(57)【要約】  本発明は、マンナンを含む免疫刺激組成物であって、マンナンの少なくとも７５％は約１０００ｋＤａより大きく、及び／又は少なくとも１５０のアルデヒド基を有するものを提供する。本発明はまた、その調製方法と共に、ワクチン接種及び遺伝子療法におけるこの組成物の使用も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンナンを含む免疫刺激組成物であって、マンナンの少なくとも７５％が約１０００ｋＤａより大きい組成物。
【請求項２】
マンナンが酸化されている請求項１の組成物。
【請求項３】
酸化マンナンを含む免疫刺激組成物であって、マンナンの少なくとも７５％が少なくとも１５０のアルデヒド基を有する組成物。
【請求項４】
酸化マンナンを含む免疫刺激組成物であって、マンナンの少なくとも７５％が約１０００ｋＤａより大きく、且つ少なくとも１５０のアルデヒド基を有する組成物。
【請求項５】
マンナン及び少なくとも１つの抗原又はそれをコードする核酸を含むワクチン組成物であって、マンナンの少なくとも７５％が約１０００ｋＤａより大きい組成物。
【請求項６】
マンナンが酸化されている請求項５の組成物。
【請求項７】
酸化マンナンが、少なくとも１つの抗原に共有結合されている請求項６の組成物。
【請求項８】
酸化マンナンが、ポリカチオンを介して少なくとも１つの核酸に抱合されている請求項６の組成物。
【請求項９】
少なくとも１つの抗原又はそれをコードする核酸に抱合される前に、酸化マンナンの少なくとも７５％が少なくとも１５０のアルデヒド基を有する請求項７又は８の組成物。
【請求項１０】
マンナンが酵母に由来する請求項１〜９のいずれか１項の組成物。
【請求項１１】
マンナンの少なくとも９０％が約１０００ｋＤａより大きい請求項１〜１０のいずれか１項の組成物。
【請求項１２】
マンナンの少なくとも９５％が約１０００ｋＤａより大きい請求項１〜１０のいずれか１項の組成物。
【請求項１３】
酸化マンナンの少なくとも９０％が少なくとも１５０のアルデヒド基を有する請求項４又は９の組成物。
【請求項１４】
酸化マンナンの少なくとも９５％が少なくとも１５０のアルデヒド基を有する請求項４又は９の組成物。
【請求項１５】
アミノナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＡＮＴＳ）で標識した後のマンナンのサイズ分布が、タンパク質基準に基づいて約１５０〜約２５０Ｄａの間であり、及び／又は炭水化物基準に基づいて約８００〜約３０００ｋＤａの間である請求項１〜１４のいずれか１項の組成物。
【請求項１６】
抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、原虫抗原、真菌抗原、又は腫瘍抗原、自己抗原、又はアレルゲンである請求項５〜１５のいずれか１項の組成物。
【請求項１７】
粘膜投与、局所投与、皮内投与、筋肉内投与、皮下投与又は静脈内投与のために製剤化されている請求項１〜１６のいずれか１項の組成物。
【請求項１８】
少なくとも１つの許容可能なキャリアをさらに含む請求項１〜１７のいずれか１項の組成物。
【請求項１９】
対象において免疫応答を誘導する及び／又は高める方法であって、請求項１〜１８のいずれか１項の組成物を対象に投与することを含む方法。
【請求項２０】
少なくとも１つの抗原又はそれをコードする核酸を投与することを含む請求項１９の方法。
【請求項２１】
マンナン及び少なくとも１つの抗原又はそれをコードする核酸を順次又は同時に投与する請求項２０の方法。
【請求項２２】
請求項５〜１８のいずれか１項に記載のワクチン組成物としてマンナン及び少なくとも１つの抗原又はそれをコードする核酸を投与する請求項２０の方法。
【請求項２３】
病原体に対して対象を免疫する請求項１９〜２２のいずれか１項の方法。
【請求項２４】
癌療法にて使用するための請求項１９〜２２のいずれか１項の方法。
【請求項２５】
組成物が、粘膜に、局所で、皮内に、筋肉内に、皮下に又は静脈内に投与される請求項１９〜２４のいずれか１項の方法。
【請求項２６】
対象が鳥類又は哺乳類である請求項１９〜２５のいずれか１項の方法。
【請求項２７】
哺乳類がヒトである請求項２６の方法。
【請求項２８】
対象において免疫応答を誘導する及び／又は高めるための薬物を製造するための請求項１〜１８のいずれか１項の組成物の使用。
【請求項２９】
対象において免疫応答を誘導する及び／又は高めるための請求項１〜１８のいずれか１項の組成物の使用。
【請求項３０】
ｉｎ  ｖｉｔro又はｅｘ  ｖｉｖｏにてマクロファージ、樹状細胞及び／又はＣＴＬを活性化する方法であって、請求項１〜１８のいずれか１項の組成物に細胞を接触させることを含む方法。
【請求項３１】
少なくとも１つの核酸を細胞に送達する組成物であって、組成物が少なくとも１つの核酸及びマンナンを含み、マンナンの少なくとも７５％が約１０００ｋＤａより大きい組成物。
【請求項３２】
マンナンが酸化されている請求項３１の組成物。
【請求項３３】
ポリカチオンを介して酸化マンナンが少なくとも１つの核酸に抱合されている請求項３２の組成物。
【請求項３４】
少なくとも１つ核酸に抱合される前に、酸化マンナンの少なくとも７５％が少なくとも１５０のアルデヒド基を有する請求項３３の組成物。
【請求項３５】
少なくとも１つの核酸を細胞に送達する方法であって、請求項３１〜３４のいずれか１項の組成物に細胞を接触させることを含む方法。
【請求項３６】
細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏにある請求項３５の方法。
【請求項３７】
遺伝子治療又は遺伝子ワクチン接種のために少なくとも１つの核酸が細胞に送達される請求項３５又は３６の方法。
【請求項３８】
遺伝子治療又は遺伝子ワクチン接種のための薬物を製造するための請求項３１〜３４のいずれか１項の組成物の使用。
【請求項３９】
遺伝子治療又は遺伝子ワクチン接種のための請求項３１〜３４のいずれか１項の組成物の使用。
【請求項４０】
請求項１〜１８又は３１〜３４のいずれか１項の組成物を調製する方法であって、
ｉ）マンナンを含む組成物を得ること、
ｉｉ）サイズに基づいて工程ｉ）の組成物を分画すること、
ｉｉｉ）マンナンを含む１以上の分画を選択し、１以上の分画におけるマンナンの少なくとも７５％が約１０００ｋＤａより大きいこと、及び
ｉｖ）少なくとも１つのその他の化合物と工程ｉｉｉ）のマンナンを任意で混合する又は抱合すること、を含む方法。
【請求項４１】
少なくとも１つのその他の化合物が、抗原又はそれをコードする核酸である請求項４０の方法。
【請求項４２】
工程ｉｖ）の前にマンナンを酸化する工程をさらに含む請求項４０又は４１の方法。
【請求項４３】
酸化マンナンの少なくとも７５％が少なくとも１５０のアルデヒド基を有する請求項４２の方法。
【請求項４４】
請求項５〜１８のいずれか１項のワクチン組成物を調製する方法であって、
ｉ）マンナンの少なくとも７５％が１０００ｋＤａより大きいマンナンを含む組成物を得ること、及び
ｉｉ）少なくとも１つの抗原又はそれをコードする核酸と工程ｉ）の組成物を混合し又は抱合し、それによってワクチン組成物を調製することを含む方法。
【請求項４５】
工程ｉｉ）の前にマンナンを酸化する工程をさらに含む請求項４４の方法。
【請求項４６】
酸化マンナンの少なくとも７５％が少なくとも１５０のアルデヒド基を有する請求項４５の方法。
【請求項４７】
マンノースを含む炭水化物ポリマーを含む組成物を選択する方法であって、
ｉ）マンノース含む炭水化物ポリマーを含む組成物を得ること、
ｉｉ）工程ｉ）の組成物のサイズ分布及び／又はアルデヒド含量を分析すること、及び
ｉｉｉ）所望のサイズ及び／又はアルデヒド含量を含むのであればその組成物を選択することを含む方法。
【請求項４８】
サイズ分布が
ｉ）組成物の一部を酸化すること、
ｉｉ）工程ｉ）の酸化された生成物をアミノナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＡＮＴＳ）で標識すること、、及び
ｉｉｉ）工程ｉｉ）のＡＮＴＳ標識された生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離することによりサイズ分布を分析すること
によって分析される請求項４７の方法。
【請求項４９】
アルデヒド含量が、
ｉ）組成物の一部を酸化すること、
ｉｉ）工程ｉ）の酸化された生成物を３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）と反応させること、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の生成物を還元剤と反応させて２−ピリジンチオンを放出させること、及び
ｉｖ）２−ピリジンチオンの放出を測定すること
によって分析される請求項４７又は４８の方法。
【請求項５０】
還元剤がジチオスレイトール（ＤＴＴ）である請求項４９の方法。
【請求項５１】
２−ピリジンチオンの放出が、ＯＤ３４３ｎｍの吸光度にて分光光度法によって測定される請求項４９又は５０の方法。
【請求項５２】
過ヨウ素酸ナトリウムによって組成物が酸化される請求項４８〜５１のいずれか１項の方法。
【請求項５３】
工程ｉ）の組成物の純度を決定することをさらに含む請求項４７〜５２のいずれか１項の方法。
【請求項５４】
純度が、
ｉ）水和硫酸の存在下でレゾルシノール（１，３−ジヒドロキシベンゼン）と組成物の一部を反応させ、
ｉｉ）ＯＤ４３０〜４８０ｎｍにて吸光度を測定し、
ｉｉｉ）標準に対して吸光度を比較することによって
炭水化物ポリマーの糖含量を定量することにより決定される請求項５３の方法。
【請求項５５】
マンノースを含む炭水化物ポリマーを含む組成物を調製する方法であって、
ｉ）炭水化物ポリマーがアルデヒド基を含む、マンノースを含む炭水化物ポリマーを含む組成物を得ること、
ｉｉ）サイズに基づいて組成物を分画すること、及び
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の所望のサイズ分布及び／又はアルデヒド含量を持つ炭水化物ポリマーを含む１以上の分画を選択し、それによって組成物を調製することを含む方法。
【請求項５６】
マンノースを含む炭水化物ポリマーを含む組成物を調製する方法であって、
ｉ）マンノースを含む炭水化物ポリマーを含む組成物を得ること、
ｉｉ）サイズに基づいて組成物を分画すること、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）から得られた１以上の分画を酸化すること、及び
ｉｖ）工程ｉｉｉ）の所望のサイズ分布及び／又はアルデヒド含量を持つ炭水化物ポリマーを含む１以上の分画を選択し、それによって組成物を調製することを含む方法。
【請求項５７】
工程ｉｉ）の前に、請求項４７〜５４のいずれか１項の方法を用いて組成物が選択される請求項５６の方法。
【請求項５８】
工程ｉｉ）が、接線流濾過、サイズ排除クロマトグラフィ及び／又は限外濾過によって実施される請求項５５〜５７のいずれか１項の方法。
【請求項５９】
１以上の分画が過ヨウ素酸ナトリウムによって酸化される請求項５６〜５８のいずれか１項の方法。
【請求項６０】
選択の前に１以上の分画のアルデヒド含量を分析することをさらに含む請求項５５〜５９のいずれか１項の方法。
【請求項６１】
アルデヒド含量が、
ｉ）１以上の分画の一部を３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）と反応させること、
ｉｉ）工程ｉ）の生成物を還元剤と反応させて２−ピリジンチオンを放出させること、、及び
ｉｉｉ）２−ピリジンチオンの放出を測定することによって分析される請求項６０の方法。
【請求項６２】
還元剤がジチオスレイトール（ＤＴＴ）である請求項６１の方法。
【請求項６３】
２−ピリジンチオンの放出が、ＯＤ３４３ｎｍの吸光度にて分光光度法によって測定される請求項６１又は６２の方法。
【請求項６４】
１以上の選択された分画のサイズ分布を分析することをさらに含む請求項５５〜６３のいずれか１項の方法。
【請求項６５】
サイズ分布が、
ｉ）１以上の分画の一部をアミノナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＡＮＴＳ）で標識することと
ｉｉ）工程ｉ）の１以上のＡＮＴＳ標識した分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離することによってサイズ分布を分析することにより分析される請求項６４の方法。
【請求項６６】
マンノースを含む炭水化物ポリマーが、マンナンであり、及び
（ａ）選択された分画におけるマンナンの分子量は約１０００ｋＤａを超え、ＡＮＴＳで標識した後のサイズ分布はタンパク質基準に基づいて約１５０〜約２５０Ｄａの間であり、及び／又は炭水化物基準に基づいて約８００〜約３０００ｋＤａの間であるか；
（ｂ）選択された分画におけるマンナンの分子量は約３００〜約１０００ｋＤａの間であり、ＡＮＴＳで標識した後のサイズ分布はタンパク質基準に基づいて約１５０〜約１７５Ｄａの間であり、及び／又は炭水化物基準に基づいて約４００〜約１０００ｋＤａの間であるか；
（ｃ）選択された分画におけるマンナンの分子量は約１００〜約３００ｋＤａの間であり、ＡＮＴＳで標識した後のサイズ分布はタンパク質基準に基づいて約８０〜約１２５Ｄａの間であり、及び／又は炭水化物基準に基づいて約９０〜約４００ｋＤａの間であるか；
（ｄ）選択された分画におけるマンナンの分子量は約５０〜約１００ｋＤａの間であり、ＡＮＴＳで標識した後のサイズ分布はタンパク質基準に基づいて約６０〜約８０Ｄａの間であり、及び／又は炭水化物基準に基づいて約５０〜約１７５ｋＤａの間であるか；又は
（ｅ）選択された分画におけるマンナンの分子量は約３０〜約５０ｋＤａの間であり、ＡＮＴＳで標識した後のサイズ分布はタンパク質基準に基づいて約５０〜約６０Ｄａの間であり、及び／又は炭水化物基準に基づいて約２０〜約５０ｋＤａの間である、請求項６５の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マンノース、特にマンナンを含む炭水化物ポリマー、その調製及び免疫刺激組成物とワクチン組成物におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
マンノース（たとえば、マンナン）、β（１，３）グルコース（たとえば、グルカン）、β（１，４）アセチル化マンノース（アセマンナン）、β（１，４）Ｎ−アセチル−グルコサミン（キチン）の幾つかの多糖類（炭水化物ポリマー）、及びラムノガラクツロナン（ペクチン）のようなヘテロ多糖類は免疫系を刺激することが示されている。
【０００３】
Ｃ型レクチン受容体への多糖類の結合は、貪食作用、増殖反応、サイトカインの放出、及び免疫系のそのほかの活性によって示されるように免疫刺激を誘導する。この免疫刺激活性のために、これらの多糖類はワクチン組成物での使用について提案されている。特に関心があるのはマンナンである。
【０００４】
マンナンはマンノース受容体（ＣＤ２０６）及びＤＣ−ＳＩＧＮ（ＣＤ２０９）のようなＣ型レクチン受容体によって認識されるポリマンノースである。抗原提示細胞上でのその存在のために、これらの受容体は、マンノース、フコース又はグルコースを含有する化合物の取り込みを特徴とする。たとえば、マンノース受容体へのマンナンの結合はエンドサイトーシスを誘導し、その後エンドソーム経路への送達を誘導する。マンノシル化抗原に関する初期の検討は、抗原上のマンノース残基の存在が樹状細胞（ＤＣ）による抗原の取り込みと主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ拘束性の抗原の提示を大きく高めることを示した。少なくとも１つの抗原へのマンナンの抱合もまた取り込みと提示を高める。
【０００５】
特定の多糖類の免疫刺激特性はしばらくの間知られていたが、その使用は大部分が研究応用に限定されている。このことは、部分的には、特にヒトに関する臨床設定での使用を支配する厳格な規制による。その結果、疾患の治療又は予防での使用のためのさらなる免疫刺激組成物とワクチン組成物、並びにその調製のための信頼できる方法に対するニーズがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
治療用途のために再現可能な特徴を持ったマンノースを含む炭水化物ポリマーを含む組成物を製造する方法を工夫しようと試みる一方で、本発明者らは、規定されたサイズ及び／又はアルデヒド含量を持つマンナンの亜集団が、出発集団と比べてと同様にその他の亜集団と比べて高い特性を有することを驚きをもって見い出した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従って、第１の態様では本発明は、マンナンを含有する免疫刺激組成物を提供するが、その際、マンナンの少なくとも７５％は約１０００ｋＤａよりも大きい。
【０００８】
一実施形態では、マンナンは酸化されるのでアルデヒド基を含む。このことは、マンナンが少なくとも１つの抗原又はそれをコードする核酸に抱合されるべきである場合、特に有用である。
【０００９】
一実施形態では、アミノナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＡＮＴＳ）で標識した後のマンナンのサイズ分布はタンパク質基準に基づいて約１５０〜約２５０Ｄａの間であり、及び／又は炭水化物基準に基づいて約８００〜約３０００ｋＤａの間である。
【００１０】
別の態様では、本発明は、酸化されたマンナンを含む免疫刺激組成物を提供するが、その際、マンナンの少なくとも７５％は少なくとも１５０のアルデヒド基を有する。
【００１１】
別の態様では、本発明は、酸化されたマンナンを含む免疫刺激組成物を提供するが、その際、マンナンの少なくとも７５％は約１０００ｋＤａより大きく、且つ少なくとも１５０のアルデヒド基を有する。
【００１２】
さらに、提供されるのは、マンナンと少なくとも１つの抗原又はそれをコードする核酸を含むワクチン組成物であり、その際、マンナンの少なくとも７５％は約１０００ｋＤａより大きい。
【００１３】
一実施形態では、マンナンは酸化されている。
【００１４】
さらなる実施形態では、酸化されたマンナンは少なくとも１つの抗原に共有結合される。
【００１５】
代わりの実施形態では、酸化されたマンナンはポリカチオンを介して少なくとも１つの核酸に抱合される。
【００１６】
一実施形態では、酸化されたマンナンの少なくとも７５％が、少なくとも１つの抗原又はそれをコードする核酸の抱合される前に少なくとも１５０のアルデヒド基を有する。
【００１７】
一実施形態では、抗原又はそれをコードする核酸への抱合の前で且つアミノナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＡＮＴＳ）で標識した後のマンナンのサイズ分布は、タンパク質基準に基づいて約１５０〜約２５０Ｄａの間であり、及び／又は炭水化物基準に基づいて約８００〜約３０００ｋＤａの間である。
【００１８】
マンナンは、たとえば、真菌、さらに好ましくは酵母のような任意の供給源に由来することができる。
【００１９】
抗原は、たとえば、ウイルス抗原、細菌抗原、原虫抗原、真菌抗原、腫瘍抗原、自己抗原又はアレルゲンのような任意の供給源に由来することができる。抗原は、たとえば、生物全体、タンパク質又は抗原性ペプチドであってもよい。
【００２０】
一実施形態では、本発明の組成物は、粘膜、局所、皮内、筋肉内、皮下又は静脈内の投与のために製剤化される。
【００２１】
一実施形態では、本発明の組成物は少なくとも１つの許容可能なキャリアをさらに含む。
【００２２】
別の態様では、本発明は、対象において免疫応答を誘導する及び／又は高めるための方法を提供するが、その方法は、本発明の組成物を対象に投与することを含む。
【００２３】
一実施形態では、方法は少なくとも１つの抗原又はそれをコードする核酸を投与することを含む。
【００２４】
一実施形態では、マンナンと少なくとも１つの抗原又はそれをコードする核酸は順次又は同時に投与される。好まれる実施形態では、それらは同一の組成物にて投与される。
【００２５】
一実施形態では、マンナンと少なくとも１つの抗原又はそれをコードする核酸は、本発明に係るワクチン組成物として投与される。
【００２６】
一実施形態では、抗原が感染因子に由来する又はその変異体／誘導体である場合、方法は病原体（感染因子）に対して対象を免疫する。別の実施形態では、抗原が癌細胞に由来する又はその変異体／誘導体である場合、方法は癌療法のためのものである。
【００２７】
一実施形態では、組成物は、粘膜内に、局所に、皮内に、筋肉内に、皮下に又は静脈内に投与される。
【００２８】
提供されるのはまた、対象において免疫応答を誘導する及び／又は高めるための薬物を製造するための本発明の組成物の使用である。
【００２９】
さらに、提供されるのは、対象において免疫応答を誘導する及び／又は高めるための本発明の組成物の使用である。
【００３０】
本発明の組成物はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏでの刺激方法で使用することができる。従って、さらなる態様では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏでマクロファージ、ＤＣ及び／又は細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を活性化する方法を提供するが、その方法は本発明の組成物に細胞を接触させることを含む。刺激された細胞を必要とする対象に投与することができる。
【００３１】
サイズ及び／又はアルデヒド含量で選択される本発明のマンナン集団を用いて少なくとも１つの核酸を細胞に送達することもできる。従って、さらなる態様では、本発明は、少なくとも１つの核酸を細胞に送達する組成物を提供するが、その組成物は少なくとも１つの核酸とマンナンを含み、その際、マンナンの少なくとも７５％は約１０００ｋＤａより大きい。
【００３２】
一実施形態では、マンナンは酸化される。
【００３３】
さらなる実施形態では、酸化されたマンナンはポリカチオンを介して少なくとも１つの核酸に抱合される。
【００３４】
さらなる実施形態では、酸化されたマンナンの少なくとも７５％は、少なくとも１つの核酸に抱合される前に少なくとも１５０のアルデヒド基を有する。
【００３５】
別の態様では、本発明は、少なくとも１つの核酸を細胞に送達する方法を提供するが、その方法は上記態様の組成物に細胞を接触させることを含む。
【００３６】
一実施形態では、細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏにある。代わりの実施形態では、細胞はｅｘ  ｖｉｖｏにある。
【００３７】
一実施形態では、核酸は遺伝子療法又は遺伝子ワクチン接種のために細胞に送達される。
【００３８】
提供されるのはまた、遺伝子療法又は遺伝子ワクチン接種のために薬物を製造するための組成物の使用である。
【００３９】
さらに、提供されるのは、遺伝子療法又は遺伝子ワクチン接種のための組成物の使用である。
【００４０】
別の態様では、本発明は、本発明の組成物を調製する方法を提供するが、その方法は、
ｉ）マンナンを含む組成物を得ること、
ｉｉ）サイズに基づいて工程ｉ）の組成物を分画すること、
ｉｉｉ）マンナンを含む１以上の分画を選択し、１以上の分画におけるマンナンの少なくとも７５％が約１０００ｋＤａより大きいこと、及び
ｉｖ）少なくとも１つのその他の化合物と工程ｉｉｉ）の分画を任意で混合することを含む。
【００４１】
一実施形態では、方法はさらに、工程ｉｖ）の前にマンナンを酸化する工程を含む。さらなる実施形態では、酸化されたマンナンの少なくとも７５％が少なくとも１５０のアルデヒド基を有する。
【００４２】
一実施形態では、少なくとも１つのその他の化合物は抗原又はそれをコードする核酸である。
【００４３】
別の態様では、本発明は、本発明のワクチン組成物を調製する方法を提供するが、その方法は、
ｉ）マンナンの少なくとも７５％が１０００ｋＤａより大きいマンナンを含む組成物を得ること、及び
ｉｉ）少なくとも１つの抗原又はそれをコードする核酸と工程ｉ）の組成物を混合し又は抱合し、それによってワクチン組成物を調製することを含む。
【００４４】
一実施形態では、方法はさらに、工程ｉｉ）の前にマンナンを酸化することを含む。さらなる実施形態では、酸化されたマンナンの少なくとも７５％は少なくとも１５０のアルデヒド基を有する。
【００４５】
本発明の組成物、さらに一般的にはマンノースを含む炭水化物ポリマーを含む組成物を製造するのを支援するために、マンノース（たとえば、マンナン）を含む炭水化物ポリマーの出発集団は、バッチ間で一貫し、及び／又は炭水化物ポリマーのより高分子量種を十分に高く提示することが好ましい。
【００４６】
従って、別の態様では、本発明は、マンノース含む炭水化物ポリマーを含む組成物を選択する方法を提供するが、その方法は、
ｉ）マンノースを含む炭水化物ポリマーを含む組成物を得ること、
ｉｉ）工程ｉ）の組成物のサイズ分布とアルデヒド含量を分析すること、及び
ｉｉｉ）所望のサイズ及び／又はアルデヒド含量を含むのであればその組成物を選択することを含む。
【００４７】
一実施形態では、サイズ分布は、
ｉ）組成物の一部を酸化すること、
ｉｉ）工程ｉ）の酸化された生成物をＡＮＴＳで標識すること、及び
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の標識された生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離することによりサイズ分布を分析することによって分析される。
【００４８】
一実施形態では、アルデヒド含量は
ｉ）組成物の一部を酸化すること、
ｉｉ）工程ｉ）の酸化された生成物を３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）と反応させること、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の生成物を還元剤と反応させて２−ピリジンチオンを放出させること、及び
ｉｖ）２−ピリジンチオンの放出を測定することによって分析される。
【００４９】
一実施形態では、還元剤はジチオスレイトール（ＤＴＴ）である。
【００５０】
一実施形態では、２−ピリジンチオンの放出はＯＤ３４３ｎｍの吸光度での分光光度法によって測定する。
【００５１】
一実施形態では、組成物は過ヨウ素酸ナトリウムによって酸化する。
【００５２】
一実施形態では、方法はさらに、工程ｉ）の組成物の純度を決定することを含む。たとえば、純度は、
ｉ）水和硫酸の存在下でレゾルシノール（１，３−ジヒドロキシベンゼン）と組成物を反応させ、
ｉｉ）ＯＤ４３０〜４８０ｎｍにて吸光度を測定し、
ｉｉｉ）標準に対して吸光度を比較することによって
炭水化物ポリマーの糖含量を定量することにより決定することができる。
【００５３】
医薬品についての製造管理及び品質管理に関する基準は、規制認可を得るのに重要な要件である。しかしながら、マンノースを含む炭水化物ポリマーを含む組成物のすべてではないが多くの供給源は、明瞭に且つ一貫して規定するのが難しい高度に不均質な集団を生じる。酵母のような天然の供給源から得られるポリマーが特にそうである。本発明者らが向上した特性を持つマンナンを含む新しい組成物を特定しているだけでなく、本発明はまた、明確に定義された特性を持ち、規制認可過程で受け入れられやすいそのような組成物、さらに一般的にはマンノースを含む炭水化物ポリマーを含む組成物を製造する方法も提供する。
【００５４】
従って、別の態様では、本発明は、マンノースを含む炭水化物ポリマーを含む組成物を調製する方法を提供するが、その方法は、
ｉ）炭水化物ポリマーがアルデヒド基を含む、マンノースを含む炭水化物ポリマーを含む組成物を得ること、
ｉｉ）サイズに基づいて組成物を分画すること、及び
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の所望のサイズ分布を持つ炭水化物ポリマーを含む１以上の分画を選択し、それによって組成物を調製すること、を含む。
【００５５】
或いは、その方法は、
ｉ）マンノースを含む炭水化物ポリマーを含む組成物を得ること、
ｉｉ）サイズに基づいて組成物を分画すること、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）から得られた１以上の分画を酸化すること、及び
ｉｖ）所望のサイズ分布及び／又はアルデヒド含量を持つ炭水化物ポリマーを含む１以上の分画を工程ｉｉｉ）から選択し、それによって組成物を調製すること、を含む。
【００５６】
代わりの方法の一実施形態では、１以上の分画が過ヨウ素酸ナトリウムによって酸化される。
【００５７】
代わりの方法の一実施形態では、工程ｉｉ）の前に、本発明の方法を用いて組成物が選択される。
【００５８】
接線流濾過、サイズ排除クロマトグラフィ及び／又は限外濾過のような、しかし、これらに限定されない好適な方法を用いて、いずれの方法についても工程ｉｉ）を実施することができる。
【００５９】
別の実施形態では、いずれかの方法はさらに、選択に先立って１以上の分画のアルデヒド含量を分析することを含む。一実施形態では、アルデヒド含量は、
ｉ）１以上の分画の一部をＰＤＰＨと反応させること
ｉｉ）工程ｉ）の生成物を還元剤と反応させて２−ピリジンチオンを放出させること、及び
ｉｉｉ）２−ピリジンチオンの放出を測定することによって分析される。
【００６０】
一実施形態では、還元剤はＤＴＴである。
【００６１】
一実施形態では、２−ピリジンチオンの放出は、ＯＤ３４３ｎｍの吸光度にて分光光度法によって測定される。
【００６２】
さらなる実施形態では、いずれかの方法は、選択された１以上の分画のサイズ分布を分析することをさらに含む。たとえば、サイズ分布は、
ｉ）１以上の分画の一部をＡＮＴＳで標識すること、及び
ｉｉ）工程ｉ）の１以上のＡＮＴＳ標識した分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離することによってサイズ分布を分析することにより分析することができる。
【００６３】
一実施形態では、マンノースを含む炭水化物ポリマーはマンナンであり、及び
（ａ）選択された分画におけるマンナンの分子量は約１０００ｋＤａを超え、ＡＮＴＳで標識した後のサイズ分布はタンパク質基準に基づいて約１５０〜約２５０Ｄａの間であり、及び／又は炭水化物基準に基づいて約８００〜約３０００ｋＤａの間であるか；
（ｂ）選択された分画におけるマンナンの分子量は約３００〜約１０００ｋＤａの間であり、ＡＮＴＳで標識した後のサイズ分布はタンパク質基準に基づいて約１５０〜約１７５Ｄａの間であり、及び／又は炭水化物基準に基づいて約４００〜約１０００ｋＤａの間であるか；
（ｃ）選択された分画におけるマンナンの分子量は約１００〜約３００ｋＤａの間であり、ＡＮＴＳで標識した後のサイズ分布はタンパク質基準に基づいて約８０〜約１２５Ｄａの間であり、及び／又は炭水化物基準に基づいて約９０〜約４００ｋＤａの間であるか；
（ｄ）選択された分画におけるマンナンの分子量は約５０〜約１００ｋＤａの間であり、ＡＮＴＳで標識した後のサイズ分布はタンパク質基準に基づいて約６０〜約８０Ｄａの間であり、及び／又は炭水化物基準に基づいて約５０〜約１７５ｋＤａの間であるか；又は
（ｅ）選択された分画におけるマンナンの分子量は約３０〜約５０ｋＤａの間であり、ＡＮＴＳで標識した後のサイズ分布はタンパク質基準に基づいて約５０〜約６０Ｄａの間であり、及び／又は炭水化物基準に基づいて約２０〜約５０ｋＤａの間である。
【００６４】
特に言及されない限り、本明細書の任意の実施形態を利用してその他の任意の実施形態に準用すべきである。
【００６５】
本発明は、例示のみを目的とすることを意図する本明細書で記載される特定の実施形態によって範囲を限定されることはない。機能的に同等である生成物、組成物及び方法は、本明細書で記載されるように明らかに本発明の範囲内にある。
【００６６】
この明細書全体を通して、語句「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」又は「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」のようなその変異体は、言及される要素、整数若しくは工程、又は要素、整数若しくは工程の群を包含することを意味するが、その他の要素、整数若しくは工程又は要素、整数若しくは工程群を排除しないことを意味するように理解される。
【００６７】
以下の非限定の実施例を手段とし、添付の図面を参照して本発明を下文で説明する。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】セントリプレップ濃縮器を用いた分画工程を示す図である。
【図２】酸化されたマンナンにおけるアルデヒド残基を定量する方法を示す模式図である。
【図３】ＡＮＴＳによる酸化マンナンの修飾を示す模式図である。
【図４】酸化マンナンにタンパク質を抱合する模式図である。
【図５】マンナンをイソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）で標識し、ｈｕｈ７ヒト肝癌細胞への種々の濃度での結合をフローサイトメトリーで測定した結果を示す図である。
【図６Ａ】マンナン全体及びマンナンの分画によるＢＭＤＣの成熟を示す図である。共刺激分子、ＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６の上方調節を６時間（図６Ａ）、２４時間（図６Ｂ）、及び４８時間（図６Ｃ）の時点でフローサイトメトリーにより測定した。種々の用量で試料を分析した。
【図６Ｂ】同上。
【図６Ｃ】同上。
【図７Ａ】マンナン全体、＞１０００ｋＤａのマンナン分画及び＞３００ｋＤａのマンナン分画によるＢＭＤＣの成熟を示す図である。共刺激分子、ＣＤ４０（図７Ａ）及びＣＤ８６（図７Ｂ）の上方調節をフローサイトメトリーにより測定した。種々の用量で、４８時間時点にて試料を分析した。
【図７Ｂ】同上。
【図８】マンナン分画における異なったマンノース含量を明らかにするレゾシノールアッセイについての吸光度と濃度の曲線を示す図である。
【図９】未変性ＰＡＧＥゲル上でのＡＮＴＳ標識したマンナン分画の分析を示す図である。
【図１０】ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でのＡＮＴＳ標識したマンナン分画の分析を示す図である。
【図１１Ａ】注釈付きＲｆによるＡＮＴＳ標識したマンナン分画の走査ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。
【図１１Ｂ】同上。
【図１２】クオンティティワンソフトウエアによって生成した標準曲線を示す図である。
【図１３】タンパク質基準に基づいた相対的な分子量を示す図である。
【図１４】炭水化物基準に基づいた相対的な分子量を示す図である。
【図１５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上におけるＭＵＣ１−ＦＰに結合したマンナン全体とマンナンの分画の分析を示す図である。星印は、マンナン全体−ＭＵＣ１−ＦＰの抱合体と同じＭＵＣ１−ＦＰ：マンナンの比率で組み込む抱合体を示す。
【図１６】１０μｇのＭＵＣ１−ＦＰ、ＭＦＰ又は＞１０００ＭＥＰによって０日目。１０日目、１７日目に免疫したマウスの脾細胞におけるＭＵＣ１特異的なＩＦＮ−γの応答を示す図である。
【図１７】１０μｇのＭＵＣ１−ＦＰ、ＭＦＰ又は＞１０００ＭＥＰによって０日目。１０日目、１７日目に免疫したマウスにおける抗ＭＵＣ１血清の総ＩｇＧ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａを示す図である。
【図１８】供給元からのマンナンの規格を示す。
【図１９Ａ】レゾシノールアッセイを用いたマンナンのバッチの分析を示す図である。
【図１９Ｂ】レゾシノールアッセイを用いて得られたマンノースの標準曲線を示す図である。
【図２０】過ヨウ素酸酸化の後にアルデヒド残基を定量することによるシグマ社のマンナンの種々のバッチの比較を示す図である。
【図２１】ＡＮＴＳと反応したマンナンの種々のバッチの蛍光と濃度の曲線を示す図である。
【図２２】＞１０００ｋＤａの酸化されたマンナンへのＦＰの抱合を示す図である。分子量標準、ＦＰ及び＞１０００ＭＥＰをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％）上で流し、クマシーブルーで染色した。
【図２３】ＭＵＣ１特異的なＴ細胞応答のリコールを示す図である。同種ＤＣ（ＢＣ１６）を１０μｇ／ｍｌ及び２０μｇ／ｍｌの＞１０００ＭＥＰ又はＦＰで感作し、ＭＵＣ１特異的Ｔ細胞株にてＣＤ８（Ａ）及びＣＤ４（Ｂ）細胞内ＩＦＮγ応答をリコールするのに使用した。
【図２４】＞１０００ｋＤａの酸化マンナンに対するｐＴｒｃ（ＭＵＣｌ−ＶＮＴＲ）の抱合を示す図である。分子量標準、ｐＴｒｃ及び＞１０００ｋＤａｐＴｒｃをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％）上で流し、クマシーブルーで染色した。
【図２５】ＭＵＣ１特異的なＴ細胞応答のリコールを示す図である。同種ＤＣ（ＢＣ１７Ａ）を２０μｇ／ｍｌ及び４０μｇ／ｍｌの＞１０００ｋＤａｐＴｒｃ又はｐＴｒｃで感作し、ドナーＢＣ１３に由来のｐＴｒｃ（ＭＵＣ１）特異的Ｔ細胞株にてＣＤ８細胞内ＩＦＮγ応答をリコールするのに使用した。
【図２６】ＭＵＣ１特異的なＴ細胞応答のリコールを示す図である。自己ＤＣを２０μｇ／ｍｌの＞１０００ｋＤａ酸化マンナン−ｐＴｒｃ又はｐＴｒｃで感作し、ドナーＢＣ１７Ｋ由来のＭＦＰ特異的Ｔ細胞株にてＣＤ８細胞内ＩＦＮγ応答をリコールするのに使用した。
【図２７】１０００ｋＤａ酸化マンナンへのＭＡＲＴ−１の抱合を示す図である。分子量標準、ＭＡＲＴ−１、＞１０００マンナン−ＭＡＲＴ−１をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％）上で流し、クマシーブルーで染色した。
【図２８】ＭＡＲＴ−１特異的な応答の刺激（１刺激）を示す図である。ドナーＢＣ２８由来のＰＢＭＣを実施例１に記載するようにＭＡＲＴ−１タンパク質又はＭＡＲＴ−１−１０００ｋＤａ酸化マンナン抱合体で刺激した。ＭＡＲＴ−１類似体及び類似体ペプチドで感作したＴ２細胞によるＭＡＲＴ−１特異的なＣＤ８細胞内ＩＦＮγ応答のリコールを示す。
【図２９】ＭＡＲＴ−１特異的な応答の刺激（２刺激）を示す図である。ドナーＢＣ２８及びＢＣ２９由来のＰＢＭＣを実施例１に記載するようにＭＡＲＴ−１タンパク質又はＭＡＲＴ−１−１０００ｋＤａ酸化マンナン抱合体で刺激した。ＭＡＲＴ−１タンパク質又は１０００ｋＤａ酸化マンナン抱合体によるＭＡＲＴ−１特異的なＣＤ８細胞内ＩＦＮγ応答のリコールを示す。
【図３０】Ｈ１Ｎ１及びＨ１Ｎ１＋＞１０００ｋＤａマンナンの混合物に対するＨ１Ｎ１特異的抗体の応答を示す図である。０日目又は１４日目に１μｇのＨ１Ｎ１を単独で又は＞１０００ｋＤａマンナンと混合してマウスに鼻内で免疫した。最終免疫の１０日後、血清試料と肺洗浄試料を回収し、ＥＬＩＳＡアッセイによって抗Ｈ１Ｎ１−ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＡの活性を調べた。
【００６９】
配列表への鍵
配列番号１：メラン／ＭＡＲＴ−１（天然）に特異的なＨＬＡ−Ａ２エピトープペプチド
配列番号２：メラン／ＭＡＲＴ−１（類似体）に特異的なＨＬＡ−Ａ２エピトープペプチド
【発明を実施するための形態】
【００７０】
一般的な技法及び定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語はすべて当業者（たとえば、細胞培養、分子遺伝学、ワクチン技術、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、及び生化学）によって一般に理解されるものと同じ意味を有するように解釈されるべきである。
【００７１】
示されない限り、本発明で利用される組換えタンパク質、細胞培養及び免疫技法は当業者に周知の標準の手順である。そのような技法は、たとえば、J. Perbal, 分子クローニングへの実際的なガイド（A Practical Guide to Molecular Cloning）, John Wiley and Sons (1984), Maniatis et al, 分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1982), J. Sambrook et al, 分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (編者), 本質的分子生物学：実際的アプローチ（Essential Molecular Biology: A Practical Approach）, 第１巻及び２巻, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (編者), ＤＮＡクローニング：実際的アプローチ（DNA Cloning: A Practical Approach）, １〜４巻, IRL Press (1995 and 1996), F.M. Ausubel et al, 編者), 分子生物学における現在のプロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, 現在までの更新をすべて含む), E. Harlow and D. Lane (編者), 抗体：実験室マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）, Cold Spring Harbour Laboratory (1988), and J.E. Coligan et al. (編者), 免疫学おける現在のプロトコール（Current Protocols in Immunology）, John Wiley & Sons (1991, 現在までの更新をすべて含む)のような供給源における文献全体にわたって説明され、記載されている。
【００７２】
本明細書で使用されるとき、「約」又は「およそ」は、所与の値又は範囲の一般に２０％以内、さらに好ましくは１０％以内、一層さらに好ましくは５％以内を意味するべきである。
【００７３】
用語「及び／又は」、たとえば、「Ｘ及び／又はＹ」は「Ｘ及びＹ」又は「Ｘ若しくはＹ」のいずれかを意味するように理解されるべきであり、双方の意味又はいずれかの意味に対する明確な支持を提供するように解釈されるべきである。
【００７４】
「対象」は、本発明の組成物を投与した際、免疫応答が誘導される及び／又は高められる任意の生物であり得る。好まれる実施形態では、対象は動物であり、さらに好ましくは哺乳類又は鳥類である。特に好まれる実施形態では、対象はヒトである。その他の好まれる実施形態には、ネコ及びイヌのようなペット／愛玩動物、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ及びヤギのような家畜、家禽又は野生動物が挙げられる。
【００７５】
マンナン及びマンノースを含むその他の炭水化物ポリマー
驚くべきことに、本発明者らは高分子量マンナン（すなわち、約１０００ｋＤａを超える）がさらに小さいマンナン又はその混合物よりも高い免疫刺激活性を有することを見い出した。従って本発明の組成物はマンナンを含み、その際、組成物中のマンナンの少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９７％、さらに好ましくは少なくとも９９％、一層さらに好ましくはすべてが約１０００ｋＤａより大きい。
【００７６】
驚くべきことに、本発明者らはまた、少なくとも１５０のアルデヒド基を有する酸化されたマンナンが１５０未満のアルデヒド基を含む酸化されたマンナン又はその混合物よりも高い免疫刺激活性を有することを見い出した。従って本発明の組成物はマンナンを含み、その際、組成物中のマンナンの少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９７％、さらに好ましくは少なくとも９９％、一層さらに好ましくはすべてがそれぞれ少なくとも１５０のアルデヒド基を有する。
【００７７】
本明細書で使用されるとき、「マンナン」は、専らマンノースで形成される直鎖又は分枝鎖の多糖類を指し、修飾された、たとえば、アセチル化マンノース（アセマンナン）、又はマンノース主鎖を有するが、非マンノース側鎖を有する置換されたマンナン（たとえば、ガラクトース側鎖を持つマンノース主鎖から成るガラクトマンナン）を指さない。
【００７８】
本発明の組成物で有用なマンナンは、たとえば、真菌、さらに好ましくは酵母に見い出される。出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）（パン屋のイースト）に由来する分枝鎖マンナンは、Ｄ−マンノピラノシル、α−Ｄ−マンノピラノシル−α−（ｌ→２）−α−Ｄ−マンノピラノシル及びα−Ｄ−マンノピラノシルα−（１→３）−α−Ｄ−マンノピラノシル−α−（ｌ→２）−α−Ｄ−マンノピラノシルの側鎖によってＯ−２原子で置換されたα−（ｌ→６）結合マンノピラノシル主鎖構造から成る。加えて、出芽酵母マンナンはまたリン酸化することもできる（Barreto-Bergter and Gorin, 1983; Vinogradov et al, 1998）。
【００７９】
マンナンは好ましくは、真菌、さらに好ましくは酵母の細胞壁から単離される。一実施形態では、マンナンは高分子量のマンナン、好ましくは１０００ｋＤａを超えるマンナンを優先的に発現するように操作されている遺伝子操作した酵母から単離され得る。
【００８０】
アルデヒド基を含むマンナンはたとえば、酵母から得られたマンナンを酸化することによって製造することができる。炭水化物ポリマーにアルデヒド基を導入する最も一般的な方法は、近隣ジオールの過ヨウ素酸が介在する（ＮａＩＯ４）酸化によるものである（図２の模式図を参照）。酸化のその他の方法については、一般に、M. L. Wolfrom (編者), 炭水化物の過ヨウ素酸酸化、炭水化物化学の進歩（Periodate oxidation of carbohydrates, Advances in Carbohydrate Chemistry）、第１１巻、１〜４０ページ（１９５６年）を参照のこと。
【００８１】
好まれる実施形態では、ＮａＩＯ４を用いてマンナンを酸化し、ポリアルデヒドを生じ、次いでそれを少なくとも１つの抗原又はそれをコードする核酸に抱合する。
【００８２】
一実施形態では、高分子量マンナン（すなわち、約１０００ｋＤａを超える）は、たとえば、出芽酵母のような酵母からの全マンナン抽出物のサイズ分画によって得られる。この例では、全マンナンは、培養細胞又は噴霧乾燥細胞の熱湯抽出及び溶媒抽出法を含む当該技術で既知の方法によって出芽酵母から導かれ得る。出芽酵母に由来するマンナンは、たとえば、シグマ（ミズーリ州、セントルイス）のような供給業者から入手し、一実施形態では、その後分画して高分子量マンナン組成物を得てもよい。
【００８３】
一実施形態では、高分子量マンナン組成物は、リボース、核酸、リボ核酸、タンパク質及び／又は炭水化物を実質的に含まない。
【００８４】
本発明の方法は、本発明の組成物、さらに好ましくはマンノースを含む炭水化物ポリマーを含む組成物の調製に関する。
【００８５】
本明細書で使用されるとき、「マンノースを含む炭水化物ポリマー」は、マンノースサブユニット（すなわち、マンノースモノマー単位）又はその変異体を含む、さらに好ましくはそれから成る多重サブユニット化合物である。例にはマンナン、ガラクトマンナン及びアセマンナンが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、炭水化物ポリマーはアルデヒド基を含む。好まれる実施形態では、炭水化物ポリマーは酸化されてポリアルデヒドを生じる。
【００８６】
マンノースを含む炭水化物ポリマーの調製
炭水化物及び糖類の分離方法は当該技術で周知である（一般にZ. El Rassi (編者), Carbohydrate analysis by modern chromatography and electrophoresis, Journal of Chromatography, volume 66, Elsevier Science (2002)を参照のこと）。
【００８７】
サイズ分画
一実施形態では、マンノースを含む炭水化物ポリマーを含む組成物、さらに好ましくはマンナンを含む組成物のサイズ分画は、クロスフロー濾過（ＣＦＦ）とも呼ばれる接線流濾過（ＴＦＦ）によって行われる。ＴＦＦは、生成物の流れ（供給液）が膜の表面に沿って接線方向に向かい、循環する溶液の大半が供給液タンクに戻る方法である。膜を横切る供給液の速い流れは表面を「掃く」働きをし、濃度分極（膜表面での生成物の濃縮）を低下させる。それはまた膜表面の孔を閉塞させ得る汚れの堆積を防ぐ。速い循環流量は圧力損失を発生し、その力によって膜の孔より小さい供給液や溶解分子の一部は膜フィルターを通過する。膜を通過した溶液は濾液又は通過液と呼ばれる。膜の孔より大きい分子又は粒子は供給液に保持され、効果的に濃縮される。
【００８８】
膜濾過は「精密濾過」法又は「限外濾過」法のいずれかに分類することができる。通常０．１ミクロン〜１ミクロンの間の孔サイズを持つ精密濾過膜は一般に浄化、滅菌、微粒子の除去又は細胞の回収に用いられる。０．００１〜０．１ミクロンの間のはるかに小さい孔サイズを持つ限外濾過膜は溶解した分子（タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物及びその他の生体分子）を濃縮すること及び脱塩すること、緩衝液を交換すること、分画及び水の精製に使用される。限外濾過膜は通常、孔サイズではなく、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）によって分類される。
【００８９】
別の実施形態では、マンノースを含む炭水化物ポリマーを含む組成物のサイズ分画はサイズ排除クロマトグラフィによって行われる。
【００９０】
サイズ排除クロマトグラフィの基本原理は当業者に周知であり、「ゲル濾過：原理と方法」ＧＥヘルスケアで説明されている。特定の範囲を分画する適当なカラム、たとえば、セファクリルＳ−１００ＨＲ、セファクリルＳ−２００ＨＲ、セファクリルＳ−３００ＨＲ、セファクリルＳ−４００ＨＲ及びセファクリルＳ−５００ＨＲ又はそれらの同等物を容易に選択し、効果的に使用して上記分画を分離することができる。類似の方法で、セファロース媒体、たとえば、セファロース６Ｂ、４Ｂ、２Ｂ又はその同等物を用いればよい。一実施形態では、セファクリルＳ４００ＨＲを用いてマンノースを含む炭水化物ポリマーを含む組成物を分画する。
【００９１】
さらに別の実施形態では、マンノースを含む炭水化物ポリマーを含む組成物のサイズ分画は限外濾過によって行われる。
【００９２】
試料の限外濾過は、適当な分子量カットオフを持つ分子膜を用いて実施すればよい。分画を達成するのに使用される特定の膜及び手順は当業者に広く利用可能である。
【００９３】
当業者はまた、マンノースを含む炭水化物ポリマーを含む組成物のサイズ分画が密度勾配遠心によって実施されてもよいことを十分に理解するであろう。
【００９４】
好まれる実施形態では、たとえば、リボース、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む核酸、タンパク質及び／又はマンノースを含まない炭水化物のような混入物を取り除くために分画の前に試料が少なくとも部分的に精製される。精製は、アフィニティクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ及び疎水性相互作用クロマトグラフィを含むその他のクロマトグラフィ法を組み合わせて達成されればよい。組成物の純度は以下で記載するようにマンノース含量を測定することによって決定されればよい。
【００９５】
非炭水化物成分の除去方法の１つは、消化酵素を用いて非炭水化物成分を切断した後、サイズ分画を行って切断生成物を取り除くことである。プロナーゼ、リボヌクレアーゼ、ＮＤＡ分解酵素及びプロテアーゼを含む消化酵素は、当該技術で周知であり、教科書に記載されており、その１つは、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）上記である。タンパク質の消化に有用なプロテアーゼには、エンドペプチダーゼ及びエクソペプチダーゼ、プロナーゼ、たとえば、トリプシン、キモトリプシン及びサブチリシンのようなセリンプロテアーゼ、パパインのようなチオールプロテーゼ、及びサーモリシンのようなカルシウム要求プロテアーゼが挙げられる。
【００９６】
或いは、非炭水化物成分は、アフィニティクロマトグラフィによって、たとえば、ＤＮＡ−又はＲＮＡ−結合のマトリクスの使用によって取り除かれ得る（Maniatis et al, 1982,上記）。別の選択肢は、レクチンのような多糖類結合マトリクスの使用によって混入成分から炭水化物ポリマーを引き離して精製することである。
【００９７】
本発明の方法によれば、選択した分画におけるマンノースを含む炭水化物ポリマーのサイズ分布、アルデヒド含量及びマンノース含量を決定することができる。この検証はヒトでの使用についての規制認可を得るのに重要であり得る。
【００９８】
サイズ分布
分画に先立って及び／又は分画後、試料のサイズ分布を決定することができる。分画に先立って実施する場合、この分析は分画のために炭水化物ポリマーの出発組成物を選択することが目的である。たとえば、出発組成物におけるポリマーの分子量種の大半が１０００ｋＤａを下回るのであれば、その組成物を捨て、炭水化物ポリマーの高分子量種のさらに高い分布を有する別のバッチを分画のために選択することができる。対照的に、回収した分画のサイズ分布の分析は分画法を確認する又は検証するように働く。このことは、これら炭水化物ポリマーをヒトで使用するための規制認可を得る場合、重要であろう。
【００９９】
組成物の炭水化物ポリマーのサイズ分布は、酸化された試料をＡＮＴＳ（図３の模式図を参照）と反応させ、ＡＮＴＳ標識した試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離することによって決定され得る。タンパク質及び／又は炭水化物の基準に対して分離したＡＮＴＳ標識試料を比較することによって前記試料のサイズ分布を決定するのが可能になる。
【０１００】
本明細書で使用されるとき、「タンパク質及び／又は炭水化物の基準」は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける分子量標準として使用される種々の分子量の既知のタンパク質又は炭水化物の組成物を指す。組成物は、同一ゲルの近隣レーンにて電気泳動される試料の分子量を推定するためのマーカーとして役立つ明瞭な上手く分離したバンドを生じるように設計される。基準は予備染色されてもよいし（電気泳動中に分子量範囲を容易に視覚化できるように）、しなくてもよい。種々の基準が電気泳動応用のために利用可能であり、たとえば、シグマ又はバイオラドから購入することができる。通常、基準は使用準備済み形式で供給され、負荷色素を還元し、予備混合し、又は加える必要性を排除する。これらの基準は、ロット間で一貫し、適当なゲル上で厳密に品質管理されて一貫したバンドの易動度と強度を保証する。
【０１０１】
アルデヒド含量
試料のアルデヒド含量も分画前及び／又は分画後に決定し、バッチ選択及び／又は分画の検証を目的としてもよい。
【０１０２】
一実施形態では、試料のアルデヒド含量は、ＮａＩＯ４による酸化の後、試料中のアルデヒド残基の数を定量することによって決定される。たとえば、マンナンを含む組成物は、マンナンがそれぞれおよそ９０〜２００のアルデヒド残基を含む分画について選択され得る。
【０１０３】
方法には、たとえば、暗所氷上において０．０１ＭのＮａＩＯ４を伴った０．１Ｍのリン酸緩衝液ｐＨ６．０の１００μｌにて１．４ｍｇの試料を１時間反応させることによって試料を先ず酸化することが含まれる。次いで１０μｌのエタンジオールで反応の進行を止め、さらに１／２時間反応させた後、０．１Ｍの酢酸緩衝液ｐＨ４．８で予備平衡化したＰＤ１０カラムに負荷し、過剰のＮａＩＯ４を取り除く。
【０１０４】
その後、ＰＤＰＨと反応させた際のピリジン−２−チオンの放出を測定することによって分光光度法によりアルデヒド基の数を測定することができる。
【０１０５】
当業者によって理解されるように、アルデヒドの定量には幾つかのその他の方法が使用され得る。たとえば、オキシム、ヒドラジド、セミカルバジド及びカルボヒドラジドは容易にアルデヒドと反応し、炭水化物ポリマーにおけるアルデヒド基の定量のためのレポーター分子（たとえば、蛍光化合物）に結合することができる。使用することができる蛍光化合物の選択は、ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−Ｐｒｏｂｅｓ−Ｔｈｅ−Ｈａｎｄｂｏｏｋ／Ｒｅａｇｅｎｔｓ−ｆｏｒ−Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ−Ｇｒｏｕｐｓ−Ｏｔｈｅｒ−Ｔｈａｎ−Ｔｈｉｏｌｓ−ｏｒ−Ａｍｉｎｅｓ／Ｈｙｄｒａｚｉｎｅｓ−Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅｓ−ａｎｄ−Ａｒｏｍａｔｉｃ−Ａｍｉｎｅｓ−ｆｏｒ−Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ−Ａｌｄｅｈｙｄｅｓ−ａｎｄ−Ｋｅｔｏｎｅｓ．ｈｔｍｌに詳述されている。例には、フルオレセイン−５−チオセミカルバジド、アレクサフルオル４８８、アレクサフルオル５５５、アレクサフルオル５６８、アレクサフルオル５９４、アレクサフルオル６３３、アレクサフルオル６４７及びテキサスレッドが挙げられる。
【０１０６】
加えて、２，４−ジニトロフェニルヒドラジンはアルデヒドと反応して赤いヒドラゾンを形成し、それを用いて吸光度分光光度法により炭水化物ポリマー中のアルデヒド基の数を定量することができる（Apostolopoulos et al, 2000）。
【０１０７】
マンノース含量
一実施形態では、組成物のマンノース含量は、天然の糖類についての比色アッセイによって決定され、その際、天然の糖類は水和硫酸溶液の存在下でレゾシノールと反応する。
【０１０８】
たとえば、２００μｌの体積にて５〜１００ナノモルの天然の糖類を有する試料（０．０１Ｍ酢酸に溶解した）を含有するアッセイ管に６ｍｇ／ｍｌのレゾシノール２００μｌと７５％硫酸１ｍｌを加える。次いで溶液をボルテックスで攪拌し、温度調節槽にて９０℃で３０分間加熱し、続いて暗所で３０分間、冷水槽に入れる。次いで４３０又は４８０ｎｍにて混合物の光学密度を測定する。同様の結果を持つ上記で示した半分の体積を用いて同じアッセイを実施することができる。
【０１０９】
或いは、マイクロプレート形式でアッセイを行うことができる。この実施形態では、２０μｌの体積にて１〜１００ナノモルの中性糖を有する試料（０．０１Ｍの酢酸に溶解した）を含有する９６穴マイクロタイタープレートのＵ字形ウェルに６ｍｇ／ｍｌのレゾシノールを２０μｌと７５％硫酸を１００μｌとプリスチンを５０μｌ加える。次いでボルテックス装置にてプレートを振盪しながら溶液を混合し、インキュベータにて９０℃で３０分間加熱し、その後暗所にて室温で３０分間保持する。マイクロタイタープレートリーダーを用いて４３０又は４８０ｎｍにて混合物の光学密度を測定する。定量目的では、ブランク、中性糖基準及び試料を２つ組、さらに好ましくは３つ組、さらに好ましくは４つ組でアッセイする。
【０１１０】
マンノース含量は、炭水化物ポリマーの酵素加水分解又は酸加水分解、その後のＨＰＬＣ、質量分光分析、キャピラリー電気泳動、又は薄層クロマトグラフィによって決定することもできる（Wang et al, 2007; Anumula, 1994; R. Townsend, Chromatography in Biotechnology, C. Horvath and L.S. Ettre 30 (editors), American Chemical Society, Washington, D.C. (1993) pp. 86-101）。
【０１１１】
免疫刺激組成物及びワクチン組成物
本明細書で使用されるとき、用語「免疫刺激組成物」は免疫応答を誘導する及び／又は高める組成物の能力を指す。
【０１１２】
用語「免疫応答」は、当該技術におけるその普通の意味を有し、液性免疫及び細胞性免疫の双方を含む。免疫応答は、抗抗原抗体の発生、抗原特異的Ｔ細胞の増殖、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の増加、抗腫瘍又は抗腫瘍抗原遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応の発生、病原体のクリアランス、病原体及び／又は腫瘍の増殖及び／又は広がりの抑制、腫瘍の退縮、転移の低下又は消失、再発までの時間の延長、病原体又は腫瘍のない生活の時間の延長、及び生存時間の延長の１以上として現れ得る。免疫応答には、Ｂ細胞の活性化、Ｔ細胞の活性化、ナチュラルキラー細胞の活性化、抗原提示細胞（たとえば、Ｂ細胞、ＤＣ、単球及び／又はマクロファージ）の活性化、サイトカインの産生、ケモカインの産生、特異的表面マーカーの発現、特に共刺激分子の発現の１以上が介在し得る。免疫応答は液性応答、細胞性応答、Ｔｈ１応答又はＴｈ２応答、又はこれらの組み合わせを特徴とし得る。
【０１１３】
液性応答
一実施形態では、組成物又はワクチンの投与によって液性免疫を生じ、その際、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ及び任意でＩｇＥ抗体の１以上の産生が刺激される。
【０１１４】
免疫グロブリンには、たとえば、ＩｇＧ２ａやＩｇＧ１のような、各抗体のクラス内で１以上のサブクラスが含まれる。
【０１１５】
一実施形態では、ＩｇＧ１及び／又はＩｇＡの産生が刺激される。
【０１１６】
幾つかの例では、ＩｇＥ産生の刺激は、たとえば、寄生虫感染に対して免疫するのに有益である。
【０１１７】
その他の例では、ＩｇＥの総産生の低下又はその他の抗体クラスに比べたＩｇＥレベルの低下は、たとえば、花粉症、喘息発作、食物及びその他のアレルギーのような１型過敏症又はアトピーを防ぐ又は軽減するのに有益であり得る。その受容体へのＩｇＥの結合とそれに続くアレルゲンとの架橋は、たとえば、アトピー性喘息を含む喘息、アレルギー性鼻炎及びアトピー性皮膚炎のような状態の根底にある免疫応答を誘発することに関与する。従って、一実施形態では、免疫応答はＩｇＥ産生を減らすようにする。
【０１１８】
別の実施形態では、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ又はこれらのサブクラスの１以上に比べたＩｇＥの力価を低下させる。組成物による免疫の際、その他の抗体の１以上の産生が高められる一方で、ＩｇＥの産生が不変であってもよい。
【０１１９】
一実施形態では、免疫はＩｇＥよりもＩｇＡ、ＩｇＧ及びＩｇＭの１以上の産生を選択的に刺激する。
【０１２０】
一実施形態では、ＩｇＡ産生が刺激され、１以上の粘膜領域及び／又は血清にてＩｇＡの力価が上昇する。
【０１２１】
一実施形態では、免疫の際のＩｇＡ産生が、ＩｇＧ、ＩＧＭ及びＩｇＥの産生に比べて大きい。
【０１２２】
別の実施形態では、免疫は、ＩｇＧ１及び／又はＩｇＧ２ａの産生における増加に比べてＩｇＡの大きな産生を生じる。
【０１２３】
さらに別の実施形態では、ＩｇＧ産生が刺激され、１以上の全身性領域及び／又は血清にてＩｇＧの力価が上昇する。
【０１２４】
一実施形態では、免疫の際のＩｇＧ産生が、ＩｇＡ、ＩＧＭ及びＩｇＥの産生に比べて大きい。
【０１２５】
別の実施形態では、免疫はＩｇＡの増加に比べてＩｇＧのさらに大きな産生を生じる。
【０１２６】
一実施形態では、免疫はＩｇＧ１の増加に比べてＩｇＧ２ａのさらに大きな産生を生じる。
【０１２７】
細胞性の免疫応答
一実施形態では、本発明の組成物又はワクチンの投与は細胞性応答を生じ、その際、１以上の抗原提示細胞が活性化される。
【０１２８】
一実施形態では、マクロファージ及び／又はＤＣが活性化される。
【０１２９】
ＤＣの活性化は、たとえば、ＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６を含む共刺激分子の表面発現の上昇、及び／又はたとえば、ＩＬ−２及び／又はＩＬ−４のような炎症誘発性サイトカインの増加、及び／又はＭＨＣクラスＩ及び／又はクラスＩＩの分子の増加を生じ得る。
【０１３０】
さらなる実施形態では、免疫はＣＤ８Ｔ細胞及び／又はＣＤ４Ｔ細胞の応答を生じる。
【０１３１】
さらなる実施形態では、免疫は細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の応答の産生を生じる。
【０１３２】
一実施形態では、ＤＣは未処理のＴ細胞を活性化する。樹状細胞はワクチン抗原に対して免疫系を刺激することにおいて少なくとも３つの異なった役割を担うと考えられる：
（１）そのエンドサイトーシスに続く外因性経路にて処理されたワクチン抗原のＭＨＣクラスＩＩ拘束性の提示；
（２）たとえば、抗原をコードするプラスミドＤＮＡによるＤＣへの直接形質移入の後のワクチン抗原のＭＨＣクラスＩ及び／又はクラスＩＩ拘束性の提示；
（３）ワクチン抗原のＭＨＣクラスＩ拘束性の「交差」提示。
【０１３３】
Ｔｈ１／Ｔｈ２
一実施形態では、本発明の組成物又はワクチンの投与は液性免疫及び／又は細胞性免疫のメディエータを刺激する。
【０１３４】
一実施形態では、本発明の組成物又はワクチンの投与は細胞が介在するＴｈ１型の応答を生じる。
【０１３５】
別の実施形態では、本発明の組成物又はワクチンの投与は抗体が介在するＴｈ２型の応答を生じる。
【０１３６】
一実施形態では、本発明の組成物又はワクチンの投与は、たとえば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、Ｉｌ−１８及びＩＦＮ−γのようなＴｈ１が誘導するサイトカインの産生を生じる。これらのサイトカインは通常、細胞介在性の免疫を促進する。
【０１３７】
別の実施形態では、本発明の組成物又はワクチンの投与は、たとえば、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１０のようなＴｈ２が誘導するサイトカインの産生を生じる。これらのサイトカインは通常、液性免疫を促進する。
【０１３８】
一実施形態では、マクロファージの活性化は、ＩＬ−１２及び／又はＩＬ−１８の産生を生じる。これは言い換えれば、ＮＫ細胞によるＩＦＮ−γδの産生を活性化し、それは、細胞介在性の免疫及び／又は補体結合性の抗体の産生を支えるＴｈ１介在性の免疫応答への分化を含む。
【０１３９】
ワクチン
用語「ワクチン組成物」はレシピエント対象にて防御免疫を引き出すのに使用することができる組成物を指す。一部の個体は強固な又は防御的な免疫応答を備えることができず、場合によってはワクチンに対する免疫応答を備えることができないので、有効であるためには、本発明のワクチンは集団の一部で免疫を引き出すことができることが言及されるべきである。この不能性は、個体の遺伝的背景が原因で生じ、又は免疫不全の状態（後天性又は先天性のいずれか）又は免疫抑制（たとえば、臓器拒絶を防ぐ又は自己免疫状態を抑えるための免疫抑制剤による治療）のために生じる。有効性は動物モデルで確立することができる。
【０１４０】
ワクチンは「一価」（単価とも呼ばれる）又は「多重価」（多価とも呼ばれる）であってもよい。一価のワクチンは単一の抗原を含む。多重価又は多価のワクチンは、たとえば、同一病原体の２以上の株に対して、又は２以上の病原体に対して免疫し得る２以上の抗原を含む。
【０１４１】
組成物又はワクチンを用いて、たとえば、病原体又は腫瘍に対して対象を免疫し、寛容化し、治療し、又は予防することができる。
【０１４２】
用語「免疫する」は、対象にて防御免疫を生成し、特定の病原体又は疾患に対する抵抗性を対象に提供することを意味するように本明細書で使用される。
【０１４３】
用語「寛容化する」は、対象にて免疫寛容を誘導することを意味するように本明細書で使用される。対象を寛容化することは、対象にて特定の免疫応答の回避又は抑制を誘導することである。免疫寛容を用いてたとえば、移植片拒絶、自己免疫又はアレルギー反応を防ぐ又は改善することができる。
【０１４４】
用語「治療する」は、好ましくは非感染細胞の最小限の破壊効果を伴って対象の中で病原体感染細胞又は腫瘍細胞を部分的に又は全体的に破壊することを意味するように本明細書で使用される。本発明の組成物の治療的投与は病原体に感染した又は腫瘍を有するレシピエント対象を治療することができる。代わりの実施形態では、たとえば、マクロファージ及びＤＣのような抗原提示細胞を本発明の組成物とｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで接触させ、次いで対象に投与する。当業者が気付いているように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される手順は生体ではなく制御された環境で実施される。そのようなｉｎ  ｖｉｔｒｏの手順は生物に由来する組織又は細胞で実施してもよく、通常ｅｘ  ｖｉｖｏの手順と呼ばれる。
【０１４５】
用語「防ぐ」は、病原体による感染若しくは腫瘍増殖の浸潤（すなわち、癌の発症を防ぐ）を防ぐ又は腫瘍増殖の発生を遅らせることを意味するように本明細書で使用される。本発明の組成物の予防的投与は前記感染又は腫瘍増殖からレシピエント対象を保護することができる。
【０１４６】
抗原
本発明は、ワクチン組成物における少なくとも１つの抗原と組み合わせたマンナンの使用を提供する。マンナンを少なくとも１つの抗原と混合する又は抱合してワクチン接種後の防御的な免疫応答を生成することができる。
【０１４７】
「少なくとも１つの抗原」によって１以上の抗原の型又は抗原決定基を意味する。さらに、１を超える抗原分子をマンナンポリマーに抱合させることができる（すなわち、抱合体はマンナンポリマーに抱合される１を超える抗原分子を含んでもよく、１以上の抗原型又は抗原決定基を含んでもよい）ことが当業者によって十分に理解されるであろう。
【０１４８】
疾患を有する、又は疾患に感受性である、又は疾患のリスクにある対象にワクチンを投与することができる。疾患は病原体の感染に関係し得る。この実施形態では、ワクチン投与は病原体による感染の影響を防ぎ得る又は改善し得る。
【０１４９】
本明細書で使用されるとき、「抗原」は特異的な免疫応答を誘導する能力を有する物質を指す。抗原は、そのライフサイクルの任意の段階での生物全体、不活化された生物全体、生物全体から単離された断片若しくは成分、生物の溶解物又は腫瘍溶解物、当該技術で既知の方法を介して遺伝的に又は合成で操作した特定の抗原であってもよい。加えて、選択された抗原は成熟した生物全体又は種虫（卵母細胞）のいずれか又は双方に由来し得る。
【０１５０】
本発明の組成物及び方法で使用するための抗原はまた、細胞全体又はその細胞より小さい分画から成ることができる。そのような細胞又はその細胞より小さい分画は、たとえば、腫瘍又は感染組織に由来し得る。
【０１５１】
好まれる選択された抗原には、たとえば、
花粉；
アレルゲン、特に喘息を誘発するもの；
たとえば、インフルエンザウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、パピローマウイルス、サイトメガロウイルス、単純性ヘルペスウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＴＬＶ−１及びＨＴＬＶ−２のようなウイルス；
たとえば、炭疽病、ハンセン病、結核、ジフテリア、ライム病、梅毒、腸チフス、及び淋病の病因因子のような細菌；
たとえば、Ｂａｂｅｏｓｉｓ  ｂｏｖｉｓ、プラスモジウム、レイシュマニアｓｐｐ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ及びＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉのような原虫；
たとえば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ及びＨｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍのような真菌；
たとえば、寄生蠕虫のような寄生虫、並びに
ムチン−１（ＭＵＣ−１）、癌胎児性抗原、前立腺特異的膜抗原、前立腺特異抗原、タンパク質ＭＺ２−Ｅ、多型性上皮ムチン（ＰＥＭ）、葉酸結合タンパク質ＬＫ２６、切断型表皮増殖因子受容体（ＥＧＲＦ）、Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ（Ｔ）抗原、テロメラーゼ、サーバイビン、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ＷＴ１、ＬＭＰ２、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６、Ｅ７，ヒト上皮増殖因子受容体（ＨＥＲ−２／ｎｅｕ）、メラノーマ関連抗原３（ＭＡＧＥ−３）、ｐ５３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、前立腺酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）、癌精巣抗原、５Ｔ４及びＧＭ２及びＧＤ−２ガングリオシドのような腫瘍抗原に由来する抗原が挙げられる。
【０１５２】
抗原は、タンパク質、ペプチド、多糖類又はオリゴ糖類（遊離の又はタンパク質キャリアに結合した）又はそれらの混合物であることができる。タンパク質及びペプチドは、抽出物若しくは溶解物の一部であり得るし、天然の供給源から精製され得るし、固相合成によって合成され得るし、又は組み換え遺伝学によって得られ得る。多糖類及びオリゴ糖類は、天然の供給源から単離され得るし、又は酵素法及び／又は有機合成法を用いて合成され得る。
【０１５３】
組換え宿主における融合タンパク質の製造の際の発現と精製を円滑にするために抗原は融合タンパク質の一部を形成してもよい。融合タンパク質の非抗原部分は一般に融合ポリペプチドのＮ末端領域を表し、カルボキシ末端配列が抗原配列を含む。融合タンパク質は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はその他のタンパク質若しくはその一部、特に得られる融合タンパク質を精製するタンパク質の結合特性又は親和特性を利用したアフィニティ精製を可能にするものから選択されてもよい。タンパク質はまた、キャリアタンパク質のＣ末端又はＮ末端に融合され得る。融合タンパク質の性質は融合タンパク質が産生されるベクター系に左右される。細菌の発現ベクターの例はｐＧＥＸであり、それは、当該遺伝子のこのベクターへのサブクローニングの際、当該タンパク質とグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼから成る融合タンパク質を産生する。当該タンパク質との融合タンパク質を生じるその他のベクター系の例はＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年、上記）に記載されている。
【０１５４】
或いは、任意でタンパク質キャリアに結合した合成ペプチド又はポリペプチドを本発明で使用してもよい。合成ペプチド又はポリペプチドは常法に従って製造してもよい。
【０１５５】
有用なペプチド又はポリペプチドは、ペプチド全体が動物に投与された場合、抗体及び／又は抗原特異的なＣＴＬ反応を引き出すことが知られるポリペプチドのエピトープを含む部分を含み得る。このポリペプチド部分のエピトープが免疫原性であり、又はポリペプチドの抗原性エピトープである。
【０１５６】
「免疫原性エピトープ」は、ペプチド全体が動物に投与された場合、抗体及び／又は抗原特異的なＣＴＬ反応を引き出すタンパク質の部分として定義される。他方、抗体又はＭＨＣ分子が結合することができるタンパク質分子の領域は「抗原性エピトープ」として定義される。タンパク質の免疫原性エピトープの数は一般に抗原性エピトープの数より少ない。
【０１５７】
抗原性エピトープを含むペプチド又はポリペプチドの選択に関して、タンパク質配列の一部を模倣する相対的に短い合成ペプチドが部分的に模倣されたタンパク質と反応する抗血清を日常的に導き出すことがその技術では周知である（たとえば、Sutcliffe et al., 1983を参照）。タンパク質反応性の血清を導き出すことが可能なペプチドはタンパク質の一次配列で表されることが多く、一連の単純な化学的ルールを特徴とし、無処理のタンパク質の免疫優勢領域（すなわち、免疫原性エピトープ）にもアミノ末端若しくはカルボキシ末端にも限定されない。
【０１５８】
本発明の抗原性エピトープを含むペプチド及びポリペプチドは好ましくは、特定のポリペプチドのアミノ酸配列内に含有される少なくとも７、さらに好ましくは少なくとも９、最も好ましくは約１５〜３０の間のアミノ酸の配列を含有する。
【０１５９】
ＣＴＬ上のＴ細胞受容体によって認識されるエピトープは抗体によって見られるものとは異なってもよい。普通、ＣＴＬは、ＭＨＣクラスＩ分子に結合し、細胞表面に露出されるペプチド（細胞質ゾルの区画で酵素によって分解されたタンパク質に由来する）を認識する。これらのＣＴＬに認識されたペプチドはＭＨＣ対立遺伝子特異的な配列モチーフに従ってＭＨＣクラスＩ分子に選択的に結合する。これらのペプチドは発現クローニングによって特定することができ（van der Bruggen, et al, 1991を参照）、種々のクラスＩとクラスＩＩの結合ペプチドのアルゴリズムを用いて予測することができる（Pietersz et al, 2006）。
【０１６０】
或いは、ＣＴＬに認識されたペプチドは、免疫に使用されたタンパク質抗原に由来するペプチドによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏの刺激によって細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導することによって特定することができる。本発明の特定のＣＴＬに認識されたエピトープを含むペプチド及びポリペプチドは好ましくは、少なくとも６つのアミノ酸、さらに好ましくは約７〜２０の間のアミノ酸の配列である。
【０１６１】
エピトープを含むペプチド及びポリペプチドは任意の従来の手段によって作製してもよい。
【０１６２】
細菌抗原
抗原は、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｒｉｄａｎｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｐｐ．、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐｐ．、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐｐ．、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｅｒｌｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．及びＲｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐを含むが、これらに限定されない細菌に由来することができる。
【０１６３】
細菌抗原は天然、組換え又は合成のものであり得る。そのような細菌抗原には、細胞表面上に存在する炭水化物決定基に結合する細菌に由来するセレクチン又はレクチン、並びに、たとえば、フィブロネクチン、ラミニン及びコラーゲンのようなタンパク質のための細菌の受容体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６４】
ウイルス抗原
抗原は、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、おたふくかぜウイルス、アデノウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、エプステインバーウイルス、リノウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ルベオロウイルス、ルベラウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ヘルペスウイルス（ヒト及び動物）、単純性ヘルペスウイルス、パルボウイルス（ヒト及び動物）、サイトメガロウイルス、肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、アルファウイルス、フラビウイルス、ブンヤウイルス、狂犬病ウイルス、アレナウイルス、フィロウイルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＦｅＬＶ、ウシＬＶ、ＦｅＩＶ、イヌジステンパーウイルス、イヌ伝染性肝炎ウイルス、ネコカリシウイルス、ネコ鼻気管支炎ウイルス、ＴＧＥウイルス（ブタ）及び口蹄疫を含むが、これらに限定されないウイルスに由来することができる。
【０１６５】
ウイルス抗原は天然、組換え又は合成のものであり得る。そのようなウイルス抗原には、たとえば、（ｉ）レトロウイルス（ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ＦｅＬＶ及びその他）及びヘルペスウイルスのエンベロープ糖タンパク質、並びに（ｉｉ）インフルエンザウイルスのノイラミダーゼのような細胞表面の受容体に結合して感染過程を開始することに関与するウイルスタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６６】
腫瘍抗原
本発明の一実施形態では、対象は癌を有するか、又は癌を発症する高いリスクにある。
【０１６７】
「癌」によって、周辺組織に侵襲する及び／又は新しいコロニー形成部位に転移する能力を有する細胞の増殖を特徴とする種々の悪性腫瘍のいずれかを意味する。癌は、たとえば、乳癌、胃癌、結腸直腸癌、膵臓癌、膀胱癌又は肺癌であってもよい。好まれる実施形態では、癌は乳癌である。
【０１６８】
癌の多数の「リスク因子」は、たとえば、癌の家族歴、癌の既往歴、異常な過形成のような増殖性疾患の以前の生検検出のように確立されている。特定の遺伝的リスク因子も知られており、たとえば、乳癌については、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＡＴＭ、ＣＨＥＫ−２及びｐ５３の変異が挙げられる。生活習慣に関連したリスク因子も考慮され得る。女性における乳癌についての生活習慣に関連したリスク因子には、３０歳後までの遅い出産及びホルモン置換療法の長期使用が挙げられる。熟練した臨床医はこれら及びその他のリスク因子を評価して対象が本発明のワクチン組成物の予防的使用から利益が得られるかどうかを判定することができる。
【０１６９】
本発明の癌ワクチンは１以上の腫瘍関連抗原を含み得る。腫瘍関連抗原は天然、組換え又は合成のものであり得る。そのような腫瘍関連抗原には、ＭＵＣ−１及びそのペプチド断片、タンパク質ＭＺ２−Ｅ、多型性上皮ムチン、葉酸結合タンパク質ＬＫ２６、ＭＡＧＥ−１又はＭＡＧＥ−３及びそのペプチド断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）及びそのペプチド断片、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）及びそのペプチド断片、アルファフェトタンパク質（ＡＦＰ）及びそのペプチド断片、膵臓腫瘍胎児抗原及びそのペプチド断片、ＣＡ１２５、１５−３、１９−９、５４９、１９５及びそのペプチド断片、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）及びそのペプチド断片、前立腺特異的膜高原（ＰＳＭＡ）及びそのペプチド断片、有棘細胞癌抗原（ＳＣＣＡ）及びそのペプチド断片、卵巣癌抗原（ＯＣＡ）及びそのペプチド断片、膵臓癌関連抗原（ＰａＡ）及びそのペプチド断片、Ｈｅｒ１／ｎｅｕ及びそのペプチド断片、ｇｐ−１００及びそのペプチド断片、変異体Ｋ−ｒａｓタンパク質及びそのペプチド断片、変異体ｐ５３及びそのペプチド断片、非変異体ｐ５３及びそのペプチド断片、切断型表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、キメラタンパク質ｐ２１０ＢＣＲ−ＡＢＬ、テロメラーゼ及びそのペプチド断片、サーバイビン及びそのペプチド断片、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１タンパク質及びそのペプチド断片、ＷＴ１タンパク質及びそのペプチド断片、ＬＭＰ２タンパク質及びそのペプチド断片、ＨＰＶＥ６Ｅ７タンパク質及びそのペプチド断片、ＨＥＲ２／ｎｅｕ及びそのペプチド断片、イディオタイプタンパク質及びそのペプチド断片、ＮＹーＥＳＯ−１タンパク質及びそのペプチド断片、ＰＡＰタンパク質及びそのペプチド断片、癌精巣タンパク質及びそのペプチド断片、並びに５Ｔ４タンパク質及びそのペプチド断片が挙げられるが、これらに限定されない。その他の例となる腫瘍抗原は、Ｃｈｅｅｖｅｒら、２００９年に記載されている。
【０１７０】
ムチン
好まれる実施形態では、抗原はムチン又はその抗原性断片若しくは免疫原性の変異体若しくは誘導体である。多数の癌がヒトのムチンの過剰産生を伴う。ムチンは多数の上皮細胞及び腫瘍によって産生される激しくグリコシル化されたタンパク質（約１００ｋＤａを超える）である。癌細胞で見られるムチンは、一部のムチンが炭水化物コートの欠損を有し、それがタンパク質のコアを暴露したままにするという点で、正常の上皮細胞上のものと幾つかの点で異なる。ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ−３、ＭＵＣ−４、ＭＵＣ−５、ＭＵＣ−６及びＭＵＣ−７等と命名された既知のヒトのムチンの２１の形態があり、ＭＵＣ−１が最も普遍的である。種々のムチンはすべて良く似た特性を有し、すなわち、それらは膜貫通型の糖タンパク質であり、すべて種々の数の反復アミノ酸配列を有し、それはセリン、スレオニン及びプロリンの高い含量を有する。異常にグリコシル化された（グリコシル化されない又はグリコシル化における欠陥のいずれか）ムチンの過剰産生は、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌及び分泌組織のその他の腫瘍の特徴である。ヒトのムチンＭＵＣ−１〜ＭＵＣ−２１の各タンパク質コアのｃＤＮＡ配列がクローニングされ、性状分析されて、特定のアミノ酸モチーフ（ＶＮＴＲとして知られる）の様々な数の繰り返しの高度に反復性の中央部分を含有することが見い出されている。例証として、ＭＵＣ−１は、４０〜８０の直列に配置されたコピー又は２０アミノ酸モチーフの繰り返しを含有する高度に反復性の中央部分によって分離される独特のアミノ末端とカルボキシ末端の配列から成る。
【０１７１】
一実施形態では、腫瘍関連抗原は、上述のようなヒトのムチンＭＵＣ−１〜ＭＵＣ−２１のいずれか１以上であり、すべてセリン、スレオニン及びプロリンが高い繰り返しアミノ酸配列の高度に反復性の中央部分を含む。特に、本発明のワクチンはヒトのムチンポリペプチド（正常な対立遺伝子変異に関連する様々な数の繰り返しを含有する）を含んでもよいし、又は１以上のヒトムチンの反復配列、好ましくは２〜８０、さらに好ましくは２〜２０、一層さらに好ましくは２〜１０のヒトムチンの反復サブユニットを含んでもよい。タンパク質のコアを露出したままにする炭水化物コートの欠陥を有する癌細胞に見られるムチンに対して免疫応答を誘発するように、ヒトムチン及びそのサブユニットは好ましくはグリコシル化されないか、又は異常にグリコシル化される。本発明が抗原の使用、特にヒトムチンＭＵＣ−１〜ＭＵＣ−２１の使用に拡大することが明瞭に理解されるべきではあるが、ヒトムチンＭＵＣ−１の使用は特に好まれる。
【０１７２】
ＭＵＣ−１抗原は、たとえば、国際公開第９５／１０８１４５号、米国特許第６，０５４，４３８号、同第６，２２２，０２０号、国際公開第９８／５０５２７号、国際公開第０１／１８０３５号、同第００／６３３６３号、同第９５／０３８２５号、同第００／０６７２３号及び同第０４／０１６６４３号に記載されたとおりであり得る。国際公開第２００８／０１１６７２号に記載されたＭＵＣ−１−Ｔ細胞エピトープに位するペプチド又はペプチド類似体の使用も熟考される。
【０１７３】
マンナン／抗原抱合体
たとえば、マクロファージ及びＤＣへの少なくとも１つの抗原の送達は、少なくとも１つの抗原がマンナンに抱合された場合、高めることができる。理論に限定されることを望まないが、マクロファージ及びＤＣは、炭水化物部分（通常、微生物由来する）を認識する細胞表面受容体を有し、抗原提示に関与する２つの過程である飲作用と同様に貪食作用に介在するので、これは最も可能性が高い。そのようなものとして本発明のマンナン／抗原抱合体はＡＰＣターゲティングの有効なメカニズムを提供する。
【０１７４】
好まれる実施形態では、少なくとも１つの抗原への抱合の前に、マンナンの多糖鎖は、たとえば、ＮａＩＯ４によって酸化される（図４の模式図を参照）。一実施形態では、少なくとも１つの抗原は、国際公開第９５／１８１４５号に記載されたものと同様に酸化マンナンに抱合される。還元されたマンナンも使用してもよく、これを含有する組成物は、酸化されたマンナン／抗原抱合体にホウ化水素ナトリウム又はシアノホウ化水素ナトリウムを加えることによって調製され得る。
【０１７５】
代わりの実施形態では、マンナンの多糖鎖は先ず、臭化シアンによって活性化され、次いで活性化された多糖鎖をジアミンと反応させ、その後少なくとも１つの抗原と抱合させて抱合体を形成し、次いで任意でそれを酸化してもよい。
【０１７６】
マンナンと少なくとも１つの抗原を架橋させるためにマンナンと少なくとも１つの抗原を二官能剤によって誘導体化してもよい。一般に使用される架橋剤には、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタールアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、たとえば、４−アジドサリチル酸とのエステル、たとえば、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジル−プロピオネート）のようなジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、及びたとえば、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンのような二官能性マレイミドが挙げられる。たとえば、メチル−３−［（ｐ−アジド−フェニル）ジチオ］プロピオイミデートのような誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することが可能である光活性化可能な中間体を生じる。酸化マンナンを抗原のヒドラジン誘導体と反応させて抱合体を生じてもよい。或いは、マンナンを先ず、カルボニルジイミダゾールのような試薬と反応させ、次いで抗原と反応させ、酸化して抱合体を生じてもよい。
【０１７７】
少なくとも１つの抗原のマンナンへのカップリングには、炭水化物上の官能基を抗原上の官能基と反応させることが含まれる。炭水化物ポリマーはヒドロキシル基が豊富である。標準の化学的手順に従ってこれらの基を活性化してもよい。たとえば、ヒドロキシル基をヨウ化水素、臭化水素及び塩化水素のようなハロゲン化水素と反応させて官能化されたハロゲン化多糖を生じてもよい。ヒドロキシル基を三ハロゲン化リン、活性金属（たとえば、ナトリウムエトキシド、アルミニウムイソプロポキシド及びカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド）によって活性化して、又は（塩化トシル若しくは酢酸のような基で）エステル化して、官能基を形成してもよく、次いでそれをポリペプチド上の官能基と反応させて１以上の結合を形成することができる。
【０１７８】
抗原をコードする核酸
一実施形態では、ワクチン組成物は抗原をコードする核酸を含む。複数の核酸がワクチンに組み込まれて多価の抗原ワクチンを提供する。一実施形態では、ワクチンはＤＮＡワクチンである。
【０１７９】
たとえば、ポリ−Ｌ−リジン、ポリエチレンイミン又はＰＡＭＡＭデンドリマーのようなポリカチオンを介して少なくとも１つの核酸をマンナンに連結することができる。一実施形態では、酸化されたマンナン／ポリカチオンの正の電荷が負に荷電したＤＮＡと相互作用し、形質移入に使用することができるポリプレックスを形成する（Tang et al, 2008; Tang et al, 2007; Tang et al, 2009）。
【０１８０】
ＤＮＡワクチンの接種には通常、対象の細胞による抗原の発現のために、たとえば、対象の筋肉又は皮膚への抗原をコードするＤＮＡの直接的なｉｎ  ｖｉｖｏ導入が含まれる。形質移入細胞によってＤＮＡにコードされた抗原がいったん処理され、提示されると、細胞性及び／又は液性の免疫応答が誘発され得る。ＤＮＡワクチンは、米国特許第５，９３９，４００号、同第６，１１０，８９８号、国際公開第９５／２０６６０号及び国際公開第９３／１９１８３号に記載されている。
【０１８１】
今日まで、哺乳類系でのほとんどのＤＮＡワクチンはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するウイルスプロモータに頼っている。多数の哺乳類種における筋肉及び皮膚双方での接種にてこれらは良好な効率を有している。ＤＮＡ免疫によって引き出される免疫応答に影響を及ぼすことが知られる因子は、ＤＮＡ送達の方法であり、たとえば、非経口経路は遺伝子導入の低い比率を生じ、遺伝子発現でかなりの変動を生じ得る。遺伝子銃を用いたプラスミドの高速接種は、たぶん、ＤＮＡ形質移入の大きな効率とＤＣによるさらに効果的な抗原提示のためにマウスにて免疫応答を高めた。本発明の核酸に基づいたワクチンを含有するベクターは、たとえば、形質移入法、電気穿孔法、微量注入法、伝染法、細胞融合法、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション（リポソーム融合）法、又はＤＮＡベクター輸送法のような当該技術で既知のその他の方法によって所望の宿主に導入されてもよい。ＤＮＡワクチンの投与のメカニズムは以下でさらに詳述される。
【０１８２】
その他の成分
本発明の組成物は少なくとも１つの薬学上許容可能なキャリアを含んでもよい。用語「薬学上許容可能なキャリア」は、対象、特に哺乳類、さらに特にヒトに投与する際、アレルギー反応、毒性反応又はそのほかの有害な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。薬学上許容可能なキャリアは固体であっても、液体であってもよい。薬学上許容可能なキャリアの有用な例には、本発明の活性剤の活性に影響を及ぼさない希釈剤、賦形剤、溶媒、界面活性剤、懸濁剤、緩衝剤、潤滑剤、ビヒクル、乳化剤、吸収剤、分散媒体、コーティング、安定化剤、保護コロイド、接着剤、増粘剤、チキソトロピー剤、浸透剤、金属イオン封鎖剤、等張剤及び吸収遅延剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８３】
キャリアは従来使用されているもののいずれかであることができ、たとえば、溶解性、及び活性剤との反応性の欠如のような物理化学的検討事項によってのみ及び投与の経路によってのみ限定され得る。本発明に好適なキャリアには、従来使用されているもの、たとえば、水、生理食塩水、デキストロース水溶液、ラクトース、リンガー液、緩衝溶液、ヒアルロナン、グリコール、デンプン、セルロース、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、石灰粉、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、塩化ナトリウム、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。リポソームもキャリアとして使用され得る。
【０１８４】
本発明の組成物の免疫原性又は有効性をさらに高め得る化合物もここに含まれてもよく、又はこれらと共に投与されてもよい。たとえば、組成物は、１以上の油（たとえば、フロインドの完全及び不完全）、サポニン、修飾サポニン、リポソーム、無機塩（たとえば、Ａ１Ｋ（Ｓ０４）２、ＡｌＮａ（Ｓ０４）２、Ａ１ＮＨ４（Ｓ０４）、シリカ、アラム、Ａｌ（ＯＨ）３、Ｃａ３（Ｐ０４）２、カオリン及び炭素）、ポリヌクレオチド（たとえば、ポリＩＣ及びポリＡＵ酸）、及び特定の天然物質（たとえば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに由来する脂質Ａ、ワックスＤ，同様にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ及びＢｒｕｃｅｌｌａ属のメンバーに見られる物質）、ウシ血清アルブミン、ジフテリア毒素、破傷風毒素、エデスチン、スカシガイのヘモシアニン、緑膿菌毒素、コレラゲノイド、コレラ毒素、百日咳毒素、ウイルスタンパク質、及びたとえば、インターフェロン、インターロイキン又は腫瘍壊死因子のような真核細胞タンパク質を含んでもよい。そのようなタンパク質は、当業者に既知の方法に従って天然の供給源又は組換え供給源から得られ得る。その他の既知の免疫原性の高分子には、多糖類、ｔＲＮＡ、たとえば、ポリビニルアミン、ポリメタクリル酸、ポリビニルピロリドン、４’，４−ジアミノジフェニル−メタン−３，３’−ジカルボン酸と４−ニトロ−２−アミノ安息香酸又は糖脂質の混合ポリ濃縮物のような非代謝性合成ポリマー、脂質又は炭水化物が挙げられる。
【０１８５】
投与
本発明のワクチン組成物は、単独で又は別の化合物との併用で、適当な経路によって対象に投与することができる。
【０１８６】
一実施形態では、化合物は抗原又はそれをコードする核酸である。一実施形態では、マンナンと少なくとも１つの抗原又はそれをコードする核酸が異なった組成物で順次又は同時に投与される。好まれる実施形態では、同一の組成物にてそれらが投与される。
【０１８７】
マンナンは少なくとも１つの抗原又はそれをコードする核酸との混合物で投与されてもよく、又は代わりにマンナンを少なくとも１つの抗原又はそれをコードする核酸に抱合することができる。
【０１８８】
投与の経口経路、食事経路、局所経路、非経口経路（たとえば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、血管内又は皮下の注射）及び吸入経路（たとえば、気管支内、鼻内又は経口吸入、点鼻剤）を含むが、これらに限定されない種々の投与経路が可能である。
【０１８９】
一実施形態では、組成物又はワクチンを粘膜部位に投与する。粘膜部位の例には、たとえば、鼻領域（たとえば、鼻）、気管、気管支及び肺のような呼吸器、経口（たとえば、口及び歯肉）及び口腔咽頭を含む頬又は口腔の組織、扁桃腺を含む喉、目の結膜、消化管（たとえば、食道、胃、十二指腸、小腸及び大腸、結腸及び直腸）、生殖器官/組織（膀胱、尿管、尿道及び関連する組織、陰茎、外陰／膣及び子宮/膣組織、並びに卵管）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９０】
投与される組成物又はワクチンの剤形は選択された投与経路に従って異なる（たとえば、溶液、エマルション、カプセル）。
【０１９１】
生理学的に許容可能なキャリアにて組成物又はワクチンを調製することができる。溶液又はエマルションについては、好適なキャリアには、生理食塩水及び緩衝化媒体を含む水溶液又はアルコール性／水溶液、エマルション又は懸濁液が挙げられる。非経口キャリアには、塩化ナトリウム溶液、リンガーのデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸化リンガー液又は不揮発性油が挙げられる。静脈内キャリアは、種々の添加剤、保存剤、又は液体、栄養又は電解質の補充液などを含む（一般にRemington's Pharmaceutical Sciences, 1985を参照）。吸入については、可溶性の組成物又はワクチンを、投与用の好適な分配器（たとえば、アトマイザー、ネブライザー又は加圧式エアゾール分配器）に負荷することができる。
【０１９２】
抗原をコードする核酸は、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はその他の好適なベクターへの組込み、又は種々のその他のタンパク質系又は脂質系の遺伝子送達複合体によって、同様に「裸の」ポリヌクレオチドの送達を促進する技法（電気穿孔法又は「遺伝子銃」送達）を介して細胞に直接送達することができる。或いは、送達のためのタンパク質を発現することが可能である宿主細胞に核酸を導入することができる。次いでこれらの形質移入した又は形質転換した細胞は、治療上有効量にて抗原を発現するのに有効な量にて埋め込まれ（単独で又はバリア用具内で）、注入され、又はさもなければ導入される。
【０１９３】
代わりの実施形態では、抗原提示細胞、たとえば、マクロファージ及び／又はＤＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで組成物に接触させて、抗原による負荷を達成し、次いで対象に投与する。一実施形態では、対象又は自己ドナーから抗原提示細胞を導き出し、ｅｘ  ｖｉｖｏで抗原を負荷する。たとえば、対象又は自己ドナーから採血し、密度勾配遠心によって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を濃縮し、その後、プラスチック表面に付着させて単球を濃縮する。次いで付着細胞をサイトカイン混合物と培養し、たとえば、未熟ＤＣへの分化を誘導することができ、得られた未熟ＤＣをワクチン抗原とマンナンに接触させ、又は代わりに前記抗原をコードする核酸で形質移入することができる。次いで、得られた成熟／活性化樹状細胞調製物（すなわち、上方調節された共刺激分子ＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６を有する）を、たとえば、プロトコールで定義したスケジュールで皮内注射によって対象に投与することができる。
【０１９４】
組成物又はワクチンの投与は、単回事象若しくは複数回事象であってもよく、又はプライム・ブースト法の一部、それらの組み合わせ、その他とのそれのそれぞれ、投与／ワクチン接種の従来法であってもよい。プライム・ブースト法は、たとえば、筋肉内、皮内、血管内、皮下又は静脈内の投与によって刺激すること及びたとえば、鼻内、筋肉内、皮内、血管内、皮下又は静脈内の投与によって追加免疫することを含む。刺激組成物及び追加免疫組成物の一方又は双方は、抗原又はそれをコードする核酸とマンナンを含んでもよい。刺激組成物及び追加免疫組成物の一方はマンナンを省略してもよい。
【０１９５】
特定の適用に有効な本発明の組成物又はワクチンの投与の量及び回数は、マンナン及び／又は少なくとも１つの抗原若しくはそれをコードする核酸の物理的及び化学的な性質、キャリアの性質、意図される投与計画、対象の免疫系の状態（たとえば、抑制された、無防備な、刺激された）、組成物又はワクチンを投与する方法、及び組成物又はワクチンが投与される種を含むが、これらに限定されない当該技術で既知の因子に従って変化する。従って、可能性のあるすべての適用に有効なマンナン及び／又は少なくとも１つの抗原若しくはそれをコードする核酸の量を一般に述べることは実践的ではない。量及び回数は主治医又は獣医によって決定されてもよい。
【０１９６】
有効量の組成物が投与される。「有効量」は投与の条件下で所望の免疫刺激効果を達成するのに十分な量である。
【０１９７】
例証として、約１００ｎｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１０μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇのマンナンが対象に投与されてもよい。一層さらに好ましくは、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇのマンナンの用量が特にヒトについて熟考される。
【０１９８】
例証として約１μｇ／ｋｇ〜約１０，０００μｇ／ｋｇ、好ましくは約５μｇ／ｋｇ〜約５０００μｇ／ｋｇ、さらに好ましくは約８μｇ／ｋｇ〜約１０００μｇ／ｋｇ、最も好ましくは約４００μｇ／ｋｇ〜約６００μｇ／ｋｇの抗原が対象に投与され得る。一層さらに好ましくは、約１００μｇ／ｋｇ〜約２００μｇ／ｋｇの抗原が特にヒトについて熟考される。
【０１９９】
本発明の組成物及びワクチンは、その他の免疫応答調節剤、たとえば、サイトカイン、ＨＬＡクラスＩＩタンパク質結合ヘルパー分子、ＣＤ４０作動薬、チェックポイント受容体（たとえば、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、Ｓｔａｔ３）の拮抗剤、Ｂ７共刺激分子、ＦＬｔ３作動薬及びＣＤ４０Ｌ作動薬と併せて対象に投与してもよい。
【０２００】
ＨＬＡクラスＩＩタンパク質結合ヘルパー分子の存在は、ヘルパー（ＣＤ４＋）Ｔ細胞を刺激するのに有効である。ＨＬＡクラスＩＩタンパク質結合ヘルパー分子は、たとえば、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風毒素（ＴＴ）、ジフテリア毒素、又はたとえば、ＰＡＤＲＥペプチドのようなさらに小さなＴ細胞ヘルパーエピトープ、及びこれらの組み合わせを含む当業者に周知のもののいずれかであってもよい。
【０２０１】
本発明の組成物の免疫原性又は有効性をさらに高める化合物及び／又は薬学上許容可能なキャリアをその中に含めてもよいし、それと一緒に同時投与してもよい。
【０２０２】
その他の免疫療法戦略、たとえば、対象が癌を有し、ワクチンが癌ワクチンである化学療法との併用も本発明の組成物を使用することができる。
【０２０３】
核酸の細胞への送達
一実施形態では、本発明は核酸を細胞に送達するための組成物に関するものであり、その組成物は少なくとも１つの核酸とマンナンを含み、その際、マンナンの少なくとも７５％は１０００ｋＤａより大きい。少なくとも１つの核酸はポリカチオンを介してマンナンに抱合され得る。
【０２０４】
一実施形態では、核酸は抗原をコードする。
【０２０５】
別の実施形態では、核酸は遺伝子をコードする。
【０２０６】
語句「核酸を細胞に導入すること」は、組換え手段により核酸配列を導入することを指す。
【０２０７】
用語「核酸」は、あらゆる形態におけるＤＮＡ、ＲＮＡ及びポリヌクレオチド、すなわち、単鎖及び二本鎖のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどと同義である。
【０２０８】
対象に核酸を送達する手段には、核酸の直接送達及び核酸で形質移入した又は形質転換した細胞の送達が含まれる。たとえば、注入、カテーテル法又は内視鏡によって細胞又は核酸を所望の臓器又は腫瘍に直接送達することができる。静脈内に、気管支内に、腫瘍内に、クモ膜下に、筋肉内に、眼内に、局所に、皮下に、経皮で又は経口でそれらを送達することができる。
【０２０９】
核酸送達ビヒクルの例は、種々の真核性及び原核性の宿主における発現について記載され、単純なタンパク質発現と同様に遺伝子療法、遺伝ワクチン接種（たとえば、ＤＮＡワクチン接種）で使用されてもよい従来技術で通常使用されるリポソーム、天然のポリマー及び合成ポリマーを含む生体適合性ポリマー、リポタンパク質、ポリペプチド、多糖類、リポ多糖類、人工的なウイルスエンベロープ、金属粒子、及び細菌、たとえば、バキュロウイルス、アデノウイルス及びレトロウイルスのようなウイルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクター及びその他の組換えビヒクルである。
【０２１０】
本明細書で使用されるとき、「ベクター」は、その発現又は複製のために非相同の核酸を細胞に導入するのに使用される個別要素を指す。たとえば、ベクターは、人工の染色体、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ又はウイルスであってもよく、宿主細胞のゲノムへの安定な統合が可能であってもよく、独立した遺伝要素として存在してもよい（たとえば、エピソーム、プラスミド）。ベクターは単一のポリヌクレオチドとして又は２以上の別々のポリヌクレオチドとして存在してもよい。ベクターは宿主細胞に存在する場合、単一コピーベクターであってもよいし、マルチコピーベクターであってもよい。本発明における使用に好まれるベクターは、宿主細胞における１以上のタンパク質の発現を指向するように正しい方向性で発現制御要素の近傍にて１以上の機能的遺伝子をベクターに挿入することができる発現ベクターである。
【０２１１】
用語「制御要素」は特定の宿主細胞にて操作可能に連結されたヌクレオチドのコーディング配列の発現に必要な核酸配列を指す。原核細胞における発現に好適な制御配列には、たとえば、複製開始点、プロモータ、リボソーム結合部位、及び転写終了部位が挙げられる。真核細胞における発現に好適な制御配列には、たとえば、複製開始点、プロモータ、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサが挙げられる。
【０２１２】
「プロモータ」は核酸の転写を指図する。本明細書で使用されるとき、「プロモータ」は、たとえば、ポリメラーゼＩＩ型プロモータの場合のＴＡＴＡ要素のような転写開始部位近傍の必要な核酸配列を含む。
【０２１３】
プロモータはまた任意で遠位の「エンハンサ又はリプレッサの要素」も含み、それは、転写開始部位から数千塩基対に位置することができる。プロモータは相同であっても非相同であってもよい。「構成的」プロモータは、ほとんどの環境条件下及び発達条件下で選択された生物にて活性があるプロモータである。「誘導可能な」プロモータは、選択された生物にて環境的な及び発達上の調節下にあるプロモータである。
【０２１４】
ベクターは、ウイルスベクターであっても非ウイルスベクターであってもよく、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター及びプラスミドベクターが含まれる。ウイルスの例となる種類には、ＨＳＶ（単純性ヘルペスウイルス）、アデノウイルス、ＡＡＶ（アデノ関連ウイルス）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＢＩＶ（ウシ免疫不全ウイルス）、及びＭＬＶ（マウス白血病ウイルス）が挙げられる。核酸は、ウイルス粒子にて、リポソームにて、ナノ粒子にて及びポリマーへの複合体化で、を含む十分に有効な送達レベルを提供する所望の形式で投与することができる。遺伝子送達、遺伝子導入などは、本明細書で使用されるとき、導入に使用される方法に関わりなく、宿主細胞への核酸（「導入遺伝子」とも言う）の導入を指す用語である。そのような方法には、たとえば、ベクターが介在する遺伝子導入（たとえば、ウイルスの感染／形質移入、又は種々のその他のタンパク質系若しくは脂質系の遺伝子送達複合体によって）、並びに「裸の」ポリヌクレオチドの送達を促進する技法（たとえば、電気穿孔法、「遺伝子銃」送達及び核酸の導入に使用される種々のその他の技法）のような種々の周知の技法が挙げられる。導入されたポリヌクレオチドは安定的に又は一時的に宿主細胞にて維持され得る。安定的な維持には通常、導入されたポリヌクレオチドが宿主細胞と適合する複製開始点を含有することか、又は染色体外のレプリコン（たとえば、プラスミド）のような宿主のレプリコン又は核若しくはミトコンドリアの染色体を統合することのいずれかが必要とされる。当該技術で知られ、本明細書で記載されるように、哺乳類細胞への遺伝子の導入に介在することが可能である多数のベクターが知られている。
【実施例】
【０２１５】
実施例１：材料及び方法
培地及び化合物
２％ＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミン及び１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清で補完することによって完全ＲＰＭＩ−１６４０培地を調製した。ＤＣを培養するのに使用する組換えＧＭ−ＣＳＦはＢＤ−ファーミンゲン（米国、サンディエゴ）から購入し、ＰＢＳで再構築した。リポ多糖（ＬＰＳ）（シグマＬ３１３７、オーストラリアのキャッスルヒル）は無菌蒸留水で再構築した。抗ＣＤ−１１ｃ−ＡＰＣはＢＤ−ファーミンゲン（米国、サンディエゴ）から購入した。抗ＣＤ４０、抗ＣＤ８０及び抗ＣＤ８６抗体は自分達で調製した。マンナン、ＮａＩＯ４、ＡＮＴＳ、エタン−１，２−ジオールはシグマから購入した。
【０２１６】
これらの試験で使用したマンナンはベーカーズ酵母（出芽酵母：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）に由来する。マンナンは、５０〜＞１，０００ｋＤａに及ぶ様々な分子量を持つマンノースが豊富な多糖類を組み入れて非常に不均質である。
【０２１７】
分画方法
二重蒸留水（ＤＤＷ）中２０ｍｇ／ｍｌのマンナンを２０ｍｌの３００ｋＤａＭＷＣＯビバスピン濃縮器（サルトリウス）に入れ、２５００ｒｐｍにて１５〜２０分間遠心し、１〜２ｍｌに濃縮した（図１）。試料全体を加えるまで濃縮器を再充填した。数回の遠心が必要だった。濾液を回収し、ＤＤＷで２回洗浄したが、洗浄液は廃棄した。濃縮した分画（濃縮液）は＞３００ｋＤａの分画である。次いで濾液を１５ｍｌの１００ｋＤａＭＷＣＯアミコンスピン濃縮器（ミリポア）に入れ、前に詳説したように実行した。次いで２×１５ｍｌの５０ｋＤａＭＷＣＯアミコンスピン濃縮器（ミリポア）、その後、２×１５ｍｌの３０ｋＤａＭＷＣＯアミコンスピン濃縮器（ミリポア）を用いてマンナンを順次分画した。これによって＞３００、１００〜３００、５０〜１００、３０〜５０及び＜３０ｋＤａの分画を生じた。粘着性なので使用しない＜３０ｋＤａの分画を除いて、濃縮液分画及び最終濾液を白色の綿毛状粉末に凍結乾燥した。試料を秤量し、回収率を記録した。
【０２１８】
後半の分画の実施では、サルトリウスの２×２０ｍｌの１０００ｋＤａＭＷＣＯビバスピン濃縮器を第１の分画工程として用い、その後、上述のような他の濃縮器を順次用いた。これによって、＞１０００、３００〜１０００、１００〜３００、５０〜１００、３０〜５０及び＜３０ｋＤａの分画を生じた。
【０２１９】
前述と同様に、濃縮液分画及び最終濾液を白色の綿毛状粉末に凍結乾燥し、＜３０ｋＤａの分画は使用しなかった。試料を秤量し、回収率を記録した。場合によっては、３００〜１０００ｋＤａの分画では粉末が無かったのでその場合、その特定の分画は分析に使用しなかった。
【０２２０】
ＰＤＰＨ定量法を用いたマンナンにおけるアルデヒド残基の定量
酸化マンナンにおけるアルデヒド基の数を定量する方法を図２で模式的に示す。酸化の程度がマンナンの分子量に左右されるように同一モル濃度のＮａＩＯ４を使用する。０．１Ｍのリン酸ｐＨ６．０緩衝液中、１．４ｍｇ／０．１ｍｌのマンナン及びマンナン分画を０．０１ＭのＮａＩＯ４で酸化し、暗所氷上にて１時間反応させた。１０μｌのエタン−１，２−ジオールで反応を止め、さらに１／２時間反応させた後、０．１Ｍの酢酸緩衝液ｐＨ４．８にてＰＤ１０カラムを通過させた。
【０２２１】
室温にて一晩回転させながら、０．７ｍｇ／ｍｌの酸化マンナン２ｍｌのうち１ｍｌを０．１ｍｇのＰＤＰＨと反応させた後、ＤＤＷにてＰＤ１０を通過させた。０．０１ＭのＤＴＴと１５分間反応させ、ＯＤ３４３ｎｍで吸光度を読み取ることによってアルデヒド基の数を決定することができる。これによってアルデヒド基を示す２−ピリジンが放出される（図２）。
アルデヒド残基の数＝２−ピリジンチオンの濃度（Ｍ）／マンナンの濃度（Ｍ）＝［ＯＤ３４３／８０８０］／［マンナンの濃度（ｍｇ／ｍｌ）／マンナンの分子量］
【０２２２】
種々の分画に使用される平均分子量は、マンナン全体＝５００ｋＤａ、＞１０００＝１０００ｋＤａ、＞３００＝６５０ｋＤａ、１００〜３００＝２００ｋＤａ、５０〜１００＝７５ｋＤａ、３０〜５０＝４０ｋＤａである。
【０２２３】
ＡＮＴＳによるマンナンの化学修飾及び定量
ＡＮＴＳによる酸化マンナンの化学修飾を図３にて模式的に示す。０．１Ｍのリン酸ｐＨ６．０緩衝液中、１．４ｍｇ／０．１ｍｌのマンナン及びマンナン分画を０．０１ＭのＮａＩＯ４で酸化し、暗所氷上にて１時間反応させた。１０μｌのエタン−１，２−ジオールで反応を止め、さらに１／２時間反応させた後、０．１Ｍの酢酸緩衝液ｐＨ４．８にてＰＤ１０カラムを通過させた。
【０２２４】
０．７ｍｇ／ｍｌの酸化マンナン、＞３００ｋＤａ、１００〜３００ｋＤａ、５０〜１００ｋＤａ及び３０〜５０ｋＤａの分画の１ｍｌをそれぞれ、３／１７酢酸／ＤＤＷ中０．２８８、０．１８４、０．５９８、１．５９及び２．９９ｍｇのＡＮＴＳ（×４００過剰）と反応させた。シアノホウ化水素ナトリウム（５０μｌ、１Ｍ、シグマ）を加え、回転させながら反応を室温にて一晩放置し、その後、ＤＤＷにてＰＤ１０を通過させた。励起４０５ｎｍ及び放射５２０ｎｍにてＡＮＴＳ基準に対してＡＮＴＳ抱合体の蛍光を読み取った。
【０２２５】
マンノース残基の定量のためのレゾシノールアッセイ
レゾシノールアッセイ（Monsigny et al., 1988）を用いてマンナン及びマンナン分画を定量した。マンノースを基準として用いた。ＯＤ４５０ｎｍ（４３０又は４８０ｎｍがないので）での吸光度にてプレートを読み取った。
抗原のマンナンへの抱合
【０２２６】
酸化されたマンナンへのタンパク質の抱合を図４にて模式的に示す。０．１Ｍのリン酸ｐＨ６．０緩衝液中、１．４ｍｇ／０．１ｍｌのマンナン及びマンナン分画＞１０００ｋＤａ、３００〜１０００ｋＤａ（又は早期の実施では＞３００）、１００〜３００ｋＤａ、５０〜１００ｋＤａ、３０〜５０ｋＤａ（１４ｍｇ／０．５ｍｌ）の３０〜５０分画を除く）をそれぞれ、０．１ＭのＮａＩＯ４の１００、７７、２５０、６００μ１及び１．２５ｍｌの添加によって酸化し、最終体積を１．６ｍｌとした。
【０２２７】
前述と同様に、混合物を暗所氷上にて１時間置き、エタン−１，２−ジオールにて反応を止め、さらに１／２時間反応させた。０．０５Ｍの重炭酸ｐＨ９．０によって事前に平衡化したＰＤ１０カラム（ＢＤバイオサイエンシズ）にて抱合体を分離し、未反応物質及び副産物を取り除いた。これには、１．６ｍｌの試料のカラムの通過の後、０．９ｍｌの緩衝液の通過と廃棄が含まれた。次の２ｍｌを回収し、１ｍｌの酸化マンナン又は分画をそれぞれＦＰ及びＯＶＡの０．３５、０．３、０．４９５、０．７３５及び０．５９ｍｇの計算された量と反応させた。抱合体を室温で一晩インキュベートし、４〜１２％又は４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離して上手く行った抱合を検証した。良好な抱合体は、スメアと明瞭なタンパクバンドの欠如とによって示される。
【０２２８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験に使用する最終＞１０００ＭＦＰ抱合体については、０．７ｍｇのＦＰ（５．４５ｍｇ／ｍｌ、１２８μｌ）を２ｍｌの酸化マンナンと反応させた。同様に、＞１０００ＭａｎＲＳＶｇ抱合体については、０．２５ｍｇのＲＳＶｇ（０．３７ｍｇ／ｍｌ、３６７μｌ）を２ｍｌの酸化マンナンと反応させた。
【０２２９】
＞１０００ＭＦＰにおけるマンナンのモル濃度はＭＦＰの半分なので１０μｇのＦＰをｉｎ  ｖｉｖｏ免疫原性試験に用いた。
【０２３０】
未処理ゲル電気泳動及び変性ゲル電気泳動
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又は未処理ゲルにてマンナン及び分画を視覚化した。予め形成された（ＰＡＧＥゲル）ＳＤＳ４〜１２％又は４〜２０％の勾配ゲル（ＰＡＧＥゲル）を１×ＭＯＰＳＳＤＳ泳動緩衝液にて泳動させた。或いは、０．０６３Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８で作製した５％濃縮ゲルとＴＢＥで作製した分離ゲルから成る１２％未処理ゲル（塩基性条件）を用いた。０．１９Ｍのグリシンを加えたＴＢＥにて電気泳動を行った（Sharma et al, 2003）。
【０２３１】
クマシー染色及びＰＡＳ染色を用いてそれぞれタンパク質及び糖類についてゲルを染色した。
【０２３２】
デンシトメトリーによるマンナン分画の分子量の決定
上記のようにマンナン分画をＮａＩＯ４で酸化し、ＡＮＴＳで標識した。ＡＮＴＳ標識したマンナンの試料をＰＡＳ染色後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。クオンティワン（バイオラド）ソフトウエアを用いたデンシトメトリーによって乾燥ゲルを走査し、分析した。
【０２３３】
骨髄由来のＤＣの生成
以前記載された（Apostolopoulos et al, 2006）ようにマウスのＤＣを生成した。手短には、大腿骨及び脛骨の内腔から骨髄細胞を取り出した。無菌の０．７３％（ｗ／ｖ）ＮＨ４Ｃ１で骨髄細胞を３７℃にて１０分間処理して赤血球を溶解させた。細胞を洗浄し、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦで補完した完全培地に再浮遊させた（２×１０６個の細胞／３ｍｌ）。２４穴プレート（１ｍｌ／ウェル）にて細胞を４日間培養した。培養培地を穏やかにピペッティングすることによって細胞を回収した。ＧＭ−ＣＳＦで培養した骨髄細胞は、混合リンパ球反応の強力な刺激細胞である多数のＭＨＣクラスＩＩ発現ＤＣを生じる。
【０２３４】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ樹状細胞成熟試験
成熟試験にはＣ５７ＢＬ／６マウス由来のＤＣを用いた。培養プレートから樹状細胞を取り出し、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦで補完した完全ＲＰＭＩの１５０μｌに１×１０５個のＤＣを再浮遊させ、４８穴プレートに播いた。８００、４００、及び２００μｇ／ｍｌの最終濃度がウェルに添加されるようにマンナン及び種々のマンナン分画を加えた。ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）を陽性対照として用い、各ウェルに加え、３７℃で１８時間インキュベートした。細胞を回収し、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）に結合した抗ＤＣ８６、抗ＣＤ４０又は抗ＣＤ８０と共に抗ＣＤ１１ｃ−ＡＰＣによって染色した。ＣＤ１１ｃｈｉｇｈ細胞をゲートで囲み、ヒストグラム解析によってＦＩＴＣの強度を判定し、ＤＣの成熟状態を判定した。
【０２３５】
Ｉｎ  ｖｉｖｏマウス免疫原性試験
［マウス及び免疫］
ＨＬＡ−Ａ２／Ｋbマウスはオーストラリア、パースのアニマルリソースセンターから購入した。ＭＦＰ、＞１０００ＭＦＰ及び非抱合ＦＰによって誘導されるエフェクター免疫応答を測定するために、０、１０及び１７日目に１００μｌの体積で尾の基部にてＨＬＡ−Ａ２／Ｋbマウスを経皮的に免疫し、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いて１０〜１４日後、免疫応答を評価した。２回目及び３回目の注射後、マウスにて採血し、ＭＵＣ１特異的な総Ｉｇ、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ１をＥＬＩＳＡアッセイで検出した。
【０２３６】
［ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗原特異的なＴ細胞応答］
免疫したＨＬＡ−Ａ２／Ｋbマウスから脾臓細胞を単離し、抗原特異的なＩＦＮ−γの分泌についてＥＬＩＳｐｏｔによって評価した。混合アセテートプレート（ＭＡＩＰミリポア）を抗マウスＩＦＮ−γ（ＡＮ１８、５μｇ／ｍｌ、ドイツ、マブテック）で一晩コートした。５×１０５個の脾臓細胞／ウェルを加え、ＭＵＣ−ＦＰ（２０μｇ／ｍｌ）の存在下で１０％ＦＣＳ  ＲＰＭＩ１６４０培地にて１８時間インキュベートした。ＣｏｎＡ（１μｇ／ｍｌ）又は細胞単独をそれぞれ陽性及び陰性の対照として用いた。細胞を捨て、洗浄した後（０．０５％ツイーン２０／ＰＢＳ）、抗マウスＩＦＮ−γ（Ｒ４−６Ａ２、米国カリフォルニア州、マブテック）を２時間加え、その後、室温にて２時間、０．１μｇ／ｍｌのエクストラアビジン−アルカリホスファターゼ（ＡＰ）（英国、シグマ）を加えた。比色ＡＰキット（米国カリフォルニア州、ヘラクレスのバイオラド）を用いて活性のスポットを検出した。ＡＩＤ  ＥＬＩＳｐｏｔリーダーシステム（ドイツ、Autoimmun Diagnostika社）によってサイトカインのスポットを計数した。データは、０．５×１０６個の細胞当たりの平均スポット形成単位（ＳＦＵ）±平均値の標準偏差（ＳＤ）として表す。
＞１０００ｋＤａの酸化マンナンに結合したタンパク質抗原のヒトｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫原性試験
【０２３７】
［タンパク質／ペプチド抗原］
ＭＡＲＴ−１タンパク質は米国のバイオビジョンから購入した。ＧＳＴ−ＭＵＣ１−ＶＮＴＲ（ＦＰ）は、Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓら、１９９３に記載されたように調製した。Ｈｉｓのタグを付けたＭＵＣ１−ＶNＴＲ（ｐＴｒｃ）は、ｐＴｒｃＢベクター（インビトロゲン）（Loveland et al., 2006）にて自分達で調製した。Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１［ＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（天然）（配列番号：１）、ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（類似体）（配列番号：２）］に特異的なＨＬＡ−Ａ２エピトープペプチドは、米国、ゲンスクリプトによって合成された。
【０２３８】
［＞１０００ｋＤａ酸化マンナンへのＧＳＴ−ＭＵＣ１−ＶＮＴＲ（ＦＰ）、ＭＵＣ１−ＶＮＴＲ（ｐＴｒｃ）及びＭＡＲＴ−１の抱合］
過ヨウ素酸＞１０００ｋＤａ酸化マンナンへの抗原の抱合は以前記載されたように実施した。＞１０００ｋＤａマンナンと抗原の比は４０：１だった。
【０２３９】
［ペプチド特異的ＣＤ８Ｔ細胞の生成］
ファイコール・パックＰＬＵＳ（ＧＥヘルスケア）を用いた密度勾配遠心によってバフィコートからＰＢＭＣを分離した。フローサイトメトリーによってＨＬＡ−Ａ２の状態を評価した。完全ＡＢ型培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＡＢ型血清、ペニシリン／ストレプトマイシン、ＨＥＰＥＳ、Ｌ−ＧＬＵＴ、ＮＥＡＡ、ピルビン酸ナトリウム（インビトロゲン）、２−メルカプトエタノール）にて５×１０６個／ｍｌでＰＢＭＣを再浮遊し、２４穴プレートにて１０μｇ／ｍｌのＭＡＲＴ−１類似体ペプチド（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）（配列番号：２）及び３μｇ／ｍｌのＲ８４８（インビトロゲン）によって刺激した。３日後、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｒ＆Ｄシステムズ）、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５及び２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（ペプロテック）で補完した別の１ｍｌのＡＢ型血清を加えた。最初の刺激の７〜１０日後、２μｇ／ｍｌのＦＭＰ又は１０μｇ／ｍｌのＭＡＲＴＩ類似体ペプチド（ＥＬＡ）で感作した放射線照射自己ＰＢＭＣ（１：１００）によって細胞を再刺激した。翌日、１ｍｌの上清を２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含有する新鮮なＡＢ型培地と交換した。これを３〜４日ごとに繰り返した。
【０２４０】
ＦＡＣＳによる選別によってＭＡＲＴ−１特異的なＴ細胞クローンを生成した。ペプチドで感作し、放射線照射（６０００ｃＧｙ）したＴ２細胞との４時間のインキュベートに続いてＦＡＣＳＡｒｉａを用いてＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶペプチド（配列番号：２）に特異的なＩＦＮγ分泌細胞を選別した。製造元のプロトコールに従って実施されるＩＦＮγの分泌検出アッセイ（ミルテニーバイオテック）を用いてＩＦＮγ分泌細胞を特定した。
【０２４１】
刺激タンパク質抗原特異的なＴ細胞応答
ＣＤ１４マイクロビーズ（ミルテニーバイオテック）を用いた自動ＭＡＣＳ分離によってＰＢＭＣから単球を精製した。Ｔ７５フラスコにて５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦと２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４（Ｒ＆Ｄシステムズ）を含有する完全ＦＣＳ培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＣＳ＋Ｌ−ＧＬＵＴ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ＨＥＰＥＳ、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、２−メルカプトエタノール）において単球（５×１０５個／ｍｌ）を５〜６日間培養することによって単球由来の樹状細胞（ＭｏＤＣ）を生成した。
【０２４２】
完全ＡＢ型培地における２×ｌ０５／ｍｌのＭｏＤＣ（１：２０のＭｏＤＣ：Ｔ細胞で）を２４穴プレート（試験条件当たり１ｍｌ）に入れ、その後、タンパク質又は＞１０００ｋＤａ酸化マンナン抱合体を加えた。４時間後、１ｍｌの完全ＡＢ型培地にて４×１０６個のＣＤ１４欠損ＰＢＭＣをウェルに加えた。３日後、２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５を加えた。７〜１０日後、抗原を負荷した１×１０５個のＭｏＤＣによってＴ細胞を再刺激した。再刺激の２４時間後、２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２で培養を補完し、３〜４日後再び補完した。Ｔ細胞の培養は通常、１又は２回の再刺激後分析した。
【０２４３】
［抗原特異的なＴ細胞応答の分析］
Ｔ細胞エピトープペプチドについて−  １．２５μｇ／ｍｌのβ２ミクログロブリンを伴った無血清培地にて無関係なペプチド（たとえば、ＣＡＰ−１の１０μｇ／ｍｌ又はペプチドなし）及び当該ペプチド（５μｇ／ｍｌ）で１時間感作することによってペプチド負荷したＴ２細胞（２×１０5個／ウェル）を調製した。１００μｌにておよそ１：５の比で（４×１０４個／ウェル）でＴ２細胞を２つ組Ｔ細胞ウェルに加え、３７℃で５％ＣＯ２にて１時間インキュベートした。Ｇｏｌｇｉ−Ｓｔｏｐ（Ｔ細胞／ＭｏＤＣ共培養２００μｌ当たり０．１μｌ）を含有する５０μｌの培地を加え、３７℃で５％ＣＯ２にて３〜４時間細胞をインキュベートした。
【０２４４】
タンパク質抗原と抱合体について−  ７５〜１００μｌの完全培地にて２×１０４個のＭｏＤＣ／ウェル（自家又はＡ２が一致）を含有するＶ底９６穴クラスタープレートに抗原又は＞１０００ｋＤａマンナン抱合体（２０μｇ／ｍｌ）を加え、２時間インキュベートした。７５〜１００μｌの完全培地における２×１０５個の刺激されたＴ細胞を各ウェルに加え、３７℃で５％ＣＯ２にて１５〜１６時間、細胞をインキュベートした。Ｇｏｌｇｉ−Ｓｔｏｐ（Ｔ細胞／ＭｏＤＣ共培養２００μｌ当たり０．１μｌ）を含有する５０μｌの培地を加え、３７℃で５％ＣＯ２にて４〜５時間細胞をインキュベートした。
【０２４５】
［細胞内インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）反応の分析］
表面マーカーＣＤ８及びＣＤ４について細胞を染色し、固定し、透過処理をし、次いでＣｙｔｏｆｉｘ／ＣｙｔｏＰｅｒｍキット（ＢＤ）と共にＣＤ４−ＡＰＣ−Ｃｙ７、ＣＤ８−ＦＩＴＣ及びＩＦＮｙ−ＰＥ−Ｃｙ７（ＢＤ）を用いて細胞内ＩＦＮγの蓄積について染色した。当該ペプチド／タンパク質の存在下でのＩＦＮγ＋ＣＤ４及びＣＤ８細胞を無関係のペプチド／タンパク質対照と比較するフローサイトメトリーによって抗原特異的なＴ細胞を特定した。
【０２４６】
実施例２：マンナンの分画
最初に、材料及び方法に記載したように順次膜を通過させて＞３００ｋＤａ、１００〜３００ｋＤａ、５０〜１００ｋＤａ、３０〜５０ｋＤａ、４〜３０ｋＤａのマンナン分画を単離した。その後、マンナン分画、＞１０００ｋＤａ、１００〜３００ｋＤａ、５０〜１００ｋＤａ及び３０〜５０ｋＤａを単離した。4〜3０ｋＤａの分画はガムのような残留物だったので以後の試験には含めなかった。
【０２４７】
３００ｋＤａ、１００ｋＤａ、５０ｋＤａ、３０ｋＤａのメンブレンを介して既知の濃度で既知の体積のマンナンを分画することによって順次分離を行った（図１）。それぞれからの通過分画及び洗浄液は次のメンブレンを通した。分離はすべて水で行い、最後に試料はすべて凍結乾燥し、白色粉末の重量を記録した（表１）。
【０２４８】
表１．酸化マンナンに関する種々の回収分画とアルデヒド残基を示す分画試行の代表的な試料  
【表１】
2013527854.tif 000002
【０２４９】
方法に記載したように０．０１ＭのＮａＩＯ４との反応後に生成したアルデヒド残基について種々の分画を分析した。表１に示すように、マンナン全体、＞３００ｋＤａ、１００〜３００ｋＤａ、５０〜1００ｋＤａ及び３０〜５０ｋＤａの分画はそれぞれ、７３、８２、３５、１９及び９のアルデヒド残基を生じる（たとえば、試行７）。
【０２５０】
実施例３：種々のマンナン分画のマンノース受容体への結合
ｈｕｈ−７細胞は、マンノース受容体を発現しているヒト肝細胞癌腫の細胞である。マンノース−ＢＳＡはマンノース受容体を結合することが知られており、これらの試験で陽性対照としてインキュベートした。マンナン全体及び種々の分画をＦＩＴＣで標識し、ｈｕｈ−７細胞への結合をフローサイトメトリーによって観察した（図５）。
【０２５１】
マンナン全体及び分画すべては用量依存性にｈｕｈ−７細胞に結合した。従って、サイズに関わりなく、マンナン分画はすべてマンノース受容体又はその他のマンノース結合性レクチンを結合する。
【０２５２】
実施例４：マンナン及びマンナンの種々の分画によるＢＭＤＣの活性化
マンナンの種々の分画がＢＭＤＣを活性化するかどうか及び分画がマンナン全体よりも優れるかどうかを確認するために、様々な用量及び様々な時間で分画をＤＣと共にインキュベートし、成熟マーカーＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６をフローサイトメトリーでモニターした（図６）。図６に示すように、分画は用量依存性にＤＣを活性化した。＞３００ｋＤａの分画はマンナン全体よりも優れていた。
【０２５３】
実施例５：＞１０００ｋＤａマンナン分画の単離
＞３００ｋＤａのマンナン分画がマンナン全体よりも効果的にＢＭＤＣを活性化したので、さらに大きい分子量分画を分析のために単離した。一層さらに大きい分子量の分画を単離するために、マンナン全体を１０００ｋＤａのカットオフメンブレンを伴ったセントリプレップ濃縮器に通した。種々の分画の収率を表２に示す。興味深いことに、３００〜１０００ｋＤａ分画が大きく減少したということは、＞１０００ｋＤａのマンナン分画が以前単離した＞３００ｋＤａマンナン分画では優勢であることを示している。
【０２５４】
実施例６：マンナン全体及び＞３００ｋＤａマンナン分画との＞１０００ｋＤａマンナン分画の活性の比較
４８時間後のＣＤ４０及びＤＣ８６の上方調節をフローサイトメトリーによって観察することにより、ＢＭＤＣを刺激する＞１０００ｋＤａ分画の種々の用量の能力を測定した（それぞれ図７Ａ及び７Ｂ）。＞１０００ｋＤａ分画を＞３００ｋＤａ分画及びマンナン全体と比較し、＞１０００ｋＤａ分画はマンナン全体よりも優れ、＞３００ｋＤａ分画に類似することが明らかであった。
【０２５５】
表２．＞１０００ｋＤａマンナン分画を単離する分画試行の代表的な試料
【表２】
2013527854.tif 000003
【０２５６】
実施例７：マンナン分画の分子量の分析
上記で見られたように、マンナンの種々の分画はＢＭＤＣを活性化し、マンノース受容体に結合することができ、＞１０００ｋＤａのマンナン分画は生物学的に最も活性のある分画である。しかしながら、分画の生化学的特性を分析できることは、一連の規格を設定できるように分画の相対的な分子量を得ることができることと共に重要である。本発明者らはすでに、種々のマンナンがＮａＩＯ４で酸化された場合、異なった数のアルデヒド基を生成することを示している（表１及び２）。
【０２５７】
マンナンのマンノース含量を測定するレゾシノールアッセイもマンナンの様々な分画の特定の手段として使用することができる（図８）。
【０２５８】
マンナンは電荷を持たない炭水化物であり、親水性が高く、その結果、タンパク質の解析で使用されるＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で移動しない。頻繁には、炭水化物は、解析のために電化と疎水性特性を組み込むように化学的に修飾される。これらの特性を組み込むには、酸化マンナンをＡＮＴＳと反応させる。未処理のＰＡＧＥゲル上のＡＮＴＳで標識されたマンナン分画の解析は（図９）は、その相対的分子量に基づいては分離しなかった。
【０２５９】
しかしながら、ＡＮＴＳ標識の分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した場合、それらは分画した分子量（メンブレンカットオフ）に類似するパターンで移動した（図１０）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをデンシトメータ解析で走査し、使用した（図１１）。通常のタンパク質基準も使用した。これによって、異なった確定したタンパク質が広がる（広がったバンド）バンドに割り当てられる分子量範囲が可能になる。幾つかの分画の泳動からのマンナンを解析して解析を検証した。既知の分子量（タンパク質又はマンナン分画）及び相対距離比（Ｒｆ）から標準曲線を生成した。Ｒｆは、特定のバンドによる移動距離で割った全移動距離として定義される（図１２）。標準曲線に基づいて種々のマンナン分画の相対的な分子量を算出した（図１３及び１４）。
【０２６０】
実施例８：ＭＵＣ１−ＦＰのマンナンへの抱合
方法で記載したようにマンナンの種々の分画をＭＵＣ１−ＦＰに抱合させた。分画に比べてマンナン全体では生成されたアルデヒド基の分子量及び数が異なるので、使用するＦＰの量はＭＵＣ１−ＦＰとアルデヒドのモル比として標準化した。加えて、ＭＵＣ１−ＦＰの量の範囲を抱合し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図１５）。
【０２６１】
実施例９：マウスにおける＞１０００ＭＦＰ及びＭＦＰのｉｎ  ｖｉｖｏ活性
上述のようにマンナン全体と＞１０００ｋＤａマンナンを調製し、ｉｎ  ｖｉｖｏの免疫原性試験に用いた。
【０２６２】
マンナン全体に連結したＭＵＣ１の免疫原性を確認するために、０、１０、１７日目及び１４日に１０μｇの用量で＞１０００ｋＤａマンナン、抱合体又はＭＵＣ１−ＦＰをマウスに経皮注射した。マウスを安楽死させ、ＥＬＩＳｐｏｔ解析によって細胞性の応答を解析した（図１６）。免疫したマウスからの脾細胞培養にて種々の用量のＭＵＣ１−ＦＰに対する抗原特異的なＩＦＮγの応答を測定した。図１６に示すように、ＭＵＣ１−ＦＰ、ＭＦＰ及び＞１０００ＭＦＰで免疫したマウスの間で細胞性の応答は有意差がなかった。免疫したマウスの血清を抗ＭＵＣ１特異的な総ＩｇＧ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体について調べた（図１７）。興味深いことに、その他の群に比べて、＞１０００ＭＦＰで免疫したマウスは約１０倍高い抗ＭＵＣ１特異的なＩｇＧ２ａの力価を有した。同様のＩｇＧ２ａの偏りは、２回免疫後の血清でも明らかにされた（データは示さず）。
【０２６３】
実施例１０：マンナンの性状と考えられる品質管理アッセイ
マンナンは現在シグマから調達されている。それは、製造管理及び品質管理に関する基準（ＧＭＰ）の標準にあるものではなく、得られただけの情報を図１８に示す。特定の基準に見合うことを保証する製造元からもたらされるかどうかは酵母マンナンにとって重要である。ＰＤＰＨアッセイを用いてアルデヒドを測定し、レゾシノールアッセイを用いてマンノース含量を測定し、ＡＮＴＳアッセイを用いてマンナンの種々のバッチの性状分析をすればよい。
【０２６４】
レゾシノールアッセイを用いてシグマからの５つのバッチのマンナンを分析した。図１９Ａに示すように、バッチがすべて濃度曲線に対して同じ吸光度を示したということは、マンナンにおけるマンノースの同一含量を示している。図１９Ｂはレゾシノールアッセイにおいてマンノースを用いた標準曲線を示す。同様に、ＮａＩＯ４による酸化後のアルデヒド残基について５つのバッチすべてを分析した（図２０）。
【０２６５】
３回の独立した測定から、アルデヒド残基の数は９０〜１５５残基の間で変化することを見ることができる。従って、生成されたアルデヒド残基が１２５±２０％であれば、マンナンについての規格は合格として設定され得る。同様に、蛍光の測定のためにＰＤＰＨの代わりにＡＮＴＳと酸化マンナンを反応させることができる（図２１）。興味深いことに、このアッセイでのバッチすべてにおける変動も約±２０％である。
【０２６６】
実施例１１：ＧＳＴ−ＭＵＣ１−ＶＮＴＲ（ＦＰ）
抱合
前に記載したように＞１０００ｋＤａ酸化マンナンにＦＰを抱合した（＞１００ＭＦＰ）（図２２）。
【０２６７】
＞１０００ｋＤａ酸化マンナンに連結したＦＰの免疫原性
酸化マンナン−ｐＴｒｃによる反復免疫、その後のＭＵＣ１特異的Ｔ細胞の選別と増殖によってＭＵＣ１特異的なＴ細胞株を生成した。ＭＵＣ１特異的なＴ細胞株にＭＵＣ１を提示する、マンナン抱合体で感作した同種ＤＣ（ＢＣ１６）の能力を検討した。図２３に示すように＞１０００ＭＦＰはＭＵＣ１特異的なＴ細胞株を刺激することができた。＞１０００ＭＦＰは１０μｇ／ｍｌ及び２０μｇ／ｍｌの用量で非抱合のＦＰよりもＴ細胞の刺激において有効だった。
【０２６８】
実施例１２：ＭＵＣ１−ＶＮＴＲ（ｐＴｒｃ）
抱合
＞１０００ｋＤａ酸化マンナンにＭＵＣ１−ＶＮＴＲ（ｐＴｒｃ）を抱合した（図２４）。種々の量のｐＴｒｃを＞１０００ｋＤａ酸化マンナンと反応させて最適な比を確認した。１：４０（１／２ｘ、レーン５）の抗原：マンナンの比での抱合体を免疫原性試験に用いた。
【０２６９】
＞１０００ｋＤａ酸化マンナンに抱合させたＭＵＣ１−ＶＮＴＲの免疫原性
凍結ＭｏＤＣ（凍結、ＢＣ１７Ｋ）によってリコールしたｐＴｒｃ（ＭＵＣ１）Ｔ細胞株（ドナーＢＣ１３由来）を介して、＞１０００ｋＤａ酸化マンナンに連結したｐＴｒｃの免疫原性を確認した（図２５）。示すように、ｐＴｒｃは有効には処理されず、ＭＵＣ１特異的Ｔ細胞に提示されなかった。しかしながら、＞１０００ｋＤａ抱合体は非抱合のｐＴｒｃよりも効果的にＭＵＣ１特異的Ｔ細胞を刺激した。２０μｇのｐＴｒｃ、＞１０００ｋＤａ／ｐＴｒｃ抱合体で感作した自己ＭｏＤＣを用いて、健常ドナーＢＣ１７Ｋに由来するＭＵＣ１特異的Ｔ細胞株からのＭＵＣ１特異的ＣＤ８応答をリコールした（図２６）。＞１０００ｋＤａ酸化マンナン抱合体は非抱合の抗原に比べてＣＤ８Ｔ細胞における細胞内ＩＦＮγ分泌を効率的に刺激した。
【０２７０】
実施例１３：ＭＡＲＴ−１
抱合
上述のように＞１０００ｋＤａ酸化マンナンに組換えＭＡＲＴ−１タンパク質も連結させた（図２７）。通常型と還元型のＭＡＲＴ−１によって２種類の抱合体を作製した。ＭＡＲＴ−１タンパク質は幾つかのシステインを有するので空気酸化し、凝集する傾向がある。抱合を円滑にするために、ＭＡＲＴ−１を先ずＤＴＴで還元し、次いで抱合に用いた。
【０２７１】
ＭＡＲＴ−１＞１０００ｋＤａマンナン抱合体の免疫原性
ペプチドによるＴ細胞の刺激及びリコール
実施例１に記載したようにＭＡＲＴ−１及び＞１０００ｋＤａ酸化マンナン抱合体（２０μｇ／ｍｌ）による刺激に２人のドナー（ＢＣ２８及びＢＣ２９）に由来するＰＢＭＣ及びＭｏＤＣを用いた。１回目の刺激後、感作したＴ２細胞を用いて類似体及び天然のＭＡＲＴ−１ペプチド特異的なＴ細胞応答を測定した（図２８）。＞１０００ｋＤａ酸化マンナン−ＭＡＲＴ−１で刺激したＢＣ２８ドナーのＴ細胞は、Ｔ２細胞によって提示された類似体又は天然のＭＡＲＴ−１ペプチドに効率的に応答した（図２８）。ＢＣ２８とＢＣ２９の培養を各タンパク質と抱合体で再刺激し、自己の感作ＭｏＤＣを抗原提示細胞として用いてＭＡＲＴ−１タンパク質特異的なＴ細胞応答について調べた（図２９）。＞１０００ｋＤａ酸化マンナン抱合体で刺激したＢＣ２８ドナーとＢＣ２９ドナーのＴ細胞にて、感作したＭｏＤＣはＭＡＲＴ−１特異的なＣＤ８Ｔ細胞応答をリコールすることができた。ＭＡＲＴ−１＞１０００ｋＤａ酸化マンナンによる刺激は非抱合のタンパク質よりも刺激において効率的だった。
【０２７２】
実施例１４：不活化インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１）と＞１０００ｋＤａマンナンの混合物によるｉｎ  ｖｉｖｏ免疫原性試験
インフルエンザウイルス及びマウス
卵で増殖させたＨ１Ｎ１（Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９）ウイルスをスクロース勾配で精製し、濃縮し、β−プロピオラクトンで不活化して、インフルエンザに関する参照及び研究にためのＷＨＯ共同研究センター（オーストラリア、北メルボルン）の副所長であるＩａｎ  Ｂａｒｒ博士に供与されたインフルエンザのゾーンプール（ＩＺＰ）を創った。マウスはすべてＷＥＨＩ（オーストラリア、メルボルン）によって供給されたＢＡＬＢ／ｃメスであり、最初の免疫時、８〜１０週齢だった。
【０２７３】
Ｈ１Ｎ１／＞１０００ｋＤａマンナン混合物の生成
それぞれの所望の用量が５０μｌに含有されるようにＨ１Ｎ１ストック（２．７ｍｇ／ｍｌから）及び＞１０００ｋＤａマンナンストック（１４ｍｇ／ｍｌから）を希釈することによってＨ１Ｎ１／＞１０００ｋＤａマンナン混合物を生成した。＞１０００ｋＤａマンナンは以前記載されたように単離した。
【０２７４】
免疫
免疫はすべて鼻内経路を介して投与した。完全に麻酔して（メトキシフルオランの吸入を介して）、直立に保持している間に、およそ５μｌの液滴を各鼻孔に交互にピペットで穏やかに入れた。
【０２７５】
血清及びＢＡＬ（気管支−肺胞洗浄／肺洗浄）の回収
記載されたように眼窩後出血によって血清を回収した。ＢＡＬの回収の前に、ケタミンとキシラジルのカクテルでマウスを安楽死させた。組織を取り除いて上部気管を露出し、その中で小さく切開した。１ｍｌのシリンジに取り付けた先端を鈍化した針の助けを借りて、１ｍｌのＰＢＳを穏やかに肺に送り、引き戻した。
【０２７６】
抗体力価のＥＬＩＳＡ測定
ＨＲＰ／ＴＭＢシステムを用いてＥＬＩＳＡを行った。１μｇ／ｍｌの濃度で不活化Ｈ１Ｎ１（Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９）全体でプレートをコートした。直接結合したラット抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（ＧＥヘルスケア、製品番号ＲＰＮ１２３ＩＶ）を用いて抗Ｈ１Ｎ１総ＩｇＧを検出し、ファーミンゲンのビオチン標識一次抗体（製品番号５５３４４１、５５３３８８及び５５６９７８）とＧＥヘルスケアのストレプトアビジン−ＨＲＰ二次抗体（製品番号３４６４８０）を用いてＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＡを検出した。滴定における最後の値として最終力価を測定し、相当する対照の値より上にあったが、その際、対照は各滴定時点の未処理のマウス血清（３〜５匹）の平均ＯＤ値＋２ＳＤとして算出した。
【０２７７】
０日目と１４日目に、４匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群をＨ１Ｎ１（１μｇ）又は＞１０００ｋＤａマンナン（１００μｇ）と混合したＨ１Ｎ１によって鼻内で免疫した。最後の免疫の１０〜１４日後に、マウスの血清と肺の分泌物をＨ１Ｎ１特異的なＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＡ抗体について分析した。図３０に見られるように、＞１０００ｋＤａマンナンは血清ＩｇＧ１の応答を高めた。さらに重要なことに、＞１０００ｋＤａマンナンは血清及び肺のＨ１Ｎ１特異的ＩｇＡを高めるのに有効だった。
【０２７８】
広く記載されているように本発明に対して多数の変形及び／又は改変を行ってもよいことが当業者によって十分に理解されるであろう。従って、本実施形態はあらゆる点で説明に役立つものであり、限定するものではないとみなされるべきである。
【０２７９】
本明細書で議論され、及び／又は参照された出版物はすべてその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２８０】
本明細書に含まれている文書、行為、物質、装置、物品などの議論は単に本発明の文脈を提供する目的のためのものである。それは、これらのことのすべて又は一部が従来技術の基礎の一部を形成する、又は本出願の各クレームの優先日の前に存在するかのように本発明に関連する分野における共通する一般知識であったという承認として解釈されるべきではない。
【０２８１】
本発明は、２０１０年５月１０日に出願された米国特許第６１／３３３，０８６号、２０１０年５月１０日に出願されたＡＵ２０１０９０１９９７及び２０１０年９月９日に出願されたＡＵ２０１０９０４０６０からの優先権を主張するが、それらの内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２８２】
（参考文献）
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【図１１Ａ】
2013527854.tif 000005
【図１１Ｂ】
2013527854.tif 000006
【図２９】
2013527854.tif 000007
【図１】
2013527854.tif 000008
【図２】
2013527854.tif 000009
【図３】
2013527854.tif 000010
【図４】
2013527854.tif 000011
【図５】
2013527854.tif 000012
【図６Ａ】
2013527854.tif 000013
【図６Ｂ】
2013527854.tif 000014
【図６Ｃ】
2013527854.tif 000015
【図７Ａ】
2013527854.tif 000016
【図７Ｂ】
2013527854.tif 000017
【図８】
2013527854.tif 000018
【図９】
2013527854.tif 000019
【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図３０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年3月9日(2012.3.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンナンを含む免疫刺激組成物であって、マンナンの少なくとも７５％が約１０００ｋＤａより大きい組成物。
【請求項２】
マンナンが酸化されている請求項１の組成物。
【請求項３】
酸化マンナンを含む免疫刺激組成物であって、マンナンの少なくとも７５％が少なくとも１５０のアルデヒド基を有する組成物。
【請求項４】
酸化マンナンを含む免疫刺激組成物であって、マンナンの少なくとも７５％が約１０００ｋＤａより大きく、且つ少なくとも１５０のアルデヒド基を有する組成物。
【請求項５】
マンナン及び少なくとも１つの抗原又はそれをコードする核酸を含むワクチン組成物であって、マンナンの少なくとも７５％が約１０００ｋＤａより大きい組成物。
【請求項６】
マンナンが酸化されている請求項５の組成物。
【請求項７】
酸化マンナンが、少なくとも１つの抗原に共有結合されている請求項６の組成物。
【請求項８】
酸化マンナンが、ポリカチオンを介して少なくとも１つの核酸に抱合されている請求項６の組成物。
【請求項９】
少なくとも１つの抗原又はそれをコードする核酸に抱合される前に、酸化マンナンの少なくとも７５％が少なくとも１５０のアルデヒド基を有する請求項７又は８の組成物。
【請求項１０】
マンナンが酵母に由来する請求項１〜９のいずれか１項の組成物。
【請求項１１】
マンナンの少なくとも９０％が約１０００ｋＤａより大きい請求項１〜１０のいずれか１項の組成物。
【請求項１２】
マンナンの少なくとも９５％が約１０００ｋＤａより大きい請求項１〜１０のいずれか１項の組成物。
【請求項１３】
酸化マンナンの少なくとも９０％が少なくとも１５０のアルデヒド基を有する請求項４又は９の組成物。
【請求項１４】
酸化マンナンの少なくとも９５％が少なくとも１５０のアルデヒド基を有する請求項４又は９の組成物。
【請求項１５】
アミノナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＡＮＴＳ）で標識した後のマンナンのサイズ分布が、タンパク質基準に基づいて約１５０〜約２５０Ｄａの間であり、及び／又は炭水化物基準に基づいて約８００〜約３０００ｋＤａの間である請求項１〜１４のいずれか１項の組成物。
【請求項１６】
抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、原虫抗原、真菌抗原、又は腫瘍抗原、自己抗原、又はアレルゲンである請求項５〜１５のいずれか１項の組成物。
【請求項１７】
粘膜投与、局所投与、皮内投与、筋肉内投与、皮下投与又は静脈内投与のために製剤化されている請求項１〜１６のいずれか１項の組成物。
【請求項１８】
少なくとも１つの許容可能なキャリアをさらに含む請求項１〜１７のいずれか１項の組成物。
【請求項１９】
対象において免疫応答を誘導する及び／又は高める方法であって、請求項１〜１８のいずれか１項の組成物を対象に投与することを含む方法。
【請求項２０】
少なくとも１つの抗原又はそれをコードする核酸を投与することを含む請求項１９の方法。
【請求項２１】
マンナン及び少なくとも１つの抗原又はそれをコードする核酸を順次又は同時に投与する請求項２０の方法。
【請求項２２】
請求項５〜１８のいずれか１項に記載のワクチン組成物としてマンナン及び少なくとも１つの抗原又はそれをコードする核酸を投与する請求項２０の方法。
【請求項２３】
病原体に対して対象を免疫する請求項１９〜２２のいずれか１項の方法。
【請求項２４】
癌療法にて使用するための請求項１９〜２２のいずれか１項の方法。
【請求項２５】
組成物が、粘膜に、局所で、皮内に、筋肉内に、皮下に又は静脈内に投与される請求項１９〜２４のいずれか１項の方法。
【請求項２６】
対象が鳥類又は哺乳類である請求項１９〜２５のいずれか１項の方法。
【請求項２７】
哺乳類がヒトである請求項２６の方法。
【請求項２８】
対象において免疫応答を誘導する及び／又は高めるための薬物を製造するための請求項１〜１８のいずれか１項の組成物の使用。
【請求項２９】
対象において免疫応答を誘導する及び／又は高めるための請求項１〜１８のいずれか１項の組成物の使用。
【請求項３０】
ｉｎ  ｖｉｔro又はｅｘ  ｖｉｖｏにてマクロファージ、樹状細胞及び／又はＣＴＬを活性化する方法であって、請求項１〜１８のいずれか１項の組成物に細胞を接触させることを含む方法。
【請求項３１】
少なくとも１つの核酸を細胞に送達する組成物であって、組成物が少なくとも１つの核酸及びマンナンを含み、マンナンの少なくとも７５％が約１０００ｋＤａより大きい組成物。
【請求項３２】
マンナンが酸化されている請求項３１の組成物。
【請求項３３】
ポリカチオンを介して酸化マンナンが少なくとも１つの核酸に抱合されている請求項３２の組成物。
【請求項３４】
少なくとも１つ核酸に抱合される前に、酸化マンナンの少なくとも７５％が少なくとも１５０のアルデヒド基を有する請求項３３の組成物。
【請求項３５】
少なくとも１つの核酸を細胞に送達する方法であって、請求項３１〜３４のいずれか１項の組成物に細胞を接触させることを含む方法。
【請求項３６】
細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏにある請求項３５の方法。
【請求項３７】
遺伝子治療又は遺伝子ワクチン接種のために少なくとも１つの核酸が細胞に送達される請求項３５又は３６の方法。
【請求項３８】
遺伝子治療又は遺伝子ワクチン接種のための薬物を製造するための請求項３１〜３４のいずれか１項の組成物の使用。
【請求項３９】
遺伝子治療又は遺伝子ワクチン接種のための請求項３１〜３４のいずれか１項の組成物の使用。
【請求項４０】
請求項１〜１８又は３１〜３４のいずれか１項の組成物を調製する方法であって、
ｉ）マンナンを含む組成物を得ること、
ｉｉ）サイズに基づいて工程ｉ）の組成物を分画すること、
ｉｉｉ）マンナンを含む１以上の分画を選択し、１以上の分画におけるマンナンの少なくとも７５％が約１０００ｋＤａより大きいこと、及び
ｉｖ）少なくとも１つのその他の化合物と工程ｉｉｉ）のマンナンを任意で混合する又は抱合すること、を含む方法。
【請求項４１】
少なくとも１つのその他の化合物が、抗原又はそれをコードする核酸である請求項４０の方法。
【請求項４２】
工程ｉｖ）の前にマンナンを酸化する工程をさらに含む請求項４０又は４１の方法。
【請求項４３】
酸化マンナンの少なくとも７５％が少なくとも１５０のアルデヒド基を有する請求項４２の方法。
【請求項４４】
請求項５〜１８のいずれか１項のワクチン組成物を調製する方法であって、
ｉ）マンナンの少なくとも７５％が１０００ｋＤａより大きいマンナンを含む組成物を得ること、及び
ｉｉ）少なくとも１つの抗原又はそれをコードする核酸と工程ｉ）の組成物を混合し又は抱合し、それによってワクチン組成物を調製することを含む方法。
【請求項４５】
工程ｉｉ）の前にマンナンを酸化する工程をさらに含む請求項４４の方法。
【請求項４６】
酸化マンナンの少なくとも７５％が少なくとも１５０のアルデヒド基を有する請求項４５の方法。
【請求項４７】
マンノースを含む炭水化物ポリマーを含む組成物を選択する方法であって、
ｉ）マンノース含む炭水化物ポリマーを含む組成物を得ること、
ｉｉ）工程ｉ）の組成物のサイズ分布及び／又はアルデヒド含量を分析すること、及び
ｉｉｉ）所望のサイズ及び／又はアルデヒド含量を含むのであればその組成物を選択することを含む方法。
【請求項４８】
サイズ分布が
ｉ）組成物の一部を酸化すること、
ｉｉ）工程ｉ）の酸化された生成物をアミノナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＡＮＴＳ）で標識すること、、及び
ｉｉｉ）工程ｉｉ）のＡＮＴＳ標識された生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離することによりサイズ分布を分析すること
によって分析される請求項４７の方法。
【請求項４９】
アルデヒド含量が、
ｉ）組成物の一部を酸化すること、
ｉｉ）工程ｉ）の酸化された生成物を３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）と反応させること、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の生成物を還元剤と反応させて２−ピリジンチオンを放出させること、及び
ｉｖ）２−ピリジンチオンの放出を測定すること
によって分析される請求項４７又は４８の方法。
【請求項５０】
還元剤がジチオスレイトール（ＤＴＴ）である請求項４９の方法。
【請求項５１】
２−ピリジンチオンの放出が、ＯＤ３４３ｎｍの吸光度にて分光光度法によって測定される請求項４９又は５０の方法。
【請求項５２】
過ヨウ素酸ナトリウムによって組成物が酸化される請求項４８〜５１のいずれか１項の方法。
【請求項５３】
工程ｉ）の組成物の純度を決定することをさらに含む請求項４７〜５２のいずれか１項の方法。
【請求項５４】
純度が、
ｉ）水和硫酸の存在下でレゾルシノール（１，３−ジヒドロキシベンゼン）と組成物の一部を反応させ、
ｉｉ）ＯＤ４３０〜４８０ｎｍにて吸光度を測定し、
ｉｉｉ）標準に対して吸光度を比較することによって
炭水化物ポリマーの糖含量を定量することにより決定される請求項５３の方法。
【請求項５５】
マンノースを含む炭水化物ポリマーを含む組成物を調製する方法であって、
ｉ）炭水化物ポリマーがアルデヒド基を含む、マンノースを含む炭水化物ポリマーを含む組成物を得ること、
ｉｉ）サイズに基づいて組成物を分画すること、及び
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の所望のサイズ分布及び／又はアルデヒド含量を持つ炭水化物ポリマーを含む１以上の分画を選択し、それによって組成物を調製することを含む方法。
【請求項５６】
マンノースを含む炭水化物ポリマーを含む組成物を調製する方法であって、
ｉ）マンノースを含む炭水化物ポリマーを含む組成物を得ること、
ｉｉ）サイズに基づいて組成物を分画すること、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）から得られた１以上の分画を酸化すること、及び
ｉｖ）工程ｉｉｉ）の所望のサイズ分布及び／又はアルデヒド含量を持つ炭水化物ポリマーを含む１以上の分画を選択し、それによって組成物を調製することを含む方法。
【請求項５７】
工程ｉｉ）の前に、請求項４７〜５４のいずれか１項の方法を用いて組成物が選択される請求項５６の方法。
【請求項５８】
工程ｉｉ）が、接線流濾過、サイズ排除クロマトグラフィ及び／又は限外濾過によって実施される請求項５５〜５７のいずれか１項の方法。
【請求項５９】
１以上の分画が過ヨウ素酸ナトリウムによって酸化される請求項５６〜５８のいずれか１項の方法。
【請求項６０】
選択の前に１以上の分画のアルデヒド含量を分析することをさらに含む請求項５５〜５９のいずれか１項の方法。
【請求項６１】
アルデヒド含量が、
ｉ）１以上の分画の一部を３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）と反応させること、
ｉｉ）工程ｉ）の生成物を還元剤と反応させて２−ピリジンチオンを放出させること、、及び
ｉｉｉ）２−ピリジンチオンの放出を測定することによって分析される請求項６０の方法。
【請求項６２】
還元剤がジチオスレイトール（ＤＴＴ）である請求項６１の方法。
【請求項６３】
２−ピリジンチオンの放出が、ＯＤ３４３ｎｍの吸光度にて分光光度法によって測定される請求項６１又は６２の方法。
【請求項６４】
１以上の選択された分画のサイズ分布を分析することをさらに含む請求項５５〜６３のいずれか１項の方法。
【請求項６５】
サイズ分布が、
ｉ）１以上の分画の一部をアミノナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＡＮＴＳ）で標識することと
ｉｉ）工程ｉ）の１以上のＡＮＴＳ標識した分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離することによってサイズ分布を分析することにより分析される請求項６４の方法。
【請求項６６】
マンノースを含む炭水化物ポリマーが、マンナンであり、及び
（ａ）選択された分画におけるマンナンの分子量は約１０００ｋＤａを超え、ＡＮＴＳで標識した後のサイズ分布はタンパク質基準に基づいて約１５０〜約２５０kＤａの間であり、及び／又は炭水化物基準に基づいて約８００〜約３０００ｋＤａの間であるか；
（ｂ）選択された分画におけるマンナンの分子量は約３００〜約１０００ｋＤａの間であり、ＡＮＴＳで標識した後のサイズ分布はタンパク質基準に基づいて約１５０〜約１７５kＤａの間であり、及び／又は炭水化物基準に基づいて約４００〜約１０００ｋＤａの間であるか；
（ｃ）選択された分画におけるマンナンの分子量は約１００〜約３００ｋＤａの間であり、ＡＮＴＳで標識した後のサイズ分布はタンパク質基準に基づいて約８０〜約１２５kＤａの間であり、及び／又は炭水化物基準に基づいて約９０〜約４００ｋＤａの間であるか；
（ｄ）選択された分画におけるマンナンの分子量は約５０〜約１００ｋＤａの間であり、ＡＮＴＳで標識した後のサイズ分布はタンパク質基準に基づいて約６０〜約８０kＤａの間であり、及び／又は炭水化物基準に基づいて約５０〜約１７５ｋＤａの間であるか；又は
（ｅ）選択された分画におけるマンナンの分子量は約３０〜約５０ｋＤａの間であり、ＡＮＴＳで標識した後のサイズ分布はタンパク質基準に基づいて約５０〜約６０kＤａの間であり、及び／又は炭水化物基準に基づいて約２０〜約５０ｋＤａの間である、請求項６５の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
一実施形態では、マンノースを含む炭水化物ポリマーはマンナンであり、及び
（ａ）選択された分画におけるマンナンの分子量は約１０００ｋＤａを超え、ＡＮＴＳで標識した後のサイズ分布はタンパク質基準に基づいて約１５０〜約２５０kＤａの間であり、及び／又は炭水化物基準に基づいて約８００〜約３０００ｋＤａの間であるか；
（ｂ）選択された分画におけるマンナンの分子量は約３００〜約１０００ｋＤａの間であり、ＡＮＴＳで標識した後のサイズ分布はタンパク質基準に基づいて約１５０〜約１７５kＤａの間であり、及び／又は炭水化物基準に基づいて約４００〜約１０００ｋＤａの間であるか；
（ｃ）選択された分画におけるマンナンの分子量は約１００〜約３００ｋＤａの間であり、ＡＮＴＳで標識した後のサイズ分布はタンパク質基準に基づいて約８０〜約１２５kＤａの間であり、及び／又は炭水化物基準に基づいて約９０〜約４００ｋＤａの間であるか；
（ｄ）選択された分画におけるマンナンの分子量は約５０〜約１００ｋＤａの間であり、ＡＮＴＳで標識した後のサイズ分布はタンパク質基準に基づいて約６０〜約８０kＤａの間であり、及び／又は炭水化物基準に基づいて約５０〜約１７５ｋＤａの間であるか；又は
（ｅ）選択された分画におけるマンナンの分子量は約３０〜約５０ｋＤａの間であり、ＡＮＴＳで標識した後のサイズ分布はタンパク質基準に基づいて約５０〜約６０kＤａの間であり、及び／又は炭水化物基準に基づいて約２０〜約５０ｋＤａの間である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１３】
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【国際調査報告】
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