(57)【要約】  本発明は、がん、高血糖症及び糖尿病を含むがそれらに限定されない代謝性疾患、肥満症、高血圧症、高コレステロール血症、アレルギー、喘息、アルツハイマー病、並びにウイルス、細菌及び真菌により引き起こされる疾患を含むがそれらに限定されない感染病を含むがそれらに限定されない疾患の治療又は予防に使用される新規の脂質とコンジュゲートする抗体に関する。【選択図】図１
2013534528.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体又はその断片であって、該抗体又は該その断片が、任意でリンカーを介して脂質と共有結合的に連結し、該脂質又は前記リンカーが、前記抗体又はその断片のＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３からなる群から選択される抗体ドメインのアミノ酸と共有結合的に連結する、抗体又はその断片。
【請求項２】
抗体又はその断片が、
（ｉ）細胞に内在化し、
（ｉｉ）細胞の脂質膜と結合し、及び／又は
（ｉｉｉ）エンベロープウイルスの脂質膜と結合することが可能である、
請求項１に記載の抗体又はその断片。
【請求項３】
抗体が、ＨＩＶ  ｇｐ４１、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、インフルエンザ血球凝集素、パラミクソウイルスのタンパク質Ｆ、フィロウイルスのタンパク質ＧＰ２、フラビウイルスのタンパク質Ｅ、コロナウイルスのタンパク質Ｓ、及びアレナウイルスのタンパク質Ｇ２からなる群から選択されるポリペプチドと結合する、請求項１又は２に記載の抗体又はその断片。
【請求項４】
抗体が、原形質膜に関連するポリペプチドと結合し、レトロウイルス、インフルエンザウイルス、パラミクソウイルス、フィロウイルス、フラビウイルス、コロナウイルス及びアレナウイルスからなる群から選択されるウイルスの結合及び侵入を媒介する、請求項１又は２に記載の抗体又はその断片。
【請求項５】
抗体が原形質膜関連（正：associated）がん抗原と結合する、請求項１又は２に記載の抗体又はその断片。
【請求項６】
アミノ酸が、
（１）前記抗体若しくはその断片のＶＬドメインのＣＤＲ−１領域のＮ末端に、
（２）前記抗体若しくはその断片のＶＨドメインのＣＤＲ−１領域のＮ末端に、
（３）前記抗体若しくはその断片のＶＬドメインのＣＤＲ−３領域内に、又は
（４）前記抗体若しくはその断片のＶＨドメインのＣＤＲ−３領域内に、
位置する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
【請求項７】
アミノ酸が、
（１）前記抗体若しくはその断片のＶＬドメインの２０位若しくは２２位に、
（２）前記抗体若しくはその断片のＶＬドメインの１９位若しくは２１位に、
（３）前記抗体若しくはその断片のＶＨドメインの７位若しくは２５位に、
（４）前記抗体若しくはその断片のＣＬドメインの１９７位に、
（５）前記抗体若しくはその断片のＣＨ１ドメインの１２５位に、
（６）前記抗体若しくはその断片のＣＨ２ドメインの２４８位若しくは３２６位に、又は
（７）前記抗体若しくはその断片のＣＨ３ドメインの４１５位若しくは４４２位に、
位置する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
【請求項８】
脂質が、コレステロール、スフィンゴ脂質、糖脂質、グリセロリン脂質、及びそれらの誘導体又は薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
【請求項９】
前記脂質がリンカーを介して前記抗体又は前記断片と共有結合的に連結し、前記リンカー、又は非切断型リンカーが０．４ｎｍ〜１５ｎｍの長さを有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
【請求項１０】
リンカー又は脂質が、アミド結合、エステル結合、チオエーテル結合、チオエステル結合、アルデヒド結合、及びオキシム結合からなる群から選択される結合を介して該抗体又はその断片と共有結合的に連結する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
【請求項１１】
リンカー又は脂質が前記抗体又はその断片のシステインと共有結合的に連結する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
【請求項１２】
リンカーが、Ｙ、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｘ）ｎ−、−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｘ）ｎ−、−Ｙ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｘ）ｎ−、−Ｙ−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｘ）ｎ−、−Ｙ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｘ）ｎ−Ｚ、−Ｙ−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｘ）ｎ−Ｚ、−Ｙ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｘ）ｎ−ＣＨ２−Ｚ、−Ｙ−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｘ）ｎ−ＣＨ２−Ｚ、−Ｙ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｘ）ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｚ、−Ｙ−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｘ）ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｚ、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ポリペプチド、糖質、及びそれらの組合せからなる群から選択される部分を含むか、又はそれらからなり、ここではＸは−Ｏ−又は−ＮＨ−であり、Ｙは−ＮＨ−、−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−又は−ＣＨ２−であり、Ｚは−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、ｎは０〜４０の整数である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
【請求項１３】
脂質がコレステロール又はその誘導体であり、該脂質が直接又は該リンカーを介して該コレステロール又はその誘導体の３位にある酸素部分を通して該抗体又はその断片に付着する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
【請求項１４】
脂質がコレステロールであり、該コレステロール及び該リンカー部分の構造が式（Ｖ）〜式（ＸＩＶ）に示されるようなものである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体又はその断片：
【化１−１】
2013534528.tif 000017
【化１−２】
2013534528.tif 000018
（式中、Ｘはそれぞれの場合で独立して、−ＮＨ−、−ＣＨ２−及び−Ｏ−から選択され、Ｙは−ＣＨ２−、−ＮＨ−、−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−及び−ＣＨ２−からなる群から選択され、Ｚは−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、
Ｒは該リンカーとの、又は該抗体若しくはその断片、若しくはそのアミノ酸の硫黄部分との結合を示し、
ｎは０〜４０の整数であり、
ｊは０〜４０から選択される整数である）。
【請求項１５】
抗体が、ＭＡＢ  Ｆ１０、ＭＡＢ  ＣＲ６２６１、ＭＡＢ  Ｄ５、ＭＡＢ  ２Ｆ５、ＭＡＢ  ４Ｅ１０、ＭＡＢ  ＶＲＣ０１、ＭＡＢ  ＶＲＣ０２、パリビズマブ、モタビズマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ、アダリムマブ、セツキシマブ、ラニビズマブ、インフリキシマブからなる群から選択されるモノクローナル抗体から選択され、前記モノクローナル抗体が任意に、１つ又は２つの単一アミノ酸置換、欠失、修飾及び／又は挿入を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
【請求項１６】
前記抗体又はその断片の重鎖のＣＤＲ３ドメインが以下の配列を含むか又はそれからなる、請求項１〜５及び８〜１３のいずれか一項に記載の抗体又はその断片：
RRGPTTXXXXXXARGPVNAMDV（配列番号４６）又は
EGTTGXXXXXXPIGAFAH（配列番号４７）
（ここでＸは任意のアミノ酸とすることができ、該脂質はＸとして示されるアミノ酸の１つと共有結合的に結合し、
配列番号４６又は配列番号４７による前記配列は任意に、１つの単一アミノ酸置換、欠失、修飾及び／又は挿入を含む）。
【請求項１７】
がん、高血糖症及び糖尿病を含むがそれらに限定されない代謝性疾患、肥満症、高血圧症、高コレステロール血症、アレルギー、喘息、アルツハイマー病、並びにウイルス、細菌及び真菌により引き起こされる疾患を含むがそれらに限定されない感染病からなる群から選択される疾患の治療又は予防に使用される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
【請求項１８】
ウイルスによって引き起こされる該疾患が、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ライノウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、西ナイルウイルス、デングウイルス、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ、水痘帯状疱疹ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ボルナ病ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ワクシニアウイルス、ロタウイルス、センダイウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヘンドラウイルス、ニパーウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサウイルスからなる群から選択されるウイルスによって引き起こされる、請求項１７に記載の抗体又はその断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん、高血糖症及び糖尿病を含むがそれらに限定されない代謝性疾患、肥満症、高血圧症、高コレステロール血症、アレルギー、喘息、アルツハイマー病、並びにウイルス、細菌及び真菌により引き起こされる疾患を含むがそれらに限定されない感染病を含むがそれらに限定されない疾患の治療又は予防に使用される新規の脂質とコンジュゲートする抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体膜は細胞の生理及び病理に重要な役割を果たす。生理現象及び病理現象の大部分は、生体膜（原形質膜及び細胞内膜の両方を含む）内に埋め込まれる又は生体膜と連結する受容体により媒介される。これらのタンパク質及びタンパク質複合体は、コレステロール及びスフィンゴ脂質等の特定の脂質に富む「脂質ラフト」として知られる膜ミクロドメインに局在していることが多い（非特許文献１）。
【０００３】
例えば、宿主の原形質膜を起源とする脂質二重層に囲まれた、「エンベロープウイルス」、例えばオルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、レトロウイルス、フラビウイルス、ラブドウイルス及びアルファウイルスによる細胞の感染には（非特許文献２）、ウイルス糖タンパク質が原形質膜上に提示される特異的な受容体に結合することと、ウイルス膜と宿主細胞膜との融合とが要求される。ウイルス糖タンパク質又は細胞−受容体を標的とするこれら２つの工程のいずれかへの干渉は、ウイルス感染の予防法又は治療法において実現可能な戦略である。
【０００４】
がんの場合、原形質膜上に提示されるタンパク質の過剰発現は、腫瘍細胞に特徴的なものであり、更には正常細胞に対して腫瘍細胞で選択的な利点（腫瘍関連抗原）を与えることができる。この場合であっても、これらの膜関連タンパク質を標的とすることは、抗がん療法に効果的な戦略である。現在のところ多くのエンベロープウイルスに対して認可を受けたワクチン及び治療物質を入手することはできない。また入手可能な場合でも、ウイルス、並びにがん、代謝性疾患、肥満症、高血圧症、高コレステロール血症、アレルギー、喘息及びアルツハイマー病等の多様な他の疾患に対する治療物質は重大な副作用を示す。このことは、病原事象、例えばウイルス侵入又は細胞機構の調節異常に干渉することが要求される相当用量でこれらの医薬品が適用される場合に頻繁に起こる。
【０００５】
要約すると、より効果的であり、そのためより少ない用量で投与することができ、また好ましくは上述の疾患に対して効果的である薬物を開発することが必要とされ、それによって効果的でかつ普遍的な治療的アプローチ及び予防的アプローチが与えられる。
【０００６】
脂質膜に結合する能力を抗体に組み込むことによりウイルス又は細胞表面提示タンパク質に対する抗体の結合効率を改善することは、より効果的で、かつより耐容性が良好な治療剤及び予防剤を生成するのに一般的なアプローチである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】B. Alberts et al., Molecular biology of the cell,Fifth Ed., Garland Science 2008
【非特許文献２】Ono and Freed, Adv. Virus Res., 2005, 273,5419-5442
【発明の概要】
【０００８】
がん、高血糖症及び糖尿病を含むがそれらに限定されない代謝性疾患、肥満症、高血圧症、高コレステロール血症、アレルギー、喘息、アルツハイマー病、並びにウイルス、細菌及び真菌により引き起こされる疾患を含むがそれらに限定されない感染病に特に効果的である好ましい作用物質には、治療抗体及び予防抗体も含まれる。
【０００９】
本発明者らは、薬学的特性が優れ、生物学的効力が大幅に改善した新規の改質抗体を特定している。そのそれぞれのエピトープに特異的に結合することが可能な抗体を、標的細胞（例えばがん細胞）の原形質膜又はエンベロープ病原ウイルスの原形質膜に更に結合するように変更することができることが示された。驚くべきことに、かかる変更は抗体の効力を増大させることが可能であり、それにより所望の治療効果を達成するのに要求される用量を低減させることが可能になる。そのため、本発明の基となる目的とする課題は、任意でリンカーを介して、脂質を治療抗体、予防抗体又は診断抗体と共有結合的に連結することによって解決された。エンベロープウイルスによって引き起こされる疾患の治療に関して、任意で本明細書に記載のリンカーを介して、抗体をコレステロール又はその誘導体に連結する場合に特に効果的であることが分かっている。
【００１０】
したがって、第１の態様では、本発明は、抗体又はその断片であって、該抗体又はその断片が、任意でリンカーを介して脂質と共有結合的に連結し、該脂質又は前記リンカーが、前記抗体又はその断片のＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３からなる群から選択される抗体ドメインのアミノ酸と共有結合的に連結する、抗体又はその断片を提供する。
【００１１】
第２の態様では、本発明は、がん、高血糖症及び糖尿病を含むがそれらに限定されない代謝性疾患、肥満症、高血圧症、高コレステロール血症、アレルギー、喘息、アルツハイマー病、並びにウイルス、細菌及び真菌により引き起こされる疾患を含むがそれらに限定されない感染病からなる群から選択される疾患の治療又は予防に使用される、本発明による抗体又は断片を提供する。本発明による抗体又は断片を、がん、高血糖症及び糖尿病を含むがそれらに限定されない代謝性疾患、肥満症、高血圧症、高コレステロール血症、アレルギー、喘息、アルツハイマー病、並びにウイルス、細菌及び真菌により引き起こされる疾患を含むがそれらに限定されない感染病からなる群から選択される疾患を治療又は予防する方法に使用することができる。本発明による抗体又は断片を、がん、高血糖症及び糖尿病を含むがそれらに限定されない代謝性疾患、肥満症、高血圧症、高コレステロール血症、アレルギー、喘息、アルツハイマー病、並びにウイルス、細菌及び真菌により引き起こされる疾患を含むがそれらに限定されない感染病からなる群から選択される疾患の治療又は予防用の薬剤の製造に使用することができる。
【００１２】
以下の図面は本発明の一例にすぎず、添付の特許請求の範囲によって示される本発明の範囲を限定するとは決して解釈されるべきものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＭＡＢ  Ｄ５に関するコレステロール付着部位を示す図である。この図はLuftig et al.,Nat. Struct. Mol. Biol. 13 (2006) 740-746で報告されるように、Ｆａｂ  Ｄ５と５−ヘリックスとの複合体の結晶構造に基づくものである。コレステロール付着に選ばれる残基（ＶＬのＴ２０、Ｔ２２）は膜平面とおよそ垂直な側面図（Ａ）及び標的細胞膜からウイルス膜方向に見た上面図（Ｂ）で球体として示している。Ｆａｂは、Ｄ５のコレステロール付着部位（複数の場合もあり）と抗原結合表面との間に立体障害がないことを示すために、９０度回転させている。
【図２】ＭＡＢ  ２Ｆ５に関するコレステロール付着部位を示す図である。この図はOfek, G., etal., 2010; Relationship between Antibody 2F5 Neutralization of HIV-1 andHydrophobicity of Its Heavy Chain Third Complementarity-Determining Region. JVirol 84:2955-2962、及びOfek, G., et al., 2004; Structureand mechanistic analysis of the anti-human immunodeficiency virus type 1 antibody2F5 in complex with its gp41 epitope. J Virol 78:10724-37）に報告されるように、ｇｐ４１上でのＦａｂ  ２Ｆ５とそのエピトープに対応するペプチドとの複合体の結晶構造に基づくものである。コレステロール付着に選ばれる残基（ＶＬのＴ２０、Ｔ２２）は球体として示している。膜の平面に対するそれらのおよその配置を示すために、Ｆａｂ  ２Ｆ５とコンジュゲートしたリンカー及びコレステロール、ｇｐ４１の細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインの残りを図（cartoon）に表している。
【図３】ＭＡＢ  ４Ｅ１０に関するコレステロール付着部位を示す図である。この図はCardoso, R.M. F., et al., 2005; Broadly Neutralizing Anti-HIV Antibody 4E10 Recognizes aHelical Conformation of a Highly Conserved Fusion-Associated Motif in gp41.Immunity 22:163-173に報告されているように、ｇｐ４１上でのＦａｂ  ４Ｅ１０とそのエピトープに対応するペプチドとの複合体の結晶構造に基づくものである。コレステロール付着に選ばれる残基（ＶＬのＴ２０、Ｓ２２）は球体として示している。膜の平面に対するそれらのおよその配置を示すために、Ｆａｂ  ４Ｅ１０とコンジュゲートしたリンカー及びコレステロール、ｇｐ４１の細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインの残りを図に表している。
【図４】ＭＡＢ  ＶＲＣ０１に関するコレステロール付着部位を示す図である。この図はZhu, T., etal., 2010; Structural Basis for Broad and Potent Neutralization of HIV-1 byAntibody VRC01. Science July 2010, DOI: 10.1126/science.1192819に報告されているように、Ｆａｂ  ＶＲＣ０１とｇｐ１２０との複合体の結晶構造に基づくものである。コレステロール付着に選ばれる残基（ＶＬのＩ２０、Ｓ２２）は球体として示している。膜の平面に対するそれらのおよその配置を示すために、Ｆａｂ  ＶＲＣ０１とコンジュゲートしたリンカー及びコレステロール及びｇｐ１２０の残りを図に表している。
【図５】ＭＡＢ  ＣＲ６２６１に関するコレステロール付着部位を示す図である。この図はEkiert, D.C., et al., 2009; Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope,Science, 324:246-51に報告されているように、Ｆａｂ  ＣＲ６２６１とＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスの血球凝集素（ＨＡ）との複合体の結晶構造に基づくものである。コレステロール付着に選ばれる残基（ＶＬのＴ１９、Ｓ２１）は球体として示している。膜の平面に対するそれらのおよその配置を示すために、Ｆａｂ  ＣＲ６２６１とコンジュゲートしたリンカー及びコレステロール、ＨＡのＣ末端配列、並びにその膜貫通ドメインを図に表している。
【図６】リツキシマブに関するコレステロール付着部位を示す図である。この図はDu, J. et al.,2007; Structural basis for recognition of CD20 by therapeutic antibodyRituximab, J. Biol. Chem., 282:15073-15080に報告されているように、ＣＤ２０の細胞外ドメインにおけるリツキシマブＦａｂとそのエピトープに対応するペプチドとの複合体の結晶構造に基づくものである。コレステロール付着に選ばれる残基（ＶＬのＴ２０、Ｓ２２）は球体として示している。膜の平面に対するそれらのおよその配置を示すために、リツキシマブＦａｂとコンジュゲートしたリンカー及びコレステロール、並びにＣＤ２０の膜貫通ドメインを図に表している。
【図７】トラスツズマブに関するコレステロール付着部位を示す図である。この図はCho H.-S. etal., 2004; Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complexwith the Herceptin Fab, Nature, 421:756-60に報告されているように、トラスツズマブＦａｂとＨＥＲ２の細胞外ドメインの膜近傍領域との複合体の結晶構造に基づくものである。コレステロール付着に選ばれる残基（ＶＬのＴ２０、Ｔ２２）は球体として示している。膜の平面に対するそれらのおよその配置を示すために、トラスツズマブＦａｂとコンジュゲートしたリンカー及びコレステロール、ＨＥＲ２のＣ末端配列、並びにその膜貫通ドメインを図に表している。
【図８】セツキシマブに関するコレステロール付着部位を示す図である。この図はLi, S. et al.,2005; Structural basis for inhibition of the Epidermal Growth Factor receptorby cetuximab, Cancer Cell, 7:301-311に報告されているように、セツキシマブＦａｂとＥＧＦＲの細胞外ドメインとの複合体の結晶構造に基づくものである。コレステロール付着に選ばれる残基（ＶＬのＳ２０、Ｓ２２）は球体として示している。膜の平面に対するそれらのおよその配置を示すために、セツキシマブＦａｂとコンジュゲートしたリンカー及びコレステロール、ＥＧＦＲのＣ末端配列、並びにその膜貫通ドメインを図に表している。トラスツズマブ−ＨＥＲ２複合体の構造（図５）との比較によって、異なる長さのリンカーに対する要求が示される。
【図９】ＭＡＢ  Ｄ５のＦａｂドメインにおけるシステインアミノ酸の好ましい最適化された場所を示す図である。システインアミノ酸は本発明による脂質又は脂質を含むリンカーとの共有結合的な連結に対して理想的な位置付けをしている。（＊）は導入されたシステインアミノ酸を示している。
【図１０】ＭＡＢ  ２Ｆ５のＦａｂドメインにおけるシステインアミノ酸の好ましい最適化された場所を示す図である。システインアミノ酸は本発明による脂質又は脂質を含むリンカーとの共有結合的な連結に対して理想的な位置付けをしている。抗ウイルス活性のないＦａｂ  ２Ｆ５の二重突然変異体も示している。（＊）は導入されたシステインアミノ酸を示している。
【図１１】ＭＡＢ  ４Ｅ１０のＦａｂドメインにおけるシステインアミノ酸の好ましい最適化された場所を示す図である。システインアミノ酸は本発明による脂質又は脂質を含むリンカーとの共有結合的な連結に対して理想的な位置付けをしている。（＊）は導入されたシステインアミノ酸を示している。
【図１２】ＭＡＢ  ＶＲＣ０１のＦａｂドメインにおけるシステインアミノ酸の好ましい最適化された場所を示す図である。システインアミノ酸は本発明による脂質又は脂質を含むリンカーとの共有結合的な連結に対して理想的な位置付けをしている。（＊）は導入されたシステインアミノ酸を示している。
【図１３】ＭＡＢ  ＶＲＣ０２のＦａｂドメインにおけるシステインアミノ酸の好ましい最適化された場所を示す図である。システインアミノ酸は本発明による脂質又は脂質を含むリンカーとの共有結合的な連結に対して理想的な位置付けをしている。（＊）は導入されたシステインアミノ酸を示している。
【図１４】ｍＡｂ  ＣＲ６２６１のＦａｂドメインにおけるシステインアミノ酸の好ましい最適化された場所を示す図である。システインアミノ酸は本発明による脂質又は脂質を含むリンカーとの共有結合的な連結に対して理想的な位置付けをしている。（＊）は導入されたシステインアミノ酸を示している。
【図１５】パリビズマブのＦａｂドメインにおけるシステインアミノ酸の好ましい最適化された場所を示す図である。システインアミノ酸は本発明による脂質又は脂質を含むリンカーとの共有結合的な連結に対して理想的な位置付けをしている。（＊）は導入されたシステインアミノ酸を示している。
【図１６】モタビズマブのＦａｂドメインにおけるシステインアミノ酸の好ましい最適化された場所を示す図である。システインアミノ酸は本発明による脂質又は脂質を含むリンカーとの共有結合的な連結に対して理想的な位置付けをしている。（＊）は導入されたシステインアミノ酸を示している。
【図１７】リツキシマブのＦａｂドメインにおけるシステインアミノ酸の好ましい最適化された場所を示す図である。システインアミノ酸は本発明による脂質又は脂質を含むリンカーとの共有結合的な連結に対して理想的な位置付けをしている。（＊）は導入されたシステインアミノ酸を示している。
【図１８】トラスツズマブのＦａｂドメインにおけるシステインアミノ酸の好ましい最適化された場所を示す図である。システインアミノ酸は本発明による脂質又は脂質を含むリンカーとの共有結合的な連結に対して理想的な位置付けをしている。（＊）は導入されたシステインアミノ酸を示している。
【図１９】セツキシマブのＦａｂドメインにおけるシステインアミノ酸の好ましい最適化された場所を示す図である。システインアミノ酸は本発明による脂質又は脂質を含むリンカーとの共有結合的な連結に対して理想的な位置付けをしている。（＊）は導入されたシステインアミノ酸を示している。
【図２０】トラスツズマブの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列、並びにトラスツズマブ（トラスツズマブＣ２０、ハーセプチンＣ２０）の軽鎖突然変異体Ａ（Ｔｈｒ２０Ｃｙｓ）におけるシステインアミノ酸の導入場所を示す図である。（＊）は導入されたシステインアミノ酸を示している。
【図２１】コレステロール−ＰＥＰＧ１２−マレイミドとの反応後のトラスツズマブＣ２０  ｍＡｂの軽鎖の再構成ＭＳスペクトルを示す図である。質量＝２３４３６及び質量＝２４５８９の２つのピークは、還元及びアルキル化後の非コンジュゲート軽鎖及びコンジュゲート軽鎖にそれぞれ対応する（質量の差異の算出値：１１５１．５、実測値：１１５３）。
【図２２】ＥｒｂＢ２陽性ＳＫＢＲ３細胞での非コンジュゲートｍＡｂ（トラスツズマブＣ２０、ハーセプチンＣ２０）及びコレステロールとコンジュゲートしたｍＡｂ（トラスツズマブＣ２０−ＣＨＯＬ、ハーセプチンＣ２０−ＣＨＯＬ）を用いたＣｅｌｌ−ＥＬＩＳＡを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明を以下で詳細に記載する前に、本明細書中に記載する特定の方法論、プロトコル及び試薬は変動し得るので、本発明はこれらに限定されないことを理解すべきである。本明細書中で使用される専門用語が、特定の実施形態を記載するためのものにすぎず、添付した特許請求の範囲のみによって限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも理解すべきである。他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００１５】
好ましくは、本明細書中で使用される用語は、"A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPACRecommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Klbl, H. eds. (1995),Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)に記載されるように、並びにAxel Kleemann and Jurgen Engel, Thieme Medical Publishing, 1999による"Pharmaceutical Substances: Syntheses, Patents,Applications"、"Merck Index: An Encyclopediaof Chemicals, Drugs, and Biologicals", Susan Budavari et al.編, CRC Press, 1996、及びUnited StatesPharmacopeia-25/National Formulary-20（the United StatesPharmcopeial Convention, Inc., Rockville Md., 2001により出版）に記載されるように定義される。他に指定されない限り、本発明の治療抗体及び予防抗体はＷＩＰＯ規格ＳＴ．２５に準拠する標準的な一文字コード又は三文字コードに従って称されるアミノ酸を含む。
【００１６】
以下の本明細書及び添付の特許請求の範囲を通じて、文脈上他に必要な場合以外は、「を含む（comprise）」という単語、並びに「を含む（comprises）」及び「を含む（comprising）」等の変化形は、記載された特徴、整数若しくは工程、又は特徴、整数若しくは工程の群を包含することを示唆するが、任意の他の特徴、整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群を除外することを示唆しないと理解される。以下の節では本発明の種々の態様をより詳細に規定する。そのようにして規定した各態様は、反対の内容が明示されない限り、任意の他の態様（単数又は複数）と組み合わせることができる。特に、好ましい又は有利であるとして示した任意の特徴を、好ましい又は有利であるとして示した任意の他の特徴（単数又は複数）と組み合わせることができる。
【００１７】
複数の文書が、本明細書の文章全体を通じて引用される。本明細書中で引用される文書（全ての特許、特許出願、科学的刊行物、製造業者の仕様書、取扱説明書等を含む）の各々が、上記のものであるか又は下記のものであるかに関わらず、その全体において引用することにより本明細書の一部をなすものとする。本明細書のどの記載も、本発明が従来の発明に基づくかかる開示に先行する権利を有しないことを認めるものと解釈すべきではない。
【００１８】
「抗体又はその断片」という用語は、本明細書で使用される場合、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を表す。例えば標的分子又は標的タンパク質と特異的に結合するファージディスプレイを含む技法により選択される免疫グロブリン様タンパク質も含まれる。本発明の免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）のもの、又は免疫グロブリン分子のサブクラスであり得る。本発明における使用に好適な「抗体及びその断片」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一価抗体、二重特異性抗体、ヘテロコンジュゲート抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化（特にＣＤＲ移植）抗体、脱免疫化（deimmunized）抗体又はキメラ抗体、一本鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ発現ライブラリにより産生される断片、ダイアボディ（diabodies）又はテトラボディ（tetrabodies）（Holliger P. et al., 1993）、ナノボディ（nanobodies）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、及び上記のもののいずれかのエピトープ結合断片を含むがそれらに限定されない。
【００１９】
幾つかの実施形態では、抗体断片は本発明の哺乳類、好ましくはヒトの抗原結合抗体断片であり、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、並びにＶＬドメイン又はＶＨドメインを含む断片を含むがそれらに限定されない。一本鎖抗体を含む抗原結合抗体断片は、可変ドメイン（複数の場合もあり）を単独で、又はヒンジ領域、ＣＬドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの全体若しくは一部と組み合わせて含み得る。ヒンジ領域、ＣＬドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインと可変ドメイン（複数の場合もあり）の任意の組合せも含む抗原結合断片も本発明に含まれる。
【００２０】
本発明において使用可能な抗体は、鳥類及び哺乳類を含む任意の動物起源由来であり得る。好ましくは、抗体は、ヒト、サル（例えばチンパンジー、ボノボ、マカク）、げっ歯類（例えばマウス及びラット）、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ又はニワトリの抗体である。抗体がヒト起源又はマウス起源のものであることが特に好ましい。本明細書で使用する場合、「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリから単離された、又は１つ又は複数のヒト免疫グロブリンを遺伝子導入し、内在性免疫グロブリンを発現しない動物（例えばKucherlapati & Jakobovitsによる米国特許第５，９３９，５９８号に記載されるような）由来の抗体を含む。
【００２１】
本発明の関連では、本発明の抗体又はその断片により認識される抗原の固有部は「エピトープ」と呼ばれる。抗体に含まれる様々な領域が当該技術分野で既知であり、例えばJaneway CA, Jr et al. (2001), Immunobiology, 5th ed., GarlandPublishingに記載されている。
【００２２】
本明細書で使用する場合、本発明の抗体又は抗体断片が第２の化合物（例えば抗原、例えば標的タンパク質）に対して１００μＭ以下、好ましくは５０μＭ以下、好ましくは３０μＭ以下、好ましくは２０μＭ以下、好ましくは１０μＭ以下、好ましくは５μＭ以下、より好ましくは１μＭ以下、より好ましくは９００ｎＭ以下、より好ましくは８００ｎＭ以下、より好ましくは７００ｎＭ以下、より好ましくは６００ｎＭ以下、より好ましくは５００ｎＭ以下、より好ましくは４００ｎＭ以下、より好ましくは３００ｎＭ以下、より好ましくは２００ｎＭ以下、更により好ましくは１００ｎＭ以下、更により好ましくは９０ｎＭ以下、更により好ましくは８０ｎＭ以下、更により好ましくは７０ｎＭ以下、更により好ましくは６０ｎＭ以下、更により好ましくは５０ｎＭ以下、更により好ましくは４０ｎＭ以下、更により好ましくは３０ｎＭ以下、更により好ましくは２０ｎＭ以下、更により好ましくは１０ｎＭ以下の解離定数ＫＤを有する場合、本発明の抗体又は抗体断片は上記第２の化合物と「特異的に結合する」と考える。
【００２３】
「薬学的に許容可能な」は、連邦政府若しくは州政府の監督官庁により承認されていること、又は米国薬局方、若しくは動物における、より具体的にはヒトにおける使用のための他の一般的に認められた薬局方にリストされていることを意味する。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」、「ペプチド」及び「ポリペプチド」（"peptide", "polypeptide", "peptides"and "polypeptides"）という用語は、全体を通して区別なく使用される。これらの用語は、自然発生的なペプチド、及び自然発生的なアミノ酸又は自然発生的ではないアミノ酸を含み得る合成ペプチドの両方を指す。ペプチドは、天然のアミノ酸又は自然発生的ではないアミノ酸の側鎖又は遊離アミノ末端若しくはカルボキシ末端を修飾することによって化学修飾されていてもよい。この化学修飾には、更なる化学的部分の付加及びアミノ酸の側鎖中の官能基の修飾（グリコシル化等）が含まれる。ペプチドは、好ましくは少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個又は少なくとも１００個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも３０個のアミノ酸を有する重合体である。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「糖質」という用語は、抗体研究の分野で知られているように、単糖、二糖、オリゴ糖及び多糖、好ましくはＮ結合型及びＯ結合型のオリゴ糖及び多糖を含むが、それらに限定されない任意の有機化合物を表し、これには、ヘキソース分子、デオキシヘキソース分子、アミノヘキソース分子、アミノノヌロン酸（aminononulosonicacid）、シアル酸、キシロース等のペントース分子、及びグリコシル化タンパク質に通常含まれるものを含む他の分子が含まれ得る。
【００２６】
本発明の抗体又はその断片に関連する「ＣＤＲ」という用語は、抗体の相補性決定領域のいずれかを表す。抗体の可変（Ｖ）ドメインには、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）が存在する。抗体は通常、２つのポリペプチド鎖からなるため、抗原と接触することができる抗原受容体それぞれに対して約６つの頻度のＣＤＲが存在する（重鎖及び軽鎖それぞれが３つのＣＤＲを含有する）。これらの中でも、ＣＤＲ３は最も大きい可変性を示す。ＣＤＲドメインは広く研究されており、そのため当業者（average skilled person）であれば、抗原受容体のＶＬドメイン及びＶＨドメインのポリペプチド配列内でＣＤＲ領域、すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を特定することが十分に可能である。１つの好ましい方法では、ＶＬドメインのＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域は以下のとおりに決定される：
ＶＬドメインのＣＤＲ１：
ＣＤＲ１の最初のアミノ酸は、ＶＬドメインのおよそ２３番目又は２４番目の残基に位置している。ＣＤＲ１の最初のアミノ酸の前の残基は、保存されたＣｙｓ残基である。ＣＤＲ１領域の最後のアミノ酸に続く残基は、保存されたＴｒｐ残基であり、それに通常はＴｙｒ−Ｇｌｎ、ただしそれだけではなくＬｅｕ−Ｇｌｎ、Ｐｈｅ−Ｇｌｎ又はＴｙｒ−Ｌｅｕが続く。ＶＬドメインのＣＤＲ１の長さは１０残基〜１７残基である。
ＶＬドメインのＣＤＲ２：
ＣＤＲ２は一般的に、ＣＤＲ１の末端の１６残基後ろに位置している。ＣＤＲ２の最初のアミノ酸の前の残基は一般的にＩｌｅ−Ｔｙｒ、ただしそれだけではなくＶａｌ−Ｔｙｒ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ、Ｉｌｅ−Ｐｈｅ又は同様のものである。ＣＤＲ２領域の長さは一般的に７残基である。
ＶＬドメインのＣＤＲ３：
ＶＬドメインのＣＤＲ３領域は、ＣＤＲ２領域の末端の３３残基後ろから始まる。ＣＤＲ３の最初のアミノ酸の前を先行する残基は常にＣｙｓである。ＣＤＲ３の後ろに、アミノ酸Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＸＸＸ−Ｇｌｙが続く。ＣＤＲ３領域の長さは通常、７残基〜１１残基である。
【００２７】
１つの好ましい方法では、ＶＨドメインのＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域は以下のとおりに決定される：
ＶＨドメインのＣＤＲ１：
ＣＤＲ１の最初のアミノ酸は、ＶＨドメインのおよそ２６番目の残基（常にＣｙｓの４残基又は５残基後ろ）に位置している。ＣＤＲ１の後ろのアミノ酸は、Ｔｒｐ（通常Ｔｒｐ−Ｖａｌ、ただしそれだけではなくＴｒｐ−Ｉｌｅ又はＴｒｐ−Ａｌａ）である。ＶＨドメインのＣＤＲ１の長さは１０残基〜１２残基である。
ＶＨドメインのＣＤＲ２：
ＣＤＲ２ドメインはＶＨドメインのＣＤＲ１の末端の１５残基後ろから始まる。通常、ＣＤＲ２ドメインの前にアミノ酸Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ又はその変異体が付く（正：preceded）。ＣＤＲ２ドメインの後ろには、３つのアミノ酸（Ｌｙｓ／Ａｒｇ）−（Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｐｈｅ／Ｔｈｒ／Ａｌａ）−（Ｔｈｒ／Ｓｅｒ／Ｉｌｅ／Ａｌａ）が続き、ＣＤＲ２ドメインは合計で約１６残基〜１９残基を含む。
ＶＨドメインのＣＤＲ３：
ＶＨドメインのＣＤＲ３の最初のアミノ酸は、ＶＨドメインのＣＤＲ２の３３残基後ろに位置し、常に保存されたＣｙｓ残基の３アミノ酸後から始まる（先行する配列は通常Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇである）。ＣＤＲ３に続く残基はＴｒｐ−Ｇｌｙ−ＸＸＸ−Ｇｌｙである。ＶＨドメインのＣＤＲ３は通常、３残基〜２５残基の長さを有する。
【００２８】
以下の表１に本明細書で言及する抗体についての概要を与える：
【表１】
2013534528.tif 000003
【００２９】
以下の表２に本明細書で言及する配列についての概要を与える：
【表２】
2013534528.tif 000004
【００３０】
本発明者らは効力が改善した新規の脂質とコンジュゲートする抗体を特定している。例えば、脂質と連結させることで、ウイルス融合の阻害剤として機能する抗体をより効果的なものにすることができた。理論に束縛されるものではないが、抗体を脂質と連結させることによって修飾した抗体は、細胞外媒体中の抗体と、例えば細胞又はエンベロープウイルス粒子の膜等の脂質膜と結合した抗体との分配比の改善を示すことが推測される。例として、本発明の抗体及びその断片は好ましくは、原形質膜、特に原形質膜の脂質ラフトミクロドメインに位置し、そこで本発明の抗体及びその断片は例えば、極めて効果的にウイルス侵入を阻むことができる。このことから、治療抗体及び予防抗体の量の低減を適用しても、現行の技術水準の各非修飾抗体によりそれぞれより大きい用量で達成されるものと同じ健康上の利点をこの少ない用量で達成することが可能となる。さらに、本発明の抗体の脂質部分は、これらの抗体の細胞取込みを助けることもでき、例えば治療カーゴ（cargo）又は更には細胞毒性カーゴ（例えばがん細胞を特異的に除去するのに好適である）を標的細胞に運ぶことが可能である。
【００３１】
第１の態様では、本発明は、抗体又はその断片であって、該抗体又はその断片が、任意でリンカーを介して脂質と共有結合的に連結し、該脂質又は前記リンカーが、前記抗体又はその断片のＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３からなる群から選択される抗体ドメインのアミノ酸と共有結合的に連結する、抗体又はその断片を提供する。
【００３２】
好ましい実施形態では、本発明の抗体及びその断片を修飾し、安定性を高めるとともに、抗原結合を高めることができる。安定性に影響を及ぼす因子には、全Ｉｇ分子の界面に隠れた疎水性残基を定常ドメイン界面へと露出させること；Ｆｖ表面上に疎水性領域を露出させ、分子間相互作用をもたらすこと；及びＦｖ  βシートの内部における又はＶＨとＶＬとの間の通常の界面での親水性残基が含まれる（Chowdhury et al., Engineering scFvs for Improved Stability, p.237-254 in Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols, (Eds.Welschof and Krauss) Humana Press, Totowa, New Jersey, 2003.）。安定性に影響を与える問題となる残基を置換することにより安定性を高めることができる。かかる修飾は、例えば本発明の抗体又はその断片のポリペプチド鎖において最大１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は最大１０個の単一アミノ酸置換、欠失、修飾及び／又は挿入、好ましくは最大３つ、最も好ましくは１つの単一置換、欠失、修飾及び／又は挿入を行うことにより達成することができる。問題となる残基を考慮に入れて一本鎖抗体の安定性を高める技法が当該技術分野で既知である（Chowdhury et al., Engineering scFvs for Improved Stability, p.237-254 in Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols,(Eds. Welschof and Krauss) Humana Press, Totowa, New Jersey, 2003.）。
【００３３】
好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ダイアボディ、テトラボディ、ナノボディ、キメラ抗体及び脱免疫化抗体からなる群から選択される。
【００３４】
好ましい実施形態では、本発明の抗体の断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ及びジスルフィド連結Ｆｖ（ｄｓＦｖ）からなる群から選択される抗体断片である。本発明の抗体又はその断片は好ましくは、脂質膜と結合することが可能である。さらに、本発明の抗体又は断片は、
（ｉ）細胞に内在化し、
（ｉｉ）細胞の原形質膜と結合し、及び／又は
（ｉｉｉ）エンベロープウイルスの脂質膜と結合することが可能であるのが好ましい。
【００３５】
上述のような好ましい実施形態では、本発明の抗体又はその断片の脂質によって、脂質ラフトを介して原形質膜と結合することが可能になり、及び／又は好ましくは脂質ラフトを介して細胞に内在化することが可能になる。インフルエンザウイルス等の多くの病原体が脂質ラフトを介して細胞に侵入し、そのため本発明の抗体はかかる病原体を細胞表面上だけでなく細胞内でも中和する能力を示すことが有益となる。内在化は、Dyer & Benjamins, J. Neurosci. (1988) 883-891、D. C. Blakey1 et al., J. Cell Biochem. Biophys. 24-25 (1994) 175-183、Coffey et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 310 (2004) 896-904に記載されているような幾つかのアプローチで研究することができる。
【００３６】
当業者は、過度の負担を伴うことなく、抗体又はその断片が、例えば細胞又はエンベロープウイルス、例えばＨＩＶ、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ライノウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、西ナイルウイルス、デングウイルス、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ、水痘帯状疱疹ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス（正：Vesicularstomatitis virus）、ボルナ病ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ワクシニアウイルス、ロタウイルス、センダイウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（正：Respiratorysyncytial virus）、ヘンドラウイルス、ニパーウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス（正：Guanaritovirus）若しくはラッサウイルス等の脂質膜と結合するか否かを試験することも十分に可能である。
【００３７】
かかる分析には、蛍光ベースの方法（例えば共局在化試験、消光等）、電子顕微鏡試験等の様々なツールが容易に利用可能であり、また好適である。
【００３８】
本発明の抗体又はその断片の１つの実施形態では、抗体は脂質膜（例えば原形質膜）の他にも、ＨＩＶ  ｇｐ４１（例えばアクセッション番号ＡＡＡ１９１５６．１）、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、インフルエンザ血球凝集素（例えばアクセッション番号ＡＡＡ４３０９９．１又はＣＡＡ４０７２８．１）、パラミクソウイルスのタンパク質Ｆ（例えばアクセッション番号ＡＡＶ５４０５２．１）、フィロウイルスのタンパク質ＧＰ２（例えばアクセッション番号Ｑ８９８５３．１又はＡＡＶ４８５７７．１）、フラビウイルスのタンパク質Ｅ（例えばアクセッション番号ＡＡＲ８７７４２．１）、コロナウイルスのタンパク質Ｓ（例えばアクセッション番号ＡＡＰ３３６９７．１又はＢＡＣ８１４０４．１）、及びアレナウイルスのタンパク質Ｇ２（例えばアクセッション番号ＢＡＡ００９６４．２又はＰ０３５４０）からなる群から選択されるポリペプチドとも結合する、好ましくは特異的に結合する。
【００３９】
本発明の抗体又はその断片の別の実施形態では、抗体は脂質膜（例えば原形質膜）の他にも、ＨＥＲ２、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ２０、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及びスカベンジャー（正：scavenger）受容体Ｂ１（ＳＲ−Ｂ１）からなる群から選択されるポリペプチドとも結合する、好ましくは特異的に結合する。
【００４０】
本発明の抗体又はその断片が上述のポリペプチドの１つのような抗原と結合するかどうかを、他の手段により実験的に決定することも、当業者の技術範囲内である。例えば、プルダウンアッセイを用いて抗体又はその断片とポリペプチド又はタンパク質との間の相互作用を分析することが可能である。例えば、ポリペプチドを精製し、ビーズ等の固相上に固定することができる。１つの実施形態では、ポリペプチドと連結したビースを抗体又はその断片に接触させ、洗浄するとともに、抗体又はその断片の不変部に特異的な二次抗体でプローブ化することができ、これは現行の技術水準において利用可能である。また例えばＥＬＩＳＡベースのアッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ベースのアッセイ、免疫共沈降アッセイ及びプラズモン共鳴アッセイ等の当該技術分野で既知であり、２つの結合パートナー間の結合親和性を決定するのに好適な他の結合アッセイも使用することができる。当該技術分野で既知であるように、結合を蛍光手段、例えば蛍光標識した二次抗体を用いることにより、又は酵素によって検出することもできる。また放射性アッセイを用いて、結合を評価することができる。このようにして、上述の例示的な方法のいずれかを用いて、本発明の抗体又はその断片が特定のポリペプチドと結合するかどうかを決定し、また任意に抗体又はその断片がどれくらいの解離定数ＫＤで上述の抗原に結合するかを決定することができる。
【００４１】
本発明の抗体又はその断片の脂質は上記抗体又はその断片のアミノ酸と（任意にリンカーを介して）連結する。好ましくは、アミノ酸は、
（１）前記抗体若しくはその断片のＶＬドメインのＣＤＲ−１領域のＮ末端に、
（２）前記抗体若しくはその断片のＶＨドメインのＣＤＲ−１領域のＮ末端に、
（３）前記抗体若しくはその断片のＶＬドメインのＣＤＲ−３領域内に、又は
（４）前記抗体若しくはその断片のＶＨドメインのＣＤＲ−３領域内に、
位置する。
【００４２】
上記のように、抗体のＣＤＲ領域は当該技術分野において十分に特性化されており、ＣＤＲ領域を任意の抗体又は抗体断片について当業者が決定することができる。以下に示される実施例９〜実施例１１及び図８〜図１６は、脂質に（任意にリンカーを介して）共有結合的に付着させるのに使用することができる抗体のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖の特に好ましいアミノ酸を具体的に述べている。
【００４３】
アミノ酸の好ましい場所は、
（１）前記抗体若しくはその断片のＶＬドメインの２０位若しくは２２位、
（２）前記抗体若しくはその断片のＶＬドメインの１９位若しくは２１位、
（３）前記抗体若しくはその断片のＶＨドメインの７位若しくは２５位、
（４）前記抗体若しくはその断片のＣＬドメインの１９７位、
（５）前記抗体若しくはその断片のＣＨ１ドメインの１２５位、
（６）前記抗体若しくはその断片のＣＨ２ドメインの２４８位若しくは３２６位、又は
（７）前記抗体若しくはその断片のＣＨ３ドメインの４１５位若しくは４４２位である。
【００４４】
最も好ましい位置は、ＶＬドメインの１９位、２０位、２１位及び２２位である。本明細書で使用される場合、「位置」は抗体又はその断片の重鎖又は軽鎖内の上記アミノ酸の場所を表す。この位置は上記抗体又はその断片の軽鎖又は重鎖それぞれの最初のＮ末端アミノ酸から指定数下流に位置するアミノ酸を具体的に述べている。上述のように、好ましいＦａｂ断片及びアミノ酸のそれらのそれぞれの好ましい位置の幾つかの例が以下の実施例９〜実施例１１で与えられる（図８〜図１６も参照されたい）。配列アラインメントを用いて、当業者であれば、好ましくは上記ＶＬドメイン又はＶＨドメインのＮ末端から数えることで、任意の所与の抗体のＶＬドメイン又はＶＨドメイン内のこれらの及び上述のアミノ酸の位置を決定することが十分に可能である。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「脂質」は細胞膜又は同等の脂質二重層への挿入能があればどのような脂質であってもよい。好ましくは、「脂質」及びその誘導体は、Xu, J. Biol. Chem. 276, (2001) 33540-33546 and Wang, Biochemistry43, (2004) 1010-8に記載されるようにラフトに組み込むことが可能であるか、及び／又はラフトを形成することが可能である。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態は、脂質がコレステロール、スフィンゴ脂質、糖脂質、グリセロリン脂質、及びそれらの誘導体又は薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される、本発明の抗体又はその断片を含む。
【００４７】
抗体又はその断片の好ましい実施形態では、脂質はガングリオシド、セレブロシド、グロボシド及びスルファチドからなる群から選択される糖脂質である。ガングリオシドは例えば、ＧＤ１ａ、ＧＤｌｂ、ＧＭ１、ＧＤ３、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＱ１ａ及びＧＱ１ｂからなる群から選択され得る。
【００４８】
抗体又はその断片の別の好ましい実施形態では、脂質はスフィンゴミエリン又はセラミドである。好ましい実施形態で脂質がグリセロリン脂質である場合、この脂質はホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルセリンからなるグリセロリン脂質の群から選択される。
【００４９】
コレステロールは細胞膜に挿入することが可能である。この特性は本発明による抗体及びその断片の有益な特性に少なくとも一部関与していると考えられる。したがって、脂質がコレステロール又はコレステロールの誘導体である、本発明の抗体又はその断片も好ましい。かかる誘導体は、同じステロイド基本構造、すなわち（８Ｒ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ）−１０，１３−ジメチル−１，２，６，７，８，９，１１，１２，１４，１５，１６，１７−ドデカヒドロシクロペンタ［ａ］フェナントレンを有し、好ましくはヒト細胞で見られる脂質組成を有する脂質二重層への挿入能を同程度有するという点でコレステロールに構造的に関連する。コレステロールの好ましい組込誘導体としては、エルゴステロール、７−ジヒドロコレステロール（正：dihydrocholesterol）及びスチグマステロールが挙げられる。脂質二重層への挿入能を、人工脂質二重層上で例えば蛍光標識したコレステロール及びその構造誘導体を用いて当該技術分野で既知の方法により試験することができる。好ましい実施形態では、本発明に有用な脂質の組込誘導体は細胞膜に含まれる脂質ラフトへの組込能を有する。脂質ラフトに組み込むことができる脂質は一般的に脂質ラフトを形成することもできる。このため、脂質を脂質ラフトに組み込み、このようにして脂質ラフトを形成することができるかどうかを、例えばXu, J. Biol. Chem. 276, (2001) 33540-33546, Wang, Biochemistry 43,(2004) 1010-8に記載のように試験することができる。
【００５０】
好ましくは、任意にリンカーを介して抗体又はその断片と共有結合的に連結する脂質には極性がなく、例えばこの脂質は任意の帯電した置換基を含まない。さらにこれについても上述のように、上記脂質が細胞膜の脂質ラフトドメインに隔離されることが可能であることが好ましい。このことは、本発明に有用な脂質が脂質ラフトに選択的に集積するのが好ましいことを意味する。脂質が脂質ラフトに隔離されるかどうかは、上述のように、又は例えば細胞を放射性同位体を含む脂質と接触させた後、例えば、RADEVA et al., Biochem. J. (2004) 380, p. 219-230及びKim et al., "The Isolation of Detergent-Resistant Lipid Raftsfor Two-Dimensional Electrophoresis", Methods in Molecular Biology (2008),Volume 424, p. 413-422に記載のようにスクロース勾配遠心分離によって脂質ラフトミクロドメインをこれらの細胞から単離することにより容易に調べることができる。このようにして、脂質ラフトミクロドメインと特異的に結合する、及び／又は脂質ラフトミクロドメインに隔離される本発明の好ましい脂質は脂質ラフトとともに分画化する（co-fractionate）。上述の例では、放射性脂質は単離された脂質ラフトで検出され、すなわち脂質ラフト画分に存在する放射能の総量はラフトとともに単離されなかった残りの脂質画分よりも大きい。
【００５１】
好ましい実施形態では、脂質は蛍光脂質、好ましくは脂質ラフトへと挿入することが可能な蛍光脂質、最も好ましくは式（Ｉ）〜式（ＩＩＩ）のいずれかによる構造を有する脂質である：
【化１】
2013534528.tif 000005
（式中、Ｒは上記リンカー（存在する場合）との、又は抗体若しくはその断片のアミノ酸、好ましくは上記アミノ酸の硫黄部分（スルフヒドリル基）との結合を示す）。
【００５２】
「共有結合的に連結する」という用語は、抗体若しくはその断片のアミノ酸と脂質、例えばコレステロールとの間の共有結合、又は抗体若しくはその断片と上記脂質との間に入り得る本明細書に記載の上記リンカーを表す。
【００５３】
抗体又はその断片の好ましい実施形態では、上記脂質は、脂質の遊離−ＯＨ基、−ＮＨ３基又は−ＣＯＯＨ基を介して、任意に上記リンカーを介して、本発明の上記抗体又はその断片の軽鎖又は重鎖のＣ末端に共有結合的に連結する、スフィンゴ脂質、糖脂質及びグリセロリン脂質から選択される。
【００５４】
好ましくは、脂質は式ＩＶによる構造を有するスフィンゴ脂質である：
【化２】
2013534528.tif 000006
（式中、
＊は脂質がリンカーに又は本発明の上記抗体又はその断片の上記アミノ酸に付着している場所を示し、Ｒ１〜Ｒ４は以下のリストから選択される：
【表３】
2013534528.tif 000007
【００５５】
本発明の抗体又はその断片にはその薬学的に許容可能な塩も含まれる。「薬学的に許容可能な塩」という用語は、例えば薬学的に許容可能な酸、例えば塩酸、硫酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、クエン酸、酒石酸、炭酸又はリン酸の溶液と、本発明の抗体若しくはその断片又はその脂質の溶液を混合することによって形成することができる酸付加塩を含む、本特許出願において特定されるような化合物の塩を表す。さらに、本発明の抗体又はその断片が酸性部分を保有する場合、好適なその薬学的に許容可能な塩は、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩又はカリウム塩）；アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩又はマグネシウム塩）；及び好適な有機リガンドを用いて形成される塩（例えば、ハロゲン化物イオン、水酸化物イオン、カルボン酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、硝酸イオン、アルキルスルホン酸イオン及びアリールスルホン酸イオン等の対アニオンを使用して形成されるアンモニウムカチオン、第４級アンモニウムカチオン及びアミンカチオンの塩）を含み得る。薬学的に許容可能な塩の具体例は、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、重酒石酸塩、ホウ酸塩、臭化物、酪酸塩、エデト酸カルシウム、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、クラブラン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、二塩酸塩、ドデシルスルホン酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストール酸塩（estolate）、エシル酸塩（esylate）、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコヘプトン酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリセロリン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩（glycolylarsanilate）、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヘキシルレゾルシン酸塩、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イソチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メタンスルホン酸塩、メチル硫酸塩、ムチン酸塩（mucate）、２−ナフタレン硫酸塩、ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、Ｎ−メチルグルカミンアンモニウム塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩（エンボン酸（embonate））、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、硫酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、トリエチオジド（triethiodide）、ウンデカン酸塩、吉草酸塩等を含むがそれらに限定されない（例えば、Berge, S. M., et al, "Pharmaceutical Salts", Journal ofPharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19を参照されたい）。本発明の抗体及びその断片は概して、塩基性官能基及び酸性官能基の両方、例えばＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ又はＡｒｇを含有しており、これによって、化合物を塩基付加塩又は酸付加塩に変換することが���能となる。
【００５６】
「リンカー」という用語は好ましくは、直鎖構造をとる有機分子を表す。上記リンカー（好ましくは非切断型リンカーである）は、０．４ｎｍ〜１５ｎｍの好ましい長さを有する。この特に好ましい範囲の長さのリンカーが、本発明の抗体及び断片に最適な活性（例えば抗ウイルス活性）を与える。このため、これに関連してリンカーが０．４ｎｍ〜１５ｎｍの長さを有し、抗体がＨＩＶ  ｇｐ４１（例えばアクセッション番号ＡＡＡ１９１５６．１）、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、インフルエンザ血球凝集素（例えばアクセッション番号ＡＡＡ４３０９９．１又はＣＡＡ４０７２８．１）、パラミクソウイルスのタンパク質Ｆ（例えばアクセッション番号ＡＡＶ５４０５２．１）、フィロウイルスのタンパク質ＧＰ２（例えばアクセッション番号Ｑ８９８５３．１又はＡＡＶ４８５７７．１）、フラビウイルスのタンパク質Ｅ（例えばアクセッション番号ＡＡＲ８７７４２．１）、コロナウイルスのタンパク質Ｓ（例えばアクセッション番号ＡＡＰ３３６９７．１又はＢＡＣ８１４０４．１）、及びアレナウイルスのタンパク質Ｇ２（例えばアクセッション番号ＢＡＡ００９６４．２又はＰ０３５４０）からなる群から選択されるポリペプチドと特異的に結合するのが好ましい。
【００５７】
これに関連して（正：in this context）リンカーが０．４ｎｍ〜１５ｎｍの長さを有し、抗体がＨＥＲ２、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ２０、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、及びスカベンジャー受容体Ｂ１（ＳＲ−Ｂ１）からなる群から選択されるポリペプチドと特異的に結合するのも好ましい。
【００５８】
本発明の抗体又はその断片の好ましい実施形態の典型的なリンカーは、ポリマースペーサー単位、好ましくは所与のモノマーの１回〜３０回の反復を有するポリマースペーサー単位と、スペーサー単位の一端でのアミノ酸、好ましくは−ＳＨ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＨＣ＝Ｏ、−ＲＣ＝Ｏ、−Ｏ−ＮＨ２、−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ、−Ｃ＝Ｃ−、−Ｃ≡Ｃ、又は−ＮＨ−ＮＨ２のような化学官能基を含有するアミノ酸との連結を可能にする部分と、もう一端での好ましくはステロイド構造の３−酸素部分を介した上記脂質、例えばコレステロール又はその誘導体との連結を可能にする部分とを含有することができる。
【００５９】
好ましくは、本発明による抗体又はその断片の脂質又はリンカーは、アミド結合、エステル結合、チオエーテル結合、チオエステル結合、アルデヒド結合及びオキシム結合（正：oximebond）結合からなる群から選択される結合を介して上記抗体又はその断片と共有結合的に連結する。本発明に使用することができる非切断型リンカー系の例としては、カルボジイミド（ＥＤＣ）系、スルフヒドリル−マレイミド系、及び過ヨウ素酸系が挙げられるが、それらは全て当該技術分野で既知である。カルボジイミド系では、水溶性カルボジイミドが脂質又は抗体若しくはその断片のカルボン酸基と反応し、これによりこのカルボキシル基の活性化が起こる。続いてカルボキシル基が脂質又は抗体若しくはその断片上に存在するアミノ基と共役する。この反応の結果が脂質と抗体又はその断片との非切断型のアミド結合である。スルフヒドリル−マレイミド系では、スルフヒドリル基を、例えばトラウト試薬等の化合物を用いて抗体又はその断片のアミン基上に導入する。それから脂質又は脂質を含むリンカーをＮＨＳエステル（例えばγ−マレイミド酪酸ＮＨＳエステル（ＧＭＢＳ））と反応させて、スルフヒドリル基と反応性があるマレイミド誘導体を形成する。その後、２つの活性化化合物（例えば抗体及び脂質）を反応させて、非切断型である共有結合的な連結を形成する。過ヨウ素酸の共役には、抗体又はその断片に存在し得るオリゴ糖基の存在が必要となる。これにより、抗体又はその断片に存在し得る糖質基から活性アルデヒド基を形成することが可能になる。それから、これらの基を脂質又はリンカー上のアミノ基と反応させることができ、それにより安定したコンジュゲートを生成する。代替的に、過ヨウ素酸によって酸化された抗体は脂質又はリンカーのヒドラジド誘導体と反応することができ、それによっても安定したコンジュゲートが得られる。
【００６０】
好ましくは、リンカー又は脂質は、本発明の上記抗体又はその断片のシステインと共有結合的に連結する。リンカーの好ましい例には、Ｙ、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｘ）ｎ−、−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｘ）ｎ−、−Ｙ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｘ）ｎ−、−Ｙ−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｘ）ｎ−、−Ｙ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｘ）ｎ−Ｚ、−Ｙ−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｘ）ｎ−Ｚ、−Ｙ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｘ）ｎ−ＣＨ２−Ｚ、−Ｙ−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｘ）ｎ−ＣＨ２−Ｚ、−Ｙ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｘ）ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｚ、−Ｙ−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｘ）ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｚ、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ポリペプチド、糖質、及びそれらの組合せが含まれる。ここで、Ｘは−Ｏ−又は−ＮＨ−であり、Ｙは−ＮＨ−、−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−又は−ＣＨ２−であり、Ｚは−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、ｎは０〜４０の整数（すなわち０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０）であり、より好ましくはｎは４〜２４の整数（すなわち４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４）である。
【００６１】
本発明の抗体又はその断片と（任意に上記リンカーを介して）連結する脂質がコレステロール又はその誘導体である場合、この脂質が直接又はリンカーを介してコレステロール又はその誘導体の３位にある酸素部分を通して抗体又はその断片に付着するのが好ましい。
【００６２】
好ましい実施形態では、脂質、好ましくはコレステロール又はリンカーが、抗体若しくはその抗体断片において自然発生的であるか、又は突然変異誘発によって上記抗体若しくはその断片に導入されているＣｙｓアミノ酸の硫黄部分に付着する。
【００６３】
本発明の抗体又はその断片のコレステロール及びリンカー部分の特に好ましい構造は式（Ｖ）〜式（ＸＩＶ）に示されている：
【化３−１】
2013534528.tif 000008
【化３−２】
2013534528.tif 000009
（式中、Ｘはそれぞれの場合において独立して、−ＮＨ−、−ＣＨ２−及び−Ｏ−から選択され、Ｙは−ＣＨ２−、−ＮＨ−、−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−及び−ＣＨ２−からなる群から選択され、Ｚは−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、
Ｒはリンカーとの、又は抗体若しくはその断片、好ましくはそのアミノ酸の硫黄部分（例えばスルフヒドリル基）との結合を示し、
ｎは０〜４０の整数（すなわち０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０）であり、より好ましくはｎは４〜２４の整数（すなわち４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４）であり、ｊは０〜４０から選択される整数（すなわち０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０）であり、より好ましくはｊは４〜２４の整数（すなわち４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４）である）。
【００６４】
本発明の抗体又はその断片の好ましい実施形態では、上記脂質又は上記リンカーが共有結合的に連結した上記アミノ酸は、上記抗体又はその断片の軽鎖に含まれ、最も好ましくは上記抗体又はその断片のＶＬドメインに含まれる。
【００６５】
好ましい実施形態では、本発明の抗体又はその断片は、ＶＨドメインを有する重鎖と、ＶＬドメインを有する軽鎖とを含み、ここでＶＨドメイン及びＶＬドメインはそれぞれ、ｉ）〜ｘｘｉｖ）のいずれかのアミノ酸配列を有し、
【表４】
2013534528.tif 000010
任意に軽鎖及び重鎖は合計で、１つ、２つ又は３つの単一アミノ酸置換、欠失、修飾及び／又は挿入を含む。上述の実施形態（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）、（ｉｘ）、（ｘｉ）、（ｘｖ）、（ｘｖｉｉ）、（ｘｉｘ）、（ｘｘｉ）及び（ｘｘｉｉｉ）での上記脂質又は上記リンカーは、本発明の抗体又はその断片のそれぞれのＶＬドメインの２０位のアミノ酸、好ましくはシステインと共有結合的に連結するのが好ましい。上述の実施形態（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｘ）、（ｘｉｉ）、（ｘｖｉ）、（ｘｖｉｉｉ）、（ｘｘ）、（ｘｘｉｉ）及び（ｘｘｉｖ）での上記脂質又は上記リンカーは、本発明の抗体又はその断片のそれぞれのＶＬドメインの２２位のアミノ酸、好ましくはシステインと共有結合的に連結するのが好ましい。上述の実施形態（ｘｉｉｉ）での上記脂質又は上記リンカーは、本発明の抗体又はその断片のＶＬドメインの１９位のアミノ酸、好ましくはシステインと共有結合的に連結するのが更に好ましい。上述の実施形態（ｘｉｖ）での上記脂質又は上記リンカーは、本発明の抗体又はその断片のＶＬドメインの２１位のアミノ酸、好ましくはシステインと共有結合的に連結するのが更に好ましい。
【００６６】
好ましくは、上述の抗体及びその断片は上記脂質を介して原形質膜において脂質ラフトミクロドメイン等の脂質膜と特異的に結合することも可能である。
【００６７】
本発明による抗体又はその断片の更に好ましい実施形態では、抗体は、ＭＡＢ  Ｆ１０、ＭＡＢ  ＣＲ６２６１、ＭＡＢ  Ｄ５、ＭＡＢ  ２Ｆ５、ＭＡＢ  ４Ｅ１０、ＭＡＢ  ＶＲＣ０１、ＭＡＢ  ＶＲＣ０２、パリビズマブ、モタビズマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ、アダリムマブ、セツキシマブ、ラニビズマブ、インフリキシマブからなる群から選択されるモノクローナル抗体から選択され、前記モノクローナル抗体は任意に、１つ又は２つの単一アミノ酸置換、欠失、修飾及び／又は挿入を含む。
【００６８】
本願全体を通して使用される場合、タンパク質又はポリペプチドの「単一アミノ酸置換、欠失、修飾及び／又は挿入」という語句は一般的に、列挙されるタンパク質又はポリペプチドの修飾型（modified version）を表し、例えばタンパク質又はポリペプチドの１つのアミノ酸が欠失、挿入、修飾及び／又は置換され得る。そのポリペプチド又はタンパク質が幾つかの単一アミノ酸置換、欠失、修飾及び／又は挿入を含む場合、かかる置換、欠失、修飾及び／又は挿入の総数はそれぞれの場合で示される。上記挿入は元のポリペプチド又はタンパク質への指定数の単一アミノ酸の挿入である。タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸を修飾してもよく、例えば示される総数の修飾で化学的に修飾してもよい。例えば、タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸の側鎖又は遊離アミノ末端若しくは遊離カルボキシ末端を、例えばグリコシル化、アミド化、リン酸化、ユビキチン化等により修飾してもよい。化学修飾は当該技術分野で既知のように、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば宿主細胞において行うこともできる。例えば、タンパク質のアミノ酸配列に存在する好適な化学修飾モチーフ、例えばグリコシル化配列モチーフにより、タンパク質がグリコシル化される。ポリペプチド又はタンパク質が１つ又は複数の単一アミノ酸置換を含む場合、上記置換はそれぞれの場合で独立して、保存的な又は非保存的な置換、好ましくは保存的な置換であり得る。最も好ましい実施形態では、全ての置換が以下で更に規定されるような保存的性質を有する。幾つかの実施形態では、置換には、自然発生的なアミノ酸の非自然発生的なアミノ酸への交換も含まれる。保存的置換には、或るアミノ酸の置換されるアミノ酸と同様の化学特性を有する別のアミノ酸への置換が含まれる。好ましくは、保存的置換は以下からなる群から選択される置換である：
（ｉ）塩基性アミノ酸の別の異なる塩基性アミノ酸への置換、
（ｉｉ）酸性アミノ酸の別の異なる酸性アミノ酸への置換、
（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸の別の異なる芳香族アミノ酸への置換、
（ｉｖ）非極性の脂肪族アミノ酸の別の異なる非極性の脂肪族アミノ酸への置換、及び
（ｖ）極性の非荷電アミノ酸の別の異なる極性の非荷電アミノ酸への置換。
【００６９】
塩基性アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン及びリシンからなる群から選択されるのが好ましい。酸性アミノ酸はアスパラギン酸又はグルタミン酸であるのが好ましい。芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンからなる群から選択されるのが好ましい。非極性の脂肪族アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン及びイソロイシンからなる群から選択されるのが好ましい。極性の非荷電アミノ酸は、セリン、トレオニン、システイン、プロリン、アスパラギン及びグルタミンからなる群から選択されるのが好ましい。保存的アミノ酸置換とは対照的に、非保存的アミノ酸置換は上で概説した保存的置換（ｉ）〜保存的置換（ｖ）に当てはまらない、或るアミノ酸の任意のアミノ酸への交換である。
【００７０】
タンパク質又はポリペプチドが１つ又は指定数の単一アミノ酸欠失を含む場合、参照ポリペプチド又はタンパク質配列に存在する上記アミノ酸（複数の場合もあり）は除去されている。
【００７１】
更なる実施形態では、本発明の抗体又はその断片の重鎖のＣＤＲ３ドメインは以下の配列を含むか又はそれからなる：
RRGPTTXXXXXXARGPVNAMDV（配列番号４６）又は
EGTTGXXXXXXPIGAFAH（配列番号４７）
（ここでＸはそれぞれの場合で任意のアミノ酸とすることができ、脂質はＸとして示されるアミノ酸の１つと共有結合的に結合し、
配列番号４６又は配列番号４７による上記配列は任意に、１つの単一アミノ酸置換、欠失、修飾及び／又は挿入を含む）。
【００７２】
更に別の態様では、本発明は、本発明による抗体又はその断片を含み、１つ又は複数の薬学的に許容可能な希釈剤；担体；賦形剤、充填剤、結合剤、滑剤、流動促進剤、崩壊剤、吸着剤；補助剤及び／又は防腐剤を更に含む、医薬組成物を提供する。
【００７３】
本発明の医薬組成物を全身投与薬の形態で使用することができることが特に好ましい。これらには、非経口物質（parenterals）（その中でも注射物質及び点滴物質を含む）が含まれる。注射物質は、アンプルの形態で又はいわゆる使用準備済み（ready-for-use）注射物質、例えば使用準備済みシリンジ又は使い捨て（single-use）シリンジとして、及びこれとは別に複数回の中断（withdrawal）のための穿刺式フラスコにおいて配合される。注射物質の投与は皮下（ｓ．ｃ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）又は皮内（ｉ．ｃ．）適用の形態で行うことができる。特に、例えばヒドロゾルのような結晶、溶液、ナノ粒子又はコロイド分散系の懸濁液としてそれぞれ好適な注射用配合物を製造することが可能である。
【００７４】
注射用配合物は更に、水性の等張希釈剤で溶解又は分散することができる濃縮物として製造することもできる。点滴物質を等張溶液、脂肪エマルション、リポソーム配合物及びマイクロエマルションの形態で調製することもできる。注射物質と同様に、点滴配合物を希釈のための濃縮物の形態で調製することもできる。注射用配合物を入院治療及び通院治療の両方において例えばミニポンプによって永続型点滴物質の形態で適用することもできる。
【００７５】
非経口薬物配合物に、例えばアルブミン、血漿、増量剤、界面活性物質、有機希釈剤、ｐＨ作用（influencing）物質、錯体形成物質又はポリマー物質を特に本発明の医薬組成物のタンパク質又はポリマーへの吸着に影響を与える物質として添加することが可能であり、又はそれらを本発明の医薬組成物の注射器具又は包装材料、例えばプラスチック又はガラスのような物質への吸着を低減させる目的で添加することもできる。
【００７６】
幾つかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、非経口物質において例えばポリ（メタ）アクリレート、ポリラクテート、ポリグリコレート、ポリアミノ酸、又はポリエーテルウレタンをベースとする微細分散粒子のような微小担体又はナノ粒子とも結合することができる。本発明の医薬組成物は、例えば本発明の組成物がそれぞれ、微細分散形態、分散形態及び懸濁形態で、若しくは薬剤中の結晶の懸濁液として導入される場合、「複合単位原理」に基づき、又は本発明の組成物が配合物中に、例えば錠剤若しくはロッド（後に埋め込まれる）中に封入される場合、「単一単位原理」に基づきデポー製剤として改質することもできる。単一単位配合物及び複合単位配合物でのこれらのインプラント又はデポー薬剤は、例えば乳酸及びグリコール酸のポリエステル、ポリエーテルウレタン、ポリアミノ酸、ポリ（メタ）アクリレート又は多糖のようないわゆる生分解性ポリマーからなっていることが多い。
【００７７】
本発明の組成物における補助剤は好ましくは、滅菌水（aqua sterilisata （sterilized water））；例えば有機又は無機の酸又は塩基、及びそれらの塩のようなｐＨ値作用物質；ｐＨ値を調整するための緩衝物質；例えば塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、グルコース及びフルクトースのような等張化のための物質；界面活性剤（tensidesand surfactants, respectively）；及び例えばポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸の部分エステル（例えばＴｗｅｅｎ（商標））又は例えばポリオキシエチレンの脂肪酸エステル（例えばＣｒｅｍｏｐｈｏｒ（商標））のような乳化剤；例えばラッカセイ油、ダイズ油又はヒマシ油のような脂肪油；例えばオレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル及び中性油（例えばＭｉｇｌｙｏｌ（商標））のような脂肪酸の合成エステル；並びに例えばゼラチン、デキストラン、ポリビニルピロリドンのようなポリマー補助剤；例えばプロピレングリコール、エタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、プロピレングリコールのような有機溶媒の溶解度を増大させる添加剤；又は例えばシトレート及び尿素のような錯体形成物質；例えば安息香酸ヒドロキシプロピルエステル及びメチルエステル、ベンジルアルコールのような防腐剤；例えば亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤；並びに例えばＥＤＴＡのような安定化剤であり得る。
【００７８】
好ましい実施形態では、懸濁液として本発明の医薬組成物を配合する場合、本発明の医薬組成物の硬化を防ぐ増粘剤、又は沈殿の再懸濁性を確保する界面活性剤及び高分子電解質、及び／又は例えばＥＤＴＡのような錯体形成剤が添加される。活性成分の様々なポリマーとの錯体を得ることも可能である。かかるポリマーの例は、ポリエチレングリコール、ポリスチロール、カルボキシメチルセルロース、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）又はポリエチレングリコールソルビタン（正：sorbitan）脂肪酸エステルである。特定の実施形態では、分散剤を更なる補助剤として添加することができる。凍結乾燥物（lyophilisates）の生成のために、マンニット、デキストラン、サッカロース、ヒトアルブミン、ラクトース、ＰＶＰ又は多様なゼラチンのようなスカフォールド形成剤（scaffolding agents）を使用することができる。
【００７９】
更なる態様では、本発明は、がん、高血糖症及び糖尿病を含むがそれらに限定されない代謝性疾患、肥満症、高血圧症、高コレステロール血症、アレルギー、喘息、アルツハイマー病、並びにウイルス、細菌及び真菌により引き起こされる疾患を含むがそれらに限定されない感染病からなる群から選択される疾患の治療又は予防に使用される、本発明の抗体若しくはその断片、又は医薬組成物を提供する。好ましくはウイルスによって引き起こされる前記疾患は、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ライノウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、西ナイルウイルス、デングウイルス、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ、水痘帯状疱疹ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ボルナ病ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ワクシニアウイルス、ロタウイルス、センダイウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヘンドラウイルス、ニパーウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサウイルスからなる群から選択されるウイルスによって引き起こされる。
【００８０】
或る特定の量の本発明による抗体、その断片及び医薬組成物、例えば患者の身体表面１ｍ２当たり５ｍｇ〜４００ｍｇ、より好ましくは１０ｍｇ〜３７５ｍｇ、最も好ましくは２０ｍｇ〜１００ｍｇの抗体又はその断片が疾患の治療に好ましい。しかしながら、疾患の重症度、疾患の種類、及び治療対象の各患者、例えば患者の全身健康状態等に応じて、様々な用量の本発明による医薬組成物が治療効果を発揮するのに要求されることが理解される。既知で十分に特性化された抗体が本発明による脂質とコンジュゲートする場合、本発明による改質抗体を、元々の非改質抗体で推奨される投薬量よりも１／３〜２／３と低い投薬量で投与するのが好ましい。適切な用量の決定は、担当医の裁量によるものである。
【００８１】
本発明の様々な修正形態及び変更形態は本発明の範囲から逸脱することなく当業者にとって明らかであろう。本発明は具体的な好ましい実施形態に関連して説明しているが、特許請求の範囲に係る本発明はかかる具体的な実施形態に過度に限定されるものではないとする。実際、関連分野の当業者にとって明らかである本発明を実施するための記載の態様の様々な修正は本発明に包含されるものと意図される。
【実施例】
【００８２】
実施例１．脂質と連結した抗体の合成
自然発生的なアミノ酸を含む抗体及び自然発生的ではないアミノ酸を含む抗体を作製する方法は当該技術分野で既知である。合成法又は微生物法を使用することもできる。抗体に導入された遊離システインにより、本発明による脂質又はリンカーとのコンジュゲート能が与えられる。ほとんどの抗体がシステインを欠いており、鎖間及び鎖内のジスルフィド結合に関わるものが抑えられるため、チオール反応性化学も抗体の誘導体化に非常に便利である。一部の人（authors）によって、抗体における不対システインの構築、並びに標的療法のためのビオチン及び細胞毒性薬物の位置選択的なコンジュゲーションのためのそれらの使用が可能であることが示されている（３１、３２、４３、７０、７４）。チオール反応性化学の例としては、コレステロールとのコンジュゲーションを、抗体におけるブロモアセチルコレステロール誘導体と遊離システイン残基との反応によって達成することができる。非常に便利で、以下の実施例で利用されているが、チオール反応性化学は、抗体において選択された場所で脂質を付着させる唯一可能な方法として採用されるものではない。
【００８３】
実施例２．コレステロールで誘導体化した抗体又はその誘導体の合成のための一般的スキーム
コレステロール部分を、抗体におけるシステイン残基のチオール基とのチオエーテル連結を介して抗体に付着させる。Zeng et al, Vaccine, 2001, 19, 3843-3852に記載のように、コンジュゲートをブロモアセチル基（コレステロール上の）と遊離チオール（抗体上の）との間の化学選択的反応を介して調製する。
【化４】
2013534528.tif 000011
【００８４】
代替的に、コンジュゲートをマレイミド基（コレステロール上の）と遊離チオール（抗体上の）との間の反応を介して調製する。
【化５】
2013534528.tif 000012
【００８５】
ブロモアセチル基又はマレイミド基を保有する所要のコレステロール誘導体を、実施例に記載のように、又は市販の化合物を使用することにより若しくは既知の方法によりそれと類似した方法によって作製することができる。コレステロールの誘導体は市販されているか、又は市販の材料から既知の方法によって作製することができる。
【００８６】
実施例３．ブロモアセチル−コレステロールの合成
【化６】
2013534528.tif 000013
１００ｍｇのコレステロールと４０ｍｇのブロモ酢酸との混合物（１．１当量）を１０ｍＬの無水ジクロロメタン中に溶解した。それから、４４μｌ（１．１当量）のＤＩＰＣ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド）及び１．５ｍｇ（０．０５当量）のＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノピリジン）を添加した。この溶液を室温で４８時間撹拌した状態にし、溶媒系としてｎ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（１０／１）の混合物を使用するＴＬＣによって分析した。溶媒を蒸発させ、反応生成物をｎ−ヘキサン／ジクロロメタン（１／１）においてシリカゲルフラッシュクロマトグラフィによって精製した。この生成物を含有する画分をプールし、蒸発させた後、水／アセトニトリル（２０／８０）中で凍結乾燥した。精製した生成物をＮＭＲによって分析した。収率：７３％。
【００８７】
実施例４．ブロモアセチル−ＰＥＧ４−コレステロールの合成
【化７】
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【００８８】
４．１  コレスタ−５−エン−３−イル−２，２−ジメチル−４−オキソ−３，８，１１，１４，１７−ペンタオキサ−５−アザイコサン−２０−オエート（１）：Ｎ−ｔ−ｂｏｃ−アミド−ｄＰＥＧ４（商標）酸（１ｇ、２．７ｍｍｏｌ、製品番号１０２２０、Quanta BioDesign, Ltd.）をコレステロール（０．９９ｇ、２．７ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２溶液４０ｍＬに添加し、その後Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（０．４３ｍＬ、３．２ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノ−ピリジン（１６ｍｇ、５％）を添加した。混合物を室温で一晩撹拌し、溶媒を真空下で蒸発させた。粗物質をＥｔＯＡｃに溶解し、１ＮのＨＣｌ、飽和ＮＨ４Ｃｌ及びブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過して濃縮した。粗物質を石油エーテル中、２５％〜５０％の勾配のＥｔＯＡｃでシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィ（BIOTAGE）によって精製し、無色の（incolor）油として１．４８ｇの所望の化合物を得た（収率７５％）。
【００８９】
４．２  コレスタ−５−エン−３−イル−１−ブロモ−２−オキソ−６，９，１２，１５−テトラオキサ−３−アザオクタデカン−１８−オエート（２）：トリフルオロ酢酸（２ｍＬ、２６ｍｍｏｌ）を化合物１（１．４８ｇ、２ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２溶液１０ｍｌに添加し、混合物を室温で３時間撹拌した。全ての揮発性物質を真空下で除去し、粗物質を凍結乾燥して、無色の油を得て、これを６０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中に溶解した。ブロモ酢酸無水物（０．６２ｇ、２．４ｍｍｏｌ）を添加し、その後Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．６５ｍＬ、３．７ｍｍｏｌ）を添加し、その混合物を室温で３時間撹拌した。溶媒を真空下で除去し、粗物質を石油エーテル中、５０％〜９０％の勾配のＥｔＯＡｃでシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィ（BIOTAGE）によって精製し、２段階で７４％の収率で無色の油として１．１ｇの所望の化合物を得た。
【００９０】
実施例５．ブロモアセチル−ＰＥＧ１２−コレステロールの合成
【化８】
2013534528.tif 000015
【００９１】
５．１  コレスタ−５−エン−３−イル−２，２−ジメチル−４−オキソ−３，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５，３８，４１−トリデカオキサ−５−アザテトラテトラコンタン−４４−オエート（３）：
アミン−ｄＰＥＧ１２（商標）酸（１．６５ｇ、２．７ｍｍｏｌ、製品番号１０２８７、QuantaBioDesign, Ltd.）を１５ｍＬのジクロロメタン中に溶解し、Ｂｏｃ無水物（０．７ｇ、３．２ｍｍｏｌ）を添加し、その後トリエチルアミン（０．７５ｍｌ、５．４ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を室温で２時間撹拌した後、溶媒を減圧下で蒸発させた。
【００９２】
粗Ｎ−Ｂｏｃアミド−ｄＰＥＧ１２（商標）酸をコレステロール（１．２４ｇ、３．２ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２溶液５５ｍＬに添加し、その後Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（０．６２ｍＬ、４ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノ−ピリジン（１６ｍｇ、５％）を添加した。この混合物を室温で４時間撹拌し、溶媒を真空下で蒸発させた。粗物質をジクロロメタン中、２％〜５％の勾配のＭｅＯＨでシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィ（BIOTAGE）によって精製し、無色の油として１．５７ｇの所望の化合物を得た（２段階で収率５５％）。
【００９３】
５．２  コレスタ−５−エン−３−イル−１−ブロモ−２−オキソ−６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６，３９−ドデカオキサ−３−アザドテトラコンタン−４２−オエート（４）：
トリフルオロ酢酸（１．７ｍＬ、２２ｍｍｏｌ）を化合物３（１．５７ｇ、１．５ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２溶液８．５ｍｌに添加し、出発物質が消失するまでこの混合物を室温で３時間撹拌した。揮発物質を全て真空下で除去し、粗物質を凍結乾燥し、無色の油を得て、これを４５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中に溶解した。ブロモ酢酸無水物（０．４８ｇ、１．８ｍｍｏｌ）を添加し、その後Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．５２ｍＬ、３ｍｍｏｌ）を添加し、その混合物を室温で４時間撹拌した。溶媒を真空下で除去し、粗物質をジクロロメタン中、２％〜４％の勾配のＭｅＯＨでシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィ（BIOTAGE）によって精製し、無色の油として１．１１ｇの所望の化合物を得た（２段階で収率６７％）。
【００９４】
実施例６．コレステロールと連結した抗体の合成
抗体をブロモアセチル−コレステロールと抗体との間のコンジュゲーションにより調製する。コレステロール誘導体を１０：１のモル比で室温で３時間〜１２時間、抗体とともにインキュベートする。コンジュゲーション前にジスルフィド結合に関与しない抗体のチオール基の反応性を確保するために、抗体を強力でない（mild）還元剤、例えばトリス−２−カルボキシエチル−ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ）又は遊離システインで処理する。コレステロール−抗体生成物をＨｉＴｒａｐ  Ｓカラム（GE Helthcare Biosciences）で精製し、余分な試薬を除去する。コンジュゲートした抗体のバッファーを５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７）に交換し（buffer-exchanged）、３０ｋＤａの分子量カットオフのスピンフィルターでおよそ２０ｍｇ／ｍＬまで濃縮する。代替的には、コレステロールで誘導体化した抗体を、当該技術分野で既知のように、タンパク質Ａアガロースカラム又はタンパク質Ｇアガロースカラムによって精製することができる。
【００９５】
実施例７．ＰＥＧ４−コレステロールとコンジュゲートした抗体の合成
抗体をブロモアセチル−ＰＥＧ４−コレステロールと抗体との間のコンジュゲーションにより調製する。ＰＥＧ４−コレステロール誘導体を１０：１のモル比で室温で３時間〜１２時間、抗体とともにインキュベートする。コンジュゲーション前にジスルフィド結合に関与しない抗体のチオール基の反応性を確保するために、抗体を強力でない還元剤、例えばトリス−２−カルボキシエチル−ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ）又は遊離システインで処理する。
【００９６】
コレステロール−抗体生成物をＨｉＴｒａｐ  Ｓカラム（GE Helthcare Biosciences）で精製し、余分な試薬を除去する。コンジュゲートした抗体のバッファーを５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７）に交換し、３０ｋＤａの分子量カットオフのスピンフィルターでおよそ２０ｍｇ／ｍＬまで濃縮する。代替的には、コレステロールで誘導体化した抗体を、当該技術分野で既知のように、タンパク質Ａアガロースカラム又はタンパク質Ｇアガロースカラムによって精製することができる。
【００９７】
実施例８．ＰＥＧ１２−コレステロールとコンジュゲートした抗体の合成
抗体をブロモアセチル−ＰＥＧ１２−コレステロールと抗体との間のコンジュゲーションにより調製する。ＰＥＧ１２−コレステロール誘導体を１０：１のモル比で室温で３時間〜１２時間、抗体とともにインキュベートする。コンジュゲーション前にジスルフィド結合に関与しない抗体のチオール基の反応性を確保するために、抗体を強力でない還元剤、例えばトリス−２−カルボキシエチル−ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ）又は遊離システインで処理する。
【００９８】
コレステロール−抗体生成物をＨｉＴｒａｐ  Ｓカラム（GE Helthcare Biosciences）で精製し、余分な試薬を除去する。コンジュゲートした抗体のバッファーを５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７）に交換し、３０ｋＤａの分子量カットオフのスピンフィルターでおよそ２０ｍｇ／ｍＬまで濃縮する。代替的には、コレステロールで誘導体化した抗体を、当該技術分野で既知のように、タンパク質Ａアガロースカラム又はタンパク質Ｇアガロースカラムによって精製することができる。
【００９９】
実施例９．抗体内の好ましいコンジュゲーション場所の選択
例えば反応性システインの導入に関する多くの可能性のある場所の中で、好ましくはコンジュゲーションのために、コンジュゲートした脂質部分と標的膜の脂質ラフトとの相互作用を可能にする抗体のアミノ酸を選ぶが、その抗体はそのタンパク質エピトープに特異的に結合する能力を損なわない。
【０１００】
以下において、既知の抗ウイルス抗体との本発明によるコレステロールコンジュゲーションの例が数多く与えられる。予期せぬことに、全ての抗体について、軽鎖の特定の場所、軽鎖の１９番目又は２０番目の残基及び２１番目又は２２番目の残基はコレステロールへの付着の代替的な最適部位を表す。これらの位置はVoynov et al.（Voynov, V., N. Chennamsetty,V. Kayser, H. J. Wallny, B. Helk, and B. L. Trout. 2010. Design and applicationof antibody cysteine variants. Bioconjug Chem 21:385-92）の定義ではクラスＩ変異体であり、すなわちこれらにより、改変システインで限定的に標識される小さいフルオロフォアとのコンジュゲートが得られ、コンジュゲーション後でも、単量体状態及び安定状態が維持される。いずれかの残基でのコレステロールのコンジュゲーションにより、薬学的特性が優れ、抗ウイルス力が大幅に改善された抗体が得られる。
【０１０１】
１．ＨＩＶ  ＭＡＢ  Ｄ５のコレステロール誘導体
図１はｍＡｂ  Ｄ５とそのペプチドエピトープとの複合体の結晶構造における軽鎖のＴｈｒ２０及びＴｈｒ２２の位置を示す（Ｔｈｒ２０及びＴｈｒ２２は球体として表す）。複合体は、現在認められているモデル（Luftig, M. A., et al., 2006; Structural basis for HIV-1neutralization by a gp41 fusion intermediate-directed antibody. Nat Struct MolBiol 13:740-7）に従ってウイルス膜に対して配向され、どのようにして抗原結合を損なうことなく、コレステロール基を膜と結合させることができるかを明らかにしている。最適な抗ウイルス活性は、システインとコレステロールとの間のリンカーの長さを５０Å〜１５０Åの範囲に選択することによって達成される。
【０１０２】
２．ＨＩＶ  ＭＡＢ  ２Ｆ５のコレステロール誘導体
図２はｍＡｂ  ２Ｆ５とそのペプチドエピトープとの複合体の結晶構造における軽鎖のＴｈｒ２０及びＴｈｒ２２の位置を示す（Ｔｈｒ２０及びＴｈｒ２２は球体として表す）。複合体は、現在認められているモデルに従って（Ofek, G., et al., 2010; Relationship between Antibody 2F5Neutralization of HIV-1 and Hydrophobicity of Its Heavy Chain ThirdComplementarity-Determining Region. J Virol 84:2955-2962、及びOfek, G., et al., 2004; Structure and mechanistic analysis of theanti-human immunodeficiency virus type 1 antibody 2F5 in complex with its gp41 epitope.J Virol 78:10724-37に従って）ウイルス膜に対して配向され、どのようにして抗原結合を損なうことなく、コレステロール基を膜と結合させることができるかを明らかにしている。最適な抗ウイルス活性は、システインとコレステロールとの間のリンカーの長さを５０Å〜１００Åの範囲に選択することによって達成される。
【０１０３】
３．ＨＩＶ  ＭＡＢ  ４Ｅ１０のコレステロール誘導体
図３はｍＡｂ  ４Ｆ１０とそのペプチドエピトープとの複合体の結晶構造における軽鎖のＴｈｒ２０及びＳｅｒ２２の位置を示す（Ｔｈｒ２０及びＳｅｒ２２は球体として表す）。複合体は、現在認められているモデル（Cardoso, R. M. F., et al., 2005; Broadly Neutralizing Anti-HIVAntibody 4E10 Recognizes a Helical Conformation of a Highly ConservedFusion-Associated Motif in gp41. Immunity 22:163-173）に従ってウイルス膜に対して配向され、どのようにして抗原結合を損なうことなく、コレステロール基を膜と結合させることができるかを明らかにしている。最適な抗ウイルス活性は、システインとコレステロールとの間のリンカーの長さを５０Å〜１００Åの範囲に選択することによって達成される。
【０１０４】
４．ＨＩＶ  ＭＡＢ  ＶＲＣ０１のコレステロール誘導体
図４はｍＡｂ  ＶＲＣ０１とｇｐ１２０との複合体の結晶構造における軽鎖のＩｌｅ２０及びＳｅｒ２２の位置を示す（Ｉｌｅ２０及びＳｅｒ２２は球体として表す）。複合体は、現在認められているモデル（Zhu, T., et al., 2010; Structural Basis for Broad and PotentNeutralization of HIV-1 by Antibody VRC01. Science July 2010, DOI:10.1126/science.1192819）に従ってウイルス膜に対して配向され、どのようにして抗原結合を損なうことなく、コレステロール基を膜と結合させることができるかを明らかにしている。最適な抗ウイルス活性は、システインとコレステロールとの間のリンカーの長さを５０Å〜１５０Åの範囲に選択することによって達成される。
【０１０５】
５．インフルエンザＭＡＢ  ＣＲ６２６１のコレステロール誘導体
図５はｍＡｂ  ＣＲ６２６１とインフルエンザ血球凝集素との複合体の結晶構造における軽鎖のＴｈｒ１９及びＳｅｒ２１の位置を示す３（Ｔｈｒ１９及びＳｅｒ２１は球体として表す）。複合体は、現在認められているモデル（Ekiert, D. C., et al., 2009; Antibody recognition of a highlyconserved influenza virus epitope, Science, 324:246-51）に従ってウイルス膜に対して配向され、どのようにして抗原結合を損なうことなく、コレステロール基を膜と結合させることができるかを明らかにしている。最適な抗ウイルス活性は、システインとコレステロールとの間のリンカーの長さを５０Å〜１００Åの範囲に選択することによって達成される。
【０１０６】
６．リツキシマブのコレステロール誘導体
図６は、Du, J. et al., 2007; Structural basis forrecognition of CD20 by therapeutic antibody Rituximab, J. Biol. Chem.,282:15073-15080で報告されるように、ＣＤ２０の細胞外ドメインでのリツキシマブＦａｂとそのエピトープに対応するペプチドとの複合体の結晶構造における軽鎖のＴｈｒ２０及びＳｅｒ２２の位置を示す。複合体は、現在認められているモデルに従ってウイルス膜に対して配向され、どのようにして抗原結合を損なうことなく、コレステロール基を膜と結合させることができるかを明らかにしている。最適な抗ウイルス活性は、システインとコレステロールとの間のリンカーの長さを５０Å〜１００Åの範囲に選択することによって達成される。
【０１０７】
７．トラスツズマブのコレステロール誘導体
図７は、Cho H.-S. et al., 2004; Structure of the extracellularregion of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab, Nature, 421:756-60で報告されるように、トラスツズマブＦａｂとＨＥＲ２の細胞外ドメインの膜近傍領域との複合体の結晶構造における軽鎖のＴｈｒ２０及びＴｈｒ２２の位置を示す。最適な抗ウイルス活性は、システインとコレステロールとの間のリンカーの長さを５０Å〜１００Åの範囲に選択することによって達成される。
【０１０８】
８．セツキシマブのコレステロール誘導体
図８は、Li, S. et al., 2005; Structural basis forinhibition of the Epidermal Growth Factor receptor by cetuximab, Cancer Cell,7:301-311で報告されるように、セツキシマブＦａｂとＥＧＦＲの細胞外ドメインとの複合体の結晶構造における軽鎖のＴｈｒ２０及びＴｈｒ２２の位置を示す。トラスツズマブ−ＨＥＲ２複合体の構造（図７）との比較によって、異なる長さのリンカーに対する要求が示される。最適な抗ウイルス活性は、システインとコレステロールとの間のリンカーの長さを５０Å〜１５０Åの範囲に選択することによって達成される。
【０１０９】
実施例１０．ＨＩＶ  ｍＡｂ  Ｄ５のコレステロール誘導体
図１はｍＡｂ  Ｄ５とそのペプチドエピトープとの複合体の結晶構造における軽鎖のＴｈｒ２０及びＴｈｒ２２の位置を示す（Ｔｈｒ２０及びＴｈｒ２２は球体として表す）。複合体は、現在認められているモデルに従ってウイルス膜に対して配向され、どのようにして抗原結合を損なうことなく、コレステロール基を膜と結合させることができるかを明らかにしている。最適な抗ウイルス活性は、システインとコレステロールとの間のリンカーの長さを５０Å〜１５０Åの範囲に選択することによって達成される。
【０１１０】
ウイルス膜に近いｇｐ４１の膜近位外部領域（ＭＰＥＲ）と結合する２Ｆ５及び４Ｅ１０のｍＡｂとは異なり、ｍＡｂ  Ｄ５はｇｐ４１のＨＲ１ドメインにおける疎水性ポケットと結合し、そのため標的細胞膜により近付くことになる。
【０１１１】
図９は、ＭＡＢ  Ｄ５のＦａｂドメインにおけるシステインアミノ酸の好ましい最適化された場所を示す。システインアミノ酸は本発明による脂質又は脂質を含むリンカーとの共有結合的な連結に対して理想的な位置付けをしている。（＊）は導入されたシステインアミノ酸を示している。
【０１１２】
実施例１１．ＨＩＶ  ｍＡｂ  ２Ｆ５のコレステロール誘導体
図２はｍＡｂ  ２Ｆ５とそのペプチドエピトープとの複合体の結晶構造における軽鎖のＴｈｒ２０及びＴｈｒ２２の位置を示す（Ofek, G., et al., 2004; Structure and mechanistic analysis of theanti-human immunodeficiency virus type 1 antibody 2F5 in complex with its gp41 epitope,J Virol, 78:10724-37を参照されたい）（Ｔｈｒ２０及びＴｈｒ２２は球体として表す）。複合体は、現在認められているモデルに従ってウイルス膜に対して配向され、どのようにして抗原結合を損なうことなく、コレステロール基を膜と結合させることができるかを明らかにしている。最適な抗ウイルス活性は、システインとコレステロールとの間のリンカーの長さを５０Å〜１００Åの範囲に選択することによって達成される。
【０１１３】
コレステロールが天然の２Ｆ５  ＣＤＲ３ループの膜ラフト結合活性を変える（substitute）という概念を調べるために、ペプチドエピトープに対する結合効率をそのままに維持するが、抗ウイルス活性を完全に排除する、ループでの２つの突然変異（Ｌｅｕ１００ＡＳｅｒ及びＰｈｅ１００ＢＳｅｒ）も、Ofek et al., J. Virol. 84 (2010) 2955-2962に記載のように導入する。
【０１１４】
図１０は、ｍＡｂ  ２Ｆ５のＦａｂドメインにおけるシステインアミノ酸の好ましい最適化された場所を示す。システインアミノ酸は本発明による脂質又は脂質を含むリンカーとの共有結合的な連結に対して理想的な位置付けをしている。抗ウイルス活性のないＦａｂ  ２Ｆ５の二重突然変異体も示している。（＊）は導入されたシステインアミノ酸を示している。
【０１１５】
実施例１２．抗体の抗ウイルス活性
抗体の抗ウイルス活性を、ＨＩＶに関しては、Miller et al., Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A. 102 (2005) 14759-14764、及びIngallinellaet al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (2009) 5801-5806に記載のように、及びインフルエンザウイルスに関してはThrosby et al., PLoS ONE 3 (2008) e3942に記載のように評価した。
【０１１６】
実施例１３．コレステロールと抗ＥｒｂＢ２  ｍＡｂトラスツズマブとのコンジュゲーション
抗ＥｒｂＢ２  ｍＡｂトラスツズマブ（ハーセプチン（商標））の重鎖及び軽鎖をコードする発現プラスミドを生成した。２０位でのＴｈｒのＣｙｓへの置換を特徴とする、抗ＥｒｂＢ２  ｍＡｂトラスツズマブ（トラスツズマブＣ２０、ハーセプチンＣ２０）の突然変異型軽鎖をコードする発現プラスミドも生成した。野生型ｍＡｂ及びＴ２０→ＣトラスツズマブＣ２０突然変異型ｍＡｂを、リポフェクタミン（Invitrogen）を用いたＨＥＫ−２９３  ＥＢＮＡ細胞への重鎖及び軽鎖の発現プラスミドの一時的な同時トランスフェクションにより作製し、全ヒトＩｇＧをＨｉ−Ｔｒａｐタンパク質Ａカラム（Amersham Biosciences）を用いて培養培地から精製した。
【０１１７】
８ｍｇ（１．１５ｍｌ）のトラスツズマブＣ２０  ｍＡｂ（７ｍｇ／ｍｌすなわち４５μＭ）を、２００倍過剰（９ｍＭ）のＬ−システイン（ＴＥ（ｐＨ８．０）中、９０ｍＭのＬ−システインストック１２８μｌ）と、Ｎ２雰囲気中、３７℃で４時間インキュベートし、その後ＴＥ（ｐＨ８．０）にバッファーを交換した。６ｍｇの濃度を低減させた（reduced）トラスツズマブＣ２０（３．１５ｍｇ／ｍｌすなわち２０μＭ）を１０倍過剰のコレステロール−ＰＥＰＧ１２−マレイミド（以下の構造を参照されたい）（ＴＥ（ｐＨ８．０）に溶解して最終的には２００μＭ）と、室温で４５分間インキュベートし、その後ＰＢＳにバッファーを交換した。
【化９】
2013534528.tif 000016
【０１１８】
コレステロール部分とｍＡｂとのコンジュゲーションを、液体クロマトグラフィ−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により確認した。分析の前に、ｍＡｂを６Ｍの塩酸グアニジン、０．１Ｍの塩化ＴＲＩＳバッファー（ｐＨ８．４）中で５ｍＭのＤＴＴ又は１％  β−メルカプトエタノール（９０分、３７℃）で還元し、１２．５ｍＭのヨードアセトアミド又は５ｍＭの４−ビニルピリジンでアルキル化した（９０分、室温、暗所で）。それから、２．５μｇ〜５μｇの還元及びアルキル化されたｍＡｂをＣ８  ＲＰカラム（ＡＣＥ  ２．１×５０ｍｍ、３００Å、５μｍ）上に注入し、５％メタノール、０．０８％ギ酸及び０．０２％  ＴＦＡを含有するＨ２Ｏ中でアセトニトリルを勾配させて溶出を行った。サンプルをＱ−ＴｏＦ  ＭＳハイブリッド系に直接溶出し、分析を行った。
【０１１９】
図２１は、コレステロール−ＰＥＰＧ１２−マレイミドとの反応後のトラスツズマブＣ２０  ｍＡｂの軽鎖の再構成ＭＳスペクトルを示す図である。質量＝２３４３６及び質量＝２４５８９の２つのピークは、還元及びアルキル化後の非コンジュゲート軽鎖及びコンジュゲート軽鎖にそれぞれ対応する（質量の差異の算出値：１１５１．５、実測値：１１５３）。図２１に示される結果によって、トラスツズマブＣ２０  ｍＡｂの５０％超がコレステロールによって誘導体化されたことが確認された。
【０１２０】
実施例１４．コレステロールとコンジュゲートした抗ＥｒｂＢ２  ｍＡｂトラスツズマブと、生存細胞上に提示される標的抗原との結合
非酵素的な解離溶液（Sigma）中で回収された、ＥｒｂＢ２陽性ＳＫＢＲ３細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３０）及びＥｒｂＢ２陰性Ａ４３１対照細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５５５）を洗浄し、Ｕ底マイクロタイター（正：microtiter）プレート（１つのウェル当たり２×１０５細胞）に移した。３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳによるブロッキングの後、細胞をＥＬＩＳＡバッファー（ＰＢＳ／３％ＢＳＡ）中で実施例１３に記載の１００ｎＭの精製抗体とインキュベートし、室温で２時間結合させた。遠心分離及び上清の除去の後、沈殿した細胞を２００μｌのＰＢＳで２回洗浄し、１００μｌのＥＬＩＳＡバッファー中で再懸濁して、実施例１３のトラスツズマブＣ２０（ハーセプチンＣ２０）抗体及びトラスツズマブＣ２０−ＣＨＯＬ（ＰＥＧ１２−コレステロール部分を含有するハーセプチンＣ２０−ＣＨＯＬ）抗体の検出のためにペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体（Sigma）とインキュベートした。１時間後、プレートを遠心分離し、ＰＢＳで洗浄して、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Sigma）と反応させた。結合の値を４５０ｎｍでの吸光度から決定し、少なくとも３つの決定値の平均として報告した（標準偏差  ５％未満）。
【０１２１】
図２１に報告される結果によって、コンジュゲートしていない抗体に対してのトラスツズマブＣ２０−ＣＨＯＬ（ハーセプチンＣ２０−ＣＨＯＬ）の結合効率の増大が示される。ＥｒｂＢ２陰性Ａ４３１対照細胞では結合は観察されなかった。
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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