(57)【要約】  第１の分子種と第２の分子種との複合体形成相互作用の結合化学量論を求める方法を提供する。（ｉ）一定の初期活性濃度の第１の分子を有する溶液を、変動活性濃度の第２の分子の溶液で滴定し、第２の分子の遊離活性濃度を測定するか、又は（ｉｉ）一定の初期濃度の第１の分子及び第２の分子を有する溶液をインキュベートし、両方の分子の遊離活性濃度を測定する。結合化学量論は、第１の場合において、両方の分子の初期濃度値及び飽和における第２の分子の遊離濃度値（複数も含む）から決定でき、第２の場合において、両方の分子の初期濃度値及び両方の分子の遊離濃度値から決定できる。活性濃度の測定は典型的に、少なくとも活性初期濃度の決定のために検量線を使用しない分析的フォーマットを使用して相互作用分析センサにより実施される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の分子種と第２の分子種との複合体形成相互作用の結合化学量論を求める方法であって、
ａ１）所定の初期活性濃度の第１の分子種と第２の分子種を含む溶液を調製する段階であって、第２の分子種の初期活性濃度が、第１の分子種に対する第２の分子種の結合の飽和を生じさせるのに十分であるように選択される段階と、
ａ２）第２の分子種の遊離活性濃度を決定する段階と、
ａ３）（第２の分子種の初期活性濃度と遊離活性濃度との差）／（第１の分子種の初期活性濃度）の比を決定する段階と、
ａ４）上記比から、相互作用の結合化学量論を決定する段階、
又は
ｂ１）それぞれ所定の初期活性濃度を有する第１の分子種及び第２の分子種の溶液を調製する段階と、
ｂ２）第１の分子種の遊離活性濃度を決定する段階と、
ｂ３）第２の分子種の遊離活性濃度を決定する段階と、
ｂ４）（第２の分子種の初期活性濃度と遊離活性濃度との差）／（第１の分子種の初期活性濃度と遊離活性濃度との差）の比を決定する段階と、
ｂ５）上記比から、相互作用の結合化学量論を決定する段階と
を含む方法。
【請求項２】
段階ａ１）〜ａ３）が、各溶液が一定所定濃度の第１の分子種と濃度を変化させた第２の分子種を含む複数の溶液を調製し、各溶液で第２の分子種の遊離活性濃度を決定し、第２の分子種の初期活性濃度と遊離活性濃度との差を各溶液について計算し、各々の差をそれぞれの初期活性濃度と関連付けて、その差での飽和レベルを求め、段階ａ４）で用いることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
分子種の活性濃度を相互作用分析センサを用いて決定する、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
相互作用分析センサが、活性濃度を決定すべき分子種に対する特異的結合パートナーを担持するセンサ表面を含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
少なくとも所定の活性濃度の決定が、決定すべき分子を含有する溶液を、少なくとも部分的に物質移動制限された条件下に変動流速でセンサ表面と接触させることを含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
活性濃度の決定を校正基準を使用せずに実施する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
相互作用分析センサがバイオセンサである、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
バイオセンサが質量検知バイオセンサ、好ましくはエバネセント波検知、特に表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づくバイオセンサである、請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、受容体とリガンドのような２つの結合パートナー間の結合化学量論を求める方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２つの分子が相互作用する場合に関与する結合部位の数、すなわち結合化学量論は、分子機能に関連しているので、基本的に興味を持たれることが多い。結合化学量論は、例えば形成される複合体の分子量の決定により直接測定することができるし、或いは相互作用分子又は結合パートナーの両方の濃度が既知であれば、結合化学量論を間接的方法で測定することができる。
【０００３】
結合化学量論を決定する従来技術の間接的方法では、通例、ＵＶ又はＮＩＲ吸光分析のような分光光度法、或いは分子の全濃度を決定する蛍光式検出が用いられる。
【０００４】
米国特許第６０２５１４２号には、１００μｍの濃度まで一定濃度のｕ−ＰＡＲをＡＮＳで滴定することによって、フルオロフォアである８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）のウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）への結合の化学量論及び親和性を求めることが開示されている。添加された全てのＡＮＳが結合曲線の初期部分において結合することを確実にするのに十分に高いタンパク濃度の滴定により、全てがｕ−ＰＡＲと結合した場合における、モル溶液の理論的蛍光が計算された。生成されたデータはＳｃａｔｃｈａｒｄの方法で解析された。
【０００５】
米国特許出願公開第２００５／００３７３７７号には、蛍光技術を用いて結合因子とプローブとの結合複合体の結合親和性及び／又は化学量論を求める方法が開示されている。その方法は、（ａ）プローブをフルオロフォアで標識し、（ｂ）標識プローブを、その標識プローブと結合して結合複合体を形成できる因子又は因子の群とインキュベートし、（ｃ）異なる画分中で結合複合体と遊離プローブとを分離し、（ｄ）結合複合体が遊離プローブとは異なる蛍光パターンを生成する条件下で段階（ｃ）からの各画分を蛍光偏光測定に付して、結合複合体を検出できるようにし、（ｅ）プローブと結合因子との結合親和性及び／又は化学量論を求めることを含んでいる。典型的に、結合複合体形成は、蛍光偏光検出によりモニターされる。
【０００６】
Zhi-Xin Wang, et al., Anal. Biochem. 206 (1992): 376・381には、分光法により検出可能なタンパク−リガンド複合体の解離定数及び結合化学量論を決定する滴定プロトコルが開示されている。その方法では、一定濃度のタンパク（又はリガンド）を、ストックリガンド（又はタンパク）溶液の体積を増加させることにより滴定し、各々の滴定剤の添加後、スペクトル信号の変化を記録する。タンパクとリガンドとの間の相互作用に関する信号は最初に増加し、最大値に到達し、次いで希釈効果に起因して減少し始める。最大信号変化を達成するのに必要とされる滴定剤の体積を利用して、その文献で開発されている理論的関係に従ってタンパク−リガンド複合体の解離定数及び結合化学量論を計算する。具体的には、アビジンと、発色団のビオチンアナログである、２−（４’−ヒドロキシアゾベンゼン）安息香酸との相互作用が、５００ｎｍにおけるそれらの相互作用の吸収信号に従って研究された。
【０００７】
しかし、これらの方法は、活性分子と不活性分子とを区別していない。活性分子は研究された相互作用において結合の一因となるだけなので、従って全分子濃度は、「活性」分子の濃度と実質的に異なり得る分子の全濃度の推量を与えるだけであろう。容易に理解されるように、これは間接的方法で結合化学量論を決定する場合の実質的な問題点であり得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第６０２５１４２号
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／００３７３７７号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Zhi-Xin Wang, et al., Anal. Biochem. 206 (1992): 376・381
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、従来技術の方法の欠点を克服する方法を提供し、相当量の不活性反応体分子を含有し得る分子溶液の場合でさえも間接的方法で結合化学量論の正確な決定を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明では、全分子濃度ではなく活性分子濃度の決定に基づいて結合化学量論を決定する。
【００１２】
結合化学量論を決定する本発明の方法は独立請求項１に定義される。
【００１３】
１つの態様では、第１の分子種と第２の分子種との複合体形成相互作用の結合化学量論を求める方法は、
ａ）所定の初期活性濃度の第１の分子種と第２の分子種を含む溶液を調製する段階であって、第２の分子種の初期活性濃度が、第１の分子種に対する第２の分子種の結合の飽和を生じさせるのに十分であるように選択される段階と、
ｂ）第２の分子種の遊離活性濃度を決定する段階と、
ｃ）（第２の分子種の初期活性濃度と遊離活性濃度との差）／（第１の分子種の初期活性濃度）の比又はその逆数を決定する段階と、
ｄ）上記比から、相互作用の結合化学量論を決定する
段階を含む。
【００１４】
この態様の方法の好ましい実施形態では、第１の分子種に対する第２の分子種の結合飽和が存在することは、第２の分子種の活性濃度を変化させながら一定の活性濃度の第１の分子種を滴定することによって担保される。上述の段階ａ）〜ｃ）は、複数の溶液を用意することによって実施してもよく、各溶液は一定所定濃度の第１の分子種と濃度を変化させた第２の分子種とを含む。各溶液で第２の分子種の遊離活性濃度を決定し、第２の分子種の初期活性濃度と遊離活性濃度との差を計算する。算出した差と初期活性濃度との関連付け（例えばプロッティング）によって、その差（第２の分子種の初期活性濃度と遊離活性濃度との差）での飽和レベルを決定でき、段階ｄ）で用いることができる。
【００１５】
別の態様では、この方法は、
ａ）それぞれ所定の初期活性濃度を有する第１の分子種及び第２の分子種の溶液を調製する段階と、
ｂ）第１の分子種の遊離活性濃度を決定する段階と、
ｃ）第２の分子種の遊離活性濃度を決定する段階と、
ｄ）（第２の分子種の初期活性濃度と遊離活性濃度との差）／（第１の分子種の初期活性濃度と遊離活性濃度との差）の比又はその逆数を決定する段階と、
ｅ）上記比から、相互作用の結合化学量論を決定する段階と
を含む。
【００１６】
活性濃度を決定すべき分子種に対する特異的結合パートナーを担持するセンサ表面を典型的に含む、相互作用分析センサを用いて、好ましくは活性濃度の決定を実施する。センサ表面を分子種と接触させた後、表面における会合／解離過程をモニターする。
【００１７】
好ましくは、少なくとも初期活性濃度の決定は、少なくとも部分的に物質移動制限された条件下で、溶液を変動流速でセンサ表面と接触させることを含むので、校正基準の使用を必要としない。
【００１８】
本発明の追加の好ましい実施形態を従属請求項に記載する。
【００１９】
本発明のより完全な理解、並びに本発明の更なる特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び添付の図面を参照することによって得られるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の方法の実施形態に従ったシミュレーションした手順についての（Ｂtot−Ｂfree）対Ｂtotのプロットを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本明細書で用いる技術用語及び科学用語は、別途定義しない限り、本発明の属する技術分野の技術者によって通常理解されている意味をもつ。本明細書において単数形で記載したものであっても、複数の場合も含む。
【００２２】
上述のように、本発明は、分子間で複合体が形成されるような２つの相互作用分子、例えば受容体とリガンドとの間の結合化学量論の決定に関する。手短に述べれば、この方法は、相互作用分子の初期活性濃度及び複合体形成が開始した後の１つ又は両方の分子の遊離（複合体化していない）分子の活性濃度を決定することに基づき、そして得られたデータから相互作用の結合化学量論を決定することに基づく。
【００２３】
相互作用分子対の更なる例としては抗体／抗原が挙げられる。
【００２４】
一実施形態では、相互作用して複合体ＡＢを形成できる２種の分子ＡとＢとの間の結合化学量論の決定は以下の段階を含む。
１）変動初期活性濃度の他の結合パートナー（Ｂtot）で滴定される一定初期活性濃度の１つの結合パートナー（Ａtot）を有する溶液中での分子ＡとＢのインキュベーション、
２）各混合物中の遊離結合パートナーＢ（Ｂfree）の活性濃度の決定、
３）（Ｂtot−Ｂfree）対Ｂtotのプロットから（Ｂtot−Ｂfree）についての飽和値（複数も含む）の識別、ここで、（Ｂtot−Ｂfree）の定義はＡとの複合体におけるＢ分子の濃度である、
４）（Ｂtot−Ｂfree）飽和／Ａtotの式からＢに対するＡの結合部位の数の決定。
【００２５】
勿論、上記で概説した手順において、分子Ａ及びＢは交換可能である。即ち、代わりに、分子Ｂを一定活性濃度にして、変動活性濃度の分子Ａで滴定してもよい。
【００２６】
別の実施形態では、Ａfree及びＢfreeが任意の相互作用混合物について両方正確に決定できると仮定すると、溶液中の一定濃度の分子Ａ及びＢをインキュベートした場合、化学量論は形成した複合体における分子の比率を調べることにより、即ち、（Ｂtot−Ｂfree）／（Ａtot−Ａfree）の比率を計算することによって決定できる。これは、これらの条件についての複合体化学量論の「スナップショット」を提供するが、これらの条件は分子Ａにおける異なる親和性の部位が同じ時間に存在しなくてもよいので、段階的決定とは異なっていてもよい。適宜、より正確な化学量論値を得るために分子Ａ及びＢの２つ以上の異なる混合物で測定を実施してもよい。
【００２７】
分子Ａ及びＢの活性濃度の決定は好ましくは相互作用分析センサ、典型的にはバイオセンサを用いて実施する。このようなバイオセンサに基づいた活性濃度の決定は、例えば、KKarlsson, R., et al. (1993) J. Immunol. Methods 166(1):75-84、Richalet-Secordel, P. M., et al. (1997) Anal Biochem. 249(2):165-73、及びSigmundsson K., et al. (2002) Biochemistry 41(26):8263-76に記載されている。これらの開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【００２８】
相互作用分析センサは典型的にはセンサ表面（複数も含む）を備え、そのセンサ表面は、その上に固定化される、活性濃度を決定する分子についての特異的結合パートナーを有する。
【００２９】
センサ技術を用いる活性濃度の決定の開発において、被分析物濃度は、校正基準に対する基準物を用いずに決定できる。通常、検量線のいらない濃度分析（Calibration-Free Concentration Analysis）（ＣＦＣＡ）と称されている、この方法は、結合の観測する速度がセンサ表面への被分析物分子の移動により部分的又は完全に制限される条件、即ち拡散により部分的又は完全に制御される条件下で、変動流速で、センサ表面に固定化した標的物に結合する被分析物の測定に依存する。以下により詳細にＣＦＣＡを説明する。しかし、まず、バイオセンサの概念を簡潔に説明する。
【００３０】
バイオセンサは典型的に、固定化層の質量、屈折率又は厚さ等のセンサ表面の特性の変化を検出する、無標識技術に基づく。本発明の目的のための典型的なバイオセンサは、センサ表面における質量検出に基づき、特に光学的方法及び圧電又は音波法を含む。光学的検出法に基づいた代表的なセンサとしては、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサを含むエバネセント波に基づいたセンサ、漏れ全反射（ＦＴＲ）センサ、及び例えば、反射干渉分光法（ＲＩｆＳ）センサを含む導波路センサを含む、反射光の方法に基づいたセンサ等の物質表面濃度を検出するセンサが挙げられる。圧電及び音波センサとしては、表面音響波（ＳＡＷ）及び水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）センサが挙げられる。
【００３１】
ＳＰＲ及び他の検出技術に基づいたバイオセンサシステムは現在市販されている。例示的なこのようなＳＰＲ−バイオセンサとしては、フロースルーセル式のＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ））並びに試料中の分子と、センサ表面（複数も含む）上に固定化した分子構造との間の相互作用を検出する表面プラズモン共鳴を使用するＰｒｏｔｅＯｎ（商標）ＸＰＲシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国カリフォルニア州ハーキュリーズ））が挙げられる。試料はセンサ表面上を通過するので、結合の進行は、相互作用が起こる速度を直接反映する。通常、試料を注入した後に緩衝液が流れ、その間に検出器応答が表面上の複合体の解離速度を反映する。システムからの典型的な出力は、会合段階部分及び解離段階部分を含む、時間と共に分子間相互作用の進行を記載しているグラフ又は曲線である。通常コンピュータースクリーン上に表示される、この結合曲線はしばしば「センサグラム」と称される。
【００３２】
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムを用いると、このように、標識を使用せず、並びにしばしば、試料中の特定分子、又は被分析物の存在及び濃度だけでなく、分子間相互作用における会合（結合）及び解離についての運動速度定数、同様に表面相互作用についての親和性を含む、追加の相互作用パラメーターに関連する物質を精製せずにリアルタイムで決定することが可能となる。
【００３３】
以下において、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム型のＳＰＲセンサに関して、例示のみのために、限定せずに、本発明をかなりの程度まで説明する。
【００３４】
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム、及び類似のセンサシステムは、被分析物の全濃度は除外して活性被分析物濃度を測定する。「活性」という用語に関して、それは測定する活性の種類を定義するセンサ表面上でのリガンドの選択である。例えば、検量線を用いる標準的なタンパク濃度分析を使用できるのに対して、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）（及び類似のセンサシステム）は、しばしば、検量線を必要としない濃度分析（ＣＦＣＡ）と称されている、検量線を必要としない方法でタンパク（及び例えば他の高分子）濃度の評価を可能にする。
【００３５】
この方法は、部分的又は全物質移動の条件下で変動流速で表面上に固定化した標的物（リガンド）に対する被分析物の結合速度の変化に依存し、拡散係数が既知であるか、又は対象の分子の分子量から推定されているならば、上述のように、既知の濃度の標準物を必要とせずに行われる。このような検量線を必要としない測定のより詳細な説明に関しては、例えば、上述のSigmundsson K., et al. (2002) Biochemistry 41(26):8263-8276を参照することができる。
【００３６】
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）機器、又は類似の機器において、試料はマイクロフローシステムに注入され、層流においてセンサ表面に移動する。拡散律速移動課程によって分子はバルク溶液からセンサ表面に到達する。被分析物分子の濃度に加えて、移動に影響を及ぼす要因としては、拡散係数、フローセル容量及び流速が挙げられる。観測される結合が移動律速であるか、又は反応律速であるかに関わらず、移動速度と結合速度との間の平衡が決定される。
【００３７】
ＣＦＣＡを成功させるためには、観測される結合速度は、移動により少なくとも部分的に制限されなければならない。少なくとも２つの異なる流速で結合実験を実施し、データを、過程を記述するモデル、例えば２分画モデルにフィッティングすることによって濃度が得られる（Myszka, D. G., et al. (1998) Biophys. J. 75, 583-594、及びSchank-Retzlaff, M. L. and Sligar, S. G. (2000) Anal. Chem. 72, 4212-4220）。Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムに関する曲線フィッティングのより包括的な説明に関しては、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（商標）ソフトウェアハンドブック（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ））を参照することができる。
【００３８】
精密フローシステムにおいて表面に付着したリガンドに対する被分析物の結合は、２つの過程である、被分析物の表面への移動及び固定化したリガンドとの分子間相互作用の総和により表される。分子間相互作用は速度定数ｋａ及びｋｄにより説明されるのに対して、表面まで及び表面からの被分析物の移動は、物質移動定数ｋｍ及びｋ−ｍ（ｋｔ及びｋ−ｔとも称される）により説明される。移動現象は本質的に拡散律速課程、所謂ｋｍ＝ｋ−ｍであるため、対称である。
【００３９】
このように、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム（又は類似物）を用いてタンパクの活性濃度を決定するために、タンパク溶液は、固定化した相互作用パートナーを有する表面上に少なくとも２回（異なる流速で）注入される。このような実験から得たセンサグラムの結合段階は、活性濃度がフィッティングパラメーターである、物質移動項を有する二分子間相互作用モデルにフィッティングされる。フィッティングは好ましくは全体的である。即ち、相互作用モデルは複数の結合曲線（センサグラム）に同時にフィッティングされる。このモデルにおいて、物質移動係数の値は上記のように一定として導入され、フローセルの容量、タンパクの拡散係数及び使用した流速から計算できる。
【００４０】
簡易化した形態において、結合したタンパクにより与えられるセンサ表面における反応増加ｄＲ／ｄｔは、物質移動定数ｋｔ及び活性濃度に比例する。すなわち、
ｄＲ／ｄｔ＝ｋｔ×（活性濃度）  （２）
ｋｔは、定数×Ｍｗ×Ｄ2/3（ここで、Ｍｗはタンパクの分子量であり、Ｄはその拡散係数である）と書き換えることができ、次式に示す通りとなる。
【００４１】
ｄＲ／ｄｔ＝定数×ＭＷ×Ｄ2/3×（活性濃度）  （３）
拡散係数Ｄは、分子のサイズ及び形状の関数及び問題になっている溶媒の粘度により与えられる摩擦抵抗である。球形分子に関して、拡散係数は半径に反比例するので、分子量の立方根に比例する。しかし、タンパク等の非常に大きな溶質分子に関して、拡散係数は比較的分子量に関係がない。
【００４２】
ここで、再び本発明に戻ると、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）型センサ機器を用いて分子Ａ及びＢの活性濃度を測定するために、それぞれの分子に対する特異的結合パートナーが、センサ機器のセンサ表面上に固定化される。
【００４３】
滴定を含む、上記の最初に述べた態様の方法を実施するために、分子Ａ及びＢを含有するそれぞれのストック溶液を調製し、分子Ａ及びＢの活性濃度を、ＣＦＣＡ並びに分子Ａ及びＢのそれぞれに対する固定化結合パートナーを有するセンサ表面を用いて決定する。次いで、多くの溶液混合物を、一定濃度の分子Ａ及び変動濃度の分子Ｂを含有するストック溶液から調製する。分子Ａ及びＢの初期濃度（それぞれＡtot及びＢtot）、即ち相互作用が起こる前の濃度は、使用するストック溶液の体積から計算できる。インキュベーション後、異なる混合物中の分子Ｂの活性濃度を、分子Ｂに対する固定化結合パートナーを有するセンサ表面（複数も含む）及び（ｉ）ＣＦＣＡ、又は（ｉｉ）標準物若しくは検量線（Ｂのストック溶液についてＣＦＣＡにより決定した活性濃度を用いて調製した）のいずれかを用いて決定する。濃度決定の結果に基づいて、次いで分子間相互作用の結合化学量論をさらに上記のように決定できる。
【００４４】
上記のように変動活性濃度の他の結合パートナーで一定の活性濃度の１つの結合パートナーを滴定する場合、バイオセンサ機器へ注入する前に異なる溶液混合物を調製するか、又は適宜、既知の活性濃度のそれぞれの反応体の溶液が、例えば、国際公開第２００８／０３３０７３号（その全開示は本明細書に参照により組み込まれている）に記載されているように、機器内で所定の割合で混合するためにバイオセンサ機器に注入されてもよい。
【００４５】
インキュベーション後の分子Ａ及びＢの遊離活性濃度の決定を含む、上述の他の態様の方法を類似の方法で実施できる。
【００４６】
以下の実施例において、本発明の方法に係る結合化学量論の決定についての手順のシミュレーションを記載する。
【実施例】
【００４７】
２種の分子ＡとＢとの間の結合相互作用（複合体ＡＢを形成する）についての化学量論のシミュレーションを以下の表１に提示する。入力データは以下の通りであった。
【００４８】
Ａの全濃度：５．００Ｅ−０７
Ｂの全濃度：１．００Ｅ−０９
親和性：１．００Ｅ−０６
【００４９】
【表１】
2013524211.tif 000002
上記のシミュレーションデータからの値を用いて、Ｂtot−ＢfreeをＢtotに対してプロットし、得られたグラフを図１に示す。容易に理解されるように、未知の場合において（即ちＫＤ及び結合機構が未知である）、このようなプロットは結合化学量論（例示した場合において１：１）を明らかにするだろう。
【００５０】
本発明に係る化学量論の決定は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システム、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ））を用いて実施でき、ここで、マイクロ流体システムを試料が通過し、泳動緩衝液は４つの個々に検出したフローセルを（一つずつ又は連続して）通る。
【００５１】
センサチップとして、例えば、共有結合的にカルボキシメチルで修飾したデキストランポリマーヒドロゲルを有する金でコーティングした表面を有するＳｅｒｉｅｓ  Ｓ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ）を用いることができる。機器からの出力は、時間の関数として検出器応答（「共鳴単位」、ＲＵで測定した）のプロットである「センサグラム」である。１０００ＲＵの増加は、約１ｎｇ／ｍｍ2のセンサ表面上の質量の増加に対応する。
【００５２】
計算のために、専用のＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア及びＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００ソフトウェア２．０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ））を使用でき、それは検量線を必要としない濃度分析（ＣＡＦＣ）用のモジュールを備える。
【００５３】
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を用いて分子Ｂについての分子Ａにおける結合部位の数を決定する手順を以下のように実施できる。
【００５４】
Ａ）活性濃度の決定
１）センサチップＣＭ５を挿入し、システムに緩衝液を入れる。
２）フローセル２中で分子Ａを固定化し、フローセル４中で分子Ｂを固定化する。
２５〜１００ＲＵ／ｋＤａの間で固定化することを目標にする（すなわち、分子Ａが５０ｋＤａの分子量を有する場合、１２５０〜５０００ＲＵの間で固定化する）。
３）固定化リガンドＡに分子Ｂを注入し、５μｌ／分の流速で少なくとも０．３ＲＵ／秒の初期結合速度を与える希釈を使用する。６０秒の注入時間を使用する。
４）また６０秒間、１００μｌ／分の流速で同じ希釈の分子Ｂを注入する。
５）段階３及び４と同様の方法で、５及び１００μ／分で固定化リガンドＢに分子Ａを注入する。
６）Ｔ１００評価ソフトウェアを開き、濃度分析／検量線を必要としない分析ツールを用いて分子Ａ及びＢの濃度を決定する。
【００５５】
Ｂ）化学量論の決定
分子Ａ及びＢの活性濃度を知ることができれば、結合化学量論を決定できる。
１）一定濃度「２ａ」の分子Ａを使用し、その１００μｌ溶液を９６ウェルプレートの１０以上のウェルにピペットで取る。
２）濃度１００×２ａ（又はそれ以上）の分子Ｂの２００μｌ溶液を調製し、１０（又はそれ以上）の連続３倍希釈のＢを調製する。
これらの溶液は、遊離濃度のＢの決定及び分子Ａとのインキュベーションのための標準曲線に使用する。
３）１００μｌの各々のＢの溶液を、分子Ａの初期濃度「ａ」を与える濃度「２ａ」で分子Ａが既に存在しているウェルに移す。
４）固定化リガンドＡに標準濃度のＢを注入する。
５）固定化リガンドＡに変動濃度のＢとインキュベートしたＡの溶液を注入する。
段階４及び５において、典型的な注入時間は３分であり、典型的な流速は１０μｌ／分である。反応値として注入停止後に記録点のセットとして１０秒を使用する。
６）Ｔ１００評価ソフトウェアを開き、既知濃度のＢに対して注入から得られた反応値をプロットすることによってＢについての標準曲線を調製する。
７）各々の混合物中のＢの遊離濃度を決定する。
８）（Ｂtot−Ｂfree）対Ｂtotをプロットし、飽和におけるデータ点（図１を参照のこと）を使用して、化学量論＝（Ｂtot−Ｂfree）飽和／Ａtotの式から化学量論を計算する。
【００５６】
本発明は上記の好ましい実施形態に限定されない。種々の代替、修飾及び等価物が使用されてもよい。従って、上記の実施形態は、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【図１】
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【国際調査報告】
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