(57)【要約】  本開示は、ＨＥＲ３に結合する、抗体などの抗原結合タンパク質、このような抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記抗原結合タンパク質を含んでなる医薬組成物、および製造方法に関する。本開示はまた、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌、黒色腫およびＨＥＲ３を過剰発現するその他の癌に関連する疾患の治療または予防におけるこのような抗原結合タンパク質の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、配列番号３および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列と７５％を越える配列同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを有する重鎖可変領域；ならびに／または配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを有する軽鎖可変領域を含んでなる、抗原結合タンパク質。
【請求項２】
前記抗原結合タンパク質がキメラ抗体およびヒト化抗体からなる群から選択される、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項３】
配列番号２で示されるＣＤＲアミノ酸配、配列番号３で示されるＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号４で示されるＣＤＲアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；ならびに配列番号６で示されるＣＤＲアミノ酸配列、配列番号７で示されるＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号８で示されるＣＤＲアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含んでなる、請求項２に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項４】
配列番号２１のアミノ酸残基１８４〜３２９を含んでなるペプチド鎖ドメインに特異的に結合する、請求項３に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項５】
配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５からなる群から選択されるアミノ酸配列と７５％を越える配列同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを有する重鎖可変領域；ならびに／または配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９からなる群から選択されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを有する軽鎖可変領域を含んでなる、抗原結合タンパク質。
【請求項６】
前記抗原結合タンパク質がキメラ抗体およびヒト化抗体からなる群から選択される、請求項５に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項７】
配列番号２３で示されるＣＤＲアミノ酸配列、配列番号２４で示されるＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号２５で示されるＣＤＲアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；ならびに／または配列番号２７で示されるＣＤＲアミノ酸配列、配列番号２８で示されるＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号２９で示されるＣＤＲアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含んでなる、請求項６に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項８】
配列番号２１のアミノ酸残基１８４〜３２９を含んでなるペプチド鎖ドメインに特異的に結合する、請求項７に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項９】
配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７からなる群から選択されるアミノ酸配列と７５％を越える配列同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを有する重鎖可変領域；ならびに／または配列番号４９、配列番号５０および配列番号５１からなる群から選択されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを有する軽鎖可変領域を含んでなる、抗原結合タンパク質。
【請求項１０】
前記抗原結合タンパク質がキメラ抗体およびヒト化抗体からなる群から選択される、請求項９に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１１】
配列番号４５で示されるＣＤＲアミノ酸配列、配列番号４６で示されるＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号４７で示されるＣＤＲアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；ならびに／または配列番号４９で示されるＣＤＲアミノ酸配列、配列番号５０で示されるＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号５１で示されるＣＤＲアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含んでなる、請求項１０に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１２】
配列番号２１のアミノ酸残基３３０〜４９５を含んでなるペプチド鎖ドメインに特異的に結合する、請求項１１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１３】
配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３からなる群から選択されるアミノ酸配列と７５％を越える配列同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを有する重鎖可変領域；ならびに／または配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７からなる群から選択されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを有する軽鎖可変領域を含んでなる、抗原結合タンパク質。
【請求項１４】
前記抗原結合タンパク質がキメラ抗体およびヒト化抗体からなる群から選択される、請求項１３に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１５】
配列番号３１で示されるＣＤＲアミノ酸配列、配列番号３２で示されるＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号３３で示されるＣＤＲアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；ならびに配列番号３５で示されるＣＤＲアミノ酸配列、配列番号３６で示されるＣＤＲアミノ酸配列、配列番号３７で示されるＣＤＲアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含んでなる、請求項１４に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１６】
配列番号２１のアミノ酸残基３３０〜４９５を含んでなるペプチド鎖ドメインに特異的に結合する、請求項１５に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１７】
配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列と７５％を越える配列同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを有する重鎖可変領域；ならびに／または配列番号１２、配列番号７、配列番号８、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを有する軽鎖可変領域を含んでなる、抗原結合タンパク質。
【請求項１８】
前記抗原結合タンパク質がキメラ抗体およびヒト化抗体からなる群から選択される、請求項１７に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１９】
配列番号１０で示されるＣＤＲアミノ酸配列、配列番号１１で示されるＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号１２で示されるＣＤＲアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；ならびに配列番号１２で示されるＣＤＲアミノ酸配列、配列番号７で示されるＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号８で示されるＣＤＲアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域か、または配列番号１８で示されるＣＤＲアミノ酸配列、配列番号１９で示されるＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号２０で示されるＣＤＲアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域かを含んでなる、請求項１８に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２０】
配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含んでなる二量体の形成を阻害する、請求項１９に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列とを含んでなる、抗原結合タンパク質。
【請求項２２】
配列番号２２で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列と、配列番号２６で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列とを含んでなる、抗原結合タンパク質。
【請求項２３】
配列番号４４で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列と、配列番号４８で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列とを含んでなる、抗原結合タンパク質。
【請求項２４】
配列番号３０で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列と、配列番号３４で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列とを含んでなる、抗原結合タンパク質。
【請求項２５】
配列番号９で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列と、配列番号１３で示されるアミノ酸配列および配列番号１７で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖可変領域配列とを含んでなる、抗原結合タンパク質。
【請求項２６】
配列番号３０で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列と、配列番号５７で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列とを含んでなる、抗原結合タンパク質。
【請求項２７】
請求項１に記載の抗原結合タンパク質をコードする、単離された核酸。
【請求項２８】
配列番号３８で示される核酸配列および配列番号３９で示される核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つの核酸を含んでなる、請求項２７に記載の単離された核酸。
【請求項２９】
配列番号５９で示される核酸配列および配列番号６０で示される核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つの核酸を含んでなる、請求項２７に記載の単離された核酸。
【請求項３０】
請求項５に記載の抗原結合タンパク質をコードする、単離された核酸。
【請求項３１】
配列番号４０で示される核酸配列および配列番号４１で示される核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つの核酸を含んでなる、請求項３０に記載の単離された核酸。
【請求項３２】
請求項９に記載の抗原結合タンパク質をコードする、単離された核酸。
【請求項３３】
配列番号５２で示される核酸配列および配列番号５３で示される核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つの核酸を含んでなる、請求項３２に記載の単離された核酸。
【請求項３４】
配列番号６１で示される核酸配列および配列番号６２で示される核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つの核酸を含んでなる、請求項３２に記載の単離された核酸。
【請求項３５】
請求項１３に記載の抗原結合タンパク質をコードする、単離された核酸。
【請求項３６】
配列番号４２で示される核酸配列および配列番号４３で示される核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つの核酸を含んでなる、請求項３５に記載の単離された核酸。
【請求項３７】
請求項２６に記載の抗原結合タンパク質をコードする、単離された核酸。
【請求項３８】
配列番号４２で示される核酸配列および配列番号５８で示される核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つの核酸を含んでなる、請求項３７に記載の単離された核酸。
【請求項３９】
請求項１７に記載の抗原結合タンパク質をコードする、単離された核酸。
【請求項４０】
配列番号５４で示される核酸配列、配列番号５５で示される核酸配列、および配列番号５６で示される核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つの核酸を含んでなる、請求項３９に記載の単離された核酸。
【請求項４１】
配列番号６３で示される核酸配列、配列番号６４で示される核酸配列、および配列番号６５で示される核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つの核酸を含んでなる、請求項３９に記載の単離された核酸。
【請求項４２】
請求項２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０および４１のいずれか一項に記載の単離された核酸を含んでなる、発現ベクター。
【請求項４３】
請求項２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０および４１のいずれか一項に記載の単離された核酸を含んでなる発現ベクターを含んでなる、組換え宿主細胞。
【請求項４４】
請求項２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０および４１のいずれか一項に記載の単離された核酸を含んでなる発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞を培養する工程、および抗原結合タンパク質を回収する工程を含んでなる、抗原結合タンパク質の生産方法。
【請求項４５】
請求項１、５、９、１３、１７、２１、２２、２３、２４、２５および２６のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質と薬学上許容される担体とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項４６】
被験体において癌を治療する方法であって、治療上有効な量の請求項１、５、９、１３、１７、２１、２２、２３、２４、２５および２６のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を前記被験体に投与し、それにより、前記被験体の癌が治療される工程を含んでなる、方法。
【請求項４７】
被験体において癌を治療する方法であって、
ａ）乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、皮膚癌、胃癌および黒色腫からなる群から選択される癌を有する被験体を特定する工程；および
ｂ）治療上有効な量の請求項２２に記載の抗原結合タンパク質を前記被験体に投与し、それにより、被験体の癌が治療される工程
を含んでなる、方法。
【請求項４８】
ｃ）前記癌が配列番号２１のアミノ酸残基１８４〜３２９を含んでなるタンパク質を発現することを判定する工程
をさらに含んでなる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記タンパク質が配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
被験体において癌を治療する方法であって、
ａ）乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、皮膚癌、胃癌および黒色腫からなる群から選択される癌を有する被験体を特定する工程；および
ｂ）治療上有効な量の請求項２４に記載の抗原結合タンパク質を前記被験体に投与し、それにより、被験体の癌が治療される工程
を含んでなる、方法。
【請求項５１】
ｃ）癌が配列番号２１のアミノ酸残基３３０〜４９５を含んでなるタンパク質を発現することを判定する工程
をさらに含んでなる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記タンパク質が配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、皮膚癌、胃癌および黒色腫からなる群から選択される病態の治療のための薬剤の製造における、請求項１、５、９、１３、１７、２１、２２、２３、２４、２５および２６のいずれか一項に記載の物質の使用。
【請求項５４】
配列番号２１のアミノ酸残基１８４〜３２９を含んでなるペプチド鎖ドメインに特異的に結合する、抗原結合タンパク質。
【請求項５５】
前記抗原結合タンパク質がキメラ抗体およびヒト化抗体からなる群から選択される、請求項５４に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項５６】
配列番号２１のアミノ酸残基３３０〜４９５を含んでなるペプチド鎖ドメインに特異的に結合する、抗原結合タンパク質。
【請求項５７】
前記抗原結合タンパク質がキメラ抗体およびヒト化抗体からなる群から選択される、請求項５６に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項５８】
ａ）請求項２９、３５および３８のいずれか一項に記載の単離された核酸を含んでなる発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞を培養する工程（ここで、該組換え宿主細胞では、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が不活性化されている）；および
ｂ）前記抗原結合タンパク質を回収する工程
を含んでなり、それにより、抗原結合タンパク質が生産される、抗原結合タンパク質の生産方法。
【請求項５９】
前記組換え宿主細胞がＣＨＯＫ１ＳＶ細胞である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
請求項５８に記載の方法により生産された抗原結合タンパク質。
【請求項６１】
ａ）請求項２９、３５および３８のいずれか一項に記載の単離された核酸を含んでなる発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞を培養する工程（ここで、該発現ベクターは、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインアミノ酸残基とＩｇＧ３  Ｆｃドメインアミノ酸残基の双方を有するキメラＦｃドメインをコードするＦｃ核酸配列を含んでなる）；および
ｂ）前記抗原結合タンパク質を回収する工程
を含んでなり、それにより、抗原結合タンパク質が生産される、抗原結合タンパク質の生産方法。
【請求項６２】
前記Ｆｃ核酸配列が、配列番号４０で示される核酸配列および配列番号４２で示される核酸配列からなる群から選択される核酸にインフレームで融合されている、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
請求項６２に記載の方法によって生産された抗原結合タンパク質。
【請求項６４】
ａ）請求項２９、３５および３８のいずれか一項に記載の単離された核酸を含有する発現ベクターを含有する組換え宿主細胞を培養する工程（該発現ベクターはＩｇＧ１  Ｆｃドメインアミノ酸残基とＩｇＧ３  Ｆｃドメインアミノ酸残基の双方を有するキメラＦｃドメインをコードするＦｃ核酸配列をさらに含んでなり、かつ、該組換え宿主細胞では、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が不活性化されている）；および
ｂ）前記抗原結合タンパク質を回収する工程
を含んでなり、それにより、抗原結合タンパク質が生産される、抗原結合タンパク質の生産方法。
【請求項６５】
前記Ｆｃ核酸配列が、配列番号４０で示される核酸配列および配列番号４２で示される核酸配列からなる群から選択される核酸にインフレームで融合されている、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記組換え宿主細胞がＣＨＯＫ１ＳＶ細胞である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
請求項６４に記載の方法によって生産された抗原結合タンパク質。
【請求項６８】
被験体において前癌状態を治療する方法であって、治療上有効な量の請求項１、５、９、１３、１７、２１、２２、２３、２４、２５および２６のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を前記被験体に投与し、それにより、被験体の前癌状態が治療される工程を含んでなる、方法。
【請求項６９】
被験体において前癌状態を治療する方法であって、
ａ）前癌状態を有する被験体を特定する工程；および
ｂ）治療上有効な量の請求項２２に記載の抗原結合タンパク質を前記被験体に投与し、それにより、被験体の前癌状態が治療される工程
を含んでなる、方法。
【請求項７０】
ｃ）前記癌が配列番号２１のアミノ酸残基１８４〜３２９を含んでなるタンパク質を発現することを判定する工程
をさらに含んでなる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記タンパク質が配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
被験体において前癌状態を治療する方法であって、
ａ）前癌状態を有する被験体を特定する工程；および
ｂ）治療上有効な量の請求項２４に記載の抗原結合タンパク質を前記被験体に投与し、それにより、被験体の癌が治療される工程
を含んでなる、方法。
【請求項７３】
ｃ）前記癌が配列番号２１のアミノ酸残基３３０〜４９５を含んでなるタンパク質を発現することを判定する工程
をさらに含んでなる、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記タンパク質が配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
ＨＥＲ３受容体に特異的に結合し、かつ、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含んでなる、抗原結合タンパク質。
【請求項７６】
ＨＥＲ３受容体に特異的に結合し、かつ、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号７で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含んでなる、抗原結合タンパク質。
【請求項７７】
ＨＥＲ３受容体に特異的に結合し、かつ、配列番号２３で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２４で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、配列番号２５で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号２８で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号２９で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含んでなる、抗原結合タンパク質。
【請求項７８】
ＨＥＲ３受容体に特異的に結合し、かつ、配列番号３１で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号３２で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、配列番号３３で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号３５で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号３６で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号３７で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含んでなる、抗原結合タンパク質。
【請求項７９】
ＨＥＲ３受容体に特異的に結合し、かつ、配列番号４５で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号４６で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、配列番号４７で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号４９で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５０で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号５１で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含んでなる、抗原結合タンパク質。
【請求項８０】
ＨＥＲ３受容体に特異的に結合し、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号１６で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含んでなる、抗原結合タンパク質。
【請求項８１】
ＨＥＲ３受容体に特異的に結合し、かつ、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号２０で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含んでなる、抗原結合タンパク質。
【請求項８２】
医療に用いるための、請求項４５に記載の医薬組成物。
【請求項８３】
乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、皮膚癌、胃癌および黒色腫の治療に用いるための、請求項４５に記載の医薬組成物。
【請求項８４】
哺乳類において癌を治療する方法であって、治療上有効な量の請求項１、５、９、１３、１７、２１、２２、２３、２４、２５および２６のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を投与することを含んでなる、方法。
【請求項８５】
前記哺乳類がヒトである、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記癌が乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、皮膚癌、胃癌および黒色腫から選択される、請求項８４または８５に記載の方法。
【請求項８７】
配列番号１００で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２０〜４６６を有する重鎖配列と、配列番号１０４で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２０〜２３８を有する軽鎖配列とを含んでなる、抗原結合タンパク質。
【請求項８８】
フコシル化グリカンを含んでなる、請求項８７に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項８９】
前記フコシル化グリカンがＧ０、Ｇ２、Ｇ０Ｆ、Ｇ２Ｆ、Ｇ１、Ｍａｎ５、Ｇ１ＦおよびＧ１Ｆ’からなる群から選択される、請求項８８に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項９０】
非フコシル化グリカンを含んでなる、請求項８７に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項９１】
前記非フコシル化グリカンがＧ０、Ｇ２、Ｇ１およびＭａｎ５からなる群から選択される、請求項９０に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項９２】
配列番号１０２で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２０〜４６６を有する重鎖配列と、配列番号１０４で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２０〜２３８を有する軽鎖配列とを含んでなる、抗原結合タンパク質
【請求項９３】
フコシル化グリカンを含んでなる、請求項９２に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項９４】
前記フコシル化グリカンがＧ０、Ｇ２、Ｇ０Ｆ、Ｇ２Ｆ、Ｇ１、Ｍａｎ５、Ｇ１ＦおよびＧ１Ｆ’からなる群から選択される、請求項９３に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項９５】
非フコシル化グリカンを含んでなる、請求項９２に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項９６】
前記非フコシル化グリカンがＧ０、Ｇ２、Ｇ１およびＭａｎ５からなる群から選択される、請求項９５に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項９７】
配列番号１００で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２０〜４６６をコードする、単離された核酸。
【請求項９８】
配列番号１０１で示される核酸配列を含んでなる、請求項９７に記載の単離された核酸。
【請求項９９】
配列番号１０４で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２０〜２３８をコードする、単離された核酸。
【請求項１００】
配列番号１０５で示される核酸配列を含んでなる、請求項９９に記載の単離された核酸。
【請求項１０１】
配列番号１０２で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２０〜４６６をコードする、単離された核酸。
【請求項１０２】
配列番号１０３で示される核酸配列を含んでなる、請求項１０１に記載の単離された核酸。
【請求項１０３】
請求項９７、９８、９９、１００、１０１および１０２のいずれか一項に記載の単離された核酸を含んでなる、発現ベクター。
【請求項１０４】
請求項９７、９８、９９、１００、１０１および１０２のいずれか一項に記載の単離された核酸を含んでなる発現ベクターを含んでなる、組換え宿主細胞
【請求項１０５】
前記α−１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が存在する、請求項１０４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１０６】
ＣＨＯＫ１細胞である、請求項１０５に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１０７】
前記α−１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が不活性化されている、請求項１０４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１０８】
ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞である、請求項１０７に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１０９】
請求項８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５および９６のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質と薬学上許容される担体とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項１１０】
被験体において癌を治療する方法であって、治療上有効な量の請求項８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５および９６のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を前記被験体に投与し、それにより、被験体の癌が治療される工程を含んでなる、方法。
【請求項１１１】
被験体において癌を治療する方法であって、
ａ）乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、皮膚癌、胃癌および黒色腫からなる群から選択される癌を有する被験体を特定する工程；および
ｂ）治療上有効な量の請求項８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５および９６のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を被験体に投与し、それにより、被験体の癌が治療される工程
を含んでなる、方法。
【請求項１１２】
ｃ）前記癌が配列番号２１のアミノ酸残基３３０〜４９５を含んでなるタンパク質を発現することを判定する工程
をさらに含んでなる、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記タンパク質が配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、皮膚癌、胃癌および黒色腫からなる群から選択される病態の治療のための薬剤の製造における、請求項８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５および９６のいずれか一項に記載の物質の使用。
【請求項１１５】
ａ）請求項９７または請求項９８に記載の単離された核酸を含んでなり、かつ、請求項９７または請求項１００に記載の単離された核酸を含んでなる発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞を培養する工程（ここで、該組換え宿主細胞では、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が活性である）；および
ｂ）前記抗原結合タンパク質を回収する工程
を含んでなり、それにより、抗原結合タンパク質が生産される、抗原結合タンパク質の生産方法。
【請求項１１６】
前記組換え宿主細胞がＣＨＯＫ１細胞である、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
請求項１１５に記載の方法によって生産された抗原結合タンパク質。
【請求項１１８】
ａ）請求項９７または請求項９８に記載の単離された核酸を含んでなり、かつ、請求項９７または請求項１００に記載の単離された核酸を含んでなる発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞を培養する工程（ここで、該組換え宿主細胞では、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が不活性化されている）；および
ｂ）前記抗原結合タンパク質を回収する工程
を含んでなり、それにより、抗原結合タンパク質が生産される、抗原結合タンパク質の生産方法。
【請求項１１９】
前記組換え宿主細胞がＣＨＯＫ１ＳＶ細胞である、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
請求項１１８に記載の方法によって生産された抗原結合タンパク質。
【請求項１２１】
ａ）請求項９９または請求項１００に記載の単離された核酸を含んでなり、かつ、請求項１０１および請求項１０２に記載の単離された核酸を含んでなる発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞を培養する工程（ここで、該組換え宿主細胞では、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が活性である）；および
ｂ）前記抗原結合タンパク質を回収する工程
を含んでなり、それにより、抗原結合タンパク質が生産される、抗原結合タンパク質の生産方法。
【請求項１２２】
前記組換え宿主細胞がＣＨＯＫ１細胞である、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
請求項１２１に記載の方法によって生産された抗原結合タンパク質。
【請求項１２４】
ａ）請求項９９または請求項１００に記載の単離された核酸を含んでなり、かつ、請求項１０１および請求項１０２に記載の単離された核酸を含んでなる発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞を培養する工程（ここで、該組換え宿主細胞では、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が不活性化されている）；および
ｂ）前記抗原結合タンパク質を回収する工程
を含んでなり、それにより、抗原結合タンパク質が生産される、抗原結合タンパク質の生産方法。
【請求項１２５】
前記組換え宿主細胞がＣＨＯＫ１ＳＶ細胞である、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
請求項１２４に記載の方法によって生産された抗原結合タンパク質。
【請求項１２７】
被験体において前癌状態を治療する方法であって、治療上有効な量の請求項８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５および９６のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を前記被験体に投与し、それにより、被験体の前癌状態が治療される工程を含んでなる、方法。
【請求項１２８】
被験体において前癌状態を治療する方法であって、
ａ）前癌状態を有する被験体を特定する工程；および
ｂ）治療上有効な量の請求項８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５および９６のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を前記被験体に投与し、それにより、被験体の前癌状態が治療される工程
を含んでなる、方法。
【請求項１２９】
ｃ）流体を前記被験体に投与する工程
をさらに含んでなる、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
ｃ）前記癌が配列番号２１のアミノ酸残基３３０〜４９５を含んでなるタンパク質を発現することを判定する工程
をさらに含んでなる、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３１】
前記タンパク質が配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
医療に用いるための、請求項１０９に記載の医薬組成物。
【請求項１３３】
乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、皮膚癌、胃癌および黒色腫の治療に用いるための、請求項１０９に記載の医薬組成物。
【請求項１３４】
哺乳類において癌を治療する方法であって、治療上有効な量の請求項８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５および９６のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を投与することを含んでなる、方法。
【請求項１３５】
前記哺乳類がヒトである、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
前記癌が乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、皮膚癌、胃癌および黒色腫から選択される、請求項１３４または１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、皮膚癌、胃癌および黒色腫からなる群から選択される病態の治療において用いるための、請求項１〜１３６のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１０年９月３日に出願された米国仮特許出願第６１／３７９，８４０号の利益および２０１１年２月８日に出願された米国仮特許出願第６１／４４０，４６０号の利益を主張するものである。上記出願の全教示は引用することにより本明細書の一部とされる。
【０００２】
（開示の分野）
本開示は、ＨＥＲ３受容体に結合する、抗体などの抗原結合タンパク質、このような抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記抗原結合タンパク質を含んでなる医薬組成物、および製造方法に関する。本開示はまた、種々の癌に関連する疾患の治療または予防におけるこのような抗原結合タンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３とも呼ばれる）（配列番号２１）は、受容体のＥｒｂＢ／ＨＥＲタンパク質ファミリーまたは上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーを含んでなる、構造的に関連のある４つの受容体チロシンキナーゼのうちの１つである。これらの受容体は、およそ６２０のアミノ酸を含む細胞外領域と、一回膜貫通領域と、細胞質チロシンキナーゼドメインから構成される。各ファミリーメンバーの細胞外領域は、Ｌ１、Ｓ１（ＣＲ１）、Ｌ２およびＳ２（ＣＲ２）という４つのサブドメインから構成される（ここで、「Ｌ」はロイシンリッチリピートドメインを表し、「ＣＲ」はシステインリッチ領域を表す）。これらの受容体の活性化は一般に、リガンドにより誘発される受容体の二量体化を必要とする。ＨＥＲ３はこのファミリーの中で、リガンド（ニューレグリン−１、ＮＲＧ；ヘレグリン、ＨＲＧ；表１参照）結合ドメインを有するが、キナーゼドメインにおけるある特定のアミノ酸変異の存在のために固有のチロシンキナーゼ活性を持たないという点で独特である。従って、ＨＥＲ３はリガンドと結合できるが、ホモ二量体としては、タンパク質のリン酸化を介して細胞にシグナルを伝達することがない。しかしながら、ＨＥＲ３は、キナーゼ活性を有する他のＥＧＦ受容体ファミリーメンバーとヘテロ二量体（例えば、ＨＥＲ１／ＨＥＲ３；ＨＥＲ２／ＨＥＲ３；ＨＥＲ３／ＨＥＲ４）を形成して有効なシグナル伝達能部分を形成する。特に注目されるのはＨＥＲ２とのペアリングであり、これはＨＥＲ２／ＨＥＲ３の組合せが、ＰＩ３Ｋ／ｐＡＫＴ経路をはじめとする種々の細胞内経路を介して最高の増殖能を有すると思われるからである。ＨＥＲ３がＨＥＲ２と二量体を形成すると、生じたシグナル伝達複合体は、ＨＥＲ２成分に対する抗体（ペルツズマブなど）によって破壊され得る。さらに、ＨＥＲ２と同時発現すると、ＨＲＧに対するＨＥＲ３の親和性が高まり得る。最近、ＨＥＲ３と他の細胞表面受容（ｃ−ＭＥＴなどの、ＨＥＲファミリー外のものを含む）の相互作用が、ある種の抗癌薬に対する耐性に関する重要な逃避機構として浮上した。ＨＥＲ３の異なるアイソフォームをコードする選択的転写スプライス変異体が、完全にではないが特徴付けがなされている。１つのアイソフォームは膜間領域を欠き、細胞外へ分泌される。この形態は膜結合型の活性を隔離リガンドにより調節する働きをすると考えられる。ＨＥＲ３の、他の受容体とのヘテロ二量体化は、細胞の増殖および生存に重要な経路の活性化をもたらす。従って、これらの経路の制御された発現および活性化は、生物の正常な成長に必要であり、これが損なわれると疾病に至り得る。
【０００４】
ＨＥＲタンパク質ファミリーのこの４つのメンバーは、潜在的増殖因子リガンドのサブセットによって活性化されると、ホモ二量体、ヘテロ二量体およびより高次のオリゴマーを形成することができる。下記の表１にＨＥＲファミリー受容体の既知のリガンドを列挙する。
【０００５】
【表１】
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【０００６】
マウスでは、ＥｒｂＢファミリーのいずれのメンバーによるシグナル伝達が欠損しても、肺、皮膚、心臓および脳を含む臓器の欠陥による胚致死に至る。
【０００７】
他方、過剰なＥｒｂＢ／ＨＥＲシグナル伝達は、多様な固形腫瘍種の発達に関連づけられている。ＥｒｂＢ−１（ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１）およびＥｒｂＢ−２（ＨＥＲ２）は多くのヒト癌に見られ、それらの過剰なシグナル伝達はこれらの腫瘍の発達および悪性度における重要な因子である可能性がある。例えば、ＥＧＦＲは、肺癌および結腸癌を含む多くの癌で過剰発現される。このような状況でこの受容体の活性を阻害するには、セツキシマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブなどの薬物が用いられる。現在とりわけハーセプチン、タモキシフェンおよびラパチニブで治療されている乳癌では、ＨＥＲ２遺伝子が増幅され、そのタンパク質が過剰発現される。これらの治療に対する感受性からの逃避が癌においてますます増えてきている問題であり、なぜより新規で有効な治療が必要とされるのかという理由である。ＨＥＲ３遺伝子の増幅および／またはそのタンパク質の過剰発現は多くの癌で報告されている。最近、例えばゲフィチニブに対して獲得された耐性はＨＥＲ３の活性亢進に関連づけることができるということが示された。これは獲得されたｃ−ＭＥＴの過剰発現に関連づけられ、ｃ−ＭＥＴはＨＥＲ３をリン酸化し、これが次に重要な細胞増殖／生存経路であるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路を活性化する。
【０００８】
ＨＥＲ３受容体（配列番号２１）は独特な特性を持ち、ＨＥＲ受容体ファミリーにより媒介される細胞シグナル伝達経路の重要な分岐点を占める。ＨＥＲ３受容体はまた、一般的な癌治療薬に対する耐性機構における関連づけがますます進んでいる。ＨＥＲ３受容体は機能的に活性なキナーゼドメインを欠いているため、従来の小分子では「創薬標的」とはなり得ない。しかしながら、種々の重要な増殖、生存および分化経路におけるその活性を他の細胞表面受容体との相互作用に頼る細胞表面受容体としてであれば、ＨＥＲ３受容体は生物薬学的アプローチに魅力的な標的である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
よって、ＨＥＲ３受容体を標的とする治療用抗体、およびこのような抗体で癌を治療する方法の必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（開示の概要）
本開示の一態様は、配列番号２、配列番号３および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列と７５％を越える配列同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを有する重鎖可変領域；および／または配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを有する軽鎖可変領域を含んでなり、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。
【００１１】
本開示の別の態様は、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５からなる群から選択されるアミノ酸配列と７５％を越える配列同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを有する重鎖可変領域；および／または配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９からなる群から選択されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを有する軽鎖可変領域を含んでなり、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。
【００１２】
本開示の別の態様は、配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７からなる群から選択されるアミノ酸配列と７５％を越える配列同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを有する重鎖可変領域；および／または配列番号４９、配列番号５０および配列番号５１からなる群から選択されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを有する軽鎖可変領域を含んでなり、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。
【００１３】
本開示の別の態様は、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３からなる群から選択されるアミノ酸配列と７５％を越える配列同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを有する重鎖可変領域；および／または配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７からなる群から選択されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを有する軽鎖可変領域を含んでなり、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。
【００１４】
本開示の別の態様は、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列と７５％を越える配列同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを有する重鎖可変領域；および／または配列番号１２、配列番号７、配列番号８、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを有する軽鎖可変領域を含んでなり、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。
【００１５】
本開示の別の態様は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列とを含んでなり、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。
【００１６】
本開示の別の態様は、配列番号２２で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列と、配列番号２６で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列とを含んでなり、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。
【００１７】
本開示の別の態様は、配列番号４４で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列と、配列番号４８で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列とを含んでなり、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。
【００１８】
本開示の別の態様は、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列と、配列番号３４で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列を含んでなり、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。
【００１９】
本開示の別の態様は、配列番号９で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列と、配列番号１３で示されるアミノ酸配列および配列番号１７で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖可変領域配列とを含んでなり、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。
【００２０】
本開示の別の態様は、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列と、配列番号５７で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列とを含んでなり、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。
【００２１】
本開示の別の態様は、配列番号２１のアミノ酸残基１８４〜３２９を含んでなるペプチド鎖ドメインに特異的に結合するＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。
【００２２】
本開示の別の態様は、配列番号２１のアミノ酸残基３３０〜４９５を含んでなるペプチド鎖ドメインに特異的に結合するＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。
【００２３】
本開示の別の態様は、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合し、かつ、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号７で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含んでなる抗原結合タンパク質である。
【００２４】
本開示の別の態様は、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合し、かつ、配列番号２３で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２４で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、配列番号２５で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号２８で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号２９で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含んでなる抗原結合タンパク質である。
【００２５】
本開示の別の態様は、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合し、かつ、配列番号３１で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号３２で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、配列番号３３で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号３５で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号３６で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号３７で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含んでなる抗原結合タンパク質である。
【００２６】
本開示の別の態様は、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合し、かつ、配列番号４５で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号４６で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、配列番号４７で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号４９で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５０で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号５１で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含んでなる抗原結合タンパク質である。
【００２７】
本開示の別の態様は、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合し、かつ、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号１６で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含んでなる抗原結合タンパク質である。
【００２８】
本開示の別の態様は、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合し、かつ、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号２０で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含んでなる抗原結合タンパク質である。
【００２９】
本開示はまた、単離された核酸、発現ベクター、組換え宿主細胞、抗原結合タンパク質の生産方法、医薬組成物、癌を治療する方法、使用、および抗原結合タンパク質（その総てが本開示のこれらの態様に関連する）の生産方法も提供する。
【００３０】
本開示の別の態様は、配列番号１００で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２０〜４６６を有する重鎖配列と、配列番号１０４で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２０〜２３８を有する軽鎖配列とを含んでなる抗原結合タンパク質である。
【００３１】
本開示の別の態様は、配列番号１０２で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２０〜４６６を有する重鎖配列と、配列番号１０４で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２０〜２３８を有する軽鎖配列とを含んでなる抗原結合タンパク質である。
【００３２】
本開示の別の態様は、配列番号１００で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２０〜４６６をコードする単離された核酸である。
【００３３】
本開示の別の態様は、配列番号１０４で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２０〜２３８をコードする単離された核酸である。
【００３４】
本開示の別の態様は、配列番号１０２で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２０〜４６６をコードする単離された核酸である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ＢｘＰＣ３膵臓癌細胞における、ヘレグリンにより誘導されるヒトＨＥＲ３受容体リン酸化の、抗ＨＥＲ３抗体による阻害。
【図２】ＣＨＬ−１黒色腫細胞における、ヘレグリンにより誘導されるヒトＨＥＲ３受容体リン酸化の、抗ＨＥＲ３抗体による阻害。
【図３】Ｎ８７胃癌細胞における、ヘレグリンにより誘導されるヒトＨＥＲ３受容体リン酸化の、抗ＨＥＲ３抗体による阻害。
【図４】ＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞における、ヘレグリンにより誘導されるヒトＨＥＲ３受容体リン酸化の、抗ＨＥＲ３抗体による阻害。
【図５】ＢＴ−４７４乳癌細胞における、ヘレグリンにより誘導されるヒトＨＥＲ３受容体リン酸化の、抗ＨＥＲ３抗体による阻害。
【図６】ＭＣＦ−７乳癌細胞における、ヘレグリンにより誘導されるヒトＨＥＲ３受容体リン酸化の、抗ＨＥＲ３抗体による阻害。
【図７】ＢｘＰＣ３膵臓癌細胞における、ヘレグリンにより誘導されるヒトＡｋｔリン酸化の、抗ＨＥＲ３抗体による阻害。
【図８】ＣＨＬ−１黒色腫細胞における、ヘレグリンにより誘導されるヒトＡｋｔリン酸化の、抗ＨＥＲ３抗体による阻害。
【図９】Ｎ８７胃癌細胞における、ヘレグリンにより誘導されるヒトＡｋｔリン酸化の、抗ＨＥＲ３抗体による阻害。
【図１０】ＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞における、ヘレグリンにより誘導されるヒトＡｋｔリン酸化の、抗ＨＥＲ３抗体による阻害。
【図１１】ＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞における上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）により誘導されるヒトＨＥＲ３受容体リン酸化の、抗ＨＥＲ３抗体による阻害。
【図１２】ＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞におけるベータセルリンにより誘導されるヒトＨＥＲ３受容体リン酸化の、抗ＨＥＲ３抗体による阻害。
【図１３】上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）およびＨＥＲ３を形質導入したＣＨＯ細胞における、ヘレグリンにより誘導されるヘテロ二量体形成およびヒトＨＥＲ３受容体リン酸化の、抗ＨＥＲ３抗体による阻害。
【図１４】ＨＥＲ２およびＨＥＲ３を形質導入したＣＨＯ細胞における、ヘレグリンにより誘導されるヘテロ二量体形成およびヒトＨＥＲ３受容体リン酸化の、抗ＨＥＲ３抗体による阻害。
【図１５】ＨＥＲ４およびＨＥＲ３を形質導入したＣＨＯ細胞における、ヘレグリンにより誘導されるヘテロ二量体形成およびヒトＨＥＲ３受容体リン酸化の、抗ＨＥＲ３抗体による阻害。
【図１６】癌細胞系統における、ヘレグリンにより誘導されるヒトＨＥＲ３受容体リン酸化の、抗ＨＥＲ３抗体による阻害（ホスホ−ＨＥＲ３  ＥＬＩＳＡ  ＩＣ５０値）。
【図１７】マウス１Ｄ９抗体（Ｍ５．１Ｄ９．１Ｆ５）は全長ヒトＨＥＲ３  ＥＣＤおよびヒトＨＥＲ３ドメインＩＩＩに結合する。
【図１８】マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）は全長ヒトＨＥＲ３  ＥＣＤおよびヒトＨＥＲ３ドメインＩＩに結合する。
【図１９】ヒト化１Ｄ９ポテリジェント（商標）抗体は全長ヒトＨＥＲ３  ＥＣＤおよびヒトＨＥＲ３ドメインＩＩＩに結合する。
【図２０】ヒト化１Ｄ９アクリタマブ（商標）抗体は全長ヒトＨＥＲ３  ＥＣＤおよびヒトＨＥＲ３ドメインＩＩＩに結合する。
【図２１】ヒト化１Ｄ９抗体は全長ヒトＨＥＲ３  ＥＣＤおよびヒトＨＥＲ３ドメインＩＩＩに結合する。
【図２２】（ａ）マウス１Ｄ９抗体（Ｍ５．１Ｄ９．１Ｆ５）は、フローサイトメトリー分析により評価した場合、ヒトＭＣＦ−７乳癌細胞上のＨＥＲ３を認識する。（ｂ）マウス１Ｄ９抗体（Ｍ５．１Ｄ９．１Ｆ５）抗体は、フローサイトメトリー分析により評価した場合、ヒトＢｘＰＣ３膵臓癌細胞上のＨＥＲ３を認識する。
【図２３】（ａ）ヒト化１Ｄ９抗体、ヒト化アクリタマブ（商標）１Ｄ９抗体、およびヒト化ポテリジェント（商標）抗体は、フローサイトメトリー分析により評価した場合、ヒトＣＨＬ−１黒色腫細胞上のＨＥＲ３を認識する。（ｂ）ヒト化１Ｄ９抗体、ヒト化アクリタマブ（商標）１Ｄ９抗体、およびヒト化ポテリジェント（商標）抗体は、フローサイトメトリー分析により評価した場合、ヒトＢｘＰＣ３膵臓癌細胞上のＨＥＲ３を認識する。
【図２４】マウス１Ｄ９抗体（Ｍ５．１Ｄ９．１Ｆ５）およびマウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）は、ヘレグリンにより誘導されるＢｘＰＣ３膵臓癌細胞の増殖を阻害する。
【図２５】マウス１Ｄ９抗体（Ｍ５．１Ｄ９．１Ｆ５）およびマウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）は、ヘレグリンにより誘導されるＭＣＦ−７乳癌細胞の増殖を阻害する。
【図２６】ヒト化１Ｄ９アクリタマブ（商標）抗体およびマウス１Ｄ９抗体は、ヘレグリンにより誘導されるＢｘＰＣ３膵臓癌細胞の増殖を阻害する。
【図２７】マウス１Ｄ９抗体（Ｍ５．１Ｄ９．１Ｆ５）、マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１）、マウス２４Ｈ５抗体（Ｍ５．２４Ｈ５．Ｃ２）、キメラ１Ｄ９抗体およびキメラ１５Ｄ５抗体は、ヘレグリンにより誘導されるＢｘＰＣ３膵臓癌細胞の浸潤を阻害する。
【図２８】マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．Ｈ１０）およびヒト化１Ｄ９抗体は、ヒトＣＨＬ−１黒色腫細胞において受容体のインターナリゼーションを誘導した。
【図２９】（ａ）マウス１Ｄ９抗体（Ｍ５．１Ｄ９．１Ｆ５）は、Ｂ１６Ｆ１０細胞上で発現されたマウスＨＥＲ３と交差反応する。（ｂ）マウス２４Ｈ５抗体（Ｍ５．２４Ｈ５．Ｃ２）は、Ｂ１６Ｆ１０細胞上で発現されたマウスＨＥＲ３と交差反応する。（ｃ）マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．１Ｃ１）は、Ｂ１６Ｆ１０細胞上で発現されたマウスＨＥＲ３と交差反応する。
【図３０】Ｂ１６Ｆ１０同一遺伝子型腫瘍モデルにおける、マウス抗ＨＥＲ３  ｍＡｂであるマウス１Ｄ９抗体の有効性。マウスＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞のボーラスｉ．ｖ．注射を投与したＣ５７ＢＬ／６マウスを、アイソタイプ対照、マウスＨｅｒ３  ｍＡｂ（ｍ１Ｄ９）またはジェムザール(GEMZAR)(商標)(ゲムシタビン）で処置し、肺における腫瘍細胞の定着に対する効果を評価した。アイソタイプ対照およびｍ１Ｄ９は、Ｂ１６Ｆ１０注射後の３日目（２５または５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）と、７日目および１１日目（５または２５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）に投与した。ジェムザール（商標）は３日目のみに投与した（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）。２０日目に湿重測定のために肺を回収した。ｍ１Ｄ９による処置は、アイソタイプ対照に比べて、肺重量に用量依存的低下をもたらした（ｐ＜０．０１；ダネットの事後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ）。ＮＴＢ＝非担癌マウス
【図３１】Ｂ１６Ｆ１０同一遺伝子型腫瘍モデルにおける、マウス抗ＨＥＲ３  ｍＡｂであるマウス１５Ｄ５抗体の有効性。マウスＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞のボーラスｉ．ｖ．注射を投与したＣ５７ＢＬ／６マウスを、アイソタイプ対照、マウスＨｅｒ３  ｍＡｂ（ｍ１５Ｄ５）またはジェムザール（商標）で処置し、肺における腫瘍細胞の定着に対する効果を評価した。アイソタイプ対照およびｍ１５Ｄ５は、Ｂ１６Ｆ１０注射後の３日目（２５または５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）と、７日目および１１日目（５または２５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）に投与した。ジェムザール（商標）は３日目のみに投与した（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）。２０日目に湿重測定のために肺を回収した。ジェムザール（商標）およびｍ１５Ｄ５による処置は、肺重量の低下をもたらしたが、アイソタイプ対照に比べて２５／５ｍｇ／ｋｇ  ｍ１５Ｄ５のみが統計学的に有意であった（ｐ＜０．０５；ダネットの事後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ）。ＮＴＢ＝非担癌マウス
【図３２】ＣＨＬ−１異種移植モデルにおける、マウス抗ＨＥＲ３  ｍＡｂであるマウス１Ｄ９抗体の有効性。５〜１００ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．の、マウス抗ＨＥＲ３  ｍＡｂであるｍ１Ｄ９で週に２回処置したところ、ＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウスにおいてＣＨＬ−１腫瘍の増殖の低下がもたらされた。移植後２４日目および２７日目に、アイソタイプ対照と比較して用量依存的かつ統計学的に有意な低下が見られた（＊ｐ＜０．０５＊＊＊ｐ＜０．００１；ボンフェローニ事後検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ反復測定分析）。
【図３３】ＣＨＬ−１異種移植モデルにおける、マウス抗ＨＥＲ３  ｍＡｂであるマウス１５Ｄ５抗体の有効性。５〜１００ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．の、マウス抗ＨＥＲ３  ｍＡｂであるｍ１５Ｄ５で週に２回処置したところ、ＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウスにおいてＣＨＬ−１腫瘍の増殖の低下がもたらされた。移植後２０、２４および２７日目に、アイソタイプ対照と比較して用量依存的かつ統計学的に有意な低下が見られた（＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１；ボンフェローニ事後検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ反復測定分析）。
【図３４】ＢｘＰＣ３異種移植モデルにおける、マウス抗ＨＥＲ３  ｍＡｂであるマウス１Ｄ９抗体の有効性。０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．の、マウス抗ＨＥＲ３  ｍＡｂであるｍ１Ｄ９で週に２回処置したところ、ＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウスにおけるＢｘＰＣ３腫瘍増殖に用量依存的かつ統計学的に有意な低下がもたらされた（＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；ボンフェローニ事後検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ反復測定分析）。
【図３５】ＢｘＰＣ３異種移植モデルにおける、マウス抗ＨＥＲ３  ｍＡｂであるマウス１５Ｄ５抗体の有効性。０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．の、マウス抗ＨＥＲ３  ｍＡｂであるｍ１５Ｄ５で週に２回処置したところ、ＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウスにおけるＢｘＰＣ３腫瘍増殖に用量依存的および統計学的に有意な低下がもたらされた（＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；ボンフェローニ事後検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ反復測定分析）。
【図３６】ＮＣＩ−Ｎ８７異種移植モデルにおける、マウス抗ＨＥＲ３  ｍＡｂであるマウス１Ｄ９抗体の有効性。ＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウスを７５または１００ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．のｍ１Ｄ９で週に２回処置したところ、ビヒクル対照と比較してＮ８７腫瘍の増殖の低下がもたらされた。アイソタイプ(isoype)対照であるマウスＩｇＧ２ｂでも同様の低下が見られた（＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；ボンフェローニ事後検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ反復測定分析）。
【図３７】ＮＣＩ−Ｎ８７異種移植モデルにおける、マウス抗ＨＥＲ３  ｍＡｂであるマウス１５Ｄ５抗体の有効性。ＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウスを７５または１００ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．のｍ１５Ｄ５で週に２回処置したところ、ビヒクル対照群またはアイソタイプ対照群と比較してＮ８７腫瘍体積の低下がもたらされたが、違いは統計学的に有意なものではなかった。
【図３８】ＣＨＬ−１異種移植モデルにおける、キメラ抗ＨＥＲ３  ｍＡｂであるキメラ１Ｄ９抗体の有効性。５〜５０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．の、キメラ抗ＨＥＲ３  ｍＡｂであるＣｈ１Ｄ９で週に２回処置したところ、ＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウスにおいてＣＨＬ−１腫瘍の増殖の低下がもたらされた。移植後２４日目および２７日目に、アイソタイプ対照と比較して用量依存的かつ統計学的に有意な低下が見られた（＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１；ボンフェローニ事後検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ反復測定分析）。
【図３９】ＣＨＬ−１異種移植モデルにおける、ヒト化抗ＨＥＲ３  ｍＡｂであるヒト化１５Ｄ５抗体の有効性。５〜５０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．の、ヒト化抗ＨＥＲ３  ｍＡｂであるｈ１５Ｄ５で週に２回処置したところ、ＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウスにおいてＣＨＬ−１腫瘍の増殖の低下がもたらされた。移植後２４日目および２７日目に、アイソタイプ対照と比較して用量依存的かつ統計学的に有意な低下が見られた（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１；ボンフェローニ事後検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ反復測定分析）。
【図４０】ＣＨＬ−１異種移植モデルにおける、ヒト化抗ＨＥＲ３  ｍＡｂであるヒト化１Ｄ９  ＲＲ抗体の有効性。５〜５０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．のヒト化１Ｄ９ＲＲで週に２回処置したところ、ＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウスにおいてＣＨＬ−１腫瘍の増殖の低下がもたらされた。この腫瘍増殖の低下は、移植後２９日目および３４日目で、アイソタイプ(isoptype)対照と比較して、総ての用量レベルで同等かつ統計学的に有意なものであった（＊＊＊ｐ＜０．００１；ボンフェローニ事後検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ反復測定分析）。
【図４１】ＣＨＬ−１異種移植モデルにおけるヒト化１Ｄ９  ＲＲアクリタマブ（商標）の有効性。５〜５０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．のヒト化１Ｄ９  ＲＲアクリタマブ（商標）で週に２回処置したところ、ＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウスにおいてＣＨＬ−１腫瘍の増殖の低下がもたらされた。この腫瘍増殖の低下は、移植後２９日目および３４日目で、アイソタイプ(isoptype)対照と比較して、総ての用量レベルで同等かつ統計学的に有意なものであった（＊＊＊ｐ＜０．００１；ボンフェローニ事後検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ反復測定分析）。
【図４２】ＣＨＬ−１異種移植モデルにおけるヒト化１Ｄ９  ＲＲポテリジェント（商標）の有効性。５〜５０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．のヒト化１Ｄ９  ＲＲポテリジェント（商標）で週に２回処置したところ、ＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウスにおいてＣＨＬ−１腫瘍の増殖の低下がもたらされた。この腫瘍増殖の低下は、移植後２９日目および３４日目で、アイソタイプ(isoptype)対照と比較して、用量依存的かつ統計学的に有意なものであった（＊＊＊ｐ＜０．００１；ボンフェローニ事後検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ反復測定分析）。
【図４３】ＢｘＰＣ３異種移植モデル（皮下移植片）における、キメラ抗ＨＥＲ３  ｍＡｂであるキメラ１Ｄ９抗体の有効性。ＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウスを、０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．の、キメラ抗ＨＥＲ３  ｍＡｂであるｃｈ１Ｄ９で週に２回処置して、ＢｘＰＣ３腫瘍の増殖に対する効果を評価した。０．５、５および５０ｍｇ／ｋｇ処置群では移植後３３日目に、また、５０ｍｇ／ｋｇ群では３６日目にも、アイソタイプ対照と比較して用量依存的かつ統計学的に有意な腫瘍増殖の低下が見られた（＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；ボンフェローニ事後検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ反復測定分析）。
【図４４】ＢｘＰＣ３異種移植モデル（皮下移植片）における、ヒト化抗ＨＥＲ３  ｍＡｂであるヒト化１５Ｄ５抗体の有効性。ＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウスを、０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．の、ヒト化抗ＨＥＲ３  ｍＡｂであるｈ１５Ｄ５で週に２回処置して、ＢｘＰＣ３腫瘍の増殖に対する効果を評価した。５０ｍｇ／ｋｇ群では移植後３３日目および３６日目に、アイソタイプ対照と比較して腫瘍増殖の低下が見られた（＊＊ｐ＜０．０１；ボンフェローニ事後検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ反復測定分析）。
【図４５】ＢｘＰＣ３異種移植モデル（皮下移植片）における、ヒト化１Ｄ９  ＲＲ抗体の有効性。０．５〜５０ｍｇ／ｋｇのｈ１Ｄ９ＲＲを、ＢｘＰＣ３担癌ＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウスに週に２回ｉ．ｐ．投与して、腫瘍細胞の増殖に対する効果を判定した。２０ｍｇ／ｋｇ群において見られた腫瘍体積の低下は、３６日目までにアイソタイプ対照レベルに戻った（＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１；ボンフェローニ事後検定比較を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ反復測定分析）。
【図４６】ＢｘＰＣ３異種移植モデル（同所移植片）におけるキメラ１Ｄ９抗体およびヒト化１５Ｄ５抗体の有効性。ＢｘＰＣ３膵臓癌断片を雌ＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウスの膵臓に同所移植した。腫瘍体積が８０〜１００ｍｍ３に達したところで、５０ｍｇ／ｋｇの、ＨＥＲ３  ｍＡｂであるｈ１５Ｄ５およびＣｈ１Ｄ９を、週に２回投与した。腫瘍体積は超音波（Ｖｅｖｏ画像解析）により１週間毎に測定した。抗ＨＥＲ３  ｍＡｂで処置すると、移植後５週目、６週目および７週目にアイソタイプ対照と比較して腫瘍増殖に有意な低下を生じた（＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；ボンフェローニ事後検定比較による二元配置）。
【図４７】ＮＣＩ−Ｎ８７異種移植モデルにおけるヒト化１Ｄ９  ＲＲ抗体および変異体の有効性。ＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウスに、５０ｍｇ／ｋｇの示されたヒト化ＨＥＲ３  ｍＡｂ（ヒト化１Ｄ９  ＲＲ抗体、ヒト化１Ｄ９  ＲＲポテリジェント（商標）抗体およびヒト化１Ｄ９  ＲＲアクリタマブ（商標）抗体）を週に２回、ｉ．ｐ．投与して、Ｎ８７腫瘍細胞の増殖に対する効果を判定した。ｈ１Ｄ９  ＲＲポテリジェント（商標）群では３７日目に、ｈ１Ｄ９ＲＲアクリタマブ（商標）群では４４日目に、アイソタイプ対照と比較して、統計学的に有意な腫瘍体積の低下が見られた（＊ｐ＜０．０５；ボンフェローニ事後検定比較を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ）。
【図４８】標的細胞としてＨＥＲ３を形質導入したＨＥＫ２９３、およびエフェクター細胞としてヒトＰＢＬ（ドナー２１２６）を用いたＡＤＣＣアッセイ。
【図４９】標的細胞としてＣＨＬ−１細胞、およびエフェクター細胞としてのヒトＰＢＬ（ドナー２１２６）を用いたＡＤＣＣアッセイ。
【図５０】標的細胞としてＨＥＲ３を形質導入したＨＥＫ２９３細胞、およびエフェクター細胞としてカニクイザルＰＢＬ（７０−１０５）を用いたＡＤＣＣアッセイ。
【図５１】標的細胞としてＨＥＲ３を形質導入したＨＥＫ２９３細胞、およびエフェクター細胞としてカニクイザルＰＢＬ（７０−１１３）を用いたＡＤＣＣアッセイ。
【図５２】標的細胞としてＣＨＬ−１細胞、およびエフェクター細胞としてカニクイザルＰＢＬ（７０−１０５）を用いたＡＤＣＣアッセイ。
【図５３】標的細胞としてＣＨＬ−１細胞、およびエフェクター細胞としてカニクイザルＰＢＬ（７０−１１３）を用いたＡＤＣＣアッセイ。
【図５４】ＨＥＲ３  ＢＡＣＭＡＭ（商標）を形質導入したＨＥＫ２９３標的細胞、およびカルビオケム（CALBIOCHEM）（商標）ウサギ補体を用いたＣＤＣアッセイ。
【図５５】ヒトＨＥＲ３  ＥＣＤ（配列番号６６；共結晶化断片）のドメインＩＩＩとマウス１Ｄ９軽鎖可変領域およびマウス１Ｄ９重鎖可変領域（共結晶化マウス１Ｄ９抗体由来Ｆａｂ）との間のアミノ酸接触を示すＸ線結晶構造。
【発明の詳細な説明】
【００３６】
本開示は抗原結合タンパク質および関連の主題を提供する。
【００３７】
本明細書において「ＨＥＲ３」および「ＨＥＲ３受容体」とは、互換的であり、ＨＥＲ３の全長非プロセシング前駆体形態；Ｃ末端ドメインの翻訳後切断から生じる成熟ＨＥＲ３；潜在型および非潜在（活性）型のうちのいずれか１つを意味する。本明細書において「ＨＥＲ３」および「ＨＥＲ３受容体」はまた、ＨＥＲ３受容体に関連する１以上の生物活性を保持するＨＥＲ３受容体の任意のフラグメントおよび変異体を意味する。
【００３８】
ＨＥＲ３受容体の全長非プロセシング前駆体型は、プロペプチドと、成熟タンパク質を形成するＣ末端ドメインを、シグナル配列とともに、または伴わずに含んでなる。この形態はポリタンパク質としても知られる。ＨＥＲ３受容体前駆体は単量体またはホモ二量体として存在し得る。
【００３９】
成熟ＨＥＲ３は、ＨＥＲ３前駆体タンパク質のＣ末端から切断されるタンパク質であり、Ｃ末端ドメインとしても知られる。成熟ＨＥＲ３は単量体、ホモ二量体、またはＨＥＲ３潜在複合体として存在し得る。条件に応じて、成熟ＨＥＲ３はこれらの異なる形態の組合せの間で平衡状態を確立し得る。
【００４０】
ＨＥＲ３プロペプチドは、シグナル配列の切断の後にＨＥＲ３前駆体タンパク質のＮ末端ドメインから切断されるポリペプチドである。プロペプチドはlatency-associated peptide （ＬＡＰ）としても知られる。ＨＥＲ３プロペプチドは、成熟ＨＥＲ３上の．プロペプチド結合ドメインと非共有結合的に結合することができる。
【００４１】
ＨＥＲ３受容体抗原結合タンパク質は、ＨＥＲ３受容体の前駆体型、成熟型、単量体型、二量体型、潜在型および活性型のいずれか１つまたはいずれかの組合せと結合することができる。該抗原結合タンパク質は、単量体型および／または二量体型の成熟ＨＥＲ３受容体と結合することができる。該抗原結合タンパク質は、プロペプチドおよび／またはフォリスタチンと複合体を形成しているＨＥＲ３受容体と結合することができる。あるいは、該抗原結合タンパク質は、ＨＥＲ２受容体または他のＨＥＲ３相互作用受容体と複合体（例えば、ＨＥＲ３のヘテロ二量体）を形成しているＨＥＲ３受容体と結合することができる。
【００４２】
本明細書において「抗原結合タンパク質」とは、単離された抗体、抗体フラグメント、抗原結合フラグメントおよびその他のタンパク質構築物（例えば、ＨＥＲ３受容体（配列番号２１）と結合することができるドメイン、配列番号２１のアミノ酸残基１８４〜３２９を含んでなるＨＥＲ３受容体のドメインＩＩ、または配列番号２１のアミノ酸残基３３０〜４９５を含んでなるＨＥＲ３受容体のドメインＩＩＩ）を意味する。
【００４３】
「抗体」とは、本明細書では広義において、免疫グロブリン様ドメインを有する分子を意味して用いられ、モノクローナル抗体、組換え抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体およびヘテロコンジュゲート抗体（モノクローナル抗体／ドメイン抗体コンジュゲートなど）；単一可変ドメイン；ドメイン抗体；抗原結合フラグメント；免疫学的に有効なフラグメント；一本鎖Ｆｖ；ダイアボディー；ＴＡＮＤＡＢＳ（商標）などを含む（別の「抗体」形式に関する要約としては、Holliger, et al., Nature Biotechnology, Vol 23, No. 9: 1126-1136 (2005)を参照）。
【００４４】
本明細書において「単一可変ドメイン」とは、異なる可変領域またはドメインとは無関係に抗原またはエピトープに特異的に結合する抗原結合タンパク質可変ドメイン（例えば、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）を意味する。
【００４５】
本明細書において「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」とは、抗原と結合することができる「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じと考えられる。免疫グロブリン単一可変ドメインはヒト抗体可変ドメインであり得るが、齧歯類ＶＨＨ  ｄＡｂ（例えば、ＷＯ００／２９００４に開示）、テンジクザメＶＨＨ  ｄＡｂおよびラクダ科ＶＨＨ  ｄＡｂなどの多種由来の単一抗体可変ドメインも含む。ラクダ科ＶＨＨは、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダおよびグアナコをはじめ、天然状態で軽鎖を欠いた重鎖抗体を産生する種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドである。このようなＶＨＨドメインは当技術分野で利用可能な標準的技術に従ってヒト化することができ、このようなドメインは「ドメイン抗体」とみなされる。本明細書において、ＶＨはラクダ科ＶＨＨドメインを含む。ＮＡＲＶは、テンジクザメをはじめとする軟骨性魚類で同定された、別のタイプの免疫グロブリン単一可変ドメインである。これらのドメインは新規な抗原受容体可変領域(Novel Antigen Receptor variable region)（一般にＶ（ＮＡＲ）またはＮＡＲＶと略される）としても知られる。詳細についてはMol. Immunol. 44, 656-665 (2006)およびＵＳ２００５００４３５１９Ａ（引用することにより本明細書の一部とされる）を参照。
【００４６】
本明細書において「ドメイン」とは、そのタンパク質の残りの部分とは独立な三次構造を有する折り畳まれたタンパク質構造を意味する。一般に、ドメインはタンパク質の個別の機能特性を担い、多くの場合、そのタンパク質および／またはドメインの残りの部分の機能を欠損することなく他のタンパク質に付加、移動または移入可能である。本明細書において「免疫グロブリン単一可変ドメイン」とは、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含んでなる、折り畳まれたポリペプチドドメインである。従って、免疫グロブリン単一可変ドメインには、完全な抗体可変ドメインおよび改変可変ドメイン（例えば、１以上のループが抗体可変ドメインに特徴的なものではない配列に置き換えられた抗体可変ドメイン）、または末端切断されているかまたはＮ末端もしくはＣ末端伸長を含んでなる抗体可変ドメイン、ならびに全長ドメインの少なくとも結合活性および特異性を保持する、折り畳まれた可変ドメインフラグメントが含まれる。ドメインは、別の可変領域またはドメインとは独立に、抗原またはエピトープに結合することができる。
【００４７】
「エピトープ結合ドメイン」とは、別のＶ領域またはドメインとは独立に、抗原またはエピトープに特異的に結合するドメインを意味し、これはドメイン抗体（ｄＡｂ）、例えば、ヒト、ラクダ科もしくはサメ免疫グロブリン単一可変ドメインであってもく、またはそれはＣＴＬＡ−４（エヴィボディ）；リポカリン；Ａタンパク質のＺ領域（アフィボディ、ＳｐＡ）、Ａ領域（アビマー／マキシボディ）などのＡタンパク質由来分子；ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳなどの熱ショックタンパク質；トランスフェリン（トランスボディ）；アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）；ペプチドアプタマー；Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）；ヒトγクリスタリンおよびヒトユビキチン（アフィリン）；ＰＤＺドメイン；ヒトプロテアーゼ阻害剤のサソリ毒ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン；およびフィブロネクチン（アドネクチン）からなる群から選択される足場の誘導体であってもよく、天然のリガンド以外のリガンドとの結合性を持たせるためにタンパク質工学的操作が施されている。
【００４８】
抗原結合フラグメントは、ドメインなどの非抗体タンパク質足場上に１以上のＣＤＲを配置することによって提供され得る。このドメインはドメイン抗体であってもよく、またはそれはＣＴＬＡ−４（エヴィボディ）；リポカリン；Ａタンパク質のＺ領域（アフィボディ、ＳｐＡ）、Ａ領域（アビマー／マキシボディ）などのＡタンパク質由来分子；ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳなどの熱ショックタンパク質；トランスフェリン（トランスボディ）；アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）；ペプチドアプタマー；Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）；ヒトクリスタリンおよびヒトユビキチン（アフィリン）；ＰＤＺドメイン；ヒトプロテアーゼ阻害剤のサソリ毒ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン；およびフィブロネクチン（アドネクチン）からなる群から選択される足場の誘導体であってもよく、天然のリガンド以外の抗原（ＨＥＲ３受容体など）との結合性を持たせるためにタンパク質工学的操作が施されている。
【００４９】
ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）は主にＣＤ４＋Ｔ細胞上で発現するＣＤ２８ファミリー受容体である。その細胞外ドメインは可変ドメイン様Ｉｇ折り畳みを有する。抗体のＣＤＲに対応するループを異種配列と置換することにより異なる結合特性を付与することができる。異なる結合特異性を有するように操作されたＣＴＬＡ−４分子は、エヴィボディとしても知られている。詳細についてはJournal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)を参照。
【００５０】
リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイドおよび脂質などの疎水性小分子を輸送する細胞外タンパク質ファミリーである。リポカリンは、円錐形構造の開口端に多くのループがある強固なシート二次構造を有し、種々の標的抗原に結合するように操作することができる。アンチカリンはサイズが１６０〜１８０アミノ酸で、リポカリンに由来する。詳細については、Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)、ＵＳ７２５０２９７Ｂ１およびＵＳ２００７０２２４６３３を参照。
【００５１】
アフィボディは、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)のＡタンパク質に由来する足場であり、抗原と結合するように操作することができる。このドメインは約５８アミノ酸の３つのらせん束からなる。表面残基の無作為化によりライブラリーが作製されている。詳細については、Protein Eng. Des. Sel. 17, 455-462 (2004)およびＥＰ１６４１８１８Ａ１参照。
【００５２】
アビマーは、Ａドメイン足場ファミリー由来の多重ドメインタンパク質である。約３５アミノ酸の天然ドメインは、定義されたジスルフィド結合構造をとっている。Ａドメインファミリーが呈する天然変異のシャッフリングにより多様性が作り出されている。詳細については、Nature Biotechnology 23(12), 1556-1561 (2005)およびExpert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007)参照。
【００５３】
トランスフェリンは、単量体血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは許容表面ループにペプチド配列を挿入することによって別の標的抗原に結合するように操作することができる。操作されたトランスフェリン足場の例としては、トランスボディがある。詳細については、J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)を参照。
【００５４】
設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、統合膜タンパク質の細胞骨格への連結を媒介するタンパク質ファミリーであるアンキリンに由来する。アンキリンの１つの繰り返し単位は、２本のらせんと１つのターンからなる３３残基のモチーフである。これらは、各繰り返し単位の第１のらせんとターンの残基を無作為化することにより種々の標的抗原に結合するように操作することができる。それらの結合面は、分子の数を増やすことにより増やすことができる（親和性成熟法）。詳細については、J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003)およびJ. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007)およびＵＳ２００４０１３２０２８Ａ１参照。
【００５５】
フィブロネクチンは、抗原に結合するように操作可能な足場である。アドネクチンは、ヒトＩＩＩ型フィブロネクチン（ＦＮ３）における１５の繰り返し単位のうちの１０番目のドメインの天然アミノ酸配列骨格からなる。サンドイッチの一方の末端の３つのループは、アドネクチンが対象とする治療標的を特異的に認識できるように操作することができる。詳細については、Protein Eng. Des. Sel. 18, 435-444 (2005)、ＵＳ２００８０１３９７９１、ＷＯ２００５０５６７６４およびＵＳ６８１８４１８Ｂ１を参照。
【００５６】
ペプチドアプタマーは、定常足場タンパク質、一般に、チオレドキシン（ＴｒｘＡ）（活性部位に挿入された拘束型の可変ペプチドループを含む）からなるコンビナトリアル認識分子である。詳細については、Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)参照。
【００５７】
ミクロボディは、３〜４個のシステイン架橋を含む２５〜５０アミノ酸長の天然マイクロタンパク質に由来する。マイクロタンパク質の例としては、ＫａｌａｔａＢ１、コノトキシンおよびノッティンがある。マイクロタンパク質はループを有し、このループをマイクロタンパク質の全体的な折り畳みに影響を与えずに２５個までのアミノ酸を含むように操作することができる。操作されたノッティンドメインの詳細については、ＷＯ２００８０９８７９６を参照。
【００５８】
他のエピトープ結合ドメインとしては、種々の標的抗原の結合特性を操作するための足場として使用されてきたタンパク質が含まれ、これにはヒトクリスタリンおよびヒトユビキチン（アフィリン）、ヒトプロテアーゼ阻害剤のｋｕｎｉｔｚ型ドメイン、Ｒａｓ結合タンパク質ＡＦ−６のＰＤＺドメイン、サソリ毒（カリブドトキシン）、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）が含まれる（これらは、Handbook of Therapeutic Antibodies (2007, Stefan Dubel 編) の第7章Non-Antibody ScaffoldsおよびProtein Science 15:14-27 (2006)に総説されている）。本開示のエピトープ結合ドメインは、これらの代替タンパク質ドメインのいずれに由来してもよい。
【００５９】
抗原結合フラグメントまたは免疫学的に有効なフラグメントは、部分的な重鎖または軽鎖可変配列を含んでなってもよい。フラグメントは少なくとも５、６、８または１０アミノ酸の長さである。あるいは、フラグメントは少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも７５、または少なくとも１００アミノ酸の長さである。
【００６０】
本明細書において抗原結合タンパク質に関して「特異的に結合する」とは、その抗原結合タンパク質がＨＥＲ３受容体と、ならびに他の（例えば、無関連の）タンパク質とは全くもしくは有意に結合しない、ＨＥＲ３受容体内の別個のドメインまたは別個のアミノ酸配列と結合することを意味する。しかしながら、この用語はこの抗原結合タンパク質がまた関連の深い分子（例えば、ＨＥＲ２受容体）と交差反応し得るということを排除するものではない。本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、ＨＥＲ２受容体などの関連の深い分子と結合する場合よりも少なくとも２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、または１０００倍大きい親和性でＨＥＲ３受容体と結合し得る。
【００６１】
本明細書に示される範囲は、記載されている特定の範囲内の全ての値と特定の範囲の終端の値を含む。
【００６２】
抗原結合タンパク質−ＨＥＲ３相互作用の結合親和性（ＫＤ）は、１ｍＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、２ｎＭ以下または１ｎＭ以下であり得る。あるいは、ＫＤは、５〜１０ｎＭの間；または１〜２ｎＭの間であり得る。ＫＤは、１ｐＭ〜５００ｐＭの間；または５００ｐＭ〜１ｎＭの間であり得る。該抗原結合タンパク質の結合親和性は、結合定数（Ｋａ）および解離定数（Ｋｄ）によって決定される（ＫＤ＝Ｋｄ／Ｋａ）。結合親和性はＢＩＡＣＯＲＥ（商標）により、例えば、Ａタンパク質をコーティングしたセンサー表面に試験抗体を捕捉し、この表面にＨＥＲ３受容体を流すことによって測定することができる。あるいは、結合親和性は、ＦＯＲＴＥＢＩＯ（商標）により、例えば、Ａタンパク質をコーティングしたニードル上に試験抗体受容体を捕捉し、この表面にＨＥＲ３受容体を流すことによって測定することもできる。
【００６３】
Ｋｄは、１×１０−３Ｍｓ−１以下、１×１０−４Ｍｓ−１以下、または１×１０−５Ｍｓ−１以下であり得る。Ｋｄは、１×１０−５Ｍｓ−１〜１×１０−４Ｍｓ−１の間；または１×１０−４Ｍｓ−１〜１×１０−３Ｍｓ−１の間であり得る。Ｋｄが遅いと、抗原結合タンパク質−リガンド複合体の解離が遅くなり、リガンドの中和が改善される。本明細書に記載の抗原結合タンパク質結合親和性および関連のデータの例を表２に示す。
【００６４】
【表２】
2013544492.tif 000003
【００６５】
表２では、「マウス１５Ｄ５抗体」は、配列番号１〜８で示される、重鎖可変鎖、軽鎖可変鎖、相補性決定領域およびフレームワーク領域を含んでなるモノクローナル抗体を意味し；「ヒト化１５Ｄ５抗体」は、配列番号２２〜２９で示される、重鎖可変鎖、軽鎖可変鎖、相補性決定領域およびフレームワーク領域を含んでなるモノクローナル抗体を意味し；「マウス１Ｄ９抗体」は、配列番号４４〜５１で示される、重鎖可変鎖、軽鎖可変鎖、相補性決定領域およびフレームワーク領域を含んでなるモノクローナル抗体を意味し；「ヒト化１Ｄ９抗体」は、配列番号３０〜３７で示される、重鎖可変鎖、軽鎖可変鎖、相補性決定領域およびフレームワーク領域を含んでなるモノクローナル抗体を意味する。特に、表２の「ヒト化１Ｄ９」モノクローナル抗体は、配列番号３０で示されるアミノ酸配列の重鎖可変領域と配列番号５７で示されるアミノ酸配列の軽鎖可変鎖、ならびに配列番号３０〜３３および配列番号３５〜３７で示される対応する相補性決定領域を含んでなる。
【００６６】
「ＥＣＤ」とは、細胞外ドメインを意味し、ＨＥＲ３に関しては、配列番号２１で示されるアミノ酸配列を有するものなどのＨＥＲ３アイソフォームのうちドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶを含んでなるペプチド鎖を表し得る。
【００６７】
本明細書において「中和する」とは、in vitroまたはin vivoにおいてＨＥＲ３の生物活性が本明細書に記載の抗原結合タンパク質の存在下で、該抗原結合タンパク質の不在下におけるＨＥＲ３の活性と比較して低減されることを意味する。中和は、限定されるものではないが、ＨＥＲ３のそのリガンドへの結合を遮断すること、ＨＥＲ３のそのリガンドによる活性化を防ぐこと、ＨＥＲ３受容体またはそのリガンドをダウンレギュレートすること、受容体の「活性な」（例えば、シグナル伝達能のある）立体配座をとる能力を妨げること、受容体のホモ、ヘテロまたはオリゴマー形成能を遮断すること、またはそうでなければ受容体活性もしくはエフェクター機能に影響を与えることの１以上のによるものであり得る。
【００６８】
ＨＥＲ３受容体活性の測定には、限定されるものではないが、リン酸化受容体（ｐＨＥＲ３）、リン酸化ＡＫＴ（ｐＡＫＴ）、ＨＥＲ３とＨＥＲ（またはその他の）受容体ファミリーのメンバーとの複合体形成、ＰＩ３キナーゼ、ＥＲＫ２、ｃ−ＪｕｎまたはＰＹＫ２活性の低下、ＨＥＲ３発現腫瘍細胞系統の増殖、前記系統の軟寒天内での増殖能（クローン増殖）、このような系統の、リガンドに応答した経膜移動などのレベルを測定する方法が含まれる。
【００６９】
生物活性の低減または阻害は部分的であっても完全なものであってもよい。中和抗原結合タンパク質は、ＨＥＲ３受容体の活性を、抗原結合タンパク質の不在下でのＨＥＲ３活性に比べて少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％中和し得る。機能アッセイでは、ＩＣ５０は、生物学的応答をその最大の５０％低減する濃度である。
【００７０】
中和は、当業者に公知の、または本明細書に記載の１以上のアッセイを用いて判定または測定することができる。例えば、抗原結合タンパク質のＨＥＲ３への結合は、サンドイッチＥＬＩＳＡ、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）、ＦＭＡＴ、ＦＯＲＴＥＢＩＯ（商標）、または同様のin vitroアッセイで評価することができる。
【００７１】
ＥＬＩＳＡに基づく受容体結合アッセイを用い、抗原結合タンパク質の存在下、プレートに固定化されたそのリガンドであるニューレグリン１およびニューレグリン２に対するＨＥＲ３受容体の結合を測定することによって抗原結合タンパク質の中和活性を測定することができる。
【００７２】
あるいは、細胞系受容体結合アッセイを用い、受容体結合、下流シグナル伝達、および遺伝子活性化の阻害を測定することによって抗原結合タンパク質の中和活性を測定することができる。
【００７３】
in vivoにおける中和は、例えば、ＨＥＲ３により媒介される機能および／またはシグナル伝達のいずれか１つまたは組合せの変化（例えば、リン酸化ＨＥＲ３（ｐＨＥＲ３）、リン酸化ＡＫＴ（ｐＡＫＴ）、ＨＥＲ３とＨＥＲ（またはその他の）受容体ファミリーのメンバーとの複合体形成の低下、ＰＩ３キナーゼ、ＥＲＫ２、ｃ−ＪｕｎまたはＰＹＫ２活性の低下）を示す動物における多くの異なるアッセイを用いて、およびまた、例えば腫瘍異種移植モデルにおいて腫瘍細胞増殖を妨げる、低減する、または減退させる抗原結合タンパク質の能力を測定することによって、測定することができる。
【００７４】
本明細書において「エフェクター機能」とは、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）により媒介される応答、Ｆｃにより媒介される食作用およびＦｃＲｎ受容体を介した抗体再循環の１以上を意味するものとする。抗体の定常領域と種々のＦｃ受容体（ＦｃＲ）の間の相互作用は、抗体のエフェクター機能を媒介すると考えられている。有意な生物学的作用は、エフェクター機能、特に、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、補体固定（補体依存性細胞傷害性またはＣＤＣ）、食作用（抗体依存性食作用またはＡＤＣＰ）および抗体の半減期／クリアランスの結果であり得る。通常、エフェクター機能媒介能には抗体の抗原への結合が必要であり、全ての抗体が全てのエフェクター機能を媒介するわけではない。
【００７５】
エフェクター機能は、例えば、ＡＤＣＣエフェクター機能の測定のための、ＦｃγＲＩＩＩのナチュラルキラー細胞への結合またはＦｃγＲＩの単球／マクロファージへの結合を介するものを含む、いくつかの方法で測定することができる。例えば、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、ナチュラルキラー細胞アッセイで等価の野生型抗体またはその抗原結合フラグメントに対して測定した場合に、高いＡＤＣＣエフェクター機能を示す。このようなアッセイの例は、Shields et al, 2001 The Journal of Biological Chemistry, Vol. 276, p6591-6604; Chappel et al, 1993 The Journal of Biological Chemistry, Vol 268, p25124-25131; Lazar et al, 2006 PNAS, 103; 4005-4010に見出すことができる。ＣＤＣ機能を測定するためのアッセイの例としては、1995 J Imm Meth 184:29-38に記載されているものが挙げられる。
【００７６】
所望のエフェクター特性に応じて、抗体の重鎖定常領域に対して種々の改変を行うことができる。ａ）従来経路による補体の活性化；およびｂ）抗体依存性細胞傷害性の媒介、の機能を実質的に欠くヒト定常領域は、ＩｇＧ４定常領域およびＩｇＧ２定常領域を含む。特定の突然変異を含むＩｇＧ１定常領域は、Ｆｃ受容体との結合を低下させることと、それゆえＡＤＣＣおよびＣＤＣを低下させることが別々に記載されている(Duncan et al. Nature 1988, 332; 563-564; Lund et al. J. Immunol. 1991, 147; 2657-2662; Chappel et al. PNAS 1991, 88; 9036-9040; Burton and Woof, Adv. Immunol. 1992, 51;1-84; Morgan et al., Immunology 1995, 86; 319-324; Hezareh et al., J. Virol. 2001, 75 (24); 12161-12168)。残基Ａｓｎ２９７における特定の突然変異またはグリコシル化の変更を含むヒトＩｇＧ１定常領域がＦｃ受容体への結合を増強することもまた記載されている。また、これらがＡＤＣＣおよびＣＤＣを増強する場合もあることも示されている(Lazar et al. PNAS 2006, 103; 4005-4010; Shields et al. J Biol Chem 2001, 276; 6591-6604; Nechansky et al. Mol Immunol, 2007, 44; 1815-1817)。
【００７７】
ＩｇＧ抗体では、ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰを含むエフェクター機能は、重鎖定常領域と免疫細胞の表面に存在するＦｃγ受容体ファミリーとの相互作用によって媒介される。ヒトの場合、これらにはＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）が含まれる。抗原に結合した抗体とＦｃ／Ｆｃγ複合体の形成との間の相互作用は、細胞傷害性、免疫細胞活性化、食作用および炎症性サイトカインの放出をはじめとする一定範囲の作用を誘導する。定常領域における特定の置換（Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅを含む）は、ある特定のＦｃ受容体に対する重鎖定常領域の親和性を高め、従って、その抗体のエフェクター機能を増強することが知られている(Lazar et al. PNAS 2006)。本明細書において「由来する」とは、その材料の物理的起源であるという意味で供給源を定義するだけでなく、対照供給源に起源しないが、その材料と構造上同一である材料を定義することを意図するものであることは当業者には明白である。よって、「ドナー抗体に見られる残基」は、必ずしもドナー抗体から精製されたものである必要はない。
【００７８】
「単離された」とは、抗原結合タンパク質または核酸などの分子が、それが本来見出され得る環境から取り出されていることを意図する。例えば、この分子は、本来それが通常一緒に存在する物質から精製されてもよい。例えば、サンプル中のこの分子の質量は全質量の９５％であり得る。
【００７９】
本明細書において「発現ベクター」とは、目的の核酸を真核細胞もしくは原核細胞などの細胞、または目的の核酸配列がタンパク質などのペプチド鎖として発現される無細胞発現系に導入するために使用可能な単離された核酸を意味する。このような発現ベクターは、例えば、コスミド、プラスミド、ウイルス配列、トランスポゾン、および目的の核酸を含んでなる直鎖核酸であり得る。発現ベクターが細胞または無細胞発現系（例えば、網状赤血球溶解液）に導入されると、目的の核酸によりコードされているタンパク質が転写／翻訳機構によって産生される。本開示の範囲内の発現ベクターは、真核生物または原核生物での発現に必要な要素を提供することができ、ウイルスプロモーター駆動ベクター（例えば、ＣＭＶプロモーター駆動ベクター、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＥＰ４およびそれらの誘導体）、バキュロウイルス発現ベクター、ショウジョウバエ発現ベクター、およびヒトＩｇ遺伝子プロモーターなどの哺乳類遺伝子プロモーターにより駆動される発現ベクターが挙げられる。他の例としては、原核生物発現ベクター（例えば、Ｔ７プロモーター駆動ベクター、例えば、ｐＥＴ４１）、ラクトースプロモーター駆動ベクターおよびアラビノース遺伝子プロモーター駆動ベクターが挙げられる。当業者ならば、他の多くの好適な発現ベクターおよび発現系を認識することができるであろう。
【００８０】
本明細書において「組換え宿主細胞」とは、細胞へのその導入に先立って単離された目的の核酸配列を含んでなる細胞を意味する。例えば、目的の核酸配列は発現ベクター内にあってよく、なお、この細胞は原核細胞でも真核細胞でもよい。真核細胞の例としては、限定されるものではないが、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、ＨｅｐＧ２、６５３、ＳＰ２／０、ＮＳ０、２９３、ＨｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫細胞またはそれらの任意の誘導体などの哺乳類細胞がある。最も好ましくは、真核細胞はＨＥＫ２９３、ＮＳ０、ＳＰ２／０またはＣＨＯ細胞である。大腸菌(E. coli)は、原核細胞の一例である。本開示による組換え細胞は、トランスフェクション、細胞融合、不死化、または当技術分野で周知の他の手法によって作製することができる。細胞にトランスフェクトされた目的の核酸配列（発現ベクターなど）は、染色体外にあってもよいし、またはその細胞の染色体に安定に組み込まれてもよい。
【００８１】
「キメラ抗体」とは、アクセプター抗体に由来する軽鎖および重鎖定常領域と会合した、ドナー抗体に由来する天然可変領域（軽鎖および重鎖）を含む、作出された抗体の一種を意味する。
【００８２】
「ヒト化抗体」とは、非ヒトドナー免疫グロブリンに由来するそのＣＤＲを有し、その分子の残りの免疫グロブリン由来部分は１以上のヒト免疫グロブリンに由来している、作出された抗体の一種を意味する。さらに、フレームワーク支持残基は、結合親和性を保持するために変更することができる（例えば、Queen et al. Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson, et al., Bio/Technology, 9:421 (1991)を参照)。好適なヒトアクセプター抗体は、ドナー抗体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列との相同性により、慣用データベース、例えば、ＫＡＢＡＴ（商標）データベース、ロス・アラモス・データベースおよびスイス・プロテイン・データベースから選択されるものであり得る。ドナー抗体のフレームワーク領域との相同性（アミノ酸に基づく）により同定されたヒト抗体は、ドナーＣＤＲの挿入のための重鎖定常領域および／または重鎖可変フレームワーク領域を提供するのに適切であり得る。軽鎖定常領域または可変フレームワーク領域を供与し得る適切なアクセプター抗体も同様にして選択することができる。アクセプター抗体重鎖および軽鎖は同じアクセプター抗体に起源する必要はないということに留意されたい。従来技術には、このようなヒト化抗体を生産するいくつかの方法の記載がある（例えば、ＥＰ−Ａ−０２３９４００およびＥＰ−Ａ−０５４９５１参照）。
【００８３】
「ドナー抗体」とは、その可変領域、ＣＤＲ、または他の機能的フラグメントもしくはその類似体のアミノ酸配列を第１の免疫グロブリンパートナーに与える抗体を意味する。よって、このドナーは、変更された免疫グロブリンコード領域と、結果として発現される、ドナー抗体に特徴的な抗原特異性および中和活性を有する、変更された抗体を提供する。
【００８４】
「アクセプター抗体」とは、ドナー抗体とは異種であり、その重鎖および／もしくは軽鎖フレームワーク領域、ならびに／またはその重鎖および／または軽鎖定常領域をコードするアミノ酸配列の全て（または任意の一部）を第１の免疫グロブリンパートナーに与える抗体を意味する。ヒト抗体はアクセプター抗体であり得る。
【００８５】
「ＶＨ」および「ＶＬ」とは、抗原結合タンパク質の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をそれぞれ意味して本明細書で用いられる。
【００８６】
「ＣＤＲ」とは、抗原結合タンパク質の相補性決定領域のアミノ酸配列と定義される。これらは免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変領域である。免疫グロブリンの可変部分には、３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲ（またはＣＤＲ領域）が存在する。従って、本明細書において「ＣＤＲ」とは、３つ全ての重鎖ＣＤＲ、３つ全ての軽鎖ＣＤＲ、全ての重鎖および軽鎖ＣＤＲ、または少なくとも１つのＣＤＲを意味し、ここで、少なくとも１つのＣＤＲはＣＤＲＨ３である。
【００８７】
本明細書を通して、可変ドメイン配列および全長抗体配列のアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔナンバリング法に従って付番されている。同様に、実施例において用いる「ＣＤＲ」、「ＣＤＲＬ１」、「ＣＤＲＬ２」、「ＣＤＲＬ３」、「ＣＤＲＨ１」、「ＣＤＲＨ２」、「ＣＤＲＨ３」もＫａｂａｔナンバリング法に従う。詳細については、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第4版, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)を参照。
【００８８】
可変ドメイン配列および全長抗体配列のアミノ酸残基に関する別のナンバリング法も存在することは、当業者には明らかである。また、ＣＤＲ配列に関しても、例えば、Chothia, et al. (1989) Nature 342: 877-883に示されているものなどの別のナンバリング法が存在する。抗体の構造およびタンパク質折り畳みは、他の残基もＣＤＲ配列の一部とみなせることを意味する場合があり、当業者ならばこういったことが理解できるであろう。
【００８９】
当業者に利用可能なＣＤＲ配列の他のナンバリング法としては、「ＡｂＭ」法（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂａｔｈ）および「ｃｏｎｔａｃｔ」（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｌｏｎｄｏｎ）法がある。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭおよびｃｏｎｔａｃｔ法のうち少なくとも２つを用いて最小重複領域を決定し、「最小結合単位」を設定することができる。最小結合単位は、１つのＣＤＲの一部分であり得る。
【００９０】
下記の表３は、各ＣＤＲまたは結合単位に対して各ナンバリング法を用いた１つの定義を表す。Ｋａｂａｔナンバリング法は表３で可変ドメインアミノ酸配列のナンバリングのために使用されている。ＣＤＲ定義には、用いる個々の刊行物によって違うものがあること留意されたい。
【００９１】
【表３】
2013544492.tif 000004
【００９２】
本明細書において「抗原結合部位」とは、抗原に特異的に結合することができる抗原結合タンパク質上の部位を意味する。これは単一ドメイン（例えば、エピトープ結合ドメイン）もしくは１本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）ドメインであってよく、または標準的な抗体に見られるような、対合したＶＨ／ＶＬドメインであってもよい。
【００９３】
本明細書において「エピトープ」とは、抗原結合タンパク質の特定の結合ドメインと接触する抗原の部分を意味する。エピトープは、抗原に由来する本質的に直鎖のアミノ酸配列を含んでなる直鎖であってよい。あるいは、エピトープは、配座型(conformational)であっても不連続型であってもよい。例えば、配座エピトープは、構造制約要素を必要とするアミノ酸残基を含んでなる。不連続エピトープは、他の配列により分離された、すなわち、抗原の一次配列においては連続した配列ではないアミノ酸残基を含んでなる。その抗原の３次および４次構造上、不連続エピトープのこれらの残基は、抗原結合タンパク質が結合するに十分近接する。
【００９４】
ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に関して「同一」または「配列同一性」とは、適当な挿入または削除を伴って最適にアラインして比較した場合の、２つの核酸配列または２つのアミノ酸配列間の同一性の程度を示す。
【００９５】
２つの配列間の同一性％は、それらの配列が共通に持つ同一位置の数の関数であり（すなわち、同一性％＝同一位置の数／位置の総数×１００）、その２配列の最適なアライメントのために導入する必要のあるギャップの数および各ギャップの長さを考慮する。２配列間の配列比較および同一性％の決定は、下記のような数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。
【００９６】
２つのヌクレオチド配列間の同一性％は、ＧＣＧソフトウエアパッケージのＧＡＰプログラムを使用し、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクスおよびギャップウェイト４０、５０、６０、７０または８０およびギャップレングス１、２、３、４、５または６を用いて決定することができる。２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間の同一性％はまた、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているMeyers, et al., Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)のアルゴリズムを使用し、ＰＡＭ１２０ウエイト・レシジュ・テーブル、ギャップレングスペナルティー１２およびギャップペナルティー４を用いて決定することができる。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性％は、ＧＣＧソフトウエアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedleman, et al., J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)アルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれか、およびギャップウェイト１６、１４、１２、１０、８、６もしくは４およびレングスウェイト１、２、３、４、５もしくは６を用いて決定することができる。
【００９７】
例として、ポリヌクレオチド配列は、参照配列と１００％同一である参照ポリヌクレオチド配列と同一であり得、または参照配列と比較した際にある整数値（例えば、少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８もしくは９９％同一）までのヌクレオチド変異を含み得る。このような変異は少なくとも１つのヌクレオチド欠失、置換（塩基転位(transition)および塩基転換(Transversion)を含む）または挿入から選択され、なお、これらの変異は参照ヌクレオチド配列の５’末端もしくは３’末端、またはこれらの末端位の間のいずれの位置に存在してもよく、参照配列のヌクレオチド間に個々に、もしくは参照配列内に１以上の連続する群として点在していてもよい。ヌクレオチド変異の数は、本明細書に記載される参照ポリヌクレオチド配列のヌクレオチド総数に個々の同一性％のパーセント数（１００で割る）を掛け、その積を参照ポリヌクレオチド配列の前記ヌクレオチド総数から引くことによって求められる。すなわち：
ｎｎ≦ｘｎ−（ｘｎ・ｙ）
式中、ｎｎはヌクレオチド変異の数であり、ｘｎは本明細書に記載される参照ポリヌクレオチド配列（参照ポリヌクレオチド配列例の「配列表」の核酸配列を参照）のヌクレオチド総数であり、ｙは、５０％であれば０．５０、６０％であれば０．６０、７０％であれば０．７０、７５％であれば０．７５、８０％であれば０．８０、８５％であれば０．８５、９０％であれば０．９０、９５％であれば０．９５、９８％であれば０．９８、９９％であれば０．９９、または１００％であれば１．００であり、・は掛け算の記号であり、ｘｎとｙの積が整数でない場合には、ｘｎからそれを引く前に端数を切り捨てて最も近い整数にする。
【００９８】
同様に、ポリペプチド配列は、本明細書に記載されるポリペプチド参照配列（参照ポリペプチド配列例の「配列表」のアミノ酸配列を参照）と同一であり得（すなわち、１００％同一）、または参照配列と比較した際にある整数値までのアミノ酸変異を含んでもよく、その結果、同一性％は１００％未満、例えば、少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８または９９％同一となる。このような変異は少なくとも１つのアミノ酸欠失、置換（保存的および非保存的置換を含む）または挿入からなる群から選択され、なお、これらの変異は参照ポリペプチド配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端、またはこれらの末端位の間のいずれの位置に存在してもよく、参照配列のアミノ酸間に個々に、もしくは参照配列内に１以上の連続する群として点在していてもよい。ある同一性％のアミノ酸変異の数は、ポリペプチド参照配列によりコードされるポリペプチド配列のアミノ酸総数に個々の同一性％のパーセント数（１００で割る）を掛け、その積を本明細書に記載されるポリペプチド参照配列（例えば、配列番号１〜２１参照）の前記アミノ酸総数から引くことによって求められる。すなわち：
ｎａ≦ｘａ−（ｘａ・ｙ）
式中、ｎａはアミノ酸変異の数であり、ｘａは参照ポリペプチド配列のアミノ酸総数であり、ｙは、５０％であれば０．５０、６０％であれば０．６０、７０％であれば０．７０、７５％であれば０．７５、８０％であれば０．８０、８５％であれば０．８５、９０％であれば０．９０、９５％であれば０．９５、９８％であれば０．９８、９９％であれば０．９９、または１００％であれば１．００であり、・は掛け算の記号であり、ｘａとｙの積が整数でない場合には、ｘａからそれを引く前に端数を切り捨てて最も近い整数にする。
【００９９】
同一性％はその配列の全長にわたって求めてよい。本明細書に定義されるように、「７５％を越える同一性」とは、７５％、８０％、８５％、９５％および９９を越える同一性％、ならびにこの範囲内のあらゆる別個の値、および別個の部分範囲を含む。
【０１００】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」はそれぞれ、２以上のアミノ酸残基を含んでなる分子を意味する。ペプチドは単量体または多量体であり得る。
【０１０１】
当技術分野においては、ある種のアミノ酸置換が「保存的」であるとみなされることは十分に認識されている。アミノ酸は共通する側鎖の特性に基づいていくつかの群に分けられ、抗原結合タンパク質の結合親和性の総てまたは実質的に総てを維持する群内での置換は保存的置換とみなされる。表４参照。本明細書に開示される抗原結合タンパク質は、「保存的」アミノ酸置換を含んでなり得る。
【０１０２】
【表４】
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【０１０３】
本開示の一態様は、配列番号２、配列番号３および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列と７５％を越える配列同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを有する重鎖可変領域；ならびに／または配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを有する軽鎖可変領域とを含んでなり、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。本開示の抗原結合タンパク質は、本明細書に開示されるマウスまたはヒト化１Ｄ９、１５Ｄ５、２２Ａ５モノクローナル抗体に由来するＣＤＲＨ３などの少なくとも１つのＣＤＲＨ３を含んでなることが好ましい。
【０１０４】
本開示はまた、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合タンパク質を提供し、ここで、該抗原結合タンパク質はキメラ抗体およびヒト化抗体からなる群から選択される。
【０１０５】
本開示はまた、配列番号２で示されるＣＤＲアミノ酸配列、配列番号３で示されるＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号４で示されるＣＤＲアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；ならびに配列番号６で示されるＣＤＲアミノ酸配列、配列番号７で示されるＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号８で示されるＣＤＲアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含んでなり、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合タンパク質を提供する。
【０１０６】
本開示はまた、配列番号２１のアミノ酸残基１８４〜３２９を含んでなるペプチド鎖ドメインに特異的に結合する抗原結合タンパク質を提供する。配列番号２１のアミノ酸残基１８４〜３２９は、ＨＥＲ３のドメインＩＩを含んでなる。ＨＥＲ３のドメインＩＩは、ヘテロ二量体形成などの二量体形成に関与する。
【０１０７】
本開示の別の態様は、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５からなる群から選択されるアミノ酸配列と７５％を越える配列同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを有する重鎖可変領域；ならびに／または配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９からなる群から選択されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを有する軽鎖可変領域を含んでなり、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。
【０１０８】
本開示はまた、配列番号２３で示されるＣＤＲアミノ酸配列、配列番号２４で示されるＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号２５で示されるＣＤＲアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；ならびに配列番号２７で示されるＣＤＲアミノ酸配列、配列番号２８で示されるＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号２９で示されるＣＤＲアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含んでなり、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合タンパク質を提供する。
【０１０９】
本開示の別の態様は、配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７からなる群から選択されるアミノ酸配列と７５％を越える配列同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを有する重鎖可変領域；ならびに／または配列番号４９、配列番号５０および配列番号５１からなる群から選択されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを有する軽鎖可変領域を含んでなり、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。
【０１１０】
本開示はまた、配列番号４５で示されるＣＤＲアミノ酸配列、配列番号４６で示されるＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号４７で示されるＣＤＲアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；ならびに／または配列番号４９で示されるＣＤＲアミノ酸配列、配列番号５０で示されるＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号５１で示されるＣＤＲアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含んでなり、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合タンパク質を提供する。
【０１１１】
本開示はまた、配列番号２１のアミノ酸残基３３０〜４９５を含んでなるペプチド鎖ドメインに特異的に結合する抗原結合タンパク質を提供する。配列番号２１のアミノ酸残基３３０〜４９５は、ＨＥＲ３のドメインＩＩＩを含んでなる。ＨＥＲ３のドメインＩＩＩは、ＨＥＲ３受容体によるリガンド結合に関与する。
【０１１２】
本開示の別の態様は、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３からなる群から選択されるアミノ酸配列と７５％を越える配列同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを有する重鎖可変領域；ならびに／または配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７からなる群から選択されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを有する軽鎖可変領域を含んでなり、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。
【０１１３】
本開示の別の態様は、配列番号３１で示されるＣＤＲアミノ酸配列、配列番号３２で示されるＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号３３で示されるＣＤＲアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；ならびに／または配列番号３５で示されるＣＤＲアミノ酸配列、配列番号３６で示されるＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号３７で示されるＣＤＲアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含んでなり、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。
【０１１４】
本開示の別の態様は、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列と７５％を越える配列同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを有する重鎖可変領域；ならびに／または配列番号１２、配列番号７、配列番号８、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを有する軽鎖可変領域を含んでなり、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。
【０１１５】
本開示はまた、配列番号１０で示されるＣＤＲアミノ酸配列、配列番号１１で示されるＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号１２で示されるＣＤＲアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；ならびに配列番号１２で示されるＣＤＲアミノ酸配列、配列番号７で示されるＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号８で示されるＣＤＲアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域か、または配列番号１８ＣＤＲで示されるアミノ酸配列、配列番号１９で示されるＣＤＲアミノ酸配列、および配列番号２０で示されるＣＤＲアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域かを含んでなり、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質を提供する。
【０１１６】
本開示はまた、ＨＥＲ３に特異的に結合し、かつ、配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含んでなる二量体の形成を阻害する抗原結合タンパク質を提供する。当業者が十分に認識するように、二量体形成の阻害は、本開示の抗原結合タンパク質の存在下と不在下の双方で二量体の量をアッセイすることによって判定することができる。このような二量体形成アッセイは当技術分野で周知であり、例えば、共沈降に基づくアッセイまたは２ハイブリッドアッセイが挙げられる。
【０１１７】
本開示の別の態様は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列と、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列とを含んでなり、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。
【０１１８】
本開示の別の態様は、配列番号２２で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列と、配列番号２６で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列とを含んでなり、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。
【０１１９】
本開示の別の態様は、配列番号４４で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列と、配列番号４８で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列とを含んでなり、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。
【０１２０】
本開示の別の態様は、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列と、配列番号３４で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列とを含んでなり、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。
【０１２１】
本開示の別の態様は、配列番号９で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列と、配列番号１３で示されるアミノ酸配列および配列番号１７で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖可変領域配列とを含んでなり、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。
【０１２２】
本開示の別の態様は、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列と、配列番号５７で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列とを含んでなり、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。
【０１２３】
本開示はまた、本明細書に記載の抗原結合タンパク質をコードする単離された核酸を提供する。
【０１２４】
本開示はまた、配列番号３８で示される核酸配列および配列番号３９で示される核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つの核酸を含んでなる単離された核酸を提供する。
【０１２５】
本開示はまた、配列番号５９で示される核酸配列および配列番号６０で示される核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つの核酸を含んでなる単離された核酸を提供する。
【０１２６】
本開示はまた、配列番号４０で示される核酸配列および配列番号４１で示される核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つの核酸を含んでなる単離された核酸を提供する。
【０１２７】
本開示はまた、配列番号５２で示される核酸配列および配列番号５３で示される核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つの核酸を含んでなる単離された核酸を提供する。
【０１２８】
本開示はまた、配列番号４２で示される核酸配列および配列番号４３で示される核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つの核酸を含んでなる単離された核酸を提供する。
【０１２９】
本開示はまた、配列番号４２で示される核酸配列および配列番号５８で示される核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つの核酸を含んでなる単離された核酸を提供する。
【０１３０】
本開示はまた、配列番号５４で示される核酸配列、配列番号５５で示される核酸配列、および配列番号５６で示される核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つの核酸を含んでなる単離された核酸を提供する。
【０１３１】
本開示はまた、配列番号６３で示される核酸配列、配列番号６４で示される核酸配列、および配列番号６５で示される核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つの核酸を含んでなる単離された核酸を提供する。
【０１３２】
本開示はまた、本明細書に記載の単離された核酸を含んでなる発現ベクターを提供する。
【０１３３】
本開示はまた、本明細書に記載の単離された核酸を含んでなる発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞を提供する。
【０１３４】
本開示はまた、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合タンパク質の生産方法であって、本明細書に記載の単離された核酸を含んでなる発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞を培養する工程；および前記抗原結合タンパク質を回収する工程を含んでなる方法を提供する。
【０１３５】
本開示はまた、本明細書に記載の抗原結合タンパク質と薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物を提供する。
【０１３６】
本開示はまた、被験体において癌を治療する方法であって、治療上有効な量の本明細書に記載の抗原結合タンパク質を前記被験体に投与し、それにより、前記被験体の癌が治療される工程を含んでなる方法を提供する。
【０１３７】
本開示はまた、哺乳類において癌を治療する方法であって、治療上有効な量の本明細書に記載の抗原結合タンパク質投与することを含んでなる方法を提供する。
【０１３８】
本開示の方法の別の態様では、哺乳類はヒトである。
【０１３９】
本開示の方法の別の態様では、癌は乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、皮膚癌、胃癌および黒色腫から選択される。
【０１４０】
一実施形態では、また、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、皮膚癌、胃癌および黒色腫の治療において用いるための本明細書に記載の抗原結合タンパク質も提供される。
【０１４１】
本開示はまた、被験体において癌を治療する方法であって、ａ）乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、皮膚癌、胃癌および黒色腫からなる群から選択される癌を有する被験体を特定する工程；およびｂ）治療上有効な量の本明細書に記載の抗原結合タンパク質を前記被験体に投与し、それにより、被験体の癌が治療される工程を含んでなる方法を提供する。
【０１４２】
本開示はまた、ｃ）前記癌が配列番号２１のアミノ酸残基１８４〜３２９を含んでなるタンパク質を発現することを判定する工程をさらに含んでなる治療方法も提供する。このような判定は、未加工の癌細胞のアッセイ、またはこのような細胞の調製物、例えば、様々な異なる技術および試薬（例えば、配列番号２１のアミノ酸残基１８４〜３２９を含んでなるペプチド鎖ドメインに特異的に結合する抗原結合タンパク質、または配列番号２１のアミノ酸残基１８４〜３２９をコードする核酸配列に特異的な核酸プライマーもしくはプローブなど）による、溶解液もしくは免疫組織化学（ＩＨＣ）標本によって行うことができる。このような判定は、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）をはじめとするフローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、サザンブロット法、ノーザンブロット法または核酸マイクロアレイ分析の使用によって行ってもよい。このような判定は、適当な陽性対照および陰性対照と比較して、または事前に採取したデータセット（例えば、特定の細胞または組織種での配列番号２１のアミノ酸残基１８４〜３２９の平均発現）に基づいて行ってもよい。
【０１４３】
本開示はまた、タンパク質が配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含んでなる場合の治療方法を提供する。本開示の治療方法は、前記被験体の少なくとも１つの腫瘍細胞が配列番号２１もしくはその一部、例えば、ＨＥＲ３のドメインＩＩもしくはドメインＩＩＩをコードする遺伝子の増幅、または配列番号２１もしくはその一部をコードするＲＮＡ転写物の増幅を有するかどうかを判定することをさらに含んでなり得る。
【０１４４】
本開示はまた、ｃ）前記癌が配列番号２１のアミノ酸残基３３０〜４９５を含んでなるタンパク質を発現することを判定する工程をさらに含んでなる治療方法を提供する。このような判定は、無傷な癌細胞のアッセイ、またはこのような細胞の調製物、例えば、様々な異なる技術および試薬（例えば、配列番号２１のアミノ酸残基３３０〜４９５に特異的に結合する抗原結合タンパク質、または配列番号２１のアミノ酸残基３３０〜４９５をコードする核酸配列に特異的な核酸プライマーもしくはプローブなど）による、溶解液もしくは免疫組織化学（ＩＨＣ）標本によって行うことができる。このような判定は、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）をはじめとするフローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、サザンブロット法、ノーザンブロット法または核酸マイクロアレイ分析の使用によって行ってもよい。このような判定は、適当な陽性対照および陰性対照と比較して、または事前に採取したデータセット（例えば、特定の細胞または組織種での配列番号２１のアミノ酸残基３３０〜４９５の平均発現）に基づいて行ってもよい。
【０１４５】
本開示はまた、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、皮膚癌、胃癌および黒色腫からなる群から選択される病態の治療のための薬剤の製造における、抗原結合タンパク質などの本明細書に記載の物質の使用を提供する。
【０１４６】
本開示はまた、脳腫瘍（神経膠腫）、膠芽腫、バナヤン−ゾナナ(Bannayan-Zonana)症候群、カウデン病、レルミット−デュクロ (Lhermitte-Duclos)病、乳癌、炎症性乳癌、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、脳室上衣細胞腫、髄芽細胞腫、結腸癌、頭頚部癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、肉腫、骨肉腫、骨巨細胞腫、甲状腺癌、リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性好中球性白血病、急性リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、形質細胞腫、免疫芽球性大細胞白血病、マントル細胞白血病、多発性骨髄腫巨核芽球性白血病、多発性骨髄腫、急性巨核球性白血病、前骨髄球性白血病、赤白血病、悪性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、リンパ芽球性Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、神経芽腫、膀胱癌、尿路上皮癌、肺癌、外陰癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、腎臓癌、中皮腫、食道癌、唾液腺癌、肝細胞癌、胃癌、鼻咽頭癌、頬粘膜癌癌、口腔癌、ＧＩＳＴ（消化管間質腫瘍）および精巣癌から選択される癌を治療する、またはその重篤度を軽減する方法に関する。
【０１４７】
本開示の別の態様は、配列番号２１のアミノ酸残基１８４〜３２９を含んでなるペプチド鎖ドメインに特異的に結合する抗原結合タンパク質である。
【０１４８】
本開示の別の態様は、配列番号２１のアミノ酸残基３３０〜４９５を含んでなるペプチド鎖ドメインに特異的に結合する抗原結合タンパク質である。
【０１４９】
本開示はまた、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合タンパク質の生産方法であって、ａ）本明細書に記載の単離された核酸を含んでなる発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞を培養する工程（ここで、該組換え宿主細胞では、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が不活性化されている）；およびｂ）前記抗原結合タンパク質を回収する工程を含んでなり、それにより抗原結合タンパク質が生産される方法を提供する。抗原結合タンパク質のこのような生産方法は、例えば、ＢｉｏＷａ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）から入手可能なポテリジェント（商標）技術システムを用いて行うことができ、この場合、ＦＵＴ８遺伝子の機能的コピーを欠くＣＨＯＫ１ＳＶ細胞が、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）が増強された（機能的ＦＵＴ８遺伝子を有する細胞において産生される同じモノクローナル抗体に比べて増強されている）モノクローナル抗体を産生する。ポテリジェント（商標）技術システムの態様は、ＵＳ７２１４７７５、ＵＳ６９４６２９２、ＷＯ００６１７３９およびＷＯ０２３１２４０に記載されており、これらは総て引用することにより本明細書の一部とされる。当業者ならば、他の適当なシステムも認識することができるであろう。さらに、組換え宿主細胞により発現された抗原結合タンパク質の回収方法も当技術分野で周知であり、親和性に基づくクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、およびサイズ排除に基づくクロマトグラフィーが含まれる。
【０１５０】
本開示の抗原結合タンパク質は、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）としても提供してもよい。本抗原結合タンパク質はプロテアーゼ切断が可能なペプチドリンカーを介して化学療法薬とコンジュゲートさせてもよい。オーリスタチンはこのような化学療法薬の一例である。好適なオーリスタチンの例としては、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）およびモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）が挙げられる。他の好適な化学療法薬も本明細書に記載されている。当業者ならば、他の好適な化学療法薬を認識することができるであろう。コンジュゲートはまた、反応性基から生じる化学結合を介して化学療法薬と抗原結合タンパク質を架橋させることによって作製してもよい。
【０１５１】
本開示はまた、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合タンパク質の生産方法を提供し、ここで、組換え宿主細胞はＣＨＯＫ１ＳＶ細胞である。
【０１５２】
本開示はまた、開示された抗原結合タンパク質の生産方法によって生産された、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合タンパク質も提供する。
【０１５３】
本開示はまた、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合タンパク質の生産方法であって、ａ）本明細書に記載の単離された核酸を含んでなる発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞を培養する工程（該発現ベクターはＩｇＧ１  Ｆｃドメインアミノ酸残基とＩｇＧ３  Ｆｃドメインアミノ酸残基の双方を有するキメラＦｃドメインをコードするＦｃ核酸配列を含んでなる）；およびｂ）前記抗原結合タンパク質を回収する工程を含んでなり、それにより抗原結合タンパク質が生産される方法を提供する。このような抗原結合タンパク質の生産方法は、例えば、ＢｉｏＷａ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）および協和発酵工業株式会社（現、協和発酵キリン株式会社）から入手可能なコンプリジェント(COMPLEGENT)（商標）技術システムを用いて行うことができ、この場合、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインアミノ酸残基とＩｇＧ３  Ｆｃドメインアミノ酸残基の双方を有するキメラＦｃドメインをコードするＦｃ核酸配列が抗体重鎖に融合されている発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞が発現されて、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）が増強された（このようなキメラＦｃドメインを欠いた、それ以外の点では同じモノクローナル抗体に比べて増強されている）抗原結合タンパク質が産生される。コンプリジェント（商標）技術システムの態様は、ＷＯ２００７０１１０４１およびＵＳ２００７０１４８１６５記載されており、これらはそれぞれ引用することにより本明細書の一部とされる。本開示の方法において、ＣＤＣ活性はまた、ＩｇＧ鎖のＦｃ領域に配列特異的突然変異を導入することによっても増強することができる。当業者ならば、他の好適な化学療法薬を認識することができるであろう。
【０１５４】
本開示はまた、Ｆｃ核酸配列が配列番号４０で示される核酸配列および配列番号４２で示される核酸配列からなる群から選択される核酸にインフレームで融合されている、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合タンパク質の生産方法を提供する。このような抗原結合タンパク質の生産方法は、例えば、ＢｉｏＷａ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）から入手可能なアクリタマブ（商標）技術システムをポテリジェント（商標）およびコンプリジェント（商標）技術システムと併用することにより行い、ＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性の双方が増強された（キメラＦｃドメインを欠いた、それ以外の点では同じモノクローナル抗体に比べて増強されている）抗原結合タンパク質を産生することができる。
【０１５５】
本開示はまた、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合タンパク質の生産方法であって、ａ）本明細書に記載の単離された核酸を含有する発現ベクターを含有する組換え宿主細胞を培養する工程（該発現ベクターはＩｇＧ１  Ｆｃドメインアミノ酸残基とＩｇＧ３  Ｆｃドメインアミノ酸残基の双方を有するキメラＦｃドメインをコードするＦｃ核酸配列をさらに含んでなり、かつ、該組換え宿主細胞では、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が不活性化されている）；およびｂ）前記抗原結合タンパク質を回収する工程を含んでなり、それにより、機能的ＦＵＴ８遺伝子を有する細胞において抗原結合タンパク質が生産される方法を提供する。
【０１５６】
本開示はまた、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合タンパク質の生産方法であって、Ｆｃ核酸配列が配列番号４０で示される核酸配列および配列番号４２で示される核酸配列からなる群から選択される核酸とインフレームで融合されている方法を提供する。
【０１５７】
本開示はまた、被験体において前癌状態を治療する方法であって、治療上有効な量の本明細書に記載の抗原結合タンパク質を前記被験体に投与し、それにより、被験体の前癌状態が治療される工程を含んでなる方法を提供する。
【０１５８】
本開示はまた、被験体において前癌状態を治療する方法であって、ａ）前癌状態を有する被験体を特定する工程；およびｂ）治療上有効な量の本開示の抗原結合タンパク質を前記被験体に投与し、それにより、被験体の前癌状態が治療される工程を含んでなる方法を提供する。
【０１５９】
本開示はまた、被験体において前癌状態を治療する方法であって、ｃ）前記癌が配列番号２１のアミノ酸残基１８４〜３２９を含んでなるタンパク質を発現することを判定する工程をさらに含んでなる方法を提供する。
【０１６０】
本開示はまた、被験体において前癌状態を治療する方法であって、タンパク質が配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含んでなる方法を提供する。
【０１６１】
本開示はまた、被験体において前癌状態を治療する方法であって、ｃ）前記癌が配列番号２１のアミノ酸残基３３０〜４９５を含んでなるタンパク質を発現することを判定する工程をさらに含んでなる方法を提供する。
【０１６２】
本開示の別の態様は、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合し、かつ、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号７で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含んでなる抗原結合タンパク質である。
【０１６３】
本開示の別の態様は、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合し、かつ、配列番号２３で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２４で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、配列番号２５で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号２８で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号２９で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含んでなる抗原結合タンパク質である。
【０１６４】
本開示の別の態様は、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合し、かつ、配列番号３１で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号３２で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、配列番号３３で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号３５で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号３６で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号３７で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含んでなる抗原結合タンパク質である。
【０１６５】
本開示の別の態様は、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合し、かつ、配列番号４５で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号４６で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、配列番号４７で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号４９で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５０で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号５１で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含んでなる抗原結合タンパク質である。
【０１６６】
本開示の別の態様は、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合し、かつ、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号１６で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含んでなる抗原結合タンパク質である。
【０１６７】
本開示の別の態様は、ＨＥＲ３受容体に特異的に結合し、かつ、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、および配列番号２０で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含んでなる抗原結合タンパク質である。
【０１６８】
本開示はまた、医療に用いるための本明細書に記載の医薬組成物を提供する。
【０１６９】
本開示はまた、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、皮膚癌、胃癌および黒色腫の治療に用いるための、本明細書に記載の医薬組成物を提供する。
【０１７０】
開示される、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、抗体、例えば、モノクローナル抗体であり得る。いくつかのこのような抗体例が本明細書に記載され、マウス型の１５Ｄ５、１Ｄ９および２２Ａ５モノクローナル抗体、ならびにヒト化型の１５Ｄ５および１Ｄ９モノクローナル抗体が含まれる。エピトープマッピングアプローチは、１５Ｄ５モノクローナル抗体がＨＥＲ３のドメインＩＩに結合し、リガンドにより誘導される、ＨＥＲ３と他の受容体（例えば、表１のものなど）の間の受容体の二量体形成を阻害または妨害できることを示す。これらには、限定されるものではないが、ＨＥＲ２と他のＨＥＲファミリー受容体、ｃ−ＭＥＴと他のチロシンキナーゼまたは細胞表面受容体が含まれる。ＨＥＲ３の、これらの受容体との相互作用能の阻害または妨害の結果は、受容体により媒介される細胞シグナル伝達プロセスまたはＨＥＲ３依存性である経路の阻害または低減である。
【０１７１】
エピトープマッピングはまた、１Ｄ９モノクローナル抗体がＨＥＲ３のドメインＩＩＩに結合し、ＨＥＲ３リガンドの結合およびヘテロ二量体の形成を阻害することを示す。
【０１７２】
開示される、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、ＨＥＲ３受容体（ＥｒｂＢ３としても知られる）（配列番号２１）に結合してこれを中和し、かつ、ＨＥＲ３受容体との結合に関して、配列番号１または９の重鎖可変領域配列と配列番号５、１３または１７の軽鎖可変領域配列とを含んでなる参照抗体と競合し得る。ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合タンパク質、例えば、マウスおよびヒト化１５Ｄ５モノクローナル抗体は、ＨＥＲ３受容体のドメインＩＩ（配列番号２１の残基１８４〜３２９）に結合し得るが、ドメインＩ（配列番号２１の残基２０〜１８３）、ＩＩＩ（配列番号２１のアミノ酸残基３３０〜４９５）またはＩＶ（ＨＥＲ３受容体（配列番号２１）の配列番号２１のアミノ酸残基４９６〜６４３）には結合しない。ＨＥＲ３受容体のドメインＩＩは、受容体二量体の形成に重要なインターフェースであり、従って、本明細書に記載の２つの抗原結合タンパク質は候補となる二量体形成阻害剤である。ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合タンパク質、例えば、マウスおよびヒト化１Ｄ９抗体もまた、ドメインＩＩＩに結合してリガンドとＨＥＲ３受容体との結合を妨げる。開示される、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合タンパク質はまた、本明細書に記載のマウスまたはヒト化１５Ｄ５、１Ｄ９または２２Ａ５モノクローナル抗体と競合し得る。
【０１７３】
本開示の抗原結合タンパク質、またはこれらを含んでなる医薬組成物はまた、ＨＥＲ３発現などのいくつかの因子に基づく、癌などの過増殖性障害またはＨＥＲ３関連障害に罹患している被験体の治療方法にも使用可能である。このような腫瘍または癌は、限定されるものではないが、乳癌、卵巣癌、消化管癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌、子宮内膜癌、肺癌、腎臓癌、頭頚部癌、神経膠腫、黒色腫および非黒色腫皮膚癌ならびに他の皮膚癌、ならびにＨＥＲ３を発現するまたは過剰発現する他の癌の群から選択され得る。本抗原結合タンパク質はまた、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体形成を阻害するＡＧ１４７８−トラスツズマブの組合せまたはペルツズマブなどの、ＥＧＦＲ標的療法に応答性のあるＨＥＲ３陽性癌を検出するために使用することもできる。例えば、Lee-Hoeflich et al., 68 Cancer. Res. 5875 (2008)およびEmlet et al., 94 Br. J. Cancer 1144 (2006)参照。さらに、本開示の利益は、１）抗ＨＥＲ２  ｍＡｂ耐性患者、２）抗ＨＥＲ２  ｍＡｂ不適格患者、３）抗ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）ｍＡｂ耐性または不適格患者、および４）チロシンキナーゼ（小分子）耐性腫瘍を有する患者、を含む群に属する人々によって引き出される。本開示の抗原結合タンパク質は、単剤療法において単独で使用することもできるし、または該薬剤を本明細書のどこかに明示されている他の薬剤とともに投与する組み合わせ療法アプローチで使用することもできる。本開示は、被験体における癌性腫瘍の阻害もしくは退縮、患者の生存の延長、腫瘍進行までの時間の延長または患者の生活の質の増進をもたらし得る方法を提供し、このような方法は、治療上有効な量の抗原結合タンパク質を単独で、または本明細書で定義される他の特定の薬剤と組み合わせて投与する工程を含んでなる。
【０１７４】
トラスツズマブエムタンシンは、トラスツズマブ−ＤＭ１またはトラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１（Ｔ−ＤＭ１と略）とも呼ばれ、細胞毒素メルタンシン（ＤＭ１）と連結された抗体トラスツズマブ（ハーセプチン（商標））からなる抗体−薬物コンジュゲートである。トラスツズマブエムタンシンは構造：
【化１】
2013544492.tif 000006
を有する。
【０１７５】
本開示の別の実施形態は、哺乳類において癌を治療する方法であって、治療上有効な量の本開示の抗原結合タンパク質を本明細書に記載の少なくとも１種類の他の薬剤とともに投与することを含んでなる方法である。このような薬剤は例えば本開示の５９〜７８頁に記載されている。
【０１７６】
別の実施形態では、少なくとも１種類の他の薬剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブおよびＴ−ＤＭ１からなる群から選択される。
【０１７７】
本開示の抗原結合タンパク質は、限定されるものではないが、乳癌、卵巣癌、消化管癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌、子宮内膜癌、肺癌、腎臓癌、頭頚部癌、神経膠腫、黒色腫および非黒色腫皮膚癌、ならびにＨＥＲ３を発現するまたは過剰発現する他の癌から選択される腫瘍に罹患している被験体を治療するためにも使用可能である。
【０１７８】
本開示の抗原結合タンパク質は、乳癌、卵巣癌、消化管癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌、子宮内膜癌、肺癌、腎臓癌、頭頚部癌、神経膠腫、黒色腫および非黒色腫皮膚癌、ならびにＨＥＲ３を発現するまたは過剰発現する他の癌の治療において使用することもできる。
【０１７９】
本抗原結合タンパク質はＨＥＲ３受容体と結合してこれを中和し、かつ、ＨＥＲ３受容体との結合に関して、配列番号１または９の重鎖可変領域配列と配列番号５、１３または１７の軽鎖可変領域配列とを含んでなる参照抗体と競合し得る。
【０１８０】
あるいは、本抗原結合タンパク質はＨＥＲ３受容体に結合してこれを中和し、かつ、ＨＥＲ３受容体との結合に関して、配列番号１または９の重鎖可変領域配列と配列番号５、１３または１７の軽鎖可変領域配列とを含んでなる参照抗体と競合し得る。いくつかの実施形態では、本抗原結合タンパク質はＨＥＲ２受容体には結合しない。
【０１８１】
前記参照抗体は、下記の重鎖と軽鎖の組合せ：（１）マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０；マウスモノクローナル抗体；配列番号１および５を含んでなる）；（２）マウス２２Ａ５抗体（Ｍ５．２２Ａ５．１Ｇ６．１  Ｃ１０；マウスモノクローナル抗体；配列番号９、１３および１７を含んでなる）；（３）ヒト化１５Ｄ５抗体（ヒト化モノクローナル抗体；配列番号２２および２６を含んでなる）；（４）ヒト化１Ｄ９抗体（ヒト化モノクローナル抗体；配列番号３０および３４を含んでなる）；（５）マウス１Ｄ９抗体（マウスモノクローナル抗体；配列番号４４および４８を含んでなる）；（６）ヒト化１Ｄ９  ＲＲ（ヒト化１Ｄ９＿Ｅ抗体とも呼ばれる；ヒト化モノクローナル抗体；配列番号３０および５７を含んでなる）を含んでなり得る。第２の抗体であるマウス２２Ａ５抗体は、２つの軽鎖可変ドメイン（配列番号１３および１７）を有し、従って、異なる重鎖と軽鎖の組合せが形成される。参照抗体はまた、下記の表１７に記載されている抗体を含んでなってもよい。
【０１８２】
抗原結合タンパク質と参照抗体との競合は、競合ＥＬＩＳＡによって判定することができる。ＨＥＲ３の中和に関する競合は、例えばＥＬＩＳＡ、ＦＭＡＴまたはＢＩＡＣＯＲＥ（商標）で判定されるＨＥＲ３との結合に関する競合；ニューレグリンリガンド１およびニューレグリン２リガンドに対するＨＥＲ３の阻害に関する競合；およびＡ２０４細胞系アッセイにおいてルシフェラーゼの発現をもたらす細胞シグナル伝達の阻害に関する競合のうちのいずれか１つまたは組合せによって判定することができる。競合する抗原結合タンパク質は、同じエピトープ、重複するエピトープ、または参照抗体が結合するエピトープに近接したエピトープに結合し得る。
【０１８３】
本抗原結合タンパク質は、ＨＥＲ３ペプチドフラグメントまたは人工ペプチド配列には有意に結合することができない。本抗原結合タンパク質は、ＨＥＲ３ペプチドフラグメントまたは人工ペプチド配列には、それぞれ抗原結合タンパク質：ペプチドが１：１〜１：１０の比率では結合することができない。
【０１８４】
抗原結合タンパク質とＨＥＲ３受容体ペプチドフラグメントまたは人工ペプチド配列との結合の有無は、ＥＬＩＳＡまたは還元条件を用いるＳＤＳ  ＰＡＧＥによって判定することができる。例えば、抗原結合タンパク質と直鎖全長ＨＥＲ３受容体配列との結合の有無は、還元的ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって判定することができる。
【０１８５】
本開示はまた、ＨＥＲ３受容体に結合してこれを中和し、かつ、配列番号４、１５もしくは２０のＣＤＲＨ３、またはその変異体ＣＤＲを含んでなる抗原結合タンパク質を提供する。
【０１８６】
本抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ１（配列番号２、１０もしくは３１）、ＣＤＲＨ２（配列番号３、１１もしくは３２）、ＣＤＲＨ３（配列番号４、１２もしくは３３）、ＣＤＲＬ１（配列番号６、１４、１８もしくは３５）、ＣＤＲＬ２（配列番号７、１５、１９もしくは３６）、およびＣＤＲＬ３（配列番号８、１６、２０もしくは３７）；またはその変異体から選択される１以上のＣＤＲ、または総てのＣＤＲを任意の組合せでさらに含んでなり得る。
【０１８７】
例えば、本抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ３（配列番号４、１２もしくは３３）およびＣＤＲＨ１（配列番号２、１０もしくは３１）またはその変異体を含んでなり得る。本抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ３（配列番号４、１２もしくは３３）およびＣＤＲＨ２（配列番号３、１１もしくは３２）またはその変異体を含んでなり得る。本抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ１（配列番号２、１０もしくは３１）、ＣＤＲＨ２（配列番号３、１１もしくは３２）、およびＣＤＲＨ３（配列番号４、１２もしくは３３）またはその変異体を含んでなり得る。
【０１８８】
本抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＬ１（配列番号６、１４、１８もしくは３５）およびＣＤＲＬ２（配列番号７、１５、１９もしくは３６）またはその変異体を含んでなり得る。  本抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＬ２（配列番号７、１５、１９もしくは３６）およびＣＤＲＬ３（配列番号８、１６、２０もしくは３７）またはその変異体を含んでなり得る。本抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＬ１（配列番号６、１４、１８もしくは３５）、ＣＤＲＬ２（配列番号７、１５、１９もしくは３６）、およびＣＤＲＬ３（配列番号８、１６、２０もしくは３７）またはその変異体を含んでなり得る。
【０１８９】
本抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ３（配列番号４、１２もしくは３３）およびＣＤＲＬ３（配列番号８、１６、２０もしくは３７）またはその変異体を含んでなり得る。本抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ３（配列番号４、１２もしくは３３）、ＣＤＲＨ２（配列番号３、１１もしくは３２）、およびＣＤＲＬ３（配列番号８、１６、２０もしくは３７）またはその変異体を含んでなり得る。本抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ３（配列番号４、１２もしくは３３）、ＣＤＲＨ２（配列番号３、１１もしくは３２）、ＣＤＲＬ２（配列番号７、１５、１９もしくは３６）、およびＣＤＲＬ３（配列番号８、１６、２０もしくは３７）またはその変異体を含んでなり得る。
【０１９０】
本抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ１（配列番号２、１０もしくは３１）、ＣＤＲＨ２（配列番号３、１１もしくは３２）、ＣＤＲＨ３（配列番号４、１２もしくは３３）、ＣＤＲＬ１（配列番号６、１４、１８もしくは３５）、ＣＤＲＬ２（配列番号７、１５、１９もしくは３６）およびＣＤＲＬ３（配列番号８、１６、２０もしくは３７）またはその変異体を含んでなり得る。
【０１９１】
本開示はまた、ＨＥＲ３受容体に結合してこれを中和する抗原結合タンパク質を提供し、ここで、該、抗原結合タンパク質は、配列番号１、９もしくは３０の可変ドメイン配列の対応するＣＤＲＨ３または変異体ＣＤＲＨ３を含んでなるキメラまたはヒト化抗体である。
【０１９２】
該キメラまたはヒト化抗原結合タンパク質は、配列番号１、配列番号９、配列番号３０の可変ドメイン配列から選択される対応するＣＤＲまたはその変異体ＣＤＲのうち１以上または総てをさらに含んでなり得る。
【０１９３】
例えば、本抗原結合タンパク質は、対応するＣＤＲＨ３および対応するＣＤＲＨ１またはその変異体を含んでなり得る。本抗原結合タンパク質は、対応するＣＤＲＨ３および対応するＣＤＲＨ２またはその変異体を含んでなり得る。あるいは、本抗原結合タンパク質は、対応するＣＤＲＨ１、対応するＣＤＲＨ２、および対応するＣＤＲＨ３；またはその変異体を含んでなり得る。
【０１９４】
本抗原結合タンパク質は、対応するＣＤＲＬ１および対応するＣＤＲＬ２またはその変異体を含んでなり得る。さらに、抗原結合タンパク質は、対応するＣＤＲＬ２および対応するＣＤＲＬ３またはその変異体を含んでなり得る。本抗原結合タンパク質はまた、対応するＣＤＲＬ１、対応するＣＤＲＬ２および対応するＣＤＲＬ３またはその変異体を含んでなり得る。
【０１９５】
本抗原結合タンパク質は、対応するＣＤＲＨ３および対応するＣＤＲＬ３またはその変異体を含んでなり得る。本抗原結合タンパク質は、対応するＣＤＲＨ３、対応するＣＤＲＨ２および対応するＣＤＲＬ３またはその変異体を含んでなり得る。あるいは、本抗原結合タンパク質は、対応するＣＤＲＨ３、対応するＣＤＲＨ２、対応するＣＤＲＬ２および対応するＣＤＲＬ３またはその変異体を含んでなり得る。
【０１９６】
本抗原結合タンパク質は、対応するＣＤＲＨ１、対応するＣＤＲＨ２、対応するＣＤＲＨ３、対応するＣＤＲＬ１、対応するＣＤＲＬ２および対応するＣＤＲＬ３またはその変異体を含んでなり得る。
【０１９７】
これらの対応するＣＤＲは、Ｋａｂａｔ（１９８７）、Ｃｈｏｔｈｉａ（１９８９）、ＡｂＭまたはｃｏｎｔａｃｔ法を参照して定義することができる。これらの各方法の１つの定義を表３に示すが、これを配列番号１、９または３０の参照重鎖可変ドメインおよび配列番号５、１３、１７または３５の参照軽鎖可変ドメインに当てはめて対応するＣＤＲを決定することができる。
【０１９８】
例えば、本抗原結合タンパク質は、結合単位ＣＤＲ  Ｈ３および結合単位ＣＤＲ  Ｈ１、またはその変異体を含んでなり得る。本抗原結合タンパク質は、結合単位ＣＤＲ  Ｈ３および結合単位ＣＤＲ  Ｈ２、またはその変異体を含んでなり得る。本抗原結合タンパク質は、結合単位ＣＤＲ  Ｈ１、結合単位ＣＤＲ  Ｈ２、および結合単位ＣＤＲ  Ｈ３、またはその変異体を含んでなり得る。
【０１９９】
本抗原結合タンパク質は、結合単位ＣＤＲ  Ｌ１および結合単位ＣＤＲ  Ｌ２、またはその変異体を含んでなり得る。本抗原結合タンパク質は、結合単位ＣＤＲ  Ｌ２および結合単位ＣＤＲ  Ｌ３、またはその変異体を含んでなり得る。本抗原結合タンパク質は、結合単位ＣＤＲ  Ｌ１、結合単位ＣＤＲ  Ｌ２、および結合単位ＣＤＲ  Ｌ３、またはその変異体を含んでなり得る。
【０２００】
本抗原結合タンパク質は、結合単位ＣＤＲ  Ｈ３および結合単位ＣＤＲ  Ｌ３、またはその変異体を含んでなり得る。あるいは、本抗原結合タンパク質は、結合単位ＣＤＲ  Ｈ３、結合単位ＣＤＲ  Ｈ２、および結合単位ＣＤＲ  Ｌ３、またはその変異体を含んでなり得る。本抗原結合タンパク質は、結合単位ＣＤＲ  Ｈ３、結合単位ＣＤＲ  Ｈ２、結合単位ＣＤＲ  Ｌ２、および結合単位ＣＤＲ  Ｌ３、またはその変異体を含んでなり得る。
【０２０１】
本抗原結合タンパク質は、結合単位ＣＤＲ  Ｈ１、結合単位ＣＤＲ  Ｈ２、結合単位ＣＤＲ  Ｈ３、結合単位ＣＤＲ  Ｌ１、結合単位ＣＤＲ  Ｌ２、および結合単位ＣＤＲ  Ｌ３、またはその変異体を含んでなり得る。
【０２０２】
ＣＤＲ変異体または変異体結合単位は、少なくとも１つのアミノ酸が改変されたアミノ酸配列を含み、該改変はアミノ酸配列の化学的変更またはまたは一部の変更（例えば、アミノ酸１０個以内）であってもよく、この改変は変異体に非改変配列の生物学的特徴を保持させることができる。例えば、変異体は、ＨＥＲ３に結合してこれを中和する機能的変異体である。ＣＤＲアミノ酸配列の部分的変更は、１〜数個のアミノ酸の欠失もしくは置換、または１〜数個のアミノ酸の付加もしくは挿入、またはその組合せ（例えば、アミノ酸１０個以内）によるものであってよい。ＣＤＲ変異体または結合単位変異体は、そのアミノ酸配列に１、２、３、４、５もしくは６個のアミノ酸置換、付加または欠失を任意の組合せで含み得る。ＣＤＲ変異体または結合単位変異体は、そのアミノ酸配列に１、２もしくは３個のアミノ酸置換、挿入または欠失を任意の組合せで含み得る。アミノ酸残基における置換は、保存的置換、例えば、ある疎水性アミノ酸の別の疎水性アミノ酸での置換であってよい。例えば、ロイシンをバリンまたはイソロイシンで置換することができる。
【０２０３】
記載のＣＤＲ、対応するＣＤＲ、変異体ＣＤＲ、結合単位または変異体結合単位を含んでなる抗原結合タンパク質は、ＨＥＲ３との結合に関して、ＥＤ５０により示した場合、本明細書に記載の参照抗体が示す効力の１０倍以内または５倍以内の効力を示し得る。ＥＤ５０により示される、ＨＥＲ３との結合効力は、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定することができる。
【０２０４】
本抗原結合タンパク質は、アミノ酸位５４においてアスパラギン（Ｎ）からアスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン（Ｑ）への置換を有しても有さなくてもよい。本抗原結合タンパク質変異体は、アミノ酸位９１におけるシステイン（Ｃ）からセリン（Ｓ）への置換を有しても有さなくてもよい。
【０２０５】
本明細書に記載のＣＤＲ、対応するＣＤＲ、変異体ＣＤＲまたは結合単位の１以上が、ヒトフレームワーク上に、例えば、ヒト化またはキメラ可変ドメインとして存在してもよい。
【０２０６】
ヒト化重鎖可変ドメインは、配列番号１および９のヒト可変ドメイン配列と、そのフレームワーク領域において７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の同一性を有するアクセプター抗体フレームワーク内に、配列表に記載されているＣＤＲ、対応するＣＤＲ、結合単位またはその変異体を含んでなり得る。ヒト化軽鎖可変ドメインは、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の同一性を有するアクセプター抗体フレームワーク内に、配列番号６、７、８、１４、１５、１６、１８、１９または２０に挙げられているＣＤＲ、対応するＣＤＲ、結合単位またはその変異体を含んでなり得る。
【０２０７】
抗原結合タンパク質可変重鎖鎖は、２８位にセリン（Ｓ）アミノ酸残基および／または１０５位にトレオニン（Ｔ）アミノ酸残基を有してよい。抗原結合タンパク質可変軽鎖は、１６位にアルギニン（Ｒ）アミノ酸残基および／または７１位にチロシン（Ｙ）アミノ酸残基および／または１００位にアラニン（Ａ）アミノ酸残基を有してよい。例えば、本抗原結合タンパク質は、可変重鎖の２８位にセリン（Ｓ）および可変軽鎖の７１位にチロシン（Ｙ）を含んでなり得る。
【０２０８】
本開示はまた、ＨＥＲ３に結合してこれを中和し、かつ、下記の重鎖および軽鎖可変領域の組合せ：（１）マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０；マウスモノクローナル抗体；配列番号１および５を含んでなる）；（２）マウス２２Ａ５抗体（Ｍ５．２２Ａ５．１Ｇ６．１  Ｃ１０；マウスモノクローナル抗体；配列番号９、１３および１７を含んでなる）；（３）ヒト化１５Ｄ５抗体（ヒト化モノクローナル抗体；配列番号２２および２６を含んでなる）；（４）ヒト化１Ｄ９抗体（ヒト化モノクローナル抗体；配列番号３０および３４を含んでなる）；（５）マウス１Ｄ９抗体（マウスモノクローナル抗体；配列番号４４および４８を含んでなる）；（６）ヒト化１Ｄ９  ＲＲ（ヒト化１Ｄ９＿Ｅ抗体とも呼ばれる；ヒト化モノクローナル抗体；配列番号３０および５７を含んでなる）のうちいずれか１つを含んでなる抗原結合タンパク質を提供する。
【０２０９】
これらの重鎖可変領域のいずれを好適なヒト定常領域と組み合わせてもよい。これらの軽鎖可変領域のいずれを好適な定常領域と組み合わせてもよい。
【０２１０】
上記のような抗原結合タンパク質、例えば、化学修飾および／または１以上のアミノ酸残基の挿入、欠失もしくは置換により配列が部分的に変化しているか、あるいは上記の配列のいずれかと７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上の同一性を有する変異体は、ＨＥＲ３との結合に関して、ＥＤ５０により示した場合、（１）Ｍ５  １５Ｄ５  ２Ａ１  １Ｈ１０（マウスモノクローナル抗体；配列番号１および５を含んでなる）；（２）Ｍ５＿２２Ａ５  １Ｇ６  １  Ｃ１０（マウスモノクローナル抗体；配列番号９、１３および１７を含んでなる）；（３）ヒト化１５Ｄ５（ヒト化モノクローナル抗体；配列番号２２および２６を含んでなる）；（４）ヒト化１Ｄ９（ヒト化モノクローナル抗体；配列番号３０および３４を含んでなる）；（５）マウス１Ｄ９（マウスモノクローナル抗体；配列番号４４および４８を含んでなる）；（６）ヒト化１Ｄ９＿Ｅ（ヒト化モノクローナル抗体；配列番号３０および５７を含んでなる）が示す効力の１０倍以内または５倍以内の効力を示し得る。ＥＤ５０により示される、ＨＥＲ３との結合効力は、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定することができる。
【０２１１】
本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、ＨＥＲ３受容体のペプチドフラグメントには結合することができない。ＨＥＲ３受容体のペプチドフラグメントは、ＨＥＲ３配列の１４個までのアミノ酸からなる任意のフラグメントであり得る。ＨＥＲ３のペプチドフラグメントは直鎖であり得る。ＨＥＲ３のペプチドフラグメントは、全長配列をはじめ、ＨＥＲ３受容体配列の任意のフラグメントであり得、その配列は直鎖である。
【０２１２】
抗原結合タンパク質とＨＥＲ３ペプチドフラグメントまたは人工ペプチド配列との結合の有無は、ＥＬＩＳＡまたは還元条件を用いるＳＤＳ  ＰＡＧＥによって判定することができる。例えば、抗原結合タンパク質と直鎖全長ＨＥＲ３配列との結合の有無は、還元的（すなわち変性）ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって判定することができる。
【０２１３】
本明細書に記載の抗原結合タンパク質が結合するＨＥＲ３受容体のエピトープは、配座エピトープまたは不連続エピトープであり得る。本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、ＨＥＲ３受容体上の直鎖エピトープには結合することができない。例えば、本抗原結合タンパク質は、ＨＥＲ３受容体の還元型または変性サンプルには結合することができない。配座エピトープまたは不連続エピトープは、ＨＥＲ３受容体結合部位と同一であっても、類似していても、または重複していてもよい。このエピトープは、ＨＥＲ３受容体がその成熟型で、また、別の受容体分子との二量体の一部として存在する場合に接近を受け得る。エピトープはまた、ＨＥＲ３受容体がその成熟型で、また、上記のような他のＨＥＲ３受容体結合分子との四量体の一部として存在する場合にも接近を受け得る。エピトープは、２つのＨＥＲ３受容体ポリペプチドに分布していてもよい。このタイプの不連続エピトープは、各ＨＥＲ３受容体分子由来の配列を含んでなり得る。これらの配列は、二量体の３次および４次構造上、エピトープを形成して抗原結合タンパク質が結合するのに互いに十分近接することができる。配座エピトープおよび／または不連続エピトープは、例えばＣＬＩＰＳ（商標）（Ｐｅｐｓｃａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）などの公知の方法によって同定され得る。
【０２１４】
本抗原結合タンパク質は、ヒトまたはマウス動物モデルにおいて少なくとも６時間、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも７日または少なくとも９日のin vivo半減期を持ち得る。
【０２１５】
抗体のＦｃエフェクター部分に対する突然変異性の変化を用いて、ＦｃＲｎと抗体の間の相互作用の親和性を変化させ、抗体のターンオーバーを調整することができる。この抗体の半減期はin vivoで延長させることができる。最大用量および最大投与頻度はin vivoにおけるＩＣ５０をより長い時間維持する結果として達成され得るので、これは患者集団にとって有益となる。
【０２１６】
本抗原結合タンパク質が結合するＨＥＲ３受容体ポリペプチドは、組換えポリペプチドであってもよい。ＨＥＲ３受容体は溶液中にあっても、または固相表面に結合されていてもよい。例えば、ＨＥＲ３受容体は、磁性ビーズなどのビーズに結合されていてもよい。さらに、ＨＥＲ３受容体はビオチン化されていてもよい。ＨＥＲ３受容体とコンジュゲートされたビオチン分子を用い、ビオチンストレプトアビジンを固相表面にカップリングさせることにより、固相表面にＨＥＲ３を固定化することができる。
【０２１７】
本抗原結合タンパク質は、ラット、マウス、霊長類（例えば、カニクイザル、旧世界ザルまたは大型類人猿）またはヒトに由来し得る。本抗原結合タンパク質は、ヒト化またはキメラ抗体であり得る。
【０２１８】
本抗原結合タンパク質は、定常領域を含んでなり得、これはいずれのアイソタイプまたはサブクラスのものでもよい。該定常領域は、ＩｇＧアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはその変異体であり得る。本抗原結合タンパク質の定常領域は、ＩｇＧ１であり得る。
【０２１９】
本抗原結合タンパク質は、その抗体が増強したエフェクター機能／ＡＤＣＣおよび／または補体活性化を有するように突然変異した定常ドメインから選択される１以上の改変を含んでなり得る。好適な改変の例は、Shields, et al., J. Biol. Chem. (2001) 276:6591-6604、Lazar, et al., PNAS (2006) 103:4005-4010、ならびにＵＳ６７３７０５６、ＷＯ２００４０６３３５１およびＷＯ２００４０２９２０７に記載されている。
【０２２０】
本抗原結合タンパク質は、本抗原結合タンパク質が増強されたエフェクター機能／ＡＤＣＣおよび／または補体活性化を有するようにグリコシル化特性が変更された定常ドメインを含んでなり得る。グリコシル化特性が変更された抗原結合タンパク質を生産するための好適な方法論の例は、ＷＯ２００３／０１１８７８、ＷＯ２００６／０１４６７９、およびＥＰ１２２９１２５に記載されている。
【０２２１】
本開示はまた、本明細書に記載の抗原結合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。該核酸分子は、重鎖可変または全長配列と軽鎖可変または全長配列の双方をコードする配列を含んでなり得る。あるいは、本明細書に記載の抗原結合タンパク質をコードする核酸分子は、重鎖可変もしくは全長配列、または軽鎖可変もしくは全長配列をコードする配列を含んでなり得る。
【０２２２】
本開示はまた、本明細書に記載の核酸分子を含んでなる発現ベクターを提供する。また、本明細書に記載の発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞も提供される。
【０２２３】
本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、好適な宿主細胞で生産することができる。本明細書に記載の抗原結合タンパク質の生産方法は、本明細書に記載の宿主細胞を培養する工程、およびおよび前記抗原結合タンパク質を回収する工程を含んでなり得る。組換え形質転換された宿主細胞、トランスフェクトされた宿主細胞または形質導入された宿主細胞は、少なくとも１つの発現カセットを含んでなり得、該発現カセットは、本明細書に記載の抗原結合タンパク質の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含んでなり、かつ、本明細書に記載の抗原結合タンパク質の軽鎖をコードするポリヌクレオチドをさらに含んでなる。あるいは、組換え形質転換された宿主細胞、トランスフェクトされた宿主細胞または形質導入された宿主細胞は、少なくとも１つの発現カセットを含んでなり得、第１の発現カセットは、本明細書に記載の抗原結合タンパク質の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含んでなり、かつ、本明細書に記載の抗原結合タンパク質の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含んでなる第２のカセットをさらに含んでなる。安定に形質転換された宿主細胞は、本明細書に記載の抗原結合タンパク質の重鎖および／または軽鎖をコードする１以上の発現カセットを含んでなるベクターを含んでなり得る。例えば、このような宿主細胞は、軽鎖をコードする第１のベクターと重鎖をコードする第２のベクターとを含んでなり得る。
【０２２４】
宿主細胞は、真核宿主細胞、例えば、哺乳類宿主細胞であり得る。このような細胞系統の例としては、ＣＨＯまたはＮＳ０が挙げられる。宿主細胞は、培養培地、例えば、血清不含培養培地中で培養され得る。本抗原結合タンパク質は、宿主細胞により培養培地中へ分泌されてもよい。本抗原結合タンパク質は、前記抗原結合タンパク質含有培養培地に対して少なくとも９５％以上（例えば、９８％以上）まで精製することができる。種々の培地組成および周囲条件で細胞を培養する方法は、当業者に周知である。
【０２２５】
本抗原結合タンパク質と薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物が提供され得る。該医薬組成物を使用説明書とともに含んでなるパーツキットが提供され得る。便宜上、該キットは所定量の試薬を使用説明書とともに含んでなり得る。
【０２２６】
抗体構造
完全抗体
ほとんどの脊椎動物種の抗体の軽鎖は、その定常領域のアミノ酸配列に基づいてκおよびγと呼ばれる２つのタイプのうちの１つに割り付けることができる。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列によって、ヒト抗体はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭの５つの異なるクラスに割り付けることができる。ＩｇＧおよびＩｇＡはさらにサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４、ならびにＩｇＡ１およびＩｇＡ２に細分することができる。少なくともＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂを有するマウスおよびラットには種変異体が存在する。
【０２２７】
可変領域の保存性の高い部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。完全な重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、３つのＣＤＲが連結した４つのＦＲを含んでなる。各鎖のこれらのＣＤＲは、これらのＦＲ領域によってともに近接して保持され、他の鎖のＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。
【０２２８】
定常領域は抗体と抗原の結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害性性（ＡＤＣＣ）、Ｆｃγ受容体との結合を介した食作用、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を介した半減期／クリアランス速度、および補体カスケードのＣ１ｑ成分を介した補体依存性細胞傷害性における関与などの種々のエフェクター機能を示す。
【０２２９】
ヒトＩｇＧ２定常領域は、古典的経路による補体活性化能、または抗体依存性細胞傷害性媒介能を本質的に欠くことが報告されている。ＩｇＧ４定常領域は、古典的経路による補体活性化能、および抗体依存性細胞傷害性媒介能（微弱に過ぎない）を欠くことが報告されている。これらのエフェクター機能を本質的に欠く抗体は、「非溶解性」抗体と呼ばれることがある。
【０２３０】
ヒト抗体
ヒト抗体は、当業者に公知のいくつかの方法によって作製することができる。ヒト抗体は、ヒト骨髄腫またはマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系統を用いたハイブリドーマ法によって作出できる。Kozbor (1984) J. Immunol 133, 3001, and Brodeur, MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCTION TECHNIQUES AND APPLICATIONS, 51-63 (Marcel Dekker Inc, 1987)参照。別法としては、ファージライブラリーまたはトランスジェニックマウスの使用があり、双方ともヒト可変領域レパートリーを用いる(Winter (1994) Annu. Rev. Immunol 12: 433-455; Green (1999) J. Immunol. Methods 231: 11-23参照)。
【０２３１】
現在、マウス免疫グロブリン遺伝子座がヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントで置換されている数系統のトランスジェニックマウスが利用可能である(Tomizuka (2000) PNAS 97: 722-727; Fishwild (1996) Nature Biotechnol. 14: 845-851; Mendez (1997) Nature Genetics, 15: 146-156参照）。抗原刺激すると、このようなマウスはヒト抗体のレパートリーを産生することができ、それから目的の抗体を選択することができる。
【０２３２】
ファージディスプレー技術は、ヒト抗原結合タンパク質（およびそのフラグメント）を作製するために使用することができる（McCafferty (1990) Nature 348: 552-553 and Griffiths, et al., EMBO 13: 3245-3260 (1994）参照）。
【０２３３】
親和性成熟の技術(Marks Bio/technol (1992) 10: 779-783）は、結合親和性の改善のために使用することができ、この場合、ヒト一次抗体の親和性が、そのＨ鎖およびＬ鎖可変領域を天然に存在する変異体で順次置換し、結合親和性の改善に基づいて選択することによって改善される。現在では、「エピトープ刷り込み(epitope imprinting)」などのこの技術の変法も使用可能である。例えば、ＷＯ９３／０６２１３；Waterhouse (1993) Nucl. Acids Res. 21: 2265-2266参照。
【０２３４】
キメラ抗体およびヒト化抗体
キメラ抗体は一般に組換えＤＮＡ法を用いて作製される。抗体をコードするＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）を単離し、従来の手順（例えば、抗体のＨ鎖およびＬ鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブの使用による）を用いて配列決定を行う。ハイブリドーマ細胞がこのようなＤＮＡの典型的な供給源として役立つ。単離されれば、このＤＮＡを発現ベクターに入れ、その後、この発現ベクターを、そうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトし、前記抗体の合成を得る。このＤＮＡを、ヒトＬ鎖およびＨ鎖のコード配列で対応する非ヒト（例えば、マウス）Ｈ鎖およびＬ鎖定常領域を置換することによって改変することができる。例えば、Morrison (1984) PNAS 81: 6851参照。
【０２３５】
免疫原性の大幅な低減は、ヒトのフレームワーク（「アクセプターフレームワーク」）および定常領域に非ヒト（例えば、マウス）抗体（「ドナー」抗体）のＣＤＲだけをグラフトしてヒト化抗体を作製することによって達成することができる（Jones, et al. (1986) Nature 321: 522-525;およびVerhoeyen, et al. (1988) Science 239: 1534-1536）。しかしながら、ＣＤＲグラフト法はそれ自体、抗原−結合特性の完全な保持をもたらすことはできず、有意な抗原−結合親和性を回復させるべき場合には、ドナー抗体のいくつかのフレームワーク残基（「逆突然変異」と呼ばれることがある）をヒト化分子において保存する必要があるという場合が頻繁に見られる（Queen, et al. (1989) PNAS 86: 10,029-10,033: Co, et al. (1991) Nature 351: 501-502参照）。この場合、ヒトフレームワーク（ＦＲ）を提供するために、データベースから非ヒトドナー抗体と最大の配列相同性を示すヒト可変領域が選択される。このヒトＦＲの選択は、ヒトコンセンサスまたは個々のヒト抗体のいずれかから行うことができる。必要であれば、ＣＤＲ立体配座を保存するために、ドナー抗体の重要な残基をヒトアクセプターフレームワークに置換導入することができる。抗体のコンピューターモデリングを用いて、このような構造上重要な残基を同定する助けとすることができる。ＷＯ９９／４８５２３参照。
【０２３６】
あるいは、ヒト化は、「ベニアリング」のプロセスによって達成することもできる。独特なヒトおよびマウス免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変領域の統計分析によれば、露出した残基の正確なパターンがヒト抗体とマウス抗体で異なり、ほとんどの個々の表面の位置が少数の異なる残基に強い優先性を持つことが明らかになった（Padlan, et al. (1991) Mol. Immunol. 28: 489-498;およびPedersen, et al. (1994) J. Mol. Biol. 235: 959-973参照）。従って、非ヒトＦｖの免疫原性は、そのフレームワーク領域において、ヒト抗体に通常見られるものとは異なる露出残基を置換することによって低減することができる。タンパク質の抗原性は表面アクセシビリティーと相関している可能性があるので、マウス可変領域をヒト免疫系から「見えないようにする」には表面残基の置換で十分である（Mark, et al. (1994) in Handbook of Experimental Pharmacology Vol. 113: The pharmacology of Monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, 105-134参照）。このヒト化手順は、抗体の表面だけが変更され、支持部分の残基はそのままであることから、「ベニアリング」と呼ばれる。さらなる変更アプローチとしては、ＷＯ０４／００６９５５に記載されているもの、および細菌発現系を用い、配列がヒト生殖細胞系に近い抗体を作製するｏＨＵＭＡＮＥＥＲＩＮＧ（商標）（Ｋａｌｏｂｉｏｓ）の手順(Alfenito-M Advancing Protein Therapeutics January 2007, San Diego, California)が挙げられる。
【０２３７】
二重特異性抗原結合タンパク質
二重特異性抗原結合タンパク質は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗原結合タンパク質である。このような抗原結合タンパク質を作製する方法は当技術分野で公知である。従来、二重特異性抗原結合タンパク質の組換え生産は、２つの免疫グロブリンＨ鎖−Ｌ鎖対の同時発現に基づき、この２つのＨ鎖が異なる結合特異性を有する。Millstein, et al. (1983) Nature 305: 537-539;ＷＯ９３／０８８２９;およびTraunecker, et al. (1991) EMBO 10: 3655-3659参照。Ｈ鎖およびＬ鎖のランダムな組み合わせのために、１０通りの異なる抗体構造の潜在的混合物が生産され、そのうち１つだけが所望の結合特異性を有する。別のアプローチとしては、所望の結合特異性を有する可変ドメインを、ヒンジ領域の少なくとも一部、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含んでなる重鎖定常領域に融合させることを含む。軽鎖結合に必要な部位を含むＣＨ１領域は、これらの融合物の少なくとも１つに存在していればよい。これらの融合物をコードするＤＮＡおよび所望によりＬ鎖は、別々の発現ベクターに挿入され、その後、好適な宿主生物に同時にトランスフェクトされる。しかしながら、２つまたは３つ総ての鎖のコード配列を１つの発現ベクターに挿入することもできる。１つのアプローチでは、二重特異性抗体は、一方のアームの第１の結合特異性を有するＨ鎖と他方のアームの第２の結合特異性を与えるＨ−Ｌ鎖対から構成される。ＷＯ９４／０４６９０；Suresh, et al. (1986) Methods in Enzymology 121: 210も参照。
【０２３８】
抗原結合フラグメント
定常領域を欠いたフラグメントは、古典的経路による補体活性化能、または抗体依存性細胞傷害性媒介能を欠く。従来、このようなフラグメントは、例えばパパイン消化（例えば、ＷＯ９４／２９３４８参照）などの完全抗体のタンパク質分解消化によって作製されるが、組換え形質転換宿主細胞から直接作製することもできる。ＳｃＦｖの作製については、Bird, et al. (1988) Science 242: 423-426を参照。さらに、抗原結合フラグメントは、下記のような種々の操作技術を用いて作製することができる。
【０２３９】
Ｆｖフラグメントは、Ｆａｂフラグメントよりも、それらの２つの鎖の相互作用エネルギーが小さいと思われる。このＶＨドメインとＶＬドメインの会合を安定化させるために、それらはペプチド(Bird, et al. (1988) Science 242: 423-426; Huston, et al. (1988) PNAS 85(16): 5879-5883)、ジスルフィド架橋(Glockshuber, et al. (1990) Biochemistry 29: 1362-1367)および「ノブ・イン・ホール(knob in hole)」突然変異(Zhu, et al. (1997) Protein Sci., 6: 781-788)と結びつけられている。ＳｃＦｖフラグメントは、当業者に周知の方法によって作製することができる（Whitlow, et al. (1991) Methods Companion Methods Enzymol, 2: 97-105およびHuston, et al. (1993) Int. Rev. Immunol 10: 195-217参照）。ＳｃＦｖは、大腸菌または真核細胞などの細菌細胞において作製することができる。ＳｃＦｖの１つ欠点は、産物が一価であることであり、このため多価結合力による高い結合力がなくなり、半減期が短い。これらの問題を克服する試みとして、化学的カップリング(Adams, et al. (1993) Can. Res 53: 4026-4034;およびMcCartney, et al. (1995) Protein Eng. 8: 301-314)によるか、または不対合Ｃ末端システイン残基を含有するＳｃＦｖの自発的部位特異的二量体形成（Kipriyanov, et al. (1995) Cell. Biophys 26: 187-204参照）による、付加的Ｃ末端システインを含有するＳｃＦｖからの二価（ＳｃＦｖ’）２の作製がある。あるいは、ＳｃＦｖは、ペプチドリンカーを３〜１２残基に短縮して「ダイアボディ」を形成させることにより、多量体の形成を余儀なくさせることもできる（Holliger, et al. (1993) PNAS 90: 6444-6448参照）。リンカーをなおさらに短縮すれば、ＳｃＦｖ三量体（「トリアボディ」、Kortt, et al. (1997) Protein Eng 10: 423-433）および四量体（「テトラボディ」、Le Gall, et al. (1999) FEBS Lett, 453: 164-168参照）を形成させることができる。二価ＳｃＦｖ分子の構築は、タンパク質二量体形成モチーフと遺伝子融合による「ミニ抗体」（Pack, et al. (1992) Biochemistry 31: 1579-1584参照）および「ミニボディ」（Hu, et al. (1996) Cancer Res. 56: 3055-3061参照）の形成によって達成することもできる。ＳｃＦｖ−Ｓｃ−Ｆｖタンデム（（ＳｃＦＶ）２）も、２つのＳｃＦｖ単位を第３のペプチドリンカーによって連結することによって作製することができる（Kurucz, et al. (1995) J. Immol. 154: 4576-4582参照）。二重特異性ダイアボディーは、ある抗体のＶＨドメインが短いリンカーによって別の抗体のＶＬドメインに連結されたものからなる２つの一本鎖融合産物の、非共有結合的会合によって作製することができる（Kipriyanov, et al. (1998) Int. J. Can 77: 763-772参照）。このような二重特異性ダイアボディーの安定性は、ジスルフィド架橋または前記「ノブ・イン・ホール」突然変異の導入によるか、または一本鎖ダイアボディー（ＳｃＤｂ）（２つのハイブリッドＳｃＦｖフラグメントがペプチドリンカーによって連結されている）の形成（Kontermann, et al. (1999) J. Immunol. Methods 226:179-188参照）によって増強することができる。四価二重特異性分子は、例えば、ＳｃＦｖフラグメントをＩｇＧ分子のＣＨ３ドメインに、またはヒンジ領域を介してＦａｂフラグメントに融合させることによって得ることができる（Coloma, et al. (1997) Nature Biotechnol. 15: 159-163参照）。あるいは、四価二重特異性分子は、二重特異性一本鎖ダイアボディーの融合によって作出されている（Alt, et al. (1999) FEBS Lett 454: 90-94参照）。ま���、より小さな四価二重特異性分子も、ヘリックス−ループ−ヘリックスモチーフを含有するリンカーを用いたＳｃＦｖ−ＳｃＦｖタンデム（ＤｉＢｉミニ抗体、Muller, et al. (1998) FEBS Lett 432: 45-49参照）か、または４つの抗体可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）を、分子内対合を妨げる配向で含んでなる一本鎖分子（タンデムダイアボディー、Kipriyanov, et al. (1999) J. Mol. Biol. 293: 41-56参照）のいずれかの二量体形成によって形成することができる。二重特異性Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、Ｆａｂ’フラグメントの化学カップリングによるか、またはロイシンジッパーを介したヘテロ二量体形成（Shalaby, et al. (1992) J. Exp. Med. 175: 217-225;およびKostelny, et al. (1992), J. Immunol. 148: 1547-1553参照）によって作出することができる。また、単離されたＶＨドメインおよびＶＬドメイン（Ｄｏｍａｎｔｉｓ  ｐｌｃ）も利用可能である。ＵＳ６，２４８，５１６；ＵＳ６，２９１，１５８；およびＵＳ６，１７２，１９７参照。
【０２４０】
ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の都合のよい架橋法を用いて形成された２つの共有結合抗体から構成される。例えば、ＵＳ４，６７６，９８０参照。
【０２４１】
その他の改変
本開示の抗原結合タンパク質はまた、それらのエフェクター機能を増強する、または変化させるその他の改変も含んでなり得る。抗体のＦｃ領域と種々のＦｃ受容体（ＦｃγＲ）の間の相互作用は、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、補体の固定、食作用および抗体の半減期／クリアランスを含む抗体のエフェクター機能を媒介すると考えられている。抗体のＦｃ領域に対する種々の改変は、所望の特性に応じて行うことができる。例えば、Ｆｃ領域における、そうでなければ溶解性抗体を非溶解性とする特定の突然変異は、ＥＰ０６２９２４０およびＥＰ０３０７４３４に詳説され、またはサルベージ受容体結合エピトープを抗体に組み込んで血清半減期を延長することもできる。ＵＳ５，７３９，２７７参照。ヒトＦｃγ受容体としては、ＦｃγＲ（Ｉ）、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａおよび新生児型ＦｃＲｎが含まれる。Shields, et al. (2001) J. Biol. Chem 276: 6591-6604は、ＩｇＧ１残基の共通セットが総てのＦｃγＲの結合に関与するが、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩはこの共通セットの範囲外の異なる部位を利用しているということを示した。ＩｇＧ１残基のある群、すなわち、Ｐｒｏ−２３８、Ａｓｐ−２６５、Ａｓｐ−２７０、Ａｓｎ−２９７およびＰｒｏ−２３９は、アラニンに変更されると、総てのＦｃγＲに対する結合を低下させた。総てがＩｇＧ  ＣＨ２ドメイン内にある、ＣＨ１とＣＨ２をつなぐヒンジ付近にクラスターを形成している。ＦｃγＲＩは結合のためにＩｇＧ１残基の共通セットだけを利用するが、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩはこの共通セットに加えて異なる残基と相互作用する。いくつかの残基を変更すると、ＦｃγＲＩＩに対する結合だけ（例えば、Ａｒｇ−２９２）、またはＦｃγＲＩＩＩに対する結合だけ（例えば、Ｇｌｕ−２９３）が低減された。いくつかの変異体はＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩに対して改善された結合を示したが、他の受容体に対する結合には影響を及ぼさなかった（例えば、Ｓｅｒ−２６７ＡｌａはＦｃγＲＩＩに対する結合を改善したが、ＦｃγＲＩＩＩに対する結合は影響を受けなかった）。他の変異体はＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩに対する結合の改善を示したが、他の受容体に対する結合は低下した（例えば、Ｓｅｒ−２９８ＡｌａはＦｃγＲＩＩＩに対する結合を改善したが、ＦｃγＲＩＩに対する結合が低下した）。ＦｃγＲＩＩＩａでは、最も良く結合するＩｇＧ１変異体には、Ｓｅｒ−２９８、Ｇｌｕ−３３３およびＬｙｓ−３３４におけるアラニン置換が組み合わせられていた。新生児型ＦｃＲｎ受容体は、抗体クリアランスと組織間の経細胞輸送の双方に関与していると考えられている（Junghans (1997) Immunol. Res 16: 29-57;およびGhetie, et al. (2000) Annu. Rev. Immunol. 18: 739-766参照）。ヒトＦｃＲｎと直接相互作用することが判明しているヒトＩｇＧ１残基としては、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４およびＨｉｓ４３５がある。この節に記載されているいずれの位置における置換も、血清半減期を延長させ、かつ／または抗体のエフェクター特性を変化させることができる。
【０２４２】
他の改変としては、抗体のグリコシル化変異体がある。定常領域の保存された位置における抗体のグリコシル化は、抗体機能、特に、上記のものなどのエフェクター機能に著しい効果を持つことが知られている。例えば、Boyd, et al. (1996) Mol. Immunol. 32: 1311-1318参照。１以上の糖鎖部分が付加、置換、欠失または改変されている、抗体またはその抗原結合フラグメントのグリコシル化変異体が企図される。アスパラギン−Ｘ−セリンまたはアスパラギン−Ｘ−トレオニンモチーフの導入により、糖鎖部分の酵素的付加のための、可能性のある部位が作出され、従って、抗体のグリコシル化を操作するために使用することができる。Raju, et al. (2001) Biochemistry 40: 8868-8876では、ＴＮＦＲ−ＩｇＧイムノアドヘシンの末端シアル化は、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼおよび／またはα−２，３シアリルトランスフェラーゼを用いた再ガラクトシル化および／または再シアル化のプロセスによって増強された。末端シアル化の増強は、免疫グロブリンの半減期を延長すると考えられる。抗体は、ほとんどの糖タンパク質と同様に、一般に糖型の混合物として生産される。この混合物は、抗体が真核生物、特に哺乳類細胞で生産された場合に特に明らかである。定義された糖型を作製するために種々の方法が開発されている。Zhang, et al. (2004) Science 303: 371: Sears, et al. (2001) Science 291: 2344; Wacker, et al. (2002) Science 298: 1790; Davis, et al. (2002) Chem. Rev. 102: 579; Hang, et al. (2001) Acc. Chem. Res 34: 727参照。
【０２４３】
本明細書に記載される抗体（例えば、ＩｇＧアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１）は、定義された数（例えば、７以下、例えば、５以下、例えば、２つまたは１つ）の糖型を含んでなり得る。
【０２４４】
これらの抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンなどの非タンパク質性ポリマーと結合させることができる。タンパク質とＰＥＧのコンジュゲーションは、タンパク質の半減期の延長ならびにタンパク質の抗原性および免疫原性の低減のために確立された技術である。種々の分子量およびスタイル（直鎖型または分岐型）でのペグ化の使用が、完全抗体ならびにＦａｂ’フラグメントを用いて検討されてきた。Koumenis et al., (2000) Int. J. Pharmaceut. 198: 83-95参照。
【０２４５】
生産方法
抗原結合タンパク質は、ヤギ（Pollock, et al. (1999) J. Immunol. Methods 231: 147-157参照）、ニワトリ（Morrow (2000) Genet. Eng. News 20: 1-55参照）、マウス（Pollock, et al.参照)または植物（Doran (2000) Curr. Opinion Biotechnol. 11: 199-204; Ma (1998) Nat. Med. 4: 601-606; Baez, et al. (2000) BioPharm 13: 50-54; Stoger, et al. (2000) Plant Mol. Biol. 42: 583-590参照）などのトランスジェニック生物で生産することができる。
【０２４６】
抗原結合タンパク質はまた、化学合成によって生産することもできる。しかしながら、抗原結合タンパク質は一般に、当業者の周知の組換え細胞培養技術を用いて生産される。本抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを単離し、さらなるクローニング（増幅）または発現のためにプラスミドなどの複製可能なベクターに挿入する。１つの発現系として、特に宿主細胞がＣＨＯまたはＮＳ０である場合には、グルタミン酸シンセターゼ系（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓにより販売されているものなど）がある。本抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、容易に単離され、従来法（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ）を用いて配列決定される。使用可能なベクターとしては、プラスミド、ウイルス、ファージ、トランスポゾン、そのプラスミドが一般に用いられるミニ染色体が挙げられる。一般に、このようなベクターは、発現を助けるために本抗原結合タンパク質ポリヌクレオチドに機能的に連結されたシグナル配列、複製起点、１以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列をさらに含む。軽鎖および重鎖をコードするポリヌクレオチドは、別個のベクターに挿入し、例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーションもしくは形質導入によって同じ宿主細胞に同時にもしくは順次導入してもよいし、または、場合により、重鎖と軽鎖の双方を、前記の導入の前に同じベクターに挿入することもできる。
【０２４７】
コドンの最適化は、宿主細胞により産生されるタンパク質の総レベルが、コドンが最適化された遺伝子でトランスフェクトした場合に、野生型配列でトランスフェクトした場合のレベルに比べて高くなるようにするために使用することができる。いくつかの方法が公開されている（Nakamura, et al. (1996) Nucleic Acids Research 24: 214-215；Ｗ０９８／３４６４０；Ｗ０９７／１１０８６）。遺伝コードの冗長性のために、本明細書に開示されているもの（特に、所与の宿主細胞における発現のためにコドンが最適化されたもの）とは別のポリヌクレオチドも本明細書に記載の抗原結合タンパク質をコードする場合がある。本抗原結合タンパク質のコドン使用頻度は、転写物および／または産物の収量を高めるよう宿主細胞のコドンバイアスを適合させるために改変することができる（例えば、Hoekema, et al., (1987), Mol Cell Biol  7(8): 2914-24参照）。コドンの選択は、発現に用いる宿主細胞との好適な適合性に基づき得る。
【０２４８】
シグナル配列
抗原結合タンパク質は、成熟タンパク質のＮ末端に特異的切断部位を有する異種シグナル配列を有する融合タンパク質として産生させることができる。このシグナル配列は宿主細胞によって認識され、かつ、プロセシングされるべきである。原核生物宿主細胞の場合、シグナル配列は、例えば、アルカリ性ホスファターゼ、ペニシリナーゼまたは熱安定性腸毒素ＩＩリーダーであり得る。酵母分泌の場合、シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダーまたは産生ホスファターゼリーダーであり得る。例えば、ＷＯ９０／１３６４６参照。哺乳類細胞系では、単純ヘルペスｇＤシグナルなどのウイルス分泌リーダーであってよく、天然免疫グロブリンシグナル配列が好適であり得る。一般に、シグナル配列は、本抗原結合タンパク質をコードするＤＮＡとリーディングフレーム内で連結される。
【０２４９】
複製起点
複製起点は当技術分野で周知であり、グラム陰性菌にはｐＢＲ３２２、ほとんどの酵母には２μプラスミド、ほとんどの哺乳類細胞にはＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶなどの種々のウイルス起源のものが好適である。一般に、複製起点成分は哺乳類発現ベクターには必要ないが、ＳＶ４０が初期プロモーターを含むことから、これを用い得る。
【０２５０】
選択マーカー
典型的な選択遺伝子は、抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートもしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与するか、または（ｂ）栄養要求性(auxiotrophic)欠陥を補足するか、もしくは複合培地において利用できない栄養素を供給するか、または（ｃ）両者の組合せを提供するタンパク質をコードする。選択スキームは宿主細胞の増殖を阻止することを含み得る。本抗原結合タンパク質をコードする遺伝子での形質転換に成功した細胞は、例えば、同時に送達された選択マーカーにより付与される薬物耐性のために生残する。一例としてＤＨＦＲ選択マーカーがあり、この場合、形質転換体をメトトレキサートの存在下で培養する。細胞を漸増量のメトトレキサートの存在下で培養し、目的の外因性遺伝子のコピー数を増幅させる。このＤＨＦＲ選択では、ＣＨＯ細胞が特に有用な細胞系統である。さらなる例として、グルタメートシンセターゼ発現系（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）である。酵母に用いられ選択遺伝子の一例として、ｔｒｐｌ遺伝子がある。Stinchcomb, et al. (1979) Nature 282: 38参照。
【０２５１】
プロモーター
抗原結合タンパク質の発現に好適なプロモーターを、抗原結合タンパク質をコードするＤＮＡ／ポリヌクレオチドに機能的に連結する。原核宿主のプロモータとしては、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリ性ホスファターゼ、トリプトファンおよびハイブリッドプロモーター（Ｔａｃなど）が挙げられる。酵母細胞での発現に好適なプロモーターとしては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖系酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース６リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼおよびグルコキナーゼが挙げられる。誘導型酵母プロモーターとしては、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、メタロチオネインおよび窒素代謝またはマルトース／ガラクトース利用を担う酵素が挙げられる。
【０２５２】
哺乳累細胞系での発現のためのプロモーターとしては、ウイルスプロモーター、例えば、ポリオーマ、鶏痘およびアデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（特に、前初期遺伝子プロモーター）、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、アクチン、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターおよび初期または後期シミアンウイルス４０が挙げられる。もちろん、プロモーターの選択は発現に用いる宿主細胞との好適な適合性に基づく。第１のプラスミドは、ＲＳＶおよび／またはＳＶ４０および／またはＣＭＶプロモーター、軽鎖可変領域（ＶＬ）、κＣ領域をネオマイシンおよびアンピシリン耐性選択マーカーをともにコードするＤＮＡを含んでなり得、第２のプラスミドは、ＲＳＶまたはＳＶ４０プロモーター、重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡ、γ１定常領域、ＤＨＦＲおよびアンピシリン耐性マーカーをコードするＤＮＡを含む。
【０２５３】
エンハンサーエレメント
適当であれば、例えば高等真核生物における発現のために、ベクター中のプロモーターエレメントに機能的に連結されたエンハンサーエレメントを使用することができる。哺乳類エンハンサー配列としては、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテインおよびインスリン由来のエンハンサーエレメントが挙げられる。あるいは、真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーエレメント、例えばＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、バキュロウイルスエンハンサーまたはマウスＩｇＧ２ａ遺伝子座を用いてもよい（ＷＯ０４／００９８２３参照）。該エンハンサーはプロモーターの上流部位のベクターに位置していてよい。あるいは、エンハンサーは、例えば、非翻訳領域内、またはポリアデニル化シグナルの下流など、どこに存在してもよい。エンハンサーの選択および配置は、発現に用いる宿主細胞との好適な適合性に基づき得る。
【０２５４】
ポリアデニル化／終結
真核生物系では、ポリアデニル化シグナルは、本抗原結合タンパク質をコードするＤＮＡ／ポリヌクレオチドに機能的に連結されている。このようなシグナルは一般に、オープンリーディングフレームの３’に配置される。哺乳類系では、限定されない例として、成長ホルモン、延長因子−１αおよびウイルス（例えば、ＳＶ４０）遺伝子またはレトロウイルスの長い末端反復配列に由来するシグナルが挙げられる。酵母系では、ポリアデニル化(polydenylation)／終結シグナルの限定されない例としては、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）およびアルコールデヒドロゲナーゼ１（ＡＤＨ）遺伝子に由来するものが挙げられる。原核生物系では、ポリアデニル化シグナルは一般に必要なく、代わりに、より短く、より良く定義されたターミネーター配列を利用するのが通常である。ポリアデニル化／終結配列の選択は、発現に用いる宿主細胞との好適な適合性に基づき得る。
【０２５５】
その他の方法／増収のためのエレメント
上記に加え、増収のために使用可能な他の特徴として、クロマチン再構成エレメント、イントロンおよび宿主細胞特異的コドン改変が挙げられる。
【０２５６】
宿主細胞
抗原結合タンパク質をコードするベクターのクローニングまたは発現のために好適な宿主細胞は、原核生物、酵母または高等真核生物の細胞である。好適な原核細胞としては、真正細菌、例えば腸内細菌科(enterobacteriaceae)、例えばエシェリキア属(Escherichia)、例えば大腸菌(E. coli)（例えば、ＡＴＣＣ３１，４４６；３１，５３７；２７，３２５）、腸内細菌属(enterobacter)、エルウィニア属(Erwinia)、クレブシエラ・プロテウス(Klebsiella Proteus)、サルモネラ菌属(Salmonella)、例えばマウスチフス菌(Salmonella typhimurium)、セラチア属(Serratia)、例えばセラチア・マルセスカンス(Serratia marcescans)および赤痢菌属(Shigella)、ならびにバチルス属(Bacilli)、例えば枯草菌 (B. subtilis)およびバチルス・リケニホルミス(B. licheniformis)（ＤＤ２６６７１０参照）、シュードモナス属(Pseudomonas)、例えば緑膿菌(P. aeruginosa)およびストレプトミセス属(Streptomyces )が挙げられる。酵母宿主細胞としては、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クルイベロミセス(Kluyveromyces)（例えば、ＡＴＣＣ１６，０４５；１２，４２４；２４，１７８；５６，５００）、ヤロウィア属(yarrowia)（ＥＰ４０２，２２６）、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)（ＥＰ１８３０７０、Peng, et al. (2004) J. Biotechnol. 108: 185-192も参照）、カンジダ(Candida)、トリコデルマ・リージア(Trichoderma reesia)（ＥＰ２４４２３４）、ペニシリン(Penicillin)、トリポクラジウム(Tolypocladium)およびアスペルギルス(Aspergillus)宿主、例えば、Ａ．ニデュランス(A. nidulans)およびＡ．ニガー(A. niger)も企図される。
【０２５７】
高等真核宿主細胞としては、哺乳累細胞、例えば、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）、ヒト真核腎細胞系統２９３、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６３２）、ＢＨＫ５７０（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１０３１４）、２９３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１、ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ６１、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞系統、例えばＤＧ４４（Urlaub, et al. (1986) Somatic Cell Mol. Genet.12: 555-556参照）、特に、懸濁培養に適したＣＨＯ細胞系統、マウスセルトリ細胞、サル腎細胞、アフリカミドリサル腎細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）、ＨＥＬＡ細胞、イヌ腎細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）、ヒト肺細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ７５）、ＨｅｐＧ２および骨髄腫またはリンパ腫細胞、例えばＮＳ０（米国特許第５８０７７１５号参照）、Ｓｐ２／０、Ｙ０が挙げられる。
【０２５８】
このような宿主細胞はまた、抗原結合タンパク質の品質、機能および／または収量を改善するためにさらに操作または適合させることができる。限定されない例として、特異的修飾（例えば、グリコシル化）酵素およびタンパク質折り畳みシャペロンの発現が挙げられる。
【０２５９】
細胞培養法
抗原結合タンパク質をコードするベクターで形質転換された宿主細胞は、当業者に公知の任意の方法で培養することができる。宿主細胞をスピナーフラスコ、回転瓶または中空繊維系で培養してもよいが、大規模生産の場合、特に懸濁培養の場合には、撹拌式タンクリアクターで培養すればよい。撹拌式タンクは、例えばスパージャー、バッフルまたは低裂断インペラーを用いた曝気に適合させることができる。気泡塔およびエアリフトリアクターの場合、空気または酸素の気泡による直接曝気を用いてもよい。宿主細胞を血清不含培地で培養する場合、該培地にプルロニックＦ−６８などの細胞保護剤を添加し、曝気工程の結果としての細胞の損傷を防止する助けとする。宿主細胞の特性に応じて、足場依存性細胞系統のための増殖支持体としてマイクロ担体を用いてもよいし、細胞を懸濁培養に適合させてもよい（これが典型的である）。宿主細胞、特に無脊椎動物宿主細胞の培養には、種々の操作方法、流加式、リピートバッチ式プロセシング（Drapeau, et al. (1994) Cytotechnology 15: 103-109参照）、拡張式バッチプロセスまたは灌流培養を利用してもよい。組換え形質転換された哺乳類宿主細胞はウシ胎児血清（ＦＣＳ）などの血清含有培地で培養してもよいが、このような宿主細胞はKeen, et al. (1995) Cytotechnology 17: 153-163に開示されているものなどの合成血清不含培地、またはＰｒｏＣＨＯ−ＣＤＭもしくはＵｌｔｒａＣＨＯ（商標）（Ｃａｍｂｒｅｘ  ＮＪ，  ＵＳＡ）などの市販の培地で、必要に応じてグルコースなどのエネルギー源および組換えインスリンなどの合成増殖因子を添加して培養される。宿主細胞を血清不含培養するには、これらの細胞が血清不含条件での増殖に順応していることが必要な場合がある。１つの順応方法は、このような宿主細胞を血清含有培地で培養し、培養培地の８０％を血清不含培地と繰り返し交換して、宿主細胞に血清不含条件に順応することを学習させることである（例えば、Scharfenberg, et al. (1995), Animal Cell Technology: Developments towards the 21st century (Beuvery, et al.編, 619-623, Kluwer Academic publishers参照）。
【０２６０】
培地に分泌される抗原結合タンパク質を回収し、種々の技術を用いて精製し、意図する使用に適した精製度を得ることができる。例えば、ヒト患者を治療するための抗原結合タンパク質の使用には、一般に、（未精製培養培地と比較して）少なくとも９５％の純度、より一般には９８％または９９％より大きな純度が必要である。培養培地からの細胞残渣は一般に、遠心分離とその後の、例え精密濾過、限外濾過および／または深層濾過を用いた上清の清澄化工程を用いて除去される。透析、ならびにゲル電気泳動、ならびにヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、アフィニティークロマトグラフィー（所望によりポリヒスチジンなどのアフィニティータグ化システムを含む）および／または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ、米国特許第５４２９７４６号参照）などのクロマトグラフィー技術といった種々の他の方法が利用可能である。抗体は、種々の清澄化工程の後に、Ａタンパク質またはＧタンパク質アフィニティークロマトグラフィーを用いて捕捉することができる。その後、イオン交換クロマトグラフィーおよび／またはＨＡクロマトグラフィー、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィー、および硫酸アンモニウム沈降などのさらなるクロマトグラフィー工程を行うことができる。また、種々のウイルス除去工程（例えば、ＤＶ−２０フィルターを用いるナノ濾過）も利用可能である。これらの種々の工程の後に、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ以上、または１００ｍｇ／ｍｌ以上の本抗原結合タンパク質を含んでなる精製（例えば、モノクローナル）調製物が得られる。このような調製物は、実質的には、抗原結合タンパク質の凝集形態を実質的に含まない。
【０２６１】
細菌系を抗原結合フラグメントの発現のために用いてもよい。このようなフラグメントは細胞内の周辺質内に局在させることもできるし、または細胞外に分泌させることもできる。不溶性タンパク質を抽出し、当業者に公知の方法（Sanchez, et al. (1999) J. Biotechnol. 72: 13-20;およびCupit, et al. (1999) Lett Appl Microbiol 29: 273-277参照）に従って、再折り畳みにより活性なタンパク質を形成させることができる。
【０２６２】
脱アミド化は、アミド官能基が除去される化学反応である。生化学では、この反応は、アミノ酸のアスパラギンおよびグルタミンのアミド含有側鎖に傷害を与えるので、タンパク質の分解において重要である。脱アミド化反応は、タンパク質の有効寿命を制限することができる因子の１つであると考えられ、治療用タンパク質の製造中に最もよく起こる翻訳後修飾の１つでもある。例えば、組換えヒトＤＮアーゼおよび組換え可溶性ＣＤ４ではin vitroまたはin vivo生物活性の低下または喪失が報告されているが、他の組換えタンパク質は影響を受けないと思われる。本明細書に記載の抗原結合タンパク質のＨＥＲ３との結合能は、ｄｅ脱アミド化を誘導するストレス条件下では影響を受けないものと思われる。よって、本明細書に記載の抗原結合タンパク質の生物活性、およびそれらの有効寿命が脱アミド化によって影響を受けるとは考えにくい。
【０２６３】
医薬組成物
本明細書に記載の抗原結合タンパク質の精製調製物を、本明細書に記載のヒト疾患、障害および症状の治療に用いる医薬組成物に配合してもよい。「疾患」、「障害」および「病態」という用語は本明細書では互換的に使用される。該医薬組成物は、ＨＥＲ３受容体が疾患に関与する場合、またはＨＥＲ３受容体活性の中和が有益となる場合に、疾患の治療に使用することができる。治療上有効な量の本明細書に記載の抗原結合タンパク質を含んでなる医薬組成物は、ＨＥＲ３受容体の中和に応答する疾患の治療に使用することができる。
【０２６４】
該医薬製剤は、抗原結合タンパク質を薬学上許容される担体と組み合わせて含んでなり得る。本抗原結合タンパク質は、単独で投与しても医薬組成物の一部として投与してもよい。
【０２６５】
一般に、このような組成物は、許容される製薬実務によって既知かつ要求される薬学上許容される担体を含んでなる。例えば、REMINGTONS PHARMACEUTICAL SCIENCES, 第16版 (1980) Mack Publishing Co.参照。このような担体の例としては、所望により好適なバッファーで５〜８の範囲内のｐＨに緩衝された生理食塩水、リンゲル液またはブドウ糖液などの無菌担体が挙げられる。
【０２６６】
医薬組成物は、注射または持続注入（例えば、静脈内、腹腔内、皮内、皮下、筋肉内または門脈内）により投与され得る。このような医薬組成物は目に見える粒状物質を含まないのが好適である。医薬組成物は１ｍｇ〜１０ｇの間の抗原結合タンパク質、例えば、５ｍｇ〜１ｇの間の抗原結合タンパク質を含んでなり得る。あるいは、該組成物は、５ｍｇ〜５００ｍｇの間、例えば、５ｍｇ〜５０ｍｇの間の抗原結合タンパク質を含んでなり得る。
【０２６７】
このような医薬組成物の調製方法は当業者に周知である。医薬組成物は、単位投与形に１ｍｇ〜１０ｇの間の抗原結合タンパク質を、場合により使用説明書とともに含んでなり得る。医薬組成物は、当業者に周知または自明の方法に従って、投与前に再組成するために凍結乾燥（フリーズドライ）してもよい。抗体がＩｇＧ１アイソタイプを有する場合、このアイソタイプの抗体の銅媒介性分解の程度を軽減するために、医薬組成物にクエン酸塩（例えば、クエン酸ナトリウム）またはＥＤＴＡまたはヒスチジンなどの銅のキレート剤を加えてもよい。ＥＰ０６１２２５１参照。医薬組成物はまた、アルギニン塩基などの可溶化剤、ポリソルベート８０などの界面活性剤／抗凝集剤、およびバイアルヘッドスペースの酸素を置換するための窒素などの不活性ガスを含んでもよい。
【０２６８】
本抗原結合タンパク質を投与するための有効量および治療計画は一般に、経験的に決定され、患者の年齢、体重および健康状態、ならびに治療される疾患または障害などの因子に依存すると考えられる。このような因子は担当医の裁量の範囲内である。適切な用量を選択する指針は例えばSmith, et al. (1977) Antibodies in human diagnosis and therapy, Raven Press, New Yorkに見出すことができる。
【０２６９】
被験体に投与される抗原結合タンパク質の用量は一般に１μｇ／ｋｇ〜１５０ｍｇ／ｋｇの間、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの間、０．５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの間、１〜２５ｍｇ／ｋｇの間または１〜１０ｍｇ／ｋｇ（被験体体重）の間である。例えば、用量は１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇまたは６０ｍｇ／ｋｇであり得る。用量はまた、１０ｍｇ／ｋｇ〜１１０ｍｇ／ｍｇ、１５ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇであり得る。本抗原結合タンパク質は、例えば、非経口、皮下、静脈内または筋肉内投与され得る。用量はこれらの用量範囲の任意の個々の部分範囲であってもよい。
【０２７０】
所望により、治療組成物の有効一日用量は、１日のうち適当な間隔で２回、３回、４回、５回、６回またはそれを越える分割用量として個別に、所望により単位投与形で投与してもよい。
【０２７１】
用量の投与は、２〜２４時間、例えば２〜１２時間または２〜６時間にわたる緩慢な持続的注入によってもよい。このような投与は毒性副作用の軽減をもたらし得る。
【０２７２】
用量の投与は必要に応じて１回以上、例えば、１日３回、毎日１回、２日毎に１回、１週間毎に１回、２週間毎に１回、１か月毎に１回、３か月毎に１回、６か月毎に１回、または１２か月毎に１回繰り返してよい。本抗原結合タンパク質は、維持療法により、例えば、１週間毎に１回、６ヶ月間以上の期間、投与してもよい。本抗原結合タンパク質は、間欠療法により、例えば、３〜６か月の期間投与し、その後、３〜６か月間は投与せず、その後、再び３〜６ヶ月間抗原結合タンパク質を投与するなどの周期で投与してもよい。
【０２７３】
例えば、用量は、１４日または２８日毎に１回、各投与日に複数回の部分用量の形態で皮下に投与することができる。
【０２７４】
用量は、抗ＨＥＲ３抗原結合タンパク質を標的とする抗イディオタイプ抗体を用い、生体サンプルにおいて、投与後の循環抗ＨＥＲ３抗原結合タンパク質の量を測定することによって決定または調節することができる。本抗原結合タンパク質は、被験体においてＨＥＲ３活性をダウンレギュレートするのに効果的な量および期間で投与することができる。
【０２７５】
本抗原結合タンパク質は、特定の部位への標的療法に関してこのようにして被験体に投与することができる。例えば、本抗原結合タンパク質は、筋肉、例えば、骨格筋に局所注射することができる。
【０２７６】
本抗原結合タンパク質は、１以上の他の治療上有効な薬剤、例えば、他の受容体チロシンキナーゼ（限定されるものではないが、他のＨＥＲファミリーメンバーなど）、ｃ−Ｍｅｔ、ＧＦ−１Ｒの抗体もしくは小分子阻害剤、受容体リガンド（血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）など）、細胞傷害性薬剤（ドキソルビシン、シスプラチンまたはカルボプラチンなど）、サイトカインまたは抗悪性腫瘍薬と併用することができる。後者の例としては、限定されるものではないが、抗体または免疫調節タンパク質、小分子阻害剤、または化学療法薬（有糸分裂阻害剤、キナーゼ阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、インターカレート抗生物質、増殖因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、抗生存剤、生物反応修飾物質、抗ホルモン剤、例えば、抗アンドロゲン剤および抗血管新生剤の群から選択される）が挙げられる。抗新生物因子が放射線である場合、治療は内部源（近接照射療法ＢＴ）または外部源（外部照射療法ＥＢＲＴ）のいずれかを用いて行うことができる。本開示の抗体は、本明細書またはその全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされるＷＯ２００７／０７７０２８に記載されるように、化学結合、疎水性相互作用、静電的相互作用などを含む任意のタイプの機構によって化学療法薬または放射性同位元素にコンジュゲートさせることができる。
【０２７７】
本開示の抗体は、本明細書に記載の疾患の治療において他の治療上有効な薬剤と併用することができる。このような組合せはＨＥＲ３受容体が疾患に関与する場合、またはＨＥＲ３受容体の中和が有益となる場合の疾患の治療に用いることができる。
【０２７８】
本抗原結合タンパク質が他の治療上有効な薬剤と併用される場合、個々の成分は一緒にまたは別個に、逐次にまたは同時に、別個のまたは組み合わせた医薬処方物で、都合のよい任意の経路で投与することができる。別個にまたは逐次に投与される場合、本抗原結合タンパク質と治療上有効な薬剤は任意の順序で投与することができる。
【０２７９】
上記でいう組合せは、上記で定義される組合せを所望により薬学上許容される担体または賦形剤とともに含んでなる単一の医薬処方物の形態で用いるために提供され得るものである。このような薬学上許容される担体または賦形剤は当技術分野で周知であり、その全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされるＷＯ２００７／０７７０２８に開示されているものが含まれる。さらに、その中に確認される他のいずれの参照文献も、引用することによりその全開示が本開示の一部とされる。
【０２８０】
同じ処方物中に組み合わせる場合には、当然のことながら、これらの成分は安定でかつ、互いに、また、その処方物の他の成分と適合しなければならず、投与向けに処方されてよい。別個に処方する場合には、それらは任意の便宜な処方物で、例えば、当技術分野で抗原結合タンパク質に関して知られているような様式で提供され得る。
【０２８１】
同じ疾患に対して有効な第２の治療薬と組み合わせる場合、各成分の用量は、その本抗原結合タンパク質が単独で用いられる場合の用量とは異なり得る。適当な用量は当業者ならば容易に認識できる。
【０２８２】
本抗原結合タンパク質と治療上有効な薬剤は相乗作用を示し得る。言い換えれば、本抗原結合タンパク質と治療上有効な薬剤を併用投与すると、本明細書に記載の疾患、障害または病態に対して各単独の作用の総和よりも大きな作用を示す。
【０２８３】
本明細書において「有効量」とは、例えば研究者または臨床医が求めている組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的応答を誘発する薬物または医薬剤の量を意味する。医薬剤は２つ以上の生物学的または医学的応答を誘発する場合もある。さらに、「治療上有効な量」とは、そのような量を受容していない対応する被験体に比べて、限定されるものではないが、疾患、障害もしくは副作用の治癒、予防もしくは改善、または疾患もしくは障害の進行速度の緩徐化をもたらす任意の量を意味する。この用語はまた、その範囲内に、通常の生理学的機能を増進するのに有効な量、ならびに患者において第２の医薬剤の治療効果を増進または補助する生理学的機能をもたらすに有効な量も含む。
【０２８４】
本明細書において「癌」、「新生物」および「腫瘍」は互換的に用いられ、単数形でも複数形でも、宿主生物に対して病的となる悪性転換を受けた細胞を意味する。原発性癌細胞（すなわち、悪性転換部位の近傍から得られる細胞）は、十分確立された技術、特に、組織検査によって非癌性細胞から容易に識別することができる。本明細書において癌細胞の定義には、原発性癌細胞だけではなく、始原癌細胞に由来するいずれの細胞も含む。これには転移性癌細胞、ならびに癌細胞に由来するin vitro培養物および細胞系統が含まれる。通常固形腫瘍として顕在化するタイプの癌に関して、「臨床上検知可能な」腫瘍とは、例えばＣＡＴスキャン、ＭＲ撮像法、Ｘ線、超音波もしくは触診などの手法により腫瘍塊に基づいて検出可能なもの、および／または患者から得られるサンプルにおける１以上の癌特異的抗原の発現のために検知可能なものである。腫瘍は造血系腫瘍、例えば血液細胞の腫瘍（液性腫瘍を意味する）であってもよい。このような腫瘍に基づく臨床病態の具体例としては、慢性骨髄球性白血病または急性骨髄球性白血病などの白血病；多発性骨髄腫などの骨髄腫；リンパ腫などが挙げられる。
【０２８５】
本明細書において「治療すること」およびその文法的変形は、治療的療法を意味する。特定の病態に関して、治療するとは、（１）その病態の１以上の生物学的顕在化の状態を改善すること、（２）（ａ）その病態に至る、もしくはその病態の一因となる生物学的カスケードの１以上の点、または（ｂ）その病態の１以上の生物学的顕在化を妨げること、（３）その病態またはその治療に関連する１以上の症状、効果もしくは副作用を緩和すること、（４）その病態もしくはその病態の１以上の生物学的顕在化の進行を緩徐化すること、または（５）その病態の１以上の生物学的顕在化の発生を回避することを意味する。予防的療法も意図される療法である。当業者ならば、「回避」が絶対的な用語ではないことが分かるであろう。医学では、「回避」は、病態もしくはその生物学的顕在化の確率もしくは重篤度を実質的に引き下げるため、またはそのような病態またはその生物学的顕在化の発生を遅延させるための薬物の予防的投与を意味するものと理解される。予防的療法は、例えば、被験体が癌を発症するリスクが高いと考えられる場合、例えば、被験体が癌の強い家族歴を有する場合、または被験体が発癌物質に曝されていた場合に適当である。
【０２８６】
本開示の方法では、抗原結合タンパク質は「併用投与」することができ、これは、本明細書に記載の抗原結合タンパク質と、化学療法および放射線療法を含めた、癌の治療に有用であることが知られているさらなる１種または複数の有効成分との同時投与または任意の様式の個別逐次投与のいずれかを意味する。本明細書においてさらなる１種または複数の有効成分とは、癌または関節炎の治療を必要とする患者に投与した際に有利な特性が知られている、または示す任意の化合物または治療薬を含む。好ましくは、投与が同時でなければ、これらの化合物は互いに近接した時間に投与される。さらに、これらの化合物が同じ投与形で投与されるならば問題はなく、例えば、ある化合物を局所投与し、別の化合物を経口投与してもよい。
【０２８７】
一般に、治療対象の感受性腫瘍に対して活性を持つ任意の抗新生物薬を本開示の癌の治療において併用投与してもよい。このような薬剤の例は、Cancer Principles and Practice of Oncology, V.T. Devita and S. Hellman(編),第6版(February 15, 2001), Lippincott Williams & Wilkins Publishersに見出すことができる。当業者ならば、薬物の特定の特徴および関連する癌に基づいて、薬物のどの組合せが有用であるを認識することができるであろう。本開示において有用な典型的な抗新生物薬としては、限定されるものではないが、ジテルペノイドおよびビンカアルカロイドなどの抗微小管剤；プラチナ錯体；ナイトロジェンマスタード、オキサアザホスホリン、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素およびトリアゼンなどのアルキル化剤；アントラサイクリン、アクチノマイシンおよびブレオマイシンなどの抗生物質；エピポドフィロトキシンなどのトポイソメラーゼＩＩ阻害剤；プリンおよびピリミジン類似体、ならびに葉酸拮抗化合物などの代謝拮抗物質；カンプトテシンなどのトポイソメラーゼＩ阻害剤；ホルモンおよびホルモン類似体；シグナル伝達経路阻害剤；非受容体チロシンキナーゼ血管新生阻害剤；免疫治療薬；アポトーシス誘導薬；および細胞周期シグナル伝達阻害剤が挙げられる。
【０２８８】
本開示の抗原結合タンパク質と併用するため、または併用投与される、さらなる１種または複数の有効成分（抗新生物薬）は、化学療法薬である。組成物中で、または治療方法における併用投与により本開示の抗原結合タンパク質と組み合わせることができるこのような化学療法薬およびその他のカテゴリーの治療薬を以下に記載する。
【０２８９】
抗微小管剤または抗有糸分裂剤は、細胞周期のＭ基または有糸分裂基における腫瘍細胞の微小管に対して活性な細胞周期特異的薬剤である。抗微小管剤の例としては、限定されるものではないが、ジテルペノイドおよびビンカアルカロイドが挙げられる。
【０２９０】
天然源に由来するジテルペノイドは、細胞周期のＧ２／Ｍ基において働く細胞周期特異的抗癌剤である。ジテルペノイドは微小管のβ−チューブリンサブユニットと結合することにより、このタンパク質を安定化させると考えられている。そして、このタンパク質の解離が阻害され、有糸分裂が中断され、細胞死に至ると思われる。ジテルペノイドの例としては、限定されるものではないが、パクリタキセルおよびその類似体ドセタキセルが挙げられる。
【０２９１】
パクリタキセル、すなわち、（２Ｒ，３Ｓ）−Ｎ−ベンゾイル−３−フェニルイソセリンとの５β，２０−エポキシ−１，２α，４，７β，１０β，１３α−ヘキサ−ヒドロキシタクス−１１−エン−９−オン４，１０−ジアセテート２−ベンゾエート１３−エステルは、タイヘイヨウイチイ(Taxus brevifolia)の木から単離された天然ジテルペン産物であり、注射溶液タキソール(TAXOL)（商標）として市販されている。パクリタキセルは、テルペン類のタキサンファミリーのメンバーである。パクリタキセルは１９７１年にWani et al.( J. Am. Chem, Soc., 93:2325. 1971)により初めて単離され、化学的方法およびＸ線結晶学的方法によってその構造が同定された。その活性の１つの機構は、パクリタキセルの、チューブリンと結合して、それにより癌細胞の増殖を阻害する能力に関連する。Schiff et al., Proc.  Natl, Acad, Sci. USA, 77:1561-1565 (1980); Schiff et al., Nature, 277:665-667 (1979); Kumar, J. Biol, Chem, 256: 10435-10441 (1981)。数種のパクリタキセル誘導体の合成および抗癌活性に関する総説としては、D. G. I. Kingston et al., Studies in Organic Chemistry vol. 26, “New trends in Natural Products Chemistry 1986”, Attaur-Rahman, P.W. Le Quesne編, (Elsevier, Amsterdam, 1986) pp 219-235を参照。
【０２９２】
パクリタキセルは、米国では、難治性卵巣癌の治療(Markman et al., Yale Journal of Biology and Medicine, 64:583, 1991; McGuire et al., Ann. lntem, Med., 111:273,1989)における臨床使用および乳癌治療に関して(Holmes et al., J. Nat. Cancer Inst., 83:1797,1991)が承認されている。パクリタキセルは皮膚の新生物(Einzig et. al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 20:46)および頭頚部癌(Forastire et. al., Sem. Oncol., 20:56, 1990)の治療にも可能性のある候補である。この化合物はまた、多嚢胞性腎疾患(Woo et. al., Nature, 368:750. 1994)、肺癌およびマラリアの治療にも可能性を示す。パクリタキセルによる患者の処置は、閾値濃度（５０ｎＭ）(Kearns, C.M. et. al., Seminars in Oncology, 3(6) p.16-23, 1995)を上回る投与期間と関連して、骨髄抑制をもたらす(multiple cell lineages, Ignoff, R.J. et. al, Cancer Chemotherapy Pocket Guide, 1998)。
【０２９３】
ドセタキセル、すなわち、５β−２０−エポキシ−１，２α，４，７β，１０β，１３α−ヘキサヒドロキシタクス−１１−エン−９−オン４−アセテート２−ベンゾエートとの（２Ｒ，３Ｓ）−Ｎ−カルボキシ−３−フェニルイソセリン，Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル，１３−エステル三水和物は、注射溶液としてのタキソテール(TAXOTERE)（商標）として市販されている。ドセタキセルは、乳癌治療に指示される。ドセタキセルは、パクリタキセル（ｑ．ｖ．）の半合成誘導体であり、ヨーロッパイチイの木の針葉から抽出される天然前駆体１０−デアセチル−バッカチンＩＩＩを用いて製造される。ドセタキセルの用量制限毒性は、好中球減少である。
【０２９４】
ビンカアルカロイドは、ツルニチニチソウ植物に由来する細胞周期特異的抗新生物剤である。ビンカアルカロイドは、チューブリンに特異的に結合することにより細胞周期のＭ期（有糸分裂期）に作用する。結果的に、結合されたチューブリン分子は、重合して微小管となることができない。有糸分裂が分裂中期で中断され、細胞死に至ると考えられている。ビンカアルカロイドの例としては、限定されるものではないが、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビノレルビンが挙げられる。
【０２９５】
ビンブラスチン、すなわち、硫酸ビンカロイコブラスチンは、注射溶液としてのＶＥＬＢＡＮ（商標）として市販れている。ビンブラスチンは様々な固形腫瘍の第二選択療法としての適用の可能性を持つが、主として精巣癌、およびホジキン病を含む様々なリンパ腫、ならびにリンパ球性および組織球性リンパ腫の治療において指示される。骨髄抑制が、ビンブラスチンの用量制限副作用である。
【０２９６】
ビンクリスチン、すなわち、ビンカロイコブラスチン，２２−オキソ−硫酸塩は、注射溶液としてのオンコビン(ONCOVIN)（商標）として市販されている。ビンクリスチンは、急性白血病の治療に指示され、ホジキンおよび非ホジキン悪性リンパ腫に対する治療計画での使用も見出せる。脱毛および神経作用がビンクリスチンの最も一般的な副作用であり、また、程度は低いが、骨髄抑制および消化管粘膜炎作用も生じる。
【０２９７】
酒石酸ビノレルビンの注射溶液（ナベルビン(NAVELBINE)（商標））として市販されているビノレルビン、すなわち、３’，４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−Ｃ’−ノルビンカロイコブラスチン［Ｒ−（Ｒ＊，Ｒ＊）−２，３−ジヒドロキシブタンジオエート（１：２）（塩）］は、半合成ビンカアルカロイドである。ビノレルビンは、様々な固形腫瘍、特に非小細胞肺癌、進行性乳癌およびホルモン不応性前立腺癌の治療において、単剤として、またはシスプラチンなどの他の化学療法薬と組み合わせて指示される。骨髄抑制がビノレルビンの最も一般的な用量制限副作用である。
【０２９８】
白金錯体は、非細胞周期特異的抗癌剤であり、ＤＮＡとの相互作用性がある。この白金錯体は腫瘍細胞に侵入し、アクア化を受け、ＤＮＡと鎖内および鎖間の架橋を形成して、腫瘍に有害な生物学的作用を引き起こす。白金錯体の例としては、限定されるものではないが、シスプラチンおよびカルボプラチンが挙げられる。
【０２９９】
シスプラチン、シス−ジアンミンジクロロ白金は、注射溶液としてのプラチノール(PLATINOL)（商標）として市販されている。シスプラチンは、主に転移性精巣癌および卵巣癌および進行性膀胱癌の治療において指示される。シスプラチンの主な用量制限副作用は腎毒性（水分補給と利尿により管理可能）および内耳神経毒性である。
【０３００】
カルボプラチン、すなわち、白金，ジアミン［１，１−シクロブタン−ジカルボキシレート（２−）−Ｏ，Ｏ’］）は、注射溶液としてのパラプラチン(PARAPLATIN)（商標）として市販されている。カルボプラチンは、主に進行性卵巣癌の第一選択治療および第二選択治療において指示される。骨髄抑制が、カルボプラチンの用量制限毒性である。
【０３０１】
アルキル化剤は、非細胞周期特異的抗癌剤であり、強力な求電子物質である。一般に、アルキル化剤は、アルキル化によって、ホスフェート、アミノ、スルフヒドリル、ヒドロキシル、カルボキシルおよびイミダゾール基などのＤＮＡ分子の求核部分を介してＤＮＡと共有結合を形成する。このようなアルキル化は核酸機能を破壊し、細胞死に至らせる。アルキル化剤の例としては、限定されるものではないが、シクロホスファミド、メルファランおよびクロラムブシルなどのナイトロジェンマスタード類；ブスルファンなどのスルホン酸アルキル類；カルムスチンなどのニトロソ尿素類；ならびにダカルバジンなどのトリアゼン類が挙げられる。
【０３０２】
シクロホスファミド、すなわち、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］テトラヒドロ−２Ｈ−１，３，２−オキサザホスホリン２−オキシド一水和物は、注射溶液または錠剤としてのシトキサン(CYTOXAN)（商標）として市販されている。シクロホスファミドは、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫および白血病の治療において、単剤として、または他の化学療法薬と組み合わせて指示される。脱毛、悪心、嘔吐および白血球減少が、シクロホスファミドの最も一般的な用量制限副作用である。
【０３０３】
メルファラン、すなわち、４−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］−Ｌ−フェニルアラニンは、注射溶液または錠剤としてのアルケラン(ALKERAN)（商標）として市販されている。メルファランは、多発性骨髄腫および卵巣の切除不能上皮癌の待期療法として指示される。骨髄抑制が、メルファランの最も一般的な用量制限副作用である。
【０３０４】
クロラムブシル、すなわち、４−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］ベンゼンブタン酸は、リューケラン(LEUKERAN)（商標）錠剤として市販されている。クロラムブシルは、慢性リンパ性白血病、ならびに悪性リンパ腫（リンパ肉腫、巨大濾胞性リンパ腫およびホジキン病など）の待期療法として指示される。骨髄抑制が、クロラムブシルの最も一般的な用量制限副作用である。
【０３０５】
ブスルファン、すなわち、１，４−ブタンジオールジメタンスルホネートは、ミレラン(MYLERAN)（商標）錠剤として市販されている。ブスルファンは、慢性骨髄性白血病の待期療法にとして指示される。骨髄抑制が、ブスルファンの用量制限副作用である。
【０３０６】
カルムスチン、すなわち、１，３−［ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソ尿素は、凍結乾燥品の単一バイアルとしてのＢｉＣＮＵ（商標）として市販されている。カルムスチンは、脳腫瘍、多発性骨髄腫、ホジキン病および非ホジキンリンパ腫の待期療法として、単剤で、または他の薬剤との組み合わせて指示される。遅発性骨髄抑制が、カルムスチンの最も一般的な用量制限副作用である。
【０３０７】
ダカルバジン、すなわち、５−（３，３−ジメチル−１−トリアゼノ）−イミダゾール−４−カルボキサミドは、単一バイアル品としてのＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（商標）として市販されている。ダカルバジンは、転移性悪性黒色腫の治療に、また、ホジキン病の第二選択治療として他の薬剤と組み合わせて指示される。悪心、嘔吐および食欲不振が、ダカルバジンの最も一般的な用量制限副作用である。
【０３０８】
抗生抗新生物剤は、ＤＮＡと結合または相互作用する、非細胞周期特異的薬剤である。一般に、その作用により、安定なＤＮＡ複合体または鎖の破損をもたらし、その核酸の正常な機能を破壊し、細胞死をもたらす。抗生抗新生物剤の例としては、限定されるものではないが、ダクチノマイシンなどのアクチノマイシン類；ダウノルビシンおよびドキソルビシなどのアントラサイクリン類(anthrocyclins)；ならびにブレオマイシン類が挙げられる。
【０３０９】
ダクチノマイシンは、アクチノマイシンＤとしても知られ、注射形態としてのコスメゲン(COSMEGEN)（商標）として市販されている。ダクチノマイシンは、ウィルムス腫瘍および横紋筋肉腫の治療に指示される。悪心、嘔吐および食欲不振が、ダクチノマイシンの最も一般的な用量制限副作用である。
【０３１０】
ダウノルビシン、すなわち、（８Ｓ−シス−）−８−アセチル−１０−［（３−アミノ−２，３，６−トリデオキシ−α−Ｌ−リキソ−ヘキソピラノシル）オキシ］−７，８，９，１０−テトラヒドロ−６，８，１１−トリヒドロキシ−１−メトキシ−５，１２ナフタセンジオン塩酸塩は、リポソーム注射形態としてのダウノキソム(DAUNOXOME)（商標）として、または注射形態としてのセルビジン(CERUBIDINE)（商標）として市販されている。ダウノルビシンは、急性非リンパ性白血病および進行性ＨＩＶ関連カポジ肉腫の治療において緩解誘導のために指示される。骨髄抑制が、ダウノルビシンの最も一般的な用量制限副作用である。
【０３１１】
ドキソルビシン、すなわち、（８Ｓ，１０Ｓ）−１０−［（３−アミノ−２，３，６−トリデオキシ−α−Ｌ−リキソ−ヘキソピラノシル）オキシ］−８−グリコロイル，７，８，９，１０−テトラヒドロ−６，８，１１−トリヒドロキシ−１−メトキシ−５，１２ナフタセンジオン塩酸塩は、注射形態としてのルベックス(RUBEX)（商標）またはアドリアマイシンＲＤＦ(ADRIAMYCIN RDF)（商標）として市販されている。ドキソルビシンは、主に急性リンパ芽球性白血病および急性骨髄芽球性白血病の治療に指示されるが、いくつかの固形腫瘍およびリンパ腫の治療においても有用な成分である。骨髄抑制が、ドキソルビシンの最も一般的な用量制限副作用である。
【０３１２】
ブレオマイシン、すなわち、放線菌(Streptomyces verticillus)株から単離される細胞傷害性グリコペプチド抗生物質の混合物は、ブレノキサン(BLENOXANE)（商標）として市販されている。ブレオマイシンは、扁平上皮癌、リンパ腫および精巣癌の待期療法として、単剤で、または他の薬剤と組み合わせて指示される。肺および皮膚毒性が、ブレオマイシンの最も一般的な用量制限副作用である。
【０３１３】
トポイソメラーゼＩＩ阻害剤としては、限定されるものではないが、エピポドフィロトキシンが挙げられる。
【０３１４】
エピポドフィロトキシンは、マンドレーク植物に由来する細胞周期特異的抗腫瘍剤である。エピポドフィロトキシンは、一般に、トポイソメラーゼＩＩおよびＤＮＡと三元複合体を形成してＤＮＡ鎖の破損を引き起こすことにより、細胞周期のＳ期およびＧ２期の細胞に影響を及ぼす。これらの鎖の破損が蓄積し、細胞死に至る。エピポドフィロトキシンの例としては、限定されるものではないが、エトポシドおよびテニポシドが挙げられる。
【０３１５】
エトポシド、すなわち、４’−デメチル−エピポドフィロトキシン９［４，６−０−（Ｒ）−エチリデン−β−Ｄ−グルコピラノシド］は、注射溶液またはカプセル剤としてのＶｅＰＥＳＩＤ（商標）として市販されており、一般にＶＰ−１６として知られる。エトポシドは、精巣癌および非小細胞肺癌の治療において、単剤として、または他の化学療法薬と組み合わせて指示される。骨髄抑制が、エトポシドの最も一般的な副作用である。白血球減少の発生率が、血小板減少よりも重篤となる傾向がある。
【０３１６】
テニポシド、すなわち、４’−デメチル−エピポドフィロトキシン９［４，６−０−（Ｒ）−テニリデン−β−Ｄ−グルコピラノシド］は、注射溶液としてのブモン(VUMON)（商標）として市販されており、一般にＶＭ−２６として知られる。テニポシドは、小児急性白血病の治療において、単剤として、または他の化学療法薬と組み合わせて指示される。骨髄抑制が、テニポシドの最も一般的な用量制限副作用である。テニポシドは、白血球減少と血小板減少の両方を誘発し得る。
【０３１７】
代謝拮抗新生物剤は、ＤＮＡ合成を阻害するか、またはプリンもしくはピリミジン塩基の合成を阻害し、それによりＤＮＡ合成を制限することによって、細胞周期のＳ期（ＤＮＡ合成期）に作用する細胞周期特異的抗新生物剤である。結果として、Ｓ期が進行せず、細胞死に至る。代謝拮抗抗新生物剤の例としては、限定されるものではないが、フルオロウラシル、メトトレキサート、シタラビン、メルカプトプリン(mecaptopurine)、チオグアニンおよびゲムシタビンが挙げられる。
【０３１８】
５−フルオロウラシル、すなわち、５−フルオロ−２，４−（１Ｈ，３Ｈ）ピリミジンジオンは、フルオロウラシルとして市販されている。５−フルオロウラシルの投与はチミジル酸合成の阻害をもたらし、ＲＮＡおよびＤＮＡの双方に組み込まれる。その結果、一般に細胞死に至る。５−フルオロウラシルは、乳癌、結腸癌、直腸癌、胃癌および膵臓癌の治療において、単剤として、または他の化学療法薬との組み合わせて指示される。骨髄抑制および粘膜炎が、５−フルオロウラシルの用量制限副作用である。他のフルオロピリミジン類似体として、５−フルオロデオキシウリジン（フロキシウリジン）および５−フルオロデオキシウリジン一リン酸が挙げられる。
【０３１９】
シタラビン、すなわち、４−アミノ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−２（１Ｈ）−ピリミジノンは、サイトサール−Ｕ(CYTOSAR-U)（商標）として市販されており、一般にＡｒａ−Ｃとして知られる。シタラビンは、成長中のＤＮＡ鎖の末端にシタラビンを組み込むことでＤＮＡ鎖の伸長を阻害することにより、Ｓ期に細胞周期特異性を示すと考えられている。シタラビンは、急性白血病の治療において、単剤として、または他の化学療法薬と組み合わせて指示される。他のシチジン類似体としては、５−アザシチジンおよび２’，２’−ジフルオロデキシシチジン（ゲムシタビン）が挙げられる。シタラビンは、白血球減少、血小板減少および粘膜炎を誘発する。
【０３２０】
メルカプトプリン、すなわち、１，７−ジヒドロ−６Ｈ−プリン−６−チオン一水和物は、プリネトール(PURINETHOL)（商標）として市販されている。メルカプトプリンは、詳細は未だ不明の機構によりＤＮＡ合成を阻害することで、Ｓ期に細胞周期特異性を示す。メルカプトプリンは、急性白血病の治療において、単剤として、または、他の化学療法薬と組み合わせて指示される。骨髄抑制および消化管粘膜炎が、高用量のメルカプトプリンの予想される副作用である。有用なメルカプトプリン類似体として、アザチオプリンがある。
【０３２１】
チオグアニン、すなわち、２−アミノ−１，７−ジヒドロ−６Ｈ−プリン−６−チオンは、タブロイド(TABLOID)（商標）として市販されている。チオグアニンは、未だ不明の機構によりＤＮＡ合成を阻害することで、Ｓ期に細胞周期特異性を示す。チオグアニンは、急性白血病の治療において、単剤として、または他の化学療法薬と組み合わせて指示される。白血球減少、血小板減少および貧血を含む骨髄抑制が、チオグアニン投与の最も一般的な用量制限副作用である。しかしながら、消化管副作用が生じ、用量制限となる場合がある。他のプリン類似体として、ペントスタチン、エリスロヒドロキシノニルアデニン、リン酸フルダラビンおよびクラドリビンが挙げられる。
【０３２２】
ゲムシタビン、すなわち、２’−デオキシ−２’、２’−ジフルオロシチジン一塩酸塩（β−イソ型）は、ジェムザール(GEMZAR)（商標）として市販されている。ゲムシタビンは、Ｇ１／Ｓ期の境界で細胞の進行を阻止することで、Ｓ期に細胞周期特異性を示す。ゲムシタビンは、局在型進行性非小細胞肺癌の治療においてシスプラチンと組み合わせて、また、局所的な進行性膵臓癌の処置において単独で指示される。白血球減少、血小板減少および貧血を含む骨髄抑制が、ムシタビン投与の最も一般的な用量制限副作用である。
【０３２３】
メトトレキサート、すなわち、Ｎ−［４［［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル］メチルアミノ］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸は、メトトレキサートナトリウムとして市販されている。メトトレキサートは、プリンヌクレオチドおよびチミジル酸の合成に必要とされるジヒドロ葉酸（dyhydrofolic acid）レダクターゼの阻害を通じ、ＤＮＡ合成、修復および／または複製を阻害することによりＳ期に細胞周期特異性を示す。メトトレキサートは、絨毛癌、髄膜白血病、非ホジキンリンパ腫、ならびに乳房、頭部、頚部、卵巣および膀胱の癌腫の治療において、単剤として、または他の化学療法薬と組み合わせて指示される。骨髄抑制（白血球減少、血小板減少および貧血）および粘膜炎が、メトトレキサート投与の予想される副作用である。
【０３２４】
カンプトテシンおよびカンプトテシン誘導体を含むカンプトテシン類は、トポイソメラーゼＩ阻害剤として入手可能であるか、または開発中である。カンプトテシン細胞傷害活性は、そのトポイソメラーゼＩ阻害活性に関連があると考えられている。カンプトテシンの例としては、限定されるものではないが、イリノテカン、トポテカン、および下記の７−（４−メチルピペラジノ−メチレン）−１０，１１−エチレンジオキシ−２０−カンプトテシンの様々な光学形態が挙げられる。
【０３２５】
イリノテカンＨＣｌ、すなわち、（４Ｓ）−４，１１−ジエチル−４−ヒドロキシ−９−［（４−ピペリジノピペリジノ）カルボニルオキシ］−１Ｈ−ピラノ［３’，４’，６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−３，１４（４Ｈ，１２Ｈ）−ジオン塩酸塩は、注射溶液カンプトサール(CAMPTOSAR)（商標）として市販されている。
【０３２６】
イリノテカンは、その活性代謝産物ＳＮ−３８とともに、トポイソメラーゼＩ−ＤＮＡ複合体と結合する、カンプトテシン誘導体である。この細胞傷害性は、トポイソメラーゼＩ：ＤＮＡ：イリノテカン(irintecan)またはＳＮ−３８三元複合体と複製酵素との相互作用により生じる回復不能な二本鎖破損の結果として生じると考えられる。イリノテカンは、結腸または直腸の転移癌の治療において指示される。イリノテカンＨＣｌの用量制限副作用は、好中球減少を含む骨髄抑制および下痢を含むＧＩ作用である。
【０３２７】
トポテカンＨＣｌ、すなわち、（Ｓ）−１０−［（ジメチルアミノ）メチル］−４−エチル−４，９−ジヒドロキシ−１Ｈ−ピラノ［３’，４’，６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−３，１４−（４Ｈ，１２Ｈ）−ジオン一塩酸塩は、注射溶液ハイカムチン(HYCAMTIN)（商標）として市販されている。トポテカンは、トポイソメラーゼＩ−ＤＮＡ複合体と結合するカンプトテシン誘導体であり、ＤＮＡ分子のねじれ歪みに応じてトポイソメラーゼＩにより生じる一本鎖破損の再連結を抑制する。トポテカンは、卵巣癌および小細胞肺癌の転移癌の第二選択治療として指示される。トポテカンＨＣｌの用量制限副作用は、骨髄抑制、主として好中球減少である。
【０３２８】
また、現在開発中の下式Ａ：
【化２】
2013544492.tif 000007
の、化学名「７−（４−メチルピペラジノ−メチレン）−１０，１１−エチレンジオキシ−２０（Ｒ，Ｓ）−カンプトテシン（ラセミ混合物）または「７−（４−メチルピペラジノ−メチレン）−１０，１１−エチレンジオキシ−２０（Ｒ）カンプトテシン（Ｒ鏡像異性体）または「７−（４−メチルピペラジノ−メチレン）−１０，１１−エチレンジオキシ−２０（Ｓ）−カンプトテシン（Ｓ鏡像異性体）」で知られるラセミ混合物（Ｒ，Ｓ）型ならびにＲおよびＳ鏡像異性体を含むカンプトテシン誘導体も着目される。このような化合物ならびに関連化合物は、製造方法を含め、米国特許第６，０６３，９２３号；同第５，３４２，９４７号；同第５，５５９，２３５号；同第５，４９１，２３７号および１９９７年１１月２４日に出願された係属中の米国特許出願第０８／９７７２１７号に記載されている。
【０３２９】
ホルモンおよびホルモン類似体は、ホルモンと癌の増殖および／または増殖の欠如との間に関係がある癌を治療するのに有用な化合物である。癌治療で有用なホルモンおよびホルモン類似体の例としては、限定されるものではないが、小児の悪性リンパ腫および急性白血病の治療に有用なプレドニゾンおよびプレドニゾロンなどの副腎皮質ステロイド；アミノグルテチミドおよび他のアロマターゼ阻害剤、例えば、副腎皮質癌およびエストロゲン受容体を含むホルモン依存性乳癌の治療に有用なアナストロゾール、レトロゾール、ボラゾール(vorazole)およびエクセメスタン；プロゲストリン(progestrin)、例えば、ホルモン依存性乳癌および子宮内膜癌の治療に有用な酢酸メゲストロール；エストロゲン、アンドロゲン、および抗アンドロゲン作用薬、例えば、前立腺癌および良性の前立腺肥大の治療に有用なフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、酢酸シプロテロンおよび５α−レダクターゼ、例えば、フィナステリドおよびデュタステライド；抗エストロゲン作用薬、例えば、ホルモン依存性乳癌および他の感受性癌の治療に有用なタモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、ヨードキシフェン、ならびに選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭＳ）、例えば米国特許第５，６８１，８３５号、同第５，８７７，２１９号および同第６，２０７，７１６号に記載のもの；ならびに前立腺癌の治療のための黄体形成ホルモン（ＬＨ）および／または卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出を刺激するゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）およびその類似体、例えば、ＬＨＲＨ促進薬および拮抗薬、例えば酢酸ゴセレリンおよびロイプロリド(luprolide)が挙げられる。
【０３３０】
シグナル伝達経路阻害剤は、細胞内変化を引き起こす化学的プロセスを遮断または阻害する阻害剤である。本明細書において、この変化は細胞増殖または分化である。本発明に有用なシグナル伝達阻害剤としては、受容体チロシンキナーゼ、非受容体型チロシンキナーゼ、ＳＨ２／ＳＨ３ドメイン遮断剤、セリン／トレオニンキナーゼ、ホスファチジルイノシトール(phosphotidyl inositol)−３キナーゼ、ミオイノシトールシグナル伝達、およびＲａｓ癌遺伝子の阻害剤が含まれる。
【０３３１】
いくつかのタンパク質チロシンキナーゼは、細胞増殖の調節に関与する様々なタンパク質の特定のチロシル残基のリン酸化を触媒する。このようなタンパク質チロシンキナーゼは、大きくは受容体または非受容体型キナーゼとして分類することができる。
【０３３２】
受容体チロシンキナーゼは、細胞外リガンド結合ドメイン、トランスメンブランドメインおよびチロシンキナーゼドメインを有するトランスメンブランタンパク質である。受容体チロシンキナーゼは細胞増殖の調節に関与し、一般に増殖因子受容体と呼ばれている。例えば過剰発現または突然変異による、これら多くのキナーゼの不適切または制御を欠いた活性化、すなわち異常なキナーゼ増殖因子受容体活性は、制御を欠いた細胞増殖をもたらすことが示されている。従って、このようなキナーゼの異常な活性は、悪性組織増殖と関連づけられている。結果として、このようなキナーゼの阻害剤は、癌治療法を提供し得る。増殖因子受容体としては、例えば、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦｒ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦｒ）、ｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ４、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦｒ）、免疫グロブリン様ドメインおよび上皮細胞増殖因子相同ドメインを含むチロシンキナーゼ（ＴＩＥ−２）、インスリン増殖因子−Ｉ（ＩＧＦＩ）受容体、マクロファージコロニー刺激因子（ｃｆｍｓ）、ＢＴＫ、ｃｋｉｔ、ｃｍｅｔ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体、Ｔｒｋ受容体（ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢおよびＴｒｋＣ）、エフリン（ｅｐｈ）受容体ならびにＲＥＴ癌原遺伝子が挙げられる。増殖受容体のいくつかの阻害剤が開発中であり、リガンド拮抗剤、抗体、チロシンキナーゼ阻害剤およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。増殖因子受容体および増殖因子受容体機能を阻害する薬剤は、例えば、Kath, John C., Exp. Opin. Ther. Patents (2000) 10(6):803-818；Shawver et al DDT Vol 2, No. 2(1997年2月)；およびLofts, F. J. et al, "Growth factor receptors as targets", New Molecular Targets for Cancer Chemotherapy,Workman, Paul and Kerr, David編, CRC press 1994, Londonに記載されている。
【０３３３】
増殖因子受容体キナーゼでないチロシンキナーゼは、非受容体型チロシンキナーゼと呼ばれる。抗癌剤の標的または潜在的標的となる、本発明で用いられる非受容体型チロシンキナーゼには、ｃＳｒｃ、Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｊａｋ、ｃＡｂｌ、ＦＡＫ（接着斑キナーゼ）、ブルトン型チロシンキナーゼ、およびＢｃｒ−Ａｂｌが挙げられる。このような非受容体型キナーゼおよび非受容体型チロシンキナーゼ機能を阻害する薬剤は、Sinh, S. and Corey, S.J., (1999) Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research 8 (5): 465-80；およびBolen, J.B., Brugge, J.S., (1997) Annual review of Immunology. 15: 371-404に記載されている。
【０３３４】
ＳＨ２／ＳＨ３ドメイン遮断剤は、ＰＩ３−Ｋ  ｐ８５サブユニット、Ｓｒｃファミリーキナーゼ、アダプター分子（Ｓｈｃ、Ｃｒｋ、Ｎｃｋ、Ｇｒｂ２）、およびＲａｓ−ＧＡＰを含む様々な酵素またはアダプタータンパク質におけるＳＨ２またはＳＨ３ドメイン結合を乱す薬剤である。抗癌剤の標的としてのＳＨ２／ＳＨ３ドメインは、Smithgall, T.E. (1995), Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 34(3) 125-32に述べられている。
【０３３５】
セリン／トレオニンキナーゼの阻害剤としては、Ｒａｆキナーゼ（ｒａｆｋ）、マイトジェンまたは細胞外調節キナーゼ(Mitogen or Extracellular Regulated Kinase)（ＭＥＫ）、および細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）の遮断剤も含むＭＡＰキナーゼカスケード遮断剤；ならびにＰＫＣ（α、β、γ、ε、μ、λ、ι、ζ）の遮断剤を含むタンパク質キナーゼＣファミリーメンバー遮断剤が挙げられる。ＩｋＢキナーゼファミリー（ＩＫＫａ、ＩＫＫｂ）、ＰＫＢファミリーキナーゼ、ａｋｔキナーゼファミリーメンバーおよびＴＧＦβ受容体キナーゼ。このようなセリン／トレオニンキナーゼおよびそれらの阻害剤は、Yamamoto, T., Taya, S., Kaibuchi, K., (1999), Journal of Biochemistry. 126 (5) 799-803; Brodt, P, Samani, A., and Navab, R. (2000), Biochemical Pharmacology, 60. 1101-1107; Massague, J., Weis-Garcia, F. (1996) Cancer Surveys. 27:41-64; Philip, P.A., and Harris, A.L. (1995), Cancer Treatment and Research. 78: 3-27, Lackey, K. et al Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, (10), 2000, 223-226; 米国特許第６，２６８，３９１号；およびMartinez-Iacaci, L. et al, Int. J. Cancer (2000), 88(1), 44-52に記載されている。
【０３３６】
ＰＩ３−キナーゼ、ＡＴＭ、ＤＮＡ−ＰＫおよびＫｕの遮断剤を含むホスファチジルイノシトール−３キナーゼファミリーメンバーの阻害剤もまた本発明において有用であり得る。このようなキナーゼは、Abraham, R.T. (1996), Current Opinion in Immunology. 8 (3) 412-8; Canman, C.E., Lim, D.S. (1998), Oncogene 17 (25) 3301-3308; Jackson, S.P. (1997), International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 29 (7):935-8;およびZhong, H. et al, Cancer res, (2000) 60(6), 1541-1545に記載されている。
【０３３７】
また、本発明では、ホスホリパーゼＣ遮断剤およびミオイノシトール類似体などのミオイノシトールシグナル伝達阻害剤も着目される。このようなシグナル伝達阻害剤は、Powis, G., and Kozikowski A., (1994) New Molecular Targets for Cancer Chemotherapy, Paul Workman and David Kerr編, CRC press 1994, Londonに記載されている。
【０３３８】
シグナル伝達経路阻害剤のもう１つの群が、Ｒａｓ癌遺伝子の阻害剤である。このような阻害剤には、ファルネシルトランスフェラーゼ、ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼおよびＣＡＡＸプロテアーゼの阻害剤、ならびにアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムおよび免疫療法が含まれる。このような阻害剤は、野生型突然変異体ｒａｓを含む細胞においてｒａｓの活性化を遮断し、それにより抗増殖薬として作用することが示されている。Ｒａｓ癌遺伝子の阻害は、Scharovsky, O.G., Rozados, V.R., Gervasoni, S.I. Matar, P. (2000), Journal of Biomedical Science. 7(4) 292-8；Ashby, M.N. (1998), Current Opinion in Lipidology. 9 (2) 99-102；およびBioChim. Biophys. Acta, (19899) 1423(3):19-30に記載されている。
【０３３９】
受容体キナーゼリガンド結合に対する抗体拮抗剤もまた、シグナル伝達阻害剤として機能し得る。この群のシグナル伝達経路阻害剤は、受容体チロシンキナーゼの細胞外リガンド結合ドメインに対するヒト化抗体の使用を含む。例えば、Ｉｍｃｌｏｎｅ  Ｃ２２５  ＥＧＦＲ特異的抗体（Green, M.C. et al, Monoclonal Antibody Therapy for Solid Tumors, Cancer Treat. Rev., (2000), 26(4), 269-286参照）；ハーセプチン(Herceptin)（商標）ｅｒｂＢ２抗体（Tyrosine Kinase Signalling in Breast cancer:erbB Family Receptor Tyrosine Kniases, Breast cancer Res., 2000, 2(3), 176-183参照)；ならびに２ＣＢ  ＶＥＧＦＲ２特異的抗体（Brekken, R.A. et al, Selective Inhibition of VEGFR2 Activity by a monoclonal Anti-VEGF antibody blocks tumor growth in mice, Cancer Res. (2000) 60, 5117-5124参照）が挙げられる。
【０３４０】
非受容体型キナーゼ血管新生阻害剤もまた、本発明において有用であり得る。血管新生関連ＶＥＧＦＲおよびＴＩＥ２の阻害剤は、シグナル伝達阻害剤について上述されている（両受容体とも、受容体チロシンキナーゼである）。ｅｒｂＢ２およびＥＧＦＲの阻害剤が血管新生、主にＶＥＧＦ発現を阻害することが示されているので、血管新生はｅｒｂＢ２／ＥＧＦＲシグナル伝達と関連する。従って、非受容体型チロシンキナーゼ阻害剤は、本開示の化合物と併用することができる。例えば、ＶＥＧＦＲ（受容体チロシンキナーゼ）を認識しないがリガンドとは結合する抗ＶＥＧＦ抗体；血管新生を阻害するインテグリン（αｖβ３）の小分子阻害剤；エンドスタチンおよびアンギオスタチン（非ＲＴＫ）もまた、開示されている化合物との組合せにおいて有用であることが分かるであろう(Bruns CJ et al (2000), Cancer Res., 60: 2926-2935; Schreiber AB, Winkler MEおよびDerynck R. (1986), Science, 232: 1250-1253；Yen L et al. (2000), Oncogene 19: 3460-3469参照）。
【０３４１】
免疫療法計画に用いられる薬剤もまた、本開示の抗原結合化合物とのとの組合せにおいて有用であり得る。免疫応答を生じさせるには、多くの免疫学的戦略が存在する。これらの戦略は一般に腫瘍ワクチン接種の範囲にある。免疫学的アプローチの有効性は、小分子阻害剤を用いたシグナル伝達経路の阻害を組み合わせることで大幅に増強され得る。ｅｒｂＢ２／ＥＧＦＲに対する免疫学的／腫瘍ワクチンアプローチに関する考察は、Reilly RT et al. (2000), Cancer Res. 60: 3569-3576；およびChen Y, Hu D, Eling DJ, Robbins J, and Kipps TJ. (1998), Cancer Res. 58: 1965-1971に見出せる。
【０３４２】
アポトーシス誘導療法で用いられる薬剤（例えば、ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチド）もまた、本発明の組合せにおいて使用可能である。Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質のメンバーは、アポトーシスを遮断する。従って、ｂｃｌ−２のアップレギュレーションは、化学療法耐性と関連づけられている。研究によれば、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）がｂｃｌ−２ファミリーの抗アポトーシスメンバー（すなわち、ｍｃｌ−１）を刺激することが示された。従って、腫瘍においてｂｃｌ−２の発現をダウンレギュレートするように設計された戦略は臨床的利益が実証され、現在第ＩＩ／ＩＩＩ相治験にある（すなわち、ジェンタのＧ３１３９ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチド）。ｂｃｌ−２に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド戦略を用いるこのようなアポトーシス誘導戦略は、Water JS et al. (2000), J. Clin. Oncol. 18: 1812-1823；およびKitada S et al. (1994), Antisense Res. Dev. 4: 71-79に述べられている。
【０３４３】
細胞周期シグナル伝達阻害剤は、細胞周期の制御に関与する分子を阻害する。サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）と呼ばれるタンパク質キナーゼファミリー、およびそれらのサイクリンと呼ばれるタンパク質ファミリーとの相互作用は、真核生物の細胞周期の進行を制御する。細胞周期の正常な進行には、異なるサイクリン／ＣＤＫ複合体の同調的活性化および不活性化が必要である。細胞周期シグナル伝達のいくつかの阻害剤が開発中である。例えば、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６を含むサイクリン依存性キナーゼ、およびそれらの阻害剤の例は、例えばRosania et al, Exp. Opin. Ther. Patents (2000) 10(2):215-230に記載されている。さらに、ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１は、サイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ）の強力かつ万能の阻害剤として記載されている(Ball et al., Progress in Cell Cycle Res., 3: 125 (1997))。ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１の発現を誘導することが知られている化合物は細胞増殖の抑制に関連づけられ、腫瘍抑制活性を有し(Richon et al., Proc. Nat Acad. Sci. U.S.A. 97(18): 10014-10019 (2000))、細胞周期シグナル伝達阻害剤として含められる。ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤は、ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１の転写活性化に関連づけられ(Vigushin et al., Anticancer Drugs, 13(1): 1-13 (Jan 2002))、本明細書で用いられる好適な細胞周期シグナル伝達阻害剤である。
【０３４４】
このようなＨＤＡＣ阻害剤の例としては、以下のものが含まれる。
【０３４５】
１．ボリノスタット（その薬学上許容される塩を含む）。Marks et al., Nature Biotechnology 25, 84 to 90 (2007); Stenger, Community Oncology 4, 384-386 (2007)。ボリノスタットは以下の化学構造および名称を有する。
【化３】
2013544492.tif 000008
−Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ’−フェニル−オクタンジアミド
【０３４６】
２．ロミデプシン（その薬学上許容される塩を含む）。Vinodhkumar et al., Biomedicine & Pharmacotherapy 62 (2008) 85-93。ロミデプシンは以下の化学構造および名称を有する。
【化４】
2013544492.tif 000009
−（１Ｓ，４Ｓ，７Ｚ，１０Ｓ，１６Ｅ，２１Ｒ）−７−エチリデン−４，２１−ジ（プロパン−２−イル）−２−オキサ−１２，１３−ジチア−５，８，２０，２３−テトラアザビシクロ［８．７．６］トリコス−１６−エン−３，６，９，１９，２２−ペントン
【０３４７】
３．パノビスタット（その薬学上許容される塩を含む）。Drugs of the Future 32(4): 315-322 (2007)。パノビスタットは以下の化学構造および名称を有する。
【化５】
2013544492.tif 000010
−（２Ｅ）−Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−（｛［２−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］アミノ｝メチル）フェニル］アクリルアミド
【０３４８】
４．バルプロ酸（その薬学上許容される塩を含む）。Gottlicher, et al., EMBO J. 20(24): 6969-6978 (2001)。バルプロ酸は以下の化学構造および名称を有する。
【化６】
2013544492.tif 000011
２−プロピルペンタン酸
【０３４９】
５．モセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３）（その薬学上許容される塩を含む）。Balasubramanian et al., Cancer Letters 280: 211-221 (2009)。モセチノスタットは以下の化学構造および名称を有する。
【化７】
2013544492.tif 000012
Ｎ−（２−アミノフェニル）−４−［［（４−ピリジン−３−イルピリミジン−２−イル）アミノ］メチル］ベンズアミド
【化８】
2013544492.tif 000013
【０３５０】
このようなＨＤＡＣ阻害剤のさらなる例はBertrand European Journal of Medicinal Chemistry 45, (2010) 2095-2116に含まれ、特に、以下に示されるようなその中の表３の化合物である。
【０３５１】
本開示の癌治療法はまた、本開示の抗原結合タンパク質および／またはその薬学上許容される塩、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグと、抗微小管剤、白金錯体、アルキル化剤、抗生物質、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼＩ阻害剤、ホルモンおよびホルモン類似体、シグナル伝達経路阻害剤、非受容体型チロシンキナーゼ血管新生阻害剤、免疫治療薬、アポトーシス誘導薬および細胞周期シグナル伝達阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種類の抗新生物剤との併用投与を含む。本開示の抗原結合タンパク質は、例えば、その全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる国際出願第ＰＣＴ／ＪＰ２００５／０１１０８２号（国際出願日２００５年６月１０日）；国際公開第ＷＯ２００５／１２１１４２号（国際公開日２００５年１２月２２日）に開示および特許請求されている、Ｎ−｛３−［３−シクロプロピル−５−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−６，８−ジメチ(dimethy)−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１−イル］フェニル｝アセトアミド、またはその薬学上許容される塩もしくは溶媒和物（ジメチルスルホキシド溶媒和物を含む）などのＭＥＫ阻害剤と併用することができる。Ｎ−｛３−［３−シクロプロピル−５−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−６，８−ジメチ(dimethy)−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１−イル］フェニル｝アセトアミドは、その全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる米国特許出願第ＵＳ２００６／００１４７６８号（２００６年１月１９日公開）に記載されているように製造することができる。本開示の抗原結合タンパク質は、例えば、その全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４２６８２号（国際出願日２００９年５月４日）開示および特許請求されている、Ｎ−｛３−［５−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミドまたはその薬学上許容される塩などのＢ−Ｒａｆ阻害剤と併用することができる。Ｎ−｛３−［５−（２−アミノ−４−ピリミジニル）−２−（１，１−ジメチルエチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−２−フルオロフェニル｝−２，６−ジフルオロベンゼンスルホンアミドは、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４２６８２号に記載されているように製造することができる。本開示の抗原結合タンパク質は、例えば、その全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５３２６９号（国際出願日２００８年２月７日）；国際公開第ＷＯ２００８／０９８１０４号（国際公開日２００８年８月１４日）に開示および特許請求されている、Ｎ−｛（１Ｓ）−２−アミノ−１−［（３，４−ジフルオロフェニル）メチル］エチル｝−５−クロロ−４−（４−クロロ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−２−フランカルボキサミドまたはその薬学上許容される塩などのＡｋｔ阻害剤と併用することができる。Ｎ−｛（１Ｓ）−２−アミノ−１−［（３，４−ジフルオロフェニル）メチル］エチル｝−５−クロロ−４−（４−クロロ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−２−フランカルボキサミドは、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５３２６９号に記載されているように製造することができる。本開示の抗原結合タンパク質はまた、例えば、その全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５３２６９号（国際出願日２００８年２月７日）；国際公開第ＷＯ２００８／０９８１０４（国際公開日２００８年８月１４日）に開示および特許請求されている、Ｎ−｛（１Ｓ）−２−アミノ−１−［（３−フルオロフェニル）メチル］エチル｝−５−クロロ−４−（４−クロロ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−２−チオフェンカルボキサミドまたはその薬学上許容される塩などのＡｋｔ阻害剤と併用することもできる。Ｎ−｛（１Ｓ）−２−アミノ−１−［（３−フルオロフェニル）メチル］エチル｝−５−クロロ−４−（４−クロロ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−２−チオフェンカルボキサミドは実施例９６の化合物であり、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５３２６９号に記載されているように製造することができる。Ｎ−｛（１Ｓ）−２−アミノ−１−［（３−フルオロフェニル）メチル］エチル｝−５−クロロ−４−（４−クロロ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−２−チオフェンカルボキサミドは、塩酸塩の形態である。この塩形態は、当業者ならば、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２２３２３号（国際出願日２０１０年１月２８日）の記載から製造することができる。
【０３５２】
パゾパニブは、本開示の抗原結合タンパク質と併用投与が可能な別の組成物である。ボトリエント(VOTRIENT)（商標）として市販されているパゾパニブは、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）である。パゾパニブは、塩酸塩として提供され、化学名は５−［［４−［（２，３−ジメチル−２Ｈ−インダゾール−６−イル）メチルアミノ］−２−ピリミジニル］アミノ］−２−メチルベンゼンスルホンアミド一塩酸塩である。パゾパニブ(Pazoponib)は、進行性腎細胞癌を有する患者の治療に承認されている。
【０３５３】
リツキシマブは、本開示の抗原結合タンパク質と併用投与が可能な別の組成物である。リツキシマブは、リツキサン(RITUXAN)（商標）およびマブセラ(MABTHERA)（商標）として販売されているキメラモノクローナル抗体である。リツキシマブは、Ｂ細胞上のＣＤ２０に結合し、細胞アポトーシスを引き起こす。リツキシマブは静脈投与され、関節リウマチおよびＢ細胞性非ホジキンリンパ腫の治療に承認されている。
【０３５４】
オファツムマブは、本開示の抗原結合タンパク質と併用投与が可能な別の組成物である。オファツムマブは、アルゼラ(ARZERRA)（商標）として販売されている完全ヒトモノクローナル抗体である。オファツムマブは、Ｂ細胞上のＣＤ２０に結合し、フルダラビン（フルダラ(Fludara)）およびアレムツズマブ（キャンパス（Campath））での治療に不応の成人における慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ；白血球の癌の一種）の治療に用いられる。
【０３５５】
ｍＴＯＲ阻害剤も、本開示の抗原結合タンパク質と併用投与が可能である。ｍＴＯＲ阻害剤としては、限定されるものではないが、ラパマイシンおよびラパログ、ＲＡＤ００１またはエベロリムス（Afinitor）、ＣＣＩ−７７９またはテムシロリムス、ＡＰ２３５７３、ＡＺＤ８０５５、ＷＹＥ−３５４、ＷＹＥ−６００、ＷＹＥ−６８７およびＰｐ１２１が挙げられる。
【０３５６】
ベキサロテンは、本開示の抗原結合タンパク質と併用投与が可能な別の組成物である。ベキサロテンは、ターグレチン(Targretin)（商標）として販売され、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）を選択的に活性化するレチノイドのサブクラスのメンバーである。これらのレチノイド受容体は、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）とは異なる生物活性を有する。化学名は４−［１−（５，６，７，８−テトラヒドロ−３，５，５，８，８−ペンタメチル−２−ナフタレニル）エテニル］安息香酸である。ベキサロテンは、少なくとも１つの他の薬剤で疾患が上手く治療できない患者において皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ、皮膚癌の一種）を治療するために用いられる。
【０３５７】
ソラフェニブは、本開示の抗原結合タンパク質と併用投与が可能な別の組成物である。ソラフェニブは、ネクサバール(Nexavar)（商標）として市販され、マルチキナーゼ阻害剤と呼ばれる薬剤の一種である。その化学名は４−［４−［［４−クロロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル］カルバモイルアミノ］フェノキシ］−Ｎ−メチル−ピリジン−２−カルボキサミドである。ソラフェニブは、進行性腎細胞癌（腎臓において発症する癌の一種）を治療するために用いられる。ソラフェニブはまた、切除不能な肝細胞癌（手術で処置できない肝臓癌の一種）を治療するために用いられる。
【０３５８】
本開示は、癌を治療する方法を提供する。開示されている方法で処置される癌は、脳腫瘍（神経膠腫）、膠芽腫、星状細胞腫、多形性膠芽腫、バナヤン−ゾナナ(Bannayan-Zonana)症候群、カウデン病、レルミット−デュクロス(Lhermitte-Duclos)病、乳癌、炎症性乳癌、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、脳室上衣細胞腫、髄芽細胞腫、結腸癌、頭頚部癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、肉腫、骨肉腫、骨巨細胞腫、甲状腺癌、リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性好中球性白血病、急性リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、形質細胞腫、免疫芽球性大細胞白血病、マントル細胞白血病、巨核芽球性白血病、多発性骨髄腫、急性巨核球性白血病、前骨髄球性白血病、および赤白血病、悪性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、リンパ芽球性Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、神経芽腫、膀胱癌、尿路上皮癌、肺癌、外陰癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、腎臓癌、中皮腫、食道癌、唾液腺癌、肝細胞癌、胃癌、鼻咽頭癌、頬粘膜癌癌、口腔癌、ＧＩＳＴ（消化管間質腫瘍）および精巣癌から選択することができる。
【０３５９】
本開示の方法において前癌状態は、子宮頚上皮内新生物、意義不明単クローン性ガンマグロブリン血症(monoclonal gammapathy of unknown significance)（ＭＧＵＳ）、骨髄異形成症候群、再生不良性貧血、子宮頚病変、皮膚斑（前黒色腫）、前立腺上皮内(intraepithleial)（腺管内）新生物（ＰＩＮ）、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、結腸ポリープおよび重症の肝炎または肝硬変であり得る。
【０３６０】
本医薬組成物は、他の薬剤、所望により使用説明書を伴う本抗原結合タンパク質のパーツキットを含んでなり得る。好都合には、該キットは所定量の試薬を使用説明書とともに含んでなり得る。
【０３６１】
「個体」、「被験体」および「患者」は本明細書では互換的に用いられる。被験体は一般にヒトである。被験体はまた、マウス、ラットまたは霊長類（例えば、マーモセットまたはサル）などの哺乳類であってもよい。被験体は非ヒト動物であり得る。また、本抗原結合タンパク質には獣医学的用途もある。治療される被験体は、農用動物、例えば、乳牛または非去勢牛(bull)、ヒツジ、ブタ、去勢牛(ox)、ヤギもしくはウマであってよく、またはイヌもしくはネコなどの飼い動物であってもよい。動物はいずれの齢であってもよく、または成熟した成体動物であってもよい。被験体がマウス、ラットまたは霊長類などの実験動物である場合、これらの動物には、乳癌、卵巣癌、前立腺癌または膀胱癌に関連する疾患または病態を誘発する処置を施すことができる。
【０３６２】
処置は治療的、予防的または抑制的であり得る。被験体はそれを必要とする被験体である。処置を必要とする被験体には、将来特定の医学的疾患を発症する可能性のある個体の他、すでにその疾患に罹患している個体を含み得る。
【０３６３】
よって、本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、予防的または回避的処置に使用することができる。この場合、本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、その疾患の１以上の態様または症状の発症を回避するまたは遅延させるために個体に投与される。被験体は無症候の場合もある。被験体はその疾患に対して遺伝的素因を持つ場合もある。予防上有効な量の本抗原結合タンパク質をこのような個体に投与する。予防上有効な量は、本明細書に記載の疾患の１以上の態様または症状の発症を回避するまたは遅延させる量である。
【０３６４】
本明細書に記載の抗原結合タンパク質はまた、療法に使用することができる。本明細書において「療法」とは、疾患の少なくとも１つの態様または症状の緩和、軽減または回避を包含する。例えば、本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、本明細書に記載の疾患の１以上の態様または症状を改善または軽減するために使用することができる。
【０３６５】
本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、治療的、予防的または回避的処置に有効な量で用いられる。本明細書に記載の抗原結合タンパク質の治療上有効な量は、疾患の１以上の態様または症状を改善または軽減するのに有効な量である。本明細書に記載の抗原結合タンパク質はまた、本明細書に記載の疾患を治療、回避または治癒するために使用することができる。
【０３６６】
本明細書に記載の抗原結合タンパク質は被験体の健康に全般的に有益な効果を持ち、例えば、被験体の予想寿命を引き延ばすことができる。
【０３６７】
本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、実行可能な処置となるために完全な治癒をもたらしたり、またはその疾患の総ての症状または病状発現を根絶したりする必要はない。関連の分野で認識されているように、治療薬として使用される薬物は、所与の病態の重篤度を軽減し得るが、有用な治療薬とみなされるためにその疾患の総ての病状発現を無効にする必要はない。同様に、予防的に投与される処置も、実行可能な予防薬となるために、疾患の発症の予防上、完全に有効である必要はない。単に、疾患の影響を軽減すること（例えば、その症状の数もしくは重篤度を軽減するか、または別の処置の有効性を高めるか、または別の有益な効果を作り出すことによる）または患者において疾患が起こるもしくは悪化する確率を引き下げること（例えば、疾患の発症を遅延させることによる）で十分である。
【０３６８】
障害、疾患または病態には、乳癌、卵巣癌、前立腺癌および膀胱癌が含まれる。該疾患は高レベルのＨＥＲ３に関連し得る。本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、ＨＥＲ３のレベルおよび／またはＨＥＲ３の活性を調整するために使用することができる。
【０３６９】
診断的使用方法
本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、in vitroまたはin vivoにおいて診断目的で生体サンプル中のＨＥＲ３を検出するために使用することができる。例えば、マウスまたはヒト化１５Ｄ５モノクローナル抗体などの抗ＨＥＲ３抗原結合タンパク質は、培養細胞、組織または血清においてＨＥＲ３を検出するために使用することができる。組織はヒトまたは動物身体から最初に取り出したもの（例えば、生検）であってもよい。ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫組織化学または免疫沈降をはじめとする従来のイムノアッセイを使用することができる。
【０３７０】
ＨＥＲ３の存在またはレベルを疾患と相関させることにより、当業者は関連の疾患を診断することができる。さらに、被験体において高レベルのＨＥＲ３が検出されれば、本明細書に記載の抗原結合タンパク質での処置に応答する患者集団であるという指標となり得る。本明細書に記載の抗原結合タンパク質で処置された被験体において、ＨＥＲ３レベル、機能またはシグナル伝達能の低下が検出されれば、腫瘍サイズの低減という生物学的効果の指標となり得る。
【０３７１】
本抗原結合タンパク質は、１以上の抗原結合タンパク質、検出可能な標識および該キットの使用説明書を含んでなる診断キットで提供することができる。好都合には、該キットは所定量の試薬を使用説明書とともに含んでなり得る。
【０３７２】
遺伝子療法
本明細書に記載の抗原結合タンパク質をコードする核酸分子を、それを必要とする被験体に投与することができる。該核酸分子は、適当な足場またはドメイン内のＣＤＲ、可変ドメインまたは全長抗体を発現し得る。該核酸分子は、ヒトまたは動物細胞内での発現を可能とするベクター内に含まれていてよい。該核酸分子またはベクターは、薬学上許容される賦形剤および／または上述のような１以上の治療上有効な薬剤とともに投与するために処方することができる。
【０３７３】
本開示の別の態様は、配列番号１００で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２０〜４６６を有する重鎖配列と、配列番号１０４で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２０〜２３８を有する軽鎖配列とを含んでなる抗原結合タンパク質である。
【０３７４】
本開示はまた、フコシル化グリカンを含んでなる本明細書に記載の抗原結合タンパク質を提供する。
【０３７５】
本開示はまた、フコシル化グリカンがＧ０、Ｇ２、Ｇ０Ｆ、Ｇ２Ｆ、Ｇ１、Ｍａｎ５、Ｇ１ＦおよびＧ１Ｆ’からなる群から選択される、本明細書に記載の抗原結合タンパク質を提供する。
【０３７６】
本開示はまた、非フコシル化グリカンを含んでなる本明細書に記載の抗原結合タンパク質を提供する。
【０３７７】
本開示はまた、非フコシル化グリカンがＧ０、Ｇ２、Ｇ１およびＭａｎ５からなる群から選択される、本明細書に記載の抗原結合タンパク質を提供する。
【０３７８】
本開示の別の態様は、配列番号１０２で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２０〜４６６を有する重鎖配列と、配列番号１０４で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２０〜２３８を有する軽鎖配列とを含んでなる抗原結合タンパク質である。
【０３７９】
本開示の別の態様は、配列番号１００で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２０〜４６６をコードする単離された核酸である。
【０３８０】
本開示はまた、配列番号１０１で示される核酸配列を含んでなる単離された核酸を提供する。
【０３８１】
本開示の別の態様は、配列番号１０４で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２０〜２３８をコードする単離された核酸である。
【０３８２】
本開示はまた、配列番号１０５で示される核酸配列を含んでなる単離された核酸を提供する。
【０３８３】
本開示の別の態様は、配列番号１０２で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２０〜４６６をコードする単離された核酸である。
【０３８４】
本開示はまた、配列番号１０３で示される核酸配列を含んでなる単離された核酸を提供する。
【０３８５】
本開示はまた、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が存在する、本明細書に記載の組換え宿主細胞を提供する。
【０３８６】
本開示はまた、ＣＨＯＫ１細胞である本明細書に記載の組換え宿主細胞を提供する。ＣＨＯＫ１とは、親ＣＨＯＫ１細胞およびこの親細胞系統に由来する任意の細胞系統の細胞（例えば、遺伝子工学、クローン選択などによる）を含む。
【０３８７】
本開示はまた、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が不活性化されている、本明細書に記載の組換え宿主細胞を提供する。
【０３８８】
本開示はまた、ａ）本明細書に記載の抗体重鎖をコードする単離された核酸を含んでなり、かつ、本明細書に記載の抗体軽鎖をコードする単離された核酸含んでなる発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞を培養する工程（ここで、該組換え宿主細胞では、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が活性状態である）；およびｂ）前記抗原結合タンパク質を回収する工程を含んでなり、それにより本抗原結合タンパク質が生産される、抗原結合タンパク質の生産方法も提供する。
【０３８９】
本開示はまた、ａ）本明細書に記載の抗体重鎖をコードする単離された核酸を含んでなり、かつ、本明細書に記載の抗体軽鎖をコードする単離された核酸含んでなる発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞を培養する工程（ここで、該組換え宿主細胞では、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が不活性化されている）；およびｂ）前記抗原結合タンパク質を回収する工程を含んでなり、それにより本抗原結合タンパク質が生産される、抗原結合タンパク質の生産方法も提供する。
【０３９０】
本開示はまた、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、皮膚癌、胃癌および黒色腫からなる群から選択される病態の治療において用いるための本明細書に記載の抗原結合タンパク質を提供する。
【実施例】
【０３９１】
実施例１
１．概要
マウス１Ｄ９抗体（Ｍ５．１Ｄ９．１Ｆ５）、マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）、キメラ１Ｄ９抗体およびキメラ１５Ｄ５抗体に対して、全長ヒトＨＥＲ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはそのサブドメインとの結合に関するＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析を行った。
【０３９２】
２．緒論
本実施例の目的は、マウス１Ｄ９抗体、マウス１５Ｄ５抗体、キメラ１Ｄ９抗体およびキメラ１５Ｄ５抗体の親和性を測定することであった。
【０３９３】
３．方法
３．１．実験プロトコール
分析は、新しい各チップの調製前にシステムチェックで試験して合格したＢＩＡＣＯＲＥ（商標）２０００装置（ＳＮ＃３３−０９０１−２４２０  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。分析は総て、２５℃でＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＢＲ−１００６−６９／５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）を実行バッファーとして用いて行った。マウスモノクローナル抗体は、第一級アミン化学法（ＮＨＳ／ＥＤＣで活性化）（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅアミンカップリングキットＢＲ−１０００−５０）によってＢＩＡＣＯＲＥ（商標）ＣＭ５チップ（ＧＥ  ＨＥａｌｔｈｃａｒｅ  ＢＲ−１０００−１４）に共有結合させたウサギ抗マウス（ＲＡＭ）ＩｇＧ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＢＲ−１００８−３８）を用いて分析した。キメラおよびヒト化競合因子モノクローナル抗体は、同様に結合させた抗ヒトＦｃ特異的モノクローナル（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＢＲ−１００８−３９）を用いて分析した。各チップはまた、捕捉試薬抗体が結合されて参照表面ででも調製した。動態解析のために、分析物の濃度を変えて複数サイクルの実行に関するセンサーグラムを取得した。１サイクルは、表面にモノクローナルを捕捉させ、バッファーを流して短時間安定化させた後、所定濃度の分析物（ＥＣＤまたはサブドメインタンパク質）を結合させることからなる。表面に結合させるために分析物を注入すると（３〜４分）、曲線の関連部分が得られる。その後バッファーのみを流すと（３〜４分）、解離データが記録できる。その後、このサイクルが終了し、捕捉キットに供給されている再生溶液（抗ヒト捕捉用のＲＡＭおよび３Ｍ  ＭｇＣｌ２の弱酸性溶液）を注入すると、捕捉された抗体／分析物が除去されるが、次のサイクルの別のモノクローナルの捕捉を行うこの捕捉抗体の能力には有意な影響を与えない。
【０３９４】
親和性分析の一般法は次の通りである。まず、チップを調製し、数種類のモノクローナル抗体濃度について捕捉された共鳴単位（ＲＵ）を調べた。その後、動態サイクル、すなわち、モノクローナル抗体をおよそ１００ＲＵのレベルまで捕捉させ、分析物タンパク質を結合させた後に解離させ、共有結合したタンパク質以外の総てのものを除去するように表面を再生させるということを行った。ＲＡＭチップは、捕捉キットに供給されている１００ｍＭグリシンｐＨ１．７で再生し、抗ヒトチップは、捕捉キットに供給されている３Ｍ  ＭｇＣｌ２で再生した。これらの一連のサイクルを６種類の異なる濃度の分析物タンパク質（通常、２５６ｎＭ、１２８ｎＭ、６４ｎＭ、３２ｎＭ、１６ｎＭおよび８ｎＭ）で行う。分析物タンパク質の前に数回のバッファーサイクルを行ってサイクルの一貫性を確認し、実験によっては、バッファーサイクルを「二重参照［．］」として用いる。用いた分析物は、ヒト全長ＨＥＲ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、ヒトＨＥＲ３の細胞外部分の各サブドメイン（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４）または組合せＨＥＲ３ドメインタンパク質（Ｄ１−２およびＤ２−３）であった。総てのヒトＨＥＲ３  ＥＣＤ分析物を発現させ、標準的な技術を用いて調製した。
【０３９５】
動態実験サイクルでは、ｍｏｃｋ結合表面を参照とし、バッファーの人為要素を排除するために実行した特異的抗体−分析物ＲＵデータから差し引いた。いくつかの実行では、動態曲線セットの各濃度に関して分析物を含有するサイクルデータからバッファーのみのサイクルを差し引くことによって二重参照を設定した。得られた曲線データに対し、ＢＩＡＥＶＡＬＵＡＴＩＯＮ（商標）ソフトウエア（ｖ．３．２）を用い、１：１ラングミュア(Langmuir)モデルへのグローバルフィッティングを行う。
【０３９６】
３．２．薬物および材料
本実施例で用いた試薬の一覧の一部は次の通りである。
マウス１Ｄ９抗体（４．７７ｍｇ／ｍｌ）
マウス１５Ｄ５抗体（４．２３ｍｇ／ｍｌ）
キメラ１Ｄ９抗体
キメラ１５Ｄ５抗体
抗体は総て、リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．０で処方および調製した。
【０３９７】
４．結果
各相互作用に関してセンサーグラムを作製した。これらを用い、ＢＩＡＥＶＡＬＵＡＴＩＯＮ（商標）ソフトウエアを用いた動態評価を行った。実行パラメーターおよび動態パラメーター（総ＫＤを含む）を下記の表５および表６に示す。
【０３９８】
【表５】
2013544492.tif 000014
【０３９９】
【表６】
2013544492.tif 000015
【０４００】
５．考察
モノクローナルマウス１Ｄ９抗体およびマウス１５Ｄ５抗体はヒトＨＥＲ３細胞外ドメインに対して作製されたものである。マウス１Ｄ９抗体抗体は、全長ヒトＨＥＲ３  ＥＣＤおよびヒトＨＥＲ３  ＥＣＤのサブドメイン３に結合する。マウス１５Ｄ５抗体は、全長ヒトＨＥＲ３  ＥＣＤおよびヒトＨＥＲ３  ＥＣＤのサブドメイン２に結合する。
【０４０１】
全長ヒトＨＥＲ３  ＥＣＤおよび選択ヒトＨＥＲ３  ＥＣＤサブドメインとの相互作用に関して、総ての抗体のナノモルおよびナノモル未満の親和性が確認された。
【０４０２】
マウス１Ｄ９抗体およびマウス１５Ｄ５抗体の双方で同様の総親和性（ＫＤ）が見られ、マウス１Ｄ９抗体はより早い結合速度（ｋａ）および解離速度（ｋｄ）を持っている。イムノアッセイおよび競合的免疫組織化学(immunocytochemisry)により、マウス１５Ｄ５抗体は、ヒトＨＥＲ３  ＥＣＤのサブドメイン２、１−２および２−３に結合するが、サブドメイン１、３または４には結合しないことが示された。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析は、これらのＨＥＲ３  ＥＣＤ部分（すなわち、ヒトＨＥＲ３  ＥＣＤのサブドメイン２、１−２および２−３）の親和性が、全長ヒトＨＥＲ３  ＥＣＤ（サブドメイン１−４）よりも増強されていることを示す。この効果は、サブドメイン２を含有する３種類のヒトＨＥＲ３  ＥＣＤタンパク質構築物（Ｄ２、Ｄ１−２およびＤ２−３）の総てで見られ、特定の理論に縛られることを望むものではないが、これは小さいサブドメインタンパク質にあるドメイン２内のエピトープの方がアクセシビリティーが大きいためではないかとと考えられる。さらに、特定の理論に縛られることを望むものではないが、構造上の問題が、マウス１５Ｄ５抗体がＨＥＲ３受容体の開放立体配座により大きな親和性を有する可能性を高くすると考えられる。この開放立体配座は、この受容体がヘレグリンリガンドと結合している時の状態であることが示されている。キメラ１５Ｄ５抗体およびキメラ１Ｄ９抗体は、親マウス１Ｄ９抗体およびマウス１５Ｄ５抗体と同等の親和性を保持している。
【０４０３】
実施例２
Ｘ線結晶解析をin silicoモデリングと組み合わせて、マウス１Ｄ９抗体およびその変異体の結合面を推定した。また、これらの解析により、マウス１Ｄ９抗体で見られた機能の中和への機構的洞察も得られ、合理的抗体成熟の助けとなった。ヒトＨＥＲ３  ＥＣＤのドメインＩＩＩと結合したマウス１Ｄ９抗体由来Ｆａｂを含んでなる複合体の高分解能（３．０Å）構造が確定された。このため、ヒトＨＥＲ３  ＥＣＤのドメインＩＩＩおよびマウス１Ｄ９抗体をＣＨＯ細胞で発現させ、アフィニティークロマトグラフィーならびにサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。マウス１Ｄ９抗体のＦａｂフラグメントは、標準的方法を用いてパパイン切断により作製した。ヒトＨＥＲ３  ＥＣＤのドメインＩＩＩと結合したマウス１Ｄ９抗体由来Ｆａｂを含んでなる複合体は、１：１．２モル比のマウス１Ｄ９抗体由来ＦａｂとヒトＨＥＲ３  ＥＣＤのドメインＩＩＩを混合することによって作製した。次に、このタンパク質混合物を濃縮し、ハンギングドロップ蒸気拡散法を用いて結晶化した。アルゴンヌ国立研究所の先端光子源施設でＸ線回折データを取得した。回折データは、ＨＫＬ２０００ソフトウエア（ＨＫＬ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）を用いて指数付けとスケーリングを行った。構造はＸ−ＰＬＯＲプログラムにおける分子置換により決定した。作成された最初の分子置換解に対し、次に、ＣＮＳにおける分子動力学的精密化とＷＩＮＣＯＯＴプログラムによる再構築を複数回行った。次に、ヒトＨＥＲ３  ＥＣＤのドメインＩＩＩと結合したマウス１Ｄ９由来Ｆａｂを含んでなる複合体の原子座標ファイルを作成し、得られた構造を解析した。
【０４０４】
この解析から、ヒトＨＥＲ３  ＥＣＤドメインＩＩＩのドメインＩＩＩ上のエピトープは、配列番号２１のアミノ酸残基２０〜６４３を含んでなるフラグメントに見出せる配列番号６６のＩｌｅ３４６、Ａｓｎ３５０、Ｇｌｙ３５１、Ａｓｐ３５２、Ｐｒｏ３５３、Ｔｒｐ３５４、Ｈｉｓ３５５、Ｌｙｓ３５６、Ｉｌｅ３５７、Ｐｒｏ３５８およびＡｌａ３５９を含んでなることが分かった。表７参照。相互作用残基間の接触は表７および図５５に記載されている。
【０４０５】
【表７】
2013544492.tif 000016
【０４０６】
特定の理論に縛られることを望むものではないが、この高分解能結晶構造に基づけば、マウス１Ｄ９抗体ＦａｂフラグメントはヒトＨＥＲ３  ＥＣＤのドメインＩＩＩと排他的に結合し、ＨＥＲ３  ＥＣＤの開放立体配座内に存在するヘレグリン結合部位と部分的に重複するエピトープを覆っていると考えられる。特定の理論に縛られることを望むものではないが、このマウス１Ｄ９抗体Ｆａｂは、閉鎖立体配座にある場合のＨＥＲ３  ＥＣＤと結合して、その受容体に二量体形成に必要な拡張型の立体配座を立体的に採らせないようにすることができる。マウス１Ｄ９抗体Ｆａｂは、１つには、ヒトＨＥＲ３  ＥＣＤのドメイン１に二量体形成に必要な立体配座を採らせないようにすることにより、その効果をもたらすと考えられる。さらに、特定の理論に縛られることを望むものではないが、ここに記載される構造的効果は、マウス１Ｄ９抗体およびその変異体によりもたらされるＨＥＲ３活性の強力な阻害に寄与すると考えられる。
【０４０７】
実施例３
開放立体配座にあるＨＥＲ３  ＥＣＤと結合したマウス１５Ｄ５抗体の相互作用のこんピューター構造モデリングを、Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｄｏｃｋソフトウエア（ＲｏｓｅｔｔａＣｏｍｍｏｎｓ．ｏｒｇ）を実行した。このソフトウエアに採用されているアルゴリズムの第１段階では、剛体モンテカルロ検索(rigid-body Monte Carlo search)、ならびに残基スケール相互作用ポテンシャル(residue-scale interaction potentials)を用いた抗体表面に対する抗原の平行移動と回転を行う。アライメントスコアにより、抗原を抗体のＣＤＲループに割り当てる。この低分解能検索の後に、主鎖依存性回転異性体パッキングアルゴリズムを用いて、タンパク質主鎖に明示的側鎖が付加される。その後、モンテカルロおよび最小化法により、側鎖の立体配座と剛体の位置を同時に最適化することによって、ドッキング立体配座空間の小領域において局部的最小値のセットを効率的に抽出する。この検索手順を種々のランダムな出発配向から繰り返して１０５通りの構造を作り出し、次に、これらをファンデルワールス相互作用、陰溶媒和モデルおよび配向依存性水素結合ポテンシャルによって支配されるエネルギー関数を用いてランク付けする。スコアカットオフを通過した上から１０００のデコイを保持した。側鎖予測の分解能を高めるために、非結合型の回転異性体立体配座を回転異性体ライブラリーに含め、側鎖ねじれ角上の勾配に基づく最小化を用いた。この高分解能検索の終了時に最もスコアの良い２００のデコイを、階層的クラスタリングアルゴリズムを用いたペアワイズ平方根偏差（ｒｍｓｄ）に基づいてクラスター化する。２．５Åクラスタリング閾値内の構造をセットと呼び、そのセット内の最もスコアの小さいデコイがクラスターを表す。
【０４０８】
結果として得られた、ヒトＨＥＲ３  ＥＣＤと結合したマウス１５Ｄ５抗体のモデルは、この抗体が開放立体配座にあるＨＥＲ３  ＥＣＤと結合し、二量体形成アーム付近に立体障害を作り出すことを予測する。特定の理論に縛られることを望むものではないが、これはマウス１５Ｄ５抗体がＨＥＲ３の二量体形成を遮断することを示唆する。
【０４０９】
実施例４
１．概要
分子生物学的技術を用い、マウス１Ｄ９抗体およびマウス１５Ｄ５抗体の一連のヒト化ＲＲ変異体を作製し、発現させた。次に、これらの抗体に、全長ヒトＨＥＲ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）との結合に関するＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析を行った。
【０４１０】
２．緒論
本実施の目的は、マウス１Ｄ９および１５Ｄ５抗体のヒト化変異体の親和性を測定することであった。
【０４１１】
３．方法
３．１．実験プロトコール
３．２．ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析
標準的な分子生物学的技術を用いて作製し、発現させたマウス１Ｄ９抗体およびマウス１５Ｄ５抗体のヒト化変異体の結合親和性を測定するためにＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析を用いた。ヒト化変異体は、１Ｄ９  Ｈ６Ｌ２  ＲＲ抗体（配列番号３０および配列番号５７を含んでなる）、１Ｄ９  Ｈ０Ｌ７  ＲＲ抗体（配列番号６７および配列番号８５を含んでなる）、１Ｄ９  Ｈ２Ｌ２  ＲＲ抗体（配列番号７１および配列番号５７を含んでなる）、１Ｄ９  Ｈ６Ｌ６  ＲＲ抗体（配列番号３８および配列番号８３を含んでなる）、１Ｄ９  Ｈ６Ｌ３  ＲＲ抗体（配列番号３０および配列番号７７を含んでなる）、１Ｄ９  Ｈ３Ｌ６  ＲＲ抗体（配列番号７３および配列番号８３を含んでなる）、１Ｄ９  Ｈ０Ｌ９  ＲＲ抗体（配列番号６７および配列番号８７を含んでなる）、１Ｄ９  Ｈ２Ｌ６  ＲＲ抗体（配列番号７１および配列番号８３を含んでなる）、１Ｄ９  Ｈ６Ｌ４  ＲＲ抗体（配列番号３０および配列番号７９を含んでなる）、１Ｄ９  Ｈ６Ｌ５  ＲＲ抗体（配列番号３０および配列番号８１を含んでなる）、１Ｄ９  Ｈ６Ｌ０  ＲＲ抗体（配列番号３０および配列番号７５を含んでなる）、１Ｄ９  Ｈ３Ｌ２  ＲＲ抗体（配列番号７３および配列番号５７を含んでなる）、１Ｄ９  Ｈ６Ｌ９  ＲＲ抗体（配列番号３０および配列番号８７を含んでなる）、１５Ｄ５  Ｈ１Ｌ３抗体（配列番号９０および配列番号９８を含んでなる）、１５Ｄ５  Ｈ２Ｌ２抗体（配列番号９２および配列番号９６を含んでなる）、１５Ｄ５  Ｈ１Ｌ１抗体（配列番号９０および配列番号２６を含んでなる）、１５Ｄ５  Ｈ３Ｌ１抗体（配列番号９４および配列番号２６を含んでなる）、１５Ｄ５  Ｈ２Ｌ１抗体（配列番号９２および配列番号２６を含んでなる）ならびに１５Ｄ５  Ｈ３Ｌ３抗体（配列番号９４および配列番号９８を含んでなる）であった。キメラ１５Ｄ５抗体（ｃｈ１５Ｄ５）もまた分析した。
【０４１２】
これらの抗体の結合動態をＢＩＡＣＯＲＥ（商標）３０００を用いて評価した。供給されているカップリングバッファー（９０００ＲＵ）を用いて固定化抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  カタログ番号ＢＲ−１００８−３９）モノクローナル抗体をコンジュゲートしたＣＭ５バイオセンサーチップに抗体を捕捉させた。全長ヒトＨＥＲ３  ＥＣＤ濃縮液を流速３０μｌ／分で１２０秒間注入した。バイオセンサーチップは実施例１に記載にように再生した。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）評価ソフトウエアを用い、１：１ラングミュア(Langmuir)モデルへのデータのグローバルフィッティングにより、動態を測定した。分析操作はランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰを用い、２５℃で行った。
【０４１３】
ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析法の基本工程の概略を以下に示す。
１）抗ヒトＦｃ抗体の固定化（９０００−１０００ＲＵ；２５μｇ／ｍｌ、酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ５．０を使用）；
２）目的抗体の捕捉（４００ｎｇ／ｍｌ）；
３）分析物の捕捉抗体への結合（例えば、ＨＥＲ  ＥＣＤ  ５１２ｎＭ〜１６ｎＭ）；
４）分析物の解離（例えば、バッファー使用）；
５）ＢＩＡｃｏｒｅ動態測定サイクル工程：バッファー、５１２ｎＭ  ＨＥＲ３  ＥＣＤ、２５６ｎＭ  ＨＥＲ３  ＥＣＤ、１２８ｎＭ  ＨＥＲ３  ＥＣＤ、６４ｎＭ  ＨＥＲ３  ＥＣＤ、３２ｎＭ  ＨＥＲ３  ＥＣＤおよび１６ｎＭ  ＨＥＲ３  ＥＣＤ。バッファーサイクルおよび二重参照は実施例１に記載のように行った；および
５）ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）最適化バッファーによるバイオセンサーチップの再生。
【０４１４】
４．結果および考察
下記の表８および表９は得られたデータを示し、親分子に対して作製された総てのヒト化抗体のうち、ヒト化１Ｄ９  ＲＲ抗体（Ｈ６Ｌ２）およびヒト化１５Ｄ５抗体（Ｈ４Ｌ１）が全長ヒトＨＥＲ３  ＥＣＤに対して最も高い親和性を有すると思われることを示す。
【０４１５】
【表８】
2013544492.tif 000017
【０４１６】
【表９】
2013544492.tif 000018
【０４１７】
実施例５
１．概要
分子生物学的技術を用い、ヒト化１Ｄ９抗体、ヒト化１Ｄ９  Ｆｃ障害抗体、ヒト化１Ｄ９アクリタマブ(ACCRETAMAB)（商標）抗体およびヒト化１Ｄ９ポテリジェント(POTELLIGENT)（商標）抗体を作製し、発現させた。次に、これらの抗体に、以下に示すように、全長ヒトＨＥＲ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、全長ラットＨＥＲ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）および全長カニクイザルＨＥＲ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）との結合に関するＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析を行った。
【０４１８】
２．緒論
本実施の目的は、ヒト化１Ｄ９抗体、ヒト化１Ｄ９  Ｆｃ障害抗体、ヒト化１Ｄ９アクリタマブ（商標）抗体およびヒト化１Ｄ９ポテリジェント（商標）抗体の親和性を測定することであった。
【０４１９】
３．方法
３．１．実験プロトコール
３．２．ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析
ヒト化１Ｄ９抗体、ヒト化１Ｄ９  Ｆｃ障害抗体、ヒト化１Ｄ９アクリタマブ（商標）抗体およびヒト化１Ｄ９ポテリジェント（商標）抗体の結合親和性を測定するためにＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析を用いた。
【０４２０】
約１３００共鳴単位（ＲＵ）のレベルまで第一級アミンを結合させることによってＡタンパク質をＣＭ５チップに固定化した後、このチップにヒト化抗体を捕捉させた。総ての抗体を同等のレベル（１００〜２００ＲＵ）で捕捉させた。次に、以下に示すように、全長ヒトＨＥＲ３  ＥＣＤをこのチップに５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２５ｎＭおよび１．５６２５ｎＭで流した。あるいは、全長ラットＨＥＲ３  ＥＣＤまたは全長カニクイザルＥＣＤをこのチップに１０ｎＭ、５ｎＭ、２．５ｎＭ、１．２５ｎＭ、０．６２５ｎＭおよび０．３１２５ｎＭで流した。バッファーのみの注入を用いて、実施例１に示すように結合曲線の二重参照とした。この表面の再生は、１０ｍＭグリシンバッファーｐＨ１．５を用いて行った。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）評価ソフトウエアを用い、この結合データを１：１モデルに当てはめた。操作は、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ３０００にて、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰを用い、２５℃で行った。
【０４２１】
４．結果および考察
下記の表１０および表１１は、以下に示すように、ヒト化１Ｄ９抗体、ヒト化１Ｄ９  Ｆｃ障害抗体、ヒト化１Ｄ９アクリタマブ（商標）抗体およびヒト化１Ｄ９ポテリジェント（商標）抗体の、全長ヒトＨＥＲ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、全長ラットＨＥＲ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）および全長カニクイザルＨＥＲ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する結合に関して得られたデータを示す。
【０４２２】
【表１０】
2013544492.tif 000019
【０４２３】
【表１１】
2013544492.tif 000020
【０４２４】
ヒト化１Ｄ９抗体、ヒト化１Ｄ９  Ｆｃ障害抗体、ヒト化１Ｄ９アクリタマブ（商標）抗体およびヒト化１Ｄ９ポテリジェント（商標）の特性決定によると、全長ヒトＨＥＲ３  ＥＣＤへの特異的結合が示される。交差種相同性推定に基づけば、ラットＨＥＲ３  ＥＣＤのドメインＩＩＩおよびカニクイザルＨＥＲ３  ＥＣＤのドメインＩＩＩは、ヒト化１Ｄ９抗体およびその変異体が結合するドメインＩＩＩヒトＨＥＲ３  ＥＣＤエピトープと約９５％相同である。これは機能的交差反応の強い可能性を示唆する。このことと一致して、ヒト化１Ｄ９  Ｆｃ障害抗体は、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析により評価した場合に、全長カニクイザルＨＥＲ３  ＥＣＤおよび全長ラットＨＥＲ３  ＥＣＤと匹敵するレベルで交差反応することが見出された。上記の表１０および表１１参照。
【０４２５】
実施例６
１．概要
本実施例は、１Ｄ９抗体（例えば、マウス１Ｄ９抗体およびそのヒト化変異体）および１５Ｄ５抗体（例えば、マウス１５Ｄ５抗体およびそのヒト化変異体）の、ヘレグリンにより誘導されるＨＥＲ３のリン酸化を阻害し、下流ＡＫＴシグナル伝達を低下させ、ヘテロ二量体形成阻害剤として、活性化されたＥＧＦＲがＨＥＲ３とヘテロ二量体を形成しないように働き、ヘレグリンにより誘導されるＥＧＦＲ−ＨＥＲ３、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ならびにＨＥＲ４−ＨＥＲ３ヘテロ二量体形成を妨げ、およびそれに続くＨＥＲ３リン酸化を妨げる能力を証明する。
【０４２６】
２．緒論
１Ｄ９抗体（例えば、マウス１Ｄ９抗体およびそのヒト化変異体）および１５Ｄ５抗体（例えば、マウス１５Ｄ５抗体およびそのヒト化変異体）の、ヘレグリンにより誘導されるＨＥＲ３のリン酸化を阻害し、下流ＡＫＴシグナル伝達を低下させ、ヘテロ二量体形成阻害剤として、活性化されたＥＧＦＲがＨＥＲ３とヘテロ二量体を形成しないように働き、ヘレグリンにより誘導されるＥＧＦＲ−ＨＥＲ３、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ならびにＨＥＲ４−ＨＥＲ３ヘテロ二量体形成を妨げ、およびそれに続くＨＥＲ３リン酸化を妨げる能力を調べた。
【０４２７】
３．方法
３．１．実験の予備事項
これらの試験に用いたモデルは、内務省によって制定された動物管理のＵＫスタンダードに準拠する。
【０４２８】
３．２．実験プロトコール
３．２．１  癌細胞系統における、ヘレグリンにより誘導されるＨＥＲ３受容体リン酸化の、抗ＨＥＲ３  ｍＡｂによる阻害
集密度およそ８０％のＢｘＰＣ３、ＣＨＬ−１、Ｎ８７、ＳＫ−ＢＲ−３、ＢＴ−４７４またはＭＣＦ−７細胞を、トリプシンを用いて採取し、１０％ＦＢＳ／培地で洗浄し、１０％ＦＢＳ／培地に３〜５×１０５細胞／ｍｌで再懸濁させた。１００μｌ／ウェルを９６ウェル組織培養処理済み平底プレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中で一晩インキュベートした。翌日、培地を吸引し、血清不含培地と交換し、一晩インキュベートして血清飢餓状態とした。次に、血清不含培地でｍＡｂ原液を調製し、半対数連続希釈液を作製した。８点濃度曲線を得るために１０μｌのｍＡｂ原液を９６ウェル細胞プレートに２反復で加え、３７℃で１時間インキュベートした。次に、１０μｌのＨＲＧβ１を加えて終濃度３０または１００ｎｇ／ｍｌとし、１５分間インキュベートした。培地を吸引し、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤を含有する低温の溶解バッファーに細胞を溶解させ、氷上で３０分間揺動した。溶解液はすぐに使用したか、または−８０℃で冷凍し、その後、氷上で解凍してヒトホスホ−ＥｒｂＢ３  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  カタログ番号ＤＹＣ１７６９）に用いた。ＥＬＩＳＡは製造者のプロトコールに従って行った。データ分析は、ＧＲＡＰＨＰＡＤ（商標）ＰＲＩＳＭ（商標）ソフトウエアを用いて行った。
【０４２９】
３．２．２  癌細胞系統における、ヘレグリンにより誘導されるＡｋｔリン酸化の、抗ＨＥＲ３  ｍＡｂによる阻害
集密度およそ８０％のＢｘＰＣ３、ＣＨＬ−１、Ｎ８７、ＳＫ−ＢＲ−３またはＢＴ−４７４細胞を、トリプシンを用いて採取し、１０％ＦＢＳ／培地で洗浄し、１０％ＦＢＳ／培地に３〜５×１０５細胞／ｍｌで再懸濁させた。１００μｌ／ウェルを９６ウェル組織培養処理済み平底プレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中で一晩インキュベートした。翌日、培地を吸引し、血清不含培地と交換し、一晩インキュベートして血清飢餓状態とした。翌日、血清不含培地でｍＡｂ原液を調製し、半対数連続希釈液を作製した。８点濃度曲線を得るために１０μｌのｍＡｂ原液を９６ウェル細胞プレートに２反復で加え、３７℃で１時間インキュベートした。次に、１０μｌのＨＲＧβ１を加えて終濃度３０または１００ｎｇ／ｍｌとし、１５分間インキュベートした。培地を吸引し、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤を含有する低温の溶解バッファーに細胞を溶解させ、氷上で３０分間揺動した。溶解液はすぐに使用したか、または−８０℃で冷凍し、その後、氷上で解凍してヒト／マウス／ラットホスホ−Ａｋｔ（Ｓ４７３）チンパンジー特異的ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  カタログ番号ＤＹＣ８８７Ｂ）に用いた。ＥＬＩＳＡは製造者のプロトコールに従って行った。データ分析は、ＧＲＡＰＨＰＡＤ（商標）ＰＲＩＳＭ（商標）を用いて行った。
【０４３０】
３．２．３  ＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞における、上皮細胞増殖因子またはベータセルリンにより誘導されるＨＥＲ３受容体リン酸化の、抗ＨＥＲ３  ｍＡｂによる阻害
ＳＫ−ＢＲ−３細胞を、ヘレグリンの代わりに上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）またはベータセルリンのいずれかを活性化リガンドとしてこと以外は、本実施例の第３．２．１節（上記）に、ヒトホスホ−ＥｒｂＢ３  ＥＬＩＳＡ  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  カタログ番号ＤＹＣ１７６９での使用に関して記載されているようにアッセイした。
【０４３１】
３．２．４  ＨＥＲファミリー受容体ＢＡＣＭＡＭ（商標）を形質導入したＣＨＯ細胞における、ヘレグリンにより誘導されるヘテロ二量体形成およびＨＥＲ３受容体リン酸化の阻害
ヘレグリン−β１刺激後のＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ４によるＨＥＲ３受容体リン酸化の、抗ＨＥＲ３  ｍＡｂにより媒介される阻害を調べるために、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＡＬＰＨＡＬＩＳＡ（商標）アッセイ技術を用いてヘテロ二量体形成アッセイを開発した。試薬はＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒプロトコールに従って調製した。簡単に述べると、ホスホ−チロシン特異的マウスｍＡｂ（Ｐ−Ｔｙｒ−１００  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  カタログ番号９４１１  ＰＢＳ単独処方物）をＡＬＰＨＡＬＩＳＡ（商標）アクセプタービーズ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  カタログ番号６７７２００２）とコンジュゲートさせた。１ｍｇのアクセプタービーズを１００μｇの抗体と４８時間コンジュゲートさせることにより、１０：１結合重量比を用いた。抗体１００μｇ当たり７．６μｌの２ｍｇ／ｍｌＣＨＲＯＭＡＬＩＮＫ（商標）ビオチン３５４（Ｓｕｌｆｏ  ＮＨＳ、ＳｏｌｕＬｉｎＫ  カタログ番号Ｂ−１００７−１０５）を用いることにより、３０：１モル比のビオチン：抗体を用いて、市販の抗ヒトＨＥＲ３抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＭＡＢ３４８１）をビオチン化した。次に、９６ウェルプレートにて、３×１０５細胞／ｍｌのチャイニーズハムスター卵巣細胞にＥＧＦＲ＋ＨＥＲ３、ＨＥＲ２＋ＨＥＲ３およびＨＥＲ４＋ＨＥＲ３の特異的ＢＡＣＭＡＭ（商標）対で一晩形質導入することにより、抗ＨＥＲ３  ｍＡｂを評価した。翌日、抗ＨＥＲ３  ｍＡｂを加え、３７℃で１時間インキュベートした。その後、ヘレグリン−β１を加えて終濃度１００ｎｇ／ｍｌとし、プレートを３０分間インキュベートした。次に、培地を吸引し、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤を含有する低温の溶解バッファーに細胞を溶解させた。溶解液を氷上で３０分間揺動し、すぐに使用したか、または−８０℃で冷凍し、氷上で解凍してＡＬＰＨＡＬＩＳＡ（商標）アッセイを行った。次に、２．５μｌの溶解液を、３８４ウェルプレート中の、１０μｌの２．５ｎＭビオチン化抗ヒトＥｒｂＢ３抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＭＡＢ３４８１）に加え、室温で１時間インキュベートした。その後、５μｌ／ウェルの５０μｇ／ｍｌホスホ−チロシン特異的マウスｍＡｂ（Ｐ−Ｔｙｒ−１００  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  カタログ番号９４１１）を加え、暗所で振盪しながら１時間インキュベートした。１２．５μｌ／ウェルの８０μｇ／ｍｌストレプトアビジンコーティングドナービーズ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  カタログ番号６７６０００２）調製物を加え、さらに３０分間インキュベートした。ＥＮＶＩＳＩＯＮ（商標）２１０３マルチラベルプレートリーダーでプレートを読み取り、ＧＲＡＰＨＰＡＤ（商標）ＰＲＩＳＭ（商標）を用いてデータ分析を行った。
【０４３２】
３．３．薬物および材料
ヒト化１Ｄ９ポテリジェント（商標）抗体（１２．６８ｍｇ／ｍｌ）
ヒト化１Ｄ９アクリタマブ（商標）抗体（７．４５ｍｇ／ｍｌ）
ヒト化１Ｄ９抗体（１．８８ｍｇ／ｍｌ）
ヒト化１Ｄ９  Ｆｃ障害抗体（３．７１３ｍｇ／ｍｌ）
マウス１Ｄ９抗体（Ｍ５．１Ｄ９．１Ｆ５；４．７７ｍｇ／ｍｌ）
マウス１５Ｄ５抗体（３．１９ｍｇ／ｍｌ）
マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ５００μｇ／ｍｌカタログ番号ＭＡＢ００２）
マウスＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ５００μｇ／ｍｌカタログ番号ＭＡＢ００４）
ヒト抗マラリアｍＡｂ（ヒトアイソタイプ対照；５．７４ｍｇ／ｍｌ）
ヘレグリン−β１（ＨＲＧβ１；１．８８ｍｇ／ｍｌ）
３．４．データ分析
本実施例で示されるデータは総て、最低２回の実験からの平均値を表す。抗体値を陽性対照ヘレグリン処置細胞値で割り、１００を掛けて「ヘレグリン対照ホスホＨＥＲ３に対する％」または「ヘレグリン対照ホスホＡＫＴ［．］に対する％」を計算した。上皮細胞増殖因子またはベータセルリン処置ＳＫ−ＢＲ−３細胞の場合には、上皮細胞増殖因子またはベータセルリン陽性対照処置細胞値を比較に用いた。個々の実験からのデータの平均をとり、ＧＲＡＰＨＰＡＤ（商標）ＰＲＩＳＭ（商標）分析ソフトウエアを用いてＩＣ５０値を計算した。
【０４３３】
４．結果
４．２．１  癌細胞における、ヘレグリンにより誘導されるＨＥＲ３受容体リン酸化の、抗ＨＥＲ３抗体による阻害
抗ＨＥＲ３  １Ｄ９および１５Ｄ５抗体は、ＢｘＰＣ３（図１）、ＣＨＬ−１（図２）、Ｎ８７（図３）、ＳＫ−ＢＲ−３（図４）、ＢＴ−４７４（図５）、およびＭＣＦ−７（図６）癌細胞において、ヘレグリンにより誘導されるＨＥＲ３リン酸化を阻害した。ヒト化１Ｄ９ポテリジェント（商標）抗体およびヒト化アクリタマブ（商標）抗体を含め、総ての１Ｄ９抗体構築物が、表１２に示されるように、２．５〜４０．６ｎｇ／ｍｌの範囲のＩＣ５０値で強い阻害を示した。
【０４３４】
【表１２】
2013544492.tif 000021
【０４３５】
４．２．２  癌細胞における、ヘレグリンにより誘導されるＡｋｔリン酸化の、抗ＨＥＲ３  ｍＡｂによる阻害
抗ＨＥＲ３  １Ｄ９抗体および１５Ｄ５抗体は、ＢｘＰＣ３（図７）、ＣＨＬ−１（図８）、Ｎ８７（図９）、およびＳＫ−ＢＲ−３（図１０）癌細胞において、ヘレグリンにより誘導されるＡＫＴリン酸化を低減した。ＡＫＴリン酸化のほとんどの強い阻害はＢｘＰＣ３細胞で見られ、その場合、ヒト化１Ｄ９アクリタマブ（商標）抗体は、ヘレグリンにより誘導されるホスホ−ＡＫＴ形成を２．６ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０値で阻害した（表１３）。
【０４３６】
【表１３】
2013544492.tif 000022
【０４３７】
４．２．３  ＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞における、上皮細胞増殖因子およびベータセルリンにより誘導されるＨＥＲ３受容体リン酸化の、抗ＨＥＲ３  ｍＡｂによる阻害
抗ＨＥＲ３  １Ｄ９抗体および１５Ｄ５抗体は、ＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞における、上皮細胞増殖因子およびベータセルリンの双方により誘導されるＨＥＲ３リン酸化を阻害した。１Ｄ９マウス構築物は、リガンドに誘導されるＨＥＲ３受容体リン酸化を、活性化リガンドの使用とは無関係に、およそ３ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０値で阻害した（表１４）。
【０４３８】
【表１４】
2013544492.tif 000023
【０４３９】
４．２．４  ＨＥＲ３とＥＧＦＲ、ＨＥＲ２またはＨＥＲ４を組み合わせたＢＡＣＭＡＭ（商標）を形質導入したＣＨＯ細胞における、ヘレグリンにより誘導されるヘテロ二量体形成およびＨＥＲ３受容体リン酸化の阻害
抗ＨＥＲ３  １Ｄ９抗体および１５Ｄ５抗体は、示されるように、ヒトＨＥＲ３受容体とＥＧＦＲ、ＨＥＲ２またはＨＥＲ４受容体とを同時形質導入したＣＨＯ細胞において、ヘレグリンにより誘導されるＨＥＲ３リン酸化を阻害した。これらの抗体は、ヘレグリンにより誘導される、ＥＧＦＲ−ＨＥＲ３、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３またはＨＥＲ４−ＨＥＲ３ヘテロ二量体の形成を阻害することができた。ＩＣ５０値を表１５に示す。
【０４４０】
【表１５】
2013544492.tif 000024
【０４４１】
５．考察
ＨＥＲ３受容体チロシンキナーゼはヒト上皮細胞増殖因子受容体ファミリーに属し、このファミリーはまたＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２およびＨＥＲ４も含む。ＨＥＲ３は、ヘレグリンリガンドに結合するが、本質的にキナーゼ不活性型(kinase dead)である。ＨＥＲ３は、その細胞内Ｃ末端ドメインにおいてチロシン残基のトランスリン酸化を可能とするためには、他のファミリーメンバーと二量体を形成しなければならない。続いて、活性化され、リン酸化されたＨＥＲ３受容体から生じる下流シグナル伝達には、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ生存経路が含まれる。
【０４４２】
本実施例のデータは、抗ＨＥＲ３  １Ｄ９抗体および１５Ｄ５抗体が、ヘレグリンにより誘導されるＨＥＲ３受容体リン酸化を阻害することができることを示す。ヘレグリン刺激の前に癌細胞系統を１Ｄ９抗体で処置すると、ヘレグリンにより誘導されるＨＥＲ３リン酸化の完全な阻害がもたらされた。図１６は、種々の１Ｄ９抗体の、種々の癌細胞系統のＨＥＲ３リン酸化阻害に関するＩＣ５０値を示す。下流のＡＫＴリン酸化も、１Ｄ９抗体および１５Ｄ５抗体処置により低減された。従って、１Ｄ９抗体および１５Ｄ５抗体は、ヘレグリンにより誘導されるＨＥＲ３リン酸化を阻害し、下流のＡＫＴシグナル伝達を低下させる。
【０４４３】
上皮細胞増殖因子およびベータセルリンはＥＧＦＲのリガンドであり、ＥＧＦＲ−ＨＥＲ３ヘテロ二量体の形成を誘導することができる。ＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞は、これらのＥＧＦＲリガンドのいずれかで処置した場合、ＨＥＲ３リン酸化の誘導を示した。ＳＫ−ＢＲ−３細胞を１Ｄ９抗体または１５Ｄ５抗体(antbodies)で処置すると、上皮細胞増殖因子またはベータセルリンにより誘導されるＨＥＲ３リン酸化が阻害された（図１１および図１２）。このことは、これらの抗体がヘテロ二量体形成阻害剤として働き、活性化されたＥＧＦＲがＨＥＲ３と二量体を形成しないようにすることができることを示唆する。
【０４４４】
１Ｄ９抗体および１５Ｄ５抗体は、ＥＧＦＲ−ＨＥＲ３またはＨＥＲ２−ＨＥＲ３またはＨＥＲ４−ＨＥＲ３ヘレグリンにより誘導されるヘテロ二量体形成を特異的に阻害した。ＣＨＯ細胞に、ＨＥＲ３と、ヘテロ二量体形成時にＨＥＲ３をトランスでリン酸化することができる他のファミリーメンバーの１つだけを形質導入した。ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２またはＨＥＲ４が二量体形成パートナーとして用いられたかどうかにかかわらず、１Ｄ９抗体および１５Ｄ５抗体は、ヘレグリンにより誘導されるＨＥＲ３リン酸化を阻害した（図１３、図１４および図１５）。このことは、１Ｄ９抗体および１５Ｄ５抗体が、ヘレグリンにより誘導される、これらの他のファミリーメンバーとのヘテロ二量体形成を妨げ、ＨＥＲ３のリン酸化を妨げることを示唆する。
【０４４５】
実施例７
１．概要
いくつかのin vitroアッセイで抗ヒトＨＥＲ３抗体の特性決定を行った。これらには、これらのｍＡｂの、全長ＨＥＲ３  ＥＣＤおよび特定のＨＥＲ３ドメインとの結合に関するアッセイ、これらのｍＡｂの腫瘍細胞との結合に関するアッセイ、増殖アッセイ、浸潤アッセイ、インターナリゼーションアッセイ、およびこれらのｍＡｂの交差種特異性（マウスおよびカニクイザル）に関するアッセイが含まれた。マウス１Ｄ９抗体、ヒト化１Ｄ９抗体、ヒト化１Ｄ９ポテリジェント（商標）抗体およびヒト化アクリタマブ（商標）抗体を評価した。結果は、抗ヒトＨＥＲ３  １Ｄ９抗体のマウス構築物およびヒト化構築物は双方とも、ヒトＨＥＲ３  ＥＣＤ全長を認識し、そのＨＥＲ３  ＥＣＤのドメイン３に特異的に結合することを示した。これらのｍＡｂは、ヘレグリンにより誘導される腫瘍細胞の増殖を用量依存的に阻害する。これらのｍＡｂはまた、ヘレグリンにより誘導される腫瘍細胞の浸潤を阻害する。１Ｄ９抗体は、腫瘍細胞へのＨＥＲ３受容体のインターナリゼーションを誘導する。これらのｍＡｂはまた、マウスＨＥＲ３と交差反応する。
【０４４６】
２．緒論
本実施例では、抗ヒトＨＥＲ３抗体に対して行ったin vitro特性決定をまとめる。本実施例は、マウス１Ｄ９抗体、ヒト化１Ｄ９ポテリジェント（商標）抗体およびヒト化アクリタマブ（商標）抗体に関するデータを含む。下記のアッセイ、すなわち、全長ヒトＨＥＲ３  ＥＣＤおよびドメイン結合、腫瘍細胞に対する結合、増殖、浸潤、インターナリゼーション、および交差特異性（マウス）から得られた結果を詳細に記載する。
【０４４７】
３．方法
３．１  ＨＥＲ３全長ＥＣＤおよびドメイン結合アッセイ
目的：これらのアッセイの目的は、ヒト化１Ｄ９ポテリジェント（商標）抗体およびヒト化１Ｄ９アクリタマブ（商標）抗体が全長ＨＥＲ３細胞外ドメインに結合することを確認することであった。これらのアッセイのもう１つの目的は、これらのｍＡｂがまたＨＥＲ３ドメインＩＩＩに特異的に結合することを確認することであった。
【０４４８】
ＨＥＲ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する抗ＨＥＲ３抗体の検出のために解離増強ランタニド蛍光イムノアッセイ（ＤＥＬＦＩＡ）を用いた。ＤＥＬＦＩＡ手順は次の通りであった：白色Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ  ＃４３７７９６）を０．１Ｍ炭酸バッファーｐＨ９．５中、４℃で一晩、１００μｌ／ウェルの１μｇ／ｍｌ  ＨＥＲ−３  ＥＣＤ全長またはＨＥＲ３ドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶでコーティングした。これらのプレートをＴＢＳ中のカゼイン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＃３７５３２  ロット番号ＪＤ１２１０７４）でブロッキングした。無希釈ハイブリドーマ上清またはＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＃４００２−００１０アッセイバッファーで１０μｇ／ｍｌ（または１００μｇ／ｍｌ）〜０．０１μｇ／ｍｌに希釈した精製抗ＨＥＲ３抗体または最低３種類の希釈率のＰＫ血清サンプル（１００μｌ／ウェル）をプレートに加えた。これらのサンプルをプレートシェーカー上にて室温で２時間、または４℃で一晩インキュベートした。１００μｌ／ウェルの抗マウスＥｕ抗体（ＰＥ  ＤＥＬＦＩＡ  ＃ＡＤ−０１２４  ロット３２６−９４９−Ａ、１：１０００＝５０ｎｇ／ｍｌで使用）またはＥｕ標識抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｗａｌｌａｃ  ＃１２４４−３３０  ５０μｇ／ｍｌ、精製抗体には１：４，０００希釈またはＰＫ試験には１：２，０００希釈で使用）を用い、室温で１時間インキュベートした。各抗体インキュベーション工程の後、このプレートをＢＩＯＴＥＫ（商標）プレート洗浄機にて、０．０５％ツィーン−２０（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＃４０１０−００１０）を含むトリスバッファーで４回洗浄した。１００μｌ／ウェルのＤＥＬＦＩＡ増強溶液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  １２４４−１０５）を室温で５分間加えた。その後、このプレートをＶＩＣＴＯＲ（商標）１４２０プレートリーダーにて、ユウロピウム時間分解蛍光測定法（ＴＲＦ）プロトコールを用いて読み取った。抗体結合を１ウェル当たりのユウロピウム総数として記録した。
【０４４９】
結果：図１７は、マウス１Ｄ９抗体（Ｍ５．１Ｄ９．１Ｆ５）の、全長ＨＥＲ３  ＥＣＤおよびＨＥＲ３ドメインＩＩＩの双方に対する特異的結合を示す。図１８は、マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）の、全長ＨＥＲ３  ＥＣＤおよびＨＥＲ３ドメインＩＩの双方に対する特異的結合を示す。図１９は、ヒト化１Ｄ９ポテリジェント（商標）抗体の、全長ＨＥＲ３  ＥＣＤおよびＨＥＲ３ドメインＩＩＩに対する特異的結合を示す。図２０は、ヒト化１Ｄ９アクリタマブ（商標）抗体の、全長ＨＥＲ３  ＥＣＤおよびＨＥＲ３ドメインＩＩＩに対する特異的結合を示す。図２１は、ヒト化１Ｄ９抗体の、全長ＨＥＲ３  ＥＣＤおよびＨＥＲ３ドメインＩＩＩに対する特異的結合を示す。図１７、図１８、図１９、図２０および図２１参照。
【０４５０】
結論：マウス１Ｄ９抗体（Ｍ５．１Ｄ９．１Ｆ５）は、全長ＨＥＲ３  ＥＣＤおよびＨＥＲ３ドメインＩＩＩの双方に特異的に結合する。マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）は、全長ＨＥＲ３  ＥＣＤおよびＨＥＲ３ドメインＩＩの双方に特異的に結合する。ヒト化１Ｄ９ポテリジェント（商標）抗体は、全長ＨＥＲ３  ＥＣＤおよびＨＥＲ３ドメインＩＩＩに特異的に結合する。ヒト化１Ｄ９アクリタマブ（商標）抗体は、全長ＨＥＲ３  ＥＣＤおよびＨＥＲ３ドメインＩＩＩに特異的に結合する。ヒト化１Ｄ９抗体は、全長ＨＥＲ３  ＥＣＤおよびＨＥＲ３ドメインＩＩＩに特異的に結合する。図１７、図１８、図１９、図２０および図２１参照。
【０４５１】
３．２  抗ヒトＨＥＲ３抗体はフローサイトメトリーアッセイにおいてヒト癌細胞系統に結合する
目的：ＨＥＲ３陽性細胞系統であることが知られているヒト癌細胞系統に対する抗ヒトＨＥＲ３抗体の結合特性を決定すること。
【０４５２】
試薬：
ＦＡＣＳバッファー：ＰＢＳ、０．２％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウム
抗体：マウス１Ｄ９抗体（Ｍ５．１Ｄ９．１Ｆ５）
ヒト化１Ｄ９抗体
ヒト化１Ｄ９アクリタマブ（商標）抗体
ヒト化１Ｄ９ポテリジェント（商標）抗体
ＰＥヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−Ｃａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  （Ｍ３０００４−４）
ヤギ抗ヒトＩｇＧ  ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ６４７（商標）−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  （Ａ２１４４５）
細胞系統：ＣＨＬ１、ＢｘＰＣ３
方法：ＨＥＲ３受容体に関して予めスクリーニングした細胞系統由来の５×１０６細胞を、フローサイトメトリーチューブに加えた。用量応答濃度の各供試抗体を適当なチューブに加えた。細胞および抗体を氷上で３０分間インキュベートした。細胞を１ｍｌの染色バッファーで１回洗浄した後、適当な二次抗体を適当なチューブに加えた。細胞を暗所、氷上で再び３０分間インキュベートした後、ＦＡＣＳバッファーで洗浄し、再懸濁させた。細胞をＦＡＣＳＣＡＮＴＯ（商標）フローサイトメーターで分析した。
【０４５３】
データ分析：ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓにより開発されたＦＡＣＳＤＩＶＡ（商標）ソフトウエアを用いて分析を行った。前方散乱と側方散乱を用いて細胞集団にゲートを設定し、蛍光強度のヒストグラムを作成した。
【０４５４】
結果：各細胞系統に対する抗体結合のヒストグラムは、アイソタイプ対照抗体のヒストグラムから右へシフトすることにより、ヒト化抗ＨＥＲ３  ｍＡｂの特異的結合を示す。マウス１Ｄ９抗体（Ｍ５．１Ｄ９．１Ｆ５）は、ＭＣＦ７ヒト乳癌細胞およびＢｘＰＣ３ヒト膵臓腫瘍細胞で発現されるヒトＨＥＲ３に結合する。図２２参照。ヒト化１Ｄ９抗体、ヒト化１Ｄ９アクリタマブ（商標）抗体およびヒト化１Ｄ９ポテリジェント（商標）抗体は総て、ＣＨＬ−１ヒト黒色腫細胞およびＢｘＰＣ３ヒト膵臓腫瘍細胞上で発現されるヒトＨＥＲ３に結合する。図２３参照。
【０４５５】
結論：マウス１Ｄ９抗体（Ｍ５．１Ｄ９．１Ｆ５）は、ＭＣＦ７ヒト乳癌細胞およびＢｘＰＣ３ヒト膵臓腫瘍細胞により発現されるヒトＨＥＲ３を認識した。図２２参照。ヒト化１Ｄ９抗体、ヒト化１Ｄ９アクリタマブ（商標）抗体およびヒト化１Ｄ９ポテリジェント（商標）抗体は総て、ＣＨＬ−１（黒色腫）およびＢｘＰＣ３（膵臓）ヒト癌細胞系統上で発現されるヒトＨＥＲ３を認識する。図２３参照。
【０４５６】
３．３  ヘレグリンにより誘導される腫瘍細胞増殖の、Ｍ５．１Ｄ９による阻害、ヘレグリンにより誘導される細胞増殖の阻害
目的：ＭＣＦ７またはＢｘＰＣ３細胞系統のいずれかにおいて、任意の抗ヒトＨＥＲ３抗体がヘレグリン−１βにより誘導される細胞増殖を阻害することができるかどうかを判定すること。
【０４５７】
試薬：
完全培地：ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、グルタミン
細胞系統：ＭＣＦ７
ＢｘＰＣ３−ＡＴＣＣ
抗体：マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）
マウス１Ｄ９抗体（Ｍ５．１Ｄ９．１Ｆ５）
マウス２４Ｈ５抗体（Ｍ５．２４Ｈ５．Ｃ２）
ヒト化１Ｄ９抗体
ヒト化１Ｄ９アクリタマブ（商標）抗体
ヒト化１Ｄ９ポテリジェント（商標）抗体
Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６非放射性細胞増殖アッセイ（ＭＴＴ）−Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｇ４０００
方法：ＭＣＦ７またはＢｘＰＣ３細胞系統のいずれか、それぞれ１×１０３または１×１０４細胞／ウェルを、平底９６ウェルプレートの各ウェルの、１０％血清を含有する完全培地中に加え、３７℃で一晩インキュベートした。培地を除去して血清不含ＲＰＭＩと交換した。スクリーニングする各抗体１０μｌを適当なウェルに４反復で加えた。抗体および細胞を３７℃で１時間インキュベートした。３０ｎｇ／ｍｌのヘレグリン−１βを各ウェルに加えた。ヒト化抗体実験では、ｐ−ＨＥＲ３およびｐＡｋｔアッセイで用いる条件に対する比較対照として１００ｎｇ／ｍｌヘレグリンを用いた。これらのプレートを３７℃で７２時間インキュベートした。ＰｒｏｍｅｇａによるＭＴＴキットを用いて増殖を測定し、これらのプレートをＥＮＶＩＳＩＯＮ（商標）２１０３マルチラベルリーダーで分析し、マイクロソフトエクセル（商標）でデータを分析した。データを、抗体濃度に対するヘレグリンにより誘導される増殖のパーセンテージとしてグラフ化した。
【０４５８】
結果：ＭＣＦ７細胞では、ヘレグリン−１βに応答した良好な増殖誘導が見られた（およそ４０％）。しかしながら、ＢｘＰＣ３細胞での応答は限られたものであった（およそ１０％）。マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）およびマウス１Ｄ９抗体（Ｍ５．１Ｄ９．１Ｆ５）は双方とも、ヘレグリン−１βにより誘導されるＭＣＦ７細胞の増殖を阻害した。マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）およびマウス１Ｄ９抗体（Ｍ５．１Ｄ９．１Ｆ５）は実際に、ＢｘＰＣ３増殖を細胞単独のレベルより低く阻害した。ヒト化１Ｄ９アクリタマブ（商標）抗体は、ＢｘＰＣ３細胞において、マウス１Ｄ９抗体（Ｍ５．１Ｄ９．１Ｆ５）と同等の阻害効力(protency)を示した。図２４、図２５および図２６参照。
【０４５９】
結論：マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）およびマウス１Ｄ９抗体（Ｍ５．１Ｄ９．１Ｆ５）は、ＭＣＦ７およびＢｘＰＣ３細胞増殖阻害能が匹敵するものであった。図２４および図２５。ヒト化１Ｄ９アクリタマブ（商標）抗体は、ＢｘＰＣ３腫瘍細胞の増殖を阻害する。図２６参照。
【０４６０】
３．４  腫瘍細胞浸潤の阻害
目的：本試験の目的は、任意の抗ヒトＨＥＲ３抗体がヘレグリン刺激後に腫瘍細胞浸潤を阻害することができるかどうかを判定することであった。
【０４６１】
方法：ＨＥＲファミリー発現に関して事前に特性決定を行ったヒト腫瘍細胞系統を浸潤アッセイに用いた。ＢＸＰＣ３細胞はＨＥＲ−２と、程度は低いがＨＥＲ３の双方を発現することが示された。ＢＸＰＣ３細胞浸潤に対するＨＥＲ３抗体の効果は、Ｔｒｅｖｉｇｅｎ  ＣＵＬＴＲＥＸ（商標）細胞浸潤アッセイ（カタログ番号３４５５−０９６−Ｋ）を用いて判定した。簡単に述べると、ＢＸＰＣ３細胞を集密度６０％まで増殖させ、一晩、血清飢餓状態とした後、ＶＥＲＳＥＮＥ（商標）キレート剤（ＥＤＴＡ）およびトリプシンを用いて培養フラスコから取り出した。細胞をクエンチバッファー（ＲＰＭＩ＋２％ＢＳＡ）で洗浄し、トリパンプルー色素排除を用いて生存率を決定し、アッセイに用いるために、細胞をＦＢＳまたはＢＳＡ含有ＲＰＭＩ培地に１００万細胞／ｍｌで懸濁させた。抗体を細胞とともに３７℃で１時間インキュベートした後、浸潤プレートの上のウェル列に加えた。下のウェル列にはＲＰＭＩ培地＋１０％熱不活性化されていないＦＢＳを入れた。しかしながら、下の一列のウェルにはランダムな移動を考慮するためにＦＢＳ不含のＲＰＭＩを入れた。移動した細胞をカルセイン−ａｍで標識し、下のチャンバーをＶＩＣＴＯＲ（商標）ＩＶプレートリーダーで読み取った。蛍光（ＲＦＵ）は、移動した細胞の量を表す。各抗体のＲＦＵをアイソタイプ対照抗体のＲＦＵで割り、１００を掛けて「対照浸潤％」値を得た。
【０４６２】
結果：マウス１Ｄ９抗体（Ｍ５．１Ｄ９．１Ｆ５）、キメラ１Ｄ９抗体およびキメラ１５Ｄ５抗体は総て、ＢＸＰＣ３細胞の浸潤を４０％阻害した。マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）は細胞浸潤を３０％阻害した。マウス１Ｄ９抗体（Ｍ５．１Ｄ９．１Ｆ５）は、腫瘍細胞浸潤を２０％阻害した。図２７参照。
【０４６３】
結論：マウス１Ｄ９抗体（Ｍ５．１Ｄ９．１Ｆ５）、キメラ１Ｄ９抗体およびキメラ１５Ｄ５抗体は、腫瘍細胞浸潤を阻害した。図２７参照。
【０４６４】
３．５  マウス１Ｄ９抗体のヒト腫瘍細胞への結合はＨＥＲ３受容体のインターナリゼーションをひき起こす
目的：任意の抗ヒトＨＥＲ３抗体が結合時にＨＥＲ３受容体のインターナリゼーションを引き起こすかどうかを判定すること。
【０４６５】
試薬：
染色バッファー：ＰＢＳ、０．２％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウム
抗体：ＩｇＧ１対照−Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＭＡＢ００２
ＩｇＧ２ｂ対照−Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＭＡＢ００４
マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）−（３．１９ｍｇ／ｍｌ）
Ｈｚ１０−（９．８２ｍｇ／ｍｌ）
ヒト化１Ｄ９抗体−（１．８８ｍｇ／ｍｌ）
二次抗体：
ＰＥヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−Ｃａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｍ３０００４−４
ヤギ抗ヒトＩｇＧ  ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ６４７（商標）−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａ２１４４５
方法：１００μｌの５×１０６細胞／ｍｌを、１０μｇの抗ＨＥＲ３抗体が入ったフローサイトメトリーチューブに加えた。各抗体を２反復で加えた。各抗体の１本のチューブを氷上でインキュベートし、他のチューブは３７℃でインキュベートした。２時間後、これらの細胞を１ｍｌの染色バッファーで洗浄し、ＰＥ標識ヤギ抗マウス二次抗体で３０分間、対比染色を行った。１ｍｌの染色バッファーでさらに洗浄した後、これらの細胞をＦＡＣＳＣＡＮＴＯ（商標）サイトメーターで分析した。データ分析は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓにより開発されたＦＡＣＳＤＩＶＡ（商標）ソフトウエアを用いて行った。前方散乱と側方散乱を用いて細胞集団にゲートを設定し、蛍光強度のヒストグラムを作成した。
【０４６６】
結果：ＣＨＬ−１細胞に対するＨＥＲ３受容体のインターナリゼーションに関して、マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）およびヒト化１Ｄ９抗体がスクリーニングされた。３７℃でインキュベートした後、これらの抗体は検出されなかったが、これはこの受容体が細胞表面には無かったことを示した。
【０４６７】
結論：マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）およびヒト化１Ｄ９抗体は、ＨＥＲ３受容体に結合した際にその受容体のインターナリゼーションを引き起こした。図２８参照。
【０４６８】
３．６  マウス１Ｄ９抗体はマウス腫瘍細胞上のマウスＨＥＲ３と交差反応する
目的：任意の抗ヒトＨＥＲ３抗体がマウスＨＥＲ３陽性細胞系統と交差反応するかどうかを判定すること。
【０４６９】
試薬：
ＦＡＣＳバッファー：ＰＢＳ、０．２％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウム
抗体：ＥＧＦＲ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ４４７８３Ｍ
ＨＥＲ２−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＡＨＯ１０１１
ＨＥＲ３−Ｕｐｓｔａｔｅ  ０５−４７１
マウス１５Ｄ５抗体
マウス１Ｄ９抗体（Ｍ５．１Ｄ９．１Ｆ５）
マウス２４Ｈ５抗体（Ｍ５．２４Ｈ５．Ｃ２）
細胞系統：Ｂ１６
Ｂ１６Ｆ１０
ＺＥＮＯＮ（商標）標識キット：
マウスＩｇＧ１  ＰＥ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｚ２５０２１
マウスＩｇＧ１  ＡＰＣ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｚ２５０５１
マウスＩｇＧ２ｂ  ＡＰＣ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｚ２５１５１
方法：市販の抗ヒトＥＧＦＲおよびＨＥＲ２抗体を準備した。供給者によりヒトＨＥＲ３を認識することが示されている市販のＨＥＲ３抗体を準備した。マウス１５Ｄ５抗体、マウス１Ｄ９抗体（Ｍ５．１Ｄ９．１Ｆ５）、マウス２４Ｈ５抗体（Ｍ５．２４Ｈ５．Ｃ２）抗体もまた準備した。これらの抗体を、ＺＥＮＯＮ（商標）標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＥまたはＡＰＣのいずれかで標識した。５×１０６のＢ１６またはＢ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞を、標識抗ＨＥＲ３抗体が入ったフローサイトメトリーチューブに加えた。細胞および抗体を暗所、氷上で３０分間インキュベートし、ＦＡＣＳバッファーで洗浄し、再懸濁させた。次に、細胞をＦＡＣＳＣＡＮＴＯ（商標）フローサイトメーターで分析した。データ分析は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓにより開発されたＦＡＣＳＤＩＶＡ（商標）ソフトウエアを用いて分析した。前方散乱と側方散乱を用いて細胞集団にゲートを設定し、蛍光強度のヒストグラムを作成した。
【０４７０】
結果：市販のＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３抗体はマウス細胞表面のこれらの受容体を認識しなかった（データは示されていない）。マウス１５Ｄ５抗体、マウス１Ｄ９抗体（Ｍ５．１Ｄ９．１Ｆ５）、およびマウス２４Ｈ５抗体（Ｍ５．２４Ｈ５．Ｃ２）は総て、Ｂ１６およびＢ１６Ｆ１０細胞表面のＨＥＲ３を認識した。図２９参照。
【０４７１】
結論：マウス１５Ｄ５抗体、マウス１Ｄ９抗体（Ｍ５．１Ｄ９．１Ｆ５）、およびマウス２４Ｈ５抗体（Ｍ５．２４Ｈ５．Ｃ２）は、マウスＨＥＲ３と交差反応する。図２９参照。
【０４７２】
実施例８
１．概要
ヒト癌のマウスモデルは、新しい抗癌薬のin vivo活性を実証するために前臨床状況で鋭意用いられている。本試験では、ヒト臨床試験に適用可能なさらなる開発のための取り組みを確立し、リード候補の優先順位を決定するために、マウス同一遺伝子型肺病巣形成モデルおよび数種のヒト異種移植モデルでマウス抗ＨＥＲ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を評価した。
【０４７３】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞の単回のｉ．ｖ．注射を行い、抗ＨＥＲ３  ｍＡｂ処置を伴うまたは伴わない肺における肺病巣形成を評価した。Ｂ１６Ｆ１０注射の３日後に５０ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）および７日後と１１日後に２５ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）のマウス１Ｄ９抗体を投与したところ、試験の終了時、すなわち、Ｂ１６Ｆ１０注射の２０日後に肺重量の有意な低下（ｐ＜０．００１）が起こった。マウス１５Ｄ５抗体はまた、肺において腫瘍細胞の病巣形成を阻害したが（ｐ＜０．０５）、２５および５ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）といった低用量計画の方が、５０／２５ｍｇ／ｋｇの用量計画に比べて活性が高かった。マウス１Ｄ９  ｍＡｂおよび１５Ｄ５  ｍＡｂは双方とも、続いて異種移植モデルでヒト腫瘍に対する活性を評価した。
【０４７４】
マウス抗ＨＥＲ３  ｍＡｂは、ＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウスに移植した進行性ＨＥＲ３＋ヒト異種移植片の成長を遅延させた。週に２回、０．５〜１００ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）のマウス１Ｄ９抗体またはマウス１５Ｄ５抗体で処置したところ、ＣＨＬ−１黒色腫腫瘍増殖に用量依存的かつ統計学的に有意な低下が起こった（≧５ｍｇ／ｋｇでｐ＜０．００１）。ＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウスにおける皮下移植後のＢｘＰＣ３膵臓腫瘍増殖にも同様の活性が見られた（≧５ｍｇ／ｋｇでｐ＜０．００１）。
【０４７５】
１Ｄ９抗体および１５Ｄ５抗体は、ＣＨＬ−１黒色腫異種移植モデルにおいて、５〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、有意かつ用量依存的な抗腫瘍活性を保持していた（ｐ＜０．００１）。さらに、ヒト化１Ｄ９  ＲＲ抗体およびヒト化１Ｄ９  ＲＲアクリタマブ（商標）抗体は、５、２５および５０ｍｇ／ｋｇの用量で有意かつ同等に強い活性を持っていた（ｐ＜０．００１）。
【０４７６】
皮下および同所ＢｘＰＣ３異種移植モデルでは、５０ｍｇ／ｋｇのキメラ１Ｄ９抗体またはヒト化１５Ｄ５抗体は、試験終了まで腫瘍増殖の有意な阻害を生じたが（ｐ＜０．００１）、５０ｍｇ／ｋｇのヒト化１Ｄ９  ＲＲ抗体は皮下ＢｘＰＣ３モデルにおける腫瘍増殖に対して、有意ではあるが（ｐ＜０．００１）、一時的な効果を示した。増殖阻害の持続時間の違いは試験間の変動（すなわち、移植されるＢｘＰＣ３フラグメントの特徴）によるものであると思われるが、やはり、遺伝的に操作されたｍＡｂの腫瘍増殖に対する有効性が示された。
【０４７７】
最後に、ＮＣＩ−Ｎ８７胃モデルにおけるヒト化１Ｄ９  ＲＲ抗体、ヒト化１Ｄ９アクリタマブ（商標）抗体、およびヒト化１Ｄ９ポテリジェント（商標）抗体の評価は、ＣＨＬ−１黒色腫異種移植片に対して増強されたｍＡｂの活性を示した。
【０４７８】
２．緒論
本試験では、マウス親またはヒト化ＨＥＲ３モノクローナル抗体の、進行性ＨＥＲ３＋ヒト異種移植片、すなわち、ＣＨＬ−１黒色腫、ＢｘＰＣ３膵臓腫瘍、およびＮＣＩ−Ｎ８７胃腫瘍に対する抗腫瘍活性を評価した。マウス親抗ＨＥＲ３  ｍＡｂの活性を評価するために、マウスＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞を用いた同一遺伝子型肺病巣形成モデルを予備評価に含めた。
【０４７９】
３．方法
３．１．実験の予備事項
これらの試験に用いたモデルは、内務省によって制定された動物管理のＵＫスタンダードに準拠する。
【０４８０】
ヒト異種移植腫瘍モデル試験は、６〜８週齢、体重およそ１５〜２０グラムの雌ＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｉｎｄｉａｎａ、ＩＮ）で行った。マウスは試験開始時には１０〜１２週齢であった。同一遺伝子型肺病巣形成モデル試験は、６〜８週齢、体重およそ１５〜２０ｇのＣ５７Ｂｌ雌マウスで行った。
【０４８１】
マウス（Ｂ１６Ｆ１０）、およびヒト（ＢｘＰＣ３、ＮＣＩ  Ｎ８７およびＣＨＬ−１）腫瘍細胞系統は細胞リポジトリから入手した。
【０４８２】
３．２．実験プロトコール
３．２．１．マウスＢ１６Ｆ１０黒色腫同一遺伝子型モデル
Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスに２×１０５のＢ１６Ｆ１０細胞をｉ．ｖ．注射した。マウス抗ＨＥＲ３抗体またはアイソタイプ対照を腫瘍細胞注射の３日後に５０または２５ｍｇ／ｋｇでｉ．ｐ．投与し、その後、７日後と１１日後に２５または５ｍｇ／ｋｇでｉ．ｐ．投与した。注射３日後にジェムザール（商標）（ＮＤＣ  ０００２−７５０２−０１；ゲムシタビン）をｉ．ｖ．投与した。２０日目に動物を安楽死させ、肺を摘出して湿重を測定した。
【０４８３】
３．２．２．ヒトＣＨＬ−１黒色腫異種移植モデル
マトリゲル(MATRIGEL)（商標）中、ＣＨＬ−１細胞（５×１０５〜５×１０６）を、ＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウスの大腿に皮下（ｓ．ｃ．）注射した。腫瘍異種移植片が平均体積８０〜１２０ｍｍ３に達したところで、マウスを治療群（各群マウスｎ＝６個体）に無作為化し、抗ＨＥＲ３  ｍＡｂまたはアイソタイプ対照を投与した。０．５〜１００ｍｇ／ｋｇの用量を週に２回ｉ．ｐ．投与した。ビヒクル処置マウスを腫瘍増殖の対照群として用いた。
【０４８４】
毎週、腫瘍の幅（Ｗ）および長さ（Ｌ）を手動カリパスで測定し、下式：Ｖ＝１／２（Ｌ×Ｗ２）を用いて腫瘍体積（Ｖ）を計算した。アイソタイプ対照の平均腫瘍体積が１０００ｍｍ３を越えた際に試験を終了した。
【０４８５】
３．２．３．ヒトＢｘＰＣ３膵臓異種移植モデル：皮下および同所移植
ＢｘＰＣ３細胞（５×１０６／マウス）を、ドナーとするＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウスにｓ．ｃ．投与した。腫瘍が８００〜１０００ｍｍ３の体積に達した際にＢｘＰＣ３担癌ドナーマウスを安楽死させ、その後、腫瘍を摘出し、３ｍｍ３の腫瘍断片に分けた。新しく摘出したＢｘＰＣ３腫瘍断片をレシピエントマウスの大腿にｓ．ｃ．移植した。同所モデルでは、断片をレシピエントマウスの膵臓に外科的に移植した。
【０４８６】
レシピエントマウスの腫瘍異種移植片が平均体積８０〜１２０ｍｍ３に達したところで、マウスを治療群（各群マウスｎ＝６個体）に無作為化し、抗ＨＥＲ３  ｍＡｂまたはアイソタイプ対照で処置した。０．５〜１００ｍｇ／ｋｇの用量を週に２回ｉ．ｐ．投与（皮下移植モデル）またはｉ．ｖ．投与（同所移植モデル）した。ビヒクル処置マウスを腫瘍増殖の対照群として用いた。
【０４８７】
腫瘍体積を上記のように毎週、手動カリパスで測定した。同所モデルでは、腫瘍を超音波で測定し、ＶＩＳＵＡＬ  ＳＯＮＩＣＳ  ＶＥＶＯ（商標）７７０画像解析システムを用いて体積を求めた。
【０４８８】
３．２．４．ヒトＮＣＩ−Ｎ８７胃異種移植モデル
ＮＣＩ−Ｎ８７細胞をドナーマウスの右大腿に約１×１０６細胞／動物で移植した。ドナーマウスから腫瘍断片を採取し、１０〜１２週齢のレシピエントマウスの大腿にｓ．ｃ．移植した。腫瘍異種移植片が平均体積５０〜８０ｍｍ３に達した際、または断片移植の２９日後に、マウス抗ＨＥＲ３  ｍＡｂによる処置を開始した。腫瘍異種移植片が平均体積８０〜１００３ｍｍに達した際、または移植の１５日後に、遺伝的に操作した抗ＨＥＲ３  ｍＡｂによる処置を開始した。
【０４８９】
腫瘍体積は上記のように手動カリパスで測定した。
【０４９０】
３．３．薬物および材料
本試験に用いた抗ＨＥＲ３抗体およびアイソタイプ対照を下表に示す。また、本明細書に含まれる略称も示す。抗体は総て、投与用に、リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．０で処方および調製した。
【０４９１】
【表１６】
2013544492.tif 000025
【０４９２】
３．４．データ分析
対照群および処置群に関して、群平均値および平均値の標準誤差を求めた。データをグラフ化し、ヒト異種移植モデルではボンフェローニ事後検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ、またはマウス同一遺伝子型モデルではダネットの事後検定を用いた一元配置Ａｎｏｖａを用いて分析した（ＧＲＡＰＨＰＡＤ（商標）ＰＲＩＳＭ（商標）ソフトウエアｖ．５）。
【０４９３】
４．  結果
４．１．マウス抗ＨＥＲ３  ｍＡｂのin vivo有効性
マウス１Ｄ９抗体およびマウス１５Ｄ５抗体を、腫瘍細胞増殖に対する有効性を証明するためにマウス同一遺伝子型モデルおよび数種のヒト異種移植モデルで評価した。
【０４９４】
４．１．１．マウスＢ１６Ｆ１０黒色腫同一遺伝子型モデル
抗ＨＥＲ３  マウス１Ｄ９抗体による処置は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肺におけるＢ１６Ｆ１０腫瘍病巣形成を低下させた。５０／２５ｍｇ／ｋｇ群は、アイソタイプ対照群に比べて肺重量の有意な低下を示した（ｐ＜０．０１）（図３０）。また、マウス１５Ｄ５抗体による処置も、２５／５ｍｇ／ｋｇ群で、アイソタイプ対照に比べて、肺における腫瘍病巣形成の低下を示した（ｐ＜０．０５；図３１）。
【０４９５】
４．１．２．ヒトＣＨＬ−１黒色腫異種移植モデル
抗ＨＥＲ３マウス１Ｄ９抗体またはマウス１５Ｄ５抗体を５〜１００ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．の範囲の用量で週に２回投与したＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウスは、それらの個々のアイソタイプ対照群に比べて、ヒトＣＨＬ−１腫瘍増殖に用量依存的かつ統計学的に有意な低下を示した（ｐ＜０．００１）（図３２および図３３）。
【０４９６】
４．１．３．ヒトＢｘＰＣ３膵臓異種移植モデル
マウス１Ｄ９抗体を０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．の用量で週に２回投与したＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウスは、アイソタイプ対照群に比べて、ＢｘＰＣ３腫瘍増殖に有意な低下を示した（≧５ｍｇ／ｋｇでｐ＜０．００１）（図３６）。同様に、マウス１５Ｄ５抗体による処置も、５〜５０ｍｇ／ｋｇ群で、アイソタイプ対照群に比べてＢｘＰＣ３腫瘍増殖の低下をもたらした（ｐ＜０．００１）（図３５）。
【０４９７】
４．１．４．ヒトＮＣＩ−Ｎ８７胃異種移植モデル
マウス１Ｄ９抗体を７５または１００ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．の用量で週に２回投与したＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウスは、ビヒクル対照群に比べて、腫瘍体積に有意な低下を示した（ｐ＜０．００１）（図３６）。ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍増殖に対する、ビヒクルおよびアイソタイプ対照群に比べてのマウス１５Ｄ５抗体の効果を図３７に示す。
【０４９８】
４．２．キメラおよびヒト化抗ＨＥＲ３  ｍＡｂのin vivo有効性
ヒト化１５Ｄ５抗体、キメラ１Ｄ９抗体、およびヒト化１Ｄ９  ＲＲ抗体を作製し、評価した。種々のin vitroおよびin vivoモデルにおけるヒト化１Ｄ９  ＲＲ抗体の活性に基づき、さらなる操作を用いて、ＩｇＧ１  ｍＡｂ（ヒト化１Ｄ９  ＲＲアクリタマブ（商標）抗体）またはＣＤＣのみ（ヒト化１Ｄ９  ＲＲポテリジェント（商標）抗体）の抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）属性を増強した。以下にヒト異種移植モデルにおける種々の抗体の活性をまとめる。
【０４９９】
４．２．１．ヒトＣＨＬ−１異種移植モデル
キメラ１Ｄ９抗体を５〜５０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．で週に２回投与したＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウスは、アイソタイプ対照群に比べて、ＣＨＬ−１腫瘍増殖に用量依存的低下を示した。移植２４日後の２５および５０ｍｇ／ｋｇ群における低下は統計学的に有意であり（ｐ＜０．０５）、移植２７日後には、総ての処置群で有意な低下が見られた（ｐ＜０．００１）（図３８）。同様の所見がヒト化１５Ｄ５抗体処置群でも見られた（図３９）。
【０５００】
ヒト化Ｈ１Ｄ９  ＲＲ抗体、ヒト化Ｈ１Ｄ９  ＲＲアクリタマブ（商標）抗体およびヒト化Ｈ１Ｄ９  ＲＲポテリジェント（商標）抗体を、ＣＨＬ−１異種移植モデルにおいて５〜５０ｍｇ／ｋｇの用量で評価した。ヒト化Ｈ１Ｄ９  ＲＲ抗体、ヒト化Ｈ１Ｄ９  ＲＲアクリタマブ（商標）抗体およびヒト化Ｈ１Ｄ９  ＲＲポテリジェント（商標）抗体は、同等の活性特性を示した。総ての用量レベルで、移植２９日後から３４日後の試験終結まで、腫瘍増殖に有意な低下が見られた（ｐ＜０．００１）（図４０、図４１および図４２）。
【０５０１】
４．２．２．ヒトＢｘＰＣ３異種移植モデル（皮下および同所移植片）
皮下ＢｘＰＣ３移植後、ｃｈ１Ｄ９を０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．で週に２回投与したＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウスは、５０ｍｇ／ｋｇ群（ｐ＜０．００１）および５および０．５ｍｇ／ｋｇ群（ｐ＜０．０１）において３３日目から腫瘍増殖に統計学的に有意な、用量依存的低下を示した。５０ｍｇ／ｋｇ群では３６日目まで有意に低い腫瘍体積を維持した（ｐ＜０．００１）（図４３）。０．５〜５０ｍｇ／ｋｇのｈ１５Ｄ５による処置は、移植３３日後および３６日後に検出可能な５０ｍｇ／ｋｇ群に腫瘍増殖遅延をもたらした（ｐ＜０．０１）（図４４）。０．５〜５０ｍｇ／ｋｇのヒト化１Ｄ９  ＲＲ抗体で週に２回処置した後に、ＢｘＰＣ３腫瘍増殖に見られた低下の特徴を図４５に示す。
【０５０２】
キメラ１Ｄ９抗体およびヒト化１５Ｄ５抗体を、皮下移植よりも臨床転帰の予測性が高いと考えられるＢｘＰＣ３の外科的同所移植モデルで評価した。週に２回、ｉ．ｖ．経路にて５０ｍｇ／ｋｇのキメラ１Ｄ９抗体またはヒト化１５Ｄ５抗体で処置したところ、移植５週間後から７週間後にアイソタイプ対照に比べて有意な腫瘍増殖の遅延が生じた（ｐ＜０．０１）（図４６）。
【０５０３】
４．２．３．ヒトＮＣＩ−Ｎ８７胃異種移植モデル
ヒト化Ｈ１Ｄ９  ＲＲ抗体、ヒト化Ｈ１Ｄ９  ＲＲアクリタマブ（商標）抗体およびヒト化Ｈ１Ｄ９  ＲＲポテリジェント（商標）抗体の抗腫瘍活性をヒトＮＣＩ−Ｎ８７胃モデルで評価した。ＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウスに週に２回、５０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．を投与した。５０ｍｇ／ｋｇで投与したヒト化Ｈ１Ｄ９  ＲＲアクリタマブ（商標）抗体は腫瘍体積の低下をもたらし、移植４４日後に統計的有意性に達した（ｐ＜０．０５）（図４７）。
【０５０４】
５．考察
ヒト癌のマウスモデルは、新しい抗癌薬のin vivo活性を実証するために前臨床状況で鋭意用いられている。本試験では、ヒト臨床試験に適用可能なさらなる開発のための取り組みを確立し、リード候補の優先順位を決定するために、マウス同一遺伝子型肺病巣形成モデルおよび数種のヒト異種移植モデルでマウス抗ＨＥＲ３モノクローナルｍＡｂを評価した。
【０５０５】
マウス抗ＨＥＲ３  ｍＡｂは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肺においてマウスＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞病巣形成に有意な低下をもたらした。マウス１Ｄ９抗体の有効用量計画は５０／２５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．であったが、マウス１５Ｄ５抗体では２５／５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．計画の方が高用量レベルに比べて有効性が大きかった。両マウス抗ＨＥＲ３  ｍＡｂとも、続いて異種移植モデルでヒト腫瘍に対する活性を評価した。
【０５０６】
マウス抗ＨＥＲ３  ｍＡｂは、進行性ＨＥＲ３＋ヒト異種移植片において定着腫瘍の増殖を遅延させた。ＣＨＬ−１黒色腫細胞移植後に５ｍｇ／ｋｇを越える用量のマウス１Ｄ９抗体またはマウス１５Ｄ５抗体で週に２回処置すると、腫瘍増殖に有意かつ用量依存的な低下が生じた。皮下ＢｘＰＣ３膵臓異種移植モデルでも同様の活性が見られた。
【０５０７】
１Ｄ９抗体および１５Ｄ５抗体は、ＣＨＬ−１黒色腫異種移植モデルにおいて、５ｍｇ／ｋｇ以上で用量依存的抗腫瘍活性を保持した。さらに、５ｍｇ／ｋｇでのヒト化１Ｄ９  ＲＲ抗体またはヒト化１Ｄ９  ＲＲアクリタマブ（商標）抗体による処置は、２５ｍｇ／ｋｇ以上の用量に比べて、腫瘍増殖の遅延をもたらした。
【０５０８】
皮下および同所ＢｘＰＣ３異種移植モデルにおいて、５０ｍｇ／ｋｇのキメラ１Ｄ９抗体またはヒト化１５Ｄ５抗体は、試験の終了まで有意な腫瘍増殖阻害を引き起こしたが、２０ｍｇ／ｋｇのヒト化１Ｄ９  ＲＲ抗体は、皮下ＢｘＰＣ３モデルにおいて腫瘍増殖に有意な効果を示した。腫瘍増殖に対するこれらの抗体の有効性が実証された。
【０５０９】
最後に、ＮＣＩ−Ｎ８７胃モデルにおいてヒト化１Ｄ９  ＲＲ抗体、ヒト化１Ｄ９  ＲＲアクリタマブ（商標）抗体およびヒト化１Ｄ９  ＲＲポテリジェント（商標）抗体を評価したところ、ＣＨＬ−１黒色腫異種移植片に対する活性に比べてｍＡｂ活性が増強される場合があることが示された。
【０５１０】
６．結論
０．５〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲の濃度で週に２回投与されるマウス親および／またはヒト化ＨＥＲ３モノクローナル抗体による療法は、ＣＨＬ−１黒色腫モデルおよびＢｘＰＣ３膵臓ヒト異種移植モデルにおいて、定着したＨＥＲ３＋ヒト腫瘍の増殖を遅延させることができた。
【０５１１】
実施例９
１．概要
抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）アッセイならびに補体媒介細胞傷害性（ＣＤＣ）アッセイの双方を用いて、野生型抗ＨＥＲ３抗体ならびにこれらの抗体の増強型の機能性を評価した。
【０５１２】
本実施例は、前記抗体の野生型および増強型の機能性を評価するために用いたin-vitroアッセイを記載する。これらのアッセイでは、抗体の、その標的に結合し、その後、補体を付加する能力を評価するために種々のＨＥＲ３発現「標的」細胞を、または抗体の機能的Ｆｃ領域を評価するために「エフェクター」細胞を用いた。
【０５１３】
２．緒論
これらの実施例は、増強されていない「野生型」抗体よりも抗ＨＥＲ３の機能性／効力が増強された「増強型抗体」を示す。
【０５１４】
３．方法
３．１．実験の予備事項
３．２．実験プロトコール
３．２．１  抗体依存性細胞傷害性
精製されたヒト末梢血単核細胞を、これらのＡＤＣＣアッセイにおいてエフェクター細胞として特性決定した。簡単に述べると、ナトリウムヘパリンを用いて採取したヒト全血を、密度勾配分離遠沈管（ＵＮＩ−ＳＥＰＭＡＸ（商標）、Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を用いて精製した。その後、これらの精製末梢血単核細胞を洗浄し、フェノールレッド不含ＲＭＰＩ  １６４０＋１０％ＦＢＳに再懸濁させた（１×１０７細胞／ｍｌ  Ｔ：Ｅ比１：５０）。次に、ＨＥＲ３受容体陽性細胞（ＨＥＲ３  ＢＡＣＭＡＭ（商標）形質導入ＨＥＫ２９３  ＭＳＲＩＩまたはＣＨＬ−１細胞）にユウロピウムを添加して標的細胞として用いた。これらの形質導入細胞を高ＨＥＲ３発現細胞系統として用い、ＣＨＬ−１細胞を低発現細胞系統として用いた。添加済み標的細胞をフェノールレッド不含ＲＭＰＩ  １６４０＋１０％ＦＢＳに８×１０５細胞／ｍｌとなるように再懸濁させた。
【０５１５】
数種の抗ＨＥＲ３抗体（２５μｌ／ウェル）を９６ウェル丸底プレートに添加した。その後、この抗体含有プレートに、ユウロピウムを添加した標的細胞（２５μｌ／ウェル）を加え、３７℃、５％ＣＯ２にて３０分間インキュベートした。この３０分のインキュベーション後に、１００μｌ／ウェルのエフェクター細胞をプレートに加え、さらに２時間インキュベーターに戻した。特異的細胞溶解の測定は、実験プレートから２５μｌ／ウェルの上清を取り出し、１００μｌ／ウェルのＤＥＬＦＩＡ（商標）増強溶液が入った９６ウェルｍａｘｉｓｏｒｐプレートに移すことにより行った。室温で５分のインキュベーション後に、プレートをＷａｌｌａｃ  ＶＩＣＴＯＲ（商標）Ｖプレートリーダーにて時間分解蛍光を用いて読み取った。溶解した標的細胞から周囲の上清中へ放出されたユウロピウム（細胞細胞傷害性）を蛍光単位として測定した。値を特異的溶解％に変換し、ＧＲＡＰＨＰＡＤ（商標）ＰＲＩＳＭ（商標）ソフトウエアを用い、抗体濃度に対する溶解％としてプロットした。特異的細胞傷害性％を計算するために用いた式は下記の通りである。
【数１】
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対照ウェル：  洗剤ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ（商標）の１％溶液を「最大放出」ウェルに加えて細胞死とそれに続くユウロピウム放出を誘導した。「自発的」ユウロピウム放出のレベルを測定するために、いくつかの付加的対照ウェルに標的細胞を入れ、エフェクター細胞は含まなかった。
【０５１６】
形質導入：  適当なＢＡＣＭＡＭ（商標）ウイルス（ヒトＨＥＲ３、カニクイザルＨＥＲ３またはラットＨＥＲ３）をＨＥＫ２９３  ＭＳＲＩＩ細胞に多重感染度（ｍｏｉ）１００（２４時間に８〜１５％ウイルス（ｖ／ｖ）に相当）で加えた。その後、形質導入細胞を組織培養フラスコからＴｒｙｐＬＥを用いて取り出し、数回洗浄し、ユウロピウムを添加し、ＡＤＣＣアッセイにおいて標的細胞として用いた。
【０５１７】
サル血液：  密度勾配分離バッファー（フィコール(FICOLL)（商標））を、Ｃａ２およびＭｇ２不含ＰＢＳで１０％（ｖ／ｖ）希釈した後、サル末梢血リンパ球（エフェクター細胞）に対して密度勾配遠心分離を行った。
【０５１８】
ヒト血液はこれらの試験に対し、既定方針に従って用いた。サル血液は、既定プロトコールの下で得た。これらの試験に用いたモデルは、動物管理のＵＳスタンダードに準拠する。
【０５１９】
３．２．２  補体依存性細胞傷害性
これらの実験は、ｈＨＥＲ３  ＢＡＣＭＡＭ（商標）形質導入ＨＥＫ  ２９３  ＭＳＲ  ＩＩ細胞系統を標的として用いて行った。簡単に述べると、これらの細胞に、Ｔ１７５培養フラスコ中、３７℃、５％ＣＯ２にて約２１時間形質導入を行った（ｍｏｉ  １００）。その後、フラスコから接着細胞を、ＴｒｙｐＬＥを用いて取り出し、数回洗浄した後に、９６ウェルプレートに１×１０５細胞／５０μｌ／ウェルで播種した。すぐに２５μｌ／ウェルの抗ヒトＨＥＲ３  ｍＡｂを加え、３７℃、５％ＣＯ２にて３０分間インキュベートした。このインキュベーション後、カルビオケム（商標）製のウサギ補体２０μｌ／ウェル（最終２０％）を実験プレートに加え、３７℃、５％ＣＯ２にてさらに２時間インキュベートした。細胞生存率の評価は、マルチチャネルピペットを用いて穏やかに混合しながら各ウェルに１００μｌの細胞ＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（商標）を加えることによって行った。その後、このプレートの発光シグナルをＷａｌｌａｃ  ＶＩＣＴＯＲ（商標）Ｖプレートリーダーで読み取った（生細胞はシグナルの増強を示す）。
【０５２０】
３．３．  薬物および材料
ヒトＨＥＲ３  ＢＡＣＭＡＭ（商標）
サル（カニクイザル）ＨＥＲ３  ＢＡＣＭＡＭ（商標）
フィコール（商標）ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＃１７−１４４０−０２
ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標）Ｓｉｇｍａ  ＃Ｔ９２８４
分離チューブ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  ＆  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＃ＵＮ−１０
ユウロピウム  Ｆｌｕｋａ  ＃２０７１２８
９６ウェル丸底プレート  Ｃｏｓｔａｒ  ＃３７９９）
９６ウェル平底プレート  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＃４３６１１０
ヒト化１Ｄ９  Ｆｃ障害抗体
ヒト化１Ｄ９抗体
ヒト化１Ｄ９アクリタマブ（商標）抗体
ヒト化１Ｄ９  １Ｄ９ポテリジェント（商標）抗体
補体カルビオケム（商標）＃２３４４００
細胞ＴＩＴＥＲ  ＧＬＯ（商標）Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃Ｇ７５７１
ＤＥＬＦＩＡ（商標）増強溶液＃４００１−００１０
３．４．データ分析
ＧＲＡＰＨＰＡＤ（商標）ＰＲＩＳＭ（商標）ソフトウエアを用いて、抗体濃度に対して特異的溶解をプロットし、ＥＣ５０値を計算した。
【０５２１】
４．結果
４．１  ＡＤＣＣアッセイ
ヒト化１Ｄ９抗体（ＨＺ１Ｄ９またはＨ６Ｌ２と表記される場合もある）、ヒト化１Ｄ９  Ｆｃ障害抗体、ヒト化１Ｄ９ポテリジェント（商標）抗体およびヒト化１Ｄ９アクリタマブ（商標）抗体を評価したヒトＰＢＬ  ＡＤＣＣアッセイから得られた結果を図４８および図４９に示す。これらの結果は、標的細胞としてＨＥＲ３  ＢＡＣＭＡＭ（商標）形質導入ＨＥＫ２９３細胞およびエフェクター細胞としてヒト末梢血リンパ球を用いて得られたものである（図４８）。この設定実験を、同時に、標的細胞集団としてＣＨＬ−１細胞（同じヒトＰＢＬエフェクター細胞を用いる）を用いても行った（図４９）。これらの結果は明らかに、野生型（非増強）抗体に比べて増強抗体では効力の増大と最大溶解の増大の双方が得られたことを示した。
【０５２２】
ヒト化１Ｄ９抗体（ＨＺ１Ｄ９またはＨ６Ｌ２と表記される場合もある）、ヒト化１Ｄ９  Ｆｃ障害抗体、ヒト化１Ｄ９ポテリジェント（商標）抗体およびヒト化１Ｄ９アクリタマブ（商標）抗体を評価したカニクイザルＰＢＬ（末梢血リンパ球）ＡＤＣＣアッセイから得られた結果を図５０〜図５３に示す。これらの結果は、標的細胞としてＨＥＲ３  ＢＡＣＭＡＭ（商標）形質導入ＨＥＫ２９３細胞およびエフェクター細胞としてカニクイザル末梢血リンパ球を用いて得られたものである（図５０および図５１）。この設定実験を、同時に、標的細胞集団としてＣＨＬ−１細胞（同じカニクイザルＰＢＬエフェクター細胞を用いる）を用いても行った（図５２および図５３）。これらの結果は明らかに、野生型（非増強）抗体に比べて増強抗体では効力の増大と最大溶解の増大の双方が得られたことを示した。
【０５２３】
４．２  ＣＤＣアッセイ
図５４に示される結果は、ヒトＨＥＲ３形質導入ＨＥＫ２９３標的細胞およびウサギ補体を用いたＣＤＣアッセイから得られたものである。これらの結果は、ヒト化１Ｄ９抗体（ＨＺ１Ｄ９またはＨ６Ｌ２と表記される場合もある）、およびヒト化１Ｄ９ポテリジェント（商標）抗体がそれぞれ同レベルの補体媒介標的細胞溶解をもたらしたことを示した。一方、ヒト化１Ｄ９アクリタマブ（商標）抗体は、補体媒介溶解に、これらの他の抗体で見られるものを越える、少なくとも１０倍の向上を示した。ヒト化１Ｄ９  Ｆｃ障害抗体は、測定可能な補体媒介溶解を示さなかった。
【０５２４】
５．考察
本明細書に示される結果は、ヒト化１Ｄ９抗体の増強型（例えば、ヒト化１Ｄ９アクリタマブ（商標）抗体およびヒト化１Ｄ９ポテリジェント（商標）抗体）が抗体依存性細胞傷害性アッセイならびに補体依存性細胞傷害性アッセイの双方で機能の向上を示したことを証明した。これは、高（ＡＤＣＣおよびＣＤＣ）および低（ＡＤＣＣ）ヒトＨＥＲ３発現細胞系統ならびにカニクイザルＨＥＲ３発現細胞（ＡＤＣＣ）の双方で証明された。
【０５２５】
ヒトエフェクター細胞データは、ＡＤＣＣ／ＣＤＣ反応性を確保するために選択基準を用いなかったことから、ヒト集団において見られる得るものとして適切である。個々のヒトドナー間では違い（特異的溶解の高低）が見られるが、「Ｆｃ増強」抗体は、親野生型抗体よりも高い効力を一貫して示した。カニクイザルエフェクター細胞データにより、本発明者らは、毒性試験全般に用いられる実際のサルからのエフェクター細胞の特性決定を行うことができた。
【０５２６】
まとめると、ヒト化１Ｄ９アクリタマブ（商標）抗体およびヒト化１Ｄ９ポテリジェント（商標）抗体は双方とも、ＡＤＣＣおよびＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能の改善（それぞれ）を示した。
【０５２７】
実施例１０
１．概要
マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）は、ヒトＨＥＲ３受容体のドメインＩＩ細胞外領域に結合するマウス抗ＨＥＲ３抗体である。この抗体は、冷凍物およびホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）物双方の癌性ヒト組織と十分に結合することが免疫組織化学により示されている。
【０５２８】
２．緒論
ＨＥＲ３発現を評価するための比較診断薬として使用できるかどうか、マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）のバリデーションを行った。この比較診断薬は、抗ＨＥＲ３モノクローナル抗体療法から臨床上利益を受け得る患者を特定する助けとして使用することができる。この比較ｍＡｂを用いれば、腫瘍を、腫瘍組織のＨＥＲ３発現レベル、および／またはＨＥＲ３受容体発現の強度に基づいてカテゴリーに分類することができる。
【０５２９】
本実施例では、マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）の特異性のバリデーションの助けとして使用される重要な実験のいくつかの概要を述べる。本実施例の実験では、マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）抗体の、ＨＥＲ３および他のＨＥＲファミリーメンバー（例えば、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２およびＨＥＲ４）に対する免疫反応性および特異性を調べる。本実施例では、冷凍組織およびホルマリン固定パラフィ包埋組織に対する免疫組織化学；４つのＨＥＲファミリーメンバー（例えば、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４）の免疫細胞化学；免疫沈降；特異性を確認するための競合アッセイ；ならびに細胞溶解液および精製ＨＥＲ３細胞外ドメイン領域ウエスタンブロット法から得られた結果を記載する。
【０５３０】
３．方法
３．１．実験の予備事項
３．２．実験プロトコール
３．２．１．Ｈｅｒファミリーメンバーのウエスタンブロット
ＨＥＫ  ２９３  ＭＳＲＩＩ細胞にＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４  ＢＡＣＭＡＭ（商標）を、３７℃、５％ＣＯ２にて２２時間、多重感染度（ｍｏｉ）１００で形質導入した。各細胞系統をバーセン(versene)を用いて採取た後、トリパンプルー排除染色を用いて細胞計数を行った。これらの細胞懸濁液を１０ｍｌのＰＢＳで洗浄した後、３×１０７細胞を回収し、１ｍｌのＲＩＰＡ溶解溶液（ＲＩＰＡ溶解原液：１０ｍｌ  １×ＲＩＰＡ溶解バッファー＋ｍｉｎｉ  ｈａｌｔプロテアーゼ阻害剤１錠）中に入れた。その後、この調製物を２分間ボルテックスにかけ、遠心分離し、上清（細胞溶解液）を４℃で保存した。
【０５３１】
これらの細胞溶解液をＬＤＳサンプルバッファーおよび還元剤と合わせた後、１０分間７０℃に加熱した。室温まで冷却した後、これらの溶解液をＱＩＡＳＨＲＥＤＤＥＲ（商標）中に入れ、２分間１４，０００ｒｐｍで回転させた。次に、これらの溶解液を４〜１２％勾配Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルの各レーンにのせ、電気泳動によりタンパク質を分離した。分離されたタンパク質をニトロセルロースに転写した後、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するブロッキング溶液とともに一晩インキュベートした。ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４ファミリーメンバーのいずれかに対する一次抗体を室温で５時間添加した。その後、ＩＲコンジュゲート二次抗体とともに１時間インキュベートした。次に、これらのブロットを、ＬＩ−ＣＯＲ（商標）ＯＤＹＳＳＥＹ（商標）画像解析装置を用いて可視化した。
【０５３２】
３．２．２．マウス１５Ｄ５抗体を用いた免疫沈降
３×１０７細胞／ｍｌの懸濁液から上記のようにして調製した２００μｌの溶解液を１０μｇのマウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）と合わせ、回転装置上、４℃で一晩インキュベートした。次に、この抗原−抗体複合体を５０μｌの沈降不動Ａ／Ｇタンパク質樹脂（１００μｌ樹脂スラリー）と合わせ、回転装置上、室温で２時間、穏やかに混合しながらインキュベートした。免疫沈降物を、４℃で５分間、５，０００ｒｐｍ（〜１，０００ｘｇ）で遠心分離することにより回収した。その後、このペレットを１ｍｌ  ＲＩＰＡバッファーで４回洗浄した。洗浄したペレットを２０μｌの１×ＬＤＳローディングバッファー（１００μｌのＲＩＰＡバッファー、３３μｌのＬＤＳサンプルバッファー（４×）、１３．３μｌの還元剤（１０×））に再懸濁させ、サンプルを１００℃で５分間煮沸した。これらのサンプルを氷上で放冷した後、５，０００ｒｐｍ（〜１，０００ｘｇ）で１分間遠心分離した。次に、これらのサンプルをゲル（０．４μｇ／レーンのＨＥＲ３抗原、１０μｌ／レーンのＨＥＲファミリーＢＡＣＭＡＭ（商標）形質導入ＨＥＫ２９３  ＭＳＲＩＩ溶解液および２０μｌ／レーンのＣＨＬ−１細胞溶解液）にのせ、２００Ｖでおよそ５０分間泳動させた。ゲルで分離されたタンパク質をニトロセルロースに転写した後、得られたブロットを市販の抗ＨＥＲ３一次ｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＭＡＢ３４８２）、次いで、ＩＲコンジュゲートヤギ抗マウス二次抗体とともにインキュベートした。その後、これらのブロットを、ＬＩ−ＣＯＲ（商標）ＯＤＹＳＳＥＹ（商標）画像解析装置を用いて可視化した。
【０５３３】
３．２．３．Ｈｅｒファミリーメンバーの免疫細胞化学
ＨＥＫ２９３  ＭＳＲＩＩ細胞にＨｅｒ３  ＢＡＣＭＡＭ（商標）を、３７℃、５％ＣＯ２にて２４時間、１００ｍｏｉで形質導入した。次に、ＴｒｙｐＬＥを用いて細胞を採取し、細胞を計数し、ＰＢＳを用いて洗浄した。その後、ＰＢＳ中、０．５×１０６細胞／ｍｌの懸濁液を調製し、この懸濁液１００μｌを、顕微鏡スライドを取り付けたサイトスピン漏斗に加えた。これらを５００ｒｐｍで５分間回転させて、５０，０００細胞を含む細胞スポットを得た。スライドを生物実験用フード内で一晩乾燥させ、翌日、室温のアセトンで２分間固定した。２時間乾燥させた後、これらのスライドをサランラップで包み、免疫染色に用いるまで−２０℃で保存した。
【０５３４】
６枚のスライドを−２０℃の冷凍庫から取り出し、室温とし、風乾させた。乾燥したところで、各細胞スポットをＰａｐペンでマークして、染色のために疎水性のバリアを形成した。スライドをＴＢＳＴ（Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水＋０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０（商標））中に入れて１０分間水和させ、タンパク質ブロッキング溶液に３０分間入れた。１μｇ／ｍｌのマウス１５Ｄ５抗体（一次抗体として）をそのままスライドに室温で２時間適用した。スライドをＴＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰコンジュゲート抗マウス二次抗体をそのまま室温で２時間適用した。スライドをＴＢＳＴを用いて各５分間３回洗浄した後、ＤＡＢ基質を２分間加えた。その後、スライドを水で各５分間３回すすぎ、ヘマトキシリン中に２分間置いた。次に、スライドを水で各５分間３回洗浄し、スライドを十分乾燥させた後、観察のためにカバーガラスをかけた。
【０５３５】
３．２．４．ＨＥＲ３の細胞外ドメインＩＩ領域を用いた競合アッセイ
ＨＥＫ２９３  ＭＳＲＩＩ細胞にＨＥＲ３  ＢＡＣＭＡＭ（商標）を、３７℃、５％ＣＯ２にて２４時間、１００ｍｏｉで形質導入した。このインキュベーション時間の後、ＴｒｙｐＬＥを用いて細胞を採取し、細胞計数を行った後、ＰＢＳを用いて細胞を洗浄した。これらの細胞をＰＢＳに０．５×１０６細胞／ｍｌとなるように再懸濁させ、１００μｌを、顕微鏡スライドを取り付けたサイトスピン漏斗に加えた。これらを５００ｒｐｍで５分間回転させて、５０，０００細胞を含む細胞スポットを得た。スライドを生物実験用フード内で一晩乾燥させ、翌日、室温のアセトンで２分間固定した。２時間乾燥させた後、これらのスライドをサラン（商標）ラップで包み、免疫染色に用いるまで−２０℃で保存した。
【０５３６】
次に、２枚のスライドを冷凍庫から取り出し、室温まで温め、風乾させた。乾燥したところで、各細胞スポットをＰａｐペンを用いて丸で囲み、染色のために疎水性のバリアを形成した。スライドをＴＢＳＴ（Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水＋０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０（商標））中に入れて１０分間水和させ、タンパク質ブロッキング溶液に３０分間入れた。１μｇ／ｍｌの一次抗体、または１：１モル比の一次抗体とヒトＨＥＲ３ドメインＩＩをそのままスライドに室温で２時間適用した。スライドをＴＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰコンジュゲート抗マウス二次抗体をそのまま室温で１時間適用した。スライドをＴＢＳＴを用いて各５分間３回洗浄した後、ＤＡＢ基質を５分間加えた。その後、スライドを水で各５分間３回洗浄し、スライドを十分乾燥させた後、観察のためにカバーガラスをかけた。
【０５３７】
３．２．５．ＨＥＲ３細胞外ドメインのウエスタンブロット
ＨＥＲ３の４つの細胞外ドメインを、還元剤を含むＬＤＳ（ドデシル硫酸リチウム）サンプルバッファーと合わせ、１０分間７０℃に加熱した。室温まで冷却した後、溶解液を４〜１２％勾配Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルの各レーンにのせ、電気泳動によりタンパク質を分離した。分離されたタンパク質をニトロセルロースに転写することによりブロッティングしてブロットを形成し、このブロットを０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するブロッキング溶液とともに一晩インキュベートした。次に、このブロットを希釈したマウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）とともに室温で２時間インキュベートした。次に、このブロットをＩＲコンジュゲート二次抗体とともに１時間インキュベートした。その後、ＬＩ−ＣＯＲ（商標）ＯＤＹＳＳＥＹ（商標）画像解析装置を用いてブロットを可視化した。
【０５３８】
３．２．６．冷凍組織およびＦＦＰＥ組織の免疫組織化学
ヒト乳癌組織（１６９４３ａ１ｄ、１６９４５ａ１ｏ、２２６８７ａ１ｐ、２３１１０ａ１ｋ）を、同じ摘出腫瘍からの冷凍サンプルおよびホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルの双方として保存した。
【０５３９】
ＨＥＲ３受容体発現の免疫組織化学的（ＩＨＣ）評価のために、保存したヒト乳癌組織の切片を作製した。簡単に述べると、ＦＦＰＥ組織を６μｍの切片とし、ＶＡＲＩＳＴＡＩＮ（商標）Ｇｅｍｉｎｉ  ＥＳ自動スライド染色装置を用い、十分なキシレン置換シリーズとアルコール段階を行うことにより、脱パラフィンと再水和を行った。種々の条件を比較するため、ＤＥＣＬＯＡＫＩＮＧ  ＣＨＡＭＢＥＲ（商標）を用いていくつかの抗原賦活（エピトープ賦活）法を適用した。Ｔｒｉｓ−０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０（商標）バッファーを用いた洗浄工程の後、組織をペルオキシダーゼブロックとともに５分間インキュベートし、その後、タンパク質ブロック溶液でブロッキングした。これらの組織切片に一次抗体を３０〜６０分間適用した。洗浄する工程の後、二次抗体を３０〜６０分間適用した。さらなる洗浄工程の後、ＤＡＢ（ジアミノベンジジン）とともに５分間インキュベートした後に特異的免疫反応性を可視化した。その後、組織切片を水ですすぎ、１分間ヘマトキシリンで対比染色を行った。モノクローナル抗体染色は、Ｄａｋｏ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて行った。
【０５４０】
冷凍組織を顕微鏡スライド上で６ミクロンの切片とし、室温で２時間乾燥させた。その後、スライド上の切片組織を室温で２分間、アセトンで固定し、乾燥させた。Ｔｒｉｓ−０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０（商標）バッファーで洗浄した後、それらの組織をペルオキシダーゼブロックとともに５分間インキュベートし、タンパク質ブロック溶液を受容させた。ＦＦＰＥ組織に関して上記で概略を示したように染色を続けた。
【０５４１】
３．２．７．Ｍｕｌｔｉ−Ｔｕｍｏｒ  ＴＭＡの免疫組織化学的評価
標準的な手動または自動染色プロトコールを用いてスライドを染色した。腫瘍を切片化し、脱パラフィンを行った。切片を内因性のペルオキシダーゼおよび非特異的抗体結合ブロッキング溶液とともにインキュベートし、エピトープ賦活を行った後、一次抗体とともにインキュベートした。インキュベーションとインキュベーションの間には洗浄工程を行った。非特異的結合に対する標準的なブロッキング工程を行った。標準的な抗原賦活技術を行った。手動染色では、ＡＢＣ（商標）ＨＲＰキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を併用する二次ビオチン化抗体か、またはＥＮＶＩＳＩＯＮ（商標）ＨＲＰコンジュゲートポリマーキット（Ｄａｋｏ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．）および製造者の説明書に一致するジアミノベンジジン基質反応産物のいずれかを用いて結合を可視化した。自動染色可視化では、ＯＭＮＩＭＡＰ（商標）ＨＲＰポリマー化学（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いて可視化を行った。適当であれば、標準的なヘマトキシリンまたはメチルグリーン核対比染色技術を用いて切片を対比染色した。
【０５４２】
３．３．薬物および材料
ＨＥＲ１  ＢＡＣＭＡＭ（商標）ｖｉｒｏｎｓ
ヒトＨＥＲ２  ＢＡＣＭＡＭ（商標）ｖｉｒｏｎｓ
ヒトＨＥＲ３  ＢＡＣＭＡＭ（商標）ｖｉｒｏｎｓ
ヒトＨＥＲ４  ＢＡＣＭＡＭ（商標）ｖｉｒｏｎｓ
ＬＤＳサンプルバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＮＰ０００７）
ＱＩＡＳＨＲＥＤＤＥＲ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ  ７９６５６）
ＭＩＮＩ−ＨＡＬＴ（商標）プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  １３５３５４００）
ウエスタンブロックバッファー（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  ＭＢ−０７０）
ニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＬＣ２０００）
ウサギ抗ヒトＥｒｂＢ２（ヒトＨＥＲ２）（Ｄａｋｏ  Ａ０４８５）
マウス抗ヒトＥＧＦＲ（ヒトＨＥＲ１）Ｄａｋｏ  Ｍ３５６３クローンＨ１１
ヤギ抗マウスＩＲ−ＤＹＥ８００（商標）抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  ６１０−１３１−１２１）
ヤギ抗ウサギＩＲ−ＤＹＥ６８０（商標）抗体（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  ８２７−８８３６７）
抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＭＡＢ３４８２）
Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（Ｄａｋｏ  ＃Ｓ１９６８）
ＥＮＶＩＳＩＯＮ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ  ＤＡＢキット（Ｄａｋｏ  ＃Ｋ４００７）
マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）（３．１９ｍｇ／ｍｌ）
ヒトＨＥＲ３ドメインＩＩ（競合に使用）（１．６６ｍｇ／ｍｌ）
タンパク質ブロック溶液（Ｄａｋｏ  Ｘ０９０９  ロット１００３７７９７）
ＴＨＥＲＭＯ  ＳＨＡＮＤＯＮ  ＥＺ  ＤＯＵＢＬＥ  ＣＹＴＯＦＵＮＮＥＬ（商標）（＃Ａ７８７１０００５）
ＶＷＲ  ＳＵＰＥＲＦＲＯＳＴ  ＰＬＵＳ（商標）＃４８３１１−７０３
ＴＲＹＰＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ（Ｇｉｂｃｏ  １２５６３−０１１）
ＲＩＰＡバッファー（Ｓｉｇｍａ  Ｒ０２７８）
Ｍｕｌｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｃｒｏ  Ａｒｒａｙ（ＴＭＡ）Ｈｕ８０３５７（ＣＡＭＢ１２−ＧＳＫ−ＴＭＡ  −Ｏｒｉｇｅｎｅ）
４．結果
４．１．１．
４つのＨＥＲファミリーメンバーを発現した細胞溶解液のウエスタンブロット法によれば、マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）がヒトＨＥＲ３を選択的に認識し、ヒトＨＥＲ１、ヒトＨＥＲ２およびヒトＨＥＲ４に対する交差反応性はほとんどないか、全くないことが示された。ＨＥＲ２およびＨＥＲ１の発現を確認し、また比較するために、ＨＥＲ２に対する市販の抗体（Ｄａｋｏ）およびＨＥＲ１に対する市販の抗体（Ｄａｋｏ）をこれらの溶解液で試験した。これらの結果によれば、ヒトＨＥＲ２およびヒトＨＥＲ１はＨＥＫ２９３細胞で行われた形質導入によって発現されたことが確認された。これらの結果はまた、抗ＨＥＲ２抗体（Ｄａｋｏ）とある程度の交差反応性を示した。
【０５４３】
４．１．２．
ヒトＨＥＲ３を形質導入したＨＥＫ２９３細胞およびＣＨＬ−１細胞を用いた免疫沈降実験では、高および低ＨＥＲ３発現細胞系統を検討する機会が得られた。これらの実験では、免疫沈降物中のヒトＨＥＲ３の検出のためにマウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）または市販の抗ＨＥＲ３抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた場合に、免疫反応性の類似のバンドパターンが示された。
【０５４４】
４．１．３．
マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）を用いたヒトＨＥＲ１、ヒトＨＥＲ２、ヒトＨＥＲ３およびヒトＨＥＲ４  ＢＡＣＭＡＭ（商標）形質導入細胞の免疫組織化学分析では、ヒトＨＥＲ３に対する強い免疫反応性が示され、他のＨＥＲファミリーメンバーとの免疫反応性はほとんどないか、全くなかった。マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）はヒトＨＥＲ３と優先的に結合する。
【０５４５】
４．１．４．
マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）またはマウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）を当モル濃度のヒトＨＥＲ３ドメインＩＩ  ＥＣＤと組み合わせて用いた場合の競合アッセイでは、マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）の免疫反応性が、ヒトＨＥＲ３のドメインＩＩとともにプレインキュベーションを行うことにより完全に遮断されたことを示した。これらの結果により、マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）がヒトＨＥＲ３受容体の細胞外ドメインＩＩ領域に特異的に結合することが確認される。
【０５４６】
４．１．５．
ＨＥＲ３細胞外ドメインのウエスタンブロット分析では、マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）の、ヒトＨＥＲ３のドメインＩＩに対する特異性、およびこの抗体にはヒトＨＥＲ３のドメインＩ、ＩＩＩおよびＩＶとの免疫反応性がないことが示された。
【０５４７】
４．１．６．
冷凍物およびＦＦＰＥ物の対応する癌性乳房組織（ｎ＝４）の免疫組織化学染色は、一致する染色パターンを示した。ＦＦＰＥ組織の構造的保全性は冷凍サンプルよりも保存状態が良いが、膜染色のパターンはこれら２種類の保存法で同様であった。図６は、これらの冷凍および固定乳房組織に見られる膜染色の１枚の代表的な写真を示す。
【０５４８】
４．１．７．
腫瘍および代表的な正常組織を含むマルチ腫瘍アレイ（Ｈｕ８０３５７）で、マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）を用いてＨＥＲ３の発現を評価した。示されている結腸、前立腺、乳房、子宮内膜、脳および皮膚腫瘍核の質的評価は総てヒトＨＥＲ３の発現を示した。腎臓腫瘍１サンプルおよび肺癌１サンプルもヒトＨＥＲ３の発現を示した。ヒトＨＥＲ３の最も強い発現は黒色腫および前立腺腫瘍サンプルで見られた。黒色腫７サンプルおよび前立腺腫瘍７サンプルは、強いヒトＨＥＲ３の発現を示した。乳癌８サンプルもヒトＨＥＲ３の発現を示した。正常組織サンプルは、腫瘍サンプルよりも著しく低いシグナルを示したが、正常結腸３サンプルおよび正常乳房１サンプルはある程度のシグナルを示した。
【０５４９】
５．考察および要約
本報告に記載されている実験は、マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）の感受性および特異性を実証する。本明細書に記載されるように、マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）は、まず、ハイブリドーマパネルから、予備ＥＬＩＳＡスクリーニングに基づき、ＨＥＲ３の細胞外領域に対するその特異性に関して選択された。ＨＥＲ３のさらなる特異性の決定は、ウエスタンブロット法およびＢＡＣＭＡＭ（商標）形質導入細胞を用いた免疫細胞化学によって行った。これらの実験では、ヒトＨＥＲ３形質導入細胞は特異的免疫反応性を示したが、他のヒトＨＥＲファミリーメンバーを発現する細胞は反応性がほとんどないことを示した。マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）を市販の抗体と組み合わせて免疫沈降アッセイでも用いたところ、ＨＥＲ３の特異的「プルダウン(pull-down)」を示した。さらに、ヒトＨＥＲ３形質導入細胞のサイトスピン標本ならびにこれらの細胞冷凍標本に対して免疫細胞化学分析を行ったところ、マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）がどのアッセイでもＨＥＲ３を認識し、免疫組織化学アッセイにおいてＨＥＲ３に結合できることが確認された。このマウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）のヒトＨＥＲ３受容体への結合は、この抗体をヒトＨＥＲ３の細胞外ドメインＩＩ領域とともにプレインキュベートすることによって遮断することができたが、これにより、ＨＥＲ３のこの領域に対するその特異性が確認される。
【０５５０】
ホルマリン固定されかつパラフィン処理された、同様のバキュロウイルス形質導入細胞に対するマウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）についても、さらなる免疫組織化学的プロトコールを開発したところ、細胞の調製法にかかわらず、マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）の、ＩＨＣによるＨＥＲ３検出能が示された。本実施例に記載される実験で、乳腺癌の冷凍サンプルとＦＦＰＥサンプルの対応する対でヒトＨＥＲ３の免疫反応性を実証することにより、マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）の挙動の、このクロスプラットフォーム的一貫性が確認される。マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）により検出されるヒトＨＥＲ３シグナルの存在量および相対的発現は、両検体調製法で同じであった。種々腫瘍タイプのパネルに対してマウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）を用いる免疫組織化学的標的バリデーション試験は発現の違いを示したが、特定の腫瘍タイプ（例えば、黒色腫、前立腺癌、乳癌）内では、ＨＥＲ３のパターンおよび相対的存在量に一貫性が見られた。さらに、マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）は、種々のプロトコールおよび染色系においてＨＥＲ３の検出に成功を収めた。これらの所見は、マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）が、プロトコールおよび検体の保存法に関わらず、腫瘍切片における免疫組織化学によりヒトＨＥＲ３を一貫して正確に検出できることを示している。
【０５５１】
マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）はまた、種々のアッセイにおいてＨＥＲ３の細胞外ドメインを特異的に検出する。本実施例ではまた、マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）がこれらのアッセイにおいて変形形態であっても一貫して機能することも記載した。特に、マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）は、組織切片において免疫組織化学によりヒトＨＥＲ３を検出するのに高い程度の特異性および感受性を示した。さらに、マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）は、同じサンプルにおいて異なるアッセイを用いて同レベルのヒトＨＥＲ３を検出することができた（マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）シグナルとヒトＨＥＲ３の存在量の間に正比例を示す）。本実施例に記載された結果を考え合わせると、マウス１５Ｄ５抗体（Ｍ５．１５Ｄ５．２Ａ１．１Ｈ１０）の性能、特異性および一貫性が実証され、ヒトＨＥＲ３診断アッセイ（例えば、ＩＨＣアッセイ）における抗体試薬としてのその適性が裏付けられる。
【０５５２】
実施例１１
非公式配列表
以下の下線は、抗体の可変重鎖および可変軽鎖部分のＣＤＲ配列、またはこれらのＣＤＲ配列をコードする核酸配列を示す。例えば、配列番号１では、フレームワークおよびＣＤＲは、示されている配列の近位アミノ末端部分から遠位カルボキシ末端部分の順に、プレーンテキストのフレームワーク１、下線のＣＤＲ１、プレーンテキストのフレームワーク２、下線のＣＤＲ２、プレーンテキストのフレームワーク３、下線のＣＤＲ３およびプレーンテキストのフレームワーク４として表される。以下の斜体はシグナル配列を示す。１文字アミノ酸コードの記号の右側のアスタリスクは、左側のアミノ酸残基が可能性のあるＮ−グリコシル化部位であることを示す。この図式は例えば配列番号５、９、１３、１７、２２、２６、３０、３４、３８〜４３、４４、４８、５７などに用いられている。本明細書に開示される種々の抗体に関する詳細を示す表も提供する。下記表１７参照。
Ｍ５＿１５Ｄ５＿２Ａ１＿１Ｈ１０＿ＶＨ
配列番号１
【化９】
2013544492.tif 000027
Ｍ５＿１５Ｄ５＿２Ａ１＿１Ｈ１０＿  ＣＤＲＨ１
配列番号２
【化１０】
2013544492.tif 000028
Ｍ５＿１５Ｄ５＿２Ａ１＿１Ｈ１０＿  ＣＤＲＨ２
配列番号３
【化１１】
2013544492.tif 000029
Ｍ５＿１５Ｄ５＿２Ａ１＿１Ｈ１０＿  ＣＤＲＨ３
配列番号４
【化１２】
2013544492.tif 000030
Ｍ５＿１５Ｄ５＿２Ａ１＿１Ｈ１０＿ＶＬ
配列番号５
【化１３】
2013544492.tif 000031
Ｍ５＿１５Ｄ５＿２Ａ１＿１Ｈ１０＿ＣＤＲＬ１
配列番号６
【化１４】
2013544492.tif 000032
Ｍ５＿１５Ｄ５＿２Ａ１＿１Ｈ１０＿ＣＤＲＬ２
配列番号７
【化１５】
2013544492.tif 000033
Ｍ５＿１５Ｄ５＿２Ａ１＿１Ｈ１０＿ＣＤＲＬ３
配列番号８
【化１６】
2013544492.tif 000034
Ｍ５＿２２Ａ５＿１Ｇ６＿１Ｃ１０＿ＶＨ    
配列番号９
【化１７】
2013544492.tif 000035
Ｍ５＿２２Ａ５＿１Ｇ６＿１Ｃ１０＿ＣＤＲＨ１
配列番号１０
【化１８】
2013544492.tif 000036
Ｍ５＿２２Ａ５＿１Ｇ６＿１Ｃ１０＿ＣＤＲＨ２
配列番号１１
【化１９】
2013544492.tif 000037
Ｍ５＿２２Ａ５＿１Ｇ６＿１Ｃ１０＿ＣＤＲＨ３
配列番号１２
【化２０】
2013544492.tif 000038
Ｍ５＿２２Ａ５＿１Ｇ６＿１Ｃ１０＿ＶＬ＿ＬＣ１
配列番号１３
【化２１】
2013544492.tif 000039
Ｍ５＿２２Ａ５＿１Ｇ６＿１Ｃ１０＿ＣＤＲＬ１＿ＬＣ１
配列番号１４
【化２２】
2013544492.tif 000040
Ｍ５＿２２Ａ５＿１Ｇ６＿１Ｃ１０＿ＣＤＲＬ２＿ＬＣ１
配列番号１５
【化２３】
2013544492.tif 000041
Ｍ５＿２２Ａ５＿１Ｇ６＿１Ｃ１０＿ＣＤＲＬ３＿ＬＣ１  
配列番号１６
【化２４】
2013544492.tif 000042
＞Ｍ５＿２２Ａ５＿１Ｇ６＿１Ｃ１０＿ＶＬ＿ＬＣ２
配列番号１７
【化２５】
2013544492.tif 000043
Ｍ５＿２２Ａ５＿１Ｇ６＿１Ｃ１０＿ＣＤＲＬ１＿ＬＣ２
配列番号１８
【化２６】
2013544492.tif 000044
Ｍ５＿２２Ａ５＿１Ｇ６＿１Ｃ１０＿ＣＤＲＬ２＿ＬＣ２
配列番号１９
【化２７】
2013544492.tif 000045
Ｍ５＿２２Ａ５＿１Ｇ６＿１Ｃ１０＿ＣＤＲＬ３＿ＬＣ２
配列番号２０
【化２８】
2013544492.tif 000046
ヒトＨＥＲ３アミノ酸配列
配列番号２１
【化２９】
2013544492.tif 000047
ヒト化＿１５Ｄ５＿ＶＨアミノ酸配列
ヒト化１５Ｄ５  Ｈ４
配列番号２２
【化３０】
2013544492.tif 000048
ヒト化＿１５Ｄ５＿ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号２３
【化３１】
2013544492.tif 000049
ヒト化＿１５Ｄ５＿ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号２４
【化３２】
2013544492.tif 000050
ヒト化＿１５Ｄ５＿ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号２５
【化３３】
2013544492.tif 000051
ヒト化＿１５Ｄ５＿ＶＬアミノ酸配列
ヒト化１５Ｄ５  Ｌ１
配列番号２６
【化３４】
2013544492.tif 000052
ヒト化＿１５Ｄ５＿ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号２７
【化３５】
2013544492.tif 000053
ヒト化＿１５Ｄ５＿ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号２８
【化３６】
2013544492.tif 000054
ヒト化＿１５Ｄ５＿ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号２９
【化３７】
2013544492.tif 000055
ヒト化＿１Ｄ９＿ＶＨアミノ酸配列
配列番号３０
ヒト化１Ｄ９  Ｈ６
【化３８】
2013544492.tif 000056
ヒト化＿１Ｄ９＿ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号３１
【化３９】
2013544492.tif 000057
ヒト化＿１Ｄ９＿ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号３２
【化４０】
2013544492.tif 000058
ヒト化＿１Ｄ９＿ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号３３
【化４１】
2013544492.tif 000059
ヒト化＿１Ｄ９＿ＶＬアミノ酸配列
配列番号３４
ヒト化１Ｄ９  Ｌ２
【化４２】
2013544492.tif 000060
ヒト化＿１Ｄ９＿ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号３５
【化４３】
2013544492.tif 000061
ヒト化＿１Ｄ９＿ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号３６
【化４４】
2013544492.tif 000062
ヒト化＿１Ｄ９＿ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号３７
【化４５】
2013544492.tif 000063
マウス１５Ｄ５＿ＶＨ核酸配列
配列番号３８
【化４６】
2013544492.tif 000064
マウス１５Ｄ５＿ＶＬ核酸配列
配列番号３９
【化４７】
2013544492.tif 000065
ヒト化＿１５Ｄ５＿ＶＨ核酸配列（細胞）
ヒト化１５Ｄ５  Ｈ４
配列番号４０
【化４８】
2013544492.tif 000066
ヒト化＿１５Ｄ５＿ＶＬ核酸配列（細胞）
ヒト化１５Ｄ５  Ｌ１
配列番号４１
【化４９】
2013544492.tif 000067
ヒト化＿１Ｄ９＿ＶＨ核酸配列（細胞）
ヒト化１Ｄ９  Ｈ６
配列番号４２
【化５０】
2013544492.tif 000068
ヒト化＿１Ｄ９＿ＶＬ核酸配列（細胞）
ヒト化１Ｄ９  Ｌ２
配列番号４３
【化５１】
2013544492.tif 000069
マウス＿１Ｄ９＿ＶＨアミノ酸配列
配列番号４４
Ｍ５．１Ｄ９．１Ｆ５  ＶＨ
【化５２】
2013544492.tif 000070
マウス＿１Ｄ９＿ＣＤＲＨ１アミノ酸配列
配列番号４５
【化５３】
2013544492.tif 000071
マウス＿１Ｄ９＿ＣＤＲＨ２アミノ酸配列
配列番号４６
【化５４】
2013544492.tif 000072
マウス＿１Ｄ９＿ＣＤＲＨ３アミノ酸配列
配列番号４７
【化５５】
2013544492.tif 000073
マウス＿１Ｄ９＿ＶＬアミノ酸配列
配列番号４８
Ｍ５．１Ｄ９．１Ｆ５  ＶＬ
【化５６】
2013544492.tif 000074
マウス＿１Ｄ９＿ＣＤＲＬ１アミノ酸配列
配列番号４９
【化５７】
2013544492.tif 000075
マウス＿１Ｄ９＿ＣＤＲＬ２アミノ酸配列
配列番号５０
【化５８】
2013544492.tif 000076
マウス＿１Ｄ９＿ＣＤＲＬ３アミノ酸配列
配列番号５１
【化５９】
2013544492.tif 000077
マウス＿１Ｄ９＿ＶＨ核酸配列
配列番号５２
【化６０】
2013544492.tif 000078
マウス＿１Ｄ９＿ＶＬ核酸配列
配列番号５３
【化６１】
2013544492.tif 000079
マウス＿２２Ａ５＿ＶＨ核酸配列
配列番号５４
【化６２】
2013544492.tif 000080
マウス＿２２Ａ５＿ＶＬ核酸配列
配列番号５５
【化６３】
2013544492.tif 000081
マウス＿２２Ａ５＿ＶＬ核酸配列
配列番号５６
【化６４】
2013544492.tif 000082
ヒト化＿１Ｄ９＿Ｅ＿ＶＬアミノ酸配列
配列番号５７
ヒト化１Ｄ９  Ｅ  Ｌ２
【化６５】
2013544492.tif 000083
ヒト化＿１Ｄ９＿Ｅ＿ＶＬ核酸配列（細胞）
配列番号５８
【化６６】
2013544492.tif 000084
マウス１５Ｄ５＿ＶＨ核酸配列（細胞）
配列番号５９
【化６７】
2013544492.tif 000085
マウス１５Ｄ５＿ＶＬ核酸配列（細胞）
配列番号６０
【化６８】
2013544492.tif 000086
マウス＿１Ｄ９＿ＶＨ核酸配列（細胞）
配列番号６１
【化６９】
2013544492.tif 000087
マウス＿１Ｄ９＿ＶＬ核酸配列（細胞）
配列番号６２
【化７０】
2013544492.tif 000088
マウス＿２２Ａ５＿ＶＨ核酸配列（細胞）
配列番号６３
【化７１】
2013544492.tif 000089
マウス＿２２Ａ５＿ＶＬ核酸配列（細胞）
配列番号６４
【化７２】
2013544492.tif 000090
マウス＿２２Ａ５＿ＶＬ核酸配列（細胞）
配列番号６５
【化７３】
2013544492.tif 000091
ヒトＨＥＲ３細胞外ドメインｗ／ｏシグナル配列（結晶構造に相当）
配列番号６６
【化７４】
2013544492.tif 000092
ヒト化１Ｄ９  Ｈ０  ＶＨアミノ酸配列
配列番号６７
【化７５】
2013544492.tif 000093
ヒト化１Ｄ９  Ｈ０  ＶＨ核酸配列
配列番号６８
【化７６】
2013544492.tif 000094
ヒト化１Ｄ９  Ｈ１  ＶＨアミノ酸配列
配列番号６９
【化７７】
2013544492.tif 000095
ヒト化１Ｄ９  Ｈ１  ＶＨ核酸配列
配列番号７０
【化７８】
2013544492.tif 000096
ヒト化１Ｄ９  Ｈ２  ＶＨアミノ酸配列
配列番号７１
【化７９】
2013544492.tif 000097
ヒト化１Ｄ９  Ｈ２  ＶＨ核酸配列
配列番号７２
【化８０】
2013544492.tif 000098
ヒト化１Ｄ９  Ｈ３  ＶＨアミノ酸配列
配列番号７３
【化８１】
2013544492.tif 000099
ヒト化１Ｄ９  Ｈ３  ＶＨ核酸配列
配列番号７４
【化８２】
2013544492.tif 000100
ヒト化１Ｄ９  Ｌ０  ＶＬアミノ酸配列
配列番号７５
【化８３】
2013544492.tif 000101
ヒト化１Ｄ９  Ｌ０  ＶＬ核酸配列
配列番号７６
【化８４】
2013544492.tif 000102
ヒト化１Ｄ９  Ｌ３  ＶＬアミノ酸配列
配列番号７７
【化８５】
2013544492.tif 000103
ヒト化１Ｄ９  Ｌ３  ＶＬ核酸配列
配列番号７８
【化８６】
2013544492.tif 000104
ヒト化１Ｄ９  Ｌ４  ＶＬアミノ酸配列
配列番号７９
【化８７】
2013544492.tif 000105
ヒト化１Ｄ９  Ｌ４  ＶＬ核酸配列
配列番号８０
【化８８】
2013544492.tif 000106
ヒト化１Ｄ９  Ｌ５  ＶＬアミノ酸配列
配列番号８１
【化８９】
2013544492.tif 000107
ヒト化１Ｄ９  Ｌ５  ＶＬ核酸配列
配列番号８２
【化９０】
2013544492.tif 000108
ヒト化１Ｄ９  Ｌ６  ＶＬアミノ酸配列
配列番号８３
【化９１】
2013544492.tif 000109
ヒト化１Ｄ９  Ｌ６  ＶＬ核酸配列
配列番号８４
【化９２】
2013544492.tif 000110
ヒト化１Ｄ９  Ｌ７  ＶＬアミノ酸配列
配列番号８５
【化９３】
2013544492.tif 000111
ヒト化１Ｄ９  Ｌ７  ＶＬ核酸配列
配列番号８６
【化９４】
2013544492.tif 000112
ヒト化１Ｄ９  Ｌ９  ＶＬアミノ酸配列
配列番号８７
【化９５】
2013544492.tif 000113
ヒト化１Ｄ９  Ｌ９  ＶＬ核酸配列
配列番号８９
【化９６】
2013544492.tif 000114
ヒト化１５Ｄ５  Ｈ１  ＶＨアミノ酸配列
配列番号９０
【化９７】
2013544492.tif 000115
ヒト化１５Ｄ５  Ｈ１  ＶＨ核酸配列
配列番号９１
【化９８】
2013544492.tif 000116
ヒト化１５Ｄ５  Ｈ２  ＶＨアミノ酸配列
配列番号９２
【化９９】
2013544492.tif 000117
ヒト化１５Ｄ５  Ｈ２  ＶＨ核酸配列
配列番号９３
【化１００】
2013544492.tif 000118
ヒト化１５Ｄ５  Ｈ３  ＶＨアミノ酸配列
配列番号９４
【化１０１】
2013544492.tif 000119
ヒト化１５Ｄ５  Ｈ３  ＶＨ核酸配列
配列番号９５
【化１０２】
2013544492.tif 000120
ヒト化１５Ｄ５  Ｌ２  ＶＬアミノ酸配列
配列番号９６
【化１０３】
2013544492.tif 000121
ヒト化１５Ｄ５  Ｌ２  ＶＬ核酸配列
配列番号９７
【化１０４】
2013544492.tif 000122
ヒト化１５Ｄ５  Ｌ３  ＶＬアミノ酸配列
配列番号９８
【化１０５】
2013544492.tif 000123
ヒト化１５Ｄ５  Ｌ３  ＶＬ核酸配列
配列番号９９
【化１０６】
2013544492.tif 000124
【０５５３】
ヒト化１Ｄ９  Ｈ６全長重鎖アミノ酸配列（ＦＵＴ８遺伝子の機能的コピーを有する非ポテリジェント（商標）系細胞においてヒト化１Ｄ９  Ｈ６Ｌ２抗体を発現させるために使用、またＦＵＴ８遺伝子の機能的コピーを欠くポテリジェント（商標）系ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞においてヒト化１Ｄ９  Ｈ６Ｌ２ポテリジェント（商標）抗体を発現させるために使用）
配列番号１００
【化１０７】
2013544492.tif 000125
【０５５４】
ヒト化１Ｄ９  Ｈ６全長重鎖核酸配列（ＦＵＴ８遺伝子の機能的コピーを有する非ポテリジェント（商標）系においてヒト化１Ｄ９  Ｈ６Ｌ２抗体を発現させるために使用、またＦＵＴ８遺伝子の機能的コピーを欠くポテリジェント（商標）系ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞においてヒト化１Ｄ９  Ｈ６Ｌ２ポテリジェント（商標）抗体を発現させるために使用）。MGWSCIILFLVATATGVHSシグナル配列をコードする部分は削除可能である。
配列番号１０１
【化１０８】
2013544492.tif 000126
【０５５５】
ヒト化１Ｄ９  Ｈ６コンプリジェント（商標）（ＦＵＴ８遺伝子の機能的コピーを有する非ポテリジェント（商標）系においてヒト化１Ｄ９  Ｈ６Ｌ２コンプリジェント（商標）抗体を発現させるために使用）またはアクリタマブ（商標）（ＦＵＴ８遺伝子の機能的コピーを欠くポテリジェント（商標）系ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞において発現させる場合に、ヒト化１Ｄ９  Ｈ６Ｌ２アクリタマブ（商標）抗体を発現させるために使用）ＩｇＧ１／ＩｇＧ３アイソタイプキメラ全長重鎖アミノ酸配列
配列番号１０２
【化１０９】
2013544492.tif 000127
【０５５６】
ヒト化１Ｄ９  Ｈ６コンプリジェント（商標）（ＦＵＴ８遺伝子の機能的コピーを有する非ポテリジェント（商標）系においてヒト化１Ｄ９  Ｈ６Ｌ２コンプリジェント（商標）抗体を発現させるために使用）またはアクリタマブ（商標）（ＦＵＴ８遺伝子の機能的コピーを欠くポテリジェント（商標）系ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞において発現させる場合に、ヒト化１Ｄ９  Ｈ６Ｌ２アクリタマブ（商標）抗体を発現させるために使用）ＩｇＧ１／ＩｇＧ３アイソタイプキメラ全長重鎖核酸配列。MGWSCIILFLVATATGVHSシグナル配列をコードする部分は削除可能である。
配列番号１０３
【化１１０】
2013544492.tif 000128
【０５５７】
ヒト化１Ｄ９  Ｌ２全長軽鎖アミノ酸配列（ヒト化１Ｄ９  Ｈ６Ｌ２抗体を生産するために、ＦＵＴ８遺伝子の機能的コピーを有する非ポテリジェント（商標）系において配列番号１００と同時発現させるために使用、ヒト化１Ｄ９  Ｈ６Ｌ２ポテリジェント（商標）抗体を生産するために、ＦＵＴ８遺伝子の機能的コピーを欠くポテリジェント（商標）系ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞において配列番号１００と同時発現させるために使用、ヒト化１Ｄ９  Ｈ６Ｌ２コンプリジェント（商標）抗体を生産するために、ＦＵＴ８遺伝子の機能的コピーを有する非ポテリジェント（商標）系において配列番号１０２と同時発現させるために使用、またヒト化１Ｄ９  Ｈ６Ｌ２アクリタマブ（商標）抗体を生産するために、ＦＵＴ８遺伝子の機能的コピーを欠くポテリジェント（商標）系において配列番号１０２と同時発現させるために使用）
配列番号１０４
【化１１１】
2013544492.tif 000129
【０５５８】
ヒト化１Ｄ９  Ｌ２全長軽鎖核酸配列（ヒト化１Ｄ９  Ｈ６Ｌ２抗体を生産するために、ＦＵＴ８遺伝子の機能的コピーを有する非ポテリジェント（商標）系において配列番号１００と同時発現させるために使用、ヒト化１Ｄ９  Ｈ６Ｌ２ポテリジェント（商標）抗体を生産するために、ＦＵＴ８遺伝子の機能的コピーを欠くポテリジェント（商標）系ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞において配列番号１００と同時発現させるために使用、ヒト化１Ｄ９  Ｈ６Ｌ２コンプリジェント（商標）抗体を生産するために、ＦＵＴ８遺伝子の機能的コピーを有する非ポテリジェント（商標）系において配列番号１０２と同時発現させるために使用、またヒト化１Ｄ９  Ｈ６Ｌ２アクリタマブ（商標）抗体を生産するために、ＦＵＴ８遺伝子の機能的コピーを欠くポテリジェント（商標）系において配列番号１０２と同時発現させるために使用）。MGWSCIILFLVATATGVHSシグナル配列をコードする部分は削除可能である。
配列番号１０５
【化１１２】
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【０５５９】
【表１７】
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【０５６０】
本発明はここに十分に記載されるが、当業者には、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなくそれらに多くの変更および改変をなし得ることが自明である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２９ａ】
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【図２９ｂ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2013544492.tif 000194
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