(57)【要約】  本発明は、高い効能及び低い全身毒性を有する免疫毒素複合体を形成するための方法及び組成物に関する。好ましい実施形態では、毒素部分は、Ｒａｐ（Ｑ）等のランピルナーゼ（Ｒａｐ）である。より好ましい実施形態では、免疫毒素は、ドック-アンド-ロック（ＤＮＬ）技術を使用して製作される。免疫毒素は、毒素単独、抗体単独、結合されていない毒素＋抗体、又は他のタイプの毒素-抗体構築体と比較してさえ、薬物動態学的向上を示し、より長い血清半減期及び著しくより高い効能を有する。最も好ましい実施形態では、構築体は、Ｒａｐに結合された抗Ｔｒｏｐ-２抗体を含むが、他の組み合わせの抗体、抗体断片、及び毒素を使用して、主題の免疫毒素を形成することができる。免疫毒素は、癌、自己免疫疾患、又は免疫機能不全等の様々な疾患の治療に有用である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＬ（ドックアンドロック）構築体であって、
ａ）タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）由来のＤＤＤ（二量体化及びドッキングドメイン）部分に結合された毒素と、
ｂ）ＡＫＡＰタンパク質由来のＡＤ（アンカードメイン）部分に結合された抗体又は抗原結合性抗体断片とを含み、
前記ＤＤＤ部分の２つのコピーが二量体を形成し、前記ＡＤ部分に結合して、前記ＤＮＬ構築体を形成する構築体。
【請求項２】
前記抗体又は抗体断片が、前記ＡＤ部分の２つのコピーを含む、請求項１に記載のＤＮＬ構築体。
【請求項３】
前記ＡＤ部分が、前記抗体又は抗体断片の重鎖のＣ末端に結合されている、請求項２に記載のＤＮＬ構築体。
【請求項４】
前記ＤＮＬ構築体が、前記毒素の４つのコピーを含む、請求項２に記載のＤＮＬ構築体。
【請求項５】
前記毒素が、細菌毒素、植物毒素、リシン、アブリン、アルファ毒素、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅＩ、ブドウ球菌腸毒素Ａ、ポークウィード抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、シュードモナス内毒素、ランピルナーゼ（Ｒａｐ）、及びＲａｐ（Ｎ６９Ｑ）からなる群から選択される、請求項１に記載のＤＮＬ構築体。
【請求項６】
前記毒素が、ランピルナーゼ（Ｒａｐ）である、請求項５に記載のＤＮＬ構築体。
【請求項７】
前記抗体又は抗体断片が、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、ＣＳＡｐ、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＩＧＦ-１Ｒ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ〜ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＡＦＰ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ-６、Ｂ７、フィブロネクチンのＥＤ-Ｂ、Ｈ因子、ＦＨＬ-１、Ｆｌｔ-３、葉酸受容体、ＧＲＯＢ、ＨＭＧＢ-１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＨＭ１．２４、インスリン様増殖因子-１（ＩＬＧＦ-１）、ＩＦＮ-γ、ＩＦＮ-α、ＩＦＮ-β、ＩＬ-２、ＩＬ-４Ｒ、ＩＬ-６Ｒ、ＩＬ-１３Ｒ、ＩＬ-１５Ｒ、ＩＬ-１７Ｒ、ＩＬ-１８Ｒ、ＩＬ-６、ＩＬ-８、ＩＬ-１２、ＩＬ-１５、ＩＬ-１７、ＩＬ-１８、ＩＬ-２５、ＩＰ-１０、ＭＡＧＥ、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ-１、ＭＩＰ-１Ａ、ＭＩＰ-１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＰＡＭ４抗原、ＮＣＡ-９５、ＮＣＡ-９０、Ｉａ、ＨＭ１．２４、ＥＧＰ-１、ＥＧＰ-２、ＨＬＡ-ＤＲ、テネイシン、Ｌｅ（ｙ）、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＴＡＣ、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ-Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、ＴＮＦ-α、ＴＲＡＩＬ受容体（Ｒ１及びＲ２）、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＰｌＧＦ、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、及び癌遺伝子産物からなる群から選択される抗原に結合する、請求項１に記載のＤＮＬ構築体。
【請求項８】
前記抗体又は抗体断片が、ｈＲ１（抗ＩＧＦ-１Ｒ）、ｈＰＡＭ４（抗ムチン）、ｈＡ２０（抗ＣＤ２０）、ｈＡ１９（抗ＣＤ１９）、ｈＩＭＭＵ３１（抗ＡＦＰ）、ｈＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ｈＬＬ２（抗ＣＤ２２）、ｈＭｕ-９（抗ＣＳＡｐ）、ｈＬ２４３（抗ＨＬＡ-ＤＲ）、ｈＭＮ-１４（抗ＣＥＡＣＡＭ５）、ｈＭＮ-１５（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、ｈＲＳ７（抗ＥＧＰ-１）、及びｈＭＮ-３（抗ＣＥＡＣＡＭ６）からなる群から選択される、請求項１に記載のＤＮＬ構築体。
【請求項９】
前記抗体又は抗体断片が、抗ＥＧＰ-１（抗Ｔｒｏｐ-２）、抗ＣＤ７４、抗ＣＤ２２、又は抗ＣＤ２０である、請求項７に記載のＤＮＬ構築体。
【請求項１０】
前記抗体又は抗体断片が、ｈＲＳ７（抗Ｔｒｏｐ-２）、ミラツズマブ（抗ＣＤ７４）、ベルツズマブ（抗ＣＤ２２）、及びエピラツズマブ（抗ＣＤ２０）からなる群から選択される、請求項９に記載のＤＮＬ構築体。
【請求項１１】
前記ＤＤＤ部分が、ヒトＲＩα、ＲＩβ、ＲＩＩα、又はＲＩＩβ  ＰＫＡに由来するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のＤＮＬ構築体。
【請求項１２】
前記毒素及び前記抗体又は抗体断片が、融合タンパク質であり、各融合タンパク質がＡＤ及びＤＤＤ部分を含む、請求項１に記載のＤＮＬ構築体。
【請求項１３】
前記ＤＤＤ部分が、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０の最初の４４個アミノ酸、配列番号２１の最初の４４個アミノ酸、配列番号２２、又は配列番号５９のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のＤＮＬ構築体。
【請求項１４】
前記ＡＤ部分が、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、Ｍ配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、又は配列番号５８のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のＤＮＬ構築体。
【請求項１５】
前記抗体又は抗体断片が、ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、及びｄＡｂからなる群から選択される、請求項１に記載のＤＮＬ構築体。
【請求項１６】
毒素を対象体に投与する方法であって、請求項１に記載のＤＮＬ構築体を対象体に投与することを含む方法。
【請求項１７】
前記抗体又は抗体断片が、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、ＣＳＡｐ、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＩＧＦ-１Ｒ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ〜ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＡＦＰ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ-６、Ｂ７、フィブロネクチンのＥＤ-Ｂ、Ｈ因子、ＦＨＬ-１、Ｆｌｔ-３、葉酸受容体、ＧＲＯＢ、ＨＭＧＢ-１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＨＭ１．２４、インスリン様増殖因子-１（ＩＬＧＦ-１）、ＩＦＮ-γ、ＩＦＮ-α、ＩＦＮ-β、ＩＬ-２、ＩＬ-４Ｒ、ＩＬ-６Ｒ、ＩＬ-１３Ｒ、ＩＬ-１５Ｒ、ＩＬ-１７Ｒ、ＩＬ-１８Ｒ、ＩＬ-６、ＩＬ-８、ＩＬ-１２、ＩＬ-１５、ＩＬ-１７、ＩＬ-１８、ＩＬ-２５、ＩＰ-１０、ＭＡＧＥ、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ-１、ＭＩＰ-１Ａ、ＭＩＰ-１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＰＡＭ４抗原、ＮＣＡ-９５、ＮＣＡ-９０、Ｉａ、ＨＭ１．２４、ＥＧＰ-１、ＥＧＰ-２、ＨＬＡ-ＤＲ、テネイシン、Ｌｅ（ｙ）、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＴＡＣ、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ-Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、ＴＮＦ-α、ＴＲＡＩＬ受容体（Ｒ１及びＲ２）、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＰｌＧＦ、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、及び癌遺伝子産物からなる群から選択される抗原に結合する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体又は抗体断片が、抗ＥＧＰ-１（抗Ｔｒｏｐ-２）、抗ＣＤ７４、抗ＣＤ２２、又は抗ＣＤ２０である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体又は抗体断片が、ｈＲ１（抗ＩＧＦ-１Ｒ）、ｈＰＡＭ４（抗ムチン）、ｈＡ２０（抗ＣＤ２０）、ｈＡ１９（抗ＣＤ１９）、ｈＩＭＭＵ３１（抗ＡＦＰ）、ｈＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ｈＬＬ２（抗ＣＤ２２）、ｈＭｕ-９（抗ＣＳＡｐ）、ｈＬ２４３（抗ＨＬＡ-ＤＲ）、ｈＭＮ-１４（抗ＣＥＡ）、ｈＭＮ-１５（抗ＣＥＡ）、ｈＲＳ７（抗ＥＧＰ-１）、及びｈＭＮ-３（抗ＣＥＡ）からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体又は抗体断片が、ｈＲＳ７（抗Ｔｒｏｐ-２）、ミラツズマブ（抗ＣＤ７４）、ベルツズマブ（抗ＣＤ２２）、及びエピラツズマブ（抗ＣＤ２０）からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記毒素が、細菌毒素、植物毒素、リシン、アブリン、アルファ毒素、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅＩ、ブドウ球菌腸毒素Ａ、ポークウィード抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、シュードモナス内毒素、ランピルナーゼ（Ｒａｐ）、及びＲａｐ（Ｎ６９Ｑ）からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記毒素が、ランピルナーゼ（Ｒａｐ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
癌、免疫機能不全、及び自己免疫疾患からなる群から選択される疾患を治療する方法であって、請求項１に記載のＤＮＬ構築体を、前記疾患を有する対象体に投与することを含む方法。
【請求項２４】
前記癌が、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞白血病、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、ヘアリーセル白血病、急性骨髄白血病、慢性骨髄白血病、多発性骨髄腫、神経膠腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、癌腫、メラノーマ、肉腫、神経膠腫、皮膚癌、口腔癌、消化器癌、結腸癌、胃癌、肺管癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、膀胱癌、膵臓癌、骨癌、肝臓癌、胆嚢癌、腎臓癌、及び精巣癌からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記自己免疫疾患が、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シドナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、狼瘡性腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、真性糖尿病、ヘノッホ-シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓性血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変症、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ヴェーゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、又は線維化性肺胞炎からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体又は抗体断片が、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、ＣＳＡｐ、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＩＧＦ-１Ｒ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ〜ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＡＦＰ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ-６、Ｂ７、フィブロネクチンのＥＤ-Ｂ、Ｈ因子、ＦＨＬ-１、Ｆｌｔ-３、葉酸受容体、ＧＲＯＢ、ＨＭＧＢ-１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＨＭ１．２４、インスリン様増殖因子-１（ＩＬＧＦ-１）、ＩＦＮ-γ、ＩＦＮ-α、ＩＦＮ-β、ＩＬ-２、ＩＬ-４Ｒ、ＩＬ-６Ｒ、ＩＬ-１３Ｒ、ＩＬ-１５Ｒ、ＩＬ-１７Ｒ、ＩＬ-１８Ｒ、ＩＬ-６、ＩＬ-８、ＩＬ-１２、ＩＬ-１５、ＩＬ-１７、ＩＬ-１８、ＩＬ-２５、ＩＰ-１０、ＭＡＧＥ、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ-１、ＭＩＰ-１Ａ、ＭＩＰ-１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＰＡＭ４抗原、ＮＣＡ-９５、ＮＣＡ-９０、Ｉａ、ＨＭ１．２４、ＥＧＰ-１、ＥＧＰ-２、ＨＬＡ-ＤＲ、テネイシン、Ｌｅ（ｙ）、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＴＡＣ、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ-Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、ＴＮＦ-α、ＴＲＡＩＬ受容体（Ｒ１及びＲ２）、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＰｌＧＦ、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、及び癌遺伝子産物からなる群から選択される抗原に結合する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体又は抗体断片が、ｈＲ１（抗ＩＧＦ-１Ｒ）、ｈＰＡＭ４（抗ムチン）、ｈＡ２０（抗ＣＤ２０）、ｈＡ１９（抗ＣＤ１９）、ｈＩＭＭＵ３１（抗ＡＦＰ）、ｈＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ｈＬＬ２（抗ＣＤ２２）、ｈＭｕ-９（抗ＣＳＡｐ）、ｈＬ２４３（抗ＨＬＡ-ＤＲ）、ｈＭＮ-１４（抗ＣＥＡ）、ｈＭＮ-１５（抗ＣＥＡ）、ｈＲＳ７（抗ＥＧＰ-１）、及びｈＭＮ-３（抗ＣＥＡ）からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体又は抗体断片が、ｈＲＳ７（抗Ｔｒｏｐ-２）、ミラツズマブ（抗ＣＤ７４）、ベルツズマブ（抗ＣＤ２２）、及びエピラツズマブ（抗ＣＤ２０）からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記毒素が、細菌毒素、植物毒素、リシン、アブリン、アルファ毒素、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅＩ、ブドウ球菌腸毒素Ａ、ポークウィード抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、シュードモナス内毒素、ランピルナーゼ（Ｒａｐ）、及びＲａｐ（Ｎ６９Ｑ）からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記毒素が、ランピルナーゼ（Ｒａｐ）である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
抗体又は抗原結合性抗体断片に結合されたランピルナーゼを含む免疫毒素。
【請求項３２】
前記免疫毒素が、構造体２Ｌ-Ｒａｐ（Ｑ）-ＭＡｂを有し、Ｒａｐ（Ｑ）が、推定Ｎ-グリコシル化部位が除去されているランピルナーゼ（Ｒａｐ）の突然変異形態であり、ＭＡｂが、抗体又は抗原結合性抗体断片である、請求項３１に記載の免疫毒素。
【請求項３３】
前記抗体又は抗体断片が、抗Ｔｒｏｐ-２（抗ＥＧＰ-１）である、請求項３１に記載の免疫毒素。
【請求項３４】
前記抗体又は抗体断片が、重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＮＹＧＭＮ、配列番号１）、ＣＤＲ２（ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧ、配列番号２）、及びＣＤＲ３（ＧＧＦＧＳＳＹＷＹＦＤＶ、配列番号３）、並びに軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＫＡＳＱＤＶＳＩＡＶＡ、配列番号４）、ＣＤＲ２（ＳＡＳＹＲＹＴ、配列番号５）、及びＣＤＲ３（ＱＱＨＹＩＴＰＬＴ、配列番号６）を含むヒト化抗Ｔｒｏｐ-２抗体である、請求項３３に記載の免疫毒素。
【請求項３５】
前記免疫毒素が、１００ｎＭ以下の濃度で癌細胞系に細胞毒性である、請求項３３に記載の免疫毒素。
【請求項３６】
前記癌細胞系が、子宮頸癌、乳癌、前立腺癌、肺腺癌、膵臓癌、又は卵巣癌細胞系である、請求項３５に記載の免疫毒素。
【請求項３７】
前記免疫毒素が、１０ｎＭ以下の濃度で癌細胞系に細胞毒性である、請求項３３に記載の免疫毒素。
【請求項３８】
前記免疫毒素が、抗体又は抗体断片のＶＬ配列のＮ末端に結合されたＲａｐ（Ｑ）を含む融合タンパク質である、請求項３３に記載の免疫毒素。
【請求項３９】
癌、免疫機能不全、及び自己免疫疾患からなる群から選択される疾患を治療する方法であって、請求項３２に記載の免疫毒素を、前記疾患を有する対象体に投与することを含む方法。
【請求項４０】
前記抗体又は抗体断片が、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、ＣＳＡｐ、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＩＧＦ-１Ｒ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ〜ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＡＦＰ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ-６、Ｂ７、フィブロネクチンのＥＤ-Ｂ、Ｈ因子、ＦＨＬ-１、Ｆｌｔ-３、葉酸受容体、ＧＲＯＢ、ＨＭＧＢ-１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＨＭ１．２４、インスリン様増殖因子-１（ＩＬＧＦ-１）、ＩＦＮ-γ、ＩＦＮ-α、ＩＦＮ-β、ＩＬ-２、ＩＬ-４Ｒ、ＩＬ-６Ｒ、ＩＬ-１３Ｒ、ＩＬ-１５Ｒ、ＩＬ-１７Ｒ、ＩＬ-１８Ｒ、ＩＬ-６、ＩＬ-８、ＩＬ-１２、ＩＬ-１５、ＩＬ-１７、ＩＬ-１８、ＩＬ-２５、ＩＰ-１０、ＭＡＧＥ、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ-１、ＭＩＰ-１Ａ、ＭＩＰ-１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＰＡＭ４抗原、ＮＣＡ-９５、ＮＣＡ-９０、Ｉａ、ＨＭ１．２４、ＥＧＰ-１、ＥＧＰ-２、ＨＬＡ-ＤＲ、テネイシン、Ｌｅ（ｙ）、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＴＡＣ、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ-Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、ＴＮＦ-α、ＴＲＡＩＬ受容体（Ｒ１及びＲ２）、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＰｌＧＦ、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、及び癌遺伝子産物からなる群から選択される抗原に結合する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗体又は抗体断片が、ｈＲ１（抗ＩＧＦ-１Ｒ）、ｈＰＡＭ４（抗ムチン）、ｈＡ２０（抗ＣＤ２０）、ｈＡ１９（抗ＣＤ１９）、ｈＩＭＭＵ３１（抗ＡＦＰ）、ｈＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ｈＬＬ２（抗ＣＤ２２）、ｈＭｕ-９（抗ＣＳＡｐ）、ｈＬ２４３（抗ＨＬＡ-ＤＲ）、ｈＭＮ-１４（抗ＣＥＡＣＡＭ５）、ｈＭＮ-１５（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、ｈＲＳ７（抗ＥＧＰ-１）、及びｈＭＮ-３（抗ＣＥＡＣＡＭ６）からなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記抗体又は抗体断片が、抗Ｔｒｏｐ-２（抗ＥＧＰ-１）である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記抗体又は抗体断片が、重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＮＹＧＭＮ、配列番号１）、ＣＤＲ２（ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧ、配列番号２）、及びＣＤＲ３（ＧＧＦＧＳＳＹＷＹＦＤＶ、配列番号３）、並びに軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＫＡＳＱＤＶＳＩＡＶＡ、配列番号４）、ＣＤＲ２（ＳＡＳＹＲＹＴ、配列番号５）、及びＣＤＲ３（ＱＱＨＹＩＴＰＬＴ、配列番号６）を含むヒト化抗Ｔｒｏｐ-２抗体である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記癌が、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞白血病、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、ヘアリーセル白血病、急性骨髄白血病、慢性骨髄白血病、多発性骨髄腫、神経膠腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、癌腫、メラノーマ、肉腫、神経膠腫、皮膚癌、口腔癌、消化器癌、結腸癌、胃癌、肺管癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、膀胱癌、膵臓癌、骨癌、肝臓癌、胆嚢癌、腎臓癌、及び精巣癌からなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記自己免疫疾患が、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シドナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、狼瘡性腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、真性糖尿病、ヘノッホ-シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓性血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変症、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ヴェーゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、又は線維化性肺胞炎からなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年４月６日に出願された米国特許出願第１２／７５４，７４０号、２０１０年４月５日に出願された第１２／７５４，１４０号；２０１０年４月１日に出願された第１２／７５２，６４９号、２０１０年３月２５日に出願された第１２／７３１，７８１号、２００９年１２月２２日に出願された第１２／６４４，１４６号、及び２００９年８月３１日に出願された米国特許仮出願第６１／２３８，４７３号、２００９年１２月３日に出願された第６１／２６６，３０５号、２０１０年３月２４日に出願された第６１／３１６，９９６号、及び２０１０年４月１４日に出願された第６１／３２３，９６０号の優先権を主張する。各優先出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
財政援助
本研究は、国立癌研究所、国立衛生研究所からの助成金２Ｒ４４ＣＡ１０８０８３-０２Ａ２により部分的に支援された。連邦政府は、本発明にある種の権利を有する場合がある。
【０００２】
本発明は、好ましくはランピルナーゼ（Ｒａｐ）を含む毒素-抗体構築体（免疫毒素）の組成物及び使用方法に関するが、当業者であれば、幅広く多様な毒素及び他の細胞毒性剤が当技術分野で公知であり、任意のそのような毒素又は細胞毒性剤を、請求項に係る組成物及び方法に使用することができることを理解するだろう。他の好ましい実施形態では、構築体は、抗ＥＧＰ-１（抗Ｔｒｏｐ-２）、抗ＣＤ７４、抗ＣＤ２２、又は抗ＣＤ２０等の抗腫瘍抗体を含む。しかしながら、本組成物及び方法は、そのようには限定されず、抗体又は抗体断片は、癌細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、自己免疫疾患細胞、病原体、又はそれに対する抗体が当技術分野で知られている任意の他の疾患関連標的細胞等の任意の標的組織に関連する抗原に結合することができる。
【０００３】
より好ましい実施形態では、免疫毒素は、好ましくは、抗体又は抗体断片に結合された４つのコピーのランピルナーゼを含むドック-アンド-ロック（ＤＮＬ）構築体である。更により好ましくは、毒素又は他の細胞毒性剤は、融合タンパク質であり、その各々がＤＤＤ（二量体化及びドッキングドメイン）部分を含み、抗体又は抗体断片は、２つのＡＤ（アンカードメイン）部分を含む融合タンパク質である。ＤＤＤ部分は、ＡＤ部分に結合する二量体を自然に形成し、１つの抗体又は抗体断片に結合された４つのコピーの細胞毒素を含むＤＮＬ構築体をもたらす。その結果生じる免疫毒素は、非常に強力な細胞毒性活性を示し、疾患を有する対象体に投与して、疾患関連細胞を死滅させることができる。免疫毒素は、親抗体単独、細胞毒素単独、結合されていない抗体及び細胞毒素の組み合わせ、又は対照抗体に結合された細胞毒素よりも、標的細胞に対してより大きな効力を示す。
【背景技術】
【０００４】
リボヌクレアーゼ、特にＲａｐ（Lee, Exp Opin Biol Ther 2008; 8:813-27）及びそのより基本的な変異体、アムヒナーゼ（amphinase）（Ardelt et al., Curr Pharm
Biotechnol 2008:9:215-25）は、潜在的な抗腫瘍剤である（Lee and Raines,
Biodrugs 2008; 22:53-8）。Ｒａｐは、ヒョウガエル（Rana pipiens）の卵母細胞から初めて単離された１０４個アミノ酸の単鎖リボヌクレアーゼである。Ｒａｐは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで様々な腫瘍細胞系に対する細胞増殖抑制効果及び細胞毒性効果を、並びにｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を示す。両生類リボヌクレアーゼは、受容体依存性エンドサイトーシスにより細胞に進入し、細胞質ゾルに内部移行されると、ｔＲＮＡを選択的に分解して、タンパク質合成の阻害及びアポトーシスの誘導をもたらす。
【０００５】
Ｒａｐは、切除不能の悪性中皮腫を有する患者において、Ｒａｐ＋ドキソルビシンの有効性をドキソルビシン単独の有効性と比較した無作為第ＩＩＩｂ相臨床試験を終えており、中間解析によると、この組み合わせのＭＳＴが１２か月であり、一方、単独療法のＭＳＴが１０か月だったことが示されている（Mutti and Gaudino, Oncol Rev 2008;2:61-5）。Ｒａｐは、患者に繰り返して投与することができ、有害な免疫応答がなく、可逆的腎毒性は、用量制限的であることが報告されている（Mikulski et al., J Clin Oncol 2002；20:274-81;
Int J Oncol 1993; 3:57-64）。
【０００６】
Ｒａｐ及び他の毒素又は細胞毒素は、癌細胞又は自己免疫疾患細胞等の選択された疾患関連細胞に対する標的送達用の抗体又は抗体断片に結合することができる。例示的な腫瘍関連抗原は、Ｔｒｏｐ-２としても知られるＥＧＰ-１である。
【０００７】
Ｔｒｏｐ-２は、Ｉ型膜貫通型タンパク質であり、ヒト細胞（Fornaro et al., Int J Cancer 1995; 62:610-8）及びマウス細胞（Sewedy et al., Int J Cancer 1998; 75:324-30）の両方からクローニングされている。腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質としてのその役割に加えて（Ripani et al., Int J Cancer 1998;76:671-6）、ヒトＴｒｏｐ-２の発現は、結腸癌細胞の腫瘍形成及び侵襲性に必要であることが示され、それはＴｒｏｐ-２の細胞外ドメインに対するポリクローナル抗体により効果的に低減することができた（Wang et al., Mol Cancer Ther 2008;7:280-5）。
【０００８】
固形癌の治療標的としてのＴｒｏｐ-２に対する関心の増加（Cubas et al., Biochim Biophys
Acta 2009;1796:309-14）は、乳癌（Huang et al., Clin Cancer
Res 2005;11:4357-64）、結腸直腸癌（Ohmachi et al., Clin Cancer
Res 2006;12:3057-63；Fang et al., Int J Colorectal Dis
2009;24:875-84）、及び口腔扁平細胞癌（Fong et al., Modern Pathol
2008;21:186-91）におけるＴｒｏｐ-２過剰発現の臨床的重要性を明らかにした報告により更に証明されている。高レベルのＴｒｏｐ-２を発現する前立腺基底細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ幹様活性のために豊富に存在するという最新の根拠には、特に注目すべきである（Goldstein et al., Proc Natl Acad Sci USA 2008;105:20882-7）。
【０００９】
マウス抗Ｔｒｏｐ-２  ｍＡｂ、ｍＲＳ７は、外科的に取り出されたヒト原発性肺扁平上皮癌に由来する粗膜調製物を免疫原として使用して、ハイブリドーマ技術により生成された（Stein et al., Cancer Res 1990; 50:1330-6）。凍結組織切片を免疫ペルオキシダーゼ染色することにより、ｍＲＳ７により規定された抗原が、肺、胃、膀胱、乳房、卵巣、子宮、及び前立腺の腫瘍に存在し、ほとんどの正常ヒト組織では反応がなかったことが示された（Stein et al., Int J Cancer 1993; 55:938-46）。ｍＲＳ７により認識された抗原は、４６〜４８ｋＤａの糖タンパク質であることが後に示されており、上皮糖タンパク質-１又はＥＧＰ-１と命名され（Stein
et al., Int J Cancer 1994; 8:98-102）、文献（Ripani et al.,
Int J Cancer 1998; 76:671-6）ではＴｒｏｐ-２とも呼ばれている。標的細胞と結合すると、ｍＲＳ７は、２時間以内で迅速に内部移行される（Stein et al., Int J Cancer 1993; 55:938-46）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
放射性同位体標識ｍＲＳ７は、幾つかの初期研究においてヌードマウスの癌異種移植片を効果的に標的化し、治療することが示されている（Stein et al., Antibody Immunoconj Radiopharm 1991; 4:703-12；Stein et al., Cancer 1994; 73:816-23；Shih et
al., Cancer Res 1995; 55:5857s-63s；Stein et al., J Nucl
Med 2001; 42:967-74；Stein et al., Crit Rev Oncol
Hematol 2001; 39:173-80）。しかしながら、Ｒａｐ又は他の細胞毒素と結合させて疾患治療用のより有効な作用剤を供給することができるＲＳ７又は他の疾患標的化抗体の免疫複合体（「免疫毒素」）の分野には、必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、疾患標的化抗体又は抗原結合性抗体断片に結合されたランピルナーゼ（Ｒａｐ）又は他の毒素を含む免疫毒素の組成物及び使用方法に関する。ある好ましい実施形態では、免疫毒素は、ヒト化抗Ｔｒｏｐ-２抗体（ｈＲＳ７）のＮ末端に結合された２つのコピーのＲａｐを含む、２Ｌ-Ｒａｐ（Ｑ）-ｈＲＳ７又は２Ｌ-Ｒａｐ-ｈＲＳ７と呼ばれる、図１に例示されている構造体であってもよい。しかしながら、当業者であれば、免疫毒素はそのようには限定されず、当技術分野で公知である他の腫瘍関連抗原又は疾患関連抗原に対する抗体を使用することができることを理解するだろう。そのような免疫毒素は、Ｒａｐの毒性副作用を最小限に抑えつつ、強力な細胞毒性及び薬物動態の向上を示す。
【００１２】
代替的な実施形態では、主題の免疫毒素は、ドック-アンド-ロック（ＤＮＬ）技術を使用して製作することができ、Ｒａｐ又は他の毒素若しくは細胞毒素を有する抗体又は抗原結合性抗体断片の結合体を含んでいてもよい。下記で本明細書に使用される場合、用語「免疫毒素」は、ＤＮＬ技術により製作された免疫毒素、又は図１に例示されている免疫毒素を指していてもよい。好ましい実施形態では、ＤＮＬ構築体は、ｈＲＳ７等の抗Ｔｒｏｐ-２抗体に結合されたＲａｐを含む。しかしながら、当業者であれば、ＤＮＬ構築体は、そのようには制限されず、主題のＤＮＬ構築体は、ランピルナーゼ又は当技術分野で公知である他の毒素又は細胞毒素に結合された、任意の疾患関連抗原に対する抗体又はその断片を含んでいてもよいことを理解するだろう。
【００１３】
特定の実施形態では、免疫毒素は、重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＮＹＧＭＮ、配列番号１）、ＣＤＲ２（ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧ、配列番号２）、及びＣＤＲ３（ＧＧＦＧＳＳＹＷＹＦＤＶ、配列番号３）、並びに軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＫＡＳＱＤＶＳＩＡＶＡ、配列番号４）、ＣＤＲ２（ＳＡＳＹＲＹＴ、配列番号５）、及びＣＤＲ３（ＱＱＨＹＩＴＰＬＴ、配列番号６）を含み、ヒト抗体フレームワーク（ＦＲ）及び定常領域配列に結合されたｈＲＳ７抗体等のヒト化抗Ｔｒｏｐ-２抗体又はその断片を含んでいてもよい（例えば、参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第７，２３８，７８５号の３４欄６行〜４４欄３７行を参照）。
【００１４】
他の特定の実施形態では、免疫毒素は、軽鎖可変領域ＣＤＲ１（ＲＡＳＳＳＶＳＹＩＨ、配列番号７）、ＣＤＲ２（ＡＴＳＮＬＡＳ、配列番号８）、及びＣＤＲ３（ＱＱＷＴＳＮＰＰＴ、配列番号９）、並びに重鎖可変領域ＣＤＲ１（ＳＹＮＭＨ、配列番号１０）、ＣＤＲ２（ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧ、配列番号１１）、及びＣＤＲ３（ＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＤＶ（配列番号９５）又はＶＶＹＹＳＮＳＹＷＹＦＤＶ、配列番号１２）を含むベルツズマブ等のヒト化抗ＣＤ２０抗体又はその断片を含んでいてもよい（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，４３５，８０３号の３８欄１５行〜４６欄５２行を参照）。
【００１５】
より特定の実施形態では、免疫毒素は、当技術分野で公知のランピルナーゼ（Ｒａｐ）アミノ酸配列を含んでいてもよい（例えば、ＮＣＢＩタンパク質データベース受入番号１ＰＵ３＿Ａを参照、またGorbatyuk et al., J Biol Chem 279:5772-80, 2004も参照）。
【００１６】
種々の実施形態では、免疫毒素は、Ｔｒｏｐ-２又はＣＤ２０以外の抗原に結合する１つ又は複数の抗体又はその断片を含んでいてもよい。好ましい実施形態では、抗原（複数可）は、以下のものからなる群から選択されていてもよい：炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、ＣＳＡｐ、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＩＧＦ-１Ｒ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ〜ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＡＦＰ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ-６、Ｂ７、フィブロネクチンのＥＤ-Ｂ、Ｈ因子、ＦＨＬ-１、Ｆｌｔ-３、葉酸受容体、ＧＲＯＢ、ＨＭＧＢ-１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＨＭ１．２４、インスリン様増殖因子-１（ＩＬＧＦ-１）、ＩＦＮ-γ、ＩＦＮ-α、ＩＦＮ-β、ＩＬ-２、ＩＬ-４Ｒ、ＩＬ-６Ｒ、ＩＬ-１３Ｒ、ＩＬ-１５Ｒ、ＩＬ-１７Ｒ、ＩＬ-１８Ｒ、ＩＬ-６、ＩＬ-８、ＩＬ-１２、ＩＬ-１５、ＩＬ-１７、ＩＬ-１８、ＩＬ-２５、ＩＰ-１０、ＭＡＧＥ、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ-１、ＭＩＰ-１Ａ、ＭＩＰ-１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＰＡＭ４抗原、ＮＣＡ-９５、ＮＣＡ-９０、Ｉａ、ＨＭ１．２４、ＥＧＰ-１、ＥＧＰ-２、ＨＬＡ-ＤＲ、テネイシン、Ｌｅ（ｙ）、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＴＡＣ、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ-Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、ＴＮＦ-α、ＴＲＡＩＬ受容体（Ｒ１及びＲ２）、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＰｌＧＦ、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、及び癌遺伝子産物。
【００１７】
使用することができる例示的な抗体には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：ｈＲ１（抗ＩＧＦ-１Ｒ、３／１２／１０に出願された米国特許出願第１２／７２２，６４５号）、ｈＰＡＭ４（抗ムチン、米国特許第７，２８２，５６７号）、ｈＡ２０（抗ＣＤ２０、米国特許第７，２５１，１６４号）、ｈＡ１９（抗ＣＤ１９、米国特許第７，１０９，３０４号）、ｈＩＭＭＵ３１（抗ＡＦＰ、米国特許第７，３００，６５５号）、ｈＬＬ１（抗ＣＤ７４、米国特許第７，３１２，３１８号）、ｈＬＬ２（抗ＣＤ２２、米国特許第７，０７４，４０３号）、ｈＭｕ-９（抗ＣＳＡｐ、米国特許第７，３８７，７７３号）、ｈＬ２４３（抗ＨＬＡ-ＤＲ、米国特許第７，６１２，１８０号）、ｈＭＮ-１４（抗ＣＥＡＣＡＭ５、米国特許第６，６７６，９２４号）、ｈＭＮ-１５（抗ＣＥＡＣＡＭ６、米国特許第７，５４１，４４０号）、ｈＲＳ７（抗ＥＧＰ-１、米国特許第７，２３８，７８５号）、及びｈＭＮ-３（抗ＣＥＡＣＡＭ６、米国特許出願第７，５４１，４４０号）、各引用された特許又は出願の実施例部分は参照により本明細書に組み込まれる。当業者であれば、このリストが限定的ではなく、下記でより詳細に考察されているように、任意の既知抗体を使用することができることを理解するだろう。
【００１８】
免疫毒素に組み込むことができる例示的な毒素には、これらに限定されないが、細菌毒素、植物毒素、リシン、アブリン、アルファ毒素、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅＩ、ブドウ球菌腸毒素Ａ、ポークウィード抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、シュードモナス内毒素、ランピルナーゼ（Ｒａｐ）、及びＲａｐ（Ｎ６９Ｑ）が含まれる。列挙された毒素の各々の配列は、当技術分野で公知であり（例えば、ＮＣＢＩデータベースを参照）、多くの例示的な毒素をコードするクローンは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、アメリカ培養細胞系統保存機関、及び当技術分野で公知の他の供給源から商業的に入手可能である。
【００１９】
種々の実施形態は、これらに限定されないが、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性及び慢性リンパ性白血病、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、ヘアリーセル白血病、急性及び慢性骨髄白血病、Ｔ細胞性リンパ腫及び白血病、多発性骨髄腫、神経膠腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、癌腫、メラノーマ、肉腫、神経膠腫、及び皮膚癌を含む疾患を治療又は診断するために、主題の免疫毒素を使用することに関する。癌腫は、口腔、胃腸管、結腸、胃、肺管、肺、乳房、卵巣、前立腺、子宮、子宮内膜、頚部、膀胱、膵臓、骨、肝臓、胆嚢、腎臓、皮膚、及び精巣の癌腫からなる群から選択されていてもよい。加えて、主題の免疫毒素は、以下を治療するために使用することができる：自己免疫疾患、例えば、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シドナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、狼瘡性腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、真性糖尿病、ヘノッホ-シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓性血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変症、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ヴェーゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、又は線維化性肺胞炎。ある実施形態では、主題の抗体は、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄白血病、又は急性骨髄白血病等の白血病を治療するために使用することができる。
【００２０】
１つの実施形態では、本発明の医薬組成物は、アミロイドーシス等の代謝性疾患、又はアルツハイマー病等の神経変性疾患を有する対象体を治療するために使用することができる。加えて、本発明の医薬組成物は、免疫調節不全障害を有する対象体を治療するために使用することができる。
【００２１】
本発明の組成物は、感染症の治療にも有用であり、免疫毒素の免疫グロブリン成分が、疾患を引き起こす微生物と特異的に結合する。本発明の範疇では、疾患を引き起こす微生物には、病原性細菌、ウイルス、真菌、及び多様な寄生生物が含まれ、抗体は、これら微生物、それらの病変に関連するそれらの産物又は抗原を標的とすることができる。微生物の例には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：ストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）、レジュネラ・ニューモフィラ（Legionella
pneumophilia）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、大腸菌（Escherichia coli）、ナイセリア・ゴノレア（Neisseria
gonorrhoeae）、ナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitidis）、肺炎球菌（Pneumococcus）、ヘモフィリス・インフルエンザＢ（Hemophilis
influenzae B）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）、ライム病スピロヘータ（Lyme disease spirochetes）、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas
aeruginosa）、癩菌（Mycobacterium leprae）、ウシ流産菌（Brucella abortus）、結核菌（Mycobacterium
tuberculosis）、破傷風毒素、１型、２型、３型ＨＩＶ、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型肝炎、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスＩ及びＩＩ、ヒト血清パルボ様ウイルス、乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス、ＲＳウイルス、水痘帯状ヘルペスウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、はしかウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞性白血病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、マウス白血病ウイルス、おたふくかぜウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス、疣ウイルス、ブルータングウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、シミアンウイルス４０、マウス乳腺腫瘍ウィルス、デング熱ウイルス、風疹ウイルス、原生動物、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、三日熱マラリア原虫（Plasmodium
vivax）、トキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii）、ランゲル・トリパノソーマ（Trypanosoma rangeli）、クルーズ・トリパノソーマ（Trypanosoma
cruzi）、トリパノゾーマ・ロデシエンセイ（Trypanosoma rhodesiensei）、トリパノソーマ・ブルーセイ（Trypanosoma brucei）、マンソン住血吸虫（Schistosoma
mansoni）、日本住血吸虫（Schistosoma japanicum）、ウシバベシア（Babesia bovis）、エルメリア・テネラ（Elmeria tenella）、回旋糸状虫（Onchocerca volvulus）、熱帯リーシュマニア（Leishmania
tropica）、旋毛虫（Trichinella spiralis）、タイレリア・パルバ（Theileria parva）、胞状条虫（Taenia hydatigena）、ヒツジ条虫（Taenia ovis）、無鉤条虫（Taenia saginata）、単包条虫（Echinococcus granulosus）、メソセストイド・コルティ（Mesocestoides
corti）、マイコプラズマ・アルスリチジス（Mycoplasma arthritidis）、Ｍ．ハイオリニス（M. hyorhinis）、Ｍ．オラーレ（M. orale）、Ｍ．アルギニニ（M. arginini）、アコレプラズマ・レイドロウイ（Acholeplasma
laidlawii）、Ｍ．サリバリウム（M. salivarium）、Ｍ．ニューモニエ（M. pneumoniae）。 これら病原性微生物に結合するモノクローナル抗体は、当技術分野において周知である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
以下の図面は本明細書の一部を形成しており、本発明のある実施形態を更に実証するために含まれている。実施形態は、本明細書に提示されている特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これら図面の１つ又は複数を参照することにより、より良く理解することができる。
【図１】（Ｑ）-ｈＲＳ７の分子設計及びサイズを示す図である。２Ｌ-Ｒａｐ-Ｘの模式的構造、ＸはＩｇＧであり、ＲａｐはＲａｐ（Ｑ）であってもよい。
【図２】ルミノール基質を使用したＥＬＩＳＡから得られた、ＰＣ-３（Ａ）、Ｃａｌｕ-３（Ｂ）、及び２２Ｒｖ１（Ｃ）の細胞結合曲線を示す図である。平均蛍光単位を濃度に対してプロットし、その結果生じたデータをＰｒｉｓｍソフトウェアで分析して、ＫＤ値を得た。
【図３】（Ａ）（Ｑ）-ｈＲＳ７及びｒＲａｐが同等のＲＮａｓｅ活性を有することを示し、（Ｂ）ｒＲａｐ（左）及び（Ｑ）-ｈＲＳ７（右）活性の初速度を酵母ｔＲＮＡの濃度に対してプロットして、ｋｃａｔ／ｋｍを決定した、ＩＶＴＴアッセイの代表的なデータを示す図である。
【図４】ＭＥ-１８０（Ａ）及びＴ-４７Ｄ（Ｂ）について示されたＭＴＳアッセイ、及び（Ｃ）ＤＵ-１４５及び（Ｄ）ＰＣ-３について示されたコロニー形成アッセイにより明らかにされた（Ｑ）-ｈＲＳ７のＩｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す図である。（Ａ）及び（Ｂ）のデータを、Ｐｒｉｓｍソフトウェアで分析して、ＥＣ５０値を得た。
【図５】（Ａ）腫瘍増殖を阻害し、（Ｂ）ＭＳＴを増加させる、Ｃａｌｕ-３ヒト異種移植モデルで実証された（Ｑ）-ｈＲＳ７の治療効能を示す図である。ヌードマウスに、１×１０７個のＣａｌｕ-３細胞を皮下接種した。腫瘍が、およそ０．１５ｃｍ３に達した際に、マウスを、５０μｇの単回静脈内投与又は７日間の間隔をあけて投与された２５μｇの２回注射のいずれかで治療した。対照動物は、生理食塩水を受容した。
【図６】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写翻訳アッセイによるＲＮａｓｅ活性を示す図である。
【図７】ｈＬＬ１及びｒａｐ-ｈＬＬ１融合タンパク質が両方とも、ＷＰ、ｈＬＬ１の抗イディオタイプ抗体に対して同じ親和性を有することを実証する競合結合アッセイを示す図である。
【図８】Ｄａｕｄｉ細胞における融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す図である：（Ａ）ＭＴＳアッセイにより測定された細胞毒性；（Ｂ）ＢＲｄＵアッセイ法により測定された細胞毒性。
【図９】ＭＴＳアッセイによる、ＭＣ／ＣＡＲ細胞における融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す図である。
【図１０】未感作ＳＣＩＤマウスにおける、２Ｌ-Ｒａｐ-ｈＬＬ１-γ４Ｐの血中クリアランスを示す図である。未感作ＳＣＩＤマウスに、８８Ｙ-ＤＴＰＡ-ｈＬＬ１（○）及び１１１Ｉｎ-ＤＴＰＡ-２Ｌ-Ｒａｐ-ｈＬＬ１-γ４Ｐ（□）を静脈内に同時注射した。投与後の選択された時点で、マウスを心穿刺により出血させ、血液試料の放射能を計数した。データは、血中における注射用量の平均±Ｓ．Ｄ．を表す（ｎ＝３）。
【図１１】２Ｌ-Ｒａｐ-ｈＬＬ１-γ４Ｐ又は成分タンパク質による、高悪性度最小Ｄａｕｄｉリンパ腫の治療を示す図である。ＳＣＩＤマウス（８〜１０匹マウス／群）に、１．５×１０７個のＤａｕｄｉ細胞を静脈内接種した。１日後に、表示されている用量の２Ｌ-Ｒａｐ-ｈＬＬ１-γ４Ｐの単回ボーラス注入で、マウスを治療した。対照群には、５０μｇの免疫毒素と等しい成分タンパク質又はＰＢＳのみを注射した。
【図１２】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳アッセイにより測定されたＲＮａｓｅ活性を示す図である。ｒＲａｐ（■）、２Ｌ-Ｒａｐ-ｈＬＬ１-γ４Ｐ（▲）、及びｈＬＬ１-γ４Ｐ（◆）の濃度を、相対的ルミネセンス単位（ＲＬＵ）に対してプロットした。
【図１３】免疫毒素で連続的に処理したか又は１時間の処理後に洗浄したかのいずれかのＤＮＬ-Ｒａｐ免疫毒素構築体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す図である。
【図１４】全ての細胞系における、ＤＮＬ-Ｒａｐ免疫毒素構築体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
定義
別様の指示がない限り、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、「１つ又は複数」を意味する。
【００２４】
本明細書で使用される場合、用語「及び」及び「又は」は、接続的又は選言的のいずれを意味するように使用することができる。すなわち、両用語は、別様の記載がない限り、「及び／又は」と同じであると理解されるべきである。
【００２５】
「治療剤」は、疾患の治療に有用な原子、分子、又は化合物である。治療剤の例には、抗体、抗体断片、ペプチド、薬物、毒素、酵素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、キレート剤、ホウ素化合物、光活性作用剤、染料、及び放射性同位元素が含まれる。
【００２６】
「診断薬」は、疾患を診断するのに有用な原子、分子、又は化合物である。有用な診断薬には、これらに限定されないが、放射性同位元素、染料（ビオチン-ストレプトアビジン複合体等を有する）、造影剤、蛍光化合物又は分子、及び磁気共鳴画像（ＭＲＩ）用の促進剤（例えば、常磁性イオン）が含まれる。
【００２７】
「抗体」は、本明細書で使用される場合、全長（つまり、天然に存在するか、又は通常の免疫グロブリン遺伝子断片組換えプロセスにより形成された）免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ抗体）、又は抗体断片のような免疫グロブリン分子の免疫学的活性（つまり、特異的に結合する）部分を指す。「抗体」には、モノクローナル、ポリクローナル、二重特異的、多重特異的、マウス、キメラ、ヒト化、及びヒト抗体が含まれる。
【００２８】
「ネイクド（ｎａｋｅｄ）抗体」は、治療薬又は診断薬に結合されていない抗体又はその抗原結合断片である。完全なネイクド抗体のＦｃ部分は、補体結合及びＡＤＣＣ等のエフェクター機能を提供することができる（例えば、Markrides, Pharmacol Rev 50:59-87,
1998を参照、）。ネイクド抗体が細胞死を誘導する他の機序には、アポトーシスが含まれていてもよい。（Vaswani
and Hamilton, Ann Allergy Asthma
Immunol 81: 105-119,1998）。
【００２９】
「抗体断片」は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、及びｄＡｂ等の完全な抗体の部分である。構造に関わらず、抗体断片は、全長抗体が認識するのと同じ抗原と結合する。例えば、抗体断片には、重鎖及び軽鎖の可変領域で構成される「Ｆｖ」断片等の可変領域で構成される単離された断片、又は軽鎖及び重鎖可変領域がペプチドリンカーにより接続されている組換え単鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）が含まれる。「単鎖抗体」は、「ｓｃＦｖ」と略されることが多く、相互作用して抗原-結合部位を形成するＶＨ及びＶＬドメインを両方とも含むポリペプチド鎖で構成される。ＶＨ及びＶＬドメインは、通常、１〜２５個アミノ酸残基のペプチドにより結合されている。抗体断片には、二重特異性抗体、三重特異性抗体、及び単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）も含まれる。
【００３０】
本明細書に記載の抗体又は免疫毒素調製物又は組成物は、投与される量が生理学的に有効である場合、「治療上有効量」で投与されたと言われる。作用剤は、その存在が受容対象体の生理に検出可能な変化をもたらす場合、生理学的に有効である。特定の実施形態では、抗体調製物は、その存在が抗腫瘍性応答引き起こすか、又は自己免疫疾患状態の徴候及び症状を緩和する場合、生理学的に有効である。また、生理学的に有効な効果は、標的細胞の増殖阻害又は死滅に結び付く、受容対象体の体液性及び／又は細胞性免疫応答の誘起であってもよい。
【００３１】
抗体及び抗体断片
事実上あらゆる標的抗原に対してモノクローナル抗体を調製する技術は、当技術分野で周知である。例えば、Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)、及びColigan et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, VOL. 1,
pages 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991)を参照されたい。手短に言えば、モノクローナル抗体は、抗原を含む組成物をマウスに注射し、脾臓を取り出してＢリンパ球を取得し、Ｂリンパ球をミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを産生し、ハイブリドーマをクローニングし、抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択し、抗原に対する抗体を産生するクローンを培養し、ハイブリドーマ培養から抗体を単離することにより得ることができる。
【００３２】
ＭＡｂは、様々な十分に確立されている技術によりハイブリドーマ培養から単離及び精製することができる。そのような単離技術には、プロテインＡセファロースによるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及びイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎの２．７．１〜２．７．１２頁及び２．９．１〜２．９．３頁を参照されたい。また、Baines et al., “Purification of
Immunoglobulin G (IgG),” in METHODS IN
MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10, pages 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)を参照されたい。
【００３３】
免疫原に対する抗体を最初に誘発した後、抗体を配列決定し、その後組換え技術により調製することができる。マウス抗体及び抗体断片のヒト化及びキメラ化は、当業者に周知である。ヒト化、キメラ、又はヒト抗体に由来する抗体成分を使用することにより、マウス定常領域の免疫原性に伴う潜在的な問題が排除される。
【００３４】
キメラ抗体
キメラ抗体は、ヒト抗体の可変領域が、例えば、マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むマウス抗体の可変領域と置換されている組換えタンパク質である。キメラ抗体は、対象体に投与した際に、免疫原性の減少及び安定性の増加を示す。マウス免疫グロブリン可変ドメインをクローニングするための一般的技術は、例えば、Orlandi et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA
86: 3833 (1989)に開示されている。キメラ抗体を構築するための技術は、当業者に周知である。一例として、Leung et al., Hybridoma 13:469 (1994)では、マウスＬＬ２、抗ＣＤ２２モノクローナル抗体のＶκ及びＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列を、それぞれのヒトκ及びＩｇＧ１定常領域ドメインと組み合わせることによるＬＬ２キメラが産生された。
【００３５】
ヒト化抗体
ヒト化ＭＡｂを産生するための技術は、当技術分野で周知である（例えば、Jones et al., Nature 321: 522 (1986)、Riechmann
et al., Nature 332: 323 (1988)、Verhoeyen et al.,
Science 239: 1534 (1988)、Carter et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA
89: 4285 (1992)、Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12: 437
(1992)、及びSinger et al., J. Immun. 150: 2844 (1993)を参照）。キメラ又はマウスモノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖可変鎖に由来するマウスＣＤＲを、ヒト抗体の対応する可変ドメインに移植することによりヒト化することができる。キメラモノクローナル抗体のマウスフレームワーク領域（ＦＲ）も、ヒトＦＲ配列と置換される。マウスＣＤＲを単にヒトＦＲに移植することでは、抗体親和性の低減がもたらされることが多く、又は喪失がもたらされることさえあり、マウス抗体の元々の親和性を回復するには、追加的な修飾が必要な場合がある。これは、ＦＲ領域の１つ又は複数のヒト残基を、それらのマウス対応物と置換して、そのエピトープに対する良好な結合親和性を有する抗体を得ることにより達成することができる。例えば、Tempest et al., Biotechnology 9:266 (1991)及びVerhoeyen
et al., Science 239: 1534 (1988)を参照されたい。一般的に、それらのマウス対応物とは異なっており、１つ又は複数のＣＤＲアミノ酸残基に接近して位置するか又は接しているヒトＦＲアミノ酸残基が、置換の候補になるだろう。
【００３６】
ヒト抗体
コンビナトリアル手法又はヒト免疫グロブリン遺伝子座で形質転換されたトランスジェニック動物のいずれかを使用して完全ヒト抗体を産生する方法は、当技術分野で公知である（例えば、Mancini et al., 2004, New Microbiol. 27:315-28；Conrad and Scheller, 2005, Comb. Chem. High Throughput Screen. 8:117-26；Brekke and Loset, 2003, Curr. Opin. Phamacol. 3:544-50）。完全ヒト抗体は、遺伝子又は染色体形質移入法、並びにファージディスプレイ技術によっても構築することができ、それらは全て当技術分野で公知である。例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)を参照されたい。そのような完全ヒト抗体は、キメラ又はヒト化抗体よりも更に少ない副作用を示し、本質的に内因的なヒト抗体としてｉｎ  ｖｉｖｏで機能すると予測される。ある実施形態では、特許請求されている方法及び手順には、そのような技術により産生されるヒト抗体が使用されてもよい。
【００３７】
１つの代替案では、ファージディスプレイ技術を使用して、ヒト抗体を産生してもよい（例えば、Dantas-Barbosa et al., 2005, Genet. Mol. Res. 4:126-40）。ヒト抗体は、正常なヒト、又は癌等の特定の疾患状態を示すヒトから産生することができる（Dantas-Barbosa et al., 2005）。疾患個体からヒト抗体を構築する利点は、循環中の抗体レパートリーが、疾患関連抗原に対する抗体に偏っている場合があるということである。
【００３８】
この方法の１つの非限定的な例では、Ｄａｎｔａｓ-Ｂａｒｂｏｓａら（２００５年）は、骨肉腫患者からヒトＦａｂ抗体断片のファージディスプレイライブラリーを構築した。一般的に、全ＲＮＡが、循環中の血液リンパ球から取得された（同上）。組換えＦａｂが、μ、γ、及びκ鎖抗体レパートリーからクローニングされ、ファージディスプレイライブラリーに挿入された（同上）。ＲＮＡが、ｃＤＮＡに変換され、重鎖及び軽鎖免疫グロブリン配列に対する特異的プライマーを使用して、Ｆａｂ  ｃＤＮＡライブラリーを製作するために使用された（Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581-97）。ライブラリー構築は、Ａｎｄｒｉｓ-Ｗｉｄｈｏｐｆら（2000, In: Phage Display Laboratory
Manual, Barbas et al. (eds), 1st edition, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY pp. 9.1 to 9.22）に従って実施された。最終Ｆａｂ断片は、制限エンドヌクレアーゼで消化され、バクテリオファージゲノムに挿入され、ファージディスプレイライブラリーが製作された。そのようなライブラリーは、当技術分野で公知の標準的ファージディスプレイ法によりスクリーニングすることができる（例えば、Pasqualini and Ruoslahti, 1996, Nature 380:364-366；Pasqualini, 1999, The Quart. J. Nucl. Med. 43:159-162を参照）。
【００３９】
ファージディスプレイは、様々な形式で実施することができ、それらの総説は、例えば、Johnson and Chiswell, Current Opinion in Structural Biology3:5564-571
(1993)を参照されたい。ヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化Ｂ細胞により産生することもできる。参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，５６７，６１０号及び第５，２２９，２７５号を参照されたい。当業者あれば、これら技術は例示であり、ヒト抗体又は抗体断片を製作及びスクリーニングするための任意の公知な方法が使用できることを理解するだろう。
【００４０】
別の代替案では、ヒト抗体を産生するように遺伝子操作されたトランスジェニック動物を使用して、本質的にあらゆる免疫原標的に対する抗体を、標準的免疫プロトコールを使用して産生することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法は、Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994)、Lonberg
et al., Nature 368:856 (1994)、及びTaylor et al., Int. Immun.
6:579 (1994)により開示されている。そのような系の非限定的な例は、Ａｂｇｅｎｉｘ社製（フリーモント、カリフォルニア州）のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）である（例えば、Green et al., 1999, J. Immunol. Methods 231:11-23）。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）及び類似の動物では、マウス抗体遺伝子が不活化され、機能的なヒト抗体遺伝子と置換されているが、マウス免疫系の残りは無傷のままである。
【００４１】
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、アクセサリー遺伝子及び調節配列と共に、大部分の可変領域配列を含むヒトＩｇＨ及びＩｇｋａｐｐａ遺伝子座の一部分を含有していた生殖系構成のＹＡＣ（酵母人工染色体）で形質転換されていた。ヒト可変領域レパートリーを使用して、抗体産生Ｂ細胞を生成することができ、それを公知の技術で処理してハイブリドーマにすることができる。標的抗原で免疫されたＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、通常の免疫応答によりヒト抗体を産生することになり、抗体は、上記で考察された標準的技術により回収及び／又は産生することができる。様々な系統のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）が入手可能であり、それらの各々は、様々なクラスの抗体を産生することが可能である。トランスジェニック的に産生されたヒト抗体は、治療能力を有し、その一方で通常のヒト抗体の薬物動態学的特性を保持することが示されている（Green et al., 1999）。当業者であれば、特許請求されている組成物及び方法は、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系の使用に限定されず、ヒト抗体を産生するように遺伝子操作されたあらゆるトランスジェニック動物を使用することができることを理解するだろう。
【００４２】
抗体断片
特定のエピトープを認識する抗体断片を、公知の技術により産生することができる。抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、及びｓＦｖ等の、抗体の抗原結合部分である。Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗体分子のペプシン消化により産生することができ、Ｆａｂ’断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することにより生成することができる。或いは、Ｆａｂ’発現ライブラリーを構築して（Huse et al., 1989, Science, 246:1274-1281）、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ’断片の迅速で容易な特定を可能にすることができる。Ｆ（ａｂ）２断片は、抗体のパパイン消化により生成することができる。
【００４３】
単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）は、ＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む。ＶＬ及びＶＨドメインは、結合して標的結合部位を形成する。これら２つのドメインは、ペプチドリンカー（Ｌ）により、更に共有結合で結合される。ｓｃＦｖ分子を製作し、好適なペプチドリンカー設計する方法は、米国特許第４，７０４，６９２号、米国特許第４，９４６，７７８号、R. Raag and M. Whitlow, “Single Chain
Fvs.” FASEB Vol 9:73-80 (1995)、及びR.E. Bird and B.W. Walker, “Single Chain
Antibody Variable Regions,” TIBTECH, Vol 9: 132-137
(1991)に記載されている。
【００４４】
また、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）を産生するための技術は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＣｏｓｓｉｎｓら（2006, Prot Express Purif 51:253-259）に開示されているように、当技術分野で公知である。
【００４５】
抗体断片は、全長抗体のタンパク質加水分解により、又は断片をコードするＤＮＡを大腸菌若しくは別の宿主で発現させることにより調製することができる。抗体断片は、従来方法により全長抗体をペプシン又はパパイン消化することにより得ることができる。これら方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、米国特許第４，０３６，９４５号、及び第４，３３１，６４７号、並びにそこに含まれている参考文献により記載されている。また、Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89: 230 (1960)；Porter, Biochem. J. 73: 119 (1959)、Edelman
et al., in METHODS IN ENZYMOLOGY VOL. 1, page 422 (Academic Press 1967)、及びColiganの２．８．１〜２．８．１０頁及び２．１０．〜２．１０．４頁を参照されたい。
【００４６】
公知の抗体
使用される抗体は、幅広く多様な公知の供給源から商業的に取得することができる。例えば、様々な抗体分泌ハイブリドーマ系統が、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、マナッサス、バージニア州）から入手可能である。腫瘍関連抗原を含むがそれに限定されない種々の疾患標的に対する多数の抗体が、ＡＴＣＣに寄託されており、及び／又は可変領域配列が公表されており、特許請求されている方法及び組成物で使用するために入手可能である。例えば、以下を参照されたい：米国特許第７，３１２，３１８号；第７，２８２，５６７号；第７，１５１，１６４号；第７，０７４，４０３号；第７，０６０，８０２号；第７，０５６，５０９号；第７，０４９，０６０号；第７，０４５，１３２号；第７，０４１，８０３号；第７，０４１，８０２号；第７，０４１，２９３号；第７，０３８，０１８号；第７，０３７，４９８号；第７，０１２，１３３号；第７，００１，５９８号；第６，９９８，４６８号；第６，９９４，９７６号；第６，９９４，８５２号；第６，９８９，２４１号；第６，９７４，８６３号；第６，９６５，０１８号；第６，９６４，８５４号；第６，９６２，９８１号；第６，９６２，８１３号；第６，９５６，１０７号；第６，９５１，９２４号；第６，９４９，２４４号；第６，９４６，１２９号；第６，９４３，０２０号；第６，９３９，５４７号；第６，９２１，６４５号；第６，９２１，６４５号；第６，９２１，５３３号；第６，９１９，４３３号；第６，９１９，０７８号；第６，９１６，４７５号；第６，９０５，６８１号；第６，８９９，８７９号；第６，８９３，６２５号；第６，８８７，４６８号；第６，８８７，４６６号；第６，８８４，５９４号；第６，８８１，４０５号；第６，８７８，８１２号；第６，８７５，５８０号；第６，８７２，５６８号；第６，８６７，００６号；第６，８６４，０６２号；第６，８６１，５１１号；第６，８６１，２２７号；第６，８６１，２２６号；第６，８３８，２８２号；第６，８３５，５４９号；第６，８３５，３７０号；第６，８２４，７８０号；第６，８２４，７７８号；第６，８１２，２０６号；第６，７９３，９２４号；第６，７８３，７５８号；第６，７７０，４５０号；第６，７６７，７１１号；第６，７６４，６８８号；第６，７６４，６８１号；第６，７６４，６７９号；第６，７４３，８９８号；第６，７３３，９８１号；第６，７３０，３０７号；第６，７２０，１５号；第６，７１６，９６６号；第６，７０９，６５３号；第６，６９３，１７６号；第６，６９２，９０８号；第６，６８９，６０７号；第６，６８９，３６２号；第６，６８９，３５５号；第６，６８２，７３７号；第６，６８２，７３６号；第６，６８２，７３４号；第６，６７３，３４４号；第６，６５３，１０４号；第６，６５２，８５２号；第６，６３５，４８２号；第６，６３０，１４４号；第６，６１０，８３３号；第６，６１０，２９４号；第６，６０５，４４１号；第６，６０５，２７９号；第６，５９６，８５２号；第６，５９２，８６８号；第６，５７６，７４５号；第６，５７２，８５６号；第６，５６６，０７６号；第６，５６２，６１８号；第６，５４５，１３０号；第６，５４４，７４９号；第６，５３４，０５８号；第６，５２８，６２５号；第６，５２８，２６９号；第６，５２１，２２７号；第６，５１８，４０４号；第６，５１１，６６５号；第６，４９１，９１５号；第６，４８８，９３０号；第６，４８２，５９８号；第６，４８２，４０８号；第６，４７９，２４７号；第６，４６８，５３１号；第６，４６８，５２９号；第６，４６５，１７３号；第６，４６１，８２３号；第６，４５８，３５６号；第６，４５５，０４４号；第６，４５５，０４０号、第６，４５１，３１０号；第６，４４４，２０６号、第６，４４１，１４３号；第６，４３２，４０４号；第６，４３２，４０２号；第６，４１９，９２８号；第６，４１３，７２６号；第６，４０６，６９４号；第６，４０３，７７０号；第６，４０３，０９１号；第６，３９５，２７６号；第６，３９５，２７４号；第６，３８７，３５０号；第６，３８３，７５９号；第６，３８３，４８４号；第６，３７６，６５４号；第６，３７２，２１５号；第６，３５９，１２６号；第６，３５５，４８１号；第６，３５５，４４４号；第６，３５５，２４５号；第６，３５５，２４４号；第６，３４６，２４６号；第６，３４４，１９８号；第６，３４０，５７１号；第６，３４０，４５９号；第６，３３１，１７５号；第６，３０６，３９３号；第６，２５４，８６８号；第６，１８７，２８７号；第６，１８３，７４４号；第６，１２９，９１４号；第６，１２０，７６７号；第６，０９６，２８９号；第６，０７７，４９９号；第５，９２２，３０２号；第５，８７４，５４０号；第５，８１４，４４０号；第５，７９８，２２９号；第５，７８９，５５４号；第５，７７６，４５６号；第５，７３６，１１９号；第５，７１６，５９５号；第５，６７７，１３６号；第５，５８７，４５９号；第５，４４３，９５３号、第５，５２５，３３８号、これらの各々の実施例部分は、参照により本明細書に組み込まれる。これらは例示に過ぎず、幅広く多様な他の抗体及びそれらのハイブリドーマが、当技術分野で公知である。当業者であれば、ほとんど全ての疾患関連抗原に対する抗体配列又は抗体分泌ハイブリドーマは、選択された目的の疾患関連標的に対する抗体について、ＡＴＣＣ、ＮＣＢＩ、及び／又はＵＳＰＴＯデータベースを単に検索することにより得ることができることを理解するだろう。クローニングされた抗体の抗原結合ドメインは、当技術分野で周知の標準的技術を使用して、増幅し、切断し、発現ベクターにライゲーションし、適した宿主細胞に形質移入し、タンパク質産生に使用することができる。
【００４７】
免疫複合体
ある実施形態では、抗体又はその断片は、１つ又は複数の治療薬又は診断薬に結合されていてもよい。治療薬は同じである必要はなく、異なっていてもよく、例えば薬物及び放射性同位元素であってもよい。例えば、１３１Ｉを抗体又は融合タンパク質のチロシンに組み込み、薬物をリジン残基のイプシロンアミノ基に結合することができる。また、治療薬及び診断薬を、例えば、還元型ＳＨ基及び／又は糖側鎖に結合させることができる。治療薬又は診断薬と抗体又は融合タンパク質との共有結合又は非共有結合による結合体を製作するための多数の方法が、当技術分野で公知であり、任意のそのような公知の方法を使用することができる。
【００４８】
治療薬又は診断薬は、ジスルフィド結合の形成により、還元型抗体成分のヒンジ領域に結合させることができる。或いは、そのような作用剤は、Ｎ-スクシニル３-（２-ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）等のヘテロ二官能性架橋剤を使用して結合させることができる。Yu et al., Int. J. Cancer 56: 244 (1994)。そのような結合形成の一般的技術は、当技術分野で周知である。例えば、Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING (CRC Press
1991)；Upeslacis et al., “Modification of Antibodies by Chemical Methods,” in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch et al.
(eds.), pages 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995)；Price, “Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived
Antibodies,” in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION,
ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter et al. (eds.), pages 60-84
(Cambridge University Press 1995)を参照されたい。或いは、治療薬又は診断薬は、抗体のＦｃ部分の糖部分を介して結合させることができる。糖基を使用して、チオール基に結合されている同じ作用剤の負荷量を増加させてもよく、又は糖部分を使用して異なる治療薬又は診断薬を結合させてもよい。
【００４９】
抗体糖部分を介してペプチドを抗体成分に結合させるための方法は、当業者に周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるShih et al., Int. J. Cancer 41: 832 (1988)；Shih
et al., Int. J. Cancer 46: 1101 (1990)；及びShih et al.、米国特許第５，０５７，３１３号を参照されたい。一般的な方法には、酸化された糖部分を有する抗体成分を、少なくとも１つの遊離アミン官能基を有する担体ポリマーと反応させることが伴う。この反応により、最初にシッフ塩基（イミン）結合がもたらされ、第二級アミンを還元することによりそれが安定化されて、最終結合体が形成される。
【００５０】
免疫複合体の抗体成分として使用される抗体が抗体断片である場合、Ｆｃ領域は存在しなくともよい。しかしながら、全長抗体又は抗体断片の軽鎖可変領域に糖部分を導入することは可能である。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるLeung et al., J. Immunol. 154: 5919 (1995)；Hansen
et al.、米国特許第５，４４３，９５３号（１９９５年）、Leung et al.、米国特許第６，２５４，８６８号を参照されたい。操作された糖部分を使用して、治療薬又は診断薬を結合させる。
【００５１】
幾つかの実施形態では、キレート剤を、抗体、抗体断片、又は融合タンパク質に結合させ、放射性核種等の治療薬又は診断薬をキレートするために使用することができる。例示的なキレート剤には、これらに限定されないが、ＤＴＰＡ（Ｍｘ-ＤＴＰＡ等）、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ、ＮＥＴＡ、又はＮＯＴＡが含まれる。金属又は他のリガンドをタンパク質に結合させるためのキレート剤の結合方法及び使用方法は、当技術分野で周知である（例えば、その実施例部分が参照により本明細書に組み込まれる米国特許７，５６３，４３３号を参照）。
【００５２】
ある実施形態では、放射性金属又は常磁性イオンを、イオンと結合するための複数のキレート基をそれに結合させることができる長い尾部を有する試薬と反応させることにより、タンパク質又はペプチドに結合することができる。そのような尾部は、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビス-チオセミカルバゾン、ポリオキシム（polyoxim）、及びこの目的に有用であることが知られているような基等の、キレート基に結合することができるペンダント基を有するポリリシン、ポリサッカライド、又は他の誘導体化された鎖若しくは誘導体化可能な鎖等のポリマーであってもよい。
【００５３】
キレート剤は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，８２４，６５９号に開示されているように、抗体又はペプチドに直接結合されていてもよい。特に有用な金属キレート剤の組み合わせには、放射性イメージング用に、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、１８Ｆ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９９ｍＴｃ、９４ｍＴｃ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、７６Ｂｒ等の６０〜４，０００ｋｅＶの一般的エネルギー範囲の診断用同位体と共に使用される２-ベンジル-ＤＴＰＡ並びにそのモノメチル及びシクロヘキシル類似体が含まれる。同じキレート剤は、マンガン、鉄、及びガドリニウム等の非放射性金属と錯体化させると、ＭＲＩに有用である。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、及びＴＥＴＡ等の大環状キレート剤は、それぞれ、様々な金属及び放射性金属と共に、最も具体的にはガリウム、イットリウム、及び銅の放射性核種と共に使用される。そのような金属キレート剤錯体は、環サイズを目的金属に合わせることにより非常に安定化させることができる。ＲＡＩＴ用の２２３Ｒａ等の核種に安定的に結合することが興味深い大環状ポリエーテル等の他の環型キレート剤が包含される。
【００５４】
より最近には、例えばＦ-１８をアルミニウム等の金属又は他の原子と反応させることによる、ＰＥＴ走査技術に使用される１８Ｆの標識方法が開示されている。１８Ｆ-Ａｌ結合体は、抗体に直接結合されるか、又は事前標的法で標的設定可能な構築体を標識するために使用されるＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、又はＮＥＴＡ等のキレート基と錯体化させてもよい。そのようなＦ-１８標識技術は、米国特許第７，５６３，４３３号に開示されており、その実施例部分は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５５】
ランピルナーゼ（Ｒａｐ）を含む免疫毒素
腫瘍標的化抗体又は抗体断片をＲａｐに結合又は融合することは、最初にＬＬ２-オンコナーゼ（Newton et al., Blood 2001;97:528-35）、Ｒａｐ及びマウス抗ＣＤ２２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を含む化学結合体について、その後２Ｌ-Ｒａｐ-ｈＬＬ１-γ４Ｐ（例えば、下記の実施例２を参照）、Ｒａｐ及びヒト化抗ＣＤ７４  ｍＡｂを含む融合タンパク質（Stein et al., Blood 2004;104:3705-11）について実証されたように、その効力を増強する有望な手法である。
【００５６】
２Ｌ-Ｒａｐ-ｈＬＬ１-γ４Ｐを生成するために使用された方法により、本発明者らは、一般的に２Ｌ-Ｒａｐ-Ｘと呼ばれる、一連の構造的に類似した免疫毒素を開発することができた。それらの全ては、各々が可撓性リンカーを介して目的抗体（Ｘ）の１つのＬ鎖のＮ末端に接続されている２つのＲａｐ分子で構成されている。本発明者らは、Ａｓｎ６９の潜在的グリコシル化部位が、Ｇｌｎ（又はＱ、単一レターコード）に変更されていることを示すために、Ｒａｐ（Ｑ）と称するＲａｐの非グリコシル化形態とＲａｐを置換することにより、２ＬＲａｐ（Ｑ）-Ｘと呼ばれる同じ設計の別の一連の免疫毒素も生成した。一連の物質の両方について、本発明者らは、ＩｇＧをＩｇＧ１（γ１）又はＩｇＧ４（γ４）のいずれかとして製作し、ＩｇＧ４半分子の形成を防止するために（Aalberse and Schuurman, Immunology 2002;105:9-19）、本発明者らは、ＩｇＧ４のヒンジ領域のセリン残基（Ｓ２２８）をプロリンに変換した（γ４Ｐ）。２Ｌ-Ｒａｐ-Ｘ又は５  ２Ｌ-Ｒａｐ（Ｑ）-Ｘの模式的構造は、図１に示されている。この設計は、このＲＮａｓｅが完全に機能的であるためには、ＲａｐのＮ末端のピログルタミン酸残基が必要であることにより決定される（Liao et al., Nucleic Acids Res 2003;31:5247-55）。
【００５７】
Ｔｒｏｐ-２を発現する固形癌の潜在的治療剤としてのｍＲＳ７の有用性を探求するために、ｍＲＳ７の相補性決定領域をヒトＩｇＧ１フレームワークに移植することにより、ヒト化ＲＳ７（ｈＲＳ７）を製作し（Qu et al., Methods 2005;36:84-95）、Ｒａｐ（Ｑ）と融合させて、２Ｌ-Ｒａｐ（Ｑ）-ｈＲＳ７がもたらされ、以降はそれを（Ｑ）-ｈＲＳ７と略す。
【００５８】
下記の実施例に記載の研究において、本発明者らは、（Ｑ）-ｈＲＳ７が、（ｉ）哺乳動物宿主中で産生され、均質に精製することができ、（ｉｉ）ｈＲＳ７の結合特異性及び親和性、並びにＲａｐのＲＮａｓｅ活性を保持し、（ｉｉｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて種々のＴｒｏｐ-２発現癌細胞系の増殖をナノモル濃度で抑制し、（ｉｖ）ｉｎ  ｖｉｖｏでヒト肺腫瘍異種移植片の増殖を阻害することを示すことにより、腫瘍標的化ｍＡｂへのＲａｐ又はＲａｐ（Ｑ）のＮ末端融合が、新規の免疫毒素を生成するための有効で用途の広い手法であることを示す。
【００５９】
当業者であれば、本発明で使用するのに好適な細胞毒性ＲＮａｓｅ部分には、天然ランピルナーゼ構造体及びその全ての酵素活性変異体を有するポリペプチドが含まれることを認識するだろう。これら分子は、ＲＮａｓｅ活性に必須であると考えられるＮ末端ピログルタミン酸残基を好都合に有し、哺乳動物ＲＮａｓｅ阻害剤により実質的に阻害されない。天然細胞毒性ＲＮａｓｅをコードする核酸は、適切な配列のクローニング及び制限により、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ増幅を使用することにより調製することができる。ヒョウガエルランピルナーゼのアミノ酸配列は、Ardelt et al., J. Biol. Chem., 256: 245 (1991)から得ることができ、天然ランピルナーゼ又はその保存的に修飾された異形をコードするｃＤＮＡ配列は、ｈＬＬ２ヒト化に使用される一括Ｖ遺伝子構築法に類似した方法により遺伝子合成することができる。（Leung et al., Mol. Immunol., 32: 1413, 1995）。細胞毒性ＲＮａｓｅ変異体を製作する方法は、当技術分野で公知であり、通常の技術内にある。
【００６０】
或いは、細胞毒性ＲＮａｓｅ又はその変異体をコードする核酸は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成することができる。化学合成により、一本鎖オリゴヌクレオチドが生成される。これを、相補的配列とのハイブリダイゼーションにより、又は短プライマー及び一本鎖をテンプレートとして使用したＤＮＡポリメラーゼによる重合により二本鎖ＤＮＡに変換することができる。化学合成は、約１００塩基の配列に最も適しており、より長い配列は、より短い配列をライゲーションすることにより得ることができる。以下の実施例２では、細胞毒性ＲＮａｓｅ遺伝子を得るための１つの例示的な方法が提供されている。
【００６１】
ドックアンドロック（ＤＮＬ）法
「ドックアンドロック」（ＤＮＬ）法では、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の制御（Ｒ）サブユニットと、Ａキナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）のアンカードメイン（ＡＤ）との間に生じる特異的タンパク質間相互作用が活用される（Baillie et al., FEBS
Letters. 2005; 579: 3264。Wong and Scott, Nat. Rev. Mol.
Cell Biol. 2004; 5: 959）。ＰＫＡは、Ｒサブユニットに対するセカンドメッセンジャーｃＡＭＰの結合により引き起こされる、最もよく研究されているシグナル伝達経路の１つに中心的な役割を果たしており、１９６８年にウサギ骨格筋から最初に単離された（Walsh et al., J.
Biol. Chem. 1968;243:3763）。ホロ酵素の構造は、Ｒサブユニットにより不活性形態に保持される２つの触媒サブユニットで構成される（Taylor, J. Biol. Chem. 1989;264:8443）。ＰＫＡのアイソザイムは、２つのタイプのＲサブユニット（ＲＩ及びＲＩＩ）に見出され、各タイプは、α及びβアイソフォームを有する（Scott, Pharmacol. Ther. 1991;50:123）。Ｒサブユニットは、安定した二量体としてのみ単離されており、二量体化ドメインは、最初の４４個アミノ末端残基で構成されることが示されている（Newlon et al., Nat.
Struct. Biol. 1999;6:222）。Ｒサブユニットに対するｃＡＭＰの結合は、広域性セリン／トレオニンキナーゼ活性の活性触媒サブユニットを解放することに結び付き、それは、ＡＫＡＰとのドッキングによるＰＫＡの区画化により、選択された基質に向かって配向される（Scott et al., J.
Biol. Chem. 1990;265;21561）。
【００６２】
最初のＡＫＡＰ、微小管結合タンパク質-２が、１９８４年に特徴付けられて以来（Lohmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA.
1984;81:6723）、原形質膜、アクチン細胞骨格、核、ミトコンドリア、及び小胞体を含む種々の細胞内部位に局在化する５０種を超えるＡＫＡＰが、酵母からヒトに及ぶ種の多様な構造で特定されている（Wong and Scott, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004;5:959）。ＰＫＡに対するＡＫＡＰのＡＤは、１４〜１８残基の両親媒性ヘリックスである（Carr et al., J.
Biol. Chem. 1991;266:14188）。ＡＤのアミノ酸配列は、個々のＡＫＡＰで非常に異なっており、２〜９０ｎＭの範囲の、ＲＩＩ二量体に対する結合親和性が報告されている（Alto et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. 2003;100:4445）。興味深いことには、ＡＫＡＰは、二量体Ｒサブユニットにのみ結合する。ヒトＲＩＩαの場合、ＡＤは、２３個のアミノ末端残基により形成された疎水性表面に結合する（Colledge and Scott, Trends Cell Biol. 1999; 6:216）。従って、ヒトＲＩＩαの二量体化ドメイン及びＡＫＡＰ結合ドメインは両方とも、同じＮ末端４４個アミノ酸配列内に位置しており（Newlon et al., Nat.
Struct. Biol. 1999;6:222；Newlon et al., EMBO J. 2001;20:1651）、本明細書ではＤＤＤと称する。
【００６３】
リンカーモジュールとしてのヒトＲＩＩαのＤＤＤ及びＡＫＡＰのＡＤ
本発明者らは、以降Ａ及びＢと呼ぶ任意の組み合わせの物質とドッキングして非共有結合性複合体になり、ジスルフィド結合の形成を容易にする戦略的位でＤＤＤ及びＡＤの両方にシステイン残基を導入することにより安定した係留構造に更にロックすることができる優れた一対のリンカーモジュールとして、ヒトＰＫＡ  ＲＩＩαのＤＤＤ及びＡＫＡＰタンパク質のＡＤを使用するプラットフォーム技術を開発した。「ドックアンドロック」手法の一般的な方法は、以下の通りである。物質Ａは、ＤＤＤ配列をＡの前駆体に結合することにより構築され、以降ａと呼ぶ第１の成分がもたらされる。ＤＤＤ配列は、二量体の自然形成を生じさせることになるため、従ってＡは、ａ２で構成されることになる。物質Ｂは、ＡＤ配列をＢの前駆体に結合することにより構築され、以降ｂと呼ぶ第２の成分がもたらされる。ａ２に含まれるＤＤＤの二量体モチーフは、ｂに含まれるＡＤ配列と結合するためのドッキング部位を生成し、それによりａ２及びｂの容易な結合を促進し、ａ２ｂで構成される三量体複合体を形成することになる。この結合事象は、ジスルフィド架橋により２つの物質を共有結合で固定するその後の反応により不可逆的となり、これは、最初の結合相互作用が、ＤＤＤ及びＡＤの両方に配置された反応性チオール基を接近させ（Chmura et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. 2001;98:8480）、部位特異的にライゲーションするはずであるため、有効局所濃度の原理に基づき非常に効率的に生じる。ある実施形態では、ａ２サブユニットは、各々が同一のＤＤＤ配列に結合されている、抗体、抗体断片、又は細胞毒素等の２つの同一エフェクター部分を含有していてもよい。三量体ａ２ｂ複合体は、２つのコピーの第１のエフェクター部分、及び１つのコピーの第２のエフェクター部分を含んでいてもよい。
【００６４】
ＤＤＤ及びＡＤを前駆体の官能基から遠ざけて結合させることにより、そのような部位特異的ライゲーションが、前駆体の元々の活性を保存することが予想される。この手法は、性質がモジュール式であり、潜在的に、広範な物質を部位特異的に共有結合で結合するために応用することができる。ＤＮＬ法は、米国特許第７，５５０，１４３号、第７，５２１，０５６号、第７６，５３４，８６６号、第７，５２７，７８７号、及び第７，６６６，４００号に開示されており、各々の実施例部分は、参照により本明細書に組み込まれる。好ましい実施形態では、ＤＮＬ複合体は、三量体構造を含んでいてもよいが、代替的な実施形態では、４つのコピーの毒素部分及び１つのコピーの抗体又は抗体断片等の、他の化学量論が可能である。
【００６５】
好ましい実施形態では、エフェクター部分は、タンパク質又はペプチド、より好ましくは抗体、抗体断片、又は毒素であり、それらは、ＤＤＤ又はＡＤ部分に結合されて、融合タンパク質又はペプチドを形成することができる。目的の融合タンパク質をコードする合成二本鎖核酸を産生する核酸合成、ハイブリダイゼーション、及び／又は増幅を含む、融合タンパク質を製作するための様々な方法が知られている。そのような二本鎖核酸は、標準的分子生物学技術により、融合タンパク質産生用の発現ベクターに挿入することができる（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A
laboratory manual, 2nd Ed, 1989を参照）。そのような好ましい実施形態では、ＡＤ及び／又はＤＤＤ部分は、エフェクタータンパク質又はペプチドのＮ末端又はＣ末端のいずれに結合されていてもよい。しかしながら、当業者であれば、エフェクター部分に対するＡＤ又はＤＤＤ部分の結合部位は、その生理学的活性に関与するエフェクター部分及びエフェクター部分の一部（複数可）の化学的性質に依存して、異なる場合があることを理解するだろう。最も好ましい実施形態では、抗体又は抗体断片に対するＡＤ又はＤＤＤ部分の結合は、分子の抗原結合部位の反対側端部の、重鎖サブユニットのＣ末端で生じる。しかしながら、下記で考察されているように、抗原結合活性を保持させつつ、抗体又は抗体断片に対するＮ末端結合を使用することもできる。様々なエフェクター部分の部位特異的な結合は、二価架橋結合試薬及び／又は他の化学的結合技術の使用等の、当技術分野で公知の技術を使用して実施することができる。
【００６６】
ＤＤＤ及びＡＤ配列変異体
ある実施形態では、免疫毒素ＤＮＬ構築体に組み込まれたＡＤ及びＤＤＤ配列は、以下のＤＤＤ１及びＡＤ１のアミノ酸配列を含む。より好ましい実施形態では、ＡＤ及びＤＤＤ配列は、ＤＤＤ部分とＡＤ部分との間のジスルフィド結合形成を容易にするように設計されているＤＤＤ２及びＡＤ２のアミノ酸配列を含む。
ＤＤＤ１
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１３）
ＤＤＤ２
ＣＧＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１４）
ＡＤ１
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号１５）
ＡＤ２
ＣＧＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡＧＣ（配列番号１６）
【００６７】
当業者であれば、ＤＤＤ１及びＤＤＤ２は、タンパク質キナーゼＡのヒトＲＩＩα型のＤＤＤ配列を含むことを理解するだろう。しかしながら、代替的な実施形態では、ＤＤＤ及びＡＤ部分は、下記のＤＤＤ３、ＤＤＤ３Ｃ、及びＡＤ３に例示されているように、タンパク質キナーゼＡのヒトＲＩα型のＤＤＤ配列及び対応するＡＫＡＰ配列に基づいてもよい。
ＤＤＤ３
ＳＬＲＥＣＥＬＹＶＱＫＨＮＩＱＡＬＬＫＤＳＩＶＱＬＣＴＡＲＰＥＲＰＭＡＦＬＲＥＹＦＥＲＬＥＫＥＥＡＫ（配列番号１７）
ＤＤＤ３Ｃ
ＭＳＣＧＧＳＬＲＥＣＥＬＹＶＱＫＨＮＩＱＡＬＬＫＤＳＩＶＱＬＣＴＡＲＰＥＲＰＭＡＦＬＲＥＹＦＥＲＬＥＫＥＥＡＫ（配列番号１８）
ＡＤ３
ＣＧＦＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＷＳＤＶＦＱＱＧＣ（配列番号１９）
【００６８】
公知のヒトＲＩβ及びＲＩＩβアミノ酸配列に基づく更に他の代替的ＤＤＤ部分を、設計及び使用することができる（例えば、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００１１５８２３３及びＮＰ＿００２７２７、下記の配列を参照）。
ヒトＰＫＡ  ＲＩβアミノ酸配列
ＭＡＳＰＰＡＣＰＳＥ  ＥＤＥＳＬＫＧＣＥＬ  ＹＶＱＬＨＧＩＱＱＶ  ＬＫＤＣＩＶＨＬＣＩ  ＳＫＰＥＲＰＭＫＦＬ  ＲＥＨＦＥＫＬＥＫＥ  ＥＮＲＱＩＬＡＲＱＫ  ＳＮＳＱＳＤＳＨＤＥ  ＥＶＳＰＴＰＰＮＰＶ  ＶＫＡＲＲＲＲＧＧＶ  ＳＡＥＶＹＴＥＥＤＡ  ＶＳＹＶＲＫＶＩＰＫ  ＤＹＫＴＭＴＡＬＡＫ  ＡＩＳＫＮＶＬＦＡＨ  ＬＤＤＮＥＲＳＤＩＦ  ＤＡＭＦＰＶＴＨＩＡ  ＧＥＴＶＩＱＱＧＮＥ  ＧＤＮＦＹＶＶＤＱＧ  ＥＶＤＶＹＶＮＧＥＷ  ＶＴＮＩＳＥＧＧＳＦ  ＧＥＬＡＬＩＹＧＴＰ  ＲＡＡＴＶＫＡＫＴＤ  ＬＫＬＷＧＩＤＲＤＳ  ＹＲＲＩＬＭＧＳＴＬ  ＲＫＲＫＭＹＥＥＦＬ  ＳＫＶＳＩＬＥＳＬＥ  ＫＷＥＲＬＴＶＡＤＡ  ＬＥＰＶＱＦＥＤＧＥ  ＫＩＶＶＱＧＥＰＧＤ  ＤＦＹＩＩＴＥＧＴＡ  ＳＶＬＱＲＲＳＰＮＥ  ＥＹＶＥＶＧＲＬＧＰ  ＳＤＹＦＧＥＩＡＬＬ  ＬＮＲＰＲＡＡＴＶＶ  ＡＲＧＰＬＫＣＶＫＬ  ＤＲＰＲＦＥＲＶＬＧ  ＰＣＳＥＩＬＫＲＮＩ  ＱＲＹＮＳＦＩＳＬＴ  Ｖ（配列番号２０）
ヒトＰＫＡ  ＲＩＩβアミノ酸配列
ＭＳＩＥＩＰＡＧＬＴ  ＥＬＬＱＧＦＴＶＥＶ  ＬＲＨＱＰＡＤＬＬＥ  ＦＡＬＱＨＦＴＲＬＱ  ＱＥＮＥＲＫＧＴＡＲ  ＦＧＨＥＧＲＴＷＧＤ  ＬＧＡＡＡＧＧＧＴＰ  ＳＫＧＶＮＦＡＥＥＰ  ＭＱＳＤＳＥＤＧＥＥ  ＥＥＡＡＰＡＤＡＧＡ  ＦＮＡＰＶＩＮＲＦＴ  ＲＲＡＳＶＣＡＥＡＹ  ＮＰＤＥＥＥＤＤＡＥ  ＳＲＩＩＨＰＫＴＤＤ  ＱＲＮＲＬＱＥＡＣＫ  ＤＩＬＬＦＫＮＬＤＰ  ＥＱＭＳＱＶＬＤＡＭ  ＦＥＫＬＶＫＤＧＥＨ  ＶＩＤＱＧＤＤＧＤＮ  ＦＹＶＩＤＲＧＴＦＤ  ＩＹＶＫＣＤＧＶＧＲ  ＣＶＧＮＹＤＮＲＧＳ  ＦＧＥＬＡＬＭＹＮＴ  ＰＲＡＡＴＩＴＡＴＳ  ＰＧＡＬＷＧＬＤＲＶ  ＴＦＲＲＩＩＶＫＮＮ  ＡＫＫＲＫＭＹＥＳＦ  ＩＥＳＬＰＦＬＫＳＬ  ＥＦＳＥＲＬＫＶＶＤ  ＶＩＧＴＫＶＹＮＤＧ  ＥＱＩＩＡＱＧＤＳＡ  ＤＳＦＦＩＶＥＳＧＥ  ＶＫＩＴＭＫＲＫＧＫ  ＳＥＶＥＥＮＧＡＶＥ  ＩＡＲＣＳＲＧＱＹＦ  ＧＥＬＡＬＶＴＮＫＰ  ＲＡＡＳＡＨＡＩＧＴ  ＶＫＣＬＡＭＤＶＱＡ  ＦＥＲＬＬＧＰＣＭＥ  ＩＭＫＲＮＩＡＴＹＥ  ＥＱＬＶＡＬＦＧＴＮ  ＭＤＩＶＥＰＴＡ（配列番号２１）
【００６９】
他の代替的な実施形態では、ＡＤ及び／又はＤＤＤ部分の様々な配列変異体を、免疫毒素ＤＮＬ構築体の構築に使用することができる。ＡＤ及びＤＤＤドメインの構造機能相関性は、研究の主題となっている。（例えば、Burns-Hamuro et al., 2005, Protein Sci 14:2982-92；Carr et al., 2001, J Biol Chem 276:17332-38；Alto
et al., 2003, Proc Natl Acad Sci USA 100:4445-50；Hundsrucker
et al., 2006, Biochem J 396:297-306；Stokka et al.,
2006, Biochem J 400:493-99；Gold et al., 2006, Mol Cell
24:383-95；Kinderman et al., 2006, Mol Cell 24:397-408を参照、それらの各々の全文は、参照により本明細書に組み込まれる。）
【００７０】
例えば、Ｋｉｎｄｅｒｍａｎら（２００６年）では、ＡＤ-ＤＤＤ結合相互作用の結晶構造が検討され、ヒトＤＤＤ配列は、下記の配列の下線で示されている、二量体形成又はＡＫＡＰ結合のいずれかに重要な多数の保存アミノ酸残基を含有すると結論付けられた。（参照により本明細書に組み込まれるKinderman et al., 2006の図１を参照。）当業者であれば、ＤＤＤ配列の配列変異体を設計する際には、下線の残基のいずれの変更も回避することが望ましいが、二量体化及びＡＫＡＰ結合にはそれほど重要ではない残基の保存的アミノ酸置換は、なされていてもよいことを理解するだろう。従って、ＤＮＬ構築体を構築するための使用される可能性のある代替的ＤＤＤ配列は、配列番号２２で示されており、そこでは「Ｘ」は、保存的アミノ酸置換を表す。保存的アミノ酸置換には、下記により詳細に考察されているが、例えば、グルタミン酸残基のアスパラギン酸残基への置換、又はイソロイシン残基のロイシン若しくはバリン残基への置換等が含まれる。そのような保存的アミノ酸置換は、当技術分野で周知である。
タンパク質キナーゼＡに由来するヒトＤＤＤ配列
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１３）
ＸＸＩＸＩＸＸＸＬＸＸＬＬＸＸＹＸＶＸＶＬＸＸＸＸＸＸＬＶＸＦＸＶＸＹＦＸＸＬＸＸＸＸＸ（配列番号２２）
【００７１】
Ａｌｔｏら（２００３年）は、種々のＡＫＡＰタンパク質のＡＤ配列のバイオインフォマティクス解析を実施し、下記に示されているＡＫＡＰ-ＩＳと呼ばれる、ＤＤＤに対する結合定数が０．４ｎＭであるＲＩＩ選択的ＡＤ配列を設計した。ＡＫＡＰ-ＩＳ配列は、ＰＫＡに対するＡＫＡＰ結合のペプチドアンタゴニストとして設計された。置換がＤＤＤに対する結合を低下させる傾向があるＡＫＡＰ-ＩＳ配列の残基は、下記の配列において下線で示されている。従って、当業者であれば、ＤＮＬ構築体に機能することができる変異体は、「Ｘ」が保存的アミノ酸置換である配列番号２３により示されていることを理解するだろう。
ＡＫＡＰ-ＩＳ配列
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号１５）
ＸＸＸＸＸＡＸＸＩＶＸＸＡＩＸＸＸ（配列番号２３）
【００７２】
同様に、Ｇｏｌｄ（２００６年）は、結晶学及びペプチドスクリーニングを使用して、ＲＩアイソフォームと比較して５桁高い、ＰＫＡのＲＩＩアイソフォームに対する選択性を示す、下記に示されているＳｕｐｅｒＡＫＡＰ-ＩＳ配列を開発した。下線の残基は、ＡＫＡＰ-ＩＳ配列と比べた、ＲＩＩαのＤＤＤ部分に対する結合を増加させるアミノ酸置換の位置を示す。この配列では、Ｎ末端Ｑ残基が残基番号４と付番されており、Ｃ末端Ａ残基が残基番号２０と付番されている。置換を行って、ＲＩＩαに対する親和性に影響を及ぼすことができる残基は、残基８、１１、１５、１６、１８、１９、及び２０であった（Gold et al., 2006）。ある代替的な実施形態では、ＳｕｐｅｒＡＫＡＰ-ＩＳ配列を、ＡＫＡＰ-ＩＳ  ＡＤ部分の配列の代わりに用いて、細胞毒性ＤＮＬ構築体を調製してもよいことが企図される。ＡＫＡＰ-ＩＳ  ＡＤ配列の代わりに用いることができる他の代替的配列は、下記に示されている。ＡＫＡＰ-ＩＳ配列と比べた置換は、下線で示されている。また、ＡＫＡＰ-ＩＳ配列のように、ＡＤ部分は、追加的なＮ末端残基システイン及びグリシン、並びにＣ末端残基グリシン及びシステインを含んでいてもよいことが予想される。
ＳｕｐｅｒＡＫＡＰ-ＩＳ
ＱＩＥＹＶＡＫＱＩＶＤＹＡＩＨＱＡ（配列番号２４）
代替的ＡＫＡＰ配列
ＱＩＥＹＫＡＫＱＩＶＤＨＡＩＨＱＡ（配列番号２５）
ＱＩＥＹＨＡＫＱＩＶＤＨＡＩＨＱＡ（配列番号２６）
ＱＩＥＹＶＡＫＱＩＶＤＨＡＩＨＱＡ（配列番号２７）
【００７３】
Ｇｏｌｄらの図２には、下記に示されている様々なＡＫＡＰタンパク質に由来する追加的なＤＤＤ結合配列が開示された。
ＲＩＩ特異的ＡＫＡＰ
ＡＫＡＰ-ＫＬ
ＰＬＥＹＱＡＧＬＬＶＱＮＡＩＱＱＡＩ（配列番号２８）
ＡＫＡＰ７９
ＬＬＩＥＴＡＳＳＬＶＫＮＡＩＱＬＳＩ（配列番号２９）
ＡＫＡＰ-Ｌｂｃ
ＬＩＥＥＡＡＳＲＩＶＤＡＶＩＥＱＶＫ（配列番号３０）
ＲＩ特異的ＡＫＡＰ
ＡＫＡＰｃｅ
ＡＬＹＱＦＡＤＲＦＳＥＬＶＩＳＥＡＬ（配列番号３１）
ＲＩＡＤ
ＬＥＱＶＡＮＱＬＡＤＱＩＩＫＥＡＴ（配列番号３２）
ＰＶ３８
ＦＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＷＳＤＶＦ（配列番号３３）
二重特異性ＡＫＡＰ
ＡＫＡＰ７
ＥＬＶＲＬＳＫＲＬＶＥＮＡＶＬＫＡＶ（配列番号３４）
ＭＡＰ２Ｄ
ＴＡＥＥＶＳＡＲＩＶＱＶＶＴＡＥＡＶ（配列番号３５）
ＤＡＫＡＰ１
ＱＩＫＱＡＡＦＱＬＩＳＱＶＩＬＥＡＴ（配列番号３６）
ＤＡＫＡＰ２
ＬＡＷＫＩＡＫＭＩＶＳＤＶＭＱＱ（配列番号３７）
【００７４】
また、Ｓｔｏｋｋａら（２００６年）は、下記に示されている、ＰＫＡに対するＡＫＡＰ結合のペプチド競合体を開発した。このペプチドアンタゴニストは、Ｈｔ３１、ＲＩＡＤ、及びＰＶ-３８と称されていた。Ｈｔ-３１ペプチドは、ＰＫＡのＲＩＩアイソフォームに対してより大きな親和性を示し、ＲＩＡＤ及びＰＶ-３８は、ＲＩに対してより高い親和性を示した。
Ｈｔ３１
ＤＬＩＥＥＡＡＳＲＩＶＤＡＶＩＥＱＶＫＡＡＧＡＹ（配列番号３８）
ＲＩＡＤ
ＬＥＱＹＡＮＱＬＡＤＱＩＩＫＥＡＴＥ（配列番号３９）
ＰＶ-３８
ＦＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＷＳＤＶＦＱＱＣ（配列番号４０）
【００７５】
Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒら（２００６年）は、ＰＫＡのＲＩＩ型のＤＤＤに対して０．４ｎＭと低い結合定数を有する、ＰＫＡに対するＡＫＡＰ結合の更に他のペプチド競合体を開発した。種々のＡＫＡＰアンタゴニストペプチドの配列は、下記に再現されているＨｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒらの表１に提供されている。
【表１】
2013503200.tif 000003
【００７６】
様々なＡＫＡＰタンパク質のＡＤドメインで高度に保存されていた残基は、下記のＡＫＡＰ-ＩＳ配列を参照して下線を施すことより下記に示されている。これら残基は、Altoら（２００３年）により観察されたものと同じであり、Ｃ末端アラニン残基が加えられている。（参照により本明細書に組み込まれるHundsrucker et al. (2006)の図４を参照。）ＲＩＩ  ＤＤＤ配列に対して特に高い親和性を有するペプチドアンタゴニストの配列は、ＡＫＡＰ-ＩＳ、ＡＫＡＰ７δ-ｗｔ-ｐｅｐ、ＡＫＡＰ７δ-Ｌ３０４Ｔ-ｐｅｐ、及びＡＫＡＰ７δ-Ｌ３０８Ｄ-ｐｅｐの配列であった。
ＡＫＡＰ-ＩＳ
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号１５）
【００７７】
Ｃａｒｒら（２００１年）は、ヒト及び非ヒトタンパク質とは異なるＡＫＡＰ結合ＤＤＤ配列間の配列相同性の度合いを検討し、様々なＤＤＤ部分で最も高度に保存されていると考えられたＤＤＤ配列の残基を特定した。それらは、ヒトＰＫＡ  ＲＩＩα  ＤＤＤ配列を参照して下線を施すことにより、下記に示されている。特に保存されていた残基は、更に斜字体により示されている。これら残基は、Ｋｉｎｄｅｒｍａｎら（２００６年）が、ＡＫＡＰタンパク質に対する結合に重要であると示唆したものと重複するが、同一ではない。従って、「Ｘ」が保存的アミノ酸置換を表す、可能なＤＤＤ配列が、配列番号５９に示されている。
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１３）
ＸＨＩＸＩＰＸＧＬＸＥＬＬＱＧＹＴＸＥＶＬＲＸＱＰＸＤＬＶＥＦＡＸＸＹＦＸＸＬＸＥＸＲＸ（配列番号５９）
【００７８】
当業者であれば、一般的に、様々なタンパク質に由来するＤＤＤ及びＡＤ配列で高度に保存されているそれらアミノ酸残基は、アミノ酸置換を行う際に依然として変わらないままであることが好ましい残基であるが、それほど高度に保存されない残基は、本明細書に記載のＡＤ及び／又はＤＤＤ配列の配列変異体を生成するためにより安易に変化させてもよいことを理解するだろう。
【００７９】
ＤＤＤ及び／又はＡＤ部分の配列変異体に加えて、ある実施形態では、抗体部分、又は抗体をＡＤ配列に結合するリンカーペプチド配列に配列変異を導入することが好ましい場合がある。１つの例示的な例として、融合タンパク質配列の３つの考え得る変異体が、下記に示されている。
（Ｌ）
ＱＫＳＬＳＬＳＰＧＬＧＳＧＧＧＧＳＧＧＣＧ（配列番号６０）
（Ａ）
ＱＫＳＬＳＬＳＰＧＡＧＳＧＧＧＧＳＧＧＣＧ（配列番号６１）
（-）
ＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＣＧ（配列番号６２）
【００８０】
アミノ酸置換
ある実施形態では、開示された方法及び組成物には、１つ又は複数の置換アミノ酸残基を有するタンパク質又はペプチドの産生及び使用が伴っていてもよい。天然、キメラ、ヒト化、若しくはヒト抗体、又はＡＤ若しくはＤＤＤ配列の構造的、物理的、及び／又は治療的特徴は、１つ又は複数のアミノ酸残基の置換により最適化することができる。例えば、ヒト化抗体の機能的特徴は、限定された数のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）アミノ酸を、親マウス抗体の対応するＦＲアミノ酸で置換することにより向上させることができることは、当技術分野で周知である。フレームワーク領域アミノ酸残基がＣＤＲ残基に近接している場合、これは特に当てはまる。
【００８１】
他の場合には、標的抗原に対する結合親和性、その標的抗原からの抗体の解離速度又はオフ速度、又は更に抗体によるＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）若しくはＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）の誘導有効性等の、抗体の治療特性は、限定された数のアミノ酸置換により最適化することができる。
【００８２】
代替的な実施形態では、主題のＤＮＬ構築体の製作に使用されるＤＤＤ及び／又はＡＤ配列は、例えば、ＤＤＤ-ＡＤ結合親和性を増加させるために更に最適化されていてもよい。ＤＤＤ又はＡＤ配列における可能な配列変異は、上記で議論されている。
【００８３】
当業者であれば、一般的に、アミノ酸置換は、典型的には、あるアミノ酸を比較的類似した特性の別のアミノ酸で置換すること（つまり、保存的アミノ酸置換）を伴うことを認識するだろう。種々のアミノ酸の特性及びタンパク質構造及び機能に対するアミノ酸置換の効果は、当技術分野の広範な研究及び知識の主題である。
【００８４】
例えば、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮してもよい（Kyte & Doolittle, 1982, J. Mol. Biol., 157:105-132）。アミノ酸の相対的な疎水性親水性特徴は、その結果生じるタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質の他の分子との相互作用を規定する。各アミノ酸には、疎水性及び電荷の特徴に基づいて、その疎水性親水性指標が割当てられており（Kyte & Doolittle, 1982）、それらは以下の通りである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（-０．４）；トレオニン（-０．７）；セリン（-０．８）；トリプトファン（-０．９）；チロシン（-１．３）；プロリン（-１．６）；ヒスチジン（-３．２）；グルタミン酸（-３．５）；グルタミン（-３．５）；アスパラギン酸（-３．５）；アスパラギン（-３．５）；リジン（-３．９）；及びアルギニン（-４．５）。保存的置換を行う際は、その疎水性親水性指標が±２以内のアミノ酸を使用することが好ましく、±１以内がより好ましく、及び±０．５以内が更により好ましい。
【００８５】
また、アミノ酸置換は、アミノ酸残基の親水性を考慮に入れてもよい（例えば、米国特許第４，５５４，１０１号）。アミノ酸残基には、親水性値が割当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０）；グルタミン酸（＋３．０）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（-０．４）；プロリン（-０．５．＋-．１）；アラニン（-０．５）；ヒスチジン（-０．５）；システイン（-１．０）；メチオニン（-１．３）；バリン（-１．５）；ロイシン（-１．８）；イソロイシン（-１．８）；チロシン（-２．３）；フェニルアラニン（-２．５）；トリプトファン（-３．４）。アミノ酸は、親水性が類似した他のアミノ酸に置換することが好ましい。
【００８６】
他の考慮すべきことには、アミノ酸側鎖のサイズが含まれる。例えば、一般的には、グリシン又はセリン等の小型側鎖を有するアミノ酸を、かさ高い側鎖を有するアミノ酸、例えばトリプトファン又はチロシンに置換することは、好ましくないだろう。タンパク質二次構造に対する種々のアミノ酸残基の影響も、考慮すべきことである。実証的研究により、タンパク質ドメインがアルファヘリックス、ベータシート、又は逆向ターンの二次構造をとる傾向に対する様々なアミノ酸残基の影響が決定されており、当技術分野で公知である（例えば、Chou
& Fasman, 1974,
Biochemistry, 13:222-245; 1978, Ann. Rev. Biochem., 47: 251-276; 1979, Biophys.
J., 26:367-384を参照）。
【００８７】
そのような考慮及び広範な実証的研究に基づいて、保存的アミノ酸置換の表が作られており、当技術分野で公知である。例えば、アルギニン及びリジン；グルタミン酸及びアスパラギン酸；セリン及びトレオニン；グルタミン及びアスパラギン；並びにバリン、ロイシン、及びイソロイシンである。或いは：Ａｌａ（Ａ）ｌｅｕ、ｉｌｅ、ｖａｌ；Ａｒｇ（Ｒ）ｇｌｎ、ａｓｎ、ｌｙｓ；Ａｓｎ（Ｎ）ｈｉｓ、ａｓｐ、ｌｙｓ、ａｒｇ、ｇｌｎ；Ａｓｐ（Ｄ）ａｓｎ、ｇｌｕ；Ｃｙｓ（Ｃ）ａｌａ、ｓｅｒ；Ｇｌｎ（Ｑ）ｇｌｕ、ａｓｎ；Ｇｌｕ（Ｅ）ｇｌｎ、ａｓｐ；Ｇｌｙ（Ｇ）ａｌａ；Ｈｉｓ（Ｈ）ａｓｎ、ｇｌｎ、ｌｙｓ、ａｒｇ；Ｉｌｅ（Ｉ）ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、ｌｅｕ；Ｌｅｕ（Ｌ）ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、ｉｌｅ；Ｌｙｓ（Ｋ）ｇｌｎ、ａｓｎ、ａｒｇ；Ｍｅｔ（Ｍ）ｐｈｅ、ｉｌｅ、ｌｅｕ；Ｐｈｅ（Ｆ）ｌｅｕ、ｖａｌ、ｉｌｅ、ａｌａ、ｔｙｒ；Ｐｒｏ（Ｐ）ａｌａ；Ｓｅｒ（Ｓ）、ｔｈｒ；Ｔｈｒ（Ｔ）ｓｅｒ；Ｔｒｐ（Ｗ）ｐｈｅ、ｔｙｒ；Ｔｙｒ（Ｙ）ｔｒｐ、ｐｈｅ、ｔｈｒ、ｓｅｒ；Ｖａｌ（Ｖ）ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ｐｈｅ、ａｌａである。
【００８８】
アミノ酸置換に関する他の考慮事項には、残基が、タンパク質の内部に位置しているか否か、又は溶媒に露出しているか否かが含まれる。内部残基の場合、保存的置換には以下のものが含まれるだろう：Ａｓｐ及びＡｓｎ；Ｓｅｒ及びＴｈｒ；Ｓｅｒ及びＡｌａ；Ｔｈｒ及びＡｌａ；Ａｌａ及びＧｌｙ；Ｉｌｅ及びＶａｌ；Ｖａｌ及びＬｅｕ；Ｌｅｕ及びＩｌｅ；Ｌｅｕ及びＭｅｔ；Ｐｈｅ及びＴｙｒ；Ｔｙｒ及びＴｒｐ（例えば、rockefeller.eduのPROWLウェブサイトを参照）。溶媒露出残基の場合、保存的置換には以下のものが含まれるだろう：Ａｓｐ及びＡｓｎ；Ａｓｐ及びＧｌｕ；Ｇｌｕ及びＧｌｎ；Ｇｌｕ及びＡｌａ；Ｇｌｙ及びＡｓｎ；Ａｌａ及びＰｒｏ；Ａｌａ及びＧｌｙ；Ａｌａ及びＳｅｒ；Ａｌａ及びＬｙｓ；Ｓｅｒ及びＴｈｒ；Ｌｙｓ及びＡｒｇ；Ｖａｌ及びＬｅｕ；Ｌｅｕ及びＩｌｅ；Ｉｌｅ及びＶａｌ；Ｐｈｅ及びＴｙｒ（同上）。ＰＡＭ２５０スコアリングマトリックス、Ｄａｙｈｏｆｆマトリックス、Ｇｒａｎｔｈａｍマトリックス、ＭｃＬａｃｈｌａｎマトリックス、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅマトリックス、Ｈｅｎｉｋｏｆｆマトリックス、Ｍｉｙａｔａマトリックス、Ｆｉｔｃｈマトリックス、Ｊｏｎｅｓマトリックス、Ｒａｏマトリックス、Ｌｅｖｉｎマトリックス、及びＲｉｓｌｅｒマトリックス等の種々のマトリックスが、アミノ酸置換の選択を支援するために作られている（同上）。
【００８９】
また、アミノ酸置換を決定する際には、正荷電残基（例えば、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）及び負荷電残基（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）間のイオン結合（塩橋）の形成、又は近隣システイン残基間のジスルフィド結合の形成等の、分子間又は分子内結合の存在を考慮してもよい。
【００９０】
コードされたタンパク質配列の任意のアミノ酸を任意の他のアミノ酸と置換する方法は周知であり、例えば、指定部位突然変異誘発の技術により、又はアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドを合成及び構築して、発現ベクター構築体にスプライシングすることによる当業者の日常的な実験作業の問題である。
【００９１】
治療薬
代替的な実施形態では、細胞毒性薬、抗血管新生作用剤、アポトーシス促進剤、抗生物質、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、ケモカイン、薬物、プロドラッグ、毒素、酵素、又は他の作用剤等の治療薬を、主題の免疫毒素に結合させるか、又は免疫毒素の前に、同時に、若しくは後で別々に投与するかのいずれかで使用することができる。使用される薬物は、抗有糸分裂剤、抗キナーゼ剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質、アルカロイド、抗血管新生剤、アポトーシス促進剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される医薬品特性を有していてもよい。
【００９２】
有用な例示的な薬物には、以下のものが含まれる：５-フルオロウラシル、アプリジン（aplidin）、アザリビン、アナストロゾール、アントラサイクリン、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブリオスタチン１、ブスルファン、カリチアマイシン（calicheamycin）、カンプトテシン、カルボプラチン、１０-ヒドロキシカンプトテシン、カルマスティン、セレブレックス、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、Ｃｏｘ-２阻害剤、イリノテカン（ＣＰＴ-１１）、ＳＮ-３８、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテカン（camptothecan）、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、２-ピロリノドキソルビシン（２Ｐ-ＤＯＸ、2-pyrrolinodoxorubicine）、シアノ-モルホリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エストラムスチン、エピポドフィロトキシン、エストロゲン受容体結合剤、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、エトポシドホスファート、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３’，５’-Ｏ-ジオレオイル-ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ-ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、ファルネシル-タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、Ｌ-アスパラギナーゼ、レノリドアミド（lenolidamide）、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６-メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、ミトマイシン、ミトタン、ナベルビン、ニトロソ尿素（nitrosurea）、プリコマイシン（plicomycin）、プロカルバジン、パクリタキセル、ペントスタチン、ＰＳＩ-３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タキソール、テマゾロミド（temazolomide）（ＤＴＩＣの水性形態）、トランス白金（transplatinum）、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、及びビンカアルカロイド。
【００９３】
使用される毒素には、以下のものが含まれていてもよい：リシン、アブリン、アルファ毒素、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、例えばオンコナーゼ、ＤＮａｓｅＩ、ブドウ球菌腸毒素Ａ、ポークウィード抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、及びシュードモナス内毒素。
【００９４】
使用されるケモカインには、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ１-アルファ、ＭＩＰ１-ベータ、及びＩＰ-１０が含まれていてもよい。
【００９５】
ある実施形態では、アンギオスタチン、バキュロスタチン（baculostatin）、カンスタチン（canstatin）、マスピン、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＰｌＧＦペプチド及び抗体、抗血管増殖因子抗体、抗Ｆｌｋ-１抗体、抗Ｆｌｔ-１抗体及びペプチド、抗Ｋｒａｓ抗体、抗ｃＭＥＴ抗体、抗ＭＩＦ（マクロファージ遊走阻害因子）抗体、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン１２、ＩＰ-１０、Ｇｒｏ-β、トロンボスポンジン、２-メトキシエストラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキシアミドトリアゾール（carboxiamidotriazole）、ＣＭ１０１、マリマスタット、ペントサンポリスルファート、アンギオポエチン-２、インターフェロン-アルファ、ハービマイシンＡ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチン断片、リノミド（ロキニメックス）、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、ＴＮＰ-４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、アキュチン（accutin）、アンギオスタチン、シドホビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ-１４７０、血小板第４因子、又はミノサイクリン等の抗血管新生剤を使用することができる。
【００９６】
使用される免疫調節物質は、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、エリトロポイエチン、トロンボポイエチン、及びそれらの組み合わせから選択されてもよい。特に有用なのは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）等のリンホトキシン、インターロイキン（ＩＬ）等の造血因子、果粒球コロニー刺激因子（Ｇ-ＣＳＦ）又は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ-ＣＳＦ）等のコロニー刺激因子、インターフェロン-α、-β、又は-γ等のインターフェロン、及び「Ｓ１因子」と命名されているもの等の幹細胞増殖因子である。サイトカインには、以下のものが含まれる：ヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン等の成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）等の糖タンパク質ホルモン；肝性増殖因子；プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミューラー阻害物質；マウスゴナドトロピン結合ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポイエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ-β等の神経成長因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-β等の形質転換増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子-Ｉ及び-ＩＩ；エリトロポイエチン（ＥＰＯ）；骨誘導性因子；インターフェロン-α、-β、及び-γ等のインターフェロン；マクロファージ-ＣＳＦ（Ｍ-ＣＳＦ）等のコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ-１、ＩＬ-１α、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１０、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２；ＩＬ-１３、ＩＬ-１４、ＩＬ-１５、ＩＬ-１６、ＩＬ-１７、ＩＬ-１８、ＩＬ-２１、ＩＬ-２５等のインターロイキン（ＩＬ）、ＬＩＦ、ｋｉｔ-リガンド又はＦＬＴ-３、アンギオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子、及びＬＴ。
【００９７】
使用される放射性核種には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、６２Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１１１Ａｇ、６７Ｇａ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１４３Ｐｒ、１４９ｐｍ、１６９Ｅｒ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、及び２１１Ｐｂ。好ましくは、治療用放射性核種は、オージェ放射体の場合は２０〜６，０００ｋｅＶの範囲の、好ましくは６０〜２００ｋｅＶの範囲の、ベータ放射体の場合は１００〜２，５００ｋｅＶの、アルファ放射体の場合は４，０００〜６，０００ｋｅＶの崩壊エネルギーを有する。有用なベータ粒子放射核種の最大崩壊エネルギーは、好ましくは２０〜５，０００ｋｅＶ、より好ましくは１００〜４，０００ｋｅＶ、及び最も好ましくは５００〜２，５００ｋｅＶである。オージェ放射粒子と共に実質的に崩壊する放射性核種も好ましい。例えば、Ｃｏ-５８、Ｇａ-６７、Ｂｒ-８０ｍ、Ｔｃ-９９ｍ、Ｒｈ-１０３ｍ、Ｐｔ-１０９、Ｉｎ-１１１、Ｓｂ-１１９、１-１２５、Ｈｏ-１６１、Ｏｓ-１８９ｍ、及びＩｒ-１９２である。有用なベータ粒子放射核種の崩壊エネルギーは、好ましくは１，０００ｋｅＶ未満、より好ましくは１００ｋｅＶ未満、及び最も好ましくは７０ｋｅＶ未満である。アルファ粒子の生成と共に実質的に崩壊する放射性核種も好ましい。そのような放射性核種には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：Ｄｙ-１５２、Ａｔ-２１１、Ｂｉ-２１２、Ｒａ-２２３、Ｒｎ-２１９、Ｐｏ-２１５、Ｂｉ-２１１、Ａｃ-２２５、Ｆｒ-２２１、Ａｔ-２１７、Ｂｉ-２１３、及びＦｍ-２５５。有用なアルファ粒子放射性核種の崩壊エネルギーは、好ましくは２，０００〜１０，０００ｋｅＶ、より好ましくは３，０００〜８，０００ｋｅＶ、及び最も好ましくは４，０００〜７，０００ｋｅＶである。使用される更なる潜在的な放射性同位元素には、以下のものが含まれる：１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、７５Ｂｒ、１９８Ａｕ、２２４Ａｃ、１２６Ｉ、１３３Ｉ、７７Ｂｒ、１１３ｍＩｎ、９５Ｒｕ、９７Ｒｕ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｕ、１０７Ｈｇ、２０３Ｈｇ、１２１ｍＴｅ、１２２ｍＴｅ、１２５ｍＴｅ、１６５Ｔｍ、１６７Ｔｍ、１６８Ｔｍ、１９７Ｐｔ、１０９Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１９９Ａｕ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５１Ｃｒ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、２０１Ｔｌ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒ、及び１６９Ｙｂ等。幾つかの有用な診断用核種には、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４Ｔｃ、９４ｍＴｃ、９９ｍＴｃ、又は１１１Ｉｎが含まれていてもよい。

【００９８】
治療薬には、光活性剤又は染料が含まれていてもよい。蛍光色素等の蛍光組成物、及び可視光線に感受性のポルフィリン等の他の色原体又は染料は、病変に好適な光を向けることにより病変を検出及び治療するために使用されている。治療では、これは、光放射線治療、光線治療、又は光力学治療と呼ばれている。Jori et al. (eds.), PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER
DISEASES (Libreria Progetto 1985)；van den Bergh, Chem. Britain
(1986), 22:430を参照されたい。更に、光線治療を達成するために、モノクローナル抗体が光活性化染料と結合されている。Mew et al., J. Immunol. (1983),130:1473；同上、Cancer Res. (1985), 45:4380；Oseroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986), 83:8744；同上、Photochem. Photobiol. (1987), 46:83；Hasan et al.,
Prog. Clin. Biol. Res. (1989), 288:471；Tatsuta et al.,
Lasers Surg. Med. (1989), 9:422；Pelegrin et al., Cancer
(1991), 67:2529を参照されたい。
【００９９】
他の有用な治療薬は、好ましくは、ｂｃｌ-２又はｐ５３等の癌遺伝子及び癌遺伝子産物に対して向けられるオリゴヌクレオチド、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。治療用オリゴヌクレオチドの好ましい形態は、ｓｉＲＮＡである。
【０１００】
診断薬
診断薬は、好ましくは、放射性核種、放射線造影剤、常磁性イオン、金属、蛍光標識、化学発光標識、超音波造影剤、及び光活性剤からなる群から選択される。そのような診断薬は周知であり、任意のそのような公知の診断薬を使用することができる。診断薬の非限定的な例には、以下のもの等の放射性核種が含まれていてもよい：１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４〜１５８Ｇｄ、３２Ｐ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂ、８３Ｓｒ、又は他のガンマ-、ベータ-、又はポジトロン-放射体。使用される常磁性イオンには、以下のものが含まれていてもよい：クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、又はエルビウム（ＩＩＩ）。金属造影剤には、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）、又はビスマス（ＩＩＩ）が含まれていてもよい。超音波造影剤は、ガス入りリポソーム等のリポソームを含んでいてもよい。放射線不透過性診断薬は、化合物、バリウム化合物、ガリウム化合物、及びタリウム化合物から選択されてもよい。幅広く多様な蛍光標識が当技術分野で公知であり、これらに限定されないが、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリテリン（phycoerytherin）、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ-フタアルデヒド（o-phthaldehyde）、及びフルオレサミンが含まれる。使用される化学発光標識には、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、又はシュウ酸エステルが含まれていてもよい。
【０１０１】
治療的処置の方法
種々の実施形態は、ヒト、イヌ及びネコ等の家庭内又は伴侶ペットを含む哺乳動物等の対象体の癌を治療する方法であって、治療上有効量の細胞毒性免疫複合体を対象体に投与することを含む方法に関する。
【０１０２】
１つの実施形態では、主題の免疫毒素で治療することができる免疫疾患には、以下のものが含まれる：例えば、強直性脊椎炎、若年性関節リウマチ、関節リウマチ等の関節疾患；多発性硬化症及び重症筋無力症等の神経疾患；糖尿病、特に若年性糖尿病等の膵臓疾患；慢性活動性肝炎、セリアック病、潰瘍性大腸炎、クローン病、悪性貧血等の胃腸管疾患；乾癬又は強皮症等の皮膚疾患；喘息等のアレルギー疾患、及び移植片対宿主病及び同種移植拒絶等の移植関連状態。
【０１０３】
細胞毒性免疫複合体の投与は、標的細胞の表面の別の抗原に結合又は反応する治療上有効量の別の抗体を同時に又は順次投与することにより、補完することができる。好ましい追加的なＭＡｂは、以下のものと反応するＭＡｂからなる群から選択される少なくとも１つのヒト化、キメラ、又はヒトＭＡｂを含む：ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＩＧＦ-１Ｒ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１５４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、Ｂ７、ＡＦＰ、ＰＳＭＡ、ＥＧＰ-１、ＥＧＰ-２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＡＭ４抗原、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、Ｉａ、ＭＩＦ、ＨＭ１．２４、ＨＬＡ-ＤＲ、テネイシン、Ｆｌｔ-３、ＶＥＧＦＲ、ＰｌＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬ-６、ＩＬ-２５、テネイシン、ＴＲＡＩＬ-Ｒ１、ＴＲＡＩＬ-Ｒ２、補体因子Ｃ５、癌遺伝子産物、又はそれらの組み合わせ。抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、及び抗ＣＤ２２抗体等の、使用される種々の抗体は、当業者に公知である。例えば、以下を参照されたい：Ghetie et al., Cancer Res. 48:2610 (1988)；Hekman
et al., Cancer Immunol. Immunother. 32:364 (1991)；Longo,
Curr. Opin. Oncol. 8:353 (1996)、米国特許第５，７９８，５５４号；第６，１８７，２８７号；第６，３０６，３９３号；第６，６７６，９２４号；第７，１０９，３０４号；第７，１５１，１６４号；第７，２３０，０８４号；第７，２３０，０８５号；第７，２３８，７８５号；第７，２３８，７８６号；第７，２８２，５６７号；第７，３００，６５５号；第７，３１２，３１８号；第７，５０１，４９８号；第７，６１２，１８０号；第７，６７０，８０４号；及び米国特許出願公開第２００８０１３１３６３号；第２００７０１７２９２０号；第２００６０１９３８６５号；及び第２００８０１３８３３３号、各々の実施例部分は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０４】
免疫毒素治療は、少なくとも１つの治療薬の同時投与又は順次投与のいずれかで更に補完することができる。例えば、「ＣＶＢ」（１．５ｇ／ｍ２のシクロホスファミド、２００〜４００ｍｇ／ｍ２のエトポシド、及び１５０〜２００ｍｇ／ｍ２のカルマスティン）は、非ホジキンリンパ腫を治療するために使用される投薬計画である。Patti et al., Eur. J. Haematol. 51: 18 (1993)。他の好適な多剤併用化学療法の投薬計画は、当業者に周知である。例えば、Freedman et al., "Non-Hodgkin’s
Lymphomas," in CANCER MEDICINE, VOLUME 2, 3rd Edition, Holland et al.
(eds.), pages 2028-2068 (Lea & Febiger 1993)を参照されたい。例示として、中悪性度の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を治療するための第一世代化学療法投薬計画には、Ｃ-ＭＯＰＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プロカルバジン、及びプレドニゾン）及びＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾン）が含まれる。有用な第二世代の化学療法投薬計画には、ｍ-ＢＡＣＯＤ（メトトレキサート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、デキサメタゾン、及びロイコボリン）であり、好適な第三世代投薬計画は、ＭＡＣＯＰ-Ｂ（メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン、ブレオマイシン、及びロイコボリン）である。追加的な有用薬物には、フェニルブチラート、ベンダムスチン、及びブリオスタチン１が含まれる。
【０１０５】
主題の免疫毒素は、薬学的に有用な組成物を調製する公知の方法により製剤化することができ、それにより免疫毒素は、薬学的に好適な賦形剤を有する混合物と混合される。無菌リン酸緩衝生理食塩水は、薬学的に好適な賦形剤の一例である。他の好適な賦形剤が、当業者に周知である。例えば、Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS,
5th Edition (Lea & Febiger 1990)、及びGennaro (ed.),
REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition (Mack
Publishing Company 1990)、及びそれらの改訂版を参照されたい。
【０１０６】
主題の免疫毒素は、例えば、ボーラス注入又は持続点滴による静脈内投与用に製剤化することができる。好ましくは、免疫毒素は、約４時間未満の期間、より好ましくは約３時間未満の期間にわたって点滴される。例えば、最初の２５〜５０ｍｇを３０分以内に、好ましくは１５分以内にでさえ点滴することができ、残りを次の２〜３時間にわたって点滴することができる。注射用製剤は、単位剤形で、例えばアンプル又は多用量容器で、保存剤を添加して提供することができる。組成物は、懸濁剤、溶液、又は油性又は水性媒体中の乳剤等の形態をとることができ、懸濁化剤、安定化剤、及び／又は分散剤等の製剤化剤を含有することができる。或いは、活性成分は、使用前に好適な媒体、例えば発熱性物質除去滅菌水で構成するための粉末形態であってもよい。
【０１０７】
追加的な製薬方法を使用して、免疫毒素の作用持続時間を制御することができる。放出制御調製物は、免疫毒素と複合体化するか又は吸着するポリマーを使用することにより調製することができる。例えば、生体適合性ポリマーには、ポリ（エチレン-酢酸ビニル共重合体）のマトリックス、及びステアリン酸二量体及びセバシン酸のポリ酸無水物コポリマーのマトリックスが含まれる。Sherwood et al., Bio/Technology 10: 1446 (1992)。そのようなマトリックスからの放出速度は、免疫毒素の分子量、マトリックス内の免疫毒素の量、及び分散粒子のサイズに依存する。Saltzman et al.,
Biophys. J. 55: 163 (1989)；Sherwood et al.、上記。他の固形剤形は、Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS,
5th Edition (Lea & Febiger 1990)、及びGennaro (ed.),
REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition (Mack
Publishing Company 1990)、及びその改訂版に記載されている。
【０１０８】
また、免疫毒素は、哺乳動物に皮下投与してもよく、又は他の非経口経路ででさえも投与することができる。更に、投与は、持続点滴によるものであってもよく、又は単一又は複数ボーラスによるものであってもよい。好ましくは、免疫毒素は、約４時間未満の期間、より好ましくは約３時間未満の期間にわたって点滴される。
【０１０９】
より一般的には、ヒトに投与する免疫毒素の用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全身病状、及び以前の病歴等の要因に依存して変動するだろう。単回の静脈内点滴として約１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量の免疫毒素を受容者に提供することが望ましい場合があるが、状況によっては、より低いか又はより高い用量を投与してもよい。１〜２０ｍｇ／ｋｇの用量は、例えば、７０ｋｇの患者の場合は７０〜１，４００ｍｇであり、又は１．７ｍの患者の場合は４１〜８２４ｍｇ／ｍ２である。投与は、必要に応じて繰り返してもよく、例えば、週１回で４〜１０週間、週１回で８週間、又は週１回で４週間である。また、投与は、維持療法に必要とされるように、隔週で数か月間、又は毎月若しくは年４回で何ヶ月間も等、それほど頻繁でなくともよい。
【０１１０】
或いは、免疫毒素は、２週間毎又は３週毎に１用量を投与して、それを合計少なくとも３用量繰り返してもよい。又は、構築体は、週２回で４〜６週間投与してもよい。用量を、およそ２００〜３００ｍｇ／ｍ２（１．７ｍの患者の場合は１用量当たり３４０ｍｇ、又は７０ｋｇの患者の場合は４．９ｍｇ／ｋｇ）に低下させる場合、週１回で４〜１０週間投与してもよく、又は週２回で４〜１０週間の投与であってさえよい。或いは、投与スケジュールは、少なくしてもよい、つまり隔週又は３週毎で２〜３か月間でもよい。しかしながら、２０ｍｇ／ｋｇを週１回又は２〜３週毎に１回等の、更により高用量を、遅速静脈内点滴で投与サイクルを繰り返すことにより投与することができることが判明している。投薬スケジュールは、随意に他の間隔で繰り返すことができ、用量は、種々の非経口経路により、用量及びスケジュールを適切に調節して投与することができる。
【０１１１】
好ましい実施形態では、免疫毒素は癌の治療に有用である。癌の例には、これらに限定されないが、癌腫、リンパ腫、神経膠芽腫、メラノーマ、肉腫、及び白血病、骨髄腫、又はリンパ性悪性疾患が含まれる。そのような癌のより多くの特定の例は、下記に注記されており、以下のものが含まれる：扁平細胞癌（例えば、上皮扁平細胞癌）、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、星状細胞腫、肺小細胞癌を含む肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、消化官癌を含む胃癌又は胃の癌、膵臓癌、多形膠芽腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、肝細胞癌、神経内分泌腫瘍、髄様甲状腺癌、分化甲状腺癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、子宮内膜癌又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓又は腎癌、前立腺癌、外陰癌、肛門癌、陰茎癌、並びに頭頸部癌。「癌」という用語は、原発性の悪性細胞又は腫瘍（例えば、元の悪性疾患又は腫瘍の部位以外の対象体中の部位にその細胞が移動していないもの）、及び続発性の悪性細胞又は腫瘍（例えば、転移、悪性細胞又は腫瘍細胞が元の腫瘍部位とは異なる二次的部位に移動することにより生じるもの）を含む。本発明の治療方法を実施することができる癌には、ＩＧＦ-１Ｒを発現、過剰発現、又は異常発現する細胞が関与する。
【０１１２】
癌又は悪性疾患の他の例には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：急性幼年期リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄白血病、副腎皮質癌、成人（原発性）肝細胞癌、成人（原発性）肝臓癌、成人急性リンパ性白血病、成人急性骨髄白血病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝癌、成人軟部組織肉腫、エイズ関連リンパ腫、エイズ関連悪性疾患、肛門癌、星状細胞腫、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、腎盂及び尿管の癌、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星細胞腫、大脳星状細胞腫、子宮頚癌、幼年期（原発性）肝細胞癌、幼年期（原発性）肝臓癌、幼年期急性リンパ芽球性白血病、幼年期急性骨髄白血病、幼年期脳幹神経膠腫、幼年期小脳星細胞腫、幼年期大脳星状細胞腫、幼年期頭蓋外胚細胞腫瘍、幼年期ホジキン病、幼年期ホジキンリンパ腫、幼年期視床下部及び視路神経膠腫、幼年期リンパ芽球性白血病、幼年期髄芽細胞腫、幼年期非ホジキンリンパ腫、幼年期松果体及びテント上方未分化神経外胚葉性腫瘍、幼年期原発性肝癌、幼年期横紋筋肉腫、幼年期軟部組織肉腫、幼年期視路及び視床下部神経膠腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、内分泌膵島細胞癌、子宮内膜癌、脳室上衣細胞腫、上皮癌、食道癌、ユーイング肉腫及び関連腫瘍、膵外分泌癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝臓外胆管癌、眼癌、女性乳癌、ゴーシェ病、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、胃腸腫瘍、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、ヘアリーセル白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、高ガンマグロブリン血症、下咽頭癌、腸癌、眼球内黒色腫、島細胞癌、島細胞膵臓癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、口唇及び口腔癌、肝臓癌、肺癌、リンパ増殖性障害、マクログロブリン血症、男性乳癌、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽細胞腫、メラノーマ、中皮腫、転移性潜在性原発性扁平上皮頚部癌、転移性原発性扁平上皮頚部癌、転移性扁平上皮頚部癌、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、骨髄性白血病、骨髄増殖性障害、鼻腔及び副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非メラノーマ皮膚癌、非小細胞肺癌、潜在性原発性転移性扁平上皮頚部癌、口腔咽頭癌、骨／悪性繊維性肉腫、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球症、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度潜在的腫瘍、膵臓癌、パラプロテイン血症、真性赤血球増加症、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂及び尿管癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、肺小細胞癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮頚部癌、胃癌、テント上原発性神経外胚葉及び松果体腫瘍、Ｔ細胞性リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂及び尿管の移行細胞癌、遷移性腎盂及び尿管癌、絨毛性腫瘍、尿管及び腎盂細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視路及び視床下部神経膠腫、外陰癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ヴィルムス腫瘍、及び上記に列挙した臓器系に位置する腫瘍形成以外の任意の他の過剰増殖性疾患。
【０１１３】
本明細書に記載されている及び特許請求されている方法及び組成物を使用して、悪性又は前悪性状態を治療し、上記に記載のそれら障害を含むがそれらに限定されない新生物性状態又は悪性状態への進行を防止することができる。そのような使用は、腫瘍形成又は癌への進行に先行することが知られているか又は疑われている状態、特に過形成、異形成、又は最も具体的には形成異常で構成される非新生物性細胞増殖が生じている状態に適用される（そのような増殖異常状態に関する総説は、Robbins and Angell, Basic Pathology, 2d Ed., W. B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 68-79
(1976)を参照）。
【０１１４】
形成異常は、癌の前兆であることが多く、主として上皮に見出される。形成異常は、個々の細胞均一性、及び細胞の構築配向性の喪失を伴う、最も無秩序な形態の非腫瘍性細胞増殖である。形成異常は、慢性的刺激又は炎症が存在するところに生じることが特徴である。治療することができる形成異常障害には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：無汗性外胚葉性形成異常、前後形成異常、窒息性胸郭形成異常、心房指形成異常、気管支肺異形成、終脳形成異常、子宮頚部形成異常、軟骨外胚葉性形成異常、鎖骨頭蓋異形成、先天性外胚葉性形成異常、頭蓋骨幹形成異常、頭蓋手根足根骨形成異常、頭蓋骨幹端形成異常、象牙質形成異常、骨幹形成異常、外胚葉性形成異常、エナメル質形成異常、脳眼形成異常、骨端半肢形成異常（dysplasia epiphysialis hemimelia）、多発性骨端形成異常、点状骨端形成異常、上皮性形成異常、顔面指趾生殖器形成異常、家族性線維性下顎形成異常、家族性白色襞性形成異常、線維筋性形成異常、線維性骨形成異常、開花性骨形成異常、遺伝性腎網膜形成異常、発汗性外胚葉性形成異常、発汗低下性外胚葉性形成異常、リンパ性減少性胸腺形成異常、乳腺形成異常、下顎顔面形成異常、骨幹端形成異常、モンディーニ型内耳形成異常、単骨性線維性形成異常、粘膜上皮形成異常、多発性骨端形成異常、眼耳脊椎形成異常、眼歯指形成異常、眼脊椎形成異常、歯牙形成異常、眼下顎形成異常（opthalmomandibulomelic dysplasia）、根尖性セメント質形成異常、多骨性線維性形成異常、偽軟骨発育不全脊椎骨端形成異常、網膜形成異常、中隔視覚形成異常、脊椎骨端形成異常、及び心室橈骨形成異常。
【０１１５】
治療することができる追加的な前新生物性疾患には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：良性増殖不全障害（例えば、良性腫瘍、繊維性嚢胞性状態、組織肥大、腸管ポリープ、又は腺腫及び食道形成異常）、白斑症、角化症、ボーエン病、農夫皮膚、日光口唇炎、及び日光角化症。
【０１１６】
好ましい実施形態では、本発明の方法を使用して、癌、特に上記に列挙したものの増殖、進行、及び／又は転移を阻害する。
【０１１７】
追加的な過剰増殖性疾患、障害、及び／又は状態には、これらに限定されないが、以下のもの等の悪性疾患及び関連障害の進行及び／又は転移が含まれる：白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄白血病（骨髄芽球、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、及び赤白血病））及び慢性白血病（例えば、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病及び慢性リンパ性白血病）を含む）、真性赤血球増加、リンパ腫（例えば、ホジキン病及び非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、並びにこれらに限定されないが、以下のもの等の肉腫及び癌腫を含む固形腫瘍：線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛膜癌、セミノーマ、胚性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫（emangioblastoma）、聴神経腫、希突起神経膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽腫、及び網膜芽細胞腫。
【０１１８】
発現ベクター
更に他の実施形態は、抗体、抗体断片、毒素、又はＤＮＬ構築体等の免疫毒素の構成融合タンパク質をコードする核酸を含むＤＮＡ配列に関していてもよい。融合タンパク質は、例えばＡＤ又はＤＤＤ部分に結合された抗体又は断片又は毒素を含んでいてもよい。
【０１１９】
種々の実施形態は、コードＤＮＡ配列を含む発現ベクターに関する。ベクターは、キメラ、ヒト化、又はヒト可変領域配列が結合されていてもよいヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖定常領域並びにヒンジ領域をコードする配列を含有することができる。ベクターは、選択された宿主細胞でコード化タンパク質（複数可）を発現するプロモーター、エンハンサー、及びシグナル又はリーダー配列を更に含有することができる。特に有用なベクターは、ｐｄＨＬ２又はＧＳである。より好ましくは、軽鎖及び重鎖定常領域並びにヒンジ領域は、随意に、アロタイプ位置のアミノ酸の少なくとも１つが、異なるＩｇＧ１アロタイプに見出されるものに変更されており、随意に、ＥＵ付番系に基づくＥＵ重鎖のアミノ酸２５３が、アラニンで置換されていてもよいヒトＥＵミエローマ免疫グロブリンに由来してもよい。Edelman et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 63: 78-85 (1969)を参照されたい。他の実施形態では、ＩｇＧ１配列は、ＩｇＧ４配列に変換されていてもよい。
【０１２０】
当業者であれば、発現構築体を遺伝子操作し、宿主細胞に挿入して操作されたタンパク質を発現させる方法は、当技術分野で周知であり、日常的な実験作業の問題であることを理解するだろう。宿主細胞及びクローニングされた抗体又は断片の発現方法は、例えば、米国特許第７，５３１，３２７号及び第７，５３７，９３０号に記載されており、各々の実施例部分は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２１】
キット
種々の実施形態は、患者の疾患組織を治療又は診断するのに好適な成分を含有するキットに関していてもよい。例示的なキットは、本明細書に記載の１つ又は複数の免疫毒素を含有していてもよい。投与成分を含有する組成物が、経口送達等による消化管を介した送達用に製剤化されていない場合、幾つかの他の経路によりキット成分を送達することが可能なデバイスが含まれていてもよい。非経口送達等の適用用の１つのタイプのデバイスは、対象体の体内に組成物を注射するために使用される注射器である。吸入器を使用することもできる。ある実施形態では、治療薬は、滅菌の液体製剤又は凍結乾燥調製物を含有する事前充填の注射器又はペン型自動注射器の形態で提供することができる。
【０１２２】
キット成分は、一緒に包装されていてもよく、又は２つ以上の容器に分離されてもよい。幾つかの実施形態では、容器は、再構成に好適である、組成物の滅菌凍結乾燥製剤を含有するバイアルであってもよい。また、キットは、再構成及び／又は他の試薬の希釈に好適な１つ又は複数の緩衝液を含有していてもよい。使用することができる他の容器には、これらに限定されないが、ポーチ、トレー、箱、又はチューブ等が含まれる。キット成分は、容器内に滅菌包装及び滅菌維持されていてもよい。含まれていてもよい別の要素は、キットを使用する人に対する使用説明書である。
【０１２３】
実施例
以下の例は、例示のために提供されており、本発明の特許請求の範囲を制限するものではない。
【０１２４】
実施例１．ヒト化内部移行性抗Ｔｒｏｐ-２抗体で標的化されたランピルナーゼ（カエルＲＮａｓｅ）は、多様なヒト上皮癌細胞に対して強力な細胞毒性を示す
本明細書では、ヒト化抗Ｔｒｏｐ-２抗体に組換え的に係留された両生類リボヌクレアーゼを含む新規の免疫毒素が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、子宮頸癌、乳癌、結腸癌、膵臓癌、卵巣癌、及び前立腺癌等の多様なヒト上皮癌細胞系に対して、並びにｉｎ  ｖｉｖｏではヒト肺癌異種移植片に対して、幅広く強力な抗増殖活性を示すことが示されている。
【０１２５】
要約
本発明者らは、本明細書において、Ｒａｐ（Ｑ）、推定Ｎ-グリコシル化部位が除去されたＲａｐの突然変異形態、及びｈＲＳ７、様々な上皮癌で過剰発現される細胞表面糖タンパク質であるＴｒｏｐ-２に対する内部移行性ヒト化抗体を含む２Ｌ-Ｒａｐ（Ｑ）-ｈＲＳ７と称する新規のＩｇＧに基づく免疫毒素の生成を記述する。サイズ排除ＨＰＬＣ、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、フローサイトメトリー、ＲＮａｓｅ活性、内部移行、細胞生存率、及びコロニー形成を含む種々の試験により、この免疫毒素の純度、分子の完全性、幾つかの異なるＴｒｏｐ-２発現細胞系に対するｈＲＳ７の結合親和性が同等であること、及びこれら細胞系の増殖をナノモル濃度で阻害する効力が実証された。また、２Ｌ-Ｒａｐ（Ｑ）-ｈＲＳ７は、Ｃａｌｕ-３ヒト非小細胞肺癌異種移植片を保持するヌードマウスの予防モデルにおいて腫瘍増殖を抑制し、生存期間中央値（ＭＳＴ）を５５から９６日に増加させた（Ｐ＜０．０１）。これらの結果は、子宮頸癌、乳癌、結腸癌、膵臓癌、卵巣癌、及び前立腺癌等の種々のＴｒｏｐ-２発現癌の治療剤としての２Ｌ-Ｒａｐ（Ｑ）-ｈＲＳ７の優れた効能を実証する。
【０１２６】
物質及び方法
細胞系及び細胞培養。子宮頚癌系（ＭＥ-１８０）、乳癌系（Ｔ-４７Ｄ、ＭＤＡ-ＭＢ-４６８、ＳＫ-ＢＲ-３）、前立腺癌系（ＤＵ-１４５、ＰＣ-３、２２Ｒｖ１）、肺腺癌系（Ｃａｌｕ-３）、膵臓癌系（Ｃａｐａｎ-１、ＢｘＰＣ-３、及びＡｓＰｃ-１）、及び卵巣癌系（ＳＫ-ＯＶ-３）を、アメリカ培養細胞系統保存機関（マナッサス、バージニア州）から取得し、１０％加熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ  Ｌ-グルタミン、２００単位／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ  １６４０培地中で５％ＣＯ２、３７℃にて培養した。
【０１２７】
抗体及び試薬。ミラツズマブ（ｈＬＬ１、抗ＣＤ７４）、ｈＲＳ７、組換えランピルナーゼ（ｒＲａｐ）、及びマウス抗Ｒａｐ  ＩｇＧは、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ社から得た。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ、Fluorescein isothiocynate）結合、フィコエリトリン（ＰＥ）結合、又は西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ヒト（ＧＡＨ）又はヤギ抗マウス（ＧＡＭ）ＩｇＧ  Ｆｃ特異的抗体を、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ社（ウエストグローブ、ペンシルベニア州）から購入した。Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ４８８に結合されたＧＡＨ  ＩｇＧ、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ５６８に結合されたヒトトランスフェリン、及びＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カールズバッド、カリフォルニア州）から得た。制限酵素は全て、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社（
ビバリー、マサチューセッツ州）から得た。
【０１２８】
ベクター構築。２Ｌ-Ｒａｐ-ｈＬＬ１-γ４Ｐ発現用のプラスミドｐｄＨＬ２-Ｒａｐ-Ｌ-ｈＬＬ１-γ４Ｐの構築は、下記の実施例２に記載した通りである。発現ベクターｐｄＨＬ２-Ｒａｐ（Ｑ）-Ｌ-ｈＬＬ１-γ４Ｐは、ＲａｐをＲａｐ（Ｑ）に置換することにより、ｐｄＨＬ２-Ｒａｐ-Ｌ-ｈＬＬ１-γ４Ｐから誘導し、（Ｑ）-ｈＲＳ７発現用のプラスミドｐｄＨＬ２-Ｒａｐ（Ｑ）Ｌ-ｈＲＳ７-γ１は、ｐｄＨＬ２-Ｒａｐ（Ｑ）-Ｌ-ｈＬＬ１-γ４Ｐに由来するＲａｐ（Ｑ）遺伝子をｐｄＨＬ２-ｈＲＳ７-γ１ベクターにサブクローニングすることにより構築した。手短かに言えば、ＥｃｏＲＶ制限部位を、好適なプライマーを使用してＰＣＲにより、ｈＲＳ７  ＶＬ遺伝子のＮ末端（５’）側に導入した。リーダーペプチド-Ｒａｐ-リンカーを含有する、ｐｄＨＬ２-Ｒａｐ（Ｑ）-Ｌ-ｈＬＬ１-γ４ＰのＸｂａＩ-ＥｃｏＲＶ断片を、ＰＣＲにより生成された、ｈＲＳ７  ＶＬ遺伝子を含有するＥｃｏＲＶ-ＢａｍＨＩ断片とライゲーションさせ、中間ベクター、ｐＢＳ-Ｒａｐ（Ｑ）-Ｌ-ｈＲＳ７にした。ｐｄＨＬ２-ｈＲＳ７-γ１のＸｂａ-ＢａｍＨＩ断片を、ｐＢＳ-Ｒａｐ（Ｑ）-Ｌ-ｈＲＳ７のＸｂａ-ＢａｍＨＩ断片と置換した。
【０１２９】
形質移入及び選択。ｐｄＨＬ２-Ｒａｐ（Ｑ）-Ｌ-ｈＲＳ７-γ１ベクター（３０μｇ）をＳａｌＩで線形化し、エレクトロポレーションによりＳｐ２／０細胞に形質移入し、それを、１０％低ＩｇＧ  ＦＢＳ、１００単位／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ-グルタミン、１μＭピルビン酸ナトリウム、１００μＭ必須アミノ酸、及び０．０５μＭメトトレキサート（ＭＴＸ）を添加した完全ハイブリドーマ無血清培地中で増殖させた。生存細胞のウェルから得た培養液上清を、ＨＲＰ結合ＧＡＨ  ＩｇＧ  Ｆｃ特異的抗体を使用したＥＬＩＳＡにより、融合タンパク質の発現について分析した。陽性クローンを増殖させ、今後の使用のために凍結した。
【０１３０】
発現及び精製。細胞を回転ボトルで増殖して、最終培養にした（生存率１０〜２０％）。上清をろ過し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ及び１００ｍＭ  ＮａＣｌを含有するｐＨ８．５の緩衝液で既に平衡化されていたプロテインＡカラムにアプライした。負荷した後、カラムを１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄し、１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）で溶出して融合タンパク質を得た。産物を含有するピークを、３Ｍ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ８．５を使用してｐＨ７．０に調整し、４０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析した。濃縮した後、産物を０．２２μｍフィルターでろ過し、２〜８℃で保管した。
【０１３１】
サイズ排除ＨＰＬＣ及びＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析。（Ｑ）-ｈＲＳ７の純度及び分子の完全性を、ＢｉｏＲａｄ社（ハーキュリーズ、カリフォルニア州）から購入したＺｏｒｂａｘカラムを使用したサイズ排除ＨＰＬＣにより、及び４〜２０％Ｔｒｉｓ-グリシンゲル（ＰＡＧＥｒ（登録商標）ＧＯＬＤプレキャストゲル、キャンブレックス社製、ロックランド、メーン州）を使用した、還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより評価した。
【０１３２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写及び翻訳（ＩＶＴＴ）アッセイ。ＲＮａｓｅ活性を、製造業者の説明書に従ってＴＮＴ（登録商標）Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、マディソン、ウィスコンシン州）を使用して、ｄｅ  ｎｏｖｏ合成されたルシフェラーゼの活性を測定することにより、無細胞系で決定した。手短かに言えば、２μＬ中で１０ｐＭ〜１００ｎＭの範囲の濃度の種々の試験試料を、メチオニン及びルシフェラーゼ対照ＤＮＡを含有する８μＬのＴＮＴ（登録商標）Ｑｕｉｃｋ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘに添加し、９６ウェル丸底プレートで２時間３０℃にてインキュベートし、それから２μＬを取り出し、黒色９６ウェル平底プレートで５０μＬのＢｒｉｇｈｔ-Ｇｌｏ基質を用いて分析した。プレートを、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ化学ルミネセンスリーダーで測定した。相対的ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）を、試験試料の濃度に対してプロットした。
【０１３３】
酵母ｔＲＮＡ分解アッセイ。また、ＲＮａｓｅ活性を、酵母ｔＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を基質として使用して形成された過塩素酸可溶性ヌクレオチドの量を測定することにより決定した（Newton et al, Blood 2001;97:528-35）。各試料を、１００μＬの最終容積中に、５ｎＭ（Ｑ）-ｈＲＳ７又はｒＲａｐ；１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．０；２００μｇ／ｍＬヒト血清アルブミン；及び１００μｇ／ｍＬ（３．０９μＭ）〜６００μｇ／ｍＬ（１８．５４μＭ）の範囲の所定濃度のｔＲＮＡを含有するように、無ＲＮａｓｅ水（Ａｍｂｉｏｎ社製、オースティン、テキサス州）を用いて、１．５ｍＬ無ＲＮａｓｅエッペンドルフチューブ中に調製した。酵素反応は、３７℃で２時間実施し、２３３μＬの３．４％氷冷過塩素酸を氷上の各試料に添加することにより終了させた。１０分後、試料を、低温室にて微量遠心分離機を用いて１０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。各試料の上清から一定量を取り出し、水で１０倍希釈し、その２６０ｎｍの光学密度（ＯＤ）を、ブランクとしての水に対して測定した。対応するＯＤ値を反応時間（７２００秒）で除算することにより各基質濃度の初速度を計算し、基質濃度に対してプロットして、ｋｃａｔ／Ｋｍを決定した。これは、ミカエリス‐メンテン式によると、Ｋｍ＞＞［Ｓ］の条件下では、その結果生じた最小２乗直線の傾きを総酵素濃度（ｒＲａｐの場合は５ｎＭ、（Ｑ）-ｈＲＳ７の場合は１０ｎＭ）で除算したものに等しいはずである。
【０１３４】
細胞結合測定。ＥＬＩＳＡに基づく方法を使用して、選択された細胞系に対する（Ｑ）-ｈＲＳ７の結合を以下のように評価した。細胞を、黒色９６ウェル平底プレートに播種し（１×１０５細胞／ウェル；１００μＬ／ウェル）、５％ＣＯ２加湿インキュベーター中で３７℃にて一晩インキュベートした。翌日、細胞を含有するプレートをインキュベーターから取り出し、軽くはじいて培地をウェルから取り除き、その後ペーパータオルに軽く叩いて乾燥した。その後、各ウェルに、５０μＬの新しい増殖培地を入れた。（Ｑ）-ｈＲＳ７の連続１：４希釈物（２００ｎＭ〜１．９ｘ１０-４ｎＭ）を、アッセイ培地（ＲＰＭＩ  １６４０；１０％ＦＢＳ完全培地）で製作し、対応するウェルにトリプリケートで添加した（５０μＬ／ウェル）（終濃度１００ｎＭ〜０．９５×１０-４ｎＭ）。４℃で１．５時間のインキュベーション後、プレートを、６００×ｇで２分間遠心分離し、培地を除去した後ペーパータオルでブロット乾燥し、１５０μＬの氷冷培地を各ウェルに添加することにより洗浄し、その後６００×ｇで２分間遠心分離した。培地を除去し、プレートをブロット乾燥した。ＨＲＰ結合ＧＡＨ抗体を１：２０，０００稀釈で使用し、その後全てのウェルに添加した（１００μＬ／ウェル）。バックグラウンド対照の場合、一組のウェルに、細胞＋二次抗体のみを入れた。プレートを４℃で１時間インキュベートした。その後、プレートを遠心分離し、ブロット乾燥した。その後、細胞を氷冷培地で２回洗浄し、その後氷冷ＰＢＳで３回目の洗浄を行った。遠心分離、培地除去、及びプレートブロットの手順を、各洗浄後に繰り返した。
【０１３５】
最後の洗浄ステップの後、ＬｕｍｉＧＬＯ（ＫＰＬ社製、ゲーサーズバーグ、メリーランド州）を、全てのウェルに添加し（１００μＬ／ウェル）、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーを使用して、プレートのルミネセンスを測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してデータを分析し、最大半量飽和に相当する濃度である、見かけ上の親和性を決定した。各実験では、ｈＲＳ７及びｈＬＬ１は、それぞれ陽性対照及びアイソタイプ対照として含まれていた。或いは、ヒト癌細胞系に対する（Ｑ）-ｈＲＳ７の結合を、製造業者の試薬、プロトコール、及びソフトウェアを使用して、Ｇｕａｖａ  ＰＣＡ（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製、ヘイワード、カリフォルニア州）を用いたフローサイトメトリーにより決定した。並行して、ｈＲＳ７及びｈＬＬ１を用いて、同様の研究を各細胞系について実施した。手短かに言えば、約５×１０５細胞の分析しようとする種々の系統を取得し、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）に再懸濁した。細胞を遠心分離し、１０μｇ／ｍＬの（Ｑ）-ｈＲＳ７、ｈＲＳ７、又はｈＬＬ１を含有する１００μＬのＰＢＳ／１％ＢＳＡに再懸濁し、４５分間４℃でインキュベートした。ＰＢＳ／１％ＢＳＡで２回洗浄し、各洗浄後に遠心分離した後で、細胞を、５０μＬのＦＩＴＣ結合ＧＡＨ  Ｆｃ特異的抗体（１：２５希釈）に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳ／１％ＢＳＡで２回洗浄し、０．５ｍＬのＰＢＳ／１％ＢＳＡに再懸濁した後、フローサイトメトリーで分析した。死細胞と生細胞を分離するために、１μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウムを添加した。各分析につき、１０，０００個の細胞を取得した。
【０１３６】
細胞増殖アッセイ。腫瘍細胞を、９６ウェルプレートに接種し（１ウェル当たり１×１０４細胞）、０．０１〜１００ｎＭの試験物質と共に７２時間インキュベートした。その後、可溶性テトラゾリウム塩、ＭＴＳ［３-（４，５-ジメチルチアゾール-２-イル）-５-（３-カルボキシメトキシフェニル）-２-（４-スルホフェニル）-２Ｈ-テトラゾリウム］を製造業者のプロトコールに従って使用して、生細胞の数を決定した。用量反応曲線からのデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して分析して、ＥＣ５０値（５０％阻害が生じる濃度）を得た。
【０１３７】
コロニー形成アッセイ。腫瘍細胞をトリプシン処理し、６０ｍｍ皿に播種した（１×１０３細胞）。細胞を各試験物質で処理し、コロニーを形成させた。試験物質を含有する新鮮な培地を４日毎に添加し、２週間のインキュベーション後、コロニーを４％ホルムアルデヒドで固定し、ギムザ染色した。５０個の細胞を超えるコロニーを顕微鏡で計数した。
【０１３８】
蛍光顕微鏡による内部移行研究。ＭＥ-１８０細胞を、８ウェルのＬａｂ-ＴｅｋＴＭ  ＩＩチャンバースライド（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製、ネーパービル、イリノイ州）に播種し（１ウェル当たり５００μＬ中２０００細胞）、（Ｑ）-ｈＲＳ７（１０μｇ／ｍＬ）又はｈＲＳ７（６μｇ／ｍＬ）と共に３７℃で１６時間インキュベートした。その後のステップは全て室温で実施した。ＰＢＳ／２％ＢＳＡで２回洗浄した後、又はＰＢＳ／２％ＢＳＡで２回洗浄し、その後０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．５で２回洗浄した後（５００μＬ、２分間）、細胞を４％ホルマリンで１５分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、その後マウス抗Ｒａｐ  ｍＡｂで探索し、その後ＰＥ結合ＧＡＭ  Ｆｃ特異的抗体で、又は直接的にＦＩＴＣ結合ＧＡＨ  Ｆｃ特異的抗体で探索して、（Ｑ）-ｈＲＳ７又はｈＲＳ７の位置を蛍光顕微鏡を使用して明らかにした。
【０１３９】
（Ｑ）-ｈＲＳ７の細胞内位置に取り組む第２の研究を、以下のように実施した。Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ５６８結合ヒトトランスフェリン（ｈＴｆ）を、８ウェルチャンバースライドに播種されたＭＤＡ-ＭＢ-４６８ヒト乳癌細胞（１ウェル当たり５００μＬ中３０００細胞）に、（Ｑ）-ｈＲＳ７（１０μｇ／ｍＬ）又はｈＲＳ７（６μｇ／ｍＬ）と共に添加した。３７℃にて２時間インキュベーションした後、上述のように細胞を洗浄及び固定し、その後室温にて１５分間Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８結合ＧＡＨ  ＩｇＧで処理した。ＰＢＳで２回洗浄した後に、細胞を、室温にて１５分間Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８で処理し、洗浄し、蛍光顕微鏡で検査した。
【０１４０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ毒性。未感作ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、７週齢、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ社製、ジャーマンタウン、ニューヨーク州）に、１匹のマウス当たり２５〜４００μｇの範囲の種々の用量の（Ｑ）-ｈＲＳ７を静脈内注射し、可視的な毒性徴候及び体重変化を毎日モニターした。最大耐用量（ＭＴＤ）は、死亡が生じず、体重減少が治療前動物体重（およそ２０ｇ）の２０％以下であった最大用量と規定した。毒性効果を経験した動物は安楽死させた。
【０１４１】
担癌マウスにおける治療効能。およそ２０ｇの雌ＮＣｒホモ接合性胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ社から受領した際は５週齢）に、１×１０７個のＣａｌｕ-３ヒトＮＳＣＬＣ細胞を皮下接種し、腫瘍の長さ×幅をノギス測定することにより腫瘍増殖をモニターした。腫瘍容積は、（Ｌ×Ｗ２）／２と計算した。腫瘍がおよそ０．１５ｃｍ３のサイズに達したら、動物を１群当たり５匹の治療群に分割した。治療は、５０μｇ（Ｑ）-ｈＲＳ７の単回静脈内注射又は７日間の間隔をあけて投与した２５μｇの２回注射のいずれかで構成されていた。対照群は、生理食塩水を受容した。動物を、毒性徴候について毎日モニターし、腫瘍が２．０ｃｍ３を超えるサイズに達したか又は潰瘍化した場合、人道的に安楽死させ、疾患進行のために死亡したとみなした。加えて、マウスが、初期体重の２０％超を喪失したか又はそうでなければ瀕死状態になった場合、マウスを安楽死させた。生存データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、カプラン-マイヤープロット（対数順位分析）を使用して分析した。差異は、Ｐ＜０．０５の場合に、統計的に有意であるとみなした。
【０１４２】
結果
純度及び分子の完全性。（Ｑ）-ｈＲＳ７は、サイズ排除ＨＰＬＣにより、観測滞留時間（７．８分）がＩｇＧよりも大きな分子サイズを示す単一ピーク（非表示）で構成されることが示された。また、（Ｑ）-ｈＲＳ７の純度は、還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥでの２つのバンドのみ、一方はｈＲＳ７の重鎖に帰属する約５０ｋＤａ、及び他方はＲａｐ（Ｑ）融合Ｌ鎖に帰属する約３７ＫＤａ、が観察されたことにより支持された（非表示）。
【０１４３】
結合分析。Ｔｒｏｐ-２発現細胞系と（Ｑ）-ｈＲＳ７との反応性を、まずＥＬＩＳＡにより評価し、ＰＣ-３（図２Ａ）及びＣａｌｕ-３（図２Ｂ）の場合、両方ともｈＲＳ７よりも約２倍高い見かけ上の解離定数（ＫＤ）をもたらすことを実証した（０．２８ｎＭ対０．１４ｎＭ）。Ｔｒｏｐ-２陰性２２Ｒｖ１の場合、結合は観察されなかった（図２Ｃ）。その後、合計１０種のＴｒｏｐ-２発現細胞系でフローサイトメトリーによる研究を実施した。その結果（非表示）は、（Ｑ）-ｈＲＳ７の結合特性とｈＲＳ７の結合特性には事実上違いがなかったことを示している。
【０１４４】
ＲＮａｓｅ活性。ＩＶＴＴアッセイでは、ＲＮａｓｅによるｍＲＮＡ分解に起因するタンパク質合成の阻害が測定される。図３Ａの中で示されているように、（Ｑ）-ｈＲＳ７及びｒＲａｐは、この無細胞アッセイでは同等のＲＮａｓｅ活性を示すが、ｈＲＳ７の場合、酵素活性は観察されなかった。酵母ｔＲＮＡを基質として使用して、本発明者らは、ｒＲａｐ及び（Ｑ）-ｈＲＳ７のｋｃａｔ／Ｋｍ（１０９Ｍ-１ｓ-１）が、それぞれ４．１０（±０．４２）及び１．９８であると推測した。従って、Ｒａｐの濃度に基づく（Ｑ）-ｈＲＳ７の触媒効率は、ｒＲａｐの約５０％であり、それは、ＬＬ２-オンコナーゼの触媒効率が、天然Ｒａｐと比較して４０％であるという報告と類似していた（Newton et al., Blood 2001;97:528-35）。代表的な一組の実験から得た初速度対ｔＲＮＡ濃度のプロットは、図３Ｂに示されている。
【０１４５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性。ＭＴＳアッセイの結果に基づくと、（Ｑ）-ｈＲＳ７は、ＭＥ-１８０（図４Ａ）、Ｔ-４７Ｄ（図４Ｂ）、ＭＤＡ-ＭＢ-４６８、及びＣａｌｕ-３に対して最も効力があり、ＥＣ５０値は、それぞれ１．５、２．０、３．８、及び８．５ｎＭである。ＭＴＳアッセイにて１００ｎＭの（Ｑ）-ｈＲＳ７で５０％未満の増殖阻害を示す細胞系について、本発明者らは、コロニー形成アッセイも実施し、（Ｑ）-ｈＲＳ７が、１０又は１００ｎＭで、ＤＵ-１４５、ＰＣ-３、ＭＣＦ７、ＳＫ-ＢＲ-３、ＢｘＰＣ-３、Ｃａｐａｎ-１、及びＳＫ-ＯＶ-３に対して細胞毒性だったことを確認した（非表示）。代表的な結果は、ＤＵ-１４５（図４Ｃ）及びＰＣ-３（図４Ｄ）について示されている。両アッセイでは、ｈＲＳ７、ｒＲａｐ、並びにｈＲＳ７及びｒＲａｐの組み合わせは、評価した全ての細胞系で、１００ｎＭにおける毒性はあったとしても非常に少なかったことを示した。Ｔｒｏｐ-２陰性ＡｓＰＣ-１は、両アッセイにおいて（Ｑ）-ｈＲＳ７に対して耐性だった。
【０１４６】
内部移行及び細胞内位置。ＭＥ-１８０細胞内への（Ｑ）-ｈＲＳ７の内部移行は、ＰＢＳ／０．２％ＢＳＡ又は低ｐＨグリシン緩衝液で洗浄して、膜結合型タンパク質を取り除いた後で固定された試料について、明白に明らかだった（非表示）。ＭＥ-１８０における細胞内（Ｑ）-ｈＲＳ７の分布パターンを、ＦＩＴＣ結合ＧＡＨにより直接的に又はＰＥ結合ＧＡＭにより間接的に、マウス抗Ｒａｐ  ＩｇＧで検出したところ、分布パターンは、ほぼ同一であると考えられ、（Ｑ）-ｈＲＳ７が、これら細胞に進入した後も完全性を保っていることが示唆された（非表示）。再利用エンドソームのマーカーとしての蛍光標識ｈＴｆ及び核を染色するＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８を使用して、（Ｑ）-ｈＲＳ７の細胞内位置を、ＭＤＡ-ＭＢ-４６８細胞内で更に探索した。３７℃にて２時間インキュベーションした後で検査した際に、（Ｑ）-ｈＲＳ７及びｈＴｆが、ＭＤＡ-ＭＢ-４６８と同じ細胞内位置を占めることは、これら結果から明らかだった（非表示）。両細胞系において、ｈＲＳ７は、予想通り、ＰＥ-ＧＡＭ／抗Ｒａｐにより可視化されなかった以外は、（Ｑ）-ｈＲＳ７と類似した内部移行特徴を示した（データ非表示）。
【０１４７】
マウスにおけるＭＴＤ。本発明者らは、５０μｇ〜１００μｇの単回静脈内注射を与えた正常ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、（Ｑ）-ｈＲＳ７のＭＴＤを決定した。現在まで製作されている他の２Ｌ-Ｒａｐ-Ｘ融合タンパク質又は２Ｌ-Ｒａｐ（Ｑ）-Ｘ融合タンパク質は、同様のＭＴＤ範囲を示している。加えて、本発明者らは、２０μｇを５日毎に４回与えることにより（ｑ５ｄ×４）８０μｇとなるようにして未感作ＳＣＩＤマウスに複数回注射した場合の、（Ｑ）-ｈＲＳ７のＭＴＤを決定した。
【０１４８】
担癌マウスにおける治療効能。図５Ａに示されているように、（Ｑ）-ｈＲＳ７による治療（５０μｇの単回投与又は５日間の間隔をおいて与えられた２５μｇの２回投与のいずれか）は、未治療対照と比較してＣａｌｕ-３異種移植片の増殖を有意に阻害し（Ｐ＜０．０１９）、生存期間中央値は、５５日から９６日に増加した（Ｐ＜０．０１；図５Ｂ）。
【０１４９】
考察
その癌治療の臨床試験が完了しているか又は多数が進行中である（Pastan et al., Nat Rev Cancer 2006;6:559-65；Pastan
et al., Annu Rev Med 2007;58:221-37；Kreitman, BioDrugs
2009;23:1-13）、植物又は細菌由来の毒素で作られた免疫毒素と比較して（Kreitman, AAPS
J 2006;8:E532-51）、免疫ＲＮａｓｅ（ImmunoRNase）と呼ばれる抗体標的化ＲＮａｓｅ（De Lorenzo et al., FEBS Lett 2002;516:208-12; Cancer Res
2004;64:4870-4）の利点は比較的わずかであり、大部分は血液悪性腫瘍の治療のために開発されており、標的化成分は、幾つかの形態のｓｃＦｖにより付与されている（Schirrmann et al., Exp Opin Biol Ther 2009;9:79-95）。現在まで、免疫ＲＮａｓｅは、癌を有する患者において一切評価されていない。
【０１５０】
他の植物又は微生物免疫毒素の臨床開発で示された２つの障害は、望ましくない毒性及び免疫原性である。これら免疫毒素で観察される正常組織毒性には、血管漏出症候群（ＶＬＳ）、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、及び肝毒性が含まれる（Kreitman, BioDrugs 2009;23:1-13）。内皮細胞に対するリシンＡ鎖又はＩＬ-２の結合に関与することが特定された構造モチーフ（ｘ）Ｄ（ｙ）は、Ｒａｐ（Ｑ）の天然配列には存在せず、ｈＲＳ７は、ヒト内皮細胞と交差反応しない。従って、本発明者らは、（Ｑ）-ｈＲＳ７がＶＬＳを引き起こす可能性は少ないと考える。（Ｑ）-ｈＲＳ７のサイズが大きいこと（約１８０ｋＤａ）は、腫瘍浸透がそれほど迅速ではないという潜在的な懸念を提起するが（Yokota et al., Cancer Res 1992;52:3402-8）、腎臓によるそのクリアランスを防止し、ＨＵＳのリスクを緩和するはずである。肝毒性に関して、本発明者らは、以下のことに留意する：ＢＬ２２、ＰＥ３８に融合されたＲＦＢ４のジスルフィド安定化Ｆｖで構成される組換え抗ＣＤ２２免疫毒素、及びＬＭＢ-２（抗Ｔａｃ（Ｆｖ）-ＰＥ３８）等の類似した免疫毒素は、非特異的に肝毒性であるため、マウスにおいて非常に低いＭＴＤを示したが、ＢＬ２２は、ヘアリーセル白血病を有する患者の臨床試験において、安全であり効果的であることが報告されている（Kreitman et al., N Engl J Med 2001;345:241-7）。従って、マウスで一般的に観察された用量制限的な肝毒性は、ヒトではほとんど現れない可能性がある（Kreitman, BioDrugs 2009;23:1-13）。その一方で、免疫原性は、より一般的な問題である。癌患者で評価されているほとんどの遺伝子操作免疫毒素は、強力な体液性免疫応答を誘導し、それにより血清半減期が短縮され、更なる投与が妨げられる。免疫応答を低減させる幾つかの手法が、実験動物で試験されており、デオキシスパガリン（Pai et al., Cancer Res 1990;50:7750-3）及びＣＴＬＡ４Ｉｇ（Sieall et al., J Immunol 1997;159:5168-73）について幾つかの成功が報告されており、免疫毒素と組み合わせたこれら及び他の免疫抑制剤の臨床試験が提唱されている（Frankel, Clin Cancer Res 2004;10:13-5）。（Ｑ）-ｈＲＳ７は、患者の抗体応答をほとんど誘導しないと考えられる毒素にヒト化抗体を融合させることを含むため、それほど免疫原性ではないだろう（Mikulski et al., J Clin Oncol 2002;20:274-81）。
【０１５１】
免疫毒素の細胞毒性には、それが標的細胞に進入し、その後細胞質ゾルに移動することが必要である。内部移行した後の細胞内経路は、ランピルナーゼ（Rodriguez et al., J Cell Sci 2007;120:1405-11; Haigis and Raines, J
Cell Sci 2003;116:313-24; Wu et al., J Biol Chem 1995;270:17476-81）及び他のＲＮａｓｅ（Wu et al., J Biol Chem 1995;270:17476-81; Leich et al., J Biol Chem
2007;282:27640-6; Bracale et al., Biochem J 2002;362:553-60）、並びにヒト抗ＥｒｂＢ２  ｓｃＦｖ（(De Lorenzo et al., Cancer Res 2004;64:4870-4; FEBS Lett
2007;581:296-300）又はヒト抗ＣＤ３０  ｓｃＦｖ-Ｆｃ（Menzel et al., Blood 2008;111:3830-7）のいずれかに融合されたヒト膵臓ＲＮａｓｅを含む免疫ＲＮａｓｅについて報告されているが、まだ完全な理解には至っていない。本発明者らの内部移行実験は、（Ｑ）-ｈＲＳ７が、ＭＤＡ-ＭＢ-４６８に添加した２時間後に検査した際に、ｈＴｆと共局在化されていることを示し、ランピルナーゼについて提唱されたように（Haigis and Raines, J Cell Sci 2003;116:313-24）、（Ｑ）-ｈＲＳ７が、エンドソームから出て細胞質ゾルに直接入ることができることを示唆する。細胞内（Ｑ）-ｈＲＳ７についてＭＥ-１８０で観察された蛍光画像が、抗Ｒａｐと抗ヒトＦｃとの間で密接に類似していることは、エンドサイトーシスプロセス中のプロテアーゼによる分解に耐性を示す（Ｑ）-ｈＲＳ７の能力を更に示唆する。
【０１５２】
（Ｑ）-ｈＲＳ７のｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力は、３日間のＭＴＳアッセイで測定すると、Ｔｒｏｐ-２発現細胞系によって様々であることが見出されたが、それは部分的には細胞内経路が異なることに起因する可能性があり、（Ｑ）-ｈＲＳ７の細胞毒性は、１４日間のコロニー形成アッセイを使用して、全ての細胞系について１０ｎＭで明白に実証された。多様な癌細胞系に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏでのその強力な細胞毒性に加えて、（Ｑ）-ｈＲＳ７が、ヌードマウスにおいてＣａｌｕ-３ヒト肺癌異種移植片の増殖を阻害するのに有効であることが示され、従ってｉｎ  ｖｉｖｏにおける（Ｑ）-ｈＲＳ７の抗腫瘍活性及び安定性が検証され、並びに免疫毒素により標的とされる固形癌の抗原の現行リストにＴｒｏｐ-２を追加することが適切であることが確認された（Kreitman, AAPS J
2006;8:E532-51；Pastan et al., Nat Rev Cancer 2006;
Pastan et al., Annu Rev Med 2007;58:221-37；Schirrmann
et al., Exp Opin Biol Ther 2009;9:79-95）。
【０１５３】
結論として、本発明者らは、ヒト化抗Ｔｒｏｐ-２抗体に組換え的に融合された両生類ＲＮａｓｅが、様々な上皮癌に対する選択的で強力な細胞毒性をｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方で示すことを実証した。
【０１５４】
実施例２．２Ｌ-ｒａｐ-ｈＬＬ１-γ４Ｐの発現及び特徴付け
下記で使用される場合、ｒａｐは、ランピルナーゼを表す。
【０１５５】
ｐｄＨＬ-ＩｇＧ４Ｐ変異体の構築：
ＩｇＧ４遺伝子を含有するＢ１３-２４細胞を、ＡＴＣＣから購入し（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ-１１３９７）、ゲノムＤＮＡを単離した。細胞をＰＢＳで洗浄し、消化緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）に再懸濁し、５０℃で１８時間インキュベートした。試料を、等容積のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、７．５Ｍ  ＮＨ４Ａｃ／１００％ＥｔＯＨで析出した。ゲノムＤＮＡを遠心分離により回収し、ＴＥ緩衝液に溶解した。ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用して、ＩｇＧ４遺伝子をＰＣＲで増幅した。
【０１５６】
増幅されたＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ-ＴＡ配列決定用ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングし、ＤＮＡ配列決定法で確認した。ｐｄＨＬ-ｈＬＬ２にあるＩｇＧ１の重鎖定常領域を含有するＳａｃＩＩ-ＥａｇＩ断片を、ＴＯＰＯ-ＴＡ-ＩｇＧ４プラスミドのＳａｃＩＩ-ＥａｇＩと置換して、ｐｄＨＬ２-ｈＬＬ２-ＩｇＧ４（ｐｄＨＬ２-ｈＬＬ２-γ４）ベクターを生成した。
【０１５７】
ＩｇＧ４-プロリン突然変異
半分子の形成を回避するために、Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ突然変異をＩｇＧ４のヒンジ領域に導入した。突然変異ヒンジ領域５６ｂｐ断片（ＰｓｔＩ-ＳｔｕＩ）を合成し、アニーリングさせ、ＩｇＧ４のＰｓｔＩ-ＳｔｕＩ断片と置換した。この構築により、最終ベクターｐｄＨＬ２-ｈＬＬ２-γ４Ｐがもたらされた。
【０１５８】
ｐｄＨＬ２-ｈＬＬ１-γ４Ｐの構築
ｐｄＨＬ２-ｈＬＬ２-γ４ＰのＸｂａＩ-ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、Ｖｋ及びＶＨ領域を含有するｐｄＨＬ２-ｈＬＬ１のＸｂａ-ＨｉｎｄＩＩＩ断片と置換して、ｈＬＬ１-γ４Ｐ構築体を生成した。
【０１５９】
ｐｄＨＬ２-２Ｌ-ｒａｐ-ｈＬＬ１-γ４Ｐの構築
グリシン４個-セリン１個のモノマーの３つのコピーを含む可撓性リンカーを使用して、ｈＬＬ１のＶｋのＮ末端にＲａｐのＣ末端を結合させた。１個のｒａｐ分子を、各軽鎖のＮ末端に結合させた。この分子のＤＮＡの構築は、ＰＣＲにより実施した。ｐｄＨＬ２-ｈＬＬ１-γ４ＰのＸｂａ-ＢａｍＨＩ断片を、ｐＢＳ-２Ｌ-ｒａｐ-ｈＬＬ１のＸｂａ-ＢａｍＨＩ（Ｘｂａ-リーダー-ｒａｐ-リンカー-Ｖｋ-ＢａｍＨＩ）断片と置換して、最終ベクターｐｄＨＬ２-２Ｌ-ｒａｐ-ｈＬＬ１-γ４Ｐを完成させた。
【０１６０】
形質移入
ベクターＤＮＡ（３０μｇ）を、ＳａｌＩ酵素で線形化し、エレクトロポレーション（４５０Ｖ）により、ＮＳＯ（４×１０６細胞／ｍＬ）又はＳｐ２／０-Ａｇ１４（５×１０６細胞／ｍＬ）ミエローマ細胞に形質移入した。低ＩｇＧ  ＦＢＳ（１０％）、ペニシリン（１００単位／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、Ｌ-グルタミン（２ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、非必須アミノ酸（１００μＭ）、及びメトトレキサート（０．１μＭ）を添加した完全ハイブリドーマＳＦＭ培地中で、細胞を増殖させた。陽性クローンをＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。手短かに言えば、プレートを、ＰＢＳ培地中５μｇ／ｍＬの５０μｌ抗ｒａｐ抗体でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳで洗浄し、２％ＢＳＡでブロッキングした後、細胞培養上清を添加した。ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ．ｓｕｂ．４抗体を検出用に使用し、ＯＰＤを発色用の基質として使用した。プレートを４９０ｎｍで測定した。陽性クローンを増殖させ、今後の使用のために凍結した。クローンＣ６が最も良好な産生体であることが特定され、それを更なる開発に使用した。
【０１６１】
発現及び精製
細胞を、各々が５００ｍｌの培地を有する２本の回転ボトルで増殖させて、最終培養にし（１０〜２０％生存率）、細胞を遠心分離で除去した。培養上清をろ過し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ／１００ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化されたプロテインＡカラムにアプライした。負荷した後、カラムを１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄し、１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）で溶出して融合タンパク質を得た。産物を含有するピークを、３Ｍ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ８．０を使用してｐＨ７．０に調整し、１０ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液に対して透析した。濃縮した後、産物を０．２２μｍフィルターでろ過し、２〜８℃で保管した。精製後に１Ｌの培養から１６ｍｇを回収した。
【０１６２】
２Ｌ-ｒａｐ-ｈＬＬ１-γ４Ｐの特徴付け
ＨＰＬＣ：タンパク質純度及び濃度を、ＨＰＬＣで調査した。鋭い単一ピークが７．７分で観察され（非表示）、この滞留時間は、この分子がＩｇＧよりも大型であることが示された。
【０１６３】
ＳＤＳ-ＰＡＧＥ：ＳＤＳ-ＰＡＧＥを、４〜２０％Ｔｒｉｓ-グリシンゲルを使用して還元条件下で実施した。予想サイズ約５０ｋＤの重鎖に関連するバンド、並びに両方ともｈＬＬ１の軽鎖（約２５ｋＤ）より大型である分子量約３７及び３９ｋＤの２つのバンドが観察された（非表示）。２つの軽鎖の存在は、融合タンパク質のｒａｐのグリコシル化によることが示された（以下を参照）。
【０１６４】
質量分析：質量分析は、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ法により、スクリプス研究所、カリフォルニア州で実施した。２つの試料を分析用に送付した。１つは、天然状態（１０ｍＭ  ＰＢＳ中１．６ｍｇ／ｍＬ）であり、他方は、還元状態（１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１０ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．５緩衝液中１．６ｍｇ／ｍＬ）だった。天然試料は、質量１７７１５０の１つの主要ピークを示し、１つのＩｇＧ＋２つのｒａｐのＭＷと良好に一致する（非表示）。還元試料は、５０５６０（重鎖に対応）、３８５２６、及び３６７００（ｒａｐを含有する２つの軽鎖に対応）の３つの主要ピークを示した（非表示）。
【０１６５】
ウエスタンブロッティング：精製したタンパク質中にｒａｐが存在することを確認するために、ウエスタンブロッティングを実施した。還元条件下のＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルからの試料を、ＰＶＤＦ膜に電気的に転写した。５％  ＢＳＡでブロッキングした後、マウス抗ｒａｐ抗体を、１：１０，０００希釈又は１０ｎｇ／ｍｌで添加し、１時間インキュベートした。洗浄した後、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＦｃ抗体を添加し、１時間インキュベートした。６回洗浄した後、ＬｕｍｉＧｌｏ（商標）（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）基質を添加し、コダックフィルムを現像した。融合された軽鎖に対応する両バンドがフィルムに検出され、両軽鎖にｒａｐが存在することが確認された（非表示）。
【０１６６】
Ｎ-グリコシダーゼによる処理：ｒａｐは、潜在的なＮ-グリコシル化部位、Ａｓｎ-Ｘ-Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｓｎ６９-Ｖａｌ７０-Ｔｈｒ７１を有するため、２つの軽鎖が２ｋＤだけ異なる分子量を有するという観察は、ｒａｐが不均等にグリコシル化された結果である可能性がある。この可能性を調査するために、ｒａｐ-ｈＬＬ１抗体を、供給業者の推奨に従って、変性条件下でＮ-グリコシダーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）と共にインキュベートした。Ｎ-グリコシダーゼ処理の後、２つの軽鎖に対応する２つのバンドは、１つに収束し（より迅速に泳動するバンド）、従って糖鎖の不均等な分布が、ＳＤＳ-ＰＡＧＥに２つのバンドが観察された理由だったことが確認された（非表示）。更なる裏づけは、Ｒａｐ（Ｎ６９Ｑ）、グリコシル化部位が除去されたＲａｐ変異体を、組換え構築体のｒａｐの代わりに用いた場合、１つのＲａｐ融合軽鎖のみが観察されたことにより提供された（データ非表示）。
【０１６７】
ｒａｐの活性：ＲＮａｓｅ活性を、供給業者の推奨に従ってＢｒｉｇｈｔ-Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼリポーターアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を使用し、ＴＮＴ（登録商標）Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）により試験した。このアッセイの原理は、ルシフェラーゼリポーター系を使用して、ＲＮａｓｅ活性の結果としてのタンパク質合成阻害（ｍＲＮＡ分解）を測定することだった。試料を、異なる希釈、遊離ｒａｐ（０．００１〜２．５ｎＭ）、ｈＬＬ１-ｒａｐ（０．０１〜２０ｎＭ）、又はＰＫ１-ＬＬ２-Ｏｎｅ及びＰＫＩＩ-ＬＬ２-Ｏｎｅとして表されるｈＬＬ２-ｒａｐの化学結合体（０．０１〜２０ｎＭ）で調製した。各試料（５μＬ）を２０μｌのＴＮＴ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘと混合し、９６ウェルプレートで２時間３０℃にてインキュベートし、それから１μｌを取り出し、５０μｌのＢｒｉｇｈｔ-Ｇｌｏ（商標）基質で分析した。結果は、エクセル又はＰｒｉｓｍ  Ｐａｄソフトウェアを使用して、図６に示されている。ＥＣ５０値は、ｒａｐ-ｈＬＬ１及びｈＬＬ２-Ｏｎｅの化学結合体の場合は約３００ｐＭであり、遊離ｒａｐの場合は３０ｐＭだった。
【０１６８】
ＷＰの競合結合。ＷＰは、ｈＬＬ１の抗イディオタイプ抗体である。ＷＰに対するｈＬＬ１抗体と比較したｒａｐ-ｈＬＬ１抗体の親和性を、競合結合アッセイにより評価した。手短かに言えば、９６ウェルプレートを、５０μｌの５μｇ／ｍＬ  ＷＰでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。３つのタイプのタンパク質試料、ｈＬＬ１、ｒａｐ-ｈＬＬ１、又はｈＡ２０を、等容積の２×ＨＲＰ結合ｍＬＬ１抗体（最終希釈は１／２０，０００である）と混合した異なる２×希釈（終濃度は、０．４９〜１０００ｎＭの範囲）で調製した。上述のようにＨＲＰ結合ｍＬＬ１と混合した５０μＬのタンパク質試料を各ウェルに添加し、１時間インキュベートした。洗浄した後、Ｈ２Ｏ２を含有するＯＰＤ基質を添加し、プレートを４９０ｎｍで測定した。図７に示されているように、エクセル又はＰｒｉｓｍ  Ｐａｄグラフソフトウェアを使用して、吸光度に対するタンパク濃度をプロットした。ｈＡ２０（ヒト化抗ＣＤ２０抗体）を陰性対照として使用した。図７から、ｒａｐ-ｈＬＬ１が、ｈＬＬ１と同様の結合親和性を示し、陰性対照、ｈＡ２０が、親和性を全く示さないことは明白である。同様の結果が、抗原の供給源としてＲａｊｉ細胞を使用して得られた。
【０１６９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性を、Ｂ細胞リンパ腫細胞系（Ｄａｕｄｉ）及び多発性骨髄腫細胞系（ＭＣ／ＣＡＲ）で決定した。細胞（０．１ｍｌ中１０，０００個）を、９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。２４時間後、遊離ｈＬＬ１、遊離ｒａｐ、又はｒａｐ-ｈＬＬ１（１０μｌ）を適切なウェルに添加し、細胞をインキュベーター中で３日間３７℃にてインキュベートした。細胞増殖を、ＭＴＳテトラゾリウム染料還元アッセイ又はＢｒＤＵ比色アッセイを使用して決定した。結果を、Ｐｒｉｓｍ  Ｐａｄソフトウェアを使用してグラフ的に得たＥＣ５０として表した。ｒａｐ-ｈＬＬ１が、Ｂ細胞リンパ腫細胞系（Ｄａｕｄｉ）及び多発性骨髄腫細胞系（ＭＣ／ＣＡＲ）の両方に対して感受性であったことは、図８〜９から明らかである。ｒａｐ-ｈＬＬ１は、ＥＣ５０値に反映されているように、ＭＣ／ＣＡＲ細胞と比較して、Ｄａｕｄｉ細胞に対して著しくより強力（細胞毒性）だった（図８及び図９）。ＭＣ／ＣＡＲ細胞の場合、ＥＣ５０値は、試験した濃度では達成されなかった。最も高い濃度（５６ｎＭ）で、細胞生存率は５７％だった。ｈＬＬ１又は遊離ｒａｐそれ自体は、いずれの細胞系でも細胞毒性を示さなかった。
【０１７０】
薬物動態及び生体内分布法。ｈＬＬ１又は２Ｌ-Ｒａｐ-ｈＬＬ１-γ４Ｐを、Sharkeyら（Int J Cancer. 1990; 46:79-85）に記載のように、２-（４-イソチオシアナトベジル）ＤＴＰＡ（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ社製、ダラス、テキサス州）を使用してジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）に結合させて、ＤＴＰＡ-ｈＬＬ１又はＤＴＰＡ-２Ｌ-Ｒａｐ-ｈＬＬ１-γ４Ｐを得、それを、薬物動態及び生体内分布を研究するために、それぞれ８８Ｙクロライド（ロスアラモス国立研究所（ロスアラモス、ニューメキシコ州）又は１１１Ｉｎクロライド（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ボストン、マサチューセッツ州）で標識した。未感作雌ＳＣＩＤマウス（８週齢、１８〜２２ｇ）に、ｈＬＬ１又は２Ｌ-Ｒａｐ-ｈＬＬ１-γ４Ｐの未標識ＤＴＰＡ結合体で補完された、０．００１ｍＣｉの８８Ｙ-ＤＴＰＡ-ｈＬＬ１及び０．０２ｍＣｉの１１１Ｉｎ-ＤＴＰＡ-２Ｌ-Ｒａｐ-ｈＬＬ１-γ４Ｐの混合物を、各動物がそれぞれ１０μｇの総用量のｈＬＬ１及び２Ｌ-Ｒａｐ-ｈＬＬ１-γ４Ｐを受容するように静脈内注射した。投与後の選択された時点で（１、２、４、１６、４８、７２、１６８時間）、５匹のマウス群に麻酔をかけ、血液試料を心穿刺により採取した。主要組織を取り出し、計量し、容器に配置した。血液試料及び組織の１１１Ｉｎ（チャンネル１２０〜４８０）及び８８Ｙ（チャンネル６００〜２０００）を、校正されたガンマカウンターで計数した。交差曲線を生成して、８８Ｙエネルギーの後方散乱を補正し、１１１Ｉｎ計数窓に合わせた。
【０１７１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ毒性。未感作ＳＣＩＤ又はＢＡＬＢ／ｃマウスに、２５〜４００μｇ／マウスの範囲の種々の用量の２Ｌ-Ｒａｐ-ｈＬＬ１-γ４Ｐを静脈内注射し、可視的な毒性徴候及び体重減少を毎日モニターした。最大耐用量（ＭＴＤ）は、死亡が生じず、体重減少が治療前動物体重（およそ２０ｇ）の２０％未満であった最大用量と規定した。毒性効果を経験した動物を犠牲にし、回収し、組織病理学的分析にかけた。未感作ＳＣＩＤマウスでは、１００、１５０、２００、２５０、３００、又は４００μｇの２Ｌ-Ｒａｐ-ｈＬＬ１-γ４Ｐの単回静脈内投与は、動物の重篤な体重減少及び死亡をもたらしたが、２５又は５０μｇの用量では、全てのマウスが生存した（非表示）。ＢＡＬＢ／ｃマウスの場合、３０又は５０μｇの２Ｌ-Ｒａｐ-ｈＬＬ１-γ４Ｐの単回静脈内投与では、全てマウスが生存したが、１００又は２００μｇでは生存しなかった（非表示）。別の実験では、７５μｇの２Ｌ-Ｒａｐ-ｈＬＬ１-γ４Ｐの投与は、ＳＣＩＤマウスに毒性であることが見出された（データ非表示）。従って、単回ボーラス注入として与えられた２Ｌ-Ｒａｐ-ｈＬＬ１-γ４ＰのＭＴＤは、ＳＣＩＤマウスでは５０〜７５μｇであり、ＢＡＬＢ／ｃマウスでは５０〜１００μｇである。死亡又は犠牲マウスの肉眼的病理学的検査は、重篤な肝毒性及び脾毒性を示した。肝臓は色が蒼白色であり、脾臓にはしわがより、通常のサイズよりも小さかった。組織病理学的検査により、肝壊死及び脾壊死が明らかにされた。代表的なマウスの血清試料は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）、及び総ビリルビンのレベル上昇を示し、これら高用量では著しく肝毒性であることを示唆した。
【０１７２】
データ分析。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性研究の場合、用量反応曲線をトリプリケート測定の平均から生成し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製、エンシニータス、カリフォルニア州）を使用して、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）値を得た。薬物動態データを、非コンパートメント分析プログラムＷｉｎＮｏｎｌｉｎ、バージョン４．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社製、マウンテンビュー、カリフォルニア州）の標準的アルゴリズムを使用して分析した。このプログラムは、線形補間を用いた線形台形法を使用して曲線下面積（ＡＵＣ）を計算する。消失速度定数（ｋβ）を、一次速度論を仮定して終末相半減期（ｔ１／２β）から計算した。生存データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアで、カプラン-マイヤープロット（対数順位分析）を使用して分析した。差異は、Ｐ＜０．０５の場合に、統計的に有意であるとみなした。
【０１７３】
薬物動態及び生体内分布データ。放射性同位体標識ｈＬＬ１及び２Ｌ-Ｒａｐ-ｈＬＬ１-γ４Ｐの薬物動態及び生体内分布を、未感作ＳＣＩＤマウスで決定した。ｈＬＬ１及び２Ｌ-Ｒａｐ-ｈＬＬ１-γ４ＰをＤＴＰＡと結合させ、８８Ｙ及び１１１Ｉｎ標識体をそれぞれ追跡した。図１０に示されているように、１１１Ｉｎ標識２Ｌ-Ｒａｐ-ｈＬＬ１-γ４Ｐは、初期の迅速な再分布（α）相及び後期のより遅い消失（β）相を特徴とする、８８Ｙ標識ｈＬＬ１と同様の２相性の血中クリアランスを示す。ｈＬＬ１と比較して（４時間）、わずかにより短い半減期が、２Ｌ-Ｒａｐ-ｈＬＬ１-γ４Ｐで観察された（５．１時間）。５時間を超えるデータポイントを使用して、ｔ１／２β、ｋβ、ＡＵＣ、平均滞留時間（ＭＲＴ）、分布の見掛け容積（Ｖｄ）、及びクリアランス速度（Ｃｌ）を計算した。これらパラメーターの値は、表２に示されている。１１１Ｉｎ標識２Ｌ-Ｒａｐ-ｈＬＬ１-γ４Ｐの組織内取り込みは、８８Ｙ標識ｈＬＬ１の取り込みと類似していた（データ非表示）。
【表２】
2013503200.tif 000004
【０１７４】
担癌マウスにおける治療効能
担癌マウスにおける治療効能：雌ＳＣＩＤマウス（８週齢、１８〜２２ｇ）、１群当たり８〜９匹に、１．５×１０７個のＤａｕｄｉ細胞を静脈内注射し、１日後に治療をした。マウスの後肢麻痺を毎日検査し、週１回計量した。マウスが後肢麻痺を発症するか又はマウスの治療前体重の２０％が失われた際に、動物を安楽死させた。各組の治療実験は、１８０日後に終了した。
【０１７５】
図１１に示されているように、未治療マウス（ＰＢＳ群）は全て、３０日以内に死亡し、生存期間中央値（ＭＳＴ）は２８日だった。５０μｇの２Ｌ-Ｒａｐ-ｈＬＬ１-γ４Ｐの成分タンパク質の組成であるｈＬＬ１-γ４Ｐ（４３．２μｇ）及びＲａｐ（６．６μｇ）の混合物を受容した対照群のＭＳＴは、７０日だった（ＰＢＳ群と比べて、Ｐ＜０．０００１）。対照的に、５又は１５μｇのいずれかの２Ｌ-Ｒａｐ-ｈＬＬ１-γ４Ｐの単回注射を受容したマウスは全て、１００日を超えて生存し（ＭＳＴ＞１８０日；成分治療群と比べて、Ｐ＝０．０００５）、１匹のマウスのみが、研究終了間際に各群から失われた。研究が１８０日後に終了した際、５、１５、３０、４０、又は５０μｇの２Ｌ-Ｒａｐ-ｈＬＬ１-γ４Ｐの単回注射を受容したマウスの９０％が治癒されていた。特筆すべきは、１μｇの単回注射を受容したマウスのＭＳＴが９２日であり、未治療群の２８日間と比較して（Ｐ＜０．０００１）、２３０％の増加を示したことである。
【０１７６】
細胞毒性ＲＮａｓｅをコードするＰＣＲ増幅ＤＮＡの合成
組換え細胞毒性ＲＮａｓｅのＮ末端配列（４６個アミノ酸）をコードするセンス鎖配列の１３９量体ＤＮＡヌクレオチド、ＯＮＣＯ--Ｎ：
５’-ＴＧＧ  ＣＴＡ  ＡＣＧ  ＴＴＴ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＡＡＡ  ＣＡＴ  ＡＴＣ  ＡＣＧ  ＡＡＴ  ＡＣＡ  ＣＧＡ  ＧＡＴ  ＧＴＡ  ＧＡＣ  ＴＧＧ  ＧＡＣ  ＡＡＴ  ＡＴＡ  ＡＴＧ  ＴＣＴ  ＡＣＧ  ＡＡＴ  ＣＴＧ  ＴＴＴ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  ＡＡＧ  ＧＡＴ  ＡＡＧ  ＡＡＴ  ＡＣＣ  ＴＴＴ  ＡＴＡ  ＴＡＣ  ＡＧＴ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  ＧＡＧ  ＣＣＴ  ＧＴＡ  ＡＡＧ  ＧＣＴ  ＡＴＣ  ＴＧＴ  Ａ-３’（配列番号８８）
を自動ＤＮＡ合成装置で合成し、下記のプライマーを用いたＰＣＲ増幅のテンプレートとして使用した。
ＯＮＮＢＡＣＫ
５’-ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＣＡＧ  ＧＡＴ  ＴＧＧ  ＣＴＡ  ＡＣＧ  ＴＴＴ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＡＡＡ-３’（配列番号８９）
ＯＮＮＦＯＲ
５’-ＣＴＴ  ＡＣＴ  ＣＧＣ  ＧＡＴ  ＡＡＴ  ＧＣＣ  ＴＴＴ  ＡＣＡ  ＧＡＴ  ＡＧＣ  ＣＴＴ  ＴＡＣ  ＡＧＧ  ＣＴＣ  ＴＧ-３’（配列番号９０）
【０１７７】
その結果生じた二本鎖ＰＣＲ産物は、細胞毒性ＲＮａｓｅのＮ末端半分の５４個アミノ酸残基をコードするｃＤＮＡ配列を含有する。ＯＮＮＢＡＣＫは、ステージングベクター（staging vector）へのサブクローニング又は細菌発現ベクターへのインフレームライゲーション（ＮｄｅＩ部位）のいずれかを容易にするために、制限部位ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｄｅＩを含有している。細胞毒性ＲＮａｓｅのＣ末端半分をコードするｃＤＮＡとのインフレームライゲーションを容易にするために、ＮｒｕＩ部位が、ＯＮＮＦＯＲプライマーに組み込まれている。
【０１７８】
同様にして、組換え細胞毒性ＲＮａｓｅのＣ末端配列（４６個アミノ酸）をコードするセンス鎖配列の１３７量体ＤＮＡヌクレオチド、ＯＮＣＯ--Ｃ：
５’-ＴＧＣ  ＴＧＡ  ＣＴＡ  ＣＴＴ  ＣＣＧ  ＡＧＴ  ＴＣＴ  ＡＴＣ  ＴＧＴ  ＣＣＧ  ＡＴＴ  ＧＣＡ  ＡＴＧ  ＴＧＡ  ＣＴＴ  ＣＡＣ  ＧＧＣ  ＣＣＴ  ＧＣＡ  ＡＡＴ  ＡＴＡ  ＡＧＣ  ＴＧＡ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＧＣＡ  ＣＴＡ  ＡＣＡ  ＡＡＴ  ＴＴＴ  ＧＣＧ  ＴＡＡ  ＣＴＴ  ＧＣＧ  ＡＧＡ  ＡＣＣ  ＡＧＧ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＴＡＣ  ＡＴＴ  ＴＣＧ  ＴＴＧ  ＧＡＧ  ＴＣＧ  ＧＧ-３’（配列番号９１）
を合成し、以下のプライマーによりＰＣＲ増幅した。
ＯＮＣＢＡＣＫ
５’-ＡＴＴ  ＡＴＣ  ＧＣＧ  ＡＧＴ  ＡＡＧ  ＡＡＣ  ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＡＣＴ  ＡＣＴ  ＴＣＣ  ＧＡＧ  ＴＴＣ  ＴＡＴ-３’（配列番号９２）
ＯＮＣＦＯＲ
５’-ＴＴＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＴＡ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＣＣＣ  ＧＡＣ  ＴＣＣ  ＡＡＣ  ＧＡＡ  ＡＴＧ  ＴＡＣ-３’（配列番号９３）
【０１７９】
最終二本鎖ＰＣＲ産物は、細胞毒性ＲＮａｓｅの残りのＣ末端半分の５１個アミノ酸をコードしたｃＤＮＡ配列を含有していた。ＰＣＲ増幅ＤＮＡのＮ末端半分とのインフレームライゲーションを可能にするＮｒｕＩ部位が、ＯＮＣＢＡＣＫに組み込まれていた。ステージングベクター又は発現ベクターにサブクローニングするための終止コドン及びＢａｍＨＩ制限部位が、ＯＮＣＦＯＲ配列に含まれていた。
【０１８０】
細胞毒性ＲＮａｓｅのＮ末端半分及びＣ末端半分をコードするＰＣＲ増幅ＤＮＡを、適切な制限酵素で処理した後、ＮｒｕＩ部位で結合し、ステージングベクター、例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社製のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングした。ライゲーションした配列は、Ｎ末端Ｍｅｔを有する１０５個アミノ酸のポリペプチドをコードする。
【０１８１】
ＬＬ２及びＭＮ-１４  Ｖ領域配列のクローニング、並びにＬＬ２及びＭＮ-１４のヒト化
ｈＬＬ２及びｈＭＮ-１４のＶ領域配列は公開されている。Leung et al., Mol.
Immunol., 32:1413 (1995); U.S.
Pat. No. 5,874,540。ＬＬ２及びＭＮ-１４のＶＫ及びＶＨ配列を、公開されている方法及びプライマーを使用して、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅ＤＮＡの配列分析により、それらが抗体ＶＫ及びＶＨドメインに典型的なタンパク質をコードしたことが示された。ＰＣＲ増幅ＬＬ２及びＭＮ-１４配列に基づいて構築されたキメラ抗体は、それらの親抗体と同等の免疫反応性を示し、得られた配列の信頼性が確認された。
【０１８２】
ＬＬ２抗体の配列分析により、フレームワーク１領域のＶＫに追加されたＮ結合グリコシル化部位の存在が明らかにされた。突然変異研究により、ＶＫに追加された部位におけるグリコシル化は、抗体の免疫反応性を維持するために必要ではないことが示された（非表示）。ＦＲ-１グリコシル化部位が含まれていないＲＥＩフレームワーク配列を、軽鎖ＣＤＲを移植するためのスキャフォールド及びＬＬ２の重鎖ＣＤＲを移植するためのＥＵ／ＮＥＷＭとして使用した。ヒト化ＬＬ２（ｈＬＬ２）の免疫反応性は、マウス及びキメラＬＬ２の免疫反応性と同等であることが示された（非表示）。ＬＬ２の内部移行速度は、抗体のキメラ化又はヒト化により影響を受けなかった（非表示）。
【０１８３】
ヒト化ＬＬ２及び細胞毒性ＲＮａｓｅの融合タンパク質をコードする遺伝子の構築
ｈＬＬ２のＶＨ及びＶＫ配列を、標準的ＰＣＲ手順によりｈＬＬ２-ｓｃＦｖ遺伝子を構築するためのテンプレートとして使用した。-１位のＭｅｔ開始コドンを、１６個アミノ酸リンカーを介してＶＨドメインに結合されていたＶＬ遺伝子のＮ末端に組み込んだ。金属キレートクロマトグラフィーによる融合タンパク質の精製を容易するために、６個のヒスチジル残基で構成される尾部が、ＶＨ鎖のカルボキシル末端に含まれていた。
【０１８４】
ランピルナーゼ-ｈＬＬ２ｓｃＦｖの免疫毒素融合タンパク質遺伝子を、制限消化及びライゲーション法により、同様の様式で構築した。ｃＤＮＡ配列は、発現されると、ＬＬ２  ＶＬ配列のＮ末端に短いリンカーを介して結合されたランピルナーゼを有する融合タンパク質をコードしていた。細胞毒性ＲＮａｓｅ  Ｃ末端とＶＬドメインＮ末端との間に挿入することができる様々なリンカーが存在する。好ましいリンカーは、シュードモナス外毒素（ＰＥ）のＣ末端２７３〜２８１位に由来するアミノ酸配列ＴＲＨＲＱＰＲＧＷ（配列番号９４）である。この配列は、サブチリシンがＰＥを活性断片に細胞内切断するための認識部位であり、切断はこの配列のＧとＷ残基との間で生じることが示されている。
Chiron et al., J. Biol. Chem., 269:18167
(1994)。この配列を組み込むことにより、融合免疫毒素が内部移行した後の、活性細胞毒性ＲＮａｓｅの放出が容易になる。或いは、ＥＤＮ-ｓｃＦｖ融合体の構築に使用されたブドウ球菌プロンテインＡのＢ断片のアミノ酸残基４８〜６０で構成される１３個アミノ酸残基スペーサーを、その代わりに使用して、細胞毒性ＲＮａｓｅとｓｃＦｖとの可撓性結合を可能にすることができる。Tai et al., Biochemistry, 29:8024 (1990) and Rybak et al., Tumor
Targeting, 1:141 (1995)。
【０１８５】
ヒト化ＭＮ-１４及びランピルナーゼの融合タンパク質をコードする遺伝子の構築
ＭＮ-１４ｓｃＦｖを、ヒト化ＭＮ-１４トランスフェクトーマに由来するｃＤＮＡのＰＣＲ増幅により生成した。ＭＮ-１４ｓｃＦｖに使用されたリンカーは、１５個アミノ酸リンカーであり、配向性は、ＶＬ-リンカーＶＨだった。ＤＮＡ配列を確認した後、単鎖構築体を、真核生物発現ベクターにサブクローニングし、適切な発現用哺乳動物宿主細胞に形質移入した。
【０１８６】
別の単鎖構築体も製作した。これを、反対の５’-３’の重鎖及び軽鎖の配向性で製作し、ｐＣＡＮＴＡＢＥ５Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、ピスカタウエイ、ニュージャージー州）にて構築し、ファージで発現させた。このｓｃＦｖを発現する組換えファージの特異的結合を、ＥＬＩＳＡで実証した（非表示）。
【０１８７】
ｓｃＦｖ配列を、ランピルナーゼがリンカーを介してＶＬ配列のＮ末端に結合されたランピルナーゼ-ＭＮ-１４融合タンパク質の構築に使用した。ランピルナーゼをコードするＤＮＡ断片を、上記で考察したように得た。２３個アミノ酸リンカーを、ランピルナーゼ配列とｓｃＦｖとの間に使用した。Kurucz et al. (1995)。
【０１８８】
ドック-アンド-ロック
実施例３．モジュール型Ｆａｂサブユニットを産生するための基本戦略
Ｆａｂモジュールは、ＤＤＤ又はＡＤ配列のいずれかを含有する融合タンパク質として産生することができる。独立したトランスジェニック細胞系を、各融合タンパク質について開発した。モジュールは、産生したら、必要に応じて精製してもよく、又は細胞培養上清液中で維持してもよい。産生した後、任意のＤＤＤ２モジュールを任意のＡＤモジュールと組み合わせて、ＤＮＬ構築体を生成することができる。
【０１８９】
プラスミドベクターｐｄＨＬ２は、多数の抗体及び抗体に基づく構築体を生成するために使用されている。Gillies et al., J Immunol Methods (1989), 125:191-202；Losman et al., Cancer (Phila) (1997), 80:2660-6を参照されたい。２シストロン性哺乳動物発現ベクターは、ＩｇＧの重鎖及び軽鎖の合成を指示する。ベクター配列は、多数の異なるＩｇＧ-ｐｄＨＬ２構築体とほとんど同一であり、唯一の違いは、可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）配列に存在する。当業者に公知である分子生物学ツールを使用して、これらＩｇＧ発現ベクターを、Ｆａｂ-ＤＤＤ又はＦａｂ-ＡＤ発現ベクターに変換することができる。Ｆａｂ-ＤＤＤの発現ベクターを生成するためには、重鎖のヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインのコード配列を、ヒンジの最初の４残基、１４残基のＧｌｙ-Ｓｅｒリンカー、及びヒトＲＩＩαの最初の４４残基（ＤＤＤ１と呼ばれる）をコードする配列と置換する。Ｆａｂ-ＡＤ発現ベクターを生成するためには、ＩｇＧのヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインの配列を、ヒンジの最初の４残基、１５残基のＧｌｙ-Ｓｅｒリンカー、及びバイオインフォマティクス及びペプチドアレイ技術を使用して生成し、ＲＩＩα二量体と非常に高い親和性（０．４ｎＭ）で結合することが示された、ＡＫＡＰ-ＩＳと呼ばれる１７残基の合成ＡＤ（ＡＤ１と呼ばれる）をコードする配列と置換する。Alto,
et al. Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A (2003), 100:4445-50を参照されたい。
【０１９０】
ＩｇＧ-ｐｄＨＬ２ベクターの、Ｆａｂ-ＤＤＤ１又はＦａｂ-ＡＤ１発現ベクターのいずれかへの変換を容易にするために、２つのシャトルベクターを下述のように設計した。
【０１９１】
ＣＨ１の調製
ｐｄＨＬ２プラスミドベクターをテンプレートとして使用して、ＣＨ１ドメインをＰＣＲで増幅した。左ＰＣＲプライマーは、上流（５’）のＣＨ１ドメイン及びＣＨ１コード配列の５’にあるＳａｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位で構成されている。右プライマーは、ヒンジの最初の４残基をコードする配列、その後の短いリンカーで構成されており、最後の２つのコドンはＢａｍＨＩ制限部位を含む。
ＣＨ１  Ｌｅｆｔプライマーの５’
５’ＧＡＡＣＣＴＣＧＣＧＧＡＣＡＧＴＴＡＡＧ-３’（配列番号６３）
ＣＨ１＋Ｇ４Ｓ-Ｂａｍ  Ｒｉｇｈｔ（「Ｇ４Ｓ」は配列番号９６として開示されている）
５’ＧＧＡＴＣＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＡＧＣＴＣＴＴＡＧＧＴＴＴＣＴＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＧＴＴＧＣＴＧＧ-３’（配列番号６４）
【０１９２】
４１０ｂｐのＰＣＲアンプライマーを、ｐＧｅｍＴ  ＰＣＲクローニングベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にクローニングし、Ｔ７（５’）配向性のインサートを求めてクローンをスクリーニングした。
【０１９３】
（Ｇ４Ｓ）２ＤＤＤ１（「（Ｇ４Ｓ）２」は配列番号９７として開示されている）の構築
リンカーペプチドの１１残基が先行するＤＤＤ１のアミノ酸配列をコードし、最初の２つのコドンがＢａｍＨＩ制限部位を含む、（Ｇ４Ｓ）２ＤＤＤ１（「（Ｇ４Ｓ）２」は配列番号９７として開示されている）と称する二本鎖オリゴヌクレオチドは、Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ社（ヘーバリル、英国）により合成された。終止コドン及びＥａｇＩ制限部位は、３’末端に付加されている。コードされたポリペプチド配列を下記に示す。
ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号６５）
【０１９４】
それらの３’末端の３０塩基対が重複する、ＲＩＩＡ１-４４ｔｏｐ及びＲＩＩＡ１-４４ｂｏｔｔｏｍと称する２つのオリゴヌクレオチドを合成し（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ社）、１７４ｂｐのＤＤＤ１配列の中央１５４ｂｐを含むように組み合わせた。オリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、Ｔａｑポリメラーゼを用いたプライマー伸長反応にかけた。
ＲＩＩＡ１-４４  ｔｏｐ
５’ＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＣＣＣＧＣＣＧＧＧＧＣＴＣＡＣＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＧＣＴＡＣＡＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧＣＧＡＣＡＧ-３’（配列番号６６）
ＲＩＩＡ１-４４  ｂｏｔｔｏｍ
５’ＧＣＧＣＧＡＧＣＴＴＣＴＣＴＣＡＧＧＣＧＧＧＴＧＡＡＧＴＡＣＴＣＣＡＣＴＧＣＧＡＡＴＴＣＧＡＣＧＡＧＧＴＣＡＧＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＴＣＧＣＡＧＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＴＧＴＡＧＣＣＣＴＧ-３’（配列番号６７）
【０１９５】
プライマーを伸長した後、以下のプライマーを使用して、二本鎖をＰＣＲで増幅した：
Ｇ４Ｓ  Ｂａｍ-Ｌｅｆｔ（「Ｇ４Ｓ」は配列番号９６として開示されている）
５’-ＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴ-３’（配列番号６８）
１-４４  ｓｔｏｐ  Ｅａｇ  Ｒｉｇｈｔ
５’-ＣＧＧＣＣＧＴＣＡＡＧＣＧＣＧＡＧＣＴＴＣＴＣＴＣＡＧＧＣＧ-３’（配列番号６９）
【０１９６】
このアンプライマーを、ｐＧｅｍＴにクローニングし、Ｔ７（５’）配向性のインサートを求めてスクリーニングした。
【０１９７】
（Ｇ４Ｓ）２-ＡＤ１（「（Ｇ４Ｓ）２」は配列番号９７として開示されている）の構築
リンカーペプチドの１１残基が先行するＡＤ１のアミノ酸配列をコードし、最初の２つのコドンがＢａｍＨＩ制限部位を含む、（Ｇ４Ｓ）２-ＡＤ１（「（Ｇ４Ｓ）２」は配列番号９７として開示されている）と称する二本鎖オリゴヌクレオチドを合成した（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ社）。終止コドン及びＥａｇＩ制限部位は、３’末端に付加されている。コードされたポリペプチド配列を下記に示す。
ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号７０）
【０１９８】
ＡＫＡＰ-ＩＳ  Ｔｏｐ及びＡＫＡＰ-ＩＳ  Ｂｏｔｔｏｍと称する２つの相補的重複オリゴヌクレオチドを合成した。
ＡＫＡＰ-ＩＳ  Ｔｏｐ
５’ＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＣＡＧＡＴＣＧＡＧＴＡＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＣＡＧＡＴＣＧＴＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＧＣＡＧＧＣＣＴＧＡＣＧＧＣＣＧ-３’（配列番号７１）
ＡＫＡＰ-ＩＳ  Ｂｏｔｔｏｍ
５’ＣＧＧＣＣＧＴＣＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＴＧＴＣＣＡＣＧＡＴＣＴＧＣＴＴＧＧＣＣＡＧＧＴＡＣＴＣＧＡＴＣＴＧＧＣＴＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧＣＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣ-３’（配列番号７２）
【０１９９】
以下のプライマーを使用して、二本鎖をＰＣＲで増幅した：
Ｇ４Ｓ  Ｂａｍ-Ｌｅｆｔ（「Ｇ４Ｓ」は配列番号９６として開示されている）
５’-ＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴ-３’（配列番号７３）
ＡＫＡＰ-ＩＳ  ｓｔｏｐ  Ｅａｇ  Ｒｉｇｈｔ
５’-ＣＧＧＣＣＧＴＣＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡＴＧ-３’（配列番号７４）
【０２００】
このアンプライマーを、ｐＧｅｍＴベクターにクローニングし、Ｔ７（５’）配向性のインサートを求めてスクリーニングした。
【０２０１】
ＤＤＤ１とＣＨ１とのライゲーション
ＤＤＤ１配列をコードする１９０ｂｐ断片を、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限酵素を用いてｐＧｅｍＴから切り出し、その後ＣＨ１-ｐＧｅｍＴの同じ部位にライゲーションして、シャトルベクターＣＨ１-ＤＤＤ１-ｐＧｅｍＴを生成した。
【０２０２】
ＡＤ１とＣＨ１とのライゲーション
ＡＤ１配列を含有する１１０ｂｐ断片を、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限酵素を用いてｐＧｅｍＴから切り出し、その後ＣＨ１-ｐＧｅｍＴの同じ部位にライゲーションして、シャトルベクターＣＨ１-ＡＤ１-ｐＧｅｍＴを生成した。
【０２０３】
ｐｄＨＬ２に基づくベクターへのＣＨ１-ＤＤＤ１又はＣＨ１-ＡＤ１のクローニング
このモジュール設計により、ＣＨ１-ＤＤＤ１又はＣＨ１-ＡＤ１のいずれかを、ｐｄＨＬ２ベクター中の任意のＩｇＧ構築体に組み込むことができる。ｐｄＨＬ２からＳａｃＩＩ／ＥａｇＩ制限断片（ＣＨ１-ＣＨ３）を除去し、それを、それぞれのｐＧｅｍＴシャトルベクターから切り出されているＣＨ１-ＤＤＤ１又はＣＨ１-ＡＤ１のＳａｃＩＩ／ＥａｇＩ断片に置換することにより、重鎖定常ドメイン全体を、上記の構築体のうちの１つと置換する。
【０２０４】
Ｎ末端ＤＤＤドメイン
ＤＤＤ又はＡＤの位置は、ＣＨ１のカルボキシル末端に限定されない。ＤＤＤ１配列がＶＨドメインのアミノ末端に結合された構築体を作り上げた。
【０２０５】
実施例４：ＤＮＬ発現ベクター
ｈ６７９-Ｆｄ-ＡＤ１-ｐｄＨＬ２の構築
ｈ６７９-Ｆｄ-ＡＤ１-ｐｄＨＬ２は、１４個アミノ酸残基で構成される可撓性Ｇｌｙ／Ｓｅｒペプチドスペーサーを介してＦｄのＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に結合されたＡＤ１を有するｈ６７９  Ｆａｂを産生するための発現ベクターである。ＳａｃＩＩ及びＥａｇＩを用いてＣＨ１-ＡＤ１-ＳＶ３シャトルベクターから切り出したＣＨ１-ＡＤ１断片を有するＳａｃＩＩ／ＥａｇＩ断片の置換により、ｈ６７９の可変ドメインを含有するｐｄＨＬ２に基づくベクターを、ｈ６７９-Ｆｄ-ＡＤ１-ｐｄＨＬ２に変換した。
【０２０６】
Ｃ-ＤＤＤ１-Ｆｄ-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２の構築
Ｃ-ＤＤＤ１-Ｆｄ-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２は、ＤＤＤ１が、可撓性ペプチドスペーサーを介してＣＨ１のカルボキシル末端でｈＭＮ-１４  Ｆａｂに結合されている融合タンパク質Ｃ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４を産生するための発現ベクターである。  ＳａｃＩＩ及びＥａｇＩ制限エンドヌクレアーゼで消化してＣＨ１-ＣＨ３ドメインを取り除き、ＳａｃＩＩ及びＥａｇＩを用いてＣＨ１-ＤＤＤ１-ＳＶ３シャトルベクターから切り出したＣＨ１-ＤＤＤ１断片を挿入することにより、ｈＭＮ-１４  ＩｇＧを産生するために使用されたプラスミドベクターｈＭＮ１４（Ｉ）-ｐｄＨＬ２を、Ｃ-ＤＤＤ１-Ｆｄ-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２に変換した。
【０２０７】
Ｎ-ＤＤＤ１-Ｆｄ-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２の構築
Ｎ-ＤＤＤ１-Ｆｄ-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２は、ＤＤＤ１が、可撓性ペプチドスペーサーを介してＶＨのアミノ末端でｈＭＮ-１４  Ｆａｂに結合されている融合タンパク質Ｎ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４の２つのコピーを含む安定した二量体を産生するための発現ベクターである。発現ベクターを以下のように操作した。下記に示されている２つのプライマーを使用して、ＤＤＤ１ドメインをＰＣＲで増幅した。
ＤＤＤ１  Ｎｃｏ  Ｌｅｆｔ
５’  ＣＣＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＣＣＣＧＣＣ-３’（配列番号７５）
ＤＤＤ１-Ｇ４Ｓ  Ｂａｍ  Ｒｉｇｈｔ（「Ｇ４Ｓ」は配列番号９６として開示されている）
５’ＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＡＴＣＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＣＧＡＧＣＴＴＣＴＣＴＣＡＧＧＣＧＧＧＴＧ-３’（配列番号７６）
【０２０８】
ＰＣＲの結果、ＮｃｏＩ制限部位、及びＢａｍＨＩ制限を含有するリンカーの一部のコード配列が、それぞれ５’及び３’末端に付加された。１７０ｂｐのＰＣＲアンプライマーを、ｐＧｅｍＴベクターにクローニングし、Ｔ７（５’）配向性のインサートを求めてクローンをスクリーニングした。１９４ｂｐインサートを、ＮｃｏＩ及びＳａｌＩ制限酵素を用いてｐＧｅｍＴベクターから切り出し、それら同じ酵素を用いて消化することにより調製したＳＶ３シャトルベクターにクローニングして、中間ベクターＤＤＤ１-ＳＶ３を生成した。
【０２０９】
下記に示されているオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ｈＭＮ-１４  Ｆｄ配列をＰＣＲで増幅した。
ｈＭＮ-１４ＶＨ  ｌｅｆｔ  Ｇ４Ｓ  Ｂａｍ（「Ｇ４Ｓ」は配列番号９６として開示されている）
５’-ＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＡＧＣＧＧ-３’（配列番号７７）
ＣＨ１-Ｃ  ｓｔｏｐ  Ｅａｇ
５’-ＣＧＧＣＣＧＴＣＡＧＣＡＧＣＴＣＴＴＡＧＧＴＴＴＣＴＴＧＴＣ-３’（配列番号７８）
【０２１０】
ＰＣＲの結果、ＢａｍＨＩ制限部位、及びリンカーの一部のコード配列が、アンプライマーの５’末端に付加された。終止コドン及びＥａｇＩ制限部位は、３’末端に付加された。１０４３ｂｐアンプライマーを、ｐＧｅｍＴにクローニングした。ｈＭＮ-１４-Ｆｄインサートを、ＢａｍＨＩ及びＥａｇＩ制限酵素を用いてｐＧｅｍＴから切り出し、その後それら同じ酵素を用いて消化することにより調製したＤＤＤ１-ＳＶ３ベクターにライゲーションして、構築体Ｎ-ＤＤＤ１-ｈＭＮ-１４Ｆｄ-ＳＶ３を生成した。
【０２１１】
Ｎ-ＤＤＤ１-ｈＭＮ-１４  Ｆｄ配列を、ＸｈｏＩ及びＥａｇＩ制限酵素を用いて切り出し、１．２８ｋｂのインサート断片を、それら同じ酵素を用いてＣ-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２を消化することにより調製したベクター断片にライゲーションした。最終発現ベクターは、Ｎ-ＤＤＤ１-Ｆｄ-ｈＭＮ-１４-ｐＤＨＬ２である。
【０２１２】
実施例５．ｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ１の産生及び精製
６７９個の抗体がＨＳＧ標的抗原に結合し、アフィニティークロマトグラフィーで精製することができる。ｈ６７９-Ｆｄ-ＡＤ１-ｐｄＨＬ２ベクターを、ＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼで消化することにより線形化し、エレクトロポレーションでＳｐ／ＥＥＥミエローマ細胞に形質移入した。２シストロン性発現ベクターは、合わせてｈ６７９Ｆａｂ-ＡＤ１を形成するｈ６７９カッパ軽鎖及びｈ６７９Ｆｄ-ＡＤ１の両方の合成及び分泌を指図する。エレクトロポレーションした後、細胞を９６ウェル組織培養プレートに播種し、形質移入クローンを、０．０５μＭメトトレキサート（ＭＴＸ）で選択した。ＢＳＡ-ＩＭＰ-２６０（ＨＳＧ）結合体でコーティングされたマイクロタイタープレートを使用し、ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＦａｂで検出したＥＬＩＳＡにより、クローンをタンパク質発現についてスクリーニングした。ＨＳＧ（ＩＭＰ-２３９）センサーチップを使用したＢＩＡｃｏｒｅ分析を使用して、希釈培地試料の注入から得られる初期傾きを測定することにより生産性を決定した。生産性が最も高いクローンは、およそ３０ｍｇ／Ｌの初期生産性を示した。合計２３０ｍｇのｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ１を、一段階のＩＭＰ-２９１アフィニティークロマトグラフィーで、４．５リットルの回転ボトル培養から精製した。培地を、ＩＭＰ-２９１-ａｆｆｉｇｅｌカラムに負荷する前に、限外ろ過によりおよそ１０倍に濃縮した。基線に達するまでカラムをＰＢＳで洗浄し、ｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ１を、１Ｍイミダゾール、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１Ｍ  ＮａＡｃ、ｐＨ４．５で溶出した。溶出液のＳＥ-ＨＰＬＣ分析は、５０ｋＤａタンパク質と一致する滞留時間（９．６３分）を示す単一の鋭いピークを示した（非表示）。還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析では、ｈ６７９-ＡＤ１のポリペプチド成分を表す２つのバンドのみが明白だった（非表示）。
【０２１３】
実施例６．Ｎ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４及びＣ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４の産生及び精製
Ｃ-ＤＤＤ１-Ｆｄ-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２及びＮ-ＤＤＤ１-Ｆｄ-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２ベクターを、エレクトロポレーションによりＳｐ２／０由来ミエローマ細胞に形質移入した。Ｃ-ＤＤＤ１-Ｆｄ-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２は、２シストロン性発現ベクターであり、合わせてＣ-ＤＤＤ１-ｈＭＮ-１４  Ｆａｂを形成するｈＭＮ-１４カッパ軽鎖及びｈＭＮ-１４  Ｆｄ-ＤＤＤ１の両方の合成及び分泌を指図する。Ｎ-ＤＤＤ１-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２は、２シストロン性発現ベクターであり、合わせてＮ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４を形成するｈＭＮ-１４カッパ軽鎖及びＮ-ＤＤＤ１-Ｆｄ-ｈＭＮ-１４の両方の合成及び分泌を指図する。各融合タンパク質は、ＤＤＤ１ドメインの相互作用により、安定したホモ二量体を形成する。
【０２１４】
エレクトロポレーションした後、細胞を９６ウェル組織培養プレートに播種し、形質移入クローンを、０．０５μＭメトトレキサート（ＭＴＸ）で選択した。ＷＩ２（ｈＭＮ-１４に対するラット抗ｉｄモノクローナル抗体でコーティングされたマイクロタイタープレートを使用し、ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＦａｂで検出したＥＬＩＳＡにより、クローンをタンパク質発現についてスクリーニングした。最も大量に産生するＣ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ１４  Ｆａｂ及びＮ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ１４  Ｆａｂクローンの初期生産性は、それぞれ６０ｍｇ／Ｌ及び６ｍｇ／Ｌだった。
【０２１５】
ＡＤ１-ＡｆｆｉｇｅｌによるＮ-ＤＤＤ１-ｈＭＮ-１４及びＣ-ＤＤＤ１-ｈＭＮ-１４の親和性精製
ＤＤＤ／ＡＤ相互作用を使用して、ＤＤＤ１含有構築体を親和性精製した。ＡＤ１-Ｃは、ＡＤ１配列、及びスルフヒドリル基とクロロ酢酸無水物を反応させた後でペプチドをＡｆｆｉｇｅｌに結合するのに使用したカルボキシル末端システイン残基で構成される合成的に製作されたペプチドである。ＤＤＤ含有ａ２構造は、中性ｐＨでＡＤ１-Ｃ-Ａｆｆｉｇｅｌ樹脂と特異的に結合し、低ｐＨ（例えば、ｐＨ２．５）で溶出することができる。
【０２１６】
合計８１ｍｇのＣ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４を、一段階のＡＤ１-Ｃアフィニティークロマトグラフィーにより、１．２リットルの回転ボトル培養から精製した。培地を、ＡＤ１-Ｃ-ａｆｆｉｇｅｌカラムに負荷する前に、限外ろ過によりおよそ１０倍に濃縮した。基線に達するまでカラムをＰＢＳで洗浄し、Ｃ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４を、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．５で溶出した。溶出液のＳＥ-ＨＰＬＣ分析は、１０７ｋＤａタンパク質と一致する滞留時間（８．７分）を示す単一の鋭いピークを示した（非表示）。また、Ｃ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４の２つのポリペプチド成分に予想される分子サイズの２つのバンドのみを示す還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより、純度を確認した（非表示）。
【０２１７】
合計１０ｍｇのＮ-ＤＤＤ１-ｈＭＮ-１４を、一段階のＡＤ１-Ｃアフィニティークロマトグラフィーにより、１．２リットルの回転ボトル培養から精製した。溶出液のＳＥ-ＨＰＬＣ分析は、Ｃ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４と類似した、１０７ｋＤａタンパク質と一致する滞留時間（８．７７分）を示す単一のタンパク質ピークを示した（非表示）。還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥは、Ｎ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４のポリペプチド成分に起因する２つのバンドのみを示した（非表示）。
【０２１８】
Ｃ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４の結合活性を、試験物質を種々の量のＷＩ２と混合した試料のＳＥ-ＨＰＬＣ分析で決定した。ＷＩ２  Ｆａｂ及びＣ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４を０．７５：１のモル比で混合することにより調製した試料は、未結合Ｃ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ１４（８．７１ｍｉｎ）、１つのＷＩ２  Ｆａｂに結合したＣ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４（７．９５ｍｉｎ）、及び２つのＷＩ２  Ｆａｂに結合したＣ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ１４（７．３７ｍｉｎ）に起因する３つのピークを示した（非表示）。４のモル比でＷＩ２  Ｆａｂ及びＣ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４を含有する試料を分析した際には、７．３６分の単一ピークのみが観察された（非表示）。これらの結果は、ｈＭＮ１４-Ｆａｂ-ＤＤＤ１が二量体であり、２つの活性結合部位を有することを実証している。この実験をＮ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４で繰り返すと、非常に類似した結果が得られた。
【０２１９】
競合ＥＬＩＳＡにより、Ｃ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４及びＮ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４は両方とも、ｈＭＮ-１４  ＩｇＧに類似した結合活性で、一価のｈＭＮ-１４  Ｆａｂよりも著しく強くＣＥＡに結合することが実証された（非表示）。ＥＬＩＳＡプレートは、ｈＭＮ-１４が特異的であるＣＥＡのエピトープ（Ａ３Ｂ３）を含有する融合タンパク質でコーティングされていた。
【０２２０】
実施例７．ａ２ｂ複合体の形成
ａ２ｂ複合体形成の根拠は、Ｃ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４（ａ２として）及びｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ１（ｂとして）を等モル量で含有する混合物のＳＥ-ＨＰＬＣ分析により提供された。そのような試料を分析すると、ｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ１（９．５５分）又はＣ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４（８．７３分）のいずれよりも大きな新しいタンパク質の形成と一致する８．４０分の滞留時間を有する単一のピークが観察された（非表示）。ｈＭＮ-１４Ｆ（ａｂ’）２をｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ１と混合したか、又はＣ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４を６７９-Ｆａｂ-ＮＥＭと混合した場合には、アップフィールドシフトは観察されず、相互作用が、ＤＤＤ１及びＡＤ１ドメインを介して特異的に媒介されることが実証された。非常に類似した結果が、ｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ１及びＮ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４を使用して得られた（非表示）。
【０２２１】
ＢＩＡｃｏｒｅを使用して、ＤＤ１及びＡＤ１融合タンパク質間の特異的相互作用を更に実証及び特徴付けた。最初に、高密度ＨＳＧ結合（ＩＭＰ２３９）センサーチップの表面にｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ１又は６７９-Ｆａｂ-ＮＥＭのいずれかを結合させ、次にＣ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４又はｈＭＮ-１４Ｆ（ａｂ’）２をその後に注入することによる実験を実施した。予想通り、ｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ１及びＣ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４の組み合わせのみが、後者を注入した際の応答単位の更なる増加をもたらした（非表示）。類似の結果が、Ｎ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４及びｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ１を使用して得られた（非表示）。
【０２２２】
実施例８．ＤＤＤ又はＡＤ融合タンパク質のいずれかの親和性精製
より低い親和性ドッキングを示すＤＤＤ又はＡＤタンパク質を産生することにより、汎用親和性精製系を開発することができる。ＲＩα二量体により形成されたＤＤＤは、ＲＩＩαと比較して、５００倍弱い親和性（２２５ｎＭ）でＡＫＡＰ-ＩＳ（ＡＤ１）と結合する。従って、最初の４４個アミノ酸残基で形成されるＲＩα二量体を産生し、樹脂に結合させて、任意のＡＤ１含有融合タンパク質を精製するための親和性マトリックスを製作することができる。
【０２２３】
多くの低親和性（０．１μＭ）ＡＫＡＰアンカードメインが、自然界に存在する。必要に応じて、高度に予想可能なアミノ酸置換を導入して、結合親和性を更に低下させることができる。低親和性ＡＤは、合成的又は生物学的のいずれでも産生することができ、任意のＤＤＤ１融合タンパク質の親和性精製に使用される樹脂に結合させることができる。
【０２２４】
実施例９．ジスルフィドで安定化された構造を産生するためのベクター
Ｎ-ＤＤＤ２-Ｆｄ-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２
Ｎ-ＤＤＤ２-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２は、Ｆｄのアミノ末端に付加されたＤＤＤ２の二量体化及びドッキングドメイン配列を有するＮ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４を産生するための発現ベクターである。ＤＤＤ２は、１５個アミノ酸残基のＧｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーを介してＶＨドメインに結合される。ＤＤＤ２は、二量体化及びドッキング配列に先行するシステイン残基を有し、それはＤＤＤ１のものと同一だった。
【０２２５】
発現ベクターを以下のように操作した。ＤＤＤ２の残基１〜１３を含む、２つの重複する相補的オリゴヌクレオチド（ＤＤＤ２  Ｔｏｐ及びＤＤＤ２  Ｂｏｔｔｏｍ）を合成的に製作した。オリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）でリン酸化し、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩ及びＰｓｔＩでそれぞれ消化されたＤＮＡとのライゲーションに適合する５’及び３’末端突出をもたらした。
ＤＤＤ２  Ｔｏｐ
５’ＣＡＴＧＴＧＣＧＧＣＣＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＣＣＣＧＣＣＧＧＧＧＣＴＣＡＣＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡ-３’（配列番号７９）
ＤＤＤ２  Ｂｏｔｔｏｍ
５’ＧＣＡＧＣＴＣＣＧＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＧＧＧＡＴＣＴＧＧＡＴＧＴＧＧＣＣＧＣＡ-３’（配列番号８０）
【０２２６】
二本鎖ＤＮＡを、ＮｃｏＩ及びＰｓｔＩで消化することにより調製したベクター断片、ＤＤＤ１-ｈＭＮ１４  Ｆｄ-ＳＶ３にライゲーションして、中間構築体ＤＤＤ２-ｈＭＮ１４  Ｆｄ-ＳＶ３を生成した。ＤＤＤ２-ｈＭＮ１４  Ｆｄのコード配列を含有していた１．２８ｋｂインサート断片を、ＸｈｏＩ及びＥａｇＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて中間構築体から切り出し、それら同じ酵素で消化することにより調製したｈＭＮ１４-ｐｄＨＬ２ベクターＤＮＡにライゲーションした。最終発現ベクターは、Ｎ-ＤＤＤ２-Ｆｄ-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２である。
【０２２７】
Ｃ-ＤＤＤ２-Ｆｄ-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２
Ｃ-ＤＤＤ２-Ｆｄ-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２は、１４個アミノ酸残基のＧｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーを介してＦｄのカルボキシル末端に付加されたＤＤＤ２の二量体化及びドッキングドメイン配列を有するＣ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４を産生するための発現ベクターである。発現ベクターを以下のように操作した。リンカーペプチドの一部（ＧＧＧＧＳＧＧＧＣＧ、配列番号８１）及びＤＤＤ２の残基１〜１３のコード配列を含む２つの重複する相補的オリゴヌクレオチドを、合成的に製作した。オリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、Ｔ４  ＰＮＫでリン酸化し、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩでそれぞれ消化されたＤＮＡとのライゲーションに適合する５’及び３’末端突出をもたらした。
Ｇ４Ｓ-ＤＤＤ２  ｔｏｐ（「Ｇ４Ｓ」は、配列番号９６として開示されている）
５’ＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＧＣＧＧＣＣＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＣＣＣＧＣＣＧＧＧＧＣＴＣＡＣＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡ-３’（配列番号８２）
Ｇ４Ｓ-ＤＤＤ２  ｂｏｔｔｏｍ（「Ｇ４Ｓ」は、配列番号９６として開示されている）
５’ＧＣＡＧＣＴＣＣＧＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＧＧＧＡＴＣＴＧＧＡＴＧＴＧＧＣＣＧＣＡＡＣＣＴＣＣＧＣＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧ-３’（配列番号８３）
【０２２８】
二本鎖ＤＮＡを、ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで消化することにより調製したシャトルベクターＣＨ１-ＤＤＤ１-ｐＧｅｍＴにライゲーションして、シャトルベクターＣＨ１-ＤＤＤ２-ｐＧｅｍＴを生成した。５０７ｂｐ断片を、ＳａｃＩＩ及びＥａｇＩを用いてＣＨ１-ＤＤＤ２-ｐＧｅｍＴから切り出し、ＳａｃＩＩ及びＥａｇＩで消化することにより調製したＩｇＧ発現ベクターｈＭＮ１４（Ｉ）-ｐｄＨＬ２にライゲーションした。最終発現構築体は、Ｃ-ＤＤＤ２-Ｆｄ-ｈＭＮ-１４-ｐｄＨＬ２である。
【０２２９】
ｈ６７９-Ｆｄ-ＡＤ２-ｐｄＨＬ２
ｈ６７９-Ｆｄ-ＡＤ２-ｐｄＨＬ２は、１４個アミノ酸残基のＧｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーを介してＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に付加されたＡＤ２のアンカードメイン配列を有するｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ２を産生するための発現ベクターである。ＡＤ２は、ＡＤ１のアンカードメイン配列の前に１つシステイン残基、及び後に別のシステイン残基を有する。
【０２３０】
発現ベクターを以下のように操作した。ＡＤ２及びリンカーペプチドの一部のコード配列を含む２つの重複する相補的オリゴヌクレオチド（ＡＤ２Ｔｏｐ及びＡＤ２Ｂｏｔｔｏｍ）を、合成的に製作した。オリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、Ｔ４  ＰＮＫでリン酸化し、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＳｐｅＩでそれぞれ消化されたＤＮＡとのライゲーションに適合する５’及び３’末端突出をもたらした。
ＡＤ２  Ｔｏｐ
５’ＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＴＧＴＧＧＣＣＡＧＡＴＣＧＡＧＴＡＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＣＡＧＡＴＣＧＴＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＧＣＡＧＧＣＣＧＧＣＴＧＣＴＧＡＡ-３’（配列番号８４）
ＡＤ２  Ｂｏｔｔｏｍ
５’ＴＴＣＡＧＣＡＧＣＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＴＧＴＣＣＡＣＧＡＴＣＴＧＣＴＴＧＧＣＣＡＧＧＴＡＣＴＣＧＡＴＣＴＧＧＣＣＡＣＡＴＣＣＧＣＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧ-３’（配列番号８５）
【０２３１】
二本鎖ＤＮＡを、ＢａｍＨＩ及びＳｐｅＩで消化することにより調製したシャトルベクターＣＨ１-ＡＤ１-ｐＧｅｍＴにライゲーションして、シャトルベクターＣＨ１-ＡＤ２-ｐＧｅｍＴを生成した。ＣＨ１及びＡＤ２コード配列を含有する４２９塩基対断片を、ＳａｃＩＩ及びＥａｇＩ制限酵素を用いてシャトルベクターから切り出し、それら同じ酵素で消化することにより調製したｈ６７９-ｐｄＨＬ２ベクターにライゲーションした。最終発現ベクターは、ｈ６７９-Ｆｄ-ＡＤ２-ｐｄＨＬ２である。
【０２３２】
実施例１０．ＴＦ１の生成
ＴＦ１と称する三価ＤＮＬ構築体の大規模調製を、以下のように実施した。最初に、Ｎ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４（タンパク質Ｌで精製）及びｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ２（ＩＭＰ-２９１で精製）を、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で、おおよそ化学量論的な濃度に混合した。ＴＣＥＰを添加する前では、ＳＥ-ＨＰＬＣは、ａ２ｂ形成の痕跡を一切示さなかった（非表示）。その代りに、ａ４（７．９７分；２００ｋＤａ）、ａ２（８．９１分；１００ｋＤａ）、及びＢ（１０．０１分；５０ｋＤａ）を表すピークが存在した。５ｍＭ  ＴＣＥＰを添加すると、１５０ｋＤａタンパク質と一致する８．４３分の新しいピークにより示されるａ２ｂ複合体の形成が、迅速にもたらされた（非表示）。この実験では、ｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ２（９．７２分）に起因するピークが依然として明白だったため、Ｂが過剰に存在していたことは明らかだったが、ａ２又はａ４のいずれに対応する明白なピークも観察されなかった。１時間の還元後、ＰＢＳを数回交換して一晩透析することにより、ＴＣＥＰを除去した。その結果生じた溶液を１０％ＤＭＳＯに調整し、室温で一晩保持した。
【０２３３】
ＳＥ-ＨＰＬＣで分析すると、ａ２ｂを表すピークは鋭くなり、０．１分〜８．３１分だけ滞留時間がわずかに遅くなったことが観察された（非表示）。これは、本発明者らの以前の知見に基づくと、結合親和性の増加を示している。複合体をＩＭＰ-２９１アフィニティークロマトグラフィーで更に精製して、カッパ鎖夾雑物を除去した。予想通り、過剰ｈ６７９-ＡＤ２が同時に精製され、その後分離用ＳＥ-ＨＰＬＣで除去された。
【０２３４】
ＴＦ１は、非常に安定した複合体である。ＴＦ１をＨＳＧ（ＩＭＰ-２３９）センサーチップに対する結合について試験すると、試料注入の終了時に応答の明白な減少は観察されなかった。対照的に、Ｃ-ＤＤＤ１-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４及びｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ１の両方の等モル混合物を含有する溶液を、同様の条件下で試験すると、応答単位の観察された増加には、試料注入間及び直後に検出可能な低下が伴い、最初に形成されたａ２ｂ構造が不安定だったことを示した。更に、その後ＷＩ２を注入することにより、ＴＦ１の応答単位に実質的な増加がもたらされたが、Ｃ-ＤＤＤ１／ＡＤ１混合物の場合は、増加は明白ではなかった。
【０２３５】
センサーチップに固定されたＴＦ１に対するＷＩ２の結合に起因する応答単位の更なる増加は、２つの完全に機能的な結合部位に対応し、Ｎ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４の１つのサブユニットがその各々に寄与していた。これは、ＷＩ２の２つのＦａｂ断片に結合するＴＦ１の能力により確認された（非表示）。ＴＦ１と全く同様に還元及び酸化されたｈ６７９-ＡＤ２及びＮ-ＤＤＤ１-ｈＭＮ１４を含有する混合物を、ＢＩＡｃｏｒｅで分析すると、ＷＩ２の更なる結合はほとんど無く（非表示）、ＴＦ１等のジスルフィドで安定化されたａ２ｂ複合体は、ＤＤＤ２及びＡＤ２の相互作用によってのみ生じ得ることが示された。
【０２３６】
プロセスの時間及び効率を低減する２つの改良をプロセスに施した。第１に、ａ４／ａ２構造の混合物として存在するわずかにモル過剰量のＮ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４を使用して、遊離ｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ２が残留せず、ｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ２に係留されていないあらゆるａ４／ａ２構造並びに軽鎖が、ＩＭＰ-２９１アフィニティークロマトグラフィーにより除去されることになるように、ｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ２と反応させた。第２に、還元後にＴＣＥＰを除去する手段として、透析又はダイアフィルトレーションの代わりに、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用した。それにより、プロセス時間が短縮されるだけでなく、ウイルス除去ステップが追加される可能性もあるだろう。Ｎ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４及び６７９-Ｆａｂ-ＡＤ２を、室温で１時間、５ｍＭ  ＴＣＥＰと混合及び還元した。溶液を０．７５Ｍ硫酸アンモニウムに調整し、その後ブチルＦＦ  ＨＩＣカラムに負荷した。カラムを、０．７５Ｍ硫酸アンモニウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＰＢＳで洗浄して、ＴＣＥＰを除去した。還元されたタンパク質を、ＰＢＳでＨＩＣカラムから溶出し、１０％ＤＭＳＯに調整した。室温で一晩インキュベーションした後、高度に精製されたＴＦ１を、ＩＭＰ-２９１アフィニティークロマトグラフィーで単離した（非表示）。ゲルろ過等の追加的な精製ステップは必要ではなかった。
【０２３７】
実施例１１．ＴＦ２の生成
ＴＦ１の生成に成功した後、ＴＦ２と称する類似体を、Ｃ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４をｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ２と反応させることにより得た。ＴＦ２の試験的バッチを、９０％を超える収率で以下のように生成した。タンパク質Ｌで精製したＣ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４（２００ｍｇ）を、１．４：１のモル比でｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ２（６０ｍｇ）と混合した。総タンパク質濃度は、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中で１．５ｍｇ／ｍｌだった。ＴＣＥＰ還元、ＨＩＣクロマトグラフィー、ＤＭＳＯ酸化、及びＩＭＰ-２９１アフィニティークロマトグラフィーを伴うその後のステップは、ＴＦ１についての記載と同じだった。ＴＣＥＰを添加する前、ＳＥ-ＨＰＬＣは、ａ２ｂ形成の痕跡を一切示さなかった（非表示）。その代りに、ａ４（８．４０分；２１５ｋＤａ）、ａ２（９．３２分；１０７ｋＤａ）、及びｂ（１０．３３分；５０ｋＤａ）に対応するピークが存在した。５ｍＭ  ＴＣＥＰを添加すると、二元構造の場合に予想される１５７ｋＤａタンパク質と一致する８．７７分の新しいピーク（非表示）により示されるａ２ｂ複合体の形成が、迅速にもたらされた。ＴＦ２を、ＩＭＰ-２９１アフィニティークロマトグラフィーで、ほぼ均質に精製した（非表示）。ＩＭＰ-２９１未結合画分をＳＥ-ＨＰＬＣで分析することにより、ａ４、ａ２、及び遊離カッパ鎖が産物から除去されたことを実証した（非表示）。
【０２３８】
ＴＦ２の機能性を、ＴＦ１について記載したようにＢＩＡＣＯＲＥで決定した。ＴＦ２、Ｃ-ＤＤＤ１-ｈＭＮ-１４＋ｈ６７９-ＡＤ１（非共有結合性ａ２ｂ複合体の対照試料として使用した）又はＣ-ＤＤＤ２-ｈＭＮ-１４＋ｈ６７９-ＡＤ２（非還元ａ２及びｂ成分の対照試料として使用した）を、１μｇ／ｍｌ（総タンパク質）に希釈し、ＨＳＧを固定化したセンサーチップに通した。ＴＦ２の応答は、２つの対照試料の応答のおよそ２倍であり、対照試料中のｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ成分のみが結合してセンサチップに残留することになることを示した。その後にＷＩ２  ＩｇＧを注入することにより、ＴＦ２のみが、追加的なシグナル応答により示されたようにｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤに強力に結合したＤＤＤ-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４成分を有することが実証された。また、センサーチップに固定されたＴＦ２に対するＷＩ２の結合に起因する応答単位の更なる増加は、２つの完全に機能的な結合部位に対応し、Ｃ-ＤＤＤ２-Ｆａｂ-ｈＭＮ-１４の１つのサブユニットがその各々に寄与していた。これは、ＷＩ２の２つのＦａｂ断片に結合するＴＦ２の能力により確認された（非表示）。
【０２３９】
ＴＦ２の相対的ＣＥＡ結合活性を、競合ＥＬＩＳＡで決定した。プレートを、ｈＭＮ-１４によって認識されるＣＥＡのＡ３Ｂ３ドメインを含有する融合タンパク質でコーティングした（０．５μｇ／ウェル）。ＴＦ１、ＴＦ２、及びｈＭＮ-１４  ＩｇＧの連続希釈を四重重複で行い、ＨＲＰ結合ｈＭＮ-１４  ＩｇＧ（１ｎＭ）を含有するウェル中でインキュベートした。データは、ＴＦ２が、ＩｇＧの結合活性と少なくとも同様であり、ＴＦ１よりも２倍強力な結合活性でＣＥＡと結合することを示す（非表示）。
【０２４０】
実施例１２．ＴＦ１及びＴＦ２の血清安定性
ＴＦ１及びＴＦ２は、血液及び組織で広範な希釈が生じるｉｎ  ｖｉｖｏで使用することができる安定的に係留された構造であるように設計されていた。ヒト血清中でのＴＦ２の安定性を、ＢＩＡＣＯＲＥを使用して評価した。ＴＦ２を、４人の供与者から貯溜した新鮮なヒト血清で０．１ｍｇ／ｍｌに希釈し、５％ＣＯ２下で７日間３７℃にてインキュベートした。連日試料を１：２５に希釈し、その後ＩＭＰ-２３９ＨＳＧセンサーチップを使用してＢＩＡＣＯＲＥで分析した。ＷＩ２  ＩｇＧの注入を使用して、完全で十分に活性なＴＦ２の量を定量化した。血清試料を、原液から直接希釈した対照試料と比較した。ＴＦ２は、血清中で高度に安定しており、７日後にその二重特異性結合活性の９８％を保持する（非表示）。ヒト又はマウス血清のいずれにおいても、ＴＦ１に関して同様の結果が得られた（非表示）。
【０２４１】
実施例１３．Ｃ-Ｈ-ＡＤ２-ＩｇＧ-ｐｄＨＬ２発現ベクターの生成
ｐｄＨＬ２哺乳動物発現ベクターは、多数の組換えＩｇＧの発現を媒介するために使用されている（Qu et al., Methods 2005, 36:84-95）。任意のＩｇＧ-ｐｄＨＬ２ベクターの、Ｃ-Ｈ-ＡＤ２-ＩｇＧ-ｐｄＨＬ２ベクターへの変換を容易にするために、プラスミドシャトルベクターを生成した。ｐｄＨＬ２ベクターをテンプレートとして、オリゴヌクレオチドＦｃ  ＢｇｌＩＩ  Ｌｅｆｔ及びＦｃ  Ｂａｍ-ＥｃｏＲＩ  Ｒｉｇｈｔをプライマーとして使用して、Ｆｃ（ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン）の遺伝子を増幅した。
Ｆｃ  ＢｇｌＩＩ  Ｌｅｆｔ
５’-ＡＧＡＴＣＴＧＧＣＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧ-３’（配列番号８６）
Ｆｃ  Ｂａｍ-ＥｃｏＲＩ  Ｒｉｇｈｔ
５’-ＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧ-３’（配列番号８７）
【０２４２】
アンプライマーを、ｐＧｅｍＴ  ＰＣＲクローニングベクターにクローニングした。Ｆｃインサート断片を、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素を用いてｐＧｅｍＴから切り出し、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩでｈ６７９-Ｆａｂ-ＡＤ２-ｐｄＨＬ２を消化することにより調製されたＡＤ２-ｐｄＨＬ２ベクターにライゲーションして、シャトルベクターＦｃ-ＡＤ２-ｐｄＨＬ２を生成した。
【０２４３】
任意のＩｇＧ-ｐｄＨＬ２発現ベクターをＣ-Ｈ-ＡＤ２-ＩｇＧ-ｐｄＨＬ２発現ベクターに変換するために、８６１ｂｐのＢｓｒＧＩ／ＮｄｅＩ制限断片を前者から切り出して、Ｆｃ-ＡＤ２-ｐｄＨＬ２ベクターから切り出した９５２ｂｐのＢｓｒＧＩ／ＮｄｅＩ制限断片と置換した。ＢｓｒＧＩはＣＨ３ドメインを切断し、ＮｄｅＩは、発現カセットの下流（３’）を切断する。
【０２４４】
実施例１４．Ｃ-Ｈ-ＡＤ２-ｈＬＬ２  ＩｇＧの産生
エピラツズマブ、又はｈＬＬ２  ＩｇＧは、ヒト化抗ヒトＣＤ２２  ＭＡｂである。Ｃ-Ｈ-ＡＤ２-ｈＬＬ２  ＩｇＧの発現ベクターを、上記に記載のようにｈＬＬ２  ＩｇＧ-ｐｄＨＬ２から生成し、エレクトロポレーションによりＳｐ２／０ミエローマ細胞を形質移入するために使用した。形質移入した後、細胞を９６ウェルプレートに播種し、トランスジェニッククローンを、メトトレキサートを含有する培地中で選択した。ｈＬＬ２特異的抗イディオタイプＭＡｂでコーティングされた９６ウェルマイクロタイタープレートを使用し、ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧで検出するサンドイッチＥＬＩＳＡにより、Ｃ-Ｈ-ＡＤ２-ｈＬＬ２  ＩｇＧ生産性についてクローンをスクリーニングした。クローンをタンパク質産生用の回転ボトルで増殖させ、Ｃ-Ｈ-ＡＤ２-ｈＬＬ２  ＩｇＧを、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して、一段階で使用済培地から精製した。ＳＥ-ＨＰＬＣ分析により、２つのタンパク質ピークが分離された（非表示）。より遅い溶出ピークの滞留時間（８．６３分）は、ｈＬＬ２  ＩｇＧに類似していた。より迅速に溶出したピークの滞留時間（７．７５分）は、約３００ｋＤａタンパク質と一致した。後に、このピークは、ジスルフィドで結合されたＣ-Ｈ-ＡＤ２-ｈＬＬ２-ＩｇＧの二量体であることが判明した。この二量体は、ＤＮＬ反応中にモノマー形態に還元される。ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析は、精製されたＣ-Ｈ-ＡＤ２-ｈＬＬ２-ＩｇＧが、モジュールの単量体形態及びジスルフィドで結合されたモジュールの二量体形態の両方で構成されることを示した（非表示）。これら２つの形態を表すタンパク質バンドは、非還元条件下におけるＳＤＳ-ＰＡＧＥで明白だったが、還元条件下では、全ての形態が、成分ポリペプチド（重鎖-ＡＤ２及びカッパ鎖）を表す２つのバンドに還元された（非表示）。他の夾雑物バンドは検出されなかった。
【０２４５】
実施例１５．Ｃ-Ｈ-ＡＤ２-ｈＡ２０  ＩｇＧの産生
ｈＡ２０  ＩｇＧは、ヒト化抗ヒトＣＤ２０  ＭＡｂである。Ｃ-Ｈ-ＡＤ２-ｈＡ２０  ＩｇＧの発現ベクターを、ｈＡ２０  ＩｇＧ-ｐＤＨＬ２から生成し、エレクトロポレーションによりＳｐ２／０ミエローマ細胞を形質移入するために使用した。形質移入した後、細胞を９６ウェルプレートに播種し、トランスジェニッククローンを、メトトレキサートを含有する培地中で選択した。ｈＡ２０特異的抗イディオタイプＭＡｂでコーティングされた９６ウェルマイクロタイタープレートを使用し、ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧで検出するサンドイッチＥＬＩＳＡにより、Ｃ-Ｈ-ＡＤ２-ｈＡ２０  ＩｇＧ生産性についてクローンをスクリーニングした。クローンをタンパク質産生用の回転ボトルで増殖させ、Ｃ-Ｈ-ＡＤ２-ｈＡ２０  ＩｇＧを、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して、一段階で使用済培地から精製した。ＳＥ-ＨＰＬＣ及びＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析は、Ｃ-Ｈ-ＡＤ２-ｈＬＬ２  ＩｇＧについて得られた結果と非常に類似した結果をもたらした（非表示）。
【０２４６】
実施例１６．複数の抗体に由来するＡＤ及びＤＤＤ結合Ｆａｂ及びＩｇＧ融合タンパク質の産生
上記の実施例に記載の技術を使用して、以下のＩｇＧ又はＦａｂ融合タンパク質を構築し、ＤＮＬ構築体に組み込んだ。融合タンパク質は、親抗体の抗原結合特徴を保持し、ＤＮＬ構築体は、組み込んだ抗体又は抗体断片の抗原結合活性を示した。
【表３】
2013503200.tif 000005
【０２４７】
実施例１７．  Ｂ細胞リンパ腫標的化抗体に結合された４つのランピルナーゼ（Ｒａｐ）を含むリボヌクレアーゼに基づくＤＮＬ免疫毒素
本発明者らは、ドック-アンド-ロック（ＤＮＬ）法を応用して、その各々が二価ＩｇＧに部位特異的に結合された４つのコピーのＲａｐを含む新規のクラスの免疫毒素を生成した。本発明者らは、大腸菌で産生された組換えＲａｐ-ＤＤＤモジュールを、ミエローマ細胞で産生され、ＣＤ２０（ｈＡ２０、ベルツズマブ）、ＣＤ２２（ｈＬＬ２、エピラツズマブ）、又はＨＬＡ-ＤＲ（ｈＬ２４３、ＩＭＭＵ-１１４）と結合することによりＢ細胞リンパ腫及び白血病を標的とする組換えヒト化ＩｇＧ-ＡＤモジュールと組み合わせて、それぞれ２０-Ｒａｐ、２２-Ｒａｐ、及びＣ２-Ｒａｐを生成した。各構築体について、Ｒａｐの二量体を、それぞれのＩｇＧの各重鎖のＣ末端に共有結合で係留した。対照構築体、１４-Ｒａｐを、Ｂ細胞リンパ腫／白血病で発現されない抗原（ＣＥＡＣＡＭ５）に結合するラベツズマブ（ｈＭＮ-１４）を使用して同様に製作した。
ＲａｐＤＤＤ２
ｐＱＤＷＬＴＦＱＫＫＨＩＴＮＴＲＤＶＤＣＤＮＩＭＳＴＮＬＦＨＣＫＤＫＮＴＦＩＹＳＲＰＥＰＶＫＡＩＣＫＧＩＩＡＳＫＮＶＬＴＴＳＥＦＹＬＳＤＣＮＶＴＳＲＰＣＫＹＫＬＫＫＳＴＮＫＦＣＶＴＣＥＮＱＡＰＶＨＦＶＧＶＧＳＣＧＧＧＧＳＬＥＣＧＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡＶＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号９４）
【０２４８】
分泌されたＲａｐ-ＤＤＤ２の推定アミノ酸配列は、上記に示されている（配列番号９４）。Ｒａｐ、下線；リンカー、斜字体；ＤＤＤ２、太字；ｐＱ、ピログルタミン酸に変換されたアミノ末端グルタミン。Ｒａｐ-ＤＤＤ２を大腸菌中で封入体として産生させ、それを変性条件下でＩＭＡＣにより精製し、再び折り畳ませ、その後ＰＢＳに透析し、その後Ｑ-セファロース陰イオン交換クロマトグラフィーで精製した。還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより、Ｒａｐ-ＤＤＤ２（１８．６ｋＤａ）に相当するＭｒを有するタンパク質バンドが分離された（非表示）。精製されたＲａｐ-ＤＤＤ２の最終収量は、１Ｌの培養当たり１０ｍｇだった。
【０２４９】
ＤＮＬ法を使用して、一群のＩｇＧ-Ｒａｐ結合体を迅速に生成した。ＩｇＧ-ＡＤモジュールを、ミエローマ細胞で発現させ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して培養液上清から精製した。Ｒａｐ-ＤＤＤ２モジュールを産生させ、ＩｇＧ-ＡＤ２と混合して、ＤＮＬ複合体を形成した。ＣＨ３-ＡＤ２-ＩｇＧモジュールは、２つのＡＤ２ペプチドを有し、各々がＲａｐ二量体を係留することができるため、その結果生じたＩｇＧ-Ｒａｐ  ＤＮＬ構築体は、４つのＲａｐ群及び１つのＩｇＧを含む。ＩｇＧ-Ｒａｐを、成分モジュールからほぼ定量的に形成させ、プロテインＡを用いてほぼ均質に精製する。
【０２５０】
ＤＮＬ反応の前では、ＣＨ３-ＡＤ２-ＩｇＧは、単量体、及びジスルフィドで結合された二量体の両方として存在する（非表示）。非還元条件下では、ＩｇＧ-Ｒａｐは、単量体ＣＨ３-ＡＤ２-ＩｇＧサイズと二量体ＣＨ３-ＡＤ２-ＩｇＧサイズとの間で予想サイズの高分子量バンドのクラスターとして分離される（非表示）。結合体をそれらの成分ポリペプチドに還元する還元条件では、重鎖-ＡＤ２（ＨＣ-ＡＤ２）、カッパ軽鎖、及びＲａｐ-ＤＤＤ２を表すバンドのみが可視化されるため（非表示）、ＩｇＧ-Ｒａｐの純度及びＤＮＬ法の一貫性が示される。
【０２５１】
２２-Ｒａｐの逆相ＨＰＬＣ分析（非表示）により、単量体形態（７．５５分）及び二量体形態（８．００分）を表すＣＨ３-ＡＤ２-ＩｇＧ-ｈＬＬ２の２つのピークの間で溶出する９．１０分の単一タンパク質ピークが分離された。Ｒａｐ-ＤＤＤ２モジュールを、それぞれ９．３０及び９．５５分で溶出された二量体及び四量体（ＤＮＬ中に二量体に還元される）の混合物として単離した（非表示）。
【０２５２】
２２-ＲａｐのＬＣ／ＭＳ分析は、Ｃ８カラムを使用した逆相ＨＰＬＣをＥＳＩ-ＴＯＦ質量分析法と組み合わせることにより達成した（非表示）。未修飾２２-Ｒａｐのスペクトルでは、幾つかの微量糖型に加えて、２つのＧ０Ｆ（Ｇ０Ｆ／Ｇ０Ｆ）又は１つのＧ０Ｆ＋１つのＧ１Ｆ（Ｇ０Ｆ／Ｇ１Ｆ）のＮ結合グリカンのいずれかを有する２つの主要種が特定される（非表示）。酵素的脱グリコシル化により、２２-Ｒａｐの計算質量と一致する単一のデコンボリューション質量がもたらされた（非表示）。ＴＣＥＰでの還元後に得られたスペクトルでは、Ｇ０Ｆ又はＧ１Ｆ構造のＮ結合グリカンで修飾された重鎖-ＡＤ２ポリペプチド、並びに追加的な微量形態が特定された（非表示）。２２-Ｒａｐを含む３つのサブユニットポリペプチドの各々を、還元及び脱グリコシル化された試料のデコンボリューション後のスペクトルで特定した（非表示）。これらの結果は、Ｒａｐ-ＤＤＤ２及びＨＣ-ＡＤ２ポリペプチドは両方とも、ピログルタミン酸（ｐＱ）に変換されているアミノ末端グルタミンを有しており、従って２２-Ｒａｐは、ｐＱで修飾されたその８つの成分ポリペプチドのうちの６つを有することを確認する。
【０２５３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性を、３つのＮＨＬ細胞系で評価した。各細胞系は、ＣＤ２２と比較して、著しくより高い表面密度でＣＤ２０を発現するが、ｈＬＬ２（抗ＣＤ２２）の内部移行速度は、ｈＡ２０（抗ＣＤ２０）よりはるかに迅速である。１４-Ｒａｐは、２２-Ｒａｐ及び２０-Ｒａｐと同じ構造を共有するが、その抗原（ＣＥＡＣＡＭ５）は、ＮＨＬ細胞では発現されない。図１３、左パネルでは、単一作用剤としてＩｇＧ-Ｒａｐで、又は親ＭＡｂ＋ｒＲａｐの組み合わせで、細胞を連続的に処理した。２０-Ｒａｐ及び２２-Ｒａｐは両方とも、１ｎＭを超える濃度で各細胞系を死滅させ、それらの作用が、単に細胞増殖抑制性であるのではなく細胞毒性であることを示した。２０-Ｒａｐは、最も強力なＩｇＧ-Ｒａｐであり、抗原密度が、内部移行速度よりも重要であり得ることを示唆した。同様の結果が、Ｄａｕｄｉ及びＲａｍｏｓで得られ、２０-Ｒａｐ（ＥＣ５０  約０．１ｎＭ）は、２２-Ｒａｐよりも３〜６倍強力だった。リツキシマブ耐性マントル細胞リンパ腫系、Ｊｅｋｏ-１は、Ｄａｕｄｉ及びＲａｍｏｓと比較して、ＣＤ２０の増加を示すが、ＣＤ２２の減少を示す。重要なことには、２０-Ｒａｐは、Ｊｅｋｏ-１において非常に強力な細胞毒性を示し（ＥＣ５０  約２０ｐＭ）、２２-Ｒａｐよりも２５倍強力だった。
【０２５４】
図１３、右パネルに示されているように、予想通り、１時間処理した後で細胞を洗浄することにより、各作用剤の細胞毒性が著しく減少した（約５０倍）。この場合も、２０-Ｒａｐは最も強力であり、そのより遅い内部移行速度が制限ではないことが示唆された。１４-Ｒａｐは、ｒＲａｐ（ＭＡｂとの組み合せ）と比較して細胞毒性の増加を示し、ＩｇＧ-Ｒａｐの４つのＲａｐ構造が、その内部移行を増強することができることを示唆する。１時間インキュベーションした後で洗浄することにより、１４-Ｒａｐの細胞毒性は、標的化２２-Ｒａｐ及び２０-Ｒａｐよりも低減された。
【０２５５】
ＩｇＧ-Ｒａｐを、３つ全ての細胞系で評価した（図１４）。相対的抗原密度は、３つの系統で類似しており、ＨＬＡ-ＤＲ＞＞ＣＤ２２＞＞ＣＤ２０だった。これらアッセイでは、親ＭＡｂはいずれも、単独でも又はｒＲａｐとの組合せでも、細胞毒性ではなかった。しかしながら、非標的化１４-Ｒａｐは、ある程度の活性を示し、ＮＨＬ系での結果と類似していた。各細胞系で、最も豊富な抗原（ＨＬＡ-ＤＲ）を標的とするＣ２-Ｒａｐは、最も強力な応答を示し、２２-Ｒａｐよりも約５０倍強力だった。非常に低いＣＤ２０抗原密度を有する全ての系統で、２０-Ｒａｐは、わずかな細胞毒性を示し、非標的化１４-Ｒａｐの細胞毒性と類似していた。これは、高ＣＤ２０密度を有し、２０-Ｒａｐに対して最も応答性だったＮＨＬ系統の結果と対照的である。従って、ＩｇＧ-Ｒａｐの効能は、標的とされた抗原の相対的存在量と相関する。
【０２５６】
結論
ＤＮＬ法は、複数の細胞毒素を標的化抗体に効率的に係留するためのモジュール式手法を提供し、薬物動態の向上及び特異的な標的化のため、より高いｉｎ  ｖｉｖｏ効力を示すことが予想される新規の免疫毒素をもたらす。ＬＣ／ＭＳ、ＲＰ-ＨＰＬＣ、及びＳＤＳ-ＰＡＧＥは、ＩｇＧ-Ｒａｐの均質性及び純度を実証した。ＭＡｂを有するＲａｐを細胞表面抗原に対して標的化することは、その腫瘍特異的細胞毒性を増強する。抗原密度及び内部移行速度は両方とも、ＩｇＧ-Ｒａｐの観察されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力の重要な要因である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結果は、ＣＤ２０-、ＣＤ２２-、又はＨＬＡ-ＤＲ-標的化ＩｇＧ-Ｒａｐが、Ｂ細胞リンパ腫及び白血病を治療するための強力な生物学的活性を有することを示す。
【０２５７】
実施例１８．癌腫に対するＲａｐ-抗Ｔｒｏｐ-２  ＩｇＧ  ＤＮＬ構築体の高い効力
実施例１７に記載のものと同じ技術を使用して、４つのコピーのＲａｐ-ＤＤＤ２に結合されたｈＲＳ７-ＩｇＧ-Ａｄ２（抗Ｔｒｏｐ-２）を含むＥ１-Ｒａｐ  ＤＮＬ構築体を生成し、それは、様々な癌細胞系に対する強力なｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖阻害特性を示した（非表示）。それらの全てが高レベルのＴｒｏｐ-２を発現する乳房（ＭＤＡ-ＭＢ-４６８）、子宮頚部（ＭＥ-１８０）、及び膵臓（ＢｘＰＣ-３及びＣａｐａｎ-１）腫瘍系において、Ｅ１-Ｒａｐは非常に強力であり、ナノモル未満の範囲（５〜８９０ｐＭ）のＥＣ５０を示し、それは、非標的化Ｒａｐ又はＲａｐ及びｈＲＳ７の組み合わせよりも１，０００〜１０００，００倍高かった。３つの前立腺癌系（ＰＣ-３、ＤＵ１４５、及びＬＮＣａＰ）等の、わずかなレベルのＴｒｏｐ-２を発現する細胞系では、Ｅ１―Ｒａｐは、それほど強力でなかったが、それでもナノモル範囲（１〜８９０ｎＭ）のＥＣ５０を示した。これら固形癌細胞系で得られた細胞結合データは、Ｅ１-Ｒａｐに対する細胞系の感受性が、細胞表面でのそのＴｒｏｐ-２発現と相関すると考えられることを示唆する。Ｅ１-Ｒａｐの毒性は、ｈＲＳ７に結合しない前立腺癌系、２２Ｒｖ１では観察されなかった。これらの結果は、乳癌、結腸癌、胃癌、肺癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、膵臓癌、及び前立腺癌を含むＴｒｏｐ-２陽性固形腫瘍の新しい治療剤としてのＥ１-Ｒａｐの効能を示す。
＊  ＊  ＊
【０２５８】
本明細書で開示及び特許請求されている組成物及び方法は全て、本開示に照らして、過度の実験作業をすることなく、製作及び使用することができる。本組成物及び方法は、好ましい実施形態の観点から記述されているが、当業者であれば、本発明の概念、趣旨、及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の組成物及び方法に、及び本方法のステップ又はステップの順序に変異を適用することができることは明らかである。より詳しくは、化学的に及び生理学的にの両方で関連するある作用剤を、本明細書に記載の作用剤の代わりに用いることができ、同じ又は類似の結果が達成されるだろう。当業者にとって明らかなそのような類似の代用物及び改変は全て、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の趣旨、範囲、及び概念内にあるとみなされる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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