(57)【要約】  本発明は、組換えHIV Env抗原蛋白質、ウィルス様粒子、及び組換えHIVウィルスを提供する。本発明はさらに、上記組換えHIV Env抗原蛋白質、上記ウィルス様粒子、又は組換えHIVウィルスを含むワクチンを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えHIV Env抗原蛋白質であって、
主要抗原エピトープを有する細胞外ドメイン、
融合ペプチド、及び
膜近接外領域（MPER）を含み、
前記MPERには、CxxC（配列番号3）、CxxxC（配列番号4）又はCxxxxC（配列番号5）から選ばれる少なくとも1つの2-システインミニドメイン（xは任意のアミノ酸を示す）が存在し、
それによって、組換えHIV Env抗原蛋白質が三量体を形成するときに、前記MPERの2つのシステインが、前記三量体を共有結合的に締め付けるタンデムジスルフィド結合ベルトを形成する、
組換えHIV Env抗原蛋白質。
【請求項２】
請求項1に記載の組換えHIV Env抗原蛋白質において、
膜貫通ドメイン（TMD）、及び 
細胞質ドメイン（CPD）、をさらに含み、
前記MPER又は前記TMDには、CxxC（配列番号3）、CxxxC（配列番号4）又はCxxxxC（配列番号5）から選ばれる少なくとも1つの2-システインミニドメインが存在し、
それによって、組換えHIV Env抗原蛋白質が三量体を形成するときに、前記MPER又は前記TMDの2つのシステインが、前記三量体を共有結合的に締め付けるタンデムジスルフィド結合ベルトを形成する、
組換えHIV Env抗原蛋白質。
【請求項３】
前記TMDは天然HIV Env蛋白質に由来し、前記TMDは少なくとも1つの2-システインミニドメインを含むように改変されている、
請求項2に記載の組換えHIV Env抗原蛋白質。
【請求項４】
前記TMDは、人工的に合成されたペプチド、又は天然形態のときに三量体を形成する非Env蛋白質由来である、
請求項2に記載の組換えHIV Env抗原蛋白質。
【請求項５】
前記組換えHIV Env抗原蛋白質は、DNA配列によってコードされており、
そのDNA配列は、組換えHIV Env発現ベクターをHIV感染に対するDNAワクチンとして使用するように、インビボ発現ベクターにクローニングされている、
請求項1に記載の組換えHIV Env抗原蛋白質。
【請求項６】
前記組換えHIV Env抗原蛋白質はDNA配列によってコードされており、
そのDNA配列は、組換えHIV Env発現ベクターをHIV感染に対するDNAワクチンとして使用されるように、インビボ発現ベクターにクローニングされている、
請求項2に記載の組換えHIV Env抗原蛋白質。
【請求項７】
前記組換えHIV Env抗原蛋白質は、HIV感染に対するワクチンとして使用される、
請求項1に記載の組換えHIV Env抗原蛋白質。
【請求項８】
前記組換えHIV Env抗原蛋白質は、HIV感染に対するワクチンとして使用される、
請求項2に記載の組換えHIV Env抗原蛋白質。
【請求項９】
ウィルス様粒子であって、
組換えHIV Env抗原蛋白質を含み、
前記組換えHIV Env抗原蛋白質は、
(a)主要抗原エピトープを有する細胞外ドメイン、
(b)融合ペプチド、
(c)膜近接外領域（MPER）、
(d)膜貫通ドメイン（TMD）、及び
(e)細胞質ドメイン（CPD）、
を含み、
前記MPER又は前記TMDには、CxxC（配列番号3）、CxxxC（配列番号4）又はCxxxxC（配列番号5）から選ばれる少なくとも1つの2-システインミニドメイン（xは任意のアミノ酸を示す）が存在し、
それによって、組換えHIV Env抗原蛋白質が三量体を形成するときに、前記MPER又は前記TMDの2つのシステインが、前記三量体を共有結合的に締め付けるタンデムジスルフィド結合ベルトを形成する、
ウィルス様粒子。
【請求項１０】
前記TMDは天然HIV Env蛋白質に由来し、前記TMDは少なくとも1つの2-システインミニドメインを含むように改変されている、
請求項9に記載のウィルス様粒子。
【請求項１１】
前記TMDは、人工的に合成されたペプチド、又は天然形態のときに三量体を形成する非Env蛋白質由来である、
請求項9に記載のウィルス様粒子。
【請求項１２】
前記ウィルス様粒子は、HIV感染に対するワクチンとして使用される、
請求項9に記載のウィルス様粒子。
【請求項１３】
組換えインフルエンザウィルスであって、
組換えHIV Env抗原蛋白質を含み、
前記組換えHIV Env抗原蛋白質は、
(a)主要抗原エピトープを有する細胞外ドメイン、
(b)融合ペプチド、
(c)膜近接外領域（MPER）、
(d)膜貫通ドメイン（TMD）、及び
(e)細胞質ドメイン（CPD）、
を含み、
前記MPER又は前記TMDには、CxxC（配列番号3）、CxxxC（配列番号4）又はCxxxxC（配列番号5）から選ばれる少なくとも1つの2-システインミニドメイン（xは任意のアミノ酸を示す）が存在し、
それによって、組換えHIV Env抗原蛋白質が三量体を形成するときに、前記MPER又は前記TMDの2つのシステインが、前記三量体を共有結合的に締め付けるタンデムジスルフィド結合ベルトを形成する、
組換えインフルエンザウィルス。
【請求項１４】
前記TMDは天然HIV Env蛋白質に由来し、前記TMDは少なくとも1つの2-システインミニドメインを含むように改変されている、
請求項13に記載の組換えインフルエンザウィルス。
【請求項１５】
前記TMDは、人工的に合成されたペプチド、又は天然形態のときに三量体を形成する非Env蛋白質由来である、
請求項13に記載の組換えインフルエンザウィルス。
【請求項１６】
前記組換えインフルエンザウィルスは、HIV感染に対するワクチンに使用される、
請求項13に記載の組換えインフルエンザウィルス。
【請求項１７】
前記ワクチンは、組換えインフルエンザウィルスのウィルス調製物由来の不活性化ウィルス粒子を含む、
請求項16に記載の組換えインフルエンザウィルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト免疫不全（HIV）の組換えエンベロープ蛋白質（Env）、及びそれを含むワクチンに関する。 
【背景技術】
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮出願番号61/408,574（2010年10月30日出願。タイトルは「ヒト免疫不全ウィルス（HIV）の組換えエンベロープ蛋白質、及びそれを含むワクチン」。）の優先権を主張するものである。また、その開示内容の全てを本明細書に援用する。
【０００３】
感染性の強いヒト免疫不全ウィルス（HIV）は依然として深刻な結果を引き起こしている。ワクチンは、ウィルス感染の予防及び治療のための最も効果的かつ経済的な手段と考えられる。残念なことに、HIVのようなウィルスは多くの血清型を有し、且つ急激な抗原変化を受ける。このことは、交差防御のために効果的なワクチンを製造する上で重要な課題となる。  
【０００４】
しかし、HIV-1に関しては、3300万人の感染者（HIV-1類似種の実質的な集団を保有する）がすでに存在している。これは、膨大な数の変異体をもたらすものであり、その変異体はいっせいに播種され、ヒト集団内を循環する。この潜在的に感染性を有する分離株の膨大な集団に対する保護を提供することは、ワクチン開発における前例のない規模の課題となっている。驚くことではないが、化学的不活性化や生存減衰化の典型的なワクチンアプローチは、幅広く防御可能又は安全なHIV-1ワクチンを生産していない。これまでのところ、HIVに対するワクチンは得られていない。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の一態様によれば、組換えHIV Env抗原蛋白質が提供される。一実施形態では、上記組換えHIV Env抗原蛋白質は、主要抗原エピトープを有する細胞外ドメイン、融合ペプチド、及び膜近接外領域（MPER）を含み、上記MPERには、CxxC（配列番号3）、CxxxC（配列番号4）又はCxxxxC（配列番号5）から選ばれる少なくとも1つの2-システインミニドメイン（xは任意のアミノ酸を示す）が存在し、それによって、組換えHIV Env抗原蛋白質が三量体を形成するときに、上記MPERの2つのシステインが、上記三量体を共有結合的に締め付けるタンデムジスルフィド結合ベルトを形成する。
【０００６】
別の実施形態では、上記組換えHIV Env抗原蛋白質は、膜貫通ドメイン（TMD）、及び細胞質ドメイン（CPD）、をさらに含み、上記MPER又は上記TMDには、CxxC（配列番号3）、CxxxC（配列番号4）又はCxxxxC（配列番号5）から選ばれる少なくとも1つの2-システインミニドメインが存在し、それによって、組換えHIV Env抗原蛋白質が三量体を形成するときに、共有結合的に密着した三量体において、上記MPER又は上記TMDの2つのシステインが、上記三量体を共有結合的に締め付けるタンデムジスルフィド結合ベルトを形成する。
【０００７】
上記組換えHIV Env抗原蛋白質の別の実施形態では、上記TMDは少なくとも1つの2-システインミニドメインを含むように改変されている。
【０００８】
上記組換えHIV Env抗原蛋白質の別の実施形態では、上記TMDは、人工的に合成されたペプチド、又はその天然形態のときに三量体を形成する非Env蛋白質由来である。
【０００９】
上記組換えHIV Env抗原蛋白質の別の実施形態では、上記組換えHIV Env抗原蛋白質はDNA配列によってコードされており、そのDNA配列は、組換えHIV Env発現ベクターをHIV感染に対するDNAワクチンとして使用するように、インビボ発現ベクターにクローニングされている。
【００１０】
上記組換えHIV Env抗原蛋白質の別の実施形態では、上記組換えHIV Env抗原蛋白質は、HIV感染に対するDNAワクチンとして使用される。
【００１１】
本発明の別の態様によれば、ウィルス様粒子が提供される。 一実施形態では、上記ウィルス様粒子は組換えHIV Env抗原蛋白質を含み、上記組換えHIV Env抗原蛋白質は、主要抗原エピトープを有する細胞外ドメイン、融合ペプチド、膜近接外領域（MPER）、膜貫通ドメイン（TMD）、及び細胞質ドメイン（CPD）、を含み、上記MPER又は上記TMDには、CxxC（配列番号3）、CxxxC（配列番号4）又はCxxxxC（配列番号5）から選ばれる少なくとも1つの2-システインミニドメイン（xは任意のアミノ酸を示す）が存在し、それによって、組換えHIV Env抗原蛋白質が三量体を形成するときに、上記MPER又は上記TMDの2つのシステインが、上記三量体を共有結合的に締め付けるタンデムジスルフィド結合ベルトを形成する。
【００１２】
本発明の別の態様によれば、組換えHIV Env抗原蛋白質を含む組換えインフルエンザウィルスが提供される。
【発明の詳細な説明】
【００１３】
本発明は、以下の本発明の実施形態の詳細な説明を参照することによって、より容易に理解することができる。
【００１４】
本出願中で刊行物が参照される場合、その刊行物の開示内容は、本発明が属する技術の状況をより完全に説明するために、参照することによりその全てが本出願に援用される。
【００１５】
特に断らない限り、本発明の実施には、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、及び免疫学の一般的な技術（これらは当業者の有する技術内である）を採用する。そのような技術は、文献（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, third edition (Sambrook and Russel, 2001)、Animal Cell Culture (R.I. Freshmey, ed., 1987)、Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987, including supplements through 2001)、Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)、The Immuno assay Handbook (D. Wild, ed., Stockton Press NY, 1994)、Methods of Immunological Analysis (R. Masseyeff, W.H. Albert, and N.A. Staines, eds., Weinheim:VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993)）で十分に説明されている。
【００１６】
HIVビリオン表面上の三量体Env糖蛋白質は、中和抗体（Nabs）の主要な抗原性ターゲットである。異なる株由来のEnv糖蛋白質は若干の違いを有することが報告されているが、主要な構造ドメインは非常に似ている。Envをコードする配列の一例を配列番号1に、翻訳後のEnv蛋白質を配列番号2に示す。配列番号2に示すように、Envは856個のアミノ酸を含み、そのアミノ酸1〜511は主要抗原エピトープ及び受容体結合ドメインを含むgp120を形成し、アミノ酸512〜856はgp41を形成する。はじめに、Envは高度にグリコシル化されたgp160前駆体として産生され、宿主プロテアーゼによってgp120とgp41の2つのサブユニットに処理される。二つのサブユニットは、非共有結合相互作用による連結状態を維持し、ウィルスの表面にヘテロ三量体スパイクを形成する。 
【００１７】
gp41は345個のアミノ酸から構成され、3つの主要なドメイン（細胞外領域（細胞外ドメインとも呼ばれる）（配列番号2に基づく番号で512〜683アミノ酸）、膜貫通ドメイン（TMD）（684〜705アミノ酸）、及び細胞質尾部（CT）（705〜856アミノ酸））に分けられる。細胞外ドメインには、公知の膜近位外部領域（MPER）（659〜683アミノ酸）がある。TMDは、22アミノ酸で構成され、脂質二重層内にEnvを固定している。それは異なるHIV-1分離株間で高度に保存されており、ウィルス感染において直接的な役割を果たすと考えられる。 
【００１８】
以前の研究で、単量体pg120免疫原が、動物モデル又はヒトにおいて幅広い反応性のNAbsを誘発しないことが示されており、そのため、ビリオン上で見られる天然Envスパイクによく似た、三量体の免疫原を生成することに焦点があてられている。しかしながら、安定かつ構造的に均質なEnv三量体を生成することは困難であることが判明している。従って、Envの免疫原を改変するための戦略が検討されている（これには、gp120とgp41間の切断部位の除去、分割されたgp120とgp41部分を安定化させるための分子内ジスルフィド結合の組み込み、及び三量体化モチーフ（例えば、T4バクテリアファージフィブリチン"フォールド−オン"（Fd）ドメイン）の追加、を含む）。T4バクテリアファージフィブリチン"フォールド−オン"（Fd）ドメインをMPERのC末端に融合させることにより、組換えEnv三量体（gp140）を生産したことが報告された。このとき、TMDとCTは、組換え蛋白質から削除された。精製gp140三量体とRibiアジュバントは、限定的に交差クレード中和抗体応答を誘発することが見られた。但し、Fdドメインは非共有結合様式で三量体構造を形成する。 
【００１９】
HIVに対する効果的なワクチンの開発はこれまでに成果を上げていなかったが、HIV分離株を広く中和するモノクローナル抗体（mAbs）の探索の努力は、いくつかのモノクローナル抗体（例えば、gp120に結合するb12、447-52D、一方でgp41のMPER を認識する2G12、2F5、Z13、4E10）を作り出した。これらの中和モノクローナル抗体は、インビトロで複数の遺伝子のHIV-1クレードによる感染を阻害し、主要なHIV-1分離株由来のエンベロープタンパク質をもつウィルスを有する動物モデルで実験的な感染を防ぐ。この幅広い中和mAbの発見は、インビボで、能動免疫によってそれらの生産を目的とすることの可能性を見せている。このことは、多数の要因（例えば、それらの抗体によって標的となる部位の構造的複雑さを含む）のため難しいということが判明した。抗体エピトープペプチドに基づくワクチンは、高力価を促すことが示された（ペプチド特異的免疫応答）。しかしながら、得られた抗血清は、ウィルス中和の能力が無かった。また、ウィルスは、少ないウィルススパイクの発現、gp120の脱落、中和エピトープのマスキングによって、免疫認識を回避する。
【００２０】
すべての以前の研究は、三量体gp160、gp140又はgp41が、ほとんど又は全てのHIV株が共有するいくつかの抗原エピトープを含むことを示唆している。残念ながら、現在のワクチンの免疫によって生産された、共有抗原エピトープに対する交差反応抗体は、抗原変異体に対して意味のある保護を提供するには余りにも低い。もしHIVワクチンが共有抗原エピトープに対して十分に交差反応する抗体を誘発できれば、すべてのHIV変異体に対する交差防御が提供される（ユニバーサルワクチン）。しかし、問題はどうすれば目標を達成するようにHIV（即ち、Env抗原）を操作できるかということである。
【００２１】
本発明では、免疫又は感染した被検体における交差反応抗体の不足は、現在のワクチン内又は感染中に、共有抗原エピトープが少ないことが原因かもしれない、さらに、現在のワクチン中に存在する共有抗原エピトープが少ない理由は、天然のEnv構造が共有抗原エピトープを維持するために十分な安定性を示さないためである、という仮説を立てた。そのため、もしEnvの構造の安定性を高めることができるれば、共有抗原エピトープの存在の増加を合理的に期待できる。しかし、問題はどのようにしてHA構造を安定化するかである。
【００２２】
私たちの日常生活では、並列材料（例えば、竹や干草）の束はベルトでしっかりと縛り付けられる。ここで、Envが並列構造の束を含むかどうかということと、さらに、そのような束が存在するなら、Envの並列構造の束に対して何らかのベルトを導入できるかどうかという疑問があった。
【００２３】
第一の疑問については、上述のように、本発明でEnvの構造を分析した。gp41は、融合ペプチド（MPER及びTMD）において多くの並列へリックス構造を含む。初期のコンピュータモデリングは、gp160又はgp41のTMDが、シングルα−ヘリックス構造を採用することを示唆した。また、ペプチドヘリックスは円筒形状を有している。そのため、3つのTMD由来の3つのへリックスは、Env三量体の内部で、3つの並列へリックスの束を形成する。このことは、全3つのEnvモノマーを共有結合的に連結する1つ以上のベルトを導入するための物理的根拠を提供する。
【００２４】
第二の疑問については、本発明で、2つのシステインによって形成したジスルフィド結合（S−S）が2つのペプチド間において形成可能であることを再考した。例えば、IgGは複数のペプチド間ジスルフィド結合によって結合したホモダイマーである。しかしながら、HA三量体中の3つのモノマーそれぞれの対応する位置のシステインは1つのジスルフィドボンドの形成を許可するが、1つのSH基はフリーのまま残る。もっと重要なことには、全3つのHAモノマーの周囲に環状ベルトが形成されない。環状ベルトを形成するため、本発明では、タンデムな3つのジスルフィド結合を3つのモノマー間で形成可能なように、各モノマーにシステインのペアーを挿入することが可能かどうかを検討した。よく知られているように、へリックスの各ターンは3.6アミノ酸を含み、ピッチ（ターン当たりの進み）は0.54nm、ライズ（アミノ酸残基当たりの進み）は0.15nmである。2つのシステインによって形成されたジスルフィド結合では、それらの中心間の距離は0.849nmである（2つのc−c結合（結合当たり0.154nm）、2つのc−s結合（結合当たり0. 17nm）、及び1つのs−s結合（0.201nm））。0.849nmの距離は、約1.57ピッチ又は5.66アミノ酸であり、このことは、もし2つのシステインが4つを超えるアミノ酸で隔てられていない場合は、ジスルフィド結合が2つのヘリックス間に形成できることを意味している。
【００２５】
本発明によれば、Env（gp160、gp140又はgp41）のTMDへ、3つの2-システインミニドメイン（(CxxC（配列番号3）、CxxxC（配列番号4）、CxxxxC（配列番号5））の1つを形成する少なくとも1つのシステインのペアーを導入することによって、3つのモノマー間のタンデムジスルフィド結合ベルトの形成を可能にすることが提供される。ここで、ミニドメインの'x'はへリックスが壊れない限り任意のアミノ酸であり、人工的に作られたミニドメイン中において、好ましくは、A、L、M、 F、E、Q、H、K、及びRである。例えば、3つのモノマーの間の3つのジスルフィド結合（1C1及び1C2を有するモノマー1、2C1及び2C2を有するモノマー2、3C1及び3C2を有するモノマー3）は、1C1-2C2、2C1-3C2、及び3C1-1C2である。このタンデムジスルフィド結合ベルトは、高度に安定な三量体を形成するように、3つのモノマーを一緒にきつくグリップする。この発見は、Envによって表される三量体蛋白質を、その三量体構造が共有結合ベルトによって安定化するように、少なくとも1つの2-システインミニドメインを含むように操作できるため、非常に重要である。gp160、pg120又はgp41の組換え蛋白質にタンデムジスルフィド結合ベルトが導入されるとき、それらの立体構造はより安定化する。また、幅広い中和抗体をより効果的に誘発し、さらにはHIVに対して効果的なワクチンとして使用されるような免疫原としての、共有結合性のgp160、gp120又はgp41の三量体を形成する。この組換えEnvは、組換え蛋白質、VLP又はウィルスの形態でワクチンの抗原として使用できる。
【００２６】
gp160又はgp41の組換え蛋白質へのタンデムジスルフィド結合ベルトの導入は、任意の適切な分子生物学的方法を用いて実現することができる。その方法は、例えば、点変異、挿入又は置換であり、本技術分野で十分に確立され知られている。組換えEnv蛋白質生産の実施形態の例は以下の通りである。
(1) CxxC（配列番号3）、CxxxC（配列番号4）又はCxxxxC（配列番号5）から選ばれる配列を有する2-システインミニドメインを形成するように、gp160、gp140又はgp41のTMDにおいて、2個のアミノ酸残基をシステインに変異させる、
(2) 挿入によってへリックス構造が壊れない限りにおいて、gp160、gp140又はgp41のTMDに2-システインミニドメインを挿入する、
(3) gp160、gp140又はgp41のTMD中の対応するアミノ酸のストレッチ、又はTMD全体を、2-システインミニドメインを含む合成へリックスペプチドで置換する、
(4) gp160、gp140又はgp41のTMD中の対応するアミノ酸のストレッチ、又はTMD全体を、2-システインミニドメイン（例えば、H3TMD (配列番号6)由来のCFFLC）を含む天然分子で置換する、
(5) gp160、gp140又はgp41の細胞外ドメイン全体を、他の蛋白質のTMD及びCTの配列と融合させる（融合したTMDは少なくとも1つの2-システインミニドメインを含む）。
一実施形態では、融合した膜貫通ドメインは、本来三量体として発現される蛋白質由来であってもよい。そのような膜貫通ドメインの一例は、膜貫通部にCxxxCミニドメインを含むインフルエンザAウィルスH3HA分子が挙げられる。なぜならば、H3HA蛋白質は3つの分子間ジスルフィド結合を有する共有結合性の三量体として発現されるためである。なお、(5)の融合は、Envの抗原性細胞外ドメインをいくつかのベクター（例えば、ウィルス様粒子（VLP）又は他のウィルス粒子）で発現することが求められる場合に、有利であると考えられる。
【００２７】
一実施形態では、2つ以上の2-システインミニドメインをEnv組換え蛋白質に導入できる。
【００２８】
以前の研究では、TM領域をインフルエンザAウィルスH2HA分子のような他の分子由来の別のTMで置換した場合、置換がウィルス感染の一部阻害を示したが、発現又はウィルス粒子への取り込みに影響を及ぼさないことが示された。他の研究では、細胞蛋白質CD22由来のTM領域の置換が、ウィルス感染に影響を与えないことが示された。これらのことは、構造の必然的な変化なしに、gp160、gp140又はgp41のTMD領域を操作できること示している。しかし、これまでの置換実験は、本発明に開示されるように、Env蛋白質の三量体構造を安定化するようにTMDを改変できることについては示唆または教示していない。
【００２９】
本発明の一実施形態によれば、組換えHIV抗原蛋白質であって、主要抗原エピトープを有するEnv蛋白質のHIV受容体結合細胞外ドメイン、膜近接外領域（MPER）、膜貫通ドメイン（TMD）、及び細胞質ドメイン（CPD）を含み、TMDには、CxxC（配列番号3）、CxxxC（配列番号4）又はCxxxxC（配列番号5）から選ばれる少なくとも1つの2-システインミニドメインが存在する、組換えHIV抗原蛋白質が提供される。一実施形態では、HIV Env蛋白質由来の天然MPER、TMD又はCPDは、1つ以上の2-システインミニドメインを含むように改変されている。一実施形態では、MPER、TMD又はCPDは、他の三量体分子（例えば、インフルエンザウィルスHA分子）に由来する。一実施形態では、MPER、TMD又はCPDは、人工的に合成されたペプチドであってもよい。組換えHIV抗原蛋白質は、発現システムがワクチン使用に効果的な組換えHIV抗原蛋白質を生産する限り、任意の適切なシステムで発現させることができる（例えば、酵母、昆虫細胞又は哺乳類細胞発現システムが好適である）。
【００３０】
2-システインミニドメインをMPERに導入した場合、三量体構造を補強するための共有結合ベルトを有する可溶性抗原として、組換えEnv蛋白質を発現できる。
【００３１】
本発明の別の実施形態によれば、インビボ発現ベクターであって、組換えHIV抗原蛋白質をコードする配列を含み、その組換えHIV抗原蛋白質は、Env蛋白質のHIV受容体結合細胞外ドメイン、膜近接外領域（MPER）、膜貫通ドメイン（TMD）、及び細胞質ドメイン（CPD）を含み、MPER又はTMDには、CxxC（配列番号3）、CxxxC（配列番号4）又はCxxxxC（配列番号5）から選ばれる少なくとも1つの2-システインミニドメインが存在する、インビボ発現ベクターが提供される。一実施形態では、HIV Env蛋白質由来の天然MPER、TMD又はCPDは、1つ以上の2-システインミニドメインを含むように改変されている。一実施形態では、MPER、TMD又はCPDは他の三量体分子（例えば、インフルエンザウィルスHA分子）に由来する。一実施形態では、MPER、TMD又はCPDは人工的に合成されたペプチドであってもよい。 発現ベクターはDNAワクチンとして使用される。発現ベクターは、例えば、レンチウィルス発現ベクター、アデノウィルス発現ベクター、アデノ随伴ウィルス発現ベクター又は他の哺乳類発現ベクターを含む。例えば、 HIV組換え蛋白質をコードする配列は、哺乳類細胞において効率的に発現するために、CMV/R発現ベクター内にクローニングされる。
【００３２】
本発明の別の実施形態によれば、ウィルス様粒子であって、組換えHIV抗原蛋白質を含み、その組換えHIV抗原蛋白質は、Env蛋白質のHIV受容体結合細胞外ドメイン、膜近接外領域（MPER）、膜貫通ドメイン（TMD）、及び細胞質ドメイン（CPD）を含み、MPER又は膜貫通ドメインには、CxxC（配列番号3）、CxxxC（配列番号4）又はCxxxxC（配列番号5）から選ばれる少なくとも1つの2-システインミニドメインが存在する、ウィルス様粒子が提供される。一実施形態では、HA蛋白質由来の天然TMD又はCPDは、1つ以上の2-システインミニドメインを含むように改変されている。一実施形態では、TMD又はCPD は、三量体分子（例えば、HIV Env分子）に由来する。一実施形態では、TMD又はCPDを人工的に合成してもよい。HIV VLPは任意の適切な方法により生成できる。一実施形態では、Env細胞外ドメインをインフルエンザウィルスHAのMPER/TM及びCPと融合する場合、HIV VLPを組換えHIV抗原蛋白質、インフルエンザウィルスNA、及びM蛋白質の共発現により生成する。このとき、HAはMPER/TMドメイン内に少なくとも1つの2-システインミニドメインを含む。VLPは任意の適切な方法により生成できる。
【００３３】
本発明の別の実施形態によれば、上述の組換えHIV抗原蛋白質を含むHIV組換えウィルスが提供される。HIV偽ウィルスは任意の従来法で生産できる。HIV組換えウィルスを用いたワクチンの生産において、ウィルス調製物は、関連の出願（タイトルは「ウィルスワクチン及びその調整方法」）の示唆に従って作製できる。ここで、ウィルス調製物中の感染性ウィルス粒子の亜集団の比率は最適化される。一実施形態では、HIV組換えウィルスは、ウィルス粒子をワクチン調製のために使用するときに安全であるために、HIV偽ウィルスである。
【００３４】
本発明の第一の目的は、幅広い交差反応性免疫応答を誘発できるHIVワクチンを提供することである。そこで、組換えEnv、組換えEnvをコードするインビボ発現ベクター、ウィルス様粒子、及び組換えインフルエンザウィルスを、ワクチンのために使用できる。同時に、それらは他の用途（例えば、交差反応性抗体の生産のための抗原又はモノクローナル抗体の結合エピトープの同定のための抗原としての用途）にも使用できる。
【００３５】
多くの生命工学系の出願は、本発明を実施する当業者のために十分な詳細な説明を提供していない（実施可能要件欠如）として、審査官が拒絶することがあるため、実験方法、確立された手順、公知技術を含め、幅広い材料を詰め込むため、非常に長い。これは、生命工学は予測可能性が低いと考えられていたためである。生命工学系の研究者である本発明の発明者は、生命工学全体は過去30年で十分に進化し、多くの基本的な手順はよく確立され知られており、より重要なことには、実験結果は機械又は電子工学系の技術と同様に予測可能であると、強く信じている。例えば、公知のウィルス及び配列があれば、そのウィルスのDNAフラグメントは、PCR増幅によって確実に得られる。また、公知の配列を有するDNAフラグメントがあれば、発現ベクターを含む任意のベクターに、インビトロ又はインビボで、想定通りにサブクローニングできる。また、クローニングした発現ベクターがあれば、クローニングした遺伝子を想定通りに発現、精製できる。また、 ウィルス様粒子は、公知技術で生成できる。また、組換えインフルエンザウィルスは、プラスミドのシステム（例えば、逆遺伝学）に基づいてレスキューできる。弁理士である私は、電子系の特許出願に、キャパシタ又は増幅器の機能の説明を含むことがないのと同様に、生命工学系の特許出願には、出願の中に不必要な材料を詰め込まない時期がきていると、強く信じている。詰め込まれた不必要な材料を削除することは、審査官とクライアントの時間の浪費を避ける助けとなり、発明の本質を容易に理解させる。このような事情を考慮して、公知の方法、及び材料は本出願に含めていない。 
【００３６】
本明細書で使用される「ワクチン」は、個体中で免疫応答を誘導するために使用される抗原調製物である。ワクチンは、複数の抗原性の成分を含有することができる。
【００３７】
本明細書で使用される「非蛋白質キャリア」は、蛋白質ではなく、且つインフルエンザマトリクス及び／又は核蛋白質の多量体ディスプレイを実現するために使用可能なキャリアである。 
【００３８】
用語「マイクロキャリア」は、微粒子組成物に対して使用される。この微粒子組成物は、水に不溶性であり、約150、120又は100um未満、より一般的には約50〜60umのサイズを有している。このサイズは約10 um未満又は約5um未満であってもよい。マイクロキャリアは、「ナノキャリア」を含む。このナノキャリアは、約1um未満、好ましくは約500nm未満のサイズを有するマイクロキャリアである。マイクロキャリアは、固相粒子を含む。この固相粒子は、生体適合性の自然に生じるポリマー又は合成コポリマーから形成される。アガロース又は架橋結合したアガロースから形成されたマイクロキャリアは、本技術分野で知られている他の生分解性材料と同様に、ここでのマイクロキャリアの定義に含めてもよいが、除外してもよい。 固相マイクロキャリアは、ポリマー、又は哺乳類の生理的条件下で非浸食性、及び／又は非分解性の他の材料（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、シリカ、セラミック、ポリアクリルアミド、金、ラテックス、ヒドロキシアパタイト、並びに強磁性及び常磁性材料）から形成される。生分解性固相マイクロキャリアは、哺乳類の生理的条件下で分解可能なポリマー（例えば、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、及びそれらのコポリマー（例えば、ポリ（D, L-ラクチド-コ-グリコリド）））又は浸食可能なポリマー（例えば、ポリ（オルトエステル（例えば、3,9 -ジエチリデン-2,4,8,10-テトラオキサスピロ[5.5]ウンデカン（DETOSU）））又はポリ（無水物）（例えば、セバシン酸のポリ（無水物）））である。マイクロキャリアは典型的には球状であるが、球状から外れてもよい（例えば、楕円、棒状等）。不溶性の性質のため、いくつかの固相マイクロキャリアは、水と水ベース（水性）溶液によって濾過できる（例えば、0.2ミクロンフィルターを使用して）。マイクロキャリアは、液相（例えば、オイル又は脂質ベースのもの）（例えば、リポソーム、抗原を除くイスコム（免疫刺激複合体（コレステロール、リン脂質、及びアジュバント活性サポニンの安定な複合体））又は水中油型又は油中水型エマルジョン（例えば、MF59）中で見られる液滴又はミセル）であってもよい。生分解性の液相マイクロキャリアマイクロキャリアは、典型的には生分解性のオイルを包含し、その多くはスクアレンやベジタブルオイルを含み、本技術分野でよく知られている。本明細書で使用される用語「非生分解性」は、通常の哺乳類の生理的条件で分解又は浸食されないマイクロキャリアに対して使用される。一般に、マイクロキャリアは、通常のヒト血清中で37℃で72時間インキュベーション後に分解（即ち、質量又は平均ポリマー長の5％未満を失うこと）されない場合、非生分解性と見なされる。
【００３９】
「個体」又は「被検体」は哺乳類である。この哺乳類は、ヒト、非ヒト霊長類、家畜、スポーツアニマル、実験動物、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）、及びペットを含むがこれらに限定されない。
【００４０】
物質の「有効量」又は「十分量」」は、所望の生物学的効果（例えば、有益な結果）（臨床結果を含む）をもたらすのに十分な量である。また、「有効量」は用いられる状況に依存する。本発明の状況下では、所望の抗原を含む組成物の有効量の一例は、個体中で免疫応答を誘発するのに十分な量である。有効量は、1回以上の投与回数で投与することができる。
【００４１】
免疫応答（例えば、体液性免疫応答又は細胞性免疫応答）の「刺激」は、応答の増加を意味する。これは、応答の誘発及び／又は増強に起因してもよい。
【００４２】
本明細書で使用され、且つ本技術分野でよく理解されている「治療」は、有益な又は所望の結果（臨床結果を含む）を得るためのアプローチである。本発明の目的では、有益な又は所望の臨床結果は、検出可能又は不可能な、1以上の症状の軽減又は改善、感染の程度の縮小、感染状態の安定化（即ち、非悪化）、感染状態の改善又は緩和、及び寛解（一部又は全部）を含むが、これらに限定されない。「治療」は、治療を受けていない場合に予想される生存期間と比較して、生存期間が延長することを意味していてもよい。
【００４３】
本発明において、ワクチン組成物の「投与量」は、特定の時点で投与されるワクチン組成物の量である。「投与量」は、徐放剤及び／又は徐放用装置を用いて動物へ徐々に投与するワクチン組成物の量であってもよい。本発明の一実施形態では、2種以上のワクチン組成物の投与量が、異なる時間に動物に投与される。
【００４４】
本発明において、HIV抗原（例えば、組換えEnv蛋白質）の「免疫学的有効量」は、治療動物において、HIVウィルスの悪性株による後続のチャレンジに対して、完全又は部分的に免疫を誘導する組換えEnv蛋白質の量である。完全又は部分的な免疫は、HIVウィルスの悪性株でチャレンジした後の、ワクチン非投与動物と比較したワクチン投与動物のHIVウィルス感染の臨床症状を、定性的又は定量的のいずれかで観察することで評価できる。チャレンジ後のワクチン投与動物のHIVウィルス感染の臨床症状が、類似又は同一のチャレンジ後のワクチン非投与動物で観察された症状に対して、縮小、減少、又は除去されるとき、ワクチン投与動物に投与された組換え蛋白質の量は、免疫学的有効量として評価される。
【００４５】
「交差防御免疫応答」は、ウィルス株による感染から防御する現象である。このウィルスは、応答を誘発するために使用されるものと同一ではない。
【００４６】
本技術分野で理解されているように、「アジュバント」は、免疫原性及び／又はワクチン組成物の有効性を促進する、1つ以上の物質を意味する。適切なアジュバントは、限定されないが、例えば、スクアラン及びスクアレン（又は動物由来の他の油）、ブロックコポリマー; Tween-80等の界面活性剤; クイルA、ドラケオール又はマルコール等のミネラルオイル、ピーナッツオイル等のベジタブルオイル; コリネバクテリウム・パルヴム等のコリネバクテリウム由来アジュバント; プロピオニバクテイリウム・アクン等のプロピオニバクテイルム由来アジュバントマイコバクテリウム・ボビス（バシル・カルメット及びゲラン又はBCG）インターロイキン2及びインターロイキン12等のインターロイキン; インターロイキン1等のモノカイン; 腫瘍壊死因子; ガンマインターフェロン等のインターフェロン; ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、リゾレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、N,N-ジクオクタデシル-N ',N'bis）2-ヒドロキシエチル-プロパンジアミン）、メトキシヘキサデシルグリセロール、プルロニックポリオール等の界面活性物質; ピラン、デキストランサルフェイト、ポリICカルボポール等のポリアミン; ムラミルジペプチド及び誘導体、ジメチルグリシン、タフトシン等のペプチド; オイルエマルジョン;  及び、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム又はミョウバン等のミネラルゲル; サポニン-水酸化アルミニウム又はクイルA水酸化アルミニウム等の組み合わせ; リポソーム; マイコバクテリア細胞壁抽出物; ムラミルジペプチド又は他の誘導体等の合成糖ペプチド; アブリジン; 脂質A誘導体; デキストランサルフェイト; DEAE-デキストラン又はリン酸アルミニウムとの組合わせ; カルボキシポリメチレン等のCarbopol'EMA; Neocryl A640等のアクリル系コポリマーエマルジョン; ワクシニア又はアニマルポックスウィルス蛋白質; コレラ毒素等のサブウィルス粒子アジュバント、又はそれらの混合物を含む。
【００４７】
本発明の治療用組成物は、治療する対象が許容できる賦形剤中に製剤化できる。賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、ハンクス溶液、及び他の水溶性の生理学的平衡塩類溶液を含む。賦形剤は、少量の添加剤（例えば、等張性、及び化学的又は生物学的安定性を促進する物質）を含んでいてもよい。緩衝液は、例えば、リン酸緩衝液、重炭酸塩緩衝液、及びトリス緩衝液を含み、また、安定剤は、例えば、ダイアモンドアニマルヘルス（デモイン、アイオワ）から入手可能なA1/A2安定剤を含む。
【００４８】
効果的に治療用組成物を投与するために許容されるプロトコルは、個人の投与量サイズ、投与回数、投与量の頻度、及び投与形態を含む。そのようなプロトコルの決定は、当業者によって成すことができ、その例は本明細書に記載されている。
【００４９】
「投与」又は「投与する」とは、個体の体内へ物質を導入することとして定義され、経口、経鼻、眼、直腸、膣、及び非経口経路を含む。組成物は、任意の投与経路（皮下（SQ）、筋肉内（IM）、静脈内（IV）、腹腔内（IP）、皮内（ID）、鼻、眼、又は口腔粘膜経由（IN）、又は経口を含むが、これらに限定されない）で、単独又は他の薬剤との組合わせで投与してもよい。
【００５０】
本発明の状況下において、患者に投与される投与量は、適切な期間にわたって患者に有益な応答をもたらすのに十分量であるべきである。投与すべき薬剤の量は、治療される被験体の年齢、性別、体重、及び一般的な健康状態、医師の判断に依存する因子に依存し得る。
【００５１】
本発明の免疫療法組成物は、ヒト等の動物に予防的又は治療的に免疫するために使用することができる。但し、他の動物も考慮される（好ましくは、家畜、コンパニオン・アニマル等の飼いならされた動物を含む脊椎動物）。
【００５２】
ワクチンは例えば、他の物質と組み合わせて使用してもよい（例えば、弱毒化ワクチンを用いたプライミングの後に不活化ワクチンを用いたブーストを続ける）。
【００５３】
本発明は、抗原、アジュバント、および薬理学的に許容されるキャリアを含む、全ての医薬組成物を包含する。
【００５４】
本発明において使用する上で好ましい薬理学的に許容されるキャリアは、非水性溶液、懸濁液、及びエマルジョンの滅菌水溶液を含んでいてもよい。非水性溶媒は、例えば、ベジタブルオイル（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイル）、及び注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）である。水性キャリアは、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョン、又は懸濁液を含み、またそれらは、生理食塩水及び緩衝化媒体を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロース及びソディウムクロリド、乳酸リンガー、又は固定オイルを含む。静脈用ビヒクルは、水分及び栄養補給剤、電解質補給剤（例えば、リンガーデキストロースに基づくもの）等を含む。防腐剤及び他の添加剤としては、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスが挙げられる。
【００５５】
＜実施例＞
【００５６】
以下、本発明の原理の説明を唯一の目的として実施例を提供する。この実施例は、本発明を限定することを意図するものではない。
【００５７】
I. 組換えHIV Env抗原蛋白質発現ベクター
【００５８】
pcDNA 3.1及びpFastBac Dualはインビトロジェン社由来である。
【００５９】
Env（配列番号2）の細胞外ドメイン（gp140）とH3 HAのTMD（配列番号6）をコードするDNAフラグメントを別々に増幅し、ライゲーションさせた。このとき、細胞外ドメインのプロテアーゼサイトを部位特異的変異により除去した。ライゲーションしたEnv-H3TMDを、DNAワクチンとして使用するためのpcDNA 3.1、及びVLP構築用のpFastBac Dualにクローニングした。
【００６０】
II. 動物実験
【００６１】
6〜8週齢のBalb/Cマウス（5匹／1群）を30ugで3回、筋肉注射で免疫した（免疫から1週間後に血清を得た）。その後、VLPで3回、粘膜免疫（鼻）を行った（免疫から2週間後に血清を得た）。ELISAの結果、pcDNA-gp140TMで免疫された群が、HIV VLPに対して最も高い力価を有していることが示された。2-システインミニドメインを有するH3TMDの導入によって、抗原性が増強することが実証された。
【００６２】
本発明を特定の実施形態を参照して説明したが、その実施形態は例示であること、及び本発明の範囲はそれらに限定されないことは理解される。本発明の別の実施形態は、本発明が属する分野の当業者に明らかである。そのような代わりの実施形態は、本発明の趣旨及び範囲内に包含されると考えられる。結果的に、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲に記載されており、上述の説明によってサポートされている。 
【配列表】
2013545733000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年6月27日(2013.6.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えHIV Env抗原蛋白質であって、
主要抗原エピトープを有する細胞外ドメイン、
融合ペプチド、及び
膜近接外領域（MPER）を含み、
前記MPERには、CxxC（配列番号3）、CxxxC（配列番号4）又はCxxxxC（配列番号5）から選ばれる少なくとも1つの2-システインミニドメイン（xは任意のアミノ酸を示す）が存在し、
それによって、組換えHIV Env抗原蛋白質が三量体を形成するときに、前記MPERの2つのシステインが、前記三量体を共有結合的に締め付けるタンデムジスルフィド結合ベルトを形成する、
組換えHIV Env抗原蛋白質。
【請求項２】
組換えHIV Env抗原蛋白質であって、
主要抗原エピトープを有する細胞外ドメイン、
融合ペプチド、
膜近接外領域（MPER）、
膜貫通ドメイン（TMD）、及び 
細胞質ドメイン（CPD）を含み、
前記MPER又は前記TMDには、CxxC（配列番号3）、CxxxC（配列番号4）又はCxxxxC（配列番号5）から選ばれる少なくとも1つの2-システインミニドメインが存在し、
それによって、組換えHIV Env抗原蛋白質が三量体を形成するときに、前記MPER又は前記TMDの2つのシステインが、前記三量体を共有結合的に締め付けるタンデムジスルフィド結合ベルトを形成する、
組換えHIV Env抗原蛋白質。
【請求項３】
前記組換えHIV Env抗原蛋白質は、DNA配列によってコードされており、
そのDNA配列は、組換えHIV Env発現ベクターをHIV感染に対するDNAワクチンとして使用するように、インビボ発現ベクターにクローニングされている、
請求項1又は2に記載の組換えHIV Env抗原蛋白質。
【請求項４】
前記組換えHIV Env抗原蛋白質は、HIV感染に対するワクチンとして使用される、
請求項1又は2に記載の組換えHIV Env抗原蛋白質。
【請求項５】
ウィルス様粒子であって、
組換えHIV Env抗原蛋白質を含み、
前記組換えHIV Env抗原蛋白質は、
(a)主要抗原エピトープを有する細胞外ドメイン、
(b)融合ペプチド、
(c)膜近接外領域（MPER）、
(d)膜貫通ドメイン（TMD）、及び
(e)細胞質ドメイン（CPD）、
を含み、
前記MPER又は前記TMDには、CxxC（配列番号3）、CxxxC（配列番号4）又はCxxxxC（配列番号5）から選ばれる少なくとも1つの2-システインミニドメイン（xは任意のアミノ酸を示す）が存在し、
それによって、組換えHIV Env抗原蛋白質が三量体を形成するときに、前記MPER又は前記TMDの2つのシステインが、前記三量体を共有結合的に締め付けるタンデムジスルフィド結合ベルトを形成する、
ウィルス様粒子。
【請求項６】
前記ウィルス様粒子は、HIV感染に対するワクチンとして使用される、
請求項5に記載のウィルス様粒子。
【請求項７】
組換えHIVウィルスであって、
組換えHIV Env抗原蛋白質を含み、
前記組換えHIV Env抗原蛋白質は、
(a)主要抗原エピトープを有する細胞外ドメイン、
(b)融合ペプチド、
(c)膜近接外領域（MPER）、
(d)膜貫通ドメイン（TMD）、及び
(e)細胞質ドメイン（CPD）、
を含み、
前記MPER又は前記TMDには、CxxC（配列番号3）、CxxxC（配列番号4）又はCxxxxC（配列番号5）から選ばれる少なくとも1つの2-システインミニドメイン（xは任意のアミノ酸を示す）が存在し、
それによって、組換えHIV Env抗原蛋白質が三量体を形成するときに、前記MPER又は前記TMDの2つのシステインが、前記三量体を共有結合的に締め付けるタンデムジスルフィド結合ベルトを形成する、
組換えインフルエンザウィルス。
【請求項８】
前記組換えHIVウィルスは、HIV感染に対するワクチンに使用される、
請求項7に記載の組換えHIVウィルス。
【請求項９】
前記ワクチンは、組換えHIVウィルスのウィルス調製物由来の不活性化ウィルス粒子を含む、
請求項8に記載の組換えHIVウィルス。
【国際調査報告】
2013545733.tif 000002
2013545733.tif 000003