(57)【要約】被験体にデスレセプターアゴニストを投与することを含んでなる、癌を有する被験体を処置する方法が提供される。ＤＲ５アゴニストに応答性の乳癌細胞をスクリーニングする方法もまた提供される。さらに、ＤＤＸ３のＮ末端ＣＡＲＤ、Ｎ末端ＣＡＲＤを欠損するＤＤＸ３、および８０ｋＤａバキュロウイルスＩＡＰリピート（ＢＩＲ）へ選択的に結合する抗体が提供される。上記方法はまた、乳癌細胞において８０ｋＤａバキュロウイルスＩＡＰリピートを含むＩＡＰタンパク質を検出することを含んでなる。
2013510171.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を有する被験体を処置する方法であって、
（ａ）基底細胞様遺伝子型癌であり、かつＨＥＲ２非増幅である乳癌を有する被験体を選択すること；および
（ｂ）該被験体にデスレセプターアゴニストを投与することを含んでなる方法。
【請求項２】
デスレセプターアゴニストがＤＲ５アゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＤＲ５アゴニストが抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
乳癌がエストロゲン受容体陰性（ＥＲ陰性）、プロゲステロン受容体陰性（ＰＲ陰性）、またはＥＲ陰性およびＰＲ陰性の両方である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
乳癌が、コントロールに比較して、ＤＲ５／ＤＤＸ３／ｃＩＡＰ１複合体レベルの減少を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＤＲ５／ＤＤＸ３／ｃＩＡＰ１複合体レベルが全細胞ライセートアッセイを用いて検出される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
乳癌が機能的なＮ末端ＣＡＲＤを欠損するＤＤＸ３を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
機能的なＮ末端ＣＡＲＤを欠損するＤＤＸ３が、切断型、または欠失型のＮ末端ＣＡＲＤを有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
乳癌がデスレセプターアゴニストの非存在下で化学療法剤に対して抵抗性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
乳癌がアドリアマイシンに対して抵抗性である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
乳癌がパクリタキセルに対して抵抗性である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
乳癌がシスプラチンまたはカルボプラチンに対して抵抗性である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
被験体に化学療法剤を投与することをさらに含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
化学療法剤が３週間ごとに静脈内投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
デスレセプターアゴニストが３週間、２週間、または１週間の間隔で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
癌を有する被験体を処置する方法であって、
（ａ）管腔細胞、ＨＥＲ２増幅、または基底細胞様遺伝子型からなる群より選択される特性の１以上を有する乳癌を有する被験体を選択すること；
（ｂ）該被験体にＩＡＰ阻害剤を投与すること；および
（ｃ）該被験体にデスレセプターアゴニストを投与することを含んでなる方法。
【請求項１７】
ＩＡＰ阻害剤がＡＴ−４０６である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
被験体に化学療法剤を投与することをさらに含んでなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
化学療法剤が、アドリアマイシン、パクリタキセル、アブラキサン、シスプラチン、およびカルボプラチンからなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
デスレセプターアゴニストが３週間、２週間、または１週間の間隔で投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
化学療法剤が３週間ごとに静脈内投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
ＤＲ５アゴニストに応答性の乳癌細胞をスクリーニングする方法であって、
（ａ）癌細胞の基底細胞様表現型を検出すること；
（ｂ）ＨＥＲ２非増幅である癌細胞を検出すること；および
（ｃ）癌細胞のＤＲ５／ＤＤＸ３／ｃＩＡＰ１複合体のレベルの、コントロールに比較した減少を検出することを含んでなる方法。
【請求項２３】
癌細胞がエストロゲン受容体陰性（ＥＲ陰性）、プロゲステロン受容体陰性（ＰＲ陰性）、またはＥＲ陰性およびＰＲ陰性の両方であるかを決定することをさらに含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＤＲ５アゴニストが抗体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
乳癌細胞が乳房生検に由来する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
ＤＲ５アゴニストに応答性のトリプルネガティブ乳癌細胞をスクリーニングする方法であって、細胞のＤＲ５／ＤＤＸ３／ｃＩＡＰ１複合体のレベルを検出すること、およびそれをコントロールと比較することを含んでなり、細胞の複合体のレベルがコントロールに比較して低いときに、乳癌細胞がＤＲ５アゴニストに対して応答性であることが示される方法。
【請求項２７】
ＤＲ５アゴニストに応答性のトリプルネガティブ乳癌細胞をスクリーニングする方法であって、乳癌細胞内にＮ末端ＣＡＲＤを欠損するＤＤＸ３を検出することを含んでなり、Ｎ末端ＣＡＲＤを欠損するＤＤＸ３によって、乳癌細胞がＤＲ５アゴニストに対して応答性であることを示す方法。
【請求項２８】
ＤＲ５アゴニストに応答性のトリプルネガティブ乳癌細胞をスクリーニングする方法であって、乳癌細胞内に８０ｋＤａバキュロウイルスＩＡＰリピートを含むＩＡＰタンパク質を検出することを含んでなり、８０ｋＤａバキュロウイルスＩＡＰリピートによって、乳癌細胞がＤＲ５アゴニストに対して応答性であることを示す方法。
【請求項２９】
ＤＤＸ３のＮ末端ＣＡＲＤへ選択的に結合する抗体。
【請求項３０】
Ｎ末端ＣＡＲＤを欠損するＤＤＸ３へ選択的に結合する抗体。
【請求項３１】
８０ｋＤａバキュロウイルスＩＡＰリピート（ＢＩＲ）を含むＩＡＰタンパク質に結合する抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる、２００９年１１月５日に出願された、米国仮出願第６１／２５８，２７４号の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）は、乳癌患者の大きな割合（約２０〜２５％）を占める。ＴＮＢＣは、ＨＥＲ２、エストロゲン受容体（ＥＲ）、およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）を有さないことが特徴である。ＴＮＢＣの予後は悪く、今日までに治療法を標的としたアプローチは見出されていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
癌を有する被験体を処置する方法が提供される。該方法は、基底細胞様遺伝子型癌であり、かつＨＥＲ２非増幅である乳癌を有する被験体を選択すること、および該被験体にデスレセプターアゴニストを投与することを含んでなる。
【０００４】
該方法は任意に、管腔細胞、ＨＥＲ２増幅、または基底細胞様遺伝子型からなる群より選択される特性の１以上を有する乳癌を有する被験体を選択すること；該被験体にＩＡＰ阻害剤を投与すること；および該被験体にデスレセプターアゴニストを投与することを含んでなる。
【０００５】
ＤＲ５アゴニストに応答性の乳癌細胞をスクリーニングする方法もまた提供される。該方法は、癌細胞の基底細胞様表現型を検出すること；ＨＥＲ２非増幅である癌細胞を検出すること；および癌細胞のＤＲ５／ＤＤＸ３／ｃＩＡＰ１複合体のレベルの、コントロールに比較した減少を検出することを含んでなる。
【０００６】
ＤＲ５アゴニストに応答性のトリプルネガティブ乳癌細胞をスクリーニングする方法もまた提供される。該方法は任意に、細胞のＤＲ５／ＤＤＸ３／ｃＩＡＰ１複合体のレベルを検出すること、およびそれをコントロールと比較することを含んでなる。細胞の複合体のレベルがコントロールに比較して低いときに、応答性が示される。
【０００７】
該方法は任意に、乳癌細胞においてＮ末端カスパーゼ結合動員ドメイン（ｃａｓｐａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｄｏｍａｉｎ：ＣＡＲＤ）を欠損するＤＤＸ３を検出することを含んでなる。Ｎ末端ＣＡＲＤを欠損するＤＤＸ３は、乳癌細胞がＤＲ５アゴニストに応答性であることを示す。
【０００８】
該方法は任意に、乳癌細胞において８０ｋＤａバキュロウイルスＩＡＰリピートを含むＩＡＰタンパク質を検出することを含んでなる。８０ｋＤａバキュロウイルスＩＡＰリピートは、乳癌細胞がＤＲ５アゴニストに非応答性であることを示す。
【０００９】
さらに、ＤＤＸ３のＮ末端ＣＡＲＤへ選択的に結合する抗体が提供される。Ｎ末端ＣＡＲＤを欠損するＤＤＸ３へ選択的に結合する抗体もまた提供される。８０ｋＤａバキュロウイルスＩＡＰリピート（ＢＩＲ）を含むＩＡＰタンパク質へ選択的に結合する抗体もまた提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、トリプルネガティブ乳癌細胞株が、ＴＲＡ−８を用いた処理によってアポトーシスを起こすことを明示するグラフを示した図である。トリプルネガティブ乳癌細胞株をＴＲＡ−８によって２４時間ｉｎ  ｖｉｔｒｏで処理した。ＡＴＰレベルを測定するためのルシフェラーゼに基づくアッセイを用いて、細胞生存率を評価した。値を、未処理のコントロール細胞に対する平均および標準偏差（ｎ＝６、反復）として表す。
【図２Ａ】図２Ａおよび２Ｂは、ＴＲＡ−８と化学療法剤との併用処理が、基底細胞Ａ型および基底細胞Ｂ型の乳癌細胞株に対して相加的または相乗的な効果を導くことを示した図である。図２Ａは、ＴＲＡ−８抗体と化学療法剤（シスプラチン、カルボプラチン、およびアドリアマイシン）の併用によって処理したトリプルネガティブ基底細胞Ｂ型ＳＵＭ１５９乳癌細胞における、アポトーシスの増大を明示するグラフを示す。図２Ｂは、ＴＲＡ−８抗体と化学療法剤（シスプラチン、カルボプラチン、およびアドリアマイシン）の併用によって処理したトリプルネガティブ上皮基底細胞Ａ型ＨＣＣ１９３７乳癌細胞における、アポトーシスの増大を示すグラフを示す。ＳＵＭ１５９およびＨＣＣ１９３７乳癌細胞は、化学療法剤で２４時間前処理した後、ＴＲＡ−８抗体でさらに２４時間処理した。細胞を、ＴＲＡ−８抗体単独、化学療法化合物単独、またはＴＲＡ−８と化学療法化合物の併用によって処理した。ＡＴＰレベルの測定によって細胞生存率を評価した。値を平均および標準偏差（ｎ＝４、反復）として表す。
【図２Ｂ】図２Ａおよび２Ｂは、ＴＲＡ−８と化学療法剤との併用処理が、基底細胞Ａ型および基底細胞Ｂ型の乳癌細胞株に対して相加的または相乗的な効果を導くことを示した図である。図２Ａは、ＴＲＡ−８抗体と化学療法剤（シスプラチン、カルボプラチン、およびアドリアマイシン）の併用によって処理したトリプルネガティブ基底細胞Ｂ型ＳＵＭ１５９乳癌細胞における、アポトーシスの増大を明示するグラフを示す。図２Ｂは、ＴＲＡ−８抗体と化学療法剤（シスプラチン、カルボプラチン、およびアドリアマイシン）の併用によって処理したトリプルネガティブ上皮基底細胞Ａ型ＨＣＣ１９３７乳癌細胞における、アポトーシスの増大を示すグラフを示す。ＳＵＭ１５９およびＨＣＣ１９３７乳癌細胞は、化学療法剤で２４時間前処理した後、ＴＲＡ−８抗体でさらに２４時間処理した。細胞を、ＴＲＡ−８抗体単独、化学療法化合物単独、またはＴＲＡ−８と化学療法化合物の併用によって処理した。ＡＴＰレベルの測定によって細胞生存率を評価した。値を平均および標準偏差（ｎ＝４、反復）として表す。
【図３】図３は、ＤＲ５／ＤＤＸ３／ＩＡＰアポトーシス抑制性複合体のモデルを示した図である。
【図４Ａ】図４は、ｓｉＲＮＡを介したＤＤＸ３のノックダウンが、ＤＲ５を介したアポトーシスに対する抵抗性を逆転させることを示した図である。図４Ａは、ＤＤＸ３  ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡによって処理した細胞における、ＤＤＸ３タンパク質発現の減少を明示するウェスタンブロット像を示す。図４Ｂは、ＴＲＡ−８抗体で処理され、ＤＤＸ３の発現が減少した細胞におけるアポトーシスの増大を明示するグラフを示す。
【図４Ｂ】図４は、ｓｉＲＮＡを介したＤＤＸ３のノックダウンが、ＤＲ５を介したアポトーシスに対する抵抗性を逆転させることを示した図である。図４Ａは、ＤＤＸ３  ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡによって処理した細胞における、ＤＤＸ３タンパク質発現の減少を明示するウェスタンブロット像を示す。図４Ｂは、ＴＲＡ−８抗体で処理され、ＤＤＸ３の発現が減少した細胞におけるアポトーシスの増大を明示するグラフを示す。
【図５Ａ】図５は、ＤＲ５結合型ＤＤＸ３がｃＩＡＰ１を動員し、ＤＤＸ３  ＣＡＲＤを通じてアポトーシスを阻害することを示した図である。図５Ａは、完全長ＤＤＸ３が、ＤＲ５へのｃＩＡＰ１の動員を通じてアポトーシスを阻害することを明示するウェスタンブロット像を示す。ＣＡＲＤ−切断型ＤＤＸ３（ＤＮ）を発現する細胞は、ＦＡＤＤの動員によって示されるように、ＴＲＡ−８を用いた処理により、デスドメイン誘導シグナル複合体（Ｄｅａｔｈ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｃｏｍｐｌｅｘ：ＤＩＳＣ）機能を回復した。図５Ｂは、ＣＡＲＤを欠損するＤＤＸ３を発現するＤＲ５抵抗性の腫瘍細胞が、ＴＲＡ−８誘導性のアポトーシスに対してさらに感受性になることを明示するグラフを示す。
【図５Ｂ】図５は、ＤＲ５結合型ＤＤＸ３がｃＩＡＰ１を動員し、ＤＤＸ３  ＣＡＲＤを通じてアポトーシスを阻害することを示した図である。図５Ａは、完全長ＤＤＸ３が、ＤＲ５へのｃＩＡＰ１の動員を通じてアポトーシスを阻害することを明示するウェスタンブロット像を示す。ＣＡＲＤ−切断型ＤＤＸ３（ＤＮ）を発現する細胞は、ＦＡＤＤの動員によって示されるように、ＴＲＡ−８を用いた処理により、デスドメイン誘導シグナル複合体（Ｄｅａｔｈ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｃｏｍｐｌｅｘ：ＤＩＳＣ）機能を回復した。図５Ｂは、ＣＡＲＤを欠損するＤＤＸ３を発現するＤＲ５抵抗性の腫瘍細胞が、ＴＲＡ−８誘導性のアポトーシスに対してさらに感受性になることを明示するグラフを示す。
【図６Ａ】図６は、ＤＲ５／ＤＤＸ３／ｃＩＡＰ１複合体が、ＴＲＡ−８感受性および抵抗性細胞において定量できることを示した図である。図６Ａは、ＴＲＡ−８感受性のＭＤＡ２３１ＰおよびＵＬ−３ＣＰ細胞株において、ＤＲ５結合型ＤＤＸ３およびｃＩＡＰ１が、ＴＲＡ−８抵抗性のＭＤＡ２３１ＲおよびＵＬ−３ＣＲ細胞株よりも低いことを明示するグラフを示す。図６Ｂは、ＴＲＡ−８抵抗性の細胞株が、ＴＲＡ−８感受性細胞株の一群に比較して、より高いレベルのＤＲ５結合型ＤＤＸ３およびｃＩＡＰ１タンパク質を発現することを明示するヒストグラムを示す。
【図６Ｂ】図６は、ＤＲ５／ＤＤＸ３／ｃＩＡＰ１複合体が、ＴＲＡ−８感受性および抵抗性細胞において定量できることを示した図である。図６Ａは、ＴＲＡ−８感受性のＭＤＡ２３１ＰおよびＵＬ−３ＣＰ細胞株において、ＤＲ５結合型ＤＤＸ３およびｃＩＡＰ１が、ＴＲＡ−８抵抗性のＭＤＡ２３１ＲおよびＵＬ−３ＣＲ細胞株よりも低いことを明示するグラフを示す。図６Ｂは、ＴＲＡ−８抵抗性の細胞株が、ＴＲＡ−８感受性細胞株の一群に比較して、より高いレベルのＤＲ５結合型ＤＤＸ３およびｃＩＡＰ１タンパク質を発現することを明示するヒストグラムを示す。
【図７】図７は、トリプルネガティブおよび非トリプルネガティブ乳癌細胞株におけるＤＲ５／ＤＤＸ３／ｃＩＡＰ１複合体の相違を示した図である。図７Ａは、ＤＲ５結合型ＤＤＸ３およびｃＩＡＰ１が、トリプルネガティブ乳癌細胞株（ＳＵＭ１４９、ＳＵＭ１５９、ＳＵＭ１０２、２ＬＭＰ、ＨＣＣ３８、ＢＴ２０）において比較的低いことを明示するグラフを示す。図７Ｂは、幾つかのトリプルネガティブ乳癌細胞株において、ＤＲ５と共免疫沈降するＤＤＸ３の分子量が、Ｎ末端ＣＡＲＤを欠損しているために、非トリプルネガティブ乳癌細胞におけるものよりも小さいことを明示するウェスタンブロット像を示す。
【図８Ａ】図８は、バキュロウイルスＩＡＰリピート（ＢＩＲ）を認識する新規抗体（３Ｈ４）の特性を示した図である。図８Ａは、３Ｈ４の、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、ＸＩＡＰ、およびサバイビンに対する結合特性を示す。図８Ｂは、３Ｈ４によって認識される共有エピトープの配列を示す。上の配列はｃＩＡＰ１の２番目のＢＩＲドメイン（配列番号：３１）；中央の配列はｃＩＡＰ２の２番目のＢＩＲドメイン（配列番号：３２）；下の配列はＸＩＡＰの２番目のＢＩＲドメイン（配列番号：３３）を示す。図８Ｃは、３Ｈ４による、ヒト膵癌細胞株のパネルに由来する全細胞ライセートのウェスタンブロット分析を示す。レーン１：ＭＩＡｃａｐａ；２：ＢＸＰＣ３；３：Ｐａｎｃ１；４：Ｐａｎｃ２．０３；５  Ｓ２０１３；６：Ｓ２ＶＰ１０。
【図８Ｂ】図８は、バキュロウイルスＩＡＰリピート（ＢＩＲ）を認識する新規抗体（３Ｈ４）の特性を示した図である。図８Ａは、３Ｈ４の、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、ＸＩＡＰ、およびサバイビンに対する結合特性を示す。図８Ｂは、３Ｈ４によって認識される共有エピトープの配列を示す。上の配列はｃＩＡＰ１の２番目のＢＩＲドメイン（配列番号：３１）；中央の配列はｃＩＡＰ２の２番目のＢＩＲドメイン（配列番号：３２）；下の配列はＸＩＡＰの２番目のＢＩＲドメイン（配列番号：３３）を示す。図８Ｃは、３Ｈ４による、ヒト膵癌細胞株のパネルに由来する全細胞ライセートのウェスタンブロット分析を示す。レーン１：ＭＩＡｃａｐａ；２：ＢＸＰＣ３；３：Ｐａｎｃ１；４：Ｐａｎｃ２．０３；５  Ｓ２０１３；６：Ｓ２ＶＰ１０。
【図８Ｃ】図８は、バキュロウイルスＩＡＰリピート（ＢＩＲ）を認識する新規抗体（３Ｈ４）の特性を示した図である。図８Ａは、３Ｈ４の、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、ＸＩＡＰ、およびサバイビンに対する結合特性を示す。図８Ｂは、３Ｈ４によって認識される共有エピトープの配列を示す。上の配列はｃＩＡＰ１の２番目のＢＩＲドメイン（配列番号：３１）；中央の配列はｃＩＡＰ２の２番目のＢＩＲドメイン（配列番号：３２）；下の配列はＸＩＡＰの２番目のＢＩＲドメイン（配列番号：３３）を示す。図８Ｃは、３Ｈ４による、ヒト膵癌細胞株のパネルに由来する全細胞ライセートのウェスタンブロット分析を示す。レーン１：ＭＩＡｃａｐａ；２：ＢＸＰＣ３；３：Ｐａｎｃ１；４：Ｐａｎｃ２．０３；５  Ｓ２０１３；６：Ｓ２ＶＰ１０。
【図９Ａ】図９は、ＤＤＸ３／ＩＡＰ複合体におけるＩＡＰの発現低下を示した図である。図９Ａは、ＡＴ−４０６とＴＲＡ−８の併用処理が、ＤＲ５によるアポトーシスに対して抵抗性の膵細胞におけるＩＡＰタンパク質の発現を低下させることを示す。２つのヒト膵癌細胞株、Ｓ２０１３（左パネル）およびＳ２ＶＰ１０（右パネル）を、コントロール培地（レーン１）、または１０００ｎｇ／ｍｌのＴＲＡ−８（レーン２）、または１０μＭのＡＴ４０６（レーン３）、または両方（レーン４）によって一晩処理した。全細胞ライセート中のＩＡＰタンパク質を、３Ｈ４抗体を用いたウェスタンブロットによって分析した。図９Ｂは、ＤＤＸ３複合体中のＩＡＰタンパク質を示す。上記の処理細胞由来の細胞ライセートを、抗ＤＤＸ３抗体（クローン３Ｅ４）によって免疫沈降した。沈降したタンパク質のウェスタンブロットを行い、３Ｈ４抗体によってＩＡＰタンパク質を検出した。
【図９Ｂ】図９は、ＤＤＸ３／ＩＡＰ複合体におけるＩＡＰの発現低下を示した図である。図９Ａは、ＡＴ−４０６とＴＲＡ−８の併用処理が、ＤＲ５によるアポトーシスに対して抵抗性の膵細胞におけるＩＡＰタンパク質の発現を低下させることを示す。２つのヒト膵癌細胞株、Ｓ２０１３（左パネル）およびＳ２ＶＰ１０（右パネル）を、コントロール培地（レーン１）、または１０００ｎｇ／ｍｌのＴＲＡ−８（レーン２）、または１０μＭのＡＴ４０６（レーン３）、または両方（レーン４）によって一晩処理した。全細胞ライセート中のＩＡＰタンパク質を、３Ｈ４抗体を用いたウェスタンブロットによって分析した。図９Ｂは、ＤＤＸ３複合体中のＩＡＰタンパク質を示す。上記の処理細胞由来の細胞ライセートを、抗ＤＤＸ３抗体（クローン３Ｅ４）によって免疫沈降した。沈降したタンパク質のウェスタンブロットを行い、３Ｈ４抗体によってＩＡＰタンパク質を検出した。
【図１０】図１０は、乳癌細胞株における、ＩＡＰに対するＡＴ−４０６のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの効果を示した図である。ヒト乳癌細胞株（ＭＢ４３６および２ＬＭＰ（図１０Ａ）、ＳＵＭ１５９およびＳＵＭ１４９（図１０Ｂ）、ＢＴ４７４およびＭＢ４６８（図１０Ｃ）を、コントロール培地（レーン１）、または１０００ｎｇ／ｍｌのＴＲＡ−８（レーン２）、または１０μＭのＡＴ４０６（レーン３）、または両方（レーン４）によって一晩処理した。処理細胞由来の細胞ライセートを、抗ＤＤＸ３抗体（クローン３Ｅ４）によって免疫沈降した。沈降したタンパク質のウェスタンブロットを行い、３Ｈ４抗体によってＩＡＰタンパク質を検出した。
【図１１】図１１は、ＴＲＡ−８とＡＴ４０６の併用処理によって生じた細胞傷害性を示した図である。細胞をＡＴ−４０６で１時間処理した後、ＴＲＡ−８とＡＴ−４０６によって２４時間処理した。ＴＲＡ−８添加後２４時間目に、ＡＴＰレベルの測定によって細胞生存率を決定した。
【図１２】図１２は、ＡＴ−４０６が、アドリアマイシンとの併用によってＴＲＡ−８のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を増強することを示した図である。ＴＲＡ−８、ＡＴ−４０６、およびアドリアマイシンは、単一薬剤として、または併用して使用した。アドリアマイシンはＡＴ−４０６の２４時間前に添加し、ＴＲＡ−８はＡＴ−４０６の１時間後に添加した。ＴＲＡ−８添加後２４時間目に、ＡＴＰレベルの測定によって細胞生存率を決定した。
【図１３Ａ】図１３は、胸腺欠損ヌードマウスにおける同所性の基底細胞Ｂの異種移植に対する、ＴＲＡ−８単独、またはアブラキサンもしくはアドリアマイシンのｉｎ  ｖｉｖｏでの効力を示した図である。ＳＵＭ１５９（図１３Ａ）または２ＬＭＰ（図１３Ｂ）細胞を乳房脂肪パッド内に移植し、腫瘍が十分に定着した１４日後に処置を開始した。矢印は抗体が投与された間隔を示す（ｎ＝９〜１０マウス／群）。
【図１３Ｂ】図１３は、胸腺欠損ヌードマウスにおける同所性の基底細胞Ｂの異種移植に対する、ＴＲＡ−８単独、またはアブラキサンもしくはアドリアマイシンのｉｎ  ｖｉｖｏでの効力を示した図である。ＳＵＭ１５９（図１３Ａ）または２ＬＭＰ（図１３Ｂ）細胞を乳房脂肪パッド内に移植し、腫瘍が十分に定着した１４日後に処置を開始した。矢印は抗体が投与された間隔を示す（ｎ＝９〜１０マウス／群）。
【図１４】図１４は、胸腺欠損ヌードマウスにおける、２ＬＭＰによる同所性の基底細胞Ｂの異種移植に対する、ＡＴ−４０６と併用したＴＲＡ−８またはアブラキサンのｉｎ  ｖｉｖｏでの効力を示した図である。２ＬＭＰ細胞を乳房脂肪パッド内に移植し、腫瘍が十分に定着した１０日後に処置を開始した。バーは抗体が投与された間隔を示す（ｎ＝１０マウス／群）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
癌を有する被験体を処置する方法が提供される。該方法は、基底細胞様遺伝子型癌であり、かつＨＥＲ２増幅である乳癌を有する被験体を選択すること、および該被験体にデスレセプターアゴニストを投与することを含んでなる。任意に、デスレセプターアゴニストはＤＲ５アゴニストである。任意に、ＤＲ５アゴニストは抗体である。任意に、デスレセプターアゴニストは３週間、２週間、または１週間の間隔で投与される。
【００１２】
該方法は例えば、管腔細胞、ＨＥＲ２増幅、または基底細胞様遺伝子型からなる群より選択される特性の１以上を有する乳癌を有する被験体を選択すること；該被験体にＩＡＰ阻害剤を投与すること；および該被験体にデスレセプターアゴニストを投与することを含んでなってよい。任意に、ＩＡＰ阻害剤はＡＴ−４０６である。
【００１３】
該方法は任意に、患者に化学療法剤を投与することをさらに含んでなる。化学療法剤は任意に、３週間ごとに静脈内投与される。化学療法剤は任意に、アドリアマイシン、パクリタキセル、アブラキサン、シスプラチン、およびカルボプラチンからなる群より選択される。
【００１４】
乳癌は、例えばエストロゲン受容体陰性（ＥＲ陰性）、プロゲステロン受容体陰性（ＰＲ陰性）、またはＥＲ陰性およびＰＲ陰性の両方であってよい。任意に、乳癌はコントロールに比較して、ＤＲ５／ＤＤＸ３／ｃＩＡＰ１複合体レベルの減少を示す。任意に、乳癌は機能的なＮ末端ＣＡＲＤを欠損するＤＤＸ３を含んでなる。例えば、機能的なＮ末端ＣＡＲＤを欠損するＤＤＸ３は、切断型、または欠失型のＮ末端ＣＡＲＤを有する。あるいは、機能的なＣＡＲＤを欠損するＤＤＸ３は、Ｎ末端ＣＡＲＤ内に変異を有する。
【００１５】
任意に、乳癌は、デスレセプターアゴニストの非存在下で化学療法剤に対して抵抗性である。乳癌は例えば、アドリアマイシンに対して抵抗性であってよい。任意に、乳癌はパクリタキセルに対して抵抗性である。任意に、乳癌はシスプラチンまたはカルボプラチンに対して抵抗性である。
【００１６】
デスレセプターを介した腫瘍細胞のアポトーシスの誘導は、癌療法に対する有望なアプローチである。全てではないとしても、ほとんどの治療法において、幾つかの標的細胞は抵抗性である。例としてＴＲＡ−８は、肝細胞への細胞傷害性をもたず（Ｉｃｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ７：９５４−９６０  （２００１））、動物モデルにおいて強力な抗癌効力を示し（Ｂｕｃｈｓｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ９：３７３１−３７４１  （２００３））、かつ非ヒト霊長類の毒性試験において安全性を示した、ヒト癌細胞のアポトーシスを誘導する独特なアゴニストモノクローナル抗ＤＲ５抗体である。従って、本明細書ではＴＲＡ−８を例として用いるが、デスレセプター（例えばＤＲ４またはＤＲ５）の活性化を通してアポトーシスを誘導するその他の薬剤もまた、本明細書で教示する方法において用いることができる。ＴＲＡ−８ならびにそのヒト化型およびヒトバージョンは、抗癌療法として臨床開発されているが、幾つかの腫瘍細胞株は、合理的なＤＲ５発現量にもかかわらず、ＴＲＡ−８を介するアポトーシスに対して抵抗性である。これらの観察により、抵抗性は、受容体の発現よりもむしろ、ＤＲ５によって惹起されるシグナル伝達機構に関連することが示唆される。確実に、ＤＲ５を介したアポトーシスは一般的な化学療法剤によって有意に増大され得る（Ｏｈｔｓｕｋａ  ａｎｄ  Ｚｈｏｕ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７：２９２９４−２９３０３  （２００２）；  Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：２０３４−２０４４  （２００３））。特定の細胞株はＴＲＡ−８を介したアポトーシスに抵抗性であるが、その他の細胞株はＴＲＡ−８を介したアポトーシスに感受性である。本明細書では、基底細胞様の表現型を有することが知られている乳癌のクラスが、ＴＲＡ−８を介したアポトーシスに感受性であることが同定された。本明細書に示すように、基底細胞様乳癌細胞株は、ＤＲ５／ＤＤＸ３／ｃＩＡＰ複合体にＴＲＡ−８抵抗性の癌細胞株を形成する変化を含む。
【００１７】
乳癌は、遺伝子発現、細胞形態、および処置に対する応答に基づいて、少なくとも５つの異なる分子サブタイプに分けることができる。乳癌は最初に、２つの大きな群であるエストロゲン受容体（ＥＲ）陽性およびＥＲ陰性に分けることができる。これらの２つの群は、生物学的および臨床的に重要な、追加の異なる亜群へさらに細分することができる。ＥＲ陽性腫瘍は、エストロゲン受容体、ＥＲ応答性遺伝子、および管腔上皮細胞のその他のタンパク質を発現する。従って、ＥＲ陽性腫瘍は「管腔腫瘍」であり、これは特徴的な遺伝子発現パターンによって、管腔Ａおよび管腔Ｂ腫瘍にさらに分類することができる。
【００１８】
ＥＲ陰性腫瘍は、３つの群：ＨＥＲ−２陽性、基底細胞様腫瘍、および正常乳腺様腫瘍（ｎｏｒｍａｌ  ｂｒｅａｓｔ−ｌｉｋｅ  ｔｕｍｏｒｓ）にさらに分類することができる。ＨＥＲ−２陽性腫瘍は、第１７染色体上の位置１７ｑ２１の、ＨＥＲ２アンプリコンに位置する、ＨＥＲ−２および増殖因子受容体結合タンパク質７（ＧＲＢ７）を含む遺伝子を高レベルで発現する。これらはまた、高度に活性化された核内因子（ＮＦ）−κＢも有し、かつ転写因子ＧＡＴＡ４を高レベルで発現するが、ＥＲおよびＧＡＴＡ３を発現していない。正常乳腺様腫瘍（ｎｏｒｍａｌ  ｂｒｅａｓｔ−ｌｉｋｅ  ｔｕｍｏｒｓ）は正常乳腺組織サンプルに類似しており、脂肪細胞およびその他の非上皮細胞型に特徴的な多くの遺伝子を比較的高レベルで発現するが、管腔上皮細胞遺伝子の発現レベルは低い。
【００１９】
基底細胞様腫瘍は、基底細胞に特徴的な遺伝子を発現する。基底細胞様遺伝子産物は、癌の特徴である、細胞増殖、アポトーシス、細胞遊走、および／または浸潤の抑制に関わる。基底細胞様腫瘍は、ＥＲ、ＥＲ応答性遺伝子、および管腔上皮細胞に特徴的なその他の遺伝子を発現しないか、または低レベルで発現する。基底細胞様腫瘍についての完全な総説は、Ｒａｋｈａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２６：２５６８−８１  （２００８）を参照されたい。
【００２０】
「トリプルネガティブ乳癌」は、エストロゲン受容体（ＥＲ）陰性、プロゲステロン受容体（ＰＲ）陰性、およびＨＥＲ２陰性の乳癌を意味する。トリプルネガティブ乳癌は、ＥＲ、ＰＲ、またはＨＥＲ２を発現しない。
【００２１】
「ＨＥＲ２非増幅」は、第１７染色体上の位置１７ｑ１２−ｑ２１に位置するＨＥＲ２アンプリコンを増幅しないことを意味する。ＨＥＲ２アンプリコンの増幅は、Ｍａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．  Ｒｅｖ．  ３３：６４−７７  （２００７）に記載される、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイを用いて決定することができる。ＨＥＲ２の増幅はＨＥＲ２陽性の癌に見られるが、ＨＥＲ２は基底細胞様表現型の乳癌では増幅されない。
【００２２】
「デスレセプター」は、リガンドがいったん結合すると、細胞のアポトーシスを誘導する受容体を意味する。デスレセプターには、例えば、デスドメイン（例えばＴＮＦＲＩ、Ｆａｓ、ＤＲ３、４、５、６）を有する腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーメンバーが含まれる。
【００２３】
例えばＤＲ５を通したシグナル伝達は、ＤＲ５を介したアポトーシスの制御における重要な機構である。ＴＮＦＲスーパーファミリーのデスレセプターに共通する特色は、それらが全て、保存された「デスドメイン」を細胞質側末端に有することである（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｓ．  ２６：３２３−３３６  （２００２））。ＤＲ５を介したアポトーシスがデスドメインにおいて惹起されることは十分に確立されている。ＴＲＡＩＬまたはアゴニスト抗ＤＲ５抗体による細胞表面のＤＲ５の架橋は、ＤＲ５のオリゴマー化を導き、その直後にＤＲ５のデスドメインへＦＡＤＤが動員される（Ｂｏｄｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２：２４１−２４３  （２０００）；  Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７：８２１−８３０  （１９９７）；  Ｋｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５：２５０６５−２５０６８  （２０００）；  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７：８３１−８３６  （１９９７）；  Ｓｐｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２：５９９−６０９  （２０００））。ＦＡＤＤが会合したデスドメインは、イニシエータであるプロカスパーゼ８および／またはプロカスパーゼ１０をさらに動員し、同種親和性のＤＤ相互作用を通してデスドメイン誘導性シグナル複合体（Ｄｅａｔｈ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｃｏｍｐｌｅｘ：ＤＩＳＣ）を形成する（Ｋｒａｍｍｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：７８９−７９５  （２０００））。活性化されたカスパーゼ８および１０は、カスパーゼ３を直接活性化し得るか、またはＢＨ３を含むタンパク質であるＢｉｄを切断し、チトクロムＣの放出およびカスパーゼ９の活性化を通してミトコンドリア依存性のアポトーシス経路を活性化し得る（Ｄｅｓａｇｈｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎｏｕ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １０：３６９−３７７  （２０００）；  Ｓｃａｆｆｉｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １７：１６７５−１６８７  （１９９８））。デスドメイン複合体の形成後、カスパーゼ、ＮＦ−κＢ、およびＪＮＫ／ｐ３８のような幾つかのシグナル伝達経路が活性化される。これらのシグナル伝達経路の活性化により、Ｂｃｌ−２およびＩＡＰファミリーのタンパク質を通して、デスレセプターを介したアポトーシスが導かれる。
【００２４】
「アゴニスト」は、細胞上の受容体（例えばデスレセプター）に結合することができ、内在性のリガンドの結合によって典型的に生じる同一の反応または活性（例えばアポトーシス）を開始する物質（分子、薬物、タンパク質など）を意味する。本方法のアゴニストはデスレセプターリガンドであってよい。従って、アゴニストはＴＮＦ、Ｆａｓリガンド、またはＴＲＡＩＬであってよい。さらに、アゴニストはデスレセプター結合ドメインを含んでなるこれらのリガンドの断片であってもよく、該断片は結合してデスレセプターを活性化することができる。さらに、アゴニストはデスレセプター結合ドメインを含んでなる融合タンパク質であってもよく、該融合タンパク質は結合してデスレセプターを活性化することができる。さらに、アゴニストはＴＮＦ、Ｆａｓ、またはＴＲＡＩＬに対して少なくとも８５％の相同性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドであってもよく、このホモログは結合してデスレセプターを活性化することができる。
【００２５】
さらに、アゴニストはデスレセプターに結合するアポトーシス誘導性抗体であってもよい。「抗体」はモノクローナル、ポリクローナル、キメラ、単鎖、ヒト化、完全ヒト抗体、またはそれらのＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）２断片のいずれであってもよい。「アポトーシス誘導性抗体」は、本明細書に提供する方法を用いた活性化の前または後に、プログラムされた細胞死を引き起こす抗体を意味する。従って本方法のアゴニストは、Ｆａｓ、ＴＮＦＲ１、またはＴＲＡＩＬデスレセプターに特異的な抗体であってよく、該抗体はデスレセプターを活性化する。アゴニストは、ＤＲ４またはＤＲ５に特異的な抗体であってよい。アゴニストは、同一のエピトープ特異性を有するか、またはＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１４２８（例えばＴＲＡ−８抗体）、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１７４１（例えばＴＲＡ−１抗体）、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１７４２（例えばＴＲＡ−１０抗体）のマウス−マウスハイブリドーマから分泌されるＤＲ５抗体であってよい。アゴニストは、同一のエピトープ特異性を有するか、またはＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−３７９８（例えば２Ｅ１２抗体）のハイブリドーマから分泌される抗体であってよい。
【００２６】
本方法の抗体が標的とするＴＲＡＩＬ受容体は、ＤＲ４またはＤＲ５であってよい。このような受容体については、それらにおいて教示される受容体についての全体が参照により本明細書に取り込まれる、特許出願公開公報である国際公開第９９／０３９９２号、国際公開第９８／３５９８６号、国際公開第９８／４１６２９号、国際公開第９８／３２８５６号、国際公開第００／６６１５６号、国際公開第９８／４６６４２号、国際公開第９８／５１７３号、国際公開第９９／０２６５３号、国際公開第９９／０９１６５号、国際公開第９９／１１７９１号、国際公開第９９／１２９６３号、および米国特許第６，３１３，２６９号の全てに記載される。これらの受容体に特異的なモノクローナル抗体は、当該技術分野において公知の方法を用いて産生することができる。例えば、その両方におけるこれらの方法についての全体が参照により本明細書に取り込まれる、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：４９５−４９７  （１９７５）、およびＥｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６：５１１−５１９  （１９７６）を参照されたい。また、その全体が参照により本明細書に取り込まれる、特許出願公開公報である国際公開第０１／８３５６０号において教示される方法も参照されたい。
【００２７】
「ＣＡＲＤ」は、カスパーゼ結合動員ドメイン（ｃａｓｐａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｄｏｍａｉｎ）を意味する。ＣＡＲＤを含むタンパク質はデスレセプターへの結合能によって特徴付けられ、結合は任意にデスドメインの外側であり、前記デスレセプターのデスドメインによってアポトーシスの活性化を調節する。ＤＤＸ３は、ＣＡＲＤを含むことによって特徴付けられるタンパク質ファミリーの代表的なメンバーである。
【００２８】
ＣＡＲＤを含むタンパク質は、細胞死の重要な制御因子として確立されてきた。ＣＡＲＤは、特定のカスパーゼのプロドメインのＮ末端に見出される、保存されたアルファヘリックス束から構成される。ＣＡＲＤはまた、様々なその他のタンパク質にも見出され得る。デスドメインタンパク質のように、ＣＡＲＤは、ＣＡＲＤ／ＣＡＲＤ相互作用を通してタンパク質の連絡を可能にする、同型のタンパク質相互作用モチーフとして機能する。ＣＡＲＤを有するタンパク質は、アポトーシス促進性または抗アポトーシス性のいずれかであってよい。アポトーシス促進性のＣＡＲＤドメインタンパク質には、アポトーシスの開始に重要な役割を果たす、カスパーゼ２、４、および９のような特定のカスパーゼならびにＡｐａｆ１が含まれる。代表的な抗アポトーシス性ＣＡＲＤタンパク質には、カスパーゼのＣＡＲＤと相互作用し、それらのバキュロウイルスＩＡＰリピート（ＢＩＲ）ドメインを通じてカスパーゼの活性化を阻害する、ｃＩＡＰ１およびｃＩＡＰ２が含まれる。このタンパク質ファミリーの機能についての多くの態様は、癌の処置における新規な薬物標的としての、それらの潜在的な有用性に向けられている。幾つかのＣＡＲＤ含有タンパク質は、調節不全の場合に腫瘍形成を促進し、化学療法に対する腫瘍の抵抗性に顕著に寄与する、保存された細胞死機構の決定的な構成要素である。幾つかの癌では不活性化されている、アポトーシス促進性タンパク質のＡｐａｆ１は、ミトコンドリア誘導性アポトーシスに不可欠のＣＡＲＤタンパク質である。ＩＡＰファミリータンパク質のようなその他の抗アポトーシス性ＣＡＲＤタンパク質が、細胞死の刺激から腫瘍を保護し、特定の型の癌に過剰発現することが示されている。従って、ＣＡＲＤタンパク質を活性化または阻害する治療薬は、従来の化学療法と併用する際に、化学療法剤の増感剤として、またはアポトーシスの修飾因子として利用することができる。
【００２９】
ＣＡＲＤ含有タンパク質のＣＡＲＤは、ウイルス感染の間にホスト細胞のアポトーシスを抑制するアポトーシス阻害物質（ＩＡＰ）の動員に関与する（Ｃｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６７：２１６８−２１７４  （１９９３））。ＩＡＰファミリーは、成熟カスパーゼと相互作用し、その酵素活性を阻害することによって細胞死に拮抗する。ＸＩＡＰ、ｃ−ＩＡＰ１、ｃ−ＩＡＰ２、およびＭＬ−ＩＡＰ／Ｌｉｖｉｎを含む、８つの異なる哺乳類ＩＡＰが同定されている（例えば、Ａｓｈｈａｂ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ４９５：５６−６０  （２００１）；  Ｋａｓｏｆ  ａｎｄ  Ｇｏｍｅｓ，    Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６：３２３８−３２４６  （２００１）；  Ｖｕｃｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．  １０：１３５９−１３６６  （２０００）を参照）。全てのＩＡＰは、１〜３のバキュロウイルスＩＡＰリピート（ＢＩＲ）ドメインを含み、相同配列を有する。ＢＩＲドメインを通し、ＩＡＰ分子はカスパーゼに結合して直接に阻害する（Ｄｅｖｅｒａｕｘ  ａｎｄ  Ｒｅｅｄ，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １３：２３９−２５２  （１９９９）；  Ｄｅｖｅｒａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３８８：３００−３０４  （１９９７））。ミトコンドリアタンパク質であるＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯは、ＩＡＰに結合して、これに拮抗することができ（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６：２７０５８−２７０６３  （２００１））、ＩＡＰの機能を抑制する（Ｗｉｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｌ．  Ｒｅｓ．  １２：４９１−５００  （２０００））。
【００３０】
ＤＲ５／ＤＤＸ３／ｃＩＡＰ複合体は、基底細胞様表現型の乳癌細胞において、変化させるか、またはレベルを減少させることができる。以下に示すように、ＤＲ５／ＤＤＸ３／ｃＩＡＰ１複合体は、例えばＮ末端ＣＡＲＤを欠損するＤＤＸ３、またはＮ末端ＣＡＲＤに変異を有するＤＤＸ３を含むことによって変化させることができる。機能的なＮ末端ＣＡＲＤを欠損したＤＤＸ３を含む複合体は、一般に、デスレセプターアゴニストを用いた処置によって分離し、ＤＲを介したアポトーシスを可能にする。ＤＤＸ３またはｃＩＡＰの発現レベルが低いことは、乳癌細胞内のＤＲ５／ＤＤＸ３／ｃＩＡＰ複合体のレベルが低いことの一因ともなり得る。複合体のレベルが低い細胞もまた、ＤＲを介したアポトーシスを可能にする、デスレセプターアゴニストによる処置に感受性である。
【００３１】
被験体にデスレセプターアゴニストを投与することを含んでなる、癌を有する被験体を処置する方法が提供される。デスレセプターアゴニストは、例えばＩＡＰ阻害剤と共に投与されてよい。任意に、ＩＡＰ阻害剤はＡＴ４０６である。デスレセプターアゴニストはまた、その他の化学療法剤と併用して投与されてもよい。化学療法剤の例には、アドリアマイシン、ブレオマイシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、コルヒチン類、シクロホスファミド、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン、エトポシド、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、メルファラン、メトトレキサート、マイトマイシン、６−メルカプトプリン、パクリタキセル、テニポシド、６−チオグアニン、ビンクリスチン、およびビンブラスチンが含まれる。化学療法剤のさらなる例は、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  １８ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｂｅｒｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ，  Ｒａｈｗａｙ，  ＮＨ  （２００５）、およびＳｌａｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ，  Ｐｏｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ  （１９８７）に見出される。
【００３２】
癌を有する被験体を処置する方法が提供される。このような方法には、有効量のデスレセプターアゴニスト、ＩＡＰ阻害剤、化学療法剤、またはそれらの組み合わせを投与することが含まれる。任意に、デスレセプターアゴニスト、ＩＡＰ阻害剤、化学療法剤、およびそれらの組み合わせは医薬組成物中に含まれる。
【００３３】
本明細書に提供されるデスレセプターアゴニスト、ＩＡＰ阻害剤、化学療法剤、およびそれらの組み合わせ、ならびに本明細書に記載される、薬剤的に許容される担体を含む組成物が提供される。本明細書に提供される組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの投与に適する。薬剤的に許容される担体は、生物学的にまたはその他により望ましくないものではない物質を意味し、すなわち該物質は望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、または該物質が含まれる医薬組成物のその他の構成要素と有害な方法で相互作用することなく、被験体に投与される。担体は、有効成分の分解が最少となり、かつ被験体における有害な副作用が最少となるように選択される。
【００３４】
適切な担体およびそれらによる製剤については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  ２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｄａｖｉｄ  Ｂ．  Ｔｒｏｙ，  ｅｄ．，  Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  （２００５）に記載される。典型的には、製剤を等張にするため、適切な量の薬剤的に許容される塩が製剤中に使用される。薬剤的に許容される担体の例には、無菌水、生理食塩水、リンゲル液のような緩衝液、およびデキストロース溶液が含まれるが、これらに限定されない。溶液のｐＨは一般に約５〜約８、または約７〜７．５である。その他の担体には、免疫原性ポリペプチドを含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスのような、持続放出製剤が含まれる。マトリックスは形態のあるもの、例えばフィルム、リポソーム、または微粒子の形である。例えば投与経路、および投与される組成物の濃度に依存して、特定の担体がさらに好ましい可能性がある。担体は、デスレセプターアゴニスト、ＩＡＰ阻害剤、化学療法剤、およびそれらの組み合わせを、ヒトまたはその他の被験体に投与するために適したものである。
【００３５】
組成物は、局所性の処置が望まれるかまたは全身性の処置が望まれるかに依存して、および処置される領域に依存して、幾つかの方法によって投与される。組成物は、局所的、経口的、非経口的、静脈内、関節内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、経皮的、肝内、頭蓋内、噴霧／吸入を含む幾つかの投与経路のいずれかを通して、または気管支鏡を通した導入によって投与される。任意に、組成物は経口吸入、経鼻吸入、または鼻腔内粘膜投与によって投与される。吸入薬による組成物の投与は、スプレーもしくは液滴機構による送達を通じて、鼻または口を通すことができる。
【００３６】
非経口投与のための製剤には、無菌の水性または非水性溶液、懸濁液、およびエマルションが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射用有機エステルである。水性担体には、生理食塩水および緩衝液を含む、水、アルコール／水溶液、エマルション、または懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、ラクトリンゲル、または固定油が含まれる。静脈内ビヒクルには、体液および栄養素補液、電解質補液（リンゲルのデキストロースを基にしたようなもの）などが含まれる。例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどのような、保存料ならびにその他の添加物が任意に存在する。
【００３７】
局所投与のための製剤には、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、液滴、坐薬、スプレー、液剤、および散剤が含まれる。従来の医薬担体、水性、粉末、または油性基剤、増粘剤などが任意に必要とされるか、または望ましい。
【００３８】
経口投与のための組成物には、散剤または顆粒、水もしくは非水性溶媒中の懸濁液または溶液、カプセル、サシェ、または錠剤が含まれる。増粘剤、香味料、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が任意に望ましい。
【００３９】
ＤＲ５アゴニストに応答性の乳癌細胞をスクリーニングする方法もまた提供される。該方法は、癌細胞の基底細胞様表現型を検出すること；ＨＥＲ２非増幅である癌細胞を検出すること；および癌細胞のＤＲ５／ＤＤＸ３／ｃＩＡＰ１複合体のレベルの、コントロールに比較した減少を検出することを含んでなる。該方法はさらに、例えば、癌細胞がエストロゲン受容体陰性（ＥＲ陰性）、プロゲステロン受容体陰性（ＰＲ陰性）、またはＥＲ陰性およびＰＲ陰性の両方であると決定することを含んでなってよい。任意に、ＤＲ５アゴニストは抗体である。任意に、乳癌細胞は乳房生検に由来する。
【００４０】
ＤＲ５アゴニストに応答性の乳癌細胞（例えばトリプルネガティブ）をスクリーニングする方法もまた提供される。該方法は、例えば、細胞内のＤＲ５／ＤＤＸ３／ｃＩＡＰ１複合体のレベルを検出すること、およびそれをコントロールと比較することを含んでなってよい。細胞の複合体のレベルがコントロールに比較して低いときに、乳癌細胞がＤＲ５アゴニストに対して応答性であることが示される。該方法は、例えば、乳癌細胞内に機能的なＮ末端ＣＡＲＤを欠損するＤＤＸ３を検出することを含んでなってよい。機能的なＮ末端ＣＡＲＤを欠損するＤＤＸ３は、乳癌細胞がＤＲ５アゴニストに対して応答性であることを示す。該方法は、例えば、乳癌細胞内に８０ｋＤａバキュロウイルスＩＡＰリピート（ＢＩＲ）を含むＩＡＰタンパク質を検出することを含んでなってよい。８０ｋＤａ  ＢＩＲは、乳癌細胞がＤＲ５アゴニストに非応答性であることを示す。
【００４１】
サンプル中のＤＤＸ３、機能的なＮ末端ＣＡＲＤを欠損するＤＤＸ３、および８０ｋＤａ  ＢＩＲを含むＩＡＰタンパク質の発現レベルを決定するために用いることのできるアッセイ技術は、当業者に公知である。このようなアッセイ法には、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、免疫組織化学法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、競合的結合法、ウェスタンブロット分析、およびＥＬＩＳＡ法が含まれる。アッセイにはまた、マイクロアレイ法、遺伝子チップ法、ノーザンブロット法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法、ワンステップＰＣＲ法、およびリアルタイム定量（ｑＲＴ）−ＰＣＲ法からなる群より選択されるアッセイを用いてＲＨＡのレベルを決定することも含まれる。タンパク質またはＲＮＡの発現を決定するための分析技術は公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ  （２００１）を参照されたい。
【００４２】
ＤＲ５／ＤＤＸ３／ｃＩＡＰ複合体のレベルを決定するための技術もまた、当業者に公知である。複合体のレベルを決定するためのアッセイは、免疫沈降法、共免疫沈降法、およびゲルを用いないアプローチ、例えばマススペクトロメトリーまたは共局在アッセイのようなタンパク質相互作用のプロファイリングからなる群より選択されてよい。アッセイは当該技術分野において公知である。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ  （２００１）；  Ｄｉｃｋｓｏｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４６１：７３５−４４  （２００８）、およびＺｉｎｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔａ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．  ４０：１０１−１１  （２００７）を参照されたい。
【００４３】
ＤＤＸ３のＮ末端ＣＡＲＤへ選択的に結合する抗体、Ｎ末端ＣＡＲＤを欠損するか、または機能的なＮ末端ＣＡＲＤを欠損するＤＤＸ３へ選択的に結合する抗体、および８０ｋＤａバキュロウイルスＩＡＰリピートを含むＩＡＰタンパク質に結合する抗体もまた提供される。
【００４４】
本明細書において抗体の語は広い意味で用いられ、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方が含まれる。この語はまた、ヒト抗体および／またはヒト化抗体も指す。ヒトモノクローナル抗体産生のための技術の例には、Ｃｏｌｅらにより（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  ｐ．  ７７  （１９８５））、およびＢｏｅｒｎｅｒらにより（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７（１）：８６−９５  （１９９１））記載されるものが含まれる。ヒト抗体（およびその断片）はまた、ファージディスプレイライブラリーを用いても産生することができる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２７：３８１  （１９９１）；  Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２：５８１  （１９９１））。開示するヒト抗体はまた、トランスジェニック動物を用いても得ることができる。例えば、免疫誘導に応答してヒト抗体の全レパトアを産生できるトランスジェニック、変異マウスについて記載されている（例えばＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：２５５１−５  （１９９３）；  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−８  （１９９３）；  Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７：３３  （１９９３）を参照）。
【００４５】
本明細書で用いられるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の語は、大まかにはペプチド結合によって連結された２以上のアミノ酸を意味する。本明細書では、タンパク質、ペプチド、およびポリペプチドもまた、アミノ酸配列に言及するために互換的に用いられる。本明細書では、ポリペプチドの語は分子を含んでなるアミノ酸の特定のサイズまたは数を示唆するものとしては用いられず、かつ本発明のペプチドは数個まで、またはそれ以上のアミノ酸残基を含んでよいことが認識されなければならない。
【００４６】
全体を通して用いられる被験体は脊椎動物であってよく、さらに詳細には哺乳類（例えばヒト、ウマ、ネコ、イヌ、雌ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ウサギ、ラット、およびモルモット）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、およびその他の動物のいずれであってもよい。この語は特定の年齢または性別を意味しない。従って、成体および新生仔の被験体が、雄性または雌性を問わずに網羅されることが意図される。本明細書で用いられる患者または被験体は互換的に使用されてよく、疾病または疾患（例えば癌）を有する被験体を指してよい。患者または被験体の語には、ヒトおよび獣医学の被験体が含まれる。
【００４７】
本明細書に教示される方法に従い、被験体には有効量のデスレセプターアゴニスト、ＩＡＰ阻害剤、化学療法剤、またはそれらのいずれかの組み合わせが投与される。有効量および有効投与量の語は互換的に用いられる。有効量の語は、望ましい生理的応答を生じさせるために必要ないずれかの量として定義される。デスレセプターアゴニスト、ＩＡＰ阻害剤、化学療法剤、およびそれらの組み合わせを投与するための有効量およびスケジュールは経験的に決定されてよく、このような決定がなされることは当該技術分野における技能の範囲内である。投与のための投与量の範囲は、疾病または疾患の１以上の症状が影響される（例えば減少するかまたは遅延する）、望ましい効果を生むために十分に広い。投与量は、望まれない交差反応、アナフィラキシー反応などのような、実質的に有害な副作用を引き起こすほど多くてはならない。一般に、投与量は年齢、状態、性別、疾病の型、疾病もしくは疾患の程度、投与経路、またはその他の薬物が投与計画に含まれるか否かによって変動する可能性があり、当業者によって決定することができる。投与量は、いずれかの禁忌の事象において、個別の医師によって調節され得る。投与量は変動してよく、１以上の用量投与によって毎日、１日または数日間投与されてよい。任意に、デスレセプターアゴニストは３週間、２週間、または１週間の間隔で投与される。任意に、化学療法剤は３週間ごとに投与される。ガイダンスは、医薬製品の所定の種類のための、適切な投与量についての文献に見出すことができる。
【００４８】
本明細書で用いられる処置、処置する、または処置しているという語は、疾病もしくは状態または疾病もしくは状態の症状の影響を減少させる方法を指す。従って開示される方法において、処置は、確立された疾病もしくは状態または疾病もしくは状態の症状の重症度における１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の減少を指してよい。例えば疾病を処置する方法は、被験体における疾病の１以上の症状が、コントロールに比較して１０％減少した場合、処置であるとみなされる。従って、減少は１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または天然もしくはコントロールレベルに比較した１０％〜１００％のいずれのパーセントの減少であってもよい。処置は、必ずしも疾病、状態、または疾病もしくは状態の症状の治癒または完全な消失を指すものではないことが理解される。
【００４９】
「任意の」または「任意に」は、続いて記載される現象、状況、もしくは物質が、起こり得るか起こり得ないか、または存在し得るか存在し得ないことを意味し、現象、状況、もしくは物質が起こるかまたは存在する場合、およびそれが起こらないかまたは存在しない場合が含まれる。
【００５０】
開示する方法および組成物のために使用できるか、該方法および組成物と併用して使用できるか、該方法および組成物の調製において使用できるか、または該方法および組成物の産物である、物質、組成物、および構成要素が開示される。本明細書ではこれらおよびその他の物質について開示するが、これらの物質の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示される一方で、これらの化合物の様々な個別の、および集合的な組み合わせならびに置換それぞれの特定の参照について明確に開示され得ない場合でも、それぞれは具体的に意図され、本明細書に記載されることが理解される。例えば方法について開示および考察され、幾つかの分子になされ得る、方法を含む幾つかの改変について考察される場合、それぞれの、および全ての方法の組み合わせならびに置換、および可能性のある改変は、特に反する指示がない限り具体的に意図される。同様に、これらのいずれのサブセットまたは組み合わせも具体的に意図され、かつ開示される。この概念は、開示する組成物を用いる方法における工程を含むがこれに限定されない、この開示の全ての態様に適用される。従って、実施できる様々な追加の工程が存在する場合、これら追加の工程のそれぞれは、開示する方法の特定の方法工程または方法工程の組み合わせのいずれによっても実施でき、かつこのような組み合わせまたは組み合わせのサブセットのそれぞれは具体的に意図され、開示されるとみなされなければならないことが理解される。
【００５１】
本明細書に引用される出版物およびそれらに引用される材料は、それらの全体が参照により本明細書に詳細に取り込まれる。
【実施例】
【００５２】
一般法
細胞株、抗体、および試薬
ヒト乳癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）（マナッサス、バージニア州）から購入した。ヒト卵巣癌細胞株であるＵＬ−３Ｃを得た。細胞は、１０％  熱不活化ＦＣＳ、５０μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、および５０Ｕ／ｍＬ  ペニシリンを加えたＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ  １６４０（Ｃｅｌｌｇｒｏ，  Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．，マナッサス、バージニア州）中で維持した。
【００５３】
抗ヒトＤＲ４（クローン：２Ｅ１２）および抗ヒトＤＲ５（クローン：ＴＲＡ−８）モノクローナル抗体については以前に記載されている（Ｉｃｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３；  Ｉｃｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。抗ヒトＤＲ５（クローン：２Ｂ４）は、フローサイトメトリーおよび免疫沈降法のために開発された。組み換え可溶性ＴＲＡＩＬはＡｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（サンディエゴ、カリフォルニア州）から購入した。ポリクローナル抗カスパーゼ３および抗カスパーゼ８抗体は、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（サンディエゴ、カリフォルニア州）から購入した。モノクローナル抗ヒトカスパーゼ２、３、８、９、および１０抗体、ならびにモノクローナル抗ヒトＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂａｘ、ｃＩＡＰ−１、ｃＩＡＰ−２、ＸＩＡＰ、およびサバイビン抗体は調製した。抗ＰＡＲＰ抗体はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．（ベバリー、マサチューセッツ州）から購入した。抗βアクチン抗体はＳｉｇｍａから購入した。抗ＦＡＤＤはＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（レキシントン、ケンタッキー州）から購入した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合の二次的試薬は全てＳｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．（バーミングハム、アラバマ州）から購入した。
【００５４】
活性化カスパーゼ−１、カスパーゼ−２、カスパーゼ−３、カスパーゼ−６、カスパーゼ−７、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９、カスパーゼ−１０はＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ（サンディエゴ、カリフォルニア州）から購入した。蛍光ペプチド誘導体Ａｃ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ＡＭＣ（Ａｃ−ＶＤＶＡＤ−ＡＭＣ、２６００６０Ｍ００１、配列番号：１）、Ａｃ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−アミノ−４−メチルクマリン（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ、２６００３１Ｍ００１、配列番号：２）、およびＡｃ−カルボニル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−７−アミド−４−メチルクマリン（Ｚ−ＩＥＴＤ−ＡＭＣ、２６００４２Ｍ００１、配列番号：３）は、Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；サンディエゴ、カリフォルニア州から購入した。カスパーゼ−２、−３、−８、−１０阻害剤（ＦＭＫＳＰ０１）はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ（ミネアポリス、ミネソタ州）から購入した。
ＴＲＡ−８、２Ｅ１２、およびＴＲＡＩＬを介するアポトーシスに対する腫瘍細胞の感受性についての、細胞傷害性の分析
細胞（ウェルあたり１，０００細胞）を９６ウェルプレートへ、８通りの濃度（１０００ｎｇ／ｍｌからの２倍連続希釈）のＴＲＡ−８、２Ｅ１２、またはＴＲＡＩＬと共に三重にまいた。一晩培養した後、ＡＴＰＬＩＴＥ（商標）アッセイ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、メリデン、コネティカット州）を製造者の指示に従って用いることにより、細胞生存率を決定した。結果を、培地コントロールウェルに比較した処理ウェル中の生細胞のパーセンテージとして示す。
フローサイトメトリー
細胞（１０６）をＰＢＳで１回洗浄し、一次抗体（１μｇ／ｍｌのＴＲＡ−８）を含む１ｍｌの冷たいＦＡＣＳ緩衝液（５％  ＦＢＳおよび０．０１％  ＮａＮ３を含むＰＢＳ）に再懸濁した。細胞を氷上で６０分間染色し、３ｍｌの冷たいＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、二次抗体（１：１００希釈したＰＥ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ）で４℃６０分間、暗所にてインキュベートした。３ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液でさらに洗浄した後、サンプルあたり１０，０００細胞をＦＡＣＳＣＡＮフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；サンノゼ、カリフォルニア州）によって分析した。
アポトーシス関連タンパク質のウェスタンブロット分析
腫瘍細胞（３×１０６）を冷たいＰＢＳで２回洗浄し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１％  ＳＤＳ、１ｍＭ  オルトバナジン酸ナトリウム、およびプロテアーゼ阻害剤の混合物（１ｍＭ  フッ化フェニルメチルスルホニル、１μｇ／ｍｌ  ペプスタチンＡ、２μｇ／ｍｌ  アプロチニン）を含む溶解緩衝液、３００μｌによって溶解した。細胞ライセートを１０秒間超音波処理し、１２，０００ｇにて２０分間遠心分離した。等量の総タンパク質を含む細胞ライセートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液と共に５分間煮沸した。全細胞ライセートを、８％、１０％、または１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜へ電気泳動的に転写した。ブロットをＴＢＳＴ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）中の５％無脂肪ドライミルクによってブロックし、ブロッキング緩衝液中の一次抗体と共に４℃にて一晩インキュベートした。ブロットをＴＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰ結合二次抗体によって１時間室温でプローブした。ＴＢＳＴで４回洗浄した後、ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；ピッツバーグ、ペンシルベニア州）を製造者の指示に従って用いることにより、プローブしたタンパク質を可視化した。
ｓｉＲＮＡを介したＤＤＸ３のノックダウン
ＲＮＡｉの設計：オンラインによる設計ツールであるＢＬＯＣＫ−ｉＴ  ＲＮＡｉ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カールズバッド、カリフォルニア州）を用いて、ＤＤＸ３を標的とするＲＮＡｉを同定した。最も高いスコアを有するＲＮＡｉ標的の上位１０から、５つの標的ｓｉＲＮＡ配列を選択した（表１を参照）。
【００５５】
【表１】
2013510171.tif 000003
これらを次にＢＬＯＣＫ−ｉＴ  Ｕ６エントリーベクター内へクローン化した。ｓｉＲＮＡはＵ６プロモーターによって駆動され、分裂しているかまたはしていない哺乳類細胞型のほとんどに、一過性に発現させることができる。ＲＮＡｉ応答のため、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カールズバッド、カリフォルニア州）を用いて、抵抗性細胞にＲＮＡｉをトランスフェクトした。トランスフェクション後３６時間目に、抗ＤＤＸ３抗体を用いたウェスタンブロット分析によってＤＤＸ３の発現の減少を判定した。いったんＤＤＸ３の発現の減少が達成されると、ｓｉＲＮＡオリゴを合成した（標的配列：ＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＴＣＡＴＧＧＧＡＡＡＣ（配列番号：１４）：センスＲＮＡ  ５’−Ｆｌ−ＧＧＡＧＡＡＡＵＵＡＵＣＡＵＧＧＧＡＡＡＣ（Ｆｌ−配列番号：１５）（Ｆｌ＝フルオレセイン）；アンチセンスＲＮＡ  ５’−ＧＵＵＵＣＣＣＡＵＧＡＵＡＡＵＵＵＣＵＣＣ−３’（配列番号：１６）。ＲＮＡｉコントロールオリゴ（ＲＩ−０１０−ＤＰ）はＭｏｌｅｃｕｌａ（コロンビア、メリーランド州）から購入した。
発現ベクターの作製
完全長ＤＤＸ３を、ＤＤＸ３のＮ末端のＨｉｓタグによってｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローン化した。ＤＤＸ３およびＤＲ５のｃＤＮＡを、ＭＤＡ２３１細胞から抽出した全ＲＮＡにより、以下のプライマー対：ＢａｍＨＩを有するＤＤＸ３１順方向プライマー：５’−ａｃｇｇａｔｃｃａａａｔｇａｇｔｃａｔｇｔｇｇｃａｇｔｇｇａ−３’（配列番号：１７）；ＸｈｏＩを有するＤＤＸ３６６２逆方向プライマー：５’−ｃｔｃｔｃｇａｇｃａａａｇｃａｇｇｃｔｃａｇｔｔａｃｃｃ−３’（配列番号：１８）を用いて行った逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって作製した。ＫｐｎＩを有するＤＲ５−１順方向プライマー：５’−ａａａｇｇｔａｃｃａｇｃｃａｔｇｇａａｃａａｃｇｇｇｇａｃａｇ−３’（配列番号：１９）；ＥｃｏＶを有するＤＲ５−４４１逆方向プライマー：５’−ａａａｇａｔａｔｃｔｔａｇｇａｃａｔｇｇｃａｇａｇｔｃｔｇｃａｔｔ−３’（配列番号：２０）；単離されたＤＤＸ３のポリメラーゼ連鎖反応断片を、インフレームでｐｃＤＮＡ３．１−Ｈｉｓベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ挿入した。ＤＲ５のｃＤＮＡをｐｓｈｕｔｔｅｒ−ＣＭＶベクター内へクローン化した。ＤＮＡ配列決定によって正確な配列を確認した。
【００５６】
ＢａｍＨＩとＸｈｏＩ部位の間のＤＤＸ３配列を欠失させることにより、ＤＤＸ３／ｐｃＤＮＡ３．１−Ｈｉｓ発現プラスミドを作製した。ＢａｍＨＩを有するＤＤＸ３１５１順方向プライマー：５’−ａｃｇｇａｔｃｃａａａｔｇｔｔｔｔｃｔｇｇａｇｇｃａａｃａｃｔｇｇｇ−３’（配列番号：２１）；以下のプライマー：ＥｃｏＲＶを有するＤＲ５−３４０逆方向プライマー：５’−ａａａｇａｔａｔｃｔｔａｃｔｇｔｃｔｃａｇａｇｔｃｔｃａｇｔｇｇｇａｔｃ−３’（配列番号：２２）；ＥｃｏＲＶおよびＸｈｏＩを有するＤＲ５−３３０逆方向プライマー：５’−ａａａｇａｔａｔｃｃｔｃｇａｇａｔｔｔｇｃｔｇｇａａｃｃａｇｃａｇｃｃｔ−３’（配列番号：２３）を用いてＤＲ５配列を欠失させることにより、ＤＲ５／ｐｓｈｕｔｔｅｒ−ＣＭＶ発現プラスミドを作製した。
細菌におけるＤＤＸ３の発現プラスミドの構築
ＤＤＸ３またはｃＩＡＰ１断片をＴＯＰＯ１００ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内へ挿入した。得られたプラスミドによりＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した後、これをＬＢ培地中で対数期まで増殖させ、０．４ｍＭ  イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドによって３時間誘導した。細胞をペレットにして、溶解緩衝液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  ノニデットＰ−４０、および２０μｇ／ｍｌ  ＰＭＳＦ）中に再懸濁した後、超音波処理した。１４，０００×ｇ、１５分間の遠心分離後の上清をＮｉカラムによって精製した。タンパク質濃度をＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）によって決定した後、一定分量を８０℃にて保管した。
２９３または３Ｔ３細胞の一過性トランスフェクション
ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、発現ベクターを２９３または３Ｔ３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後、それぞれのモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット分析により、タンパク質の発現を決定した。共免疫沈降法による分析のため、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む免疫沈降−溶解緩衝液によって細胞を溶解した。
共免疫沈降法
抗ＤＤＸ３または抗ＤＲ５抗体をセファロースビーズに結合させた（Ｓｉｇｍａ；セントルイス、ミズーリ州）。ＤＲ５  ＤＩＳＣの組成物は以下のように決定した。５×１０６の細胞（他に指示のない限り）を５００ｎｇ／ｍｌのＴＲＡ−８によって、指示する時間３７℃にて処理した後、免疫沈降溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％  ノニデットＰ４０および１０％グリセロール、ならびにコンプリートプロテアーゼ阻害剤カクテル）中で溶解するか、または処理なしで溶解した（無刺激条件）。次にＤＲ５  ＤＩＳＣを３０μｌのビーズによって４℃で一晩沈降した。免疫沈降後、ビーズを溶解緩衝液で４回洗浄した。次にビーズを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液で５回洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット分析のためのローディング緩衝液に再懸濁した。
カスパーゼ活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
蛍光定量アッセイを９６ウェルの透明底プレート内で行い、全ての測定は三重のウェルで行った。１００μｌのアッセイ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１ｍＭ  ＤＴＴ）を添加した。各ウェルに、活性化カスパーゼ８およびペプチド基質（Ａｃ−ＩＥＴＤ−ＡＭＣ）を最終濃度が１００ｎｇ／μｌになるように添加した。共免疫沈降の溶出画分を添加して反応を開始させた。アッセイ緩衝液、基質、および細胞ライセートを含まない溶解緩衝液を入れたウェル中でバックグラウンド蛍光を測定した。アッセイプレートを３７℃で１時間インキュベートした。３５５ｎｍの励起および４４０ｎｍの発光に設定した蛍光プレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ；ウィヌースキ、バーモント州）において、蛍光を測定した。
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏカスパーゼ切断アッセイ
カスパーゼがＤＤＸ３を切断する能力を、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイによって調べた。１０μｌのＤＲ５共ＩＰ由来の抽出画分、１０μｌの反応緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．０］、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＡＴＰ）、および５μｌ（０．１Ｕ／μｌ）の組み換え活性化型カスパーゼを含む切断反応を、３７℃で３０分間行った。切断は、抗ＤＤＸ３抗体を用いたウェスタンブロットによって判定した。
実施例１
ＴＲＡＩＬ−Ｒ２を介するアポトーシスにおけるＤＤＸ３の役割
抵抗性細胞においてＤＲ５のデスドメイン遮断を引き起こす、候補となるタンパク質であるＤＤＸ３のプロテオミクス解析。
【００５７】
デスレセプターを標的とする、治療薬としてのＴＲＡＩＬおよびアゴニスト抗体に自発的に発生するかまたは誘導されるアポトーシス抵抗性は、これらの薬剤による癌の有効な処置における主要な障害である。抵抗性細胞において、ＤＲ５デスドメイン複合体の別の組成物が存在するか否かを判定するため、ＴＲＡ−８感受性の親細胞およびＴＲＡ−８抵抗性のＭＤＡ２３１細胞において、現存するＤＲ５結合タンパク質のプロテオミクスプロファイルを、ＴＲＡ−８による処理の前と後に、二次元プロテオミクスおよびマススペクトロメトリー解析によって比較した。ＳＹＰＲＯ（商標）ｒｕｂｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ；ユージーン、オレゴン州）によって染色した二次元ゲルの実験にて、約〜８０ｋＤａのタンパク質スポットが見出された。このタンパク質とＤＲ５との結合がＤＲ５デスドメイン誘導シグナル複合体（Ｄｅａｔｈ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｃｏｍｐｌｅｘ：ＤＩＳＣ）の形成を遮断することで、ＴＲＡ−８抵抗性が引き起こされる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥから〜８０ｋＤａのタンパク質を切り出し、トリプシンによって消化した後、ペプチド配列をマススペクトロメトリーによって解析した。６つの消化断片からのタンパク質のアミノ酸配列は、ＧｅｎｂａｎｋのヒトＤＤＸ３配列と１００％同一であったことから（表２）、ＴＲＡ−８誘導性アポトーシスの間にＤＤＸ３はＤＲ５から解離することが示される。このタンパク質がＤＲ５結合タンパク質複合体に結合したままである場合、これはＦＡＤＤの動員を阻止して、ＤＩＳＣ形成の不全を引き起こし得る。
【００５８】
【表２】
2013510171.tif 000004
ＤＤＸ３は、ＤＲ５を介するアポトーシスにおけるＤＲ５結合タンパク質である。
【００５９】
ＤＤＸ３が実際にＤＲ５に結合しているか否かを判定するため、ＤＤＸ３の完全長（アミノ酸１〜６６２）、Ｎ末端断片（アミノ酸１〜３１６）、およびＣ末端断片（アミノ酸３１０〜６６２）を、Ｎ末端の６−Ｈｉｓタグを用いてＰＣＤＮＡＩＩＩ３．１内にクローン化した。これらの発現ベクターをＭＤＡ２３１親細胞にトランスフェクトして、ＤＤＸ３の組み換え完全長および欠失変異体の過剰発現を達成した。抗６−Ｈｉｓ抗体を用いた共免疫沈降法分析とそれに続くウェスタンブロット分析によって検出されたように、完全長ＤＤＸ３のみがＤＲ５に結合しており、そのＮ末端およびＣ末端欠失変異体は結合していなかった。これらの結果により、完全長ＤＤＸ３がＤＲ５に結合していることが確認された。ＤＤＸ３は、ＭＤＡ２３１細胞において抗ＤＲ５により免疫沈降された。
【００６０】
ＤＤＸ３とＤＲ５の結合についてさらに確認するため、ＤＤＸ３のＮ末端欠失バージョン、Ｃ末端欠失バージョン、および完全長バージョンをＥ．ｃｏｌｉに発現させた。タンパク質を精製し、ＤＤＸ３に対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のパネルを産生するための抗原として使用した。マウス抗ＤＤＸ３モノクローナル抗体を用いた共免疫沈降法およびウェスタンブロット分析により、ＤＲ５に結合したＤＤＸ３を検出した。この結果により、ＤＤＸ３は、非アポトーシス性の親細胞および抵抗性細胞の両方において、ＤＲ５と共に共免疫沈降されることが示された。アポトーシスの間に、ＴＲＡ−８感受性細胞において時間に依存したＤＤＸ３の減少が見られたが、ＴＲＡ−８抵抗性細胞では見られなかった。加えてＴＲＡ−８誘導性アポトーシスの間に、ウェスタンブロット分析により、ＤＲ５に結合したＤＤＸ３の迅速な減少および切断が観察された。これにより、ＤＤＸ３の切断はカスパーゼ依存性であることが示された。これらの結果に基づいてＤＤＸ３配列のＮ末端における潜在的な切断部位を詳しく調べ、アミノ酸１２９〜１３５に比較的保存されたカスパーゼ切断モチーフＤＫＳＤＥＤＤ（配列番号：３０）が見出された。ＤＩＳＣに切断が起こり、ＤＤＸ３の決定的な機能的エレメントがＤＲ５から放出されることは明らかである。このデータは、惹起されたカスパーゼがＤＲ５へ迅速に動員され、ＤＤＸ３を容易に切断することを示唆する後述のモデルに適合している。加えて、ＦＡＤＤとカスパーゼ−８がＤＲ５に動員され、結合してＤＩＳＣが形成されることにより、次に、ＤＲ５に結合したＤＤＸ３の切断に関連するカスパーゼカスケードの活性化が導かれる。このことは、ＤＤＸ３が特定の環境下でアポトーシスプログラムに必須であることを示し、ＤＤＸ３はＤＲ５に結合して、ＤＲ５を介したアポトーシス抵抗性に関与すると説明される。
ＤＤＸ３とＤＲ５の相互作用領域のマッピング
ＤＲ５を介したシグナル伝達におけるＤＤＸ３の調節についてさらに理解するため、ＤＤＸ３の欠失変異体をコードするプラスミドを一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ａ細胞を用いて、ＤＲ５に結合するために必要なおおよそのＤＤＸ３の領域を決定した。ＤＲ５に結合したＴＲＡ−８、完全長ＤＤＸ３、ＤＤＸ３Δ２０１−６６２、またはＤＤＸ３Δ１−４００を用い、共免疫沈降法によって組み換えＤＤＸ３とＤＲ５の相互作用を決定した。しかしながら、ＤＤＸ３Δ２５１−６６２またはＤＤＸ３Δ１−３５０のいずれもＤＲ５に結合できなかった。これにより、ＤＤＸ３はＤＲ５に対する２つの結合モチーフを有することが示される。１つはＮ末端（アミノ酸２００〜２５０）に位置し；もう１つはアミノ酸３５０〜４００に隣接する。同じ細胞からのライセートのウェスタンブロット分析によって野生型ＤＤＸ３およびＤＤＸ３の欠失断片の産生量は同程度であることが確認されたことから、これらの結果に対する説明として、タンパク質発現における相違は除外された。
【００６１】
ＤＤＸ３は持続的にＤＲ５に結合しており、ＴＲＡ−８抵抗性細胞におけるＦＡＤＤの動員の遮断に関連することから、ＤＲ５に結合したＤＤＸ３はＦＡＤＤの動員を阻止することが示される。ＤＤＸ３とＦＡＤＤの間にはＤＲ５を通した結合が存在し得る。予め結合したＤＤＸ３がＦＡＤＤの動員に干渉するように、ＤＲ５のデスドメインにおいてＤＤＸ３およびＦＡＤＤが共通の結合モチーフを共有するか、または２つの結合モチーフが互いに近接しているかについて調べるため、ＤＲ５におけるＤＤＸ３の結合ドメインの位置を決定した。完全長ＤＲ５、およびデスドメインの完全な欠失を含む、ＤＲ５の一連のアミノ末端ドメイン欠失をコードするベクターを構築した。ＤＤＸ３の機能を評価し、かつ内在性のヒトＤＲ５を排除するための類似のアプローチにおいて、ヒトＤＲ５とＤＤＸ３の共発現のためのホスト細胞としてマウス線維芽細胞株であるＮＩＨ３Ｔ３を選択した。３Ｔ３細胞に、Ｈｉｓ−タグ化ＤＤＸ３および完全長ＤＲ５、ＤＤＸ３およびＤＲ５の一連の欠失変異体、ならびにＤＤＸ３単独をコードするプラスミドを共トランスフェクトした。細胞表面のＤＲ５の発現を、ＴＲＡ−８染色を用いたフローサイトメトリーによって調べた。トランスフェクトした細胞は全て同等レベルの細胞表面ＤＲ５を示したことから、細胞内ドメインの欠失は細胞表面ＤＲ５を変化させなかったことが示される。加えて、抗６−ｈｉｓ抗体を用いた全細胞ライセートのウェスタンブロット分析によって検出されたように、トランスフェクトした細胞は全て同等レベルの組み換えＤＤＸ３を発現していた。組み換えＤＤＸ３とＤＲ５の欠失変異体との結合を、ＴＲＡ−８を用いた共免疫沈降法および抗６−Ｈｉｓ抗体を用いたウェスタンブロット分析によって調べた。ＤＲ５とＤＤＸ３の相互作用は、ＤＲ５のデスドメインとは無関係である。ＤＲ５結合モチーフをさらに正確に定義するため、ＤＲ５のさらなる欠失変異体であるＤ３３０、およびＤＲ５の切断型（Ｔ３００−３３０）を構築し、ＤＤＸ３と共に３Ｔ３細胞へ共トランスフェクトした後、それらの相互作用について分析した。この結果により、ＤＤＸ３はＤＲ５デスドメインに結合しないが、デスドメイン（アミノ酸３４０〜４２０）に近い膜の近位領域（アミノ酸３００〜３３０）に結合することが示された。これによりＤＤＸ３は、ＤＲ５シグナル伝達において、以前に同定されたデスドメイン結合タンパク質とは異なる役割を果たし得ることが示される。加えて、この領域はＤＲ４およびＤｃＲ２との高い相同性をもつ。これらのデータにより、ＤＤＸ３は、デスレセプターファミリーメンバーに結合する共通のアダプタータンパク質であることが示される。
ＤＤＸ３はＣＡＲＤを含む
次にＤＲ５を介したアポトーシスにおけるＤＤＸ３の機能的な重要性を、この分子の特異的な性質を分析することによって調べた。最近、カスパーゼ動員ドメイン（ＣＡＲＤ）を含む、ＤＥＡＤボックスタンパク質ファミリーの少なくとも２つのＲＮＡヘリカーゼが同定された。これらのＲＮＡヘリカーゼにおいて、ＣＡＲＤはアポトーシスの制御因子として機能する。ＤＲ５を介したアポトーシスの調節においてＤＤＸ３は重要な役割を果たすことから、ＤＥＡＤボックスタンパク質ファミリーのヘリカーゼのメンバーであるＤＤＸ３も同様にＣＡＲＤを有し、ＤＤＸ３のアポトーシス抑制性機能は直接ＣＡＲＤに依存する可能性がある。従って、ＤＤＸ３がＣＡＲＤタンパク質である可能性について調べた。アミノ酸のアラインメント解析により、ＤＤＸ３はアミノ酸５０〜１５０の間に、ＭＤＡ５およびＲＩＧＩのように保存された作用モチーフを含むことが示された。ＣＡＲＤは同型の相互作用モチーフである。ＣＡＲＤを含むタンパク質は、このドメインを通して互いに相互作用できる。ＤＤＸ３は新規であり、かつ高度に保存されたＣＡＲＤ含有ヘリカーゼであることから、その他のＣＡＲＤタンパク質と相互作用することができる。同様にＣＡＲＤ含有タンパク質であるｃＩＡＰ１は、カスパーゼの阻害剤として広く認識されており、ＴＮＦＲＩおよびＴＮＦＲＩＩへ動員されてＴＮＦＲＩを介したアポトーシスを調節する。ＤＤＸ３がｃＩＡＰ１と相互作用できるか否かについて、抗ＤＤＸ３または抗ＤＲ５抗体を用いて共免疫沈降実験により調べた。ｃＩＡＰ１は、ＴＲＡ−８により処理されていない親細胞および抵抗性細胞の両方において、ＤＤＸ３およびＤＲ５抗体によって容易に共免疫沈降できると決定された。しかしながら、ｃＩＡＰ１はＴＲＡ−８感受性細胞においてＤＲ５−ＤＤＸ３複合体から迅速に放出され、このことは親細胞におけるＤＤＸ３の切断と関連していた。対照的に、ＤＲ５−ＤＤＸ３複合体におけるｃＩＡＰ１のレベルは、抵抗性細胞においてＴＲＡ−８による処理後に増大した。これらの結果により、ＤＤＸ３は、ＤＲ５とｃＩＡＰ１の間を連結するものとして役立つことが示される。
ＤＤＸ３のノックダウンによる抵抗性の逆転
ＤＲ５シグナル伝達におけるＤＤＸ３の役割について研究するため、ＴＲＡ−８誘導性のアポトーシスにおける内在性ＤＤＸ３の重要性について調べた。ＤＤＸ３は、ＴＲＡ−８誘導性アポトーシスの間に抵抗性細胞において減少しなかったことから、癌細胞をアポトーシスに対して感受性にするためには、ＤＤＸ３の発現レベルの減少が必要とされ得る。ＤＲ５を介したアポトーシスに対する抵抗性におけるＤＤＸ３の役割を決定するため、ＲＮＡｉストラテジーを用いた。オンラインによる設計ツールであるＢＬＯＣＫ−ＩＴ（商標）ＲＮＡｉ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＤＤＸ３を標的とするＲＮＡｉを同定した。最も高いスコアを有するＲＮＡｉ標的の上位１０から、５つの標的ｓｉＲＮＡ配列を選択して、ＢＬＯＣＫ−ＩＴ（商標）Ｕ６エントリーベクター内へクローン化した。ＴＲＡ−８抵抗性のＭＤＡ２３１細胞に５つのＲＮＡｉコンストラクトをトランスフェクトして、トランスフェクションから４８時間後に、モノクローナル抗ＤＤＸ３抗体を用いたウェスタンブロット分析により、ＤＤＸ３のタンパク質発現レベルを決定した。調べた５つのＲＮＡｉコンストラクトのうちの４つは、トランスフェクトしていないか、またはＧＦＰをトランスフェクトしたコントロールに比較して、ＤＤＸ３発現の非常に効果的な（５０％を超える減少）阻害物質であった。これらのコンストラクトのうち最も効果的な＃２を、ＴＲＡ−８を介したアポトーシスにおけるＤＤＸ３ノックダウンの効果を分析するために選択した。ＤＤＸ３発現のノックダウンが、ＴＲＡ−８抵抗性細胞においてＴＲＡ−８に対する感受性を逆転させるか否かを判定するため、ＴＲＡ−８抵抗性のＭＤＡ２３１細胞に、ＲＮＡｉベクター（コンストラクト＃２）およびトランスフェクトした細胞の指標としてのＧＦＰ発現ベクターを共トランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間目に、ＤＤＸ３をＤＲ５と共に共免疫沈降した。予想されたように、ＤＤＸ３の発現はコントロール細胞に比較して有意に減少した。ＧＦＰ陽性細胞を選別し、様々な濃度のＴＲＡ−８と共に一晩培養した。ＡＴＰＬＩＴＥ（商標）アッセイによると、ＧＦＰおよびコントロールベクターをトランスフェクトしたＭＤＡ２３１細胞はＴＲＡ−８による処理後にアポトーシスを起こさなかったことから、細胞はＴＲＡ−８に対する抵抗性を保持していたことが示された。しかしながら、ＤＤＸ３  ＲＮＡｉとＧＦＰを共トランスフェクトした細胞は、ＴＲＡ−８による用量依存性の細胞死を示した。ＴＵＮＥＬ染色によると、著しい数のＤＤＸ３ノックダウン細胞がアポトーシスを起こしていることが見出された。これらの結果により、ＤＤＸ３の発現減少がＴＲＡ−８に対する抵抗性を逆転させたことが示される。ＤＲ５を介したアポトーシスの原因となるＤＤＸ３の役割をさらに決定するため、腫瘍細胞のパネルにおいてＤＤＸ３の発現を減少させ、ＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対するそれらの感受性を分析した。ＤＤＸ３  ＲＮＡｉは内在性ＤＤＸ３の量を減少させ、幾つかの自発性の抵抗性細胞を含む腫瘍細胞のパネルにおいて、ＴＲＡ８誘導性アポトーシスを増大させた。対照的に、コントロールオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした細胞は通常のＤＤＸ３の発現を示し、ＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対して抵抗性のままであった。従って、ＤＤＸ３はＤＲ５シグナル伝達装置の決定的な構成要素であり、かつＤＲ５を介したアポトーシスに対する抵抗性に必須のものである。
ＤＤＸ３結合領域をもたないＤＲ５はアポトーシス促進性である
ＤＤＸ３結合モチーフが、ＤＲ５のデスドメイン機能を調節する新規な負の調節性ドメインを表しているか否かについて調べるため、変異型ＤＲ５のアポトーシス誘導性機能を野生型ＤＲ５と比較した。デスドメインをもたないＤＲ５をトランスフェクトした細胞はＴＲＡ−８による処理に応答しないようにみえるが、切断型のＤＤＸ３結合ドメインを有するＤＲ５をトランスフェクトした細胞はアポトーシス促進性であるようにみえ、かつ野生型のＤＲ５をトランスフェクトした細胞に比較して、ＴＲＡ−８誘導性のアポトーシスに対するより高い感受性を示した。ＤＤＸ３には、ＤＲ５を介したアポトーシスを抑制し得る明白な抑制効果が存在した。これらの知見により、ＤＤＸ３は、ＤＲ５を介したアポトーシスに対する抑制性メディエーターであることが示される。
ＤＤＸ３は、ＤＲ５を介したアポトーシスを調節するＣＡＲＤタンパク質である。
【００６２】
ＤＲ５−ＤＤＸ３−ｃＩＡＰ１のシグナル伝達を分析するため、そのｃＩＡＰ１への結合に必要とされる領域を調べた。ＣＡＲＤはＤＤＸ３のＮ末端に存在してｃＩＡＰ１と相互作用すると思われることから、この領域がｃＩＡＰ１の結合に関与する可能性がある。ＨＥＫ２９３Ａ細胞に、Ｈｉｓ−タグ化完全長ＤＤＸ３、ＤＤＸ３Δ５１−６６２、ＤＤＸ３Δ１０１−６６２、ＤＤＸ３Δ１５１−６６２、またはＤＤＸ３Δ１−３５０をコードするプラスミドをトランスフェクトした。完全長およびＣ末端を欠失したＤＤＸ３の両方はｃＩＡＰ１と共免疫沈降することができ、最初の１００アミノ酸を欠失したＤＤＸ３はｃＩＡＰ１と共免疫沈降することができなかった。これらの結果により、ＤＤＸ３のＮ末端ＣＡＲＤは、ＤＲ５複合体へのｃＩＡＰ１の動員に関与することが確認された。ｃＩＡＰ１結合モチーフは、切断部位であるアミノ酸１２９〜１３５（ＤＫＳＤＥＤＤ；配列番号：３０）の直前の、ＤＤＸ３のアミノ酸５０〜１００に位置することもまた示される。ＤＤＸ３がＤＲ５を介したアポトーシスの間に切断される場合、ｃＩＡＰ１と結合したＤＤＸ３のＮ末端断片はＤＲ５複合体から離脱する可能性があり、これによってｃＩＡＰ１の細胞死シグナル伝達に対する抑制が取り除かれる。従ってＤＤＸ３は、アポトーシス抵抗性のためにｃＩＡＰ１とデスレセプターを結合させる候補である。
【００６３】
この概念をさらに実証するため、アミノ酸１〜１５０を欠損したドミナントネガティブ変異体ＤＤＸ３を用いた。この変異体ＤＤＸ３ΔＣＡＲＤ（ＤＤＸ３Δ１５１−６６２）はｃＩＡＰ１と相互作用できないが、ＤＲ５にはなお結合することができる。従って、ＤＤＸ３Δ１５１−６６２が、ＤＲ５に結合する野生型ＤＤＸ３と競合する内在性ＤＤＸ３のドミナントネガティブ阻害物質となり得るか否かについて評価した。４つの型の細胞に、ＤＤＸ３ΔＣＡＲＤをトランスフェクトした。ＤＤＸ３ΔＣＡＲＤをトランスフェクトした細胞は、内在性の完全長ＤＤＸ３に比較してより高いレベルのＤＤＸ３ΔＣＡＲＤの発現を示したことから、切断型のＤＤＸ３はＤＲ５への結合に対して内在性ＤＤＸ３と競合できることが示唆される。ＤＲ５との共ＩＰならびに抗ＤＤＸ３および抗ｃＩＡＰ１抗体によりプローブするウェスタンブロッティングによって分析されたように、ｃＩＡＰ１は完全長ＤＤＸ３と共免疫沈降されたが、ＤＤＸ３ΔＣＡＲＤとは共免疫沈降されなかった。さらにＡＴＰＬＩＴＥ（商標）アッセイを用いて、トランスフェクトした細胞のＴＲＡ−８を介したアポトーシスに対する感受性を調べた。調べた全ての細胞がＴＲＡ−８による処理後に抵抗性のままであったことから、完全長組み換えＤＤＸ３の発現は、ＴＲＡ−８を介したアポトーシスに対する感受性を変化させなかった。しかしながら、高レベルのＤＤＸ３ΔＣＡＲＤを発現したＴＲＡ−８抵抗性の腫瘍細胞は、ＤＲ５に結合したｃＩＡＰ１の減少後に、ＴＲＡ−８により誘導されるアポトーシスに対するそれらの感受性を回復した。これらのデータにより、ＴＲＡ−８により誘導されるアポトーシスに対するｃＩＡＰ１による阻害は、ＤＤＸ３の未変化のＣＡＲＤによって仲介されることが示される。Ｎ末端ＣＡＲＤを欠損したＤＤＸ３は、ＴＲＡ−８に対する抵抗性を部分的に逆転させるドミナントネガティブとして役立ち得る。ＴＲＡ−８により誘導されるアポトーシスに対する癌細胞の潜在的な感受性は、ＤＲ５結合複合体におけるＤＤＸ３とｃＩＡＰ１のレベルによって調節され得る。
ＤＲ５−ＤＤＸ３−ｃＩＡＰ１複合体はカスパーゼ−８の活性化を阻害する
細胞内に存在するＤＤＸ３のレベルが、ＤＲ５  ＤＩＳＣにおけるカスパーゼ−８の動員および処理にどのように関わるかを調べるため、ＤＤＸ３を定量した。ＭＤＡ２３１ならびにＵＬ−３Ｃの親細胞および抵抗性細胞をＴＲＡ−８で４時間処理した後、ＤＲ５を、ＴＲＡ−８とは異なるＤＲ５のエピトープを認識する新規な抗ＤＲ５モノクローナル抗体（クローン２Ｂ４）によって免疫沈降した。ＤＲ５／ＤＤＸ３／ｃＩＡＰ１複合体をビーズから遊離させ、ＤＲ５に結合したＤＤＸ３およびｃＩＡＰ１を、抗ＤＤＸ３および抗ｃＩＡＰ１抗体を用いる免疫ブロッティングおよびサンドイッチＥＬＩＳＡ分析に供した。ＥＬＩＳＡプレートに２Ｂ４抗ＤＲ５抗体をコートして、免疫沈降されたＤＲ５を捕捉した後、ＤＤＸ３（３Ｅ２）およびｃＩＡＰ１に対する特異的なモノクローナル抗体によってＤＤＸ３およびｃＩＡＰ１を測定した。ＴＲＡ−８による処理は、感受性の親細胞または誘導された抵抗性の腫瘍細胞いずれのＤＲ５タンパク質レベルも変化させなかった。しかしながら、ＤＲ５に結合したＤＤＸ３のレベルは、感受性および抵抗性細胞の両方において、ＴＲＡ−８処理により有意に変化した。第１に、３Ｅ２抗ＤＤＸ３抗体によって検出されたように、未処理の抵抗性細胞は、未処理の感受性細胞に比較して、ＤＲ５に結合したＤＤＸ３を高レベルで発現した。重要なことには、ＴＲＡ−８による処理後に、ＤＲ５に結合したＤＤＸ３はＴＲＡ−８抵抗性細胞において有意に増加したが、感受性細胞では顕著な減少が示された。ＤＲ５複合体におけるｃＩＡＰ１のレベルもまた、ＤＤＸ３と同じパターンで変化した。これらの結果により、アポトーシスの間にＴＲＡ−８感受性細胞ではＤＤＸ３のＣＡＲＤドメインが切断されてＤＲ５複合体からＤＤＸ３が遊離するが、ＤＤＸ３およびｃＩＡＰ１は、感受性細胞よりもむしろ抵抗性細胞において、ＴＲＡ−８の刺激によってＤＲ５に動員されることが示唆された。
【００６４】
機能的なＤＩＳＣを形成するためには、ＴＲＡ−８により誘導されるアポトーシスの間に、癌細胞がＤＲ５複合体からｃＩＡＰ１を遊離して、カスパーゼに対するその抑制を減少させることが必須である。この過程はＤＤＸ３の切断を必要とすることから、この工程はフィードフォワードのアポトーシス増幅ループを開始するために重要であることが示される。ＤＲ５に結合したＤＤＸ３の切断に対する抵抗性は、抵抗性細胞におけるＤＩＳＣ形成の不全に関連していることから、ＤＲ５−ＤＤＸ３−ｃＩＡＰ１複合体におけるＤＤＸ３切断に対する感受性は、親細胞と抵抗性細胞の間で異なっている。異なるカスパーゼによる、ＤＲ５に結合したＤＤＸ３切断の可能性を、両細胞において分析した。ＤＲ５−ＤＤＸ３−ｃＩＡＰ１複合体を、抗ＤＲ５抗体によって共免疫沈降した。ビーズからの溶出画分を、活性化カスパーゼ−２および−８と共にインキュベートした。ＤＤＸ３の切断を、抗ＤＤＸ３抗体を用いたウェスタン分析によって検出した。これらの結果とＥＬＩＳＡ分析との組み合わせにより、抵抗性細胞におけるカスパーゼ−８によるＤＤＸ３の切断は、感受性細胞に比較して高度に減弱していたが、カスパーゼ−２は、両細胞において同等のプロテアーゼとしての可能性を提示したことが示された。これらの結果により、ＴＲＡ−８感受性細胞と抵抗性細胞の間には、ＤＤＸ３複合体の機能的な相違があることが示された。また、デスレセプターに結合した最初のカスパーゼによるＤＤＸ３切断の不全が、ＴＲＡ−８に対する抵抗性の発生における重要な工程であることも示された。
【００６５】
誘導された抵抗性細胞においてＤＤＸ３の切断が阻害されたことにより、ＤＤＸ３がＤＲ５を介したアポトーシスを阻害する、アポトーシスシグナル伝達における工程を決定するための研究が促された。ＤＤＸ３／ｃＩＡＰ１複合体はカスパーゼ−８の活性化を阻害すると予測されることから、受容体活性化後の最初の検出可能な現象の１つとしての、ＤＲ５−ＤＤＸ３−ｃＩＡＰ１複合体におけるカスパーゼ−８の活性化について調べた。カスパーゼ−８の活性化におけるＤＲ５−ＤＤＸ３−ｃＩＡＰ１複合体の効果を評価するため、蛍光基質であるＡｃ−ＩＥＴＤ−ＡＭＣを用い、活性化カスパーゼ−８と感受性親細胞または誘導された抵抗性細胞由来のＤＤＸ３共ＩＰ溶出画分をインキュベートして、カスパーゼ活性を測定した。抵抗性細胞由来のＤＲ５共ＩＰ溶出画分において、広範囲の希釈度にわたり、感受性細胞に比較してカスパーゼ−８活性の用量依存性の阻害が観察された。加えて、精製したｃＩＡＰ１もまた、カスパーゼ−８のプロテアーゼ活性を完全に抑制した。ＤＤＸ３に結合したｃＩＡＰ１は、カスパーゼ−８の最初の活性化における阻害物質であり、それによってＤＤＸ３の切断が阻止されるということには説得力がある。従ってこれらのデータにより、ＤＤＸ３−ｃＩＡＰ１がカスパーゼ−８活性を調節し得ることの直接の証拠が提供され、かつＤＤＸ３−ｃＩＡＰ１はＤＲ５によって結合されたカスパーゼ−８の特異的な制御因子であることが示される。
【００６６】
カスパーゼ−８の活性化におけるＤＲ５−ＤＤＸ３−ｃＩＡＰ１の効果を、ｃＩＡＰ１により阻害されたカスパーゼ−８の直接の分析により、カスパーゼアッセイによるＤＤＸ３の切断と組み合わせて調べることで、ＤＤＸ３−ｃＩＡＰ１は新規な型のカスパーゼ阻害物質としても機能することが示された。ＤＤＸ３−ｃＩＡＰ１複合体は、カスパーゼ−８の活性化を抑制することでデスレセプターによるアポトーシス促進性のシグナルを抑止することができ、これによって最初のカスパーゼによるＤＲ５に結合したＤＤＸ３の切断を阻害する。このモデルにより、ＤＤＸ３は、ｃＩＡＰ１の動員を通してＴＲＡ−８誘導性アポトーシスから細胞を保護し、癌細胞における細胞死のシグナル伝達経路の遮断に寄与することが示される。
実施例２
トリプルネガティブ（ＴＮ）基底細胞型乳癌細胞株に対する、抗ＤＲ５を介した細胞傷害性
表３および４に要約するように、基底細胞型（基底細胞Ａ型および基底細胞Ｂ型）に分類された１５の細胞株、ＨＥＲ−２過剰発現基底細胞型である２の細胞株、および管腔表現型を示す９の細胞株を含む２６の乳癌細胞株のパネルを、ＴＲＡ−８（ＤＲ５）抗体に対する細胞傷害性応答と乳癌の亜型との間の関連性を調べるために用いた。ＴＲＡ−８は１５のトリプルネガティブ乳癌細胞（ＴＮＢＣ）細胞株（基底細胞型）のうちの１２に死滅を誘導し、ＩＣ５０値は０．９〜４．８ｎｇ／ｍｌの範囲であった（表３）。基底細胞Ｂ型である亜型の４細胞株に対するＴＲＡ−８の細胞傷害性を図１に示す。ＴＲＡＩＬによって同等の細胞傷害性が生じた。９の管腔乳癌細胞株は全てＴＲＡ−８に対して抵抗性であった（表４）。ＴＲＡ−８抗体と、アドリアマイシン、シスプラチン、およびカルボプラチンを含む化学療法剤との併用処理によって、基底細胞Ａ型および基底細胞Ｂ型の乳癌細胞株に相加的から相乗的な死滅が生じた（図２）。ＴＲＡ−８に対して抵抗性である、ＢＲＣＡ−１変異型細胞株のＨＣＣ１９３７は、ＴＲＡ−８と化学療法の併用によって相乗的な細胞傷害性を示した（図２）。
【００６７】
【表３】
2013510171.tif 000005
【００６８】
【表４】
2013510171.tif 000006
実施例３
ＤＲ５／ＤＤＸ３／ｃＩＡＰ１アポトーシス抑制性複合体の性質決定
上記のようにＤＲ５／ＤＤＸ３／ｃＩＡＰ１は、ＤＩＳＣの形成および機能に拮抗する負の調節複合体として役立つ。従って、ＤＲ５に結合したＤＤＸ３および動員されたアポトーシス阻害物質は、ＤＲ５を介したアポトーシスに対する癌細胞の感受性のバイオマーカーであることが予測される。モデルを図３に示す。このモデルにおいて、ＤＤＸ３はＤＲ５のデスドメインの近位領域に結合する。ＲＮＡヘリカーゼファミリーのその他のメンバーと同様に、ＤＤＸ３はそのＮ末端に、ＣＡＲＤ／ＣＡＲＤ相互作用を通したアポトーシス阻害物質（ＩＡＰ）の動員に関与するＣＡＲＤを含む。さらに、動員されたＩＡＰは、そのバキュロウイルスＩＡＰリピート（ＢＩＲ）を通してカスパーゼの活性を阻害することによって、デスドメインにおけるアポトーシスシグナル伝達の開始を阻害する。このモデルの新規性は、ＤＲ５の細胞質側末端が、ＤＲ５のアポトーシスシグナル伝達を決定するために互いに相互作用する、少なくとも２の機能的に異なるドメインを含むことである。ＤＤＸ３／ＩＡＰ複合体がデスドメイン複合体よりも優位であるとき、癌細胞はＤＲ５を介したアポトーシスに対する抵抗性へとシフトする。従って、ＤＲ５に結合したＤＤＸ３とｃＩＡＰ１は、抗ＤＲ５（ＴＲＡ−８）を介したアポトーシスに対する腫瘍細胞の応答を予測するバイオマーカーとして役立ち、かつＤＲ５を介したアポトーシスを増大させるための薬物標的としても役立ち得る。
【００６９】
ＴＲＡ−８を介したアポトーシスに対して確定された感受性を有する癌細胞のパネルにおける、ＤＲ５結合タンパク質のタンパク質プロファイルについて調べた。これにより、ＤＲ５のデスドメインにおいてアポトーシス抵抗性を仲介する、新規なＤＲ５結合アダプタータンパク質としてのＤＤＸ３の同定が導かれた。
ＤＤＸ３結合ドメインを欠損したＤＲ５は、さらにアポトーシス促進性である
上記のように、ＤＤＸ３結合ドメインは、ＤＲ５の細胞質側末端のアミノ酸３００〜３３０の領域にマップされた。この領域が切断された変異体ＤＲ５（Ｄ７）はＤＤＸ３の結合を喪失したが、ＤＲ５の表面発現は変化しなかった。切断型ＤＲ５は、野生型ＤＲ５を発現する細胞に比較して、自発性アポトーシスおよびＴＲＡ−８により誘導されるアポトーシスの増大を示した。これらの結果により、ＤＲ５の細胞質側末端は、ＤＤＸ３の結合を通してＤＲ５のアポトーシスシグナル伝達を負に調節する機能的領域を有することが示される。
ＤＤＸ３のノックダウンは、ＤＲ５によるアポトーシスに対する抵抗性を逆転する
誘導性（ＭＤＡ２３１ＲおよびＵＬ−３ＣＲ）ならびに自発性の抵抗性細胞（ＳＫＷ６２０、ＨＴ２９、およびＳＫＷ１１ｌ６）の両方を含む、ＤＲ５によるアポトーシスに対して抵抗性の細胞において、ｓｉＲＮＡによりＤＤＸ３の発現をノックダウンして（図４Ａ）、ＴＲＡ−８により誘導されるアポトーシスに対する腫瘍細胞の感受性を分析した。アポトーシス抵抗性は、全ての抵抗性細胞においてＤＤＸ３の発現が減少した後に逆転されたことから（図４Ｂ）、ＤＤＸ３は、ＤＲ５を介したアポトーシスの負の制御因子であることが示される。
ＤＤＸ３は、ｃＩＡＰ１を動員してＤＲ５を介したアポトーシスを阻害するＣＡＲＤタンパク質である
ＭＤＡ５およびＲＩＧ−１のようなその他のヘリカーゼタンパク質と同様に、ＤＤＸ３はそのＮ末端に保存されたＣＡＲＤを有する。共免疫沈降法により、野生型ＤＤＸ３はｃＩＡＰ１をプルダウンすることが示された（図５Ａ）。しかしながら、ＤＤＸ３の最初の１００残基の切断型（ＤＮ）では、ｃＩＡＰ１の共免疫沈降は失われた。ＴＲＡ−８による処理後のＦＡＤＤの動員によって示されるように、ＤＩＳＣ機能は、ＣＡＲＤ−切断型ＤＤＸ３を発現する細胞において回復した。ＣＡＲＤを欠損するＤＤＸ３を発現するＤＲ５抵抗性の腫瘍細胞は、ＴＲＡ−８により誘導されるアポトーシスに対してさらに感受性となった（図５Ｂ）。これらの結果により、ＤＤＸ３はＤＲ５のアダプタータンパク質として機能することが示される。ＤＤＸ３がＤＲ５に結合する一方で、そのＣＡＲＤがｃＩＡＰ１を動員することによって、デスドメインにおいてＤＲ５を介したアポトーシスを阻害する。
ＤＲ５／ＤＤＸ３／ｃＩＡＰ１タンパク質複合体はＤＲ５を介したアポトーシスを予測するバイオマーカーである
全細胞ライセートを用いたＤＲ５／ＤＤＸ３／ｃＩＡＰ１複合体の定量のためのアッセイを開発した。ＤＲ５の共免疫沈降後、ＤＲ５、ＤＤＸ３、およびｃＩＡＰ１の量をサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。感受性の親細胞（ＭＤＡ２３１ＰおよびＵＬ−３ＣＰ）ならびに抵抗性細胞（ＭＤＡ２３１ＲおよびＵＬ−３ＣＲ）の両方においてＤＲ５が同等に沈降されたとき、結合したＤＤＸ３およびｃＩＡＰ１は、感受性細胞では少なかったが、抵抗性細胞ではかなり多かった（図６Ａ）。確定されたＴＲＦ−８に対する感受性を有するヒト癌細胞株のパネルについてさらに分析した。ＴＲＡ−８抵抗性細胞の一群は、ＴＲＡ−８感受性細胞の一群に比較して、かなり高レベルのＤＲ５結合ＤＤＸ３およびｃＩＡＰ１を発現していた（図６Ｂ）。これらの結果により、ＤＲ５に結合したＤＤＸ３およびｃＩＡＰ１は、誘導された抵抗性細胞のみではなく、自発性の抵抗性を発生した細胞においてもＴＲＡ−８抵抗性を誘導することが示される。
トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）細胞におけるＤＲ５／ＤＤＸ３／ｃＩＡＰ１タンパク質複合体
最近、全てのＴＮＢＣ細胞は細胞表面ＤＲ５を発現し、かつＴＲＡ−８により誘導されるアポトーシスに感受性であるが、非ＴＮＢＣ細胞は一貫して抵抗性であることが示された。従って、ＤＲ５／ＤＤＸ３／ｃＩＡＰ１複合体をＴＮＢＣ細胞株のパネルにおいて調べた。ＤＲ５に結合したＤＤＸ３およびｃＩＡＰ１は、ＴＮＢＣ細胞において低めであった（図７Ａおよび表５）。興味深いことに幾つかのＴＮＢＣ細胞では、抗Ｃ末端ＤＤＸ３抗体である３Ｅ４によって示されるように、ＤＲ５と共免疫沈降されたＤＤＸ３の分子量はより小さかった（図７Ｂ）。このことは、Ｎ末端ＣＡＲＤに特異的な抗ＤＤＸ３抗体である３Ｅ２によって判定されたように、Ｎ末端ＣＡＲＤの喪失によるものであった。これらのＴＮＢＣ細胞では、ＣＡＲＤの喪失に対応して、結合したｃＩＡＰ１もまた減少していた。ＤＤＸ３の２Ｄ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるプロテオミクス分析により、ＴＮＢＣ細胞におけるＤＤＸ３タンパク質プロファイルは変化していることが明らかになった。これらの結果により、ＤＲ５／ＤＤＸ３／ｃＩＡＰ１複合体はＴＮＢＣ細胞において変化している可能性があり、このことが、ＴＲＡ−８により誘導されるアポトーシスに対するこれらの細胞の高い感受性を説明し得ることが示唆された。
新規抗体はＢＩＲを認識する
抗ＩＡＰモノクローナル抗体のプールをスクリーニングする間に、独特なモノクローナル抗体（３Ｈ４）が同定された。３Ｈ４抗体はｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、およびＸＩＡＰに対して同等に結合したが、サバイビンには結合しなかった（図８Ａ）。これらのタンパク質に共通な唯一のエピトープまたは構造はＢＩＲドメインであることから、この特定の抗体はＢＩＲドメイン特異的な抗体であると思われた。一連の切断型ＩＡＰタンパク質を３Ｈ４抗体のエピトープをマップするために使用して、３Ｈ４により認識されるエピトープが、サバイビンには存在しない、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、およびＸＩＡＰの第２ＢＩＲドメインであることを見出した（図８Ｂ）。ウェスタンブロット分析により、３Ｈ４抗体は６８ｋＤａのｃＩＡＰ１またはｃＩＡＰ２、および５８ｋＤａのＸＩＡＰを検出することが示された。これらの既知のＩＡＰタンパク質に加え、３Ｈ４は、膵癌細胞株のパネルに示すように、未知の８０ｋＤａのタンパク質もまた検出した（図８Ｃ）。
【００７０】
【表５】
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ＤＤＸ３／ＩＡＰ複合体におけるＩＡＰの発現低下
Ａｓｃｅｎｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発されたＡＴ−４０６は、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、およびＸＩＡＰを含む複数のＩＡＰタンパク質に、低いナノモル親和性で結合する。ＡＴ−４０６は、ＴＲＡＩＬを介したアポトーシスを相乗的に増大させることが示されてきた。ＡＴ−４０６が、ＤＲ５によるアポトーシスに対する膵癌細胞の抵抗性を克服できるか否かを決定するため、ＴＲＡ−８により誘導されるアポトーシスにおけるＡＴ４０６の効果を、その両方がＴＲＡ−８を介したアポトーシスに対して高度に抵抗性である２つのヒト膵癌細胞株、Ｓ０１３およびＳ２ＶＰ１０に対して調べた。１０００ｎｇ／ｍｌのＴＲＡ−８による処理後、アポトーシス細胞はほとんどみられなかった。１０μＭのＡＴ４０６単独による処理では、有意な細胞死は誘導されなかった。しかしながら、併用処理では７０％を超える細胞死がもたらされた。全細胞ライセートのウェスタンブロット分析によって示されるように、ＡＴ−４０６単独では総ＩＡＰタンパク質の発現は変化しなかった（図９Ａ）。しかしながら、併用処理では全てのＩＡＰが減少したことから、アポトーシスの相乗的な誘導は、ＡＴ−４０６により誘導されるＩＡＰタンパク質の分解を促進することが示された。ＤＲ５／ＤＤＸ３／ｃＩＡＰ１タンパク質複合体におけるＡＴ−４０６の効果を判定するため、ＤＲ５共ＩＰによってｃＩＡＰ１の量を調べた。ＡＴ４０６単独および併用処理後に、ＤＲ５複合体においてｃＩＡＰ１の劇的な減少がみられた（図９Ｂ）。ＤＤＸ３がＤＲ５と同等に共免疫沈降されたことから、これはＤＲ５に結合したＤＤＸ３の減少によるものではなかった。これらの結果により、ＡＴ−４０６は、ＤＲ５／ＤＤＸ３タンパク質複合体中のｃＩＡＰ１を選択的に標的とすることが示された。
乳癌のＩＡＰにおけるＡＴ４０６のｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果
ＤＤＸ３複合体中のＩＡＰタンパク質の発現におけるＡＴ４０６の効果を、トリプルネガティブおよび非トリプルネガティブ株を含む乳癌細胞株のパネルにおいて分析した。以前に示したように、４つのトリプルネガティブ乳癌細胞株、ＭＢ４３５、２ＬＭＰ（図１０Ａ）、ＳＵＭ１５９、およびＳＵＭ１４９（図１０Ｂ）は、ＤＤＸ３と共免疫沈降した際、ＴＲＡ−８を介したアポトーシスに対して抵抗性であった２つの非トリプルネガティブ株、ＢＴ４７４およびＭＢ４６８（図１０Ｃ）に比較して、低レベルのｃＩＡＰ１またはｃＩＡＰ２タンパク質を発現していた。ＴＲＡ−８単独による処理は、ＩＡＰタンパク質のレベルを変化させなかった。しかしながら、ＡＴ４０６単独（図１０Ａ〜１０Ｃ、レーン３）またはＴＲＡ−８との併用（図１０Ａ〜１０Ｃ、レーン４）は、ＤＤＸ３に結合したＩＡＰタンパク質のレベルを有意に減少させた。
ＴＲＡ−８およびＡＴ４０６により生じる細胞傷害性
乳癌細胞株に対するＴＲＡ−８を介したアポトーシスにおけるＡＴ−４０６の効果を調べた。ＢＴ−４７４、ＢＴ−５４９、および２ＬＭＰ細胞に対するＡＴ−４０６とＴＲＡ−８の相互作用の証拠が存在した（図１１）。ＡＴ−４０６およびＴＲＡ−８を介したアポトーシスにおけるアドリアマイシンの効果もまた調べた。２ＬＭＰ細胞のＡＴ−４０６、アドリアマイシン、およびＴＲＡ−８による併用処理後に細胞傷害性は増大した（図１２）。
ＴＮＢＣ異種移植に対するＴＲＡ−８およびアドリアマイシンまたはアブラキサンのｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性
ＴＲＡ−８単独およびアブラキサンまたはアドリアマイシンとの併用によるｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍の有効性を、胸腺欠損ヌードマウスにおける２ＬＭＰおよびＳＵＭ１５９の同所性の基底細胞Ｂ型異種移植モジュールを用いて調べた。腫瘍直径が約６ｍｍとなり、腫瘍がいったん十分に定着した後に処置を開始し、時間と共に腫瘍サイズをモニターした。未処理のＳＵＭ１５９腫瘍の平均腫瘍サイズは、１７．９日で倍になった。ＳＵＭ１５９腫瘍を有するマウスのＴＲＡ−８単独での処置による腫瘍の倍加時間は、図１３Ａに示すように８１．３日であり、腫瘍増殖は未処置のコントロール腫瘍に比較して有意に阻害されたが、アドリアマイシンまたはアブラキサン単独での処置によっては、平均腫瘍倍加時間はそれぞれ４１．９および４９．３日に及んだ。ＴＲＡ−８とアドリアマイシンの併用処置によって、ＴＲＡ−８単独による腫瘍増殖の阻害を反映する平均腫瘍サイズの減少がもたらされ、平均腫瘍倍加時間は８４．７日であり、１／１０の完全な腫瘍退縮がみられたが、ＴＲＡ−８単独で処置したマウスでは完全な腫瘍退縮は起こらなかった。ＴＲＡ−８およびアブラキサンで処置した動物には、ＴＲＡ−８単独またはＴＲＡ−８とアドリアマイシンで処置したものと同様の腫瘍増殖の阻害がみられ、平均腫瘍倍加時間は７４．７日であった。
【００７１】
図１３Ｂに示すように、未処置マウスにおける２ＬＭＰ腫瘍の平均サイズは８．６日で倍になったことから、この悪性度の高い同所性腫瘍モデルの迅速な増殖が示される。アブラキサン単独での処置によって１／１０の完全な腫瘍退縮がもたらされ、腫瘍倍加時間は４６．２日に延長された。２ＬＭＰ異種移植に対する単独薬剤としてアドリアマイシンはアブラキサンよりもさらに有効であり、腫瘍倍加時間は５１．１日に増大した。ＴＲＡ−８単独での処置によって２ＬＭＰ腫瘍の増殖は有意に阻害され、腫瘍倍加時間は５８．４日に延長され、２／１０の完全な腫瘍退縮がもたらされた。ＴＲＡ−８とアドリアマイシンとの併用処置によって平均腫瘍サイズの有意な減少がもたらされ、平均腫瘍倍加時間は７８．２日に延長された。ＴＲＡ−８とアブラキサンとの併用処置は最も有効な措置であり、平均倍加時間は８７．２日に延長され、２／９の完全な腫瘍退縮がもたらされた。これらの結果により、基底細胞Ｂ型腫瘍の異種移植に対して化学療法剤をＴＲＡ−８と併用して用いることの、ｉｎ  ｖｉｖｏでの増強された有効性が示される。
ＴＲＡ−８、アブラキサン、およびＡＴ−４０６のｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性
２ＬＭＰ腫瘍を有するマウスをＴＲＡ−８およびＡＴ−４０６、ＴＲＡ−８およびアブラキサン、またはＴＲＡ−８とアブラキサンおよびＡＴ−４０６で処置することにより、ＴＲＡ−８、アブラキサン、またはＡＴ−４０６単独による処置に比較して腫瘍倍加時間は延長した（図１４）。これらの結果により、ＡＴ−４０６の添加によって腫瘍の阻害は増強されることが示される。
【図６Ａ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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