33 (M12732.1)（配列番号23）、及びHPV45 (X74479.1)（配列番号24）に対応することができ、また、これらは、登録番号を参照することにより組み込まれる。
【００５９】
1以上のプローブ又はプローブ集合（probe set）は、種々の標識によって標識される2、3以上のプローブのサブセットを含んでもよい。好ましくは、かかるプローブは、ゲノムDNA若しくは感染性ウイルスDNAの形態を決定するか、又は、ウイルスゲノムDNA分子、感染性ウイルスDNA分子若しくは他の病原性DNA分子（癌遺伝子若しくはプロト癌遺伝子等）の種々の部分若しくはセグメントを同定するために使用される。
【００６０】
別の実施態様において、本発明は、哺乳動物の細胞、組織若しくは体液における感染性ウイルスのポリヌクレオチド配列若しくはゲノムウイルスのポリヌクレオチド配列を検出するか、又は同定する方法であって、分子コーミングを用いて、細胞、組織若しくは体液における感染性ウイルスのポリヌクレオチド若しくはゲノムウイルスのポリヌクレオチドの存在若しくは量を検出することを含む、方法に関する。さらに別の実施態様は、感染性ウイルスのポリヌクレオチド配列又はゲノムウイルスのポリヌクレオチド配列を定量化する方法であって、感染していない対照試料又はそれ以外の種々の時点で得られる同様の試料と比較して、細胞、組織又は体液における感染性ウイルスのポリヌクレオチド又はゲノムウイルスのポリヌクレオチドの量を検出することを含む、方法を構成する。
【００６１】
また、ウイルスの存在を検出するか、又は生体試料におけるウイルスの複製を検出する方法、並びに、特に、哺乳動物の細胞、組織若しくは体液における、ウイルスの複製又はウイルスゲノム若しくは感染性ウイルスDNAの再編成を縦方向に追跡する方法も熟慮される。かかる方法は、細胞又は組織における潜伏ウイルスDNA若しくは複製ウイルスDNA、又は再編成されたウイルスDNAの存在のための、適切な試料又は特定の期間に採取した試料から得られる分子コーミングDNAによって、行うことができる。
【００６２】
また、本発明は、抗ウイルス療法の効果を評価する方法であって、分子コーミングを用いて、対象から得られる試料における感染性ウイルスDNA若しくはゲノムウイルスDNAの存在、編成若しくは量を検出すること、抗ウイルス剤によって対象を治療すること、又は他の抗ウイルス療法を行うこと、及び、治療後に、本明細書に記載する分子コーミング法を用いて、感染性ウイルスDNA若しくはゲノムウイルスDNAの存在、編成若しくは量をモニター又は再評価することを含む、前記方法に関する。
【００６３】
分子コーミングを行うためのキットは、分子コーミング装置及び／又は試薬と、感染性ポリヌクレオチドに結合する1以上のプローブと、場合により、1以上の細胞、組織又は体液試料、並びに分子コーミング、DNA伸長又はハイブリダイゼーションを行うための他の従来の原料と、を含む。一部の実施態様において、該キットは、コーミングされたDNA分子におけるゲノムウイルスDNAを検出するか、又は同定するための1組のプローブを含み、該プローブは、ウイルスゲノム、感染性ウイルス核酸、癌遺伝子、若しくはプロト癌遺伝子の少なくとも5%（特に、80、85、90、95、99若しくは100%）を網羅する。プローブ又はプローブ集合の最小長さは、1kbである。一部の実施態様において、該キットは、感染性配列を検出するか、又は分類するためのソフトウェアを更に含む。また、別の実施態様において、該キットは、本発明の方法によってウイルスゲノム又は感染性ウイルス核酸を検出するための説明書を更に含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は、本発明によって使用することができるHSV-1特異性プローブの一例を示す。ドットプロットは、HSV-1ゲノム配列（水平軸）とHSV-1特異性プローブ（垂直軸）の間の比較を表し、互いに異なるプローブをマッピングする。HSV-1断片（HSV-S54、-B52及び-S58）の一部は、逆反復配列とハイブリダイズし、結果的に、2つのコピーに存在する。表AにリストするHSV-1断片は、HSV-1ゲノムを検出するために、関連づけて、種々の色で示すことができる。この例において、次に示すように、41のプローブの関連性（63の利用可能なプローブにおいて、表A）は、HSV-1ゲノムの99%を網羅することを可能にする。HSV-S54、-P4、-P5、-S4及び-B4断片は、見かけ上、H1 21kbのプローブに対応する。見かけ上のH2 56kbのプローブは、19の重複プローブ（HSV-B7、-B8、-S14、-B10、-S16、-B13、-S18、-B15、-S21、-B19、-S23、-B21、-B22、-S30、-S31、-S32、-B26、-P8及び-B28断片）からなる。45kbのH3プローブは、HSV-B30、-S44、-S45、-B38、-B39、-B40、-S49、-B44、-B45、-B46、-B48及び-S54断片からなる。逆反復配列の存在により、H4 (13kb)及びH6 (6.5kb)プローブは共に、HSV-B52及び-S58断片からなる。また、HSV-S59断片もH4プローブに存在する。そして、3つの重複する断片（HSV-S60、-B58及び-B60）は、H5 7.5kbのプローブを形成した。HSV-1ゲノムの特定領域に特異的なシグネチャを形成する、位置特定プローブ(localization probe)は、H1、H3及びH5プローブで赤色（ジゴキシゲニン標識、黒色の囲み）、H2、H4及びH6プローブで緑色（ビオチン標識、グレーの囲み）である。位置特定プローブのサイズ（最も近いkbに四捨五入）は、各囲みの下にそれぞれ示す。
【００６５】
【図２】図２は、ウイルス粒子からのHSV-1 DNA抽出の2つの方法の比較を示す。図２Ａは、シラン処理表面上のコーミングされたHSV-1 DNAの一例を示す。標準フェノールクロロホルム（左の写真）、又はアガロースプラグに埋め込まれたHSV-1からの改良抽出プロトコール（右の写真）のいずれかによって抽出したHSV-1 DNA溶液のコーミング後、繊維を、挿入剤YOYO-1によって明らかにし、カメラを装備したエピ蛍光顕微鏡で観察する。該図は、各抽出方法の特徴である2つの写真を示す。縮尺はバーとして表示する。図２Ｂは、HSV-1粒子から単離されたゲノムDNA上に含まれる所定の間隔内のDNA繊維サイズの累積度数を示す、ヒストグラムである。間隔幅は10μmである。したがって、例えば、3番目の点は、[30〜40μm]間隔における測定数を表す。左のパネルは、標準フェノール：クロロホルム抽出で抽出したDNA溶液において記録された（654の測定）、すべてのHSV-1 DNA繊維の長さを示す。繊維のメジアン径は、18μm（すなわち、36kb）である。右のパネルは、代替方法で得られるDNA繊維の長さの分布（2322の測定）を示す。この場合、分布のメジアン径は、42μm（すなわち、84kb）である。
【００６６】
【図３】図３は、ウイルス粒子及び感染細胞から抽出されたDNA溶液におけるHSV-1ゲノムの異性体の検出を示す。図３Ａは、コーミングされたHSV-1 DNAにおけるFISHの一例を示す。HSV-1ゲノムの種々の異性体に対応するハイブリダイゼーションパターンの種々の可能性のある組織の概略図を示す（ジゴキシゲニン標識H1、H3及びH5プローブは、黒色の囲みで表し；ビオチン標識H2、H4及びH6プローブは、グレーの囲みで表す）。また、「HSV-1検出シグナルの分析」の節に定義する、最低条件ハイブリダイゼーションパターンも、完全なシグナルのちょうど上に示す。代表的な線状の4つのハイブリダイゼーション鎖は、HSV-1ゲノムの完全な異性体をそれぞれ示す（白色：テキサスレッド/アレキサ594蛍光：H1、H3及びH5；黒色：グリーンアレキサ488蛍光：H2、H4及びH6）。各HSV-1ゲノム異性体の概略図を、対応する写真の上に示す。図３Ｂは、Vero、COS7及びNeuro2A細胞株で産生されたウイルス粒子におけるHSV-1 KOS株の分布ゲノム異性体のヒストグラムを示す。「実施例」の節に記載するように、ハイブリダイゼーションシグナルを選択し、分析した。本実施例において、各試験の全405のハイブリダイゼーションシグナルを同定し、分類した。各バーは、HSV-1ゲノムのそれぞれの異性体の数を表す。本実施例において、HSV-1 KOS株の異性体の分布は、COS7細胞からウイルス粒子に同等に分布するが、P及びISの異性体は、Neuro2A及びVero細胞株から産生されたウイルス粒子に多い異性体である。この後者の分布は、等モル分布（カイ2乗検定）とは統計的に異なる。図３Ｃは、種々の感染細胞（BSR、COS-7、Neuro2A、及びVero細胞）におけるHSV-1 Sc16株及びKOSのゲノム異性体の分布のヒストグラムを示す。「実施例」の節に記載するように、ハイブリダイゼーションシグナルを選択し、分析した。これらの例において、各産物からの405のシグナルを選択し、分類した。BSR、COS-7、Neuro2A、及びVero細胞において産生したHSV-1 Sc16株の分布、COS-7において産生したHSV-1 KOS株の分布は、等モル分布（カイ2乗検定）と統計的に等価物である。Neuro2A及びVero感染細胞では、P及びIS異性体は、IL及びILS異性体よりも多くみられる。
【００６７】
【図４】図４は、マウス及びウサギ角膜からのゲノムDNAの抽出方法を示す。図４Ａは、シラン処理表面上のコーミングされたゲノムDNAの一例を示す。実施例の節に記載するプロトコールによって角膜から抽出した後、ゲノムDNA溶液をコーミングし、カメラを装備したエピ蛍光顕微鏡での観察前に、挿入剤YOYO-1によって明らかにする。左の写真は、健全なマウス角膜から抽出した、コーミングされたDNAの代表的な像を示し、右の写真は、健全なウサギ角膜から抽出した、コーミングされたDNAの代表的な像を示す。分子コーミングを低密度で行い、ゲノムDNA繊維の長さを測定する。縮尺をバーとして表示する。図４Ｂは、HSV粒子から単離されたゲノムDNA上に含まれる所定の間隔内のDNA繊維サイズの累積度数を示す、ヒストグラムである。間隔幅は25kbである。したがって、例えば、5番目のバーは、[225〜250kb]間隔における測定数を表す。左のパネルは、マウス角膜から抽出したDNA溶液において記録された（10069の測定）、すべてのDNA繊維の長さを示す。繊維のメジアン径は204kbである。この試料では、ゲノムDNA繊維の約31%は、200kbを超えるサイズを示した。右のパネルは、ウサギ角膜から得られるDNA繊維の長さの分布（8336の測定）の一例を示す。この場合、分布のメジアン径は、196kbであり、27%の長さで200kbを超える繊維の割合である。
【００６８】
【図５】図５は、感染マウス角膜におけるHSV-1ゲノムの異性体の分布のヒストグラムを示す。HSV-1感染マウス角膜からすべてのDNAを抽出し、コーミングし、HSV-1特異性プローブによってハイブリダイズした。本例において、全18のハイブリダイゼーションシグナルを同定し、分類した。各バーは、HSV-1ゲノムのそれぞれの異性体の数を表す。
【００６９】
【図６】図６は、HSV-1感染マウス角膜におけるHSV-1の複製中間体の検出を示す。該図は、複製コンカテマーに対応する複合HSV-1ゲノムDNAの2つの例を示す（白色のシグナル：テキサスレッド/アレキサ594蛍光：H1、H3及びH5；黒色のシグナル：グリーンアレキサ488蛍光：H2、H4及びH6）。上の写真は、少なくとも2つの仮想の重複するHSV-1ゲノム（ISとP異性体からなる）からなるシグナルを表し、一方、下の写真は、少なくともILS及びILシグナルからなるHSV-1コンカテマーを示す。
【００７０】
【図７】図７は、HSV-1感染マウス角膜における非標準HSV-1ゲノムの検出を示す。図７Ａは、感染マウス角膜からの非標準HSV-1の一例を示す。該図は、HSV-1ゲノムの標準異性体うちの1つに対応しないハイブリダイゼーションパターンの代表例を示す（白色のシグナル：テキサスレッド/アレキサ594蛍光：H1、H3及びH5；黒色のシグナル：グリーンアレキサ488蛍光：H2、H4及びH6）。縮尺バーは、HSV-1 Sc16株に感染したVero細胞のコーミングされたDNA抽出物で得られる、ILS異性体に対応した表示する標準ハイブリダイゼーションパターン（ビオチン標識H1、H2B及びH3プローブは、グレーの囲み及びシグナルで表し、ジゴキシゲニン標識H2A及びH5は、白色の囲み及びシグナルで表し、また、アレキサ488標識H4及びH6プローブは、黒色の囲み及びシグナルで表す）である。本例は、H4/H6領域における非標準構造の割合を評価するために標識された、HSV-1特異性プローブH1〜H6を示す。図７Ｃは、Vero細胞抽出物におけるHSV-1 Sc16株での非標準H4/H6を示す。第1のハイブリダイゼーションパターンは、H4/H6プローブに対応する種々のサイズのアレキサ488蛍光シグナル（黒色のシグナル）、及びH1、H2B若しくはH3プローブ断片に対応するアレキサ594蛍光（グレーのシグナル）、又は最大10kbのH2A若しくはH5プローブの一部に対応するAMCA/アレキサ350蛍光シグナル（白色のシグナル）の変化を示す。第2の例は、種々のサイズのアレキサ488蛍光シグナル（黒色のシグナル）、及びアレキサ594蛍光シグナル（グレーのシグナル）に包囲される、AMCA/アレキサ350蛍光シグナル（白色のシグナル）の間の変化を示す。第3の例は、アレキサ594蛍光シグナル（グレーのシグナル）に包囲された、アレキサ488蛍光シグナル（黒色のシグナル）の特有の反復を示す。縮尺バーを表示する。図７Ｄは、HSV-1のH4/H6領域における標準と非標準構造間の分布のヒストグラムを示す。「実施例」の節に記載するように、367のハイブリダイゼーションシグナルを選択し、分析した。本実施例において、H4/H6プローブの80%は、理論上の構造に対応する。
【００７１】
【図８】図８は、ACH-2細胞培養物におけるプロウイルスのHIV-1 DNAの検出を示す。ヒストグラムはすべて、キロベースで、2つのFISHシグナル間の1つのFISHシグナル長さ又はギャップサイズの関数における所定の長さ（0.644kb/クラス）内のシグナルの数を示している。したがって、例えば、最初のヒストグラムの2番目のバーは、[7.86〜8.50kb]間隔における測定数を表す。図８Ａは、G248P87988G9及びG248P86255A8フォスミドを使用して、染色体7p15にあるプロウイルスHIV-1 DNAの一例を示す。組込みプロウイルスHIV-1 DNAに対応するハイブリダイゼーションパターンの組織の概略図を示す（ジゴキシゲニン標識HIV-1プローブは、黒色の囲み及びシグナルで表し、ビオチン標識フォスミドは、白色の囲み及びシグナルで表す）。左右のヒストグラムは、フォスミドG248P87988G9グリーンアレキサ488蛍光シグナルとHIV-1テキサスレッド/アレキサ594蛍光シグナルの間の間隔サイズの分布、HIV-1テキサスレッド/アレキサ594蛍光シグナルとフォスミドG248P86255A8グリーンアレキサ488蛍光シグナルの間のギャップサイズの分布をそれぞれ示す。中央のヒストグラムは、HIV-1テキサスレッド/アレキサ594蛍光シグナルサイズの分布を示す。図８Ｂは、7p15遺伝子座の正常な対立遺伝子の一例を示す。正常な対立遺伝子に対応するハイブリダイゼーションパターンの組織の概略図を示す（ビオチン標識フォスミドは、グレーの囲み及びシグナルで表す）。ヒストグラムは、フォスミドG248P87988G9グリーンアレキサ488蛍光シグナルとG248P86255A8グリーンアレキサ488蛍光シグナルの間のギャップサイズの分布を示す。図８Ｃは、単離されたプロウイルスのHIV-1 DNAを示す。HIV-1の単離形態に対応するハイブリダイゼーションパターンの組織の概略図を示す（ジゴキシゲニン標識HIV-1プローブは、黒色の囲み及びシグナルで表す）。ヒストグラムは、HIV-1テキサスレッド/アレキサ594蛍光シグナルサイズの分布を示す。図８Ｄは、G248P84833H9フォスミドを使用する、染色体7p15にあるプロウイルスHIV-1 DNAの一例を示す。組込みプロウイルスHIV-1 DNA（ジゴキシゲニン標識HIV-1プローブは、黒色の囲み及びシグナルで表す）及び野生型遺伝子座（ビオチン標識G248P84833H9フォスミドは、白色の囲み及びシグナルで表す）に対応するハイブリダイゼーションパターンの組織の概略図を示す。ヒストグラムは、HIV-1テキサスレッド/アレキサ594蛍光シグナルサイズの分布を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、試料中の感染性ウイルスのポリヌクレオチド又は感染性ウイルス起源DNAの、迅速で、特異的で、かつ高感度の検出を可能にし、PCR又はELISA等の血清検査等の増幅方法に課される多くの制約を回避する。
【００７３】
先行技術の方法とは対照的に、本発明の分子コーミング法は、完全なウイルスゲノム、又はウイルスのポリヌクレオチド配列の感染性若しくは毒性部分の良好な検出を可能にし、急性ウイルス感染若しくは潜伏ウイルス感染の診断の改善をもたらす。
【００７４】
本発明の方法は、HSVの型及びそのゲノムの構造を、確実に、時間及びコスト効率の良い方法で、かつ放射能操作の制約なしで、検出することを可能にする。さらに、本発明の方法は、考慮される治療の型が何であっても、抗ウイルス療法後のウイルス感染の存在の追跡を可能にする。
【００７５】
本発明は、真核細胞の感染細胞におけるDNAウイルスのゲノムの存在をインビトロで検出する方法に関する（特に、HSVゲノムの検出）。前記方法は、少なくとも、HSV DNAに特異的なプローブ又は1組のプローブによって、所定のウイルスの代表的な核酸のハイブリダイゼーション手段を含む。
【００７６】
本発明によって用いることができる分子コーミング法は、Bensimonらの米国特許第6,303,296号、及びLebofskyらの国際公開公報第2008/028931号によって開示され、これらの開示は、引用により本明細書中に組み込まれる。本発明者らは、伝統的な培養技術によるもの以外に、ウイルスの感染形態の完全な又は再編成されていないゲノムの存在を検出することができる技術がないことを認識し、そのため、感染性ウイルスDNAの検出にこれらの技術を適用及び適応させようとした。コーミング法は、かかるウイルスのDNA形態を検出する有効なツールとして試験されず、特異的な遺伝的環境において、かかる配列の遺伝的影響の理解を考慮して、細胞ゲノムに挿入されたDNAの長い配列の位置についてのみ試験されたにすぎなかった。本発明者らによって開発された改良法による感染性ウイルス(HSV) DNAの検出の非限定例を、以下に示す。
【００７７】
本発明者らは、ウイルス粒子からウイルスゲノムDNAを単離するための標準抽出プロトコールを改良した。一般に、0.1% SDSは、標準プロトコールにおいて、0.1% サルコシルの代わりに、低融点アガロースプラグにおけるウイルス粒子の溶解に使用される。また、方法も、角膜からゲノムDNAを抽出して、診断目的で、感染角膜におけるHSV DNAの存在を調査するために、開発した。
【００７８】
本発明は、感染した細胞、組織又は体液の核酸に含まれる、ウイルスDNA（特に、HSV DNA及びHIV DNA）を検出する方法に関する。前記方法は、特異的なプローブ又はプローブ集合による前記ウイルスDNAの代表的な核酸のハイブリダイゼーション手段を含み、該特異的なプローブ又はプローブ集合は、前記ウイルスDNAのすべてを網羅し、前記ウイルスDNAの代表的な核酸内の再編成を識別することを可能にする。
【００７９】
本明細書で使用する、「核酸」、特に「ウイルスDNAの代表的な核酸」という用語は、本明細書に定義する支持体に付着及び伸長することができる（特に、分子コーミング法の使用によって伸長することができる）核酸の型の1以上の分子を示す。核酸分子には、DNA（特に、ゲノムDNA、とりわけ、ウイルスDNA、又はcDNA）及びRNA（特に、mRNA）が含まれる。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であり得る。
【００８０】
「前記ウイルスDNAの代表的な核酸」とは、本発明の目的に関して、前記核酸が、遺伝子情報又は不可欠な情報の全体を含み、前記ウイルスDNAに存在することを意味する。この用語には、例えば、宿主染色体に組み込まれる、及び感染性ウイルス、特定のゲノムエレメントを欠いているが、特に宿主細胞で発現する場合、感染性であり得る感染性ウイルスDNA、及びウイルス癌遺伝子等の宿主細胞に対して病原性の影響を有するウイルス遺伝子を産生することができる、ゲノムウイルスDNAが含まれる。
【００８１】
プロト癌遺伝子には、これらの正常な遺伝子が含まれ、これは、突然変異によって変えられる場合、細胞を増殖させるか、又は調節されない方法で分割させることができる、癌遺伝子に変換することができる。プロト癌遺伝子は、多様な細胞機能を有し、その一部は、細胞分裂にシグナルを提供し、また、他のものは、アポトーシスにおいて役割を果たすことができる。核酸配列を含む、癌遺伝子の機能的及び構造的特徴は、当該技術分野で周知であり、J. Nicolasらの文献、「ヒト癌ウイルス：形質転換及び病因の原理(Human Cancer Viruses: Principles of Transformation and Pathogenesis)」（Karger Publishers (2010), ISBN3805585764, 9783805585767（第244頁））を参照することにより組み込まれる。
【００８２】
癌遺伝子は、プロト癌遺伝子の欠損型を包含する。癌遺伝子の単一のコピーは、抑制されない細胞増殖が生じる場合がある。代表的な癌遺伝子には、ras、myc、src、Her-2/neu、hTERT及びBcl-2が含まれる。核酸配列を含む、癌遺伝子の機能的及び構造的特徴は、当該技術分野で周知であり、L. M. Surhoneらの文献「癌遺伝子：遺伝子、突然変異、腫瘍、アポトーシス、遺伝子発現、タンパク質、細胞増殖、細胞分化(Oncogene: Gene, Mutation, Tumor, Apoptosis, Gene Expression, Protein, Cell Growth, Cellular Differentiation)」（Betascript Publishers (2010), ISBN6130361599, 9786130361594（第172頁））を参照することにより組み込まれる。癌遺伝子の更なる説明及び同定は、http://_www.cancerquest.org/index.cfm?page=780（最終アクセス2011年4月11日）、並びにCooper G.の文献「癌遺伝子(Oncogenes)」(Jones and Bartlett Publishers, 1995)及びVogelstein B, Kinzler KWの文献；「ヒト癌の遺伝学的基礎(The Genetic Basis of Human Cancer)」(McGraw-Hill: 1998)を参照することにより組み込まれ、これらの文献は、引用により組み込まれる。癌遺伝子へのプロト癌遺伝子の活性化の過程には、ウイルスの形質導入又はウイルスの組込み、点突発変異、挿入変異、遺伝子増幅、染色体転座、及び／又はタンパク質間相互作用が含まれ得る。プロト癌遺伝子の活性化を誘導することができるウイルスには、HBV及びHCV（肝細胞癌）、HTLV（白血病）、HPV（子宮頸癌、肛門癌及び陰茎癌）、HSV-8（カポジ肉腫）、Merkel細胞ポリオーマウイルス（Merkel細胞癌）、並びにEBV（バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、移植後リンパ増殖性疾患、及び鼻咽頭癌）が含まれる。
【００８３】
特定の実施態様において、伸長に使用される核酸試料は、ゲノムDNA、特に全ゲノムDNA、好ましくは、感染した細胞若しくは組織の染色体ゲノムDNA（核ゲノムDNA）、及び／又はこれらの断片である。本明細書で使用する「核酸」という用語は、1以上の染色体、及び／又は染色体の1以上の断片の代表的な核酸を示す。前記断片は、任意のサイズであり、最も長い分子は、複数のメガ塩基に達し得る。前記断片は、一般に、10〜2000kb、より好ましくは20〜500kb含まれ、平均は約300kbである。
【００８４】
本発明の方法に使用する核酸試料は、体液又は生物起源の組織から得ることができ、前記試料又は組織は、例えば、ヒト、ヒト以外の哺乳動物、又は鳥から単離される。
【００８５】
本明細書に定義するように、プローブは、ポリヌクレオチド、核酸/ポリペプチドハイブリッド、又はポリペプチドであり、本明細書に定義するウイルスDNAの代表的な核酸（特に、RNA及びDNA）にハイブリダイズする能力を有する。この用語は、RNA（特に、mRNA）及びDNA（特に、ウイルスcDNA又はウイルスゲノムDNA）分子、ペプチド核酸(PNA)、及びタンパク質ドメインを包含する。前記ポリヌクレオチド又は核酸ハイブリッドは、一般に、少なくとも100、300及び500のヌクレオチド、好ましくは、少なくとも700、800の若しくは900のヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも1、2、3、4若しくは5kbを含むか、又はこれからなる。例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15kb以上、特に、30、50、100又は150kbのプローブを使用することができる。かかるプローブ又は1組のプローブは、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、98、99若しくは100%のウイルスゲノム（特に、感染性ウイルスのゲノム）に対応するか、又はこれを網羅することができる。核酸プローブは、一本鎖若しくは二本鎖ポリヌクレオチド又は修飾ポリヌクレオチドであり得る。一連の連続的なプローブ集合は、ゲノム若しくはすべてのゲノムの特定の部分を網羅するか、又はこの部分に対して互いに重複する。適切なプローブは、本明細書に開示するもののようなウイルスのポリヌクレオチド配列に基づいてもよく、任意の適切な方法によって同定されるか、又は合成されてもよい。プローブは、放射能標識、蛍光標識される(labelled or tagged)か、又は当該技術分野で公知の他の手段によって標識され(labelled or tagged)てもよい。
【００８６】
ポリペプチドプローブは、一般に、少なくとも6つのヌクレオチドの配列、より好ましくは、少なくとも10、15又は20のヌクレオチドの配列に特異的に結合する。本明細書に使用するように、プローブの配列は、プローブがポリペプチドである場合、前記ポリペプチドが特異的に結合する配列として理解される。
【００８７】
特定領域「の部分」とは、本明細書において、前記特定領域の配列の連続するヌクレオチドを意味する。本発明による部分は、少なくとも15若しくは20の連続的なヌクレオチド、好ましくは、少なくとも100、200、300、500若しくは700の連続するヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも1、2、3、4若しくは5kbの連続的な前記特定領域を含むか、又はこれからなり得る。例えば、部分は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15kbの連続的な前記特定領域を含むか、又はこれからなり得る。
【００８８】
特定の実施態様において、使用されるプローブ又は使用されるプローブの少なくとも1つは、標的核酸の1つの鎖の一部に対して100%の相補配列を示すプローブのヌクレオチド変異体である。前記変異体の配列は、標的核酸の1つの鎖の一部の配列に対して少なくとも70、80、85、90又は95%の相補性を有し得る。前記変異体は、特に、1〜20、好ましくは1〜10のヌクレオチドの欠失、挿入及び／又は好ましくは置換（特に、元のヌクレオチド配列における1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10のヌクレオチドの欠失、挿入、及び／又は好ましくは置換）によって、100%同一か又は相補的であるプローブとは異なり得る。特定の実施態様において、該変異体は、ハイブリダイズする能力、特に、核酸標的の配列、同様に、核酸標的の配列に対して100%同一か又は100%相補的なプローブに特異的にハイブリダイズする能力を維持する（特に、本明細書に定義するハイブリダイゼーション条件において）。
【００８９】
本発明の文脈における「相補配列」という用語は、「相補的な」及び「逆」又は「逆の」配列（すなわち、前記配列を有するDNA鎖にワトソン‐クリック模型の相互作用によって結合するDNA鎖の配列）を意味する。
【００９０】
本発明の特定の実施態様において、本発明を実施するために使用される、プローブ又は1以上のプローブは、1以上のハプテン（例えば、ビオチン及びジゴキシゲニン）によって標識され、これらのハプテンに対して特異的な抗体で示される。所定のプローブ又はプローブ集合のための種々のハプテンの使用によって、所定のウイルスDNAの内の再編成を検出することができる。本明細書に定義するように、及び、引用により組み込まれる国際公開公報第2008/028931号に記載するように、前記プローブは、標識することができる。
【００９１】
本明細書に使用する1組のプローブは、少なくとも2つのプローブからなる。例えば、前記1組のプローブは、2〜20のプローブ（2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20のプローブ）からなり得る。1組のプローブの数は、通常、10、20、30、40、50、60、70、80、90又は100のプローブを超えず、必要な感度及びプローブの長さに依存し、1組のプローブは、最大2、3、4、5、6、7、8、9又は10のプローブからなることが好ましい。
【００９２】
本発明のプローブ又はプローブ集合は、全ゲノムウイルスDNAを検出するだけでなく、ゲノムウイルスDNA内に生じ得る再編成を識別することができる。例えば、実施例１においてプローブHSV検出のために使用するプローブ集合は、特有の領域UL及びUSを包囲する、逆反復配列間の相同組換えによって発生する種々のHSVゲノム異性体の検出を可能にする。さらに、HSV検出のためのプローブ集合（H1〜H6）はそれぞれ、異なる2つのハプテン（H1、H3及びH5プローブからなる断片におけるジゴキシゲニン；H2、H4及びH6プローブからなる断片におけるビオチン）によって標識される複数のプローブ（3〜19の種々の断片）からなる。所定のプローブ集合内の他のハプテン（このハプテンの性質のものはすべて）に1又は複数の断片のハプテンを交換することによって、ウイルスDNAのこの特定領域内の再編成の識別を可能にする、種々の色の蛍光アレイの生成を可能にする。
【００９３】
また、分子コーミングは、ウイルス感染によって癌を発症する余地のある患者（例えば、プロト癌遺伝子から癌遺伝子への変換の危険性のある患者）の早期診断のための有用なツールでもあり得る。実際、分子コーミングは、組込みウイルスゲノムとエピソームイルスゲノム間を識別することができる。ウイルスDNAが組み込まれる場合、特異的なプローブ集合を使用することによって、分子コーミングは、組込みウイルスDNAが完全なウイルス癌遺伝子を含むか、又は組込みウイルスDNAが、細胞のプロト癌遺伝子に隣接して組み込まれるか否かを判断することを可能にする。
【００９４】
また、本発明は、遺伝子療法と共に使用されてもよい。特異的なプローブ集合を、各遺伝子組換え及び／又はウイルスベクターに使用することによって、分子コーミングは、ウイルスベクターに基づく遺伝子療法の効果及び安全性の評価のための強力なツールを提供する。実際、分子コーミングは、組込み導入遺伝子とエピソーム導入遺伝子の間を識別することができる。導入遺伝子が組み込まれる場合（レンチウイルス及びレトロウイルスに基づくベクター）、特異的なプローブ集合を使用することによって、分子コーミングは、組込みウイルスDNAが、遺伝子に組み込まれる（挿入突然変異）か、又は細胞のプロト癌遺伝子に隣接して組み込まれるか否かを判断することを可能にする。この場合、導入遺伝子はエピソームである（アデノウイルスベクター、AAV、又はHSVベクター）。分子コーミングは、増殖する細胞集団における導入遺伝子の定量化に有用であり、導入遺伝子の再投与の適切な時間を確定するのを支援し得る。
【００９５】
本発明の具体的な実施態様には、次に示す方法及び生産物が含まれる。生体試料における感染性ウイルスのポリヌクレオチドを検出する方法であって、該方法は、前記試料からポリヌクレオチドを分離すること、抽出すること、又は、それ以外に、得ることと、前記ポリヌクレオチドを分子コーミングして、伸長したポリヌクレオチドを形成することと、前記伸長したポリヌクレオチドを、感染性ウイルス配列を認識する、1以上のプローブに接触させることと、コーミングされた試料に対するプローブのハイブリダイゼーションを検出することと、を含む、前記方法。この方法は、対象（例えば、血液、血漿、血清、CSF、滑液試料、若しくは対象の他の種類の体液）から得られる組織又は細胞の試料である、生体試料を使用して行うことができる。この方法に使用するポリヌクレオチドは、組織若しくは細胞試料、又は対象から得られる体液の成分から抽出することができる。一般に、該試料は、生存している対象から得られるが、死亡した対象から得られてもよい。試料は、ヒト、若しくは畜牛、ウシ属の動物、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、及びヒト以外の霊長類等のヒト以外の哺乳動物、又はニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ダチョウ、エミュー、又は他の鳥類等の鳥類の種等の他の動物から得ることができる。該方法は、DNA又はRNA等の感染性若しくは非感染性ゲノムウイルスDNA又は非感染性非ゲノムウイルスのポリヌクレオチドも含むか、又はこれからなり得るDNAである、ポリヌクレオチドによって実施することができる。この方法によって検出されるか、又は解析されるポリヌクレオチドは、対象のDNAへ組み込まれ得るか、又はエピソームの形態であり得る。検出されるポリヌクレオチドは、一本鎖及び二本鎖DNAウイルスを共に含む、DNAウイルスに結合する1以上のプローブに接触することができる。例えば、ポリヌクレオチドは、単純ヘルペスウイルス(HSV)等のヘルペスウイルスに結合する1以上のプローブに接触してもよい。パピローマウイルス、B型肝炎ウイルス、又はHIV等のレトロウイルス等の他のウイルスに結合する、他のプローブを使用してもよい。一部の実施態様において、該方法は、ウイルスのゲノムDNA又は感染性DNAの少なくとも80%、90%、95%又は99%に結合する1組のプローブを使用する。別の実施態様において、該方法に使用する1以上のプローブは、例えば、種々のプローブが結合するウイルスゲノムの種々の部分若しくはセグメントの識別を可能にするか、又はウイルスゲノムにおける再編成の識別を可能にするために、種々の標識によって標識される、少なくとも2組のプローブを含む。
【００９６】
本発明の別の具体的な実施態様には、次に示すものが含まれる。
【００９７】
哺乳動物の細胞、組織若しくは体液における感染性ウイルスのポリヌクレオチド配列若しくはゲノムウイルスのポリヌクレオチド配列を検出、同定又は視覚化する方法であって、該方法は、分子コーミングを用いて、細胞、組織若しくは体液における感染性ウイルスのポリヌクレオチド若しくはゲノムウイルスのポリヌクレオチドの存在若しくは量を検出することを含む、前記方法。
【００９８】
感染性ウイルスのポリヌクレオチド配列又はゲノムウイルスのポリヌクレオチド配列を定量化する方法であって、該方法は、分子コーミングを用いて、感染していない対照試料又はそれ以外の種々の時点で得られる同様の試料と比較して、細胞、組織又は体液における感染性ウイルスのポリヌクレオチド又はゲノムウイルスのポリヌクレオチドの量を検出することを含む、前記方法。
【００９９】
哺乳動物細胞におけるウイルスの存在若しくはウイルスの複製、若しくはウイルスゲノムの再編成を検出するか、又は追跡する方法であって、該方法は、細胞、組織若しくは体液における潜伏ウイルスDNA若しくは複製ウイルスDNA若しくは再編成されたウイルスDNAの存在のために、分子コーミングすることを含む、前記方法。
【０１００】
抗ウイルス療法の効果を評価する方法であって、該方法は、分子コーミングを用いて、対象から得られる試料における感染性ウイルスDNA又はゲノムウイルスDNAの存在、編成又は量を検出することと、抗ウイルス剤によって前記対象を治療することと、分子コーミングを用いて、感染性ウイルスDNA又はゲノムウイルスDNAの存在、編成又は量を再評価することと、を含む、前記方法。
【０１０１】
HSVゲノム、HIVゲノム、HBVゲノム又はHPVゲノムの80〜100%を網羅する1組のプローブ。
【０１０２】
分子コーミング装置及び／又は試薬と、感染性ポリヌクレオチドに結合する1以上のプローブと、場合により、1以上の細胞、組織又は体液試料と、を含む、分子コーミングを行うためのキット。コーミングされたDNA分子におけるゲノムウイルスDNAを検出するか、又は同定するための1組のプローブを含む、キット。感染性配列を検出するか、又は分類するためのソフトウェアを更に含む、キット。
【０１０３】
また、本発明は、ブダペスト条約下で、CNCM、パスツール研究所(25 Rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15)に、2010年4月15日付で寄託された、次に示す生体物質にも関する：HSV-B4 (CNCM I-4298)、HSV-B19 (CNCM I-4299)、HSV-Sc54 (CNCM I-4300)、及びHSV-P4 (CNCM I-4301)。各生体物質は、HSVの検出用のプローブに対応するポリヌクレオチド断片を含む。したがって、本発明は、これらのそれぞれのポリヌクレオチド断片、及びこれらの組合せのうちのいずれか指す。
【実施例】
【０１０４】
（実施例１  単純ヘルペスウイルスの検出）
（ウイルス粒子からの埋込みDNAプラグの調製）
HSV-1 DNAを、標準フェノール：クロロホルム抽出（Ben-Zeev, Weinbergらの文献1974）、又はLebofskyらの文献（Lebofsky, Heiligら, 2006）記載する改良手順によって、ウイルス粒子から抽出した（これらの文献は共に、引用により組み込まれる）。簡潔には、HSV-1粒子を、5×106ウイルス粒子/mLの濃度で、1×PBS中に再懸濁させ、50℃で、PBS中で調製した低融点アガロース（Nusieve GTG, ref. 50081, Cambrex社製）の1.2% w/v溶液と1:1の比で完全に混合した。90μLのウイルス粒子/アガロース混合物を、プラグ形成ウエル(plug-forming well)（BioRad社製, ref. 170-3713）に注ぎ、4℃で少なくとも30分放置して冷却させた。埋込みウイルス粒子を、50℃で30分間、0.1% SDS‐0.5M EDTA (pH 8.0)溶液中に溶解した。室温で10分の0.5M EDTA (pH 8.0)緩衝液中における洗浄工程後、プラグを、250μLの消化緩衝液 (0.5M EDTA, pH 8.0)中で、2 mg/mLのプロテイナーゼK（Eurobio社製, コードGEXPRK01, France）との50℃で一晩のインキュベーションによって、消化した。サルコシルの代わりの0.1% SDSの使用は、非常に生産性が高く、非常に高品質の抽出ウイルスDNAを回収することを可能にする。
【０１０５】
（感染細胞からの埋込みDNAプラグの調製）
以前に記載された（SchurraとBensimonの文献2009）とおりに、感染細胞培養物（BSR、COS-7、Neuro2A及びVero）からHSV-1 DNAを抽出した。簡潔には、感染細胞を、5000gで5分間の遠心分離によってペレット化し、2×106細胞/mLの濃度で、1×PBS緩衝液中に再懸濁させ、50℃で、1×PBS中で調製した低融点アガロース（Nusieve GTG, ref. 50081, Cambrex社製）の1.2% w/v溶液と1:1の比で完全に混合した。90μLの細胞/アガロース混合物を、プラグ形成ウエル（BioRad社製, ref. 170-3713）に注ぎ、4℃で少なくとも30分放置して冷却させた。
【０１０６】
以前に記載された（SchurraとBensimonの文献2009）とおりに、ブロック中で細胞溶解を行った。簡潔には、アガロースプラグを、250μLの0.5M EDTA (pH 8)、1%サルコシル、250μg/mLプロテイナーゼK（Eurobio社製, コード：GEXPRK01, France）溶液中で、50℃で一晩インキュベーションし、次いで、室温で30分間、トリス10mM、EDTA 1mM溶液中で2回洗浄した。
【０１０７】
（感染角膜からの埋込みDNAプラグの調製）
HSV-1 Sc16株感染マウス角膜を、感染の最終段階で回収し、Corneamax（登録商標）（Eurobio社製, コードEYEMAX00, France）培地に維持した。15分間、室温で、1×PBS溶液によって3回洗浄後に、すべての角膜を小片に切断した。組織溶解を、GIBCO（商標）1×ハンクスの平衡塩類溶液HBSS緩衝液（Invitrogen社製, France, コード14060040）中で調製した、0.3mg/mLのコラゲナーゼA（Roche社製, コード10 103 578 001）及び0.8mg/mLのGIBCO（商標）ディスパーゼ（Invitrogen社製, France, コード17105-041）で、37℃で16時間以内に行った。溶解物を、5000gで10分間の遠心分離によってペレット化し、1×106〜2×106細胞/mLの濃度で、1×PBS緩衝液中に再懸濁させ、50℃で、1×PBS中で調製した低融点アガロース（Nusieve GTG, ref. 50081, Cambrex社製）の1.2% w/v溶液と1:1の比で完全に混合した。90μLの細胞/アガロース混合物を、プラグ形成ウエル（BioRad社製, ref. 170-3713）に注ぎ、4℃で少なくとも30分放置して冷却させた。
【０１０８】
以前に記載された（SchurraとBensimonの文献2009）とおりに、ブロック中で細胞溶解を行った。簡潔には、アガロースプラグを、250μLの0.5M EDTA (pH 8)、1%サルコシル、250μg/mLプロテイナーゼK（Eurobio社製, コード：GEXPRK01, France）溶液中で、50℃で一晩インキュベーションし、次いで、室温で30分間、トリス10mM、EDTA 1 mM溶液中で2回洗浄した。
【０１０９】
（DNAの最終抽出及び分子コーミング）
以前に記載された（SchurraとBensimonの文献2009）とおりに、ウイルス粒子又は角膜からの埋込みDNAのプラグを、DNAをコーミングするために処理した。簡潔には、プラグを、20分間、MES 0.5M (pH 5.5)溶液中に、68℃で溶融し、1.5ユニットのベータ‐アガラーゼ（New England Biolabs社製, ref. M0392S, MA, USA）を加え、放置し、42℃で最大16時間インキュベートした。次いで、DNA溶液を、テフロン（登録商標）リザーバに注ぎ、分子コーミングを、分子コーミングシステム（Genomic Vision社製, Paris, France）及び分子コーミングカバーグラス（20mm×20mm, Genomic Vision社製, Paris, France）を使用して行った。コーミング表面を、60℃で4時間乾燥した。
【０１１０】
（HSV-1プローブの合成及び標識化）
Genbank配列NC_001806.1に関連するすべてのプローブの座標を、表Aにリストする。本実施例におけるプローブのサイズは、1110〜9325 bpである。
【０１１１】
HSV-1特異性プローブを、CNRS（Prof. Marc Labetoulle, laboratoire de virology moleculaire et structurale, UMR CNRS 2472-INRA 1157, Gif-sur-Yvette, France）から入手したHSV-1 sc16株のSacI又はBspEI（New England Biolabs社製, Beverly, MA, USA, それぞれコードR0156L及びR0156L）のいずれかの酵素消化によって、又はLR Taq DNAポリメラーゼ（Roche社製, キットコード：11681842001）と、表Bにリストするプライマー、及びテンプレートDNAとしてHSV-1 sc16のDNAを使用するロングレンジ(long-range) PCRによって、生成した。SacI及びBspEIのHSV-1断片をそれぞれ、SacI及びXmaIで消化したpNEB193プラスミド（New England Biolabs社製, Beverly, MA, USA, コードN3051S）においてライゲーションした。PCR産物を、TOPO（登録商標）TAクローニングキット（Invitrogen社製, France, コードK455040）を使用して、pCR（登録商標）2.1ベクターにおいてライゲーションした。各プローブの2つの端を、確認目的でシークエンスした。見かけ上のH1 (21kb)、H2 (56kb)、H3 (45kb)、H4 (13kb)、H5 (7.5kb)及びH6 (6.5kb)プローブは、表Aにリストする隣接するか又は重複する複数のプローブの混合である。H4及びH6プローブに関係する非標準構造の視覚化では、見かけ上のH2プローブは、2つのプローブH2A (31kb)及びH2B (25kb)に分裂していた。
【０１１２】
プローブの標識化を、従来のランダムプライミングプロトコールを用いて行った。ビオチン-11-dCTP標識については、標識化反応を一晩進行させた以外は、BioPrime（登録商標）DNAキット（Invitrogen社製, コード：18094-011, CA, USA）を、メーカーの説明書に従って使用した。11-ジゴキシゲニン-dUTP及びアレキサ488-7-OBEA-dCTPについては、キットのdNTP混合物を、表Cに明示する混合物と交換した。200ngの各プラスミドを別々の反応で標識した。異性体分類では、H1、H3、H5プローブを、11-ジゴキシゲニン-dUTPによって標識し、H2、H4及びH6プローブを、ビオチン-11-dCTPによって標識した。H4及びH6プローブに関係する非標準構造の視覚化では、H1、H2B及びH3プローブを、ビオチン-11-dCTPによって標識し、H2A及びH5プローブを、11-ジゴキシゲニン-dUTPによって標識し、また、H4、H6をアレキサ488-7-OBEA-dCTPによって標識した。反応生成物をアガロースゲル上で視覚化して、DNAの合成を確認した。
【０１１３】
（コーミングされたウイルスDNAにおけるHSV-1プローブのハイブリダイゼーション及び検出）
また、その後の工程も、以前にSchurraとBensimon, 2009の文献（SchurraとBensimon 2009）（引用により組み込まれる）に記載されたとおりに、実質的に行った。簡潔には、標識化プローブの混合（250ngの各プローブ、下記のプローブ合成及び標識化に関する詳細を参照のこと）を、20μLのハイブリダイゼーション緩衝液（50%ホルムアミド、2×SSC、0.5% SDS、0.5% サルコシル、10mM NaCl、30% Block-aid（Invitrogen社製, ref. B-10710, CA, USA））中に懸濁させた10μgのニシン精子DNA及び2.5μgのヒトCot-1 DNA（Invitrogen社製, ref. 15279-011, CA, USA）と共にエタノール沈殿させた。プローブ溶液及びプローブを、90℃で5分間、ハイブリダイザー(Hybridizer) (Dako社製, ref. S2451)において共に熱変性させ、ハイブリダイゼーションを、37℃で一晩、ハイブリダイザーにおいて続け、進行させた。スライドを、室温で5分間、50%ホルムアミド、2×SSC溶液中で3回、及び2×SSC溶液中で3回洗浄した。検出抗体層及びBlock-Aid中のそれぞれの希釈液を、表D及びEに記載する。各層において、20μLの抗体溶液をスライドに加え、コーミングされたカバーグラスで覆い、また、該スライドを、37℃で20分間、湿度の高い大気中でインキュベートした。該スライドを、室温で3分間、各層と最後の層で、2×SSC、1% Tween20溶液中で3回洗浄した。異性体分類では、H1、H3及びH5プローブの1:25希釈物中テキサスレッド結合マウス抗ジゴキシゲニン（Jackson Immunoresearch社製, France）抗体、並びに、一次抗体として、H2、H4及びH6プローブの1:25希釈物中アレキサ488結合ストレプトアビジン抗体（Invitrogen社製, France）を使用して、検出を行った。第2層として、1:25に希釈したアレキサ594結合ヤギ抗マウス（Invitrogen社製, France）、及び1:50に希釈したビオチン化ヤギ抗ストレプトアビジン（Vector Laboratories社製, UK）を使用した。H2、H4及びH6プローブのアレキサ488蛍光シグナルを増幅するために、付加的な検出層を、1:25希釈物で第1層に使用するのと同じアレキサ488結合ストレプトアビジンを使用することによって実現した。H4及びH6プローブに関係する非標準構造の視覚化では、H2A及びH5プローブの1:25希釈物中AMCA結合マウス抗ジゴキシゲニン（Jackson Immunoresearch社製, France）抗体、H1、H2B及びH3の1:25希釈物中アレキサ594結合ストレプトアビジン抗体（Invitrogen社製, France）、並びに、一次抗体として、1:25希釈物中ウサギ抗アレキサ488を使用して、検出を行った。第2層として、1:25に希釈したアレキサ594結合ヤギ抗マウス（Invitrogen社製, France）、1:50に希釈したビオチン化ヤギ抗ストレプトアビジン（Vector Laboratories社製, UK）、及び1:25に希釈したアレキサ488結合ヤギ抗マウスを使用した。H1、H2B及びH3プローブのアレキサ594蛍光シグナルと、H2A及びH5プローブのAMCA/アレキサ350シグナルを増幅するために、1:25希釈物で第1層に使用するのと同じアレキサ594結合ストレプトアビジン、及び1:25に希釈したアレキサ350結合ヤギ抗ラットをそれぞれ使用することによって実現した。最後の洗浄工程後、ガラスカバースリップをすべて、エタノール及び乾燥大気中で脱水した。
【０１１４】
（HSV-1検出シグナルの分析）
コーミングされたHSV-1繊維の直接的な視覚化では、カバースリップを、20μLのProlong（Invitrogen社製, France ref P36930）-YOYO-1ヨウ化物（Molecular Probes, コードY3601）混合物(1/1000 v/v)に載せ、40×対象レンズを装備した逆自動エピ蛍光顕微鏡(inverted automated epifluorescence microscope)（ImageXpress Micro, Molecular Devices社製, USA）によって走査した。YOYO-1染色したDNA繊維の長さを測定し、内蔵ソフトウェアGVlab 04.2.1（Genomic Vision社製, Paris, France）により、2 kb/μm（SchurraとBensimonの文献2009）の拡張因子を使用して、kbに変換した。
【０１１５】
異性体分類では、ウイルス粒子又は角膜調製物のハイブリダイズ‐コーミングされたDNAを、封入剤を使用せずに、40×対象レンズを装備した、逆自動エピ蛍光顕微鏡（ImageXpress Micro, Molecular Devices社製, USA）を使用して、走査した。内蔵ソフトウエア(Gvlab 0.4.2)によって、シグナルは、視覚的に又は自動的に検出することができる。両方のFISHシグナルは、H1、H3、H5のテキサスレッド/アレキサ594蛍光の連続的なシグナルと、H2、H4及びH6のアレキサ488蛍光とからなり、また、以下に記載するパターンのうちの1つに対応する連続的なシグナルからなるシグナルが考慮された。
【０１１６】
(a) H4に対応するアレキサ488蛍光シグナルによって直接追跡される、28kbの最小長さのテキサスレッド/アレキサ594蛍光シグナル、及び3kbの最小長さの他のテキサスレッド/アレキサ594蛍光シグナル。
【０１１７】
(b) H6に対応するアレキサ488蛍光シグナルによって直接追跡される、28kbの最小長さのテキサスレッド/アレキサ594蛍光シグナル、及び3kbの最小長さの他のテキサスレッド/アレキサ594蛍光シグナル。
【０１１８】
(c) H1に対応するテキサスレッド/アレキサ594蛍光シグナル、その次に、H4に対応するアレキサ488蛍光シグナルによって直接追跡される、3kbの最小長さのアレキサ488蛍光シグナル、及び3kbの最小長さの他のテキサスレッド/アレキサ594蛍光シグナル。
【０１１９】
(d) H1に対応するテキサスレッド/アレキサ594蛍光シグナル、その次に、H6に対応するアレキサ488蛍光シグナルによって直接追跡される、3kbの最小長さのアレキサ488蛍光シグナル、及び3kbの最小長さの他のテキサスレッド/アレキサ594蛍光シグナル。
【０１２０】
次いで、選択されたFISHシグナルを、分析された連続的なFISHシグナルパターンによって、次に示すように分類した：
【０１２１】
H1/H2/H3/H4/H5/H6プローブ、又はパターン(a)からなるプローブアレイは、HSV-1のプロトタイプ(P)形態として分類される（Hayward, Jacobらの文献1975）。
【０１２２】
パターンH1/H2/H3/H6/H5/H4、又はパターン(b)は、HSV-1のInverted Short (IS)ゲノム領域形態として分類される（Hayward, Jacobらの文献1975）。
【０１２３】
パターンH3/H2/H1/H4/H5/H6、又はパターン(c)は、HSV-1のInversed Long (IL)ゲノム領域形態として分類される（Hayward, Jacobらの文献1975）。
【０１２４】
パターンH3/H2/H1/H6/H5/H4、又はパターン(d)は、HSV-1のInversed Long及びShort (ILS)ゲノム領域形態として分類される（Hayward, Jacobらの文献1975）。
【０１２５】
観察される分布が、予想された分布（4つの異性体における事象の同等の数）（BatailleとEpsteinの文献1997）と顕著に異なるという仮説を、カイ2乗検定によって試験し、p値が0.05未満である場合、これを認めた。
【０１２６】
H4及びH6プローブに関係する非標準構造の視覚化では、感染細胞調製物のハイブリダイズ‐コーミングされたDNAを、封入剤を使用せずに、40×対象レンズを装備した、逆自動エピ蛍光顕微鏡（ImageXpress Micro, Molecular Devices社製, USA）を使用して、走査した。内蔵ソフトウエア(Gvlab 0.4.2)によって、シグナルは、視覚的に検出することができる。H4及びH6のアレキサ488蛍光の連続的なシグナルからなるすべてのシグナルを選択した。パターンのうちの1つに対応するシグナルを、標準構造として、次に示すように分類した。
【０１２７】
(e) H4プローブに対応する13kbのアレキサ488蛍光シグナルに追跡される、最小3kbのアレキサ594蛍光シグナルと、H5プローブに対応する7.5kbのAMCA/アレキサ350蛍光シグナルと、H6プローブに対応する7kbのアレキサ488蛍光とからなる連続的なシグナル。
【０１２８】
(f) H6プローブに対応する7kbのアレキサ488蛍光シグナルに追跡される、最小3kbのアレキサ594蛍光シグナルと、H5プローブに対応する7.5kbのAMCA/アレキサ350蛍光シグナルと、H4プローブに対応する13kbのアレキサ488蛍光とからなる連続的なシグナル。
【０１２９】
他のすべてのシグナルを非標準構造として分類した。標準及び非標準構造の割合を比較した。
【０１３０】
（ウイルス粒子からのHSV-1 DNAの抽出）
試料調製時において、調製されるDNAのサイズに高い不安定性を生ずる、制御されない操作力により、多くのDNA分子をランダムにシェアリングした。溶融したアガロースプラグでタンパク質除去される場合、ガラスカバーグラスを使用して、分子コーミングにより、高分子量のDNAが伸長できることが示されている（Lebofsky及びBensimonの文献2003）。したがって、解析されたDNA分子は、可変長であり、平均約300kbであり、最も長い分子は、複数のメガ塩基に達する。
【０１３１】
HSV-1 DNAは、分子コーミングに使用されていないので、本発明者らは、2つの異なる方法（すなわち、「実施例」の節に記載するように、標準フェノール：クロロホルム抽出法、及びわずかに改良したLebofsky, Heiligらの文献2006に記載する方法）によって抽出されたDNA繊維の品質を、長さの点から初めて評価した。
【０１３２】
図２に示すように、80μmを超えるサイズの繊維は、検出されなかった。これは、2kbの一定の伸長因子を考慮すると、HSV-1ゲノムの最大予想サイズ(152kb)と一致する。両方法では、回避することができない機械的操作により、依然として、ランダムなDNAシェアリングがあるため、及び全長標準HSV-1ウイルスゲノムより短いDNA分子が、核カプシド内にカプシド形成するようになる（Vlazny, Kwongらの文献1982）ため、152kbの長いDNA繊維のみが検出されない。
【０１３３】
しかしながら、抽出を標準フェノール：クロロホルム法で行う場合、DNA繊維のメジアン径は、140kbより長い繊維の1.2%で36kbである。対照的に、本発明者らの代替プロトコールを用いる、アガロースプラグに埋め込まれたウイルス粒子からのDNAの抽出が実現される場合、HSV-1 DNA繊維のメジアン径は、140kbより長い繊維の2.5%で84kbである。長い分子の割合は低いが、ガラスカバーグラス上でコーミングされた数万の繊維があるので、解析に利用可能な多くのコーミングされた長いDNA分子がある。
【０１３４】
これらの結果は、本発明者らによって開発された代替方法が、分子コーミングによる解析を可能にする標準方法と比較して、ウイルス粒子から抽出される、コーミングされたDNAの品質を改善したことを示す。
【０１３５】
（ウイルス粒子におけるHSV-1ゲノムの構造とその分布）
本発明者らは、分子コーミングを適用して、ウイルス粒子及び感染細胞から抽出されたHSV-1 DNAを均一に伸長し、得られるコーミングされたHSV-1 DNAを隣接するか又は重複するHSV-1特異性DNAプローブによってハイブリダイズして（図１；H1、H3、H5：レッドテキサス/アレキサ594蛍光；H2、H4、H6：グリーンアレキサ488蛍光）、HSV-1ゲノムの構造を決定した（図３Ａ）。免疫蛍光顕微鏡検査（図３Ｂ）は、評価基準を満たした、COS7、Vero及びNeuro2A細胞株から産生されたHSV-1 KOS株ウイルス粒子の各産生において、405のマルチカラーの線状パターンを示した（「実施例」の節を参照のこと）。シグナルの分類は、HSV-1 KOS株異性体の分布は、COS7細胞のウイルス粒子において同様に分布するが、P及びISの異性体は、Neuro2A及びVero細胞株から産生されたウイルス粒子で多くみられる異性体である。
【０１３６】
ハイブリダイズされ、コーミングされたHSV-1感染細胞において、4つの異性体の分布を、種々の細胞株（BSR、COS7、Neuro2A及びVero）で産生されたSc16及びKOSのHSV-1株で比較した。各産生に対応する405のマルチカラーの線状パターン、及び評価基準を満たすマルチカラーの線状パターン（「試験手順」の節を参照のこと）を分類した。4つの異性体間の分布は、（BSR、Vero、Neuro 2a、及びCOS-7細胞での）HSV-1 Sc16のすべての産生において、統計的に同等であった（カイ2乗検定）。同じ方法で、該分布は、COS-7細胞で産生されたHSV-1 KOS株において同等であることが分かった。顕著に、初めて、本発明者らは、IS及びP異性体が、Vero及びNeuro2A細胞のHSV-1 DNA KOS株調製物の主な形態であるが、IL異性体は、あまり存在しない異性体であることを発見した。
【０１３７】
本発明者らは、本明細書に記載する分子コーミング技術が、特有の分子レベルにおけるHSV-1ゲノムDNAの構造解析のための、及び生体試料中のその分布を定量化するための強力な方法であることを発見した。
【０１３８】
（マウス及びウサギ角膜からのゲノムDNAの抽出）
コーミングを、培養細胞（株化細胞、不死化一次細胞）又は体液（すなわち、末梢血リンパ球、羊膜細胞）を含む単離細胞からのDNA溶液によって、良好に行った（Gad, Klingerらの文献2002；Caburet, Contiらの文献2005）。しかしながら、ヒト角膜は、5層（角膜皮膜組織、コラーゲンを多く含むボーマン膜、まばらに分布し、相互に連結した実質細胞と共に、規則的に配置した膠原線維からなる、角膜ストロマ、非細胞デスメ膜、及び角膜内皮）からなる複合構造を有する固体組織である。角膜からゲノムDNAを抽出するために、本発明者らは、標準手順を進行する前に、角膜細胞を単離するための具体的方法を開発した。角膜の機械的破壊及び酵素消化を含む、種々の方法を試験した。後者は、最良の結果であり、また、種々の濃度で、種々の型のプロテアーゼ（すなわち、トリプシン、コラゲナーゼA、ディスパーゼ等）を使用して最適化した。図４Ａ及びＢは、16時間、0.3mg/mlのコラゲナーゼA及び0.8mg/mlのディスパーゼで消化されたマウス及びウサギ角膜の両方で得られる結果の一例を示す。分子コーミングのための標準抽出については、ゲノムDNAが無作為の場所で破壊されている。したがって、解析されたゲノムDNA分子は、可変長であり、平均約200kbであり、最も長い分子は、両方の型の角膜で1Mbを超える（メガ塩基）。角膜から抽出されたDNA繊維のサイズは、単離された細胞から得ることができる一般的なサイズ（平均約300kb、最も長い分子は、複数のメガ塩基に達する）よりわずかに下回る。
【０１３９】
（マウス角膜におけるHSV-1感染の検出）
したがって、本発明者らは、分子コーミングを、HSV-1感染マウス角膜から抽出されたDNAに適合及び適用し、上述するHSV-1特異性プローブによってハイブリダイズした。図５に示すように、これは、マウス感染角膜におけるHSV-1ゲノムのすべての型の異性体を検出することを可能にした。
【０１４０】
成熟HSV-1ゲノムの検出に加え、本発明の分子コーミング法は、ウイルスが、解析された試料の角膜において積極的に複製していることを示す、コンカテマー（図６）の検出を可能にする。
【０１４１】
（感染細胞及びマウス角膜における非標準形態の検出）
本発明者らは、感染マウス角膜抽出物、及び感染細胞抽出物におけるウイルスの複製時の組換えからおそらく発生する、HSV-1ゲノムの非標準構造（図７Ａ）を検出した。
【０１４２】
標識した隣接及び重複するHSV-1特異性プローブを、HSV-1 Sc16株感染Vero細胞のコーミングされたDNA抽出物でハイブリダイズし（図７Ｂ；H1、H2A、H3：グレーで現れるレッドアレキサ594蛍光；H2B、H5：白色で現れるブルーAMCA/アレキサ350蛍光；H4、H6：黒色で現れるグリーンアレキサ488蛍光）、H4/H6領域における非標準構造の割合を評価した。計367のマルチカラーの線状パターンを分類し、20% (73)が、非標準H4/H6構造を有することが分かった。
【０１４３】
分子コーミングは、非標準構造の視覚化を可能にし、可能性のあるバーコードの組合せの無限性によって、これらを解析するための強力な方法である。
【０１４４】
【表１】
2013524806.tif 000002
2013524806.tif 000003
【０１４５】
【表２】
2013524806.tif 000004
【０１４６】
【表３】
2013524806.tif 000005
【０１４７】
【表４】
2013524806.tif 000006
【０１４８】
【表５】
2013524806.tif 000007
【０１４９】
（実施例２  ヒト免疫不全ウイルスの検出）
（ACH-2細胞培養物からの埋込みDNAプラグの調製）
ACH-2細胞株（Clouse, Powellらの文献1989）を、筆者の説明に従って培養した。DNAを、SchurraとBensimonの文献2009に記載するとおりに、抽出した。簡潔には、細胞を、107細胞/mLの濃度で、1×PBS中で懸濁させ、50℃で、1×PBS中で調製した低融点アガロース（Nusieve GTG, ref. 50081, Cambrex社製）の1.2% w/v溶液と1:1の比で完全に混合した。90μLの細胞/アガロース混合物を、プラグ形成ウエル（BioRad社製, ref. 170-3713）に注ぎ、4℃で少なくとも30分間放置して冷却させた。アガロースプラグを、250μLの0.5M EDTA (pH 8)、1%サルコシル、250μg/mLプロテイナーゼK（Eurobio社製, コード：GEXPRK01, France）溶液中で、50℃で一晩インキュベーションし、次いで、室温で30分間、トリス10mM、EDTA 1mM溶液中で2回洗浄した。
【０１５０】
（DNAの最終抽出及び分子コーミング）
以前に記載された（SchurraとBensimonの文献2009）とおりに、ACH-2細胞からの埋込みDNAプラグを、DNAをコーミングするために処理した。簡潔には、プラグを、20分間、MES 0.5M (pH 5.5)溶液中に、68℃で溶融し、1.5ユニットのベータ‐アガラーゼ（New England Biolabs社製, ref. M0392S, MA, USA）を加え、放置し、42℃で最大16時間インキュベートした。次いで、DNA溶液を、テフロン（登録商標）リザーバに注ぎ、分子コーミングを、分子コーミングシステム（Genomic Vision社製, Paris, France）及び分子コーミングカバーグラス（20mm×20mm, Genomic Vision社製, Paris, France）を使用して行った。コーミング表面を、60℃で4時間乾燥した。
【０１５１】
（HSV-1プローブの合成及び標識化）
Genbank配列M19921.1に関連するすべてのプローブの座標を、表Fにリストする。本実施例におけるプローブのサイズは、2927〜3749 bpである。
【０１５２】
HIV特異性プローブを、LR Taq DNAポリメラーゼ（Roche社製, キットコード：11681842001）と、表Gにリストするプライマー、及びテンプレートDNAとしてHIV pNL4-3のDNAを使用し、ロングレンジPCRによって、生成した。PCR産物を、TOPO（登録商標）TAクローニングキット（Invitrogen社製, France, コードK455040）を使用して、pCR（登録商標）2.1ベクターにおいてライゲーションした。各プローブの2つの端を、確認目的でシークエンスした。
【０１５３】
2006年3月のヒトアセンブリ(NCBI Build 36.1)及びHIV-1プローブによって、HIV-1の挿入部位の側面に位置する2つのフォスミドG248P87988G9とG248P86255A8、又はACH-2細胞（Ishida, Hamanoらの文献2006）におけるHIV-1プロウイルス挿入部位を包含する1つのフォスミドG248P84833H9を、従来のランダムプライミングプロトコールを用いて標識した。ビオチン-11-dCTP標識については、標識化反応を一晩進行させた以外は、BioPrime（登録商標）DNAキット（Invitrogen社製, コード：18094-011, CA, USA）を、メーカーの説明書に従って使用した。ジゴキシゲニン-11-dUTPについては、キットのdNTP混合物を、表Cに明示する混合物と交換した。200ngの各プラスミド/フォスミドを別々の反応で標識した。すべてのHIV-1検出では、HIV-1をジゴキシゲニン-11-dUTPによって標識し、フォスミドをビオチン-11-dCTPによって標識した。反応生成物をアガロースゲル上で視覚化して、DNAの合成を確認した。
【０１５４】
（コーミングされたウイルスDNAにおけるHSV-1プローブのハイブリダイゼーション及び検出）
また、その後の工程も、以前にSchurraとBensimon, 2009の文献（SchurraとBensimon 2009）に記載されたとおりに、実質的に行った。簡潔には、標識化プローブの混合（250ngの各プローブ）を、20μLのハイブリダイゼーション緩衝液（50%ホルムアミド、2×SSC、0.5% SDS、0.5% サルコシル、10mM NaCl、30% Block-aid（Invitrogen社製, ref. B-10710, CA, USA））中に懸濁させた10μgのニシン精子DNA及び2.5μgのヒトCot-1 DNA（Invitrogen社製, ref. 15279-011, CA, USA）と共にエタノール沈殿させた。プローブ溶液及びプローブを、90℃で5分間、ハイブリダイザー(Dako, ref. S2451)において共に熱変性させ、ハイブリダイゼーションを、37℃で一晩、ハイブリダイザーにおいて続け、進行させた。スライドを、室温で5分間、50%ホルムアミド、2×SSC溶液中で3回、及び2×SSC溶液中で3回洗浄した。検出抗体層及びBlock-Aid中のそれぞれの希釈液を、表D及びEに記載する。各層において、20μLの抗体溶液をスライドに加え、コーミングされたカバーグラスで覆い、また、該スライドを、37℃で20分間、湿度の高い大気中でインキュベートした。該スライドを、室温で3分間、各層と最後の層で、2×SSC、1% Tween20溶液中で3回洗浄した。
【０１５５】
HIV-1プローブの1:25希釈物中テキサスレッド結合マウス抗ジゴキシゲニン（Jackson Immunoresearch社製, France）抗体、並びに、一次抗体として、フォスミドの1:25希釈物中アレキサ488結合ストレプトアビジン抗体（Invitrogen社製, France）を使用して、すべてのHIV-1の検出を行った。第2層として、1:25に希釈したアレキサ594結合ヤギ抗マウス（Invitrogen社製, France）、及び1:50に希釈したビオチン化ヤギ抗ストレプトアビジン（Vector Laboratories社製, UK）を使用した。フォスミドのアレキサ488蛍光シグナルを増幅するために、付加的な検出層を、1:25希釈物で第1層に使用するのと同じアレキサ488結合ストレプトアビジンを使用することによって実現した。最後の洗浄工程後、ガラスカバースリップをすべて、エタノール及び乾燥大気中で脱水した。
【０１５６】
（HIV-1検出シグナルの分析）
ACH-2細胞調製物のハイブリダイズ‐コーミングされたDNAを、封入剤を使用せずに、40×対象レンズを装備した、逆自動エピ蛍光顕微鏡（ImageXpress Micro, Molecular Devices社製, USA）を使用して、走査した。内蔵ソフトウエア(Gvlab 0.4.2)によって、シグナルは、視覚的に又は自動的に検出することができる。
【０１５７】
HIV-1の挿入部位の側面に位置する、2つのフォスミドG248P87988G9及びG248P86255A8を使用して、2 kb/μmの拡張因子（SchurraとBensimonの文献2009）を使用し、次に示すパターンのうちの1つに対応するFISHシグナルを、考慮し、測定した。
【０１５８】
HIV-1のテキサスレッド／アレキサ594蛍光の連続的なシグナルからなる、FISHシグナル。単離されたHIVプロウイルスDNAに対応する、すべてのシグナルを測定する。
【０１５９】
2つのギャップ、及びフォスミド配列に対応したアレキサ488蛍光の2つの連続的なシグナルによって側面に位置する、HIV-1のテキサスレッド/アレキサ594蛍光のシグナル鎖からなる、FISHシグナルアレイ。このシグナルの側面に位置するすべてのテキサスレッド/アレキサ594蛍光シグナル及びギャップの長さを測定し、7p15（Ishida, Hamanoらの文献2006）において染色体7に組み込まれたHIV-1プロウイルスDNAに対応した。
【０１６０】
ギャップによって分離した2つのアレキサ488蛍光シグナルを有する、FISHシグナルアレイ。HIV-1プロウイルスDNAの組込みのない7p15遺伝子座に対応するギャップの長さを測定した。
【０１６１】
HIV-1プロウイルスの挿入部位を包含する、フォスミドG248P84833H9を使用して、2 kb/μmの拡張因子（SchurraとBensimonの文献2009）を使用し、次に示すパターンのうちの1つに対応するFISHシグナルを、考慮し、測定した。
【０１６２】
HIV-1のテキサスレッド/アレキサ594蛍光の連続的なシグナルからなる、FISHシグナル。単離されたHIVプロウイルスDNAに対応する、すべてのシグナルを測定する。
【０１６３】
フォスミド配列に対応したアレキサ488蛍光の2つのシグナルによって側面に位置する、HIV-1のテキサスレッド/アレキサ594蛍光の連続的なシグナル鎖からなる、FISHシグナルアレイ。すべてのテキサスレッド/アレキサ594蛍光シグナルを測定し、7p15（Ishida, Hamanoらの文献2006）において染色体7に組み込まれたHIV-1プロウイルスDNAに対応した。
【０１６４】
1つの長いアレキサ488蛍光シグナルを有するFISHシグナルは、HIV-1プロウイルスDNAの組込みのない7p15遺伝子座に対応する。
【０１６５】
（ACH-2細胞培養物におけるHIV-1の検出）
本発明者らは、分子コーミングを適用して、ACH-2細胞株（Clouse, Powell et al. 1989）において完全なHIV-1組込みプロウイルスを検出し、これは、7p14.3（Ishida, Hamanoらの文献2006）におけるNT5C3（サイトゾル5'-ヌクレオチダーゼIII）遺伝子中のそのゲノムにHIV-1の特有の組込み形態を含む。挿入部位の側面に位置する標識フォスミド（G248P87988G9及びG248P86255A8）を、標識HIV-1プローブより同時に、コーミングされたACH-2 DNAでハイブリダイズした。10.2kb+/-0.8kbの平均サイズを、1又は両方のフォスミドによって側面に位置する124のHIV-1 FISHシグナルの測定から得、これは、HIV-1の予想サイズ(9.7 kb)に相当した（図８Ａ、HIVプローブ：赤 テキサスレッド/アレキサ594蛍光、フォスミド：緑 アレキサ488蛍光）。2006年3月のヒトアセンブリ(NCBI Build 36.1)によって、NT5C3遺伝子の正常な対立遺伝子を検出し、フォスミドG248P87988G9及びG248P86255A8のFISHシグナル間のギャップの長さの測定によって、32.8±1.8kbの平均サイズとなり、31kbの予想サイズを軽く上回った。この結果は、分解によって、分子コーミングが、この遺伝子座に関する情報を更に有し得ることを示す（図８Ｂ）。さらに、133の単離されたHIV-1 FISHシグナルを、このコーミングされたACH-2 DNA調製物で測定し、10.05kbの+/-0.79kbの平均サイズであった（図８Ｃ）。これは、以前に記載された（Ishida, Hamanoらの文献2006）、予想された特有のHIV-1挿入部位と異なり、他のACH-2ゲノム若しくはHIV-1の他の挿入部位に存在し、又は非組込み形態のHIV-1が、ACH-2核において持続性を有することを示唆する。挿入部位(G248P84833H9)を包含する標識フォスミドが、標識HIV-1プローブより同時に、コーミングされたACH-2 DNAでハイブリダイズする場合、同様の観察を行う（図８Ｄ）。10.4kb+/-0.5kbの平均サイズを、フォスミドのシグナル内の57のHIV-1 FISHシグナルの測定から得、これは、HIV-1プロウイルスの予想サイズ(9.7 kb)に相当した（HIVプローブ：レッドテキサスレッド/アレキサ594蛍光、フォスミド：グリーンアレキサ488蛍光）。さらに、35の単離されたHIV-1 FISHシグナルも、このコーミングされたACH-2 DNA調製物で検出及び測定し、10.03kb+/- 0.82 kbの平均サイズであった（図示せず）。
【０１６６】
これらの結果は、分子コーミングが、HIVゲノムDNAの構造を解析するための、及び特有の分子レベルで、生体試料において、ゲノムDNA中のその組込みを定量化するための、強力な方法であることを示す。
【０１６７】
【表６】
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【０１６８】
【表７】
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【０１６９】
（実施例３  分子コーミングによる癌遺伝子の検出）
実施例１におけるHSVゲノムDNAの検出に類似する方法で、ウイルス癌遺伝子の存在を検出するように、プローブを設計する。プローブを、関心を惹く活性のあるウイルス癌遺伝子の80〜100%を相補するように設計し、分子コーミングを行う。結果は、対象において活性のある癌遺伝子の存在を示し、これは、診断的介入及び治療的介入をもたらす。
【０１７０】
（実施例４  分子コーミングを用いる、感染性ウイルスDNAの再編成の検出）
実施例１におけるHSVゲノムDNAの検出に類似する方法で、感染性ウイルスDNAの種々の再編成の存在を検出するように、プローブを設計する。種々の着色蛍光プローブによって認識される種々のハプテンによって標識された、種々のプローブ集合を、関心を惹く活性のあるウイルス癌遺伝子の80〜100%を相補するように設計し、分子コーミングを行う。対象の細胞、組織又は体液のウイルス遺伝子の編成における変化を用いて、癌遺伝子へのプロト癌遺伝子の変換による腫瘍形成性の危険性又は誘発等の、ウイルスゲノムの再編成に関連するウイルス疾患又は疾患の進行の危険性を診断するか、又は予後する。
【０１７１】
（実施例５  分子コーミングによる遺伝子療法のモニタリング）
実施例２におけるHIV-1のプロウイルス形態の検出に類似する方法で、組込み治療アデノウイルスベクター又はこれを有するトランスジェネティック配列(transgenetic sequence)の80〜100%を相補するように、プローブを特別に設計する。宿主染色体に組み込まれた遺伝子組換え物質の存在を検出するために、特別に設計したプローブを使用して、導入遺伝子を積極的に発現することができる形態で遺伝子組換え物質が編成されるか否かについて、分子コーミングを行う。対象における導入遺伝子の量を縦方向に追跡し、治療アデノウイルスベクターをいつ再投与するか、及びこれを再投与するか否かについて決定する。
【０１７２】
（参考文献）
（特許）
【化１】
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【０１７３】
（引用による組込み）
本開示によって引用するか、又は本開示に言及する、それぞれの文献、特許、特許出願若しくは特許公報は、特に、本明細書における言及の引用の周囲にある具体的な主題に関して、その全体が引用により組み込まれる。但し、かかる引用が、背景技術と、引用文献の正確さ及び妥当性を疑う権利とを構成することを容認するものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年1月23日(2013.1.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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