(57)【要約】  化合物の感作性をスクリーニングするための方法が提供される。この方法はケラチノサイト又はこれら細胞の重要な特徴を共有する細胞に基づいているが、他の成分、たとえば、タンパク質も使用することが可能である。この方法は、アレルギー性接触皮膚炎（ＡＣＤ）、薬物過敏症反応（ＤＨＲ）及び自己免疫疾患を含むが、これらに限定されないいくつかの状態のために重要である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
感作性について化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）試験される化合物を選択された範囲の希釈度まで希釈する工程；
ｂ）選択された量の前記化合物の希釈物を、集密まで増殖させたケラチノサイト細胞の層に添加する工程；
ｃ）前記ケラチノサイト細胞と化合物希釈物とを一緒にインキュベートする工程；
ｄ）前記ケラチノサイト細胞を調べてケラチノサイト小疱形成応答を決定する工程；
ｅ）前記ケラチノサイト小疱形成応答を定量化する工程；及び
ｆ）前記ケラチノサイト小疱形成応答を用いて前記化合物の感作性を決定する工程
を含む上記方法。
【請求項２】
前記ケラチノサイト小疱形成応答が、標準感作物質との比較を用いた小疱形成までの時間、ケラチノサイト細胞がインキュベーション後に小疱を産生した前記化合物の濃度、高濃度の前記化合物での小疱の大きさ、高濃度の前記化合物での小疱の数、並びに／又は小疱における放出されたタンパク質及び／若しくはそのネオエピトープの量というパラメータを用いて決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標準感作物質が、オキサゾロン、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン、ｍＢＢｒ、ｄＢＢｒ、グリオキサール、ホルムアルデヒド及びα−ヘキシル桂皮アルデヒドからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ケラチノサイト小疱形成応答が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び／又はウェスタンブロットによる放出されたタンパク質及び／又はそのネオエピトープの量と種類の決定、膜プローブを使用する放出された小疱の量の測定、表面プラズモン共鳴の決定、水晶振動子マイクロバランス技術、小疱の放出に関して報告する工学的に操作された蛍光システム、蛍光エネルギー移動現象を示す蛍光標識化技法、絶対小疱数を計測するフローサイトメトリーシステム、細胞形態及び小疱放出を分析するハイスループットスクリーニング、小疱形成応答を分析するマイクロフルイディクス、小疱及び／又は細胞により放出される特定のタンパク質及び／又はそのネオエピトープの量を定量化する捕獲システム、光学顕微鏡を使用して及び／又は小疱形成応答を示す細胞を含有する必要な障壁特徴及び侵入特徴を示すインビトロ上皮組織を使用してケラチノサイト小疱形成応答を決定するケラチノサイト細胞の検査、からなる群から選択される方法により定量化される、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ケラチノサイト小疱形成応答が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び／又はウェスタンブロットによる放出されたタンパク質及び／又はそのネオエピトープの量と種類の決定、膜プローブを使用する放出された小疱の量の測定、小疱及び／又は細胞により放出される特定のタンパク質及び／又はそのネオエピトープの量を定量化する捕獲システム、光学顕微鏡を使用してケラチノサイト小疱形成応答を決定するケラチノサイト細胞の検査からなる群から選択される方法により定量化される、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記小疱形成応答が、溶液蛍光を用いて溶液中の小疱膜の量を測定することにより、水性媒体中では非蛍光性であるが膜内に挿入されると強い蛍光性になる膜プローブを用いて定量化される、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記膜プローブがＦＭ１−４３である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記小疱形成応答が、小疱及び／又はケラチノサイト細胞により放出されるタンパク質及び／又はそのネオエピトープの量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び／又はウェスタンブロットを通じて決定することにより定量化される、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記放出されるタンパク質及び／又はそのネオエピトープが、ケラチン５、ケラチン１４、ケラチン１、ケラチン１０、ケラチン８、ケラチン１８、グルコース−６−ホスファターゼイソメラーゼ、移行型小胞体ＡＴＰアーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、カルモジュリン、インポーチン５、ケラチン６（Ａ、Ｂ及びＣ）、スタスミン、トランスゲリン−２、１４−３−３タンパク質シグマ、カルレティキュリン、エンドプラスミン、ヒートショックプロテイン９０、アクチンベータ、アクチンガンマ、アルファアクチニン、コフィリン１、エズリン、フィブロネクチン、ミオシン１ｃ、プラスチン２、プラスチン３、チューブリンベータ２Ｃ、アネキシン２、ペルオキシレドキシン１、ＳＳＡ／Ｒｏリボ核タンパク質、アルファエノラーゼ、並びにペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼＡからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記放出されるタンパク質及び／又はそのネオエピトープが、ケラチン５及びケラチン１４を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
インキュベーション後、ケラチノサイト細胞の層から液体を吸引する工程、インキュベーション期間中に離昇した可能性のある小疱をケラチノサイト細胞から分離する工程、小疱を溶解する工程、及び全タンパク質濃度を測定することにより小疱形成応答を定量化する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
小疱が、遠心分離を用いてケラチノサイト細胞から分離される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記小疱形成応答が、アレルギー性接触皮膚炎、薬物誘導過敏症応答、化学的に誘導された喘息、食物アレルギーからなる群から選択される病気、及び／又は化合物との上皮接触を通じて引き起こされることのある他の病気についての予測的インビトロ試験として利用される、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記小疱形成応答を用い、関連するヒト上皮細胞を使用して薬物誘導過敏症反応を引き起こす純粋形態、又は混合物、製剤及び溶液での化合物のリスクを計測する、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物の感作性を用いて、アレルギー性接触皮膚炎におけるリスクを評価する、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物の感作性を用いて、前記化合物の自己免疫疾患を引き起こす能力を決定する、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記化合物の感作性を用いて、前記化合物の小疱形成を阻害する能力を決定する、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記化合物の感作性を用いて、前記化合物の薬物誘導過敏症を引き起こす能力を評価する、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
感作性について化合物をスクリーニングするためのケラチノサイト細胞の使用。
【請求項２０】
前記化合物の感作性を用いて、前記化合物のアレルギー性接触皮膚炎を引き起こす能力を決定する、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記化合物の感作性を用いて、前記化合物の自己免疫疾患を引き起こす能力を決定する、請求項１９に記載の使用。
【請求項２２】
前記化合物の感作性を用いて、前記化合物の薬物誘導過敏症を引き起こす能力を決定する、請求項１９に記載の使用。
【請求項２３】
前記化合物の感作性を用いて、前記化合物の食物アレルギーを引き起こす能力を決定する、請求項１９に記載の使用。
【請求項２４】
化合物との上皮接触により引き起こされることがある状態に対する感作潜在力について化合物、混合物、製剤、及び溶液をインビトロスクリーニングするための製品であって、
ａ）標準化された濃度の試験物質；
ｂ）ケラチノサイト細胞培養物；及び
ｃ）少なくとも１つの標準感作物質
を含む、上記製品。
【請求項２５】
前記製品が、アレルギー性接触皮膚炎、自己免疫疾患、薬物誘導過敏症反応、食物アレルギー、及び自己中毒のリスクからなる群から選択される状態についてスクリーニングする、請求項２５に記載の製品。
【請求項２６】
感作性について化合物、混合物、製剤又は溶液をスクリーニングするためのキットであって、
ａ）少なくとも１つのケラチノサイト細胞培養物；
ｂ）前記少なくとも１つのケラチノサイト細胞培養物を集密的増殖まで増殖するための手段；
ｃ）前記化合物、混合物、溶液の製剤を選択された範囲の希釈度まで希釈するための手段；
ｄ）前記少なくとも１つのケラチノサイト細胞培養物を増殖するための手段及び希釈するための手段を使用するための使用説明書
を含む、上記キット。
【請求項２７】
少なくとも１つの標準感作物質をさらに含む、請求項２６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的には免疫学に関する。さらに具体的には、本発明は化合物の感作性をスクリーニングするための方法に関する。本方法は、アレルギー性接触皮膚炎（ＡＣＤ）、薬物過敏症反応（ＤＨＲ）及び自己免疫疾患を含むがこれらに限定されない、いくつかの状態にとって重要である。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、自己と非自己間の主要な障壁であり、脱水、並びに、たとえば、微生物、化学物質及び紫外線への曝露の有害な効果から我々を保護している。皮膚は我々の周囲の化合物から保護できないことがあり、そうなると、とりわけ、刺激性接触皮膚炎（ＩＣＤ）又はアレルギー性接触皮膚炎（ＡＣＤ）を生じることがある。ＡＣＤは恒久的な特異的免疫性過敏症反応であり、ＩＣＤは非免疫学的局所的炎症反応である。ＡＣＤは西洋世界の人口の１５〜２０％を冒し、ヒトに見出されるなかで最も蔓延している形態の免疫毒性である。ＡＣＤは一般的職業病なので、かなりの心理社会的及び社会経済的影響がある。
【０００３】
ＡＣＤは皮膚障壁に入りこむ小分子（ハプテン）により引き起こされる。個人が感作されると、今日では治療法はないが、障害を起こす化合物及びいかなる交差反応化合物も避けなければならなくなる。ニッケル、保存料及び芳香剤などの普通に存在するアレルゲンのせいでこれを実行するのは非常に困難になりうる。ＡＣＤを引き起こす可能性のある化合物の増え続ける一覧表には、現在、４０００を超える物質が含まれる。化合物の感作性を予想するためには、ＯＥＣＤ承認の現在のベンチマーク試験は、マウス局所リンパ節試験（ＬＬＮＡ）である（局所リンパ節アッセイ及び相対効力の評価：バリデーションの状況。Ｂａｓｋｅｔｔｅｒ  ＤＡ、Ｇｅｒｂｅｒｉｃｋ  Ｆ、Ｋｉｍｂｅｒ  Ｉ．Ｃｏｎｔａｃｔ  Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ．２００７  Ａｕｇ；５７（２）：７０〜５）。しかし、ＥＵ指令によれば、化粧品及びトイレタリー成分のインビボ試験の禁止は、２０１３年から実施されることになっている。したがって、このベンチマーク試験に取って代わることができる代替法の必要性が存在する。
【０００４】
皮膚は重層化された組織であり、最外側層は表皮と呼ばれている。表皮は、今度は、死んだ層（角質層、ＳＣ）と生きた表皮に細分することが可能である。表皮は主に（約９５％）ケラチノサイトで構成されている。これらには、特殊化した抗原提示細胞（ランゲルハンス細胞）、メルケル細胞及びメラニン細胞が分散している。ケラチノサイトの名称の由来はケラチンと呼ばれるその大量のＩ型及びＩＩ型の中間径フィラメントである。これらの構造タンパク質が、基本的に、表皮（及び上皮）に高い引っ張り強度を与えている。上皮組織は、細胞型と発生段階に応じて、異なった対のケラチンを発現する。重層上皮の基底層のケラチノサイトは、主にケラチン５／ケラチン１４（Ｋ５／Ｋ１４）対を発現し、そのタンパク質含有量の最大３５％はＫ５及びＫ１４である。この対は基底上層においてはＫ１／Ｋ１０対で置き換えられ、この対は完全に分化したケラチノサイトの全細胞含有量の約８０〜８５％も占めている。要約すると、表皮は主にケラチノサイトで構成されており、これは今度は、非常に高含有量のケラチンを有する。
【０００５】
ケラチンは不溶性フィラメントの束を形成して細胞内骨格を与える。基底層の細胞（表皮中唯一の有糸分裂層）がアポトーシスを受けると（正常な増殖調節の一部として）、そうでなければアミロイド斑を形成すると考えられる不溶性ケラチンを処理する機序が準備を整えている。このようにアポトーシスを受ける基底ケラチノサイトは、アポトーシス小疱において細胞残遺物と共にケラチンを一掃する。皮膚では、これらはケラチン小体と呼ばれる。ケラチン小体は基底膜から抜け落ち、次に樹状細胞により貪食される。
【０００６】
ＡＣＤは、Ｔ細胞により媒介されることが明らかにされている。Ｔ細胞媒介は、リンパ節におけるナイーブＴ細胞へのペプチドのＭＨＣ（主要組織適合性複合体）拘束及び提示を通じて生じる。ＭＨＣ分子はペプチドを８〜１０アミノ酸（ＭＨＣクラスＩ）、又は９〜２５アミノ酸（ＭＨＣクラスＩＩ）の桁で提示するために、したがって、ハプテンそれ自体は、Ｔ細胞媒介免疫応答を保証するには小さすぎる。それよりむしろ、Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ及びＪａｃｏｂｓにより早くも１９３５年に発表された影響力の強い論文では、感作の重要なステップは、自己を非自己に変える担体タンパク質へのハプテンの共有結合を通した完全アレルゲンの形成であると提案されている。既知のハプテンの一覧表を調べてみると、共通の特徴、すなわち、ハプテンは典型的には小型で（≦１０００Ｄａ）、疎水性であり（ｌｏｇＰ≧２）、求電子性基を含有することが多いことが明らかになる。したがって、自己を非自己に変える共有結合は、主に、ハプテン上の求電子性基とタンパク質の求核部分との間の反応として想定される。代わりに、１つ（単座）ではなく２つの反応基（二座）を含有するハプテンの場合、２つの自己タンパク質の架橋結合も起こりえる。求電子性部分を含有しない一見無害な化合物もアレルゲン性になりえる。これらの化合物は、身体外で自己酸化され若しくは光酸化され（プレハプテン）又は皮膚で代謝され（プロハプテン）、強力なハプテンを形成することができると提案されてきた。
【０００７】
現在認められた説は、化合物は以下のステップを経てＡＣＤを引き起こす。すなわち、
化合物は表皮に侵入し、そこでタンパク質にコンジュゲートする。皮膚に存在する樹状細胞によるハプテン化されたタンパク質の取込み／プロセシング。これまで焦点は表皮のランゲルハンス細胞に合わされていたが、最近では皮膚樹状細胞のほうが関心を集めてきている。それに続く、ランゲルハンス細胞のハプテン誘導成熟及び遊走。成熟ランゲルハンス細胞は、流入領域リンパ節においてナイーブＴ細胞にＭＨＣクラスＩ又はＩＩ拘束された（ハプテンの性質に応じて）ハプテン化されたペプチドを提示する。ヘルパーＴ細胞（ＴＨ）及び／又は細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ）は増殖し、循環に入る。罹患した人は今や感作されている。
次に前記ハプテンに遭遇すると、アレルギーが誘発される。アレルギー症候群を回避する唯一の方法は、今後、前記ハプテン及びいかなる交差反応化合物も避けることである。
【０００８】
上記のように、感作における重要なステップは、このように自己を非自己に変える担体タンパク質へのハプテンの共有結合を通じた完全アレルゲンの形成であると提案されている。感作を解読するためには、ハプテン化されたタンパク質を、全背景のプロテオームに対して分子精度で抜きだし、最後には標的タンパク質（単数又は複数）及びハプテン化の正確な位置を同定する必要がある。これはこれまで実現されたことがない。
【０００９】
薬物過敏症反応（ＤＨＲ）は主要な問題であり、ＤＨＲの背後にある機序は完全には分かっていない。ＤＨＲは、すべての薬物有害反応のほぼ３分の１を表し、重篤になることがあり、入院加療が必要となることがあり、薬物処方の変更を必要とする。７％を超える人口が関係しているので、これは重要な公衆衛生問題である。ＤＨＲは、不運にも予想不可能であり、前向きの臨床研究は実施するのが極めて困難である。動物モデル（ラット、モルモット、ネコ、イヌ）の使用は、化合物のＤＨＲを引き起こす可能性を試験するほとんど唯一の方法である。
【００１０】
しかし、ＤＨＲは動物でも予測不可能であるために、ある種の動物モデルがヒトにおける効果を正しく予測するのかどうかを前もって入手し知るのは困難である。化合物の感作性（すなわち、皮膚接触を通じて適応免疫応答を誘導する能力）を予測するために、現在のベンチマーク試験はＯＥＣＤ承認ＬＬＮＡである。ＥＵ指令によれば、化粧品及びトイレタリー成分のインビボ試験の禁止は、２０１３年から実施されることになっている。不運にも、免疫系がハプテンによりどのようにして誘発されるのかについての分子理解なしでは、ＬＬＮＡに安全に取って代わることが可能なインビトロ又はインシリコ（コンピュータ）モデルは存在しえない。動物に取って代わるためには、複雑な生物学的背景で起きている多数のステップをインビトロで再現しなければならなくなる。主に細胞生物学者及び免疫学者によるＥＵ指令主導のＳＥＮＳ−ｉｔ−ｉｖｅでは、多数の研究グループがＬＬＮＡのインビトロ代替物に向けて取り組んでいる。彼らのワークパッケージは、以前に発表された報告、すなわち、世界的ゲノム解析、免疫蛍光アッセイ、等に類似する戦略の連続体／拡張を詳しく述べている。化粧品、トイレタリー及び香水産業（ＣＯＬＩＰＡ）の欧州事業者団体は、類似の専門委員会及び戦略を有している。これらの試みすべての共通の欠点は、主要なハプテン標的を発現しない不適切な細胞型が使用されてきたことである。先行技術において細胞試験でケラチノサイトが存在していた場合、ケラチノサイトは大部分、炎症シグナルを提供していると見なされてきた。
【００１１】
ＡＣＤの背後で支配しているプロセスを詳細に理解する代わりに、インビトロ代替物を作り出すことに向けられた主要な努力はすべてが、これまでのところ、表皮の抗原提示細胞に焦点を合わせてきた（樹状細胞及び皮膚感作：有害性同定における生物学的役割及び使用。Ｒｙａｎ  ＣＡ、Ｋｉｍｂｅｒ  Ｉ、Ｂａｓｋｅｔｔｅｒ  ＤＡ、Ｐａｌｌａｒｄｙ  Ｍ、Ｇｉｌｄｅａ  ＬＡ、Ｇｅｒｂｅｒｉｃｋ  ＧＦ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００７  Ｊｕｎ  １５；２２１（３）：３８４〜９４）。これは認められた説と一致していた（上記参照）。本発明は、これが焦点を合わせるには不適切な細胞型であることを明らかにすることになる。
【００１２】
他の大きな欠点は、読出しが均一ではなく、生細胞においてはリアルタイムで行われたことがないことである。典型的な試験は、細胞ライセートにおけるＲＴ−ＰＣＲ及び／又は免疫蛍光アッセイを使用する。しかし、ＥＬＩＳＡ試験は完了するのに２日かかり、ハプテン濃度及び時点の調査／最適化を妨げる可能性がある。時間がかかる、数多くの洗浄及び（抗体）処理ステップも、実験の人為的結果及びエラーを招くことがある。ホールセルアッセイは、実験の人為的結果を招くことなく、迅速な測定を可能にする。さらに、ハイスループットスクリーンでは、資源を要求し費用がかかるかなりの量の特定の抗体を使用しなければならず、実際、抗体を得るための動物の使用が必要になる。本発明のスクリーニング法は、いわゆる生細胞の小疱形成に基づいており、抗体を使用することなくリアルタイムでの読出しを提供し、ハイスループットな形態でのスケールアップを直接受け入れやすい。
【００１３】
細胞ベースの試験での他の以前の試みでは、標準化された濃度のハプテンを使用する代わりに、＞８０％の細胞（樹状細胞／細胞系）生存率をもたらす濃度のハプテンを使用することが標準法であった。これは、細胞毒性効果を回避するために行われる。これは、不適切な細胞型の使用に加えて２つの大きな欠点を招く結果になる。第一に、感作化は、多数のケラチノサイト死滅が膜小疱の駆逐を引き起こすことと関係がある。したがって、高生存率を保つことに基づく細胞アッセイは、誤った結果をもたらすことになる。本発明の試験方法は、代わりに、免疫系が、大量の潜在性エピトープ及びネオエピトープ（別々にプロセシングされる及び／又はハプテン化される）に曝露される身体中で起こるプロセスに基づいている。第二に、感作化のために、物質を互いに比較することが非常に困難／不可能になる。すべてが異なった濃度であり及び／又は異なった時点である（多くの以前の細胞ベースの試験のように）ならば、物質Ａの応答を対照物質と標準化する又はＡを物質Ｂと比較することもほぼ不可能である。本試験方法は、標準化された濃度の試験物質を使用し、直接の比較及び標準化を可能にする。これらの点は、段階的応答を得るのに不可欠な特長である（下記参照）。
【００１４】
要約すれば、現在まで、インビトロ細胞ベースのプロセスにおいて感作過程を正確に再現することが可能であったことはない。インビトロ試験に対する現在の試みは身体で起こっているプロセスに基づいていない。しかし、本明細書には、感作化中に身体で起こる実際の機序についての知見に基づく、化合物の感作潜在力についての予測的細胞ベースインビトロ試験が提供される。ヒトケラチノサイトは試験の土台として使用され、小疱形成応答は化合物が生ケラチノサイトに添加されるときに測定される。小疱形成応答（類別及び測定された出力、等を用いて）を使用して、異なる化合物、混合物、製剤及び溶液との上皮接触により引き起こされるＤＨＲ、自己免疫疾患及び他の状態のリスクを測定することも可能である。
【発明の概要】
【００１５】
本発明の目的は、アレルギー性接触皮膚炎（ＡＣＤ）におけるケラチノサイトの役割についての知識を使用してＡＣＤについて化合物をスクリーニングする新しい方法を創り出すことである。
【００１６】
別の目的は、ケラチノサイト並びにケラチン及び他のタンパク質の分析を使用してＡＣＤについて化合物をスクリーニングすることである。
【００１７】
別の目的は、ＡＣＤについてスクリーニングするインビトロ試験において小疱という概念を使用することである。
【００１８】
別の目的は、ＡＣＤについて異なる化合物をスクリーニングするための製品及びキットを提供することである。
【００１９】
別の目的は、感作化及び／又は自己免疫疾患の発生を防ぐために、小疱形成応答を阻害する異なる化合物をスクリーニングするための製品及びキットを提供することである。
【００２０】
別の目的は、薬物製剤への曝露後の小疱の放出を防ぐために、小疱形成応答を阻害する異なる化合物をスクリーニングするための製品及びキットを提供することである。
【００２１】
別の目的は、本発明を使用して、上皮細胞との接触（経口、目、吸入を通じて、等）を通じて罹るアレルギーにおけるリスク評価のために化合物をスクリーニングすることである。
【００２２】
別の目的は、本発明を使用して、薬物誘導過敏症及び自己免疫疾患におけるリスク評価のために化合物をスクリーニングすることである。
【００２３】
別の目的は、本発明を使用して、小疱形成応答を阻害する可能性について化合物をスクリーニングすることである。
【００２４】
本発明の別の目的は、本発明を使用して見出される、小疱形成を阻害する分子（すなわち、阻害剤）を使用することである。
【００２５】
本発明の別の目的は、前記同定された阻害剤の構造類似物を使用することである。
【００２６】
本発明の別の目的は、感作性について化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）試験される化合物を選択された範囲の希釈度まで希釈する工程；
ｂ）選択された量の前記化合物の希釈物を集密まで増殖させたケラチノサイト細胞の層に添加する工程；
ｃ）前記ケラチノサイト細胞と化合物希釈物とを一緒にインキュベートする工程；
ｄ）前記ケラチノサイト細胞を調べてケラチノサイト小疱形成応答を決定する工程；
ｅ）前記ケラチノサイト小疱形成応答を定量化する工程；及び
ｆ）前記ケラチノサイト小疱形成応答を用いて前記化合物の感作性を決定する工程
を含む上記方法を提供することである。
【００２７】
前記方法は、ケラチノサイト小疱形成応答が、標準感作物質との比較を用いた小疱形成までの時間、ケラチノサイト細胞がインキュベーション後に小疱を産生した化合物の濃度、高濃度の化合物での小疱の大きさ、高濃度の化合物での小疱の数並びに／又は小疱における放出されたタンパク質及び／若しくはそのネオエピトープの量というパラメータを用いて決定されることをさらに含んでいてもよい。
【００２８】
前記方法は、標準感作物質が、オキサゾロン、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン、ｍＢＢｒ、ｄＢＢｒ、グリオキサール、ホルムアルデヒド及びα−ヘキシル桂皮アルデヒドからなる群から選択されることをさらに含んでいてもよい。
【００２９】
前記方法は、ケラチノサイト小疱形成応答が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び／又はウェスタンブロットによる放出されたタンパク質及び／又はそのネオエピトープの量と種類の決定、膜プローブを使用する放出された小疱の量の測定、表面プラズモン共鳴の決定、水晶振動子マイクロバランス技術、小疱の放出に関して報告する工学的に操作された蛍光システム、蛍光エネルギー移動現象を示す蛍光標識化技法、絶対小疱数を計測するフローサイトメトリーシステム、細胞形態及び小疱放出を分析するハイスループットスクリーニング、小疱形成応答を分析するマイクロフルイディクス、小疱及び／又は細胞により放出される特定のタンパク質及び／又はそのネオエピトープの量を定量化する捕獲システム、光学顕微鏡を使用して及び／又は小疱形成応答を示す細胞を含有する必要な障壁特徴及び侵入特徴を示すインビトロ上皮組織を使用してケラチノサイト小疱形成応答を決定するケラチノサイト細胞の検査、からなる群から選択される方法により定量化されることをさらに含んでいてもよい。
【００３０】
前記方法は、小疱形成応答が、溶液蛍光を用いて溶液中の小疱膜の量を測定することにより、水性媒体中では非蛍光性であるが膜内に挿入されると強い蛍光性になる膜プローブ（たとえば、ＦＭ  １−４３）を用いて定量化されることをさらに含んでいてもよい。
【００３１】
前記方法は、小疱形成応答が、小疱及び／又はケラチノサイト細胞により放出されるタンパク質及び／又はそのネオエピトープの量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び／又はウェスタンブロットを通じて決定することにより定量化されることをさらに含んでいてもよい。
【００３２】
前記方法は、小疱及び／又はケラチノサイトにより放出されるタンパク質及び／又はそのネオエピトープが、ケラチン５、ケラチン１４、ケラチン１、ケラチン１０、ケラチン８、ケラチン１８、グルコース−６−ホスファターゼイソメラーゼ、移行型小胞体ＡＴＰアーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、カルモジュリン、インポーチン５、ケラチン６（Ａ、Ｂ及びＣ）、スタスミン、トランスゲリン−２、１４−３−３タンパク質シグマ、カルレティキュリン、エンドプラスミン、ヒートショックプロテイン９０、アクチンベータ、アクチンガンマ、アルファアクチニン、コフィリン１、エズリン、フィブロネクチン、ミオシン１ｃ、プラスチン２、プラスチン３、チューブリンベータ２Ｃ、アネキシン２、ペルオキシレドキシン１、ＳＳＡ／Ｒｏリボ核タンパク質、アルファエノラーゼ、並びにペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼＡからなる群から選択されることをさらに含んでいてもよい。
【００３３】
小疱形成応答を定量化するために、前記方法は、インキュベーション後、ケラチノサイト細胞の層から液体を吸引する、インキュベーション期間中に離昇した可能性のある小疱をケラチノサイト細胞から分離する（たとえば、遠心分離を用いて）、小疱を溶解する、及び全タンパク質濃度を測定することにより小疱形成応答を定量化することをさらに含んでいてもよい。
【００３４】
前記方法は、アレルギー性接触皮膚炎、薬物誘導過敏症応答、化学的に誘導された喘息、食物アレルギーからなる群から選択される病気、及び／又は化合物との上皮接触を通じて引き起こされることのある他の病気についての予測的インビトロ試験として小疱形成応答が利用されることをさらに含んでいてもよい。
【００３５】
前記方法は、小疱形成応答を用い、関連するヒト上皮細胞を使用して薬物誘導過敏症反応を引き起こす純粋形態、又は混合物、製剤及び溶液中の化合物のリスクを計測することをさらに含んでいてもよい。
【００３６】
前記方法は、前記化合物の感作性を用いて、アレルギー性接触皮膚炎におけるリスクを評価することをさらに含んでいてもよい。
【００３７】
前記方法は、前記化合物の感作性を用いて、前記化合物の自己免疫疾患を引き起こす能力を決定することをさらに含んでいてもよい。
【００３８】
前記方法は、前記化合物の感作性を用いて、前記化合物の小疱形成を阻害する能力を決定することをさらに含んでいてもよい。
【００３９】
前記方法は、前記化合物の感作性を用いて、前記化合物の薬物誘導過敏症を引き起こす能力を評価することをさらに含んでいてもよい。
【００４０】
本発明の別の目的は、感作性について化合物をスクリーニングするためにケラチノサイト細胞を使用することである。
【００４１】
このスクリーニングは、前記化合物の感作性を用いて、前記化合物のアレルギー性接触皮膚炎を引き起こす能力を決定することをさらに含んでいてもよい。
【００４２】
このスクリーニングは、前記化合物の感作性を用いて、前記化合物の自己免疫疾患を引き起こす能力を決定することをさらに含んでいてもよい。
【００４３】
このスクリーニングは、前記化合物の感作性を用いて、前記化合物の薬物誘導過敏症を引き起こす能力を決定することをさらに含んでいてもよい。
【００４４】
このスクリーニングは、前記化合物の感作性を用いて、前記化合物の食物アレルギーを引き起こす能力を決定することをさらに含んでいてもよい。
【００４５】
本発明の別の目的は、化合物との上皮接触により引き起こされることがある状態に対する感作潜在力について化合物、混合物、製剤、及び溶液をインビトロスクリーニングするための製品であって、
ａ）標準化された濃度の試験物質；
ｂ）ケラチノサイト細胞培養物；及び
ｃ）少なくとも１つの標準感作物質
を含む、上記製品を提供することである。
【００４６】
この製品は、前記製品が、アレルギー性接触皮膚炎、自己免疫疾患、薬物誘導過敏症反応、食物アレルギー、及び自己中毒のリスクからなる群から選択される状態についてスクリーニングすることをさらに含んでいてもよい。
【００４７】
本発明の別の目的は、感作性について化合物、混合物、製剤又は溶液をスクリーニングするためのキットであって、
ａ）少なくとも１つのケラチノサイト細胞培養物；
ｂ）前記少なくとも１つのケラチノサイト細胞培養物を集密的増殖まで増殖するための手段；
ｃ）前記化合物、混合物、溶液の製剤を選択された範囲の希釈度まで希釈するための手段；
ｄ）前記少なくとも１つのケラチノサイト細胞培養物を増殖するための手段及び希釈するための手段を使用するための使用説明書
を含む上記キットを提供することである。
【００４８】
前記キットは、少なくとも１つの標準感作物質をさらに含んでいてもよい。
【００４９】
本発明の他の目的及び利点は読者には明らかになり、これらの目的及び利点は本発明の範囲内であることは意図されている。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１Ａは、感作物質が皮膚と接触すると何が起こるかに関する本明細書の知見を図示する概略図である。図１Ｂは、ケラチノサイトがインビトロにおいて感作物質／試験化合物に曝露されるとケラチノサイトにより示される小疱形成応答を図示する概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
定義
本明細書で使用されるように、用語「ケラチノサイト」又は「ケラチノサイト細胞」は、始原ヒトケラチノサイト、又は他の哺乳動物由来のケラチノサイトを意味するように意図されている。前記用語は、成人始原ヒト表皮ケラチノサイト（ＨＥＫａ）若しくは新生児始原ヒト表皮ケラチノサイト（ＨＥＫｎ）などの始原、不死化及び幹細胞培養系又はＨａＣａＴなどのＨＥＫｎ特徴を有する細胞系をさらに含んでいてもよい。
【００５２】
本明細書で使用されるように、用語「ケラチン（単数又は複数）」は、皮膚、毛髪及び爪の重要な構造成分のうちの１つである線維状構造タンパク質のケラチンタンパク質ファミリーを意味するように意図されている。前記用語は、特定のケラチンサブタイプのケラチン１、５、８、１０、１４及び１８を意味するように主として意図されているが、これらに限定されない。
【００５３】
本明細書で使用されるように、用語「ハプテン」は、ヒト人体において内在性巨大分子、たとえば、タンパク質と免疫原性複合体を形成し、適応免疫系を活性化することができる生体異物化合物を意味するように意図されている。一般的に、前記用語は、皮膚障壁を破り、そこでタンパク質と反応したときに、たとえば、接触アレルギーを引き起こすことができる生体異物化合物のことであるが、たとえば、皮下に、静脈内に、経口的に、しかし、これらに限定されない他の入口経路を有する化合物のことでもありえる。
【００５４】
本明細書で使用されるように、用語「ハプテン化」は、ハプテンと巨大分子、たとえば、タンパク質間の反応及び複合体形成を意味するように意図されており、「ハプテン化されたタンパク質」は、形成されたハプテン−タンパク質複合体、すなわち、ハプテンに結合しているタンパク質を意味するように意図されている。
【００５５】
本明細書で使用されるように、用語「ハプテン化部位」又は「ハプテン化位置」は、ハプテンが反応する特定のタンパク質の特定のアミノ酸、すなわち、タンパク質上のハプテンの正確な位置を意味するように意図されている。
【００５６】
本明細書で使用されるように、用語「小疱」又は「小疱形成」は、膜小胞の形成及び細胞からの放出を意味するように意図されている。小疱形成は膜突起が形成されるプロセスである。小疱は、細胞の細胞膜で形成される突起であり、この突起は最終的に細胞から周囲の培地中に解離する又は出芽する。小疱は一般的には球状性質であり、径が約１μｍから約１００μｍの細胞膜二重層からなる。用語「ケラチノサイト小疱形成応答」は、特に、ケラチノサイト又はすでに記載されているケラチノサイト型の細胞からの膜脂質小胞の細胞駆逐を意味するように意図されている。
【００５７】
明細書で使用されるように、用語「感作」は、個人が、たとえば、接触アレルギー化合物、すなわち、巨大分子と免疫原性複合体を形成することにより、適応免疫系を活性化するハプテンに曝露される免疫過程を意味するように意図されている。
【００５８】
明細書で使用されるように、用語「誘発」は、個人が感作される化合物の再曝露による、又は任意の交差反応性化合物の曝露による個人の皮膚炎症反応を意味するように意図されている。
【００５９】
明細書で使用されるように、用語「タンパク質誘導体化」は、化合物（たとえば、ハプテン）がタンパク質に結合する事象を意味するように意図されている。
【００６０】
明細書で使用されるように、用語「アレルギー性接触皮膚炎（ＡＣＤ）」は、個人が感作される接触アレルゲン（ハプテン）、又は任意の交差反応性化合物に再曝露されたときに個人が発症する皮膚免疫学的過敏性反応の臨床症状を意味するように意図されている。
【００６１】
明細書で使用されるように、用語「薬物過敏症反応（ＤＨＲ）」又は「タンパク質薬物誘導過敏症反応」は、薬物がハプテンとして作用し、内在性のタンパク質と共有結合して感作を、その後の再曝露では誘発を引き起こす、薬物への免疫媒介反応を意味するように意図されている。
【００６２】
明細書で使用されるように、用語「自己免疫疾患」は、免疫応答が、通常、身体中に存在している内在性物質、成分及び組織に対して反応する疾患を意味するように意図されている。これには、関節炎リウマチ、ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）、シェーグレン症候群（ＳＳ）、Ｉ型糖尿病及び乾癬などの疾患を含むことになるが、これらに限定されない。
【００６３】
明細書で使用されるように、用語「標準感作物質」は、接触アレルギーを引き起こすことが知られている化合物を意味するように意図されている。これには、アレルギー試験のための標準パッチ試験シリーズに通常、存在する化合物、たとえば、ホルムアルデヒド、芳香混合物、及びパラベンを含むことになるが、これらに限定されない。
【００６４】
明細書で使用されるように、用語「集密」は、細胞による細胞培養皿又はフラスコ又は別の材料の完全な又はほとんど完全な（少なくともほぼ５０〜６０％の被覆度）被覆を意味するように意図されている。
【００６５】
明細書で使用されるように、用語「潜在性エピトープ」又は「ネオエピトープ」は、ハプテン化されたペプチド及びタンパク質、並びに／又は通常ならばプロセシングされていたと考えられるようにはプロセシングされていないタンパク質及びペプチド、並びに／又は架橋したタンパク質を意味するように意図されている。したがって、これらのエピトープは通常、免疫系から隠されている。
【００６６】
明細書で使用されるように、用語「エピトープ拡大」は、支配的なエピトープとは異なり、それとは非交差反応性のエピトープへの免疫応答の発展を意味するように意図されている。
【００６７】
通説とは反対に、本発明者らは、驚くべきことに、ヒトＡＣＤでは、ケラチノサイトが感作過程において決定的に重要な役割を果たしていることを発見した。ヒト皮膚の進化的防御システムは、大きな寄生生物、ウイルス及び微生物に向けられている。しかし、このために、反応性ハプテンの基底ケラチノサイトまでの下向及びその中への侵入を可能にする理想的重層化した生理化学的特性が生じることを明らかにすることが可能である。さらに、他のタンパク質に加えて、重要な標的はケラチンであり、具体的には、ヒト皮膚エクサープトにおけるケラチン５及び１４（Ｋ５及びＫ１４）であることが見出されている。特に、Ｋ５のアミノ酸システイン５４（Ｃ５４）は、ヒト組織及び始原ヒトケラチノサイトにおけるチオール反応性ハプテンの標的として同定されている。この残基は、デスモプラキンのＣ末端テールと決定的に重要な非共有的接触をし、それによって、デスモソーム（細胞−細胞）及びへミデスモソーム（細胞−基底膜）を通じて細胞をその周囲と固定化するアミノ酸のストレッチに位置している。近くの残基が変更されると、ケラチン−デスモプラキン相互作用を実質的に減らし、それによって、細胞−細胞及び細胞−マトリックス相互作用を減らして、ホームレス細胞を生じることが明らかにされている。上皮細胞がその周囲との接触を失うならば、増殖調節過程の準備が整って誤った植民地化を防ぐ。したがって、ホームレス上皮細胞はアノイキス、すなわち、「家がない」ことにより引き起こされるアポトーシスが運命付けられる。アポトーシス中、膜小胞、いわゆる「小疱」が細胞表面上に出現することがある。次に、細胞は、アポトーシス小体と呼ばれるさらに小さな断片に分解する。その後、食細胞が、炎症反応を引き起こすことなくアポトーシス小体を貪食する。小疱形成は一般的現象であり、アポトーシスに加えて、不運動性胚割球において、及びいくつかの細胞遊走事象において、たとえば、細胞分裂の細胞質分裂段階中に小疱形成が起きる。
【００６８】
ヒトケラチノサイトに関する研究を通じて、ハプテンはケラチン（及び他のタンパク質）を共有結合的に修飾すること、並びにｍＢＢｒ（モノブロモビマン）などのチオール反応性ハプテンがＫ５のＣ５４を修飾することを明らかにすることができる。さらに、ヒトケラチノサイトに関する研究を通じて、ハプテンは、タンパク質中の異なる求核基に対して向けられるが、小疱形成を引き起こし、したがって潜在性エピトープ及びネオエピトープ（たとえば、ハプテン化されたペプチド及びタンパク質、並びに／又は通常ならばプロセシングされていたと考えられるようには処理されていないタンパク質及びペプチド）を放出することが明らかにされている。ウェスタンブロット実験を通じて、大部分アミン指向のハプテンオキサゾロン及び大部分アルギニン反応性ハプテングリオキサール由来の小疱もＫ５及びＫ１４を含有することが明らかにされる。さらに、刺激物質（たとえば、ドデシル硫酸ナトリウム、ＳＤＳ）及び非アレルギー性化合物（たとえば、ノナン酸）は小疱形成を開始しないことも明らかにされている。前記の説は実験動物（マウス）由来の血清でＥＬＩＳＡ実験を実施することによりインビボ背景では妥当であることが明らかにされる。感作化合物に（皮膚接触を介して）曝露されていた動物由来の血清では、Ｋ１４に対する抗体が検出された。さらに、一部の感作化合物（ｄＢＢｒ（ジブロモビマン）を含むが、これに限定されない）と接触すると、血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ）などの急性期タンパク質のレベルが増加することが見出された。通常、ＳＡＰの血漿濃度は炎症に呼応して増加する。慢性炎症は、自然免疫防御のせいで、自己攻撃（自己毒性）をもたらすことがあることは知られている。ＳＡＰのレベルが増加することは、アルツハイマー病などの自己毒性疾患においては一般的特長である。
【００６９】
文献に基づけば、共有結合的修飾は、十中八九、ホームレス上皮細胞による誤った植民地化を防ぐ短絡防御機序である。要約すると、ハプテンは基底層まで侵入して降り、基底ケラチノサイトに入り、Ｋ５及びＫ１４（及び他のそれほど豊富ではないタンパク質）と反応し、こうして小疱形成を引き起こし、ケラチン小体（すなわち、他の細胞残遺物の中でもハプテン化された、すなわち、ケラチンの他に他のタンパク質を含む非自己タンパク質を含有する小疱）を形成し、これは基底膜の下に落ちて、そこでそのネオ及び／又は潜在性エピトープは抗原提示細胞（樹状細胞）により貪食される。このように、この過程により、免疫系は大量の潜在性エピトープに曝露され、さらにそのタンパク質の一部はハプテン化される、すなわち、非自己になる。ハプテン化は、ネオエピトープが曝露されるようにタンパク質のプロセシングにも影響を与えうる。これらの面のすべてがおそらく個人を感作する一因である。エキソソームを含むが、これに限定されないもっと小さな小疱も感作の一因になることは排除されない。おそらく角質層と基底層の両方において、ハプテンが再びケラチン、ケラチン由来ペプチド及び／又は他のタンパク質を誘導体化すると、誘発が起こる。当然のことながら、他のタンパク質も誘導体化されることがあるが、しかし、ケラチノサイトは表皮において細胞の約９５％を構成しており、ケラチンは完全に分化したケラチノサイト中の全細胞タンパク質の≧８０％を構成している。注目すべきは、Ｋ５はＫ１などの他のＩＩ型ケラチンと相同であり、Ｋ１４はＫ１０などの他のＩ型ケラチンと相同である点である。したがって、化合物が基底上層においてＫ１及びＫ１０と反応する誘発期には、相同エピトープが産生される。したがって、感作においても誘発においても、ケラチンが誘導体化されるので、身体は大量の高度に相同な／同一の再発エピトープにさらされることになる。
【００７０】
さらに、本研究から生じるのが、化合物への上皮曝露による再発エピトープという説である。すべての重層化扁平上皮基底細胞は標的タンパク質を極めて大量に発現する（細胞含有量の最大３５％）。上皮細胞は身体全体の構造体の腔及び表面を裏打ちしており、多くの腺も表皮組織から形成される。たとえば、Ｋ５抗体は、気管支（呼吸器上皮細胞）、頸部、精巣上体、食道、上咽喉、口腔粘膜、前立腺、唾液腺、膀胱、扁桃腺中の扁平上皮細胞、膣及び外陰部／肛門皮膚などの組織中の細胞を染色する。肺中のマクロファージも染色される。ヒト角膜上皮もＫ５では染色する。Ｋ１４（及びＫ１５）はＫ５と一組で発現されるので、Ｋ１４もこれらの組織及び細胞中に存在する。単純上皮細胞は相同なＫ８／Ｋ１８対を発現するという事実と組み合わせると、したがってその結果は、身体中への化合物の進入経路とは無関係に、同一の又は高度に相同なエピトープに遭遇する一般的機序を示している。したがって、小疱形成応答の分析に他の上皮細胞及び上皮組織を使用するのは本発明の範囲内である。
【００７１】
したがって、小疱形成応答は、たとえば、ＡＣＤ、ＤＨＲ、しかし化学的に誘導される喘息も含み、化合物との上皮接触を通じて引き起こされることがある他の病気も排除しない様々な病気の予測的インビトロ試験として利用することが可能である。身体中への化合物の進入経路とは無関係に、同一の又は高度に相同なエピトープに遭遇するという知見（Ｋ５／Ｋ１４及びＫ８／Ｋ１８により例証される）は、他の意味を有する。したがって、化合物との上皮接触（たとえば、皮膚を介して）のせいで基底ケラチノサイトが死滅し、小疱を放出すると、ケラチン（及び他のタンパク質）に対する自己抗体（及びおそらく記憶Ｔ細胞）が産生され、個人はこの時点で感作されている。薬物などの別の無関係な化合物が摂取される／吸入される／又は他の方法で上皮組織と接触する場合、前記化合物は基底上皮細胞と反応することがあり、小疱形成も引き起こすことがある。個人がすでにそれに対する自己抗体を有するのと同じエピトープが再び小疱において放出される。次に、前記タンパク質エピトープに対する循環している記憶Ｔ細胞及び／又は自己抗体が動員されて、薬物過敏症反応（ＤＨＲ）が観察される。このように、一部のＤＨＲ（固定薬疹を含むが、これに限定されない）では、化合物が上皮細胞とどのようにして相互作用をするのかに関して、同じ機序が機能している可能性が高い。前記応答は大部分、放出された自己タンパク質に対して向けることが可能であるので、これらの知見は、個人が問題の薬物に以前一度も曝露されたことがない場合でも、ＤＨＲを観察することができる理由を説明している。この仮説も、薬物誘導過敏症反応においては基底ケラチノサイトが標的にされるという知見によって実証される（薬物反応における皮膚の基底細胞と反応性の循環する抗体の発生率。Ｔ  ｖａｎ  Ｊｏｏｓｔ．Ａｃｔａ  Ｄｅｒｍａｔｏｖｅｎｅｒ（Ｓｔｏｃｋｈｏｍ）５４：１８３〜１８８、１９７４）。
【００７２】
したがって、小疱形成応答は、関連のあるヒト上皮細胞を使用して薬物誘導過敏症反応（ＤＨＲ）を引き起こす化合物（純粋な形、混合物、製剤、溶液中、等）のリスクも計測することが可能である。このように、本明細書に提示される発明は、上皮接触による薬物有害反応についての予測的スクリーニングの大きな前進を表している。
【００７３】
さらに、本発明者らは、ハプテン化により、他の方法では免疫系に到達できない潜在性エピトープ、及び／又は別々にプロセシングされているネオエピトープが放出されることを明らかにしている。これは、接触アレルギーについてのみに重要なのではなく、自己免疫疾患における自己寛容の違反に関して緊急な意味を有する。この仮説は、マウス血清中でのＫ１４に対する自己抗体についての我々の知見により裏付けられている。すなわち、ＥＬＩＳＡは、ハプテン化されたタンパク質に対する抗体ではなく、タンパク質それ自体に向かう抗体を測定する。たとえ実験が、倫理的な理由で、マウスで実施されるにしても、ヒトも感作物質に皮膚接触すると自己抗体を発生させる可能性は高い。小疱形成が煽動され自己寛容が違反される（すなわち、Ｋ５及びＫ１４に対する寛容の違反、上記の他のタンパク質に対する寛容の違反、相同性を通じたエピトープ拡大、リボ核タンパク質のような他のアポトーシス残渣の放出、等）と、身体内で多くの過程が起こりうる。
【００７４】
これらの自己免疫疾患の例には、ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）；リウマチ（ＲＡ）；シェーグレン症候群（ＳＳ）；及びＩ型糖尿病が含まれるが、他の自己免疫疾患を排除しない。とりわけ、これらの疾患（及び他の自己免疫疾患）中、ケラチンに対する自己抗体は文献において報告されてきた。その上、ケラチノサイトは、アトピー性皮膚炎に罹った患者由来の血清中に見出される自己抗体の標的である。したがって、小疱形成応答に関するこの知見を使用すれば、自己寛容の違反を引き起こす化合物、混合物、溶液及び他の製剤の能力を測定し、したがって自己免疫疾患を予防することも可能である。これは新しい知見であり、新しい説なので、この詳細な理解を提供する試験法は現在存在しない。
【００７５】
グリシン豊富な細胞壁タンパク質（ＧＲＰ）は、自己免疫障害における一般的標的である、ケラチン及び他の自己タンパク質（たとえば、エプスタイン・バーウイルス由来核抗原−１（ＥＢＮＡ−１）、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質及び線維性コラーゲン）と高い相同性を有する偏在性食物タンパク質である。ＧＲＰ及びペプチド特異的Ｔ細胞クローン由来のペプチドエピトープに対する抗体は、自己免疫障害（ＲＡ、ＳＬＥ、乾癬性関節炎ＰｓＡ、慢性特発性蕁麻疹ＣＩＵ）、ＣＰＩ（慢性パルボウイルスＢ１９感染）並びに食物アレルギー（穀類、魚、果実及び野菜）に罹った患者由来の血清中に見出すことができる。しかし、正常な対象はこれらの免疫応答を示さない（「グリシン豊富な細胞壁タンパク質は、自己免疫障害及び食物アレルギー障害において特異的抗原標的として作用する」。Ｃ．Ｌｕｎａｒｄｉ，  ｅｔ．ａｌ．、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１２、Ｎｏ．５、ｐｐ６４７〜６５７）。
【００７６】
さらに、血清から精製された抗ＧＲＰペプチド抗体はＥＢＮＡ−１並びにケラチン、コラーゲン及びアクチンなどの自己抗原を特異的に認識した。したがって、植物、ウイルス及びヒト由来の明らかに多岐にわたるタンパク質間で共通（相同性）配列を通じた抗原拡大が、自己免疫疾患の他に食物アレルギーの原因である可能性がある。重要なことは、これが、ＧＲＰからではなく、上皮曝露による感作分子（ハプテン）の作用を通じて小疱に放出されるケラチン及び他のタンパク質からのエピトープ拡大の例になることは極めて考えうることである。したがって、本発明を使用すれば、たとえば、食物アレルギーに関連する問題に取り組むために小疱形成応答を研究することも可能である。
【００７７】
化合物が上皮及び上皮細胞に遭遇すると起こることが、たとえば、上記の小疱形成応答を生じること、を分子理解したおかげで、
アレルギー性接触皮膚炎におけるその感作潜在力
上皮接触により引き起こされる他の病気
自己寛容の違反を引き起こす、すなわち、自己免疫疾患の危険を冒すリスク
ＤＨＲを引き起こすリスク
食物アレルギーを引き起こすリスク
自己毒性のリスク
について、たとえば、化合物、混合物、製剤、及び溶液をインビトロスクリーニングするための製品を開発することが可能になった。
【００７８】
さらに、本発明により、他の物質（これ以降、阻害剤と呼ばれる）を、たとえば混合物、製剤、及び溶液に添加することにより小疱形成応答の阻害をスクリーニングするための手段として小疱形成応答を使用することが可能になる。次に、これらの阻害剤（又は見出された阻害剤の重要な相互作用を再現する化合物）は、感作及び本出願の別の場所で言及されている感作の負の下流効果を防ぐために、製剤、溶液、混合物、等における添加剤として潜在的には使用することが可能である。これは、本発明でのように、インビボ事象を再現する細胞ベースの試験においてのみ可能である。本発明のこれらの適用すべてが、新しい分子理解を通して可能になり、したがって、以前の技術では提供することができない適用を表す。
【００７９】
皮膚などの上皮組織との接触により起こる反応を研究するために、本発明者らは、臭素原子の置換に先立って非蛍光性であるケージ化されたハプテン（ブロモビマン）を配置した。免疫学的問題を引き起こすことがある有害な化合物は、アレルギー性接触皮膚炎などの疾患では「ハプテン」と呼ばれていることに注目すべきである。しかし、用語「ハプテン」の使用は、化合物との上皮接触を通じて生じうる他のあらゆる状態を排除すると解釈されるべきではない。それどころか、本発明は、新しい化合物、混合物、溶液及び他の製剤が自己免疫疾患、ＤＨＲ、等を引き起こすリスクを計測するための手段としての小疱形成応答の使用も含む。
【００８０】
ブロモビマンの解放は、好ましくは、生理的ｐＨで強力な求核種であるチオール（システイン）と一緒に起こる。多くの、大部分ではないにしても、臨床ハプテンがチオール反応性であるために、チオールに対する優先反応性は有利である。ペプチド及びタンパク質中のその他の主要なハプテン反応性部分は、求核性アミノ基（タンパク質のアミノ末端を構成するリシンのＮＨ２基及びα−ＮＨ２基）である。感作及び上皮免疫毒性の背後にある詳細な分子機序を解明に向けて大きく前進するために、反応基なし（ｓｙｎＢｉｍ）、１個の反応基（ｍＢＢｒ）又は２個の反応基（ｄＢＢｒ）を有する一連のビマンが配置された。
【００８１】
第一ステップは、前記分子が皮膚（角質層）に接触することである。前記反応性分子の多くが角質層で反応するが、これは、実験ではヒト皮膚エクサープト及びケージ化された（ｍＢＢｒ及びｄＢＢｒ）ハプテンを用いて見ることができるものである。
【００８２】
しかし、前記分子のかなりの割合が、表皮の基底上層までさらに下に侵入するが、濾胞経路も生体異物を皮膚内に運び入れるのに重要である。前記侵入は、角質層の酸性ｐＨ（前記分子はｐＨが低いときのほうがゆっくり反応する）のせいであり、利用可能な基の多くは反応が終わっているからでもある可能性がある。基底上層では、細胞の角質化が基底細胞の周りに厚く比較的不浸透性の外膜を作るために、ハプテンはなかなか細胞に侵入できない。したがって、ハプテンは下の基底層まで侵入する。ここでは、細胞膜ははるかに薄くより流動性であり、したがって前記分子は基底細胞に入ることができる。ヒト皮膚エクサープトを用いた実験により、角質層に加えて、基底層の細胞はケージ化されたハプテンであるｄＢＢｒ及びｍＢＢｒにより標識されていることが明らかにされている。
【００８３】
第二のステップは、前記分子が基底細胞に入ることである。細胞外環境は酸化性であるために、細胞外システインは大部分ジスルフィドまで酸化される。
【００８４】
しかし、還元された細胞内環境において、ハプテンは反応する相手の還元されたチオールを見出す。細胞内部に入ると、化合物は利用可能な（すなわち、立体障害型ではない）還元されたシステイン（チオール基）と反応することになる。このステップでは、前記標識された細胞は基底ケラチノサイトであることが実証されている。さらに、ハプテンが反応するシステインのうちの１つは、Ｋ５のシステイン５４（Ｃ５４）であることが確かめられた。ナノスプレー源を備えたＬＴＱ−ＦＴ−ＩＣＲ質量分析計を使用して、チオール反応性ハプテンｍＢＢｒは、無傷の全層ヒト皮膚において、生きたヒトケラチノサイトがｍＢＢｒに曝露された場合には、Ｋ５のＣ５４を修飾することが見出された。Ｃ５４での激しい反応の理由の１つは、おそらく、細胞膜内部でのその高い有効濃度である。その上皮完全性に二重安全装置を備えておくのは生物の生命では非常に重要であり、ＫＩＦの束形成は、Ｃ５４を含有するペプチドストレッチの高い有効局所濃度を保証し、細胞のその周囲への強い溶着を確実にする。一次配列において近いアミノ酸は、したがって、類似する高い有効濃度で入ってくる化合物の物理的範囲内にも位置している。アミン反応性化合物及びアルギニン反応性化合物により引き起こされる小疱形成をこの角度から見ると、残基Ｋ７１及びＲ７２が一次配列における最も近い候補である。
【００８５】
第三ステップは、この残基（Ｃ５４）が、デスモソームの完全性を維持するのに非常に重要であることがデスモプラキンとのその相互作用を通して明らかにされているＫ５のストレッチ内に位置していることである。易感染性細胞−細胞（及び／又は細胞−マトリックス）接触を有する上皮細胞がアポトーシス（「アノイキス」）を受けることは知られている。感作化合物との接触の結果である小疱形成は、天然に起こるアポトーシスと少なくともいくつかの機序を共有していると思われる。基底ケラチノサイトは、不溶性ケラチン中間径フィラメント（ＫＩＦ）の最大３５％からなる。基底ケラチノサイトは時折アポトーシスを受けるので、不溶性ケラチン残渣の廃物除去の機序は進化してきた。身体では、アポトーシス基底細胞は、その残遺物を、かなりの程度Ｋ５及びＫ１４からなることが明らかにされているいわゆる「ケラチン小体」に詰め込む。細胞からケラチン小体が突出する。したがって、ケラチノサイトが感作化合物に曝露されると、天然に起こるアポトーシスの背後の機序のうちの少なくとも一部が起こり、ＫＩＦ（及び他の細胞残遺物）が小疱に詰め込まれる。したがって、このステップは、ハプテン化が細胞を誘発して小疱を産生させる（図１）ことであるが、これはビマンへのケラチノサイト曝露後の蛍光性ビマン含有小疱のインビトロ作製により明らかにされている。非反応性非アレルゲン性物質であるｓｙｎＢｉｍを細胞に添加した場合には、これは起こらなかった。したがって、オキサゾロン、ホルムアルデヒド、ＣＤＮＢ（１−クロロ２，４ジニトロベンゼン）、グリオキサール、等などの非蛍光性臨床的関連ハプテンは小疱形成応答を誘発する。オキサゾロン（主にアミン反応性）及びグリオキサール（主にアルギニン反応性）の添加から生じる小疱もケラチンを含有する。
【００８６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験では、チオール、アミン、及びアルギニン反応性感作物質は同じタンパク質を含有する小疱を生じることが明らかにされた。このステップでは、したがって、ハプテンをケラチノサイトに添加することにより、その細胞内位置並びに／又はハプテン化された／別にプロセシングされたペプチド及びタンパク質からなるネオエピトープを通じて、通常は免疫系から隠されている高量の潜在性エピトープの駆除を誘導することが明らかにされた。小疱は、言及されたケラチン以外にも他のタンパク質、たとえば、グルコース−６−ホスファターゼイソメラーゼ、移行型小胞体ＡＴＰアーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、カルモジュリン、インポーチン５、ケラチン６（Ａ、Ｂ及びＣ）、スタスミン、トランスゲリン−２、１４−３−３タンパク質シグマ、カルレティキュリン、エンドプラスミン、ヒートショックプロテイン９０、アクチンベータ、アクチンガンマ、アルファアクチニン、コフィリン１、エズリン、フィブロネクチン、ミオシン１ｃ、プラスチン２、プラスチン３、チューブリンベータ２Ｃ、アネキシン２、ペルオキシレドキシン１、ＳＳＡ／Ｒｏリボ核タンパク質、アルファエノラーゼ、及びペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼＡを含有することも、ナノスプレー源を備えたＬＴＱ−ＦＴ−ＩＣＲ質量分析計を使用して明らかにされた。さらに、ネオエピトープ（ハプテン−タンパク質コンジュゲート）は排出される（小疱中のＣ５４−ハプテンコンジュゲートを立証することにより例証される）ことが見出された。感作化合物は他のタンパク質も修飾すること、ＳＤＳゲル上の蛍光バンドにより視覚化されるように、これらのタンパク質は小疱に放出されることも明らかにされた。ネオエピトープ概念は、二座ハプテン（たとえば、ｄＢＢｒ）は、たとえば、ケラチン間の架橋結合を引き起こすという結果によりさらに実証される。
【００８７】
ネオエピトープの形成に加えて、架橋結合から、変更されたタンパク質高次構造／プロセシング／クリアランスなどの他の問題が生じる。この説に一致して、一部の感作化合物（グリオキサール、ＣＤＮＢ（１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン）及びｄＢＢｒ（ジブロモビマン）を含むが、これらに限定されない）により、血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ）などの急性期タンパク質のレベルが増加することが分かる。通常、ＳＡＰの血漿濃度は炎症に呼応して増加する。したがって、一部の感作分子は永久的炎症応答を煽動する可能性がある。ＳＡＰはタンパク質分解に高度に抵抗性であり、その結合はアミロイド線維を安定化し、インビトロでのその形成を増強し、全身性アミロイドーシス、自己免疫疾患及びアルツハイマー病におけるその病原性蓄積及び／又はインビボでの持続の一因となる。慢性炎症は、自然免疫防御のせいで自己攻撃（自己毒性）をもたらすことがあることは知られており、アルツハイマー病における炎症の際立った役割はますます関心を集めている。ＳＡＰは血液脳関門を通過することがあることも示唆されており、これは直接的に神経細胞傷害性である。ＳＡＰは、ヒト皮膚においてケラチン小体に、他にもインビトロでは単離されたＫＩＦ凝集体に結合することが分かっている。
【００８８】
さらに、ＳＬＥ中の抗ＳＡＰ抗体の量は疾病活性と相関している。ＳＡＰも尿中に見出すことが可能である。一部の感作物質に曝露されているが、他の物（オキサゾロンを含むが、これに限定されない）には曝露されていないマウスの血清でＳＡＰの量が増加するという知見は、追加の診断用インビトロ特長として利用することが可能である。
【００８９】
ハプテン（ｍＢＢｒ、ｄＢＢｒ、ＣＤＮＢ、オキサゾロン及びグリオキサールを含むが、他のものを排除しない）に局所的に曝露されたマウスは、その血清中において抗核抗体（ＡＮＡ）のレベルを増加させていたことも明らかにされた。上方調節されたレベルのＡＮＡは、一般に、様々な自己免疫疾患、すなわち、ＳＬＥ、ＲＡ、ＳＳのマーカーとして使用されている。
【００９０】
第四ステップは、身体においては、ケラチン小体は基底膜の下に降りてくることが明らかにされたことである。ケラチン小体は抗原提示細胞により食べ尽くされることは明らかにされている。真皮では、これらは主に真皮樹状細胞である。ランゲルハンス細胞などの表皮抗原提示細胞も、当然のことながら、これらの細胞残遺物に曝露され、これらの細胞も十中八九、感作過程の一部である。したがって、このステップでは、ネオ及び潜在性エピトープは抗原提示細胞により食べ尽くされる。ケラチンが放出され抗原として機能することを実証するため、皮膚接触を通じてハプテンに曝露されたマウスにおいて、ケラチンに対して自己抗体のＥＬＩＳＡ捕獲が実施された。その結果により、ハプテンはケラチンを免疫系に曝露させること、及びそのタンパク質断片は、それに対してマウスが自己抗体を発現するので、抗原性であることが示されている。このことは、小疱に見出された他のそれほど豊富ではないタンパク質（たとえば、スタスミン及びカルモジュリン）は感作物質と接触すると身体内に放出されることも実証している。
【００９１】
これらのステップは、システインよりも他のアミノ酸と優先的に反応するハプテンにも当てはまる。これは、ハプテンのパネルをヒトケラチノサイトに添加することにより明らかにされ、細胞応答を視覚化した。ハプテンは、媒体（ＤＭＳＯ）とは反対に、小疱形成を煽動する。ｓｙｎＢｉｍなどの非アレルギー性化合物、又はノナン酸は、小疱形成を誘導しない。刺激化合物のＳＤＳは小疱形成を引き起こさず、代わりに、細胞はＳＤＳに曝露されると「溶解する」ように思われる。
【００９２】
小疱はケラチンと他のタンパク質を含有する。小疱形成は身体でも起こる一般的応答であることは、単座又は多座である同じ求核種と異なる反応機序を通じて反応する多様な求核種（アミノ酸）に向けられる感作化合物に曝露されたマウスにおいてＫ１４に対する自己抗体を捕獲することにより実証されてきた。細胞への化合物の添加に先立って、活性化ステップ（たとえば、第１相解毒酵素による活性化）を含むことにより、プロハプテンは反応型（単数又は複数）の転換されることが可能であることが想定されている。プレハプテンは、身体の外で活性化されるために、「従来の」ハプテンに類似する形で機能する。
【００９３】
これらのステップ１〜４が感作を確立する。これらの発見に基づくインビトロ試験は本明細書の発明の中核である。
【００９４】
したがって、いくつかの実験を通して、ヒト組織におけるハプテンの卓越した標的はケラチノサイトであることが見出された。表皮が約９５％のケラチノサイト又はその残遺物（角質細胞）からなるにしても、ケラチノサイトの役割は見過ごされてきたことは驚きである。皮膚の重層性のせいで、ハプテンは、大量（細胞の全タンパク質含有量の最大３５％）のケラチン５及び１４（Ｋ５及びＫ１４）を含有する基底ケラチノサイトに到達することが可能である。
【００９５】
このように、本発明は、たとえば、ＡＣＤに対する感作物質である化合物に晒されたケラチノサイトは小疱を産生し、これらの小疱は、免疫を確立するのに重要な役割を果たしているケラチンなどのタンパク質を含有しているという発見に基づいている。小疱に見出される他のそれほど豊富ではないタンパク質（たとえば、スタスミン及びカルモジュリン）も、感作物質に接触すると身体内にも放出される。したがって、標準感作物質との比較を用いた、小疱形成までの時間などの小疱形成の異なる面の測定、インキュベーション後にケラチノサイト細胞が小疱を産生する化合物の濃度、高濃度の化合物での小疱の大きさ、高濃度の化合物での小疱の数、小疱中のＫ５及びＫ１４などの放出されたタンパク質の量は、本発明の基礎である。小疱は、当技術分野で公知である遠心分離、超遠心分離及び蛍光標識細胞ソーティングを通じて分離することが可能である。本発明において使用される細胞は、たとえば、マルチウェルプレートにおいて、細胞培養皿上で、試験管で、フラスコで、顕微鏡用スライドガラス上で及びバイオリアクターで培養することが可能である。
【００９６】
重層扁平上皮における基底細胞は極めて大量に、細胞含有量の最大２５〜３５％、Ｋ５及びＫ１４を発現する。したがって、感作及び誘発が、摂取を通じて、目接触、吸入を通じて、等などの身体中への物質の進入経路とは無関係である病気においても、記載されている機序（ステップ１から４まで、上記参照）が関与している可能性がある。したがって、化合物がケラチノサイトの小疱形成を引き起こす場合、問題の化合物がＡＣＤに加えて他の状態も誘導することがあるという高リスクが存在する。したがって、本発明の小疱形成応答は、化合物との上皮接触により引き起こされることがある他の状態の予測的試験としても利用することが可能である。これらの状態には、化学的に誘導される喘息が含まれるが、他の病気を排除しない。
【００９７】
さらに、身体内への化合物の進入経路に関係なく、同一の又は高度に相同なエピトープに遭遇するという知見（Ｋ５／Ｋ１４及びＫ８／Ｋ１８により例証される）には他の意味もある。この例は、小疱形成応答も重要である可能性があるＤＨＲである。したがって、本発明の別の目的は、小疱形成応答を用いて、薬物誘導過敏症反応（ＤＨＲ）を引き起こす化合物（純粋な形、混合物、製剤、溶液中、等）のリスクを計測することである。このように、本発明は、上皮接触による薬物有害反応についての予測的スクリーニングの大きな前進を表している。前記試験を使用して、これらの効果と関連付けて小疱形成応答の阻害剤についてスクリーニングすることも可能である。先ず、仮の阻害剤が、インビトロ試験において、感作物質についてと同じ方法で細胞に添加される。極度の、強い、中程度の及び弱い感作物質と同じタイムスケール又は濃度では小疱は形成されないはずである。仮の阻害剤がこの第一ステップを通過する、つまり、小疱形成応答が記録されない場合、阻害剤は次のステップに移される。次のステップは、細胞を異なる強度の感作物質を用いるインビトロ試験において前記阻害剤と一緒にインキュベートすることである。小疱形成応答は評価され、感作物質それ自体から生じた小疱形成応答と比較される。阻害剤は、それが小疱形成応答を減少させる又は完全に妨げる場合には、成功であると見なされる。
【００９８】
したがって、小疱形成が煽動され、免疫学的閾値を通過すると、自己寛容が違反されることが提案される。これらの寛容違反には、Ｋ５、Ｋ１４及び、放出されたタンパク質と他の自己タンパク質間（たとえば、Ｋ５とＫ８間及びＫ１４とＫ１８間）の相同性を通じたエピトープ拡大を含むいくつかの標的が含まれる。したがって、本明細書に提示される本発明は小疱形成応答を用いて、自己寛容の違反を引き起こし、したがって、自己免疫疾患を煽動する化合物、混合物、溶液及び他の製剤の能力を測定することが可能である。前記試験を使用して、これらの効果と関連付けて小疱形成応答の阻害剤についてスクリーニングすることも可能である。
【００９９】
したがって、感作化合物は、一般に、ケラチノサイトを促進して小疱を産生させると結論付けることができる。これは、最終的には感作（ＡＣＤ）；及び／若しくは自己免疫疾患；及び／若しくは他のアレルギーをもたらし；並びに／又はＤＨＲに対して個人を抗原刺激する記号論理学的連鎖の事象における重要な関門に相当する。それぞれの場合の特定の結果は、個人の免疫系及びその環境要因に依存する可能性がある。規制問題を反映する段階的予測的インビトロ試験の開発を可能にしたいくつかの実行可能なパラメータが同定されている。その上、混合物、溶液、製剤、等は、化合物の組合せ効果をその特定の調製物において試験するために希釈／溶解後に使用することが可能である。どの感作化合物が放出されるのかとは無関係に同じエピトープが放出されるので、法律制定前には考えられていなかった相加的及び潜在的には相乗的ですらある効果が存在する。消費者製品の大部分が同じ製剤中（たとえば、香水、洗髪剤、化粧水、等中）に多くの感作化合物を含有するので、これには化合物の試験方法及び安全限界の評価方法に関して大きな意味がある。
【０１００】
マウスＬＬＮＡ、すなわち、間もなく時代遅れになることになるＡＣＤに対するＯＥＣＤ承認試験の１つの重要な特長は、それが化合物を極度に、強力に、中程度に、弱い又は非アレルギー性に分類する段階的読取りを与えることである。類別は、化合物の法的取り扱い及び分類に免疫毒性学的基礎を与える。これは、本発明の細胞ベースのインビトロ試験において取り組む特長である。段階的読取りを可能にするのに十分なダイナミックレンジを与える応答の混合が使用される。
【０１０１】
この例には、異なる濃度のハプテンにおいて、ハプテン添加後のどの時点で小疱形成が起きるのか；どの濃度で小疱形成は起きるのか（固定された時点）；濃度ｘ及び時間ｙにおいて何個の小疱が周囲の培地中に放出されるのか；が含まれる（しかし、他の変数を排除しない）。標準化は、たとえば、ノナン酸又は類似の化合物などの非アレルゲン及び非刺激物質を用いた処置を受けたマウスとの比較を通じて与えられることになる。対照試料はどんな試験化合物にも晒されたことがない。細胞は、ヒト始原ケラチノサイト、ケラチノサイト由来の細胞系又は必要な小疱形成応答を共有する他の上皮細胞であってよい。測定されるパラメータは、組み合わされたシグナルが段階的読取りを与えることになる行列を形成することになる。
【０１０２】
ＬＬＮＡに存在するが、他の細胞ベースの試みでは見落とされてきた別の重要な特長は、キャリブレーション（及び再現性）という特長である。典型的には、ＨＣＡ（αヘリックス桂皮アルデヒド）を使用して、応答を較正し、試験手順の状態の検査をする。ＨＣＡキャリブレーション実験は、典型的には、時には年間を通じて含まれる。本発明の試験では、特定の信頼できる応答を与えることが知られている制御された物質を添加することによりキャリブレーションは与えられることになり、例には、オキサゾロン、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン、ｍＢＢｒ、及びＨＣＡが含まれるが、他の物質を排除しない。このキャリブレーションは試験が行われるたびに実行することが可能である。これは、ｐＨ測定ごとに前にｐＨ電極が較正されることに類似している。したがって、本発明の試験は、実際に、間もなく時代遅れになるＬＬＮＡよりすぐれたキャリブレーションを与えることになる。
【０１０３】
すでに言及されたように、本明細書に提示される本発明には、始原ヒトケラチノサイト、他の哺乳動物由来のケラチノサイト及び前記細胞の特徴（すなわち、有害な化合物と接触すると小疱形成する）を共有する他の関連する哺乳動物上皮細胞が含まれる。本発明には、前記細胞の特徴（すなわち、有害な化合物と接触すると小疱形成する）を共有する細胞系も含まれる。本発明には、ケラチン及び／又はその変異体を発現する他の細胞／細胞系も含まれる。本発明には、重層組織まで分化したケラチノサイトの使用も含まれる。前記ケラチン及びその他のタンパク質の化学修飾は極めて意味深い事象であり、これらのタンパク質又はその変異体又はこれらのタンパク質に基づく配列を有するペプチドが、化合物、混合物、溶液又は製剤の感作力を計測する手段を提供することができると考えられる。すなわち、試験は潜在的には細胞なしでも設定することができ、関連するタンパク質／ペプチドと問題の化合物（単数又は複数）間の反応を直接測定することができる。
【０１０４】
細胞ベースのアッセイの出力基準（新しい化合物（純粋な形、混合物、溶液及び他の製剤で）が細胞に添加されるときの小疱形成応答）は、
ｉ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットを通じた放出されるタンパク質（たとえば、Ｋ５及びＫ１４又は他のタンパク質）の量。
ｉｉ．デジタルカメラに連結した光学顕微鏡を使用する放出された小疱の大きさ及び量。
ｉｉｉ．膜プローブ、たとえば、ＦＭ１−４３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用する放出された小疱の量。このプローブは水性媒体中では非蛍光性であり、細胞膜（又は小疱膜）に挿入されると、強い蛍光性になる。蛍光量はハプテンに強度と相関する、すなわち、ハプテンが強力であるほど、蛍光も高くなる。
ｉｖ．蛍光標識細胞ソーティングを使用する放出された小疱の大きさ及び量。小疱は大きさにより分別され、それに続いて、その含有量はＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び／又はウェスタンブロットを使用して分析することができる。
ｖ．絶対小疱数を計測し小疱の大きさを測定するフローサイトメトリー法、たとえば、Ｇｕａｖａ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ−９６（ＰＣＡ−９６）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。
ｖｉ．ラボオンチップ。「ラボオンチップ」又は「マイクロ流体デバイス」は、最も一般的には、光学顕微鏡に適しているが、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）に限定されない透明の材料からなるデバイスである。前記デバイスは、大きさがわずかミリメートルから数平方センチメートルである。前記用語は、実デバイスに連結されているポンプ及びバルブのような機械的流量調節器又は流量計及び粘度計のようなセンサーのことでもある。前記デバイス内部にはマイクロメーターサイズのチャンバー及びチャネルがあり、これらは、細胞培養、細胞ソーティング及び１個、又は数個の細胞を異なる化合物に曝露するなどのいくつかの実験室ステップを統合する機能を有する。１個、又は数個の細胞から出現する小疱の数及び時間スケールの他にも大きさはこの方法を用いて評価される。
ｖｉｉ．ハイスループットスクリーニング。この方法は、撮像デバイス及びタンパク質分析と組み合わせて（しかしこれらに限定されない）、ロボットスクリーニングアッセイを使用する多数の化合物の急速インビトロスクリーニングのために使用される。ＨＴＳでは、多くの化合物は、好ましくは、細胞上で並行して試験され同時にスクリーニングされる。画像分析は、小疱数、小疱の大きさ及び標識された細胞成分の蛍光強度などの多くの異なるパラメータについて画像から数値データを生み出すことができる。
ｖｉｉｉ．小疱の放出に関して報告する工学的に操作された蛍光システム。Ｋ５−ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質又はたとえば、蛍光性である類似のタンパク質）形質転換細胞（たとえば、正常なヒト表皮ケラチノサイト（ＨＥＫｎ）又は必要なＨＥＫｎ特徴を共有する細胞系）が使用される。試験化合物が添加されると、それが感作物質である場合、その化合物は小疱形成をもたらし、Ｋ５は小疱内に放出されるために、小疱は蛍光性になり培地中の蛍光を定量化することができる。他のタンパク質構築物、たとえば、Ｋ１４−ＧＦＰ構築物も使用することが可能である。
ｉｘ．たとえば、互いとの又は、たとえば、デスモプラキン若しくは近接空間接触している他のタンパク質との蛍光エネルギー移動現象を示す蛍光Ｋ５及びＫ１４構築物などの蛍光標識法を使用して、小疱中へのタンパク質の放出に関して報告してもよい。デスモプラキンとＫ５が空間的に離れている場合は、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）現象はもはや示されない。
ｘ．たとえば、Ｋ１４及びＫ５に対する抗体又は結合物質に基づく捕獲システム（たとえば、ＥＬＩＳＡ）を使用して、細胞により周囲の培地に放出される特定のタンパク質の量を定量化することもできる。
ｘｉ．水晶振動子マイクロバランス法
ｘｉｉ．たとえば、捕獲試薬として小疱中のタンパク質に対する抗体を使用する表面プラズモン共鳴。
ｘｉｉｉ．細胞は、アポトーシスのタイムスケールと両立するタイムスケールで小疱形成を放出するために、及び小疱放出細胞はアポトーシス細胞と少なくともいくつかの特長を共有していると思われるために、アポトーシスを測定するのに使用される標識及びキット（たとえば、アネキシンＶ又はカスパーゼキット）を使用して、たとえば、免疫蛍光及びフローサイトメトリーを用いて小疱形成応答を測定することもできる。
ｘｉｖ．細胞（たとえば、ＨＥＫｎ細胞又はＨＥＫｎ特徴を有する細胞系）は半透過性支持体上で増殖させることが可能であり、その小疱及び／又は小疱内容物は、「フロースルー」を使用することにより収穫することができる。例には、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）  Ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用することが含まれるが、これに限定されない。試験される化合物（純粋な形、混合物、溶液及び他の製剤で）が表面に添加され、フロースルーが収集され、放出されたタンパク質の量（すなわち、細胞からの小疱形成応答）が測定される。類似する形で、支持体マトリックスは細胞を増殖させるためにも使用することが可能である。
ｘｖ．必要な障壁特徴及び透過特徴を示すインビトロ上皮組織であって、小疱形成応答を示す細胞を含有する上記インビトロ上皮組織を分析において使用することが可能である。試験される化合物（純粋な形、混合物、溶液及び他の製剤で）が組織の表面に添加され、フロースルーが収集され、放出されたタンパク質の量（すなわち、組織中の細胞からの小疱形成応答）が測定される。
【０１０５】
本発明の追加の態様は、感作性について化合物又はその混合物、製剤、及び溶液をスクリーニングするためのキットであって、
ｉ）１つ又は複数のケラチノサイト細胞培養物
ｉｉ）前記１つ又は複数のケラチノサイト細胞培養物を集密まで増殖させるための手段
ｉｉｉ）試験する前記化合物を選択された範囲の希釈度まで希釈する手段
ｉｖ）本明細書に記載される方法のうちのいずれかに従ってｉｉ）及びｉｉｉ）における前記手段を使用するための使用説明書
を含む上記キットを包含する。
【０１０６】
さらに、前記キットは上記の１つ又は複数の標準感作物質を含みうる。
【０１０７】
さらに、前記キットは、たとえば、試験される前記化合物を選択された範囲の希釈度まで希釈するための手段及びケラチノサイト培養物を集密まで増殖させるための手段、又は特定の試薬の使用手段の使用を開示する説明資料を含みうる。前記説明資料は、電子書式で（たとえば、コンピュータディスケット若しくはコンパクトディスク）書かれてもよいし、又は視覚的（たとえば、ビデオフィルム）でもよい。前記キットは、前記キットの設計目的である特定の適用を促進するための追加の成分を含んでいてもよい。したがって、たとえば、前記キットは、特定の開示された方法の実行のために常用されている緩衝剤、増殖培地、補助剤及び他の試薬を含むことが可能である。そのようなキット及び適切な内容物は当業者には周知である。
【０１０８】
前記キットは、本明細書に記載されるケラチノサイト小疱形成応答を評価するための手段を、１つ又は複数の別々に包装された試薬として、少なくとも１つのアッセイに十分な量で、他にもそれを使用するための別々の使用説明書をさらに含みうる。
【０１０９】
前記包装された試薬の使用のための使用説明書も典型的には含まれる。そのような使用説明書は、典型的には、試薬濃度並びに／又は混合される試薬と化合物の相対量、試薬／試料混合物の維持期間、温度、緩衝条件及び同等の物などの少なくとも１つの試験方法パラメータを説明する具体的表現を含む。
【０１１０】
前記キットは、箱、袋、サッチェル、プラスチック製容器（たとえば、成型プラスチック又は他の透明包装）、ラッパー（たとえば、密封された若しくは密封可能なプラスチック、紙、又は金属製ラッパー）、或いは他の容器などのキャリア手段をさらに含み得る。
【０１１１】
いくつかの例では、キット成分は、箱又は他の容器などの１つの包装単位であって、１つ又は複数のキット成分を入れることができる仕切りを有しうる上記包装単位に封入されることになる。他の例では、キットは、１つ又は複数の容器、たとえば、バイアル、管、及び、たとえば、試験される１つ又は複数の生体試料を保持することができる同等の物を含む。
【０１１２】
他のキット実施形態は、たとえば、生体試料を取り扱う、収集する及び／又は処理するのに有用でありうる注射器、綿棒、又はゴム手袋を含む。キットは、随意に、たとえば、点滴器、注射器、及び同等の物を含む、生体試料をある場所から別の場所に移動させるのに有用な道具も含有しうる。さらに、前記キットは、使用済みの又はもはや必要ではない物（たとえば、対象試料、等）を破棄するための処分手段を含んでいてもよい。そのような処分手段は、制限なく、プラスチック、金属又は他の不透過性袋、箱若しくは容器などの廃棄物質からの漏れを含有することができる容器を含むことが可能である。
【０１１３】
キット成分は、ケラチノサイト細胞培養物若しくは培地補助剤のためのドライアイス又は冷却しておくべき成分、たとえば、増殖培地のための氷嚢などの、異なる貯蔵及び輸送温度に必要な包装をさらに含みうる。
【実施例】
【０１１４】
（例１）
ＡＣＤにおけるリスク評価のための化合物のインビトロスクリーニング。光学顕微鏡を使用する分析
細胞培養
正常なヒト表皮ケラチノサイト（ＨＥＫｎ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡ）は、６０μＭのＣａＣｌ２、抗生物質ゲンタマイシン／アンホテリシン及び１％（ｖ／ｖ）ヒトケラチノサイト増殖補助剤（ＨＫＧＳ；Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を補充されたフェノールレッド無しのＥｐｉＬｉｆｅケラチノサイト培地（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）において維持された。代わりに、２００μＭのＣａＣｌ２を含有し、ＨＫＧＳ（１％（ｖ／ｖ））を補充された、抗生物質のないＭｅｄｉｕｍ１５４が使用される。細胞は、加湿された５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で増殖させた。補充された培地中の成分の最終濃度は、ウシ下垂体抽出物、０．２％ｖ／ｖ；ウシインスリン、５ｍｇ／ｍＬ；ヒドロコルチゾン、０．１８ｍｇ／ｍＬ；ウシトランスフェリン、５ｍｇ／ｍＬ；ヒト表皮増殖因子、０．２ｎｇ／ｍＬ；随意に、ゲンタマイシン、１０μｇ／ｍＬ、及びアンホテリシンＢ、０．２５μｇ／ｍＬであった。試薬はすべて、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡから入手した。ケラチノサイトは、第５又は第６継代で実験に使用された。
【０１１５】
スクリーニング
継代６のＨＥＫｎ細胞は分割され、１％（ｖ／ｖ）ヒトケラチノサイト増殖補助剤（ＨＫＧＳ；Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、抗生物質添加なし）を補充されたｍｅｄｉｕｍ１５４（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）中１８５００細胞／ｍｌまで再懸濁された。細胞懸濁液（０．５ｍｌ）は２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍｕｌｔｉｄｉｓｈｅｓ  Ｎｕｎｃｌｏｎ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）の各ウェルに添加され、５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートされた。培地は、細胞が培養密度になるまで、ＨＫＧＳを補充された新鮮な１５４培地（抗生物質添加なし）で１日おきに交換された。
【０１１６】
試験される化合物（たとえば、ｍＢＢｒ、ＳＤＳ、ＣＤＮＢ、ノナン酸、ＨＣＡ、オキサゾロンはＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、ｑＢＢｒ、ｄＢＢｒ、グリオキサール及びホルムアルデヒドはＭｅｒｃｋ−Ｓｃｈｕｃｈａｒｄｔ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙから入手した）はＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）中、最終濃度の５０ｍＭ、５ｍＭ及び０．５ｍＭまで希釈された。これらの保存液は、実験が実施されるたびに新たに調製された。
【０１１７】
代わりに、混合物、溶液、製剤、等は、ＤＭＳＯ中における希釈／溶解後に使用することができる（その特定の調製物における化合物の組合せ効果を試験するため）。同じエピトープが放出されるために、法律制定前は考えられなかった相加効果が存在する。
【０１１８】
１）実験を開始する直前の細胞調製：細胞培養プレート中の培地は、ＨＫＧＳ（１％（ｖ／ｖ）ヒトケラチノサイト増殖補助剤（ＨＫＧＳ；Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ））を補充された２５０μｌの新鮮なＭｅｄｉｕｍ１５４（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）に置き換えられ、細胞は５％ＣＯ２、３７℃で保管される。
【０１１９】
２）培地中での試験化合物の調製：２４５μｌのＭｅｄｉｕｍ１５４は０．５ｍｌのマイクロチューブに添加され、３７℃まで予熱された（水浴）。５μｌの化合物の保存液は、予熱された培地を含有するマイクロチューブに添加された。次に、これらの溶液は直ちに２４ウェルプレートの細胞に添加された。
【０１２０】
３）マイクロチューブ中の溶液（すなわち、２５０μｌ培地＋試験化合物）は各プレートに添加された。したがって、試験における各化合物の最終濃度は、０．５ｍＭ、０．０５ｍＭ、及び０．００５ｍＭであった。細胞と試験化合物を含有するプレートは５％ＣＯ２、３７℃で２４時間インキュベートされた。
【０１２１】
４Ａ）各ウェルは、デジタルカメラに連結された光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  ＴＥ３００倒立顕微鏡）を用いて調べられて、小疱形成応答を決定した。所定の時点（１．５；２．５；２４時間）での産生された小疱の量は、盲検試験（すなわち、小疱を計測する顕微鏡使用者は、各ウェルにどの化合物が添加されているのかに関する知識はまったくない）での目視検査を通じて評価された。測定されたパラメータは：
小疱形成までの時間
極度の感作物質（オキサゾロンを含む）
オキサゾロン１．５時間
強い感作物質（ｄＢＢｒ、ｍＢＢｒ、ＣＤＮＢを含む）
ｍＢＢｒ２．５時間
ＣＤＮＢ２４時間
細胞が２４時間後に小疱を産生した濃度
極度の感作物質（オキサゾロンを含む）
０．５ｍＭ、０．０５ｍＭ
強い感作物質（ｄＢＢｒ、ｍＢＢｒ、ＣＤＮＢを含む）
０．５ｍＭ（ｄＢＢｒは０．０５ｍＭでも）
中程度の感作物質（グリオキサールを含む）
０．５ｍＭ
弱い感作物質（ＨＣＡを含む）
試験された濃度では小疱形成なし
小疱の量（時間２４時及び濃度０．５ｍＭで）
極度の感作物質（オキサゾロンを含む）
高量の小疱（＋＋＋）
強い感作物質（ｄＢＢｒ、ｍＢＢｒ、ＣＤＮＢを含む）
中程度量の小疱（＋＋）
中程度の感作物質（グリオキサールを含む）
低量の小疱（＋）
弱い感作物質（ＨＣＡを含む）
小疱は検出されない
である。
【０１２２】
これらの３種のエンドポイントを使用して、化合物の感作潜在力の収集分析が行われた。オキサゾロンは極度の感作物質であり、ｍＢＢＲ及びＣＤＮＢは強い感作物質であり、グリオキサールは中程度の感作物質であることが見出され、ＨＣＡは試験された濃度では小疱形成を誘導しなかった。これらの結果はＬＬＮＡ実験とよく相関しており、前記方法が化合物の感作性を決定するためによく機能することを実証していた。
【０１２３】
（例２）
ＡＣＤにおけるリスク評価のための化合物のインビトロスクリーニング。蛍光色素による分析
この例は、ハプテン誘導「小疱形成」の差、すなわち、ハプテンの強度を定量化するための蛍光の測定のために、試験化合物の添加の２４時間後（オキサゾロンにより例証される）、３×９０μｌは２４ウェルプレートの各ウェル（濃度０．５ｍＭ、０．０５ｍＭ、及び０．００５ｍＭ）から９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｆ９６  ｍｕｌｔｉｓｏｒｐ）に移されたこと以外は、例１に述べられる通りに実施された。１０μｌ（最終濃度５μｇ／ｍｌ）の色素ＦＭ  １−４３（Ｔ３１６３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）が各ウェルに添加された。プレートは暗所で２分間インキュベートされ、蛍光は、励起５１０ｎｍ及び発光６２６ｎｍのプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｇｏｔｅｎｂｏｒｇｓ  Ｔｅｒｍｏｍｅｔｅｒｆａｂｒｉｋ、Ｇｏｔｅｂｏｒｇ、Ｓｗｅｄｅｎ）において検出された。
【０１２４】
色素ＦＭ  １−４３は水性溶媒中では実質的に非蛍光性であるが、細胞膜（又は小疱膜）中に挿入されると強い蛍光性になるので、この色素を使用して溶液中の小疱膜の量を測定することが可能である。したがって、蛍光はハプテンの強度と相関しており、すなわち、ハプテンが強いほど、それだけ多くの小疱が周囲の培地に放出され、その培地中の蛍光はそれだけ高くなった。
【０１２５】
（例３）
ＡＣＤにおけるリスク評価のための化合物のインビトロスクリーニング。放出されたタンパク質の分析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットを通じて放出されたタンパク質（たとえば、Ｋ５及びＫ１４）の量を観察することにより、小疱形成応答の定量化も行われた。小疱は例４に記載される通りに収集され溶解された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：試料は、ＸＴ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４Ｘ（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）及びｍｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて希釈された（小疱：ブロッティングでは４６μｇ、３０μｌ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥでは２９．２μｇ、４０μｌ。Ｋ１４及びＫ５：０．２μｇ、５μｌ）。１μｌのＤＴＴ（２Ｍ）が各試料に添加され、続いてゲル上に適用する前に９６℃で２分間加熱する。電気泳動プログラム：２００Ｖ、４００ｍＡ、５０Ｗ、５０分。ＭＯＰＳランニング緩衝液。ゲルは固定され、蛍光について走査され（励起４８０ｎｍ、発光５３０ｎｍ）及びクーマシー染色された（Ｂｉｏ−Ｓａｆｅ（商標）Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）。次に、ゲルはタンパク質の定量的測定のために使用された。ウェスタンブロット：固定されていないゲルはポリビニルジフルオリド膜（ＰＶＤＦ  Ｒｅａｄｙ−ｇｅｌ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓａｎｄｗｉｃｈｅｓ、７×８．５ｃｍ、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）上にブロットされた。ブロッティングプログラム：７０Ｖ、４００ｍＡ、５０Ｗ、３０分。トランスファー緩衝液。Ｎｏｖｅｘ  ＸＣｅｌｌ  ＩＩ（商標）Ｂｌｏｔ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｅ１９０５１、Ｎｏｖｅｘ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）。ブロットは、ブロッキング緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、３％の脱脂粉乳）、抗体希釈緩衝液で１：５０００に希釈された始原ケラチン５又はケラチン１４モルモット抗ヒトポリクローナル抗体（Ｌｉｆｅｓｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＵＳ）、並びに抗体希釈緩衝液中１：２０００に希釈されたペルオキシダーゼウサギ抗モルモットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）中でインキュベートされた。ブロットは各ステップ間に洗浄緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）で３×１０分間洗浄され、ＤＡＢ及び過酸化尿素（ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ（商標）３，３’−ジアミノベンジジンタブレット、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｇｍｂｈ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で現像された。ペルオキシダーゼ−ＤＡＢ反応は、ミリ−Ｑ水で洗浄することにより消光された。
【０１２６】
ブロットの現像後、分析により、Ｋ５及び／又はＫ１４がＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に存在するかどうかが示された。
【０１２７】
（例４）
小疱の収集
小疱の収集を改善し、死んだ非粘着性細胞による汚染を回避するために、この手順に従った。この手順により、小疱形成応答を測定するのに使用することができる試料が得られる。
【０１２８】
細胞
細胞（ＨＥＫｎ）は、７５ｃｍ２フラスコにおいて開始密度約１．８×１０５細胞／ｃｍ２で増殖され、細胞が７０〜８０％培養密度に到達するまで培養された（上記の通り）。
【０１２９】
試験化合物
ｍＢＢｒ、ｄＢＢｒ、ｑＢＢｒ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）及びオキサゾロン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の５０ｍＭ保存液は、ＤＭＳＯ中で調製され、グリオキサール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）はダルベッコＰＢＳ（Ｃａ、Ｍｇなし；ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｉｎｚ、Ａｕｓｔｒｉａ）中、７９ｍＭで調製された。インキュベーション前に、試薬は５ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０６ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ）中、そのそれぞれの濃度（ｍＢＢｒ、ｄＢＢｒ  ０．０５ｍＭ；ｑＢＢｒ、グリオキサール、オキサゾロン  ０．５ｍＭ）まで希釈された。
【０１３０】
試験化合物を用いたインキュベーション
細胞層はＨＥＰＥＳ緩衝液を用いて洗浄され、５％ＣＯ２加湿インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｏｒｍａ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）中、３７℃で２４時間、試薬液と一緒にインキュベートされた。
【０１３１】
小疱の調製
インキュベーション培地は細胞層から吸引され、５００×ｇ、室温で５分間遠心分離されて、インキュベーション期間中に離昇した可能性のある細胞から小疱を分離した。このステップは、小疱から死んだ非粘着性細胞を分離する。小疱は上清中に存在し、細胞はペレット化された。
【０１３２】
小疱溶液の更なる使用
上清中の小疱は、エタノール、ドライアイス及び３７℃の水浴を使用して４×凍結融解サイクルを用いて溶解された。前記ライセートは濃縮され、５ｋＤａ  ＭＷＣＯ  ４ｍｌのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ａｇｉｌｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）中で脱塩された。全タンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙを用いて決定された。濃縮物は、前記タンパク質の分析が実施されるまで−２０℃で保存された（例３に記載される方法に従って）。
【０１３３】
（例５）
ＡＣＤにおけるリスク評価のための化合物のインビトロスクリーニング。蛍光標識細胞ソーティングによる分析
この例では、試験手順は例１にある通りに実施され、小疱の収集は例４にある通りに実施された。次に、小疱の大きさと量は、ソーティング機能のあるフローサイトメーター（ＦＡＣＳＡｒｉａ、ＢＤ、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析された。次に、小疱は大きさに従って分別され、各小疱が計測された。ビーズは大きさの標準として使用することが可能である。
【０１３４】
小疱溶液のさらなる使用
収集され小疱は溶解され、例３に記載されるタンパク質含有量に関して分析された。
【０１３５】
（例６）
ＡＣＤにおけるリスク評価のための化合物のインビトロスクリーニング。フローサイトメトリーを使用する分析
このスクリーニングは、例５にある通りに実施された。小疱の数はフローサイトメーター（たとえば、Ｇｕａｖａ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ−９６（ＰＣＡ−９６）Ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）において計測された。小疱の大きさは、サイズ標準ビーズを使用して評価することが可能である。
【０１３６】
（例７）
ラボオンチップを使用する、ＡＣＤにおけるリスク評価のための化合物のインビトロスクリーニング
細胞培養
細胞（ＨＥＫｎ）は、７５ｃｍ２フラスコにおいて開始密度約１．８×１０５細胞／ｃｍ２で増殖され、細胞が７０〜８０％培養密度に到達するまで培養された（上記の通り）。
【０１３７】
ラボオンチップ
継代６のＨＥＫｎ細胞は分割され、１％（ｖ／ｖ）ヒトケラチノサイト増殖補助剤（ＨＫＧＳ；Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、抗生物質添加なし）を補充されたｍｅｄｉｕｍ１５４（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）中１８５００細胞／ｍｌまで再懸濁された。細胞懸濁液（０．５ｍｌ）は、たとえば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）からなるが、これに限定されないマイクロ流体デバイスに添加され、５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートされた。培地は、細胞が培養密度になるまで、ＨＫＧＳを補充された新鮮な１５４培地（抗生物質添加なし）で、前記デバイスを洗い流すことにより１日おきに交換された。
【０１３８】
スクリーニング
ｍＢＢｒ、ｄＢＢｒ、ｑＢＢｒ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）及びオキサゾロン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の保存液（たとえば、５０ｍＭ）は、ＤＭＳＯ中で調製され、グリオキサール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）はダルベッコＰＢＳ（Ｃａ、Ｍｇなし；ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｉｎｚ、Ａｕｓｔｒｉａ）中、７９ｍＭで調製された。インキュベーション前に、試薬は５ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０６ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ）中、そのそれぞれの濃度（ｍＢＢｒ、ｄＢＢｒ  ０．０５ｍＭ；ｑＢＢｒ、グリオキサール、オキサゾロン  ０．５ｍＭ）まで希釈された。
【０１３９】
試験化合物を用いたインキュベーション
マイクロ流体デバイスは光学顕微鏡試料台上に載せられ、透過光及び蛍光撮像（たとえば、Ｎｉｋｏｎ  ＴＥ３００倒立顕微鏡）を可能にした。顕微鏡試料台は好ましくは自動化され、同一チップ上のいくつかの化合物の自動調査を可能にした。前記デバイスは、３７℃、５％ＣＯ２加湿インキュベーターにおいて封入される必要がある。前記細胞を含有する前記デバイスは、純粋なＨＥＰＥＳ緩衝液で洗い流された。その後、前記流れは試験溶液に交換され、試薬液と一緒にインキュベートされた。
【０１４０】
小疱をモニターする
細胞は連続して（たとえば、２０分毎に）モニターされ、試験溶液への曝露中に撮像された。小疱形成開始までの時間は、上記の通りにモニターされた。しかし、小疱の大きさと形状も、顕微鏡に接続されたデジタルカメラにより記録された。同時に、放出された小疱はマイクロ流体透析により収集され、マイクロチューブに収集された。
【０１４１】
マイクロチューブは遠心分離されて（例２に記載された通りに）、インキュベーション期間中に離昇した可能性のある細胞から小疱を分離した。
【０１４２】
小疱溶液のさらなる使用
収集され小疱は溶解され、例３に記載されるタンパク質含有量に関して分析された。
【０１４３】
（例８）
ハイスループットスクリーニングを使用する、ＡＣＤにおけるリスク評価のための化合物のインビトロスクリーニング
細胞培養
細胞（ＨＥＫｎ）は、７５ｃｍ２フラスコにおいて開始密度約１．８×１０５細胞／ｃｍ２で増殖され、細胞が７０〜８０％培養密度に到達するまで培養された（上記の通り）。
【０１４４】
スクリーニング
継代６のＨＥＫｎ細胞は分割され、１％（ｖ／ｖ）ヒトケラチノサイト増殖補助剤（ＨＫＧＳ；Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、抗生物質添加なし）を補充されたｍｅｄｉｕｍ１５４（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）中１８５００細胞／ｍｌまで再懸濁された。細胞懸濁液（０．５ｍｌ）はいくつかの２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍｕｌｔｉｄｉｓｈｅｓ  Ｎｕｎｃｌｏｎ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）の各ウェルに添加され、５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートされた。培地は、細胞が培養密度になるまで、ＨＫＧＳを補充された新鮮な１５４培地（抗生物質添加なし）で１日おきに交換された。
【０１４５】
ｍＢＢｒ、ｄＢＢｒ、ｑＢＢｒ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）及びオキサゾロン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の保存液（たとえば、５０ｍＭ）は、ＤＭＳＯ中で調製され、グリオキサール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）はダルベッコＰＢＳ（Ｃａ、Ｍｇなし；ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｉｎｚ、Ａｕｓｔｒｉａ）中、７９ｍＭで調製された。インキュベーション前に、試薬は５ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０６ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ）中、そのそれぞれの濃度（ｍＢＢｒ、ｄＢＢｒ  ０．０５ｍＭ；ｑＢＢｒ、グリオキサール、オキサゾロン  ０．５ｍＭ）まで希釈され、例１に記載されるとおりに細胞に添加された。
【０１４６】
前記ウェルは、好ましくは、プレート搭載ロボット、たとえば、ハミルトンプレート搭載ロボット付きのオリンパスＳｃａｎ∧Ｒを備えたＨＣＳデバイスに載せられた。細胞形態と小疱の両方が、異なる濃度の多数の試験化合物についてモニターされることになる。
【０１４７】
小疱溶液のさらなる使用
収集され小疱は溶解され、例３に記載されるタンパク質含有量に関して分析された。
【０１４８】
（例９）
工学的に操作された蛍光システムを使用する、ＡＣＤにおけるリスク評価のための化合物のインビトロスクリーニング
ケラチノサイトは、標準手順に従ってケラチン５及びケラチン１４にカップリングされた緑色蛍光タンパク質を発現するように形質転換された。次に、代わりにこれらの工学的に操作された細胞を使用して、例１及び４にある通りに試験は実施された。次に、小疱の量は、ＧＦＰを検出するプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｉｎｃ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）において分析された。
【０１４９】
（例１０）
ＡＣＤにおけるリスク評価のための化合物のインビトロスクリーニング。捕獲システムを使用する分析（ＥＬＩＳＡ）
スクリーニングは、例１に記載される通りに実施された。小疱は、例４に従って分離され、溶解された。次に、小疱含有量、たとえば、Ｋ１４の量は、サンドイッチＥＬＩＳＡシステムを使用して分析された。
【０１５０】
コーティング
ヒト抗Ｋ１４捕獲抗体（Ｌｉｆｅｓｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ、ＵＳ）はＰＢＳに希釈された（１対５００）。５０μｌの溶液が９６ウェルプレートのウェルに添加された。プレートはパラフィンで覆われ、湿室において、４℃で一晩インキュベートされた。
【０１５１】
ランニング
各ウェルは吸引され、３００μｌの洗浄緩衝液（ＴＲＩＳ、０．０５％ＴＷＥＥＮ）で合計３回洗浄された。最後の洗浄後、残っている洗浄緩衝液は、プレートを清潔な紙タオルに倒立させることにより取り除かれた。１５０μｌのブロッキング溶液（０．５％ＢＳＡ、０．０５Ｍ  ＴＲＩＳ、ｐＨ７．４）が各ウェルに添加され、前記プレートは室温（ＲＴ）で１時間インキュベートされた。洗浄ステップは、以前に記載された通りに４回実施された。
【０１５２】
小疱内容物は試料緩衝液（０．０５Ｍ  ＴＲＩＳ、０．０１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に１対１００、１対５、１対５、１対５で希釈され、５０μｌ／ウェルはプレートに３通りに添加された。ヒトＫ１４（Ｇｅｎｗａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）は正の対照として使用され、プレートにおいて１対４００から１対６４００までの試料緩衝液での連続希釈により、２通りに調製された。プレートは室温で１時間インキュベートされた。洗浄ステップは、上に記載される通りに４回実施された。
【０１５３】
ヒト抗Ｋ１４抗体（Ｌｉｆｅｓｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ、ＵＳ）は適切に希釈され（１対３０００）、５０μｌが各ウェルに添加され、プレートは室温で３０分から１時間インキュベートされた。洗浄ステップは、上に記載される通りに４回実施された。
【０１５４】
ビオチン化された検出抗体（マウスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ  Ｆ（ａｂ）２断片に対するヤギポリクローナル、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）は、試料緩衝液に１／１５００で希釈され、５０μｌが各ウェルに添加された。プレートは３７℃で２時間インキュベートされた。洗浄ステップは、以前に記載された通りに４回実施された。
【０１５５】
ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼは試料緩衝液に１対２０００で希釈され、５０μｌが各ウェルに添加され、プレートはＲＴで１時間インキュベートされた。洗浄ステップは、上に記載される通りに４回実施された。
【０１５６】
１ｍＭのＡＢＴＳ溶液は、７０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）中で調製され、光から保護された（使用まで）。１０μｌのＨ２Ｏ２（３０％）が１０ｍｌのＡＢＴＳ溶液に添加された。Ｈ２Ｏ２の添加後直ちに、１００μｌの前記溶液がプレートの各ウェルに添加された。プレートは光から保護され、３０分から最長１時間までインキュベートされた。その後、吸光度がプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｉｎｃ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）において４０５ｎｍで測定された。放出された小疱が多いほど、この方法により検出されるＫ１４もそれだけ多くなる。
【０１５７】
（例１１）
ＡＣＤにおけるリスク評価のための化合物のインビトロスクリーニング。アポトーシスを測定することによる分析
スクリーニングは、例１に記載される通りに実施された。アポトーシス細胞を検出するために、ＡｐｏＤＥＴＥＣＴ  Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）が、マニュアルの使用説明書に従って使用された。細胞は、フローサイトメトリー又は蛍光顕微鏡により分析された。アポトーシス細胞の量が多いほど、それだけアレルゲン／感作化合物は強かった。
【０１５８】
（例１２）
半透性支持体上で増殖させた細胞を使用する、ＡＣＤにおけるリスク評価のための化合物のインビトロスクリーニング
ケラチノサイトは、細胞が代わりに半透性支持体（０．４〜８μｍポアサイズのＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）Ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）上で増殖されること以外は、例１に記載される通りに増殖させた。スクリーニングは、例１に従って実施された。フロースルーは標準ピペットを用いて収集され、例３に記載される通りに放出されるタンパク質（たとえば、Ｋ５及びＫ１４）に関して分析された。
【０１５９】
（例１３）
ＤＨＲを引き起こす化合物の能力を試験する
細胞培養
正常なヒト表皮ケラチノサイト（ＨＥＫｎ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡ）は、６０μＭのＣａＣｌ２、抗生物質ゲンタマイシン／アンホテリシン及び１％（ｖ／ｖ）ヒトケラチノサイト増殖補助剤（ＨＫＧＳ；Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を補充されたフェノールレッド無しのＥｐｉＬｉｆｅケラチノサイト培地（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）において維持された。代わりに、２００μＭのＣａＣｌ２を含有し、ＨＫＧＳ（１％（ｖ／ｖ））を補充された、抗生物質のないＭｅｄｉｕｍ１５４が使用された。細胞は、加湿された５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で増殖させた。補充された培地中の成分の最終濃度は、ウシ下垂体抽出物、０．２％ｖ／ｖ；ウシインスリン、５ｍｇ／ｍＬ；ヒドロコルチゾン、０．１８ｍｇ／ｍＬ；ウシトランスフェリン、５ｍｇ／ｍＬ；ヒト表皮増殖因子、０．２ｎｇ／ｍＬ；随意に、ゲンタマイシン、１０μｇ／ｍＬ、及びアンホテリシンＢ、０．２５μｇ／ｍＬである。試薬はすべて、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡから入手した。ケラチノサイトは、第６継代で実験に使用された。
【０１６０】
スクリーニング
継代６のＨＥＫｎ細胞は分割され、１％（ｖ／ｖ）ヒトケラチノサイト増殖補助剤（ＨＫＧＳ；Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、抗生物質添加なし）を補充されたｍｅｄｉｕｍ１５４（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）中１８５００細胞／ｍｌまで再懸濁された。細胞懸濁液（０．５ｍｌ）は２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍｕｌｔｉｄｉｓｈｅｓ  Ｎｕｎｃｌｏｎ）の各ウェルに添加され、５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートされた。培地は、細胞が培養密度になるまで、ＨＫＧＳを補充された新鮮な１５４培地（抗生物質添加なし）で１日おきに交換された。
【０１６１】
試験される薬物候補は、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）中、最終濃度の５０ｍＭ、５ｍＭ及び０．５ｍＭまで希釈された。これらの保存液は、実験が実施されるたびに新たに調製された。
【０１６２】
１）実験を開始する直前の細胞調製：細胞培養プレート中の培地は、ＨＫＧＳ（１％（ｖ／ｖ）ヒトケラチノサイト増殖補助剤（ＨＫＧＳ；Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ））を補充された２５０μｌの新鮮なＭｅｄｉｕｍ１５４（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）で置き換えられ、細胞は５％ＣＯ２、３７℃で保管された。
【０１６３】
２）培地中での試験化合物の調製：２４５μｌのＭｅｄｉｕｍ１５４は０．５ｍｌのマイクロチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）に添加され、３７℃まで予熱された（水浴）。５μｌの薬物候補の保存液は、予熱された培地を含有するマイクロチューブに添加された。次に、これらの溶液は直ちに２４ウェルプレートの細胞に添加された。
【０１６４】
３）マイクロチューブ中の溶液（すなわち、２５０μｌ培地＋試験化合物）は各プレートに添加された。したがって、試験における各化合物の最終濃度は、０．５ｍＭ、０．０５ｍＭ、及び０．００５ｍＭであった。細胞と試験化合物を含有するプレートは５％ＣＯ２、３７℃で２４時間インキュベートされた。
【０１６５】
４Ａ）各ウェルは光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  ＴＥ３００倒立顕微鏡）を用いて調べられて、小疱形成応答を決定した。所定の時点（１．５；２．５；２４時間）での産生された小疱の量は、盲検試験（すなわち、小疱を計測する顕微鏡使用者は、各ウェルにどの化合物が添加されているのかに関する知識はまったくない）での目視検査を通じて評価された。測定されたパラメータは：
小疱形成までの時間
極度の感作物質１．５時間から
強い感作物質２．５時間〜２４時間
細胞が２４時間後に小疱を産生した濃度
極度の感作物質０．００５ｍＭ
強い感作物質０．０５ｍＭ
中程度の感作物質０．５ｍＭ
弱い感作物質は試験された濃度では小疱形成なし
小疱の量（時間２４時及び濃度０．５ｍＭで）
極度の感作物質：高量の小疱（＋＋＋）
強い感作物質：中程度量の小疱（＋＋）
中程度の感作物質：低量の小疱（＋）
弱い感作物質：小疱は検出されない
である。
【０１６６】
これら３種のエンドポイントを使用して、化合物の感作潜在力（すなわち、感作する及び／又はＤＨＲを誘発する能力）の収集分析が行われた。
【０１６７】
４Ｂ）薬物候補の添加の２４時間後、薬物誘導「小疱形成」の差、すなわち、化合物の強度を定量化するための蛍光の測定のために、３×９０μｌは２４ウェルプレートの各ウェル（濃度０．５ｍＭ、０．０５ｍＭ、及び０．００５ｍＭ）から９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｆ９６  ｍｕｌｔｉｓｏｒｐ）に移された。１０μｌ（最終濃度５μｇ／ｍｌ）の色素ＦＭ  １−４３（Ｔ３１６３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）が各ウェルに添加された。プレートは暗所で２分間インキュベートされ、蛍光は、励起５１０ｎｍ及び発光６２６ｎｍのプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）において検出された。色素ＦＭ  １−４３は水性溶媒中では実質的に非蛍光性であるが、細胞膜（又は小疱膜）中に挿入されると強い蛍光性になるので、この色素を使用して溶液中の小疱膜の量を測定することが可能である。したがって、蛍光は化合物の強度と相関しており、その場合、すなわち、化合物が強いほど、それだけ多くの小疱が周囲の培地に放出され（すなわち、薬物候補の作用を通じてそれだけ多くのエピトープが放出された）、その培地中の蛍光はそれだけ高くなった。
【０１６８】
（例１４）
他の上皮細胞を使用してＤＨＲを引き起こす化合物の能力を試験する
細胞培養
ヒト食道上皮細胞（ＨＥＥＣ、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）、つまり、ＤＨＲに関連する上皮細胞は、上皮細胞培地−２（ＥｐｉＣＭ−２、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）において維持された。細胞は、加湿された５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で増殖させた。試薬はすべて、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡから入手した。
【０１６９】
スクリーニング
ＨＥＥＣ細胞は分割され、ＥｐｉＣＭ−２中１８５００細胞／ｍｌまで再懸濁された。細胞懸濁液（０．５ｍｌ）は２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍｕｌｔｉｄｉｓｈｅｓ  Ｎｕｎｃｌｏｎ）の各ウェルに添加され、５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートされた。培地は、細胞が培養密度になるまで、１日おきに交換された。
【０１７０】
試験される薬物候補は、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）中、最終濃度の５０ｍＭ、５ｍＭ及び０．５ｍＭまで希釈された。これらの保存液は、実験が実施されるたびに新たに調製された。
【０１７１】
１）実験を開始する直前の細胞調製：細胞培養プレート中の培地は、２５０μｌの新鮮なＥｐｉＣＭ−２で置き換えられ、細胞は５％ＣＯ２、３７℃で保管された。
【０１７２】
２）培地中での試験化合物の調製：２４５μｌのＥｐｉＣＭ−２は０．５ｍｌのマイクロチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）に添加され、３７℃まで予熱された（水浴）。５μｌの薬物候補の保存液は、予熱された培地を含有するマイクロチューブに添加された。次に、これらの溶液は直ちに２４ウェルプレートの細胞に添加された。
【０１７３】
３）マイクロチューブ中の溶液（すなわち、２５０μｌ培地＋試験化合物）は各プレートに添加された。したがって、試験における各化合物の最終濃度は、０．５ｍＭ、０．０５ｍＭ、及び０．００５ｍＭであった。細胞と試験化合物を含有するプレートは５％ＣＯ２、３７℃で２４時間インキュベートされた。
【０１７４】
４Ａ）各ウェルは光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  ＴＥ３００倒立顕微鏡）を用いて調べられて、小疱形成応答を決定した。所定の時点（１．５；２．５；２４時間）での産生された小疱の量は、盲検試験（すなわち、小疱を計測する顕微鏡使用者は、各ウェルにどの化合物が添加されているのかに関する知識はまったくない）での目視検査を通じて評価された。測定されたパラメータは：
小疱形成までの時間
細胞が２４時間後に小疱を産生した濃度
小疱の量
である。
【０１７５】
これら３種のエンドポイントを使用して、化合物の感作潜在力（すなわち、感作する及び／又はＤＨＲを誘発する能力）の収集分析が行われた。
【０１７６】
４Ｂ）薬物候補の添加の２４時間後、薬物誘導「小疱形成」の差、すなわち、化合物の強度を定量化するための蛍光の測定のために、３×９０μｌは２４ウェルプレートの各ウェル（濃度０．５ｍＭ、０．０５ｍＭ、及び０．００５ｍＭ）から９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｆ９６  ｍｕｌｔｉｓｏｒｐ）に移された。１０μｌ（最終濃度５μｇ／ｍｌ）の色素ＦＭ  １−４３（Ｔ３１６３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）が各ウェルに添加された。プレートは暗所で２分間インキュベートされ、蛍光は、励起５１０ｎｍ及び発光６２６ｎｍのプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）において検出された。色素ＦＭ  １−４３は水性溶媒中では実質的に非蛍光性であったが、細胞膜（又は小疱膜）中に挿入されると強い蛍光性になるので、この色素を使用して溶液中の小疱膜の量を測定することが可能である。したがって、蛍光は化合物の強度と相関しており、その場合、すなわち、化合物が強いほど、それだけ多くの小疱が周囲の培地に放出され（すなわち、薬物候補の作用を通じてそれだけ多くのエピトープが放出された）、その培地中の蛍光はそれだけ高くなった。
【０１７７】
収集分析は、化合物の感作潜在力（すなわち、感作する及び／又はＤＨＲを誘発する能力）についての情報を与える。
【０１７８】
（例１５）
自己免疫疾患を引き起こす化合物の能力を試験する
細胞培養
正常なヒト表皮ケラチノサイト（ＨＥＫｎ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡ）は、６０μＭのＣａＣｌ２、抗生物質ゲンタマイシン／アンホテリシン及び１％（ｖ／ｖ）ヒトケラチノサイト増殖補助剤（ＨＫＧＳ；Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を補充されたフェノールレッド無しのＥｐｉＬｉｆｅケラチノサイト培地（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）において維持された。代わりに、２００μＭのＣａＣｌ２を含有し、ＨＫＧＳ（１％（ｖ／ｖ））を補充された、抗生物質のないＭｅｄｉｕｍ１５４が使用された。細胞は、加湿された５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で増殖させた。補充された培地中の成分の最終濃度は、ウシ下垂体抽出物、０．２％ｖ／ｖ；ウシインスリン、５ｍｇ／ｍＬ；ヒドロコルチゾン、０．１８ｍｇ／ｍＬ；ウシトランスフェリン、５ｍｇ／ｍＬ；ヒト表皮増殖因子、０．２ｎｇ／ｍＬ；随意に、ゲンタマイシン、１０μｇ／ｍＬ、及びアンホテリシンＢ、０．２５μｇ／ｍＬである。試薬はすべて、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡから入手した。ケラチノサイトは、第６継代で実験に使用された。
【０１７９】
スクリーニング
継代６のＨＥＫｎ細胞は分割され、１％（ｖ／ｖ）ヒトケラチノサイト増殖補助剤（ＨＫＧＳ；Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、抗生物質添加なし）を補充されたｍｅｄｉｕｍ１５４（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）中１８５００細胞／ｍｌまで再懸濁された。細胞懸濁液（０．５ｍｌ）は２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍｕｌｔｉｄｉｓｈｅｓ  Ｎｕｎｃｌｏｎ）の各ウェルに添加され、５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートされた。培地は、細胞が培養密度になるまで、ＨＫＧＳを補充された新鮮な１５４培地（抗生物質添加なし）で１日おきに交換された。
【０１８０】
試験される化合物は、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）中、最終濃度の５０ｍＭ、５ｍＭ及び０．５ｍＭまで希釈された。これらの保存液は、実験が実施されるたびに新たに調製された。
【０１８１】
１）実験を開始する直前の細胞調製：細胞培養プレート中の培地は、ＨＫＧＳ（１％（ｖ／ｖ）ヒトケラチノサイト増殖補助剤（ＨＫＧＳ；Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ））を補充された２５０μｌの新鮮なＭｅｄｉｕｍ１５４（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）で置き換えられ、細胞は５％ＣＯ２、３７℃で保管された。
【０１８２】
２）培地中での試験化合物の調製：２４５μｌのＭｅｄｉｕｍ１５４は０．５ｍｌのマイクロチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に添加され、３７℃まで予熱された（水浴）。５μｌの試験化合物の保存液は、予熱された培地を含有するマイクロチューブに添加された。次に、これらの溶液は直ちに２４ウェルプレートの細胞に添加された。
【０１８３】
３）マイクロチューブ中の溶液（すなわち、２５０μｌ培地＋試験化合物）は各プレートに添加された。したがって、試験における各化合物の最終濃度は、０．５ｍＭ、０．０５ｍＭ、及び０．００５ｍＭであった。細胞と試験化合物を含有するプレートは５％ＣＯ２、３７℃で２４時間インキュベートされた。
【０１８４】
４Ａ）各ウェルは光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  ＴＥ３００倒立顕微鏡）を用いて調べられて、小疱形成応答を決定した。所定の時点（１．５；２．５；２４時間）での産生された小疱の量は、盲検試験（すなわち、小疱を計測する顕微鏡使用者は、各ウェルにどの化合物が添加されているのかに関する知識はまったくない）での目視検査を通じて評価された。測定されたパラメータは：
小疱形成までの時間：小疱形成を引き起こし、したがって上皮接触すると潜在的に自己免疫疾患を引き起こすことができる化合物：
１．５時間から非常に可能性が高い
強い可能性がある：２．５時間〜２４時間
細胞が２４時間後に小疱を産生した濃度：上皮接触すると潜在的に自己免疫疾患を引き起こす可能性が非常に高い化合物：
強い可能性がある：０．０５ｍＭ
中程度の可能性がある：０．５ｍＭ
弱い感作物質は試験された濃度では小疱形成する可能性は弱い
小疱の量（時間２４時及び濃度０．５ｍＭで）
極度に可能性が高い：高量の小疱（＋＋＋）
強い可能性がある：中程度量の小疱（＋＋）
中程度の可能性がある：低量の小疱（＋）
可能性は弱い：小疱は検出されない
である。
【０１８５】
これら３種のエンドポイントを使用して、自己免疫疾患を引き起こすことに関する化合物の効力の収集分析が行われた。
【０１８６】
４Ｂ）試験化合物の添加の２４時間後、「小疱形成」の差、すなわち、化合物の強度を定量化するための蛍光の測定のために、３×９０μｌは２４ウェルプレートの各ウェル（濃度０．５ｍＭ、０．０５ｍＭ、及び０．００５ｍＭ）から９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｆ９６  ｍｕｌｔｉｓｏｒｐ）に移された。１０μｌ（最終濃度５μｇ／ｍｌ）の色素ＦＭ  １−４３（Ｔ３１６３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）が各ウェルに添加された。プレートは暗所で２分間インキュベートされ、蛍光は、励起５１０ｎｍ及び発光６２６ｎｍのプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で検出された。
【０１８７】
色素ＦＭ  １−４３は水性溶媒中では実質的に非蛍光性であるが、細胞膜（又は小疱膜）中に挿入されると強い蛍光性になるので、この色素を使用して溶液中の小疱膜の量を測定することが可能である。したがって、蛍光は化合物の強度と相関しており、その場合、すなわち、化合物が強いほど、それだけ多くの小疱が周囲の培地に放出され（すなわち、試験化合物の作用を通じてそれだけ多くの自己エピトープが放出された）、その培地中の蛍光はそれだけ高くなった。
【０１８８】
（例１６）
化合物の阻害（小疱形成に関して）能力を試験する
阻害効果についてスクリーニングされる化合物（これ以降、阻害剤と呼ばれる）は、その最終用途（すなわち、通常、ケラチノサイト（又は同等の物）に小疱を産生させると考えられる化合物と一緒に混合物、溶液、製剤において使用するため）に関して適切な連続希釈においてＤＭＳＯ中に溶解された。
【０１８９】
細胞培養
正常なヒト表皮ケラチノサイト（ＨＥＫｎ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡ）は、６０μＭのＣａＣｌ２、抗生物質ゲンタマイシン／アンホテリシン及び１％（ｖ／ｖ）ヒトケラチノサイト増殖補助剤（ＨＫＧＳ；Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を補充されたフェノールレッド無しのＥｐｉＬｉｆｅケラチノサイト培地（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）において維持された。代わりに、２００μＭのＣａＣｌ２を含有し、ＨＫＧＳ（１％（ｖ／ｖ））を補充された、抗生物質のないＭｅｄｉｕｍ１５４が使用された。細胞は、加湿された５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で増殖させた。補充された培地中の成分の最終濃度は、ウシ下垂体抽出物、０．２％ｖ／ｖ；ウシインスリン、５ｍｇ／ｍＬ；ヒドロコルチゾン、０．１８ｍｇ／ｍＬ；ウシトランスフェリン、５ｍｇ／ｍＬ；ヒト表皮増殖因子、０．２ｎｇ／ｍＬ；随意に、ゲンタマイシン、１０μｇ／ｍＬ、及びアンホテリシンＢ、０．２５μｇ／ｍＬである。試薬はすべて、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡから入手した。ケラチノサイトは、第５又は第６継代で実験に使用された。
【０１９０】
スクリーニング
継代６のＨＥＫｎ細胞は分割され、１％（ｖ／ｖ）ヒトケラチノサイト増殖補助剤（ＨＫＧＳ；Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、抗生物質添加なし）を補充されたｍｅｄｉｕｍ１５４（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）中１８５００細胞／ｍｌまで再懸濁された。細胞懸濁液（０．５ｍｌ）は２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍｕｌｔｉｄｉｓｈｅｓ  Ｎｕｎｃｌｏｎ）の各ウェルに添加され、５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートされた。培地は、細胞が培養密度になるまで、ＨＫＧＳを補充された新鮮な１５４培地（抗生物質添加なし）で１日おきに交換された。
【０１９１】
オキサゾロン（すなわち、小疱を引き起こしていたが、薬物／シャンプー／香水／皿洗い機液体／等中に含めたい化合物。（ここではオキサゾロンにより例証されているが、使用を通じて上皮接触する任意の種類の製剤又は混合物中の任意の化合物でもよい））は、ＤＭＳＯ（ＤＭＳＯ及びオキサゾロンはＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製）中、最終濃度の１００ｍＭ、１０ｍＭ及び１ｍＭまで希釈された。その阻害効果についてスクリーニングされる化合物（これ以降阻害剤と呼ばれる）は、その最終用途（すなわち、通常、ケラチノサイト（又は同等の物）に小疱を産生させると考えられる化合物と一緒に混合物、溶液、製剤で使用するため）に関して適切な連続希釈（０．１μＭから１０Ｍ）においてハプテンとして同じ溶液中に溶解された。これらの保存液は、実験が実施されるたびに新たに調製される。
【０１９２】
１）実験を開始する直前の細胞調製：細胞培養プレート中の培地は、ＨＫＧＳ（１％（ｖ／ｖ）ヒトケラチノサイト増殖補助剤（ＨＫＧＳ；Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ））を補充された２５０μｌの新鮮なＭｅｄｉｕｍ１５４（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）で置き換えられ、細胞は５％ＣＯ２、３７℃で保管された。
【０１９３】
２）培地中での試験混合物（ハプテンと阻害剤）の調製：２４５μｌのＭｅｄｉｕｍ１５４は０．５ｍｌのマイクロチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に添加され、３７℃まで予熱された（水浴）。５μｌの保存液は、予熱された培地を含有するマイクロチューブに添加された。次に、これらの溶液は直ちに２４ウェルプレートの細胞に添加された。
【０１９４】
３）マイクロチューブ中の溶液（すなわち、２５０μｌ培地＋試験化合物）は各プレートに添加された。したがって、試験における各化合物の最終濃度は、０．５ｍＭ、０．０５ｍＭ、及び０．００５ｍＭであった。細胞と試験化合物を含有するプレートは５％ＣＯ２、３７℃で２４時間インキュベートされた。
【０１９５】
４Ａ）各ウェルは、デジタルカメラに連結された光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  ＴＥ３００倒立顕微鏡）を用いて調べられて、小疱形成応答を決定した。所定の時点（１．５；２．５；２４時間）での産生された小疱の量は、盲検試験（すなわち、小疱を計測する顕微鏡使用者は、各ウェルにどの化合物が添加されているのかに関する知識はまったくない）での目視検査を通じて評価された。測定されたパラメータは：
阻害剤なしでの小疱形成までの時間：オキサゾロン１．５時間
阻害剤は、オキサゾロン（又は新しい試験化合物）が細胞に添加されると、ケラチノサイトが小疱を産生するのを停止するはずである。
細胞が２４時間後に小疱を産生した濃度
オキサゾロン  ０．５ｍＭ、０．０５ｍＭ
【０１９６】
弱い感作物質及び非感作物質は、０．５ｍＭ、０．０５ｍＭ、及び０．００５ｍＭでは小疱形成しないので、阻害剤を添加することによって、同様に小疱形成しないはずである。
小疱の量（時間２４時及び濃度０．５ｍＭ）：
極度の感作物質（オキサゾロンのような）は高量の小疱（＋＋＋）を与える
【０１９７】
弱い感作物質及び非感作物質は、０．５ｍＭ、０．０５ｍＭ、及び０．００５ｍＭでは小疱形成しないので、阻害剤は同様に、時間２４時及び濃度０．５ｍＭでは小疱形成をしないはずである。
【０１９８】
これらの３種のエンドポイントを使用して、化合物の阻害潜在力の収集分析が行われる。試験化合物が添加されると小疱形成応答を阻害するのに効率的である化合物は、阻害剤と呼ばれる。次に、その阻害剤（又は類似物）は、溶液、混合物、製剤、等中の試験化合物と一緒に使用して、アレルギー性接触皮膚炎／自己免疫疾患／ＤＨＲ／化学的に誘導される喘息、等を引き起こすリスクを最小限に抑えることが可能である。
【図１Ａ】
2013524209.tif 000002
【図１Ｂ】
2013524209.tif 000003
【国際調査報告】
2013524209.tif 000004
2013524209.tif 000005