(57)【要約】  ベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウム（ｂｅｎｚａｚｏｌｏ［３，２−ａ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｕｍ）クロリドの塩の合成方法ならびにアミノ置換基及びニトロ置換基の含有によって、ＮＢＱ−３８（７−エチル−３−ニトロベンズイミダゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリド）、ＮＢＱ−９５（２−クロロ−１０−メチル−３−ニトロベンゾチアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリド）、ＡＢＱ−３８（３−アミノ−７−エチルベンズイミダゾ［３，２−ａ］キノリニウムクロリド）、及びＡＢＱ−９５（３−アミノ−２−クロロ−１０−メチルベンゾチアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリド）といった４の化合物が得られ、該方法によって化合物の生物学的活性が増加する。前記化合物は更に、細胞内結合と、ミトコンドリア損傷ならびにカスパーゼ３及びカスパーゼ７の活性化によって介在されるアポトーシスの活性化を通した悪性細胞の細胞毒性と、細胞器官の結合及び損傷と、自動蛍光特性によるマーカーのために用いられる。【選択図】図１
2013527122.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
2013527122.tif 000003
からなり、Ｒ１がニトロ基であり、Ｘが硫黄及びＮＲからなる群から選択される、アミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法であって：
ａ．ニトロ置換型の２−（２−クロロスチリル）ベンゾチアゾールの合成ステップと；
ｂ．前記ニトロ基の還元ステップと；
ｃ．生物学的蛍光性のアミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩を生成するための前記ニトロ置換型の２−（２−クロロスチリル）ベンゾチアゾールの光誘導性の環化処理ステップと；
を具えることを特徴とする、アミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法。
【請求項２】
請求項１に記載のアミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法において、ヒドラジンが触媒としてホウ化ニッケルを用いるステップを、前記ニトロ基の還元ステップが具えることを特徴とする、アミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法。
【請求項３】
請求項１に記載のアミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法において、前記ニトロ置換型の２−（２−クロロスチリル）ベンゾチアゾールの合成ステップが：
ａ．等モル混合物をモル過剰量の無水酢酸に溶解し、かつ１８ないし２４時間還流するステップであって、前記等モル混合物が２−クロロ置換型のベンズアルデヒドと２−メチルベンザゾールの誘導体とからなるステップと；
ｂ．２３℃ないし２５℃の温度で前記等モル混合物を冷却可能にするステップであって、固体が沈殿するステップと；
ｃ．該沈殿した固体を分離し、かつ前記固体を再結晶処理に供するステップと；
を具えることを特徴とする合成方法。
【請求項４】
請求項３に記載のアミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法において、前記沈殿した固体が濾過を通して分離され、無水酢酸又は冷却した２：１のヘキサン／アセトンの混合物で洗浄されることを特徴とする、アミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法。
【請求項５】
請求項３に記載のアミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法において、有機性の中性溶媒がアセトン、１：１のヘキサン／アセトン混合物、シクロヘキサン、又はトルエンから選択されるステップを、該再結晶処理ステップが具えることを特徴とする、アミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法。
【請求項６】
請求項１に記載のアミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法において、前記ニトロ置換型の２−（２−クロロスチリル）ベンゾチアゾールの合成ステップが：
ａ．５０パーセントの水酸化ナトリウム溶液に等モル溶液を、２３℃ないし２５℃の温度で一定に攪拌して添加するステップであって、前記等モル溶液が約１０ｍＬのジメチルスルホキシド中の２−メチルベンゾチアゾールと２−クロロ−６−置換型のベンズアルデヒドとからなるステップと；
ｂ．前記等モル溶液を更に５ないし１５分間攪拌するステップと；
ｃ．水を添加して、かつ固体が沈殿するまで約５分間攪拌するステップと；
ｄ．該沈殿した固体を分離し、かつ前記固体を再結晶処理に供するステップと；
を具えることを特徴とする、アミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法。
【請求項７】
請求項６に記載のアミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法において、前記沈殿した固体が真空濾過を通して分離されることを特徴とする、アミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法。
【請求項８】
請求項６に記載のアミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法において、前記再結晶処理がトルエン又はアセトンを含むことを特徴とする、アミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法。
【請求項９】
請求項６に記載のアミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法において、前記等モル混合物を添加するステップが、４８ないし１６８時間の反応時間で無水酢酸を煮沸する際に、前記等モル溶液を少量の２−メチルベンザゾールの誘導体とともに還流するステップを具えることを特徴とする、アミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法。
【請求項１０】
請求項１に記載のアミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法において、前記ニトロ置換型の２−（２−クロロスチリル）ベンゾチアゾールの合成ステップが：
ａ．ジメトキシエチレン中の２．２当量のＮａＨを、（Ｅ）−２−スチリルベンザゾールの一部に添加して、第１の反応混合物を生成するステップと；
ｂ．前記第１の反応混合物を２３℃ないし２５℃の温度で３０分間攪拌するステップと；
ｃ．アルキル化剤でアルキル化するステップであって、前記アルキル化剤のハロゲン化アルキルが２３℃ないし２５℃の温度で緩徐に添加されて、第２の反応混合物を生成し、当該第２の反応混合物が１当量の（Ｅ）−スチリルベンズイミダゾールあたり１．５当量のアルキル化剤からなるステップと；
ｄ．前記第２の反応混合物を窒素雰囲気下で６ないし２４時間攪拌するステップと；
ｅ．前記第２の反応混合物を氷水浴で冷却し、かつ固体が沈殿するまで水を添加するステップと；
ｆ．該沈殿した固体を真空下で濾過し、１：１のアセトン／ヘキサンの混合物で洗浄し、かつ空気乾燥させるステップと；
を具えることを特徴とする、アミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のアミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法において、前記光誘導性の環化処理ステップが：
ａ．３５０ｎｍの波長に対し透過性のある容器と、照射手段とを選択するステップであって、前記照射手段が３５０ｎｍ波長のランプを具備するステップと；
ｂ．好適な量の（Ｅ）−２−（２−クロロスチリル）ベンザゾールを前記容器内部に配置するステップと；
ｃ．事前選択した時間を間欠的に分割して、前記容器を前記照射手段で照射するステップと；
を具え、各々の間欠期に溶液がニトロ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の一部を純粋な形態で除去すべく濾過され、前記容器に残った残余の前記ニトロ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物が抽出されることを特徴とする、アミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載のアミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法において、前記容器内部に配置される前記好適な量が、１５０ないし２５０ｍＬの３：１のベンゼン：ジオキサンの混合物に溶解される０．２ないし１．０グラムの前記（Ｅ）−２−（２−クロロスチリル）ベンザゾールを含み、該照射時間が４ないし６時間の間隔で１０ないし１８時間であることを特徴とする、アミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載のアミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法において、前記容器内部に配置される前記好適な量が、１５０ないし２５０ｍＬの２：１：１のベンゼン：ブロモベンゼン：ジオキサンの混合物に溶解される０．２ないし１．０グラムの前記（Ｅ）−２−（２−クロロスチリル）ベンザゾールを含むことを特徴とする、アミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載のアミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法において、前記容器内部に配置される前記好適な量が、１５０ないし２５０ｍＬの３：１のベンゼン：ジオキサンの混合物に溶解される０．２ないし１．０ｇの前記（Ｅ）−２−（２−クロロスチリル）ベンザゾール（ＩＩ）を含み、前記混合物が最初にアルゴンで脱気され、次いで４ないし５時間の間隔で５ないし１８時間照射されることを特徴とする、アミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法。
【請求項１５】
請求項１１に記載のアミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法において、前記容器の壁部に残った前記ニトロ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物が、蒸留水で抽出され濾過されることを特徴とする、アミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載のアミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法において、該濾過した水が純性のＢＱＳを分離するように凍結乾燥に供されることを特徴とする、ベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法。
【請求項１７】
請求項１に記載のアミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法において、前記光誘導性の環化処理ステップが：
ａ．撹拌子があるフラスコと照射手段とを選択するステップであって、前記照射手段が３５０ｎｍのランプを具備するステップと；
ｂ．前記フラスコを混合物で充填するステップであって、前記混合物が３ｍＬのメチルスルホキシドを含むステップと；
ｃ．２−スチリルベンゾチアゾールを前記混合物に添加するステップと；
ｄ．固体が完全に溶解され、かつ２３℃ないし２５℃の温度で凝固して反応混合物を生成するまで、前記フラスコを前記照射手段に配置し、かつ４ないし６時間、前記混合物を照射し、磁気攪拌するステップと；
ｅ．前記反応混合物を５０ないし７５ｍＬの蒸留水を含むビーカーに添加し、かつ第１の固体が沈殿するまで約１５分間攪拌するステップと；
ｆ．該沈殿した第１の固体を除去し、かつ当該沈殿した第１の固体をデシケーターに配置するステップと；
ｇ．選択した時間、前記沈殿した第１の固体を乾燥可能にするステップと；
ｈ．１００ｍＬの乾燥ベンゼンに前記沈殿した第１の固体を溶解し、かつ前記第２の固体を乾燥させるステップと；
を具えることを特徴とする、アミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載のアミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法において、前記選択した時間が２４時間であり、前記沈殿した第１の固体を１００ｍｌの乾燥ベンゼンに溶解した後に、無水硫酸ナトリウムで乾燥することを特徴とする、アミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載のアミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法において、前記沈殿した固体を乾燥させた後に、該硫酸ナトリウムが濾過によって除去され、得られた溶液が照射容器に配置され、前記照射手段で３５０ｎｍの光に露光されることを特徴とする、アミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法。
【請求項２０】
請求項１７に記載のアミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法において、前記沈殿した第１の固体を除去するステップが、真空蒸留によって前記沈殿した第１の固体を除去するステップと、前記沈殿した第１の固体を蒸留水で洗浄するステップとを具えることを特徴とする、アミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法。
【請求項２１】
請求項１７に記載のアミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法において、前記フラスコに配置された前記混合物が０．１５ないし０．３ｇの異性化すべき前記２−スチリルベンゾチアゾールを含むことを特徴とする、アミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の化合物の合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニトロ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウム（ｂｅｎｚａｚｏｌｏ［３，２−ａ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｕｍ）クロリドの塩（ＮＢＱ）及びアミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩（ＡＢＱ）の合成及び生物学的活性、特に、特有の生物学的活性及び蛍光特性を呈示するベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩及びアミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩を生成するための合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
科学団体は所定の内部刺激又は外部刺激に対してどのように細胞又は対象が応答又は挙動するのかを調査する際に細胞マーカーを適用する必要がある。これらの刺激の一部は限定しないが、薬剤処置、治療、及び天然の疾患経過を含む。
【０００３】
Ｃｏｘらに対する米国特許出願第４，５９０，２７５号（Ｃｏｘ‘２７５）は細胞毒性、抗腫瘍性、及び抗ウイルス性の活性を示すベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩（ＢＱＳ）の調製を開示する。しかしながら、Ｃｏｘ‘２７５はアミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウム（ＡＢＱ）の化合物の合成を開示しておらず、前記ＡＢＱは細胞器官の同定に適用可能な蛍光特性と治療への応用に適用可能な生物学的活性とを有している。蛍光特性はユーザが細胞器官を同定するのを補助し、化合物は研究、診察、又は治療に対する優秀なマーカーとなる。生物学的活性の一部は限定しないが、細胞毒性、ミトコンドリア損傷、及び培養中の癌化細胞株のアポトーシス誘導を含む。
【０００４】
更に、Ｃｏｘ‘２７５はいくつかの化合物の様々な合成方法を開示するが、開示した方法は所望されない反応が所望されない特徴及び特性を引き起こすのを回避するために、化合物の照射による励起を制限しない。更に、水溶性の過塩素酸又は過塩素酸ナトリウムの飽和溶液の添加により純性のＢＱＳの分離を回避することによって、ＢＱＳは沈殿を通して過塩素酸塩として分離された。
【発明の概要】
【０００５】
本発明はＣｏｘ‘２７５によって提示されるようなベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの塩の合成の制限を克服し、腫瘍細胞に対する生物学的活性及び大きな感受性を増大させ、細胞培養における自己蛍光を提供し、細胞器官に結合してアポトーシスを通して細胞毒性を誘発し、培養中のヒト悪性細胞又はヒト正常細胞の、カスペース活性を誘発する。
【０００６】
選択される化合物はベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウム塩（ＢＱＳ）の一部であり、４つの系：
・系１（Ｘ＝Ｓ）：環Ｃ及び環Ｄに融解したベンゾチアゾールを取り込むベンゾチアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリド又はペルクロラート；
・系２（Ｘ＝ＮＲ）：環Ｃ及び環Ｄに融解したベンズイミダゾール部分を取り込むベンズイミダゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリド；
・系３（Ｘ＝Ｏ）：環Ｃ及び環Ｄにベンズオキサゾール環を取り込むベンズオキサゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリド又はペルクロラート；
・系４（Ｘ＝Ｓｅ）：環Ｃ及び環Ｄにベンゾセレナゾール部分を取り込むベンゾセレナゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリド；
に合成された。
【０００７】
系１ないし４における化合物は、環Ａにおけるニトロ基又はアミノ置換基の含有によって更に特徴づけられ、これらはそれぞれＮＢＱ及びＡＢＱと同定される。総てのこれらの系が存在する場合でも、本発明は特に、系１及び系２に属する４のＢＱＳ（ＮＢＱ−３８、ＡＢＱ−３８、ＮＢＱ−９５、及びＡＢＱ−９５）の合成及び生物学的活性に関する。
【０００８】
第１に本発明は：
（１）細胞内結合；
（２）ミトコンドリア損傷及びカスパーゼ３及びカスパーゼ７の活性化によって介在された、アポトーシス活性化を通した悪性細胞での細胞毒性；
（３）細胞器官の結合及び損傷；
を示す、アミノ置換型のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムといった化合物を開示する。更に、化合物は細胞と接触して自己蛍光特性を示している。これらの蛍光特性によって、細胞器官との相互作用の明確な呈示が、研究における蛍光マーカーとして、あるいは臨床研究における治療マーカー又は診断マーカーとして機能しうる。微生物はこれらの蛍光化合物が結合しうる細胞器官を更に所有するため、環境における微生物の存在及び濃度をモニタリングするのに、蛍光化合物は適用できる。更に、ＡＢＱは系１及び系２のＮＢＱと比較すると、癌細胞に対する感受性の増加を呈示する。
【０００９】
第２に本発明は、アポトーシス機構を介して細胞死を生じさせ、ミトコンドリア及びＤＮＡといった大型の細胞小器官と相互作用し、カスパーゼ３及びカスパーゼ７を活性化し、ＸＯ／ＨＸの存在下で生体内還元時に８−２−ｄＧの付加物を形成する、ニトロ置換型及びアミノ置換型のベンゾチアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムの塩Ｉを開示する。更に、合成したニトロ置換型のベンゾチアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムの塩Ｉは選択的に低酸素細胞を標的とする能力と、腫瘍細胞におけるトポイソメラーゼＩＩを抑制抑制するための能力とを示す。
【００１０】
第３に、本発明はベンゾチアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムの塩Ｉ（ＢＱ）の改善した合成方法を開示する。
【００１１】
従って、本発明の目的の１つは：細胞内結合と；ミトコンドリア損傷とカスパーゼ３及びカスパーゼ７の活性化とによって介在された、アポトーシス活性化を通した悪性細胞での細胞毒性と；細胞器官の結合及び損傷と；自己蛍光と；を示す化合物を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、アポトーシス機構を介して細胞死を生じさせ、ミトコンドリア及びＤＮＡといった大型の細胞小器官と相互作用し、カスパーゼ３及びカスパーゼ７を活性化し、ＸＯ／ＨＸの存在下で生体内還元時に８−２−ｄＧの付加物を形成する、合成したニトロ置換型のベンゾチアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムの塩Ｉ（ＮＢＱ）を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、腫瘍組織又は病的組織を同定可能にする合成したニトロ置換型のベンゾチアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムの塩を提供することである。
【００１４】
本発明の別の目的は、生体系と更に互換性のあるＢＱの改善した新規の合成方法を提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、所望されない反応を回避するＢＱの合成方法を提供することである。
【００１６】
本発明の別の目的は、化合物の性能を改善するＢＱの合成方法を提供することである。
【００１７】
本発明の別の目的は、抗癌治療薬として好適な化合物を提供することである。
【００１８】
本発明の更なる目的は、ＢＱとともに相互作用する器官又は組織を示しうるため治療マーカーとして作用する蛍光性のＢＱアナログを提供することである。
【００１９】
本発明自体は、動作の構成及びモードの双方が最良に理解され、その更なる目的及び利点は添付の図面と連携して以下の好適な実施形態の詳細な記載によって明確となるであろう。
【００２０】
ここで本願出願人は、本出願の開示は２以上の発明を含んでもよく、２以上の発明がある場合は、これらの発明は特許性があり、他の発明によって自明でないことを主張する。
【００２１】
更には、添付の要約書の目的は米国特許商標局と、通常の大衆、特に特許若しくは法律の用語又は語法を熟知していない科学者、技師、及び実務家とが、本出願の技術的な開示の性質及び本質を通り一遍の検証で判断可能にすることである。要約書は特許請求の範囲によって評価される本出願の発明を規定することを目的とするものでも、いずれかの方法で本発明の範囲に関して限定することを目的とするものでもない。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
添付の図面は、本明細書中に組み込まれており、明細書の一部を構成し、本発明の好適な実施形態を例示している。
【００２３】
【図１】図１は、本発明の一般的構成を示す。
【図２】図２は、開発したＢＱＳの化学式の表を示す。
【図３】図３は、（Ｅ）−２−スチリルベンザゾール誘導体ＩＩの調製のための合成方法である。
【図４】図４は、（Ｅ）−２−スチリルベンザゾール誘導体ＩＩの化学式の表を示す。
【図５】図５は、符号ＩＩの光誘導性の環化によるＢＱＳ（Ｉ）の合成を示す。
【図６】図６は、新規の方法を用いた新規のベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの誘導体の合成である。
【図７】図７は、系１のベンゾチアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの誘導体を示す表である。
【図８】図８は、系２のベンズイミダゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの誘導体を示す表である。
【図９】図９は、系３のベンズオキサゾロ（Ｂｅｎｚｏｘａｌｏ）［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの誘導体を示す表である。
【図１０】図１０は、系４のベンゾセレナゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの誘導体を示す表である。
【図１１】図１１は、Ａ４３１ヒト腫瘍でのＡＢＱのミトコンドリア及びＤＮＡとの細胞内結合の画像である。
【図１２】図１２は、Ａ４３１腫瘍細胞でのＡＢＱ３８の自己蛍光の画像である。
【図１３】図１３は、ＢＱ及び負のコントロールで処理したＡ４３１細胞でのＩＣ５０の定量値を示す表である。
【図１４】図１４は、ＢＱで処理したＡ４３１細胞でのミトコンドリア膜の状態を示すグラフである。
【図１５】図１５は、ＢＱで処理したＡ４３１細胞でのカスパーゼ３及びカスパーゼ７の比較を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
図１は合成したＮＢＱ及びＡＢＱの一般的構成を示す。本発明は特に、図２に示すように４のＢＱＳ（ＮＢＱ−３８、ＡＢＱ−３８、ＮＢＱ−９５、及びＡＢＱ−９５）の合成及び生物学的活性に関する。合成順序は図３及び図４に示すように、ニトロ置換型の２−（２−クロロスチリル）ベンゾチアゾールＩＩの合成に始まり、特定の方法体系に次いで、触媒としてホウ化ニッケルを用いて、ヒドラジンでニトロ基を還元する。更には、手順を通した符号ＩＩの光誘導性の環化は許容可能な収量で符号Ｉを与える。得られるのは、図５、図６、及び図７に示すような合成したベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドである。
【００２５】
４つの系が合成され：系１（Ｘ＝Ｓ）は図７に示すように、環Ｃ及び環Ｄに融解したベンゾチアゾールを取り込むベンゾチアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリド又はペルクロラートを含み；系２（Ｘ＝ＮＲ）は図８に示すように、環Ｃ及び環Ｄに融解したベンズイミダゾール部分を取り込むベンズイミダゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドを含み；系３（Ｘ＝Ｏ）は図９に示すように、環Ｃ及び環Ｄにベンズオキサゾール環を取り込むベンズオキサゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリド又はペルクロラートを含み；最後に系４（Ｘ＝Ｓｅ）は図１０に示すように、環Ｃ及び環Ｄにベンゾセレナゾール部分を取り込むベンゾセレナゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドを含む。系１ないし４における化合物は、環Ａにおけるニトロ基又はアミノ置換基の含有によって更に特徴づけられ、これらはそれぞれＮＢＱ及びＡＢＱと同定される。ＮＢＱ及びＡＢＱから選択されたものは図２に示したように、系１及び系２から得られたＮＢＱ−３８、ＡＢＱ−３８、ＮＢＱ−９５、及びＡＢＱ−９５であった。
【００２６】
特定の方法体系又は方法は、化合物の合成を行うために用いられるいくつかの測定及び装置を含む。簡単な場合においては、いくつかの処理は別段に述べない限りにおいては、開放的雰囲気下で事前乾燥（２時間、１２５℃）させたガラス器具で行われた。照射は３５０ｎｍのランプを装着したＲａｙｏｎｅｔ社の光化学反応器（Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｃｔｏｒ）を用いて２３℃ないし２５℃の室温で行われた。融点は溶融温度（Ｍｅｌｔ−Ｔｅｍｐ）装置を用いて毛管で定量した。１Ｈ及び１３Ｃの核磁気共鳴スペクトルは、１Ｈ及び１３Ｃについてそれぞれ、３００．１５ＭＨｚ及び７５．４８ＭＨｚの観測周波数で動作し、Ｎｉｃｏｌｅｔ１２８０データシステム及び２９３−Ｃパルスプログラマーといった観測から得られたデータを処理及び分析するソフトウェアを具備するＧｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ＱＥ−３００（５ｍｍのＣ／Ｈデュアルプローブを使用）といった分光計、あるいは１Ｈ及び１３Ｃについてそれぞれ、５００．１３ＭＨｚ及び１２５．７７ＭＨｚの観測可能な周波数で動作するＢｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ５００（５ｍｍのブロードバンドプローブを使用）といった分光計に記録された。水素のデータはδ０．０ｐｐｍでのテトラメチレン（ＴＭＳ）、δ７．２６ｐｐｍでのクロロホルム（ＣＤＣｌ３）、あるいはδ２．４９ｐｐｍでのメチルスルホキシド（ＤＭＳ０−ｄ６）のいずれかに引用した。１３Ｃの核はδ７７．０ｐｐｍでの重水素のクロロホルム（ｄｅｕｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）の１：１：１多重線の中央のピークに引用され、６重水素のメチルスルホキシド（ｈｅｘａｄｅｕｔｅｒｉｏｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）の多重線はδ３９．５ｐｐｍで割り当てられた。
【００２７】
赤外線スペクトルはＮｉｃｏｌｅｔ  Ｓｅｒｉｅｓ６０００のＦＴ−ＩＲ分光計で記録した。高分解能質量分析（ＨＲＭＳ：Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒａ）のスペクトルはＦＩＳＯＮ機器、Ｄｉｒｅｃｔ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅ（ＤＩＰ）を用いたＶＧ  Ａｕｔｏ  Ｓｐｅｃｔ  Ｓｅｒｉｅｓといった蛍光分光器で記録した。ＨＲＭＳパラメータは電子衝撃が７０ｅＶ、分解能が１０００ｐｐｍ、温度ランプが１００ないし４００℃（３０℃／分）であった。薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ：Ｔｈｉｎ  Ｌａｙｅｒ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）は蛍光指示薬で０．２５ｃｍ厚のポリエステルで支持されたシリカゲル上に展開し、紫外線（２５４ｎｍ）で可視化した。元素分析はＡｔｌａｎｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｌａｂ社で行われた。
【００２８】
更に、化合物は核磁気共鳴の調査に供されて、処理は５ｍｍのＮＭＲの試料チューブを用いて２３℃ないし２５℃の温度で行われた。用いられる溶媒はＤＭＳ０−ｄ６及びＣＤＣｌ３であり、試料の量は３０ないし１５０ｍｇの範囲にあり、総ては約０．５０ないし０．７５ｍＬの対応する重水素で置換した溶媒に溶解した。１Ｈ及び１３Ｃの核磁気共鳴スペクトルの測定条件は、パルス幅がそれぞれ８．７５μｓ（９０°）及び９．６０μｓ（９０°）であり、スペクトル幅がそれぞれ３３１１Ｈｚ及び１４７０５Ｈｚであり、データポイントがそれぞれ１６Ｋ及び３２Ｋであった。
【００２９】
ＣＯＳＹスペクトルはＢａｘ及びＦｒｅｅｍａｎによって記載の系列といったパルス系列を用いて記録した。スペクトル幅は双方の次元（Ｆ１、Ｆ２）において３３１１Ｈｚであった。スペクトルはＢｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ５００においては２５６×１Ｋのデータのブロックとして、あるいはＧｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ＱＥ−３００においては、１ブロックあたり１６ないし２４の捕捉で、かつ０．１秒の捕捉間隔で収集され、各々の次元においてＳｉｎｅ−Ｂｅｌｌ乗算（ｓｉｎｅ  ｂｅｌｌ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を用いて（Ｆ１次元をゼロフィリングして）最終的な５１２×５１２の実点マトリクスに処理し、次いで最終的なデータマトリクスを対称化した。
【００３０】
ヘテロ核多重量子コヒーレンス（ＨＭＱＣ：Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）及びヘテロ核多重量子コヒーレンス（ＨＭＱＣ：Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｂｏｎｄ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）の実験はＢｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ５００のＮＭＲ分光計で行われた。スペクトルは２５６×４マトリクスから得られ、捕捉は各々のｔｉで行われ、それぞれＦ１及びＦ２次元において余弦平方乗算（ｃｏｓｉｎｅ  ｓｑｕａｒｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ）及び正弦平方乗算（ｓｉｎｅ  ｓｑｕａｒｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を用いて（Ｆ１次元をゼロフィリングして）最終的な５１２×５１２の実点マトリクスに処理した。遅延時間は１の結合応答を抑制するために３．０ｍｓ（１／２  ＪＣＨ＝Δ１）であり、長い範囲の結合の発生（１０Ｈｚ）のために５０ｍｓ（１／ｎ  ＪＣＨ＝Δ２）であった。
【００３１】
ＢＱＳ、ＮＢＱ、及びＡＢＱはいくつかの方法を用いて合成された。しかしながら、環Ａにおけるアミノ置換基及びニトロ置換基の含有は（Ｅ）−２−スチリルベンザゾール及びベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリド（ＢＱＳ）の合成後に行われた。
【００３２】
（Ｅ）−２−スチリルベンザゾールの合成は図３及び図４に示されるように、少なくとも以下の４の異なる方法がある。
【００３３】
［１．方法１］
対応する２−クロロ置換型のベンズアルデヒド及び対応する２−メチルベンザゾールの誘導体はモル過剰量の無水酢酸に溶解され、１８ないし２４時間還流された。溶液は２３℃ないし２５℃の温度で冷却可能であり、沈殿した固体は濾過されるか、無水酢酸あるいは冷却した２：１のヘキサン／アセトンの混合物で洗浄された。アセトン、１：１のヘキサン／アセトン混合物、シクロヘキサン、又はトルエンといった有機中性溶媒による沈殿の再結晶化によって、所望の生成物が得られた。
【００３４】
［２．方法２］
ＤＭＳＯ（１０ｍＬ）中の２−メチルベンゾチアゾール及び対応する２−クロロ−６−置換型のベンズアルデヒドの等モル溶液は、１ステップで５０％の水酸化ナトリウム溶液（３．０ｍＬ）に、２３℃ないし２５℃の温度で一定に攪拌して添加した。固体の形態は即時に観察され、混合物は更に５ないし１５分間、攪拌可能にした。水を添加した後、反応混合物は約５分間攪拌した。真空濾過及びトルエン又はアセトンによる再結晶化によって、所望の生成物が得られた。
【００３５】
［３．方法３］
対応する２−クロロ置換型のベンズアルデヒドと対応する２−メチルベンザゾールの誘導体との等モル混合物はモル過剰量の無水酢酸に溶解され、１８ないし２４時間還流された。溶液は２３℃ないし２５℃の温度で冷却可能であり、沈殿した固体は濾過されるか、無水酢酸あるいは冷却した２：１のヘキサン／アセトンの混合物で洗浄された。アセトン、１：１のヘキサン／アセトン混合物、シクロヘキサン、又はトルエンといった有機中性溶媒による沈殿の再結晶化によって、所望の生成物が得られた。
【００３６】
２−クロロ−６−置換型のベンズアルデヒドを妨害するために、本方法は還流といった縮合に関与する技術からなる拡張を含む。還流中、４８ないし１６８時間の延長した反応時間で無水酢酸を煮沸する際に、等モル溶液は少量の２−メチルベンザゾールの誘導体（０．２当量）とともに含まれている。反応の進行はＴＬＣ及び１Ｈ  ＮＭＲの分光測定によってモニタリングされる。
【００３７】
［４．方法４］
本方法は（Ｅ）−１−置換型の２−（２−クロロ−５−ニトロスチリル）ベンズイミダゾール（ＩＩ）の調製用に開発され、官能基Ｒは酸性状態に感受性がある。特に、これらの化合物は対応する（Ｅ）−２−スチリルベンズイミダゾ−１−イルのアニオンをハロゲン化アルキル（Ｒ−Ｘ）でアルキル化することによって調製した。鉱油中に分散した６０％の水素化ナトリウムが乾燥したＤＭＥに添加され、アルゴン雰囲気下で氷水浴で冷却して攪拌した。（Ｅ）−１Ｈ−２−（２−クロロ−５−ニトロスチリル）ベンズイミダゾール（１．０当量）が次いで一部分に添加された。（Ｅ）−スチリルベンズイミダゾール（ＩＩ）の添加が完了した時点で、反応混合物は２３℃ないし２５℃で３０分間、攪拌して維持された。アルキル化剤（１当量の（Ｅ）−スチリルベンズイミダゾールあたり１．５当量）が次いで室温で緩徐に添加され、反応混合物は窒素雰囲気下で６ないし２４時間攪拌して維持された。この期間の最後に、得られた反応混合物は氷水浴で冷却され、水が添加された。得られた沈殿は真空下で濾過され、１：１のアセトン／ヘキサンの混合物を用いて洗浄され、空気乾燥された。
【００３８】
ベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリドの合成は図６に示すように、以下の少なくとも４の異なる方法を用いて行われる。
【００３９】
［１．方法１］
３５０ｎｍのランプに対し透過可能な容器を用いた。簡単な場合においては、選択した反応容器はＰｙｒｅｘチューブであった（４０×６×０．３ｃｍ）。照射は光源として、４５０Ｗ−Ｈａｎｏｖｉａ水銀ランプの代わりに３５０ｎｍのランプを具備したＲａｙｏｎｅｔ社の光化学反応器を用いて誘導された。照射の特異性が所望されない反応を回避することであることを理解することは重要である。１５０ないし２５０ｍＬの３：１のベンゼン：ジオキサンの混合物に溶解した、０．２ないし１．０ｇの対応する（Ｅ）−２−（２−クロロスチリル）ベンザゾール（ＩＩ）の試料は１０ないし１８時間の間隔で照射された。各々の中断の後に、溶液は生成物の一部を除去するために濾過された。濾過紙上の固体物質は純形態で得られた。残余の生成物はチューブの壁部に残っており、蒸留水（約１５ｍＬ）で抽出した。濾過紙は更に水で洗浄され、水溶性の生成物を除去した。数回の照射による、組合わせた水の抽出物は濾過され、凍結乾燥に供され、純性のＢＱＳを分離した。再利用する前に、照射容器は経時的に、アセトン、エタノール、硫酸（１．０Ｍ）、水、希釈炭酸ナトリウム溶液（１０％）、蒸留水、及びアセトンで洗浄した。最終的に乾燥器で２４時間未満乾燥させた。
【００４０】
［２．方法２］
３５０ｎｍのランプに対し透過可能な容器を用いた。簡単な場合においては、反応容器はＰｙｒｅｘチューブであった（４０×６×０．３ｃｍ）。照射は光源として、４５０Ｗ−Ｈａｎｏｖｉａ水銀ランプの代わりに３５０ｎｍのランプを具備したＲａｙｏｎｅｔ社の光化学反応器を用いて誘導された。０．２ないし１．０ｇの対応する（Ｅ）−２−（２−クロロスチリル）ベンザゾール（ＩＩ）の試料は照射前に、１５０ないし２５０ｍＬの２：１：１のベンゼン：ブロモベンゼン：ジオキサンの混合物に溶解した。各々の中断の後に、溶液は生成物の一部を除去するために濾過された。濾過紙上の固体物質は純形態で得られた。残余の生成物はチューブの壁部に残っており、蒸留水（約１５ｍＬ）で抽出した。濾過紙は更に水で洗浄され、水溶性の生成物を除去した。数回の照射による、組合わせた水の抽出物は濾過され、凍結乾燥に供され、純性のＢＱＳを分離した。再利用する前に、照射容器は経時的に、アセトン、エタノール、硫酸（１．０Ｍ）、水、希釈炭酸ナトリウム溶液（１０％）、蒸留水、及びアセトンで洗浄した。最終的に乾燥器で２４時間未満乾燥させた。
【００４１】
［３．方法３］
３５０ｎｍのランプに対し透過可能な容器を用いた。簡単な場合においては、反応容器はＰｙｒｅｘチューブであった（４０×６×０．３ｃｍ）。照射は光源として、４５０Ｗ−Ｈａｎｏｖｉａ水銀ランプの代わりに３５０ｎｍのランプを具備したＲａｙｏｎｅｔ社の光化学反応器を用いて誘導された。１５０ないし２５０ｍＬの３：１のベンゼン：ジオキサンの混合物に溶解した、０．２ないし１．０ｇの対応する（Ｅ）−２−（２−クロロスチリル）ベンザゾール（ＩＩ）の試料は最初にアルゴンで脱気し、次いで５ないし１８時間照射した。４ないし５時間の間欠期の間に、溶液は生成物の一部を除去するために濾過された。濾過紙上の固体物質は純形態で得られた。残余の生成物はチューブの壁部に残っており、蒸留水（約１５ｍＬ）で抽出した。濾過紙は更に水で洗浄され、水溶性の生成物を除去した。数回の照射による、組合わせた水の抽出物は濾過され、凍結乾燥に供され、純性のＢＱＳを分離した。元の手順において、ＢＱＳは水溶性の過塩素酸又は過塩素酸ナトリウムの飽和溶液の添加によって、沈殿を通して過塩素酸塩として分離された。再利用する前に、照射容器は経時的に、アセトン、エタノール、硫酸（１．０Ｍ）、水、希釈炭酸ナトリウム溶液（１０％）、蒸留水、及びアセトンで洗浄した。最終的に乾燥器で２４時間未満乾燥させた。
【００４２】
［４．方法４］
この方法は収量を改善する場合にＮＢＱ−９５を調製するのに用いられる。３ｍＬのＤＭＳＯ−ｄ６と、卵型又は円形の撹拌子とを含む小さな丸底フラスコに、０．１５ないし０．３ｇの異性化すべき２−スチリルベンゾチアゾール（ＩＩ）を添加する。本方法は２−スチリルベンゾチアゾール（ＩＩ）がＤＭＳＯに完全には溶解しない場合であっても都合良く機能する。フラスコは３５０ｎｍランプに装着したＲａｙｏｎｅｔ社の装置といった光化学反応器に配置され、４ないし６時間の期間磁気攪拌した。反応期間の終わりには、固体は完全に溶解し、室温に冷却時に固体化する。反応混合物は５０ないし７５ｍＬの蒸留水を含むビーカーに添加され、更に１５分間攪拌可能にする。沈殿した固体は真空蒸留によって除去され、３部の５０ｍＬの蒸留水で洗浄した。固体はデシケーターに配置され、２４時間乾燥可能にする。固体は１００ｍＬの乾燥ベンゼンに溶解し、無水硫酸ナトリウムで乾燥する。硫酸ナトリウムは濾過によって除去され、透明な溶液は照射チューブに配置され、Ｒａｙｏｎｅｔ社の装置内で３５０ｎｍの光に露光され、ＢＱＳの合成のために方法１に記載のように生成する。
【００４３】
（Ｅ）−２−スチリルベンザゾール及びベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリド（ＢＱＳ）の合成、ならびにアミノ置換基及びニトロ置換基の含有後に、以下の選択した４の化合物が得られた。
【００４４】
［１．ＮＢＱ−３８（７−エチル−３−ニトロベンズイミダゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリド）］
方法１によって、２−（２１−クロロ−５１−ニトロスチリル）−１−エチルベンズイミダゾール（ＩＩｔ）（０．６０ｇ、１．８ｍｍｏｌ）は０．４５ｇ（７５％）のＮＢＱ−３８を提供すべく光環化された（ＢＱＳの方法１）：１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）δ９．４３（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ，芳香族）、９．４０（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）、９．２０（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ  芳香族）、９．０６（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ，芳香族）、８．７８（ｄｄ，Ｊ＝９．０，３．０Ｈｚ，１Ｈ，芳香族）、８．６９（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ  芳香族）、８．４３（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ  芳香族）、８．０５−７．９４（ｍ，２Ｈ，芳香族）、５．０１（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、１．５０（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ，Ｍｅ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）δ３１．３、１１１．７、１１３．６、１１６．４、１１８．９、１２３．９、１２６．２、１２６．４、１２６．８、１２７．６、１２８．６、１３２．７、１３６．１、１３９．１、１４３．９、１４４．８；ＩＲ（ＫＢｒ）３４００．０、３３５０．０、３０２５．０、３０００．０、２９５０．０、２９２５．０、１６１８．０、１５７０．２、１５２７．６、１４７３．２、１４５１．０、１４２７．２、１３８４．３、１３４６．５、１３７３．０、１２５３．０、１２５３．４、１２０８．８、１１６１．４、１０８８．８、９８７．０、９１３．１、８１２．９、７６３．２、７３７．６、６９６．７、６０１．７、５８４．５、５５６．３、５０７．４、４５５．６ｃｍ−１。化合物はペルクロラートの誘導体として分析した。Ｃ１７Ｈ１４ＣｌＮ３Ｏ６の分析理論値：Ｃ，５２．１２；Ｈ，３．６０；Ｎ，１０．７３。実測値：Ｃ，５２．０８；Ｈ，３．６３；Ｎ，１０．６７。
【００４５】
［２．ＮＢＱ−９５（２−クロロ−１０−メチル−３−ニトロベンゾチアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリド）
（Ｅ）−５−メチル−２−（２，４−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−５−ニトロスチリル）ベンゾチアゾール（０．５４３ｇ、１．４９ｍｍｏｌ）から開始する方法４を用いることにより合成され、図３（ＢＱＳの方法１）に記載のように無水酢酸の煮沸時に２，４−ジクロロ−５−ニトロベンズアルデヒド及び２，５−ジメチルベンゾチアゾールの縮合で調製した。得られたスチリル誘導体（ＩＩｃ）は黄色固体として０．２２ｇ（４１％）のＮＢＱ−９５を得るために光環化された：融点２３６ないし２４０℃（デシメーター）；１Ｈ  ＮＭＲ（３００．１５ＭＨｚ、ＤＭＳＯｄ６）：δ  ｐｐｍ  ９．５４（ｓ，１Ｈ）、９．３７（ｓ，１Ｈ）、９．０６（ｓ，１Ｈ），９．００（ｓ，２Ｈ）、８．５９、及び７．８６（ＡＢ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、２．７４（ｓ，３Ｈ）；ＵＶ−ｖｉｓ（９５％ＥｔＯＨ）λｍａｘ／ｎｍ（ｅ）：３８９（１１１９６）、３８０（１１３６３）、２７０（１４８５８）、２２５ｓｈ（２１４４１）、及び２０２（２８３９０）；Ｃ１６Ｈ１０Ｃｌ２Ｎ２Ｏ２ＳＨ２Ｏの分析理論値：Ｃ，５０．１４；Ｈ，３．１６；Ｎ，７．３１％。実測値：Ｃ，４９．８５；Ｈ，３．３５；Ｎ，７．００％。
【００４６】
［３．ＡＢＱ−３８及びＡＢＱ−９５（３−アミノ−７−エチルベンズイミダゾ［３，２−ａ］キノリニウムクロリド及び３−アミノ−２−クロロ−１０−メチルベンゾチアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリド）］
ＡＢＱ−３８及びＡＢＱ−９５のアミノ前駆物質である（Ｅ）−７−エチル−２−（５−アミノ−２−クロロスチリル）ベンズイミダゾール（ＩＩｖ）及び（Ｅ）−５−メチル−２−（５−アミノ−２，４−ジクロロスチリル）ベンゾチアゾール（ＩＩｄ）はそれぞれ、乾燥メタノールにおけるホウ化ニッケルの存在下で、対応するニトロ誘導体のヒドラジンでの還元によって調製した。図３参照。（Ｅ）−７−エチル−２−（５−アミノ−２−クロロスチリル）ベンズイミダゾール（ＩＩｖ）は黄色固体として３−アミノ−７−エチルベンズイミダゾ［３，２−ａ］キノリニウムクロリド（ＡＢＱ−３８）を得るために記載（ＢＱＳの方法１）のように光環化した：１Ｈ  ＮＭＲ（５００．１３ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ｐｐｍ  ９．０５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５０Ｈｚ）、８．８８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ）、８．５６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，８．２７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ）、８．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５０Ｈｚ）、７．９０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）、７．８１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）、７．４３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５，２．５）、７．２７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．５Ｈｚ）、４．８３（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）、１．４８（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）；ＵＶ−ｖｉｓ（９５％ＥｔＯＨ）λｍａｘ／ｎｍ（ｅ）：４０９（１４１０）、３５１（８１０４）、３３６（９８１５）、及び２７１（２０８６６）；Ｃ１７Ｈ１６Ｎ３についてのＨＲＭＳ理論値（クロリド対イオンのない化合物）２６２．１、ｍ／ｚでのＥＳＩによる実測値２６１．９。（Ｅ）−５−メチル−２−（５−アミノ−２，４−ジクロロスチリル）ベンゾチアゾール（ＩＩｄ）は黄色固体として３−アミノ−２−クロロ−１０−  メチルベンゾチアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリド（ＡＢＱ−９５）を得るために記載（ＢＱＳの方法１）のように光環化した：１Ｈ  ＮＭＲ（５００．１３ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ｐｐｍ  ９．１７（ｓ，１Ｈ）、８．９２（ｓ，１Ｈ）、８．６３（ＡＢ四重線，２Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ）、８．４８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ）、７．７６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ）、７．５３（ｓ，１Ｈ）、６．５０（ｍ，２Ｈ）、２．７０（ｓ，３Ｈ）；ＵＶ−ｖｉｓ（９５％ＥｔＯＨ）λｍａｘ／ｎｍ（ｅ）：４２９（４４１７）、３８０（１０３８７）、２８２（２２５６８）、及び２１４（２６５０）；Ｃ１６Ｈ１２ＣｌＮ２ＳについてのＨＲＭＳ理論値（クロリド対イオンのない化合物）２９９．０、ｍ／ｚでのＥＳＩによる実測値２９９．０Ｍ＋．
【００４７】
（Ｅ）−２−スチリルベンザゾール及びベンズアゾロ［３，２−ａ］キノリニウムクロリド（ＢＱＳ）の合成のための環Ａにおけるアミノ置換基及びニトロ置換基の含有によって、いくつかの特性、特に生物学的活性の増加を呈示するＡＢＱ及びＮＢＱが得られる。例えば、ＡＢＱ化合物は：（１）細胞内結合と；（２）自己蛍光と；（３）ミトコンドリア損傷とカスパーゼ３及びカスパーゼ７の活性化とによって介在される、アポトーシス活性化を通した悪性細胞での細胞毒性と；（４）ヒト癌化細胞株である類表皮癌Ａ４３１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−Ｉ５５５ＡＢＱ）で試験された場合の細胞器官の結合及び損傷と；を呈示する。
【００４８】
細胞小器官での結合について、図１１は微分干渉及び電動台を有するＮｉｋｏｎ社のＥｃｌｉｐｓｅ  Ｅ８００の広視野蛍光顕微鏡でのＡ４３１腫瘍細胞の写真が、ＤＮＡ及びミトコンドリアに結合するこれらのＡＢＱ（ＡＢＱ−３８及びＡＢＱ−９５）の能力を明確に例示している。
【００４９】
自己蛍光については、エリプチシンはＡＢＱＳの構造類似体であるため、蛍光の正のコントロールとして選択した。Ａ４３１におけるエリプチシンのＩＣ５０用量は０ないし５０ｕＭの範囲の濃度で（２つ組で）Ａ４３１細胞培養を処理することによって定量した。各々のプレートの最終用量は細胞部分標本、培地及び薬剤を含んだ９ｍＬの改質したＲＰＭＩ１６４０であった。細胞はＩＣ５０濃度でＡＢＱＳ及びエリプチシンに供し、倒立顕微鏡（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）によって７２時間インキュベート及びモニタリングした。Ｏｌｙｍｐｕｓ社のＣＫＸ４１の蛍光倒立顕微鏡（５０Ｗの水銀ランプ）はＵフィルタを有し４０倍の対物レンズを有する。写真はＱ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて１３ないし１７秒の露光で得られた。自己蛍光細胞は、基準として負のコントロール及び正のコントロールを用いて非自己蛍光細胞と区別した。図１１及び図１２は蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＣＫＸ４１）によるＡ４３１腫瘍細胞でのＡＢＱ３８の自己蛍光を示す。画像は細胞相互作用のマーカーとしてのＡＢＱの自己蛍光能力を明確に示している。
【００５０】
細胞毒性について、ＢＱＳの細胞毒性を定量するために、５×１０６の細胞の２つ組みの培養物が２５ｃｍ２のフラスコに播種された。各々のプレートの最終用量は細胞部分標本、培地及び本発明のＢＱＳを含んだ９ｍＬの改質したＲＰＭＩ１６４０であった。細胞は次いで４時間インキュベートして、細胞がフラスコに付着するのを可能にした。細胞は５ないし１００ｕＭの範囲の濃度でＢＱＳとともに４８時間培養した。超純水（溶媒）で処理された負のコントロールは各々の実験に含まれていた。培養中の細胞は異なる濃度の各々の化合物で処理されて、ＩＣ５０の定量又は５０％の細胞集団の抑制を通して成長抑制能を定量した。露光期間の最後に、培地は除去され、培養物は、溶液中の化合物の除去のためにリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回すすいだ。細胞は５％のトリプシン酵素で脱離され、遠心分離され、新しい培地で再懸濁され、Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ分析といった細胞生存度プロトコルを通して計数された。細胞の生存度は算出され、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（登録商標）ソフトウェアで時間に対してプロットされた。図１２はニトロ置換型の類似体と比較したＡＢＱの得られたＩＣ５０％が、ＮＢＱ３８：３６ｕＭ；ＡＢＱ３８：３２ｕＭ；ＮＢＱ９５：２８ｕＭ、及びＡＢＱ９５：３６ｕＭであったことを示している。
【００５１】
膜透過性及びカスパーゼの活性化によって介在されるアポトーシス誘導については、プログラム細胞死（アポトーシス）が、指標としてミトコンドリア膜の透過性を用いた主要な細胞死機構として検証した。実験は２つ組みで行われた。培養中の細胞はＩＣ５０の濃度のＢＱに供されて、４８時間インキュベートした。コントロールは正のコントロールとしてバリノマイシンを含み、負のコントロールとして超純粋を含んだ。処理期間の最後に、細胞はＰＢＳで洗浄され、５％のトリプシンで脱離され、遠心分離された。細胞部分標本は各々の試料用に調製され、製造業者の指示に従い、Ｍｉｔｏ  ＰＴ（商標）アッセイ（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＬＬＣ社）で１時間着色した。アポトーシス性の細胞（５２７ｎｍ）及び非アポトーシス性の細胞（５９０ｎｍ）はＵ励起フィルタ及び４０倍の対物レンズを有する倒立顕微鏡で同時に観察した。アポトーシス性の細胞（緑色）は基準として負のコントロール及び正のコントロールを用いて、非アポトーシス性の細胞（赤味のかかった橙色）と区別した。
【００５２】
定量的なアポトーシス分析のために、処理後の約５×１０６の細胞の部分標本は計数されて、Ｍｉｔｏ  ＰＴ（商標）色素で着色された。試料の蛍光性は５２７ｎｍでの蛍光単量体の信号と、５９０ｎｍでのＪ凝集体とをＴｕｒｎｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社の単一チューブ型のＭｏｄｕｌｕｓ蛍光光度計で測定することによって推定された。アポトーシス性の細胞（５２７ｎｍ）に対応する５１５ないし５７０ｎｍの青色のフィルタで捕捉される発光が観察され、このフィルタでの高い蛍光強度は損傷したミトコンドリア膜を呈示した。緑色のフィルタは５８０ないし６４０ｎｍの発光範囲を捕捉し、健常細胞を検出し、このチャネルでの高い蛍光健常な強度は健常なミトコンドリアを呈示した。ＡＢＱは蛍光色素の発光波長近傍の蛍光を弱く発光するため、我々はバックグラウンドの定量及びデータの正規化のために双方のフィルタ（青色及び緑色）で部分標本の蛍光を測定、着色、及び脱色した。データは負のコントロールからバックグラウンドの蛍光を減算することによって２回算出及び正規化した。アポトーシス性の細胞の割合が算出され、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（登録商標）ソフトウェアで薬剤に対してプロットされた。図１３は、ミトコンドリアの膜透過性に対する選択したＢＱＳ（ＮＢＱ−３８、ＡＢＱ−３８、ＮＢＱ−９５、及びＡＢＱ−９５）の能力間の比較を例示する。
【００５３】
更にカスパーゼ３及びカスパーゼ７の活性化については、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＭａｇｉｃ  Ｒｅｄ（商標）アッセイといった活性カスパーゼに結合する酵素に基づく比色分析アッセイを適用した。アポトーシス時に、リソソームに配置されるチモーゲンは開裂され、カスパーゼ３及びカスパーゼ７の活性酵素のＤＥＶＤアーゼとなる（Ｂｅｌｌｏｃ，Ｆら、２０００）。チモーゲンはその活性部位を呈示するのに生化学的変化（開裂）を必要とする不活性酵素前駆物質である（Ｂｉａｇｉｏｔｔｉ，Ｅら、２０００；Ｌｅｅ，Ｂ．Ｗ、２００３）。Ｍａｇｉｃ  Ｒｅｄ（商標）アッセイでは、カスパーゼ３及びカスパーゼ７が不活性なアポトーシス性の細胞は蛍光を発しないが、カスパーゼ３及びカスパーゼ７が活性化した細胞は負のアポトーシス又は正のアポトーシスを示す赤色蛍光を発する。文献は、スタウロスポリン及びシスプラチンがカスパーゼ３及びカスパーゼ７と関連するアポトーシスを誘発し（Ｚｈａｎｇ，Ｘ．Ｄら、２００４；Ｂｌａｎｃ，Ｃら、２０００）、シスプラチン及びスタウロスポリンがこのアッセイで正のコントロールに使用されることを示している。
【００５４】
ＲＰＭＩ１６４０といった細胞培養培地は、細胞の複製を改善し、細菌の混入を防ぐために添加される、ウシ胎仔血清及び抗菌剤といった更なる栄養剤及び添加剤で改質され用いられた。５×１０６の細胞の細胞培養物は２５ｃｍ２のｔ型フラスコに（２つ組みで）播種された。各々のプレートの最終用量は細胞部分標本、培地及び薬剤を含んだ９ｍＬの改質したＲＰＭＩ１６４０であった。シスプラチン（３ｕＭ）及びスタウロスポリン（１ｕＭ）はアポトーシス誘導能力に対する正のコントロールとして用いられ、無処理の細胞は負のコントロールとして用いられた。処理期間の最後に、細胞はＰＢＳで洗浄され、５％のトリプシンで脱離され、遠心分離された。細胞は計数され、部分標本はクレシルバイオレット（蛍光色素）で１時間着色した。活性のカスパーゼ３及びカスパーゼ７は倒立顕微鏡で定量的にモニタリングされ、Ｇフィルタを用いて９秒の露光で細胞画像を、４０倍の対物レンズで捕捉した。アポトーシス性の細胞（赤色）は基準として負のコントロール及び正のコントロールを用いて、非アポトーシス性の細胞（非蛍光性）と区別した。最近傍の５×１０５に露光した細胞の部分標本が調製され、製造業者の指示に軽微に変更して従い色素で着色された。
【００５５】
図１２に観察されたように、カスパーゼ３及びカスパーゼ７の活性化の順序は以下の通りであった：シスプラチン；５１±１３％＝ＡＢＱ３８；５１±１％）＞ＡＢＱ９５；４６±６％＞ＢＱ１０８；２７±５％＞ＮＢＱ３８；２２±７％、及び負のコントロール；０±１％。ＡＢＱ３８は４８時間の露光で最も高いカスパーゼ３及びカスパーゼ７の活性化を示した。
【００５６】
本発明は上述のような詳細な構成に限定されない。本発明は好適な設計を有するように記載されてきたが、しかしながら、本発明の多くの変化、変更、変動、ならびに他の使用及び用途は、添付の図面とともに本明細書を考察後、本発明の新規の教示及び利点から実質的に逸脱することなく当該技術分野の当業者に明確となることは理解されよう。従って、本発明の精神及び範囲から逸脱しない総てのこのような変化、変更、変動、ならびに他の使用及び用途は、以下の特許請求の範囲及びその法律上の等価物に規定されるように、本発明によってカバーされると考える。特許請求の範囲における、意味と機能との節は存在する場合は、列挙した機能を行う場合の本明細書に記載の構造と、構造上の等価物のみではなく等価構造とをカバーすることを目的としている。
【００５７】
本明細書中及び本明細書に添付の宣誓書に列挙した、特許、特許出願、及び刊行物の総ては、存在する場合は、全体が本明細書中で説明されるが如く引用によって取り込まれる。このような特許に開示の総ての又は実質的に総ての内容は本発明の実施形態ならびにその等価物に用いてもよい。本明細書中に引用によって組み込まれる特許、特許出願、及び刊行物中の記載は、任意の補正した請求項と適用された先行技術との明確に区別するための請求項の更なる限定として、係属中の請求項に出願人の意見で取り込み可能なことを考慮しうる。
【図１】
2013527122.tif 000004
【図２】
2013527122.tif 000005
【図３】
2013527122.tif 000006
【図４】
2013527122.tif 000007
【図５】
2013527122.tif 000008
【図６】
2013527122.tif 000009
【図７】
2013527122.tif 000010
【図８】
2013527122.tif 000011
【図９】
2013527122.tif 000012
【図１０】
2013527122.tif 000013
【図１１】
2013527122.tif 000014
【図１２】
2013527122.tif 000015
【図１３】
2013527122.tif 000016
【図１４】
2013527122.tif 000017
【図１５】
2013527122.tif 000018
【国際調査報告】
2013527122.tif 000019