(57)【要約】  本発明は、腫瘍細胞の表面に存在するプロセシングされていないｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する抗体に関する。これらの抗体は、癌の診断および治療に、または癌細胞に成分を送達するための薬剤として有益である。本発明の抗体を化学療法剤または抗ガン剤と組み合わせて治療に使用してもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞の表面に存在するプロセシングされていないｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項２】
エピトープ配列ＶＶＤＴＹＹＤＤＱＬ（配列番号２）に特異的に結合する、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項３】
ＡＴＣＣに寄託され、ＰＴＡ−１１４０６と命名されたハイブリドーマ細胞株で産生された抗体ＬＭＨ８２が結合するエピトープに特異的に結合する、請求項１または２に記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項４】
ＡＴＣＣに寄託され、ＰＴＡ−１１４０６と命名されたハイブリドーマ細胞株で産生されたＬＭＨ８２である、請求項１から３に記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項５】
（ｉ）相補性決定領域（ＣＤＲ）配列の配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７のそれぞれ、またはそれらの１つもしくは複数に実質的に記載されているアミノ酸配列を含む可変領域を含む免疫グロブリン重鎖、および／または
（ｉｉ）相補性決定領域（ＣＤＲ）配列の配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０のそれぞれ、またはそれらの１つもしくは複数に実質的に記載されているアミノ酸配列を含む可変領域を含む免疫グロブリン軽鎖
を含み、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する、請求項１から４のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項６】
（ｉ）配列番号２１と少なくとも９０％同一である可変領域のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および／または
（ｉｉ）配列番号２２に少なくとも９０％同一である可変領域のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖：
を含む、請求項１から５のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項７】
エピトープ配列ＲＨＦＱＳＣＳＱＣＬＳＡＰＰＦＶＱＣＧＷ（配列番号５）またはエピトープ配列ＲＨＦＱＳＣＳＱＣＬＳＡＰＰＦ（配列番号６）に特異的に結合する、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項８】
ＡＴＣＣに寄託され、ＰＴＡ−１１４０５と命名されたハイブリドーマ細胞株で産生された抗体ＬＭＨ８０が結合するエピトープに特異的に結合する、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項９】
ＡＴＣＣに寄託され、ＰＴＡ−１１４０５と命名されたハイブリドーマ細胞株で産生されたＬＭＨ８０である、請求項１または８に記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１０】
（ｉ）相補性決定領域（ＣＤＲ）配列の配列番号７、配列番号８および配列番号９のそれぞれ、またはそれらの１つもしくは複数に実質的に記載されているアミノ酸配列を含む可変領域を含む免疫グロブリン重鎖、および／または
（ｉｉ）相補性決定領域（ＣＤＲ）配列の配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２のそれぞれ、またはそれらの１つもしくは複数に実質的に記載されているアミノ酸配列を含む可変領域を含む免疫グロブリン軽鎖
を含み、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１１】
（ｉ）  配列番号１３に少なくとも９０％同一である可変領域のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および／または
（ｉｉ）  配列番号１４に少なくとも９０％同一である可変領域のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖
を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１２】
腫瘍細胞上のｃ−Ｍｅｔに特異的に結合し、ｃ−Ｍｅｔ受容体が活性化していない状況で前記受容体の下方制御を誘導する、単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１３】
コア配列ＤＶＬＰＥＦＲＤＳＹ（配列番号４）から成るｃ−Ｍｅｔのα鎖のエピトープ配列に特異的に結合する、請求項１２に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１４】
前記抗体が、配列番号２９に記載の可変領域のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および／または配列番号３０に記載の可変領域のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含む、請求項１２または１３に記載の抗原またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１５】
（ｉ）配列番号２９に少なくとも９０％同一である可変領域のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および／または
（ｉ）配列番号３０に少なくとも９０％同一である可変領域のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖
を含み、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１６】
（ｉ）相補性決定領域（ＣＤＲ）配列の配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５のそれぞれ、またはそれらの１つもしくは複数に実質的に記載されているアミノ酸配列を含む可変領域を含む免疫グロブリン重鎖、および／または
（ｉｉ）相補性決定領域（ＣＤＲ）配列の配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８のそれぞれ、またはそれらの１つもしくは複数に実質的に記載されているアミノ酸配列を含む可変領域を含む免疫グロブリン軽鎖
を含み、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１７】
ｓｃＦＶである請求項１５または１６に記載の抗原結合性フラグメント。
【請求項１８】
腫瘍細胞上のｃ−Ｍｅｔに特異的に結合し、ｃ−Ｍｅｔ受容体が活性化していない状況で前記受容体の下方制御を誘導する、請求項１５もしくは１６に記載の抗体、または請求項１７に記載の抗原結合性フラグメント。
【請求項１９】
対象における腫瘍細胞の細胞増殖を阻害する方法であって、前記対象に抗体またはその抗原結合性フラグメントを投与することを含み、前記抗体が、配列番号２９を含む可変領域のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および／または配列番号３０を含む可変領域のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含むＬＭＨ８７である、方法。
【請求項２０】
対象における腫瘍細胞の細胞増殖を阻害する方法であって、前記対象に単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントを投与することを含み、前記抗体が、
（ｉ）相補性決定領域（ＣＤＲ）配列の配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５のそれぞれ、またはそれらの１つもしくは複数に実質的に記載されているアミノ酸配列を含む可変領域を含む免疫グロブリン重鎖、および／または
（ｉｉ）相補性決定領域（ＣＤＲ）配列の配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８のそれぞれ、またはそれらの１つもしくは複数に実質的に記載されているアミノ酸配列を含む可変領域を含む免疫グロブリン軽鎖
を含む、方法。
【請求項２１】
前記抗原結合性フラグメントがｓｃＦｖである、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
ｃ−Ｍｅｔのαまたはβ鎖上に存在するエピトープに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、前記エピトープが、ＶＶＤＴＹＹＤＤＱＬ（配列番号２）、ＶＲＲＬＫＥＴＫＤＧＦＭＦＬＴ（配列番号３）、ＤＶＬＰＥＦＲＤＳＹ（配列番号４）、およびＲＨＦＱＳＣＳＱＣＬＳＡＰＰＦＶＱＣＧＷ（配列番号５）から成る群から選抜されるアミノ酸配列を含む、またはそれらから本質的に成る、単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項２３】
ｃ−Ｍｅｔエピトープ配列ＲＨＦＱＳＣＳＱＣＬＳＡＰＰＦ（配列番号６）に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項２４】
ＤＶＬＰＥＦＲＤＳＹ（配列番号４）から成るコアエピトープ配列に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項２５】
ｃ−Ｍｅｔエピトープ配列ＶＲＲＬＫＥＴＫＤＧＦＭＦＬＴ（配列番号３）に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項２６】
請求項１から１８または２２から２５の１つに記載の抗体のＶＶＤＴＹＹＤＤＱＬ（配列番号２）、ＶＲＲＬＫＥＴＫＤＧＦＭＦＬＴ（配列番号３）、ＤＶＬＰＥＦＲＤＳＹ（配列番号４）、ＲＨＦＱＳＣＳＱＣＬＳＡＰＰＦＶＱＣＧＷ（配列番号５）およびＲＨＦＱＳＣＳＱＣＬＳＡＰＰＦ（配列番号６）から成る群から選抜されるエピトープへの結合を競合的に阻害することが可能な抗体。
【請求項２７】
（ｉ）配列番号３７に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む可変領域を含む免疫グロブリン重鎖、および／または
（ｉ）配列番号３８に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む可変領域を含む免疫グロブリン軽鎖を含み、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する、単離されたアゴニスト抗ｃ−Ｍｅｔ抗体ＬＭＨ８５。
【請求項２８】
（ｉ）配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３に記載の相補性決定領域（ＣＤＲ）のそれぞれ、またはそれらの１つもしくは複数に実質的に記載されているアミノ酸配列を含む可変領域を含む免疫グロブリン重鎖、および／または
（ｉ）配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６に記載の相補性決定領域（ＣＤＲ）のそれぞれ、またはそれらの１つもしくは複数に実質的に記載されているアミノ酸配列を含む可変領域を含む免疫グロブリン軽鎖
を含み、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する、請求項２７に記載のアゴニスト抗ｃ−Ｍｅｔ抗体ＬＭＨ８５。
【請求項２９】
配列番号３７の可変領域配列を含む免疫グロブリン重鎖および配列番号３８の可変領域配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含むｓｃＦｖ。
【請求項３０】
ｃ−Ｍｅｔのアンタゴニストである請求項２９に記載のｓｃＦｖ。
【請求項３１】
薬剤に結合する、請求項１から１８または２２から３０のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項３２】
検出可能標識もしくは機能性標識から選抜される薬剤、または、細胞毒もしくは抗新生物薬剤から選抜される治療薬剤に結合する、請求項３１に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項３３】
請求項１から１８または２２から３０のうちのいずれか１項に記載の抗体または抗原結合性フラグメントをコードする、単離された核酸配列。
【請求項３４】
請求項３３に記載の核酸配列であって、前記配列が、配列番号３９の重鎖可変領域配列および／または配列番号４０の軽鎖可変領域配列を含む、核酸配列。
【請求項３５】
配列番号４１の重鎖可変領域配列および／または配列番号４２の軽鎖可変領域配列を含む、またはそれらから成る請求項３３に記載の核酸配列。
【請求項３６】
請求項３３から３５のうちのいずれか１項に記載の単離された核酸配列を含むベクター。
【請求項３７】
請求項３６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３８】
前記核酸を発現し、前記抗体が産生されるように請求項３７に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を産生する工程。
【請求項３９】
請求項１から１８もしくは２２から３０のうちのいずれか１項に記載の抗体もしくは抗原結合性フラグメント、または請求項３１に記載の抗体複合体を薬学的に許容される担体もしくは賦形剤と共に含む、医薬組成物。
【請求項４０】
抗ガン薬剤もしくは治療剤、血管新生の阻害剤または免疫変調成分から成る群から選抜される薬剤と同時にまたは連続して投与される、請求項３９に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
対象における望ましくない細胞増殖または細胞増殖性疾患を治療する方法であって、請求項１から１８もしくは２２から３０のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、または請求項３１に記載の複合物の治療上有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項４２】
対象における疾患を診断する方法であって、前記対象または前記対象から得られたサンプルと、請求項１から１８もしくは２２から３０のいずれか１項に記載の抗体もしくは抗原結合性フラグメント、または請求項３１に記載の複合物とを接触させること、およびヒトｃ−Ｍｅｔと抗体または複合物との間の結合に関して前記対象またはサンプルを解析すること、を含む方法。
【請求項４３】
請求項１から１８もしくは２２から３０のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメントまたは請求項３１に記載の抗体複合物の、対象における望ましくない細胞増殖を減少させるか、細胞増殖性疾患を調節するか、治療するための薬剤の製造における使用。
【請求項４４】
薬学的に許容される担体または賦形剤と一緒に、配列ＲＨＦＱＳＣＳＱＣＬＳＡＰＰＦＶＱＣＧＷ（配列番号５）またはＲＨＦＱＳＣＳＱＣＬＳＡＰＰＦ（配列番号６）を含む、またはそれらから成る、ワクチン抗原。
【請求項４５】
抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を得るために動物を免疫化する方法であって、配列番号１の配列を含む切断ｃ−Ｍｅｔ抗原フラグメントをｃ−Ｍｅｔを過剰発現する細胞と連続して、または一緒に前記動物に投与することを含む、方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の免疫処置方法により産生された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項４７】
癌細胞における化学療法剤に対する耐性の克服または軽減に使用される、請求項１から１８もしくは２２から３０のうちのいずれか１項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連案件の相互参照
本出願は、２０１０年６月１日に出願された米国特許出願第６１／３９６，６９１号、および２０１０年１１月３日に出願されたオーストラリア特許出願第２０１０９０４９０３号に基づき優先権を主張する。これら文献の全内容を参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
本発明は、ｃ−Ｍｅｔのα鎖またはβ鎖に特異的に結合する抗体に関する。これらの抗体は、癌の診断および治療に、または癌細胞に成分を送達するための薬として有益である。本発明の抗体も化学療法または抗癌剤と組み合わせて治療に使用されてもよい。
【背景技術】
【０００３】
受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、多細胞生物の細胞の成長および維持にとって不可欠な細胞間シグナルを媒介する。ＲＴＫの最小ドメイン構造は、細胞外のリガンド結合ドメイン構造、１回膜貫通ヘリックス、および細胞質のチロシンキナーゼ（ＴＫ）ドメインから成る。
【０００４】
ｃ−Ｍｅｔ（上皮間葉移行因子）は、細胞表面の、ｃ−Ｍｅｔ原癌遺伝子によりコードされるジスルフィド結合したヘテロ二量体のＲＴＫである。ｃ−Ｍｅｔ受容体はまた肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）とも呼ばれる。これは肝細胞増殖因子／分散因子（ＨＧＦ／ＳＦ）の受容体であり、これは上皮コロニーおよび細胞遊走（ＳＦ）の分散を引き起こすタンパク質として、また肝臓細胞の分裂促進因子（ＨＧＦ）として見出された大型のポリペプチド増殖因子である。
【０００５】
ｃ−Ｍｅｔ受容体は１７０ｋＤａ前駆体として合成され、グリコシル化され、ポストゴルジコンパートメントにおいて細胞外の５０ｋＤａのα鎖、および、ＴＫドメインを含む細胞外／細胞内の１４５ｋＤａのβ鎖へとタンパク分解的に切断される。これらの鎖は、ジスルフィド結合により切断後も結合し続け、ヘテロ二量体の分子となる。ｃ−ＭｅｔのＨＧＦ／ＳＦおよびヘパリン結合部位は、α鎖（アミノ酸２５−３０７）およびβ鎖の最初の２１２個のアミノ酸（アミノ酸３０８〜５１９）に及ぶ大きなＮ末端ドメインの内に含まれる。残基５２０−５６１の中に、システインリッチなドメインがある。このドメインもｃ−ＭｅｔのＣ末端の半分（アミノ酸５６２−９３２）も、ＨＧＦ／ＳＦまたはヘパリンに直接結合しない。
【０００６】
ｃ−Ｍｅｔの細胞外の部分は、セマフォリン（ｃ−Ｍｅｔの完全なα鎖、およびβ鎖のＮ末端部分を含むＳｅｍａドメイン）に対する相同領域、システインリッチなｃ−Ｍｅｔ関連配列（ＭＲＳ）とそれに続くグリシン−プロリン−リッチ（Ｇ−Ｐ）なリピート、および４つの免疫グロブリン様構造を含んでいる。ｃ−Ｍｅｔの細胞内領域は３つの領域を含んでいる：（ｉ）（ａ）タンパク質キナーゼまたはＣａ２＋カルモジュリン依存性キナーゼによりリン酸エステル化されると受容体キナーゼ活性を下方制御するセリン残基（Ｓｅｒ９８５）と（ｂ）Ｍｅｔポリユビキチン鎖形成、細胞内取込および分解の原因であるユビキチン連結酵素Ｃｂｌを結合するチロシン（Ｔｙｒ１００３）とを含む膜近傍のセグメント；（ｉｉ）受容体活性化で、Ｔｙｒ１２３４およびＴｙｒ１２３５のトランスリン酸化を起こすチロシンキナーゼドメイン；ならびに（ｉｉｉ）Ｓｒｃホモロジー（ＳＨ２）ドメインを含むいくつかの下流のアダプターを使用できる多基質結合部位を表わす変性されたモチーフに挿入された２つの重大なチロシン（Ｔｙｒ１３４９およびＴｙｒ１３５６）を含むＣ末端部分。Ｇｅｎｔｉｌｅ，Ａら（２００８）に構造の詳細な説明を見ることができる。
【０００７】
ｃ−Ｍｅｔ発現およびシグナル伝達
典型的には、ｃ−Ｍｅｔ発現は上皮型の由来細胞において見られる一方、ＨＧＦ／ＳＦが周囲の間葉で発現している。成長期には、ｃ−Ｍｅｔは胎盤、肝臓、腎、神経のおよび骨格筋の適切な成長に必要とされる。成人では、ｃ−Ｍｅｔ発現は抗原選択におけるＢ細胞性の成長を含む血球新生において役割を果たし、組織傷害中に上方制御される。
【０００８】
ＨＧＦ結合に際して、ｃ−ＭｅｔはそのＴＫドメインの活性化に結びつく、ホモ二量体となり、Ｃ末端の残基Ｙ１３４９およびＹ１３５６を含むいくつかのチロシン残基を自己リン酸化する。リン酸エステル化されたＹ１３４９およびＹ１３５６は、いくつかのアダプタータンパクを結合することができる多基質結合部位（Ｙ１３４９ＶＨＶＸＸＸＹ１３５６ＶＮＶ）を形成し、ＰＩ３Ｋ／ＡｋｔおよびＲａｓ／ＭＡＰＫの経路を一般に使用して、下流シグナル伝達を開始する（Ｅｄｅｒ  ＪＰら，２００９，およびＢｉｒｃｈｍｅｉｅｒ  Ｃら，２００３）。多基質結合部位はｃ−Ｍｅｔシグナル伝達に必ず必要である。
【０００９】
ｃ−Ｍｅｔの膜近傍のドメインはさらに調節的役割を果たす。Ｅ３ユビキチンリガーゼ、ＣＢＬのようなタンパク質を結合すると、このドメイン内のＹ１００３のリン酸エステル化がｃ−Ｍｅｔ下方制御に関与する。ＣＢＬの結合により、さらにｅｎｄｏｐｈｉｌｉｎ−ＣＩＮ８５複合体を採用し、ｃ−Ｍｅｔ内部移行および分解がもたらされる（Ｍａら、２００３）。膜近傍のドメイン内のＳ９７５のリン酸エステル化もｃ−Ｍｅｔ内部移行に関与し、タンパク質キナーゼおよびＣａ２＋カルモジュリン依存性キナーゼによりリン酸エステル化されたことが示された。ｃ−Ｍｅｔの内部移行はＥＲＫ信号伝達に必要である。
【００１０】
ｃ−Ｍｅｔのリガンド活性化に加えて、ｃ−Ｍｅｔおよび他の受容体の間のクロストークからのシグナル誘導もある。ｃ−Ｍｅｔは、腫瘍細胞ではそのリガンドの存在に関係なく、ＥＧＦＲと免疫共沈降する。
【００１１】
癌におけるｃ−Ｍｅｔの役割
ｃ−Ｍｅｔ受容体チロシンキナーゼは細胞の遊走、侵襲、増殖および血管新生等の癌に連鎖的な複数の経路に関与し、多くの癌で上方制御される（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，ＪＧら，（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔ  ２２５：１−２６；Ｊｉａｎｇ，ＷＧら，（２００５）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｎｃｏｌ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ５３：３５−６９）。ｃ−Ｍｅｔは、１９８４年に癌遺伝子として最初に同定され、ヒト癌において最も頻繁に発現される癌遺伝子の１つである。ｃ−Ｍｅｔの変化または脱制御（変異、発現、増幅の変化）は多数のタイプのヒト癌、例えば腎、肝臓、胃、結腸、胸、脳、前立腺、卵巣、肺臓、膀胱、頭頸部、甲状腺、に関連している（Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ，Ｃら，（２００３）Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ４：９１５−９２５；Ｃｏｒｓｏ  Ｓら，（２００５）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １１：２８４−９２；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ＪＧ．，ら（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ  ２２５：１−２６；Ｓａｌｇｉａ，Ｒ（２００９）Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３６（２補遺１）Ｓ５２−５８；Ｅｎｇｅｌｍａｎ  ＪＡ．ら（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１６：１０３９−１０４３；ｖａｉ．ｏｒｇ／ｖａｒｉ／ｍｅｔ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ）。リガンド非依存のｃ−Ｍｅｔ変異体を産生する遺伝子変化は遺伝性および散発性の乳頭状腎細胞癌において発見されており、ｃ−Ｍｅｔのチロシンキナーゼドメインにおける変異を伴う（Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｌら，（１９９７）Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １６：６８−７３；Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｌら，（１９９９）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：２３４３−５０；Ｄｈａｒｍａｗａｒｄａｎａ  ＰＧら，（２００４）Ｃｕｒｒ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ４：８５５−６８）。ｃ−Ｍｅｔ（主にキナーゼドメイン内）におけるミスセンス変異も、卵巣癌、小児期肝細胞癌、転移性頭頸部扁平上皮癌、および胃癌において同定された（Ｇｅｎｔｉｌｅら，２００８；Ｍａら，２００３）。メラノーマ、ならびに肺小細胞癌および中皮腫等の胸部悪性病変において、ｃ−Ｍｅｔ変異は、主にＳＥＭＡおよび膜近傍のドメインに集中している。（Ｍａ  ＰＣら，２００３，Ｐｕｒｉ  Ｎら，２００７およびＪａｇａｄｅｅｓｗａｒａｎ  Ｒら，２００６）。
【００１２】
ｃ−Ｍｅｔに影響を及ぼす最も一般的な遺伝子変異は、ｃ−Ｍｅｔの過剰発現に結びつく遺伝子増幅である。ｃ−Ｍｅｔの過剰発現は、乳癌、胃癌、子宮頚部癌、肝細胞癌、脳腫瘍および頭頸部癌等、多数のヒトの腫瘍に認められており（ｗｗｗ．ｖａｉ．ｏｒｇ／ｍｅｔ）、リガンド非依存のリン酸化酵素活性化に結びついている可能性もある。卵巣癌の約２５％および神経膠腫の１１％は、高レベルのｃ−Ｍｅｔを発現する。癌では、ｃ−Ｍｅｔの活性化がリガンド依存性のメカニズムによって生じることが最も多い。グリア芽腫および多発性骨髄腫で典型的に見られるように、この刺激は多くの場合自己分泌である。
【００１３】
ＨＧＦ：ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達軸は、現在利用可能な治療では治療するのが困難な致死性の脳腫瘍である多形性神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ）等、いくつかの高悪性度の癌の開始および進行に重要な役割を果たしている。ｃ−ｍｅｔ遺伝子はＧＢＭ（ＭｃＬｅｎｄｏｎ  Ｒら，２００８）のおよそ４％で増幅されているが、高悪性度のＧＢＭでは過剰発現され、ＨＧＦと共発現されることが多い。ＧＢＭにおけるｃ−Ｍｅｔの過剰発現は、患者の無増悪生存期間および全生存期間を減少させる（Ｄｏｏ−Ｓｉｋ  Ｋｏｎｇら，２００９）。
【００１４】
ｃ−Ｍｅｔの標的化
ｃ−Ｍｅｔは、進行型のヒト癌において最も頻繁に遺伝子改変された、または調節不全の受容体チロシンキナーゼの１つであり、したがって治療標的として徹底的に研究されており、いくつかのクラスの薬剤が新規治療薬として開発中である。この中には低分子量のチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）があり、これはＴＫドメインに対するＡＴＰ結合競合剤として作用することでｃ−Ｍｅｔの活性化を阻止する。これらのＴＫＩは抗腫瘍作用を有することがインビトロおよびインビボの両方で示されており（Ｓｔｅｌｌｒｅｃｈｔら，２００９，Ｅｄｅｒ  ＪＰら，２００９，Ｃｏｍｏｇｌｉｏ  ＰＭら，２００８；Ｔｓｅｎｇ  ＪＲら，（２００８）におけるレビュー）、現在いくつかの候補が治験で評価されている。ｃ−Ｍｅｔの標的化に使用されたアプローチには他に、ｃ−ｍｅｔ発現を標的にする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびリボザイムの使用がある。ＲＴＫ阻害剤には、ｃ−Ｍｅｔ特異的なものと、より一般的なチロシンキナーゼ阻害薬とがあり、Ｋ２５２ａ，ＳＵ１１２７４（Ｓｕｇｅｎ），ＰＨ−６６５７５２（Ｐｆｉｚｅｒ），ＡＲＱ１９７（ＡｒＱｕｌｅ），ＸＬ８８０（Ｅｘｅｌｅｓｉｓ），ＭＰ４７０（ＳｕｐｅｒＧｅｎ）が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００１５】
別のクラスの治療薬はｃ−ＭｅｔまたはＨＧＦに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）である。本発明者らおよび他は、ＨＧＦに対する完全ヒト中和抗体であるＡＭＧ１０２を用いたＵ８７ＭＧ  ＧＢＭ異種移植片の治療により、腫瘍成長が有意に阻害されることを示した（Ｂｕｒｇｅｓｓ  Ｔら，２００６，Ｐｉｌｌａｙ  Ｖら，２００９）。抗ｃ−Ｍｅｔ抗体のアゴニスト活性は多くの場合、受容体二量体化とひいてはリン酸化酵素活性化とを誘導する抗体によるものである。
【００１６】
Ｐｒａｔ  Ｍら，１９９１、およびＰｅｔｒｅｌｌｉ  Ａら，２００６に記載のＤＮ３０は、ｃ−Ｍｅｔのβ鎖に結合するモノクローナル抗体である。抗体は、受容体のリン酸エステル化を誘導はしても、ｃ−Ｍｅｔの下流の生体への作用全体を活性化しないため、部分的アゴニストとして作用する。したがって、抗体が、二重のタンパク分解的切断を伴うメカニズムによって、ｃ−Ｍｅｔ受容体の下方制御を引き起こすことが分かった。ｃ−Ｍｅｔ下方制御作用はＨＧＦに依存するように見える（Ｐｅｔｒｅｌｌｉ  Ａら，２００６）。この抗体がｃ−Ｍｅｔ受容体の初期活性化を引き起こすという事実は、治療には問題となる。
【００１７】
さらなるモノクローナルＭＥＴ４はＫｎｕｄｓｅｎら，２００９および国際公開第０９／０２９５９１号において記載されている。この抗体は、アミノ酸２３６−２４２でヒトｃ−Ｍｅｔタンパク質のα鎖の上のエピトープを認識する。抗体は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織における免疫組織化学的検査によりｃ−Ｍｅｔを認識する診断薬として開発された。これらの開示はどちらも、この抗体が抗腫瘍活性を示すかどうかに関して何も触れていない。  
【００１８】
ＯＡ−５Ｄ５は、マウス重鎖および軽鎖可変ドメインならびにヒトｌｇＧ１定常ドメインを含む片腕のモノクローナル抗Ｍｅｔ抗体である。この抗体はＯｈａｓｈｉら，２０００およびＧｅｎｅｎｔｅｃｈに付与された国際公開第０６／０１５３７１号において記載されている。ＯＡ−５Ｄ５は完全に作動薬の抗ｃ−Ｍｅｔ  ｍＡｂ由来であり、インビボのＨＧＦ依存性ＧＢＭ異種移植片の成長を強く阻害するが、ＨＧＦ非依存性のＧＢＭ異種移植片には効果を示さない（Ｍａｒｔｅｎｓ  Ｔら，２００６）。
【００１９】
最近では、抗ｃ−ＭｅｔのＦａｂ分子Ｒ１３およびＲ２８の生成が報告された（ｖａｎ  ｄｅｒ  ｈｏｒｓｔ  ＥＨら，２００９）。これらのＦａｂ’は、Ｒ２８エピトープを安定化する構造へｃ−Ｍｅｔを固定するＲ１３の初期結合を通じて一緒に作用する。次いで、Ｒ２８は、ＨＧＦ結合をブロックするためにｃ−Ｍｅｔに結合する。
【００２０】
さらに、Ｐｆｉｚｅｒ  ＣＥ−３５５６２１抗体は、Ｕ８７ＭＧマウス異種移植モデルにおいて有効性を示した（Ｔｓｅｎｇら（２００８））。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】米国特許出願第６１／３９６，６９１号
【特許文献２】オーストラリア特許出願第２０１０９０４９０３号
【特許文献３】国際公開第０９／０２９５９１号
【特許文献４】国際公開第０６／０１５３７１号
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Ｇｅｎｔｉｌｅ，Ａら（２００８）
【非特許文献２】Ｅｄｅｒ  ＪＰら，２００９
【非特許文献３】Ｍａら、２００３
【非特許文献４】Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，ＪＧら，（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔ  ２２５：１−２６
【非特許文献５】Ｊｉａｎｇ，ＷＧら，（２００５）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｎｃｏｌ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ５３：３５−６９
【非特許文献６】Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ，Ｃら，（２００３）Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ４：９１５−９２５
【非特許文献７】Ｃｏｒｓｏ  Ｓら，（２００５）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １１：２８４−９２
【非特許文献２】Ｓａｌｇｉａ，Ｒ（２００９）Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３６（２補遺１）Ｓ５２−５８
【非特許文献８】Ｅｎｇｅｌｍａｎ  ＪＡ．ら（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１６：１０３９−１０４３
【非特許文献９】ｖａｉ．ｏｒｇ／ｖａｒｉ／ｍｅｔ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ
【非特許文献１０】Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｌら，（１９９７）Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １６：６８−７３
【非特許文献１１】Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｌら，（１９９９）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：２３４３−５０
【非特許文献１２】Ｄｈａｒｍａｗａｒｄａｎａ  ＰＧら，（２００４）Ｃｕｒｒ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ４：８５５−６８
【非特許文献１３】Ｍａ  ＰＣら，２００３
【非特許文献１４】Ｐｕｒｉ  Ｎら，２００７
【非特許文献１５】Ｊａｇａｄｅｅｓｗａｒａｎ  Ｒら，２００６
【非特許文献１６】ｗｗｗ．ｖａｉ．ｏｒｇ／ｍｅｔ
【非特許文献１７】ＭｃＬｅｎｄｏｎ  Ｒら，２００８
【非特許文献１８】Ｄｏｏ−Ｓｉｋ  Ｋｏｎｇら，２００９
【非特許文献１９】Ｓｔｅｌｌｒｅｃｈｔら，２００９
【非特許文献２０】Ｃｏｍｏｇｌｉｏ  ＰＭら，２００８
【非特許文献２１】Ｔｓｅｎｇ  ＪＲら，（２００８）
【非特許文献２２】Ｂｕｒｇｅｓｓ  Ｔら，２００６
【非特許文献２３】Ｐｉｌｌａｙ  Ｖら，２００９
【非特許文献２４】Ｐｒａｔ  Ｍら，１９９１
【非特許文献２５】Ｐｅｔｒｅｌｌｉ  Ａら，２００６
【非特許文献２６】Ｋｎｕｄｓｅｎら，２００９
【非特許文献２７】Ｏｈａｓｈｉら，２０００
【非特許文献２８】Ｍａｒｔｅｎｓ  Ｔら，２００６
【非特許文献２９】ｖａｎ  ｄｅｒ  ｈｏｒｓｔ  ＥＨら，２００９
【非特許文献３０】Ｔｓｅｎｇら（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
これらの文献において証明されたように、抗腫瘍療法のターゲットとしてのｃ−Ｍｅｔに対する強い関心が明らかに存在し、様々なアプローチが、現在調査されている。あらゆる受容体アゴニスト活性がない状況で腫瘍細胞上のｃ−Ｍｅｔを標的とすることができる、または特異的にｃ−Ｍｅｔ活性、特にＴＫ活性を阻害する、さらなる特異的抗体に対する明らかなニーズが存在する。
【００２４】
本明細書における参考文献の引用は、そのようなものが本発明に対する先行技術であるという承認として解釈されないものとする。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明につながる作業において、本発明者らは、治療および／または診断試薬として利用するため、ｃ−Ｍｅｔに結合することができる抗体を産生しようと努力した。抗体を産生するために独特の免疫戦略を使用した。この戦略には無傷のヒトｃ−Ｍｅｔ過剰発現細胞とｃ−Ｍｅｔのアミノ酸残基２５−５６７を含むヒトｃ−Ｍｅｔから誘導した精製フラグメントでマウスを免疫化することを含んでいた。フラグメントは、Ｎ末端の余分な３つのアミノ酸残基（ＥＴＲ）およびＣ末端の余分な９つのアミノ酸（ＡＤＬと終末のＨｉｓ６タグ）を含み、配列番号１に記載の配列に対応している。余分なＮ末端およびＣ末端のアミノ酸は、Ｉｇリーダー（Ｎ末端）とインフレームでｃ−Ｍｅｔフラグメントをクローン化すること、および精製（Ｃ末端配列）を可能とする。
【００２６】
免疫プロトコルに使用されたｃ−Ｍｅｔフラグメント内には、Ｎ末端のα鎖（アミノ酸２５−３０７）およびβ鎖（アミノ酸３０８−５１９）の最初の２１２のアミノ酸が配置されている。配列は２つのドメイン、７枚羽根のβプロペラドメインおよびシステインリッチな小さいドメインを含む（Ｇｈｅｒａｒｄｉら、２００３）。βプロペラドメインは現在、適切な「ｓｅｍａ」ドメインとも呼ばれる。βプロペラドメインはｃ−Ｍｅｔ配列のアミノ酸残基５１４で終結し、また、システインリッチなドメインは、ｃ−Ｍｅｔのアミノ酸残基５２０−５６１を含む。短いリンカー（アミノ酸残基５１５−５１９）が２つのドメインを接続する。
【００２７】
構成的にｃ−Ｍｅｔを過剰発現するＡ５４９細胞と生理的に適切なｃ−Ｍｅｔタンパク質フラグメント（配列番号１のフラグメント）とを結合する独特のアプローチを用いて、本発明者らはいくつもの抗体を同定し、機能上の基準に基づいて３つのサブセットに分類した。例えば、本発明者らは、ｃ−Ｍｅｔに結合できる様々な抗体を同定し、そのうち１つはｃ−Ｍｅｔのβ鎖のエピトープを認識し、そのうち６つはｃ−Ｍｅｔのα鎖上に存在するエピトープを明確に認識し、そしてそのうち３つは、立体構造エピトープを認識するように思われる。そのような抗体は、治療および／または診断に適用する際に重要である。
【００２８】
本明細書に同定された抗体は、ｃ−Ｍｅｔのプロセシングされた形態かプロセシングされていない形態かのいずれかに特異的に結合してｃ−Ｍｅｔ受容体の機能または活性を調節することができる合成物を代表するものであり、結果として、ｃ−Ｍｅｔを特徴づけて調節するのに有益な治療および／または診断試薬ならびに癌の治療／検出のための基盤を提供する。更に、本発明による抗体のいくつかは、ｃ−Ｍｅｔ受容体のＨＧＦ依存性およびＨＧＦ非依存性の活性化を阻害することができる。
【００２９】
本発明は、腫瘍細胞の表面に存在するプロセシングされていないｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
【００３０】
プロセシングされていないｃ−Ｍｅｔは、典型的には正常細胞の表面では発見されない。したがって、プロセシングされていないｃ−Ｍｅｔを認識できる抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、腫瘍特異的であることが予想される。ｃ−Ｍｅｔ腫瘍特異的抗体の有用性により、ＴＫ阻害剤、標的ｓｉＲＮＡ、および抗体等のｃ−Ｍｅｔ標的治療剤に対する感応性または感受性があるものとして、腫瘍または癌細胞を同定し、特徴づけるための方法が提供される。そのような腫瘍特異的抗体の有利性は、本発明の当業者に直ちに認識可能であろう。
【００３１】
本発明者らは、細胞表面でｃ−Ｍｅｔのプロセシングされていないｐ１７０形態を特異的に認識するＬＭＨ８０、ＬＭＨ８１およびＬＭＨ８２と命名された３つの抗体を生成した。これらの抗体により認識されたエピトープはいずれも、フューリン切断部位（すなわちαおよびβ鎖を分離する部位）と重ならないことが発見された。抗体ＬＭＨ８０／８１は、ｃ−Ｍｅｔのβ鎖内にαヘリックス構造を結合し、一方ＬＭＨ８２は、ＭＥＴβプロペラドメインの底面上の鎖２ａおよび２ｂを連結するループを結合する。本発明者らは、抗体ＬＭＨ８０および非浸透性免疫蛍光を用いて、ｃ−Ｍｅｔ先駆物質がヒト癌細胞の細胞表面上で発現されることを立証することができたが、これはヒトＳｋＨｅｐ１およびＬｏＶｏ培養細胞株での過去の研究と一致する。（Ｇｏｍｅｓ  ＤＡら，（２００８）；Ｋｏｍａｄａ  Ｍら（１９９３）；Ｍｏｎｄｉｎｏ  Ａら，（１９９１））。さらに、ｃ−Ｍｅｔのプロセシングされていないｐ１７０形態は細胞表面に露出され、ＨＧＦにより活性化され得ることが、癌細胞由来のマウスにより証明されている（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ  ＧＡら，（１９９１）；Ｒｏｎｇ  Ｓら，（１９９２））。ラットの非癌性初代培養肝細胞の非浸透分析により、ｐ１７０は、細胞表面の１２５１−ＨＧＦ結合には利用できなかったことが示唆され（Ｍｉｚｕｎｏ，Ｋら，（１９９３））、これは、ｐ１７０細胞表面発現は癌細胞に特異的であることを強く示唆しており、重要である。本明細所に記載のＬＭＨ８５に対する点状のｃ−Ｍｅｔ染色は、以前に報告されたような細胞表面上のｃ−Ｍｅｔの非共有結合性の集団を示す可能性が高い（Ｆａｌｅｔｔｏ，ＤＬら，（１９９２））。このパターンはＬＭＨ８０に対しても認められたため、ｐ１７０も細胞表面で類似の非共有結合性の集団を形成することを示している可能性がある。したがって、抗体ＬＭＨ８０−８２は、放射線治療剤および化学療法剤を腫瘍へ向け、肝臓のような正常組織を過剰レベルの毒性から保護するのに有用であり得る。更に、ナノ粒子技術が発展するにつれて、これらの抗体は、そのような粒子を腫瘍塊内にさらに保持していくための非常に有用なツールとなり得る。
【００３２】
一実施例においては、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、プロセシングされていないｃ−Ｍｅｔ（ｐ１７０）のα鎖に存在する配列に特異的に結合する。より詳細には、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、プロセシングされていないｃ−Ｍｅｔ上のエピトープ配列ＶＶＤＴＹＹＤＤＱＬ（配列番号２）に特異的に結合する。別の実施例において、抗体は、ＡＴＣＣに寄託され、ＰＴＡ−１１４０６と命名されたハイブリドーマ細胞株で産生された抗体ＬＭＨ８２が結合するエピトープに、特異的に結合する。別の実施例において、抗体は、ＡＴＣＣに寄託され、ＰＴＡ−１１４０６と命名されたハイブリドーマ細胞株で産生されたＬＭＨ８２である。
【００３３】
別の実施例において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、
（ｉ）相補性決定領域（ＣＤＲ）配列の配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７のそれぞれ、またはそれらの１つもしくは複数に実質的に記載されているアミノ酸配列を含む可変領域を含む免疫グロブリン重鎖、および／または
（ｉｉ）相補性決定領域（ＣＤＲ）配列の配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０のそれぞれ、またはそれらの１つもしくは複数に実質的に記載されているアミノ酸配列を含む可変領域を含む免疫グロブリン軽鎖
を含み、この抗体はｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する。
【００３４】
別の実施例において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、
（ｉ）配列番号２１に少なくとも９０％同一である可変領域のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および／または
（ｉｉ）配列番号２２に少なくとも９０％同一である可変領域のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖
を含む。
【００３５】
好ましい実施例において、免疫グロブリン重鎖は、配列番号２１と少なくとも９３％、９５％、９９％同一の可変領域のアミノ酸配列を含む。またさらなる実施例において、免疫グロブリン重鎖は、配列番号２１に記載の可変領域のアミノ酸配列を含む。
【００３６】
好ましい実施例において、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号２２と少なくとも９３％、９５％、９９％同一の可変領域のアミノ酸配列を含む。またさらなる実施例において、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号２２に記載の可変領域のアミノ酸配列を含む。
【００３７】
別の実施例において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、プロセシングされていないｃ−Ｍｅｔ（ｐ１７０）のβ鎖に存在する配列に特異的に結合する。別の実施例において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、プロセシングされていないｃ−Ｍｅｔ上のエピトープ配列ＲＨＦＱＳＣＳＱＣＬＳＡＰＰＦＶＱＣＧＷ（配列番号５）またはエピトープ配列ＲＨＦＱＳＣＳＱＣＬＳＡＰＰＦ（配列番号６）に特異的に結合する。別の実施例において、抗体は、ＡＴＣＣに寄託され、ＰＴＡ−１１４０５と命名されたハイブリドーマ細胞株で産生された抗体ＬＭＨ８０が結合するエピトープに特異的に結合する。別の実施例において、抗体は、ＡＴＣＣに寄託され、ＰＴＡ−１１４０５と命名されたハイブリドーマ細胞株で産生されたＬＭＨ８０である。
【００３８】
別の実施例において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、
（ｉ）相補性決定領域（ＣＤＲ）配列の配列番号７、配列番号８および配列番号９のそれぞれ、またはそれらの１つもしくは複数に実質的に記載されているアミノ酸配列を含む可変領域を含む免疫グロブリン重鎖、および／または
（ｉｉ）相補性決定領域（ＣＤＲ）配列の配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２のそれぞれ、またはそれらの１つもしくは複数に実質的に記載されているアミノ酸配列を含む可変領域を含む免疫グロブリン軽鎖を含み、この抗体はｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する。
【００３９】
別の実施例において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、
（ｉ）配列番号１３に少なくとも９０％同一である可変領域のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および／または
（ｉｉ）配列番号１４に少なくとも９０％同一である可変領域のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含む。
【００４０】
好ましい実施例において、免疫グロブリン重鎖は、配列番号１３と少なくとも９３％、９５％、９９％同一の可変領域のアミノ酸配列を含む。またさらなる実施例において、免疫グロブリン重鎖は、配列番号１３に記載の可変領域のアミノ酸配列を含む。
【００４１】
好ましい実施例において、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号１４と少なくとも９３％、９５％、９９％同一の可変領域のアミノ酸配列を含む。またさらなる実施例において、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号１４に記載の可変領域のアミノ酸配列を含む。
【００４２】
本発明者らは、思いがけず、本発明の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体のあるものは、受容体の自己活性化を引き起こすことなくｃ−Ｍｅｔ受容体の下方制御を誘導することができることを発見した。従来技術の抗体は典型的には受容体活性化を引き起こし、したがって、アゴニストとして機能するか、または受容体を最初に活性化させてから下方制御させる部分アゴニストとして作用する。ちなみに、ｃ−Ｍｅｔ受容体の自己活性化を誘導する抗体が網膜の問題を引き起こす場合があることが分かった。さらに、本発明の抗体が、ｃ−Ｍｅｔ受容体のリガンド依存性および非リガンド依存性の活性化を阻害することがわかった。したがって最初の自己活性化が全くない状態でｃ−Ｍｅｔ受容体の下方制御を誘導することができる抗体は、癌治療において、重大な副作用または毒性をもたらさずに有効性を増強する可能性を含めて、とりわけ有利である。例えば、使用において毒性のリスクが無く、副作用も少ない抗体濃度を高くすることができる。標準的な治療と比較して、副作用の少ない治療薬を設計できるため、特に効果的で望ましい薬剤を臨床医に提供することができる。
【００４３】
したがって本発明は、腫瘍細胞上のｃ−Ｍｅｔに特異的に結合し、ｃ−Ｍｅｔ受容体が活性化していない状況で受容体の下方制御を誘導する、単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。特に、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、受容体の自己活性化またはＨＧＦリガンドの存在に関係なくｃ−Ｍｅｔ受容体の下方制御を誘導する。
【００４４】
一実施例において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、コア配列ＤＶＬＰＥＦＲＤＳＹ（配列番号４）から成るｃ−Ｍｅｔのα鎖のエピトープ配列に特異的に結合する。またさらなる実施例において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号２９に記載の可変領域のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および／または配列番号３０に記載の可変領域のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含む。
【００４５】
別の実施例において、本発明は、受容体が活性化していない状況でｃ−Ｍｅｔ受容体の下方制御を誘導する抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供し、この抗体は、配列番号２９に記載の可変領域のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および／または配列番号３０に記載の可変領域のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含む。
【００４６】
本発明の分野の当業者は所与の抗体またはその抗原結合性フラグメントがｃ−Ｍｅｔ受容体の下方制御／分解を誘導することができるかどうかを決定することができるだろう。そのような分析には、本明細書の実施例において記載されているものが含まれる。
【００４７】
本発明はまた、
（ｉ）配列番号２９に少なくとも９０％同一である可変領域のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および／または
（ｉｉ）配列番号３０に少なくとも９０％同一である可変領域のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖：
を含み、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
【００４８】
抗体またはその抗原結合性フラグメントが、受容体が活性化していない状態でｃ−Ｍｅｔ受容体の下方制御を誘導することが好ましい。
【００４９】
好ましい実施例において、免疫グロブリン重鎖は、配列番号２９と少なくとも９３％、９５％、９９％同一の可変領域のアミノ酸配列を含む。またさらなる実施例において、免疫グロブリン重鎖は、配列番号２９に記載の可変領域のアミノ酸配列を含む。
【００５０】
好ましい実施例において、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号３０と少なくとも９３％、９５％、９９％同一の可変領域のアミノ酸配列を含む。またさらなる実施例において、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号３０に記載の可変領域のアミノ酸配列を含む。
【００５１】
本発明はまた、
（ｉ）相補性決定領域（ＣＤＲ）配列の配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５のそれぞれ、またはそれらの１つもしくは複数に実質的に記載されているアミノ酸配列を含む可変領域を含む免疫グロブリン重鎖、および／または
（ｉｉ）相補性決定領域（ＣＤＲ）配列の配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８のそれぞれ、またはそれらの１つもしくは複数に実質的に記載されているアミノ酸配列を含む可変領域を含む免疫グロブリン軽鎖
を含み、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
【００５２】
抗体またはその抗原結合性フラグメントが、受容体が活性化していない状態でｃ−Ｍｅｔ受容体の下方制御を誘導することが好ましい。
【００５３】
別の実施例において、上記による抗原結合性フラグメントは、
（ｉ）配列番号２９の可変領域のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖：および／または
（ｉｉ）配列番号３０の可変領域のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖
を含むｓｃＦＶである。
【００５４】
本発明の分野の当業者は、腫瘍細胞上のｃ−Ｍｅｔ受容体の下方制御が細胞増殖および侵襲の阻害およびアポトーシス誘導をもたらすことを理解するであろう。
【００５５】
したがって、本発明は対象における腫瘍細胞の細胞増殖を阻害する方法を提供し、この方法は、受容体が活性化していない状態でｃ−Ｍｅｔ受容体の下方制御を誘導する本発明による抗体またはその抗原結合性フラグメントを対象に投与することを含む。一実施例において、抗体は、配列番号２９を含む可変領域のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および／または配列番号３０を含む可変領域のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含むＬＭＨ８７である。
【００５６】
別の実施例では、対象における腫瘍細胞の細胞増殖を阻害する方法は、対象に単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントを投与することを含み、この抗体は、
（ｉ）相補性決定領域（ＣＤＲ）配列の配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５のそれぞれ、またはそれらの１つもしくは複数に実質的に記載されているアミノ酸配列を含む可変領域を含む免疫グロブリン重鎖、および／または
（ｉｉ）相補性決定領域（ＣＤＲ）配列の配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８のそれぞれ、またはそれらの１つもしくは複数に実質的に記載されているアミノ酸配列を含む可変領域を含む免疫グロブリン軽鎖
を含む。
【００５７】
抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ｃ−Ｍｅｔ受容体の下方制御／分解の誘導により細胞増殖を阻害することが好ましい。
【００５８】
別の実施例において、ｃ−Ｍｅｔ受容体の下方制御／分解の誘導による腫瘍細胞増殖を阻害する方法は、対象に抗体ＬＭＨ８７に基づくｓｃＦｖを投与することにより達成される。
【００５９】
別の実施例において、ｃ−Ｍｅｔ受容体の下方制御／分解の誘導による腫瘍細胞増殖を阻害する方法は、ＬＭＨ８７と同一のエピトープ配列に結合する抗体ＬＭＨ８８を対象に投与することにより達成される。
【００６０】
抗体またはその抗原結合性フラグメントは、１つまたは複数の他の治療剤と一緒に投与してもよい。好適な他の治療剤の例としては、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）受容体を標的とする薬剤、老化関連受容体様キナーゼ（ＳＡＲＫ）または抗血管新生薬剤を標的とする薬剤が挙げられる。
【００６１】
本発明はまた、ｃ−Ｍｅｔのαまたはβ鎖上に存在するエピトープに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供し、このエピトープは、ＶＶＤＴＹＹＤＤＱＬ（配列番号２）、ＶＲＲＬＫＥＴＫＤＧＦＭＦＬＴ（配列番号３）、ＤＶＬＰＥＦＲＤＳＹ（配列番号４）、およびＲＨＦＱＳＣＳＱＣＬＳＡＰＰＦ（配列番号６）から成る群から選抜されるアミノ酸配列を含む、または基本的にこのアミノ酸配列から成る。
【００６２】
一実施例において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ｃ−Ｍｅｔのエピトープ配列ＲＨＦＱＳＣＳＱＣＬＳＡＰＰＦＶＱＣＧＷ（配列番号５）に特異的に結合する。実施例において、抗体は、配列ＤＶＬＰＥＦＲＤＳＹ（配列番号４）から成るコアエピトープ配列に結合する。
【００６３】
別の実施例において、抗体またはその抗原結合性フラグメントはコアエピトープ配列ＶＲＲＬＫＥＴＫＤＧＦＭＦＬＴ（配列番号３）に特異的に結合する。別の実施例において、抗体は、抗体ＬＭＨ８４が結合するエピトープ配列ＶＲＲＬＫＥＴＫＤＧＦＭＦＬＴ（配列番号３）に特異的に結合する。
【００６４】
本発明による抗体は、様々な強さの親和性でｃ−Ｍｅｔ受容体に結合する。一実施例において、本発明は、約１０−３５ｎＭの範囲の親和性で配列ＲＨＦＱＳＣＳＱＣＬＳＡＰＰＦＶＱＣＧＷ（配列番号５）を含むｃ−Ｍｅｔのエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。別の実施例において、本発明は、低親和性、好ましくは５ｎＭ未満、より詳細には３ｎＭ未満の親和性で配列ＤＶＬＰＥＦＲＤＳＹ（配列番号４）を含むｃ−Ｍｅｔのエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。特定の一実施例において、本発明はエピトープ配列ＤＶＬＰＥＦＲＤＳＹ（配列番号４）に結合し、配列番号２９および配列番号３０それぞれに記載の重鎖および軽鎖可変領域の配列を含むＬＭＨ８７と命名された抗体を提供する。別の実施例、において、本発明は、高親和性、好ましくは７０ｎＭ超、より詳細には７５ｎＭ超の親和性で配列ＤＶＬＰＥＦＲＤＳＹ（配列番号４）を含むｃ−Ｍｅｔのエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。抗原結合親和性をアッセイする方法は当技術分野において周知であり、最大半量結合アッセイ、拮抗実験、ＢＩＡｃｏｒｅおよびスキャチャード解析を含む。
【００６５】
別の実施例において、本発明は、コアエピトープ配列ＤＶＬＰＥＦＲＤＳＹ（配列番号４）から成るｃ−Ｍｅｔのエピトープに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供し、この抗体は、寄託番号ＰＴＡ−７６８０でＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株により産生されたＭｅｔ４抗体ではない。
【００６６】
本発明は、さらにＶＶＤＴＹＹＤＤＱＬ（配列番号２）、ＶＲＲＬＫＥＴＫＤＧＦＭＦＬＴ（配列番号３）、ＤＶＬＰＥＦＲＤＳＹ（配列番号４）、ＲＨＦＱＳＣＳＱＣＬＳＡＰＰＦＶＱＣＧＷ（配列番号５）およびＲＨＦＱＳＣＳＱＣＬＳＡＰＰＦ（配列番号６）から成る群から選抜されたエピトープへの本発明の抗体の結合を競合的に阻害できる抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
【００６７】
本発明はさらに、本明細書で記述するように本発明の抗体、例えば、ＬＭＨ８０、ＬＭＨ８２、ＬＭＨ８４、ＬＭＨ８５またはＬＭＨ８７と命名された抗体を競合的に阻害できる抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
【００６８】
本発明は、さらにｃ−Ｍｅｔ受容体のアゴニストである抗体を提供する。一実施例において、本発明は、
（ｉ）配列番号３７に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む可変領域を含む免疫グロブリン重鎖、および／または
（ｉｉ）配列番号３８に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む可変領域を含む免疫グロブリン軽鎖
を含み、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する、アゴニスト抗ｃ−Ｍｅｔ抗体ＬＭＨ８５を提供する。
【００６９】
好ましい実施例において、免疫グロブリン重鎖は、配列番号３７と少なくとも９３％、９５％、９９％同一の可変領域のアミノ酸配列を含む。またさらなる実施例において、免疫グロブリン重鎖は、配列番号３７に記載の可変領域のアミノ酸配列を含む。
【００７０】
好ましい実施例において、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号３８と少なくとも９３％、９５％、９９％同一の可変領域のアミノ酸配列を含む。またさらなる実施例において、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号３８に記載の可変領域のアミノ酸配列を含む。
【００７１】
別の実施例において、本発明はさらに、
（ｉ）配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３に記載の相補性決定領域（ＣＤＲ）のそれぞれ、またはそれらの１つもしくは複数に実質的に記載されているアミノ酸配列を含む可変領域を含む免疫グロブリン重鎖、および／または
（ｉｉ）配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６に記載の相補性決定領域（ＣＤＲ）のそれぞれ、またはそれらの１つもしくは複数に実質的に記載されているアミノ酸配列を含む可変領域を含む免疫グロブリン軽鎖
を含み、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する、アゴニスト抗ｃ−Ｍｅｔ抗体ＬＭＨ８５を提供する。
【００７２】
驚いたことに、本発明者らは、ｃ−ＭｅｔのＨＧＦ活性化をブロックすることにより、ＬＭＨ８５に基づくｓｃＦｖがアンタゴニスト活性を示すことを発見した。したがって、本発明はさらに配列番号３７の可変領域配列を含む免疫グロブリン重鎖、および配列番号３８の可変領域配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含むｓｃＦｖを提供する。
【００７３】
本発明はさらに、薬剤、好ましくは検出可能な標識もしくは機能性標識、または治療薬に結合された本発明による抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、またはｓｃＦｖのうちのいずれかを提供する。特に好ましい抗体は、抗体ＬＭＨ８０、ＬＭＨ８１またはＬＭＨ８２により例示されるようなｃ−Ｍｅｔのプロセシングされていない形態に特異的に結合するものである。
【００７４】
治療薬は抗体に直接または間接的に結合され得る。治療薬の例には、これらに限定するものではないが、細胞毒、放射性同位体（例えば、ヨウ素１３１、イットリウム９０またはインジウム−１１１）、免疫調節剤、血管新生抑制物質、抗新血管新生および／または他の血管新生化薬剤、トキシン、抗増殖性の薬剤、アポトーシス促進性の薬剤、化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害薬および治療用核酸がある。
【００７５】
本発明による抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってもよい。抗体またはその抗原結合性フラグメントは、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であってもよい。あるいは、組み換え方法で抗体を産生してもよい。本明細書に記述された抗体または抗原結合性フラグメントは、ヒト可変領域フレームワーク配列および定常領域配列を含むことが好ましい。
【００７６】
本発明の抗体は、あらゆる抗体クラス、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはサブクラスに属することができる。ＩｇＧの代表的なサブクラスはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４である。
【００７７】
本発明による抗原結合性フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ‘）２、Ｆｖ、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬおよびＶＨドメインフラグメント、ドメイン抗体、三重特異性（Ｆａｂ３）、二重特異性（Ｆａｂ２）、ダイアボディ（（ＶＬ−ＶＨ）２または（ＶＨ−ＶＬ）２）、トリアボディ（三価）、テトラボディ（四価）、ミニボディ（（ｓｃＦｖ−ＣＨ３）２）、二重特異性単鎖Ｆｖ（ビス−ｓｃＦｖ）、ＩｇＧｄｅｌｔａＣＨ２、ｓｃＦｖ−Ｆｃおよび（ｓｃＦｖ）２−Ｆｃから選抜されてもよい。
【００７８】
本発明はさらに、いずれかの実施例による本明細書に記述された抗体または抗原結合性フラグメントをコードする、単離された核酸配列を提供する。したがって、本発明はさらに、本明細書に記述された抗体のヌクレオチド酸配列まで及ぶ。したがって一実施例において、抗体または抗原結合性フラグメントは、配列番号３９の核酸配列を含む免疫グロブリン重鎖の可変領域、および／または配列番号４０の核酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖の可変領域を含む。別の実施例において、抗原結合性フラグメントは、配列番号４１の核酸配列を含む、免疫グロブリン重鎖の可変領域および／または配列番号４２の核酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖の可変領域を含むか、またはこれらから成るｓｃＦｖである。
【００７９】
本発明はさらに、本発明の１つまたは複数の核酸配列を含むベクターを提供する。一実施例において、ベクターは、本明細書に記載された抗体または抗原結合性フラグメントをコードする核酸配列を含む。一実施例において、ベクターは、配列番号３９の配列を含む重鎖可変領域を含む核酸配列、および／または配列番号４０の配列を含む軽鎖可変領域配列を含む。別の実施例において、ベクターは、配列番号４１の配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号４２の配列を含む軽鎖可変領域を含む核酸配列を含む。さらなる実施例において、ベクターは、配列番号１３の配列をコードする重鎖可変領域の核酸配列、および／または配列番号１４の配列をコードする軽鎖可変領域の核酸配列を含む。さらなる実施例において、ベクターは、配列番号２１の配列をコードする重鎖可変領域の核酸配列、および／または配列番号２２の配列をコードする軽鎖可変領域の核酸配列を含む。
【００８０】
本発明は、さらに本発明による抗体またはその抗原結合性フラグメントを発現する本発明の核酸配列を含む、形質転換されたか形質移入された宿主細胞を提供する。宿主細胞は、本発明によるベクターを含むのが好ましい。宿主細胞は、細菌、酵母、植物または動物細胞のようなあらゆる細胞型であり得る。
【００８１】
本発明はさらに、核酸が発現され、抗体が産生されるように本発明の宿主細胞を培養することを含む本発明の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を産生する工程を提供し、この宿主細胞は、本発明の少なくとも１つの核酸配列を含む。一実施例において、１つの隣接する核酸上の２つの別々のオープンリーディングフレームにより免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン重鎖がコードされる。
【００８２】
本発明は、さらに薬学的に許容される担体または賦形剤と一緒に本発明による抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、ｓｃＦｖまたは抗体複合体を含む医薬組成物を提供する。一実施例において、組成物は、配列番号１３、もしくは配列番号２１、もしくは配列番号２９、もしくは配列番号３７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖の可変領域、および／または配列番号１４、配列番号２２、配列番号３０もしくは配列番号３８のアミノ酸配列を含む可変領域を含む免疫グロブリン軽鎖、を含む抗体もしくはその抗原結合性フラグメントを、薬学的に許容される担体または賦形剤と一緒に含む。別の実施例において、組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤と一緒に、本発明によるハイブリドーマ（ＰＴＡ−１１４０５またはＰＴＡ−１１４０６と命名）により産生された抗体を含む。
【００８３】
本発明の組成物は、治療すべき疾患に応じて、単独で、または他の処置、治療剤もしくは薬剤と組み合わせて同時にまたは順次に投与することができる。本発明は、本明細書中に記載された本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントと、抗癌剤もしくは治療剤、血管新生の阻害剤、または免疫変調成分等の他の薬剤もしくは治療剤とを含む組成物を予想し、それを含む。抗癌剤または治療剤は、１つまたは複数の癌治療抗体またはその活性フラグメント（複数可）であってもよい。抗体（複数可）は、癌細胞または腫瘍において変質されるか過剰発現させられる癌抗原またはタンパク質、または受容体に特異的であってもよい。そのような実施形態の代表的なものにおいて、抗癌剤は、抗ＥＧＦＲ薬剤または、抗体（国際公開第０２／０９２７７１号、国際公開第０５／０８１８５４号および国際公開第０９／０２３２６５号に記載されたもの等）であってもよい。より一般的には、これらの抗癌剤は、チロシンキナーゼ阻害剤もしくはリン酸化カスケード阻害剤、翻訳後モジュレーター、細胞増殖阻害剤もしくは細胞分裂阻害剤、およびシグナル伝達阻害剤であり得る。本発明による典型的な抗癌剤は、抗悪性腫瘍薬、例えば、ドキソルビシン、カルボプラチン、テモゾロミドおよびシスプラチンを含む。本発明による典型的な免疫変調成分は、インターロイキン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）および免疫応答を刺激して癌細胞もしくは腫瘍を減少させるか排除するデキサメタゾン等の他の増殖因子、サイトカイン、またはホルモンを含む。
【００８４】
本発明による抗体、その抗原結合性フラグメントまたは複合物は、例えば対象における望ましくない細胞増殖または細胞増殖性疾患を治療する方法であって、本発明の抗体もしくは抗原結合性フラグメント、ｓｃＦｖまたは抗体複合物の治療的有効量を前記対象に投与することを含む方法など、ヒトまたは動物体の治療または診断の方法に使用されてもよい。方法は、癌の治療に使用されることが好ましい。
【００８５】
一実施例において本発明は、対象における疾患を診断する方法を提供し、この方法には、対象または対象から得たサンプルを本発明の抗体、抗体フラグメントもしくは抗体複合体と接触させ、ヒトｃ−Ｍｅｔと抗体または抗体複合体との間の結合に関して対象またはサンプルを解析することが含まれる。方法は、インビトロまたはインビボで実施することができる。したがって本発明は、癌または癌性の病状、特にｃ−Ｍｅｔ媒介癌または腫瘍を診断または監視するための方法を提供する。
【００８６】
一実施例において、この方法は、対象から得た組織または体液の組織学的試料または副画分を使用してインビトロで実施される。さらなる実施例において、この方法は、標識抗体と、任意の有用で適切な造影法または評価法とを使用して、培養された腫瘍生検または試料細胞を使用して、インビボまたはエキソビボで実施される。
【００８７】
本発明はさらに、試料におけるヒトｃ−Ｍｅｔの有無または量を検出する方法を提供し、この方法は試料と本発明の抗体、抗体フラグメントまたは本発明の複合物とを接触させ、ヒトｃ−Ｍｅｔと抗体または複合物との間の結合に関して試料を分析することを含む。
【００８８】
テストできる適切な試料の例としては、血液、血清、血漿のほかに細胞、腫瘍または組織のバイオプシーも挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００８９】
本発明はまた、腫瘍または細胞の試料を特徴づけるための、またはインビトロ、エキソビボおよびインビボの診断検査を含む腫瘍もしくは癌をスクリーニングするためのアッセイにおける、または対象のｃ−Ｍｅｔにより顕在化された細胞増殖性疾患を診断するための試薬の製造における、本発明による抗体またはその抗原結合性フラグメントの使用を提供する。
【００９０】
本発明は、ｃ−Ｍｅｔの存在もしくは活性および／または本発明の抗体の活性もしくは結合を調節するのに有効と思われる薬剤をスクリーニングするためのアッセイシステムを提供する。抗原ペプチドまたは抗体を試験系内に導入することが可能であり、生じた細胞培養内に有望な薬物を導入することも可能であり、次いで培養を検査して、その有望な薬物のみの添加による、または公知の物質（複数可）の添加量の効果による細胞の活性、抗体の結合または、ＨＧＦ反応の活性の量および広がりにおける変化を観察することが可能である。
【００９１】
本発明はまた、本発明による抗体もしくは抗原結合性フラグメント、またはその抗体複合体の薬剤における使用を提供する。例えば、本発明はまた、対象における望ましくない細胞増殖を減少させるため、または細胞増殖性疾患を調節もしくは治療するための薬剤の製造における本発明による抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗体複合体の使用を提供する。薬剤は癌の治療に使用されるのが好ましい。
【００９２】
本発明はさらに、対象の抗腫瘍治療における本発明の抗体複合体の使用を提供する。本発明による治療薬または造影剤を送達するためにこのような複合物を使用できることが理解されよう。
【００９３】
本発明はさらに、対象における望ましくない細胞増殖を阻害する方法を提供し、この方法は、本発明による抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたは本発明による抗体複合体を対象に投与することを含む。一実施例において、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２９または配列番号３７を含む免疫グロブリン重鎖の可変領域配列、および／または配列番号１４、配列番号２２、配列番号３０または配列番号３８を含む免疫グロブリン軽鎖の可変領域配列を含む抗体またはその抗原結合性フラグメントを用いてこの方法を実行する。  方法は癌の治療に使用されるのが好ましい。
【００９４】
別の実施例において、配列番号３７を含む免疫グロブリン重鎖の可変領域配列、および配列番号３８を含む免疫グロブリン軽鎖の可変領域配列を含むｓｃＦｖを用いてこの方法を実行する。
【００９５】
本発明は、さらに配列ＲＨＦＱＳＣＳＱＣＬＳＡＰＰＦＶＱＣＧＷ（配列番号５）またはＲＨＦＱＳＣＳＱＣＬＳＡＰＰＦ（配列番号６）を含む、またはそれらから成るワクチン抗原を、薬学的に許容される担体または賦形剤と一緒に提供する。好ましい実施形態において、ワクチンは癌を治療するために使用する。
【００９６】
本発明はさらに、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を得るために動物を免疫化する方法を提供し、この方法は、配列番号１の配列を含む切断ｃ−Ｍｅｔ抗原フラグメントをｃ−Ｍｅｔを過剰発現する細胞と、順番に、または一緒に動物に投与することを含む。一実施例において、抗原フラグメントおよび細胞を交互に動物に投与する。この実施例による動物はマウス、ラットまたはウサギであることが好ましい。
【００９７】
別の実施例において、ＶＶＤＴＹＹＤＤＱＬ（配列番号２）、ＶＲＲＬＫＥＴＫＤＧＦＭＦＬＴ（配列番号３）、ＤＶＬＰＥＦＲＤＳＹ（配列番号４）、およびＲＨＦＱＳＣＳＱＣＬＳＡＰＰＦＶＱＣＧＷ（配列番号５）から成る群から選抜された配列を含む抗原ペプチド配列で動物を免疫化する。
【００９８】
本発明は、さらに本発明による免疫化方法により産生された抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
【００９９】
ＥＲＢＢ３シグナル伝達（Ｅｎｇｅｌｍａｎ  ＪＡら，２００７）の活性化により、肺癌細胞においてｃ−Ｍｅｔ増幅がゲフィチニブ耐性に結びつくことが分かった。したがって、本発明は、さらに癌細胞において化学療法剤に対する耐性を克服するか緩和するために、本発明による抗体または抗原結合性フラグメントの使用法を提供する。好ましい実施例において、本発明による抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ｃ−Ｍｅｔの増幅により引き起こされる化学療法剤での治療に対する耐性を克服することができる。化学療法剤は当業者に公知であり、本明細書の別の箇所に記載されているような薬剤を含む。
【０１００】
一実施例において、抗体または抗原結合性フラグメントは、配列番号２９を含む可変領域のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および／または配列番号３０を含む可変領域のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含むＬＭＨ８７抗体である。
【０１０１】
別の実施例において、抗体は、配列番号３７を含む可変領域のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および／または配列番号３８を含む可変領域アミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含むｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ８５）である。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１−１】ＬＭＨ抗体パネルの生化学的特性解析を示す代表的なデータである。（Ａ）抗体ＬＭＨ８５およびＬＭＨ８７がＡ５４９細胞上に発現した表面のｃ−Ｍｅｔに結合することを示すフローサイトメトリー分析である。一番左のヒストグラムはＩｇＧ１イソタイプ対照を表す。（Ｂ）ｃ−Ｍｅｔのα鎖特異性を示す免疫ブロット。抗体ＬＭＨ８５を使用して全ｃ−ＭｅｔをＡ５４９細胞から免疫沈降し、２５Ｈ２［市販のβ鎖結合ｍＡｂ］（左パネル）または抗体ＬＭＨ８０、８４および８７でプローブした。２５Ｈ２は、ｃ−Ｍｅｔ（α鎖およびβ鎖の両方を含む）のプロセシングされていない形態およびｃ−Ｍｅｔのβ鎖を認識する。（Ｃ）選抜されたＬＭＨ抗体の免疫沈降。抗体（ＬＭＨ８５、８６、８７、８８および８９）５μｇ／ｍｌを使用して、ｃ−ＭｅｔをＡ５４９細胞可溶化物から免疫沈降した。続いて、免疫沈降されたｃ−Ｍｅｔを、市販の抗体２５Ｈ２ｍＡｂでブロットした。
【図１−２】ＬＭＨ抗体パネルの生化学的特性解析を示す代表的なデータである。（Ｄ）選抜されたＬＭＨ抗体のアゴニスト／アンタゴニスト活性を示す免疫ブロット。Ａ４５９細胞を、抗体単独でまたはＨＧＦリガンドの存在下の抗体で処理し、全細胞可溶化物を調製した。サンプルを、全ｃ−Ｍｅｔ（上パネル）またはリン酸エステル化ｃ−Ｍｅｔ（Ｙ１２３４／Ｙ１２３５）（下パネル）に関してプローブした。（Ｅ）細胞遊走に対する選抜されたＬＭＨ抗体の効果。抗体を、ＳＫ−ＯＶ−３細胞内の細胞遊走を誘導する能力に関してテストした。抗体ＬＭＨ８５は、細胞遊走を刺激したが、抗体ＬＭＨ８７は効果がなかった（上パネル）。ＬＭＨ８７を異なる濃度で、３００ｐＭのＨＧＦと混合し、ＳＫ−ＯＶ−３細胞のＨＧＦ誘導遊走を阻害したかどうかを測定した。抗体ＬＭＨ８７は部分的には、ＨＧＦにより刺激された遊走活性を阻害した（下パネル）。両グラフにおいてデータはパーセンテージ遊走対３００ｐＭのＨＧＦ±ＳＤとして示される。
【図２】Ａ５４９細胞からのｃ−ｍｅｔを抗体ＬＭＨ８０、８１、８２または８５により免疫沈降し、受容体のプロセシングされていない、およびプロセシングされた両形態でｃ−Ｍｅｔのβ鎖を認識する２５Ｈ２でウエスタンブロットした。同一のサンプルを複製して使用した。
【図３】主にプロセシングされていないｃ−Ｍｅｔを発現するＬｏＶｏ結腸癌細胞（上パネル）上のｃ−ＭｅｔおよびＵ８７ＭＧ細胞（下パネル）へのＬＭＨ抗体８０、８１または８２および抗体８５の結合のフローサイトメトリー分析。結合を、フィコエリトリン（ＰＥ）標識抗マウス二次抗体を使用して検出した。ＥＧＦＲを結合するｍＡｂ  ５２８を陽性対照として使用した。陰性対照は、イソタイプに適合した非特異的な一次抗体、次いで二次抗体であった。これらは左側のヒストグラムにより表される。
【図４−１】ＬＭＨ抗体のエピトープマッピング。抗体を、全ｃ−ＭｅｔのＳＥＭＡドメインを表す重なったビオチン化ペプチドのパネルに対してテストした。抗体の反応を標準的なＥＬＩＳＡにより測定し、選抜されたペプチド類に対する平均吸光度の読取り値±ＳＥＭを示すデータと共に結果をグラフ表示する。（Ａ）抗体ＬＭＨ８０、（Ｂ）抗体ＬＭＨ８２、（Ｃ）ＬＭＨ８７抗体に対してデータを示す。抗体により結合されたペプチド配列はコアエピトープを決定するために整列させた（各グラフの右側）。
【図４−２】ＬＭＨ抗体のエピトープマッピング。抗体を、全ｃ−ＭｅｔのＳＥＭＡドメインを表す重なったビオチン化ペプチドのパネルに対してテストした。抗体の反応を標準的なＥＬＩＳＡにより測定し、選抜されたペプチド類に対する平均吸光度の読取り値±ＳＥＭを示すデータと共に結果をグラフ表示する。（Ａ）抗体ＬＭＨ８０、（Ｂ）抗体ＬＭＨ８２、（Ｃ）ＬＭＨ８７抗体に対してデータを示す。抗体により結合されたペプチド配列はコアエピトープを決定するために整列させた（各グラフの右側）。
【図５】抗体ＬＭＨ８５の単鎖の（ｓｃＦｖ）可変フラグメントのアンタゴニスト活性。Ａ５４９細胞の全細胞可溶化物をｓｃＦｖ８５またはｓｃＦｖ８７のいずれかで処理し、全ｃ−Ｍｅｔ、リン酸エステル化ｃ−Ｍｅｔ（Ｔｙｒ１２３４／１２３５）および（Ｔｙｒ１２３０／１２３４／１２３５）または積載量の対照となるｐａｎ−ａｃｔｉｎ抗体のいずれかでＨＧＳをプローブした。
【図６】ＬＭＨ８７は全表面ｃ−Ｍｅｔを下方制御し、腫瘍細胞増殖を阻害する。（Ａ）ｃ−Ｍｅｔを、抗体ＬＭＨ８７で処理した後に細胞表面をビオチン化したＡ５４９肺癌細胞から免疫沈降した。ＬＭＨ８７でのインキュベーション後に残った細胞表面のｃ−Ｍｅｔ（上部のブロット）および全ｃ−Ｍｅｔ（下部のブロット）。棒グラフは濃度測定による定量化を示す。（Ｂ）ＬＭＨ８７でのインキュベーション後にＵ８７ＭＧグリオーマ細胞に残った全ｃ−Ｍｅｔ。棒グラフは濃度測定による定量化を示す。（Ａ）および（Ｂ）の両方とも繰り返し実験の代表的なブロットである。（Ｃ）ＬＭＨ８８は、Ｕ８７ＭＧ細胞の下方制御を媒介した。ｃ−Ｍｅｔは、８時間および２４時間ＬＭＨ８８で処理されたＵ８７ＭＧ細胞から免疫沈降した。２４時間のＰＢＳ対照を含めた。全ｃ−Ｍｅｔは両時点でＬＭＨ８８により減少した。
【図７】インビトロのおよびインビボでの癌細胞増殖のＬＭＨ８７阻害。（Ａ）ＬＭＨ８７で処理されたＡ５４９細胞上のｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ分析。Ａ５４９細胞をＰＢＳでまたは抗体ＬＭＨ８７の複数回投与；１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、および１００μｇ／ｍｌで処理した。データを２１ｈ（抗体が付加された時点）に標準化された細胞インデックス±ＳＥＭで表示した。（Ｂ）ＬＭＨ８７で処理されたＵ８７ＭＧ異種移植片。マウスにＵ８７ＭＧ細胞を移植し、１ｍｇのＬＭＨ８７または賦形剤を３回（７、１０および１２日目）に注射した。データを、平均腫瘍容積（ｍｍ３）±ＳＥＭで表示した。
【発明を実施するための形態】
【０１０３】
配列表の見出し
配列番号１−Ｎ末端の余分な３アミノ酸およびＣ末端の余分な９アミノ酸を有するｃ−Ｍｅｔの残基２５−５６７のアミノ酸配列。
配列番号２−ヒトｃ−Ｍｅｔ配列の残基１２１−１３０に対応し、かつ抗体ＬＭＨ８２のコアエピトープ配列に対応するエピトープのアミノ酸配列。
配列番号３−ヒトｃ−Ｍｅｔ配列の残基２１６−２３０に対応し、かつ抗体ＬＭＨ８４のコアエピトープ配列に対応するエピトープのアミノ酸配列。
配列番号４−ヒトｃ−Ｍｅｔ配列の残基２３６−２４５に対応し、かつ抗体ＬＭＨ８６、ＬＭＨ８７、ＬＭＨ８８およびＬＭＨ８９のコアエピトープ配列に対応するエピトープのアミノ酸配列。
配列番号５−ヒトｃ−Ｍｅｔ配列の残基５２１−５４１に対応し、かつ抗体ＬＭＨ８１のコアエピトープ配列に対応するエピトープのアミノ酸配列。
配列番号６−ヒトｃ−Ｍｅｔ配列の残基５２１−５３５に対応し、かつ抗体ＬＭＨ８０のコアエピトープ配列に対応するエピトープのアミノ酸配列。
配列番号７−抗体ＬＭＨ８０のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列。
配列番号８−抗体ＬＭＨ８０のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列。
配列番号９−抗体ＬＭＨ８０のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列。
配列番号１０−抗体ＬＭＨ８０のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列。
配列番号１１−抗体ＬＭＨ８０のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列。
配列番号１２−抗体ＬＭＨ８０のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列。
配列番号１３−抗体ＬＭＨ８０の重鎖可変領域のアミノ酸配列。
配列番号１４−抗体ＬＭＨ８０の軽鎖可変領域のアミノ酸配列。
配列番号１５−抗体ＬＭＨ８２のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列。
配列番号１６−抗体ＬＭＨ８２のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列。
配列番号１７−抗体ＬＭＨ８２のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列。
配列番号１８−抗体ＬＭＨ８２のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列。
配列番号１９−抗体ＬＭＨ８２のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列。
配列番号２０−抗体ＬＭＨ８２のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列。
配列番号２１−抗体ＬＭＨ８２の重鎖可変領域のアミノ酸配列。
配列番号２２−抗体ＬＭＨ８２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列。
配列番号２３−抗体ＬＭＨ８７のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列。
配列番号２４−抗体ＬＭＨ８７のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列。
配列番号２５−抗体ＬＭＨ８７のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列。
配列番号２６−抗体ＬＭＨ８７のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列。
配列番号２７−抗体ＬＭＨ８７のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列。
配列番号２８−抗体ＬＭＨ８７のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列。
配列番号２９−抗体ＬＭＨ８７の重鎖可変領域のアミノ酸配列。
配列番号３０−抗体ＬＭＨ８７の軽鎖可変領域のアミノ酸配列。
配列番号３１−抗体ＬＭＨ８５のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列。
配列番号３２−抗体ＬＭＨ８５のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列。
配列番号３３−抗体ＬＭＨ８５のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列。
配列番号３４−抗体ＬＭＨ８５のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列。
配列番号３５−抗体ＬＭＨ８５のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列。
配列番号３６−抗体ＬＭＨ８５のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列。
配列番号３７−抗体ＬＭＨ８５の重鎖可変領域のアミノ酸配列。
配列番号３８−抗体ＬＭＨ８５の軽鎖可変領域のアミノ酸配列。
配列番号３９−抗体ＬＭＨ８７の重鎖可変領域のヌクレオチド配列。
配列番号４０−抗体ＬＭＨ８７の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列。
配列番号４１−抗体ＬＭＨ８５の重鎖可変領域のヌクレオチド配列。
配列番号４２−抗体ＬＭＨ８５の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列。
【０１０４】
選択された定義
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変部にある、少なくとも１つのエピトープ認識部位で標的に結合できる免疫グロブリン分子を指す。この用語はポリクローナルおよびモノクローナル抗体のほかに、要求された特異性のエピトープ認識部位を有する抗体部分を含む変種、融合タンパク質、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体および他の任意の要求された特異性のエピトープ認識部位を含む免疫グロブリン分子の修飾された構成も包含する。
【０１０５】
用語「抗体」は、天然で産生されるか或いは部分的または完全に合成されるかにかかわらず免疫グロブリンを指す。この用語は、抗体結合ドメインであるかまたは抗体結合ドメインと相同である結合ドメインを有するポリペプチドまたはタンパク質をも包含する。ＣＤＲ移植抗体もこの用語に包含される。「抗体」は、抗体およびそのフラグメントを含めた特異的エピトープを結合する任意の免疫グロブリンである。この用語はポリクローナル、モノクローナル、およびキメラ抗体を包含し、キメラ抗体は米国特許第４，８１６，３９７号明細書および同第４，８１６，５６７号明細書に記載されている。用語「抗体」は、４つの完全長ポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖、またはその等価なＩｇホモログ（例えば重鎖をわずかにしか含まないラクダのナノボディ）を一般的に含む野生型免疫グロブリン（Ｉｇ）分子；Ｉｇ分子の本質的なエピトープ結合特徴を保持する、その完全長の機能性変異体、変種、または誘導体、二重特異（ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）、二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）、多重特異性、および複可変領域抗体を含む。免疫グロブリン分子は、あらゆるクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、またはサブクラス（例えば、ｌｇＧ１、ｌｇＧ２、ｌｇＧ３、ｌｇＧ４、ｌｇＡ１、およびｌｇＡ２）であり得る。さらに、用語「抗体」の意味の範囲内には任意の「抗体フラグメント」も含まれる。
【０１０６】
「抗体フラグメント」は、完全長ではない少なくとも１つのポリペプチド鎖を含む分子を意味し、（ｉ）軽鎖可変（ＶＬ）、重鎖可変（ＶＨ）、軽鎖定常（ＣＬ）および重鎖定常１（ＣＨ１）ドメインから成る一価のフラグメントであるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域のジスルフィド結合により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成るＦａｂ（Ｆｄ）フラグメントの重鎖部分；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインから成る可変フラグメント（Ｆｖ）フラグメント；（ｖ）単一の可変ドメインを含むドメイン抗体（ｄＡｂ）フラグメント（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４−５４６（１９８９））；（ｖｉ）ラクダ抗体；（ｖｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；（ｖｉｉｉ）抗原結合部位を形成するように２つのドメインが会合することを可能にするペプチドリンカーによってＶＨドメインおよびＶＬドメインが連結される、単鎖Ｆｖフラグメント（Ｂｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８５，５８７９−５８８３，１９８８）；（ｉｘ）単一のポリペプチド鎖上でＶＨおよびＶＬドメインを発現するが、同一鎖上の２つのドメイン間の対合が不可能な短いリンカーを使用し、別の鎖の相補性ドメインと対合させ２つの抗原結合部位を作る、二価の二重特異性抗体であるダイアボディ（国際公開第９４／１３８０４号；Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０  ６４４４−６４４８，（１９９３）；ならびに、（ｘ）相補性軽鎖ポリペプチドと一緒に、一対の抗原結合ドメインを形成する一対のタンデムＦｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む直鎖状抗体；（ｘｉ）多価抗体フラグメント（ｓｃＦｖの二量体、三量体および／または四量体（ＰｏｗｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４２：１９３−２０４９（２０００））；ならびに、（ｘｉｉ）重鎖および／もしくは軽鎖の他の非完全長部分、またはその変異体、変種、もしくは誘導体の単独、またはあらゆる組み合わせを含む。
【０１０７】
抗体は多数の方法で修飾され得るため、用語「抗体」は、所要の特異性を有する結合ドメインを有する任意の特異的結合メンバーまたは物質を包含すると解釈されるべきである。よって、この用語は、天然で産生されるか或いは部分的または完全に合成されるかにかかわらず、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含めた抗体の抗体フラグメント、抗体の誘導体、機能均等価物およびホモログを包含する。従って、別のポリペプチドに融合している免疫グロブリン結合ドメインを含むキメラ分子または均等物が含まれる。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、欧州特許出願公開第０１２０６９４号明細書および同第０１２５０２３号、ならびに米国特許第４，８１６，３９７号明細書および同第４，８１６，５６７号明細書に記載されている。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、用語「抗原結合性フラグメント」は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬおよびＶＨドメインフラグメント、ドメイン抗体、三重特異性（Ｆａｂ３）、二重特異性（Ｆａｂ２）、ダイアボディ（（ＶＬ−ＶＨ）２または（ＶＨ−ＶＬ）２）、トリアボディ（三価）、テトラボディ（四価）、ミニボディ（ｓｃＦｖ−ＣＨ３）２）、二重特異性単鎖Ｆｖ（ビス−ｓｃＦｖ）、ＩｇＧｄｅｌｔａＣＨ２、ｓｃＦｖ−Ｆｃおよび（ｓｃＦｖ）２−Ｆｃを含むと解釈される。「Ｆａｂフラグメント」は、抗体分子の一価の抗原結合性フラグメントから成り、パパイン酵素で全抗体分子を分解して、無傷の軽鎖および重鎖の一部分から成るフラグメントを産生することにより得られる。抗体分子の「Ｆａｂ’フラグメント」は、ペプシンで全抗体分子を処理し、次いで還元して無傷の軽鎖および重鎖の一部分から成る分子を産生することにより得ることができる。このように処理された抗体分子ごとに２つのＦａｂ’フラグメントが得られる。抗体の「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は２つのジスルフィド結合により一緒になった２つのＦａｂ’フラグメントの二量体から成り、酵素ペプシンで全抗体を処理し、還元をしないことにより得られる。「Ｆｖフラグメント」は、軽鎖の可変部、および２つの鎖として発現された重鎖の可変部を含む遺伝子改変フラグメントである。「単鎖抗体」（ＳＣＡ）は、適切な、そして柔軟なポリペプチドリンカーにより連結した、軽鎖の可変部と重鎖の可変部を含む遺伝子改変の単鎖分子である。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、「抗体可変領域」は、相補性決定領域（ＣＤＲ：つまりＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）、およびフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む抗体分子の軽鎖および重鎖の部分を指す。ＶＨは、重鎖の可変部を指す。ＶＬは、軽鎖の可変部を指す。本発明において使用される方法によれば、ＣＤＲおよびＦＲに割り当てられたアミノ酸位置をＫａｂａｔに従って定義してもよい（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７  ａｎｄ  １９９１））またはＣｈｏｔｉａおよびＬｅｓｋ  １９８７  Ｊ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）。抗体または抗原結合フラグメントのアミノ酸の番号付けも、Ｋａｂａｔの番号付けに従っている。本発明の抗体については、ＩＭＧＴ付番方式を使用して、相補性決定領域の決定を行った（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ−Ｐら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７，２０９−２１２（１９９９））。
【０１１０】
用語「抗体複合体」は本明細書で使用される場合、付着させた治療薬または標識を含む抗体またはその抗原結合フラグメントを指す。薬剤は共有結合的にもしくは非共有結合的に、またはリンカーによって付着されていてもよい。薬剤は、検出可能または機能性標識を含む標識を包含すると理解されてもよい。適切な治療薬は本明細書の他の部分で記述されている。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、用語「特異的に結合する」は、抗体が別の細胞または実体とよりも、特定の細胞または実体と、より長い間、および／またはより強い親和性で、より高頻度に、より速やかに反応する、または結合することを意味するものと解釈されるものとする。また、第１の標的に特異的に結合する抗体が、第２の標的に特異的に結合する場合も結合しない場合もあるということも、この定義を読むことにより理解される。そのため、「特異的結合」は、別の分子との排他的な結合または検出できない結合を必ずしも要求せず、これは、用語「選択的結合」によって包含される。必ずというわけではないが一般的に、結合への言及は特異的結合を意味する。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、用語「細胞増殖性疾患」およびその文法上のバリエーションは、細胞、組織または臓器に関して使用される場合、あらゆる望ましくない、過剰な、または異常な細胞、組織または臓器の成長、増殖、分化または生存を指す。望ましくない細胞増殖疾患は、対象における望ましくない、過剰な、または異常な細胞数、細胞成長、細胞増殖、細胞生存または分化という特徴を有する、いずれも良性で過形成状態の疾病および生理学的条件を含む。そのような障害の具体例としては、転移性および非転移性の新生物形成、腫瘍および癌（悪性病変）が挙げられる。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、用語「ｃ−Ｍｅｔ」はｃ−Ｍｅｔ受容体、原癌遺伝子およびＨＧＦ／ＳＦの受容体または、ＨＧＦに結合できるｃ−Ｍｅｔの部分、およびチロシンキナーゼ活性を有する部分、または配列番号１に記載のｃ−Ｍｅｔ受容体部分を含む、ｃ−Ｍｅｔ受容体の一部分を指す。用語ｃ−Ｍｅｔはヒトｃ−Ｍｅｔを指すことが好ましい。
【０１１４】
用語「キメラ抗体」は、重鎖および／または軽鎖の一部分が、特定の種（例えばマウス）由来か、特定の抗体のクラスまたはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一か、または相同である一方で、鎖の残りの部分が、別の種（例えば霊長類）由来か、別の抗体のクラスまたはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一か、または相同である抗体を指し、またそのような抗体のフラグメントも、所望の生物学的活性を示す限り含まれる。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、用語「相補性決定領域」（同義語ＣＤＲ；つまりＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）は、抗原結合に必要な抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指す。各可変ドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として同定された３つのＣＤＲ領域を有するのが一般的である。相補性決定領域はそれぞれ、Ｋａｂａｔにより定義されるようなＣＤＲ領域のアミノ酸残基を含んでもよい（すなわち、軽鎖可変ドメインのアミノ酸残基２４−３４または２４−３９（Ｌ１））、５０−５６または５５−６１（Ｌ２）および８９−９７または９３−１０２（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインの３１−３５または２６−３５（Ｈ１）、５０−６５または５０−６６（Ｈ２）および９５−１０２または９７−１０８（Ｈ３）；Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））ならびに／または、「超可変ループ」の残基、つまり、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）および９１−９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインの２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）および９６−１０１（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７）Ｊ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  1９６：９０１−９１７）。場合によっては、相補性決定領域は、Ｋａｂａｔに従って定義されたＣＤＲ領域および超可変ループの両方のアミノ酸を含むことができる。当業者は、ＦＲの位置決めにおけるいくらかの変化、例えば変異（例えば、遺伝子欠失および／または挿入）の結果、例えば５つまでの残基の変化、または４つの残基の変化、２つの残基の変化、１つの残基の変化（例えば本明細書で例示された抗体として）を認識するであろう。
【０１１６】
本明細書を通して、用語「含む」、または「含む」もしくは「含むこと」等のバリエーションは、述べられた要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップのグループの包含を意味するが、他のいかなる要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップのグループも排除しないと理解される。
【０１１７】
用語「から成る」または「から本質的に成る」は、より大型の産物に共有結合で付着されていない、定義された数の残基のペプチド配列を指す。
【０１１８】
用語「定常領域」（ＣＲ）は、本明細書で使用される場合、エフェクター機能を与える抗体分子の部分を指す。対象のヒト化抗体の定常領域はヒト免疫グロブリン由来である。
重鎖の定常領域は、α、デルタ、イプシロン、ガンマまたはミューの５つのイソタイプのうちのいずれかから選択することができる。さらに、重鎖の多様なサブクラス（重鎖のＩｇＧサブクラスのような）は、異なったエフェクター機能をもたらし、したがって所望の重鎖の定常領域を選ぶことにより、所望のエフェクター機能を有する抗体を産生することができる。好ましい重鎖の定常領域は、ガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ２（ＩｇＧ２）、ガンマ３（ＩｇＧ３）およびガンマ４（ＩｇＧ４）である。軽鎖の定常領域は、カッパまたはラムダタイプ、好ましくはカッパタイプであり得る。
【０１１９】
「フレームワーク領域」（以下ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。天然抗体の各可変ドメインは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４として同定された４つのＦＲを有する。
【０１２０】
用語「ヒト化抗体」はキメラ分子を指すものとして理解され、一般に、組み換え技術を使用して作製され、非ヒト種の免疫グロブリンから誘導されたエピトープ結合部位、ならびにヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づいた分子の残存する免疫グロブリン構造を有する。抗原結合部位は、ヒト抗体の可変ドメイン内の適切なフレームワーク領域上に移植された非ヒト抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト抗体の残りの領域を含むことが好ましい。
【０１２１】
用語「ヒト抗体」は、抗体分子および結合タンパク質に関して本明細書で使用される場合、ヒト、例えばヒトの生殖細胞系または体細胞で発見された配列に由来する、または対応する可変（例えばＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲおよびＦＲ領域）および定常抗体領域を有する抗体を指す。
【０１２２】
用語「同一性」およびその文法上のバリエーションは、２つ以上の参照された実体が同じであることを意味する。したがって、２つの抗体配列が同一である場合、それらには少なくとも参照された領域または部分の中で同一のアミノ酸配列がある。２つの核酸配列が同一である場合、それらには少なくとも参照された領域または部分の中で同一のポリヌクレオチド配列がある。同一性は配列の限定された部分（領域またはドメイン）全体に存在する場合がある。ＧＡＰ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ４８：  ４４４−４５３．１９７０）分析（ＧＣＧ  ｐｒｏｇｒａｍ）は、ギャップ生成ペナルティー＝５、およびギャップ伸張ペナルティー＝０．３で、ポリヌクレオチドの％同一性を決定する。別段の記載のない限り、問い合わせ配列は少なくとも長さ４５ヌクレオチドであり、ＧＡＰ分析は、少なくとも４５ヌクレオチドの領域にわたって２つの配列をアラインさせる。問い合わせ配列は少なくとも長さ１００ヌクレオチドであり、ＧＡＰ分析は、少なくとも１００ヌクレオチドの領域にわたって２つの配列をアラインさせるのが好ましい。２つの配列はそれらの全長にわたってアラインさせるのが最も好ましい。
【０１２３】
ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質を含む用語「単離された」は、天然の状態において付随しているまたは連結されているポリヌクレオチド／ポリペプチド配列から少なくとも部分的に分離されているポリヌクレオチド／ポリペプチドを意味する。好ましくは、単離されたポリヌクレオチド／ポリペプチドは、それらが天然で付随している他の構成成分を少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、および最も好ましくは少なくとも９０％含まない。  
【０１２４】
用語「モノクローナル抗体」は、同一の抗原（複数可）、好ましくは抗原（複数可）内の同一のエピトープ決定基に結合することができる同種の抗体集団を指す。この用語は、抗体のソース、またはそれを作る方法に関して限定することを意図しない。
【０１２５】
用語「核酸」は、本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」と交換可能である。
【０１２６】
用語「薬学的に許容可能な」は、生理学的に許容することができ、一般的にアレルギーまたは同様の有害反応をもたらさない分子的実体および組成物を指す。
【０１２７】
用語「対象」は、本明細書で使用される場合、任意の動物、特に哺乳動物、特に農業または獣医学に関連し、かつ／または一般に医薬品もしくは治療薬で治療される、または医薬品もしくは治療薬の動物試験に使用される動物もしくは哺乳動物を意味し、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、ネコおよびイヌを含み、適切な場合には用語「患者」と交換可能に使用されてもよい。患者は霊長類であることが好ましい。特に、患者はヒトである。
【０１２８】
用語「記載されているのと実質的に同じ」は、本発明のそのＣＤＲ領域が、配列番号７から１２または１５から２０または２３から２８または３１から３６の特定された領域と同一または高度に相同であることを意味する。「高度に相同」は、少数、好ましくは１から４、または、１から３、または１から２個のみの置換がＣＤＲ内に行われ得ることを意味する。
【０１２９】
用語「治療的有効量」は、細胞増殖疾患の１つまたは複数の症状を、その疾患の臨床的な特性として観察され認められるレベルを下回るレベルまで縮小させるかまたは阻害するのに十分な量の抗体または抗原結合性フラグメントを意味するものと解釈する。当業者は、このような量は特定の抗体、フラグメント、および／もしくは特定の患者、ならびに／または疾病のタイプもしくは重症度もしくはレベルにより変動するであろうことを認識しているであろう。したがってこの用語は、本発明を特定の量に限定するものと解釈するべきではない。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、用語「治療する」「治療すること」「治療」およびその文法上のバリエーションは、患者において生理学的な反応または結果を得ることが望まれるプロトコル、レジメン、プロセスまたは治療法を個々の患者に受けさせることを意味する。治療を受けた患者の全員が特定の治療プロトコル、レジメン、プロセスまたは治療法に反応するとは限らないため、治療では、所望の生理学的な応答または結果が全ての患者または患者集団において達成されることが要求されない。したがって、所与の患者または患者集団が治療に反応しない、または不十分な反応を示す場合もある。
【０１３１】
用語「腫瘍」または「癌」の使用は交換可能であり、その成長、増殖または生存が、その対応物である正常な細胞よりも大きい細胞または細胞集団、例えば細胞増殖性障害または細胞分化性障害の細胞または細胞集団を指す。成長は制御できないのが一般的である。
【０１３２】
発明の詳細な説明
本発明は、当分野の通常の分子生物学、微生物学および組換ＤＮＡ技術を使用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）を参照のこと。
【０１３３】
本明細書に記載された特定の実施形態は、例示のみを目的とし、本発明はこの実施形態の範囲に限定されない。
【０１３４】
機能上等価な抗体
本発明はさらに、本発明の抗体の重鎖および軽鎖可変部配列の１つまたは複数のアミノ酸が付加、欠失、または置換されているが、本発明の抗体の機能をなお保持している抗体またはその抗原結合性フラグメントを想定する。これらの改変は、例えば、部位特異的変異誘発によるような意図的なものであってもよいし、その抗体を発現する宿主の変異により得られるような偶発的なものであってもよい。
【０１３５】
当分野で公知の任意の技術を使用して、変異（変化させた）ポリペプチドを調製することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドをインビトロで突然変異誘発させることができる。そのようなインビトロ突然変異誘発技術は、適切なベクターへポリヌクレオチドをサブクローン化し、そのベクターをＥ．ｃｏｌｉのＸＬ−１ｒｅｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）等の「突然変異誘発」株に形質転換し、適切な世代数にわたって、形質転換された細菌を繁殖させることを含む。本明細書に記述された技術を使用して、変異／改変ＤＮＡから誘導した産物をスクリーニングし、それらが受容体結合および／または受容体阻害活性を有しているかどうかを容易に判定することができる。
【０１３６】
アミノ酸配列の変異体を設計する際に、変異部位の位置および変異の性質は、修飾される特性（複数可）によって異なるであろう。変異に関する部位は、例えば
最初に（１）保守的なアミノ酸を選択し、次いで達成される結果に応じてより過激な選択をして置換する、（２）標的残基を欠失させる、または（３）決められた部位に隣接させて他の残基を挿入するなどによって、個々にまたは連続して修飾することができる。
【０１３７】
アミノ酸配列の欠失は、一般に約１〜１５個の残基、より好ましくは約１〜１０個の残基、典型的には約１〜５個の連続した残基の範囲に及ぶ。
【０１３８】
置換変異体では、可変部を含む抗体および／または免疫グロブリン鎖分子の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その代わりに異なる残基が挿入されている。置換変異誘発で重要性の高い部位は、抗原結合に関して重要であると同定された部位を含む。これらの部位、特にヒト抗体および／または免疫グロブリン鎖の他の少なくとも３箇所の同一に保存された部位の配列の範囲内に入る部位は、比較的保守的な方法で置換されることが好ましい。「代表的な置換」という見出しの下の表１にこのような保存的置換を示す。
【０１３９】
本発明により、保守的なアミノ酸置換も想定される。これらは、下の表に記載のアミノ酸置換を意味すると理解される。
【表１】
2013534515.tif 000002
【０１４０】
本明細書に記載のアミノ酸は「Ｌ」異性体であることが好ましい。しかし、ポリペプチドが免疫グロブリン結合の所望の機能特性を保有する限りにおいて、Ｌ−アミノ酸残基の代わりにＤ異性体の残基を使用することができる。修飾体にはさらに構造上および機能上の類似体、例えば、合成もしくは非天然のアミノ酸またはアミノ酸類似体および誘導された形態を有するペプチド模倣体が含まれる。
【０１４１】
抗体の製造
ハイブリドーマによるモノクローナル抗体製造のための一般的な方法はよく知られている。不死化抗体産生細胞系は、融合以外の技術、例えば、発癌性ＤＮＡを用いたＢリンパ球の直接的な形質転換またはエプスタインバーウイルスを用いたトランスフェクションによっても作製され得る。  例えば、Ｍ．Ｓｃｈｒｅｉｅｒら，“Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”（１９８０）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”（１９８１）；Ｋｅｎｎｅｔｔら，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”（１９８０）；また、米国特許第４，３４１，７６１号、同第４，３９９，１２１号、同第４，４２７，７８３号、同第４，４４４，８８７号、同第４，４５１，５７０号、同第４，４６６，９１７号、同第４，４７２，５００号、同第４，４９１，６３２号、同第４，４９３，８９０号を参照されたい。ｃ−Ｍｅｔに対して産生されたモノクローナル抗体のパネルは、種々の特性、例えばイソタイプ、エピトープ、親和性などに関してスクリーニングすることができる。特に興味深いのは、ｃ−Ｍｅｔまたはそのサブユニットの活性を模倣するモノクローナル抗体である。このようなモノクローナル抗体は特異的結合メンバー活性アッセイにおいて容易に同定することができる。高親和性抗体はまた、天然または組換えの特異的結合メンバーの免疫親和性精製が可能である場合にも有用である。本発明の実施において有用なモノクローナル抗体は、適当な抗原特異性の抗体分子を分泌するハイブリドーマを含有する栄養培地を含むモノクローナルハイブリドーマ培養を開始することにより産生できる。培養は、ハイブリドーマが抗体分子を培地内に分泌するのに十分な条件下および時間にわたって維持する。次いで抗体含有培地を回収する。次いで、周知の技術により、抗体分子をさらに単離することができる。
【０１４２】
抗原を含む精製ｓｅｍａドメインと本発明による生存ｃ−Ｍｅｔ発現細胞とを用いた動物の免疫化も、本発明の抗体をもたらすことができる。本発明者らが知る限り、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体産生のためのこのような免疫化方法は今まで記載されていない。
【０１４３】
抗体に関する方法でさらに使用され得る適切な方法は、親和性精製、非変性ゲル精製、ＨＰＬＣまたはＲＰ−ＨＰＬＣ、サイズ排除、プロテインＡカラムでの精製、およびこれらの技術のあらゆる組み合わせを含む。例えばＥＬＩＳＡ分析を使用して、抗体のイソタイプを判定することができ、マウスＩｇ吸収済み抗ヒトＩｇを使用して、ヒトＩｇを同定することができる。
【０１４４】
組換え抗体の産生
本発明の抗体および抗原結合性フラグメントはさらに、容易に利用可能な技術と材料、例えば自動ペプチド合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．を参照のこと）を使用して組換えにより産生することができる。
【０１４５】
可変ドメインは任意の生殖細胞系または再構成されたヒト可変ドメイン由来であってもよく、または公知ヒト可変ドメインのコンセンサス配列に基づく合成可変ドメインであってもよい。本発明のＣＤＲ由来配列は、組換えＤＮＡ技術を用いて、ＣＤＲ領域を欠く可変ドメインのレパートリー内に導入され得る。例えば、Ｍａｒｋｓら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９２，１０：７７９−７８３）は、可変ドメイン領域の５’末端またはその近傍に対するコンセンサスプライマーをヒトＶＨ遺伝子の第３フレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーと共に使用して、１つまたは複数のＣＤＲを欠くＶＨ可変ドメインのレパートリーを得る、抗体可変ドメインのレパートリーの産生方法を記載している。Ｍａｒｋｓらはさらに、このレパートリーがどのようにして特定の抗体のＣＤＲと組み合わされ得るかを記載している。類似した技術を用いて、本発明のＣＤＲ由来配列を、１以上のＣＤＲを欠くＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーとシャッフルすることが可能であり、シャッフルされた完全ＶＨまたはＶＬドメインはコグネイトＶＬまたはＶＨドメインと組合されて本発明の抗体をもたらし得る。次いで、レパートリーは、好適な宿主系（例えば、国際公開第９２／０１０４７号のファージディスプレイ系）において提示され得、その結果、適切な特異的結合メンバーが選択され得る。レパートリーは、１０４個以上、例えば、１０６〜１０８または１０１０メンバーの任意の個々のメンバーからなり得る。類似の混合またはコンビナトリアル技術はまた、Ｓｔｅｍｍｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ，１９９４，３７０：３８９−３９１）によって開示され、Ｓｔｅｍｍｅｒは、β−ラクタマーゼ遺伝子に関連する技術を記載するが、このアプローチが抗体の産生のために使用され得るとの見解を述べている。
【０１４６】
抗体は、当技術分野において公知の選択および／または変異誘発法を使用して親和成熟させてもよい。
【０１４７】
米国特許第５，９６９，１０８号に公開されているようなファージディスプレイ法によっても、本発明の組換え抗体を産生することができる。
【０１４８】
本発明の抗体はさらに、抗体の定常領域またはその一部を含み得る。例えば、配列番号１４、２２、３０または３８に基づく抗体は、それらのＣ末端において、ヒトＣκまたはＣλ鎖を含む抗体の軽鎖定常ドメインに結合され得る。同様に、配列番号１３、２１、２９または３７に基づく抗体は、それらのＣ末端において、任意の抗体のイソタイプ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＭ、およびイソタイプのサブクラスのいずれか、特にＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ４に由来する免疫グロブリン重鎖の全部または一部に結合され得る。
【０１４９】
組換え産生のため、本発明の抗体をコードする核酸が単離され、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために、複製可能なベクター内に挿入されるのが好ましい。この抗体をコードするＤＮＡは、通常の手法を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）、容易に単離または合成される。多くのベクターが入手可能である。ベクター成分としては、これらに制限されるものではないが、一般に次のものの１つまたは複数が含まれる：シグナル配列、本発明の抗体またはそのフラグメント（例えば本明細書に提供された情報から誘導された）をコードする配列、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列である。
【０１５０】
（ｉ）シグナル配列成分。本発明の抗体は組換え手法によって直接的に産生されるだけではなく、シグナル配列または成熟タンパク質もしくはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドであることが好ましい、異種性ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても生産され得る。好ましく選択された異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識されプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。天然の抗体シグナル配列を認識せずプロセシングしない原核生物宿主細胞に対しては、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは耐熱性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置換される。酵母の分泌に関しては、天然シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー、または酸ホスファターゼリーダー、カンジダアルビカンスグルコアミラーゼリーダー、または国際特許公開第９０／１３６４６号に記載されているシグナルにより置換され得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物のシグナル配列のほかウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルも利用することができる。このような前駆体領域のＤＮＡは、抗体をコードするＤＮＡに対するリーディングフレーム内に結合される。
【０１５１】
（ｉｉ）プロモーター成分。発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常は宿主生物によって認識されるプロモーターを有し、抗体核酸と操作可能に連結している。原核生物宿主での使用に適したプロモーターには、ｐｈｏＡプロモーター、βラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、およびｔａｃプロモーター等のハイブリッドプロモーターが含まれる。しかし、他の公知の細菌プロモーターも適している。細菌系で使用されるプロモーターも、抗体をコードするＤＮＡと操作可能に結合したシャインダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を有するであろう。
【０１５２】
真核生物についてのプロモーターが知られている。実質上全ての真核生物の遺伝子は、転写開始部位より約２５から３０塩基上流に位置するＡＴ富化領域を有する。多数の遺伝子の転写開始位置より７０から８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大部分の真核生物遺伝子の３’末端には、コード配列の３’末端へのポリＡ末端の付加に対するシグナルとなり得るＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３−ホスホグリセラートキナーゼまたは他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼ等に対するプロモーターが挙げられる。他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘導プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母の発現に使用される適切なベクターとプロモーターはＥＰ７３，６５７にさらに記載されている。酵母エンハンサーも、酵母プロモーターと共に有利に使用される。
【０１５３】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗体転写は、例えば、ポリオーマウイルス、伝染性上皮腫ウイルス、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ＣＭＶ、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはサルウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター、ヒートショックプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
【０１５４】
（ｉｉｉ）エンハンサーエレメント成分。より高等な真核生物による本発明の抗体をコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強されることが多い。哺乳動物の遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在公知である（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインシュリン）。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（１００−２７０塩基対）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核生物のプロモーターの活性化のための増強要素については、Ｙａｎｉｖ（１９８２），Ｎａｔｕｒｅ，２９７：１７−１８も参照されたい。エンハンサーは、抗体コード配列の５’または３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、プロモーターから５’位に位置するのが好ましい。
【０１５５】
（ｉｖ）転写終結成分。真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物由来の有核細胞）に用いられる発現ベクターは、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’、時には３’の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、抗体をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号とその中に開示された発現ベクターを参照されたい。
【０１５６】
（ｖ）宿主細胞の選択および形質転換。本明細書のベクターにＤＮＡをクローニングまたは発現させるのに適した宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、または高等真核生物の細胞である。この目的に適した原核生物には、真正細菌、例えばグラム陰性またはグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンスおよび赤痢菌属、ならびに桿菌、例えば枯草菌およびバシラス・リシェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、シュードモナス属、例えば緑膿菌およびストレプトマイセス属が含まれる。一つの好適な大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）であるが、他の大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）および大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）のような株も好適である。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。
【０１５７】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母菌のような真核微生物が、抗体をコードするベクターに適したクローニング宿主または発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、または一般的なパン酵母は、下等真核生物宿主微生物のなかで最もよく用いられる。しかしながら、多数の他の属、種および菌株も、一般的に入手可能で本明細書で使用することができ、例えば、シゾサッカロマイセスポンベ；クルイベロマイセス宿主、例えばＫ．ラクティス、Ｋ．フラギリス（ＡＴＣＣ１２４２４）、Ｋ．ブルガリカス（ＡＴＣＣ１６０４５）、Ｋ．ウィッケラミイ（ＡＴＣＣ２４１７８）、Ｋ．ワルチイ（ＡＴＣＣ５６５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（ＡＴＣＣ３６９０６）、Ｋ．サーモトレランス、およびＫ．マルキシアナス；ヤローウィア（ＥＰ４０２２２６）；ピチアパストリス（ＥＰ１８３０７０）；カンジダ；トリコデルマ・リーシア（ＥＰ２４４２３４）；アカパンカビ；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス；および糸状真菌、例えばパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム、およびコウジカビ属宿主、例えば偽巣性コウジ菌およびクロカビが使用できる。
【０１５８】
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、植物および昆虫の細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株および変異体および対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ（毛虫）、アエデス・アエジプティ（蚊）、アエデス・アルボピクトゥス（蚊）、ドゥロソフィラ・メラノガスター（ショウジョウバエ）、およびボンビクス・モリが同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのロイシンＬ−変異体とボンビクス・モリ  ＮＰＶのＢｍ−５株が公に利用でき、そのようなウイルスは本明細書に記載の本発明によるウイルスとして使用でき、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションに使用することができる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例としては、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚腎臓株［２９３または懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）；ハムスター乳児腎細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ（１９８０）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１）；サルの腎細胞（ＣＶＩ  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザルの腎細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ  ８０６５）；マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ  ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら（１９８２），Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびＰＥＲ．Ｃ６（商標）（ＣｒｕｃｅｌｌＮＶ）がある。
【０１５９】
キメラ抗体
キメラ抗体は、一つの種の抗体産生細胞から得られた軽鎖および重鎖の可変領域（ＶＬおよびＶＨ）を、別の種の軽鎖および重鎖の定常領域と組み合わせることによる組み換え手法により作られる。キメラ抗体は、ヒトのドメインを主に有する抗体を産生するために、齧歯類またはウサギの可変領域とヒトの定常領域を利用するのが一般的である。例えば、キメラ抗体は、本明細書で記述するようにいずれかの実施形態に従って、ヒトの定常領域に融合されたマウス抗体の可変領域を含む。そのようなキメラ抗体の産生は当技術分野において公知であり、標準的な方法（例えば、ｉｎ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら，（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１２５：１９１−２０２；米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号および同第４，８１６，３９７号に記載）により達成され得る。さらに、本発明のキメラ抗体のヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５、ＩｇＧ６、ＩｇＧ７、ＩｇＧ８、ＩｇＧ９、ＩｇＧ１０、ＩｇＧ１１、ＩｇＧ１２、ＩｇＧ１３、ＩｇＧ１４、ＩｇＧ１５、ＩｇＧ１６、ＩｇＧ１７、ＩｇＧ１８またはＩｇＧ１９の定常領域から選択し得ることも想定される。
【０１６０】
ヒト化抗体およびヒト抗体
本発明の抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体であり得る。非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化形態とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合サブ配列）であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、マウス、ラットまたはウサギのような所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体はまた、最適には免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含むであろう（Ｊｏｎｅｓら，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９；およびＰｒｅｓｔａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６）。
【０１６１】
非ヒト抗体をヒト化する方法は当技術分野で公知である。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の１つまたは複数のアミノ酸残基が導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基は、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称されることが多い。Ｊｏｎｅｓら上記；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら上記；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）サイエンス、２３９：１５３４−１５３６の方法に従って、ヒト抗体の対応配列の代わりに齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列を置換することにより、実質的にヒト化を実施できる。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基および場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【０１６２】
また、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリ（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ（１９９１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２２７：３８１；  Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２２２：５８１）を含む当技術分野で公知の種々の方法を用いて作成することができる。また、ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらの技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に好適である（Ｃｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ．ｐ．７７（１９８５）およびＢｏｅｒｎｅｒら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６−９５）。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、および抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の産生が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５、１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１、０１６号に記載されている。
【０１６３】
「ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」と呼ばれる技術を使用して、選抜された抗原決定基を認識する完全ヒト抗体を産生することができる。このアプローチにおいて、選抜された非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を、同一のエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択のガイドとして使用する（Ｊｅｓｐｅｒｓら，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９−９０３（１９８８））。
【０１６４】
抗体はさらに、当技術分野において公知の選択法および／または変異誘発法を使用して親和性成熟させてもよい。好ましい親和性成熟抗体は、成熟抗体が調製される出発抗体（一般的に、マウス、ヒト化またはヒト）の５倍、より好ましくは１０倍、さらに好ましくは２０または３０倍の親和性を有する。
【０１６５】
修飾抗体
抗体のグリコシル化パターンを、参照抗体の元のグリコシル化パターンから変更してもよい。この変更は、抗体中に見出される１つまたは複数の炭水化物部分を除去し、および／または抗体中に存在しない１つまたは複数のグリコシル化部位を付加することを意味する。抗体のグリコシル化は典型的にはＮ−結合かＯ−結合である。Ｎ−結合はアスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付加を意味する。Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸であるアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニンのトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付加のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が生成される。Ｏ−結合グリコシル化は、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンもまた使用し得るが、糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの一つのヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの付加を意味する。抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列が１つまたは複数の上述のトリペプチド配列（Ｎ−結合グリコシル化部位に対するもの）を含むようにこれを改変することにより簡便に達成される。改変はまた、（Ｏ−結合グリコシル化部位に対する）原抗体の配列への１つまたは複数のセリンまたはスレオニン残基の付加または置換によってもなされ得る。
【０１６６】
本発明の抗体の修飾されたグリコフォームは、これに限らないが、エフェクター機能を増強するか減少させる、および／または抗体の半減期を変更する等の種々の目的に有益であり得る（例えば、国際公開第２００７／０１０４０１を参照のこと）。そのような変更は、Ｃ１ｑ結合およびＣＤＣまたはＦｃｙＲ結合およびＡＤＣＣの低下または増大という結果となり得る。例えば、重鎖定常領域のアミノ酸残基の１つまたは複数を置換することができ、したがって修飾された抗体と比較して、抗原に結合する能力を保持する一方でエフェクター機能を変更することができる。米国特許第５，６２４，８２１号および米国特許第５，６４８，２６０号を参照のこと。操作されたグリコフォームは、当業者に公知の任意の方法、例えば、操作された、もしくは変異発現系統の使用により、１つもしくは複数の酵素、例えばβ（１、４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩ  １）との同時発現により、様々な生物体、もしくは様々な生物体の培養細胞株における抗体もしくはそのフラグメントの発現により、または抗体もしくはフラグメントを発現した後、炭水化物を変更することにより生成することができる。操作されたグリコフォームを生成する方法は、当技術分野において公知であり、以下に記載されたものを含むがこれらに限定するものではない。Ｕｍａｎａら，１９９９，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：１７６−１８０；Ｄａｖｉｅｓら，２００７  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ７４：２８８−２９４；Ｓｈｉｅｌｄｓら，２００２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２６７３３−２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａら，２００３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：３４６６−３４７３）米国特許第６，６０２，６８４号；米国特許出願第１０／２７７，３７０号；米国特許出願第１０／１１３，９２９号；ＰＣＴ国際公開第００／６１７３９Ａ１号；ＰＣＴ国際公開第０１／２９２２４６Ａ１号；ＰＣＴ国際公開第０２／３１１１４０Ａ１号；ＰＣＴ国際公開第０２／３０９５４Ａ１号；Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）；ＧｌｙｃｏＭＡｂ（商標）ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＧＬＹＣＡＲＴ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。例えば、国際公開第０００６１７３９号；ＥＡ第０１２２９１２５号；米国特許公開第２００３０１１５６１４号；Ｏｋａｚａｋｉら，２００４，ＪＭＢ，３３６：１２３９−４９を参照のこと。
【０１６７】
例えば、抗体の抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ）を強化するため、エフェクター機能に関して本発明の抗体を修飾することは望ましい場合がある。抗体のＦｃ領域に１つまたは複数のアミノ酸置換を導入することにより、これを達成してもよい。その代わりに、または追加で、システイン残基（複数可）をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させるようにしてもよい。そのようにして生成されたホモ二量体抗体では、内部移行能力が改善され、ならびに／または相補鎖媒介細胞殺傷および抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）が増強され得る。Ｃａｒｏｎら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照のこと。抗腫瘍活性が増強したホモ二量体抗体はまた、Ｗｏｌｆｆら，Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されたようなヘテロ二官能性架橋を用いても調製し得る。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように操作して、相補鎖溶解およびＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら．Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ３：２１９−２３０（１９８９）を参照のこと。
【０１６８】
抗体の血清半減期を延長するために、例えば米国特許第５，７３９，２７７号に記載のように、抗体（特に抗体フラグメント）へサルベージ受容体結合エピトープを組み入れてもよい。本明細書で使用される場合、用語「サルベージ受容体結合エピトープ」はＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指し、ＩｇＧ分子のインビボの血清半減期の延長を担う。あるいは、ペグ化により抗体半減期を延長させ得る。
【０１６９】
抗体複合体
本発明はさらに、薬剤または検知可能な標識に結合した本明細書のいずれかの実施形態による抗体および抗原結合性フラグメントを提供する。標識は、例えば検出可能なまたは機能的な標識を含むことができる。治療薬には細胞毒、または抗新生物薬を含むことができる。検知可能な標識には、ラジオアイソトープ（例えば、ヨウ素−１３１、イットリウム−９０、インジウム−１１１、Ｃ14、Ｓ３５、Ｐ３２、Ｐ３３、Ｈ３、Ｉ１２５、Ｉ１３１、ガリウム６７および６８、スカンジウム−４７、ルテチウム−１７７、ラジウム−２２３）を含み得る。
【０１７０】
細胞毒は、細胞に有害な（例えば死滅させる）あらゆる薬剤を含む。当技術分野において公知のこれらのクラスの薬剤およびその作用メカニズムの記述については、Ｇｏｏｄｍａｎら，Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１９９０．を参照のこと。例えばＶｉｔｅｔｔａ（１９９３）および米国特許第５，１９４，５９４号において抗体免疫毒素の調製に関連するさらなる技術が提供されている。代表的な毒素としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、α−サルシン、アレウリテス・フォーディ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・チャランチア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）インヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）およびトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）が挙げられる。例えば、国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。
【０１７１】
本発明による好適な抗新生物薬には、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチブロ、エメチン、ゲフィチニブマイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、
１つのデヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピュロマイシン、代謝拮抗物質（例えばメソトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、のような、フルダラビン、５−フルオロウラシル、ダカルバジン、ヒドロキシウレア、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン、クラドリビン）、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオテパ、クロランブシル、メルファラン、のような、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ロムスチン）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、プロカルバジン、マイトマイシンＣ、シスプラチンおよびカルボプラチン等の他の白金誘導体、）、抗生剤（例えばダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカミシン、アントラマイシン（ＡＭＣ））が含まれる。
【０１７２】
標識には蛍光標識も含まれ、例えばビオチンストレプトアビジン、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、アルカリフォスファターゼ、βガラクトシダーゼ、およびクロラムフェニコールトランスフェラーゼがある。
【０１７３】
好適な検出可能な標識には、Ｔ７−、Ｈｉｓ−、ｍｙｃ−、ＨＡ−およびＦＬＡＧ−タグ；高電子密度の試薬；エネルギー移動分子；常磁性標識；フルオロフォア（フルオレッセイン、ローダミン、フィコエリトリン）；発色団；化学発光（イミダゾール、ルシフェラーゼ）；およびバイオ発光剤を含む。
【０１７４】
本発明の抗体は、検出可能なまたは機能的な標識で標識され得る。検出可能な標識には、これらに限定するものではないが、アイソトープ３Ｈ，14Ｃ，３２Ｐ，３５Ｓ，３６ＣＩ，５１Ｃｒ，５７Ｃｏ，５８Ｃｏ，５９Ｆｅ，９０Ｙ，１２１ｌ，１２４ｌ，１２５ｌ，１３１ｌ，１１１ｌｎ，１１７Ｌｕ，２１１Ａｔ，１９８Ａｕ，６７Ｃｕ，２２５Ａｃ，２１３Ｂｉ，９９Ｔｃおよび１８６Ｒｅ等の放射標識があり、抗体イメージングの分野において公知の通常の化学的性質を使用して、本発明の抗体に付加され得る。標識としてはまた、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド）およびＭＲＩ−ＣＴイメージングの分野において通常使用される標識が挙げられる。また、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ等の酵素標識も挙げられる。標識としてはさらに、ビオチンのような化学部分が挙げられ、これは、特定の同族の検出可能な部分（例えば、標識アビジン）に結合することによって、検出され得る。機能的標識としては、腫瘍の部位を標的とし、腫瘍組織の破壊を引き起こすように設計された物質が挙げられる。このような機能的標識としては、細胞傷害性薬物（例えば、５−フルオロウラシルまたはリシン等）および酵素（例えば、細菌性カルボキシペルオキシダーゼまたはニトロレダクターゼ等）が挙げられ、これらは、腫瘍部位でプロドラッグを活性薬物に転換することができる。
【０１７５】
また、フラグメントを含む抗体、ならびに特異的結合メンバー、抗体および／またはこれらのサブユニットの産生または活性を調節する薬物は、特定の診断用途を有し得、例えば、癌、前癌性病変、過剰増殖性の細胞成長に関連する、またはそれがもたらす状態等の病状を検出および／または測定する目的で利用され得る。例えば、特異的結合メンバー、抗体またはそのサブユニットを使用して、公知の技術、例えば、融合マウス脾臓リンパ球および骨髄腫細胞を利用するハイブリドーマ技術等によって、種々の細胞培地中で、それら自体に対するポリクローナル抗体とモノクローナル抗体との両方を産生し得る。同様に、本発明の特異的結合メンバーの活性を模倣またはアンタゴナイズする低分子が、発見または合成され得、そして診断および／または治療のプロトコルにおいて使用され得る。
【０１７６】
放射性同位体標識された特異的結合メンバー、特に抗体およびそのフラグメントは、インビトロ診断技術ならびにインビボでの放射性画像化技術および放射免疫治療において有用である。インビボでの画像化の例において、本発明の特異的結合メンバーは、放射性同位体（複数可）よりむしろ、造影剤（磁気共鳴画像増強剤が挙げられるが、これに限定されない）に結合体化され得、ここで、例えば、抗体分子が多数の常磁性イオンを、キレート基を介して負荷される。キレート基の例としては、ＥＤＴＡ、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、およびポリオキシムが挙げられる。常磁性イオンの例としては、ガドリニウム、鉄、マンガン、レニウム、ユーロピウム、ランタン、ホルミウム、およびテルビウムが挙げられる。本発明のさらなる態様において、放射性同位体標識された特異的結合メンバー、特に抗体およびそのフラグメント、特に放射性免疫結合体は、放射免疫治療、特に癌治療のための放射性同位体標識された抗体として有用である。またさらなる態様において、放射標識された特異的結合メンバー、特に抗体およびそのフラグメントは、放射免疫誘導手術の手技において有用であり、ここで、これらのメンバーは、癌細胞、前癌細胞、腫瘍細胞、および過剰増殖細胞の存在および／または位置を、このような細胞を除去する手術の前、手術の間または手術の後に同定し、示すことができる。
【０１７７】
本発明の免疫結合体または抗体融合タンパク質（ここで、本発明の特異的結合メンバー、特に抗体およびそのフラグメントは、他の分子または薬剤に結合体化または付着されている）としては、さらに、化学解離剤、毒素、免疫調節因子、サイトカイン、細胞毒性物質、化学療法剤または薬物に結合体化された結合メンバーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７８】
放射免疫治療（ＲＡＩＴ）は臨床実習に入り、種々の抗体免疫結合体を使用して有効性を実証してきた。１３１Ｉで標識されたヒト化抗癌胎児抗原（抗ＣＥＡ）抗体ｈＭＮ−１４は、結腸直腸癌において評価され（Ｂｅｈｒ  ＴＭら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  ９４（補遺４）：１３７３−８１）、そしてこの同じ抗体の９０Ｙ標識を有するものが、甲状腺髄様癌において評価されている（Ｓｔｅｉｎ  Ｒら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  ９４（１）：５１−６１）。モノクローナル抗体を使用する放射免疫治療もまた、非ホジキンリンパ腫および膵臓癌について、評価および報告されている（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ＤＭ（２００１）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｎｃｏｌ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ３９（１−２）：１９５−２０１；Ｇｏｌｄ  ＤＶら（２００１）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｎｃｏｌ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ３９（１−２）１４７−５４）。特定の抗体を用いる放射免疫治療の方法もまた、米国特許第６，３０６，３９３号および同第６，３３１，１７５号に記載されている。放射免疫誘導手術（ＲＩＧＳ）もまた、臨床実習に入り、そして有効性および有用性が実証されている（抗ＣＥＡ抗体および腫瘍関連抗原に対する抗体の使用を含む）（Ｋｉｍ  ＪＣら（２００２）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９７（４）：５４２−７；Ｓｃｈｎｅｅｂａｕｍ  Ｓら（２００１）Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  ２５（１２）：１４９５−８；Ａｖｉｔａｌ  Ｓら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  ８９（８）：１６９２−８；ＭｃＩｎｔｏｓｈ  ＤＧら（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ  １２（４）：２８７−９４）。  
【０１７９】
動物モデル
癌または動物異種移植片研究のインビボ動物モデルを当業者が使用して、本発明の抗体またはそのフラグメントをさらに、または追加的にスクリーニング、評価および／または検証してもよく、これにはｃ−Ｍｅｔの調節、ｃ−Ｍｅｔの下方制御のさらなる評価、および／またはインビボでのｃ−Ｍｅｔ活性化／ｔｋ活性の阻害、ならびに腫瘍進行および／または浸潤の阻害が含まれる。そのような動物モデルとしては、これらに限定するものではないが、ｃ−Ｍｅｔ媒介癌、またはｃ−Ｍｅｔが活性化もしくは過剰発現された細胞（腎細胞癌など）の異種移植片のモデルを含む。代表的かつ好適なモデルは、ＨＧＦおよびｃ−Ｍｅｔの両方を発現するいくつかの癌化細胞株中にあるグリア芽腫のＵ８７ＭＧマウス異種移植モデルである（Ｇｕｅｒｉｎ  Ｃら（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２７３：２８７−２９３；Ｔｓｅｎｇ  ＪＲら（２００８）Ｊ  Ｎｕｄｅ  Ｍｅｄ  ４９（１）：１２９−１３４）。
【０１８０】
競合的阻害
エピトープへの本発明のＬＭＨ抗体の結合を競合的に阻害する抗体は、当技術分野において公知の従来の競合結合アッセイを使用して、スクリーニングし、同定することができる。多くの種類の競合結合アッセイが公知であるが、例えば、固相直接または間接放射免疫測定法（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，９２：２４２−２５３，（１９８３）；Ｋｉｍら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５７：９４４，（１９８９）を参照のこと）；固相化の直接的なビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３７：  ３６１４−３６１９（１９８６）を参照のこと）；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８）１２５Ｉ標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌら，Ｃｕｒｒ  Ｓｔｕｄ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｔｒａｎｓｆｕｓ，５５：  ５３−６３，（１９８８）を参照のこと）；固相直接型ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７６：５４６，（１９９０））；または直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒら，Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，３２：７７−８２，（１９９０））がある。（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，１９８８）を参照のこと）
【０１８１】
このようなアッセイは典型的には、固体表面に結合した精製抗原、標識されていない試験タンパク質および標識された比較タンパク質を使用する。試験タンパク質が存在する状態で固体表面に結合された標識の量を測定することにより、競合的阻害を計測する。
【０１８２】
本発明の組成物
本発明の抗体は、通常、医薬組成物の形態で投与され、これは、抗体またはその抗原結合性フラグメントに加え、少なくとも１つの成分を含み得る。したがって、本発明の、および本発明に従い使用される医薬組成物は、有効成分に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、バッファー、安定剤または当業者に周知の他の物質を含み得る。そのような物質は無毒性であるべきであり、有効成分の効力を妨げるべきではない。担体または他の物質の厳密な性質は、経口経路または静脈内等の注射であり得る投与経路に左右されるであろう。
【０１８３】
経口投与用の医薬組成物は錠剤、カプセル剤、散剤または液体形態であり得る。錠剤は、固体担体、例えばゼラチン、または補助物質を含み得る。液体医薬組成物は、一般に、液体担体、例えば水、石油、動物もしくは植物油、鉱油または合成油を含む。生理食塩水、デキストロースもしくは他の糖溶液、またはグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールが含有され得る。
【０１８４】
静脈内注射、または罹患部位における注射の場合、有効成分は、発熱物質を含有せず適当なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態であろう。当業者は、例えば等張性ビヒクル、例えば食塩注射剤、リンゲル注射剤、乳酸添加リンゲル注射剤を使用して、適当な溶液を製造することが十分に可能である。必要に応じて、保存剤、安定剤、バッファー、抗酸化剤および／または他の添加剤も加えてよい。
【０１８５】
実施形態のいくつかにおいては、リポソームおよび／またはナノ粒子を有効成分と共に使用してもよい。リポソームの構造および利用は、当業者に一般に公知である。リポソームは、水性媒体に分散され、自発的に多重膜同心二重層小胞  （多重膜小胞（ＭＬＶ）とも称される）を形成するリン脂質から形成される。ＭＬＶは、一般に、２５ｎｍから４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理により、核に水性溶液を含む２００から５００オングストロームの範囲の直径を有する小さい単層小胞（ＳＵＶ）の形成が生じる。リン脂質は、水に分散されると、脂質と水とのモル比に応じて、リポソーム以外の種々の構造を形成することができる。低い比では、リポソームが優先的構造である。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度および２価カチオンの存在に依存する。リポソームはイオン性および極性物質に対して低い透過性を示すことがあるが、高い温度では、それらの透過性を顕著に変化させる相転移を受ける。この相転移は、ゲル状態として知られる密に詰まった秩序構造から、液体状態として知られるゆるく詰まった低秩序構造への変化を伴う。
【０１８６】
本発明の組成物は、治療すべき状態に応じて、単独で、または他の処置、治療用物資もしくは薬剤と組合せて同時または連続的に投与され得る。また、本発明は、本明細書に記載されている抗体またはそのフラグメントおよび他の物質または治療用物質、例えば、抗癌物質もしくは治療、ホルモン、抗ＥＧＦＲ物質もしくは抗体、抗ｃ−Ｍｅｔ物質もしくは抗体、抗ＨＧＦ物質、例えばＡＭＧ−１０２、血管新生抑制薬または免疫モジュレーター、を含む組成物を想定し、これを含む。より一般的には、これらの抗癌物質はチロシンキナーゼインヒビターまたはリン酸化カスケードインヒビター、翻訳後モジュレーター、細胞増殖または分裂インヒビター（例えば、抗有糸分裂物質）、またはシグナル伝達インヒビターであり得る。他の治療薬または療法は、適当な用量の鎮痛薬、例えば非ステロイド性抗炎症薬（例えばアスピリン、パラセタモール、イブプロフェンまたはケトプロフェン）またはオピエート、例えばモルヒネ、または制吐薬の投与を含み得る。組成物は、チロシンキナーゼインヒビター（限定的なものではないが、ＡＧ１４７８およびＺＤ１８３９、ＳＴＩ５７１、ＯＳＩ−７７４、ＳＵ−６６６８が含まれる）、ドキソルビシン、テモゾロミド、シスプラチン、カルボプラチン、ニトロソウレア、プロカルバジン、ビンクリスチン、ヒドロキシ尿素、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、エピポドフィロトキシン、カルムスチン、ロムスチンおよび／または他の化学療法剤と組合せて（連続的（すなわち、前または後に）または同時に）投与することができる。したがって、これらの物質は抗ＥＧＦＲ特異的物質またはチロシンキナーゼインヒビター、例えばＡＧ１４７８、ＺＤ１８３９、ＳＴＩ５７１、ＯＳＩ−７７４、またはＳＵ−６６６８であることが可能であり、あるいはより一般的な抗癌および抗腫瘍物質、例えばドキソルビシン、シスプラチン、テモゾロミド、ニトロソウレア、プロカルバジン、ビンクリスチン、ヒドロキシ尿素、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、エピポドフィロトキシン、カルムスチンまたはロムスチンであり得る。また、組成物は、ホルモン、例えばデキサメタゾン、免疫モジュレーター（免疫調節物質）、例えばインターロイキン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、または免疫応答および癌細胞もしくは腫瘍の減少もしくは排除を刺激する他の増殖因子もしくはサイトカインと共に投与され得る。
【０１８７】
本発明の抗体は、任意の適当な経路、通常は血流もしくはＣＳＦ内へのまたは直接的に腫瘍の部位内への注射により、治療を要する患者に投与され得る。厳密な用量は、抗体が診断用なのか治療用なのか、腫瘍のサイズおよび位置、抗体の厳密な性質（全抗体、フラグメント、ジアボディなどであるかどうか）ならびに抗体に結合した検出可能なまたは機能的な標識の性質を含む多数の要因に左右される。放射性核種が治療に使用される場合、適切な最小の単回用量は、約４５ｍＣｉ／ｍ２から最大約２５０ｍＣｉ／ｍ２である。好ましい投与量は１５〜４０ｍＣｉの範囲であり、さらに好ましい投与量範囲は２０〜３０ｍＣｉ、または１０〜３０ｍＣｉである。そのような療法は骨髄または幹細胞置換を要するかもしれない。腫瘍イメージングまたは腫瘍治療のための典型的な抗体用量はＦ（ａｂ’）２形態の抗体０．５〜４０ｍｇ、好ましくは１〜４ｍｇの範囲となろう。裸抗体は、好ましくは、２０〜１０００ｍｇタンパク質／用量、または２０〜５００ｍｇタンパク質／用量、または２０〜１００ｍｇタンパク質／用量の用量で投与される。これは成人患者の単一治療のための用量であり、小児および乳児では、比例的に調節することが可能であり、また、他の抗体形態では、分子量に比例して調節され得る。治療は、医師の判断により、毎日、週２回、毎週または毎月の間隔で反復され得る。
【０１８８】
適切な血管形成阻害剤（抗血管新生剤）の例には、これらに限定するものではないが、
ウロキナーゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤（例えばｍａｒｉｍａｓｔａｔ、ｎｅｏｖａｓｔａｔ、ＢＡＹ１２−９５６６、ＡＧ３３４０、ＢＭＳ−２７５２９１および類似の剤）、内皮細胞遊走および増殖の阻害剤（例えばＴＮＰ−４７０、スクワラミン、２−メトキシエストラジオール、コンブレタスタチン、エンドスタチン、アンジオスタチン、ペニシラミン、ＳＣＨ６６３３６（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ｃｏｒｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＮＪ）、Ｒ１１５７７７（Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ，Ｉｎｃ，Ｔｉｔｕｓｖｉｌｌｅ，ＮＪ）および類似の剤、血管新生促進因子のアンタゴニスト（例えば例えばＺＤ６４７４、ＳＵ６６６８、血管形成剤および／またはそれらの受容体に対する抗体（例えばＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、およびアンギオポエチン−１）、サリドマイド、サリドマイド類似体（例えばＣＣ−５０１３）、Ｓｕｇｅｎ５４１６、ＳＵ５４０２、血管新生阻害のリボザイム（例えばａｎｇｉｏｚｙｍｅ）、インターフェロン（例えばインターフェロンａ２ａ）、スラミンおよび類似の剤）、ＶＥＧＦ−Ｒキナーゼ阻害薬および他の血管新生阻害のチロシンキナーゼ阻害剤（例えばＳＵ０１１２４８）、内皮特異的インテグリン／生存シグナル伝達の阻害剤（ｖｉｔａｘｉｎ等および類似の剤）、銅アンタゴニスト／キレート剤（テトラチオモリブデート、カプトプリル等のおよび類似の剤）、カルボキシアミド−トリアゾール（ＣＡＩ）、ＡＢＴ−６２７、ＣＭ１０１、インターロイキン１２（インターロイキン１２）、ＩＭ８６２、ＰＮＵ１４５１５６Ｅと同様血管新生を阻害するヌクレオチド分子（例えばアンチセンス−ＶＥＧＦ−ｃＤＮＡ）、アンジオスタチンをコードするｃＤＮＡ、ｐ５３をコードするｃＤＮおよび欠損ＶＥＧＦレセプター−２をコードするｃＤＮＡ）および類似の剤を含む。血管新生、新生血管形成、および／または他の血管新生化の阻害剤には他にも、抗血管新生ヘパリン誘導体および関連分子（例えば、ヘパリナーゼＩＩＩ）、テモゾロミド、ＮＫ４、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、シクロオキシゲナーゼ２阻害剤、低酸素誘導因子１の阻害剤、血管新生阻害の大豆イソフラボン、オルチプラズ、フマギリンおよびその類似体、ソマトスタチン類似体、多流酸ペントサン、テコガランナトリウム、ダルテパリン、タムスタチン、トロンボスポンジン、ｎＭ−３、コンブレタスタチン、カンスタチン、アバスチン、他の関連ターゲットに対する抗体（例えば抗α−ｖ／β３インテグリンおよび抗キニノスタチンｍＡｂｓ）および類似の剤が含まれる。
【０１８９】
細胞生存度の計測
細胞の毒性および生存度（細胞アポトーシス、溶解、成長、増殖等）は、当技術分野において公知の熱量測定、ルミネセンス、放射測定、または蛍光分析に基づく種々の方法で計測することができる。細胞生存度を判定するための比色分析技術には、例えば、トリパンブルー排除法が含まれる（（例えば、実施例１および２を参照のこと）。手短に言えば、細胞をはトリパンブルーで染色し、血球計を使用して数える。生存細胞は色素を排除する一方、死滅したおよび死につつある細胞は青色染料を取り込み、光学顕微鏡で容易に識別される。ニュートラルレッドは生存細胞により吸着され、細胞ライソゾームに集中し；生存細胞はニュートラルレッドで染色された細胞の数の定量化により光学顕微鏡で測定することができる。
【０１９０】
細胞生存度を判定するための蛍光定量的な技術は、例えば、ヨウ化プロピジウム、つまり蛍光ＤＮＡ挿入剤を含む。プロピジウムヨウ化物は生存細胞から排除されるが、死細胞の核を染色する。その後、ヨウ化プロピジウム標識細胞のフローサイトメトリーを使用して生細胞および死細胞を定量することができる。乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出は、構造損傷および細胞死を示し、分光光度酵素アッセイにより測定することができる。ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）は新しく合成したＤＮＡに組み入れられ、蛍光色素標識抗体を用いて検出することができる。蛍光染料Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８はＤＮＡを標識し、細胞の増殖を定量するために使用され得る（例えば、フローサイトメトリー）。蛍光染料カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥまたはＣＦＤＡ−ＳＥ）の定量的な組み入れにより、細胞分裂分析を提供することができる（例えば、フローサイトメトリー）。この技術はインビトロまたはインビボのいずれかで使用することができる。７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）は、ＤＮＡと会合するとスペクトルシフトを受ける蛍光インターカレーターであり、細胞分裂分析を提供することができる（例えば、フローサイトメトリー）。
【０１９１】
細胞増殖を確認するための放射測定技術としては、例えば、［３Ｈ］−チミジンが挙げられ、これは生細胞の新たに合成されたＤＮＡ中に組み入れられ、細胞の増殖を決定するために頻繁に使用される。細胞生存率を定量するために、死細胞からのクロム（５１Ｃｒ）−放出を、シンチレーション計数により定量することができる。
【０１９２】
細胞生存度を測定するための発光技術には、例えば、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存度測定）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．）を含む。この技術は、存在ＡＴＰの量を定量化して生存細胞数を測定する。
【０１９３】
細胞生存度および細胞増殖を判定するための市販のキットには、例えばＣｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｔｒａｋ  ＥＬＩＳＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）；蛍光試薬の取り込み差に基づいた迅速な細胞数計測および生存度決定を提供するＧｕａｖａ  ＶｉａＣｏｕｎｔ（商標）Ａｓｓａｙ，（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，Ｃａｌｉｆ．）；ＣｙＱＵＡＮＴ（商標）；細胞増殖アッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）；およびＣｙｔｏＬｕｘ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）がある。ＤＥＬＦＩＡ（商標）アッセイキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）は、時間分解蛍光測定法を使用して細胞の増殖および生存度を判定することができる。Ｑｕａｎｔｏｓ（商標）細胞増殖アッセイは、溶解細胞からのＤＮＡ色素複合体の蛍光を計測する、蛍光に基づいた分析である（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ細胞生存度アッセイは、細胞生存度を計測するための発光アッセイである（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．）。
【０１９４】
用途
本発明の抗体は、種々の適用、例えば研究、診断および治療への適用に有用である。
【０１９５】
本明細書に記述された抗体は、（ａ）ｃ−Ｍｅｔ受容体への（例えばリガンド、阻害剤の）結合、（ｂ）受容体シグナル伝達機能、および／または（ｃ）刺激性機能、を阻害する（減少させる場合も阻止する場合もある）ための阻害剤として作用することができる。ｃ−Ｍｅｔ受容体機能の阻害剤として作用する抗体は、リガンド結合を直接または間接的に（例えば、コンホメーション変化を引き起こすことにより）ブロックすることができる。例えば、抗体は、リガンドの結合の阻害により、または脱感作（リガンドの結合の阻害の有無に関わらず）によりｃ−Ｍｅｔ受容体機能を阻害することができる。
【０１９６】
一態様において、本発明は、対象の障害を治療または予防する方法を提供する。本明細書で使用される場合、「障害」は正常機能の破壊、または正常機能に対する干渉である。
【０１９７】
診断アッセイ
本発明はまた、異常に発現されたｃ−Ｍｅｔのような刺激の存在を、本発明の抗体により認識されるその能力を参照することにより検出する方法を含む種々の診断用途に関する。本発明の抗体（複数可）の診断用途には、当業者には周知かつ標準的である本記載に基づくインビトロおよびインビボ用途が含まれる。ｃ−Ｍｅｔ状態（特にｃ−Ｍｅｔの異常発現に関するもの）のインビトロ査定および評価のための診断アッセイおよびキットは、患者のサンプル、例えば、癌、前癌状態、過剰増殖細胞増殖に関連した状態を有するまたは有する疑いのあるもの、または腫瘍サンプルを診断、評価およびモニターするために利用され得る。ｃ−Ｍｅｔ状態の査定および評価は、薬物の臨床試験のための患者の適合性、または特定の化学療法剤もしくは本発明の特異的結合メンバー、特に抗体（その組合せを含む）の投与のための、異なる物質または抗体と比較した場合の患者の適合性の判定においても有用である。このタイプの診断モニターおよび評価は、乳癌におけるＨＥＲ２タンパク質に対する抗体（Ｈｅｒｃｅｐ  Ｔｅｓｔ，Ｄａｋｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を利用して既に実施されており、この場合、アッセイは、ヘルセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）を使用する抗体療法に関して患者を評価するためにも用いられる。インビボ用途には、腫瘍のイメージングまたは個体の癌状態の評価（放射性イメージングを含む）が含まれる。
【０１９８】
細胞中のｃ−Ｍｅｔの存在は、当業者に公知のインビトロ免疫学的手順またはインビボ免疫学的手順によって確認され得る。例えば、ｃ−Ｍｅｔ受容体は１つまたは複数の抗体と複合体を形成し、複合体の１つのメンバーは検出可能な標識で標識される。これらの実験で最もよく使用される標識は放射性元素、酵素、紫外光に露出された場合に蛍光を発する化学物質その他である。多数の蛍光物質が公知であり、標識として利用することができる。これらは、例えば、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサスレッド、ＡＭＣＡブルーおよびルシフェールイエローを含む。また、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は放射性元素で、または酵素で標識することもできる。放射性標識は現在利用可能な計数法のいずれかによって検出することができる。好ましい同位体は３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２１Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、２１１Ａｔ，１９８Ａｕ，６７Ｃｕ，２２５Ａｃ，２１３Ｂｉ，９９Ｔｃおよび１８６Ｒｅから選択することができる。酵素標識は同様に有用であって、現在利用されている比色、分光測定、蛍光分光測定、アンペロメトリーまたはガソメトリー技術のいずれかによって検出することができる。酵素は、カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒドなどのような橋渡し分子との反応によって、選択された粒子に結合体化される。これらの手法で用いることができる多くの酵素が公知であり、利用することができる。好ましいのはペルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ＋ペルオキシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼである。米国特許第３，６５４，０９０号、同第３，８５０，７５２号および同第４，０１６，１４３号は、別の標識材料および方法を開示しているため例示的に参照される。
【０１９９】
本発明はさらに、現在の治療法で使用するための本発明の抗体を含む治療または診断キットの使用法を想定する。そのようなキットは、一般に適切な容器手段内に、本発明の少なくとも１つのＬＭＨ抗体またはフラグメントの薬学的に許容される製剤を含むであろう。キットは、生体試料中にｃ−Ｍｅｔ受容体の存在を検出するために使用することができる。本発明の抗体組成物は、液剤または凍結乾燥した形態で、単独か、または他のエピトープに特異的な追加の抗体との組み合わせで、提供することができる。抗体は標識されていても、標識されていなくてもよく、補助成分（例えばトリス、リン酸および炭酸塩等の緩衝液、安定剤、賦形剤、殺生物剤および／またはウシ血清アルブミン等の不活性タンパク質など）を有するキットに含めることができる。例えば、抗体は、補助成分を有する凍結乾燥した混合物として提供することができ、またはユーザーが組み合わせるように補助成分を別にして提供できる。一般に、これらの補助材料は活性な抗体の量に基づいて約５％重量未満、通常は、抗体濃度に基づいて少なくとも約０．００１％重量の総量で存在するだろう。抗体に結合することができる二次抗体が使用される場合、そのような抗体は、例えば別のバイアルまたは容器に入れてキットで提供することができる。二次抗体が存在する場合は、典型的には標識され、本明細書に記述された抗体製剤と類似の方法で調剤することができる。
【０２００】
腫瘍細胞
本発明による腫瘍細胞はｃ−Ｍｅｔを発現するあらゆる細胞である。これらは例えば
膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、腎癌、肝臓癌、肺癌、上咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌および甲状腺癌等の癌、骨肉腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫等の筋骨格肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫および線維肉腫等の軟部組織肉腫、Ｔ細胞白血病、リンパ腫および多発性骨髄腫等の造血器悪性腫瘍、ならびにグリア芽腫、メラノーマ、中皮腫およびウィルムス腫瘍等の他の新生物を含む。
【０２０１】
アプタマー
アプタマーを使用して本明細書に記述されたｃ−Ｍｅｔエピトープ配列を標的にすることが可能であることも理解されるであろう。核酸アプタマー（適応可能なオリゴマー）は、分子標的に結合する能力をもたらす二次および／または三次構造を形成することができる核酸分子である。アプタマーの生成方法は当技術分野において公知であり、Ｍａｓｃｉｎｉにより一般に開示された方法を使用して調製され得る（Ａｐｔａｍｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ，２００９）。アプタマーライブラリーは、例えば、ベクター（またはＲＮＡアプタマーの場合の発現ベクター）へランダムなオリゴヌクレオチドをクローン化することにより産生され、ここでは、ランダム配列には、ＰＣＲプライマーが結合する部位を提供する公知の配列が隣接する。活性が亢進したアプタマーは、例えばＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化））を使用して、選抜された。アプタマーライブラリーの産生および／またはスクリーニングに好適な方法は、例えばＥｌｌｏｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：８１８−２２，１９９０に記載されている。
【０２０２】
したがって本発明はさらに、本明細書に記載されたｃ−Ｍｅｔのエピトープ配列に特異的に結合する核酸アプタマーにも関する。そのようなアプタマーは、本明細書に記述された細胞増殖性疾患の治療においてｃ−Ｍｅｔを標的とするために使用することができる。
【０２０３】
寄託申告
モノクローナル抗体ＬＭＨ８０を産生するハイブリドーマ細胞株は、２０１０年１０月１４日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  より入手した。このハイブリドーマには、特許寄託番号ＰＴＡ−１１４０５が割り当てられている。モノクローナル抗体ＬＭＨ８２を産生するハイブリドーマ細胞株は、２０１０年１０月１４日に  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡより入手した。このハイブリドーマには、特許寄託番号ＰＴＡ−１１４０６が割り当てられている。これらの寄託物は、ブダペスト条約下の要件に従って入手することができるであろう。しかしながら、寄託物の入手が可能であっても、政府の決定により付与された特許権に減損をもたらすような本主題の発明の実施が許可されるわけではないことを理解するべきである。さらに、本主題の培養寄託物は、微生物の寄託のためのブタペスト条約の規定に合わせて保存され、公共の利用に供される、すなわち、それらは寄託物の試料提供を求める最も最近の要求があった後少なくとも５年間、かついかなる場合でも、寄託日から少なくとも３０年間、あるいは、当該培養物の開示を発令する任意の特許の有効期間プラス寄託物の試料が最後に要求された後さらに５年間、それらを生存させてコンタミをしないようにし続けるために必要なあらゆる配慮をもって保存されるであろう。寄託者は、受託者が試料を要求された時に、寄託物の状態のために万一試料が提供できない場合には、寄託物差し替えの義務を受け入れる。
【０２０４】
具体的な実施形態に示される通り、広範に記載された本発明の範囲から逸脱することなく本発明に対して多くのバリエーションおよび／または変更が行われ得ることは、当業者により理解されるであろう。したがって、本発明の実施形態はあらゆる点で例示的なものであり、限定的なものと考えてはならない。
【０２０５】
下記の非限定的な実施例において本発明をさらに記載する。
【実施例】
【０２０６】
実施例１
材料および方法
１．１  細胞
肺腺癌細胞株Ａ５４９（ＡＴＣＣ  ＃ＣＣＬ−１８５）および神経膠腫細胞株Ｕ８７ＭＧ（ＡＴＣＣ  ＃ＨＴＢ−１４）はすべて、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）から得た。細胞株はすべて、５％ＦＣＳと５ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液において３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
ＳＫ−ＯＶ−３ヒト卵巣癌細胞はＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−７７）から得た。
【０２０７】
１．２  免疫方法および抗体産生
ヒト肺癌細胞株Ａ５４９を、２５−５６７Ｈ（配列番号１）と命名された精製された切断ｃ−Ｍｅｔフラグメントと組み合わせてミュータントマウスを免疫化するために使用した。Ａ５４９細胞は自動活性化されたｃ−Ｍｅｔ受容体を含み、したがって恒常的にｃ−Ｍｅｔを過剰発現させる。これらの細胞は、さらにｃ−Ｍｅｔ受容体のあるプロセシングされていない形態を含む。免疫処置に使用された切断ｃ−Ｍｅｔフラグメントは、ｃ−Ｍｅｔの残基２５−５６７を含む構築物を形質移入されたＣＨＯ−Ｌｅｃ細胞由来であり、残基２５−５６７には、Ｉｇリーダー配列（Ｎ末端）のフレームにおけるクローン化、および精製（Ｃ末端）のため、Ｎ末端（ＥＴＲ）で別の３アミノ酸およびＣ末端で別の９アミノ酸（Ｈｉｓ６末端の標識を含む）をさらに含む。形質移入されたＣＨＯ−Ｌｅｃ細胞は、Ｄｒ  Ｅｒｍａｎｎｏ  Ｇｈｅｒａｒｄｉ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）により提供された。
【０２０８】
表に記載した免疫プロトコルにより示されるように、ＢＡＬＢ／ｃミュータントマウスを、フロイント完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ）での最初の免疫処置後、フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ）中２×１０６溶解Ａ５４９細胞で、または、精製切断組み換えｃ−Ｍｅｔ抗原で、４週間隔で４〜５回、腹腔内で（ｉ．ｐ．）免疫化することにより、マウスハイブリドーマを産生した。フロイント不完全アジュバントを次の免疫化に使用した。免疫プロトコルを下の表１に記載する。
【表２】
2013534515.tif 000003
【０２０９】
免疫化されたマウスの脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞株ＳＰ２／０と融合した。新規に産生したクローンの上澄部を、下に記載したように、組み換えｃ−Ｍｅｔ抗原と一緒に比反応性に関してＥＬＩＳＡによりスクリーンした。次いで下で記載するように、陽性の上澄部を、Ａ５４９細胞上のｃ−Ｍｅｔ受容体への結合に関してフローサイトメトリーによりスクリーニングした。抗体を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを標準方法に従って使用して、陽性クローンの上澄部から精製した。
【０２１０】
１．３  ＥＬＩＳＡ分析
ＥＬＩＳＡ分析では、Ｅｌｉｓａプレート（Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ４４６６１２）のウェルを、０．０５ＭのＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．２中３μｇ／ｍｌのｃ−Ｍｅｔ抗原５０μｌで４℃で一晩コートした。インキュベーション後、上澄部を除去し、ウェルを洗浄緩衝液０．０５％のＴｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで２回洗浄し、次いで３％のＦＣＳ／ＰＢＳを２３０μｌ／ウェルで室温で１時間ブロックした。次いで、ウェルを洗浄緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２−ＰＢＳ）で１回洗浄しＰＢＳでリンスした。次いで、サンプル（ハイブリドーマ上清）１００μｌを各ウェルに添加し、プレートを１時間室温でインキュベートした。その後、洗浄緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２−ＰＢＳ）で４回洗浄しＰＢＳでリンスした。次いで、洗浄緩衝液に１：２０００に希釈されたヤギ抗マウスＩｇガンマ−ＡＰ（Ｓｉｇｍａ  Ａ３４３８）１００μｌを添加し室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルを洗浄緩衝液で４回洗浄しＰＢＳでリンスした。室温で１０分間ｐＮＰＰ（１ｍｇ／ｍｌ  ｎジエタノールアミン−ＨＣＬ緩衝液ｐＨ９．６）１００μｌで発色させた。その後、停止液（３．０ＭのＮａＯＨ、５０μｌ／ウェル）を添加した。ＯＤは４０５ｎｍで計測された。
【０２１１】
試薬は以下のように調製された：
標識：
ヤギ抗マウスＩｇ（全）−アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ  Ａ−３６８８ロット６９Ｈ９２０７）
１％ＦＣＳ／ＰＢＳ中１：３０００希釈、１００μｌ／ウェル、室温  １時間
基質：
ｐＮＰＰ（パラニトロフェニル燐酸；ＩＣＮ  Ｃａｔ  Ｎｏ．１５１７６６；ロットＮｏ．６９０９Ｃ、貯蔵−２０℃）
１ｍｇ／ｍｌジエタノールアミンＨＣＩ（０．１Ｍ）中およびＭｇＣＩ２．６Ｈ２０緩衝液  
１００μｌ／ウェル、室温１０分
【０２１２】
１．４  フローサイトメトリー
５×１０５Ａ５４９細胞を、抗体ＬＭＨ８５または抗体ＬＭＨ８７（１０μｇ／ｍｌ）と一緒にインキュベートした。結合した抗体はＰＥ標識抗マウス抗体を使用して検出された。対照抗体はマウスｌｇＧ１イソタイプと一致した抗体だった。ＰＥシグナル強度の上昇は、ｃ−Ｍｅｔに結合する抗体を示す。
【０２１３】
１．５  ＳＫＯＶ−３細胞遊走アッセイ
抗体を、Ｎｅｕｒｏ  ＰｒｏｂｅのＡシリーズ９６ウェルＣｈｅｍｏｔａｘｉｓ  Ｃｈａｍｂｅｒを用いて、コラーゲンでコートされた８μｍ膜のフレームをつけて、細胞遊走を刺激するまたは阻害する能力に関してテストした。卵巣癌細胞ＳＫ−ＯＶ−３をすべての分析に使用した。チャンバーの底のウェルを、０．２５％ＢＳＡを有するＲＰＭＩで希釈した所望の濃度の抗体で充填した。アンタゴニスト検定では、０．３ｐＭのＨＧＦを抗体と混合した。チャンバーの上部を、ＲＰＭＩ／０．２５％ＢＳＡ中４×１０５ＳＫ−ＯＶ−３細胞で充填した。３７℃のインキュβーで４時間インキュベーションした後、膜は遊走細胞と共に回収し、４％のホルムアルデヒドで１ｈ固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＤｅｅｐＲｅｄ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｓｔａｉｎ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）で一晩染色した。ＬｉＣｏｒ社製Ｏｄｅｓｓｅｙ赤外スキャナを使用して、７００ｎｍで膜をスキャンし、細胞を計測した。
【０２１４】
１．６  エピトープマッピング
ｃ−Ｍｅｔのアミノ酸１−５６７（ＳＥＭＡドメインを含む）に及ぶＰｅｐＳｅｔ（商標）ペプチドライブラリーを合成した（Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ，Ｃｌａｙｔｏｎ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）。ライブラリーはＮ末端にビオチン標識した、２０−ｍｅｒペプチドで、１５個のアミノ酸を重ねたものからなり、９６ウェルのストレプトアビジン被覆プレートにあらかじめ吸収させた。ＬＭＨ抗体８０〜８９をこのプレートに添加し、標準的なＥＬＩＳＡを使用して、個々の単一のペプチドに対するそれらの反応性を測定した。各抗体のエピトープは、抗体と反応したペプチドの配列を重ねることにより決定し、コアの共通アミノ酸配列を決定した。
【０２１５】
１．７  ウエスタン分析
細胞は６ウェルプレートに２ｘ１０５／ウェルで播種し、８時間、３７℃、５％Ｃ０２でインキュベートした。培地を除去し、細胞をＰＢＳで２回、無血清培地で１回洗浄した後、１６時間血清飢餓状態とした。アゴニストおよびアンタゴニストの分析については、各抗体５０ｍｇ／ｍｌを付加し、３７℃、５％Ｃ０２で４５分間、細胞をインキュベートした。その後、アンタゴニストテストのみ、ＨＧＦ４００ｎｇ／ｍｌを直後に培地に付加し、細胞をさらに７分インキュベートした。ｃ−Ｍｅｔ下方制御分析については、各抗体５０ｍｇ／ｍｌを付加し、細胞を８時間インキュベートした。処理後、上記に記載したように、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００細胞溶解緩衝液で細胞を溶解し、処理して、ｃ−Ｍｅｔ免疫沈降した（Ｐｉｌｌａｙら，２００９）。
【０２１６】
４−１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上でタンパク質試料を分離し、平衡緩衝器中２２℃で２０分間ゲルを浸漬した［２ｘＭＥＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０％メタノール、１：１０００ＮｕＰａｇｅ酸化防止剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｄｄＨ２０］。ｉＢｌｏｔ  ｄｒｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＰＶＤＦ膜にあらかじめ平衡にしたゲルを移した。Ｏｄｙｓｓｅｙ  ｂｕｆｆｅｒ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）中で、膜ブロッキングおよび抗体インキュベーションのステップをすべて行った。全ｃ−Ｍｅｔを、Ｍｅｔ（２５Ｈ２）マウスｍＡｂ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）か、または、ウサギポリクローナル抗  Ｍｅｔ（ｃ−Ｍｅｔ）抗体  （Ａｂｅａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）のいずれかでプローブすることにより検出した。リン酸エステル化されたｃ−Ｍｅｔをリン酸−Ｍｅｔ（Ｔｙｒ１２３４／１２３５）（３Ｄ７）ウサギｍＡｂ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でプローブすることにより検出した。検出に使用された二次抗体は、ＩＲＤｙｅ  ＣＷ８００標識アフィニティ精製抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ，ＰＡ）だった。Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ウェスタンブロットを解析した。
【０２１７】
１．８  ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ
検定はすべて０．５％ＦＣＳおよび５ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で行なった。Ａ５４９細胞を未処理のＥ−プレート（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に、ウェルあたり５，０００細胞播種し、Ｕ８７ＭＧ細胞を、１：５０マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）で前処理されたＥ−プレートに、ウェル当たり４０，０００細胞播種した。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２の加湿された細胞インキュベーター内でｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ  ＲＴＣＡ  ＳＰ装置（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に接続した。ＲＴＣＡソフトウエア１．２（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）上の下記の解析プログラムを使用し、細胞増殖に関するデータを収集した。まず１分間隔の１８０スイープ、続いて、３０分間隔の９９９スイープを開始した。
Ａ５４９細胞を２１時間増殖させ、Ｕ８７ＭＧ細胞を４８時間増殖させた後、このプログラムを中止し、抗体処理物を細胞に直接付加した。１分間隔で１８０スイープ、続いて、３０分間隔で９９９スイープの第２プログラムを、Ａ５４９細胞に対して６０時間、Ｕ８７ＭＧ細胞に対して１２０時間終了するまで実行した。ＲＴＣＡソフトウエア１．２プログラム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）を使用して、データを解析した。抗体付加直前のポイントまで読み値を標準化した。データは全て、時間に対して平均細胞インデックス±ＳＥＭとして示す。
【０２１８】
１．９  Ｕ８７ＭＧ異種移植片試験
Ｕ８７ＭＧ異種移植片試験を基本的に上で記載したように実施した［Ｐｉｌｌａｙら、２００９］。簡単に述べると、４〜６週齡の雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの腹面の左右脇腹に、１ｘ１０６細胞を注射した。腫瘍サイズが１００ｍｍ３に到達した時に、処理を開始した。腹腔内（ｉ．ｐ．）投与経路を使用した後、腫瘍測定および統計分析を上で記載したように実施した［Ｐｉｌｌａｙら、２００９］。Ｍｏｎａｓｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅはこのプロジェクトを承認した。
【０２１９】
１．１０  抗ｃ−Ｍｅｔ抗体のＢｉｏｃｏｒｅ分析
ＬＭＨ抗体の親和性をＢＩＡｃｏｒｅ分析により、詳細な記載に従って（Ｎｉｅｂａ  Ｌら、１９９７）測定した。簡単に述べると、ＮＴＡセンサチップにＮｉ２＋をロードし、Ｈｉｓ６−ｃ−Ｍｅｔ（２５−５６７フラグメント）を固定化するために使用した。ＬＭＨ抗体を、見かけの親和性（ＫＤ）を測定するため濃度をばらつかせて素子上を通過させた。素子をＥＤＴＡで再生成した。
【０２２０】
１．１１  細胞表面での下方制御のための方法
Ａ５４９細胞を播種して一晩置き、無血清培養液で２回洗浄し、次いで、無血清培養液を加えて２４時間処理した。翌日、抗体をシャーレの培養液を使用した８時間の処理に付加した。処理完了後、シャーレを多量のＰＢＳ、ｐＨ８．０で３回洗浄した。次に、ＰＢＳ、ｐＨ８．０中０．５ｍｇ／ｍｌの不浸透性ＥＺリンク（登録商標）Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を付加し、細胞を４℃で１時間振とうさせた。冷やした１００ｍＭの多量のグリシンで細胞を３回洗浄した。ｃ−Ｍｅｔの免疫沈殿法（ＩＰ）のため、細胞をＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００細胞溶解緩衝液［３０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣＩ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０ｍＭのＮａＦ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  Ｓｅｔ  Ｉ、２００μＭ  Ｎａ３Ｖ０４および０．４％（ｖ／ｖ）Ｈ２０２］を付加して溶解し、２０分間氷上でインキュベートした。次いで、遠心法により４℃で溶解物を清澄化し、抗ｃ−Ｍｅｔビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を使用して免疫沈降した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥと移行の後、ビオチン化ｃ−Ｍｅｔに関してＩＲＤｙｅ６８０に標識したストレプトアビジン（ＬｉＣｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、または全ｃ−Ｍｅｔに関してウサギ抗Ｍｅｔ（１０００−１１００）ポリクローナル抗体（Ａｂｅａｍ）、次いで二次抗体として、抗ウサギＩＲＤｙｅ８００を使用して、膜をプローブした。赤外線検出を使用して、ブロットを発色させた。
【０２２１】
結果
実施例２：抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の特性記述
表２にＬＭＨ抗体８０〜８９の特性記述の要旨を記す。ＬＭＨクローンの上澄みを最初に、組み換え切断ｃ−Ｍｅｔ抗原との特異的な反応性について、材料および方法で記述したようにＥＬＩＳＡ分析によりスクリーニングした。次いで陽性の上澄部を、フローサイトメトリーによりＡ５４９細胞上のｃ−Ｍｅｔ受容体への結合に関してスクリーニングした。表２にこれらの統計分析の結果を示す。図１Ａに、イソタイプ対応対照に対する、抗体ＬＭＨ８５およびＬＭＨ８７の結合を示す代表的なＦＡＣＳ分析を示す。
【表３】
2013534515.tif 000004
【０２２２】
免疫ブロット／ウエスタンブロット解析で、抗体の反応性を調査した。Ａ５４９細胞から全ｃ−Ｍｅｔを免疫沈降し、２５Ｈ２でｃ−Ｍｅｔのβ（β）鎖に結合する市販の抗体および抗体ＬＭＨ８０、８２、８４および８６から８９をプローブした。この分析の結果を、図１Ｂ（抗体ＬＭＨ８０、ＬＭＨ８４およびＬＭＨ８７に関して）および表２に示す。抗体ＬＭＨ８２、８４、８６、８７、８８および８９がｃ−Ｍｅｔのα鎖に結合し、一方ＬＭＨ８０がβ鎖に特異的に結合した（抗体ＬＭＨ８０、ＬＭＨ８４およびＬＭＨ８７の代表的なブロットを図１Ｂに示す）。
【０２２３】
さらに確認の実験で、ＬｏＶｏ細胞のｃ−Ｍｅｔを抗体ＬＭＨ８０、８１、８２または８５により免疫沈降し、受容体がプロセシングされていない形態でもプロセシングされた形態でもｃ−Ｍｅｔβ鎖を認識する２５Ｈ２でウエスタンブロットした。このデータは、抗体ＬＭＨ８０、８１および８２が、ｃ−Ｍｅｔのプロセシングされていない形態を認識したという点で、Ａ５４９細胞で見られたものを支持している（図示せず）。
【０２２４】
免疫沈殿法検査は、抗体抗体ＬＭＨ８０、８１、８２および８４−８９がｃ−Ｍｅｔを免疫沈降することができたことを示した。図１Ｃは、ＬＭＨ抗体ＬＭＨ８５、ＬＭＨ８６、ＬＭＨ８７、ＬＭＨ８８およびＬＭＨ８９の代表的な免疫ブロットを示す。
【０２２５】
図１Ｄで示すように、免疫ブロットにより、選抜されたＬＭＨ抗体のアゴニスト／アンタゴニスト活性を調査した。Ａ４５９細胞を抗体単独で、またはＨＧＦリガンド存在下の抗体で処理し、全細胞可溶化物を用意した。抗体ＬＭＨ８５はｃ−Ｍｅｔのリン酸エステル化を促進し、したがってｃ−Ｍｅｔのアゴニストとして作用することが認められた。抗体ＬＭＨ８６および８７はｃ−Ｍｅｔのリン酸エステル化に効果がない。さらに、抗体ＬＭＨ８６は、ＨＧＦに刺激されたｃ−Ｍｅｔのリン酸エステル化を阻止することができなかった。表２に抗体のアゴニスト／アンタゴニスト活性を要約する。
【０２２６】
ＢＩＡｃｏｒｅ分析により、ＬＭＨ抗体の結合親和性を決定した。表２に解離定数を示す。
【０２２７】
実施例３：抗体ＬＭＨ８５およびＬＭＨ８７のアゴニストおよびアンタゴニストのプロファイル
抗体ＬＭＨ８５は、ＳＫ−ＯＶ−３細胞での遊走を誘導することができ（図１Ｅ、上のパネル）、これはｃ−Ｍｅｔのリン酸エステル化を誘導するその能力と一致している。対照的に、ＬＭＨ８７単独では細胞遊走に効果がなく（図１Ｅ、上のパネル）、アゴニスト活性の欠如が確認できる。しかしながら対照的に、抗体ＬＭＨ８７は、ＳＫ−ＯＶ３細胞のＨＧＦ／ＳＦ誘導性遊走を有意に阻害した（図１Ｅ、下のパネル、ｐ＜０．０５）。このデータは、抗体ＬＭＨ８７がｃ−Ｍｅｔのアンタゴニストであることを確認している。
【０２２８】
これらの結果は生化学データと一致している。ｃ−ＭｅｔのＬＭＨ８５活性化により遊走が増加し、一方ｃ−Ｍｅｔ活性化に効果がないＬＭＨ８７は細胞遊走に効果がない。
【０２２９】
図１ｆで示したように、ＨＧＦが細胞遊走を刺激した一方、陰性対照は細胞遊走刺激を示さなかった。ＨＧＦをＬＭＨ８７と混合すると、使用されたすべての濃度で細胞遊走の一貫した減少が認められた（細胞遊走が約６０％減少）。これは、ＬＭＨ８７がｃ−Ｍｅｔアンタゴニストであることを示す。
【０２３０】
実施例４：ＬＭＨ抗体のさらなる特性記述
図２に示すように、ＬＭＨ抗体８０〜８２および８５をｃ−Ｍｅｔへの結合に関してさらに特徴づけた。縮小状況下では、ｃ−Ｍｅｔのプロセシングされていない形態は無傷のままであるが、プロセシングされた形態はα鎖およびβ鎖に還元されている。したがって、免疫ブロットにおいてＬＭＨ８０−８２がプロセシングされたｃ−Ｍｅｔに結合した場合、β鎖は存在しているはずである。図２で示したように、ＬＭＨ抗体ＬＭＨ８０−８２のみが、細胞表面上の受容体のプロセシングされていない形態に結合した。対照的に、抗体ＬＭＨ８５は、β鎖の存在が立証するように、プロセシングされていないｃ−Ｍｅｔおよびプロセシングされたｃ−Ｍｅｔの両方を免疫沈降することがわかった。
【０２３１】
図３は、抗体ＬＭＨ８０−８２がプロセシングされていないｃ−Ｍｅｔを認識することをさらに示す。ＬｏＶｏ結腸癌細胞は主にプロセシングされていないｃ−Ｍｅｔを発現する。フローサイトメトリー分析により証明されたように、ＬＭＨ８０および８１はこれらの細胞への強い結合を示す。Ｕ８７ＭＧ細胞は主にプロセシングされていないｃ−Ｍｅｔを発現し、プロセシングされていない受容体の発現量は少ない。抗体ＬＭＨ８５と比較して、ＬＭＨ８０−８２のこれらの細胞への結合は弱く、それらがｃ−Ｍｅｔのプロセシングされていない形態を認識することが確認できる。
【０２３２】
実施例５：ＬＭＨ抗体のエピトープマッピング
ＬＭＨ抗体のエピトープマッピングを、材料および方法での記述に従って実行した。ＥＬＩＳＡ分析により、所与の２０−ｍｅｒペプチドへの抗体の反応性を決定し、代表的な抗体ＬＭＨ８０、ＬＭＨ８２およびＬＭＨ８７の結果を図４（Ａ−Ｃ）に示す。各抗体が結合したペプチド配列を、コアエピトープを決定するために整列させた。
【０２３３】
抗体ＬＭＨ８０は、ｃ−Ｍｅｔ配列のアミノ酸５２１〜５３５にあるコアアミノ酸配列ＲＨＦＱＳＣＳＱＣＬＳＡＰＰＦを有するエピトープを認識した。
【０２３４】
抗体ＬＭＨ８１は、ｃ−Ｍｅｔ配列のアミノ酸５２１〜５４１にあるコアアミノ酸配列ＲＨＦＱＳＣＳＱＣＬＳＡＰＰＦＶＱＣＧＷを有するエピトープを認識した。
【０２３５】
抗体ＬＭＨ８２は、ｃ−Ｍｅｔ配列のアミノ酸１２１〜１３０にあるコアアミノ酸配列ＶＶＤＴＹＹＤＤＱＬを有するエピトープを認識した。
【０２３６】
抗体ＬＭＨ８７は、コアアミノ酸配列ＤＶＬＰＥＦＲＤＳＹを有するエピトープを認識した。ｃ−Ｍｅｔ配列のアミノ酸２３６〜２４５にある抗体ＬＭＨ８６、ＬＭＨ８８およびＬＭＨ８９もこのコアエピトープを認識した。
【０２３７】
抗体ＬＭＨ８４は、ｃ−Ｍｅｔ配列のアミノ酸２１６〜２３０にあるコアアミノ酸配列ＶＲＲＬＫＥＴＫＤＧＦＭＦＬＴを有するエピトープを認識した。
【０２３８】
実施例６：ＬＭＨ抗体のアミノ酸配列
ＬＭＨ８５およびＬＭＨ８７に対して、可変重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を、材料および方法で記述したような標準プロトコルで決定した。抗体ＬＭＨ８５およびＬＭＨ８７に関して相補性決定領域（ＣＤＲ）を下に示す。
【０２３９】
ＣＤＲ配列は以下のとおりである：
重鎖ＣＤＲ  ＬＭＨ８０
ＬＭＨ８０  ＶＨ  ＣＤＲ１  ＧＹＴＦＴＤＮＳ（配列番号７）
ＬＭＨ８０  ＶＨ  ＣＤＲ２  ＶＮＴＥＴＧＥＰ（配列番号８）
ＬＭＨ８０  ＶＨ  ＣＤＲ３  ＡＲＤＧＨＹＦＡＹ（配列番号９）
軽鎖ＣＤＲ  ＬＭＨ８０
ＬＭＨ８０  ＶＬ  ＣＤＲ１  ＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＤＹ（配列番号１０）
ＬＭＨ８０  ＶＬ  ＣＤＲ２  ＷＡＳ（配列番号１１）
ＬＭＨ８０  ＶＬ  ＣＤＲ３  ＱＱＹＹＳＹＰＬＴ（配列番号１２）
重鎖ＣＤＲ  ＬＭＨ８２
ＬＭＨ８２  ＶＨ  ＣＤＲ１  ＧＹＴＦＴＤＹＹ（配列番号１５）
ＬＭＨ８２  ＶＨ  ＣＤＲ２  ＩＮＰＮＮＧＧＴ（配列番号１６）
ＬＭＨ８２  ＶＨ  ＣＤＲ３  ＡＲＳＧＹ（配列番号１７）
軽鎖ＣＤＲ  ＬＭＨ８２
ＬＭＨ８２  ＶＬ  ＣＤＲ１  ＱＳＩＬＨＳＮＧＮＴＹ（配列番号１８）
ＬＭＨ８２  ＶＬ  ＣＤＲ２  ＫＶＳ（配列番号１９）
ＬＭＨ８２  ＶＬ  ＣＤＲ３  ＦＱＧＳＨＶＰＷＴ（配列番号２０）
重鎖ＣＤＲ  ＬＭＨ８５
ＬＭＨ８５  ＶＨ  ＣＤＲ１  ＧＹＴＦＩＩＹＷ（配列番号３１）
ＬＭＨ８５  ＶＨ  ＣＤＲ２  ＩＮＰＳＮＤＹＴ（配列番号３２）
ＬＭＨ８５  ＶＨ  ＣＤＲ３  ＡＲＤＳＹＤＹＤＤＧＡＹＡＭＤＹ（配列番号３３）
軽鎖ＣＤＲ  ＬＭＨ８５
ＬＭＨ８５  ＶＬ  ＣＤＲ１  ＳＧＶＮＹ（配列番号３４）
ＬＭＨ８５  ＶＬ  ＣＤＲ２  ＡＴＳ（配列番号３５）
ＬＭＨ８５  ＶＬ  ＣＤＲ３  ＱＱＷＩＳＨＰＦＴ（配列番号３６）
重鎖ＣＤＲ  ＬＭＨ８７
ＬＭＨ８７  ＶＨ  ＣＤＲ１  ＧＮＴＬＫＤＤＨ（配列番号２３）
ＬＭＨ８７  ＶＨ  ＣＤＲ２  ＩＹＰＧＧＧＲＴ（配列番号２４）
ＬＭＨ８７  ＶＨ  ＣＤＲ３  ＴＮＬＶＦＤＶ（配列番号２５）
軽鎖ＣＤＲ  ＬＭＨ８７
ＬＭＨ８７  ＶＬ  ＣＤＲ１  ＫＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹ（配列番号２６）
ＬＭＨ８７  ＶＬ  ＣＤＲ２  ＲＭＳ（配列番号２７）
ＬＭＨ８７  ＶＬ  ＣＤＲ３  ＭＱＮＬＥＹＰＦＴ（配列番号２８）
【０２４０】
実施例７：単鎖（ｓｃＦｖ）フラグメントのアンタゴニスト活性
ｓｃＦｖ８５またはｓｃＦｖ８７のいずれか５０μｇ／ｍｌでＡ５４９細胞を１時間処理し、次に、ＨＧＦを付加した。次いで、全細胞可溶化物を調製し、全ｃ−Ｍｅｔ、リン酸エステル化ｃ−Ｍｅｔ（Ｔｙｒ１２３４／１２３５）および（Ｔｙｒ１２３０／１２３４／１２３５）または積載量に関する対照ｐａｎ−ａｃｔｉｎ抗体に関してプローブした。両リン酸エステル化ｃ−Ｍｅｔブロットは、ｓｃＦｖ８７ではなくｓｃＦｖ８５が、ｃ−ＭｅｔのＨＧＦ刺激をブロックしたことを示す（図５を参照）。したがって、ｓｃＦｖ  ＬＭＨ８５は、ｃ−ＭｅｔのＨＧＦ刺激のアンタゴニストとして作用する。この機能は、ｃ−Ｍｅｔ受容体のアゴニストである無傷のＬＭＨ８５抗体とは著しく異なる。
【０２４１】
実施例８：ＬＭＨ８７はｃ−ｍｅｔ全表面をダウンレギュレートし、癌細胞増殖を阻害する。
Ａ５４９肺癌細胞におけるｃ−Ｍｅｔをダウンレギュレートする抗体ＬＭＨ８７の能力について、８時間または２４時間抗体で細胞を処理することによりテストした。ＬＭＨ８７はＡ５４９細胞の表面のｃ−Ｍｅｔ（図６Ａ、上のパネル）を４０％（図６Ａ、下の棒グラフ）、全細胞のｃ−Ｍｅｔを同量（図６Ａ、下のブロット）ダウンレギュレートできた。濃度測定（図Ｂ、棒グラフ）により判定されるように、ＬＭＨ８７は、さらにＵ８７ＭＧグリオーマ細胞（図６Ｂ）の全ｃ−Ｍｅｔを５０％減少させた。未処理、または、ＰＢＳ処理した対照は、ｃ−Ｍｅｔの類似の総量を示すが、ＬＭＨ８７で処理された細胞は、両細胞株において全ｃ−Ｍｅｔの低減を示す。したがって、ＬＭＨ８７がｃ−Ｍｅｔ受容体の下方制御を引き起こすことが見出された。したがって、このデータは、Ａ５４９細胞の表面からｃ−Ｍｅｔが除去されたことを証明する。
【０２４２】
抗体ＬＭＨ８６、８８および８９は抗体ＬＭＨ８７と同一のコアエピトープに結合する。しかし、ＬＭＨ８８が全ｃ−Ｍｅｔレベルを下げる他の唯一の抗体だった；ｃ−Ｍｅｔ受容体の抗体ＬＭＨ８７の下方制御は少なくとも２４時間持続した（図６Ｃ）。
【０２４３】
実施例９：抗体ＬＭＨ８７のインビトロおよびインビボでの細胞増殖の阻害
図７Ａで、ＬＭＨ８７で処理されたＡ５４９細胞のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（商標）分析をインビトロで実施した。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムは、所与の刺激に応じたリアルタイムの細胞の分析を容易にする。図６Ｃで示したように、Ａ４５９細胞をＰＢＳで、または抗体ＬＭＨ８７の複数回投与；１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、および１００μｇ／ｍｌ、で処理した。５０および１００μｇ／ｍｌの両処理群とも、ＰＢＳ対照群と比較して、細胞指標の有意な減少を引き起こし、これは細胞増殖の阻害と一致している。
【０２４４】
さらに、抗体ＬＭＨ８７はマウス異種移植モデルにおいて腫瘍増殖を著しく阻害することができた。ＬＭＨ８７で治療されたマウスのＵ８７ＭＧ異種移植片の結果を、図７Ｂに示す。ＬＭＨ８７は１２日目（ｐ＝０．０１４）および１４日目（ｐ＝０．０３）に腫瘍増殖を有意に阻害した。
【０２４５】
考察
本発明者らは、ｃ−Ｍｅｔに結合し、癌の治療に有益な一連の抗体を同定した。３つの抗体、ＬＭＨ８０、８１および８２は、癌細胞表面のプロセシングされていない形態のｃ−Ｍｅｔへ優先的に結合することができる点が独特である。この特質はこれらの抗体に腫瘍特異性をもたらすため、腫瘍細胞への細胞毒、放射性同位体およびｓｉＲＮＡ等の化合物の送達に理想的である。これらの抗体のうち、ＬＭＨ８０はｃ−Ｍｅｔのβ鎖に特異的であり、ＬＭＨ８２はｃ−ｍｅｔのα鎖に特異的であった。
【０２４６】
発明者により同定された別の抗体、抗体ＬＭＨ８５は、ｃ−Ｍｅｔのアゴニストであることが認められ、ｃ−Ｍｅｔ上にある立体配座エピトープを認識するようである。この抗体に基づいたｓｃＦＶは興味深いことに、ｃ−ＭｅｔのＨＧＦ活性化をブロックし、したがって、アンタゴニスト活性を示す。
【０２４７】
抗体ＬＭＨ８６、ＬＭＨ８７、ＬＭＨ８８およびＬＭＨ８９はすべてｃ−Ｍｅｔのα鎖上の同一のコアエピトープ配列を認識することが認められた。このグループの代表的な抗体ＬＭＨ８７は癌細胞に結合してｃ−Ｍｅｔ受容体の下方制御／分解を直接引き起こし、インビトロのおよびインビボの両方で見られる腫瘍増殖を抑制することが示された。別の代表的な抗体ＬＭＨ８８も、ｃ−Ｍｅｔ受容体の下方制御／分解を引き起こすことがわかった。
【０２４８】
[参考文献]
2013534515.tif 000005
2013534515.tif 000006
2013534515.tif 000007
【図１−１】
2013534515.tif 000008
【図１−２】
2013534515.tif 000009
【図２】
2013534515.tif 000010
【図３】
2013534515.tif 000011
【図４−１】
2013534515.tif 000012
【図４−２】
2013534515.tif 000013
【図５】
2013534515.tif 000014
【図６】
2013534515.tif 000015
【図７】
2013534515.tif 000016
【配列表】
2013534515000001.app
【国際調査報告】
2013534515.tif 000017
2013534515.tif 000018
2013534515.tif 000019
2013534515.tif 000020
2013534515.tif 000021