(57)【要約】  （ａ）半許容性ヒト腫瘍細胞内で出発株としての齧歯類パルボウイルスを連続的に継代することによって入手可能なヒト腫瘍細胞を通して増殖及び伝播可能なパルボウイルス変異体、及び（ｂ）ヒト腫瘍細胞を通して増殖及び伝播可能なパルボウイルス変異体であって、特定のアミノ酸の欠失及び／又は置換、例えばＮＳ１のＣ末端／ＮＳ２の中央エクソンにおける数個のアミノ酸の欠失を特徴とするパルボウイルス変異体が記載される。そのようなパルボウイルスを含有する医薬組成物、並びに癌、好ましくは膠芽細胞腫、を治療するための使用についても記載される。
2013527759.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
半許容性ヒト腫瘍細胞内で出発株としての齧歯類パルボウイルスを連続的継代することによって入手可能なヒト腫瘍細胞を通して増殖及び伝播可能な齧歯類パルボウイルス変異体。
【請求項２】
ヒト腫瘍細胞を通して増殖及び伝播可能なパルボウイルス変異体であって、ＮＳ１のＣ末端における６１９〜６４６位／ＮＳ２の中央エクソンにおける１２６〜１５３位の２８個のアミノ酸の欠失を含むことを特徴とするパルボウイルス変異体。
【請求項３】
ヒト腫瘍細胞を通して増殖及び伝播可能なパルボウイルス変異体であって、ＶＰ１／２における以下のアミノ酸置換、
（ａ）Ｈ３７４Ｙ、
（ｂ）Ｄ３９１Ｎ、及び／又は
（ｃ）Ｄ４３９Ｓ、
を含むことを特徴とするパルボウイルス変異体。
【請求項４】
ヒト腫瘍細胞を通して増殖及び伝播可能なパルボウイルス変異体であって、請求項２に記載の欠失及び請求項３に記載の少なくとも１つの置換を含むことを特徴とするパルボウイルス変異体。
【請求項５】
前記出発株が、ラットパルボウイルスである請求項１〜４のいずれか一項に記載のパルボウイルス変異体。
【請求項６】
前記ラットパルボウイルスが、ラットＨ１−ＰＶである請求項４に記載のパルボウイルス変異体。
【請求項７】
前記腫瘍細胞が、神経膠腫細胞である請求項１〜６のいずれか一項に記載のパルボウイルス変異体。
【請求項８】
前記神経膠腫は、膠芽細胞腫である請求項７に記載のパルボウイルス変異体。
【請求項９】
前記半許容性ヒト腫瘍細胞が、ＮＣＨ１４９細胞である請求項１に記載のパルボウイルス変異体。
【請求項１０】
前記連続的継代が、少なくとも１０継代を含む請求項１〜９のいずれか一項に記載のパルボウイルス変異体。
【請求項１１】
前記継代後に、個々のウイルスクローンがプラーク精製される請求項１〜１０のいずれか一項に記載のパルボウイルス変異体。
【請求項１２】
前記ウイルスクローンが、ＮＢ３２４Ｋ細胞上でプラーク精製される請求項１１に記載のパルボウイルス変異体。
【請求項１３】
ヒト腫瘍細胞を通して増殖及び伝播可能なパルボウイルス変異体を産生する方法であって、半許容性ヒト腫瘍細胞内で出発株としての齧歯類パルボウイルスを連続的に継代する工程を含む方法。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の前記パルボウイルス変異体をコードするＤＮＡ。
【請求項１５】
請求項１４に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のパルボウイルス変異体又は請求項１５に記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のパルボウイルス変異体のＮＳ１タンパク質に対する抗体であって、欠失を有する前記変異体のタンパク質にのみ結合して野生型のタンパク質には結合しないことをさらに特徴とする抗体。
【請求項１８】
（ａ）請求項１〜１２のいずれか一項に記載のパルボウイルス変異体、
（ｂ）請求項１４に記載のＤＮＡ、
（ｃ）請求項１７に記載の抗体、及び／又は、場合により、
（ｄ）従来型補助物質、例えば溶媒、緩衝剤、担体、マーカー及びコントロール
を含むキットであって、前記（ａ）〜（ｄ）の１つ以上の代表的成分が各々存在するキット。
【請求項１９】
（ａ）請求項１〜１２のいずれか一項に記載のパルボウイルス変異体、請求項１４に記載のＤＮＡ、請求項１５に記載の発現ベクター、請求項１６に記載の宿主細胞又は請求項１７に記載の抗体、及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物。
【請求項２０】
癌を治療するための医薬組成物を製造するための請求項１〜１２のいずれか一項に記載のパルボウイルス変異体、請求項１４に記載のＤＮＡ、請求項１５に記載の発現ベクター、請求項１６に記載の宿主細胞又は請求項１７に記載の抗体の使用。
【請求項２１】
癌を治療する方法において使用するための請求項１〜１２のいずれか一項に記載のパルボウイルス変異体、請求項１４に記載のＤＮＡ、請求項１５に記載の発現ベクター、請求項１６に記載の宿主細胞又は請求項１７に記載の抗体。
【請求項２２】
前記癌が、脳腫瘍である請求項２０又は２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記脳腫瘍が、神経膠腫、髄芽細胞腫、髄膜腫又は膠芽細胞腫である請求項２２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、半許容性ヒト腫瘍細胞内で出発株としての齧歯類パルボウイルスを連続的に継代することによって入手可能なヒト腫瘍細胞を通して増殖及び伝播可能な齧歯類パルボウイルス変異体（バリアント）に関する。本発明はさらに、ヒト腫瘍細胞を通して増殖及び伝播可能なパルボウイルス変異体であって、特定のアミノ酸欠失及び／又は置換、例えばＮＳ１のＣ末端／ＮＳ２の中央エクソンにおける数個のアミノ酸の欠失を特徴とするパルボウイルス変異体に関する。本発明はさらに、そのようなパルボウイルスを含有する医薬組成物、並びに癌、好ましくは膠芽細胞腫、を治療するための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍退縮性ウイルス、例えば齧歯類パルボウイルスは、癌治療のための新規なツールを意味する。特に癌細胞の殺滅（腫瘍退縮）の他、これらの物質はさらにウイルス感染腫瘍を排除するように免疫系を刺激する危険信号を出す。腫瘍退縮事象の結果として、先天的及び後天的免疫系が腫瘍抗原へ接近し、これによりクロスプライミング及びワクチン接種効果が生じる。齧歯類パルボウイルスは、内因性細胞退縮活性を有する一本鎖ＤＮＡウイルスであり、即ち、当該齧歯類パルボウイルスは、マウス及びヒト起源両方の癌細胞内で優先的に複製し該癌細胞を殺滅する。
【０００３】
膠芽細胞腫は、治療の可能性が極めて限定されている深刻な疾患である。明らかに、患者の予後は新規な療法を必要としている。上記で考察した複製可能な腫瘍退縮性ウイルスは悪性組織を通して伝播し、抗腫瘍免疫応答を誘導することができるため、有望であると考えられる。中でも、齧歯類パルボウイルスは、その天然の腫瘍親和性、ヒト細胞に感染する能力、新生物細胞に対する特異的毒性、及びヒトにとって低病原性であることから、卓越した候補であると思われる。ラットモデルでは、Ｈ１−ＰＶは再発を全く伴わない確立した神経膠腫の完全退縮を引き起こすことができ、Ｈ１−ＰＶは様々なヒト神経膠腫を標的とすることができ、それにより公知の死誘導因子（death inducer）に向かうその獲得耐性とは無関係にこれらの細胞を効率的に殺滅できることが証明された。Ｈ１−ＰＶはこれまでに試験されたヒト膠芽細胞腫細胞系の大多数に感染して効果的に殺滅できることが証明されたが、これらの細胞の大多数は効率的ウイルス複製、子孫粒子の産生及び伝播に耐性を示した。このヒト腫瘍組織を通した増殖及び伝播の失敗は、細胞殺滅が限定された比率の腫瘍細胞にのみ到達可能な単一ヒット事象に限定されるためのみならず、子孫ビリオンの細胞表面への活発な細胞内輸送が欠如するために、イン ヴィヴォ（in vivo）でのヒト神経膠腫の治療有効性に対して重大な影響を及ぼす可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このため、本発明の目的は、先行技術株の欠点を克服する、つまりヒト腫瘍組織を通して増殖及び伝播可能なパルボウイルスを提供することである。
【０００５】
本発明によると、この課題は、特許請求の範囲に規定した主題によって解決される。本発明者らの初期の実験は、子孫ＰＶビリオンは、当該子孫ＰＶビリオンが培養液上清内に遊離する細胞溶解の前に核から細胞周縁へ小胞を通って往復することを証明している。さらに、この小胞放出は、細胞表面へ「共積荷（co-cargo）」として運ばれ、宿主抗腫瘍免疫刺激に寄与することができる複数の細胞内タンパク質（潜在的腫瘍抗原を含む）と関連している。ヒト膠芽細胞腫におけるウイルスの増殖及び伝播における最初のＨ１−ＰＶ単離体（ｐＳＲ１９）の欠損を修復するために、本発明者らは、半許容性の患者由来ヒト膠芽細胞腫細胞系における連続継代を通した増殖能力を有するＨ１−ＰＶ変異体を得ることを、すなわち感染プロセス（脱穀、ウイルスゲノムの核への送達、二本鎖変換）中の潜在的ボトルネックを回避することを目指し、Ｈ１−ＰＶ（ｐＳＲ−１９）の感染クローンＤＮＡを様々なヒト膠芽細胞腫細胞系（例、ＮＣＨ１４９、ＮＣＨ８２、ＮＣＨ８９）内にトランスフェクトし、この複製能力を有するＤＮＡを細胞変性効果が視認できるようになるまで継代した。追加のウイルス継代（＞１５）は、ｖＴＥ（ｐＨ８．７）中での反復冷凍及び解凍により得られた細胞関連子孫ビリオンと感染による培養液遊離ウイルスとを組合させた。次に増殖能力を有するウイルスのプールを効率的ウイルスＤＮＡ増幅、子孫ビリオンの生成及び様々なヒト膠芽細胞腫培養を通しての伝播を提示するＮＣＨ１４９細胞上での２５継代後に分析した。この初代のプールから、個々のウイルスクローンをＮＢ３２４Ｋ細胞上でのプラーク精製により単離し、再びＮＣＨ１４９細胞上で増幅させ、クローン化して配列決定した。
【０００６】
全Ｈ１−ＰＶ変異体の遺伝分析は、ＮＳ１（Ｃ−末端）及びＮＳ２のコーディング領域の２８個のアミノ酸に影響を及ぼす８４ｎｔ（ヌクレオチド）の欠失ならびにＶＰ２においてＨｉｓ３７４をＴｙｒへ変化させる３９１３位での単一のシトシンからチミジンへの移行を明らかにした。Ａｓｐ３９１からＡｓｎ及びＡｓｐ４３９からＳｅｒへの変化をもたらすＶＰ２領域における２つの追加のグアニジンからアデノシンへの置換（３９６４及び４１０８）は、２つの単離体にのみに起因する。３’非コーディング領域内でのわずかな変化は、保有率が様々なままであった。明らかに、およそ２，０００〜２，２００ｎｔの領域は、ＮＳ１／ＮＳ２機能の調節によりＨ１−ＰＶの宿主環境への順応を可能にする変異のホットスポットを含んでいる。このため、この領域内の挿入／欠失により、Ｈ１−ＰＶの宿主範囲のみならず、他の密接に関連するラットＰＶ株、Ｈ３及びＴＶＸも能動的に改変することができる。
【０００７】
新規に産生されたＨ１−ＰＶ変異体は、ヒト膠芽細胞腫細胞（系）を通して増殖及び伝播することができる。これは、増加した感染／既に樹立されたヒト腫瘍の破壊を可能にし、その結果、より優れた抗腫瘍免疫刺激を発生させると予測される。本発明者らのパルボウイルス小胞放出に関する以前の発見と一致して、該表面への細胞内タンパク質の共輸送が宿主免疫応答のために腫瘍細胞を曝露させるために役立ち得ると想定することは道理にかなっている。この共積荷作用は、初代のＨ１−ＰＶ単離体（ｐＳＲ−１９）を使用した子孫ビリオン形成の不在下では存在しない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の概略
実施例において概説する半許容性細胞内で順応プロセス（継代）を行うと、多数の他のヒト膠芽細胞腫細胞系における増殖能力のあるＨ１−ＰＶ変異体を産生することができた。概説した方法は、腫瘍幹細胞を含む他のヒト腫瘍細胞（系）に拡張することができる。
【０００９】
ラットＨ１−ＰＶのヒト膠芽細胞腫細胞への順応は、Ｈ１のＮＳ１のＣ末端／ＮＳ２の中央エクソンにおける欠失をもたらした。この領域はＨ１−ＰＶ宿主範囲を決定する変異のホットスポット領域を表しており、他のこれまでに特徴付けられていない齧歯類ＰＶ単離体の追加の順応／分析を行うと、この領域内で追加の変異を見いだすことができる。
【００１０】
ヒト膠芽細胞腫の腫瘍組織内で細胞から細胞へ潜在的に伝播可能であり、このため（適応度検定によって指摘されるように）腫瘍細胞殺滅のより高い潜在能力を有するＨ１−ＰＶ変異体を産生する他、この単離体の子孫粒子は、小胞を通して細胞周縁へ能動的に輸送される。新規に合成されたビリオンの他、そのような小胞と結び付いている複数の細胞タンパク質が感染後に見いだされたが、これらは非感染ヒト膠芽細胞腫細胞内には存在しなかった。この共積荷作用は、宿主免疫系が腫瘍細胞を利用できるように当該腫瘍細胞を露出させることにより、ウイルス誘発性抗腫瘍免疫応答に寄与することができた。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】（上）順応アプローチの模式図  ラットパルボウイルスＨ１−ＰＶは、ラット神経膠腫ＲＧ−２などの形質変換ラット細胞内では容易に増殖するが（左）、ヒト膠芽細胞腫細胞系内での産生及び伝播は限定されている。これらの制限を克服するために、許容性Ｈ１−ＰＶ変異体の突然変異及び増幅の発生を可能にする連続継代を半許容性ヒト膠芽細胞腫において実施した。増殖能力を有する変異体は、ＮＣＨ１４９細胞内での２０連続継代後に入手／分析した。（Ｂ、Ｃ）ＮＣＨ１４９内でのウイルスＤＮＡ増幅の決定  ＮＣＨ１４９細胞を１０ｐｆｕ（プラーク形成単位）／細胞のＨ１−ＰＶで感染させ、感染後の指示時間後に複製中間体の存在をサザンブロッティングによって測定した。（Ｂ）ラットＨ１−ＰＶ（ｐＳＲ１９）による感染。（Ｃ）ヒト神経膠腫順応Ｈ１−ＰＶを用いた一次及び二次ＤＮＡ増幅、小胞放出及び伝播のために機能するゲルゾリンの決定。Ｉｎｆ １、一次感染、Ｉｎｆ ２、Ｉｎｆ １からの上清、を使用して、無処置のＮＣＨ１４９細胞を感染させた。ウイルス複製中間体の産生は、サザンブロッティングによって測定した。αＣｏｎ、コントロール血清。αＧｌｎ、ゲルゾリンに対して産出された中和抗血清。ｄＲＦ、二量体複製中間体。ｍＲＦ、単量体複製中間体。ｓｓＤＮＡ、子孫ウイルス粒子＝一本鎖ウイルスゲノム。
【図２】Ｈ１−ＰＶ小胞放出の決定及び「共積荷」の同定  （Ａ）ＮＣＨ１４９細胞を１０ｐｆｕ／細胞のヒト神経膠腫順応Ｈ１−ＰＶに感染させ、細胞小胞を含有する核（Ｎｕｃ）、重鎖ミトコンドリア分画（ＨＭＦ）及び軽鎖ミトコンドリア分画（ＬＭＦ）について分画した。小胞分画内の子孫ビリオンの存在を決定するために、ＬＭＦ成分をさらにiodexanol勾配により分離し、ビリオンＤＮＡの存在は（ウエスタンブロッティング法によって決定した）小胞マーカーの存在と比較してサザンブロッティングにより測定した。（Ｂ）ｈｇＨ１−ＰＶ及び偽感染ＮＣＨ１４９細胞中での小胞タンパク質の決定。小胞は（Ａ）に記載したように精製し、それらのタンパク質含量はＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色によって分析した。ｈｇＨ１−ＰＶ感染細胞小胞内で過剰発現したタンパク質は、矢印によって示されている。
【図３】（Ａ）ラット（ｐＳＲ１９）対ヒト神経膠腫順応Ｈ１−ＰＶでのＮＣＨ１４９細胞の感染後のウイルスタンパク質発現の決定  ＮＣＨ１４９細胞を１０ｐｆｕ／細胞で感染させ、感染後の指示した時点で収集した。ウイルスタンパク質の蓄積は、ウエスタンブロッティングによって決定した。ｈｇＨ１−ＰＶ感染後に産生したＮＳ１の大きな不均質性（赤色）ならびにＮＳ２及びＮＳ３のより大きな蓄積（青色）が丸で囲まれている。（Ｂ）ＲＧ−２及びＮＣＨ１４９細胞を指示したウイルス調製物により感染多重度１０で感染させ、感染２４時間後に４時間にわたり３２Ｐ−オルトリン酸塩で代謝的に標識した  細胞を収集し、ＮＳ１を免疫沈降法及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって精製し、二次元電気泳動法／クロマトグラフィーによってトリプシンリンペプチドパターンを決定した。ラット神経膠腫（左）、ＮＣＨ１４９（中央）ならびにＮＣＨ１４９細胞中のｈｇＨ１−ＰＶ（右）におけるラットＨ１−ＰＶ（ｐＳＲ−１９）によって産生されたＮＳ１のリンペプチドパターンを示した。丸で囲まれている部分は、ウイルスＤＮＡ増幅を駆動することが公知であるリン酸化である。
【図４】（Ａ）様々な標的細胞系の感染後の投与ウイルスの増殖  指示した細胞系を感染多重度１０で感染させ、洗浄し、感染４（投入ウイルス）、２４及び４８時間後に収集した。細胞及び培養液付随ウイルスは、プラークアッセイによって決定した。感染２４及び４８時間後の平均増幅率は、投与（４時間後）ウイルス力価に比して表示した。（Ｂ）ウイルス適応度判定  標的細胞系を２４ウエル培養皿に播種し、指示した感染多重度で適切なウイルス調製物により感染させ、生きている細胞を固定し、感染６日後にクリスタルバイオレットで染色した。
【図５】上：ヒト神経膠腫における順応後に見いだされた変異の指示を伴うＨ１−ＰＶのゲノム構成 中央区間：プラーク精製ウイルス調製物から産生されたＰＣＲフラグメント 下：プラーク精製ｈｇＨ１−ＰＶ変異体の遺伝的決定  クローン化されたＰＣＲフラグメントは黒線によって示し、配列決定された材料は点線で囲まれた四角形によって示し、個々の変異の存在は緑色で示した。
【図５ｂ】Ｈ１−ＰＶ変異体プラーク＃１３：  ５つのプラーク（１、２、３、５及び８）の初回特性解析後、同一順応実験由来の追加のプラークをクローン化及び配列決定した（プラーク＃１３）。この追加の変異体は、第１ラウンドの特性解析において見いだされた突然変異２及び６とともにＮＳ１のＣ末端部分／ＮＳ２の中央エクソンにおける相違する欠失によって認識された（プラーク１〜８）。
【図６】個々のプラークの配列決定によって見いだされた全ての遺伝的変異についての詳細な特性解析
【図６ｂ】プラーク＃１３の配列決定によって見いだされたＮＳ１／ＮＳ２のコーディング領域における追加の欠失の詳細な特性解析
【図７】個々のプラーク単離体に由来するウイルスストックのウイルス順応度判定
【図８】ＤＮＡ配列決定によって得られたヌクレオチド変化から推測され、図６に要約されたＨ１−ＰＶタンパク質配列における変化  ＮＣ＿００１３５８の下で公表されたＨ１−ＰＶヌクレオチド配列に対応するタンパク質配列。Qiu et al.,（2006）の転写パターンから推定されたＮＳ２ｐの３つのエクソンは、イタリック体（ＮＳ１＝エクソン１を備える共通Ｎ末端）−標準体（中央エクソン）−イタリック体（各ＮＳ２アイソフォームに特有のＣ末端エクソン）で示した。修正された配列決定誤差はライトグレーで示した（公表された配列との相違は本発明者らの全単離体において同様に見いだされた）。ＮＣＨ１４９細胞内での継代を通して作製された変異は、ボールド体で示し、ライトグレーでマーキングした。ＶＰ１特異的配列は、イタリック体で表示した。
【図８ｂ】ＤＮＡ配列決定によって得られたヌクレオチド変化から推測され、図６ｂに要約されたプラーク＃１３におけるＨ１−ＰＶタンパク質配列における変化  ＮＣ＿００１３５８の下で公表されたＨ１−ＰＶヌクレオチド配列に対応するタンパク質配列。Qiu et al.,（2006）の転写パターンから推定されたＮＳ２ｐの３つのエクソンは、イタリック体（ＮＳ１＝エクソン１を備える共通Ｎ末端）−標準体（中央エクソン）−イタリック体（各ＮＳ２アイソフォームに特有のＣ末端エクソン）で示した。修正された配列決定誤差はライトグレーで示した（公表された配列との相違は本発明者らの全単離体において同様に見いだされた）。ＮＣＨ１４９細胞内での継代を通して調製された変異は、ボールド体で示した。ＶＰ１特異的配列は、イタリック体で示した。プラーク＃１３の欠失Ｄ１ｂ及びＶＰ１／２  ｍｕｔ４のコーディング変化は、ボールド体で示し、ライトグレーでマーキングした。
【図９】Ｈ１−ＰＶ感染（野生型及びプラーク＃３）がヌードｂａｌｂ／ｃマウスに皮下移植されたＵ８７膠芽細胞腫細胞の腫瘍増殖に各々及ぼす影響
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、第一態様において、半許容性ヒト腫瘍細胞内で出発株としての齧歯類パルボウイルスを連続的に継代することによって入手可能なヒト腫瘍細胞を通して増殖及び伝播可能なパルボウイルス変異体を提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、第二態様において、ヒト腫瘍細胞を通して増殖及び伝播可能なパルボウイルス変異体であって、ＮＳ１のＣ末端における６１９〜６４６位（Rhode and Paradiso, 1983）／ＮＳ２の中央エクソン内の１２６〜１５３位（Rhode and Paradiso, 1983；Qiu et al., 2006）からの２８個のアミノ酸の欠失を含むことを特徴とするパルボウイルス変異体を提供する。
【００１４】
本発明はさらに、ヒト腫瘍細胞を通して増殖及び伝播可能なパルボウイルス変異体であって、ＶＰ１／２における以下のアミノ酸置換、
（ａ）Ｈ３７４Ｙ、
（ｂ）Ｄ３９１Ｎ、及び／又は
（ｃ）Ｄ４３９Ｓ、
を含むことを特徴とするパルボウイルス変異体を提供する。
【００１５】
本明細書で使用する用語「増殖する（propagating）」は、本パルボウイルス変異体の子孫ビリオンが投与レベルに比して有意な増幅率（即ち、＞５倍）を示すことを意味する。
【００１６】
本明細書で使用する用語「〜を通して伝播する（spreading through）」は、本発明のパルボウイルス変異体の子孫ビリオンが一次的に感染細胞集団を殺滅することができるだけではなく、さらに第１ラウンドの感染中に産生された粒子により無処置の細胞の二次感染を引き起こすことができることを意味する。
【００１７】
宿主細胞を特徴付けるために本明細書で使用する用語「半許容性（semi-permissive）」は、ウイルスによる感染が特定タイプの宿主細胞内での不完全ウイルス複製を結果として生じさせるが、ウイルスＤＮＡ増幅及び子孫ビリオンの最終的な低収率によって特徴付けられることを意味する。後者は、当該方法の開始時には必ずしも感染性であることを必要としない。
【００１８】
語句「パルボウイルス」は、任意のパルボウイルス、特に齧歯類パルボウイルス、例えばマウスの微小ウイルス（ＭＶＭ）及びＨ−１ウイルスならびにそのようなウイルスもしくは誘導体をベースとする関連ウイルスもしくはベクターを含んでいる。当業者であれば、出発株を以下の実施例において説明した連続継代を受けることによって、又は所望の生物学的特性の改変、即ち当該パルボウイルス変異体を、増殖させ、そして、パルボウイルスの非構造的タンパク質の既知の核酸配列及びアミノ酸配列、例えばパルボウイルスＨ−１（Rhode and Paradiso, 1983；Qiu et al., 2006）から出発してヒト腫瘍細胞全体に伝播し、これにより殺滅する能力、を結果として生じさせる欠失を導入することによって、本発明によるパルボウイルス変異体に到達することができる。当業者であればさらに、以下の実施例において説明した検定法を使用することにより特定の変異体が所望の生物学的特性を示すかどうかを容易に評価することができる。
【００１９】
好ましくは、本発明のパルボウイルス変異体は、パルボウイルスＨ１（Ｈ−１ＰＶ）もしくは関連齧歯類パルボウイルスに由来する。好ましい関連齧歯類パルボウイルスの例として、ＬｕＩＩＩ、マウス微小ウイルス（ＭＭＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＰＶ）、ラット微小ウイルス（ＲＭＶ）、ラットパルボウイルス（ＲＰＶ）又はラットウイルス（ＲＶ）があげられる。
【００２０】
原理上は、本発明のパルボウイルス変異体を使用してあらゆる腫瘍を治癒することができるが、神経膠腫が好ましい。
【００２１】
特に好ましい神経膠腫は、膠芽細胞腫である。
【００２２】
好ましいヒト半許容性腫瘍細胞系は、ＮＣＨ１４９である。
【００２３】
連続継代の方法に関しては、当業者であれば、本発明のパルボウイルスに到達するために何回の継代で十分であるかを容易に決定することができる。しかし一般には、本発明の方法は、少なくとも１０継代、好ましくは少なくとも２０〜２５継代、又はそれ以上を含んでいる。好ましくは、継代は、ＮＣＨ１４９細胞上で行われる。
【００２４】
ウイルス変異体の純度及び安定性を保証するために、個々のクローンは、好ましくはＮＢ３２４Ｋ細胞上で継代後にプラーク精製することができる。
【００２５】
本発明はさらに、ヒト腫瘍細胞を通して増殖及び伝播可能なパルボウイルス変異体を産生する方法であって、上記及び以下の実施例に記載したように半許容性ヒト腫瘍細胞内で出発株としての齧歯類パルボウイルスを連続的に継代する工程を含む方法を提供する。
【００２６】
本発明のまた別の主題は、核酸、特に上記のパルボウイルス変異体をコードするＤＮＡに関する。
【００２７】
本発明によるＤＮＡは、ベクター及び発現ベクターの各々の中に存在してよい。当業者であれば、その例を熟知している。Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）に対する発現ベクターの場合、これらは例えば、ｐＧＥＭＥＸ、ｐＵＣ誘導体、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＥＴ３ｂ、Ｔ７をベースとする発現ベクター及びｐＱＥ−８である。酵母内での発現には、例えばｐＹ１００及びＹｃｐａｄ１を言及しなければならないが、例えば動物細胞内での発現には、例えばｐＫＣＲ、ｐＥＦＢＯＳ、ｃＤＭ８、ｐＭＳＣＮＤ及びｐＣＥＶ４を指定しなければならない。昆虫細胞内での発現には、バキュロウイルス発現ベクターｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａが特に適している。
【００２８】
好ましい実施形態では、本発明によるＤＮＡを含有するベクターは、ウイルス、例えばアデノウイルス、ワクシニアウイルス、ＡＡＶウイルスもしくはパルボウイルス、例えばＭＶＭ又はＨ−１であるが、パルボウイルスが好ましい。ベクターは、さらにまたレトロウイルス、例えばＭｏＭＵＬＶ、ＭｏＭｕＬＶ、ＨａＭｕＳＶ、ＭｕＭＴＶ、ＲＳＶもしくはＧａＬＶでありうる。
【００２９】
本発明によるＤＮＡを含有する発現ベクターを構築するためには、当該技術分野において公知の一般的方法を使用することができる。これらの方法には、例えば、インヴィトロ（in vitro）組換え技術、合成方法及びイン ヴィヴォ（in vivo）組換え法が含まれる。
【００３０】
さらに、本発明は、上述した変異体もしくはベクターを含有する宿主細胞に関する。これらの宿主細胞には、ヒト２９３（Ｔ）、ＮＢＫ、ラットＲＧ２細胞、ＮＣＨ１４９、ＮＣＨ８２、又はＵ８７細胞が含まれる。これらの宿主細胞を形質転換させる方法、形質転換体を表現型的に選択する方法、及び上述したベクターを使用することによって本発明によるＤＮＡを発現させる方法は、当該技術分野において公知である。
【００３１】
そこで、本発明はさらに、本発明のパルボウイルス変異体を産生する方法であって、本発明の宿主細胞を適切な条件下で培養する工程及び当該細胞もしくは培地から当該パルボウイルス変異体を収集する工程を含む方法を提供する。
【００３２】
さらに、本発明は、上述したパルボウイルス変異体、すなわち当該パルボウイルス変異体のポリペプチド領域を特異的に認識する抗体に関し、このとき、欠損は、当該齧歯類パルボウイルス変異体がヒト神経膠腫を通して増殖及び伝播可能な特性を明らかにして位置付けされる。抗体は、モノクローナル、ポリクローナルもしくは合成抗体又はそれらのフラグメント、例えばＦａｂ、Ｆｖ又はｓｃＦＶフラグメントであってよい。好ましくは、モノクローナル抗体に関係する。製造のためには、動物、特にポリクローナル抗体にはウサギもしくはニワトリ、モノクローナル抗体にはマウス、を上記のパルボウイルス変異体もしくはそれらのフラグメントを用いて免疫することが好ましい。さらに動物の追加免疫は、同一パルボウイルス変異体又はそれらのフラグメントを用いて実行することができる。それから、ポリクローナル抗体は、動物の血清及び卵黄から各々得られる。モノクローナル抗体は、標準方法によって得られ、特にKohler and Milstein（Nature 256（1975）, 495）及びGalfre（Meth. Enzymol. 73（1981）, 3）による方法を参照されたい。この場合、マウス骨髄腫細胞は、免疫動物に由来する脾臓細胞と融合される。本発明による抗体は、多数の方法で、例えば上述したパルボウイルス変異体の免疫沈降のため、又はそれらの単離のために使用することができる。これらの抗体は、イムノアッセイにおいて液相中で、もしくは固体担体に結合させることができる。この関連で、抗体は、様々な方法により標識することができる。当業者であれば、適切なマーカー及び標識方法に習熟している。イムノアッセイの例として、ＥＬＩＳＡ及びＲＩＡが挙げられる。
【００３３】
本発明の適用のために、キットも提供される。本キットは、
（ａ）本発明によるパルボウイルス変異体、
（ｂ）本発明によるＤＮＡ、例えば発現ベクター、特にパルボウイルス、
（ｃ）本発明による抗体、及び／又は、場合により、
（ｄ）従来型補助剤、例えば溶媒、緩衝剤、担体、マーカー及びコントロール
を含んでいる。
【００３４】
成分（ａ）〜（ｄ）の内、１つ以上の代表的なものが各々存在してよい。
【００３５】
本発明は、さらに本発明のパルボウイルス変異体、ベクター又は当該パルボウイルス変異体を産生する細胞（「パルボ治療剤」もしくは「パルボ治療用組成物」）、例えばヒト２９３（Ｔ）、ＮＢＫもしくはラットＲＧ２細胞を含有する医薬組成物を提供する。
【００３６】
投与のために、当該パルボ治療薬は適切な薬用担体と結合することができる。当該技術分野において周知であり容易に市販で入手可能なタイプの適切な薬用担体には、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液、水、例えば油／水型エマルジョンなどのエマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、無菌溶液などが含まれる。そのような担体は、適切な用量で被験者に投与するため、パルボ治療薬を用いて、従来型の調製方法により調製することができる。
【００３７】
追加の薬学的に適合する担体には、ゲル、生体吸収性マトリックス材料、該治療薬を含有する移植用成分又は他の適切な媒体（vehicle）、送達もしくは分注手段又は材料が含まれ得る。
【００３８】
当該パルボ治療用医薬組成物の被験者、例えば脳腫瘍患者への投与は、任意の数多くの適切な方法のいずれか、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、皮内、頭蓋内及び腫瘍内投与によって行うことができる。投与経路は、当然ながら、疾患の性質及び医薬組成物中に含有される特定治療薬に依存する。
【００３９】
そのようなパルボ治療薬が血液脳関門を通って侵入する能力を備える感染性ウイルス粒子を含む場合、治療はウイルス治療薬、例えばＨ１−ＰＶ変異体の静脈内注射によって実施することができる、又は少なくとも開始することができる。
【００４０】
長期静脈内治療はウイルス治療薬に対する中和抗体が形成されるため、非効率的になりやすく、様々な投与様式は静脈内ウイルス投与の初期投与計画後に順応させることができ、又はそのような様々な投与技術、例えばパルボウイルス治療の全経過を通して頭蓋内もしくは腫瘍内ウイルス投与を代わりに使用することができる。
【００４１】
また別の特異的な投与技術として、パルボ治療薬（ウイルス、ベクター及び／又は細胞剤）を、患者に移植された起源から当該患者に投与できる。例えば、その後の外科的治療介入を行わずに該パルボ治療用組成物の様々な時点での局所的注射を可能にするため、例えばシリコンもしくは他の生体適合材料のカテーテルを腫瘍切除中に、又は別個の手法によって当該患者に据え付けられた小さな皮下リザーバ（Ｒｉｃｋｈａｍ  リザーバ）へ接続することができる。本パルボウイルス変異体もしくはそれに由来するベクターもまた、例えば腫瘍内へ定位外科手術技術によって、又はニューロナビゲーション ターゲティング技術によって注射することもできる。
【００４２】
また、パルボウイルス剤もしくは組成物の投与は、ウイルス粒子又はウイルス粒子を含有する流体の移植カテーテルを通して、適切なポンプシステム、例えば蠕動式注入ポンプもしくは対流増加送達（ＣＥＤ）ポンプ、を使用して低流量での連続注入により実施することもできる。
【００４３】
当該パルボ治療用組成物のさらにまた別の投与方法は、当該パルボ治療薬を所望の部位、例えば腫瘍へ分注するために構築及び配置された、移植装置からの投与である。例えば、当該パルボ治療用組成物、例えばパルボウイルスＨ−１変異体を含浸したウエハーを使用することができ、このとき当該ウエハーは外科的腫瘍切除の終了時に切除腔の辺縁に付着させられる。そのような治療介入では、複数のウエハーを使用することができる。
【００４４】
当該パルボ治療薬、例えばパルボウイルスＨ−１変異体、又はＨ−１変異体ベクターを能動的に産生する細胞を、腫瘍除去後に所望の腫瘍内へ、又は腫瘍腔内へ注射することができる。
【００４５】
２つ以上の上述した投与様式の組み合わせを、任意の適切な方法で、例えば同時に、同時期に、又は連続的に使用することができる。
【００４６】
当該パルボ治療薬の投与計画は、当該技術分野の技術内で、患者のデータ、観察所見及び、例えば、投与される患者の体格、体表面積、年齢、性別、特定ウイルス、ベクター、細胞など、投与の時間及び経路、腫瘍のタイプ及び特性、患者の全身健康状態、ならびに該患者が服用している他の薬物もしくは受けている治療法を含むその他の臨床因子に基づき容易に決定することができる。
【００４７】
したがって、本発明はさらに、癌を治療する目的の医薬組成物を調製するための、本発明によるパルボウイルス変異体、前記パルボウイルス変異体を産生する細胞、ＤＮＡ、本発明の発現ベクターもしくは抗体の使用に関する。脳腫瘍（好ましくは神経膠腫、髄芽細胞腫、髄膜腫又は膠芽細胞腫）は、本発明の薬剤を用いた治療に特に適していると予測される。
【００４８】
以下の実施例では、本発明をより詳細に説明する。
【実施例１】
【００４９】
ラットＨ１−ＰＶ（ｐＳＲ１９）のヒト神経膠腫への順応
多数のヒト膠芽細胞腫細胞系のｐＳＲ１９単離体（目録番号ＮＣ＿００１３５８）由来のＨ１−ＰＶによる感染は、ウイルスタンパク質の発現及び結果として薬物誘導性アポトーシスに対するそれらの耐性とは無関係に細胞殺滅をもたらした。しかし、ウイルスＤＮＡ増幅及び子孫粒子産生をモニタリングしたところ、ＮＣＨ８９を除き、試験したヒト膠芽細胞腫細胞系の大多数がほとんどＤＮＡ増幅することができず、子孫産生を実質的に増加しなかった（Herrero y Calle et al., 2004、DiPiazza et al., 2007）。この欠損を改良するため、ＤＮＡ増幅に対する能力はあるが子孫ビリオン産生が妨害されたヒト膠芽細胞腫細胞におけるｐＳＲ１９の連続継代を通して（ａ）増殖能力を有するＨ１−ＰＶ変異体を得ることを目指した。Ｈ１−ＰＶの感染性クローンＤＮＡであるｐＳＲ１９をサザンブロッティングによって低レベルのＤＮＡ増幅を許容することが証明された細胞系であるＮＣＨ１４９細胞内にトランスフェクトした（図１Ｂ）。パルボウイルスは、一本鎖ゲノムから二本鎖転写鋳型への変換にはＳ期を必要とするため、（急速に）増殖する細胞に依存している。このため、初期接種（トランスフェクト細胞）を、表面上で集密度（confluency）に達した後、最初は１：４の希釈度で増幅させた。細胞数が４×１０８個に達した後、細胞の３／４を収集し、冷凍及び解凍の繰り返しによって子孫ビリオンを上清中へ遊離させ、無処置細胞及びトランスフェクト細胞の組み合わせを集密度もしくはＣＰＥが得られるまでこれらのビリオンを用いて再感染させた。この手法を２０〜２５継代まで継続して実施した。
【実施例２】
【００５０】
ヒト神経膠腫順応Ｈ１−ＰＶの分析
２０回超の連続継代後、本発明者らは、ＮＣＨ１４９培養中で、ウイルスＤＮＡ増幅能力、子孫ビリオン産生能力及び伝播能力を有するウイルスストックを得た。このウイルスプールの特性を分析した。サザンブロッティングによる図１Ｃに示したように、このウイルスプールは、ＮＣＨ１４９細胞の感染後の強力なＤＮＡ増幅、単量体及び二量体複製中間体ならびに一本鎖ビリオンＤＮＡの産生を特徴とした。ゲノムウイルスＤＮＡの産生を反映することに加えて、この後者の形態は、一本鎖ＤＮＡの産生にはパッケージングプロセスが結び付いているため、子孫ビリオンの形成を示している。さらに、感染した細胞の上清を採取して（Ｉｎｆ １）、無処置ＮＣＨ１４９細胞を感染させると（Ｉｎｆ ２）、類似のＤＮＡ増幅及び一本鎖ビリオンＤＮＡの産生が観察され、これはＮＣＨ１４９細胞内で多量の感染性子孫ビリオンが産生及び遊離されたことを証明している。実際に、培地上清中への子孫ビリオンの遊離は、ゲルゾリン中和抗体の適用がこのプロセスを阻害したので、細胞ゲルゾリンの活性に左右される。子孫ビリオンの遊離に対するゲルゾリンへのこの依存性は、子孫ビリオンの細胞周縁への能動的小胞輸送が関与することを示している（Bar et al., 2008）。
【００５１】
図２Ａに生化学的分画後の一本鎖子孫ビリオンＤＮＡのサザンブロッティングによって示したように、子孫Ｈ１−ＰＶ変異体粒子は、感染した細胞の小胞分画と強度に関連することが見いだされている。さらに、銀染色によりタンパク質含量を分析して非感染対感染ＮＣＨ１４９細胞由来の小胞を比較することにより、多数のタンパク質がビリオン含有小胞分画と関連しているが、非感染細胞中では欠如することが確認された。これらのタンパク質の性質は、現在ではＭＳ／ＭＳ分析によって決定される。
【００５２】
そこで、ＮＣＨ１４９細胞において許容性表現型を誘発するウイルス改変体の性質が確認された。初代のＨ１−ＰＶ（ｐＳＲ１９）はラットＲＧ−２神経膠腫から産生したが、順応させたＨ１−ＰＶ変異体（ｈｇＨ１−ＰＶ）はＮＣＨ１４９内で産生した。どちらのウイルスストックも、許容性ＮＢ３２４Ｋ細胞中でのプラークアッセイによって滴定した。感染は、ＮＣＨ１４９細胞中で、感染多重度１０で実施し、ウイルスタンパク質の産生はウエスタンブロッティングによる経時的実験において決定した。図３Ａに示したように、小さな非構造タンパク質ＮＳ２及びＮＳ３の発現レベルにおける顕著な相違が観察されたが、ｈｇＨ１−ＰＶ由来のＮＳ１はｐＳＲ１９由来のＮＳ１よりはるかに不均質であることが証明された。ＮＳ１は、ウイルス増幅中に多数のプロセスに必要とされ、差次的リン酸化によってその機能が調節される多機能リンタンパク質である。実際、図３Ｂに示したように、ラットＲＧ−２細胞及びヒトＮＣＨ１４９細胞の感染後にｐＳＲ１９から得られたＮＳ１のリン酸化パターンが分析され、ＮＣＨ１４９の感染後の２つの特徴的なペプチドの欠如（丸で囲まれている）が観察された。これとは対照的に、ｈｇＨ１−ＰＶはこれらのリンペプチド（及び矢印でマーキングされた追加のペプチド）を産生することができ、これはウエスタンブロッティングにより観察された移動パターンにおける相違を説明している。さらに、ＭＶＭ  ＮＳ１リン酸化（パターン）の詳細な機能分析は、ＮＣＨ１４９内でのＲＧ−２／ｈｇＨ１−ＰＶにおいてｐＳＲ１９について観察されたものに酷似しており、２つの丸で囲まれたペプチドがＮＳ１タンパク質の複製機能に関係する重要なリン酸化であることを示唆している。
【００５３】
最後に、順応させたｈｇＨ１−ＰＶストックを、ｐＳＲ１９単離体と比較して様々な（ヒト）膠芽細胞腫培養を通した増殖及び伝播への順応度について試験した。図４に示したように、ＮＣＨ１４９細胞に加えて、これまでに試験した全ての他のヒト膠芽細胞腫細胞系はｈｇＨ１−ＰＶ（ｐＳＲ１９ではない）子孫ウイルス粒子を増幅させることについて投与レベルより少なくとも１０倍有能であることが証明され、そして培養を通した伝播についてｐＳＲ１９より優れていることが証明された。
【実施例３】
【００５４】
ヒト神経膠腫順応Ｈ１−ＰＶの遺伝的特性解析
初代の接種（ｐＳＲ１９）と比較してＮＣＨ１４９内での継代中に獲得された遺伝的変異ｈｇＨ１−ＰＶを決定するために、エンドポイント滴定を実施して個々のウイルス変異体をプラーク精製し、ビリオンＤＮＡを単離した。図５及び５ｂに示したように、６つの個々のプラークのＤＮＡを入手し、全コーディング領域を３段階のＰＣＲによって増幅させ、重複フラグメントをｐＣＲ２．１内にクローニングした。遺伝的変異は、配列決定によって決定し、ｐＳＲ１９の公表された配列（目録番号 ＮＣ＿００１３５８）と比較した。個々のプラーク単離体上に存在することが見いだされたｐＳＲ１９配列と比較した突然変異をＨ１−マップ上に示し、番号付けし、位置決めした。詳細な配列変異は、図６及び６Ｂに示した。
【００５５】
個々のクローンの性質をさらに特徴付けるため、個々のプラーク単離体のウイルスストックを産生し、それらがラットＲＧ−２細胞中で産生したｐＳＲ１９と比較し、伝播及びヒト膠芽細胞腫細胞培養物を殺滅するための適応度を試験した。図７に示したように、ＮＳ１のＣ末端部分／ＮＳ２の中央エクソンにおける欠失変異体を内部に持つ全ての単離体はそれらが伝播してヒト膠芽細胞腫細胞を殺滅することについての順応度においてｐＳＲ１９より優れており、プールされた変異体を用いた初期所見を確証し、欠失変異体が観察された宿主範囲スウィッチの原因であることを証明している。
【実施例４】
【００５６】
Ｈ１−ＰＶ感染（野生型及びプラーク＃３）が腫瘍増殖に及ぼす影響
Ｕ８７膠芽細胞腫細胞を１．５ｐｆｕ／細胞のＭＯＩ（感染多重度）でエキソ ヴォヴォ（ex vivo）感染させた、又は感染させなかった（ＷＴ Ｈ−１ＰＶ野生型、プラーク＃３ プラーク＃３由来の順応Ｈ−１ＰＶ、偽 未感染Ｕ８７細胞）。細胞を洗浄し、感染４時間後にＰＢＳ中に溶解させ、１００μＬのＰＢＳ中の２×１０６個の偽、又はＨ−１ＰＶ感染細胞を１群当たり８匹のマウスに皮下移植した。腫瘍サイズ（長さ、幅、高さ）は、腫瘍細胞移植１２日後から開始して週２回、ノギス（calliper）を用いて機械的に測定した。容積は次のように、１／２×長さ×幅２で計算した。動物は、腹膜癌又は悪性腹水が見られる場合、最大２，５００ｍｍ３の腫瘍サイズの時点で屠殺した。全生存動物は、細胞移植６１日後に屠殺した。「生存」として示された（１×ＷＴ、２×プラーク＃３）。図９、９ａ及び９ｂでは、プラーク＃３の腫瘍阻害がＨ−１ＰＶ野生型を用いた場合より強度であることが図示された。さらに、プラーク＃３は、Ｈ−１ＰＶ野生型より多数の生存動物を生じさせた。
【００５７】
参照文献リスト
Rhode, S.L. III and Paradiso, P.R. (1983. Parvovirus genome: nucleotide sequence of H-1 and mapping of its genes by hybrid-arrested translation. J. Virol. 45, 173-184.
Qiu, J., Yoto, Y., Tullis, G., and Pintel, D.J. (2006). Parvovirus processing strategies, pp.253-274.  In "Parvoviruses" Eds. Kerr, J.R., Cotmore, S.F., Bloom, M.E., Linden, R.M., and Parrish, C.R. Hodder Arnold, London.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【国際調査報告】
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