(57)【要約】  細胞のクローン集団を作製するための方法であって、ａ）インビトロにおいて増幅され、未分化または本質的に未分化の状態に維持された多能性または多分化能性の細胞の集団を得る工程；ｂ）集団の個別化された細胞を増幅して細胞のクローン集団にする工程；ならびにｃ）神経細胞型、肝細胞、または心筋細胞のいずれかについて少なくとも約５０％均一である集団に分化する能力を有することが決定された、細胞の１つまたはそれより多くのクローン集団を選択する工程を含む方法が開示される。本発明の方法によって作製される細胞のクローン集団、および被験体への本発明のクローン細胞の投与を含む、被験体における疾患を治療する方法もまた、開示される。本発明の方法によって作製される細胞のクローン集団と試験化合物を接触させることを含む、試験化合物をスクリーニングするための方法もまた、記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞のクローン集団を作製するための方法であって、
ａ）インビトロにおいて増幅され、未分化または本質的に未分化の状態に維持された多能性または多分化能性細胞の集団を得る工程；
ｂ）該集団の個別化された細胞を増幅して細胞のクローン集団にする工程；ならびに
ｃ）神経細胞、肝細胞、または心筋細胞のいずれかについて少なくとも約５０％均一である集団に分化する能力を有することが決定された、細胞の１つまたはそれより多くのクローン集団を選択する工程を含む方法。
【請求項２】
前記選択された細胞のクローン集団が、心臓形成性の分化能を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記クローン集団が、少なくとも約６５％心筋細胞の細胞に分化する能力を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記クローン集団が、少なくとも約７５％の心筋細胞の細胞に分化する能力を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記クローン集団が、少なくとも約９０％の心筋細胞の細胞に分化する能力を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記多能性細胞が、ヒト胚性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記選択された細胞のクローン集団が、神経形成性の分化を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記クローン集団が、少なくとも約６５％の神経細胞に分化する能力を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記クローン集団が、少なくとも約７５％の神経細胞に分化する能力を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記神経細胞が、ドーパミン作動性ニューロンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記多能性細胞が、ヒト胚性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヒト胚性幹細胞が、Ｈ１、Ｈ９、ｈＥＳ２、ｈＥＳ３、ｈＥＳ４、ｈＥＳ５、ｈＥＳ６、ＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＨＳＦ１、ＨＳＦ６、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３ＢおよびＨ１４からなるリストから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記多能性細胞が、誘導多能性細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｉＰＳＣが、ｉＰＳ  ６．１、ｉＰＳ  ６．６、ｉＰＳ、ｉＰＳ  ５．６、ｉＰＳ  ５．１２、ｉＰＳ  ５．２．１５、ｉＰＳ  ５．２．２４、ｉＰＳ  ５．２．２０、ｉＰＳ  ６．２．１、およびｉＰＳ  ５／３−４．３からなるリストから選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記選択された細胞のクローン集団を増幅する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
細胞が、神経細胞、肝細胞、または心筋細胞のいずれかについて少なくとも約５０％均一な集団に分化する能力を有するかどうかを決定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記選択された細胞のクローン集団を提供する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
保存または輸送のための、前記選択された細胞のクローン集団を調製する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記保存または輸送のための細胞の調製が、該細胞を凍結させる工程を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記増幅された細胞を試験化合物に曝露する工程、および該増幅された細胞における、毒性と関連する細胞パラメーターを測定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記クローン集団が、分化作用物質への曝露によって、少なくとも約５０％の心筋細胞を含む細胞の集団に分化できる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞のクローン集団が、ヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記多分化能性または多能性細胞が、前記個別化の前に少なくとも１回継代されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１に記載の方法によって作製される、複数のクローン由来心筋細胞。
【請求項２５】
前記心筋細胞が組織中に含まれる、請求項２４に記載の心筋細胞。
【請求項２６】
前記組織は、適した容器手段中に含まれる、請求項２５に記載の心筋細胞。
【請求項２７】
複数のクローン由来心筋細胞組織が、容器手段中に含まれる、請求項２６に記載の心筋細胞。
【請求項２８】
請求項１に記載の方法によって作製される複数のクローン由来心筋細胞および薬学的に許容されるキャリアを含む、組成物。
【請求項２９】
向上した神経分化能を示す細胞のクローン集団を調製するための方法であって、
ａ）インビトロにおいて増幅され、未分化または本質的に未分化の状態に維持された多能性または多分化能性細胞の集団を得る工程；
ｂ）該多分化能性または多能性細胞の集団由来の複数の細胞を個別化および増幅する工程；
ｃ）該個別化された細胞から増幅された細胞を、神経細胞型に分化する能力について試験する工程；および
ｄ）分化作用物質に該細胞を曝露することによって少なくとも約５０％の神経細胞に分化できる、増幅された細胞を選択する工程
を含む、方法。
【請求項３０】
前記増幅された細胞が、７５％のドーパミン作動性ニューロンに分化できる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記多能性または多分化能性細胞が、多能性細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記多能性細胞が、ヒト胚性幹細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記ヒト胚性幹細胞が、Ｈ１、Ｈ９、ｈＥＳ２、ｈＥＳ３、ｈＥＳ４、ｈＥＳ５、ｈＥＳ６、ＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＨＳＦ１、ＨＳＦ６、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３ＢおよびＨ１４からなるリストから選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記多能性細胞が、誘導多能性細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ｉＰＳＣが、ｉＰＳ  ６．１、ｉＰＳ  ６．６、ｉＰＳ、ｉＰＳ  ５．６、ｉＰＳ  ５．１２、ｉＰＳ  ５．２．１５、ｉＰＳ  ５．２．２４、ｉＰＳ  ５．２．２０、ｉＰＳ  ６．２．１、およびｉＰＳ  ５／３−４．３からなるリストから選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記神経細胞を試験化合物に曝露する工程、および該神経細胞における、毒性と関連する細胞パラメーターを測定する工程をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１に記載の方法によって作製される、複数のクローン由来の神経細胞。
【請求項３８】
前記神経細胞が組織中に含まれる、請求項３７に記載の神経細胞。
【請求項３９】
前記組織が、適した容器手段中に含まれる、請求項３８に記載の神経細胞。
【請求項４０】
複数のクローン由来神経組織が、容器手段中に含まれる、請求項３７に記載の神経細胞。
【請求項４１】
請求項１に記載の方法によって作製される複数のクローン由来神経細胞および薬学的に許容されるキャリアを含む、組成物。
【請求項４２】
試験化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）複数の心筋細胞、肝細胞、または神経細胞を該試験化合物と接触させる工程；
ｂ）該試験化合物との接触に起因する、該細胞の表現型または活性の何らかの変化を決定する工程を含み、該細胞が、請求項１に記載の方法によって作製される、方法。
【請求項４３】
前記表現型または活性が、毒性の測定値であなる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
１つまたはそれより多くの遺伝子の発現が、前記複数の心筋細胞または神経細胞において測定される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記１つまたはそれより多くの遺伝子が、活性化カスパーゼ３、ＮＦ−ｋＢ、ＴＮＦ−アルファ、熱誘導性因子（ＨＩＦ−１アルファ）、熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）、トランスアミナーゼ、ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ、およびアルカリホスファターゼから選択される群からの少なくとも１つの遺伝子を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記遺伝子発現が、ハイスループット遺伝子配列決定、ウエスタンブロット、遺伝子発現アレイ、フローサイトメトリー、免疫蛍光法、プロモーター／レポーター遺伝子ベースのアッセイ、または比色アッセイを使用して測定される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
表現型または活性の何らかの変化の決定が、心筋細胞の収縮、細胞死、活動電位のパターン、およびイオン透過性からなる群から選択されるパラメーターを評価する工程を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
前記多能性または多分化能性細胞が、ヒト細胞である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
心臓形成性の分化能を示す細胞のクローン集団を作製するための方法であって、
ａ）インビトロにおいて増幅され、未分化または本質的に未分化の状態に維持された多能性または多分化能性細胞の集団を得る工程；
ｂ）前記集団の個別化された細胞を細胞のクローン集団に増幅する工程；
ｃ）心筋細胞について少なくとも約５０％均一である集団に分化する能力を有することが決定された、細胞の１つまたはそれより多くのクローン集団を選択する工程；ならびに
ｄ）工程（ｃ）において観察される、前記増幅された細胞が心筋細胞に分化する能力に基づいて、前記選択された細胞を、細胞および組織工学、薬剤スクリーニング、または細胞療法のために使用する工程を含む、方法。
【請求項５０】
神経細胞の実質的に均一な集団を被験体に投与する工程を含む、疾患を治療する方法であって、前記神経細胞が、
ａ）インビトロにおいて増幅され、未分化または本質的に未分化の状態に維持された多能性または多分化能性細胞の集団を得る工程；
ｂ）該集団の個別化された細胞を細胞のクローン集団に増幅する工程；
ｃ）神経細胞型について少なくとも約５０％均一である集団に分化する能力を有することが決定された、細胞の１つまたはそれより多くのクローン集団を選択する工程；および
ｄ）該細胞の１つまたはそれより多くの選択された集団の細胞またはそれらの子孫を提供する工程を含む方法によって作製されたものである、方法。
【請求項５１】
前記神経細胞が、ドーパミン作動性ニューロンである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記疾患が、パーキンソン病である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記ドーパミン作動性ニューロンの集団が、黒質緻密部の少なくとも一部分を含む領域に注射される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
約１００，０００〜約１０，０００，０００細胞が、注射される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記被験体が、ヒトである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
被験体における心疾患を治療するための方法であって、工程１の方法によって作製される複数のクローン由来心筋細胞を被験体に投与する工程を含み、前記心疾患が治療される、方法。
【請求項５７】
前記被験体が、虚血性心疾患を有する被験体として同定される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記心筋細胞を静脈内に、動脈内に、または心筋内に投与する工程を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
心疾患の治療のための療法の１つまたはそれより多くの副次的な形態を実行する工程をさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記被験体の心臓の心機能が向上する、請求項５６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本願は、２００９年１２月２日に提出された米国出願第６１／２６６，０７２号に対する優先権を主張する。その開示全体は、放棄なしにその全体が本明細書中に具体的に参考として援用される。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、一般に、幹細胞選択、幹細胞分化、および細胞療法の分野に関連する。特に、本発明は、明確な分化能力を有する非遺伝子修飾クローン多能性幹細胞系の選択のための方法および本発明の方法によって作製される幹細胞クローンの適用に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．関連技術の説明
胚性幹（ＥＳ）細胞および誘導多能性幹細胞を含む多能性幹細胞は、初期発生を研究し、疾患および毒性学をモデル化し、細胞療法において使用するための大きな見込みがある。同じことは、成体および胚性神経幹細胞に該当する。そのような細胞が培養において増殖することができ、異なる細胞型に分化するそれらの潜在能を維持することができるので、それらは、様々な疾患を治療するために細胞のほぼ無限の供給をもたらすことができる。
【０００４】
研究が活発な１つの分野は、細胞療法を使用する神経系疾患および心血管疾患の治療である。変性神経系疾患の治療に対するアプローチは、ドーパミン作動性ニューロンなどのような中枢神経系の細胞を神経系の患部に移植することである。
【０００５】
細胞療法のための細胞についての可能性のある供給源は、ＥＳ細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、および他のタイプの幹細胞をインビトロにおいて分化させることによって調製される。霊長動物ＥＳ細胞培養物を調製するための方法は、ヒト、アカゲザル、およびマーモセットＥＳ細胞について記載されている（特許文献１；特許文献２；特許文献３）。
【０００６】
あいにく、多能性幹細胞に由来する異なる細胞型の異種性の混合物は、培養において得るのが容易であるが、特異的な系列へのそれらの標的分化は、困難なままである。一般に、培養におけるＥＳ細胞の分化は、細胞の異種性の混合物を産生し、これらのうちのいくつかのみが、神経細胞などのような、細胞療法に適している分化細胞となり得る。
【０００７】
より制御された分化プロセスは、幹細胞による神経細胞工学および神経組織工学の改善を強く支援するであろう。したがって、細胞療法において使用される幹細胞由来の分化細胞を調製するための、改善された方法についての必要性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，８４３，７８０号明細書
【特許文献２】米国特許第６，２００，８０６号明細書
【特許文献３】米国特許第７，０２９，９１３号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、特異的なまたは特定の分化能を有する多能性幹細胞のクローン集団を提供するための方法の同定に部分的に基づく。本発明の方法は、ＥＳＣを利用する細胞療法またはバイオテクノロジーにおいて適用することができる、分化細胞の豊富な集団を提供する利点を有する。さらに、治療上の適用における、精製されたまたは高度に精製された分化細胞の使用は、脳への細胞の移植に続く、奇形腫または神経上皮腫瘍の危険性などのような、被験体における副作用の危険性を低下させる。さらに、本発明の方法は、遺伝子修飾されていない細胞のクローン集団を提供してもよい。
【００１０】
細胞のクローン集団を作製するまたは生成するための方法であって、ａ）インビトロにおいて増幅（ｅｘｐａｎｄ）し、未分化または本質的に未分化の状態に維持された多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）または多分化能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）の細胞の集団を得る工程；ｂ）集団の個別化された細胞を増幅して細胞のクローン集団にする工程；ならびにｃ）神経細胞型、肝細胞、筋細胞、または心筋細胞のいずれかについて少なくとも約５０％均一である集団に分化する能力を有することが決定された、細胞の１つまたはそれより多くのクローン集団を選択する工程を含む方法が本発明において含まれる。ある実施形態では、方法は、細胞の１つまたはそれより多くの選択集団の細胞またはそれらの子孫を提供することをさらに含んでいてもよい。下記の実施例において示されるように、ある種のクローン多能性細胞系における肝細胞特有のマーカーの増加は、胚様体への分化の間に約１００倍増加した。
【００１１】
「細胞のクローン集団」は、単一の共通の母細胞の子孫である細胞の群を指すように本明細書において定義される。
【００１２】
用語「多能性幹細胞」は、３つの胚葉、すなわち内胚葉、中胚葉、および外胚葉すべての細胞を誘発することができる細胞を指す。理論上、多能性細胞は、体のあらゆる細胞に分化することができるが、多能性の実験的な決定は、それぞれの胚葉のいくつかの細胞型への多能性細胞の分化に典型的に基づく。本発明のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚性幹（ＥＳ）細胞である。他の実施形態では、多能性幹細胞は、分化細胞の再プログラムによって誘発される誘導多能性幹細胞である。ある実施形態では、多能性幹細胞は、体細胞核移植によって誘発される胚性幹細胞である。多能性細胞は、ヒト胚性幹細胞であってもよい。ヒト胚性幹細胞の非限定的な例は、Ｈ１、Ｈ９、ｈＥＳ２、ｈＥＳ３、ｈＥＳ４、ｈＥＳ５、ｈＥＳ６、ＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＨＳＦ１、ＨＳＦ６、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３Ｂ、およびＨ１４を含む。多能性細胞は、よりいっそう詳細に下記に議論されるように、誘導多能性細胞（ｉＰＳＣ）であってもよい。ｉＰＳＣの非限定的な例は、ｉＰＳ  ６．１、ｉＰＳ  ６．６、ｉＰＳ、ｉＰＳ  ５．６、ｉＰＳ  ５．１２、ｉＰＳ  ５．２．１５、ｉＰＳ  ５．２．２４、ｉＰＳ  ５．２．２０、ｉＰＳ  ６．２．１、およびｉＰＳ  ５／３−４．３を含む。方法は、細胞の選択クローン集団を増幅することをさらに含んでいてもよい。方法は、細胞が、神経細胞、肝細胞、または心筋細胞のいずれかについて少なくとも約５０％均一な集団に分化する能力を有するかどうかを決定することをさらに含んでいてもよい。方法は、細胞の選択クローン集団を提供することをさらに含んでいてもよい。方法は、保存または輸送のための、細胞の選択クローン集団を調製することをさらに含んでいてもよい。当該保存または輸送のための細胞の調製は、細胞を凍結させることを含んでいてもよい。
【００１３】
用語「多分化能性幹細胞」は、限られた数の組織型に分化することができる幹細胞を指す。多分化能性幹細胞の非限定的な例は、神経幹細胞および造血幹細胞を含む。「神経幹細胞」は、神経細胞に最終的に分化するさらに多くの神経幹細胞および子孫細胞を誘発することができる（つまり、自己再生を示す）神経組織由来の未分化細胞である。神経幹細胞は、成体または胚性神経幹細胞とすることができる。
【００１４】
本明細書において使用される用語「心筋細胞」は、（ａ）成熟もしくは未成熟心筋細胞中に存在することが公知の１つもしくは複数の形態的特徴を示す細胞または（ｂ）成熟もしくは未成熟心筋細胞中に存在することが公知の１つもしくは複数のマーカーもしくは他のタンパク質を発現する細胞を指す。したがって、本明細書において使用される用語「心筋細胞」は、成熟または未成熟心筋細胞の両方を指す。形態的特徴の非限定的な例は、拍動している筋細胞の形成、心臓特異的筋節タンパク質の発現、およびイオンチャネルの発現を含む。マーカーの非限定的な例は、心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）、筋節ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ＧＡＴＡ−４、Ｎｋｘ２．５、Ｎ−カドヘリン、ベータ．１−アドレノセプター（β１−ＡＲ）、ＡＮＦ、転写因子のＭＥＦ−２ファミリー、クレアチンキナーゼＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）、ミオグロビン、および心房性ナトリウム利尿因子（Ｌｉら、２００６年）を含む。
【００１５】
本明細書において使用される「神経細胞」は、（ａ）成熟ニューロン、未成熟ニューロン、成熟グリア細胞、未成熟グリア細胞、もしくは神経前駆細胞中に存在することが公知の１つもしくは複数の形態的特徴を示す細胞または（ｂ）成熟ニューロン、未成熟ニューロン、成熟グリア細胞、未成熟グリア細胞、もしくは神経前駆細胞中に存在することが公知の１つもしくは複数のマーカー、神経伝達物質、もしくは他のタンパク質を発現する細胞を指す。形態的特徴の非限定的な例は、小さな細胞体、軸索を暗示する複数のプロセス、および樹状突起を含む。マーカー、神経伝達物質、または他のタンパク質の非限定的な例は、ａ）ニューロンの特徴であるβ３−チューブリン、微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ−２）、または神経細線維；ｂ）アストロサイト中に存在するグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）；ｃ）希突起膠細胞の特徴である２’，３’−環状ヌクレオチド３’−ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰａｓｅ）ガラクトセレブロシド（ＧａＩＣ）またはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）；ｄ）未分化ＥＳ細胞の特徴であるＯｃｔ−４；ｅ）神経前駆体および他の細胞の特徴であるＰａｘ−６およびネスチン；ｆ）中枢神経系を発生させる特徴であるＳｏｘ  １；ｇ）カテコールアミンニューロン中に存在するチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）；ｈ）ガンマ−アミノ酪酸を含有するニューロン中に存在するグルタミン酸デカルボキシラーゼ、アイソフォーム６７（ＧＡＤ６７）；ｉ）中間の神経分化の特徴であるビメンチン；ならびにｊ）ドーパミン作動性分化についてのサインであるドーパミン分泌、放射性ドーパミン取り込み、およびドーパミントランスポーター発現を含む。「グリア細胞」の非限定的な例は、アストロサイト、希突起膠細胞、上衣細胞、放射神経膠、シュワン細胞、および衛星細胞を含む。本明細書において使用される「神経細胞」は、「ニューロン細胞」を含む。本明細書において使用される「ニューロン細胞」は、成熟または未成熟ニューロンを指す。たとえば、成熟または未成熟ニューロンは、成熟または未成熟ドーパミン作動性ニューロンであってもよい。
【００１６】
本明細書において使用される用語「肝細胞」は、（ａ）成熟もしくは未成熟肝細胞中に存在することが公知の１つもしくは複数の形態的特徴を示す細胞または（ｂ）成熟もしくは未成熟肝細胞中に存在する公知の１つもしくは複数のマーカーもしくは他のタンパク質を発現する細胞を指す。したがって、本明細書において使用される用語「肝細胞」は、成熟または未成熟肝細胞の両方を指す。形態的特徴の非限定的な例は、好酸性細胞質、多数のミトコンドリアおよび好塩基性顆粒、分散したクロマチンを有する丸い核、ならびに顕著な核小体を含む。肝細胞はまた、アルファフェトプロテインを含む肝臓特異的タンパク質、アルブミンの発現の同定によって同定されてもよい。肝細胞を区別するために使用されてもよいさらなる方法は、電子顕微鏡、免疫細胞化学、免疫蛍光法、定量的ＰＣＲ、ウエスタンブロッティング、およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含む。
【００１７】
細胞の選択クローン集団は、心臓形成性の分化能を示してもよい。細胞の選択クローン集団は、肝細胞分化能を示してもよい。その代わりに、細胞のクローン集団は神経形成性の分化能を示してもよい。神経形成性の分化能を示す細胞のクローン集団は、任意の特定のタイプの神経細胞への分化を示してもよい。非限定的な例は、ニューロン、希突起膠細胞、アストロサイト、小グリア細胞、衛星細胞、およびシュワン細胞を含む。特定の実施形態では、神経細胞は、ドーパミン作動性ニューロンである。
【００１８】
いくつかの実施形態では、細胞の選択クローン集団は、少なくとも５５％の神経細胞、少なくとも６０％の神経細胞、少なくとも６５％の神経細胞、少なくとも７０％の神経細胞、少なくとも７５％の神経細胞、少なくとも８０％の神経細胞、少なくとも８５％の神経細胞、少なくとも９０％の神経細胞、少なくとも９５％の神経細胞、もしくは少なくとも９９％の神経細胞またはその中で推論できる任意の範囲に分化する能力を示してもよい。他の実施形態では、細胞の選択クローン集団は、少なくとも５５％の心筋細胞、少なくとも６０％の心筋細胞、少なくとも６５％の心筋細胞、少なくとも７０％の心筋細胞、少なくとも７５％の心筋細胞、少なくとも８０％の心筋細胞、少なくとも８５％の心筋細胞、少なくとも９０％の心筋細胞、少なくとも９５％の心筋細胞、もしくは少なくとも９９％の心筋細胞またはその中で推論できる任意の範囲に分化する能力を示してもよい。さらに他の実施形態では、細胞の選択クローン集団は、少なくとも５５％の肝細胞、少なくとも６０％の肝細胞、少なくとも６５％の肝細胞、少なくとも７０％の肝細胞、少なくとも７５％の肝細胞、少なくとも８０％の肝細胞、少なくとも８５％の肝細胞、少なくとも９０％の肝細胞、少なくとも９５％の肝細胞、もしくは少なくとも９９％の肝細胞またはその中で推論できる任意の範囲に分化する能力を示してもよい。
【００１９】
集団の個別化された細胞を増幅して細胞のクローン集団にする任意の方法もまた、本明細書において記載された方法において使用するために企図される。方法は、集団の個別化された細胞の単離を含んでいてもよい。フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）、免疫磁気技術、抗体カラム、免疫沈降、およびイムノパニングを含むが、これらに限定されない様々なタイプの免疫選択は、細胞を単離するために本発明の実施において使用されてもよい。さらなる例は、本明細書において下記に議論される。特定の実施形態では、単離は、インビトロにおいて実行される。細胞培養技術は、当業者らに周知である。そのような技術の非限定的な例は、本明細書において下記に記載される。
【００２０】
いくつかの実施形態では、細胞のクローン集団は、神経細胞型または心筋細胞への分化を誘導するために、１つまたはそれより多くの分化作用物質に曝露される。本明細書において使用される用語「分化を誘導すること」または「分化を誘導する」は、幹細胞に対する直接的なまたは意図的な作用の結果として、幹細胞を発生させて、特異的な分化細胞型にすることを意味するようにとられる。作用因子は、イオン流入などのような細胞パラメーター、ｐＨ変化、ならびに／またはこれらに限定されないが、分化を調節し、引き起こす増殖因子およびサイトカインなどのような、分泌タンパク質などのような細胞外因子を含むことができる。それは、細胞をコンフルエンスまで培養することを含んでいてもよく、細胞密度が作用してもよい。いくつかの実施形態では、分化作用物質は、細胞によって提供される。そのような作用物質の非限定的な例は、本明細書において下記に記載される。
【００２１】
細胞の分化を評価するための、当業者らに公知の任意の方法は、本発明の方法における適用について企図される。分化作用物質への未分化幹細胞の曝露によって調製される分化細胞は、神経前駆体細胞、心筋細胞、肝細胞、または他の細胞型としてのそれらのステータスを確認するために、形態学的に、免疫化学的に、および他の方法において特徴付けることができる。形態的分析に関して、細胞は、多くの表現型の基準に従って特徴付けることができる。基準は、形態的特徴の顕微鏡観察、発現した細胞マーカーの検出または定量化、酵素活性、神経伝達物質およびそれらの受容体、ならびに電気生理学的機能を含むが、これらに限定されない。
【００２２】
細胞はまた、それらが特定の種類の細胞の特徴である表現型マーカーを発現するかどうかに従って分化について評価することができる。当技術分野において公知の組織特異的マーカーは、細胞表面マーカーについてのフローイムノサイトケミストリー（ｆｌｏｗ  ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）および蛍光活性化セルソーター、細胞内または細胞表面マーカーについての免疫組織化学的検査（たとえば固定された細胞または組織切片の）、細胞抽出物のウエスタンブロット解析、ならびに細胞抽出物または培地に分泌された産物についての酵素結合免疫測定法などのような任意の適した免疫学的技術を使用して分化を評価するために検出することができる。抗原に結合している抗体は、標識を増幅するための、標識された二次抗体もしくは他のコンジュゲート（ビオチン−アビジンコンジュゲートなど）を使用する、細胞の固定後の、標準的な免疫細胞化学もしくはフローサイトメトリーアッセイまたは当技術分野において周知の他の免疫学的方法によって観察することができる。一般に、免疫複合体形成の検出は、当技術分野において周知であり、多数のアプローチの適用を通して達成されてもよい。
【００２３】
いくつかの実施形態では、細胞のクローン集団を提供するための方法は、インビトロにおいて増幅された細胞を試験化合物に曝露することおよび増幅された細胞における、毒性と関連する細胞パラメーターを測定することをさらに含む。特定の実施形態では、細胞は、インビトロにおいて試験化合物に曝露される。
【００２４】
細胞のクローン集団は、哺乳動物細胞であってもよい。細胞の供給源の非限定的な例は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、雌ウシ、霊長動物、またはヒトを含む。特定の実施形態では、細胞のクローン集団は、ヒトの細胞である。
【００２５】
ある実施形態では、多分化能性または多能性細胞は、個別化された細胞の、細胞のクローン集団への増幅の前に少なくとも１回、継代されている。
【００２６】
本発明はまた、向上した神経分化能を示す細胞のクローン集団を調製するまたは作製するための方法であって、ａ）インビトロにおいて増幅され、未分化または本質的に未分化の状態に維持された多能性または多分化能性細胞の集団を得る工程；ｂ）多分化能性または多能性細胞の集団由来の複数の細胞を個別化および増幅する工程；ｃ）神経細胞型について少なくとも約５０％均一である集団に分化する能力を有することが決定された、細胞の１つまたはそれより多くのクローン集団を選択する工程；ならびにｄ）細胞の１つまたはそれより多くの選択集団の細胞またはそれらの子孫を提供する工程を含む方法にも関する。増殖した細胞は、少なくとも５５％の神経細胞、少なくとも６０％の神経細胞、少なくとも６５％の神経細胞、少なくとも７０％の神経細胞、少なくとも７５％の神経細胞、少なくとも８０％の神経細胞、少なくとも８５％の神経細胞、少なくとも９０％の神経細胞、少なくとも９５％の神経細胞、もしくは少なくとも９９％の神経細胞またはその中で推論できる任意の範囲に分化する能力を示してもよい。特定の実施形態では、神経細胞は、ドーパミン作動性細胞である。多能性または多分化能性細胞は、上記に議論される細胞のいずれかであってもよい。いくつかの実施形態では、方法は、神経細胞を試験化合物に曝露することおよび神経細胞における、毒性と関連する細胞パラメーターを測定することをさらに含む。細胞またはそれらの子孫の提供は、当業者らに公知の任意の方法を使用して、細胞またはそれらの子孫を被験体に投与することを含んでいてもよい。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態は、本発明の方法によって作製される複数のクローン由来心筋細胞または複数のクローン由来神経細胞に関する。本発明の方法によって作製される心筋細胞または神経細胞は、組織中に含まれていてもよいまたは含まれていなくてもよい。組織は、適した容器手段中のものとしてもよい。特定の実施形態では、神経細胞は、ドーパミン作動性細胞である。神経細胞は、組織中に含まれていてもよい。組織および／または細胞は、容器手段中に含まれていてもよい。
【００２８】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の方法によって作製される複数のクローン由来神経細胞、肝細胞、または心筋細胞およびキャリアを含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、組成物中の複数のクローン由来神経細胞、肝細胞、または心筋細胞は、単一の共通の前駆細胞から増幅されている。他の実施形態では、細胞は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の共通の前駆細胞に由来する。組成物は、哺乳動物被験体への投与のために製剤された医薬組成物であってもよい。
【００２９】
いくつかの実施形態では、組成物中の複数のクローン由来神経細胞、肝細胞、または心筋細胞は、単離クローン由来神経細胞または単離心筋細胞としてさらに定義される。組成物は、単離クローン由来神経細胞または単離クローン由来心筋細胞ではない他の細胞を含んでいてもよいまたは含んでいなくてもよい。組成物中の細胞の数は、少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０、少なくとも１０１１、少なくとも１０１２、少なくとも１０１３、少なくとも１０１４、少なくとも１０１５、少なくとも１０１６、少なくとも１０１７、少なくとも１０１８、少なくとも１０１９、少なくとも１０２０、もしくはそれ以上の細胞または本明細書において推論できる細胞の数の任意の範囲であってもよい。
【００３０】
いくつかの実施形態では、組成物は、組成物中に、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくはそれ以上の神経細胞、肝細胞、もしくは心筋細胞または本明細書において推論できるパーセンテージの任意の範囲を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約９０％の神経細胞を含む。他の実施形態では、組成物は、少なくとも約９０％の心筋細胞を含む。
【００３１】
組成物は、当業者らに公知の、任意の薬学的に許容されるキャリアを含んでいてもよい。そのようなキャリアの非限定的な例は、本明細書において下記に記載される。いくつかの実施形態では、組成物は、１つまたはそれより多くの副次的な治療剤を含む。副次的な治療剤の非限定的な例は、化学療法剤を含む。化学療法剤のいくつかの例は、本明細書において下記に記載される。
【００３２】
本発明は、本発明の方法によって作製される複数のクローン由来細胞を含む、適した容器手段を含むキットをさらに含む。細胞は、組織中に含まれていてもよいまたは含まれていなくてもよい。他の任意選択のキット成分は、本明細書において下記に記載される。
【００３３】
本発明はまた、試験化合物をスクリーニングするための方法であって、ａ）複数の心筋細胞、肝細胞、または神経細胞を試験化合物と接触させることならびにｂ）試験化合物との接触に起因する細胞の表現型および活性に対するあらゆる変化を決定することを含み、細胞は、本明細書において記載される方法によって作製される、方法に関する。いくつかの実施形態では、表現型または活性は、毒性の測定値となる。細胞の表現型または活性に対するあらゆる変化の決定は、当業者らに公知の任意の方法に従って実行されてもよい。適用することができる方法の例は、形態的分析、免疫化学的分析、および上記に記載される他の方法を含む。いくつかの実施形態では、１つまたはそれより多くの遺伝子の発現は、複数の心筋細胞、肝細胞、または神経細胞において測定される。そのような遺伝子の非限定的な例は、カスパーゼ３、ＮＦ−ｋＢ、ＴＮＦ−アルファ、熱誘導性因子（ＨＩＦ−１アルファ）、熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）、細胞統合性遺伝子（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｇｅｎｅ）（たとえばトランスアミナーゼ）、ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、および酸化ストレス遺伝子を含む。遺伝子発現は、任意の方法または当業者らに周知の方法の組み合わせを使用して測定されてもよい。そのような方法の非限定的な例は、ハイスループット遺伝子配列決定、ウエスタンブロット、遺伝子発現アレイ、フローサイトメトリー、免疫蛍光法、プロモーター／レポーター遺伝子ベースのアッセイ、または比色アッセイを含む。測定されてもよいパラメーターの他の例は、心筋細胞の収縮、細胞死、活動電位のパターン、およびイオン透過性を含む。
【００３４】
本発明のさらなる実施形態は、心臓形成性の分化能を示す細胞のクローン集団を調製するまたは作製するための方法であって、ａ）インビトロにおいて増幅され、未分化または本質的に未分化の状態に維持された多能性または多分化能性細胞の集団を得る工程；ｂ）多分化能性または多能性細胞の集団由来の複数の細胞を個別化し、かつ細胞のクローン集団を増幅する工程；ｃ）心筋細胞について少なくとも約５０％均一である集団に分化する能力を有することが決定された、細胞の１つまたはそれより多くのクローン集団を選択する工程；ならびにｄ）工程（ｃ）において観察されるように、増幅された細胞が心筋細胞に分化する能力に基づいて、細胞および組織工学、薬剤スクリーニング、または細胞療法のために増幅された細胞を使用する工程を含む方法に関する。
【００３５】
本発明のさらなる実施形態は、肝細胞分化能を示す細胞のクローン集団を提供するための方法であって、ａ）インビトロにおいて増幅され、未分化または本質的に未分化の状態に維持された多能性または多分化能性細胞の集団を得る工程；ｂ）多分化能性または多能性細胞の集団由来の複数の細胞を個別化し、かつ細胞のクローン集団を増幅する工程；ｃ）肝細胞について少なくとも約５０％均一である集団に分化する能力を有することが決定された、細胞の１つまたはそれより多くのクローン集団を選択する工程；ならびにｄ）工程（ｃ）において観察されるように、増幅された細胞が肝細胞に分化する能力に基づいて、細胞および組織工学、薬剤スクリーニング、または細胞療法のために増幅された細胞を使用する工程を含む方法に関する。
【００３６】
本発明の方法によって作製される細胞のクローン集団を含む、被験体における疾患を治療するための方法もまた、企図される。本発明の方法によって作製される細胞またはそれらの子孫は、移植、細胞療法、または遺伝子療法のために使用されてもよい。本発明は、細胞ベースの療法のための本発明の方法によって作製される神経細胞、肝細胞、または心筋細胞の使用を企図する。たとえば、細胞は、成体において疾患または外傷により実質的に損傷しており、著しく衰えているヒト組織を再生するために使用されてもよい。再生は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて実行されてもよい。たとえば、本明細書において記載される方法によって作製される心筋細胞は、被験体における心組織の再生に適用されてもよく、対象の心組織は、心虚血によって損傷している。本発明の神経細胞は、損傷したまたは変性を受けた神経系の細胞を再生する目的で投与されてもよい。本発明の肝細胞は、損傷したまたは変性を受けた神経系の細胞を再生する目的で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、被験体に直接投与されてもよい。そのため、本開示の方法は、心臓または神経系の多くの疾患、外傷、または他の有害な状態の治療において有用であり得る。
【００３７】
いくつかの実施形態では、本発明の心筋細胞、肝細胞、または神経細胞は、３Ｄ再構築によってヒトの体器官をモデル化するために使用することができる。たとえば、たとえば、ヒトの脳における組織は、本明細書において記載される方法によって作製される神経細胞の３Ｄ培養によってモデル化されてもよい。心臓組織は、本発明の方法によって作製される心筋細胞から誘発され、再構築されてもよい。いくつかの実施形態では、本開示の神経細胞および心筋細胞はまた、たとえば、必要に応じて、細胞を遺伝子操作し、分化させ、遺伝子療法のためのドナーにおける標的部位に細胞または組織を送達することによってヒトの体の様々な部位に送達されることとなる様々な治療上活性な分子または遺伝子のためのキャリアビヒクルとして使用されてもよい。
【００３８】
いくつかの実施形態では、方法は、神経細胞の実質的に均一な集団を被験体に投与する工程を含み、神経細胞は、本明細書において記載される方法によって作製されたものであるまたは本明細書において記載される方法によって作製される神経細胞の子孫である。特定の実施形態では、神経細胞は、ドーパミン作動性細胞である。他の実施形態では、投与される細胞は、本発明の方法によって作製される心筋細胞である。被験体は、神経系を含む疾患または心血管系を含む疾患を有することが知られているまたは疑われる被験体であってもよい。
【００３９】
いくつかの実施形態では、疾患は、神経変性疾患である。治療のために企図される神経変性疾患の非限定的な例は、パーキンソン病、アルツハイマー（Ａｌｚｅｉｍｅｒ）病、多発性硬化症、卒中、筋萎縮性側索硬化症（ルー  ゲーリッグ病）、前頭側頭型認知症（ピック病）、プリオン病、ハンチントン病、脳虚血、特発性パーキンソン病、局所的または薬剤誘導性パーキンソン症候群、異なる起源のアルツハイマー病および大脳の認知症症候群、ハンチントン舞踏病、ＡＩＤＳ脳症、クロイツフェルトヤコプ病、麻疹ウイルスおよびヘルペスウイルスによって誘導される脳症、ならびにボレリア症などのような感染誘導性神経変性障害、肝性、アルコール性、低酸素性、低血糖、または高血糖誘導性脳症および溶媒または医薬品によって誘導される脳症などのような代謝毒性神経変性障害、様々な起源の変性網膜障害、外傷誘導性脳および骨髄損傷、脊髄損傷、医薬、毒素、病毒、および薬剤の追加および／または除去後のなどのような、様々な起源の大脳過剰興奮性症状、精神また外傷誘導性大脳過剰興奮性状態、代謝、医薬、毒性、および伝染誘導性多発ニューロパシーおよび多発神経炎などのような末梢神経系の神経変性症候群を含む。特定の実施形態では、疾患は、パーキンソン病である。心血管疾患の非限定的な例は、心筋虚血症、心筋症、うっ血性心不全、および心筋梗塞を含む。
【００４０】
本発明の他の態様は、心疾患または心状態を治療するまたは予防するための方法である。心疾患は、典型的に、心機能の低下と関連し、これらに限定されないが、心筋梗塞、心肥大、および心不整脈などのような状態を含む。本発明の本態様では、方法は、本発明の単離された分化心筋細胞の細胞および／または本発明の方法を使用して処理された場合に心筋細胞の細胞に分化することができる細胞を被験体の心組織に導入する工程を含む。単離された分化心筋細胞は、本明細書において記載される方法によって作製される心筋細胞の子孫であってもよい。単離された心筋細胞の細胞は、被験体の損傷した心組織に好ましくは移植される。より好ましくは、方法は、被験体において心機能の回復をもたらす。いくつかの実施形態では、被験体は、虚血性心疾患またはうっ血性心不全を有する被験体である。細胞は、当業者らに公知の任意の方法を使用して投与されてもよい。非限定的な例は、静脈内投与、動脈内投与、および心筋内投与を含む。方法は、任意選択で、心疾患の治療のための１つまたはそれより多くの副次的な形態の療法を実行するまたは投与することを含んでいてもよい。そのような療法の非限定的な例は、下記に議論される。
【００４１】
本発明のさらに他の態様では、心組織を修復するための方法であって、本明細書において記載される方法によって作製される、本発明の単離心筋細胞もしくは単離された心前駆細胞または心筋細胞の子孫を被験体の損傷した心組織に導入する工程を含む方法が提供される。
【００４２】
本発明の他の態様は、肝疾患または状態を治療するまたは予防するための方法である。治療のために企図される肝疾患の非限定的な例は、肝炎、非アルコール性脂肪性肝疾患、肝硬変、肝臓癌、ウィルソン病、原発性硬化性胆管炎、原発性胆汁性肝硬変、小胆管の自己免疫疾患、バッド−キアリー症候群、ジルベール症候群、および糖原病ＩＩ型を含む。
【００４３】
細胞は、当業者らに公知の任意の方法を使用して投与されてもよい。非限定的な例は、直接的な注射、皮内、鞘内、心臓内、経皮的、非経口、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮下、脳または中枢神経系への注射、経皮的、気管内、腹腔内、灌流、および灌注を含む。特定の実施形態では、パーキンソン病は、黒質緻密部の少なくとも一部分を含む領域にドーパミン作動性ニューロンを注射することによって治療される。
【００４４】
疾患を治療する利点があることが公知であるかまたはそのように思われる任意の数の細胞が投与される。いくつかの実施形態では、約１００，０００〜約１０，０００，０００の細胞が、用量当たりに投与される。単一の用量が投与されてもよいまたは複数回の用量が投与されてもよい。
【００４５】
特定の実施形態における被験体は、哺乳動物被験体である。哺乳動物被験体の非限定的な例は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、雌ウシ、ウマ、霊長動物、およびヒトを含む。特定の実施形態では、被験体は、ヒトである。
【００４６】
本発明の一実施形態に関して議論されるあらゆる限定は、本発明の任意の他の実施形態に適用されてもよいことが明確に企図される。さらに、本発明のあらゆる組成物は、本発明のあらゆる方法において使用されてもよく、本発明のあらゆる方法は、本発明のあらゆる組成物を作製するまたは利用するために使用されてもよい。
【００４７】
請求項における用語「または」の使用は、選択肢のみを指すようにまたは選択肢が相互に排他的であることが明示的に示されない限り、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は選択肢のみならびに「および／または」を指す定義を支持する。
【００４８】
本出願の全体にわたって、用語「約」は、値が、デバイスおよび／または値を決定するために利用される方法についての誤差の標準偏差を含むことを示すために使用される。
【００４９】
本明細書において使用されるように、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という指定は、その他に明確に示されない限り、１つまたは複数を意味してもよい。請求項（複数可）において本明細書において使用されるように、語「含むこと」と共に使用される場合、単語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１つのまたは１つを超える、を意味してもよい。本明細書において使用されるように、「他の」は、少なくとも第２のまたはそれ以上の、を意味してもよい。
【００５０】
本発明の方法、細胞、およびキットのいずれかの任意の実施形態は、記載される特徴および／または工程を含む／含む／含有する／有するではなく、それから成ってもよいまたはそれから本質的に成ってもよい。したがって、請求項のいずれかにおいて、用語「からなる」または「から本質的になる」は、オープンエンド連結動詞を使用して、それがないものから所与の請求項の範囲を変更するために、上記に列挙されるオープンエンド連結動詞のいずれかと置き換えられてもよい。
【００５１】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかしながら、本発明の精神および範囲内の様々な変化および修飾が、この詳細な説明から当業者らに明らかになるので、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、例証のみのために提供されることが理解されたい。
【００５２】
以下の図は、本明細書の一部を形成し、本発明のある態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書において提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、１つまたはそれより多くのこれらの図面への参照によってより理解されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１Ａ〜Ｄ。ＥＳＣの亜集団は、神経分化を回避する。ＥＳＣは、ＰＡ６間質細胞との５日間の共培養によって神経分化にかけた。初期の分化は、最初の５日間で実行された。後期の分化は、細胞解離およびポリオルニチン上での再度の平板培養の後に誘導された。（図１Ａ）初期の分化の間のネスチンおよびベータ−ＩＩＩ−チューブリン発現のフローサイトメトリー分析。（図１Ｂ）初期の分化の間のネスチンおよびＯｃｔ−４発現のフローサイトメトリー分析。（図１Ｃ）ＥＳＣの初期および後期の分化の間のフローサイトメトリーによるＣＦＳＥ希釈液の分析。（図１Ｄ）分化中のＥＳＣにおける表現型分析およびＣＦＳＥ希釈液分析の組み合わせ。ＣＦＳＥ希釈液は、異なる亜集団について異なる時点で評価した：ネスチンポジティブ／ベータ−ＩＩＩ−チューブリンネガティブ（神経上皮細胞）、ネスチンネガティブ／ベータ−ＩＩＩ−チューブリンポジティブ（ニューロン細胞）、ネスチンネガティブ／ベータ−ＩＩＩ−チューブリンネガティブ（非神経細胞）。
【図２】図２Ａ〜Ｅ。個々の親ＥＳＣから誘導した子孫の変異性。（図２Ａ）１つのコロニーを１つの親ＥＳＣから誘導した実験装置において、細胞は、７２時間の分化後にネスチンおよびベータ−ＩＩＩ−チューブリンについて染色した。（図２Ｂ）ＥＳＣ−Ｔａｌｐｈａ−１−ＧＦＰは、７２時間、神経分化を受けさせ、緑色蛍光について分析した。（図２Ｃ）１５０のＥＳＣ誘導コロニーを、ＮｅｕＮポジティブ（成熟期ニューロン）、ＴＨポジティブ（ドーパミン作動性ニューロン）、およびベータ−ＩＩＩ−チューブリンポジティブ（ニューロン細胞）細胞の存在または不在について分析した。（図２Ｄ）、（図２Ｅ）ＥＳＣ−Ｈ２Ｂ−ｍＲＦＰ１は、神経分化を受けさせ、最初の２日間、生の画像化によってモニターした。
【図３】図３Ａ〜Ｂ。ＥＳＣ亜系におけるｍＲＮＡ発現プロファイル。全ｍＲＮＡ発現プロファイルを、個々のクローンＥＳＣ亜系に対して実行した。（図３Ａ）多能性および／または初期内部細胞塊に関連するｍＲＮＡの発現が確立された。（図３Ｂ）６８００の遺伝子の発現は、ＥＳＣクローンの間で著しく変動した。それぞれのクローンの遺伝子発現プロファイルに基づいて、ＥＳＣクローンを分類するために階層的クラスターを確立した。２つの最も異なるクローンは、クローン１および２であったが、クローン４および６は非常に類似した。
【図４】図４Ａ〜Ｄ。クローンＥＳＣは、神経形成性および心臓形成性の分化能を共有しない。（図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ）クローンＥＳＣは、ＰＡ６間質細胞上で共培養によって神経分化を受けさせた。（図４Ａ）ネスチンポジティブ神経上皮細胞を含むコロニーのパーセンテージを３日後に評価した。（図４Ｂ、図４Ｃ）ベータ−ＩＩＩ−チューブリンポジティブニューロン細胞（図４Ｂ）または（Ｃ）ＴＨポジティブドーパミン作動性ニューロンを含むコロニーのパーセンテージを、１週間後に評価した。（図４Ｄ）ＥＳＣクローン１、２、３、および４は、胚様体に向けて分化した。心臓分化は、異なる時点で、拍動する胚様体のパーセンテージによって評価した。
【図５】図５Ａ〜Ｈ。クローンＥＳＣは、同じ分化能を共有しない。ＥＳＣクローンは、胚様体に向けてインビトロにおいて分化し、異なる組織学的タイプおよび胚葉に特異的な遺伝子の発現について定量的ＰＣＲによって評価した。
【図６】図６Ａ〜Ｂ。Ｄ３  ＥＳＣ由来のクローン亜系は、細胞の多様性を確認する。全ｍＲＮＡ発現プロファイルを、個々のクローンＤ３亜系に対して実行した。（図６Ａ）多能性および／または初期内部細胞塊に関連するｍＲＮＡの発現が確立された。（図６Ｂ）Ｄ３亜系は、ＰＡ６間質細胞上で共培養によって神経分化を受けさせた。βＩＩＩ−チューブリン＋ニューロン細胞、ｎｅｕＮ＋成熟ニューロン、およびＴＨ＋ドーパミン作動性ニューロンを含むコロニーのパーセンテージは、１週間後に評価した。
【図７】図７Ａ〜Ｂ。ベータ−ＩＩＩ−チューブリンプロモーターの特異性。（図７Ａ）ＰＡ６間質細胞上でのＥＳＣ−Ｈ２Ｂ−ｍＲＦＰ１−βＩＩＩｐ−ＧＦＰの１週間の神経分化後の神経細胞におけるネスチンおよび（図７Ｂ）ベータ−ＩＩＩ−チューブリンに対する免疫蛍光法。
【図８】個々の親ＥＳＣから誘導した子孫の系統発生。系統樹は、図２において説明する画像から確立した。系統樹の５つの例を示す。
【図９】クローン１、２、６、および７における未同定誘導染色体（ｄｅｒ）の存在。標準的な核型は、継代１６で、クローン１、２、６、および７について実行した。染色体をＧバンド染色し、数え、高異数倍数性４１、ＸＹ優勢集団細胞において存在するさらなる染色体が示された（＊）。
【図１０】ＥＳＣクローン１および２の間で異なって発現される遺伝子の機能的な分類。経路は、ＭｅｔａＣｏｒｅを使用して同定した。チャートは、クローン１および２の間で３１１の異なって発現されたｍＲＮＡに基づくものとした。パーセンテージは、ＧＯの割り当てを有する遺伝子の総数と比較した、それぞれの経路において異なって発現された遺伝子の数を指す。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
例示的な実施形態の説明
本発明は、結果として生じる細胞集団の不均一性の低下をもたらす、多能性および多分化能性幹細胞からの神経細胞および心筋細胞の、制御された分化プロセスを含む。多能性幹細胞から分化させた細胞の不均一性は、治療上の適用のための細胞調製物の品質および純度を損ない、可能性としてレシピエント被験体にとって危険である。下記の実施例において示されるように、内部細胞塊（ＩＣＭ）および多能性のマーカーを発現するクローンＥＳＣ亜系は、樹立され、ある種のクローン亜系は、ある期間にわたって安定した別個の分化能を示すことが観察された。たとえば、外胚葉（たとえばニューロン）、内胚葉（たとえば肝細胞）、または中胚葉（たとえば筋細胞もしくは心筋細胞）の細胞系列への優先的な分化を示す、様々なクローン多能性幹細胞系が、樹立された。現在入手可能であるｉＰＳ細胞および／もしくは今後開発され得るｉＰＳを含む誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）またはＥＳＣは、改変された分化能を示すクローン多能性幹細胞系を作製するために使用されてもよい。したがって、本発明は、低下した不均一性およびしたがって、副作用についての可能性の低下と共に治療効果についてのより大きな可能性を有する細胞のクローン集団を提供するための方法を部分的に提供する。様々な実施形態では、本明細書において記載される方法を介して産生されるクローン多能性細胞系に由来する細胞は、試験化合物の薬理学的または毒物学的評価のために使用されてもよい。
【００５５】
Ａ．多能性および多分化能性細胞
多能性または多分化能性細胞の集団由来の細胞のクローン集団を提供するための方法は、本発明によって企図される。あらゆる多能性または多分化能性細胞が、本発明の方法において使用するために企図される。多能性幹細胞および多分化能性幹細胞の非限定的な例は、下記に議論される。
【００５６】
１．哺乳動物胚性幹細胞
哺乳動物胚性幹（ＥＳ）細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性細胞である。ＥＳ細胞は、発生中の胚の外側の栄養外胚葉層を除去し、次いで、非増殖性細胞のフィーダー層上で内部細胞塊を培養することによって単離することができる。適切な条件下で、増殖中の未分化ＥＳ細胞のコロニーが作製される。コロニーは、取り出し、個々の細胞に解離し、次いで、新鮮なフィーダー層上で再度平板培養することができる。再度平板培養された細胞は、増殖し続け、未分化ＥＳ細胞の新しいコロニーを作製することができる。次いで、新しいコロニーは、取り出し、解離させ、さらに再度平板培養し、成長するのを可能にすることができる。未分化ＥＳ細胞を「継代培養する」または「継代する」ためのこのプロセスは、未分化ＥＳ細胞を含有する細胞系を作製するために何度も繰り返すことができる（米国特許第５，８４３，７８０号；第６，２００，８０６号；第７，０２９，９１３号）。「初代細胞培養物」は、胚盤胞の内部細胞塊などのような組織から直接得られた細胞の培養物である。「継代培養物」は、初代細胞培養物に由来する任意の培養物である。
【００５７】
マウスＥＳ細胞を得るための方法は、周知である。ある方法では、マウスの１２９株由来の着床前の胚盤胞は、栄養外胚葉を除去するためにマウス抗血清を用いて処理され、内部細胞塊は、ウシ胎児血清を含有する培地において、化学的に不活性化されたマウス胚性線維芽細胞のフィーダー細胞層上で培養される。発生する未分化ＥＳ細胞のコロニーは、ＥＳ細胞の集団を作製するために、ウシ胎児血清の存在下においてマウス胚性線維芽細胞フィーダー層上で継代培養される。いくつかの方法では、マウスＥＳ細胞は、血清含有培養培地にサイトカイン白血病抑制因子（ＬＩＦ）を追加することによって、フィーダー層の非存在下において成長することができる（Ｓｍｉｔｈ、２０００年）。他の方法では、マウスＥＳ細胞は、骨形成タンパク質およびＬＩＦの存在下において無血清培地において成長することができる（Ｙｉｎｇら、２００３年）。
【００５８】
ヒトのＥＳ細胞は、先に記載される方法を使用して、胚盤胞から得ることができる（Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９５年；Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８年；ＴｈｏｍｓｏｎおよびＭａｒｓｈａｌｌ、１９９８年；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら、２０００年）。ある方法では、５日目のヒト胚盤胞は、ウサギ抗ヒト脾臓細胞抗血清に曝露され、次いで、栄養外胚葉細胞を溶解するためにモルモット補体の１：５希釈液に曝露される。無傷の内部細胞塊から、溶解した栄養外胚葉細胞を除去した後に、内部細胞塊は、ガンマ不活性化マウス胚性線維芽細胞のフィーダー層上でかつウシ胎児血清の存在下において培養される。９〜１５日間後に、内部細胞塊に由来する細胞の塊は、化学的に（つまり、トリプシンに曝露）または機械的に解離し、ウシ胎児血清およびマウス胚性線維芽細胞のフィーダー層を含有する新鮮な培地において再度平板培養することができる。さらなる増殖に際して、未分化形態を有するコロニーは、マイクロピペットによって選択され、機械的に解離して塊にし、再度平板培養される（米国特許第６，８３３，２６９号を参照されたい）。ＥＳ様の形態は、明らかに高い核対細胞質比および顕著な核小体を有する密度の高いコロニーとして特徴付けられる。結果として生じるＥＳ細胞は、簡潔なトリプシン処理によってまたはマイクロピペットによる個々のコロニーの選択によってルーチン的に継代することができる。いくつかの方法では、ヒトＥＳ細胞は、塩基性線維芽細胞増殖因子の存在下において線維芽細胞のフィーダー層上でＥＳ細胞を培養することによって血清を伴うことなく成長させることができる（Ａｍｉｔら、２０００年）。他の方法では、ヒトＥＳ細胞は、塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する「条件」培地の存在下においてＭａｔｒｉｇｅｌまたはラミニンなどのようなタンパク質マトリックス上で細胞を培養することによって、フィーダー細胞層を伴うことなく成長させることができる（Ｘｕら、２００１年）。培地は、線維芽細胞と共に共培養することによって先に条件付けられる。
【００５９】
アカゲザルおよび一般的なマーモセットのＥＳ細胞の単離のための方法もまた、公知である（ＴｈｏｍｓｏｎおよびＭａｒｓｈａｌｌ、１９９８年；Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９５年；ＴｈｏｍｓｏｎおよびＯｄｏｒｉｃｏ、２０００年）。
【００６０】
ＥＳ細胞の他の供給源は、樹立ＥＳ細胞系である。様々なマウス細胞系およびヒトＥＳ細胞系は、公知であり、それらの成長および増殖のための条件は、定義されている。たとえば、マウスＣＧＲ８細胞系は、マウス株１２９胚の内部細胞塊から樹立され、ＣＧＲ８細胞の培養物は、フィーダー層を伴わないでＬＩＦの存在下において成長することができる。さらなる例として、ヒトＥＳ細胞系Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、およびＨ１４は、Ｔｈｏｍｐｓｏｎらによって樹立された。さらに、Ｈ９系のサブクローンＨ９．１およびＨ９．２が開発された。当技術分野において公知の事実上いかなるＥＳ細胞系または幹細胞系も、たとえば、参照によって本明細書において組み込まれるＹｕおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ（２００８年）において記載されるものなどのように、本発明と共に使用されてもよいことが予想される。さらなるｉＰＳ細胞は、治療上、患者に投与され戻されてもよい細胞を作製するために被験体から樹立されてもよい。ｉＰＳ細胞は、したがって、テーラーメイド医療のために使用されてもよい。
【００６１】
本発明に関連して使用するためのＥＳ細胞の供給源は、胚盤胞、胚盤胞の内部細胞塊の培養に由来する細胞、または樹立細胞系の培養物から得られる細胞とすることができる。したがって、本明細書において使用されるように、用語「ＥＳ細胞」は、胚盤胞の内部細胞塊の細胞、内部細胞塊の培養物から得られるＥＳ細胞、およびＥＳ細胞系の培養物から得られるＥＳ細胞を指すことができる。
【００６２】
多能性細胞は、体のあらゆる細胞に分化することができる。ＥＳ細胞の多能性は、様々な方法において決定されてきた（Ｍａｒｔｉｎ、１９８２年）。ある試験では、胚盤胞の内部細胞塊に由来するマウスＥＳ細胞は、他の胚盤胞の腔に注射される。注射された胚盤胞は、偽妊娠雌マウスの子宮の中に置かれ、注射された胚盤胞細胞およびレシピエント胚盤胞細胞のキメラである子孫を産生する。他の試験では、マウスＥＳ細胞は、成体マウスに注射され、奇形腫と呼ばれる腫瘍を産生する。そのような腫瘍は、内胚葉、中胚葉、および外胚葉に由来する様々な細胞型を含有することができる。ある実施形態では、１つまたはそれより多くの奇形腫誘発性の細胞は、培養されてもよいまたは本発明に従って神経細胞もしくは神経系にコミットした細胞に分化できる。ヒトＥＳ細胞の多能性はまた、免疫不全マウスにおける奇形腫の形成によって試験することができる。第３の試験は、ＥＳ細胞がより特殊化した細胞に分化することを可能にするために培養条件を改変することである。たとえば、マウスＥＳ細胞は、フィーダー層を除去し、培養培地にＬＩＦを追加することによって、様々な細胞型に自発的に分化することができる。同様に、ヒトＥＳ細胞は、フィーダー層を除去し、浮遊液において非接着性表面上でＥＳ細胞を成長させることによって自発的に分化することができる（Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒら、２０００年；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら、２０００年；Ｒｏａｃｈら、１９９３年）。そのような条件下で、ＥＳ細胞は、ニューロンおよび心筋細胞の特徴を有する細胞を含有する胚様体と呼ばれる細胞凝集塊を形成することができる。これらの試験のすべてにおいて、ＥＳ細胞の多能性は、内胚葉、中胚葉、および外胚葉起源の細胞を生成するそれらの能力によって示される。
【００６３】
ＥＳ細胞は、それらが産生するタンパク質によって特徴付けることができる。たとえば、以下のマーカータンパク質は、ＥＳ細胞を特徴付けるために使用されてきた：段階特異的胚抗原ＳＳＥＡ−１、段階特異的胚抗原ＳＳＥＡ−３、段階特異的胚抗原ＳＳＥＡ−４、腫瘍拒絶抗原−１−６０（ＴＲＡ１−６０）、腫瘍拒絶抗原−１−８１（ＴＲＡ１−８１）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、および転写因子Ｏｃｔ−４。表１において示されるように、マウス、ヒト、および霊長動物細胞は、これらのマーカーの発現のそれらのパターンにおいて異なる。たとえば、ＳＳＥＡ−１は、ヒトまたはサルＥＳ細胞ではなく、マウスＥＳ細胞において発現されるが、ＴＲＡ１−６０は、マウスＥＳ細胞ではなく、ヒトおよびサルＥＳ細胞において発現される。
【００６４】
【表１】
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培養条件に依存して、ＥＳ細胞は、分化細胞または未分化細胞のコロニーを産生することができる。用語「分化する」は、発生経路に沿った細胞の進行を意味する。用語「分化した」は、他の細胞と比較した、発生経路に沿った細胞の進行を説明する相対的な用語である。たとえば、多能性細胞は、体のあらゆる細胞を誘発することができるが、造血細胞などのようなより分化した細胞は、より少ない細胞型を誘発する。本明細書において使用されるように、「未分化ＥＳ細胞」は、より特殊化した細胞の特徴を示さないＥＳ細胞を指す。
【００６５】
２．誘導多能性幹細胞
誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、ＥＳ細胞の特徴を有するが、分化体細胞の再プログラムによって得られる細胞である。誘導多能性幹細胞は、様々な方法によって得られてきた。ある方法では、成体ヒト皮膚線維芽細胞は、レトロウイルス形質導入を使用し、転写因子Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４を用いてトランスフェクトされる（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７年）。トランスフェクトされた細胞は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を補足した培地において、ＳＮＬフィーダー細胞（ＬＩＦを産生するマウス細胞線維芽細胞細胞系）上で平板培養される。およそ２５日間後に、ヒトＥＳ細胞コロニーに類似するコロニーが、培養中に現れる。ＥＳ細胞様のコロニーは、採集され、ｂＦＧＦの存在下においてフィーダー細胞上で増幅される。細胞の特徴に基づいて、ＥＳ細胞様のコロニーの細胞は、誘導多能性幹細胞である。誘導多能性幹細胞は、ヒトＥＳ細胞に形態学的に類似し、様々なヒトＥＳ細胞マーカーを発現する。また、ヒトＥＳ細胞の分化をもたらすことが公知の条件下で成長させた場合、誘導多能性幹細胞は、その結果、分化する。たとえば、誘導多能性幹細胞は、ニューロン構造物およびニューロンマーカーを有する細胞に分化することができる。事実上いかなるｉＰＳ細胞またはｉＰＳ細胞系も、たとえば、ＹｕおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ  （２００８年）において記載されるもの含めて、本発明と共に使用されてもよいことが予想される。
【００６６】
他の方法では、ヒト胎児線維芽細胞またはヒト新生児線維芽細胞は、レンチウイルス形質導入を使用し、４つの遺伝子、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８を用いてトランスフェクトされる（Ｙｕら、２００７年）。感染の１２〜２０日後に、ヒトＥＳ細胞形態を有するコロニーが、見て明らかになる。コロニーは、採集され、増幅される。コロニーを構成する誘導多能性幹細胞は、ヒトＥＳ細胞に形態学的に類似し、様々なヒトＥＳ細胞マーカーを発現し、マウスへの注射後に、神経組織、軟骨、および腸上皮を有する奇形腫を形成する。
【００６７】
マウス由来の誘導多能性幹細胞を調製するための方法もまた、知られている（ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ、２００６年）。ｉＰＳ細胞の誘導は、典型的に、Ｓｏｘファミリー由来の少なくとも１つのメンバーおよびＯｃｔファミリー由来の少なくとも１つのメンバーの発現またはそれへの曝露を必要とする。ＳｏｘおよびＯｃｔは、ＥＳ細胞の独自性を特定する転写調節階層の中心となると考えられる。たとえば、Ｓｏｘは、Ｓｏｘ−１、Ｓｏｘ−２、Ｓｏｘ−３、Ｓｏｘ−１５、またはＳｏｘ−１８であってもよく、Ｏｃｔは、Ｏｃｔ−４であってもよい。さらなる因子は、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４、またはｃ−Ｍｙｃのように、再プログラム効率を増加させてもよく、再プログラム因子の特定のセットは、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、および任意選択でＬｉｎ−２８を含むまたはＳｏｘ−２、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、および任意選択でｃ−Ｍｙｃを含むセットであってもよい。様々な実施形態では、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ−４、およびＳｏｘ−２は、ＥＳＣの多能性を誘導するおよび／または維持するために使用されてもよい。
【００６８】
３．体細胞核移植によって誘導される胚性幹細胞
ある実施形態では、多能性幹細胞は、体細胞核移植によって誘発される胚性幹細胞である。体細胞核移植では、ドナー核は、紡錘体なしの卵母細胞の中に移される。核移植によって産生される幹細胞は、ドナー核と遺伝子的に同一である。ある方法では、アカゲザルの皮膚線維芽細胞由来のドナー線維芽細胞核は、電気融合によって、紡錘体なしの成熟中期ＩＩアカゲザル卵母細胞の細胞質の中に導入される（Ｂｙｒｎｅら、２００７年）。融合された卵母細胞は、イオノマイシンへの曝露によって活性化され、次いで、胚盤胞段階までインキュベートされる。選択された胚盤胞の内部細胞塊は、次いで、培養され、胚性幹細胞系を産生する。胚性幹細胞系は、通常のＥＳ細胞形態を示し、様々なＥＳ細胞マーカーを発現し、インビトロまたｉｎ  ｖｉｖｏにおいて複数の細胞型に分化する。本明細書において使用されるように、用語「ＥＳ細胞」は、受精核を含有する胚に由来する胚性幹細胞を指す。ＥＳ細胞は、「体細胞核移植によって誘導される胚性幹細胞」と呼ばれる、核移植によって産生される胚性幹細胞と区別される。
４．神経幹細胞
神経幹細胞は、神経幹細胞（自己再生が可能）または神経細胞に最終的に分化するであろう細胞を誘発することができる、神経組織由来の未分化細胞である。神経幹細胞は、成体神経幹細胞または胚性神経幹細胞とすることができる。本明細書において使用されるように、用語「成体」神経幹細胞は、成体または小児由来かどうかに関わらず体細胞組織に由来する幹細胞を指す。ヒトおよび他の動物由来の成体および胚性神経幹細胞を単離するための方法は、周知である（ＲｉｅｔｚｅおよびＲｅｙｎｏｌｄｓ、２００６年；Ｓｖｅｎｄｓｅｎら、１９９９年）。
【００６９】
Ｂ．細胞培養
１．一般の細胞培養
当業者らに公知の多能性幹細胞および多分化能性幹細胞を培養するための任意の方法が、本発明の方法における包含のために企図される。細胞生物学、組織培養、および発生学における標準的な教科書および概説は、すべて、参照によって本明細書において組み込まれるＴｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  （１９８７年）；Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  （１９９３年）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  インビトロ  （１９９３年）；Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  （１９９８年）を含む。
【００７０】
組織培養において一般に使用される標準的な方法は、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  （１９８７年）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  （１９８７年）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９８７年＆１９９５年）において記載されている。
【００７１】
２．増殖培地
幹細胞培養のための様々な培地および培養条件が、当技術分野において公知である。ある態様では、細胞は、線維芽細胞などのようなフィーダー細胞を用いてまたは線維芽細胞条件培地において成長させてもよい。しかしながら、いくつかの実例では、幹細胞は、フィーダー細胞の非存在下において成長させることが好ましいことがある。いくつかの態様では、細胞は、ＴｅＳＲなどのような限定培地（たとえば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能なＭＴＥＳＲ．ＴＭ．１）において成長させてもよい（Ｌｕｄｗｉｇら、２００６ａ、米国特許出願第２００６／００８４１６８号）。そのような培地は、ＥＳ細胞の無血清培養のために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、培地は、必要な増殖因子を供給するために、ウシまたはヒト血清を補足される（Ｌｕｄｗｉｇら、２００６ｂ）。
【００７２】
たとえば、培養培地は，ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ  １６４０、ＧＭＥＭ、またはｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地とすることができる。培養培地は、血清を含有することができるまたは無血清培地とすることができる。無血清培地は、外因性の増殖因子の追加を伴うことなく使用することができるまたは塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インスリン様増殖因子−２（ＩＧＦ−２）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子８（ＦＧＦ８）、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、またはビタミンＣなどのような増殖因子を補足することができる。非接着性表面は、低接着組織培養プラスチックとすることができる。
【００７３】
第１の工程でのように、第２の工程の培養培地は、多能性幹細胞または神経幹細胞の成長を支持する任意の培地とすることができる。培地は、血清を含有することができるまたは増殖因子の追加を伴ってもしくは伴わないで、無血清培地とすることができる。同様に、細胞は、非接着性組織培養表面上で浮遊液において成長させることができる。
【００７４】
本発明のさらなる態様では、さらなる培地成分は、細胞が分離されるようになる場合（たとえば細胞集団の分割の間に）、幹細胞アポトーシスを低下させる分子などのように、幹細胞増殖培地中に含まれていてもよい。たとえば、培地は、Ｙ−２７６３２またはその誘導体などのような、１つまたはそれより多くのＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含んでいてもよい。いくつかの態様では、本発明の培地は、ＨＡ−１００またはその誘導体を含んでいてもよい。幹細胞増殖培地中に含まれていてもよい他のＲＯＣＫ阻害剤は、Ｈ−１１５２（（Ｓ）−（＋）−２−メチル−１−［（４−メチル−５−イソキノリニル）スルホニル］ホモピペラジン）を含む。Ｈ−１１５２は、ＨＡ−１００よりもおよそ１０倍大きな効力を示す。したがって、Ｈ−１１５２は、たとえば、約０．１〜１０μΜ、約０．５〜５μΜ、約１〜３μΜ、または約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、もしくは５μΜまたはその中で推論できる任意の範囲の濃度でＥＳ細胞成長培地中に存在してもよい。ある実施形態では、ＨＡ−１００は、約１μΜで、ＥＳ細胞増殖培地中に存在する。Ｈ−１１５２は、９６ウェルプレートにおける、個別化されたヒトＥＳ細胞の非常に効率的な接種を可能にする（ＨＡ−１００と同様であるが、１０分の１の濃度で）。他の場合には細胞集団で継代される個別化されたＨＥＳ細胞は、ウェル当たりより一定の細胞密度を可能にし、これは、細胞ベースの小分子スクリーニングのためのストリンジェントな必要条件となる。Ｈ−１１５２は、したがって、本発明に従って、自動細胞培養を含む、ＥＳ細胞ベースの小分子スクリーニングのためのプロトコールにおいて使用することができる。Ｈ−１１５２は、たとえば、参照によって本明細書において組み込まれるＩｋｅｎｏｙａら  （２００２年）およびＳａｓａｋｉら  （２００２年）において先に記載されている。
【００７５】
ＥＳ細胞増殖培地中に含まれていてもよい他のＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ−２７６３２、Ｎ−（４−ピリジル）−Ｎ’−（２，４，６−トリクロロフェニル）尿素、３−（４−ピリジル）−１Ｈ−インドール、グリシル−Ｈ１１５２（（Ｓ）−（＋）−２−メチル−４−グリシル−１−（４−メチルイソキノリニル−５−スルホニル）ホモピペラジン）、および／またはＨＡ１１００（ヒドロキシファスジル（Ｈｙｄｒｏｘｙｆａｕｓｄｉｌ））を含む。Ｙ−２７６３２（（Ｒ）−（＋）−トランス−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから市販で入手可能であり、先に記載されている（たとえばＭａｅｋａｗａら、１９９９年；Ｄａｖｉｅｓら、２０００年を参照されたい）。
【００７６】
３．細胞培養装置、系、および方法
いくつかの態様では、本発明は、バイオリアクター技術を利用してもよい。バイオリアクターにおける細胞の成長は、最終用途用にさらなる分化が可能な、十分に生物学的に活性な細胞の大規模生産を可能にする。バイオリアクターは、浮遊および足場依存性動物細胞培養の両方からの生物学的産物の生産のために広く使用されてきた。撹拌タンクバイオリアクターにおけるマイクロキャリア細胞培養は、非常に高度な体積特有の培養表面積を提供し、ウイルスワクチンの生産のために使用されてきた（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、１９８６年）。さらに、撹拌タンクバイオリアクターは、計量可能であることが産業的に証明されているが、そのような技術は、細胞が足場非依存性培養において成長し得る場合のみ、利用されてもよい。Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒによって製造されるマルチプレートＣＥＬＬＣＵＢＥ（商標）細胞培養システムもまた、非常に高度な体積特有の培養表面積を提供する。細胞は、コンパクトな立方体の形状をした、相互に密閉し合った培養プレートの両側で成長する。撹拌タンクバイオリアクターと異なり、ＣＥＬＬＣＵＢＥ（商標）培養ユニットは、使い捨てである。これは、使い捨てのシステムと関連する資本支出、品質管理、および品質保証の費用が削減されるために、臨床上の産物の早期の生産に非常に望ましい。
【００７７】
ａ．非灌流接着システム
従来より、足場依存性細胞培養物は、本明細書において記載されるように、小さなガラスまたはプラスチック容器の底で増殖させる。実験室規模に適している、典型的な従来の技術によって提供される制限された表面積対体積比は、大規模な細胞および細胞産物の生産においてボトルネックを引き起こした。小さな培養体積における細胞増殖のために大きな接触可能表面を提供するシステムを提供するための試みでは、多くの技術が提案されてきた：ローラーボトルシステム、スタックプレートプロパゲーター、スパイラルフィルムボトルシステム、中空繊維システム、充填ベッド、プレートエクスチェンジャーシステム、および膜チュービングリール。これらのシステムがそれらの性質において不均一であり、時に複数のプロセスに基づくので、それらは、以下の、スケールアップのための可能性の欠点による制限、細胞試料を採取する際の困難さ、重要なプロセスパラメーターを測定し、制御する可能性の制限、および培養の全体にわたって均一な環境条件を維持する際の困難さの影響を受ける。
【００７８】
これらの短所にもかかわらず、大規模足場依存性細胞生産のための一般に使用されるプロセスは、ローラーボトルである。大きな、異なった形状のＴ型フラスコと大差ないので、システムの単純性は、それを非常に信頼できるものにし、よって魅力的なものにする。１日当たり何千ものローラーボトルを操作し、したがって、他の場合に必要とされる極度の人間の操作と関連する混入の危険性および不整合性を排除することができる完全自動ロボットが、利用可能である。
【００７９】
ｂ．マイクロキャリア上での培養
従来の足場依存性培養プロセスの欠点を克服するために、ｖａｎ  Ｗｅｚｅｌ  （１９６７年）は、マイクロキャリア培養システムの概念を開発した。このシステムでは、細胞は、ゆっくりとした撹拌によって増殖培地中に浮遊させた小さな固体粒子の表面上で増殖させる。細胞は、マイクロキャリアに接着し、マイクロキャリア表面上で培養密度まで徐々に成長する。実際、この大規模培養システムは、単一ディスクプロセスから単層培養および浮遊培養の両方が統合された単位プロセスに、接着依存性の培養を改良する。したがって、細胞が成長するのに必要な表面を均一な浮遊培養の利点と組み合わせることにより、生産を増加させる。
【００８０】
ほとんどの他の足場依存性大規模培養方法に対するマイクロキャリア培養の利点は、数倍となる。第１に、マイクロキャリア培養は、高度な細胞密度収率および高度に濃縮された細胞産物を得る可能性を導く高度な表面積対体積比（キャリア濃度を変化させることによって可変）を提供する。培養物を灌流リアクターモードにおいて増殖させた場合、細胞収率は、１〜２＊１０７細胞／ｍｌとなる。第２に、細胞は、多くの小さな低生産性容器（つまりフラスコまたは皿）を使用する代わりに、１つの単位プロセス容器において増殖させることができる。これは、はるかによりよい栄養素利用率および培養培地の相当な節約をもたらす。さらに、単一のリアクターにおける増殖は、設備スペースの必要性および細胞当たりに必要とされる操作工程の数の削減を導き、したがって、労務費および混入の危険性を削減する。第３に、十分に混合される、均一なマイクロキャリア浮遊培養は、環境条件（たとえば、培地成分のｐＨ、ｐＯ２、および濃度）をモニターし、かつ制御するのを可能にし、したがって、より再現可能な細胞増殖および産物回収を導く。第４に、顕微鏡観察、化学分析、または計数のために代表試料を採取することが可能である。第５に、マイクロキャリアが、浮遊液から速やかに沈降するので、流加プロセスの使用または細胞の採取は、比較的容易に行うことができる。第６に、マイクロキャリア上での足場依存性培養増殖のモードは、このシステムを、タンパク質分解酵素の使用を伴わない細胞の移動、細胞の共培養、動物への移植、およびマイクロキャリア保持のためにデカンター、カラム、流動層、または中空繊維を使用する培養物の灌流などのような他の細胞の操作のために使用することを可能にする。第７に、マイクロキャリア培養は、浮遊液中での微生物および動物細胞の培養のために使用される従来の設備を使用して、比較的容易にスケールアップされる。
【００８１】
ｃ．哺乳動物細胞のマイクロカプセル化
哺乳動物細胞を培養するのに特に有用であることが示された１つの方法は、マイクロカプセル化である。哺乳動物細胞は、半透性ヒドロゲル膜の内部で保持される。多孔質膜は、細胞のまわりに形成され、カプセルを囲む大量の培地を用いる、栄養素、ガス、および代謝産物の交換を可能にする。緩やかで、迅速で、無毒性であるいくつかの方法が、開発されてきており、結果として生じる膜は、培養の期間を通じて、成長している細胞集団を保持するのに十分に多孔質であり、強い。これらの方法はすべて、カルシウム含有溶液との液滴接触によってゲル化される可溶性アルジネートに基づく。Ｌｉｍ（１９８２年、参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第４，３５２，８８３号）は、押し出されて、小さな開口部を通り、液滴を形成し、およそ１％の塩化カルシウム溶液の中に遊離する、アルギン酸ナトリウムのおよそ１％の溶液中で濃縮された細胞を記載する。次いで、液滴は、表面のアルジネートにイオン結合するポリアミノ酸の層に流し込まれる。最後に、アルジネートは、カルシウムイオンを除去するためにキレート剤中で液滴を処理することによって再液化される。他の方法は、アルジネート溶液の中に滴下され、したがって、中空のアルジネート球体を生成することとなるカルシウム溶液中の細胞を使用する。同様のアプローチは、アルジネートの中に滴下され、これもまた中空の球体を生成する、キトサン溶液中の細胞を含む。
【００８２】
マイクロカプセル化された細胞は、撹拌タンクリアクター中で、直径が１５０〜１５００μｍの範囲のビーズサイズで容易に増殖され、細かい網状のスクリーニングを使用して、灌流リアクター中で容易に保持される。総培地体積に対するカプセル体積の比は、１：２〜１：１０ほど密に維持することができる。１０８までの被膜内の細胞密度と共に、培養において有効な細胞密度は、１〜５＊１０７である。
【００８３】
他のプロセスに対するマイクロカプセル化の利点は、スパージングおよび撹拌から生じるずり応力の有害作用からの保護、灌流システムを使用する目的のためにビーズを容易に保持する能力、スケールアップが比較的簡単であること、ならびにビーズを埋め込みのために使用する能力を含む。
【００８４】
ｄ．灌流接着システム
灌流接着システムもまた、本発明の方法において使用するために企図される。灌流は、（生理的な栄養液の、）細胞の集団を通るまたはそれに対する、安定した速度での連続流動を指す。それは、回収された培地を用いて細胞を洗浄する連続流動培養とは対照的に、培養単位の範囲内での細胞の保持を包含する（たとえばケモスタット）。灌流についての考えは、今世紀の始めから公知であり、顕微鏡観察の延長のために、組織の小片を生存可能に保つために適用されてきた。この技術は、血液、リンパ液、または他の体液が継続的に細胞に供給されるｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞環境を模倣するために始められた。灌流を伴うことなく、培養中の細胞は、供給および欠乏の交互のフェーズを通り抜け、したがって、それらの成長および代謝潜在能力の完全な発現を制限する。
【００８５】
灌流培養の現行の使用は、高密度（つまり０．１〜５＊１０８細胞／ｍｌ）で成長している細胞についての課題に応じるものである。２〜４＊１０６細胞／ｍｌ超に密度を増加させるために、培地は、栄養不足を補い、毒性産物を除去するために、新鮮な供給物と絶えず交換しなければならない。灌流は、培養環境（ｐＨ、ｐＯ２、栄養素レベルなど）のはるかによい制御を可能にし、細胞接着のための培養物内で表面積の利用率を著しく増加させる手段である。
【００８６】
不織布のベッドマトリックスを使用する灌流充填ベッドリアクターの開発は、１０８細胞／ベッド体積ｍｌを超過する密度で灌流培養物を維持するための手段を提供した（ＣＥＬＬＩＧＥＮ（商標）、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｅｄｉｓｏｎ、Ｎ．Ｊ．）。概説すると、このリアクターは、足場依存性細胞および非足場依存性細胞の両方の培養のために改善されたリアクターを含む。リアクターは、内部の再循環を提供するための手段を有する充填ベッドとして設計されている。好ましくは、繊維マトリックスキャリアは、リアクター容器内のバスケット中に配置される。バスケットの上部および底部は、穴を有し、培地がバスケットを通って流れることを可能にする。特別に設計されたインペラーは、栄養素の一定の供給および廃棄物の除去を確実にするために、繊維マトリックスによって占められるスペースを通る培地の再循環を提供する。これは、同時に、無視できる量の総細胞集団が培地中に浮遊することを確実にする。バスケットおよび再循環の組み合わせはまた、繊維マトリックスを通る、酸素で処理された培地の泡のない流れを提供する。繊維マトリックスは、直径１０μｍ〜１００μｍの「細孔」を有する不織布であり、個々の細胞の体積の１〜２０倍に対応する細孔体積と共に高度な内部体積を提供する。
【００８７】
他の培養システムと比較して、このアプローチは、いくつかの著しい長所を有する。繊維マトリックスキャリアにより、細胞は、撹拌および発泡からの機械的ストレスから保護される。バスケットを通る自由な培地の流れは、最適に調節されたレベルの酸素、ｐＨ、および栄養素を細胞に提供する。産物は、継続的に培養物から取り出すことができ、採取された産物は、細胞がなく、続く精製工程を促進する低タンパク質培地中で作製することができる。また、このリアクターシステムの特有のデザインは、リアクターをスケールアップするためのより容易な方法を提供する。現在、３０リットルまでのサイズが、利用可能である。１００リットルおよび３００リットルのバージョンは、開発中であり、理論的な計算は、１０００リットルのリアクターまでを支持する。この技術は、ＷＯ  ９４／１７１７８において詳細に説明される（１９９４年８月４日、Ｆｒｅｅｄｍａｎら、その全体が参照によってこれによって組み込まれる）。
【００８８】
ＣＥＬＬＣＵＢＥ（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ）モジュールは、基体に接着した細胞の固定および成長のための大きなスチレン表面積を供給する。それは、隣接するプレートの間に薄い密閉された層流スペースを生み出すためにつながれた一連の並列の培養プレートを有する、全体にカプセル化された無菌で使い捨てのデバイスである。
【００８９】
ＣＥＬＬＣＵＢＥ（商標）モジュールは、対角線上に互いに向き合い、培地の流れを調節するのを助ける入口および出口のポートを有する。成長の最初の数日の間に、培養物は、最初の接種後にシステム内に含有される培地によって一般に満たされる。最初の接種および培地灌流の開始の間の時間は、接種する接種材料中の細胞の密度および細胞増殖速度に依存する。循環培地における栄養素濃度の測定値は、培養物のステータスの好適な指標となる。手順を確立する場合、最も経済的で生産的なオペレーティングパラメーターを決定するために、様々な異なる灌流量で栄養素組成をモニターすることが必要となり得る。
【００９０】
システム内の細胞は、従来の培養システムよりも高度な密度の溶液（細胞／ｍｌ）に達する。多くの典型的に使用される基本培地は、１〜２＊１０６細胞／ｍｌ／日を支持するように設計される。８５，０００ｃｍ２表面により実行される代表的なＣＥＬＬＣＵＢＥ（商標）は、モジュール内におよそ６Ｌの培地を含有する。細胞密度は、培養容器中で１０７細胞／ｍＬを超過することが多い。コンフルエンスでは、培地の２〜４リアクター分の体積が１日当たりに必要とされる。
【００９１】
ｅ．ＥＳ細胞の自動増幅のための装置／システム
本発明のある態様は、ＥＳ細胞などのような多能性または多分化能性細胞の自動増幅のための装置またはシステムを含む。例示的なデバイスは、生存可能なＥＳ細胞集団、インキュベーターと流体連結している液体ハンドラーユニット、および細胞分離のためのオペレーティングプログラムを含むコントローラーを含むことができる。
【００９２】
本発明の装置において使用されるＥＳ細胞集団は、当業者らに公知の任意の供給源由来のＥＳ細胞集団を含んでいてもよい。たとえば、ヒトＥＳＣなどのような胚性幹細胞を得るための方法は、米国特許第５，８４３，７８０号、第６，２００，８０６号、および第７，０２９，９１３号において先に記載されている。本明細書において使用される装置という用語は、単一のハウジングのデバイスに限定されず、たとえば電気的な、機械的な、または他の接続メカニズムを介して相互に連結される複数のデバイスを含んでいてもよいことが理解される。
【００９３】
様々なタイプの液体ハンドラーユニットが、市販で入手可能であり、たとえば、ある態様では、液体ハンドラーは、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＭＩＣＲＯＬＡＢ（登録商標）  ＳＴＡＲワークステーションまたはＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＢＩＯＭＥＫ（登録商標）  ２０００液体ハンドラー（Ｂ２Ｋ）などのようなロボットハンドラーであってもよい。ロボット液体ハンドラーに関して、米国特許第６，３２５，１１４号もまた、参照されたい。さらに他の態様では、液体ハンドラーは、ロボットアームを含まないが、むしろ、流体またはマイクロ流体液体ハンドラーなどのような、バルブの衝動作用および圧力勾配の適用によって液体を移動させるデバイスであってもよい。
【００９４】
多くのインキュベーターは、当技術分野において公知であり、本発明の実施形態に従って使用されてもよい。たとえば、ある実施形態では、インキュベーターは、Ｋｅｎｄｒｏ  ＣＹＴＯＭＡＴ（商標）インキュベーターであってもよい。
【００９５】
さらに、本発明のある実施形態における細胞増幅装置およびシステムは、幹細胞増幅の制御のためのコントローラーを含んでいてもよい。そのようなプログラムは、液体ハンドラーユニット、流体連結デバイス、および／またはインキュベーターと電子通信していてもよい。当業者は、ある態様では、オペレーティング装置またはシステムは、コンピューターまたはコンピューター読み取り可能な媒体中に含まれてもよいことを認識するであろう。
【００９６】
十分に理解されるように、オペレーティング装置は、コンピューター自動化の手段によって達成されてもよく、それによって、オペレーティング装置は、本発明のある実施形態を構成する様々なハードウェアデバイスに指示し、それを制御する。ハードウェアエレメントの統合を達成するために利用されてもよい例示的なオペレーティングプログラムは、ＯＶＥＲＬＯＲＤ（商標）統合ソフトウェアプログラム（Ｂｉｏｓｅｒｏ，  Ｉｎｃ．）であり、これは、機器の間の連絡を設定するために、単純なドラッグアンドドロップシステムを使用する。ソフトウェアはまた、数値変数および文字列変数、条件文、ならびにコントロールループなどのような一連のプログラムエレメントを可能にする。
【００９７】
任意選択で、本発明による装置は、インキュベーターおよび液体ハンドラーユニットの間の流体連結を促進する流体連結デバイスを含んでいてもよい。たとえば、液体ハンドラーがロボットハンドラーである場合では、流体連結デバイスは、液体ハンドラーユニットおよびインキュベーターの間で細胞のプレートを移動させるデバイスなどのようなロボットデバイスであってもよい。たとえば、ロボットデバイスは、Ｈｕｄｓｏｎ  Ｐｌａｔｅｃｒａｎｅ  ＸＬであってもよい。
【００９８】
さらに、多能性またはＥＳ細胞の増幅システムは、液体ハンドラーユニットのための試薬を含む、１つまたはそれより多くのレザバーを含んでいてもよい。たとえば、レザバーは、プロテイナーゼ阻害剤を有するまたは有していない細胞増殖培地；細胞培養プレート；タンパク質分解酵素溶液；リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）；および／またはピペットチップを含んでいてもよい。ある態様では、さらなるロボットデバイスは、液体ハンドラーデバイスおよびレザバーの間の連絡を促進するために使用されてもよい。ある実施形態では、レザバーは、任意選択でＲＯＣＫ阻害剤および／またはダイズトリプシン阻害剤などのようなプロテアーゼ阻害剤と共に、ＴｅＳＲ培地を含有していてもよい。他の実施形態では、レザバーは、タンパク質分解酵素（たとえばトリプシン、ＥＤＴＡなど）を含む溶液を含有していてもよい。
【００９９】
いくつかの態様では、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｓｔａｃｋｅｒ  Ｃａｒｏｕｓｅｌは、レザバー（たとえばプレートまたはピペットレザバー）および液体ハンドラーデバイスの間の連絡を促進するために使用されてもよい。レザバーは、冷蔵庫などのような温度制御ユニット中に収容されてもよい。温度制御ユニットは、所望の温度（たとえば約３７℃）まで溶液を予熱するために任意選択で加熱ユニットを含んでいてもよいが、本発明者らは、加熱ユニットが、単純な冷蔵庫のように、ある実施形態では必要ではないことを発見した。
【０１００】
４．集団からの個々細胞の単離
本発明の方法のある実施形態は、細胞の集団からの細胞の選択を含む。当業者らに公知のあらゆる方法は、細胞の集団から個々の細胞を単離するための方法として企図される。いくつかの実施形態では、フローサイトメトリーセルソーターを使用する典型的限界希釈アッセイ（９６ウェルプレートにおいて）は、集団から個々の細胞を単離するために利用される。
【０１０１】
多くのセルソーティング技術は、非心筋細胞系列細胞から心筋細胞系列細胞をソートするために利用可能である。それらのセルソーティング技術は、ネガティブ免疫選択およびポジティブ免疫選択を含むが、これらに限定されない。
【０１０２】
免疫選択は、選択システムの特異性が、抗体またはレクチンもしくはハプテンなどのような抗体様の分子によって与えられる様々な技術を包含する総称である。そのような特異性の例は、特異的な細胞表面抗原に対する抗体の親和性である。一般的な２つのタイプの免疫選択技術が、実施される。ネガティブ免疫選択は、本明細書における方法による、霊長動物多能性幹細胞の分化に起因する細胞集団からの非心筋細胞系列細胞の排除などのような、不均一な集団からの成分の特異的な亜集団の排除を含む。対照的に、ポジティブ免疫選択は、本明細書における方法による、霊長動物多能性幹細胞の分化に由来する心筋細胞系列細胞の直接的な選択および回収などのような、特異的な成分の直接的な選択および回収を指す。フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）、免疫磁気技術、抗体カラム、免疫沈降、およびイムノパニングを含むが、これらに限定されない様々なタイプの免疫選択は、本発明の実施において使用されてもよい。
【０１０３】
５．未分化の状態の維持
多能性および多分化能性細胞は、当業者らに公知の任意の方法によって未分化の状態で維持することができる。たとえば、未分化の状態は、血清およびフィーダー層の存在下において細胞を培養することによって維持されてもよい。たとえば、フィーダー層は、マウス胚性線維芽細胞であってもよい。未分化の状態において幹細胞を維持する他の方法もまた、公知である。たとえば、マウスＥＳ細胞は、フィーダー層を伴わないでＬＩＦの存在下において培養することによって、未分化の状態で維持することができる。しかしながら、マウスＥＳ細胞と異なり、ヒトＥＳ細胞は、ＬＩＦに応答しない。ヒトＥＳ細胞は、塩基性線維芽細胞増殖因子の存在下において線維芽細胞のフィーダー層上でＥＳ細胞を培養することによって（Ａｍｉｔら、２０００年）またはフィーダー層を伴うことなくかつ線維芽細胞条件培地および塩基性線維芽細胞増殖因子の存在下においてＭａｔｒｉｇｅｌもしくはラミニンなどのようなタンパク質マトリックス上で培養することによって（Ｘｕら、２００１年；米国特許第６，８３３，２６９号）、未分化の状態で維持することができる。
【０１０４】
多能性または多分化能性細胞の培養物は、集団における幹細胞およびそれらの誘導体の実質的な割合が、未分化の細胞の形態学的特質を示す場合、「未分化の」として記載され、胚または成体の起源の分化した細胞をそれらと明確に区別する。未分化のＥＳ細胞は、当業者らによって認識され、高度な核／細胞質比および顕著な核小体を有する細胞のコロニーにおいて二次元の顕微鏡視野に典型的に現れる。未分化の細胞のコロニーは、分化した隣接する細胞を有することができることが理解される。
【０１０５】
Ｃ．幹細胞の分化
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）などのような幹細胞および好ましくは分化因子（複数可）を提供する任意の細胞は、インビトロにおいて共培養される。これは、好ましくは、培養における胚細胞の増殖によって産生される胚細胞単層にｈＥＳ細胞を導入することを含む。胚細胞単層は、実質的なコンフルエンスまで成長させてもよく、幹細胞の特異的な細胞型への分化を誘導するのに十分な期間、胚細胞の細胞外培地の存在下において幹細胞を成長させる。その代わりに、幹細胞は、胚細胞（複数可）の存在下ではなく、胚細胞（複数可）の細胞外培地を含有する培養において成長させてもよい。胚細胞および幹細胞は、フィルターまたは寒天などのような無細胞マトリックスによって互いに分離されてもよい。
【０１０６】
幹細胞の分化のために、幹細胞は、胚細胞の単層上で平板培養され、幹細胞の分化を誘導するための培養において成長させてもよい。しかしながら、本発明の目的のために、幹細胞は、当業者らに公知の任意の方法によって、心筋細胞および心性前駆細胞に分化されてもよい。たとえば、アスコルビン酸は、分化を増強するために追加することができる。
【０１０７】
幹細胞成長のための最適条件からの段階的な離脱は、特異的な細胞型への幹細胞の分化を促進する。適した培養条件は、分化速度および／または効率を増加させることができる共培養におけるＤＭＳＯ、レチノイン酸、ＦＧＦ、またはＢＭＰの追加を含んでいてもよい。
【０１０８】
胚細胞層の細胞密度は、典型的に、その安定性および性能に影響する。ｈＥＳ細胞の心筋細胞分化を増強するための細胞培養培地は、アスコルビン酸またはその誘導体もしくは機能的等価物を含んでいてもよい。培地の濃度は、好ましくは、ｈＥＳ細胞にアスコルビン酸、その誘導体、または機能的等価物を送達するのに適した濃度である。濃度は、１０−３Ｍ〜１０−５Ｍの範囲であってもよい。より好ましくは、濃度は、１０−４Ｍである。あらゆるタイプの培養培地が、適しているが、それがｈＥＳ細胞を培養するのに適していることを条件とする。
【０１０９】
細胞培養培地は、無血清であってもよい。しかしながら、様々な濃度の血清が許容され、２０％〜０％の範囲であってもよい。血清濃度はまた、２０％、１０％、５％、２．５％、および０％を含む群から選択される濃度で提供されてもよい。
【０１１０】
本発明に従って、分化作用物質への未分化の哺乳動物幹細胞の曝露が、実行される。未分化幹細胞は、分化作用物質の存在下において一時、培養することができ、次いで、分化作用物質の非存在下において増殖させる。分化作用物質への曝露の結果が神経細胞、肝細胞、または心筋細胞への幹細胞の分化である限り、様々なこの基本的な手順が企図される。たとえば、第１の工程において、未分化幹細胞は、分化作用物質の存在下において非接着性表面上で浮遊液中で培養することができる。第２の工程において、適切な時間、分化作用物質に幹細胞を曝露させた後に、細胞は、新鮮な培養培地と共に、分化作用物質の存在において、非接着性表面上で、浮遊液中で培養することができる。第３の工程において、曝露させた細胞は、分化作用物質の非存在下において平板培養し、成長させることができる。細胞が約８０〜９０％の培養密度に達した場合、増殖中の細胞は、分割し、継代することができる。
【０１１１】
第１の工程において、培養培地は、幹細胞の生存および成長を支持する任意の培地とすることができる。たとえば、培養培地は，ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ  １６４０、ＧＭＥＭ、またはｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地とすることができる。培養培地は、血清を含有することができるまたは無血清培地とすることができる。無血清培地は、外因性の増殖因子の追加を伴うことなく使用することができるまたは塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インスリン様増殖因子−２（ＩＧＦ−２）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子８（ＦＧＦ８）、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、またはビタミンＣなどのような増殖因子を補足することができる。非接着性表面は、低接着組織培養プラスチックとすることができる。
【０１１２】
第１の工程でのように、第２の工程の培養培地は、幹細胞の成長を支持する任意の培地とすることができる。培地は、血清を含有することができるまたは増殖因子の追加を伴ってもしくは伴わないで、無血清培地とすることができる。同様に、細胞は、非接着性組織培養表面上で浮遊液において成長させることができる。
【０１１３】
第３の工程において、曝露された細胞は、血清を含有する培養培地において、増殖因子を有していない無血清培地において、またはｂＦＧＦ、ＩＧＦ−２、ＥＧＦ、ＦＧＦ８、Ｓｈｈ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、もしくはビタミンＣなどのような増殖因子を含有する無血清培地において、接着性表面上で平板培養することができる。接着性表面は、組織培養プラスチックとすることができるまたはポリオルニチン／ラミニン、ウシコラーゲンＩ、ヒト細胞外抽出物、ブタ皮膚ゼラチン、またはＭａｔｒｉｇｅｌによりコーティングされた組織培養プレートなどのようなコーティング組織培養表面とすることができる。細胞は、それらが培養密度、８０〜９０％の培養密度、または任意の他のレベルの培養密度に達する場合、継代することができる。細胞の凝集塊、単一細胞浮遊液、またはその両方は、平板培養することができる。継代のために細胞を調製するために、細胞は、たとえばピペット操作によって、接着性表面から機械的に取り出すことができるまたはトリプシン−ＥＤＴＡ、コラゲナーゼ、もしくはディスパーゼなどのようなプロテアーゼを用いる処理によって化学的に取り出すことができる。
【０１１４】
第１の工程、第２の工程、および第３の工程のあらゆる組み合わせが企図される。たとえば、ある手順では、第１の工程は、増殖因子を有していない無血清培地の使用を含むが、第２および第３の工程は、増殖因子を有する無血清培地の使用を含む。他の手順では、３つの工程はすべて、増殖因子を有する無血清培地の使用を含む。他の手順では、細胞が、第３の工程において平板培養される前に、培養培地の変化を伴うことなく分化作用物質に曝露されるように、第１および第２の工程は、組み合わせられる。
【０１１５】
分化作用物質の有効な濃度は、用量−応答分析によって決定することができる。分化作用物質は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などのような溶媒中に溶解することができ、次いで、ＥＳ細胞培養物に様々な濃度で追加することができる。
【０１１６】
当業者らに公知の任意の分化作用物質は、本発明の分化作用物質として企図される。たとえば、ドーパミン作動性細胞などのような神経形成性の細胞型への分化のために、適切な培地における、ＰＡ６フィーダー細胞上での共培養と共に、間質誘導誘発活性（ｓｔｒｏｍａｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）（ＳＤＩＡ）が、利用されてもよい。後期分化実験のために、共培養物は、酵素により解離され、ポリオルニチンコーティングガラスカバーガラス上で再度平板培養される。
【０１１７】
心筋細胞は、浮遊液中に生じる。ＥＳＣは、単一細胞レベルで解離され、それぞれの細胞は、胚様体と呼ばれる、限定培地中の浮遊構造を生じる。１週間後に、拍動している細胞を含有する胚様体のパーセンテージが、定量化される（肉眼的な評価）。ある実施形態では、アクチビンが、培養培地中に含まれる。ある実施形態では、分化中に使用されるアクチビンは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、またはアクチビンＣである。ある実施形態では、１つを超えるアクチビンが、使用されてもよい。ある実施形態では、ＴＧＦ−β、ノダル（ｎｏｄａｌ）、またはレフティーなどのような他のＴＧＦβスーパーファミリーメンバーは、本発明の方法において、アクチビンの代わりに置き換えられてもよいまたはそれに加えられてもよい。ある実施形態では、分化中に使用されるＢＭＰは、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、またはＢＭＰ−７である。ある実施形態では、ＢＭＰは、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、またはＢＭＰ−７以外のＢＭＰである（ＢＭＰ−１を除く）。ある実施形態では、１つを超えるＢＭＰが、使用されてもよい。
【０１１８】
分化中の細胞は、ＢＭＰ工程後に、アクチビンおよびＢＭＰの両方がない状態で培養されてもよい。ＩＧＦは、その培養工程において含まれていてもよい。いくつかのそれらの実施形態では、ＩＧＦは、１０ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ；または２５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ；または５０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれる。ある実施形態では、ＩＧＦは、１０ｎｇ／ｍｌ未満または５００ｎｇ／ｍｌを超える濃度で含まれる。ＩＧＦは、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２であってもよい。ある実施形態では、インスリンは、本発明の方法においてＩＧＦの代わりに置き換えられてもよい。
Ｄ．細胞の選択
１．神経前駆体細胞、神経細胞、およびグリア細胞の特徴付け
様々な量の分化作用物質への曝露後のＥＳ細胞培養物の分化の程度は、神経前駆体細胞および／または神経細胞において活性なプロモーター、遺伝子、およびタンパク質の発現を測定することによって決定することができる。たとえば、Ｔａ−１プロモーター、β３−チューブリン遺伝子およびタンパク質、ネスチン遺伝子およびタンパク質、ダブルコルチン遺伝子およびタンパク質、ビメンチン遺伝子およびタンパク質、ＮｅｕＮ遺伝子およびタンパク質、ＭＡＰ２遺伝子およびタンパク質の発現を分析することができる。用量−応答分析のための濃度の典型的な範囲は、１００ｎＭ〜１００ｎＭの分化作用物質である。
【０１１９】
分化作用物質への未分化幹細胞の曝露によって調製される分化細胞は、神経前駆体細胞としてのそれらのステータスを確認するために、形態学的に、免疫化学的に、および他の方法において特徴付けることができる。
【０１２０】
細胞は、多くの表現型の基準に従って特徴付けることができる。基準は、形態的特徴の顕微鏡観察、発現した細胞マーカーの検出または定量化、酵素活性、神経伝達物質およびそれらの受容体、ならびに電気生理学的機能を含むが、これらに限定されない。
【０１２１】
本発明において包含されるある種の細胞は、神経細胞またはグリア細胞の特徴である形態的特徴を有する。これらの特徴は、当業者らによって認識される。たとえば、ニューロンは、小さな細胞体および軸索を暗示する複数のプロセスおよび樹状突起を含む。
【０１２２】
神経細胞はまた、それらが特定の種類の神経細胞の表現型マーカー特徴を発現するかどうかに従って特徴付けることができる。対象のマーカーは、ａ）ニューロンの特徴であるβ３−チューブリン、微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ−２）、または神経細線維；ｂ）アストロサイト中に存在するグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）；ｃ）希突起膠細胞の特徴である２’，３’−環状ヌクレオチド３’−ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰａｓｅ）ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）またはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）；ｄ）未分化ＥＳ細胞の特徴であるＯｃｔ−４；ｅ）神経前駆体および他の細胞の特徴であるＰａｘ  ６およびネスチン；ｆ）中枢神経系を発生させる特徴であるＳｏｘ  １；ｇ）カテコールアミンニューロン中に存在するチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）；ｈ）ガンマ−アミノ酪酸を含有するニューロン中に存在するグルタミン酸デカルボキシラーゼ、アイソフォーム６７（ＧＡＤ６７）；ならびにｉ）中間の神経分化の特徴であるビメンチンを含むが、これらに限定されない。
【０１２３】
当技術分野において公知の組織特異的マーカーは、細胞表面マーカーについてのフローイムノサイトケミストリーおよび蛍光活性化セルソーター、細胞内または細胞表面マーカーについての免疫組織化学的検査（たとえば固定された細胞または組織切片の）、細胞抽出物のウエスタンブロット解析、ならびに細胞抽出物または培地に分泌された産物についての酵素結合免疫測定法などのような、任意の適した免疫学的技術を使用して検出することができる。抗原に結合している抗体は、標識を増幅するための、標識された二次抗体もしくは他のコンジュゲート（ビオチン−アビジンコンジュゲートなど）を使用する、細胞の固定後の、標準的な免疫細胞化学もしくはフローサイトメトリーアッセイまたは当技術分野において周知の他の免疫学的方法によって観察することができる。一般に、免疫複合体形成の検出は、当技術分野において周知であり、多数のアプローチの適用を通して達成されてもよい。これらの方法は、一般に、それらの放射性、蛍光性、生物学的、および酵素学的タグのいずれかなどのような標識またはマーカーの検出に基づく。そのような標識の使用に関する米国特許は、それぞれは、参照によって本明細書において組み込まれる第３，８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号；第３，９３９，３５０号；第３，９９６，３４５号；第４，２７７，４３７号；第４，２７５，１４９号、および第４，３６６，２４１号を含む。
【０１２４】
組織特異的遺伝子産物の発現はまた、ノーザンブロット解析もしくはドットブロットハイブリダイゼーション分析によってまたはそれぞれ、それらの全体が参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、および第４，８００，１５９号においてならびにＩｎｎｉｓら、１９８８年において詳細に記載される標準的な増幅方法において配列特異的なプライマーを使用する、逆転写酵素によって始められるポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によってｍＲＮＡレベルで検出することもできる。本開示において列挙される特定のマーカーについての配列データは、ＧｅｎＢＡＮＫなどのような公的なデータベースから得ることができる。タンパク質またはｍＲＮＡレベルで検出される組織特異的マーカーの発現は、レベルが、未分化ＥＳ細胞などのような対照細胞の少なくとも２倍、好ましくは１０または５０倍を超える場合、ポジティブであると考えられる。
【０１２５】
また、神経細胞、特に最終分化細胞の特徴は、神経伝達物質の生合成、放出、および再取り込みに関与する受容体および酵素ならびにシナプス伝達に関連する脱分極および再分極の事象に関与するイオンチャネルである。シナプス形成の証拠は、シナプトフィジンの染色によって得ることができる。ある種の神経伝達物質に対する受容性の証拠は、ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、グルタメート、ドーパミン、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）、ノルアドレナリン、アセチルコリン、およびセロトニンに対する受容体の検出によって得ることができる。
【０１２６】
神経細胞は、多くの表現型の基準に従って特徴付けることができる。基準は、形態的特徴の顕微鏡観察、発現した細胞マーカーの検出または定量化、酵素活性、神経伝達物質およびそれらの受容体、ならびに電気生理学的機能を含むが、これらに限定されない。
【０１２７】
本発明において包含されるある種の細胞は、神経細胞またはグリア細胞の特徴である形態的特徴を有する。これらの特徴は、当業者らによって認識される。たとえば、ニューロンは、小さな細胞体および軸索を暗示する複数のプロセスおよび樹状突起を含む。
【０１２８】
神経細胞はまた、それらが特定の種類の神経細胞の表現型マーカー特徴を発現するかどうかに従って特徴付けることができる。対象のマーカーは、ａ）ニューロンの特徴であるβ３−チューブリン、微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ−２）、または神経細線維；ｂ）アストロサイト中に存在するグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）；ｃ）希突起膠細胞の特徴である２’，３’−環状ヌクレオチド３’−ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰａｓｅ）ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）またはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）；ｄ）未分化ＥＳ細胞の特徴であるＯｃｔ−４；ｅ）神経前駆体および他の細胞の特徴であるＰａｘ  ６およびネスチン；ｆ）中枢神経系を発生させる特徴であるＳｏｘ  １；ｇ）カテコールアミンニューロン中に存在するチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）；ｈ）ガンマ−アミノ酪酸を含有するニューロン中に存在するグルタミン酸デカルボキシラーゼ、アイソフォーム６７（ＧＡＤ６７）；ならびにｉ）中間の神経分化の特徴であるビメンチンを含むが、これらに限定されない。
【０１２９】
本開示において列挙され、当技術分野において公知である組織特異的マーカーは、細胞表面マーカーについてのフローイムノサイトケミストリーおよび蛍光活性化セルソーター、細胞内または細胞表面マーカーについての免疫組織化学的検査（たとえば固定された細胞または組織切片の）、細胞抽出物のウエスタンブロット解析、ならびに細胞抽出物または培地に分泌された産物についての酵素結合免疫測定法などのような、任意の適した免疫学的技術を使用して検出することができる。抗原に結合している抗体は、標識を増幅するための、標識された二次抗体もしくは他のコンジュゲート（ビオチン−アビジンコンジュゲートなど）を使用する、細胞の固定後の、標準的な免疫細胞化学もしくはフローサイトメトリーアッセイまたは当技術分野において周知の他の免疫学的方法によって観察することができる。一般に、免疫複合体形成の検出は、当技術分野において周知であり、多数のアプローチの適用を通して達成されてもよい。これらの方法は、一般に、それらの放射性、蛍光性、生物学的、および酵素学的タグのいずれかなどのような標識またはマーカーの検出に基づく。そのような標識の使用に関する米国特許は、それぞれは、参照によって本明細書において組み込まれる第３，８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号；第３，９３９，３５０号；第３，９９６，３４５号；第４，２７７，４３７号；第４，２７５，１４９号、および第４，３６６，２４１号を含む。
【０１３０】
組織特異的遺伝子産物の発現はまた、ノーザンブロット解析もしくはドットブロットハイブリダイゼーション分析によってまたはそれぞれ、それらの全体が参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、および第４，８００，１５９号においてならびにＩｎｎｉｓら、１９８８年において詳細に記載される標準的な増幅方法において配列特異的なプライマーを使用する、逆転写酵素によって始められるポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によってｍＲＮＡレベルで検出することもできる。本開示において列挙される特定のマーカーについての配列データは、ＧｅｎＢＡＮＫなどのような公的なデータベースから得ることができる。タンパク質またはｍＲＮＡレベルで検出される組織特異的マーカーの発現は、レベルが、未分化ＥＳ細胞などのような対照細胞の少なくとも２倍、好ましくは１０または５０倍を超える場合、ポジティブであると考えられる。
【０１３１】
また、神経細胞、特に最終分化細胞の特徴は、神経伝達物質の生合成、放出、および再取り込みに関与する受容体および酵素ならびにシナプス伝達に関連する脱分極および再分極の事象に関与するイオンチャネルである。シナプス形成の証拠は、シナプトフィジンの染色によって得ることができる。ある種の神経伝達物質に対する受容性の証拠は、ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、グルタメート、ドーパミン、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）、ノルアドレナリン、アセチルコリン、およびセロトニンに対する受容体の検出によって得ることができる。
【０１３２】
胚性幹細胞（ＥＳ）を使用して神経分化を評価する場合、一般に、神経発生に関与する生理的細胞間相互作用を可能な限り厳密に模倣するのが望ましい。ヒトＥＳの気相／液相界面ベースの培養を含む方法は、本発明の方法において企図される。この培養システムは、追加の増殖因子の非存在下において三次元の細胞増幅および神経分化を可能にすることができる。ある実施形態では、その全体が参照によって組み込まれるＥｉｒａｋｕら  （２００８年）において記載されるものなどのような培養方法は、本発明により使用されてもよい。
【０１３３】
２．心筋細胞の特徴付け
分化についての細胞の特徴付けの先の方法のいずれも、心筋細胞への分化についての細胞を評価する際に適用することができる。ヒト胚性幹細胞は、心臓特異的筋節タンパク質およびイオンチャネルを発現する、拍動している筋細胞を形成するように、マウス臓側内胚葉（ＶＥ）様細胞と共に共培養されてもよい。この共培養法は、心筋細胞分化の誘導を可能にする。たとえばヒトＥＳ細胞を含む多能性ＥＳ細胞のＥＮＤ−２細胞との共培養は、様々な系列からの２つの特有の細胞型への広範囲な分化を誘導する。一方は、上皮であり、アルファ−フェトプロテインについてポジティブに染色される大きな嚢胞性の構造物を形成し、推測上、胚体外臓側内胚葉であり、他方は、高度な局所密度の領域に分類され、自発的に拍動する。これらの拍動している細胞は、心筋細胞である。心筋細胞分化に関するさらなる情報は、参照によって本明細書において明確に組み込まれる米国特許出願公開第２００８００３１８５７号、第２００８０１８７４９４号、および第２００７００１００１２号において見つけることができる。
【０１３４】
３．肝細胞の特徴付け
分化についての細胞の特徴付けの先の方法のいずれも、肝細胞への分化についての細胞を評価する際に適用することができる。インビトロにおける肝細胞への多能性幹細胞の分化を促進するための方法は、たとえば、Ｓａｎｃｈｏ−Ｂｒｕら  （２００９年）またはＺａｒｅｔら  （２００８年）において記載されるように、それらの分化を予防する因子の除去を含んでいてもよいおよび／また適切な増殖因子への曝露を通してのものであってもよい。ｉＰＳ細胞は、肝細胞に分化してもよく、組織置換または遺伝子療法のために使用されてもよい。肝臓の発生は、アクチビンＡへの曝露によってｉＰＳから始められてもよい。次いで、ＢＭＰ−４およびｂＦＧＦを用いるさらなる処理は、肝臓系列に向けて細胞を分化させることができる（たとえばＺａｒｅｔら  （２００８年）を参照されたい）。以前の研究により、ヒトｉＰＳ細胞がＥＳＣと同等の肝細胞系列分化潜在能力を有することが示されている（Ｓｉ−Ｔａｙｅｂら  （２０１０年）。肝細胞分化に関するさらなる情報は、参照によって本明細書において明確に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／００８６５２５号、第２０１０／０１２９３５１号、第２００５／００４２７５０号、第２０１０／０１４３３１３号、第２０１０／００８６９９９号、ＷＯ  ２０１０／０４９７５２Ａ１、およびＵＳ７４７３５５５において見つけることができる。
【０１３５】
Ｅ．スクリーニングの適用
本明細書において記載される方法によって作製される細胞はまた、発生の細胞生物学および分子生物学、機能ゲノム科学、ならびに治療上もしくは予防的な移植、治療、薬剤スクリーニング、またはインビトロにおける創薬において使用される分化細胞の生成を研究するために使用することができる。たとえば、細胞は、ゲノム解析のために、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはゲノムライブラリーを作製するために、ヒト化モノクローナル抗体を含むが、これらに限定されない特異的なポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体を作製するために（ＷＯ  ０１／５１６１６、参照によって本明細書において明確に組み込まれる）、または薬剤研究における医薬化合物などのような、それに由来する細胞もしくは組織に対する様々な試験化合物もしくは生物学的活性分子の効果をスクリーニングするために使用することができる。細胞はまた、培養中の神経細胞または心筋細胞の特徴およびこれらの細胞の分化に影響する因子（小分子薬剤、ペプチド、ポリヌクレオチド、およびその他同種のものなど）または条件（細胞培養条件もしくは操作など）をスクリーニングするために使用することもできる。
【０１３６】
本発明は、本発明の方法によって作製される神経細胞または心筋細胞において試験化合物を評価するための方法を含む。試験化合物は、それが、試験化合物との接触に起因する、細胞の表現型または活性の変化を誘導するかどうかについて評価されてもよい。これらのアッセイは、単一の試験化合物を試験することまたは候補物質の大きなライブラリーの無作為のスクリーニングを含んでいてもよい。その代わりに、アッセイは、ニューロンまたは神経性にコミットした細胞の機能をおそらく調整するであろうと考えられる構造の特質を考慮して選択される特定のクラスの化合物に集中するために使用されてもよい。ある実施形態では、試験化合物の毒性は、化合物を、人工神経組織を形成した細胞などのような（Ｓｃｈｍａｎｄｔら、２００５年）（たとえば、ヒト胚性幹細胞に由来する）、複数の神経細胞または神経性にコミットした細胞と接触させることによって評価されてもよい。ＥＮＴは、本発明による細胞の分化を介して産生されてもよいヒト胎児の脳のある種の層に類似している、胚性幹細胞（ＥＳ）に由来する組織の３次元の片である。毒性試験は、たとえば、ヒト患者などのような被験体への試験化合物の臨床上の投与前に、インビトロにおける薬剤スクリーニングプロセスの一部として利用されてもよい。
【０１３７】
様々な特質は、試験化合物が細胞において毒性をもたらすかどうか決定するために評価されてもよい。パラメーターは、たとえば細胞死（ネクローシス、アポトーシス）興奮毒性、細胞毒性、神経機能の改変（たとえば、活動電位または長期増強の生成の改変など）、脳受容体機能の改変、公知の毒性化合物を用いる攻撃に対する抵抗性の減少、シナプス毒性、発生神経毒性、または神経系列に特異的な毒性（たとえば希突起膠細胞、アストロサイト、もしくはドーパミン作動性ニューロンにおける）は、試験化合物が毒性または神経毒性をもたらすかどうかを決定するために細胞において評価されてもよい。電気生理学的技術は、神経活動または機能を検出するために使用されてもよい。シナプスマーカーの測定は、シナプス毒性を有する化合物を検出するために使用されてもよい。細胞は、発光または蛍光タンパク質などのようなレポーター遺伝子の発現を制御する、定義される系列（たとえば希突起膠細胞、ドーパミン作動性ニューロンなど）に特異的なプロモーターを含有するように操作されてもよく、このように、神経系列に特異的な毒性は、インビトロにおいてレポーター遺伝子の発現の変化によって、より容易に観察されてもよい。ある実施形態では、活性酸素種は、試験化合物が細胞の酸化ストレスの増加をもたらすかどうかを決定するために測定されてもよい。ある実施形態では、用量−応答関係は、試験化合物の毒性を評価するために生成されてもよい。ある実施形態では、発生的な神経毒性は、試験化合物および神経分化中の細胞をインキュベートすることによって評価されてもよい。
【０１３８】
複数の化合物または小分子ライブラリーの一部もしくはすべては、本発明に従って培養された細胞における毒性もしくは神経活性についてスクリーニングされてもよい。いくつかまたは本質的にすべての神経細胞または神経系にコミットした細胞は、試験化合物の毒性の評価前にドーパミン作動性細胞にさらに分化してもよく、これは、化合物のドーパミン作動性毒性を理解することが望ましい可能性のある実例において特に有用であり得る。
【０１３９】
本発明の培養および／または毒性試験方法は、自動化されてもよい。ある実施形態では、細胞を培養する工程、細胞を分化させる工程、および／または試験化合物の特性（たとえば毒性）を評価する工程と関連する１つまたはそれより多くの工程は、たとえば、細胞においてハイスループット毒性評価を促進するために、ロボット工学の使用を介して、自動化されてもよい。たとえば、様々なロボット工学は、細胞を培養するために、細胞に培地を追加するまたはそれから除去するために、本発明に従って分化させた神経細胞または神経性にコミットした細胞を含む培地に試験化合物を追加するために使用されてもよい。本発明の方法と共に使用されてもよい、特定のロボット工学は、所望されるようにより多くのまたは少ないウェルを使用することができるが、典型的に１２〜３８４ウェルの範囲のマルチウェルにおける細胞の自動標準化された配分を可能にする細胞ディスペンサー（たとえばＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．からのＭａｔｒｉｘ  ＷｅｌｌＭａｔｅ（商標））ならびにマルチウェルプレートへのライブラリー化合物の自動配分およびたとえば、ＩＣ５０の計算のための化合物の自動希釈を可能にする多チャネル液体ハンドラー（たとえばＣａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓからのＺｅｐｈｙｒ）を含む。
【０１４０】
化合物の毒性を評価するために、一般に、試験化合物の存在下および非存在下において細胞の機能および／または生存率が決定される。たとえば、方法は、一般に、
試験化合物を提供する工程；
本発明に従って産生された単離細胞または複数の細胞と試験化合物を混合する工程；
候補修飾因子が、工程（ｃ）における細胞（複数可）において、細胞の生存率または機能を改変するまたは破壊することができるかどうかを測定する工程；および
工程（ｃ）において測定された特徴を、当該候補修飾因子の非存在下における細胞（複数可）の特徴と比較する工程を含み、
測定された特徴の間の差異は、当該候補修飾因子が、細胞（複数可）に対する毒性に影響するまたはそれを示すことを示す。
【０１４１】
スクリーニングは、９６ウェルプレートなどのような１つまたはそれより多くのマルチウェルプレートを使用し、ハイスループットアッセイにおいて実行されてもよい。たとえば、ＥＮＴは、試験化合物（たとえば、小分子、タンパク質、ペプチド、抗体、推定上の治療薬）または複数の化合物（たとえば化合物バンク、小分子ライブラリー、ペプチドライブラリー、抗体ライブラリーなどからの）の神経毒性の可能性を研究するために、スクリーニングプラットフォームを確立するためにマルチウェルプレートにおいて産生されてもよい。試験化合物は、合成して産生されてもよいまたは天然の供給源から精製されてもよい。ＥＮＴを作製するおよび／または試験化合物の特性を評価するための方法は、自動化されてもよく、たとえば、マルチウェルプレートに化合物もしくは溶液を追加するもしくはそれから除去する工程、マルチウェルプレートにおいて発光もしくは蛍光を検出する工程、および／またはマルチウェルプレートにおいてＥＮＴを作製する工程は、たとえばロボット工学を介して自動化されてもよい。
【０１４２】
様々な実施形態では、試験化合物の組み合わせは、神経細胞、肝細胞、または心筋細胞への２、３、４、５、６、またはそれ以上の試験化合物の同時のまたは連続する適用が、特定の効果または毒性をもたらすかどうかを決定するために評価されてもよい。組織への複数の化合物の連続する投与は、所望されるように、数秒〜数時間、数週間、またはそれ以上の範囲であってもよい。たとえば、そのような実例では、互いに約１２〜２４時間以内に、より好ましくは、互いに約６〜１２時間以内に、細胞を両方のモダリティーと接触させてもよいことが企図される。しかしながら、それぞれの投与の間に数日間（２、３、４、５、６、または７）〜数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８）経過する場合、いくつかの状況では、治療の期間を著しく延長することは望ましい可能性がある。様々な組み合わせは、試験化合物「Ａ」および試験化合物「Ｂ」の間で利用されてもよい：
【０１４３】
【化１】
2013512671.tif 000003
他の実施形態では、試験化合物は、様々な神経組織または神経性にコミットした組織（複数可）と別々に接触させてもよい。
【０１４４】
この目的のために使用されてもよい特定の神経プロモーターは、たとえば、Ｔα１  α−チューブリンプロモーター（Ｔα１）およびβＩＩＩ−チューブリンプロモーターを含む。たとえば、ドーパミン作動性ニューロン特異的プロモーター（たとえばチロシンヒドロキシラーゼプロモーター）、シナプス特異的プロモーター（たとえばシナプシンＩプロモーター）、軸索特異的プロモーター（たとえばＭＡＰ２プロモーター）、および非神経特異的プロモーター（たとえばＣＮＰａｓｅ  ＩＩプロモーターによって評価される希突起膠細胞）を含む、特定の神経系列についての様々なプロモーターは、特定の細胞型における応答を評価するために使用されてもよい。用語「プロモーター」は、ＤＮＡ調節配列を含むヌクレオチド領域を指すためのその通常の意味で、本明細書において使用され、調節配列は、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流の（３’方向の）コード配列の転写を始めることができる遺伝子に由来する。
【０１４５】
ある実施形態では、多能性幹細胞は、神経細胞または神経性にコミットした細胞への幹細胞の分化を検出するために、２重レポーター系を用いてトランスフェクトされてもよい。２重レポーター系は、第１の発光または蛍光タンパク質を発現するためのニューロン特異的プロモーターを利用してもよく、第２のプロモーター（たとえばすべての細胞または第２の細胞型によって発現されるプロモーター）は、第２の発光または蛍光タンパク質の発現を駆動することができる。このように、神経マーカーの相対的な発現が、観察されてもよい。レポーター系は、たとえば、リポソームトランスフェクション、微粒子銃、またはレンチウイルストランスフェクションなどのようなウイルストランスフェクションを含む様々な技術を介して多能性細胞にトランスフェクトされてもよい。下記の実施例では、２重レポーター系は、Ｔα１プロモーターを介してのＦｉｒｅｆｌｙルシフェラーゼおよびＥＦ１−αショートプロモーター（ＥＦ１−αＳ）を介してのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの発現を観察するために使用される。
【０１４６】
蛍光タンパク質は、一般に、少なくとも３つのアミノ酸から形成される蛍光発色団を含み、典型的に、ｐ−ヒドロキシベンジリデン−イミダゾリジノン発色団を生成する環化反応によって特徴付けられる。発色団は、補欠分子族を含有していなくてもよく、選択的なエネルギーの光を放射することができ、エネルギーは、正確な波長（複数可）を含む外部の光源からの先の照明によって発色団中に保存されている。自発的に、蛍光タンパク質は、構造および発色団中に存在するアミノ酸の数において広く異なり得るが、発色団が、ｐ−ヒドロキシベンジリデン−イミダゾリジノン環構造を含むことを条件とする。いくつかの実例では、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質において見つけられ、Ｃｈａｌｆｉｅら（１９９４年）において記載されるものなどのようなβ−バレル構造を含んでいてもよい。蛍光タンパク質は、典型的に、タンパク質によって吸収される特定の波長の入射光に応じて、より長い波長の光を放射する能力を示す。蛍光活性化セルソーティングまたは（ＦＡＣＳ）は、ある実施形態において、１つまたはそれより多くのニューロン特異的マーカーの発現を検出するために使用されてもよい。本発明により使用されてもよいＦＡＣＳ製品、たとえばＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｓｏｎ）が、利用可能である。
【０１４７】
試験化合物は、天然に存在する化合物の断片もしくは一部を含んでいてもよいまたは他の場合には不活性である公知の化合物の活性な組み合わせとして見出されてもよい。動物、細菌、菌類、葉および樹皮を含む植物供給源ならびに海洋試料などのような天然の供給源から単離される化合物は、可能性として有用な医薬作用物質の存在についての候補としてアッセイされてもよいことが提案されている。スクリーニングされることとなる医薬作用物質はまた、化学組成物または人工の化合物から誘導するまたは合成することもできることが理解されよう。したがって、本発明によって同定される候補物質は、公知の阻害剤または刺激物質から開始されるラショナルドラッグデザインを通して設計されてもよいペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、小分子阻害剤、または任意の他の化合物であってもよいことが理解される。
【０１４８】
他の試験化合物は、アンチセンス分子、リボザイム、および抗体（単鎖抗体を含む）を含み、これらのそれぞれは、標的分子に対して特異的であろう。そのような化合物は、この文書において、よりいっそう詳細に別記される。たとえば、翻訳開始部位または転写開始部位に結合するアンチセンス分子またはスプライスジャンクションは、理想的な候補阻害剤となるであろう。薬理学的活性化合物に立体的に類似しているペプチド修飾因子または他の化合物のペプチドミメティックもまた、試験化合物として果たしてもよい。
【０１４９】
当然ながら、本発明のスクリーニング方法はすべて、毒性または他のいくつかの特性が、試験化合物においてまたはそれについて、観察されるかもしれないまたは観察されないかもしれないという事実にもかかわらず、それら自体、有用であることが理解されよう。
【０１５０】
Ｆ．組織工学および細胞療法
本発明はまた、細胞ベースの療法のための本発明の方法によって作製される神経細胞、肝細胞、または心筋細胞の使用をも企図する。疾患または外傷により実質的に損傷しているヒト組織を再生する能力は、成体において著しく衰えている。本明細書において開示される細胞は、細胞補充療法または組織再生のために哺乳動物被験体に投与されてもよいまたは移植されてもよい。その代わりに、本発明の細胞は、被験体に直接投与されてもよい。そのため、本開示の方法は、多くの疾患、外傷、または他の有害な状態の治療において有用であり得る。
【０１５１】
本発明の心筋細胞、肝細胞、または神経細胞は、３Ｄ組織工学によってヒトの体器官をモデル化するために使用することができる。たとえば、ヒトの脳における組織は、本明細書において記載される方法によって作製される神経細胞の３Ｄ培養によってモデル化することができる。同様に、心臓組織は、本発明の方法によって作製される心筋細胞から誘発され、再構築されてもよい。肝臓組織は、本発明の方法によって作製される肝細胞から誘発され、再構築されてもよい。本開示の神経細胞、肝細胞および心筋細胞はまた、たとえば、必要に応じて、細胞を遺伝子操作し、分化させ、遺伝子療法のためのドナーにおける標的部位に細胞または組織を送達することによってヒトの体の様々な部位に送達されることとなる様々な治療上活性な分子または遺伝子のためのキャリアビヒクルとして使用されてもよい。
【０１５２】
Ｇ．疾患の治療
他の態様では、本発明は、被験体における疾患を治療するための方法であって、本発明の方法によって作製される、有効量の神経細胞または心筋細胞を、疾患を有する被験体に投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ドーパミン作動性ニューロンは、神経系疾患または外傷を治療するために投与される。
【０１５３】
本発明が有効となってもよい神経変性疾患および障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、卒中、筋萎縮性側索硬化症（ルー  ゲーリッグ病）、前頭側頭型認知症（ピック病）、プリオン病、ハンチントン病、脳虚血、特発性パーキンソン病、局所的または薬剤誘導性パーキンソン症候群、異なる起源のアルツハイマー病および大脳の認知症症候群、ハンチントン舞踏病、ＡＩＤＳ脳症、クロイツフェルトヤコプ病、麻疹ウイルスおよびヘルペスウイルスによって誘導される脳症、ならびにボレリア症などのような感染誘導性神経変性障害、肝性、アルコール性、低酸素性、低血糖、または高血糖誘導性脳症および溶媒または医薬品によって誘導される脳症などのような代謝毒性神経変性障害、様々な起源の変性網膜障害、外傷誘導性脳および骨髄損傷、脊髄損傷、医薬、毒素、病毒、および薬剤の追加および／または除去後のなどのような、様々な起源の大脳過剰興奮性症状、精神また外傷誘導性大脳過剰興奮性状態、代謝、医薬、毒性、および伝染誘導性多発ニューロパシーおよび多発神経炎などのような末梢神経系の神経変性症候群、ならびに鎮咳気管支増幅性の作用を含むが、これらに限定されない。
【０１５４】
本発明が有効であってもよい肝疾患および障害は、肝炎、非アルコール性脂肪性肝疾患、肝硬変、肝臓癌、ウィルソン病、原発性硬化性胆管炎、原発性胆汁性肝硬変、小胆管の自己免疫疾患、バッド−キアリー症候群、ジルベール症候群、糖原病ＩＩ型、急性肝不全、アラジール症候群、アルファ−１アンチトリプシン欠損症、自己免疫性肝炎、胆道閉鎖症、糖原病、肝芽腫、肝細胞癌（肝癌）、進行性家族性肝内胆汁うっ滞（ＰＦＩＣ）、および尿素サイクル障害を含むが、これらに限定されない。
【０１５５】
１．医薬製剤
本発明の方法によって作製される神経細胞、肝細胞、または心筋細胞は、医薬組成物中に含まれていてもよい。細胞の医薬組成物は、当業者らに公知の任意の方法によって投与することができる。たとえば、投与は、神経系の損傷部位への直接的な注射によるものであってもよいまたは非経口的に、静脈内に、皮内に、筋肉内に、経皮的に、腹腔内に、もしくは鞘内に投与されてもよい。
【０１５６】
注射については、細胞の溶液は、水性溶媒中のものとする。注射用の使用に適している医薬形態は、無菌水溶液を含む。たとえば、キャリアは、水、エタノール、ポリオール（たとえばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、およびその他同種のもの）、その適した混合物、ならびに／または植物油を含有する溶媒または分散媒とすることができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、およびその他同種のものによってもたらすことができる。多くの場合では、等張剤、たとえば糖、塩化ナトリウムを含むことは好ましい。
【０１５７】
水溶液における非経口投与については、たとえば、溶液は、必要ならば、適宜緩衝されるべきであり、液体希釈剤は、最初に、十分な食塩水またはグルコースと等張にされるべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内投与にとりわけ適している。これに関連して、利用することができる無菌水性溶媒は、本発明の開示に照らして当業者らに公知となろう。投与の担当者は、少なくとも、個々の被験体に適切な用量を決定するであろう。
【０１５８】
本明細書において使用されるように、「キャリア」は、いずれかおよびすべての溶媒、分散培地、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝剤、キャリア溶液、懸濁剤、コロイド、ならびにその他同種のものを含む。医薬活性物質に対するそのような培地および作用物質の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の培地または作用物質が活性成分と不適合性である場合を除いて、治療用組成物におけるその使用は、企図される。補足活性成分もまた、組成物の中に組み込むことができる。
【０１５９】
語句「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」は、ヒトに投与された場合に、アレルギー反応または同様の好ましくない反応をもたらさない分子要素および組成物を指す。活性成分としてタンパク質を含有する水性組成物の調製は、当技術分野において十分に理解されている。典型的に、そのような組成物は溶液か懸濁剤のいずれかとして注射液として調製される；注射前の、液体中の溶液または懸濁剤に適している固体形態もまた、調製することができる。
【０１６０】
２．投与
神経系損傷の治療については、被験体は、本発明の細胞の薬学的有効量を投与される。投与のルートは、損傷の場所および性質に応じて、自然に変化し、また、たとえば、皮内、鞘内、中枢神経系への注射、心臓内、経皮的、非経口、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮下、経皮的、気管内、腹腔内、灌流、灌注、および直接的な注射を含むこととなる。
【０１６１】
細胞は、１回の用量または複数回の用量で与えることができる。適切な場合には、連続投与もまた、適用されてもよい。一般に、継続的な灌流を介しての治療用組成物の用量は、１回または複数回の注射から与えられるものと等価であり、灌流が行われる期間の間、調節される。投与される細胞の用量は、治療されている被験体、被験体の体重、投与の方法、および医師の判断に依存する。治療レジメンも同様に変化し、神経系損傷のタイプ、損傷の場所、疾患進行、ならびに患者の健康および年齢に依存することが多い。
【０１６２】
３．治療の組み合わせ
ある実施形態では、本発明の組成物および方法は、本発明の方法によって作製されるクローン細胞の投与および１つまたはそれより多くのさらなる療法を含む。そのような療法は、本発明のクローン細胞を用いる治療が企図される、任意の疾患の治療において適用することができる。たとえば、その疾患は、神経変性疾患、心血管疾患、肝疾患、または癌などのような過剰増殖疾患であってもよい。
【０１６３】
併用療法を含む方法および組成物は、治療または防護効果を増強するおよび／または他の療法の治療効果を増加させる。治療上および予防的な方法および組成物は、神経変性の治療または心血管疾患の治療などのような所望の効果を達成するのに有効な量の組み合わせで提供することができる。
【０１６４】
本発明のクローン細胞は、療法の副次的な形態の前に、その間に、その後に、またはそれに関連して様々な組み合わせで投与されてもよい。投与は、同時〜数分間〜数日間〜数週間の範囲の間隔であってもよい。各送達時の間で、かなりの期間にわたって期限切れにならなかったこと、それゆえ、２つの化合物が、患者に対して、好都合に組み合わせられた効果をなお及ぼすことができるであろうことが一般に保証されるだろう。細胞および副次的な療法は、互いに、約１２〜２４または７２時間以内に、より好ましくは、互いに、約６〜１２時間以内に投与されてもよい。いくつかの状況では、それぞれの投与の間に数日間（２、３、４、５、６、または７）〜数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８）経過する場合、治療の期間を著しく延長することは望ましい可能性がある。
【０１６５】
ある実施形態では、治療のコースは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０日、またはそれ以上続くことになる。一方の作用物質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、および／または９０日目、その任意の組み合わせに与えられてもよく、他方の作用物質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、および／もしくは９０日目またはその任意の組み合わせに与えられてもよいことが企図される。１日（２４時間）以内に、患者は１回または複数回の細胞（複数可）の投与が与えられてもよい。さらに、治療のコースの後、治療が投与されない期間があることが企図される。この期間は、彼らの予後、体力、健康などのような患者の状態に依存して、１、２、３、４、５、６、７日間および／または１、２、３、４、５週間および／または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２か月間またはそれ以上続いてもよい。
【０１６６】
様々な組み合わせが、利用されてもよい。下記の例について、本発明のクローン細胞は、「Ａ」として示され、療法の副次的な形態は、「Ｂ」とする：Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ  。
【０１６７】
患者への本発明の任意の化合物または療法の投与は、もしあれば作用物質の毒性を考慮に入れて、そのような化合物の投与のための一般的なプロトコールに従う。そのため、いくつかの実施形態では、併用療法に起因する毒性をモニターする工程がある。治療サイクルは、必要に応じて繰り返されることが期待される。様々な標準的な療法および外科的介入が、記載される療法と組み合わせて適用されてもよいこともまた、企図される。
【０１６８】
様々な実施形態では、本発明の方法によって誘導される細胞（たとえば心筋細胞、肝細胞、神経細胞、ドーパミン作動性ニューロンなど）は、免疫抑制薬と組み合わせて患者に投与されてもよい。他の実施形態では、本発明の細胞と組み合わせて免疫抑制薬を投与することは不必要であってもよい。たとえば、ｉＰＳ細胞は、被験体由来の細胞から産生されてもよく、所望の細胞型に続いて再分化されてもよく、次いで、これらの細胞は、被験体に、治療上、投与され戻されてもよい。細胞が被験体の細胞から誘導されたので、再分化細胞は、有害な免疫学的応答をほとんどまたはまったくもたらさない可能性がある。それにもかかわらず、様々な実施形態では、たとえば、患者が炎症性疾患または自己免疫疾患を有する場合、免疫抑制薬または抗炎症性化合物が患者に好都合に投与されてもよい。
【０１６９】
特定の態様では、標準的な副次的な療法は、薬物療法、化学療法、免疫療法、外科的療法、放射線療法、または遺伝子療法を含んでいてもよく、本明細書において記載されるクローン細胞と組み合わせて利用されてもよいことが企図される。下記は、薬物療法の副次的な形態の非限定的な例である。
【０１７０】
ａ．心血管薬
本発明において使用されてもよい薬理学的治療剤の非限定的な例は、抗高リポタンパク血症剤、抗動脈硬化剤、抗血栓／線維素溶解剤、血液凝固薬、抗不整脈薬、血圧降下剤、血管昇圧剤、うっ血性心不全のための治療剤、抗狭心症剤、抗菌剤、またはその組み合わせを含む。
【０１７１】
さらに、β−遮断薬が、本発明の実施例（以下を参照されたい）において使用されたので、以下のいずれも、心臓療法標的遺伝子の新しいセットを開発するために使用されてもよいことが注目されるべきである。これらの遺伝子の多くが部分的に重なっていることが期待されるが、おそらく新しい遺伝子標的を開発することができる。
【０１７２】
ある実施形態では、「抗高リポタンパク血症薬」として本明細書において公知である、１つまたはそれより多くの血中脂質および／またはリポタンパク質の濃度を低下させる作用物質の投与は、特に、血管組織のアテローム性動脈硬化症、肥大、または封鎖の治療において、本発明に従って心血管療法と組み合わせられてもよい。ある態様では、抗高リポタンパク血症剤は、アリールオキシアルカン／フィブリン酸誘導体、樹脂／胆汁酸捕捉剤、ＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、ニコチン酸誘導体、甲状腺ホルモンもしくは甲状腺ホルモンアナログ、種々の作用物質、またはその組み合わせを含んでいてもよい。
【０１７３】
アリールオキシアルカン／フィブリン酸誘導体の非限定的な例は、ベクロブレート、ベザフィブレート（ｅｎｚａｆｉｂｒａｔｅ）、ビニフィブレート、シプロフィブレート、クリノフィブレート、クロフィブレート（ａｔｒｏｍｉｄｅ−Ｓ）、クロフィブリン酸、エトフィブレート、フェノフィブレート、ゲムフィブロジル（ｌｏｂｉｄ）、ニコフィブレート、ピリフィブレート、ロニフィブレート、シンフィブレート、およびテオフィブレートを含む。
【０１７４】
樹脂／胆汁酸捕捉剤の非限定的な例は、コレスチラミン（ｃｈｏｌｙｂａｒ、ｑｕｅｓｔｒａｎ）、コレスチポール（ｃｏｌｅｓｔｉｄ）、およびポリデキシド（ｐｏｌｉｄｅｘｉｄｅ）を含む。
【０１７５】
ＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の非限定的な例は、ロバスタチン（ｍｅｖａｃｏｒ）、プラバスタチン（ｐｒａｖｏｃｈｏｌ）またはシンバスタチン（ｚｏｃｏｒ）を含んでいる。
【０１７６】
ニコチン酸誘導体の非限定的な例は、ニコチネート、アシピモックス、ニセリトロール、ニコクロネート、ニコモール、およびオキシニアシン酸を含む。
【０１７７】
甲状腺ホルモンおよびそのアナログの非限定的な例は、エトロキセート（ｅｔｏｒｏｘａｔｅ）、チロプロープ酸、およびチロキシンを含む。
【０１７８】
種々の抗高リポタンパク血症薬の非限定的な例は、アシフラン、アザコステロール、ベンフルオレックス、β−ベンザルブチルアミド、カルニチン、硫酸コンドロイチン、クロメストロン（ｃｌｏｍｅｓｔｒｏｎｅ）、デキストラン（ｄｅｔａｘｔｒａｎ）、デキストラン硫酸ナトリウム、５，８，１１，１４，１７−イコサペンタエン酸、エリタデニン、フラザボール、メグルトール、メリナミド、ミタトリエンジオール、オルニチン、γ−オリザノール、パンテチン、四酢酸ペンタエリスリトール、α−フェニルブチルアミド、ピロザジル、プロブコール（ｌｏｒｅｌｃｏ）、β−シトステロール、スルトシル酸ピペラジン塩、チアデノール、トリパラノール、およびキセンブシンを含む。
【０１７９】
抗動脈硬化薬の非限定的な例は、ピリジノールカルバメートを含む。
【０１８０】
ある実施形態では、血餅の除去または予防を支援する作用物質の投与は、特にアテローム性動脈硬化症および血管系（たとえば動脈性）封鎖の治療において、修飾因子の投与と組み合わせられてもよい。抗血栓および／または線維素溶解剤の非限定的な例は、抗凝血薬、抗凝血薬アンタゴニスト、抗血小板剤、血栓溶解剤、血栓溶解剤アンタゴニスト、またはその組み合わせを含む。
【０１８１】
ある態様では、たとえばアスピリンおよびワルファリン（ｃｏｕｍａｄｉｎ）などのような、経口的に投与することができる抗血栓剤は好ましい。
【０１８２】
抗凝血薬の非限定的な例、アセノクマロール、アンクロッド、アニシンジオン、ブロムインジオン、クロリンジオン、クメストロール（ｃｏｕｍｅｔａｒｏｌ）、シクロクマロール、デキストラン硫酸ナトリウム、ジクマロール、ジフェナジオン、ビスクマ酢酸エチル、エチリデンジクマロール、フルインジオン、ヘパリン、ヒルジン、リアポレートナトリウム（ｌｙａｐｏｌａｔｅ  ｓｏｄｉｕｍ）、オキサジジオン、ペントサンポリサルフェート、フェニンジオン、フェンプロクーモン、フォスビチン、ピコタミド、チオクロマロール、およびワルファリンを含む。
【０１８３】
抗血小板剤の非限定的な例は、アスピリン、デキストラン、ジピリダモール（ｐｅｒｓａｎｔｉｎ）、ヘパリン、スルフィンピラゾン（ａｎｔｕｒａｎｅ）、およびチクロピジン（ｔｉｃｌｉｄ）を含む。
【０１８４】
血栓溶解剤の非限定的な例は、組織プラスミノーゲン活性化因子（ａｃｔｉｖａｓｅ）、プラスミン、プロウロキナーゼ、ウロキナーゼ（ａｂｂｏｋｉｎａｓｅ）、ストレプトキナーゼ（ｓｔｒｅｐｔａｓｅ）、アニストレプラーゼ／ＡＰＳＡＣ（ｅｍｉｎａｓｅ）を含む。
【０１８５】
患者が出血または出血の可能性の増加に苦しんでいる実施形態では、血液凝固を増強してもよい作用物質が、使用されてもよい。血液凝固促進物質の非限定的な例は、血栓溶解剤アンタゴニストおよび抗凝血薬アンタゴニストを含む。
【０１８６】
抗凝血薬アンタゴニストの非限定的な例は、プロタミンおよびビタミンＫ１を含む。
【０１８７】
血栓溶解剤アンタゴニストの非限定的な例は、アミノカプロン酸（ａｍｉｃａｒ）およびトラネキサム酸（ａｍｓｔａｔ）を含む。抗血栓薬の非限定的な例は、アナグレリド、アルガトロバン、シロスタゾール、ダルトロバン、デフィブロタイド、エノキサパリン、ｆｒａｘｉｐａｒｉｎｅ、インドブフェン、ラモパラン（ｌａｍｏｐａｒａｎ）、オザグレル、ピコタミド、プラフィブリド、テデルパリン（ｔｅｄｅｌｐａｒｉｎ）、チクロピジン、およびトリフルサルを含む。
【０１８８】
抗不整脈剤の非限定的な例は、クラスＩ抗不整脈剤（ナトリウムチャネル遮断薬）、クラスＩＩ抗不整脈剤（β−アドレナリン遮断薬）、クラスＩＩ抗不整脈剤（再分極延長薬）、クラスＩＶ抗不整脈剤（カルシウムチャネル遮断薬）、および種々の抗不整脈剤を含む。
【０１８９】
ナトリウムチャネル遮断薬の非限定的な例は、クラスＩＡ、クラスＩＢ、およびクラスＩＣ抗不整脈剤を含む。クラスＩＡ抗不整脈剤の非限定的な例は、ジソピラミド（ｎｏｒｐａｃｅ）、プロカインアミド（ｐｒｏｎｅｓｔｙｌ）、およびキニジン（ｑｕｉｎｉｄｅｘ）を含む。クラスＩＢ抗不整脈剤の非限定的な例は、リドカイン（ｘｙｌｏｃａｉｎｅ）、トカイニド（ｔｏｎｏｃａｒｄ）、およびメキシレチン（ｍｅｘｉｔｉｌ）を含む。クラスＩＣ抗不整脈剤の非限定的な例は、エンカイニド（ｅｎｋａｉｄ）およびフレカイニド（ｔａｍｂｏｃｏｒ）を含む。
【０１９０】
他にβ−アドレナリン遮断薬、β−アドレナリンアンタゴニスト、またはクラスＩＩ抗不整脈剤として公知であるベータ遮断薬の非限定的な例は、アセブトロール（ｓｅｃｔｒａｌ）、アルプレノロール、アモスラロール、アロチノロール、アテノロール、ベフノロール、ベタキソロール、ベバントロール、ビソプロロール、ボピンドロール、ブクモロール、ブフェトロール、ブフラロール、ブニトロロール、ブプラノロール、ブチドリンハイドロクロライド、ブトフィロロール、カラゾロール、カルテオロール、カルベジロール、セリプロロール、セタモロール、クロラノロール、ジレバロール、エパノロール、エスモロール（ｂｒｅｖｉｂｌｏｃ）、インデノロール、ラベタロール、レボブノロール、メピンドロール、メチプラノロール、メトプロロール、モプロロール、ナドロール、ナドキソロール、ニフェナロール（ｎｉｆｅｎａｌｏｌ）、ニプラジロール、オクスプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、プラクトロール、プロネタロール、プロパノロール（ｉｎｄｅｒａｌ）、ソタロール（ｂｅｔａｐａｃｅ）、スルフィナロール、タリノロール、テルタトロール、チモロール、トリプロロール、ならびにキシビノロール（ｘｉｂｉｎｏｌｏｌ）を含む。ある態様では、ベータ遮断薬は、アリールオキシプロパノールアミン誘導体を含む。アリールオキシプロパノールアミン誘導体の非限定的な例は、アセブトロール、アルプレノロール、アロチノロール、アテノロール、ベタキソロール、ベバントロール、ビソプロロール、ボピンドロール、ブニトロロール、ブトフィロロール、カラゾロール、カルテオロール、カルベジロール、セリプロロール、セタモロール、エパノロール、インデノロール、メピンドロール、メチプラノロール、メトプロロール、モプロロール、ナドロール、ニプラジロール、オクスプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、プロパノロール、タリノロール、チモロール、およびトリプロロールを含む。
【０１９１】
クラスＩＩＩ抗不整脈剤としても公知である、再分極を延長する作用物質の非限定的な例は、アミオダロン（ｃｏｒｄａｒｏｎｅ）およびソタロール（ｂｅｔａｐａｃｅ）を含む。
【０１９２】
他にクラスＩＶ抗不整脈剤として公知であるカルシウムチャネル遮断薬の非限定的な例は、アリールアルキルアミン（たとえばベプリジル（ｂｅｐｒｉｄｉｌｅ）、ジルチアゼム、フェンジリン、ガロパミル、プレニルアミン、テロジリン、ベラパミル）、ジヒドロピリジン誘導体（フェロジピン、イスラジピン、ニカルジビン、ニフェジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン）ピペラジン（ｐｉｐｅｒａｚｉｎｄｅ）誘導体（たとえばシンナリジン、フルナリジン、リドフラジン）、またはベンシクラン、エタフェノン、マグネシウム、ミベフラジル、もしくはペルヘキシリンなどのような種々のカルシウムチャネル遮断薬を含む。ある実施形態では、カルシウムチャネル遮断薬は、長時間作用性のジヒドロピリジン（ニフェジピンタイプ）カルシウムアンタゴニストを含む。
【０１９３】
種々の抗不整脈剤の非限定的な例は、アデノシン（ａｄｅｎｏｃａｒｄ）、ジゴキシン（ｌａｎｏｘｉｎ）、アセカイニド、アジュマリン、アモプロキサン、アプリンジン、プレチリウムトシレート、ブナフチン、ブトベンジン、カポベン酸、シフェンリン、ジソピラミド、ヒドロキニジン、インデカイニド、臭化イプラトロピウム、リドカイン、ロラジミン、ロルカイニド、メオベンチン、モリシジン、ピルメノール、プラジュマリン、プロパフェノン、ピリノリン、ポリガラクツロン酸キニジン、硫酸キニジン、およびビキジルを含む。
【０１９４】
血圧降下剤の非限定的な例は、交感神経抑制薬、アルファ／ベータ遮断薬、アルファ遮断薬、抗アンギオテンシンＩＩ剤、ベータ遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、血管増幅薬、および種々の抗高血圧薬を含む。
【０１９５】
α−アドレナリン遮断薬またはα−アドレナリンアンタゴニストとしても公知であるアルファ遮断薬の非限定的な例は、アモスラロール、アロチノロール、ダピプラゾール、ドキサゾシン、メシル酸エルゴロイド、フェンスピリド、インドラミン、ラベタロール、ニセルゴリン、プラゾシン、テラゾシン、トラゾリン、トリマゾシン、およびヨヒンビンを含む。ある実施形態では、アルファ遮断薬は、キナゾリン誘導体を含んでいてもよい。キナゾリン誘導体の非限定的な例はアルフゾシン、ブナゾシン、ドキサゾシン、プラゾシン、テラゾシン、およびトリマゾシンを含む。
【０１９６】
ある実施形態では、血圧降下剤は、アルファおよびベータアドレナリンアンタゴニストの両方である。アルファ／ベータ遮断薬の非限定的な例は、ラベタロール（ｎｏｒｍｏｄｙｎｅ、ｔｒａｎｄａｔｅ）を含む。
【０１９７】
抗アンギオテンシンＩＩ剤の非限定的な例は、アンギオテンシン変換酵素阻害剤およびアンギオテンシンＩＩ受容体アンタゴニストを含む。アンギオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥ阻害剤）の非限定的な例は、アラセプリル、エナラプリル（ｖａｓｏｔｅｃ）、カプトプリル、シラザプリル、デラプリル、エナラプリラト、ホシノプリル、リシノプリル、モベルトプリル（ｍｏｖｅｌｔｏｐｒｉｌ）、ペリンドプリル、キナプリル、およびラミプリルを含む。アンギオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、ＡＮＧ受容体遮断薬、またはＡＮＧ−ＩＩ  １型受容体遮断薬（ＡＲＢＳ）としても公知であるアンギオテンシンＩＩ受容体遮断薬の非限定的な例は、アンジオカンデサルタン（ａｎｇｉｏｃａｎｄｅｓａｒｔａｎ）、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、およびバルサルタンを含む。
【０１９８】
交感神経遮断薬の非限定的な例は、中枢性交感神経遮断薬または末梢性交感神経遮断薬を含む。中枢神経系（ＣＮＳ）交感神経遮断薬として公知である中枢性交感神経遮断薬の非限定的な例は、クロニジン（ｃａｔａｐｒｅｓ）、酢酸グアナベンズ（ｗｙｔｅｎｓｉｎ）グアンファシン（ｔｅｎｅｘ）、およびメチルドパ（ａｌｄｏｍｅｔ）を含む。末梢性交感神経遮断薬の非限定的な例は、神経節遮断剤、アドレナリン作動性ニューロン遮断剤、β−アドレナリン遮断剤、またはアルファ１アドレナリン遮断剤を含む。神経節遮断剤の非限定的な例は、メカミルアミン（ｉｎｖｅｒｓｉｎｅ）およびトリメタファン（ａｒｆｏｎａｄ）を含む。アドレナリン作動性ニューロン遮断剤は、非限定的に、グアネチジン（ｉｓｍｅｌｉｎ）およびレセルピン（ｓｅｒｐａｓｉｌ）を含む。β−アドレナリン遮断薬の非限定的な例は、アセブトロール（ａｃｅｎｉｔｏｌｏｌ）（ｓｅｃｔｒａｌ）、アテノロール（ｔｅｎｏｒｍｉｎ）、ベタキソロール（ｋｅｒｌｏｎｅ）、カルテオロール（ｃａｒｔｒｏｌ）、ラベタロール（ｎｏｒｍｏｄｙｎｅ、ｔｒａｎｄａｔｅ）、メトプロロール（ｌｏｐｒｅｓｓｏｒ）、ナダノール（ｎａｄａｎｏｌ）（ｃｏｒｇａｒｄ）、ペンブトロール（ｌｅｖａｔｏｌ）、ピンドロール（ｖｉｓｋｅｎ）、プロプラノロール（ｉｎｄｅｒａｌ）、およびチモロール（ｂｌｏｃａｄｒｅｎ）を含む。アルファ１アドレナリン遮断薬の非限定的な例は、プラゾシン（ｍｉｎｉｐｒｅｓｓ）、ドキサゾシン（ｃａｒｄｕｒａ）、およびテラゾシン（ｈｙｔｒｉｎ）を含む。
【０１９９】
ある実施形態では、心血管治療剤は、血管増幅薬（たとえば脳血管増幅薬、冠血管増幅薬、または末梢血管増幅薬）を含んでいてもよい。ある好ましい実施形態では、血管増幅薬は、冠血管増幅薬を含む。冠血管増幅薬の非限定的な例は、アモトリフェン、ベンダゾール、ベンフロジルヘミスクシネート、ベンズヨーダロン、クロラシジン（ｃｈｌｏｒａｃｉｚｉｎｅ）、クロモナール、クロベンフロール、クロニトレート、ジラゼブ、ジピリダモール、ドロプレニラミン、エフロキサート、四硝酸エリトリチル（ｅｒｙｔｈｒｉｔｙｌ  ｔｅｔｒａｎｉｔｒａｎｅ）、エタフェノン、フェンジリン、フロレジル、ガングレフェン、ヘレストロール（ｈｅｒｅｓｔｒｏｌ）ビス（β−ジエチルアミノエチルエーテル）、ヘキソベンジン、イトラミントシレート、ケリン、リドフラジン（ｌｉｄｏｆｌａｎｉｎｅ）、マンニトールヘキサニトレン（ｈｅｘａｎｉｔｒａｎｅ）、メジバジン、ニトログリセリン（ｎｉｃｏｒｇｌｙｃｅｒｉｎ）、四硝酸ペンタエリスリトール、ペントリニトロール、ペルヘキシリン、トラピジル、トリクロミル、トリメタジジン、リン酸トロルニトレート、およびビスナジンを含む。
【０２００】
ある態様では、血管増幅薬は、慢性療法血管増幅薬または高血圧緊急症血管増幅薬を含んでいてもよい。慢性療法血管増幅薬の非限定的な例は、ヒドララジン（ａｐｒｅｓｏｌｉｎｅ）およびミノキシジル（ｌｏｎｉｔｅｎ）を含む。高血圧緊急症血管増幅薬の非限定的な例は、ニトロプルシド（ｎｉｐｒｉｄｅ）、ジアゾキシド（ｈｙｐｅｒｓｔａｔ  ＩＶ）、ヒドララジン（ａｐｒｅｓｏｌｉｎｅ）、ミノキシジル（ｌｏｎｉｔｅｎ）、およびベラパミルを含む。
【０２０１】
種々の抗高血圧薬の非限定的な例は、アジュマリン、γ−アミノ酪酸、ブフェニド、シクレタニン（ｃｉｃｌｅｔａｉｎｉｎｅ）、シクロシドミン、タンニン酸クリプテナミン、フェノルドパム、フロセキナン、ケタンセリン、メブタメート、メカミルアミン、メチルドパ、メチル４−ピリジルケトンチオセミカルバゾン、ムゾリミン、パルギリン、ペンピジン、ピナシジル、ピペロキサン、プリマペロン、プロトベラトリン、ラウバシン、レシメトール、リルメニジン（ｒｉｌｍｅｎｉｄｅｎｅ）、サララシン、ニトロプルシドナトリウム、チクリナフェン、カンシル酸トリメタファン、チロシナーゼ、およびウラピジルを含む。
【０２０２】
ある態様では、抗高血圧薬は、アリールエタノールアミン誘導体、ベンゾチアジアジン誘導体、Ｎ−カルボキシアルキル（ペプチド／ラクタム）誘導体、ジヒドロピリジン誘導体、グアニジン誘導体、ヒドラジン／フタラジン、イミダゾール誘導体、第四アンモニウム化合物、レセルピン誘導体、またはスルホンアミド（ｓｕｆｌｏｎａｍｉｄｅ）誘導体を含んでいてもよい。
【０２０３】
アリールエタノールアミン誘導体の非限定的な例は、アモスラロール、ブフラロール、ジレバロール、ラベタロール、プロネタロール、ソタロール、およびスルフィナロールを含む。
【０２０４】
ベンゾチアジアジン誘導体の非限定的な例はアルチジド（ａｌｔｈｉｚｉｄｅ）、ベンドロフルメサイアザイド、ベンズチアジド、ベンチルヒドロクロロチアジド、ブチアジド、クロロサイアザイド、クロルサリドン、シクロペンチアジド、シクロチアジド、ジアゾキシド、エピサイアザイド、エチアジド、フェンキゾン、ヒドロクロロチアジド（ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｏｔｈｉｚｉｄｅ）、ヒドロフルメチアジド（ｈｙｄｒｏｆｌｕｍｅｔｈｉｚｉｄｅ）、メチクロチアジド、メチクラン、メトラゾン、パラフルチジド、ポリチジド（ｐｏｌｙｔｈｉｚｉｄｅ）、テトラクロルメチアジド、およびトリクロルメチアジドを含む。
【０２０５】
Ｎ−カルボキシアルキル（ペプチド／ラクタム）誘導体の非限定的な例は、アラセプリル、カプトプリル、シラザプリル、デラプリル、エナラプリル、エナラプリラト、ホシノプリル、リシノプリル、モベルチプリル、ペリンドプリル、キナプリル、およびラミプリルを含む。
【０２０６】
ジヒドロピリジン誘導体の非限定的な例は、アムロジン、フェロジピン、イスラジピン、ニカルジビン、ニフェジピン、ニルバジピン、ニソルジピン、およびニトレンジピンを含む。
【０２０７】
グアニジン誘導体の非限定的な例は、ベタニジン、デブリソキン、グアナベンズ、グアナクリン、グアナドレル、グアナゾジン、グアネチジン、グアンファシン、グアノクロル、グアノキサベンズ、およびグアノキサンを含む。
【０２０８】
ヒドラジン／フタラジンの非限定的な例は、ブドララジン、カドララジン、ジヒドララジン、エンドララジン、ヒドラカルバジン、ヒドララジン、フェニプラジン、ピルドララジン、およびトドララジンを含む。
【０２０９】
イミダゾール誘導体の非限定的な例は、クロニジン、ロフェキシジン、フェントラミン、チザニジン、およびトロニジンを含む。
【０２１０】
第四アンモニウム化合物の非限定的な例は、臭化アザメトニウム、塩化クロルイソンダミン、ヘキサメソニウム、ペンタシニウムビス（硫酸メチル）、臭化ペンタメトニウム、酒石酸ペントリニウム、フェナクトロピニウムクロリド、およびトリメチジニウムメトサルフェートを含む。
【０２１１】
レセルピン誘導体の非限定的な例は、ビエタセルピン、デセルピジン、レシナミン、レセルピン、およびシロシンゴピンを含む。
【０２１２】
スルホンアミド誘導体の非限定的な例は、アンブシド、クロパミド、フロセミド、インダパミド、キネサゾン、トリパミド、およびキシパミドを含む。
【０２１３】
血管昇圧剤は、一般に、外科手技の間に起こり得るショックの間に血圧を増加させるために使用される。抗低血圧薬としても公知である血管昇圧剤の非限定的な例は、アメジニウム硫酸メチル、アンギオテンシンアミド、ジメトフリン、ドーパミン、エチフェルミン、エチレフリン、ゲペフリン、メタラミノール、ミドドリン、ノルエピネフリン、フォレドリン、およびシネフリンを含む。
【０２１４】
うっ血性心不全の治療のための作用物質の非限定的な例は、抗アンギオテンシンＩＩ作用物質、後負荷前負荷低下治療、利尿薬、および変力剤を含む。
【０２１５】
ある実施形態では、アンギオテンシンアンタゴニストに対して耐性がない動物患者は、併用療法を用いて治療されてもよい。そのような療法は、ヒドララジン（ａｐｒｅｓｏｌｉｎｅ）および硝酸イソソルビド（ｉｓｏｒｄｉｌ、ｓｏｒｂｉｔｒａｔｅ）の投与を組み合わせてもよい。
【０２１６】
利尿薬の非限定的な例は、チアジドまたはベンゾチアジアジン誘導体（たとえばアルチアジド、ベンドロフルメチアジド（ｂｅｎｄｒｏｆｌｕｍｅｔｈａｚｉｄｅ）、ベンズチアジド、ベンチルヒドロクロロチアジド、ブチアジド、クロロチアジド、クロロチアジド、クロルサリドン、シクロペンチアジド、エピチアジド、エチアジド、エチアジド、フェンキゾン、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチクロチアジド、メチクラン、メトラゾン、パラフルチジド、ポリチジド、テトラクロルメチアジド、トリクロルメチアジド）、有機水銀化合物（たとえばクロルメロドリン、メラルリド、メルカムファミド（ｍｅｒｃａｍｐｈａｍｉｄｅ）、メルカプトメリンナトリウム、メルクマリル酸、マーキュマチリンナトリウム（ｍｅｒｃｕｍａｔｉｌｉｎ  ｄｏｄｉｕｍ）、塩化第一水銀、マーサリル）、プテリジン（たとえばフルテレン、トリアムテレン）、プリン（たとえばアセフィリン、７−モルホリノメチルテオフィリン、パマブロム（ｐａｍｏｂｒｏｍ）、プロテオブロミン（ｐｒｏｔｈｅｏｂｒｏｍｉｎｅ）、テオブロミン）、アルドステロンアンタゴニストを含むステロイド（たとえばカンレノン、オレアンドリン、スピロノラクトン）、スルホンアミド誘導体（たとえばアセタゾラミド、アンブシド、アゾセミド、ブメタニド、ブタゾールアミド、クロラミノフェナミド、クロフェナミド、クロパミド、クロレキソロン、ジフェニルメタン−４，４’−ジスルホンアミド、ジスルファミド、エトキシゾラミド、フロセミド、インダパミド、メフルシド、メタゾラミド、ピレタニド、キネサゾン、トラセミド、トリパミド、キシパミド）、ウラシル（たとえばアミノメトラディン、アミソメトラジン）、カリウム保持性アンタゴニスト（たとえばアミロライド、トリアムテレン）またはアミノジン（ａｍｉｎｏｚｉｎｅ）などのような種々の利尿薬、アルブチン、クロラザニル、エタクリン酸、エトゾリン、ヒドラカルバジン、イソソルビド、マンニトール、メトカルコン、ムゾリミン、ペルヘキシリン、チクリナフェン（ｔｉｃｒｎａｆｅｎ）、および尿素を含む。
【０２１７】
強心剤としても公知である陽性変力剤の非限定的な例は、アセフィリン、アセチルジギトキシン、２−アミノ−４−ピコリン、アムリノン、ベンフロジルヘミスクシネート、ブクラデシン、セルベロシン（ｃｅｒｂｅｒｏｓｉｎｅ）、カンフォタミド、コンバラトキシン、シマリン、デノパミン、デスラノシド、ジギタリン、ジギタリス、ジギトキシン、ジゴキシン、ドブタミン、ドーパミン、ドペキサミン、エノキシモン、エリトロフレイン、フェナルコミン、ギタリン、ギトキシン、グリコシアミン、ヘプタミノール、ヒドラスチニン、イボパミン、ラナトシド、メタミバム（ｍｅｔａｍｉｖａｍ）、ミルリノン、ネリフォリン（ｎｅｒｉｆｏｌｉｎ）、オレアンドリン、ウアベイン、オキシフェドリン、プレナルテロール、プロシラジン、レジブフォゲニン、シラレン、シラレニン、ストロファンチン（ｓｔｒｐｈａｎｔｈｉｎ）、スルマゾール、テオブロミンおよびキサモテロールを含む。
【０２１８】
特定の態様では、変力剤は、強心配糖体、ベータアドレナリンアゴニスト、またはホスホジエステラーゼ阻害剤である。強心配糖体の非限定的な例は、ジゴキシン（ｌａｎｏｘｉｎ）およびジギトキシン（ｃｒｙｓｔｏｄｉｇｉｎ）を含む。β−アドレナリンアゴニストの非限定的な例は、アルブテロール、バンブテロール、ビトルテロール、カルブテロール、クレンブテロール、クロルプレナリン、デノパミン、ジオキセテドリン（ｄｉｏｘｅｔｈｅｄｒｉｎｅ）、ドブタミン（ｄｏｂｕｔｒｅｘ）、ドーパミン（ｉｎｔｒｏｐｉｎ）、ドペキサミン、エフェドリン、エタフェドリン、エチルノルエピネフリン、フェノテロール、ホルモテロール、ヘキソプレナリン、イボパミン、イソエタリン、イソプロテレノール、マブテロール、メタプロテレノール、メトキシフェナミン、オキシフェドリン、ピルブテロール、プロカテロール、プロトキロール、レプロテロール、リミテロール、リトドリン、ソテレノール、テルブタリン、トレトキノール、ツロブテロール、およびキサモテロールを含む。ホスホジエステラーゼ阻害剤の非限定的な例は、アムリノン（ｉｎｏｃｏｒ）を含む。
【０２１９】
抗狭心症薬は、硝酸エステル、カルシウムチャネル遮断薬、ベータ遮断薬、およびその組み合わせを含んでいてもよい。
【０２２０】
ニトロ血管増幅剤としても公知である硝酸エステルの非限定的な例は、ニトログリセリン（ｎｉｔｒｏ−ｂｉｄ、ｎｉｔｒｏｓｔａｔ）、硝酸イソソルビド（ｉｓｏｒｄｉｌ、ｓｏｒｂｉｔｒａｔｅ）、および硝酸アミル（ａｓｐｉｒｏｌ、ｖａｐｏｒｏｌｅ）を含む。
【０２２１】
外科的療法は、副次的な療法として企図される。血管および心血管疾患および障害のためのそのような外科的治療剤は、当業者らに周知であり、生物に対して外科手術を実行すること、心臓血管機械的プロテーゼ、血管形成術、冠状動脈再灌流、カテーテルアブレーションを提供すること、被験体に対する植え込み型除細動器、機械的循環支持体、心臓移植、血管形成術、弁置換外科手術、冠動脈バイパス術、またはその組み合わせを提供すること含んでいてもよいが、これらに限定されない。本発明において使用されてもよい機械的循環支持体の非限定的な例は、大動脈内バルーンカウンターパルセイション、左室補助デバイス、またはその組み合わせを含む。
【０２２２】
ｂ．神経変性疾患の副次的な療法
神経変性疾患の副次的な療法の例は、薬物療法または外科的療法を含む。薬物療法の非限定的な例は、コリンエステラーゼ阻害剤を含む。例として、ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミンを含む。副次的な療法の他の例は、Ｍｅｍａｎｔｉｎｅなどのような、脳におけるグルタメートを調節する作用物質を含む。さらなる例として、ビタミンＥなどのような酸化防止剤を含む。抗精神病薬、神経抑制薬、抗うつ薬、不安緩解剤を含み、睡眠補助薬もまた、療法の副次的な形態として企図される。他の副次的な作用物質は、セレギリン、選択的モノアミンオキシダーゼ阻害剤、エストロゲン、抗炎症薬、およびｇｉｎｋｇｏ  ｂｉｌｏｂａを含む。
【０２２３】
副次的な療法はまた、レボドパ、ドーパミンアゴニスト、およびＣＯＭＴ阻害剤を含む。
【０２２４】
副次的な外科的療法は、剥離、深部脳刺激、淡蒼球切裁、および本発明の細胞以外のドーパミン産生細胞の大脳移植を含む。
【０２２５】
ｃ．肝疾患の副次的な療法
肝疾患の副次的な療法の例は、薬物療法または外科的療法を含む。薬物療法の非限定的な例は、スルファサラジン、コルチコステロイド、抗炎症性化合物、サイトカイン特異的療法（たとえばペントキシフィリンまたは抗ＴＮＦ、酸化防止剤、および抗ウイルス療法を含む。
【０２２６】
ｄ．化学療法剤
種々様々の化学療法剤は、本発明に従って使用されてもよい。用語「化学療法」は、癌を治療するための薬剤の使用を指す。「化学療法剤」は、癌の治療において投与される化合物または組成物を意味するために使用される。これらの作用物質または薬剤は、細胞内の活性のそれらのモード、たとえば、それらが細胞周期に影響するかどうかおよびその段階によって分類される。その代わりに、作用物質は、ＤＮＡに直接架橋する、ＤＮＡの中にインターカレートする、または核酸合成に影響することによって染色体および有系分裂の異常を誘導するその能力に基づいて特徴付けられてもよい。ほとんどの化学療法剤は、以下の種類に分類される：アルキル化薬、代謝拮抗薬、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害剤およびニトロソ尿素。これらの作用物質の例は、先に記載されている。
【０２２７】
Ｈ．キット
本発明の様々な態様では、キットは、本発明の細胞のクローン集団を含む、１つまたはそれより多くの密閉容器を含有することが構想される。いくつかの実施形態では、キットはまた、ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ、アッセイプレート、注射器、ボトル、またはチューブなどのようなキットの成分と反応しない容器である、適した容器手段を含んでいてもよい。容器は、プラスチックまたはガラスなどのような滅菌可能な物質から作られたものでもよい。
【０２２８】
キットは、供給源、保存指示、投与指示などのような、本発明の方法に関する手順の工程または細胞のクローン集団に関する情報を概説する指示シートをさらに含んでいてもよい。指示情報は、コンピューターを使用して実行された場合に、薬学的有効量の治療剤を送達する実際のまたは仮想の手順を表示する、機械読み取り可能な指示を含有する、コンピューター読み取り可能な媒体中のものであってもよい。キットは、疾患の治療または予防において適用することができる、１つまたはそれより多くのさらなる治療剤を任意選択で含んでいてもよい。たとえば、さらなる治療剤は、神経変性疾患または心血管疾患の治療または予防において適用することができる作用物質であってもよい。そのような作用物質の非限定的な例は、本明細書において他のところで議論される。
【実施例】
【０２２９】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれる。続く実施例において開示される技術は、本発明の実施において十分に機能するように、発明者によって発見された技術を示し、したがって、その実施のための好ましいモードを構成すると考えることができることが、当業者らによって十分に理解されるはずである。しかしながら、当業者らは、本開示を考慮して、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多くの変化が、開示される特定の実施形態において成され、同様のまたは類似する結果をなお得ることができることを十分に理解するはずである。
【０２３０】
（実施例１）
材料および方法
細胞培養：マウスＣＧＲ８  ＥＳＣ系は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）から得た；間質ＰＡ６細胞系は、Ｒｉｋｅｎ  ＢＲＣ細胞バンク、Ｊａｐａｎによって提供された。ＣＧＲ８胚性幹細胞系は、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ；ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）、および白血病抑制因子を補足したＢＨＫ−２１培地中で維持した。ＣＧＲ８は、ゼラチンコーティング皿上で培養した。ＰＡ６間質細胞系は、１０％ウシ胎児血清を補足したＭＥＭ−アルファ培地中で維持した（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。
【０２３１】
抗体：以下の一次抗体を使用した：マウス抗ネスチン、マウス抗ニューロン核特異的タンパク質（ＮｅｕＮ）、ウサギ抗チロシンヒドロキシラーゼ、ラット抗ドーパミントランスポーター（ＤＡＴ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ；ｗｗｗ．ｃｈｅｍｉｃｏｎ．ｃｏｍ）、マウス抗チロシンヒドロキシラーゼ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ；ｗｗｗ．ｓｃｂｔ．ｃｏｍ）、マウス抗ベータ−ＩＩＩチューブリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ；ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）、およびウサギ抗ベータＩＩＩチューブリン（Ｃｏｖａｎｃｅ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ；ｗｗｗ．ｃｏｖａｎｃｅ．ｃｏｍ）。以下の蛍光色素標識二次抗体を使用した：マウス、ヤギ、またはウサギに対するヤギまたはロバ由来のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（５５５または４８８）標識抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡ；ｐｒｏｂｅｓ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）；マウスＩｇＧに対するＣｙ５コンジュゲートロバ、ウサギＩｇＧに対するＰＥ−Ｃｙ５．５ヤギ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ；ｗｗｗ．ｊａｃｋｓｏｎｉｍｍｕｎｏ．ｃｏｍ）。
【０２３２】
フローサイトメトリー：細胞は、メーカーの推奨に従って、１．２５μｍｏｌ／Ｌ  ５，６−カルボキシ−フルオレセイン−スクシンイミジル−エステル（ＣＦＳＥ、Ｓｉｇｍａ、ｃｉｔｙ？）を用いて標識した。使用した以下の抗体は、ネスチンおよびベータ−ＩＩＩ−チューブリンに対するものとした。それらの細胞内検出のために、細胞は、０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１０％胎児ウシ血清を含有する、ＰＢＳ中の抗体の適切な希釈液とのインキュベーション（４５分）の前に、一定の撹拌下で、室温で、１０分間、パラホルムアルデヒド０．５％を用いて固定した。細胞は、ＰＢＳを用いて２回すすぎ、適切な二次抗体と共に４５分間、インキュベートし、蛍光励起セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析の前に洗浄した。蛍光は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ；ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｂｄ．ｃｏｍ）およびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いて分析した。
【０２３３】
免疫蛍光法および顕微鏡検査法：細胞を含有するガラス製カバーガラスは、さらに３０分間のＰＢＳ中でのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．２％を用いる透過処理の前に、室温で、１５分間、ＰＢＳ中で、２％パラホルムアルデヒドを用いて固定した。ＰＢＳを用いて洗浄した後に、カバーガラスは、１％のウシ胎児血清を含有するＰＢＳ中で一次抗体の適切な希釈液と＋４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ中で洗浄した後に、カバーガラスは、二次抗体の適切な希釈液と室温で１時間、インキュベートし、さらに洗浄し、３００ｎＭ  ４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）と共に１５分間、インキュベートした。細胞は、ＰＢＳ中で洗浄し、ＦｌｕｏｒＳａｖｅ封入剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；ＵＳＡ；ｗｗｗ．ｅｍｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ）への封入の前に水を用いてすすいだ。自動画像化は、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、ｃｉｔｙ、ｃｏｕｎｔｒｙ）を使用し、ｉｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ自動蛍光顕微鏡を用いて実行した。
【０２３４】
ＥＳＣの神経分化：ＥＳＣは、照射（５０００ｒａｄ）ＰＡ６のコンフルエントな層上で低密度（１００細胞／ｃｍ２）で平板培養する前にＰＢＳを用いて洗浄した。分化用の培地は、ＧＭＥＭ、１５％のノックアウト血清代替品、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＭ非必須アミノ酸、０．１ｍＭベータ−メルカプトエタノール、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含んだ。いくつかの実験では、神経分離進行中の細胞は、トリプシン／ＥＤＴＡ  ０．５％使用して分離し、５０００細胞／ｃｍ２の密度で、ポリオルニチンコーティング細胞培養ペトリ皿（０．００１％）上で再度平板培養した。
【０２３５】
胚様体の生成：ＣＧＲ８は、ＰＢＳを用いて１回洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ  ５％を使用して分離した。細胞は、白血病抑制因子を有していない培養培地中で希釈し、細胞プレートのカバー上の５００細胞の２０μｌ液滴上に置いた。２日後に、胚様体を形成する細胞は、１０ｍｌ超低付着プレート中にプールし、３日間、インキュベーター中にもう一度残した。５日目に、胚様体を、ゼラチンコーティング皿上で平板培養した。第１の胚様体は、７日目に拍動し始めた。培養培地は、２日毎に交換した。
【０２３６】
レンチウイルスベクターおよびＥＳＣ形質導入：エントリーベクターを生成するために、プロモーター（ｅｔａ−ＩＩＩｐおよびＴａｌｐｈａ−１）ならびに対象の遺伝子（ＧＦＰおよびＨ２Ｂ−ｍＲＦＰ１）は、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）  ＢＰ  ｃｌｏｎａｓｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ｐＤＯＮＲＰ４−Ｐ１ＲおよびｐＤＯＮＲ２２１の中にそれぞれクローニングした。次いで、結果として生じるエントリーベクターは、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）  ＬＲ  ｐｌｕｓ  ｃｌｏｎａｓｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、２Ｋ７ｂｓｄまたは２Ｋ７ｎｅｏレンチウイルスベクターの中に組換えた。レンチウイルスベクター粒子は、リン酸カルシウムを使用する、２９３Ｔ細胞中での一時的なトランスフェクションによって産生した。レンチウイルスベクターを含有する上清は、７２時間後に収集し、０．４５μｍ細孔サイズのポリエーテルスルホン膜でろ過し、超遠心分離法（４℃で９０分間、５０，０００ｘｇ）によって１２０倍に濃縮した。ペレットは、ＥＳＣ培養培地中に再懸濁し、続いて、標的細胞に追加した。形質導入の３日後に、ブラストサイジン（７．５μｇ／ｍｌ）またはネオマイシン（４００μｇ／ｍｌ）を培養培地に追加し、選択を６日（ブラストサイジン）または１０日（ネオマイシン）間、維持した。
【０２３７】
マイクロアレイ：全ＲＮＡは、ＲＮＡ  ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ、ｃｉｔｙ、ｃｏｕｎｔｒｙ）を用いて単離し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）でキャピラリー電気泳動法によってＲＮＡの完全性について品質管理した。５００ｎｇを増幅し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｏｔａｌＰｒｅｐ  ＲＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ、ｃｉｔｙ、ｃｏｕｎｔｒｙ）を使用して標識した。ｃＲＮＡの品質は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒでキャピラリー電気泳動法によって評価した。ヒト発現アレイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ｃｉｔｙ、ｃｏｕｎｔｒｙ）に対するハイブリダイゼーションは、メーカーの指示に従って実行した。
【０２３８】
データは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｂｅａｄｓｔｕｄｉｏ  ３．１．３（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎおよびｑｕａｎｔｉｌｅ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）を使用して、標準化し、分析した。それぞれの試料の発現プロファイルは、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇＧＸ  ７．３．１（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にインポートした。発現値に加えて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＢｅａｄＳｔｕｄｉｏソフトウェアは、検出ｐ値を算出する。これに基づいて、プローブに、検出フラグ（Ｐ（存在）：ｐ＜０．０４５；Ｍ（限界）：０．０５０〜０．０４５の間のｐ、Ａ（不在）：ｐ＞０．０５）をそれぞれ割り当てた。異なって発現した転写産物を同定するために、スチューデントｔ検定および／またはＡＮＯＶＡおよびフィルタリングのさらなる工程を実行した。機能的な存在論についてのＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓは、ＭｅｔａＣｏｒｅソフトウェア（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｇｏ．ｃｏｍ）を使用して行った。
【０２３９】
細胞遺伝学的および分子分析：ＥＳＣは、４時間、５０ｎｇ／ｍｌでコルセミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて処理した。有系分裂停止細胞は、５分間、ＫＣｌ  ０．０７５Ｍ使用して、低浸透圧性の処理にかけ、３回、カルノア固定液（メタノール：酢酸＝３：１、ｖ／ｖ）と溶液を交換することによって固定し、その後で、細胞を含有する溶液をスライドガラス上に広げた。染色体は、続いて、標準的な手順に従ってＧバンド染色した。オリゴヌクレオチドアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（Ａｒｒａｙ−ＣＧＨ）分析は、約２０ｋｂの分解能を有する、全ゲノムをカバーするＭｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＣＧＨ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｋｉｔ  ２４４Ｂ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、メーカーのプロトコールに従って実行した。データは、それぞれ２．５および６．０の感度閾値ならびに０．２Ｍｂの移動平均ウィンドウに従って、統計アルゴリズムｚ−スコアおよびＡＤＡＭ−２を使用し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＣＧＨ  ａｎａｌｙｔｉｃｓ  ３．４ソフトウェアを用いて分析した。マッピングデータは、ＮＣＢＩ  ｄａｔａｂａｓｅ  Ｂｕｉｌｄ  ３７（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を使用し、マウスゲノム配列に基づいて分析した。
【０２４０】
（実施例２）
胚性幹細胞内の細胞の多様性：多能性クローン亜系は、別個の分化能を示す
初期内部細胞塊（ＩＣＭ）から誘導した胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、理論上均一な多能性細胞から構成される。本研究は、１つの親ＥＳＣから誘導した子孫の特徴付けを可能にする実験条件を使用して、この概念を試験するために設計した。フローサイトメトリーおよび生の画像分析は、神経分化を受けた、いくつかの個々のＥＳＣが、初期に所望の表現型に回避する子孫を生成することを実証した。それは、分化プログラムの遅延によるものではなく、ニューロンを生成する、個々の親ＥＳＣの能力における著しい差異によるものであり、したがって、ＥＳＣの間のクローン多様性の可能性を高めた。さらにこの仮説を実証するために、マウスＥＳＣ由来のクローン亜系を限界希釈法によって生成した。すべてのクローンが同等のレベルの多能性マーカー（Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４を含む）を発現したという事実にもかかわらず、これらのクローン系のトランスクリプトーム分析は、遺伝子発現プロファイルにおける著しい差異を示した。異なるクローンは、表現型分化アッセイにおいておよび胚様体における遺伝子発現に関して、別個の分化能を示した。これらの発見のより幅広い適用可能性を実証するために、クローンを他のＥＳＣ系から生成した。これらのクローン亜系もまた、それらの分化能において著しい個体性を示した。まとめると、これらの観察は、多能性ＥＳＣが、別個の分化能を有する個々の細胞型からなることを実証する。これらの発見は、ＥＳＣについての生物学的理解のための新規なエレメントを同定するだけではなく、それらの将来のインビトロおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける使用のための主な可能性を有する新しいツールを提供する。
ＥＳＣの分化は、神経の運命に初期に回避する増殖細胞を生成する
ＥＳＣの分化の間に、典型的に、細胞の画分は、所望の細胞の表現型を獲得しない。これは、非等時性（ａｎｉｓｏｃｈｒｏｎｉｃｉｔｙ）、つまり、亜集団の、成熟プロセスにおける進行の遅れによるものであり得るが、細胞の亜集団は、分化プロトコールに対する本質的な抵抗性のために所望の分化を回避するかもしれない。この疑問を検討するために、発明者らは、細胞分裂の分析と分化マーカーの免疫検出を組み合わせるフローサイトメトリーアッセイを開発した。
【０２４１】
マウスＣＧＲ８  ＥＳＣは、初期の分化を誘導するために、照射間質細胞（ＰＡ６）（Ｓｈｉｎｔａｎｉら、２００８年）のコンフルエントな層上で低密度で５日間、培養し、示された場合、分離し、より進んだ神経分化に向けて進行するように、ポリオルニチン上で平板培養した。未分化ＥＳＣは、ネスチンおよびベータ−ＩＩＩ−チューブリンに対してネガティブであった（図１Ａ、左パネル）。分化の５日目に、２つのマーカーの細胞発現についての複合パターンが、ベータ−ＩＩＩ−チューブリンポジティブ、ネスチンネガティブニューロン細胞、ネスチンポジティブ、ベータ−ＩＩＩ−チューブリンネガティブ前駆体細胞、およびダブルポジティブ移行細胞の小さな集団により観察された（図１Ａ、右パネル）。ダブルネガティブ細胞の注目すべき、かなり大きな集団が、観察されたが、ＳＳＥＡ−１発現が、ネスチンポジティブおよびネガティブ集団の両方において分化の５日後に消失したので、これらは、多能性状態からの亜集団の離脱の遅延によるものではなかった（図１Ｂ）。
【０２４２】
細胞分裂の同時性もまた、蛍光プローブカルボキシ−フルオレセイン−スクシンイミジル−エステル（ＣＦＳＥ）を使用してモニターした（Ｌｙｏｎｓ、２０００年）。ＣＦＳＥは、それぞれの細胞分裂の後に娘細胞において５０％ずつ希釈される、安定した、無毒性の蛍光色素であり、それによって、有系分裂事象の数のフローサイトメトリーによる定量を可能にする。非分裂細胞は、ＣＦＳＥ蛍光の最初のレベルを維持するが、分裂細胞は、分裂の数の関数として蛍光を失う。単相性のＣＦＳＥヒストグラムにおいて示されるように、ほとんどの細胞は、初期神経分化の間に分裂した（図１Ｃ、左パネル）。対照的に、多相性のＣＦＳＥヒストグラムは、細胞の亜集団が、後期神経分化の間に分裂の速度を落とすまたはそれを停止することを示す（図１Ｃ、右パネル）。
【０２４３】
次いで、細胞増殖は、ポリオルニチン（図１Ｄ）上での平板培養の２４時間、４８時間、７２時間後に、後期神経分化の間の細胞分化マーカーの関数として分析した。平板培養の２日後に、ニューロン亜集団（ネスチンネガティブ／ベータ−ＩＩＩ−チューブリンポジティブ）は、活発に増殖した神経上皮（ネスチンポジティブ／ベータ−ＩＩＩ−チューブリンネガティブ）および非神経細胞（ネスチンネガティブ／ベータ−ＩＩＩ−チューブリンネガティブ）（より低いＣＦＳＥ強度）と比較して、その増殖の速度を落とした（より高度なＣＦＳＥ強度）。再度平板培養した３日後に、ニューロン集団は、決定的に分裂を停止した細胞を含んだが、非神経細胞および神経上皮細胞は、分裂を継続した。異なるＣＦＳＥ強度に対応する注目すべき、いくつかのピークが、３つの亜集団内で観察され、これもまた、それらの間の不均一性を実証した。
【０２４４】
まとめると、これらの観察は、すべてのＥＳＣが、分化プログラムを開始したが、いくつかの細胞が、非常に早期に神経の運命に回避し、有糸分裂後のニューロンが増殖中の神経細胞前駆体および非神経細胞と共存する混合培養物を生成したことを示す。この回避応答は、神経分化を受けたＥＳＣの間の不均一性によって説明することができるかもしれない。
【０２４５】
神経分化を受けた個々のＥＳＣは、明確な子孫を生成する
次いで、ＥＳＣの間の不均一性の仮説を調査した。１つの個々のＥＳＣから排他的に誘導した子孫の特徴付けを可能にする実験条件を設計した。神経分化は、ＰＡ６間質細胞上で、超低密度でＥＳＣを平板培養することによって誘導した。これらの条件下で、単一のＥＳＣは、分化が進行中のコロニーを生成し、それぞれの子孫の性質をモニターすることができる。３日後に、ＥＳＣから誘導されたコロニーは、不均一であった。いくつかのコロニーは、神経表現型（ネスチン＋およびβＩＩＩ−チューブリン＋）を有する細胞を含んでいたが、他のコロニーは、非神経細胞であった（ダブルネガティブ）（図２Ａ）。この観察は、１つの単一ＥＳＣから誘導した子孫の性質における大きな差異を示した。定量により、コロニーの半分が、３日後にβＩＩＩ−チューブリン＋ニューロン細胞を含んだことが示された（図２Ｂ）。分化の後期に、コロニーの２５％は、ドーパミン作動性表現型（チロシンヒドロキシラーゼポジティブ（ＴＨ）＋）を有するニューロンを含み、コロニーの１０％は、成熟期ニューロン（ＮｅｕＮ＋）を含んだ（図２Ｂ）。コロニーの間の不均一性は、２つの他の神経細胞前駆体細胞マーカー、Ｐａｘ−６およびＳｏｘ−１を使用して確認した。神経コミットメントについてのコロニーの間の不均一性は、初期神経特異的プロモーターＴα１の制御下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する遺伝子修飾ＥＳＣ系を使用して確認した（Ｓｕｔｅｒら、２００９年）。先の観察のとおりに、神経分化を受けたＥＳＣ−Ｔα１−ＧＦＰは、ＧＦＰ＋およびＧＦＰ−コロニーを誘導し（図２Ｃ）、神経および非神経子孫の共存を確認した。したがって、神経運命に回避するいくつかの細胞の能力は、それらが由来する親細胞の性質に関連付けられる。
【０２４６】
異なる子孫の間で観察された変異性は、プロモーター／レポーター遺伝子ベースの方法を使用して、よりいっそう詳細に分析した。遺伝子修飾ＣＧＲ８  ＥＳＣ系は、βＩＩＩ−チューブリン−プロモーター（βＩＩＩｐ）の制御下でＧＦＰを発現するように開発した。これらのＥＳＣ−βＩＩＩｐ−ＧＦＰ細胞は、その細胞核に対するターゲティングのためにＨ２Ｂヒストンに融合した単量体赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ１）を発現するレンチウイルスベクターを用いて同時形質導入した。これは、ＥＳＣ−βＩＩＩｐ−ＧＦＰ−Ｈ２Ｂ−ｍＲＦＰ１が、それらの赤色の蛍光性核のために、蛍光顕微鏡法によって可視化されるのを可能にした。βＩＩＩ−チューブリンについてのプロモーターは、未分化ＥＳＣにおいて低レベルで恒常的に活性である。対照的に、ＧＦＰ発現は、ネスチン非神経集団において減少する（図７Ａ）が、より高度なＧＦＰ発現が、βＩＩＩ−チューブリン＋ニューロン細胞において誘導される（図７Ｂ）。ＥＳＣ−βＩＩＩｐ−ＧＦＰ−Ｈ２Ｂ−ｍＲＦＰ１を、神経分化のためにＰＡ６上で平板培養し、いくつかの個々のＥＳＣは、自動ハイスループット画像システム（ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、２日間、経過観察した。画像化により、未分化ＥＳＣ−βＩＩＩｐ−ＧＦＰ−Ｈ２Ｂ−ｍＲＦＰ１が、バックグラウンドレベルのＧＦＰを発現し、平板培養後に速やかに分裂することを確認した。いくつかのコロニーでは、ＧＦＰ発現は、ＥＳＣから誘導された子孫において維持されたまたは増加した（図２Ｄ、コロニー１）。他のコロニーでは、ＧＦＰ発現は、すべての細胞において速やかに消失し（図２Ｄ、コロニー２）、いくつかの個々のＥＳＣが、非神経子孫を生成することを確認した。最後に、細胞の１つの画分のみがＧＦＰ発現をオフにしたコロニーもまた、観察され（図２Ｅ）１つの個々のＥＳＣから誘導された子孫もまた、神経および非神経細胞の間の混合物となり得ることを示した。
【０２４７】
ＧＦＰ発現を含む系統樹は、生の画像化動画から確立した。すべての分析した系統樹のどれも、同一ではなく、したがって、個々のＥＳＣから誘導された子孫の独自性が確認された。たとえば、子孫の一部（図８Ａ、Ｂ、Ｄ）または全体（図８Ｃ）がＧＦＰ発現をオフにしたことを観察することができる。他のコロニーでは、プロモーターは、２日後に、ほとんどの細胞において活性なままであった（図８Ｄ）。興味深いことには、ＧＦＰ発現をオフにした細胞は、最初の分裂によって生成された２つの娘細胞の一方から排他的に誘導されることが多かった。対照的に、ＧＦＰ発現を維持したものは、他方の娘細胞から誘導され、最初の分裂が、それぞれ異なる子孫を生成する２つの異なる娘細胞を産生したことを示した。
【０２４８】
まとめると、これらの観察により、個々のＥＳＣが、明確な子孫を生成し、神経子孫の生成について同じ潜在能を共有しないということが確認される。
【０２４９】
初期多能性ＩＣＭに対応するＥＳＣの間のクローン多様性
同じ培養における個々のＥＳＣが同じ神経形成性の潜在能を共有しないという観察は、個体の間の不均一性またはＥＳＣ神経分化を引き起こす決定における確率性によって説明することができる。単一細胞レベルでＥＳＣの間の個体性の仮説を調査した。７つのクローン亜系を限界希釈法によってＥＳＣから誘導した。それぞれのクローン亜系の多能性表現型を最初に調査した。試験した亜系のほとんどは、ｒｅｘ−１、アルカリホスファターゼ、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ−４、Ｓｏｘ−２、Ｋｌｆ−２、Ｐｅｃａｍ−１、およびＰｒａｍｅｌ−４を含む初期ＩＣＭの多能性細胞のマーカーを発現した（図３Ａ）。ほとんどのクローンにおいて、多様な発現レベルであるが、Ｓｔｅｌｌａの発現が見出されたことは注目すべきことである。１つのクローン系（クローン５）は、原始内胚葉マーカーを発現したので、研究から除外した。
【０２５０】
クローンＥＳＣ亜系は、次いで、それらのゲノム構造の分析にかけた。異なるクローン（クローン１〜７）の標準的な核型分析（Ｇバンド染色）を実行した。染色体数および染色体異常の存在は、２つの培養時間間隔（継代１０および１６）で評価した（表２）。ほとんどのクローンは、継代１６で、クローン７以外は、細胞モザイク現象を示した。クローン３における通常の２ｎ＝４０の頻度値は、継代２０で３６％であり、継代１６で６０％＞であった（表２）。分析はまた、染色体異常の存在をも明らかにした。クローン１、２、６、および７は、両方の継代に存在する未同定の誘導染色体（ｄｅｒ）の存在によって同一の構造の再配列を示した。この再配列した染色体は、高異数倍数性４１、ＸＹ優勢集団細胞中に存在した（図９）。クローンの高解像度ゲノム解析はまた、分子核型分析（ａｒｒａｙ−ＣＧＨ）によって実行した。この分析は、すべての分析したクローンにおいて１Ｍｂよりも小さな、共通の部分的な欠失および重複の存在を明らかにした（表３）。染色体Ｘ上の重複がクローン１および２において存在したが、他において不在であったことは注目すべきことである。廃棄したクローン５は、５ｑＥ１における領域の欠如によって代表される異なるゲノムのプロファイルを示した。まとめると、これらの結果は、クローンのゲノム構造が、クローン５を例外として、類似しており、主な異常を示さなかったことを示唆する。
【０２５１】
【表２】
2013512671.tif 000004
【０２５２】
【表３】
2013512671.tif 000005
明らかなゲノムの異常を有していないクローン亜系（つまりクローン１、２、３、４、６、７）は、マイクロアレイによる全ｍＲＮＡ発現分析にかけた。６８００の遺伝子の発現は、クローン系の間で著しく変動した（ＡＮＯＶＡ統計的検定を使用する分散分析）。個々のクローンのＥＳＣについてのこれらの６８００の遺伝子の発現プロファイルの数学的分析は、階層クラスタリングを可能にした（図３Ｂ）。最も異なるクローンＥＳＣは、クローン１および２であった。これに反して、クローン４／クローン６の組と同様に、クローン２は、クローン３に、より類似していた。図１０は、クローン１および２の間の、異なって発現された遺伝子のファミリーを概説する（公的なデータベースＧＯ  ｐｒｏｃｅｓｓ  （Ｍｅｔａｃｏｒｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）；ｗｗｗ．ｇｅｎｅｇｏ．ｃｏｍから）。２つのクローンの間で異なって発現された遺伝子のおよそ半分を、ニューロン生成を含む発生プロセスにおいて分類した。すべてのクローン系の間の最も重要な変化の性質もまた、分析した。表４中に、異なるクローンの間で発現レベルの定量的に最も重要な差異を示す３０の遺伝子を列挙する。リストは、遺伝子：ｉ）３つのグアニル酸結合タンパク質（Ｇｂｐ  １、２、３）；ｉｉ）３つのケラチン（Ｋｒｔ  ８、１８、１９）；ｉｉｉ）２つのカルボニックアンヒドラーゼ（Ｃａｒ２、４）のいくつかの群を含有する。インスリン様増殖因子結合タンパク質３（Ｉｇｆｂｐ３）と共に、インスリン様増殖因子２（Ｉｇｆ２）の対およびいくつかの転写因子もまた、注目されたい。
【０２５３】
【表４】
2013512671.tif 000006
表４において、すべての転写産物の発現レベルをクローンの間で比較した。標準偏差に対応する値は、クローンの間の転写産物発現の平均を用いて標準化した。転写産物はすべて、標準偏差および発現レベルの間の比に従って分類した。表は、より高度な比と関連する３０の最初の遺伝子のリストを提供する。
【０２５４】
発明者らは、ｍＲＮＡ発現レベルにおけるこれらの差異が、異なるクローンへの特異的な分化経路に対する傾向を与えるかもしれないと仮定した。機能レベルで変異性を調査するために、クローンＥＳＣを、ＰＡ６間質細胞との共培養によって神経分化を受けさせた。系はすべて、神経および非神経コロニーを誘導した。しかしながら、神経および非神経コロニーの間の比は、クローンの間で異なった。クローン２および６は、クローン７よりも、神経上皮細胞（ネスチン＋）を含む、著しくより高度なパーセンテージのコロニーを生成した（図４Ａ）。クローン２および６のこの能力の増加は、ニューロンβＩＩＩ−チューブリン染色によって確認した（図４Ｂ）。分化の１週間後およびこれらの観察のとおりに、クローン７は、ＴＨドーパミン作動性ニューロンを有するコロニーを生成する能力がより低かった（図４Ｃ）。クローン１が、他のクローンよりも多数のＴＨポジティブコロニーを誘導したことは注目すべきことである。クローンはまた、それらの心臓形成性の潜在能においても変動した。クローン２および３は、拍動している心筋細胞を産生するのに、クローン４よりも著しく効率的であった。対照的に、クローン１は、心臓細胞を生成するのに効率的ではなかった（図４Ｄ）。
【０２５５】
適切な条件下で、亜系はすべて、浮遊胚様体を生成する能力を有した。次いで、異なる胚葉／細胞型に関連付けられる遺伝子の発現は、２週間後に胚様体において定量化した。分析した遺伝子のすべての発現は、クローンの間で異なった（図５Ａ〜Ｈ）。外胚葉Ｚｉｃ１（図５Ａ）および神経外胚葉ｎｋｘ２．２（図５Ｂ）の不均一な発現が観察され、ＥＳＣクローンの神経形成性の潜在能における変異性を示唆した。不均一性はまた、内胚葉遺伝子Ｆｏｘａ２を使用して観察された（図５Ｃ）。クローン２および３は、より高度なレベルの心臓マーカーＭｙｈ７を誘導した（図５Ｄ）が、肝臓α−フェトプロテインは、クローン７においてより生成された（図５Ｅ）。変異性はまた、膵臓インスリン（図５Ｆ）ならびに中胚葉Ｔａｌ１（図５Ｇ）および筋細胞アクチニン１（図５Ｈ）を生成するクローンの能力において観察された。
【０２５６】
まとめると、これらのデータにより、クローン系が、同じ分化能を共有しないことが示され、かつ同じ培養におけるその個々の多能性ＥＳＣが機能的に不均一であることが確認される。
【０２５７】
クローンの不均一性のこの概念はまた、他のＥＳＣ系（Ｄ３）においても試験した。亜系は、限界希釈法によってＤ３から生成し、クローンはそれぞれ、ゲノム解析および全遺伝子発現プロファイルにかけた。ＣＧＲ８系について観察されたように、亜系の間で主なゲノムの異常はなかった。遺伝子発現アレイを実行し、初期ＩＣＭに対応する多能性マーカーはすべて、クローンにおいて検出された（図６Ａ）。Ｄ３亜系は、βＩＩＩ−チューブリン＋ニューロン（図６Ｂ）、ＮｅｕＮ＋成熟期ニューロン（図６Ｃ）、およびＴＨ＋ドーパミン作動性ニューロン（図６Ｄ）を含む、コロニーを生成するそれらの能力において、著しく異なり、ＥＳＣにおける細胞の個体性が確認された。
【０２５８】
参考文献
以下の参考文献は、それらが、本明細書において記載されるものに対して補足的な、例示的な手順のまたは他の詳細を提供する程度まで、参照によって本明細書において明確に組み込まれる。
【０２５９】
【表５−１】
2013512671.tif 000007
【０２６０】
【表５−２】
2013512671.tif 000008
【０２６１】
【表５−３】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
2013512671.tif 000012
【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図２】
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【図３】
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【図７】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年8月1日(2012.8.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞のクローン集団を作製するための方法であって、
ａ）インビトロにおいて増幅され、未分化または本質的に未分化の状態に維持された多能性または多分化能性細胞の集団を得る工程；
ｂ）該集団の個別化された細胞を増幅して細胞のクローン集団にする工程；ならびに
ｃ）神経細胞、肝細胞、または心筋細胞のいずれかについて少なくとも約５０％均一である集団に分化する能力を有することが決定された、細胞の１つまたはそれより多くのクローン集団を選択する工程を含む方法。
【請求項２】
前記選択された細胞のクローン集団が、心臓形成性の分化能を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞のクローン集団が、少なくとも約７５％の心筋細胞の細胞に分化する能力を示す、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記多能性細胞が、胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記多能性細胞がヒト細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記選択された細胞のクローン集団が、神経形成性の分化能を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞のクローン集団が、少なくとも約７５％の神経細胞に分化する能力を示す、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記選択された細胞のクローン集団を増幅する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記選択されたクローン集団を、神経細胞、肝細胞、または心筋細胞のいずれかについて少なくとも約５０％均一な細胞集団に分化させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記分化させた細胞集団が、神経細胞、肝細胞、または心筋細胞のいずれかについて少なくとも約７５％均一である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が、神経細胞へと分化される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が、肝細胞へと分化される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が、心筋細胞へと分化される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記分化させた細胞を試験化合物に曝露する工程、および該分化させた細胞における、毒性と関連する細胞パラメーターを測定する工程をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記多分化能性または多能性細胞が、前記個別化の前に少なくとも１回継代されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
請求項９に記載の方法によって作製される、複数のクローン由来分化細胞。
【請求項１７】
少なくとも約５０％心筋細胞、肝細胞または神経細胞とさらに規定される、請求項１６に記載の分化細胞。
【請求項１８】
容器手段中に含まれる、請求項１６に記載の分化細胞。
【請求項１９】
請求項１に記載の方法によって作製された細胞の複数のクローン集団。
【請求項２０】
容器手段中に含まれる、請求項１９に記載の分化細胞。
【請求項２１】
請求項１６または１９に記載の複数の細胞、および薬学的に許容されるキャリア。
【請求項２２】
請求項１６、１９または２１に記載の複数の細胞を含む、疾患を治療するための組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
特定の実施形態における被験体は、哺乳動物被験体である。哺乳動物被験体の非限定的な例は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、雌ウシ、ウマ、霊長動物、およびヒトを含む。特定の実施形態では、被験体は、ヒトである。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
細胞のクローン集団を作製するための方法であって、
ａ）インビトロにおいて増幅され、未分化または本質的に未分化の状態に維持された多能性または多分化能性細胞の集団を得る工程；
ｂ）該集団の個別化された細胞を増幅して細胞のクローン集団にする工程；ならびに
ｃ）神経細胞、肝細胞、または心筋細胞のいずれかについて少なくとも約５０％均一である集団に分化する能力を有することが決定された、細胞の１つまたはそれより多くのクローン集団を選択する工程を含む方法。
（項目２）
前記選択された細胞のクローン集団が、心臓形成性の分化能を示す、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記クローン集団が、少なくとも約６５％心筋細胞の細胞に分化する能力を示す、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記クローン集団が、少なくとも約７５％の心筋細胞の細胞に分化する能力を示す、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記クローン集団が、少なくとも約９０％の心筋細胞の細胞に分化する能力を示す、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記多能性細胞が、ヒト胚性幹細胞である、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記選択された細胞のクローン集団が、神経形成性の分化を示す、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記クローン集団が、少なくとも約６５％の神経細胞に分化する能力を示す、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記クローン集団が、少なくとも約７５％の神経細胞に分化する能力を示す、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記神経細胞が、ドーパミン作動性ニューロンである、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記多能性細胞が、ヒト胚性幹細胞である、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記ヒト胚性幹細胞が、Ｈ１、Ｈ９、ｈＥＳ２、ｈＥＳ３、ｈＥＳ４、ｈＥＳ５、ｈＥＳ６、ＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＨＳＦ１、ＨＳＦ６、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３ＢおよびＨ１４からなるリストから選択される、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記多能性細胞が、誘導多能性細胞（ｉＰＳＣ）である、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記ｉＰＳＣが、ｉＰＳ  ６．１、ｉＰＳ  ６．６、ｉＰＳ、ｉＰＳ  ５．６、ｉＰＳ  ５．１２、ｉＰＳ  ５．２．１５、ｉＰＳ  ５．２．２４、ｉＰＳ  ５．２．２０、ｉＰＳ  ６．２．１、およびｉＰＳ  ５／３−４．３からなるリストから選択される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記選択された細胞のクローン集団を増幅する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１６）
細胞が、神経細胞、肝細胞、または心筋細胞のいずれかについて少なくとも約５０％均一な集団に分化する能力を有するかどうかを決定する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記選択された細胞のクローン集団を提供する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１８）
保存または輸送のための、前記選択された細胞のクローン集団を調製する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記保存または輸送のための細胞の調製が、該細胞を凍結させる工程を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記増幅された細胞を試験化合物に曝露する工程、および該増幅された細胞における、毒性と関連する細胞パラメーターを測定する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記クローン集団が、分化作用物質への曝露によって、少なくとも約５０％の心筋細胞を含む細胞の集団に分化できる、項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記細胞のクローン集団が、ヒト細胞である、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記多分化能性または多能性細胞が、前記個別化の前に少なくとも１回継代されている、項目１に記載の方法。
（項目２４）
項目１に記載の方法によって作製される、複数のクローン由来心筋細胞。
（項目２５）
前記心筋細胞が組織中に含まれる、項目２４に記載の心筋細胞。
（項目２６）
前記組織は、適した容器手段中に含まれる、項目２５に記載の心筋細胞。
（項目２７）
複数のクローン由来心筋細胞組織が、容器手段中に含まれる、項目２６に記載の心筋細胞。
（項目２８）
項目１に記載の方法によって作製される複数のクローン由来心筋細胞および薬学的に許容されるキャリアを含む、組成物。
（項目２９）
向上した神経分化能を示す細胞のクローン集団を調製するための方法であって、
ａ）インビトロにおいて増幅され、未分化または本質的に未分化の状態に維持された多能性または多分化能性細胞の集団を得る工程；
ｂ）該多分化能性または多能性細胞の集団由来の複数の細胞を個別化および増幅する工程；
ｃ）該個別化された細胞から増幅された細胞を、神経細胞型に分化する能力について試験する工程；および
ｄ）分化作用物質に該細胞を曝露することによって少なくとも約５０％の神経細胞に分化できる、増幅された細胞を選択する工程
を含む、方法。
（項目３０）
前記増幅された細胞が、７５％のドーパミン作動性ニューロンに分化できる、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記多能性または多分化能性細胞が、多能性細胞である、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
前記多能性細胞が、ヒト胚性幹細胞である、項目２９に記載の方法。
（項目３３）
前記ヒト胚性幹細胞が、Ｈ１、Ｈ９、ｈＥＳ２、ｈＥＳ３、ｈＥＳ４、ｈＥＳ５、ｈＥＳ６、ＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＨＳＦ１、ＨＳＦ６、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３ＢおよびＨ１４からなるリストから選択される、項目２９に記載の方法。
（項目３４）
前記多能性細胞が、誘導多能性細胞（ｉＰＳＣ）である、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記ｉＰＳＣが、ｉＰＳ  ６．１、ｉＰＳ  ６．６、ｉＰＳ、ｉＰＳ  ５．６、ｉＰＳ  ５．１２、ｉＰＳ  ５．２．１５、ｉＰＳ  ５．２．２４、ｉＰＳ  ５．２．２０、ｉＰＳ  ６．２．１、およびｉＰＳ  ５／３−４．３からなるリストから選択される、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記神経細胞を試験化合物に曝露する工程、および該神経細胞における、毒性と関連する細胞パラメーターを測定する工程をさらに含む、項目２９に記載の方法。
（項目３７）
項目１に記載の方法によって作製される、複数のクローン由来の神経細胞。
（項目３８）
前記神経細胞が組織中に含まれる、項目３７に記載の神経細胞。
（項目３９）
前記組織が、適した容器手段中に含まれる、項目３８に記載の神経細胞。
（項目４０）
複数のクローン由来神経組織が、容器手段中に含まれる、項目３７に記載の神経細胞。
（項目４１）
項目１に記載の方法によって作製される複数のクローン由来神経細胞および薬学的に許容されるキャリアを含む、組成物。
（項目４２）
試験化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）複数の心筋細胞、肝細胞、または神経細胞を該試験化合物と接触させる工程；
ｂ）該試験化合物との接触に起因する、該細胞の表現型または活性の何らかの変化を決定する工程を含み、該細胞が、項目１に記載の方法によって作製される、方法。
（項目４３）
前記表現型または活性が、毒性の測定値であなる、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
１つまたはそれより多くの遺伝子の発現が、前記複数の心筋細胞または神経細胞において測定される、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記１つまたはそれより多くの遺伝子が、活性化カスパーゼ３、ＮＦ−ｋＢ、ＴＮＦ−アルファ、熱誘導性因子（ＨＩＦ−１アルファ）、熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）、トランスアミナーゼ、ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ、およびアルカリホスファターゼから選択される群からの少なくとも１つの遺伝子を含む、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記遺伝子発現が、ハイスループット遺伝子配列決定、ウエスタンブロット、遺伝子発現アレイ、フローサイトメトリー、免疫蛍光法、プロモーター／レポーター遺伝子ベースのアッセイ、または比色アッセイを使用して測定される、項目４４に記載の方法。
（項目４７）
表現型または活性の何らかの変化の決定が、心筋細胞の収縮、細胞死、活動電位のパターン、およびイオン透過性からなる群から選択されるパラメーターを評価する工程を含む、項目４２に記載の方法。
（項目４８）
前記多能性または多分化能性細胞が、ヒト細胞である、項目４２に記載の方法。
（項目４９）
心臓形成性の分化能を示す細胞のクローン集団を作製するための方法であって、
ａ）インビトロにおいて増幅され、未分化または本質的に未分化の状態に維持された多能性または多分化能性細胞の集団を得る工程；
ｂ）前記集団の個別化された細胞を細胞のクローン集団に増幅する工程；
ｃ）心筋細胞について少なくとも約５０％均一である集団に分化する能力を有することが決定された、細胞の１つまたはそれより多くのクローン集団を選択する工程；ならびに
ｄ）工程（ｃ）において観察される、前記増幅された細胞が心筋細胞に分化する能力に基づいて、前記選択された細胞を、細胞および組織工学、薬剤スクリーニング、または細胞療法のために使用する工程を含む、方法。
（項目５０）
神経細胞の実質的に均一な集団を被験体に投与する工程を含む、疾患を治療する方法であって、前記神経細胞が、
ａ）インビトロにおいて増幅され、未分化または本質的に未分化の状態に維持された多能性または多分化能性細胞の集団を得る工程；
ｂ）該集団の個別化された細胞を細胞のクローン集団に増幅する工程；
ｃ）神経細胞型について少なくとも約５０％均一である集団に分化する能力を有することが決定された、細胞の１つまたはそれより多くのクローン集団を選択する工程；および
ｄ）該細胞の１つまたはそれより多くの選択された集団の細胞またはそれらの子孫を提供する工程を含む方法によって作製されたものである、方法。
（項目５１）
前記神経細胞が、ドーパミン作動性ニューロンである、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記疾患が、パーキンソン病である、項目５０に記載の方法。
（項目５３）
前記ドーパミン作動性ニューロンの集団が、黒質緻密部の少なくとも一部分を含む領域に注射される、項目５１に記載の方法。
（項目５４）
約１００，０００〜約１０，０００，０００細胞が、注射される、項目５０に記載の方法。
（項目５５）
前記被験体が、ヒトである、項目５０に記載の方法。
（項目５６）
被験体における心疾患を治療するための方法であって、工程１の方法によって作製される複数のクローン由来心筋細胞を被験体に投与する工程を含み、前記心疾患が治療される、方法。
（項目５７）
前記被験体が、虚血性心疾患を有する被験体として同定される、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記心筋細胞を静脈内に、動脈内に、または心筋内に投与する工程を含む、項目５６に記載の方法。
（項目５９）
心疾患の治療のための療法の１つまたはそれより多くの副次的な形態を実行する工程をさらに含む、項目５６に記載の方法。
（項目６０）
前記被験体の心臓の心機能が向上する、項目５６に記載の方法。
【国際調査報告】
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