(57)【要約】導入遺伝子発現のための方法および真核生物宿主細胞を開示する。細胞を処理および／または修飾して、相同性組換え（ＨＲ）の増大、非相同的末端結合（ＮＨＥＪ）の減少、および／または前記細胞におけるＨＲ／ＮＨＥＪ比の増強が可能である。有利には細胞のゲノム中に組み込まれて２００超の導入遺伝子コピーを含み得るコンカテマー構造を形成する導入遺伝子を含むベクターで、そのような細胞をトランスフェクトすることができる。導入遺伝子発現をさらに増強および／または促進するために、ＭＡＲなどのある発現増強エレメントが有利には提供される。ＥＲ膜を越える転位および／または原形質膜を越える分泌に関与するタンパク質および／またはＲＮＡ、特に霊長類タンパク質および／またはＲＮＡをコード化するトランスジェニック配列を含む組換え真核生物宿主細胞、特に非霊長類宿主細胞も開示される。【選択図】図１Ｃ【特許請求の範囲】
【請求項１】
導入遺伝子発現のための方法であって：
（ａ）真核生物、好ましくは、ほ乳類宿主の細胞を提供し（ここで、前記宿主細胞は、相同性組換え（ＨＲ）の増大、非相同的末端結合（ＮＨＥＪ）の減少および／または前記細胞におけるＨＲ／ＮＨＥＪ比の増強のために修飾または処理されている）、そして
（ｂ）前記細胞を、
前記導入遺伝子を含む少なくとも１つのベクター、および
場合によって、マトリックス付着領域（ＭＡＲ）エレメント（ここで、前記ＭＡＲエレメントは前記導入遺伝子にシスまたはトランスで提供される）
でトランスフェクトすることを含む、方法。
【請求項２】
（ｂ）におけるトランスフェクションが後続トランスフェクションであり、ベクターまたは核酸フラグメントなどの核酸での初期トランスフェクションが先行する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記細胞の細胞集団の細胞周期が同期される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記初期および後続トランスフェクションが、集団の細胞の大部分が細胞周期のＧ１期にあるときに起こる、請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
細胞集団の細胞の３０％超、３１％超、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３６％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％または４５％がＧ１期にある、請求項４記載の方法。
【請求項６】
細胞集団を化学的または温度処理に付すことによって、細胞周期が同期される、請求項３および以下の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ＨＲ酵素、ＨＲアクチベーターおよび／またはＮＨＥＪサプレッサーが、前記初期トランスフェクションの前に前記細胞に投与される、請求項２または以下の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が組換え真核生物宿主細胞であり、ＨＲ酵素、ＨＲアクチベーターおよび／またはＮＨＥＪサプレッサーをコード化するトランスジェニック配列を含み、および／または前記細胞がＮＨＥＪまたはＨＲ遺伝子において突然変異している、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が組換え真核生物宿主細胞であり、前記細胞のゲノムが、ＮＨＥＪを不活性化し、少なくとも１つのＨＲ酵素、少なくとも１つのＨＲアクチベーターおよび／または少なくとも１つのＮＨＥＪサプレッサーの発現または活性を増大させるように突然変異する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記初期トランスフェクションの核酸が、導入遺伝子を含む少なくとも１つのベクターであり、初期トランスフェクションの少なくとも１つの前記ベクターおよび前記少なくとも１つの後続トランスフェクションの少なくとも１つのベクターが細胞のゲノム中への組み込み前および／または組み込み後に１つまたはそれ以上のコンカテマー構造を形成する、請求項２または以下の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
初期トランスフェクションの前記少なくとも１つのベクターおよび前記後続トランスフェクションの前記少なくとも１つのベクターが、細胞のゲノム中に組み込まれるコンカテマー構造を形成し、前記コンカテマー構造が、少なくとも２００、３００、４００、５００または６００コピーの前記導入遺伝子を含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
細胞のＨＲ／ＮＨＥＪ比が、前記トランスジェニック配列を含まず、突然変異していない細胞において見いだされる比よりもそれぞれ２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０倍まで高いか、またはＮＨＥＪ活性が０に等しい、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの後続トランスフェクション後に前記細胞のゲノム中に組み込まれた前記導入遺伝子の組み込みコピー数が、（ｂ）のベクターで細胞を直接トランスフェクトすることによって得られる組み込みコピー数を表す基準値の２倍超である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの初期トランスフェクションがシングルトランスフェクションである、請求項２および後の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
初期トランスフェクションの核酸が、ＭＡＲエレメントおよび前記導入遺伝子を含むベクターであり、初期トランスフェクション後に、前記導入遺伝子の発現が初期レベルに達し、後続トランスフェクション後の導入遺伝子の発現が、付加的であるよりも高い後続レベルに達し、好ましくは１回の後続トランスフェクション後に、前記初期レベルの２倍、３倍または４倍を越える後続レベルに達する、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）における核酸が、ＭＡＲエレメントおよび前記導入遺伝子を含むベクターであり、初期トランスフェクション後に、細胞のゲノム中に組み込まれる導入遺伝子コピー数が（ｎ）に等しく、少なくとも１つの後続トランスフェクション後に、ゲノム中に組み込まれる導入遺伝子コピー数が２（ｎ）、３（ｎ）または４（ｎ）を越える、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１つの後続トランスフェクションがシングルトランスフェクションである、請求項１５または１６記載の方法。
【請求項１８】
導入遺伝子が、前記細胞のゲノム中に、コンカテマー構造として、１つの座で組み込まれる、請求項１５または１６記載の方法。
【請求項１９】
（ｂ）におけるＭＡＲエレメントが、発現を改善し、複数コピーの導入遺伝子を含むベクターの共組み込みからの阻害効果を実質的にまたは完全に防止する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも１つの後続トランスフェクションのベクターの５０％、６０％、７０％、８０％超が核中に輸送される、請求項２および以下の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
初期トランスフェクション後に、導入遺伝子発現産物の初期レベルおよび初期導入遺伝子コピー数に達し、前記少なくとも１つの後続トランスフェクション後に、導入遺伝子発現産物のレベルが後続レベルまで増加し、そして初期導入遺伝子コピー数が後続導入遺伝子コピー数まで増加し、導入遺伝子発現産物の第１から第２レベル間の増加が、初期導入遺伝子コピー数から後続導入遺伝子コピー数間の増加を２０％、３０％、４０％、５０％または６０％上回る、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも１つの第１トランスフェクションの前記ベクターのベクター配列が、前記後続トランスフェクション（複数可）の少なくとも第１のもののベクターのベクター配列と１００％または少なくとも９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性を有する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
初期トランスフェクションのベクターがＭＡＲエレメントを含み、前記ＭＡＲエレメントが前記後続トランスフェクション（複数可）の少なくとも第１のもののベクターのＭＡＲエレメントと１００％または少なくとも９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性を有する、請求項２または以下の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
初期トランスフェクションのベクターが導入遺伝子を含み、導入遺伝子が前記後続トランスフェクション（複数可）の少なくとも第１のもののベクターの導入遺伝子と１００％または少なくとも９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性を有する、請求項２または以下の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
ＭＡＲエレメントが（ｂ）におけるベクターの一部としてシスで提供される、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
（ｂ）における前記少なくとも１つのＭＡＲエレメントが（ｂ）におけるベクターの一部としてシスで提供され、導入遺伝子が前記少なくとも２つのＭＡＲエレメントと隣接している、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
ＭＡＲエレメントが前記導入遺伝子のプロモーター／エンハンサー配列の上流に位置する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
ＭＡＲ配列が配列番号１〜３と少なくとも９０％の配列同一性を有するか、またはその変異体である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
（ａ）ＮＨＥＪサプレッサーを発現するトランスジェニック配列、
（ｂ）１つまたはそれ以上のＨＲ酵素またはＨＲアクチベーターを発現するトランスジェニック配列、
（ｃ）ＮＨＥＪ遺伝子を不活性化または下方調節する突然変異、および／または
（ｄ）ＨＲ酵素、ＨＲアクチベーターもしくはＮＨＥＪサプレッサーの発現もしくは活性を増強する突然変異
を含む組換え真核生物、好ましくはほ乳類の宿主細胞であって、
（ａ）および／または（ｂ）の前記トランスジェニック配列を含まない細胞において見いだされる比よりも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０倍超高いＨＲ／ＮＨＥＪ比を有し、
場合によって、マトリックス付着領域（ＭＡＲ）エレメントを含む、組換え真核生物の宿主細胞。
【請求項３０】
（ａ）ＮＨＥＪサプレッサーを発現するトランスジェニック配列、
（ｂ）１つまたはそれ以上のＨＲ酵素またはＨＲアクチベーターを発現するトランスジェニック配列、
（ｃ）ＮＨＥＪ遺伝子を不活性化または下方調節する突然変異、および／または
（ｄ）ＨＲ酵素、ＨＲアクチベーターまたはＮＨＥＪサプレッサーの発現または活性を増強する突然変異、および
前記細胞のゲノム中に組み込まれた導入遺伝子、ならびに
場合によってＭＡＲエレメントを含み、前記ＭＡＲエレメントがシスまたはトランスで前記導入遺伝子に対して提供される、組換え真核生物、好ましくはほ乳類の宿主細胞。
【請求項３１】
１つまたはそれ以上のＨＲ酵素が、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５２、ＲｅｃＡ、Ｒａｄ５４、ＲｕｖＣまたはＢＲＣＡ２であり、および／またはＨＲアクチベーターがＲＳ−１であり、および／またはＮＨＥＪサプレッサーがＮＵ７０２６および／またはワートマニンである、請求項２９または３０記載の細胞。
【請求項３２】
導入遺伝子が誘導性プロモーターなどの誘導性発現についての制御エレメントと機能的に連結し、前記誘導性プロモーターが熱ショックプロモーターなどの物理的に活性化されたプロモーターまたはＩＰＴＧもしくはテトラサイクリンなどにより化学的に活性化されたプロモーターなどの化学的に活性化されたプロモーターである、請求項２９または３０記載の細胞。
【請求項３３】
（ｃ）または（ｄ）における前記突然変異が、ｘｒｃｃ４遺伝子、ＲＡＤ５１鎖トランスフェラーゼ遺伝子、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ遺伝子、Ｒａｄ５２遺伝子、ＲｅｃＡ遺伝子、Ｒａｄ５４遺伝子、ＲｕｖＣ遺伝子および／または、ＢＲＣＡ２遺伝子における突然変異である、請求項２９または以下の請求項のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３４】
導入遺伝子が細胞のゲノムの１つの座中に組み入れられ、そしてコンカテマー構造を形成する、請求項２９または以下の請求項のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３５】
前記コンカテマー構造が少なくとも２００、３００、４００、５００または６００コピーの導入遺伝子を含む、請求項３４または以下の請求項のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３６】
ゲノムの１つの座中に組み入れられた、プロモーターに機能的に連結された導入遺伝子のコンカテマー構造を含み、コンカテマー構造が少なくとも３００、４００、５００または６００コピーの導入遺伝子および少なくとも１つのＭＡＲエレメントを含み、前記ＭＡＲエレメントがシスまたはトランスで前記導入遺伝子に対して提供され、前記細胞が好ましくは、同期された細胞集団の一部である、組換え真核生物、好ましくはほ乳類の宿主細胞。
【請求項３７】
少なくとも１つのＭＡＲがシスで提供され、前記導入遺伝子の大部分に前記導入遺伝子のそれぞれのＭＡＲが提供されている、請求項３６記載の細胞。
【請求項３８】
導入遺伝子に少なくとも２つの前記ＭＡＲエレメントが隣接している、請求項３６記載の細胞。
【請求項３９】
少なくとも１つのＭＡＲエレメントが配列番号１〜３と少なくとも９０％の配列同一性を有するか、または配列番号１〜３の変異体である、請求項２９または以下の請求項のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項４０】
ＭＡＲエレメントが前記導入遺伝子のプロモーター／エンハンサー配列の上流に位置する、請求項２９または以下の請求項のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項４１】
細胞がＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、幹細胞または前駆細胞である、請求項２９または以下の請求項のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項４２】
前記導入遺伝子の発現における請求項２９または以下の請求項のいずれか１項に記載のいずれか１つの組換え真核生物宿主細胞の使用。
【請求項４３】
ａ第１容器中に、場合によってＭＡＲエレメントおよび前記ベクター中への導入遺伝子の組み込みのための制限部位を含むベクター、
ｂ第２容器中に、請求項２８〜４２の組換え真核生物宿主細胞、ならびに
ｃ導入遺伝子発現のために前記細胞をトランスフェクトする際の前記ベクターの使用法の説明書
を含むキット。
【請求項４４】
同期剤または前記細胞（複数可）を含む細胞集団を同期させる方法に関する説明書を更に含む、請求項４３記載のキット。
【請求項４５】
ベクターを使用して、前記細胞集団の細胞のほとんどがＧ１期にある時に細胞を前記ベクターで少なくとも２回トランスフェクトする、請求項４４記載のキット。
【請求項４６】
小胞体（ＥＲ）膜を越える転位および／または原形質膜を越える分泌に関与する少なくとも１つの霊長類タンパク質もしくは霊長類ＲＮＡ、たとえばシグナル認識粒子（ＳＲＰ）のタンパク質もしくはＲＮＡまたは分泌複合体（トランスロコン）のタンパク質またはそのサブユニットをコード化するトランスジェニック配列を含む、非霊長類組換え真核生物宿主細胞
【請求項４７】
前記細胞が、シグナルペプチドコーディング配列に機能的に付着した導入遺伝子をさらに含み、前記導入遺伝子が細胞において複数コピーで、好ましくはコンカテマー構造の形態で存在する、請求項４６記載の細胞。
【請求項４８】
前記細胞が、少なくとも２００、３００、４００、５００または６００コピーの導入遺伝子を含む、請求項４７記載の細胞。
【請求項４９】
前記シグナルペプチドコーディング配列によりコード化されるシグナルペプチドがアミノ酸の疎水性ストレッチを含み、ＳＲＰ５４と相互作用するための配列を有する、請求項４７または４８記載の細胞。
【請求項５０】
前記導入遺伝子に対してシスまたはトランスに位置する後成的な調節エレメント、たとえばＭＡＲエレメントをさらに含む、請求項４６または以下の請求項のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５１】
ＥＲ膜を越える転位および／または原形質膜を越える分泌に関与する前記タンパク質またはＲＮＡが、ＳＲＰ、特にＳＲＰ９、ＳＲＰ１４、ＳＲＰ１９、ＳＲＰ５４、ＳＲＰ６８、ＳＲＰ７２および／または７ＳＲＮＡのタンパク質またはＲＮＡである、請求項４６または以下の請求項のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５２】
ＳＲＰのタンパク質が、好ましくは、ＥＲ膜を越える転位および／または原形質膜を越える分泌に関与する１以上の他の前記タンパク質またはＲＮＡと組み合わされたヒトＳＲＰ１４である、請求項５１記載の細胞。
【請求項５３】
前記１以上の他の前記タンパク質が、ヒトＳＲおよび／またはヒトトランスロコンタンパク質である、請求項５２記載の細胞。
【請求項５４】
ＳＲＰのタンパク質が、好ましくは、ＥＲ膜を越える転位および／または原形質膜を越える分泌に関与する１以上の他の前記タンパク質またはＲＮＡと組み合わされたヒトＳＲＰ５４である、請求項５１記載の細胞。
【請求項５５】
前記１以上の他の前記タンパク質が、ヒトＳＲおよび／またはヒトトランスロコンタンパク質である、請求項５４記載の細胞。
【請求項５６】
ＥＲ膜を越える転位および／または原形質膜を越える分泌に関与する前記タンパク質またはＲＮＡが、トランスロコンのタンパク質の１つ、特にＳｅｃ６１αβγ、Ｓｅｃ６２、Ｓｅｃ６３および／またはそのサブユニットである、請求項４６または以下の請求項のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５７】
ＥＲ膜を越える転位および／または原形質膜を越える分泌に関与する前記タンパク質またはＲＮＡが、ＳＲＰ９、ＳＲ１４およびトランスロコンタンパク質の組み合わせである、請求項４６または以下の請求項のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５８】
前記導入遺伝子が、免疫グロブリン、そのサブユニットもしくはフラグメントまたは融合タンパク質である、請求項４６または以下の請求項のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５９】
前記非霊長類細胞が、齧歯類細胞、好ましくはＣＨＯ細胞である、請求項４６または以下の請求項のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６０】
シグナルペプチドコーディング配列が、配列番号４〜１１と少なくとも９０％の配列同一性を有するか、または前記配列のいずれか１つの変異体である、請求項４６または以下の請求項のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６１】
ＥＲ膜を越える転位および／または細胞の原形質膜を越える分泌における請求項４６または以下の請求項のいずれか１項に記載の非霊長類組換え真核生物宿主細胞の使用。
【請求項６２】
（ａ）１つの容器中に、細胞のゲノムの一部として、ＥＲ膜を越える転位および／または原形質膜を越える分泌に関与する少なくとも１つのタンパク質またはＲＮＡ、たとえば、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）のタンパク質またはＲＮＡまたは分泌複合体（トランスロコン）のタンパク質またはそのサブユニットをコード化するトランスジェニック配列を含む非霊長類組換え宿主細胞、
（ｂ）別の容器中に、導入遺伝子の前記ベクター中への組み込みのための制限部位および場合によってＭＡＲエレメントを含む少なくとも１つのベクター、ならびに
（ｃ）前記細胞を用いた前記導入遺伝子の導入遺伝子発現産物の発現および分泌のための説明書
を含むキット。
【請求項６３】
（ｃ）ＥＲ膜を越える転位および／または原形質膜を越える分泌に関与する少なくとも１つの霊長類タンパク質または霊長類ＲＮＡ、たとえばシグナル認識粒子（ＳＲＰ）のタンパク質またはＲＮＡまたは分泌複合体（トランスロコン）のタンパク質またはそのサブユニットをコード化するトランスジェニック配列、および
（ｄ）シグナルペプチドコーディング配列に機能的に付着した導入遺伝子
を含む非霊長類真核生物宿主細胞を提供することを含む、導入遺伝子のタンパク質分泌のための方法。
【請求項６４】
前記トランスジェニック配列が、
前記細胞中に存在する、ＥＲ膜を越える転位および／または原形質膜を越える分泌に関与するタンパク質またはＲＮＡの総量を、前記トランスジェニック配列を発現する前の細胞中で見いだされるレベルよりも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％を越えて増大させる、請求項６３記載のタンパク質分泌のための方法。
【請求項６５】
前記導入遺伝子が細胞において細胞のゲノム中に組み込まれたコンカテマー構造として存在し、コンカテマー構造が好ましくは少なくとも２００、３００、４００、５００または６００コピーの導入遺伝子を含み、前記細胞のゲノムの１つの座で組み込まれる、請求項６３または６４記載の方法。
【請求項６６】
シグナルペプチドコーディング配列によってコード化されるシグナルペプチドが、アミノ酸の疎水性ストレッチを含み、ＳＲＰ５４と相互作用する配列を有する、請求項６３または以下の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
（ｂ）におけるトランスフェクションが後続トランスフェクションであり、ベクターまたは核酸フラグメントなどの核酸での初期トランスフェクションが先行する、請求項６３または以下の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
初期トランスフェクションの前記ベクターが（ｂ）におけるベクターに対応する、請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
トランスジェニック配列が、配列番号４〜１１の群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するか、または前記配列のいずれか１つの変異体である、請求項６３または以下の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
トランスジェニック配列の活性を増大させるタンパク質分泌および／または転位を特定する方法であって：
組換えタンパク質をコード化する導入遺伝子を含む第１ほ乳類細胞をモニタリングし（ここで、前記組換えタンパク質は前記細胞により第１レベルで分泌される）、
前記組換えタンパク質をコード化する前記導入遺伝子を含む第２ほ乳類細胞をモニタリングし（ここで、組換えタンパク質は前記細胞により第２レベルで分泌され、前記第２レベルは前記第１レベルを上回る）、
前記第１ほ乳類細胞中にＥＲ膜を越える転位および／または原形質膜を越える分泌に関与する少なくとも１つのタンパク質またはＲＮＡをコード化するトランスジェニック配列を導入し、そして
前記第１細胞中の前記組換えタンパク質の分泌レベルにおける変化を測定する（ここで、第１レベルを超える増加は、前記トランスジェニック配列の活性を増大させるタンパク質分泌を特定する）
ことを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、その全体が参照することによって本明細書中に組み入れられる、２００９年９月１８日に出願された、米国仮特許出願第６１／２４３，９５０号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、導入遺伝子発現のための方法および真核生物宿主細胞に関する。導入遺伝子発現は、非相同的末端結合（ＮＨＥＪ）よりも相同的組換え（ＨＲ）を選択することによりブーストされる。本発明は、非霊長類真核生物宿主細胞において、霊長類、特にヒトに関連するタンパク質、ＥＲ膜を越える転位および／または原形質膜を越える分泌に介在するかまたは影響を及ぼす経路を提供することにも関する。
【背景技術】
【０００３】
治療的タンパク質の生物工学的産生ならびに遺伝子および細胞治療は、真核生物細胞中に導入された導入遺伝子の発現の成功にかかっている。導入遺伝子発現の成功は多くの場合、宿主染色体中に導入遺伝子組み込むことを必要とし、とりわけ、組み込まれた導入遺伝子コピー数によって、そして低いかもしくは不安定な転写および／または高いクローン変異性を引き起こし得る後成的な効果によって制限される。導入遺伝子発現産物の細胞からの輸送の失敗または低減もまた、多くの場合、治療的タンパク質の産生ならびに遺伝子および細胞治療を制限する。本発明を説明するために、特に実施に関するさらなる詳細を提供するために用いられる刊行物および他の資料（特許および受入番号を包含する）は、その全体が参照することによって本明細書中に組み込まれる。便宜上、刊行物は以下の文で、著者および日付によって参照され、添付の参考文献目録に著者のアルファベット順で列挙されている。真核生物のＤＮＡはクロマチン中にぎっちりと詰め込まれているという事実から、直径数マイクロメートルの核内に真核生物ゲノム全体をちょうど収めることができる。しかし、この事実は、遺伝子発現が、高度に調節された精緻な細胞機構を含むクロマチンの局所的一時的凝縮および脱凝縮により制御されることを必要とする。加えて、宿主染色体中への導入遺伝子組み込みは、ほとんどの場合、ランダムな事象であり、その結果、ランダムな組み込み位置および様々なコピー数となる。安定な導入遺伝子発現において独立した形質転換体間で一般的に観察される高度の変異性は、宿主ゲノム内に組み込まれる導入遺伝子のコピー数および導入遺伝子組込み部位でのクロマチン環境に依存すると考えられる（Ｋａｌｏｓ  ａｎｄ  Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，  １９９５；  Ｒｅｃｉｌｌａｓ−Ｔａｒｇａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。ランダムな位置中に組み込まれる導入遺伝子の発現は、組み込み位置での調節エレメントの任意の存在ならびに組み込み位置に隣接する染色体ドメインのクロマチン構造により影響を受ける可能性がある。例えば、位置効果変動と呼ばれる現象は、抑制クロマチンに近いので、時間とともに活性遺伝子のサイレンシングを誘発し得る。（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５；  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，  １９９６；  Ｗａｋｉｍｏｔｏ，  １９９８）。
【０００４】
種々のトランスフェクション効率で遺伝子導入を促進するために、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈、ポリエチレンイミン法、エレクトロポーレーションおよびポリカチオン性脂質などの多くの方法が開発されている。導入遺伝子のコピー数を増加させ、ひいては導入遺伝子発現を増大させる一方法は、遺伝子増幅である（Ｋａｕｆｍａｎ，  ２０００）。代替法は、合成または天然制御配列の挿入により発現ベクターを最適化することである。
【０００５】
ほ乳類細胞において導入遺伝子発現を増大させ、安定化させるために、マイナスの位置効果から導入遺伝子をするために後成的なレギュレーターが使用されており（Ｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ，  １９９９）、これらには、境界またはインスレーターエレメント、遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）、安定化およびアンチリプレッサー（ＳＴＡＲ）エレメント、偏在的作用性（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓｌｙ  ａｃｔｉｎｇ）クロマチンオープニング（ＵＣＯＥ）エレメントならびに前記マトリックス付着領域（ＭＡＲ）が含まれる。これらの後成的なレギュレーターは全て、ほ乳類細胞系における組換えタンパク質産生のために使用されており（Ｚａｈｎ−Ｚａｂａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１；  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）、また遺伝子治療のために使用されている（Ａｇａｒｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６；  Ｃａｓｔｉｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。
【０００６】
前述のように、細胞からの導入遺伝子発現産物の輸送の失敗または低下によっても、治療的タンパク質の産生ならびに遺伝子および細胞治療が制限されることが多い。導入遺伝子発現産物は、多くの場合、種々の支障に直面する。すなわち、その天然のタンパク質を処理し、輸送する機構を備えているだけの細胞は、ある種の導入遺伝子発現産物を輸送することにより、特にそれらが多くの場合に望ましいよりも異常に高いレベルで産生される場合に、容易に限界を超える可能性があり、この産物を細胞内で凝集させ、および／または、たとえば機能的タンパク質産物の適切なフォールディングを妨げる。
【０００７】
輸送およびプロセッシングの支障を克服するために、種々の方法が実施されている。たとえば、改善された分泌特性を有するＣＨＯ細胞は、膜小胞輸送（ｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）、そしてひいては分泌されたタンパク質エキソサイトーシスのレギュレーターとして作用するＳＭタンパク質Ｍｕｎｃ１８ｃまたはＳｌｙ１の発現によって操作された（米国特許公開第２００９０２４７６０９号）。ＥＲストレスを軽減し、タンパク質分泌を増大させるために、Ｘボックス結合タンパク質１（Ｘｂｐ１）、分泌細胞分化ならびにＥＲ維持および増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を制御する転写因子、または種々のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）も使用されている（Ｍｏｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７）。タンパク質分泌を増大させるための他の試みには、ＣＨＯ細胞におけるシャペロンＥＲｐ５７、カルネキシン、カルレティキュリンおよびＢｉＰ１の発現が含まれていた（Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。最後に、低温ショックで誘発されたタンパク質、低温誘発性ＲＮＡ結合タンパク質（ＣＩＲＰ）の発現は、組換えγ−インターフェロンの収率を増大させることが示された。分泌複合体のタンパク質を過剰発現する試みもなされた。しかし、例えば、Ｌａｋｋａｒａｊｕら（２００８）は、ＷＴヒト細胞（たとえば、低レベルのＳＲＰ１４を発現するように操作されていない細胞）においては外因性ＳＲＰ１４発現が分泌されたアルカリホスファターゼタンパク質の分泌効率を改善しなかったことを報告した。
【０００８】
したがって、効率的で、より信頼性の高い導入遺伝子発現、たとえば、組換えタンパク質産生および遺伝子治療が必要とされている。導入遺伝子発現産物を細胞の外側へうまく輸送することも必要とされる。
【０００９】
このような必要性および当該技術分野における他の必要性については、本発明のある実施形態で取り組む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、導入遺伝子発現のための方法であって、（ａ）真核生物、好ましくはほ乳類宿主細胞を提供し（ここで、前記宿主細胞は、相同性組換え（ＨＲ）の増大、非相同的末端結合（ＮＨＥＪ）の減少、および／または前記細胞におけるＨＲ／ＮＨＥＪ比の向上のために修飾または処理されている）、そして（ｂ）前記細胞を、前記導入遺伝子を含む少なくとも１つのベクター、および場合によってマトリックス付着領域（ＭＡＲ）エレメントでトランスフェクトすること（ここで、前記ＭＡＲエレメントは、前記導入遺伝子に対してシスまたはトランスで提供される）を含む方法に関する。
【００１１】
（ｂ）でのトランスフェクションは、１回だけの後続トランスフェクション（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を含む後続トランスフェクションであってよく、その前に、核酸、たとえばベクターまたは核酸フラグメントでの初期トランスフェクション（１回だけの初期トランスフェクションを含む）が先行してもよい。細胞集団を化学または温度処理に付すことにより、前記細胞の細胞集団の細胞周期を同期させることができる。初期および後続トランスフェクションは、集団の細胞の大部分が細胞周期のＧ１期である時点で起こり得る。細胞集団の細胞の３０％超、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３６％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％または４５％超がＧ１期であり得る。好ましくは、初期トランスフェクションの前に、ＨＲ酵素、ＨＲアクチベーターおよび／またはＮＨＥＪサプレッサーを投与することができる。細胞は組換え真核生物宿主細胞であってもよく、ＨＲ酵素、ＨＲアクチベーターおよび／またはＮＨＥＪサプレッサーをコード化するトランスジェニック配列を含み得る。細胞はまた、ＮＨＥＪまたはＨＲ遺伝子において突然変異し得る。その代わりに、またはそれに加えて、前記細胞のゲノムを突然変異させて、ＮＨＥＪを不活性化し、少なくとも１つのＨＲ酵素、少なくとも１つのＨＲアクチベーターおよび／または少なくとも１つのＮＨＥＪサプレッサーの発現もしくは活性を増大させることができる。
【００１２】
前記初期トランスフェクションの核酸は、ある実施形態では、導入遺伝子を含むベクターである。初期トランスフェクションのベクターおよび前記少なくとも１つの後続トランスフェクションの少なくとも１つのベクターは、細胞のゲノム中への組み込みの前および／または後にコンカテマー構造を形成し得る。コンカテマー構造は、少なくとも２００、３００、４００、５００または６００コピーの前記導入遺伝子を含み得る。細胞のＨＲ／ＮＨＥＪ比は、それぞれ、前記トランスジェニック配列を含まず、突然変異されていない細胞で見出される比よりも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０倍まで高い可能性がある。細胞のＮＨＥＪ活性は約０に等しい可能性がある。
【００１３】
前記少なくとも１つの後続トランスフェクション後に前記細胞のゲノム中に組み込まれた前記導入遺伝子の組み込みコピー数は、（ｂ）のベクターで直接トランスフェクションすることにより得られる組み込みコピー数を表す基準値の２倍を超える可能性がある。
【００１４】
初期トランスフェクションの核酸は、ＭＡＲエレメントおよび前記導入遺伝子を含むベクターであり得る。初期トランスフェクション、例えば１回の初期トランスフェクション後に、前記導入遺伝子の発現は、初期レベルに達する可能性があり、後続トランスフェクション、例えば１回の後続トランスフェクション後の導入遺伝子の発現は、付加的以上、好ましくは前記初期レベルの２倍、３倍または４倍超である後続レベルに達し得る。その代わりに、またはそれに加えて、初期トランスフェクション後に、細胞のゲノム中に組み込まれる導入遺伝子コピー数は、（ｎ）に等しい可能性があり、少なくとも１回の後続トランスフェクション後に、ゲノム中に組み込まれる導入遺伝子コピー数は、２（ｎ）、３（ｎ）または４（ｎ）超であり得る。導入遺伝子は、１つの座でコンカテマー構造として前記細胞のゲノム中に組み込まれる可能性がある。
【００１５】
（ｂ）におけるＭＡＲエレメントは、発現を改善することができ、複数コピーの導入遺伝子を含むベクターを共組み込みから実質的または完全に防ぐことができる。
【００１６】
少なくとも１つの後続トランスフェクションのベクターの５０％、６０％、７０％、８０％超が核中に輸送され得る。
【００１７】
初期トランスフェクション後、導入遺伝子発現産物の初期レベルおよび初期導入遺伝子コピー数に到達する可能性がある。前記少なくとも１つの後続トランスフェクション後、導入遺伝子発現産物のレベルは、後続レベルまで増加する可能性があり、初期導入遺伝子コピー数は後続導入遺伝子コピー数まで増加する可能性があり、この場合、導入遺伝子発現産物の第１レベルから第２レベル間の増加は、初期導入遺伝子コピー数から後続導入遺伝子コピー数間の増加を２０％、３０％、４０％、５０％または６０％を上回る可能性がある。
【００１８】
少なくとも１つの第１トランスフェクションの前記ベクターのベクター配列は、少なくとも、前記後続トランスフェクション（複数可）の第１のもののベクターのベクター配列と１００％または少なくとも９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性を有し得る。初期トランスフェクションのベクターは、ＭＡＲエレメントを含んでもよく、前記ＭＡＲエレメントは、少なくとも、前記後続トランスフェクション（複数可）の第１のもののベクターのＭＡＲエレメントと１００％または少なくとも９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性を有し得る。初期トランスフェクションのベクターは、導入遺伝子を含む可能性があり、導入遺伝子は、少なくとも、前記後続トランスフェクション（複数可）の第１のもののベクターの導入遺伝子と１００％または少なくとも９５％、９０％、８５％もしくは８０％の配列同一性を有し得る。ＭＡＲエレメントは、（ｂ）においてベクターの一部としてシスで提供され得る。ある実施形態において、導入遺伝子には、少なくとも２つのＭＡＲエレメントが隣接している。ＭＡＲエレメントは、前記導入遺伝子のプロモーター／エンハンサー配列の上流に位置する可能性がある。ＭＡＲ配列は、配列番号１〜３と少なくとも９０％の配列同一性を有し得るか、またはその変異体である。
【００１９】
本発明はまた、
（ａ）ＮＨＥＪサプレッサーを発現するトランスジェニック配列、
（ｂ）１つまたはそれ以上のＨＲ酵素またはＨＲアクチベーターを発現するトランスジェニック配列、
（ｃ）ＮＨＥＪ遺伝子を不活性化もしくは下方調節する突然変異、および／または
（ｄ）ＨＲ酵素、ＨＲアクチベーターもしくはＮＨＥＪサプレッサーの発現もしくは活性を増強する突然変異を
含む組換え真核生物、好ましくはほ乳類の宿主細胞に関し、
この場合、組換え真核生物宿主細胞は、（ａ）および／または（ｂ）の前記トランスジェニック配列を含まない細胞において見出される比よりも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０倍超高いＨＲ／ＮＨＥＪ比を有し、そして、場合によってマトリックス付着領域（ＭＡＲ）エレメントを含む。
【００２０】
本発明はまた、
（ａ）ＮＨＥＪサプレッサーを発現するトランスジェニック配列、
（ｂ）１つまたはそれ以上のＨＲ酵素またはＨＲアクチベーターを発現するトランスジェニック配列、
（ｃ）ＮＨＥＪ遺伝子を不活性化もしくは下方調節する突然変異、および／または
（ｄ）ＨＲ酵素、ＨＲアクチベーターまたはＮＨＥＪサプレッサーの発現または活性を増強する突然変異、および
前記細胞のゲノム中に組み込まれた導入遺伝子、および
場合によって、ＭＡＲエレメント
を含む、組換え真核生物、好ましくはほ乳類の宿主細胞にも関し、ここで、前記ＭＡＲエレメントは、シスまたはトランスで前記導入遺伝子に対して提供される。
【００２１】
１つまたはそれ以上のＨＲ酵素は、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５２、ＲｅｃＡ、Ｒａｄ５４、ＲｕｖＣもしくはＢＲＣＡ２であってよく、および／またはＨＲアクチベーターはＲＳ−１であってよく、および／又ＮＨＥＪサプレッサーは、ＮＵ７０２６および／またはワートマニンであってよい。
【００２２】
導入遺伝子は、誘導性プロモーターなどの誘導性発現のための制御エレメントと機能的に連結されている可能性があり、この場合、前記誘導性プロモーターは、場合によって、熱ショックプロモーターなどの物理的に活性化されたプロモーターまたはＩＰＴＧもしくはテトラサイクリンにより活性化されたプロモーターなどの化学的に活性化されたプロモーターである。
【００２３】
（ｃ）または（ｄ）における突然変異（複数可）は、ｘｒｃｃ４遺伝子、ＲＡＤ５１鎖トランスフェラーゼ遺伝子、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ遺伝子、Ｒａｄ５２遺伝子、ＲｅｃＡ遺伝子、Ｒａｄ５４遺伝子、ＲｕｖＣ遺伝子および／またはＢＲＣＡ２遺伝子における突然変異（複数可）であり得る。
【００２４】
導入遺伝子は、細胞のゲノムの１つの座中に組み入れられる可能性があり、コンカテマー構造を形成する可能性がある。このコンカテマー構造は、少なくとも２００、３００、４００、５００または６００コピーの導入遺伝子を含み得る。
【００２５】
本発明はまた、
ゲノムの１つの座中に組み込まれた、プロモーターに機能的に連結した導入遺伝子のコンカテマー構造を含む、組換え真核生物、好ましくはほ乳類宿主細胞にも関し、ここで、コンカテマー構造は、少なくとも３００、４００、５００または６００コピーの導入遺伝子および少なくとも１つのＭＡＲエレメントを含み、前記ＭＡＲエレメントはシスまたはトランスで前記導入遺伝子に提供され、前記細胞は、好ましくは同期された細胞集団の一部である。
【００２６】
少なくとも１つのＭＡＲは、シスで提供される可能性があり、前記導入遺伝子の大部分は、前記導入遺伝子のそれぞれについてＭＡＲが提供されていてもよく、および／または導入遺伝子は少なくとも２つの前記ＭＡＲエレメントと隣接していてもよい。少なくとも１つのＭＡＲエレメントは、配列番号１〜３と少なくとも９０％の配列同一性を有し得るか、または配列番号１〜３の変異体であり得、および／または前記導入遺伝子のプロモーター／エンハンサー配列の上流に位置し得る。細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、幹細胞または前駆細胞であり得る。
【００２７】
本発明はまた、本明細書中に記載される組換え真核生物宿主細胞のいずれか１つの、特に前記導入遺伝子の発現のための使用にも関する。
【００２８】
本発明はまた、
ａ．第１容器中に、場合によってＭＡＲエレメントおよび導入遺伝子の前記ベクター中への組み込みの制限部位を含むベクター、
ｂ．第２容器中に、本明細書中に記載される組換え真核生物宿主、ならびに
ｃ．導入遺伝子発現のために前記細胞をトランスフェクトする際の前記ベクターの使用法の説明書
を含むキットにも関する。
【００２９】
キットは、同期剤または前記細胞（複数可）を含む細胞集団を同期させる方法に関する説明書も含んでもよい。ベクターを用いて細胞を少なくとも２回トランスフェクトすることができる（それぞれの場合、前記細胞集団の細胞のほとんどがＧ１期である）。
【００３０】
本発明はまた、
ＥＲ膜を越える転位および／または原形質膜を越える分泌に関与する少なくとも１つの霊長類タンパク質または霊長類ＲＮＡをコード化するトランスジェニック配列、たとえばシグナル認識粒子（ＳＲＰ）のタンパク質もしくはＲＮＡまたは分泌複合体（トランスロコン）のタンパク質もしくはそのサブユニットなど
を含む非霊長類組換え真核生物宿主細胞にも関する。
【００３１】
細胞は、シグナルペプチドコーディング配列と機能的に結合した導入遺伝子をさらに含んでもよく、この場合、前記導入遺伝子は、細胞中に複数コピーで、好ましくはコンカテマー構造の形態で存在してもよい。細胞は、少なくとも２００、３００、４００、５００または６００コピーの導入遺伝子を含み得る。前記シグナルペプチドコーディング配列によってコード化されるシグナルペプチドは、アミノ酸の疎水性ストレッチを含み得、ＳＲＰ５４と相互作用するための１つまたはそれ以上の配列を有し得る。細胞はまた、前記導入遺伝子に対してシスまたはトランスに位置する後成的な調節エレメント、たとえばＭＡＲエレメントも含み得る。ＥＲ膜を越える転位および／または原形質膜を越える分泌に関与するタンパク質またはＲＮＡは、ＳＲＰ、特にＳＲＰ９、ＳＲＰ１４、ＳＲＰ１９、ＳＲＰ５４、ＳＲＰ６８、ＳＲＰ７２および／または７ＳＲＮＡのタンパク質またはＲＮＡであってよい。ＳＲＰのタンパク質は、好ましくは、ＥＲ膜を越える転位および／または原形質膜を越える分泌に関与する１つもしくはそれ以上の他の前記タンパク質またはＲＮＡと結合したヒトＳＲＰ１４であり得る。１つまたはそれ以上の他の前記タンパク質は、ヒトＳＲおよび／またはヒトトランスロコンタンパク質であり得る。ＳＲＰのタンパク質は、好ましくはＥＲ膜を越える転位および／または原形質膜を越える分泌に関与する１つまたはそれ以上の他の前記タンパク質またはＲＮＡと結合したヒトＳＲＰ５４であり得る。１つまたはそれ以上の他の前記タンパク質は、ヒトＳＲおよび／またはヒトトランスロコンタンパク質であり得る。
【００３２】
原形質膜を越える分泌および／または転位に関与するタンパク質またはＲＮＡは、トランスロコンのタンパク質のうちの１つ、特にＳｅｃ６１αβγ、Ｓｅｃ６２、Ｓｅｃ６３および／またはそのサブユニットであってよい。原形質膜を越える分泌および／または転位に関与するタンパク質またはＲＮＡは、ＳＲＰ９、ＳＲＰ１４およびトランスロコンタンパク質の組み合わせであってよい。導入遺伝子は、免疫グロブリン、そのサブユニットもしくはフラグメントまたは融合タンパク質であってよい。非霊長類細胞は、齧歯類細胞、好ましくはＣＨＯ細胞であり得る。シグナル配列コーディング配列は、配列番号４〜１１と少なくとも９０％の配列同一性を有し得るか、または前記配列のいずれか１つの変異体であり得る。
【００３３】
本発明はまた、細胞の原形質膜を越える導入遺伝子発現産物の分泌および／または転位における非霊長類組換え真核生物宿主細胞の使用に関する。
【００３４】
本発明はまた、
（ａ）１つの容器中に、細胞のゲノムの一部、ＥＲ膜を越える転位および／または原形質膜を越える分泌に関与する少なくとも１つのタンパク質またはＲＮＡ、たとえばシグナル認識粒子（ＳＲＰ）のタンパク質またはＲＮＡあるいは分泌複合体（トランスロコン）のタンパク質またはそのサブユニットをコード化するトランスジェニック配列を含む非霊長類組換え宿主細胞、
（ｂ）別の容器中に、導入遺伝子を前記ベクター中に組み込むための制限部位および場合によってＭＡＲエレメントを含む少なくとも１つのベクター、ならびに
（ｃ）前記細胞を使用して前記導入遺伝子の導入遺伝子発現産物を発現し、分泌させるための説明書
を含むキットに関する。
【００３５】
本発明はさらに：
（ａ）小胞体を越える分泌および／または転位に関与する少なくとも１つの霊長類タンパク質または霊長類ＲＮＡおよび／または小胞体および／または原形質膜、たとえばシグナル認識粒子（ＳＲＰ）のタンパク質またはＲＮＡまたは分泌複合体（トランスロコン）のタンパク質またはそのサブユニットをコード化するトランスジェニック配列、ならびに
（ｂ）シグナルペプチドコーディング配列に機能的に結合した導入遺伝子
を含む非霊長類真核生物宿主細胞を提供することを含む、導入遺伝子のタンパク質分泌のための方法に関する。
【００３６】
トランスジェニック配列は、前記細胞中に存在する原形質膜を越える分泌および／または転位に関与するタンパク質またはＲＮＡの合計量を、前記トランスジェニック配列を含む／発現する前の細胞中で見いだされるレベルよりも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％を越えて増大させる可能性がある。
【００３７】
導入遺伝子は、細胞のゲノム中に組み入れられたコンカテマー構造として存在し得、この場合、コンカテマー構造は、好ましくは、少なくとも２００、３００、４００、５００または６００コピーの導入遺伝子を含み、前記細胞のゲノムの１つの座中に組み入れられていてもよい。
【００３８】
シグナルペプチドコーディング配列によってコード化されるシグナルペプチドは、アミノ酸の疎水性ストレッチを含み得、ＳＲＰ５４と相互作用するための配列を有し得る。
【００３９】
（ｂ）におけるトランスフェクションは、後続トランスフェクションであり得、ベクターまたは核酸フラグメントなどの核酸での初期トランスフェクションが先行してもよい。
【００４０】
初期トランスフェクションのベクターは、（ｂ）におけるベクターに対応し得る。
【００４１】
トランスジェニック配列は、配列番号４〜１１の群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し得るか、または前記配列のいずれか１つの変異体であり得る。
【００４２】
本発明はまた、トランスジェニック配列の活性を増大させるタンパク質分泌および／または転位を特定するための方法であって：
組換えタンパク質をコード化する導入遺伝子を含む第１ほ乳類細胞をモニタリングし（ここで、前記組換えタンパク質は第１レベルで前記細胞により分泌される）、
前記組換えタンパク質をコード化する前記導入遺伝子を含む第２のほ乳類細胞をモニタリングし（組換えタンパク質は第２のレベルで前記細胞により分泌され、前記第２レベルは前記第１レベルを上回る）、
前記第１ほ乳類細胞中に、原形質膜を越える分泌および／または転位に関与する少なくとも１つのタンパク質またはＲＮＡをコード化するトランスジェニック配列を導入し、そして
前記第１細胞における前記組換えタンパク質の分泌レベルの変化を測定すること
を含む方法にも関し、
この場合、第１レベルを越えた増加は、前記トランスジェニック配列の活性を増加させるタンパク質分泌を確認する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１Ａ】ＭＡＲおよび連続したトランスフェクションの遺伝子導入および発現に対する効果の分析ならびにＭＡＲ含有発現ベクターのダブルトランスフェクションにより得られる導入遺伝子発現レベルの図である。
【図１Ｂ】ＭＡＲおよび連続したトランスフェクションの遺伝子導入および発現に対する効果の分析ならびにＭＡＲ含有発現ベクターのダブルトランスフェクションにより得られる導入遺伝子発現レベルの図である。
【図１Ｃ】ＭＡＲおよび連続したトランスフェクションの遺伝子導入および発現に対する効果の分析ならびにＭＡＲ含有発現ベクターのダブルトランスフェクションにより得られる導入遺伝子発現レベルの図である。
【図１Ｄ】ＭＡＲおよび連続したトランスフェクションの遺伝子導入および発現に対する効果の分析ならびにＭＡＲ含有発現ベクターのダブルトランスフェクションにより得られる導入遺伝子発現レベルの図である。
【図１Ｅ】ＭＡＲおよび連続したトランスフェクションの遺伝子導入および発現に対する効果の分析ならびにＭＡＲ含有発現ベクターのダブルトランスフェクションにより得られる導入遺伝子発現レベルの図である。
【図１Ｆ】ＭＡＲおよび連続したトランスフェクションの遺伝子導入および発現に対する効果の分析ならびにＭＡＲ含有発現ベクターのダブルトランスフェクションにより得られる導入遺伝子発現レベルの図である。
【図２Ａ】連続トランスフェクションと細胞分裂サイクルを通しての細胞培養進行との間の至適時期の決定。
【図２Ｂ】連続トランスフェクションと細胞分裂サイクルを通しての細胞培養進行との間の至適時期の決定。
【図２Ｃ】連続トランスフェクションと細胞分裂サイクルを通しての細胞培養進行との間の至適時期の決定。
【図２Ｄ】連続トランスフェクションと細胞分裂サイクルを通しての細胞培養進行との間の至適時期の決定。
【図３Ａ】連続トランスフェクションによるＤＮＡ輸送、組み込みおよび発現およびモノクローン細胞集団における平均ＧＦＰ蛍光と導入遺伝子コピー数との間の関係。
【図３Ｂ】連続トランスフェクションによるＤＮＡ輸送、組み込みおよび発現およびモノクローン細胞集団における平均ＧＦＰ蛍光と導入遺伝子コピー数との間の関係。
【図３Ｃ】連続トランスフェクションによるＤＮＡ輸送、組み込みおよび発現およびモノクローン細胞集団における平均ＧＦＰ蛍光と導入遺伝子コピー数との間の関係。
【図３Ｄ】連続トランスフェクションによるＤＮＡ輸送、組み込みおよび発現およびモノクローン細胞集団における平均ＧＦＰ蛍光と導入遺伝子コピー数との間の関係。
【図３Ｅ】連続トランスフェクションによるＤＮＡ輸送、組み込みおよび発現およびモノクローン細胞集団における平均ＧＦＰ蛍光と導入遺伝子コピー数との間の関係。
【図４Ａ】トランスフェクトされたＤＮＡの細胞内分布およびＤＮＡのコンフォメーションの遺伝子導入および発現に対する影響。
【図４Ｂ】トランスフェクトされたＤＮＡの細胞内分布およびＤＮＡのコンフォメーションの遺伝子導入および発現に対する影響。
【図４Ｃ】トランスフェクトされたＤＮＡの細胞内分布およびＤＮＡのコンフォメーションの遺伝子導入および発現に対する影響。
【図５Ａ】ＭＡＲＳを介した高い導入遺伝子発現、プラスミド相同性および相同性組換えならびにＭＡＲでの繰り返しトランスフェクションにより改善された発現のモデル。
【図５Ｂ】ＭＡＲＳを介した高い導入遺伝子発現、プラスミド相同性および相同性組換えならびにＭＡＲでの繰り返しトランスフェクションにより改善された発現のモデル。
【図５Ｃ】ＭＡＲＳを介した高い導入遺伝子発現、プラスミド相同性および相同性組換えならびにＭＡＲでの繰り返しトランスフェクションにより改善された発現のモデル。
【図５Ｄ】ＭＡＲＳを介した高い導入遺伝子発現、プラスミド相同性および相同性組換えならびにＭＡＲでの繰り返しトランスフェクションにより改善された発現のモデル。
【図５Ｅ】ＭＡＲＳを介した高い導入遺伝子発現、プラスミド相同性および相同性組換えならびにＭＡＲでの繰り返しトランスフェクションにより改善された発現のモデル。
【図６Ａ】高および低組換えＩｇＧプロデューサーＣＨＯクローンにより発現された免疫グロブリンの重および軽鎖の特性化。
【図６Ｂ】高および低組換えＩｇＧプロデューサーＣＨＯクローンにより発現された免疫グロブリンの重および軽鎖の特性化。
【図６Ｃ】高および低組換えＩｇＧプロデューサーＣＨＯクローンにより発現された免疫グロブリンの重および軽鎖の特性化。
【図７】ＥＲフォールディングならびに高および低ＩｇＧ−プロデューサーのＵＰＲ機構の特性化。
【図８Ａ】組換えＩｇＧ産生ＣＨＯクローンのＳＲＰ１４トランスフェクションは、軽鎖凝集を消滅させ、ＩｇＧ分泌を救済した。
【図８Ｂ】組換えＩｇＧ産生ＣＨＯクローンのＳＲＰ１４トランスフェクションは、軽鎖凝集を消滅させ、ＩｇＧ分泌を救済した。
【図９】ＳＲＰ９、ＳＲＰ１４、ＳＲＰ５４、ＳＲおよびトランスロコンの種々の組み合わせを発現するＣＨＯ細胞プールにおけるＭＡｂ産生の増加
【図１０】２つのＳＧＥが隣接した対象の導入遺伝子の発現カセットを示す発現ベクターのマップ。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明の文脈で用いられる導入遺伝子は、所定の成熟タンパク質（本明細書中では、タンパク質をコード化するＤＮＡとも称する）または前駆体タンパク質もしくは機能的ＲＮＡをコードする、単離・精製されたデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）配列である。本発明によるいくつかの好ましい導入遺伝子は、免疫グロブリン（Ｉｇ）およびＦｃ−融合タンパク質および他のタンパク質、特に治療的活性を有するタンパク質（「バイオセラピューティックス」）をコード化する導入遺伝子である。本明細書中で用いられる場合、導入遺伝子という用語は、タンパク質をコード化するＤＮＡとの関連では、ＲＮＡ転写開始シグナル、ポリアデニル化付加部位、プロモーターまたはエンハンサーなどの非転写フランキング領域を含まない。一般的に、導入遺伝子という用語は、真核生物宿主細胞などの細胞中にトランスフェクションにより導入され（この用語は、本発明の文脈では、ウイルスベクターにより外来ＤＮＡを導入するプロセスも包含し、場合によっては形質導入とも称する）、本明細書においては「導入遺伝子発現産物」または「異種タンパク質」とも称する対象の産物をコード化するＤＮＡ配列に言及する場合にこの文脈では用いられる。導入遺伝子は、シグナルペプチドをコード化するシグナルペプチドコーディング配列に機能的に結合する可能性があり、これは次に小胞体および／または原形質膜を越える転位および／または分泌を媒介および／または促進し、分泌前または分泌中に除去される。「トランスジェニック配列」という用語は、一方では、真核生物宿主細胞などの細胞中にトランスフェクションにより導入され、対象の産物の発現および／または分泌を増大させるＤＮＡ配列に言及する場合に用いられる。トランスジェニック配列は、多くの場合、タンパク質またはＲＮＡ配列をコード化する。本発明のトランスジェニック配列は、例えば、ＨＲ（相同性組換え）を特異的に増強するか、または非相同的末端結合（ＮＨＥＪ）を減少させるものである。各タンパク質を以下でさらに詳細に検討する。他の「トランスジェニック配列」は、プロセッシング、小胞体および／または原形質膜を越える分泌および／または転位に関与するタンパク質（複数可）またはＲＮＡ（複数可）をコード化するものである。「トランスジェニック配列」は、非翻訳制御配列を含み得る。
【００４５】
発現および／または分泌の増強を、各トランスジェニック配列を含まない対照細胞から得られる値に対して測定する。対照の値に対する任意の統計的に有意な増強は、促進として見なされる。
【００４６】
ＨＲ／ＮＨＥＪ比（またはＨＲ／ＮＨＥＪ活性比）は、真核生物細胞、例えば組換え真核生物宿主細胞などの細胞で起こるＨＲ（相同性組換え）のＮＨＥＪ（非相同的末端結合）活性に対する比である。ＨＲ／ＮＨＥＪ比は、一般的に細胞集団において、すなわち、例えば、ＣＨＯ細胞クローンなどの同じ種類の真核生物細胞の群で測定される。本明細書中で、例えば細胞のＨＲ／ＮＨＥＪ比を最適化または増強（増大）することについて言及する場合、当然ながら、そのような最適化または増強は各細胞集団で起こる。任意のそのような最適化または増強の基準点は、ＨＲ／ＮＨＥＪ比を増強または最適化させるための手段が実施されなかった対応する細胞集団中に存在する比である。これは、たとえば、前記細胞の親細胞集団、すなわち、増強または最適化された細胞が誘導される細胞集団である。ＨＲ／ＮＨＥＪ比（またはＨＲ／ＮＨＥＪ活性比）は、本明細書中では、たとえば、「前記トランスジェニック配列を含まない、および／または突然変異していない細胞」と称する参考細胞集団の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５倍超まで増強することができる。最適化および増強測定は、細胞が一般的に遺伝子改変されることなく「処理される」処理を含む。そのような処理は、細胞集団を同期させる簡単な手段を含み、したがって、集団の細胞のほとんどが、トランスフェクションの時点でＧ１期にある。そのような同期化を達成するための種々の方法が知られており、そしてそれらには、化学薬品（同期化薬品）および低温の使用が含まれるが、これらに限定されるものではない。Ｇｏｌｚｉｏら（２００２）は、細胞を酪酸ナトリウムでの処理に付すことによる細胞の同期化を記載している。Ｇｒｏｓｊｅａｎら（２００２）は、細胞の大部分が、同期化薬品としてのミモシンの投与後にＧ１およびＳ期の間の境界で停止されることを記載している。Ｂｊｕｒｓｅｌｌら（１９７３）は、チミジンを使用してＣＨＯ細胞を同期させることを記載している。
【００４７】
ＨＲはＲＡＤ５１関連タンパク質群を必要とすることが報告されている（Ｗｅｓｔ  ２００３）。したがって、ＨＲは、例えばＲａｄ５１、Ｒａｄ５２、ＲｅｃＡ、Ｒａｄ５４、ＲｕｖＣまたはＢＲＣＡ２をはじめとする追加のＨＲタンパク質（ＨＲ酵素）を細胞に提供することによって増強することができる。ＨＲアクチベーターも用いることができる。これらには、ＲＳ−１（ＲＤ５１刺激化合物１）が含まれるが、これに限定されるものではない。ＲＳ−１は、活性なシナプス前フィラメントの形成を促進することによってｈＲＡＤ５１の相同性組換え活性を増強する（Ｊａｙａｔｈｉｌａｋａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８）。ＮＨＥＪは、ほ乳類細胞において、２つのタンパク質複合体、ＤＮＡ−ＰＫｃｓと結合したヘテロ二量体Ｋｕ８０−Ｋｕ７０およびその補因子ＸＲＣＣ４と結合したリガーゼＩＶを含むことが報告されている（Ｄｅｌａｃｏｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。ＮＨＥＪのサプレッサー（これもまた本発明との関連で用いることができる）には、ＮＵ７０２６（２−（モルホリン−４−イル）−ベンゾ（ｈ）コメン−４−オン）（ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤）が含まれる。化学物質ＮＵ７０２６を用いたＮＨＥＪ機能の抑制は、ＤＮＡ末端がインタクト相同性組換え修復経路に接近するのを促進する可能性がある（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９）。ＮＨＥＪの別のサプレッサーはワートマニン（ｐ１１０ＰＩ３キナーゼのＰＩ３ｋ阻害剤）であり、これも、ＤＮＡ二本鎖修復に介在することが知られているＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼを阻害する（Ｂｏｕｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）。
【００４８】
細胞のＨＲ／ＮＨＥＪ比は、これらのＨＲ酵素、ＨＲアクチベーターおよび／またはＮＨＥＪサプレッサーを過剰発現することによるか、またはＨＲを活性化するかもしくはＮＨＥＪを抑制する物理的もしくは化学的処理によって増強することができる。このような過剰発現を達成する一方法は、そのような酵素などをコード化する「トランスジェニック配列」を各細胞中に導入することによる。そのような配列は、「トランスジェニック配列」と称し、対応する無修飾細胞の一部でないことを示す。トランスジェニック配列は、多くの場合、細胞のゲノム中に組み込まれる。
【００４９】
ＨＲ酵素、アクチベーターおよび／またはＮＨＥＪサプレッサーなどの前記タンパク質は、誘導的に、または構成的に修飾細胞において発現され得る。当業者は、誘導的または構成的発現を可能にする適切なベクター構造を容易に確認することができる。
【００５０】
同様に、細胞は、ＨＲの増強および／またはＮＨＥＪの減少および／または細胞のＨＲ／ＮＨＥＪ比の増強のために突然変異によって修飾されている。いくつかの刊行物は、細胞におけるポリヌクレオチドのランダムな組み込みに関与する経路であるＮＨＥＪ経路の阻害を、ＨＲ／ＮＨＥＪ比を改善するための方法として記載している（例えば、Ｋｒａｐｐｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６を参照）。ＮＨＥＪをブロックするために不活性化することができる遺伝子および／またはタンパク質としては、Ｋｕ８０、Ｋｕ７０、リガーゼＩＶまたはＸＲＣＣ４が挙げられ（Ｖ３．３突然変異体に対する本明細書中の言及も参照）、本発明の関連で、ＨＲ／ＮＨＥＪ比の非常に顕著な増強および導入遺伝子発現の改善、例えば平均で導入遺伝子発現の５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０倍までまたはさらには６０倍までの増加をもたらす可能性がある。同様に、ある突然変異は、例えば、ある内因性ＨＲ酵素または細胞のアクチベーターの発現を増強することによって、ＨＲを増強する可能性がある。
【００５１】
ＨＲ／ＮＨＥＪピーク（またはＨＲ／ＮＨＥＪ活性ピーク）は、ＨＲ／ＮＨＥＪ比が上昇し、ピークに達する真核生物細胞の細胞集団の細胞周期中の期間である。本発明の文脈で、細胞のＨＲ／ＮＨＥＪピークについて言及される場合、同じ種類の細胞集団の細胞、例えば、ＨＲ酵素を発現するようにトランスジェニック配列によって修飾された細胞集団について言及されると理解される。「ＨＲ／ＮＨＥＪピーク」は、ＨＲ／ＮＨＥＪまたは単にＨＲを表す値に対して時間をプロットしたグラフで最高のＨＲ／ＮＨＥＪ上昇（ピークの先端、ピーク先端）付近の期間を包含する。トランスフェクションについて好ましい期間は、ＨＲ／ＮＨＥＪピーク（例えば、細胞周期のＧ１期）の前であり、したがってＤＮＡは、ピークの先端へ向かって直線が上昇し始める値（「底値」）からピークの先端までＨＲ／ＮＨＥＪ（または単にＨＲ）の５０％以上の上昇に達する時点より定義される、ピークの先端付近の時間（ピーク先端、たとえば後期ＳおよびＧ２期）に細胞核に到達する。ピークは、細胞集団中の最小数の細胞がＧ１期、または初期Ｓ期（ＨＲ活性が低いことが知られている期）にある時、および／または細胞の大部分がＳ期またはＧ２期（ＨＲ活性が最高であることが知られている時）にある時に出現する。
【００５２】
細胞集団の細胞の大部分がＧ１期にある時点も、図２（Ｂ）で示されるグラフで示される。ここでは、各細胞周期状態（Ｇ１、Ｓ、Ｇ２／Ｍ）に関連する集団のパーセンテージが表示されている。この図からわかるように、図示される集団の細胞の８０％超、８５％超、９０％超またはさらには９５％超がＧ１、ＳまたはＧ２／Ｍ期のいずれかにあると特定された。これらの期のうちの１つにあることが判明した細胞のうち、大部分が、この例では、２１時間後にＧ１期にあることが判明した。Ｇ１期細胞のパーセンタイルは、したがってＳまたはＧ２／Ｍ期細胞のパーセンタイルと比較して最高であった。
【００５３】
機能的ＲＮＡには、タンパク質に翻訳されるのとは異なる細胞における直接的または間接的効果を生む任意の種類のＲＮＡが含まれる。典型的な例は、アンチセンスＲＮＡまたは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉ  ＲＮＡ）である。
【００５４】
真核生物宿主細胞は、本発明の導入遺伝子の「宿主」となるかまたは宿主となるように設計される細胞である。組換え真核生物宿主細胞は、遺伝子改変され、すなわち、一般的に導入遺伝子発現産物の発現または分泌を増強するために、ベクターなどの追加の配列を、そのゲノムの一部として、または染色体外因子の一部としてのいずれかで含む。
【００５５】
コンカテマーまたはコンカテマー構造は、長い連続したＤＮＡストレッチまたは一列に連結した複数コピーの同じモノマーＤＮＡ配列を含む分子である。本発明の文脈で、モノマーＤＮＡ配列は導入遺伝子であるか、または多くの場合、導入遺伝子を含む。たとえば、プロモーターおよびエンハンサー配列を含み得る導入遺伝子のコンカテマー構造は、一般的に宿主細胞のゲノム中に組み込まれる。この組み込みは、宿主の染色体の複数の位置（座）（組み込み部位）または１つの座で起こり得る。１つのコンカテマー構造は、２００、３００、４００、５００、６００、７００超または８００超の、前記導入遺伝子を含むモノマーＤＮＡ配列を含み得る。モノマーＤＮＡ配列の頭尾アレイ（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ  ａｒｒａｙ）が優先的に観察される。細胞中に複数コピーで存在するとされる導入遺伝子はコンカテマー構造を有し得る。
【００５６】
本発明のＭＡＲエレメント、ＭＡＲ構築物、ＭＡＲ配列、Ｓ／ＭＡＲまたは単にＭＡＲは、天然に存在する「ＳＡＲ」または「ＭＡＲ」と１つまたはそれ以上（たとえば、２、３または４）の特徴を共有し、前記ＭＡＲにより影響を受ける任意の遺伝子のタンパク質発現を促進する少なくとも１つの性質を有するヌクレオチド配列である。ＭＡＲエレメントはまた、ＭＡＲ活性、特に、転写調節、好ましくは増強活性だけてなく、たとえば、発現安定化活性および／または「増強されたＭＡＲ構築物」でも記載する他の活性も有する単離および／または精製核酸であるという特性も有する。ＭＡＲエレメントは、境界またはインスレーターエレメント、遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）、安定化およびアンチリプレッサー（ＳＴＡＲ）エレメント、ならびに偏在作用性クロマチンオープニング（ＵＣＯＥ）エレメントも含む後成的な調節エレメントのさらに広範囲の群に属する。ＭＡＲエレメントは、それらが主に基づいている同定されたＭＡＲに基づいて定義することができる：ＭＡＲ  Ｓ４構築物は、したがって、そのヌクレオチドの大部分（５０％＋）がＭＡＲ  Ｓ４に基づくＭＡＲエレメントである。ＡおよびＴ含有量が高いいくつかの簡単な配列モチーフが、ＳＡＲおよび／またはＭＡＲ内で見いだされることが多いが、ほとんどの場合、それらの機能的重要性および潜在的な作用様式は解明されていない。これらには、Ａボックス、Ｔボックス、ＤＮＡ巻き戻しモチーフ、ＳＡＴＢ１結合部位（Ｈボックス、Ａ／Ｔ／Ｃ２５）および脊椎動物またはショウジョウバエのコンセンサストポイソメラーゼＩＩ部位が含まれる。
【００５７】
ＭＡＲエレメントにおいて一般的に見出されるＡＴ／ＴＡ−ジヌクレオチドリッチなベントＤＮＡ領域（本明細書中で以下、「ＡＴリッチな領域」と称する）は、多数のＡおよびＴを（特にジヌクレオチドＡＴおよびＴＡの形態で）含むベントＤＮＡ領域である。好ましい実施形態では、１００の連続した塩基対のストレッチ上、少なくとも１０％のジヌクレオチドＴＡ、および／または少なくとも１２％のジヌクレオチドＡＴ、好ましくは１００の連続した塩基対のストレッチ上（またはＡＴリッチな領域がより短い長さである場合に、それぞれの短いストレッチ上）、少なくとも３３％のジヌクレオチドＴＡ、および／または少なくとも３３％のジヌクレオチドＡＴを含みつつ、ベント二次構造を有する。しかし、「ＡＴリッチな領域」は、約３０ヌクレオチド以下の短いものであってもよいが、好ましくは約５０ヌクレオチド、約７５ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０または約４００ヌクレオチド長またはそれ以上である。
【００５８】
脊椎動物（ＲＮＹＮＮＣＮＮＧＹＮＧＫＴＮＹＮＹ）またはショウジョウバエ（ＧＴＮＷＡＹＡＴＴＮＡＴＮＮＲ）のＳＡＴＢ１結合部位（Ｈボックス、Ａ／Ｔ／Ｃ２５）およびコンセンサストポイソメラーゼＩＩ部位などのいくつかの結合部位も、多くの場合、比較的高いＡおよびＴ含有量を有する。しかし、結合部位領域（モジュール）、特に、結合部位のクラスターを含むＴＦＢＳ領域は、領域の屈曲パターンの比較により、ＡおよびＴ含有量が高いＭＡＲエレメントからのＡＴおよびＴＡジヌクレオチドリッチな領域（「ＡＴリッチな領域」）から容易に区別することができる。たとえば、ＭＡＲ１＿６８について、後者は約３．８または約４．０を越える平均屈曲率を有し得、一方、ＴＦＢＳ領域は約３．５または約３．３未満の平均屈曲率を有し得る。特定されたＭＡＲの領域は、これに限定されるものではないが、本明細書中の他の箇所で記載されるような相対的融解温度などの別の手段によっても確認することができる。しかし、そのような値は、種特異的であり、したがって種によって様々であり得、例えばさらに低い可能性がある。したがって、各ＡＴおよびＴＡジヌクレオチドリッチな領域は、約３．２〜約３．４または約３．４〜約３．６または約３．６〜約３．８などの低い屈曲率を有し得、ＴＦＢＳ領域は、例えば約２．７未満、約２．９未満、約３．１未満、約３．３未満などの、比例して低い屈曲率を有し得る。ＳＭＡＲ  Ｓｃａｎ  ＩＩでは、それぞれのより低いウインドウサイズが当業者によって選択されるであろう。
【００５９】
ＭＡＲエレメント、ＭＡＲ構築物、ＭＡＲ配列、Ｓ／ＭＡＲまたは単なるＭＡＲという用語は、本発明のＭＡＲ構築物が基づく可能性がある天然に存在するおよび／または同定されたＭＡＲよりも増強した特性を有する、増強されたＭＡＲ構築物も含む。そのような特性には、これらに限定されるものではないが、完全長の天然に存在するおよび／または同定されたＭＡＲに対して減少した長さ、遺伝子発現／転写の増強、発現の安定性の増強、組織特異性、誘導性またはそれらの組み合わせが含まれる。したがって、増強されるＭＡＲエレメントは、例えば、同定されたＭＡＲ配列のヌクレオチドの数の約９０％未満、好ましくは約８０％未満、なお一層好ましくは約７０％未満、約６０％未満、または約５０％未満を含み得る。ＭＡＲエレメントは、適切な細胞の前記構築物での形質転換により導入遺伝子の遺伝子発現および／または転写を増強し得る。
【００６０】
ＭＡＲエレメントは、対象の遺伝子が機能的に結合しているかまたは機能的に結合することができるプロモーター領域の上流に挿入される。しかし、ある実施形態において、ＭＡＲエレメントが対象の遺伝子／ヌクレオチド酸配列の上流ならびに下流またはすぐ下流に位置するのが有利である。他の複数のＭＡＲ配置（シスおよび／またはトランスの両方）も本発明の範囲内に含まれる。
【００６１】
本発明はまた、１つまたはそれ以上の非ＭＡＲ後成的レギュレーター、例えばこれらに限定されるものではないが、ヒストン修飾因子、例えばヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、他のＤＮＡエレメント（後成的調節エレメント）、例えば遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）、インスレーター、例えばｃＨＳ４またはアンチリプレッサーエレメント（例えば、安定剤およびアンチリプレッサーエレメント（ＳＴＡＲもしくはＵＣＯＥエレメント）またはホットスポットと組み合わされたＭＡＲエレメントの使用にも関する（Ｋｗａｋｓ  ＴＨＪ  ａｎｄ  Ｏｔｔｅ  ＡＰ）。
【００６２】
合成的とは、ＭＡＲ／ＭＡＲエレメントの関連で用いられる場合、そのデザインが、同定されたＭＡＲまたはそれに基づくＭＡＲの配列／領域または部分的領域の単純な入れ換え、複製および／または欠失以上のものを含むＭＡＲを指す。特に、合成ＭＡＲ／ＭＡＲエレメントは、一般的に、同定されたＭＡＲの１以上、好ましくは１つの領域（ただし、ある実施形態では合成または修飾される可能性がある）、ならびに具体的に設計され、十分に特性化されたエレメント、例えば１つもしくは一連のＴＦＢＳ（好ましい実施形態では合成により産生される）を含む。これらのデザイナーエレメントは、多くの実施形態では、比較的短く、特に、一般的には約３００ｂｐ長以下、好ましくは約１００、約５０、約４０、約３０、約２０または約１０ｂｐ長以下である。これらのエレメントは、ある実施形態においては多量体化されていてもよい。そのような合成ＭＡＲエレメントもまた本発明の一部であり、当然のことながら、一般的にこの記載は、合成ＭＡＲエレメントにも等しく当てはまる「ＭＡＲエレメント」について当てはまるとされる任意のものであると理解され得る。
【００６３】
同定されたＭＡＲエレメントのヌクレオチド配列の機能的フラグメントも、前記のＭＡＲエレメントの機能を維持している限り、前記定義に含まれる。
【００６４】
いくつかの好ましい同定されたＭＡＲエレメントとしては、これらに限定されるものではないが、ＭＡＲ  １＿６８、ＭＡＲ  Ｘ＿２９、ＭＡＲ  １＿６、ＭＡＲ  Ｓ４、ＭＡＲ  Ｓ４６（これらおよび他のＭＡＲエレメントの配列の開示に関して参照することにより本出願に特に組み入れられるＷＯ２００５０４０３７７および米国特許出願第２００７０１７８４６９号で開示されるような全てのそれらの順列を含む）が挙げられる。ニワトリリゾチームＭＡＲも好ましい実施形態である（これもまた、そのＭＡＲエレメントの開示について本明細書中に特に組み込まれる米国特許第７，１２９，０６２号を参照）。
【００６５】
シスとは、たとえば、同じベクターまたは染色体などであるが、これらに限定されない同じ核酸分子上に２以上のエレメント（たとえばクロマチンエレメント）が配置されていることを指す。
【００６６】
トランスとは、たとえば、２以上のベクターまたは染色体であるが、これらに限定されない２以上の核酸分子上に２以上のエレメント（たとえばクロマチンエレメント）が配置されていることを指す。
【００６７】
配列は、シス／トランス位置からその活性を発揮する場合に、たとえば遺伝子に対してシスおよび／またはトランスで作用するといわれる。
【００６８】
本発明の導入遺伝子またはトランスジェニック配列は、多くの場合、ベクターの一部である。本発明によるベクターは、別の核酸、たとえば、ベクターに結合され、一般的にはその中に組み込まれている、このベクターにより発現される導入遺伝子を輸送することができる核酸分子である。たとえば、プラスミドは１種のベクターであり、レトロウイルスまたはレンチウイルスは別の種類のベクターである。本発明の好ましい実施形態では、ベクターはトランスフェクションの前に線形化される。
【００６９】
ベクターのベクター配列は、導入遺伝子などの任意の「他の」核酸ならびにＭＡＲエレメントなどの遺伝因子を除いたベクターのＤＮＡまたはＲＮＡ配列である。
【００７０】
本明細書で「プラスミド」または「ベクター」相同性について言及する場合、この用語は、ＭＡＲおよび遺伝子を含む全プラスミドまたはベクターの相同性（本明細書中では配列同一性と同義で用いられる）を指す。
【００７１】
本発明による真核生物（ほ乳類細胞を含む）、たとえば組換え真核生物宿主細胞を細胞培養条件下で維持することができる。この種類の細胞の非限定的な例は、非霊長類真核生物宿主細胞、たとえばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞および新生児ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）である。霊長類真核生物宿主細胞としては、たとえば、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）およびＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）が挙げられる。組換え真核生物宿主細胞は、たとえばトランスジェニック配列でのトランスフェクションおよび／または突然変異により修飾された細胞を意味する。真核生物宿主細胞は、前記細胞によって発現されたタンパク質の転写後修飾を実施することができる。本発明のある実施形態では、真核生物（たとえば非霊長類）宿主細胞の細胞カウンターパートは完全に機能的である。すなわち、たとえば突然変異によって不活性化されていない。むしろ、トランスジェニック配列（たとえば霊長類）が、その細胞カウンターパート（たとえば非霊長類）に加えて発現される。
【００７２】
本発明によるトランスフェクションは、たとえば、これらに限定されるものではないが、エレクトロポーレーション、リポフェクション、ウイルスベクターを介して（「形質導入」と称する場合もある）、またはポリカチオン性脂質が関与するものをはじめとする化学的手段を介する、レシピエント真核生物細胞中への核酸の導入である。
【００７３】
本明細書中で用いられる形質転換とは、核酸の添加による真核細胞の修飾を指す。たとえば、形質転換された細胞には、たとえば、この配列を含むベクターのエレクトロポーレーションによりトランスジェニック配列でトランスフェクトされた細胞が含まれる。しかし、本発明の多くの実施形態では、本発明のトランスジェニック配列を細胞中に導入する方法は、任意の特定の方法に限定されない。
【００７４】
シングルトランスフェクションとは、記載したトランスフェクションを１回だけ実施することを意味する。
【００７５】
転写とは、ＤＮＡテンプレートからのＲＮＡの合成を意味する。「転写的活性」とは、転写される導入遺伝子を指す。
【００７６】
同一性は、全および完全配列などの２つのそのような配列間の一致の同一性によって決定される２つのヌクレオチド配列間の配列関連性の程度を意味する。同一性は容易に計算することができる。２つのヌクレオチド配列間の同一性を測定するための多くの方法が存在するが、「同一性」という用語は、当業者に周知である（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｌｅｓｋ，  Ａ．  Ｍ．，  ｅｄ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８８；  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．  Ｗ．，  ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９３；  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  Ｉ，  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｈ．  Ｇ．，  ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  １９９４；  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，  Ｇ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  ｅｄｓ．，  Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９１）。２つの配列間の同一性を決定するために通常用いられる方法には、これらに限定されないが、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｈｕｇｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，  Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．  Ｂｉｓｈｏｐ，  ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  １９９４、およびＣａｒｉｌｌｏ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｄ．，  ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．  ４８：  １０７３  （１９８８）で開示されているものが含まれる。同一性を決定するための好ましい方法は、試験された２つの配列間の最大一致をもたらすように設計されている。そのような方法は、コンピュータープログラムで体系化される。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータープログラム法としては、これらに限定されるものではないが、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．）プログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）．  ３８７  （１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）；  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７））が挙げられる。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いて同一性を決定することもできる。
【００７７】
実例として、たとえば、参考ヌクレオチド配列と少なくとも９５％の「同一性」を有するヌクレオチド配列を含む核酸とは、参考ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５までの点突然変異を含み得る以外は、核酸のヌクレオチド配列が参考配列と同一であることを意味する。言い換えると、参考ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するヌクレオチドを得るためには、参考配列において５％までのヌクレオチドが欠失しているか、または別のヌクレオチドで置換されていてもよく、あるいは参考配列中の全ヌクレオチドの５％までの多くのヌクレオチドが参考配列中に挿入されていてもよい。参考配列のこれらの突然変異は、参考ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置で、またはこれらの末端位置間のどこかで起こり得、参考配列中のヌクレオチド間で個別に、または参考配列内で１以上の連続した群で点在している。約６０％、約７０％、約７５％、約８５％または約９０％超の配列同一性も本発明の範囲内に含まれる。
【００７８】
別の核酸配列に対して実質的同一性を有する核酸配列は、記載される各方法に対して全くまたはほとんど影響を及ぼさず、多くの場合、１００ｂｐにおいて、１、２、３または４の突然変異に反映される、点突然変異、欠失または付加をその配列中に有する配列を指す。
【００７９】
本発明は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド変異体の両方に関する。「変異体」とは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと異なるが、その基本的性質を保持するポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。一般的に、変異体は、全体的に密接に類似し、多くの領域で本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと同一である。
【００８０】
変異体は、コーディング領域、非コーディング領域、または両方で改変を含み得る。特に好ましいのは、サイレント置換、付加、または欠失をもたらすが、コード化されたポリペプチドの特性または活性を変更しない改変を含むポリヌクレオチド変異体である。遺伝コードの縮重によるサイレント置換によって産生されるヌクレオチド変異体が好ましい。さらに、５〜１０、１〜５、または１〜２のアミノ酸が任意の組み合わせで置換、欠失、または付加されている変異体も好ましい。
【００８１】
本発明はまた、前記ポリヌクレオチドの対立遺伝子変異体も含む。対立遺伝子変異体は、同じ染色体座を占有する遺伝子の２以上の代替形態のいずれかを示す。対立遺伝子変異は突然変異により自然に生じ、集団内で多形をもたらし得る。遺伝子突然変異はサイレント（コード化されたポリペプチドにおいて変化がない）である可能性があるか、または改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化する可能性がある。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコード化されるポリペプチドである。
【００８２】
プロモーター配列または単にプロモーターとは、特定の核酸配列の発現に関して宿主細胞によって認識される核酸配列である。プロモーター配列は、ポリヌクレオチドの発現を調節する転写制御配列を含む。プロモーターは、突然変異体、トランケート型、およびハイブリッドプロモーターをはじめとする最適の宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列であってよく、宿主細胞に対して相同性または異種のいずれかの細胞外または細胞内ポリペプチドをコード化する遺伝子から得ることができる。プロモーターは、前記プロモーターに対してその機能を発揮する場合、特定の核酸配列に対して「機能的に連結」される。
【００８３】
エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を増大させる、通常、約１０〜約３００ヌクレオチド長のＤＮＡのシス作用型エレメントである。グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−フェトプロテイン、およびインシュリンエンハンサーからのエンハンサーを用いることができる。しかし、ウイルスからのエンハンサーを用いることができ；例としては、複製起点の後側（ｌａｔｅ  ｓｉｄｅ）のＳＶ４０、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
【００８４】
本明細書中で用いられる指数関数的とは、正確な数学的用語ではなく、細胞の生物学的成長曲線を表し、この場合、そのような成長のグラフは直線ではなく、上向きであり、少なくともある一定の期間にわたって連続して急勾配になる曲線である。いずれの場合でも、付加的以上のもの、たとえば増加を意味する。
【００８５】
発明の文脈で用いられる発現の変異性とは、１つの形質転換細胞の、同じ種類の別の形質転換細胞に対する発現における変異性を指す。この変異性は、異なる導入遺伝子コピーおよび／または導入遺伝子組込み部位の結果である。また、複数コピーの導入遺伝子の同じ座での共組み込みは、サイレンシングに至り、したがって変異性に貢献する可能性がある。
【００８６】
さらに、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」という用語およびその派生語は、他の要素またはステップを除外するものではない。さらに、不定冠詞「ａ」およびその派生語は、複数を除外するものではない。請求の範囲に記載されるいくつかの特性の機能は、統一によって達成される可能性がある。特徴または値に関連した、実質的に、約、およそなどの用語はまた、特に、まさにこの特徴またはまさにこの値も規定する。
【００８７】
相同性組換え（ＨＲ）、非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）および導入遺伝子発現の変異性の減少
独立した形質転換体間の導入遺伝子発現における変異性は、細胞のゲノム中に安定して組み込まれた遺伝子の数および組み込み部位によって影響を受ける。ＭＡＲを研究している際、そして特になぜＭＡＲによって導入遺伝子のさらに高い発現が得られるかを究明する際に、次のような、さらに幅広い、ＭＡＲに無関係な発見をもたらす観察がなされた：
まず、定量ＰＣＲにより、ＭＡＲエレメントがゲノム中に組み込まれた導入遺伝子コピー数を増加させることを証明できた。これらの結果により、以前の半定量的な観察結果が実証された（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４；  Ｇｉｒｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。加えて、安定な細胞プールの分裂中期の染色体の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション分析により、ＭＡＲでトランスフェクトされた細胞においてさらに高い強度の蛍光が示され、したがって、導入遺伝子組込みの増加が確認された。
さらなる研究の結果、導入遺伝子および各ＭＡＲでのシングルトランスフェクション後に、ＭＡＲはトランスフェクション後に細胞核に輸送されるプラスミドの量に対して著しい影響を及ぼさなかったことが判明した。可能な解釈は、コンカテマー化および／または組み込みで細胞のゲノム中に組み込まれるコピー数が高いことの説明がつくということである。当初は、ＭＡＲがＤＮＡ組換えシグナルとしての役割を果たし得ると考えられた。それらの構造特性、たとえばそれらの巻き戻しおよび対不形成可能性のために、トランスフェクトされたプラスミド間の相同性組換えの頻度を増大させることができ、かくしてさらに大きなコンカテマーの形成および多数のプラスミドコピーの組み込みが可能になる可能性が存在する。
第２に、ある状況下で、導入遺伝子の隣のＭＡＲでの２つの連続したトランスフェクション（１回の初期トランスフェクションおよび後続トランスフェクション）により、たとえば２つの独立したトランスフェクションから予想される単なる付加を提供するというよりむしろ、導入遺伝子発現にたとえば２倍の増加などの付加的以上の増加が可能になる。
定量ＰＣＲにより、連続ＭＡＲトランスフェクションに関連する高い導入遺伝子発現は、１つの事象と比較して、複数のトランスフェクション事象後に組み入れられた導入遺伝子コピー数の同様の高い増加に基づくものであることが証明された。
核に進入したプラスミドの数が増加するので、連続したＭＡＲトランスフェクションにおいて多数の組み入れられた導入遺伝子コピーが、少なくとも一つには、連続したトランスフェクション中に細胞中に導入された相同性プラスミド間のより良好なコンカテマー化によるものであるかどうかをさらに調査した。相同性組換えを含むプロセスが疑われ、プラスミド相同性の効果を研究することによって試験した。特に、導入遺伝子、プラスミド骨格および／またはＭＡＲの種々の組み合わせでダブルトランスフェクションを実施した。ＦＡＣＳ分析で、さらに高効率の組み込みおよび導入遺伝子発現のためには、高いプラスミド相同性（ベクター配列相同性ならびに導入遺伝子およびＭＡＲ相同性）が一般的に必要であることが明らかになった。発現およびベクター配列の遺伝子またはＭＡＲのいずれかを変えると、組み込みおよび導入遺伝子発現の両方の効率が低下した。実際、ダブルトランスフェクションの観察される効果は、全ての配列が異なる場合に全体としてなくなった。
加えて、連続トランスフェクション間のタイミングは、最適タンパク質発現を達成するために非常に重要であることが示された。２回目のトランスフェクションの時点で、細胞は、さらに高い組換え率に有利な細胞周期状態になければならず、さらに大きなコンカテマーの形成および宿主ゲノム中へのさらに多くのプラスミドの組み込みに至ると仮定された。上記のように、導入遺伝子のコンカテマー化は、真核生物細胞に存在する２つの主な機構が原因である可能性があり、その一方はＨＲであり、もう一方はＮＨＥＪである。したがって、ダブルトランスフェクションに対するどちらか一方の効果を試験した。このために、非相同性末端結合または相同性組換えのいずれかが欠損した異なるＣＨＯ突然変異体を使用した。ＮＨＥＪ経路は効率的な導入遺伝子組込みおよび発現を拮抗し、一方、機能的相同性組換え経路およびトランスフェクトされたベクター上の相同性ＤＮＡ配列は高レベル発現に有利であることが判明した。相同性組換えのみに依存する突然変異体ＣＨＯ細胞を使用した場合、ＭＡＲ含有ベクターのトランスフェクションにより、非突然変異細胞と比較して、導入遺伝子発現のレベルが非常に増加した。また、ＦＩＳＨ分析は、特定の期間（ここでは２１時間）での連続したトランスフェクションをともなう複数の組み込み事象を示さず、全ての導入遺伝子が１つの染色体座で組み込まれたことを示した。
したがって、ＭＡＲの組み込みに対する非相同性末端結合または相同性組換えが欠損した宿主細胞の効果は、導入遺伝子に影響を及ぼし、ＭＡＲに関係ないさらに広い概念、すなわち、導入遺伝子組込みにはＨＲが有利であり、ＮＨＥＪが不利であるという考えが導かれた。したがって、本発明者らは、導入遺伝子組込み、そしてひいては導入遺伝子発現を増大させるためにこの発見を利用した方法および構築物を考案した。この方法には、化学的もしくは温度処理または細胞集団の同期化を可能にする他の処理などの処理で組み込みの時点でＨＲを増大、ＮＨＥＪを減少、および／またはＨＲ／ＮＨＥＪ比を増大させるための方法が含まれる。他の処理および変法は、ＨＲ／ＮＨＥＪ比の考察で前述されている。構築物は、主に、ＨＲ増強、ＮＨＥＪ減少および／またはＨＲ／ＮＨＥＪ比の増強を可能にする好適な構造を有するものであった。
宿主細胞におけるＮＨＥＪの減少および／またはＨＲまたはＨＲ／ＮＨＥＪ比の増強は、ＭＡＲが関与するかまたは関与しない連続したトランスフェクションに関連して特に有利な効果も有する。
しかし、ＭＡＲに無関係なプロセスは、導入遺伝子組込みおよび発現に関して相当な進展をもたらすが、ＭＡＲおよび他の後成的なレギュレーターはさらに、相同性組換えに有利に影響することにより、またそのうちのいくつかはすでに検討されている他の機構（たとえば、米国特許出願第ＵＳ２００７／０１７８４６９号を参照）によって一部説明できるさらに有利な特性を提供する。
ＭＡＲエレメントは、非許容ヘテロクロマチン座における組み込みに起因する可能性が高い、サイレンシング効果から導入遺伝子を保護することにより、低レベルのタンパク質を発現する集団を減じることによって、導入遺伝子発現を改善する能力を有すると記載されている（Ｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｆｅｌｓｅｎｂｅｒｇ，  １９９９）。ＭＡＲの存在下で観察される抗サイレンシング効果は、導入遺伝子組込み部位でのヒストン過剰アセチル化などのクロマチン修飾（Ｒｅｃｉｌｌａｓ−Ｔａｒｇａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２；  Ｙａｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）または核内局在化における変化を介してもたらされる可能性がある。さらに、ＭＡＲは、クロマチンを修飾してさらに転写的に許容される状態をとる調節タンパク質を動員し得るか、または遺伝子発現を活性化する転写因子を動員することができる（Ｙａｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２；  Ｈａｒｔ  ａｎｄ  Ｌａｅｍｍｌｉ，  １９９８）。あるいは、これに限定されるものではないが、ＭＡＲは、タンパク質を動員して、組み込み事象についてより許容性である開口状態にクロマチン構造を改造することができる。また、導入遺伝子の転写は、ＭＡＲによる導入遺伝子プロモーターまたはエンハンサーの活性化によって改善することができる。ＭＡＲはまた、染色体内の許容性座における組み込みに有利であり得る。最後に、これらは、ＨＲとは関係のない機構によって宿主ゲノム中に組み込まれる導入遺伝子コピー数を増大させる可能性がある。
この文脈で、より高いコピー数は常に導入遺伝子のより強力な発現を支持するという認識は、必ずしも妥当であるとは限らないことに注意すべきである。なぜなら、宿主ゲノム中に組み込まれた複数コピーの存在は、サイレンシングに有利であり、これは反復エレメントがヘテロクロマチンにおいて対合および集合する傾向があることに起因するからである。あるいは、反復遺伝子の発現は、二本鎖および／または低分子干渉ＲＮＡの形成に至る可能性があり、これは次に後成的なサイレンシングに至る可能性がある。しかし、本発明の文脈では、導入遺伝子コピー数および細胞は蛍光レベルがＭＡＲの存在下で十分に相関することを証明することができた。したがって、導入遺伝子発現の増加は、細胞のゲノム中にさらに多くの導入遺伝子が組み込まれることだけに起因するのではなく、タンデム遺伝子コピーの組み込みに関連する後成的なサイレンシング事象のＭＡＲが介在する阻害によっても支持される可能性が高い。
特に連続したトランスフェクションの文脈で上記したように、実施した実験における導入遺伝子組込み／発現の増加は、核中に輸送された導入遺伝子の量を定量化することによって一部説明することができた。実際、細胞核は、特にＭＡＲでの２回のトランスフェクションで、そして特に２回目のトランスフェクション中にさらなるプラスミドを受容することを示すことができた。なぜなら、第１トランスフェクションは、２回目のトランスフェクション中に細胞によるＤＮＡ取り込みおよび核輸送を促進することができるからである。実際、ＤＮＡの細胞内輸送を評価し、各トランスフェクション後にリソソーム、核およびサイトゾルなどの細胞小器官中の標識されたｐＤＮＡのパーセンタイルを定量化することによって、ＭＡＲを有するプラスミドＤＮＡが、リソソーム分解を免れ、２回目のトランスフェクション中にはるかに効率的に核に侵入するようであることを証明することができた。説明は、プラスミド、特に第１トランスフェクションのプラスミドは、細胞分解機構を飽和させ得、かくして２回目のトランスフェクション中に核へのさらに効率的な輸送を可能にするということである。
したがって、増強されたＨＲ／ＮＨＥＪ比，増強されたＨＲおよび／または減少したＮＨＥＪを有する細胞をＭＡＲエレメントと組み合わせることは、非常に有効であり、本発明の一部である。
【００８８】
相同性組換え（ＨＲ）および非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）の機構
導入遺伝子は、組換え機構を使用して、二本鎖切断端で宿主ゲノム中に組み込まれる。
二本鎖切断（ＤＳＢ）は、生物学的に最も有害な種類のゲノム損傷であり、潜在的に細胞死または幅広い種類の遺伝子再配列に至る。正確な修復は、遺伝情報の維持および伝播の成功に必須である。
２つの主なＤＳＢ修復機構：非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）および相同性組換え（ＨＲ）がある。相同性組換えは、相同性を共有するＤＮＡ配列間の遺伝子交換のためのプロセスであり、細胞周期のＳ／Ｇ２期のみで有効であり、一方、ＮＨＥＪは、２つの切断されたＤＮＡ末端（通常は配列相同性がない）を単につなぎ合わせ、そして細胞周期の全ての期で機能するが、Ｇ０〜Ｇ１、および有糸核分裂細胞の初期Ｓ期中で特に重要である（Ｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，  １９８５；  Ｄｅｌａｃｏｔｅ  ａｎｄ  Ｌｏｐｅｚ，  ２００８）。脊椎動物では、ＨＲおよびＮＨＥＪは、ＤＳＢの性質および細胞周期の期に応じて、ＤＳＢ修復に異なって貢献する（Ｔａｋａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。
【００８９】
ＮＨＥＪ：基本的機構
概念的に、ＮＨＥＪプロセスの分子機構は単純であるようにみえる：１）一組の酵素が切断されたＤＮＡ分子を捕捉し、２）２つのＤＮＡ末端をまとめる分子ブリッジが形成され、そして３）切断された分子を再ライゲートする。そのような反応を実施するために、ほ乳類細胞におけるＮＨＥＪ機構は、２つのタンパク質複合体、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ（ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼの触媒サブユニット）と関連したヘテロ二量体Ｋｕ８０／Ｋｕ７０およびＤＮＡリガーゼＩＶとその補因子ＸＲＣＣ４（Ｘ線相補性チャイニーズハムスター遺伝子４）および多くのタンパク質因子、たとえばＡｒｔｅｍｉｓおよびＸＬＦ（ＸＲＣＣ４様因子；またはＣｅｒｎｕｎｎｏｓ）（Ｄｅｌａｃｏｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）を含む。ＮＨＥＪは、しばしば、誤りがちなＤＳＢ修復と見なされる。というのも、これは通常配列相同性を有さない２つの切断されたＤＮＡ末端を単につなぎ合わせ、小さな挿入および欠失を生じるからである（Ｍｏｏｒｅ  ａｎｄ  Ｈａｂｅｒ，  １９９６；  Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）。ＮＨＥＪは、細胞周期全体にわたってＤＳＢの修復のための機構を提供するが、有糸核分裂細胞のＧ０−Ｇ１および初期Ｓ期で特に重要である（Ｔａｋａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｄｅｌａｃｏｔｅ  ａｎｄ  Ｌｏｐｅｚ，  ２００８）。ＮＨＥＪによるＤＳＢの修復は、細菌からほ乳類までにおよぶ生物で観察され、進化の間で保存されていることを示す。
ＤＳＢ形成後、ＮＨＥＪ修復経路における重要なステップは、切断されたＤＮＡ末端の物理的並置である。ＮＨＥＪは、Ｋｕ７０／８０ヘテロ二量体タンパク質複合体の切断されたＤＮＡ分子の両端への会合により開始され、末端を捕捉し、つなぎ、他のＮＨＥＪの重要な因子のアセンブリのための足場を作製する。ＤＮＡ結合Ｋｕヘテロ二量体複合体は、ＤＮＡ−ＰＫｃｓをＤＳＢ（ＰＩＫＫ（タンパク質キナーゼのホスホイノシチド３−キナーゼ様ファミリー）に属する４６０ｋＤａタンパク質）へ動員し（Ｇｏｔｔｌｉｅｂ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ，  １９９３）、そのセリン／トレオニンキナーゼ機能を活性化する（Ｙａｎｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。２つのＤＮＡ−ＰＫｃｓ分子はＤＳＢ全体にわたって相互作用し、かくして切断されたＤＮＡ両端間で分子ブリッジを形成し、そしてそれらの分解を阻害する（ＤｅＦａｚｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。次に、ＤＮＡ末端を直接ライゲートすることができるが、ＤＳＢから生じる末端のほとんどは、ライゲーション前に適切に処理されなければならない（Ｎｉｋｊｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。切断の性質に応じて、ギャップを埋め、損傷を受けたＤＮＡまたは切断の周りに二次構造を除去することによって適合性のオーバーハングを生成させるために、プロセッシング酵素の種々の組み合わせの作用が必要であり得る。ＮＨＥＪプロセスにおけるこのステップは、ＮＨＥＪ修復に関連するヌクレオチドの偶発的損失の原因となると考えられる。ほ乳類ＮＨＥＪにおける１つの重要な末端プロセッシング酵素は、酵素のメタロ−β−ラクタマーゼスーパーファミリーのメンバーであるＡｒｔｅｍｉｓであり、これは、ほとんどの放射線感受性重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）患者において突然変異遺伝子として見いだされた（Ｍｏｓｈｏｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。Ａｒｔｅｍｉｓは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性と、ＤＮＡ含有ｄｓ−ｓｓ転移およびＤＮＡヘアピンに対するＤＮＡ−ＰＫｃｓ依存性エンドヌクレアーゼ活性との両方を有する（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。その活性はまた、ＡＴＭによって調節される。したがって、Ａｒｔｅｍｉｓは、複数のＤＮＡ−損傷応答に関与する可能性が高いようである。しかし、ＤＳＢ修復における主な欠陥はＡｒｔｅｍｉｓ欠損細胞では観察されなかったので、ＤＮＡ病巣のサブセットのみがＡｒｔｅｍｉｓによって修復されるようである（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ｄａｒｒｏｕｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。
修復を可能にするためにはＤＮＡギャップを埋めなければならない。ヌクレオチドのＤＳＢへの付加は、ポリメラーゼμおよびλに限定される（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４；  Ｃａｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。ＸＲＣＣ４との相互作用により、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）もＤＮＡ末端へ動員され、ＤＮＡ重合およびライゲーションの両方が可能になる（Ｋｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。最後に、ＮＨＥＪは、ＸＲＣＣ４、ＤＮＡリガーゼＩＶおよびＸＬＦを含む複合体により実施されるステップである、ＤＮＡ末端のライゲーションにより完成する（Ｇｒａｗｕｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。他のリガーゼは、ＤＮＡリガーゼＩＶを部分的に置換することができる。なぜなら、ＮＨＥＪはＸＲＣＣ４およびリガーゼＩＶの非存在下で起こり得るからである（Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。さらに、研究により、ＸＲＣＣ４およびリガーゼＩＶはＮＨＥＪの外側では役に立たず、一方、対照的に、ＫＵは転写、アポトーシス、および微環境に対する反応などの他のプロセスで作用することが示された（Ｍｏｎｆｅｒｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４；  Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５；  Ｄｏｗｎｓ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ，  ２００４）。
当業者には容易に理解されるように、ＮＨＥＪを減少または停止させる、上述したタンパク質（例えば、ヘテロ二量体Ｋｕ８０／Ｋｕ７０、ＤＮＡ−ＰＫｃｓであるが、特にＤＮＡリガーゼＩＶ、ＸＲＣＣ４、ＡｒｔｅｍｉｓおよびＸＬＦ（ＸＲＣＣ４様因子；またはＣｅｒｎｕｎｎｏｓ）、ＰＩＫＫ（タンパク質キナーゼのホスホイノシチド３−キナーゼ様ファミリー）の遺伝子のうちの１つでまたはその付近での任意の突然変異は本発明の範囲内に含まれる。同様に、前記経路のうちのいずれか１つに対して作用して、これを減少または停止させる任意のタンパク質またはトランスジェニック配列は本発明の範囲内に含まれる。
【００９０】
ＨＲ：基本的機構
相同性組換え（ＨＲ）は非常に正確な修復機構である。相同性染色分体は切断された鎖の修復のためのテンプレートとしての役目を果たす。ＨＲは、姉妹染色分体が利用可能である場合、細胞周期のＳおよびＧ２期中で起こる。古典的ＨＲは主に３つのステップ：１）切断された末端の５’の切除、２）ストランド侵入および相同性ＤＮＡ二重鎖との交換、ならびに３）組換え中間体の分割によって特徴付けられる。異なる経路は、ストランド侵入を実施する能力に依存してＤＳＢ修復を完成することができ、合成依存性ストランドアニーリング（ＳＤＳＡ）経路、古典的二本鎖切断修復（ＤＳＢＲ）（Ｓｚｏｓｔａｋ  ｅｔ  ａｌ，  １９８３）、切断により誘発される複製（ＢＩＲ）、および、あるいは、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）経路を含む。すべてのＨＲ機構は、相互接続し、多くの酵素ステップを共有する。
すべてのＨＲ反応の第１ステップは、ＭＲＮ複合体（ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＮＢＮ（以前はＮＢＳ１、ナイミーヘン染色体不安定症候群１について、））およびＣｔＩＰ（ＣｔＢＰ相互作用タンパク質）の助けを借りたヌクレアーゼによる５’末端切断ＤＮＡストランドの切除である（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１；  Ｗｈｉｔｅ  ａｎｄ  Ｈａｂｅｒ，  １９９０）。結果としての３’一本鎖ＤＳＢの生成は、相同性配列を検索することができる。相同性二重鎖の侵入は、ＲＡＤ５１リコンビナーゼタンパク質でコーティングされた３’ｓｓ−ＤＮＡで構成されるヌクレオフィラメントによって実施される（Ｂｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）。真核生物においてｓｓＤＮＡに関連したＤＮＡ代謝プロセスに関与するヘテロ三量体ｓｓＤＮＡ結合ンパク質である複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ）（Ｗｏｌｄ，  １９９７）の要件は、ＲＡＤ５１フィラメントのアセンブリに必要である（Ｓｏｎｇ  ａｎｄ  ｓｕｎｇ，  ２０００）。次いで、ＲＡＤ５１は環状構造を有するＲＡＤ５２と相互作用し（Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）、ＲＰＡ分子を置換し、ＲＡＤ５１ローディングを促進する（Ｓｏｎｇ  ａｎｄ  ｓｕｎｇ，  ２０００）。Ｒａｄ５２は、酵母における組換えプロセスに重要である（Ｓｙｍｉｎｇｔｏｎ，  ２００２）。しかし、脊椎動物では、ＲＡＤ５２ではなくはむしろＢＲＣＡ２（乳ガン２型感受性タンパク質）がストランド侵入および交換で重要な役割を果たすようである（Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ，  ２００７；  Ｅｓａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。ＲＡＤ５１／ＲＡＤ５２相互作用は、ＲＡＤ５４の結合により安定化される。ＲＡＤ５４は、Ｄループ形成後の組換え中間体の成熟においても役割を果たす（Ｂｕｇｒｅｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。他方で、ＢＲＣＡ１（乳ガン１）はＢＡＲＤ１（ＢＲＣＡ１関連ＲＩＮＧドメイン１）およびＢＡＣＨ１（ＢＴＢおよびＣＮＣ相同性１）と相互作用して、それぞれ、リガーゼおよびヘリカーゼＤＳＢ修復活性を発揮する（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。ＢＲＣＡ１はまた、ＣＤＫに依存した方法でＣｔＩＰと相互作用し、そしてＤＮＡ損傷に反応してユビキチン化を受ける（Ｌｉｍｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。結果として、ＢＲＣＡ１、ＣｔＩＰおよびＭＲＮ複合体は、細胞周期のＳおよびＧ２期におけるＤＮＡのＨＲ介在性修復の活性化において役割を果たす。
ヌクレオフィラメントの侵入の結果、置換ループ（Ｄループ）と呼ばれるヘテロ二重鎖が形成され、侵入型ストランドによる二重鎖のうちの１本のストランドの置換および他のストランドとの対合を含む。次いで、いくつかのＨＲ経路はテンプレートとして相同性配列を用いて修復を完成して、ＤＳＢを取り巻く配列を置換することができる。使用される機構に応じて、相同性テンプレートと切断されたＤＮＡ分子との間の相互交換（クロスオーバー）は、ＨＲ修復と関連し得るか、または関連し得ない。クロスオーバーは、重要な遺伝的影響、たとえばゲノム再配列またはヘテロ接合の損失を有し得る。
当業者には容易に理解されるように、ＨＲを増強する、上述したタンパク質の遺伝子の１つでまたはその周りの任意の突然変異の１つでまたはその周りの任意の突然変異（例えば、ＭＲＮ複合体（ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＮＢＮ（以前はＮＢＳ１ナイミーヘン染色体不安定症候群１について）のタンパク質）およびＣｔＩＰ（ＣｔＢＰ相互作用タンパク質）、ＲＡＤ５１、複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ）、Ｒａｄ５２、ＢＲＣＡ２（乳ガン２型感受性タンパク質）、ＲＡＤ５４、ＢＲＣＡ１（乳ガン１）はＢＡＲＤ１（ＢＲＣＡ１関連ＲＩＮＧドメイン１）、ＢＡＣＨ１（ＢＴＢおよびＣＮＣ相同性１）と相互作用する）は、本発明の範囲内に含まれる。同様に、前記経路のうちの１つに対して作用して、これを向上させる任意のタンパク質またはトランスジェニック配列は本発明の範囲内に含まれる。
【００９１】
ＤＮＡ  ＤＳＢ修復経路間の選択
ＮＨＥＪおよびＨＲは、２つの主な真核生物ＤＳＢ修復経路のようである。それにもかかわらず、それらの間のバランスは、種間で非常に異なる。脊椎動物細胞は、酵母よりも頻繁にＮＨＥＪを使用する。１つの解釈は、高等真核生物ゲノムの複雑さのために、ＨＲに必要な相同性の検索がさらに困難になるということである。加えて、高レベルの反復は、異所性組換えの場合に遺伝的安定性にとって危険であり得る。あるいは、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ、ＢＲＣＡ１およびＡｒｔｅｍｉｓなどのいくつかの因子が脊椎動物で見いだされるが、酵母では見いだされない。
ほ乳類では、ＮＨＥＪおよびＨＲは競合的方法および協調的方法の両方で機能することが知られており、齧歯類細胞およびヒトガン細胞系に関する研究は、ＮＨＥＪとＨＲ経路との間の選択が細胞周期段階に依存することを証明した。ＮＨＥＪは細胞周期全体にわたってＤＳＢ修復のための機構を提供するが、有糸核分裂細胞のＧ０−Ｇ１および初期Ｓ期で特に重要であり（Ｔａｋａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｄｅｌａｃｏｔｅ  ａｎｄ  Ｌｏｐｅｚ，  ２００８）、一方、ＨＲは、後期Ｓ／Ｇ２期において活性である。調節された発現および修復タンパク質のリン酸化、修復因子についてのクロマチンアクセシビリティー、および相同性修復テンプレートの利用可能性をはじめとするいくつかの因子も、両経路間の選択の調節に重要である。
ＨＲ効率を調節する重要な因子は、テンプレート利用可能性である。したがって、姉妹染色分体が利用可能である場合、細胞周期のＳおよびＧ２期中に細胞がＨＲを上方調節することは意外ではない。なぜなら、これらはＨＲにとって好ましいテンプレートであるからである（Ｄｒｏｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。この選好は、これらがＳ期で形成される時から後期で分離するまで、姉妹染色分体間の近接性の効果により説明することができる。しかし、相同性テンプレートの存在は、ＨＲ適格性に十分ではない。細胞がＧ１からＳ／Ｇ２へと推移する際のＮＨＥＪからＨＲへのシフトが積極的に調節されることを示す証拠が増えている。
実際、ＨＲは、ほ乳類細胞におけるＣＤＫに依存した細胞周期制御によって厳しく調節される。ＢＲＣＡ２のセリン３２９１のＣＤＫが介在するリン酸化は、Ｍおよび初期Ｇ１期でのＲＡＤ５１とのその相互作用をブロックすることが示されている。このリン酸化は、これによりＨＲが下方調節される機構の１つである（Ｅｓａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。さらに、ＨＲとＮＨＥＪとの間の基本的な相違は、ＨＲが介在する修復は、相同性検索およびストランド侵入のためにＤＮＡ切除（約１００〜２００ヌクレオチド）を必要とすることである（Ｓｕｎｇ  ａｎｄ  Ｋｌｅｉｎ，  ２００６）。ＤＮＡ５’−末端切除が、ＨＲを開始し、ＮＨＥＪのさらなる可能性を阻害することによりＤＳＢ修復の選択に貢献する重要なステップであることは、現在明らかである。切除はＣＤＫ１活性に依存する。興味深いことに、ＣＤＫ１をブロックすることは、ＤＳＢ部位でのＭＲＥ１の存続につながり、このことは、ＣＤＫ１活性が、切断された末端へのＭＲＮ動員のためではなく、むしろ末端切除の調節のために必要であることを示唆する（Ｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。最後に、ＲＡＤ５１およびＲＡＤ５２発現は、Ｓ期中に増加し、ＨＲ活性化に貢献する（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。対照的に、ＮＨＥＪは、Ｓ期でのＤＮＡ−ＰＫ活性の減少によって下方調節される（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。
【００９２】
ＨＲ／ＮＨＥＪ界面でのタンパク質
修復経路間の選択の調節は、両修復経路で作用する早期作用型タンパク質によって制御することができる。ＭＲＮ複合体およびＡＴＭはこれらに含まれ、それらのメディエーターおよびトランスデューサータンパク質とともに、任意のＤＮＡ損傷を感知し、シグナルを送る効率的なネットワークを形成する。このネットワークは、損傷後、非常に急速に機能し始め、タスクが完了するとすぐにスイッチオフになる。
ＭＲＮ複合体は、ＨＲ、ＮＨＥＪ、ＤＮＡ複製、テロメア維持などのＤＮＡ修復機構および細胞周期チェックポイントへのシグナリングに関与する（Ｄ’Ａｍｏｕｒｓ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ，  ２００２；  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。ＤＮＡ損傷修復における第１ステップは、ＭＲＥ１のＤＮＡ結合モチーフを介した、ＤＳＢの切断された末端とのヘテロ四量体（Ｍ２Ｒ２）としてのＭＲＮ複合体の会合である（ｄｅ  Ｊａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。この結合は、ＲＡＤ５０  ＷａｌｋｅｒＡおよびＢモチーフを有する球状ドメインとして配置され、ＤＮＡ分子を架橋する。
ＭＲＮ複合体はしたがって、ＤＳＢの第１センサーであり、２つのステップによりＡＴＭを活性化する（Ｍｉｒｚｏｅｖａ  ａｎｄ  Ｐｅｔｒｉｎｉ，  ２００３；  Ｌａｖｉｎ  ２００７）。まず、これは、ＤＮＡ末端の局所濃度を、ＡＴＭモノマー化を引き起こすレベルまで増加させる。次いで、ＡＴＭに対するＮＢＮ結合は、これを活性なコンフォメーションに変換する（Ｄｕｐｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。一旦活性化されると、ＡＴＭはＤＳＢシグナリングにおいて中心的役割を果たし、種々のタンパク質標的をリン酸化する。例えば、ＡＴＭは、ｐ５３中間体の作用により細胞周期停止を誘発する（Ｃａｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｗａｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。他の基質、たとえばＮＢＳ、ＭＲＥ１、ＢＲＣＡ１、ＣＨＫ２、ＦＡＮＣＤ２、ＡｒｔｅｍｉｓおよびＤＮＡ−ＰＫｃｓは活性化ＡＴＭキナーゼによりリン酸化され、ＤＮＡ修復、細胞周期制御、および転写に関与することにより、細胞の運命を決定するために重要である。ＭＲＮ複合体およびＡＴＭは、ＤＳＢの認識およびシグナリングにおいて相互依存している（Ｌａｖｉｎ，  ２００７）。
Ｃ末端Ｓ１３９残基でのＡＴＭによるＨ２Ａの急速なリン酸化もＤＳＢに反応して観察される（Ｂｕｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１；  Ｓｔｉｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。リン酸化されたＨ２ＡＸ（γＨ２ＡＸ）は数秒でＤＳＢを取り巻くメガ塩基対領域上で見出され、いくつかのタンパク質のドッキング部位としての役割を果たすことにより、ＤＮＡ損傷シグナル変換として機能する（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。
ＭＲＥ１１のヌクレアーゼ活性は、ＲＰＡの結合部位である３’−ｓｓＤＮＡ（Ｗｈｉｔｅ  ａｎｄ  Ｈａｂｅｒ，  １９９９０）を処理することにより、ほ乳類細胞においてＣｔＩＰと協同して一本鎖ＤＮＡの生成を調節することが判明している（Ｌｉｍｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｓａｒｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。ＲＰＡ−ｓｓＤＮＡ複合体は、任意のさらなるヌクレアーゼ活性を阻害し、修復機構の作用部位を提供する（Ｓｕｇｉｙｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７；  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。相同性配列の存在、タンパク質調節および切除の大きさに応じて、この後にＨＲＡ−ＮＨＥＪのいずれかが続く（Ｒａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。
ＣｔＩＰは最初に転写リプレッサーＣｔＢＰ（カルボキシ末端結合タンパク質）および網膜芽細胞腫タンパク質およびＢＲＣＡ１などの細胞周期レギュレーター（Ｆｕｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｓｃｈａｅｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）に対するその結合のコファクターとして特性化された。ＣｔＩＰは、細胞周期の進行において転写依存性および独立性の両方の関与をすることが知られている（Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，  ２００６；  Ｗｕ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，  ２００６）。ＤＮＡ  ＤＳＢに対する細胞周期チェックポイント反応におけるその中心的役割に加えて、最近の研究では、ＣｔＩＰは、ＤＢＳ末端切除を開始することによりＨＲによるＤＳＢ損傷を修復する決定を制御することが示唆された（Ｓａｒｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｙｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。加えて、これは、Ｇ１期中のＭＭＥＪに必要なＤＳＢ末端の制限された切除に関与する可能性もある（Ｙｕｎ  ａｎｄ  Ｈｉｏｍ，  ２００９）。したがって、ＣｔＩＰは、細胞周期制御、ＤＮＡ損傷チェックポイントおよび修復を関連付ける。ＭＲＮ複合体もＤＳＢ末端切除に必要であるので、ＣｔＩＰは、ＭＲＮ複合体とＢＲＣＡ１との間の物理的接続を提供する可能性が高い（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，  ２００９；  Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。
ＤＮＡ修復に関与するこれらの遺伝子のいずれかにおける突然変異は、ＭＲＥ１１、ＮＢＳ、およびＲＡＤ５０における突然変異について、それぞれ毛細血管拡張性運動失調様障害（ＡＴＬＤ）（Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９；  Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）、ナイミーヘン染色体不安定症候群（ＮＢＳ）およびナイミーヘン染色体不安定症候群の変異形（Ｂｅｎｄｉｘ−Ｗａｌｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）などのゲノム不安定性症候群に至る。加えて、無発現変異は、マウスにおいて胚性致死に至る（Ｘｉａｏ  ａｎｄ  Ｗｅａｖｅｒ  １９９７；  Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９；  Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。ＡＴＭまたはＡＴＲ遺伝子における他の突然変異は、それぞれ、毛細血管拡張性運動失調（Ａ−Ｔ）またはゼッケル症候群（ＳＣＫＬ１）などのゲノム不安定性症候群を引き起こす（Ｏ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。Ａｒｔｅｍｉｓ欠乏症（Ｍｏｓｈｏｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）、ＤＮＡリガーゼＩＶ欠乏症（ＬｉｇＩＶ）（Ｏ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）、Ｃｅｒｎｕｎｎｏｓ−ＸＬＦ（ＸＲＣＣ４様因子）欠乏症（Ｂｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）、ブルーム症候群（ＢＳ）、ウェルナー症候群（ＷＳ）、およびファンコニ貧血（ＦＡ）は、ＤＮＡ損傷修復機構の他のメンバーと関連する（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  ａｎｄ  Ｄ’Ａｎｄｒｅａ，  ２００６）。さらに、ゲノム不安定性障害に加えて、そのような症候群の患者は、様々な種類の悪性疾患を患っていることが多く、修復されていないＤＮＡ損傷とガン発症との間の関連を示す。ＤＮＡ修復に関与する遺伝子は、したがって、腫瘍予防において重要な役割を果たす。
【００９３】
当業者には容易に理解されるように、修復経路間の選択をＨＲへとシフトされることにより、ＨＲを増強、ＮＨＥＪを減少、および／またはＨＲ／ＮＨＥＪ比を増強する上述した遺伝子のうちの１つまたはその周りでの任意の突然変異は、本発明の範囲内に含まれる。同様に、前記経路のいずれか１つに対し作用して、ＨＲを増強、ＮＨＥＪを減少、および／またはＨＲ／ＮＨＥＪ比を増強する任意のタンパク質またはトランスジェニック配列は、本発明の範囲内に含まれる。
【００９４】
非霊長類真核生物宿主細胞における導入遺伝子発現産物の増強された分泌
トランスフェクトされた細胞集団には、一般的に、相当量の導入遺伝子発現産物（１０〜１００および１００〜１０００超を示す中または高プロデューサークローン／細胞（それぞれ相対的光単位（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔ）（ＲＬＵ））を産生する少量の細胞および導入遺伝子発現産物をほとんど産生しない細胞（たとえば１０ＲＬＵ未満を示す低プロデューサークローン／細胞）がある。しかし、場合によっては、特定の導入遺伝子から高プロデューサークローン／細胞を得ることができない。導入遺伝子発現におけるこの相違は産物特異性であり、ある「発現しにくい」タンパク質があることを示すことができた。そのような発現しにくいタンパク質の低プロデューサー細胞、程度は少ないがたとえば発現しやすいタンパク質の中および高プロデューサー細胞も、特に前駆体タンパク質の細胞内沈着および潜在的なポリペプチド架橋を示し、したがって、最終産物のプロセッシング、フォールディングおよび／またはアセンブリにおける問題の可能性も示した。
本明細書中に提示するさらなるデータは、特にＥＲ転位およびプロセッシングにおけるタンパク質分泌の問題も示唆した。タンパク質分泌経路の成分を発現することによりタンパク質分泌を増大させる以前の試みは成功していないが（Ｌａｋｋａｒａｊｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）、ＣＨＯ細胞などの非霊長類細胞およびトランスジェニック配列、特にそのような成分をコード化する霊長類、たとえばヒト配列の組み合わせは、低プロデューサー細胞だけでなく、高プロデューサー細胞においても分泌の改善をもたらした。試験した成分のうち、特定のものおよび特定の組み合わせが特に好ましい結果をもたらした。たとえば、ＳＲＰ１４は、試験に成功したタンパク質のうちの１つであった。新生ポリペプチドがＳＲＰ５４の助けを借りて利用可能なＳＲを見つけるまでは、延長を停止することが必要である可能性がある。トランスロコン（Ｔｒａｎｓｌ）とのさらなる組み合わせが特に高い分泌をもたらしたので、転位が起こるためには、結果として得られる複合体をＴｒａｎｓｌと会合させる必要があり得、それ自体は小胞体中のシグナルペプチドの除去をもたらし、適切に処理され、組み立てられたタンパク質の分泌をもたらす。しかし、当業者には容易に理解されるように、他の成分のトランスジェニック配列の導入およびそのような配列の組み合わせは、本発明の範囲内に含まれる。本明細書中の他の箇所のタンパク質分泌経路の説明について特に参照される。
本明細書中で、転位という用語は、小胞体の膜を越えた輸送を指すために主に用いられる。しかし、この用語は、多くの場合、文献ではさらに一般的な概念を指すために使用されると認められるべきである。
【００９５】
タンパク質分泌経路
タンパク質の分泌は、３つの界全ての生物に共通のプロセスである。この複雑な分泌経路は、特に、細胞の原形質膜を越えたサイトゾルからのタンパク質転位を必要とする。タンパク質がその最終目的地に到達するためには、複数のステップおよび様々な因子が必要である。ほ乳類細胞では、この分泌経路は、２つの主な高分子アセンブリ、つまりシグナル認識粒子（ＳＲＰ）および分泌複合体（Ｓｅｃ複合体またはトランスロコン）を含む。ＳＲＰは、９、１４、１９、５４、６８および７２ｋＤａの質量を有する６つのタンパク質および７Ｓ  ＲＮＡから構成され（Ｋｅｅｎａｎ，  Ｆｒｅｙｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１）、トランスロコンは、Ｓｅｃ６１αβγ、Ｓｅｃ６２およびＳｅｃ６３から構成されるドーナッツ形粒子である。
【００９６】
タンパク質分泌における第１ステップは、シグナルペプチドに依存し、これは、膜を越えた、小胞体（ＥＲ）の内腔中への新生タンパク質の転位に介在するポリペプチドのアミノ末端で特定のペプチド配列を含む。このステップの間、主な翻訳リボソームから現れるシグナルペプチドは、シグナルペプチドを認識するＳＲＰ粒子のサブユニット、すなわち、ＳＲＰ５４と相互作用する。シグナルペプチドに結合するＳＲＰは、新生ポリペプチドのさらなる伸長をブロックし、その結果、翻訳停止となる。ＳＲＰ９およびＳＲＰ１４タンパク質は、伸長停止に必要である（Ｗａｌｔｅｒ  ａｎｄ  Ｂｌｏｂｅｌ  １９８１）。第２のステップで、リボソーム−新生ポリペプチド−ＳＲＰ複合体を、ＳＲＰ５４のＳＲＰ受容体（ＳＲ）との相互作用によりＥＲ膜にドッキングさせる（Ｇｉｌｍｏｒｅ，  Ｂｌｏｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  １９８２；  Ｐｏｏｌ，  Ｓｔｕｍｍ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２）。ＳＲは、ＧＴＰａｓｅ活性を示す２つのタンパク質、ＳＲαおよびＳＲβを含むヘテロ二量体複合体である（Ｇｉｌｍｏｒｅ，  Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９８２）。ＳＲのＳＲＰ５４との相互作用は、ＧＴＰの結合に依存する（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，  Ｒａｐｉｅｊｋｏ  ｅｔ  ａｌ．  １９９１）。ＳＲは、リボソーム−新生ポリペプチド複合体からのＳＲＰの放出およびリボソームの出口部位のＳｅｃ６１複合体（トランスロコン）との会合を調整する。成長しつつある新生ポリペプチドは、トランスロコンチャンネルを通ってＥＲに侵入し、翻訳がその通常の速度で再開する。リボソームは、翻訳が完了するまで、トランスコロンの細胞質表面上に結合したままである。リボソームに加えて、トランスロコンは、細胞質表面上のリボホリンならびにカルレティキュリンおよびカルネキシンなどのシャペロン、ならびに内腔面上のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）およびオリゴサッカリルトランスフェラーゼと密接に関連している。成長する新生ポリペプチドがＥＲの内腔中につきだした後、シグナルペプチドは、シグナルペプチダーゼと呼ばれる酵素によりプレタンパク質から切断され、それにより成熟タンパク質をＥＲ中に放出する。翻訳後修飾、正しいフォールディングおよび多量体化後に、タンパク質はＥＲを出て、ゴルジ装置へ、次いで分泌小胞へと移動する。分泌小胞の原形質膜との融合により、ベシクルの内容物は細胞外環境中に放出される。
【００９７】
注目すべきことに、分泌されたタンパク質は、細胞膜を越えるそれら自身の転位に非常に適した特定のシグナル配列を有するように進化した。異なるシグナルペプチドとして見いだされる種々の配列は、独特の方法で分泌装置と相互作用する可能性がある。シグナル配列は、主に、疎水性であり、この特性は新生ペプチドを分泌タンパク質へと向かわせることに関与し得る。アミノ酸の疎水性ストレッチに加えて、多くの一般的な配列の特性は、ほとんどのほ乳類分泌シグナルによって共有される。異なるシグナルペプチドは異種タンパク質を分泌させる効率が異なるが、異種組換えタンパク質を分泌させるために用いることができるいくつかの分泌シグナルペプチド（すなわち、インターロイキンシグナル配列、免疫グロブリンシグナル配列、組織適合性受容体シグナル配列などの分泌シグナルペプチド）が特定されている。類似点にもかかわらず、これらの配列は、発現しにくいいくつかのタンパク質の効率的な分泌を促進するために最適でない。なぜなら、自然のシグナルペプチドは自然の状況から離れて正しく機能することができないからであるか、または宿主細胞もしくは分泌プロセスに関連する相違のためである。異種タンパク質の効率的な分泌に適切なシグナル配列の選択は、切断されたシグナルペプチド内の配列と成熟タンパク質の他の部分との相互作用によってさらに複雑になる可能性がある（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，  Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９３）。
【００９８】
図面の詳述
繰り返しトランスフェクションの導入遺伝子発現に対する効果
あるヒトＭＡＲ、たとえばＭＡＲ１−６８は、プロモーター／エンハンサー配列の上流に挿入された場合、培養された細胞ならびにマウスにおける遺伝子発現を強力に増大させ、そして安定化させることが判明している（Ｇｉｒｏｄ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７，  Ｇａｌｂｅｔｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９）。
ＭＡＲおよび連続したトランスフェクションの遺伝子導入および発現に対する効果の分析を図１に示す。図１（Ａ）は、ＧＦＰ発現細胞のポリクローン集団における蛍光分布を表す。ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞をＭＡＲエレメントがないＧＦＰ発現ベクター（ＧＦＰ、左のプロフィール）、またはＭＡＲ１−６８を含むベクター（ＭＡＲ１−６８ＧＦＰ、左から２番目のプロフィール）、およびピューロマイシンに対する耐性を媒介するｐＳＶｐｕｒｏプラスミドでコトランスフェクトした。これらの細胞のうちのいくつかを同じであるが、選択プラスミド媒介ネオマイシン耐性を有するＧＦＰ発現ベクターで、第１トランスフェクションの翌日（右のプロフィール）またはピューロマイシン耐性についての２週間の選択後（右から２番目のプロフィール）のいずれかで第２のトランスフェクションに付した。ピューロマイシンおよび／またはネオマイシン耐性についての２週間の選択後、ｅＧＦＰ蛍光を細胞蛍光測定により定量化した。示したプロフィールは、４つの独立した実験の代表例である。図１（Ｂ）において、ヒストグラムは、パネルＡで示すような安定な細胞プールの分析から測定した場合、１０相対的光単位（ＲＬＵ）未満を示す非／低エクスプレッサー（ｅｘｐｒｅｓｓｏｒ）に相当する全細胞のパーセンテージ、または中および高（＞１００ＲＬＵ）もしくは非常に高い（＞１０００ＲＬＵ）ＧＦＰ蛍光を示す細胞のパーセンテージを示す。図１（Ｃ）において、それぞれの安定なポリクローン細胞プールの平均ＧＦＰ蛍光をＭＡＲＧＦＰのトランスフェクションから得られたものに対して正規化し、４回の独立したトランスフェクションの平均および標準偏差をＭＡＲの非存在下での１回のトランスフェクションによって得られる蛍光からの増加（倍）として示す。星印は、ＧＦＰ発現における有意差（スチューデントｔ検定、Ｐ＜０．０５）を示す。図１（Ｄ）は、ヒトＭＡＲの存在下または非存在下で１回または２回トランスフェクトした細胞におけるｅＧＦＰ導入遺伝子染色体組み込み部位のＦＩＳＨ分析の結果を表す。安定な細胞プールの中期染色体の広がりを、ＭＡＲのないＧＦＰプラスミドでハイブリダイズし、そして結果の代表的な図を示す。図１（Ｅ）は染色体の拡大図であり、蛍光強度の違いを示す。
この図は、ＧＦＰ発現ベクターおよび抗生物質耐性プラスミドのコトランスフェクションと、それに続いて、それらのゲノム中に安定に組み込まれた導入遺伝子を有する細胞の抗生物質選択により、典型的には、フローサイトメトリーにより分析した場合、ポリクローン細胞集団において蛍光の二峰性分布が得られることを示す（図１Ａ）。この実験設定でＹ軸に重なる第１細胞亜集団は、検出不可能なレベルでＧＦＰを発現する細胞に相当し、一方、細胞の別の亜集団は、著しいＧＦＰレベルを発現する。ＭＡＲ１−６８を含めることにより、蛍光細胞からの発現レベルが増加し、付随してサイレント細胞の割合が減少した（１５％対３６％、図１Ｂ）。
同じＧＦＰ発現ベクターを２週間後に異なった抗生物質耐性遺伝子でコトランスフェクトした場合、蛍光の２．４倍の増加が平均して第２の抗生物質に対する耐性について選択した後に観察され、これは予想される２倍の増加に近い（図１Ａおよび１Ｃ）。対照的に、ＧＦＰ発現の予想外に高い（４〜５倍）の増加が、連日行った２回の連続したトランスフェクションとそれに続く両抗生物質での選択から観察された。平均して、ポリクローン集団の全ての細胞にわたって、ＭＡＲのないシングルトランスフェクションに対して、ＭＡＲ含有プラスミドの連続したトランスフェクションにより発現の２０倍の増加が得られた（図１Ｃ）。さらに、一部の細胞は、非常に高い発現レベルを示し、サイレント細胞の発生はポリクローン集団からほぼ完全に抑止された（０．５％、図１Ｂ）。ＭＡＲのない連続したトランスフェクションにより中程度のＧＦＰ発現が生じ、その結果、シングルトランスフェクションと比較した場合、全体的な蛍光レベルが３．２倍増加したが、サイレント細胞の発生を抑止しなかった（図１Ｃ、データは不掲載）。したがって、ＭＡＲの存在および繰り返しトランスフェクションは相乗的に作用して、向上した発現レベルをもたらす。
全体として、ＭＡＲ含有プラスミドの２回の連続した（第１および後続）トランスフェクションから得られる発現レベルは非常に高いので、ＵＶ照射をしなくても、太陽光で細胞培養単層からＧＦＰ蛍光を容易に見ることができた（図１Ｆ、太陽光で細胞単層の可視ＧＦＰ蛍光によりＭＡＲ−ＧＦＰベクターで２回トランスフェクトされた安定なポリクローン細胞プールから得られるＧＦＰ発現レベルを示す）。ＣＭＶプロモーターおよびＤｓＲｅｄレポーター遺伝子を有するプラスミドで同様の結果が得られ、治療用免疫グロブリンの非常に高い発現も連続したトランスフェクションで得られたので（データは不掲載）、この効果は、この研究で使用したＧＦＰ導入遺伝子またはＳＶ４０プロモーターに限定されるものではなく、図１Ｇは、導入遺伝子発現と細胞分裂サイクルの期間との間の関係を示す。ＳＶ４０プロモーターの上流にヒトＭＡＲ１−６８ならびに軽および重鎖のそれぞれを含む免疫グロブリンＧ発現ベクターを抗生物質耐性プラスミドでコトランスフェクトし、そして抗生物質耐性細胞を３週間選択した。モノクローン細胞集団を２ラウンドの限界希釈により単離し、分泌されたＩｇＧ量および平均細胞分裂時間を測定した。四角および三角は、それぞれ１回または２回のトランスフェクション後に得られたクローンを表す）。興味深いことに、モノクローンＣＨＯ細胞クローンにより発現された免疫グロブリンの非常に高いレベルは、多くの場合、細胞分裂時間の増加と相関していた。このことは、タンパク質合成に関してそれらの生理学的限界に達していた可能性が高いことを示す。それら自身の細胞タンパク質（約１００ｐｇ／細胞）と比較した場合、細胞は同様の量の組換えタンパク質を合成していたので、このことを予想することができる。これは、各細胞分裂で必要なエネルギーインプットを２倍にするはずである。それにもかかわらず、かなりにクローンは、細胞分裂を有意に減速させなかったので、自身の代謝を妨害することなく非常に高レベルで異種タンパク質を発現することが見出された（図１Ｇ）。
【００９９】
繰り返しトランスフェクションによる導入遺伝子の共組み込み
繰り返しトランスフェクションにより発現を引き起こす重要なパラメータは、トランスフェクション間の時間間隔であることが判明した。２回のトランスフェクションが２つの独立した、したがって付加的事象として挙動する場合、２週間後に細胞を再トランスフェクトすると、発現に対する相乗効果は観察されなかった（図１Ｃ）。このことは、各トランスフェクションのＤＮＡが核内で染色体外エピソームとして相互作用しなければならない可能性があり、細胞ゲノム中に組み込まれる前に混合コンカテマーを形成する可能性があることを示唆する。これを、安定なポリクローン集団からの中期染色体スプレッドの蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析によって評価した。ＭＡＲエレメントを用いるか、または用いないかのいずれかで１回トランスフェクトした８０の個々のＭ期細胞を、ＭＡＲを含まないＧＦＰプラスミドからなるプローブとハイブリダイズした。１つの組み込み部位が観察されたが、ＭＡＲでトランスフェクトされた細胞からさらに高い蛍光強度が観察された（図１ＤおよびＥ）。蛍光強度はダブルトランスフェクションプロセスにより更に増加し、このことは、さらに多数の導入遺伝子コピーが組み込まれたことを示唆する。１回または２回の連続したトランスフェクション後の全ての場合で独特の組み込み部位が見られた。しかし、１週間の間隔で２回トランスフェクトされた細胞の約半分で二重組み込み事象が観察され、この場合、染色体外エピソームＤＮＡは第１トランスフェクションからほとんど残留していないはずである。このことは、第１トランスフェクションからのＤＮＡ組み込みが、２回目のトランスフェクションが実施される前に完了している場合、独立した組み込み事象が起こり得ることを示す。分析した細胞はいずれも同じ組み込み部位を有さなかったので、ダブルトランスフェクションは検出可能な染色体再配列に至らなかったし、また検出可能な好ましい染色体座での挿入にも至らなかった。したがって、２つのトランスフェクションによる導入遺伝子組み込みは、ＭＡＲ含有プラスミドのシングルトランスフェクションについてすでに報告されているように（Ｇｉｒｏｄ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７）、任意の特定の染色体または染色体部位を目標とするようにされないようである。
【０１００】
高導入遺伝子発現ならびに細胞周期およびトランスフェクションのフェージング
トランスフェクション間のタイミングは高導入遺伝子発現に関与するようであるので、トランスフェクション間の時間間隔の体系的変化の効果を分析した。２回目のトランスフェクションを１回目の２１時間後に実施した場合、モデル細胞において、最高のＧＦＰ発現レベルが観察され、シングルトランスフェクションと比較して、一貫して蛍光の５倍の増加が得られた。
図２は、連続したトランスフェクション間の至適時期をどのようにして決定したかを表す。図２（Ａ）は、安定なポリクローン集団が、シングルトランスフェクション（−）によるか、または表示された時間間隔をあけたＭＡＲ−ＧＦＰ発現プラスミドの２回の連続したトランスフェクションによって生成したことを示す。２週間の選択後、全ポリクローン集団の平均ＧＦＰ発現を測定した。蛍光レベルを得られた最大値に対して正規化し、シングルトランスフェクションから得られる発現からの増加（倍）として表す（ここで、（ｎ）は独立したトランスフェクションの数に相当する）。星印は、ＧＦＰ発現における有意差（スチューデントｔ検定、Ｐ＜０．０５）を示す。図２（Ｂ）は、細胞周期の進行の分析を示す。第１および第２トランスフェクションの時点で、ＣＨＯ細胞を収集し、ヨウ化プロピジウムで染色し、蛍光を細胞蛍光測定により分析した。相対的ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）蛍光の分析は、細胞あたりのゲノムＤＮＡの量を表す。各細胞周期状態（Ｇ１、Ｓ、Ｇ２／Ｍ）に関連する集団のパーセンテージは表示されるとおりである。
結果は、２回目のトランスフェクションを１８時間、２４時間および２７時間後に実施した場合、シングルトランスフェクションに対して３〜３．５倍の発現の増加が得られたことを示す。しかし、この増加は、２１時間後に得られるものよりも有意に低かった（図２Ａ）。この期間は細胞通過後の細胞分裂サイクルの期間に近いので（図２ＣおよびＤ）、このことは、連続したトランスフェクションによる高い導入遺伝子発現が細胞分裂サイクルの特定の期と関連し得ることを示唆する。
分裂サイクルに沿って細胞の分布をＤＮＡのヨウ化プロピジウム染色によって測定した。この分析は、細胞通過の１８時間後のＧ１期の細胞の過剰出現を示し、そしてこれは、シングルトランスフェクションからの最高の発現を生じるタイミングに相当することが判明した（図２Ｂ、データは不掲載、および図２ＣおよびＤ、これらの図は細胞分裂サイクルを通しての細胞培養進行を示す。図２（Ｃ）は、細胞周期の進行の時間プロフィールを表す。ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞を、細胞周期分析のために、第１トランスフェクションの至適時期に相当する細胞通過の１８時間後から始めて２時間ごとに収集した。細胞を固定し、ＤＮＡをヨウ化プロピジウムで染色した後、１０，０００細胞の蛍光レベルを得た。図２（Ｄ）は、細胞周期期間の測定を示す。Ｇ１期の細胞のパーセンテージを、細胞を通過させた後２時間ごとに測定した。ブラケットは、２つの最大間のタイミングを示し、これを１サイクル期間（１４時間）と見なした。１８時間の延長された第１サイクルは、ｔ＝０での細胞通過のために不安定であり、遅延は、細胞が培養皿表面に付着するため、そして細胞分裂サイクル進行を再開するためにさらに４時間必要であるためである）。Ｇ１細胞の類似のパターンおよび過剰出現は、第１トランスフェクションの１２時間後（これもまた、第２のトランスフェクションにより最高レベルをもたらすタイミングに相当する）に得られた。発現が実際に細胞周期フェージングに関連する場合、導入遺伝子発現の別の最適値は、２回目のトランスフェクションを２細胞分裂に相当する間隔で実施する場合に観察されるはずである。４２時間後、発現が１つのトランスフェクションについて得られるものと類似していたので、２つのトランスフェクションの相乗効果は失われた。しかし、導入遺伝子発現の第２の、さらに低いが相乗的な増加が４８時間後に観察された。１８時間での第１トランスフェクションから、そして２１または４８時間間隔で実施された第２のトランスフェクションについて観察されるさらに高い発現レベルは、最適のＤＮＡ転移および／または発現が特定の細胞分裂段階で起こり得ることを意味する。
【０１０１】
細胞ＤＮＡ取り込みに対するＭＡＲおよび連続したトランスフェクションの効果
ＦＩＳＨ分析は、連続したトランスフェクションによる発現の増加が、一つには、ゲノム中のさらに多数の導入遺伝子コピーの組み込みから生じ得ることを示唆した（図１Ｄ）。１日間隔での連続したトランスフェクションは、核におけるプラスミドエピソーム濃度の増加をもたらし得、したがって、細胞ゲノム内の導入遺伝子組込みの可能性を増大させる。各トランスフェクションで核に侵入する導入遺伝子の量を評価するために、一時的シングルおよびダブルトランスフェクションをそれぞれ実施し、続いて２回目のトランスフェクションの１または２日後に単離された核からプラスミドを抽出し、リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により導入遺伝子の定量化を行った。
図３は、連続したトランスフェクションに際してのＤＮＡ輸送、組み込みおよび発現を示す。図３（Ａ）は、ＭＡＲの有無にかかわらずＧＦＰまたはＤｓＲｅｄ（「ＲＥＤ」）プラスミドでのシングルおよびダブル一時的トランスフェクションの間に細胞核中に輸送されるＧＦＰ導入遺伝子の量を示す。ＭＡＲ−ＧＦＰ＋ＭＡＲ−ＲＥＤは、ＭＡＲ−ＧＦＰを１回目のトランスフェクション中に転移させ、一方、ＭＡＲ−ＲＥＤを２回目のトランスフェクションで使用するダブルトランスフェクションに相当する。核を単離し、全ＤＮＡをそれぞれシングルトランスフェクションまたは２回目のトランスフェクションの１日後に抽出し、核中に輸送されたＧＦＰ導入遺伝子の数をｑＰＣＲにより定量化した。結果を、参考ＣＨＯ細胞ゲノムＧＡＰＤＨ遺伝子の結果に対して正規化し、４回の独立したトランスフェクションの平均を表す。図３（Ｂ）は、組み入れられたＧＦＰ導入遺伝子コピー数に対するＭＡＲおよび連続したトランスフェクションの効果を示す。全ゲノム組み入れ導入遺伝子ＤＮＡを先に記載されたＧＦＰ発現細胞から、安定なポリクローン細胞プールの３週間の選択後に抽出し、Ａについてと同様にＤＮＡを定量化した。図３（Ｃ）は、ＧＦＰ発現に対するＭＡＲおよび連続したトランスフェクションの効果を示す。Ｂで分析した安定な細胞プールのＧＦＰ蛍光レベルを細胞蛍光測定により分析した。
図３（Ｄ）および（Ｅ）は、モノクローン細胞集団における平均ＧＦＰ蛍光と導入遺伝子コピー数との間の関係を示す。
図３（Ｄ）では、ＧＦＰ、ＭＡＲ−ＧＦＰでトランスフェクトされたか、またはＭＡＲ−ＧＦＰで２回トランスフェクトされた異なる安定な細胞クローンの平均ＧＦＰ蛍光レベルを、ｑＰＣＲにより測定される、ゲノムあたりのそれらの導入遺伝子コピー数の関数として表す。
図３（Ｅ）では、導入遺伝子コピー数に対して正規化されたＧＦＰ蛍光レベル間の関係をゲノムあたりの組み込まれた導入遺伝子コピー数の関数として表す。算出した回帰曲線を点線で表し、Ｒ２は相関係数を示す。
結果から、ＭＡＲ−ＧＦＰで２回トランスフェクトされた細胞が、ＭＡＲ−ＧＦＰで１回だけトランスフェクトされた細胞よりも、それらの核において３．８倍多いＧＦＰ導入遺伝子コピーを示したことがわかる（図３Ａ）。ＧＦＰまたはＤｓＲｅｄ（「ＲＥＤ」）のいずれかを発現するこれらの異なるプラスミドでトランスフェクトされた細胞を比較した場合、ＭＡＲ−ＧＦＰの２回目のトランスフェクションから生じる核送達が、このプラスミドのシングルトランスフェクションから観察されるものよりも４．２倍高いことが観察された。しかし、最初にトランスフェクトされたＧＦＰプラスミドの核輸送は、２回目のトランスフェクションを実施することにより有意に増加しなかった。２回目のトランスフェクションからの核へのＤＮＡ輸送には、先の第１トランスフェクションを実施することが有利であると結論づけられた。
これらの結論は、ＤＮＡ輸送の共焦点イメージングによって強化され、この場合、第１トランスフェクションに使用されるプラスミドをローダミンで標識し、一方、第２にトランスフェクトされるプラスミドをＣｙ５で標識した（それぞれ、暗色（小さいドット）および白色（小さいドット）表示、図４Ａ）。特に、図４は、トランスフェクトされたＤＮＡの細胞内分布を表す。図４（Ａ）は、ＤＮＡ細胞内輸送の共焦点顕微鏡分析を示す。一時的シングルまたはダブルトランスフェクションを、表示されるように、ローダミンおよびＣｙ５フルオロフォアで標識されたＭＡＲを有するかまたは有さないプラスミドを用いてＣＨＯ細胞において実施した。トランスフェクトされた細胞を固定し、トランスフェクション後３時間、６時間、２１時間にＤＡＰＩ（大きな暗色のエリアルスポット）で染色した。ＧＦＰを発現する細胞は、写真では大きな明色のエリアルスポットとして見える。図４（Ｂ）は、細胞内プラスミドＤＮＡ分布の定量化を示し、これは、エンドソーム／リソソームコンパートメントをＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＤＮＤ−９９で染色する以外は、Ａについて実施した共焦点レーザー顕微鏡法で実施した。ローダミンまたはＣｙ５蛍光から誘導されるクラスターの画素面積を用いて、約１２０細胞中のプラスミドＤＮＡの量を推定した。
ＭＡＲの有無にかかわらず第１トランスフェクション後の細胞核において類似した数のローダミンで標識されたプラスミドクラスターが観察され、これは、ｑＰＣＲにより評価されるように、ＤＮＡ輸送に対するＭＡＲの効果がないこととよく相関する（図３Ａおよび４Ａ）。核プラスミドクラスターは２つのトランスフェクション後の本質的に全ての細胞で観察された。しかし、ごく少数の細胞だけが一時的にトランスフェクトされた遺伝子を発現できるという以前の観察結果と一致して、ごくわずかな細胞だけがＧＦＰを発現した（Ａｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７）。
【０１０２】
細胞取り込み、リソソーム回避および核内移行を含むことが知られている、ＣＨＯ細胞におけるトランスフェクトされたプラスミドＤＮＡの輸送は、エンドソーム／リソソーム分解により制限される（Ａｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７）。したがって、トランスフェクトされたプラスミドＤＮＡの細胞内輸送は、エンドソーム／リソソームおよび核コンパートメントをサイトゾルから区別するための特異的染色後に、各トランスフェクション後の細胞小器官およびサイトゾルにおけるその分布を定量化することによって評価した。図４Ｂにまとめた結果は、第１トランスフェクションの２１時間後にＭＡＲの有無にかかわらずプラスミドＤＮＡの類似した細胞内分布を示すが、ＭＡＲ含有プラスミドの核輸送は、初期の時点で若干速いようであった。ＭＡＲのないプラスミドの第２のトランスフェクションの実施により、核輸送は改善されなかった。しかし、ＭＡＲのないプラスミドが４０％未満であるのに比べて、全Ｃｙ５標識ｐＤＮＡの８０％が２回目のトランスフェクションの２１時間後にＭＡＲの存在下で核中に位置していたので、ＭＡＲエレメントを有するプラスミドは、リソソーム滞留を回避し、はるかに効率的に核に侵入した。むしろ、第１トランスフェクションについても見られるように、ＭＡＲのないプラスミドのほとんどは最終的にリソソーム／エンドソームコンパートメントに落ち着いた。このように、ＭＡＲおよび反復遺伝子導入のリソソーム回避に対する共同的効果が意外にも発見されたことで、単離された核におけるエピソームの濃度の増加について説明がつく（図３Ａおよび４Ｂ）。この現象は、第１トランスフェクションのＤＮＡによる細胞分解コンパートメントの飽和から起こる可能性があり、したがって、２回目のトランスフェクションのプラスミドが細胞原形質中に残留することが可能になり、細胞原形質中で、ＭＡＲは核中への輸送を促進し得る。
【０１０３】
ＭＡＲエレメントはゲノムに組み込まれた導入遺伝子のコピー数を増加させる
次に、ＭＡＲおよび連続したトランスフェクションにより誘発されるプラスミドＤＮＡの輸送の増大が、ＣＨＯ細胞のゲノム中への導入遺伝子組み込みを増加させるかどうかを試験した。安定なポリクローン細胞集団を図１についてと同様に選択し、ゲノムあたりの安定に組み入れられたＧＦＰ導入遺伝子コピーの平均数を、ｑＰＣＲを用いて全細胞ＤＮＡに関して測定した。トランスフェクトされたプラスミド中にＭＡＲエレメントを含めることは、安定な細胞プールのゲノム中に組み込まれる導入遺伝子の数を有意に増大させる（図３Ｂ）。ＭＡＲはシングルトランスフェクション後に核輸送を増大させるように作用しないので（図３Ａ）、これは、ＭＡＲがプラスミド自体のゲノム組み込みを増加させることができることを意味していた。この発見は、ＭＡＲの使用により、レシピエント細胞のゲノム中に組み込まれる導入遺伝子のコピー数が増加するという以前の示唆（Ｇｉｒｏｄ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５，  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  ２００４）を実証する。
連続したトランスフェクションは、プラスミド組み込みの４倍の増加ももたらし、これは、一時的トランスフェクションにおいて見られる遊離細胞外エピソームの増加に比例する（図３Ａおよび３Ｂ）。ＭＡＲなしで１回トランスフェクトする場合、平均して４８ＧＦＰプラスミドコピーが組み込まれ、一方、ＭＡＲでのそれぞれ１回または２回の連続したトランスフェクションから平均して約１６３コピーおよび６７６コピーが得られると推定することができた。全体として、ＭＡＲおよび連続したトランスフェクションの両方により相乗的に誘発された核輸送の増大により、ＭＡＲにより引き起こされるプラスミド組み込みの増加と組み合わされた場合、導入遺伝子コピー数が１０倍を越えて増加した。これにより、ＭＡＲの以前に観察された抗サイレンシング効果から予想されるように、導入遺伝子発現がさらに増加した（１５倍超、図３Ｃ）（Ｇａｌｂｅｔｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９）。
ポリクローン集団から単離された個々の細胞クローンにおいてＧＦＰ発現および導入遺伝子コピー数を評価する場合、導入遺伝子発現とコピー数との間に良好な全体的相関関係が見いだされた（図３Ｄ）。このことは、導入遺伝子コピー数が、ＭＡＲ含有プラスミドのダブルトランスフェクションによる発現増加の主な駆動因子であることを示す。さらに、非常に多数の導入遺伝子コピーおよびＭＡＲが共組み込みされたＭＡＲ含有クローンから、発現の有意な減少は検出されなかった（図３Ｅ）。したがって、ＭＡＲは、共組み込みされたプラスミドの反復性および／またはアンチセンス転写から生じ得る阻害効果、このＭＡＲエレメントの強力な抗サイレンシング特性の原因となり得る効果を防止することができたと結論づけられた（Ｇａｌｂｅｔｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９）。しかし、またはｄｓＲＥＤベクターでのコトランスフェクション実験において、個々の細胞クローンを分析した場合、または第１もしくは第２にトランスフェクトされたＤＮＡからのＧＦＰ発現を比較した場合に見られるように、発現の平均レベルはコピー数と必ずしも完全に一致するわけではなった（図３Ｂおよび３Ｃ）。このことから、ＭＡＲ含有プラスミドの２つのトランスフェクション後に観察される増強された導入遺伝子発現は、一つには、改善された核内移行およびゲノム組み込み、そしてひいては導入遺伝子コピー数、サイレンシングの欠如、ならびに導入遺伝子コピーあたりのさらに高い導入遺伝子発現により説明することができるが、他の効果も、トランスフェクション履歴および条件に応じて導入遺伝子発現に影響を及ぼし得るという結論に至った。
【０１０４】
プラスミド組み込みおよび発現に対するＤＮＡ相同性の効果
ＭＡＲ含有プラスミドの連続したトランスフェクションから観察される高いＧＦＰ蛍光が一つには１つの染色体座での増大した導入遺伝子組み込みから起こるので、この効果の分子基盤を評価した。例えば、クロマチンをアクセス可能な状態に維持し、したがって相同性組換えの適切な標的を提供するＭＡＲの能力から予想できるように、第１トランスフェクション中のＭＡＲ含有プラスミドの組み込みは、２回目のトランスフェクション中の同じゲノム座での第２の組み込みを促進する可能性がある。あるいは、核中の高濃度の染色体外エピソームによりもたらされ得るように、連続したトランスフェクションから観察される多数の組み込まれた導入遺伝子コピーは、両トランスフェクション中に導入されるプラスミドの更に効率的なコンカテマー化から起こり得る。相同性組換えは、トランスフェクトされたプラスミドの大きなコンカテマーの形成をもたらすことが提案され（Ｆｏｌｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９８５）、これはゲノムＤＮＡでの組換えに際して複数のプラスミドの共組み込みに至る可能性がある。後者のモデルにおいて、相同性組換えは、第１および第２トランスフェクション中に用いられるプラスミド上の類似のプラスミド配列間で起こる可能性があり、したがって、導入遺伝子組込みおよび発現の有効性はＤＮＡ配列相同性に依存する。
導入遺伝子（ＧＦＰまたはＤｓＲｅｄ）、プラスミド骨格（アンピシリンまたはカナマイシン細菌耐性）および／またはＭＡＲ（ニワトリリゾチームＭＡＲまたはヒトＭＡＲ１−６８）の様々な組み合わせで連続したトランスフェクションを実施することにより、導入遺伝子発現に対するプラスミド相同性の効果を分析することによって、この後者の可能性をまず評価した。
図５は、ＭＡＲ、プラスミド相同性および相同性組換えがどのように高い導入遺伝子発現をもたらすかを示す。図５（Ａ）に関して、安定なポリクローン細胞プールを、異なる導入遺伝子（ＧＦＰまたはＤｓＲｅｄ（「ＲＥＤ」））、ＭＡＲ（ヒト１〜６８についてＭＡＲ１またはニワトリリゾチームＭＡＲについてＭＡＲ２）、および／または細菌耐性遺伝子（アンピシリンもしくはカナマイシン）を有するプラスミドのトランスフェクションにより生成させ、そして４つの独立したトランスフェクションの相対的平均ＧＦＰ蛍光は、ＭＡＲのない１つのトランスフェクションから得られるものの４倍増加として示される。星印は、ＧＦＰ発現における有意差（スチューデントｔ検定、Ｐ＜０．０５）を示す。図５（Ｂ）に関して、ＧＦＰまたはＭＡＲ１−６８ＧＦＰプラスミドでの安定なトランスフェクションを、親ＣＨＯ細胞系（ＡＡ８）において、および相同性組換え（５１Ｄ１）または非相同性末端結合（Ｖ３．３）経路のいずれかがない突然変異体において実施した。シングルトランスフェクション（（Ｂ）の上のパネル）または２回の連続したトランスフェクション（（Ｂ）の下のパネル）から生じたそれぞれの安定なポリクローン細胞プールの平均ＧＦＰ蛍光を、ＭＡＲのないプラスミドで１回トランスフェクトされたＡＡ８細胞から得られるものに対して正規化した。星印は、ＧＦＰ発現における有意差（スチューデントｔ検定、Ｐ＜０．０５）を示す。５１Ｄ１細胞のダブルトランスフェクションから安定にトランスフェクトされた細胞は得られなかった。
結果は、異なったＭＡＲ、導入遺伝子、または細菌耐性のトランスフェクションは全て、連続したトランスフェクションで通常観察される高い発現を減少させたことを示す（図５Ａ）。異なるＭＡＲ、導入遺伝子およびベクターエレメント（ＭＡＲ１−ＧＦＰ＋ＭＡＲ２−ＲＥＤ構築物）を用いた場合、ダブルトランスフェクション効果はほぼ完全になくなり、このことは、連続したトランスフェクションから高い発現を達成するためにプラスミド相同性が必要であることを示唆する。
相同性組換えは、多くの場合、相同性組換え修復（ＨＲＲ）と称するプロセスにおいて、二本鎖切断のＤＮＡ修復機構として誘発される。したがって、トランスフェクション前のプラスミド線形化が連続したトランスフェクションから得られる高い発現をもたらすかどうかを試験した。
図４（Ｃ）は、遺伝子導入および発現に対するＤＮＡのコンフォメーションの効果を示す。線状または環状プラスミドでの１回または連続したトランスフェクション後の導入遺伝子発現レベルを比較するために、同じ等モル量のＧＦＰおよびＭＡＲ−ＧＦＰ環状ＤＮＡまたはＰｖｕＩで消化されたプラスミドをトランスフェクションのために使用した。選択の２週間後、安定にトランスフェクトされた細胞集団のｅＧＦＰ蛍光を細胞蛍光測定により分析した。プロフィールは、ＭＡＲのないプラスミドで１回トランスフェクトされた対照細胞からのＧＦＰ蛍光レベルの増加（倍）を示す。線状または環状プラスミドで得られる蛍光値をそれぞれ暗灰色または明灰色で示す。星印は、ＧＦＰ発現におけるいくつかの有意差（スチューデントｔ検定、Ｐ＜０．０５）を示す。
導入遺伝子発現の付加的以上の増加は環状プラスミドでも観察されたが、全体的な発現は線状プラスミドを用いて得られるものよりも低く（図４Ｃ）、一貫して相同性組換えプロセスにおいて線状ＤＮＡの組換え誘導特性は増大していた（Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９８６）。
【０１０５】
相同性組換えは増大した発現をもたらす
プラスミド相同性および二本鎖切断がダブルトランスフェクションによりさらに高い発現レベルを達成するために必要であることは、相同性組換えが関与し得ることを意味する。導入遺伝子は、非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）または相同性組換え（ＨＲ）と称する２つの拮抗経路ファミリーを用いて細胞ゲノム中に組み込まれることが提案された。細胞周期のＳおよびＧ２／Ｍ期でＤＮＡ複製中またはＤＮＡ複製後にＤＮＡ損傷を修復するために用いられるＨＲにより例証されるように、これらの経路は、細胞周期の特定の期でより活性である（Ｔａｋａｔａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８）。古典的なＮＨＥＪ遺伝子がない細胞は、ＨＲに偏った二本鎖切断端（ＤＳＢ）修復を示し、このことは、これらの２つの主な経路が通常競合して、これらのＤＮＡ損傷を修復することを示唆している（Ｄｅｌａｃｏｔｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２）。したがって、ＨＲを活性化するための一方法は、酵母およびほ乳類細胞で見られるように、ＮＨＥＪを抑制または遺伝子不活性化することである（Ｄｅｌａｃｏｔｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２，  Ｃｌｉｋｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１，  Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２，  Ｐｉｅｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１）。ＭＡＲおよび／または連続したトランスフェクションから生じる増大した導入遺伝子発現におけるＨＲ関連機構の可能な結果を、このように、両経路の重要な成分において突然変異し、したがってＨＲまたはＮＨＥＪのいずれかの唯一の成分であるＣＨＯ細胞系を用いて直接評価した。
５１Ｄ１  ＣＨＯ突然変異体誘導体はＲＡＤ５１鎖ランスフェラーゼがなく、したがって、相同性組換えが欠損し、一方、Ｖ３．３ＣＨＯ細胞は、ＮＨＥＪ経路を開始するために必須の役割を果たすＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼＤＮＡ−ＰＫの触媒活性がない（Ｊａｃｋｓｏｎ  １９９７，  Ｈｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６，  Ｊｅｇｇｏ  １９９７）。ＭＡＲなしで安定にトランスフェクトされた細胞と比較して、全ＧＦＰ蛍光の３倍の増加が、野生型親細胞系（ＡＡ８）のポリクローン集団におけるＭＡＲによってもたらされた（図５Ｂ）。しかし、５１Ｄ１細胞系において抗生物質耐性について選択した後に安定してトランスフェクトされたコロニーはほとんど生き残っておらず、ＧＦＰ発現は非常に低いままであった。対照的に、ＮＨＥＪ欠損細胞では導入遺伝子発現のＭＡＲによる活性化の悪化が観察され、その結果、ＭＡＲのないＧＦＰ発現ベクターで１回トランスフェクトされた細胞と比較した場合、導入遺伝子発現が６倍以上増加した。
親ＡＡ８細胞と比較して、Ｖ３．３細胞由来のＧＦＰ発現は、ＭＡＲの存在および連続したトランスフェクションの両方によって増加した点で、連続したトランスフェクションについて類似した傾向がみられた（図５Ｂ、上下のパネルで目盛りが異なることに注意）。親細胞における対照プラスミドのシングルトランスフェクションと比較して、ＮＨＥＪ欠損Ｖ３．３細胞のＭＡＲでの２回の連続したトランスフェクションから、全体として、導入遺伝子発現において３５倍の増加が得られた。対照的に、ＮＨＥＪ経路の不活性化は、ＭＡＲのないプラスミドの発現に対してほとんど影響を及ぼさず、このことは、ＭＡＲの存在および高いＨＲ活性はどちらも非常に高い導入遺伝子発現を得るために必須であることを示す。一貫して、ＨＲが欠損した細胞は、低い発現レベルを生じ、一方、ダブルトランスフェクションから抗生物質耐性コロニーは得られなかった。
これらの結果から、連続した遺伝子導入プロセスで用いられる２つの選択遺伝子の組み込みおよび維持におけるＨＲ経路の重要性が明らかになる。
図５（Ｃ）〜（Ｅ）は、ＭＡＲでの繰り返しトランスフェクションにより改善された発現のモデルを示す。
図５（Ｃ）および（Ｄ）で示されるスキームにおいて見られるように、導入遺伝子発現の指数関数的増加は、ＭＡＲエレメントおよびダブルトランスフェクションプロセスの両方に起因する、細胞核中へのプラスミドの増大した侵入およびゲノム組み込みによって部分的に説明される。第１トランスフェクション後、ＭＡＲの存在は、トランスフェクトされたプラスミド間の相同性組換えの頻度を増大させる可能性があり、より大きなコンカテマー構造の形成およびより多くのプラスミドコピーの組み込みを可能にする。加えて、ＭＡＲは、クロマチン構造を開口状態に改造するためにタンパク質を動員する可能性がある。図５（Ｅ）で見られるように、第１トランスフェクションおよび細胞の分解コンパートメントの起こり得る飽和の結果として、２回目のトランスフェクションのプラスミドは、より効率的に核へと輸送され得る。ＭＡＲエレメントは、前述同様に組換えを促進するように作用することができ、両トランスフェクションからの相同性プラスミドのより良好なコンカテマー化を可能にする。細胞周期状態も最適タンパク質発現を達成するためのパラメータである。細胞がＧ１期にあるときにトランスフェクションを実施することにより、プラスミドは細胞周期の後期（たとえば、ＳまたはＧ２／Ｍ）で核に達する可能性があり、これは相同性組換えにとってより都合がよく、より大きなプラスミドコンカテマーの形成および染色体組み込みにさらに貢献する。
【０１０６】
タンパク質分泌
低および高プロデューサーＣＨＯクローンにより産生される組換えＩｇＧの特性化
まず、高または低Ｍａｂ産生レベルを示すＣＨＯ細胞クローンによるＩｇＧ重鎖および軽鎖の発現および分泌に影響を及ぼし得る支障または欠陥を検討した。
異なる組換えＩｇＧを発現するＣＨＯ−Ｋ１  Ｓの種々のクローンを生成させた。
【０１０７】
図６は、高および低組換えＩｇＧ−プロデューサーＣＨＯクローンにより発現される免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の特性化を表す。
図６（Ａ）は、抗ヒトＩｇＧ抗体を使用した細胞内（細胞可溶化物）および分泌されたＩｇＧ（培地）のウェスタンブロットを示す。高（ＨＰ）および低（ＬＰ）ＩｇＧ−プロデューサーＣＨＯ−Ｋ１−Ｓを全細胞抽出に付し、Ｌａｅｍｍｌｉ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ８％で分析した。免疫グロブリン重鎖および軽鎖を図ではそれぞれＨＣおよびＬＣとする。図６（Ｂ）は、ＴＸ−１００溶解度分析を示す。細胞を、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を含むＰＢＳ中に溶解させた。１０．０００×ｇで１０分間遠心分離した後、Ｔｘ可溶性タンパク質を含む上清およびＴｘ不溶性タンパク質を含むペレットを還元性および非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ８％下で分割した。図６（Ｃ）は、ＩｇＧのフォールディングおよび分泌動力学のシクロヘキシミドベースの追跡分析を示す。高（ＨＰ）および低（ＬＰ）ＩｇＧ−プロデューサーＣＨＯ−Ｋ１  Ｓクローンを１００μＭのシクロヘキシミドの存在下で培養した。種々の時点で、細胞を収集し、１％のＴＸ−１００を含有する緩衝液中に溶解させた。Ｔｘ可溶性および不溶性フラクションを次いで非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ４〜１０％で分割した。免疫グロブリンの遊離、二量体およびアセンブリ中間複合体を、それぞれ遊離−ＨＣまたは遊離−ＬＣ；（ＬＣ）２および（ＨＣ）２；ＨＣ−ＬＣおよびＩｇＧとした。矢印は、適切に処理された構造を示し、楔形は異常な構造を示す。
【０１０８】
図６からわかるように、培養上清におけるＭａｂ力価は、過剰発現されたＭａｂタンパク質によって非常に多様であった。しかし、結果は、再現性が高く、Ｍａｂは一貫して低産生性細胞クローンを産生するものもあれば、一貫して高産生性細胞クローンを産生するものもあった。しかし、発現レベルは、トランスフェクションに使用したプラスミド構築物と無関係であり、使用したシグナル配列に依存せず、実際、すべてのＭａｂについて同じであった（データは不掲載）。
【０１０９】
種々のクローンのポリペプチド生合成とＩｇＧ分泌レベルとの間の相関関係を見いだすために、各クローンによって発現された細胞内重鎖および軽鎖（ＨＣおよびＬＣ）を分析した。全細胞抽出物および定常状態でＣＨＯ−Ｋ１  Ｓクローンにより産生される分泌されたＩｇＧ免疫沈殿物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより還元条件下で分割した。タンパク質移動プロフィールから、それぞれ高ＩｇＧ−プロデューサークローン１２Ｂ、１６ＤおよびＳ２９のＨＣおよびＬＣの予想される５０ｋＤａおよび２５ｋＤａバンドが明らかになった。しかし、低ＩｇＧ−プロデューサーＣ２４およびＣ５８により発現された軽鎖は、異常に高い見かけの分子量で移動した（図６Ａ）。分泌されたタンパク質を分析すると、同じ異常な挙動がみられた。ＰＮＧａｓｅ  Ｆは、細胞抽出物に対して実施された脱グリコシル化実験を媒介し、分泌されたＩｇＧはＬＣ移動度を変更せず、このことは、低プロデューサーのＬＣの低速の電気泳動移動がさらなるグリカン部分によるものではなかったことを示す（データは不掲載）。
異常なＬＣの生化学的性質を評価するために、１％のｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｔｘ）を含むＰＢＳ溶液中の細胞内ＨＣおよびＬＣ含有物を抽出し、１０．０００×ｇで１０分間の遠心分離によりＴｘ不溶性タンパク質からＴｘ可溶性タンパク質を分離した。尿素９Ｍを追加したＳＤＳ含有Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中にタンパク質を完全に可溶化させた後、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりフラクションを分割した。予想通り、高ＩｇＧ−プロデューサークローンのＬＣおよびＨＣがＴｘ可溶性フラクション中のみで検出された（図６（Ｂ）；Ｓ２９レーン）。しかし、Ｃ２４およびＣ５８低プロデューサーのＬＣのかなりの部分は、Ｔｘ処理によって可溶化することができず、細胞内沈着および潜在的なポリペプチド架橋を示した。驚くべきことに、ＬＣのこのＴｘ不溶性フラクションは、濃縮用ゲル中に残留したままであり、高分子量凝集物およびジスルフィド結合の形成を示すので、非還元条件下で分割することができなかった。これらのデータは、Ｔｘ耐性形態でのその凝集に至るＬＣフォールディングまたはアセンブリプロセスにおけるデフォルトを示唆していた。
【０１１０】
シクロヘキシミドに基づく追跡アッセイを次に実施して、ＩｇＧフォールディングおよびアセンブリ動力学ならびにＣＨＯ細胞クローンにおけるＩｇＧ凝集体の運命を調査した。非還元性条件下での高プロデューサークローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、遊離ＬＣ種の蓄積およびＨＣおよびＬＣ二量体の形成を明らかにした。ＨＣ含有種は、次第に減少するようであり、同時にＨＣ−ＬＣ複合体中および完成ＩｇＧ四量体中へ組み込まれた（図６Ｃ）。対照的に、ＬＣは、低ＩｇＧ−プロデューサー中の凝集形態内でのみ検出されるか（図１Ｃ、Ｔｘ−１０不溶性パネル）またはＨＣ−ＬＣなどのアセンブリの中間複合体中および完成ＩｇＧ中へ組み込まれた（図６Ｃ：Ｔｘ−１００可溶性パネル）。興味深いことに、洗剤不溶性ＬＣ形態の量は、長時間にわたって一定のままであり、したがってＩｇＧフォールディングプロセスに関与しなかった（図６Ｃ：Ｔｘ−１００不溶性パネル、Ａｇｒ−ＬＣ）。このことは、ＬＣ凝集物が任意のさらなるフォールディングおよびアセンブリプロセスについて役に立たないことを示した。
これらの結果から、以下の仮説をたてた：（１）高ＩｇＧ−プロデューサーのＥＲフォールディング機構および分泌能力は、ＨＣおよびＬＣの大規模な生合成および蓄積により飽和に近いが、細胞はそれにもかかわらず、正常構造のＭａｂのアセンブリを続行した；（２）低ＩｇＧ−プロデューサーによって産生されたアセンブリできないＬＣ凝集物の蓄積により、これらのクローンの分泌欠陥を説明できた；そして（３）低ＩｇＧプロデューサーにおけるＬＣシグナルペプチド切断やＬＣの付随する凝集の潜在的な欠損（ＥＲにおけるポリペプチドの共翻訳転位のデフォルトを示す可能性がある）。
【０１１１】
低プロデューサークローンにおけるＥＲの潜在的な機能不全を評価するために、ＥＲタンパク質フォールディングおよびストレス反応の種々のセンサーの発現を調べた。ＥＲのフォールディング能力を越えた組換えタンパク質の過剰発現は、アンフォールド型タンパク質応答（Ｕｎｆｏｌｄｅｄ−Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｒｅｓｐｏｎｓｅ（ＵＰＲ））と総称される一組の細胞応答を誘発することが示されている。これらの細胞機構は、ＥＲフォールディング能力を改善し、ＥＲストレスを軽減し、ＥＲ機能を回復する働きをすることができるが、これらはまた組換えタンパク質の産生を低下させる可能性もある（Ｋｈａｎ  ＳＵ  ｅｔ  ａｌ，  ２００８；  Ｋａｎｇ  Ｓ−Ｗ  ｅｔ  ａｌ，  ２００６）。例えば、ＥＲＡＤ（ＥＲ関連分解）遺伝子発現のＵＰＲによる活性化は、アンフォールド型またはミスアセンブルされたＥＲ関連組換えタンパク質に分解経路を標的とさせることができる。さらに、重度のＥＲストレスの場合、それらのタンパク質分泌機構を適応させることができない細胞は、アポトーシス経路を誘発する可能性がある。
【０１１２】
組換え免疫グロブリン鎖のＬＣミスプロセッシングおよび／または過剰発現がＥＲストレスおよび／またはＵＰＲを誘発し得るかどうかを評価するために、低および高プロデューサークローンを７日間培養し、培養手順に沿って種々の時間で分析した。
【０１１３】
図７は、高および低ＩｇＧ−プロデューサーのＥＲフォールディングおよびＵＰＲ機構の特性化を示す。高（ＨＰ）、低（ＬＰ）ＩｇＧ−プロデューサークローンおよび親細胞をバッチ培養法で培養した。培養の０、３、５および７日の種々の時点で細胞を収集した。細胞抽出物を次いで抗ＢｉＰ抗体（上のパネル）および抗ＣＨＯＰ抗体（中間のパネル）を用いたウェスタンブロッティングによって分析した。タンパク質ローディング対照をＧＡＰＤＨ含有量（下のパネル）により推定した。ＣＨＯＰ前駆体および活性形態をそれぞれ星印および矢印により示した。
【０１１４】
ウェスタンブロットは、２つの低プロデューサークローンにおいて、ＢｉＰの増大した発現、ＵＰＲ活性化のセンチネルマーカーを示した。対照的に、高プロデューサークローンについてＢｉＰレベルは検出の増加は検出されなかった（図７）。これらの結果は、ミスプロセッシングＬＣを発現する低プロデューサークローンが、ＢｉＰ過剰発現によって媒介されるＥＲ−ストレス応答を誘発したことを示唆した。対照的に、高プロデューサークローンによって発現される低レベルのＢｉＰタンパク質は、これらの細胞がＵＰＲカスケードを活性化することなく非常に高レベルの組換えＩｇＧを取り扱い、分泌することができることを示唆した。
【０１１５】
タンパク質−フォールディングの支障またはミスフォールディングをＵＰＲによって解決することができない場合、その発現を誘導することができる、ＣＨＯＰプロアポトーシス転写因子の発現レベルも分析した。低および高ＩｇＧ−プロデューサーＣＨＯクローンはどちらも、Ｍａｂを発現しない対照細胞と比較した場合、ＣＨＯＰタンパク質の過剰発現を示した（図７）。興味深いことに、ＣＨＯＰタンパク質は培養の第５日まで２つの低プロデューサークローンにおいて次第に蓄積し、一方、細胞ＣＨＯＰレベルおよびプロアポトーシス経路は高プロデューサークローンにおいて構成的に誘発されるようであった。
【０１１６】
これらの観察結果は、ＢｉＰが介在する低プロデューサークローンのＵＰＲ応答の結果、ＵＰＲの末期となり、そしてアポトーシス細胞死プログラムが活性化されたことを意味するものであった。対照的に、高プロデューサークローンはＢｉＰが介在するＵＰＲ応答を引き起こさなかったが、ＣＨＯＰが介在するプロアポトーシス応答がこれらのクローンにおいて誘発された。このことは、組換えＭａｂの異常で膨大な過剰発現は、主なＥＲストレスセンサーＢｉＰと独立して細胞死プログラムを開始し得ることを示唆するものであった。
【０１１７】
異なるＩｇＧ−プロデューサークローンが組換えＩｇＧタンパク質の種々のフォールディングおよびプロセッシング状態を示し、宿主細胞の異なる細胞および分子応答がそれらの発現および分泌中に誘発されたことも証明することができた。したがって、これらの種々の低および高プロデューサークローンはどちらも、発現しやすい組換えタンパク質または発現しにくい組換えタンパク質の工業生産に悪影響を及ぼし得る制限に直面する可能性がある。したがって、本発明者等は、生物工学アプローチを用いて組換えＩｇＧ産生を改善するための新規手段を特定するための細胞モデルとして、これらの高および低ＩｇＧ−プロデューサーＣＨＯクローンを引き続き使用した。
【０１１８】
タンパク質のプロセッシングおよび救済効率的な分泌を修正するための戦略
低プロデューサークローンにおけるＬＣの溶解度の不足およびその低速の移動度は、ペプチドシグナルの存在を示唆し、ＥＲコンパートメントに対するＬＣプレタンパク質の非効率的なターゲティングおよび／またはミスプロセッシングを支持した。したがって、シグナルペプチドミスプロセッシングおよび組換えＩｇＧのＩｇＧ軽鎖の凝集は、ＥＲ中への不適切なターゲティングおよび／または転位から起こり得る可能性があった。最近の研究は、ＢｉＰなどのＥＲストレス関連タンパク質を発現させるための宿主細胞系の生物工学が、異種タンパク質の分泌を改善できることを示唆した（Ｐｅｎｇ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ，  ２００９）。しかし、ＥＲストレスタンパク質ＢｉＰは低プロデューサークローンにおいてすでに自発的に上方調節されることが見出されたので、これは成功の可能性が高い選択肢ではなかった。
【０１１９】
タンパク質転位機構の成分の過剰発現によりタンパク質分泌を改善する試みは、ほ乳類細胞系では成功しなかった。例えば、正常レベルを越えるＳＲ１４発現は培養されたヒト細胞からの分泌効率を改善しなかった（Ｌａｋｋａｒａｊｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。
これらの結果と関係なく、アフィニティーシグナルペプチドと結合し、ＳＲＰ−ＲＮＡ−リボソーム複合体のＥＲ膜上へのドッキングを媒介する多タンパク質−ＲＮＡ複合体であるシグナル認識粒子（ＳＲＰ）のタンパク質またはシグナル認識粒子に関連するタンパク質を発現することにより、タンパク質分泌を増強する試みがなされた。具体的には、（１）ヒトＳＲＰ１４サブユニット、（２）細胞アポトーシスの調節に関与するＦＡＤＤ（ＦＡＳ関連デスドメイン）タンパク質のドミナントネガティブ型突然変異体が発現され、また（３）対照として無関係のＧＦＰタンパク質も発現された。
【０１２０】
１つは低収率モノクローナル抗体（例えば、インフリキシマブ、発現するのが困難なタンパク質）を発現し、もう１つは同じシグナルペプチドを有する高収率ＭＡｂ（例えば、トラスツズマブ、発現しやすいタンパク質）を発現する、２つのクローン細胞系を使用し、５．１×１０５細胞を、エレクトロポーレーション（ＭＩＣＲＯＰＯＲＡＴＯＲ、１２５０Ｖ、２０ｍｓパルス時間および３パルス）により表示されたタンパク質をコード化する５μｇのプラスミドで再トランスフェクトした。ミクロポーレーション後に、８ｍＭのグルタミンおよび２ｘＨＴを追加したＳＦＭ４ＣＨＯ培地（ＨＹＣＬＯＮＥ）に細胞を添加した。２日後、細胞を適切な希釈度の選択マーカー（３００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８）でＴ７５プレートに移し、そして細胞をさらに培養した。約２週間後、薬剤耐性細胞を振盪フラスコ中で増殖させ、ＳＲＰ１４発現集団を限界希釈プロセスにおける単細胞クローニングのために希釈した。以下に提示した結果は、表示されたタンパク質を発現する細胞クローンで得られた。
【０１２１】
ＳＲＰ１４発現によるＭａｂ産生の増強
まず、細胞内ＨＣおよびＬＣのＴｘ溶解度を測定し、ＳＲＰ関連タンパク質を発現する高および低ＩｇＧ−プロデューサークローンの分泌レベル。
【０１２２】
図８は、組換えＩｇＧ産生ＣＨＯクローンのＳＲＰ１４トランスフェクションが軽鎖凝集をなくし、ＩｇＧ分泌を救済したことを示す。２つの異なるＣＨＯクローン、つまり高（Ｆ９）および低（Ａ３７）組換えＩｇＧ産生ＣＨＯクローンを、種々の対照または組換えＩｇＧの正しいプロセッシングおよび分泌を救済すると予想される候補タンパク質をコードするｃＤＮＡ構造でのトランスフェクションに付した（Ａ：ＧＦＰ；Ｇ：ＳＲＰ１４；Ｈ：ＦＡＤＤ−ＤＮ）。
図８（Ａ）において、タンパク質Ａ、ＧまたはＨを共発現する低および高プロデューサーＣＨＯクローンの細胞抽出物のＴＸ−１００可溶性およびＴＸ−１００不溶性フラクションを４％〜１０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ＩｇＧタンパク質をケミルミネッセンスにより検出した。明色矢印は、低ＩｇＧプロデューサー（明色楔形）によって産生された遊離・未処理ＬＣおよび未処理・凝集ＬＣを示す。ＧまたはＨタンパク質のトランスフェクション後に低ＩｇＧプロデューサークローンによって産生された遊離した適切に処理されたＬＣを黒色楔形で示した。
図８（Ｂ）は、細胞培養培地上清に関して実施した、分泌されたＭａｂのＥＬＩＳＡアッセイから評価した場合の、ＳＲＰ１４発現ベクターでのトランスフェクション前（−）および後（Ｇ）のＦ９およびＡ３７クローンの比生産性分布を示す。
【０１２３】
興味深いことに、ウェスタンブロット分析は、完全長ヒトＳＲＰ１４（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセス番号Ｘ７３４５９．１、その全体が参照することによって本明細書中に組み込まれる）の過剰発現は、ｐｒｏ−ＬＣを、フォールディングおよびＨＣとのアセンブリについて適格な正常ＬＣ成熟形態のように移動する種への変換し、一方、ＨＣの移動は影響を受けなかったことを示した（図８Ａ、上のパネルのレーンＧ、矢印を参照）。なお一層驚くべきことに、ＳＲＰ１４過剰発現はＴＸ不溶性フラクションにおけるＬＣ凝集を完全に無効にした（図８Ａ、下のパネル）。対照ＧＦＰタンパク質の発現は、タンパク質溶解度を改善せず、ＬＣの適切なプロセッシングも回復しなかった（図８Ａ、レーンＡ）。ＳＲＰ１４の発現は、高プロデューサークローンから得られるＨＣおよびＬＣ移動パターンに対して影響を及ぼさなかったが、遊離ＨＣおよびＬＣの量ならびに完全にアセンブルされたＩｇＧの量は、対照と比較してやや増加した（図８Ａ、ＦＰ−Ｆ９クローン、レーンＧ）。
【０１２４】
ＳＲＰ１４の外因性発現の組換えＩｇＧ力価に対する影響を測定するために、上清細胞培養を次いでＥＬＩＳＡにより分析し、適切にアセンブルされたＭａｂについて調べた。低ＩｇＧ−プロデューサーにおけるＳＲＰ１４の過剰発現は、低プロデューサークローンからのＩｇＧ分泌の有意な増加をもたらした（図３Ｂ）。低プロデューサー細胞から単離されたクローン（ＬＰ−Ｇ集団）は、比生産性（Ｑｐ）において７倍の平均増加を示した。さらに、Ｑｐの３０％増加を観察することができたので（ＨＰ−Ｇクローン）、ＳＲＰ１４の外因性発現はまた、ＨＰクローンの分泌も改善した。興味深いことに、発現しにくいＭａｂおよび発現しやすいＭａｂについて同じレベルでＩｇＧを発現することができる個々のクローンが単離され（＞４０ｐｃｄ）、このことは、転位におけるその後のステップが律速段階になることを示唆する。
【０１２５】
外因性ＳＲＰ１４発現の作用は予想外である。ＳＲＰにより媒介される伸長停止におけるこのサブユニットの機能が与えられると、発現は、産生しにくいＩｇＧプロデューサークローンにおけるＬＣ伸長の遅延の拡大を引き起こし得る。低プロデューサークローンのＭａｂの適切なプロセッシングは、予想外に長い翻訳中断を必要とする可能性がある。これはおそらくは、これらの特定のＩｇＧの転位を媒介する複合体のＥＲ上へのドッキングの反応速度が他の分泌されたタンパク質よりも遅い可能性があるためである。外因性ＳＲＰ１４成分による翻訳速度の調節は、今度はＥＲにおけるプロＬＣの共転位（ｃｏ−ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）に影響を及ぼすことができ、したがって、シグナルペプチドの効率的なプロセッシングを回復することができた。
【０１２６】
別の制御タンパク質、すなわち、デスドメインを有するＦＡＳ関連タンパク質（ＦＡＤＤ）の効果も、ＦＡＤＤのドミナントネガティブ変異体（ＦＡＤＤ−ＤＮ）を発現することによって評価した（Ｎｅｗｔｏｎ，  Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８）。ＦＡＤＤ−ＤＮの過剰発現もまた、ＳＲＰ１４について見られるように、ＬＣ凝集をなくすことが見出された（図８Ａ、下のパネル、レーンＨ）。ＦＡＤＤは、死誘発シグナリング複合体（ＤＩＳＣ）を形成することによって細胞においてアポトーシスを誘発するデス受容体（ＤＲ）タンパク質のファミリーと会合することが知られているので、このことは予想されなかった。細胞質に位置するＦＡＤＤの主な生理学的役割は、このように、細胞死を誘発することであり、したがって、ＦＡＤＤを不活性化して、ＣＨＯ細胞アポトーシスを防止する試みがなされた。しかし、最近の研究は、修飾および細胞内局在化に応じて、複数の非アポトーシス活性の原因はＦＡＤＤであるとした。例えば、ＦＡＤＤリン酸化および核移行は遺伝子発現を調節し、細胞周期および有糸分裂進行の両方を活性化する（Ｔｏｕｒｎｅｕｒ  ａｎｄ  Ｃｈｉｏｃｃｈｉａ  ２０１０）。さらに、ＲＴＮ３と称するＥＲ結合タンパク質は、ＦＡＤＤをＥＲ膜に動員することができ、そしてＦＡＤＤ自体は非定型微小胞ベースの経路により分泌され得る。しかし、これまで、ＦＡＤＤはＥＲによるタンパク質分泌の調節に関与しなかった。本発明者等の発見は、したがって、過剰発現されたＭａｂのプロセッシングの改善の関連でＦＡＤＤについての新規機能を示す。あるいは、ＦＡＤＤ−ＤＮの発現は、翻訳機構を飽和させた可能性があり、このプロセスをなんとか遅らせ、ＥＲへの適切なターゲティングを可能にする。しかし、ＦＡＤＤ−ＤＮもＧＦＰ過剰発現も、高レベルでのＩｇＧ分泌を有意に回復しないことが判明した。したがって、ＳＲＰ１４の外因性発現のみが、Ｍａｂ産生を回復することができた。したがって、ＳＲＰ−複合体機能の調節は、ＥＲ−内腔トランスロコンパートナーの動員および／または新たに合成された（ｎｅｏｓｙｎｔｈｅｔｉｚｅｄ）ＬＣのＥＲフォールディングシャペロンとの相互作用に特に必要であり得ると仮定された。非常に高いＭａｂ分泌レベルは６ヶ月を越えて維持され、これがＳＲＰ１４発現細胞の安定な性質であることを示す。流加培養法において、培地１リットルあたり８グラムを越えるＭａｂが得られ、これは、本発明者等がこの発現しにくいタンパク質に関してＳＲＰ１４発現なしでは達成できなかった高い力価である。
【０１２７】
ＳＲＰ１４の発現後に良好な結果が得られたので、ＥＲにおける新生ポリペプチドの適切な転位に貢献し得る他のタンパク質の影響を試験した。アフィニティーシグナルペプチドを結合し、ＳＲＰ−ＲＮＡ−リボソーム複合体のＥＲ膜上へのドッキングを媒介する多タンパク質−ＲＮＡ複合体であるシグナル認識粒子（ＳＲＰ）の他のタンパク質、またはＳＲＰ機能に関連するタンパク質も試験した。具体的には、本発明者等は（１）ヒトＳＲＰ５４サブユニット（シグナル配列認識を増大させるために）、（２）ヒトＳＲＰ９および／またはＳＲＰ１４サブユニット（これら２つのポリペプチドはインビボで複合体を形成して、おそらくは翻訳を遅延させるので）、（３）ヒトＳＲＰ受容体（ＳＲ）サブユニットαおよびβ（転位機構の能力を増大させるために）、および（４）トランスロコンＳｅｃ６１ヒトサブユニット（Ｔｒａｎｓｌ）（おそらくはＥＲにおける転位を改善するために）を発現した。
【０１２８】
図９は、ＳＲＰ９、ＳＲＰ１４、ＳＲＰ５４、ＳＲおよびトランスロコンの種々の組み合わせを発現するＣＨＯ細胞プールにおけるＭＡｂ産生の増加を表す。低プロデューサーＡ３７クローンを、表示された候補タンパク質の発現を引き起こすｃＤＮＡ構造でのトランスフェクションに付した。培養上清をＥＬＩＳＡにより分析し、Ｍａｂ分泌の力価を測定した。
【０１２９】
図面からわかるように、ＳＲＰ１４またはＳＲＰ５４の発現は、Ｍａｂ分泌の強力な増加に至るのに対して、ＳＲおよびＴｒａｎｓｌは小さいが、依然として有意な分泌の増加をもたらし、一方、ＳＲＰ９単独は発現を著しく改善しなかった（図９およびデータは不掲載）。これらのタンパク質の組み合わせも試験した。ＳＲＰ９は、ＳＲＰ１４および／または５４の発現により得られる陽性効果を完全に無効にし（ＳＲＰ９＋ＳＲＰ１４＋ＳＲＰ５４レーン）、改善された分泌をもたらす任意のＳＲＰタンパク質の単純な発現ではないことを示す。ＳＲ発現は、ＳＲＰ１４およびＴｒａｎｓｌのみによって媒介される効果をやや増加させたが、ＳＲＰ９、１４および５４の存在下で得られる分泌を強力に増大させた（ＳＲＰ９＋ＳＲＰ１４＋ＳＲＰ５４レーンをＳＲＰ９＋ＳＲＰ１４＋ＳＲＰ５４＋ＳＲレーンと比較）。しかし、分泌における最高の増加は、ＳＲＰ１４およびＳＲに加えてＴｒａｎｓｌを過剰発現する場合に得られた（ＳＲＰ１４＋ＳＲ＋Ｔｒａｎｓｌ対ＳＲＰ１４＋ＳＲ）。ＳＲＰ１４、ＳＲＰ５４、ＳＲおよびＴｒａｎｓｌの他の組み合わせもタンパク質分泌を改善するために貢献し、したがって、このような組み合わせはすべて本発明で具体化されることは当業者には明らかであろう。
【０１３０】
材料および方法
Ｉ．導入遺伝子組込みおよび発現
プラスミドおよび構築物
ｐＧＥＧＦＰｃｏｎｔｒｏｌは、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）からｅＧＦＰ遺伝子の発現を引き起こすｐＧＬ３（ＰＲＯＭＥＧＡ）由来のＳＶ４０初期プロモーター、エンハンサーおよびベクター骨格を含む。ｐＰＡＧ０１ＳＶ４０ＥＧＦＰは、ｐＧＥＧＦＰｃｏｎｔｒｏｌのＳＶ４０初期プロモーターの上流のニワトリリゾチームＭＡＲフラグメントの挿入から生じる（Ｇｉｒｏｄ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５）。ヒトＭＡＲ１−６８は、ＤＮＡ構造特性を用いてＳＭＡＲＳｃａｎプログラムにより特定された。これをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにおいてヒト大腸菌人工染色体からクローンし、次いでＳＶ４０初期プロモーターの上流のｐＧＥＧＦＰｃｏｎｔｒｏｌ中に挿入し、その結果、ｐ１−６８（ＮｃｏＩ  ｆｉｌｌｅｄ）ＳＶ４０ＥＧＦＰプラスミドを得た（Ｇｉｒｏｄ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７）。
ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（ＰＲＯＭＥＧＡ）においてｐＣＭＶ−ＤｓＲｅｄ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）から、ＣＭＶプロモーター（エンハンサーを含む）の制御下でＤｓＲｅｄ遺伝子を挿入することによって、ｐＧＬ３−ＣＭＶ−ＤｓＲｅｄを作製した。ＢｓｐＨＩで両プラスミドを消化することにより、ｐＧＬ３−ＣＭＶ−ＤｓＲｅｄのアンピシリン遺伝子をｐＣＭＶ−ＤｓＲｅｄ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）由来のカナマイシン耐性遺伝子と交換することによって、ｐＧＬ３−ＣＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ｋａｎを次に作製した。次いで、ニワトリリゾチームまたはヒト１−６８ＭＡＲをｐＧＬ３−ＣＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ｋａｎプラスミド中に挿入した。これらを、ニワトリリゾチームフラグメントを含むＫｐｎＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントとして、またはＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩヒト１−６８ＭＡＲフラグメントとして、ｐＧＬ３−ＣＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ｋａｎにおけるＣＭＶプロモーターの上流に挿入し、その結果、ｐＰＡＧ０１ＧＬ３−ＣＭＶ−ＤｓＲｅｄおよびｐ１−６８（ＮｃｏＩ）ｆｉｌｌｅｄＧＬ３−ＣＭＶ−ＤｓＲｅｄがそれぞれ得られた。
【０１３１】
細胞培養およびトランスフェクション
ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞系（Ｕｒｌａｕｂ  １９８３）を、ＨＴ（ＧＩＢＣＯ）および１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＧＩＢＣＯ）を追加したＤＭＥＭ：Ｆ１２（ＧＩＢＣＯ）中で培養した。親ＣＨＯ細胞ＡＡ８、ＮＨＥＪ欠損細胞Ｖ３．３およびＨＲ欠損細胞５１Ｄ１（Ａｄａｙａｐａｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）はＦａｂｒｉｚｉｏ  Ｐａｌｉｔｔｉ博士のご厚意により提供を受け、１０％ウシ胎仔血清および抗生物質を含むＤＭＥＭ：Ｆ１２培地中で培養した。
製造業者の説明書（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）にしたがって、Ｌｉｐｏｆｅｃｔ−ＡＭＩＮＥ２０００を使用してこれらの細胞でトランスフェクションを実施した。蛍光励起セルソーター（ＦＡＣＳ）を用い、トランスフェクション（一時的トランスフェクション）の１、２または３日後にＧＦＰまたはＤｓＲｅｄ蛍光レベルを分析した。ＧＦＰおよび／またはＤｓＲｅｄを発現するＣＨＯ−ＤＧ４４細胞の安定なプールを耐性プラスミドｐＳＶｐｕｒｏ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）のコトランスフェクションによって得た。ＣＨＯ−ＤＧ４４については５μｇ／ｍｌのピューロマイシン（ＡＡ８、Ｖ３．３および５１Ｄ１について８μｇ／ｍｌのピューロマイシン）で２週間選択した後、細胞をＦＡＣＳによって分析した。
複数のトランスフェクションを以下のように実施した：第１トランスフェクション後、耐性プラスミドが別の耐性遺伝子、ｐＳＶ２  ｎｅｏ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を含む以外は、前記のようにして、細胞を次いで二度目のトランスフェクトに付した。２つのトランスフェクションは、本文中で特に別段の記載がない限り、細胞周期に従うようにタイミングをはかった。２回目のトランスフェクションの２４時間後、細胞を継代し、２５０μｇ／ｍｌのＧ４１８および／または２．５μｇ／ｍｌのピューロマイシン（ＡＡ８、Ｖ３．３および５Ａ１Ｄ１について２５０μｇ／ｍｌのＧ４１８および４μｇ／ｍｌのピューロマイシン）で選択した。３週間の選択後、ＧＦＰおよび／またはＤｓＲｅｄ発現をＦＡＣＳにより分析した。
【０１３２】
蛍光活性化セルソート
ｅＧＦＰおよびＤｓＲｅｄタンパク質の一時的発現を、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）を用いてトランスフェクションの２４時間、４８時間または７２時間後に定量化し、一方、安定な細胞プールの発現を、少なくとも２週間の抗生物質選択後に測定した。細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡ中に収集し、プールし、そして無血清合成ＰｒｏＣＨＯ５培地（ＣＡＭＢＲＥＸ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中に再懸濁させた。一時発現のためにＧＦＰチャンネル（ＦＬ−１）で３５０Ｖ、ＤｓＲｅｄチャンネル（ＦＬ−３）で４５０に設定して、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）で蛍光分析を行い、一方、ＦＬ−１について２４０ＶおよびＦＬ−３について３８０Ｖの設定を使用して、安定な発現を分析した。安定なトランスフェクションについて１００，０００の事象を取得し、一時的トランスフェクションについては１０，０００の事象を取得した。ＷｉｎＭＤソフトウェアを用いてデータ処理を実施した。
【０１３３】
細胞周期分析
表示した時間で、ＤＮＡをヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した後に、ＣＨＯ細胞のフローサイトメトリーにより細胞周期状態を分析した。細胞をまず（ＰＢＳ）で洗浄し、トリプシン化し、そしてミクロ遠心分離器中、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより、１ｍｌの成長培地中に収集した。さらなるＰＢＳ洗浄後、細胞を１ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させた後、５００μｌの冷７０％エタノールを細胞懸濁液に渦状に撹拌しながら滴加することによりエタノールで固定した。試料を３０分間−２０℃でインキュベートし、そして細胞を前述同様に遠心分離した。結果として得られた細胞ペレットを、５０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡを追加した５００μｌの冷ＰＢＳ中に再懸濁させ、そしてＤＮＡを４０μｇ／ｍｌのＰＩで３０分間暗所にて染色した。細胞を次いでＰＢＳで洗浄し、遠心分離し、そして５００μｌのＰｒｏＣＨＯ５培地（ＣＡＭＢＲＥＸ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中に再懸濁させた後、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＦＬ−３チャンネル；ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）で分析した。１０，０００事象をそれぞれの試料について取得した。
【０１３４】
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション
ＦＩＳＨ（蛍光インサイチュハイブリダイゼーション）は、Ｄｅｒｏｕａｚｉら（２００６）およびＧｉｒｏｄら（２００７）で記載されているようにして実施した。手短に説明すると、１−６８ヒトＭＡＲの有無にかかわらずトランスフェクトし、そしてコルヒチンで処理した細胞から、中期染色体スプレッドを得た。ＭＡＲなしでｐＳＶ４０ＧＥＧＦＰプラスミドの直接ニック翻訳により調製したハイブリダイゼーションプローブを用いてＦＩＳＨを実施した。
【０１３５】
核およびＤＮＡの単離
核を、一時的トランスフェクション（複数可）の１、２または３日後に、６ウェルプレート中で増殖させた増殖性およびコンフルエントＣＨＯ  ＤＧ４４細胞から単離した。１×１０６細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、２体積の冷緩衝液Ａ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）２、２ｍＭのジチオトレイトール）中に再懸濁させ、そして１０分間氷上で膨張させた。Ｄｏｕｎｃｅ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｓｅｒを用いて細胞を破砕した。ホモジネートを２分間２０００ｒｐｍ、４℃にて遠心分離した。破砕した細胞のペレットを次いで１５０μｌのＰＢＳ中に再懸濁させ、緩衝液Ｂ（３０％のスクロース、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）のクッション上に置き、９分間１２００ｇで遠心分離した。核のペレットを２００μｌの緩衝液Ｃ（４０％のグリセロール、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）中に再懸濁させ、そして必要になるまで−８０℃で凍結保存した（Ｍｉｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００）。
全細胞ＤＮＡを、ＣＨＯ  ＤＧ４４安定細胞プールまたは単離された細胞核から、ＱＩＡＧＥＮ製のＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔを用いて単離した。安定な細胞プールに関して、６ウェルプレート中で増殖する１×１０６コンフルエントＣＨＯ  ＤＧ４４細胞を集めた。培養された動物細胞からの全ＤＮＡの単離についての製造業者の説明書にしたがって、ＤＮＡ抽出を実施した。単離された細胞核については、核の凍結ペレットをまず解凍し、３００ｇで５分間遠心分離して緩衝液Ｃを除去した後、安定な細胞系についてと同じプロトコルにしたがってＤＮＡ抽出を開始した。
【０１３６】
導入遺伝子コピー数測定および定量ＰＣＲ
ゲノム中に組み込まれた導入遺伝子のコピー数を測定するために、約６ｎｇのゲノムＤＮＡを、ＥＵＲＯＧＥＮＴＥＣ  Ｉｎｃ製のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ−Ｔａｑポリメラーゼキット、およびＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  ＰＣＲマシンを用いて定量ＰＣＲにより分析した。以下のプライマー：ＧＦＰ−Ｆｏｒ：ＡＣＡＴＴＡＴＧＣＣＧＧＡＣＡＡＡＧＣＣおよびＧＦＰ−Ｒｅｖ：ＴＴＧＴＴＴＧＧＴＡＡＴＧＡＴＣＡＧＣＡＡＧＴＴＧを用いてＧＦＰ  ＤＮＡを定量し、プライマーＧＡＰＤＨ−Ｆｏｒ：ＣＧＡＣＣＣＣＴＴＣＡＴ−ＴＧＡＣＣＴＣおよびＧＡＰＤＨ−Ｒｅｖ：ＣＴＣＣＡＣＧＡＣＡＴＡＣＴＣＡＧＣＡＣＣを用いてＧＡＰＤＨ遺伝子を増幅した。ＧＦＰ標的遺伝子コピー数の比を、以前に記載されているようにして、ＧＡＰＤＨ参照遺伝子に対して計算した（Ｋａｒｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７）。トランスフェクション後の核中への導入遺伝子移入を定量するために、前記と同じＧＦＰおよびＧＡＰＤＨプライマー対を用いて精製された核から抽出されたＤＮＡに関して定量ＰＣＲを実施した。
ＣＨＯゲノム配列はまだ利用可能でないので、参照として使用されるＧＡＰＤＨ遺伝子および偽遺伝子コピー数をマウスゲノムについて推定した。マウスゲノムに関するＧＡＰＤＨプライマーによって生成された１９０ｂｐのアンプリコンのＤＮＡ配列のＮＣＢＩソフトウェアを用いて実施したＢＬＡＳＴ分析によりアラインメントを実施し、これにより、ハプロイドゲノムあたり８８ヒットが得られた。ＣＨＯ  ＤＧ４４は近二倍体細胞であるので（Ｄｅｒｏｕａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６）、本発明者らは１７６コピーのＧＡＰＤＨ遺伝子および偽遺伝子がＣＨＯ  ＤＧ４４細胞のゲノム中に存在すると推定する。この数値を、ＧＦＰ導入遺伝子コピー数を定量するための正規化基準として使用した。
【０１３７】
共焦点顕微鏡法
ｐＧＥＧＦＰｃｏｎｔｒｏｌおよびｐ１−６８（ＮｃｏＩ  ｆｉｌｌｅｄ）ＳＶ４０ＥＧＦＰプラスミドを、Ｌａｂｅｌ  ＩＴ  Ｔｒａｃｋｅｒ  ＴＨ−Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｋｉｔによりローダミンで、またはＬａｂｅｌ  ＩＴ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｃｙ  ５  Ｋｉｔ（ＭＩＲＵＳ，  ＭＩＲＵＳＢＩＯ）によりＣｙ５で、のいずれかで、製造業者のプロトコルにしたがって標識し、エタノール沈殿により精製した。トランスフェクションに関して、ＤＮＡトランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を用い、供給業者の説明書にしたがって実施した。トランスフェクションの３時間、６時間および２１時間後、培地を除去し、細胞を４％パラホルムアルデヒドで室温にて１５分間固定した。必要であれば、細胞を、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｒｅｄ  ＤＮＤ−９９（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）で７５ｎＭの最終濃度にて３０分間処理した後、固定し、製造業者の説明書にしたがって酸性細胞小器官（たとえば、エンドソームおよびリソソーム）を染色した。固定された細胞を次いでＰＢＳで２回洗浄し、ＤＡＰＩ／Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｄ溶液中にマウントして、核を染色した。
６３ｘ
ＮＡ１．４プランアクロマート対物レンズを備えたＣＡＲＬ  ＺＥＩＳＳ  ＬＳＭ  ５１０  Ｍｅｔａ倒立共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて蛍光および明視野画像を取得した。カバーガラスの底面から細胞の表面までのＺシリーズ画像を取得した。各８ビットＴＩＦＦ画像をＩｍａｇｅＪソフトウェアに移して、対象の各領域の全輝度および画素面積を定量化した。データ分析のためにサイトゾルｓｉ（ｃｙｔ）、核ｓｉ（ｎｕｃ）およびリソソームｓｉ（ｌｙｓ）における各クラスターの画素面積を各ＸＹ平面で別々に合計した。これらの値（それぞれ、Ｓ’Ｚ＝ｊ（ｃｙｔ）、Ｓ’Ｚ＝ｊ（ｎｕｃ）およびＳ’Ｚ＝ｊ（ｌｙｓ））を画像のＺシリーズのすべてにわたってさらに合計し、それぞれ、Ｓ（ｃｙｔ）、Ｓ（ｎｕｃ）およびＳ（ｌｙｓ）と表示した。細胞における標識されたｐＤＮＡのクラスターの全画素面積Ｓ（ｔｏｔ）を、Ｓ（ｃｙｔ）、Ｓ（ｎｕｃ）およびＳ（ｌｙｓ）の合計として計算した。各コンパートメント中のｐＤＮＡの割合を、Ｆ（ｋ）＝Ｓ（ｋ）／Ｓ（ｔｏｔ）（式中、Ｓ（ｔｏｔ）は各細胞内コンパートメント（核、サイトゾルまたはリソソーム）を表す）として計算した。
【０１３８】
ＩＩ．導入遺伝子発現産物分泌
プラスミドおよび構築物
発現ベクターは、アンピシリン耐性を付与するＴｒａｎｓｐｏｓｏｎ  Ｔｎ３（ＡｍｐＲ）からの細菌ベータ−ラクタマーゼ遺伝子、および細菌性ＣｏｌＥ１複製起源を含む。ｐＧＬ３  Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＰＲＯＭＥＧＡ）の誘導体として、ベクターのターミネーター領域は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの下流に位置するＳＶ４０エンハンサーを有する。ヒトガストリンターミネーターをＳＶ４０ｐｏｌｙＡシグナルとＳＶ４０エンハンサーとの間に挿入した。各ベクターは、発現カセットに隣接する２つのヒト１＿６８ＳＧＥおよびＳＶ４０プロモーターの制御下で組み込まれたピューロマイシン耐性遺伝子も含む。すべてのベクターはｈＧＡＰＤＨプロモーターの制御下でＧＯＩをコード化する（図１０）。
異なるクローンされた導入遺伝子を、Ｐｗｏ  ＳｕｐｅｒＹｉｅｌｄ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｋｉｔを製造業者の説明書（ＲＯＣＨＥ）にしたがって使用し、テンプレートとしてヒトユニバーサルｃＤＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ（登録商標））および発現ベクター中へのクローニングのための適合性制限部位を有する５’尾部を有するＣＤＳの５’および３’末端に対する特異的プライマー（ＭＩＣＲＯＳＹＮＴＨ  ＡＧ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、表１を参照）を使用して、ＰＣＲにより増幅した。
ＰＣＲ産物および発現ベクターを適切な制限酵素（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳまたはＰＲＯＭＥＧＡ）により消化した。消化されたＤＮＡを１％ｗ／ｖのアガロース（ＥＵＲＯＢＩＯ，  ＣＨＥＭＩＥ  ＢＲＵＮＳＣＨＷＥＩＧ  ＡＧ）ゲル上で電気泳動に付した。ベクターバンドおよび消化されたＰＣＲ産物を、ＤＮＡを損なわない調製用ＵＶランプ（（ＵＬ−６Ｌ，  ＶＩＬＢＥＲ  ＬＯＵＲＭＡＴ））下での可視化によりゲルから切り出し、１．５ｍＬの微細管中に移し、製造業者の説明書にしたがって標準的技術（ＷＩＺＡＲＤ  ＳＶ  ＧｅｌおよびＰＣＲ  ＣｌｅａｎＵｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）、ＰＲＯＭＥＧＡ）を用いて精製した。
精製された両フラグメント（消化されたＳｅｌｅｘｉｓ（商標）発現ベクターおよびＰＣＲ産物）を、ＬｉｇａＦａｓｔ（商標）  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＰＲＯＭＥＧＡ）を用い、１０μＬの最終体積で５分間、ＲＴ（＝室温）にて製造業者の説明書にしたがってライゲートした。全ライゲーション混合物を使用して、５０μＬのコンピテントＤＨ５アルファ細胞（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を製造業者の説明書にしたがって変換した。新たに作製されたプラスミドの完全性および適切な構造を制限分析によってチェックした。１つの細菌クローンを、プラスミドＤＮＡのバルク抽出のために振盪管中、５ｍＬのＬＢ＋１００μｇ／ｍＬのアンピシリン中で増殖させた。製造業者の説明書にしたがってＷＩＺＡＲＤ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓキット（ＰＲＯＭＥＧＡ）を使用して、プラスミドを抽出した。プラスミドの完全性は、ＧＯＩおよび関連するフランキング配列をシーケンシングすることによって確認した。
確認したら、標準的ＤＮＡ単離キット（ＪＥＴＳＴＡＲ  ２．０，  ＧＥＮＯＭＥＤ）を用い、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを追加したＬＢ中１５０ｍＬの一夜培養物から、ベクターのマキシプレパレーション（ｍａｘｉｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）を実施して、非常に純粋なプラスミドＤＮＡを得た。精製後、ＤＮＡを３００μＬの滅菌脱イオン水中に再懸濁させた。ＰｖｕＩ消化によって線形化を実施し、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡアッセイキット（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ／  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いてＤＮＡ定量化を実施した。
【０１３９】
【表１】
2013505013.tif 000002
【０１４０】
ＣＨＯ細胞のトランスフェクションおよび安定な形質転換体の選択
ＣＨＯ細胞をトランスフェクションの１日前に３００，０００細胞／ｍｌの密度で継代した。トランスフェクション当日に、細胞を計数し、５１０，０００個の細胞を遠心分離によって収集した。上清を除去し、細胞ペレットを３０ｕｌの再懸濁緩衝液（Ｂｕｆｆｅｒ  Ｒ、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）中に再懸濁させた。試験される１つのタンパク質をコード化する線形化プラスミド（４マイクログラム）を細胞に添加し、ＤＩＧＩＴＡＬ  ＢＩＯ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ製のＭｉｃｒｏｐｏｒａｔｏｒミニ装置を用いて細胞をエレクトロポーレートした。エレクトロポーレーションに使用した設定は、１２３０ボルト、２０ｕｓおよび３パルスであった。
【０１４１】
エレクトロポーレートされた細胞を、８ｍＭのグルタミンおよび２ｘＨＴを追加した３ｍｌの培地（ＳＦＭ４ＣＨＯ、Ｈｙｃｌｏｎｅ（商標））を含む６ウェルプレート中で培養した。トランスフェクションの１日後に、５００ｕｇ／ｍｌのＧ４１８を培地に添加することによって、安定な形質転換体の選択を開始した。培養の第３日に、遠心分離によって細胞を収集し、培地を、抗生物質を追加した１０ｍｌの新しい培地と取り替えた。１週間後、１．５×１０６の細胞を、抗生物質を追加した５ｍｌの培地を含む５０ｍｌのミニ反応試験管（ＴＢＳ）中に移し、振盪インキュベーター中でインキュベートした。１週間に２回継代することによって、培養を維持した。継代培養に際して、細胞の数を記録し、生成物の濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。これらの数値を使用して、試験される種々のタンパク質の効果を比較するために比生産性を計算した。
【０１４２】
本発明を図面および対応する記載に基づいて詳細に説明し、記載しているが、この説明およびこの詳述は実例や典型例であり、本発明を限定するものではないと理解されるべきである。当業者が以下の請求の範囲から逸脱することなく変更および適用を実施できることは自明である。特に、本発明は、種々の実施形態と関連して本明細書中で記載される特性の任意の組み合わせの実施形態も含む。
【０１４３】
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Ｄｕｐｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）．  Ｔｗｏ−ｓｔｅｐ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＴＭ  ｂｙ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｍｒｅ１１−Ｒａｄ５０−Ｎｂｓ１  ｃｏｍｐｌｅｘ．  Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １３，  ４５１−４５７．
Ｅｓａｓｈｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）．  Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＡＤ５１  ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｉｌａｍｅｎｔｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ＢＲＣＡ２．  Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １４，  ４６８−４７４．
Ｆｏｌｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｎｏｎｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｅｘｃｈａｎｇｅｓ  ｏｆ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ＤＮＡ  ｄｕｐｌｅｘｅｓ  ｃｏｉｎｊｅｃｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅｉ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，  ５，  ５９−６９．
Ｆｕｓｃｏ，  Ｃ．，  Ｒｅｙｍｏｎｄ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｚｅｒｖｏｓ，  Ａ．  Ｓ．  （１９９８）．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５１，  ３５１−３５８．
Ｇａｌｂｅｔｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  ＭＡＲ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｉｎａｃｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｓｙｓｔ，  ５，  １４３−１５０．
Ｇｉｌｍｏｒｅ，  Ｒ．，  Ｇ．  Ｂｌｏｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８２）．  “Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ａｃｒｏｓｓ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ．  Ｉ．  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ．”  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９５（２  Ｐｔ  １）：  ４６３−９．
Ｇｉｌｍｏｒｅ，  Ｒ．，  Ｐ．  Ｗａｌｔｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８２）．  “Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ａｃｒｏｓｓ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ．  ＩＩ．  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．”  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９５（２  Ｐｔ  １）：  ４７０−７．
Ｇｉｒｏｄ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ４，  ７４７−７５３．
Ｇｉｒｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｌｙｓｏｚｙｍｅ  ５‘  ｍａｔｒｉｘ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｈｉｇｈ  ｐｒｏｄｕｃｅｒ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，  ９１，  １−１１．
Ｇｏｌｚｉｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｃｅｌｌ  ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄ．    Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  （ＢＢＡ）  −  Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，  Ｖｏｌｕｍｅ  １５６３  （１−２），  Ｐａｇｅｓ  ２３−２８．
Ｇｏｔｔｌｉｅｂ，  Ｔ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ，  Ｓ．  Ｐ．  （１９９３）．  Ｔｈｅ  ＤＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ：  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｅｎｄｓ  ａｎｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｋｕ  ａｎｔｉｇｅｎ．  Ｃｅｌｌ  ７２，  １３１−１４２．
Ｇｒａｗｕｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）．  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  ＩＶ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＸＲＣＣ４  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３８８，  ４９２−４９５．
Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）．  Ｍｕｌｔｉｆａｃｔｏｒｉａｌ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ａｎ  ａｃｕｔｅ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｂｙ  ＢＲＣＡ１／ＢＡＲＤ１−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２０，  ３４−４６  
Ｇｒｏｓｊｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）．  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｅｎｃｙ  ｕｓｉｎｇ  Ｃａ／ＰＯ４．  Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３８．
Ｈａｒｔ，  Ｃ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｌａｅｍｍｌｉ，  Ｕ．Ｋ．  （１９９８）  Ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｂｙ  ＳＡＲｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ，  ８，  ５１９−５２５．
Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，  Ｓ．  （１９９６）  Ｄｏｓａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｅｆｆｅｃｔ  ｖａｒｉｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ．  Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，  １８，  ４０１−４０９．
Ｈｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  Ｒａｄ５１Ｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  ３４，  １３５８−１３６８．
Ｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）．  ＤＮＡ  ｅｎｄ  ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ，  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｒｅｑｕｉｒｅ  ＣＤＫ１．  Ｎａｔｕｒｅ  ４３１，  １０１１−１０１７．
Ｊａｃｋｓｏｎ，  Ｄ．Ａ．  （１９９７）  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ：  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｎｕｃｌｅｉ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐ，  ２４，  ２０９−２２０．
Ｊａｙａｔｈｉｌａｋａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ａ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｔｈａｔ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＲＡＤ５１．  ＰＮＡＳ  １０５  （４１），  １５８４８−１５８５３．
Ｊｅｇｇｏ，  Ｐ．Ａ．  （１９９７）  ＤＮＡ−ＰＫ：  ａｔ  ｔｈｅ  ｃｒｏｓｓ−ｒｏａｄｓ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ．  Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ，  ３８４，  １−１４．
Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）．  Ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ  ｃｈａｒｇｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｐｌａｃｅｄ  ｎｅｘｔ  ｔｏ  ａ  ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂｌｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｍｏｒｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｔｈａｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ．  Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２３９（１−２），  ２５１−６．
Ｋａｌｏｓ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，  Ｒ．Ｅ．  （１９９５）  Ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｂｏｕｎｄａｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｄｏｍａｉｎ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，  １５，  １９８−２０７．
Ｋａｒｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）．  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ．  ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，  ８，  １３１．
Ｋａｕｆｍａｎ，  Ｒ．Ｊ．  （２０００）．  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  １６，  １５１−１６０．
Ｋｅｅｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）．  Ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７０，  ７５５−７５．
Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）．  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  １０７，  ９５−１０５．
Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．    （２００６）．  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＭＲＮ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｎｄ  ＭＤＣ１  ｄｕｒｉｎｇ  ｅａｒｌｙ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．  Ｍｏｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｇ  ４５，  ４０３−４０８．
Ｋｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）．  Ｘｒｃｃ４  ｐｈｙｓｉｃａｌｌｙ  ｌｉｎｋｓ  ＤＮＡ  ｅｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｂｙ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  ＩＶ．  Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２３，  ３８７４−３８８５．
Ｋｒａｐｐｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｅｕｋａｒｙｏｔ．  Ｃｅｌｌ．  ５：２１２−２１５．
Ｌａｋｋａｒａｊｕ，  Ａ．  Ｋ．，  Ｃ．  Ｍａｒｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）．  “ＳＲＰ  ｋｅｅｐｓ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｂｙ  ｓｌｏｗｉｎｇ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｍａｔｃｈ  ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ＥＲ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ．"
Ｃｅｌｌ  １３３（３）：  ４４０−５１．
Ｌａｖｉｎ，  Ｍ．  Ｆ．  （２００７）．  ＡＴＭ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｍｒｅ１１  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｏｍｂｉｎｅ  ｔｏ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌ  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２６，  ７７４９−７７５８．
Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）．  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｌａｍｂｄａ  ｉｎ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ−ｂａｓｅｄ  ｇａｐ  ｆｉｌｌｉｎｇ  ｆｏｒ  ｎｏｎｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ＤＮＡ  ｅｎｄ  ｊｏｉｎｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｘｔｒａｃｔｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９，  ８０５−８１１．
Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）．  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ＤＮＡＰＫ−  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  −ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌl ｃｙｃｌｅ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １７，  １４２５−１４３３．
Ｌｉｍｂｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）．  Ｃｔｐ１  ｉｓ  ａ  ｃｅｌｌ−ｃｙｃｌｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈａｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｍｒｅ１１  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｔｏ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ  ｂｙ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２８，  １３４−１４６．
Ｌｉｕ，  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｌｅｅ，  Ｗ．  Ｈ．  （２００６）．  ＣｔＩＰ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｉｔｓ  ｏｗｎ  ａｎｄ  ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｖｉａ  ｔｈｅ  Ｅ２Ｆ／ＲＢ  ｐａｔｈｗａｙ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｇ１／Ｓ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２６，  ３１２４−３１３４．
Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）．  Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲａｄ５０  ｃａｕｓｅｓ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｅｔｈａｌｉｔｙ，  ａｂｎｏｒｍａｌ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｉｏｎｉｚｉｎｇ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９６，  ７３７６−７３８１．
Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）．  Ｈａｉｒｐｉｎ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｏｖｅｒｈａｎｇ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｂｙ  ａｎ  Ａｒｔｅｍｉｓ／ＤＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｉｎ  ｎｏｎｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｄ  ｊｏｉｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｖ（Ｄ）Ｊ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ  １０８，  ７８１−７９４．
Ｍｉｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）．  Ｈ１９  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ  ｂｙ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲＮＡ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  １９，  ５８１０−５８１６．
Ｍｉｒｚｏｅｖａ，  Ｏ．  Ｋ．，  ａｎｄ  Ｐｅｔｒｉｎｉ，  Ｊ．  Ｈ．  （２００３）．  ＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｒｅ１１  ｃｏｍｐｌｅｘ．  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １，  ２０７−２１８．
Ｍｏｈａｎ  ｅｔ  ａｌ  （２００７）．  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌｓ：  ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．    Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ９８（３），  ６１１−６１５．
Ｍｏｎｆｅｒｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）．  Ｔｈｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＤＮＡ  ｒｅｐａｉｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｕ  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ９．  Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２３，  ３７５８−３７６８．
Ｍｏｏｒｅ，  Ｊ．  Ｋ．，  ａｎｄ  Ｈａｂｅｒ，  Ｊ．  Ｅ．  （１９９６）．  Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｏｆ  ｎｏｎｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｄ−ｊｏｉｎｉｎｇ  ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋｓ ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６，  ２１６４−２１７３．
Ｍｏｓｈｏｕｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）．  Ａｒｔｅｍｉｓ，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ／Ｖ（Ｄ）Ｊ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ｉｓ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．  Ｃｅｌｌ  １０５，  １７７−１８６．
Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）．  Ｔｈｅ  ｄｏｕｂｌｅ  ｌｉｆｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｋｕ  ｐｒｏｔｅｉｎ：  ｆａｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ＤＮＡ  ｂｒｅａｋｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ４，  ４３８−４４１．
Ｎｅｗｔｏｎ，  Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ａ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ｍｕｔａｎｔ  ｏｆ  ＦＡＤＤ／ＭＯＲＴ１  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ  ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｔｕｒｅ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １７（３）：７０６−１８．
Ｎｉｋｊｏｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）．  Ｔｒａｃｋ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｎ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｂｉｏｌｏｇｙ：  ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄｉａｔ  Ｂｉｏｌ  ７３，  ３５５−３６４．
Ｏ‘Ｄｒｉｓｃｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）．  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  ＩＶ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｄｅｌａｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ８，  １１７５−１１８５．
Ｏ‘Ｄｒｉｓｃｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）．  Ａ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｔａｘｉａ−ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ  ａｎｄ  Ｒａｄ３−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＡＴＲ）  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  Ｓｅｃｋｅｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ． Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３３，  ４９７−５０１．
Ｐｉｅｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｋｕ  ＤＮＡ  ｅｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ，  １５，  ３２３７−３２４２．
Ｐｏｏｌ，  Ｍ．  Ｒ．，  Ｊ．  Ｓｔｕｍｍ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）．  “Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｍｏｄｅｓ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ．”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７（５５８５）：  １３４５−８．
Ｒａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｍｒｅ１１  ｉｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｎｏｎｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｄ  ｊｏｉｎｉｎｇ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １６，  ８１９−８２４．
Ｒｅｃｉｌｌａｓ−Ｔａｒｇａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｅｆｆｅｃｔ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｉｎｓｕｌａｔｏｒ  ａｒｅ  ｓｅｐａｒａｂｌｅ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，  ９９，  ６８８３−６８８８．
Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｖａｒｉｅｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｏｂｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，  ９２，  ５３７１−５３７５．
Ｓａｒｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）．  Ｈｕｍａｎ  ＣｔＩＰ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ＤＮＡ  ｅｎｄ  ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４５０，  ５０９−５１４．
Ｓｃｈａｅｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）．  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅ１Ａ  （ＣｔＢＰ）  ａｎｄ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ  ｂｙ  Ｅ１Ａ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ＰＬＤＬＳ  ｍｏｔｉｆ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３，  ８５４９−８５５２．
Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）．  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＲＡＤ５１  ａｎｄ  ＲＡＤ５２  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１，  １４８−１５２．
Ｓｏｎｇ，  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｓｕｎｇ，  Ｐ．  （２０００）．  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ａｍｏｎｇ  ｙｅａｓｔ  Ｒａｄ５１  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ，  Ｒａｄ５２  ｍｅｄｉａｔｏｒ，  ａｎｄ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｓｔｒａｎｄ  ｅｘｃｈａｎｇｅ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５，  １５８９５−  １５９０４．
Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）．  Ｔｈｅ  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ  ｇｅｎｅ  ｈＭＲＥ１１  ｉｓ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｉｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ａｔａｘｉａ−ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ−ｌｉｋｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ．  Ｃｅｌｌ  ９９，  ５７７−５８７．
Ｓｔｉｆｆ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）．  ＡＴＭ  ａｎｄ  ＤＮＡ−ＰＫ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｄｕｎｄａｎｔｌｙ  ｔｏ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅ  Ｈ２ＡＸ  ａｆｔｅｒ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  ｉｏｎｉｚｉｎｇ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４，  ２３９０−２３９６．
Ｓｕｇｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）．  Ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｎｅｅｄｅｄ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｒａｄ５１  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２，  ７９４０−７９４５．
Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）．  Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ３‘−ｏｖｅｒｈａｎｇｉｎｇ，  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｍｅｉｏｓｉｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ＡＲＧ４  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ．  Ｃｅｌｌ  ６４，  １１５５−１１６１．
Ｓｕｎｇ，  Ｐ．，  ａｎｄ  Ｋｌｅｉｎ，  Ｈ．  （２００６）．  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ：  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｈｅｌｉｃａｓｅｓ  ｔａｋｅ  ｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７，  ７３９−７５０．
Ｓｙｍｉｎｇｔｏｎ，  Ｌ．  Ｓ．  （２００２）．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＲＡＤ５２  ｅｐｉｓｔａｓｉｓ  ｇｒｏｕｐ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ６６，  ６３０−６７０．
Ｓｚｏｓｔａｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  Ｔｈｅ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ−ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ，  ３３，  ２５−３５．
Ｔａｋａｔａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｄ−ｊｏｉｎｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ  ｈａｖｅ  ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｉｎ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｃｅｌｌｓ．  Ｅｍｂｏ  Ｊ，  １７，  ５４９７−５５０８．
Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）．  Ｃｔｐ１／ＣｔＩＰ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＭＲＮ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｌ  ｓｔｅｐｓ  ｏｆ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２８，  ３５１−３５２．
Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｄ‘Ａｎｄｒｅａ，  Ａ．  Ｄ．  （２００６）．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｆａｎｃｏｎｉ  ａｎｅｍｉａ：  ｒｅｃｅｎｔ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ．  Ｂｌｏｏｄ  １０７，  ４２２３−４２３３．
Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）．  Ａｔａｘｉａ−ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ−ｌｉｋｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ  （ＡＴＬＤ）−ｉｔｓ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ．  ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ  （Ａｍｓｔ）  ３，  １２１９−１２２５．
Ｔｏｕｒｎｅｕｒ  ａｎｄ  Ｃｈｉｏｃｃｈｉａ      （２０１０）．  ＦＡＤＤ：  ａ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｌｉｆｅ  ａｎｄ  ｄｅａｔｈ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ３１，  ２６０−２６９．
Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｐｌｏｉｄ  ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｌｏｃｕｓ  ｆｒｏｍ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｅｌｌ，  ３３，  ４０５−４１２．
Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）．  Ｔｈｅ  ＭＲＮ  ｃｏｍｐｌｅｘ：  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｂｒｏｋｅｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ．  ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ  ４，  ８４４−８４９．
Ｗａｋｉｍｏｔｏ，  Ｂ．Ｔ．  （１９９８）  Ｂｅｙｏｎｄ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ：  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｅｆｆｅｃｔ  ｖａｒｉｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ．  Ｃｅｌｌ，  ９３，  ３２１−３２４．
Ｗａｌｔｅｒ，  Ｐ．  ａｎｄ  Ｇ．  Ｂｌｏｂｅｌ  （１９８１）．  “Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｃｒｏｓｓ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ＩＩＩ．  Ｓｉｇｎａｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＳＲＰ）  ｃａｕｓｅｓ  ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｒｒｅｓｔ  ｏｆ  ｃｈａｉｎ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｒｅｌｅａｓｅｄ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．”  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９１（２  Ｐｔ  １）：  ５５７−６１．  
Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５ａ）．  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  ＩＩＩ  ａｓ  ａ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｂａｃｋｕｐ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｏｆ  ｎｏｎｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｄ  ｊｏｉｎｉｎｇ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５，  ４０２０−４０３０．
Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５ｂ）．  Ａｒｔｅｍｉｓ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ａ  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ  ｄｅｆｅｃｔ  ａｎｄ  Ａｒｔｅｍｉｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｕｓ  ｉｓ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．  ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ  （Ａｍｓｔ）  ４，  ５５６−５７０．
Ｗａｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．  ＡＴＭ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ５３  ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  １４−３−３  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １９，  １７５−１７８．
Ｗｅｓｔ，  Ｓ．Ｃ．  （２００３）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｖｉｅｗｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，  ４，  ４３５−４４５．
Ｗｈｉｔｅ，  Ｃ．  Ｉ．，  ａｎｄ  Ｈａｂｅｒ，  Ｊ．  Ｅ．  （１９９０）．  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍａｔｉｎｇ  ｔｙｐｅ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．  Ｅｍｂｏ  Ｊ  ９，  ６６３−６７３
Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）．  Ｍｒｅ１１−Ｒａｄ５０−Ｎｂｓ１  ｉｓ  ａ  ｋｅｙｓｔｏｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ｒｅｐａｉｒ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ，  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｔｅｍｐｌａｔｅ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８５，  ５０９−５２０．
Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）．  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ  Ｒａｄ３２，  ｔｈｅ  Ｍｒｅ１１  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ，  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｄ  ｊｏｉｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ｌｅｎｇｔｈ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２７，  ２６５５−２６６１．  
Ｗｏｌｄ，  Ｍ．  Ｓ．  （１９９７）．  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ：  ａ  ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃ，  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ＤＮＡ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６６，  ６１−９２．  
Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ＢＲＣＡ１  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １７，  ２２７９−２２８５．
Ｗｏｎｇ，  Ｅ．Ａ．  ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，  Ｍ．Ｒ．  （１９８６）  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ．  Ｓｏｍａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ，  １２，  ６３−７２．
Ｗｕ，  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｌｅｅ，  Ｗ．  Ｈ．  （２００６）．  ＣｔＩＰ，  ａ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ａｄａｐｔｏｒ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ５，  １５９２−１５９６．
Ｘｉａｏ，  Ｙ．，  ａｎｄ  Ｗｅａｖｅｒ，  Ｄ．  Ｔ．  （１９９７）．  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ  Ｍｒｅ１１  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５，  ２９８５−２９９１．
Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）．  ＩｇＨ  ｃｌａｓｓ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｓ  ｕｓｅ  ａ  ｒｏｂｕｓｔ  ｎｏｎ−ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｅｎｄ−ｊｏｉｎｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４４９，  ４７８−４８２．
Ｙａｎｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）．  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｗｉｔｈ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｗｉｔｈ  Ｋｕ：  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ａｔｏｍｉｃ−ｆｏｒｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ．  Ｅｍｂｏ  Ｊ  １６，  ５０９８−５１１２
Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）．    ｐ３００／ＣＢＰ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｃｏｍｐｅｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ１Ａ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３８２，  ３１９−３２４．
Ｙａｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  ＳＡＴＢ１  ｔａｒｇｅｔｓ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ｔｏ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｇｅｎｅｓ  ｏｖｅｒ  ｌｏｎｇ  ｄｉｓｔａｎｃｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ４１９，  ６４１−６４５．
Ｙｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）．  ＣｔＩＰ  ｌｉｎｋｓ  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｔｏ  ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ３６，  ９５４−９６９．
Ｙｕｎ，  Ｍ．  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｈｉｏｍ，  Ｋ．  （２００９）．  ＣｔＩＰ−ＢＲＣＡ１  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｃｈｏｉｃｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ  ｐａｔｈｗａｙ  ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４５９，  ４６０−４６３．
Ｚａｈｎ−Ｚａｂａｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｔａｂｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ８７，  ２９−４２．
Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）．  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｉｊｍｅｇｅｎ  ｂｒｅａｋａｇｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｇｅｎｅ  ＮＢＳ１  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｅａｒｌｙ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｌｅｔｈａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １１，  １０５−１０９．
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ−１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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