(57)【要約】【課題】本発明は、プログラム細胞死１（ＰＤ１）シグナル伝達経路を阻害することが可能な免疫抑制化合物を提供する。【解決手段】本発明は更に、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２によって引き起こされる免疫抑制シグナリングの阻害による免疫増強によって癌を治療又は感染を治療するためのペプチドベースの組成物、及びそれらを用いた治療（免疫増強基質を有効成分として含む）。更に、本発明は、癌、癌転移、免疫不全、感染症等の予防及び／又は治療薬のための前記ペプチド部分を含む組成物の適用、及び前記ペプチド部分の、疾患の試験又は診断又は研究薬としての適用を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉに表される化合物又はその薬剤的に許容可能な塩であって、
【化１】
2013534922.tif 000080
少なくとも５つのアミノ酸を含む化合物。
式中、Ａは、ＦＧループ、ＢＣループ、Ｃ−Ｃ’ループ、Ｃストランド、Ｃ’ストランドからＣ’−Ｃ’’ループ、ＣＣ’ループからＣ’ストランドより選択される哺乳類のＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上ペプチド配列完全長以下のアミノ酸配列であるか、又はＧｌｕ−Ａｓｐであるか、又は不存在であり、
Ｂは、ＢＣループ、ＦＧループ、ＣＣ’ループからＣ’ストランド、Ｃストランド、Ｄストランド、Ｃ’ストランドからＣ’−Ｃ’’ループより選択される哺乳類のＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上ペプチド配列完全長以下のアミノ酸配列であるか、又はＧｌｕ−Ａｓｐであるか、又は不存在であり、
Ｚは以下の（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）であり、
（ｉ）任意の順序で配列された１〜４のペプチド配列であって、それぞれが、ＢＣループ、Ｄストランド、ＦＧループ、Ｇストランド、Ｃストランド、Ｆストランド、Ｃ’ストランド、Ｃ”ストランド、Ｃ”−Ｄループ、Ｃ’ストランドからＣ’−Ｃ’’ループ、Ｃ’ストランドからＣ’’ストランド又はＤストランドからＤＥループより選択される哺乳類のＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上完全長以下であるもの、
（ｉｉ）Ｇ−Ｌ−Ｚ’
式中、Ｇは、Ｄストランドより選択される哺乳類のＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上ペプチド配列完全長以下のアミノ酸配列であるか、又は不存在であり、
Ｌは、−ＣＯ（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−又はＰＥＧ２−２０ＫＤから選択され、
「ｎ」は２〜１０から選択される整数であり、
Ｚ’は、任意の順序で配列された１〜３のペプチド配列であって、それぞれがＦＧループ及びＧストランドより選択される哺乳類のＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上完全長以下であるもの、
（ｉｉｉ）任意の順序で配列された１〜４のペプチド配列であって、それぞれがＤ−ストランド、ＦＧループ及びＧストランドより選択される哺乳類のＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上完全長以下であり、前記ペプチド配列の２以上のアミノ酸は結合して、前記２以上の断片のいずれかの間で又は前記断片内でラクタム結合を形成するもの、
Ｄは任意の順序で配列された２以下のペプチド配列であって、それぞれが、ＢＣループ、ＦＧループ、ＣＣ’ループからＣ’ストランドより選択される哺乳類のＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上完全長以下であるか、又は不存在であり、
Ｅは任意の順序で配列された４以下のペプチド配列であって、それぞれが、ＢＣループ、Ｄストランド、ＦＧループ、ＣＣ’ループからＣ’ストランド、Ｇストランド、ＦＧループからＧストランドより選択される哺乳類のＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上完全長以下であるか、又は不存在であり、
Ｘ及びＸ’は、リジン、オルニチン、ジアミノプロピオン酸、ジアミノ酪酸又は下記式のオレフィンアミノ酸から独立して選択され、随意に更なるリジンと結合しているか、又は
【化２】
2013534922.tif 000081
Ｘ及びＸ’は結合して、随意に更なるリジンと結合しているオレフィンアミノ酸と環を形成しているか、又は
Ｘ又はＸ’の１つは、不存在である又は両方が不存在であり、
「ｍ」は１〜６から選択される整数であり、
Ｒ１は、Ｃ２−Ｃ２０アシル、ＰＥＧ２−２０ＫＤ部分からなる群より選択されるか、又は不存在であり、
Ｒ２及びＲ３は、Ｃ２−Ｃ２０アシル、ＰＥＧ２−２０ＫＤ、不存在又はＲａ−Ｌ’からなる群より独立して選択され、
Ｒａはビオチン又はマレイミドプロピオン酸から選択され、
Ｌ’はリンカーである−ＣＯ（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−、−ＣＯ（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎＮＨ又は−ＣＯＣＨ２（−ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｎＮＨ−から選択され、及び
「ｎ」は２〜１０から選択される整数であり、
Ｒ４及びＲ５は、独立してＮＨ２であるか、又はＲ４又はＲ５の１つ又は両方が不存在であり、
式Ｉの化合物は、以下の条件を有し、上記に定義した式Ｉの化合物において、
ａ）前記アミノ酸の５％以上２５％以下は、他の天然又は非天然アミノ酸と置換されてもよく、
ｂ）前記アミノ酸の３０％以下は除かれてもよく、
ｃ）それぞれの前記ペプチド配列において、２以下のアミノ酸をいずれの位置に独立して追加してもよく、
ｄ）前記ペプチド結合の５％以上２５％以下は代わりに還元されたアミド結合（−ＣＨ２ＮＨ−）で置換されてもよく、
ｅ）前記アミノ酸の１００％以下はＤ−アミノ酸であってもよく、
ｆ）前記アミノ酸の１００％以下は逆順であってもよい。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物であって、前記哺乳類のＰＤ１細胞外領域断片が、ヒト、マウス、イヌ、ウマ又はラットＰＤ１から選択されることを特徴とする化合物。
【請求項３】
請求項１に記載の化合物であって、
Ａは、下記表に示されるＦＧループ、ＢＣループ、Ｃ−Ｃ’ループ、Ｃストランド、Ｃ’ストランドからＣ’−Ｃ’’ループ、ＣＣ’ループからＣ’ストランドより選択されるヒト又はマウスのＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上ペプチド配列完全長以下のアミノ酸配列であるか、又はＧｌｕ−Ａｓｐであるか、又は不存在であり、
【表１】
2013534922.tif 000082
Ｂは、下記表に示されるＢＣループ、ＦＧループ、ＣＣ’ループからＣ’ストランド、Ｃストランド、Ｄストランド、Ｃ’ストランドからＣ’−Ｃ’’ループより選択されるヒト又はマウスのＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上ペプチド配列完全長以下のアミノ酸配列であるか、又はＧｌｕ−Ａｓｐであるか、又は不存在であり、
【表２】
2013534922.tif 000083
Ｚは以下の（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）であり、
（ｉ）任意の順序で配列された１〜４のペプチド配列であり、それぞれが、ＢＣループ、Ｄストランド、ＦＧループ、Ｇストランド、Ｃストランド、Ｆストランド、Ｃ’ストランド、Ｃ”ストランド、Ｃ”−Ｄループ、Ｃ’ストランドからＣ’−Ｃ’’ループ、Ｃ’ストランドからＣ’’ストランド又はＤストランドからＤＥループより選択されるヒト又はマウスのＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上完全長以下であるもの、
（ｉｉ）Ｇ−Ｌ−Ｚ’
式中、Ｇは、Ｄストランドより選択されるヒト又はマウスのＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上ペプチド配列完全長以下のアミノ酸配列であるか、又は不存在であり、Ｌは、−ＣＯ（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−又はＰＥＧ２−２０ＫＤから選択され、「ｎ」は２〜１０から選択される整数であり、Ｚ’は、任意の順序で配列された１〜３のペプチド配列であり、それぞれがＦＧループ及びＧストランドより選択されるヒト又はマウスのＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上完全長以下であるもの、
（ｉｉｉ）任意の順序で配列された１〜４のペプチド配列であって、それぞれがＤストランド、ＦＧループ及びＧストランドより選択されるヒト又はマウスのＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上完全長以下であり、前記ペプチド配列の２以上のアミノ酸は結合して、前記２以上の断片のいずれかの間で又は前記断片内でラクタム結合を形成するもの、
前記断片は下記表に規定されるものであり、
【表３】
2013534922.tif 000084
Ｄは任意の順序で配列された２以下のペプチド配列であって、それぞれが、ＢＣループ、ＦＧループ、ＣＣ’ループからＣ’ストランドより選択されるヒト又はマウスのＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上完全長以下であるか、又は不存在であり、
【表４】
2013534922.tif 000085
Ｅは任意の順序で配列された４以下のペプチド配列であって、それぞれが、ＢＣループ、Ｄストランド、ＦＧループ、ＣＣ’ループからＣ’ストランド、Ｇストランド、ＦＧループからＧストランドより選択されるヒト又はマウスのＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上完全長以下であるか、又は不存在であり、
【表５】
2013534922.tif 000086
Ｘ及びＸ’は、リジン、オルニチン、ジアミノプロピオン酸、ジアミノ酪酸又は下記式のオレフィンアミノ酸から独立して選択され、随意に更なるリジンと結合しているか、又は
【化３】
2013534922.tif 000087
Ｘ及びＸ’は結合して、随意に更なるリジンと結合しているオレフィンアミノ酸と環を形成しているか、又は
Ｘ又はＸ’の１つは、不存在である又は両方が不存在である、
「ｍ」は１〜６から選択される整数であり、
Ｒ１はＣ２−Ｃ２０アシル、ＰＥＧ２−２０ＫＤ部分からなる群より選択されるか、又は不存在であり、
Ｒ２及びＲ３は、Ｃ２−Ｃ２０アシル、ＰＥＧ２−２０ＫＤ、不存在又はＲａ−Ｌ’からなる群より独立して選択され、
Ｒａはビオチン又はマレイミドプロピオン酸から選択され、
Ｌ’はリンカーである−ＣＯ（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−、−ＣＯ（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎＮＨ又は−ＣＯＣＨ２（−ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｎＮＨ−から選択され、及び
「ｎ」は２〜１０から選択される整数であり、
Ｒ４及びＲ５は、独立してＮＨ２であるか、又はＲ４又はＲ５の１つ又は両方が不存在である、
式Ｉの化合物は、以下の条件を有し、上記に定義した式Ｉの化合物において、
ａ）前記アミノ酸の５％以上２５％以下は、他の天然又は非天然アミノ酸と置換されてもよく、
ｂ）前記アミノ酸の３０％以下は除かれてもよく、
ｃ）それぞれの前記ペプチド配列において、２以下のアミノ酸をいずれの位置に独立して追加してもよく、
ｄ）前記ペプチド結合の５％以上２５％以下は代わりに還元されたアミド結合（−ＣＨ２ＮＨ−）で置換されてもよく、
ｅ）前記アミノ酸の１００％以下はＤ−アミノ酸であってもよく、
ｆ）前記アミノ酸の１００％以下は逆順であってもよい。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか１項に記載の化合物であって、Ｚは前記ペプチド配列の１つからなり、少なくともＡ、Ｂ、Ｄ又はＥの１つは不存在ではないことを特徴とする化合物。
【請求項５】
請求項１乃至３のいずれか１項に記載の化合物であって、Ａ、Ｂ、Ｄ及びＥが不存在である場合、Ｚが２〜４の前記ペプチド配列を含むことを特徴とする化合物。
【請求項６】
請求項１乃至３のいずれか１項に記載の化合物であって、ＺがＤストランド、ＦＧループ及びＧストランドの組み合わせであることを特徴とする化合物。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載の化合物であって、Ｘがリジンであり、Ｘ’が不存在であることを特徴とする化合物。
【請求項８】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載の化合物であって、Ｘ及びＸ’の両方がリジンであることを特徴とする化合物。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれか１項に記載の化合物であって、Ｒ２及びＲ３がＣ２−Ｃ２０アシル、又はＲａ−Ｌ’から選択されることを特徴とする化合物。
式中、Ｒａはマレイミドプロピオン酸であり、
Ｌ’は−ＣＯＣＨ２（−ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｎＮＨ−であり、
「ｎ」は２〜１０から選択される整数である。
【請求項１０】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載の化合物であって、Ｘ’、Ｄ、Ｅ及びＲ５が不存在で、Ｒ４がＮＨ２であることを特徴とする化合物。
【請求項１１】
以下より選択される化合物。
【表６】
2013534922.tif 000088
【表７】
2013534922.tif 000089
【表８】
2013534922.tif 000090
【表９】
2013534922.tif 000091
【表１０】
2013534922.tif 000092
【表１１】
2013534922.tif 000093
【表１２】
2013534922.tif 000094
【表１３】
2013534922.tif 000095
【請求項１２】
請求項３項に記載の化合物であって、式（Ｉａ）で表される化合物又はその薬剤的に許容可能な塩。
【化４】
2013534922.tif 000096
式中、
Ａは、ＦＧループ、ＢＣループ、Ｃ’ストランド、Ｃ−Ｃ’ループ、Ｃストランド、Ｃ’ストランドからＣ’−Ｃ’’ループより選択されるヒト又はマウスＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上ペプチド配列完全長以下のアミノ酸配列であるか、又は不存在であり、
Ｂは、ＢＣループ、ＦＧループ、Ｃ−Ｃ’ループからＣ’ストランド、Ｃストランド、Ｄストランド、Ｃ’ストランドからＣ’−Ｃ’’ループより選択されるヒト又はマウスＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上ペプチド配列完全長以下のアミノ酸配列であるか、又は不存在であり、
Ｚは任意の順序で配列された１〜３のペプチド配列であって、それぞれが、Ｄストランド、ＦＧループ、Ｇストランド、Ｃストランド及びＦストランドより選択されるヒト又はマウスＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上ペプチド配列完全長以下であり、
Ｘはリジンである。
【請求項１３】
請求項１２項に記載の化合物であって、Ａ及びＢが独立して、前記ＢＣループのアミノ酸３つ以上完全長以下のアミノ酸配列であることを特徴とする化合物。
【請求項１４】
請求項１３項に記載の化合物であって、Ａ及びＢが独立して、完全長の前記ＢＣループであることを特徴とする化合物。
【請求項１５】
請求項１２項に記載の化合物であって、ＺがＤストランド−ＦＧループ−Ｇストランドであることを特徴とする化合物。
【請求項１６】
請求項１２項に記載の化合物であって、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が不存在であることを特徴とする化合物。
【請求項１７】
請求項１２項に記載の化合物であって、Ｒ３がＣ１６−アシルであることを特徴とする化合物。
【請求項１８】
請求項１２項に記載の化合物であって、３以上のアミノ酸がＤ−アミノ酸であることを特徴とする化合物。
【請求項１９】
請求項１２項に記載の化合物であって、全てのアミノ酸がＤ−アミノ酸であることを特徴とする化合物。
【請求項２０】
請求項１２項に記載の化合物であって、３以上の還元されたアミド結合（−ＣＨ２ＮＨ−）を有することを特徴とする化合物。
【請求項２１】
請求項１に記載の式Ｉに表される化合物又はその薬剤的に許容可能な塩であって、薬剤として用いられることを特徴とする化合物。
【請求項２２】
請求項１に記載の式Ｉに表される化合物又はその薬剤的に許容可能な塩であって、癌又は感染症の治療のための薬剤として用いられることを特徴とする化合物。
【請求項２３】
請求項１に記載の式Ｉに表される化合物又はその薬剤的に許容可能な塩及び薬剤的に許容可能な希釈剤又はキャリアを含む医薬組成物。
【請求項２４】
被験体におけるＰＤ−１シグナル伝達経路を介した免疫反応を調節する方法であって、前記被験体に、前記被検体における免疫反応が調節されて治療効果のある量の請求項１〜２０に記載の化合物を投与する工程を含む方法。
【請求項２５】
被験体における腫瘍細胞及び／又は転移の成長を抑制する方法であって、前記被験体に、プログラム細胞死１（ＰＤ１）シグナル伝達経路を阻害可能な治療効果のある量の請求項１〜２０のいずれか１項に記載の化合物を投与する工程を含む方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、前記腫瘍細胞が、黒色腫、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、結腸癌及び肺癌からなる群より選択される癌であることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項２５に記載の方法であって、前記腫瘍細胞が、骨肉腫、脾臓癌、皮膚癌、頭部又は頸部の癌、皮膚又は眼球悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、頸部癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病などの慢性又は急性白血病、小児期固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓又は尿管癌、腎盂癌、中枢神経系腫瘍（ＣＮＳ）、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍の血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類上皮癌、扁平上皮細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストによって引き起こされるものなど環境によって引き起こされる癌、及びこれらの癌の組み合わせからなる群より選択される癌であることを特徴とする方法。
【請求項２８】
被験体における感染症を治療する方法であって、前記被験体に、プログラム細胞死１（ＰＤ１）シグナル伝達経路を阻害可能な、前記被検体の前記感染症が治療されて治療効果のある量の請求項１〜２０のいずれか１項に記載の化合物を投与する工程を含む方法。
【請求項２９】
被験体における細菌性及びウイルス性感染を治療する方法であって、前記被験体に、プログラム細胞死１（ＰＤ１）シグナル伝達経路を阻害可能な、前記被検体の前記細菌性及びウイルス性感染が治療されて治療効果のある量の請求項１〜２０のいずれか１項に記載の化合物を投与する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は２０１０年６月２５日に出願したインド仮出願番号１８０５／ＣＨＥ／２０１０及び２０１０年９月１０日に出願した米国仮出願番号６１／３８１，５９３の優先権を主張し、これらは全て参照によりここに組み込まれる。
【０００２】
本発明は、式Ｉで表される新規のペプチド化合物又その薬剤的に許容可能な塩に関し、該化合物はプログラム細胞死１（ＰＤ１）シグナル伝達経路を阻害することができる治療薬として有用な、少なくとも５つのアミノ酸を含む。
【０００３】
【化１】
2013534922.tif 000002
【０００４】
また、本発明は、前記治療薬の修飾体及び誘導体に関する。
【０００５】
更に本発明は、前記式Ｉで表される新規のペプチド化合物又はその薬剤的に許容可能な塩を治療薬として含む医薬組成物に関する。
【０００６】
本発明の化合物は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２により誘導される免疫抑制シグナルの阻害を含む免疫増強に利点がある場合の特定の疾患又は関連疾患に関する治療に有用である。
【０００７】
本発明は、プログラム細胞死１（ＰＤ１）シグナル伝達経路を阻害することができる治療薬としての新規のペプチドに関する。
【０００８】
また、本発明は、前記治療薬の修飾体及び誘導体に関する。
【０００９】
更に本発明は、前記新規のペプチド及びその誘導体を治療薬として含む医薬組成物に関する。
【００１０】
また、本発明は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、又はＰＤ−Ｌ２により誘導される免疫抑制シグナルの阻害を含む免疫増強を通じた疾患の治療のための前記治療薬、修飾体及び誘導体の使用を包含する。
【背景技術】
【００１１】
プログラム細胞死１又はＰＤ−１（ＰＤＣＤ１と呼ぶこともある）は５０〜５５ｋＤタイプＩ膜糖タンパク質（非特許文献１）である。ＰＤ−１は、特定のリガンドと相互作用することによってＴ細胞抗原受容体シグナリングをネガティブに制御するＣＤ２８スーパーファミリーの受容体であり、自己寛容を維持する役割を果たすと考えられている。
【００１２】
ＰＤ−１ペプチドは、自己免疫、腫瘍免疫、感染免疫、移植免疫、アレルギー及び免疫学的特権を含む免疫反応のほぼ全てのアスペクトに関係する。
【００１３】
前記ＰＤ−１タンパク質の構造は、
・細胞外ＩｇＶドメイン、続いて
・膜貫通領域、及び
・細胞内テールを含む。
【００１４】
前記細胞内テールは免疫受容抑制性チロシンモチーフ及び免疫受容スイッチチロシンモチーフに位置する２つのリン酸化部位を含み、これはＰＤ−１がＴＣＲシグナルをネガティブに制御することを示唆している。また、ＰＤ−１は活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞及びマクロファージの表面に発現され（非特許文献２）、これはＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＤ１５２（表面抗原分類１５２）としても知られている）は、免疫系で重要な調節をする役割も果たすタンパク質である）と比較して、ＰＤ−１がより幅広く免疫反応をネガティブに制御することを示唆している。
【００１５】
ＰＤ−１は、２つのリガンド、ＰＤ−Ｌ１（プログラム死リガンド１又はＰＤＣＤ１Ｌ１又はＢ７−Ｈ１）（非特許文献３）及びＰＤ−Ｌ２（プログラム死リガンド２又はＰＤＣＤ１Ｌ２又はＢ７−ＤＣ）（非特許文献４）を有し、これらはＢ７ファミリーのメンバーである。ＰＤ−Ｌ１は、免疫細胞に発現されるだけでなく、ある種の癌化細胞株（例えば、単球白血病由来細胞株、肥満細胞腫瘍由来細胞株、血腫由来細胞株、神経芽細胞腫由来細胞株、及び種々の乳腺腫瘍由来細胞株）においても、種々のヒト癌組織に由来する癌細胞（非特許文献４）においても、及びＩＦＮ−γを用いた治療の際のＰＡ１骨髄腫、Ｐ８１５肥満細胞腫及びＢ１６黒色腫を含むほとんど全てのマウス癌化細胞株（非特許文献５及び非特許文献６）においても発現されることが知られている。同様に、ＰＤ−Ｌ２発現はより限定的であり、主に樹状細胞及びいくつかの癌化細胞株によって発現される。ＰＤ−Ｌ２発現はホジキンリンパ腫細胞株などにおいて確認されている。いくつかの癌又は腫瘍細胞は、それら自身へのＴ細胞免疫反応を抑制又はインターセプトするために、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２との間の相互作用を利用するという仮説がある（非特許文献７）。
【００１６】
腫瘍細胞及びウイルス（ＨＣＶ及びＨＩＶを含む）感染細胞は、ホストＴ細胞による免疫監視機構から逃れるために、ＰＤ−１のリガンドを発現することが知られている（免疫抑制を作り出すために）。ＰＤ−１遺伝子は、全身性紅斑性狼瘡など自己免疫疾患の原因である遺伝子の１つであることが報告されている（非特許文献８）。ＰＤ−１欠損マウスが糸球体腎炎及び関節炎などの狼瘡自己免疫疾患（非特許文献９、非特許文献１０）及び拡張型心筋症様疾患を発症するという理由で、ＰＤ−１は自己免疫疾患の発病のため（特に末梢自己寛容のため）の制御因子として機能すると示されている（非特許文献１１）。
【００１７】
したがって、１つのアプローチにおいては、ＰＤ−１とそのリガンド（ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２又は両方）との相互作用のブロッキングは、特定の腫瘍及びウイルスの免疫療法に効果的な方法を提供するかもしれない。
【００１８】
特許文献１は、ＰＤ−１を発現している免疫細胞を、ＰＤ−１に結合している抗体に、マルチバレントな態様で接触させる工程を含む免疫反応を下方制御する方法を開示しており、ネガティブなシグナルがＰＤ−１を介して形質導入され、これにより免疫反応が下方制御される。そのような抗体はＰＤ−１に架橋した抗体又はＰＤ−１に固定化された抗体であってもよい。
【００１９】
特許文献２及びその分割出願である特許文献３は、単離した核酸分子、指定のＢ７−４核酸分子（新規のＢ７−４ポリペプチドをエンコードするもの）、単離したＢ７−４タンパク質、融合タンパク質、抗原性ペプチド及びアンチＢ７−４抗体（ポリペプチドが第１面に存在し、Ｔ細胞受容体を介して活性化シグナルを伝達する抗原又は多クローン性活性化因子が異なる第２面に存在する時にインヴィトロでＴ細胞増殖を同時刺激するもの）を開示している。
【００２０】
ＰＤ−１の免疫抑制活性又はＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２との間の相互作用を阻害する物質、及びその使用についていくつかの報告がある。ＰＤ−１阻害抗体又はＰＤ−１阻害ペプチドのコンセプトについては特許文献４、特許文献５、及び特許文献６において報告されている。一方、ＰＤ−Ｌ１阻害抗体又はＰＤ−Ｌ１阻害ペプチドは、特許文献７、特許文献８、特許文献９及び特許文献１０に報告されている。ＰＤ−Ｌ２阻害抗体又はＰＤ−Ｌ２阻害ペプチドは特許文献８及び特許文献１１に報告されている。
【００２１】
特許文献１２には、高い親和性でＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する単離したヒトモノクローナル抗体が記載されている。アンチＰＤ−Ｌ１抗体を用いた癌を含む様々な疾患を治療する方法をが開示されている。
【００２２】
特許文献１３はマルチマー、特にＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１の細胞外領域の四量体について説明している。この出願は治療用ペプチドを説明している。
【００２３】
更に、前記明細書には、例えば患者における同時刺激を変えることなどによって病気を治療するために、ペプチドを治療用に用いることができると記載されている。単離したＢ７−４又はＰＤ−１タンパク質、又はその一部若しくは断片（又はそのようなポリペプチドをエンコードする核酸分子）を、ポリクローナル及びモノクローナル抗体を調製する標準的な技術を用いて、Ｂ７−４又はＰＤ−１と結合する抗体を発生させるための免疫原として用いることができる。完全長のＢ７−４又はＰＤ−１タンパク質を用いることができる。または代わりに、前記発明は免疫原として使用するためのＢ７−４又はＰＤ−１の抗原性ペプチド断片を提供する。Ｂ７−４又はＰＤ−１の抗原性ペプチドは少なくとも８つのアミノ酸残基を含み、Ｂ７−４又はＰＤ−１のエピトープを包含し、ペプチドに対して発生した抗体はＢ７−４又はＰＤ−１と特定の免疫複合体を形成する。抗原性ペプチドは好ましくは少なくとも１０のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１５のアミノ酸残基、更に好ましくは少なくともアミノ酸残基、最も好ましくは少なくとも３０のアミノ酸残基を含む。
【００２４】
特許文献１４はＰＤ−１を介したシグナルの存在下でＴ細胞活性化を上方制御する化合物を特定する方法を開示及び請求している。また、前記発明の組成物を利用した診断及び治療方法が提供されている。
【００２５】
更に、特許文献１５は、ＰＤ−Ｌ２とＰＤ−１との間の相互作用を抑制する薬で免疫反応を上方制御する方法を包含しているものである。
【００２６】
しかし上述したように多くの開示が存在するにも関わらず、治療の分野において代替となる治療薬として効果的なペプチド又は修飾したペプチドがないため、重要で満たされていない医学的ニーズが未だ存在する。例えばより新しい技術による製造の容易性、より高い純度と細胞物質による汚染の欠如、低い免疫原性、向上した効能及び選択性など、合成ペプチドは抗体に対する一定の優れた効果を発揮することが知られている。ペプチドは抗体よりも安定し、良好な保存性を発揮するだろう。更に、ペプチドは抗体と比べて良好な組織透過性をしばしば有し、そのためより良好な有効性を有する結果と成り得る。ペプチドは、より程度の低い毒性及び低い薬物間相互作用の可能性など、小分子治療用カウンターパートに対する確かな優れた効果を発揮することもできる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２７】
【特許文献１】ＵＳ６，８０８，７１０（Wood et al）
【特許文献２】ＵＳ６９３６７０４（Freeman et al）
【特許文献３】ＵＳ７０３８０１３（Freeman et al）
【特許文献４】ＷＯ０１／１４５５７
【特許文献５】ＷＯ２００４／００４７７１
【特許文献６】ＷＯ２００４／０５６８７５
【特許文献７】ＷＯ０２／０７９４９９
【特許文献８】ＷＯ０３／０４２４０２
【特許文献９】ＷＯ２００２／０８６０８３
【特許文献１０】ＷＯ２００１／０３９７２２
【特許文献１１】ＷＯ０２／００７３０
【特許文献１２】ＷＯ２００７００５８７４
【特許文献１３】ＵＳ２００９／０３０５９５０
【特許文献１４】ＵＳ７４３２０５９（Freeman et al）
【特許文献１５】ＵＳ７，７０９，２１４（Freeman et al）
【非特許文献】
【００２８】
【非特許文献１】Shinohara T et al, Genomics, 1994、Vol. 23, No. 3, pp. 704-706
【非特許文献２】Y. Agata et al., Int Immunol 8, 765, May 1996
【非特許文献３】Freeman GJ et al, Journal of Experimental Medicine, 2000, Vol. 19, No. 7, pp. 1027-1034
【非特許文献４】Latchman Y et al, Nature Immunology, 2001, Vol. 2, No. 3, pp. 261-267
【非特許文献５】Y. Iwai et al., Proc Natl Acad Sci U S A 99, 12293, Sep 17, 2002
【非特許文献６】C. Blank et al., Cancer Res 64, 1140, Feb, 2004
【非特許文献７】Iwai Y et al, Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, 2002, Vol. 99, No. 19, pp. 12293-12297
【非特許文献８】Prokunina et al, Naturegenetics, 2002, Vol. 32, No. 4, 666-669
【非特許文献９】Nishimura H et al, International Immunology, 1998, Vol. 10, No. 10, pp. 1563-1572
【非特許文献１０】Nishimura H et al, Immunity, 1999, Vol. 11, No. 2, pp. 141-151
【非特許文献１１】Nishimura H et al, Science, 2001, Vol. 291, No. 5502, pp. 319-332
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
本発明は、したがって、ＰＤ１細胞外領域に基づく新規の合成ペプチド及びその誘導体を提供することによって、この満たされていない医学的ニーズの解決方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
本発明によって、プログラム細胞死１（ＰＤ１）シグナル伝達経路を抑制及び／又は阻害することができる新規の修飾したペプチドが提供される。
【００３１】
本発明の１つのアスペクトは、式Ｉに表される化合物又はその薬剤的に許容可能な塩の構造を提供する。
【００３２】
【化２】
2013534922.tif 000003
【００３３】
前記化合物は、少なくとも５つのアミノ酸を含み、式中、
Ａは、ＦＧループ、ＢＣループ、Ｃ−Ｃ’ループ、Ｃストランド、Ｃ’ストランドからＣ’−Ｃ’’ループ、ＣＣ’ループからＣ’ストランドより選択される哺乳類のＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上ペプチド配列完全長以下のアミノ酸配列であるか、又はＧｌｕ−Ａｓｐであるか、又は不存在であり、
Ｂは、ＢＣループ、ＦＧループ、ＣＣ’ループからＣ’ストランド、Ｃストランド、Ｄストランド、Ｃ’ストランドからＣ’−Ｃ’’ループより選択される哺乳類のＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上ペプチド配列完全長以下のアミノ酸配列であるか、又はＧｌｕ−Ａｓｐであるか、又は不存在であり、
Ｚは以下の（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）であり、
（ｉ）任意の順序で配列された１〜４のペプチド配列であって、それぞれが、ＢＣループ、Ｄストランド、ＦＧループ、Ｇストランド、Ｃストランド、Ｆストランド、Ｃ’ストランド、Ｃ”ストランド、Ｃ”−Ｄループ、Ｃ’ストランドからＣ’−Ｃ’’ループ、Ｃ’ストランドからＣ’’ストランド又はＤストランドからＤＥループより選択される哺乳類のＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上完全長以下であるもの、
（ｉｉ）Ｇ−Ｌ−Ｚ’
式中、Ｇは、Ｄストランドより選択される哺乳類のＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上ペプチド配列完全長以下のアミノ酸配列であるか、又は不存在であり、Ｌは、−ＣＯ（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−又はＰＥＧ２−２０ＫＤから選択され、「ｎ」は２〜１０から選択される整数であり、Ｚ’は、任意の順序で配列された１〜３のペプチド配列であり、それぞれがＦＧループ及びＧストランドより選択される哺乳類のＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上完全長以下であるもの、又は
（ｉｉｉ）任意の順序で配列された１〜４のペプチド配列であって、それぞれがＤ−ストランド、ＦＧループ及びＧストランドより選択される哺乳類のＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上完全長以下であり、前記ペプチド配列の２以上のアミノ酸は結合して、前記２以上の断片のいずれかの間で又は前記断片内でラクタム結合を形成するもの、
Ｄは任意の順序で配列された２以下のペプチド配列であって、それぞれが、ＢＣループ、ＦＧループ、ＣＣ’ループからＣ’ストランドより選択される哺乳類のＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上完全長以下であるか、又は不存在であり、
Ｅは任意の順序で配列された４以下のペプチド配列であって、それぞれが、ＢＣループ、Ｄストランド、ＦＧループ、ＣＣ’ループからＣ’ストランド、Ｇストランド、ＦＧループからＧストランドより選択される哺乳類のＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上完全長以下であるか、又は不存在であり、
Ｘ及びＸ’は、リジン、オルニチン、ジアミノプロピオン酸、ジアミノ酪酸又は下記式のオレフィンアミノ酸から独立して選択され、随意に更なるリジンと結合しているか、又は
【００３４】
【化３】
2013534922.tif 000004
【００３５】
Ｘ及びＸ’は結合して、随意に更なるリジンと結合しているオレフィンアミノ酸と環を形成しているか、又は
Ｘ又はＸ’の１つは、不存在である又は両方が不存在であり、
「ｍ」は１〜６から選択される整数であり、
Ｒ１は、Ｃ２−Ｃ２０アシル、ＰＥＧ２−２０ＫＤ部分からなる群より選択されるか、又は不存在であり、
Ｒ２及びＲ３は、Ｃ２−Ｃ２０アシル、ＰＥＧ２−２０ＫＤ、不存在又はＲａ−Ｌ’からなる群より独立して選択され、
Ｒａはビオチン又はマレイミドプロピオン酸から選択され、
Ｌ’はリンカーである−ＣＯ（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−、−ＣＯ（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎＮＨ又は−ＣＯＣＨ２（−ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｎＮＨ−から選択され、及び
「ｎ」は２〜１０から選択される整数であり、
Ｒ４及びＲ５は、独立してＮＨ２であるか、又はＲ４又はＲ５の１つ又は両方が不存在であり、
式Ｉの化合物は、以下の条件を有し、上記に定義した式Ｉの化合物において、
ａ）前記アミノ酸の５％以上２５％以下は、他の天然又は非天然アミノ酸と置換されてもよく、
ｂ）前記アミノ酸の３０％以下は除かれてもよく、
ｃ）それぞれの前記ペプチド配列において、２以下のアミノ酸をいずれの位置に独立して追加してもよく、
ｄ）前記ペプチド結合の５％以上２５％以下は代わりに還元されたアミド結合（−ＣＨ２ＮＨ−）で置換されてもよく、
ｅ）前記アミノ酸の１００％以下はＤ−アミノ酸であってもよく、
ｆ）前記アミノ酸の１００％以下は逆順であってもよい。
【００３６】
本発明の他のアスペクトにおいては、疾患又は障害の治療又は予防に有用な式Ｉで表される化合物を提供し、プログラム細胞死１（ＰＤ１）シグナル伝達経路の阻害及びＰＤ−１に結合するＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２を低減する能力、その結果のＰＤ−１による免疫抑制シグナリングに利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ＨＥＫ２９３細胞を発現するｈＰＤＬ２を用いた、ＰＤ１のＰＤ−Ｌ２への結合の阻害のアッセイにおける化合物８の効能測定。
【図２】化合物８による、ラットＰＢＭＣ増殖のＰＤＬ１を介した阻害の抑止（abrogation）。
【図３】ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路において、ラットＰＢＭＣ増殖アッセイにおける化合物８のＥＣ５０測定。
【図４】様々な化合物による、ヒトＰＤＬ１におけるヒトＰＢＭＣ増殖の回復。
【図５】化合物８、１３及び３４とＪ４３抗体の間のマウス脾細胞増殖レスキュー率（パーセンテージ）の比較。
【図６】細胞毒性Ｔリンパ球分析におけるＩＦＮ−γ産生に対する様々なテスト化合物の効果。
【図７】皮下注射したＢ１６Ｆ１０細胞の腫瘍増殖抑制に対する化合物８の効果。
【図８】静脈内注射したＢ１６Ｆ１０細胞の肺転移に対する化合物８の効果。
【図９】Ｂ１６Ｆ１０モデルにおける肺転移に対する様々な化合物の効果。
【図１０】乳腺脂肪体に同所性注入された４Ｔ１細胞の腫瘍増殖抑制に対する化合物８の効果。
【図１１】ＲＥＮＣＡ細胞を同所性注入した腎臓における腫瘍量の低減に対するペプチドの効果。
【図１２】大腸菌性敗血症モデルに対する化合物８のインビボの有効性。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
ここで「ペプチド」は、ペプチド結合又は還元されたペプチド結合によって配列に結合された天然又は非天然アミノ酸の配列を示すために用いられる。
【００３９】
ここで用いられる「化合物」は、本発明で開示されるペプチドを含む。
【００４０】
本明細書を通して以下のアミノ酸の一般的な略語が使用されている。
【００４１】
【表１】
2013534922.tif 000005
【００４２】
小文字コードはＤ−アミノ酸を表すために本明細書を通して使用されている。
【００４３】
後述されるペプチドの修飾及び関連するところは、Ｄ−アミノ酸によるいくつか又は全てのＬ−アミノ酸の置換、α−アミノ基以外におけるアミノ酸の結合（側鎖アミノ又はカルボキシル基における等）、ペプチド配列間の非ペプチドリンカーの含有、架橋、脂質化、ステープリング、及びＰＥＧ化を含む。
【００４４】
後述するペプチドの修飾及び関連するところは、更に、２つのアミノ酸の間の修飾ペプチド結合を含み、２つのアミノ酸の間の典型的なペプチド結合（−ＣＯＮＨ−）は、還元されたアミド結合（−ＣＨ２ＮＨ−）で置換されている。これは従来の表記方法を用いて、Ψ［ＣＨ２ＮＨ］（記号「Ψ」は修飾ペプチド結合を表す）と特徴付けられる。
【００４５】
ここで用いられているように、「非天然アミノ酸」は、天然に産生されないアミノ酸である（例えば、遺伝子コードでエンコードされたもの又は翻訳後修飾によるもの）、又は哺乳類に天然に見つかる。非天然アミノ酸は、通常タンパク質に生じないアミノ酸を含む（例えば、Ｄ型立体配置を有するα−アミノ酸又はその（Ｄ，Ｌ）−異性体混合物）、天然に生じるアミノ酸の同族体（例えば、β−又はγ−アミノ酸アナログ）、天然に生じるアミノ酸のα，α−ジ−置換アナログ、又はアミノ酸側鎖がメチレン基で短縮されたα−アミノ酸（例えば、これらに限定されないが、ジアミノプロピオン酸（ＤＡＰ）、ジアミノ酪酸（ＤＡＢ）、オルニチン（Ｏｒｎ）等）、若しくは炭素原子１０以下に延ばされたもの、若しくは炭素原子１０以下にオレフィン基で延ばされたものを含み、これらに限定されないが以下を含む。
【００４６】
【化４】
2013534922.tif 000006
【００４７】
他の非天然アミノ酸は、ＧＡＢＡアナログであるγ−アミノ酸を含み、例えば（Ｓ）−３−（アミノメチル）−５−メチルヘキサン酸（プレガバリン）、２−［ｌ−（アミノメチル）シクロヘキシル］酢酸（ガバペンチン）、又はYogeeswari et al.（Recent Patents on CNS Drug Discovery 2006;l:113-118、参照によりここに組み込まれる）に記載されたものが含まれる。
【００４８】
本発明は、プログラム細胞死１（ＰＤ１）シグナル伝達経路の抑制及び／又は阻害が可能な免疫抑制調節ペプチドを提供する。
【００４９】
本発明は更に、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２によって引き起こされる免疫抑制シグナルを阻害することによって生じる免疫増強による癌又は感染の治療のためのペプチドを含むペプチドの修飾体、誘導体及び医薬組成物、及び免疫増強基質が有効成分として含まれているこれらを用いた治療を提供する。
【００５０】
ヒトＰＤ−１の完全なアミノ酸配列はＵＳ５６２９２０４（Honjo et al.）及びFinger et al.（Gene, 1997, 197:177-187）に開示されている。ヒト及びマウスＰＤ−１は、約６０％のアミノ酸同一性を有するのに対し、細胞外ＩｇＶドメインは、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ４とそれぞれ２１％及び１６％の配列同一性しか示さない。
【００５１】
ＰＤ−１は複数ループ構造及びループ間のストランドを有する細胞外領域を有する。ヒトＰＤ−１細胞外領域のアミノ酸配列は配列番号：１に記載のものである。
【００５２】
配列番号：１  ヒトＰＤ−１
PPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRSAGQFQTLV
【００５３】
前記ヒトＰＤ−１細胞外領域配列におけるループ及びストランド配列は以下のとおりである。
【００５４】
Ａストランド：PPTFS                                  配列番号：２
Ｂストランド：ATFT CSF                              配列番号：３
ＢＣループ：SNTSESF                                  配列番号：４
Ｃ−ストランド：VLNWYRM                              配列番号：５
Ｃ−Ｃ’ループ：SPS NQ                              配列番号：６
Ｃ’−ストランド：TDKLAAFP                          配列番号：７
Ｃ’−Ｃ”ループ：ED                                配列番号：８
Ｃ”ストランド：RSQP                                配列番号：９
Ｃ”−Ｄ−ループ：GQDCR                              配列番号：１０
Ｄ−ストランド：FRVTQ                                配列番号：１１
ＤＥループ：LPNG R                                  配列番号：１２
Ｅストランド：DFHMSV                                配列番号：１３
Ｆ−ストランド：GTYLC GAIS                          配列番号：１４
Ｆ−Ｇループ：LAPKA                                  配列番号：１５
Ｇ−ストランド：QIKE                                配列番号：１６
Ｃ’ストランドからＣ’Ｃ’’ループ：FPED            配列番号：２１
Ｃ’ストランドからＣ’’ストランド：TDKLAAFPEDRSQP  配列番号：２２
ＣＣ’ループからＣ’ストランド：SPSNQTDKLAAFP        配列番号：２３
ＦＧループからＧストランド：LAPKAQIKE                配列番号：２４
ＤストランドからＤＥループ：FRVTQLPNGR              配列番号：２５
【００５５】
配列番号：１７  マウス−ＰＤ−１
SLTFYPAWLTVSEGANATFTCSLSNWSEDLMLNWNRLSPSNQTEKQAAFCNGLSQPVQDARFQIIQLPNRHDFHMNILDTRRNDSGIYLCGAISLHPKAKIEESPGAELVVTERILETSTRYPSPSPKPEGRFQGMV
【００５６】
前記マウスＰＤ−１細胞外領域配列におけるループ及びストランド配列は以下の通りである。
【００５７】
Ｂストランド：ATFT CSL                              配列番号：２６
ＢＣループ：SNWSEDL                                  配列番号：２７
Ｃ−ストランド：MLNWNRL                              配列番号：２８
Ｃ−Ｃ’ループ：SPSNQ                                配列番号：２９
Ｃ’−ストランド：TEKQAAFC                          配列番号：３０
Ｃ”ストランド：LSQP                                配列番号：３１
Ｃ”−Ｄ−ループ：VQDAR                            配列番号：３２
Ｄ−ストランド：FQIIQ                                配列番号：３３
Ｆ−ストランド：GIYLC GAIS                          配列番号：３４
Ｆ−Ｇループ：LHPKA                                  配列番号：３５
Ｇ−ストランド：KIEE                                配列番号：３６
Ｃ’ストランドからＣ’Ｃ’’ループ：FCNG            配列番号：３７
Ｃ’ストランドからＣ’’ストランド：TEKQAAFCNGLSQP  配列番号：３８
ＣＣ’ループからＣ’ストランド：SPSNQTEKQAAFC        配列番号：３９
ＦＧループからＧストランド：LHPKAKIEE                配列番号：４０
ＤストランドからＤＥループ：FQIIQLPNRH              配列番号：４１
【００５８】
配列番号：１８  ラット−ＰＤ−１
QLSWQSGWLLVSEGANATFTCSFSNWSEDLKLNWYRLSPSNQTEKQAAFCNGYSQPVRDARFQIVQLPNGHDFHMNILDARRNDSGIYLCGAISLPPKAQIKESPGAELVVTERILETPTRYPRPSPKPEGQFQGLV
【００５９】
配列番号：１９  イヌ−ＰＤ−１
PLTFSPAQLTVQEGENATFTCSLADIPDSFVLNWYRLSPRNQTDKLAAFQEDRIEPGRDRRFRVMRLPNGRDFHMSIVAARLNDSGIYLCGAIYLPPNTQINESPRAELSVTERTLEPPTQSPSPPPRLSGQLQGLV
【００６０】
配列番号：２０  ウマ−ＰＤ−１
PLTFSPARLMVＰＥＧANATFTCSFSNTSEHFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDSSQPGRSGRFRVTRLPNGRDFHMSVLAARRNDSGIYLCGAISLPPKTQINESPRAELTVTERIPEPPTEHPSPPPSPAGQLQGLV
【００６１】
これらのアミノ酸のループ及びストランド割当は、Lazar-Molnar et al（PNAS、2008、105、30、10483-10488）に報告されているマウスＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ２複合体の１．８Å分解能構造に基づき、そこで報告されているヒトとマウスのタンパク質の間のアミノ酸配列バリエーションを考慮している。Lazar-Molnar et alには、マウス、ヒト、ラット、イヌ及びウマのＰＤ−１細胞外領域のアライメントが記載されている。ＰＤ−１はマウスのβストランドに示されており、ＰＤ−１は、配列の上に矢型セグメントで表示されている。
【００６２】
本発明は更に、マウス、ラット、イヌ又はウマＰＤ−１（Lazar-Molnar et al、PNAS、2008、105、30、10483-10488）の細胞外領域ペプチド断片を含む化合物を提供する。
【００６３】
したがって、分岐ペプチドを含む化合物において、１以上の分枝は、少なくとも５つのアミノ酸残基を含むヒトＰＤ−１（配列番号：１）の前記細胞外領域部のペプチド部分を含有していてもよい。
【００６４】
本発明によれば、一実施形態において、プログラム細胞死１（ＰＤ１）シグナル伝達経路を阻害する能力を有し、且つ、ＰＤ−１に結合するＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２及びＰＤ−１により生じる免疫抑制シグナリングを低減することが可能な化合物が提供され、該化合物は３５以下、好ましくは３０以下のアミノ酸残基を含むペプチド部分を含む。
【００６５】
本発明に係る化合物の構造は、下記式（Ｉ）で表される、又はその薬剤的に許容可能な塩であって。
【００６６】
【化５】
2013534922.tif 000007
【００６７】
前記化合物は、少なくとも５つのアミノ酸を含む。
式中、Ａは、ＦＧループ、ＢＣループ、Ｃ−Ｃ’ループ、Ｃストランド、Ｃ’ストランドからＣ’−Ｃ’’ループ、ＣＣ’ループからＣ’ストランドより選択される哺乳類のＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上ペプチド配列完全長以下のアミノ酸配列であるか、又はＧｌｕ−Ａｓｐであるか、又は不存在であり、
Ｂは、ＢＣループ、ＦＧループ、ＣＣ’ループからＣ’ストランド、Ｃストランド、Ｄストランド、Ｃ’ストランドからＣ’−Ｃ’’ループより選択される哺乳類のＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上ペプチド配列完全長以下のアミノ酸配列であるか、又はＧｌｕ−Ａｓｐであるか、又は不存在であり、
Ｚは以下の（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）であって、
（ｉ）任意の順序で配列された１〜４のペプチド配列であり、それぞれが、ＢＣループ、Ｄストランド、ＦＧループ、Ｇストランド、Ｃストランド、Ｆストランド、Ｃ’ストランド、Ｃ”ストランド、Ｃ”−Ｄループ、Ｃ’ストランドからＣ’−Ｃ’’ループ、Ｃ’ストランドからＣ’’ストランド又はＤストランドからＤＥループより選択される哺乳類のＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上完全長以下であるもの、
（ｉｉ）Ｇ−Ｌ−Ｚ’
式中、Ｇは、Ｄストランドより選択される哺乳類のＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上ペプチド配列完全長以下のアミノ酸配列であるか、又は不存在であり、
Ｌは、−ＣＯ（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−又はＰＥＧ２−２０ＫＤから選択され、
「ｎ」は２〜１０から選択される整数であり、
Ｚ’は、任意の順序で配列された１〜３のペプチド配列であって、それぞれがＦＧループ及びＧストランドより選択される哺乳類のＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上完全長以下であるもの、
（ｉｉｉ）任意の順序で配列された１〜４のペプチド配列であって、それぞれがＤ−ストランド、ＦＧループ及びＧストランドより選択される哺乳類のＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上完全長以下であり、前記ペプチド配列の２以上のアミノ酸は結合して、前記２以上の断片のいずれかの間で又は前記断片内でラクタム結合を形成するもの、
Ｄは任意の順序で配列された２以下のペプチド配列であって、それぞれが、ＢＣループ、ＦＧループ、ＣＣ’ループからＣ’ストランドより選択される哺乳類のＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上完全長以下であるか、又は不存在であり、
Ｅは任意の順序で配列された４以下のペプチド配列であって、それぞれが、ＢＣループ、Ｄストランド、ＦＧループ、ＣＣ’ループからＣ’ストランド、Ｇストランド、ＦＧループからＧストランドより選択される哺乳類のＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上完全長以下であるか、又は不存在であり、
Ｘ及びＸ’は、リジン、オルニチン、ジアミノプロピオン酸、ジアミノ酪酸又は下記式のオレフィンアミノ酸から独立して選択され、随意に更なるリジンと結合している、又は
【００６８】
【化６】
2013534922.tif 000008
【００６９】
Ｘ及びＸ’は結合して、随意に更なるリジンと結合しているオレフィンアミノ酸と環を形成している、又は
Ｘ又はＸ’の１つは、不存在である又は両方が不存在であり、
「ｍ」は１〜６から選択される整数であり、
Ｒ１は、Ｃ２−Ｃ２０アシル、ＰＥＧ２−２０ＫＤ部分からなる群より選択されるか、又は不存在であり、
Ｒ２及びＲ３は、Ｃ２−Ｃ２０アシル、ＰＥＧ２−２０ＫＤ、不存在又はＲａ−Ｌ’からなる群より独立して選択され、
Ｒａはビオチン又はマレイミドプロピオン酸から選択され、
Ｌ’はリンカーである−ＣＯ（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−、−ＣＯ（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎＮＨ又は−ＣＯＣＨ２（−ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｎＮＨ−から選択され、及び
「ｎ」は２〜１０から選択される整数であり、
Ｒ４及びＲ５は独立してＮＨ２であるか、又はＲ４又はＲ５の１つ又は両方が不存在であり、
式Ｉの化合物は、以下の条件を有し、上記に定義した式Ｉの化合物において、
ａ）前記アミノ酸の５％以上２５％以下は、他の天然又は非天然アミノ酸と置換されてもよく、
ｂ）前記アミノ酸の３０％以下は除かれてもよく、
ｃ）それぞれの前記ペプチド配列において、２以下のアミノ酸をいずれの位置に独立して追加してもよく、
ｄ）前記ペプチド結合の５％以上２５％以下は代わりに還元されたアミド結合（−ＣＨ２ＮＨ−）で置換されてもよく、
ｅ）前記アミノ酸の１００％以下はＤ−アミノ酸であってもよく、
ｆ）前記アミノ酸の１００％以下は逆順であってもよい。
【００７０】
一実施形態によれば、特に式（Ｉ）に表される化合物が提供される。
Ａは、下記表に示されるＦＧループ、ＢＣループ、Ｃ−Ｃ’ループ、Ｃストランド、Ｃ’ストランドからＣ’−Ｃ’’ループ、ＣＣ’ループからＣ’ストランドより選択されるヒト又はマウスのＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上ペプチド配列完全長以下のアミノ酸配列であるか、又はＧｌｕ−Ａｓｐであるか、又は不存在であり、
【００７１】
【表２】
2013534922.tif 000009
【００７２】
Ｂは、下記表に示されるＢＣループ、ＦＧループ、ＣＣ’ループからＣ’ストランド、Ｃストランド、Ｄストランド、Ｃ’ストランドからＣ’−Ｃ’’ループより選択されるヒト又はマウスのＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上ペプチド配列完全長以下のアミノ酸配列であるか、又はＧｌｕ−Ａｓｐであるか、又は不存在であり、
【００７３】
【表３】
2013534922.tif 000010
【００７４】
Ｚは以下の（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）であり、
（ｉ）任意の順序で配列された１〜４のペプチド配列であり、それぞれが、ＢＣループ、Ｄストランド、ＦＧループ、Ｇストランド、Ｃストランド、Ｆストランド、Ｃ’ストランド、Ｃ”ストランド、Ｃ”−Ｄループ、Ｃ’ストランドからＣ’−Ｃ’’ループ、Ｃ’ストランドからＣ’’ストランド又はＤストランドからＤＥループより選択されるヒト又はマウスのＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上完全長以下であるもの、
（ｉｉ）Ｇ−Ｌ−Ｚ’
式中、Ｇは、Ｄストランドより選択されるヒト又はマウスのＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上ペプチド配列完全長以下のアミノ酸配列であるか、又は不存在であり、
Ｌは、−ＣＯ（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−又はＰＥＧ２−２０ＫＤから選択され、
「ｎ」は２〜１０から選択される整数であり、
Ｚ’は、任意の順序で配列された１〜３のペプチド配列であり、それぞれがＦＧループ及びＧストランドより選択されるヒト又はマウスのＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上完全長以下であるもの、又は
（ｉｉｉ）任意の順序で配列された１〜４のペプチド配列であって、それぞれがＤストランド、ＦＧループ及びＧストランドより選択されるヒト又はマウスのＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上ペ完全長以下であり、前記ペプチド配列の２以上のアミノ酸は結合して、前記２以上の断片のいずれかの間で又は前記断片内でラクタム結合を形成するもの、
前記断片は下記表に規定されるものであり、
【００７５】
【表４】
2013534922.tif 000011
【００７６】
Ｄは任意の順序で配列された２以下のペプチド配列であって、それぞれが、ＢＣループ、ＦＧループ、ＣＣ’ループからＣ’ストランドより選択されるヒト又はマウスのＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上完全長以下であるか、又は不存在であり、
【００７７】
【表５】
2013534922.tif 000012
【００７８】
Ｅは任意の順序で配列された４以下のペプチド配列であって、それぞれが、ＢＣループ、Ｄストランド、ＦＧループ、ＣＣ’ループからＣ’ストランド、Ｇストランド、ＦＧループからＧストランドより選択されるヒト又はマウスのＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上完全長以下であるか、又は不存在であり、
【００７９】
【表６】
2013534922.tif 000013
【００８０】
Ｘ及びＸ’は、リジン、オルニチン、ジアミノプロピオン酸、ジアミノ酪酸又は下記式のオレフィンアミノ酸から独立して選択され、随意に更なるリジンと結合しているか、又は
【００８１】
【化７】
2013534922.tif 000014
【００８２】
Ｘ及びＸ’は結合して、随意に更なるリジンと結合しているオレフィンアミノ酸と環を形成しているか、又は
Ｘ又はＸ’の１つは、不存在である又は両方が不存在である、
「ｍ」は１〜６から選択される整数であり、
Ｒ１はＣ２−Ｃ２０アシル、ＰＥＧ２−２０ＫＤ部分からなる群より選択されるか、又は不存在であり、
Ｒ２及びＲ３は、Ｃ２−Ｃ２０アシル、ＰＥＧ２−２０ＫＤ、不存在又はＲａ−Ｌ’からなる群より独立して選択され、
Ｒａはビオチン又はマレイミドプロピオン酸から選択され、
Ｌ’はリンカーである−ＣＯ（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−、−ＣＯ（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎＮＨ又は−ＣＯＣＨ２（−ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｎＮＨ−から選択され、及び
「ｎ」は２〜１０から選択される整数であり、
Ｒ４及びＲ５は、独立してＮＨ２であるか、又はＲ４又はＲ５の１つ又は両方が不存在である、
式Ｉの化合物は、以下の条件を有し、上記に定義した式Ｉの化合物において、
ａ）前記アミノ酸の５％以上２５％以下は、他の天然又は非天然アミノ酸と置換されてもよく、
ｂ）前記アミノ酸の３０％以下は除かれてもよく、
ｃ）それぞれの前記ペプチド配列において、２以下のアミノ酸をいずれの位置に独立して追加してもよく、
ｄ）前記ペプチド結合の５％以上２５％以下は代わりに還元されたアミド結合（−ＣＨ２ＮＨ−）で置換されてもよく、
ｅ）前記アミノ酸の１００％以下はＤ−アミノ酸であってもよく、
ｆ）前記アミノ酸の１００％以下は逆順であってもよい。
【００８３】
以下の実施形態は、本発明を説明するものであり、特許請求の範囲を特定の例示した実施形態に限定するものではない。
【００８４】
一実施形態によれば、特に、Ｚは前記ペプチド配列の１つからなり、少なくともＡ、Ｂ、Ｄ又はＥの１つは不存在ではない式（Ｉ）で表される化合物が提供される。
【００８５】
他の実施形態によれば、特に、Ａ、Ｂ、Ｄ及びＥが不存在であり、Ｚが２〜４の同じ又は異なるペプチド配列を含む式（Ｉ）で表される化合物が提供される。
【００８６】
更に他の実施形態によれば、特に、ＺがＤストランド、ＦＧループ及びＧストランドの組み合わせである式（Ｉ）で表される化合物が提供される。
【００８７】
更に他の実施形態によれば、特に、Ｘがリジンであり、Ｘ’が不存在である式（Ｉ）で表される化合物が提供される。
【００８８】
更に他の実施形態によれば、特に、Ｘ及びＸ’の両方がリジンである式（Ｉ）で表される化合物が提供される。
【００８９】
更に他の実施形態によれば、特に、Ｒ２及びＲ３がＣ２−Ｃ２０アシル、又はＲａ−Ｌ’から選択される式（Ｉ）で表される化合物が提供される。
式中、Ｒａはマレイミドプロピオン酸であり、
Ｌ’は−ＣＯＣＨ２（−ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｎＮＨ−であり、
「ｎ」は２〜１０から選択される整数である。
【００９０】
更に他の実施形態によれば、本発明は式（Ｉａ）で表される化合物又はその薬剤的に許容可能な塩を提供する。
【００９１】
【化８】
2013534922.tif 000015
【００９２】
式中、
Ａは、ＦＧループ、ＢＣループ、Ｃ’ストランド、Ｃ−Ｃ’ループ、Ｃストランド、Ｃ’ストランドからＣ’−Ｃ’’ループより選択されるヒト又はマウスＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上ペプチド配列完全長以下のアミノ酸配列であるか、又は不存在であり、
Ｂは、ＢＣループ、ＦＧループ、Ｃ−Ｃ’ループからＣ’ストランド、Ｃストランド、Ｄストランド、Ｃ’ストランドからＣ’−Ｃ’’ループより選択されるヒト又はマウスＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上ペプチド配列完全長以下のアミノ酸配列であるか、又は不存在であり、
Ｚは任意の順序で配列された１〜３のペプチド配列であって、それぞれが、Ｄストランド、ＦＧループ、Ｇストランド、Ｃストランド及びＦストランドより選択されるヒト又はマウスＰＤ１細胞外領域断片のアミノ酸３つ以上ペプチド配列完全長以下であり、
Ｘはリジンである。
【００９３】
更に他の実施形態によれば、特に、Ａ及びＢが独立して、前記ＢＣループのアミノ酸３つ以上完全長以下のアミノ酸配列である式（Ｉａ）で表される化合物が提供される。
【００９４】
更に他の実施形態によれば、特に、Ａ及びＢが独立して、完全長の前記ＢＣループである式（Ｉａ）で表される化合物が提供される。
【００９５】
更に他の実施形態によれば、特に、ＡがＢＣループであり、全てのアミノ酸が逆順である式（Ｉａ）で表される化合物が提供される。
【００９６】
更に他の実施形態によれば、特に、ＺがＤストランド−ＦＧループ−Ｇストランドである式（Ｉａ）で表される化合物が提供される。
【００９７】
更に他の実施形態によれば、特に、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が不存在である式（Ｉａ）で表される化合物が提供される。
【００９８】
更に他の実施形態によれば、特に、Ｒ３がＣ１６−アシルである式（Ｉａ）で表される化合物が提供される。
【００９９】
更に他の実施形態によれば、特に、３以下のアミノ酸がＤ−アミノ酸である式（Ｉ）又は（Ｉａ）で表される化合物が提供される。随意に１０％以下、あるいは２０％以下、あるいは５０％以下、あるいは８０％以下又は９０％以下のアミノ酸がＤ−アミノ酸である、又は、少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも８０％又は少なくとも９０％がＤ−アミノ酸である。
【０１００】
更に他の実施形態によれば、特に、全てのアミノ酸がＤ−アミノ酸である式（Ｉ）又は（Ｉａ）で表される化合物が提供される。
【０１０１】
更に他の実施形態によれば、特に、５％以上２５％以下のペプチド結合は代わりに還元されたアミド結合（−ＣＨ２ＮＨ−）で置換されてもよい式（Ｉ）又は（Ｉａ）で表される化合物が提供される。あるいは、１又は２又は３以上、又は２０％又は１０％以下のペプチド結合は代わりに還元されたアミド結合（−ＣＨ２ＮＨ−）で置換されてもよい。
【０１０２】
更に他の実施形態によれば、特に、全てのアミノ酸が逆順である、又は、２以上のアミノ酸の配列が逆順で、随意に５以上又は随意に１０以上、又は１０以下、又は５以下が逆順である式（Ｉ）又は（Ｉａ）で表される化合物が提供される。
【０１０３】
更に他の実施形態によれば、特に、５％以上２５％以下のアミノ酸は他の天然又は非天然 アミノ酸で置換されるされても良い式（Ｉ）又は（Ｉａ）で表される化合物が提供される。
【０１０４】
更に他の実施形態によれば、特に、３０％以下、あるいは２０％以下、又は１０％以下のアミノ酸が除かれてもよい、式（Ｉ）又は（Ｉａ）で表される化合物が提供される。
【０１０５】
更に他の実施形態によれば、特に、式（Ｉ）又は（Ｉａ）で表される化合物であって、それぞれのペプチド配列において３以下のアミノ酸（あるいは２以下のアミノ酸、あるいは１つのみ以下のアミノ酸）をいずれの位置にも個別に追加してもよいものが提供される。
【０１０６】
本発明の化合物は、直鎖又は分岐ペプチドを含んでも良いが、１を越えるペプチド部分を有する分岐ペプチドを含む化合物が好ましく、１を越える枝が存在してもよい。
【０１０７】
一実施形態は本発明の化合物に関し、該化合物は分岐型であり、１以上の枝が、少なくとも５つのアミノ酸残基のヒト又はマウスＰＤ−１の細胞外領域部を含むペプチド部分を含み、該化合物は、第１のＮ末端部及び第２のＮ末端部ペプチド部分を含み、両方が分枝点でＣ末端部ペプチド部分に結合している。
【０１０８】
他の実施形態は本発明の化合物に関し、該化合物は分岐型であり、１以上の枝が、少なくとも５つのアミノ酸残基のヒト又はＰＤ−１の細胞外領域部を含むペプチド部分を含み、該化合物は、第１のＮ末端部及び第２のＮ末端部ペプチド部分を含み、両方が分枝点で中葉ペプチド部分ポーションに結合しており、一方、該中葉ペプチド部分ポーションは更なる分枝点で第１のＣ末端部及び第２のＣ末端部ペプチド部分の夫々に結合している。
【０１０９】
本発明の更に他の実施形態は本発明に開示した化合物に関し、該化合物は脂質付加されている及び／又はグリコシル化されている。
【０１１０】
本発明の更なる実施形態は本発明に開示した化合物に関し、該化合物がＰＥＧ部分を含有する。
【０１１１】
本発明の更なる実施形態は本発明に開示した化合物に関し、該化合物のペプチド部分の１以上のアミノ酸が、Ｄ−アミノ酸で置換されている。
【０１１２】
更に他の本発明の実施形態は本発明に開示した化合物に関し、該化合物のペプチド部分の１以上のアミノ酸が、Ｄ−アミノ酸で置換されており、Ｄ−アミノ酸がペプチド部分のＮ末端又はＣ末端の５つのアミノ酸において存在する。
【０１１３】
また更に他の本発明の実施形態は本発明に開示した化合物に関し、該化合物のペプチド部分の１以上のアミノ酸が、Ｄ−アミノ酸で置換されており、該Ｄ−アミノ酸がペプチド部分のＮ末端又はＣ末端に存在する。
【０１１４】
本発明の一実施形態において、プログラム細胞死１（ＰＤ１）シグナル伝達経路を阻害する能力を有し、且つ、ＰＤ−１に結合するＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２及びＰＤ−１により生じる免疫抑制シグナリングを低減することが可能な化合物が提供され、該化合物は３５以下のアミノ酸残基のペプチド部分を含む。
【０１１５】
本発明の他の実施形態において、プログラム細胞死１（ＰＤ１）シグナル伝達経路を阻害する能力を有し、且つ、ＰＤ−１に結合するＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２及びＰＤ−１により生じる免疫抑制シグナリングを低減することが可能な化合物が提供され、該化合物は３５以下のアミノ酸残基のペプチド部分を含み、該ペプチド部分は、以下３つのアミノ酸残基配列の１つを含む少なくとも５つの連続したアミノ酸残基のヒトＰＤ−１の細胞外領域ドメイン部を含む。
【０１１６】
【表７】
2013534922.tif 000016
【０１１７】
又は、このような少なくとも５つの連続したアミノ酸残基のヒトＰＤ−１の細胞外領域部の変異体を含み、２以下の該残基は除去、置換又は修飾されている、又は２以下の追加のアミノ酸残基が追加される。
【０１１８】
更なる本発明の実施形態は、本発明に開示した化合物を提供し、該化合物は少なくとも以下の配列の１つを含む。
【０１１９】
【表８】
2013534922.tif 000017
【０１２０】
他の実施形態は本発明の化合物に関し、前記３つのアミノ酸残基配列に含まれた１以下のアミノ酸残基が除去、置換又は修飾されている。
【０１２１】
更に他の実施形態は本発明の化合物に関し、該化合物は分岐型であり、１以上の分枝は、前記少なくとも５つの連続したアミノ酸残基のヒトＰＤ−１の細胞外領域部を含むペプチド部分を含む。
【０１２２】
更に他の実施形態は本発明の化合物に関し、該化合物は分岐型であり、１以上の分枝は、前記少なくとも５つの連続したアミノ酸残基のヒトＰＤ−１の細胞外領域部を含むペプチド部分を含み、該化合物は、第１のＮ末端部及び第２のＮ末端部ペプチド部分を含み、両方が分枝点でＣ末端部ペプチド部分に結合している。
【０１２３】
更に他の実施形態は本発明の化合物に関し、該化合物は分岐型であり、１以上の分枝は、前記少なくとも５つの連続したアミノ酸残基のヒトＰＤ−１の細胞外領域部を含むペプチド部分を含み、該化合物は、第１のＮ末端部及び第２のＮ末端部ペプチド部分を含み、両方が分枝点で中葉ペプチド部分ポーションに結合しており、一方、該中葉ペプチド部分ポーションは更なる分枝点で第１のＣ末端部及び第２のＣ末端部ペプチド部分の夫々に結合している。
【０１２４】
本発明の更に他の実施形態は、前記第１のＮ末端部及び前記第２のＮ末端部ペプチド部分を含む本発明の分岐型化合物に関し、前記第１及び／又は第２のＮ末端部ペプチド部分は、以下の３つのアミノ酸残基配列の１つを含む、少なくとも５つの連続したアミノ酸残基のヒトＰＤ−１の細胞外領域部を含む。
【０１２５】
【表９】
2013534922.tif 000018
【０１２６】
更に他の本発明の実施形態は本発明の分岐型化合物に関し、第１のＮ末端部及び第２のＮ末端部ペプチド部分を含み、前記第１の及び／又は第２のＮ末端部ペプチド部分は、以下の３つのアミノ酸残基配列の１つを含む少なくとも５つの連続したアミノ酸残基のヒトＰＤ−１の細胞外領域部を含む。
【０１２７】
【表１０】
2013534922.tif 000019
【０１２８】
更に他の実施形態は本発明の化合物に関し、該化合物は分岐型であり、１以上の分枝は、前記少なくとも５つの連続したアミノ酸残基のヒトＰＤ−１の細胞外領域部を含むペプチド部分を含み、該化合物は、第１のＮ末端部及び第２のＮ末端部ペプチド部分を含み、両方が分枝点でＣ末端部ペプチド部分に結合しており、該Ｃ末端部又は第１の及び／又は第２のＣ末端部は、以下３つのアミノ酸残基配列の１つを含む少なくとも５つの連続したアミノ酸残基のヒトＰＤ−１の細胞外領域部を含む。
【０１２９】
【表１１】
2013534922.tif 000020
【０１３０】
更に他の実施形態は本発明の化合物に関し、該化合物は分岐型であり、１以上の分枝は、前記少なくとも５つの連続したアミノ酸残基のヒトＰＤ−１の細胞外領域部を含むペプチド部分を含み、該化合物は、第１のＮ末端部及び第２のＮ末端部ペプチド部分を含み、両方が分枝点で中葉ペプチド部分ポーションに結合しており、一方、該中葉ペプチド部分ポーションは更なる分枝点で第１のＣ末端部及び第２のＣ末端部ペプチド部分の夫々に結合しており、前記第１の及び第２のＣ末端部の１つは、以下３つのアミノ酸残基配列の１つを含む少なくとも５つの連続したアミノ酸残基のヒトＰＤ−１の細胞外領域部を含む。
【０１３１】
【表１２】
2013534922.tif 000021
【０１３２】
本発明の一実施形態において、プログラム細胞死１（ＰＤ１）シグナル伝達経路を阻害する能力を有し、且つ、ＰＤ−１に結合するＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２及びＰＤ−１により生じうる免疫抑制シグナリングを低減することが可能な化合物が提供され、該化合物は３５以下のアミノ酸残基のペプチド部分を含む。
【０１３３】
更なる本発明の実施形態は、本発明に開示した化合物を提供し、該化合物は、以下の表に示される個別の種から選択される配列の少なくとも１つを含む。
【０１３４】
【表１３】
2013534922.tif 000022
【０１３５】
以下は代表的な化合物であり、単に説明するだけのものであって、本願発明の範囲を限定するものではない。
【０１３６】
【表１４】
2013534922.tif 000023
【０１３７】
【表１５】
2013534922.tif 000024
【０１３８】
【表１６】
2013534922.tif 000025
【０１３９】
【表１７】
2013534922.tif 000026
【０１４０】
【表１８】
2013534922.tif 000027
【０１４１】
【表１９】
2013534922.tif 000028
【０１４２】
【表２０】
2013534922.tif 000029
【０１４３】
【表２１】
2013534922.tif 000030
【０１４４】
【表２２】
2013534922.tif 000031
【０１４５】
【表２３】
2013534922.tif 000032
【０１４６】
【表２４】
2013534922.tif 000033
【０１４７】
【表２５】
2013534922.tif 000034
【０１４８】
【表２６】
2013534922.tif 000035
【０１４９】
【表２７】
2013534922.tif 000036
【０１５０】
【表２８】
2013534922.tif 000037
【０１５１】
【表２９】
2013534922.tif 000038
【０１５２】
【表３０】
2013534922.tif 000039
【０１５３】
【表３１】
2013534922.tif 000040
【０１５４】
【表３２】
2013534922.tif 000041
【０１５５】
【表３３】
2013534922.tif 000042
【０１５６】
【表３４】
2013534922.tif 000043
【０１５７】
【表３５】
2013534922.tif 000044
【０１５８】
本発明の化合物は、脂質付加された、ＰＥＧ化された、及び／又はグリコシル化されたペプチド部分を含んでもよい。ペプチドの１以上のアミノ酸は、インビボの安定性の増加を目的としてＤ−アミノ酸であってもよい。
【０１５９】
本発明は薬剤の投与のために処方された（典型的には、薬剤的に許容可能なキャリア又は希釈剤との組み合わせで）、上述の化合物を含む。
【０１６０】
本発明は、医療の方法（例えば、癌の治療、細菌性及びウイルス性感染の治療）に用いる上述の化合物を含む。
【０１６１】
更に、本発明は、ＰＤ−１とＰＤ−１リガンドの間の相互作用をブロックする能力について化合物をスクリーニングする方法を含み、上述した種類の候補の化合物を、ＰＤ−１又はＰＤ−１のＰＤ−１リガンド結合部と、及びＰＤ−１リガンド又はＰＤ−１リガンドのＰＤ−１結合部と接触させる工程、並びにＰＤ−１/ＰＤ−１リガンドの結合の程度を測定する工程を含む。
【０１６２】
上述したように、本発明の化合物はＰＥＧ化によって修飾されたペプチドであってもよい。ポリマーは薬物動態学及び薬力学（ペプチド、タンパク質及び小分子などの薬の性能）の向上に広く使用されてきた。薬学的応用に最も広く用いられているポリマーはポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）である。「ＰＥＧ化」は、１以上のＰＥＧ分子が薬剤と共有結合（「カップリング」）するように、薬剤が化学的に修飾されるプロセスである（ＰＥＧと相互作用できる及び共役させられるサイトが薬剤にどのくらいあるかによる)。薬剤のＰＥＧ化に伴う向上した薬理的及び生物学的特性は、薬剤の技術分野においてよく知られている。例えば、ＰＥＧ化は、例えば、これらに限定されないが、タンパク質分解酵素による分解の低減及びそれによる薬剤濃度の増加、付随した薬剤のサイズの増大及びそれによる薬剤の生体内分布の向上、及び、必要であれば免疫原性の低減における抗原性エピトープの遮蔽によって治療の有効性を増加することができる。治療の有効性を増加することによって、治療効果を得るのに必要な投与頻度及び／又は薬剤の量を低減することができる。
【０１６３】
ＰＥＧ（直鎖ポリエーテルとして）、は一般的な構造、ＨＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ（ここでｎは典型的には約１０〜約２０００の範囲である）を有する。
【０１６４】
ＰＥＧは修飾されていてもよく、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯＯＨを含む（ここでｎは典型的には約１０〜約２０００の範囲である）。
【０１６５】
ＰＥＧ誘導体（ＰＥＧ及びＰＥＧ誘導体はこの技術分野において「ＰＥＧ」として知られている）の形成において、ＰＥＧ修飾の多くは、ＰＥＧ分子を薬剤に共有結合するのに用いられるそれらの化学反応性官能基の追加又は変形において、末端基（「官能基」）に向けられている。様々なＰＥＧ誘導体がこの技術分野においてよく知られている。ＰＥＧを薬剤に結合するために、典型的には、化学的に反応性を有するようにＰＥＧ分子の官能基を活性化させる必要がある。官能基のタイプ及び特異性は、ＰＥＧ分子が結合される薬剤の化学反応性基の選択に基づく。タンパク質及びペプチドに最も一般的なのは、化学反応性基はアミノ酸（遊離化学反応性基を有する側鎖を有する内部アミノ酸であってもよく、例えば、限定されないが、リジン、システイン、グルタミン酸、セリン、トレオニン等が挙げられる）、Ｎ末端アミノ酸（遊離化学反応性基をしてＮ末端アミン基又は側鎖アミン基を有する）、Ｃ末端アミノ酸(Ｃ末端カルボン酸、又は側鎖アミン基を遊離化学反応性基として有する)又はこれらの組み合わせに存在する。ＰＥＧに結合するペプチドのサイトの中でも、最も頻繁に選択されるのは、ペプチドのＮ末端アミノ酸のＮ末端アミン基（「α-アミン」）、及びリジン（ペプチドのＮ末端アミノ酸又はＣ末端アミノ酸ではないアミノ酸配列内において見られるリジン）のイプシロンアミン基（「イプシロンアミン」）、又はリジンのイプシロンアミン基（リジンがペプチドにＮ末端アミノ酸又はＣ末端アミノ酸として存在する場合）である。
【０１６６】
ペプチドに複数のリジン基がある場合及びＰＥＧ分子の複数の結合が望まれない場合、合成中に選択したアミノ酸の位置のそのアミノ酸配列に、ＰＥＧ化中ＰＥＧのアミン反応性官能基との化学反応性から化学保護剤でブロックされている１以上のアミン基（例えば１以上のα−アミン又はイプシロンアミン）を導入することができる。それにより、合成ペプチドの選択されたアミノ酸の位置の遊離アミン基だけ（化学修飾を通して）をＰＥＧ化してＰＥＧに共有結合することができる。
【０１６７】
ＰＥＧ化に用いる好ましいポリオールは、水溶性ポリ（アルキレンオキサイド）ポリマーを含み、直鎖又は分岐鎖を有してもよい。「ポリオール」は好ましくは水溶性ポリアルコールを意味し、これに限定されないが、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリプロピレングリコール（「ＰＰＧ」）、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、エチレングリコール、ジプロピレングリコール、ＰＰＧを含むコポリマー（例えば、エチレングリコール／ＰＰＧ）、ＰＥＧを含むコポリマー（例えば、ＰＥＧ／ＰＰＧ）、ｍＰＥＧ（モノメトキシ−ポリ（エチレン）グリコール）などを含む。好適なポリオールは、ホモポリマー及びコポリマーの両方を包含し、更に、当業者に知られている分岐構造又は直鎖構造を含む構造を有しても良い。
【０１６８】
個体のインビボの応用に用いられる場合には、前記ポリマーは実質的に無毒であることが好ましい。好ましい実施形態において、ポリマーの分子量は、約２００ダルトン〜約４０，０００ダルトン、好ましくは約４００ダルトン〜約１０，０００ダルトンである。本願発明に適用するのに好ましいポリマーは、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を含み、好ましくは分子量が約４００ダルトン以上、約２０，０００ダルトン以下のポリエチレングリコールを含む。
【０１６９】
上述したように、様々なＰＥＧの形態があり、典型的にはＰＥＧ分子を薬剤に共有結合するのに用いられる末端基又は化学反応性官能基が異なる。様々なＰＥＧがこの技術分野においてよく知られている。本発明において合成ペプチドの１以上の無保護のアミン基に結合するのに好ましいＰＥＧは、ＰＥＧを１以上の無保護のアミン基に共有結合することができる化学反応性基（例えば、「官能基」）を有する。ＰＥＧはこれらに限定されないが、ＰＥＧ−トレシレート、ヘテロ二官能性ＰＥＧ、ＰＥＧジクロロトリアジン、ＰＥＧスクシンイミジルカーボネート、ＰＥＧベンゾトリアゾールカーボネート、ＰＥＧｐ−ニトロフェニルカーボネート、ＰＥＧトリクロロフェニルカーボネート、ＰＥＧカルボニルイミダゾール、ＰＥＧスクシンイミジルサクシネート、ｍＰＥＧスクシンイミジルプロピオネート、ｍＰＥＧスクシンイミジルブタノエート、ＰＥＧブチルアルデヒド、ｍＰＥＧ−プロピオンアルデヒド、ＰＥＧアルデヒド、ＰＥＧ−アセトアルデヒド、ＰＥＧアセトアルデヒドジエチルアセタール、ＰＥＧカルボン酸、ｍＰＥＧフェニルエーテルスクシンイミジルカーボネート、ｍＰＥＧベンズアミドスクシンイミジルカーボネート、ＰＥＧチオエステル、直鎖ＰＥＧ、分岐（branched）ＰＥＧ、及び直鎖分岐（forked）ＰＥＧを含む。
【０１７０】
また、本発明の化合物は、デンドリマーなどのキャリア分子、例えばｐＡＭＡＭデンドリマー、リポソーム、マイクロ粒子及びポリシアノアクリレートナノ粒子などのナノ粒子と併用してもよく、これらはＰＥＧ化されてもよい。
【０１７１】
本発明の化合物に類似しているが、化合物のＰＤ−１シグナル伝達経路のブロッキングにおける活性を少ない状態にする修飾が行われている化合物は、例えばスクリーニングプロトコルのコントロールとして有用であるかもしれない。そのような化合物の中でも、アミノ酸のすべて又はほとんどがＤ−アミノ酸である場合は、ここに記載した本発明のいずれの化合物のアナログ、アミノ酸の全て又はほとんどの配列が逆順（レトロ−化合物）である場合は、ここに記載した本発明のいずれの化合物のアナログ、アミノ酸のすべて又はほとんどがＤ−アミノ酸で、レトロインベルソ−化合物である場合は、そのようなレトロ−化合物のアナログであることが期待される。
【０１７２】
本発明の更なる実施形態は本発明に開示した化合物に関し、該化合物のペプチド部分の１以上のアミノ酸が、Ｄ−アミノ酸で置換されている。
【０１７３】
本発明で開示された化合物は薬剤の投与のために処方されたものである。
【０１７４】
本発明の他の実施形態は、開示された前記化合物及び薬剤的に許容可能なキャリア又は希釈剤を含む医薬組成物、を提供する。
【０１７５】
更に本発明の他の実施形態は、本発明に開示された化合物の、癌の治療のための薬剤の調製への使用を提供する。
【０１７６】
更に本発明の他の実施形態は、本発明に開示された化合物の、細菌性及びウイルス性感染の治療への薬剤の調製のための使用を提供する。
【０１７７】
更に本発明の他の実施形態は、癌を治療する方法を提供し、該方法は、効果的な量の本発明の化合物及び／又はペプチドの、それを必要とする対象者への投与を含む。更に本発明の他の実施形態は、効果的な量の本発明の化合物を、それを必要とする対象者へ投与することにより、腫瘍細胞及び／又は転移の成長を抑制する方法を提供する。
【０１７８】
前記腫瘍細胞としては、黒色腫、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、結腸癌及び肺癌などの癌に限定されず、骨肉腫、脾臓癌、皮膚癌、頭部又は頸部の癌、皮膚又は眼球悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、頸部癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病などの慢性又は急性白血病、小児期固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓又は尿管癌、腎盂癌、中枢神経系腫瘍（ＣＮＳ）、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍の血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類上皮癌、扁平上皮細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストによって引き起こされるものなど環境によって引き起こされる癌、及びこれらの癌の組み合わせが挙げられる。
【０１７９】
また更に本発明の他の実施形態は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２によって引き起こされる免疫抑制シグナルの阻害に起因する免疫増強による感染症を治療する方法を提供し、該方法は、効果的な量の本発明の化合物及び／又はペプチドの、それを必要とする対象者への投与を含む。
【０１８０】
前記感染症としては、限定されないが、ＨＩＶ、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア、マラリア、リーシュマニア、肝炎ウイルス（Ａ、Ｂ及びＣ型）による病原性感染、ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−Ｉ、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩ及びＣＭＶ、エプスタイン・バーウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コルノウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デング熱ウイルス、乳頭腫ウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス及びアルボウイルス性脳炎ウイルス、クラミジア菌、リケッチア様細菌、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌及びコノ球菌、クレブシエラ菌、プロテウス属、セラシア属、シュードモナス菌、大腸菌、レジオネラ菌、ジフテリア、サルモネラ、桿菌、コレラ、破傷風、ボツリヌス、炭疽菌、ペスト、レプトスピラ、及びライム病バクテリアによる病原性感染、カンジダカビ（アルビカンス、クルーゼアイ、グラブラタ、トロピカリス等）、クリプトコックス・ネオフォルマンス、アスペルギルス属（フミガーツス、黒色等）、ケカビ目属（ケカビ、アブシディア属、リゾプス属）、スポロスリックス・シェンキー、ブラストミセス・デルマチチジス、ブラジルパラコクシジオイデス、コクシジオイデス・イミティス及びヒストプラスマ・カプスラーツムによる病原性感染、及び、寄生虫、大腸バランチジウム、ネグレリアフォーレリ、アカントアメーバ属、ジアルジアランビア、クリプトスポリジウム属、ニューモシスティス・カリニ、三日熱マラリア原虫、バベシア・ミクロチ、トリパノソーマ・ブルーセイ、クルーズ・トリパノソーマ、ドノバン・リーシュマニア、トキソプラズマ原虫、ブラジル鉤虫による病原性感染が挙げられる。
【０１８１】
本発明の化合物は、医療方法に用いるものである。
【０１８２】
本発明の化合物は、単独の薬剤として、又は、前記化合物が様々な薬理的に許容可能な材料と混合された医薬組成物として用いることができる。
【０１８３】
前記医薬組成物は通常、非経口投与経路によって投与されるが、経口又は吸入経路により投与してもよい。非経口投与としては、注射による投与、及び経皮、粘膜吸収型、経鼻及び経肺動脈投与が挙げられる。
【０１８４】
注入可能な材料としては、溶液、懸濁液、及び使用前に溶媒に溶解した又は懸濁させた固形注射剤が挙げられる。
【０１８５】
前記注射は、１以上の有効成分を溶媒に溶解、懸濁又は乳化された後に使用される。溶媒としては、水溶性溶媒（例えば、蒸留水、生理食塩水及びリンゲル溶液）、油溶媒（例えば、オリーブ油、ゴマ油、綿実油及びコーン油などの植物油、及びプロピレングリコール、ポリエチレングリコール及びエタノールなどのアルコール）、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【０１８６】
更に、前記注射は安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン）、可溶化剤（例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム及び酢酸ナトリウム）、懸濁化剤（例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、アミノプロピオン酸ラウリル、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム及びモノステアリン酸グリセリルなどの界面活性剤；ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシルメチル・セルロース・ナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース及びヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性ポリマー；ポリソルベート；及びポリオキシエチレン硬化ひまし油）、乳化剤、無痛化剤（例えば、ベンジルアルコール）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール及びグルコース）、緩衝剤、防腐剤（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコール、クロロブタノール及びフェノール）、防腐剤（例えば、パラオキシ安息香酸エステル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸及びソルビン酸）、酸化防止剤（例えば、亜硫酸塩及びアスコルビン酸塩）及び分散剤（例えば、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ひまし油６０、エチレングリコール、カルボキシメチルセルロース及びアルギン酸ナトリウム）を含んでもよい。
【０１８７】
これらの注射は、様々な薬局方に記載された方法など処方技術分野における公知の方法で調製することができる。これらは例えば、最終段階の殺菌プロセス又は無菌操作法によって調製される。また、凍結乾燥品など無菌固形製剤（無菌固形製剤は使用前に注射のための無菌又は滅菌蒸留水又は他の溶媒に調製及び溶解される）を用いることもできる。
【０１８８】
これらの非経口溶液は、プラスチック又はガラスのバイアル、アンプル、シリンジ及び注射器など通常の容量の容器、又はボトルなど大きい容量の容器で提供されてもよい。
【０１８９】
本発明の化合物の投与量は、年齢、体重、症状、治療の有効性、投与計画及び／又は治療時間によって変化する。一般的に、非経口経路（好ましくは静脈内投与）で大人の場合、１回１ｎｇ〜１００ｍｇの量で、２、３日に１回から３日に１回、２日に１回、１日に１回、１日数回まで投与されるか、又は、静脈内投与により１日１〜２４時間継続的に投与されてもよい。投与量は様々な条件に影響されるため、上記投与量より少ない量で時々よく効くかもしれないし、ある場合にはより多い投与量を必要とするかもしれない。
【０１９０】
注射による非経口の投与には、全ての形態の注射、また静脈内輸液が含まれる。例えば、筋肉注射、皮下注射、皮内注射、動脈注射、静脈注射、腹腔内注射、脊椎腔注射、及び静脈内点滴を含む。
【０１９１】
本発明の化合物は、以下のために他の薬剤と組み合わせて投与してもよい。（１）本発明の予防及び／又は治療薬剤の予防及び／又は治療効果の補完及び／又は増大、（２）本発明の予防及び／又は治療薬剤のダイナミックス、吸収向上、投与量低減、及び／又は（３）本発明の予防及び／又は治療薬剤の副作用の低減。
【０１９２】
本発明のペプチド及び他の薬剤を含む併用薬を、両成分が１つの処方に含有された配合剤として投与してもよいし、又は別々の処方として投与してもよい。別々の処方の投与には、同時の投与及びいくらか時間間隔をあけた投与が含まれる。いくらか時間間隔をあけた投与の場合には、本発明の化合物を最初に投与した後、他の薬剤を投与してもよいし、又は他の薬剤を最初に投与した後、本発明の化合物を投与してもよい。それぞれの薬剤の投与方法は同じでも異なってもよい。
【０１９３】
他の薬剤の投与量は、臨床的に用いられる投与量に基づいて適切に選択することができる。本発明の化合物及び他の薬剤の配合比は、投与の対象者の年齢及び体重、投与方法、投与時間、治療される疾患、症状及びこれらの組み合わせに応じて適切に選択することができる。例えば、他の薬剤は、本発明の化合物１質量部に対して、０．０１〜１００質量部用いてもよい。他の薬剤は、２種以上の任意の薬剤の適当な割合の組み合わせであってもよい。本発明の化合物の予防及び／又は治療効果を補完及び／又は増大する他の薬剤は、既に発見されていものだけでなく、上記メカニズムに基づき将来発見されるものを含む。
【０１９４】
この併用が予防及び／又は治療効果を発揮する疾患は特に限定されない。併用薬は、本発明の化合物の予防及び／又は治療効果を補完及び／又は増大することができる限りどの疾患にも用いることができる。
【０１９５】
特に、本発明の化合物はリンパ系細胞を刺激又は増大する効果を発揮するため、前記併用は、一般的に用いられる化学療法薬の投与量又は放射線治療の照射線量を低減することができる。これにより、化学療法及び放射線治療に伴う副作用を抑制することができる。
【０１９６】
本発明の化合物は、既存の化学療法薬と同時に又は混合した状態で用いることもできる。化学療法薬としては、アルキル化剤、ニトロソ尿素剤、代謝拮抗物質、抗癌抗生物質、植物起源のアルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン剤、ホルモン拮抗薬、アロマターゼ阻害剤、Ｐ糖タンパク質阻害剤、白金錯体誘導体、他の免疫療法薬及び他の抗がん剤が挙げられる。更に、白血球減少症（好中球減少症）治療薬、血小板減少症治療薬、制吐剤及び癌疼痛介入剤（pain intervention drug）などの癌治療補助剤と同時に又は混合した状態で使用することができる。
【０１９７】
本発明の化合物は、他の免疫刺激剤と同時に又は混合した状態で用いることができる。免疫刺激剤としては、様々なサイトカインが挙げられる。免疫反応を刺激するサイトカインとしては、例えばＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、インターフェロン−α、β，又はγ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３及びＩＬ−１２が挙げられる。
【０１９８】
本発明の化合物と癌抗原の同時の使用は、付加的又は共同作用の増大効果を与えることができる。癌抗原としては、例えば悪性黒色腫のＭＡＧＥ−１又はＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ−１及びｇｐ１００から生じるＨＬＡ−Ａ１及びＨＬＡ−Ａ２由来のペプチド、乳癌及び卵巣癌のＨＥＲ２／ｎｅｕペプチド、アデノ癌腫のＭＵＣ−１ペプチド及び転移性癌のＮＹ−ＥＳＯ−１が挙げられる。
【０１９９】
本発明の化合物がそのリガンド分子に強く特異的に結合するため、そのラベリング剤は、細胞表面機能分子又はリガンド分子が関係している疾患の検査薬又は診断薬又は研究試薬として使用することができる。
【０２００】
本発明の化合物をラベリングできるラベリング剤としては、放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質、紫外線吸収物質が挙げられる。
【０２０１】
本発明の化合物を酵素免疫吸着法（ＥＩＡ）に用いる場合には、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リンゴ酸脱水素酵素及びルシフェラーゼなど）でラベリングして用いることができる。
【０２０２】
本発明の化合物を放射免疫測定（ＲＩＡ）方法に用いる場合には、放射性同位体（例えば１３１Ｉ、１２５Ｉ、９９ｍＴｃ、３５５Ｓ、３２Ｐ、１４Ｃ及び３Ｈ）でラベリングして用いることができる。
【０２０３】
本発明の化合物を蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）方法に用いる場合には、蛍光物質（例えば、フルオレセイン、ダンシル、フルオレサミン、クマリン、ナフチルアミン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミン１０１、ルシファーイエロー、アクリジン、アクリジンイソチオシアネート、リボフラビン及び誘導体、及びユーロピウム（Ｅｕ）など）でラベリングして用いることができる。
【０２０４】
本発明の化合物を化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）に用いる場合には、発光物質（例えば、ルミノー誘導体（例えば、ルシフェリン、イソルミノー、ルミノー、アミノエチルイソルミノー、アミノエチルエチルイソルミノー、アミノプロピルイソルミノー、アミノブチルイソルミノー及びアミノヘキシルエチルイソルミノー）；ルシフェリン；ルシゲニン；及びビス（２，４，６−トリフルオロフェニル）オキシレートなど）でラベリングして用いることができる。
【０２０５】
本発明の化合物を紫外線吸収方法に用いる場合には、紫外線の波長に吸収を有する物質（例えば、フェノール、ナフトール、アントラセン及びその誘導体など）でラベリングして用いることができる。
【０２０６】
本発明の化合物を電子スピン共鳴（ＥＳＲ）方法に用いる場合には、オキシル基を有する化合物に代表されるスピンラベリング剤（例えば、４−アミノ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル、３−アミノ−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル、２，６−ジ−ｔ−ブチル−α−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−オキソ−２，５−シクロヘキサジエン−１−イリデン）−ｐ−トチルオキシル）でラベリングして用いることができる。
【０２０７】
更に、本発明の化合物は、この技術分野で通常用いられているいずれのラベリング剤でもラベリングすることができる。
【０２０８】
上記ラベリング剤を本発明の化合物のペプチド部分に結合するためには、公知のラベリング方法（ＥＩＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡ等で通常行われているもの）が適用される。例えば、「Medical Chemistry Experimental Course, 1st Ed., Vol. 8, Edited by U. Yamamura, published by Nakayama Bookstore, 1971」、「Illustrated Fluorescent Antibody、1st Ed., written by A. Kawao, published by Softscience, 1983」、「Enzyme-linked immunoassay, 2nd Ed., compiled by E. Ishikawa, T. Kawai and K. Muroi, published by Igakushoin, 1982」に記載されているものが挙げられる。
【０２０９】
このようなラベリング方法の中でも、アビジン（又はストレプトアビジン）とビオチンの間の反応を利用する方法が好ましい。アビジン（又はストレプトアビジン）とビオチンの間の反応を利用する場合、ビオチンを本発明の化合物のペプチド部分に結合する方法には、商業的に利用可能なビオチン化剤（例えば、サクシンイミド基（例えば、ＮＨＳ−ビオチン）が導入されたビオチン又はＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）をビオチンにスペーサーを介して結合することによって調製された試薬）をタンパク質のアミノ基と反応させる方法（Journal of Biological Chemistry, 1989, Vol. 264, pp.272-279）、商業的に利用可能なビオチン−ＨＰＤＰ（Ｎ−［６−（ビオチンアミド）ヘキシル］−３’−（２’−ピリジルチオ)プロピオンアミド)又はＮ−ヨードアセチル−Ｎ−ビオチニルヘキシレンジアミンをタンパク質のチオール基と反応させる方法（Ann. New York Acad. Sci., 1975, Vol. 254, No. 203)、又は、アルデヒド化（aldehyded）タンパク質におけるヒドラジン基が導入されたビオチンをアルデヒド基と反応する方法（Biotech.Apple.Biochem., 1987, Vol. 9, pp.488-496）が含まれる。
【実施例】
【０２１０】
本発明を以下の実施例によって更に説明及び解説する。
【０２１１】
プロテインテクノロジーズ社製シンフォニーパラレルシンセサイザーを用いて自動ペプチド合成を行った。
【０２１２】
シンフォニーパラレルシンセサイザーを用いた手順
膨潤、第１の残基の結合及びキャッピングのプログラム（表Ｉ）
【０２１３】
【表３６】
2013534922.tif 000045
【０２１４】
アミノ酸のカップリングのプログラム（表ＩＩ）。
【０２１５】
【表３７】
2013534922.tif 000046
【０２１６】
Ｎ末端アミノ酸のカップリングのプログラム（表ＩＩＩ）。
【０２１７】
【表３８】
2013534922.tif 000047
【０２１８】
ペプチジル樹脂の切断及び広域（global）脱保護の手順
ペプチジル樹脂をＭｅＯＨ（６ｘ１５ｍｌ）及び溶媒エーテル（３ｘ１５ｍｌ）で洗浄し、真空下で乾燥した。室温で２．５時間ペプチド樹脂を各ペプチドごとの切断混合液で処理することによって固体支持体からのペプチドの切断を達成する。切断混合液をろ過して回収し、前記樹脂をＴＦＡ及びＤＣＭで洗浄した。過剰なＴＦＡ及びＤＣＭを窒素下で少量に濃縮し、ＤＣＭを残留物に添加し、窒素下で濃縮した。このプロセスを３〜４回繰り返し、ほとんどの揮発性不純物を除去した。残留物を０℃まで冷却し、無水エーテルを添加してペプチドを沈澱させた。沈澱したペプチドを遠心分離機にかけ、上澄みエーテルを除去し、該ペプチドに新たなエーテルを添加して更に遠心分離機にかけた。残留物をミリポア水に溶解し、凍結乾燥して粗ペプチドを得た。
【０２１９】
切断混合液Ａ＝８２．５％ＴＦＡ／５％フェノール／５％チオアニソール／２．５％１，２エタンジチオール／５％水
切断混合液Ｂ＝８０％ＴＦＡ／５％フェノール／５％チオアニソール／２．５％１，２エタンジチオール／５％ＤＣＭ／２．５％ＤＭＳ
切断混合液Ｃ＝９０％ＴＦＡ／５％ＴＩＰＳ／５％水
【０２２０】
ペプチドの精製及びキャラクタリゼーション
Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８シリカカラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ）を用いて逆相分析ＨＰＬＣを行った。
【０２２１】
用いた溶出条件は以下のとおりである。
方法１：緩衝液Ａ：０．１％ＴＦＡ／水、緩衝液Ｂ：０．１％ＴＦＡ（９：１アセトニトリル／水において）。
２％緩衝液Ｂによるカラムの平衡、及び２％〜７０％緩衝液Ｂによるグラジエント溶出（１５分間）
方法２：緩衝液Ａ：０．１％ＴＦＡ／水、緩衝液Ｂ：０．１％ＴＦＡ（９：１アセトニトリル／水において）。
２％緩衝液Ｂによるカラムの平衡、及び２％〜２５％緩衝液Ｂ（５分間）及び２５％〜４０％緩衝液Ｂ（合計実行時間２０分）によるグラジエント溶出
方法３：緩衝液Ａ：０．１％ＴＦＡ／水、緩衝液Ｂ：０．１％ＴＦＡ（９：１アセトニトリル／水において）。
２％緩衝液Ｂによるカラムの平衡、及び２〜７０％緩衝液Ｂ（０〜１５分）、７０〜９５％緩衝液Ｂ（１５〜２０分）によるグラジエント溶出
【０２２２】
Ｇ１３１５Ｂ  ＤＡＤジオードアレイディテクターを有するアジレント１１００シリーズＨＰＬＣを備えたＡＰ１  ２０００ＬＣ／ＭＳ／ＭＳトリプルクワッド（Applied biosystems社製）でMercury MSカラムを用いて液体クロマトフラフ質量分析（LCMS）を行った。
【０２２３】
実施例１：配列番号４７の合成
【０２２４】
【化９】
2013534922.tif 000048
【０２２５】
直鎖断片：FRVTQKFRVTQ[Ahx]LAPKAQIKE-NH2の合成
乾燥したＣＬＥＡＲアミド樹脂（１００〜２００メッシュ、０．４ｍｍｏｌ／ｇ、０．５ｇ）を、ポリプロピレンフィルターを備えた２つのポリエチレン容器に分配した。以下の表に記載された合成プログラムで、シンフォニーパラレルシンセサイザー（ＰＴＩ）を用いて直鎖ペプチドの固相合成を自動で行った。膨潤、Ｃ末端アミノ酸[Fmoc-Glu(OtBu)-OH]結合及びペプチジル樹脂のキャッピングを表Iの手順により行った。続くアミノ酸カップリングを表ＩＩに記載されているように行った。
【０２２６】
前記合成に用いたアミノ酸はFmoc Phe-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ahx-OH（Fmoc-6-アミノヘキサン酸）、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OHであった。自動ペプチドシンセサイザーで直鎖合成断片を完了した後、樹脂を取り出しプールし、合成を手動で行った。
【０２２７】
Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸で採用したのと同じ手順で、ペプチドの直鎖のＮ末端アミノ酸フェニルアラニンをＮ−Ｂｏｃアミノ酸として結合した。Ｎ末端から６番目のリジンのε−アミノ基は分枝点として用いられ、Ｄｄｅ基で保護された。直鎖ペプチド鎖の完成後、リジンのε−アミノ基のＤｄｅ保護をオルトゴナル方向に脱保護した。脱保護は、５及び１５分間２．５％（体積／体積）ヒドラジン水和物溶液（ＤＭＦにおいて）で樹脂を処理することによって行われた。その後、樹脂を濾過し、ＤＭＦ（６ｘ１０ｍＬ）、ＤＣＭ（６ｘ１０ｍＬ）及びＤＭＦ（６ｘ１０ｍＬ）で洗浄した。
【０２２８】
ポジティブなニンヒドリンテストで脱保護を確認した。乾燥ＤＭＦ中Fmoc-Phe-OH（０．３９ｇ；５当量、１ｍｍｏｌ）を脱保護した樹脂に添加し、ＤＭＦ中でＤＩＣ（０．１６ｍＬ；５当量）及びＨＯＢＴ（０．１４ｇ；５当量）でカップリングを開始した。反応混合液の各反応物質の濃度は約０．４Ｍであった。室温で２時間、混合液をローターで回転させた。樹脂を濾過し、ＤＭＦ（６ｘ１０ｍＬ）、ＤＣＭ（６ｘ１０ｍＬ）及びＤＭＦ（６ｘ１０ｍＬ）で洗浄した。カップリング完了の際のペプチド樹脂アリコットに対するカイザーテストはネガティブであった。
【０２２９】
５及び１５分間（１０ｍＬ）２０％（体積／体積）ピペリジン／ＤＭＦ溶液で２回処理することによって、ペプチジル樹脂のＦｍｏｃ基を脱保護した。樹脂をＤＭＦ（６Ｘ１０ｍＬ）、ＤＣＭ（６Ｘ１０ｍＬ）及びＤＭＦ（６Ｘ１０ｍＬ）で洗浄した。Ｆｍｏｃ−脱保護の完了の際のペプチド樹脂アリコットに対するカイザーテストはポジティブであった。
【０２３０】
次に、乾燥ＤＭＦ中ペプチド配列のアミノ酸Fmoc-Ser(OtBu)-OH（０．３９ｇ；５当量、１ｍｍｏｌ）を脱保護した樹脂に添加し、ＤＭＦ中でＤＩＣ（０．１６ｍＬ；５当量）及びＨＯＢＴ（０．１４ｇ；５当量）でカップリングを開始した。反応混合液における各反応物質の濃度は約０．４Ｍであった。混合液を室温で２時間ローターで回転した。樹脂を濾過し、ＤＭＦ（６ｘ１０ｍＬ）、ＤＣＭ（６ｘ１０ｍＬ）及びＤＭＦ（６ｘ１０ｍＬ）で洗浄した。カップリング完了の際のペプチド樹脂アリコットに対するカイザーテストはネガティブであった。
【０２３１】
セリンカップリング完了の際に、５及び１５分間（１０ｍＬ）２０％（体積／体積）ピペリジン／ＤＭＦ溶液で２回処理することによって、セリンのＦｍｏｃ基を脱保護した。樹脂をＤＭＦ（６Ｘ１０ｍＬ）、ＤＣＭ（６Ｘ１０ｍＬ）及びＤＭＦ（６Ｘ１０ｍＬ）で洗浄した。Ｆｍｏｃ−脱保護の完了の際のペプチド樹脂アリコットに対するカイザーテストはポジティブであった。
【０２３２】
次に、乾燥ＤＭＦ中アミノ酸Fmoc-Glu(OtBu)-OH（０．４３ｇ；５当量、１ｍｍｏｌ）を脱保護した樹脂に添加し、ＤＭＦ中でＤＩＣ（０．１６ｍＬ；５当量）及びＨＯＢＴ（０．１４ｇ；５当量）でカップリングを開始した。反応混合液における各反応物質の濃度は約０．４Ｍであった。混合液を室温で２時間ローターで回転した。樹脂を濾過し、ＤＭＦ（６ｘ１０ｍＬ）、ＤＣＭ（６ｘ１０ｍＬ）及びＤＭＦ（６ｘ１０ｍＬ）で洗浄した。カップリング完了の際のペプチド樹脂アリコットに対するカイザーテストはネガティブであった。
【０２３３】
５及び１５分間（１０ｍＬ）２０％（体積／体積）ピペリジン／ＤＭＦ溶液で２回処理することによって、ペプチジル樹脂のＦｍｏｃ基を脱保護した。樹脂をＤＭＦ（６Ｘ１０ｍＬ）、ＤＣＭ（６Ｘ１０ｍＬ）及びＤＭＦ（６Ｘ１０ｍＬ）で洗浄した。Ｆｍｏｃ−脱保護の完了の際のペプチド樹脂アリコットに対するカイザーテストはポジティブであった。
【０２３４】
次に、乾燥ＤＭＦ中アミノ酸Fmoc-Ser(OtBu)-OH（０．３９ｇ；５当量、１ｍｍｏｌ）を脱保護した樹脂に添加し、ＤＭＦ中でＤＩＣ（０．１６ｍＬ；５当量）及びＨＯＢＴ（０．１４ｇ；５当量）でカップリングを開始した。反応混合液における各反応物質の濃度は約０．４Ｍであった。混合液を室温で２時間ローターで回転した。樹脂を濾過し、ＤＭＦ（６ｘ１０ｍＬ）、ＤＣＭ（６ｘ１０ｍＬ）及びＤＭＦ（６ｘ１０ｍＬ）で洗浄した。カップリング完了の際のペプチド樹脂アリコットに対するカイザーテストはネガティブであった。
【０２３５】
５及び１５分間（１０ｍＬ）２０％（体積／体積）ピペリジン／ＤＭＦ溶液で２回処理することによって、ペプチジル樹脂のＦｍｏｃ基を脱保護した。樹脂をＤＭＦ（６Ｘ１０ｍＬ）、ＤＣＭ（６Ｘ１０ｍＬ）及びＤＭＦ（６Ｘ１０ｍＬ）で洗浄した。Ｆｍｏｃ−脱保護の完了の際のペプチド樹脂アリコットに対するカイザーテストはポジティブであった。
【０２３６】
次に、乾燥ＤＭＦ中アミノ酸Fmoc-Thr(OtBu)-OH（０．４ｇ；５当量、１ｍｍｏｌ）を脱保護した樹脂に添加し、ＤＭＦ中でＤＩＣ（０．１６ｍＬ；５当量）及びＨＯＢＴ（０．１４ｇ；５当量）でカップリングを開始した。反応混合液における各反応物質の濃度は約０．４Ｍであった。混合液を室温で２時間ローターで回転した。樹脂を濾過し、ＤＭＦ（６ｘ１０ｍＬ）、ＤＣＭ（６ｘ１０ｍＬ）及びＤＭＦ（６ｘ１０ｍＬ）で洗浄した。カップリング完了の際のペプチド樹脂アリコットに対するカイザーテストはネガティブであった。
【０２３７】
５及び１５分間（１０ｍＬ）２０％（体積／体積）ピペリジン／ＤＭＦ溶液で２回処理することによって、ペプチジル樹脂のＦｍｏｃ基を脱保護した。樹脂をＤＭＦ（６ｘ１０ｍＬ）、ＤＣＭ（６ｘ１０ｍＬ）及びＤＭＦ（６ｘ１０ｍＬ）で洗浄した。Ｆｍｏｃ−脱保護の完了の際のペプチド樹脂アリコットに対するカイザーテストはポジティブであった。
【０２３８】
次に、乾燥ＤＭＦ中アミノ酸Fmoc-Asn(Trt)-OH（０．６ｇ；５当量、１ｍｍｏｌ）を脱保護した樹脂に添加し、ＤＭＦ中でＤＩＣ（０．１６ｍＬ；５当量）及びＨＯＢＴ（０．１４ｇ；５当量）でカップリングを開始した。反応混合液における各反応物質の濃度は約０．４Ｍであった。混合液を室温で２時間ローターで回転した。樹脂を濾過し、ＤＭＦ（６ｘ１０ｍＬ）、ＤＣＭ（６ｘ１０ｍＬ）及びＤＭＦ（６ｘ１０ｍＬ）で洗浄した。カップリング完了の際のペプチド樹脂アリコットに対するカイザーテストはネガティブであった。
【０２３９】
５及び１５分間（１０ｍＬ）２０％（体積／体積）ピペリジン／ＤＭＦ溶液で２回処理することによって、ペプチジル樹脂のＦｍｏｃ基を脱保護した。樹脂をＤＭＦ（６ｘ１０ｍＬ）、ＤＣＭ（６ｘ１０ｍＬ）及びＤＭＦ（６ｘ１０ｍＬ）で洗浄した。Ｆｍｏｃ−脱保護の完了の際のペプチド樹脂アリコットに対するカイザーテストはポジティブであった。
【０２４０】
次に、乾燥ＤＭＦ中アミノ酸Fmoc-Ser(OtBu)-OH（０．３９ｇ；５当量、１ｍｍｏｌ）を脱保護した樹脂に添加し、ＤＭＦ中でＤＩＣ（０．１６ｍＬ；５当量）及びＨＯＢＴ（０．１４ｇ；５当量）でカップリングを開始した。反応混合液における各反応物質の濃度は約０．４Ｍであった。混合液を室温で２時間ローターで回転した。樹脂を濾過し、ＤＭＦ（６ｘ１０ｍＬ）、ＤＣＭ（６ｘ１０ｍＬ）及びＤＭＦ（６ｘ１０ｍＬ）で洗浄した。カップリング完了の際のペプチド樹脂アリコットに対するカイザーテストはネガティブであった。
【０２４１】
５及び１５分間（１０ｍＬ）２０％（体積／体積）ピペリジン／ＤＭＦ溶液で２回処理することによって、ペプチジル樹脂のＦｍｏｃ基を脱保護した。樹脂をＤＭＦ（６ｘ１０ｍＬ）、ＤＣＭ（６ｘ１０ｍＬ）及びＤＭＦ（６ｘ１０ｍＬ）で洗浄した。Ｆｍｏｃ−脱保護の完了の際のペプチド樹脂アリコットに対するカイザーテストはポジティブであった。
【０２４２】
切断混合液Ａを用いて、切断の手順に記載されているように、ペプチジル樹脂を切断し、４５０ｍｇを得た（収率６９％）。Zorbax Eclipse XDB-C18カラム（９．４ｍｍｘ２５０ｍｍ、５μｍ）で予備ＨＰＬＣによって、緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ／水）、緩衝液Ｂ（０．１％ＴＦＡ、９：１アセトニトリル／水において）を用いて原料を精製した。流速５ｍＬ／分でペプチドをグラジエント溶出した（０〜５分＝５〜２０％緩衝液Ｂ、５〜４０分＝２０〜３５％緩衝液Ｂ）。ＨＰＬＣ：（方法２）：保持時間（RT）１４．６分（９４．４％）；液体クロマトフラフ質量分析（LCMS）計算質量：３２３７．８３、観測質量：１６１９．９［Ｍ／２＋Ｈ］＋；１０８０．２［Ｍ／３＋Ｈ］＋
【０２４３】
実施例２：配列番号４９の合成
【０２４４】
【化１０】
2013534922.tif 000049
【０２４５】
直鎖断片-Fmoc-FRVTQLAPKAQIKEの合成
乾燥したＣＬＥＡＲアミド樹脂（１００〜２００メッシュ、０．４ｍｍｏｌ／ｇ、０．５ｇ）を、ポリプロピレンフィルターを備えた２つのポリエチレン容器に分配した。以下の表に記載された合成プログラムで、シンフォニーパラレルシンセサイザー（ＰＴＩ）を用いて直鎖ペプチドの固相合成を自動で行った。膨潤、Ｃ末端アミノ酸[Fmoc-Glu(OtBu)-OH]結合及びペプチジル樹脂のキャッピングを表Iの手順により行った。続くアミノ酸カップリングを表ＩＩに記載されているように行った。
【０２４６】
前記合成に用いたアミノ酸はFmoc Phe-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OHであった。Fmoc-Phe-OHカップリングを完了した後、樹脂をペプチドシンセサイザーから取り出し、以下のとおりカップリングを手動で行った。
【０２４７】
自動シンセサイザーから取り出したFmoc-Phe-OHペプチジル樹脂をフリットを備えたガラス容器にプールした。５及び１５分間（１０ｍＬ）２０％（体積／体積）ピペリジン／ＤＭＦ溶液で樹脂を２回処理することによって、ペプチジル樹脂のＦｍｏｃ基を脱保護した。樹脂をＤＭＦ（６ｘ１０ｍＬ）、ＤＣＭ（６ｘ１０ｍＬ）及びＤＭＦ（６ｘ１０ｍＬ）で洗浄した。Ｆｍｏｃ−脱保護完了の際のペプチド樹脂アリコットに対するカイザーテストはポジティブであった。
【０２４８】
乾燥ＤＭＦ中Fmoc-Lys(Fmoc)-OH（０．４８ｇ；４当量、０．８ｍｍｏｌ）を脱保護した樹脂に添加し、ＤＭＦ中でＤＩＣ（０．１５ｍＬ；５当量、１ｍｍｏｌ）及びＨＯＢＴ（０．０８ｇ；５当量、０．６ｍｍｏｌ）でカップリングを開始した。反応混合液における各反応物質の濃度は約０．４Ｍであった。混合液を室温で３時間ローターで回転した。樹脂を濾過し、ＤＭＦ（６ｘ１５ｍＬ）、ＤＣＭ（６ｘ１５ｍＬ）及びＤＭＦ（６ｘ１５ｍＬ）で洗浄した。カップリング完了の際のペプチド樹脂アリコットに対するカイザーテストはネガティブであった。
【０２４９】
５及び１５分間（１５ｍＬ）２０％（体積／体積）ピペリジン／ＤＭＦ溶液で２回処理することによって、ペプチジル樹脂のＦｍｏｃ基を脱保護した。樹脂をＤＭＦ（６Ｘ１５ｍＬ）、ＤＣＭ（６Ｘ１５ｍＬ）及びＤＭＦ（６Ｘ１５ｍＬ）で洗浄した。Fmoc-脱保護の完了の際のペプチド樹脂アリコットに対するカイザーテストはポジティブであった。
【０２５０】
Fmoc-Lys(Fmoc)が結合したペプチジル樹脂のＦｍｏｃ基を脱保護した後、投入する樹脂に対して８当量の過剰のアミノ酸（１．６ｍｍｏｌ、８当量の過剰のＨＯＢｔ（０．２２ｇ、１．６ｍｍｏｌ）及び１０当量の過剰のＤＩＣ（０．３２ｍＬ、２ｍｍｏｌ））を用いて両方の遊離アミノ末端からペプチド鎖の成長を行った。室温で３時間カップリングを行った。ペプチジル樹脂に結合したアミノ酸は以下のとおりである。Fmoc-Phe-OH（０．６２ｇ；８当量、１．６ｍｍｏｌ）、Fmoc-Ser(OtBu)-OH（０．６２ｇ；８当量、１．６ｍｍｏｌ）、Fmoc-Glu(OtBu)-OH（０．６８ｇ；８当量、１．６ｍｍｏｌ）、Fmoc-Ser(OtBu)-OH（０．６２ｇ；８当量、１．６ｍｍｏｌ）、Fmoc-Thr(OtBu)-OH（０．６４ｇ；８当量、１．６ｍｍｏｌ）、Fmoc-Asn(Trt)-OH（０．９５ｇ；８当量、１．６ｍｍｏｌ）、及びＮ末端アミノ酸のBoc-Ser(OtBu)-OH（０．４１ｇ；８当量、１．６ｍｍｏｌ）。
【０２５１】
切断混合液Ａを用いて、切断の手順に記載されているように、ペプチジル樹脂を切断し、５６５ｍｇを得た（収率７０％）。Zorbax Eclipse XDB-C18カラム（９．４ｍｍｘ２５０ｍｍ、５μｍ）で予備ＨＰＬＣによって、緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ／水）、緩衝液Ｂ（アセトニトリル）を用いて原料を精製した。
【０２５２】
ペプチドを流速７ｍＬ／分でグラジエント溶出した（０〜５分＝５〜１０％緩衝液Ｂ、１０〜２０分＝２９％緩衝液Ｂ）。ＨＰＬＣ：（方法１）：保持時間（RT）１２分（９６％）；液体クロマトフラフ質量分析（LCMS）計算質量：３２６１．６２、観測質量：１６３１．６［Ｍ／２＋Ｈ］＋；１０８８［Ｍ／３＋Ｈ］＋；８１６．２［Ｍ／４＋Ｈ］＋
【０２５３】
実施例３：配列番号１０２の合成
【０２５４】
【化１１】
2013534922.tif 000050
【０２５５】
乾燥したＣＬＥＡＲアミド樹脂（１００〜２００メッシュ、０．４９ｍｍｏｌ／ｇ、０．５ｇ）を、ポリプロピレンフィルターを備えた２つのポリエチレン容器に分配した。以下の表に記載された合成プログラムで、シンフォニーパラレルシンセサイザー（ＰＴＩ）を用いて直鎖ペプチドの固相合成を自動で行った。膨潤、Ｃ末端アミノ酸[Fmoc-Ser(OtBu)-OH]結合及びペプチジル樹脂のキャッピングを表Iの手順により行った。続くFmoc-アミノ酸を表ＩＩに記載されているように結合した。
【０２５６】
前記合成に用いたアミノ酸はFmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Tyr(OtBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ahx-OHであった。ビオチンカップリングの場合には、ビオチン（０．１５ｇ、２．５ｍＬのＤＭＦ中）を、ＤＭＦ／ＤＭＳＯ（１：１）に溶解し、手動で自動ペプチドシンセサイザーの反応容器に添加し、表ＩＩのステップ３及び４（アミノ酸はビオチンに置換される）に記載されているようにカップリング反応を続けた。
【０２５７】
Ｄｄｅ基のオルトゴナル脱保護
Ｎ末端から１６番目の残基リジンのε−アミノ基は分枝点として用いられ、Ｄｄｅ基で保護された。直鎖ペプチド鎖の完成後、リジンのε−アミノ基のＤｄｅ保護をオルトゴナルに脱保護した。脱保護は、２．５％（体積／体積）ヒドラジン水和物溶液（ＤＭＦにおいて）で樹脂を処理する（２ｘ７．３０分）ことによって行われた。ヒドラジン水和物溶液は手動で添加し、自動シンセサイザーを用いた。更に樹脂を、表ＩＩのステップ４のようにパラレルシンセサイザーにおいて手動プログラムで洗浄した。
【０２５８】
表ＩＩに記載されているアミノ酸のカップリングのプログラムを用いて（Fmoc-Ser(OtBu)-OHから始まる）、分枝のアミノ酸のカップリングを、続くアミノ酸の導入によって行った。表ＩＩＩに記載されているプログラムを用いて、分枝ペプチジル樹脂のＮ末端アミノ酸Fmoc-Lys(Boc)-OHを結合した。
【０２５９】
切断混合液Ｂを用いて、切断の手順に記載されているように、ペプチジル樹脂を切断し、５１６ｍｇを得た（収率６５％）。Zorbax Eclipse XDB-C18カラム（９．４ｍｍｘ２５０ｍｍ、５μｍ）で予備ＨＰＬＣによって、緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ／水）、緩衝液Ｂ（アセトニトリル）を用いて原料を精製した。ペプチドを流速７ｍＬ／分でグラジエント溶出した（０〜４分＝１０％緩衝液Ｂ、４〜２５分＝１０〜２８％緩衝液Ｂ）。ＨＰＬＣ：（方法１）：保持時間（RT）１１．９４分（９６％）；液体クロマトフラフ質量分析（LCMS）計算質量：３２４５．６９、観測質量：１６２３［Ｍ／２＋Ｈ］＋；１０８２．３［Ｍ／３＋Ｈ］＋；８１１．８［Ｍ／４＋Ｈ］＋
【０２６０】
実施例４：配列番号６１の合成
【０２６１】
【化１２】
2013534922.tif 000051
【０２６２】
乾燥したＣＬＥＡＲアミド樹脂（１００〜２００メッシュ、０．４ｍｍｏｌ／ｇ、０．３ｇ）を、ポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れた。以下の表に記載された合成プログラムで、シンフォニーパラレルシンセサイザー（ＰＴＩ）を用いて直鎖ペプチドの固相合成を自動で行った。膨潤、Ｃ末端アミノ酸[Fmoc-Glu(OtBu)-OH]結合及びペプチジル樹脂のキャッピングを表Iの手順により行った。続いてFmoc-アミノ酸を表ＩＩに記載されているように結合した。
【０２６３】
前記合成に用いたアミノ酸はFmoc Phe-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ser(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OHであった。
【０２６４】
Ｄｄｅ基のオルトゴナル脱保護
Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸で採用したのと同じ手順で、ペプチドの直鎖のＮ末端アミノ酸Ser(OtBu)-OHをＮ−Ｂｏｃアミノ酸として結合した。Ｃ末端から１５番目の残基リジンのε−アミノ基は分枝点として用いられ、Ｄｄｅ基で保護された。直鎖ペプチド鎖の完成後、リジンのε−アミノ基のＤｄｅ保護をオルトゴナルに脱保護した。脱保護は、２．５％（体積／体積）ヒドラジン水和物溶液（ＤＭＦにおいて）で樹脂を処理する（２ｘ７．３０分）ことによって行われた。ヒドラジン水和物溶液は手動で添加し、自動シンセサイザーを用いた。更に樹脂を、表ＩＩのステップ４のようにパラレルシンセサイザーにおいて手動プログラムで洗浄した。
【０２６５】
表ＩＩに記載されているアミノ酸のカップリングのプログラムを用いて（Fmoc-Phe-OHから始まる）、分枝のアミノ酸のカップリングを、続くアミノ酸の導入によって行った。前記合成に用いたアミノ酸はFmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ser(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OHであった。ヘキサン酸（０．２２ｇ、２．５ｍＬのＤＭＦ中）を用いてＮ末端アミノ酸カップリングを行った。ヘキサン酸は手動で自動ペプチドシンセサイザーの反応容器に添加し、表ＩＩのステップ３及び４に記載されているようにカップリング反応を続けた（アミノ酸はヘキサン酸で置換された）。
【０２６６】
切断混合液Ａを用いて、切断の手順に記載されているように、ペプチジル樹脂を切断し、３２０ｍｇを得た（収率７４％）。Zorbax Eclipse XDB-C18カラム（９．４ｍｍｘ２５０ｍｍ、５μｍ）で予備ＨＰＬＣによって、緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ／水）、緩衝液Ｂ（０．１％ＴＦＡ、９：１アセトニトリル／水において）を用いて原料を精製した。ペプチドを流速７ｍＬ／分でグラジエント溶出した（０〜２５分＝５〜５０％緩衝液Ｂ）。ＨＰＬＣ：（方法１）：保持時間（RT）１２．８分（９４．４％）；液体クロマトフラフ質量分析（LCMS）計算質量：３３５９．６２、観測質量：１６８０．３［Ｍ／２＋Ｈ］＋；１１２０．４［Ｍ／３＋Ｈ］＋；８４０．５［Ｍ／４＋Ｈ］＋
【０２６７】
実施例５：配列番号６４の合成
【０２６８】
【化１３】
2013534922.tif 000052
【０２６９】
peptide international社製のＣＬＥＡＲアミド樹脂（０．４６ｍｍｏｌ／ｇ；５００ｍｇ）について、シンフォニーパラレルシンセサイザーを用いて２つの反応容器で実施例５の合成を行った。第１のアミノ酸の結合及びペプチジル樹脂のキャッピングを表Ｉの手順に従って行った。続くアミノ酸のカップリングを表ＩＩに記載されているように行った。
【０２７０】
ポジション８及び１２のカップリングの自動合成中、表ＩＩの洗浄工程（ステップ２）の後に配列を休ませ、手動でFmoc-(R)-2-(4’-ペンテニル)アラニンを添加し、続く手動プログラムで表ＩＩのステップ３及び４に記載されているように試薬を添加し、続くアミノ酸のカップリングの配列を再開した。Ｆｍｏｃ−アミノ酸に用いたのと同様の手順を用いてＢｏｃアミノ酸としてＮ末端アミノ酸を結合した。
【０２７１】
Ｄｄｅ基のオルトゴナル脱保護
Ｃ末端から１５番目の残基リジンのε−アミノ基は分枝点として用いられ、Ｄｄｅ基で保護された。直鎖ペプチド鎖の完成後、リジンのε−アミノ基のＤｄｅ保護をオルトゴナルに脱保護した。脱保護は、２．５％（体積／体積）ヒドラジン水和物溶液（ＤＭＦにおいて）で樹脂を処理する（２ｘ７．３０分）ことによって行われた。ヒドラジン水和物溶液は手動で添加し、自動シンセサイザーを用いた。更に樹脂を、表ＩＩのステップ４のように手動プログラムで洗浄した。
【０２７２】
表ＩＩに記載されているアミノ酸のカップリングのプログラムを用いて（Fmoc-Phe-OHから始まる）、分枝のアミノ酸のカップリングを、続くアミノ酸の導入によって行った。前記合成に用いたアミノ酸はFmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ser(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OHであった。Ｆｍｏｃ−アミノ酸に用いたのと同様の手順を用いてＢｏｃアミノ酸としてＮ末端アミノ酸を結合した。
【０２７３】
オレフィンアミノ酸のスティッチング
カスタマイズされた濾過板を有する２０ｍＬ容量の固相ペプチド容器において２つのオレフィンアミノ酸のスティッチングを行った。直鎖ペプチド配列の完成後、室温で２時間、脱気した１，２ジクロロエタン（ＤＣＥ）中で、２０ｍｏｌ％グラブス触媒（１．７ｇ、１５ｍｌにおいて）を用いて、樹脂に結合したＮ末端でキャップされたペプチドの閉環メタセンシスを行った。２時間後、樹脂をＤＣＥ、ＤＣＭ、メタノールで洗浄し、その後、真空中で一晩乾燥した。
【０２７４】
切断混合液Ｃを用いて、切断の手順に記載されているように、ペプチジル樹脂を切断し、５３０ｍｇを得た（収率６３％）。Zorbax Eclipse XDB-C18カラム（９．４ｍｍｘ２５０ｍｍ、５μｍ）で予備ＨＰＬＣによって、緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ／水）、緩衝液Ｂ（アセトニトリル）を用いて原料を精製した。ペプチドを流速７ｍＬ／分でグラジエント溶出した（０〜３０分＝１０〜８０％緩衝液Ｂ。ＨＰＬＣ：（方法１）：保持時間（RT）１２．９分（９５．４％）；液体クロマトフラフ質量分析（LCMS）計算質量：３６９７、観測質量：１２３２．５［Ｍ／３＋Ｈ］＋；９２４．９［Ｍ／４＋Ｈ］＋；７４０．２［Ｍ／５＋Ｈ］＋
【０２７５】
実施例６：
Ser-Asn-Thr-Ser-Glu-Ser-Phe-Lys-Ser-Asn-Thr-Ser-Glu-Ser-Phe-Phe-Arg-Val-Thr-Gln-Leu-Ala-Pro-Lys-Ala-Gln-Ile-Lys-Glu-NH2（配列番号６９）
の合成
【０２７６】
乾燥したＣＬＥＡＲアミド樹脂（１００〜２００メッシュ、０．４６ｍｍｏｌ／ｇ、０．２５ｇ）を、ポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れた。以下の表に記載された合成プログラムで、シンフォニーパラレルシンセサイザー（ＰＴＩ）を用いて直鎖ペプチドの固相合成を自動で行った。膨潤、Ｃ末端アミノ酸[Fmoc-Glu(OtBu)-OH]結合及びペプチジル樹脂のキャッピングを表Iの手順により行った。続いてＦｍｏｃ−アミノ酸を表ＩＩに記載されているように結合した。
【０２７７】
前記合成に用いたアミノ酸はFmoc Phe-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ser(OtBu)-OHであった。Ｎ末端アミノ酸Fmoc-Ser(OtBu)を表ＩＩＩのプログラムにより結合した。
【０２７８】
切断混合液Ａを用いて、切断の手順に記載されているように、ペプチジル樹脂を切断し、２６５ｍｇを得た（収率７０％）。Zorbax Eclipse XDB-C18カラム（９．４ｍｍｘ２５０ｍｍ、５μｍ）で予備ＨＰＬＣによって、緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ／水）、緩衝液Ｂ（アセトニトリル）を用いて原料を精製した。ペプチドを流速７ｍＬ／分でグラジエント溶出した（０〜３０分＝１０〜８０％緩衝液Ｂ）。ＨＰＬＣ：（方法１）：保持時間（RT）１２．０４分（９５．２％）；液体クロマトフラフ質量分析（LCMS）計算質量：３２６１．８、観測質量：１６３０．７［Ｍ／２＋Ｈ］＋；１０８７．５［Ｍ／３＋Ｈ］＋
【０２７９】
実施例７：配列番号８３の合成
【０２８０】
【化１４】
2013534922.tif 000053
【０２８１】
乾燥したＣＬＥＡＲアミド樹脂（１００〜２００メッシュ、０．４ｍｍｏｌ／ｇ、０．３ｇ）を、ポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れた。以下の表に記載された合成プログラムで、シンフォニーパラレルシンセサイザー（ＰＴＩ）を用いて直鎖ペプチドの固相合成を自動で行った。膨潤、Ｃ末端アミノ酸[Fmoc-Glu(OtBu)-OH]結合及びペプチジル樹脂のキャッピングを表Iの手順により行った。続くアミノ酸カップリングを表ＩＩに記載されているように行った。
【０２８２】
前記合成に用いたアミノ酸はFmoc Phe-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、 Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OHであった。
【０２８３】
Ｄｄｅ基のオルトゴナル脱保護
Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸で採用したのと同じ手順で、ペプチドの直鎖のＮ末端アミノ酸Ser(OtBu)-OHをＮ−Ｂｏｃアミノ酸として結合した。Ｎ末端から１３番目の残基リジンのε−アミノ基は分枝点として用いられ、Ｄｄｅ基で保護された。直鎖ペプチド鎖の完成後、リジンのε−アミノ基のＤｄｅ保護をオルトゴナルに脱保護した。脱保護は、２．５％（体積／体積）ヒドラジン水和物溶液（ＤＭＦにおいて）で樹脂を処理する（２ｘ７．３０分）ことによって行われた。ヒドラジン水和物溶液は手動で添加し、自動シンセサイザーを用いた。更に樹脂を、表ＩＩのステップ４のように洗浄した。
【０２８４】
表ＩＩに記載されているアミノ酸のカップリングのプログラムを用いて（Fmoc-Phe-OHから始まる）、分枝のアミノ酸のカップリングを、続くアミノ酸の導入によって行った。前記合成で用いられたアミノ酸はFmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ser(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OHである。表ＩＩＩに記載されているプログラムによって、Ｎ末端アミノ酸Fmoc-Ser(OtBu)を結合した。
【０２８５】
切断混合液Ａを用いて、切断の手順に記載されているように、ペプチジル樹脂を切断し、３２０ｍｇを得た（収率７４％）。Zorbax Eclipse XDB-C18 Prep-HTカラム（２１．２ｍｍｘ１５０ｍｍ、５μｍ）で予備ＨＰＬＣによって、緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ／水）、緩衝液Ｂ（０．１％ＴＦＡ、アセトニトリル中）を用いて原料を精製した。ペプチドを流速１８ｍＬ／分でグラジエント溶出した（０〜５分＝５〜２０％緩衝液Ｂ、５〜２２分＝２０〜３０％緩衝液Ｂ）。ＨＰＬＣ：（方法１）：保持時間（RT）１２．５分（９７．６％）；液体クロマトフラフ質量分析（LCMS）計算質量：３２６１．６２、観測質量：１６３１．６［Ｍ／２＋Ｈ］＋；１０８８［Ｍ／３＋Ｈ］＋；８１６．２［Ｍ／４＋Ｈ］＋
【０２８６】
実施例８：配列番号８８の合成
【０２８７】
【化１５】
2013534922.tif 000054
【０２８８】
乾燥したＣＬＥＡＲアミド樹脂（１００〜２００メッシュ、０．４ｍｍｏｌ／ｇ、０．３ｇ）を、ポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れた。以下の表に記載された合成プログラムで、シンフォニーパラレルシンセサイザー（ＰＴＩ）を用いて直鎖ペプチドの固相合成を自動で行った。膨潤、Ｃ末端アミノ酸[Fmoc-Glu(OtBu)-OH]結合及びペプチジル樹脂のキャッピングを表Iの手順により行った。続くアミノ酸カップリングを表ＩＩに記載されているように行った。
【０２８９】
投入する樹脂に対してい５当量の過剰のアミノ酸及びカップリング試薬をカップリングに用いた。前記合成に用いたアミノ酸はFmoc Phe-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OHであった。
【０２９０】
Ｄｄｅ基のオルトゴナル脱保護
Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸で採用したのと同じ手順で、ペプチドの直鎖のＮ末端アミノ酸Ser(OtBu)-OHをＮ−Ｂｏｃアミノ酸として結合した。８番目の残基リジンのε−アミノ基は分枝点として用いられ、Ｄｄｅ基で保護された。直鎖ペプチド鎖の完成後、リジンのε−アミノ基のＤｄｅ保護をオルトゴナルに脱保護した。脱保護は、２．５％（体積／体積）ヒドラジン水和物溶液（ＤＭＦにおいて）で樹脂を処理する（２ｘ７．３０分）ことによって行われた。ヒドラジン水和物溶液は手動で添加し、自動シンセサイザーを用いた。更に樹脂を、表ＩＩのステップ４のように洗浄した。
【０２９１】
表ＩＩに記載されているアミノ酸のカップリングのプログラムを用いて（Fmoc-D-Phe-OHから始まる）、分枝のアミノ酸のカップリングを、続くＤ−アミノ酸の導入によって行った。前記合成で用いたアミノ酸はFmoc-D-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-D-Asn(Trt)-OH、Fmoc-D-Ser(OtBu)-OH、Fmoc-D-Glu(OtBu)-OHであった。表ＩＩＩに記載されているプログラムを用いて、Ｎ末端アミノ酸Fmoc-D-Ser(OtBu)を結合した。
【０２９２】
切断混合液Ａを用いて、切断の手順に記載されているように、ペプチジル樹脂を切断し、３５０ｍｇを得た（収率８９％）。Zorbax Eclipse XDB-C18 Prep-HTカラム（２１．２ｍｍｘ１５０ｍｍ、５μｍ）で予備ＨＰＬＣによって、緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ／水）、緩衝液Ｂ（０．１％ＴＦＡ、アセトニトリル中）を用いて原料を精製した。ペプチドを流速１８ｍＬ／分でグラジエント溶出した（０〜５分＝５〜２０％緩衝液Ｂ、５〜１８分＝２０〜２７％緩衝液Ｂ）。ＨＰＬＣ：（方法１）：保持時間（RT）１２．０６分（９６．６％）；液体クロマトフラフ質量分析（LCMS）計算質量：３２６１．６、観測質量：１６３１．６［Ｍ／２＋Ｈ］＋；１０８８［Ｍ／３＋Ｈ］＋；８１６．２［Ｍ／４＋Ｈ］＋
【０２９３】
実施例９：配列番号１２４の合成
【０２９４】
【化１６】
2013534922.tif 000055
【０２９５】
乾燥したリンク−アミドＭＢＨＡ樹脂（１００〜２００メッシュ、０．６６ｍｍｏｌ／ｇ、１ｇ）を、ポリプロピレンフィルターを備えた４つのポリエチレン容器に分配した。以下の表に記載された合成プログラムで、シンフォニーパラレルシンセサイザー（ＰＴＩ）を用いて直鎖ペプチドの固相合成を自動で行った。膨潤、Ｃ末端アミノ酸[Fmoc-Glu(OtBu)-OH]結合及びペプチジル樹脂のキャッピングを表Iの手順により行った。続くアミノ酸カップリングを表ＩＩに記載されているように行った。
【０２９６】
前記合成に用いたアミノ酸はFmoc Phe-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OHであった。直鎖配列において、Ｎ末端から第８番目のアミノ酸、Lys、をFmoc-Lys(Fmoc)-OHとして結合した。
【０２９７】
次の残基以降（Fmoc-Phe-OH）、表ＩＩに記載されているように、続くアミノ酸のカップリングを行った。投入する樹脂に対して１０当量の過剰のアミノ酸（５ｍＬ、各０．２５Ｍアミノ酸、１ＭのＮＭＭ／ＤＭＦ中の０．２５ＭのＨＢＴＵ）カップリング試薬をカップリングに用いた。Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸に採用したのと同様の手順で、ペプチドの両方のＮ末端のＮ末端アミノ酸Ser(OtBu)-OHをＮ−Ｂｏｃアミノ酸として結合した。
【０２９８】
Ｄｄｅ基のオルトゴナル脱保護
Ｎ末端から１７番目の残基リジンのε−アミノ基は分枝点として用いられ、Ｄｄｅ基で保護された。直鎖ペプチド鎖の完成後、リジンのε−アミノ基のＤｄｅ保護をオルトゴナルに脱保護した。脱保護は、２．５％（体積／体積）ヒドラジン水和物溶液（ＤＭＦにおいて）で樹脂を処理する（２ｘ７．３０分）ことによって行われた。ヒドラジン水和物溶液は手動で添加し、自動シンセサイザーを用いた。更に樹脂を、表ＩＩのステップ４のようにパラレルシンセサイザーにおいて手動プログラムで洗浄した。
【０２９９】
表ＩＩに記載されているアミノ酸のカップリングのプログラムを用いて、分枝のアミノ酸のカップリングを、続くアミノ酸の導入によって行った（Ｆｍｏｃ−８−アミノ３，６−ジオキサオクタン酸（０．２４ｇ、２．５ｍＬのＤＭＦについて）から始まる。マレイミドプロパン酸（０．１ｇ、２．５ｍＬのＤＭＦにおいて）について）。
【０３００】
切断混合液Ｃを用いて、切断の手順に記載されているように、ペプチジル樹脂を切断し、１．６ｇを得た（収率７０％）。Phenomenex-C18シリカカラム（１０ｍｍｘ２５０ｍｍ、５μｍ）で予備ＨＰＬＣによって、緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ／水）、緩衝液Ｂ（アセトニトリル）を用いて原料を精製した。ペプチドを流速６ｍＬ／分でグラジエント溶出した（０〜９分＝１０〜１５％緩衝液Ｂ）。ＨＰＬＣ：（方法１）：保持時間（RT）１１．７分（９５％）；液体クロマトフラフ質量分析（ＬＣＭＳ）計算質量：３５５７．０９、観測質量：１７７９．８［Ｍ／２＋Ｈ］＋１１８７．１［Ｍ／３＋Ｈ］＋
【０３０１】
実施例１０：配列番号７７の合成
【０３０２】
【化１７】
2013534922.tif 000056
【０３０３】
乾燥したＣＬＥＡＲアミド樹脂（１００〜２００メッシュ、０．４ｍｍｏｌ／ｇ、０．３ｇ）を、ポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れた。以下の表に記載された合成プログラムで、シンフォニーパラレルシンセサイザー（ＰＴＩ）を用いて直鎖ペプチドの固相合成を自動で行った。膨潤、Ｃ末端アミノ酸[Fmoc-Glu(OtBu)-OH]結合及びペプチジル樹脂のキャッピングを表Iの手順により行った。続くアミノ酸カップリングを表ＩＩに記載されているように行った。
【０３０４】
直鎖配列において、Ｎ末端から第８番目のアミノ酸、Lys、をFmoc-Lys(Dde)-OHとして結合した。直鎖の１６番目の残基リジンをFmoc-Lys(Alloc)-OHとして結合した。Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸に採用したのと同様の手順で、ペプチドの直鎖のＮ末端アミノ酸Ser(OtBu)-OHをＮ−Ｂｏｃアミノ酸として結合した。
【０３０５】
Ｄｄｅ基のオルトゴナル脱保護
Ｎ末端から８番目の残基リジンのε−アミノ基は分枝点として用いられ、Ｄｄｅ基で保護された。直鎖ペプチド鎖の完成後、リジンのε−アミノ基のＤｄｅ保護をオルトゴナルに脱保護した。脱保護は、２．５％（体積／体積）ヒドラジン水和物溶液（ＤＭＦにおいて）で樹脂を処理する（２ｘ７．３０分）ことによって行われた。ヒドラジン水和物溶液は手動で添加し、自動シンセサイザーを用いた。更に樹脂を、表ＩＩのステップ４のように洗浄した。
【０３０６】
表ＩＩに記載されているアミノ酸のカップリングのプログラムを用いて、分枝のアミノ酸のカップリングを、続くアミノ酸の導入によって行った。前記合成に用いたアミノ酸はFmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ser(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OHであった。ＯＨ。Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸に採用したのと同様の手順で、ペプチドの直鎖の分枝のＮ末端アミノ酸Ser(OtBu)-OHをＮ−Ｂｏｃアミノ酸として結合した。
【０３０７】
アリルオキシカルボニル（Alloc）保護基の脱保護
Ｎ末端から１６番目の残基リジンのε−アミノ基をLys(Alloc)として結合し、直鎖配列に追加の分枝点を作った。Lys(Alloc)からのＡｌｌｏｃ保護基をペプチジル樹脂から除去した。これは、アラゴン下で６時間、クロロホルム／Ｎ−メチルピロリジン（９５／５体積／体積）の溶液において、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(０）（５当量；２．８ｇ）及びフェニルシラン（１０当量、０．６５ｍＬ）で処理することによって行われた。樹脂を１０％ＮＭＰのクロロホルム溶液（６ｘ１０ｍＬ）、１％ＤＩＥＰＡのＤＭＦ（６ｘ１０ｍＬ）、ＤＣＭ（６ｘ１０ｍＬ）、ＤＭＦ（６ｘ１０ｍＬ）で洗浄した。
【０３０８】
Ａｌｌｏｃ脱保護の完了後、樹脂を自動ペプチドシンセサイザーに再投入した。遊離アミノ基は配列の第２の分枝点として用いられた。表ＩＩに記載されているアミノ酸のカップリングのプログラムを用いて、分枝のアミノ酸のカップリングを、続くアミノ酸の導入によって行った。前記合成に用いたアミノ酸はFmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Boc-Pro-OHであった。Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸で採用したのと同じ手順で、分枝のＮ末端アミノ酸プロリンをＮ−Ｂｏｃアミノ酸として結合した。
【０３０９】
切断混合液Ａを用いて、切断の手順に記載されているように、ペプチジル樹脂を切断し、２００ｍｇを得た（収率５０％）。Zorbax Eclipse XDB-C18カラム（９．４ｍｍｘ２５０ｍｍ、５μｍ）で予備ＨＰＬＣによって、緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ／水）、緩衝液Ｂ（０．１％ＴＦＡ、アセトニトリルにおいて）を用いて原料を精製した。流速７ｍＬ／分でペプチドをグラジエント溶出した（０〜２分＝１０〜２０％緩衝液Ｂ、２〜８分＝２０〜２５％緩衝液Ｂ、８〜１９分＝２５〜２９％緩衝液Ｂ）。ＨＰＬＣ：（方法１）：保持時間（RT）１２．３分（９４％）；液体クロマトフラフ質量分析（ＬＣＭＳ）計算質量：３３８９．８、観測質量：１６９５．２［Ｍ／２＋Ｈ］＋；１１３０．５［Ｍ／３＋Ｈ］＋８４８．３［Ｍ／４＋Ｈ］＋
【０３１０】
実施例１１：配列番号１２９の合成
【０３１１】
【化１８】
2013534922.tif 000057
【０３１２】
ブロック構築の合成
【０３１３】
【化１９】
2013534922.tif 000058
【０３１４】
−２０℃のＮ−Ｂｏｃアミノ酸（１０．０ｇ、３８．２８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１００ｍＬ）溶液にＮ−メチルモルフォリン（ＮＭＭ、４．２５ｇ、４２．１１ｍｍｏｌ）及びエチルクロロホルメート（４．５７ｇ、４２．１１ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合液を同じ温度で２０分間、撹拌した。無機塩類を濾過し、ろ液を１０〜１５分間、湿性ＮａＢＨ４（２．９ｇ、７６．５６ｍｍｏｌ）で処理した。そして、反応液を水とＥｔＯＡｃとに分離した。
【０３１５】
有機層を水、１０％ＮａＨＣＯ３溶液（１００ｍＬｘ２）及び塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮し、Ｎ−Ｂｏｃアミノールを得た。それを更に、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（溶離液：０〜５０％ＥｔＯＡｃ、ヘキサン中）で精製し、８．２ｇの生成物を得た［収率：８５．４％、質量：計算２４７．３、観察：２４８．２（Ｍ＋１）、２７０．２（Ｍ＋Ｎａ）］。
【０３１６】
【化２０】
2013534922.tif 000059
【０３１７】
Ｎ−Ｂｏｃ−アミノール（３．０ｇ、１２．１３ｍｍｏｌ）の蒸留されたＤＣＭ（３０．０ｍＬ）溶液に、０℃でデス・マーチン・ペルヨージナン（１０．３ｇ、２４．２７ｍｍｏｌ）を少しづつ添加し、ＴＬＣ分析で規定されているように反応物質が消費されるまで、室温でＮ２雰囲気下で３０分間撹拌した。１．０ＭのＮａ２Ｓ２Ｏ３溶液の添加によって反応混合液を急冷し、生成物をＤＣＭで抽出した。
【０３１８】
有機抽出物を（５％、１：１）Ｎａ２Ｓ２Ｏ３／ＮａＨＣＯ３溶液（２０ｍＬｘ２）、塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、原材料を得た。それを更に、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（溶離液：０〜２０％ＥｔＯＡｃ、ヘキサン中）で精製し、２．４ｇの純生成物１（収率８２％、質量計算２４５．３２、観測２４７．９（Ｍ＋１）、２６５．１（Ｍ＋Ｎａ））を得た。
【０３１９】
【化２１】
2013534922.tif 000060
【０３２０】
Fmoc-Asn(trt)-OH（４．０ｇ、６．７ｍｍｏｌ）の３０．０ｍＬのＤＭＦ溶液に、Ｃｓ２ＣＯ３（２．６２ｇ、８．０ｍｍｏｌ）を添加した。そして混合液を０℃に冷却し、ベンジルブロマイド（１．３７ｇ、８．０ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を３０分間０℃、そして室温で１２時間攪拌した。反応混合液を減圧下で濃縮し、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で希釈し、有機層をＮａＨＣＯ３（２ｘ５０ｍＬ）及び塩水（１ｘ５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過及び真空中で濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（溶離液：０〜３０％のＥｔＯＡｃ、ヘキサン中)で精製し、白い固体のFmoc-Asn(trt)-OBnを得た［収率：４．５ｇ、９８．０％；質量：計算６８６．２８、観察６８７．３（Ｍ＋１）、７０９．１（Ｍ＋Ｎａ）］。
【０３２１】
Fmoc-Asn(Trt)-OBn（３．５ｇ、５．１ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１４．０ｍＬ）溶液に、ジエチルアミン（１４．０ｍＬ）を添加し、室温で１時間攪拌した。得られた溶液を真空中で濃縮し、濃厚な残基を中性アルミナカラムクロマトグラフィ（溶離液：０〜５０％ＥｔＯＡｃ、ヘキサン中、その後０〜５％ＭｅＯＨ、ＣＨＣｌ３中）で精製し、H-Asn(trt)-Obn２を得た（収率：１．７５ｇ、７３．０％；質量：計算４６４．２１、観察４６５．３（Ｍ＋１）、４８７．２（Ｍ＋Ｎａ））。
【０３２２】
【化２２】
2013534922.tif 000061
【０３２３】
H-Asn(Trt)-OBn（４．５ｇ、９．７ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（２．５ｇ、１９．４ｍｍｏｌ）及びBoc-Ser(OtBu)-CHO（２．４ｇ、９．７ｍｍｏｌ）を０℃でＤＣＭ（４５ｍＬ）中で混合し、そして室温で１時間攪拌した。再び、反応混合液を０℃まで冷却し、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（４．１ｇ、１９．４ｍｍｏｌ）で処理し、そして混合液を室温でＮ２雰囲気下で６時間、ＴＬＣ分析で規定されているように反応物質が消費されるまで撹拌した。水を添加して反応混合液を急冷し、生成物をＤＣＭで抽出した。
【０３２４】
有機抽出物を５％ＮａＨＣＯ３溶液（５０ｍＬｘ２）、５％クエン酸溶液（５０ｍＬｘ２）、塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を濃縮し、粗生成物を得た。粗生成物を更にシリカゲルカラムクロマトグラフィ（溶離液：５〜４０％ＥｔＯＡｃ、ヘキサン中）で精製し、所望の生成物３を得た（収量：４．２ｇ、６２．０％；質量：計算６９３．２７、観察６９４．４（Ｍ＋１）、７１６．０（Ｍ＋Ｎａ））。
【０３２５】
【化２３】
2013534922.tif 000062
【０３２６】
化合物３（４．０ｇ）のメタノール（７０．０ｍＬ）溶液に不活性雰囲気下で、１０％Ｐｄ−Ｃ（１．０ｇ）を添加し、混合液を４時間Ｈ２雰囲気下で攪拌した。反応の完了をＴＬＣ分析で確認した。そして触媒をセライトパッドで濾過して除去し、そして５０ｍＬのメタノールで洗浄した。混合した有機ろ液を減圧下で蒸発させ、生成物４を単離した（収量：３．３ｇ、９６．０％；質量：計算６０３．２５、観察６０４．４（Ｍ＋１）、６２６．４（Ｍ＋Ｎａ））。
【０３２７】
ペプチドの合成：
乾燥したリンク−アミドＭＢＨＡ樹脂（１００〜２００メッシュ、０．６６ｍｍｏｌ／ｇ、０．１ｇ）を、ポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れた。以下の表に記載された合成プログラムで、シンフォニーパラレルシンセサイザー（ＰＴＩ）を用いて直鎖ペプチドの固相合成を自動で行った。膨潤、Ｃ末端アミノ酸[Fmoc-Glu(OtBu)-OH]結合及びペプチジル樹脂のキャッピングを表Iの手順により行った。続くアミノ酸カップリングを表ＩＩに記載されているように行った。
【０３２８】
投入する樹脂に対して５当量の過剰のアミノ酸及びカップリング試薬をカップリングに用いた。前記合成に用いたアミノ酸はFmocPhe-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OHであった。直鎖配列において、Ｎ末端から８番目のアミノ酸、Lys、をFmoc-Lys(Fmoc)-OHとして結合した。
【０３２９】
次の残基以降（Fmoc-Phe-OH）、表ＩＩに記載されているように、続くアミノ酸のカップリングを行った。投入する樹脂に対して１０当量の過剰のアミノ酸（５ｍＬ、各０．２５Ｍアミノ酸、１ＭのＮＭＭ／ＤＭＦ中の０．２５ＭのＨＢＴＵ）カップリング試薬をカップリングに用いた。前記合成に用いたアミノ酸はFmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OHであった。Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸に採用したのと同様の手順で、両方のＮ末端のＮ末端アミノ酸Boc-SerΨ[CH2NH]Asn(Trt)-OH（０．４ｇ、５ｍＬにおいて）をＮ−Ｂｏｃアミノ酸として結合した。
【０３３０】
切断混合液Ｃを用いて、切断の手順に記載されているように、ペプチジル樹脂を切断し、１５０ｍｇを得た（収率７０％）。粗サンプルを予備ＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥した。Zorbax Eclipse XDB-C18カラム（９．４ｍｍｘ２５０ｍｍ、５μｍ）で予備ＨＰＬＣによって、緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ／水）、緩衝液Ｂ（アセトニトリル）を用いて原料を精製した。流速７ｍＬ／分でペプチドをグラジエント溶出した（０〜２５分＝２〜３０％緩衝液Ｂ）。ＨＰＬＣ：（方法１）：保持時間（RT）１２分（９３％）；液体クロマトフラフ質量分析（ＬＣＭＳ）計算質量：３２３２．８、観測質量：１６１７．４［Ｍ／２＋Ｈ］＋、８０９．６［Ｍ／４＋Ｈ］＋
【０３３１】
実施例１２：配列番号７５の合成
【０３３２】
【化２４】
2013534922.tif 000063
【０３３３】
乾燥したリンク−アミドＭＢＨＡ樹脂（１００〜２００メッシュ、０．６６ｍｍｏｌ／ｇ、１５ｇ）を、フリットを有する濾過板ガラス反応容器を備えた５つのカスタマイズされた容量の固相ペプチド容器に等分に分配した。各反応器の樹脂をＤＣＭ（３０ｍＬ）で１時間及びＤＭＦ（３０ｍＬ）で１時間膨潤させた。リンク−アミドＭＢＨＡ−アミドのＦｍｏｃ基を脱保護した。脱保護は、５及び１５分（３０ｍＬ）、２０％（体積／体積）ピペリジン／ＤＭＦ溶液で２回処理することによって行われた。樹脂をＤＭＦ（６Ｘ３０ｍＬ）、ＤＣＭ（６Ｘ３０ｍＬ）及びＤＭＦ（６Ｘ３０ｍＬ）で洗浄した。Ｆｍｏｃ−脱保護の完了の際のペプチド樹脂アリコットに対するカイザーテストはポジティブであった。
【０３３４】
乾燥ＤＭＦに溶解したＣ末端アミノ酸、Fmoc-Glu(OtBu)-OH（２１ｇ；５当量、４９．５ｍｍｏｌ）を等体積で５つ全てのガラス反応器に分配した。ＤＭＦに溶解したＤＩＣ（７．６ｍＬ；５当量、４９．５ｍｍｏｌ）及びＨＯＢＴ（６．７ｇ；４９．５ｍｍｏｌ）を５つのガラス反応容器に等分に分配して添加して、カップリングを開始した。反応混合液の各反応物質の濃度は約０．４Ｍであった。室温で２時間、混合液をローターで回転させた。樹脂を濾過し、ＤＭＦ（６ｘ３０ｍＬ）、ＤＣＭ（６ｘ３０ｍＬ）及びＤＭＦ（６ｘ３０ｍＬ）で洗浄した。カップリング完了の際のペプチド樹脂アリコットに対するカイザーテストはネガティブであった。第１のアミノ酸の結合後、樹脂に未反応のアミノ基があれば、配列の欠損を回避するために、無水酢酸／ピリジン／ＤＣＭ（１：８：８）を用いて２０分間キャッピングした。
【０３３５】
キャッピング後、各反応器の樹脂をＤＣＭ（６ｘ３０ｍＬ）、ＤＭＦ（６ｘ３０ｍＬ）、ＤＣＭ（６ｘ３０ｍＬ）及びＤＭＦ（６ｘ３０ｍＬ）で洗浄した。５及び１５分間（３０ｍＬ）２０％（体積／体積）ピペリジン／ＤＭＦ溶液で２回処理することによって、Ｃ末端アミノ酸が結合したペプチジル樹脂のＦｍｏｃ基を脱保護した。樹脂をＤＭＦ（６Ｘ３０ｍＬ）、ＤＣＭ（６Ｘ３０ｍＬ）及びＤＭＦ（６Ｘ３０ｍＬ）で洗浄した。Ｆｍｏｃ−脱保護の完了の際のペプチド樹脂アリコットに対するカイザーテストはポジティブであった。
【０３３６】
続いてアミノ酸Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH及びFmoc-Ala-OHを、投入する樹脂に対して５当量の過剰の各アミノ酸、ＤＩＣ及びＨＯＢｔを用いてカップリングした。Ｃ末端から第６番目の残基ＬｙｓをFmoc-Lys(Dde)-OHとして結合した。乾燥ＤＭＦに溶解したFmoc-Lys(Dde)-OH（１６ｇ；３当量、２９．７ｍｍｏｌ）を等体積で５つ全てのガラス反応器に分配した。ＤＭＦに溶解したＤＩＣ（４．５ｍＬ；３当量、２９．７ｍｍｏｌ）及びＨＯＢＴ（４ｇ；３当量、２９．７ｍｍｏｌ）を５つのガラス反応容器に等分に分配して添加して、カップリングを開始した。反応混合液の各反応物質の濃度は約０．４Ｍであった。
【０３３７】
室温で３時間、混合液をローターで回転させた。樹脂を濾過し、ＤＭＦ（６ｘ３０ｍＬ）、ＤＣＭ（６ｘ３０ｍＬ）及びＤＭＦ（６ｘ３０ｍＬ）で洗浄した。カップリング完了の際のペプチド樹脂アリコットに対するカイザーテストはネガティブであった。ペプチジル樹脂のＦｍｏｃ基を脱保護した。脱保護は、５及び１５分（３０ｍＬ）、２０％（体積／体積）ピペリジン／ＤＭＦ溶液で２回処理することによって行われた。樹脂をＤＭＦ（６Ｘ３０ｍＬ）、ＤＣＭ（６Ｘ３０ｍＬ）及びＤＭＦ（６Ｘ３０ｍＬ）で洗浄した。Ｆｍｏｃ−脱保護の完了の際のペプチド樹脂アリコットに対するカイザーテストはポジティブであった。
【０３３８】
続いてアミノ酸Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OHを、５当量の過剰のアミノ酸、ＨＯＢｔ及びＤＩＣ方法を用いてペプチジル樹脂に結合した。反応は室温で３時間行った。Ｃ末端から第１５番目の残基ＬｙｓをFmoc-Lys(Fmoc)-OHとして結合した。乾燥ＤＭＦに溶解したFmoc-Lys(Fmoc)-OH（１７．５ｇ；３当量、２９．７ｍｍｏｌ）を等体積で５つ全てのガラス反応器に分配した。ＤＭＦに溶解したＤＩＣ（４．５ｍＬ；３当量、２９．７ｍｍｏｌ）及びＨＯＢＴ（４ｇ；３当量、２９．７ｍｍｏｌ）を５つのガラス反応容器に等分に分配して添加して、カップリングを開始した。反応混合液の各反応物質の濃度は約０．４Ｍであった。
【０３３９】
室温で３時間、混合液をローターで回転させた。樹脂を濾過し、ＤＭＦ（６ｘ３０ｍＬ）、ＤＣＭ（６ｘ３０ｍＬ）及びＤＭＦ（６ｘ３０ｍＬ）で洗浄した。カップリング完了の際のペプチド樹脂アリコットに対するカイザーテストはネガティブであった。ペプチジル樹脂のＦｍｏｃ基を脱保護した。脱保護は、５及び１５分（３０ｍＬ）、２０％（体積／体積）ピペリジン／ＤＭＦ溶液で２回処理することによって行われた。樹脂をＤＭＦ（６Ｘ３０ｍＬ）、ＤＣＭ（６Ｘ３０ｍＬ）及びＤＭＦ（６Ｘ３０ｍＬ）で洗浄した。
【０３４０】
Fmoc-Lys(Fmoc)が結合したペプチジル樹脂を脱保護した後、投入する樹脂に対して８当量の過剰のアミノ酸（７９ｍｍｏｌ）、８当量の過剰のＨＯＢｔ（７９ｍｍｏｌ）及び１０当量の過剰のＤＩＣ（９９ｍｍｏｌ）を用いて、両方の遊離アミノ末端からペプチド鎖の成長を行った。反応は室温で２時間行った。前記合成で用いたアミノ酸はFmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ser(OtBu)-OH及びFmoc-Glu(OtBu)-OHであった。ＤＩＣ／ＨＯＢＴ方法（投入する樹脂に対して８当量の過剰）用いて、Ｎ末端アミノ酸セリンをBoc-Ser(OtBu)-OHとして結合した。
【０３４１】
Ｄｄｅ基のオルトゴナル脱保護：
Ｎ末端から１７番目の残基リジンのε−アミノ基は分枝点として用いられ、Ｄｄｅ基で保護された。直鎖ペプチド鎖の完成後、リジンのε−アミノ基のＤｄｅ保護をオルトゴナルに脱保護した。脱保護は、実施例１に記載されているように、２．５％（体積／体積）ヒドラジン水和物溶液（ＤＭＦにおいて）で樹脂を処理することによって行われた。
【０３４２】
パルミチン酸のカップリング
リジンの遊離ε−アミノ基に、ＤＭＦに溶解したパルミチン酸（１２ｇ、５当量、４９．５ｍｍｏｌ）を、均等な割合で５つの反応容器に添加し、ＤＭＦ中のＤＩＣ（７．６ｍＬ；５当量、４９．５ｍｍｏｌ）及びＨＯＢＴ（６．７ｇ；４９．５ｍｍｏｌ）を同様の方法で添加した。
【０３４３】
切断混合液Ｃを用いて、切断の手順に記載されているように、ペプチジル樹脂を切断し、２２ｇを得た（収率６５％）。粗サンプルを予備ＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥した。Waters X-Bridge Prep C18-OBDカラム（１９ｍｍｘ１５０ｍｍ、５μｍ）で予備ＨＰＬＣによって、緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ／水）、緩衝液Ｂ（０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル）を用いて原料を精製した。ペプチドを流速１５ｍＬ／分でグラジエント溶出した（０〜３分＝１５〜２５％緩衝液Ｂ、３〜５分＝２５〜３８％緩衝液Ｂ、５〜１５分＝３８〜５０％緩衝液Ｂ、１５〜１９分＝５０％緩衝液Ｂ）。ＨＰＬＣ：（方法３）：保持時間（RT）１７．５分（９５．４％）；液体クロマトフラフ質量分析（ＬＣＭＳ）計算質量：３４９９．６２、観測質量：１７５０．３［Ｍ／２＋Ｈ］＋；１１６７．２［Ｍ／３＋Ｈ］＋
【０３４４】
実施例１３：配列番号１０３の合成
【０３４５】
【化２５】
2013534922.tif 000064
【０３４６】
乾燥したリンク−アミドＭＢＨＡ樹脂（１００〜２００メッシュ、０．６ｍｍｏｌ／ｇ、０．２８ｇ）を、ポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れた。以下の表に記載された合成プログラムで、シンフォニーパラレルシンセサイザー（ＰＴＩ）を用いて直鎖ペプチドの固相合成を自動で行った。膨潤、Ｃ末端アミノ酸[Fmoc-Glu(OtBu)-OH]結合及びペプチジル樹脂のキャッピングを表Iの手順により行った。続くアミノ酸カップリングを表ＩＩに記載されているように行った。
【０３４７】
前記合成に用いたアミノ酸はFmoc Phe-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OHであった。直鎖断片において、Ｃ末端から第２のアミノ酸をFmoc-Lys(Alloc)-OHとして結合し、Ｃ末端から第６番目のアミノ酸をFmoc-Glu(OAll)-OHとして結合した。直鎖配列において、Ｎ末端第８番目のアミノ酸、Ｌｙｓ、をFmoc-Lys(Fmoc)-OHとして結合した。
【０３４８】
次の残基以降（Fmoc-Phe-OH）、表ＩＩに記載されているように、続くアミノ酸のカップリングを行った。カップリング試薬としてそれぞれ５ｍＬの０．２５Ｍアミノ酸、１ＭのＮＭＭ／ＤＭＦ中の０．２５ＭのＨＢＴＵをカップリングに用いた。前記合成に用いたアミノ酸はFmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OHであった。両端のＮ末端アミノ酸をBoc-Ser(OtBu)-OHとして結合した。
【０３４９】
Ａｌｌｏｃ保護基の脱保護
ペプチド配列全体が完成した後、リジン及びグルタミン酸に存在するオルトゴナルＡｌｌｏｃ及びアリル保護基をペプチジル樹脂から除去した。除去は、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）（１０当量；２．１ｇ）及びフェニルシラン（２０当量、０．３２ｍＬ）で、クロロホルム／Ｎ−メチルピロリジン（９５／５体積／体積）溶液において、アルゴン下で６時間処理することにより行った。樹脂を１０％ＮＭＰのクロロホルム溶液（６ｘ１０ｍＬ）、１％ＤＩＥＰＡのＤＭＦ溶液（６ｘ１０ｍＬ）、ＤＣＭ（６ｘ１０ｍＬ）、ＤＭＦ（６ｘ１０ｍＬ）で洗浄した。ＮＭＰに溶解したＨＯＢｔ（０．１２ｇ；０．９２ｍｍｏｌ）及びＤＩＣ（０．１８ｍＬ；１．１ｍｍｏｌ）を用いて、リジンのε−遊離アミノ基及びグルタミン酸のγ-遊離カルボキシル基は、ラクタム架橋形成のために維持された。１７時間後、樹脂を濾過し、ＤＭＦ（６ｘ１０ｍＬ）、ＤＣＭ（６ｘ１０ｍＬ）、ＤＭＦ（６ｘ１０ｍＬ）で洗浄した。
【０３５０】
切断混合液Ｃを用いて、切断の手順に記載されているように、ペプチジル樹脂を切断し、４０７ｍｇを得た（収率６８％）。Zorbax Eclipse XDB-C18カラム（９．４ｍｍｘ２５０ｍｍ、５μｍ）で予備ＨＰＬＣによって、緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ／水）、緩衝液Ｂ（アセトニトリル）を用いて原料を精製した。流速７ｍＬ／分でペプチドをグラジエント溶出した（０〜４分＝１０％緩衝液Ｂ、４〜２１．５分＝１０〜３０．９％緩衝液Ｂ、２１．５〜３０．９分＝３０．９〜３５％緩衝液Ｂ）。ＨＰＬＣ：（方法１）：保持時間（RT）１２．５分、液体クロマトフラフ質量分析（ＬＣＭＳ）計算質量：３２４４．１２、観測質量：１６２２．９［Ｍ／２＋Ｈ］＋；１０８２．１［Ｍ／３＋Ｈ］＋
【０３５１】
実施例１４：配列番号１４０の合成
【０３５２】
【化２６】
2013534922.tif 000065
【０３５３】
乾燥したリンク−アミドＭＢＨＡ樹脂（１００〜２００メッシュ、０．６６ｍｍｏｌ／ｇ、０．３ｇ）を、ポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れた。以下の表に記載された合成プログラムで、シンフォニーパラレルシンセサイザー（ＰＴＩ）を用いて直鎖ペプチドの固相合成を自動で行った。膨潤、Ｃ末端アミノ酸[Fmoc-Glu(OtBu)-OH]結合及びペプチジル樹脂のキャッピングを表Iの手順により行った。続くアミノ酸カップリングを表ＩＩに記載されているように行った。直鎖配列において、Ｎ末端から第８番目のアミノ酸、OrnをFmoc-Orn-(Dde)-OHとして結合した。Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸に採用したのと同様の手順を用いてＮ−Ｂｏｃアミノ酸としてペプチドの直鎖のＮ末端アミノ酸Ser(OtBu)-OHを結合した。
【０３５４】
Ｄｄｅ基のオルトゴナル脱保護
第８番目の残基オルニチンのε−アミノ基は分枝点として用いられ、Ｄｄｅ基で保護された。直鎖ペプチド鎖の完成後、オルニチンのε−アミノ基のＤｄｅ保護をオルトゴナルに脱保護した。脱保護は、２．５％（体積／体積）ヒドラジン水和物溶液（ＤＭＦにおいて）で樹脂を処理する（２ｘ７．３０分）ことによって行われた。ヒドラジン水和物溶液は手動で添加し、自動シンセサイザーを用いた。更に樹脂を、表ＩＩのステップ４のようにシンセサイザーにおいて手動プログラムで洗浄した。表ＩＩに記載されているアミノ酸のカップリングのプログラムを用いて、分枝のアミノ酸のカップリングを、続くアミノ酸の導入によって行った。
【０３５５】
前記合成に用いたアミノ酸はFmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ser(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OHであった。ＯＨ。Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸で採用したのと同じ手順で、ペプチドの直鎖の分枝のＮ末端アミノ酸Ser(OtBu)-OHをＮ−Ｂｏｃアミノ酸として結合した。
【０３５６】
切断混合液Ｃを用いて、切断の手順に記載されているように、ペプチジル樹脂を切断し、２９５ｍｇを得た（収率７０％）。Zorbax Eclipse XDB-C18 カラム（２１．２ｍｍｘ１５０ｍｍ、５μｍ）で予備ＨＰＬＣによって、緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ／水）、緩衝液Ｂ（アセトニトリル）を用いて原料を精製した。ペプチドを流速１８ｍＬ／分でグラジエント溶出した（０〜５分＝５〜２０％緩衝液Ｂ、５〜１５分＝２０〜２５％緩衝液Ｂ）。ＨＰＬＣ：（方法１）：保持時間（RT）１１．１分、液体クロマトフラフ質量分析（LCMS）計算質量：２１３５．７７、観測質量：１０６７．９［Ｍ／２］＋；７１１．９［Ｍ／３］＋
【０３５７】
実施例１５：配列番号１３３の合成
【０３５８】
【化２７】
2013534922.tif 000066
【０３５９】
乾燥したH-Glu(OtBu)-2-クロロトリチルクロライド樹脂（１００〜２００メッシュ、０．５ｍｍｏｌ／ｇ、０．３５ｇ）を、ポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れた。以下の表に記載された合成プログラムで、シンフォニーパラレルシンセサイザー（ＰＴＩ）を用いて直鎖ペプチドの固相合成を自動で行った。続くアミノ酸カップリングを表ＩＩに記載されているように行った。前記合成に用いたアミノ酸はFmoc Phe-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OHであった。直鎖配列において、Ｎ末端から８番目のアミノ酸ＬｙｓをFmoc-Lys(Fmoc)-OHとして結合した。
【０３６０】
次の残基以降（Fmoc-Phe-OH）、表ＩＩに記載されているように、続くアミノ酸のカップリングを行った。カップリング試薬としてそれぞれ５ｍＬの０．２５Ｍアミノ酸、１ＭのＮＭＭ／ＤＭＦ中の０．２５ＭのＨＢＴＵをカップリングに用いた。Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸で採用したのと同じ手順で、ペプチドの両方のＮ末端のＮ末端アミノ酸Ser(OtBu)-OHをＮＢｏｃアミノ酸として結合した。
【０３６１】
切断混合液Ｃを用いて、切断の手順に記載されているように、ペプチジル樹脂を切断し、４００ｍｇを得た（収率６６％）。Zorbax Eclipse XDB-C18カラム（２１．２ｍｍｘ１５０ｍｍ、５μｍ）で予備ＨＰＬＣによって、緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ／水）、緩衝液Ｂ（アセトニトリル）を用いて原料を精製した。ペプチドを流速１８ｍＬ／分でグラジエント溶出した（０〜５分＝５〜２０％緩衝液Ｂ、５〜１８分＝２０〜２７％緩衝液Ｂ）。ＨＰＬＣ：（方法１）：保持時間（RT）１２．１分、液体クロマトフラフ質量分析（LCMS）計算質量：３２６２．６２、観測質量：１０８８．６［Ｍ／３＋Ｈ］＋；８１３．４［Ｍ／４＋Ｈ］＋
【０３６２】
その他の本発明の化合物は、当業者に知られている好適な修飾体について上述した同様の手順によって調製した。液体クロマトフラフ質量分析（LCMS）でペプチドのアイデンティティを確認した（表ＩＶ）。
【０３６３】
【表３９】
2013534922.tif 000067
【０３６４】
【表４０】
2013534922.tif 000068
【０３６５】
【表４１】
2013534922.tif 000069
【０３６６】
【表４２】
2013534922.tif 000070
【０３６７】
【表４３】
2013534922.tif 000071
【０３６８】
【表４４】
2013534922.tif 000072
【０３６９】
【表４５】
2013534922.tif 000073
【０３７０】
【表４６】
2013534922.tif 000074
【０３７１】
【表４７】
2013534922.tif 000075
【０３７２】
実施例１６：フローサイトメトリーによる結合阻害分析
試薬：
哺乳類の細胞のマウスＦｃ領域によるＰＤ１融合の発現：
pFUSE-Fc（商品名、Invivogen社製、カリフォルニア州）において、ヒトＰＤ１の細胞外領域（１−１６７アミノ酸残基）をクローニングした。このコンストラクトをLipofectamine 2000（商品名、Invitrogen社製）を用いてＨＥＫ２９３細胞（商品名：CRL1573、ATCC社製）にトランスフェクトし、一時的に発現させた。マウスＩｇＧのＦｃ領域で融合した細胞外ＰＤ１タンパク質を含有する分泌型組み換えタンパク質を、トランスフェクトした細胞を成長させた培地から精製した。
【０３７３】
ＰＤ１のためのリガンドのソースとしての細胞株：
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、ＲＴ−ＰＣＲによってＰＤ−Ｌ１を発現することがわかり、そのためアッセイにおいてＰＤ−Ｌ１のソースとして使用された。ＨＥＫ２９３細胞を発現する組み換えＰＤＬ２は、細胞状況においてＰＤＬ２のソースとして使用された。
【０３７４】
ＰＤ１とそのリガンドの結合のフローサイトメトリーに基づく測定：
このアッセイは、ＰＤ１とそのリガンドＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２の結合における化合物の効果を測定するために行われた。簡潔にいうと、組み換えｈＰＤＬ−２を安定した状態で過剰に発現しているＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ社製、商品名：ＣＲＬ−１５７３）及びpcDNA Myc HisAでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３（ネガティブコントロール）細胞株を、ＤＭＥＭ完全培地（シグマ社製、商品名：D5648-1L）を用いて、密集度６０〜７０％まで成長させた。細胞を細胞解離緩衝液（Invitrogen社製、商品名：13151-014）で解離させ、カウントし、そして２ｘ１０５個の細胞をＦＡＣＳ管において５０μｌのＤＭＥＭ完全培地で再懸濁させた。
【０３７５】
細胞を解離する前に、Ｆｃ（一時的にトランスフェクトした細胞の濃縮した上澄み由来）でタグ付けされた可溶性ＰＤ１を、テスト化合物８で培養した（１時間に合計量１０μｌ）。ＰＤ１−中和抗体（マウスモノクローナルＩｇＧ２Ｂクローン１９２１０６、カタログ番号ＭＡＢ１０８６、R&D Labs社製、アメリカ）も、ＰＤ１とそのリガンドの結合の阻害のポジティブコントロールとして用いるために、可溶性ＰＤ１でプレインキュベートした。ＰＤ１／ｐＦｕｓｅの混合物を様々な投与量の化合物８でプレインキュベートした。化合物を細胞に添加し、結合させた。
【０３７６】
ＰＤ１とリガンドを発現している細胞の結合を検出するために、アンチマウス二次抗体（Alexafluor488（商品名、Invitrogen社製、カタログ番号１１００１）に共役しているもの、１：１０００希釈で）を細胞に添加し、４℃で３０分間培養した。５００μＬのＦＡＣＳシース流（ＢＤ社製、カタログ番号３３６５２４）をこれらの管に添加し、３０分後、BD FACS Calibur machine（商品名）で分析を行った。図１に示すように、化合物８は、ＨＥＫ２９３細胞に発現しているＰＤ１とＰＤ−Ｌ２の結合を強力に阻害することができた。
【０３７７】
実施例１７：ラットＰＢＭＣ増殖の回復の測定
このアッセイは、ＰＢＭＣの機能に対するペプチドの効果をテストするために行った。ＰＤ１（ＰＢＭＣに発現したもの）とそのリガンド（腫瘍細胞に発現したもの）との間の相互作用に対するペプチドの効果の結果として、ＰＢＭＣ増殖が影響される。ＰＢＭＣ増殖は、破壊ペプチドの存在下において、ＰＤ１とそのリガンドの間の結合の抑止の際に増加することが期待される。テスト化合物のこの相互作用に対する効果を決定するために、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞（ＡＴＣＣ社製、商品名：ＣＲＬ ＨＴＢ−２６）を発現しているｈＰＤＬ１を２４穴プレートに接種した。２４穴プレートは、ｈＰＤＬ２細胞のために１００μｇ／ｍｌのGeneticin（商品名、シグマ社製、カタログ番号Ｇ８１６８）が添加されたＤＭＥＭ完全培地（シグマ社製、カタログ番号Ｄ５６４８）を含んでいた。
【０３７８】
５ｘＤＭＥＭ培地で希釈された１ｍＬのラットの血液を、６．２５ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（ホルボール１２−ミリスチン酸１３−アセテート、シグマ社製、カタログ番号８１３９）及び０．５μｇ／ｍｌのイオノマイシン（シグマ社製、カタログ番号Ｉ０６３４）と共に細胞の上に重ねた。１０μｌ／穴を超えない量のテスト化合物を適切な濃度で、血液と共にそれぞれのウェルに添加し、３７℃でＣＯ２インキュベーターにおいてプレートを培養した。
【０３７９】
４８時間後、ラットＰＢＭＣを、Histopaque1077（商品名、シグマ社製、カタログ番号１０７７１）を用いて単離し、サンプルを７０％エタノールに固定し、ＲＮａｓｅ（シグマ社製、商品名：Ｒ６５１３）で処理し、ヨウ化プロピジウム（シグマ社製、カタログ番号８１８４５）で着色した。これらのサンプルをBD FACS Caliburフローサイトメーター（商品名）で分析した。図２に示すように、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を発現するリガンドの存在下で、ＰＭＡで刺激されたＰＢＭＣ細胞にわずかな増殖が観察された一方、化合物８の導入によって効果的に増殖を回復することができた。
【０３８０】
実施例１８：ラットＰＢＭＣ増殖レスキューアッセイにおける化合物８の効能の測定
この調査は、上述した実施例１７の手順を用いて行われた。様々な濃度の化合物をこのアッセイにおいてテストし、ＰＭＡで刺激されたＰＢＭＣの増殖の回復においてペプチド化合物８の効能を決定した。図３に示すように、このアッセイはＭＤＡ−ＭＢ２３１を発現するＰＤ−Ｌ１の下で行われた。
【０３８１】
実施例１９：ヒトＰＢＭＣ増殖の回復の測定
ヒトの血液をヘパリンで採取し、リン酸塩緩衝液で処理された生理食塩水で希釈し、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、Histopaque（商品名）を用いて単離した。２４穴プレートをアンチＣｄ３及びアンチＣｄ２８（５ｕｇ／ｍｌ）で３時間プレコートした。その他のプレートはアイソタイプコントロール抗体（ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ）でプレコートし、増殖誘発のネガティブコントロールとして用いた。ＰＢＭＣをカウントし、各ウェルに細胞６０万個／ｍｌを、各ウェルに１μｇ／ｍｌの組み換えｈＰＤＬ１と共に接種した後、適切な濃度のテスト化合物を接種した。プレートを４８時間培養し、ＰＢＭＣを採取し、エタノールで固定し、ヨウ化プロピジウム着色による細胞サイクルプロファイルの分析を行った。テストした化合物のヒトＰＢＭＣ増殖の回復のデータを図４に示す。
【０３８２】
実施例２０：ＰＤＬ１を発現しているＭＤＭＢＡ２３１腫瘍細胞によるマウス脾細胞増殖抑制におけるペプチドの効果
ＰＤ−Ｌ１のソースとしてのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の使用：
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞はＲＴ−ＰＣＲによりＰＤ−Ｌ１を発現することが確認され、したがって、アッセイにおいてＰＤ−Ｌ１のソースとして使用された。
【０３８３】
必要条件：
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ６マウスから採取したマウス脾臓細胞；
ＲＰＭＩ１６４０（GIBCO社製、カタログ番号１１８７５）；
高グルコースを有するＤＭＥＭ（GIBCO社製、カタログ番号Ｄ６４２９）；
ウシ胎児血清［HyClone社製、カタログ番号ＳＨ３００７１．０３］；
ペニシリン（１００００ユニット／ｍｌ）−ストレプトマイシン（１０，０００μｇ／ｍｌ）、液体（GIBCO社製、カタログ番号１５１４０−１２２）；
ＭＥＭピルビン酸ナトリウム溶液１００ｍＭ（１００ｘ）、液体（GIBCO社製、カタログ番号１１３６０）；
非必須アミノ酸（GIBCO社製、カタログ番号１１１４０）；
Ｌ−グルタミン（GIBCO社製、カタログ番号２５０３０）；
アンチＣＤ３抗体（eBiosciences社製、１６−００３２）；
アンチＣＤ２８抗体（eBiosciences社製、１６−０２８１）；
ACK lysis緩衝液（１ｍＬ）（GIBCO社製、カタログ番号Ａ１０４９２）；
Histopaque（密度１．０８３ｇｍ／ｍｌ、商品名、シグマ社製、１０８３１）；
トリパンブルー溶液（シグマ社製、Ｔ８１５４）；
血球計（輝線、シグマ社製、Ｚ３５９６２９）；
ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ）：リン酸塩緩衝液で処理された生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２（HiMedia社製、ＴＳ１００６）＋０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（シグマ社製、Ａ７０５０）及びアジ化ナトリウム（シグマ社製、０８５９１）；
ＣＦＳＥの５ｍＭ保存溶液：ＣＦＳＥ保存溶液を、凍結乾燥したＣＦＳＥを１８０μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ  Ｃ２Ｈ６ＳＯ、シグマ社製、Ｄ−５８７９）で希釈することによって調製し、更なる使用のために複数の管に分配した。作用濃度を１０μＭから１μＭに滴定した。（eBioscience社製、６５０８５０−８５）；
９６穴フォーマットＥＬＩＳＡプレート（Corning社製、ＣＬＳ３３９０）；
BD FACS caliber（Ｅ６０１６）。
【０３８４】
手順
脾細胞の調製:
４０μＭ細胞濾過器で脾臓をすり潰して５０ｍｌファルコンチューブに採取した脾臓細胞を更に、１ｍｌのACK lysis緩衝液で５分間室温で処理した。９ｍｌのＲＰＭＩ完全培地で洗浄した後、３ｍｌの１ｘＰＢＳ（１５ｍｌ管中）に細胞を再懸濁させた。３ｍｌのhistopaqueを、上の層である脾細胞懸濁液を乱すことなく、管の底に極めて注意深く添加した。室温で２０分間８００ｘｇで管をスピンした。リンパ球の不透明層を、どの層も乱す又は混合することなく注意深く採取した。細胞を冷たい１ｘＰＢＳで２回洗浄し、そしてトリパンブルー除去法を用いて総細胞数のカウントを行い、更に細胞ベースのアッセイに用いた。
【０３８５】
ＣＦＳＥ増殖アッセイ：
高グルコースＤＭＥＭ完全培地に腫瘍細胞（ＭＤＭＢＡ２３１）を培養し、維持した。１ｘ１０５個の腫瘍細胞を、必要な濃度のＰＤ１由来のペプチドと共に９６穴プレートに蒔き、３７℃で４時間接着させた。１ｘ１０６個／ｍｌの採取した脾臓細胞を、３７℃で１０分間予熱した１ｘＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ溶液において５μＭのＣＦＳＥで処理した。細胞のボリュームに対して５倍のボリュームの氷冷培地を用いて過剰なＣＦＳＥを急冷し、氷上で５分間培養した。ＣＦＳＥでラベリングされた脾臓細胞を更に氷冷のＤＭＥＭ完全培地で３回洗浄した。ＣＦＳＥでラベリングされた１ｘ１０５個の脾臓細胞を、腫瘍細胞及びテスト化合物を含む上記ウェルに添加した。脾臓細胞をアンチＣＤ３及びアンチＣＤ２８抗体（各１μｇ／ｍｌ）で刺激し、３７℃で７２時間、５％のＣＯ２でコカルチャーを更に培養した。
【０３８６】
細胞を採取し、氷冷ＦＡＣＳ緩衝剤で３回洗浄し、４８８ｎｍ励起及び５２１ｎｍ蛍光フィルタを備えたFACS caliberを用いて増殖率（％）を分析した。各実験条件は３通り行われ、各実験は少なくとも３回行われた。脾細胞増殖を、cell quest FACSプログラムを用いて分析し、発光量比を、各値をパーセントバックグラウンド増殖に対して正規化することによって計算した。
【０３８７】
発光量比＝パーセント脾細胞増殖／パーセントバックグラウンド増殖
刺激された脾臓細胞：脾臓細胞＋アンチＣＤ３／ＣＤ２８刺激
バックグラウンド増殖：脾臓細胞＋アンチＣＤ３／ＣＤ２８＋腫瘍
パーセント増殖レスキュー＝｛（化合物パーセント増殖−グラウンドパーセントバック増殖）／（刺激されたパーセント増殖−パーセントバックグラウンド増殖）｝ｘ１００
【０３８８】
（ａ）化合物８、１３及び３４とmAb J43抗体の増殖レスキュー率（パーセンテージ）の比較。
mAb J43（Int.Immunol社製、1996-8(5):765-72）及びテストペプチドを、上述した手順のＣＦＳＥ方法を用いて、マウス脾細胞増殖レスキュー調査について、分析し、結果を図５にまとめた。
【０３８９】
（ｂ）ＣＦＳＥベースのマウス脾細胞増殖レスキューの調査に対する化合物の効果
テスト化合物をマウス脾細胞増殖レスキュー調査について、上述した手順の方法を用いて分析し、表Ｖに示すように、データは化合物８ペプチドに対するパーセント活性として表されている。
【０３９０】
【表４８】
2013534922.tif 000076
【０３９１】
【表４９】
2013534922.tif 000077
【０３９２】
【表５０】
2013534922.tif 000078
【０３９３】
【表５１】
2013534922.tif 000079
【０３９４】
実施例２１：細胞毒性Ｔリンパ球ＩＦＮ−γアッセイ
腫瘍細胞を高グルコースＤＭＥＭ完全培地で培養及び維持した。１ｘ１０５個の腫瘍細胞を、必要な濃度のテスト化合物と共に９６穴プレートに蒔き、３７℃で４時間接着させた。１ｘ１０５個の採取した脾臓細胞を、腫瘍細胞及びテスト化合物を含むウェルに添加した。脾臓細胞をアンチＣＤ３及びアンチＣＤ２８抗体（各１μｇ／ｍｌ）で刺激し、コカルチャーを更に３７℃で７２時間、５％のＣＯ２で培養した。７２時間のインキュベーション後、細胞培養液の上澄みを採取し、メーカーの手順（e Biosciences社製、88-7314)に従って、ＥＬＩＳＡによるマウスＩＦＮガンマ測定のために処理した。
【０３９５】
ＥＬＩＳＡ：メーカーのプロトコールによる
簡潔にいうと、９６穴ＥＬＩＳＡプレートを、緩衝剤中の１００μｌ／穴のキャプチャー抗体でコートし、４℃で一晩、培養した。プレートを洗浄緩衝剤で５回洗浄し、更に１時間室温で、２００μｌの１ｘアッセイ希釈剤でブロックした。洗浄工程の後、１００μｌの細胞培養液の上澄みをウェルに添加し、更に室温で２時間培養した。適切な標準物質も含まれていた。
【０３９６】
洗浄工程後、１時間プレートを１００μｌ／穴の標識抗体で培養した。洗浄工程を繰り返し、プレートを１００μｌ／穴のアビジン−ＨＲＰで３０分間培養した。プレートを再度数回洗浄緩衝剤で洗浄し、１００μｌ／穴の基質溶液で１５分間培養した。５０μｌの停止液を各ウェルに添加し、プレートを４５０ｎｍで読んだ。吸光度の値を標準物質に対してプロットし、ＩＦＮ−γの濃度をGraph Pad Prism softwareを用いて決定した（図６）。各実験条件を３通り（triplicates）行い、各実験は少なくとも３回行った。
【０３９７】
発光量比＝化合物の存在又は不存在下における刺激された脾細胞により産生されたＩＦＮ−γ／バックグラウンドＩＦＮ−γの産生
刺激された脾臓細胞：テスト化合物の存在又は不存在下における脾臓細胞＋アンチＣＤ３／ＣＤ２８刺激
バックグラウンドＩＦＮ−γの産生：脾臓細胞＋アンチＣＤ３／ＣＤ２８＋腫瘍
【０３９８】
実施例２２：Ｂ１６Ｆ１０皮下黒色腫モデルにおける、原発腫瘍 成長及び肺転移に対する化合物８のインビボの有効性
【０３９９】
動物:
６〜８週齢のＣ５７／黒い６匹のメスマウス（Aurigene社製（バンガロール、インド）)を実験に用いた。実験を行う前に、動物を１週間実験室で順応させた。
【０４００】
０日目、密集度７０〜７５％で１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で成長させたＢ１６Ｆ１０細胞を採取し、動物１匹につき細胞１ｘ１０６個をマウスの右側腹部に皮下注射した。１日目、投与量５ｍｇ／ｋｇのペプチド（化合物８）をｐＨ７．４のＰＢＳに溶解し、１０ｍｌ／ｋｇの量で１４日間１日１回皮下に投与した。基剤対照グループのマウスには生理食塩水しか与えられなかった。各グループは１０匹の動物からなる。体重及び臨床兆候を毎日記録した。腫瘍体積をスライドキャリパーで測定した。
【０４０１】
５ｍｇ／ｋｇを投与された化合物８は、４４％程度、腫瘍の成長を抑制した（ｐ＜０．００１、双方向分散分析）。投与期間中、体重の低減はなく、臨床兆候は観察されなかった。基剤を与えられた動物の平均腫瘍体積は４９６ｍｍ３であり、一方、化合物８を与えられた動物は、１４日間の投与期間の終わりに２７６ｍｍ３を示した（図７）。投与期間の終わりに、肺を採取し、黒い小結節をカウントして転移の分析を行った。化合物８は６０％を超える転移の低減が観察された。基剤及び化合物８が投与与えられた肺の写真を図８に示す。
【０４０２】
実施例２３  化合物８、３４、６９、８２、８３、９１のＢ１６Ｆ１０転移モデルにおける転移の抑制に対するインビボの有効性
転移モデルの場合、０．１Ｘ１０６個のＢ１６Ｆ１０細胞をＣ５７／黒い６匹のマウスに静脈内注射した。ｐＨ７．４のＰＢＳに溶解したテスト化合物を５ｍｇ／ｋｇ、１日１回皮下に投与した。基剤対照グループのマウスは生理食塩水しか与えられなかった。各グループは１０匹の動物からなる。体重及び臨床兆候を毎日記録した。１１日間の投与後、肺転移を、解剖顕微鏡で腫瘍小結節の数をカウントして定量した。図９は１１日間の投与の終わりの肺転移を示す。
【０４０３】
実施例２４  ４Ｔ１同所性乳腺癌腫モデルにおける化合物８の効果
０日目、密集度７０〜７５％で１０％ＦＢＳを含むRPMI 1640中で成長させた4T1細胞を採取し、動物１匹につき細胞０．１ｘ１０６個をマトリゲルと共に同所的に乳腺脂肪体に注射した。１日目、投与量３ｍｇ／ｋｇのペプチド（化合物８）をｐＨ７．４のＰＢＳに溶解し、１０ｍｌ／ｋｇの量で５．５週間１日１回皮下に投与した。基剤対照グループのマウスは生理食塩水しか与えられなかった。各グループは１０匹の動物からなる。体重及び臨床兆候を毎日記録した。腫瘍体積をスライドキャリパーで測定した。調査の終わりに、肺への転移を、解剖顕微鏡で肺の腫瘍小結節の数をカウントして定量した。
【０４０４】
４０日間の投与期間の終わりに、３ｍｇ／ｋｇ投与された化合物８は、原発腫瘍体積を４４％程度まで抑制したことが図１０に示されている。投与期間中、体重の減少はなかった。化合物８を与えらえたグループの動物の中の１０％は完全退縮を示し、その他の１０％は部分的な腫瘍成長の退縮を示した。４０日目に、動物を安楽死させ、それらの肺を腫瘍小結節について解剖顕微鏡下で観察した。１匹の動物においては、腫瘍体積は基剤を投与したグループと同様であったが、転移は完全に抑制された（腫瘍小結節は全く見られなかった）。原発腫瘍体積に完全退縮が見られた動物には目に見える腫瘍小結節が見られなかった。化合物８を与えらえた動物は＞６０％程度までの平均転移低減を示した。
【０４０５】
実施例２５  腎臓細胞癌腫モデルにおける化合物３４及び８３の効果
メスの６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、１２時間／１２時間明暗切替で適宜エサ及び水を与えて恒温室に保持した。１日目、腹膜を開けることなく、非融合性単層から採取したＲＥＮＣＡ細胞を腎臓被膜下に注射した。皮膚切開を自動縫合クリップで閉じた。１日目、４０μｌの培地中のＲｅｎｃａ細胞（１５ｘ１０４個）をマウスの腎臓被膜下に注射した。２日目から２１日間、ペプチドを１日４回５ｍｐｋで皮下に投与した。投与期間の終わりに（２１日間）、動物を安楽死させ、左右の腎臓（コントロール）の腫瘍の重量を測定し、図１１に示すように抑制率としてプロットした。
【０４０６】
実施例２６：微量液体希釈法による最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）測定の手順
必要な量の化合物を計量し、水／ジメチルスルホキシド／好適な溶媒に溶解し、１ｍｇ／ｍｌの保存溶液を得た。保存溶液をＭＨＢ／ＣＡＭＨＢで希釈し、必要に従って８μｇ／ｍｌ又は６４μｇ／ｍｌ又は５１２μｇ／ｍｌの溶液を得た。マルチチャネルピペットを用いて９６ウェルマイクロタイタートレイに化合物の連続２倍希釈液をＭＨＢ／ＣＡＭＨＢで調製した。生体をＭＨＢ／ＣＡＭＨＢ中、４〜５時間３５±２ｏＣ、１１０±１０ｒｐｍで成長させた。培養液の光学密度（ＯＤ）を６２５ｎｍに調整し（0.5 Mc Farland standard（１〜２ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌ）に対応する）、更に希釈して（５±５）ｘ１０４ｃｆｕ／穴の最後の接種材料を得た。培養液、化合物及び生体コントロールをセットした。
【０４０７】
３５±２℃で１６〜２０時間時間、外気インキュベーターで微量希釈トレイを培養した。培養時間後、ウェル中の生体の成長を、視覚装置を利用し肉眼で検出した。肉眼によって検出された、生体の成長を完全に抑制する抗菌剤の最低濃度をＭＩＣとした。ＭＩＣ値は、テスト化合物８（ＭＩＣ（μｇ／ｍｌ）は＞３２）が全く抗菌活性を発現しないことを示しており、他方、標準物質すなわちレボフロキサシン及びシプロフロキサシンは、同じ実験においてＭＩＣ（μｇ／ｍｌ）値０．０１５及び０．００７を示す。
【０４０８】
実施例２７：大腸菌性敗血症ノマウスモデルニオケル化合物＃ノインビボノ有効性
（材料及び方法）
用いた細菌の菌株は大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２であり、細菌懸濁液を通常生理食塩溶液で調製し、〜５ｘ１０８ＣＦＵ／ｍｌの接種材料を得た。ＢＡＬＢ／ｃ又は重量１８〜２２ｇｍｓのSwiss albinoマウスが調査に使用された。動物は５日間個々に換気式ケージ（ＩＶＣｓ）で隔離された。エサ及び水は適宜提供した。１２時間の明暗周期で、温度は２２〜２６℃に維持された。
【０４０９】
（手順）
〜１−２ｘ１０８ＣＦＵ／ｍｌを含む前記最後の接種材料を静脈注射によって動物に投与した。感染から２４時間後に治療を開始し、２日間３時間の間隔をおいて１日３回、化合物を投与した。１つの動物のグループは感染コントロールとするために治療しなかった。
【０４１０】
２日間の治療が完了した後、最後の投与から３時間後に全ての動物（治療したもの及び治療しなかったもの）を屠殺し、様々な器官（腎臓、脾臓及び肺）を無菌状態で回収し、細菌数計数のために処理した。回収した器官サンプルをホモジナイズし、通常生理食塩溶液で連続的に希釈し、ＴＳＡプレート上に置いた。前記プレートを１８〜２４時間３５±２℃で培養し、細菌数を計数処理した。治療した動物とコントロール動物を比較することで結果を分析し、好適な統計的手法を適用して図１２に示すように統計的有意性を計算した。
【０４１１】
アミノ酸配列情報：
配列番号：１はヒトＰＤ−１細胞外領域のアミノ酸配列を示す。
配列番号：２はヒトＰＤ−１細胞外領域のＡストランドのアミノ酸配列を示す。
配列番号：３はヒトＰＤ−１細胞外領域のＢストランドのアミノ酸配列を示す。
配列番号：４はヒトＰＤ−１細胞外領域のＢＣループのアミノ酸配列を示す。
配列番号：５はヒトＰＤ−１細胞外領域のＣストランドのアミノ酸配列を示す。
配列番号：６はヒトＰＤ−１細胞外領域のＣ−Ｃ’ループのアミノ酸配列を示す。
配列番号：７はヒトＰＤ−１細胞外領域のＣ’ストランドのアミノ酸配列を示す。
配列番号：８はヒトＰＤ−１細胞外領域のＣ’−Ｃ”ループのアミノ酸配を列示す。
配列番号：９はヒトＰＤ−１細胞外領域のＣ”ストランドのアミノ酸配列を示す。
配列番号：１０はヒトＰＤ−１細胞外領域のＣ”−Ｄループのアミノ酸配列を示す。
配列番号：１１はヒトＰＤ−１細胞外領域のＤストランドのアミノ酸配列を示す。
配列番号：１２はヒトＰＤ−１細胞外領域のＤ−Ｅループのアミノ酸配列を示す。
配列番号：１３はヒトＰＤ−１細胞外領域のＥストランドのアミノ酸配列を示す。
配列番号：１４はヒトＰＤ−１細胞外領域のＦストランドのアミノ酸配列を示す。
配列番号：１５はヒトＰＤ−１細胞外領域のＦＧループのアミノ酸配列を示す。
配列番号：１６はヒトＰＤ−１細胞外領域のＧストランドのアミノ酸配列を示す。
配列番号：１７はマウスＰＤ−１細胞外領域のアミノ酸配列を示す。
配列番号：１８はラットＰＤ−１細胞外領域のアミノ酸配列を示す。
配列番号：１９はイヌＰＤ−１細胞外領域のアミノ酸配列を示す。
配列番号：２０はウマＰＤ−１細胞外領域のアミノ酸配列を示す。
配列番号：２１はヒトＰＤ−１細胞外領域のＣ’ストランドからＣ’Ｃ’’ループのアミノ酸配列を示す。
配列番号：２２はヒトＰＤ−１細胞外領域のＣ’ストランドからＣ’’ストランドのアミノ酸配列を示す。
配列番号：２３はヒトＰＤ−１細胞外領域のＣＣ’ループからＣ’ストランドのアミノ酸配列を示す。
配列番号：２４はヒトＰＤ−１細胞外領域のＦＧループからＧストランドのアミノ酸配列を示す。
配列番号：２５はヒトＰＤ−１細胞外領域のＤストランドからＤＥループのアミノ酸配列を示す。
配列番号：２６はマウスＰＤ−１細胞外領域のＢストランドのアミノ酸配列を示す。
配列番号：２７はマウスＰＤ−１細胞外領域のＢＣループのアミノ酸配列を示す。
配列番号：２８はマウスＰＤ−１細胞外領域のＣ−ストランドのアミノ酸配列を示す。
配列番号：２９はマウスＰＤ−１細胞外領域のＣ−Ｃ’ループのアミノ酸配列を示す。
配列番号：３０はマウスＰＤ−１細胞外領域のＣ’−ストランドのアミノ酸配列を示す。
配列番号：３１はマウスＰＤ−１細胞外領域のＣ”ストランドのアミノ酸配列を示す。
配列番号：３２はマウスＰＤ−１細胞外領域のＣ”−Ｄ−ループのアミノ酸配列を示す。
配列番号：３３はマウスＰＤ−１細胞外領域のＤ−ストランドのアミノ酸配列を示す。
配列番号：３４はマウスＰＤ−１細胞外領域のＦ−ストランドのアミノ酸配列を示す。
配列番号：３５はマウスＰＤ−１細胞外領域のＦ−Ｇループのアミノ酸配列を示す。
配列番号：３６はマウスＰＤ−１細胞外領域のＧ−ストランドのアミノ酸配列を示す。
配列番号：３７はマウスＰＤ−１細胞外領域のＣ’ストランドからＣ’Ｃ’’ループのアミノ酸配列を示す。
配列番号：３８はマウスＰＤ−１細胞外領域のＣ’ストランドからＣ’’ストランドのアミノ酸配列を示す。
配列番号：３９はマウスＰＤ−１細胞外領域のＣＣ’ループからＣ’ストランドのアミノ酸配列を示す。
配列番号：４０はマウスＰＤ−１細胞外領域のＦＧループからＧストランドのアミノ酸配列を示す。
配列番号：４１はマウスＰＤ−１細胞外領域のＤストランドからＤＥループのアミノ酸配列を示す。
【図１】
2013534922.tif 000097
【図２】
2013534922.tif 000098
【図３】
2013534922.tif 000099
【図４】
2013534922.tif 000100
【図５】
2013534922.tif 000101
【図６】
2013534922.tif 000102
【図７】
2013534922.tif 000103
【図８】
2013534922.tif 000104
【図９】
2013534922.tif 000105
【図１０】
2013534922.tif 000106
【図１１】
2013534922.tif 000107
【図１２】
2013534922.tif 000108
【配列表】
2013534922000001.app
【国際調査報告】
2013534922.tif 000109
2013534922.tif 000110
2013534922.tif 000111
2013534922.tif 000112
2013534922.tif 000113
2013534922.tif 000114
2013534922.tif 000115