(57)【要約】本発明は、フサリウム属のカビ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＮ０８０３２６から分離した抗癌活性を有する新規なフサリセチン化合物およびその用途に関するものであり、より詳細には、土壌サンプルから分離したカビフサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＮ０８０３２６から分離精製した新規なフサリセチン化合物が、乳癌細胞、肝癌細胞または骨髄性白血病細胞のような癌細胞に対して増殖阻害および転移阻害の活性を有しているため、前記化合物を有効成分として含有する有用な抗癌用組成物として使用することができる。
2013534216.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩：
【化１】
2013534216.tif 000008
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、アセチル、ベンジル、ハロゲン原子、水酸基またはカルボキシル基を有することができ、すべての非対称炭素での異性体を含有する。
【請求項２】
請求項１において、下記の化学式２で表されるフサリセチン（ｆｕｓａｒｉｓｅｔｉｎ）Ａ化合物または薬学的に許容可能な塩：
【化２】
2013534216.tif 000009
【請求項３】
請求項１において、下記の化学式３で表されるフサリセチン（ｆｕｓａｒｉｓｅｔｉｎ）Ｂ化合物または薬学的に許容可能な塩：
【化３】
2013534216.tif 000010
【請求項４】
前記フサリセチン化合物が、カビフサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＮ０８０３２６から分離されたことを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する癌の予防および治療用薬学的組成物。
【請求項６】
前記癌が、乳癌、肝癌または骨髄性白血病であることを特徴とする、請求項５に記載の癌の予防および治療用薬学的組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する、癌の予防および改善用健康食品。
【請求項８】
前記癌が、乳癌、肝癌または骨髄性白血病であることを特徴とする、請求項７に記載の癌の予防および改善用健康食品。
【請求項９】
１）フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＮ０８０３２６菌株を培養する工程、および
２）前記１）工程で得られた菌株培養物からフサリセチン化合物を分離する工程を含む、請求項１に記載のフサリセチン化合物の産生方法。
【請求項１０】
受託番号ＫＣＴＣ１１９８５ＢＰで寄託された、請求項１に記載の化合物を生産するフサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＮ０８０３２６菌株。
【請求項１１】
薬学的に有効な量の請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を、癌にかかった個体に投与する工程を含む、癌の治療方法。
【請求項１２】
薬学的に有効な量の請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を個体に投与する工程を含む、癌の予防方法。
【請求項１３】
癌の予防および治療用薬学的組成物に使用するための、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１４】
癌の予防および改善用健康食品に使用するための、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌活性を有する土壌から分離したカビ、前記カビから産生された癌細胞増殖阻害および癌細胞転移阻害の活性を有する化合物、前記化合物を有効成分として含有する抗癌用組成物、および前記化合物の分離方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌は、現代社会において死亡率の１位を占める主要な疾病であり、現在まで多くの研究にもかかわらず画期的な治療法がないのが実情である。現代医学の代表的癌治療法には、外科的手術療法、生物療法、放射線療法、抗癌物質投与による化学療法などがある。化学療法は、抗癌剤を経口や注射で投与して癌細胞の増殖を抑制する方法であり、転移した癌を治療することができるということから、現在、化学療法は転移性癌の治療における標準療法として使用されている。もちろん、転移した癌を化学療法で完治させることはできないが、症状を緩和させて寿命延長において重要な役割をする。
【０００３】
天然物由来の抗癌剤の中で最も広く使用されている抗癌剤は、タキソール（ｔａｘｏｌ）で、乳癌、卵巣癌の治療に使用されている。しかし、このような化学療法剤は、副作用および抗癌剤に対する耐性の発現などの問題点を有しており、今まで癌に対する多くの研究が進められているが、癌自体の多様性および多様な発病機序のため、より少ない副作用と耐性を克服することができる新しい抗癌剤の開発が求められている。
【０００４】
天然物の探索と利用に関する研究は、有機体の生合成能力を探索して利用することであり、今まで主に植物と微生物がその主な対象となってきた。特に微生物は、種の多様性と共に独特で興味深い生理活性物質を産生する例が多く、世代交代期間が短くて大量生産が容易で産業的利用の可能性が高くて魅力ある生理活性物質の探索源となってきた。微生物から探索された多くの生理活性物質は、放線菌、カビ、細菌から起因し、その中でも約２５％がカビから発見されており、抗癌物質を含めた生理活性物質の産生菌として、産業的または医学的な側面から非常に重要な微生物資源として知られている。
【０００５】
そこで、本発明者らは、抗癌活性に優れた物質に対して土壌微生物の代謝産物から探索中、土壌サンプルから抗癌活性が優れた物質を産生するカビ菌株フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＮ０８０３２６を選別し、それから新しい構造のフサリセチン（ｆｕｓａｒｉｓｅｔｉｎ）化合物を純粋に分離および精製し、前記フサリセチン化合物が乳癌細胞、肝癌細胞、骨髄白血病細胞のような癌細胞に対して、癌細胞増殖阻害および癌細胞の転移阻害活性を示すことを確認して本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、抗癌活性を有する土壌から分離したフサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＮ０８０３２６カビ、前記カビから産生された癌細胞増殖阻害および癌細胞転移阻害活性を有する新規フサリセチン（ｆｕｓａｒｉｓｅｔｉｎ）化合物を提供することである。
【０００７】
本発明の他の目的は、本発明によるフサリセチン化合物を生産する方法を提供することである。
【０００８】
本発明のまた他の目的は、本発明によるフサリセチン化合物を生産する新規菌株を提供することである。
【０００９】
本発明のまた他の目的は、本発明によるフサリセチン化合物を含有する抗癌用組成物を提供することである。
【００１０】
本発明のまた他の目的は、本発明によるフサリセチン化合物を用いた癌の予防または治療方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記課題を解決するため、本発明は、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【００１２】
【化１】
2013534216.tif 000003
【００１３】
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、アセチル、ベンジル、ハロゲン原子、水酸基またはカルボキシル基を有することができ、すべての非対称炭素での異性体を含有する。
【００１４】
また、本発明は前記化合物を有効成分として含有する癌の予防および治療用薬学的組成物を提供する。
【００１５】
また、本発明は前記化合物を有効成分として含有する癌の予防および改善用健康食品を提供する。
【００１６】
また、本発明は前記化合物を生産する方法を提供する。
【００１７】
また、本発明は受託番号ＫＣＴＣ１１９８５ＢＰで寄託された、前記化合物を生産するフサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＮ０８０３２６菌株を提供する。
【００１８】
また、本発明は薬学的に有効な量の前記化合物またはその薬学的に許容可能な塩を癌にかかった個体に投与する工程を含む、癌の治療方法を提供する。
【００１９】
また、本発明は薬学的に有効な量の前記化合物またはその薬学的に許容可能な塩を個体に投与する工程を含む、癌の予防方法を提供する。
【００２０】
また、本発明は癌の予防および治療用薬学的組成物に使用するための、前記化合物またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【００２１】
また、本発明は癌の予防および改善用健康食品に使用するための、前記化合物またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【００２２】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００２３】
本発明は、下記の化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【００２４】
【化２】
2013534216.tif 000004
【００２５】
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、アセチル、ベンジル、ハロゲン原子、水酸基またはカルボキシル基を有することができ、すべての非対称炭素での異性体を含有する。
【００２６】
前記の化学式１で表される化合物は、下記の化学式２で表されるフサリセチンＡ化合物であることが好ましいが、それに限定されない。
【００２７】
【化３】
2013534216.tif 000005
【００２８】
前記の化学式１で表される化合物は、下記の化学式３で表されるフサリセチンＢ化合物であることが好ましいが、それに限定されない。
【００２９】
【化４】
2013534216.tif 000006
【００３０】
前記フサリセチン化合物は、カビフサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＮ０８０３２６から分離することが好ましいが、それに限定されない。
【００３１】
前記フサリセチン化合物は、乳癌細胞、肝癌細胞または骨髄性白血病細胞のような癌細胞に対して、増殖阻害および転移阻害の活性を有することが好ましいが、それに限定されない。
【００３２】
前記癌は、乳癌、肝癌または骨髄性白血病であることが好ましく、乳癌であることがさらに好ましいが、それに限定されない。
【００３３】
本発明は、前記の化学式１で表されるフサリセチン化合物またはその薬学的に許容される塩だけではなく、それから製造され得る可能な溶媒化物、水和物をすべて含有する。
【００３４】
本発明の化学式１のフサリセチン化合物は、薬学的に許容可能な塩の形態で使用することができ、塩としては薬学的に許容可能な遊離酸（ｆｒｅｅ  ａｃｉｄ）によって形成された酸付加塩が有用である。酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、ブロム化水素酸、ヨード化水素酸、亜硝酸または亜リン酸のような無機酸類と脂肪族モノおよびジカルボキシレート、フェニル置換されたアルカノエート、ヒドロキシアルカノエートおよびアルカンジオエート、芳香族酸類、脂肪族および芳香族スルホン酸類のような無毒性有機酸から得られる。このような薬学的に無毒な塩類では、スルファート、ピロスルファート、バイスルファート、サルファイト、バイサルファイト、ニトラート、ホスファート、モノヒドロゲンホスファート、ジヒドロゲンホスファート、メタホスファート、ピロホスファートクロライド、ブロマイド、アイオダイド、フルオライド、アセタート、プロピオネート、デカノエート、カプリレート、アクリレート、ホルマート、イソブチレート、カプレート、ヘプタノエート、プロピオネート、オキサレート、マロネート、サクシネート、スベラート、セバケート、フマレート、マリエート、ブチン−１，４−ジオエート、ヘキサン−１，６−ジオエート、ベンゾエート、クロロベンゾエート、メチルベンゾエート、ジニトロベンゾエート、ヒドロキシベンゾエート、メトキシベンゾエート、フタレート、テレフタレート、ベンゼンスルホナート、トルエンスルホナート、クロロベンゼンスルホナート、キシレンスルホナート、フェニルアセテート、フェニルプロピオネート、フェニルブチレート、シトラート、ラクタート、β−ヒドロキシブチレート、グリコラート、マレート、タートレート、メタンスルホナート、プロパンスルホナート、ナフタリン−１−スルホナート、ナフタリン−２−スルホナートまたはマンデレートを含有する。
【００３５】
本発明による酸付加塩は、通常の方法、例えば、化学式１のフサリセチン化合物を過量の酸水溶液中に溶解させて、その塩を水混和性有機溶媒、例えばメタノール、エチルアルコール、アセトンまたはアセトニトリルを使用して沈澱させて製造することができる。
【００３６】
同量の化学式１のフサリセチン化合物および水中の酸またはアルコールを加熱して、続いて、その混合物を蒸発させて乾燥させるか、または析出した塩を吸入ろ過して製造することもできる。
【００３７】
また、塩基を使用して薬学的に許容可能な金属塩を作ることができる。アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩は、例えば化合物を過量のアルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物の溶液中に溶解して、非溶解化合物塩をろ過して、余液を蒸発、乾燥させて得る。ここで、金属塩としては、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩を製造することが製薬上相応しい。また、それに対応する銀塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩を適当な銀塩（例、硝酸銀）と反応させて得る。
【００３８】
本発明では、土壌試料から菌株を分離した後、前記菌株の配列分析を行なって得られた塩基配列をＧｅｎＢａｎｋ検索した結果、フサリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）（ＤＱ９１６１５０）に９９％、フサリウム・インカルナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ）（ＥＵ１１１６５７）に９９％の相同性を示した。それで、本菌株をフサリウム属と同定し、それをフサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＮ０８０３６２と名付けて、２０１１年７月１８日韓国生命工学研究院微生物資源センター（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，ＫＣＴＣ）に寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ１１９８５ＢＰ）。
【００３９】
本発明では、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＮ０８０３２６菌株の培養液を同量のエチルアセテートで抽出して抽出液を得た後、前記抽出液を減圧蒸発方法で濃縮して濃縮液を得た後、カラムクロマトグラフィーを用いて活性分画を溶出した後、前記活性分画を減圧濃縮した後、高速液体クロマトグラフィーを用いて本発明の化合物１および２をそれぞれ分離した（図１参照）。
【００４０】
本発明では、前記のカビＦｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．ＦＮ０８０３２６の培養液から分離した化合物１および２を、ＥＳＩ質量分析機（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）を使用して分子量および分子式を決定した。また、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析を通じて１Ｈ  ＮＭＲ、１３Ｃ  ＮＭＲ、ＣＯＳＹ（Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、ＨＭＱＣ（１Ｈ−Ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ−Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）、ＨＭＢＣ（Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ−Ｂｏｎｄ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）、ＤＥＰＴ（Ｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎｌｅｓｓ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｂｙ  Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、ＮＯＥＳＹ（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｆｆｅｃｔ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）スペクトルを得て、化合物１および２の分子構造を決定した結果、前記化合物１および２は下記化学式のような６−６−５−５−５員環が順に連続した新規な骨格の化合物と同定した（図２、図３、図４および図５）。そこで、前記化合物１および２をそれぞれフサリセチン（Ｆｕｓａｒｉｓｅｔｉｎ）ＡおよびＢと名付けた。フサリセチンＡおよびＢは、ＨＲＥＳＩＭＳ分析とＮＭＲ分析を通じて、分子量３８９、分子式Ｃ２２Ｈ３１ＮＯ５であることを確認し、同一な分子量と分子式を有する化合物であり、１Ｈ  ＮＭＲの結合定数値およびＮＯＥＳＹ結果から、化合物１および２は５番の炭素の立体配位が異なる異性体であることを確認した。
【００４１】
本発明では、フサリセチンＡおよびＢが癌細胞増殖阻害活性を有するかどうかを調べるため、ヒト乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）、ラット線維芽細胞株（３Ｙ１細胞）、ヒト肝癌細胞株（Ｈｅｐ３Ｂ）、ヒト慢性骨髄性白血病細胞株（Ｋ５６２細胞）およびヒト前骨髄性白血病細胞株（ＨＬ−６０細胞）をフサリセチンＡおよびＢを多様な濃度で添加した培地に培養した後、前記細胞の生存率を測定した。その結果、本発明のフサリセチンＡおよびＢは、それぞれＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、３Ｙ１細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、Ｋ５６２細胞、およびＨＬ−６０細胞株すべてに対して５０％増殖阻害濃度であるＩＣ５０値を濃度依存的に減少させた（図７および図８参照）。したがって、本発明のフサリセチンＡおよびＢは、優れた癌細胞増殖阻害活性を有することが分かる。
【００４２】
本発明では、フサリセチンＡおよびＢが癌細胞転移阻害活性を有するかどうかを調べるため、ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）をフサリセチンＡおよびＢを多様な濃度で添加した培地に培養した後、トランスウェルチャンバーを用いて前記細胞の転移程度を測定した。その結果、本発明のフサリセチンＡおよびＢはそれぞれＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対して、１００％転移阻害濃度を示すＥＤ１００を顕著に減少させた。したがって、本発明のフサリセチンＡおよびＢは、癌細胞に対する癌転移抑制活性を有することが理解される。かかる結果を通じて、フサリセチンＡおよびＢは、１０％濃度の牛胎児血清（ＦＢＳ）に誘導された細胞の転移を阻害することからみて、癌細胞転移に関与する因子群、例えばインテグリン（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ）、マトリックスメタロプロテアーゼ（Ｍｅｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ；ＭＮＰｓ）、ヘパラナーゼ（Ｈｅｐａｒａｎａｓｅ）、線維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ；ＦＧＦ）などを阻害するものであることが分かる。
【００４３】
また、本発明は、受託番号ＫＣＴＣ１１９８５ＢＰで寄託された、前記フサリセチンＡまたはＢの化合物を生産するフサリウム属ＦＮ０８０３２６菌株を提供する。
【００４４】
また、本発明は、本発明のフサリウム属ＦＮ０８０３２６菌株からフサリセチンＡまたはＢの化合物を分離する方法を提供する。
【００４５】
具体的に、
１）フサリウム属ＦＮ０８０３２６菌株を培養する工程、および
２）前記１）工程で得られた菌株培養物からフサリセチン化合物を分離する工程を含む、本発明によるフサリセチン化合物の分離方法を提供する。
【００４６】
本発明の実施例では、
１）フサリウム属ＦＮ０８０３２６菌株を培養する工程、
２）前記１）工程で得られた菌株培養物をエチルアセテートで抽出する工程、および
３）前記２）工程で得られたエチルアセテート抽出物をカラムクロマトグラフィーで分離する工程を含む、分離方法を行なった。
【００４７】
前記方法において、工程１）は、カビフサリウム属ＦＮ０８０３２６菌株を培養する工程であって、前記菌株は受託番号ＫＣＴＣ１１９８５ＢＰに寄託されたフサリウム属ＦＮ０８０３２６菌株であることが好ましい。
【００４８】
菌株培養は、通常の微生物に使用することができる栄養源を含有した培地で培養することができる。栄養源では、従来カビの培養に用いられている公知の栄養源を使用することができる。例えば、炭素源ではグルコース、水飴、デキストリン、澱粉、糖蜜、動物油、植物油などを使用することができ、窒素源では、ふすま、大豆粕、小麦、麦芽、綿実粕、魚粕、コーン・スティープ・リカー、肉汁、酵母抽出物、硫酸アンモニウム、硝酸ソーダ、尿素などを使用することができる。必要によって、食塩、カリウム、マグネシウム、コバルト、塩素、リン酸、硫酸およびその他イオン生成を促進する無機塩類を添加すると非常に効果的である。培養方法では好気的条件では振盪培養または定置培養が好ましいがそれに限定されない。
【００４９】
培養温度は、前記の各条件で培養する場合、条件によって少しずつ相異してはいるが、普通２０〜３７℃で培養することが好ましく、２５〜３０℃で培養するのがさらに好ましいが、それに限定されない。
【００５０】
前記方法において、工程２）は前記工程１）で得られた菌株培養物をエチルアセテートで抽出する工程であり、本発明のフサリセチンＡまたはＢの化合物は菌株の培養液だけではなく菌糸体部分にも存在し得る。したがって、菌株の培養液および菌糸体にエチルアセテートなどの有機溶媒を加えて、培養液および菌糸体から有効成分を抽出した後、得られた抽出液を減圧蒸発方法で濃縮することが好ましいが、それに限定されない。
【００５１】
前記方法において、工程３）は本発明のフサリセチンＡまたはＢの化合物を分離する工程であり、前記工程２）で得たエチルアセテート濃縮液をメタノール：水混合溶媒を用いてフラッシュカラムクロマトグラフィーを実施した後、高速液体クロマトグラフィーで精製して分離することができる。
【００５２】
また、本発明は、本発明のフサリセチンＡまたはＢの化合物を有効成分として含有する癌予防および治療用薬学的組成物を提供する。
【００５３】
本発明のフサリセチンＡまたはＢの化合物は、乳癌細胞、肝癌細胞または骨髄性白血病細胞のような癌細胞に対して増殖阻害および転移阻害活性を有しているので、前記フサリセチンＡまたはＢの化合物を抗癌剤の有効成分として有用に使用することができることが理解される。
【００５４】
本発明によるフサリセチンＡまたはＢ、またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する組成物は、一般的な医薬品製剤の形態で使用することができる。
【００５５】
すなわち、本発明のフサリセチンＡまたはＢは、実際の臨床投与時に経口および非経口のさまざまな剤形で投与することができる。また、製剤化する場合には有効成分であるフサリセチンＡまたはＢ以外に追加で薬剤学的で許容可能な担体を１種以上含んで製造することができる。薬剤学的に許容可能な担体は、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エチルアルコールおよびそれら成分の中で１成分以上を混合して使用することができ、必要によって抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。
【００５６】
経口投与のための固形製剤では、錠剤、丸薬、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが挙げられ、このような固形製剤はフサリセチンＡまたはＢに少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混合し調剤される。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウムタルクのような滑剤も使用できる。
【００５７】
また、経口投与のための液状製剤では、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当し、よく使用される単純希釈剤である水、流動パラフィン以外にさまざまな賦形剤、例えば湿潤剤、甘味料、芳香剤、保存剤などを含むことができる。非経口投与のための製剤では、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤および懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどを使用することができる。坐剤の基材には、ハードファット（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴ−ル、ツイーン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを使用することができる。
【００５８】
さらに、本発明の薬学的組成物は、非経口で投与することができ、非経口投与は、皮下注射、静脈注射または筋肉内注射による。非経口投与用剤形に製剤化するためには、前記フサリセチンＡまたはＢを安定剤または緩衝剤とともに水で混合して溶液または懸濁液に製造し、それをアンプルまたはバイアルの単位投与型に製剤する。
【００５９】
本発明によるフサリセチンＡまたはＢは、組成物総重量に対して０．１〜５０重量％で含むことが好ましい。しかし、前記のような組成は必ずそれに限定されるのではなく、患者の状態、疾患の種類および進行程度によって変わり得る。
【００６０】
本発明によるフサリセチンＡまたはＢの好ましい投与量は、患者の状態および体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路および期間によって異なるが、当業者によって適切に選択され得る。しかし、好ましい効果のためには、１日に０．０１ｍｇ／ｋｇないし１０ｇ／ｋｇで、好ましくは１ｍｇ／ｋｇないし１ｇ／ｋｇで投与した方が良い。投与は、一日に一度投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。したがって、前記投与量はどのような面においても本発明の範囲を限定するものではない。
【００６１】
また、本発明は本発明のフサリセチンＡまたはＢの化合物を有効成分として含有する癌の予防および改善用健康食品を提供する。
【００６２】
本発明のフサリセチンＡまたはＢの化合物は、乳癌細胞、肝癌細胞または骨髄性白血病細胞のような癌細胞に対して増殖阻害および転移阻害活性を有しているので、前記フサリセチンＡまたはＢの化合物を抗癌用健康食品の有効成分として有用に使用できる。
【００６３】
前記食品の種類には特別な制限はない。前記物質を添加することができる食品の例では、飲料、ガム、ビタミン複合剤または健康補助食品などがあり、通常的な意味での健康食品をすべて含有する。
【００６４】
本発明の飲料組成物は、通常の飲料のようにさまざまな香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。上述した天然炭水化物は、ブドウ糖、果糖のようなモノサッカライド、マルトース、スクロースのようなジサッカライド、およびデキストリン、シクロデキストリンのようなポリサッカライド、キシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。甘味料としては、タウマチン、ステビア抽出物のような天然甘味料や、サッカリン、アスパルテームのような合成甘味料などを使用することができる。前記天然炭水化物の割合は、本発明の健康食品１００ｍｌ当たり０．０１〜０．０４ｇ、好ましくは約０．０２〜０．０３ｇである。
【００６５】
その他、本発明の組成物は様々な営養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含むことができる。その他に本発明の組成物は、天然果物ジュース、果物ジュース飲料および野菜飲料製造のための果肉を含むことができる。このような成分は独立的にまたは組み合わせて使用することができる。このような添加剤の割合はそれほど重要ではないが、本発明の組成物１００重量部当り０．０１〜  ０．１重量部の範囲で選択することが一般的である。
【００６６】
また、本発明は、薬学的に有効な量の前記化合物またはその薬学的に許容可能な塩を癌にかかった個体に投与する工程を含む癌の治療方法を提供する。
【００６７】
また、本発明は、薬学的に有効な量の前記化合物またはその薬学的に許容可能な塩を個体に投与する工程を含む癌の予防方法を提供する。
【００６８】
本発明のフサリセチンＡまたはＢの化合物は、乳癌細胞、肝癌細胞または骨髄性白血病細胞のような癌細胞に対して増殖阻害および転移阻害活性を有しているので、前記フサリセチンＡまたはＢの化合物は癌の予防または治療に有用に使用できる。
【００６９】
また、本発明は、癌の予防および治療用薬学的組成物に使用するための、前記化合物またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【００７０】
また、本発明は、癌の予防および改善用健康食品に使用するための、前記化合物またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【００７１】
本発明のフサリセチンＡまたはＢの化合物は、乳癌細胞、肝癌細胞または骨髄性白血病細胞のような癌細胞に対して増殖阻害および転移阻害活性を有しているので、前記フサリセチンＡまたはＢの化合物を抗癌剤の製造に有効成分として有用に使用できる。
【００７２】
前記食品の種類には、特別な制限はない。前記物質を添加することができる食品の例では、飲料、ガム、ビタミン複合剤または健康補助食品などがあり、通常的な意味での健康食品をすべて含む。
【発明の効果】
【００７３】
本発明の新規なフサリセチン化合物は、多様な癌細胞に対する優れた増殖阻害および癌細胞の転移阻害活性を示すので、前記フサリセチン化合物を抗癌剤として有用に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】本発明で分離した化合物１および２（フサリセチンＡとＢ）のＨＰＬＣクロマトグラムを示した図である。
【図２】本発明で分離した化合物１（フサリセチンＡ）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、アセトン−ｄ６）を示した図である。
【図３】本発明で分離した化合物１（フサリセチンＡ）の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ、アセトン−ｄ６）を示した図である。
【図４】本発明で分離した化合物２（フサリセチンＢ）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、アセトン−ｄ６）を示した図である。
【図５】本発明で分離した化合物２（フサリセチンＢ）の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ、アセトン−ｄ６）を示した図である。
【図６】本発明で分離したフサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＮ０８０３２６の顕微鏡写真を示した図である。
【図７】本発明で分離した化合物１（フサリセチンＡ）の癌細胞増殖抑制能を示した図である。
【図８】本発明で分離した化合物２（フサリセチンＢ）の癌細胞増殖抑制能を示した図である。
【図９】本発明で分離した化合物１および２（フサリセチンＡとＢ）の癌細胞転移阻害能を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
以下、本発明を実施例、実験例および製造例によって詳しく説明する。
【００７６】
但し、下記の実施例、実験例および製造例は、本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例、実験例および製造例に限定されるのではない。
【００７７】
＜実施例１＞フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＮ０８０３２６菌株の分離
本菌株は、２００８年３月に大田市近隣の土壌試料から分離した。採集した土壌試料は採集後直ちに滅菌したプラスチック容器に入れて、実験に使用するまで冷凍保管した。土壌試料は、滅菌した蒸留水を用いて、１０倍に希釈した。希釈液１ｍｌをポテトデキストロースアガー培地に塗抹して、２８℃で５日間培養して現れた集落を純粋分離した。
【００７８】
＜実施例２＞菌株の同定および命名
本菌株の胞子に対する顕微鏡観察（図６）とｒＲＮＡ配列分析を行なった。前記配列分析の結果、菌株のＩＴＳ、２６Ｓおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡ配列は下記のように示された。
【００７９】
ＩＴＳ（５０６ｂｐ）
AGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCTATACGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCGCCCCGTAAAACGGGACGGCCCGCCCGAGGACCCTAAACTCTGTTTTTAGTGGAACTTCTGAGTAAAACAAACAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCAGCTTGGTGTTGGGACTCGCGGTAACCCGCGTTCCCCAAATCGATTGGCGGTCACGTCGAGCTTCCATAGCGTAGTAATAATACACCTCGTTACTGGTAATCGTCGCGGCCACGCCGTAAAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAA（配列番号１）
【００８０】
２６Ｓ（５６３ｂｐ）
AAACCAACAGGGATTGCCCTAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCTCTCGGGCCCGAGTTGTAATTTGTAGAGGATGCTTTTGATGCGGTGCCTTCCGAGTTCCCTGGAACGGGACGCCATAGAGGGTGAGAGCCCCGTCTGGTTGGATACCAAATCTCTGTAAAGCTCCTTCGACGAGTCGAGTAGTTTGGGAATGCTGCTCTAAATGGGAGGTATATGTCTTCTAAAGCTAAATACTGGCCAGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTTAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGTTTATGACCAGACTTGGGCTTGGATAATCATCTGGGGTTCTCCCCAGTGCACTTTTCCAGTCCAGGCCAGCATCAGTTTTCGCCGGGGGATAAAGGCTTCGGGAATGTGGCTCCCTCCGGGGAGTGTTATAGCCCGTTGCGTAATACCCTGGCGGGGACTGAGGTTCGCGCATCTGCAAGGATGCTGGCGTAATGGTCATCAACGAC（配列番号２）
【００８１】
１８Ｓ（１６７５ｂｐ）
CATTATACCGCGAAACTGCGAATGGCTCATTATATAAGTTATCGTTTATTTGATAGTACCTTACTACTTGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAATCCCGACTTCGGAAGGGATGTATTTATTAGATTAAAAACCAATGCCCTTCGGGGCTCACTGGTGATTCATGATAACTCCTCGAATCGCATGGCCTTGTGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTTCCCTATCAACTTTCGATGTTTGGGTATTGGCCAAACATGGTTGCAACGGGTAACGGAGGGTTAGGGCTCGACCCCGGAGAAGGAGCCTGAGAAACGGCTACTACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACAGGGCTCTTTTGGGTCTTGTAATTGGAATGAGTACAATTTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGTGGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGCCTGGCCGTCCGGTCCGCCTCACCGCGTGTACTGGCTCGGCCGGGCCTTTCCCTCTGTGGAACCCCATGCCCTTCACTGGGCGTGGCGGGGAAACAGGACTTTTACTGTGAAAAAATTAGAGTGCTCCAGGCAGGCCTATGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGTGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGACAGTCGGGGGCATCAGTATTCAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGACGGTGTTATTTTTTGACCCGTTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTGCTTGGGCTCCAGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGGGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACACAATGAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTTTGTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGCGATAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGCCCGTATTGCTTTGGCAGTACGCTGGCTTCTTAGAGGGACTATCGGCTCAAGCCGATGGAAGTTTGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGACGGAGCCAGCGAGTACTTCCTTGTCCGAAAGGTCCGGGTAATCTTGTTAAACTCCGTCGTGCTGGGGATAGAGCATTGCAATTATTGCTCTTCAACGAGGAATCCCTAGTAAGCGCAAGTCATCAGCTTGCGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTCAGTGAGGCGTCCGGACTGGCCCAGAGAGGTGGGCAACTACCACTCAGGGCCGGAAAGCTCTCCAAACTCGGTCATTAGAGAAG（配列番号３）
【００８２】
前記配列分析を通じて得られた塩基配列のＧｅｎＢａｎｋ検索の結果、フサリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）（ＤＱ９１６１５０）に９９％、フサリウム・インカルナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ）（ＥＵ１１１６５７）に９９％の相同性を示した。それで本菌株をフサリウム属と同定し、それをフサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＮ０８０３６２と命名し、２０１１年７月１８日に韓国生命工学研究院微生物資源センター（ＫＣＴＣ）に寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ１１９８５ＢＰ）。
【００８３】
＜実施例３＞フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＮ０８０３２６菌株の培養
本発明のカビ菌株を培養するために、一般的に微生物に用いる栄養源を含有する培地を準備した。カビ菌株の粗培養培地および産生培地としてポテトデキストロースアガー培地を使用した。
【００８４】
前記種培地１５０ｍｌを入れた５００ｍｌ容量の三角フラスコ二つを１２１℃で２０分間滅菌した後、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＮ０８０３２６菌株の保管プレートから白金で接種して３日間振盪培養して種培養にした。本培養のために、容量１４リットルの醗酵槽二つにそれぞれ生産培地８ｌを入れて滅菌した後、それぞれの醗酵槽に種培養液１５０ｍｌずつを接種して２８℃、撹拌速度１６５ｒｐｍ、空気注入量１０ｌ／分の条件で６日間培養した。
【００８５】
＜実施例４＞フサリウム属ＦＮ０８０３２６菌株から化合物の分離および精製
前記の実施例３で培養したフサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＮ０８０３２６菌株の培養液（１６ｌ）を同量のエチルアセテートで三度抽出して、得られた抽出液を減圧乾燥器を用いて減圧蒸発方法で濃縮した。この濃縮液をＯＤＳ  ＲＰ−１８に吸着させてＯＤＳ  ＲＰ−１８フラッシュカラムクロマトグラフィーを実施し、ここでメタノール／水（１：９−１０／０、ｖ／ｖ）を混合溶媒にして段階的にメタノール濃度を増加させながら溶出した。ここで、化合物１および２を含んだ活性分画は、８０％メタノールで溶出した。その活性分画を減圧濃縮した後、化合物１および２を含んだ分画を高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＲＳ  ｔｅｃｈ  Ｏｐｔｉｍａ  Ｐａｋ  Ｃ１８、長さ２５０ｍｍ、直径１０ｍｍ）を用いて溶媒に４８％アセトニトリル、溶出流速３ｍｌ／分の条件で溶出して、２０３および２５４ｎｍのＵＶ吸収ピークで検出された化合物１（保持時間４２分）および化合物２（保持時間４５分）をそれぞれ分離した（図１）。
【００８６】
＜実施例５＞フサリウム属ＦＮ０８０３２６菌株から化合物の構造分析
前記のカビフサリウム属ＦＮ０８０３２６の培養液から分離した化合物１および２は、ＥＳＩ質量分析機（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）を使用して分子量および分子式を決定した。また、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析を通じて１Ｈ  ＮＭＲ、１３Ｃ  ＮＭＲ、ＣＯＳＹ（Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、ＨＭＱＣ（１Ｈ−Ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ−Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）、ＨＭＢＣ（Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ−Ｂｏｎｄ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）、ＤＥＰＴ（Ｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎｌｅｓｓ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｂｙ  Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、ＮＯＥＳＹ（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｆｆｅｃｔ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）スペクトルを得て、化合物の分子構造を決定した（図２、図３、図４および図５）。
【００８７】
前記測定の結果、図２ないし図５にみられるように、前記フサリウム属ＦＮ０８０３２６菌株の培養液から分離した物質は、下記化学式のように６−６−５−５−５員環が順に連結された新規な骨格の化合物と同定し、それぞれフサリセチン（Ｆｕｓａｒｉｓｅｔｉｎ）ＡおよびＢ（化合物１、２）と名付けた。
【００８８】
フサリセチンＡおよびＢは、ＨＲＥＳＩＭＳ分析とＮＭＲ分析を通じて、分子量３８９、分子式Ｃ２２Ｈ３１ＮＯ５であることを確認し、同一な分子量と分子式を有する化合物であり、１Ｈ  ＮＭＲの結合定数値およびＮＯＥＳＹ結果から、化合物１および２は５番の炭素の立体配位が異なる異性体であることを確認した。
【００８９】
[化学式１]
【００９０】
フサリセチンＡ（Ｆｕｓａｒｉｓｅｔｉｎ  Ａ）（化合物１）：白粉末；
［α］Ｄ＋８４．６（ｃ０．２，ＭｅＯＨ）；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ（ｌｏｇ  ε）２０８（２．３４），２８２（２．３６）；ＩＲ（ｎｅａｔ）νｍａｘ３３２５，２９２５，１７３４，１６６６，１４５１，１４０２，１３７６，１１７２，１０７５ｃｍ−１；１Ｈ，１３Ｃ  ＮＭＲデータは下記の表１に示した；ＨＲＥＳＩＭＳ  ｍ／ｚ４１２．２０８５［Ｍ＋Ｎａ］＋（ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２２Ｈ３１ＮＯ５Ｎａ，４１２．２１００）。
【００９１】
[化学式２]
【００９２】
フサリセチンＢ（Ｆｕｓａｒｉｓｅｔｉｎ  Ｂ）（化合物２）：白粉末；
［α］Ｄ＋８４．９（ｃ０．２，ＭｅＯＨ）；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ（ｌｏｇ  ε）  ２０８（２．３４），２８１（３．１８）；ＩＲ（ｎｅａｔ）νｍａｘ３３２５，２９２５，１７３４，１６６６，１４５１，１４０２，１３７６，１１７２，１０７５ｃｍ−１；１Ｈ，１３Ｃ  ＮＭＲデータは下記の表１に示した；ＨＲＥＳＩＭＳ  ｍ／ｚ４１２．２０９４［Ｍ＋Ｎａ］＋（ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２２Ｈ３１ＮＯ５Ｎａ，４１２．２１００）。
【００９３】
【表１】
2013534216.tif 000007
【００９４】
ａ  １００ＭＨｚで測定。ｂ  ４００ＭＨｚで測定。
【００９５】
＜実験例１＞本発明のフサリセチン化合物の癌細胞増殖阻害活性測定
本発明で導出した化合物１および２の癌細胞増殖阻害活性を調べるため、次の実験を行なった。
【００９６】
ヒト乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、５．０×１０３  ｃｅｌｌｓ  ｐｅｒ  ｗｅｌｌ）、ラット線維芽細胞株（３Ｙ１細胞、５．０×１０３  ｃｅｌｌｓ  ｐｅｒ  ｗｅｌｌ）、ヒト肝癌細胞株（Ｈｅｐ３Ｂ、５．０×１０３  ｃｅｌｌｓ  ｐｅｒ  ｗｅｌｌ）をＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅａｇｌｅｓ  ｍｅｄｉｕｍ，１０％牛胎児血清含有）でそれぞれ培養した。また、ヒト慢性骨髄性白血病細胞株（Ｋ５６２細胞、３．０×１０４  ｃｅｌｌｓ  ｐｅｒ  ｗｅｌｌ）とヒト前骨髄白血病細胞株（ＨＬ−６０細胞、１．０×１０５  ｃｅｌｌｓ  ｐｅｒ  ｗｅｌｌ）をＲＰＭＩ１６４０（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  １６４０培地、１０％牛胎児血清含有）でそれぞれ培養した。それぞれ培養された細胞株に化合物１および２を１００μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ添加して３７℃、４８時間、５％ＣＯ２培養器で培養した後、高感度水溶性ホルマザンを生成するＷＳＴ−８試薬（２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，モノナトリウム塩）を添加して２４時間培養した後、４５０ｎｍの吸光度で測定して細胞生存率を算出した。
【００９７】
その結果、図７および図８にみられるように、本発明で導出した化合物１のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、３Ｙ１細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、Ｋ５６２細胞およびＨＬ−６０細胞株に対する、５０％増殖阻害濃度であるＩＣ５０値は、それぞれ６９．５μｇ／ｍｌ、６７．５μｇ／ｍｌ、３４．７μｇ／ｍｌ、６１．３μｇ／ｍｌおよび５７．７μｇ／ｍｌの濃度で示された。また、化合物２はそれぞれの細胞株に対して、７６．５μｇ／ｍｌ、６２．２μｇ／ｍｌ、２７．２μｇ／ｍｌ、４９．３μｇ／ｍｌおよび２９．４μｇ／ｍｌの濃度を示した（図７および図８）。したがって、本発明の化合物１および２は、癌細胞増殖阻害活性を有することが理解される。
【００９８】
＜実験例２＞本発明のフサリセチン化合物の癌細胞転移阻害活性測定
癌細胞転移阻害活性実験は、トランスウェルチャンバー（ＢｉｏＣｏａｔ（商標）  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｃｈａｍｂｅｒ，有功サイズ８μｍ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて実施した。ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）は、チャンバー上端に１．０×１０５  ｃｅｌｌｓ  ｐｅｒ  ｗｅｌｌの濃度で塗布した。使用した培地は、ＤＭＥＭ培地（無血清）を使用し、細胞を塗布して３０分後にチャンバー上端に化合物１および２を３０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ添加した。３０分経過後、チャンバー下端に１０％濃度で牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加して、３７℃、２４時間５％ＣＯ２培養器で培養した。２４時間経過した時点でチャンバー下端部の１０％濃度牛胎児血清に誘導されて多孔膜を通じて転移した細胞を１００％ＭｅＯＨで固定した後、ライト染色試液で染色した。染色後、顕微鏡を用いて転移した細胞数を計算した。
【００９９】
その結果、図９でヒト乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）の１００％転移阻害濃度を示すＥＤ１００は、それぞれ１０μｇ／ｍｌの濃度で示された（図９）。この結果を通じて、化合物１および２は、１０％濃度の牛胎児血清（ＦＢＳ）で誘導された細胞の転移を阻害することからして、癌細胞転移に関与する因子群、例えばインテグリン（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ）、マトリックスメタロプロテアーゼ（Ｍｅｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ；ＭＮＰｓ）、ヘパラナーゼ（Ｈｅｐａｒａｎａｓｅ）、繊維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ；ＦＧＦ）などを阻害することが予測される。したがって、本発明の化合物１および２は癌細胞に対する癌転移抑制活性を有することが分かる。
【０１００】
＜製剤例１＞散剤の製造
フサリセチンＡ                                            ２０ｍｇ
乳糖                                                    １００ｍｇ
タルク                                                    １０ｍｇ
前記の成分を混合して気密包装に充填して散剤を製造する。
【０１０１】
＜製剤例２＞錠剤の製造
フサリセチンＡ                                            １０ｍｇ
とうもろこし澱粉                                        １００ｍｇ
乳糖                                                    １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                                    ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法にしたがって打錠して錠剤を製造する。
【０１０２】
＜製剤例３＞カプセル剤の製造
フサリセチンＡ                                            １０ｍｇ
結晶性セルロース                                            ３ｍｇ
ラクトース                                            １４．８ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                                ０．２ｍｇ
通常のカプセル剤の製造方法によって前記の成分を混合して、ゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造する。
【０１０３】
＜製剤例４＞注射剤の製造
フサリセチンＢ                                           １０ｍｇ
マンニトール                                           １８０ｍｇ
注射用滅菌蒸留水                                     ２９７４ｍｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４，１２Ｈ２Ｏ                                  ２６ｍｇ
通常の注射剤の製造方法によって、１アンプル当り（２ｍｌ）前記の成分含量で製造する。
【０１０４】
＜製剤例５＞液剤の製造
フサリセチンＢ                                          ２０ｍｇ
異性化糖                                                  １０ｇ
マンニトール                                                ５ｇ
精製水適量
通常の液剤の製造方法によって精製水にそれぞれの成分を加えて溶解させてレモン香を適量加えた後、前記の成分を混合した後、精製水を加えて全体を１００ｍｌに調節した後、茶色ビンに充填して滅菌して液剤を製造する。
【０１０５】
＜製剤例６＞健康食品の製造
フサリセチンＡ                                         １０００ｍｇ
ビタミン混合物                                                 適量
ビタミンＡアセテート                                       ７０μｇ
ビタミンＥ                                               １．０ｍｇ
ビタミンＢ１                                           ０．１３ｍｇ
ビタミンＢ２                                           ０．１５ｍｇ
ビタミンＢ６                                             ０．５ｍｇ
ビタミンＢ１２                                           ０．２μｇ
ビタミンＣ                                                 １０ｍｇ
ビオチン                                                   １０μｇ
ニコチン酸アミド                                         １．７ｍｇ
葉酸                                                       ５０μｇ
パントテン酸カルシウム                                   ０．５ｍｇ
ミネラル混合物                                                 適量
硫酸第１鉄                                             １．７５ｍｇ
酸化亜鉛                                               ０．８２ｍｇ
炭酸マグネシウム                                       ２５．３ｍｇ
第１リン酸カリウム                                         １５ｍｇ
第２リン酸カルシウム                                       ５５ｍｇ
クエン酸カリウム                                           ９０ｍｇ
炭酸カルシウム                                           １００ｍｇ
塩化マグネシウム                                       ２４．８ｍｇ
前記のビタミンおよびミネラルの混合物の組成比は、比較的健康食品に相応しい成分を好ましい実施例として混合組成したが、その配合比を任意に変形して実施しても構わず、通常の健康食品製造方法によって前記の成分を混合した後、顆粒を製造して、通常の方法によって健康食品組成物製造に使用することができる。
【０１０６】
＜製剤例７＞健康飲料の製造
フサリセチンＢ                                        １０００ｍｇ
クエン酸                                              １０００ｍｇ
オリゴ糖                                                  １００ｇ
梅濃縮液                                                      ２ｇ
タウリン                                                      １ｇ
精製水                                              全体９００ｍｌ
通常の健康飲料の製造方法によって前記の成分を混合した後、約１時間８５℃で撹拌加熱した後、作られた溶液をろ過して滅菌された２ｌの容器に入れて密封滅菌した後、冷蔵保管した後、本発明の健康飲料組成物の製造に使用する。
【０１０７】
前記組成比は、比較的に嗜好飲料に相応しい成分を好ましい実施例として混合組成したが、需要者層、需要国、使用用途など、地域的、民族的嗜好度によってその配合比を任意に変形して実施しても構わない。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
前記のとおり、本発明を通じてフサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＮ０８０３２６菌株を用いて本発明の新規なフサリセチン化合物を大量産生することができ、本発明の新規なフサリセチン化合物を用いて、抗癌剤または抗癌用健康食品を開発するために使用することができる。
【図１】
2013534216.tif 000011
【図２】
2013534216.tif 000012
【図３】
2013534216.tif 000013
【図４】
2013534216.tif 000014
【図５】
2013534216.tif 000015
【図６】
2013534216.tif 000016
【図７】
2013534216.tif 000017
【図８】
2013534216.tif 000018
【図９】
2013534216.tif 000019
【配列表】
2013534216000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年3月7日(2013.3.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
前記課題を解決するため、本発明は、下記化学式３で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
【化１】
2013534216.tif 000020
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
本発明は、下記の化学式３で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
【化２】
2013534216.tif 000021
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
前記の化学式３で表される化合物は、下記の化学式２で表されるフサリセチンＡ化合物であることが好ましいが、それに限定されない。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
【化３】
2013534216.tif 000022
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
前記の化学式３で表される化合物は、下記の化学式２で表されるフサリセチンＢ化合物であることが好ましいが、それに限定されない。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
【化４】
2013534216.tif 000023
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
本発明は、前記の化学式３で表されるフサリセチン化合物またはその薬学的に許容される塩だけではなく、それから製造され得る可能な溶媒化物、水和物をすべて含有する。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
本発明の化学式３のフサリセチン化合物は、薬学的に許容可能な塩の形態で使用することができ、塩としては薬学的に許容可能な遊離酸（ｆｒｅｅ  ａｃｉｄ）によって形成された酸付加塩が有用である。酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、ブロム化水素酸、ヨード化水素酸、亜硝酸または亜リン酸のような無機酸類と脂肪族モノおよびジカルボキシレート、フェニル置換されたアルカノエート、ヒドロキシアルカノエートおよびアルカンジオエート、芳香族酸類、脂肪族および芳香族スルホン酸類のような無毒性有機酸から得られる。このような薬学的に無毒な塩類では、スルファート、ピロスルファート、バイスルファート、サルファイト、バイサルファイト、ニトラート、ホスファート、モノヒドロゲンホスファート、ジヒドロゲンホスファート、メタホスファート、ピロホスファートクロライド、ブロマイド、アイオダイド、フルオライド、アセタート、プロピオネート、デカノエート、カプリレート、アクリレート、ホルマート、イソブチレート、カプレート、ヘプタノエート、プロピオネート、オキサレート、マロネート、サクシネート、スベラート、セバケート、フマレート、マリエート、ブチン−１，４−ジオエート、ヘキサン−１，６−ジオエート、ベンゾエート、クロロベンゾエート、メチルベンゾエート、ジニトロベンゾエート、ヒドロキシベンゾエート、メトキシベンゾエート、フタレート、テレフタレート、ベンゼンスルホナート、トルエンスルホナート、クロロベンゼンスルホナート、キシレンスルホナート、フェニルアセテート、フェニルプロピオネート、フェニルブチレート、シトラート、ラクタート、β−ヒドロキシブチレート、グリコラート、マレート、タートレート、メタンスルホナート、プロパンスルホナート、ナフタリン−１−スルホナート、ナフタリン−２−スルホナートまたはマンデレートを含有する。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
同量の化学式３のフサリセチン化合物および水中の酸またはアルコールを加熱して、続いて、その混合物を蒸発させて乾燥させるか、または析出した塩を吸入ろ過して製造することもできる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の化学式３で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩：
【化１】
2013534216.tif 000024
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、アセチル、ベンジル、ハロゲン原子、水酸基またはカルボキシル基を有することができ、すべての非対称炭素での異性体を含有する。
【請求項２】
請求項１において、下記の化学式１で表されるフサリセチン（ｆｕｓａｒｉｓｅｔｉｎ）Ａ化合物または薬学的に許容可能な塩：
【化２】
2013534216.tif 000025
【請求項３】
請求項１において、下記の化学式２で表されるフサリセチン（ｆｕｓａｒｉｓｅｔｉｎ）Ｂ化合物または薬学的に許容可能な塩：
【化３】
2013534216.tif 000026
【請求項４】
前記フサリセチン化合物が、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＮ０８０３２６から分離されたことを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する癌の予防および治療用薬学的組成物。
【請求項６】
前記癌が、乳癌、肝癌または骨髄性白血病であることを特徴とする、請求項５に記載の癌の予防および治療用薬学的組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する、癌の予防および改善用健康食品。
【請求項８】
前記癌が、乳癌、肝癌または骨髄性白血病であることを特徴とする、請求項７に記載の癌の予防および改善用健康食品。
【請求項９】
１）フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＮ０８０３２６菌株を培養する工程、および
２）前記１）工程で得られた菌株培養物からフサリセチン化合物を分離する工程を含む、請求項１に記載のフサリセチン化合物の産生方法。
【請求項１０】
受託番号ＫＣＴＣ１１９８５ＢＰで寄託された、請求項１に記載の化合物を生産するフサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＮ０８０３２６菌株。
【国際調査報告】
2013534216.tif 000027
2013534216.tif 000028
2013534216.tif 000029
2013534216.tif 000030
2013534216.tif 000031
2013534216.tif 000032