(57)【要約】  本発明は、シスチンを微生物に接触させるステップを含んでなる、シスチンをシステインおよび／またはグルタチオンに転換する方法を提供する。本発明はまた、少なくとも１．８ｍｇ／ｇのシステインを含んでなる酵母抽出物、および少なくとも１．３ｍｇ／ｇのシステインを含んでなる酵母自己溶解物にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シスチンを微生物に接触させるステップと、システインおよび／またはグルタチオンを回収するステップを含んでなる、シスチンからシステインおよび／またはグルタチオンを生成する方法。
【請求項２】
前記微生物が酵母である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
溶解微生物が細胞壁である、請求項１または２に記載の方法
【請求項４】
前記微生物が発酵培地中にある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記シスチンが前記発酵培地に添加される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
還元剤および／または補助因子が存在する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
１つ以上の酵素が存在する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記酵素が、プロテアーゼ、システイン還元酵素、ヒドロゲナーゼ、およびリポアミドデヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
全乾燥物質を基準にして少なくとも１．８ｍｇ／ｇのシステインを含んでなる、酵母抽出物。
【請求項１０】
ＮａＣｌ非含有乾燥物質重量を基準にして少なくとも１％ｗ／ｗの５’リボヌクレオチドを含んでなる、請求項９に記載の酵母抽出物。
【請求項１１】
全乾燥物質を基準にして、少なくとも１．３ｍｇ／ｇｗ／ｗのシステインを含んでなる、酵母自己溶解物。
【請求項１２】
ＮａＣｌ非含有乾燥物質重量を基準にして、少なくとも１％ｗ／ｗの５’−リボヌクレオチドを含んでなる、請求項１１に記載の酵母自己溶解物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、シスチンからシステインおよび／またはグルタチオンを製造する方法に関する。
【０００２】
［背景技術］
市販されるシステインの主要原料はシスチンである。シスチンを電気化学的に還元して、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎ、；時に「ｃｙｓｔｅｉｎｅ」とも綴られる）にすることができる。この方法は高価かつ複雑である。特開平３−１８０１８８号公報は、ヒドロゲナーゼ活性があるアルカリ抵抗性酵素の溶液を使用して、アルカリ性条件下でシステインをシスチンから製造する方法について記載する。特開平２−０９２２９４号公報は、ヒドロゲナーゼ活性がある酵素溶液を使用して、システインをシスチンから製造する方法について記載する。
【０００３】
［発明の説明］
意外にも出願人らは、シスチンを微生物と接触させることで、システインおよび／またはグルタチオンを生成され得ることを発見した。したがって第１の態様では、本発明は、シスチンを微生物と接触させるステップと、システインおよび／またはグルタチオンを回収するステップを含んでなる、シスチンからシステインおよび／またはグルタチオンを製造する方法を提供する。
【０００４】
好ましい実施態様では、本発明の方法の温度は０〜１００℃である。好ましくは温度は２０〜８０℃、より好ましくは３０〜７０℃、なおもより好ましくは３５〜６５℃、最も好ましくは４０〜６０℃である。温度が低すぎる（すなわち０℃未満である）場合、シスチンからシステインおよび／またはグルタチオンへの転換が起きない、またはわずかな程度しか起きない場合がある。加えて低温ではシスチンの溶解度が低く、それは溶液中に少なすぎるシスチンをもたらすかもしれない。温度が高すぎる（すなわち１００℃を超える）場合、シスチンからシステインおよび／またはグルタチオンへの転換が起きない、またはわずかな程度しか起きない場合がある。
【０００５】
微生物は、細胞内にグルタチオンの形態でシステインを貯蔵してもよい。したがってシスチンと微生物の接触中には、システインだけでなくグルタチオンもまた形成されてもよい。本発明の第１の態様の段階次第で、システインのみ、グルタチオンのみ、または両者の組み合わせが検出されてもよい。グルタチオンの生成は、システインもまた生成したが、グルタチオンに転換されたことを意味する。
【０００６】
本発明の方法のｐＨは、好ましくは２〜１０である。好ましくはｐＨは３〜９、より好ましくは４〜８、なおもより好ましくは５〜７である。
【０００７】
好ましい実施態様では、本発明の方法は工業規模で実施される。本発明の説明全体を通じて、工業規模工程または工業工程は、≧１０Ｌ、好ましくは≧１００Ｌ、より好ましくは≧１ｍ３、≧５ｍ３、なおもより好ましくは≧１０ｍ３、最も好ましくは≧２５ｍ３、好ましくは２５０ｍ３未満の体積規模の工程を包含するものと理解されてもよい。
【０００８】
本発明の方法では、あらゆるタイプの微生物を使用してもよい。好ましくは微生物は、シスチンからシステインおよび／またはグルタチオンへの転換に適する。食品および飼料用途に適したものなどの細菌および真菌微生物が好ましい。好ましい微生物は食品等級である実態を有し、したがってヒト消費のための食品に安全に応用し得るものである。本発明の方法で使用するのに適した微生物の例としては、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）またはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）などの糸状菌、および酵母が挙げられる。好ましくは微生物は酵母である。サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）またはカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する酵母株が好ましく使用される。サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母株、例えばサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株がなおもより好ましい。適切な細菌微生物の例としては、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、そしてメタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）やメタノサルシナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）などの古細菌が挙げられる。
【０００９】
好ましい実施態様では、本発明の方法の微生物は発酵培地中にある。シスチンを生きている（生）微生物と接触させてもよく、それは発酵培地中のシステインおよび／またはグルタチオン形成をもたらしてもよく、またはそれは、その中にシスチンが存在せずおよび／またはそれにシスチンが添加されていない発酵で得られる微生物と比較して、システインおよび／またはグルタチオン含量が増大している微生物（すなわち微生物細胞）をもたらしてもよい。好ましくはシスチンが、好ましくは発酵開始時に発酵培地に添加される。発酵は、例えばタンパク質加水分解産物の酵母抽出物を含有する富栄養培地を使用して実施してもよいが、合成または最少培地を使用してもよい。合成または最少培地は、例えばシスチン以外のイオウ源を除外することで、またはこのようなイオウ源の濃度を可能な限り低く保つことで、微生物がシスチンをシステインおよび／またはグルタチオンに転換するよう刺激する培地組成物を合成し得る利点を有し得る。例えば発酵培地にスルフェート（硫酸塩）を添加しないことが、有利であり得る。合成または最少培地は、成長に必要な通常のビタミン、補助因子、および微量元素を含んでなってもよい。当業者は異なる各種微生物の成長にビタミン、補助因子、および微量元素が必要であることを知っているが、それらは発酵または微生物学便覧にもまた列挙されており、したがって当業者によって過度の負担なしに容易に見出され得る。
【００１０】
別の実施態様では、死滅しているが無傷の微生物にシスチンを接触させてもよい。例えば死滅処理後、例えば発酵の終わりに、死滅しているが無傷の微生物にシスチンを接触させてもよい。死滅しているが無傷の微生物は、例えば９０〜１００℃で熱ショックを与えることによって得られてもよく、それは透過性（「漏出」）細胞をもたらしてもよい。
【００１１】
さらに別の実施態様では、シスチンを溶解微生物と接触させてもよい。例えば酵母抽出物の生成中に、シスチンを溶解微生物と接触させてもよい。溶解生物は、細胞壁画分（細胞壁）と可溶性画分からなる。細胞壁を溶解微生物として使用することは、本発明の方法後に、それらをシステインおよび／またはグルタチオンから単離し再使用し得ることから、有利であり得る。溶解微生物は、機械的、化学的、または酵素的に処理することで得られてもよい。機械的処理としては、均質化技術が挙げられる。この目的で、高圧ホモジナイザーの使用も可能である。その他の均質化技術としては、例えば砂および／またはガラスビーズなどの粒子との混合、または製粉装置（例えばビーズミル）の使用が挙げられる。処理はまた、細胞を加熱することで実施してもよい。化学処理剤としては、塩、酸またはアルカリおよび／または１つ以上の界面活性剤または洗剤の使用が挙げられる。化学処理剤は、システインまたはグルタチオンの分解または変性をもたらし得るので、あまり好ましくない。酵素処理は、セルラーゼ、グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、キチナーゼ、プロテアーゼおよび／またはペクチナーゼを使用して実施してもよい。処理の併用もまた可能である。
【００１２】
好ましい実施態様では、溶解生物は細胞壁（例えば細胞壁の形態）である。細胞壁は酵母自己溶解物の一部であってもよいが、また細胞内容物から分離されてもよい。
【００１３】
好ましい実施態様では、本発明の方法中に、還元剤および／または補助因子が存在する。還元剤および／または補助因子を添加することは、方法の速度および／または転換および／または収率を向上させ得る。還元剤および／または補助因子は、好ましくは、（還元）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、（還元）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、（還元）リポアミド、（還元）フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、（還元）フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、（還元）金属イオン、およびＨ２からなる群から選択される。
【００１４】
別の実施態様では、本発明の方法中に１つ以上の酵素が存在する。酵素は、好ましくは、プロテアーゼ、システイン還元酵素、ヒドロゲナーゼ、およびリポアミドデヒドロゲナーゼからなる群から選択される。好ましくは１つ以上の酵素が微生物に添加される。
【００１５】
一実施態様では、補助因子再生系が存在する。このような系は、酵素によって酸化され得る基質と共に、通常は酸化還元酵素である酵素からなってもよい。補助因子再生系の例は、グルコースデヒドロゲナーゼ／グルコースおよびギ酸デヒドロゲナーゼ／ギ酸である。補助因子再生系は、シスチンからシステインまたはグルタチオンへの転換に必要であってもよく、またはそれは前記転換を増大または向上させてもよく、またはそれはより長い期間にわたり進行する工程をもたらしてもよい。
【００１６】
別の態様では、本発明は、好ましくは、全乾燥物質を基準にして少なくとも１．８ｍｇ／ｇのシステインを含んでなる、システインおよび／またはグルタチオンに富んだ酵母抽出物を提供する。Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｄｅｘは、「酵母抽出物」を次のように定義する。「酵母抽出物は酵母細胞の水溶性構成要素を含んでなり、その組成物は主としてアミノ酸、ペプチド、炭水化物、および塩である。酵母抽出物は食用酵母中に存在する天然酵素による、または食品等級酵素の添加による、ペプチド結合の加水分解を通じて生成される」。システインおよびグルタチオンは、還元性糖類との反応による加工香料調製の主要原料である。米国特許第４，５９２，９１７号明細書は、還元性糖類と、アミノ酸（ロイシン）と、システインであってもよいイオウ含有物質とを反応させることによる、茹でチキン香料の調製について記載する。酵母抽出物は長年にわたり、タンパク質、ペプチド、システインなどのアミノ酸、脂肪、ミネラル、およびＢビタミンの原料として知られている。システインに富んだ酵母抽出物は、加工香料を製造するための適切なシステインまたはグルタチオン原料になるであろう。好ましくは本発明の酵母抽出物中のシステインの量は、全乾燥物質を基準にして、少なくとも４．６ｍｇ／ｇ、４．７ｍｇ／ｇ、より好ましくは少なくとも５ｍｇ／ｇ、５．１ｍｇ／ｇ、６．１ｍｇ／ｇ、６．２ｍｇ／ｇ、なおもより好ましくは少なくとも６．７ｍｇ／ｇ、６．８ｍｇ／ｇである。好ましくは本発明の酵母抽出物は、いかなる添加グルタチオンまたはシステインも含まない。
【００１７】
好ましい実施態様では本発明の酵母抽出物は、ＮａＣｌ非含有乾燥物質重量を基準にして、少なくとも１％ｗ／ｗの５’−リボヌクレオチドを含んでなる。５’−リボヌクレオチド、特に５’−ＩＭＰおよび５’−ＧＭＰは、それらの香味増強特性が知られている。それらは特定の各種食品において、よい風味と旨みを増強できる。この現象は、「口当たり」またはウマミ（ｕｍａｍｉ）と記述される。５’−リボヌクレオチドに富んだ酵母抽出物は、通常、スープ、ソース、マリネード、および香味調味料に添加される。好ましくは、本発明の酵母抽出物中の５’−リボヌクレオチドの量は、ＮａＣｌ非含有乾燥物質重量を基準にして、少なくとも２％ｗ／ｗ、３％、４％、より好ましくは少なくとも６、８、１０％ｗ／ｗ、なおもより好ましくは少なくとも１２％、１４％、１６％、なおもより好ましくは少なくとも１８％、２０％、２２％、最も好ましくは少なくとも２５％ｗ／ｗである。本発明の酵母抽出物中の５’−リボヌクレオチドの重量百分率（％ｗ／ｗ）は、組成物のＮａＣｌ非含有乾燥物質重量を基準にして、５’−リボヌクレオチドの二ナトリウム塩七水和物（２Ｎａ．７Ａｑ）として計算される。ＮａＣｌ非含有とは、酵母抽出物がＮａＣｌを含有し得ないことを意味しないが、％ｗ／ｗ計算のためにＮａＣｌが酵母抽出物から除外されていることを意味する。後者の計算は、当業者に知られている方法によって実施することができる。
【００１８】
別の態様では、本発明は、好ましくは全乾燥物質を基準にして少なくとも１．２ｍｇ／ｇｗ／ｗのシステインを含んでなる、システインおよび／またはグルタチオンに富んだ酵母自己溶解物を提供する。Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｄｅｘは、自己溶解酵母を次のように定義する。「自己溶解酵母は、食品等級酵母から得られる、濃縮され、抽出されていない、部分的可溶性消化物である。可溶化は、酵母細胞の酵素加水分解または自己消化によって達成される。自己溶解酵母は、酵母細胞全体に由来する、可溶性および不溶性双方の構成要素を含有する」。酵母自己溶解物は、酵母抽出物中に存在する全ての関心のある構成要素に加えて、可溶性画分から分離されていない関心のある細胞壁構成要素もまた含有するので、酵母自己溶解物は「酵母抽出物」とは異なる。細胞壁からの関心のある構成要素の例はβ−グルカン、マンノプロテイン、および酵母脂質画分である。これらの構成要素は、油っこさや満腹感などの口当たり属性を引き起こし、または増強し得る。酵母自己溶解物は、タンパク質、ペプチド、システインなどのアミノ酸、脂肪、ミネラル、およびＢビタミンの原料として、長年にわたって知られている。システインに富んだ酵母自己溶解物は、加工香料を製造するための適切なシステインまたはグルタチオン原料になるであろう。本発明の酵母自己溶解物は、クリーム酵母から、または全発酵ブロス、すなわち発酵残渣を含む酵母細胞から得られてもよい。好ましくは本発明の酵母自己溶解物は、５０〜９５の乾燥固体比を有する。乾燥固体比が５０〜９５の酵母自己溶解物を生成する方法は、国際公開第２００９／００７４２４号パンフレットに記載される。
【００１９】
好ましくは、本発明の酵母自己溶解物中のシステインの量は、全乾燥物質を基準にして、少なくとも３．３ｍｇ／ｇ、より好ましくは少なくとも３．６ｍｇ／ｇ、４．４ｍｇ／ｍＬ、なおもより好ましくは少なくとも４．８ｍｇ／ｇである。好ましくは本発明の酵母自己溶解物の５’−リボヌクレオチドの量は、ＮａＣｌ非含有乾燥物質重量を基準にして、少なくとも２％ｗ／ｗ、３％、４％、より好ましくは少なくとも６、８、１０％ｗ／ｗ、なおもより好ましくは少なくとも１２％、１４％、１６％、なおもより好ましくは少なくとも１８％、２０％、２２％、最も好ましくは少なくとも２５％ｗ／ｗであり、ＮａＣｌ非含有については上で定義される。
【００２０】
システインおよびグルタチオンは、例えばＮＭＲ、例えば高圧ＬＣ（ＨＰＬＣ）などの液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、または質量分析法（ＬＣＭＳ）併用ＬＣ、または（ＨＰ）ＬＣ−ＭＳＭＳを使用して、いくつかの方法によって測定されてもよい。
【００２１】
システインはまた、Ｍ．Ｋ．Ｇａｉｔｏｎｄｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ（１９６７年），ｖｏｌ．１０４，ｐ．６２７〜６３３に記載されるように、ニンヒドリンを使用して測定されてもよい。
【００２２】
システインおよび／またはグルタチオンは、当該技術分野で知られている技術によって回収してもよい。例えばシステインおよび／またはグルタチオンを遠心分離によって回収してもよく、それによって微生物をペレットとして廃棄し、システインおよび／またはグルタチオンを上清中で回収するか、または濾過によって回収してもよく、それによって微生物を残余分（または濾過ケーク）として濾液中に回収される。シスチンを生微生物または死滅しているが無傷の微生物と接触させる場合、システインおよび／またはグルタチオンを回収するのに先立って、システインおよび／またはグルタチオンを放出させるために、微生物細胞を溶解させることが好ましい場合がある。システインおよび／またはグルタチオンは、例えば遠心分離および（限外）濾過によって、主に細胞壁からなる固体画分を含んでなる溶解微生物懸濁液から回収してもよい。当業者は、細胞壁を構成する前記固体画分が、幾分かのシステインまたはグルタチオンもまた含んでなってもよいことを理解するであろう。したがってできる限り多くのシステインおよびグルタチオンを回収するためには、固体画分を１回以上洗浄することが好ましい場合がある。
【００２３】
［実施例］
［実施例１］
酵母自己消化中のシステイン生成
バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）からのエンドプロテアーゼ（デンマーク国のノボザイムズ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）からのアルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ））を添加して、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのクリーム酵母（乾燥固形分１８．２％）をｐＨ５．９および５１℃で自己消化させた。自己消化中、自己消化開始時（ｔ＝０時間）または自己消化開始４時間後（ｔ＝４時間）のどちらかに、シスチン（２％ｗ／ｗ）、還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ、１％ｗ／ｗ）および／またはグルコース（１％ｗ／ｗ）を添加し、添加量は全て表１に従った、全乾燥重量を基準にしたｗ／ｗである。
【００２４】
自己消化の２０時間後に、ｐＨ調節せずに遠心分離によって固体液体分離を実施した。乾燥物質の収率は７０％であった。ＮＭＲおよびＨＰＬＣを使用して、酵母細胞からの可溶性構成要素を含有する上清をシステイン含量（ｍｇ／ｇ乾燥物質）について分析した。結果を表１に示す。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
［実施例２］
酵母細胞壁および酵母抽出物によるシステイン生成
サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのおよそ２ｋｇのクリーム酵母（乾燥固形分１９．９％ｗ／ｗの酵母懸濁液）を５１℃で５分間で加熱処理した。引き続いてＮａＯＨを使用して懸濁液のｐＨを６．０に調節した。乾燥物質を基準にして０．００６８ｇ／ｇの量で）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｕｓ）セリンエンドプロテアーゼ（デンマーク国のノボザイムズからアルカラーゼとして得られる）を添加して、３．５時間インキュベーションし、自己溶解物を得て、酵母懸濁液を自己消化させた。引き続いてＨ２Ｓ０４を使用して自己溶解物のｐＨを５．１に低下させ、自己溶解物をおよそ１８時間インキュベートした。次に自己溶解物を４４００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、細胞壁を含んでなるペレットと酵母抽出物である上清を得た。ペレットを冷水で２回洗浄し、水に再懸濁して同一条件下で遠心分離した。上清を廃棄し、細胞壁を含んでなるペレットを水に再懸濁して、懸濁液中の細胞壁の最終濃度を細胞壁の全乾燥重量を基準にして７．７％ｗ／ｗにした。酵母抽出物の乾物含量は１５％ｗ／ｗであった。
【００２７】
１５０ｇの酵母抽出物に、シスチン（１．２ｇ）、グルコース（１．３ｇ）、グルコースデヒドロゲナーゼ（１０Ｕ／ｇ）、および酸化ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（０．５ｍＭ）を添加した。１５０ｇの細胞壁懸濁液に、シスチン（０．６ｇ）、グルコース（０．７ｇ）、グルコースデヒドロゲナーゼ（１０Ｕ／ｇ）、および酸化ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（０．５ｍＭ）を添加した。表２を参照されたい。ｐＨを６．５に調節した。次に細胞壁懸濁液および酵母抽出物を３５℃でおよそ１８時間インキュベートした。Ｍ．Ｋ．Ｇａｉｔｏｎｄｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ（１９６７年），ｖｏｌ．１０４，ｐ．６２７〜６３３に記載されるように、ニンヒドリン試薬を使用してシステインを分光光度法で測定した。
【００２８】
グルコースデヒドロゲナーゼは、米国カリフォルニア州９４０６３レッドウッドシティ（Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ  ９４０６３，ＵＳＡ）２００  Ｐｅｎｏｂｓｃｏｔ  ＤｒｉｖｅのＣｏｄｅｘｉｓ，Ｉｎｃから得た。
【００２９】
【表２】
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【００３０】
［実施例３］
発酵中のシステイン生成
サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、１００ｍＬの振盪フラスコ内で、表３に従ったミネラル上で成長させた。ビタミン、補助因子、および微量元素は別々に添加した。
【００３１】
【表３】
2013505712.tif 000004
【００３２】
培地を１６０℃で１８０分間にわたり加熱滅菌した。インキュベーション温度は３０℃であり、発酵時間は２４時間であった。各フラスコを二連（ＡおよびＢ）で発酵させた。その他の条件は表４に列挙される。システインおよびシスチンは表５に従って添加した。
【００３３】
【表４】
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【００３４】
【表５】
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【００３５】
発酵の終わりに、増殖の指標として６００ｎｍにおけるブロスの吸光度を測定した。その後ブロスを２つの部分に分割した。１つの部分はシステインおよび／またはグルタチオンを放出させるために１０分間沸騰させた。これは細胞懸濁液をもたらした。乾燥と引き続く秤量によって、この細胞懸濁液の乾物含量を測定した。別の部分は濾過した。得られた残余分を廃棄して透明な濾液を得た。ｔ＝０（接種後）とｔ＝２４時間（表６）の双方で、システインについて濾液と細胞懸濁液の双方を分析した。
【００３６】
【表６】
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【００３７】
ドイツ国ダルムシュタット（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のメルク（Ｍｅｒｃｋ）からのＺＩＣ−ＨＩＬＩＣカラムを使用した、ＷａｔｅｒｓからのＨＰＬＣ−ＭＳＭＳシステムを使用して、システインを測定した。１３Ｃ標識システインを内部基準として使用した。
【国際調査報告】
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