(57)【要約】  本発明は薬学分野に関する。本発明は、３，３’−ジインドリルメタン（ＤＩＭ）を含有するブロック共重合体医薬組成物を開示する。本願の経口投与用医薬組成物は、活性成分としての３，３’−ジインドリルメタンおよび標的剤を包含し、該標的剤はオキシエチレンとオキシプロピレンとのブロック共重合体であり、該ブロック共重合体の疎水性ブロック含有量は５０質量％未満であり、親水性ブロックの分子量は２，２５０Ｄａ以上であり、該活性成分に対するブロック共重合体の比率は１０：１〜２：１の範囲内である。この組成物は、経口投与した際の血流中への活性成分の吸収を向上させる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性成分としての３，３’−ジインドリルメタンおよび標的剤を包含する経口投与用医薬組成物であって、該標的剤はオキシエチレンとオキシプロピレンとのブロック共重合体であり、該ブロック共重合体の疎水性ブロック含有量は５０質量％未満であり、親水性ブロックの分子量は２，２５０Ｄａ以上であり、該活性成分に対するブロック共重合体の比率は１０：１〜２：１の範囲内であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
オキシエチレンとオキシプロピレンとのブロック共重合体としてプルロニックＦ１２７を包含する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
プルロニックＬ１０を更に包含する、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
薬学的に許容される担体を更に包含する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
錠剤、凍結乾燥粉末、懸濁液またはカプセル剤の剤形であることを特徴とする、請求項４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は薬学分野に関し、特に新規な３，３’−ジインドリルメタン（ＤＩＭ）経口投与用医薬組成物およびその補助による疾患の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
３，３’−ジインドリルメタン（ＤＩＭ）、その類似体および誘導体は、広い生物活性スペクトルを有し、それ故にＤＩＭは非常に有望な薬理活性化合物であると考えられている。３，３−ジインドリルメタン（ＤＩＭ）は、インドール−３−カルビノール（Ｉ３Ｃ）の主要なオリゴマー産物であり、様々な起源の悪性転換細胞に対して高い選択性を示すことが立証されている（Aggarwal B.B., Ichikawa H. (2005), Molecular Targets and Anticancer Potential of Indole-3-Carbinol and Its Derivatives, Cell Cycle, 4(9), 1201-1215）。胃の酸性媒体中では、経口投与したＩ３Ｃがほぼ瞬時にＤＩＭに変換されることが薬理動態研究によって明らかとなった（Arneson D.W., Hurwitz A., McMahon L.M., Robaugh D. (1999), Presence of 3,3'-Diindolylmethane in Human Plasma after Oral Administration of Indole-3-Carbinol (Abstr.), Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 40, 2833）。よって、Ｉ３Ｃの抗癌活性を研究している研究者の多くが、Ｉ３Ｃの投与によって生じる臨床効果の大部分が、実際はインドール−３−カルビノールの２量体、即ちＤＩＭ、によるものであることを認める傾向にある。
【０００３】
Ｉ３Ｃによってin vitroおよびin vivoで誘導される複数の抗癌メカニズムのほぼ全てが、ＤＩＭにも固有のものであることが実験によって明示された（Chang X., Tou J.C., Hong C., et al. (2005), 3,3'-Diindolylmethane Inhibits Angiogenesis and the Growth of Transplantable Human Breast Carcinoma in Athymic Mice, Carcinogenesis, 264(4), 771-778；Firestone G.L., Bjeldanes L.F. (2003), Indole-3-Carbinol and 3,3'-Diindolylmethane Anti-Proliferative Signaling Pathways Control Cell Cycle Gene Transcription in Human Breast Cancer Cells by Regulating Promoter-Sp1 Transcription Factor Interactions, J. Nutr., 133, 2448S-2455S；Ge X., Yannai S., Rennert G., et al. (1996), 3,3'-Diindolylmethane Induces Apoptosis in Human Cancer Cells, Biochem. Biophys. Res. Commun., 228, 153-158；Hong C., Kim H.A., Firestone G.L., et al. (2002), 3,3'-Diindolylmethane (DIM) Induces a Cell Cycle Arrest in Human Breast Cancer Cells That Is Accompanied by Sp-1-Mediated Activation of p21 WAF1/CIP1 Expression, Carcinogenesis, 23, 1297-1305；Leibelt D.A., Hedstrom O.R,, Fisher K.A. (2003), Evaluation of Chronic Dietary Exposure to Indole-3-Carbinol and Absorption Enhanced 3,3'-Diindolylmethane in Sprague-Dawley Rats, Toxicol. Sci., 74, 10-21； Li Y., Li X., Sarkar F.H. (2003), Gene Expression Profiles of I3C- and DIM-Treated PC3 Human Prostate Cancer Cells Determined by cDNA Microarray Analysis, J. Nutr., 133, 1011-1019；Nachshon-Kedmi M., Yannai S., Haj A., Fares F.A. (2003), Indole-3-Carbinol and 3,3'-Diindolylmethane Induces Apoptosis in Human Prostate Cancer Cells, Food Chem. Toxicol., 41, 745-752）。この結論は、前立腺癌にも当てはまる。Ｉ３Ｃと同様に、ＤＩＭもin vitroおよびin vivoにおける前立腺癌細胞の増殖を阻害し（Li Y., Li X., Sarkar F.H. (2003), Gene Expression Profiles of I3C- and DIM-Treated PC3 Human Prostate Cancer Cells Determined by cDNA Microarray Analysis, J. Nutr., 133, 1011-1019；Nachshon-Kedmi M., Fares F.A., Yannai S. (2004), Therapeutic Activity of 3,3'-Diindolylmethane on Prostate Cancer in an in vivo Model, Prostate, 61 (2), 153-160）、そのアポトーシスを誘導する（Li Y., Li X., Sarkar F.H. (2003), Gene Expression Profiles of I3C- and DIM-Treated PC3 Human Prostate Cancer Cells Determined by cDNA Microarray Analysis, J. Nutr., 133, 1011-1019； Nachshon-Kedmi M., Yannai S., Fares F.A. (2004), Induction of Apoptosis in Human Prostate Cancer Cell Line, PC3, by 3,3'-Diindolylmethane Through the Mitochondrial Pathway, Br. J. Cancer, 91, 1358-1363）。この場合、Ｉ３Ｃと同様に、ＤＩＭは増殖過程、分化過程および生存過程に関与する遺伝子の発現を制御し（Li Y., Li X., Sarkar F.H. (2003), Gene Expression Profiles of I3C- and DIM-Treated PC3 Human Prostate Cancer Cells Determined by cDNA Microarray Analysis, J. Nutr., 133, 1011-1019）、細胞の過剰増殖に繋がる複数のシグナル伝達経路を阻害することによって、その活性をサブ分子レベルで提示する。
【０００４】
ホルモン感受性の前立腺細胞（培養ＬＮＣａＰ）を用いて、ＤＩＭが複数のアンドロゲン受容体に同時的に結合することで、核へのトランスロケーションとそれに続く遺伝子転写の活性化、更には前立腺特異的ＰＳＡ抗原をコードする遺伝子プロモーターの発現を抑制することが示された。ＰＳＡタンパク質（特異的前立腺プロテアーゼ）は、前立腺癌細胞によって大量に産生および分泌される、前立腺癌の古典的マーカーである。上記文献においては、構造研究を実施した後にＤＩＭの分子幾何学が公知の合成抗アンドロゲンであるカソデックスと非常に類似していることを確立した（Le H.T,, Schaldach C.M., Bjeldanes L.F. (2003), Plant-Derived 3,3'-Diindolylmethane Is a Strong Androgen Antagonist in Human Prostate Cancer Cells, J. Biol. Chem., 278, 21136-21145）。しかしながら、ＤＩＭとは異なり、カソデックスはアンドロゲン受容体の核へのトランスロケーションを促進する（Masiello D., Cheng S., Bubley G.J., et al. (2002), Bicalutamide Functions as an Androgen Receptor Antagonist by Assembly of a Transcriptionally Inactive Receptor, J. Biol. Chem., 277, 26321-26326）。
【０００５】
ＤＩＭが抗血管新生活性を提示する能力は近年発見されたばかりであるが、これは非常に重要な発展である。過形成性且つ腫瘍性の過程は、ほぼ確実に血管の病的な成長を伴う。直径が１〜２ｍｍの新しい腫瘍に酸素と栄養を供給するための毛細血管のネットワークが形成されない限り、腫瘍はその成長を全く継続しないというのは常識である。In vitroにおけるマイクロモル濃度のＤＩＭが内皮細胞の増殖と遊走、および内皮細胞の血管形成能を効果的に抑制することが示されている。In vivoにおいては、実験動物にＤＩＭ（毎日５ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射したところ、７４％において病的な血管新生を抑制する効果を示した（Chang X., Tou J.C., Hong C., et al. (2005), 3,3'-Diindolylmethane Inhibits Angiogenesis and the Growth of Transplantable Human Breast Carcinoma in Athymic Mice, Carcinogenesis, 264(4), 771-778；McCarty M.F., Block K.I. (2005), Multifocal Angiostatic Therapy: An Update, Integrative Cancer Therapies,  4(4), 301-314）。
【０００６】
核転写因子ＮＦ−κＢは、臨床診療用に開発され使用されている近年の標的製剤（直接製剤）が遮断することを意図した活性を提示する最も重要な分子標的である。この因子は、炎症性応答を仲介し、成長因子およびサイトカインの誘導するシグナル伝達経路の最終段階における、増殖性（抗アポトーシス性）、血管新生性、遊走性および浸潤性の細胞活性の制御において主要な役割を担うものであることが立証されている。更に、活性因子の核へのトランスロケーションおよびこれら過程を担う遺伝子の転写活性化は重要な事象である。In vitroで使用すると、ＤＩＭ（Rahman K.M., Ali S., Aboukameel A., et al. (2007), Inactivation of NF-KappaB by 3,3'-Diindolylmethane Contributes to Increased Apoptosis Induced by Chemotherapeutic Agent in Breast Cancer Cells, Mol. Cancer Ther., 6(10), 2757-2765；Rahman K.M., Sarkar F.H. (2005), Inhibition of Nuclear Translocation of Nuclear Factor-κB Contributes to 3,3'-Diindolylmethane-Induced Apoptosis in Breast Cancer Cells, Cancer Res., 65, 364-371）およびその代謝先行物質であるＩ３Ｃは、ＮＦ−κＢの核へのトランスロケーションおよびその活性の抑制に効果的であることが判明した。これは、その抗増殖性効果および抗血管新生効果に加えて、ＤＩＭに基づく製剤は、ホルモン依存性の臓器および組織における過形成性且つ腫瘍性の過程に頻繁に伴う局所的な炎症反応を抑制する能力を有することを意味している。
【０００７】
プラセボ群を対照とした臨床研究の枠組み内で行われた、子宮頚部形成異常の退縮を示した患者に関する詳細な研究は、疾患の陽性動態とＩ３ＣのＤＩＭへの変換効率との間に見られる直接的な繋がりをたどるための一助となった（Sepkovic D.W., Bradlow H.L., Bell M. (2001), Quantitative Determination of 3,3'-Diindolylmethane in the Urine of Individuals Receiving Indole-3-Carbinol, Natr. Cancer, 41, 57-63）。製剤を投与した患者の尿からは、高濃度のＤＩＭが検出された。
【０００８】
最近の実験の１つは、ＤＩＭがin vitroのヒト子宮頸部ＨＰＶ感染ケラチノサイトに対してアポトーシスを誘導する能力について明らかにした。更に、研究した３種の子宮頸部癌細胞系の内の１種においては、ＤＩＭはＩ３Ｃよりも遥かに高い効率を示した。ＬＤ50値は、ＤＩＭでは５０〜６０μＭであり、Ｉ３Ｃでは２００μＭであったが、その代謝先行物質（Ｉ３Ｃ）とは異なり、ＤＩＭは正常な（悪性転換していない）ケラチノサイトに対してアポトーシス性変化を誘導しなかった（Chen D.Z., Qi M., Auborn K., Carter T.H. (2001), Indole-3-Carbinol and Diindolylmethane Induce Apoptosis of Human Cervical Cancer Cells and in Murine HPV16-Transgenic Preneoplastic Cervical Epithelium, J. Nutrit., 131, 3294-3302）。
【０００９】
最後に、ＤＩＭには近年新たに発見された特性、それも最も重要な利点の１つであると考えられる免疫調節活性がある。研究者によって、ＤＩＭをin vitroで使用すると、ＩＦＮγ受容体の発現や、他のＩＦＮ応答性調節タンパク質を活性化することで、腫瘍細胞内のＩＦＮγ−依存性シグナル伝達経路を促進することが示された。
【００１０】
ＤＩＭに基づく製剤を経口的に投薬する方法は、特に患者の快適さ、柔軟な治療手法および治療費の観点から他の投薬方法に比べて一連の長所を有するため、好ましい方法として選ばれるべきである。しかし、ＤＩＭの経口投与は、ＤＩＭの低い溶解性および小腸における低い吸収効率故に、その生物学的利用能を著しく制限することになる。典型的には、ＤＩＭは生理食塩水中で低い溶解性を示し、隔膜を透過する能力にも限界がある。更にこの化合物は、血液中の血漿タンパク質に結合し、血流内の様々な非特異的反応に関与することで、疾患幹部への送達効率が著しく低下することが知られている。
【００１１】
上記問題を解決するための手段として、ペグ化ビタミンＥ（ＴＰＧＳ）に基づく数種の医薬が近年開発されている（Anderton M.J., Manson M.M., et al. (2004), Physiological Modeling of Formulated and Crystalline Diindolylmethane  Pharmacokinetics Following Oral Administration in Mice, Drug Metabolism and Disposition, 32(6), 632-638）。ペグ化ビタミンＥは、種々の物質の水に対する溶解性を高め（Constantinides P.P., Tustian A., Kessler D.R. (2004), Tocol Emulsions for Drug Solubilization and Parenteral Delivery, Adv. Drug Deliv. Rev., 56, 1243-1255)、経口投与した際に生物学的利用能を向上させる能力（Wu S.H.W., Hopkins W.K. (1999), Characteristics of d-α-Tocopheryl PEG 1000 Succinate for Applications as an Absorption Enhancer in Drug Delivery Systems, Pharm. Technol., 23, 52-68）を持つことで知られている。しかしながら、ＴＰＧＳに基づく組成物は、ＤＩＭおよびその類似体や誘導体の生物学的利用能を有意に上昇させることはできないため（５０％〜１００％の増加のみである）（Zeligs, et al., US Patent 6,416,793,  Formulation and Use of Controlled-Release Indole Alkaloids）、上記化合物の治療的潜在能力を完全に利用することができない。
【発明の概要】
【００１２】
本発明の１つの目的は、ＤＩＭの送達を向上させることである。
【００１３】
この目的は、オキシエチレンとオキシプロピレンとのブロック共重合体に基づく、ＤＩＭの経口送達用の新規医薬組成物によって達成される。
【００１４】
経口投与用の医薬組成物は、活性成分となる３，３'−ジインドリルメタンおよび標的剤を包含し、標的剤はオキシエチレンとオキシプロピレンとのブロック共重合体であり、該ブロック共重合体の疎水性ブロック含有量は５０質量％未満であり、親水性ブロックの分子量は２，２５０Ｄａ以上であり、該活性成分に対するブロック共重合体の比率は１０：１〜２：１の範囲内であることを特徴とする医薬組成物である。
【００１５】
医薬組成物は、オキシエチレンとオキシプロピレンとのブロック共重合体として、プルロニックＦ１２７共重合体を包含することが好ましい。
【００１６】
医薬組成物は、プルロニックＬ１０を更に包含してもよい。
【００１７】
医薬組成物は、薬学的に許容される担体を更に包含してもよい。
【００１８】
医薬組成物は、錠剤、凍結乾燥粉末、懸濁液またはカプセル剤の剤形であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＤＩＭ溶解能の動態（ＤＩＭ濃度は、光学密度の変化から求めた）。組成物１：ＤＩＭ（対照）；組成物２：プルロニックＦ１２７およびＤＩＭ；組成物３：プルロニックＦ１２７、プルロニックＬ１０およびＤＩＭ。
【図２】以下の組成物を投与したラットの血漿におけるＤＩＭの薬理動態。組成物１：ＤＩＭ（対照）；組成物２：プルロニックＦ１２７およびＤＩＭ；組成物３：プルロニックＦ１２７、プルロニックＬ１０およびＤＩＭを含む溶液の凍結乾燥品；組成物４：プルロニックＦ１２７およびＤＩＭ；組成物５：プルロニックＬ１０およびＤＩＭ。
【図３】前立腺腺腫（ＰＧＡ）および前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）の患者の、処置前および処置後の形態学的研究結果。グループＩ（患者１８人）は、本発明のＤＩＭに基づく医薬組成物を投与した。グループＩＩ（患者１６人）は、結晶化ＤＩＭを含む医薬組成物を投与した。
【図４】製剤の投与前および投与後の、ＩＧＦ成長因子、ＥＧＦ成長因子およびＴＧＦ−β調節因子を用いた免疫組織化学的解析の結果。グループＩ（患者４人）は、請求の範囲で定義したＤＩＭに基づく医薬組成物を投与した。グループＩＩ（患者４人）は、結晶化ＤＩＭを含む医薬組成物を投与した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
オキシエチレンとオキシプロピレンとのブロック共重合体は、プルロニックおよびポロキサマの名称でも知られている。
【００２１】
プルロニックの疎水性−親水性特性、およびプルロニックが非水溶性化合物を可溶化する能力は、そのポリオキシエチレン（親水性）ブロックとポリオキシプロピレン（疎水性）ブロックとの大きさおよび比率によって決まる。次の表（表１）に種々のプルロニックの構造的特徴をまとめた。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
上記のブロック共重合体は、例えば、疎水性の非水溶性化合物の溶解能の向上のために、医薬組成物および化粧用組成物に広く用いられているが（Foster B., Cosgrove T., Hammouda B. (2009), Pluronic Triblock Copolymer Systems and Their Interactions with Ibuprofen, Langmuir, 25(12), 6760-6766）、その使用方法については、個々の特定の薬剤のために個別の手法を考える必要がある。
【００２４】
今日では、薬剤の生物学的利用能に何らかの影響を与えることが可能な５０種を超えるＡＴＰ依存性トランスポーターが知られている（Oostendorp R.L., Beijnen J.H., Schellens J.H. (2009), The Biological and Clinical Role of Drug Transporters at the Intestinal Barrier, Cancer Treat. Rev., 35(2), 137-147）。更に、これらトランスポーターの遺伝子多型も、種々の薬剤の生物学的利用能の変動性に有意に貢献している（Nakamura T., Yamamori M., Sakaeda T. (2008), Pharmacogenetics of Intestinal Absorption, Curr. Drug Deliv., 5(3), 153-169）。様々な薬剤の生物学的利用能を制限する、種々の界面活性ポリマー、種々のトランスポーターおよびそれらの組み合わせの間で生じる相互作用の正確なメカニズムは未だ確立されておらず、ある活性物質の生物学的利用能に対して正の効果を示す組成物が、別の活性物質に対しては効果的ではない場合や、その逆もまた起こりうる。
【００２５】
オキシエチレンとオキシプロピレンとのブロック共重合体の使用によって向上する経口生物学的利用能は、Ｐ−糖タンパク活性と関連する。従って、これらブロック共重合体は、Ｐ−糖タンパク質の基質が活性物質である組成物（Kabanov A.V. et al., US Patent 6,277,410, Copolymer Compositions for Oral Delivery）や、数種のＭＲＰ処方（Miller D.W., Batrakova E.V., Kabanov A.V. (1999), Inhibition of Multidrug Resistance-Associated Protein (MRP) Functional Activity with Pluronic Copolymers, Pharm. Res., 16(3), 396-401）への添加が提案されている。同様の特性が他の界面活性ポリマー化合物についても示されている。特に、ソルトールＨ１５は、非水溶性化合物に対する高い可溶化作用に加えて、Ｐ−糖タンパク質の活性制御能が確立されており（Coon J.S., Knudson W., Clodfelter K., et al. (1991), Solutol HS 15, Nontoxic Polyoxyethylene Esters of 12-Hydroxystearic Acid, Reverses Multidrug Resistance, Cancer Res., 51, 897-902）、それ故、経口医薬処方用の吸収増強剤となり得る。同様の性質が、クレモホールＥＬ、トゥイーン８０、上述したＴＰＧＳおよび他の類似化合物についても明らかになっている（Seelig A., Gerebtzoff G. (2006), Enhancement of Drug Absorption by Noncharged Detergents Through Membrane and P-Glycoprotein Binding, Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology, 2(5), 733-752）。
【００２６】
後述する実際の実験（実施例８）は、ＤＩＭはＰ−糖タンパク質を発現する細胞によるローダミン１２３の捕捉を増強しないことを示し、この結果は、ＤＩＭがこのトランスポーターの基質ではないことを示した。この知見は、ＤＩＭの生物学的利用能を向上させるためにＴＰＧＳを高活性Ｐ−糖タンパク質モジュレーターとして使用する上記試みの結果、即ち、このパラメーターを有意に向上させる試みが失敗したことと一致する。一方、本発明において使用する種々の界面活性ポリマーは、この薬剤の経口生物学的利用能の有意な向上をもたらした。
【００２７】
疎水性ブロックと親水性ブロックを種々の比率で含有するプルロニックに対するＤＩＭの溶解度の解析によって、親水性ブロックを５０質量％以上含有するポリマーの方が、親水性ブロックの含有量が５０質量％未満のポリマーよりも高い可溶化能を有することが明らかとなった。一定の分子量の親水性エレメントと種々の含量のオキシエチレン基を有する複数種のプルロニックの存在が知られている。
【００２８】
意外にも、ＤＩＭの生物学的利用能は、親水性ブロックの分子量にも依存することを発見した。生物学的利用能の向上に、疎水性ブロックの含有量が５０質量％未満であり、親水性ブロックの分子量が２，２５０Ｄａ以上である、オキシエチレンとオキシプロピレンとのブロック共重合体が寄与する。プルロニックＦ１２７が最も高い効率を示し、３ｍｇ／ｍｌ以上のＤＩＭを含有する安定な水系分散液を得るために使用することができる。このＤＩＭ組成物をラットに経口投与したところ、その生物学的利用能は有意に上昇した（５倍を超えた）。活性成分に対するブロック共重合体の比率は、所望の放出時間に依存して変化するが、平均的には１０：１〜２：１の範囲内である。プルロニックＦ１２７とＤＩＭの最適な比率は、６：１である。
【００２９】
意外にも、プルロニックＬ１０（親水性ブロックを約４０％含有し、総分子量が約３，２００）は、水に対するＤＩＭの溶解度およびラットに経口投与した際の生物学的利用能に対して僅かな効果しか示さなかったものの、プルロニックＦ１２７の効果を有意に増強し、ＤＩＭ処方の生物学的利用能を対照に対して１５倍に増加させた。プルロニックＦ１２７とプルロニックＬ１０の最適な比率は、８：１〜１：１の範囲内であることが判明した。更に、親水性ブロックの含有量が５０％未満の他のプルロニック、例えば、プルロニックＰ８５やプルロニックＬ６１、が同様の効果を示さなかったことも驚くべことである。
【００３０】
本発明の組成物は、例えば、水、アルコール、または水−アルコール混合溶媒などの適切な溶媒に、構成成分を組み合わせてまたは個別に溶解し、続いて必要な比率になるように溶液を混合することで製造することができる。
【００３１】
得られた溶液は、必ずしも乾燥して固体の剤形にしなくてもよい。溶液は、技術的に適切ないかなる方法またはそれらの組み合わせによって乾燥することが可能であり、乾燥方法としては、例えば、回転式蒸発器またはSpeedVacによる蒸発、凍結乾燥、または連続流下式乾燥が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
投与用製剤（Ready drug formulation）は、乾燥した組成物を、必要な賦形剤、例えば、ステアリン酸ナトリウム、乳糖、セルロース誘導体などと共に打錠することによって得ることができる。
【００３３】
投与用製剤は、乾燥した組成物をカプセル、例えば、固体の殻からなるゼラチン製カプセルに詰めることによっても、得ることができる。
【００３４】
有効量のＤＩＭを含有する医薬組成物は、種々の疾患の治療に用いることができる。
【００３５】
ＤＩＭの上述した分子標的、特にエストロゲンの代謝に対するプラスの効果、アポトーシス過程の復帰、抗増殖活性、抗腫瘍活性および抗血管新生活性を考慮すると、本願に記載した組成物は、子宮筋腫、腺筋症および過形成性前立腺疾患などの増殖性疾患の治療に適している。我々はトラコーマ病原体などの細胞内感染性病原体による尿路感染症の治療における、生物学的利用能の高いＤＩＭの高い臨床効率を示した。これらの効果は、トラコーマ病原体に感染した上皮細胞のプログラムされた細胞死の誘導によって生じるものである可能性が最も高い。
【００３６】
治療および発症予防に必要な３，３’−ジインドリルメタンの有効量は、疾患の種類とその重篤度および患者の年齢と状態に依存して変化するが、担当医師によってケースごとに決定することができる。投与量は１日当たり２ｍｇ〜２，０００ｍｇの範囲内である。
【００３７】
本発明を以下の実施例によって詳細に説明する。
【実施例１】
【００３８】
種々のプルロニックの水系分散液におけるＤＩＭの溶解度の決定
プルロニック溶液の調製
４００ｍｇのプルロニック、９．７ｍｌの脱水エチルアルコールおよび０．３ｍｌの蒸留水をガラス容器に入れた。得られた混合物を、透明な溶液が得られるまで、マグネティックミキサーで丁寧に攪拌した。
【００３９】
ＤＩＭ溶液の調製
１０ｍｇのＤＩＭをガラス容器に入れ、１．０ｍｌの脱水エチルアルコールを添加した。得られた混合物を、透明な溶液が得られるまで、マグネティックミキサーで丁寧に攪拌した。
【００４０】
プルロニックおよびＤＩＭを含有する分子分散液の調製
０．５ｍｌのプルロニック溶液（２０ｍｇ）および０．２ｍｌのＤＩＭ溶液を２ｍｌの試験管に入れた。得られた溶液を超音波処理に１０分間付し、続いて１時間攪拌した。得られた混合物からエタノールを除去するために、回転式蒸発器（またはSpeedVac）による蒸発処理を真空で１晩実施した。これら処理の結果として得られた混合物を１．５ｍｌの蒸留水に溶解して濾過し、得られた溶液のＤＩＭ濃度を分光測定によって求めた。以下の表（表２）に示した結果は、プルロニックＦ１２７を使用した際にＤＩＭの溶解度が最大になることを示している。
【００４１】
【表２】
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【実施例２】
【００４２】
プルロニックＦ１２７およびＤＩＭを含む分子懸濁液の調製
プルロニックＦ１２７溶液の調製
４００ｍｇのプルロニックＦ１２７、９．７ｍｌの脱水エチルアルコールおよび０．３ｍｌの蒸留水をガラス容器に入れた。得られた混合物を、透明な溶液が得られるまで、マグネティックミキサーで丁寧に攪拌した。
【００４３】
ＤＩＭ溶液の調製
１０ｍｇのＤＩＭをガラス容器に入れ、１．０ｍｌの脱水エチルアルコールを添加した。内容物を、透明な溶液が得られるまで、マグネティックミキサーで丁寧に攪拌した。
【００４４】
プルロニックＦ１２７およびＤＩＭを含有する分子懸濁液の調製
０．５ｍｌのプルロニックＦ１２７溶液（２０ｍｇ）および０．２ｍｌのＤＩＭ溶液を２ｍｌの試験管に入れた。得られた溶液を超音波処理に１０分間付し、続いて１時間攪拌した。得られた混合物からエタノールを除去するために、回転式蒸発器（またはSpeedVac）による蒸発処理を真空で１晩実施した。これら処理の結果として得られたワックス状の塊状体を、標的ＤＩＭ濃度が３ｍｇとなるように、１ｍｌの蒸留水に溶解した。
【実施例３】
【００４５】
プルロニックＦ１２７、プルロニックＬ１０およびＤＩＭを含む分子懸濁液の調製
プルロニックＬ１０溶液の調製
２５０ｍｇのプルロニックＬ１０および１０ｍｌの脱水エチルアルコールをガラス容器に入れた。得られた混合物をマグネティックミキサーで丁寧に攪拌した。
【００４６】
プルロニックＦ１２７溶液の調製
４００ｍｇのプルロニックＦ１２７、９．７ｍｌの脱水エチルアルコールおよび０．３ｍｌの蒸留水をガラス容器に入れた。得られた混合物を、透明な溶液が得られるまで、マグネティックミキサーで丁寧に攪拌した。
【００４７】
ＤＩＭ溶液の調製
１０ｍｇのＤＩＭをガラス容器に入れ、１．０ｍｌの脱水エチルアルコールを添加した。得られた混合物を、透明な溶液が得られるまで、マグネティックミキサーで丁寧に攪拌した。
【００４８】
プルロニックＦ１２７、プルロニックＬ１０およびＤＩＭを含有する分子懸濁液の調製
０．５ｍｌのプルロニックＦ１２７溶液（２０ｍｇ）、０．２ｍｌのＤＩＭ溶液および０．１ｍｌのプルロニックＬ１０溶液を２ｍｌの試験管に入れた。得られた溶液を超音波処理に１０分間付し、続いて１時間攪拌した。得られた混合物からエタノールを除去するために、回転式蒸発器（またはSpeedVac）による蒸発処理を真空で１晩実施した。これら処理の結果として得られたワックス状の塊状体を、標的ＤＩＭ濃度が３ｍｇとなるように、１ｍｌの蒸留水に溶解した。
【実施例４】
【００４９】
凍結乾燥による、水溶性ＤＩＭ組成物の調製
１ｍｌの蒸留水を、実施例１または２で得たプルロニックを含有するＤＩＭ溶液に添加した。得られた混合物を、透明な溶液が得られるまでミキサー攪拌した。この溶液は１５時間にわたり安定だった。得られた溶液を凍結し、凍結乾燥機に入れた。凍結溶液の凍結乾燥によって無色の粉末が得られた。
【実施例５】
【００５０】
噴霧乾燥による、ＤＩＭ組成物の調製
２００ｇのプルロニックＦ１２７、３００ｍｌの蒸留水および１０リットルのエタノールを２０リットルのガラス容器に入れた。プルロニックが完全に溶解し、透明な溶液が得られるまで攪拌した。得られた溶液に２５ｇのプルロニックＬ１０および２０ｇのＤＩＭを添加した。得られた混合物を透明な溶液が得られるまで攪拌し、その後、濾過した。得られた溶液を４０℃の噴霧乾燥機で乾燥した。
【実施例６】
【００５１】
ＤＩＭを溶融プルロニックに直接溶解する方法による組成物の調製
プルロニックＦ９８およびプルロニックＦ１２７、または最適な比率でこれらが混合された混合物（Ｆ９８：Ｆ１２７が約１：４）を混合して（６０℃で）溶融した。結晶化ＤＩＭを溶融物に添加して激しく攪拌した。ＤＩＭが溶解した後に、溶液を＋５℃まで急速に冷却した。得られた塊状体をすりつぶして粉末にした。
【実施例７】
【００５２】
ＤＩＭ含有組成物の溶解度に関する研究
実施例２および３で得たＤＩＭ組成物の水に対する溶解度を決定するために研究を実施した。このために、２ｍｌの０．９％塩化ナトリウム水溶液を各組成物に添加し（それぞれのボタン状沈殿物は６ｍｇのＤＩＭを含有）、２００回転／分の条件で回転する水平シェイカーに設置した。光学密度の変化からＤＩＭ濃度を求めるために、０．２ｍｌのサンプルを経時的に抜き出した。実験結果を図面（図１）に示した。
【実施例８】
【００５３】
膜Ｐ−糖タンパク質に対するＤＩＭの阻害活性に関する研究
Ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）を発現するＭＥＳＳＡ／ＤＸ細胞によるローダミン（ローダミン１２３（Ｒ１２３））の吸収について、今後実施する実験のモデルとして研究した。Ｐ−ｇｐ陰性のＭＥＳＳＡ／ＤＸ細胞を対照とした。９６穴プレートに、４０，０００細胞／ウェルの濃度になるように細胞を加えた。２４時間のインキュベーションの後、濃度が３μＭのＲ１２３を細胞に添加し、３７℃、種々の濃度のＤＩＭおよびベラパミル（広く知られたＰ−ｇｐ阻害剤）の存在下で更にインキュベーションを１時間実施した。インキュベーションの最後には、溶液を除去し、細胞を冷たいリン酸緩衝液で３回すすいだ。次に、細胞サンプルのローダミン蛍光を測定した。全ての実験を３回繰り返した。予想通り、膜Ｐ−ｇｐを発現するＭＥＳＳＡ／ＤＸ細胞は、陰性のＭＥＳＳＡ細胞と比べて有意にではないが、ローダミンを吸収した。広く知られたＰ−ｇｐ阻害剤であるベラパミルは用量依存的にＭＥＳＳＡ／ＤＸ細胞によるＲ１２３の蓄積を増加させたものの、ＤＩＭはいずれの細胞系におけるＲ１２３蓄積にも影響することはなく、これはＤＩＭがＰ−ｇｐの基質ではないことを明らかに示している。
【実施例９】
【００５４】
ＤＩＭ組成物を投与した実験動物におけるＤＩＭの薬理動態
実施例３〜４で調製したＤＩＭ組成物を本実験に用いた。結果はこの実施例の最後に記載した表に示した。
【００５５】
組成物は、ＤＩＭの標的濃度が３ｍｇとなる量の組成物を加えた１ｍｌの溶媒からなる水系分散液の形状で、動物に経口投与した。結晶化ＤＩＭは、０．５％のメチルセルロースを含む蒸留水５ｍｌに１５ｍｇのＤＩＭを加えた懸濁液として投与した。
【００５６】
体重が２５０〜３５０ｇの雌のSpraque-Dawleyラットを実験に用いた。全ての実験を、ＧＬＰの規則を厳守しながら実施した。体重１ｋｇ当たり６０ｍｇのＤＩＭ製剤を投与した。血液サンプルは、薬剤投与後の種々の時点（１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間および２４時間）で採取した。血液サンプルは採血の直後に遠心分離し、血液から分離した血漿は凍結して−８０℃で保存した。
【００５７】
イソフルラン（カナダ国、オンタリオ州、ケンブリッジ、Bimeta-MTC, Animal Health Inc.製）。血液は、頸静脈から抜きだしてヘパリンの入った試験管に導入し、直ちに５〜１０分間氷中に静置した。次に血液を遠心分離し、血漿を血液から分離した。血漿は凍結して−８０℃で保存した。
【００５８】
サンプルの抽出と分析
血漿サンプルを解凍し、遠心分離に付し、１００μｌ等量をプラスチック製の試験管に詰めた。次にサンプルを、１８０℃で攪拌しながら、７５０μｌのメチル三級ブチルエステルで２分間の抽出に２回付した。サンプルを１０，０００ｒ.ｐ.ｍ.で１０分の遠心分離に付した。上清を分離し、ガラス製の試験管に移送した。サンプルが完全に乾くまで、有機相を５０℃の窒素ガスによって蒸発させた。乾燥したサンプルを−８０℃で保存した。研究に用いるサンプルは１５μｌのアセトニトリルおよび８５μｌの移動相に溶解した。合計２０μｌの当量をＨＰＬＣ法で分析した。
【００５９】
ＨＰＬＣの条件：
С18逆相カラム５０×４．６ｍｍ、Symmetery/shield ３．５μｍ（吸着剤、μｍで表した粒径）、３０℃、流速１．５ｍｌ／分、注入容量２０μｌ、２８０ｎｍ。
【００６０】
移動相：バッファーＢの直線濃度勾配、０％〜１００％、バッファーＡ：５％のアセトニトリル、０．１％のトリフルオロ酢酸、バッファーＢ：９０％のアセトニトリル、０．１％のトリフルオロ酢酸、１０分。
【００６１】
ＤＩＭ濃度は、ピーク面積（ＡＵＰ）に基づき、検量曲線から求めた。曲線下面積（ＡＵＣ）は、台形規則（特定の積分値を決定するために使用）から決定した。対照および組成物のＣmax値およびＡＵＣ値を以下の表（表３）に示した。
【００６２】
【表３】
2013505233.tif 000005
【００６３】
データは、上記組成物を投与したラット血漿中のＤＩＭの薬理動態を図解した添付の図面（図２を参照）に示した。
【実施例１０】
【００６４】
実施例２の医薬用ＤＩＭ組成物の臨床効率に関する研究
研究目的
結晶化ＤＩＭを含む医薬組成物（５０ｍｇの結晶化ＤＩＭを含むカプセル剤）との比較による、新規な医薬用ＤＩＭ組成物（５０ｍｇの３，３’−ジインドリルメタンを含むカプセル剤）の臨床効率、形態的効果および安全性を評価するために研究を実施した。
【００６５】
本研究の主旨は：
・前立腺腺腫患者における、下部尿路の機能不全症状の動態およびの生活の質に対する製剤の効果の評価、
・主要な尿動態因子である最大尿流量（Ｑmax）および残尿量（Ｖres）に対する製剤の効果の評価、
・ＰＳＡの動態に対する製剤の効果の評価、
・前立腺容量に対する製剤の効果の評価、
・プラセボとの比較による、前立腺組織に対する形態的効果の性質の評価、および
・血漿中の主要な生化学的パラメーターに生じる望ましくない事象の頻度、副作用の頻度および動態頻度に基づく、製剤の安全性の評価。
【００６６】
試験は以下のように実施した：
本発明のＤＩＭを含有する医薬組成物（グループＩ）、２錠のカプセル剤／１日２回。
結晶化ＤＩＭを含有する医薬組成物（グループＩＩ）、２錠のカプセル剤／１日２回。
製剤の臨床効率、形態的効果および安全性を評価するために、前立腺腺腫（ＰＧＡ）および前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）の患者３４人を検査し、処置した。グループＩ（１８人の患者）は、ＤＩＭ含有医薬組成物のカプセル剤２錠を１日２回摂取し、グループＩＩ（１６人の患者）は、結晶化ＤＩＭ含有医薬組成物のカプセル剤２錠を１日２回摂取した。
【００６７】
治療のための患者は、以下の基準に従って選択した：
・症候性および形態学特徴から、ＰＧＡおよびＰＩＮと確認された外来患者および入院患者であり、
・年齢が５０歳以上であり、
・処方された治療に対して書面により同意し、医師の指示に従った患者であり、
・発病症状の尺度であるＩ−ＰＳＳに基づく評価が７を超え、
・Ｑmax値が５ｍｌ／秒を超え、１５ｍｌ／秒未満であり、
・残尿量が２００ｍｌ以下であり、
・前立腺容量が２５ｃｍ3を超え、且つ
・ＰＳＡ値が１０ｎｇ／ｍｌ以下である。
【００６８】
臨床病状に対する製剤の効果の評価
開始時点（Ｖ１）には、２種の形態学的特徴であるＬ−ＰＩＮおよびＨ−ＰＩＮを両方のグループについて記録した。製剤の効果によって、患者の病状は悪化したか、変化しないかまたは好転した。Ｖ１とＶ２の間に起こりうる臨床応答には、合計して７種の可能な変化が存在した。本実験においては、（Ｖ１とＶ２の間の）臨床変化を順序尺度に対して評価することができる。検討したグループの臨床変化を比較する上で最も感受性の高い方法はMann-Whitneyの基準である。
【００６９】
グループＩおよびＩＩにおいて研究過程で観察された形態学的特徴の変化を図解した図面（図３を参照）に、全ての患者の形態学的研究データに見られる変化を示した。
【００７０】
治療効果の両側検定の有意水準に基づくと、（本発明のＤＩＭ含有医薬組成物を投与した）グループＩおよび（結晶化ＤＩＭ含有医薬組成物を投与した）グループＩＩの間には有意差が存在した（р＝０．００２）。
【００７１】
悪性頻度の比較
研究したグループ間の悪性頻度の違いを検討するために、別の研究を行った。悪性度の兆候は、コアグループ（１８人の患者に新規なＤＩＭ含有医薬組成物を投与した群）には見られなかった。４件の前立腺癌の兆候が、対照グループ（１６人の患者に結晶化ＤＩＭ含有医薬組成物を投与した群）では記録された。χ二乗推定の誤差の可能性を考慮し、より正確なFischer判定基準を用いた。
【００７２】
考察：
検討したグループには、悪性頻度の違いが見られ、その差は統計的有意差であった（ｐ＝０．０３９）。
【００７３】
免疫組織化学的データに対する、請求の範囲で定義したＤＩＭ含有医薬組成物の効果の評価：
免疫組織化学的解析を、新規処方のＤＩＭ含有医薬組成物を投与したグループＩおよび結晶化ＤＩＭ含有医薬組成物を投与したグループＩＩからそれぞれ選択した４人の患者からなる２つのグループに対して実施した。研究対象の組成物の投与前および投与後のＩＧＦ成長因子とＥＧＦ成長因子およびＴＧＦ−β制御因子について評価した。ＩＧＦ、ＥＧＦおよびＴＧＦ−βの開始値は統計学的に均一であり、更に計測を続けることによって、これらパラメーターの水準に以下の差異が記録された。
【００７４】
新処方のＤＩＭ含有医薬組成物を投与した患者群においては、成長因子であるＩＧＦ（ｐ＝０．００４）およびＥＧＦ（ｐ＝０．００２）について、統計的信頼性のある低下が記録され、更にはＴＧＦ−β（ｐ＝０．０４７）のレベルに増加が認められた。対照群については、信頼性のある動態は記録されなかった。得られたデータは、添付の図面に示した（図４を参照）。
【００７５】
考察
得られたデータにおいては、請求の範囲で定義したＤＩＭ含有医薬組成物を摂取した患者群における、成長因子ＩＧＦおよびＥＧＦの信頼性のある低下、ならびにＴＧＦ−β水準の増加が見られ、このことは、製剤の活性成分の、病的細胞増殖の主要なシグナル伝達機構対する効果を示し、また悪性転換細胞のアポトーシスを誘導する効果も示している。
【００７６】
治療の最中に副作用や望ましくない事象が記録されることはなかった。
【００７７】
新処方のＤＩＭ含有医薬組成物は、前立腺腺腫および前立腺上皮内腫瘍の患者において、抗増殖活性を発揮した。
【００７８】
新処方のＤＩＭ含有医薬組成物は、治療期間中に副作用や望ましくない事象をもたらすことのない、ＰＧＡおよびＰＩＮの治療用の安全な薬剤である。
【図１】
2013505233.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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