(57)【要約】  本発明は、その糖部分上において、フコースを欠いている、低減したフコース量を有する、又は他の非定型糖を有する分子を生成するための細胞に関する。本発明は、上記細胞を用いて、その糖部分上において、フコースを欠いている、低減したフコース量を有する、又は他の非定型糖を有する分子を生成する方法、及び上記方法で入手可能な分子にも関する。本発明は更に、人工のグリコシル化パターンを有する分子に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
自然状態ではその糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有する分子を生成するための脊椎動物細胞であって、
基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用するが、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースをＧＤＰ−Ｌ−フコースに変換する反応を触媒しない酵素を少なくとも１つ含む、自然状態ではその糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有する分子を生成するための脊椎動物細胞。
【請求項２】
基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用する該酵素が、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）、ＧＤＰ−ペロサミンシンテターゼ（Ｐｅｒ）、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−タロースシンテターゼ（ＧＴＳ）、ＧＤＰ−フコースシンテターゼＣｙｓ１０９Ｓｅｒ（ＧＦＳ−Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒ）突然変異体、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース−３−デヒドラターゼ（ＣｏｌＤ）、又はＧＤＰ−Ｌ−コリトースシンターゼ（ＣｏｌＣ）と組み合わせたＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース−３−デヒドラターゼ（ＣｏｌＤ）、及びそれらの変異体からなる群から選択される、請求項１に記載の脊椎動物細胞。
【請求項３】
ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）が緑膿菌由来（配列番号１）である、請求項２に記載の脊椎動物細胞。
【請求項４】
ＧＤＰ−Ｄ−ラムノース、ＧＤＰ−Ｄ−ペロサミン、ＧＤＰ−デオキシ−Ｄ−タロース、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−アルトロース、ＧＤＰ−４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース、及び／又はＧＤＰ−Ｌ−コリトースを更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の脊椎動物細胞。
【請求項５】
前記細胞に一時的に存在する又は安定して維持される核酸から該酵素が発現される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の脊椎動物細胞。
【請求項６】
フコシルトランスフェラーゼに対する基質となることができる少なくとも１つの分子を更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の脊椎動物細胞。
【請求項７】
分子がタンパク質又は脂質である、請求項６に記載の脊椎動物細胞。
【請求項８】
タンパク質が内因性タンパク質又は外因性タンパク質である、請求項７に記載の脊椎動物細胞。
【請求項９】
タンパク質が、抗体、若しくはＩｇＧ１抗体、抗体断片、若しくは抗体のＦｃ領域を含む抗体断片、融合タンパク質、若しくは抗体のＦｃ領域を含む融合タンパク質、ウイルスタンパク質、ウイルスタンパク質断片、抗原、又はホルモンである、請求項７又は８に記載の脊椎動物細胞。
【請求項１０】
哺乳類細胞、魚類細胞、両生類細胞、爬虫類細胞又は鳥類細胞である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の脊椎動物細胞。
【請求項１１】
ｉ）哺乳類細胞がヒト細胞、ハムスター細胞、イヌ細胞若しくはサル細胞、若しくはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、メイディンダービーイヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、ヒトＰＥＲ．Ｃ６細胞、若しくはヒトＡＧＥ１．ＨＮ細胞であり、
ｉｉ）魚類細胞がアメリカナマズ（チャネル・キャットフィッシュ）卵巣（ＣＣＯ）細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２７７２）であり、
ｉｉｉ）両生類細胞がアフリカツメガエル腎臓細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０２）であり、
ｉｖ）爬虫類細胞がグリーンイグアナ心臓細胞（ＩｇＨ−２）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０８）であり、又は
ｖ）鳥類細胞がトリ網膜細胞、若しくはＡＧＥ１．ＣＲ．ＰＩＸ細胞、若しくはトリ体節細胞である、請求項１０に記載の脊椎動物細胞。
【請求項１２】
ＧＤＰ−Ｄ−ラムノース、ＧＤＰ−Ｄ−ペロサミン、ＧＤＰ−デオキシ−Ｄ−タロース、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−アルトロース、ＧＤＰ−４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース又はＧＤＰ−Ｌ−コリトースに対する少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼを更に含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の脊椎動物細胞。
【請求項１３】
自然状態ではその糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有する分子を生成する方法であって、
ｉ）請求項１〜１２のいずれか一項に記載の脊椎動物細胞を準備する工程と、
ｉｉ）ｉ）における該細胞からフコシルトランスフェラーゼに対する基質となることができる分子、又はタンパク質若しくは脂質を単離する工程と、
を含む、自然状態ではその糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有する分子を生成する方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法により入手可能な、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有する分子。
【請求項１５】
請求項１４に記載の分子の組成物。
【請求項１６】
ｉ）７０％〜９５％のＧ０−ＧｌｃＮａｃ、Ｇ０、Ｇ１及び／又はＧ２の複合型Ｎ−グリカンと、
ｉｉ）５％〜３０％の高マンノース型Ｎ−グリカンと、
を含む糖タンパク質を含む組成物であって、該糖タンパク質の該複合型Ｎ−グリカンがフコースを含まない、又はフコースを実質的に含まない、糖タンパク質を含む組成物。
【請求項１７】
複合型Ｎ−グリカンの７５％がＧ０の複合型Ｎ−グリカンであり、２５％がＧ０−ＧｌｃＮａｃ、Ｇ１及び／又はＧ２の複合型Ｎ−グリカンである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
高マンノース型Ｎ−グリカンの５０％がｍａｎ５グリカンであり、５０％がｍａｎ６、ｍａｎ７及び／又はｍａｎ８のＮ−グリカンである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
糖タンパク質が抗体、又はＩｇＧ１である、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
Ｄ−ラムノース、Ｄ−ペロサミン、デオキシ−Ｄ−タロース、６−デオキシ−Ｄ−アルトロース、４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース及び／又はＬ−コリトースを含有する糖部分を含む、タンパク質又は脂質。
【請求項２１】
基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用するが、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースをＧＤＰ−Ｌ−フコースに変換する反応を触媒しない酵素をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに操作可能に連結した脊椎動物の発現制御配列を１つ又は複数含む発現単位。
【請求項２２】
基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用する該酵素が、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）、ＧＤＰ−ペロサミンシンテターゼ（Ｐｅｒ）、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−タロースシンテターゼ（ＧＴＳ）、ＧＤＰ−フコースシンテターゼＣｙｓ１０９Ｓｅｒ（ＧＦＳ−Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒ）突然変異体、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース−３−デヒドラターゼ（ＣｏｌＤ）、又はＧＤＰ−Ｌ−コリトースシンターゼ（ＣｏｌＣ）と組み合わせたＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース−３−デヒドラターゼ（ＣｏｌＤ）、及びそれらの変異体からなる群から選択される、請求項２１に記載の発現単位。
【請求項２３】
通常その糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有するタンパク質を生成するための真核細胞であって、
ｉ）基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用する酵素をコードする核酸配列を含む第１のポリヌクレオチドと、
ｉｉ）タンパク質をコードする核酸配列を含む第２のポリヌクレオチドと、
を含み、該酵素がＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースをＧＤＰ−Ｌ−フコースに変換する反応を触媒しない、通常その糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有するタンパク質を生成するための真核細胞。
【請求項２４】
基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用する該酵素が、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）、ＧＤＰ−ペロサミンシンテターゼ（Ｐｅｒ）、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−タロースシンテターゼ（ＧＴＳ）、ＧＤＰ−フコースシンテターゼＣｙｓ１０９Ｓｅｒ（ＧＦＳ−Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒ）突然変異体、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース−３−デヒドラターゼ（ＣｏｌＤ）、又はＧＤＰ−Ｌ−コリトースシンターゼ（ＣｏｌＣ）と組み合わせたＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース−３−デヒドラターゼ（ＣｏｌＤ）、及びそれらの変異体からなる群から選択される、請求項２３に記載の真核細胞。
【請求項２５】
タンパク質が、抗体、若しくはＩｇＧ１抗体、抗体断片、若しくは抗体のＦｃ領域を含む抗体断片、抗体のＦｃ領域を含む融合タンパク質、ウイルスタンパク質、ウイルスタンパク質断片、抗原、又はホルモンである、請求項２３又は２４に記載の真核細胞。
【請求項２６】
通常その糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有するタンパク質を生成する方法であって、
ｉ）請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の真核細胞を準備する工程と、
ｉｉ）前記細胞において該第１のポリヌクレオチドによりコードされる該酵素及び該第２のポリヌクレオチドによりコードされる該タンパク質を発現する工程と、
ｉｉｉ）前記細胞から該タンパク質を単離する工程と、
を含む、通常その糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有するタンパク質を生成する方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法により入手可能な、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、その糖部分上において、フコースを欠いている、低減したフコース量を有する、又は他の非定型糖を有する分子を生成するための細胞に関する。本発明は、上記細胞を用いて、その糖部分上において、フコースを欠いている、低減したフコース量を有する、又は他の非定型糖を有する分子を生成する方法、及び上記方法で入手可能な分子にも関する。本発明は更に、人工のグリコシル化パターンを有する分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトでの使用を目的とする治療用グリコシル化分子は、ヒトで見られるものと類似の複雑なグリコシル化パターンを有するものとする。そのため、グリコシル化分子が複雑なヒト様グリコシル化パターンを有することが望まれる場合、治療用グリコシル化分子、例えばタンパク質又は脂質を生成するのに一般的に動物細胞が使用される。グリカンの構造及び複雑性は、半減期、受容体の結合の変調、免疫反応の誘導又は抑制により生体分子のｉｎ  ｖｉｖｏ機能に重大な影響を与える。
【０００３】
糖脂質の糖鎖は複雑であり、かつ相当量のフコースを含有する可能性がある（非特許文献１）。糖タンパク質の糖鎖は、タンパク質部分との結合形態に基づきおおまかに２つのタイプ、すなわちアスパラギンと結合する糖鎖（Ｎ−グリコシド連結型糖鎖）と、セリン、トレオニン等の他のアミノ酸と結合する糖鎖（Ｏ−グリコシド連結型糖鎖）とに分けられる。
【０００４】
Ｎ−グリコシド連結型糖鎖は様々な構造を有する（非特許文献２）が、基本的な共通のコア構造を有することが知られている。アスパラギンと結合する糖鎖末端は還元末端と呼ばれ、反対側は非還元末端と呼ばれる。Ｎ−グリコシド連結型糖鎖には、マンノースが単独でコア構造の非還元末端と結合する高マンノース型と、トリマンノースのコアの非還元末端側が通常、２つの（１，３及び１，６）マンノース結合手（arms）のそれぞれに結合した少なくとも１つのガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃと称される）を有する複合型とが含まれる。Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃの非還元末端側はガラクトース及びシアル酸、バイセクティング（bisecting）Ｎ−アセチルグルコサミン等を含有することがある。混成型では、コア構造の非還元末端側が高マンノース型及び複合型両方の分岐を有する。脊椎動物細胞由来のグリカンでは、フコースは、α１，３連結を介して分岐型（antennary）ＧｌｃＮＡｃに（末端フコース）、又はα１，６連結を介してアスパラギン連結型ＧｌｃＮＡｃに（コアフコース）結合することができる。昆虫細胞は１，３連結したコアフコースを含有し得るグリカンを生成する。
【０００５】
初めにＮ−グリコシル化タンパク質のオリゴ糖部分が脂質連結型オリゴ糖から生合成され、Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２−ピロホスホリル−ドリコールが生成され、それからそれが小胞体（ＥＲ）におけるタンパク質のトリペプチド配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＴｈｒ（ここでＸはＰｒｏを除く任意のアミノ酸であり得る）にあるアスパラギンへと転移する。その後、該タンパク質はゴルジ装置へと輸送され、そこでオリゴ糖部分が以下の順番で更にプロセシングされる：まず３つ全てのグルコース（Ｇｌｃ）残基がグルコシダーゼＩ及びグルコシダーゼＩＩにより取り除かれ、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２−タンパク質が生じる。Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２構造は、多数のマンノース（Ｍａｎ）残基を取り除くことにより、更にプロセシングされ得る。初めに、４つのα−１，２連結型マンノースが取り除かれ、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−タンパク質が生じた後、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基の付加により伸長する。この新たな構造、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−タンパク質はα−１，３連結型マンノース及びα−１，６連結型マンノースを取り除くマンノシダーゼＩＩに対する基質である。その後、他の糖、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコース及びシアル酸が連続して付加され、Ｎ−グリコシル化タンパク質でよく見られる複合型の構造が生じる。
【０００６】
ＩｇＧ分子は例えば、Ｆｃ領域におけるＣＨ２ドメインのうちのそれぞれの保存されたＡｓｎ２９７で共有結合したＮ連結型オリゴ糖を含有する。血清ＩｇＧのＦｃ領域で見られるオリゴ糖は複合型のほとんどが二分岐の（biantennary）グリカンである。ＩｇＧグリコシル化パターンの変形には、コア構造：２×Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及び３×マンノース（Ｍａｎ）（ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３）への末端シアル酸（ＮｅｕＡｃ）、第３のＧｌｃＮａｃ結合手（バイセクティングＧｌｃＮＡｃ）の結合、末端のガラクトシル化（Ｇ）、及びα−１，６連結型のコアのフコシル化（Ｆ）が含まれる。グリコシル化の正確なパターンはＩｇＧサブコンポーネント、特にＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの構造特性によって決まる（非特許文献３）。
【０００７】
動物細胞及びヒト細胞は、タンパク質上のＮ−グリカンの還元末端でＧｌｃＮＡｃ残基に、又は糖脂質上の他の新生糖構造にフコース残基を付加するフコシルトランスフェラーゼを有する。タンパク質と結合した糖部分又は脂質と結合した糖部分のフコシル化には、ドナーとしてヌクレオチド糖であるＧＤＰ−Ｌ−フコース、またフコシル残基をドナーからアクセプタ分子へと転移させる特定のフコシルトランスフェラーゼの存在が要求される（非特許文献４）。真核細胞では、ＧＤＰ−Ｌ−フコースを２つの異なる経路、すなわち主要な（more prominent）フコースｄｅ  ｎｏｖｏ経路又は副次的な（minor）サルベージ経路のいずれかにより合成することができる（非特許文献４）。サルベージ経路又は「スカベンジャー」経路はＧＤＰ−Ｌ−フコースの副次的な供給源（およそ１０％）であり、培養培地からの遊離フコース及びフコシル化糖タンパク質の排除により容易に遮断することができる。サルベージ経路は細胞外フコースから開始し、該細胞外フコースはフコース特異的な原形質膜輸送体により細胞質コンパートメントへと輸送され得る。代替的に、取り込まれた（endocytosed）糖タンパク質から切断したフコースは細胞質へと侵入し得る。細胞質Ｌ−フコースはフコキナーゼによりリン酸化されてフコース−１−ホスフェートとなり、それからＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼによりＧＤＰ−Ｌ−フコースへと変換される（図１、右側のパネル）。細胞培養実験により、サルベージ経路が細胞質のＧＤＰ−Ｌ−フコースプールには比較的僅かしか寄与しないことが示唆されている（非特許文献４）。
【０００８】
主要なフコースｄｅ  ｎｏｖｏ経路は、ＧＤＰ−Ｄ−マンノースから開始し、ともに細胞質に位置するＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼ（ＧＭＤ）及びＧＤＰ−ケト−デオキシ−マンノース−エピメラーゼ／ＧＤＰ−ケト−デオキシ−ガラクトース−レダクターゼ（ＧＭＥＲ、ヒトではＦｘとしても知られる）からなり、協働してＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−Ｌ−フコースに変換する（図１、左側のパネル）。その後、ＧＤＰ−Ｌ−フコースはゴルジ装置の膜に位置するＧＤＰ−フコース輸送体により、ゴルジ体内へと輸送される。ＧＤＰ−Ｌ−フコースがゴルジ体の内腔コンパートメントに侵入すると、フコシルトランスフェラーゼはＧＤＰ−Ｌ−フコースをゴルジ体内の新生糖部分と共有的に連結させることができる。特に、フコシルトランスフェラーゼ（Ｆｕｔ８）はフコース残基を１，６連結によりＮ−グリカンの還元末端におけるＧｌｃＮＡｃ残基の６位へと転移させる。
【０００９】
糖タンパク質上でフコースを欠いていることが、特に有利であることが分かっている。例えば、モノクローナル抗体、免疫グロブリン及び関連分子では、免疫グロブリンのＦｃ部分（ＣＨ２ドメイン）のＡｓｎ２９７に結合するＮ−グリカン由来のコアフコース糖がないことにより、Ｆｃ受容体との免疫グロブリンの結合が増大又は変化することが分かっている。異なるタイプの定常領域は異なるＦｃ受容体と結合する。例としては、ＩｇＧ１  ＦｃドメインとコグネートＦｃ受容体ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）、ＣＤ３２（ＦｃγＲＩＩ−Ｂ１及びＦｃγＲＩＩ−Ｂ２）又はＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）との結合、ＩｇＡ  ＦｃドメインとコグネートＦｃ受容体ＣＤ８９（ＦｃαＲＩ）との結合、及びＩｇＥドメインとコグネートＦｃ受容体ＦｃεＦＲ１又はＣＤ２３との結合が挙げられる。ＮＫ細胞の表面上に存在する（which）ＦｃγＲＩＩＩとの結合が強く増大する（非特許文献５）。
【００１０】
治療抗体の主な作用機序は抗体依存性の細胞毒性（以下、「ＡＤＣＣ活性」と称される）である。Ｆａｂ部分により標的細胞（腫瘍細胞又は病原体に感染した細胞）と結合する抗体は、エフェクター細胞、通常ＮＫ細胞のＦｃ受容体によりそのＦｃ部分で認識される。結合すると、エフェクター細胞はＩＦＮ−γ等のサイトカイン、及びパーフォリンを含有する細胞毒性顆粒、及び標的細胞へと入り細胞死を誘導するグランザイムを放出する。ＦｃγＲＩＩＩとの結合親和性は、ＡＴＣＣを通じて作用する抗体に重要である。受容体の低親和性対立遺伝子のキャリアは、リツキシマブ等の治療抗体とはほとんど反応しない（非特許文献６）。
【００１１】
結果として、Ｆｃグリカン上のコアフコースの非存在により媒介されるＦｃγＲＩＩＩに対するより高い親和性により、主に臨床的利点及びコストの意味合いで生物治療製品の効力を増大させるか、又は有効用量を低減させることができる。
【００１２】
生成される糖タンパク質の糖鎖構造を修飾するために、１）糖鎖の修飾に関連する酵素に対する阻害剤の適用、２）糖合成又は糖転移に関与する遺伝子のホモ接合型（homozygous）ノックアウト、３）突然変異体の選択、４）糖鎖の修飾に関連する酵素をコードする遺伝子の導入等の様々な方法が試みられている。具体例を以下に記載する。
【００１３】
糖鎖の修飾に関連する酵素に対する阻害剤の例としては、グリコシダーゼＩの阻害剤であるカスタノスペルミン及びＮ−メチル−１−デオキシノジリマイシン、グリコシダーゼＩＩの阻害剤であるブロモコンズリトール、マンノシダーゼＩの阻害剤である１−デオキシノジリマイシン及び１，４−ジオキシ−１，４−イミノ−Ｄ−マンニトール、マンノシダーゼＩＩの阻害剤であるスワインソニン等が挙げられる。グリコシルトランスフェラーゼに特異的な阻害剤の例としては、Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼＶ（ＧｎＴＶ）に対する基質のデオキシ誘導体等が挙げられる。
【００１４】
糖鎖の修飾に関連する酵素の突然変異体は主に、レクチン耐性細胞株から選択及び入手されている。例えば、ＣＨＯ細胞の突然変異体は、ＷＧＡ（タチジャコウソウ（T. vulgaris）から誘導されるコムギ胚芽凝集素）、ＣｏｎＡ（タチナタマメ（C.ensiformis）から誘導されるコンカナバリン（concanavalin）Ａ）、ＲＩＣ（トウゴマ（R. communis）から誘導される毒素）、Ｌ−ＰＨＡ（インゲンマメ（P.vulgaris）から誘導される白血球凝集素）、ＬＣＡ（レンズマメ（L. culinaris）から誘導されるレンティル凝集素）、ＰＳＡ（エンドウマメ（P. sativum）から誘導されるエンドウレクチン（pea lectin））等のレクチンを用いて、レクチン耐性細胞株から入手されている。
【００１５】
さらに、フコースを欠いている組換え抗体を産生する方法が幾つか報告されている。Ｎ−糖部分のコアフコシル化を可能にする最も重要な酵素の１つがα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ８（Ｆｕｔ８）である。上記酵素は、複合型Ｎ−グリカンのＮ−グリコシド連結型糖鎖のペンタコア（pentacore）におけるα結合を介した、フコースのＮ−アセチルグルコサミンの還元末端での６位への結合を触媒する（特許文献１）。フコーストランスポーター遺伝子の発現が人工的に抑制された細胞を用いることで、低減したフコース含量を有する抗体も実現されている（特許文献２）。α−１，６−フコシルトランスフェラーゼの機能を抑制可能なＲＮＡの導入も説明されており、これによりフコースを欠いている抗体分子の産生がもたらされる（特許文献３）。
【００１６】
治療適応症に使用することができる変化したグリコシル化パターンを有する分子を生成するために提案された細胞又は方法の多くが、重大な欠点を有する。例えば、グリコシル化を除去する酵素、例えばフコース残基を除去するフコシダーゼによる抗体の処理は、費用及び時間がかかり、また潜在的に重大な経済的リスク及び薬物に一貫した（drug consistency）リスクのある（which）付加的な製造工程を伴う。さらに、糖タンパク質の合成に関与する重要な酵素をノックアウトするための細胞株の分子工学的手法は面倒で、費用がかかり、また成功が約束されているわけではない。加えて、上記細胞株には、治療上の使用に関する有効性及び安全性を最適化するのに、多様なＡＤＣＣ効力又はＣＤＣ効力を有する分子の「調整可能な（tunable）」生成ができないという欠点がある。糖タンパク質の合成に関与する重要な酵素のレベルをノックダウンするためのＲＮＡｉ又はアンチセンス分子による細胞株の処理は予期せぬオフターゲットな（off-target）影響を与える可能性があり、費用がかかり、また製造規模での実施には向かないと考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】国際公開第００／６１７３９号
【特許文献２】米国特許出願公開第２００９００６１４８５号
【特許文献３】欧州特許出願公開第１  ７９２  ９８７号
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】PNAS 1985; 82: 3045-3049.
【非特許文献２】糖蛋白質糖鎖研究法（生物化学実験法２３）（学会出版センター（GakujutsuShuppan Center））、高橋礼子編（1989）
【非特許文献３】Lund et al. (2000) Eur. J. Biochem., 267:7246-7257
【非特許文献４】Becker and Lowe, 1999
【非特許文献５】Shields et al. JBC 277 (30): 26733. (2002)
【非特許文献６】Cartron et al. Blood 99: 754-758
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
このため、治療上の使用に関して改善した特性を有する、変化したグリコシル化パターンを有する分子の生成のための新規の有益な細胞及び方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、変化したグリコシル化パターンを有する分子、すなわちそのグリカン構造上でフコースを欠いている、低減したフコース量を有する、又は他の非定型糖を有する分子の生成のための細胞を提供する。本発明は、上記細胞を用いて、変化したグリコシル化パターンを有する分子、すなわちそのグリカン構造上でフコースを欠いている、低減したフコース量を有する、又は他の人工糖を有する分子を生成する方法も提供する。上記分子は治療上の使用に関して改善した特性、例えば増大したＡＤＣＣ活性又はＣＤＣ活性、向上したシグナル伝達事象の阻害能、増大したアポトーシスの誘導能、及び／又は増大した免疫療法の効力（ability）を有する。加えて、本発明により提供される細胞及び方法により、変化したグリコシル化パターンを有する分子、すなわちそのグリカン構造上でフコースを欠いている、低減したフコース量を有する、又は他の人工糖を有する分子の、調整可能で、信頼性があり、費用がかからず単純な生成が可能になる。さらに本発明は、製造のスケールアップに好適な方法を提供する。
【００２１】
多くの場合、所望のレベルで対象となる導入遺伝子を発現する効果的な産生細胞株を生成及び開発するために、かなりの時間が費やされるとともに、多大な労力が注がれてきた。対象となる導入遺伝子がＡＤＣＣエフェクター機能の向上による利益を受けることができる治療抗体である場合、高産生細胞がＮ−糖部分にコア−フコースを結合することができない、又はＮ−糖部分に人工糖を結合することができるように産生細胞株を更に操作することが望ましいであろう。
【００２２】
本発明は、例えば向上したＡＤＣＣ活性を有する抗体を産生するために、糖タンパク質の新生糖構造にフコースを結合することができなくする、又は糖タンパク質の新生糖構造にフコース以外の他の人工糖を結合することができるように、既存の遺伝子操作された細胞に容易に適用することができる発現単位を提供する。
【００２３】
発明の概要
第１の態様では、本発明は、自然状態ではその糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有する分子を生成するための脊椎動物細胞であって、基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用するが、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースをＧＤＰ−Ｌ−フコースに変換する反応を触媒しない酵素を少なくとも１つ含む、自然状態ではその糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有する分子を生成するための脊椎動物細胞に関する。
【００２４】
第２の態様では、本発明は、自然状態ではその糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有する分子を生成する方法であって、
ｉ）第１の態様による脊椎動物細胞を準備する工程と、
ｉｉ）ｉ）における該細胞からフコシルトランスフェラーゼに対する基質となることができる分子、好ましくはタンパク質又は脂質を単離する工程と、
を含む、自然状態ではその糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有する分子を生成する方法に関する。
【００２５】
第３の態様では、本発明は、第２の態様の方法により入手可能な、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有する分子に関する。
【００２６】
第４の態様では、本発明は、第２の態様の方法により入手可能な、Ｄ−ラムノース、Ｄ−ペロサミン、デオキシ−Ｄ−タロース、６−デオキシ−Ｄ−アルトロース、４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース、及び／又はＬ−コリトースを含有する糖部分を含む分子に関する。
【００２７】
第５の態様では、本発明は、
ｉ）７０％〜９５％のＧ０−ＧｌｃＮａｃ、Ｇ０、Ｇ１及び／又はＧ２の複合型Ｎ−グリカンと、
ｉｉ）５％〜３０％の高マンノース型Ｎ−グリカンと、
を含む糖タンパク質を含む組成物であって、該複合型Ｎ−グリカンがフコースを含まない、又はフコースを実質的に含まない、糖タンパク質を含む組成物に関する。
【００２８】
第６の態様では、本発明は、Ｄ−ラムノース、Ｄ−ペロサミン、デオキシ−Ｄ−タロース、６−デオキシ−Ｄ−アルトロース、４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース、及び／又はＬ−コリトースを含有する糖部分を含む、タンパク質又は脂質に関する。
【００２９】
第７の態様では、本発明は、
ｉ）１つ又は複数の脊椎動物発現制御配列と、
ｉｉ）基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用する酵素をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドと、
を含む発現単位であって、該酵素がＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースをＧＤＰ−Ｌ−フコースに変換する反応を触媒しない、発現単位に関する。
【００３０】
第８の態様では、本発明は、通常その糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有するタンパク質を生成するための真核細胞であって、
ｉ）基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用する酵素をコードする核酸配列を含む第１のポリヌクレオチドと、
ｉｉ）タンパク質をコードする核酸配列を含む第２のポリヌクレオチドと、
を含み、該酵素がＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースをＧＤＰ−Ｌ−フコースに変換する反応を触媒しない、通常その糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有するタンパク質を生成するための真核細胞に関する。
【００３１】
第９の態様では、本発明は、通常その糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有するタンパク質を生成する方法であって、
ｉ）第８の態様による真核細胞を準備することと、
ｉｉ）上記細胞において該第１のポリヌクレオチドによりコードされる該酵素及び該第２のポリヌクレオチドによりコードされる該タンパク質を発現することと、
ｉｉｉ）上記細胞から該タンパク質を単離することと、
を含む、通常その糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有するタンパク質を生成する方法に関する。
【００３２】
第１０の態様では、本発明は、第９の態様の方法により入手可能な、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有するタンパク質に関する。
【００３３】
発明の詳細な説明
本発明を以下で詳細に説明する前に、本明細書中で説明する特定の方法論、プロトコル及び試薬は変動し得るので、本発明はこれらに限定されないと理解すべきである。本明細書中で使用される専門用語は、特定の実施の形態を説明するためのものにすぎず、添付した特許請求の範囲のみによって限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも理解すべきである。他に規定のない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
【００３４】
好ましくは、本明細書中で使用される用語は、"A multilingual glossary ofbiotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W,Nagel, B. and Koelbl, H. eds.(1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel,Switzerlandに記載されているように規定される。
【００３５】
以下の本明細書及び添付の特許請求の範囲を通じて、文脈上他の要求がなされる場合以外は、「を含む（comprise）」という単語、並びに「を含む（comprises）」及び「を含む（comprising）」等の変化形は、記載の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を包含することを示唆するが、任意の他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を除外することを示唆しないと理解される。
【００３６】
複数の文書が、本明細書の文章を通じて引用される。本明細書中で引用される文書（全ての特許、特許出願、科学的刊行物、製造業者の仕様書、取扱説明書、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号配列寄託（submissions）等を含む）の各々が、上記のものであるか又は下記のものであるかに関わらず、その全体が参照により本明細書に援用される。本明細書のどの記載も、本発明が先行発明に基づくこのような開示に先行する権利を有しないことを認めるものと解釈すべきではない。
【００３７】
以下では、本発明の要素を記載する。これらの要素を特定の実施の形態とともに列挙するが、任意の様式及び任意の数でこれらを組み合わせて、更なる実施の形態を作り出すことができることを理解すべきである。様々に記載される実施例及び好ましい実施の形態を、明示的に記載される実施の形態にのみ本発明を限定するものと解釈すべきではない。この記載を、明示的に記載される実施の形態を任意の数の開示される及び／又は好ましい要素と組み合わせた実施の形態を支持及び包含するものと理解すべきである。さらに、本出願において記載される全ての要素の任意の置換及び組合せが、文脈上他に示されない限り、本出願の記載により開示されるものと考えるべきである。
【００３８】
本発明による「を含む（comprise）」という用語、又は「を含む（comprises）」若しくは「を含む（comprising）」等の変化形は、記載の整数又は整数の群を包含することを意味するが、任意の他の整数又は整数の群を除外することを意味しない。本発明による「から本質的になる」という用語は、記載の整数又は整数の群を包含するが、記載の整数に実質的に影響を与える又は記載の整数を実質的に変化させる変更値又は他の整数を除外することを意味する。本発明による「からなる（consisting of）」という用語、又は「からなる（consists of）」等の変化形は、記載の整数又は整数の群を包含すること、及び任意の他の整数又は整数の群を排除することを意味する。
【００３９】
本発明との関連では、「オリゴペプチド」という用語は、アミノ酸、例えば典型的には約５０アミノ酸長未満、より典型的には約３０アミノ酸長未満のアミノ酸の短いペプチド連結鎖を表す。
【００４０】
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本発明との関連では区別なく使用され、アミノ酸、例えば典型的に５０アミノ酸長又は５０アミノ酸長を超えるアミノ酸の長いペプチド連結鎖を表す。
【００４１】
「ポリペプチド断片」という用語は本発明との関連で使用される場合、全長ポリペプチドと比較して欠失、例えばアミノ末端の欠失、及び／又はカルボキシ末端の欠失、及び／又は内部欠失を有するポリペプチドを表す。
【００４２】
本発明との関連では、「融合タンパク質」という用語は、異種アミノ酸配列と連結したポリペプチド又はポリペプチド断片を含むポリペプチドを表す。融合タンパク質は２つ以上の異なるタンパク質からの２つ以上の所望の機能要素を含有するように構築することができるため、有用である。
【００４３】
「抗体」、「免疫グロブリン」、「Ｉｇ」及び「Ｉｇ分子」という用語は本発明との関連では区別なく使用される。各重鎖のＣＨ２ドメインは、アスパラギン残基でのＮ連結型グリコシル化に関する単一部位を含有し、通常Ａｓｎ−２９７残基でＮ−グリカンと抗体分子とが連結する（Kabat et al., Sequence of proteins of immunological interest, FifthEd.、米国保健社会福祉省、ＮＩＨ刊行番号９１−３２４２）。この用語の範囲内には、Ｉｇ群、すなわちＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＤが含まれる。この用語の範囲内には、ＩｇＧのサブタイプ、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４も含まれる。この用語は最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体及び多重特異的抗体（例えば二重特異的抗体）を含む。
【００４４】
「抗体断片」という用語は本発明との関連で使用される場合、ＣＨ２ドメインのＮ連結型グリコシル化部位を含む重鎖免疫グロブリン定常領域のＣＨ２ドメインの少なくとも一部を含有し、抗原と特異的に結合することができる抗体の断片、すなわち少なくとも１つのＶＬ鎖及び／若しくはＶＨ鎖を有する鎖又はその結合部分を表す。
【００４５】
「Ｆｃドメイン」及び「Ｆｃ領域」という用語は、Ｆｃ受容体と呼ばれる細胞表面受容体及び補体系の幾つかのタンパク質と相互作用する抗体重鎖のＣ末端部を表す。この特性により、抗体が免疫系を活性化させることが可能になる。
【００４６】
本発明との関連では、「糖タンパク質」という用語は、ポリペプチド側鎖に共有結合したオリゴ糖鎖（グリカン）を含有するタンパク質を表す。炭水化物は翻訳時修飾又は翻訳後修飾においてタンパク質に結合する。このプロセスはＮ−グリコシル化又はＯ−グリコシル化等のグリコシル化として知られる。
【００４７】
「Ｎ−グリコシル化」はアスパラギンの側鎖上のアミド窒素への糖鎖の付加を意味する。「Ｏ−グリコシル化」はヒドロキシリシン、ヒドロキシプロリン、セリン又はスレオニンの側鎖上のヒドロキシル酸素への糖鎖の付加を意味する。
【００４８】
「糖脂質」という用語は本発明との関連で使用される場合、炭水化物と結合した脂質を表す。糖脂質は、炭水化物の鎖が細胞膜の外形質（exoplasmic）表面上のリン脂質と結び付くと生じる。炭水化物は全ての真核細胞膜の外表面上に見られる。糖脂質の炭水化物構造は、脂質を付加するグリコシルトランスフェラーゼ及び付加後にグリカンを修飾するグリコシルヒドロラーゼにより制御される。糖脂質は、弱毒化生ワクチンとして使用されるウイルスを含むエンベロープウイルスの表面上にも生じる。
【００４９】
「グリカン」又は「糖部分」という用語は、多糖又はオリゴ糖を表すのに本発明との関連では区別なく使用される。「オリゴ糖」という用語は、少数（典型的には３個〜１０個）の構成糖（単純な糖又は単糖としても知られる）を含有するサッカリド重合体を意味する。「多糖」という用語は、グリコシド結合により結合した反復単位（典型的に１０個を超える単糖又は二糖）から構成される炭水化物の重合体構造を意味する。グリカンは、糖タンパク質のようにタンパク質に結合して、又は糖脂質のように脂質に結合して見出されることがある。この用語は、Ｎ−グリカン、例えば高マンノース型Ｎ−グリカン、複合型Ｎ−グリカン又は混成型のＮ−グリカン、Ｏ−グリカンを包含する。
【００５０】
本発明との関連では、以下の単糖を以下のように省略する：グルコース＝Ｇｌｃ、ガラクトース＝Ｇａｌ、マンノース＝Ｍａｎ、フコース＝Ｆｕｃ若しくはＦ、Ｎ−アセチルガラクトサミン＝ＧａｌＮＡｃ、又はＮ−アセチルグルコサミン＝ＧｌｃＮＡｃ。
【００５１】
「Ｎ−グリカン」はＮ連結型の多糖又はオリゴ糖を意味する。Ｎ連結型オリゴ糖は例えば、タンパク質におけるアスパラギン残基のアミド窒素に連結したＮ−アセチルグルコサミン残基により結合している又は結合していたものである。Ｎ−糖タンパク質で見られる主要糖は、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及びシアル酸（例えばＮ−アセチル−ノイラミン酸（ＮＡＮＡ））である。糖類のプロセシングはＥＲの内腔で翻訳時に起こり、Ｎ連結型糖タンパク質ではゴルジ装置でも継続する。Ｎ−グリカンはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ」はマンノースを表し、「Ｇｌｃ」はグルコースを表し、「ＮＡｃ」はＮ−アセチルを表し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを表す）の共通の五糖コアを有する。Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コア構造（「トリマンノースコア」、「五糖コア」又は「パウチマンノースコア」とも称される）に付加される周辺糖（例えばＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコース及びシアル酸）を含む分岐（アンテナ）の数が異なる。Ｎ−グリカンは分岐の（branched）構成要素に応じて分類される（例えば高マンノース型、複合型又は混成型）。
【００５２】
「高マンノース型Ｎ−グリカン」は、５個のマンノース残基（Ｍａｎ５）又はより多くのマンノース残基（例えばＭａｎ６、Ｍａｎ７又はＭａｎ８）を有するＮ連結型の多糖又はオリゴ糖を意味する。
【００５３】
「複合型Ｎ−グリカン」は、典型的に「トリマンノース」コアの１，３マンノース結合手に結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃと、１，６マンノース結合手に結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃとを有するＮ連結型の多糖又はオリゴ糖を意味する。複合型Ｎ−グリカンは、任意でシアル酸又は誘導体（例えば「ＮＡＮＡ」又は「ＮｅｕＡｃ」（ここで「Ｎｅｕ」はノイラミン酸を表し、「Ａｃ」はアセチルを表す）で修飾されたガラクトース（「Ｇａｌ」）残基又はＮ−アセチルガラクトサミン（「ＧａｌＮＡｃ」）残基も有し得る。複合型Ｎ−グリカンは、「バイセクティング」ＧｌｃＮＡｃとコアフコース（「Ｆｕｃ」）とを含む鎖内置換も有し得る。複合型Ｎ−グリカンは本発明との関連では、０個（Ｇ０）、１個（Ｇ１）又は２個（Ｇ２）のガラクトースと、還元末端上の第１のＧｌｃＮＡｃに結合した１個のフコースとを含有し得る（それぞれＧ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆと示される）。
【００５４】
「混成型Ｎ−グリカン」は、トリマンノースコアの１，３マンノース結合手の末端上に少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃと、トリマンノースコアの１，６マンノース結合手に０個以上（zero or more）のマンノースとを有するＮ連結型の多糖又はオリゴ糖を意味する。
【００５５】
糖構造を説明するのに本発明との関連で使用される略語は以下のように規定される：
コア＝Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２
Ｇ０＝ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２
Ｇ０−ＧｌｃＮＡｃ＝１個のＧｌｃＮＡｃを欠くＧ０構造（すなわちＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）
Ｇ１＝１個の更なるガラクトース残基を含有するＧ０構造（すなわちＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）
Ｇ２＝２個の更なるガラクトース残基を含有するＧ０構造（すなわちＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）
Ｇ０Ｆ＝五糖コアの第１のＧｌｃＮＡｃ残基に結び付いた１個の更なるフコース残基を含有するＧ０構造（すなわちＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｆｕｃ）
Ｇ０Ｆ−ＧｌｃＮＡｃ＝五糖コアの第１のＧｌｃＮＡｃ残基に結び付いた１個の更なるフコース残基を含有するＧ０−ＧｌｃＮＡｃ構造（すなわちＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｆｕｃ）
Ｇ１Ｆ＝五糖コアの第１のＧｌｃＮＡｃ残基に結び付いた１個の更なるフコース残基を含有するＧ１構造（すなわちＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｆｕｃ）
Ｇ２Ｆ＝五糖コアの第１のＧｌｃＮＡｃ残基に結び付いた１個の更なるフコース残基を含有するＧ２構造（すなわちＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｆｕｃ）
Ｍａｎ４＝１個の更なるマンノース残基を含有するコア構造（すなわちＭａｎＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）
Ｍａｎ５＝２個の更なるマンノース残基を含有するコア構造（すなわちＭａｎ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）
Ｍａｎ６＝３個の更なるマンノース残基を含有するコア構造（すなわちＭａｎ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）
Ｍａｎ７＝４個の更なるマンノース残基を含有するコア構造（すなわちＭａｎ４Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）
Ｍａｎ８＝５個の更なるマンノース残基を含有するコア構造（すなわちＭａｎ５Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）
【００５６】
「Ｏ−グリカン」はＯ連結型の多糖又はオリゴ糖を意味する。Ｏ連結型グリカンは通常、セリン残基又はトレオニン残基を介してペプチド鎖に結合する。Ｏ連結型グリコシル化は、ゴルジ装置で起こり、コンセンサス配列を必要としない真性の翻訳後事象であり、オリゴ糖前駆体はタンパク質転移に必要ではない。最も一般的なタイプのＯ連結型グリカンは最初のＧａｌＮＡｃ残基（又はＴｎエピトープ）を含有し、これらは一般的にムチン型グリカンと称される。他のＯ連結型グリカンは、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ残基と結合する最初の糖としてグルコサミン、キシロース、ガラクトース、フコース又はマンノース（mannose）を含む。Ｏ連結型糖タンパク質は通常、一般的にＮ−グリカンと比較して分岐がより少ない二分岐の巨大タンパク質（＞２００ｋＤａ）である。
【００５７】
「自然状態ではその糖部分上において、フコースを含む分子」という用語は本発明との関連で使用される場合、糖部分にフコースを付加することが可能な、すなわち糖部分にフコースを付加する能力が変わらない真核細胞、好ましくは脊椎動物細胞における生成によると、少なくとも１つのフコース残基を含む糖部分を含む任意の化合物を表す。このような分子は、グリカン転移酵素によって認識される、例えばＡｓｐ残基、Ｓｅｒ残基又はＴｈｒ残基、好ましくはトリペプチド配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ここでＸはＰｒｏを除く任意のアミノ酸である）を含む少なくとも１つ又は複数の配列モチーフを含む。フコースを有する糖部分を含む分子を生成する真核細胞（例えば脊椎動物細胞）の好ましい例は、ＣＨＯ、ＡＧＥ１．ＨＮ、ＡＧＥ１．ＣＲ、ＡＧＥ１．ＣＲ．ＰＩＸ又はＡＧＥ１．ＣＳである。好ましくはかかる化合物は、タンパク質、融合タンパク質又は脂質である。好ましくはタンパク質は、真核生物起源、好ましくは脊椎動物起源、最も好ましくは哺乳類起源のものであるか、又はそれらから誘導される。
【００５８】
「その糖部分上において、フコースを欠いている分子」という用語は本発明との関連では、自然状態ではその糖部分上において、フコースを含む分子上に、検出可能な量のフコースが存在しないことを意味する。純度に関して表すと、「その糖部分上において、フコースを欠いている分子」は、自然状態ではその糖部分上において、フコースを含む分子がその糖部分上において、糖残基であるフコースを１００％含んでいないことを意味する。
【００５９】
「その糖部分上において、低減したフコース量を有する分子」という用語は、糖部分上において、フコース量が、糖部分にフコースを付加することが可能な、すなわち糖部分にフコースを付加する能力が変わらない細胞において発現される場合の数（ｎ）から低減した分子を表す。このため、低減状態はｎ−ｘ（ここで、ｎは上記の意味を有し、ｘは１〜（ｎ−１）の整数である）である。好ましくは、自然状態でｎが２である場合、ｎ−ｘは１まで低減する。同様に、自然状態でｎが３である場合、ｎ−ｘは好ましくは２若しくは１まで低減し、自然状態でｎが４である場合、ｎ−ｘは好ましくは３、２若しくは１まで低減し、自然状態でｎが５である場合、ｎ−ｘは好ましくは４、３、２若しくは１まで低減し、又は自然状態でｎが６である場合、ｎ−ｘは好ましくは５、４、３、２若しくは１まで低減する。
【００６０】
「その糖部分上において、低減したフコース量を有する分子の組成物」という用語は本発明との関連では、自然状態ではその糖部分上において、フコースを含む組成物の分子の、その糖部分上において、フコース数が低減したことを示すのに使用される。かかる比較は上記の細胞株により生成される分子を用いて行うのが好ましい。低減に関して表すと、この用語は、組成物の一定数の分子、好ましくは組成物の１ｐｍｏｌ、１０ｐｍｏｌ、１００ｐｍｏｌ又は１０００ｐｍｏｌの分子のうち、フコース残基数が１０％〜９５％、好ましくは約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％又は約９４％低減することを意味する。低減全体は、組成物におけるその糖部分上において、フコースを欠いている及び／又はその糖部分上において、フコース量が低減した組成物における分子の増大に起因するものであり得る。
【００６１】
「その糖部分上において、フコースを実質的に含まない分子の組成物」という用語は本発明との関連では、自然状態ではその糖部分上において、フコースを含む組成物の分子が、その糖部分上において、糖残基であるフコースを本質的に欠いていることを示すのに使用される。純度に関して表すと、「その糖部分上において、フコースを実質的に含まない分子の組成物」という用語は、組成物の一定数の分子、好ましくは組成物の１ｐｍｏｌ、１０ｐｍｏｌ、１００ｐｍｏｌ又は１０００ｐｍｏｌの分子のうち、上記の分子の少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．１％、約９９．２％、約９９．３％、約９９．４％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％、約９９．８％又は少なくとも約９９．９％がその糖部分上において、糖残基であるフコースを含まないことを意味する。
【００６２】
当業者は、（ｉ）対象となる分子を生成する条件下で本発明の細胞を培養することと、（ｉｉ）上記分子を上記細胞から単離することと、（ｉｉｉ）その糖部分に結合したフコース残基に関して、上記分子の糖鎖構造を分析するとともに、上記分子の糖鎖構造に存在するフコース残基の平均値を算出することと、（ｉｖ）該結果を、該分子をフコースが低減していないグリコシル化パターンで産生する細胞で産生される同じ分子、例えば抗体分子の結果と比較することとにより、特定の分子、例えば抗体分子の糖部分上において、低減したフコース量を実験により容易に決定することができる。好ましくは、２つの実験に用いられる細胞は同一であるが、一方の細胞が基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用するが、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースをＧＤＰ−Ｌ−フコースに変換する反応を触媒しない酵素を少なくとも１つ含むという違いがある。好ましくは、両方の細胞を同一の培養条件下で培養し、培養条件の違いに起因し得るフコシル化の変化を排除する。
【００６３】
分子、例えば抗体分子における糖鎖構造を、二次元糖鎖マッピング法（Anal. Biochem., 171,73 (1988)、非特許文献２）により簡単に分析することができる。二次元糖鎖マッピング法により推定される構造を、各糖鎖のＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザ脱離イオン化）−ＴＯＦ−ＭＳ等の質量分析法を行うことにより決定することができる。
【００６４】
真核細胞（例えば脊椎動物細胞）において糖部分を含む分子、例えばタンパク質又は脂質のフコシル化には、ドナーとしてのヌクレオチド糖、ＧＤＰ−Ｌ−フコースと、更にドナーからアクセプタ分子へとフコシル残基を転移させる特定のフコシルトランスフェラーゼの存在とが要求される。真核細胞（例えば脊椎動物細胞）では、ＧＤＰ−Ｌ−フコースを２つの異なる経路、主要なフコースｄｅ  ｎｏｖｏ経路又は副次的なサルベージ経路のいずれかにより合成することができる。
【００６５】
本発明者らは、真核細胞（例えば脊椎動物細胞）における基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを効率的に利用するが、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースをＧＤＰ−Ｌ−フコースへと変換する反応を触媒しない酵素（偏向（deflecting）酵素）の存在により、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有する分子、例えばタンパク質又は脂質の生成がもたらされることを見出した。「ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロース」という用語は「ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース」という用語と同義である。両方の用語は本明細書で区別なく使用される。
【００６６】
このため第１の態様では、本発明は、自然状態ではその糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有する分子を生成するための（改変）脊椎動物細胞であって、基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用するが、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースをＧＤＰ−Ｌ−フコースへと変換する反応を触媒しない酵素を少なくとも１つ含む、（改変）脊椎動物細胞を提供する。
【００６７】
本発明の第１の態様の脊椎動物細胞に存在する酵素は、基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用する任意の酵素であり得るが、上記酵素はＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースをＧＤＰ−Ｌ−フコースへと変換する反応を触媒しないものとする。それどころか上記酵素は、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを、脊椎動物細胞におけるＧＤＰ−Ｌ−フコース合成にもはや利用することができない生成物へと変換する。
【００６８】
本発明の第１の態様の脊椎動物細胞に含まれる酵素は、脊椎動物細胞には通常存在しない酵素、すなわち異種又は人工の酵素、例えば別の界の生物、例えば原核生物、好ましくは細菌由来の酵素である。代替的には、上記酵素は、通常脊椎動物細胞に存在するが、例えば突然変異の存在により基質ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースをＧＤＰ−Ｌ−フコースに変換せず、異なる生成物へと変換する酵素であってもよい。
【００６９】
本発明の第１の態様の脊椎動物細胞に存在する酵素を、例えばタンパク質マイクロインジェクション、タンパク質エレクトロポレーション又はタンパク質リポフェクションにより、脊椎動物細胞へと導入している。例えばＤＮＡマイクロインジェクション、ＤＮＡエレクトロポレーション又はＤＮＡリポフェクションにより、好ましくは発現ベクターに組み込まれた、酵素をコードする核酸配列を脊椎動物細胞に導入した後、脊椎動物細胞において各タンパク質へと転写及び翻訳することも可能である。当業者は、タンパク質又はタンパク質をコードする核酸配列を脊椎動物細胞に導入するための分子生物学技法、例えばマイクロインジェクション、エレクトロポレーション又はリポフェクションについての十分な情報を有し、これらの技法を実行する方法を知っている。
【００７０】
基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用するが、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースのＧＤＰ−Ｌ−フコースへの変換を触媒しない２個以上、すなわち２個、３個、４個、５個、６個又は７個の酵素が脊椎動物細胞に存在し、上記細胞においてフコースｄｅ  ｎｏｖｏ経路を効率的に遮断することが好ましい。
【００７１】
好ましくは、基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用する酵素は、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースレダクターゼ（ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノースレダクターゼと同義であり、ＲＭＤと略される）、ＧＤＰ−ペロサミンシンテターゼ（Ｐｅｒ）、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−タロースシンテターゼ（ＧＴＳ）、ＧＤＰ−フコースシンテターゼＣｙｓ１０９Ｓｅｒ（ＧＦＳ−Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒ）突然変異体、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース−３−デヒドラターゼ（ＣｏｌＤ）、好ましくはＧＤＰ−Ｌ−コリトースシンターゼ（ＣｏｌＣ）と組み合わせたＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース−３−デヒドラターゼ（ＣｏｌＤ）、及びその変異体からなる群から選択され、好ましくは酵素は細菌由来であるか、又はかかる細菌酵素から誘導される。より好ましくは、基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用する酵素はＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）、ＧＤＰ−フコースシンテターゼＣｙｓ１０９Ｓｅｒ（ＧＦＳ−Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒ）突然変異体、及び／又はＧＤＰ−ペロサミンシンテターゼ（Ｐｅｒ）である。
【００７２】
ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）は基質ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースをＧＤＰ−Ｄ−ラムノースへと還元する。ＧＤＰ−Ｄ−ラムノースは、細菌におけるＤ−ラムノシル化のためのヌクレオチド糖ドナーであり、脊椎動物では発生しない。脊椎動物細胞は特定のラムノシルトランスフェラーゼも欠いており、そのためＧＤＰ−Ｄ−ラムノースを脊椎動物細胞内の糖タンパク質又は糖脂質の新生糖構造に組み込むことができない。
【００７３】
酵素ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−タロースシンテターゼ（ＧＴＳ）は基質ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースをＧＤＰ−デオキシ−Ｄ−タロースへと還元する。ＧＤＰ−デオキシ−Ｄ−タロースは、細菌における６−デオキシ−Ｄ−タロシル化のためのヌクレオチド糖ドナーであり、脊椎動物では発生しない。脊椎動物細胞は特定のデオキシタロシルトランスフェラーゼも欠いており、そのためＧＤＰ−デオキシ−Ｄ−タロースを脊椎動物細胞内の新生糖構造に組み込むことができない。
【００７４】
さらに、酵素ＧＤＰ−ペロサミンシンテターゼ（Ｐｅｒ）は基質ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを還元し、アミノ基転移を行い、ＧＤＰ−Ｄ−ペロサミンにする。ＧＤＰ−Ｄ−ペロサミンは細菌、例えば大腸菌におけるペロサミニル化（perosaminylation）のためのヌクレオチド糖ドナーである。ＧＤＰ−Ｄ−ペロサミンは通常、脊椎動物細胞には存在しない。脊椎動物細胞は特定のペロサミニルトランスフェラーゼも欠いており、そのためＧＤＰ−Ｄ−ペロサミンは脊椎動物細胞内で新生糖構造に結合することができない。
【００７５】
そのため、異種酵素ＧＴＳ及び／又はＰｅｒは、（ｉ）脊椎動物細胞において基質ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを枯渇させ、（ｉｉ）ＧＤＰ−Ｌ−フコース合成にもはや利用することができない人工生成物（すなわちＧＴＳの場合、ＧＤＰ−デオキシ−Ｄ−タロース、及びＰｅｒの場合、ＧＤＰ−Ｄ−ペロサミン）の合成をもたらす。したがってＧＴＳ及び／又はＰｅｒを含む脊椎動物細胞で生成される、通常その糖部分にフコースを含む分子は、その糖部分上において、フコースを欠くか、又はフコース量が低減している。
【００７６】
酵素ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース−３−デヒドラターゼ（ＣｏｌＤ）は、基質ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用して、それをＧＤＰ−４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノースへと変換する。中間体ＧＤＰ−４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノースは脊椎動物細胞では不安定であり得るため、ＣｏｌＤを酵素ＧＤＰ−Ｌ−コリトースシンターゼ（ＣｏｌＣ）と併用するのが好ましい。酵素ＣｏｌＣはＧＤＰ−４−デヒドロ−６−デオキシ−Ｄ−マンノースエピメラーゼ／レダクターゼの群に属する。酵素ＣｏｌＣは、中間体ＧＤＰ−４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノースを安定した最終生成物であるＧＤＰ−Ｌ−コリトースへと更に変換する。生成物は両方とも、上記細胞がＧＤＰ−４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース及び／又はＧＤＰ−Ｌ−コリトースを上記細胞に存在する分子の糖部分へと転移させるそれぞれのグリコシルトランスフェラーゼを欠いているため、脊椎動物細胞内の新生糖構造へと組み込むことはできない。このため、ＣｏｌＤがＣｏｌＣとともに脊椎動物細胞に存在するのが好ましい。
【００７７】
酵素ＧＤＰ−フコースシンテターゼ（ＧＦＳ）（ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノースエピメラーゼ／レダクターゼ、ＧＭＥＲとしても知られる）は、脊椎動物細胞においてＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノースをＧＤＰ−Ｌ−フコースへと変換する。ＧＦＳ反応はＣ−３''及びＣ−５''の両方でのエピマー化、その後のＣ−４でのカルボニルのＮＡＤＰＨ依存性の還元を伴う。活性部位の突然変異体、好ましくはＧＦＳ−Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒを本発明に使用し、これはＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノースをＧＤＰ−Ｌ−フコースとは異なる生成物、すなわちＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−アルトロースへと変換する（Lau S.T.B., Tanner, M.E. 2008. Mechanism and active site residues ofGDP-Fucose Synthase, Journal of the American Chemical Society, Vol. 130, No.51, pp. 17593-17602を参照されたい）。
【００７８】
好ましくは、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）、ＧＤＰ−ペロサミンシンテターゼ（Ｐｅｒ）、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−タロースシンテターゼ（ＧＴＳ）、ＧＤＰ−フコースシンテターゼＣｙｓ１０９Ｓｅｒ（ＧＦＳ−Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒ）突然変異体、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース−３−デヒドラターゼ（ＣｏｌＤ）、好ましくはＧＤＰ−Ｌ−コリトースシンターゼ（ＣｏｌＣ）と組み合せたＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース−３−デヒドラターゼ（ＣｏｌＤ）、及びそれらの変異体からなる群から選択される２個以上、すなわち２個、３個、４個、５個、６個又は７個の酵素が脊椎動物細胞に存在する。
【００７９】
本発明で好ましいＲＭＤ酵素、Ｐｅｒ酵素、ＧＴＳ酵素、ＧＦＳ−Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒ酵素、ＣｏｌＤ酵素又はＣｏｌＣ酵素の変異体は、アミノ酸配列における最大１５０個（すなわち最大１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個又は１５０個）のアミノ酸の変化（すなわち交換、挿入、欠失、Ｎ末端切断及び／又はＣ末端切断）により誘導されるという点でＲＭＤ酵素、Ｐｅｒ酵素、ＧＴＳ酵素、ＧＦＳ−Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒ酵素、ＣｏｌＤ酵素又はＣｏｌＣ酵素とは異なる。アミノ酸の交換は保存的又は非保存的であり得る。本発明で好ましいＲＭＤ酵素、Ｐｅｒ酵素、ＧＴＳ酵素、ＧＦＳ−Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒ酵素、ＣｏｌＤ酵素又はＣｏｌＣ酵素の変異体は、代替的に又は付加的に、誘導元であるＲＭＤ酵素、Ｐｅｒ酵素、ＧＴＳ酵素、ＧＦＳ−Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒ酵素、ＣｏｌＤ酵素又はＣｏｌＣ酵素との或る特定の程度の配列同一性を特徴とすることができる。このため、本発明で好ましいＲＭＤ酵素、Ｐｅｒ酵素、ＧＴＳ酵素、ＧＦＳ−Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒ酵素、ＣｏｌＤ酵素又はＣｏｌＣ酵素の変異体は、それぞれの参照となるＲＭＤ酵素、Ｐｅｒ酵素、ＧＴＳ酵素、ＧＦＳ−Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒ酵素、ＣｏｌＤ酵素又はＣｏｌＣ酵素に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。好ましくは配列同一性は、それぞれの参照となるＲＭＤ酵素、Ｐｅｒ酵素、ＧＴＳ酵素、ＧＦＳ−Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒ酵素、ＣｏｌＤ酵素又はＣｏｌＣ酵素の４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００又はそれ以上のアミノ酸の連続ストレッチにわたる、好ましくは全長にわたるものである。配列同一性が、それぞれの参照となるＲＭＤ酵素、Ｐｅｒ酵素、ＧＴＳ酵素、ＧＦＳ−Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒ酵素、ＣｏｌＤ酵素又はＣｏｌＣ酵素の全長にわたって少なくとも８０％であり、全長にわたって少なくとも８５％であり、全長にわたって少なくとも９０％であり、全長にわたって少なくとも９５％であり、全長にわたって少なくとも９８％であり、又は全長にわたって少なくとも９９．５％であるのが特に好ましい。配列同一性が、それぞれの参照となるＲＭＤ酵素、Ｐｅｒ酵素、ＧＴＳ酵素、ＧＦＳ−Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒ酵素、ＣｏｌＤ酵素又はＣｏｌＣ酵素の少なくとも２００個若しくは２５０個のアミノ酸にわたって少なくとも８０％であり、少なくとも２００個若しくは２５０個のアミノ酸にわたって少なくとも８５％であり、少なくとも２００個若しくは２５０個のアミノ酸にわたって少なくとも９０％であり、少なくとも２００個若しくは２５０個のアミノ酸にわたって少なくとも９５％であり、少なくとも２００個若しくは２５０個のアミノ酸にわたって少なくとも９８％であり、又は少なくとも２００個若しくは２５０個のアミノ酸にわたって少なくとも９９．５％であることも特に好ましい。
【００８０】
ＲＭＤ酵素、Ｐｅｒ酵素、ＧＴＳ酵素、ＧＦＳ−Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒ酵素、ＣｏｌＤ酵素又はＣｏｌＣ酵素の断片（すなわち欠失変異体）は、そのＮ末端及び／又はそのＣ末端及び／又はその内部に最大１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個又は１５０個のアミノ酸の欠失を有するのが好ましい。
【００８１】
さらに、参照酵素に対して上記に示される程度の関連性を有するＲＭＤ酵素、Ｐｅｒ酵素、ＧＴＳ酵素、ＧＦＳ−Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒ酵素、ＣｏｌＤ酵素又はＣｏｌＣ酵素は、それぞれの参照酵素の活性の少なくとも３０％程度まで関連の生体活性を示す場合にのみ変異体とみなされる。本発明との関連では、関連の「生体活性」は、「酵素活性」、すなわち基質ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを利用し、それをそれぞれＧＤＰ−Ｄ−ラムノース、ＧＤＰ−Ｄ−ペロサミン、ＧＤＰ−デオキシ−Ｄ−タロース、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−アルトロース、ＧＤＰ−４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース又はＧＤＰ−Ｌ−コリトースに変換するＲＭＤ酵素、Ｐｅｒ酵素、ＧＴＳ酵素、ＧＦＳ−Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒ酵素、ＣｏｌＤ酵素又はＣｏｌＣ酵素の変異体の活性である。当業者は、ＲＭＤ酵素、Ｐｅｒ酵素、ＧＴＳ酵素、ＧＦＳ−Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒ酵素、ＣｏｌＤ酵素又はＣｏｌＣ酵素の変異体が、それぞれの参照となるＲＭＤ酵素、Ｐｅｒ酵素、ＧＴＳ酵素、ＧＦＳ−Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒ酵素、ＣｏｌＤ酵素又はＣｏｌＣ酵素の酵素活性のうちの少なくとも３０％の酵素活性を有するかを容易に評価することができる。それぞれの参照酵素の酵素活性と比較した酵素変異体の「酵素活性」を決定するのに好適なアッセイ、例えば酵素活性アッセイが当業者にとって既知である。
【００８２】
好ましくは、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）酵素は緑膿菌（Pseudomonasaeruginosa）由来である（配列番号１）。ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−タロースシンテターゼ（ＧＴＳ）酵素はアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（Actinobacillus actinomycetemcomitans）由来であるのが好ましい（配列番号２）。ＧＤＰ−ペロサミンシンテターゼ（Ｐｅｒ）酵素がコレラ菌（Vibrio cholerae）由来であるのが好ましい（配列番号３）。好ましくは、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース−３−デヒドラターゼ（ＣｏｌＤ）が大腸菌由来である（配列番号４）。大腸菌由来のＧＤＰ−Ｌ−コリトースシンターゼ（ＣｏｌＣ）の使用も好ましい（配列番号７）。野生型ＧＤＰ−フコースシンテターゼ（ＧＦＳ）はクリセツラス・グリセウス（Cricetulus griseus）（チャイニーズハムスター）由来である（配列番号５）。クリセツラス・グリセウス（チャイニーズハムスター）由来のＧＤＰ−フコースシンテターゼＣｙｓ１０９Ｓｅｒ（ＧＦＳ−Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒ）突然変異体は配列番号６のアミノ酸配列を有する。
【００８３】
上述のように、本発明は、基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用する酵素の変異体を包含する。このため本発明は、上述の配列の識別番号の変異体、すなわち配列番号１の変異体、配列番号２の変異体、配列番号３の変異体、配列番号３の変異体、配列番号４の変異体、配列番号５の変異体、配列番号６の変異体及び配列番号７の変異体も包含する。上記変異体の構造的定義及び／又は機能的定義については、上述の段落を参照する。
【００８４】
好ましくは、ＲＭＤ、Ｐｅｒ、ＧＴＳ、ＣｏｌＤ、ＣｏｌＣ又はＧＦＳ−Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒの核酸配列はコドン最適化されている（codon-optimized）。「コドン最適化」という用語は本発明との関連で使用する場合、例えば、内部のＴａｔａボックス、ｃｈｉ部位、リボソーム侵入部位、ＲＮＡ不安定性モチーフ、反復配列、強いＲＮＡ二次構造及び潜在スプライス部位の除去と、真核（例えば脊椎動物）細胞において利用度（utilization）がより高いコドン又は真核（例えば脊椎動物）細胞において高度に発現した遺伝子の使用とを意味する。
【００８５】
さらに脊椎動物細胞においてフコースサルベージ経路が遮断されることが更に好ましい。このため、本発明の細胞を培養する際に、フコース及びフコシル化糖タンパク質を含まない成長培地を使用することが好ましい。
【００８６】
脊椎動物細胞は該酵素に加えて又は該酵素の代わりに、ＧＤＰ−Ｌ−フコース合成を阻害又は防止するためＧＤＰ−Ｄ−ラムノース、ＧＤＰ−Ｄ−ペロサミン、ＧＤＰ−デオキシ−Ｄ−タロース、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−アルトロース、ＧＤＰ−４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース及び／又はＧＤＰ−Ｌ−コリトースを含むが、これは思いがけず本発明者らが、人工糖ＧＤＰ−Ｄ−ラムノース、ＧＤＰ−Ｄ−ペロサミン、ＧＤＰ−デオキシ−Ｄ−タロース、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−アルトロース、ＧＤＰ−４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース及び／又はＧＤＰ−Ｌ−コリトースの補充、特に細胞質補充（例えば細胞質内注入による）が脊椎動物細胞におけるフコース転移の阻害にプラスに寄与することに気が付いたためである。人工糖（複数も可）ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−アルトロース、ＧＤＰ−Ｄ−ラムノース及び／又はＧＤＰ−Ｄ−ペロサミンの補充が特に好ましい。
【００８７】
基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用するが、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースをＧＤＰ−Ｌ−フコースに変換する反応を触媒しない酵素がエピソーム的に又は染色体的に脊椎動物細胞に一時的に存在する又は安定して維持される核酸配列から発現されることが好ましい。
【００８８】
酵素、好ましくはＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）、ＧＤＰ−ペロサミンシンテターゼ（Ｐｅｒ）、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−タロースシンテターゼ（ＧＴＳ）、ＧＤＰ−フコースシンテターゼＣｙｓ１０９Ｓｅｒ（ＧＦＳ−Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒ）突然変異体、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース−３−デヒドラターゼ（ＣｏｌＤ）又はＧＤＰ−Ｌ−コリトースシンターゼ（ＣｏｌＣ）をコードする核酸配列が、細胞を形質転換するのに使用される発現ベクターに組み込まれる。
【００８９】
好適な発現ベクターはプラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）及びウイルスベクターを含む。好ましくは、非ウイルス性の発現ベクターが使用される。
【００９０】
酵素をコードする核酸の発現は発現制御配列により制御される。
【００９１】
「発現制御配列」という用語は、真核細胞（例えば脊椎動物細胞）における操作可能に連結したコード配列の発現に影響を与えるヌクレオチド配列を表す。発現制御配列は、核酸配列の転写を制御する配列、例えばプロモーター、ＴＡＴＡボックス、エンハンサー；転写後事象、例えばポリアデニル化を制御する配列；及び翻訳を制御する配列である。
【００９２】
好ましいプロモーターは、サイトメガロウイルスのｈＣＭＶ前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０の初期若しくは後期プロモーターを含む構成的プロモーター、又はＣＵＰ−１プロモーター、例えばｔｅｔ−ｏｎシステム若しくはｔｅｔ−ｏｆｆシステムで利用されるｔｅｔリプレッサー、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）に関するプロモーター、酸ホスファターゼのプロモーター、及び酵母のα接合因子若しくはａ接合因子のプロモーターを含む調節性プロモーター、例えば構成的ＣＭＶ前初期遺伝子プロモーター、初期又は後期ＳＶ４０プロモーター、ポリヘドリンプロモーター、レトロウイルスＬＴＲ、ＰＧＫプロモーター、伸長因子１−α（ＥＦ１−α）、ＥＦ２及びホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）である。特に好ましいプロモーターは、潜在的な毒性問題を避けるための酵素の中程度の（intermediate）又は弱い発現のみを支持するプロモーターである。所定のプロモーターの発現強度は、該発現を内因性ＧＡＰＤＨの発現を目的とする強い構成的プロモーターの発現強度と比較することにより正規化することができる。ＧＡＰＤＨの１０％〜１％の強度での酵素の発現を目的とするプロモーターが、中程度の発現を目的とするプロモーターとみなされ、１％未満の強度での酵素の発現を目的とするプロモーターが弱いプロモーターとみなされる。発現強度を、例えばリアルタイムＰＣＲを含む当該技術分野で既知の方法により評価することができる。
【００９３】
マーカータグも本発明の実施の形態で使用することができる。好ましくは、マーカータグの核酸配列が、タグ付されるタンパク質（例えば酵素、抗体）をコードする核酸配列に操作可能に連結する。好ましくは、マーカータグはＧＦＰ及びその変異体からなる群から選択される蛍光タンパク質（ＧＦＰを含むがこれに限定されない）である。本明細書で使用される場合、「操作可能に連結した」は、フレームシフト又は終止コドンを避けた対応する融合タンパク質のインフレーム発現が影響を受け得るように、１つの核酸が第２の核酸と連結していることを意味する。これらの用語は、対象となるコード核酸配列（例えば酵素、抗体）の発現を効果的に制御するための上記配列への発現制御配列の連結も意味する。これらの用語は、対象となるコード核酸配列（例えば酵素、抗体）との親和性タグ又はマーカータグをコードする核酸配列の連結も表す。
【００９４】
発現ベクターにおける酵素ＲＭＤ、Ｐｅｒ、ＧＴＳ、ＧＦＳ−Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒ、ＣｏｌＤ又はＣｏｌＣをコードする核酸配列が、脊椎動物特異的な発現制御配列と操作可能に連結する（linked）ことにより、脊椎動物細胞において酵素ＲＭＤ、Ｐｅｒ、ＧＴＳ、ＧＦＳ−Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒ、ＣｏｌＤ又はＣｏｌＣをコードする核酸配列の発現が可能になることが好ましい。
【００９５】
結果として、酵素（複数も可）ＲＭＤ、Ｐｅｒ、ＧＴＳ、ＧＦＳ−Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒ及び／又はＣｏｌＤ、好ましくはＣｏｌＣと組み合わせたＣｏｌＤが、所望の効果に最適な収率で本発明の脊椎動物細胞において発現される。酵素の性質及び発現に使用される細胞に応じて、これらの収率は高くても、中程度であっても、又は低くてもよい。当業者が高い、中程度の又は低いレベルの発現を得るために適切な脊椎動物特異的な発現制御配列を選択することは容易である。
【００９６】
脊椎動物細胞における酵素（複数も可）ＲＭＤ、Ｐｅｒ、ＧＴＳ、ＧＦＳ−Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒ及び／又はＣｏｌＤ、好ましくはＣｏｌＣと組み合わせたＣｏｌＤの発現には、ＧＤＰ−Ｌ−フコース合成を効果的に阻止し、これにより自然状態ではその糖部分上において、フコースを含むが、それらの発現によりその糖部分上において、フコースを欠いている、又は低減したフコース量を有する分子の生成がもたらされる効果がある。
【００９７】
組換えタンパク質の長期的な高収率の生成のために、安定した発現が好ましい。例えば、基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用するが、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースをＧＤＰ−Ｌ−フコースへと変換する反応を触媒しない酵素、及びタンパク質、例えば抗体をコードする核酸を安定して発現する真核細胞（例えば脊椎動物細胞）を改変することができる。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを使用することなく、真核細胞（例えば脊椎動物細胞）を適切な発現制御配列（例えばプロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）によって制御されるベクターと、任意で選択可能なマーカーとを用いて形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後に、形質転換した細胞を、このような細胞由来の核酸を分析することにより、発現の効果（例えばレクチン結合を用いたフコースを欠くこと）を検出することにより検出することができ、又は形質転換した細胞を、選択圧を加えることにより選択することができる。好適な選択系は当該技術分野で既知である。
【００９８】
好ましくは、脊椎動物細胞は、フコシルトランスフェラーゼに対する基質となることができる少なくとも１つの（アクセプタ）分子を更に含む。「フコシルトランスフェラーゼに対する基質となることができる（アクセプタ）分子」という用語は本発明の関連で使用される場合、フコシル化活性が変わらない細胞で生成される場合、少なくとも１つのフコース残基が結合した糖部分を有する又は含む、対象となる任意の化合物、例えばタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、脂質、脂質断片又は融合タンパク質を表す。かかる化合物はフコシルトランスフェラーゼに関する好適な基質である。したがって好ましいアクセプタ分子は、糖タンパク質、糖ポリペプチド、糖オリゴペプチド、糖脂質、糖脂質断片又はグリコシル化融合タンパク質である。「フコシルトランスフェラーゼに対する基質となることができる（アクセプタ）分子」という用語は本発明の関連で使用される場合、少なくとも１つのフコース残基が結合することができるプロスペクティブ（prospective）糖タンパク質又は糖脂質、すなわち脊椎動物細胞による生成後にフコシルトランスフェラーゼにより、フコースが結合することができる単糖を含むオリゴ糖構造が連結したタンパク質又は脂質である限りにおいて、いずれのタンパク質又は脂質をも表す。好ましくはタンパク質は原核生物起源のものではない。タンパク質が哺乳類タンパク質である又はそれから誘導されるのが特に好ましい。
【００９９】
本発明の脊椎動物細胞におけるフコシルトランスフェラーゼに対する基質となることができる分子、例えば少なくとも１つのフコース残基が結合することができる糖部分を含むタンパク質又は脂質の存在により、フコース残基が結合することができるにもかかわらずその糖部分上において、フコースを含まない、又はその糖部分上において、低減したフコース量を有するこの分子が生成される。
【０１００】
フコシルトランスフェラーゼに対する基質となることができる分子はタンパク質、好ましくは内因性又は外因性のタンパク質であるのが好ましい。「外因性タンパク質」という用語は、各細胞の外側由来のものであるか、又は各細胞へと導入される核酸により細胞内において発現される任意のタンパク質を意味する。「内因性タンパク質」という用語は、細胞のゲノムによりコードされる任意のタンパク質を表す。好ましくは対象となるタンパク質、すなわちプロスペクティブ糖タンパク質は組換えによって脊椎動物細胞で発現される。上記タンパク質は脊椎動物細胞に一時的に存在する又は安定して維持される核酸配列から発現されるのが好ましい。好適な発現ベクター及び発現制御配列は酵素に関して上記されている。これらは対象となるタンパク質をコードする核酸の発現に関して同様に使用することができる。
【０１０１】
このため本発明の好ましい実施の形態では、脊椎動物細胞は、
（ｉ）脊椎動物特異的な発現制御配列（それぞれの酵素をコードする核酸配列の発現を可能とする）に操作可能に連結した、酵素ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）、ＧＤＰ−ペロサミンシンテターゼ（Ｐｅｒ）、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−タロースシンテターゼ（ＧＴＳ）、ＧＤＰ−フコースシンテターゼＣｙｓ１０９Ｓｅｒ（ＧＦＳ−Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒ）突然変異体、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース−３−デヒドラターゼ（ＣｏｌＤ）又はＧＤＰ−Ｌ−コリトースシンターゼ（ＣｏｌＣ）をコードする核酸配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）脊椎動物特異的な発現制御配列（上記細胞において対象となるタンパク質、例えばＩｇＧ１のような抗体をコードする核酸配列の発現をもたらす）に操作可能に連結した、対象となるタンパク質、すなわちプロスペクティブ糖タンパク質、例えばＩｇＧ１のような抗体をコードする核酸配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドと、
を含む。
【０１０２】
結果として、（ｉ）酵素（複数も可）ＲＭＤ、Ｐｅｒ、ＧＴＳ、ＧＦＳ−Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒ及び／又はＣｏｌＤ、好ましくはＣｏｌＣと組み合わせたＣｏｌＤと、（ｉｉ）対象となるタンパク質（複数も可）、すなわちプロスペクティブ糖タンパク質（複数も可）、例えばＩｇＧ１のような抗体とが本発明の脊椎動物細胞において発現される。
【０１０３】
好ましくは、本発明の第１の態様では、タンパク質は抗体、抗体断片、融合タンパク質、ウイルスタンパク質、ウイルスタンパク質断片、抗原又はホルモンである。最も好ましくは、抗体又は抗体断片は、ＩｇＧ、好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥからなる群から選択される。最も好ましくは、融合タンパク質は、抗体のＦｃ領域、例えばＩｇＧのＦｃ領域、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥのＦｃ領域を含む。最も好ましくは、ホルモンは卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、性腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、インターロイキン−２、インターロイキン−６、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、可溶性インターロイキン−４、エリスロポエチン又はトロンボポエチンである。好ましくは、ウイルスタンパク質又はウイルスタンパク質断片はエンベロープウイルスのエンベロープ膜に含まれる。ウイルスタンパク質が呼吸器合胞体ウイルス由来のＧタンパク質又はＦタンパク質であり、かつウイルスタンパク質断片が上記タンパク質の細胞外断片であるのが特に好ましい。
【０１０４】
本発明の更なる態様は、上記のウイルスタンパク質又はウイルスタンパク質断片を含むウイルスである。
【０１０５】
フコシルトランスフェラーゼに対する基質となることができる分子は脂質であるのが好ましい。好ましくは、脂質はグリセロ糖脂質、最も好ましくはガラクト脂質、スルホ脂質（ＳＱＤＧ）又はスフィンゴ糖脂質、最も好ましくはセレブロシド（例えばガラクトセレブロシド又はグルコセレブロシド）、ガングリオシド、グロボシド、スルファチド又はホスホスフィンゴ糖脂質である。脂質はエンベロープウイルスのエンベロープ膜に含まれるのが特に好ましい。
【０１０６】
スフィンゴ糖脂質（ＧＳＬ）が特に好ましい。スフィンゴ糖脂質は疎水性セラミドアンカーであるＮ−アシルスフィンゴシンと、サッカリドから構成される親水性ヘッド基とを含有する。スフィンゴ糖脂質は通常、細胞膜の外表面に見られる。サッカリド部分の組成は細胞型に特有のものであり、生物の発生段階に応じて様々であり、又は細胞の発がん状態とともに変化し得る。
【０１０７】
最も好ましくは、ウイルスタンパク質及び／又は脂質がエンベロープウイルスのエンベロープに含まれる。
【０１０８】
既に上述したように、タンパク質はエンベロープウイルスのエンベロープ膜に含まれるウイルスタンパク質であり得る。脂質はエンベロープウイルスのエンベロープ膜に含まれる脂質でもあり得る。
【０１０９】
本発明の更なる態様は上記脂質を含むウイルスである。
【０１１０】
上述のウイルスをウイルス感染により脊椎動物細胞に導入することができる。ウイルスを、産生されるウイルスの全て又は一部をコードする核酸を導入することによって、脊椎動物細胞に導入することもできる。複製、例えばアセンブリ（assembly：集合化）に要求されるタンパク質を提供する必要がある場合、このことは通常、１つ又は複数のウイルスタンパク質を発現することが可能なウイルス産生細胞株を使用することにより達成される。例えばＨＥＫ２９３細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞及びＡＧＥ１．ＨＮ細胞がアデノウイルスＥ１Ａタンパク質を発現し、そのためＥ１コード領域を欠くＤＮＡを補完することが可能である。
【０１１１】
好ましくは、脊椎動物細胞は哺乳類細胞、魚類細胞、両生類細胞、爬虫類細胞又は鳥類細胞である。
【０１１２】
ｉ）哺乳類細胞がヒト細胞、ハムスター細胞、イヌ細胞若しくはサル細胞、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、メイディンダービー（Darby）イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、ヒトＰＥＲ．Ｃ６細胞（Crucell（Leiden, The Netherlands）の市販細胞）、若しくはヒト（ホモ・サピエンス（homo sapiens））ＡＧＥ１．ＨＮ細胞（ProBioGen（Berlin, Germany）の市販細胞）であり、
ｉｉ）魚類細胞がアメリカナマズ（Ictalurus punctatus）（チャネル・キャットフィッシュ）卵巣（ＣＣＯ）細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２７７２）であり、
ｉｉｉ）両生類細胞がアフリカツメガエル（Xenopus laevis）腎臓細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０２）であり、
ｉｖ）爬虫類細胞がグリーンイグアナ（Iguana iguana）心臓細胞（ＩｇＨ−２）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０８）であり、又は
ｖ）鳥類細胞がトリ網膜細胞ＡＧＥ１．ＣＲ、若しくはＡＧＥ１．ＣＲ．ＰＩＸ、若しくはトリ体節細胞ＡＧＥ１．ＣＳ（全ての細胞がノバリケン（Muscovy duck）（カイリナ・モスチャタ（Cairina moschata））から誘導される）であることが特に好ましい。
【０１１３】
これらの細胞株は全て、ProBioGen AGから市販されている。
【０１１４】
細胞株ＡＧＥ１．ＣＲ．ＰＩＸ（１７ａ１１ｂ）は、DSMZ-Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH（Mascheroder Weg1b, 38124 Braunschweig, Germany）にProBioGen AG（Goethestr. 54, 13086 Berlin, Germany）によって２００５年１１月２４日にアクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４９で寄託された。細胞株ＡＧＥ１．ＨＮ（ＮＣ５Ｔ１１＃３４）は、DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany）にProBioGen AG（Goethestr. 54, 13086 Berlin,Germany）によって２００５年１１月４日にアクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４４で寄託された。細胞株ＡＧＥ１．ＣＲ．ＰＩＸ（１７ａ１１ｂ）はノバリケン（カイリナ・モスチャタ）の胚性網膜細胞から誘導される。細胞株ＡＧＥ１．ＨＮ（ＮＣ５Ｔ１１＃３４）はヒト（ホモ・サピエンス）胎児の脳室周囲の神経領域から誘導される。両方の細胞株をアデノウイルスＥ１Ａ及びＥ１Ｂタンパク質の安定した組込み及び発現により不死化させる。
【０１１５】
別の好ましい脊椎動物細胞はＶＩＶＡＬＩＳ（Nantes, France）の市販細胞である鳥類ＥＢ１４細胞である。他の好ましい脊椎動物細胞は以下の表１に要約される。
【０１１６】
【表１】
2013505028.tif 000003
表１中の英語
細胞株
寄託番号
起源
誘導体
野生型
ＡＴＣＣによる寄託なし
マウス骨髄腫
幼ハムスターの腎臓（Kidney）
チャイニーズハムスターの卵巣
クリセツラス・グリセウス
ヒトの胚腎臓
【０１１７】
脊椎動物細胞は、ＧＤＰ−Ｄ−ラムノース、ＧＤＰ−Ｄ−ペロサミン、ＧＤＰ−デオキシ−Ｄ−タロース、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−アルトロース、ＧＤＰ−４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース又はＧＤＰ−Ｌ−コリトースが通常、脊椎動物細胞において合成されない又は存在しないため、上記糖に対するグリコシルトランスフェラーゼを自然状態では含まない。このためたとえ人工糖ＧＤＰ−Ｄ−ラムノース、ＧＤＰ−Ｄ−ペロサミン、ＧＤＰ−デオキシ−Ｄ−タロース、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−アルトロース、ＧＤＰ−４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース又はＧＤＰ−Ｌ−コリトースが本発明の第１の態様による脊椎動物細胞において不自然に生成されたとしても、上記糖をタンパク質又は脂質の新生糖構造に組み込むことはできない。
【０１１８】
しかしながら本発明者らは、それぞれの異種グリコシルトランスフェラーゼ、及び任意でさらにそれぞれの異種ＧＤＰ−デオキシヘキソース糖ヌクレオチド輸送体が脊椎動物細胞に存在していれば、人工糖ＧＤＰ−Ｄ−ラムノース、ＧＤＰ−Ｄ−ペロサミン、ＧＤＰ−デオキシ−Ｄ−タロース、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−アルトロース、ＧＤＰ−４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース又はＧＤＰ−Ｌ−コリトースをタンパク質又は脂質のグリカン構造に組み込むことができることを予期せず発見した。
【０１１９】
したがって好ましい実施の形態では、本発明の第１の態様による脊椎動物細胞は、好ましくは脊椎動物細胞に含まれ、脊椎動物特異的な発現制御配列に操作可能に連結した核酸によりコードされる、ＧＤＰ−Ｄ−ラムノース、ＧＤＰ−Ｄ−ペロサミン、ＧＤＰ−デオキシ−Ｄ−タロース、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−アルトロース、ＧＤＰ−４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース又はＧＤＰ−Ｌ−コリトースに対する少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼ（該発現制御配列により上記核酸配列の発現が可能になる）と、任意で好ましくは脊椎動物細胞に含まれ、脊椎動物特異的な発現制御配列に操作可能に連結した核酸によりコードされる、ＧＤＰ−Ｄ−ラムノース、ＧＤＰ−Ｄ−ペロサミン、ＧＤＰ−デオキシ−Ｄ−タロース、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−アルトロース、ＧＤＰ−４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース又はＧＤＰ−Ｌ−コリトースに対する少なくとも１つのＧＤＰ−デオキシヘキソース糖ヌクレオチド輸送体（該発現制御配列により上記核酸配列の発現が可能になる）とを更に含む。より好ましい実施の形態では、本発明の第１の態様による脊椎動物細胞は、ＧＤＰ−Ｄ−ラムノース、ＧＤＰ−Ｄ−ペロサミン及び／又はＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−アルトロースに対するグリコシルトランスフェラーゼを更に含む。
【０１２０】
２個以上、例えば２個、３個、４個、５個、６個又は７個の上述のグリコシルトランスフェラーゼと、任意で２個以上、例えば２個、３個、４個、５個、６個又は７個の上述のＧＤＰ−デオキシヘキソース糖ヌクレオチド輸送体が脊椎動物細胞、例えば真核細胞に存在することが特に好ましい。
【０１２１】
かかる核酸の一時的な又は安定した発現のための好適なシステムは、当業者に既知であるが、好ましいものが上記されており、グリコシルトランスフェラーゼ及び任意でＧＤＰ−デオキシヘキソース糖ヌクレオチド輸送体を発現することに関して同じように使用することができる。
【０１２２】
好ましくは、ＧＤＰ−Ｄ−ラムノース、ＧＤＰ−Ｄ−ペロサミン、ＧＤＰ−デオキシ−Ｄ−タロース、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−アルトロース、ＧＤＰ−４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース又はＧＤＰ−Ｌ−コリトースに対するグリコシルトランスフェラーゼが組換えによって脊椎動物細胞で発現される。ＧＤＰ−Ｄ−ラムノース、ＧＤＰ−Ｄ−ペロサミン、ＧＤＰ−デオキシ−Ｄ−タロース、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−アルトロース、ＧＤＰ−４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース又はＧＤＰ−Ｌ−コリトースに対するグリコシルトランスフェラーゼを脊椎動物細胞に一時的に存在する又は安定して維持される核酸配列から発現することができる。上述のＧＤＰ−デオキシヘキソース糖ヌクレオチド輸送体が組換えによって脊椎動物細胞で発現されることも好ましい。上記ＧＤＰ−デオキシヘキソース糖ヌクレオチド輸送体を脊椎動物細胞に一時的に存在する又は安定して維持される核酸配列から発現することができる。
【０１２３】
このため本発明の別の好ましい実施の形態では、脊椎動物細胞は、
（ｉ）脊椎動物特異的な発現制御配列に操作可能に連結した、酵素ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）、ＧＤＰ−ペロサミンシンテターゼ（Ｐｅｒ）、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−タロースシンテターゼ（ＧＴＳ）、ＧＤＰ−フコースシンテターゼＣｙｓ１０９Ｓｅｒ（ＧＦＳ−Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒ）突然変異体、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース−３−デヒドラターゼ（ＣｏｌＤ）又はＧＤＰ−Ｌ−コリトースシンターゼ（ＣｏｌＣ）をコードする核酸配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）脊椎動物特異的な発現制御配列に操作可能に連結した、対象となるタンパク質、すなわちプロスペクティブ糖タンパク質、例えばＩｇＧ１のような抗体をコードする核酸配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド（該発現制御配列により上記細胞において上記タンパク質をコードする核酸配列の発現が可能になる）と、
（ｉｉｉ）脊椎動物特異的な発現制御配列に操作可能に連結した、ＧＤＰ−Ｄ−ラムノース、ＧＤＰ−Ｄ−ペロサミン、ＧＤＰ−デオキシ−Ｄ−タロース、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−アルトロース、ＧＤＰ−４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース又はＧＤＰ−Ｌ−コリトースに対するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド（該発現制御配列により上記細胞において上記タンパク質をコードする核酸配列の発現が可能になる）と、任意で
（ｉｖ）脊椎動物特異的な発現制御配列に操作可能に連結した、ＧＤＰ−Ｄ−ラムノース、ＧＤＰ−Ｄ−ペロサミン、ＧＤＰ−デオキシ−Ｄ−タロース、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−アルトロース、ＧＤＰ−４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース又はＧＤＰ−Ｌ−コリトースに対するＧＤＰ−デオキシヘキソース糖ヌクレオチド輸送体をコードする核酸配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド（該発現制御配列により上記細胞において上記タンパク質をコードする核酸配列の発現が可能になる）と、
を含む。
【０１２４】
結果として、（ｉ）酵素（複数も可）と、（ｉｉ）対象となるタンパク質（複数も可）と、（ｉｉｉ）グリコシルトランスフェラーゼ（複数も可）と、任意で（ｉｖ）ＧＤＰ−デオキシヘキソース糖ヌクレオチド輸送体とが本発明の脊椎動物細胞において過剰発現される。
【０１２５】
上記タンパク質（複数も可）は、酵素（複数も可）の最終生成物（複数も可）、すなわちＧＤＰ−Ｄ−ラムノース、ＧＤＰ−Ｄ−ペロサミン、ＧＤＰ−デオキシ−Ｄ−タロース、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−アルトロース、ＧＤＰ−４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース及び／又はＧＤＰ−Ｌ−コリトースを利用し、それらをその糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有するタンパク質（複数も可）の糖構造に組み込む同時発現したグリコシルトランスフェラーゼ（複数も可）により、更に修飾される。これにより、その糖部分上において、Ｄ−ラムノース、Ｄ−ペロサミン、デオキシ−Ｄ−タロース、６−デオキシ−Ｄ−アルトロース、４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース及び／又はＬ−コリトースを含む新たな人工タンパク質（複数も可）が生成される。
【０１２６】
好ましくは、上述のＧＤＰ−デオキシヘキソース糖ヌクレオチド輸送体は、ゴルジ体のＧＤＰ−デオキシヘキソース糖ヌクレオチド輸送体、すなわち脊椎動物細胞、例えば真核細胞のゴルジ膜を介した上述のヌクレオチド糖の輸送を可能にする輸送体である。
【０１２７】
本発明による（改変）脊椎動物細胞を使用して、その糖部分上において、フコースを有しない又はその糖部分上において、低減したフコース量を有する、エンベロープ表面の糖タンパク質又は糖脂質を含む、エンベロープウイルスを産生することができる。
【０１２８】
好ましくは、エンベロープウイルスを、完全に又は部分的にウイルスワクチンの活性成分として使用する。「ウイルスワクチン」という用語は、投与するとウイルスに対する抗体産生又は細胞性免疫を刺激するが、重大な感染を引き起こす能力のない弱毒化又は死滅ウイルスの製剤を意味する。
【０１２９】
本発明による（改変）脊椎動物細胞を使用して、その糖部分上において、Ｄ−ラムノース、Ｄ−ペロサミン、デオキシ−Ｄ−タロース、６−デオキシ−Ｄ−アルトロース、４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース及び／又はＬ−コリトースを含む、エンベロープ表面の糖タンパク質又は糖脂質を含む、エンベロープウイルスを産生することもできる。
【０１３０】
第２の態様では、本発明は、自然状態ではその糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有する分子を生成する方法であって、
ｉ）第１の態様による脊椎動物細胞を準備する工程と、
ｉｉ）ｉ）における該細胞からフコシルトランスフェラーゼに対する基質となることができる分子、好ましくはタンパク質又は脂質を単離する工程と、
を含む、自然状態ではその糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有する分子を生成する方法に関する。
【０１３１】
好ましくは、工程ｉ）では、フコシルトランスフェラーゼに対する基質となることができる分子、例えばタンパク質がｉ）における細胞で発現する。
【０１３２】
上記分子、例えばその糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有するタンパク質又は脂質を工程ｉｉ）において脊椎動物細胞から容易に単離することができる。
【０１３３】
修飾分子、例えばその糖部分上において、フコースを欠いている若しくは低減したフコース量を有するタンパク質を含む、真核細胞（例えば脊椎動物細胞）内に包まれる又はかかる細胞から分泌される分子に関して様々な単離法が当該技術分野で既知である。かかる方法は通常、細胞内分子の場合、細胞の収集、分解及び分画／精製と、細胞を含まない培養上清の生成、その後の分泌された分子の精製とを伴う。
【０１３４】
本発明に有用な抽出法は単離対象の修飾分子に妨害されない。例えば抽出を、強い洗浄剤及び還元剤又はタンパク質変性を誘導することができる任意の作用物質の非存在下で行うのが好ましい。
【０１３５】
第３の態様では、本発明は、第２の態様の方法により入手可能な、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有する分子を提供する。好ましくは、この分子は脂質又はタンパク質である。
【０１３６】
第１の態様に関して上記されたように、タンパク質は抗体、ホルモン、抗原又はウイルスタンパク質であるのが特に好ましい。
【０１３７】
脂質はグリセロ糖脂質、最も好ましくはガラクト脂質、スルホ脂質（ＳＱＤＧ）又はスフィンゴ糖脂質、最も好ましくはセレブロシド（例えばガラクトセレブロシド又はグルコセレブロシド）、ガングリオシド、グロボシド、スルファチド又はホスホスフィンゴ糖脂質であるのが特に好ましい。好ましくは脂質、例えばガングリオシドはエンベロープウイルスの膜に含まれる。
【０１３８】
最も好ましくは、ウイルスタンパク質及び／又は脂質がエンベロープウイルスのエンベロープに含まれる。
【０１３９】
更なる態様では、本発明は、第３の態様による分子の組成物を提供する。
【０１４０】
第４の態様では、本発明は、第２の態様の方法により入手可能な、Ｄ−ラムノース、Ｄ−ペロサミン、デオキシ−Ｄ−タロース、６−デオキシ−Ｄ−アルトロース、４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース、及び／又はＬ−コリトースを含有する糖部分を含む分子を提供する。
【０１４１】
この分子はその糖部分上において、Ｌ−フコースを含まない、又はＬ−フコース量が低減しているのが好ましい。好ましくは、この分子は脂質又はタンパク質である。さらにかかる修飾分子、好ましくは脂質及び／又はタンパク質を発現する脊椎動物細胞、好ましくは腫瘍細胞が提供される。Ｄ−ラムノースを含むグリカンを含有する腫瘍細胞が特に好ましい。Ｄ−ラムノースは、ガノデルマ・ルシダム（Ganoderma lucidum：霊芝）多糖の構成要素である。これらの多糖は免疫エフェクター細胞の活性を高める伝統的な漢方薬に使用されている：ＮＫ細胞及びリンホカイン活性化キラー細胞を活性化させ、マクロファージの貪食及び細胞毒性を増大させる（Zhu et al., 2007, Journal of Ethnopharmacology 111 (2), 219-226）。かかる細胞を使用して、例えば活性な免疫化アプローチのように、所定の腫瘍細胞に対する免疫応答を増大させることができる。
【０１４２】
更なる態様では、本発明は第４の態様による分子の組成物を提供する。
【０１４３】
第５の態様では、本発明は、
ｉ）７０％〜９５％、すなわち７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％及び９５％、好ましくは８０％のＧ０−ＧｌｃＮａｃ、Ｇ０、Ｇ１及び／又はＧ２の複合型Ｎ−グリカンと、
ｉｉ）５％〜３０％、すなわち５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％及び３０％、好ましくは２０％の高マンノース型Ｎ−グリカンと、
を含む糖タンパク質を含む組成物であって、該糖タンパク質の該複合型Ｎ−グリカンがフコースを含まない、又はフコースを実質的に含まない、糖タンパク質を含む組成物を提供する。好ましくは、該組成物の糖タンパク質は上記の好ましい糖タンパク質、特に抗体である。
【０１４４】
該組成物内で複合型Ｎ−グリカンの７０％〜８０％、好ましくは約７５％がＧ０の複合型Ｎ−グリカンであり、２０％〜３０％、好ましくは約２５％がＧ０−ＧｌｃＮａｃ、Ｇ１及び／若しくはＧ２の複合型Ｎ−グリカンであり、並びに／又は高マンノース型Ｎ−グリカンの４５％〜５５％、好ましくは約５０％がｍａｎ５グリカンであり、４５％〜５５％、好ましくは約５０％がｍａｎ６、ｍａｎ７及び／若しくはｍａｎ８  Ｎ−グリカンであるのが特に好ましい。それぞれの場合の数字は合計で１００％になることが理解される。
【０１４５】
また、該組成物内で複合型Ｎ−グリカンの７０％〜９０％、好ましくは約８０％がＧ０の複合型Ｎ−グリカンであり、１０％〜３０％、好ましくは約２０％がＧ０−ＧｌｃＮａｃ、Ｇ１及び／若しくはＧ２の複合型Ｎ−グリカンであり、並びに／又は高マンノース型Ｎ−グリカンの６０％〜８５％、好ましくは約７０％がｍａｎ５グリカンであり、１５％〜４０％、好ましくは約３０％がｍａｎ６、ｍａｎ７及び／若しくはｍａｎ８  Ｎ−グリカンであるのが特に好ましい。それぞれの場合の数字は合計で１００％になることが理解される。
【０１４６】
糖タンパク質は本発明の第１の態様との関連で好ましいとして示されたもの、特に抗体、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４であるのが好ましく、これらの抗体は非改変の親細胞（例えば脊椎動物細胞のような真核細胞）で産生される抗体組成物よりも高いＡＤＣＣ活性を有するのが好ましい。
【０１４７】
ＡＤＣＣは腫瘍（がん）細胞に指向性を有する抗体がその効果を発揮する主要な機構である。ＡＤＣＣを使用して、自己免疫疾患における発病を妨げるために特定の免疫細胞を取り除くこともできる。
【０１４８】
ウイルス感染症及び細菌感染症を含む様々な疾患を、本発明による高いＡＤＣＣ活性を有する抗体を使用してウイルス又は細菌に感染した細胞の増殖を抑制することにより予防及び治療することができる。
【０１４９】
第６の態様では、本発明は、Ｄ−ラムノース、Ｄ−ペロサミン、デオキシ−Ｄ−タロース、６−デオキシ−Ｄ−アルトロース、４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース及び／又はＬ−コリトースを含有する糖部分を含む、タンパク質、好ましくは非原核生物タンパク質、好ましくはウイルス若しくは哺乳類のタンパク質、又は脂質、好ましくは非原核生物脂質、例えばスフィンゴ糖脂質を提供する。好ましくは、ウイルスタンパク質及び／又は脂質がエンベロープウイルスのエンベロープに含まれる。代替的には、かかるタンパク質及び／又は脂質を含む、真核細胞、好ましくは脊椎動物細胞、より好ましくは哺乳類細胞、最も好ましくはヒト細胞（同種又は自己の腫瘍細胞）が提供される。
【０１５０】
好ましくは、タンパク質又は脂質は、その糖部分上において、Ｄ−ラムノース、Ｄ−ペロサミン、デオキシ−Ｄ−タロース、６−デオキシ−Ｄ−アルトロース、４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース及び／又はＬ−コリトース、より好ましくはＤ−ラムノース及び／又はＤ−ペロサミンを含み、かつその糖部分上において、Ｌ−フコースを含まない又はＬ−フコース量が低減している。第６の態様のタンパク質がまた、本発明の方法の好ましい態様及び特に好ましい態様を用いた結果として起こる全ての特性を有し得ることは明らかである。
【０１５１】
人工糖、例えばＤ−ラムノース、Ｄ−ペロサミン、デオキシ−Ｄ−タロース、６−デオキシ−Ｄ−アルトロース、４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース及び／又はＬ−コリトースが、例えば細菌表面上の電荷を中和することにより、カチオン性ペプチド、例えばポリミキシンＢ、ディフェンシン等に対する耐性を付与することが知られている（Breazeale et al., 2003, The Journal of Biological Chemistry, 278,24731-24739を参照されたい）。
【０１５２】
ディフェンシンは、例えば真核生物（例えば脊椎動物）に見られる低分子の高システインカチオン性タンパク質である。ディフェンシンは、細菌、真菌、並びに多くのエンベロープウイルス及び非エンベロープウイルスに対して活性がある。ディフェンシンは、６個（脊椎動物では）〜８個の保存されたシステイン残基を含む１８個〜４５個のアミノ酸からなる。免疫系の真核（例えば脊椎動物）細胞が、例えば好中性顆粒球及びほとんど全ての上皮細胞において貪食された細菌を死滅させるのを助けるためにこれらのペプチドを含有する。
【０１５３】
このため、その糖部分上において、Ｄ−ラムノース、Ｄ−ペロサミン、デオキシ−Ｄ−タロース、６−デオキシ−Ｄ−アルトロース、４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース及び／又はＬ−コリトース、好ましくはカチオン性アミノ糖であるＤ−ペロサミンを含有するウイルスタンパク質を含む、エンベロープウイルスの確立は、これらのウイルスがディフェンシン及び先天性免疫防御の他のカチオン性ペプチドの攻撃に対して耐性であるため、例えばベクターとして遺伝子療法において極めて有用である。その糖部分上において、糖残基Ｄ−ラムノース、Ｄ−ペロサミン、デオキシ−Ｄ−タロース、６−デオキシ−Ｄ−アルトロース、４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース及び／又はＬ−コリトースを１つ又は複数含有するウイルス又はウイルス糖タンパク質の産生は優れた免疫応答を誘導するのに極めて有用である。これらの糖残基は自然状態で哺乳類の糖タンパク質には存在しない。しかしながらこれらの糖残基は、細菌の糖タンパク質及びリポ多糖には存在することが多い。ＲＭＤ配列の供給源である緑膿菌は、免疫不全宿主及び嚢胞性線維症（ＣＦ）の患者で見られる最も重要な細菌性病原体の１つである。
【０１５４】
特に、糖残基Ｄ−ペロサミンを含有するタンパク質又は糖残基Ｄ−ペロサミンを含有するウイルスタンパク質を含むエンベロープウイルスの確立が、Ｄ−ペロサミンのカチオン性（cationicity）のために好まれる。そのエンベロープに糖残基Ｄ−ペロサミンを含有する糖タンパク質を含むウイルスはカチオン性の表面電荷を有し、これにより上記ウイルスを先天性免疫防御から保護することができる。
【０１５５】
第７の態様では、本発明は、基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用するが、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースをＧＤＰ−Ｌ−フコースへと変換する反応を触媒しない酵素をコードする核酸配列を含む（第１の）ポリヌクレオチドに操作可能に連結した脊椎動物の発現制御配列を１つ又は複数含む発現単位を提供する。
【０１５６】
発現単位は、１つ又は複数の脊椎動物の発現制御配列及び基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用する酵素をコードする核酸配列を含む（第１の）ポリヌクレオチドを組み込むことができる当業者に既知の任意の発現系、例えばプラスミド、コスミド、ウイルス等であり得る。
【０１５７】
好ましくは、発現単位に含まれる１つ又は複数の脊椎動物の発現制御配列は、基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用する酵素をコードする核酸配列を含む（第１の）ポリヌクレオチドと操作可能に連結することにより、脊椎動物細胞、例えばＣＨＯ細胞又はＨｅＬａ細胞において基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用する酵素をコードする核酸配列の発現が可能になる。
【０１５８】
好ましくは、発現ベクター、例えばプラスミドベクターにより、脊椎動物細胞の細胞質における基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用する酵素をコードする核酸配列の一時的な発現が可能になる、又は上記細胞のゲノムにおける上記配列の組込み後の脊椎動物細胞において基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用する酵素をコードする核酸配列の安定した発現が可能になる。
【０１５９】
基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用する酵素は、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）、ＧＤＰ−ペロサミンシンテターゼ（Ｐｅｒ）、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−タロースシンテターゼ（ＧＴＳ）、ＧＤＰ−フコースシンテターゼＣｙｓ１０９Ｓｅｒ（ＧＦＳ−Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒ）突然変異体、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース−３−デヒドラターゼ（ＣｏｌＤ）、好ましくはＧＤＰ−Ｌ−コリトースシンターゼ（ＣｏｌＣ）と組み合わせたＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース−３−デヒドラターゼ（ＣｏｌＤ）、及びその変異体からなる群から選択されるのが特に好ましい。
【０１６０】
好ましくは、発現単位は、好ましくは１つ又は複数の脊椎動物の発現制御要素、例えばプロモーターと操作可能に連結し、好ましくは発現ベクター、例えばプラスミドベクターに含まれることにより、脊椎動物細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞又は腫瘍細胞、好ましくは自己腫瘍細胞においてグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列の発現が可能になる、ＧＤＰ−Ｄ−ラムノース、ＧＤＰ−Ｄ−ペロサミン、ＧＤＰ−デオキシ−Ｄ−タロース、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−アルトロース、ＧＤＰ−４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース又はＧＤＰ−Ｌ−コリトースに対する上記グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含む（第２の）ポリヌクレオチドと、任意で、好ましくは１つ又は複数の脊椎動物の発現制御要素、例えばプロモーターと操作可能に連結し、好ましくは発現ベクター、例えばプラスミドベクターに含まれることにより、脊椎動物細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞又は腫瘍細胞、好ましくは自己腫瘍細胞においてＧＤＰ−デオキシヘキソース糖ヌクレオチド輸送体をコードする核酸配列の発現が可能になる、ＧＤＰ−Ｄ−ラムノース、ＧＤＰ−Ｄ−ペロサミン、ＧＤＰ−デオキシ−Ｄ−タロース、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−アルトロース、ＧＤＰ−４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース又はＧＤＰ−Ｌ−コリトースに対する上記ＧＤＰ−デオキシヘキソース糖ヌクレオチド輸送体をコードする核酸配列を含む（第３の）ポリヌクレオチドとを更に含む。
【０１６１】
上記の第１の、第２の、及び任意で第３のポリヌクレオチドを発現ベクター、例えば一時的な発現ベクター又は細胞のゲノムに組み込むベクターに別々に組み込むことができる。代替的に、上記の第１の、第２の、及び任意で第３のポリヌクレオチドは１つの発現ベクターに含まれ得る。発現は１つのプロモーター、２つのプロモーター又は３つのプロモーターから駆動され得る。前者の場合、第１の、第２の、及び任意で第３のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質が単一の転写産物として転写され、ＩＲＥＳでのみ分離されるのが好ましい。
【０１６２】
本発明の好ましい実施の形態では、発現単位は、好ましくはそれぞれ１つの発現ベクターに、２つの発現ベクターに、又は３つの発現ベクターに含まれる、酵素ＲＭＤをコードする核酸配列を含む第１のポリヌクレオチドに操作可能に連結した１つ又は複数の脊椎動物の発現制御配列と、ＧＤＰ−Ｄ−ラムノースに対するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含む第２のポリヌクレオチドに操作可能に連結した１つ又は複数の脊椎動物の発現制御配列と、任意に、ＧＤＰ−Ｄ−ラムノースに対するＧＤＰ−デオキシヘキソース糖ヌクレオチド輸送体をコードする核酸配列を含む第３のポリヌクレオチドに操作可能に連結した１つ又は複数の脊椎動物の発現制御配列とを含む。
【０１６３】
本発明の別の好ましい実施の形態では、発現単位は、第１のポリヌクレオチド内に含まれる酵素ＲＭＤをコードする核酸配列の発現を制御する１つ又は複数の脊椎動物の発現制御配列と、第２のポリヌクレオチド内に含まれるＧＤＰ−Ｄ−ラムノースに対するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列と、任意で、第３のポリヌクレオチド内のＧＤＰ−Ｄ−ラムノースに対するＧＤＰ−デオキシヘキソース糖ヌクレオチド輸送体をコードする核酸配列とを含み、第１の、第２の、及び任意で第３のポリヌクレオチドは、ＩＲＥＳで互いに分離され、好ましくは発現ベクターに含まれる。
【０１６４】
本発明の第７の態様による発現単位は医薬に、特に免疫刺激から利益を受ける疾患、特に腫瘍の治療法又は予防法に関するワクチンの調製に使用することもできる。
【０１６５】
さらに第７の態様との関連では、特に発現される様々な核酸、例えばＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用する酵素の中程度又は低い発現を誘導する発現制御要素を含むポリヌクレオチドに関する、本発明の第１の態様の更なる好ましい実施の形態及び特に好ましい実施の形態は全て、第７の態様との関連で等しく好ましい。
【０１６６】
多くの場合、対象となる導入遺伝子を所望のレベルで発現する効果的な薬学的な産生細胞株を生成及び開発するのに、生物医薬品企業はかなりの時間を費やし、多大な努力が為されてきた。対象となる導入遺伝子がＡＤＣＣエフェクター機能の向上からの利益を受けることができる治療抗体である場合、高産生細胞がＮ−糖部分へとコア−フコースを結合することができない、又はＮ−糖部分へと人工糖を結合することができるように、産生細胞株を更に操作することが強く望まれる。
【０１６７】
好ましくは、既に上述のように、発現単位は、ＧＤＰ−Ｄ−ラムノース、ＧＤＰ−Ｄ−ペロサミン、ＧＤＰ−デオキシ−Ｄ−タロース、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−アルトロース、ＧＤＰ−４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース又はＧＤＰ−Ｌ−コリトースに対するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含む第２のポリヌクレオチドと、任意でＧＤＰ−Ｄ−ラムノース、ＧＤＰ−Ｄ−ペロサミン、ＧＤＰ−デオキシ−Ｄ−タロース、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−アルトロース、ＧＤＰ−４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース又はＧＤＰ−Ｌ−コリトースに対するＧＤＰ−デオキシヘキソース糖ヌクレオチド輸送体をコードする核酸配列を含む第３のポリヌクレオチドとを更に含む。
ＧＤＰ−Ｄ−ラムノース、ＧＤＰ−Ｄ−ペロサミン、ＧＤＰ−デオキシ−Ｄ−タロース、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−アルトロース、ＧＤＰ−４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース又はＧＤＰ−Ｌ−コリトースに対するグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含む第２のポリヌクレオチドが、１つ又は複数の脊椎動物の発現制御配列に操作可能に連結することにより、脊椎動物細胞、例えばＨｅＬａ細胞又はＣＨＯ細胞において上記グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列の発現が可能になることが好ましい。ＧＤＰ−Ｄ−ラムノース、ＧＤＰ−Ｄ−ペロサミン、ＧＤＰ−デオキシ−Ｄ−タロース、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−アルトロース、ＧＤＰ−４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース又はＧＤＰ−Ｌ−コリトースに対するＧＤＰ−デオキシヘキソース糖ヌクレオチド輸送体をコードする核酸配列を含む第３のポリヌクレオチドが、１つ又は複数の脊椎動物の発現制御配列に操作可能に連結することにより、脊椎動物細胞、例えばＨｅＬａ細胞又はＣＨＯ細胞において上記ＧＤＰ−デオキシヘキソース糖ヌクレオチド輸送体をコードする核酸配列の発現が可能になることも好ましい。
【０１６８】
異なる核酸配列の互いに対する発現の比は脊椎動物細胞のゲノムにおけるコピー数及び組込み部位の両方に応じて変わる。標準的なスクリーニングプロセスにより、所望の比で個々の遺伝子産物を発現する細胞クローンを単離することが可能である。
【０１６９】
上記の好ましい発現単位を、糖タンパク質又は糖脂質の新生糖構造へとフコース以外の人工糖（例えばＤ−ラムノース、Ｄ−ペロサミン、デオキシ−Ｄ−タロース又は６−デオキシ−Ｄ−アルトロース）を結合することが可能になるように、既存の細胞株（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ）に容易に適用することができる。この発現単位を、糖タンパク質の新生糖構造へとフコース以外の人工糖（例えばＤ−ラムノース）を結合することが可能になるように、例えば人工グリコシル化構造を有する抗体、例えばＩｇＧ１／＋Ｄ−ラムノースを産生するために、予め遺伝子操作された細胞株（例えばＩｇＧ１産生ＣＨＯ細胞）に容易に適用することもできる。
【０１７０】
好ましくは、発現単位は対象となるタンパク質、例えばＩｇＧ１をコードする核酸配列を含む更なるポリヌクレオチドを（第２の、第３の又は第４のポリヌクレオチドのいずれかとして）含む。対象となるタンパク質、例えばＩｇＧ１をコードする核酸を含む更なるポリヌクレオチドが、発現制御配列に操作可能に連結することにより、脊椎動物細胞、例えばＨｅＬａ細胞又はＣＨＯ細胞において上記タンパク質をコードする核酸配列の発現が可能になることが好ましい。
【０１７１】
本発明の第７の態様の発現単位との関連では、本発明の第１の及び第２の態様に教示される、全ての要素、好ましくは酵素をコードする核酸、発現制御要素、基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用するが、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースをＧＤＰ−Ｌ−フコースへと変換する反応を触媒しない酵素をコードする核酸配列が同様に好ましい。
【０１７２】
第８の（eighth）態様では、本発明は、通常その糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有するタンパク質を生成するための（改変）真核細胞であって、
ｉ）基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用する酵素をコードする核酸配列を含む第１のポリヌクレオチドと、
ｉｉ）タンパク質をコードする核酸配列を含む第２のポリヌクレオチドと、
を含み、該酵素がＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースをＧＤＰ−Ｌ−フコースに変換する反応を触媒しない、通常その糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有するタンパク質を生成するための（改変）真核細胞に関する。
【０１７３】
真核細胞に関しては、本発明の第１の態様の脊椎動物細胞との関連でこれまでに記載された好ましい実施の形態及び特に好ましい実施の形態が全て、同様に好ましい。
【０１７４】
好ましくは、真核細胞は、好ましくは本発明の第１の態様に関して上記で概説されたような、脊椎動物細胞、例えば哺乳類細胞、魚類細胞、両生類細胞、爬虫類細胞若しくは鳥類細胞、又は昆虫細胞である。バキュロウイルス発現系とともに使用される昆虫細胞、例えばＳｆ９細胞又はＨｉ５細胞が、高い収率及び速度のために糖タンパク質を産生するのに好ましい。しかしながら、昆虫細胞由来の糖タンパク質はコアα１，３−フコースを含有し得る。糖残基は昆虫由来糖タンパク質に対する広範な（amajor extend to）抗体、特にＩｇＥ抗体に寄与する。糖残基は昆虫の糖タンパク質に対するアレルギー反応の基盤である。
【０１７５】
基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用するが、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースをＧＤＰ−Ｌ−フコースへと変換する反応を触媒しない酵素を少なくとも１つ含む昆虫細胞はそのグリカン上でフコースを欠いている又はフコースが低減している。これにより、かかる糖タンパク質（glycoproteins）に対するアレルギー反応が低減する又は取り除かれる。
【０１７６】
上述の（改変）真核細胞は、基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用する酵素をコードする核酸配列を含む２つ以上のポリヌクレオチド、例えば基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用する異なる酵素をコードする複数の核酸配列を含む複数のポリヌクレオチドを含んでいてもよい（本発明の第１の態様を参照されたい）。
【０１７７】
第９の態様では、本発明は、通常その糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有するタンパク質を生成する方法であって、
ｉ）第８の態様による真核細胞を準備する工程と、
ｉｉ）上記細胞において該第１のポリヌクレオチドによりコードされる該酵素及び該第２のポリヌクレオチドによりコードされる該タンパク質を発現する工程と、
ｉｉｉ）上記細胞から該タンパク質を単離する工程と、
を含む、通常その糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有するタンパク質を生成する方法に関する。
【０１７８】
本発明の真核細胞を使用する方法に関しては、本発明の第１の態様の脊椎動物細胞及び本発明の第２の態様の方法に関してこれまでに記載された好ましい実施の形態及び特に好ましい実施の形態は全て、本発明の第９の態様に関しても同様に好ましい。
【０１７９】
第１０の態様では、本発明は、第９の態様の方法により入手可能な、その糖部分上において、フコースを欠いている又は（or）低減したフコース量を有するタンパク質に関する。
【０１８０】
本発明の様々な変更形態及び変形形態が、本発明の範囲を逸脱することなく当業者に明らかである。本発明を特定の好ましい実施の形態に関連して説明したが、特許請求される発明はそのような特定の実施の形態に不当に限定されないことが理解されよう。実際に、関連分野の当業者に明らかな本発明を実施する記載の形態の様々な変更形態は、本発明に包含されることが意図される。
【０１８１】
以下の図面及び実施例は本発明の一例にすぎず、添付の特許請求の範囲によって示される本発明の範囲を限定するものとは決して解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１８２】
【図１】真核細胞（例えば脊椎動物（vertebrate）細胞）におけるフコースのサルベージ経路及びｄｅ  ｎｏｖｏ経路の概略図である。フコースの非存在下では、細胞はサルベージ経路を介してＧＤＰ−フコースを合成することができない（右側のパネルを参照されたい）。ｄｅ  ｎｏｖｏ経路は中間体ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースの通常脊椎動物細胞では生じない終末（dead end）生成物への酵素的変換により遮断することができる（左側のパネル）。例えば偏向酵素がＲＭＤである場合、終末生成物はＧＤＰ−Ｄ−ラムノースである。ＧＤＰ−Ｄ−ラムノース等のＧＤＰ−デオキシヘキソースはＧＭＤ酵素に対してフィードバック阻害を示すことにより、フコースｄｅ  ｎｏｖｏ経路、及び代替的なＧＤＰ−ラムノース合成を更に遮断することができる。
【図２】ＲＭＤ導入遺伝子を安定して過剰発現するＲＭＤ−ＣＨＯ−ＩｇＧ細胞のＧＦＰ蛍光を示す図である。
【図３】ＲＭＤ導入遺伝子を発現するクローンのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。レーンＭ＝ｂｐ−ＤＮＡマーカー、レーン１：ＲＭＤ−ＣＨＯ−ＩｇＧクローン１；レーン２：ＲＭＤ−ＣＨＯ−ＩｇＧクローン２；レーン３：ＲＭＤ−ＣＨＯ−ＩｇＧクローン３；レーン４：ＲＭＤ−ＣＨＯ−ＩｇＧクローン４；レーン５：ＲＭＤ−ＣＨＯ−ＩｇＧクローン５；レーン６：ＲＭＤ−ＣＨＯ−ＩｇＧクローン６；レーン７：ＣＨＯ−ＩｇＧ親クローン；レーン８：陰性ＰＣＲ対照。ＲＭＤバンドは全てのＲＭＤをトランスフェクトしたクローンで見ることができる。
【図４】ＣＨＯ−ＩｇＧ細胞（Ｂ）及びＲＭＤ−ＣＨＯ−ＩｇＧ細胞（Ａ）のＩｇＧ１から放出される過メチル化Ｎ−グリカンのＭＡＬＤＩ  ＭＳプロファイルの総観的比較を示す図である。ＰＮＧａｓｅ  Ｆ消化により放出される抗体Ｆｃのオリゴ糖を、ｓｍａｒｔｂｅａｍ−ＩＩ（商標）レーザを備えたＵｌｔｒａＦｌｅｘ  ＩＩＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計を使用して分析した。ｍ／ｚ値ピークはナトリウムと結合した（associated）オリゴ糖イオンに対応する。全ての標識化［Ｍ＋Ｎａ］＋分子イオンシグナルを注釈したように割り当てることができた。パネルＡに示されるＭＡＬＤＩスペクトルにおける主なｍ／ｚピークの１６４Ｄａシフトはフコースの喪失を示している。各ピークのオリゴ糖構造図はそれぞれの注釈付きピークの上に示す。ＲＭＤ導入遺伝子を安定して過剰発現するＲＭＤ−ＣＨＯ−ＩｇＧ細胞で発現した治療用ＩｇＧ１抗体から得られたＮ−糖構造は、ＭＡＬＤＩピーク相対強度に基づくと、結合したフコース残基が完全になく、相対的により大量の高マンノース構造を含有する（パネルＡ；主要な高マンノース構造を丸で囲った）が、非改変ＣＨＯ−ＩｇＧ親細胞で発現した治療用ＩｇＧ１抗体から得られたＮ−糖構造はコア−フコシル化されており、高マンノース構造の含有量は顕著に少ない（フコース残基＝丸で囲った黒色の三角；パネルＢ）。
【図５−１】（Ａ）ＷＴ  ＣＨＯ細胞；（Ｂ）ＲＭＤ−ＣＨＯクローンＨ１；（Ｃ）ＲＭＤ−ＣＨＯクローンＨ２；（Ｄ）ＲＭＤ−ＣＨＯクローンＨ３を使用して産生した脱シアル化ＩｇＧ  Ｎ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す図である。全ての分子イオンはナトリウム化（sodiated）［Ｍ＋Ｎａ＋］形態又はカリウム化（potassiated）［Ｍ＋Ｋ＋］形態（黒色の十字型）のいずれかで存在する。暗灰色の円、Ｍａｎ；明灰色の円、Ｇａｌ；黒色の四角、ＧｌｃＮＡｃ；黒色の三角、Ｆｕｃ；白色の十字型、いずれの炭水化物材料も含有しない。
【図５−２】Ｃ）ＲＭＤ−ＣＨＯクローンＨ２；（Ｄ）ＲＭＤ−ＣＨＯクローンＨ３を使用して産生した脱シアル化ＩｇＧ  Ｎ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す図である。
【図６】（Ａ）血漿の非存在下でのＷＴ  ＩｇＧ及び非フコシル化ＩｇＧに対するＦｃｇＲＩＩＩａ−Ｈｉｓ（Ｐｈｅ１５８）の結合曲線を示す図である。ＦｃγＲＩＩＩａ結合を、捕捉試薬としてＦｃγＲＩＩＩａ−Ｈｉｓ、検出試薬として抗ヒトＩｇＧペルオキシダーゼ結合抗体、及び発色基質としてテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を使用するＥＬＩＳＡにより検出した。点は４５０ｎｍでペルオキシダーゼと反応したＴＭＢの吸光度の中央値（ｎ＝２）を示す。バーはＳＤを示す。白丸＝野生型のフコシル化ＩｇＧ（ＷＴ）、黒丸＝クローンＨ１由来の非フコシル化ＩｇＧ（Ｈ１）；黒四角＝クローンＨ２由来の非フコシル化ＩｇＧ（Ｈ２）；上向きの黒三角＝クローンＨ３由来の非フコシル化ＩｇＧ（Ｈ３）。（Ｂ）ＷＴ  ＩｇＧに対する非フコシル化ＩｇＧのＦｃγＲＩＩＩ結合の相対的な増加倍率を示す図である。ＦｃγＲＩＩＩ結合の相対的な増加倍率を、ＥＣ５０値から算出した。ＷＴ、野生型フコシル化ＩｇＧ；Ｈ１、クローンＨ１由来の非フコシル化ＩｇＧ；Ｈ２、クローンＨ２由来の非フコシル化ＩｇＧ；Ｈ３、クローンＨ３由来の非フコシル化ＩｇＧ。
【図７】ＡＤＣＣ活性アッセイに関するＮＫ細胞の調製及び分析を示す図である。（Ａ）ＡＤＣＣアッセイに使用される単離した初代ＮＫ細胞の純度レベルを示すドットプロット。初代ＮＫ細胞を電磁ビーズ分離により健常なヒトドナーの全血から単離した。それから単離したＮＫ細胞を、ＮＫ細胞マーカーＣＤ１６及びＣＤ５６に対する抗体を使用するフローサイトメトリにより純度に関して分析した。（Ｂ）単離したＮＫ細胞の性能。単離したＮＫ細胞の細胞溶解活性を決定するために、カルセインＡＭで染色したＫ５６２標的細胞を単独で、ＮＫ細胞とともに、又は細胞溶解剤サポニンとともに４時間インキュベートした。インキュベートした標的細胞から放出される平均蛍光強度（ＭＦＩ）は細胞溶解の程度を間接的に示す。自発的細胞溶解で得られたＭＦＩから減算したＮＫ媒介性の細胞溶解で観察されるＭＦＩは、ＡＤＣＣアッセイで観察される可能な最大限の比ＭＦＩを示す。ＮＫ媒介性の溶解は総溶解から得られるＭＦＩレベルに完全には達しないことに留意する。
【図８】ＣＨＯ及びＲＭＤ−ＣＨＯ由来の非フコシル化及びフコシル化ＩｇＧのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡＤＣＣ活性を示す図である。点は所定のＩｇＧ濃度（％）での特異的細胞溶解の平均（ｎ＝４）（％）を示す。バーは±ＳＤを示す。野生型ＩｇＧ（白四角）、クローンＨ１由来の非フコシル化ＩｇＧ（黒丸）、クローンＨ２由来の非フコシル化ＩｇＧ（下向きの黒三角）及びクローンＨ３由来の非フコシル化ＩｇＧ（上向きの黒三角）。比較データをＳＫ−ＢＲ−３細胞を標的細胞として使用して得た（データは示さず）。
【図９】（Ａ）非改変ＣＨＯ細胞及び（Ｃ）ＲＭＤ−ＣＨＯクローンＨ２の細胞質画分から加水分解した単糖のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤプロファイルを示す図である。（Ｂ）は１０ｐｍｏｌ／μｌのＬ−ラムノースを加えた（Ａ）であり、（Ｄ）は１０ｐｍｏｌ／μｌのＬ−ラムノースを加えた（Ｃ）である。単糖はＴＦＡ加水分解後に再Ｎ−アセチル化されなかったので、ＧｌｃＮＡｃはＧｌｃＮＨ２として測定した。選択された条件下で、Ｌ−ラムノースのピークはおよそ１５．５分の保持時間で溶出する。改変クローンＨ２由来の細胞溶解物のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤクロマトグラムではフコースのピークが存在しないことに留意されたい。
【図１０】（Ａ）ＷＴ  ＣＨＯ細胞及び（Ｃ）改変ＲＭＤ−ＣＨＯクローンＨ２由来のＩｇＧ  Ｎ−グリカンから放出された単糖のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤプロファイルを示す図である。（Ｂ）は１０ｐｍｏｌ／μｌのＬ−ラムノースを加えた（Ａ）であり、（Ｄ）は１０ｐｍｏｌ／μｌのＬ−ラムノースを加えた（Ｃ）である。単糖はＴＦＡ加水分解後に再Ｎ−アセチル化されなかったので、ＧｌｃＮＡｃはＧｌｃＮＨ２として測定した。選択された条件下で、Ｌ−ラムノースのピークはおよそ１５．５分の保持時間で溶出する。ＲＭＤ−ＣＨＯクローンＨ２由来のＩｇＧ  Ｎ−グリカン試料のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤクロマトグラムではフコースのピークが存在しないことに留意されたい。  なお、図面中の訳の意味は以下である；図１DE NOVO PATHWAY  ｄｅ  ｎｏｖｏ経路Putative feedback inhibition  推定フィードバック阻害GDP-Mannose  ＧＤＰ−マンノースGDP-Mannose-4,6-Dehydratase  ＧＤＰ−マンノース−４，６−デヒドラターゼGDP-4-keto-6-deoxymannose  ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース3,5-Epimerase  ３，５−エピメラーゼGDP-4-keto-6-deoxygalactose  ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシガラクトース4-Reductase  ４−レダクターゼGDP-Fucose  ＧＤＰ−フコースGDP-D-Rhamnose  ＧＤＰ−Ｄ−ラムノースDead end  終末Major Pathway  主要経路Independent of Fucose source  フコース供給源には非依存的Blocked by deflection of metabolic precursor  代謝前駆体の偏向により遮断されるSALVAGE PATHWAY  サルベージ経路Lysosome  リソソームExtracellular Space  細胞外空間L-Fucose  Ｌ−フコースFucose-Kinase  フコースキナーゼFucose-1-Phosphate  フコース−１−ホスフェートGDP-Fucose Pyrophosphorylase  ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼMinor Pathway  副次的な経路dependent of Fucose source  フコース供給源に依存的Blocked by avoidance of external fucose source  外部フコース供給源の回避により遮断される図５Intensity  強度図６Absorption  吸光度Concentration  濃度X-fold increase over WT  ＷＴに対するＸ倍増大図７Gate  ゲートspontaneous lysis  自発的溶解NK-mediated lysis  ＮＫ媒介性の溶解Total lysis  総溶解Control  対照図８specific cell lysis  特異的細胞溶解conc  濃度図９PAD response  ＰＡＤ応答Deoxyribose  デオキシリボースtime[min]  時間（分）図１０PAD response  ＰＡＤ応答Deoxyribose  デオキシリボースtime[min]  時間（分）
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１８３】
１．実験部
１．１  材料及び方法
１．１．１  細胞株
組換えＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株ＣＨＯ−ＩｇＧは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損ＣＨＯ細胞株、ＣＨＯ／ＤＧ４４（Urlaubet al., 1986, Proc Natl Acad Sci USA. 83 (2): 337-341）の、治療用モノクローナル抗体（トラスツズマブ（ハーセプチン（商標））の軽鎖及び重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む抗体発現カセットを含有する発現ベクターを用いる安定したトランスフェクションにより本発明者らの研究所で以前に樹立された。細胞株ＲＭＤ−ＣＨＯ−ＩｇＧの生成は既存のＣＨＯ−ＩｇＧ細胞株から始めた。両方の細胞株が血清無含有培地で維持された。
【０１８４】
１．１．２  遺伝子最適化及び合成
オキシドレダクターゼＲｍｄに関するアミノ酸配列（緑膿菌ＰＡＯ１；３０４個のアミノ酸）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＧ０８８３９．１）を逆翻訳し、得られたヌクレオチド配列を、ＣＨＯ細胞（クリセツラス・グリセウス）の要件に適合するように、潜在スプライス部位及びＲＮＡ不安定化配列要素のノックアウト、ＲＮＡ安定性の増大に関する最適化、並びにコドン使用頻度の適応により最適化した。
【０１８５】
１．１．３  ＲＭＤ発現プラスミドの構築
合成したＲＭＤ構築物をＥｃｏＲＩ及びＢｇｌ  ＩＩにより切断し、ウシ腸ホスファターゼにより脱リン酸化した（dephosphorylated）。消化及び脱リン酸化した挿入物を事前に消化させた２シストロン性の発現ベクターへとライゲートし、それにより２シストロン性のメッセージからのＲＭＤと緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）との協調した同時発現が可能になる。発現プラスミドは２シストロン性の発現カセットを安定して組み込んだ細胞の直接選択を可能にするネオマイシン耐性遺伝子を備える。発現プラスミドを構築するための一般的手順は、Sambrook, J., E.F. Fritsch and T. Maniatis: Cloning I/II/III, ALaboratory Manual New York/Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, SecondEditionに記載されている。
【０１８６】
１．１．４  抗体産生ＣＨＯ−ＩｇＧ細胞の非フコシル化抗体を分泌する細胞への変換
ＩｇＧ１型の治療抗体トラスツズマブを安定して発現するＣＨＯ−ＩｇＧ細胞を、製造業者の取扱説明書（MicroPorator,PEQLAB Biotech, Germany）に従ってエレクトロポレーションによりＲＭＤ−ｇｆｐ導入遺伝子を用いて安定にトランスフェクトした。エレクトロポレーションの２４時間後、トランスフェクタントを、抗生物質Ｇ４１８を含有するα−ＭＥＭにおいて選択した。それからＧ４１８耐性クローンを限界希釈クローニングにより単離した。すなわちＧ４１８耐性クローンを、この選択培地中で再懸濁し、ポアソン統計に基づき単一の細胞からコロニーが得られる尤度が９５％を超える希釈率で９６ウェルプレートに播種した。確実に単クローン性にするために、９６ウェル内で成長させた細胞を単離し、限界希釈率で９６ウェルプレートに再び播種した。これらの２回の単一細胞のクローニング後、幾つかの単離された単一細胞のクローンをより大きい容量へと増殖させた。その後、それらを懸濁状態での成長に適合させた。培養皿におけるｇｆｐ蛍光分布から評価されるように、記載のエレクトロポレーションプロトコルを用いて、２×１０６個のエレクトロポレーションを行った細胞あたりおよそ２０００個という形質転換効率が達成された（図２）。
【０１８７】
１．１．５  蛍光顕微鏡検査によるクローンのスクリーニング
単一細胞のクローンを９６ウェルプレートに播種し、ｃｍｏｕｎｔアダプタを取り付けたＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ−５０（OlympusOptical Co., Europe）を用いたＧＦＰ蛍光のモニタリングにより、ＲＭＤ組込みの成功に関してスクリーニングした。ＧＦＰスキャンに関して、２００倍の倍率（extension）で蛍光フィルタを位相差に対して使用した。画像をＶｉｅｗｆｉｎｄｅｒ  ｌｉｔｅの適用により編集した。さらに、ＲＭＤ導入遺伝子のｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲ分析により確認した。ＲＭＤ導入遺伝子の発現の成功を、ＲＭＤ特異的なプライマーセットを使用したＲＴ−ＰＣＲにより確認した（図３）。
【０１８８】
１．１．６  振盪管中の血清無含有バッチ培養による非修飾の糖鎖改変した（glycoengineered）ＩｇＧ１の産生
ＲＭＤについて改変したＣＨＯ産生クローンにより産生される抗体（ＲＭＤ−ＣＨＯ−ＩｇＧ）の糖構造を、非改変ＣＨＯ抗体産生細胞から分泌されるＩｇＧ１型抗体（ＣＨＯ−ＩｇＧ）の糖構造と比較するために、両方の細胞株を使用して、培養上清においてＩｇＧ１抗体を産生した。ＲＭＤ−ＣＨＯ−ＩｇＧ抗体産生クローン及びＣＨＯ−ＩｇＧ抗体産生クローンをフコース欠損成長培地において１ｍｌあたり２×１０５個の細胞で接種した。振盪管を１８０ｒｐｍ、３７℃、７．５％  ｐＣＯ２下でインキュベートした。細胞が依然として８０％を超える生存率（vitality）を示していた場合には７日後に培養を停止させた。生存細胞密度を、トリパンブルー除去法を使用して自動細胞計数器Ｖｉ−ＣＥＬＬ（商標）ＸＲ（Beckman Coulter, Fullerton, CA）により測定した。流加バッチアッセイの期間中の生存率の低下パターン及び流加バッチ振盪器アッセイの３日〜１０日の比生産性（specific productivity）（ｑｐ）の平均は２つの異なるクローン間で同程度に維持された。それから細胞を１０分間、５０００ｒｐｍの遠心分離によりペレット状にし、上清を別々のバイアルに移した。ＲＭＤ−ＣＨＯ  ＩｇＧ細胞及び非改変ＣＨＯＩｇＧ細胞を同様に培養した。培養上清中の抗体濃度をヒトＩｇＧ１に特異的なサンドイッチイムノアッセイによりＧｙｒｏｌａｂ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Gyros AB, Sweden）で測定した。両方のクローンが対数的に成長し、それぞれのサンプリングデータで同程度のＩｇＧ力価が得られ、同程度の初期倍増時間を有していた。両方のクローンがチャイニーズハムスター卵巣細胞に特有の形態を保持していた。
【０１８９】
１．１．７  プロテインＡアフィニティクロマトグラフィによるＩｇＧ１の精製
０．２μｍのフィルタによる滅菌ろ過後に、上清をプロテインＡ−セファロースミニカラムに充填した。総容量が１０ｍｇのカラム支持材料０．５ｍｌを使用した。カラムは重力流で５カラム体積の２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で平衡化した。緩やかな流速でのタンパク質結合の後、カラムを平衡化バッファーで２回洗浄した。それから抗体を重力流で４カラム体積の０．１Ｍのグリシンバッファー（ｐＨ３．０）によって溶出した。画分１ｍｌを回収し、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）によってすぐに中和した。それぞれの精製ＩｇＧ１の完全性及び純度を還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により確認した。溶出した抗体の純度は９０％を超え、溶出した抗体の組込みは、還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により確認した。
【０１９０】
１．１．８  抗体由来のＮ連結型オリゴ糖の調製
各抗体１００μｇをＮ連結型オリゴ糖の質量分析による特性化に使用した。タンパク質をトリプシンで消化した（０：２ｍｇ／ｍｌ、３７℃、１６時間）後、Ｎ−グリカンを３７℃で１８時間の１単位のペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ、Roche Diagnostics）とのインキュベーションにより放出させた。放出されたＮ−グリカンを、ＲＰ−（Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８−）カラム、その後のｃａｒｂｏｇｒａｐｈ抽出除去カラム上での二段階クロマトグラフィにより回収した（Wuhrer et al., 2006, Glycobiology 16 (2006), pp. 991-1006）。Ciucanu and Kerekにより記載されたように（Ciucanu andKerek, 1984, Carbohydr Res. 1984: 131 :209）、各Ｎ−グリカンプールの５０％が３７℃で１８時間の１０ｍＵのノイラミニダーゼにより消化され、５０％がヨウ化メチルにより過メチル化した。
【０１９１】
１．１．９  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによるＮ連結型オリゴ糖の分析
それぞれの精製したＩｇＧ１から放出されるＮ−グリカンをｓｍａｒｔｂｅａｍ−ＩＩ（商標）レーザを備えたＵｌｔｒａＦｌｅｘ  ＩＩＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計（Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany）により分析した。測定を陽イオンモードで行った。陽イオンを２５ｋＶの加速電圧及び１０ｎｓの遅延引き出し（extraction delay）に供し、リフレクトロンモードで分析した。分析のために、脱シアル化グリカンをＨ２Ｏに溶解し、過メチル化グリカンを７０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルに溶解した。試料０．５μｌを標的上で８０％  ＥｔＯＨに溶解したアラビノサゾン（Arabinosazone）（２ｍｇ／ｍｌ）と１：１（ｖ／ｖ）で混合し、室温で乾燥させた。デキストランラダーによる外部較正を使用した。スペクトルをＧｌｙｃｏ−ｐｅａｋｆｉｎｄｅｒ（Maas et al., 2007, Proteomics 7, 4435-4444）を用いて分析した。同定したグリカン構造はＧｌｙｃｏ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈソフトウェア（Ceroni et al., 2008, J. Proteome Res. 7(4) 1650-1659）を用いて構築した。最終培養培地から精製された生成物のオリゴ糖プロファイル分析により、生成物のＮ連結型Ｆｃオリゴ糖が高マンノース型及び二分岐複合型のものであること、並びにＲＭＤ−ＣＨＯ−ＩｇＧクローンから分泌されたＩｇＧ１生成物がコアのフコシル化を完全に欠いていることが確認された。糖構造の分析により、親ＣＨＯ−ＩｇＧクローンのものと比較して、ＲＭＤを同時発現するクローンにより産生される抗体の非フコシル化オリゴ糖の割合がそれぞれの場合で、顕著に増大すること（すなわち最大９９％、９５％、９７％及び９８％）が示された（図４）。ＭＡＬＤＩ−Ｐｅａｋ相対強度に基づくと、ＲＭＤ−ＣＨＯ−ＩｇＧ細胞で発現されるＩｇＧ１抗体産物から得られたＮ−糖構造には、結合したフコース残基がほぼ完全になく、相対的により大量の高マンノース構造を含有する（図４、パネルＡ；主要な高マンノース構造を丸で囲った）が、非改変ＣＨＯ−ＩｇＧ細胞で発現した治療用ＩｇＧ１抗体から得られたＮ糖構造はコア−フコシル化されており、高マンノース構造の含有量は顕著に少ない（フコース残基＝丸で囲った三角；図４、パネルＢ）。
【０１９２】
２．実験部
２．２  材料及び方法
２．２．１  細胞株、遺伝子最適化及び合成、ＲＭＤ発現プラスミドの構築、抗体産生ＣＨＯ−ＩｇＧ細胞の非フコシル化抗体を分泌する細胞への変換、蛍光顕微鏡検査及びＲＴ−ＰＣＲによるクローンのスクリーニング
ＲＭＤ−ＣＨＯ−ＩｇＧ細胞株を産生するために使用されるＣＨＯ−ＩｇＧ細胞株、ＲＭＤの遺伝子最適化及び合成、ＲＭＤ発現プラスミドの構築、抗体産生ＣＨＯ−ＩｇＧ細胞の非フコシル化抗体を分泌する細胞への変換、ＲＭＤ組込みの成功に関する蛍光顕微鏡検査及びＲＭＤ導入遺伝子のｍＲＮＡ発現の成功に関するＲＴ−ＰＣＲによるクローンのスクリーニングに関しては、上述の１．１．１項〜１．１．５項を参照する（１．実験部）。
【０１９３】
２．２．２  流加バッチ培養
Ｎ−グリカン構造を比較するためにＣＨＯ細胞及びＲＭＤ−ＣＨＯ細胞（クローンＨ１、Ｈ２及びＨ３）の両方を用いてＩｇＧを産生した。４ｍＭのグルタミンを加えたが、抗生物質又はＭＴＸを有しない血清無含有培地（ProBioGenのカスタム製剤；SAFC Bioscience, Lenexa, KA）１００ｍｌの入った５００ｍｌ容の振盪フラスコに細胞を１ｍｌあたり４×１０５個の細胞で播種した。培養物を１８０ｒｐｍ、３７℃及び７．５％  ＣＯ２下でかき混ぜた。培養４日目に細胞に１００ｍｌの培養量あたり１．７５ｍｌのＰＢＧ−Ｆｅｅｄ  Ｍｉｘを与えた。細胞密度及び細胞生存率を自動ＶｉＣｅｌｌ細胞定量システム（Beckman Coulter, Brea, CA）を使用してトリパンブルー除去法により決定した。ＩｇＧ濃度を決定するために、一定量の細胞培養上清を３日目、５日目及び７日目に回収し、これらをＧｙｒｏｌａｂサンドイッチイムノアッセイにより測定した。細胞が依然として８０％を超える生存率を示していた場合には７日後に培養を停止させた。細胞培養上清を回収し、滅菌ろ過した。
【０１９４】
２．２．３  ＩｇＧ１特異的なＧｙｒｏｌａｂサンドイッチイムノアッセイ
ＩｇＧ１濃度をＧｙｒｏｌａｂ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Gyros AB, Uppsala, Sweden）で行われるサンドイッチイムノアッセイにより決定した。このアッセイには、ビオチン化捕捉抗体（ＩｇＧのＦｃ部分上のエピトープを認識する）、細胞培養上清試料又はポリクローナルヒトＩｇＧ参照基準、及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７標識化検出抗体（ＩｇＧのＦａｂドメインにおいてエピトープに結合する）の連続添加が含まれた。試料及び基準を三連で測定した。平均ＯＤ、標準偏差（ＳＤ）及び変動係数％（％ＣＶ）を、それぞれの測定の後に、Ｇｙｒｏｌａｂ  ｅｖａｌｕａｔｏｒソフトウェアにより自動算出した。記載のＩｇＧ１  Ｇｙｒｏｌａｂサンドイッチイムノアッセイは、それぞれの較正基準に対する余り（residuals）が２０％の相対誤差（ＲＥ）の許容限界を満たすという前提に基づき事前に正当性が認められた。
【０１９５】
２．２．４．  プロテインＡアフィニティクロマトグラフィを用いたＩｇＧ精製
細胞培養上清を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で予め平衡化した０．５ｍｌのプロテインＡ−セファロースカラムに充填した。２ベッド体積の平衡化バッファーでカラムを洗浄した後、抗体を４カラム体積の０．１Ｍのグリシン（ｐＨ３．０）で溶出した。画分を回収し、すぐに１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）で中和した。それぞれの精製ＩｇＧ１の完全性及び純度を還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により確認した。精製ＩｇＧのタンパク質濃度をＧｙｒｏｌａｂサンドイッチイムノアッセイにより決定した。
【０１９６】
２．２．５  ＩｇＧのＮ−グリカンのプロセシング
ＩｇＧ（１００μｇ）をトリプシンにより３７℃で１６時間消化した。９５℃で５分間試料を加熱することにより反応を終結させた。抗体を１ＵのＰＮＧａｓｅ  Ｆにより３７℃で１８時間更に消化した。放出されるＮ−グリカンを、逆相Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８カートリッジ、その後のｃａｒｂｏｇｒａｐｈ抽出除去カラム上で単離するとともに、脱塩処理した。それぞれのＮ−グリカンプールを、１０ｍＵのノイラミニダーゼにより３７℃で１８時間消化した。
【０１９７】
２．２．６  質量分析法
Ｎ−グリカンをｓｍａｒｔｂｅａｍ−ＩＩ（商標）レーザ及びＬＩＦＴ−ＭＳ／ＭＳ設備を備えたＵｌｔｒａＦｌｅｘ  ＩＩＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計（Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany）により分析した。スペクトルを２５ｋＶの加速電圧及び１０ｎｓの遅延引き出しでリフレクターモードで記録した。測定を陽イオンモードで行った。デキストランラダーを使用して外部較正を行った。脱シアル化Ｎ−グリカンをＨ２Ｏに溶解した。試料０．５μｌをスチール標的上で７０％エタノール水溶液に溶解したＤ−アラビノサゾン（５ｍｇ／ｍｌ）と１：１（ｖ／ｖ）で混合した（Chen et al. 1997）。スペクトルをＧｌｙｃｏ−Ｐｅａｋｆｉｎｄｅｒを用いて分析した（Maas et al., 2007）。同定したグリカン構造はＧｌｙｃｏ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈソフトウェアを用いて構築した（Ceroni et al., 2008）。
【０１９８】
２．２．７  Ｆｃ−γ受容体ＩＩＩＡ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）特異的な結合アッセイ
ＩｇＧ試料のＦｃγＲＩＩＩＡ結合活性を、少し変更を加えたNiwaet al., 2004に記載のようなＦｃγＲＩＩＩＡ特異的な結合アッセイにより分析した。ヒスチジン（ＨＩＳ）タグを付したＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８）（２２ｋＤａ；１５８Ｆ；R&D Systems,Minneapolis, MN)を、受容体結合のために抗テトラＨＩＳモノクローナル抗体（Qiagen,Hilden, Germany）とともに使用した。イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Thermo,Waltham, MA）に抗テトラＨＩＳ抗体をコーティングし、ブロッキング試薬（RocheDiagnostics, Penzberg, Germany）を用いてブロッキングした。その後、組換えＨＩＳタグ付きＦｃγＲＩＩＩＡをイムノプレートに加えた。それからコーティングしたプレートを段階的な試料希釈液及び対照とともにインキュベートし、それにより固定化ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体に結合させることができる。洗浄工程後、結合したＩｇＧを抗ヒトＩｇＧペルオキシダーゼ結合ｍＡｂ（Dianova, Hamburg, Germany）により検出し、結合したＩｇＧの量をペルオキシダーゼ活性により定量化した。各インキュベーション工程の後、イムノプレートを０．２％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで３回洗浄した。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ；Seramun, Heidesee, Germany）を発色基質として使用し、反応を１Ｍの硫酸を用いて終結させ、最後に吸光度を４５０ｎｍで検出した（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ２００リーダー、Tecan, Crailsheim, Germany）。濃度依存的な吸光度データに基づき、十分な曲線の適合を、４パラメータロジスティック曲線モデル（Ｍａｇｅｌｌａｎソフトウェア６．１、Tecan）を用いて行った。このＦｃγＲＩＩＩＡ結合アッセイに関する系列内（intra-serial）正確性を、１５％  ＣＶ以内であると決定した。
【０１９９】
２．２．８  抗体依存的な細胞毒性（ＡＤＣＣ）アッセイ
初代ヒトＮＫ細胞を末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離した。ＰＢＭＣを、密度勾配遠心分離により健常なヒトドナーの全血から分離し、続いてＮＫ細胞を負電磁ビーズ分離により単離した（Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany）。単離したＮＫ細胞の純度を、フローサイトメトリ（ＰＥ結合ＣＤ１６抗体及びＡｌｅｘａ４８８結合ＣＤ５６抗体、BD, San Jose, CA）により確認した。細胞株ＢＴ−４７４（Lasfargueset al., 1978、ヒトの乳房の浸潤性腺管癌、ＣＬＳ、Eppelheim, Germany）及びＳＫ−ＢＲ−３（Zabrecky et al., 1991、ヒトの乳房の腺癌、ＡＴＣＣ、Manassas,VA）を標的細胞として使用した。両方の細胞株がフローサイトメトリによりＨｅｒ２／ｎｅｕマーカーに対して陽性であることが確認された（データは示さず）。標的細胞株は接種の３日前にｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｅｌｌ  ｂａｎｋで再活性化させた。抗体依存的なＮＫ細胞により誘導された標的細胞の溶解を、生体染色の放出により定量化した（Calcein AM, Life Technologies, Carlsbad, CA）。標的細胞を製造業者のプロトコルに従い染色し、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、５０μＬ  ＲＰＭＩ  １６４０（Life Technologies）＋１０％  ＦＣＳ（Biochrom, Berlin, Germany）中、１つのウェルあたり２×１０４個の生存細胞で播種した。ＲＰＭＩ  １６４０＋１０％  ＦＣＳ中で抗体の１：３段階希釈液を調製した。５０μＬ／ウェルのそれぞれの希釈液をｎ＝３でピペッティングし、ＮＫ細胞接種前に、３７℃で３０分間、標的細胞とともにプレインキュベートした。抗体のプレインキュベーションの終了時に、エフェクター細胞を５：１のエフェクター細胞対標的細胞の比（Ｅ：Ｔ）で播種した。続いてプレートを２００ｇで３分間遠心分離し、３７℃で４時間、５％  ＣＯ２下でインキュベートした。それぞれの細胞株に対して、自発的標的細胞溶解対照（ＮＫ細胞なし）、抗体非依存的な標的細胞溶解対照（ＮＫ細胞あり）及び総標的細胞溶解対照（サポニンにより誘導される）が誘導された。対照ウェルにおいて総溶解は、インキュベーション期間の終了の１５分前にＲＰＭＩ  １６４０＋１０％  ＦＣＳ中、１つのウェルあたり１５μＬの０．１ｍｇ／ｍＬのサポニンを添加することにより誘導された。全ての他のウェルでは、１５μＬのＲＰＭＩ  １６４０＋１０％  ＦＣＳを加えた。カルセインＡＭの放出を培養上清における蛍光検出により定量化した。プレートを遠心分離し（１５０ｇ、３分）、各ウェルから上清１００μＬを９６ウェルの黒色の蛍光プレート（Thermo）に移した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＩｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ２００リーダー（Tecan、４８５ｎｍ／５３５ｎｍ  励起／発光フィルタ）を用いて検出した。曲線の適合を、４パラメータロジスティック容量応答モデル（Ｍａｇｅｌｌａｎソフトウェアバージョン６．１）を用いて行った。特異的細胞溶解を以下のように算出した：特異的細胞溶解［％］＝［ＭＦＩ（試料）−ＭＦＩ（自発的）］／［ＭＦＩ（総）−ＭＦＩ（自発的）］×１００。ＭＦＩ（試料）が特異的標的細胞溶解により放出される平均蛍光強度であり、ＭＦＩ（自発的）が標的細胞による蛍光色素の段階的な放出であり、ＭＦＩ（総）が洗浄剤により誘導される総標的細胞溶解後に得られた平均蛍光強度である。
【０２００】
２．２．９  単糖分析及びラムノース測定
細胞（３×１０７個）を上清から１００ｇで５分間の遠心分離により分離した。続いて細胞を３回の凍結融解サイクルにより溶解させた。それから細胞膜を細胞質画分から４℃で３０分間、２１０００ｇで分離した。細胞培養上清、細胞膜、細胞質画分及びＩｇＧ  Ｎ−グリカンを１００℃で４時間、２ＮのＴＦＡにおいて加水分解した。還元雰囲気下での蒸発の後に、試料をDionexのＩＣＳ−３０００を用いてＰＡ−１カラム上でＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより分析し、２−デオキシリボースを内部標準として使用した。中性の単糖を２．２５ｍＭのＮａＯＨを用いた定組成溶出により分離した。２００ｍＭのＮａＯＨのポストカラム添加により、アンペロメトリ検出が可能になった。ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤでは、エナンチオマー同一性を評価することができない（Horton, D. 2004）ため、Ｌ−ラムノースを標準として用いて、Ｄ−ラムノースで予測される保持時間を求めた。ラムノースに関するＬＯＤを、分析手順のバリデーションのためのＩＣＨの三極共通ガイドライン（harmonized tripartite guideline）（ＩＣＨＱ２（Ｒ１））の第６．３章に記載のように求めた。
【０２０１】
２．３  結果
２．３．１  ＲＭＤ導入遺伝子の異種発現
分泌されたＩｇＧのフコシル化レベルに対するＲＭＤ導入遺伝子発現の効果を評価するために、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）及び緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）に関する遺伝子を含む２シストロン性の発現カセットを備えたベクターを生成し、バイオシミラー（biosimilar：後発生物製剤）バージョンのＩｇＧ１型治療抗体トラスツズマブ（ハーセプチン（商標）、Roche）の過剰発現及び分泌のために事前に改変されたＣＨＯ／ＤＧ４４クローンに導入した。導入遺伝子を発現するＧ４１８耐性クローンをそのｇｆｐ媒介性の緑色蛍光により同定し、トランスフェクションの２週間以内に現れた。ｇｆｐ蛍光分布から評価されるように、エレクトロポレーションによりおよそ８０％の形質転換効率が達成された（データは示していないが、図２に示されるデータと同じようなものである）。ＲＭＤ導入遺伝子の発現の成功を、ＲＭＤ特異的なプライマーセットを使用したＲＴ−ＰＣＲにより確認した（データは示していないが、図３に示されるデータと同じようなものである）。ＲＭＤ導入遺伝子を発現する改変ＣＨＯ細胞はＲＭＤ−ＣＨＯと呼ばれる。
【０２０２】
２．３．２  ＣＨＯ抗体産生細胞及びＲＭＤ−ＣＨＯ抗体産生細胞の血清無含有流加バッチ培養
非改変の親ＣＨＯ細胞及びＩｇＧを産生するトランスフェクトしたＲＭＤ−ＣＨＯ細胞の血清無含有流加バッチ培養を、Ｌ−グルタミンを加えたフコース欠損成長培地の入った５０ｍｌ容のバイオリアクター管において行った。バイオリアクター管を１ｍｌあたり４×１０５個の細胞の出発細胞密度で接種し、その後１８０ｒｐｍ、３７℃、７．５％  ｐＣＯ２下でインキュベートした。流加バッチ培養の性能を１４日間モニタリングし、並べて比較した。ＣＨＯ細胞及びＲＭＤ−ＣＨＯ細胞の並行した流加バッチ培養の比較分析では、１４日間で顕著な偏差は示されなかった。それぞれのサンプリング日での初期倍増速度、増殖速度及びＩｇＧ力価は両方の細胞株で一致していた。両方のクローンはＣＨＯ細胞に特有の形態を保持していた。流加バッチアッセイの期間中の生存率の低下パターン及び流加バッチ振盪器アッセイの３日〜１０日の比生産性（ｑｐ）の平均は２つの異なるクローン間で同程度に維持された（データは示さず）。
【０２０３】
２．３．３  ＣＨＯ細胞及びＲＭＤ−ＣＨＯ細胞から産生されたＩｇＧのＮ−グリカン分析
ＣＨＯ細胞及びＲＭＤ−ＣＨＯ細胞をバッチ培養で成長させた。ＩｇＧを産生する３つの異なるＲＭＤ−ＣＨＯクローン、すなわちＨ１、Ｈ２及びＨ３を使用した。細胞を１ｍＬあたり４×１０５個の細胞の出発細胞密度で接種し、１８０ｒｐｍ、３７℃、７．５％  ｐＣＯ２下でバイオリアクター管において７日間成長させた。上清を７日目に収集し、ＩｇＧ試料をプロテインＡアフィニティクロマトグラフィにより精製した。溶出した抗体の純度及び完全性を還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。ＰＮＧａｓｅ  Ｆを用いて放出させたＮ−グリカンを脱シアル化し、続いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより分析した。Ｎ−グリカンのシグナル強度の相対的定量化を、クロマトグラフ方法と比較してより信頼性のある結果を得られることが以前に実証されたように行った（Wada et al., 2007）。高マンノース型及び複合型の二分岐（diantennary）Ｎ−グリカン構造を全ての試料で検出した（図５）。モノフコシル化された非ガラクトシル化／モノガラクトシル化／ジガラクトシル化二分岐Ｎ−グリカンは、野生型（ＷＴ）ＩｇＧで見られる３つの最も豊富なＮ−グリカン構造であった（図５Ａ）。これらのピーク、すなわちｍ／ｚ１４８５．４、１６４７．４及び１８０９．４でのコア−フコースの存在が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦにより確認された。診断用の断片イオンｄＨｅｘ１ＨｅｘＮＡｃ２は、いずれのスペクトルにおいてもｍ／ｚ５９２．８で観察された。ＲＭＤ−ＣＨＯ細胞から産生されたＩｇＧ試料において、最大でＮ−グリカンプール全体の２％を表す（試料Ｈ２）、ごく微量のフコースが観察された（図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ）。同時に、試料Ｈ２はＷＴ  ＩｇＧよりも大量の高マンノース構造を含有していた。
【０２０４】
２．３．４  ＣＨＯ細胞及びＲＭＤ−ＣＨＯ細胞から産生されたＩｇＧのＩｇＧ１−Ｆｃ結合活性
ＩｇＧ１とそのコグネートＦｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａとの間の比較的弱い相互作用（Ｋｄ  約１μＭ）がＡＤＣＣエフェクター機能に寄与する主な因子の１つであるため（Sondermannet al., 2000）、ＦｃγＲＩＩＩａ結合アッセイはＩｇＧ１モノクローナル抗体試料のＡＤＣＣ活性を予測する間接的な評価基準である。ＲＭＤ−ＣＨＯ細胞から分泌される非フコシル化ＩｇＧのＦｃγＲＩＩＩａ結合は、野生型ＣＨＯ細胞から分泌されるフコシル化ＩｇＧと比較して大きく増大しており、約１６倍少ないタンパク質でＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆと同等に結合する（図６Ａ、図６Ｂ）。データは、参照としてフコシル化ＩｇＧを用いた、非フコシル化ＩｇＧの結合の相対的な増加倍率として図６Ｂに報告される。
【０２０５】
２．３．５  ＲＭＤ−ＣＨＯ細胞を用いて産生された非フコシル化ＩｇＧのＡＤＣＣ活性
ＡＤＣＣ活性を分析するために、単離したＮＫ細胞及びＨＥＲ２を発現する標的細胞を、非フコシル化ＩｇＧ及びフコシル化ＩｇＧの段階希釈液とともに同時インキュベートした。アッセイの必要条件として、ＮＫ細胞を７３％の純度レベルで全血試料から単離した（図７）。技術的な（technical）ＮＫ細胞の細胞毒性対照は、ＡＤＣＣアッセイに使用されるドナー材料に対して７７％の特異的溶解活性を示した（図７）。ＨＥＲ２を発現する標的細胞株ＢＴ−４７４（ヒトの乳房の浸潤性腺管癌から単離した）をＡＤＣＣアッセイに使用した。ＢＴ−４７４標的細胞株は、ＡＤＣＣ以外の機構によってもＮＫ細胞により攻撃を受ける。ＢＴ−４７４細胞は平均値１６％の抗体非依存的な細胞溶解を示す（データは示さず）。ＩｇＧ試料により誘導される特異的細胞溶解に関するデータを図８に示す。３つ全ての非フコシル化ＩｇＧ試料（Ｈ１〜Ｈ３）はＷＴ抗体と比較してＡＤＣＣ応答の増大を誘導した（図８）。非フコシル化ＩｇＧ試料Ｈ２は最大のＡＤＣＣ応答を誘導した（図８）。ＳＫ−ＢＲ−３細胞（乳房のＨＥＲ２陽性腺癌）を該アッセイにおいて標的細胞として使用した場合に、同様の結果が得られた。ＢＴ−４７４細胞及びＳＫ−ＢＲ−３細胞とともにインキュベートした非フコシル化ＩｇＧ試料及びフコシル化ＩｇＧ試料に関して算出されたＥＣ５０値を表２に要約する（下記を参照されたい）。野生型ＩｇＧと変異体Ｈ１〜Ｈ３との間で観察されるＥＣ５０シフトは、ＡＤＣＣアッセイで使用される標的細胞株に関係なく同程度のままであった（図８）。ＨＥＲ２陽性のＢＴ４７４標的細胞株及びＳＫ−ＢＲ−３標的細胞株、並びに精製ＮＫ細胞の存在下で、非フコシル化ＩｇＧは０．４４３μｇ／ｍｌ及び０．００８１７μｇ／ｍｌの平均ＥＣ５０値で平均１６倍の抗体媒介性の標的細胞枯渇活性を示し、このことはフコシル化ＩｇＧと比較してはるかに高い有効性を示していた。ＦｃγＲＩＩＩａ結合活性の増大を示した非フコシル化ＩｇＧ試料が、ＷＴ  ＩｇＧと比較してより高いＡＤＣＣ応答も誘導したことに留意されたい。
【０２０６】
表２：異なる抗原提示標的細胞（ＢＴ−４７４、ＳＫ−ＢＲ−３）とともにインキュベートした非フコシル化（Ｈ１〜Ｈ３）ＩｇＧ及びフコシル化（ＷＴ）ＩｇＧのＡＤＣＣエフェクター機能の結果の要約。算出されたＥＣ５０（フコシル化）／ＥＣ５０（非フコシル化）比はＡＤＣＣエフェクター機能の向上を示す。
【表２】
2013505028.tif 000004
試料名
比
【０２０７】
２．３．６  単糖分析−細胞溶解物における及びＩｇＧ  Ｎ−グリカンにおける検出可能な量のＤ−ラムノースの非存在
細胞膜、培養上清及び細胞質画分をＲＭＤ−ＣＨＯ細胞から単離した。続いて単糖を放出させ、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより分析した。予想通り、フコースはＣＨＯ細胞に存在し、ＲＭＤ−ＣＨＯ細胞には存在しなかった。検出限界（ＬＯＤ）を超えるレベルのラムノースは細胞質画分では観察されなかった（図９）。較正曲線のｙ切片及び傾きの標準偏差に基づくと、ＬＯＤは１０μｌの試料注入容量あたりラムノース及びフコースに対してそれぞれ１．２ｐｍｏｌ及び１．１ｐｍｏｌであった。同様に、ＲＭＤ−ＣＨＯ細胞を用いて産生される精製抗体から放出されたＮ−グリカンをＴＦＡによって加水分解し、得られる単糖をＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより分析した。ＴＦＡで加水分解したＮ−グリカンは、ＬＯＤを超えるラムノースピークを全く生じなかった（図１０）。結論として、ＲＭＤ−ＣＨＯ細胞も分泌された抗体も検出可能な量のラムノースを含有してない。
【０２０８】
２．４  備考（Final Remarks）
本発明者らは、細胞質のフコースｄｅ  ｎｏｖｏ合成経路由来の重要な代謝中間体の連続除去のために改変された細胞株からのフコース欠損ｍＡｂの分泌を達成するための糖鎖改変アプローチを評価した（図１）。本発明者らのデータは、異種細菌酵素のトランスジェニック発現が、新生糖タンパク質Ｎ−グリカン上でのフコースの合成の所望の阻止を引き起こすことをはっきりと示している。この方法によるフコース枯渇の程度は、培養培地からのフコースの排除がサルベージ経路（遮断されなければ（otherwise）細胞質のＧＤＰ−フコースの代替供給源として働くことのできる）を完全に遮断するのに十分であったことも示している。
【０２０９】
本発明者らのアプローチにおける重要な代謝標的は、細菌において例えばＧＤＰ−Ｌ−フコース、ＧＤＰ−４−デオキシ−Ｄ−タロース、ＧＤＰ−コリトース及びＧＤＰ−Ｄ−ペロサミンを含む幾つかの異なるＧＤＰ−モノデオキシヘキソースの合成の共通の中間体であるＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノースであった。さらに、ＧＤＰ−フコースシンターゼの活性部位Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒ突然変異体はＧＤＰ−フコースの代わりにＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−アルトロースを生成する（Lau and Tanner, 2008）。
【０２１０】
本発明者が本発明者らのアプローチで例として選択した特定の原核生物酵素は、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースレダクターゼ（ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノースレダクターゼと同義であり、ＲＭＤと略される）であった（Kneidinger et al., 2001; Maeki et al., 2002）。ここで本発明者らは、細胞質内での原核生物酵素ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）の異種発現が効率的にフコースｄｅ  ｎｏｖｏ経路を偏向させることができることを実証した。上記酵素は水素ドナーとしてＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨを利用し、フコース経路の中間体ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノースの４−ケト基の標的化還元を触媒することにより、ＧＤＰ−Ｄ−ラムノースを得る。逆反応が検出されなかったことから（Kneidinger et al., 2001）、ＲＭＤによるＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノースのＧＤＰ−Ｄ−ラムノースへの変換は定量的に進行すると考えられる。
【０２１１】
本発明者らのデータは、或る特定の細菌の複合糖質でのみ見出されるが、動物では見出されない６−デオキシヘキソースであるＧＤＰ−ラムノース（Webb et al., 2004）が脊椎動物の細胞質との関連内において終末生成物であることも示している。非改変脊椎動物細胞はラムノシルトランスフェラーゼを欠いており（Webb et al., 2004）、また膜輸送体を欠いており、このためＧＤＰ−Ｄ−ラムノースの新生グリカンへの組込みが脊椎動物細胞内で起こる可能性は非常に低い。本発明者らのデータにより、これを確認することができた。本発明者らのデータは、人工Ｄ−ラムノースが、細胞内において、分泌されたＩｇＧに又はその他の箇所に組み込まれなかったことをはっきりと示している（図９及び図１０）。
【０２１２】
グルカン構造上でフコースを欠くことに加えて、遺伝子操作されたクローンから分泌されるＩｇＧは、より高いレベルの高マンノース構造を示した。これはＧＤＰ−Ｄ−ラムノースによるＧＭＤのフィードバック阻害により生じ得る。ＧＤＰ−マンノースに関する代替的な代謝シンクとしてのＧＭＤ活性を欠くことは細胞質ＧＤＰ−Ｄ−マンノースのプールの上昇に寄与する可能性があり、これによりＲＭＤ改変宿主細胞から分泌される生成物で観察される高マンノース構造の増加が引き起こされた可能性がある（図４及び図５）。
【０２１３】
ＦｃγＲＩＩＩ結合アッセイ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡＤＣＣアッセイに関する本発明者らの結果は、非フコシル化ＩｇＧがＦｃγＲＩＩＩａに対する顕著に高い結合活性及び向上したＡＤＣＣ応答を有することも示す。観察されたＥＣ５０シフト及び標的細胞枯渇活性の倍増（表２、図８）は、アッセイを全血、血清又は血漿の存在下で行った場合、更に高いであろう。興味深いことに本発明者らは、最大レベルの高マンノース構造を有する非フコシル化ＩｇＧ試料Ｈ２が、アッセイに使用される標的細胞（ＢＴ４７４又はＳＫ−ＢＲ−３）に関係なく最大のＡＤＣＣ活性も示すことを観察した（表２）。
【０２１４】
まとめると、この研究により、脊椎動物宿主細胞におけるＲＭＤの過剰発現が、細胞質ＧＤＰ−フコースの合成のための重要な主要中間体（ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース）の枯渇を引き起こすことが実証される。このアプローチにより、代謝的に改変された細胞株の生成が可能になり、また既存の抗体を発現する細胞クローンをフコース枯渇治療法のための産生細胞に変換する非常に有力な新たな戦略も与える。既に存在する細胞株においてフコースの欠損を確実に改変する能力は、次世代のモノクローナル抗体のための薬物開発を促進させるのに役立ち得る。
【０２１５】
３．略称
ＡＣＮ、アセトニトリル；ＣＨＯ、チャイニーズハムスター卵巣；ＣＶ、変動係数；ｄＨｅｘ、デオキシヘキソース；ＥＣ５０、５０％最大有効濃度（すなわち、基準線応答と最大応答との中間の応答を誘起するアゴニストの濃度）、Ｆｕｃ、フコース；Ｇａｌ、ガラクトース；ＧａｌＮＡｃ、Ｎ−アセチルガラクトサミン；ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ−アセチルグルコサミン；ＧＭＥＲ、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ／４−レダクターゼ；ＨＰＬＣ、高速液体クロマトグラフィ；ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ、パルスアンペロメトリ検出を伴う高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィ；ＬＯＤ、検出限界；ｍＡｂ、モノクローナル抗体；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、マトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析法；ＭＥＭ、変法イーグル培地；ＰＢＭＣ、末梢血単核細胞；ＰＢＳ、リン酸バッファー生理食塩水；ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、ペプチド−Ｎ４−（Ｎ−アセチル−β−グルコサミニル）アスパラギンアミダーゼＦ；Ｒｈａ、ラムノース；ＲＭＤ、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースレダクターゼ；ＳＤＳ、ドデシル硫酸ナトリウム；ＴＦＡ、トリフルオロ酢酸。
【０２１６】
参考文献
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【０２１７】
（寄託情報）
2013505028.tif 000005
2013505028.tif 000006
【図１】
2013505028.tif 000007
【図４】
2013505028.tif 000008
【図５−１】
2013505028.tif 000009
【図５−２】
2013505028.tif 000010
【図６】
2013505028.tif 000011
【図８】
2013505028.tif 000012
【図９】
2013505028.tif 000013
【図１０】
2013505028.tif 000014
【図２】
2013505028.tif 000015
【図３】
2013505028.tif 000016
【図７】
2013505028.tif 000017
【配列表】
2013505028000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年8月17日(2012.8.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自然状態ではその糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有する分子を生成するための脊椎動物細胞であって、
基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用するが、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースをＧＤＰ−Ｌ−フコースに変換する反応を触媒しない酵素を少なくとも１つ含む、自然状態ではその糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有する分子を生成するための脊椎動物細胞。
【請求項２】
基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用する該酵素が、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）、ＧＤＰ−ペロサミンシンテターゼ（Ｐｅｒ）、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−タロースシンテターゼ（ＧＴＳ）、ＧＤＰ−フコースシンテターゼＣｙｓ１０９Ｓｅｒ（ＧＦＳ−Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒ）突然変異体、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース−３−デヒドラターゼ（ＣｏｌＤ）、又はＧＤＰ−Ｌ−コリトースシンターゼ（ＣｏｌＣ）と組み合わせたＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース−３−デヒドラターゼ（ＣｏｌＤ）、及びそれらの変異体からなる群から選択される、請求項１に記載の脊椎動物細胞。
【請求項３】
ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）が緑膿菌由来（配列番号１）である、請求項２に記載の脊椎動物細胞。
【請求項４】
ＧＤＰ−Ｄ−ラムノース、ＧＤＰ−Ｄ−ペロサミン、ＧＤＰ−デオキシ−Ｄ−タロース、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−アルトロース、ＧＤＰ−４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース、及び／又はＧＤＰ−Ｌ−コリトースを更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の脊椎動物細胞。
【請求項５】
前記細胞に一時的に存在する又は安定して維持される核酸から該酵素が発現される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の脊椎動物細胞。
【請求項６】
フコシルトランスフェラーゼに対する基質となることができる少なくとも１つの分子を更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の脊椎動物細胞。
【請求項７】
分子がタンパク質又は脂質である、請求項６に記載の脊椎動物細胞。
【請求項８】
タンパク質が内因性タンパク質又は外因性タンパク質である、請求項７に記載の脊椎動物細胞。
【請求項９】
タンパク質が、抗体、若しくはＩｇＧ１抗体、抗体断片、若しくは抗体のＦｃ領域を含む抗体断片、融合タンパク質、若しくは抗体のＦｃ領域を含む融合タンパク質、ウイルスタンパク質、ウイルスタンパク質断片、抗原、又はホルモンである、請求項７又は８に記載の脊椎動物細胞。
【請求項１０】
哺乳類細胞、魚類細胞、両生類細胞、爬虫類細胞又は鳥類細胞である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の脊椎動物細胞。
【請求項１１】
ｉ）哺乳類細胞がヒト細胞、ハムスター細胞、イヌ細胞若しくはサル細胞、若しくはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、メイディンダービーイヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、ヒトＰＥＲ．Ｃ６細胞、若しくはヒトＡＧＥ１．ＨＮ細胞であり、
ｉｉ）魚類細胞がアメリカナマズ（チャネル・キャットフィッシュ）卵巣（ＣＣＯ）細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２７７２）であり、
ｉｉｉ）両生類細胞がアフリカツメガエル腎臓細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０２）であり、
ｉｖ）爬虫類細胞がグリーンイグアナ心臓細胞（ＩｇＨ−２）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０８）であり、又は
ｖ）鳥類細胞がトリ網膜細胞、若しくはＡＧＥ１．ＣＲ．ＰＩＸ細胞、若しくはトリ体節細胞である、請求項１０に記載の脊椎動物細胞。
【請求項１２】
ＧＤＰ−Ｄ−ラムノース、ＧＤＰ−Ｄ−ペロサミン、ＧＤＰ−デオキシ−Ｄ−タロース、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−アルトロース、ＧＤＰ−４−ケト−３，６−ジデオキシ−Ｄ−マンノース又はＧＤＰ−Ｌ−コリトースに対する少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼを更に含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の脊椎動物細胞。
【請求項１３】
自然状態ではその糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有する分子を生成する方法であって、
ｉ）請求項１〜１２のいずれか一項に記載の脊椎動物細胞を準備する工程と、
ｉｉ）ｉ）における該細胞からフコシルトランスフェラーゼに対する基質となることができる分子、又はタンパク質若しくは脂質を単離する工程と、
を含む、自然状態ではその糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有する分子を生成する方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法により入手可能な、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有する分子。
【請求項１５】
請求項１４に記載の分子の組成物。
【請求項１６】
基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用するが、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースをＧＤＰ−Ｌ−フコースに変換する反応を触媒しない酵素をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに操作可能に連結した脊椎動物の発現制御配列を１つ又は複数含む発現単位。
【請求項１７】
基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用する該酵素が、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）、ＧＤＰ−ペロサミンシンテターゼ（Ｐｅｒ）、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−タロースシンテターゼ（ＧＴＳ）、ＧＤＰ−フコースシンテターゼＣｙｓ１０９Ｓｅｒ（ＧＦＳ−Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒ）突然変異体、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース−３−デヒドラターゼ（ＣｏｌＤ）、又はＧＤＰ−Ｌ−コリトースシンターゼ（ＣｏｌＣ）と組み合わせたＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース−３−デヒドラターゼ（ＣｏｌＤ）、及びそれらの変異体からなる群から選択される、請求項１６に記載の発現単位。
【請求項１８】
通常その糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有するタンパク質を生成するための真核細胞であって、
ｉ）基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用する酵素をコードする核酸配列を含む第１のポリヌクレオチドと、
ｉｉ）タンパク質をコードする核酸配列を含む第２のポリヌクレオチドと、
を含み、該酵素がＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースをＧＤＰ−Ｌ−フコースに変換する反応を触媒しない、通常その糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有するタンパク質を生成するための真核細胞。
【請求項１９】
基質としてＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースを使用する該酵素が、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）、ＧＤＰ−ペロサミンシンテターゼ（Ｐｅｒ）、ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−タロースシンテターゼ（ＧＴＳ）、ＧＤＰ−フコースシンテターゼＣｙｓ１０９Ｓｅｒ（ＧＦＳ−Ｃｙｓ１０９Ｓｅｒ）突然変異体、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース−３−デヒドラターゼ（ＣｏｌＤ）、又はＧＤＰ−Ｌ−コリトースシンターゼ（ＣｏｌＣ）と組み合わせたＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース−３−デヒドラターゼ（ＣｏｌＤ）、及びそれらの変異体からなる群から選択される、請求項１８に記載の真核細胞。
【請求項２０】
タンパク質が、抗体、若しくはＩｇＧ１抗体、抗体断片、若しくは抗体のＦｃ領域を含む抗体断片、抗体のＦｃ領域を含む融合タンパク質、ウイルスタンパク質、ウイルスタンパク質断片、抗原、又はホルモンである、請求項１８又は１９に記載の真核細胞。
【請求項２１】
通常その糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有するタンパク質を生成する方法であって、
ｉ）請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の真核細胞を準備する工程と、
ｉｉ）前記細胞において第１のポリヌクレオチドによりコードされる酵素及び第２のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を発現する工程と、
ｉｉｉ）前記細胞からタンパク質を単離する工程と、
を含む、通常その糖部分上において、フコースを含むが、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有するタンパク質を生成する方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法により入手可能な、その糖部分上において、フコースを欠いている又は低減したフコース量を有するタンパク質。
【国際調査報告】
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