(57)【要約】  広範囲の離散スペクトル増分にわたる医学的診断用の赤外線顕微鏡データを迅速に収集するように設計された、広範囲の波長可変量子カスケードレーザ（ＱＣＬ）などの、コヒーレント透過光源からの赤外線（ＩＲ）透過を用いて、組織及び他の試料を撮像するための方法、装置、及びシステムである。赤外線透過は、これを透過し、これから反射され、及び／又はこれを透過反射し、次に、検知器により検知される前に、拡大され、及び／又は、合焦される。検知後、試料に関連した画像データを用いて試料を評価する。こうした方法、装置及びシステムを用いて、組織における異常を、例えば従来の細胞病理学的方法を用いてこうした異常が診断される前に検知することができる。本方法、装置及びシステムはまた、随意的に、撮像の制御及び処理を助けるために、可視光検知サブシステム及び／又は運動制御サブシステムを含むことができる。【選択図】      図５
2013524246.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
撮像情報を取得するためのシステムであって、
赤外線放射を生成するための赤外線出力装置と、
撮像される試料の少なくとも部分を透過するための、前記試料から反射した又は前記試料を透過した前記赤外線放射を受け、拡大するための赤外線拡大器と、
前記反射した又は透過した赤外線放射を受け、かつ、前記反射した又は透過した赤外線放射を拡大し、合焦させるための拡大及び合焦装置と、
前記拡大及び合焦された赤外線放射を受け、分析のために処理装置に送るための赤外線検知装置と、
を含むことを特徴とするシステム。
【請求項２】
前記赤外線出力装置は、コヒーレント光源レーザであることを特徴とする、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記レーザは、前記赤外線スペクトルにわたって波長によって徐々に可変であることを特徴とする、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
前記レーザは、和周波数生成又は差周波数生成により波長可変赤外線レーザ照射を生成する線形又は非線形の光学装置であることを特徴とする、請求項２に記載のシステム。
【請求項５】
前記レーザは、量子カスケード・レーザであることを特徴とする、請求項２に記載のシステム。
【請求項６】
前記赤外線出力装置により生成される前記赤外線放射は、約５乃至１０μｍの少なくとも１つの離散波長における照射であることを特徴とする、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記赤外線拡大器は、カセグレン式源であることを特徴とする、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記拡大及び合焦装置は、カセグレン式対物レンズであることを特徴とする請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記赤外線拡大器により拡大された前記赤外線放射を前記拡大及び合焦装置に再指向させるための再指向機構をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記再指向機構は赤外線反射器であることを特徴とする、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
前記赤外線検知機構は、マイクロボロメータ・アレイ検知器であることを特徴とする、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
撮像情報を取得するためのシステムであって、
赤外線放射を生成するための赤外線出力装置と、
撮像される試料の少なくとも一部分を透過するための、前記試料から反射した又は前記試料を透過した前記赤外線放射を受け、拡大するための赤外線拡大器と、
前記反射した又は透過した赤外線放射を受け、かつ、前記反射した又は透過した赤外線放射を拡大し、合焦させるための拡大及び合焦装置と、
前記拡大され及び合焦された赤外線放射を受け、分析のために処理装置に伝送するための赤外線検知装置と、
を含む赤外線撮像サブシステムと、
前記撮像される試料の部分に対応するデータを前記赤外線検知装置から受信し、かつ、前記撮像される試料の前記組成の分析のために前記データを処理するよう構成された処理装置と、
を含む制御サブシステムと、
を含むことを特徴とするシステム。
【請求項１３】
可視光発光源と、
前記撮像される試料の少なくとも部分を透過させるための、前記試料から反射した又は前記試料を透過した可視光の出力を前記可視光発光源から受け、これを拡大するための可視光拡大器と、
前記反射した又は透過した可視光を合焦させるためのレンズと、
前記反射した又は透過した可視光出力を受けるための可視光検知装置と、
を含む二次検知サブシステムをさらに含むことを特徴とする、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記可視光発光源は発光ダイオードであることを特徴とする、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
可視光出力を受け、拡大するための前記拡大器はカセグレン対物レンズであることを特徴とする、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１６】
前記反射した又は透過した可視光を拡大するための拡大器をさらに含むことを特徴とする、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１７】
前記反射した又は透過した可視光を拡大するための前記拡大器は、可視光対物レンズであることを特徴とする、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
前記可視光検知装置は電荷結合素子を含むことを特徴とする、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１９】
前記制御サブシステムは、前記処理装置に動作可能に結合された運動制御装置をさらに含み、前記運動制御装置は、前記赤外線撮像サブシステムを前記撮像される試料に対して移動させるように構成されることを特徴とする、請求項１３に記載のシステム。
【請求項２０】
撮像情報を得るための方法であって、
赤外線放射を赤外線出力装置から赤外線拡大器に送るステップと、
前記赤外線拡大器が、前記赤外線放射を拡大し、前記照射を撮像される試料に送るステップと、
拡大及び合焦装置が、前記拡大された放射を拡大し、これを合焦させ、前記拡大され、合焦された放射を送るステップと、
を含み、前記赤外線放射は前記試料から反射されるか又は前記試料を透過し、
前記反射した又は透過した放射を合焦装置に送出するステップと、
前記放射を合焦させるステップと、
前記合焦した照射を検知器に送り、前記撮像される試料に対応するデータ出力を生成するステップと、
プロセッサが、前記受信したデータに基づいて、前記撮像された試料を評価するステップと、
をさらに含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の態様は、撮像データの分析、組織試料を含む撮像される試料の評価の分野に関連する。より具体的には、本発明の態様は、波長可変レーザを用いて撮像された生体試料及び他の赤外線反射又は吸収試料を含む、試料のスペクトル特性化に向けられる。
本出願は、全体が引用により本明細書に組み込まれる２０１０年４月９日に出願された「Ａ  ＴＵＮＡＢＬＥ  ＬＡＳＥＲ−ＢＡＳＥＤ  ＩＮＦＲＡＲＥＤ  ＩＭＡＧＩＮＧ  ＳＹＳＴＥＭ」という名称の、本出願人の同時係属中の米国仮特許出願第６１／３２２，６４２号に対する優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
当技術分野において、多くの疾患は、核及び細胞形態学並びに染色パターンの試験を必要とする古典的な細胞病理学方法を用いて診断される。典型的には、こうした診断は、試料内の１０，０００個までの細胞を試験し、異常である約１０個乃至約５０個の細胞の発見により行われる。この発見は、試料内の細胞の目視顕微鏡検査の主観的な解釈に基づいている。
【０００３】
こうした古典的な細胞病理学の例は、Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕが、一般的に「パップ（Ｐａｐ）」試験として知られる試験により子宮頸部の疾患の発症を監視する方法を導入した、前世紀の中頃まで遡る。この試験では、細胞は、へら又はブラシを用いて剥離され、検査のために顕微鏡スライド上に付着される。この試験の当初の実施において、剥離ブラシが顕微鏡スライドの上に塗沫され、そのため「パップ・スメア（Ｐａｐ  ｓｍｅａｒ）」と名付けられた。次に、細胞は、ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）又は「パップ染色剤」（Ｈ＆Ｅ及び幾つかの他の対比染色からなる）で染色され、低倍率の顕微鏡を用いて、細胞学者又は細胞検査技師により目視検査された（それぞれ、例示的なパップ・スメア・スライドについてのフォトスタット画像については図１Ａを、１０倍の顕微鏡拡大下のその一部のフォトスタット画像については図１Ｂを参照されたい）。
【０００４】
こうした試料の顕微鏡写真は、細胞の凝集、細胞残屑による汚染及び血液ベースの細胞（赤血球及び白血球／リンパ球）を示すことが多い。従って、オリジナルの「パップ試験」は、偽陽性及び偽陰性の診断の割合が非常に高かった。現代の液体ベースの方法（細胞遠心分離法、ＴｈｉｎＰｒｅｐ（登録商標）又はＳｕｒｅｐａｔｈ（登録商標）法）は、細胞の凝集をなくし、交絡細胞タイプを除去することにより、細胞試料を改善した（例えば、図２に示す液体ベースの方法により調製された細胞試料の１０倍の顕微鏡写真の例示的なフォトスタット像を参照されたい）。
【０００５】
しかしながら、顕微鏡スライド上に剥離された細胞試料を調製するための方法は、実質的に改善されたものの、当技術分野における診断ステップは、典型的には、依然として目視検査、及び結果を細胞検査技師の記憶にあるデータベースとの比較に頼っている。従って、診断は依然として本質的に主観的なものであり、かつ観察者間及び観察者内の低い再現性と関連している。この側面を緩和するため、細胞の目視検査の際に細胞検査技師を助けるために他の技術の自動可視光画像分析システムが導入された。しかしながら、異型性と低度の形成異常との区別は極めて困難であるため、こうした従来の自動画像ベースの方法は、細胞検査技師の実際の責任の重圧を実質的に軽減するには至っていない。
【０００６】
当技術分野においては、スペクトル法もまた、生体組織検査により入手可能な組織切片の診断に適用される。「スペクトル組織病理学（ＳＨＰ）」と呼ばれる、この手法についてのデータ取得は、スペクトル細胞病理学（ＳＣＰ）に用いられる同じ可視光ベースの器具を用いて実施することができる。
【０００７】
図３Ａ及び図３Ｂは、従来技術の方法を用いた、切除された腋窩リンパ節における転移性がんの検知に関するＳＨＰの結果のフォトスタットを示す。図３Ａは、腋窩リンパ節組織のＨ＆Ｅ染色画像の顕微鏡写真を示し、領域は、１）きょう膜、２）正常リンパ節組織、３）髄洞、及び４）乳がん転移のようにマーク付けされる。図３Ｂに示すフォトスタット画像を取得するために、収集された赤外線スペクトル・データが、何人かの患者のデータを用いて訓練される診断アルゴリズムにより分析され、この診断アルゴリズムは、続いて、リンパ節内の正常領域とがん領域とを区別することができる。図３Ｂにおいて、フォトスタット画像は、正常組織とがん組織のみを区別するように訓練された教師あり（ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ）人工神経回路網により構成された、図３Ａと同じ組織を示す。回路網は、１２人の患者のデータを用いて訓練された。
【０００８】
当技術分野の幾つかの方法において、広帯域赤外線（ＩＦ）又は他の光出力が、干渉計などの器具を用いて試料（例えば組織試料）に透過され、干渉パターンを生成する。次いで、反射した及び／又は通過した透過が、典型的には別の干渉パターンとして検知される。次に、高速フーリエ変換（ＦＦＴ）を、比例化されたパターンで実行し、試料に関連するスペクトル情報を取得する。
【０００９】
ＦＦＴベースの技術プロセスの１つの限界は、例えばＩＲ及び可視光の両方を含むことができる広帯域スペクトル透過を用いるため、各帯域における単位時間あたりの利用可能エネルギー量が非常に低くなり得ることである。結果として、プロセスに利用可能なデータは、一般に、この手法においては本質的に制限される。さらに、利用可能な検知されたエネルギー・データがこのように低い場合に、受信したデータを背景のノイズと区別するためには、高感度液体窒素冷却検知器のような高感度器具を用いる必要がある（その結果、冷却により背景のＩＲ干渉の影響が緩和される）。他の欠点の中としては、このような技術システムは、非常に多額のコストがかかり、かつ冷却剤の使用を必要とすることがある。
【００１０】
Ｂｌｏｃｋ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社（非特許文献１を参照されたい）により製造された１つの技術装置において、干渉撮像装置をもたないＱＣＬの使用を提案しているが、ＱＣＬと撮像装置との間の動作を適切に協働させるための装置又はシステムは識別されていない。
【００１１】
当技術分野においては、例えば疾病の診断などの目的のために大気条件下で組織試料及び他の試料を撮像するために用いるために、ＩＲ及び／又は他の類似の透過を透過及び検知するための装置、方法及びシステムに対する、まだ対処されていない必要性が残っている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｊ．Ｃｏａｔｅｓ著、「Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＩＲ  Ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｙ：Ｔｈｅ  Ｄｅｖｉｌ  Ｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｅｔａｉｌ」、ＢｉｏＰｈｏｔｏｎｉｃｓ、２０１０年１０月、２４−２７頁
【非特許文献２】Ｍｉｌｏｓ  Ｍｉｌｊｋｏｖｉｃ著、「Ｌａｂｅｌ−Ｆｒｅｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  Ｈｕｍaｎ  Ｃｅｌｌｓ：Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ｆｏｒ  Ｉｍａｇｅ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒａｍａｎ  Ｈｙｐｅｒｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｄａｔａｓｅｔｓ」、Ａｎａｌｙｓｔ、２０１０年、２００２−２０１２頁、Ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
【発明の概要】
【００１３】
本発明の態様は、広範囲の離散スペクトル増分にわたる医学的診断用の赤外線顕微鏡データを迅速に収集するように設計された、広帯域、波長可変量子カスケードレーザ（ＱＣＬ）などのコヒーレント透過光源からのＩＲ透過、反射及び／又は透過反射などを用いた組織及び他の試料を撮像するための方法、装置及びシステムを含む。赤外線透過、反射及び／又は透過反射は、試料を透過し又は試料から反射され、次に検知器で検知する前に拡大及び／又は合焦される。検知後、試料に関連した画像データを用いて試料を評価する。
【００１４】
こうした方法、装置及びシステムは、既知の細胞病理学方法を用いて、こうした異常を診断できる前に、組織における異常を検知することができる。
【００１５】
方法、装置及びシステムはまた、撮像の制御及び処理を助けるために、可視光検知サブシステム及び／又は運動制御サブシステムを随意的に含むこともできる。
【００１６】
本発明の変形に関連する付加的な利点及び新規な特徴は、以下の記載において部分的に述べられており、以下を検証する又はその態様の実施を学習すると、当業者には、部分的にさらに明らかになるであろう。
【００１７】
本発明の態様は、本明細書で以下に与えられる詳細な説明、並びに単なる実例及び例として与えられ、従ってその態様に対して制限されない添付図面から完全に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】従来技術による、例示的なパップ・スメア・スライドのフォトスタット画像を示す。
【図１Ｂ】従来技術による、１０倍の顕微鏡拡大下の例示的なパップ・スメア・スライドの部分のフォトスタット画像を示す。
【図２】従来技術の液体ベースの方法により調製された細胞学的試料の１０倍の顕微鏡画像のフォトスタット画像の一例を示す。
【図３Ａ】従来技術の方法を用いた切除された腋窩リンパ節における転移性がんの検知についてのＳＨＰの結果のフォトスタット画像を示す。
【図３Ｂ】従来技術の方法を用いた切除された腋窩リンパ節における転移性がんの検知についてのＳＨＰの結果のフォトスタット画像を示す。
【図４】本発明の態様による、例示的な利用可能なＱＣＬ赤外線マイクロ分光計の種々の特徴の代表的なブロック図を示す。
【図５】本発明の態様による、波長可変レーザ・ベースのＩＲ源を用いた、画像試料からＩＲデータを収集するための例示的システムの代表的な図を示す。
【図６】本発明の態様に従って使用するための、種々のハードウェア・コンポーネント及びソフトウェア、並びに他の構成部の例示的なシステム図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本出願は、２００９年５月２９日の国際出願日を有する「ＭＥＴＨＯＤ  ＯＦ  ＲＥＣＯＮＳＴＩＴＵＴＩＮＧ  ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＳＰＥＣＴＲＡ  ＵＳＥＦＵＬ  ＦＯＲ  ＤＥＴＥＣＴＩＮＧ  ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ」と題する特許協力条約（ＰＣＴ）特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４５６８１号に基づいた、２０１０年１１月２４日に出願された「ＭＥＴＨＯＤ  ＯＦ  ＲＥＣＯＮＳＴＩＴＵＴＩＮＧ  ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＳＰＥＣＴＲＡ  ＵＳＥＦＵＬ  ＦＯＲ  ＤＥＴＥＣＴＩＮＧ  ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ」と題する、本出願人の同時係属中の米国特許出願第１２／９９４，６４７号にも関連し、２００８年５月２９日に出願された「ＭＥＴＨＯＤ  ＯＦ  ＲＥＣＯＮＳＴＩＴＵＴＩＮＧ  ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＳＰＥＣＴＲＡ  ＦＲＯＭ  ＭＡＰＰＩＮＧ  ＤＡＴＡ」と題する米国特許出願第６１／０５６，９５５号に対する優先権を主張し、さらに、２０１０年６月２５日に出願された「ＤＩＧＩＴＡＬ  ＳＴＡＩＮＩＮＧ  ＯＦ  ＨＩＳＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＳＰＥＣＩＭＥＮＳ  ＶＩＡ  ＳＰＥＣＴＲＡＬ  ＨＩＳＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＹ」と題する米国仮特許出願第６１／３５８，６０６号に関連する。本明細書で述べられる全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、その全体が引用により組み入れられる。相反する場合、定義を含む本明細書が基準となる。さらに、材料、方法及び例は、単なる説明のためのものであり、制限することを意図するものではない。別段の定めがない限り、本明細書で用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明の態様が属する技術分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。本明細書で述べられるものと類似又は同等の方法及び材料を、本発明の実施又は試験に用いることができるが、好適な例示的方法及び材料を以下に説明する。
【００２０】
特に、本発明の態様は、医療診断についての赤外線顕微鏡データの迅速な収集のために利用可能な器具、特徴及びシステムを説明し、これらを用いて、古典的な細胞病理学方法を用いて異常を診断できる前に、細胞における異常を検知することができる。
【００２１】
定義
便宜上、明細書、実施例及び添付の特許請求の範囲に用いられる特定の用語がここに集められる。本明細書における群又は用語に与えられた初期の定義は、特に示されない限り、個々の群又は用語に、又は別の群の部分として本明細書に適用される。
【００２２】
冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、本明細書においては、その冠詞の文法的目的語の１つ又は１つより多く（すなわち、少なくとも１つの）を指すために用いられる。例として、「１つの要素」は、１つの要素又は１つより多い要素を意味する。
【００２３】
用語「又は」は、本明細書においては、文脈上明らかに他のことを示さない限り、用語「及び／又は」を意味するように用いられ、これと変換可能に用いられる。
【００２４】
用語「約」は、本明細書においては、所定の数値の−又は＋２０％の値を意味するよう用いられる。従って、約６０％は６０％−２０％から６０％＋２０％までの値（すなわち４８％から７２％まで）を意味する。
【００２５】
用語「実質的に同じ」は、本明細書においては、２つの比較対象が、共通の特徴の少なくとも９０％を共有することを意味するよう用いられる。特定の例においては、共通の特徴は少なくとも９５％とすることができる。他の特定の例においては、共通の特徴は少なくとも９９％とすることができる。
【００２６】
用語「強度」は、本明細書においては、吸光率、透過率、反射吸光強度（透過反射率）等の測定値を含む、広義の通常の意味に従って用いられる。
【００２７】
用語「異常」は、良性疾患、ウイルス疾患又はがんをもたらし得る疾患を有する細胞を指す。異常細胞は、「正常」細胞とは異なるように検出可能であるスペクトルから判断されたスペクトル及び基準を有し得る。これらの異常細胞は、形態学的に正常又は非病変に見えるが、疾患を発現させる傾向がある。「正常」細胞は、疾患を持たず、かつ対照細胞として使用することができる。正常細胞は、疾患を持たないか又は疾患が発現しない被験者から試料採取することができる。
【００２８】
用語「上皮細胞」は、これらに限定されるものではないが、扁平、柱状又は立方形であり得る内皮細胞、中皮細胞、及び尿路上皮細胞を含む、器官の内側を覆う全ての細胞を含む。
【００２９】
用語「剥離細胞」は、自然過程により又は物理的操作により組織表面から擦り落ちた、除去された、分離された、又は落ちた細胞を指す。剥離細胞を収集する例示的な方法は、これらに限定されるものではないが、口腔又は膀胱擦過（子宮頸部へら又はブラシを使用）、婦人科の診察、尿のろ過などを含む。
【００３０】
本開示全体を通して使用されるときに、用語「スペクトル細胞病理学」（ＳＣＰ）は、特に断らない限り、個々に複数の細胞の中間赤外線スペクトル・データを取得し、かつ正常から良性疾患、ウイルスが感染した状態、又は前がん状態、又はがん状態への移行中の細胞の組成変化を判断するために得られたスペクトルを分析するためにマイクロ分光計を使用する方法を意味するものとする。
【００３１】
スペクトルによる組織切片の分析は、「スペクトル組織病理学」（ＳＨＰ）と呼ばれる。
【００３２】
本明細書で開示されるＱＣＬベースの赤外線マイクロ分光計（ＱＣＬＩＲＭＳ）は、大気温度におけるＩＲ検知を実質的に改善し、ＳＣＰ及びＳＨＰに対するスペクトル・データセットの取得を加速し、それにより、とりわけ赤外線ベースの医療診断及び予後予測の速度、実用性及び一般的適用性を改善するために用いることができる。
【００３３】
用語「扁平」、「柱状」及び「立方形」は、単純又は重層、角化又は非角化、及び／又は繊毛上皮細胞又は非繊毛上皮細胞のタイプを指す。
【００３４】
「単純」扁平細胞は、血管、リンパ管、体腔の中皮、及び腎臓の上行の薄い肢の内側を覆うことが見出されている。「重層」扁平細胞は、硬口蓋、舌背、歯肉、食道、直腸、肛門、皮膚、頸部、膣、大陰唇、中咽頭、角膜、及び外尿道口を覆うことが見出されている。
【００３５】
「単純」柱状細胞は、顎下腺、付着歯肉、小管、精巣上体、精管、精嚢、喉頭、気管、鼻、膜性尿道、陰茎尿道、胃、小腸と大腸、直腸、胆嚢、管上皮及び小葉上皮、卵管、子宮、子宮内膜、頸部、射精管、尿道球腺、及び前立腺の管内で見られる。「重層」柱状上皮細胞は、顎下腺付着歯肉、小管精巣上体、精管、精嚢、喉頭、気管、鼻、膜性尿道、及び陰茎尿道の管に見られる。
【００３６】
「単純」立方形細胞は、甲状腺瀘胞、脳質上衣、卵巣、細管直筋、精巣網、呼吸細気管支、及び腎臓の近位及び遠位尿細管内に見られる。「重層」立方形細胞は、汗腺管内に見られる。
【００３７】
用語「試験細胞」は、分析又は観察の対象になる生体内又は体外供給源から試料採取した細胞を指す。
【００３８】
細胞の「生理学的状態」は、正常、異常に関わらず、その健康状態を指し、かつ細胞疾患に至る可能性がある形態上の異常、生化学的異常、遺伝子異常、又は他の異常を含む異常を発現させるその傾向を指す。
「所定の基準」は正常な細胞又は異常な細胞の特性を示す値である。
【００３９】
本発明の態様は、組織の試料から取得することができるようなデータを含む、スペクトル・データの検知及び分析と共に用いられるコヒーレント及び非コヒーレントな透過光源を提供するための方法、システム及び装置を含む。本発明の態様による１つの例示的な変形において、ＩＲ波長可変レーザがコヒーレント透過光源として用いられる。幾つかの変形において、波長可変レーザからのＩＲ透過の波長は、関心のあるスペクトルにわたって別個のステップで変更され、スペクトルにわたる透過及び／又は反射した透過を検知し、画像分析に用いることができる。ＩＲ波長可変レーザを用いて得られた透過及び検知の大規模のために、こうした変更を行うことにより、とりわけ、検知器の冷却の使用及び関連した空間の必要性、並びに他のコストを大幅に削減することができる。
【００４０】
本発明の態様により使用可能なレーザの一例は、量子カスケード・レーザ（ＱＣＬ）であり、これは、例えば約６μｍから１０μｍまでの間のＩＲ波長出力（例：ＩＲ放射）の変更を可能にすることができる。他のタイプのレーザを用いて、類似の波長範囲にわたる出力を生成することもできる。しかしながら、多くのこうした他のレーザは、著しく高価であり、一般的には、生成された画像を評価することができる病理学者その他による使用には一般的に適しておらず、及び／又はＱＣＬと比べて他の欠点を有する場合がある。
【００４１】
１つの例示的な実施において、ＱＣＬを介してＩＲ波長出力の変化をもたらし、観察される試料に対する出力を方向付け、適切に拡大及び／又は合焦させ、かつ透過した及び／又は反射したＩＲ波長画像情報を検知するためのシステム・コンポーネントのセット全体は、およそ１立方フィート又はそれ未満を囲む寸法を有するハウジング内に構成可能かつ収容可能である。
【００４２】
本発明の態様によるシステムのこの例において、各々の要素が室温において３０×３０μｍの範囲の領域を検知する検知器の構成（例えば、配列）が用いられる。こうした検知器の配置は、例えば、こうした検知器の３２０×２８０のこうした検知器のアレイとし、８９，６００のこうした検知器の画像スペースを生成することができる（こうしたアレイ検知器の例は、本明細書において、「焦点面アレイ（ＦＰＡ）」検知器の「マイクロボロメータ検知器」又は「ＭＢＡ」と交換可能に称される）。
【００４３】
動作において、本発明の態様による特徴を用いた最小倍率で、ＱＣＬからのビーム出力は、３０×３０μｍ検知器による検知のために、試料の各領域を約１０×１０μｍの範囲で適切に照射することができる。従って、本発明の態様によるシステムは、ＩＲ顕微鏡とは異なる特徴及び動作を有する。
【００４４】
本発明の態様による１つの例示的な実施において、ＱＣＬのビームは、赤外線反射又は透過スライド上の巨視的スポット（直径約５−８ｍｍ）を照射するよう光学的に調整され、そのスライド上で赤外線ビームは試料と相互作用する。反射した又は透過した赤外線ビームは、好適な結像光学系を介して赤外線アレイ検知器に投射され、概ね解析限界のピクセル・サイズ（空間解像度）で照射領域全体を試料採取する。
【００４５】
例えば、試料は、生体組織検査からの組織のミクロトーム切片、又は剥離細胞の試料からの細胞の堆積からなることができる。しかしながら、本開示はこれらの生体試料に制限されるものではなく、空間解像赤外線分光計情報が所望されるいずれの試料を含むこともできる。
【００４６】
本方法を用いて、様々な細胞を試験することができる。こうした細胞は、上皮細胞を含む剥離細胞とすることができる。上皮細胞は、扁平上皮細胞（単純又は重層、及び角質化又は非角質化）、柱状上皮細胞（単純、重層、又は擬似重層、及び繊毛性又は非繊毛性）、及び立方上皮細胞（単純又は重層、繊毛性又は非繊毛性）に分類される。これらの上皮細胞は、腸、卵巣、男性胚組織、呼吸器系、角膜、鼻及び腎臓などの身体全体の種々の器官の内側を覆う。内皮細胞は、咽頭、胃、血管、リンパ系及び舌の内張りに見られる上皮細胞の一種である。中皮細胞は、体腔の内張りに見られる上皮細胞の一種である。尿路上皮細胞は、膀胱の内張りに見られる上皮細胞の一種である。これらの細胞の種類は、本明細書で説明される方法により区別されている。
【００４７】
組織又は細胞のボクセルの赤外線スペクトルは、試料ボクセルの化学組成又は生化学的組成全体のスナップ写真を表す。この組成は、正常な状態からがん状態への移行中に変化し、疾病は、細胞又は組織から収集されたスペクトルの多変量統計解析又は他の数学的方法により検知することができる。従って、多変量解析の好適な方法と併せて、赤外線顕微分光法を用いて、人体細胞の健康状態又は組織の切片におけるがん領域の存在を監視することができる。
【００４８】
ＳＣＰは、口腔及び子宮頸部細胞の両方における前がん、がん及びウイルス感染の診断に用いられる（例えば、ＤｉｅｍのＰＣＴ出願第ＵＳ２００９／０４８１号を参照されたい）。さらに、細胞の核からの赤外線波長のミー散乱及び反射の寄与の結果得られる光学的効果を含む、幾つかの光学的効果が説明され、これらは「共鳴ミー」散乱と呼ばれている効果を介する吸収特性と混合される。これらの光学的効果の理解に続いて、汚染されたスペクトルを修正する方法を説明する。
【００４９】
こうした大きな変化を有するデータセットに対して開発された分析方法は、二方向からの手法を用いる。第一に、教師なし多変量解析の方法を採用して、データセットが定量化可能な差異を含有するか否かを調査した。このために、主成分分析（ＰＣＡ）を用いた。
【００５０】
個々の細胞からスペクトル・データセットを解析するための第２のアプローチは、訓練された又は教師ありアルゴリズムを用いるものである。教師なし方法でスペクトル・パターンを区別できる場合は、標準的な細胞病理学又は細胞生物学からのスペクトル・データ及び相関関係に基づいて細胞を分類することができる判別アルゴリズムを考案することができる。この方法で、人工神経網（ＡＮＮ）及び／又は利用可能なスペクトル・データのサブセット上で訓練された他の装置及び／又はアルゴリズムを介して、細胞周期の異なる段階における上皮細胞の判別を実行することができる。成熟した子宮頸部細胞を、未熟なヒトの子宮頸部細胞と区別することもできるだけでなく、更年期の女性からの細胞を、更年期開始よりかなり前のものと区別することもできる。
【００５１】
正常剥離細胞のデータ・リポジトリを構築して、子宮頸部、口腔及び尿試料内に見られる細胞の正常な分布を確立した。この結果、スペクトル細胞病理学のあらゆる将来の応用の基本が形成され、細胞の成熟及び分化、及び疾病の段階に向けたスペクトル細胞学の優れた感度を実証した。
【００５２】
ＳＣＰ及びＳＨＰは、疾病の検知及び診断に対する必要な感度及び特異度を有する。これらのスペクトル方法は、古典的な細胞学及び病理学に優る幾つかの重要な利点を有し、それらは現在、染色細胞及び組織の目視（顕微鏡）検査により実行されている。ＳＣＰ及びＳＨＰの結果は、高い再現性及び反復性を有する分光計を介した物理的測定に基づいており、これらはデジタル方式で記録及び格納される。測定されたスペクトルの解釈は、利用可能な最良のコンセンサス・ベースの金基準に対して訓練された自己学習アルゴリズムにより実行され、再現可能かつ反復可能な基準によりスペクトル・データを評価する。スペクトル測定及びデータ解析の両方とも完全に機械ベースであり、オペレータの疲労及び専門知識に左右されない。ＳＣＰ及びＳＨＰは、適切な器具の検証及びアルゴリズムの訓練の後は、世界中で同じ結果を生成する。また、正常、異型、低悪性度腫瘍、高悪性度腫瘍、及びがんのような視覚的割り当て基準に依存するのではなく、各細胞についてのスペクトル細胞学の結果は、適切な規模の数値指標により表すことができる。
【００５３】
データの品質を保持及び改善しながら、従来のシステムに比べて少なくとも１０倍のデータ取得における削減を得ることができる。このデータ削減は、光子束、検知素子の検知感度、レーザ同調速度及びアレイ検知器の読み出し速度を考慮した計算を用いて得られる。
【００５４】
データ取得時間の削減は、がん、前がん及びウイルス感染のスクリーニングするための、剥離細胞の自動分析を実用的にする。さらに、同じ又は類似の器具のプラットフォームを用いて、改善された子宮頸部がんスクリーニング試験などの多くの組織病理学的手順のための組織切片を撮像することができる。標準的な細胞学的子宮頸部試験の全体的な精度は、約６５％である。さらに、例えば、類似の方法を用いて、異なる診断アルゴリズムにより、口腔の扁平細胞がんなどの口腔がんを診断することができる。これらのがんは、喫煙の直接的副産物であり、増加している。
【００５５】
以下のもの：すなわち、口腔がんスクリーニング（ＳＣＰ）、子宮頸部がんスクリーニング（ＳＣＰ）、ＨＰＶ試験、口腔／頸部（ＳＣＰ）、乳がんの腋窩リンパ節転移（ＳＨＰ）、乳がん−周縁部の退縮（ＳＨＰ）、乳がん−細針吸引（ＳＨＰ）、及び肺がん細針吸引（ＳＨＰ）は、ＳＣＰ／ＳＨＰの例示的な商業用途である。
【００５６】
これらの細胞試料のいずれにも影響を与える疾患は、本発明の態様による方法、システム及び装置を用いて検知可能である。例えば、本明細書における方法の変形を用いて、これらに限定されるものではないが、単純ヘルペス、ＨＰＶ及びエプスタイン・バー・ウイルスなどのウイルス感染、がんを示す形成異常及び悪性疾患に関連した変化、並びに過形成、化生及び炎症を含む良性反応性変化などの前疾病状態を示し得る細胞の成熟及び分化の変化を検知することができる。
【００５７】
幾つかの実験を行って、上述の方法及びシステムにより生成された再構成されたスペクトルの有用性を確立した。例えば、再構成されたスペクトルは、３つの広義の細胞区分：すなわち（ａ）正常な患者から収集された正常細胞、（ｂ）疾患を有することが分かっている患者から収集された形態学的に正常に見える細胞、（ｃ）疾患を有すること分かっている患者から収集された形態学的に異常に見える細胞について生成された。従来の形態学的分析は、タイプ（ａ）と（ｃ）（すなわち、形態学的に正常に見える細胞及び形態学的に異常に見える細胞）を区別することはできる。しかしながら、従来の形態学的分析は、タイプ（ａ）と（ｂ）（すなわち、正常細胞と、疾患を有することが分かっている患者から収集された視覚的に正常に見える細胞）は区別しない。しかしながら、以下に述べるように、タイプ（ｂ）（すなわち、疾患を有することが分かっている患者から収集された視覚的に正常にみえる細胞）の細胞の再構成されたスペクトルは、タイプ（ａ）の細胞（すなわち、正常細胞）のものとは異なり、これと区別することができる。以下に説明する方法は、タイプ（ａ）の細胞とタイプ（ｂ）の細胞とを容易にかつ自動的に区別し、これにより、従来の形態学的技術を用いて可能なよりも早くかつ信頼できる診断が可能になる。
【００５８】
例示的な実施
図４は、本発明の態様による例示的なＱＣＬＩＲＭＳの種々の特徴の代表的なブロック図である。ここで導入される器具の概念は、ＳＣＰ及びＳＨＰに対して等しく適用可能である。示される例において、波長可変ＱＣＬなどのコヒーレントＩＲ透過光源５０は、幾つかの従来装置の熱源（黒色本体）及び干渉計と置き換えられる。場合によっては、例えば、広帯域波長可変（１８００乃至９００ｃｍ-1、すなわち５．５乃至１１μｍ）ＱＣＬは、最初に低可変範囲のＱＣＬを用いる場合があるが、試料を適切に励起することができる。例えば０．５ｃｍ-1の帯域において、スペクトル範囲全体にわたって２０ｍＷより大きいコヒーレント波長レーザ出力を与えることができる。こうした適切なレーザは容易に入手可能である。こうしたレーザのビームの直径は、例えば、５ｍｍより大きいとすることができる。レーザは、波長範囲にわたって電子的に波長可変であり、数ｍｓの範囲内で波長を選択することができる。
【００５９】
随意的ビーム調整光学系５５を動作させて、レーザ出力を所望のサイズ及びビーム・プロファイルに合焦させることができる。次いで、例えば反射及び／又は透過スライド上に取り付けられた又は堆積された組織を含むことができる試料６０に、出力を向けることができる。試料６０により透過、反射及び／又は透過反射される出力を、収集し、例えば結像光学系６５などにより合焦させ、反射器６４などにより、６４０×４８０ピクセルのマイクロボロメータ・アレイ（ＭＰＡ）などの室温検知器７０に随意的に向けることができる。ＶＯｘマイクロボロメータ・アレイの比検出度Ｄ＊は、約２×１０8ｃｍＨｚ1/2Ｗとすることができる。こうしたレベルの検出度は、ＱＣＬの高出力と併せて、従来のシステムよりも改善した信号対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を有するスペクトルを容易に生成することができる。
【００６０】
図４の画像収集システム７５は、例えば、約１２インチ×６インチの設置面積、約１０インチの高さを有し、水蒸気の干渉を削減するために不活性ガスで充填された恒久的に密封された容器内に収容することができる。顕微鏡スライドは、反射面／試料を下向きにして、手作業で又は自動スライド・フィーダにより、ユニット上部のスライド・ホルダ内に配置することができる。
【００６１】
次いで、以下にさらに説明するように、検知器７０から受信したデータを、端末又は他のデータ取得ユニット（ＤＡ）などの処理装置８０により処理することができる。
【００６２】
図５を参照して以下にさらに説明するように、赤外線撮像モードにおいて、ＱＣＬから発せられた光を、カセグレン源を介して合焦させ、カセグレン対物レンズ内に合焦させて、例えば、円形開口部の半分だけが照射されるようにすることができる。レーザ光は、銀で被覆された反射スライド（「ｌｏｗ−ｅ」ｅスライド）上に取り付けられた試料により透過反射される前に、例えばフッ化バリウムを含む赤外線透明窓を通過することができる。カセグレンの他の半分は、受け取った反射出力を再収集し、その出力をカセグレン検知器の上に合焦し、カセグレン検知器は、例えば縁部上で７μｍの試料ピクセルが検知素子を満たすように画像を拡張し、試料ピクセルは、使用される検知器アレイによって、例えば、縁部上で１７×１７μｍから２５×２５μｍまでの間とすることができる。
【００６３】
別個の可視の撮像モードにおいて、カセグレン対物レンズの前に４５度ミラーを挿入して、非常に明るいＬＥＤにより生成できるような可視光により対物レンズの開口部全体を照らすことができる。この可視光は、試料によりｌｏｗ−ｅスライドに透過し、試料についての視覚画像データを収集する、標準的なＣＣＤのような検知器に合焦させることができる。
【００６４】
図５に示すように、例えば、本発明の態様は、波長可変レーザ（例えばＱＣＬ）などの波長可変ＩＲ出力装置１０５を含むＩＲ源サブシステム１００を含むことができ、波長可変ＩＲ出力装置の出力１０６（例えば、任意の所与の設定における単一の波長ビーム）は、カセグレン源（ＳＣ）などの整流装置１１０内に透過される。例えば、こうしたレンズ系がＩＲ透過性材料から構築されていない限りは、ＩＲの透過に対してこうしたレンズは不適当であるので、こうした装置１１０に対して顕微鏡レンズを使用することはできない。
【００６５】
出力１０６が整流装置１１０を出ると、随意的に、出力１０６は、ＩＲ反射器などの再指向機構１１５を介して、カセグレン対物レンズ（ＣＯ）などの拡大又は縮小装置１２０に再指向することができる。拡大（縮小）装置１２０から、合焦した後の出力１０６は、スライド上の組織試料などの撮像される試料１２５に向けることができる。本発明の態様による１つの例示的な変形において、撮像される試料１２５は、組織試料を含有し、裏塗り（例えば、薄い銀ベース塗装）を有して、出力１０６を反射させて透過反射（ｔｒａｎｓｆｌｅｃｔｉｏｎ）測定を可能にする。こうした被膜は、例えば可視スペクトル透過性とすることができる。
【００６６】
撮像される試料１２５から。透過した及び／又は反射した出力１２６は、カセグレン検知器（ＤＣ）などの合焦及び拡大装置１４０に向けられる。本発明の態様による１つの例示的な変形において、出力１２６は、反射器などの再指向機構１３０により再指向することができる。合焦及び拡大装置１４０内で、出力１２６を拡大し、ＭＢＡなどの検知装置１５０に向けることができる。例えば、拡大は、出力１２６が検知装置１５０内の１つの検知器のサイズに合致するような大きさにすることができる（例えば、試料の１０×１０μｍの面積の反射出力１２６を３倍に拡大し、例えば約５×７ｍｍのサイズとすることができる検知装置１５０全体の中の対応する３０×３０μｍ検知器による検知のために受けられるように撮像された領域を拡大する。）
【００６７】
図５には、サブシステム１００と併せて使用可能な、可視光検知サブシステムなどの随意的な二次検知サブシステム２００も示される。随意的な二次検知サブシステム２００は、例えば、撮像される試料１２５とＩＲ検知サブシステム１００との間に、全体的に又は部分的に動作可能に配置可能であり、移動させて、そのように配置されたときに、対応するＩＲ検知サブシステムの移動をもたらすように設計することができる。例えば、二次検知サブシステム２００は、ユーザが、二次検知サブシステム２００を視覚的に配置し、撮像される試料を可視の照明源に対して適切に位置合わせすることを可能にし、その結果、これに対応してＩＲ検知サブシステム１００からのＩＲ出力を撮像される試料１２５と位置合わせするように、ユーザが可視試料情報を取得できるようにする可視光検知構成部を含むことができる（例えば、１つの目的は、赤外線画像と可視画像の相関及び共存を可能にする可視画像を収集することとすることができる）。
【００６８】
図５に示されるように、サブシステム２００は、例えば、可視光源（例えば、１つ又はそれ以上の発光ダイオードすなわちＬＥＤ）などの可視出力装置２０５を含むことができる。可視出力装置２０５からの出力２０６は、可視光を合焦させるための、ＣＯなどの合焦装置２２０に向けることができる（注意：幾つかの変形においては、サブシステム２００のための合焦装置２２０は、サブシステム１００において用いられる合焦装置１２０と同じとすることができる）。出力２０６は、随意的に、例えば再指向装置２１５（例えば、ミラー）を介して、合焦装置２２０に再指向させることもできる。
【００６９】
出力２０６は、合焦装置２１５により合焦した後、撮像される試料１２５（例えば、スライド上の組織試料）を透過する、及び／又は、これに反射することができる。次に、透過された及び／又は合焦された出力２２６は、可視光対物レンズ（ＶＯ）などの可視光拡大装置２４０に向けることができる。拡大装置２４０から、出力２０６を、随意的に、例えば反射装置２４５（例えば、ミラー）及び合焦レンズ２５０を介して、可視光検知器（例えば、電荷結合素子すなわちＣＣＤカメラ）などの検知装置２６０にさらに向けることができる。
【００７０】
図５のシステムは、１つ又はそれ以上のパーソナル・コンピュータ（ＰＣ）、ミニコンピュータ、メインフレーム・コンピュータ、マイクロコンピュータ、電話装置、又はシステムの動作を制御し、データを受信、格納及び処理するための、携帯情報端末（ＰＤＡ）又は手持ち式無線装置のような無線装置などの、１つ又はそれ以上の端末３００を含む制御サブシステムをさらに含むことができる。１つ又はそれ以上の端末３００は、プロセッサ、データ・リポジトリ、及び／又は、例えばインターネット若しくはイントラネットなどの、例えばネットワークを介するデータのためのリポジトリへの結合を含むことができる。この結合は、例えば、有線、無線、又は光ファイバーリンクを含むことができる。
【００７１】
１つ又はそれ以上の端末３００は、ＩＲ出力装置１０５、検知装置１５０、検知装置２６０、及び／又は１つ又はそれ以上の運動制御装置３１０（例えば、サーボモータ）の１つ又はそれ以上に結合して（例えば、結合３０１）、出力１０６及び／又は出力２２６に対して撮像される試料１２５の位置を制御することができ、これらの全て又は一部は、制御サブシステムの部分を含むこともできる。
【００７２】
作動において、１つ又はそれ以上の端末３００は、例えば、二次検知サブシステム２００が検知装置２６０からデータを受信できるようになったとき、受信したデータを処理し、撮像される試料１２５を透過した可視光に対応する出力を生成する（例えば、ディスプレイ上に画像を表示する）。撮像される試料１２５の第１の１０×１０μｍの部分について、撮像される試料１２５をＩＲ検知サブシステム１００に対して正しく配置すると、１つ又はそれ以上の端末３００により、ＩＲ出力装置１０５が、１つ又はそれ以上の波長設定を順に行って、各波長について特定の時間だけ対応する出力１０６を生成し、各出力波長に対応する検知器１５０からいずれかのデータ出力を取得及び格納し、次に、相対位置を移動させ、撮像される試料の残りの１０×１０μｍの部分の各々に対応する取得されたデータを同様に再撮像及び格納する。
【００７３】
作動において、例えば、ＩＲ出力の範囲（例えば、１８００乃至９００ｃｍ-1）をもつ波長可変ＱＣＬは、ＭＢＡの各検知素子におけるスライド上の組織試料の（又は、例えば細胞についての）照射領域全体における範囲の第１の波長（例えば１７９９．５ｃｍ-1）において第１の透過を生成するよう設定することができる。この波長（例えば、１７９９．５ｃｍ-1）に対応する画像は、端末上のデータ・リポジトリ内に格納される。このプロセスは、ＱＣＬの次の波長増分（例えば、１７９０．０ｃｍ-1）について反復され、試料の１０×１０μｍの部分の全てについての、ＱＣＬの波長範囲全体にわたって反復される。
【００７４】
異なるレーザ波長で収集された、検知素子の各ピクセルについての強度値は、結合されて特定のピクセル位置に対応する赤外線スペクトルを形成する。それぞれのピクセル位置により参照される全てのスペクトルが結合されて、「スペクトル超立方体」として知られるデータ構造となる。
【００７５】
取得された全データから（データの全体性は、本明細書において、「スペクトル超立方体」及び／又は「ハイパー・データセット」と交換可能に呼ばれる）、初期プロセスを実行し、データを、例えば試料中の特定の化学成分が多いことを強調する「一変量マップ」すなわち「化学的画像」に再構成する。例えば、その内容全体を引用により本明細書に組み入れる非特許文献２を参照されたい。
【００７６】
初期プロセスは、例えば、試料内の細胞についての細胞スペクトルの再構成を含むことができ、以下のように生成することができる（例えば、Ｄｉｅｍ他のＰＣＴ出願第ＵＳ２００９／０４８１号を参照されたい）。赤外線マイクロ分光計からの生データセットを、好ましくは各細胞について９から１００までの間の、マッピング・モードで収集された個々の細胞のスペクトルを再構成するソフトウェアに取り込むことができる。これは、どのピクセル・スペクトルが画像マップの所定の細胞に属するかを確立することによって行われる。このプロセスは、個々の細胞に属する隣接する領域が識別されるバイナリ・マスクを構成することによって達成される。このマスクは、アミドＩ強度の閾値を定めることによって確立することができる。細胞により占有される各隣接する領域に対して、最大アミドＩ強度を有するスペクトルから始まる細胞スペクトルを計算する。このスペクトルは、恐らく常に最大たんぱく質強度を示す細胞の核からのものである。ひとたびバイナリ・マスクによりスペクトルが細胞と関連付けられると、全てのスペクトルは、続いて相互追加され（ｃｏ−ａｄｄ）、スペクトル品質を保証するために幾つかの制約を受ける。これらの基準は、分散アーチファクトにより汚染される場合がある細胞の縁部からのスペクトルのような細胞スペクトルを汚染する不良の信号対ノイズ比をもつ非常に弱いスペクトルの相互追加を防止するために課せられる。次に、相互追加された細胞スペクトル、並びに各細胞の座標を更なるデータ分析のためにエクスポートする。
ここでこの方法が次のようにより詳細に説明される。
【００７７】
データセットを生成するために、顕微鏡スライド上で細胞試料の赤外線スペクトル・データを全ての試料領域から収集する。ピクセルごとに、あらゆる強度オフセットを除去し、かつ、全てのスペクトルが正の強度値を有することを確実にするように、同じピクセルのスペクトル内の各強度値から、各ピクセルのスペクトルの最低強度値を減算する。例えば、ピクセルＰは、測定値のセット（Ｉ１、Ｉ２、．．．ＩＮ）を含むことができ、ここで各測定値ＩＮは、特定の波数での強度を表している。ＩｊがこれらのＮ値で最も低い場合、このステップの後に、ピクセルＰは、値（Ｉ１−Ｉｊ、Ｉ２−Ｉｊ、．．．ＩＮ−Ｉｊ）を有する。この正規化ステップが、各ピクセルに対して実行される。
【００７８】
前のステップにおいて生成された減算されたスペクトル・データを用いて、全てのサンプリング領域のスペクトル・マップが作成される。スペクトル・マップ内のピクセルの数は、所定のピクセル・サイズで走査した試料領域に基づいている。スペクトル・マップは、各ピクセルにグレイスケール値を割り当てることによって作成することができる。このグレイスケール値は、「アミドＩ」帯域の積分領域に基づくことができ、これは、全てのタンパク質の赤外線スペクトル内の波数およそ１６４０ｃｍ-1と１６７０ｃｍ-1との間で発生する。
【００７９】
アミドＩ帯域に高い積分強度を有するピクセルには、白色又は薄い灰色の色調が割り当てられ、最低強度を有するピクセルには、黒色又は濃い灰色の色調が割り当てられる。最高強度値と最低強度値との間の強度を有するピクセルは、黒と白の間のグレイスケール尺度上に線形にマッピングすることができる。スペクトル・マップは、グレイスケールの代わりに、カラー画像として生成することもできる。グレイスケール値は、例えば、スペクトル領域内のあらゆる帯域の強度、スペクトル領域内の２つの強度点の間の比率、スペクトル領域内の２つの強度点の間の積分領域、又は２つのスペクトル領域間の積分領域の比率に基づくこともできる。
【００８０】
ピクセルのアミドＩ強度を判断する方法をここで説明する。１６５０ｃｍ-1のピークは、細胞タンパク内のペプチド骨格のカルボニル伸縮振動から生じるものであり、かつ細胞の存在を示すものである。従って、アミドＩ強度は、波数１６５０ｃｍ-1に最も近い強度ピークの位置を見つけることによって判断される。最小アミドＩ強度閾値値を設定する。例えば、最小アミドＩ強度閾値値は、明確なタンパク質をもたないあらゆるピクセルを拒否するために０．１５吸光立単位に設定することができ、従って細胞によるものではない。この閾値のための０．１５の値は、検知器により受信したビームの強度を試料に入射するビームの強度で割ったものが０．１５に等しい状況に対応する。閾値を用いて、グレイスケール・マップをバイナリマップに変換する。バイナリマップの各ピクセルは、スペクトル・マップ内の１つのピクセルに対応し、バイナリマップ内の各ピクセルを２つの値（例えば、白色又は黒色）の一方に設定することができる。スペクトル・マップからピクセルを選択し、ピクセル・スペクトル内のアミドＩ強度値を識別する。アミドＩ強度値を最小アミドＩ強度閾値値と比較する。アミドＩ強度値が閾値よりも大きいか又はそれに等しい場合、バイナリマップ内の対応するピクセルに白色を割り当てる。アミドＩ強度値が閾値より小さい場合、バイナリマップ内の対応するピクセルに黒色を割り当てる。スペクトル・マップ内の全てのピクセルが選択されるまで、このプロセスを繰り返す。
【００８１】
バイナリマップ内の隣接する白色領域を識別し、細胞又は細胞の塊と関連付ける。次に、隣接する白色領域の群に基づいて、バイナリマップ内の初期細胞数を識別する（例えば、隣接する白色領域の数をカウントする）。各ピクセルの位置座標を格納する。
【００８２】
バイナリマップは、細胞の塊及び／又は汚染物質と関連付けられたピクセルを除去することによって精緻化することができる。例えば、１つの細胞に寄与するピクセルの数の上限及び下限を設定し、バイナリマップから直径約６０μｍを超える重なり合う扁平細胞に寄与するピクセルを除去することができる。一例として、９０ピクセルという上限値により、バイナリマップにおいて、大きな成熟した扁平細胞に対応するか、又は重なり合う細胞の大きな塊に対応する隣接する白色ピクセルが、さらに分析されることが防止される。細胞を定めるピクセル数の下限値は、汚染物質に相当するバイナリマップ内の隣接する白色ピクセルがさらに分析されることを防止するために、約１５に設定することができる。従って、本方法は、関心のある細胞になるには大きすぎるか又は小さすぎるバイナリマップ内の隣接する白色ピクセル域の領域を選別して除去する。これらのステップでは、事実上、大きすぎるか又は小さすぎる領域を廃棄することにより、精緻化されたバイナリマップを生成する。結果として得られるバイナリマップは、試料内の関心のある細胞に属するピクセルを示し得る。精緻化したバイナリマップにおいて識別した細胞の数と等しくなるよう、試料内の細胞の数を更新する。
【００８３】
バイナリマップにおいて識別された各細胞のスペクトルを、個々のピクセル・スペクトルから再構成する。生成された精緻化されたバイナリマップにおいて識別された細胞から単一の細胞を選択し、最大アミドＩ強度値を有する細胞内のピクセルを識別する。次に、同じ細胞と関連付けられ、そのピクセルに隣接する白色ピクセルを識別する。選択したピクセルの２つの基準（その両方を以下で説明する）を検査する。ピクセルが両方の基準を満たす場合、選択したピクセルのスペクトルは、前のピクセルのスペクトルに相互追加される。この相互追加されたスペクトルは「再構成された」スペクトルである。例えば、スペクトル領域内のあらゆる帯域の強度、スペクトル領域内の２つの強度点の間の比率、スペクトル領域内の２つの強度点の間の積分領域、又は２つのスペクトル領域間の積分領域の比率により、ピクセルを選択することができる。
【００８４】
２つの基準のうちの第１のものは、ピクセル内のアミドＩ強度を閾値強度値と比較し、アミドＩ強度がその閾値強度値よりも大きいか又はこれに等しいかを判断するための検査である。閾値は、最大アミドＩ強度を有していた細胞内のピクセルの値の百分率の所定の百分率（例えば６６パーセント）に設定することができる。ピクセルの値が閾値より小さい場合、そのピクセルを廃棄する（すなわち、そのスペクトルは、細胞内の他のピクセルのスペクトルに相互追加されない）。この評価では、全体的に薄く、かつ弱いノイズがあるスペクトルに関連している原形質の外縁に関連付けられたピクセル・スペクトルを除去する。ピクセルがアミドＩ強度基準を満たす場合、ピクセル内のアミドＩ強度に対応する波数が、細胞内の最大アミドＩ強度に対応する波数と比較される。値が等しくない場合、最大値からの値のシフトが判断され、値を閾値アミドＩ波数シフト値と比較する。例えば、閾値波数シフト値は、４ｃｍ-1に設定することができる。ピクセルのアミドＩ波数シフトが閾値波数シフト値未満であるか又はこれに等しい場合、ピクセルのスペクトルを細胞内の他のピクセルのスペクトルに相互追加する。他の場合には、ピクセルは、廃棄されて他のピクセルに相互追加されない。
【００８５】
細胞の位置座標と共に各細胞の相互追加されたスペクトルを格納する。細胞スペクトルは、典型的には、約３０乃至約７０個の個々のピクセル・スペクトルを相互追加することによって構成することができる。
【００８６】
代替的に、再構成されたスペクトルは、(ａ)いずれかの波数で強度を測定する、（ｂ）いずれかの波数で２つの強度値の間の比率を計算する、（ｃ）いずれかの波数で２つの強度値の間の積分領域を計算する、又は（ｄ）いずれかの波数で２つの強度値の間の積分領域の比率を計算することのいずれかによって生成することができる。スペクトル・マップは、アミドＩ帯域の強度又は積分領域だけに対していずれかの選択した強度に基づくことができる。同様に、アミドＩ強度値に対して最小閾値を、ピクセルのいずれかの選択した値と比較することができる。また、いずれかの選択した波数で最大値を有することに基づいて、ピクセルを選択することができ、アミドＩに対応する波数は用いる必要がない。次に、ピクセルは、特定の波数での強度に基づいて保持又は廃棄され、ここでもまた、アミドＩに対応する波数は用いる必要がない。
【００８７】
ひとたび全てのデータが取得され、格納され、初期の処理がなされると、全体データパターンを評価する。例えば、撮像される試料が組織試料である場合は、その組織試料についてのスペクトル・データパターンを、疾病のある組織に対して評価し、疾病が存在する尤度を判断することができる。例えば、こうした評価は、試料内の化学組成の空間的変化の分析を含むことができる（例えば、組織におけるがんの存在は、健康な組織と比較して、異常な組成のスペクトルを生成し得る）。
【００８８】
本発明の態様は、ハードウェア、ソフトウェア又はそれらの組み合わせを用いて実施することができ、かつ１つ又はそれ以上のコンピュータ・システム又は他の処理システムにおいて実施することができる。本発明の１つの態様において、特徴は、本明細書において説明される機能を実行することができる１つ又はそれ以上のコンピュータ・システムに向けられる。こうしたコンピュータ・システム４００の例を図６に示す。
【００８９】
コンピュータ・システム４００は、プロセッサ４０４などの１つ又はそれ以上のプロセッサを含む。プロセッサ４０４は、通信インフラ４０６（例えば通信バス、クロスオーバー・バー、又はネットワーク）に結合される。種々のソフトウェア態様が、この例示的なコンピュータ・システムに関連して説明される。本説明を読めば、他のコンピュータ・システム及び／又はアーキテクチャを用いて本発明の態様をどのように実施するかが、当業者には明らかになるであろう。
【００９０】
コンピュータ・システム４００は、ディスプレイ・ユニット４３０上に表示するために、グラフィックス、テキスト及び他のデータを通信インフラ４０６（又は、図示されないフレーム・バッファ）から転送するディスプレイ・インターフェース４０２を含むことができる。コンピュータ・システム４００は、好ましくはランダム・アクセス・メモリ（ＲＡＭ）であるメインメモリ４０８を含むことができ、二次メモリ４１０を含むこともできる。二次メモリ４１０は、例えば、ハードディスク・ドライブ４１２及び／又は、フロッピーディスク・ドライブ、磁気テープ・ドライブ、光学ディスク・ドライブなどを表す取り外し可能ストレージ・ドライブを含むことができる。取り外し可能ストレージ・ドライブ４１４は、周知の方法で取り外し可能ストレージ・ユニット４１８との間で読み出し及び／又は書き込みを行うことができる。取り外し可能ストレージ・ユニット４１８は、取り外し可能ストレージ・ドライブ４１４との間で読み出し及び書き込みを行うことができる、フロッピーディスク、磁気テープ、光学ディスクなどを表す。理解されるように、取り外し可能ストレージ・ユニット４１８は、コンピュータ・ソフトウェア及び／又はデータが内部に格納されるコンピュータ使用可能ストレージ媒体を含むことができる。
【００９１】
本発明の代替的な態様は、二次メモリ４１０を含むことができ、かつコンピュータ・プログラム又は他の命令をコンピュータ・システム４００内にロードすることを可能にするための他の類似の装置を含むことができる。こうした装置は、例えば、取り外し可能ストレージ・ユニット４２２及びインターフェース４２０を含むことができる。こうした例としては、プログラム・カートリッジ及びカートリッジ・インターフェース（ビデオゲーム装置に見られるものなど）、取り外し可能メモリチップ（消去可能プログラム可能読み出し専用メモリ（ＥＰＲＯＭ）、又はプログラム可能読み出し専用メモリ（ＰＲＯＭ）など）及び関連したソケット、並びに、ソフトウェア及びデータを取り外し可能ストレージ・ユニット４２２からコンピュータ・システム４００に転送するのを可能にする他の取り外し可能ストレージ・ユニット４２２及びインターフェース４２０を挙げることができる。
【００９２】
コンピュータ・システム４００はまた、通信インターフェース４２４を含むこともできる。通信インターフェース４２４は、ソフトウェア及びデータをコンピュータ・システム４００及び外部装置の間で転送することを可能にできる。通信インターフェース４２４の例として、モデム、ネットワーク・インターフェース（イーサネット・カードなど）、通信ポート、パーソナル・コンピュータ・メモリカード国際協会（ＰＣＭＣＩＡ）スロット及びカード等を挙げることができる。通信インターフェース４２４を介して転送されるソフトウェア及びデータは、信号４２８の形態とすることができ、この信号４２８は、電子信号、電磁信号、光信号、又は通信インターフェース４２４により受信することができる他の信号とすることができる。これらの信号４２８は、通信パス（例えば、チャネル）４２６を介して通信インターフェース４２４に提供することができる。このパス４２６は、信号４２８を伝達し、ワイヤ又はケーブル、光ファイバ、電話回線、携帯リンク、無線周波数（ＲＦ）リンク及び／又は他の通信チャネルを用いて実装することができる。本明細書で用いられる「コンピュータ・プログラム媒体」及び「コンピュータ使用可能媒体」という用語は、一般的に、取り外し可能ストレージ・ドライブ４８０、ハードディスク・ドライブ４７０内に取り付けられたハードディスク及び／又は信号４２８などの媒体を指す。これらコンピュータ・プログラム製品は、ソフトウェアをコンピュータ・システム４００に提供することができる。本発明の態様は、こうしたコンピュータ・プログラム製品に向けられる。
【００９３】
コンピュータ・プログラム（コンピュータ制御論理とも呼ばれる）は、メインメモリ４０８及び／又は二次メモリ４１０内に格納することができる。コンピュータ・プログラムは、通信インターフェース４２４を介して受信することもできる。こうしたコンピュータ・プログラムは、実行されるとき、コンピュータ・システム４００が、本明細書で説明された本発明の態様による特徴を実行することを可能にする。特に、コンピュータ・プログラムは、実行されるとき、プロセッサ４１０が本発明の態様による特徴を実行することを可能にする。従って、こうしたコンピュータ・プログラムは、コンピュータ・システム４００のコントローラを表すことができる。
【００９４】
ソフトウェアを用いて本発明の態様を実施できる場合、ソフトウェアは、コンピュータ・プログラム製品内に格納し、取り外し可能ストレージ・ドライブ４１４、ハードドライブ４１２又は通信インターフェース４２４を用いてコンピュータ・システム４００にロードすることができる。制御論理（ソフトウェア）は、プロセッサ４０４によって実行されるとき、プロセッサ４０４に本明細書で説明された機能を実行させることができる。本発明の別の態様において、システムは、主として、例えば特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）などのハードウェア部品を用いてハードウェアに実装することができる。本明細書で説明された機能を実行させるためのハードウェア状態機械の実装は、当業者には明らかになるであろう。
【００９５】
更に別の変形において、ハードウェア及びソフトウェア両方の組み合わせを用いて、本発明の態様を実施することができる。
【００９６】
実施例
現在利用されているデータ取得のためのＳＣＰ及びＳＨＰ器具による方法
文献の調査により、干渉計の原則に基づいた市販の又は修正された分光計を用いて収集された信頼できるＳＨＰ及びＳＣＰ結果が近年出版されたことが分かった。これらの器具においては、広帯域光源からの赤外線（典型的には、１３００Ｋから２０００Ｋまでの間に加熱された黒体放射体）がマイケルソン型干渉計により変調され、カセグレン対物レンズを介して試料上に合焦され、同じ又は別のカセグレンを介して収集され、焦点面において検知器の上に合焦される。市販の器具は、６４×６４素子から２５６×２５６素子までの様々なサイズがある光起電ＨｇＣｄＴｅ検知器アレイ、又は、８×２素子の光伝導性ＨｇＣｄＴｅ検知器のいずれかを用いる。これら検知器のタイプの両方とも、典型的には７７°Ｋの極低温で動作させる必要がある。各検知素子（及び結果的に、各々のピクセル領域）について収集された干渉写真が、フーリエ変換され、背景スペクトルに対して比例化されて、各々の試料点の透過又は吸収スペクトルを生成する。
【００９７】
調査した最新の報告は、可視スペクトル範囲においては透明であるが、赤外線においては完全に反射性の特別に被覆された顕微鏡スライド上に調製された試料についての吸収−反射（透過反射としても知られる）モードで実行された。これらの「ｌｏｗ−ｅ」スライドは、低価格で市販されている（例えば、オハイオ州Ｃｈｅｓｔｅｒｌａｎｄ所在のＫｅｖｌｅｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。赤外線データ取得の時点で、染色剤がスペクトル・データ取得を妨げるので、試料はまだ染色されていない。
【００９８】
以下の説明においては、識別される器具は、例としてのみ提供され、説明はこれらの器具に限定されるものではない。ＳＨＰの場合、（未染色の）組織の領域をＩＲ顕微鏡により視覚的に選択してデータ取得することができる。その後、器具は、サイズが６．２５μｍ×６．２５μｍの個々のピクセルからスペクトル・データを収集する。信号品質を改善するために、各ピクセルについて複数のデータ取得が可能である。最終データセットは、固有の器具フォーマットで格納され、遠隔処理のためエクスポートされる。
【００９９】
最大数平方ミリメートルに至る領域の画像データ取得は、ＳＨＰにおける標準的手法であるが、データ取得を単純化しスピードアップするＳＣＰに対する撮像手法を用いることもできる。この手法の実施の１つの例においては、細胞堆積物のサンプリング領域全体が、約６．２５μｍ×６．２５μｍのピクセル・サイズでマッピングされる。この例示的な方法のアルゴリズムは、後に個々のピクセル・スペクトルから細胞スペクトルを再構成する。
【０１００】
これら器具は、概ね満足できるデータを提供するが、医学的に重要なデータセットの取得には、病理学者又は細胞学者が単一のスライドにかかる時間よりも、大幅に長い時間がかかる。ＳＨＰにおいて、所望の信号品質における１×１ｍｍの組織切片のデータ取得には、６．２５μｍのピクセル・サイズにおいて２５，６００のスペクトルの収集を必要とし、約４０分かかる。データ取得のための装置は、液体窒素などの低温冷却剤の使用を回避するために室温の検知器を使用すべきであり、かつ「押しボタン式操作可能なもの」であるべきである。
【０１０１】
ここで本発明の例示的な態様が上記の利点に従って説明された。これらの例は、単に本発明の例証であることが理解される。当業者には、多くの変形及び修正が明らかであろう。
【符号の説明】
【０１０２】
６０、１２５：試料
６５：光学系
７０：検知器
７５：画像収集システム
１００：ＩＲ検知サブシステム
１０５、２０５：出力装置
１０６、１２６、２０６、２２６：出力
１１０：整流装置
１１５：再指向機構
１２０、２４０：合焦装置（拡大（縮小）装置）
１３０：再指向機構
１４０：合焦及び拡大装置
１５０、２６０：検知装置
２００：二次検知サブシステム
２４０：拡大装置
２４５：反射装置
２５０：合焦レンズ
３００：端末
３１０：運動制御装置
４００：コンピュータ・システム
４０２：ディスプレイ・インターフェース
４０４：プロセッサ
４０６：通信インフラ
４０８：メインメモリ
４１０：二次メモリ
４１２：ハードディスク・ドライブ
４１４、４１８、４８０：取り外し可能ストレージ・ドライブ
４２０：インターフェース
４２２：取り外し可能ストレージ・ユニット
４２４：通信インターフェース
４２８：信号
４３０：ディスプレイ・ユニット
ＭＢＡ：マイクロボロメータ検知器
ＱＣＬ：量子カスケード・レーザ
ＱＣＬＩＲＭＳ：ＱＣＬベースの赤外線マイクロ分光計
ＳＣＰ：スペクトル細胞病理学
ＳＨＰ：スペクトル組織病理学
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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