(57)【要約】  本発明はアレイ、アレイを構築する方法、およびそのようなアレイの使用方法を提供する。本発明のアレイは、基材の面上に、任意選択によりリンカー分子によって結合された２つ以上の別々の構築物または構築物の別々のセットを有する基材を含む。構築物は、目的のペプチドおよび親和性タグをコードする領域および非翻訳領域を含むオリゴヌクレオチド、目的のペプチドおよび親和性タグの両方を含む融合ペプチド、ならびに親和性タグと結合対を形成する捕獲剤を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
面を有する基材と、
前記基材の前記面上に結合した２つ以上の個別の構築物と、を備えるアレイであって、前記個別の構築物は、
目的のペプチドをコードするオリゴヌクレオチドと、
前記目的のペプチドとを含み、
前記オリゴヌクレオチドは前記基材面に結合され、前記ペプチドは前記オリゴヌクレオチドに結合されている、アレイ。
【請求項２】
面を有する基材と、
前記基材の前記面上に結合した２つ以上の個別の構築物と、を備えるアレイであって、
前記個別の構築物は、
目的のペプチドをコードする領域と、親和性タグをコードする領域と、非翻訳領域とを含むオリゴヌクレオチドと、
前記目的のペプチドおよび親和性タグを含むペプチドと、
前記親和性タグに選択的に結合する捕獲剤とを含み、
前記オリゴヌクレオチドは前記基材面に結合され、前記ペプチドは前記親和性タグの前記捕獲剤への結合によって、前記オリゴヌクレオチドに結合されている、アレイ。
【請求項３】
前記非翻訳領域が転写開始点およびリボソーム結合部位を含む、請求項２に記載のアレイ。
【請求項４】
前記捕獲剤が前記オリゴヌクレオチドに結合されている、請求項２に記載のアレイ。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドがリンカーによって前記基材面に結合されている、請求項２に記載のアレイ。
【請求項６】
前記捕獲剤が前記リンカーに結合されている、請求項２に記載のアレイ。
【請求項７】
前記基材が平坦な担体である、請求項２に記載のアレイ。
【請求項８】
前記基材がビーズである、請求項２に記載のアレイ。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドが二本鎖である、請求項２に記載のアレイ。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドが前記オリゴヌクレオチドへの前記捕獲剤の導入に使用される領域をさらに含む、請求項２に記載のアレイ。
【請求項１１】
前記領域がリンカー分子によって前記オリゴヌクレオチドに結合されている、請求項１０に記載のアレイ。
【請求項１２】
アレイを構築する方法において、
（ａ）２つ以上の構築物を含む面を提供するステップであって、前記構築物は、目的のペプチドおよび親和性タグをコードする一本鎖のオリゴヌクレオチド領域を含む、前記ステップと、
（ｂ）前記一本鎖のオリゴヌクレオチド領域を二本鎖のオリゴヌクレオチド領域に変換するステップと、
（ｃ）前記二本鎖のオリゴヌクレオチド領域の５’末端に、リボソーム開始部位を含む非翻訳領域を導入するステップであって、前記非翻訳領域は、前記親和性タグと結合対を
形成する能力を有する捕獲剤に結合される、前記ステップと、
（ｄ）前記目的のペプチドおよび前記親和性タグを含むペプチドを生成するために前記二本鎖のオリゴヌクレオチド領域を転写および翻訳させるステップと、を備え、
ステップ（ｄ）において生成されたタンパク質は、翻訳後に前記構築物の捕獲剤により捕獲され、それによって前記ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドに結合した前記ペプチドを含む個々の構築物が形成される、方法。
【請求項１３】
アレイを構築する方法において、
（ａ）面を有する基材を提供するステップであって、前記面上に２つ以上の構築物が結合されており、前記構築物は、目的のペプチドおよび親和性タグをコードする一本鎖のオリゴヌクレオチドを含む、前記ステップと、
（ｂ）前記構築物の前記オリゴヌクレオチドに対する第２のユニバーサルなオリゴヌクレオチドのライゲーションを行うステップであって、前記ユニバーサルなオリゴヌクレオチドはリボソーム結合部位を含む非翻訳領域を含む、前記ステップと、
（ｃ）前記第２のオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによって前記オリゴヌクレオチドに捕獲剤を取り付けるステップと、
（ｄ）前記構築物の前記一本鎖のオリゴヌクレオチド領域を二本鎖のオリゴヌクレオチド領域に変換するステップと、
（ｅ）前記二本鎖のオリゴヌクレオチドを転写および翻訳させ、前記二本鎖のオリゴヌクレオチドからペプチドを生成するステップと、を備え、
ステップ（ｅ）において生成されたタンパク質は、前記構築物の捕獲剤により捕獲され、結果として生じるアレイは核酸を含む別々のユニットを含み、前記核酸は前記核酸によりコードされた前記ペプチドに結合されている、方法。
【請求項１４】
アレイを構築する方法において、
（ａ）２つ以上の構築物を含む面を提供するステップであって、前記構築物は、目的のペプチドおよび親和性タグをコードする配列の逆の相補的な配列を有する一本鎖のオリゴヌクレオチド領域を含む、前記ステップと、
（ｂ）前記一本鎖のオリゴヌクレオチド領域を二本鎖のオリゴヌクレオチド領域に変換するステップと、
（ｃ）前記二本鎖のオリゴヌクレオチド領域の５’末端に、リボソーム開始部位を含む非翻訳領域を導入するステップであって、前記非翻訳領域は、前記親和性タグと結合対を形成する能力を有する捕獲剤に結合される、前記ステップと、
（ｄ）前記二本鎖のオリゴヌクレオチド領域を転写および翻訳させて、前記目的のペプチドおよび前記親和性タグを含むペプチドを生成するステップと、を備え、
ステップ（ｄ）において生成されたタンパク質は、翻訳後に前記構築物の捕獲剤により捕獲され、それによって前記ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドに結合した前記ペプチドを含む個々の構築物が形成される、方法。
【請求項１５】
アレイを構築する方法において、
（ａ）面上で結合した２つ以上の構築物を有する前記面を含む基材を提供し、前記構築物は、目的のペプチドおよび親和性タグをコードする配列の逆の相補的な配列を有する一本鎖のオリゴヌクレオチドを含む、提供するステップ；
アレイを構築する方法において、
（ａ）面を有する基材を提供するステップであって、前記面上に２つ以上の構築物が結合されており、前記構築物は、目的のペプチドおよび親和性タグをコードする配列の逆の相補的な配列を有する一本鎖のオリゴヌクレオチドを含む、前記ステップと、
（ｂ）前記構築物の前記オリゴヌクレオチドに対する第２のユニバーサルなオリゴヌクレオチドのライゲーションを行うステップであって、前記ユニバーサルなオリゴヌクレオチドはリボソーム結合部位を含む非翻訳領域を含む、前記ステップと、
（ｃ）前記第２のオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによって前記オリゴヌクレオチドに捕獲剤を取り付けるステップと、
（ｄ）前記構築物の前記一本鎖のオリゴヌクレオチド領域を二本鎖のオリゴヌクレオチド領域に変換するステップと、
（ｅ）前記二本鎖のオリゴヌクレオチドを転写および翻訳させ、前記二本鎖のオリゴヌクレオチドからペプチドを生成するステップと、を備え、
ステップ（ｅ）において生成されたタンパク質は、前記構築物の捕獲剤により捕獲され、結果として生じるアレイは核酸を含む別々のユニットを含み、前記核酸は前記核酸によりコードされた前記ペプチドに結合されている、方法。
【請求項１６】
目的のペプチドに結合する作用剤を同定する方法において、
アレイを提供するステップであって、
面を有する基材と、
前記基材の前記面上に結合した２つ以上の個別の構築物とを備え、前記個別の構築物が、
（ｉ）目的のペプチドをコードするオリゴヌクレオチドと、
（ｉｉ）前記目的のペプチドと、を含むアレイであって、
前記オリゴヌクレオチドは前記基材面に結合され、かつ前記ペプチドは前記オリゴヌクレオチドに結合されている、前記ステップと、
前記アレイを作用剤に接触させるステップと、
前記作用剤の前記目的のペプチドへ結合の有無を検出するステップと、を含む方法。
【請求項１７】
前記作用剤が試料により提供され、前記目的のペプチドへの結合の存在によって、試料における前記作用剤の存在が示される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記作用剤が試料により提供され、前記目的のペプチドへの結合の不在によって、試料における前記作用剤の不在が示される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
目的のペプチドに結合する作用剤を同定する方法において、
アレイを提供するステップであって、
面を有する基材と、
前記基材の前記面上に結合した２つ以上の個別の構築物とを備え、前記個別の構築物が、
（ｉ）目的のペプチドをコードすると、親和性タグをコードする領域と、非翻訳領域とを含むオリゴヌクレオチドと、
（ｉｉ）前記目的のペプチドおよび親和性タグを含むペプチドと、
（ｉｉｉ）前記親和性タグに選択的に結合する捕獲剤とを含むアレイであって、
前記オリゴヌクレオチドは前記基材面に結合され、前記ペプチドは前記親和性タグの前記捕獲剤への結合によって前記オリゴヌクレオチドに結合されている、前記ステップと、
前記アレイを作用剤に接触させるステップと、
前記作用剤の前記目的のペプチドへ結合の有無を検出するステップと、を含む方法。
【請求項２０】
前記作用剤が試料により提供され、前記目的のペプチドへの結合の存在によって、試料における前記作用剤の存在が示される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記作用剤が試料により提供され、前記目的のペプチドへの結合の不在によって、試料における前記作用剤の不在が示される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
アレイを構築するための方法において、
ａ）固体基材上の既知の配列の核酸配列の１セットを合成するステップと、
ｂ）前記固体基材上の前記核酸に１つまたは複数の追加の核酸領域を取り付け、前記基材上に伸長核酸を提供するステップと、
ｃ）ペプチドの生成のための鋳型として前記伸長核酸を利用するインビトロの転写および翻訳を実施するステップと、
ｄ）前記固体基材上の既知の位置に、生成したペプチドを取り付けるステップと、を備える方法。
【請求項２３】
生成したペプチドは、前記ペプチドのその核酸基材に取り付けられる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸が直接前記固体基材上で化学的に合成される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
ステップｂ）における前記追加の核酸が酵素的なライゲーションによって取り付けられる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記核酸のセットが前記基材上に少なくとも１，０００の核酸配列を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記核酸のセットが前記基材上に少なくとも５，０００の核酸配列を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記核酸のセットが前記基材上に少なくとも１０，０００の核酸配列を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ｂ）固体基材上の前記核酸に１つまたは複数の追加の核酸領域を取り付け、前記基材上に伸長核酸を提供すること；
ｃ）ペプチドの生成のための鋳型として前記伸長核酸を利用するインビトロの転写および翻訳を実施すること；ならびに
ｄ）前記固体基材上に生成したペプチドを取り付けること、
を含む方法。
ペプチドアレイを構築するための方法において、
ａ）アミノ酸配列をコードする、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドの１セットを含む核酸マイクロアレイを製造するステップと、
ｂ）前記固体基材上の前記核酸に１つまたは複数の追加の核酸領域を取り付け、前記基材上に伸長核酸を提供するステップと、
ｃ）ペプチドの生成のための鋳型として前記伸長核酸を利用するインビトロの転写および翻訳を実施するステップと、
ｄ）前記固体基材上に、生成したペプチドを取り付けるステップと、を備える方法。
【請求項３０】
生成したペプチドは、前記ペプチドのその核酸基材に取り付けられる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸が直接前記固体基材上で化学的に合成される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
ステップｂ）における前記追加の核酸が酵素的なライゲーションによって取り付けられる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記マイクロアレイが少なくとも１，０００の核酸配列を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記マイクロアレイが少なくとも５，０００の核酸配列を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記マイクロアレイが少なくとも１０，０００の核酸配列を含む、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドベースのアレイ、そのようなアレイを作製する方法および関連する使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
以下の議論において、ある物品および方法を、背景および導入目的のために記述する。本明細書に記載のいずれもが、先行技術の「容認」として解釈されるべきではない。本明細書で参照される物品および方法が、適用可能な法律の条項の下で先行技術を構成しないことを、出願人は、必要に応じて実証する権利を明確に保有する。
【０００３】
プロテオミクス、すなわちタンパク質の機能、構造および相互作用に関する研究では、タンパク質を十分な量で生成し、かつスループットの高い方法でこれらのタンパク質を研究する能力が求められる。タンパク質マイクロアレイは、タンパク質のこのような高スループットな分析に対して非常に有益なツールである。しかし、大規模なプロテオミクス研究にマイクロアレイ技術を利用することは、タンパク質の生成の困難さおよび費用により、まだ非常に限定的である。（非特許文献１）。伝統的に、ペプチドアレイは、あらかじめ合成されたペプチドを面上にスポッティングすることにより（非特許文献２）、または、ＳＰＯＴ方法としても知られているが、標準的な固相ペプチド合成を使用してセルロースろ過シート上のスポットでペプチドを合成することにより（非特許文献３）作製する。数十〜数十万のペプチドを有するアレイを作成する費用は非常に高く、このようなアレイを大規模に、高スループットに使用することは、費用面で無理がある。最近になって、インビトロでの翻訳によるペプチドアレイ作製の方法が開発されており、タンパク質インシツアレイ（ＰＩＳＡ）作製（非特許文献４）、核酸プログラム型タンパク質アレイ（ＮＡＰＰＡ）作製（非特許文献５）、ＤＮＡ−タンパク質アレイ（ＤＡＰＡ）構築（Ｈｅ  Ｍ
Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５：１７５−１７７（２００８））および、インシツのピュロマイシン捕獲を使用したタンパク質アレイ（非特許文献６）がある。しかしながら、これらのアプローチは個々に合成された鋳型核酸を必要とし、またその費用は、伝統的方法により配置された個々のペプチドの費用よりも高い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  Ｇ  ａｎｄ  Ｂｒａｄｌｅｙ  Ｍ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ａｕｇ；１８（４）：３２６−３０，（２００７），Ｅｐｕｂ  ２００７  Ａｕｇ  ６；Ｔａｐｉａ  ＶＥ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００９；５７０：３−１７（２００９）
【非特許文献２】Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ  ＣＭ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．  ２００２  Ｄｅｃ  １８；１２４（５０）：１４８６８−７０（２００２）
【非特許文献３】Ｆｒａｎｋ  Ｒ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００２  Ｓｅｐ  １；２６７（１）：１３−２６（２００２）
【非特許文献４】Ｈｅ  Ｍ  ａｎｄ  Ｔａｕｓｓｉｇ  ＭＪ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２９，ｅ７３（２００１）
【非特許文献５】Ｒａｎａｃｈａｎｄｒａｎ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５：８６−９０（２００４）
【非特許文献６】Ｔａｏ  Ｓ−Ｃ  ａｎｄ  Ｚｈｕ  Ｈ，Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２４：１２５３−１２５４（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
高密度、高品質で、多様な配列のペプチドアレイを製作する能力は、高スループットな結合および酵素活性プロファイリングの研究を可能にし、研究、診断法および治療学上の開発において様々に利用されるであろう。本発明はこの要求に取り組む。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この「概要」は、数々のコンセプトを、以下の「詳細な説明」でさらに詳述される単純化した形態で紹介するために提供される。この「概要」は、特許請求される主題の重要なまたは基本的な特徴を同定することを意図しない。また特許請求される主題の範囲の限定も意図しない。特許請求される主題の他の特徴、詳細、有用性および利点は、添付された図面で説明され、添付された特許請求の範囲で限定された態様を含む以下の「詳細な説明」から明らかとなるであろう。
【０００７】
本発明はアレイ、アレイを構築する方法、およびそのようなアレイの使用方法を提供する。本発明のアレイは、基材の面上に、任意選択によりリンカー分子によって結合された２つ以上の別々の構築物または構築物の別々のセットを有する基材を含む。構築物は、目的のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド、および目的のペプチドそれ自体の両方を含む。オリゴヌクレオチドは基材面に、またペプチドはオリゴヌクレオチドに、直接またはリンカー分子によって結合されている。
【０００８】
特定の態様において、アレイの構築物は、目的のペプチドおよび親和性タグをコードする第１のオリゴヌクレオチド領域、非翻訳領域を含み、第１のオリゴヌクレオチドに５’で配置した第２のオリゴヌクレオチド領域、目的のペプチドおよび親和性タグの両方を含む融合ペプチド、ならびに融合タンパク質の親和性タグと結合対を形成するオリゴヌクレオチドに結合した捕獲剤を含む。オリゴヌクレオチドの非翻訳領域は、転写開始点およびリボソーム結合部位を、目的のペプチドおよび親和性タグをコードする領域の５’に含む。
【０００９】
捕獲剤は、オリゴヌクレオチドに直接的に、またはリンカー分子によって結合してもよい。好ましい態様において、融合ペプチドは、基材面から遠位にあるオリゴヌクレオチドの終端で、オリゴヌクレオチドに直接または間接的に結合した捕獲剤との結合によって、オリゴヌクレオチドと結合している。ある他の態様において、ペプチドは、オリゴヌクレオチドに結合した捕獲剤によって、または、オリゴヌクレオチドを基材面に取り付けるリンカーに結合した捕獲剤のいずれかによって、基材の面近くのオリゴヌクレオチドに結合される。好ましい態様において、捕獲剤は、オリゴヌクレオチドに連結したプライマー配列によって、例えば合成リンカー分子を使用して、基材面から遠位にあるオリゴヌクレオチド上の位置で結合される。
【００１０】
ある態様において、アレイ基材は、平坦な担体、フィルム、ビーズまたはそれらの組み合わせである。オリゴヌクレオチドの１つの鎖は、オリゴヌクレオチドへ非翻訳領域を導入するために使用されるプライマー領域を含む。非翻訳領域は、転写反応の開始のためのリボソーム開始部位および転写プロモーター領域を含む。
【００１１】
ある特定の態様において、構築物は、フローセル、好ましくは高スループットな配列決定に使用されるフローセルの面に配置される。配列をフローセルにおいてインシツでクローン的に任意に増幅できる。この態様において、配列はランダムに配置されるが、各クローン配列の同一性は、タンパク質の生成およびスクリーニングアッセイでの使用の前、または後のいずれかで決定できる。何百万もの鋳型ＤＮＡを配置し、かつそれらの配列を決定する能力は、鋳型オリゴヌクレオチドの合成の間に規定された位置で、塩基をランダム化することにより、より長い鋳型を形成するためにより短いオリゴヌクレオチドを組み合
わせることにより、またはゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーから配列のライブラリーを導き出すことにより、非常に安価に実行できる。
【００１２】
本発明のある態様において、アレイの構築物は、ペプチドに結合した二本鎖のオリゴヌクレオチドを含む。他の態様においては、ペプチドが結合した後にオリゴヌクレオチド鎖のうちの１本を除去するのが望ましい場合もあり、アレイは、目的のペプチドに結合した一本鎖のオリゴヌクレオチドを含むことになる。
【００１３】
本発明はまた、本発明のアレイを構築する方法を提供する。本発明のペプチドアレイを作製する特定の方法は、基材面（例えば平坦な基材、またはビーズの１セット）上で合成された核酸のセットを利用する。アミノ酸配列をコードする既知の配列の核酸は、例えば化学合成技術を使用して、面上で直接合成されるのが好ましい。アレイ上の個々の異なる位置または部位での配列の同一性はあらかじめ決定されてもよく、または固体基材上での合成、もしくはマイクロアレイ等の固定フォーマットへ集合させた（例えばビーズの場合）後に決定されてもよい。配列同一性もペプチドアレイの構築後に決定されてもよい。核酸を合成的に生成した後、所望の配列情報（例えばペプチドアレイの要素をコードする配列、転写または翻訳に必要な配列等）を含む核酸を、基材面上の合成された核酸に、化学的および好ましくは酵素的ライゲーション、プライマー伸長、増幅などの方法を使用して、追加で取り付ける。伸長した核酸は、インビトロの転写および翻訳による目的のペプチドおよび他のペプチドの要素（例えば親和性タグ）の生成の鋳型として使用される。
【００１４】
ペプチドアレイを構築するための別の特定の態様において、アミノ酸配列をコードする、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを１セット含む核酸マイクロアレイが作製される。所望の配列情報（例えばペプチドアレイの要素をコードする配列、転写または翻訳に必要な配列等）を含む核酸を、化学的および、好ましくは酵素的なライゲーション、プライマー伸長、増幅等の方法を使用して、これらのアレイのオリゴヌクレオチドに追加で取り付ける。伸長した核酸は、インビトロの転写および翻訳による目的のペプチドおよび他のペプチドの要素（例えば親和性タグ）の生成の鋳型として使用される。
【００１５】
ペプチドの生成後に、ペプチドは、基材面上の既知の位置で捕獲される。ペプチドは、ペプチドそれぞれの鋳型核酸の位置と、または実際の鋳型と直接、本明細書に詳細に記述された方法を使用して結合するのが好ましい。合成の、および、合成後の核酸構築の組み合わせを利用する本発明のこれらの方法は、基材面上の既知の配列のペプチドを多数生成するのに、特に有益である。例えば、これらの方法を使用すると、少なくとも１００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、および少なくとも１０，０００のアレイの分析可能なペプチドが、基材面上で生成できる。
【００１６】
あるいは、伸長された核酸配列を（直接的に、または複製物として）面に移行させ、インシツで増幅し、ペプチドアレイ構築の残りのプロセスが実行される。
態様のいくつかにおいて、アレイは、目的のペプチドおよび親和性タグをコードする一本鎖の鋳型オリゴヌクレオチド領域を含む２つ以上の構築物を含む面を使用して作製できる。一態様において、一本鎖の鋳型オリゴヌクレオチドは二本鎖のオリゴヌクレオチド領域に変換され、転写開始点およびリボソーム結合部位を含む非翻訳領域は、二本鎖のオリゴヌクレオチド領域の５’末端に導入される。他の好ましい態様において、非翻訳領域は、一本鎖のオリゴヌクレオチドの二本鎖の鋳型への変換に先立って一本鎖領域に付加される。その後、二本鎖のオリゴヌクレオチド領域はインビトロで転写および翻訳され、目的のペプチドおよび親和性タグを含む融合ペプチドが生成され、この融合ペプチドは、オリゴヌクレオチドに直接的にまたは間接的に結合されている捕獲剤に、融合ペプチドの親和性タグ部分を結合することにより、構築物に捕獲される。捕獲剤は、任意選択によりオリゴヌクレオチドの非翻訳領域に結合しており、この非翻訳部位の領域に相補的な領域によ
ってオリゴヌクレオチドに導入される。あるいは、捕獲剤は、ペプチドコード領域によって、または基材面に鋳型オリゴヌクレオチドを取り付けるリンカーによって構築物に結合していてもよい。
【００１７】
別の態様において、アレイは、目的のペプチドをコードする配列に相補的な、および親和性タグをコードする配列に相補的な配列を含む一本鎖の鋳型オリゴヌクレオチド領域を含む２つ以上の構築物を含む面を使用して作製できる。一本鎖の鋳型オリゴヌクレオチドは二本鎖のオリゴヌクレオチド領域に変換され、転写開始点およびリボソーム結合部位を含む非翻訳領域は、二本鎖のオリゴヌクレオチド領域の５’末端に導入される。その後、二本鎖のオリゴヌクレオチド領域を転写および翻訳させて、目的のペプチドおよび親和性タグを含むペプチドが生成され、この融合ペプチドは、捕獲剤に、融合ペプチドの親和性タグ部分を結合することにより、構築物に捕獲される。捕獲剤は任意選択により非翻訳領域に結合しており、この領域で構築物に導入される。あるいは、捕獲剤は、ペプチドコード領域によって、または基材面にオリゴヌクレオチドを取り付けるリンカーによって構築物に結合していてもよい。
【００１８】
さらに別の態様において、本発明は、目的のペプチドおよび親和性タグをコードする一本鎖のオリゴヌクレオチド領域を含む２つ以上の構築物を有する面を含む基材を提供することによりアレイを構築する方法を提供する。転写開始点およびリボソーム結合部位を有する非翻訳領域を含む第２のユニバーサルなオリゴヌクレオチドは、構築物のオリゴヌクレオチドに取り付けられており、捕獲剤はユニバーサルなオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによってオリゴヌクレオチドに結合している。構築物の一本鎖のオリゴヌクレオチド領域は二本鎖のオリゴヌクレオチド領域に変換され、また、二本鎖の鋳型オリゴヌクレオチド領域を転写および翻訳させて、目的のペプチドおよび親和性タグを含む融合ペプチドを生成する。この翻訳イベントから生成された融合タンパク質は、ペプチドの親和性タグによって捕獲剤により捕獲される。結果として生じるアレイは、核酸によりコードされたペプチドに結合した核酸を含む別々のユニットを含む。これらの別々の構築物ユニットは、別の目的のペプチドを有する他の構築物から区別可能な１つまたは複数の構築物を含むことができる。
【００１９】
さらに別の態様において、本発明は、目的のペプチドおよび親和性タグをコードする一本鎖のオリゴヌクレオチドを含む２つ以上の構築物を有する面を含む基材を提供することによりアレイを構築する方法を提供する。転写開始点およびリボソーム結合部位を有する非翻訳領域を含む第２のユニバーサルなオリゴヌクレオチドは、構築物のオリゴヌクレオチドに結合されており、捕獲剤はユニバーサルなオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによってオリゴヌクレオチドに結合している。構築物の一本鎖のオリゴヌクレオチド領域は二本鎖のオリゴヌクレオチド領域に変換され、また、二本鎖の鋳型オリゴヌクレオチド領域を転写および翻訳させて、目的のペプチドおよび親和性タグを含む融合ペプチドを生成する。この翻訳イベントから生成された融合タンパク質は、ペプチドの親和性タグによって捕獲剤により捕獲される。結果として生じるアレイは、核酸によりコードされたペプチドに結合した核酸を含む別々のユニットを含む。これらの別々の構築物ユニットは、別の目的のペプチドを有する他の構築物から区別可能な１つまたは複数の構築物を含むことができる。
【００２０】
さらに別の態様において、本発明は、目的のペプチド、親和性タグ、および非翻訳領域をコードする領域を含む一本鎖のオリゴヌクレオチドを含む２つ以上の構築物を有する面を含む基材を提供することによりアレイを構築する方法を提供し、オリゴヌクレオチドはその５’末端で基材面に取り付けられている。オリゴヌクレオチドの非翻訳領域にアニーリングするプライマーは転写の開始部位で二本鎖領域を生成するが、これは目的のペプチドおよび親和性タグをコードするペプチドの転写および翻訳を開始するのに効率的である
。アレイの構築物は転写および翻訳の開始前には、二本鎖のオリゴヌクレオチドに変換されない。
【００２１】
本発明はさらに、試料中の作用剤の有無の検出を含む、目的のペプチドに対する作用剤の結合を検出するための方法を提供する。これらの方法は、面を有する基材、基材の面上に結合した２つ以上の個別の構築物、目的のペプチドをコードするオリゴヌクレオチドおよび目的のペプチドそれ自体の両方を有する個別の構築物、を含むアレイを提供することを含む。特定の態様において、これらの検出方法において使用されるアレイは、目的のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド領域、親和性タグおよび非翻訳領域をコードするオリゴヌクレオチド領域、目的のペプチドおよび親和性タグを含むペプチド、および親和性タグに選択的に結合する捕獲剤を含む２つ以上の構築物を有する。目的のペプチドへの作用剤の結合の検出がアレイを作用剤に接触させ、作用剤の目的のペプチドへの結合の有無の検出により行われる。個別の構築物はオリゴヌクレオチドと基材面との結合によってアレイに結合され、ペプチドは、例えば、捕獲剤への親和性タグの結合によってオリゴヌクレオチドと結合する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】Ａ−Ｆ：本発明の複合オリゴヌクレオチドペプチドアレイにおいて使用される代表的な構築物を図示する。
【図２】同じ融合ペプチドを含む同一の構築物のセットを含むアレイを図示する。
【図３】異なる構成において同じオリゴヌクレオチド領域を含む構築物のセットを含むアレイを図示する。
【図４】同じペプチドを有するが、異なる親和性タグおよび捕獲剤を有する構築物を含むアレイを図示する。
【図５】本発明の複合オリゴヌクレオチド−ペプチドアレイを作製するための第１の一般的な方法を図示する。
【図６】捕獲剤を使用して、本発明の複合オリゴヌクレオチド−ペプチドアレイを作製するための第２の一般的な方法を図示する。
【図７】ビーズ上で捕獲剤および鋳型オリゴヌクレオチドを使用する、第１の作製方法を図示する。
【図８】平坦な面上で捕獲剤および鋳型オリゴヌクレオチドを使用する、第２の作製方法を図示する。
【図９】鋳型オリゴヌクレオチドにより生成されたペプチドのピュロマイシン捕獲を使用する、第３の作製方法を図示する。
【図１０】翻訳後修飾を使用した、図９の作製方法のより特定の態様を図示する。
【図１１】図１０で図示した方法を使用する、ＦＧＥを使用した、ＬＣＴＰＳＲペプチドを図示する。
【図１２】配列決定フローセルを利用する一般的なアッセイシステムを図示する。
【図１３】本発明のアレイ上での構築物の様々な構成の使用を図示する。
【図１４】本発明のアレイ上で偽陽性を減少させるハロー効果を生みだすための拡散の使用を図示する。
【図１５】図７のビーズアレイを使用して得られたペプチドの結合結果を図示する。
【図１６】図８で示すように作製したスライドアレイを使用して得られたペプチド結合結果を図示する。
【００２３】
定義
本明細書に使用される用語は、当業者が理解するような明白な一般的な意味を有することを目的とする。以下の定義は、読者が本発明を理解するのを助けることを目的とするが、そのような用語の意味を変えることも、限定することも意図しない。
【００２４】
用語「親和性タグ」は、本明細書で使用される場合、捕獲剤に選択的に結合する結合対の一方のメンバーを指す。
用語「結合対」は、互いに選択的に結合することが知られているあらゆる２つの分子を意味する。２つのタンパク質の場合には、本明細書でより詳細に記述するように、分子は互いに選択的に結合する。このような結合は共有結合、および／または非共有結合を含んでいてもよい。例えば、ビオチンとアビジン、ビオチンとストレプトアビジン、抗体およびその特定の抗原決定基、等があるが、これに限定されない。
【００２５】
用語「捕獲剤」は、本明細書で使用される場合、ペプチドの親和性タグとの結合によって、またはペプチドの親和性タグとの連結によって、ペプチドを捕獲できるあらゆる成分を指す。捕獲剤とその親和性タグとの間の結合は共有結合および／または非共有結合であってもよい。捕獲剤には、例えば、融合ペプチド上の親和性タグに選択的に結合する結合対のメンバー、組み換え技術、または他のメカニズムにより付加される化学結合等を含む。特定の態様において、捕獲剤は親和性タグの抗原決定基に選択的に結合する抗体である。捕獲剤はハイブリダイゼーション、クロスリンキング（例えばソラレンを使用した共有結合固定化）、翻訳後修飾による導入等を含む従来の技術を使用して、構築物に結合させることができる。
【００２６】
用語「相補的な」は、核酸結合対の相互作用面の形態上の互換性または双方向性の構造を指す。好ましい相補的構造は、互いに結合親和性を有し、核酸が互いに有する相補性の程度が高くなるほど、構造間のハイブリダイゼーションがより強くなる。
【００２７】
用語「診断ツール」は、本明細書で使用される場合、患者の試料の診断テストまたはアッセイを実行するために使用される本発明のあらゆる構成物またはアッセイを指す。診断ツールとして、本発明の構成物を分析物に特異的な試薬の集合と考えてもよく、これを用いて、米国連邦または州関係機関によって規制される診断テストの一部を形成してもよい。本発明の組成物を診断ツールとして使用することは、治療薬の開発においてこの組成物を使用することとの関連を意図しない。
【００２８】
用語「オリゴヌクレオチド」を、ヌクレオチドモノマーの直線状の重合体を意味するために本明細書で使用する。この用語が本明細書で使用される場合、一本鎖または二本鎖の形態を指す場合がある。核酸とオリゴヌクレオチドを形成するモノマーは、天然のポリヌクレオチドに特異的に結合できるが、これはワトソンクリック型の塩基対形成、塩基スタッキング、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型の塩基対形成等の、モノマー同士の規則的な型の相互作用による結合であり、この結合によって二本鎖または三重鎖の形態を作り上げる。このようなモノマーおよびこのヌクレオシド間結合は天然でもよく、またはその類似体、例えば天然もしくは非天然の類似体でもよい。非天然の類似体にはペプチド核酸、ロックド核酸、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合、蛍光体、もしくはハプテン等の標識が結合できる結合基等を含む塩基がある。オリゴヌクレオチドまたは核酸の使用において、ポリメラーゼによる伸張およびリガーゼによるライゲーション等の、酵素によるプロセシングが必要となる場合は常に、ヌクレオシド間結合、糖成分または塩基のある種の類似体が酵素反応と適合しない場合、上記のようなオリゴヌクレオチドまたは核酸には、どの位置にもそのような類似体を含めないことを当業者は理解するだろう。核酸の大きさは典型的には少数のモノマー単位、例えば５から４０の範囲であり、数十万以上のモノマー単位の場合には通常「オリゴヌクレオチド」と呼ばれる。核酸またはオリゴヌクレオチドを文字の配列（大文字か小文字）よって、例えば「ＡＴＧＣＣＴＧ、」等で表す場合は常に、別記しない限り、または文脈から明らかな場合、ヌクレオチドは５’から３方向へ、左から右に記載され、「Ａ」はデオキシアデノシン、「Ｃ」はデオキシシチジン、「Ｇ」はデオキシグアノシン、および「Ｔ」はデオキシチミジン、「Ｉ」はデオキシイノシン、「Ｕ」はウリジンを表すと理解される。通常、核酸は、ホスホジエステル
結合によってつながった天然のヌクレオシド（例えばＤＮＡのデオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはこれらに対応するＲＮＡのリボース）を含む；しかしながら、非天然のヌクレオチド類似体、例えば修飾塩基、糖類、ヌクレオシド間の結合を含んでもよい。酵素が活性に必要な特定のオリゴヌクレオチドまたは核酸基質、例えば一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖等を有する場合、オリゴヌクレオチドまたは核酸基質に適切な組成物は、当業者の知識を持って選択でき、特にＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９）等の専門書や同様の参照文献の手引きも参考にできる。
【００２９】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」等は本明細書では交換可能に使用し、任意の長さのアミノ酸の重合形態を指す。これにはコードされた、およびコードされないアミノ酸、化学的または生物化学的に修飾した、または誘導したアミノ酸、およびペプチド骨格を改変したポリペプチドがある。
【００３０】
用語「研究ツール」は、本明細書で使用される場合、本発明のあらゆる構成物またはアッセイを指し、これらは薬品による治療及び／又は生物学的な治療の開発等の、自然界を対象とした科学的、学術的、または商業的な研究で使用される。本発明の研究ツールの意図は、治療用ではなく、規制認可の対象とすることでもない。むしろ、本発明の研究ツールは、開発事業での研究を容易にし、開発活動を支援することを意図し、この活動には、規制当局への提出をサポートするための情報を作成するために実施されるあらゆる活動が含まれる。
【００３１】
用語「選択的に結合する」、「選択的な結合」等は、本明細書で使用され、結合対（例えば、タンパク質、核酸、抗体等）を指す場合、指定の分析条件下で、高親和性および／または選択的なハイブリダイゼーションを保証する相補性を有する、２つ以上の結合対の結合反応を指す。典型的には、特異的結合はバックグラウンド信号またはノイズの少なくとも３倍、より典型的にはバックグラウンドの１０〜１００倍を超えるだろう。したがって、指定の条件下、結合パートナーは自身の特定の「標的」分子と結合し、試料中にある他の分子とはあまり結合しない。
【００３２】
用語「Ｔｍ」は「融解温度」に関して使用する。融解温度は、二本鎖核酸分子の集団の半分が一本鎖へと分離される温度である。核酸のＴｍを計算するための等式がいくつかあり、当該技術分野においてよく知られている。標準的な基準に示されているように、核酸が１ＭのＮａＣｌ水溶液中にある場合、Ｔｍ値の単純な推定値を、等式、Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）で計算できる。（例えば、ＡｎｄｅｒｓｏｎおよびＹｏｕｎｇ、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（１９８５）参照のこと。）他の参照文献には（例えば、Ａｌｌａｗｉ，Ｈ．Ｔ．およびＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｊ．，Ｊｒ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６，１０５８１−９４（１９９７））は、Ｔｍを計算するために、配列特性と同様、構造および環境特性をも考慮に入れる別の計算方法が記載されている。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本明細書に記述された技術の実行にあたり、別記しない限り、有機化学、ポリマー技術、分子生物学（組み換え技術を含む）、細胞生物学、生化学および配列決定技術の従来の技術および記述を採用する場合がある。これらは当該分野の範囲内である。このような従来の技術には、ポリマーアレイ合成、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよびライゲーション、標識を使用したハイブリダイゼーションの検出がある。適切な技術の特定の例示は、以下の例に参考として含まれ得る。しかし、他の等価な従来手順もまた、当
然ながら使用され得る。そのような従来の技術および記述は、標準的な実験マニュアルにおいて見出すことができる。例えば、Ｇｒｅｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄｓ．  （１９９９），  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ  （Ｖｏｌｓ．  Ｉ−ＩＶ）；  Ｗｅｉｎｅｒ，  Ｇａｂｒｉｅｌ，  Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，  Ｅｄｓ．  （２００７），  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；  Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，  Ｅｄｓ．  （２００３），  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；  Ｂｏｗｔｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  （２００３），ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ；Ｍｏｕｎｔ（２００４）、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００６）、Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；およびＳａｍｂｒｏｏｋ
ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（全てＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（４ｔｈ  Ｅｄ．）Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｎ．Ｙ．；Ｇａｉｔ，”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”１９８４，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ；  Ｎｅｌｓｏｎ
ａｎｄ  Ｃｏｘ（２０００）、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．；およびＢｅｒｇら（２００２）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．があり、全文献を全目的のため本明細書に参照して組み込む
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形（「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈が明らかに別途指示しないかぎり、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「基質」に言及する場合、基質の１つまたは複数のコピーを指し、「分析」に言及する場合、当業者等が認識している同等なステップおよび方法への言及も含まれる。
【００３４】
別に定義しない限り、本明細書で使用される技術および科学用語はすべて本発明が属する業界の関係者により一般に理解されるのと同じ意味を有している。本明細書で言及する全文献を、本明細書に参照して完全に組み込むが、その目的は本発明に関連して使用され得る、デバイス、調剤および方法を説明および開示するためである。
【００３５】
ある値の範囲が示されるが、各介在値、その範囲の上限値および下限値、ならびに表示範囲内の他の表示値または介在値が、本発明に包含されるものと理解される。これらのより狭い範囲の上限および下限は独立して、より狭い範囲に含まれてよく、表示範囲における任意の特定除外限度を条件として、これらも本発明の範囲に含まれる。表示範囲が一方または両方の限度を含む場合、それら包含される限度の一方または両方を除外する範囲も本発明に含まれる。
【００３６】
以下の記述において、本発明を徹底的に理解するために、特定の詳細を多数提示する。しかしながら、本発明がこれらの特定の詳細を１つまたは複数欠いても実行し得ることは当業者には明らかであろう。他の例において、本発明を不明瞭にしないため当業者によく知られた特徴および方法は記述していない。
【００３７】
本発明の一般的内容
本発明のアレイは新規のアレイ構成、および対費用効果の高い方法でこれらのアレイを生成する方法を提供する。本発明のアレイは、オリゴヌクレオチドのペプチドをコードす
る鋳型、および、好ましくは二本鎖のオリゴヌクレオチドのペプチドをコードする鋳型の両方を含み、これらは鋳型オリゴヌクレオチドによりコードされたペプチドに結合されている。本発明のマイクロアレイは、非常に安価なマイクロアレイベースの合成により得られた鋳型オリゴヌクレオチドのインビトロの転写／翻訳を使用して生成される。アレイのオリゴヌクレオチドは、アレイ面に取り付けたオリゴヌクレオチドの鋳型ＲＮＡへの転写、続くこれら鋳型のペプチドへの翻訳によりオリゴペプチド複合構築物に変換される。その後、翻訳されたペプチドは、化学的なリンカー基の使用、捕獲剤の使用等を含む異なるメカニズムによって鋳型オリゴヌクレオチドに結合される。アレイで利用可能なペプチドの種類は、アレイ上の元の鋳型オリゴヌクレオチドの複雑さを反映する。
【００３８】
本発明の特定の態様において、アレイは、ペプチド上の親和性タグ領域に結合するために使用される捕獲剤を含む。この例において、ペプチドはＣ末端領域で捕獲剤と結合する親和性タグ領域を、Ｎ末端領域に目的のペプチドを含む融合ペプチドである。親和性タグは構築物内の鋳型オリゴヌクレオチドによりコードされ、転写および翻訳により生成された融合ペプチドの捕獲のために使用される。
【００３９】
好ましい態様において、アレイの複数のペプチドが同一の親和性タグを含むと、構築物では共通の捕獲剤の使用が可能となる。例えば、アレイは、単一の共通の親和性タグおよび捕獲剤を有する様々な配列のペプチドを含んでもよい。これにより、アレイの構築において、単一のペプチド結合成分の付加が可能となり、複雑度および製造費が著しく減少する。
【００４０】
別の実施例において、アレイは、同一の目的のペプチド配列を有するが、異なる親和性タグおよび捕獲剤を有する２つ以上の構築物を含んでもよい。この後者の方法は、目的のペプチドの活性がアレイを構築するまたは使用する過程により悪影響を受けないことを保証するための内部制御メカニズムを有するアレイの形成を可能にする。
【００４１】
本発明のタンパク質マイクロアレイ産生の方法は信頼性が高く、再現性があり、また、同一の品質およびタンパク質量の同一のアレイを作製できる。本発明のアレイは、様々なクラスおよび大きさのタンパク質およびそのフラグメントを含む、ペプチドの広範な種類の提示に有益である。アレイユニットごとのタンパク質の産生量は十分に高く、特定のアレイユニットで再現可能であり別々の検出および／または活性が可能である。これにより、アレイを高濃度だが比較的低コストで、大規模に作製できる。
【００４２】
重要なことは、本発明のアレイは、全てのタンパク質、ペプチド領域、タンパク質の活性サイト等を含む機能性ペプチドを提示する能力を有していることである。通常インヴィヴォのソースから単離するのが難しい機能性タンパク質、例えばプリオンまたはベータアミロイドペプチド等の非可溶性タンパク質を調査するためにペプチドアレイを生成することができるのが、本発明の特徴である。
【００４３】
本発明のアレイは、基材面および目的のペプチドの両方に結合した二本鎖または一本鎖のオリゴヌクレオチドを含む。代表的な３つの分子が図１のＡ〜Ｆに図示される。図１のＡにおいて、アレイ構築物は、非翻訳領域１１０、目的のペプチドをコードする領域１１２、および親和性タグおよび終止コドンをコードする領域１１４を含むオリゴヌクレオチド部分１０２を含む。オリゴヌクレオチドは面に直接結合していてもよく、または任意選択によりリンカー１０６を使用してアレイに取り付けてもよい。一般的に、一本の鎖がアレイ面に取り付けられており、この鎖をその３’または５’末端のいずれかで取り付けてもよい。アレイに対して遠位にあるオリゴヌクレオチドの部分は、鋳型オリゴヌクレオチドから生成されたペプチドを、インビトロの転写および翻訳後に構築物に結合可能とするペプチド結合成分１１６を含む。結合したペプチド１５０は、オリゴヌクレオチドのコー
ド領域１１２によりコードされ、オリゴヌクレオチドの領域１１４によりコードされる親和性タグ１２２に融合される目的のペプチド１２０を含む。親和性タグ１２２は、オリゴヌクレオチドにペプチド１５０を取り付け可能とする。図１のＢにおいて、ペプチド結合成分１１６は捕獲剤、例えば抗体またはタンパク質結合対のメンバーを含む。図１のＣにおいて、オリゴヌクレオチド構築物は、転写および翻訳後に除去される鎖を有してもよく、ペプチドをコードする配列またはペプチドをコードする配列に相補的な配列のいずれかを有する一本鎖の分子１０４が生じる。この一本鎖は、３’または５’末端のいずれかで基材面に取り付けてもよい。
【００４４】
構築物は捕獲剤の近くに非翻訳領域を有するように図示されているが、非翻訳領域が基材面に取り付けられ、親和性タグをコードする領域が、捕獲剤に近くなるように、構築物が構成されてもよい。例えば、図１のＤは、図１のＢと同じ構成要素を有する構築物を図示するが、図１のＤではオリゴヌクレオチド１０２の方向は事実上反転している。
【００４５】
図１のＥおよびＦにおいて、捕獲剤１１６は、オリゴヌクレオチドに対して基材面の近くに結合される。捕獲剤１１６は、基材面１０８にオリゴヌクレオチド部分を取り付けるリンカー１０６（１のＥに図示）、またはオリゴヌクレオチド１０２それ自体（１のＦに図示）のいずれかによって構築物に結合させることができる。ここで示されたオリゴヌクレオチド構築物１０２は、図１のＣで図示したように一本鎖であっても、または図１のＡ、ＢおよびＤにおいて図示したように二本鎖であってもよい。一般的に、一本の鎖がアレイ面に取り付けられており、この鎖はその３’または５’末端のいずれかで基材に取り付けてもよい。
【００４６】
アレイは、個別の構築物を含んでいてもよく、これは、目的のペプチドの分析のための別々の調査可能なユニットである。しかしながら、ある適用では、アレイ上に生成された信号の強度を増加させることが望ましい。本発明はしたがって、同じ目的のペプチドを提示する、２つ以上の同一の構築物を含む別々の調査可能なユニットを有するアレイも含む。例えば図２において、アレイは、２つ以上の構築物の別々のグループでアレイ上に配置された異なる構築物を有する基材を含み、この構築物は、オリゴヌクレオチドにペプチドを結合させるため、同じ捕獲剤および親和性タグを利用するのが好ましい。第１セットの構築物は、非翻訳領域２１０、第１の目的のペプチドをコードする領域２１２、および親和性タグおよび終止コドンをコードする領域２１４を含むオリゴヌクレオチド部分２０２を含む。第２セットの構築物は、非翻訳領域２１０、第２の目的のペプチドをコードする領域２３２、および親和性タグおよび終止コドンをコードする領域２１４を含むオリゴヌクレオチド部分２０４を含む。両セットのオリゴヌクレオチドは面に直接結合させてもよく、または任意選択によりリンカー２０６を使用してアレイに取り付けてもよい。アレイに対して遠位にあるオリゴヌクレオチドの部分は、鋳型オリゴヌクレオチドから生成されたペプチドを、インビトロの転写および翻訳後に構築物に結合可能とするペプチド結合成分２１６を含む。第１セットの結合ペプチド２５０は、２１４によりコードされる親和性タグ２２２に融合した第１の目的のペプチド２２０を含む。第２セットの結合ペプチド２５２は、第１セットと同じ親和性タグ２２２に融合した第２の目的のペプチド２２０を含み、親和性タグ２２２は、第１の構築物におけるのと同様、共通領域２１４によりコードされる。
【００４７】
他の態様において、アレイは、同じオリゴヌクレオチド領域を、基材に関して異なる関係性で有する個別の構築物を含んでもよい。図３において、構築物は図１のＢおよびＤの構築物と同じ構成要素を有し、構築物の１セットは図１のＢの構成におけるアレイ上の少なくとも１つの構築物を有しており、構築物の第２のセットは図１のＤの構成におけるアレイ上の少なくとも１つの構築物を有している。第１セットの構築物は、非翻訳領域３１０、第１の目的のペプチドをコードする領域３１２、および親和性タグおよび終止コドン
をコードする領域３１４を含むオリゴヌクレオチド部分３０２を含み、後者の領域３１４は、基材面上に取り付けられている。第２セットの構築物は、非翻訳領域３１０、第１の目的のペプチドをコードする領域３１２、および親和性タグおよび終止コドンをコードする領域３１４を含むオリゴヌクレオチド部分３０４を含むが、この構成では、最初の領域３１０が、基材面上に取り付けられている。両セットのオリゴヌクレオチドは、直接基材面に結合されてもよく、任意選択によりリンカー３０６を使用してアレイに取り付けられてもよく、オリゴヌクレオチドは３’または５’末端のいずれかで面に取り付けられてもよい。基材に対して遠位にあるオリゴヌクレオチドの部分は、鋳型オリゴヌクレオチドから生成されたペプチドを、インビトロの転写および翻訳後に構築物に結合可能とするペプチド結合成分３１６を含む。
【００４８】
本発明の他の態様において、異なる親和性タグに融合され、オリゴヌクレオチド上の異なる捕獲剤に結合されている同一の目的のペプチドを含む２つ以上の構築物をアレイ上に有することが望ましい。これを図４において図示する。ここで、図示されたアレイは、同一の目的のペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを含む個別の構築物を含むが、各ペプチドは、オリゴヌクレオチド上の２つの異なる捕獲剤に結合している。オリゴヌクレオチド４０２および４５２の第１のセットは、同一の非翻訳領域４１０および第１の目的のペプチド４２０をコードする領域４１２を含むが、それらは異なる親和性タグをコードする異なる領域４１４および４４４に連結される。これらの２つの構築物から生成されたペプチドは同一の目的のペプチドを含むが、２つの異なる捕獲剤４１６および４４６を使用して捕獲される、２つの異なる親和性タグに融合される。同様にオリゴヌクレオチド４０４および４５４の第２のセットは、同一の非翻訳領域４１０および第２の目的のペプチド４４０をコードする領域４４２を含むが、これらは異なる親和性タグ４２２、４３２をコードする異なる領域４１４および４４４に連結される。
【００４９】
ペプチドアレイ製作のプロセスのための一般的な方法
本発明のアレイは、数多くの技術のうちのいずれかを使用して、最初のオーダーメードのオリゴヌクレオチドアレイを使用して製作できる。アレイは平坦な面、または集合してアレイを形成する連続した別々の面、例えばビーズ上で製作することができる。複合オリゴペプチドアレイはいかなる一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドアレイを使用しても製作できる。
【００５０】
そのようなオリゴヌクレオチドアレイの製作に適切な方法は、例えば、Ｃｈｅｎｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ．への２００９年７月に発行された米国特許第７，５５６，９１９号明細書；Ｓａｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．への２００７年１１月に発行された米国特許第７，２９１，４７１号明細書；Ｂｏｙｃｅ−Ｊａｃｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．への２００１年９月に発行された米国特許第６，２９４，３３６号明細書；Ｐｉｒｒｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．への２００１年９月に発行された米国特許第６，２９１，１８３号明細書；Ｓａｂａｎａｙａｇａｍ  ｅｔ  ａｌ．への２００１年９月に発行された米国特許第６，２８４，４９７号明細書；Ｐｉｒｒｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．への２００１年７月に発行された米国特許第６，２６１，７７６号明細書；Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．への２００１年４月に発行された米国特許第６，２２２，０３０号明細書；Ｄａｌｅへの２０００年７月に発行された米国特許第６，０８７，１１２号明細書；ＳｃｈｌｉｅｆｅｒおよびＭａｙへの２００年６月に発行された第６，０７７，６７４号明細書；Ｓｕｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．への１９９９年７月に発行された米国特許第５，９１９，５２３号明細書；Ｃｈｅｅ  ｅｔ
ａｌ．への１９９９年１月に発行された米国特許第５，８６１，２４２号明細書；Ｌｉｐｓｈｕｔｚ  ｅｔ  ａｌへの１９９９年１月に発行された米国特許第５，８５６，１７４号明細書；Ｃｈｅｅ  ｅｔ  ａｌ．への１９９８年１１月に発行された米国特許第５，８３７，８３２号明細書；Ｌｏｃｋｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌへの１９９８９年６月に発行された米国特許第５，７７０７２２号明細書；Ｒｏｓｃｈ  ｅｔ  ａｌへの１９９８年５月
に発行された米国特許第５，７５０，６６９号明細書；ＭｃＧａｌｌへの１９９８年１２月に発行された米国特許第５，８４３，６５５号明細書；Ｓｏｕｔｈｅｒｎへの１９９７年１２月に発行された米国特許第５，７００，６３７号明細書；Ｄｅｈｌｉｎｇｅｒへの１９９８年３月に発行された米国特許第５，７２３，３２０号明細書；Ｄｒｍａｎａｃ  ｅｔ  ａｌ．への１９９７年１２月に発行された米国特許第５，６９５，９４０号明細書；１９９７年５月、Ｓｔｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．に発行された米国特許第５，６３１，７２４号明細書；１９９６年９月、Ｌｏｃｋｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．に発行された米国特許第５，５５６，７５２号明細書；１９９６年７月、Ｄｒｍａｎａｃ  ｅｔ  ａｌに発行された米国特許第５，５２５，４６４号明細書；１９９６年２月、Ｄｒｍａｎａｃ  ｅｔ  ａｌに発行された米国特許第５，４９２，８０６号明細書；１９９５年８月、Ｆｏｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．に発行された米国特許第５，４４５，９３４号明細書；および１９９５年７月に発行された米国特許第５，４３６，３２７号明細書において見出すことができる。
【００５１】
これら、またはこのような他のアレイ技術を使用すると、多数の鋳型オリゴヌクレオチドが、アレイ上で平行して合成できる。目的のペプチド（または目的のペプチドをコードする配列に相補的な配列）をコードすることに加えて、一本鎖のオリゴヌクレオチドは、非翻訳領域またはユニバーサルな非翻訳領域に相補的な領域に対応するユニバーサルなプライマー配列を含む。さらに、オリゴヌクレオチドは、翻訳後のペプチドの捕獲のための領域に結合している。
【００５２】
オリゴヌクレオチドを、これらの要素の各々を有するよう合成でき、または、オリゴヌクレオチドを、基材面に結合した最初のオリゴヌクレオチドに様々な要素を追加することにより、基材上で構築できる。例えば、１実施例において、アレイの構築に使用されるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの一端に親和性タグおよび終止コドンをコードする領域を、オリゴヌクレオチドの他端に長いユニバーサルな非翻訳領域を取り付けるためのプライマー領域を含む。一本鎖のオリゴヌクレオチドがアレイの構築に使用される場合、一本鎖のオリゴヌクレオチドはさらに一本鎖のオリゴヌクレオチドに相補的な鎖を合成するために使用されるプライマーに相補的な領域を含み、一本鎖のオリゴヌクレオチドを、インビトロの転写および翻訳反応で使用される二本鎖の鋳型オリゴヌクレオチドへ伸張させる。
【００５３】
好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５’末端に非翻訳領域を取り付けるプライマー、およびオリゴヌクレオチドの３’末端に親和性タグをコードする配列を含むであろう。あるいは、基材に結合された一本鎖のオリゴヌクレオチドは逆の相補配列を含んでもよく、最初のオリゴヌクレオチドに相補的な鎖が転写されるであろう。後者の場合、非翻訳領域および親和性タグに相補的な配列を含む一本鎖のオリゴヌクレオチドが、基材に最初に結合される。
【００５４】
欠失があるペプチド断片またはペプチドが選択されるであろうことは、本発明のアレイ上の構築物の特徴である。というのも、欠失または挿入（例えばオリゴヌクレオチド合成の副生成物または転写での誤りによる）を含む鋳型から発現された融合ペプチドは、翻訳中にフレームシフトし、親和性タグの正しい配列を提示しないため、通常アレイ上で捕獲されないためである。
【００５５】
非翻訳領域は、５’末端で転写プロモーター領域を含むことが好ましく、アレイのペプチドを生成するための転写および翻訳イベントの開始に使用されるリボソーム結合部位（ＲＢＳ）が続く。非翻訳配列を最初に合成されたオリゴヌクレオチドに含めることができ、または、様々な技術を使用して、鋳型オリゴヌクレオチドに取り付けられる。１実施例において、オリゴヌクレオチドの５’プライマー領域は制限エンドヌクレアーゼ部位を含んでもよく、また、ユニバーサルな非翻訳領域は消化およびライゲーションによりオリゴ
ヌクレオチドに５’に付加できる。別の実施例において、５’プライマー領域およびユニバーサルな非翻訳領域の両方に相補的なプライマーは、２つの分子のスプリントライゲーションに使用できる。
【００５６】
図５は、一本鎖のオリゴヌクレオチドアレイを使用した、本発明のアレイの作製の一般的なスキームを図示する。この方法は、面５０８上に、任意選択によりリンカー配列５０６によって取り付けられ配置されたオリゴヌクレオチド５００から始まる。オリゴヌクレオチド５００はそれぞれ、親和性タグおよび終止コドンをコードし、オリゴヌクレオチドのプライマー伸長に使用されるプライマーに選択的にハイブリダイズする配列を含む第１の領域５１４、ペプチドをコードする、またはペプチドをコードする領域に相補的なコード領域５１２、およびユニバーサルな非翻訳領域５１８の取り付けのための第２のプライマー領域５１０および／またはコードされたペプチドのための捕獲剤５１６を含む。この捕獲剤５１６は、親和性タグに相互作用し結合する化学結合基であってもよい。
【００５７】
プライマー領域５１４からの一本鎖の分子の伸張、およびステップ５１１における非翻訳領域の取り付けにより、構築物上で基材５０８に対して遠位に配置された捕獲剤５１６を含む二本鎖の鋳型５０２が生成される。この実施例において、コード領域５１２は目的のペプチドをコードし、捕獲剤５１６に結合する親和性タグのためのコード領域および終止コドンを含むプライマー伸長領域５１４。インビトロの転写および翻訳により、目的のペプチド５２０および親和性領域５２２の両方を含む融合ペプチド５５０が生成する。親和性領域５２２はペプチド合成後に捕獲剤５１６に結合する。
【００５８】
本発明のある態様において、ＤＮＡは二本鎖の分子として生成される。この分子に捕獲剤を付加するため、オリゴｄＡと結合した捕獲領域がハイブリダイズできる一本鎖のオリゴｄＴ領域を、末端転移酵素で末端に付加できる。
【００５９】
図６は、一本鎖のオリゴヌクレオチドアレイおよび捕獲剤を使用する、本発明のアレイの作製のための別の一般的なスキームを図示する。この方法は、面６０８上に、任意選択によりリンカー配列６０６によって取り付けられ配置されたオリゴヌクレオチド６００から始まる。オリゴヌクレオチド６００はそれぞれ、親和性タグおよび終止コドンをコードし、オリゴヌクレオチドのプライマー伸長に使用されるプライマーに選択的にハイブリダイズする配列を含む第１の領域６１４、ペプチドをコードする、またはペプチドをコードする領域に相補的なコード領域６１２、およびユニバーサルな非翻訳領域６１８を取り付けるための第２のプライマー領域６１０および／または領域６１４によりコードされた親和性タグに特異的に結合する捕獲剤を含む捕獲剤６１６を含む。プライマー領域６１４からの一本鎖の分子の伸張、およびステップ６１１における非翻訳領域の取り付けにより、構築物上で基材６０８に対して遠位に配置された捕獲剤を含む二本鎖の鋳型６０２が生成される。この実施例において、コードされた領域６１２は目的のペプチドをコードし、また、プライマー伸長領域６１４は、捕獲剤６１６に結合する親和性タグおよび終止コドンをコードする。インビトロの転写および翻訳により、目的のペプチド６２０および親和性領域６２２の両方を含む融合ペプチド６５０が生成され、親和性領域６２２は、ペプチド合成後、ペプチド結合成分６１６に結合する。
【００６０】
ある作製方法において、オリゴヌクレオチドは異なる面、例えば溶液内にあるビーズにつながれている。図７は、別々の面、例えばビーズへのオリゴヌクレオチドの取り付けを使用して本発明のアレイを構築するためのより詳細な方法を図示する。アレイは捕獲剤の導入のための領域７１０、目的のポリペプチドをコードする領域７１２および、終止コドンが後続する親和性タグをコードする領域７１４を含む鋳型オリゴヌクレオチド７００を使用して構築される。領域７１４は、さらに一本鎖のオリゴヌクレオチドのプライマー伸長のためのプライマー部位を含み、任意選択によりリンカー分子７０８によってビーズ７
１８の表面に取り付けてもよい。
【００６１】
ビーズ７１８上のオリゴヌクレオチド７００は、オリゴヌクレオチド伸張部の付加が可能となるよう、リン酸化体で提供される、またはステップ７１１でリン酸エステル化される。その後、オリゴヌクレオチド伸張部７０２は、ステップ７１３で、オリゴヌクレオチド８００およびオリゴヌクレオチド伸張部８０２の両方に選択的に結合するライゲーションオリゴヌクレオチド８４０を使用した、スプリントライゲーション技術によって鋳型オリゴヌクレオチド７００へライゲートされる。オリゴヌクレオチド伸張部７０２は、スプリントライゲーションで使用される、非翻訳領域およびプライマー領域を含む領域７０４；任意選択によりリンカー分子７３８；および捕獲グループ７１６の取り付けのためのオリゴヌクレオチド領域７３６を含む。アレイの作製の次のステップは、捕獲剤７１６およびプライマー伸長のためのプライマー７２４を付加する結合ステップ７１５である。オリゴヌクレオチド伸張部７０２の領域７３６に相補的なオリゴヌクレオチド７４２に結合した捕獲剤７１６、およびプライマー伸長のためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチド７２４はその後、ビーズ上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。
【００６２】
目的のペプチドおよび親和性タグをコードする一本鎖のオリゴヌクレオチドを、インビトロの転写および翻訳で使用する二本鎖の鋳型に変換するため、プライマー伸長ステップ７１７を実行した。インビトロの転写および翻訳はこの二本鎖の鋳型からステップ７１９で実行され、目的のペプチド７２０および親和性タグ７２２を含む融合ペプチド７５０が生成される。生成した融合ペプチド７５０は、翻訳後に鋳型オリゴヌクレオチド領域から拡散するため、捕獲剤７１６により捕獲される。
【００６３】
ビーズ上で直接合成される構築物は、例えばビーズ等の別々の面の集合上の構築物のアレイとして合成され使用されてもよく、または面上のオリゴヌクレオチド−ペプチド融合物の合成の前、または後に平坦な面に配置されてもよい。ビーズが配置される前に合成が実行される場合、通常、隣接する構築物とペプチドとの相互作用を阻止するための方法が取られ。例えば、転写および翻訳はプレートの異なるウェルにおいて分離された異なる配列を有する各ビーズタイプで実行され、１つの構築物を含むビーズセットのペプチドが異なるビーズセットにより捕獲されないことが保証される。これらの面、例えば、ビーズは、例えば、米国特許第７，０６０，４３１号明細書は２００６年６月、Ｃｈｅｅ  ｅｔ  ａｌ．に記載された技術を用いて単離し配置することができる。
【００６４】
図８は、平坦なアレイへのオリゴヌクレオチドの取り付けを使用した、本発明のアレイを構築するためのより詳細で、好ましい方法を図示する。アレイは、捕獲剤の導入のための領域８１０、目的のポリペプチドをコードする領域８１２および、終止コドンが後続する親和性タグをコードする領域８１４を含む鋳型オリゴヌクレオチド８００を使用して構築される。領域８１４は、さらに一本鎖のオリゴヌクレオチドのプライマー伸長のためのプライマー部位を含み、任意選択によりリンカー分子８０６によって基材８０４の表面に取り付けてもよい。
【００６５】
平坦なアレイ８０４上のオリゴヌクレオチド８００は、オリゴヌクレオチド伸張部が付加できるよう、ステップ８１１でリン酸エステル化される。その後、オリゴヌクレオチド伸張部８０２は、ステップ８１３において、オリゴヌクレオチド８００およびオリゴヌクレオチド伸張部８０２の両方に選択的に結合するライゲーションオリゴヌクレオチド８４０を使用する、スプリントライゲーション技術によって鋳型オリゴヌクレオチド８００へライゲートされる。オリゴヌクレオチド伸張部８０２は、スプリントライゲーションで使用される非翻訳領域、およびプライマー領域を含む領域８０４；任意選択によりリンカー分子８３８；および捕獲基８１６を取り付けるためのオリゴヌクレオチド領域８３６を含む。アレイの作製の次のステップは、捕獲剤８１６およびプライマー伸長のためのプライ
マー８２４を付加する結合ステップ８１５である。オリゴヌクレオチド伸張部８０２の領域８３６に相補的なオリゴヌクレオチド８４２に結合した捕獲剤８１６、およびプライマー８２４は、スライド上のオリゴヌクレオチドに同時にまたは順次ハイブリダイズされる。
【００６６】
プライマー伸長ステップ８１７を、目的のペプチドおよび親和性タグをコードする一本鎖のオリゴヌクレオチドをインビトロの転写および翻訳で使用される二本鎖の鋳型に変換するために実行した。ステップ８１９のインビトロの転写および翻訳反応により、この二本鎖の鋳型から目的のペプチド８２０および親和性タグ８２２を含む融合ペプチド８５０が生成される。生成された融合ペプチド８５０は、翻訳後、鋳型オリゴヌクレオチド領域から拡散し、平面から離れるため、捕獲剤８１６により捕獲される。
【００６７】
別の実施例において、本発明の構築物はピュロマイシン捕獲方法を使用して生成される。図９は、平坦な面上でこのようなアレイを構築するための一般的な方法を図示するが、アレイが図７に記述したようなビーズ上で形成され得ることも予見される。この方法は、基材面９０８上に、オリゴヌクレオチドの３’または５’末端で、任意選択によりリンカー配列９０６によって取り付けられ配置された、二本鎖オリゴヌクレオチド９００から始まる。オリゴヌクレオチド９００はそれぞれ、目的のペプチドをコードするコード領域９１２および、終止コドンが後続するＲＮＡ親和性タグを含む領域９１４、ＤＮＡのＲＮＡの結合領域９１８およびピュロマイシン９１６が取り付く、転写プロモーターを含む非翻訳領域９１０を含む。インビトロの転写ステップ９１１により、目的のペプチドをコードする領域９２６および親和性タグ９２４を含むｍＲＮＡ分子が生成される。親和性タグ９２４は、オリゴヌクレオチドの領域９１８に選択的にハイブリダイズし構築物にｍＲＮＡ分子をつなぐ。翻訳中に、リボゾームは、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイズ領域に到達した時に停止するであろう。インビトロの翻訳ステップ９１３後、ペプチド９２０はピュロマイシン残基領域９１６により捕獲される。
【００６８】
翻訳後修飾によるペプチド捕獲
特定の態様において、化学的反応種（例えばアルデヒドタグ）は構築物の構築および他の結合領域の標識要素の導入を支援するために付加されてもよい。例えばホルミルグリシン生成酵素により認識されたスルファターゼコンセンサス配列の導入により、組換えタンパク質へアルデヒド基が部位特異的に導入される。このコンセンサス配列は６〜１３個のアミノ酸でありえ、「アルデヒドタグ」等の最も低分子のものはＨｉｓ６タグよりも長くない。ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）によるスルファターゼモチーフにおける酵素的な修飾により、ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）残基が生成され、ヒドラジンまたはオキシム標識されたオリゴ鋳型上の共有結合性の捕獲により、捕獲剤または他の目的の成分のペプチドへの部位特異的な取り付けが可能となる。さらに、この修飾は可逆性であるので、組み換えのペプチドへのこのタグの導入は、アルデヒド標識されたタンパク質を複数の抗原決定基で可逆的に修飾できる。本発明で使用されるアルデヒドタグの例は、例えば米国特許出願公開第２００８／０１８７９５６号明細書；Ｔ．  Ｄｉｅｒｋｓ  ａｎｄ  Ｍ．−Ａ．  Ｆｒｅｓｅ，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  １０，４２５−４２７（２００９）；ＪＳ  Ｒｕｓｈ  ａｎｄ  ＣＲ  Ｂｅｒｔｏｚｚｉ  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ９  Ｖｏｌ．  １３０：３７，（２００８）；Ｊ  Ｌａｎｄｇｒｅｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ３１６  ４７−５６（２００３）；Ｉ  Ｃａｒｒｉｃｏ，Ｎａｔ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：６（２００７）；Ｃａｒｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００８  Ｊｕｌ  １８；２８３（２９）：２０１１７−２５；およびＷｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００９  Ｍａｒ  ３；１０６（９）：３０００−５；に記載されており、これら各々を、ペプチド修飾において有益なタグ、およびその使用を教示するために、その内容全体を本明細書に参照して組み込む。
【００６９】
より具体的なアプローチにおいて、共有結合的に連結したペプチドアレイの生成を図１０に示す。このアプローチは、図１に概説した、より一般的なスキームを実施するための代表的な方法であるが、共有結合を使用している。これは、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）により認識される６−ｍｅｒペプチドコンセンサス配列（ＬＣＴＰＳＰ、アルデヒドタグとして命名）を使用した、組換えタンパク質へのアルデヒド基の部位特異的な導入のための方法を利用する。ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）は、システイン残基を酸化しホルミルグリシンを生成することが最近報告されている。この態様において、アルデヒドタグは、ペプチドアレイ生成の間にインビトロの転写／翻訳過程へＦＧＥを付加するためにある。ペプチドはＣ末端のアルデヒドタグ、およびアレイ面上の鋳型ＤＮＡへ組み込んだ活性基と反応するホルミルグリシン残基に変換されたタグ内のシステイン残基とで作ることができる。これにより、鋳型ＤＮＡに共有結合で取り付けられている、ペプチドのアレイが作製される。
【００７０】
この態様を、図１０と図１１により詳細に図示する。鋳型オリゴヌクレオチドは目的のペプチド配列１００６、およびアルデヒド親和性タグ（ＬＣＴＰＳＰ）および終止コドンを含む領域１００４をコードする。Ｔ７プロモーターおよびリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を有する非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むユニバーサルな配列１０１０は、遠位のタグ１０１８によって鋳型に付加され１００１、鋳型を伸長して、捕獲基１０１４を含む二本鎖核酸１００２を生成するために使用される。捕獲基１０１４は基材１００８に結合した鎖の１００６にコードされる目的のペプチド１０１６のためにある。反応基１０２２は、任意選択によりリンカー分子１０１２上で、二本鎖の鋳型オリゴヌクレオチド１００２の一方の鎖に結合している。一旦、目的のペプチド配列１０１６およびアルデヒドタグ１０２０を含むペプチドが生成されれば１００３、これは、目的のペプチドおよび捕獲基１０１４の相互作用により捕獲される。アルデヒドタグ１０２０はアルデヒド基１０２４に変換され１００５、これが反応基１０２２と相互作用する。基材１００８に結合されていない核酸の鎖の分離に際し１００７、目的のペプチド１０１６をコードする一本鎖のオリゴヌクレオチドは、反応基およびアルデヒド基によってペプチド１０１６と結合され続ける。必要に応じて、捕獲剤１０１４を除去できる。
【００７１】
図１１において、目的の配列１１１６を有するペプチドは、ＦＧＥ酵素の存在下、インビトロの転写／翻訳によって作られる。図１１に詳細に図示したように、目的のペプチド１１１６に融合したアルデヒドタグ１１２０は、１１１６のヒドラジンまたはアミノオキシ酢酸残基とＦＧＥとの相互作用によって生成でき、ペプチドに組み込んだＬＣＴＰＳＲ領域をアルデヒド基１１２４へ変換する１１０１。このアルデヒド基は、反応基１１２２と相互作用し、目的のペプチド１１０６をコードするオリゴヌクレオチド、ユニバーサル配列、およびアルデヒドタグ１１０４をコードする配列へ目的のペプチド１１１６を結合するために使用される。
【００７２】
配列決定フローセルを使用するアッセイシステム
特定の態様において、ペプチドアレイの作製に使用されるコード配列は、フローセル、例えば配列決定技術に使用されるフローセルの面上で提供される。コード配列は、フローセルの面上にランダムに配置できる。アレイの構築物は、オリゴ鋳型の合成の間に規定された位置で、塩基をランダム化することにより、より長い鋳型を形成するためにより短いオリゴを組み合わせることにより、またはゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーから配列のライブラリーを導き出すことにより、生成できる。一旦配列がフローセルの面上に置かれれば、各配列の同一性は、係留タンパク質の生成およびスクリーニングアッセイでこれを使用する前に、または後に決定できる。
【００７３】
コード配列は、面上でのペプチドアレイの作製前に、クローン的に増幅したＤＮＡ分子
の「クラスター」を形成する各配列と一緒に、インシツで、任意にクローン的に増幅できる。この特定の態様において、非常に高い充填密度を達成でき、例えば、数億のクラスターをフローセル面に配置できる。何百万もの鋳型ＤＮＡを配置し、それらの配列を決定する能力により、大規模なコンビナトリアルタンパク質ライブラリーを非常に効率的で安価に作製する可能性が広がる。
【００７４】
配列決定フローセルをアレイ基材に使用する一般的なスキームを、図１２に示す。目的の配列１２１２、リンカー領域１２０４およびプライマー結合領域１２１４を含むオリゴヌクレオチド１２０２は、フローセル面１２０８上で構築される。面上の他のリンカー領域１２０６は、鋳型オリゴヌクレオチドのインシツ増幅のために任意選択により存在する。これらの構築物の配列決定後、オリゴヌクレオチド−抗体複合物１２１６はクラスターＤＮＡ配列の３’末端にアニールされる１２０１。ＤＮＡ配列はすべてペプチドまたはタンパク質をコードし、効率的な転写を可能にするＴ７プロモーター（または同等物）、および効率的な翻訳に必要とされる非翻訳領域（ＵＴＲ）を有する。複合物１２１６のオリゴヌクレオチド部分はＤＮＡポリメラーゼで伸長され１２０３、取り付けられたオリゴヌクレオチド１２０２に相補的なオリゴヌクレオチド１２２２を生成する。一体化した転写／翻訳反応（ＴＮＴ）１２０５により、クラスターＤＮＡ１２０２によりコードされたペプチドまたはタンパク質１２２０の生成および自身の鋳型への取り付けが導かれる。ペプチドはすべて、抗体を捕獲するために使用されるＣ末端の親和性タグを所有している（示さず）。捕獲分子と親和性タグの他の組み合わせを使用できる。そのような結合対の例には、ストレプトアビジンとビオチン、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓ６タグ、または２つの化学的反応基（アルデヒドタグとヒドラジン残基）があるが、これらに限定されない。
【００７５】
さらに、この方法は、単一分子のインビトロのクローニングを可能とする他のフォーマットに適用可能である。例えば、面上でのＰＣＲを使用したフローセル面上の捕獲および増幅の代わりに、鋳型分子をビーズ上で捕獲し、エマルジョンＰＣＲにより増幅できる。このプロセスは次世代のある配列決定技術のためのクローン鋳型を生成するために使用される。個々の鋳型が増幅されることが好ましいが、ある態様において、単一分子の配列は、クローン増幅の使用なしで決定できる。
【００７６】
任意選択により、フローセルの面には、鋳型オリゴヌクレオチドのインシツ増幅目的のため、面上に他のリンカー領域を含んでもよい。これらの構築物は、ペプチド核酸ハイブリッドの構築前に、ならびに構築後に、および／または使用（示さず）後のいずれかで配列決定される。前者の場合、構築物はこれらのペプチド核酸構築物の生成前に配列決定され、オリゴヌクレオチド−抗体複合物は、面上のクラスターＤＮＡ配列の３’末端にアニールされる。あるいは、配列はアッセイフォーマットでの特定の配列の構築および／または同定後に決定できる。
【００７７】
抗体は、フローセルの面上に付加され、プライマー部分に結合し、ＤＮＡ−抗体複合体が伸長ＤＮＡのみにハイブリダイズするため、フローセル上のＤＮＡクラスターだけを指向する。あるいは、面上のオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドに結合した抗体を、フローセル面に導入できる。この態様において、ＤＮＡ−抗体複合体は、フローセルの面上に均一に分布したオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズするため、抗体はフローセルの全表面に付加される。その後、ペプチドアレイは本明細書に記載の方法のうちの１つを使用して、これらの鋳型ＤＮＡから形成される。
【００７８】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標）Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）技術により提供されるような配列決定技術は、シーケンスリードの「ペアエンド」対を生成するために、鋳型ＤＮＡを両端部から配列決定できる。Ｉｌｌｕｍｉｎａの技術の場合には、ａ）１本の鎖の配列決定により対の１端の配列を得て；その後、ｂ）逆の相補体鎖の配列決定により
対のもう１端の配列を得ることが含まれる。プロセスは配列決定のために適切な鎖を生成し連続して存在させるために実行される。したがって、アレイは第２の（すなわち逆の相補）鎖を使用して、単に、捕獲剤（すなわちこれらの例においては、抗体）に結合する適切な配列を選ぶことにより、構築することもできる。
【００７９】
本発明のアレイは、鋳型オリゴヌクレオチドの長さ、したがってインビトロの転写および翻訳を通じて生成されるペプチドを長くするために複数のライゲーションイベントを利用できる。これは、制限酵素の消化およびライゲーション、または好ましくは、アレイに結合したオリゴヌクレオチド、およびアレイに付加されるオリゴヌクレオチドの両方に相補的なプライマーでのスプリントライゲーションを使用して行うことができる。例えば、非翻訳領域を含むオリゴヌクレオチドを付加するために記述したようなスプリントライゲーションを使用して、アレイ上の構築物のすべてまたはサブセットに、ある領域を付加できる。別の実施例において、２つ以上の異なる配列を有するオリゴヌクレオチドのプールを、対応する相補的配列を有するスプリントライゲーションプライマーと共に使用でき、基材に結合したオリゴヌクレオチドに複数の異なる可変オリゴヌクレオチドを付加できる。定常および可変領域の両方を含む付加領域を有する構築物を生成するために、任意選択によりこれらのアプローチを組み合わせることもできる。
【００８０】
これらの技術は、より長いタンパク質を調査するアレイの生成には特に有益となり得る。例えば、多数のタンパク質には、ドメイン内のＣ末端またはＮ末端でわずかに変化している様々な代替のスプライスアイソフォームがあり、本発明のアレイは、基材面上で直接合成したこれらタンパク質の可変部、およびライゲーションによってこれらのオリゴヌクレオチドに付加した共通ドメインを有することができる。特定の実施例において、少なくとも２７の代替スプライス神経系接着分子（ＮＣＡＭ）ｍＲＮＡが生成され、ＮＣＡＭの主要なアイソフォーム３つは、それらの細胞質ドメインにおいてわずかに変化している。本発明のアレイ上でより長い鋳型オリゴヌクレオチドを生成する能力により、様々な形態のタンパク質の活性およびタンパク質相互作用の解明を進めるためのツールが提供され、制御についての深い理解が、例えば治療学上の開発に関して与えられる。ある定常ドメイン、例えば、Ｎ末端、Ｃ末端および活性結合部位、酵素的な活性領域等を有する構築された領域の、このような使用は多数、本発明のアレイで予見される。これは、本開示を読んで当業者に明白となるであろう。
【００８１】
これらの構築物の安定した性質により、あるアッセイシステムにおいて、アレイも、２回以上利用できる。親和性タグ−捕獲剤相互作用によるオリゴヌクレオチドへのペプチドの結合は、最もよく見られる一時的なタンパク質間相互作用で見られる結合よりもかなり堅固な結合であり、したがって、アレイを調査するために使用される多数のタンパク質および化合物を効果的に除去できるため、他の調査にアレイを使用できる。さらに、アレイは、構築物上のハイブリダイズされた部分を全て除去することで再生成できるため、ペプチドアレイの構築に使用された最初のアレイを効果的に再生できる。一本鎖のオリゴヌクレオチドは再び二本鎖のオリゴヌクレオチドに変換でき、本発明のアレイを含むペプチドを再生成するために使用される本発明の方法の残りのステップ。
【００８２】
プライマー伸長
様々な態様において、最初のオリゴヌクレオチドは、基材面上で合成され、例えばプライマー伸長により二本鎖の分子に変換される、一本鎖のオリゴヌクレオチドである。プライマー伸長は、一本鎖の鋳型オリゴヌクレオチド上のプライマー結合領域へのプライマーのハイブリダイゼーションにより開始でき、伸張後に、非翻訳領域、ペプチドコード領域、および親和性タグをコードする領域を含む二本鎖の鋳型が生成される。プライマー結合領域は親和性タグ配列および終止コドンの３’側に位置させてもよいが、プライマー結合領域は親和性タグ配列および／または終止コドン配列を組み込むことが好ましい。
【００８３】
プライマー伸長プロセスは典型的には鋳型オリゴヌクレオチドに相補的な１つまたは複数のプライマーを利用し、ポリメラーゼおよび遊離のｄＮＴＰの存在下、逆鎖の合成を行う。そのような態様において、典型的には、鋳型オリゴヌクレオチド領域の伸張後にＤＮＡ分子へ導入されたポリメラーゼ停止機構がある。この機構には、ポリメラーゼが使用できないヌクレオチド類似体であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の合成リンカーを含んでいてもよい。二本鎖のプライマー領域の鋳型領域の上流に（例えばニッカーゼまたはウラシルの分解により）導入されたニック等の合成リンカーを含んでいてもよい。複数のプライマー／親和性タグコード領域を、単一の構築物において使用してもよく、これによりアレイの構築において単一のオリゴヌクレオチドを様々な親和性タグ−捕獲剤結合対と共に使用することが可能となる。構築物はさらに、捕獲剤の選択的なライゲーションを支援するために、基材面から遠位にこのような配列を有してもよい。
【００８４】
本発明で使用される基材
典型的には、本発明の基材は、単一分子のランダムアレイを低容量のハイブリダイゼーション反応により分析する場合は特に、非多孔性である。適切な基材は、ガラス、ポリアクリルアミド被膜ガラス、セラミクス、シリカ、シリコン、石英、各種プラスチック等の物質からできている基材を含む。一態様において、基材はビーズである。別の態様において、基材は平坦な面である。従来の用途に対して、典型的には、平坦な面は、０．０２〜２０ｃｍ２までの範囲であり、またはこれよりも大きい。基材のサイズの範囲は、使用される検出方法および、面上の異なる構築物および／または構築物の領域の分解能（例えば、蛍光マーカーの場合には、光学的分解能）に基づく。検出方法は改善され続けているため、基材のサイズを大きくしてもよく、および／または、基材上の構築物の密度を増加させてもよい。
【００８５】
本発明の基材のフォーマットは、実質上平坦な面と同様、基材面に、例えばくぼみ、ウェル、台座等の様々な形を導入した基材も含んでいる。そのような基材は、硬質の、または半硬質の面の面を有する物質または物質群で通常構成される。ある態様において、例えばウェル、高くした領域、台座、エッチング穴等を有するアレイ上の領域を物理的に分離することが望ましい。このような基材は、例えば、多重コーティング技術または当技術分野でよく知られる他の技術を使用することにより、作製できる。パターン形成した（ｐａｔｔｅｒｅｄ）アレイを作製する技術の例には、熱および／または電子ビーム蒸着、複製、転写または成膜；ＣＶＤタイプのプロセス（ＬＰＣＶＤ、ＰＥＣＶＤ等）；スパッタリング、例えばＤＣマグネトロンスパッタリング等のＰＶＤタイプのプロセス；イオンアシスト蒸着プロセス、ならびにゾルゲルプロセスがある。基材の層は、結合または分子付着により基礎上に任意に移行する。
【００８６】
本発明の異なる態様において、リンカーを、面にアレイ構築物を取り付けるために使用してもよい。様々なタイプのリンカーを使用でき、リンカーは通常、構築物のタイプ（アミノ酸、核酸等）、リンカーの所望の性質（長さ、適応性）、および他の同様の特性に基づいて選択されるであろう。そのようなリンカーにはヌクレオチド、ポリペプチドまたは適切な合成材料を含み得る。リンカー構造は、生体適合性の高分子材料（例えばポリエチレングリコール）で構成される炭化水素ベースのポリマーであることが好ましい。また、リンカーの選択は、捕獲剤が構築物のリンカー部分で構築物に結合しているか否かにも依存する。
【００８７】
ある態様において、面に固定した構築物は、基材から特定の構築物を分離可能とする、基材に直接取り付けられた切断可能なリンカーを含む。態様のいくつかにおいて、切断可能なリンカーは同じであるか、または面に固定した構築物のすべてにとって同一のものである。他の態様において、面上の構築物のあるサブセットは同一の切断可能なリンカーを
有し、この切断可能なリンカーは、同じ基材面上の他のサブセットで使用されている切断可能なリンカーとは異なっている。これにより、ある構築物は基材から分離されるが、他の構築物は分離できない。
【００８８】
ある態様において、ミクロ流体のガスケットシステムを基材面上で使用して、ペプチドアレイ上の各機構を効果的に分離させ、アレイの合成およびアレイを使用した分析の間に、拡散を制御できる。これにより、アレイの１つまたは複数の部分において、反応条件のより優れた制御が可能となる。例えば、密閉システムにより拡散が制限されるため、インビトロの転写および翻訳をより長期間実行することができる。さらに、一旦ペプチドが捕獲されると、洗浄および／または試薬交換ステップが実行され、ペプチドの共有結合のように、新しい反応を起こせる。最終的には、ガスケットにより提供される密閉システムにより、第２面上でペプチドを捕獲できる。このように、複数のペプチドアレイは、Ｈｅ  Ｍ  Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５：１７５−１７７（２００８）において必要とされているような、膜による拡散の必要がない、原始的な鋳型ＤＮＡアレイから生成できる。
【００８９】
ペプチド捕獲用結合対
多数の結合対を、本発明のアレイにおいて使用される親和性タグおよび捕獲剤を設計するために使用できる。結合対には、ストレプトアビジン、およびＳｔｒｅｐＴａｇ（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ，１９９６；Ｓｃｈｍｉｄｔ  ＆  Ｓｋｅｒｒａ，１９９４；Ｓｋｅｒｒａ  ＆  Ｓｃｈｍｉｄｔ，２０００）、ＳｔｒｅｐＴａｇ  ＩＩ（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ＆  Ｓｋｅｒｒａ，２００７；Ｖｏｓｓ  ＆  Ｓｋｅｒｒａ，１９９７）および、ＨＰＱモチーフ（Ｇｉｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，１９９５；Ｈｅｌｍｓ  ｅｔ  ａｌ，２００７）等の短いストレプトアビジン結合ペプチド；オリゴヒスチジンペプチドタグおよびＨｉｓ６結合グループ（Ｃｒｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９４；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ，１９８８）；ＦＬＡＧペプチドタグおよびＨｉｓ６ペプチド基；ビオチンおよびストレプトアビジン、ビオチンおよびアビジン、および抗体抗原対、等があるが、これらに限定されない。
【００９０】
ペプチド結合対の相互作用の強度は、所与の結合部位に対する、または、結合対の一方のメンバーの抗原決定基に対する、結合対の他方の「結合親和性」により特徴づけられる。例えば、免疫学の分野において、抗体は、所与の結合部位または抗原決定基に対する抗体の「結合親和性」により特徴づけられる。抗体はすべてアミノ酸の特別な３次元構造から成り、エピトープまたは抗原と呼ばれる別の構造に結合する。
【００９１】
結合相手の組成物への選択的な結合は、単一の二分子による可逆反応であり、抗体の抗原への結合とは異なる。例えば、抗体をＡｂで、抗原をＡｇで表す場合、標準的な速度論によりこの反応を分析できる。単一の結合部位を想定すると、反応は以下のように等式Ｉにより表される：
【００９２】
【数１】
2013512691.tif 000002
式中Ａｇ−Ａｂは結合した複合体である。速度定数ｋ１およびｋ２は正結合反応と逆結合反応をそれぞれ表す。抗原に対する抗体の「結合親和力」は、平衡状態での遊離の反応体と生成物との比により測定する。平衡状態における反応体の濃度が低いほど、抗原に対する抗体の結合親和力は高い。免疫学の分野では、結合親和力は「結合定数」によって表され、シンボル「Ｋ」で表され、「Ｋａ」と呼ばれることもある。「Ｋ」を等式ＩＩにより以下のように定義する：
【００９３】
【数２】
2013512691.tif 000003
式中角括弧は、モル毎リットル、リットル毎モルの濃度を意味する。
【００９４】
結合親和力Ｋａの典型的な値は「Ｋ」とも呼ばれ、典型的な抗体の「結合定数」であるが、これは約１０５〜１０１１リットル毎モルの範囲にある。Ｋａは、抗原を含む溶液中にある抗体の結合部位の半分と結合するために必要とされる遊離の抗原の濃度である。リットル毎モルで測定したＫａ、つまり結合定数が高い場合（例えば１０１１）、溶媒が多く、遊離の抗原が非常に低濃度であることを意味し、したがって抗体が抗原決定基に対して高い結合親和力を所有していることが示される。
【００９５】
リットル毎モルで測定したＫａが低い場合（例えば１０−１１）、抗体結合部位の半分と結合する必要がある遊離の抗原の濃縮溶液が少なく、したがって高い結合親和力を示す。
【００９６】
Ｋａを測定するために平衡状態を達成する。より具体的には、Ｋａは、抗原に結合した抗体［Ａｇ−Ａｂ］の濃度が、抗体［Ａｂ］の濃度と等しい時に測定する。したがって、［Ａｇ−Ａｂ］を［Ａｂ］で割ると、１に等しくなる。
【００９７】
よって、上記の等式ＩＩは以下のように等式ＩＩＩに分解できる：
【００９８】
【数３】
2013512691.tif 000004
等式ＩＩＩにおいて、Ｋの単位はリットル毎モルである。リットル毎モルの典型的な値は、約１０５から約１０１１リットル毎モルの範囲である。
【００９９】
上記の等式の逆数はＫ＝［Ａｇ］であり、Ｋの単位はモル毎リットルであり、典型的な値は、１０−６から約１０−１２リットルの範囲である。上記は、典型的な結合親和性が６桁超える範囲で変動することを示す。したがって、有益と考えられる抗体は、有益と考えられる別の抗体の結合親和力と比較して、１００，０００倍超の結合親和力を有している可能性がある。
【０１００】
アレイ上の個々の構築物の分析性
アレイ構築のための複数の方法を、様々な調査技術を有するアッセイにおいて使用する場合、構築物がアレイ上に超高密度で存在する場合であっても、アレイ上の個別の構築物が分析可能であることを保証するために使用できる。個別の構築物から生成したペプチドが、ある程度の量で拡散するため、アレイ上の構築物の様々な構成を、この拡散により特定の構築物への結合を同定する能力が妨げられないよう保証するために使用でき、ある態様において、拡散は実際に有益な特徴として使用できる。
【０１０１】
本発明のある態様において、「空（ｅｍｐｔｙ）」、または構築物もしくは捕獲剤が存
在しない、アレイ上の１つまたは複数の機構を備え、ペプチドが自身の構築物から隣接の構築物へ拡散しすぎないよう余分な空間を設けることで、構築物の分析性を増強できる。インビトロの翻訳後のペプチド拡散は、比較的近距離（例えば７５−２２５μｍ）では容易に制御可能であり、構築物間の空の特徴、好ましくは０〜２つの空の特徴を有することで、個別の構築物の分析可能で再生可能な同定が可能となり、したがって、目的の作用剤のアレイ上の特定のペプチドへの結合を同定できる。図１３で図示したように、同一の捕獲剤を含む個別の構築物（図１３のＡ）を有するアレイには、コード構築物１３０２の間に１つの空の機構１３０４があってもよい。より広範囲に拡散するペプチドを使用する場合、２つ以上の空の機構を構築物の間で使用できる。図１３のＣは、同一の捕獲剤を有するコード構築物１３０２の間に２つの空の機構１３０４があるアレイを図示する（図１３のＣ）。これらの態様の各々において、コード構築物１３０２の各々は、特異的に捕獲剤に結合する同一の親和性タグをコードする。
【０１０２】
別の態様において、複数の捕獲剤および親和性タグを個別の構築物に使用でき、異なる捕獲剤−親和性タグ対を含む構築物は、構築物から生成されたペプチドの拡散および隣接した構築物による意図しない捕獲を阻止するための構成で、アレイ上に分散させる。例えば１００％の密度でおよそ１５０μｍ以上の拡散による非特異的な信号は、図１３のＢで示すように、それぞれ異なる親和性タグ−捕獲剤対を有する構築物（１３０２、１３０６、１３０８および１３１０）の４セットを使用することにより防げる。別の実施例において、およそ２２５μｍ以上の拡散による非特異的な信号は、図１３のＤで示すように、それぞれ異なる親和性タグ−捕獲剤対を有する構築物（１３０２、１３０６、１３０８、１３１０、１３１２、１３１４、１３１６、１３１８、１３２０）の９セットを使用することにより防げる。たとえ、拡散が起こっても、拡散ペプチドは適合しない捕獲剤を有しているため拡散ペプチドは、隣接の機構で捕獲されないであろう。
【０１０３】
拡散の問題解決の一助に加えて、複数の捕獲剤−親和性タグ対を使用することにより、同一の目的のペプチドを有する複数の構築物を使用でき、これはそれぞれ、アレイ上の構築物のサブセットを標的とする捕獲剤と結合している。これにより、異なる捕獲剤−親和性タグ対を有する同一の目的のペプチドをアレイ上で提示できるようになる。例えば、ある目的のペプチドはあるペプチド親和性タグと不適合である可能性がある。異なる捕獲剤−親和性タグ対の使用により、このような対２つ以上と目的のペプチドとの結合が可能となり、たった１つではなく２つの異なる親和性タグを有するペプチドを提示することで、そのような作用を軽減するであろう。
【０１０４】
他の態様において、ペプチドの周囲の構築物への拡散は、アレイ上の陽性結果を測定する際に利点として使用できる。同一の捕獲剤を有する構築物間の少量のペプチド拡散は、特定の構築物で陽性結果を確認するために、実際に使用できる。なぜなら、周囲の構築物への少量の拡散が、結合の「ハロー」効果を生みだし、作用剤が選択的に結合する構築物を取り囲む構築物において、弱いが、同定可能な信号が発生する。図１４は、作用剤に選択的に結合し、結合アッセイで陽性結果を示す構築物１４０２を有するアレイを図示する。アレイにはさらに信号のない多数の構築物１４０４、および偽陽性として誤って検出される他のある構築物を有する。構築物１４０２から周囲の構築物１４０６へのペプチド拡散により、周囲の構築物１４０６は、真の陽性構築物１４０２と比較して、弱いが検出可能な結合を示す。陽性の構築物１４０２とその隣接構築物１４０６の間の結合における違いは、統計的に有意で、したがって、真の陽性１４０２の同定が可能である。このハロー効果は、構築物上の結合活性を、構築物１４０８で示すような陽性結果を示す他の潜在的な偽のソースから区別し、内部制御メカニズムとしてアッセイにおいて偽陽性の数を減少させるものとして働く。
【０１０５】
実施例
以下の実施例は、本発明をいかにして作成及び使用するかの完全な開示及び記載を当業者に提供するために示されるものであり、本発明者らが本発明と見なすものの範囲を制限するためのものではないし、下記の実験が実施した実験の全てや唯一のものであることを示す、または意味するためのものでない。当業者は、特定の実施形態において示したように、広く記載されている本発明の精神または範囲から逸脱せず本発明の多数のバリエーションおよび／または改変を作製し得ることを理解するだろう。したがって、本発明の実施形態は限定ではなく説明のために提示されたと考えられるべきである。
【０１０６】
使用された数（例えば、量、温度等）に関しては正確さを保証すべく努力がなされたが、いくつかの実験の誤差及び偏差は斟酌されるべきである。特記しない限り、部分は重量部分であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧又は大気圧付近の圧力である。
【０１０７】
実施例１：鋳型オリゴヌクレオチドの設計および合成
一本鎖のオリゴヌクレオチドをアレイの構築に使用した。最初のオリゴヌクレオチドは共通領域である、３’末端のＦＬＡＧペプチド（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号１）またはそのより短いバージョンのＦＬＡＧＳ（ＤＤＤＤＫ）のいずれかの親和性タグをコードする領域；ＨＡペプチド（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号２）またはＡＵ１ペプチド（ＤＴＹＲＹＩＤＹＡ）（配列番号３）のいずれかの目的のペプチドをコードする領域；およびユニバーサルな非翻訳領域の取り付けのためのプライマー領域を含む６０−ｍｅｒであった。プライマー領域は、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）が後続する５’末端でＴ７プロモーター領域を含む長い非翻訳領域の付加を可能とするように設計された。
【０１０８】
オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５’または３’終端のいずれかにアルデヒド基を導入するためにホルミルインドールホスホラミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）を使用して、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ８９０９ＤＮＡ合成装置上で合成した。３’末端修飾の場合には、合成をｄＴ−ＣＰＧ担体で開始し、全オリゴヌクレオチドの３’末端でホルミルインドール（Ｆｏｒｍｙｌｉｎｄｏｌ）−ｄＴ残基を生じさせた。内部のＣｙ５修飾因子ホスホラミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、オリゴヌクレオチドの３’末端でＣｙ５色素を導入するために使用した。この場合、合成はｄＡ−ＣＰＧ担体で開始し、オリゴヌクレオチドの３’末端にＣｙ５−ｄＡ残基を生じさせた。
【０１０９】
実施例２：ビーズ上のアレイの作製
この方法は、確立されたプロトコルを使用して、アミノ修飾されたシリカビーズ上で本発明のアレイを合成するために開発された。最初に、アミノ基を、エタノール中０．５％の３−アミノプロピルトリエトキシ（ｔｈｒｉｅｔｈｏｘｙ）シラン溶液（Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理することにより３μｍのシリカビーズ（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｓ）へ組み込んだ。次に、アミノ基を含むビーズを、アセトニトリル中０．２Ｍジイソプロピルエチルアミンを含む０．１Ｍの塩化シアヌル溶液（Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理し、次いでＤＭＦ中２％ヒドラジン（Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液で処理した。エタノール、アセトニトリルおよびＤＭＦでの洗浄を各ステップの間にそれぞれ実施した。このプロセスにより、ビーズ面上にヒドラジントリアジン基を含むビーズが生じた。３’アルデヒド基を有するオリゴヌクレオチドは、ビーズに共有結合で取り付けられた。この反応を、１．５ＭのＮａＣｌを含む、１００ｍＭのＮａ−クエン酸緩衝液、ｐＨ５．０で室温にて一晩実施した。一晩のインキュベーション後に、ビーズを、水で３回、エタノールで２回洗浄し、エタノールに１０％ビーズ含量で再懸濁し、使用するまで冷蔵した。
【０１１０】
ビーズに共有結合で連結されたオリゴヌクレオチドは、捕獲剤の導入のためのプライマー領域、転写開始点およびＲＢＳを含む非翻訳領域、目的のＨＡまたはＡＵ１ペプチドの
いずれかをコードする領域、および終止コドンが後続するＦＬＡＧ親和性タグをコードする領域を含む。ＦＬＡＧ領域は、さらに一本鎖のオリゴヌクレオチドのプライマー伸長のためのプライマー部位を含む。さらに、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド伸張部のライゲーションを可能にするために５’リン酸を含む。
【０１１１】
調製されたシリカビーズ０．０５ｍｇを各反応において使用した。記載した様々なインキュベーション間での溶液の除去に関しては、ビーズはペレットとして、従来のベンチトップ遠心機を使用して濃縮し、ペレットを壊さないように液体を注意深く吸引した。ビーズを０．２ｍｌのＰＣＲチューブに入れた。１×ＰＢＳＴ［３ｍＭのＮａＨ２Ｐ０４，１ｍＭのＫＨ２Ｐ０４，１５０ｍＭのＮａＣｌ，０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（ｐＨ７．４）］５０μｌを付加し、ビーズを１回洗浄した。１×ＰＢＳＴを除去し、ＫＢ溶液［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭのＭｇＣｌ２（ｐＨ７．５）］溶液５０μｌを付加し、ビーズをこの緩衝液で１回洗浄した。
【０１１２】
非翻訳領域、スプリントライゲーションで使用される領域、ＰＥＧリンカー分子、および捕獲基を取り付けるためのＴ３０オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド伸張部を、基材に連結されたオリゴヌクレオチドおよび伸張プライマーの両方にハイブリダイズするスプリントプライマーを使用してビーズに連結されたオリゴヌクレオチドにライゲートした。
【０１１３】
Ｈ２Ｏ、３７．５μｌ、１０×Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）５μｌ、あらかじめアニールした伸張およびスプリントオリゴヌクレオチド（１０μΜ）の５μｌ、およびＴ４−ＤＮＡリガーゼ（４００，０００Ｕ／ｍｌ、ＮＥＢ）７．５μｌを含むライゲーション混合物を各チューブに付加し、回転機で室温にて３０分間インキュベートした。
【０１１４】
ライゲーション反応後、ライゲートされたオリゴヌクレオチド伸張部およびビーズに連結された鋳型オリゴヌクレオチドからスプリントライゲーションプライマーを変性させるためにビーズを処理した。１×ＰＢＳＴ、５０μｌでビーズを３回洗浄した。９５％ホルムアミド水溶液５０μｌおよび１ｍＭのＥＤＴＡでビーズを処理し、室温で５分インキュベートし、この処理を再度繰り返した。その後、１×ＰＢＳＴ５０μｌでビーズを３回洗浄した。
【０１１５】
オリゴヌクレオチド伸張部の領域に相補的なオリゴヌクレオチドと結合した抗ＦＬＡＧ抗体捕獲剤、およびプライマー伸長のためのプライマーとして使用するオリゴヌクレオチドを、その後、ビーズ上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた。１×Ｈｙｂ緩衝液［４５０ｍＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのリン酸二水素ナトリウム、１３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％のＴｗｅｅｎ−２０（ｐＨ７．４）］５０μｌでビーズを１回洗浄した。捕獲剤プライマー溶液［Ｈ２Ｏ、２２．５μｌ、２×Ｈｙｂ緩衝液２５μｌ、伸張プライマー（１００μΜ；ＴＴＡＣＴＴＡＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣ）（配列番号４）０．５μｌ、捕獲剤［（Ａ３０−Ｃｙ５−抗−ＦＬＡＧ−ＩｇＧ  約６．７μΜ）２μｌ］５０μｌをビーズに付加し、回転機で室温にて３０分間インキュベートした。
【０１１６】
目的のペプチドおよびＦＬＡＧ親和性タグをコードする一本鎖のオリゴヌクレオチドを、二本鎖のビーズに連結したオリゴヌクレオチドに変換するためにプライマー伸長を実行した。ビーズに連結したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたプライマー伸長プライマーを有するビーズを１×Ｈｙｂ緩衝液５０μｌで２回、１×ＲｅａｃｔＩＩ［５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ８）］５０μｌで１回洗浄した。伸張混合物［Ｈ２Ｏ、３５μｌ、１０×ＲｅａｃｔＩＩ５μｌ、２５ｍＭのｄＮＴＰ５μｌ、２Ｕ／μｌの希釈したＤＮＡ  Ｐｏｌ  Ｉ（Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）５μｌ］５０μｌを付加し
、回転機で４５分間３７℃にてビーズをインキュベートした。
【０１１７】
インビトロの転写および翻訳を、ＦＬＡＧ親和性タグおよび目的のペプチドを含む融合ペプチドを生成するために二本鎖の鋳型上で行なった。プライマー伸長後、１×ＲｅａｃｔＩＩ５０μｌでビーズを洗浄し、次に、ＩＶＴＴ緩衝液［５０ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ、１３ｍＭのＭｇ−アセテート（ｐＨ７．６）］５０μｌで２回リンスした。ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ溶液（Ｈ２Ｏ、７０μｌ、溶液Ａ１２５μｌ、溶液Ｂ５０μｌ、８Ｕ／μｌのマウスＲＮアーゼ阻害剤５μｌ、ＮＥＢ）をあらかじめ３７℃で３０分間加熱し、次に、ビーズにＴＮＴ溶液１２．５μｌを付加し、これを回転機で３７℃にて６０分間インキュベートした。
【０１１８】
目的のペプチドは、目的のペプチドそれぞれの抗原決定基を認識する一次抗体によりビーズ上で検出された。一次抗体を６７ｎＭの濃度で使用し、ビーズを室温で３０分間、一次抗体の存在下でインキュベートした。特異的に一次抗体に結合する、標識された二次抗体を１７ｎＭの濃度で用いてインキュベーションを実施した。ＤＭ６０００Ｂ自動蛍光顕微鏡および画像システムを使用して、ビーズを画像化した。
【０１１９】
実験の結果は図１５のグラフに示す通りである。目的のＨＡペプチドを含む構築物は、抗ＨＡ一次抗体でよく検出され、ＡＵ１ペプチドはいかなる有意水準でも検出されなかった。同様に、目的のＡＵ１ペプチドは、抗ＡＵ１一次抗体でよく検出され、ＨＡペプチドはいかなる有意水準でも検出されなかった。
【０１２０】
実施例３：スライドガラス上のアレイ
捕獲剤の導入のためのプライマー領域、ＡＵ１（ＤＴＹＲＹＩＤＹＡ）（配列番号５）、ＡＵ５（ＴＤＦＹＬＫＤＹＡ）（配列番号６）、ＨＡ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号７）またはＶ５（ＩＰＮＰＬＬＧＬＤ）（配列番号８）９−ｍｅｒペプチドをコードする領域、および終止コドンが後続するＦＬＡＧ親和性タグをコードする領域を含むオリゴヌクレオチドを使用して、アレイを構築した。この領域にはさらに、一本鎖のオリゴヌクレオチドのプライマー伸長に使用されるプライマーのハイブリダイゼーションのためのプライマー部位を含めた。
【０１２１】
共有結合で連結させ取り付けたオリゴヌクレオチドを有するスライドガラスを、アミノ修飾スライドおよび、５’−アルデヒド基を有するオリゴヌクレオチドから生成した。アミノ基を含むＥＳ顕微鏡スライドガラス（Ｅｒｉｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、アセトニトリルに０．２Ｍのジイソプロピルエチルアミンを含む０．１Ｍの塩化シアヌル溶液（Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理し、次いでＤＭＦ中２％ヒドラジン溶液で処理した。各ステップ間でアセトニトリルおよびＤＭＦで洗浄を行なった。このプロセスにより、オリゴヌクレオチド上のアルデヒド基と反応するヒドラジントリアジン基を含むスライド表面が生成された。鋳型オリゴヌクレオチドを、３’−アルデヒド連結によって共有結合で活性化スライド表面に取り付けた。スライドを生成するため、１００ｍＭのＮａ−クエン酸緩衝液、ｐＨ５．１、１．５ＭのＮａＣｌ中２００μΜの５’−アルデヒドオリゴヌクレオチド３の３０μｌを２つのリポータースライド間に付加した。この反応を加湿容器内で室温にて１８時間進めた。スライドを水で３回２回洗浄し、乾燥させ、使用するまで冷蔵した。
【０１２２】
スライドを生成するため、スライド表面に３’−アルデヒド修飾オリゴヌクレオチド（クエン酸緩衝液［１００ｍＭのクエン酸ナトリウム、１．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．０）］中５μΜ）のマイクロリットル未満の液滴を付加した。この反応を加湿容器内で室温にて１８時間進めた。スライドを水で洗浄し、乾燥させ、使用するまで冷蔵した。
【０１２３】
その後、オリゴヌクレオチドスライドを、アレイ構築のため、フロースルー装置内で１
００％ホルムアミドを１５０μｌ付加して調製した。１×ＰＢＳＴ２５０μｌを２つの１２５μｌアリコートで各スライドに付加し、１分インキュベートし、次いでこれの洗浄ステップを繰り返した。ブロッキング溶液［１×Ｈｙｂ緩衝液、５×デンハート溶液、および０．１ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ］２５０μｌを２つの１２５μｌアリコートで各スライドに付加し、５分間インキュベートした。新しいブロッキング溶液２５０μｌを付加し、スライドを１０分間インキュベートした。
【０１２４】
その後、ＫＢ溶液［５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２］４５０μｌ溶液を、３つの均一なアリコートで各スライドに付加し、室温で３０秒間インキュベートした。この洗浄ステップを４回繰り返した。キナーゼ溶液［Ｈ２Ｏ、１９５μｌ、１０×ＰＮＫ緩衝液（ＮＥＢ，Ｉｐｓｉｃｈ，ＭＡ）２５μｌ、１０ｍＭのＡＴＰ２５μｌおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０ｕ／μｌ）５μｌ］２５０μｌ（１２５μｌ、２回）を各スライドに付加し、その後、あらかじめ３７℃に平衡させた加湿インキュベーション容器にスライドを入れた。
【０１２５】
スプリントライゲーションで使用される非翻訳領域およびＴ３０領域、ＰＥＧリンカー分子、ならびに捕獲基を取り付けるためのオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド伸張部を、スプリントプライマーを使用して、鋳型オリゴヌクレオチドにライゲートした。スプリントプライマーは、基材に結合されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド伸張部の両方にハイブリダイズする。ライゲーションのためのスライドを調製するために、その後、ＫＢ溶液４５０μｌ（１５０μｌ、３回）を３つの均一のアリコートでスライドに付加し、スライドを室温で３０秒間インキュベートした。この洗浄を２回繰り返し、スライドを含むフロースルー容器を、冷蔵庫内であらかじめ４℃に平衡させた加湿インキュベーション容器に置き、１０分間インキュベートした。
【０１２６】
Ｈ２Ｏ、１１２．５μｌ、１０×Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）１５μｌ、２０Ｕ／μｌ伸張オリゴヌクレオチド７．５μｌおよびＴ４−ＤＮＡリガーゼ（４００，０００Ｕ／ｍｌ、ＮＥＢ）２．５μｌを含むライゲーション混合物を各スライドに付加し、スライドを室温で３０分間インキュベートした。その後、追加で冷たいライゲーション混合物１５０μｌアリコートを付加し、スライドを室温でさらに３０分の間インキュベートした。生じた構造は、伸張オリゴヌクレオチドにライゲートした鋳型オリゴヌクレオチドを含んでいた。
【０１２７】
ライゲーション反応後、ライゲートされ基材に連結された伸長オリゴヌクレオチドからスプリントライゲーションプライマーを変性させるために、スライドを処理した。ＫＢ溶液［５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２］４５０μｌを、３つの均一のアリコートで各スライドに付加し、スライドを室温で３０秒間インキュベートした。１ｍＭのＥＤＴＡを有する９５％ホルムアミド水溶液４５０μｌを、３つの均一のアリコートで付加し、スライドを室温で１分間インキュベートした。これを１ｍＭのＥＤＴＡを有する別の９５％ホルムアミド水溶液４５０μｌを３つの均一のアリコートで付加して交換し、室温で５分間インキュベートした。
【０１２８】
伸張オリゴヌクレオチドの領域に相補的なオリゴヌクレオチドと結合した抗ＦＬＡＧ抗体捕獲剤、およびプライマー伸長のためのプライマーとして使用するオリゴヌクレオチドを、その後、スライド上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた。各スライドに１×Ｈｙｂ緩衝液４５０μｌを付加し、室温で３０秒間インキュベートした。これを４回繰り返した。捕獲剤プライマー溶液［Ｈ２Ｏ、６７．５μｌ、２×Ｈｙｂ緩衝液７５μｌ、伸張プライマー（１００μΜ；ＴＴＡＣＴＴＡＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣ）（配列番号９）１．５μｌ、捕獲剤［（Ａ３０Ｃｙ５−抗−ＦＬＡＧ−ＩｇＧ  〜６．７μΜ）６μｌ］をフロースルー容器に付加し、加湿容器内で室温にて３０分間インキュベートした。
【０１２９】
ライゲーション反応後、ライゲートされ、基材に連結された伸長オリゴヌクレオチドからスプリントライゲーションプライマーを変性させるため、スライドを処理した。ＫＢ溶液［５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２］４５０μｌを、３つの均一なアリコートで各スライドに付加し、スライドを室温で３０秒間インキュベートした。１ｍＭのＥＤＴＡを有する９５％ホルムアミド水溶液４５０μｌを、３つの均一のアリコートで付加し、スライドを室温で１分間インキュベートした。これを１ｍＭのＥＤＴＡを有する別の９５％ホルムアミド水溶液４５０μｌを３つの均一のアリコートで付加して交換し、室温で５分間インキュベートした。
【０１３０】
伸張オリゴヌクレオチドの領域に相補的なオリゴヌクレオチドと結合した抗ＦＬＡＧ抗体捕獲剤、およびプライマー伸長のためのプライマーとして使用するオリゴヌクレオチドを、その後、スライド上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた。各スライドに１×Ｈｙｂ緩衝液４５０μｌを付加し、室温で３０秒間インキュベートした。これを４回繰り返した。捕獲剤プライマー溶液［Ｈ２Ｏ、６７．５μｌ、２×Ｈｙｂ緩衝液７５μｌ、伸張プライマー（１００μΜ；ＴＴＡＣＴＴＡＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣ）（配列番号１０）１．５μｌ、捕獲剤［（Ａ３０Ｃｙ５−抗−ＦＬＡＧ−ＩｇＧ  〜６．７μΜ）６μｌ］をフロースルー容器に付加し、加湿容器内で室温にて３０分間インキュベートした。
【０１３１】
目的のペプチドおよびＦＬＡＧ親和性タグをコードする、基材に連結した一本鎖のオリゴヌクレオチドを二本鎖の基材に連結した分子に変換するためにプライマー伸長を実行した。スライドに連結したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたプライマー伸長プライマーを有するスライドを、１×Ｈｙｂ緩衝液４５０μｌを３つの均一のアリコートで付加して処理し、３０秒間インキュベートし、その後、１×ＲｅａｃｔＩＩ４５０μｌで２回処理し、３０秒間インキュベートした。伸張混合物［Ｈ２Ｏ、１０５μｌ、１０×ＲｅａｃｔＩＩ１５μｌ、２５ｍＭのｄＮＴＰ１５μｌ、２Ｕ／μｌの希釈したＤＮＡ  Ｐｏｌ
Ｉ（Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））１５μｌ］１５０μｌを付加し、スライドを、あらかじめ３７℃に平衡させた加湿インキュベーション容器内で４５分間インキュベートベートした。
【０１３２】
ＦＬＡＧ親和性タグおよび目的のペプチド、ＨＡまたはＡＵ１のいずれかを含む融合ペプチドを生成するために二本鎖の基材に連結した産物上でインビトロの転写および翻訳を行なった。プライマー伸長後、１×ＲｅａｃｔＩＩ４５０μｌを３つの均一のアリコートで付加し、室温で３０秒間インキュベートした。その後、スライドを、ＩＶＴＴ緩衝液４５０μｌで３０秒間、２回リンスした。
【０１３３】
ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ溶液（Ｈ２Ｏ、７０μｌ、溶液Ａ１２５μｌ、溶液Ｂ５０μｌ、８Ｕ／μｌのマウスＲＮアーゼ阻害剤５μｌ、ＮＥＢ）をあらかじめ３７℃で３０分間加熱した。その後、フロースルー容器を、あらかじめ３７℃に平衡させた加湿インキュベーション容器に入れ、３７℃で０．５分〜６０分間インキュベートした。
【０１３４】
目的のペプチドは、目的のペプチドの抗原決定基を認識する一次抗体によりアレイ面上で検出された。一次抗体を６.７ｎＭの濃度で付加し（Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ内，Ｔｈｅ
ｒｍｏＳｃｉ）、スライドを室温で１５分間インキュベートした。その後、このステップを繰り返した。１×ＰＢＳＴ４５０μｌで３回洗浄した後に、特異的に一次抗体に結合する、標識された二次抗体を１７ｎＭの濃度で用いて（Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ内）インキュベーションを１５分間実施した。このステップを１回繰り返した。スライドを１×ＰＢＳＴ４５０μｌで３回洗浄し、次いでフロースルー容器から取り出した。１×ＰＢＳＴでさらにもう１回洗浄した後、スライドを乾燥させて、次いでＰＥ  ＳｃａｎＡｒｒａｙ  Ｌｉｔｅマイクロアレイ読み取り装置（ＧＳＩ  Ｌｕｍｉｎｏｍｉｃｓ）で画像化した。図
１６の棒グラフは、スライド上の抗体蛍光検出の結果を図示する。ＡＵ１、ＡＵ５、ＨＡおよびＶ５の９−ｍｅｒペプチドを同一のレイアウトでの３つの顕微鏡スライド上で構築し、１スライド当たりの各ペプチドの３つのスポットを形成した。ＡＵ１、ＡＵ５またはＨＡペプチドに対する特異的抗体で各スライドを処理することにより特定の信号を検出した。Ｖ５ペプチドを、３つのすべての検出条件に対してネガティブコントロールとした。図に示したように、ペプチドは適切な抗体により選択的に検出された：３つのＡＵ１ペプチドは、抗ＡＵ１抗体（１６のＡ）で検出され、３つのＡＵ５ペプチドは、抗ＡＵ５抗体（１６のＢ）で検出され、３つのＨＡペプチドは、抗ＨＡ抗体（１６のＣ）で検出された。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年1月16日(2013.1.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
面を有する基材と、
前記基材の前記面に結合した２つ以上の個別の構築物と、を備えるアレイであって、前記個別の構築物は、
目的のペプチドをコードするオリゴヌクレオチドと、
前記目的のペプチドとを含み、
前記オリゴヌクレオチドは前記基材の前記面に結合され、前記ペプチドは前記オリゴヌクレオチドに結合されている、アレイ。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドは、親和性タグをコードする領域と、非翻訳領域とを含み、
前記ペプチドは、親和性タグを含み、
前記構築物は、前記親和性タグに選択的に結合することのできる捕獲剤を含み、
前記ペプチドは前記親和性タグの前記捕獲剤への結合によって、前記オリゴヌクレオチドに結合されている、請求項１に記載のアレイ。
【請求項３】
前記非翻訳領域が転写開始点およびリボソーム結合部位を含む、請求項２に記載のアレイ。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドがリンカーによって前記基材の前記面に結合されている、請求項２に記載のアレイ。
【請求項５】
前記捕獲剤がリンカーによって前記オリゴヌクレオチドに結合されている、請求項２に記載のアレイ。
【請求項６】
前記基材がビーズを含む、請求項２に記載のアレイ。
【請求項７】
請求項２に記載のアレイを構築する方法において、
（ａ）２つ以上のオリゴヌクレオチド構築物を含む面を提供するステップであって、各オリゴヌクレオチド構築物は、目的のペプチドをコードする領域を含む、前記ステップと、
（ｂ）リボソーム結合部位を含むユニバーサルなオリゴヌクレオチドを取り付けること
によって各オリゴヌクレオチド構築物を伸長させるステップと、
（ｃ）各オリゴヌクレオチド構築物に対する前記ユニバーサルなオリゴヌクレオチドの取り付けの前または後に、前記オリゴヌクレオチド構築物または前記ユニバーサルなオリゴヌクレオチドに捕獲剤を取り付けるステップと、
（ｄ）前記目的のペプチドおよび親和性タグを含むペプチドを生成するために伸長させたオリゴヌクレオチド構築物を転写および翻訳させるステップであって、前記親和性タグは、前記オリゴヌクレオチド構築物、前記ユニバーサルなオリゴヌクレオチド、またはその両方によってコードされ、前記ペプチドは翻訳に続いて前記捕獲剤によって捕獲されることによって、前記ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドに関連したペプチドを含む個々の構築物が形成される、方法。
【請求項８】
目的のペプチドに結合する作用剤を同定する方法において、
請求項２に記載のアレイを提供するステップであって、該アレイは１つ以上の目的のペプチドを含む、前記ステップと、
前記アレイを作用剤に接触させるステップと、
前記アレイ上の前記目的のペプチドに対する前記作用剤の結合を評価するステップと、を含む方法。
【請求項９】
アレイを構築するための方法において、
ａ）固体基材上の既知の配列のオリゴヌクレオチドの１セットを合成するステップと、
ｂ）前記固体基材上の前記既知の配列のオリゴヌクレオチドに１つまたは複数の追加のオリゴヌクレオチドを取り付け、前記基材上に伸長オリゴヌクレオチドを提供するステップと、
ｃ）ペプチドの生成のための鋳型として前記伸長オリゴヌクレオチドを利用するインビトロの転写および翻訳を実施するステップと、
ｄ）前記固体基材上の既知の位置に、生成したペプチドを取り付けるステップと、を備える方法。
【請求項１０】
前記既知の配列のオリゴヌクレオチドのセットが前記基材上に少なくとも１０，０００の既知の配列の異なるオリゴヌクレオチドを含む、請求項９に記載の方法。
【国際調査報告】
2013512691.tif 000022