(57)【要約】本発明は、内因性アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子の突然変異を含むＡＬＳインヒビター除草剤耐性ベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）植物およびその部分に関する。ここで、該ＡＬＳ遺伝子は、ＡＬＳポリペプチドの５６９位にトリプトファンとは異なるアミノ酸を含有するＡＬＳポリペプチドをコードしている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
内因性アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子の突然変異を含むＡＬＳインヒビター除草剤耐性ベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）植物およびその部分であって、該ＡＬＳ遺伝子が、ＡＬＳポリペプチドの５６９位にトリプトファンとは異なるアミノ酸を含有するＡＬＳポリペプチドをコードしている、該ベータ・ブルガリス植物およびその部分。
【請求項２】
該ＡＬＳポリペプチドが、天然でコードされているアミノ酸であるトリプトファンの代わりに、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、バリンまたはアルギニンであるアミノ酸を５６９位に有する、請求項１記載のベータ・ブルガリス植物およびその部分。
【請求項３】
該ＡＬＳ遺伝子が、配列番号２のＡＬＳポリペプチド配列の５６９位にトリプトファンとは異なるアミノ酸を含有するＡＬＳポリペプチドをコードしている、請求項１記載のベータ・ブルガリス植物およびその部分。
【請求項４】
該アミノ酸がロイシンであり、該内因性ＡＬＳ遺伝子が、配列番号３のヌクレオチド配列と同一である、請求項１記載のベータ・ブルガリス植物およびその部分。
【請求項５】
スルホニル尿素除草剤、スルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン除草剤、イミダゾリノン除草剤、トリアゾロピリミジン除草剤およびピリミジニル（チオ）ベンゾアート除草剤からなる群に属する１以上のＡＬＳインヒビター除草剤に耐性である、請求項１記載のベータ・ブルガリス植物およびその部分。
【請求項６】
内因性アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子の突然変異に関してホモ接合である、請求項１記載のベータ・ブルガリス植物およびその部分。
【請求項７】
該部分が該植物の器官、組織および細胞、好ましくは種子である、請求項１記載のベータ・ブルガリス（植物の部分。
【請求項８】
（ａ）ベータ・ブルガリス由来のカルスを、約１０−７Ｍ〜１０−９ＭのＡＬＳインヒビター除草剤、好ましくはホラムスルフロンにさらし、
（ｂ）３×１０−６ＭまでのＡＬＳインヒビター除草剤、好ましくはホラムスルフロンの存在下で成長しうる細胞コロニーを選択し、
（ｃ）ＡＬＳインヒビター除草剤、好ましくはホラムスルフロンの存在下でシュートを再生させ、
（ｄ）ＡＬＳインヒビター除草剤、好ましくはホラムスルフロン、ヨードスルフロン−メチル−ナトリウムおよび／またはそれらの両方の混合物（ここで、ホルムスルフロンの用量は、好ましくは、７〜７０ｇ  ａ．ｉ．／ｈａと同等であり、ヨードスルフロン−メチル−ナトリウムの用量は、好ましくは、１〜１０ｇ  ａ．ｉ．／ｈａと同等である）で、再生された小植物を選択する工程を含む、
請求項１記載のベータ・ブルガリス植物およびその部分の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＬＳインヒビター除草剤耐性ベータ・ブルガリス植物およびその部分ならびにそれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
栽培品種のベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）（Ｆｏｒｄ−Ｌｌｏｙｄ（２００５）  Ｓｏｕｒｃｅｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｕｓ  Ｂｅｔａ．Ｉｎ：Ｂｉａｎｃａｒｄｉ  Ｅ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＬＧ，Ｓｋａｒａｃｉｓ  ＧＮ，Ｄｅ  Ｂｉａｇｇｉ  Ｍ（編）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｕｇａｒ  Ｂｅｅｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｅｎｆｉｅｌｄ（ＮＨ），ＵＳＡ，ｐｐ２５−３３において定義されてるとおり）は温帯および亜熱帯地方における重要な農業作物である。例えば、世界の糖生産量の約２０％はテンサイに基づくものである。ビートの実生およびその一生の最初の６〜８週間における幼若植物は、その若い作物植物を打ち負かす速く成長する雑草により引き起こされる激しい競争にさらされるため、これらの作物の領域においては、信頼しうる雑草防除手段が不可欠である。
【０００３】
４０年以上も前から、除草剤は、栽培されているテンサイにおける雑草を防除するための好ましい手段である。フェンメジファム、デスメジファンおよびメタミトロンのような、この目的に使用される製品は、該作物を損なうことなくテンサイ圃場における雑草の成長を抑制することを可能にする。それでも、チェノポジウム・アルブム（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ａｌｂｕｍ）、アマランツス・レトロフレクス（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｅｔｒｏｆｌｅｘｕｓ）および／またはトリプロイロスペルムム・イノドラタ（Ｔｒｉｐｌｅｕｒｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｉｎｏｄｏｒａｔａ）のような有害雑草が長期間にわたって発芽する場合には特に、不利な環境条件下のこれらの製品の効力には改良の余地がある。
【０００４】
ビートにおける雑草防除のための選択肢を改良するためには、革新的な除草活性成分が非常に望ましい。そのような化合物は、ビート作物にその発生段階には無関係に悪影響を及ぼすことなく、好ましくは雑草の出芽から雑草植物の完全発育までの広範な雑草スペクトルに対して作用すべきである。古典的な除草剤スクリーニング法では、過去数十年間、農学的に優れた様態で全てのこのような厳しい特性を満足する、ビートに対する選択的除草活性成分は発見されなかった。
【０００５】
幾つかの化学物質は酵素「アセトヒドロキシ酸シンターゼ」（ＡＨＡＳ）（「アセト乳酸シンターゼ」（ＡＬＳ［ＥＣ  ４．１．３．１８］）としても公知である）を阻害する。ＡＬＳは、（ａ）スルホニル尿素除草剤（Ｂｅｙｅｒ  Ｅ．Ｍら（１９８８），Ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａｓ  ｉｎ  Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｍｏｄｅ  ｏｆ  Ａｃｔｉｏｎ；Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８，１１７−１８９）、（ｂ）スルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン除草剤（Ｐｏｎｔｚｅｎ，Ｒ．，Ｐｆｌａｎｚ．−Ｎａｃｈｒｉｃｈｔｅｎ  Ｂａｙｅｒ，２００２，５５，３７−５２）、（ｃ）イミダゾリノン除草剤（Ｓｈａｎｅｒ，Ｄ．Ｌ．ら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９８４，７６，５４５−５４６；Ｓｈａｎｅｒ，Ｄ．Ｌ．およびＯ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｓ．Ｌ．（編）Ｔｈｅ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ  Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏ，ＦＬ，１９９１）、（ｄ）トリアゾロピリミジン除草剤（Ｋｌｅｓｃｈｉｃｋ，Ｗ．Ａ．ら，Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，１９９２，４０，１０８３−１０８５）および（ｅ）ピリミジニル（チオ）ベンゾアート除草剤（Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｔ．Ｊ．，Ｐｅｓｔｉｃ．Ｓｃｉ．，１９９７，２２，２４５−２５６；Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｔ．ら，Ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ  Ｓｙｎｔｅｈａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ  Ｃｌａｓｓｅｓ  ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｂｏｇｅｒ，Ｐ．，Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ．Ｋ．，Ｈｉｒａｉ，Ｋ．（編），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，２００２，１−４１）のようなＡＬＳインヒビター除草剤のクラスに属する構造的に多様な５つの除草剤ファミリーの作用部位である。
【０００６】
ＡＬＳは２つのピルビン酸分子からアセト乳酸分子および二酸化炭素への変換に関与する。該反応は、２つのピルビン酸分子を連結するためにチアミンピロリン酸を利用する。この反応の生成物であるアセト乳酸は最終的にバリン、ロイシンおよびイソロイシンになる（Ｓｉｎｇｈ（１９９９）“Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｌｉｎｅ，ｌｅｕｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ”，Ｐｌａｎｔ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｓｉｎｇｈ，Ｂ．Ｋ．編，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２２７−２４７）。
【０００７】
ＡＬＳのインヒビターは植物におけるバリン、ロイシンおよびイソロイシンの生合成を遮断する。その結果、直ちにそれぞれのアミノ酸プールの枯渇が生じて、タンパク質生合成が停止し、植物成長の停止、そして最終的には植物の枯死または少なくとも損傷がもたらされる。
【０００８】
ＡＬＳインヒビター除草剤は、それが適度な施用量で有効であり動物において比較的に無毒性であるため、現代の農業において広く使用されている。ＡＬＳ活性を阻害することにより、これらの除草剤ファミリーは、多数の雑草種を含む感受性植物の更なる成長および発育を妨げる。十分な雑草防除に要求されうる更に高い濃度のＡＬＳインヒビター除草剤に対する増強された耐性を植物に付与するために、作物植物の追加的なＡＬＳ阻害除草剤耐性育種系および品種、ならびにＡＬＳ阻害除草剤耐性育種系および品種の製造および使用のための方法および組成物が必要とされている。
【０００９】
多種多様なＡＬＳインヒビター除草剤が、多種多様な雑草種をそれらの成長段階に無関係に農家が防除することを可能にするが、これらの非常に有効な除草剤はビートには使用できない。なぜなら、通常のビート植物／商業的ビート品種はこれらのＡＬＳインヒビター除草剤に対して非常に感受性だからである。それでも、これらのＡＬＳインヒビター除草剤は広葉およびイネ科雑草種に対しては優れた除草活性を示す。ＡＬＳを阻害する作用様式を有する最初の除草剤は、既に３０年前に、農業におけるその使用のために開発された。現在、このクラスの除草剤の有効成分は強力な雑草防除を示し、トウモロコシおよび穀類において並びにビート以外の双子葉作物において広く使用されている。
【００１０】
ビートにおいて出芽後施用法で施用される現在公知の唯一のＡＬＳインヒビター除草剤はＤｅｂｕｔ（登録商標）である。この除草剤（有効成分としてのトリフルスルフロン−メチルおよび特定の製剤化化合物を含有する）は、それがビート内因性ＡＬＳ酵素を阻害しうる前にビートにより分解され、それはビートの成長場所における雑草防除における重大な隔たりを有する。
【００１１】
ＡＬＳインヒビター除草剤が農業に導入されて以来、天然に存在する雑草を含む感受性植物種は時にはこのクラスの除草剤に対する自然耐性を発達させることが観察された。ＡＬＳ遺伝子の特定の部位における単一の塩基対の置換が通常、ＡＬＳインヒビター除草剤による種々のレベルの阻害を示すいくぶん耐性であるＡＬＳ酵素変異体を与える。したがって、突然変異ＡＬＳ対立遺伝子を付与する植物は、ＡＬＳインヒビター除草剤の化学構造およびＡＬＳ遺伝子内の点突然変異の部位に応じて、ＡＬＳインヒビター除草剤に対する種々のレベルの耐性を示す。例えば、Ｈａｔｔｏｒｉら（１９９５），Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４６：４１９−４２５は、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）細胞系におけるＴｒｐ５５７コドン［全ＡＬＳ／ＡＨＡＳ突然変異体を比較するために該文献において用いられているアラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）配列の番号づけによれば、これは「５７４」位に相当し、これはビートＡＬＳ配列の５６９位に等しい］における単一突然変異を記載している。これらの著者は、スルホニル尿素、イミダゾリノンおよびトリアゾロピリミジンのようなＡＬＳインヒビター除草剤のサブクラスの幾つかのメンバーに対する耐性を観察した。
【００１２】
イミダゾリノンのＡＬＳインヒビター除草剤サブクラスに対する或る耐性をもたらすＡｌａ  １２２コドンにおける点突然変異を付与するビート突然変異体が記載されているが（ＷＯ  ９８／０２５２６）、これは農業施用法における雑草防除に十分ではない。この突然変異体を使用することによる他のＡＬＳインヒビター除草剤クラスに対する交差耐性は記載されていない。更に、Ｐｒｏ  １９７コドンにおいて第２の点突然変異を付与するビート植物は、スルホニル尿素除草剤のサブクラスのメンバーに属するＡＬＳインヒビター除草剤に対する中等度の耐性を示した。また、これらの２つの二重突然変異体が記載されている（ＷＯ  ９８／０２５２７）。しかし、これらの突然変異体はいずれも、ビート品種の市場導入には使用されなかった。なぜなら、ＡＬＳインヒビター除草剤に対する除草剤耐性のレベルが、農業に利用されるほどにはこれらの突然変異体において十分には高くなかったからである。
【００１３】
Ｓｔｏｕｇａａｒｄら，（１９９０），Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｓｕｐｐｌ．１４Ｅ，３１０は四倍体テンサイ細胞培養におけるＡＬＳ突然変異体の単離を記載している。アミノ酸３７位においてのみ異なる２つの異なるＡＬＳ遺伝子（ＡＬＳ  ＩおよびＡＬＳ  ＩＩ）が単離された。突然変異体１はそのＡＬＳ  Ｉ遺伝子内に２つの突然変異を含有し、一方、突然変異体２はそのＡＬＳ  ＩＩ遺伝子内に３つの突然変異を含有していた。どの突然変異がＡＬＳインヒビターに対する耐性を付与するのかを決定するために該突然変異が分離された後、組換え大腸菌(Ｅ．ｃｏｌｉ)から合成されたＡＬＳが、それが、アミノ酸「Ｌｅｕ」によるアミノ酸「Ｔｒｐ」の置換をもたらすＴｒｐ  ５７４コドン［全ＡＬＳ突然変異体を比較するために文献において用いられているアラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）配列の番号づけによる］（これはビートＡＬＳアミノ酸配列の５６９位に等しい）における点突然変異を含有している場合に、除草剤耐性であることが明らかにされた。Ｓｔｏｕｇａａｒｄらは、テンサイＡＬＳ遺伝子のいずれかの５６９位の突然変異が、ＡＬＳインヒビター除草剤に対する許容レベルの耐性を得るために十分であることを、テンサイにおいては示していない。更に、Ｓｔｏｕｇａａｒｄらは、テンサイＡＬＳの５６９位におけるＴｒｐからＬｅｕへの突然変異などの突然変異を含むテンサイ植物を再生させておらず、また、扱ってもいない。
【００１４】
この知見に基づいて、Ｓｔｏｕｇａａｒｄらは、植物形質転換において使用するための、種々のＡＬＳ遺伝子を含有する植物形質転換ベクターを構築した。しかし、現在までに、特に、ベータ・ブルガリス植物内にこの突然変異を含む植物および／または農業分野に対するＡＬＳインヒビター除草剤の施用の効果に関する更なるデータは、遺伝的に操作された植物または突然変異植物のいずれにおいても、これらの又は他の著者により、その後２０年以上も開示されていない。
【００１５】
ＷＯ  ９９／５７９６５は、一般に、スルホニル尿素耐性テンサイ植物、およびそれをＥＭＳ（エチルメタンスルホナート）突然変異誘発により入手するための方法を記載している。しかし、そのような突然変異体を得るのに必要な研究以外では、この公開はそのような植物を記載しておらず、また、ＡＬＳインヒビター除草剤耐性突然変異体の入手に関連している可能性のあるＡＬＳ遺伝子内のいずれの特定の位置をも記載しておらず、また、その相関するいずれの農業用途をも開示していない。更に、ＥＭＳのようなそのような強力な突然変異誘発性化合物を使用することにより、ゲノム内の他の位置で種々の他の突然変異が生じうる可能性が高く、これは、そのような得られる植物の不稔および／または成長遅延に至る欠点をもたらしうる。更に、ＥＭＳの適用は、ＤＮＡとのその化学的相互作用のため、トリプレットＴＧＧからＴＴＧへの変換のような特定の突然変異を誘発する欠点を有しうる。なぜなら、ＥＭＳは常にグアノシンからアデノシンへと変換するからである。
【００１６】
アマランツス（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ）のような幾つかの雑草種においては、Ｔｒｐ  ５７４  Ｌｅｕ突然変異が、ＡＬＳインヒビター除草剤に繰返しさらされた植物集団において検出されうるであろう。これらのＴｒｐ  ５７４  Ｌｅｕ突然変異体は、スルホニル尿素およびスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノンからなる群から選択されるもののようなＡＬＳインヒビター除草剤の幾つかの化学的クラスに対する高レベルの耐性を示す。
【００１７】
ＷＯ  ２００８／１２４４９５はＡＬＳ二重および三重突然変異体を開示している。ＷＯ  ２００９／０４６３３４によれば、ＡＬＳ遺伝子内の特定の突然変異が得られた。しかし、ＷＯ  ２００９／０４６３３４によるそのような突然変異を含有する農業に利用されうる除草剤耐性ベータ・ブルガリス突然変異体は現在までに得られていない。
【００１８】
更に、例えば、世界の糖生産量の約２０％をテンサイが占めることを考慮すると、非常に強力な雑草と比べて成長上の利点を有するテンサイ植物が入手可能となることも非常に望ましいであろう。したがって、ＡＬＳ遺伝子に関して非トランスジェニックな、ＡＬＳインヒビター除草剤に対して耐性であるテンサイ植物などのベータ・ブルガリス植物が入手可能となることが非常に望ましいであろう。したがって、農業に利用されうるＡＬＳインヒビター除草剤レベルでＡＬＳインヒビター除草剤に対して耐性であるそのような非トランスジェニックなベータ・ブルガリス植物、特にテンサイ植物が必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本技術的課題は、この要求を満足させることである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明はこの要求に対処するものであり、したがって、その技術的課題の解決手段として、内因性アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子の突然変異を含むＡＬＳインヒビター除草剤耐性ベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）植物およびその部分を提供し、ここで、該ＡＬＳ遺伝子は、ＡＬＳポリペプチドの５６９位にトリプトファンとは異なるアミノ酸を含有するＡＬＳポリペプチドをコードしている。
【００２１】
本発明の種子は２０１０年３月１２日付けでＮＣＩＭＢ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＵＫに番号ＮＣＩＭＢ  ４１７０５として寄託されている。
【００２２】
種々の育種法を適用することにより、強力なＡＬＳインヒビター除草剤耐性の付加価値を有する、全ての特定の市場において高い競争力のある高収量商業用品種が、最初に得られた突然変異植物を使用することにより後に開発されうる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書中で用いる単数形は、文脈に明らかに矛盾しない限り、複数対象物を含むことに注意する必要がある。したがって、例えば、「試薬」に対する言及は、そのような種々の試薬の１以上を含み、「方法」に対する言及は、本明細書に記載されている方法から修飾または置換されうる当業者に公知の同等の工程および方法に対する言及を含む。
【００２４】
本開示において引用されている全ての刊行物および特許の全体を参照により本明細書に組み入れることとする。参照により本明細書に組み入れられる資料が本明細書と矛盾する又は合致しない場合、本明細書がそのようないずれの資料にも優先する。
【００２５】
特に示されていない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」なる語は、そのような一連のものにおける各要素に関するものであると理解されるべきである。当業者は、本明細書に記載されている本発明の具体的な実施形態に対する多数の均等物を認識し、または単なる通常の実験を用いて該均等物を確認しうるであろう。そのような均等物は本発明に含まれると意図される。
【００２６】
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲の全体において、文脈に矛盾しない限り、「含む」なる語ならびに「含み」および「含んでいる」のような派生語は、示されている整数もしくは工程または整数もしくは工程の群の包含を示唆し、他のいずれの整数もしくは工程または整数もしくは工程の群の除外をも示唆しないと理解されるであろう。ある態様における「含む」なる語およびその派生語ならびに別の態様における「含有する」なる語およびその類似派生語は、それらのいずれにも優先性が与えられることなく、互換的に用いられうる。
【００２７】
本発明において、特異的に選択されたＡＬＳインヒビター除草剤に対する数サイクルの選択により得られた点突然変異をＴｒｐ  ５６９コドン［配列番号２に示されているベータ・ブルガリスＡＬＳアミノ酸参照配列に関するもの；これは、配列番号６に示されている参照アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）配列の５７４位に等しい］に含有する改変された内因性ＡＬＳ遺伝子（「ＡＨＡＳ」遺伝子とも称される）を含むビート植物が得られた。
【００２８】
本発明のベータ・ブルガリス植物は、自然突然変異植物細胞を単離することにより得られ、これは、本明細書に更に詳細に記載されているとおり、点突然変異を有する完全稔性ビート植物へと直接的に再生された。これらの植物はＡＬＳ遺伝子に関しては非トランスジェニックである。更に、本発明の植物自体およびその後代は稔性であり、したがって、遺伝的バックグラウンドのストレス誘発性の更なる改変を引き起こしうる更なるいずれの操作も要することなく、育種目的に有用である。本発明において適用される選択方法により得られるそのような植物は、ビート成長場所における革新的な雑草防除手段を可能にするようにＡＬＳインヒビター除草剤に対する農業的に有用なレベルの耐性を付与するビート品種および／またはハイブリッドを作製するために直接使用されうる。
【００２９】
本明細書中で用いる「トランスジェニック」なる語は、遺伝子（これは同じ又は異なる種のものでありうる）が、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のような適当な生物学的担体により、またはプロトプラスト形質転換もしくは粒子射出のようないずれかの他の物理的手段により、植物内に導入されており、該遺伝子が、新たな宿主環境、すなわち、その遺伝的に修飾された生物（ＧＭＯ）において発現されうることを意味する。前記定義に従い、「非トランスジェニック」なる語はそれとは正反対を意味し、すなわち、それぞれの遺伝子の導入が適当な生物学的担体またはいずれかの他の物理的手段により行われていないことを意味する。しかし、突然変異遺伝子が天然の又は育種法による受粉により導入されて、この特異的遺伝子に関する別の非トランスジェニック植物を与えうる。
【００３０】
「内因性」遺伝子は、遺伝子操作技術により植物内に導入されたのではない、植物の遺伝子を意味する。
【００３１】
本明細書中で用いる「配列」なる語は、「配列」なる語が用いられる文脈に応じて、ヌクレオチド配列、ポリヌクレオチド、核酸配列、核酸、核酸分子、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質に関するものである。
【００３２】
「ヌクレオチド配列」、「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「核酸」、「核酸分子」なる語は本明細書中では互換的に用いられ、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドまたは両方の組合せのいずれかの、任意の長さの重合非分枝形態のヌクレオチドを意味する。核酸配列はセンスおよびアンチセンス鎖の両方のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、合成形態および混合重合体を包含し、あるいは当業者に容易に理解されるとおりの非天然または誘導体化ヌクレオチド塩基を含有しうる。
【００３３】
本明細書中で用いる「ポリペプチド」または「タンパク質」（両方の語は本明細書中では互換的に用いられる）なる語は、ある長さのアミノ酸鎖を含むペプチド、タンパク質またはポリペプチドを意味し、ここで、アミノ酸残基は共有ペプチド結合により連結されている。しかし、２０種の遺伝子コード化アミノ酸に加えて、例えばセレノシステインのような機能性類似体によりアミノ酸および／またはペプチド結合が置換されている、そのようなタンパク質／ポリペプチドのペプチド模倣体も、本発明に含まれる。ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質はポリペプチドと称されうる。ポリペプチドなる語は、ポリペプチドの修飾（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など）されたものをも意味し、それを除外しない。そのような修飾は基本的な教科書およびより詳細なモノグラフならびに研究論文に十分に記載されている。本明細書において好ましく意図されるポリペプチド（またはタンパク質）はベータ・ブルガリスＡＬＳポリペプチド（またはＡＬＳタンパク質）［配列番号２］である。
【００３４】
アミノ酸置換は、天然に存在する異なるアミノ酸残基によりアミノ酸が置換されているアミノ酸変化を含む。野生型ＡＬＳタンパク質内のアミノ酸残基が、類似特性を有する天然に存在する別のアミノ酸により置換されている場合（例えば、ＧｌｙとＡｌａとの間の置換、ＶａｌとＩｌｅとＬｅｕとの間の置換、ＡｓｐとＧｌｕとの間の置換、ＬｙｓとＡｒｇとの間の置換、ＡｓｎとＧｌｎとの間の置換、またはＰｈｅとＴｒｐとＴｙｒとの間の置換）、そのような置換は「保存的」なものとして分類されうる。本発明に含まれる置換は「非保存的」であることも可能であり、この場合、野生型ＡＬＳタンパク質内に存在するアミノ酸残基が、異なる特性を有するアミノ酸、例えば、異なる群の天然に存在するアミノ酸により置換されている（例えば、荷電または疎水性アミノ酸の、アラニンによる置換）。本明細書中で用いる「類似アミノ酸」は、類似アミノ酸側鎖を有するアミノ酸、すなわち、極性、無極性または実質的に中性の側鎖を有するアミノ酸を意味する。本明細書中で用いる「非類似アミノ酸」は、異なるアミノ酸側鎖を有するアミノ酸を意味し、例えば、極性側鎖を有するアミノ酸は、無極性側鎖を有するアミノ酸とは非類似である。極性側鎖は通常、タンパク質の表面上に存在する傾向にあり、この部位で、それは、細胞内で見られる水性環境と相互作用しうる（「親水性」アミノ酸）。一方、「無極性」アミノ酸はタンパク質の中心部に存在する傾向にあり、この部位で、それは類似無極性隣接体と相互作用しうる（「疎水性」アミノ酸）。極性側鎖を有するアミノ酸の例としては、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リシン、セリンおよびトレオニン（疎水性であるシステイン以外は全て親水性）が挙げられる。無極性側鎖を有するアミノ酸の例としては、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリンおよびトリプトファン（中性であるグリシン以外は全て疎水性）が挙げられる。
【００３５】
一般に、ＡＬＳ、ＡＬＳＬ、ＡＨＡＳまたはＡＨＡＳＬなる語が用いられる場合、それぞれヌクレオチド配列または核酸が意図されているのか、あるいはアミノ酸配列またはポリペプチドが意図されているのかは、当業者の一般的な知識および文脈により、当業者に理解される。
【００３６】
本明細書中で用いる「遺伝子」なる語は、リボヌクレオチドまたはデスオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドの重合形態を意味する。該用語は二本鎖および一本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡを含む。それはまた、公知型の修飾、例えばメチル化、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドの１以上の、類似体による置換を含む。好ましくは、遺伝子は、本明細書中で定められているポリペプチドをコードするコード配列を含む。「コード配列」は、適当な調節配列の制御下に配置されている又は該制御下にある場合にｍＲＮＡへと転写され及び／又はポリペプチドへと翻訳されるヌクレオチド配列である。コード配列の境界は、５’末端の翻訳開始コドン、および３’末端の翻訳停止コドンにより決定される。コード配列は、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、組換え核酸配列またはゲノムＤＮＡを含みうるが、これらに限定されるものではなく、ある状況下ではイントロンも存在しうる。
【００３７】
本明細書中で用いる「ベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）」なる語は「ビー・ブルガリス（Ｂ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）」と略される。更に、「ビート」なる語が本明細書中で用いられる。それらの３つの語は互換的に用いられ、Ｆｏｒｄ−Ｌｌｏｙｄ（２００５）  Ｓｏｕｒｃｅｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｕｓ  Ｂｅｔａ．Ｉｎ：Ｂｉａｎｃａｒｄｉ  Ｅ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＬＧ，Ｓｋａｒａｃｉｓ  ＧＮ，Ｄｅ  Ｂｉａｇｇｉ  Ｍ（編）  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｕｇａｒ  Ｂｅｅｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｅｎｆｉｅｌｄ（ＮＨ），ＵＳＡ，ｐｐ  ２５−３３において定義されている栽培品種のベータ・ブルガリスを完全に含むと理解されるべきである。同様に、例えば、「アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）」なる語は「エイ・サリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）」と略される。両方の語は本明細書中で互換的に用いられる。
【００３８】
本発明に従い用いられる「位置」なる語は、本明細書に記載されているアミノ酸配列内のアミノ酸の位置、または本明細書に記載されているヌクレオチド配列内のヌクレオチドの位置のいずれかを意味する。また、本明細書中で用いる「対応」なる語は、位置が、先行するヌクレオチド／アミノ酸の番号により決定されるだけではないことを含む意である。置換されうる、本発明における与えられたヌクレオチドの位置は、プロモーターおよび／またはいずれかの他の調節配列または遺伝子（エキソンおよびイントロンを含む）を含むＡＬＳ  ５’−非翻訳領域（ＵＴＲ）内の他の位置におけるヌクレオチドの欠失または付加により変動しうる。同様に、置換されうる、本発明における与えられたアミノ酸の位置は、ＡＬＳポリペプチド内の他の位置におけるアミノ酸の欠失または付加により変動しうる。したがって、本発明における「対応位置」においては、ヌクレオチド／アミノ酸は、示されている番号において異なりうるが、類似する隣接ヌクレオチド／アミノ酸を尚も有しうる、と理解されるべきである。置換、欠失または付加されうる該ヌクレオチド／アミノ酸も、「対応位置」なる語に含まれる。
【００３９】
与えられたＡＬＳヌクレオチド／アミノ酸配列内のヌクレオチド残基またはアミノ酸残基が、配列番号１のヌクレオチド配列または配列番号２のアミノ酸配列内の或る位置に対応するか否かを決定するために、当業者は、当技術分野でよく知られた手段および方法を用いることが可能であり、例えば、手動での又はコンピュータプログラム、例えばＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，（１９９０），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１５，４０３−４１０）（これはＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌを表す）またはＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，（１９９４），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２２，４６７３−４６８０）または配列アライメントの作製に適したいずれかの他の適当なプログラムを使用することによるアライメントを用いることが可能である。
【００４０】
配列番号１は、ベータ・ブルガリス野生型ＡＬＳをコードするヌクレオチド配列である。配列番号２は、配列番号１から誘導されたベータ・ブルガリスアミノ酸配列である。したがって、配列番号１のヌクレオチド配列の１７０５−１７０７位のコドンは配列番号２の５６９位のアミノ酸（すなわち、３文字記号によればアミノ酸「Ｔｒｐ」または１文字記号によれば「Ｗ」）をコードしている。
【００４１】
与えられたＡＬＳヌクレオチド／アミノ酸配列内のヌクレオチド残基またはアミノ酸残基が配列番号１のヌクレオチド配列内の或る位置に対応するか否かを決定するための代替手段においては、配列番号５に示されているエイ・サリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）野生型ＡＬＳをコードするヌクレオチド配列が使用されうる。配列番号６は、配列番号５から誘導されたエイ・サリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）アミノ酸配列である。したがって、配列番号５のヌクレオチド配列の１７２０−１７２２位のコドンは配列番号６の５７４位のアミノ酸（すなわち、３文字記号によればアミノ酸「Ｔｒｐ」または１文字記号によれば「Ｗ」）をコードしている。
【００４２】
配列番号５に示されているエイ・サリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）野生型ＡＬＳヌクレオチド配列が参照配列として使用される場合（それは関連文献のほとんどにおいて使用されており、したがって、そのような既知配列の、より容易な比較を可能にするために使用される）、配列番号５に示されているエイ・サリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＡＬＳ遺伝子のヌクレオチド配列の１７２０−１７２２位に対応する位置には、トリプトファンと異なるアミノ酸をコードするコドンが位置する。
【００４３】
しかし、以下の開示の全てにおいては、参照ヌクレオチド配列としては配列番号１が好ましく、参照アミノ酸配列としては配列番号２が好ましい。
【００４４】
以下の表は、ヌクレオチド配列内の点突然変異またはアミノ酸配列内の置換の位置を決定する場合の、本明細書中で用いる参照配列の概要を示す。
【００４５】
【表１】
2013542725.tif 000002
したがって、いずれにしても、配列番号１もしくは５（ヌクレオチド配列）または配列番号２もしくは６（アミノ酸配列）のような参照配列とのアライメントにより等価位置が尚も決定されうるであろう。
【００４６】
ビー・ブルガリス野生型ＡＬＳ遺伝子と、本発明のビー・ブルガリス植物に含まれるＡＬＳ遺伝子との間の相違を考慮して、本発明のビー・ブルガリス植物に含まれるＡＬＳ遺伝子（またはポリヌクレオチドまたはヌクレオチド配列）は「突然変異ＡＬＳ遺伝子」、「突然変異ＡＬＳ対立遺伝子」、「突然変異ＡＬＳポリヌクレオチド」などともみなされうる。したがって、本明細書の全体において、「突然変異対立遺伝子」、「突然変異ＡＬＳ対立遺伝子」、「突然変異ＡＬＳ遺伝子」または「突然変異ＡＬＳポリヌクレオチド」なる語は互換的に用いられる。
【００４７】
本明細書中に特に示されていない限り、これらの語は、配列番号１に示されているビー・ブルガリスＡＬＳ遺伝子のヌクレオチド配列の１７０５−１７０７位に対応する位置においてトリプトファンとは異なるアミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチド配列を意味する。配列番号５に示されているエイ・サリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）参照配列に関して示されている場合には、該コドンの位置は１７２０−１７２２である。
【００４８】
同様に、これらの語は、配列番号２に示されているベータ・ブルガリスＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列の５６９位に対応する位置に、トリプトファンとは異なるアミノ酸を有するＡＬＳタンパク質をコードするヌクレオチド配列を意味する。配列番号６に示されているエイ・サリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）参照配列に関して示されている場合には、該位置は５７４である。「トリプトファンとは異なるアミノ酸」（３文字記号の「Ｔｒｐ」、または同等に用いられる１文字記号の「Ｗ」により示される）は、トリプトファンとは異なるいずれかの天然に存在するアミノ酸を含む。これらの天然に存在するアミノ酸はアラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リシン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）またはバリン（Ｖ）を含む。
【００４９】
しかし、好ましくは、（中性極性アミノ酸の群に属する）トリプトファンとは異なるアミノ酸は、トリプトファンとは異なる物理化学的特性を有するアミノ酸、すなわち、中性無極性、酸性または塩基性特性を示すアミノ酸のいずれかに属するアミノ酸である。より好ましくは、トリプトファンとは異なるアミノ酸は、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、バリンおよびアルギニンからなる群から選択される。より一層好ましくは、該アミノ酸は中性無極性アミノ酸、例えばアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリンまたはバリンである。特に好ましくは、該アミノ酸はアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリンである。より一層好ましいのはグリシンおよびロイシンである。最も好ましくは、それはロイシンである。
【００５０】
これに対して、特に示さない限り、「野生型対立遺伝子」、「野生型ＡＬＳ対立遺伝子」、「野生型ＡＬＳ遺伝子」または「野生型ＡＬＳポリヌクレオチド」なる語は、配列番号２に関するＷ５６９置換（または配列番号６に関するＷ５７４置換）を欠くＡＬＳタンパク質をコードするヌクレオチド配列を意味する。これらの語は、配列番号１に示されているビー・ブルガリスＡＬＳ遺伝子のヌクレオチド配列の１７０５−１７０７位に対応する位置に、トリプトファンとは異なるアミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチド配列をも意味する。そのような「野生型対立遺伝子」、「野生型ＡＬＳ対立遺伝子」、「野生型ＡＬＳ遺伝子」または「野生型ＡＬＳポリヌクレオチド」は、Ｗ５６９置換を引き起こす突然変異以外の突然変異を含んでいても、含んでいなくてもよい。本質的には、ＡＬＳ遺伝子に関しては、野生型ビー・ブルガリス植物と本発明のビー・ブルガリス植物との間の唯一の相違は、好ましくは（そして特異的には）、本明細書に特定されている位置において（特に、配列番号１に示されているビー・ブルガリスＡＬＳ遺伝子のヌクレオチド配列の１７０５−１７０７位に対応する位置において）、本発明のビー・ブルガリス植物は、トリプトファンとは異なるアミノ酸をコードするコドンを含み、好ましくは、該コドンは、本明細書中の他の箇所において特定されているアミノ酸をコードしている。しかし、前記のとおり、追加的な突然変異のような他の相違が野生型および突然変異ＡＬＳ対立遺伝子（本明細書に特定されているもの）間に存在しうる。しかし、これらの他の相違は、前記相違が存在する限り、重要ではない。
【００５１】
したがって、Ｗ５６９置換（または配列番号６のエイ・サリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＡＬＳアミノ酸配列が参照体として使用された場合にはＷ５７４置換）は、配列番号１に示されているヌクレオチド配列の１７０５−１７０７位に対応する位置（またはそれぞれ配列番号５に示されているヌクレオチド配列の１７２０−１７２２位に対応する位置）におけるコドンの変化の結果である。好ましくは、５６９位の置換はＷからＬへの置換であり、ここで、「Ｌ」はコドン「ＣＴＴ」、「ＣＴＣ」、「ＣＴＡ」、「ＣＴＧ」、「ＴＴＡ」または「ＴＴＧ」のいずれかによりコードされる。最も好ましくは、配列番号１に示されているヌクレオチド配列の１７０６位に対応する位置（またはそれぞれ配列番号５に示されているヌクレオチド配列の１７２１位に対応する位置）の「Ｇ」ヌクレオチドの、「Ｔ」ヌクレオチドへのトランスバージョンによる、５６９位の置換ＷからＬへの置換である。したがって、配列番号１に示されているヌクレオチド配列の１７０５−１７０７に対応する位置（またはそれぞれ配列番号５に示されているヌクレオチド配列の１７２０−１７２２位に対応する位置）のコドンが「ＴＧＧ」から「ＴＴＧ」に変化している。コドン「ＴＧＧ」はトリプトファンをコードするが、コドン「ＴＴＧ」はロイシンをコードする。
【００５２】
したがって、最も好ましい実施形態においては、本発明は、内因性ＡＬＳ遺伝子のヌクレオチド配列内に、配列番号１に示されているベータ・ブルガリスＡＬＳ突然変異遺伝子のヌクレオチド配列の１７０５−１７０７位に対応する位置のコドンＴＴＧ（ロイシンをコードする）を含むベータ・ブルガリス植物を提供し、ここで、該ヌクレオチド配列は配列番号３を含む（またはそれほどは好ましくないが配列番号３からなる）。
【００５３】
配列番号２に示されているベータ・ブルガリスＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列の５６９位に対応する位置に、トリプトファンとは異なるアミノ酸を有する、ＡＬＳポリペプチドをコードするビー・ブルガリス植物は、好ましくは、配列番号１に示されているビー・ブルガリスＡＬＳ遺伝子のヌクレオチド配列の１７０５−１７０７位に対応する位置に、トリプトファンとは異なるアミノ酸をコードするコドンを、内因性ＡＬＳ遺伝子のヌクレオチド配列内に含む。
【００５４】
ビー・ブルガリス「ＡＬＳ」または「ＡＨＡＳ」遺伝子なる語はまた、配列番号１または３のビー・ブルガリスＡＬＳヌクレオチド配列に対して少なくとも９０、９５、９７、９８または９９％同一であるビー・ブルガリスヌクレオチド配列を含み、ここで、これらの６０、７０、８０、９０、９５、９７、９８または９９％同一であるヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド配列の１７０５−１７０７に対応する位置に、トリプトファンとは異なるアミノ酸をコードするコドンを含む。同様に、これらの少なくとも９０、９５、９７、９８または９９％同一であるヌクレオチド配列は、配列番号２の５６９位に対応する位置に、トリプトファンとは異なるアミノ酸を含むＡＬＳポリペプチドをコードしている。該同一ヌクレオチド配列は、本明細書に記載されているとおりの活性を保有するＡＬＳタンパク質をコードしており、より好ましくは、このようにしてコードされるＡＬＳポリペプチドは、本明細書に記載されているとおり、１以上のＡＬＳインヒビター除草剤に耐性である。該用語はまた、ＡＬＳポリペプチドをコードする対立遺伝子変異体およびホモログを含み、該ＡＬＳポリペプチドは、好ましくは、本明細書に記載されているとおりの１以上のＡＬＳインヒビター除草剤に耐性である。核酸配列が本発明のヌクレオチド配列に対して或る度合の同一性を有するかどうかを決定するために、当業者は、当技術分野でよく知られた手段および方法を用いることが可能であり、例えば、手動の又はコンピュータプログラム（例えば、「ハイブリダイゼーション」および相同性の度合なる語の定義に関して後記で更に詳しく記載されているもの）を使用することによるアライメントを用いることが可能である。
【００５５】
例えば、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌを表すＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１９９７），３３８９−３４０２；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６（１９９３），２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（１９９０），４０３−４１０）が、局所配列アライメントを検索するために使用されうる。ＢＬＡＳＴは、配列類似性を決定するために、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の両方のアライメントを生成する。該アライメントの局所性のため、ＢＬＡＳＴは、厳密なマッチを決定するのに又は類似配列を特定するのに特に有用である。ＢＬＡＳＴアルゴリズム出力の基本単位はハイ・スコアリング・セグメント・ペア（Ｈｉｇｈ−ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｓｅｇｍｅｎｔ  Ｐａｉｒ）（ＨＳＰ）である。ＨＳＰは、任意だが等しい長さの２つの配列断片からなり、そのアライメントは局所的に最大であり、該配列断片に関するアライメントスコアは、使用者により設定された閾値またはカットオフスコアを満足し又はそれを超える。ＢＬＡＳＴ法は、問合せ配列とデータベース配列との間のＨＳＰを探して、見出されたいずれかのマッチの統計的有意性を評価し、使用者により選択された有意性閾値を満足するマッチのみを報告するためのものである。パラメータＥは、データベース配列マッチを報告するための統計的に有意な閾値を確定する。Ｅは全データベース検索のコンテクスト内のＨＳＰ（またはＨＳＰの組合せ）の予想偶然出現頻度（ｅｘｐｅｃｔｅｄ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｃｈａｎｃｅ  ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ）の上限と解釈される。マッチがＥを満足するいずれかのデータベース配列がプログラム出力において報告される。ヌクレオチドデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋまたはＥＭＢＬにおける同一または関連分子を検索するために、ＢＬＡＳＴを使用する類似コンピュータ技術（Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９７），前記引用文中；Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３），前記引用文中；Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０），前記引用文中）が使用される。この解析は、複数の膜に基づくハイブリダイゼーションより遥かに速い。また、該コンピュータ検索の感度は、いずれかの特定のマッチが完全（ｅｘａｃｔ）または類似として分類されるかどうかを決定するために修飾されうる。該検索の基本は、
（％配列同一性×％最大ＢＬＡＳＴスコア）／１００
として定義される積スコアであり、それは、２つの配列間の類似性の度合および配列マッチの長さの両方を考慮する。例えば、４０の積スコアにおいて、該マッチは１〜２％の誤差内で完全であり、７０においては、該マッチは完全であろう。類似分子は通常、１５〜４０の積スコアを示すものを選択することにより特定されるが、より低いスコアが関連分子を特定することもある。
【００５６】
ビー・ブルガリス「ＡＬＳ」または「ＡＨＡＳ」ポリペプチドなる語はまた、配列番号２または４のＡＬＳアミノ酸配列に対して少なくとも９０、９５、９７、９８または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、これらの少なくとも９０、９５、９７、９８または９９％同一であるアミノ酸配列は、配列番号２の５６９位に対応する位置に、トリプトファンとは異なるアミノ酸を含む。該同一アミノ酸配列は、本明細書に記載されているとおりのＡＬＳの活性を保有し、より好ましくは、該ＡＬＳポリペプチドは、本明細書に記載されているとおり、ＡＬＳインヒビター除草剤に耐性である。
【００５７】
ＡＬＳ活性は、必要に応じて、Ｓｉｎｇｈ（１９９１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：４５７２−４５７６に記載されているアッセイにより測定されうる。
【００５８】
しかし、ＡＬＳポリペプチドをコードする本明細書中で言及されているＡＬＳヌクレオチド配列は、好ましくは、本明細書に記載されているとおり、１以上のＡＬＳインヒビター除草剤に対する耐性（または、逆に言えば、ＡＬＳインヒビター除草剤に対する、より低い感受性）を付与する。これは、本明細書に記載されているとおりのアミノ酸置換をもたらす点突然変異によるものである。したがって、ＡＬＳインヒビター除草剤に対する耐性（または、逆に言えば、ＡＬＳインヒビター除草剤に対する、より低い感受性）は、Ｓｉｎｇｈら（１９８８）［Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，４４４，２５１−２６１］に記載されているとおり、ＡＬＳインヒビター除草剤の存在下、突然変異ＡＬＳ配列を含有する植物からの又は突然変異ＡＬＳ配列を欠く植物からの細胞抽出物から得られるＡＬＳ活性の比較により測定されうる。
【００５９】
しかし、配列番号１に示されているビー・ブルガリスＡＬＳ遺伝子のヌクレオチド配列の１７０５−１７０７位に対応する位置にトリプトファンとは異なるアミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチド配列によりコードされるＡＬＳポリペプチドに関する、より好ましい活性アッセイは、以下のとおりに行われうる。
【００６０】
ベータ・ブルガリス野生型および突然変異ビー・ブルガリス植物のコード配列を、例えばＮｏｖａｇｅｎ  ｐＥＴ−３２ａ（＋）ベクター内にクローニングし、該ベクターを、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＡＤ４９４内に、該製造業者の説明に従い形質転換する。細菌を、好ましくは、１００ｍｇ／ｍｌ  カルベニシリンおよび２５ｍｇ／ｌ  カナマイシンを含有するＬＢ−培地におけるような選択圧下の培地内で３７℃で増殖させ、例えば１ｍＭ  イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドで、好ましくは約０．６のＯＤ６００で誘導し、好ましくは１８℃で約１６時間培養し、遠心分離により回収する。細菌ペレットを、０．１ｍＭ  チアミン−ピロリン酸、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１μＭ  ＦＡＤを含有する１００ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）に、２５ｍｌのバッファー当たり１グラムの湿潤重量の濃度で再懸濁させ、音波処理により破壊する。遠心分離後に得られた粗タンパク質抽出物をＡＬＳ活性の測定に使用する。
【００６１】
ついで、例えば、Ｒａｙ（１９８４），Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，７５，８２７−８３１に記載されている方法の変法を用いて、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、ＡＬＳアッセイを行う。該反応混合物は、好ましくは、２０ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、０．４５ｍＭ  チアミン−ピロリン酸、０．４５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、９μＭ  ＦＡＤ、ＡＬＳ酵素および種々の濃度のＡＬＳインヒビターを約９０μｌの最終容量中に含有する。
【００６２】
アッセイを、酵素を加えることにより開始し、好ましくは、４０μｌの０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４の添加により、３０℃で７５分間のインキュベーションの後で終了する。室温で約６０分後、０．７Ｍ  ＮａＯＨ中の１．４％  α−ナフトールおよび０．１４％  クレアチンの溶液約８０μｌを加え、室温で更に約４５分間のインキュベーションの後、５４０ｎｍで吸光度を測定する。ＡＬＳの阻害に関するｐＩ５０値を、ＩＤ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ，ＵＫのＸＬＦｉｔ  Ｅｘｃｅｌ  アドイン  バージョン４．３．１曲線フィッティングプログラムを使用して、Ｒａｙ（１９８４）），Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，７５，８２７−８３１に記載されているとおりに決定した。
【００６３】
植物を使用する場合、ＡＬＳ活性は、好ましくは、野生型の細胞抽出物または葉抽出物、および得られた突然変異体のビー・ブルガリス細胞抽出物または葉抽出物において、種々の濃度のＡＬＳインヒビター除草剤、好ましくはスルホニル尿素除草剤またはスルホニルアミノ−カルボニルトリアゾリノン除草剤の存在下、より好ましくは、種々の濃度のＡＬＳインヒビター除草剤「ホラムスルフロン（ｆｏｒａｍｓｕｌｆｕｒｏｎ）」の存在下で測定される。例えば、ＡＬＳは、Ｒａｙ（１９８４），Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ７５：８２７−８３１に記載されているとおりに、好ましくは、テンサイ葉またはテンサイ組織培養から抽出される。
【００６４】
本発明のビー・ブルガリス植物は、ＡＬＳインヒビターに対する、より低い感受性を有することが好ましく、より好ましくは、それは少なくとも１００倍低い感受性を有し、より好ましくは５００倍、より一層好ましくは１０００倍、最も好ましくは２０００倍低い感受性を有する。本明細書中で用いる低い感受性は、逆に言えば、「より耐性」または「より抵抗性」と理解されうる。同様に、「より耐性」または「より抵抗性」は、逆に言えば、「より低い感受性」と理解されうる。例えば、本発明のビー・ブルガリス植物、特に、後記実施例に記載されているビー・ブルガリス植物は、該野生型酵素と比較して、ＡＬＳインヒビター除草剤ホラムスルフロン（ＡＬＳインヒビターサブクラス「スルホニル尿素除草剤」のメンバー）に対する少なくとも２０００倍低い感受性を有する。
【００６５】
好ましくは、本発明のビー・ブルガリス植物は、スルホニル尿素除草剤、スルホニルアミノ−カルボニルトリアゾリノン除草剤およびイミダゾリノン除草剤のようなＡＬＳインヒビター除草剤の種々のメンバーに対する、より低い感受性を有する。好ましくは、該植物がより低い感受性を示すスルホニル尿素除草剤およびスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン除草剤が選択される。特定の好ましい実施形態においては、本発明のビー・ブルガリス植物は、ＡＬＳインヒビター除草剤ホルマスルフロン（スルホニル尿素除草剤）の単独体に対する、またはそれと組合された、スルホニル尿素除草剤のサブクラスもしくはいずれかの他のサブクラスのＡＬＳインヒビター除草剤からの１以上の他のＡＬＳインヒビター除草剤に対する、より低い感受性を有する。
【００６６】
したがって、ＡＬＳインヒビター除草剤に対する、好ましくはより低い感受性を有する、本発明のビー・ブルガリス植物は、同様に、ＡＬＳインヒビターに対して「より耐性」（すなわち、ＡＬＳインヒビター耐性植物）であることにより特徴づけられうる。
【００６７】
したがって、「ＡＬＳインヒビター耐性」植物は、正常または野生型植物の成長を通常に阻害するレベルで、少なくとも１つのＡＬＳインヒビター除草剤（好ましくは、該ＡＬＳインヒビター除草剤は正常または野生型植物を防除する）に対して、より耐性である植物、特にビー・ブルガリス植物を意味する。該正常または野生型植物は、配列番号１に示されているビー・ブルガリス（Ｂ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）ＡＬＳ遺伝子のヌクレオチド配列の１７０５−１７０７位に対応する位置でトリプトファンとは異なるアミノ酸をコードするコドンを、内因性ＡＬＳ遺伝子のいずれかの対立遺伝子のヌクレオチド配列内に含まない。
【００６８】
該ヌクレオチド配列は、一般に、「ＡＬＳインヒビター除草剤耐性」ヌクレオチド配列であることによっても特徴づけられうる。「ＡＬＳインヒビター除草剤耐性ヌクレオチド配列」は、配列番号２に示されているビー・ブルガリスＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列の５６９位に対応する位置にトリプトファンとは異なるアミノ酸を有さないＡＬＳタンパク質と比較した場合にトリプトファンとは異なるアミノ酸をコードするコドンを与える少なくとも１つの突然変異を含むヌクレオチド配列を含む核酸分子を意味し、ここで、そのような少なくとも１つの突然変異は、ＡＬＳインヒビター除草剤ＡＬＳタンパク質に対する、より低い感受性の発現をもたらす。「除草剤耐性ＡＬＳタンパク質」は、そのようなＡＬＳタンパク質が、ＡＬＳ活性を阻害することが知られている少なくとも１つのＡＬＳインヒビター除草剤の存在下、野生型ＡＬＳタンパク質のＡＬＳ活性を阻害することが知られている該除草剤の濃度またはレベルで、野生型ＡＬＳタンパク質のＡＬＳ活性より高い活性を示すことを意味する。
【００６９】
同様に、「ＡＬＳインヒビター除草剤」または略して「ＡＬＳインヒビター」なる語は互換的に用いられる。本明細書中で用いる「ＡＬＳインヒビター除草剤」または「ＡＬＳインヒビター」は、ＡＬＳ酵素の活性を阻害する単一の除草剤には限定されないと意図される。したがって、特に示されていない限り、またはそうでないことが文脈から明らかでない限り、「ＡＬＳインヒビター除草剤」または「ＡＬＳインヒビター」は、ＡＬＳ酵素の活性をそれぞれが阻害する好ましくは本明細書中に特定されている当技術分野で公知の１つの除草剤または２つ、３つ、４つ若しくはそれ以上の除草剤の混合物でありうる。
【００７０】
驚くべきことに、本発明による単一の点突然変異でさえも、ビー・ブルガリス植物およびその後代において、特にホモ接合が確立されている場合に、農業に有用な且つ安定なレベルのＡＬＳインヒビター除草剤耐性をもたらすことが見出された。そのような突然変異が専らヘテロ接合で存在する同じ遺伝的バックグラウンドの除草剤耐性ベータ・ブルガリス植物と比較して、該突然変異に関してホモ接合である除草剤耐性ベータ・ブルガリス植物は、より良好な農業的レベルのＡＬＳインヒビター除草剤耐性を示した。
【００７１】
したがって、本発明は、内因性アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子の突然変異を有するＡＬＳインヒビター除草剤耐性ベータ・ブルガリス植物に関するものであり、ここで、該ＡＬＳ遺伝子は、ＡＬＳポリペプチドの５６９位にトリプトファンとは異なるアミノ酸を含有するＡＬＳポリペプチドをコードしている。それぞれの突然変異はヘテロ接合で存在することが可能であり、好ましくは、ＡＬＳ遺伝子の唯一の突然変異でありうる。より好ましくは、それぞれの突然変異はホモ接合で存在することが可能であり、最も好ましくは、それぞれの突然変異は内因性ＡＬＳ遺伝子の唯一の突然変異としてホモ接合で存在する。
【００７２】
また、ＷＯ  ２０１０／０３７０６１は、農業に有用なＡＬＳインヒビター除草剤耐性を付与するためにはＡＬＳ遺伝子内の二重または三重突然変異体が必要だと教示しているため、ベータ・ブルガリスにおけるＡＬＳ遺伝子のただ１つの単一突然変異で十分であるとは予想され得ないであろう。
【００７３】
したがって、突然変異に関してヘテロ接合であるビー・ブルガリス植物およびその部分はそれほど好ましくはないが、本発明に尚も含まれ、或る施用法および／または或る環境条件には十分でありうる。また、内因性ＡＬＳ遺伝子内に１以上の他の突然変異を有する１つ（２倍性の場合）またはそれ以上（倍数性の場合）の他の対立遺伝子を含有し、配列番号１に示されているビー・ブルガリスＡＬＳ遺伝子のヌクレオチド配列の１７０５−１７０７に対応する位置にトリプトファンとは異なるアミノ酸、好ましくはロイシンをコードするコドンを、少なくとも内因性ＡＬＳ遺伝子の対立遺伝子の１つに含有する植物も、本発明に含まれる。
【００７４】
したがって、本明細書中で用いる「ヘテロ接合」または「ヘテロ接合で」なる語は、本発明の植物が、特定の遺伝子座、特にＡＬＳ遺伝子座に異なる対立遺伝子を有することを意味する。
【００７５】
「ホモ接合」または「ホモ接合で」は、本発明の植物が、異なるＤＮＡ鎖上、特にＡＬＳ遺伝子座に同一対立遺伝子の２つのコピーを有することを意味する。
【００７６】
そうでないと明らかに示されていない限り、本明細書中で用いる「植物」なる語は任意の発生段階の植物を意味すると意図される。
【００７７】
本発明のベータ・ブルガリス植物は正倍数体または非正倍数体であることが好ましい。正倍数体植物は、好ましくは、半数体、２倍体、４倍体、６倍体、８倍体、１０倍体または１２二倍体であることが可能であり、一方、非正倍数体植物は、好ましくは、３倍体または５倍体であることが可能である。
【００７８】
植物の部分は完全植物の全体に付着している、またはそれから分離していることが可能である。植物のそのような部分には、植物の器官、組織および細胞、好ましくは種子が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７９】
したがって、本発明のビー・ブルガリス植物は内因性ＡＬＳ遺伝子に関して非トランスジェニックである。もちろん、遺伝的操作により、または交配のような通常の方法により、該植物に外来遺伝子が導入されることが可能である。該遺伝子は、除草剤耐性を付与する遺伝子、好ましくは、ＡＬＳインヒビター除草剤耐性とは異なる除草剤耐性を付与する遺伝子、収量を改善する遺伝子、生物学的生物に対する抵抗性を改善する遺伝子、および／または含有物修飾に関する遺伝子でありうる。
【００８０】
もう１つの態様においては、本発明は、以下の工程：
（ａ）カルス、好ましくはテンサイ由来のカルスを、約１０−７Ｍ〜１０−９ＭのＡＬＳインヒビター除草剤、好ましくはホラムスルフロン（ｆｏｒａｍｓｕｌｆｕｒｏｎ）にさらし、
（ｂ）３×１０−６ＭまでのＡＬＳインヒビター除草剤、好ましくはホラムスルフロン［ＣＡＳ  ＲＮ  １７３１５９−５７−４］の存在下で成長しうる細胞コロニーを選択し、
（ｃ）ＡＬＳインヒビター除草剤、好ましくはホラムスルフロンの存在下でシュートを再生させ、
（ｄ）ＡＬＳインヒビター除草剤、好ましくはホラムスルフロン、ヨードスルフロン（ｉｏｄｏｓｕｌｆｕｒｏｎ）−メチル−ナトリウム［ＣＡＳ  ＲＮ  １４４５５０−３６−７］および／またはそれらの両方の混合物（ここで、ホルムスルフロンの用量は、好ましくは、７〜７０ｇ  ａ．ｉ．／ｈａと同等であり、ヨードスルフロン−メチル−ナトリウムの用量は、好ましくは、１〜１０ｇ  ａ．ｉ．／ｈａと同等である）で、再生された小植物を選択することを含む、ベータ・ブルガリス植物およびその部分の製造方法に関する。
【００８１】
もう１つの態様においては、前記の工程（ａ）〜（ｄ）により得られた再生小植物を、以下の工程（ｅ）〜（ｍ）を適用することにより、ベータ・ブルガリス植物の更なる製造に使用することが可能である：
（ｅ）各ＡＬＳインヒビター除草剤耐性小植物細胞系（クローン）を樹立することによる、種々の陽性変異体をレスキューするための、工程（ｄ）の個々の小植物の栄養微小繁殖（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ  ｍｉｃｒｏｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）、
（ｆ）栄養（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ）状態における各樹立クローンの長期貯蔵、
（ｇ）該長期貯蔵からの各クローンのクローン化植物の、温室内への移動、
（ｈ）開花を誘導するための春化室内での春化および適応、
（ｉ）成長室（制御された温度および光）への春化植物の移動、
（ｊ）工程（ｄ）の小植物の生殖稔性（ｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ）（雄および雌）に対する体細胞クローン変異の負の影響に対処するための、優良（ｅｌｉｔｅ）であるがＡＬＳインヒビター除草剤感受性である系の除雄植物との交配のための、最良開花クローンの最良花粉放出植物の選択、
（ｋ）稔性が回復するまでは優良系への、そして最終的には、ホモ接合状態を得るための自家ヘテロ接合植物への戻し交配、
（ｌ）圃場評価のための各戻し交配系の自殖種子およびＡＬＳインヒビター除草剤感受性相手との検定交雑、
（ｍ）最良性能系（好ましくは、そのホモ接合状態のもの）を選択するための、農業的に適切な用量の種々のＡＬＳインヒビター除草剤の施用。
【００８２】
対立遺伝子の少なくとも１つに本発明のＷ５６９突然変異を含有するヘテロ接合植物の適切な選択を行うための、ＡＬＳコード化内因性遺伝子の種々の位置に１以上の突然変異を含有する場合、またはホモ接合形態で突然変異を得るための植物の適切な選択を確保するための、および該方法を加速させるための分子育種技術（標識支援育種（ｍａｒｋｅｒ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ）または標識支援選択のような分子育種技術）により支持される育種業界で公知の方法に従う商業的品種の開発のための基礎を、前記工程（ａ）〜（ｍ）により得られた系は構成する（総説としては、Ｂｅｒｔｒａｎｄ  Ｃ．Ｙ．ら，（２００８），Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ，Ｂ．，３６３，５５７−５７２を参照されたい）。
【００８３】
カルスは、当技術分野で一般に公知の手段および方法により、例えば後記実施例に記載されているとおりに得られる。
【００８４】
前記工程（ｍ）により得られた種子はＮＣＩＭＢ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＵＫに番号ＮＣＩＭＢ  ４１７０５として寄託されている。
【００８５】
もう１つの態様においては、本発明は、（ｉ）内因性アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子の突然変異（ここで、該ＡＬＳ遺伝子は、ＡＬＳポリペプチドの５６９位にトリプトファンとは異なるアミノ酸を含有するＡＬＳポリペプチドをコードしている）、および（ｉｉ）該内因性ＡＬＳ遺伝子内の追加的な突然変異を含む、除草剤耐性ベータ・ブルガリス植物およびその部分の製造方法に関するものであり、該製造方法は、以下の工程を含む：
（ａ）内因性アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子の突然変異を含むＡＬＳインヒビター除草剤耐性ベータ・ブルガリス植物（親Ａ）を得（ここで、該ＡＬＳ遺伝子は、ＡＬＳポリペプチドの５６９位にトリプトファンとは異なるアミノ酸を含有するＡＬＳポリペプチドをコードしている）、
（ｂ）アミノ酸５６９位とは異なる位置における内因性ＡＬＳ遺伝子内の１以上の他の突然変異を含有するベータ・ブルガリス植物（親Ｂ）と親Ａを交配させ、
（ｃ）アミノ酸５６９位のＡＬＳ遺伝子突然変異に関して、および親Ｂによりコードされるいずれかの他のＡＬＳ遺伝子突然変異の１以上に関してヘテロ接合であるベータ・ブルガリス後代を得、
（ｄ）ここで、該育種法は、
（ｉ）標識支援育種および／もしくはミクロシークエンシング技術の適用、ならびに／または
（ｉｉ）工程（ｃ）により得られた後代が耐性である１以上のＡＬＳインヒビター除草剤の農業的に適切な用量の施用により制御される。
【００８６】
したがって、本発明はまた、前記製造方法により得られるビー・ブルガリス植物に関するものであると予想される。
【００８７】
非限定的な例においては、以下の非限定的な方法により、本発明のテンサイ植物を得た。理論により束縛されるものではないが、テンサイ以外のビー・ブルガリス（Ｂ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）植物を得るために同じ方法が用いられうる。
【００８８】
テンサイ細胞培養を２倍体テンサイ遺伝子型７Ｔ９０４４の実生から開始した（例えば、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｄｏｖｚｈｅｎｋｏ，ＰｈＤ  Ｔｈｅｓｉｓ，題名：“Ｔｏｗａｒｄｓ  ｐｌａｓｔｉｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｐｅｓｅｅｄ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ  Ｌ．）ａｎｄ  ｓｕｇａｒｂｅｅｔ（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  Ｌ．）”，Ｌｕｄｗｉｇ−Ｍａｘｉｍｉｌｉａｎｓ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ  Ｍｕｎｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２００１に記載されているとおり）。テンサイ種子を７０％  エタノール中に６０秒間浸漬し、ついで、０．０１％  界面活性剤を含有する無菌水で２回洗浄し、ついで１％  ＮａＯＣｌ漂白剤中で１〜４時間インキュベートした。ついで該種子を無菌水で３回洗浄し、該種子を無菌水中、４℃で一晩保存した。ついで、鉗子および外科用メスを使用して、胚を単離した。新たに調製した胚を０．５％  ＮａＯＣｌ中に３０分間浸漬し、ついで無菌水で３回洗浄した。最後の洗浄工程の後、それらをホルモン非含有ＭＳ寒天培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ（１９６２），Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，１５，４７３−４９７）上に配置した。無菌実生へと発育した胚を、再生可能なテンサイ培養の開始に使用した。子葉および胚軸を長さ２〜５ｍｍの断片に切断し、ついで、１ｍｇ／ｌ  ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）または０．２５ｍｇ／ｌ  チジアズロン（ＴＤＺ）を含有する寒天（０．８％）固化ＭＳ培地上で培養した。４週間後、発育中のシュート培養を同じ組成の新鮮寒天培地上に移し、ついで１カ月間隔で継代培養した。該培養を１２時間／１２時間の明／暗周期で薄明下で２５℃に維持した。７〜１０回の継代培養の後、チジアズロン含有培地上で成長したシュート培養は特徴的なカルス型を形成し、これは、速い成長を示し、軟らかく、脆かった。このカルス型の色は黄色から淡緑色であった。これらの脆いカルスの幾つかは胚様構造体からクロロフィル含有シュート原基を一貫して生成した。これらの速く成長する再生可能カルスをＡＬＳインヒビター除草剤耐性テンサイ突然変異体の選択に使用した。このカルス型を１０−９Ｍのスルホニル尿素ホラムスルフロン（ＣＡＳ  ＲＮ  １７３１５９−５７−４）にさらしたところ、該細胞は生存したが、該インヒビターを欠く培地上のそれらの同胞のバイオマスの５０％未満を与えたに過ぎなかった。３×１０−８Ｍ  ホラムスルフロンを含有する培地上では、成長は全く検出されなかった。大規模突然変異体選択実験のために、１０−７Ｍ  ホラムスルフロンを選択した。生存し成長している細胞コロニーを計数し、４〜６週間後、３×１０−７Ｍの該インヒビターを含有する新鮮培地上に移した。これらの細胞コロニーの１つは、該インヒビターのこの濃度だけでなく、３×１０−６Ｍのホラムスルフロンの存在下でさえも成長することが可能であった。このクローン（ＳＢ５７４ＴＬ）から、該ＡＬＳインヒビター除草剤の存在下でシュートを再生させ、ついで該シュートを、０．０５ｍｇ／ｌ  ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）を含有するＭＳ培地に移した。４〜１２週間以内に、該シュートは根を形成し、ついでそれらを、湿潤滅菌パーライトで満たされた無菌植物容器内に��し、半分の強度のＭＳ無機成分と共に給水した。あるいは、該小植物を該寒天固化培地から温室内のパーライト含有土壌混合物に直接的に移した。土壌含有基質中に移した後の最初の１０〜１５日間は、該植物を、高い湿度を有する環境中に維持した。それらを通常の温室湿度形態に切り換える途中および切り換えた後、該植物を、２０＋−３℃／１５＋−２℃の昼／夜温度で人工光（１２時間）下の温室内で維持した。
【００８９】
３〜５週間後、前記で得られたホラムスルフロン耐性細胞培養（ＳＢ５７４ＴＬ）からの及び野生型細胞培養からの再生植物をホラムスルフロン、ヨードスルフロン−メチル−ナトリウム（ＣＡＳ  ＲＮ  １４４５５０−３−７）、および両方の活性成分の混合物で処理した。試験された除草剤の用量はホラムスルフロンに関しては７〜７０ｇ  ａ．ｉ．／ｈａ、そしてヨードスルフロン−メチル−ナトリウムに関しては１〜１０ｇ  ａ．ｉ．／ｈａと同等であった。この耐性細胞系からの再生植物は、最高の除草剤の用量（ホラムスルフロン、ヨードスルフロン−メチル−ナトリウムおよび７：１の比のそれらの混合物）にも耐えたが、該野生型植物は最低の用量でも枯死した。
【００９０】
後代を（非限定的に）以下のとおりに試験した。ＳＢ５７４ＴＬに基づいて、ヘテロ接合状態で耐性対立遺伝子を付与する実験的ハイブリッドのＦ２およびＦ３種子、ならびにホモ接合状態で突然変異対立遺伝子を付与するＦ４〜Ｆ６種子を圃場に播種し、該植物が３〜５個のロセット葉を生成したら、ホラムスルフロン、ヨードスルフロン−メチル−ナトリウムおよび両方のＡＬＳインヒビター除草剤の混合物で処理した。該ホモ接合実生は、成長遅延または視認可能な損傷のいずれの徴候をも伴うことなく、３５ｇのホラムスルフロン／ｈａ＋７ｇのヨードスルフロン−メチル−ナトリウム／ｈａの混合物に耐えた。幾つかの場合には、ヘテロ接合系は、これらの比率において遅延成長および何らかの葉クロロシスの徴候を示したが、それらは３〜５週間以内に回復した。一方、通常のテンサイ実生は該ＡＬＳインヒビター除草剤により枯死した。
【００９１】
該ＡＬＳ突然変異体は以下のとおりに特徴づけられた。得られた突然変異体の抽出および核酸配列解析は、修正された標準的プロトコールに従いＬＧＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙにより行われた。
【００９２】
テンサイ突然変異体ＳＢ５７４ＴＬから得られた核酸配列を配列番号３に示す。配列番号４は対応アミノ酸配列を表す。一方、配列番号１は、出発物質として採用された野生型テンサイ植物を配列決定した後で得られた。配列番号２は野生型テンサイの対応アミノ酸配列を表す。全てのこれらの配列の比較は、５７４位の突然変異のみが存在し、この内因性ＡＬＳ遺伝子のいずれの他の部分においても他の変化が生じなかったことを示している。
【００９３】
【化１】
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しかし、本発明のビー・ブルガリス植物およびその部分は農業に利用されうることが一般に好ましい。「農業に利用されうる」は、該ビー・ブルガリス植物およびその部分が農業目的に有用であることを意味する。例えば、該ビー・ブルガリス植物は、糖製造、生物燃料（例えば、バイオガス、バイオブタノール）、エタノール製造、ベタインおよび／またはウリジン製造に有用となるという目的に役立つはずである。本明細書中で用いる「農業に利用されうる」なる語はまた、本発明のビー・ブルガリス植物が、好ましくは、ＡＬＳインヒビター除草剤に対する、より低い感受性を有すること、より好ましくは、それが少なくとも１００倍低い感受性を有すること、より好ましくは５００倍、より一層好ましくは１０００倍、最も好ましくは２０００倍低い感受性を有することを含む意である。該ＡＬＳインヒビター除草剤は、本明細書に記載されている１以上のものであり、好ましくは、それはホラムスルフロンの単独体、またはそれと組合された、スルホニル尿素除草剤のサブクラスもしくはいずれかの他のサブクラスのＡＬＳインヒビター除草剤からの１以上の他のＡＬＳインヒビター除草剤であり、最も好ましくは、それはホラムスルフロンと、他のスルホニル尿素除草剤および／またはスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン除草剤サブクラスのＡＬＳインヒビターとの組合せである。
【００９４】
好ましくは、本発明の、農業に利用されうるビー・ブルガリス植物、最も好ましくはテンサイ植物は、完全稔性であり、より好ましくは、野生型稔性を有する。稔性は、本発明のビー・ブルガリス植物が農業に利用されうるためには、この上なく重要である。
【００９５】
農業に利用されうるビー・ブルガリス植物の一例はテンサイである。１ヘクタールの面積で栽培される本発明のテンサイ植物（約８０，０００〜９０，０００のテンサイ）は、好ましくは、少なくとも４トンの糖の製造に役立つはずである。
【００９６】
あるいは、本発明のテンサイ植物は、農業に利用されうるためには、好ましくは、１５〜２０％、好ましくは少なくとも１７％の糖含量を含有するべきである。したがって、１５〜２０％、好ましくは少なくとも１７％の糖含量を含有するテンサイ植物は本発明の好ましい実施形態である。
【００９７】
本発明の植物はいずれかの遺伝子型分析法により特定されうる。植物の遺伝子型評価は、アイソザイム電気泳動、制限断片長多形（ＲＦＬＰ）、ランダム増幅多形ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、任意プライム化（Ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ  Ｐｒｉｍｅｄ）ポリメラーゼ連鎖反応技術（ＡＰ−ＰＣＲ）、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）、ＤＮＡ増幅フィンガープリンティング（ＤＡＦ）、配列特徴づけ増幅領域（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｒｅｇｉｏｎｓ）（ＳＣＡＲ）、増幅断片長多形（ＡＦＬＰ）、単一配列反復（Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｅａｔｓ）（ＳＳＲ）（これは「マイクロサテライト」とも称される）を用いることを含む。本発明において提供される植物の遺伝子型を分析するための追加的な組成物および方法には、米国公開第２００４／０１７１０２７号、米国公開第２００５／０２０８０５０６号および米国公開第２００５／０２８３８５８号に開示されている方法が含まれる。
【００９８】
本発明のもう１つの態様は、本明細書に記載されているベータ・ブルガリス植物および／または本明細書に記載されている収穫可能部分もしくは繁殖物質の、ベータ・ブルガリス植物の製造／育種のための使用である。ビー・ブルガリス植物の製造／育種のための方法は本明細書に記載されている。そのような製造／育種方法は、干ばつ、高温、低温または塩ストレス（これらに限定されるものではない）のようなストレスに対する耐性のような新規植物形質を更に含む本発明のビー・ブルガリス植物を作製するために使用されうる。
【００９９】
更にもう１つの態様においては、本発明は、ＡＬＳインヒビター除草剤の選択のためのスクリーニング方法における、本明細書に記載されている除草剤耐性ベータ・ブルガリス植物および／またはそれに由来する収穫可能部分もしくは繁殖物質の使用を含む。
【実施例】
【０１００】
本発明の及びその多数の利点の更に深い理解が以下の実施例から得られるであろう。該実施例は例示目的で記載されているに過ぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【０１０１】
実施例１：突然変異体の単離
テンサイ細胞培養を２倍体テンサイ遺伝子型７Ｔ９０４４の実生から開始した（例えば、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｄｏｖｚｈｅｎｋｏ，ＰｈＤ  Ｔｈｅｓｉｓ，題名：“Ｔｏｗａｒｄｓ  ｐｌａｓｔｉｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｐｅｓｅｅｄ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ  Ｌ．）ａｎｄ  ｓｕｇａｒｂｅｅｔ（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  Ｌ．）”，Ｌｕｄｗｉｇ−Ｍａｘｉｍｉｌｉａｎｓ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ  Ｍｕｎｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２００１に記載されているとおり）。
【０１０２】
テンサイ種子を７０％  エタノール中に６０秒間浸漬し、ついで、０．０１％  界面活性剤を含有する無菌水で２回洗浄し、ついで１％  ＮａＯＣｌ漂白剤中で１〜４時間インキュベートした。ついで該種子を無菌水で３回洗浄し、該種子を無菌水中、４℃で一晩保存した。ついで、鉗子および外科用メスを使用して、胚を単離した。新たに調製した胚を０．５％  ＮａＯＣｌ中に３０分間浸漬し、ついで無菌水で３回洗浄した。最後の洗浄工程の後、それらをホルモン非含有ＭＳ寒天培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ（１９６２），Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，１５，４７３−４９７）上に配置した。無菌実生へと発育した胚を、再生可能なテンサイ培養の開始に使用した。
【０１０３】
子葉および胚軸を長さ２〜５ｍｍの断片に切断し、ついで、１ｍｇ／ｌ  ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）または０．２５ｍｇ／ｌ  チジアズロン（ＴＤＺ）を含有する寒天（０．８％）固化ＭＳ培地上で培養した。４週間後、発育中のシュート培養を同じ組成の新鮮寒天培地上に移し、ついで１カ月間隔で継代培養した。該培養を１２時間／１２時間の明／暗周期で薄明下で２５℃に維持した。７〜１０日後（継代培養）、チジアズロン含有培地上で成長したシュート培養は特徴的なカルス型を形成し、これは、速い成長を示し、軟らかく、脆かった。このカルス型の色は黄色から淡緑色であった。これらの脆いカルスの幾つかは胚様構造体からクロロフィル含有シュート原基を一貫して生成した。これらの速く成長する再生可能カルスをＡＬＳインヒビター除草剤耐性テンサイ突然変異体の選択に使用した。このカルス型を１０−９ＭのＡＬＳインヒビター除草剤ホラムスルフロン（スルホニル尿素サブクラスに属する；前記参照）にさらしたところ、該細胞は生存したが、該インヒビターを欠く培地上のそれらの同胞のバイオマスの５０％未満を与えたに過ぎなかった。３×１０−８Ｍ  ホラムスルフロンを含有する培地上では、成長は全く検出されなかった。大規模突然変異体選択実験のために、１０−７Ｍ  ホラムスルフロンを選択した。生存し成長している細胞コロニーを計数し、４〜６週間後、３×１０−７Ｍの該インヒビターを含有する新鮮培地上に移した。これらの細胞コロニーの１つは、該インヒビターのこの濃度だけでなく、３×１０−６Ｍのホラムスルフロンの存在下でさえも成長することが可能であった。このクローン（ＳＢ５７４ＴＬ）から、該ＡＬＳインヒビター除草剤の存在下でシュートを再生させ、ついで該シュートを、０．０５ｍｇ／ｌ  ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）を含有するＭＳ培地に移した。
【０１０４】
４〜１２週間以内に、該シュートは根を形成し、ついでそれらを、湿潤滅菌パーライトで満たされた無菌植物容器内に移し、半分の強度のＭＳ無機成分と共に給水した。あるいは、該小植物を該寒天固化培地から温室内のパーライト含有土壌混合物に直接的に移した。土壌含有基質中に移した後の最初の１０〜１５日間は、該植物を、高い湿度を有する環境中に維持した。それらを通常の温室湿度形態に切り換える途中および切り換えた後、該植物を、２０＋−３℃／１５＋−２℃の昼／夜温度で人工光（１２時間）下の温室内で維持した。
【０１０５】
３〜５週間後、前記で得られたホラムスルフロン耐性細胞培養（ＳＢ５７４ＴＬ）からの及び野生型細胞培養からの再生植物をホラムスルフロン、ヨードスルフロン−メチル−ナトリウム（ＣＡＳ  ＲＮ  １４４５５０−３−７）、および両方の活性成分の混合物で処理した。試験された除草剤の用量はホラムスルフロンに関しては７〜７０ｇ  ａ．ｉ．／ｈａ、そしてヨードスルフロン−メチル−ナトリウムに関しては１〜１０ｇ  ａ．ｉ．／ｈａと同等であった。この耐性細胞系からの再生植物は、最高の除草剤の用量（ホラムスルフロン、ヨードスルフロン−メチル−ナトリウムおよび７：１の比のそれらの混合物）にも耐えたが、該野生型植物は最低の用量でも枯死した。
【０１０６】
実施例２：後代の試験
ＳＢ５７４ＴＬに基づいて、ヘテロ接合状態で耐性対立遺伝子を付与する実験的ハイブリッドのＦ２およびＦ３種子、ならびにホモ接合状態で突然変異対立遺伝子を付与するＦ４〜Ｆ６種子を圃場に播種し、該植物が３〜５個のロセット葉を生成したら、ホラムスルフロン、ヨードスルフロン−メチル−ナトリウムおよび両方のＡＬＳインヒビター除草剤の混合物で処理した。該ホモ接合実生は、成長遅延または視認可能な損傷のいずれの徴候をも伴うことなく、３５ｇのホラムスルフロン／ｈａ＋７ｇのヨードスルフロン−メチル−ナトリウム／ｈａの混合物に耐えた。ヘテロ接合系は、これらの比率において遅延成長および何らかの葉クロロシスの徴候を示したが、それらは３〜５週間以内に回復した。一方、通常のテンサイ実生は該ＡＬＳインヒビター除草剤により枯死した。
【０１０７】
実施例３：得られたテンサイ突然変異体（ＳＢ５７４ＴＬ）の分子的特徴づけ
得られた突然変異体の抽出および核酸配列解析は、修正された標準的プロトコールに従いＬＧＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙにより行われた。
【０１０８】
テンサイ突然変異体ＳＢ５７４ＴＬから得られた核酸配列を配列番号３に示す。配列番号４は対応アミノ酸配列を表す。一方、配列番号１は、出発物質として採用された野生型テンサイ植物を配列決定した後で得られた。配列番号２は野生型テンサイの対応アミノ酸配列を表す。
【０１０９】
全てのこれらの配列の比較は、５７４位の突然変異のみが存在し、この内因性ＡＬＳ遺伝子のいずれの他の部分においても他の変化が生じなかったことを明らかに示している。
【０１１０】
実施例４：酵素活性測定
ベータ・ブルガリス野生型およびＷ５７４Ｌ−突然変異体（ＳＢ５７４ＴＬ）ＡＬＳ遺伝子のコード配列をＮｏｖａｇｅｎ  ｐＥＴ−３２ａ（＋）ベクター内にクローニングし、該ベクターを、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＡＤ４９４内に、該製造業者の説明に従い形質転換した。細菌を、１００ｍｇ／ｍｌ  カルベニシリンおよび２５ｍｇ／ｌ  カナマイシンを含有するＬＢ−培地（ルリア−ブロス−培地）内で３７℃で増殖させ、１ｍＭ  イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシドで０．６のＯＤ６００で誘導し、１８℃で１６時間培養し、遠心分離により回収した。細菌ペレットを、０．１ｍＭ  チアミン−ピロリン酸、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１μＭ  ＦＡＤを含有する１００ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）に、２５ｍｌのバッファー当たり１グラムの湿潤重量の濃度で再懸濁させ、音波処理により破壊した。遠心分離後に得られた粗タンパク質抽出物をＡＬＳ活性の測定に使用する。
【０１１１】
Ｒａｙ（１９８４）に記載されている方法の変法を用いて、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、ＡＬＳアッセイを行った。該反応混合物は２０ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、０．４５ｍＭ  チアミン−ピロリン酸、０．４５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、９μＭ  ＦＡＤ、ＡＬＳ酵素および種々の濃度のＡＬＳインヒビターを９０μｌの最終容量中に含有していた。アッセイを、酵素を加えることにより開始し、４０μｌの０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４の添加により、３０℃で７５分間のインキュベーションの後で終了させた。室温で６０分後、０．７Ｍ  ＮａＯＨ中の１．４％  α−ナフトールおよび０．１４％  クレアチンの溶液８０μｌを加え、室温で更に約４５分間のインキュベーションの後、５４０ｎｍで吸光度を測定した。ＡＬＳの阻害に関するｐＩ５０値を、ＩＤ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ＬｉｍｉｔｅｄのＸＬＦｉｔ  Ｅｘｃｅｌ  アドイン  バージョン４．３．１曲線フィッティングプログラムを使用して、Ｒａｙ（１９８４）に記載されているとおりに決定した。
【０１１２】
総合すると、該突然変異酵素は、ＡＬＳインヒビターホラムスルフロンに対する、該野生型酵素より少なくとも２０００倍低い感受性を示した。
【０１１３】
実施例５：酵素活性測定（植物からのもの）
Ｒａｙ（１９８４），Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ７５：８２７−８３１に記載されているとおりに、テンサイ葉またはテンサイ組織培養からＡＬＳを抽出した。
【０１１４】
野生型テンサイの葉抽出物および得られたＳＢ５７４ＴＬの葉抽出物において、種々の濃度のホラムスルフロンの存在下、実施例４に記載されているとおりにＡＬＳ活性を測定した。
【０１１５】
総合すると、該突然変異酵素は、ＡＬＳインヒビターホラムスルフロンに対する、該野生型酵素より少なくとも２０００倍低い感受性を示した。
【０１１６】
実施例６：ホモ接合ＡＬＳインヒビター除草剤耐性テンサイ植物を使用することによる圃場試験
ＳＢ５７４ＴＬに基づいて、ホモ接合状態で内因性ＡＬＳ遺伝子の突然変異対立遺伝子を付与するＦ４〜Ｆ６種子を更なる試験のために施用した。ホモ接合ＳＢ５７４ＴＬ突然変異植物の植物種子ならびに伝統品種ＫＬＡＲＩＮＡ（ＡＬＳタンパク質の５６９位にそれぞれの突然変異を有さない、一般的に入手可能なＡＬＳインヒビター感受性基準テンサイ品種）の種子を圃場に播き、ＢＢＣＨ標準（ｍｏｎｏｇｒａｐｈｉｅ“Ｅｎｔｗｉｃｋｌｕｎｇｓｓｔａｄｉｅｎ  ｍｏｎｏ−  ｕｎｄ  ｄｉｋｏｔｙｌｅｒ  Ｐｆｌａｎｚｅｎ”，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１，Ｕｗｅ  Ｍｅｉｅｒ編，Ｂｉｏｌｏｇｉｓｃｈｅ  Ｂｕｎｄｅｓａｎｓｔａｌｔ  ｆｕｒ  Ｌａｎｄ  ｕｎｄ  Ｆｏｒｓｔｗｉｒｔｓｃｈａｆｔに定義されているとおり）に従い種々の成長段階まで成長させた。ついで該植物を、選択法において使用されてる以下の表１に特定されているそれぞれのＡＬＳインヒビター除草剤で試験した。種々の施用において施用した水量は２００  ｌ／ｈａに等しかった。それぞれのＡＬＳインヒビター除草剤の施用の８、１４および２８日後（ＤＡＡ）（表１に示されているとおり）、種々のテンサイ植物に対する損傷（植物毒性）を０％から１００％までの尺度に従い評価した。この場合、「０％」は「植物毒性無し」を意味し、「１００％」は、植物が完全に枯死したことを意味する。
【０１１７】
【表２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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