(57)【要約】  馴化細胞培地を調製するためのプロセスを提供する。該プロセスは、ａ）細胞増殖を補助するのに有効な組成を有する増殖培地において、真核細胞を培養し；ｂ）培養した細胞を増殖培地から分離し；そしてｃ）培養した細胞を、細胞生存を維持するのに適しているが、実質的な細胞増殖を補助するには適していない組成を有する基本培地において維持する工程を含む。細胞は、好ましくは、真皮鞘（ｄｅｒｍａｌ  ｓｈｅａｔｈ）、真皮乳頭（ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ）または真皮線維芽細胞である。組成物は、薬学的組成物として、特に創傷治癒のために有用である。【選択図】図２
2013505011.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
馴化細胞培地を調製するためのプロセスであって：
ａ）細胞増殖を補助するのに有効な組成を有する増殖培地において、真核細胞を培養し；
ｂ）培養した細胞を増殖培地から分離し；
ｃ）培養した細胞を、細胞生存を維持するのに適しているが、実質的な細胞増殖を補助するには適していない組成を有する基本培地において維持する
工程を含む、前記プロセス。
【請求項２】
細胞が、真皮鞘（ｄｅｒｍａｌ  ｓｈｅａｔｈ）、真皮乳頭（ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ）または真皮線維芽細胞である、請求項１記載のプロセス。
【請求項３】
基本培地が、培養細胞導入前に、タンパク質不含である、先行する請求項いずれか記載のプロセス。
【請求項４】
細胞が、マイクロキャリアーに付着して培養される、先行する請求項いずれか記載のプロセス。
【請求項５】
細胞が、増殖培地からの分離後、および基本培地内への導入前に洗浄される、先行する請求項いずれか記載のプロセス。
【請求項６】
工程ｃ）の産物を、続いて、以下の１またはそれより多いプロセス：
ａ）部分的または完全精製；
ｂ）凍結；
ｃ）凍結乾燥；および
ｄ）乾燥
に供する、先行する請求項いずれか記載のプロセス。
【請求項７】
先行する請求項いずれか記載のプロセスによって産生される組成物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項記載のプロセスによって産生される薬学的組成物。
【請求項９】
ＩＬ−６、Ｇｒｏ−α、ＳＤＦ−１、ＦＧＦ−２、ＳＰＡＲＣ、ＰＡＩ−１、ＩＬ−８、コラーゲン、フィブロネクチン、Ｉ−３０９、ＩＬ−１３、ＭＩＦおよびＳＤＦ−１およびＴＧＦ−βタンパク質の１またはそれより多くを含む、請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
創傷治癒のための、請求項８または９記載の薬学的組成物の使用。
【請求項１１】
ａ）真皮鞘細胞、真皮線維芽細胞または真皮乳頭細胞からなる群より選択される、幹細胞潜在能力を保持する分化したヒト細胞を、増殖培地中で培養し；そしてｂ）細胞から培地を分離することによって得られる、馴化細胞培地を含む、薬学的組成物。
【請求項１２】
Ｇｒｏ−α、Ｉ−３０９、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１３、ＭＩＦ、ＰＡＩ−１、ＳＤＦ−１およびＴＧＦ−βタンパク質の１またはそれより多くを含む、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
以下の１またはそれより多いプロセス：
ａ）部分的または完全精製；
ｂ）凍結；
ｃ）凍結乾燥；および
ｄ）乾燥
にさらに供されている、請求項１１または１２記載の組成物。
【請求項１４】
創傷治癒のための、請求項１１〜１３のいずれか一項記載の組成物の使用。
【請求項１５】
薬剤としての、請求項８、９、１１、１２または１３のいずれか一項記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病変および火傷の治療を含む、薬学的、美容的および薬用化粧品適用において使用するための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、複数のタイプの細胞を形成する能力があるため、多くの療法的、美容的および薬用化粧品適用において、非常に興味が持たれている。例えば、ＥＰ  ０９８０２７０を参照されたい。さらに、増殖中の細胞によってタンパク質および他の因子が培地内に分泌されることから生じる、療法的、美容的および薬用化粧品使用のための、幹細胞を含む細胞を増殖させるのに用いられる培地が記載されてきている。例えば、ＵＳ７，１１８，７４６；ＵＳ７，１６０，７２６およびＷＯ２００８／０２０８１５を参照されたい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＥＰ  ０９８０２７０
【特許文献２】ＵＳ７，１１８，７４６
【特許文献３】ＵＳ７，１６０，７２６
【特許文献４】ＷＯ２００８／０２０８１５
【発明の概要】
【０００４】
療法的、美容的および薬用化粧品目的のための代替組成物を同定することが、依然、望ましい。幹細胞の増殖を補助するために使用されたタンパク質性物質が混入していない馴化培地を産生する方法を同定することが特に望ましい。さらに、馴化培地製造のための、有効で、拡大可能な方法を同定することが特に望ましいであろう。
【０００５】
本発明の第一の側面にしたがって、ａ）真皮鞘細胞（ｄｅｒｍａｌ  ｓｈｅａｔｈ  ｃｅｌｌｓ）、真皮線維芽細胞または真皮乳頭細胞（ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ  ｃｅｌｌｓ）からなる群より選択される、幹細胞潜在能力を保持する分化したヒト細胞を、増殖培地中で培養し；そしてｂ）細胞から培地を分離することによって得られる、馴化細胞培地を含む、薬学的組成物を提供する。
【０００６】
本発明の第一の側面において使用可能な増殖培地は、細胞の増殖に十分な培地である。細胞培養法および培地は当該技術分野に周知であり、そしてこれには、血清補充基本培地、血清不含培地、タンパク質不含培地または化学的に定義された増殖培地が含まれる。増殖培地には、典型的には、必須アミノ酸、糖、塩、ビタミン、ミネラル／無機塩、微量金属、脂質およびヌクレオシドが含まれ、そして血清、タンパク質（例えばインスリン、トランスフェリン、増殖因子および他のホルモン）、抗生物質（例えばゲンタマイシン、ストレプトマイシン、ペニシリン）、付着因子（例えばフィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン類）など、細胞増殖を補助するのに必須の多様なさらなる構成要素が補充される。補充は、例えば血清の場合におけるように組み合わせであってもよく、または個々にであってもよい。増殖培地は、特定の細胞タイプが、制御されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境において増殖するための栄養要求を満たすのに必要な構成要素を、細胞に提供する。
【０００７】
１つの態様において、細胞培養プロセスを１つの培養容器中で実施し、細胞を、マイクロキャリアーを含有する培養容器内に直接接種し、望ましい細胞密度に到達するまで、細胞を増殖させる。他の態様において、細胞培養プロセスを、少なくとも２つの別個の細胞培養容器／系、例えば１またはそれより多いシード拡大容器、その後、細胞産生容器中で、実施する。この複数のシード拡大プロセスは、好ましくは、最終産生細胞培養容器の接種に十分な数の細胞が得られるまで、サイズが増加する培養容器を使用する。シード拡大培養容器は、同じタイプ（例えば組織培養フラスコ、振盪フラスコ、ローラーボトル、スピナーフラスコ、ウェーブ・バイオリアクター、攪拌タンクバイオリアクター）であるが、シードの拡大が進むにつれてサイズが増加するものであってもよいし、または産生バイオリアクターへのトランスファーに備えて、シード培養が拡大するにつれてサイズが増加する、培養系の混合であってもよい（例えば、組織培養フラスコから振盪フラスコ、さらにスピナーフラスコ、さらに攪拌タンクバイオリアクター系）。
【０００８】
典型的には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境を制御して、最適増殖温度、溶解酸素、二酸化炭素、ｐＨおよび浸透圧を維持する。多くの細胞培地配合物が当該技術分野に知られるか、またはこれらは、商業的供給源から容易に得られうる。細胞培養期間に渡って、細胞の増殖を可能にする増殖培地中に細胞を植え付けることによって、馴化細胞培地を産生可能であることが、当業者に知られる。細胞培養終了時、または培養中の選択した時点で、細胞を取り除き、そして馴化培地を採取する。馴化培地は、元来の細胞培養増殖培地の構成要素の多くを含有するであろうが、それに加えてまた、細胞によって分泌された細胞代謝産物およびさらなるタンパク質も含有するであろう。分泌されるタンパク質は、生物学的に活性である増殖因子、サイトカイン、プロテアーゼおよび他の細胞外タンパク質およびペプチドであってもよい。多くの態様において、本発明の第一の側面にしたがって、組成物は、Ｇｒｏ−α、Ｉ−３０９、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１３、ＭＩＦ、ＰＡＩ−１、ＳＤＦ−１およびＴＧＦ−βタンパク質、特にＴＧＦ−β１の１またはそれより多くを含む。
【０００９】
本発明の第二の側面にしたがって、馴化細胞培地を調製するためのプロセスであって：
ａ）細胞増殖を補助するのに有効な組成を有する増殖培地において、真核細胞を培養し；
ｂ）培養した細胞を増殖培地から分離し；
ｃ）培養した細胞を、細胞生存を維持するのに適しているが、実質的な細胞増殖を補助するには適していない組成を有する基本培地において維持する
工程を含む、前記プロセスを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は「アレイパネルＡ」膜を用いた馴化培地の分析結果を示す。
【図２】図２は馴化培地中で同定されたサイトカインの相対レベルを示す。
【図３】図３は濃縮馴化培地のＥＺＢｌｕｅ染色ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
【図４】図４は馴化培地試料中のヒトＴＧＦ−β１レベルを示す。
【図５】図５は馴化培地試料中のヒトＩＬ−６レベルを示す。
【図６】図６は馴化培地試料中のヒトＩＬ−８レベルを示す。
【図７】図７は馴化培地試料中のヒトＰＡｌ−１レベルを示す。
【図８】図８はマウス抗ＳＰＡＲＣ抗体とインキュベートした馴化培地試料のウェスタンブロットの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の第二の側面において使用可能な真核細胞は、‘Ｂａｓｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ’  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００２）  Ｊ．  Ｍ．  Ｄａｖｉｓ監修；および  ‘Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ’  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  （２０００）  Ｊｏｈｎ．  Ｒ．  Ｗ．  Ｍａｓｔｅｒｓ監修に記載され；これらはどちらも、その全体が本明細書に援用される。用語「幹細胞」は、複数の組織タイプの細胞を生じさせうる細胞を記載する。幹細胞は、胚、胎児または成人由来の細胞であり、指示を提供する特定のシグナル伝達複合体を提示された際に、異なる細胞タイプになる能力を有する。異なるタイプの幹細胞がある。精子が卵を受精させると、単一の全能性細胞（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）が形成され、そして該細胞は、それによって生物全体を形成する能力を有する。受精後、最初の数時間に、この細胞は、同一の全能性細胞に分裂する。受精後およそ４日間、および数周期の細胞分裂後、これらの全能性幹細胞は、特殊化し始める。全能性細胞がより特殊化し始めると、これらは次いで、「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）」と称される。多能性細胞は、体内のすべての細胞タイプに分化可能であるが、胎盤、または胎児発生に必要な支持組織は生じない。多能性細胞の分化に関する潜在能力は「完全」ではないため、こうした細胞は「全能性」とは称されず、そしてこれらは胚ではない。多能性幹細胞は、さらなる特殊化を経て、多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞になり、これらは、特定の機能のために特殊化された特定の系譜の細胞に分化するよう拘束されている。多分化能細胞は、由来する組織に見られる細胞タイプに分化可能であり；例えば、間葉系幹細胞、例えば真皮鞘、真皮乳頭および真皮線維芽細胞などの多分化能（成人）幹細胞がある。
【００１２】
細胞は、成人、新生児または胎児組織に由来してもよく、そして自家または同種であってもよい。当該技術分野においてよく確立された方法を用いて、細胞を遺伝子修飾してもよい。例えばタンパク質を上方または下方制御するか、新規タンパク質を導入するか、あるいはイオン濃度を制御するため、遺伝子修飾を用いて、細胞増殖馴化細胞培地または馴化基本細胞培地内に分泌される１またはそれより多い構成要素の濃度を改変することも可能である。
【００１３】
特定の態様において、細胞は、共培養として増殖する。共培養細胞は、一緒に増殖する、２またはそれより多い異なる種類の細胞の混合物である。
第二の側面のプロセスにおいて使用されるのに適した細胞は、当該技術分野に知られる方法によって得られうる。特に、細胞を組織から単離し、先に確立された細胞ストックから拡大し、継代し、そして培養して、細胞増殖馴化細胞培地または馴化基本細胞培地を産生してもよい。未分化または分化細胞を用いて、細胞増殖馴化細胞培地または馴化基本細胞培地を産生してもよい。
【００１４】
本発明の第二の側面のプロセスにおいて使用される細胞は、好ましくは、真皮鞘細胞、真皮線維芽細胞または真皮乳頭細胞からなる群より選択される、幹細胞潜在能力を保持する、分化したヒト細胞である。
【００１５】
本発明の第二の側面において使用可能な増殖培地は、第一の側面に関して上述する通りである。所望の細胞密度が達成されるまで、増殖培地中で細胞を培養する。
本発明の第二の側面において使用される基本培地は、細胞生存を維持するのに適した組成を有し、例えば細胞溶解を回避するｐＨおよび浸透圧を有するが、実質的な細胞増殖を補助せず、そして好ましくは細胞増殖をまったく補助しない組成を有する。基本培地は、無機塩、アミノ酸、ビタミン、および糖を含むエネルギー供給源を含むが、血清、タンパク質、ホルモンおよび付着因子などの構成要素を補充されない。好ましいエネルギー供給源はグルタミンを含む。基本培地は、培養細胞導入前に、タンパク質不含であり、そして培養細胞導入後に、基本培地にタンパク質補充剤はまったく添加されない。基本培地の組成は、培養細胞の生存を維持し、基本培地内への細胞代謝産物および分泌物の搬出を可能にするように選択される。使用可能な基本培地の例には、エイムス培地、イーグル基本培地、クリック培地、ダルベッコの修飾イーグル培地、ハム栄養混合物Ｆ−１２、グラスゴー最小必須培地、イスコーブの修飾ダルベッコ培地、最小必須培地イーグルおよびＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。
【００１６】
本発明の第二の側面の多くの好ましい態様において、増殖培地からの分離後、および基本培地内への導入前に細胞を洗浄する。細胞に適した洗浄溶液の例が当該技術分野に周知であり、そしてこれには、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液が含まれる。いくつかの好ましい態様において、使用する洗浄溶液は、上述のものなどの基本培地であり、そして一般的に、細胞において、同じ基本培地が続いて維持されるものとする。
【００１７】
基本培地内への培養細胞の導入は、細胞増殖期間終了時に達成されるのと同じ細胞濃度であってもよいし、またはより好ましくは、基本培地内への分泌構成要素の濃度が増加するよう、より高い濃度であってもよい。細胞を２Ｄ培養中で増殖させる場合、細胞を、一般的に、非常に集密な（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）単層を生じるように増殖させる。こうした細胞濃度は、典型的には、１ｘ１０４〜１ｘ１０５細胞／ｃｍ２、好ましくは２ｘ１０４〜５ｘ１０４細胞／ｃｍ２である。こうした非常に集密な細胞単層はまた、２Ｄ様式で、基本培地と接触する場合にも使用される。マイクロキャリアーに付着させるなど、細胞を３Ｄ培養中で増殖させる場合、細胞を、一般的に、１ｘ１０７〜１ｘ１０１２細胞／リットル、好ましくは１ｘ１０８〜１ｘ１０１０細胞／リットルの範囲の濃度に増殖させる。多くの態様において、２Ｄまたは３Ｄ培養いずれかで、使用する基本培地の体積は、細胞増殖を補助するのに使用した培地体積よりも、最大１５、一般的には２〜１０、好ましくは４〜６、例えば約５倍低い。
【００１８】
培養される細胞は、培地が所望の組成を有するまで、基本培地中、一般的には１２時間より長い、典型的には１８〜２６時間、例えば約２４時間の期間、一般的に維持される。この再インキュベーション期間終了時、細胞を取り除いて、細胞不含馴化基本細胞培地を生じる。馴化基本細胞培地は、細胞代謝産物および分泌タンパク質を含有するであろう。分泌タンパク質は、生物学的に活性である増殖因子、サイトカイン、プロテアーゼならびに他の細胞外タンパク質およびペプチドであってもよい。
【００１９】
培養中の細胞を記載するために、多様な用語が用いられる。「細胞培養」は、一般的に、生存している生物から採取され、そして制御された条件下で増殖する細胞を指す。初代細胞培養は、最初の継代培養前の、生物から直接採取された細胞、組織または臓器の培養物である。細胞は、増殖および／または分裂を促進する条件下で、増殖培地中に置かれた際、培養中で拡大し、より大きな細胞集団を生じる。細胞株は、初代細胞培養の１またはそれより多い継代培養によって形成される細胞集団である。継代培養の各周期は、継代と呼ばれる。継代期間中に多くの集団倍加がありうることが、当業者によって理解されるであろう。
【００２０】
係留依存性または付着依存性細胞は、組織培養における増殖および成長のために、表面に付着する必要がある細胞である。いくつかの態様において、本発明を実施するのに用いられる細胞は、懸濁培養中で増殖することが可能である。本明細書において、懸濁適格性細胞は、大きく堅固な凝集物を作製することなく、懸濁中で増殖可能な細胞、すなわち、単分散であるかまたは凝集体あたり数細胞のみを含む緩い凝集体で増殖する細胞である。懸濁適格性細胞には、限定なしに、適応または操作を伴わずに懸濁中で増殖する細胞、および付着依存性細胞が懸濁増殖に次第に適応することによって、懸濁適格性になっている細胞が含まれる。こうした細胞を用いる場合、細胞増殖は、懸濁中で実行可能であり、したがって、マイクロキャリアーを、産生バイオリアクター自体における最終増殖期および産生期においてのみ用いてもよい。懸濁適応細胞の場合、用いられるマイクロキャリアーは、典型的には多孔キャリアーであり、ここで、細胞は、キャリアーの内部構造内部の物理的捕捉の手段によって付着される。
【００２１】
本明細書において、用語「マイクロキャリアー」は、細胞付着および増殖に適した、小さい別個の粒子を意味する。常にではないが、しばしば、マイクロキャリアーは、ポリマーから形成される多孔性ビーズである。マイクロキャリアーはまた、凹みを含む密な表面を有してもよい。通常、細胞は、こうしたビーズの外表面に付着し、そしてその上で増殖する。
【００２２】
本発明のプロセスは、細胞増殖を導く条件下で細胞を培養することによって行われる。培養条件、例えば温度、ｐＨ、溶解酸素（低酸素条件を含む）等は、特定の細胞に最適であることが知られるものであり、そしてこの分野の当業者には明らかであろう（例えば、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  第２版，  Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，  Ｄ．およびＨａｍｅｓ，  Ｂ．  Ｄ．監修，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）を参照されたい）。
【００２３】
本発明の第一および第二の側面において、細胞は、固体支持体媒体に付着して好適に培養される。大規模産生のためのオプションには、組織培養フラスコ、ローラーボトル、灌流に基づく系（例えば中空ファイバーバイオリアクター、内部および外部スピンフィルター、聴覚細胞保持デバイス、ろ過に基づく細胞保持デバイス）、単一、複数プレートまたは積み重ねプレート細胞培養系、細胞キューブ、およびマイクロキャリアーが含まれる。細胞はまた、細胞が付着することが可能であり、そして細胞が１より多い層で増殖することが可能である、任意の材料およびまたは形状で構成される三次元足場を用いて培養されてもよい。フレームワークの構造には、メッシュ、スポンジが含まれてもよく、あるいはヒドロゲルで形成されてもよい。１つの適切な三次元フレームワークは、ＩｎｔｅｇｒａＴＭ皮膚再生テンプレート（Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。細胞を三次元足場上で直接培養してもよいし、あるいは、細胞増殖馴化細胞培地または馴化基本細胞培地を産生するために、三次元足場上に再植え付けする前に、組織培養フラスコ、ローラーボトル、中空ファイバー系、単一、複数プレートまたは積み重ねプレート細胞培養系、細胞キューブ、およびマイクロキャリアーから採取してもよい。細胞はまた、灌流細胞培養を用いても培養可能である。灌流細胞培養において、フィルター（例えば内部または外部スピンフィルター）、細胞保持メッシュ、細胞定着材（ｓｅｔｔｌｅｒ）、聴覚デバイスなどの細胞保持デバイスを用いて、細胞をバイオリアクター中に保持する。細胞培養増殖培地を連続してまたは定期的にバイオリアクターに供給し、そして細胞不含「消費」培地を連続してまたは定期的に取り除く。
【００２４】
特定の好ましい態様において、細胞を固相マイクロキャリアー表面に付着させるか、あるいはマイクロキャリアーがゼラチン（加水分解したコラーゲン）マイクロキャリアーである際の多孔性マイクロキャリアーの内部構造である、内部の物理的捕捉に細胞を付着させるか、または細胞が該物理的捕捉によって付着される。こうしたマイクロキャリアーは、ゼラチン粒子、架橋ゼラチン粒子、あるいはポリスチレンまたはガラス粒子などのキャリアー材料上のコーティングとして用いられるゼラチンを含んでもよい。ゼラチンは、天然供給源由来であってもよいし、あるいは組換え的または合成的に産生されてもよい。
【００２５】
いくつかの態様において、細胞培養プロセスを１つの培養容器中で行う。マイクロキャリアーを含有する培養容器内に、細胞を直接接種し、そして所望の細胞密度に到達するまで、細胞を増殖させる。増殖した細胞を含有するマイクロキャリアーを無菌的に採取し、そして洗浄する。次いで、洗浄したマイクロキャリアーを基本培地中に再懸濁して、そして最適条件下でインキュベーションして、一定期間（典型的には２４時間）、細胞生存を維持する。次いで、馴化培地を採取する。洗浄工程を１回または複数回行ってもよい。
【００２６】
他の態様において、細胞培養プロセスを少なくとも２つの別個の細胞培養容器／系、例えば１またはそれより多いシード拡大容器、その後、細胞産生容器中で実施する。この複数のシード拡大プロセスは、好ましくは、最終産生細胞培養容器の接種に十分な数の細胞が得られるまで、サイズが増加する培養容器を使用する。シード拡大培養容器は、同じタイプ（例えば組織培養フラスコ、振盪フラスコ、ローラーボトル、スピナーフラスコ、ウェーブ・バイオリアクター、攪拌タンクバイオリアクター）であるが、シードの拡大が進むにつれてサイズが増加するものであってもよいし、または産生バイオリアクターへのトランスファーに備えて、シード培養が拡大するにつれてサイズが増加する培養系の混合であってもよい（例えば、組織培養フラスコから振盪フラスコ、さらにスピナーフラスコ、さらに攪拌タンクバイオリアクター系）。
【００２７】
望ましい場合、マイクロキャリアーが細胞培養容器の底に定着するのを可能にし、その後、最大すべてのそしてすべてを含む、選択した割合の増殖培地体積を取り除き、マイクロキャリアーを場合によって洗浄し、そして対応する割合の新鮮な細胞培養増殖培地を細胞培養容器に添加することによって、培地交換を行ってもよい。次いで、マイクロキャリアーを培地中に再懸濁し、そして培養を続ける。所望の細胞密度が達成されるまで、培地除去および交換のこのプロセスを反復してもよい。
【００２８】
本発明の方法で使用可能なゼラチンマイクロキャリアーは、典型的には、およそ球状であるが、他の形状を有してもよく、そして多孔性または固形のいずれであってもよい。多孔性および固形タイプのマイクロキャリアーはどちらも、供給業者から商業的に入手可能である。多孔性ゼラチンマイクロキャリアーは商業的に入手可能であり、例えば、Ｐｅｒｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｙｔｉｃａ  ＡＢ、スウェーデンから入手可能な「Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ」マイクロキャリアーがある。ゼラチンマクロ多孔性マイクロキャリアーは、粒子が、非常に架橋されたゼラチンマトリックスに基づき、１０〜５００μｍの粒子サイズであり、そして直径１〜５０μｍを有する多数の腔を封入するポリマーマトリックスからなる。細胞付着のためにマイクロキャリアーを使用すると、係留依存性細胞の増殖のため、攪拌タンクおよび関連するバイオリアクターを使用することが容易になる。細胞は、一般的に、懸濁された粒子に付着する。懸濁が望ましいために、典型的には、使用可能なマイクロキャリアーの物理的パラメーターは限定される。マイクロキャリアー粒子サイズ範囲は、一般的に、係留依存性細胞タイプに適応するために十分に大きく、一方、攪拌フラスコ、ローラーボトル、スピナーフラスコ、ウェーブ・バイオリアクターおよび攪拌タンクバイオリアクター系などの細胞培養バイオリアクターにおいて使用するのに適した特性を持つ懸濁物を形成するために十分に小さい。ゼラチンまたはコラーゲンは、リジンのアミン基を介して、グルタミン酸またはアスパラギン酸のカルボキシル基を介して、あるいはその組み合わせで架橋可能である。
【００２９】
細胞は、増殖されるかまたは維持されてきた培地から、当該技術分野に知られる方法によって、例えば細胞定着およびデカント、バッチまたは連続遠心分離および／または微量ろ過を用いて、分離される。得られる細胞不含培地をさらにプロセシングして、例えば限外ろ過、ダイアフィルトレーションまたはクロマトグラフィー精製を用いて、１またはそれより多い因子または構成要素を濃縮するかまたは減少させてもよい。
【００３０】
本発明の第二の側面のプロセスにおいて産生される馴化培地は、好ましくは薬学的組成物として使用される。したがって、こうした薬学的組成物は、本発明の第三の側面を形成する。薬学的組成物、特に真皮鞘細胞、真皮線維芽細胞または真皮乳頭細胞に由来するものは、一般的に、創傷および病変治癒に有用に使用される。組成物はまた、培地構成要素が有効であることが知られる他の適用のためにも使用可能である。
【００３１】
好ましい組成物は、ＩＬ−６、Ｇｒｏ−α、ＳＤＦ−１、ＦＧＦ−２、ＳＰＡＲＣ、ＰＡＩ−１、ＩＬ−８、コラーゲン、フィブロネクチン、Ｉ−３０９、ＩＬ−１３、ＭＩＦおよびＳＤＦ−１およびＴＧＦ−βタンパク質、特にＴＧＦ−β１の１またはそれより多くを含む。特に好ましい組成物は、表２、３または４に列挙するタンパク質の１またはそれより多くを含む。
【００３２】
本発明の第一および第三の側面の組成物を、液体として、薬剤として使用してもよく、あるいは、凍結するか、凍結乾燥するか、フィルムを形成するか、または粉末になるように乾燥してもよい。組成物を希釈するか、濃縮するか、他の構成要素と混合するか、あるいは部分的にまたは完全に精製してもよい。任意の適切な手段によってヒトまたは動物の体に組成物を送達してもよい。馴化培地を、内部投与のためのビヒクルとしての薬学的に許容されうるキャリアーと一緒に配合するか、創傷／病変に直接適用するか、局所適用のため、軟膏（ｓａｌｖｅまたはｏｉｎｔｍｅｎｔ）とともに配合するか、あるいは例えば創傷包帯、移植可能組成物および医学的デバイス用のコーティングを生成するための生物分解性ポリマーまたはヒドロゲルにするか、またはこれらに添加するか、またはこれらの中に分散させてもよい。生物分解性ポリマー内に分散させる１つの利点は、系を徐放送達系用に使用可能であることである。これは、ポリマーから慢性創傷に生物活性構成要素を送達するために特に好適であり、これによって、創傷のタンパク質分解性環境から迅速に分解されるのに抵抗し、そして生物活性構成要素が持続して放出されるはずである。当業者には、送達法が、送達しようとする馴化培地に対する特定のｉｎ  ｖｉｖｏ適用に依存することが明らかであろうし、そして当業者は、適宜、どの手段を使用するか決定することが可能であろう。
【００３３】
組織は、細胞の代わりにまたは細胞に加えて、細胞からの分泌物を適用されることによって、内因性組織修復の増進を通じて再生または修復可能である。本発明は、最適な組織修復およびリモデリングには、複数のタンパク質の異なる発現／分泌を伴う複数の複合プロセスが必要であるという前提に基づく。本発明において産生される馴化培地は、組織修復、リモデリングおよび創傷治癒において重要であると考えられ、そして例えば創傷治癒のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて、枯渇していることが示されている制御タンパク質の多くを含有する。こうしたタンパク質の例には、ＴＧＦ−β、ＩＬ−６、Ｇｒｏ−α、ＳＤＦ−１、ＦＧＦ−２、ＳＰＡＲＣ、ＰＡＩ−１、ＩＬ−８、コラーゲン、フィブロネクチン、Ｉ−３０９、ＩＬ−１３、ＭＩＦおよびＳＤＦ−１が含まれる。
【００３４】
ＴＧＦ−β１は、皮膚創傷治癒において、主要なＴＧＦ−βタンパク質である。創傷治癒において、ＴＧＦ−β１は、炎症、血管形成、再上皮形成、および結合組織再生に重要である。ＴＧＦ−β１は、傷害の開始とともに増加した発現を有することが示されている（Ｋｏｐｅｃｋｉ  Ｚ，  Ｌｕｃｈｅｔｔｉ  ＭＭ，  Ａｄａｍｓ  ＤＨ，  Ｓｔｒｕｄｗｉｃｋ  Ｘ，  Ｍａｎｔａｍａｄｉｏｔｉｓ  Ｔ，  Ｓｔｏｐｐａｃｃｉａｒｏ  Ａ，  Ｇａｂｒｉｅｌｌｉ  Ａ，  Ｒａｍｓａｙ  ＲＧ，  Ｃｏｗｉｎ  ＡＪ，  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００７；２１１：３５１−６１．  Ｋａｎｅ  ＣＪ，  Ｈｅｂｄａ  ＰＡ，  Ｍａｎｓｂｒｉｄｇｅ  ＪＮ，  Ｈａｎａｗａｌｔ  ＰＣ，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １９９９；１４８：１５７−７３．）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究によって、ＴＧＦ−β１が、フィブロネクチン、フィブロネクチン受容体、ならびにコラーゲンおよびプロテアーゼ阻害剤を含む、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）形成と関連する遺伝子の発現を増加させることによって、肉芽形成開始を補助することが示されてきている（Ｗｈｉｔｅ  Ｌ  Ａ；  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  Ｔ  Ｉ；  Ｂｒｉｎｃｋｅｒｈｏｆｆ  Ｃ  Ｅ，  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  ａｃｔａ，  ２０００；１４９０（３）：２５９−６８．  Ｍａｕｖｉｅｌ  Ａ，  Ｃｈｕｎｇ  ＫＹ，  Ａｇａｒｗａｌ  Ａ，  Ｔａｍａｉ  Ｋ，  Ｕｉｔｔｏ  Ｊ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９６；２７１：１０９１７−２３．    Ｐａｐａｋｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｕ  Ｅ，  Ａｌｅｔｒａ  ＡＪ，  Ｒｏｔｈ  Ｍ，  Ｔａｍｍ  Ｍ，  Ｋａｒａｋｉｕｌａｋｉｓ  Ｇ，  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ２００３，  ２４：  ２５−３５．  Ｚｅｎｇ  Ｇ，  ＭｃＣｕｅ  ＨＭ，  Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｏ  Ｌ，  Ｍｉｌｌｓ  ＡＪ，    Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １９９６；  ２２８：２７１−６）。さらなるｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究によって、ＴＧＦ−β１が、コラーゲンマトリックスの線維芽細胞収縮を促進することによって、創傷収縮に役割を果たすことが示されてきている（Ｍｅｃｋｍｏｎｇｋｏｌ  ＴＴ，  Ｈａｒｍｏｎ  Ｒ，  ＭｃＫｅｏｗｎ−Ｌｏｎｇｏ  Ｐ，  Ｖａｎ  Ｄｅ  Ｗａｔｅｒ  Ｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２００７；３６０：７０９−１４）。創傷治癒のマトリックス形成およびリモデリング期において、ＴＧＦ−β１は、特にＩ型およびＩＩ型の、コラーゲン産生に関与する（Ｐａｐａｋｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｕ  Ｅ，  Ａｌｅｔｒａ  ＡＪ，  Ｒｏｔｈ  Ｍ，  Ｔａｍｍ  Ｍ，  Ｋａｒａｋｉｕｌａｋｉｓ  Ｇ，  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ２００３；２４：２５−３５）。過剰発現されると、ＴＧＦ−β１は、やはり肥大性およびケロイド瘢痕の発展に重要な役割を果たすことが知られる結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）を刺激することが示されてきている（Ｃｏｌｗｅｌｌ  ＡＳ，  Ｐｈａｎ  ＴＴ，  Ｋｏｎｇ  Ｗ，  Ｌｏｎｇａｋｅｒ  ＭＴ，  Ｌｏｒｅｎｚ  ＰＨ，  Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ａｅｓｔｈｅｔ  Ｓｕｒｇ  ２００５；１１６：１３８７−９０）。
【００３５】
ＩＬ−６は、創傷治癒反応を開始する際に重要であることが示されており、そして創傷形成後に発現が増加し、より古い創傷において持続する傾向がある（Ｓｏｇａｂｅ  Ｙ，  Ａｂｅ  Ｍ，  Ｙｏｋｏｙｍａｎａ  Ｙ，  Ｉｓｈｉｋａｗａ，  Ｏ，  Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅｇｅｎ  ２００６；１４：４５７−６２．  Ｇｒｅｌｌｎｅｒ  Ｗ，  Ｇｅｏｒｇ  Ｔ，  Ｗｉｌｓｋｅ  Ｊ，  Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｃｉ  Ｉｎｔ  ２０００；１１３：２５１−６４．  Ｆｉｎｎｅｒｔｙ  ＣＣ，  Ｈｅｒｎｄｏｎ  ＤＮ，  Ｐｒｚｋｏｒａ  Ｒ，  Ｐｅｒｅｉｒａ  ＣＴ，  Ｏｌｉｖｅｉｒａ  ＨＭ，  Ｑｕｅｉｒｏｚ  ＤＭ，  Ｒｏｃｈａ  ＡＭ，  Ｊｅｓｃｈｋｅ  ＭＧ，  Ｓｈｏｃｋ  ２００６；２６：１３−９）。Ｉｌ−６は、角化細胞に対して、分裂促進性（Ｒａｎｄｌｅ  Ｍ  Ｇａｌｌｕｃｃｉ，  Ｄｕｓｔｉ  Ｋ  Ｓｌｏａｎ，  Ｊｕｌｉｅ  Ｍ  Ｈｅｃｋ，  Ａｎｎｅ  Ｒ  Ｍｕｒｒａｙ  ａｎｄ  Ｓｉｊｙ  Ｊ  Ｏ’Ｄｅｌｌ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  （２００４）  １２２，  ７６４-７７２）および増殖性（Ｓａｔｏ  Ｍ，  Ｓａｗａｍｕｒａ  Ｄ，  Ｉｎａ  Ｓ，  Ｙａｇｕｃｈｉ  Ｔ，  Ｈａｎａｄａ  Ｋ，  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  Ｉ，    Ａｒｃｈ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｒｅｓ  １９９９；２９１：４００−４．  Ｐｅｓｃｈｅｎ  Ｍ，  Ｇｒｅｎｚ  Ｈ，  Ｂｒａｎｄ−Ｓａｂｅｒｉ  Ｂ，  Ｂｕｎａｅｓ  Ｍ，  Ｓｉｍｏｎ  ＪＣ，  Ｓｃｈｏｐｆ  Ｅ，  Ｖａｎｓｃｈｅｉｄｔ  Ｗ，  Ａｒｃｈ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｒｅｓ  １９９８；２９０：２９１−７）の効果があり、そして好中球に対して化学誘引性である。
【００３６】
Ｇｒｏ−α（ＣＸＣＬ１）ケモカインは、ＣＸＣファミリーメンバーであり、そして好中球走化性の強力な制御因子であり、そして急性創傷において上方制御される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究によって、角化細胞遊走を促進することによって、再上皮形成における役割を果たすことが示唆されている（Ｅｎｇｌｅｈａｒｄｔ  Ｅ，  Ｔｏｋｓｏｙ  Ａ，  Ｇｏｅｂｅｌｅｒ  Ｍ，  Ｄｅｂｕｓ  Ｓ，  Ｂｒｏｃｋｅｒ  ＥＢ，  Ｇｉｌｌｉｔｚｅｒ  Ｒ，  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １９９８；１５３：１８４９−６０．  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎ  Ｋ  ＩＩ，  Ｈｒｏｍａｓ  Ｒ，  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００１；１９：３８８−９６）。
【００３７】
ＳＤＦ−１（ＣＸＣＬ１２）は、創傷に対してリンパ球を補充し、そして血管形成を促進することによって、炎症反応において役割を果たす。急性創傷においてホメオスタシスが妨害された際、ＳＤＦ１は、創傷境界で増加したレベルで見られる（Ｔｏｋｓｏｙ  Ａ，  Ｍｕｌｌｅｒ  Ｖ，  Ｇｉｌｌｉｔｚｅｒ  Ｒ，  Ｇｏｅｂｅｌｅｒ  Ｍ，  Ｂｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２００７；１５７：１１４８−５４）。ＳＤＦ−１は、上皮細胞の増殖および遊走を促進する（Ｓａｌｃｅｄｏ  Ｒ，  Ｗａｓｓｅｒｍａｎ  Ｋ，  Ｙｏｕｎｇ  ＨＡ，  Ｇｒｉｍｍ  ＭＣ，  Ｈｏｗａｒｄ  ＯＭ，  Ａｎｖｅｒ  ＭＲ，  Ｋｌｅｉｎｍａｎ  ＨＫ，  Ｍｕｒｐｈｙ  ＷＪ，  Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ  ＪＪ，  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １９９９；１５４：１１２５−３５）。ＳＤＦ−１はまた、角化細胞増殖を増進可能であり、したがって、再上皮形成に寄与しうる（Ｆｌｏｒｉｎ  Ｌ，  Ｍａａｓ−Ｓｚａｂｏｗｓｋｉ  Ｎ，  Ｗｅｒｎｅｒ  Ｓ，  Ｓｚａｂｏｗｓｋｉ  Ａ，  Ａｎｇｅｌ  Ｐ，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  ２００５；１１８（Ｐｔ９）：１９８１−９）。
【００３８】
ＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）は、多様なＥＣＭ構成要素の合成および沈着を制御し、再上皮形成中の角化細胞運動を増加させ（Ｓｏｇａｂｅ  Ｙ，  Ａｂｅ  Ｍ，  Ｙｏｋｏｙｍａｎａ  Ｙ，  Ｉｓｈｉｋａｗａ，  Ｏ，  Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅｇｅｎ  ２００６；１４：４５７−６２．  Ｇｒｅｌｌｎｅｒ  Ｗ，  Ｇｅｏｒｇ  Ｔ，  Ｗｉｌｓｋｅ  Ｊ，  Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｃｉ  Ｉｎｔ  ２０００；１１３：２５１−６４．  Ｄｉ  Ｖｉｔａ  Ｇ，  Ｐａｔｔｉ  Ｒ，  Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ  Ｐ，  Ｃａｒｕｓｏ  Ｇ，  Ａｒｃａｒａ  Ｍ，  Ｂｕｓｃｅｍｉ  Ｓ，  Ｂｏｎｖｅｎｔｒｅ  Ｓ，  Ｆｅｒｌａｚｚｏ  Ｖ，  Ａｒｃｏｌｅｏ  Ｆ，  Ｃｉｌｌａｒｉ  Ｅ，  Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅｇｅｎ  ２００６；１４：２５９−６４）、そして線維芽細胞の遊走を促進し、そして線維芽細胞がコラゲナーゼを産生するのを刺激する（Ｓａｓａｋｉ  Ｔ，  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  １９９２  Ｎｏｖ；１９（１１）：６６４−６）。
【００３９】
ＳＰＡＲＣ（酸性であり、そしてシステインリッチである分泌タンパク質）は、皮膚創傷治癒などの、リモデリングおよび修復中に、異なる組織で発現され（Ｒｅｅｄ  ＭＪ，  Ｐｕｏｌａｋｋａｉｎｅｎ  Ｐ，  Ｌａｎｅ  ＴＦ，  Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ  Ｄ，  Ｂｏｒｎｓｔｅｉｎ  Ｐ，  Ｓａｇｅ  ＥＨ，  Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  １９９３，  ４１：１４６７−１４７７）、再生において機能を有することが示唆される（Ｌｏｕｉｓｅ  Ｈ．  Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，  Ｓｔｉｎｅ  Ｊ．  Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ，  Ｊｅｅｖａ  Ｓｅｌｌａｔｈｕｒａｉ，  Ｄｉｔｔｅ  Ｃ．  Ａｎｄｅｒｓｅｎ，  Ｓｕｓａｎｎｅ  Ｔｈａｙｓｓｅｎ，  Ｄｏｒｔｅ  Ｊ．  Ｓａｎｔ，  Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ  Ｈ．  Ｊｅｎｓｅｎ  ａｎｄ  Ｈｅｎｒｉｋ  Ｄ．  Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，    Ｖｏｌｕｍｅ  ５７（１）：  ２９−３９，  ２００９）。いくつかのマトリックス細胞タンパク質が傷害に反応して発現増加を示す（Ｂｒａｄｓｈａｗ  ＡＤ，  Ｓａｇｅ  ＥＨ，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００１，  １０７：１０４９−１０５４）。ＳＰＡＲＣは、マトリックス細胞糖タンパク質であり、そして細胞とＥＣＭの相互作用を調節する。ＳＰＡＲＣヌルマウスでは、皮膚創傷閉鎖の加速およびコラーゲン沈着の改変が報告されてきている（Ｂｒａｄｓｈａｗ  ＡＤ，  Ｒｅｅｄ  ＭＪ，  Ｓａｇｅ  ＥＨ，  Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ２００２，  ５０：１−１０）。創傷部位での発現パターンおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究から、ＳＰＡＲＣが、創傷治癒の制御に関連付けられてきている（Ｂａｓｕ  Ａ，  Ｋｌｉｇｍａｎ  ＬＨ，  Ｓａｍｕｌｅｗｉｃｚ  ＳＪ，  Ｈｏｗｅ  ＣＣ，  ＢＭＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００１；２：１５．  Ｅｐｕｂ  ２００１  Ａｕｇ  ７）。
【００４０】
ＰＡＩ−１（セルピンＥ１）は、プラスミン生成のための重要な生理学的制御因子である。ＰＡＩ−１は、通常、上皮において、角化細胞によって発現されないが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ創傷傷害後に発現が増加することが示されてきている（Ｒｏｍｅｒ  Ｊ，  Ｌｕｎｄ  ＬＲ，  Ｅｒｉｋｓｅｎ  Ｊ，  Ｒａｌｆｋｉａｅｒ  Ｅ，  Ｚｅｈｅｂ  Ｒ，  Ｇｅｌｅｈｒｔｅｒ  ＴＤ，  Ｄａｎｏ  Ｋ，  Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  Ｐ，  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １９９１，  ９７：８０３−８１１．  Ｓｔａｉａｎｏ−Ｃｏｉｃｏ  Ｉ，  Ｃａｒａｎｏ  Ｋ，  Ａｌｌａｎ  ＶＭ，  Ｓｔｅｉｎｅｒ  ＭＧ，  Ｐａｇａｎ−Ｃｈａｒｒｙ  Ｉ，  Ｂａｉｌｅｙ  ＢＢ，  Ｂａｂａａｒ  Ｐ，  Ｒｉｇａｓ  Ｂ，  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＰＪ，  Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １９９６，  ２２７：１２３−１３４）。創傷治癒においてＰＡＩ−１が役割を果たしていることを裏付ける研究によって、ＰＡＩ−１機能が喪失すると、創傷治癒加速が生じることが示されてきている（Ｊｏｙｃｅ  Ｃ．Ｙ．  Ｃｈａｎ，  Ｄａｎｉｅｌｌｅ  Ａ．  Ｄｕｓｚｃｚｙｓｚｙｎ，  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｊ．  Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ  ａｎｄ  Ｖｉｃｔｏｒｉａ  Ａ  Ｐｌｏｐｌｉｓ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．  ２００１；１５９：１６８１−１６８８）。研究によって、ｕＰＡおよびＰＡＩ−１が、再上皮形成中の角化細胞および結合組織細胞の遊走中、そして創傷治癒に関連する組織リモデリング中、その発現を空間的および時間的の両方で制御されることが示されてきている（Ｒｏｍｅｒ  Ｊ，  Ｌｕｎｄ  ＬＲ，  Ｅｒｉｋｓｅｎ  Ｊ，  Ｒａｌｆｋｉａｅｒ  Ｅ，  Ｚｅｈｅｂ  Ｒ，  Ｇｅｌｅｈｒｔｅｒ  ＴＤ，  Ｄａｎｏ  Ｋ，  Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  Ｐ，  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １９９１，  ９７：８０３−８１１）。
【００４１】
ＩＬ−８発現は、急性創傷において増加し（Ｅ，  Ｔｏｋｓｏｙ  Ａ，  Ｇｏｅｂｅｌｅｒ  Ｍ，  Ｄｅｂｕｓ  Ｓ，  Ｂｒｏｃｋｅｒ  ＥＢ，  Ｇｉｌｌｉｔｚｅｒ  Ｒ，  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １９９８；１５３：１８４９−６０）、そして、角化細胞遊走および増殖の増加によって、再上皮形成において、役割を果たすことが示されてきている（Ｍｉｃｈｅｌ  Ｇ，  Ｋｅｍｅｎｙ  Ｌ，  Ｐｅｔｅｒ  ＲＵ，  Ｂｅｅｔｚ  Ａ，  Ｒｅｉｄ  Ｃ，  Ａｒｅｎｂｅｒｇｅｒ  Ｐ，  Ｒｕｚｉｃｋａ  Ｔ，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  １９９２；３０５：２４１−３．  Ｔｕｓｃｈｉｌ  Ａ，  Ｌａｍ  Ｃ，  Ｈａｓｌｂｅｒｇｅｒ  Ａ，  Ｌｉｎｄｌｅｙ  Ｉ，  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  １９９２  Ｓｅｐ；９９（３）：２９４−８）。ＩＬ−８はまた、白血球において、ＭＭＰの発現も誘導し、組織リモデリングを刺激する（Ｅｎｇｌｅｈａｒｄｔ  Ｅ，  Ｔｏｋｓｏｙ  Ａ，  Ｇｏｅｂｅｌｅｒ  Ｍ，  Ｄｅｂｕｓ  Ｓ，  Ｂｒｏｃｋｅｒ  ＥＢ，  Ｇｉｌｌｉｔｚｅｒ  Ｒ，  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １９９８；１５３：１８４９−６０）。ＩＬ−８は、好中球に対する強力な化学誘引剤であり、したがって、炎症反応に関与する（Ｒｅｎｎｅｋａｍｐｆｆ  ＨＯ，  Ｈａｎｓｂｒｏｕｇｈ  ＪＦ，  Ｋｉｅｓｓｉｇ  Ｖ，  Ｄｏｒｅ  Ｃ，  Ｓｔｉｃｈｅｒｌｉｎｇ  Ｍ，  Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  ＪＭ，  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｒｅｓ．  ２０００  Ｓｅｐ；９３（１）：４１−５４）。さらに、高レベルでＩＬ−８を添加すると、角化細胞増殖および線維芽細胞によるコラーゲン格子収縮が減少する（Ｉｏｃｏｎｏ  ＪＡ，  Ｃｏｌｌｅｒａｎ  ＫＲ，  Ｒｅｍｉｃｋ  ＤＧ，  Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ  ＢＷ，  Ｅｈｒｌｉｃｈ  ＨＰ，  Ｇａｒｎｅｒ  ＷＬ，  Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅｇｅｎ．  ２０００  Ｍａｙ−Ｊｕｎ；８（３）：２１６−２５）。
【００４２】
コラーゲンおよびフィブロネクチン−創傷治癒の増殖期は、血管形成、コラーゲン沈着、肉芽組織形成、上皮形成、および創傷収縮によって特徴付けられる（Ｍｉｄｗｏｏｄ  Ｋ．Ｓ．，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｌ．Ｖ．，  ａｎｄ  Ｓｃｈｗａｒｚｂａｕｅｒ  Ｊ．Ｅ．  ２００４，  Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３６  （６）：  １０３１-１０３７）。線維増殖および肉芽組織形成において、線維芽細胞が増殖し、そしてコラーゲンおよびフィブロネクチンを排出することによって新規ＥＣＭを形成する（Ｍｉｄｗｏｏｄ  Ｋ．Ｓ．，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｌ．Ｖ．，  ａｎｄ  Ｓｃｈｗａｒｚｂａｕｅｒ  Ｊ．Ｅ．  ２００４，  Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３６（６）：  １０３１-１０３７）。線維芽細胞は、創傷形成の２〜５日後、炎症期が終わるにつれて創傷部位に進入し始め、そしてこれらの数は創傷形成の１〜２週間後にピークとなる（ｄｅ  ｌａ  Ｔｏｒｒｅ  Ｊ．，  Ｓｈｏｌａｒ  Ａ．  （２００６），  Ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ：  Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｗｏｕｎｄｓ．  Ｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｃｏｍ，２００８年１月にアクセス）。最初の週が終わるまでに、線維芽細胞は創傷における主な細胞となる（Ｓｔａｄｅｌｍａｎｎ  Ｗ．Ｋ．，  Ｄｉｇｅｎｉｓ  Ａ．Ｇ．  ａｎｄ  Ｔｏｂｉｎ  Ｇ．Ｒ．（１９９８），  Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  １７６（２）：  ２６Ｓ−３８Ｓ）。線維増殖は、創傷形成の２〜４週後に終わる。傷害後、最初の２または３日は、線維芽細胞は、主に増殖し、そして遊走するが、後には、創傷部位において、コラーゲンマトリックスを蓄積する、主な細胞となる（Ｓｔａｄｅｌｍａｎｎ  Ｗ．Ｋ．，  Ｄｉｇｅｎｉｓ  Ａ．Ｇ．  ａｎｄ  Ｔｏｂｉｎ  Ｇ．Ｒ．  （１９９８），  Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  １７６（２）：  ２６Ｓ−３８Ｓ）。正常組織由来の線維芽細胞は、創傷境界から創傷領域内に遊走する。まず、線維芽細胞は、炎症期に形成されたフィブリン痂皮を、遊走するために用い、フィブロネクチンに接着する（Ｒｏｍｏ  Ｔ．  ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｊ．Ｍ．  ２００５，  Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ，  Ｓｋｉｎ．  Ｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｃｏｍ，  ２００６年１２月２７日にアクセス）。次いで、線維芽細胞は、創傷床内に細胞質基質を、そして後にコラーゲンを沈着させ、線維芽細胞は遊走のためにこれらに接着可能である（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  Ｌ．，  ｄｅ  ｌａ  Ｔｏｒｒｅ  Ｊ．  （２００６），  Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ，  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ．  Ｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｃｏｍ，  ２００８年１月２０日にアクセス）。コラーゲン沈着は、創傷強度を増加させるため、重要であると見なされ；コラーゲンが蓄積される前は、フィブリン−フィブロネクチン塊が創傷を閉鎖して保持する（Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ  Ｄ．Ｇ．  （１９９８），  Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３０（９）：  １０１９-１０３０）。��た、炎症、血管形成、および結合組織構築に関与する細胞は、線維芽細胞によって蓄積されたコラーゲンマトリックス上に付着し、その上で増殖し、そして分化する（Ｒｕｓｚｃｚａｋ  Ｚ．  ２００３，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  ５５（１２）：  １５９５-１６１１）。
【００４３】
ヒト・サイトカインＩ−３０９は、多くの炎症性サイトカインに構造的に関連する小さい糖タンパク質であり、血管形成中、ヒト単球を特異的に刺激する（Ｍｉｌｌｅｒ  ＭＤ，  Ｋｒａｎｇｅｌ  ＭＳ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９２ｂ  ８９：２９５０-２９５４）。
【００４４】
一般的に、創傷治療において、増殖因子の直接添加によって、これらの供給を増進させることが望ましいと考えられる。このアプローチを用いると、限定されるわけではないが、免疫適格性および腫瘍形成性などの、細胞に基づく療法に関連する現在の問題は排除されるであろう。本発明の細胞増殖馴化細胞培地および馴化基本細胞培地はまた、組織または損傷の修復および／または再生が望ましい他のタイプの組織損傷の治療にも有用であり、これは、必要であることが知られる多くの一連の因子が、本出願者らの細胞増殖馴化細胞培地および馴化基本細胞培地中に見られるためである。
【００４５】
本発明は、限定なしに、以下の実施例によって例示される。
細胞株の樹立
以下に記載する修飾を伴って、本質的にＥＰ９８０２７０に記載されるように、毛包間葉系細胞を単離した。ヒト皮膚組織試料を、１μｇ／ｍｌアンホテリシンおよび１０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含有する最小必須培地（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ  Ｍ４６５５）で３回洗浄した。解剖顕微鏡下、微細外科ハサミを用いて、成長期「終末小体」を解剖し、そして少量（典型的には１００〜２００μｌ）のＭＥＭ内に入れた。針を用いて終末小体を反転させ、そして乳頭を解剖し、そして鞘を抽出した。次いで、乳頭および鞘を別個に４ウェル細胞培養プレート（Ｎｕｎｃ）に移した。ウェルあたり、１０の乳頭および１０の鞘を、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．５μｇ／ｍｌアンホテリシンおよび５μｇ／ｍｌゲンタマイシンを補充した１ｍｌのＭＥＭ中に移した。無菌および標準的条件（３７℃、５％二酸化炭素）下で４ウェル細胞培養プレートをインキュベーションした。細胞増殖１０日後、各ウェルから細胞を剥がし（当該技術分野でよく確立された標準法を用いる）、そして３５ｍｍ直径細胞培養ディッシュ（Ｎｕｎｃ）に別個に移した。細胞増殖が集密になったら、先に示すように、真皮鞘（本明細書において、以後、「ＡＶＤＳ」と称する）および真皮乳頭（本明細書において、以後、「ＡＶＤＰ」と称する）細胞株を剥がし、そして上述の条件下でさらに拡大するために、Ｔ２５細胞培養フラスコ（Ｎｕｎｃ）に移した。上述の同じヒト皮膚組織試料から、真皮線維芽細胞（本明細書において、以後、「ＡＶＤＦ」と称する）細胞株を樹立した。真皮乳頭層を真皮網状層および脂肪層から分離し、そして次いで顕微鏡下で、およそ２〜３ｍｍ２の表面積の片に解剖した。解剖した組織を、真皮鞘および真皮乳頭細胞株に関して記載するように補充したＭＥＭを含有するＴ２５細胞培養フラスコ（Ｎｕｎｃ）に移した。無菌および標準的条件（先に記載する通り）下で真皮線維芽細胞（ＡＶＤＦ）細胞株を含有するＴ２５細胞培養フラスコをインキュベーションした。次いで、培養が集密に到達したら、同じ条件を用いて、真皮線維芽細胞（ＡＶＤＦ）細胞株をさらに拡大した。
【００４６】
いくつかの異なるヒト組織試料から、ＡＶＤＳ、ＡＶＤＰおよびＡＶＤＦ細胞株を樹立した。以下の実施例に記載するこれらの細胞株の要約を以下の表１に提供する。
表１：細胞株の要約
【００４７】
【表１】
2013505011.tif 000003
【実施例】
【００４８】
実施例１
ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中、静置培養中で増殖したＡＶＤＦ４およびＡＶＤＳ４細胞を採取した（当該技術分野においてよく確立された標準法を用いる）。細胞を用いて、５０ｍｌ  ＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中、フラスコあたり５ｘ１０５細胞で、２２５ｃｍ２フラスコに植え付け、そして第４日に新鮮な培地（ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）と交換し、３７℃、５％ＣＯ２で８日間インキュベーションした。第８日、馴化培地を採取し、ろ過し（０．２μｍ）、そして分析まで、−２０℃で凍結保存した。
【００４９】
キットとともに提供される方法にしたがって、ヒト・サイトカイン・アレイ「パネルＡ」キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＲＹ００５）を用いて、ＡＶＤＦ４およびＡＶＤＳ４由来の馴化培地を分析した。ＡＶＤＦ４およびＡＶＤＳ４増殖培地は１０％のＦＢＳを含有するため、対照として、ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳもまた分析した。得た結果を図１に示す。ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ対照に比較して強度が増加したことが同定されたスポットを、当該技術分野によく記載される方法を用いて定量化した。各膜上で、陽性対照に対して、そしてＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ対照膜上の対応するサイトカインスポットに対して、データを規準化した。図２に示す結果は、二つ組試料由来のＡＶＤＳ４およびＡＶＤＦ４馴化培地中で同定される各サイトカインの相対レベルを示す。驚くべきことに、同定されたサイトカイン（用いた「パネルＡ」キットに含まれるものに限定される）の中で、サイトカイン、Ｇｒｏα、Ｉ−３０９、ＩＬ６、ＩＬ−８、ＰＡＩ−１が、ＡＶＤＳ４およびＡＶＤＦ４細胞株によって産生される馴化培地両方において検出された。これらは、創傷治癒プロセスを促進する際に重要であることが、当該技術分野に確立されてきている。
【００５０】
実施例２
真皮線維芽細胞、真皮鞘および真皮乳頭細胞株から、血清不含馴化培地を調製した。ＡＶＤＦ４、ＡＶＤＳ４およびＡＶＤＰ２細胞を、ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ細胞培養増殖培地中、３７℃、５％ＣＯ２で６日間、静置培養中で増殖させた。細胞を採取し（当該技術分野でよく確立された標準法を用いる）、そして１５ｍｌのＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中、フラスコあたり２ｘ１０６細胞で、７５ｃｍ２フラスコに別個に植え付けるのに用いた。フラスコを３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベーションした。このインキュベーション期間後、各フラスコから増殖培地を取り除き、そして廃棄した。２０ｍｌリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で、細胞単層を注意深く３回洗浄し、そして次いで、２０ｍｌ  ＭＥＭのみ（ＦＢＳなし）でさらに３回洗浄した。次いで、２ｍＭグルタミンを補充した新鮮なＭＥＭ（ＦＢＳなし、６ｍｌ）を各フラスコに添加し、そして３７℃、５％ＣＯ２で、フラスコを２４時間インキュベーションした。各フラスコから馴化基本培地を採取し、ろ過し（０．２μｍ）、そして分析まで、−２０℃で凍結保存した。ＭＥＭ増殖培地（ＦＢＳなし）の試料もまた、対照として含めた。試料（８ｍｌ）を融解し、そしてＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５  Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐデバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を３２００ＲＣＦ、４５分間、室温で用いて、２５０μｌに濃縮した。次いで、Ｓｐｅｅｄｖａｃを用いて、各２００μｌの試料をさらに２倍濃縮した。次いで、４−２０％ＮｕＰａｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いて、各１０μｌの４つの試料を分析し、そしてＥＺＢｌｕｅ（Ｓｉｇｍａ）を用いて染色した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを図３に示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの各レーン（１〜４）を清潔なメスで１０のバンドに切り、ＰｒｏＧｅｓｔ消化ロボットに関する標準法を用いて、４０のバンド各々の中のタンパク質をトリプシンで消化した。当該技術分野によく確立されるように、ＬＣ−ＭＳ−ＭＳを用い、Ｔｈｅｒｍｏ  ＬＴＱ  ＸＬ  Ｏｒｂｉｔｒａｐエレクトロスプレイ質量分析装置を用いて、各５μｌの消化物を分析した。Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｃｓｃｉｅｎｃｅ）およびＳｅｑｕｅｓｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）検索エンジンならびにＰｒｏｔｅｏｍｅＤｉｓｃｏｖｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ）インターフェースを用いて、現在のバージョンのデータベースＳｗｉｓｓｐｒｏｔに対して、ＭＳ−ＭＳスペクトルを検索した。検索パラメータを非常に厳しく（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔｌｙ）（ＦＤＲ＜１％）設定した。ＡＶＤＰ２、ＡＶＤＦ４およびＡＶＤＳ４由来の馴化培地に関して、同定されるタンパク質を、それぞれ、表２、３および４に示す。
【００５１】
表２：ＡＶＤＰ２馴化基本細胞培地において同定されるタンパク質
【００５２】
【表２−１】
2013505011.tif 000004
【００５３】
【表２−２】
2013505011.tif 000005
【００５４】
【表２−３】
2013505011.tif 000006
【００５５】
【表２−４】
2013505011.tif 000007
【００５６】
表３：ＡＶＤＦ４馴化基本細胞培地において同定されるタンパク質
【００５７】
【表３−１】
2013505011.tif 000008
【００５８】
【表３−２】
2013505011.tif 000009
【００５９】
【表３−３】
2013505011.tif 000010
【００６０】
表４：ＡＶＤＳ４馴化基本細胞培地において同定されるタンパク質
【００６１】
【表４−１】
2013505011.tif 000011
【００６２】
【表４−２】
2013505011.tif 000012
【００６３】
【表４−３】
2013505011.tif 000013
【００６４】
【表４−４】
2013505011.tif 000014
【００６５】
驚くべきことに、細胞株ＡＶＤＰ２由来の馴化基本細胞培地において、総数１７７の異なるヒトタンパク質が同定され、細胞株ＡＶＤＦ４由来の馴化基本培地において、１３１の異なるヒトタンパク質が同定され、そして細胞株ＡＶＤＳ４由来の馴化基本培地において、１６７の異なるヒトタンパク質が同定された。これは、比較的短いインキュベーション期間、および馴化基本細胞培地を産生するのに用いた基本細胞培地を考慮すると、特に予期されないことであった。したがって、本文書に記載する細胞は、これらのあらゆるタンパク質、あるいは該細胞によって分泌されるかまたは発現されるいかなるタンパク質または他の分子の供給源としても用いられることが可能である。当業者は、該分析が、当該技術分野において、創傷治癒に重要であることがよく確立されたタンパク質の存在を示すことを認識し、そして新規タンパク質が同定されていることを認識するであろう。当業者には、これらの細胞株間の相違を用いて、どのように馴化基本細胞培地の異なる物理的態様を産生可能であるか、あるいはどのように、馴化基本細胞培地をさらにプロセシングして、例えば限外ろ過、ダイアフィルトレーションまたはクロマトグラフィー精製を用いて、１またはそれより多い因子または構成要素を濃縮するかまたは減少させうるかが明らかであろう。
【００６６】
実施例３
静置培養条件で増殖させた真皮線維芽細胞ＡＶＤＦ３の２２５ｃｍ２細胞培養フラスコ（Ｎｕｎｃ）を剥がし、そして当該技術分野によく記載される方法を用いて、細胞数を決定した。２．３ｘ１０６細胞を用いて、２ｍＭグルタミン（Ｓｉｇｍａ）を補充した総体積３３０ｍｌの血清不含増殖培地中、１．５ｇ／Ｌ  ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ  Ｓマイクロキャリアー（製造者によって記載されるように調製）を含有する１．５Ｌ細胞培養スピナーフラスコに植え付けた。スピナーフラスコのヘッドスペースを５％ＣＯ２、２％Ｏ２ガスで平衡化した。スピナーフラスコを３７℃の細胞培養インキュベーターに移し、そして磁気スターラーベースを用いて、３５ｒｐｍで攪拌した。記載する条件下で４日間インキュベーションした後、スピナーフラスコから３５ｍｌの細胞培養上清を取り除き、そして新鮮な血清不含増殖培地（上記の通り）と交換した。インキュベーション第５日および第７日、５０ｍｌの培養上清を取り除き、そして上記のように、新鮮な血清不含増殖培地と交換した。第８日、８０ｍｌの培養上清を取り除き、そして新鮮な血清不含培地と交換した。総計１０日の培養後、当該技術分野でよく確立された方法を用いて、マイクロキャリアーからＡＶＤＦ３細胞を剥がした。１．３５ｘ１０７細胞を用いて、２ｍＭグルタミン、０．２％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８および１．５ｇ／Ｌ  Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ  Ｓマイクロキャリアー（先に記載されるように調製）を補充した総体積２Ｌの血清不含増殖培地中、ガラス細胞培養バイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）に接種した。温度３６．５℃、ｐＨ７．０（二酸化炭素ガス・スパージングおよび／または水酸化ナトリウム添加によって手動調節）、溶解酸素圧５．０％（空気飽和）および４０ｒｐｍを培養経過中に次第に６０ｒｐｍに増加させる攪拌装置速度で、バイオリアクターを培養した。ＣＯ２およびＮ２ガス・スパージングを用いて、細胞培養中の溶解酸素レベルを維持した。発泡が観察された場合は、エマルジョンＣ消泡剤（Ｓｉｇｍａ）をバイオリアクターに添加した。記載する条件下で４日間インキュベーションした後、バイオリアクターから２００ｍｌの培養上清を取り除き、そして新鮮な血清不含増殖培地（上記の通り）と交換した。第６日、第８日、第１０日、第１１日、第１３日、第１５日、第１７日および第２１日、さらに２００ｍｌの培養上清を取り除き、そして新鮮な血清不含増殖培地（上記の通り）と交換した。１７日間増殖させた後、２００ｍｌの培養物（培地、および細胞が付着したマイクロキャリアー）を無菌的に採取した。採取した培養物を、４つの５０ｍｌコニカル試料試験管に等しくアリコットし、そして細胞が付着したマイクロキャリアーを、重力下で、試料試験管の底に沈降させた。マイクロキャリアー不含培地を注意深く取り除き、そして沈降した、細胞が付着したマイクロキャリアーをＰＢＳでまず３回、そしてＭＥＭ（ＦＢＳなし）でさらに３回洗浄して、消費された微量の増殖培地を元来の細胞培養物から取り除いた。細胞が付着したマイクロキャリアーを最終体積４５ｍｌのＭＥＭ（ＦＢＳなし）＋２ｍＭグルタミンにプールした。この懸濁物を用いて、フラスコあたりおよそ２ｘ１０６細胞で、３つ��Ｅ１２５振盪フラスコに植え付けた。フラスコのヘッドスペースを５％ＣＯ２、２％Ｏ２ガスで平衡化し、そして３７℃、６０ｒｐｍで２４時間、軌道振盪装置に移した。各フラスコから馴化基本培地を採取し、０．２μｍフィルターを用いてろ過し、そして分析まで−２０℃で保存した。
【００６７】
実施例４
静置培養条件で増殖させた真皮線維芽細胞ＡＶＤＰ３の２つの２２５ｃｍ２細胞培養フラスコ（Ｎｕｎｃ）を剥がし、そして当該技術分野によく記載される方法を用いて計数した。２．４ｘ１０６細胞を用いて、４ｍＭグルタミンを補充した総体積３００ｍｌのＭｅｓｅｎＰｒｏ増殖培地（低血清、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、１．５ｇ／Ｌ  ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ  Ｓマイクロキャリアー（先に記載するように調製）を含有する１．５Ｌ細胞培養スピナーフラスコに植え付けた。スピナーフラスコのヘッドスペースを５％ＣＯ２、２％Ｏ２ガスで平衡化した。スピナーフラスコを３７℃の細胞培養インキュベーターに移し、そして磁気スターラーベースを用いて、３５ｒｐｍで攪拌した。記載する条件下で３日間インキュベーションした後、スピナーフラスコから８０ｍｌの細胞培養上清を取り除き、そして新鮮な増殖培地（上記の通り）と交換した。記載する条件下で総計９日間インキュベーションした後、スピナーフラスコから１０ｍｌの試料を採取し、そして当該技術分野によく記載される標準法を用いて、細胞数および細胞生存度を決定した。細胞数および細胞生存度を用いて、マイクロキャリアーに付着してスピナーフラスコ中に保持される生存細胞総数を概算した。スピナーフラスコ由来の、付着した細胞を含むマイクロキャリアーを、先に記載するように、ＰＢＳを用いて洗浄し、次いで、７５ｍｌ  ＭＥＭ（ＦＢＳなし）中に懸濁し、そしてこれを用いて、マイクロキャリアーに付着したおよそ２．５ｘ１０７細胞を１つの２５０ｍｌ振盪フラスコに植え付けた。フラスコのヘッドスペースを５％ＣＯ２、２％Ｏ２ガスで平衡化し、そして３７℃、６０ｒｐｍで２４時間、軌道振盪装置に移した。フラスコから馴化基本細胞培地を採取し、０．２μｍフィルターを用いてろ過し、そして分析まで−２０℃で保存した。
【００６８】
静置培養条件で増殖させた真皮線維芽細胞ＡＶＤＳ６の２つの２２５ｃｍ２細胞培養フラスコ（Ｎｕｎｃ）を剥がし、そして当該技術分野によく記載される方法を用いて計数した。２．４ｘ１０６細胞を用いて、４ｍＭグルタミンを補充した総体積３００ｍｌのＭｅｓｅｎＰｒｏ増殖培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、１．５ｇ／Ｌ  ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ  Ｓマイクロキャリアー（先に記載するように調製）を含有する１．５Ｌ細胞培養スピナーフラスコに植え付けた。フラスコのヘッドスペースを５％ＣＯ２、２％Ｏ２ガスで平衡化した。スピナーフラスコを３７℃の細胞培養インキュベーターに移し、そして磁気スターラーベースを用いて、３５ｒｐｍで攪拌した。記載する条件下で３日間インキュベーションした後、スピナーフラスコから８０ｍｌの細胞培養上清を取り除き、そして新鮮な増殖培地（上記の通り）と交換した。記載する条件下で総計９日間培養した後、スピナーフラスコから１０ｍｌの試料を採取し、そして当該技術分野によく記載される標準法を用いて、細胞数および細胞生存度を決定した。細胞数および細胞生存度を用いて、スピナーフラスコ中に保持される生存細胞総数を概算した。付着した細胞を含むマイクロキャリアーを、先に記載するように、ＰＢＳを用いて洗浄し、次いで、最終体積５４ｍｌ  ＭＥＭ（ＦＢＳなし）中にプールし、そしてこれを用いて、マイクロキャリアーに付着したおよそ１．８ｘ１０７細胞を１つの２５０ｍｌ振盪フラスコに植え付けた。フラスコのヘッドスペースを５％ＣＯ２、２％Ｏ２ガスで平衡化し、そして３７℃、６０ｒｐｍで２４時間、軌道振盪装置に移した。フラスコから馴化基本培地を採取し、０．２μｍフィルターを用いてろ過し、そして分析まで−２０℃で保存した。
【００６９】
実施例５
ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔアレイ技術（Ａｕｓｈｏｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）を用いて、ＡＶＤＦ４、ＡＶＤＳ４およびＡＶＤＰ２（実施例１および２に記載するように調製）、ＡＶＤＦ３（実施例３に記載するように調製）、ならびにＡＶＤＳ６およびＡＶＤＰ３（実施例４に記載するように調製）由来の馴化培地を分析した。ＭＥＭおよびＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ増殖培地を対照として含んだ。Ａｕｓｈｏｎ  ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔタンパク質アレイ技術は、分析物のそれぞれの捕捉抗体が、９６ウェルマイクロプレートの各ウェル内に、アレイ状にスポットされている、分析物の化学発光または蛍光検出に基づく多重化サンドイッチＥＬＩＳＡ系である。ウェルあたり、最大１６の分析物（各ウェル中、４ｘ４アレイ）を測定可能であり、したがって、各試料（５０μｌ）を用いて１６のサイトカインまたは他のバイオマーカーを同時にアッセイ可能である。ＴＧＦβ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＰＡＩ−１レベルに関して試料を分析した。馴化培地／馴化基本培地試料において同定される各タンパク質の濃度を、図４、５、６および７に示す。試料に１〜１０の番号を付け、そしてこれらの試料の同一性を表５に示す。
【００７０】
表５：試料同一性
【００７１】
【表５】
2013505011.tif 000015
【００７２】
図４〜７に示すデータは、創傷治癒に関与する重要なタンパク質（ＴＧＦβ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＰＡＩ−１）を、３つの新規細胞タイプＡＶＤＳ、ＡＶＤＰおよびＡＶＤＦ由来の馴化培地において、検出し、そして定量化することも可能であることを例示する。馴化細胞培地または馴化基本細胞培地中のタンパク質レベルは、用いる細胞濃度および／または増殖培地組成および／または細胞培養系を調整することによって変化しうる。また、用いる細胞培養増殖条件、細胞株のさらなる発展をどのように実施して、マイクロキャリアーに付着する細胞の数を増加させることが可能であるか、そしてこれが、馴化基本細胞培地を産生する際に、タンパク質分泌にどのように影響を及ぼすかが、当業者には明らかであろう。マイクロキャリアーに付着した細胞を用い、２Ｌ攪拌タンク細胞培養バイオリアクターを用いて生成されるデータが、本発明の物理的態様の大規模産生のための、拡大可能であり、そして経済的な製造系である、馴化基本培地の産生を立証することが、当業者には明らかであろう。細胞を拡大するためのマイクロキャリアーに基づくバイオリアクタープロセスが完了した際、マイクロキャリアーを沈降させ、馴化培地を採取し、そして／またはマイクロキャリアーに付着した細胞をｉｎ  ｓｉｔｕで洗浄し、そして基本細胞培地とインキュベーションすることも可能であることがが当業者には明らかであろう。馴化基本培地は、マイクロキャリアーのｉｎ  ｓｉｔｕ沈降（重力沈降）および細胞不含馴化基本細胞培地のデカントによって容易に採取可能である。
【００７３】
実施例６
当該技術分野によく確立されているように、ウェスタンブロッティングによって、ＡＶＤＦ４、ＡＶＤＳ４およびＡＶＤＰ２（実施例１および２に記載するように調製）、ＡＶＤＦ３（実施例３に記載するように調製）、ならびにＡＶＤＳ６およびＡＶＤＰ３（実施例４に記載するように調製）由来の馴化培地を分析した。簡潔には、試料を還元し、そしてＭＥＳ泳動緩衝液を用いて、ＳｅｅＢｌｕｅ分子量マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに、４−１２％ＢｉｓＴｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で泳動した。次いで、試料をＰＶＤＦ膜にトランスファーした。ブロッティング後、膜を１５ｍｌのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）中、ロッキング・プラットフォーム上、室温で１時間インキュベーションした。ブロッキング緩衝液をデカントし、そして膜を８ｍｌの１／２０００希釈のマウス・モノクローナル抗ＳＰＡＲＣ抗体（Ｓｉｇｍａ  ＷＨ０００６６７８Ｍ２）中、４℃で一晩インキュベーションした。次いで、１５ｍｌ  ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中、ロッキング・プラットフォーム上、膜を３回、室温で各５分間洗浄した。８ｍｌの１／１０，０００希釈のウサギ抗マウスＩｇＧ（全分子）−ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ａ９０４４）を添加し、そしてロッキング・プラットフォーム上、室温で１時間インキュベーションした。次いで、１５ｍｌ  ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中、ロッキング・プラットフォーム上、膜を３回、室温で各５分間洗浄した。１５ｍｌの水に溶解したＳＩＧＭＡＦＡＳＴＴＭ  ３，３’−ジアミノベンジジン錠剤（Ｓｉｇｍａ  Ｄ４４１８）中、ロッキング・プラットフォーム上、室温で１５分間インキュベーションすることによって、膜を現像した。ウェスタンブロットの結果を図８に示す。
【００７４】
細胞培養フラスコ、スピナーフラスコおよびバイオリアクターを用いて拡大された、３つの細胞株ＡＶＤＳ、ＡＶＤＰおよびＡＶＤＦのすべて由来の馴化培地は、ＳＰＡＲＣタンパク質の分泌および集積を示す。
【００７５】
実施例７
フィブロネクチンおよびコラーゲンタンパク質の分泌および集積に関して、ドットブロット（当該技術分野によく確立されるように）によって、ＡＶＤＦ４、ＡＶＤＳ４およびＡＶＤＰ２（実施例１および２に記載するように調製）、ＡＶＤＦ３（実施例３に記載するように調製）、ならびにＡＶＤＳ６およびＡＶＤＰ３（実施例４に記載するように調製）由来の馴化培地を分析した。ＰＶＤＦ膜をメタノールで湿らせ、そして次いでＰＢＳ中に浸し、各１０μｌの試料および対照を膜上にスポットした。５０ｎｇおよび５ｎｇの標準（フィブロネクチン−Ｓｉｇｍａ  Ｆ１１４１またはコラーゲン−Ｓｉｇｍａ  Ｃ８９１９）もまた膜上にスポットし、そしてすべてのスポットを１時間風乾した。次いで、膜を再びメタノールで湿らせ、ＰＢＳでリンスし、そして次いで８ｍｌブロッキング緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）中、４℃で一晩インキュベーションした。ブロッキング緩衝液をデカントし、そして膜を、ロッキング・プラットフォーム上、４ｍｌの１／２０００希釈のマウスモノクローナル抗フィブロネクチン抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｆ７３８７）またはマウスモノクローナル抗コラーゲン抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｃ２４５６）いずれかにおいて、室温で２時間インキュベーションした。次いで、８ｍｌ  ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中、ロッキング・プラットフォーム上、膜を３回、室温で各５分間洗浄した。４ｍｌの１／２０００希釈のウサギ抗マウスＩｇＧ（全分子）−ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ａ９０４４）を添加し、そしてロッキング・プラットフォーム上、室温で１時間インキュベーションした。次いで、８ｍｌ  ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中、ロッキング・プラットフォーム上、膜を３回、室温で各５分間洗浄した。１５ｍｌの水に溶解したＳＩＧＭＡＦＡＳＴＴＭ  ３，３’−ジアミノベンジジン錠剤（Ｓｉｇｍａ  Ｄ４４１８）中、ロッキング・プラットフォーム上、室温で１５分間インキュベーションすることによって、膜を現像した。ドットブロットの結果を表６に示す。
【００７６】
細胞培養フラスコ、スピナーフラスコおよびバイオリアクターを用いて拡大された、３つの細胞株ＡＶＤＳ、ＡＶＤＰおよびＡＶＤＦのすべて由来の馴化培地は、コラーゲンタンパク質の分泌および集積を示す。
【００７７】
表６：コラーゲンおよびフィブロネクチンの存在に関する、細胞増殖馴化細胞培地および馴化基本細胞培地の分析
【００７８】
【表６】
2013505011.tif 000016
【００７９】
ＮＤ＝未検出
（１）＝試料において、ＦＢＳによってマスキングされたドット。ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ分析（実施例２）は、コラーゲンの分泌および集積を示す。
【図１】
2013505011.tif 000017
【図２】
2013505011.tif 000018
【図３】
2013505011.tif 000019
【図４】
2013505011.tif 000020
【図５】
2013505011.tif 000021
【図６】
2013505011.tif 000022
【図７】
2013505011.tif 000023
【図８】
2013505011.tif 000024
【国際調査報告】
2013505011.tif 000025
2013505011.tif 000026
2013505011.tif 000027