(57)【要約】  本発明は、特にＤｋｋ１またはＳＯＳＴとＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６の結合を阻害することにより、Ｗｎｔシグナル経路を調節する方法と組成物を提供する。
2013544798.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列Ｘ０Ｘ１Ｘ２Ｘ３を含み、ここでＸ０はＮであり；Ｘ１はＡ、Ｓ、Ｆ、Ｔ、Ｙ、ＬもしくはＫまたはＲであり；Ｘ２はＩまたはＶであり；Ｘ３はＫ、ＲまたはＨである、単離されたペプチド。
【請求項２】
ペプチドがアミノ酸配列Ｘ１Ｘ０Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４を含み、ここでＸ−１はＰ、Ｓ、ＣまたはＧであり；Ｘ０はＮであり；Ｘ１はＡ、Ｓ、Ｆ、Ｔ、Ｙ、ＬもしくはＫまたはＲであり；Ｘ２はＩまたはＶであり；Ｘ３はＫ、ＲまたはＨであり；Ｘ４はＦ、Ｔ、Ｙ、ＬまたはＶである、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
ペプチドがＮ Ｘ１ＩＫ、Ｎ Ｘ１ＶＫ、Ｎ Ｘ１ ＩＲ、Ｎ Ｘ１ ＶＲ、Ｎ Ｘ１ ＩＨおよびＮ Ｘ１ＶＨからなる群より選ばれるアミノ酸配列を含み、ここでＸ１はＡ、Ｓ、Ｆ、Ｔ、Ｙである、請求項１記載のペプチド。
【請求項４】
ペプチドがファミリー１のペプチド（図１）からなる群より選ばれる、請求項１記載のペプチド。
【請求項５】
ペプチドの少なくとも１のアミノ酸がアミノ酸アナログで置換される、請求項４記載のペプチド。
【請求項６】
ペプチドがアミノ酸アナログを含む、請求項１記載のペプチド。
【請求項７】
ペプチドがＤｋｋ１とＬＲＰの結合を阻害するが、Ｗｎｔ９ＢとＬＲＰ６の結合を阻害しない、請求項１記載のペプチド。
【請求項８】
ペプチドがＬＲＰ６のＥ１ β-プロペラに結合する、請求項１記載のペプチド。
【請求項９】
ペプチドがＬＲＰ６のＥ１ β-プロペラのアミノ酸残基Ｒ２８、Ｅ５１、Ｄ５２、Ｖ７０、Ｓ７１、Ｅ７３、Ｌ９５、Ｓ９６、Ｄ９８、Ｅ１１５、Ｒ１４１およびＮ１８５の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１またはすべてと相互作用する、請求項８記載のペプチド。
【請求項１０】
アミノ酸配列：Ｘ０Ｘ１Ｘ２Ｘ３を含み、ここでＸ０はＮであり；Ｘ１はＦ、Ｙ、Ｌ、Ａ、ＲまたはＳであり；Ｘ２はＩまたはＶであり；Ｘ３はＫ、ＲまたはＨである、単離された環状ペプチド。
【請求項１１】
環状ペプチドがアミノ酸配列Ｘ−１Ｘ０Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４を含み、ここでＸ−１はＰ、Ｓ、ＣまたはＧであり；Ｘ０はＮであり；Ｘ１はＦ、Ｙ、Ｌ、Ａ、ＲまたはＳであり；Ｘ２はＩまたはＶであり；Ｘ３はＫ、ＲまたはＨであり；Ｘ４はＦ、Ｔ、Ｙ、ＬまたはＶである、請求項１０記載の環状ペプチド。
【請求項１２】
環状ペプチドがＮ Ｘ１ＩＫ、Ｎ Ｘ１ＶＫ、Ｎ Ｘ１ ＩＲ、Ｎ Ｘ１ ＶＲ、Ｘ１ ＩＨおよびＮ Ｘ１ＶＨからなる群のアミノ酸配列を含み、ここでＸ１はＦ、Ｙ、Ｌ、Ａ、ＲまたはＳである、請求項１０記載の環状ペプチド。
【請求項１３】
ペプチドがファミリー２のペプチド（図２）からなる群より選ばれる、請求項１０記載の環状ペプチド。
【請求項１４】
ペプチドの少なくとも１のアミノ酸がアミノ酸アナログで置換される、請求項１３記載の環状ペプチド。
【請求項１５】
ペプチドがアミノ酸アナログを含む、請求項１０記載の環状ペプチド。
【請求項１６】
ペプチドがＤｋｋ１とＬＲＰの結合を阻害するが、Ｗｎｔ９ＢとＬＲＰ６の結合を阻害しない、請求項１０記載の環状ペプチド。
【請求項１７】
ペプチドがＬＲＰ６のＥ１ β-プロペラに結合する、請求項１０記載の環状ペプチド。
【請求項１８】
ペプチドがＬＲＰ６のＥ１ β-プロペラのアミノ酸残基Ｒ２８、Ｅ５１、Ｄ５２、Ｖ７０、Ｓ７１、Ｅ７３、Ｌ９５、Ｓ９６、Ｄ９８、Ｅ１１５、Ｒ１４１およびＮ１８５の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１またはすべてと相互作用する、請求項１０記載の環状ペプチド。
【請求項１９】
アミノ酸配列：Ｘ−１Ｘ０Ｘ１Ｘ２を含み、ここでＸ−１はＷ、Ｌ、Ｙ、ＦまたはＩであり；Ｘ０はＤまたはＥであり；Ｘ１はＦ、Ｗ、Ｉ、ＳまたはＹであり；Ｘ２はＭである、単離されたペプチド。
【請求項２０】
ペプチドがアミノ酸配列：Ｘ−２Ｘ−１Ｘ０Ｘ１Ｘ２Ｘ３を含み、ここでＸ−２はＶ、Ｉ、ＬまたはＦであり；Ｘ−１はＷ、Ｌ、Ｙ、ＦまたはＩであり；Ｘ０はＤまたはＥであり；Ｘ１はＦ、Ｗ、Ｉ、ＳまたはＹであり；Ｘ２はＭであり；Ｘ３はＷ、Ｍ、ＡまたはＧである、請求項１９記載のペプチド。
【請求項２１】
ペプチドがファミリー３のペプチド（図３）からなる群より選ばれる、請求項１９記載のペプチド。
【請求項２２】
ファミリー４のペプチド（図４）からなる群より選ばれる、単離されたペプチド。
【請求項２３】
試験化合物をＬＲＰ６またはその機能的等価物に接触させることと、
Ｄｋｋ１とＬＲＰ６との相互作用を阻害するペプチドリガンドの存在下および不在下で、試験化合物とＬＲＰ６またはその機能的等価物との結合度を決定することを含み、
ここでペプチドリガンドの存在下または不在下での結合度の変化は、試験化合物がＤｋｋ１とＬＲＰ６との相互作用を阻害することを示し、
ここでペプチドリガンドが
ａ）ファミリー１（図１）；
ｂ）ファミリー２（図２）；
ｃ）ファミリー３（図３）；および
ｄ）ファミリー４（図４）
のアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含む、
Ｄｋｋ１とＬＲＰ６との相互作用を阻害する化合物のスクリーニング法。
【請求項２４】
ペプチドリガンドが検出可能な標識で標識される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
試験化合物をＬＲＰ５またはその機能的等価物に接触させることと、
Ｄｋｋ１とＬＲＰ５との相互作用を阻害するペプチドリガンドの存在下および不在下で、試験化合物とＬＲＰ５またはその機能的等価物との結合度を決定することを含み、
ここでペプチドリガンドの存在下または不在下での結合度の変化は、試験化合物がＤｋｋ１とＬＲＰ５との相互作用を阻害することを示し、
ここでペプチドリガンドが
ａ）ファミリー１（図１）；
ｂ）ファミリー２（図２）；
ｃ）ファミリー３（図３）；および
ｄ）ファミリー４（図４）
のアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含む、
Ｄｋｋ１とＬＲＰ５との相互作用を阻害する化合物のスクリーニング法。
【請求項２６】
ペプチドリガンドが検出可能な標識で標識される、請求項２５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２０１０年１０月２０日に出願された米国特許仮出願第６１／３９４８４０号の利益を主張するものであり、該仮出願の開示はその全体を参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は一般にＷｎｔ経路調節の分野に関する。より具体的には、本発明はＷｎｔシグナル経路のモジュレーターおよび前記モジュレーターの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｗｎｔ／β-カテニンシグナル経路は、胎発生から成体生物の恒常性維持まで重要であり、調節されなければ骨粗鬆症から癌まで様々な疾患を誘発しうる（１〜４）。当初ｉｎｔ−１と命名された最初のＷｎｔ遺伝子（５）は１９８２年に発見され、後にショウジョウバエにおけるそのホモログＷｇの発見後、Ｗｎｔ遺伝子ファミリーの創設メンバーとして再分類された（６、７）。過去３０年間で、Ｗｎｔ／β-カテニンシグナルの中核をなす、この経路のオンオフ状態を定めるタンパク質が同定されている。Ｗｎｔリガンドの不在下では、細胞内β-カテニンは、β-カテニンをリン酸化しβ-Ｔｒｃｐによるユビキチン化後プロテアゾームで分解する標的とするアキシン、ＡＰＣ、ＧＳＫ３およびＣＫ１で形成される複合体の一部である（２）。Ｗｎｔ／β-カテニンシグナルは、分泌Ｗｎｔがその共受容体であるＦｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）（８）および低濃度リポタンパク質受容体類似タンパク質５または６（９、１０）に結合することにより開始する。Ｗｎｔに媒介されるＦｚとＬＲＰの結合は、細胞表面で三元複合体の形成を誘導し（１０、１１）、結果としてタンパク質Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｄｖｌ）とＦｚの細胞内ドメインが会合し、ＬＲＰ６のＣ末端ＰＰＰＳＰｘＳモチーフがタンパク質キナーゼＧＳＫ３とＣＫ１によりリン酸化されるが、この二つのイベントはアキシンを細胞膜に動員するのに必要である（１２〜１５）。Ｗｎｔに媒介されてアキシンが移動すると、β-カテニン細胞質プールの安定化が誘導され核への転位置が可能になり、核内でβ-カテニンはＴＣＦ／ＬＥＦと複合して共転写因子として活動し、Ｗｎｔ標的遺伝子の発現を活性化する（２）。
【０００４】
Ｗｎｔ／β-カテニン経路は、代謝疾患（１６）、神経変性（１７、１８）および様々な癌タイプ（１、２、４）と結びつけられている。完全なるβ-カテニン調節を阻止するＡＰＣタンパク質の変異と結腸直腸癌の間にはより明白な結びつきがある（４、１９、２０）。特筆すべきはＬＲＰ５と骨の恒常性の間の遺伝的関係である。ＬＲＰ５の機能欠失型変異は、低骨量、眼の異常および骨折素因といった特徴をもつ常染色体劣性遺伝疾患である骨粗鬆症・偽性神経膠腫症候群（ＯＰＰＧ）の原因となる（２１）。逆に、ＬＲＰ５の付加的遺伝特徴は、高骨量密度の表現型に翻訳する変異を示した（２２〜２４）。
【０００５】
Ｗｎｔ／β-カテニンシグナルは、細胞表面で、明白な作用機序を有する２つの分泌プロテインのグループにより調節される。１つめは、可溶性のＦｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質、すなわちｓＦＲＰｓ（２５）であり、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体のシステインに富むドメイン（ＣＲＤ）と同様の折りたたみを有し（２６）、Ｗｎｔタンパク質に直接結合することによりＷｎｔ／β-カテニン経路を阻害する。２つめのタイプのＷｎｔ結合阻害剤であるＷｎｔ阻害因子（ＷＩＦ）は、代わりにＷＩＦドメインと５つのＥＧＦドメインで構成されるが（２７）、このことはＷｎｔタンパク質が構造的に異なる阻害剤と相互作用できることを示している。Ｗｎｔ阻害剤の２つめのクラスは、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ（Ｄｋｋ）（２８、２９）およびＷＩＳＥ／スクレロスチン（３０〜３２）タンパク質ファミリーからなる。これらのタンパク質は、共受容体ＬＲＰ５およびＬＲＰ６（２９、３３）との結合をＷｎｔと直接競うことにより、Ｗｎｔ／β-カテニンシグナル経路を阻害する。Ｄｋｋ１とスクレロスチン（ＳＯＳＴ）はいずれも、ＬＲＰ５による骨成長調節に直接関与することが示されている。特に、スクレロスチンの機能欠失は硬結性骨化症およびＶａｎ  Ｂｕｃｈｅｍ病の原因であり（３４、３５）、これらの疾患に認められる異常に高密度で強い骨はＬＲＰ５機能獲得型変異が原因のｈＢＭＤ表現型と類似している。これに相当する効果をもたらすＤｋｋ１変異は、マウスの骨の発生におけるＤｋｋ１の機能がスクレロスチンの機能に相当するものの（３６）、発見されていない。
【０００６】
現在、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は市販されている唯一のＦＤＡ認可骨形成製品であるが、ＰＴＨは抗カルシウム血症および骨肉腫などの安全性の問題に関連がある（３７）。ビホスホネート（biphosphonate）や核因子κＢ活性化受容体（ＲＡＮＫＬ）を標的とする抗体などの他の治療法は、骨の再吸収を低減させる効果のある破骨細胞サブタイプを標的とする（３８）。あるいは、Ｗｎｔ／β-カテニンシグナル経路は骨芽細胞形成を刺激するので（３９）、Ｗｎｔシグナルの刺激により骨形成を誘導できる（４０）。骨折、骨粗鬆症およびリューマチ性関節炎の素因をもつ高齢化社会にあって、安全かつ治療的に効果のある骨同化剤が必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、Ｗｎｔ経路を調節する化合物と、当該化合物を使用する方法を提供する。本発明の一態様は、Ｄｋｋ１および／またはＳＯＳＴがＬＲＰ６および／またはＬＲＰ５に結合するのを阻害する化合物を提供する。一実施態様では、化合物は、ＷｎｔがＬＲＰ６および／またはＬＲＰ６に結合するのを阻害しない。一実施態様では、化合物は、Ｗｎｔ９ＢがＬＲＰ６および／またはＬＲＰ５に結合するのを阻害しない。
【０００８】
本発明の一態様は、アミノ酸配列Ｘ０Ｘ１Ｘ２Ｘ３を含む単離されたペプチドを提供し、ここでＸ０はＮであり；Ｘ１はＡ、Ｓ、Ｆ、Ｔ、Ｙ、ＬもしくはＫまたはＲであり；Ｘ２はＩまたはＶであり；Ｘ３はＫ、ＲまたはＨである。一実施態様では、ペプチドはアミノ酸配列Ｘ１Ｘ０Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４を含み、ここでＸ−１はＰ、Ｓ、ＣまたはＧであり；Ｘ０はＮであり；Ｘ１はＡ、Ｓ、Ｆ、Ｔ、Ｙ、ＬもしくはＫまたはＲであり；Ｘ２はＩまたはＶであり；Ｘ３はＫ、ＲまたはＨであり；Ｘ４はＦ、Ｔ、Ｙ、ＬまたはＶである。一実施態様では、ペプチドはＮ Ｘ１ＩＫ、Ｎ Ｘ１ＶＫ、Ｎ Ｘ１ ＩＲ、Ｎ Ｘ１ ＶＲ、Ｎ Ｘ１ ＩＨおよびＮ Ｘ１ＶＨからなる群より選ばれるアミノ酸配列を含み、ここでX1はＡ、Ｓ、Ｆ、Ｔ、Ｙである。一実施態様では、ペプチドはファミリー１（図１）のペプチドから選ばれる。一実施態様では、ペプチドの少なくとも１つのアミノ酸がアミノ酸アナログで置換される。一実施態様では、ペプチドはアミノ酸アナログを含む。一実施態様では、ペプチドはＤｋｋ１がＬＲＰ６に結合するのを阻害し、Ｗｎｔ９ＢがＬＲＰ６に結合するのを阻害しない。一実施態様では、ペプチドはＬＲＰ６のＥ１ β-プロペラに結合する。一実施態様では、ペプチドはＬＲＰ６のＥ１ β-プロペラのアミノ酸残基Ｒ２８、Ｅ５１、Ｄ５２、Ｖ７０、Ｓ７１、Ｅ７３、Ｌ９５、Ｓ９６、Ｄ９８、Ｅ１１５、Ｒ１４１およびＮ１８５の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１またはすべてと相互作用する。
【０００９】
本発明の一態様は、アミノ酸配列：Ｘ０Ｘ１Ｘ２Ｘ３を含む単離された環状ペプチを提供し、ここでＸ０はＮであり；Ｘ１はＦ、Ｙ、Ｌ、Ａ、ＲまたはＳであり；Ｘ２はＩまたはＶであり；Ｘ３はＫ、ＲまたはＨである。一実施態様では、環状ペプチドはアミノ酸配列Ｘ−１Ｘ０Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４を含み、ここでＸ−１はＰ、Ｓ、ＣまたはＧであり；Ｘ０はＮであり；Ｘ１はＦ、Ｙ、Ｌ、Ａ、ＲまたはＳであり；Ｘ２はＩまたはＶであり；Ｘ３はＫ、ＲまたはＨであり；Ｘ４はＦ、Ｔ、Ｙ、ＬまたはＶである。一実施態様では、環状ペプチドは、Ｎ Ｘ１ＩＫ、Ｎ Ｘ１ＶＫ、Ｎ Ｘ１ ＩＲ、Ｎ Ｘ１ ＶＲ、Ｎ Ｘ１ ＩＨおよびＮ Ｘ１ＶＨからなる群からのアミノ酸配列を含み、ここでX1はＦ、Ｙ、Ｌ、Ａ、ＲまたはＳである。一実施態様では、環状ペプチドはファミリー２（図２）のペプチドから選ばれる。一実施態様では、環状ペプチドの少なくとも１つのアミノ酸はアミノ酸アナログで置換される。一実施態様では、環状ペプチドはアミノ酸アナログを含む。一実施態様では、環状ペプチドは、Ｄｋｋ１がＬＲＰ６に結合するのを阻害し、Ｗｎｔ９ＢがＬＲＰ６に結合するのを阻害しない。一実施態様では、環状ペプチドはＬＲＰ６のＥ１ β-プロペラに結合する。一実施態様では、環状ペプチドは、ＬＲＰ６のＥ１ β-プロペラのアミノ酸残基Ｒ２８、Ｅ５１、Ｄ５２、Ｖ７０、Ｓ７１、Ｅ７３、Ｌ９５、Ｓ９６、Ｄ９８、Ｅ１１５、Ｒ１４１およびＮ１８５の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１またはすべてと相互作用する。
【００１０】
本発明の一態様は、アミノ酸配列：Ｘ−１Ｘ０Ｘ１Ｘ２を含む単離されたペプチドを提供し、ここでＸ−１はＷ、Ｌ、Ｙ、ＦまたはＩであり；Ｘ０はＤまたはＥであり；Ｘ１はＦ、Ｗ、Ｉ、ＳまたはＹであり；Ｘ２はＭである。一実施態様では、ペプチドはアミノ酸配列：Ｘ−２Ｘ−１Ｘ０Ｘ１Ｘ２Ｘ３を含み、ここでＸ−２はＶ、Ｉ、ＬまたはＦであり；Ｘ−１はＷ、Ｌ、Ｙ、ＦまたはＩであり；Ｘ０はＤまたはＥであり；Ｘ１はＦ、Ｗ、Ｉ、ＳまたはＹであり；Ｘ２はＭであり；Ｘ３はＷ、Ｍ、ＡまたはＧである。一実施態様では、ペプチドはファミリー３（図３）のペプチドから選ばれる。
【００１１】
本発明の一態様は、ファミリー４（図４）のペプチドから選ばれる単離されたペプチドを提供する。
【００１２】
本発明の一態様は、Ｄｋｋ１とＬＲＰ６との相互作用を阻害するペプチドリガンドの存在下および不在下で、試験化合物をＬＲＰ６またはその機能的等価物と接触させることと、試験化合物のＬＲＰ６またはその機能的等価物との結合度を決定することを含む、Ｄｋｋ１とＬＲＰ６との相互作用を阻害する化合物のスクリーニング法を提供し、ここでペプチドリガンドの存在下または不在下での結合度の変化は、試験化合物がＤｋｋ１とＬＲＰ６との相互作用を阻害することを示し、ここでペプチドリガンドは（ａ）ファミリー１（図１）、（ｂ）ファミリー２（図２）、（ｃ）ファミリー３（図３）および（ｄ）ファミリー４（図４）のアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含む。一実施態様では、ペプチドリガンドは検出可能な標識で標識される。
【００１３】
本発明の一態様は、Ｄｋｋ１とＬＲＰ５との相互作用を阻害するペプチドリガンドの存在下および不在下で、試験化合物をＬＲＰ５またはその機能的等価物と接触させることと、試験化合物のＬＲＰ５またはその機能的等価物との結合度を決定することを含む、Ｄｋｋ１とＬＲＰ５との相互作用を阻害する化合物のスクリーニング法を提供し、ここでペプチドリガンドの存在下または不在下での結合度の変化は、試験化合物がＤｋｋ１とＬＲＰ５との相互作用を阻害することを示し、ここでペプチドリガンドは（ａ）ファミリー１（図１）、（ｂ）ファミリー２（図２）、（ｃ）ファミリー３（図３）および（ｄ）ファミリー４（図４）のアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含む。一実施態様では、ペプチドリガンドは検出可能な標識で標識される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ファミリー１の例示的ペプチドである。
【図２】ファミリー２の例示的ペプチドである。
【図３】ファミリー３の例示的ペプチドである。
【図４】図４Ａ〜Ｃはファミリー４の例示的ペプチドである。
【図５】ＣＤＲ Ｈ３とＬＲＰ６の溝の残基との相互作用の詳細図であり、ＮＡＶＫ配列で作られる相互作用ネットワークを示している。
【図６】Ｈ３とは別の抗体ＣＤＲで作られる相互作用の詳細。
【図７】（Ａ）Ｄｋｋ１、Ｄｋｋ２、Ｄｋｋ４、スクレロスチンおよびＷｉｓｅの一次配列のアラインメント。（Ｂ）「ＮＸＩ」モチーフを有するタンパク質に基づくペプチドの例。
【図８】Ｄｋｋ１と他のＷｎｔ経路阻害剤の間の競合結合。図示のＬＲＰ６コンストラクトをバイオセンサーの先端に予めロードした。Ｄｋｋ１（１００ｎＭ）（またはバッファーコントロール）と試験リガンド（１００ｎＭ）を順にＬＲＰ６を先端にロードした。（Ａ）Ｄｋｋ２とＤｋｋ１の競合。（Ｂ）スクレロスチンとＤｋｋ１の競合。Ｄｋｋ１存在下でのパーセント結合を対バッファーコントロールで示す。
【図９】Ｗｎｔ阻害剤Ｄｋｋ１およびスクレロスチンの結合決定因子（Ａ）「ＮＸＩ」モチーフの保存ＡｓｎおよびＩｌｅ残基は、Ｄｋｋ１およびスクレロスチンがＬＲＰ６ Ｅ１Ｅ２に結合するのに重要である。（Ｂ）Ｄｋｋ１は２つの重要な結合領域を有し、一方はＬＲＰ６ Ｅ１Ｅ２を識別し、他方はＬＲＰ６ Ｅ３Ｅ４を識別する。「ＮＸＩ」モチーフ中の置換（Ｎ４０Ａ、Ｉ４２Ｅ）はＬＲＰ６ Ｅ１Ｅ２との結合には影響するが、Ｅ３Ｅ４との結合には影響しない。一方で、Ｃ末端のシステインに富む領域中の置換（Ｈ２０４Ｅ、Ｋ２１１Ｅ）は、ＬＲＰ６ Ｅ３Ｅ４との結合には影響するが、Ｅ１Ｅ２との結合には影響しない。いずれの場合も変異タンパク質はＬＲＰ６ Ｅ１Ｅ４との結合を維持する。
【図１０】ＳＥＣ−ＭＡＬＳで研究した異なるＤｋｋ１−ＬＲＰ６ Ｅ１Ｅ４複合体と、考えられる相互作用モデルを描いた絵（cartoon）である。個々の分子または複合体の予測分子量と、その下に実験で観察された分子量が示されている。観察された分子量は、ＬＲＰ６ Ｅ１Ｅ４と各Ｄｋｋ１バリアントの間の１：１の複合体形成に一致する。データはモデル３（２：１のストイキオメトリを示す）とは一致しない。しかし、データは、１個のＤｋｋ１分子が２つのＬＲＰ６結合領域をブリッジできるモデル４か、または一方もしくは他方の部位のみが結合されたＤｋｋ１にアクセス可能なモデル５／６と一致する。
【図１１】Ｄｋｋ１またはスクレロスチンの存在下または不在下でＬＲＰ６ Ｅ１Ｅ４に結合するＷｎｔ。Ｄｋｋ１（１２５ｎＭ）はＷｎｔ３ＡとＷｎｔ９Ｂ（各１２５ｎＭ）の両方の結合を阻害し、スクレロスチン（１２５ｎＭ）はＷｎｔ９Ｂの結合のみを阻害した。
【図１２】野生型および変異阻害剤の存在下または不在下でのＷｎｔ／β-カテニンリポーターの誘導。細胞は（ＬＲＰ６ Ｅ１Ｅ２に結合する）Ｗｎｔ１で形質移入された。Ｄｋｋ１およびスクレロスチンのバリアント、またはコントロール阻害剤Ｆｚ８ ＣＲＤを指示どおりの用量で使用した。
【図１３】ＬＲＰ５ ＢＭＤの置換をＬＲＰ６ Ｅ１Ｅ２に導入するとＷｎｔ阻害剤に対する親和性が低下する。特徴が明らかな５種類の置換をｙ軸上に示す。各ＬＲＰ６バリアントに結合するＷｎｔ９ｂ、Ｄｋｋ１およびスクレロスチンの定常状態親和性測定を行った。Ｗｎｔ９ｂとの結合における差異は小さかった（野生型の変化と比べて≦５倍）が、Ｄｋｋ１およびスクレロスチンとの結合はより有意に影響を受けていた（野生型の親和性喪失と比べて１０〜２５０倍）。
【図１４】ＬＲＰ６ Ｅ１Ｅ２に対する直鎖状および環状ペプチドライブラリーから選択されたファージクローンに存在する保存モチーフ（Ａ）例示的ファミリー１の直鎖状ペプチド。（Ｂ）例示的ファミリー２の環状ペプチド。
【図１５】ＬＲＰ５ Ｅ１に対する直鎖状および環状ペプチドライブラリーから選択されたファージクローンに存在する保存モチーフ（Ａ）例示的ファミリー３の直鎖状ペプチド。（Ｂ）例示的ファミリー４の環状ペプチド。
【図１６】ファージディスプレイライブラリーから発見されたＬＲＰ６ Ｅ１とペプチドの共結晶構造。（Ａ）例示的ファミリー１のペプチドＡｃ−ＳＮＳＩＫＦＹＡ−ａｍ。（Ｂ）ペプチドＡｃ−ＧＳＬＣＳＮＲＩＫＰＤＴＨＣＳＳ−ａｍ（ジスルフィド）、例示的ファミリー２のＣＸ９Ｃクラスのメンバー。（Ｃ）ペプチドＡｃ−ＣＮＳＩＫＬＣ−ａｍ（ジスルフィド）、例示的ファミリー２のＣＸ５Ｃクラスのメンバー。（Ｄ）ペプチドＡｃ−ＣＮＳＩＫＣＬ−ａｍ（ジスルフィド）、例示的ファミリー２のＣＸ４Ｃクラスのメンバー。
【図１７】Ｄｋｋ１の７量体ペプチドの構造活性研究。図示のペプチドを標準的なＦｍｏｃ法により合成し、ＩＣ５０値を実施例１記載のように決定した。（Ａ）Ｃ末端とＮ末端のトランケーション。（Ｂ）「ＮＸＩ」モチーフの「Ｘ」位での置換。
【図１８】図１８ＡおよびＢ。Ｎ、Ｓ、ＩおよびＫ残基の置換効果を示すＤｋｋ１の７量体ペプチドの構造活性研究。図示のペプチドを標準的なＦｍｏｃ法により合成し、ＩＣ５０値を実施例１記載のように決定した。
【図１９】例示的ファミリー1の直鎖状ペプチドの構造活性研究。置換は「ＮＸＩ」モチーフのＩｌｅ位で行った。図示のペプチドを標準的なＦｍｏｃ法により合成し、ＩＣ５０値を実施例１記載のように決定した。
【図２０】「ＮＸＩ」エピトープを構築されたペプチド足場に転写。（Ａ）構築されたミメティックの設計。抗体複合体構造の残基Ｎ１００〜Ｖ１００ｂをＢｏｗｍａｉｎ−Ｂｉｒｋ阻害性（ＢＢＩ）ループペプチド（ＰＤＢ  ｃｏｄｅ  １ＧＭ２）の代表的構造に重ねた（４２）。分岐疎水性残基に先行するアミド結合回転は別にして、ペプチドのコンホメーションは類似している。３残基モチーフの側鎖β-炭素の位置は一致する。ＢＢＩループの鋳型と「ＮＸＩ」含有ＢＢＩミメティックの配列を示す。（Ｂ）ＢＢＩミメティックはＬＲＰ６ Ｅ１に結合し、保存Ａｓｎをもたないコントロールペプチドは結合しない。
【図２１】Ｄｋｋ１の７量体ペプチドのアミド環化バリアントの設計。（Ａ）ＬＲＰ６ Ｅ１との複合体から取ったＤｋｋ１ペプチドの構造を上段に示す。Ｓｅｒ２の側鎖は短い間隙を挟んでＡｓｎ７の側鎖に向けて突き出している。下段はＳｅｒ２がＬｙｓで置換され、Ａｓｎ７がＡｓｐで置換されたモデルである。Ｌｙｓ ε-アミンとＡｓｐカルボン酸塩の間のアミド結合により側鎖が結合されている。（Ｂ）競合結合データは環化ペプチドがＬＲＰ６ Ｅ１に結合することを示している。
【図２２】ＬＲＰ６ Ｅ１結合ペプチドは、Ｗｎｔ阻害剤とＬＲＰ６ Ｅ１Ｅ２の結合は阻害するが、Ｗｎｔ９Ｂの結合は阻害しない。実施例１記載のようにバイオレイヤー干渉法により結合を評価した。固定化ＬＲＰ６ Ｅ１Ｅ２を、測定されたＥ１Ｅ２解離常数の３倍の濃度で溶液中に存在するタンパク質リガンド（Ｗｎｔ９ｂ、Ｄｋｋ１またはスクレロスチン）に曝露した。競合ペプチドを飽和濃度（測定されたＩＣ５０値の２０倍の濃度）で添加した。ペプチドＡ：Ａｃ−ＮＳＮＡＩＫＮ−ａｍ；ペプチドＢ：Ａｃ−ＣＮＳＩＫＦＣＧ−ａｍ（ジスルフィド）；ペプチドＣ：Ａｃ−ＧＳＬＣＳＮＲＩＫＰＤＴＨＣＳＳ−ａｍ（ジスルフィド）
【発明を実施するための形態】
【００１５】
一般的技術
本発明の実施は、特に明記しない限り、当分野の範囲内である、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の一般的な技術を使用する。これらの技術は、“Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 第２版 (Sambrookら, 1989); “Oligonucleotide Synthesis” (M. J. Gait, ed., 1984); “Animal Cell Culture” (R. I. Freshney編, 1987); “Methods in Enzymology” (Academic Press, Inc.); “Current Protocols in Molecular Biology” (F. M. Ausubelら編, 1987および定期更新版); “PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullisら編, 1994); “A Practical Guide to Molecular Cloning” (Perbal Bernard V., 1988)などの文献に詳細に説明されている。
【００１６】
定義
本発明の範囲内で用語「アミノ酸」とは、その最も広い意味で使用され、天然のＬ-アミノ酸または残基を意味する。本明細書では天然のアミノ酸に一般的に使用される１文字および３文字の略号を使用する（Lehninger, Biochemistry, 第２版, pp. 71-92, (Worth Publishers: New York, 1975）。この用語はＤ-アミノ酸ならびにアミノ酸アナログなどの化学修飾アミノ酸、ノルロイシンなどの通常はタンパク質に取り込まれない天然のアミノ酸および当分野でアミノ酸の特徴として知られる特性を持つ化学合成された化合物を含む。例えば、フェニルアラニンまたはプロリンのアナログまたはミメティックは、天然ＰｈｅまたはＰｒｏと同様のペプチド化合物のコンホメーション的制限を可能にし、アミノ酸の定義に含まれる。本明細書では、このようなアナログおよびミメティックをアミノ酸の「機能的等価物」と呼ぶ。アミノ酸の他の例は、RobertsおよびVellaccioのThe Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Eds. GrossおよびMeiehofer, Vol. 5, p341. (Academic Press, Inc, N.Y. 1983）に列挙されている。
【００１７】
特定の実施態様では、１または複数のアミノ酸置換を有するペプチドバリアントなどの化合物のバリアントが提供される。保存的置換を表１の「保存的置換」の見出しの下に示す。より実質的な変化を表１の「例示的置換」の見出しの下に提供し、さらに、アミノ酸側鎖のクラスに関して以下に記述する。
【表１】
2013544798.tif 000003
アミノ酸は側鎖に共通の特性によりグループ分けされうる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の方向性に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスのうち１の一メンバーを別のクラスと交換することを伴う。
【００１８】
例えば標準的な固相合成技術により合成される合成ペプチドは、遺伝子にコードされるアミノ酸に限定されないので、所与のアミノ酸は様々な置換が可能である。遺伝暗号にコードされないアミノ酸は、本明細書では「アミノ酸アナログ」と呼ばれ、例えば国際公開第９０／０１９４０号に記載のものおよび以下の表（表２）に記載のもの、ならびに、例えばＧｌｕおよびＡｓｐの２-アミノアジピン酸（Ａａｄ）；ＧｌｕおよびＡｓｐの２-アミノピメリン酸（Ａｐｍ）；Ｍｅｔ、Ｌｅｕおよび他の脂肪族アミノ酸の２-アミノ酪酸（Ａｂｕ）；Ｍｅｔ、Ｌｅｕおよび他の脂肪族アミノ酸の２-アミノヘプタン酸（Ａｈｅ）；Ｇｌｙの２-アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅのシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ＡｒｇおよびＬｙｓのホモアルギニン（Ｈａｒ）；Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓの２,３-ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）；Ｇｌｙ、ＰｒｏおよびＡｌａのＮ-エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）；Ｇｌｙ、ＰｒｏおよびＡｌａのＮ-エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）；ＡｓｎおよびＧｌｎのＮ-エチルアスパラギン（ＥｔＡｓｎ）；Ｌｙｓのヒドロキシルリジン（Ｈｙｌ）；Ｌｙｓのアロヒドロキシルリジン（ＡＨｙｌ）；Ｐｒｏ、ＳｅｒおよびＴｈｒの３-（および４-）ヒドロキシプロリン（３Ｈｙｐ、４Ｈｙｐ）；Ｉｌｅ、ＬｅｕおよびＶａｌのアロイソロイシン（ＡＩｌｅ）；Ａｒｇの４-アミジノフェニルアラニン；Ｇｌｙ、ＰｒｏおよびＡｌａのＮ-メチルグリシン（ＭｅＧｌｙ、サルコシン）；ＩｌｅのＮ-メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；Ｍｅｔおよび他の脂肪族アミノ酸のノルバリン（Ｎｖａ）；Ｍｅｔおよび他の脂肪族アミノ酸のノルロイシン（Ｎｌｅ）；Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓのオルニチン（Ｏｒｎ）；Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎのシトルリン（Ｃｉｔ）およびメチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）；およびＰｈｅのＮ-メチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ），トリメチルフェニルアラニン、ハロ-（Ｆ-, Ｃｌ-, Ｂｒ-またはＩ-）フェニルアラニンまたはトリフルオリルフェニルアラニンを含む。
【表２】
2013544798.tif 000004
【００１９】
ペプチドまたはポリペプチドに関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとして、特定のペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性の決定を目的とするアラインメントは、当業者の技量の範囲の様々な方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）といったソフトウエアなどの公に入手可能なコンピューターソフトウエアを使用して達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを得るのに必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメント測定用の適切なパラメータを決定できる。本明細書の目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較用コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ-２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータープログラムはジェネンテック社によって作成され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９にユーザーマニュアルとともに提出されており、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテック社（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）から公に入手可能である。
【００２０】
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとのまたはそれに対する％アミノ酸配列同一性（所与のアミノ酸配列Ｂとのまたはそれに対するある程度の％アミノ酸配列同一性を有するまたは含む所与のアミノ酸配列Ａ、とも言い換えられる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２のＡおよびＢのアラインメントにおいて完全一致であるとスコアされたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢのアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることが理解されよう。
【００２１】
特に断らない限り、本明細書で使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、上記のようにＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。
【００２２】
「単離された」化合物は、その天然環境の化合物から分離されたものである。いくつかの実施態様では、ペプチドなどの化合物は、例えば電気泳動（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）やクロマトグラフィー（例えばイオン交換または逆相ＨＰＬＣ）などにより決定される９５％よりも高い純度か９９％の純度に精製される。純度評価法については、例えばFlatmanら, J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照されたい。
【００２３】
「単離された」核酸は、その天然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、もともと核酸分子を含有する細胞に含まれる核酸分子を含むが、この核酸分子は、染色体外か、またはその天然の染色体位置とは違う染色体位置に存在する。
【００２４】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、連結している他の核酸を輸送できる核酸分子を指すと意図される。ベクターの一タイプは「プラスミド」であり、付加的なＤＮＡセグメントがライゲートされうる円形の二本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの別のタイプは、ファージベクターである。ベクターの別のタイプは、ウイルスベクターであり、付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲートさせうる。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自己複製できる（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターとエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、宿主ゲノムと共に複製する。さらに、特定のベクターは、それらが作用可能に連結している遺伝子の発現を指令し得る。このようなベクターはここでは「組換え発現ベクター」（または単に「組換えベクター」）と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形をとる。プラスミドが最も広く使用されているベクターの形態であるので、本明細書では「プラスミド」と「ベクター」は交換可能に使用されうる。
【００２５】
本明細書で交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドまたは塩基、および／またはそれらのアナログ、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼにより、もしくは合成反応によりポリマー中に取り込み可能な任意の基質とすることができる。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびそれらのアナログを含み得る。存在するならば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの会合前または後になされ得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、標識を用いたコンジュゲートなどにより、合成後さらに修飾されてもよい。他のタイプの修飾には、例えば「キャップ（cap）」、アナログとの天然のヌクレオチドの１または複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結（例えばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマート等）および荷電連結（ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等）を有するもの、ペンダント部分、例えばタンパク質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ-Ｌ-リジン等）を含むもの、インターカレーター（intercalator）を有するもの（例えばアクリジン、ソラレン等）、キレート剤（例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属等）を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾された連結を含むもの（例えばアルファアノマー核酸等）、ならびにポリヌクレオチド（類）の未修飾形態が含まれる。さらに、糖類中に通常存在する任意のヒドロキシル基は、例えばホスホネート基、ホスフェート基で置き換えられてもよく、標準的な保護基で保護されてもよく、または付加的なヌクレオチドへのさらなる連結を調製するように活性化されてもよく、または固体もしくは半固体担体にコンジュゲートされてもよい。５’および３’末端のＯＨはホスホリル化可能であり、または１〜２０の炭素原子を有する有機キャップ基部分またはアミンで置換することもできる。他のヒドロキシルはまた、標準的な保護基に誘導体化されてもよい。ポリヌクレオチドはまた、当分野で一般的に知られているリボースまたはデオキシリボース糖類の類似形態のものをさらに含み得、これらには例えば２’-Ｏ-メチル-、２’-Ｏ-アリル、２’-フルオロまたは２’-アジド-リボース、炭素環式糖アナログ、アルファ-アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロースまたはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログおよび例えばメチルリボシドなどの非塩基性ヌクレオシドアナログが含まれる。１または複数のホスホジエステル連結は代替の連結基で置き換えてもよい。これらの代替の連結基には、限定されるものではないが、ホスフェートがＰ(Ｏ)Ｓ(「チオエート」)、Ｐ(Ｓ)Ｓ(「ジチオエート」)、「(Ｏ)ＮＲ２(「アミデート」)、Ｐ(Ｏ)Ｒ、Ｐ(Ｏ)ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２(「ホルムアセタール」)と置き換えられた実施態様のものが含まれ、ここでそれぞれのＲおよびＲ’は独立して、Ｈか、またはエーテル（-Ｏ-）連結を含みう��置換もしくは未置換のアルキル(１〜２０Ｃ)、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルジル（araldyl）である。ポリヌクレオチド中の全ての連結が同一である必要はない。先の記述は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む本明細書で引用される全てのポリヌクレオチドに適用される。
【００２６】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」は一般に、短く、一般に単鎖であり、また必ずしもそうではないが、一般的に約２００未満のヌクレオチド長さの、一般的に合成のポリヌクレオチドを意味する。「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」なる用語は、相互に排他的ではない。ポリヌクレオチドについての上記記載はオリゴヌクレオチドと同等かつ十分に適用可能である。
【００２７】
「ＬＲＰ６」という用語は、本明細書では、特に明記しない限りは霊長類（例えばヒト）や齧歯類（例えばマウスやラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源の任意の天然ＬＲＰ６を指す。この用語は、「完全長の」未処理ＬＲＰ６ならびに細胞内のプロセシングから生じる任意の形態のＬＲＰ６を包含する。この用語はまた、例えばスプライスバリアントやアレルバリアントなどの天然のＬＲＰ６バリアントも含有する。例示的ヒトＬＲＰ６のアミノ酸配列がＮＣＢＩ受託番号ＡＡＩ４３７２６、Strausberg, R. L.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 16899-16903 (2002) (He, Xら, Development, 131:1663-1677 (2004); Chen, M.ら, J. Biol. Chem., 284:35040-35048 (2009)に提供されている。
【００２８】
「ＬＲＰ５」という用語は、本明細書では、特に明記しない限りは霊長類（例えばヒト）や齧歯類（例えばマウスやラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源の任意の天然ＬＲＰ５を指す。この用語は、「完全長の」未処理ＬＲＰ５ならびに細胞内のプロセシングから生じる任意の形態のＬＲＰ５を包含する。この用語はまた、例えばスプライスバリアントやアレルバリアントなどの天然のＬＲＰ５バリアントも含有する。例示的ヒトＬＲＰ５のアミノ酸配列がＮＣＢＩ受託番号Ｏ７５１９７、Hey, P.J.ら, Gene 216 (1), 103-111 (1998)に提供されている。
【００２９】
本明細書で使用される「治療」（および「治療する」「治療している」などの文法的変化形）は、治療されている個体の自然な経過を改変するための臨床的介入を意味し、予防のためまたは臨床病理の経過で実施できる。治療の望ましい効果には、限定ではなく、疾患の発生または再発の防止、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な任意の病的結果の軽減、転移の防止、疾患の進行速度の低減、疾患状態の寛解緩解または緩和、緩解およびまたは予後の改善が含まれる。ある実施態様では、本発明の化合物は疾患の発症または進行を遅らせるために用いられる。
【００３０】
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、最も広い意味で交換可能に使用され、モノクローナル抗体（例えば全長または無傷のモノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体（例えば、所望の生物学的活性を示す限りにおいての二重特異性抗体）を含み、また特定の抗体断片（本明細書で詳述）を含みうる。抗体はヒト、ヒト化および／または親和性成熟でありうる。
【００３１】
「抗体断片」は完全な抗体の一部分のみを含み、当該一部分は、完全な（インタクトな）抗体に存在する場合の当該一部分に通常関連する機能の少なくとも１つの、好ましくはその機能のほとんどまたはすべてを保持することが好ましい。一実施態様では、抗体断片は完全な抗体の抗原結合部位を含むので、抗原結合能を保持する。別の実施態様では、抗体断片、例えばＦｃ領域を含むものは、完全な抗体に存在する場合のＦｃ領域に通常関連する生物学的な機能、例えばＦｃＲｎ結合、抗体半減期の調節、ＡＤＣＣ機能および補体結合の少なくとも１つを保持する。一実施態様では、抗体断片は、完全な抗体と実質的に類似のインビボ半減期を有する一価性抗体である。例えば、このような抗体断片は、インビボ安定性を断片に与えることができるＦｃ配列に結合した抗原結合アームを含んでもよい。
【００３２】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、少量で存在しうる、自然に生じる可能性のある変異を除き、集団を構成する個々の抗体は同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原に対する。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物と違って、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対するものである。
【００３３】
本明細書では、モノクローナル抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種由来の抗体、あるいは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるかまたは相同性があり、鎖の残りの部分が、他の種由来の抗体、あるいは他の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるかまたは相同である「キメラ」抗体、ならびに所望の生物的活性を有する限りこのような抗体の断片を特に含む（米国特許第４８１６５６７号およびMorrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984))。
【００３４】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域の残基で置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の能力をさらに洗練するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は少なくとも１つ、典型的には２つの全可変ドメインを実質的に含み、ここで全てまたはほとんど全ての超可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全てまたはほとんど全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列である。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含みうる。さらなる詳細は、JonesらNature 321, 522-525(1986); Riechmannら, Nature 332, 323-329(1988)およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照されたい。また、以下のレビュー文献およびその引用文献も参照されたい：VaswaniおよびHamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); HurleおよびGross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)。
【００３５】
「ヒト抗体」は、ヒトにより生成される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するもの、および／または本明細書中に開示のヒト抗体をつくるためのいずれかの技術を使用してつくられたものである。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除く。
【００３６】
「親和性成熟」抗体は、その１または複数のＣＤＲに１または複数の変更を有する抗体であり、そのような変更をもたない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性が改善される。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当分野において既知の方法で生産される。Marksらは、Bio/Technology, 10:779-783(1992年)で、ＶＨドメインとＶＬドメインのシャフリングによる親和性成熟を開示している。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダムな変異誘発が、Barbasら, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994); Schierら, Gene, 169:147-155 (1995);Yeltonら, J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jacksonら, J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)およびHawkinsら, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)に開示されている。
【００３７】
「疾患」は、本発明の物質／分子または方法を用いた治療の恩恵を受ける任意の症状である。これには慢性および急性の疾患や疾病が含まれ、哺乳動物が当該疾患の素因を有するような病的状態も含まれる。本明細書で治療される疾患の非限定的な例は、Ｗｎｔシグナルで活性化または阻害されるプロセスの疾患も含む。このようなプロセスの例として、様々な癌タイプにおける細胞増殖、細胞運命特定および幹細胞の自己再生や、発達プロセスなどが挙げられる。本発明の化合物は、例えば、Ｗｎｔに媒介される骨や骨格系の疾患の治療に有用である。本発明の化合物を使用して治療可能な骨格または骨の疾患の例として、骨粗鬆症、変形性関節症、骨折および骨病変ならびに様々な形態の骨変性などが挙げられる。
【００３８】
「細胞増殖性疾患」および「増殖性疾患」という用語は、ある程度の異常な細胞増殖を伴う疾患を指す。一実施態様では、細胞増殖性疾患は癌である。
【００３９】
本明細書で用いられる「腫瘍」は、悪性または良性に関わらず全ての腫瘍形成細胞の成長および増殖、および全ての前癌性および癌性の細胞および組織を意味する。「癌」、「癌性」、「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」および「腫瘍」なる用語は本明細書では相互排他的ではない。
【００４０】
「癌」および「癌性」という用語は、典型的には、未制御の細胞成長／増殖を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すかまたは記述する。癌の例には、限定ではなく、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が含まれる。このような癌の具体例には、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、および肺扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝癌（liver cancer）、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、直腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝癌（liver cancer）、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌（hepatic carcinoma）および様々なタイプの頭部および頸部の癌が含まれる。
【００４１】
「有効な量」とは、所望の治療または予防結果を得るのに必要な用量および時間での効果的な量を指す。
【００４２】
本発明の物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストの「治療的に有効な量」は、個体の疾患ステージ、年齢、性別および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストの能力などの要因により変わりうる。治療に有効な量はまた、物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストの任意の毒性または有害な効果を治療的に有益な効果が上回るものである。「予防的に有効な量」とは、必要な用量および期間で所望の予防結果を得る効果的な量を意味する。典型的には、ただし必要ではないが、予防用量は疾患の初期のステージまたはその前の患者に用いるので、治療有効量よりも少ないであろう。
【００４３】
本明細書で用いられる「細胞傷害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害または阻止し、および／または細胞破壊をもたらす物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２およびＬｕの放射性同位体）、化学治療薬、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロランブシル、ダウノルビシンまたは他のインターカレーター、核溶解性酵素などの酵素およびその断片、抗生物質、小分子毒素または細菌、真菌、植物または動物由来の酵素的に活性な毒素などの毒素とそれらの断片および／またはバリアント、および以下に開示する種々の抗腫瘍または抗癌剤を含むように意図されている。他の細胞傷害性剤を以下に記載する。殺腫瘍性剤は腫瘍細胞の破壊をもたらす。
【００４４】
化合物と方法
Ｄｉｃｋｋｏｐｆ（Ｄｋｋ）およびＷＩＳＥ／スクレロスチン（ＳＯＳＴ）のタンパク質ファミリーは、その共受容体であるＬＲＰ５およびＬＲＰ６との結合を直接Ｗｎｔと競うことで、Ｗｎｔ／β-カテニンシグナル経路を阻害する。本明細書では、ＤＫＫ１とＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６との相互作用を調節する化合物およびＳＯＳＴとＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６との相互作用を調節する化合物を提供する。いくつかの実施態様では、化合物はＤｋｋ１およびＳＯＳＴとＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６との相互作用を調節する。
【００４５】
一実施態様では、化合物はＤＫＫ１とＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６との相互作用を阻害する。一実施態様では、化合物はＳＯＳＴとＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６との相互作用を阻害する。一実施態様では、化合物はＤｋｋ１およびＳＯＳＴとＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６との相互作用を阻害する。
【００４６】
一実施態様では、化合物はＬＲＰ６との結合をＤｋｋ１と競う。一実施態様では、化合物はＬＲＰ６との結合をＳＯＳＴと競う。一実施態様では、化合物はＬＲＰ５との結合をＤｋｋ１と競う。一実施態様では、化合物はＬＲＰ５との結合をＳＯＳＴと競う。一実施態様では、化合物はＬＲＰ６のＤｋｋ１結合部位に結合する。一実施態様では、化合物はＬＲＰ６のＳＯＳＴ結合部位に結合する。一実施態様では、化合物はＬＲＰ５のＤｋｋ１結合部位に結合する。一実施態様では、化合物はＬＲＰ５のＳＯＳＴ結合部位に結合する。一実施態様では、化合物はＬＲＰ６のＥ１ β-プロペラに結合する。一実施態様では、化合物はＬＲＰ５のＥ１ β-プロペラに結合する。一実施態様では、化合物はＬＲＰ６のＥ１ β-プロペラのアミノ酸残基Ｒ２８、Ｅ５１、Ｄ５２、Ｖ７０、Ｓ７１、Ｅ７３、Ｌ９５、Ｓ９６、Ｄ９８、Ｅ１１５、Ｒ１４１およびＮ１８５の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１またはすべてと相互作用する。一実施態様では、化合物はＬＲＰ５のＥ１ β-プロペラのアミノ酸残基Ｒ２８、Ｅ６３、Ｄ６４、Ｖ８２、Ｓ８３、Ｅ８５、Ｖ１０８、Ｓ１０９、Ｄ１１１、Ｅ１２８、Ｒ１５４およびＮ１９８の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１またはすべてと相互作用する。Ｄｋｋ１またはＳＯＳＴ結合領域に直接結合することにより、化合物は、Ｄｋｋ１およびＳＯＳＴの結合と関連するＷｎｔ経路シグナル調節を標的化して行うことを可能にする。一実施態様では、化合物は、Ｄｋｋ１のＬＲＰ５またはＬＲＰ６との結合に関連するＷｎｔ経路シグナルを調節する。一実施態様では、化合物は、ＳＯＳＴのＬＲＰ５またはＬＲＰ６との結合に関連するＷｎｔ経路シグナルを調節する。一実施態様では、化合物は、セロトニン経路を調節することなく、Ｄｋｋ１および／またはＳＯＳＴのＬＲＰ５またはＬＲＰ６との結合に関するＷｎｔ経路シグナルを調節する。
【００４７】
いくつかの実施態様では、化合物は、Ｄｋｋ１のＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６との相互作用を阻害するが、ＷｎｔのＬＲＰ５またはＬＲＰ６との相互作用は阻害しない。いくつかの実施態様では、化合物は、ＳＯＳＴのＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６との相互作用を阻害するが、ＷｎｔのＬＲＰ５またはＬＲＰ６との相互作用は阻害しない。一実施態様では、ＷｎｔはＷｎｔ３ａである。一実施態様では、ＷｎｔはＷｎｔ９ｂである。この選択的阻害は、Ｗｎｔシグナル経路が阻害剤Ｄｋｋ１またはＳＯＳＴに阻害されるのを阻止しながらも、Ｗｎｔ分子による経路の刺激を可能にするのに役立つ。結果として、化合物は、Ｗｎｔ経路と関連する骨成長および修復を促進するのに役立つ。
【００４８】
いくつかの実施態様では、化合物は、例えば骨粗鬆症、リューマチ性関節炎、例えば多発性骨髄腫などの癌を含む数々の条件により生じうる骨分解または変性など、骨成長促進の恩恵を受けうる様々な骨格疾患の治療や、低骨密度または低骨強度と関連する骨折や他の骨疾患の治療に用いられる。
【００４９】
本発明の一態様では、化合物はペプチドである。一実施態様では、化合物は直鎖状ペプチドである。一実施態様では、直鎖状ペプチドは３から１００、３から５０、３から３０、３から２０、３から１０、３から９、３から８、３から７、３から６、３から５または３から４のアミノ酸長さを有する。一実施態様では、直鎖状ペプチドは４から１０、５から８、６から７のアミノ酸長さを有する。一実施態様では、直鎖状ペプチドは３、４、５、６、７、８、９または１０のアミノ酸長さを有する。別の実施態様では、化合物は環状ペプチドである。ある実施態様では、環状ペプチドは５から１００、５から５０、５から３０、５から２０、５から１０、７から２０、７から１７、７から１６、７から１７、７から１８、７から１９または７から２０のアミノ酸長さを有する。一実施態様では、環状ペプチドは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のアミノ酸長さを有する。
【００５０】
別の実施態様では、ペプチドは構築された（structured）ペプチドであるか、または標的との結合の不在下で明白なコンホメーションをとるペプチド（アドプティブペプチド）である。ペプチドがとるこのコンホメーションは、結合状態構造のペプチドのコンホメーションと似ている。いくつかの実施態様では、構築されたペプチドまたはアドプティブペプチドは、不定形の（unstructured）ペプチドと比べて高い治療効果がある。一実施態様では、構築されたペプチドまたはアドプティブペプチドは、不定形のペプチドと比べて、高い標的結合性、高い安定性および高いバイオアベイラビリティーといった特徴を１つまたは複数有する。
【００５１】
一態様では、本発明は，アミノ酸配列：Ｘ０Ｘ１Ｘ２Ｘ３を含むファミリー１の直鎖状ペプチドを提供し、ここでＸ０はアスパラギン（Ｎ）残基である。ファミリー１のペプチドは、ＬＲＰ６のＥ１ β-プロペラに結合する。いくつかの実施態様では、ファミリー１のペプチドはまた、ＬＲＰ５に結合する。一実施態様では、Ｘ０はＮであり；Ｘ１はＡ、Ｓ、Ｆ、Ｔ、Ｙ、Ｌ、ＫまたはＲであり；Ｘ２はＩまたはＶであり；Ｘ３はＫ、ＲまたはＨである。一実施態様では、Ｘ０はＮであり；Ｘ１はＡ、Ｓ、Ｆ、Ｔ、Ｙ、Ｌ、ＫまたはＲであり；Ｘ２はＩであり；Ｘ３はＫ、ＲまたはＨである。一実施態様では、Ｘ０はＮであり；Ｘ１はＡ、Ｓ、Ｆ、Ｔ、Ｙ、Ｌ、ＫまたはＲであり；Ｘ２はＩまたはＶであり；Ｘ３はＫである。一実施態様では、Ｘ０はＮであり；Ｘ１はＡ、Ｓ、Ｆ、Ｔ、Ｙ、Ｌ、ＫまたはＲであり；Ｘ２はＶであり；Ｘ３はＫ、ＲまたはＨである。一実施態様では、Ｘ０はＮであり；Ｘ１はＡ、Ｓ、Ｆ、Ｔ、Ｙ、Ｌ、ＫまたはＲであり；Ｘ２はＩであり；Ｘ３はＫである。一実施態様では、Ｘ０はＮであり；Ｘ１はＡ、Ｓ、Ｆ、Ｔ、Ｙ、Ｌ、ＫまたはＲであり；Ｘ２はＩであり；Ｘ３はＲである。一実施態様では、Ｘ０はＮであり；Ｘ１はＡ、Ｓ、Ｆ、Ｔ、Ｙ、Ｌ、ＫまたはＲであり；Ｘ２はＶであり；Ｘ３はＫである。一実施態様では、Ｘ０はＮであり；Ｘ１はＡ、Ｓ、Ｆ、Ｔ、Ｙ、Ｌ、ＫまたはＲであり；Ｘ２はＶであり；Ｘ３はＲまたはＨである。
【００５２】
別の実施態様では、ファミリー１の直鎖状ペプチドはさらにＸ０Ｘ１Ｘ２Ｘ３の両側に付加アミノ酸を含む。一実施態様では、本発明はアミノ酸配列：Ｘ−１Ｘ０Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４を含むファミリー１のペプチドを提供し、ここでＸ０はＮである。一実施態様では、Ｘ−１はＰ、Ｓ、ＣまたはＧであり；Ｘ０はＮであり；Ｘ１はＡ、Ｓ、Ｆ、Ｔ、Ｙ、Ｌ、ＫまたはＲであり；Ｘ２はＩまたはＶであり；Ｘ３はＫ、ＲまたはＨであり；Ｘ４はＦ、Ｔ、Ｙ、ＬまたはＶである。一実施態様では、Ｘ−１はＰ、Ｓ、ＣまたはＧであり；Ｘ０はＮであり；Ｘ１はＡ、Ｓ、Ｆ、Ｔ、Ｙ、Ｌ、ＫまたはＲであり；Ｘ２はＩであり；Ｘ３はＫ、ＲまたはＨであり；Ｘ４はＦ、Ｔ、Ｙ、ＬまたはＶである。一実施態様では、Ｘ−１はＰ、Ｓ、ＣまたはＧであり；Ｘ０はＮであり；Ｘ１はＡ、Ｓ、Ｆ、Ｔ、Ｙ、Ｌ、ＫまたはＲであり；Ｘ２はＩまたはＶであり；Ｘ３はＫであり；Ｘ４はＦ、Ｔ、Ｙ、ＬまたはＶである。一実施態様では、本発明はアミノ酸配列：Ｘ−１Ｘ０Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５を含むファミリー１のペプチドを提供し、ここでＸ０はＮである。一実施態様では、Ｘ−１はＰ、Ｓ、ＣまたはＧであり；Ｘ０はＮであり；Ｘ１はＡ、Ｓ、Ｆ、Ｔ、Ｙ、Ｌ、ＫまたはＲであり；Ｘ２はＩまたはＶであり；Ｘ３はＫ、ＲまたはＨであり；Ｘ４はＦ、Ｔ、Ｙ、ＬまたはＶであり；Ｘ５はＦ、Ｔ、Ｙ、ＬまたはＶである。一実施態様では、Ｘ−１はＰ、Ｓ、ＣまたはＧであり；Ｘ０はＮであり；Ｘ１はＡ、Ｓ、Ｆ、Ｔ、Ｙ、Ｌ、ＫまたはＲであり；Ｘ２はＩであり；Ｘ３はＫ、ＲまたはＨであり；Ｘ４はＦ、Ｔ、Ｙ、ＬまたはＶであり；Ｘ５はＦ、Ｔ、Ｙ、ＬまたはＶである。一実施態様では、Ｘ−１はＰ、Ｓ、ＣまたはＧであり；Ｘ０はＮであり；Ｘ１はＡ、Ｓ、Ｆ、Ｔ、Ｙ、Ｌ、ＫまたはＲであり；Ｘ２はＩまたはＶであり；Ｘ３はＫであり；Ｘ４はＦ、Ｔ、Ｙ、ＬまたはＶであり；Ｘ５はＦ、Ｔ、Ｙ、ＬまたはＶである。
【００５３】
一実施態様では、ファミリー１のペプチドは、Ｎ Ｘ１ＩＫ、Ｎ Ｘ１ＶＫ、Ｎ Ｘ１ ＩＲ、Ｎ Ｘ１ ＶＲ、Ｎ Ｘ１ ＩＨおよびＮ Ｘ１ＶＨからなる群より選ばれるペプチドを含み、ここでＸ１はＡ、Ｓ、Ｆ、Ｔ、Ｙ、ＲまたはＫである。例示的ファミリー１のペプチドを図1に示す。
【００５４】
別の態様では、本発明はアミノ酸配列：Ｘ０Ｘ１Ｘ２Ｘ３を含むファミリー２の環状ペプチドを提供し、ここでＸ０はＮである。ファミリー２のペプチドはＬＲＰ６のＥ１ β-プロペラに結合する。いくつかの実施態様では、ファミリー２のペプチドはまた、ＬＲＰ５に結合する。一実施態様では、Ｘ０はＮであり；Ｘ１はＦ、Ｙ、Ｌ、Ａ、ＲまたはＳであり；Ｘ２はＩまたはＶであり；Ｘ３はＫ、ＲまたはＨである。一実施態様では、Ｘ０はＮであり；Ｘ１はＦ、Ｙ、Ｌ、Ａ、ＲまたはＳであり；Ｘ２はＩであり；Ｘ３はＫ、ＲまたはＨである。一実施態様では、Ｘ０はＮであり；Ｘ１はＦ、Ｙ、Ｌ、Ａ、ＲまたはＳであり；Ｘ２はＩまたはＶであり；Ｘ３はＫであり；Ｘ４はＦ、Ｔ、Ｙ、ＬまたはＶである。一実施態様では、Ｘ０はＮであり；Ｘ１はＦ、Ｙ、Ｌ、Ａ、ＲまたはＳであり；Ｘ２はＩであり；Ｘ３はＫである。一実施態様では、Ｘ０はＮであり；Ｘ１はＦ、Ｙ、Ｌ、Ａ、ＲまたはＳであり；Ｘ２はＩであり；Ｘ３はＲである。一実施態様では、Ｘ０はＮであり；Ｘ１はＦ、Ｙ、Ｌ、Ａ、ＲまたはＳであり；Ｘ２はＶであり；Ｘ３はＫである。一実施態様では、Ｘ０はＮであり；Ｘ１はＦ、Ｙ、Ｌ、Ａ、ＲまたはＳであり；Ｘ２はＶであり；Ｘ３はＲである。
【００５５】
別の実施態様では、ファミリー２の環状ペプチドはさらにＸ０Ｘ１Ｘ２Ｘ３の両側に付加アミノ酸残基を含む。一実施態様では、本発明はアミノ酸配列：Ｘ−１Ｘ０Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４を含むファミリー２の環状ペプチドを提供し、ここでＸ０はＮである。一実施態様では、Ｘ−１はＰ、Ｓ、ＣまたはＧであり；Ｘ０はＮであり；Ｘ１はＦ、Ｙ、Ｌ、Ａ、ＲまたはＳであり；Ｘ２はＩまたはＶであり；Ｘ３はＫ、ＲまたはＨであり；Ｘ４はＦ、Ｔ、Ｙ、ＬまたはＶである。一実施態様では、Ｘ−１はＰ、Ｓ、ＣまたはＧであり；Ｘ０はＮであり；Ｘ１はＦ、Ｙ、Ｌ、Ａ、ＲまたはＳであり；Ｘ２はＩであり；Ｘ３はＫ、ＲまたはＨであり；Ｘ４はＦ、Ｔ、Ｙ、ＬまたはＶである。一実施態様では、Ｘ−１はＰ、Ｓ、ＣまたはＧであり；Ｘ０はＮであり；Ｘ１はＦ、Ｙ、Ｌ、Ａ、ＲまたはＳであり；Ｘ２はＩまたはＶであり；Ｘ３はＫであり；Ｘ４はＦ、Ｔ、Ｙ、ＬまたはＶである。別の実施態様では、本発明はアミノ酸配列：Ｘ１Ｘ０Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５を含むファミリー１のペプチドを提供し、ここでＸ０はＮである。一実施態様では、Ｘ−１はＰ、Ｓ、ＣまたはＧであり；Ｘ０はＮであり；Ｘ１はＦ、Ｙ、Ｌ、Ａ、ＲまたはＳであり；Ｘ２はＩまたはＶであり；Ｘ３はＫ、ＲまたはＨであり；Ｘ４はＦ、Ｔ、Ｙ、ＬまたはＶであり；Ｘ５はＦ、Ｔ、Ｙ、ＬまたはＶである。一実施態様では、Ｘ−１はＰ、Ｓ、ＣまたはＧであり；Ｘ０はＮであり；Ｘ１はＦ、Ｙ、Ｌ、Ａ、ＲまたはＳであり；Ｘ２はＩであり；Ｘ３はＫ、ＲまたはＨであり；Ｘ４はＦ、Ｔ、Ｙ、ＬまたはＶであり；Ｘ５はＦ、Ｔ、Ｙ、ＬまたはＶである。一実施態様では、Ｘ−１はＰ、Ｓ、ＣまたはＧであり；Ｘ０はＮであり；Ｘ１はＦ、Ｙ、Ｌ、Ａ、ＲまたはＳであり；Ｘ２はＩまたはＶであり；Ｘ３はＫであり；Ｘ４はＦ、Ｔ、Ｙ、ＬまたはＶであり；Ｘ５はＦ、Ｔ、Ｙ、ＬまたはＶである。
【００５６】
一実施態様では、ファミリー２のペプチドはＮ Ｘ１ＩＫ、Ｎ Ｘ１ＶＫ、Ｎ Ｘ１ ＩＲ、Ｎ Ｘ１ ＶＲ、Ｎ Ｘ１ ＩＨおよびＮ Ｘ１ＶＨからなる群より選ばれるペプチドを含み、ここでＸ１はＦ、Ｙ、Ｌ、Ａ、ＲまたはＳである。
【００５７】
例示的ファミリー２のペプチドを図２に示す。
【００５８】
別の態様では、本発明はアミノ酸配列：Ｘ−１Ｘ０Ｘ１Ｘ２を含むファミリー３の直鎖状ペプチドを提供し、ここでＸ０はＤまたはＥであり、Ｘ２はＭである。ファミリー３のペプチドはＬＲＰ５のＥ１ β-プロペラに結合する。いくつかの実施態様では、Ｘ−１はＷ、Ｌ、Ｙ、ＦまたはＩであり；Ｘ０はＤまたはＥであり；Ｘ１はＦ、Ｗ、Ｉ、ＳまたはＹであり；Ｘ２はＭである。一実施態様では、Ｘ−１はＷ、Ｌ、Ｙ、ＦまたはＩであり；Ｘ０はＤであり；Ｘ１はＦ、Ｗ、Ｉ、ＳまたはＹであり；Ｘ２はＭである。一実施態様では、Ｘ−１はＷ、Ｌ、Ｙ、ＦまたはＩであり；Ｘ０はＥであり；Ｘ１はＦ、Ｗ、Ｉ、ＳまたはＹであり；Ｘ２はＭであり；Ｘ３はＷ、Ｍ、ＡまたはＧである。一実施態様では、Ｘ−１はＦであり；Ｘ０はＥであり；Ｘ１はＩであり；Ｘ２はＭであり；Ｘ３はＷである。
【００５９】
別の実施態様では、ファミリー３の直鎖状ペプチドはさらにＸ−１Ｘ０Ｘ１Ｘ２の両側に付加アミノ酸残基を含む。一実施態様では、ファミリー３の直鎖状ペプチドはアミノ酸配列：Ｘ−２Ｘ−１Ｘ０Ｘ１Ｘ２Ｘ３を含み、ここでＸ０はＤまたはＥであり、Ｘ２はＭである。一実施態様では、Ｘ−２はＶ、Ｉ、ＬまたはＦ；Ｘ−１はＷ、Ｌ、Ｙ、ＦまたはＩであり；Ｘ０はＤまたはＥであり；Ｘ１はＦ、Ｗ、Ｉ、ＳまたはＹであり；Ｘ２はＭであり；Ｘ３はＷ、Ｍ、ＡまたはＧである。一実施態様では、Ｘ−２はＶ、Ｉ、ＬまたはＦ；Ｘ−１はＷ、Ｌ、Ｙ、ＦまたはＩであり；Ｘ０はＤであり；Ｘ１はＦ、Ｗ、Ｉ、ＳまたはＹであり；Ｘ２はＭであり；Ｘ３はＷ、Ｍ、ＡまたはＧである。一実施態様では、Ｘ−２はＶ、Ｉ、ＬまたはＦ；Ｘ−１はＷ、Ｌ、Ｙ、ＦまたはＩであり；Ｘ０はＥであり；Ｘ１はＦ、Ｗ、Ｉ、ＳまたはＹであり；Ｘ２はＭであり；Ｘ３はＷ、Ｍ、ＡまたはＧである。一実施態様では、Ｘ−２はＶであり；Ｘ−１はＦであり；Ｘ０はＥであり；Ｘ１はＩであり；Ｘ２はＭであり；Ｘ３はＷである。別の実施態様では、本発明はアミノ酸配列：Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１Ｘ０Ｘ１Ｘ２Ｘ３，を含むファミリー３の直鎖状ペプチドを提供し、ここでＸ０はＤまたはＥであり、Ｘ２はＭである。一実施態様では、Ｘ−３はＨ、Ｆ、ＮまたはＱであり；Ｘ−２はＶ、Ｉ、ＬまたはＦ；Ｘ−１はＷ、Ｌ、Ｙ、ＦまたはＩであり；Ｘ０はＤまたはＥであり；Ｘ１はＦ、Ｗ、Ｉ、ＳまたはＹであり；Ｘ２はＭであり；Ｘ３はＷ、Ｍ、ＡまたはＧである。一実施態様では、Ｘ−３はＨ、Ｆ、ＮまたはＱであり；Ｘ−２はＶ、Ｉ、ＬまたはＦ；Ｘ−１はＷ、Ｌ、Ｙ、ＦまたはＩであり；Ｘ０はＤであり；Ｘ１はＦ、Ｗ、Ｉ、ＳまたはＹであり；Ｘ２はＭであり；Ｘ３はＷ、Ｍ、ＡまたはＧである。一実施態様では、Ｘ−３はＨ、Ｆ、ＮまたはＱであり；Ｘ−２はＶ、Ｉ、ＬまたはＦ；Ｘ−１はＷ、Ｌ、Ｙ、ＦまたはＩであり；Ｘ０はＥであり；Ｘ１はＦ、Ｗ、Ｉ、ＳまたはＹであり；Ｘ２はＭであり；Ｘ３はＷ、Ｍ、ＡまたはＧである。一実施態様では、Ｘ−３はＨであり；Ｘ−２はＶであり；Ｘ−１はＦであり；Ｘ０はＥであり；Ｘ１はＩであり；Ｘ２はＭであり；Ｘ３はＷである。
【００６０】
例示的ファミリー３のペプチドを図３に示す。
【００６１】
別の態様では、本発明はファミリー４の環状ペプチドを提供する。ファミリー４のペプチドはＬＲＰ５のＥ１ β-プロペラに結合する。いくつかの実施態様では、本発明は図４に示すファミリー４のペプチドを提供する。
【００６２】
いくつかの実施態様では、本発明のペプチドは１００ｕＭ未満、５０ｕＭ未満、２０ｕＭ未満、１０ｕＭ未満、５ｕＭ未満、１ｕＭ未満、０．５ｕＭ未満、０．１ｕＭ未満または０．０１ｕＭ未満のＫｄで標的に結合する。いくつかの実施態様では、本発明のペプチドは１００ｕＭ未満、５０ｕＭ未満、２０ｕＭ未満、１０ｕＭ未満、５ｕＭ未満、１ｕＭ未満、０．５ｕＭ未満、０．１ｕＭ未満または０．０１ｕＭ未満のＩＣ５０で標的に結合する。
【００６３】
いくつかの実施態様では、本発明のペプチドはアミノ酸アナログを含む。いくつかの実施態様では、本発明のペプチドはファミリー１、ファミリー２、ファミリー３および／またはファミリー４のペプチドを含み、ここでペプチドの少なくとも１のアミノ酸がアミノ酸アナログで置換される。アミノ酸アナログ置換の具体例として、限定ではなく、ＧｌｕおよびＡｓｐの２-アミノアジピン酸（Ａａｄ）；ＧｌｕおよびＡｓｐの２-アミノピメリン酸（Ａｐｍ）；Ｍｅｔ、Ｌｅｕおよび他の脂肪族アミノ酸の２-アミノ酪酸（Ａｂｕ）；Ｍｅｔ、Ｌｅｕおよび他の脂肪族アミノ酸の２-アミノヘプタン酸（Ａｈｅ）；Ｇｌｙの２-アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅのシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ＡｒｇおよびＬｙｓのホモアルギニン（Ｈａｒ）；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓの２,３-ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、およびＡｌａのＮ-エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、およびＡｌａのＮ-エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）；Ａｓｎ、およびＧｌｎのＮ-エチルアスパラギン（ＥｔＡｓｎ）；Ｌｙｓのヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）；Ｌｙｓのアロヒドロキシリジン（ＡＨｙｌ）；Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒの３-（および４-）ヒドロキシプロリン（３Ｈｙｐ、４Ｈｙｐ）；Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、およびＶａｌのアロイソロイシン（ＡＩｌｅ）；Ａｒｇの４-アミジノフェニルアラニン；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、およびＡｌａのＮ-メチルグリシン（ＭｅＧｌｙ、サルコシン）；ＩｌｅのＮ-メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；Ｍｅｔおよび他の脂肪族アミノ酸のノルバリン（Ｎｖａ）；Ｍｅｔおよび他の脂肪族アミノ酸のノルロイシン（Ｎｌｅ）；Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓのオルニチン（Ｏｒｎ）；Ｔｈｒ、Ａｓｎ、およびＧｌｎのシトルリン（Ｃｉｔ）およびメチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）；およびＰｈｅのＮ-メチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、トリメチルフェニルアラニン、ハロ-（Ｆ-,Ｃｌ-,Ｂｒ-またはＩ-）フェニルアラニンまたはトリフルオリルフェニルアラニンが含まれる。
【００６４】
本発明の化合物のより具体的な例として、オリゴヌクレオチド（アプタマーでもよい）、限定ではなくポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体および抗体断片、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体およびこのような抗体または断片のキメラまたはヒト化バージョンならびにヒト抗体および抗体断片を含む抗体が含まれる。あるいは、化合物は、例えばＬＲＰ５またはＬＲＰ６を識別するが付加的効果は与えないＤｋｋ１またはＳＯＳＴの変異型で、したがって野生型Ｄｋｋ１またはＳＯＳＴの作用を競合的に阻害するような関連タンパク質でもよい。上述したように、化合物は、いくつかの実施態様では、Ｄｋｋ１またはＳＯＳＴの作用を阻害するがＷｎｔ分子とＬＲＰ５またはＬＰＲ６との作用は阻害しない。
【００６５】
本発明の付加的な化合物は、Ｄｋｋ１とＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６との相互作用またはＳＯＳＴとＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６との相互作用を阻害する小分子を含む。小分子の例として、限定ではなく、ペプチド様分子および合成非ペプチジル有機または無機化合物が含まれる。
【００６６】
これらの小分子は、本明細書で述べる任意の１または複数のスクリーニングアッセイおよび／または当業者に公知の任意の他のスクリーニング技術により同定できる。
【００６７】
本明細書で記載のように、本発明の化合物はペプチドでよい。このようなペプチドを得る方法は当分野では公知であり、適当な標的抗原のバインダーを求めてペプチドライブラリーをスクリーニングすることを含む。一実施態様では、適当な標的抗原はＬＲＰ５またはＬＲＰ６（またはそのＤｋｋ１またはＳＯＳＴ結合領域を含む一部分)を含み、これは本明細書に詳述されている。例えば、適当な標的抗原はＬＲＰ６またはＬＲＰ５のＥ１ β-プロペラである。ペプチドライブラリーは当分野では周知であり、技術的方法に従って調製することも可能である。例えば、Clarkらの米国特許第６，１２１，４１６号を参照されたい。ファージコートタンパク質などの異種タンパク質成分に融合されたペプチドライブラリーは当分野では周知であり、例えばClarkらのsupraに記載されている。第１のペプチドバインダーのバリアントは、対象となる特徴（例えば標的結合親和性の向上、薬物動態の向上、毒性の低下、治療指数の向上など）を得ることにより、ペプチドの変異体をスクリーニングして産生されうる。変異誘発技術は当分野では周知である。さらに、系統的変異導入技術（アラニンスキャニングに基づくものなど）は、ペプチド内の個々のアミノ酸残基の構造的および／または機能的重要性を評価するのに特に有用でありうる。
【００６８】
ベクター構築
本明細書のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列はまた、標準的な組換え技術を使用して得られうる。所望のポリヌクレオチド配列は適切なソース細胞から単離され配列決定されうる。抗体のソース細胞は、ハイブリドーマ細胞などの抗体産生細胞を含みうる。あるいは、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドシンセサイザーまたはＰＣＲ技術を用いて合成されうる。獲得後、免疫グロブリンをコードする配列は、宿主細胞内で異種ポリヌクレオチドを複製および発現可能な組換えベクターに挿入される。本発明の目的には、入手可能な、当分野で既知の多くのベクターが使用可能である。適切なベクターの選択は、ベクターに挿入される核酸およびベクターで形質転換される特定の宿主細胞のサイズに主として依存する。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅または発現、またはその両方）と、それが存在する特定の宿主細胞との適合性により、異なるコンポーネントを含有する。ベクターのコンポーネントは一般に、限定ではなく、複製開始点（特にベクターが原核細胞に挿入される場合）、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合領域（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸挿入および転写終結配列を含む。
【００６９】
一般に、宿主細胞と適合性のある種由来のレプリコンおよびコントロール配列を含むプラスミドベクターが、これらの宿主と関連して使用される。ベクターは、通常、複製部位ならびに形質転換細胞において表現型の選択を提供可能なマーキング配列を有する。例えば、大腸菌は、典型的には大腸菌種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換される。ｐＢＲ３２２はアンピシリン（Ａｍｐ）およびテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性のコード遺伝子を含むので、形質転換細胞の同定を容易にする。ｐＢＲ３２２、その誘導体または他の微生物プラスミドまたはバクテリオファージもまた、微生物が外来性タンパク質発現に使用できるプロモーターを含みうるか、または含むように変更されうる。
【００７０】
加えて、宿主微生物と適合性のあるレプリコンおよびコントロール配列を含むファージベクターを、これら宿主と関連して、形質転換ベクターとして使用できる。例えば、λＧＥＭ.ＴＭ.-１１などのバクテリオファージを、大腸菌ＬＥ３９２などの感受性の宿主細胞の形質転換に使用可能な組換えベクターの作製に利用できる。
【００７１】
当業者が確認できる特定の状況の必要性に従って、構成または誘導プロモーターの何れかを本発明で使用することができる。様々な潜在的な宿主細胞に認識される多数のプロモーターがよく知られている。選択したプロモーターは、制限酵素消化によって供給源ＤＮＡ由来のプロモーターを除去し、単離したプロモーター配列を選択したベクターに挿入することで、本明細書記載のポリペプチドをコードするシストロンＤＮＡに作用可能に連結できる。ネイティブのプロモーター配列と多数の異種プロモーターはいずれも標的遺伝子の増幅および／または発現の指令に使用されうる。しかし、異種プロモーターのほうがネイティブの標的ポリペプチドプロモーターよりも一般に転写活性が高く発現標的遺伝子の収量も高いので、より好ましい。
【００７２】
原核生物宿主との使用に適したプロモーターには、ＰｈｏＡプロモーター、β-ガラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系およびｔａｃまたはｔｒｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが含まれる。しかし、細菌において機能的な他のプロモーター（例えば、他の既知のバクテリアまたはファージプロモーター）も同様に適している。そのヌクレオチド配列は公開されているので、当業者は、リンカーまたはアダプターを用いてそれらを標的の軽鎖および重鎖をコードするシストロンに作用可能にライゲートさせて任意必要な制限部位を供給できる（Siebenlistら, (1980) Cell, 20:269）。
【００７３】
ある実施態様では、組換えベクター内の各シストロンは、発現されたポリペプチドが膜を越えて転位置するのを指示する分泌シグナル配列コンポーネントを含む。一般に、シグナル配列はベクターのコンポーネントであってよく、またはベクターに挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部であってもよい。本発明の目的に選択されるシグナル配列は、宿主細胞に認識されプロセスされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）配列であるべきである。異種ポリペプチド本来のシグナル配列を識別もプロセスもしない原核生物の宿主細胞に対しては、シグナル配列を例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡおよびＭＢＰからなる群より選択される原核生物のシグナル配列で置換する。
【００７４】
ポリペプチドを発現させるのに好適な原核生物の宿主細胞としては、グラム陰性またはグラム陽性生物などの古細菌および真正細菌が挙げられる。有用な細菌の例としてはエシェリキア属（例えば、大腸菌）、桿菌（例えば、枯草菌）、腸内細菌、シュードモナス種（例えば、緑膿菌）、ネズミチフス菌、セラチア・マルセスカンス、クレブシエラ属、プロテウス属、赤痢菌属、根粒菌、ビトレオシラ、またはパラコッカスが挙げられる。好ましくは、グラム陰性細胞が使用される。好ましくは、宿主細胞は最少量のタンパク分解性酵素を分泌すべきであり、追加のプロテアーゼ阻害剤を細胞培養物中に望ましくは導入してもよい。
【００７５】
ポリペプチド産生
宿主細胞を上述した発現ベクターで形質転換または形質移入し、プロモーターの誘導、形質転換体の選抜または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適するよう改変した一般的な栄養培地で培養する。
【００７６】
形質移入とは、任意のコード配列が実際に発現されようとされまいと、発現ベクターが宿主細胞に取り込まれることを指す。数多くの形質移入法が当業者に知られており、例えばＣａＰＯ４沈殿法および電気穿孔法がある。成功裏の形質移入は、一般に、このベクターの作用の任意の指標が宿主細胞内で生じる場合に認識される。
【００７７】
形質転換とは、ＤＮＡを原核生物の宿主に導入し、そのＤＮＡが染色体外要素としてまたは染色体組込み体により複製可能になることを意味する。形質転換は、用いる宿主細胞に応じて、かかる細胞に適切な標準的技術を用いて行う。一般に、かなりの細胞壁バリアを含む細菌細胞には塩化カルシウムを用いるカルシウム処理が使用される。別の形質転換法は、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。さらに別の技術として電気穿孔法が用いられる。
【００７８】
本発明のポリペプチドを生産するために用いられる原核細胞は、選択した宿主細胞の培養に適切な当分野で既知の培地中で増殖させる。適切な培地の例としては、必要なサプリメントを補填したルリアブロス（ＬＢ）が挙げられる。好ましい実施態様では、培地はまた、発現ベクターの構成を基に選択した選択剤も含み、発現ベクターを含有する原核細胞の選択的な増殖を可能にしてよい。例えば、アンピシリンを培地に加えて、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞を増殖する。
【００７９】
炭素、窒素および無機リン酸供給源の他に、任意必要なサプリメントも適当な濃度で、単独でまたは複合窒素源などの他のサプリメントもしくは培地との混合物として導入し含めてもよい。培養培地は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリスリトールおよびジチオスレイトールからなる群より選択される１または複数の還元剤を含んでもよい。
【００８０】
原核宿主細胞を適切な温度で培養する。例えば、大腸菌増殖の好ましい温度は約２０℃から約３９℃、より好ましくは約２５℃から約３７℃の範囲であり、さらに好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは、主として宿主生物に依存して、約５から約９の範囲の任意のｐＨでよい。大腸菌には、ｐＨは好ましくは約６．８から約７．４であり、より好ましくは約７．０である。
【００８１】
発現ベクターに誘導プロモーターを用いる場合には、タンパク質発現はプロモーターの活性化に適切な条件下で誘導される。例えば、転写制御にＰｈｏＡプロモーターを用いる場合、形質転換された宿主細胞は誘導のためにリン酸制限培地で培養されうる。用いられるベクター構築物によっては、当分野で周知のように、様々な他の誘導物質を用いてもよい。
【００８２】
微生物中に発現される本明細書記載のポリペプチドは、宿主細胞のペリプラズムに分泌されそこから回収されうる。タンパク質回収は典型的には、一般に浸透圧ショック、超音波処理または溶解といった手段による微生物の破壊を伴う。細胞を破壊したら、細胞細片または全細胞を遠心分離または濾過によって取り除くことができる。タンパク質は、例えば樹脂アフィニティークロマトグラフィーでさらに精製してもよい。あるいは、タンパク質は培養培地に移行され、そこから単離されうる。細胞は培養物および培養物上清から濾過され濃縮されて除去され、産生されたタンパク質がさらに精製されうる。発現されたポリペプチドはさらに単離され、一般的に既知の方法、例えば免疫親和性またはイオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカまたはＤＥＡＥなどのカチオン交換樹脂でのクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ−７５を使用してのゲル濾過；疎水性アフィニティー樹脂、マトリックスに固定した適切な抗原を使用するリガンドアフィニティおよびウェスタンブロットアッセイを使用してさらに単離、同定できる。
【００８３】
原核宿主細胞の他に、真核宿主細胞系もまた当分野で十分に確立されている。適切な宿主にはＣＨＯなどの哺乳動物細胞株および以下に記載の昆虫細胞が含まれる。
【００８４】
ポリペプチド精製
産生されたポリペプチドを精製して、更なるアッセイおよび用途のための実質的に均質な調製物を得ることができる。当分野で既知の標準的なタンパク質精製法を用いることができる。以下の手順は適切な精製手順の例である：免疫親和性またはイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカまたはＤＥＡＥなどのカチオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿および例えばセファデックスＧ−７５を使用してのゲル濾過。
【００８５】
本発明の候補物質／分子の化合物がＤｋｋ１のＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６との結合およびＳＯＳＴのＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６との結合を阻害する能力は、実施例セクションに記載の、インビトロまたはインビボアッセイで化合物の調節能力を試験することで決定されうる。
【００８６】
薬学的組成物および投与様式
様々な化合物（ペプチドなどを含む）が治療剤として使用されうる。一実施態様は、本発明の化合物を含有する薬学的組成物または医薬および治療的に不活性な担体、希釈剤または賦形剤ならびにこのような組成物や医薬を調製するために本発明の化合物を使用する方法を提供する。一例では、化合物は、室温および適切なｐＨで、所望の純度で、生理的に許容可能な担体、すなわちガレノス（galenical）投与形態で使用する用量と濃度でレシピエントに無毒の担体と混合して処方されうる。製剤のｐＨは主として化合物の特定の用途と濃度によるが、好ましくは、約３から約８の範囲の任意の値である。一例では、化合物は酢酸バッファー中ｐＨ５で処方される。別の実施態様では、化合物は無菌である。化合物は、例えば個体または非結晶の組成物として、凍結乾燥組成物として、または水溶液として保存されうる。
【００８７】
化合物は優良医療規範に則った様式で処方され、服用され、投与される。この場合に考慮すべき要素には、治療されている特定の疾患、治療されている特定の患者、患者個人の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュールおよび医師に既知の他の要素が含まれる。
【００８８】
適用のための薬学的組成物（または製剤）は、薬剤の投与方法により、様々な方法で包装されうる。一般に、流通品は、適切な形態で薬剤が入れられた容器を含む。適切な容器は当業者には公知であり、瓶（プラスチックおよびガラス）、小袋、アンプル、ビニール袋、金属製シリンダーなどの物品を含む。容器はまた、包装内容物の不注意な使用を避けるために不正開封防止部を含んでよい。加えて、容器にはその内容物を記載したラベルを取り付けてよい。ラベルはまた、適切な警告を含みうる。
【００８９】
徐放性製剤が調製されうる。徐放性製剤の適切な例は、化合物を含有する疎水性固形ポリマーの半透過性マトリックスを含み、このマトリックスは、例えば薄膜やマイクロカプセルなどの成形された物品の形をとる。徐放性製剤の例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば２-ヒドロキシエチル-メタクリレート）、またはポリ(ビニルアルコール)）、ポリ酪酸、Ｌ-グルタミン酸およびガンマ-エチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-ビニルアセテート、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴＴＭなどの分解性乳酸‐グリコール酸コポリマー（乳酸‐グリコール酸コポリマーとリュープロリド酢酸塩からなる注入可能な微粒子）およびポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸を含む。
【００９０】
一例では、非経口的に投与される本発明の化合物の用量当たりの治療的に効果のある量は、化合物１日当たり患者体重の約０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ、あるいは約０．１から２０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、化合物の典型的な開始使用範囲は０．３から１５ｍｇ／ｋｇ／日である。別の実施態様では、錠剤やカプセルなどの経口ユニットの投与形態は、本発明の化合物を好ましくは約５〜１００ｍｇ含有する。
【００９１】
本発明の化合物は、経口、（バッカル（頬側）や舌下を含む）局所的、直腸内、膣内、経皮、非経口、皮下、腹腔内、肺内、皮内、くも膜下内および硬膜外および鼻腔内、および局所治療に所望の場合は病巣内投与を含む任意適切な方法で投与されうる。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または皮下投与を含む。
【００９２】
本発明の化合物は、例えば錠剤、粉末、カプセル、溶液、分散液、懸濁液、シロップ、スプレー、座薬、ゲル、乳濁液、パッチなどの任意一般的な投与形態で投与されうる。このような組成物は、例えば希釈物、担体、ｐＨ調整剤、甘味料、バルク剤および他の活性剤などの一般的な薬剤調製成分を含有しうる。
【００９３】
典型的な製剤は、本発明の化合物と担体または賦形剤を混合して調製される。適切な担体と賦形剤は当業者には公知であり、詳細は例えばAnsel, Howard C.ら, Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems. Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, 2004; Gennaro, Alfonso R.ら, Remington: The Science and Practice of Pharmacy. Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, 2000;およびRowe, Raymond C. Handbook of Pharmaceutical Excipients. Chicago, Pharmaceutical Press, 2005に記載されている。製剤はまた、１または複数のバッファー、安定剤、界面活性剤、湿潤剤、潤滑剤、乳化剤、懸濁剤、保存料、酸化防止剤、オペーク剤、滑走剤、加工補助剤、着色料、甘味料、芳香剤、香味剤、希釈剤および薬剤（すなわち本発明の化合物またはその薬学的組成物）の外観を整えるか、または薬学的製品（すなわち医薬）の製造を補助する他の既知の添加剤を含みうる。
【００９４】
適切な経口剤形の一例は、約９０〜３０ｍｇの無水乳糖、約５〜４０ｍｇのクロスカルメロースナトリウム、約５〜３０ｍｇのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）Ｋ３０および約１〜１０ｍｇのステアリン酸マグネシウムと調合された本発明の化合物を約２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２５０ｍｇまたは５００ｍｇ含有する錠剤である。粉末成分を最初に混合し、次いでＰＶＰ溶液と混合する。得られた組成物は、一般的な装置を用いて乾燥、粒化され、ステアリン酸マグネシウムと混合されて錠剤形に圧縮されうる。エアロゾル製剤の一例は、例えば５〜４００ｍｇの本発明の化合物を、例えばホスフェートバッファーなどの適切なバッファー溶液中に、所望ならば例えば塩化ナトリウムなどの塩などの等張化剤（tonicifier）を加え、溶解させて調製されうる。溶液は例えば０．２ミクロンのフィルターを用いて濾過され、不純物と混入物が除去されうる。
【００９５】
したがって、一実施形態は、化合物またはその立体異性体または薬学的に許容可能な塩を含む薬学的組成物を含む。別の実施態様は、薬学的に許容可能な担体または賦形剤とともに化合物またはその立体異性体または薬学的に許容可能な塩を含む薬学的組成物を含む。
【００９６】
本明細書の製剤はまた、必要に応じて、治療される特定の適応症のため、好ましくは互いに有害な影響を与えない相補的活性を有する２以上の活性化合物を含有してよい。あるいは、または加えて、組成物は、例えば細胞傷害性薬物、サイトカイン、化学療法薬または増殖阻害剤などの、組成物の機能を増強する薬物を含みうる。このような分子は、意図する目的に有効な量で、組み合わせて適切に存在する。
【００９７】
スクリーニング法
別の態様では、本発明はＤｋｋ１および／またはＳＯＳＴとＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６との相互作用を阻害する化合物のスクリーニング法を提供する。方法は（好ましくは、ただし必要ではないが、特異的に）ＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６に結合して、Ｄｋｋ１および／またはＳＯＳＴがこれらの受容体に特異的に結合するのを阻害する化合物のスクリーニングを含む。
【００９８】
本発明は、Ｄｋｋ１とＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６との相互作用を阻害する化合物およびスクレロスチンとＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６との相互作用を阻害する化合物を同定するための候補または試験化合物をスクリーニングする方法を包含する。一実施態様では、化合物はＷｎｔシグナルを阻害しない。スクリーニングアッセイは、ＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６に結合するか複合する、またはＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６とＤｋｋ１および／またはＳＯＳＴとの相互作用を阻害する化合物を同定するように設計される。このようなスクリーニングアッセイは、化合物ライブラリーの高効率なスクリーニングを可能にし、特に小分子薬剤候補の同定に適するアッセイを含む。
【００９９】
アッセイは、当分野で特徴が明らかにされている。タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイおよび細胞アッセイを含む様々なフォーマットで実施可能である。
【０１００】
一実施態様では、アッセイは、候補化合物とＬＲＰ５またはＬＲＰ６（またはその等価物）との相互作用に十分な時間および条件下でこれら２種類の組成物を接触させることが必要である。一実施態様では、候補化合物はＬＲＰ６のＥ１のβ-プロペラドメインと接触させられる。一実施態様では、候補化合物はＬＲＰ５のＥ１のβ-プロペラドメインと接触させられる。結合アッセイでは、相互作用は結合であり、形成された複合体は反応混合物中で単離または検出されうる。特定の実施態様では、候補化合物は例えばマイクロタイタープレートなどの固相に共有結合または非共有結合で固定される。非共有結合は一般に、固体表面を物質／分子の溶液でコートし乾燥させて得られる。あるいは、固定される物質／分子の特異的な抗体（例えばモノクローナル抗体）などの固定化親和性分子を用いて物質／分子を固体表面に固定してもよい。アッセイは、検出可能な標識で標識されうる非固定化コンポーネントを固定化コンポーネント（例えば固定されたコンポーネントを含有するコート面）に付加することにより実施される。反応が完了すると、反応しなかったコンポーネントは例えば洗浄などにより除去され、固体表面に固定された複合体が検出される。当初の非固定化コンポーネントが検出可能な標識をもつ場合、表面に固定化された標識の検出は、複合が生じたことを示す。もとの非固定化コンポーネントが標識をもたないところでは、例えば固定化複合体に特異的に結合する標識抗体を使用して、複合が検出されうる。
【０１０１】
別の実施態様では、候補化合物とＬＲＰ５もしくはＬＲＰ６またはＬＲＰ６のＥ１のβ-プロペラドメインもしくはＬＲＰ５のＥ１のβ-プロペラドメインなどその機能的等価部分の間の相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出する周知の方法によって検定されうる。このようなアッセイには、従来の手法、例えば、架橋結合、同時免疫沈降法および勾配またはクロマトカラムによる同時精製が含まれる。加えて、ChevrayおよびNathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991)に開示のFieldsと共同研究者ら記述（FieldsおよびSong, Nature (London), 340:245-246 (1989)；Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)）の酵母ベースの遺伝システムを用いて、タンパク質−タンパク質相互作用をモニターできる。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化因子は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。前記文献記載の酵母発現系（一般に「ツーハイブリッドシステム」と呼ばれる）は、この特性を生かして２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１-ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質−タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性基質を用いて検出される。ツーハイブリッド技術を用いた２つの特定のタンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を同定する完全なキット（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲＴＭ）は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から購入できる。この系はまた、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、ならびにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張使用できる。
【０１０２】
本発明の別の態様は、Ｄｋｋ１またはＳＯＳＴとＬＲＰ５またはＬＲＰ６標的分子の相互作用を試験化合物が阻害する能力をスクリーニングするのに本明細書のペプチドを使用することを含むアッセイを提供する。ＬＲＰ５またはＬＲＰ６標的分子は、完全長のＬＲＰ５またはＬＲＰ６分子ならびにＬＲＰ６のＥ１のβ-プロペラドメインもしくはＬＲＰ５のＥ１のβ-プロペラドメインなどのその機能的等価部分を含む。一実施態様では、アッセイは、本発明のペプチド、例えばファミリー１、ファミリー２、ファミリー３またはファミリー４のペプチドから選ばれるペプチドの存在下または不在下で、試験化合物とＬＲＰ５またはＬＲＰ６標的分子を接触させることを含む。このペプチドはアッセイのコンテキストではペプチドリガンドと呼ばれる。試験化合物がＬＲＰ５またはＬＰＲ６標的分子との結合を競合したり、ＬＲＰ５またはＬＰＲ６標的分子からペプチドリガンドを追い出す場合は、試験化合物はＤｋｋ１またはＳＯＳＴと標的分子との相互作用を阻害する化合物として選択される。選択された試験化合物はさらに、本明細書記載の当分野では周知のアッセイを使用して、骨成長促進能などの特異的な所望の特徴、ならびにＷｎｔリガンドとＬＲＰ５またはＬＰＲ６標的分子を結合させる効果について評価できる。
【０１０３】
試験化合物がペプチドリガンドとＬＲＰ５またはＬＰＲ６標的分子の結合を阻害する能力は、当分野では周知の技術により評価されうる。標的分子、ペプチドリガンドまたは試験化合物のいずれかをアッセイ相互作用のモニタリングを容易にするために検出可能な標識で標識してよい。このような標識は、放射性同位元素、蛍光標識、化学発光標識、磁気粒子、染料、金属粒子、酵素などを含む。このような標識の例として、限定ではなく、ビオチン、フルオレセイン、テキサスレッド、ルシファーイエローおよびローダミンが挙げられる。他の標識法は、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼおよびグルコースオキシダーゼなどの酵素トレーサーを含む。
【０１０４】
このようなスクリーニングアッセイは、化合物ライブラリーの高効率なスクリーニングを可能にし、特に小分子薬剤候補の同定に適するアッセイを含む。意図される小分子は、合成有機または無機化合物を含む。アッセイは、当分野で特徴が明らかにされている、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイおよび細胞アッセイを含む様々なフォーマットで実施可能である。
【０１０５】
試験化合物は、例えばペプチド、ペプチドミメティック、ビニル性ペプトイド（vinylogous peptoid）などのペプトイド、ポリヌクレオチドまたは有機小分子などを含む任意のタイプの分子でよい。
【０１０６】
以下は本発明の方法と組成物の実施例である。上述の一般的な記載をふまえて、他の様々な実施態様が実施されうることを理解されたい。
【０１０７】
本明細書に引用される特許出願および公開を含むすべての文献は、その全体が参照として組み込まれる。
【実施例】
【０１０８】
実施例１
材料と方法
材料。高純度のＷｎｔ３ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｄｋｋ２、Ｄｋｋ３およびＤｋｋ４を無担体タンパク質としてＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ミネソタ州ミネアポリス）から入手し、結合および細胞アッセイに使用した。先述のように（１１）、Ｄｋｋ１、スクレロスチンおよびＬＲＰ６タンパク質をコードする遺伝子を、改変されたｐＡｃＧＰ６７バキュロウイルスＤＮＡトランスファーベクター（BD Pharmingen）にクローニングし、Ｔｎｉ昆虫細胞（Expression Systems, LLC, カリフォルニア州ウッドランド）でバキュロウイルスを発生させ細胞外で発現させた。
【０１０９】
タンパク質の発現および精製。先述のプロトコール（１１）に従って、本研究で使用されるすべてのＬＲＰ６、Ｄｋｋ１およびスクレロスチンタンパク質が発現され精製された。この後、純タンパク質は濃縮して１０μＭのストックとして−８０℃で保存できる。抗ＬＲＰ６ Ｅ１ ＹＷ２１０．０９ Ｆａｂを、形質転換されたＥ．Ｃｏｌｉ３４Ｂ８（Stratagene)を低濃度ホスフェートＡＰ５培地で２４時間３０℃で成長させて（４３）発現させ、Ｇタンパク質アフィニティーカラム（GE Healthcare）で精製した（４４）。Ｆａｂ含有断片はさらにＳＰ−セファロースカラム（GE Healthcare）を通過させて精製した。タンパク質濃度は２８０ｎｍの吸光度で決定した。
【０１１０】
タンパク質複合体の結晶化。精製されたＬＲＰ６ Ｅ１Ｅ２をＹＷ２１０．０９ Ｆａｂと一晩インキュベートして安定な複合体を形成し、複合体をＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００ゲル濾過カラム（GE Healthcare）で精製した。複合体を含有する断片をプールし、８ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、１０ｍＭのトリスｐＨ８、３００ｍＭのＮａＣｌおよび２．５％のグリセロールを含有するバッファーに透析した。０．２Ｍのギ酸アンモニウムと２０％のＰＥＧ３３５０（ｗ／ｖ）の溶液から結晶が得られた。溶解構造中にＬＲＰ６Ｅ１しか観察できなかったので結晶を質量分析法で分析し、ＬＲＰ６ Ｅ２がＡｒｇ ３３５を超えて溶解していることが見いだされた。精製されたＬＲＰ６ Ｅ１とＤｋｋ１ペプチドの複合体を０．１Ｍのチオシアン酸カリウムと３０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ  ＭＭＥ  ２０００、または０．２ＭのＮａＣｌ、０．１ＭのトリスｐＨ８、２５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ  ３，３５０から結晶化した。付加ペプチドとＬＲＰ６ Ｅ１の複合体の結晶化が、過剰な対象ペプチド（１から２ｍＭの最終濃度）とＬＲＰ６ Ｅ１の存在下でもとの共結晶（Ｄｋｋ１ペプチド含有）をマイクロシードして得られた。播種された結晶は２つのもとのＤｋｋ１ペプチドの結晶化条件の一方（または両方）から２、３日で成長し、対象となるペプチドを含有することが見いだされた。
【０１１１】
データ収集と構造決定。回折データは単色Ｘ線ビーム（１２３９８．１ｅＶ）を用いてＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＬＳ）のビームライン５．０．２で収集した。Ｘ線検出装置はＡＤＳＣ  ｑｕａｎｔｕｍ−２１０  ＣＣＤ検出器であり、結晶から３５０ｍｍ離して設置した。あるいは、データは、スタンフォード・シンクロトロン放射光研究所（ＳＳＲＬ７１）またはＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｃｅ（ＡＰＳ２１１ＤＦ）で、または社内でＲｉｇａｋｕ  Ｘ線発生装置００７ＨＦモデルをＲｉｇａｋｕ  ＣＣＤカメラ（００７ＨＦ／Ｓａｔｕｒｎ  ９４４＋）に連結して使用し収集した。データ収集に先立ち、結晶を２５％のグリセロール含有凍結保護溶液に移し、次いで液体窒素中で急速冷凍した。完全なデータセットを収集するため、単結晶にフレーム当たり１°の振動、トータルウェッジサイズは１８０°で回転法を適用した。次いでＨＫＬ２０００プログラム（４５）を使用してデータを指数付けし、積分し、スケーリングした。ＬＲＰ６ Ｅ１／Ｆａｂ構造をＰｈａｓｅｒプログラム（CCP4, 英国  デアスベリー）を用いて分子置換（ＭＲ）法により解析した。マシューズ係数（Matthews’ coefficient）計算の結果、非対称の各ユニットは１つのＦａｂ／Ｅ１複合体と５４％の溶媒からなることが示された。したがって、ＦａｂのＮ末端ドメイン、ＦａｂのＣ末端ドメインおよびＥ１のβ-プロペラドメインを含む３つのサブユニットの１セットを探すようにＭＲ計算を行った。ＮおよびＣ末端ドメインは、Ｆａｂのエルボ角度を変数として別々に探した。ＦａｂサブユニットのサーチモデルはＨＧＦＡ／Ｆａｂ複合体の結晶構造から得た（４６）。β-プロペラドメインのサーチモデルはＥＳｙＰｒｅｄ３Ｄウェブサーバーを介して生成した相同モデルであり（４７）、ＬＤＬ受容体の細胞外ドメイン構造（４８）を相同モデルの鋳型として使用した。ＭＲソリューションを使用して算出した差異電子密度マップにより、ＥＦＧドメイン構造が明らかになった。Ｆａｂ複合体のＬＲＰ６Ｅ１ドメインをサーチモデルとして用いて、分子置換によりＬＲＰ６−ペプチド複合体の構造を決定した。電子密度にペプチドを手動で組み込んだ。手動での再構築はＣＯＯＴプログラム（４９）を用いて行った。構造の精密化は、最尤標的機能、異方性の個々のＢ因子精密化を使用して、ＲＥＦＭＡＣ５（５０）およびＰＨＥＮＩＸプログラム（５１）を用いて実施した（ペプチド複合体のみ。
【０１１２】
結合アッセイ。前述したように（１１）、結合キネティクスは、Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ測定器（ForteBio）を使用してバイオレイヤー干渉法により測定した。ストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサーに５０ｍＭのトリス、ｐＨ８、３００ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｖ／ｖ）のグリセロールおよび０．０５％（ｗ／ｖ）のトリトンＸ−１００中ビオチン化したｈＬＲＰ６をロードした。ロードされたバイオセンサーを同じバッファー中で洗ったあと、指示の回数会合と解離の測定を実施した。各相互作用のＫｄはＯｃｔｅｔ  Ｒｅｄソフトウェアｖ６．３で定常状態解析を使用して決定された。報告された値はそれぞれ、異なる濃度の３またはそれ以上の実験の平均値であり、実験のカーブフィッティングは、相関係数の二乗（Ｒ２）が０．９６を上回った。
【０１１３】
あるいは、親和性は蛍光偏光法（ＦＰ）により決定された。フルオレセインで修飾されたペプチドプローブ（３０ｎＭ）を、特定の標的−プローブの組み合わせの親和性に適切な濃度でＬＲＰ５またはＬＲＰ６ Ｅ１ドメインと混合した（およそのＫｄ）。次いで競合試験剤（タンパク質またはペプチド）を加え、試験剤の濃度関数としてＦＰモニターを行った。阻害定数は、得られたカーブをカレイダグラフプログラム（Synergy Software）を使用して標準方程式にフィットさせて得た。
【０１１４】
ペプチドの親和性はまた、結合ペプチドを提示しているファージとの競合によって決定された（競合ファージＥＬＩＳＡ）。段階希釈した試験ペプチドを適切な（不飽和）濃度のファージと混合し、混合物を標的に曝露して均衡に到達させた。非結合材料を洗浄した後、抗Ｍ１３抗体西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートとインキュベートし、適切な発色性ＨＲＰ基質に曝露することにより結合ファージを検出した。
【０１１５】
最後に、ペプチドの親和性はまた、競合ＥＬＩＳＡにより決定された。Ｍａｘｉ−Ｓｏｒｂプレート（Nunc）をストレプトアビジンまたはニュートラアビジン（リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中５μｇ／ｍＬ；一晩、４°Ｃ）でコートし、ＰＢＳ中０．２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックした（１時間、室温）。ビオチン化Ｅ１結合ペプチドＡｃ−ＧＳＬＣＳＮＲＩＫＰＤＴＨＣＳＳＫ（ビオチン）−ａｍ（ジスルフィド）の溶液（ＰＢＳ中５００ｎＭ）を各ウェルに３０分加え、次いでウェルをＰＢＳ含有０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０で３回洗浄して過剰ペプチドを除去した。ＨｉｓタグＥ１ドメインまたはＦＬＡＧタグＥ１Ｅ２タンパク質（最終濃度５〜１０ｎＭ）を段階希釈した試験ペプチドと１５分プレインキュベートし、混合物をアッセイプレートのウェルに３０分加えた。ウェルを洗浄し、次いでＱｉａｇｅｎペンタＨｉｓ−ＨＲＰコンジュゲートまたはシグマ抗ＦＬＡＧ  Ｍ２  ＨＲＰコンジュゲート（ＰＢＳ中１：２０００希釈、０．２％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を３０分加え、結合したＬＲＰ６をプローブした。洗浄後、ＴＭＢ基質を加えた（Kirkegaard and Perry Laboratories）。ウェルを１ＭのＨ３ＰＯ４でクエンチし、プレートを４５０ｎｍで読んだ。カレイダグラフプログラム（Synergy Software）を使用して、得られたカーブを標準的な４つのパラメータ方程式にフィットさせて阻害定数を得た。
【０１１６】
光散乱実験。前述したとおり（１１）、１１０μｌのタンパク質または一晩均衡させたタンパク質複合体の一定分量をＳＥＣ−ＭＡＬＳ（Ｏｐｔｉｌａｂ  Ｒｅｘに連結したＱＥＬＳ  ＨＰＬＣを用いたＤａｗｎ  Ｈｅｌｉｏｓ  ２、Wyatt Technologies）で分析した。
【０１１７】
ファージディスプレイ。ファージディスプレイペプチドライブラリー（およそ２×１０１０の独自のメンバー）を記載のとおり（４１）構築し、ＬＲＰ６ Ｅ１Ｅ２、Ｅ１またはＥ３Ｅ４に対する、またはＬＲＰ５ Ｅ１に対する溶液結合選択に４回かけた。ファージＥＬＩＳＡでＬＲＰ６に結合した個々のファージクローンをＤＮＡ配列解析に供した。
【０１１８】
細胞内β／-カテニンアッセイ。Ｗｎｔシグナルをマウス線維芽細胞Ｌ細胞またはＨＥＫ２９３細胞で評価した。２９３細胞のルシフェラーゼリポーターアッセイを記載（５２）のとおり実施した。マウス線維芽細胞Ｌ細胞イメージングアッセイを基本的に記載（５３）のとおり実施した。細胞は指示どおりにＷｎｔ３ａ、Ｆｚ８  ＣＲＤ（（米国特許公開第２００８０２９９１３６号；（５４）、ＬＲＰ６またはＤｋｋ１、またはこれらのタンパク質の組み合わせで処理し、３７℃、５％ＣＯ２で６時間の後プロセスした。
【０１１９】
頭蓋冠骨モデル。前述のとおり（５２、５５）頭蓋冠を採取し培養する。頭蓋冠を０．１％ウシ血清アルブミンと各１００Ｕ／ｍｌのペニシリンとストレプトマイシンを補充したＢＧＪｂ培地の組織培養プレートで１日培養し、適切な濃度のペプチドまたはタンパク質で７日間処理する。骨は５％のＣＯ２を含む３７ｏＣの湿った大気中で培養する。マウスの頭蓋冠はμＣＴ４０（SCANCO Medical,スイス、バッサードルフ）Ｘ線マイクロＣＴシステムで撮像する。マイクロＣＴスキャンはＡｎａｌｙｚｅ（AnalyzeDirect Inc., アメリカ合衆国、カンザス州レネクサ）で分析する。あるいは、頭蓋冠を組織学的に染色し、石灰化領域を観察する。マウスを使用する実験はすべてGenentech Institutional Animal Care and Use Committeeの指針に従って実施される。
【０１２０】
実施例２
ＬＲＰ６ Ｅ１−ＹＷ２１０．０９ Ｆａｂ複合体の構造。
ＬＲＰ６の第１のβ-プロペラとＥＧＦドメイン（Ｅ１ドメイン）と抗ＬＲＰ６抗体ＹＷ２１０．０９（国際公開第２０１１１１９６６１号）のＦａｂの複合体の結晶構造を分子置換により決定し、ＲとＲフリーはそれぞれ０．１７５と０．２２０で１．９Åの分解能まで精密化した。結晶非対称単位は１つのＬＲＰ６ Ｅ１ドメインと１つのＹＷ２１０．０９ Ｆａｂからなる。解釈可能な電子密度でＥ１ドメインの残基Ａｌａ２０からＬｙｓ３２４の追跡ができた。Ｆａｂ重鎖の残基Ｓｅｒ１２７からＴｈｒ１３１を除いて、Ｆａｂ重鎖と軽鎖はそれぞれ残基Ａｓｐ１からＧｌｕ２１３およびＧｌｕ１からＬｙｓ２１４を追跡できた（すべてＫａｂａｔの番号付け法を使用した（５６））。
【０１２１】
ＬＲＰ６ Ｅ１ドメインはβ-プロペラモジュールと上皮増殖因子（ＥＧＦ）様モジュールを備えるモジュラー構造内に構築される。β-プロペラは、４本鎖の逆平行のβシートが放射状に配置されて形成されるブレード６枚からなり、Ｎ末端の端部は中心チャネルに面し、ＹＷＴＤモチーフが各ブレードの２番目の鎖に局在する。ＬＲＰ６ Ｅ１のβ-プロペラ構造はＬＤＬｒ構造と酷似しており（５７）、配列一致性はわずか３６％にもかかわらず、２４５Ｃα原子と重ね合わせを行うとｒｍｓｄは０．８３Åであった。保存残基のほとんどは、β-プロペラの構造完全性に不可欠な、βシートを形成するＹＷＴＤコアモチーフの周りに集中した。これに対し、表面残基はこれらの受容体の機能的多様性からも考えられるように、非常に多様であった。ＬＲＰ６はそのＥＧＦ様ドメインを使ってプロペラの第１および第６のブレードを固定する（その機械的強度を維持するため）。ＥＧＦ様分子はβ-プロペラからＣ末端側に１０残基のリンカーを経て伸長し、β-プロペラの下側へと折り返し、第３と第４のブレードの間の表面に連結する。埋められた広大な１２２６Å２の総表面積および形状相補性スコアが０．７４ということから示されるように、ＥＧＦ様ドメインとβ-プロペラとの相互作用は広範である（５８）。ＥＧＦモジュールの第１のβ鎖の残基Ｌｅｕ２９６、Ｌｅｕ２９８およびＭｅｔ２９９はβ-プロペラの相補的くぼみに納まる疎水性コアを構成し、この疎水性コアはいくつかの直接的または水媒介の極性相互作用に囲まれている。これらの特徴はＬＤＬｒ構造にも観察されている（４８、５７）。
【０１２２】
ＹＷ２１０．０９Ｆａｂが識別するβ-プロペラ上心部は、しばしばタンパク質−タンパク質相互作用への関与が発見される領域である（５９）。このパラトープは３つの重鎖ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）および２つの軽鎖ＣＤＲ（Ｌ１とＬ３）を含むＣＤＲの５つの残基からなる。抗体がβ-プロペラに結合すると総面積にして１６９１Å２が埋まり、形状相補性スコアは０．７６である。酸性パッチがβ-プロペラのこの側の総表面積の約３分の１を占めるが、ＹＷ２１０エピトープとはめったに重複しない。抗体重鎖と軽鎖は別の領域を識別する。重鎖ＣＤＲが形成する直接接触が埋められた表面積の８０％を占めるうち、ＣＤＲ  Ｈ３が単独で５０％以上を占めている。このセグメントは１７の残基からなり、このなかの残基Ｈｉｓ９８からＬｙｓ１００ｃがβ-プロペラとの直接接触を形成する。重要なことに、抗体のＡｓｎ１００はＬＲＰ６のＡｓｎ１８５と水素結合の対をなし、「握手」的相互作用を形成する（図５）。加えて、Ｖａｌ１００ｂおよびＬｙｓ１００ｃを通る主鎖の異常なコンホメーションは、「後方」でＬＲＰ６のＡｒｇ２８と相互作用するカルボニル基と、「前方」で２個の水分子（Ｗａｔ１およびＷａｔ２）を介して酸性パッチと相互作用する２つのＮＨ基を位置決めする（図５）。Ｌｙｓ１００ｃの側鎖もまた、ＬＲＰ６のＶａｌ７０とＳｅｒ９６主鎖カルボニルと水素結合して酸性パッチを部分的に中和する。ＬＲＰ６のＡｒｇ１４１が中間に固定されて、架橋する水Ｗａｔ２、ＬＲＰ６のＡｓｎ１８５およびＹＷ２１０．０９のＡｌａ１００ａと相互作用する。Ａｒｇ１４１は２つの水素結合ネットワークを統合するようである。加えて、Ｖａｌ１００ｂの側鎖はβ-プロペラの中心チャネルの疎水性のくぼみに連結する。したがって、短い一続きのＹＷ２１０．０９  Ｈ３配列ＮＡＶＫは、ＬＲＰ６のβ-プロペラ Ｅ１と極めて強い相互作用を呈する。他のＣＤＲはβ-プロペラ上部の周囲に沿って残基と相互作用する。Ｈ１とＨ２は第５および第６のブレードと接触し、Ｌ１とＬ３は第６、第１および第２のブレードと接触する（図６）。結晶充填相互作用はＹＷ２１０．０９がＬＲＰ６のエピトープと接触する領域に直接関与しておらず、このことは、結晶構造が２個の分子が溶液中でどのように相互作用するかを反映するはずであることを示している。
【０１２３】
実施例３
ＹＷ２１０．０９  Ｈ３ループ配列は、Ｄｋｋｓ、スクレロスチンおよびｗｉｓｅの中で保存された「ＮＸＩ」モチーフを表す。
明白なＣＤＲ Ｈ３ ＮＡＶＫＮモチーフとＬＲＰ６ Ｅ１ β-プロペラとの相互作用は、報告されているラミニンとナイドジェンとの相互作用（６０）と酷似している。いずれの場合も、重要な接触は、上述のＡｓｎの握手と、分岐疎水性残基がβ-プロペラの中心チャネル上部に形成された疎水性のくぼみに入ることを通じて生じる。ＬＤＬｒと違って、ナイドジェンとＬＲＰ６ Ｅ１チャネルの中心は、付近のフェニルアラニンの側鎖または「Ｐｈｅシャッター」により所定位置に維持されているトリプトファン残基により溶媒から遮断されている（６０）。この特徴により低分子量のリガンドに結合できるＹＷＴＤプロペラドメインが予測可能であることが提案されている（６０）。ヒトＤｋｋ１の短い配列（ＮＡＩＫＮ；アミノ酸４０から４４）はＹＷ２１０．０９のＣＤＲ Ｈ３ループ（図７）に見られるモチーフとほぼ一致する。このモチーフは、異種の、Ｄｋｋ３を除く複数のＤｋｋファミリーメンバーの中で厳密に保存されている。強力な保存は、Ｄｋｋ１、２および４のこのセグメントが重要な機能を有することを示唆している。保存モチーフはＤｋｋ１のＮ末端付近の、無秩序であることが予測され、以前は機能的に重要であるとは同定されていなかった領域に見いだされる（６１）。加えて、このモチーフはＬＲＰ５／６との相互作用を通じてＷｎｔシグナルを調節する別の２つのタンパク質、すなわちスクレロスチン（３２）およびｗｉｓｅ（３０）に現れる（図７Ａ）。スクレロスチンとｗｉｓｅはシステインノットタンパク質のスーパーファミリーに属し（６２）、この明白な折りたたみの「ヒール」とも呼ばれる伸長したループ２の中にこのモチーフを提示する（６３、６４）。スクレロスチンの場合、「ヒール」は中和抗体の結合エピトープとして位置づけられており、この領域が機能的に重要であることを示唆している。スクレロスチンまたはｗｉｓｅとＬＲＰ５またはＬＲＰ６との相互作用の詳細は報告されていない。
【０１２４】
実施例４
Ｄｋｋ１およびスクレロスチンのペプチドはＬＲＰ６ β-プロペラ上部に結合する。
Ｄｋｋ１およびＳｏｓｔの７残基のペプチドを標準的なＦｍｏｃ手順で合成した。図７Ｂ。これらのペプチドは上述の「ＮＸＩ」モチーフを含む。ペプチドのＬＲＰ６ Ｅ１Ｅ２に対する親和性を競合ファージＥＬＩＳＡにより決定した（４１）。Ｄｋｋ１ペプチドは比較的高い親和性で結合したが、スクレロスチンペプチドの結合は約１０倍弱かった（ＩＣ５０はそれぞれ４μＭおよび４５μＭ）。これらの値はラミニンペプチドのナイドジェンのβ-プロペラに対する親和性に匹敵する（６５）。ペプチドとＬＲＰ６との相互作用の詳細を理解するため、ＬＲＰ６ Ｅ１ β-プロペラに結合したペプチドの高分解能の共結晶構造を決定した。構造を分子置換により決定し、Ｄｋｋ１およびＳｏｓｔペプチドをそれぞれ１．９および１．５Å分解能まで精密化した（図８）。注目すべきは、ペプチドは、抗体ループと比較して結合状態のコンホメーションは酷似しており、いずれの場合も重要なアスパラギン側鎖が上述の「握手」的相互作用の位置にあることである。ペプチドイソロイシン残基は抗体ループのバリン側鎖が相互作用する疎水性ポケットを占める。抗体ループとＤｋｋ１ペプチドの全体的な比較は特に顕著であり、抗体残基Ｖａｌ９９からＬｙｓ１００ｃ（Ｌｙｓ β-炭素およびＡｓｎ１００、Ａｌａ１００ａおよびＶａｌ１００ｂの全側鎖も含む主鎖Ｃα−ｔｏ−Ｃα）とＤｋｋ１ペプチドの等価な原子のアラインメントはコンホメーションが基本的に同一であることを示している（２６個の原子のＲＭＳＤは０．１４Å）。「ＮＸＩ」コアモチーフに加えて、各ペプチドの塩基性側鎖は、配列内で相対的な位置が異なるにもかかわらずＬＲＰ６の酸性パッチと相互作用する。Ｄｋｋ１ペプチドに関しては、リジンはイソロイシン残基に直続し、リジンのε-アミノ基は、抗体ループのリジンアナログの相互作用と酷似した態様で小さい酸性の間隙を占める。Ｓｏｓｔペプチドの場合、イソロイシンの後にはグリシンを挟んで塩基性アルギニン残基がある。これによりペプチド主鎖が再配向され、アルギニン側鎖はＬＲＰ６の酸性パッチのより周辺部に位置する。これらのペプチド構造は、ＬＲＰ６ Ｅ１との結合が、極めて明白なコアモチーフ（Ａｓｎ側鎖とＩｌｅ側鎖との相互作用）と、様々な支持的接触が可能な周囲の面との相互作用の両方により駆動されることを示している。この後者の相互作用群は、付加的な親和性だけでなく特異性ももたらすと考えられる。例えば、ラミニン関連ペプチドは、ナイドジェンとの高親和性結合にＡｓｎおよびＶａｌ残基を要し（６５）、これらはＬＲＰ６複合体構造の「ＮＸＩ」モチーフに見られる接触と酷似した接触を形成する（６０）。しかし、ナイドジェンとの高親和性相互作用は、コアモチーフのＡｓｎより２残基前に生じるＡｓｐからの付加的な接触を要する（６０、６５）。このＡｓｐはナイドジェンには存在するがＬＲＰ５またはＬＲＰ６には不在のＡｒｇの表面と塩橋を形成する。全体的に、Ｄｋｋ１およびスクレロスチンペプチドの結合特性は、複数のＷｎｔ経路阻害剤に観察される「ＮＸＩ」モチーフ（図７）が、これらのタンパク質のＬＲＰ５およびＬＲＰ６との結合に重要であり、したがってこれらの阻害活性にも重要である、という見解と一致する。
【０１２５】
実施例５
Ｗｎｔ経路阻害剤とＬＲＰ６の個々のβ-プロペラとの相互作用のマッピング。
異なるＤｋｋおよびスクレロスチンと様々なＬＲＰ６ドメインとの相互作用をバイオレイヤー干渉法アッセイを使用して測定した（１１）。精製された受容体は、以下のように、単独のβ-プロペラＥＧＦ様ユニット（Ｅ１、Ｅ２またはＥ４）、２つのβ-プロペラ（Ｅ１Ｅ２またはＥ３Ｅ４）または４つのβ-プロペラ（Ｅ１Ｅ４）を含有した：
ヒトＬＲＰ６：コンストラクトＥ１Ｅ４−ＬＰＲ６のアミノ酸Ａ２０−Ｑ１２５３；コンストラクトＥ１Ｅ２−ＬＰＲ６のアミノ酸Ａ２０−Ｅ６３１；コンストラクトＥ３Ｅ４ ＬＰＲ６のアミノ酸Ｅ６３１−Ｑ１２５３；コンストラクトＥ１−ＬＰＲ６のアミノ酸Ａ２０−Ｄ３２５；コンストラクトＥ２−ＬＰＲ６のアミノ酸Ｄ２３５−Ｅ６３１；コンストラクトＥ４−Ｔ９３３−Ｑ１２５３。単独のＬＲＰ６ β-プロペラ Ｅ３は発現できかった。
ヒトＬＲＰ５：コンストラクトＥ１−ＬＲＰ５のアミノ酸Ｐ３３−Ｒ３４８
【０１２６】
Ｄｋｋ１はＬＲＰ６のＥ１Ｅ２およびＥ３Ｅ４の両方の領域に結合できる（１１）。この研究は、Ｄｋｋ１およびＤｋｋ２のＬＲＰ６ Ｅ１Ｅ２に対する高親和性結合（それぞれ２２および５３ｎＭ）を示すことで、その発見を展開させる。さらに、Ｄｋｋ１およびＤｋｋ２はまた、Ｅ３Ｅ４にも結合した（それぞれ５１および３８ｎＭ）。これに対し、高親和性の相互作用はＤｋｋ３およびＤｋｋ４では観察されなかった。Ｄｋｋ３は試験したＬＲＰ６コンストラクトのいずれにも結合できず、これは最近の報告（６６）とも一致した。Ｄｋｋ４はＬＲＰ６ Ｅ１Ｅ４およびＥ３Ｅ４との極めて弱い結合の証拠を示したが、興味深いことにＥ１Ｅ２には結合しなかった。Ｄｋｋ１およびＤｋｋ２の個別のβ-プロペラとの結合をさらに分析すると、これらがそれぞれＥ１のみに高い親和性を有することが示される。Ｅ４との結合は検出されず、観察されたＥ３Ｅ４との相互作用はおそらくＥ３との高親和性相互作用によることが示唆された。Ｅ２との部分的結合は、Ｄｋｋの非常に高い濃度でのみ検出され、このことは非常に弱い結合または非特異的効果と一致した。スクレロスチンの結合も同様の方法でマッピングされた。スクレロスチンはＥ１Ｅ４、Ｅ１Ｅ２およびＥ１のみと結合し、Ｅ２との結合は極めて弱いかまたは非特異的である。
【０１２７】
Ｄｋｋ１、Ｄｋｋ２およびスクレロスチンがＬＲＰ６ Ｅ１の同じ部位に結合するか評価するために、Ｄｋｋ２またはスクレロスチンの結合を予めロードしたＤｋｋ１（１００ｎＭ）の存在化で測定した。Ｄｋｋ２の結合はわずかに阻害されたのみであり(図８Ａ）、Ｄｋｋ１およびＤｋｋ２の結合部位は実質的に重複しないことが示唆された。これに対し、スクレロスチンの結合はＤｋｋ１の存在化で非常に強力に阻害され（図８Ｂ）、これらの２種類の阻害剤の重複する結合部位が示唆された。この結論は、Ｄｋｋ１およびスクレロスチンの「ＮＸＩ」モチーフが類似の態様でＬＲＰ６ Ｅ１と相互作用することを示す上記のペプチド相互作用研究と一致する。
【０１２８】
実施例６
「ＮＸＩ」モチーフはＤｋｋ１およびスクレロスチンとＬＲＰ６ Ｅ１の結合に重要である。
ペプチドおよびドメインマッピングの研究結果に基づき、Ｄｋｋ１およびスクレロスチンとＬＲＰ６ Ｅ１の結合は、各タンパク質に存在する「ＮＸＩ」モチーフに主として媒介されると仮定された。この見解を検証すべく、モチーフの主要な接触残基を相互作用を妨害すると予測されるアミノ酸で置換した（Ａｓｎ-ｔｏ-Ａｌａ；またはＩｌｅ-ｔｏ-Ｇｌｕ）。とりわけラミニンの類似残基の置換はナイドジェンとの結合に多大な影響を与え、親和性消失は３０００から５００００倍であった（６７）。Ｄｋｋ１のＡｓｎ４０Ａｌａの置換はＬＲＰ６ Ｅ１Ｅ２に対し７５倍の親和性消失をもたらし、Ｉｌｅ４２Ｇｌｕの置換では結合が大幅に阻止された（＞３６４倍の効果）（図９Ａ）。スクレロスチンの結合に対する置換の影響は明白ではあったが、さほど強力ではなく、Ａｓｎ１１７ＡｌａとＩｌｅ１１９Ｇｌｕの置換の親和性消失はそれぞれ１４倍と１９倍であった（図９Ａ）。これらのデータは、特にＤｋｋ１に対する「ＮＸＩ」モチーフの重要な役割と一致する。
【０１２９】
実施例７
Ｄｋｋ１のＣＲＤ２のアミノ酸置換はＬＲＰ６ Ｅ３Ｅ４との結合を妨害する。
Ｄｋｋタンパク質のC末端領域の重要な役割が提案されており、例えば、第１のシステインに富む領域（ＣＲＤ１）のないヒトＤｋｋ１またはＤｋｋ２をコードするｍＲＮＡは、アフリカツノガエルの胚に注入されるとｘＷｎｔ８シグナルを阻害できることが示されている（６１）。しかし、今日まで、いかなるＤｋｋファミリーメンバーも、相互作用パートナーとのいかなる複合体も、その完全なる構造はわかっていない。マウスのＤｋｋ２のＣＲＤ２の実験的構造がＬＲＰ５ Ｅ３の相同性モデルにコンピューターでドッキングされている（６８）。この複合体モデルに基づき、マウスのＤｋｋ１残基Ｈｉｓ２１０、Ｌｙｓ２１７またはＡｒｇ２４２（ヒトのＤｋｋ１残基２０４、２１１および２３６にそれぞれ対応）がＧｌｕで置換されると結合が阻害されると予測され（６８）、すべてのケースで、ＬＲＰ６で形質移入された細胞との結合と、Ｄｋｋ１のＷｎｔ３ａシグナル阻害能の両方が妨害されることが見いだされた（６９）。実施例５で記載のように、Ｄｋｋ１は、ＬＲＰ６のＥ１ドメインおよびおそらくはＥ３ドメインの両方に結合しうる。したがって、報告されたＣＲＤ２のアミノ酸置換を取り込んだヒトＤｋｋ１ではＬＲＰ６ Ｅ３に対する親和性がかなり低く、Ｅ１との結合は影響を受けないのでは、と考えられた。この仮説をＤｋｋ１変異体Ｈ２０４ＥおよびＫ２１１Ｅを用いて検証し、結果は図９Ｂに示すとおりであった。実際、これらの変異はＬＲＰ６ Ｅ３Ｅ４との結合は妨害したが、Ｅ１Ｅ２との結合は妨害しなかった。上述の結果と一致して、その逆が「ＮＸＩ」モチーフ置換に当てはまった。興味深いことに、ＣＲＤ２および「ＮＸＩ」モチーフのいずれの置換もＤｋｋ１のＥ１Ｅ４との結合に大きく影響した。まとめると、これは、Ｄｋｋ１は独立してＥ１Ｅ４の２つの異なる部位に結合することができるか（２：１の複合体；図１０の絵３）、または、Ｄｋｋ１は互いに排他的な２つの部位に結合できる（すなわち、代替的な１：１の複合体；図１０の絵５および６）ことを示す。第３の可能性として、１個のＤｋｋ１分子がＥ１およびＥ３の部位に同時に結合する（図１０の絵４）が、変異体の２つのクラスと比較して野生型Ｄｋｋ１が任意の「結合活性効果」を欠くのでこの可能性は薄いと考えられる。加えて、Ｅ１Ｅ２、Ｄｋｋ１およびＥ３Ｅ４の三元複合体は形成されなかった（１１）。２：１と１：１の結合モデルを区別するために、Ｄｋｋ１バリアントとＥ１Ｅ４の複合体を光散乱検出と併せてサイズ排除クロマトグラフィーで分析した。これらのデータは、Ｄｋｋ１ Ｅ１Ｅ４とＬＲＰ６ Ｅ１Ｅ４複合体がすべて１：１のストイキオメトリを呈することを示す（図１０）。全体的に、親和性測定および光散乱データは、２つの独立した、かつ互いに排他的な、Ｄｋｋ１とＬＲＰ６間の結合様式の存在を示している。
【０１３０】
実施例８
スクレロスチンはＷｎｔのサブセットしか調節しないが、Ｄｋｋ１はＷｎｔ経路の広範な阻害剤として作用する。
上述したように（実施例５）、スクレロスチンはＬＲＰ６ Ｅ１とは結合するが、ＬＲＰ６のＥ３Ｅ４領域とは相互作用しない。Ｗｎｔ９ｂもＥ１Ｅ２領域とは結合するが、Ｅ３Ｅ４領域とは結合しない（１１）。したがって、スクレロスチンは、Ｗｎｔ９ｂのＬＲＰ６ Ｅ１Ｅ４との結合を阻害する（図１１）。これに対し、スクレロスチンは、Ｗｎｔ３ａのＬＲＰ６ Ｅ１Ｅ４との結合を阻害できず（図１１）、これはＷｎｔ３ａがＬＲＰ６のＥ１Ｅ２領域とは結合しないがＥ３Ｅ４領域とは結合するという前述の観察と一致する（１１）。Ｄｋｋ１の場合は、おそらくは２つの明白な相互作用様式により（実施例５〜７）、ＬＲＰ６のＥ１Ｅ２断片およびＥ３Ｅ４断片の両方と高親和性結合できるので、より複雑である（１１）。したがって、Ｄｋｋ１はＷｎｔ３ａおよびＷｎｔ９ｂ両方のＬＲＰ６ Ｅ１Ｅ４との結合を阻害する（図１１）。
【０１３１】
精製タンパク質間の結合に及ぼす観察された効果が細胞シグナルに関連するかどうか検証するため、Ｄｋｋ１およびスクレロスチンの活性をＷｎｔ依存性ＴＯＰｂｒｉｔｅルシフェラーゼリポーターアッセイでさらに検証した（５２）。リポーターで安定に形質移入された細胞が、Ｗｎｔ１で一時的に形質移入された。Ｗｎｔ形質移入細胞を精製Ｄｋｋ１またはスクレロスチンバリアントで処理し、リポーター誘導効果を測定した（図１２）。野生型Ｄｋｋ１およびスクレロスチンでは、Ｗｎｔ１依存性シグナルの強力な阻害が観察された。これは、ＬＲＰ５／６のＥ１Ｅ２部分を通じて、Ｗｎｔ１がＷｎｔシグナルの一クラスに属する、という先の観察と一致する（１１、５２）。Ｄｋｋ１およびスクレロスチン変異体はＬＲＰ６との結合と一致する活性を示す（図１２）。スクレロスチンＩｌｅ１１９Ｇｌｕ（「ＮＸＩ」モチーフ）は、Ｄｋｋ１ Ｉｌｅ４２Ｇｌｕと同様、Ｗｎｔ１駆動シグナル阻害能が野生型よりも低い。これに対し、Ｄｋｋ１ Ｌｙｓ２１１Ｇｌｕ（ＣＲＤ２）は効果的にＷｎｔ１シグナルを阻害し、このことは、この変異体が維持しているＥ１Ｅ２との結合能と一致する（図９Ｂ）。
【０１３２】
まとめると、細胞アッセイの結合データとＷｎｔシグナルに対する効果は、保存「ＮＸＩ」モチーフがＤｋｋ１およびスクレロスチンがＥ１Ｅ２との結合を通じてこれらのＷｎｔシグナルを阻害するのに機能的に関与することと、Ｄｋｋ１ ＣＲＤ２とＥ３Ｅ４との相互作用がＷｎｔリガンドの異なるサブセットの阻害のみに重要であることを裏付ける。加えて、データは、Ｄｋｋ１は（２つの明白な結合様式で）広域にＷｎｔシグナルを阻害するが、スクレロスチンはより選択的であることを示す。
【０１３３】
実施例９
ヒト骨密度（ＢＭＤ）の変異は、Ｗｎｔ９ｂの結合に影響を与えることなく、Ｄｋｋ１およびスクレロスチンのＬＲＰ６ Ｅ１Ｅ２との結合を阻害する。
Ｄｋｋ１およびスクレロスチンとＬＲＰ６の第１のβ-プロペラとの相互作用を理解することで、ＬＲＰ５の機能獲得型変異の機構が明らかになる。ＬＲＰ５ Ｅ１のこれらの単一アミノ酸置換により罹患個体の骨強度と厚みがかなり増す（２２〜２４）。過去８年間で全部で９件のＬＲＰ５の機能獲得型変異（７つの位置で）が記述されている（２３）。これらの７つのアミノ酸はそれぞれＬＲＰ５とＬＲＰ６の間で厳密に保存される。全体として、ＬＲＰ５とＬＲＰ６のＥ１ β-プロペラはよく保存されており（６８％の同一性）、重要なことにはこれらの相互作用する上面はほぼ完全に一致する。構造的にもっとも驚くべきＢＭＤ変異は、Ａｓｎ１９８とＳｅｒの置換であり（２４）、Ａｓｎ１９８は、Ｄｋｋ１およびスクレロスチンに見られる「ＮＸＩ」モチーフとの「握手」的相互作用に関わるＬＲＰ６ Ａｓｎ１８５に対応する（実施例２および４）。ＬＲＰ６ Ｅ１／Ｄｋｋ１ペプチド複合体の表面でのＢＭＤ変異部位のマッピングにより、Ａｓｎ１８５に加えて、ＬＲＰ６残基のＡｓｐ９８、Ａｒｇ１４１およびＡｌａ２０１がペプチドと直接接触するか、または結合ポケットに近接することが明らかになった。したがって、これらの変異はＤｋｋ１およびスクレロスチンがＬＲＰ６ Ｅ１と結合するのを阻害すると推測されうる。
【０１３４】
他の３つの変異部位は結合したペプチドから遠く離れているが、ペプチド結合ポケットの完全性に間接的に影響を及ぼすと考えることができる。ＬＲＰ６残基のＧｌｙ１５８は表面ループに存在し、Ｔｒｐ１５７のコンホメーションに影響すると考えることができる。Ｔｒｐ１５７のインドール環はＢＭＤ変異部位のＡｒｇ１４１の隣にあり、ここで溶媒からＡｒｇの側鎖とペプチドＡｓｎのカルボニル基の水素結合をスクリーニングしうる。Ｔｒｐ１５７のインドールはまた、Ａｓｎ−Ａｓｎの「握手」を取り囲むポケットの壁のうち一つを形成する。Ｇｌｙ１５８ループに隣接して第２のインドール側鎖（Ｔｒｐ１８３の側鎖）があり、このインドールはＡｓｎ−Ａｓｎポケットの２番目の壁を形成する。別のＢＭＤ変異部位であるＡｌａ２０１は、Ｇｌｙ１５８とは反対側でＴｒｐ１８３の隣にある。Ｔｒｐ１５７またはＴｒｐ１８３の側鎖の配置が正しくなければ「ＮＸＩ」ペプチドの結合が阻害されると考えられる。ＢＭＤ部位のＴｈｒ２４０およびＡｌａ２２９は、タンパク質表面から離れて隣接するβ鎖の末端付近に位置する。Ｔｈｒ２４０は、このクラスのプロペラタンパク質の特徴的な「ＹＷＴＤ」繰り返しのどれかに生じる。Ｔｈｒ２４０のヒドロキシル基の水素はＡｌａ２２９の主鎖アミドに結合し、いずれかの残基の置換によりタンパク質の不安定化が生じると考えることができる。加えて、Ａｌａ２２９は、リガンド結合部位底部を溶媒から遮断するのに重要だと思われる（６０）「Ｐｈｅシャッター」直下にある（実施例３参照）。
【０１３５】
ＢＭＤ変異を担持するＬＲＰ５バリアントで形質移入された細胞は、スクレロスチンとの結合が減少し、Ｗｎｔ１０ｂまたはＷｎｔ６シグナルのスクレロスチン阻害に対し感受性が低い（７０）。ＢＭＤ置換の効果をさらに試験するために、これらのいくつかをＬＲＰ６ Ｅ１Ｅ２に導入し、図１３の結果を得た。ＬＲＰ６ Ｅ１Ｅ２のＧｌｙ１５８Ｖａｌは昆虫細胞で発現できなかった。この観察は哺乳動物細胞で観察された対応するＬＲＰ５変異体の非常に低い発現度と一致し（７０）、この残基の置換で構造的不安定化が生じることが示される。試験した他のＬＲＰ６変異はすべて、Ｄｋｋ１およびスクレロスチン両方のＬＲＰ６ Ｅ１Ｅ２との結合を阻害する。Ａｓｎ１８５のＳｅｒへの変異は、Ｄｋｋ１およびスクレロスチンに対しそれぞれ１８３倍および５９倍の親和性消失で有意に結合を阻害した。同様に、Ａｒｇ１４１Ｍｅｔは、Ｄｋｋ１およびスクレロスチンに対しそれぞれ２９倍および３１倍の親和性消失を誘導した。重要なことに、Ｗｎｔ９ｂのＬＲＰ６バリアントとの結合には、影響はほとんどないか、まったくなかった。これらの結果は、ＢＭＤ変異を原因とする機能獲得は、Ｗｎｔリガンドの親和性獲得を原因とするのではなく、Ｗｎｔ阻害剤の選択的な親和性消失に起因する、という見解を支持している。重要なことには、影響を受けたのはスクレロスチンとの結合のみならず（７０）、Ｄｋｋ１とそのＥ１相互作用部位との結合も阻害されることである。
【０１３６】
実施例１０
ＬＲＰ５およびＬＲＰ６ Ｅ１ β-プロペラは非常に特異的なペプチド識別モジュールである。
ＬＰＲ６ β-プロペラをプローブしファージディスプレイを用いてペプチド結合の特異性を検証した。直鎖状または環状ペプチドのナイーブライブラリーをＬＲＰ６ Ｅ１Ｅ２またはＥ３Ｅ４、またはＬＲＰ５ Ｅ１に対する溶液結合実験に用いた（４１）。各標的を使用して結合選択を４回実施した。ＢＳＡとの結合と比べて特異的標的との結合は大幅な濃縮が観察され、ＬＲＰ６ Ｅ１Ｅ２とＥ３Ｅ４はそれぞれ１０００倍と６０００倍であった。同様の強力な濃縮がＬＲＰ５ Ｅドメインに対する選択に観察された。個々のファージクローンについて、対象標的との結合および他のＬＲＰ６ β-プロペラコンストラクトとの結合をスクリーニングした。ＬＲＰ６ Ｅ１Ｅ２またはＥ３Ｅ４コンストラクトに対し選択されたファージは顕著に特異的であり、単離されたクローンはすべて、他のＬＲＰ６コンストラクトとの架橋結合なしにもとの標的にのみ結合した。加えて、Ｅ１Ｅ２に特異的なファージはＥ１ドメインにのみ結合し、Ｅ３Ｅ４に対し選択されたファージはＥ３に特異的であると考えられる。ペプチドの配列は、対象のクローンの配列決定により得られた。特に有望なクローンを使用して親和性成熟の二次ライブラリーを設計し、これらのライブラリーをさらに選択とスクリーニングに供した。
【０１３７】
ＬＲＰ６ Ｅ１ペプチド配列モチーフ（図１４）は、Ｄｋｋ１、スクレロスチンおよびｗｉｓｅに見られる「ＮＸＩ」モチーフと驚くほど一致している。直鎖状および環状ライブラリーのいずれにも厳密に保存されたＡｓｎが存在する（ゼロ位置）。＋２の位置には分岐疎水性残基が常にあり、非常に多くの場合Ｉｌｅが存在する。特異的に結合するファージのこれら残基の強力な選択は、「ＮＸＩ」モチーフのこれら２残基の重要性を裏付ける。直鎖状ライブラリー由来のペプチドは、−１の位置にターンを可能にするＰｒｏ、Ｓｅｒ、ＣｙｓまたはＧｌｙなどの残基が好ましい。Ｓｅｒは＋１の位置にもっとも好ましく、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＬｅｕなどの疎水性残基がこれに続く。Ｄｋｋ１配列に観察されるように、Ｌｙｓは＋３の位置にもっとも好ましく、ＡｒｇとＨｉｓが２番目と３番目にもっとも一般的な残基である。最後に、＋４と＋５の位置には疎水性残基が好ましい。２つのシステイン間に長大な範囲のループ長を含んだ環状ライブラリーは、結合選択後、環状ペプチドを４種類のみもたらした。これらはＣｙｓ残基と比べてループ長および「ＮＸＩ」モチーフの位置の両方が異なった。加えて、環の種類が異なると、保存ＡｓｎおよびＩｌｅ残基に隣接する位置の残基の選択は異なる。例えば、＋３の位置のＬｙｓの選択は「ＣＮＸＩＸＣ」型の環では比較的緩い。他の場合は、例えば「ＣＸＮＸＩＫＸ４Ｃ」型の環の下線をひいたＬｙｓはほぼ不変である。これらの結果は「ＮＸＩ」モチーフの強力な特異性のみならず、異なる種類の環状ペプチドの明白なコンホメーション選択性（およびおそらくは結合接触）とも一致する。
【０１３８】
ＬＲＰ５ Ｅ１に結合するペプチドが上述のＬＲＰ６ Ｅ１Ｅ２と同様にして得られた。ＬＲＰ６と同様、ＬＲＰ５は明白な直鎖状および環状のペプチドモチーフをもたらした（図１５）。しかし、これらのモチーフはＬＲＰ６ Ｅ１に結合するモチーフとは異なっていた。特に、これらのペプチドは「ＮＸＩ」モチーフを含有しない。直鎖状ペプチドは代わりに保存された酸性の位置（ゼロ位置）を示し、疎水性のアミノ酸が＋２、＋３および−１の位置（それぞれＭｅｔ、ＴｒｐおよびＰｈｅ）にある。成熟クローンは−３のＨｉｓと−５のＡｒｇに対し非常に強い選択性を示す。３つの環状ペプチドファミリーのうち２つも保存された酸性残基を有するが、それらの配列パターンは直鎖状ファミリーのものとは異なる。
【０１３９】
実施例１１
ファージライブラリーの選択で同定されたペプチドの合成はそれらがＬＲＰ６ Ｅ１と結合することを裏付ける。
例示的ファミリー１と２のいくつかのペプチドを化学的に合成し、それらがファージ粒子のディスプレイのコンテキストの外側で標的（ＬＲＰ６ Ｅ１）に結合するかを評価した。一般に、これらの合成ペプチドは標的に対する結合能があった。例示的ファミリー１の直鎖状ペプチドの親和性はＤｋｋ１の７量体ペプチド（低マイクロモル）と同じ範囲内であり、例示的ファミリー２の環状ペプチドは低マイクロモルから中程度のナノモルの親和性を有した。これらのファージ由来のペプチドがどのようにＬＲＰ６ Ｅ１を識別したかを理解するために、いくつかの共結晶構造を決定した（図１６）。図示の構造中の４つのペプチドはすべて「ＮＸＩ」モチーフを含有し、したがって、４つのペプチドはすべてＤｋｋ１およびスクレロスチンペプチドと同じ部位に結合し、各ペプチドのＡｓｎおよびＩｌｅ残基は上述した他の構造の同じ部位を占める。加えて、ペプチド構造はいくつかのユニークな特徴を示す。パートＢに示す「ＣＸ９Ｃ」環状ペプチドは、Ｎ末端のアセチル基をＬＲＰ６表面（上心部）の第３の浅いポケットに配置する。このポケットはＤｋｋ１ペプチドに占められない。興味深いことに、このペプチドのいくつかの残基（左下のＬｙｓの後ろの残基）は電子密度で観察できず、結合状態で動的であることが示唆される。パートＣとＤの構造のペプチドは配列的に密に関連があり、違いは最後の２つの残基が逆になっていることのみである。この残基の逆転は、環のサイズを「ＣＸ５Ｃ」から「ＣＸ４Ｃ」に縮小する付随的効果がある。２つのペプチドはタンパク質とわずかに異なる接触をし、特にＬｙｓ側鎖の相互作用が異なるので、ペプチド親和性が影響を受ける。
【０１４０】
実施例１２
Ｄｋｋ１ペプチドの最小結合配列の決定と最小化アナログの個別の残基の置換。
Ｄｋｋ１ペプチドの７残基すべてがＬＲＰ６ Ｅ１との結合に必要であるか決定するために、いくつかの短いペプチドを合成した。これらのペプチドはＮ末端またはＣ末端の１または複数の残基が欠失していた。いずれかの末端から３残基を除去すると、結合は完全に阻止された。これらの欠失は、「ＮＸＩ」モチーフの保存Ａｓｎまたは保存Ｉｌｅのいずれかを除去するのに十分であった。このことは、これら両方の残基はＬＲＰ６部位との結合に重要であることを裏付ける。欠失数が少ないと、一般に結合は維持されるが、親和性は３倍以下の影響を受けた。図１７（ＡおよびＢ）。
【０１４１】
置換の研究結果を図１８に示す。ペプチドＡｃ−ＮＳＩＫＧＹ−ａｍのＡｓｎ残基の置換は、この残基がＬＲＰ６ Ｅ１ドメインとの結合に重要であることを裏付けた。特に、通常の保存的置換Ｇｌｎの結果、検出可能な結合は完全に消失した。Ｓ、ＩおよびＫ残基の置換は一般的により耐性があった。ＳｅｒをＡｌａまたは塩基性残基のＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓまたはε,ε-ジメチル Ｌｙｓで置換すると親和性はわずかに向上したが、Ｏｒｎ、ＤａｂおよびＤａｐなどの短い側鎖をもつ塩基性残基は側鎖の長さが減少するにつれて親和性が低下した。Ｉｌｅの多くの疎水性置換は耐性があったが、Ｐｈｅなどの長い側鎖をもつアミノ酸は耐性がなかった。ＬｅｕやＭｅｔの側鎖などの比較的長い側鎖はかなりの親和性消失をもたらした。Ｉｌｅのβ-メチル基は、ＮｖａがＩｌｅ含有の親と同様の親和性で結合し、最小限の重要性しかもたないと考えられ、同様のパターンはＶａｌとＡｂｕのアナログにも観察された。しかし、Ｉｌｅ残基を電荷を帯びた残基（Ｇｌｕ）で置換すると、結合が阻止された。最後に、Ｌｙｓ残基は様々な塩基性アミノ酸で置換可能であった。これらのうち、ＯｒｎおよびＡｒｇペプチドはＬｙｓ親の親和性に近い親和性を維持したが、短い側鎖のアミノ酸（ＤａｐおよびＤａｂ）のペプチド親和性は減少した。Ｎα-メチルアミノ酸の任意の位置で検証した置換（Ｓ、ＩまたはＫ）の結果、親和性が相当消失した（結合は検出されなかった）。
【０１４２】
実施例１３
疎水性ポケットのさらなる検証。
「ＮＸＩ」モチーフのＩｌｅ位置での側鎖の選択を、例示的ファミリー１（親ペプチドは図１６Ａに示すものと同じ）のペプチドのコンテキストで検証した。追加で、それぞれＩｌｅ残基の代わりに異なる疎水性のアミノ酸を有する１０個のペプチドを合成した（表２；図１９）。シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）の置換を除いて、各ペプチドはＬＲＰ６に結合した。非遺伝的にコードしたアミノ酸のノルバリン（Ｎｖａ）を組み込んだペプチドは親Ｉｌｅペプチドと等電位であった。加えて、３つのβ-メチル基を有するＴｌｅペプチドは（このようなメチル基を２つ有する）Ｖａｌペプチドと等電位であった。これらの比較からも、ＬＲＰ６ Ｅ１は、親和性を減少させることなくペプチド側鎖に余剰なβ-メチル基を１つ収容（またはこのような１つのメチル基を欠失）しうることが推測できる。
【０１４３】
実施例１４
「ＮＸＩ」モチーフを構築されたペプチド足場に転写。
特異的な接触に必要な側鎖および溶液中明白（かつ適切）なコンホメーションの両方をもつペプチドは、標的タンパク質に高親和性を有すると考えられる。この見解をふまえて、ＬＲＰ６に結合したリガンドの構造を、出版されているペプチド構造と比較した。「ＮＸＩ」モチーフのＡｓｎの周りの異常な主鎖のコンホメーションが、植物のプロテアーゼ阻害剤の１クラスと一致すると思われた（Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ阻害剤；ＢＢＩ）。短いジスルフィド結合の阻害ペプチドを大きい天然の阻害剤から取ることができ、これらのペプチドのいくつかの構造が決定されている（４２）。いくつかの残基を比較すると、「ＮＸＩ」モチーフの主鎖のコンホメーションは、ＢＢＩペプチドの構造と密に重なった（図２０Ａ）。唯一重大な配列の違いは、ＬＲＰ６との結合に必要なＡｓｎに対するＢＢＩループのＬｙｓ（トリプシン阻害のＰ１決定基）であった。この１種類のアミノ酸を変えてＢＢＩ関連ペプチドを合成すると、ＬＲＰ６親和性のペプチドが得られた（２２μＭ；図２０Ｂ）。とりわけ、このＢＢＩミメティックは、ＬＲＰ６の酸性パッチと相互作用するＤｋｋ１のＬｙｓ残基の等価物をもたない。このことは、「ＮＸＩ」モチーフがＬＲＰ６  Ｅ１との結合に十分であることを示している。
【０１４４】
実施例１５
ジスルフィド結合以外のペプチド環化ストラテジー。
先の実施例で記載のように、ペプチドの環化により標的タンパク質に対する親和性が向上しうる。加えて、場合によっては、環化により生物学的環境が安定し、またはその他にも生物学的効果の調節に使用するペプチドの特性が向上するかもしれない。このため所定のペプチドの様々な環化法を定義することは興味深い。ＬＲＰ６に結合したＤｋｋ１のペプチド構造はこのようなストラテジーを示唆した（図２１Ａ）。結合したペプチドは、２番目（Ｓｅｒ）と７番目（Ａｓｎ）の残基の側鎖が互いに向けて突き出すように曲げられる。その距離は、（Ｓｅｒの代わりの）Ｌｙｓ側鎖と（Ａｓｎの代わりの）Ａｓｐ側鎖の間のアミド結合の形成により結合可能な距離である。標的の環状ペプチドが合成され、親Ｄｋｋ１ペプチドと同等の親和性でＬＲＰ６に結合することが発見された（図２１Ｂ）。
【０１４５】
実施例１６
「ＮＸＩ」モチーフペプチドは、Ｗｎｔ阻害剤とＬＲＰ６の結合を阻害するが、Ｗｎｔの結合は阻害しない。
Ｗｎｔに刺激される骨成長の刺激や修復に向けた治療ストラテジーは、Ｗｎｔリガンドによる正のシグナルを阻害することなく阻害剤の作用を排除すれば、もっとも効果的といえよう。阻害剤の結合とＷｎｔの結合が（ＬＲＰ５／６の明白なエピトープにより）分離可能であることが、ＬＲＰ６のＢＭＤ変異体アナログの実験で示唆された（実施例９）。タンパク質の変異誘発の結果を支持するために、ペプチドをアッセイし、様々なリガンドとＬＲＰ６の結合の阻害活性を測定した。３つの異なるペプチドが、Ｗｎｔ９Ｂの結合に影響を与えることなく阻害剤Ｄｋｋ１およびスクレロスチンとＬＲＰ６ Ｅ１Ｅ２との結合を阻害した（図２２）。このことは、低分子量のリガンドはＢＭＤ変異の効果を再現できることを示している。
【０１４６】
実施例１７
化合物はエクスビボ（生体外）の骨成長アッセイで試験可能である。
ペプチドまたは他の薬剤が骨成長に有用な効果があるか評価するために、エクスビボの骨成長アッセイを使用した。このアッセイの前に、培地でマウス胎仔の頭蓋骨（頭蓋冠）を発生させる。発生中の骨は、例えば骨芽細胞などのいくつかの関連の細胞型を産生し、切開した頭蓋冠は、インビボの反応を潜在的に示す態様で、治療に反応するのに十分な複雑さを備える。加えて、頭蓋冠アッセイは動物の治療よりも簡便である。一般的に、前述したように、頭蓋冠はアッセイのために採取され半分に分割される（実施例１を参照されたい）（５２、５５）。ペプチドを標的アッセイの５０倍濃度で水に溶かし、毎日新たに希釈してアッセイ培地にする。培地は７日間毎日交換する。この成長期間の終わりに、記載のとおり（５２、５５）、サンプルをプロセスし記載の分析に供する。組織学的染色（アリザリンレッド／アルシアンブルー）により石灰化した部分が赤く染まる。
【０１４７】
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【図１】
2013544798.tif 000005
【図２】
2013544798.tif 000006
【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年6月20日(2013.6.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列Ｘ０Ｘ１Ｘ２Ｘ３を含み、ここでＸ０はＮであり；Ｘ１はＡ、Ｓ、Ｆ、Ｔ、Ｙ、ＬもしくはＫまたはＲであり；Ｘ２はＩまたはＶであり；Ｘ３はＫ、ＲまたはＨである、単離されたペプチド。
【請求項２】
ペプチドがアミノ酸配列Ｘ１Ｘ０Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４を含み、ここでＸ−１はＰ、Ｓ、ＣまたはＧであり；Ｘ０はＮであり；Ｘ１はＡ、Ｓ、Ｆ、Ｔ、Ｙ、ＬもしくはＫまたはＲであり；Ｘ２はＩまたはＶであり；Ｘ３はＫ、ＲまたはＨであり；Ｘ４はＦ、Ｔ、Ｙ、ＬまたはＶである、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
ペプチドがＮ Ｘ１ＩＫ、Ｎ Ｘ１ＶＫ、Ｎ Ｘ１ ＩＲ、Ｎ Ｘ１ ＶＲ、Ｎ Ｘ１ ＩＨおよびＮ Ｘ１ＶＨからなる群より選ばれるアミノ酸配列を含み、ここでＸ１はＡ、Ｓ、Ｆ、Ｔ、Ｙである、請求項１記載のペプチド。
【請求項４】
ペプチドがファミリー１のペプチド（図１）からなる群より選ばれる、請求項１記載のペプチド。
【請求項５】
ペプチドの少なくとも１のアミノ酸がアミノ酸アナログで置換される、請求項４記載のペプチド。
【請求項６】
ペプチドがアミノ酸アナログを含む、請求項１記載のペプチド。
【請求項７】
ペプチドがＤｋｋ１とＬＲＰ６の結合を阻害するが、Ｗｎｔ９ＢとＬＲＰ６の結合を阻害しない、請求項１記載のペプチド。
【請求項８】
ペプチドがＬＲＰ６のＥ１ β-プロペラに結合する、請求項１記載のペプチド。
【請求項９】
ペプチドがＬＲＰ６のＥ１ β-プロペラのアミノ酸残基Ｒ２８、Ｅ５１、Ｄ５２、Ｖ７０、Ｓ７１、Ｅ７３、Ｌ９５、Ｓ９６、Ｄ９８、Ｅ１１５、Ｒ１４１およびＮ１８５の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１またはすべてと相互作用する、請求項８記載のペプチド。
【請求項１０】
アミノ酸配列：Ｘ０Ｘ１Ｘ２Ｘ３を含み、ここでＸ０はＮであり；Ｘ１はＦ、Ｙ、Ｌ、Ａ、ＲまたはＳであり；Ｘ２はＩまたはＶであり；Ｘ３はＫ、ＲまたはＨである、単離された環状ペプチド。
【請求項１１】
環状ペプチドがアミノ酸配列Ｘ−１Ｘ０Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４を含み、ここでＸ−１はＰ、Ｓ、ＣまたはＧであり；Ｘ０はＮであり；Ｘ１はＦ、Ｙ、Ｌ、Ａ、ＲまたはＳであり；Ｘ２はＩまたはＶであり；Ｘ３はＫ、ＲまたはＨであり；Ｘ４はＦ、Ｔ、Ｙ、ＬまたはＶである、請求項１０記載の環状ペプチド。
【請求項１２】
環状ペプチドがＮ Ｘ１ＩＫ、Ｎ Ｘ１ＶＫ、Ｎ Ｘ１ ＩＲ、Ｎ Ｘ１ ＶＲ、Ｎ Ｘ１ ＩＨおよびＮ Ｘ１ＶＨからなる群のアミノ酸配列を含み、ここでＸ１はＦ、Ｙ、Ｌ、Ａ、ＲまたはＳである、請求項１０記載の環状ペプチド。
【請求項１３】
ペプチドがファミリー２のペプチド（図２）からなる群より選ばれる、請求項１０記載の環状ペプチド。
【請求項１４】
ペプチドの少なくとも１のアミノ酸がアミノ酸アナログで置換される、請求項１３記載の環状ペプチド。
【請求項１５】
ペプチドがアミノ酸アナログを含む、請求項１０記載の環状ペプチド。
【請求項１６】
ペプチドがＤｋｋ１とＬＲＰ６の結合を阻害するが、Ｗｎｔ９ＢとＬＲＰ６の結合を阻害しない、請求項１０記載の環状ペプチド。
【請求項１７】
ペプチドがＬＲＰ６のＥ１ β-プロペラに結合する、請求項１０記載の環状ペプチド。
【請求項１８】
ペプチドがＬＲＰ６のＥ１ β-プロペラのアミノ酸残基Ｒ２８、Ｅ５１、Ｄ５２、Ｖ７０、Ｓ７１、Ｅ７３、Ｌ９５、Ｓ９６、Ｄ９８、Ｅ１１５、Ｒ１４１およびＮ１８５の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１またはすべてと相互作用する、請求項１０記載の環状ペプチド。
【請求項１９】
アミノ酸配列：Ｘ−１Ｘ０Ｘ１Ｘ２を含み、ここでＸ−１はＷ、Ｌ、Ｙ、ＦまたはＩであり；Ｘ０はＤまたはＥであり；Ｘ１はＦ、Ｗ、Ｉ、ＳまたはＹであり；Ｘ２はＭである、単離されたペプチド。
【請求項２０】
ペプチドがアミノ酸配列：Ｘ−２Ｘ−１Ｘ０Ｘ１Ｘ２Ｘ３を含み、ここでＸ−２はＶ、Ｉ、ＬまたはＦであり；Ｘ−１はＷ、Ｌ、Ｙ、ＦまたはＩであり；Ｘ０はＤまたはＥであり；Ｘ１はＦ、Ｗ、Ｉ、ＳまたはＹであり；Ｘ２はＭであり；Ｘ３はＷ、Ｍ、ＡまたはＧである、請求項１９記載のペプチド。
【請求項２１】
ペプチドがファミリー３のペプチド（図３）からなる群より選ばれる、請求項１９記載のペプチド。
【請求項２２】
ファミリー４のペプチド（図４）からなる群より選ばれる、単離されたペプチド。
【請求項２３】
試験化合物をＬＲＰ６またはその機能的等価物に接触させることと、
Ｄｋｋ１とＬＲＰ６との相互作用を阻害するペプチドリガンドの存在下および不在下で、試験化合物とＬＲＰ６またはその機能的等価物との結合度を決定することを含み、
ここでペプチドリガンドの存在下または不在下での結合度の変化は、試験化合物がＤｋｋ１とＬＲＰ６との相互作用を阻害することを示し、
ここでペプチドリガンドが
ａ）ファミリー１（図１）；
ｂ）ファミリー２（図２）；
ｃ）ファミリー３（図３）；および
ｄ）ファミリー４（図４）
のアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含む、
Ｄｋｋ１とＬＲＰ６との相互作用を阻害する化合物のスクリーニング法。
【請求項２４】
ペプチドリガンドが検出可能な標識で標識される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
試験化合物をＬＲＰ５またはその機能的等価物に接触させることと、
Ｄｋｋ１とＬＲＰ５との相互作用を阻害するペプチドリガンドの存在下および不在下で、試験化合物とＬＲＰ５またはその機能的等価物との結合度を決定することを含み、
ここでペプチドリガンドの存在下または不在下での結合度の変化は、試験化合物がＤｋｋ１とＬＲＰ５との相互作用を阻害することを示し、
ここでペプチドリガンドが
ａ）ファミリー１（図１）；
ｂ）ファミリー２（図２）；
ｃ）ファミリー３（図３）；および
ｄ）ファミリー４（図４）
のアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含む、
Ｄｋｋ１とＬＲＰ５との相互作用を阻害する化合物のスクリーニング法。
【請求項２６】
ペプチドリガンドが検出可能な標識で標識される、請求項２５記載の方法。
【国際調査報告】
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