(57)【要約】  本発明は、新規の酵素及びその使用に関する。また、本発明は、そのような酵素、それをコードする核酸、組み換え細胞を生成する方法、及びそのような材料からバイオマスを改変する方法に関する。特に、本発明は、バイオマスを分解すること、バイオマス分解を改良すること、及びバイオエネルギー製品又は組み換えタンパク質を生成することに適する。また、本発明は、紙産業、織物産業、化学分野及び医薬分野の分野における酵素の種々の適用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ディノコッカス又はその関連細菌由来であり、エネルギー代謝に関連する酵素。
【請求項２】
３０℃以上、好ましくは４０℃以上で活性である請求項１に記載の酵素。
【請求項３】
バイオマスの改変を触媒する請求項１又は２に記載の酵素。
【請求項４】
アミラーゼ、グルコシダーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペクチナーゼ、エステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ及びグルクロニダーゼから選択される請求項３に記載の酵素。
【請求項５】
シグナルペプチドを有さない成熟型で、SEQ ID NOs: 1-12, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70及び72から選択されるアミノ酸配列の全て又は１つの活性部を備える請求項４に記載の酵素。
【請求項６】
発酵によるバイオ燃料の生成に関連する請求項３に記載の酵素。
【請求項７】
アセトアルデヒド、デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デヒドロゲナーゼから選択される請求項６に記載の酵素。
【請求項８】
SEQ ID NOs:27-41から選択されるアミノ酸配列の全て又は１つの活性部を備える請求項６に記載の酵素。
【請求項９】
SEQ ID NOs:1-12, 27-41, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70及び72から選択されるアミノ酸配列、又はその連続した少なくとも１５残基を有する断片を備えているポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の酵素又はポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１１】
請求項１０の核酸を備えたベクター。
【請求項１２】
請求項１０の核酸又は請求項１１のベクターを含む組み換え細胞。
【請求項１３】
ディノコッカス又はその関連細菌である請求項１２の細胞。
【請求項１４】
バイオマスの改変及び／又は代謝物質若しくはエネルギー製品の生成、又は木材、パルプ、農業廃棄物、有機廃棄物、飲料、界面活性剤、樹脂、織物、健康製品及び薬剤の処理のための請求項１〜１３のいずれか１項に記載の酵素、核酸、ベクター又は細胞の使用。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の酵素、核酸、ベクター又は細胞にバイオマスを曝露することを備えているバイオマスを改変する方法。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の酵素、核酸、ベクター又は細胞に炭素源を曝露することを備えている代謝物質又はバイオエネルギー製品を生成する方法。
【請求項１７】
少なくとも２種の異なる微生物の共生培養物であって、
前記微生物の少なくとも１つはディノコッカスであり、前記微生物の少なくとも１つは原核又は真核細胞であり、
前記少なくとも２種の微生物は、互いに共生し、
前記少なくとも１つのディノコッカスは、請求項１〜８のいずれか１項の酵素の活性を示す共生培養物。
【請求項１８】
少なくとも２種の異なる微生物の共生培養物であって、
前記微生物の少なくとも１つはディノコッカスであり、前記微生物の少なくとも１つは酵母であり、
前記少なくとも１つのディノコッカスは、請求項１〜８のいずれか１項の酵素の活性を示す共生培養物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の酵素及びその使用に関する。また、本発明は、そのような酵素、それをコードする核酸、組み換え細胞を生成する方法、及びそのような材料からバイオマスを改変する方法に関する。特に、本発明は、バイオマスを分解すること、バイオマス分解を改良すること、及びバイオエタノール等のバイオエネルギー製品又は他の有用な代謝物質若しくはタンパク質を生成することに適する。また、本発明は、紙産業、織物産業、樹脂産業、化学分野及び医薬分野の分野における酵素の種々の適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオエネルギー製品又は代謝物質の生成のためのバイオマスの改変を行う微生物の使用は、本技術分野において提案されてきた。そのようなプロセスは、理想的には、２つの型の活性が必要であり、それは、(i)発酵性糖にバイオマスを改変するための分解活性、及び(ii)バイオエネルギー製品又は他の有用な代謝物質に前記糖を改変する発酵活性である。これまで、主に発酵ステップを触媒するための能力を有する微生物を同定することを目的として努力されてきた。
【０００３】
微生物を用いた発酵を介してエタノールを生成する研究論文が、J.R.Hettenhausにより「Ethanol Fermentation Strains」というタイトルで the aegis of the United States Department of Energy and theNational Renewable Energy Laboratory (December 16, 1998)において公開された。この文献における研究の関係者による貢献を要約すると、Saccharomyces, Zymomonas 及びE. coliに類似する微生物のみが既設設備において用いられ、短期的に、キシロース及びアラビノースの増大された発酵が主な目的であるが、ヘキソース又はオリゴマー型の他の糖の変換効率を増大するための重要性がほとんどないことが示され、より長い期間において、獲得は、より高い操作温度、並びに酵素生成、糖化及び加水分解のステップの組み合わせに関して達成され得る。
【０００４】
近年の産業プロセスは、用いる産業的微生物（酵母）の脆弱性のため、約３０℃でエタノールの発行及び抽出をするために微生物を培養及び増殖させることのみである。この発酵に通常用いられる酵母は、１００ｇ／ｌ以上のエタノール濃度に耐えられないので、それらは発酵後にエタノールを濃縮するために多くのバイオエネルギーを必要とする。さらに、酵母の発酵は、実際に、グルコース型のＣ６糖のみを用いる。
【０００５】
微生物を用いるバイオマスの改変も試験されている(Blumer-Schuette等., 2008, Extremelythermophilic microorganisms for biomass conversion: status and prospects, CurrOpinion Biotechnol 19, pp. 210-217; Perez等., 2002, IntMicrobiol 5, pp 53-63)。しかしながら、Mosier等. (Bioresource Technology 96 (2005) 673-686)に報告されるように、リグノセルロースバイオマスの前処理は、発酵性糖に炭水化物ポリマーを変換させる酵素とセルロースとがより反応しやすくするためのセルロースの構造の変更のために必要である。
【０００６】
生（すなわちデンプン、リグノセルロース）バイオマスから発酵性糖（例えば単糖類）の産業的及び効率的な生成は、未だ挑戦され続けている。種々のアプローチは、熱化学的方法、酸性加水分解又は酵素加水分解糖の生バイオマスを用いることを提案する。SunH等(Appl Biochem Biotechnol. 2010 Feb;160(4):988-1003)は、デンプンの分解のための非Deinococcus酵素の使用を論じている。PolizeliML等,及びCollinT等(Appl Microbiol Biotechnol. 2005 Jun;67(5):577-591 ; FEMS Microbiol Rev.2005 Jan;29(1):3-23)は、キシランの分解のための非Deinococcus酵素の使用を論評している。WilsonDB等(Curr Opin Biotechnol.2009 Jun;20(3):295-299)は、バイオ燃料への適用のためのセルロースの分解のために非Deinococcus酵素の使用を論じている。
【０００７】
しかしながら、これらのアプローチは、これまで、バイオマスから代謝物質を生成する効率的及び産業的な酵素的方法の実行につながらなかった。さらに、デンプン、セルロース、ヘミセルロース及びリグニンの特定の構成をそれぞれ有するリグノセルロースの多様性のため、改善された活性を有する更なる酵素が必要となる。
【０００８】
従って、バイオマスの改変に新規の酵素活性が必要である。また、発酵性糖等の有用な製品、又はバイオエネルギー製品又は及び代謝物質に、デンプン及びリグノセルロースバイオマスを分解するための費用効果があり、計測可能なプロセスが本技術分野において必要である。
【０００９】
出願人により行われた研究は、ディノコッカス（Deinococcus）属の菌株がバイオエネルギー製品を含む代謝物質にバイオマスを変換するのに用いるための驚くべき特性を示すことを発見したことにつながる(WO2009/063079)。特に、出願人は、ディノコッカス菌株が発酵性糖へのバイオマス分解を触媒可能である、又は引き起こすことが可能であり、前記糖から代謝物質を生成することが可能であることを証明している。また、出願人は、それらの菌株が、高い温度、高いエタノール濃度及び広いｐＨ範囲に耐性があり、活性であること証明している(PCT/EP2010/056600, 現在、未だ公開されていない)。さらに、出願人は、ディノコッカスがデンプン、キシラン又はセルロースを含む生バイオマスを分解することが可能であり、それがバイオマスの改変及び代謝物質の生成にさらに実質的に有利となることを発見している(WO2010/094665)。従って、ディノコッカス及びその関連細菌は、バイオマスから新規で効率的なバイオエネルギー及び代謝物質の生成を可能とする。
【００１０】
本発明は、ディノコッカス及びその関連細菌由来の新規の酵素活性を開示する。これらの酵素は、エネルギー代謝に関連する。それらは、構造的に特徴付けられ、異なるモチーフ又は配列を示し、それらは前記タンパク質に驚くべき生物学的活性を与える。これらのDeinococcal酵素は、例えば、産業的プロセスに適する条件下で、キシラン、セルロース及び／又はヘミセルロース若しくはリグノセルロース材料を含むバイオマスの主な成分を加水分解する能力を有する。そのような酵素は、本技術分野において報告又は単離されておらず、それは、バイオマスの改変の産業的プロセスの開発を実質的に改善する。その酵素は、産業的プロセスにおいて、精製型又は単離型、又は本発明の少なくとも１つの酵素を備えた酵素の混合物として用いられ得る。また、それらの酵素は、発酵のためのより安価な炭素源の使用を可能とする又は奨励し、代謝物質、バイオエネルギー製品の生成、又は組み換えタンパク質の生成（若しくは過剰発現）に用いられ得る。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、新規の酵素、それらの製造及びそれらの使用に関する。また、本発明は、それらの酵素をコードする核酸、ベクター、組み換え細胞及びそれらの使用に関する。さらに、本発明は、バイオマスの改変及び／又はバイオマス若しくはその誘導体から有用な製品を生成するための組成物並びに方法に関する。特に、本発明は、発酵性糖、バイオエネルギー製品及び他の化合物を含む有用な製品にデンプン及びバイオマス若しくはその誘導体を改変する能力を有する新規の酵素に関する。また、本発明は、そのような酵素を使用して有用な製品及び代謝物質を生成する方法に関する。さらに、本発明は、本発明の酵素を使用する産業的、農業的、及び健康的な適用に関する。
【００１２】
本発明は、特にエタノール、他のアルコール、及び化合物といったバイオエネルギーを生成するのに用いられ得る化合物を工業規模で、経済的に、信頼して得るために、デンプン及びバイオマス若しくはその誘導体を改変する予期しない、驚くべき特性を有する酵素の同定に由来する。
【００１３】
従って、本発明の対象は酵素に関し、その酵素は、ディノコッカス又はその関連細菌に由来し、エネルギー代謝に関連する。
【００１４】
本発明の更なる対象は酵素であり、その酵素は、ディノコッカス又はその関連細菌に由来し、好ましくは３０℃以上で、より好ましくは４０℃以上でバイオマスを発酵性糖に改変する能力を有する。
【００１５】
本発明の更なる対象は酵素であり、その酵素は、ディノコッカス又はその関連細菌に由来し、好ましくは３０℃以上で、より好ましくは４０℃以上でキシラン又はセルロースを加水分解する能力を有する。
【００１６】
特定の実施形態において、本発明の酵素は、バイオマスの改変を触媒し、好ましくはアミラーゼ、グルコシダーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペクチナーゼ、エステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ及びグルクロニダーゼから選択される。
【００１７】
他の特定の実施形態において、その酵素は、糖の発酵を触媒し、特に発酵によるエタノールの生成を触媒する。そのような酵素の好ましい特定の例は、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デヒドロゲナーゼを含む。
【００１８】
本発明の最も好ましい酵素は、ディノコッカス由来のものである。
【００１９】
本発明の更なる対象は、SEQID NOs: 1〜12, 27〜41, 58, 60,62, 64, 66, 68, 70 及び72のアミノ酸配列のいずれか１つの全て又は一部を含むポリペプチドである。本発明の更なる対象は、上記の通り定義された酵素の少なくとも１つを備えた組成物である。その組成物は、好ましくはエネルギー代謝において活性である本発明の酵素又は他の酵素から選択される更なる酵素を含み得る。その組成物は、例えば触媒又はスターターとして用いられ得る。特定の実施形態において、本発明は、上述のように、キシラン及び少なくとも１つのアミラーゼ、グルコシダーゼ又はセルラーゼを含む組成物に関する。
【００２０】
本発明の更なる対象は、上記の酵素をコードする核酸である。
【００２１】
本発明の更なる対象は、上記の核酸を含むベクターである。
【００２２】
また、本発明の更なる対象は、上記の核酸又はベクターの少なくとも１つを含む組み換え細胞に関し、好ましくは上記の核酸又はベクターの少なくとも１つを含む組み換え細菌に関する。
【００２３】
また、実際に、本発明は、上記の核酸又はベクターの少なくとも１つを含むディノコッカス細菌に関する。本発明は、ディノコッカスＤＮＡのみの使用により、デンプン及びリグノセルロースバイオマスを処理するための改善された能力を有するディノコッカス菌株の操作を可能とする。
【００２４】
また、本発明は、本発明の細胞の抽出物に関する。そのような抽出物は、好ましくは酵素活性を示す。
【００２５】
また、本発明は、バイオマスの改変するための、及び／又は代謝物質、バイオエネルギー製品若しくはタンパク質の生成のための、又は木材、パルプ、農業廃棄物、有機廃棄物、飲料、界面活性剤、樹脂、織物、健康製品及び薬剤の処理のための、上記の酵素の使用、若しくは複数の酵素の組み合わせ、対応する核酸、ベクター、細胞若しくは細胞抽出物の使用に関する。
【００２６】
また、本発明は、そのようなバイオマスを上記の酵素、若しくは複数の酵素の組み合わせ、対応する核酸、ベクター、細胞若しくは細胞抽出物に曝露することを含むバイオマスを改変する方法に関する。
【００２７】
また、本発明は、バイオマスの改変を増大するための方法に関し、その方法は、バイオマスに上記の酵素、若しくは複数の酵素の組み合わせ、対応する核酸、ベクター、細胞若しくは細胞抽出物を加えることを含む。
【００２８】
また、本発明は、化学反応の触媒速度を改善するための方法に関し、その方法は、上記の本発明の酵素若しくは複数の酵素の組み合わせ、対応する核酸、ベクター、細胞若しくは細胞抽出物をその反応に加えることを含む。
【００２９】
また、本発明は、代謝物質又はバイオエネルギー製品を生成する方法に関し、その方法は、例えばバイオマス又はその成分等の炭素源を上記の本発明の酵素若しくは複数の酵素の組み合わせ、対応する核酸、ベクター、細胞若しくは細胞抽出物に曝露することを含む。その方法は、代謝物質又はバイオエネルギー製品を回収するステップをさらに含むことが好ましい。
【００３０】
一般に、それらの酵素は、より安価な炭素源を発酵性糖に変えるために用いられ得る。上記の代謝物質及びバイオエネルギー製品の生成に加えて、それらは、組み換えタンパク質の生成のために用いられ得る。特に、本発明の酵素は、バイオマス糖の安価な炭素源を用いる能力を有する細菌等の微生物を操作するために、また、そのような設計された微生物から低いコスト及び／又は高いレベルの製品を生成するために用いられ得る。特に、産業的に重要なタンパク質（酵素及び医薬的タンパク質等）をコードする核酸は、本発明の酵素を発現するように操作されたディノコッカス等の細菌でクローン化され、発現され得る。そのような細菌は、安価な炭素源を用いて組み換えタンパク質を生成し得る。そのような細菌は、改善された代謝経路により、高いレベルで組み換えタンパク質を発現し得る。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１Ａは、ＤＲＨ４６及びＭ１−３Ｈの濾紙の分解について示す。図１Ｂは、ＤＲＨ４６のＣＭＣ１％における強いセルロース分解活性を示す。
【図２】図２は、Ｍ２３ｒ−２Ａ、ＤＲＨ３８及びＭＣ２−２Ａが単一の炭素源としてデンプンの存在下で速く増殖することを示す。
【図３】図３は、単一の炭素源として０．５％デンプンの存在下におけるＭ２３ｒ−２Ａの強いアミロース分解活性を示す。
【図４】図４は、ＭＣ３−４Ａ、ＤＲＨ３８及びＤＲＨ４６が単一の炭素源としてのカバ材キシラン存在下で速く増殖すること、及び強いキシラン分解性酵素をコードすることを示す。
【図５】図５Ａは、ディノコッカスαを発現するE.coliの細胞非含有の上清におけるアミラーゼ活性を示し、それは、デンプンを含む限定最少培地で細胞を増殖した後のアミラーゼである。pETDEST42ベクターにおいて誘導性IPTGプロモーターの下流にクローン化され、６（Ｈｉｓ）タグ化αアミラーゼを含むE.coliの増殖を示す。図５Ｂは、ディノコッカスαを発現するE.coliの細胞非含有の上清におけるアミラーゼ活性を示し、それは、デンプンを含む限定最少培地で細胞を増殖した後のアミラーゼである。IPTGの存在下又は非存在下における培養の３日後及び６日後における組み換え６（Ｈｉｓ）タグ化αアミラーゼ活性が組み換えE.coliの細胞非含有の上清で測定されている。
【図６】図６Ａは、D.geothermalis由来の組み換えαアミラーゼの精製及び活性であり、ニッケル親和性クロマトグラフィーによる組み換え６（Ｈｉｓ）タグ化αアミラーゼの精製後のＳＤＳ−ＰＡＧＥのクマシーブルー染色を示す。矢印は精製αアミラーゼに対応するバンドを示す。図６Ｂは、D.geothermalis由来の組み換えαアミラーゼの精製及び活性であり、精製酵素の活性を示す。
【図７】図７Ａは、SEQ ID NO: 3の組み換えαアミラーゼの活性及び安定性におけるＣａ２＋の影響を示す。図７Ｂは、加水分解生成物の２４時間におけるＨＰＬＣ分析結果を示し、Termamyl 120Lを参照酵素として用いた。
【図８】図８は、D.geothermalis由来の本発明の組み換え酵素の精製であり、ニッケル親和性クロマトグラフィーによる組み換え６（Ｈｉｓ）タグ化酵素の精製後のＳＤＳ−ＰＡＧＥのクマシーブルー染色を示す。矢印は精製酵素に対応するバンドを示す。
【図９】図９は、ＭＣ３−４Ａからの組み換えキシランの最適ｐＨを示す。
【図１０】図１０は、ＭＣ３−４Ａからの組み換えキシランの最適温度を示す。
【図１１】図１１Ａは、ディノコッカスエンドキシラナーゼＭＣ３−４Ａのキシラン分解活性であり、ディノコッカスエンドキシラナーゼＭＣ３−４Ａによるアラビノキシランの加水分解を示し、図１１Ｂは、ＭＣ３−４Ａ株からの組み換えエンドキシラナーゼによるアラビノキシランの加水分解を示し、加水分解生成物（すなわち、キシロース、xylo-2, xylo-3, xylo-4, xylo-5及びxylo-6）の４８時間の時点のＨＰＬＣ分析を示す。T.reesei Xyn11Aを参照酵素として用いた。図１１Ｃは、Deinococcus geothermalisＭＣ３−４Ａからの組み換えエンドキシラナーゼのキシラン加水分解を示す。２０μｇの精製酵素を５％ＡＺＯカバ材キシラン(S-AXBL Megazyme)を含む最少培地アガープレート上にスポットし、３７℃で２日間インキュベートした。左の写真は陰性対照であり、D. geo M23-3Aからの組み換え精製αアミラーゼである。右の写真はD. geo MC3-4Aからの組み換え精製エンドキシラナーゼである。
【図１２】図１２は、ＭＣ３−４Ａからの組み換えエンドキシラナーゼの長期間（２４時間）の温度安定性を示す。
【図１３】図１３は、Ｍ２３−３Ａ株からの組み換えαアミラーゼ及び粗製酵素調製物の最適ｐＨを示す。
【図１４】図１４は、Ｍ２３−３Ａ株からの組み換えαアミラーゼの最適ｐＨにおけるバッファーの影響を示す。
【図１５】図１５は、Ｍ２３−３Ａ組み換えαアミラーゼの熱安定性を示す。
【図１６】図１６は、ディノコッカス DRH-46由来の組み換えエンドセルラーゼの精製であり、ニッケル親和性クロマトグラフィーによる組み換え６（Ｈｉｓ）タグ化エンドセルラーゼの精製後のＳＤＳ−ＰＡＧＥのクマシーブルー染色を示す。矢印は精製エンドセルラーゼに対応するバンドを示す。
【図１７】図１７は、ディノコッカス DRH-46由来の組み換えエンドセルラーゼのセルロース加水分解を示す。１０μｇの精製酵素を５％ＡＺＯセルロース(S-ACMCL Megazyme)を含む最少培地アガープレートにスポットし、３７℃で２日間インキュベートした。左の写真は陰性対照であり、D. geo M23-3Aからの組み換え精製αアミラーゼである。右の写真はD. DRH46からの組み換え精製エンドキシラナーゼである。
【図１８】図１８は、ＤＲＨ４６株からの組み換えアセチルキシランエステラーゼの最適ｐＨを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、ディノコッカス又はその関連細菌由来の有益な酵素に関し、それはエネルギー代謝に関連し、より好ましくはバイオマスの改変に関連する。これらの酵素は、好ましくは３０℃で活性であり、より好ましくは４０℃以上でも活性であり、酵素反応を引き起こす又は改善するために単独で又は組み合わせで用いられ得る。これらの酵素又はそれらをコードする核酸は、バイオマスの改変を引き起こす又は改善するのに寄与し得る改善された組み換え細菌を作製するのに用いられ得る。
【００３３】
本開示は、以下の定義を参考にすることにより、よく理解されるだろう。
【００３４】
本発明の内容において、酵素に関して「ディノコッカス又はその関連細菌由来」の用語は、酵素がそのような細菌から単離される、又は酵素がそのような細菌から単離、精製又は特徴付けられる酵素のアミノ酸配列の全て又は生物活性部分を含むことを意味する。さらに、「ディノコッカス又はその関連細菌由来」の用語は、ディノコッカス又はその関連細菌で同定された核酸又はアミノ酸配列から合成された組み換え、合成及び／又は任意の変異酵素（例えば化学的、酵素的、物理的変異）を含む。
【００３５】
「ディノコッカス細菌」は、ディノコッカス属のいずれかの細菌種をいう。ディノコッカス細菌は、以下のものに限られないが、D.cellulolysiticus, D. radiodurans, D. proteolyticus, D.radiopugnans, D. radiophilus, D. grandis, D. indicus, D. frigens, D. saxicola,D. maricopensis, D. marmoris, D. deserti, D.geothermalis, D. murrayi, D. aerius,D. aerolatus, D. aerophilus, D.aetherius, D. alpinitundrae, D. altitudinis, D. apachensis,D. aquaticus, D. aquatilis, D. aquiradiocola, D. aquivivus,D. caeni, D. claudionis, D.ficus, D. gobiensis, D. hohokamensis, D. hopiensis, D.misasensis, D. navajonensis, D. papagonensis, D. peraridilitoris,D. pimensis, D. piscis, D. radiomollis, D.roseus, D. sonorensis, D.wulumuqiensis, D. xibeiensis, D. xinjiangensis, D.yavapaiensis及びD. yunweiensisを含む。
【００３６】
ディノコッカスに「関連する」細菌又は細菌株は、(i) GTTACCCGGAATCACTGGGCGTA(SEQ ID NO: 26)及びGGTATCTACGCATTCCACCGCTA (SEQ IDNO: 25)のプライマーを用いて増殖され、約１５８塩基対の断片を生じる１６Ｓ ｒＤＮＡを含み、及び／又は(ii)４ｍＪ／ｃｍ２のＵＶ処理に抵抗する細菌をいう。特定の実施形態において、ディノコッカス関連細菌は、ディノコッカスの１６ＳｒＤＮＡ配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％の同一性を有する１６Ｓ ｒＤＮＡ分子を有する細菌である。
【００３７】
酵素又は核酸に関して、「精製された」又は「単離された」の用語は、酵素又は核酸が天然の媒体又は形態にないことをいう。従って、「単離された」の用語は、元来の環境、例えばそれが自然に生じるのであれば自然の環境から移された酵素又は核酸を含む。例えば、単離された酵素は、それが正常に関連する又はそれが正常に混合され若しくは溶液中にある少なくともいくつかのタンパク質又は他の細胞の成分を欠く。単離された酵素は、細胞ライセートに含まれる天然に生成された酵素、精製又は部分的に精製された型の酵素、組み換え酵素、細菌により発現又は分泌された酵素、及び異種の宿主細胞又は培養における酵素を含む。核酸に関して、「単離された」又は「精製された」の用語は、例えば核酸が天然の遺伝子の構成でない（例えば、プロモーターに結合された又は異種宿主細胞に人工的に導入された発現カセットとしてベクター内にある）ことをいう。
【００３８】
「エネルギー代謝」の用語は、細胞内のエネルギー製品又は代謝物質を生成する又は保持するのに寄与する全ての生物学的経路及び反応をいう。これらは、以下のものに限られないが、例えばバイオマスのポリマーの発酵性糖への分解、及び発酵性糖の有益な代謝物質又は製品への分解といったバイオマス処理等の経路及び反応を含む。バイオマス処理に関連する酵素は、より好ましくは、以下のものに限られないが、デンプン、キシラン、セルロース、又はリグノセルロースバイオマスの主要なコンポーネントのいずれか、又はセルロース若しくはヘミセルロースを含む組成物等、産業的処理の副産物等の物質を改変又は分解又は加水分解する酵素、又は細胞内で代謝物質若しくはエネルギー製品を生じるためにピルビン酸を用いることに寄与する酵素を含む。
【００３９】
本発明に係る「バイオマス」の用語は、通常、生物学的材料をいう。特にバイオマスの用語は、植物性又は動物性バイオマスを含む生物起源の未加工の材料を含む。バイオマスの例は、以下のものに限られないが、材木又は紙製品に適しない成熟した樹木、パルプ、リサイクル紙、有機廃棄物を含む林産物、牧草、わら、作物及び動物性肥料等の農業製品、並びに藻類及び海藻等の水産物を含む。バイオマスの例は、ススキ、麻、スイッチグラス、テンサイ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、米、大豆、カノラ、ナタネ、モロコシ、サトウキビ、落花生、綿花、ハウチワマメを含む種々の植物の型、並びに、ユーカリからアブラヤシ、ポプラ、ヤナギの広い種々の樹木種由来の樹木又は植物性材料を含む。バイオマスの特定の原料は、以下のものに限られないが、植物残査、硬材又は軟材の幹、穂軸、わら、芝、葉、種、紙等を含む(例えばSun等., Bioresource Technology 83 (2002) 1-11を参照)。また、バイオマスの用語は改変されたバイオマス又は二次バイオマスを含み、それは、加水分解され、前処理されたバイオマス製品を本質的に含む。好ましい実施形態において、本発明に係るバイオマスは、例えばセルロース、ヘミセルロース及び／又はキシランといったリグノセルロース材料を含む。
【００４０】
本発明の内容におけるバイオマスの「改変」は、バイオマスの変換、分解、加水分解、転換又は処理を含むバイオマスの改変を含む。バイオマスの「改変」の用語は、通常、発酵性糖、単糖類、多糖類、代謝物質、樹脂及び／又は化学物質、又は他の有益な製品といった製品を生じるバイオマスの改変を含む。また、改変は、通常、バイオマスの生物学的ポリマーの加水分解を含む。
【００４１】
「発酵性糖」の用語は、以下のものに限られないが、基本構造（ＣＨ２０）ｎを有する炭水化物をいう。炭素の数（例えば３、４、５又は６）に基づいて、オリゴ糖は、トリオース（すなわちグリセロール）、テトラオース、ペンタオース（すなわちキシロース）、ヘキソース（すなわちグルコース）等である。デンプンは、１−４及び１−６グリコシド結合により互いに結合された多くのグルコースユニットからなる炭水化物をいう。デンプンは、多くの植物及び細菌により蓄積されるエネルギー貯蔵分子であり、デンプン分子は、半結晶細粒で植物内にある。
【００４２】
さらに、発明者等は、アミラーゼ、セルラーゼ及びキシラナーゼ等の本発明の酵素が同一又は異なる単糖類のいくつかの分子からなるオリゴ糖を生じることを発見した。特定の実施形態において、本発明の酵素は、１５に至る単糖類を含むポリマーを生成する。好ましい実施形態において、本発明に係る酵素は、二糖類、三等類及び四糖類等の低分子ポリマーを生じる。本発明の酵素により生じるそのようなポリマーは、樹脂産業（例えばプラスチック、塗料、ニス、接着剤及び他の合成製品の作製）への適用に特に関心がもたれる。
【００４３】
バイオマス処理酵素
本発明は、バイオマス処理に関連する新規の酵素の単離及び特徴付けについて開示する。特に、本発明は、好ましくは３０℃以上、一般には３０℃から７０℃でバイオマスを発酵性糖に改変する（又はその改変に寄与する）新規の酵素を提供する。本発明の好ましい酵素は、デンプン、キシラン及び／又はセルロースの発酵性糖への分解を触媒する。これらの酵素は、新規の構造及び有益な生物活性を示す。本発明の他の好ましい酵素は、糖の発酵によるエタノールの生成を触媒する。そのような酵素の例は、アルコールデヒドロゲナーゼ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デヒドロゲナーゼを含む。これらの酵素は、ディノコッカス細菌から単離されたエネルギー代謝に関連する第１の機能的酵素である。それらの活性、構造及び物理化学的特性のため、これらの酵素は、産業分解処理、環境汚染物質の処理、バイオエネルギー製品、パルプ及び紙産業、織物産業、樹脂産業、並びに化学及び医薬分野に用いるための新規の有益な製品である。
【００４４】
上述のように、本発明の特定の好ましい酵素は、デンプン、キシラン又はセルロースの発酵性糖への分解を触媒する（又はその分解に寄与する）。これに関して、本発明の好ましい酵素は、グルコシダーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、エステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ及びグルクロニダーゼから選択される。
【００４５】
キシラナーゼは、硬材及び軟材ヘミセルロースの主要成分であるキシランの加水分解を触媒する酵素である。キシラナーゼは、それらの基質特異性、及び／又はそれらが切断し得る化学結合の型に依存して、エンドキシラナーゼ、グリコシドヒドロラーゼ、βキシロシダーゼ及びα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ等の種々の型のものであってもよい。本発明は、新規で生物学的に活性なキシラナーゼの単離及び特徴付けを開示する。特に、本発明は、エンドキシラナーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、αグルクロニダーゼ、グリコシドヒドロラーゼ、βキシロシダーゼ及びα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの単離及び特徴付けを開示し、それは本発明の特定の目的である。そのような酵素の特定の例は、実施例において開示され、SEQ ID NOs: 6から12, 64, 66, 68又は72のいずれか１つの全て又は活性部を備えたポリペプチドを含む。
【００４６】
アミラーゼは、多糖類、特にデンプンの加水分解に関連する。デンプンは、１−４及び１−６グリコシド結合により互いに結合された多くのグルコースユニットからなる炭水化物である。「アミラーゼ」の用語は、αアミラーゼ、βアミラーゼ、グルコアミラーゼ、αグルコシダーゼ又はプルラナーゼ（グリコシルヒドロラーゼ）活性を有するポリペプチドを含む。αアミラーゼは、低分子量マルトデキストリンを生成するために、デンプン内のα−１，４−グルコシド結合の加水分解をする能力を有する。グルコアミラーゼは、α−１，４−及びα−１，６−グルコシド結合により結合されたグルコースポリマーを加水分解する能力を有する。グルコアミラーゼは、グルカンからβ−Ｄ−グルコースを放出する能力を有する。本発明のアミラーゼポリペプチドは、デンプンからグルコース等の糖への加水分解を触媒するのに用いられ得る。本発明は、新規で生物的活性なDeinococcalアミラーゼの単離及び特徴付けを開示する。特に、本発明は、Deinococcalαアミラーゼ及びαグルコシダーゼの単離及び特徴付けを開示し、それは、本発明の特定の目的である。そのような酵素の特定の例は、実施れにおいて開示され、SEQ ID NOs: 3から5, 58又は62のいずれか１つの全て又は活性部を備えたポリペプチドを含む。
【００４７】
セルラーゼは、硬材及び軟材の主要なコンポーネントであるセルロース又はヘミセルロースの加水分解を触媒する酵素である。セルラーゼは、エンドグルカナーゼ、エンドセルラーゼ、セロビオヒドラーゼ（ＣＢＨ）若しくはセロビオシダーゼ、又はβグルコシダーゼ（セロビアーゼ；ＢＧＬ）等の種々の型の酵素であってもよい。本発明は、新規で生物的に活性なDeinococcalセルラーゼの単離及び特徴付けを開示する。特に、本発明は、Deinococcalエンドグルカナーゼ、セロビオヒドラーゼ及びβグルコシダーゼの単離及び特徴付けを開示し、それは、本発明の特定の目的である。そのような酵素の特定の例は、実施例において開示され、例えばSEQ ID NOs: 1, 2, 60 又は70の全て又は活性部を備えたポリペプチドを含む。
【００４８】
本発明の他の特定の好ましい酵素は、糖発酵、特に、発酵によるエタノールの生成を触媒する（又は触媒に寄与する）。特に好ましい酵素は、ピルビン酸のエタノールへの改変を触媒する（又は触媒に寄与する）。そのような酵素の例は、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デヒドロゲナーゼを含む。アルコールデヒドロゲナーゼ及びアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼは、多くの生物において生じるデヒドロゲナーゼ酵素の群であり、アルコールとアルデヒド又はケトンとの間の改変を促進する。細菌において、それらは、種々の代謝物質の生合成の際に有益なアルコール群の生成に関与する。特に、それらは、発酵によるエタノールの生成において重要な役割を果たす。特に、解糖から生じるピルビン酸は、アセトアルデヒドと二酸化炭素とに改変され、その後、アセトアルデヒドは、アルコールデヒドロゲナーゼ及び／又はアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼによりエタノールに還元される。また、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼは、アセチルＣｏＡのアセトアルデヒドへの改変を触媒する（又は触媒に寄与する）。
【００４９】
本発明は、特に、Deinococcalアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼの単離及び特徴付けを開示し、それは本発明の特定の目的である。そのような酵素の特定の例は、実施例に開示され、SEQ ID NOs: 27から31のいずれかの全て又は活性部を備えたポリペプチドを含む。
【００５０】
また、本発明は、Deinococcalアルコールデヒドロゲナーゼの単離及び特徴付けを開示し、それは本発明の特定の目的である。そのような酵素の特定の例は、実施例に開示され、SEQ ID NOs: 32から41のいずれかの全て又は活性部を備えたポリペプチドを含む。
【００５１】
本発明の酵素はポリペプチドであり、それは天然型、組み換え型、及び／又は合成型であってもよく、また任意に（例えば化学的に、酵素的に、物理的等に）修飾されていてもよい。その酵素は、単離又は精製された型であることが好ましい。その酵素は、３０℃以上で有利に機能する。本発明の好ましい酵素は、４０℃以上、又は例えば４５℃以上でも用いられ得る。また、それらは、厳しいｐＨ条件下（例えば３．５〜９）又はアルコール条件下において活性である。
【００５２】
好ましい実施形態において、本発明の酵素は、SEQID NOs: 1から12のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、少なくとも１５の連続するアミノ酸残基を含むその断片、又はキシラナーゼ、アミラーゼ若しくはセルラーゼ活性を有するその機能的変異体である。
【００５３】
他の好ましい実施形態において、本発明の酵素は、SEQ ID NOs: 27から31のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、少なくとも１５の連続するアミノ酸残基を含むその断片、又はアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するその機能的変異体である。
【００５４】
他の好ましい実施形態において、本発明の酵素は、SEQ ID NOs: 32から41のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、少なくとも１５の連続するアミノ酸残基を含むその断片、又はアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するその機能的変異体である。
【００５５】
本発明に係る機能的変異体は、参照ポリペプチドの活性を保持する。それらは、通常、参照ポリペプチドに対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を示し、より好ましくは、少なくとも６０％、７０％、８０％又は９０％の同一性を示す。配列同一性（相同性）の程度は、デフォルトのパラメータとBLAST2.2.2又はFASTA version 3.0t78を含むコンピュータープログラム及び関連するパラメータを用いて決定され得る。好ましい機能的変異体は、参照配列に対して少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９２％、９５％又は９７％の同一性のレベルを有する。
【００５６】
好ましい実施形態において、機能的変異体は、参照ポリペプチドと比較して、多くとも１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２５、１〜２０、１〜１５、１〜１０又は１〜５残基の変異（例えば欠失、置換又は挿入）アミノ酸残基を含む。
【００５７】
本発明に係るポリペプチドは、参照ポリペプチドの酵素活性の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％の活性を示す場合、機能的であるとみなされる。
【００５８】
本発明のポリペプチドの好ましい断片は、そのポリペプチドの少なくとも約１０、１５、２０、２５、４０、５０又はより好ましくは６０残基の連続したアミノ酸を含む。最も好ましい断片は、それ自体により、又は他のポリペプチドと融合又は結合された際に、機能的である。また、本発明のポリペプチドは、複数の活性を有する融合ポリペプチド又はキメラポリペプチドを作製するために用いられ得る。
【００５９】
ポリペプチドの「活性部」は、全体のポリペプチドの酵素活性を与える又は示すポリペプチドの一部を意味する。その活性部は、例えば基質特異性又は親和性を与え、触媒部位を含み、又は薬物動態特性を与え得る。また、タンパク質の活性部は、タンパク質の成熟型を意味する（すなわち、タンパク質のＮ末端にシグナルペプチドを含まない）。
【００６０】
この点に関して、本発明の酵素は、例えば、
−シグナルペプチドを有さないSEQ ID NO: 6のエンドキシラナーゼの成熟型
MKRSKTHLAVVGLGLLALLGSCGQS；
−シグナルペプチドを有さないSEQ ID NO: 3のエンドキシラナーゼの成熟型
MRRLPLLAALLASLAGAQA;
−シグナルペプチドを有さないSEQ ID NO: 62のエンドキシラナーゼの成熟型
MKRFQKVGRSGALAVLTLALSACGVLKA;
を含む。
【００６１】
本発明のポリペプチドは、組み換え技術により生成され得る、又はそれらは自然に生じる場合、自然発生源から単離又は生成され得る、又はそれらは人工的に生成され得る。その酵素は、可溶型又は固相であってもよい。特に、それらは、細胞膜若しくは脂質小胞に結合され得る、又は例えばビーズ、カラム及びプレート等の形態のガラス、プラスチック、ポリマー、フィルター、膜等の合成支持体に結合され得る。
【００６２】
本発明の酵素は、ディノコッカス又はその関連細菌から発現、導出、分泌、単離又は精製され得る。その酵素は、本技術分野において周知の技術により精製され、従来の技術に基づいて保存され得る。そのポリペプチドは、例えば安定性又は活性を改善するためにさらに修飾され得る。それらは、生バイオマスの発酵性糖への改変に関連する酵素反応を触媒するために、単一又は組み合わせの精製型で用いられ得る。それらは、バイオマスの発酵性糖への改変の追加の生物学的プロセスに用いられ得る。例えば、それらは、活性を追加するために、微生物又は酵素を含むリアクターの中に添加され得る。好ましい実施形態において、それらの酵素は、新規の生物活性を有する改善された微生物を作製するために用いられる。他の特定の実施形態において、本発明の酵素は、以下に記載するように（バイオエタノール等の）バイオエネルギーの生成、産業的なバイオマス分解プロセス、バイオエネルギー生成、パルプ及び紙産業（パルプ化、紙の漂白）、織物産業、界面活性剤産業、樹脂産業、並びに化学及び医薬分野に用いられ得る。
【００６３】
核酸
本発明の更なる対象は、上記の酵素又はポリペプチドをコードする核酸である。本発明の更なる対象は、上記の核酸を含むベクターである。
【００６４】
「核酸」の用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＤＮＡ様材料又はＲＮＡ様材料等の核酸のいずれかの型をいい、それは、組み換え型、人工型、及び／又は合成型であってもよく、１本鎖又は２本鎖であってもよく、センス鎖又はアンチセンス鎖である。その用語は、天然ヌクレオチドの周知のアナログを含む核酸を包含する。また、その用語は、合成された骨格を有する核酸様構造を含む。
【００６５】
そのような核酸の特定の例は、SEQID NOs: 13から24, 42から57, 59, 61,63, 65, 67, 69及び71のいずれかから選択される配列を含む核酸を含む。SEQ ID NOs: 13-24は、それぞれSEQ ID NOs: 1-12のタンパク質をコードする核酸配列を含む。
SEQ ID NOs: 42-56 は、それぞれSEQ ID NOs: 27-41のタンパク質をコードする核酸配列を含む。SEQ IDNO 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69及び71は、それぞれSEQ ID NOs: 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 及び72のタンパク質をコードする核酸配列を含む。本発明の核酸は、単離型又は精製型であってもよく、例えばｃＤＮＡライブラリーのクローニング及び発現、増幅、酵素的合成、又は組み換え技術といった本技術分野において周知の技術により作製、単離及び／又は操作され得る。また、その核酸は、例えばBelousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444に記載されているような周知の化学的合成技術により、インビトロで合成され得る。
【００６６】
また、本発明は、上記の酵素をコードする核酸に、厳しい条件下でハイブリダイズする核酸を含む。好ましくは、そのような厳しい条件は、2 X SSC/0.1%SDSを用い、約４２℃で約２．５時間ハイブリダイゼーションフィルターのインキュベートを行い、その後1 X SSC/0.1% SDSを用いて６５℃で１５分間のフィルターの洗浄を４度行うことを含む。用いられたプロトコールは、参考としてSambrook等. (Molecular Cloning: a LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor N.Y. (1988)) 及びAusubel (Current Protocols in Molecular Biology (1989))に記載されている。
【００６７】
また、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸を含み、その核酸の配列又はその配列の少なくとも一部は、最適化されたコドン出現頻度を用いて作製された。
【００６８】
本発明の特定の実施形態は、上記の酵素をコードするポリヌクレオチドを含み、それは、SEQ ID NOs: 1-12, 27-41, 58, 60,62, 64, 66, 68, 70及び72から選択される配列を含む。
【００６９】
他の特定の実施形態において、本発明は、SEQ ID NO: 1-12, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70及び72から選択されるポリペプチドの活性部又は成熟型（すなわちシグナルペプチドを有さない）をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００７０】
本発明の更なる特定の実施形態は、SEQ ID NOs: 13-24, 42-57, 59, 61, 63, 65, 67, 69及び71のいずれかから選択される配列を含むポリペプチドを含む。
【００７１】
本発明の核酸は、選択された宿主細胞又はシステムにおける酵素の発現を引き起こす又は制御するために用いられ得る制御領域、すなわちプロモーター、エンハンサー、サイレンサー及びターミネーター等の追加のヌクレオチド配列を含み得る。
【００７２】
本発明の更なる態様は、上記の核酸を含む、発現、クローニング又はレポーターベクター等のベクターを含む。そのようなベクターは、プラスミド、組み換えウィルス、ファージ、エピソーム及び人工クロモソーム等から選択され得る。そのようなベクターの多くは、商業的に入手可能であり、また、本明細書にその全体が参考として組み込まれるSambrook等., Molecular Cloning (2d ed. ColdSpring Harbor Press 1989)等のマニュアルに示された方法等の本技術分野に周知の組み換え技術に従って生成され得る。そのようなプラスミドの特定の例は、例えば米国特許出願2003/0175977に記載されており、それは、D. radiopugnans菌株由来の内在性プラスミドｐＵＥ３０を開示し、それは、ディノコッカス属の細菌で自律的に複製可能なベクターとして用いられ、またE.coli及びその誘導体で自律的に複製可能なプラスミド及びディノコッカス属及びE.coliの両方の細菌で複製可能なプラスミドを含むシャトルベクターを構築するのに用いられ得る。
【００７３】
本発明の更なる態様は、上記の少なくとも１つの核酸又はベクターを用いて形質転換又は形質移入された宿主細胞を含む。核酸（又はベクター）は、染色体外に維持され、又は例えば相同組み換え又は非相同組み換えによりゲノムに導入され得る。その宿主細胞は、遺伝子改変及び好ましくは培養され得る細胞であってもよい。その細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、真菌、細菌細胞等の真核性又は原核性であってもよい。典型的な例は、細菌（例えばE.coli, Deinococcus等）を含む。本発明は、特定の細胞の型に限られず、細胞の全ての種に適用され得ることが理解されるべきである。形質転換は、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法等の本技術分野に周知の技術を用いて行われ得る。
【００７４】
他の実施形態において、本発明は、上記の少なくとも１つのベクターを含む組み換え細胞を含む。
【００７５】
また、本発明は、上記の少なくとも１つの核酸又はベクターを含む組み換え細胞に関する。
【００７６】
また、本発明は、上記の少なくとも１つの核酸又はベクターを含むディノコッカス又はその関連細菌に関する。本発明は、実際に、ディノコッカスのＤＮＡのみの使用によってデンプン及びリグノセルロースバイオマスを処理するための改善された能力を有するディノコッカス菌株の作製を可能とする。
【００７７】
「野生型」セルロース分解性及び／又はキシラン分解性及び／又はアミロース分解性ディノコッカス菌株のネイティブの特性は、セルロース、キシラン及びデンプンの分解のために最適化されていない。本発明の酵素又は酵素群をコードするディノコッカス遺伝子を有する野生型菌株の同定及び置換又は補完は、バイオマスの最適な処理を可能とする。我々は、バイオマス基質に含まれるセルロース及びキシラン及びデンプンの加水分解に必要な最小限の酵素を概説する。得られるデータは、構想の可能性を証明し、前処理されたリグノセルロース、ヘミセルロース及びデンプンリッチバイオマス基質に対する最小限の酵素混合物の使用により得られる潜在的な改善を示す。
【００７８】
使用方法
本発明は、種々の産業的、農業的、生物工学的、化学的及び医学的分野に、本発明の酵素を用いる方法を提供する。実際に、それらの高い触媒効果の結果、本発明の酵素は、向上された触媒速度を有するため、他の周知の化学触媒及び微生物触媒と比較してより有利である。本発明の酵素は、例えばバイオマスの処理、脱リグニン及びパルプ漂白、バイオ燃料の生成、織物産業、パン工業、医薬品、樹脂産業、有機合成等に用いられ得る。
【００７９】
バイオマスの改変及びバイオエネルギーの生成
本発明の酵素は、バイオマス、又はセルロース、ヘミセルロース、リグニン及び／若しくはキシランを含むリグノセルロース材料の改変のための方法に用いられ得る。特定の実施形態において、バイオマスは、植物由来のセルロース、デンプン又はキシラン含有材料である。本発明の酵素は、例えばバイオマスからの代謝物質及び／又はエネルギー製品（例えばバイオ燃料）又は化学物質の生成のための、バイオマスの発酵性糖及び／又は単糖類及び／又は多糖類への改変に適用され得る。
【００８０】
また、本発明は、バイオマスの改変及び／又は代謝物質又はエネルギー製品の生成のための、上記の酵素、核酸、ベクター若しくは細胞、またはそれらの組み合わせの使用に関する。
【００８１】
また、本発明は、そのようなバイオマスを上記酵素、核酸、ベクター若しくは細胞、又はそれらの組み合わせに曝露することを含むバイオマスの改変のための方法に関する。
【００８２】
また、本発明は、バイオマスの改変を向上するための方法に関し、その方法は、バイオマスに上記酵素、核酸、ベクター若しくは細胞、又はそれらの組み合わせを添加することを含む。
【００８３】
本発明は、例えばバイオマス又はその成分といった炭素源を上記酵素、核酸、ベクター若しくは細胞、又はそれらの組み合わせに曝露することを含む、代謝物質又はバイオエネルギー製品を生成するための方法に関する。その方法は、さらに代謝物質又は産生物を単離又は回収するステップを含み得る。代謝物質の例は、以下のものに限られないが、好ましくはギ酸塩、乳酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、ピルピン酸塩、プロパノール、マンニトール及びアラビトール等の有機酸及びアルコールを含む。エネルギー製品の例は、以下のものに限られないが、エタノール、ブタノール又はメタノール等のバイオ燃料を含む。
【００８４】
特定の実施形態において、炭素源はキシラン含有バイオマスであり、酵素は少なくとも本発明のキシラナーゼを含む。
【００８５】
他の特定の実施形態において、炭素源はセルロース又はヘミセルロース含有バイオマスであり、酵素は少なくとも本発明のセルラーゼを含む。
【００８６】
特定の実施形態において、炭素源は多糖類含有バイオマス（例えばデンプン含有バイオマス）であり、酵素は少なくとも本発明のアミラーゼを含む。
【００８７】
他の実施形態において、炭素源はピルビン酸塩含有材料であり、酵素は少なくとも本発明のＡＤＨ、ＡＣＤＨ又はＰＤＨを含む。
【００８８】
本発明の特定の対象は、例えばバイオマス又はその成分及び／又は発酵性糖といった炭素源を上記酵素、核酸、ベクター若しくは細胞又はそれらの組み合わせに曝露すること、並びに生成されたバイオ燃料を回収することを含むバイオ燃料（例えば、バイオエタノール、バイオメタノール、バイオプロパノール、バイオブタノール等）生成のための方法に関する。概して、本発明の酵素は、安価な炭素源を用いる能力を有する微生物を作製するために用いられ得る。そのような微生物は、より低いコスト及び又は改善されたレベルで所望の生成物（例えばタンパク質、ＲＮＡｓ、代謝物質等）を生成するために用いられ得る。この点に関して、本発明は、上記の少なくとも１つの酵素をコードする組み換え微生物に上記タンパク質を発現することを含む、組み換えタンパク質を生成するための方法に関する。そのような組み換えタンパク質の例は、医薬的タンパク質、又は例えばリパーゼ等の産業的酵素を含む。
【００８９】
また、本発明は、デンプン又はデンプン含有材料を上記酵素、核酸、ベクター、細胞又は細胞抽出物に曝露することを含む、デンプンを改変する方法に関する。
【００９０】
また、本発明は、キシラン又はキシラン含有材料を上記酵素、核酸、ベクター、細胞又は細胞抽出物に曝露することを含む、キシランを改変する方法に関する。
【００９１】
また、本発明は、セルロース又はセルロース含有材料を上記酵素、核酸、ベクター、細胞又は細胞抽出物に曝露することを含む、セルロースを改変する方法に関する。
【００９２】
本発明の方法は、バイオエネルギー製品又は代謝物質を生成するために、バイオマスの改変を可能とする適当な条件又は環境で行われ得る。これに関して、その方法は、必要ならば適当な栄養物又は添加物の存在下において、リアクター、発酵装置、屋外で行われ得る。その方法は、通常、３０℃以上で、また、適当な基質の存在下で行われる。
【００９３】
パルプ及び紙産業
本発明の酵素は、特に、紙産業における製紙用パルプを生成する方法等の多くの産業プロセスに用いられ得る。
【００９４】
特定の実施形態において、本発明は、本発明の酵素を用いることによるパルプ化の方法、リパルピングの方法を提供する。
【００９５】
特定の実施形態において、本発明の方法は、例えば本発明のキシラナーゼを用いることによる製紙プロセスの前に木材パルプの無塩素漂白を可能とする。
【００９６】
また、本発明は、より高いパルプ収率及びエネルギーの節約をもたらすパルプ又は紙クラフト漂白の方法を提供する。そのような方法は、例えば本発明のキシラナーゼを用い得る。
【００９７】
他の実施形態において、本発明は、例えば本発明のセルラーゼを用いることによるセルロース繊維の改変及び紙の質の改善をする方法を提供する。
【００９８】
織物産業
本発明は、本発明の酵素を用いて織物を処理する方法を提供する。その酵素は、織物を織る際若しくはその後、又は糊抜き段階の際、又は更なる織物加工ステップの際に適用され得る。
【００９９】
特定の実施形態において、本発明のセルラーゼは、織物産業及び洗濯洗剤に用いられ得る。
【０１００】
他の特定の実施形態において、本発明のアミラーゼは、例えば織物及び食器におけるデンプンを分解するための衣服洗剤及び食器洗い機洗剤に用いる界面活性剤成分の調製のための界面活性剤産業に用いられ得る。
【０１０１】
樹脂産業
本発明の酵素は、特にプラスチック、塗料、ニス、接着剤等を生成する樹脂産業にも用いられ得る。この点に関して、プラスチック、塗料、ニス、接着剤及び他の合成品を生成するための樹脂産業に用いられ得る好ましい酵素は、上記の糖のポリマーを生成することが可能な本発明のアミラーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼである。この点に関して、最も効果的な酵素は、１５までの単糖類から構成されるポリマー、好ましくは二糖類、三糖類及び四糖類を生成することが可能である。
【０１０２】
パン産業
特定の実施形態において、本発明の酵素（例えばキシラナーゼ）は、生地改良剤における重要な材料として、又は生地被加工性及び吸水性の改善のために用いられ得る。
【０１０３】
他の特定の実施形態において、本発明のアミラーゼ酵素は、（小麦粉で見られる）デンプン等の複合糖質を単糖類に分解するために、例えばパン製造等における生地の生成に用いられ得る。単糖類はさらにアルコールとＣＯ２に改変される。従って、本発明のアミラーゼは、パンの製造プロセスをより速くすることができ、商業的使用のためにより実践的にすることができる。本発明のアミラーゼは、生地から調製される及び小麦粉が含む栄養物に香りを加えるために用いられ得る。
【０１０４】
医薬的適用
本発明の酵素は、医薬分野にも用いられ得る。例えば、本発明のセルラーゼは、ヒトの胃内で発見されるセルロース胃石である、植物胃石を処理するのに用いられ得る。本発明のアミラーゼは、医学的診断の目的で用いられ得る。
【０１０５】
分子生物学において、本発明のアミラーゼは、例えばレポーターコンストラクト、及び抗生物質耐性の組み込みが成功したものを選択する方法のツールとして用いられ得る。例えば、レポーター遺伝子がアミラーゼ遺伝子の相同領域により隣接されている場合、組み込みが成功すると、アミラーゼ遺伝子を破壊し、ヨウ素染色を介して容易に検出できるデンプンの分解を防止できるだろう。
【０１０６】
本発明は、上記の適用の全てのための、本明細書における上記の酵素、核酸、ベクター若しくは細胞又はそれらの組み合わせの使用に関する。
【０１０７】
それらの活性、構造及び物理化学的特性のため、本発明の酵素は、種々の産業、農業、化学、生物工学及び医学分野に使用するための新規で高い有益性がある産物である。ディノコッカス又はその関連細菌由来のそのような酵素は、バイオマス分解プロセス、バイオエネルギーの生成、パルプ及び紙産業、織物産業、界面活性剤産業、パン産業、並びに化学及び医学分野で当業者により適用される他の従来の酵素の活性と比較して高い触媒活性を示す。
【０１０８】
その酵素は、単一で又は組み合わせで用いられ得る。この点に関して、本発明は、上記の少なくとも２つの酵素を含む組成物に関する。組み合わせで用いる場合、その酵素は、同時に又は経時的に組み合わせられ得る。例えば、２つ又はそれ以上の酵素は、組成物中で組み合わせられてもよく、その組成物はバイオマス若しくは炭素源に添加され得る、又は上述のリアクターに添加され得る。
【０１０９】
代替的に、２つ又はそれ以上の酵素は、反応に組み合わせられた酵素活性を提供するために上記バイオマス、炭素源又はリアクターに経時的に添加され得る。同様に、組み合わせられた酵素をコードする又は発現する核酸、ベクター又は細胞が用いられ得る。また、全細胞の代わりに、その細胞の酵素的に活性なライセート又は上清等の抽出物が用いられ得る。本発明の酵素は、さらに他の本技術分野において周知の酵素、開示された酵素又は入手可能な酵素と組み合わせられ得る。
【０１１０】
条件に依存して、バイオマス又は基質は、単独の本発明の産物と、又はそれと他の酵素若しくは微生物との組み合わせと接触され得る。効率的にバイオマスを実質的なバイオエネルギー産物又は代謝物質に改変するために、最初に用いられる酵素又は細菌の適切な量は、細菌の型、バイオマスの型及び培養条件に依存して当業者により調整され得る。
【０１１１】
特定の実施形態において、本発明の方法は、バイオマスの改変のリアクター内で行われる。「リアクター」は、バイオマスの改変のための従来の発酵タンク、装置又はシステムを意味し、通常、バイオリアクター、バイオフィルター、回転生物接触機、並びに他の気相及び／又は液相バイオリアクターから選択される。本発明に従って用いられ得る装置は、連続的に又はバッチ毎に用いられ得る。
【０１１２】
リアクターにおいて、本発明の方法を実行するために、少なくとも１つの本発明の酵素、細菌又は細菌抽出物が用いられ、そのリアクターは、その酵素又は細菌が利用可能となるように、その中の物理化学的条件が調整され、また、維持されるように準備され、提供されている。
【０１１３】
用いられる細菌に依存して、その方法は好気条件、嫌気条件又は低好気条件下で行われ得る。
【０１１４】
共生培養物
本発明の更なる態様は、改善された特性を有する微生物の共生培養物に関する。特に、本発明は、ディノコッカス細菌を用いた共生培養物に関し、共生培養物は、酵素活性又は物理化学的特性を改善してきた。特定の実施形態において、本発明は、少なくとも２種の別の微生物の共生培養物に関し、その微生物の少なくとも１種はディノコッカス細菌であり、その微生物の少なくとも１種は原核細胞又は真核細胞であり、それらの少なくとも２種の微生物は互いに共生し、その少なくとも１種のディノコッカス細菌は本発明に係る酵素活性を示す。
【０１１５】
その原核細胞又は真核細胞は、例えば細菌、酵母、植物細胞、真菌及び哺乳動物細胞から選択され得る。酵母の例は、以下のものに限られないが、Saccharomyces, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Pichia等を含む。細菌の例は、ディノコッカス細菌, Bacillus sp., E. Coli, Clostridium sp.等を含む。２種の微生物は、両方が生存及び増殖のために他方を必要とする場合、互いに共生とみなされる。本発明の共培養物は、３種又は４種等の２つ以上の別の微生物を含む。また、共生培養は、同時又は経時的、好ましくは同時であり得る。
【０１１６】
この点に関して、本発明の特定の対象は、少なくとも２種の微生物の培養物であり、その微生物の少なくとも１種はディノコッカス細菌であり、その微生物の少なくとも１種は酵母であり、その少なくとも１種はディノコッカス 細菌は本発明に係る酵素活性を示す。
【０１１７】
これらの共生培養物は、酵素活性の改善された範囲を提供し、産業的プロセスのための有益な産物となる。
【０１１８】
本発明の更なる態様及び利点は、本発明を詳説する以下の実施例に開示される。
【０１１９】
（実施例）
材料及び方法
選択試験及び培養培地成分
１６７サーマス培地
2013544086.tif 000002
【０１２０】
リン酸緩衝液
2013544086.tif 000003
【０１２１】
最少培地の成分
- MOPS buffer 1X (ph7) 、以下のものを含む：酸性MOPS緩衝液40 mM,  NH4Cl  20mM, KOH 10 mM, NaOH 10 mM, CaCl2 0.5μM, Na2SO4 0.276 mM, MgCl2 0.528 mM. 
- 微量栄養素の溶液(pH5): (NH4)6(MO7)24 3nM, H3BO3 400 nM, CoCl2 30 nM, CuSO4 10, nM,MnCl2 250 nM, ZnSO4 10 nM. 
- ビタミン溶液, pH4.0, (1μg/l each): D-ビオチン, ナイアシン, ピリドキサール-HCl, チアミン-HCl,ビタミンB12
- リン酸溶液: K2HPO4 5.7 mM 
- FeCl3 20 μM (クエン酸ナトリウムで調製し、その後濾過した。)
実施例１  セルロース分解活性を有する酵素の同定（図１）
ディノコッカス spを、濾過されたｐＨ７のMOPS緩衝液:酸性MOPS緩衝液 40 mM (Sigma, France), (NH4Cl 20 mM, KOH10 mM, NaOH 10 mM, CaCl2 0.5 μM, Na2SO40.276 mM, MgCl2 0.528 mM), ｐＨ５の微量栄養素溶液((NH4)6(MO7)243 nM, H3BO3 400 nM, CoCl230 nM, CuSO4 10 nM, MnCl2 250 nM,ZnSO4 10 nM), pH4のビタミン溶液 (1 μg/Lof D-ビオチン, ナイアシン, ピリドキサール-HCl, チアミン-HCl及び ビタミンB12), K2HPO4 溶液5.7 mM 、並びにFeCl3溶液 20 μM （溶媒はNaH2(C3H5O(COO)3)）により構成された最小培養培地に播種した。ワットマンＩフィルターの１枚を単一の炭素源として加えた。
【０１２２】
細菌を４５℃又は３０℃で増殖させた。濾紙の分解を２８日間観察した。これらの条件下で増殖する能力、及びワットマンＩフィルター紙を分解する能力を有する菌株を単離し、及びセルロース分解性として選定した。さらに、無細胞培養上清に対して、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）からグルコースを放出するための能力の試験を行った。
【０１２３】
図１Ａは、ＤＲＨ４６及びＭ１−３Ｈ菌株が濾紙を分解することを示す。さらに、この分解は、強いセルロース分解活性と関連する（図１Ｂ）。
【０１２４】
関連する酵素を特徴付け、これらのセルロース分解性酵素のアミノ酸配列は本願に記載されている：
−Ｍ１−Ｈ３からのセロビオヒドラーゼ（エンドセルラーゼ加工性）はSEQ ID NOs: 1 (部分的配列) 及び60 (全長 自然変異体)で示される；
−ＤＲＨ４６からの２つのエンドグルカナーゼはSEQ ID NOs: 2及び70のそれぞれで示される。
【０１２５】
コードする核酸配列は単離され、SEQID NOs: 13（SEQ ID NO: 1のセロビオヒドラーゼをコードするヌクレオチド配列）、14（SEQ ID NO: 2のエンドグルカナーゼをコードするヌクレオチド配列）、69（SEQ ID NO:70のエンドグルカナーゼをコードするヌクレオチド配列）及び59（SEQ ID NO: 1のセロビオヒドラーゼをコードするヌクレオチド配列）のそれぞれで示される。これらの核酸をpETDEST42発現ベクターにクローン化し、そのベクターを含む組み換え細菌を生成及び維持した。
【０１２６】
実施例２  アミラーゼ分解活性を有する酵素の同定
ディノコッカス spを、濾過されたｐＨ７のMOPS緩衝液:酸性MOPS緩衝液 40 mM (Sigma, France), (NH4Cl 20 mM, KOH10 mM, NaOH 10 mM, CaCl2 0.5 μM, Na2SO40.276 mM, MgCl2 0.528 mM), ｐＨ５の微量栄養素溶液((NH4)6(MO7)243 nM, H3BO3 400 nM, CoCl230 nM, CuSO4 10 nM, MnCl2 250 nM,ZnSO4 10 nM), pH4のビタミン溶液 (1 μg/Lof D-ビオチン, ナイアシン, ピリドキサール-HCl, チアミン-HCl及び ビタミンB12), K2HPO4 溶液5.7 mM 、並びにFeCl3溶液 20 μM （溶媒はNaH2(C3H5O(COO)3)）により構成された最小培養培地に播種した。ジャガイモからの可溶性デンプンを、最終濃度０．５％(w/v)で単一の炭素源として加えた。
【０１２７】
細菌を好気条件で増殖させる。デンプンを含む最小培地において４５℃で増殖される菌株の動的な増殖を、５０時間以上のＯＤ６００ｎｍの測定により観察した。そのような条件下において増殖する能力を有する細菌を単離し、アミラーゼ分解性として選定した。さらに、無細胞培養上清を用いて、ＤＮＳ法を用いることによってデンプンから還元糖の単糖類（グルコース）を放出するそれらの能力を試験する、又はCeralpha法(K-cera; Megazyme)を用いることにより、ｐ−ニトロフェニルマルトサッカライドからｐ−ニトロフェニルを放出するそれらの能力を試験する。
【０１２８】
我々の結果は、M23r-2A,DRH38 及びMC2-2Aの菌株が単一の炭素源としてのデンプンの存在下で急速に増殖することを示す（図２）。さらに、我々は、M23r-2Aの急速な増殖が強いアミラーゼ分解活性と関連することを示す（図３）。
【０１２９】
M23r-2Aを用いて、我々は、αアミラーゼ酵素を同定することができた。デンプンを分解できるこの酵素のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 3に示される。さらに、我々の結果は、この酵素の配列が既知のアミラーゼの配列と異なることを示す。
【０１３０】
また、我々は、ＤＲＨ３８から、グルカン１，４−αグルコシダーゼ又はグルコアミラーゼを同定した。デンプンを分解できるこの酵素のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 4に示される。さらに、我々の結果は、この酵素の配列が既知のアミラーゼの配列と異なることを示す。
【０１３１】
また、我々は、MC2-2Aから、グルカン１，４−αグルコシダーゼ又はグルコアミラーゼを同定した。デンプンを分解できるこの酵素のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 5に示される。さらに、我々の結果は、この酵素の配列が既知のアミラーゼの配列と異なることを示す。
【０１３２】
それらをコードする核酸配列を単離し、それらは、それぞれSEQ ID NOs: 15-17で示される。
【０１３３】
さらに、我々はM23-3A菌株から他のαアミラーゼ酵素を同定した。この酵素のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 62で示される。それをコードする核酸配列を単離し、それはSEQID NO: 61で示される。この核酸をpETDEST42発現ベクター内にクローン化し、そのベクターを含む組み換え細菌を生成し、維持した。
【０１３４】
また、我々はM23-3A菌株からグルコアミラーゼ酵素を同定した。アミロペクチン及びデンプンを分解できるこの酵素のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 58で示される。その結果は、さらにこの酵素の配列が既知のアミラーゼの配列と異なることを示す。それをコードする核酸配列を単離し、それはSEQ ID NO: 57で示される。この核酸をpETDEST42発現ベクター内にクローン化し、そのベクターを含む組み換え細菌を生成し、維持した。
【０１３５】
実施例３  キシラン分解活性を有する酵素の同定
ディノコッカス spを、濾過されたｐＨ７のMOPS緩衝液:酸性MOPS緩衝液 40 mM (Sigma, France), (NH4Cl 20 mM, KOH10 mM, NaOH 10 mM, CaCl2 0.5 μM, Na2SO40.276 mM, MgCl2 0.528 mM), ｐＨ５の微量栄養素溶液((NH4)6(MO7)243 nM, H3BO3 400 nM, CoCl230 nM, CuSO4 10 nM, MnCl2 250 nM,ZnSO4 10 nM), pH4のビタミン溶液 (1 μg/L の D-ビオチン, ナイアシン, ピリドキサール-HCl, チアミン-HCl及び ビタミンB12), K2HPO4 溶液5.7 mM 、並びにFeCl3溶液 20 μM （溶媒はNaH2(C3H5O(COO)3)）により構成された最小培養培地に播種した。カバ材のキシランを０．５％(w/v)の最終濃度で単一の炭素源として添加した。
【０１３６】
細菌を好気条件で増殖させる。カバ材キシランを含む最小培地において４５℃で増殖される菌株の動的増殖を、５０時間以上ＯＤ６００ｎｍを測定することにより観察した。そのような条件下で増殖する能力を有する細菌を同定し、単離し、キシラン分解性として選定した。さらに、無細胞培養上清を用いて、カバ材キシランから還元糖の単糖類（キシロース）を放出するそれらの能力を試験する。放出されたキシロースの量を以前に記載されている(Miller G.L 1959)ようなＤＮＳ（３，５−ジニトロサリチル酸）を用いて決定した。１分毎に１μｍｏｌのキシロースを生成する活性を１ユニットと定義した。
【０１３７】
我々の結果は、MC3-4A,DRH38及びDRH46菌株が単一の炭素源としてのカバ材キシランで急速に増殖し、強いキシラン分解性酵素をコードすることを示す（図４）。対応する酵素を同定し、特徴付けた。それらの酵素は、
−SEQ ID NO: 6で示されるアミノ酸配列を有する、MC3-4A菌株由来のエンドキシラナーゼ（エンド１，４−β−グルカナーゼ）；
−SEQ ID NO: 7で示されるアミノ酸配列を有する、DRH-38菌株由来のグリコシドヒドロラーゼ；
−SEQ ID NO: 8で示されるアミノ酸配列を有する、DRH-46菌株由来のβキシロシダーゼ；及び
−SEQ ID NO: 9-12及び68でそれぞれ示されるアミノ酸配列を有する、DRH-46菌株由来の５つの別のアラビノフラノシダーゼである。
【０１３８】
それらをコードする核酸配列は、単離され、それぞれSEQ ID NOs: 18-24及び67で示される。これらの核酸をpETDEST42発現ベクター内にクローン化し、そのベクターを含む組み換え細菌を生成し、維持した。
【０１３９】
実施例４  ＡＣＤＨ活性を有する酵素の同定
ディノコッカス細菌を４５℃又は３０℃で増殖する。無細胞培養上清を以下のプロトコールに従って試験した。試験された反応は以下の通りである。
アセチルCoA +s-NAD(P) --> アセトアルデヒド + s-NAD(P)H
その反応を、速度決定のための連続的分光光度法を用いて、25°C,pH = 8.5, A340nmで試験する。以下の試薬を用いる（初期濃度）。
【０１４０】
試薬Ａ：100 mM グリシン/NaOH, pH 8.5;
試薬Ｂ：0,4 mM アセチル CoA；
試薬Ｃ：10mM NaOH(s-NADH)で還元された1 mM s-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド;
試薬Ｄ：酵素溶液(細胞粗抽出物又は精製タンパク質)；
試薬Ｅ：ＢＳＡ（ブランク）。
【０１４１】
プロトコール
マイクロプレートに以下の試薬をピペットで移す（μｌ）。
【０１４２】
試験      ブランク
試薬Ａ（緩衝液）            １５０    １５０
試薬Ｂ（アセチルCoA）        ７５      ７５
試薬Ｃ（β−ＮＡＤＨ）        ６０      ６０
マイクロプレートを撹拌し、２５℃に平衡させる。適当に温度制御された分光光度計を用いて一定になるまでＡ３４０ｎｍを観察した。その後、１５μｌの試薬Ｄ(酵素溶液)、１５μｌの試薬Ｅ（ブランク）を加える。
【０１４３】
反転によりすぐに混合し、約６分間、Ａ３４０ｎｍの増大を記録する。試験とブランクとの両方の１分から６分の範囲を用いてΔA340nm/分を得る。
【０１４４】
その結果は、試験されたDRH05及びM23r-2A菌株が実質的にＡＣＤＨ活性を示すことを示している。対応する酵素を特徴付け、これらのＡＣＤＨ酵素のアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NOs: 27-31で示される。
【０１４５】
それらをコードする核酸配列は単離され、それぞれSEQ ID NOs: 42-46で示される。これらの核酸をpETDEST42発現ベクター内にクローン化し、そのベクターを含む組み換え細菌を生成し、維持した。
【０１４６】
実施例５  ＡＤＨ活性を有する酵素の同定
ディノコッカス細菌を４５℃又は３０℃で増殖する。無細胞培養上清を以下のプロトコールに従って試験する。試験された反応は以下の通りである。
エタノール+ s-NAD(P)--> アセトアルデヒド + s-NAD(P)H
その反応を、速度決定のための連続的分光光度法を用いて、25°C,pH = 8.8, A340nmで試験する。以下の試薬を用いる（初期濃度）。
【０１４７】
試薬Ａ：50 mM リン酸ナトリウム緩衝液, pH 8.8;
試薬Ｂ：エタノール又はブタン−１−オール又はその他；
試薬Ｃ：15mM β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド溶液(s-NAD)。同じくs-NADP；
試薬Ｄ：酵素溶液(細胞粗抽出物又は精製タンパク質)；
試薬Ｅ：0.1% BSA含有10 mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH7.5, 25℃（ブランク）。
【０１４８】
プロトコール
マイクロプレートに以下の試薬をピペットで移す（μｌ）。
【０１４９】
試験      ブランク
試薬Ａ（緩衝液）            １３０    １３０
試薬Ｂ（アルコール）         １０      １０
試薬Ｃ（β−ＮＡＤ）        １５０    １５０
マイクロプレートを撹拌し、２５℃に平衡させる。適当に温度制御された分光光度計を用いて一定になるまでＡ３４０ｎｍを観察した。その後、１０μｌの試薬Ｄ(酵素溶液)、１０μｌの試薬Ｅ（ブランク）を加える。
【０１５０】
反転によりすぐに混合し、約６分間、Ａ３４０ｎｍの増大を記録する。試験とブランクとの両方の１分から６分の範囲を用いてΔA340nm/分を得る。
【０１５１】
その結果は、試験されたDRH05及びDRH46菌株が実質的にＡＤＨ活性を示すことを示している。対応する酵素を特徴付け、これらのＡＤＨ酵素のアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NOs: 32-41で示される。
【０１５２】
それらをコードする核酸配列は単離され、それぞれSEQ ID NOs: 47-56で示される。これらの核酸をpETDEST42発現ベクター内にクローン化し、そのベクターを含む組み換え細菌を生成し、維持した。
【０１５３】
実施例６  組み換え酵素の生成
実施例２で述べたように、SEQID NO : 3を含むM23r-2A由来のαアミラーゼをコードする核酸を従来の組み換え技術に従ってpETDEST42ベクター内にクローン化した。そのベクターにおいて、その核酸を、組み換えタンパク質の精製を容易にするために、6(His)タグと共にフレーム内にクローン化する。
【０１５４】
組み換え核酸を有するE.coli細胞を４Ｌのルリアベルターニ培地で調製及び増殖した。αアミラーゼタンパク質の生成の誘導を、1 mM IPTGの存在下において、３０℃で一晩行った。培養液の遠心分離の後、細胞を50mMTris HCl緩衝液 pH8, 300mM NaCl, 5mM イミダゾール, 5% グリセリン, 0.5mM PMSF, 1mg/ml リゾチームに再懸濁し、超音波処理により破壊した。細胞の破片を遠心分離により除去し、その上清を回収し、His-Trap親和性クロマトグラフィーカラム(HisTrap HP カラム)にアプライした。組み換えαアミラーゼを含む分画を、300mMイミダゾール, 300mM NaCl, 50mM Tris HCl pH8を含む緩衝剤により溶出した。組み換えαアミラーゼを含む分画を、50mM pH8 Tris HCl, 50mM NaCl, 5%グリシンに対して透析した。
【０１５５】
M23r-2A由来のαアミラーゼを、4mg/l培養液の量に対して９０％の均一性に精製した。図６Ａは、約４９ｋＤａの分子量を有するタンパク質が正しく発現したことを示す。
【０１５６】
同様に、図８は、本発明の組み換えＡＤＨｓ（ＡＤＨ1-5はそれぞれSEQ ID NO: 32-36である）が正しく発現され、精製されていることを示す。
【０１５７】
以下の実施例で特徴付けられる全ての組み換え酵素は、上述のように精製及び精製された。
【０１５８】
実施例７  SEQ ID NO:3の組み換えアミラーゼの活性
pETDEST42ベクター内にクローン化されたM23r-2A 由来のαアミラーゼをコードする組み換え核酸を含むE.coliを、単一の炭素源として０．５％デンプンを含む最小培地において１ｍＭＩＰＴＧの存在下又は非存在下で増殖させた。培養液のアリコートを遠心分離により細胞を除去した後の培養液上清においてαアミラーゼ活性を測定するために、３日間及び６日間増殖させた。
【０１５９】
αアミラーゼ活性を、（ブロッキング基の存在のためネイティブ基質に作用しない）過剰レベルの熱安定性αグルコシダーゼの存在下で、非還元端ブロック化ｐ−ニトロフェニルマルトヘプトシド（ＢＮＰＧ７）のオリゴ糖を基質として用いるCeralpha法(K-cera 08/05, Megazyme)を用いることにより評価した。エンドアクティングαアミラーゼによるオリゴ糖の加水分解で、過剰量のαグルコシダーゼは、ｐ−ニトロフェニルマルトサッカライド断片のグルコース及び遊離ｐ−ニトロフェノールへの定量的加水分解を示す。
【０１６０】
粗酵素（無細胞培養液上清）又は精製αアミラーゼ（実施例６の方法の後におけるペプチドシグナルがない可溶性サイトゾル分画から精製されたもの）を、2.5 mM Ca2+の存在又は非存在下で50mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7に含まれる109 μg BNPG7基質と共に４５℃で３０分間インキュベートした。その反応を３００μｌのリン酸３ナトリウム(Na3PO4)１％溶液pH11の添加により、室温で停止した。次に、溶液の吸光度を４００ｎｍで計測した。粗酵素でなく水を含む反応ブランクを上記のように処理した。ｐ−ニトロフェノール(10 mM, Sigma Aldrich, N7660)を、検量性の作製のために用いた。
【０１６１】
活性の１ユニットを、過剰な熱安定性αグルコシダーゼの存在下において、上記のアッセイ条件下での１分間にＢＮＰＧ７から１マイクロモルのｐ−ニトロフェノールを放出するのに必要な酵素の量として定義する。上清のタンパク質濃度を、MicroBCアッセイ(Interchim)を用いて販売者により示されるように決定し、ＢＳＡをスタンダードとした。
【０１６２】
その結果を図５及び図６に示す。図５Ａに示すように、組み換え細胞は、酵素の誘導にのみ基づき単一の炭素源としてデンプンの存在下で増殖され得る。さらに、図５Ｂは、精製デンプンでタンパク質のαアミロース分解活性を確認する。図６Ａは、約４９ｋＤａの分子量を有するタンパク質が正常に発現されていることを示し、図６Ｂは、そのタンパク質がその試験条件において、約20 IU/mgの活性を示す。従って、それらの結果は、組み換え酵素が十分に活性であり、強いアミラーゼ活性を示すことを明確に証明する。
【０１６３】
さらに、デンプンからの還元単糖類（マルトース）を放出する無細胞培養液上清の能力を試験するために、αアミラーゼ活性を、ＤＮＳ法（表１Ａ）を用いることにより評価した。
【０１６４】
【表１Ａ】
2013544086.tif 000004
【０１６５】
表１Ａは、試験条件において(45°C, pH=7)、SEQ ID NO: 3の組み換えアミラーゼは、αアミラーゼ組み換え酵素が十分に活性で、強いアミロース分解活性を示すことを確認する約30 U/mgの活性を示していることを表示する。
【０１６６】
組み換えαアミラーゼの活性を、以下の表１Ｂに示された他の試験条件で特徴付けた。
【０１６７】
【表１Ｂ】
2013544086.tif 000005
【０１６８】
表１Ｂは、SEQ ID NO: 3の組み換えアミラーゼが試験条件(≦40°C, pH=9)において、組み換えアミラーゼが十分に活性で、強いアミロース分解活性を示すことを確認する約100 U/mgの活性を示すことを表示する。
【０１６９】
温度効果及びＣａ２＋効果
酵素の熱不活性化を、5mM Ca2+の存在下又は非存在下においてウォーターバスで６０℃、１時間行った。サンプルを、5 mM Ca2+の存在下又は非存在下において、上記のように酵素アッセイを行う前に、５分間氷上で冷却した。維持された活性をじょうきのように45℃、pH7で測定した。非加熱サンプルを１００％とした。
【０１７０】
その結果を図７で示す。それらは、5 mM Ca2+の添加が精製アミラーゼの熱安定性を増大すること、及びカルシウムの存在下で組み換え酵素が６０℃で１時間処理後であっても活性であることを示す。さらに、上記表１Ｂに示すように、組み換えアミラーゼが６０℃で２時間処理後であっても活性である。
【０１７１】
ＨＰＬＣ分析
他の試験において、ゼラチン化されたSigmaデンプンを、M23-3A菌株及びM23-3A菌株からのSEQ ID NO: 3の組み換え酵素の加水分解パターンを決定するための基質として用いた。２４時間の加水分解後、加水分解産物をＨＰＬＣにより分析した。基質のゼラチン化を、８８℃で９０分間行った。ゼラチン化の後、デンプン懸濁液を４５℃に調節し、緩衝液を加えた。
【０１７２】
加水分解を5 mM CaCl2含有100 mM HEPES緩衝液(pH 8.0)で行った。 サンプルの体積を1.0 mlとした。基質濃度をゼラチン化デンプンで２重量％にした。酵素のローディングを0.1 Ceralpha U/mlとした。M23-3Aの培養上清を、Vivaspin 20遠心濃縮機(5000 MWCO PES) を用いて分析する前に、約２０倍濃縮し、緩衝液は5 mM CaCl2含有100 mM HEPES (pH 8.0)にチャージさせた。
【０１７３】
濃縮されたサンプルのCeralpha活性を、5.0 mM CaCl2含有100 mM HEPES緩衝液pH7.0で決定した。４５℃で２４時間のインキュベート後、加水分解反応を、100 μlの1 M NaOHの添加により停止させた。サンプルを遠心分離(15分, 3000 rpm)し、濾過した(Syringe Filter Acrodisc, GHP/PF, 45um, 25mm, Pall Life Science)。加水分解産物をCarboPac PA-1 guard及び分析カラムを用いたＨＰＬＣにより分析した。
【０１７４】
図７Ｂに示すように、M23-3A菌株からの組み換え酵素は、主にグルコース物質をもたらし、一方、参照酵素Termamyl 120Lはグルコースをもたらすことはできない。
【０１７５】
最適ｐＨ
色素で標識され、架橋されたデンプンを基質(Ceralpha,Amylazyme, Megazyme)として用い、以下の緩衝液と共に４５℃で２０分間インキュベートした。
100 mM酢酸ナトリウム−酢酸  (pH範囲3.8-5.8)
100 mMＭＯＰＳ−ＮａＯＨ  (pH範囲6.8-7.8)
100 mMグリシン−ＮａＯＨ  (pH範囲8.8-10.8)
全ての緩衝液は5 mM CaCl2を含む。
【０１７６】
粗酵素（M23-3A培養上清）はpH7.0で最も高い活性を示し、一方、精製組み換えM23-3Aはグリシン−ＮａＯＨ緩衝液のpH9.0（図１３に示す）で最も高い活性を示した。ＭＯＰＳ緩衝液において、最適ｐＨは約８．０であった（図１４）。
【０１７７】
緩衝液効果
酵素のCeralpha基質活性を種々の緩衝液で決定した。基質を50 mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0に溶解した。酵素を以下のいずれかで希釈した。
蒸留水
50又は100 mMＨＥＰＥＳ緩衝液 pH 7.0
50又は100 mMＭＯＰＳ緩衝液 pH 7.0
保存液：50 mM Tris-HCl + 50 mM NaCl + 5%グリセロール, pH 7.0又はpH 8.0
（以下の表２に示すように）酵素をＨＥＰＥＳ緩衝液で希釈した場合、最も高い活性を得た。
【０１７８】
【表２】
2013544086.tif 000006
【０１７９】
MOPS (pH7.0)に5mMCaCl2を添加し、リン酸ナトリウムを検体から除去した場合、より高い活性を得た。そのような条件において、希釈に従って、118.3U/mlから69.6 U/mlの範囲の酵素活性を示した。
【０１８０】
10 mMCaCl2含有200 mM HEPES (pH 7.0)において、酵素活性は170U/mlであった。
【０１８１】
精製M23-3Aαアミラーゼの熱安定性
精製M23-3Aαアミラーゼの熱安定性を、円偏光二色性分光を用いて検討した。スペクトルを、5mMCaCl2の存在下で10mM HEPES緩衝液 (pH 7.0)で記録した。タンパク質濃度は2.9 μMで、波長は222 nmであった。
【０１８２】
その結果を図１５に示す。酵素の見かけの熱転移温度(T1/2)は６９℃であった。ＣＤスペクトルによると、酵素は折り畳まれている。従って、これらの結果は、組み換え酵素が十分に活性で、強いアミラーゼ活性を示すことを明確に証明する。
【０１８３】
実施例８  SEQ ID NO:58の組み換えグルコアミラーゼの活性
pETDEST42ベクター内にクローン化されたSEQ ID NO: 58の組み換えグルコアミラーゼ（M23-3A菌株由来）をコードする組み換え核酸を含むE.coliを調製し、４Ｌのルリアベルターニ培地で増殖させた。グルコアミラーゼタンパク質生成の誘導を、1 mM IPTGを含む４Ｌのルリアベルターニ培地を用いて３０℃で一晩中行った。培養液の遠心分離後、細胞を50mM Tris HCl緩衝液pH8, 300mM NaCl, 5mM イミダゾール, 0.5mM PMSF, 1mg/ml リゾチームに懸濁し、超音波処理により破壊した。細胞の破片を遠心分離により除去し、上清を回収し、Cobalt His-Trap親和性クロマトグラフィーカラム (HisTrap HPカラム)にアプライした。組み換えグルコアミラーゼを含む分画を50mM Tris HCl緩衝液pH8, 50mMイミダゾール, 300mM NaClを含む緩衝液を用いて溶出した。続いて、組み換えグルコアミラーゼを含む分画を、50mM Tris HCl pH8緩衝液， 50mM NaCl, 5% グリセリンに対してHi-Trap脱塩カラムを用いて脱塩した。
【０１８４】
M23-3A由来のグルコアミラーゼを９０％の均一性に精製した。
【０１８５】
グルコアミラーゼ活性を、基質としてデンプン(Fluka 85649)を用いることにより評価した。インキュベーションの間に放出されるグルコースを、スタンダードとしてグルコースを用いるグルコースキット(Roche 11448676)で定量した。
【０１８６】
反応を、20mM酢酸ナトリウム緩衝液pH5.0中において、６０℃で１０分間行った。活性の１ユニットを、上記のアッセイ条件下で１分間に基質から１マイクロモルのグルコースが放出されるのに必要な酵素量で定義した。その結果を以下の表３に示す。
【０１８７】
【表３】
2013544086.tif 000007
【０１８８】
表３は、組み換えグルコアミラーゼが試験条件下(60°C, pH=5)で35.1 U/mgの活性を示すことを表している。
【０１８９】
これらの結果は、SEQ ID NO: 58のグルコアミラーゼ組み換え酵素が十分に活性であり、強いアミロース分解活性を示すことを証明する。
【０１９０】
実施例９  SEQ ID NO: 60のエンドグルカナーゼの活性
pETDEST42ベクター内にクローン化されたSEQID NO: 60のエンドグルカナーゼをコードする組み換え核酸を含むE.coliを、炭素源としてセルロースを含む最小培地に1mM IPTGを含む、又は含まない培地で増殖させる。遠心分離による細胞の除去後の上清におけるエンドグルカナーゼ活性を測定するために、増殖後３日目及び６日目に培養液のアリコートを取った。
【０１９１】
酵素活性を、１０分の反応期間における最初の反応速度に基づいて５０℃でアッセイする。反応混合液(0.5 mL)は、1 mmol/L CaCl2を含む50 mmol/L 2-N-モルフォリノ-エタンスルホン酸 (MES)緩衝液(pH 6.0)中の1% (wt/vol)の基質(例えばAvicel PH-105, RAC, カルボキシメチルセルロース)を含む。反応における酵素濃度は、他に断らない限り、2 μg/mL (〜20 nmol/L)である。反応は、５分間沸騰させることにより停止させる。遠心分離の後、上清のアリコートを還元糖の放出のためのアッセイをした。
【０１９２】
還元糖の濃度を、スタンダードとしてグルコースを用い、Zhang等(Zhang 及び Lynd, 2005)により記載される修飾を有する2,2′-ビシンコニン酸法(Waffenschmidt及びJaneicke, 1987)により決定し、還元反応温度（７５℃）は混合セロデキストリンの還元糖末端のためのより正確な結果を生むことができる。活性の１ユニットを、１分毎に１μｍｏｌの還元糖を放出する酵素量として定義する。
【０１９３】
20 μg/mLの精製酵素によるＲＡＣ基質の６時間の加水分解の後、可溶性セロデキストリンを、0.4 mL/minの流速でBio-RadHPX-42Aカラム及び屈折率検出器を有する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析する。
【０１９４】
実施例１０  SEQ ID NO: 6の組み換えエンドキシラナーゼの活性
pETDEST42ベクター内にクローン化されたSEQ ID NO: 6のエンドキシラナーゼをコードする組み換え核酸を含むE.coliを調製し、ルリアベルターニ培地で増殖した。グルコアミラーゼタンパク質生成の誘導を、1 mM IPTGを含む４Ｌのルリアベルターニ培地を用いて３７℃で６時間行った。培養液の遠心分離後、細胞を50mMリン酸緩衝液pH7.5, 300mM NaCl, 5mM イミダゾール, 0.5mM PMSF, 1mg/ml リゾチームに懸濁し、超音波処理により破壊した。細胞の破片を遠心分離により除去し、上清を回収し、Nickel His-Trap親和性クロマトグラフィーカラム (HisTrap HPカラム)にアプライした。組み換えエンドキシラナーゼを含む分画を50mMリン酸緩衝液pH7.5, 50mMイミダゾール, 300mM NaClを含む緩衝液を用いて溶出した。続いて、組み換えエンドキシラナーゼを含む分画を、50mM Tris HCl pH8緩衝液， 50mM NaCl, 5% グリセリンに対してHi-Trap脱塩カラムを用いて脱塩した。
【０１９５】
MC3-4A由来のエンドキシラナーゼを、10mg/lの培養液を用いて９０％の均一性に精製した。
【０１９６】
エンドキシラナーゼ活性を、キシラン又は他の基質から還元単糖類（キシロース）を放出する組み換えタンパク質の能力を試験するＤＮＳ法を用いることにより評価した。その反応をマイクロプレート内において５５℃で行った。５０μｌの精製タンパク質を、50 mMクエン酸ナトリウムpH4.5を用いて調製された５０μｌの1% (w/v)カバ材キシラン(Sigma, X0502)又はコムギアラビノキシラン(Megazyme)に加えた。５５℃で３０分間インキュベートした後、150 μlのDNS（3.5ジニトロサリチル酸）溶液の添加により反応を停止した。その後、マイクロプレートを９０℃で３０分間インキュベートし、室温で数分間冷却した。
【０１９７】
ＯＤを540nmで計測した。キシロースの検量線(0.41から8.33 μmol/ml)を、アッセイで生じるキシロースのμmol/mlを決定するために用いた。コントロールのサンプルにおいて、酵素を適当な緩衝液に交換した。エンドキシラナーゼ活性の１ユニットを、上記のアッセイ条件下で１分間に１マイクロモルのキシロースを放出するのに必要な酵素の量を定義する。その結果を以下の表４及び表５に示す。
【０１９８】
【表４】
2013544086.tif 000008
【０１９９】
【表５】
2013544086.tif 000009
【０２００】
表４は、SEQID NO: 6の組み換えエンドキシラナーゼが試験条件(55°C, pH=4.5, 基質としてカバ材キシラン)において、組み換え酵素が十分に活性であると認められる640 U/mgの活性を示すことを表示する。さらに、組み換えエンドキシラナーゼ酵素の活性は、キシラナーゼthermomyces lanuginosusの参照酵素の活性と比較して約１３倍高い。
【０２０１】
表５は、SEQ ID NO: 6の組み換えエンドキシラナーゼが試験条件(55°C, pH=4.5, 基質としてコムギアラビノキシラン)において、組み換え酵素が十分に活性であると認められる350 U/mgの活性を示すことを表示する。さらに、組み換えエンドキシラナーゼ酵素の活性は、キシラナーゼthermomyces lanuginosusの参照酵素の活性と比較して約４７倍高い。
【０２０２】
他の一連の実施形態において、組み換えエンドキシラナーゼ活性を、基質としてRothキシランを用い、ＤＮＳ法を用いて、T.reesei Xyn11A 及びT.maritima Xyn10A等の他の参照酵素の活性と比較した。これらのアッセイを、100μlの酵素(1:500〜1:8000に希釈) 、及び100μl 1 % Rothキシランを含む500 mM酢酸ナトリウムpH 5.0を用いて行った。
【０２０３】
用いた基質は１％カバ材グルクロノキシラン(Roth 7500)であり、放出されたキシロオリゴサッカライドを色素反応で定量化した。そのアッセイを９６ウェルマイクロプレート上で行った。基質の４％（溶媒は水）保存溶液を、アッセイ温度（５５℃）に予め温めた。２５μｌの培養上清及び５０μｌのMcIlvaine緩衝液(pH 3-8)を各ウェルにピペットで移した。プレートを５５℃で５分間温めた後、２５μｌの予め温めた基質を添加した。反応を５５℃で１０分間行った。その反応を１００μｌのＤＮＳ（ジニトロサリチル酸）を添加して修了させた。その反応混合液を９６ウェルＰＣＲプレートにピペットで移し、二つ折りシールで密閉し、ＰＣＲブロックにおいて９８℃で５分間加熱し、氷上で冷却した。１５０μｌの混合液を９６ウェルマイクロタイタープレートにピペットで移し、吸光度を５４０ｎｍで測定した。酵素ゼロ点及び測定ゼロ点を全てのサンプルに適用した。
【０２０４】
純粋キシロースをスタンダードとして用い、そのスタンダードをサンプルと同様に処理した。吸光度を、検量線を用いて酵素活性(U/ml)に変換した。コントロールサンプルにおいて、酵素を適当な緩衝液に交換した。エンドキシラナーゼ活性の１ユニットを、上記のアッセイ条件下で１分間に１マイクロモルのキシロースを放出するのに必要な酵素の量として定義する。これらの試験の結果を以下の表６に示す。
【０２０５】
【表６】
2013544086.tif 000010
【０２０６】
表６は、(607 U/mgの)MC3-4Aからの精製組み換えキシラナーゼの比活性がT.reesei Xyn11Aの比活性よりも約２倍高く、T.maritima Xyn10Aの比活性よりも２０倍高いことを示す。
【０２０７】
加水分解の最適条件
アラビノキシランの加水分解試験において、組み換えエンドキシラナーゼ活性を、参照酵素（すなわち、T.reesei Xyn11A, T.reesei Xyn1及びT.maritima Xyn10A）の活性と比較した。このアッセイを、基質として５ｇ／ｌのコムギアラビノキシラン(Megazymes)を用いて行った。酵素の量を基質１ｇに対して０．０２ｍｇとした。その反応をｐＨ５.０、５５℃で行った。アラビノキシランの加水分解を（図１１Ａに示すように）４時間、２４時間及び４８時間の時点で評価した。還元糖の放出を、基質としてキシロースを用いたＰＨＡＢＡＨで測定した。加水分解速度（ｗ／ｗ）を、測定された可溶性キシロース重量を（キシロースとして計算された）アラビノキシランの初期重量により割って計算した。
【０２０８】
図１１Ａは、本発明の組み換えディノコッカスエンドキシラナーゼMC3-4Aによるアラビノキシランの加水分解の実験的最大値は３３％以上であったことを示す。図１１Ａに示された結果は、本発明の組み換え酵素がT.reesei Xyn11Aよりも約３倍効果的であり、T.maritima Xyn10Aよりも約１１倍効果的であり、T.reesei Xyn1よりも約６３倍効果的であることを示す。
【０２０９】
他の試験において、４８時間の時点のサンプルを、アラビノキシランの加水分解産物を分析するためにＨＰＬＣにより試験した。図１１Ｂに示すように、MC3-4A菌株からの組み換え酵素はキシロビオース及びキシロトリオースを主にもたらす。組み換えエンドキシラナーゼをキシラン加水分解で試験した（図１１Ｃ）。図１１Ｃの写真は、ディノコッカスMC3-4A菌株からの組み換えエンドキシラナーゼがキシラン加水分解活性を明確に示すことを表す。
【０２１０】
最適ｐＨ
アッセイを、50μl Mcllvaine緩衝液pH 3-8, 25μl酵素(20μg/ml)及び25μl 4% Roth キシラン（水が溶媒）を含むマイクロタイタープレートで行った。サンプルを５５℃で１０分間加熱した。１００μｌのＤＮＳを加え、９８℃で５分間インキュベートして反応を停止させた。ＯＤを５４０ｎｍで測定した。MC3-4A菌株から精製組み換えエンドキシラナーゼ酵素は、ｐＨ５．０で最も高い活性を示した。しかしながら、組み換えエンドキシラナーゼの活性は、参照酵素ではほとんど活性が無いような例えばｐＨ４．０を含む広い範囲で高い活性を維持する（図９に示す）。
【０２１１】
最適温度
アッセイを、100μlの組み換え酵素(最終濃度2% g/ml, T.maritima16*g/ml)と、 50mM酢酸ナトリウム pH 5を溶媒とする100μlの2% Rothキシランとを含むマイクロチューブで行った。サンプルを５５℃で１０分間加熱した。２００μｌのＤＮＳを加え、９８℃で５分間インキュベートして反応を停止させた。ＯＤを５４０ｎｍで測定した。図１０に示すように、組み換えエンドキシラナーゼの最適温度曲線では、少なくとも９０％のその活性が５５℃から７０℃の温度範囲で維持しており、最適温度範囲が広い。結論として、MC3-4Aからの組み換えエンドキシラナーゼの最適温度は、参照酵素のT.maritima Xyn10A及びT.reesei Xyn11Aの最適温度よりも広い。
【０２１２】
組み換えエンドキシラナーゼの熱安定性
２４時間以上のMC3-4Aエンドキシラナーゼの温度安定性を検討した。T.reesei Xyn11Aを参照酵素として用いた。種々の温度(すなわち45°C, 55°C, 60°C 及び 65°C)で２４時間インキュベートした後、残りのキシナラーゼ活性をアラビノキシランで測定した。その結果を図１２に示す。組み換え酵素は、５５℃で２４時間処理した後も、まだ活性であり、約２０％の活性を維持している。図１２の結果は、組み換えエンドキシラナーゼMC3-4AがT.reesei Xyn11Aからの参照キシラナーゼよりも安定で効果があることを示す。
【０２１３】
さらに、４８時間のインキュベーション後に、組み換えエンドキシラナーゼMC3-4Aの熱安定性を参照酵素T.reesei Xyn11Aと比較して検討した。その結果を以下の表７に示す。
【０２１４】
【表７】
2013544086.tif 000011
【０２１５】
表７は、本発明の組み換えエンドキシラナーゼ酵素が５０℃で４８時間インキュベートした後もまだ安定であり、一方、参照酵素T.reesei Xyn11Aは、４５℃よりも高い温度でインキュベートすると安定でなくなることを示す。上記の全ての結果は、SEQID NO: 6の組み換えエンドキシラナーゼ酵素が十分に活性であり、強いキシラン分解活性を示すことを証明する。
【０２１６】
実施例１１  アセチルキシランエステラーゼ活性を有する酵素の同定
ディノコッカス spを、濾過されたMOPS緩衝液 pH7:酸性MOPS緩衝液40 mM (Sigma, France), NH4Cl 20 mM, KOH10 mM, NaOH 10 mM, CaCl2 0.5 μM, Na2SO40.276 mM, MgCl2 0.528 mM), 微量栄養素溶液pH5 ((NH4)6(MO7)24 3 nM, H3BO3400 nM, CoCl2 30 nM, CuSO4 10 nM, MnCl2 250 nM,ZnSO4 10 nM), ビタミン溶液 pH4 (1 μg/Lof D-ビオチン, ナイアシン, ピリドキサール-HCl, チアミン-HCl及びビタミンB12),K2HPO4溶液 5.7 mM 並びにNaH2(C3H5O(COO)3)を溶媒とするFeCl3 溶液 20 μM から構成された最小培地に播種した。アセチル化キシランを炭素源として加えた。
【０２１７】
発明者等により得られた結果は、DRH-46菌株がキシラン存在下で増殖することを示す。発明者等は、２つのアセチルキシランエステラーゼ（本明細書ではアセチルキシランエステラーゼn°1 (AXE1)及びアセチルキシランエステラーゼn°2 (AXE2)と呼ぶ）を同定できた。アセチル化キシランを分解できるそれらの酵素のアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO: 64及び66で示される。
【０２１８】
それらをコードする核酸配列は単離され、それらはそれぞれSEQ ID NO: 63及び65で示される。それらの核酸をpETDEST42発現ベクター内にクローン化し、それらのベクターを含む組み換え細菌を生成し、維持した。
【０２１９】
pETDEST42ベクター内にクローン化されたAXE1又はAXE2をコードする組み換え核酸を含むE.coliを調製し、ルリアベルターニ培地で増殖させた。AXE1又はAXE2組み換えタンパク質の生成の誘導を、1 mM IPTGを含む４Ｌのルリアベルターニ培地を用いて３０℃で一晩中行った。培養液の遠心分離後、細胞を50mM Tris HCl緩衝液pH8, 300mM NaCl, 5mMイミダゾール, 0.5mM PMSF, 10mg/mlリゾチームにより再懸濁し、超音波処理により破壊した。細胞の破片を遠心分離により除去し、上清を回収し、Nickel His-Trap親和性クロマトグラフィーカラム (HisTrap HPカラム)にアプライした。組み換えアセチルキシランエステラーゼを含む分画を、200mMイミダゾール, 300mM NaCl, 50mM Tris HCl緩衝液pH8.0, 10%グリセリンを含む緩衝液を用いて溶出した。続いて、組み換えアセチルキシランエステラーゼを含む分画を、50mM Tris HCl pH8緩衝液， 50mM NaCl, 10% グリセリンに対してHi-Trap脱塩カラムを用いて脱塩した。
【０２２０】
DRH-46由来のアセチルキシランエステラーゼAXE1及びAXE2を９０％の均一性に精製した。
【０２２１】
アセチルキシランエステラーゼ活性を、スチーム処理(BFH Hamburg)後カバ材から水と共に抽出されたアセチル化キシロオリゴマー基質(Birkeretentate)を用いて評価した。基質を50 mMクエン酸ナトリウム緩衝液pH 5で調製した (50mg/ml)。
【０２２２】
反応を５０℃で行い、３０μｌの組み換え精製タンパク質を３０μｌの基質（50mg/mlのアセチル化キシロオリゴマー、ＤＰｎが１０）に加えた。アッセイをｐＨ７、５０℃で１時間行った。サンプルを３分間沸騰させることにより反応を停止させた。サンプルを遠心分離し、生成される酢酸をベーリンガーテストコンビネーションキット148261を用いて酵素的に測定した。酵素及び測定ゼロをアプライした。１ユニットの活性を、上記のアッセイ条件下で１分間に基質から１マイクロモルの酢酸を放出するのに必要な酵素の量として定義した。その結果を以下の表８に示す。
【０２２３】
【表８】
2013544086.tif 000012
【０２２４】
表８は、組み換えアセチルキシランエステラーゼAXE1及びAXE2の活性が参照酵素のOrpinomyces sp.アセチルキシランエステラーゼの活性と比較して（それぞれ）３倍から５倍高いことを示す。
【０２２５】
最適ｐＨ
アッセイを５０μｌの基質（αナフチルアセテート）と緩衝液で希釈された５０μｌの酵素を含むマイクロタイタープレートで行った。その後、Varioskanを用いて、２３５ｎｍの吸光度を１０分間測定した。図１８に示すように、DRH-46菌株からの精製組み換えアセチルキシランエステラーゼ酵素は、pH 8 (AXE1)及びpH8-9 (AXE2)で最も高い活性を示した。
【０２２６】
上記の結果の全ては、SEQID NO: 64及び66の組み換えアセチルキシランエステラーゼ酵素は十分に活性であり、強いキシラン分解活性を示すことを証明する。
【０２２７】
実施例１２  SEQ IDNO: 68の組み換えα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの活性
pETDEST42ベクター内にクローン化されたSEQID NO: 68のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼをコードする組み換え核酸を含むE.coliを調製し、ルリアベルターニ培地で増殖させた。E.coli培養で組み換えタンパク質の生成を誘導した。その誘導を、1 mM IPTGを含む４Ｌのルリアベルターニ培地を用いて３０℃で５時間行った。培養液の遠心分離後、細胞を50mM リン酸緩衝液pH7.4, 300mM NaCl, 5mMイミダゾール, 0.5mM PMSF, 1mg/mlリゾチームにより再懸濁し、超音波処理により破壊した。細胞の破片を遠心分離により除去し、上清を回収し、Nickel His-Trap親和性クロマトグラフィーカラム (HisTrap HPカラム)にアプライした。組み換えαＬアラビノフラノシダーゼを含む分画を、300mMイミダゾール, 300mM NaCl, 50mM リン酸緩衝液pH7.4,を含む緩衝液を用いて溶出した。続いて、組み換えαＬアラビノフラノシダーゼを含む分画を、50mM リン酸 pH7.4緩衝液，50mM NaCl, 10% グリセリンに対してHi-Trap脱塩カラムを用いて脱塩した。
【０２２８】
DRH-46由来のαＬアラビノフラノシダーゼを９０％の均一性に精製した。
【０２２９】
アラビノフラノシダーゼ活性を以下のように評価した。
【０２３０】
反応をマイクロプレート内で３０℃で行い、１００μｌの精製タンパク質を１００μｌの基質に加え、基質は、４−メチルウンベリフェリルα−Ｌ−アラビノフラノシド0.01mM（Sigma, ref : M9519を参照）をリン酸ナトリウム50mM pH7で調製した。コントロールサンプルとしては、酵素を適当な緩衝液に置き換えた。スタンダードには、50mMリン酸ナトリウムpH7.0 (0.0005mM-5mM)４−メチルウンベリフェロンナトリウム塩(Sigma, ref: M1508)を用いた。蛍光をBMG labtech Fluoを用いて検出した(励起 355 nm, 発光 460nm)。１ユニットのα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ活性を１分間に１マイクロモルの４−メチルウンベリフェロンを放出するのに必要な酵素の量として定義した。その結果を以下の表９Ａに示す。
【０２３１】
【表９Ａ】
2013544086.tif 000013
【０２３２】
表９Ａは、SEQ IDNO: 68の組み換えα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼが試験条件において、1500 U/mgの活性を示し、組み換え酵素が十分に活性であることを示す。さらに、組み換えα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ酵素の活性は、AspergillusNiger Megazyme E-AFASEの参照酵素の活性と比較して５倍高い。
【０２３３】
組み換えα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの活性を、以下の表９Ｂに示すような他の試験条件で試験した。
【０２３４】
用いた基質を50 mM クエン酸ナトリウム緩衝液 pH 5を溶媒とした2 mM p-ニトロフェニル-α-L-アラビノフラノシド(SigmaN-3641)を用い、基質から放出されたp-ニトロフェニルにより生じた色を４００ｎｍで測定した。アッセイを９６ウェルマイクロタイタープレート上で行った。基質をアッセイ温度（５０℃）に予め温めた。１０μｌの培養上清を各ウェルにピペットで移し、そのプレートを５０℃に温めた後９０μｌの基質を加えた。プレートをサーマルミキサー(Eppendorf)で１０分間インキュベートし、反応を５０μｌの1MNa2CO3を加えることにより停止した。生じた色を分光光度計により４００ｎｍで測定した。酵素及び測定ゼロをアプライした。P-ニトロフェノールをスタンダードとして用い、基質をサンプルと同様に処理した。吸光度を、検量線を用いて酵素活性(U/ml)に変換した。
【０２３５】
【表９Ｂ】
2013544086.tif 000014
【０２３６】
表９Ｂは、SEQ IDNO: 68の組み換えα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼが試験条件において、24.3U/mgの活性を示し、その組み換え酵素が十分に活性であることを示す。
【０２３７】
さらに、組み換えα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ酵素の活性が、AspergillusNiger又は Bifidobacterium sp.の参照酵素のそれぞれの活性と比較して３から３０３倍高い。
【０２３８】
安定性について、４０℃、ｐＨ７でその酵素は２４時間で７０％の活性を維持する。
【０２３９】
上記の結果の全ては、SEQID NO: 68の組み換えα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼが十分に活性で、強いキシラン分解活性を有することを示す。
【０２４０】
実施例１３  SEQ IDNO: 70の組み換えエンドセルラーゼの活性
pETDEST42ベクター内にクローン化されたエンドセルラーゼをコードする組み換え核酸を含むE.coliを調製し、ルリアベルターニ培地で増殖させた。E.coli培養で組み換えタンパク質の生成を誘導した。その誘導を、1 mM IPTGを含む４Ｌのルリアベルターニ培地を用いて室温で一晩中行った。培養液の遠心分離後、細胞を50mM Tris HCl緩衝液pH8, 50mM NaCl, 10% グリセリン, 0.5mM PMSF, 1mg/mlリゾチームにより再懸濁し、超音波処理により破壊した。細胞の破片を遠心分離により除去し、上清を回収し、Nickel His-Trap親和性クロマトグラフィーカラム (HisTrap HPカラム)にアプライした。組み換えエンドセルラーゼを含む分画を、50mM Tris HCl緩衝液pH8, 200mMイミダゾール, 50mM NaClを含む緩衝液を用いて溶出した。続いて、組み換えエンドセルラーゼを含む分画を、50mM Tris HCl緩衝液pH8，50mM NaCl, 10% グリセリンに対してHi-Trap脱塩カラムを用いて脱塩した。
【０２４１】
DRH-46由来のエンドセルラーゼを９０％の均一性に精製した。
【０２４２】
エンドセルラーゼ活性の評価のために用いた基質は、50mM NaAc緩衝液(pH 5)に溶解された２％カルボキシメチルセルロース(CMC)(Sigma)である。アッセイを９６ウェルタイタープレート上で行う。５０μｌの培養上清及び５０μｌの基質を混合し、４０℃で一晩中インキュベートした。反応を、１００μｌのＤＮＳを加え、９８℃で１０分間加熱することにより停止した。サンプルを氷上で冷却した後、生じた色を５４０ｎｍで測定した。グルコースをスタンダードとして用い、吸光度を還元糖量(g/l)に変換するために検量線を用いた。
【０２４３】
その結果を以下の表１０に示す。さらに、図１６に約８８ｋＤａの分子量を有するタンパク質が正常に発現されていることを示す。
【０２４４】
【表１０】
2013544086.tif 000015
【０２４５】
表１０は、SEQ IDNO: 70の組み換えエンドセルラーゼ酵素が十分に活性で強いセルロース分解活性を示すことを表す。
【０２４６】
組み換えエンドセルラーゼをAZO-セルロース加水分解(S-ACMCL Megazyme)で試験した。図１７の写真は、ディノコッカスDRH-46菌株からの精製組み換えエンドセルラーゼが明確にセルロース分解活性を示すことを表す。
【０２４７】
上記の結果の全ては、組み換えエンドセルラーゼが十分に活性で強いセルロース分解活性を示すことを明確に表す。
【０２４８】
実施例１４  αグルクロニダーゼ活性を有する酵素の同定
ディノコッカス spを、濾過されたｐＨ７のMOPS緩衝液:酸性MOPS緩衝液 40 mM (Sigma, France), (NH4Cl 20 mM, KOH10 mM, NaOH 10 mM, CaCl2 0.5 μM, Na2SO40.276 mM, MgCl2 0.528 mM), ｐＨ５の微量栄養素溶液((NH4)6(MO7)243 nM, H3BO3 400 nM, CoCl230 nM, CuSO4 10 nM, MnCl2 250 nM,ZnSO4 10 nM), pH4のビタミン溶液 (1 μg/L の D-ビオチン, ナイアシン, ピリドキサール-HCl, チアミン-HCl及び ビタミンB12), K2HPO4 溶液5.7 mM 、並びにFeCl3溶液 20 μM （溶媒はNaH2(C3H5O(COO)3)）により構成された最小培養培地に播種した。αグルクロノシドを基質として用いた。
【０２４９】
本発明では、αグルクロニダーゼ酵素を同定できた。この酵素のアミノ酸配列は、SEQID NO: 72で示される。それをコードする核酸配列を単離し、それはSEQ ID NO: 71で示される。
【図１】
2013544086.tif 000016
【図２】
2013544086.tif 000017
【図３】
2013544086.tif 000018
【図４】
2013544086.tif 000019
【図５】
2013544086.tif 000020
【図６】
2013544086.tif 000021
【図７】
2013544086.tif 000022
【図８】
2013544086.tif 000023
【図９】
2013544086.tif 000024
【図１０】
2013544086.tif 000025
【図１１】
2013544086.tif 000026
【図１２】
2013544086.tif 000027
【図１３】
2013544086.tif 000028
【図１４】
2013544086.tif 000029
【図１５】
2013544086.tif 000030
【図１６】
2013544086.tif 000031
【図１７】
2013544086.tif 000032
【図１８】
2013544086.tif 000033
【配列表】
2013544086000001.app
【国際調査報告】
2013544086.tif 000034
2013544086.tif 000035
2013544086.tif 000036
2013544086.tif 000037
2013544086.tif 000038
2013544086.tif 000039
2013544086.tif 000040