(57)【要約】  改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドおよび改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを使用する方法が提供される。また、改変されたテルペンシンターゼを生成する方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドをコードする核酸分子であって、
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号３に示される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドに対して１００％未満または１００％の同一性を有するアミノ酸の配列を含み、
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対して９５％未満の同一性を有するアミノ酸の配列を含み、
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼに対して６２％超の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む、核酸分子。
【請求項２】
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、バレンセンシンターゼポリペプチド中にアミノ酸改変を含み、それによって
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号３に示される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドに対して１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対して９５％未満の同一性を有するアミノ酸の配列を含み、
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼに対して６２％超の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
改変されたバレンセンポリペプチドが、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼに対して少なくとも８２％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
改変を含有しないバレンセンシンターゼまたは配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドと比較して、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチド中の改変の数が、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６または１３７である、請求項１から２のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項５】
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、９５％未満かつ７５％超、９４％未満かつ７５％超、９３％未満かつ７５％超、９２％未満かつ７５％超、９５％未満かつ８０％超、９４％未満かつ８０％超、９３％未満かつ８０％超、９２％未満かつ８０％超、９５％未満かつ８５％超、９４％未満かつ８５％超、９３％未満かつ８５％超および９２％未満かつ８５％超の中から選択される配列番号２に示されるバレンセンシンターゼに対する配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む、請求項１から４のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項６】
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼに対して、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％もしくは７５％未満または約９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％もしくは７５％の同一性を有するアミノ酸の配列を含む、請求項１から５のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項７】
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号３に示される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸の配列を含む、請求項１から６のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項８】
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号３に示される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドに対して、少なくともまたは約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸の配列を含む、請求項１から７のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項９】
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドをコードする核酸分子であって、
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号２８９〜２９１、３４６、３４７、７５２、８８２、８８３または８８６のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含有せず、
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼと比較してアミノ酸改変を含み、それによって、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対して、１００％未満の同一性かつ６２％超の同一性を有するアミノ酸の配列を含む、核酸分子。
【請求項１０】
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号６〜８、１４〜１６および３４８のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含有しない、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項１１】
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号３に示されるアミノ酸の配列を含有しない、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項１２】
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号５に示されるアミノ酸の配列を含有しない、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項１３】
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、非環式ピロリン酸テルペン前駆体からのバレンセンの形成を触媒する、請求項１から１２のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項１４】
非環式ピロリン酸テルペン前駆体が、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）である、請求項１３に記載の核酸分子。
【請求項１５】
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、同一条件下で、同一宿主細胞において配列番号２に示されるバレンセンシンターゼによってＦＰＰから生成されたバレンセンの量よりも多い量で、宿主細胞においてＦＰＰからバレンセンを生成し、それによって、宿主細胞がＦＰＰを生成する細胞である、請求項１から１４のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項１６】
宿主細胞が、酵母細胞である、請求項１５に記載の核酸分子。
【請求項１７】
生成されたバレンセンの量が、
同一条件下、酵母の同一株において、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドおよび配列番号２に示されるバレンセンシンターゼを発現する酵母細胞を別個に培養することと、
生成されたバレンセンの量を比較することと
によって評価される、請求項１６に記載の核酸分子。
【請求項１８】
改変されたバレンセンシンターゼによってＦＰＰから生成されたバレンセンの量が、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼによってＦＰＰから生成されたバレンセンの量よりも、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、５００％もしくはそれ以上多い；または配列番号２に示されるバレンセンシンターゼによってＦＰＰから生成されたバレンセンの量よりも、１０％〜５００％、１０％〜２５０％、５０％〜２５０％、１００％〜５００％多いか、もしくは１００％〜２５０％多い、請求項１５から１７のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項１９】
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドによって生成されたバレンセンの量が、酵母細胞培養培地中、少なくとももしくは約０．１ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ、０．３ｇ／Ｌ、０．４ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、０．６ｇ／Ｌ、０．７ｇ／Ｌ、０．８ｇ／Ｌ、０．９ｇ／Ｌ  １．０ｇ／Ｌ、１．１ｇ／Ｌ、１．２ｇ／Ｌ、１．３ｇ／Ｌ、１．４ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、２．０ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４．０ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、５．０ｇ／Ｌもしくはそれ以上である；または酵母細胞培養培地中、０．１ｇ／Ｌ〜５．０ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ〜３．０ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ〜５．０ｇ／Ｌ、１．０ｇ／Ｌ〜５．０ｇ／Ｌもしくは１．０〜３．０ｇ／Ｌである、請求項１から１８のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項２０】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼが、配列番号２に示されるアミノ酸位置に関するＣＶＳ番号付けによって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、５０、５３、５４、５５、５６、５７、５８、６０、６２、６９、７７、７８、８２、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１８、１２０、１２１、１２２、１２４、１２５、１２７、１２９、１３０、１３２、１３５、１３６、１３８、１３９、１４１、１４２、１４４、１４６、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６２、１６３、１６５、１６６、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２７、２２８、２２９、２３８、２５２、２５７、２６３、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０５、３０６、３０７、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２９、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７５、３７７、３７８、３８０、３８１、３８２、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４２２、４２３、４２４、４２８、４２９、４３４、４３５、４３６、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５１、４５２、４５４、４５７、４６５、４６８、４７３、４７４、４８４、４９２、４９５、４９６、４９９、５００、５０１、５０６、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３６および５３９の中から選択される位置に対応する位置で、バレンセンシンターゼポリペプチド中に少なくとも１つのアミノ酸改変を含む、請求項１から１９のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項２１】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号２に示される位置に関するＣＶＳ番号付けによってM1T、S2R、S2K、S2E、S2Q、S2P、S2T、S2L、S2H、S2A、S2V、S3D、S3R、S3G、S3I、S3E、S3V、S3A、S3T、S3L、S3M、S3N、G4K、G4V、G4N、G4I、G4R、G4S、G4P、G4A、G4E、G4F、G4C、G4T、G4L、G4Q、E5A、E5G、E5S、E5T、E5D、E5H、E5I、E5P、E5L、E5N、E5V、T6R、T6V、T6D、T6L、T6A、T6E、T6K、T6S、T6G、T6C、T6M、T6Y、F7C、F7A、F7Q、F7K、F7S、F7G、F7T、F7L、F7R、F7P、F7N、T10V、A11T、D12N、S16N、L17I、R19K、R19P、R19G、N20D、H21Q、L23I、L23S、K24A、K24Q、K24Y、K24T、G25Y、A26T、S27P、D28G、D28E、F29D、D33T、H34R、T35A、A36C、T37K、Q38V、Q38A、Q38N、Q38E、R40Q、H41I、R50G、T53L、T53R、D54A、D54P、D54C、A55T、A55P、A55R、A55V、A55Q、E56G、E56P、E56F、E56A、E56T、E56Q、D57R、D57P、D57S、D57Q、D57A、K58Q、K58R、K58P、K58E、K58A、V60I、V60G、K62R、V69I、F78L、I82V、A85M、I86L、Q87D、K88Q、K88A、K88H、L89I、C90Y、P91N、I92Y、I92N、I92S、Y93H、Y93F、Y93F、I94E、I94H、D95A、S96H、S96C、N97D、N97E、R98K、R98Y、R98D、A99N、A99M、H102Y、L106A、L106S、L106K、L106F、L111S、Q113R、I166Y、K117T、V122I、E124N、K125A、K125Q、K127T、D129E、E130R、R132G、S135E、S136A、N139S、Q142R、S146G、Y152H、M153N、M153G、H159Q、H159K、H159R、E163D、K173E、K173Q、K173A、Q178A、D179P、V181L、T182K、P183S、K184R、K184P、Q188R、I189A、I189V、I189P、T200Q、P202S、F209I、F209H、F209E、F209L、F209T、M210T、M212R、M212D、M212N、M212S、M212A、M212Y、M212K、M212F、M212H、M212Q、M212I、M212S、M212V、I213Y、I213M、I213A、I213R、I213S、I213L、I213F、I213S、I213P、I213Q、I213N、I213K、I213V、I213Y、N214D、N214E、N214S、N214L、N214Y、N214V、N214P、N214H、N214C、N214A、N214T、N214R、N214Y、N214Q、S215H、S215G、S215K、S215R、S215P、S215A、S215N、S215T、S215L、S215V、S215Q、S215D、T216Q、T216Y、T216E、T216P、T216R、T216C、T216V、T216K、T216D、T216A、T216S、T216K、S217R、S217K、S217F、S217I、S217T、S217G、S217Y、S217N、S217H、S217E、S217F、S217C、S217E、S217D、D218I、D218G、D218V、D218C、D218P、D218M、D218R、D218L、D218S、D218A、D218Y、D218K、D218E、H219D、H219A、H219L、H219C、H219W、H219R、H219S、H219F、H219E、H219G、H219Q、H219A、L220V、L220S、L220T、L220P、L220M、L220A、L220H、L220E、L220G、L220D、L220F、Y221C、Y221V、Y221Q、Y221F、Y221S、Y221N、Y221T、Y221P、Y221L、Y221K、Y221W、Y221E、Y221V、Y221H、N227S、E238D、K252A、K252Q、T257A、D274M、D274N、D274S、D274F、D274G、D274H、D274E、F279S、F279I、F279P、F279D、F279L、F279N、F279M、F279H、F279C、F279A、F279G、F279W、E280L、P281S、P281H、P281K、P281A、P281W、P281L、P281Y、Q282L、Q282S、Q282A、Q282I、Q282R、Q282Y、Q282G、Q282W、Q282P、Q282E、Y283F、Y283N、A284T、A284G、A284P、A284V、A284R、A284D、A284E、A284S、A284H、A284K、A284I、A284W、A284M、Q292K、I299Y、Y307H、L310H、E311P、E311T、L313C、S314A、S314T、L315M、F316L、T317S、E318K、A319T、V320D、V320G、V320S、Q321A、W323R、N324S、I325T、E326K、E333D、K336R、L337I、L343V、A345V、A345T、N347L、N347S、E348A、E348S、E350K、G357R、H360L、H360A、C361R、V362A、E367G、N369I、Q370D、Q370H、Q370G、K371G、A375D、S377Y、Y387C、I397V、L399S、T405R、T409G、N410S、F424L、N429S、N429G、A436S、V439L、Q448L、C465S、K468Q、S473Y、K474T、E484D、I492V、E495G、K499E、P500L、T501P、P506S、D536EおよびA539Vに対応するアミノ酸置換の中から選択されるアミノ酸置換である少なくとも１つの改変を含む、請求項１から２０のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項２２】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、アミノ酸置換である少なくとも１つの改変を含み、少なくとも１つのアミノ酸置換が、配列番号２に示される位置に関するＣＶＳ番号付けによって１、２、３、４、５、６、７、１１、１９、２０、２３、２４、２８、３８、５０、５３、５４、５５、５６、５７、５８、６０、６２、６９、７８、８２、８８、９３、９７、９８、１０２、１０６、１１１、１１３、１２５、１３２、１５２、１５３、１５９、１６３、１７３、１８４、１８８、１８９、２００、２０２、２０９、２１０、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２７、２３８、２５２、２５７、２７４、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２９２、２９７、２９９、３０７、３１０、３１１、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２３、３２４、３２５、３２６、３３３、３３６、３３７、３４３、３４５、３４７、３４８、３５０、３５７、３６０、３６１、３６２、３６７、３６９、３７０、３７１、３７５、３７７、３８７、３９７、３９９、４０５、４０９、４１０、４２４、４２９、４３６、４３９、４４８、４６５、４６８、４７３、４７４、４８４、４９２、４９５、４９９、５００、５０１、５０６、５３６および５３９の中から選択される位置に対応する位置である、請求項１から１９のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項２３】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号２に示される位置に関するＣＶＳ番号付けによってM1T、S2R、S2K、S2E、S2Q、S2P、S2T、S2L、S2H、S2A、S2V、S3D、S3R、S3G、S3I、S3E、S3V、S3A、S3T、S3L、S3M、S3N、G4K、G4V、G4N、G4I、G4R、G4S、G4P、G4A、G4E、G4F、G4C、G4T、G4L、E5A、E5G、E5S、E5T、E5D、E5H、E5I、E5P、E5L、E5N、T6R、T6V、T6D、T6L、T6A、T6E、T6K、T6S、T6G、T6C、T6M、T6Y、F7C、F7A、F7Q、F7K、F7S、F7G、F7T、F7L、F7R、F7P、A11T、R19K、R19P、N20D、L23S、K24A、K24Q、K24Y、D28G、Q38V、Q38A、Q38N、R50G、T53L、T53R、D54A、D54P、D54C、A55T、A55P、A55R、A55V、A55Q、E56G、E56P、E56F、E56A、E56T、E56Q、D57R、D57P、D57S、D57Q、D57A、K58Q、K58R、K58P、K58E、K58A、V60I、V60G、K62R、V69I、F78L、I82V、K88Q、K88A、Y93H、N97D、R98K、H102Y、L106A、L106S、L106K、L106F、L111S、Q113R、K125A、K125Q、R132G、Y152H、M153N、M153G、H159Q、H159K、H159R、E163D、K173E、K173Q、K173A、K184R、Q188R、I189A、I189V、I189P、T200Q、P202S、F209I、F209H、F209E、F209L、F209T、M210T、M212R、M212D、M212N、M212S、M212A、M212Y、M212K、M212F、M212H、M212Q、I213Y、I213M、I213A、I213R、I213S、I213L、I213F、I213S、I213P、I213Q、I213N、I213K、I213V、N214D、N214E、N214S、N214L、N214Y、N214V、N214P、N214H、N214C、N214A、N214T、N214R、S215H、S215G、S215K、S215R、S215P、S215A、S215N、S215T、S215L、S215V、S215Q、T216Q、T216Y、T216E、T216P、T216R、T216C、T216V、T216K、T216D、T216A、T216S、S217R、S217K、S217F、S217I、S217T、S217G、S217Y、S217N、S217H、S217E、S217F、S217C、D218I、D218G、D218V、D218C、D218P、D218M、D218R、D218L、D218S、D218A、D218Y、D218K、H219D、H219A、H219L、H219C、H219W、H219R、H219S、H219F、H219E、L220V、L220S、L220T、L220P、L220M、L220A、L220H、L220E、L220G、L220D、Y221C、Y221V、Y221Q、Y221F、Y221S、Y221N、Y221T、Y221P、Y221L、Y221K、Y221W、Y221E、Y221V、N227S、E238D、K252A、K252Q、T257A、D274M、D274N、D274S、D274F、D274G、D274H、D274E、F279S、F279I、F279P、F279D、F279L、F279N、F279M、F279H、F279C、F279A、F279G、F279W、E280L、P281S、P281H、P281K、P281A、P281W、P281L、P281Y、Q282L、Q282S、Q282A、Q282I、Q282R、Q282Y、Q282G、Q282W、Q282P、Q282E、Y283F、Y283N、A284T、A284G、A284P、A284V、A284R、A284D、A284E、A284S、A284H、A284K、A284I、A284W、A284M、Q292K、I299Y、Y307H、L310H、E311P、E311T、L313C、S314A、S314T、L315M、F316L、T317S、E318K、A319T、V320D、V320G、V320S、Q321A、W323R、N324S、I325T、E326K、E333D、K336R、L337I、L343V、A345V、A345T、N347L、N347S、E348A、E348S、E350K、G357R、H360L、H360A、C361R、V362A、E367G、N369I、L399S、Q370D、Q370H、Q370G、K371G、A375D、S377Y、Y387C、I397V、T405R、T409G、N410S、F424L、N429S、N429G、A436S、V439L、Q448L、C465S、K468Q、S473Y、K474T、E484D、I492V、E495G、K499E、P500L、T501P、P506S D536EおよびA539Vに対応するアミノ酸置換の中から選択されるアミノ酸置換である少なくとも１つの改変を含む、請求項１から２０のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項２４】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼが、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対する番号付けを用いて６０、９７、２０９、２１２、２１４、２２１、２３８、２９２、３３３、３４５、３６９、４０５、４２９、４７３および／または５３６の中から選択される位置に対応する位置でアミノ酸置換を含む、請求項１から２３のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項２５】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号２に示される位置に関するＣＶＳ番号付けによってV60I、V60G、N97D、F209I、F209H、F209E、F209L、F209T、M212R、M212D、M212N、M212S、M212A、M212Y、M212K、M212F、M212H、M212Q、N214D、N214E、N214S、N214L、N214Y、N214V、N214P、N214H、N214C、N214A、N214T、N214R、Y221C、Y221V、Y221Q、Y221F、Y221S、Y221N、Y221T、Y221P、Y221L、Y221K、Y221W、Y221E、Y221V、E238D、Q292K、E333D、A345V、A345T、N369I、T405R、N429S、N429G、S473Y、および/またはD536Eの中から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項２４に記載の核酸分子。
【請求項２６】
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号２に示される位置に対する番号付けを用いるＣＶＳ番号付けによってN214D/S473Y;  T405R;  A345V/D536E;  Y221C;  E238D;  F209I;  N97D;  E333D/N369I;  N214D/T405R;  N214D/A345V/T405R/D536E;  R98K/N214D/N227S/T405R; V60I/N214D/A345T/T405R;  N214D/T405R/N429S;  N214D/Q292K/T405R;  V60G/N214D/T405R;  V60I/N214D/A345T/T405R/N429S;  V60I/M212R/N214D/Y221V/A345T/T405R/N429Gに対応する置換の中から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項９から２５のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項２７】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼが、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチド中の位置に対する番号付けを用いるＣＶＳ番号付けによって位置６０、２０９、２３８および２９２に対応する位置でアミノ酸置換を含む、請求項１から２５のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項２８】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、各々、配列番号２に示される位置に対する番号付けを用いるＣＶＳ番号付けによって、
Ｖ６０ＩまたはＶ６０Ｇである位置Ｖ６０での置換、
Ｆ２０９Ｉ、Ｆ２０９Ｈ、Ｆ２０９Ｅ、Ｆ２０９ＬまたはＦ２０９Ｔである位置Ｆ２０９での置換、
Ｅ２３８Ｄである位置Ｅ２３８での置換、
Ｑ２９２Ｋである位置Ｑ２９２での置換
を含む、請求項２７に記載の核酸分子。
【請求項２９】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼが、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対する番号付けを用いて位置６０、１２５、１７３、２０９、２３８、２５２および２９２に対応する位置でアミノ酸置換を含む、請求項１から２８のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項３０】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、
各々、配列番号２に示される位置に対する番号付けを用いるＣＶＳ番号付けによって
Ｖ６０ＩまたはＶ６０Ｇである位置Ｖ６０での置換、
Ｋ１２５ＡまたはＫ１２５Ｑである位置Ｋ１２５での置換、
Ｋ１７３Ｅ、Ｋ１７３ＱまたはＫ１７３Ａである位置Ｋ１７３での置換、
Ｆ２０９Ｉ、Ｆ２０９Ｈ、Ｆ２０９Ｅ、Ｆ２０９ＬまたはＦ２０９Ｔである位置Ｆ２０９での置換、
Ｅ２３８Ｄである位置Ｅ２３８での置換、
Ｋ２５２Ｑである位置Ｋ２５２での置換および
Ｑ２９２Ｋである位置Ｑ２９２での置換
を含む、請求項２９に記載の核酸分子。
【請求項３１】
改変されたバレンセンシンターゼが、各々、配列番号２に示される位置に対する番号付けを用いて、
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/ K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/ Q321A/E333D/A345T/ N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/ N429G/ A436S/T501P/D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/V320S/Q321A/E326K/E333D/A345T/N369I/ S377Y/T405R/N429G/A436S/ T501P/D536E;
K24A/Q38A/R50G/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/ H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/V320G/Q321A/ E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/ T501P/D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/L315M/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/ D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/V320G/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/ D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/Q321A/E333D/A345T/G357R/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/ D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/E367G/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/ D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/Q370D/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/ D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/I299Y/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/ D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/Q321A/E333D/A345T/H360L/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/ D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/T317S/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/ D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/V320D/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/ D536E;
K24A/Q38V/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/T409G/N429G/A436S/E495G/ T501P/D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/P281S/Q292K/Q321A/E333D/L337I/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/ T501P/D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/A375D/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/ D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/Q321A/E333D/K336R/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/ D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/E311P/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/ D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/Q370H/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/ D536E;
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K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212S/I213L/N214E/S215P/T216P/S217F/D218M/L220P/Y221C/E238D/K252Q/Q292K/L313C/S314T/L315M/T317S/Q321A/E333D/K336R/L337I/A345T/G357R/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/ D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212A/N214Y/S215A/T216R/S217T/D218G/H219R/L220M/Y221N/E238D/K252Q/Q292K/L313C/S314T/L315M/T317S/Q321A/E333D/K336R/L337I/A345T/G357R/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212N/I213M/N214S/T216Y/S217R/D218G/H219C/L220S/Y221V/E238D/K252Q/P281S/Q292K/L313C/S314T/L315M/T317S/A319T/Q321A/E333D/K336R/L337I/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/ D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212D/I213A/S215G/T216E/S217K/D218V/H219L/L220S/Y221F/E238D/K252Q/P281S/Q292K/L313C/S314T/L315M/T317S/Q321A/E333D/K336R/L337I/A345T/G357R/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/ T501P/D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212S/I213R/N214S/S215K/T216P/S217F/D218C/H219W/L220T/Y221S/E238D/K252Q/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/ T501P/D536E;および
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209H/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/P281S/Q292K/L313C/S314T/L315M/T317S/Q321A/E333D/K336R/L337I/A345T/G357R/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E
に対応する置換の中から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項１から３０のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項３２】
配列番号１２８〜２０２、２０４〜２８８、６９３〜７０１、７０４〜７１２、７１６〜７２２、７５４〜７７５および８００のいずれかに示される核酸の配列；配列番号１２８〜２０２、２０４〜２８８、６９３〜７０１、７０４〜７１２、７１６〜７２２、７５４〜７７５および８００のいずれかに示される核酸の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸の配列ならびにその縮重配列を含む、請求項１から３１のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項３３】
配列番号１２８〜２０２、２０４〜２８８、６９３〜７０１、７０４〜７１２、７１６〜７２２、７５４〜７７５および８００のいずれかに示される核酸の配列を含む、請求項１から３２のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項３４】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼが、配列番号３〜６６、６８〜１２７、７２３〜７３１、７３４〜７４２、７４６〜７５１、８１０〜８３２および８５７のいずれかに示されるアミノ酸の配列、ならびに配列番号３〜６６、６８〜１２７、７２３〜７３１、７３４〜７４２、７４６〜７５１、８１０〜８３２および８５７のいずれかに示されるアミノ酸の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む、請求項１から３３のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項３５】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼが、配列番号３〜６６、６８〜１２７、７２３〜７３１、７３４〜７４２、７４６〜７５１、８１０〜８３２および８５７のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含む、請求項１から３４のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項３６】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、１種または複数のテルペンシンターゼに由来する１種または複数の異種ドメインまたはその一部を含み、ドメインが、不定形ループ１、αヘリックス１、不定形ループ２、αヘリックス２、不定形ループ３、αヘリックス３、不定形ループ４、αヘリックス４、不定形ループ５、αヘリックス５、不定形ループ６、αヘリックス６、不定形ループ７、αヘリックス７、不定形ループ８、αヘリックス８、不定形ループ９、αヘリックスＡ、Ａ−Ｃループ、αヘリックスＣ、不定形ループ１１、αヘリックスＤ、不定形ループ１２、αヘリックスＤ１、不定形ループ１３、αヘリックスＤ２、不定形ループ１４、αヘリックスＥ、不定形ループ１５、αヘリックスＦ、不定形ループ１６、αヘリックスＧ１、不定形ループ１７、αヘリックスＧ２、不定形ループ１８、αヘリックスＨ１、不定形ループ１９、αヘリックスＨ２、不定形ループ２０、αヘリックスＨ３、不定形ループ２１、αヘリックスａ−１、不定形ループ２２、αヘリックスＩ、不定形ループ２３、αヘリックスＪ、Ｊ−Ｋループ、αヘリックスＫおよび／または不定形ループ２５の中から選択される、請求項１から３５のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項３７】
改変されたバレンセンポリペプチドをコードする核酸分子であって、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、１種または複数のテルペンシンターゼに由来する１種または複数の異種ドメインまたはその一部を含み、ドメインが、不定形ループ１、αヘリックス１、不定形ループ２、αヘリックス２、不定形ループ３、αヘリックス３、不定形ループ４、αヘリックス４、不定形ループ５、αヘリックス５、不定形ループ６、αヘリックス６、不定形ループ７、αヘリックス７、不定形ループ８、αヘリックス８、不定形ループ９、αヘリックスＡ、Ａ−Ｃループ、αヘリックスＣ、不定形ループ１１、αヘリックスＤ、不定形ループ１２、αヘリックスＤ１、不定形ループ１３、αヘリックスＤ２、不定形ループ１４、αヘリックスＥ、不定形ループ１５、αヘリックスＦ、不定形ループ１６、αヘリックスＧ１、不定形ループ１７、αヘリックスＧ２、不定形ループ１８、αヘリックスＨ１、不定形ループ１９、αヘリックスＨ２、不定形ループ２０、αヘリックスＨ３、不定形ループ２１、αヘリックスａ−１、不定形ループ２２、αヘリックスＩ、不定形ループ２３、αヘリックスＪ、Ｊ−Ｋループ、αヘリックスＫ、および／または不定形ループ２５の中から選択される、核酸分子。
【請求項３８】
異種ドメインまたはその連続する部分が、異種ドメインを含有しないバレンセンシンターゼの対応する天然ドメインのすべてまたは連続する部分を置換する、請求項３６または請求項３７に記載の核酸分子。
【請求項３９】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼが、異なるテルペンシンターゼの異種ドメインのすべてを含む、請求項３６から３８のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項４０】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼが、１種または複数のテルペンシンターゼに由来する異種ドメインの連続するアミノ酸の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％を含む、請求項３６から３９のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項４１】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、不定形ループ２ドメインのすべてまたは連続する部分である異種ドメインを含む、請求項３６から４０のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項４２】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、異種不定形ループ２ドメインまたはその連続する部分を含み、それによって、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドのアミノ酸残基５３〜５８に対応する天然の不定形ループ２ドメインが、異なるテルペンシンターゼに由来する対応する領域のすべてまたは一部で置換される、請求項４１に記載の核酸分子。
【請求項４３】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、αヘリックス３ドメインのすべてまたは連続する部分である異種ドメインを含む、請求項３６から４２のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項４４】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、異種αヘリックス３ドメインまたはその連続する部分を含み、それによって、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドのアミノ酸残基７９〜９３に対応する天然のαヘリックス３ドメインが、異なるテルペンシンターゼに由来する対応する領域のすべてまたは一部で置換される、請求項４３に記載の核酸分子。
【請求項４５】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、不定形ループ５ドメインのすべてまたは連続する部分である異種ドメインを含む、請求項３６から４４のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項４６】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、不定形ループ５ドメインまたはその連続する部分を含み、それによって、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドのアミノ酸残基１１５〜１４１に対応する天然の不定形ループ５ドメインが、異なるテルペンシンターゼに由来する対応する領域のすべてまたは一部で置換される、請求項４５に記載の核酸分子。
【請求項４７】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、不定形ループ６ドメインのすべてまたは連続する部分である異種ドメインを含む、請求項３６から４６のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項４８】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、異種不定形ループ６ドメインまたはその連続する部分を含み、それによって、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドのアミノ酸残基１５３〜１６２に対応する天然の不定形ループ６ドメインが、異なるテルペンシンターゼに由来する対応する領域のすべてまたは一部で置換される、請求項４７に記載の核酸分子。
【請求項４９】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、不定形ループ７ドメインのすべてまたは連続する部分である異種ドメインを含む、請求項３６から４８のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項５０】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、異種不定形ループ７ドメインまたはその連続する部分を含み、それによって、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドのアミノ酸残基１７４〜１８４に対応する天然の不定形ループ７ドメインが、異なるテルペンシンターゼに由来する対応する領域のすべてまたは一部で置換される、請求項４９に記載の核酸分子。
【請求項５１】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、不定形ループ９ドメインのすべてまたは連続する部分である異種ドメインを含む、請求項３６から５０のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項５２】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、異種不定形ループ９ドメインまたはその連続する部分を含み、それによって、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドのアミノ酸残基２１３〜２２２に対応する天然の不定形ループ９ドメインが、異なるテルペンシンターゼに由来する対応する領域のすべてまたは一部で置換される、請求項５１に記載の核酸分子。
【請求項５３】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、αヘリックスＤ１ドメインのすべてまたは連続する部分である異種ドメインを含む、請求項３６から５２のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項５４】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、異種αヘリックスＤ１ドメインまたはその連続する部分を含み、それによって、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドのアミノ酸残基３１０〜３２２に対応する天然のαヘリックスＤ１ドメインが、異なるテルペンシンターゼに由来する対応する領域のすべてまたは一部で置換される、請求項５３に記載の核酸分子。
【請求項５５】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、Ｊ−Ｋループドメインのすべてまたは連続する部分である異種ドメインを含む、請求項３６から５４のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項５６】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、異種のＪ−Ｋループドメインまたはその連続する部分を含み、それによって、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドのアミノ酸残基５２２〜５３４に対応する天然のＪ−Ｋループドメインが、異なるテルペンシンターゼに由来する対応する領域のすべてまたは一部で置換される、請求項５５に記載の核酸分子。
【請求項５７】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、不定形ループ１ドメインのすべてまたは連続する部分である異種ドメインを含む、請求項３６から５６のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項５８】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、異種不定形ループ１ドメインまたはその連続する部分を含み、それによって、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドのアミノ酸残基１〜２９に対応する天然の不定形ループ１ドメインが、異なるテルペンシンターゼに由来する対応する領域のすべてまたは一部で置換される、請求項５７に記載の核酸分子。
【請求項５９】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、ヘリックス１ドメインのすべてまたは連続する部分である異種ドメインを含む、請求項３６から５８のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項６０】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、異種αヘリックス１ドメインまたはその連続する部分を含み、それによって、配列番号２のアミノ酸残基３０〜３９および４４〜５２に対応する天然のαヘリックス１ドメインが、異なるテルペンシンターゼに由来する対応する領域のすべてまたは連続する部分で置換される、請求項５９に記載の核酸分子。
【請求項６１】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、不定形ループ４ドメインのすべてまたは連続する部分である異種ドメインを含む、請求項３６から６０のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項６２】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、異種不定形ループ４ドメインまたはその連続する部分を含み、それによって、配列番号２のアミノ酸残基９４〜１００に対応する天然の不定形ループ４ドメインが、異なるテルペンシンターゼに由来する対応する領域のすべてまたは連続する部分で置換される、請求項６１に記載の核酸分子。
【請求項６３】
異なるテルペンシンターゼが、表５Ｂに示されるテルペンシンターゼである、請求項３６から６２のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項６４】
異なるテルペンシンターゼが、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）バレンセンシンターゼ、タバコエピアリストロチェンシンターゼ（ＴＥＡＳ）およびヒオシアムス・ムチクス（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ  ｍｕｔｉｃｕｓ）プレムナスピロジエンシンターゼ（ＨＰＳ）の中から選択される、請求項３６から６３のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項６５】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、異種不定形ループ２ドメインまたはその連続する部分を含み、それによって、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドの位置５３〜５８に対応するアミノ酸残基が、配列番号２９５または９４１に示されるＴＥＡＳポリペプチドのアミノ酸残基５８〜６３で置換される、請求項３６から６４のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項６６】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、異種αヘリックス３ドメインまたはその連続する部分および異種不定形ループ４ドメインまたはその連続する部分を含み、それによって、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドの位置８５〜８９に対応するアミノ酸残基が、配列番号９４２に示されるＨＰＳポリペプチドのアミノ酸残基９３〜９７で置換される、請求項３６から６５のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項６７】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、異種αヘリックス３ドメインまたはその連続する部分および異種不定形ループ４ドメインまたはその連続する部分を含み、それによって、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドの位置８５〜９９に対応するアミノ酸残基が、配列番号３４６に示されるブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）バレンセンシンターゼのアミノ酸残基９６〜１１２で置換される、請求項３６から６６のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項６８】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、異種不定形ループ５ドメインまたはその連続する部分を含み、それによって、バレンセンシンターゼポリペプチドの位置１１５〜１４６に対応する位置のアミノ酸残基が、配列番号３４６に示されるブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）バレンセンシンターゼのアミノ酸残基１２８〜１２９で置換される、請求項３６から６７のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項６９】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、異種不定形ループ７ドメインまたはその連続する部分を含み、それによって、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドの位置１７４〜１８４に対応する位置のアミノ酸残基が、配列番号９４２に示されるＨＰＳポリペプチドのアミノ酸残基１８５〜１９３で置換される、請求項３６から６８のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項７０】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、異種ループ９ドメインまたはその連続する部分を含み、それによって、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドの位置２１２〜２２１に対応する位置のアミノ酸残基が、配列番号９４２に示されるＨＰＳポリペプチドのアミノ酸残基２２１〜２２８で置換される、請求項３６から６９のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項７１】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、異種ループ９ドメインまたはその連続する部分を含み、それによって、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドの位置２１２〜２２１に対応する位置のアミノ酸残基が、配列番号２９５に示されるＴＥＡＳポリペプチドのアミノ酸残基２１３〜２２１で置換される、請求項３６から６９のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項７２】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、異種不定形ループ９ドメインまたはその連続する部分を含み、それによって、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドの位置２１２〜２２１に対応する位置のアミノ酸残基が、配列番号３４６に示されるブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）バレンセンシンターゼのアミノ酸残基２２３〜２３０で置換される、請求項３６から７１のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項７３】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、異種不定形ループ１ドメインまたはその連続する部分および異種αヘリックス１ドメインまたはその連続する部分を含み、それによって、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドの位置３〜４１に対応する位置のアミノ酸残基が、配列番号３４６に示されるブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）バレンセンシンターゼのアミノ酸残基３〜５１で置換される、請求項３６から７２のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項７４】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、異種不定形ループ６ドメインまたはその連続する部分を含み、それによって、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドの位置１５２〜１６３に対応する位置のアミノ酸残基が、配列番号９４２に示されるＨＰＳポリペプチドのアミノ酸残基１６３〜１７４で置換される、請求項３６から７３のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項７５】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、異種αヘリックスＤ１ドメインまたはその連続する部分を含み、それによって、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドの位置３１０〜３２２に対応する位置のアミノ酸残基が、配列番号９４２に示されるＨＰＳポリペプチドのアミノ酸残基３１７〜３２９で置換される、請求項３６から７４のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項７６】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、異種のＪ−Ｋループドメインまたはその連続する部分を含み、それによって、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドの位置５２２〜５３４に対応する位置のアミノ酸残基が、配列番号９４２に示されるＨＰＳポリペプチドのアミノ酸残基５２７〜５４１で置換される、請求項３６から７５のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項７７】
改変されたバレンセンシンターゼが、
K24Q/Q38N/ T53L/ D54A/ A55T/ E56G/ D57R / V60I/K88Q/Y93H/ N97D/ R98K/ K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/ H219D/Y221V/E238D/K252Q/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/ D536E;
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K24Q/Q38N/T53L/D54A/A55T/E56G/D57R/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/P281S/Q292K/L313C/S314T/L315M/T317S/Q321A/E333D/K336R/L337I/A345T/G357R/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
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K24Q/ Q38N/ K58Q/ V60I/ I82V/ K88Q/ P91N/ I92S/ Y93F/ I94H/ S96C/ R98D/ A99M/ ---→G101/ ---→D102/ K125→Q127/ K173→Q175/ K184→R186/ F209→I211/ M212→R214/ N214→D216/ H219→D221/ Y221→V223/ E238→D240/ K252→Q254/ Q292→K294/ Q321→A323/ E333→D335/ A345→T347/ N369→I371/ S377→Y379/ L399→S401/ T405→R407/ N429→G431/ A436→S438/ T501→P503/ D536→E538;
S3T/ G4Q/ E5V/ ---→S6/ ---→A7/ ---→S8/ ---→S9/ ---→L10/ ---→A11/ ---→Q12/ ---→I13/ ---→P14/ ---→Q15/ ---→P16/ T6→K17/ F7→N18/ T10→V21/ D12→N23/ S16→N27/ L17→I28/ R19→G30/ N20→D31/ H21→Q32/ L23→I34/ K24→T35/ G25→Y36/ A26→T37/ S27→P38/ D28→E39/ F29→D40/ T31→---/ D33→T43/ H34→R44/ T35→A45/ A36→C46/ T37→K47/ Q38→E48/ R40→Q50/ H41→I51/ V48→I58/ T53→L63/ D54→A64/ A55→T65/ E56→G66/ D57→R67/ V60→I70/ I86→L96/ K88→H98/ L89→I99/ P91→N101/ I92→S102/ Y93→F103/ I94→H104/ S96→C106/ R98→D108/ A99→M109/ ---→G111/ ---→D112/ H102→Y114/ I116→Y128/ K117→T129/ V122→I134/ E124→N136/ K127→T139/ D129→E141/ E130→R142/ S135→E147/ S136→A148/ N139→S151/ Q142→R154/ S146→G158/ K173→Q185/ L175→---/ V176→---/ Q178→A188/ D179→P189/ V181→L191/ T182→K192/ P183→S193/ K184→P194/ F209→I219/ M212→V222/ I213→Y223/ N214→---/ S215→---/ T216→Q224/ S217→D225/ D218→E226/ H219→A227/ L220→F228/ Y221→H229/ E238→D246/ K252→Q260/ P281→S289/ Q292→K300/ L313→C321/ S314→T322/ L315→M323/ T317→S325/ Q321→A329/ E333→D341/ K336→R344/ L337→I345/ A345→T353/ G357→R365/ N369→I377/ S377→Y385/ T405→R413/ N429→G437/ A436→S444/ E484→D492/ T501→P509/ D536→E544;
S3T/ G4Q/ E5V/ ---→S6/ ---→A7/ ---→S8/ ---→S9/ ---→L10/ ---→A11/ ---→Q12/ ---→I13/ ---→P14/ ---→Q15/ ---→P16/ T6→K17/ F7→N18/ T10→V21/ D12→N23/ S16→N27/ L17→I28/ R19→G30/ N20→D31/ H21→Q32/ L23→I34/ K24→T35/ G25→Y36/ A26→T37/ S27→P38/ D28→E39/ F29→D40/ T31→---/ D33→T43/ H34→R44/ T35→A45/ A36→C46/ T37→K47/ Q38→E48/ R40→Q50/ H41→I51/ T53→L63/ D54→A64/ A55→T65/ E56→G66/ D57→R67/ V60→I70/ I86→L96/ K88→H98/ L89→I99/ P91→N101/ I92→S102/ Y93→F103/ I94→H104/ S96→C106/ R98→D108/ A99→M109/ ---→G111/ ---→D112/ K125→Q137/ K173→Q185/ L175→---/ V176→---/ Q178→A188/ D179→P189/ V181→L191/ T182→K192/ P183→S193/ K184→P194/ F209→I219/ M212→V222/ I213→Y223/ N214→---/ S215→---/ T216→Q224/ S217→D225/ D218→E226/ H219→A227/ L220→F228/ Y221→H229/ E238→D246/ K252→Q260/ P281→S289/ Q292→K300/ L313→C321/ S314→T322/ L315→M323/ T317→S325/ Q321→A329/ E333→D341/ K336→R344/ L337→I345/ A345→T353/ G357→R365/ N369→I377/ S377→Y385/ T405→R413/ N429→G437/ A436→S444/ E484→D492/ T501→P509/ D536→E544;および
S3T/ G4Q/ E5V/ ---→S6/ ---→A7/ ---→S8/ ---→S9/ ---→L10/ ---→A11/ ---→Q12/ ---→I13/ ---→P14/ ---→Q15/ ---→P16/ T6→K17/ F7→N18/ T10→V21/ D12→N23/ S16→N27/ L17→I28/ R19→G30/ N20→D31/ H21→Q32/ L23→I34/ K24→T35/ G25→Y36/ A26→T37/ S27→P38/ D28→E39/ F29→D40/ T31→---/ D33→T43/ H34→R44/ T35→A45/ A36→C46/ T37→K47/ Q38→E48/ R40→Q50/ H41→I51/ T53→L63/ D54→A64/ A55→T65/ E56→G66/ D57→R67/ V60→I70/ A85→M95/ I86→L96/ Q87→D97/ K88→H98/ L89→I99/ C90→Y100/ ---→R101/ ---→A102/ ---→D103/ I92→Y105/ Y93→F106/ I94→E107/ D95→A108/ S96→H109/ N97→E110/ R98→Y111/ A99→N112/ K125→Q138/ K173→Q186/ L175→---/ V176→---/ Q178→A189/ D179→P190/ V181→L192/ T182→K193/ P183→S194/ K184→P195/ F209→I220/ M212→V223/ I213→Y224/ N214→---/ S215→---/ T216→Q225/ S217→D226/ D218→E227/ H219→A228/ L220→F229/ Y221→H230/ E238→D247/ K252→Q261/ P281→S290/ Q292→K301/ L313→C322/ S314→T323/ L315→M324/ T317→S326/ Q321→A330/ E333→D342/ K336→R345/ L337→I346/ A345→T354/ G357→R366/ N369→I378/ S377→Y386/ T405→R414/ N429→G438/ A436→S445/ E484→D493/ T501→P510/ D536→E545
に対応する改変の中から選択される改変を含む、請求項１から７６のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項７８】
配列番号２０３、３５２〜３５３、７０２、７０３、７１３〜７１５、７７６〜７９９、８０１〜８０９、８９１〜８９４、８９６、９４５、９４７、９４９、９５１、９５３、９５５、９５７、９５９、９６１、９６３、９６５、９６７、９６９、９７１、９７３、９７５、９７７、９７９、９８１、９８３、９８５、９８７、９８９、９９１、９９３、９９５、９９７および９９９；のいずれかに示される核酸の配列；配列番号２０３、３５２〜３５３、７０２、７０３、７１３〜７１５、７７６〜７９９、８０１〜８０９、８９１〜８９４、８９６、９４５、９４７、９４９、９５１、９５３、９５５、９５７、９５９、９６１、９６３、９６５、９６７、９６９、９７１、９７３、９７５、９７７、９７９、９８１、９８３、９８５、９８７、９８９、９９１、９９３、９９５、９９７および９９９のいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸の配列；ならびにその縮重配列を含む、請求項３６から７７のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項７９】
配列番号２０３、３５２〜３５３、７０２、７０３、７１３〜７１５、７７６〜７９９、８０１〜８０９、８９１〜８９４、８９６、９４５、９４７、９４９、９５１、９５３、９５５、９５７、９５９、９６１、９６３、９６５、９６７、９６９、９７１、９７３、９７５、９７７、９７９、９８１、９８３、９８５、９８７、９８９、９９１、９９３、９９５、９９７および９９９のいずれかに示される核酸の配列を含む、請求項３６から７８のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項８０】
改変されたバレンセンシンターゼが、配列番号６７、３５０、３５１，７３２〜７３３、７４３〜７４５、８３３〜８５６、８５８〜８６６、８８７〜８９０、８９５、９４４、９４６、９４８、９５０、９５２，９５４、９５６、９５８、９６０、９６２、９６４、９６６、９６８、９７０、９７２、９７４、９７６、９７８、９８０、９８２、９８４、９８６、９８８、９９０、９９２、９９４、９９６および９９８のいずれかに示されるアミノ酸の配列；ならびに配列番号６７、３５０、３５１、７３２〜７３３、７４３〜７４５、８３３〜８５６、８５８〜８６６、８８７〜、８９５、９４４、９４６、９４８、９５０、９５２，９５４、９５６、９５８、９６０、９６２、９６４、９６６、９６８、９７０、９７２、９７４、９７６、９７８、９８０、９８２、９８４、９８６、９８８、９９０、９９２、９９４、９９６および９９８のいずれかに示されるアミノ酸の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む、請求項３６から７９のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項８１】
改変されたバレンセンシンターゼが、配列番号６７、３５０、３５１、７３２〜７３３、７４３〜７４５、８３３〜８５６、８５８〜８６６、８８７〜８９０、８９５、９４４、９４６、９４８、９５０、９５２，９５４、９５６、９５８、９６０、９６２、９６４、９６６、９６８、９７０、９７２、９７４、９７６、９７８、９８０、９８２、９８４、９８６、９８８、９９０、９９２、９９４、９９６および９９８のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含む、請求項３６から８０のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項８２】
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/ M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/V320S/Q321A/E326K/ E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;および K24A/Q38A/R50G/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/ F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/V320G/Q321A/ E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E
の中から選択されるアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換、ならびに
１種または複数のさらなるアミノ酸置換を含む、請求項１から８１のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項８３】
非改変バレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号２〜４、２８９〜２９１、３４６、３４７、７５２、８８２および８８３のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含む、請求項１から８２のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項８４】
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼから生成された同一テルペン生成物のパーセンテージと比較して、低減したパーセンテージのバレンセン以外のテルペン生成物を生成し、それによって、テルペン生成物が、ＦＰＰを生成する宿主細胞においてシンターゼによって別個に生成される、請求項１から８３のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項８５】
バレンセン以外のテルペン生成物が、β−セリネン、τ−セリネン、エレモフィロン、７−エピ−α−セリネン、ゲルマクレンＡおよびβ−エレメンの中から選択される、請求項８４に記載の核酸分子。
【請求項８６】
バレンセン以外のテルペン生成物が、生成されるゲルマクレンＡ生成物の尺度となるβ−エレメンである、請求項８４または請求項８５に記載の核酸分子。
【請求項８７】
生成された総テルペンのパーセンテージとしてのバレンセン以外のテルペン生成物のパーセンテージが、０．０１％〜９０％、１％〜８０％、５％〜８０％、１０％〜６０％または０．０１％〜２０％減少する、請求項８４から８６のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項８８】
総テルペンのパーセンテージとしてのバレンセン以外のテルペン生成物のパーセンテージが、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上減少する、請求項８４から８７のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項８９】
コードされる改変されたバレンセンポリペプチドが、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対するＣＶＳ番号付けによる、位置２８１、３１３、３１４、３１５、３１７、３３６、３３７、３４７または３５７に対応する位置のアミノ酸置換を含む、請求項８４から８８のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項９０】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、置換Ｐ２８１Ｓ、Ｐ２８１Ｈ、Ｐ２８１Ｋ、Ｐ２８１Ａ、Ｐ２８１Ｗ、Ｐ２８１Ｌ、Ｐ２８１Ｙ、Ｌ３１３Ｃ、Ｓ３１４Ｔ、Ｌ３１５Ｍ、Ｔ３１７Ｓ、Ｋ３３６Ｒ、Ｌ３３７Ｉ、Ｎ３４７ＬまたはＧ３５７Ｒに対応する位置にアミノ酸置換を含む、請求項８４から８９のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項９１】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対するＣＶＳ番号付けによる、位置２８１、３１３、３１４、３１５、３１７、３３６、３３７および３５７に対応する位置にアミノ酸置換を含む、請求項８４から９０のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項９２】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対するＣＶＳ番号付けによる位置３４７にアミノ酸置換を含む、請求項９１に記載の核酸分子。
【請求項９３】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、
Ｐ２８１Ｓ、Ｐ２８１Ｈ、Ｐ２８１Ｋ、Ｐ２８１Ａ、Ｐ２８１Ｗ、Ｐ２８１ＬまたはＰ２８１Ｙである位置Ｐ２８１での置換、
Ｌ３１３Ｃである位置Ｌ３１３での置換、
Ｓ３１４Ｔである位置Ｓ３１４での置換、
Ｌ３１５Ｍである位置Ｌ３１５での置換、
Ｔ３１７Ｓである位置Ｔ３１７での置換、
Ｋ３３６Ｒである位置Ｋ３３６での置換、
Ｌ３３７Ｉである位置Ｌ３３７での置換、
Ｇ３５７Ｒである位置Ｇ３５７での置換
を含む、請求項８４から９２のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項９４】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、置換Ｐ２８１Ｓ、Ｌ３１３Ｃ、Ｓ３１４Ｔ、Ｌ３１５Ｍ、Ｔ３１７Ｓ、Ｋ３３６Ｒ、Ｌ３３７ＩおよびＧ３５７Ｒを含む、請求項８４から９３のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項９５】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、置換Ｐ２８１Ｓ、Ｌ３１３Ｃ、Ｓ３１４Ｔ、Ｌ３１５Ｍ、Ｔ３１７Ｓ、Ｋ３３６Ｒ、Ｌ３３７Ｉ、Ｎ３４７ＬおよびＧ３５７Ｒを含む、請求項８４から９４のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項９６】
核酸が、改変された柑橘類バレンセンシンターゼをコードし、改変されたバレンセンシンターゼが、柑橘類由来のバレンセンシンターゼと比較してアミノ酸の相違を含む、請求項１から９５のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項９７】
核酸が、改変されたグレープフルーツまたはオレンジバレンセンシンターゼをコードし、改変されたバレンセンシンターゼが、グレープフルーツ由来またはオレンジ由来バレンセンシンターゼと比較してアミノ酸の相違を含む、請求項１から９６のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項９８】
柑橘類由来のバレンセンシンターゼが、配列番号２、２８９〜２９１、７５２および８８６のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含む、請求項９６または請求項９７に記載の核酸分子。
【請求項９９】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、融合タンパク質またはキメラタンパク質である、請求項９８に記載の核酸分子。
【請求項１００】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼと比較して増大した触媒活性を示す、請求項９９に記載の核酸分子。
【請求項１０１】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼと比較して変更された基質特異性を示す、請求項１００に記載の核酸分子。
【請求項１０２】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼと比較して変更された生成物分布を示す、請求項１０１に記載の核酸分子。
【請求項１０３】
請求項１０２に記載の核酸分子によってコードされる、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチド。
【請求項１０４】
請求項１０２に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１０５】
原核生物ベクター、ウイルス性ベクターまたは真核生物ベクターである、請求項１０４に記載のベクター。
【請求項１０６】
酵母ベクターである、請求項１０４または請求項１０５に記載のベクター。
【請求項１０７】
酵母発現ベクターである、請求項１０４から１０６のいずれかに記載のベクター。
【請求項１０８】
請求項１０４から１０７のいずれかに記載のベクターを含む細胞。
【請求項１０９】
原核細胞または真核細胞である、請求項１０８に記載の細胞。
【請求項１１０】
細菌、酵母、昆虫、植物または哺乳動物細胞の中から選択される、請求項１０８または請求項１０９に記載の細胞。
【請求項１１１】
酵母細胞であり、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属細胞またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属細胞である、請求項１０８に記載の細胞。
【請求項１１２】
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞である、請求項１１０に記載の細胞。
【請求項１１３】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞である、請求項１１０に記載の細胞。
【請求項１１４】
ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）を生成する、請求項１０８から１１３のいずれかに記載の細胞。
【請求項１１５】
非改変細胞と比較して、より多くのＦＰＰを生成するよう改変されている、請求項１０８から１１４のいずれかに記載の細胞。
【請求項１１６】
スクアレンシンターゼをコードする遺伝子中に改変を含有し、それによって、細胞において発現されるスクアレンシンターゼの量または細胞において発現されるスクアレンシンターゼの活性が、非改変細胞と比較して低下する、請求項１０８から１１５のいずれかに記載の細胞。
【請求項１１７】
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを発現する、請求項１０８から１１６のいずれかに記載の細胞。
【請求項１１８】
請求項１０８から１１７のいずれかに記載の細胞によって生成された、改変されたバレンセンシンターゼ。
【請求項１１９】
請求項１０４から１０７のいずれかに記載のベクターを含むトランスジェニック植物。
【請求項１２０】
柑橘類植物である、請求項１１９に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１２１】
タバコ植物である、請求項１１９に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１２２】
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを生成する方法であって、
請求項１から１０２のいずれかに記載の核酸分子または請求項１０４から１０７のいずれかに記載のベクターを細胞に導入すること、
核酸またはベクターによってコードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドの発現に適した条件下で細胞を培養すること、および
任意に、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを単離すること
を含む、方法。
【請求項１２３】
バレンセンを生成する方法であって、
非環式ピロリン酸テルペン前駆体を、非環式ピロリン酸テルペン前駆体からのバレンセンの形成に適した条件下で、請求項１０３もしくは請求項１１８に記載の、または請求項１から１０２のいずれかに記載の核酸分子によってコードされる、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドと接触させること、および
任意に、バレンセンを単離すること
を含む、方法。
【請求項１２４】
非環式ピロリン酸テルペン前駆体を、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドと接触させる工程が、インビトロまたはインビボで達成される、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
非環式ピロリン酸テルペン前駆体が、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）およびゲラニル−ゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）の中から選択される、請求項１２３または請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
非環式ピロリン酸テルペン前駆体がＦＰＰである、請求項１２３から１２５のいずれかに記載の方法。
【請求項１２７】
バレンセンを生成する方法であって、
請求項１から１０２のいずれかに記載の核酸分子または請求項１０４から１０７のいずれかに記載のベクターで形質転換された細胞を培養すること
を含み、それによって、
細胞が、非環式ピロリン酸テルペン前駆体を生成し、
核酸分子またはベクターによってコードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが発現され、
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、非環式ピロリン酸テルペン前駆体からのバレンセンの形成を触媒する、方法。
【請求項１２８】
非環式ピロリン酸テルペン前駆体が、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）およびゲラニル−ゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）の中から選択される、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
非環式ピロリン酸テルペン前駆体が、ＦＰＰである、請求項１２７または請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
細胞が、細菌、酵母、昆虫、植物または哺乳動物細胞の中から選択される、請求項１２７から１２９のいずれかに記載の方法。
【請求項１３１】
細胞が、酵母細胞であり、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞である、請求項１２７から１３０のいずれかに記載の方法。
【請求項１３２】
細胞が、非改変細胞と比較して、より多くのＦＰＰを生成するよう改変されている、請求項１２７から１３１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３３】
細胞が、スクアレンシンターゼをコードする遺伝子中に改変を含有し、それによって、細胞において発現されるスクアレンシンターゼの量または細胞において発現されるスクアレンシンターゼの活性が、非改変細胞と比較して低下する、請求項１２７から１３２のいずれかに記載の方法。
【請求項１３４】
生成されたバレンセンの量が、同一宿主細胞種が配列番号２に示されるバレンセンシンターゼをコードする核酸で形質転換された場合に同一条件下で生成されたバレンセンの量よりも多い、請求項１２７から１３３のいずれかに記載の方法。
【請求項１３５】
生成されたバレンセンの量が、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼによって同一条件下で生成されるバレンセンの量よりも、少なくともまたは約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、５００％もしくはそれ以上多い；または配列番号２に示されるバレンセンシンターゼによってＦＰＰから生成されるバレンセンの量よりも、１０％〜５００％、１０％〜２５０％、５０％〜２５０％、１００％〜５００％多いか、もしくは１００％〜２５０％多い、請求項１２７から１３４のいずれかに記載の方法。
【請求項１３６】
生成されたバレンセンの量が、細胞培養上清中、少なくともまたは約０．１ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ、０．３ｇ／Ｌ、０．４ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、０．６ｇ／Ｌ、０．７ｇ／Ｌ、０．８ｇ／Ｌ、０．９ｇ／Ｌ  １．０ｇ／Ｌ、１．１ｇ／Ｌ、１．２ｇ／Ｌ、１．３ｇ／Ｌ、１．４ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、２．０ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４．０ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌもしくは５．０ｇ／Ｌであるか；または酵母細胞培養培地中、０．１ｇ／Ｌ〜５．０ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ〜３．０ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ〜５．０ｇ／Ｌ、１．０ｇ／Ｌ〜５．０ｇ／Ｌもしくは１．０〜３．０ｇ／Ｌである、請求項１２７から１３５のいずれかに記載の方法。
【請求項１３７】
バレンセンを単離することをさらに含む、請求項１２７から１３６のいずれかに記載の方法。
【請求項１３８】
バレンセンを酸化して、ヌートカトンを生成することをさらに含む、請求項１２７から１３７のいずれかに記載の方法。
【請求項１３９】
酸化が、生合成的に、または化学的に実施される、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
ヌートカトンを単離することをさらに含む、請求項１３８または請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
異種ドメインを含む改変されたテルペンシンターゼを生成する方法であって、
第１のテルペンシンターゼのドメインのすべてまたは連続する部分を、第２のテルペンシンターゼ中の対応するドメインのすべてまたは連続する部分で置換すること
を含み、ここで、
第１のテルペンシンターゼおよび第２のテルペンシンターゼのドメインのアミノ酸配列またはドメインの連続する部分は、少なくとも１個のアミノ酸残基で異なり、
ドメインは、不定形ループ１、αヘリックス１、不定形ループ２、αヘリックス２、不定形ループ３、αヘリックス３、不定形ループ４、αヘリックス４、不定形ループ５、αヘリックス５、不定形ループ６、αヘリックス６、不定形ループ７、αヘリックス７、不定形ループ８、αヘリックス８、不定形ループ９、αヘリックスＡ、Ａ−Ｃループ、αヘリックスＣ、不定形ループ１１、αヘリックスＤ、不定形ループ１２、αヘリックスＤ１、不定形ループ１３、αヘリックスＤ２、不定形ループ１４、αヘリックスＥ、不定形ループ１５、αヘリックスＦ、不定形ループ１６、αヘリックスＧ１、不定形ループ１７、αヘリックスＧ２、不定形ループ１８、αヘリックスＨ１、不定形ループ１９、αヘリックスＨ２、不定形ループ２０、αヘリックスＨ３、不定形ループ２１、αヘリックスａ−１、不定形ループ２２、αヘリックスＩ、不定形ループ２３、αヘリックスＪ、Ｊ−Ｋループ、αヘリックスＫおよび／または不定形ループ２５の中から選択され、
連続する部分は、少なくとも３個のアミノ酸残基を含有し、それによって
改変されたテルペンシンターゼの特性が、第１のテルペンシンターゼと比較して変更される、方法。
【請求項１４２】
改変されたテルペンシンターゼの特性が、第１のテルペンシンターゼと比較して改善される、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
第１のテルペンシンターゼのドメインに由来する少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０個またはそれ以上のアミノ酸残基が、第２のテルペンシンターゼの対応するドメインに由来する少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０個またはそれ以上のアミノ酸残基で置換される、請求項１４１または請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
第１のテルペンシンターゼのドメインに由来するアミノ酸残基すべてが、第２のテルペンシンターゼの対応するドメインに由来するアミノ酸残基のすべてで置換される、請求項１４１から１４３のいずれかに記載の方法。
【請求項１４５】
不定形ループ１が、配列番号２のアミノ酸１〜２９に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックス１が、配列番号２のアミノ酸３０〜３９および４４〜５２に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ２が、配列番号２のアミノ酸５３〜５８に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックス２が、配列番号２のアミノ酸５９〜７１に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ３が、配列番号２のアミノ酸７２〜７８に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックス３が、配列番号２のアミノ酸７９〜９３に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ４が、配列番号２のアミノ酸９４〜１００に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックス４が、配列番号２のアミノ酸１０１〜１１４に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ５が、配列番号２のアミノ酸１１５〜１４１に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックス５が、配列番号２のアミノ酸１４２〜１５２に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ６が、配列番号２のアミノ酸１５３〜１６２に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックス６が、配列番号２のアミノ酸１６３〜１７３に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ７が、配列番号２のアミノ酸１７４〜１８４に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックス７が、配列番号２のアミノ酸１８５〜１９４に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ８が、配列番号２のアミノ酸１９５〜２０１に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックス８が、配列番号２のアミノ酸２０２〜２１２に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ９が、配列番号２のアミノ酸２１３〜２２２に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックスＡが、配列番号２のアミノ酸２２３〜２５３に対応するアミノ酸残基を含有し、Ａ−Ｃループが、配列番号２のアミノ酸２５４〜２６６に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックスＣが、配列番号２のアミノ酸２６７〜２７６に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ１１が、配列番号２のアミノ酸２７７〜２８３に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックスＤが、配列番号２のアミノ酸２８４〜３０５に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ１２が、配列番号２のアミノ酸３０６〜３０９に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックスＤ１が、配列番号２のアミノ酸３１０〜３２２に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ１３が、配列番号２のアミノ酸３２３〜３２８に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックスＤ２が、配列番号２のアミノ酸３２９に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ１４が、配列番号２のアミノ酸３３０〜３３２に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックスＥが、配列番号２のアミノ酸３３３〜３５１に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ１５が、配列番号２のアミノ酸３５２〜３６２に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックスＦが、配列番号２のアミノ酸３６３〜３８５に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ１６が、配列番号２のアミノ酸３８６〜３９０に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックスＧ１が、配列番号２のアミノ酸３９１〜３９５に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ１７が、配列番号２のアミノ酸３９６〜４０４に���応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックスＧ２が、配列番号２のアミノ酸４０５〜４１３に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ１８が、配列番号２のアミノ酸４１４〜４２１に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックスＨ１が、配列番号２のアミノ酸４２２〜４２８に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ１９が、配列番号２のアミノ酸４２９〜４３１に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックスＨ２が、配列番号２のアミノ酸４３２〜４４７に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ２０が、配列番号２のアミノ酸４４８〜４５０に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックスＨ３が、配列番号２のアミノ酸４５１〜４５５に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ２１が、配列番号２のアミノ酸４５６〜４６１に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックスａ−１が、配列番号２のアミノ酸４６２〜４７０に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ２２が、配列番号２のアミノ酸４７１〜４７３に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックスＩが、配列番号２のアミノ酸４７４〜４９５に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ２３が、配列番号２のアミノ酸４９６〜５０８に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックスＪが、配列番号２のアミノ酸５０９〜５２１に対応するアミノ酸残基を含有し、Ｊ−Ｋループが、配列番号２のアミノ酸５２２〜５３４に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックスＫが、配列番号２のアミノ酸５３５〜５４１に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ２５が、配列番号２のアミノ酸５４２〜５４８に対応するアミノ酸残基を含有する、請求項１４１から１４４のいずれかに記載の方法。
【請求項１４６】
第１のテルペンシンターゼの２つ以上のドメインのすべてまたは連続する部分が、第２のテルペンシンターゼの対応するドメインのすべてまたは連続する部分で置換される、請求項１４１から１４５のいずれかに記載の方法。
【請求項１４７】
第１のテルペンシンターゼ中のドメインに隣接する１個または複数のさらなる残基を置換することをさらに含む、請求項１４１から１４６のいずれかに記載の方法。
【請求項１４８】
第１のテルペンシンターゼ中のドメインに隣接する少なくともまたは約１、２、３、４、５個またはそれ以上のさらなる残基を置換することをさらに含む、請求項１４１から１４７のいずれかに記載の方法。
【請求項１４９】
第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２のアミノ酸５３〜５８に対応するアミノ酸が、第２のテルペンシンターゼに由来する対応する領域で置換される、請求項１４１から１４８のいずれかに記載の方法。
【請求項１５０】
第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２のアミノ酸８５〜９９に対応するアミノ酸が、第２のテルペンシンターゼに由来する対応する領域で置換される、請求項１４１から１４９のいずれかに記載の方法。
【請求項１５１】
第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２のアミノ酸１１５〜１４６に対応するアミノ酸が、第２のテルペンシンターゼに由来する対応する領域で置換される、請求項１４１から１５０のいずれかに記載の方法。
【請求項１５２】
第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２のアミノ酸１５２〜１６３に対応するアミノ酸が、第２のテルペンシンターゼに由来する対応する領域で置換される、請求項１４１から１５１のいずれかに記載の方法。
【請求項１５３】
第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２のアミノ酸１７４〜１８４に対応するアミノ酸が、第２のテルペンシンターゼに由来する対応する領域で置換される、請求項１４１から１５２のいずれかに記載の方法。
【請求項１５４】
第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２のアミノ酸２１３〜２２２に対応するアミノ酸が、第２のテルペンシンターゼに由来する対応する領域で置換される、請求項１４１から１５３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５５】
第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２のアミノ酸３１０〜３２２に対応するアミノ酸が、第２のテルペンシンターゼに由来する対応する領域で置換される、請求項１４１から１５４のいずれかに記載の方法。
【請求項１５６】
第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２のアミノ酸５２２〜５３４に対応するアミノ酸が、第２のテルペンシンターゼに由来する対応する領域で置換される、請求項１４１から１５５のいずれかに記載の方法。
【請求項１５７】
第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２のアミノ酸５３〜５８に対応するアミノ酸が、配列番号２９５または９４１に示されるＴＥＡＳポリペプチドのアミノ酸５８〜６３で置換される、請求項１４１から１５６のいずれかに記載の方法。
【請求項１５８】
第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２のアミノ酸８５〜８９に対応するアミノ酸が、配列番号９４２に示されるＨＰＳポリペプチドのアミノ酸９３〜９７で置換される、請求項１４１から１５７のいずれかに記載の方法。
【請求項１５９】
第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２のアミノ酸８５〜９９に対応するアミノ酸が、配列番号３４６に示されるブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）バレンセンシンターゼのアミノ酸９６〜１１２で置換される、請求項１４１から１５８のいずれかに記載の方法。
【請求項１６０】
第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２のアミノ酸１１５〜１４６に対応するアミノ酸が、配列番号３４６に示されるブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）バレンセンシンターゼのアミノ酸１２８〜１５９で置換される、請求項１４１から１５９のいずれかに記載の方法。
【請求項１６１】
第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２のアミノ酸１５２〜１６３に対応するアミノ酸が、配列番号９４２に示されるＨＰＳポリペプチドのアミノ酸１６３〜１７４で置換される、請求項１４１から１６０のいずれかに記載の方法。
【請求項１６２】
第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２のアミノ酸１７４〜１８４に対応するアミノ酸が、配列番号９４２に示されるＨＰＳポリペプチドのアミノ酸１８５〜１９３で置換される、請求項１４１から１６１いずれかに記載の方法。
【請求項１６３】
第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２のアミノ酸２１２〜２２１に対応するアミノ酸が、配列番号９４２に示されるＨＰＳポリペプチドのアミノ酸２２１〜２２８で置換される、請求項１４１から１６２のいずれかに記載の方法。
【請求項１６４】
第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２のアミノ酸３１０〜３２２に対応するアミノ酸が、配列番号９４２に示されるＨＰＳポリペプチドのアミノ酸３１７〜３２９で置換される、請求項１４１から１６３のいずれかに記載の方法。
【請求項１６５】
第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２のアミノ酸５２２〜５３４に対応するアミノ酸が、配列番号９４２に示されるＨＰＳポリペプチドのアミノ酸５２７〜５４１で置換される、請求項１４１から１６４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６６】
第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドのアミノ酸２１２〜２２１に対応するアミノ酸が、配列番号２９５に示されるＴＥＡＳポリペプチドのアミノ酸２１３〜２２１で置換される、請求項１４１から１６５のいずれかに記載の方法。
【請求項１６７】
第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドのアミノ酸２１２〜２２１または２１２〜２２２に対応するアミノ酸が、配列番号３４６に示されるブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）バレンセンシンターゼのアミノ酸２２３〜２３０で置換される、請求項１４１から１６６のいずれかに記載の方法。
【請求項１６８】
第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドのアミノ酸３〜４１に対応するアミノ酸が、配列番号３４６に示されるブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）バレンセンシンターゼのアミノ酸３〜５１で置換される、請求項１４１から１６７のいずれかに記載の方法。
【請求項１６９】
第２のテルペンが、セスキテルペンである、請求項１４１から１６８のいずれかに記載の方法。
【請求項１７０】
第１のテルペンが、セスキテルペンである、請求項１４１から１６９のいずれかに記載の方法。
【請求項１７１】
セスキテルペンが、バレンセンシンターゼ、サンタレンシンターゼ、ＴＥＡＳおよびＨＰＳの中から選択される、請求項１６９および請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７２】
サンタレンシンターゼが、配列番号４８１〜４８５の中から選択されるアミノ酸の配列を有する、請求項１７１に記載の方法。
【請求項１７３】
テルペンシンターゼ中の複数のドメインが、２種以上のその他のテルペンシンターゼに由来する対応するドメインで置換される、請求項１４１から１７２のいずれかに記載の方法。
【請求項１７４】
第１のテルペンシンターゼと比較して変更されるか、または改善される改変されたテルペンシンターゼの特性が、総テルペン収量、特定のテルペン収量、触媒活性、生成物分布および基質特異性の中から選択される、請求項１４１から１７３のいずれかに記載の方法。
【請求項１７５】
請求項１４１から１７４のいずれかに記載の方法によって生成された、改変されたテルペンシンターゼ。
【請求項１７６】
バレンセン生成を改善する方法であって、
コードされるバレンセンシンターゼポリペプチドが主生成物として非環式ピロリン酸テルペン前駆体からのバレンセンの形成を触媒する、請求項８４から９５のいずれかに記載の核酸分子を、非環式ピロリン酸テルペン前駆体を生成する宿主細胞に導入することと、
バレンセンを生成するための前駆体の触媒作用のためのコードされるバレンセンシンターゼポリペプチドの発現にとって十分な条件下で細胞を培養することと、
細胞培地からバレンセンを回収することと
を含む、方法。
【請求項１７７】
バレンセンの回収が、有機溶媒を用いる抽出によって達成される、請求項１７７に記載の方法。
【請求項１７８】
回収されたバレンセンが、６８重量％超のバレンセン溶液である、請求項１７６または請求項１７７に記載の方法。
【請求項１７９】
回収されたバレンセンが、約７０％、７１％、７２％、７３％、７５％、７５％、７６％、７７％、７８％、７８％、７９％、８０重量％超または７０％、７１％、７２％、７３％、７５％、７５％、７６％、７７％、７８％、７８％、７９％、８０重量％超のバレンセン溶液である、請求項１７７から１７８のいずれかに記載の方法。
【請求項１８０】
非環式ピロリン酸テルペン前駆体が、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）およびゲラニル−ゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）の中から選択される、請求項１７７から１７９のいずれかに記載の方法。
【請求項１８１】
非環式ピロリン酸テルペン前駆体がＦＰＰである、請求項１７７から１８０のいずれかに記載の方法。
【請求項１８２】
細胞が、細菌、酵母、昆虫、植物または哺乳動物細胞の中から選択される、請求項１７７から１８１のいずれかに記載の方法。
【請求項１８３】
細胞が、酵母細胞であり、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞である、請求項１７７から１８２のいずれかに記載の方法。
【請求項１８４】
バレンセンを酸化してヌートカトンを生成することをさらに含む、請求項１７７から１８３のいずれかに記載の方法。
【請求項１８５】
酸化が、生合成的に、または化学的に実施される、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８６】
ヌートカトンを単離することをさらに含む、請求項１８４または請求項１８５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
Park E.、Burlingame, R.P.、Amick, J.D.およびJulien, B.の２０１０年１０月２９日に出願された「改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドおよびその使用（MODIFIED VALENCENE SYNTHASE POLYPEPTIDES AND USES THEREOF）」と題された、米国仮出願第６１／４５５，９９０号、ならびにPark E.、Burlingame R.P.、Amick J.D.およびJulien, B.の２０１１年９月９日に出願された、「改変されたバレンセンシンターゼポリペプチド、コーディング核酸分子およびその使用（MODIFIED VALENCENE SYNTHASE POLYPEPTIDES, ENCODING NUCLEIC ACID MOLECULES AND USES THEREOF）」と題された、米国仮出願第６１／５７３，７４５号の優先権の利益が主張される。
【０００２】
本願は、米国仮出願第６１／４５５，９９０号および同６１／５７３，７４５号の優先権を主張する、「改変されたバレンセンシンターゼポリペプチド、コーディング核酸分子およびその使用（MODIFIED VALENCENE SYNTHASE POLYPEPTIDES, ENCODING NUCLEIC ACID MOLECULES AND USES THEREOF）」と題された、本明細書と同日に出願された米国出願第１３／３１７，８３９号に関する。
【０００３】
許容される場合には、上記で参照された出願各々の対象は、参照によりその全体が組み込まれる。
【０００４】
電子的に提供された配列表の参照による組み込み
配列表の電子版は本明細書とともに出願され、その内容は参照によりその全体が組み込まれる。電子ファイルは、３．２１メガバイトの大きさであり、２０３ＰＣｓｅｑ．００１．ｔｘｔ．とタイトルがついている。
【０００５】
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチド、改変されたバレンセンシンターゼをコードする核酸分子および改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを使用する方法が提供される。また、改変テルペンシンターゼを生成する方法も提供される。
【背景技術】
【０００６】
バレンセンおよびヌートカトンは、オレンジおよびグレープフルーツおよびその他の植物などの柑橘油中に天然に見られるセスキテルペンである。バレンセンは、非環式ピロリン酸テルペン前駆体、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）の環化から誘導され、バレンセンの酸化は、ヌートカトンの形成をもたらす。バレンセンおよびヌートカトンは両方とも、香味剤および芳香剤として使用されているが、ヌートカトンは、特に、香水およびフレーバー工業において広く使用されている。したがって、本明細書における目的の中に、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドの提供およびバレンセンおよびヌートカトンの生成のために改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを使用する方法がある。
【発明の概要】
【０００７】
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドをコードする核酸分子およびそれにコードされる改変されたバレンセンシンターゼが、本明細書において提供される。また、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを作製する方法も本明細書において提供される。また、バレンセンを生成する方法およびバレンセンからヌートカトンを生成する方法も本明細書において提供される。また、改変テルペンシンターゼを作製する方法および改変テルペンシンターゼも本明細書において提供される。
【０００８】
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドをコードする核酸分子が、本明細書において提供される。一部の例では、本明細書において提供される核酸分子は、配列番号３に示される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドに対して１００％未満の同一性を有するアミノ酸の配列を含有する改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドをコードする。その他の例では、本明細書において提供される核酸分子は、配列番号３に示される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドに対して１００％の同一性を有するアミノ酸の配列を含有する改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドをコードする。一部の態様では、核酸分子によってコードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対して９５％未満の同一性を有する。その他の態様では、核酸分子によってコードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼに対して６２％を超える配列同一性を有する。
【０００９】
また、配列番号３に示される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドに対して１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸の配列を有するバレンセンシンターゼポリペプチド中に、アミノ酸改変を含有する、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドをコードする核酸分子も、本明細書において提供される。一部の例では、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対して９５％未満の同一性を有するアミノ酸の配列を含有する。その他の例では、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼに対して６２％を超える配列同一性を有するアミノ酸の配列を含有する。一部の態様では、核酸分子によってコードされる改変バレンセンポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼに対して少なくとも８２％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含有する。
【００１０】
改変を含有しないバレンセンシンターゼまたは配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドと比較して、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６もしくは１３７個または少なくとも２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６もしくは１３７個のアミノ酸改変を含有する改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドをコードする核酸分子も、本明細書において提供される。
【００１１】
９５％未満かつ７５％超；９４％未満かつ７５％超；９３％未満かつ７５％超；９２％未満かつ７５％超；９５％未満かつ８０％超；９４％未満かつ８０％超；９３％未満かつ８０％超；９２％未満かつ８０％超；９５％未満かつ８５％超；９４％未満かつ８５％超；９３％未満かつ８５％超；ならびに９２％未満かつ８５％超の中から選択される配列番号２に示されるバレンセンシンターゼに対する配列同一性を有するアミノ酸の配列を含有する改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドをコードする核酸分子が、本明細書において提供される。一部の例では、本明細書において提供される核酸分子によってコードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼに対して、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％もしくは７５％未満または約９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％もしくは７５％未満の同一性を有するアミノ酸の配列を有する。その他の例では、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号３に示される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドに対して、少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸の配列を有する。さらにその他の例では、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号３に示される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドに対して、少なくともまたは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸の配列を有する。
【００１２】
また、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼと比較して、アミノ酸改変を含有する改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドをコードする核酸分子も本明細書において提供され、それによって、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対して、１００％未満の同一性および６２％超の同一性を有するアミノ酸の配列を含み、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２８９〜２９１、３４６、３４７、７５２、８８２、８８３または８８６のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含有しない。一部の態様では、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号６〜８、１４〜１６および３４８のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含有しない。その他の態様では、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸の配列を含有しない。さらにその他の態様では、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号５に示されるアミノ酸の配列を含有しない。
【００１３】
一部の例では、本明細書において提供される核酸分子は、非環式ピロリン酸テルペン前駆体からのバレンセンの形成を触媒する改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドをコードする。例えば、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、非環式ピロリン酸テルペン前駆体ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）からのバレンセンの形成を触媒する。
【００１４】
また、同一条件下で、同一宿主細胞において配列番号２に示されるバレンセンシンターゼによってＦＰＰから生成されるバレンセンの量よりも多い量で、宿主細胞においてＦＰＰからバレンセンを生成する改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドをコードする核酸分子も本明細書において提供され、宿主細胞はＦＰＰを生成する細胞である。一部の態様では、宿主細胞は、酵母細胞である。改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドによって生成されるバレンセンの量は、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドおよび配列番号２に示されるバレンセンシンターゼを発現する酵母細胞を、同一条件下、同一酵母株において、別個に培養することおよび生成されたバレンセンの量を比較することによって評価できる。一部の例では、改変されたバレンセンシンターゼによってＦＰＰから生成されたバレンセンの量は、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼによってＦＰＰから生成されたバレンセンの量より少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、５００％またはそれ以上多い。その他の例では、改変されたバレンセンシンターゼによってＦＰＰから生成されたバレンセンの量は、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼによってＦＰＰから生成されたバレンセンの量より１０％〜５００％、１０％〜２５０％、５０％〜２５０％、１００％〜５００％多いか、または１００％〜２５０％多い。例えば、以下および実施例に記載されるような、本明細書において提供された例示的な改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、増大したバレンセンを生成する。
【００１５】
一部の態様では、本明細書において提供された核酸分子によってコードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、酵母細胞培養培地中で、少なくともまたは約０．１ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ、０．３ｇ／Ｌ、０．４ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、０．６ｇ／Ｌ、０．７ｇ／Ｌ、０．８ｇ／Ｌ、０．９ｇ／Ｌ  １．０ｇ／Ｌ、１．１ｇ／Ｌ、１．２ｇ／Ｌ、１．３ｇ／Ｌ、１．４ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、２．０ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４．０ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、５．０ｇ／Ｌまたはそれ以上のバレンセンを生成する。その他の態様では、本明細書において提供された核酸分子によってコードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、酵母細胞培養培地中で、０．１ｇ／Ｌ〜５．０ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ〜３．０ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ〜５．０ｇ／Ｌ、１．０ｇ／Ｌ〜５．０ｇ／Ｌまたは１．０〜３．０ｇ／Ｌのバレンセンを生成する。このような例では、バレンセンは、大規模発酵法によって生成される。ミクロ培養または振盪フラスコ（例えば、５０ｍＬ）またはその他のより小規模な生成方法は、増大したバレンセンを生成するが、一般に、１０ｍｇ／Ｌ〜１０００ｍｇ／Ｌの間またはおよそ１０ｍｇ／Ｌ〜１０００ｍｇ／Ｌの間、例えば、５０〜６０ｍｇ／Ｌまたは６００〜８００ｍｇ／Ｌのバレンセンの量を生成することは理解される。
【００１６】
配列番号２に示されるアミノ酸位置に関するＣＶＳ番号付けによって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、５０、５３、５４、５５、５６、５７、５８、６０、６２、６９、７７、７８、８２、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１８、１２０、１２１、１２２、１２４、１２５、１２７、１２９、１３０、１３２、１３５、１３６、１３８、１３９、１４１、１４２、１４４、１４６、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６２、１６３、１６５、１６６、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２７、２２８、２２９、２３８、２５２、２５７、２６３、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０５、３０６、３０７、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２９、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７５、３７７、３７８、３８０、３８１、３８２、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４２２、４２３、４２４、４２８、４２９、４３４、４３５、４３６、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５１、４５２、４５４、４５７、４６５、４６８、４７３、４７４、４８４、４９２、４９５、４９６、４９９、５００、５０１、５０６、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３６および５３９の中から選択される位置に対応する位置で、バレンセンシンターゼポリペプチド中に少なくとも１つのアミノ酸改変を含有する改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドをコードする核酸分子が、本明細書において提供される。
【００１７】
特定の実施形態では、本明細書において提供される核酸分子は、配列番号２に示される位置に関してＣＶＳ番号付けによって、Ｍ１Ｔ、Ｓ２Ｒ、Ｓ２Ｋ、Ｓ２Ｅ、Ｓ２Ｑ、Ｓ２Ｐ、Ｓ２Ｔ、Ｓ２Ｌ、Ｓ２Ｈ、Ｓ２Ａ、Ｓ２Ｖ、Ｓ３Ｄ、Ｓ３Ｒ、Ｓ３Ｇ、Ｓ３Ｉ、Ｓ３Ｅ、Ｓ３Ｖ、Ｓ３Ａ、Ｓ３Ｔ、Ｓ３Ｌ、Ｓ３Ｍ、Ｓ３Ｎ、Ｇ４Ｋ、Ｇ４Ｖ、Ｇ４Ｎ、Ｇ４Ｉ、Ｇ４Ｒ、Ｇ４Ｓ、Ｇ４Ｐ、Ｇ４Ａ、Ｇ４Ｅ、Ｇ４Ｆ、Ｇ４Ｃ、Ｇ４Ｔ、Ｇ４Ｌ、Ｇ４Ｑ、Ｅ５Ａ、Ｅ５Ｇ、Ｅ５Ｓ、Ｅ５Ｔ、Ｅ５Ｄ、Ｅ５Ｈ、Ｅ５Ｉ、Ｅ５Ｐ、Ｅ５Ｌ、Ｅ５Ｎ、Ｅ５Ｖ、Ｔ６Ｒ、Ｔ６Ｖ、Ｔ６Ｄ、Ｔ６Ｌ、Ｔ６Ａ、Ｔ６Ｅ、Ｔ６Ｋ、Ｔ６Ｓ、Ｔ６Ｇ、Ｔ６Ｃ、Ｔ６Ｍ、Ｔ６Ｙ、Ｆ７Ｃ、Ｆ７Ａ、Ｆ７Ｑ、Ｆ７Ｋ、Ｆ７Ｓ、Ｆ７Ｇ、Ｆ７Ｔ、Ｆ７Ｌ、Ｆ７Ｒ、Ｆ７Ｐ、Ｆ７Ｎ、Ｔ１０Ｖ、Ａ１１Ｔ、Ｄ１２Ｎ、Ｓ１６Ｎ、Ｌ１７Ｉ、Ｒ１９Ｋ、Ｒ１９Ｐ、Ｒ１９Ｇ、Ｎ２０Ｄ、Ｈ２１Ｑ、Ｌ２３Ｓ、Ｌ２３Ｉ、Ｋ２４Ａ、Ｋ２４Ｑ、Ｋ２４Ｙ、Ｋ２４Ｔ、Ｇ２５Ｙ、Ａ２６Ｔ、Ｓ２７Ｐ、Ｄ２８Ｇ、Ｄ２８Ｅ、Ｆ２９Ｄ、Ｄ３３Ｔ、Ｈ３４Ｒ、Ｔ３５Ａ、Ａ３６Ｃ、Ｔ３７Ｋ、Ｑ３８Ｖ、Ｑ３８Ａ、Ｑ３８Ｎ、Ｑ３８Ｅ、Ｒ４０Ｑ、Ｈ４１Ｉ、Ｒ５０Ｇ、Ｔ５３Ｌ、Ｔ５３Ｒ、Ｄ５４Ａ、Ｄ５４Ｐ、Ｄ５４Ｃ、Ａ５５Ｔ、Ａ５５Ｐ、Ａ５５Ｒ、Ａ５５Ｖ、Ａ５５Ｑ、Ｅ５６Ｇ、Ｅ５６Ｐ、Ｅ５６Ｆ、Ｅ５６Ａ、Ｅ５６Ｔ、Ｅ５６Ｑ、Ｄ５７Ｒ、Ｄ５７Ｐ、Ｄ５７Ｓ、Ｄ５７Ｑ、Ｄ５７Ａ、Ｋ５８Ｑ、Ｋ５８Ｒ、Ｋ５８Ｐ、Ｋ５８Ｅ、Ｋ５８Ａ、Ｖ６０Ｉ、Ｖ６０Ｇ、Ｋ６２Ｒ、Ｖ６９Ｉ、Ｆ７８Ｌ、Ｉ８２Ｖ、Ａ８５Ｍ、Ｉ８６Ｌ、Ｑ８７Ｄ、Ｋ８８Ｑ、Ｋ８８Ａ、Ｋ８８Ｈ、Ｌ８９Ｉ、Ｃ９０Ｙ、Ｐ９１Ｎ、Ｉ９２Ｙ、Ｉ９２Ｎ、Ｉ９２Ｓ、Ｙ９３Ｈ、Ｙ９３Ｆ、Ｙ９３Ｆ、Ｉ９４Ｅ、Ｉ９４Ｈ、Ｄ９５Ａ、Ｓ９６Ｈ、Ｓ９６Ｃ、Ｎ９７Ｄ、Ｎ９７Ｅ、Ｒ９８Ｋ、Ｒ９８Ｙ、Ｒ９８Ｄ、Ａ９９Ｎ、Ａ９９Ｍ、Ｈ１０２Ｙ、Ｌ１０６Ａ、Ｌ１０６Ｓ、Ｌ１０６Ｋ、Ｌ１０６Ｆ、Ｌ１１１Ｓ、Ｑ１１３Ｒ、Ｉ１６６Ｙ、Ｋ１１７Ｔ、Ｖ１２２Ｉ、Ｅ１２４Ｎ、Ｋ１２５Ａ、Ｋ１２５Ｑ、Ｋ１２７Ｔ、Ｄ１２９Ｅ、Ｅ１３０Ｒ、Ｒ１３２Ｇ、Ｓ１３５Ｅ、Ｓ１３６Ａ、Ｎ１３９Ｓ、Ｑ１４２Ｒ、Ｓ１４６Ｇ、Ｙ１５２Ｈ、Ｍ１５３Ｎ、Ｍ１５３Ｇ、Ｈ１５９Ｑ、Ｈ１５９Ｋ、Ｈ１５９Ｒ、Ｅ１６３Ｄ、Ｋ１７３Ｅ、Ｋ１７３Ｑ、Ｋ１７３Ａ、Ｑ１７８Ａ、Ｄ１７９Ｐ、Ｖ１８１Ｌ、Ｔ１８２Ｋ、Ｐ１８３Ｓ、Ｋ１８４Ｒ、Ｋ１８４Ｐ、Ｑ１８８Ｒ、Ｉ１８９Ａ、Ｉ１８９Ｖ、Ｉ１８９Ｐ、Ｔ２００Ｑ、Ｐ２０２Ｓ、Ｆ２０９Ｉ、Ｆ２０９Ｈ、Ｆ２０９Ｅ、Ｆ２０９Ｌ、Ｆ２０９Ｔ、Ｍ２１０Ｔ、Ｍ２１２Ｒ、Ｍ２１２Ｄ、Ｍ２１２Ｎ、Ｍ２１２Ｓ、Ｍ２１２Ａ、Ｍ２１２Ｙ、Ｍ２１２Ｋ、Ｍ２１２Ｆ、Ｍ２１２Ｈ、Ｍ２１２Ｑ、Ｍ２１２Ｉ、Ｍ２１２Ｓ、Ｍ２１２Ｖ、Ｉ２１３Ｙ、Ｉ２１３Ｍ、Ｉ２１３Ａ、Ｉ２１３Ｒ、Ｉ２１３Ｓ、Ｉ２１３Ｌ、Ｉ２１３Ｆ、Ｉ２１３Ｓ、Ｉ２１３Ｐ、Ｉ２１３Ｑ、Ｉ２１３Ｎ、Ｉ２１３Ｋ、Ｉ２１３Ｖ、Ｉ２１３Ｙ、Ｎ２１４Ｄ、Ｎ２１４Ｅ、Ｎ２１４Ｓ、Ｎ２１４Ｌ、Ｎ２１４Ｙ、Ｎ２１４Ｖ、Ｎ２１４Ｐ、Ｎ２１４Ｈ、Ｎ２１４Ｃ、Ｎ２１４Ａ、Ｎ２１４Ｔ、Ｎ２１４Ｒ、Ｎ２１４Ｙ、Ｎ２１４Ｑ、Ｓ２１５Ｈ、Ｓ２１５Ｇ、Ｓ２１５Ｋ、Ｓ２１５Ｒ、Ｓ２１５Ｐ、Ｓ２１５Ａ、Ｓ２１５Ｎ、Ｓ２１５Ｔ、Ｓ２１５Ｌ、Ｓ２１５Ｖ、Ｓ２１５Ｑ、Ｓ２１５Ｄ、Ｔ２１６Ｑ、Ｔ２１６Ｙ、Ｔ２１６Ｅ、Ｔ２１６Ｐ、Ｔ２１６Ｒ、Ｔ２１６Ｃ、Ｔ２１６Ｖ、Ｔ２１６Ｋ、Ｔ２１６Ｄ、Ｔ２１６Ａ、Ｔ２１６Ｓ、Ｔ２１６Ｋ、Ｓ２１７Ｒ、Ｓ２１７Ｋ、Ｓ２１７Ｆ、Ｓ２１７Ｉ、Ｓ２１７Ｔ、Ｓ２１７Ｇ、Ｓ２１７Ｙ、Ｓ２１７Ｎ、Ｓ２１７Ｈ、Ｓ２１７Ｅ、Ｓ２１７Ｆ、Ｓ２１７Ｃ、Ｓ２１７Ｅ、Ｓ２１７Ｄ、Ｄ２１８Ｉ、Ｄ２１８Ｇ、Ｄ２１８Ｖ、Ｄ２１８Ｃ、Ｄ２１８Ｐ、Ｄ２１８Ｍ、Ｄ２１８Ｒ、Ｄ２１８Ｌ、Ｄ２１８Ｓ、Ｄ２１８Ａ、Ｄ２１８Ｙ、Ｄ２１８Ｋ、Ｄ２１８Ｅ、Ｈ２１９Ｄ、Ｈ２１９Ａ、Ｈ２１９Ｌ、Ｈ２１９Ｃ、Ｈ２１９Ｗ、Ｈ２１９Ｒ、Ｈ２１９Ｓ、Ｈ２１９Ｆ、Ｈ２１９Ｅ、Ｈ２１９Ｇ、Ｈ２１９Ｑ、Ｈ２１９Ａ、Ｌ２２０Ｖ、Ｌ２２０Ｓ、Ｌ２２０Ｔ、Ｌ２２０Ｐ、Ｌ２２０Ｍ、Ｌ２２０Ａ、Ｌ２２０Ｈ、Ｌ２２０Ｅ、Ｌ２２０Ｇ、Ｌ２２０Ｄ、Ｌ２２０Ｆ、Ｙ２２１Ｃ、Ｙ２２１Ｖ、Ｙ２２１Ｑ、Ｙ２２１Ｆ、Ｙ２２１Ｓ、Ｙ２２１Ｎ、Ｙ２２１Ｔ、Ｙ２２１Ｐ、Ｙ２２１Ｌ、Ｙ２２１Ｋ、Ｙ２２１Ｗ、Ｙ２２１Ｅ、Ｙ２２１Ｖ、Ｙ２２１Ｈ、Ｎ２２７Ｓ、Ｅ２３８Ｄ、Ｋ２５２Ａ、Ｋ２５２Ｑ、Ｔ２５７Ａ、Ｄ２７４Ｍ、Ｄ２７４Ｎ、Ｄ２７４Ｓ、Ｄ２７４Ｆ、Ｄ２７４Ｇ、Ｄ２７４Ｈ、Ｄ２７４Ｅ、Ｆ２７９Ｓ、Ｆ２７９Ｉ、Ｆ２７９Ｐ、Ｆ２７９Ｄ、Ｆ２７９Ｌ、Ｆ２７９Ｎ、Ｆ２７９Ｍ、Ｆ２７９Ｈ、Ｆ２７９Ｃ、Ｆ２７９Ａ、Ｆ２７９Ｇ、Ｆ２７９Ｗ、Ｅ２８０Ｌ、Ｐ２８１Ｓ、Ｐ２８１Ｈ、Ｐ２８１Ｋ、Ｐ２８１Ａ、Ｐ２８１Ｗ、Ｐ２８１Ｌ、Ｐ２８１Ｙ、Ｑ２８２Ｌ、Ｑ２８２Ｓ、Ｑ２８２Ａ、Ｑ２８２Ｉ、Ｑ２８２Ｒ、Ｑ２８２Ｙ、Ｑ２８２Ｇ、Ｑ２８２Ｗ、Ｑ２８２Ｐ、Ｑ２８２Ｅ、Ｙ２８３Ｆ、Ｙ２８３Ｎ、Ａ２８４Ｔ、Ａ２８４Ｇ、Ａ２８４Ｐ、Ａ２８４Ｖ、Ａ２８４Ｒ、Ａ２８４Ｄ、Ａ２８４Ｅ、Ａ２８４Ｓ、Ａ２８４Ｈ、Ａ２８４Ｋ、Ａ２８４Ｉ、Ａ２８４Ｗ、Ａ２８４Ｍ、Ｑ２９２Ｋ、Ｉ２９９Ｙ、Ｙ３０７Ｈ、Ｌ３１０Ｈ、Ｅ３１１Ｐ、Ｅ３１１Ｔ、Ｌ３１３Ｃ、Ｓ３１４Ａ、Ｓ３１４Ｔ、Ｌ３１５Ｍ、Ｆ３１６Ｌ、Ｔ３１７Ｓ、Ｅ３１８Ｋ、Ａ３１９Ｔ、Ｖ３２０Ｄ、Ｖ３２０Ｇ、Ｖ３２０Ｓ、Ｑ３２１Ａ、Ｗ３２３Ｒ、Ｎ３２４Ｓ、Ｉ３２５Ｔ、Ｅ３２６Ｋ、Ｅ３３３Ｄ、Ｋ３３６Ｒ、Ｌ３３７Ｉ、Ｌ３４３Ｖ、Ａ３４５Ｖ、Ａ３４５Ｔ、Ｎ３４７Ｌ、Ｎ３４７Ｓ、Ｅ３４８Ａ、Ｅ３４８Ｓ、Ｅ３５０Ｋ、Ｇ３５７Ｒ、Ｈ３６０Ｌ、Ｈ３６０Ａ、Ｃ３６１Ｒ、Ｖ３６２Ａ、Ｅ３６７Ｇ、Ｎ３６９Ｉ、Ｑ３７０Ｄ、Ｑ３７０Ｈ、Ｑ３７０Ｇ、Ｋ３７１Ｇ、Ａ３７５Ｄ、Ｓ３７７Ｙ、Ｙ３８７Ｃ、Ｉ３９７Ｖ、Ｌ３９９Ｓ、Ｔ４０５Ｒ、Ｔ４０９Ｇ、Ｎ４１０Ｓ、Ｆ４２４Ｌ、Ｎ４２９Ｓ、Ｎ４２９Ｇ、Ａ４３６Ｓ、Ｖ４３９Ｌ、Ｑ４４８Ｌ、Ｃ４６５Ｓ、Ｋ４６８Ｑ、Ｓ４７３Ｙ、Ｋ４７４Ｔ、Ｅ４８４Ｄ、Ｉ４９２Ｖ、Ｅ４９５Ｇ、Ｋ４９９Ｅ、Ｐ５００Ｌ、Ｔ５０１Ｐ、Ｐ５０６Ｓ、Ｄ５３６ＥおよびＡ５３９Ｖに対応するアミノ酸置換の中から選択されるアミノ酸置換である少なくとも１つの改変を有する改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドをコードする。
【００１８】
一実施形態では、本明細書において提供される核酸分子は、アミノ酸置換である少なくとも１つの改変を有する改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドをコードし、少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号２に示される位置に関してＣＶＳ番号付けによって、１、２、３、４、５、６、７、１１、１９、２０、２３、２４、２８、３８、５０、５３、５４、５５、５６、５７、５８、６０、６２、６９、７８、８２、８８、９３、９７、９８、１０２、１０６、１１１、１１３、１２５、１３２、１５２、１５３、１５９、１６３、１７３、１８４、１８８、１８９、２００、２０２、２０９、２１０、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２７、２３８、２５２、２５７、２７４、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２９２、２９７、２９９、３０７、３１０、３１１、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２３、３２４、３２５、３２６、３３３、３３６、３３７、３４３、３４５、３４７、３４８、３５０、３５７、３６０、３６１、３６２、３６７、３６９、３７０、３７１、３７５、３７７、３８７、３９７、３９９、４０５、４０９、４１０、４２４、４２９、４３６、４３９、４４８、４６５、４６８、４７３、４７４、４８４、４９２、４９５、４９９、５００、５０１、５０６、５３６および５３９の中から選択される位置に対応する位置である。例えば、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチド中の少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号２に示される位置に関してＣＶＳ番号付けによって、Ｍ１Ｔ、Ｓ２Ｒ、Ｓ２Ｋ、Ｓ２Ｅ、Ｓ２Ｑ、Ｓ２Ｐ、Ｓ２Ｔ、Ｓ２Ｌ、Ｓ２Ｈ、Ｓ２Ａ、Ｓ２Ｖ、Ｓ３Ｄ、Ｓ３Ｒ、Ｓ３Ｇ、Ｓ３Ｉ、Ｓ３Ｅ、Ｓ３Ｖ、Ｓ３Ａ、Ｓ３Ｔ、Ｓ３Ｌ、Ｓ３Ｍ、Ｓ３Ｎ、Ｇ４Ｋ、Ｇ４Ｖ、Ｇ４Ｎ、Ｇ４Ｉ、Ｇ４Ｒ、Ｇ４Ｓ、Ｇ４Ｐ、Ｇ４Ａ、Ｇ４Ｅ、Ｇ４Ｆ、Ｇ４Ｃ、Ｇ４Ｔ、Ｇ４Ｌ、Ｅ５Ａ、Ｅ５Ｇ、Ｅ５Ｓ、Ｅ５Ｔ、Ｅ５Ｄ、Ｅ５Ｈ、Ｅ５Ｉ、Ｅ５Ｐ、Ｅ５Ｌ、Ｅ５Ｎ、Ｔ６Ｒ、Ｔ６Ｖ、Ｔ６Ｄ、Ｔ６Ｌ、Ｔ６Ａ、Ｔ６Ｅ、Ｔ６Ｋ、Ｔ６Ｓ、Ｔ６Ｇ、Ｔ６Ｃ、Ｔ６Ｍ、Ｔ６Ｙ、Ｆ７Ｃ、Ｆ７Ａ、Ｆ７Ｑ、Ｆ７Ｋ、Ｆ７Ｓ、Ｆ７Ｇ、Ｆ７Ｔ、Ｆ７Ｌ、Ｆ７Ｒ、Ｆ７Ｐ、Ａ１１Ｔ、Ｒ１９Ｋ、Ｒ１９Ｐ、Ｎ２０Ｄ、Ｌ２３Ｓ、Ｋ２４Ａ、Ｋ２４Ｑ、Ｋ２４Ｙ、Ｄ２８Ｇ、Ｑ３８Ｖ、Ｑ３８Ａ、Ｑ３８Ｎ、Ｒ５０Ｇ、Ｔ５３Ｌ、Ｔ５３Ｒ、Ｄ５４Ａ、Ｄ５４Ｐ、Ｄ５４Ｃ、Ａ５５Ｔ、Ａ５５Ｐ、Ａ５５Ｒ、Ａ５５Ｖ、Ａ５５Ｑ、Ｅ５６Ｇ、Ｅ５６Ｐ、Ｅ５６Ｆ、Ｅ５６Ａ、Ｅ５６Ｔ、Ｅ５６Ｑ、Ｄ５７Ｒ、Ｄ５７Ｐ、Ｄ５７Ｓ、Ｄ５７Ｑ、Ｄ５７Ａ、Ｋ５８Ｑ、Ｋ５８Ｒ、Ｋ５８Ｐ、Ｋ５８Ｅ、Ｋ５８Ａ、Ｖ６０Ｉ、Ｖ６０Ｇ、Ｋ６２Ｒ、Ｖ６９Ｉ、Ｆ７８Ｌ、Ｉ８２Ｖ、Ｋ８８Ｑ、Ｋ８８Ａ、Ｙ９３Ｈ、Ｎ９７Ｄ、Ｒ９８Ｋ、Ｈ１０２Ｙ、Ｌ１０６Ａ、Ｌ１０６Ｓ、Ｌ１０６Ｋ、Ｌ１０６Ｆ、Ｌ１１１Ｓ、Ｑ１１３Ｒ、Ｋ１２５Ａ、Ｋ１２５Ｑ、Ｒ１３２Ｇ、Ｙ１５２Ｈ、Ｍ１５３Ｎ、Ｍ１５３Ｇ、Ｈ１５９Ｑ、Ｈ１５９Ｋ、Ｈ１５９Ｒ、Ｅ１６３Ｄ、Ｋ１７３Ｅ、Ｋ１７３Ｑ、Ｋ１７３Ａ、Ｋ１８４Ｒ、Ｑ１８８Ｒ、Ｉ１８９Ａ、Ｉ１８９Ｖ、Ｉ１８９Ｐ、Ｔ２００Ｑ、Ｐ２０２Ｓ、Ｆ２０９Ｉ、Ｆ２０９Ｈ、Ｆ２０９Ｅ、Ｆ２０９Ｌ、Ｆ２０９Ｔ、Ｍ２１０Ｔ、Ｍ２１２Ｒ、Ｍ２１２Ｄ、Ｍ２１２Ｎ、Ｍ２１２Ｓ、Ｍ２１２Ａ、Ｍ２１２Ｙ、Ｍ２１２Ｋ、Ｍ２１２Ｆ、Ｍ２１２Ｈ、Ｍ２１２Ｑ、Ｉ２１３Ｙ、Ｉ２１３Ｍ、Ｉ２１３Ａ、Ｉ２１３Ｒ、Ｉ２１３Ｓ、Ｉ２１３Ｌ、Ｉ２１３Ｆ、Ｉ２１３Ｓ、Ｉ２１３Ｐ、Ｉ２１３Ｑ、Ｉ２１３Ｎ、Ｉ２１３Ｋ、Ｉ２１３Ｖ、Ｎ２１４Ｄ、Ｎ２１４Ｅ、Ｎ２１４Ｓ、Ｎ２１４Ｌ、Ｎ２１４Ｙ、Ｎ２１４Ｖ、Ｎ２１４Ｐ、Ｎ２１４Ｈ、Ｎ２１４Ｃ、Ｎ２１４Ａ、Ｎ２１４Ｔ、Ｎ２１４Ｒ、Ｓ２１５Ｈ、Ｓ２１５Ｇ、Ｓ２１５Ｋ、Ｓ２１５Ｒ、Ｓ２１５Ｐ、Ｓ２１５Ａ、Ｓ２１５Ｎ、Ｓ２１５Ｔ、Ｓ２１５Ｌ、Ｓ２１５Ｖ、Ｓ２１５Ｑ、Ｔ２１６Ｑ、Ｔ２１６Ｙ、Ｔ２１６Ｅ、Ｔ２１６Ｐ、Ｔ２１６Ｒ、Ｔ２１６Ｃ、Ｔ２１６Ｖ、Ｔ２１６Ｋ、Ｔ２１６Ｄ、Ｔ２１６Ａ、Ｔ２１６Ｓ、Ｓ２１７Ｒ、Ｓ２１７Ｋ、Ｓ２１７Ｆ、Ｓ２１７Ｉ、Ｓ２１７Ｔ、Ｓ２１７Ｇ、Ｓ２１７Ｙ、Ｓ２１７Ｎ、Ｓ２１７Ｈ、Ｓ２１７Ｅ、Ｓ２１７Ｆ、Ｓ２１７Ｃ、Ｄ２１８Ｉ、Ｄ２１８Ｇ、Ｄ２１８Ｖ、Ｄ２１８Ｃ、Ｄ２１８Ｐ、Ｄ２１８Ｍ、Ｄ２１８Ｒ、Ｄ２１８Ｌ、Ｄ２１８Ｓ、Ｄ２１８Ａ、Ｄ２１８Ｙ、Ｄ２１８Ｋ、Ｈ２１９Ｄ、Ｈ２１９Ａ、Ｈ２１９Ｌ、Ｈ２１９Ｃ、Ｈ２１９Ｗ、Ｈ２１９Ｒ、Ｈ２１９Ｓ、Ｈ２１９Ｆ、Ｈ２１９Ｅ、Ｌ２２０Ｖ、Ｌ２２０Ｓ、Ｌ２２０Ｔ、Ｌ２２０Ｐ、Ｌ２２０Ｍ、Ｌ２２０Ａ、Ｌ２２０Ｈ、Ｌ２２０Ｅ、Ｌ２２０Ｇ、Ｌ２２０Ｄ、Ｙ２２１Ｃ、Ｙ２２１Ｖ、Ｙ２２１Ｑ、Ｙ２２１Ｆ、Ｙ２２１Ｓ、Ｙ２２１Ｎ、Ｙ２２１Ｔ、Ｙ２２１Ｐ、Ｙ２２１Ｌ、Ｙ２２１Ｋ、Ｙ２２１Ｗ、Ｙ２２１Ｅ、Ｙ２２１Ｖ、Ｎ２２７Ｓ、Ｅ２３８Ｄ、Ｋ２５２Ａ、Ｋ２５２Ｑ、Ｔ２５７Ａ、Ｄ２７４Ｍ、Ｄ２７４Ｎ、Ｄ２７４Ｓ、Ｄ２７４Ｆ、Ｄ２７４Ｇ、Ｄ２７４Ｈ、Ｄ２７４Ｅ、Ｆ２７９Ｓ、Ｆ２７９Ｉ、Ｆ２７９Ｐ、Ｆ２７９Ｄ、Ｆ２７９Ｌ、Ｆ２７９Ｎ、Ｆ２７９Ｍ、Ｆ２７９Ｈ、Ｆ２７９Ｃ、Ｆ２７９Ａ、Ｆ２７９Ｇ、Ｆ２７９Ｗ、Ｅ２８０Ｌ、Ｐ２８１Ｓ、Ｐ２８１Ｈ、Ｐ２８１Ｋ、Ｐ２８１Ａ、Ｐ２８１Ｗ、Ｐ２８１Ｌ、Ｐ２８１Ｙ、Ｑ２８２Ｌ、Ｑ２８２Ｓ、Ｑ２８２Ａ、Ｑ２８２Ｉ、Ｑ２８２Ｒ、Ｑ２８２Ｙ、Ｑ２８２Ｇ、Ｑ２８２Ｗ、Ｑ２８２Ｐ、Ｑ２８２Ｅ、Ｙ２８３Ｆ、Ｙ２８３Ｎ、Ａ２８４Ｔ、Ａ２８４Ｇ、Ａ２８４Ｐ、Ａ２８４Ｖ、Ａ２８４Ｒ、Ａ２８４Ｄ、Ａ２８４Ｅ、Ａ２８４Ｓ、Ａ２８４Ｈ、Ａ２８４Ｋ、Ａ２８４Ｉ、Ａ２８４Ｗ、Ａ２８４Ｍ、Ｑ２９２Ｋ、Ｉ２９９Ｙ、Ｙ３０７Ｈ、Ｌ３１０Ｈ、Ｅ３１１Ｐ、Ｅ３１１Ｔ、Ｌ３１３Ｃ、Ｓ３１４Ａ、Ｓ３１４Ｔ、Ｌ３１５Ｍ、Ｆ３１６Ｌ、Ｔ３１７Ｓ、Ｅ３１８Ｋ、Ａ３１９Ｔ、Ｖ３２０Ｄ、Ｖ３２０Ｇ、Ｖ３２０Ｓ、Ｑ３２１Ａ、Ｗ３２３Ｒ、Ｎ３２４Ｓ、Ｉ３２５Ｔ、Ｅ３２６Ｋ、Ｅ３３３Ｄ、Ｋ３３６Ｒ、Ｌ３３７Ｉ、Ｌ３４３Ｖ、Ａ３４５Ｖ、Ａ３４５Ｔ、Ｎ３４７Ｌ、Ｎ３４７Ｓ、Ｅ３４８Ａ、Ｅ３４８Ｓ、Ｅ３５０Ｋ、Ｇ３５７Ｒ、Ｈ３６０Ｌ、Ｈ３６０Ａ、Ｃ３６１Ｒ、Ｖ３６２Ａ、Ｅ３６７Ｇ、Ｎ３６９Ｉ、Ｑ３７０Ｄ、Ｑ３７０Ｈ、Ｑ３７０Ｇ、Ｋ３７１Ｇ、Ａ３７５Ｄ、Ｓ３７７Ｙ、Ｙ３８７Ｃ、Ｉ３９７Ｖ、Ｌ３９９Ｓ、Ｔ４０５Ｒ、Ｔ４０９Ｇ、Ｎ４１０Ｓ、Ｆ４２４Ｌ、Ｎ４２９Ｓ、Ｎ４２９Ｇ、Ａ４３６Ｓ、Ｖ４３９Ｌ、Ｑ４４８Ｌ、Ｃ４６５Ｓ、Ｋ４６８Ｑ、Ｓ４７３Ｙ、Ｋ４７４Ｔ、Ｅ４８４Ｄ、Ｉ４９２Ｖ、Ｅ４９５Ｇ、Ｋ４９９Ｅ、Ｐ５００Ｌ、Ｔ５０１Ｐ、Ｐ５０６Ｓ、Ｄ５３６ＥおよびＡ５３９Ｖに対応するアミノ酸置換の中から選択され得る。
【００１９】
別の実施形態では、本明細書において提供される核酸分子によってコードされる改変されたバレンセンシンターゼは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対する番号付けを用いて、６０、９７、２０９、２１２、２１４、２２１、２３８、２９２、３３３、３４５、３６９、４０５、４２９、４７３および／または５３６の中から選択される位置に対応する位置にアミノ酸置換を含有する。例えば、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示される位置に関してＣＶＳ番号付けによって、Ｖ６０Ｉ、Ｖ６０Ｇ、Ｎ９７Ｄ、Ｆ２０９Ｉ、Ｆ２０９Ｈ、Ｆ２０９Ｅ、Ｆ２０９Ｌ、Ｆ２０９Ｔ、Ｍ２１２Ｒ、Ｍ２１２Ｄ、Ｍ２１２Ｎ、Ｍ２１２Ｓ、Ｍ２１２Ａ、Ｍ２１２Ｙ、Ｍ２１２Ｋ、Ｍ２１２Ｆ、Ｍ２１２Ｈ、Ｍ２１２Ｑ、Ｎ２１４Ｄ、Ｎ２１４Ｅ、Ｎ２１４Ｓ、Ｎ２１４Ｌ、Ｎ２１４Ｙ、Ｎ２１４Ｖ、Ｎ２１４Ｐ、Ｎ２１４Ｈ、Ｎ２１４Ｃ、Ｎ２１４Ａ、Ｎ２１４Ｔ、Ｎ２１４Ｒ、Ｙ２２１Ｃ、Ｙ２２１Ｖ、Ｙ２２１Ｑ、Ｙ２２１Ｆ、Ｙ２２１Ｓ、Ｙ２２１Ｎ、Ｙ２２１Ｔ、Ｙ２２１Ｐ、Ｙ２２１Ｌ、Ｙ２２１Ｋ、Ｙ２２１Ｗ、Ｙ２２１Ｅ、Ｙ２２１Ｖ、Ｅ２３８Ｄ、Ｑ２９２Ｋ、Ｅ３３３Ｄ、Ａ３４５Ｖ、Ａ３４５Ｔ、Ｎ３６９Ｉ、Ｔ４０５Ｒ、Ｎ４２９Ｓ、Ｎ４２９Ｇ、Ｓ４７３Ｙ、および／またはＤ５３６Ｅの中から選択されるアミノ酸置換を含有する。
【００２０】
本明細書において提供される核酸分子の中に、配列番号２に示される位置に対する番号付けを用いるＣＶＳ番号付けによって、Ｎ２１４Ｄ／Ｓ４７３Ｙ；Ｔ４０５Ｒ；Ａ３４５Ｖ／Ｄ５３６Ｅ；Ｙ２２１Ｃ；Ｅ２３８Ｄ；Ｆ２０９Ｉ；Ｎ９７Ｄ；Ｅ３３３Ｄ／Ｎ３６９Ｉ；Ｎ２１４Ｄ／Ｔ４０５Ｒ；Ｎ２１４Ｄ／Ａ３４５Ｖ／Ｔ４０５Ｒ／Ｄ５３６Ｅ；Ｖ６０Ｉ／Ｎ２１４Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｔ４０５Ｒ；Ｎ２１４Ｄ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｓ；Ｎ２１４Ｄ／Ｑ２９２Ｋ／Ｔ４０５Ｒ；Ｖ６０Ｇ／Ｎ２１４Ｄ／Ｔ４０５Ｒ；Ｖ６０Ｉ／Ｎ２１４Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｓ；Ｖ６０Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ａ３４５Ｔ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇに対応する置換の中から選択されるアミノ酸置換を含有する改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドをコードするものがある。
【００２１】
一部の例では、本明細書において提供される核酸分子は、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチド中の位置に対する番号付けを用いるＣＶＳ番号付けによって、位置６０、２０９、２３８および２９２に対応する位置にアミノ酸置換を有する改変されたバレンセンシンターゼをコードする。例えば、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、各々、配列番号２に示される位置に対する番号付けを用いるＣＶＳ番号付けによって、Ｖ６０ＩまたはＶ６０Ｇである位置Ｖ６０の置換、Ｆ２０９Ｉ、Ｆ２０９Ｈ、Ｆ２０９Ｅ、Ｆ２０９ＬまたはＦ２０９Ｔである位置Ｆ２０９の置換、Ｅ２３８Ｄである位置Ｅ２３８の置換およびＱ２９２Ｋである位置Ｑ２９２の置換を含有する。
【００２２】
一部の例では、本明細書において提供される核酸分子は、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対する番号付けを用いて、位置６０、１２５、１７３、２０９、２３８、２５２および２９２に対応する位置にアミノ酸置換を有する改変されたバレンセンシンターゼをコードする。例えば、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、各々、配列番号２に示される位置に対する番号付けを用いるＣＶＳ番号付けによって、Ｖ６０ＩまたはＶ６０Ｇである位置Ｖ６０の置換、Ｋ１２５ＡまたはＫ１２５Ｑである位置Ｋ１２５の置換、Ｋ１７３Ｅ、Ｋ１７３ＱまたはＫ１７３Ａである位置Ｋ１７３の置換、Ｆ２０９Ｉ、Ｆ２０９Ｈ、Ｆ２０９Ｅ、Ｆ２０９ＬまたはＦ２０９Ｔである位置Ｆ２０９の置換、Ｅ２３８Ｄである位置Ｅ２３８の置換、Ｋ２５２Ｑである位置Ｋ２５２の置換およびＱ２９２Ｋである位置Ｑ２９２の置換を含有する。
【００２３】
本明細書において提供される核酸分子の中に、各々、配列番号２に示される位置に対する番号付けを用いて、
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｖ３２０Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３２６Ｋ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｒ５０Ｇ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｖ３２０Ｇ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１５Ｍ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｖ３２０Ｇ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｇ３５７Ｒ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
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Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｈ１５９Ｋ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｉ１８９Ｐ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ｐ／Ａ５５Ｒ／Ｅ５６Ｆ／Ｄ５７Ｓ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２ＱＱ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｖ／Ｅ５６Ａ／Ｄ５７Ｑ／Ｋ５８Ｐ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｌ１０６Ｆ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｒ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｑ／Ｅ５６Ｔ／Ｄ５７Ａ／Ｋ５８Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｒ／Ｄ５４Ｃ／Ａ５５Ｖ／Ｅ５６Ｑ／Ｄ５７Ｐ／Ｋ５８Ｅ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｒ１３２Ｇ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｈ１５９Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｍ１５３Ｇ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｉ３９７Ｖ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｉ１８９Ａ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１０Ｈ／Ｅ３１１Ｐ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｎ／Ｉ２１３Ｙ／Ｎ２１４Ｌ／Ｓ２１５Ｒ／Ｔ２１６Ｒ／Ｓ２１７Ｉ／Ｄ２１８Ｐ／Ｈ２１９Ａ／Ｌ２２０Ｄ／Ｙ２２１Ｓ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｐ２８１Ｓ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１３Ｃ／Ｓ３１４Ｔ／Ｌ３１５Ｍ／Ｔ３１７Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ｋ３３６Ｒ／Ｌ３３７Ｉ／Ａ３４５Ｔ／Ｇ３５７Ｒ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｑ１１３Ｒ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｄ／Ｉ２１３Ｙ／Ｎ２１４Ｅ／Ｓ２１５Ｈ／Ｔ２１６Ｑ／Ｄ２１８Ｉ／Ｈ２１９Ｌ／Ｌ２２０Ｖ／Ｙ２２１Ｑ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｐ２８１Ｓ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１３Ｃ／Ｓ３１４Ｔ／Ｌ３１５Ｍ／Ｔ３１７Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ｋ３３６Ｒ／Ｌ３３７Ｉ／Ａ３４５Ｔ／Ｇ３５７Ｒ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｓ／Ｉ２１３Ｌ／Ｎ２１４Ｅ／Ｓ２１５Ｐ／Ｔ２１６Ｐ／Ｓ２１７Ｆ／Ｄ２１８Ｍ／Ｌ２２０Ｐ／Ｙ２２１Ｃ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１３Ｃ／Ｓ３１４Ｔ／Ｌ３１５Ｍ／Ｔ３１７Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ｋ３３６Ｒ／Ｌ３３７Ｉ／Ａ３４５Ｔ／Ｇ３５７Ｒ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ａ／Ｎ２１４Ｙ／Ｓ２１５Ａ／Ｔ２１６Ｒ／Ｓ２１７Ｔ／Ｄ２１８Ｇ／Ｈ２１９Ｒ／Ｌ２２０Ｍ／Ｙ２２１Ｎ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１３Ｃ／Ｓ３１４Ｔ／Ｌ３１５Ｍ／Ｔ３１７Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ｋ３３６Ｒ／Ｌ３３７Ｉ／Ａ３４５Ｔ／Ｇ３５７Ｒ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｎ／Ｉ２１３Ｍ／Ｎ２１４Ｓ／Ｔ２１６Ｙ／Ｓ２１７Ｒ／Ｄ２１８Ｇ／Ｈ２１９Ｃ／Ｌ２２０Ｓ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｐ２８１Ｓ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１３Ｃ／Ｓ３１４Ｔ／Ｌ３１５Ｍ／Ｔ３１７Ｓ／Ａ３１９Ｔ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ｋ３３６Ｒ／Ｌ３３７Ｉ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｄ／Ｉ２１３Ａ／Ｓ２１５Ｇ／Ｔ２１６Ｅ／Ｓ２１７Ｋ／Ｄ２１８Ｖ／Ｈ２１９Ｌ／Ｌ２２０Ｓ／Ｙ２２１Ｆ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｐ２８１Ｓ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１３Ｃ／Ｓ３１４Ｔ／Ｌ３１５Ｍ／Ｔ３１７Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ｋ３３６Ｒ／Ｌ３３７Ｉ／Ａ３４５Ｔ／Ｇ３５７Ｒ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｓ／Ｉ２１３Ｒ／Ｎ２１４Ｓ／Ｓ２１５Ｋ／Ｔ２１６Ｐ／Ｓ２１７Ｆ／Ｄ２１８Ｃ／Ｈ２１９Ｗ／Ｌ２２０Ｔ／Ｙ２２１Ｓ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；および
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｈ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｐ２８１Ｓ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１３Ｃ／Ｓ３１４Ｔ／Ｌ３１５Ｍ／Ｔ３１７Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ｋ３３６Ｒ／Ｌ３３７Ｉ／Ａ３４５Ｔ／Ｇ３５７Ｒ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ
に対応する置換の中から選択されるアミノ酸置換を含有する改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドをコードするものがある。
【００２４】
配列番号１２８〜２０２、２０４〜２８８、６９３〜７０１、７０４〜７１２、７１６〜７２２、７５４〜７７５および８００のいずれかに示される核酸の配列を有する核酸分子が、本明細書において提供される。また、配列番号１２８〜２０２、２０４〜２８８、６９３〜７０１、７０４〜７１２、７１６〜７２２、７５４〜７７５および８００のいずれかに示される核酸の配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸の配列を有する核酸分子が、本明細書において提供される。また、配列番号１２８〜２０２、２０４〜２８８、６９３〜７０１、７０４〜７１２、７１６〜７２２、７５４〜７７５および８００のいずれかに示される核酸の配列に縮重である核酸の配列を有する核酸分子も本明細書において提供される。例えば、核酸分子は、配列番号１２８〜２０２、２０４〜２８８、６９３〜７０１、７０４〜７１２、７１６〜７２２、７５４〜７７５および８００のいずれかに示される核酸の配列を有する。
【００２５】
配列番号３〜６６、６８〜１２７、７２３〜７３１、７３４〜７４２、７４６〜７５１、８１０〜８３２および８５７のいずれかに示されるアミノ酸の配列を有する改変されたバレンセンシンターゼをコードする核酸分子が、本明細書において提供される。また、配列番号３〜６６、６８〜１２７、７２３〜７３１、７３４〜７４２、７４６〜７５１、８１０〜８３２および８５７のいずれかに示されるアミノ酸の配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を有する改変されたバレンセンシンターゼをコードする核酸分子も、本明細書において提供される。例えば、核酸分子は、配列番号３〜６６、６８〜１２７、７２３〜７３１、７３４〜７４２、７４６〜７５１、８１０〜８３２および８５７のいずれかに示されるアミノ酸の配列を有する改変されたバレンセンシンターゼをコードする。
【００２６】
また、１種または複数のテルペンシンターゼに由来する１種または複数の異種ドメインまたはその一部を含有する改変バレンセンポリペプチドをコードする核酸分子も、本明細書において提供され、ここで、ドメインは、不定形ループ（ｕｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  ｌｏｏｐ）１、αヘリックス１、不定形ループ２、αヘリックス２、不定形ループ３、αヘリックス３、不定形ループ４、αヘリックス４、不定形ループ５、αヘリックス５、不定形ループ６、αヘリックス６、不定形ループ７、αヘリックス７、不定形ループ８、αヘリックス８、不定形ループ９、αヘリックスＡ、Ａ−Ｃループ、αヘリックスＣ、不定形ループ１１、αヘリックスＤ、不定形ループ１２、αヘリックスＤ１、不定形ループ１３、αヘリックスＤ２、不定形ループ１４、αヘリックスＥ、不定形ループ１５、αヘリックスＦ、不定形ループ１６、αヘリックスＧ１、不定形ループ１７、αヘリックスＧ２、不定形ループ１８、αヘリックスＨ１、不定形ループ１９、αヘリックスＨ２、不定形ループ２０、αヘリックスＨ３、不定形ループ２１、αヘリックスａ−１、不定形ループ２２、αヘリックスＩ、不定形ループ２３、αヘリックスＪ、Ｊ−Ｋループ、αヘリックスＫおよび／または不定形ループ２５である。
【００２７】
また、１種または複数のテルペンシンターゼに由来する１種または複数の異種ドメインまたはその一部を含有する改変バレンセンポリペプチドをコードする核酸分子も、本明細書において提供される。例えば、１種または複数の異種ドメインは、不定形ループ１、αヘリックス１、不定形ループ２、αヘリックス２、不定形ループ３、αヘリックス３、不定形ループ４、αヘリックス４、不定形ループ５、αヘリックス５、不定形ループ６、αヘリックス６、不定形ループ７、αヘリックス７、不定形ループ８、αヘリックス８、不定形ループ９、αヘリックスＡ、Ａ−Ｃループ、αヘリックスＣ、不定形ループ１１、αヘリックスＤ、不定形ループ１２、αヘリックスＤ１、不定形ループ１３、αヘリックスＤ２、不定形ループ１４、αヘリックスＥ、不定形ループ１５、αヘリックスＦ、不定形ループ１６、αヘリックスＧ１、不定形ループ１７、αヘリックスＧ２、不定形ループ１８、αヘリックスＨ１、不定形ループ１９、αヘリックスＨ２、不定形ループ２０、αヘリックスＨ３、不定形ループ２１、αヘリックスａ−１、不定形ループ２２、αヘリックスＩ、不定形ループ２３、αヘリックスＪ、Ｊ−Ｋループ、αヘリックスＫおよび／または不定形ループ２５の中から選択され得る。一部の例では、異種ドメインまたはその連続する部分は、異種ドメインを含有しないバレンセンシンターゼの対応する天然ドメインのすべてまたは連続する部分を置換する。その他の例では、コードされる改変されたバレンセンシンターゼは、異なるテルペンシンターゼの異種ドメインのすべてを含有する。また、１種または複数のテルペンシンターゼに由来する異種ドメインの連続するアミノ酸の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％を含有する改変バレンセンポリペプチドをコードする核酸分子も、本明細書において提供される。
【００２８】
一実施形態では、核酸分子によってコードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、不定形ループ２ドメインのすべてまたは連続する部分である異種ドメインを含有する。例えば、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドのアミノ酸残基５３〜５８に対応する天然不定形ループ２ドメインが、異なるテルペンシンターゼに由来する対応する領域のすべてまたはその一部で置換されている異種不定形ループ２ドメインまたはその連続する部分を含有する。別の実施形態では、核酸分子によってコードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、αヘリックス３ドメインのすべてまたは連続する部分である異種ドメインを含有する。例えば、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドのアミノ酸残基７９〜９３に対応する天然αヘリックス３ドメインが、異なるテルペンシンターゼに由来する対応する領域のすべてまたはその一部で置換されている異種αヘリックス３ドメインまたはその連続する部分を含有する。さらなる実施形態では、核酸分子によってコードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、不定形ループ５ドメインのすべてまたはその連続する部分である異種ドメインを含有する。例えば、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドのアミノ酸残基１１５〜１４１に対応する天然不定形ループ５ドメインが、異なるテルペンシンターゼに由来する対応する領域のすべてまたはその一部で置換されている不定形ループ５ドメインまたはその連続する部分を含有する。
【００２９】
さらに別の実施形態では、核酸分子によってコードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、不定形ループ６ドメインのすべてまたはその連続する部分である異種ドメインを含有する。例えば、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドのアミノ酸残基１５３〜１６２に対応する天然不定形ループ６ドメインが、異なるテルペンシンターゼに由来する対応する領域のすべてまたはその一部で置換されている異種不定形ループ６ドメインまたはその連続する部分を含有する。一実施形態では、核酸分子によってコードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、不定形ループ７ドメインのすべてまたはその連続する部分である異種ドメインを含有する。例えば、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドのアミノ酸残基１７４〜１８４に対応する天然不定形ループ７ドメインが、異なるテルペンシンターゼに由来する対応する領域のすべてまたはその一部で置換されている異種不定形ループ７ドメインまたはその連続する部分を含有する。
【００３０】
別の実施形態では、核酸分子によってコードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、不定形ループ９ドメインのすべてまたはその連続する部分である異種ドメインを含有する。例えば、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドのアミノ酸残基２１３〜２２２に対応する天然不定形ループ９ドメインが、異なるテルペンシンターゼに由来する対応する領域のすべてまたはその一部で置換されている異種不定形ループ９ドメインまたはその連続する部分を含有する。別の実施形態では、核酸分子によってコードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、αヘリックスＤ１ドメインのすべてまたはその連続する部分である異種ドメインを含有する。例えば、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドのアミノ酸残基３１０〜３２２に対応する天然αヘリックスＤ１ドメインが、異なるテルペンシンターゼに由来する対応する領域のすべてまたはその一部で置換されている異種αヘリックスＤ１ドメインまたはその連続する部分を含有する。
【００３１】
さらに別の実施形態では、核酸分子によってコードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、Ｊ−Ｋループドメインのすべてまたはその連続する部分である異種ドメインを含有する。例えば、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドのアミノ酸残基５２２〜５３４に対応する天然Ｊ−Ｋループドメインが、異なるテルペンシンターゼに由来する対応する領域のすべてまたはその一部で置換されている異種Ｊ−Ｋループドメインまたはその連続する部分を含有する。別の実施形態では、核酸分子によってコードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、不定形ループ１ドメインのすべてまたはその連続する部分である異種ドメインを含有する。例えば、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドのアミノ酸残基１〜２９に対応する天然不定形ループ１ドメインが、異なるテルペンシンターゼに由来する対応する領域のすべてまたはその一部で置換されている異種不定形ループ１ドメインまたはその連続する部分を含有する。
【００３２】
さらに別の実施形態では、核酸分子によってコードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、αヘリックス１ドメインのすべてまたはその連続する部分である異種ドメインを含有する。例えば、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基３０〜３９および４４〜５２に対応する天然αヘリックス１ドメインが、異なるテルペンシンターゼに由来する対応する領域のすべてまたはその連続する部分で置換されている異種αヘリックス１ドメインまたはその連続する部分を含有する。さらなる実施形態では、核酸分子によってコードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、不定形ループ４ドメインのすべてまたはその連続する部分である異種ドメインを含有する。例えば、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基９４〜１００に対応する天然不定形ループ４ドメインが、異なるテルペンシンターゼに由来する対応する領域のすべてまたはその連続する部分で置換されている異種不定形ループ４ドメインまたはその連続する部分を含有する。
【００３３】
１種または複数のテルペンシンターゼに由来する１種または複数の異種ドメインまたはその一部を含有する改変バレンセンポリペプチドをコードする核酸分子が、本明細書において提供され、ここで、異なるテルペンシンターゼは、表５Ｂに示されるテルペンシンターゼである。一例では、異なるテルペンシンターゼは、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）バレンセンシンターゼ、タバコエピアリストロチェンシンターゼ（ＴＥＡＳ）およびヒオシアムス・ムチクス（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ  ｍｕｔｉｃｕｓ）プレムナスピロジエンシンターゼ（ＨＰＳ）の中から選択される。
【００３４】
一実施形態では、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドの位置５３〜５８に対応するアミノ酸残基が、配列番号２９５または９４１に示されるＴＥＡＳポリペプチドのアミノ酸残基５８〜６３で置換されている異種不定形ループ２ドメインまたはその連続する部分を有する。別の実施形態では、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドの位置８５〜８９に対応するアミノ酸残基が、配列番号９４２に示されるＨＰＳポリペプチドのアミノ酸残基９３〜９７で置換されている、異種αヘリックス３ドメインまたはその連続する部分および異種不定形ループ４ドメインまたはその連続する部分を含む。さらに別の実施形態では、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドの位置８５〜９９に対応するアミノ酸残基が、配列番号３４６に示されるブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）バレンセンシンターゼのアミノ酸残基９６〜１１２で置換されている、異種αヘリックス３ドメインまたはその連続する部分および異種不定形ループ４ドメインまたはその連続する部分を含有する。さらなる実施形態では、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、バレンセンシンターゼポリペプチドの位置１１５〜１４６に対応する位置のアミノ酸残基が、配列番号３４６に示されるブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）バレンセンシンターゼのアミノ酸残基１２８〜１２９で置換されている、異種不定形ループ５ドメインまたはその連続する部分を含有する。
【００３５】
さらなる実施形態では、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドの位置１７４〜１８４に対応する位置のアミノ酸残基が、配列番号９４２に示されるＨＰＳポリペプチドのアミノ酸残基１８５〜１９３で置換されている、異種不定形ループ７ドメインまたはその連続する部分を含む。別の実施形態では、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドの位置２１２〜２２１に対応する位置のアミノ酸残基が、配列番号９４２に示されるＨＰＳポリペプチドのアミノ酸残基２２１〜２２８で置換されている、異種ループ９ドメインまたはその連続する部分を含む。さらに別の実施形態では、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドの位置２１２〜２２１に対応する位置のアミノ酸残基が、配列番号２９５に示されるＴＥＡＳポリペプチドのアミノ酸残基２１３〜２２１で置換されている、異種ループ９ドメインまたはその連続する部分を含む。
【００３６】
一実施形態では、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドの位置２１２〜２２１に対応する位置のアミノ酸残基が、配列番号３４６に示されるブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）バレンセンシンターゼのアミノ酸残基２２３〜２３０で置換されている、異種不定形ループ９ドメインまたはその連続する部分を含む。その他の実施形態では、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドの位置３〜４１に対応する位置のアミノ酸残基が、配列番号３４６に示されるブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）バレンセンシンターゼのアミノ酸残基３〜５１で置換されている、異種不定形ループ１ドメインまたはその連続する部分および異種αヘリックス１ドメインまたはその連続する部分を含む。さらに別の実施形態では、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドの位置１５２〜１６３に対応する位置のアミノ酸残基が、配列番号９４２に示されるＨＰＳポリペプチドのアミノ酸残基１６３〜１７４で置換されている、異種不定形ループ６ドメインまたはその連続する部分を含む。
【００３７】
一実施形態では、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドの位置３１０〜３２２に対応する位置のアミノ酸残基が、配列番号９４２に示されるＨＰＳポリペプチドのアミノ酸残基３１７〜３２９で置換されている、異種αヘリックスＤ１ドメインまたはその連続する部分を含む。別の実施形態では、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドの位置５２２〜５３４に対応する位置のアミノ酸残基が、配列番号９４２に示されるＨＰＳポリペプチドのアミノ酸残基５２７〜５４１で置換されている、異種Ｊ−Ｋループドメインまたはその連続する部分を含む。
【００３８】
本明細書において提供される核酸分子の中に、
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｔ／Ｅ５６Ｇ／Ｄ５７Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｔ／Ｅ５６Ｇ／Ｄ５７Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｐ２８１Ｓ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１３Ｃ／Ｓ３１４Ｔ／Ｌ３１５Ｍ／Ｔ３１７Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ｋ３３６Ｒ／Ｌ３３７Ｉ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３４７Ｌ／Ｇ３５７Ｒ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｔ／Ｅ５６Ｇ／Ｄ５７Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｐ２８１Ｓ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１３Ｃ／Ｓ３１４Ｔ／Ｌ３１５Ｍ／Ｔ３１７Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ｋ３３６Ｒ／Ｌ３３７Ｉ／Ａ３４５Ｔ／Ｇ３５７Ｒ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／
Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１７６／Ｄ１７９→Ｐ１７７／Ｖ１８１→Ｌ１７９／
Ｔ１８２→Ｋ１８０／Ｐ１８３→Ｓ１８１／Ｋ１８４→Ｐ１８２／Ｆ２０９→Ｉ２０７／Ｍ２１２→Ｒ２１０／Ｎ２１４→Ｄ２１２／Ｈ２１９→Ｄ２１７／Ｙ２２１→Ｖ２１９／Ｅ２３８→Ｄ２３６／Ｋ２５２→Ｑ２５０／Ｐ２８１→Ｓ２７９／Ｑ２９２→Ｋ２９０／Ｌ３１３→Ｃ３１１／Ｓ３１４→Ｔ３１２／Ｌ３１５→Ｍ３１３／Ｔ３１７→Ｓ３１５／Ｑ３２１→Ａ３１９／Ｅ３３３→Ｄ３３１／Ｋ３３６→Ｒ３３４／Ｌ３３７→Ｉ３３５／Ａ３４５→Ｔ３４３／Ｇ３５７→Ｒ３５５／Ｎ３６９→Ｉ３６７／Ｓ３７７→Ｙ３７５／Ｔ４０５→Ｒ４０３／Ｎ４２９→Ｇ４２７／Ａ４３６→Ｓ４３４／Ｔ５０１→Ｐ４９９／Ｄ５３６→Ｅ５３４；
Ｓ２Ｒ／Ｓ３Ｄ／Ｇ４Ｋ／Ｅ５Ｇ／Ｆ７Ｃ／Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１７６／Ｄ１７９→Ｐ１７７／
Ｖ１８１→Ｌ１７９／Ｔ１８２→Ｋ１８０／Ｐ１８３→Ｓ１８１／Ｋ１８４→Ｐ１８２／Ｆ２０９→Ｉ２０７／Ｍ２１２→Ｒ２１０／Ｎ２１４→Ｄ２１２／Ｈ２１９→Ｄ２１７／Ｙ２２１→Ｖ２１９／Ｅ２３８→Ｄ２３６／Ｋ２５２→Ｑ２５０／Ｐ２８１→Ｓ２７９／Ｑ２９２→Ｋ２９０／Ｌ３１３→Ｃ３１１／Ｓ３１４→Ｔ３１２／Ｌ３１５→Ｍ３１３／Ｔ３１７→Ｓ３１５／Ｑ３２１→Ａ３１９／Ｅ３３３→Ｄ３３１／Ｋ３３６→Ｒ３３４／Ｌ３３７→Ｉ３３５／Ａ３４５→Ｔ３４３／Ｇ３５７→Ｒ３５５／Ｎ３６９→Ｉ３６７／Ｓ３７７→Ｙ３７５／Ｔ４０５→Ｒ４０３／Ｎ４２９→Ｇ４２７／Ａ４３６→Ｓ４３４／Ｅ４８４→Ｄ４８２／Ｔ５０１→Ｐ４９９／Ｄ５３６→Ｅ５３４；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｔ／Ｅ５６Ｇ／Ｄ５７Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ａ８５Ｍ／Ｉ８６Ｌ／Ｑ８７Ｄ／Ｋ８８Ｈ／Ｌ８９Ｉ／Ｃ９０Ｙ／−−−→Ｒ９１／−−−→Ａ９２／−−−→Ｄ９３／Ｉ９２→Ｙ９５／Ｙ９３→Ｆ９６／Ｉ９４→Ｅ９７／
Ｄ９５→Ａ９８／Ｓ９６→Ｈ９９／Ｎ９７→Ｅ１００／Ｒ９８→Ｙ１０１／Ａ９９→Ｎ１０２／Ｌ１１１→Ｓ１１４／Ｋ１２５→Ｑ１２８／Ｋ１７３→Ｑ１７６／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１７９／Ｄ１７９→Ｐ１８０／
Ｖ１８１→Ｌ１８２／Ｔ１８２→Ｋ１８３／Ｐ１８３→Ｓ１８４／Ｋ１８４→Ｐ１８５／Ｆ２０９→Ｉ２１０／Ｍ２１２→Ｒ２１３／Ｎ２１４→Ｄ２１５／Ｈ２１９→Ｄ２２０／Ｙ２２１→Ｖ２２２／Ｅ２３８→Ｄ２３９／Ｋ２５２→Ｑ２５３／Ｐ２８１→Ｓ２８２／Ｑ２９２→Ｋ２９３／Ｌ３１３→Ｃ３１４／Ｓ３１４→Ｔ３１５／Ｌ３１５→Ｍ３１６／Ｔ３１７→Ｓ３１８／Ｑ３２１→Ａ３２２／Ｅ３３３→Ｄ３３４／Ｋ３３６→Ｒ３３７／Ｌ３３７→Ｉ３３８／Ａ３４５→Ｔ３４６／Ｇ３５７→Ｒ３５８／Ｎ３６９→Ｉ３７０／Ｓ３７７→Ｙ３７８／Ｔ４０５→Ｒ４０６／Ｎ４２９→Ｇ４３０／Ａ４３６→Ｓ４３７／Ｅ４８４→Ｄ４８５／Ｔ５０１→Ｐ５０２／Ｄ５３６→Ｅ５３７；
Ｒ１９Ｋ／Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｔ／Ｅ５６Ｇ／Ｄ５７Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ａ８５Ｍ／Ｉ８６Ｌ／Ｑ８７Ｄ／Ｋ８８Ｈ／Ｌ８９Ｉ／Ｃ９０Ｙ／−−−→Ｒ９１／−−−→Ａ９２／−−−→Ｄ９３／Ｉ９２→Ｙ９５／Ｙ９３→Ｆ９６／
Ｉ９４→Ｅ９７／Ｄ９５→Ａ９８／Ｓ９６→Ｈ９９／Ｎ９７→Ｅ１００／Ｒ９８→Ｙ１０１／Ａ９９→Ｎ１０２／Ｋ１２５→Ｑ１２８／Ｋ１７３→Ｑ１７６／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１７９／Ｄ１７９→Ｐ１８０／
Ｖ１８１→Ｌ１８２／Ｔ１８２→Ｋ１８３／Ｐ１８３→Ｓ１８４／Ｋ１８４→Ｐ１８５／Ｆ２０９→Ｉ２１０／Ｍ２１２→Ｒ２１３／Ｎ２１４→Ｄ２１５／Ｈ２１９→Ｄ２２０／Ｙ２２１→Ｖ２２２／Ｅ２３８→Ｄ２３９／Ｋ２５２→Ｑ２５３／Ｐ２８１→Ｓ２８２／Ｑ２９２→Ｋ２９３／Ｌ３１３→Ｃ３１４／Ｓ３１４→Ｔ３１５／Ｌ３１５→Ｍ３１６／Ｔ３１７→Ｓ３１８／Ｑ３２１→Ａ３２２／Ｅ３３３→Ｄ３３４／Ｋ３３６→Ｒ３３７／Ｌ３３７→Ｉ３３８／Ａ３４５→Ｔ３４６／Ｇ３５７→Ｒ３５８／Ｎ３６９→Ｉ３７０／Ｓ３７７→Ｙ３７８／Ｔ４０５→Ｒ４０６／Ｎ４２９→Ｇ４３０／Ａ４３６→Ｓ４３７／Ｅ４８４→Ｄ４８５／Ｔ５０１→Ｐ５０２／Ｄ５３６→Ｅ５３７；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｔ／Ｅ５６Ｇ／Ｄ５７Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ａ８５Ｍ／Ｉ８６Ｌ／Ｑ８７Ｄ／Ｋ８８Ｈ／Ｌ８９Ｉ／Ｃ９０Ｙ／−−−→Ｒ９１／−−−→Ａ９２／−−−→Ｄ９３／Ｉ９２→Ｙ９５／Ｙ９３→Ｆ９６／Ｉ９４→Ｅ９７／Ｄ９５→Ａ９８／Ｓ９６→Ｈ９９／Ｎ９７→Ｅ１００／Ｒ９８→Ｙ１０１／Ａ９９→Ｎ１０２／Ｋ１２５→Ｑ１２８／Ｋ１７３→Ｑ１７６／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１７９／Ｄ１７９→Ｐ１８０／Ｖ１８１→Ｌ１８２／Ｔ１８２→Ｋ１８３／Ｐ１８３→Ｓ１８４／Ｋ１８４→Ｐ１８５／Ｆ２０９→Ｉ２１０／Ｍ２１２→Ｒ２１３／Ｎ２１４→Ｄ２１５／Ｈ２１９→Ｄ２２０／Ｙ２２１→Ｖ２２２／Ｅ２３８→Ｄ２３９／Ｋ２５２→Ｑ２５３／Ｐ２８１→Ｓ２８２／Ｑ２９２→Ｋ２９３／Ｌ３１３→Ｃ３１４／Ｓ３１４→Ｔ３１５／Ｌ３１５→Ｍ３１６／Ｔ３１７→Ｓ３１８／Ｑ３２１→Ａ３２２／Ｅ３３３→Ｄ３３４／Ｋ３３６→Ｒ３３７／Ｌ３３７→Ｉ３３８／Ａ３４５→Ｔ３４６／Ｇ３５７→Ｒ３５８／Ｎ３６９→Ｉ３７０／Ｓ３７７→Ｙ３７８／Ｔ４０５→Ｒ４０６／Ｎ４２９→Ｇ４３０／Ａ４３６→Ｓ４３７／Ｅ４８４→Ｄ４８５／Ｔ５０１→Ｐ５０２／Ｄ５３６→Ｅ５３７；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｉ／Ｉ２１３Ｙ／Ｎ２１４Ｅ／Ｓ２１５→−−−／Ｔ２１６→−−−／Ｓ２１７→Ｅ２１５／Ｄ２１８→Ｅ２１６／Ｈ２１９→Ｇ２１７／Ｌ２２０→Ｆ２１８／Ｙ２２１→Ｋ２１９／Ｅ２３８→Ｄ２３６／Ｋ２５２→Ｑ２５０／Ｐ２８１→Ｓ２７９／Ｑ２９２→Ｋ２９０／Ｌ３１３→Ｃ３１１／Ｓ３１４→Ｔ３１２／Ｌ３１５→Ｍ３１３／Ｔ３１７→Ｓ３１５／Ｑ３２１→Ａ３１９／Ｅ３３３→Ｄ３３１／Ｋ３３６→Ｒ３３４／Ｌ３３７→Ｉ３３５／Ａ３４５→Ｔ３４３／Ｇ３５７→Ｒ３５５／Ｎ３６９→Ｉ３６７／Ｓ３７７→Ｙ３７５／Ｔ４０５→Ｒ４０３／Ｎ４２９→Ｇ４２７／Ａ４３６→Ｓ４３４／Ｔ５０１→Ｐ４９９／Ｄ５３６→Ｅ５３４；
Ｒ１９Ｋ／Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｔ／Ｅ５６Ｇ／Ｄ５７Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ａ８５Ｍ／Ｉ８６Ｌ／Ｑ８７Ｄ／
Ｋ８８Ｈ／Ｌ８９Ｉ／Ｃ９０Ｙ／−−−→Ｒ９１／−−−→Ａ９２／−−−→Ｄ９３／Ｉ９２→Ｙ９５／Ｙ９３→Ｆ９６／
Ｉ９４→Ｅ９７／Ｄ９５→Ａ９８／Ｓ９６→Ｈ９９／Ｎ９７→Ｅ１００／Ｒ９８→Ｙ１０１／Ａ９９→Ｎ１０２／Ｋ１２５→Ｑ１２８／Ｋ１７３→Ｑ１７６／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１７９／Ｄ１７９→Ｐ１８０／Ｖ１８１→Ｌ１８２／
Ｔ１８２→Ｋ１８３／Ｐ１８３→Ｓ１８４／Ｋ１８４→Ｐ１８５／Ｆ２０９→Ｉ２１０／Ｍ２１２→Ｓ２１３／Ｎ２１４→Ｙ２１５／Ｓ２１５→Ｄ２１６／Ｔ２１６→Ｋ２１７／Ｓ２１７−−／Ｄ２１８Ｅ／Ｈ２１９Ｑ／Ｌ２２０Ｓ／Ｙ２２１Ｋ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｐ２８１Ｓ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１３Ｃ／Ｓ３１４Ｔ／Ｌ３１５Ｍ／Ｔ３１７Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ｋ３３６Ｒ／Ｌ３３７Ｉ／Ａ３４５Ｔ／Ｇ３５７Ｒ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｅ４８４Ｄ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６ＥＲ１９Ｋ／Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｔ／Ｅ５６Ｇ／Ｄ５７Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ａ８５Ｍ／Ｉ８６Ｌ／Ｑ８７Ｄ／Ｋ８８Ｈ／Ｌ８９Ｉ／Ｃ９０Ｙ／−−−→Ｒ９１／−−−→Ａ９２／−−−→Ｄ９３／Ｉ９２→Ｙ９５／Ｙ９３→Ｆ９６／Ｉ９４→Ｅ９７／Ｄ９５→Ａ９８／
Ｓ９６→Ｈ９９／Ｎ９７→Ｅ１００／Ｒ９８→Ｙ１０１／Ａ９９→Ｎ１０２／Ｋ１２５→Ｑ１２８／Ｋ１７３→Ｑ１７６／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１７９／Ｄ１７９→Ｐ１８０／Ｖ１８１→Ｌ１８２／Ｔ１８２→Ｋ１８３／Ｐ１８３→Ｓ１８４／Ｋ１８４→Ｐ１８５／Ｆ２０９→Ｉ２１０／Ｍ２１２→Ｓ２１３／Ｎ２１４→Ｙ２１５／Ｓ２１５→Ｄ２１６／Ｔ２１６→Ｋ２１７／Ｓ２１７−−／Ｄ２１８Ｅ／Ｈ２１９Ｑ／Ｌ２２０Ｓ／Ｙ２２１Ｋ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｐ２８１Ｓ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１３Ｃ／Ｓ３１４Ｔ／Ｌ３１５Ｍ／Ｔ３１７Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｉ３２５Ｔ／Ｅ３３３Ｄ／Ｋ３３６Ｒ／Ｌ３３７Ｉ／Ａ３４５Ｔ／Ｇ３５７Ｒ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｅ４８４Ｄ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｒ１９Ｋ／Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｔ／Ｅ５６Ｇ／Ｄ５７Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ａ８５Ｍ／Ｉ８６Ｌ／Ｑ８７Ｄ／Ｋ８８Ｈ／Ｌ８９Ｉ／Ｃ９０Ｙ／−−→Ｒ９１／−−→Ａ９２／−−→Ｄ９３／Ｉ９２→Ｙ９５／Ｙ９３→Ｆ９６／Ｉ９４→Ｅ９７／Ｄ９５→Ａ９８／Ｓ９６→Ｈ９９／Ｎ９７→Ｅ１００／Ｒ９８→Ｙ１０１／Ａ９９→Ｎ１０２／Ｋ１２５→Ｑ１２８／Ｋ１７３→Ｑ１７６／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１７９／Ｄ１７９→Ｐ１８０／Ｖ１８１→Ｌ１８２／Ｔ１８２→Ｋ１８３／Ｐ１８３→Ｓ１８４／Ｋ１８４→Ｐ１８５／Ｆ２０９→Ｉ２１０／Ｍ２１２→Ｖ２１３／Ｉ２１３→Ｙ２１４／Ｎ２１４→−−／Ｓ２１５→−−／Ｔ２１６→Ｑ２１５／Ｓ２１７→Ｄ２１６／Ｄ２１８→Ｅ２１７／Ｈ２１９→Ａ２１８／Ｌ２２０→Ｆ２１９／Ｙ２２１→Ｈ２２０／Ｅ２３８→Ｄ２３７／Ｋ２５２→Ｑ２５１／Ｐ２８１→Ｓ２８０／Ｑ２９２→Ｋ２９１／Ｌ３１３→Ｃ３１２／Ｓ３１４→Ｔ３１３／Ｌ３１５→Ｍ３１４／Ｔ３１７→Ｓ３１６／Ｑ３２１→Ａ３２０／Ｅ３３３→Ｄ３３２／Ｋ３３６→Ｒ３３５／Ｌ３３７→Ｉ３３６／Ａ３４５→Ｔ３４４／Ｇ３５７→Ｒ３５６／Ｎ３６９→Ｉ３６８／Ｓ３７７→Ｙ３７６／Ｔ４０５→Ｒ４０４／Ｎ４２９→Ｇ４２８／Ａ４３６→Ｓ４３５／Ｅ４８４→Ｄ４８３／Ｔ５０１→Ｐ５００／Ｄ５３６→Ｅ５３５／
Ｒ１９Ｋ／Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｔ／Ｅ５６Ｇ／Ｄ５７Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ａ８５Ｍ／Ｉ８６Ｌ／Ｑ８７Ｄ／Ｋ８８Ｈ／Ｌ８９Ｉ／Ｃ９０Ｙ／−−−→Ｒ９１／−−−→Ａ９２／−−−→Ｄ９３／Ｉ９２→Ｙ９５／Ｙ９３→Ｆ９６／
Ｉ９４→Ｅ９７／Ｄ９５→Ａ９８／Ｓ９６→Ｈ９９／Ｎ９７→Ｅ１００／Ｒ９８→Ｙ１０１／Ａ９９→Ｎ１０２／Ｋ１２５→Ｑ１２８／Ｋ１７３→Ｑ１７６／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１７９／Ｄ１７９→Ｐ１８０／Ｖ１８１→Ｌ１８２／Ｔ１８２→Ｋ１８３／Ｐ１８３→Ｓ１８４／Ｋ１８４→Ｐ１８５／Ｆ２０９→Ｉ２１０／Ｍ２１２→Ｙ２１３／Ｉ２１３→Ｓ２１４／Ｎ２１４→Ｐ２１５／Ｓ２１５→Ｎ２１６／Ｔ２１６→Ｖ２１７／Ｓ２１７→Ｉ２１８／Ｈ２１９→Ｌ２２０／Ｌ２２０→Ａ２２１／Ｙ２２１→Ｐ２２２／Ｅ２３８→Ｄ２３９／Ｋ２５２→Ｑ２５３／Ｑ２９２→Ｋ２９３／Ｑ３２１→Ａ３２２／Ｅ３３３→Ｄ３３４／Ａ３４５→Ｔ３４６／Ｎ３６９→Ｉ３７０／Ｓ３７７→Ｙ３７８／Ｔ４０５→Ｒ４０６／Ｎ４２９→Ｇ４３０／Ａ４３６→Ｓ４３７／Ｔ５０１→Ｐ５０２／Ｄ５３６→Ｅ５３７；
Ｒ１９Ｋ／Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｔ／Ｅ５６Ｇ／Ｄ５７Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ａ８５Ｍ／Ｉ８６Ｌ／Ｑ８７Ｄ／Ｋ８８Ｈ／Ｌ８９Ｉ／Ｃ９０Ｙ／−−−→Ｒ９１／−−−→Ａ９２／−−−→Ｄ９３／Ｉ９２→Ｙ９５／Ｙ９３→Ｆ９６／Ｉ９４→Ｅ９７／Ｄ９５→Ａ９８／Ｓ９６→Ｈ９９／Ｎ９７→Ｅ１００／Ｒ９８→Ｙ１０１／Ａ９９→Ｎ１０２／Ｋ１２５→Ｑ１２８／Ｋ１７３→Ｑ１７６／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１７９／Ｄ１７９→Ｐ１８０／Ｖ１８１→Ｌ１８２／Ｔ１８２→Ｋ１８３／Ｐ１８３→Ｓ１８４／Ｋ１８４→Ｐ１８５／Ｆ２０９→Ｉ２１０／Ｍ２１２→Ｋ２１３／Ｉ２１３→Ｐ２１４／Ｎ２１４→Ｖ２１５／Ｓ２１５→Ｔ２１６／Ｔ２１６→Ｒ２１７／Ｄ２１８→Ｌ２１９／Ｈ２１９→Ｓ２２０／Ｌ２２０→Ａ２２１／Ｙ２２１→Ｌ２２２／Ｅ２３８→Ｄ２３９／Ｋ２５２→Ｑ２５３／Ｑ２９２→Ｋ２９３／Ｖ３２０→Ａ３２１／Ｑ３２１→Ａ３２２／Ｅ３３３→Ｄ３３４／Ａ３４５→Ｔ３４６／Ｎ３６９→Ｉ３７０／Ｓ３７７→Ｙ３７８／Ｔ４０５→Ｒ４０６／Ｎ４２９→Ｇ４３０／Ａ４３６→Ｓ４３７／Ｔ５０１→Ｐ５０２／Ｄ５３６→Ｅ５３７；
Ｒ１９Ｋ／Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｔ／Ｅ５６Ｇ／Ｄ５７Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ａ８５Ｍ／Ｉ８６Ｌ／Ｑ８７Ｄ／Ｋ８８Ｈ／Ｌ８９Ｉ／Ｃ９０Ｙ／−−−→Ｒ９１／−−−→Ａ９２／−−−→Ｄ９３／Ｉ９２→Ｙ９５／Ｙ９３→Ｆ９６／Ｉ９４→Ｅ９７／Ｄ９５→Ａ９８／Ｓ９６→Ｈ９９／Ｎ９７→Ｅ１００／Ｒ９８→Ｙ１０１／Ａ９９→Ｎ１０２／Ｋ１２５→Ｑ１２８／Ｋ１７３→Ｑ１７６／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１７９／Ｄ１７９→Ｐ１８０／Ｖ１８１→Ｌ１８２／Ｔ１８２→Ｋ１８３／Ｐ１８３→Ｓ１８４／Ｋ１８４→Ｐ１８５／Ｆ２０９→Ｉ２１０／Ｉ２１３→Ｑ２１４／Ｎ２１４→Ｈ２１５／Ｓ２１５→Ｌ２１６／Ｔ２１６→Ｃ２１７／Ｓ２１７→Ｆ２１８／Ｄ２１８→Ｓ２１９／Ｈ２１９→Ｒ２２０／Ｌ２２０→Ｈ２２１／Ｙ２２１→Ｋ２２２／Ｅ２３８→Ｄ２３９／Ｋ２５２→Ｑ２５３／Ｑ２９２→Ｋ２９３／Ｑ３２１→Ａ３２２／Ｅ３３３→Ｄ３３４／Ａ３４５→Ｔ３４６／Ｎ３６９→Ｉ３７０／Ｓ３７７→Ｙ３７８／Ｔ４０５→Ｒ４０６／Ｎ４２９→Ｇ４３０／Ａ４３６→Ｓ４３７／Ｔ５０１→Ｐ５０２／Ｄ５３６→Ｅ５３７；
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Ｓ３Ｔ／Ｇ４Ｑ／Ｅ５Ｖ／−−−→Ｓ６／−−−→Ａ７／−−−→Ｓ８／−−−→Ｓ９／−−−→Ｌ１０／−−−→Ａ１１／−−−→Ｑ１２／−−−→Ｉ１３／−−−→Ｐ１４／−−−→Ｑ１５／−−−→Ｐ１６／Ｔ６→Ｋ１７／Ｆ７→Ｎ１８／Ｔ１０→Ｖ２１／Ｄ１２→Ｎ２３／Ｓ１６→Ｎ２７／Ｌ１７→Ｉ２８／Ｒ１９→Ｇ３０／Ｎ２０→Ｄ３１／Ｈ２１→Ｑ３２／Ｌ２３→Ｉ３４／Ｋ２４→Ｔ３５／Ｇ２５→Ｙ３６／Ａ２６→Ｔ３７／Ｓ２７→Ｐ３８／Ｄ２８→Ｅ３９／Ｆ２９→Ｄ４０／Ｔ３１→−−−／Ｄ３３→Ｔ４３／Ｈ３４→Ｒ４４／Ｔ３５→Ａ４５／Ａ３６→Ｃ４６／Ｔ３７→Ｋ４７／Ｑ３８→Ｅ４８／Ｒ４０→Ｑ５０／Ｈ４１→Ｉ５１／Ｔ５３→Ｌ６３／Ｄ５４→Ａ６４／Ａ５５→Ｔ６５／Ｅ５６→Ｇ６６／Ｄ５７→Ｒ６７／Ｖ６０→Ｉ７０／Ａ８５→Ｍ９５／Ｉ８６→Ｌ９６／Ｑ８７→Ｄ９７／Ｋ８８→Ｈ９８／Ｌ８９→Ｉ９９／Ｃ９０→Ｙ１００／−−−→Ｒ１０１／−−−→Ａ１０２／−−−→Ｄ１０３／Ｉ９２→Ｙ１０５／Ｙ９３→Ｆ１０６／Ｉ９４→Ｅ１０７／Ｄ９５→Ａ１０８／Ｓ９６→Ｈ１０９／Ｎ９７→Ｅ１１０／Ｒ９８→Ｙ１１１／Ａ９９→Ｎ１１２／Ｋ１２５→Ｑ１３８／Ｋ１７３→Ｑ１８６／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１８９／Ｄ１７９→Ｐ１９０／Ｖ１８１→Ｌ１９２／Ｔ１８２→Ｋ１９３／Ｐ１８３→Ｓ１９４／Ｋ１８４→Ｐ１９５／Ｆ２０９→Ｉ２２０／Ｍ２１２→Ｖ２２３／Ｉ２１３→Ｙ２２４／Ｎ２１４→−−−／Ｓ２１５→−−−／Ｔ２１６→Ｑ２２５／Ｓ２１７→Ｄ２２６／Ｄ２１８→Ｅ２２７／Ｈ２１９→Ａ２２８／Ｌ２２０→Ｆ２２９／Ｙ２２１→Ｈ２３０／Ｅ２３８→Ｄ２４７／Ｋ２５２→Ｑ２６１／Ｐ２８１→Ｓ２９０／Ｑ２９２→Ｋ３０１／Ｌ３１３→Ｃ３２２／Ｓ３１４→Ｔ３２３／Ｌ３１５→Ｍ３２４／Ｔ３１７→Ｓ３２６／Ｑ３２１→Ａ３３０／Ｅ３３３→Ｄ３４２／Ｋ３３６→Ｒ３４５／Ｌ３３７→Ｉ３４６／Ａ３４５→Ｔ３５４／Ｇ３５７→Ｒ３６６／Ｎ３６９→Ｉ３７８／Ｓ３７７→Ｙ３８６／Ｔ４０５→Ｒ４１４／Ｎ４２９→Ｇ４３８／Ａ４３６→Ｓ４４５／Ｅ４８４→Ｄ４９３／Ｔ５０１→Ｐ５１０／Ｄ５３６→Ｅ５４５；
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Ｒ１９Ｋ／Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｔ／Ｅ５６Ｇ／Ｄ５７Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ａ８５Ｍ／Ｉ８６Ｌ／Ｑ８７Ｄ／Ｋ８８Ｈ／Ｌ８９Ｉ／Ｃ９０Ｙ／−−−→Ｒ９１／−−−→Ａ９２／−−−→Ｄ９３／Ｉ９２→Ｙ９５／Ｙ９３→Ｆ９６／Ｉ９４→Ｅ９７／Ｄ９５→Ａ９８／Ｓ９６→Ｈ９９／Ｎ９７→Ｅ１００／Ｒ９８→Ｙ１０１／Ａ９９→Ｎ１０２／Ｋ１２５→Ｑ１２８／Ｋ１７３→Ｑ１７６／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１７９／Ｄ１７９→Ｐ１８０／Ｖ１８１→Ｌ１８２／Ｔ１８２→Ｋ１８３／Ｐ１８３→Ｓ１８４／Ｋ１８４→Ｐ１８５／Ｆ２０９→Ｉ２１０／Ｍ２１２→Ｒ２１３／Ｎ２１４→Ｄ２１５／Ｈ２１９→Ｄ２２０／Ｙ２２１→Ｖ２２２／Ｅ２３８→Ｄ２３９／Ｋ２５２→Ｑ２５３／Ｐ２８１→Ｓ２８２／Ｑ２９２→Ｋ２９３／Ｌ３１３→Ｃ３１４／Ｓ３１４→Ｔ３１５／Ｌ３１５→Ｍ３１６／Ｔ３１７→Ｓ３１８／Ｑ３２１→Ａ３２２／Ｅ３３３→Ｄ３３４／Ｋ３３６→Ｒ３３７／Ｌ３３７→Ｉ３３８／Ａ３４５→Ｔ３４６／Ｇ３５７→Ｒ３５８／Ｎ３６９→Ｉ３７０／Ｓ３７７→Ｙ３７８／Ｔ４０５→Ｒ４０６／Ｎ４２９→Ｇ４３０／Ａ４３６→Ｓ４３７／Ｅ４８４→Ｄ４８５／Ｔ５０１→Ｐ５０２／Ｄ５３６→Ｅ５３７；
Ｒ１９Ｋ／Ｎ２０Ｄ／Ｌ２３Ｓ／Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｔ／Ｅ５６Ｇ／Ｄ５７Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ａ８５Ｍ／Ｉ８６Ｌ／Ｑ８７Ｄ／Ｋ８８Ｈ／Ｌ８９Ｉ／Ｃ９０Ｙ／−−−→Ｒ９１／−−−→Ａ９２／−−−→Ｄ９３／Ｉ９２→Ｙ９５／Ｙ９３→Ｆ９６／Ｉ９４→Ｅ９７／Ｄ９５→Ａ９８／Ｓ９６→Ｈ９９／Ｎ９７→Ｅ１００／Ｒ９８→Ｙ１０１／Ａ９９→Ｎ１０２／Ｋ１２５→Ｑ１２８／Ｋ１７３→Ｅ１７６／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１７９／Ｄ１７９→Ｐ１８０／Ｖ１８１→Ｌ１８２／Ｔ１８２→Ｋ１８３／Ｐ１８３→Ｓ１８４／Ｋ１８４→Ｐ１８５／Ｆ２０９→Ｉ２１０／Ｍ２１２→Ｒ２１３／Ｎ２１４→Ｄ２１５／Ｈ２１９→Ｄ２２０／Ｙ２２１→Ｖ２２２／Ｅ２３８→Ｄ２３９／Ｋ２５２→Ｑ２５３／Ｐ２８１→Ｓ２８２／Ｑ２９２→Ｋ２９３／Ｌ３１３→Ｃ３１４／Ｓ３１４→Ｔ３１５／Ｌ３１５→Ｍ３１６／Ｔ３１７→Ｓ３１８／Ｑ３２１→Ａ３２２／Ｅ３３３→Ｄ３３４／Ｋ３３６→Ｒ３３７／Ｌ３３７→Ｉ３３８／Ａ３４５→Ｔ３４６／Ｇ３５７→Ｒ３５８／Ｎ３６９→Ｉ３７０／Ｓ３７７→Ｙ３７８／Ｔ４０５→Ｒ４０６／Ｎ４２９→Ｇ４３０／Ａ４３６→Ｓ４３７／Ｃ４６５→Ｓ４６６／Ｅ４８４→Ｄ４８５／Ｔ５０１→Ｐ５０２／Ｄ５３６→Ｅ５３７／Ａ５３９→Ｖ５４０；
Ｓ２Ｃ／Ｓ３Ｍ／Ｇ４Ｔ／Ｅ５Ｇ／Ｔ６Ｅ／Ｆ７Ｓ／Ｒ１９Ｋ／Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｔ／Ｅ５６Ｇ／Ｄ５７Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ａ８５Ｍ／Ｉ８６Ｌ／Ｑ８７Ｄ／Ｋ８８Ｈ／Ｌ８９Ｉ／Ｃ９０Ｙ／−−−→Ｒ９１／−−−→Ａ９２／−−−→Ｄ９３／Ｉ９２→Ｙ９５／Ｙ９３→Ｆ９６／Ｉ９４→Ｅ９７／Ｄ９５→Ａ９８／Ｓ９６→Ｈ９９／Ｎ９７→Ｅ１００／Ｒ９８→Ｙ１０１／Ａ９９→Ｎ１０２／Ｋ１２５→Ｑ１２８／Ｋ１７３→Ｑ１７６／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１７９／Ｄ１７９→Ｐ１８０／Ｖ１８１→Ｌ１８２／Ｔ１８２→Ｋ１８３／Ｐ１８３→Ｓ１８４／Ｋ１８４→Ｐ１８５／Ｆ２０９→Ｉ２１０／Ｍ２１２→Ｓ２１３／Ｎ２１４→Ｙ２１５／Ｓ２１５→Ｄ２１６／Ｔ２１６→Ｋ２１７／Ｓ２１７→−−−／Ｄ２１８Ｅ／Ｈ２１９Ｑ／Ｌ２２０Ｓ／Ｙ２２１Ｋ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｐ２８１Ｓ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１３Ｃ／Ｓ３１４Ｔ／Ｌ３１５Ｍ／Ｔ３１７Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ｋ３３６Ｒ／Ｌ３３７Ｉ／Ａ３４５Ｔ／Ｅ３４８Ａ／Ｇ３５７Ｒ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｅ４８４Ｄ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｓ２Ｃ／Ｓ３Ｍ／Ｇ４Ｔ／Ｅ５Ｇ／Ｔ６Ｅ／Ｆ７Ｓ／Ｒ１９Ｋ／Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｔ／Ｅ５６Ｇ／Ｄ５７Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ａ８５Ｍ／Ｉ８６Ｌ／Ｑ８７Ｄ／Ｋ８８Ｈ／Ｌ８９Ｉ／Ｃ９０Ｙ／−−−→Ｒ９１／−−−→Ａ９２／−−−→Ｄ９３／Ｉ９２→Ｙ９５／Ｙ９３→Ｆ９６／Ｉ９４→Ｅ９７／Ｄ９５→Ａ９８／Ｓ９６→Ｈ９９／Ｎ９７→Ｅ１００／Ｒ９８→Ｙ１０１／Ａ９９→Ｎ１０２／Ｋ１２５→Ｑ１２８／Ｋ１７３→Ｑ１７６／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１７９／Ｄ１７９→Ｐ１８０／Ｖ１８１→Ｌ１８２／Ｔ１８２→Ｋ１８３／Ｐ１８３→Ｓ１８４／Ｋ１８４→Ｐ１８５／Ｆ２０９→Ｉ２１０／Ｍ２１２→Ｓ２１３／Ｎ２１４→Ｙ２１５／Ｓ２１５→Ｄ２１６／Ｔ２１６→Ｋ２１７／Ｓ２１７→−−−／Ｄ２１８Ｅ／Ｈ２１９Ｑ／Ｌ２２０Ｓ／Ｙ２２１Ｋ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｐ２８１Ｓ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１３Ｃ／Ｓ３１４Ｔ／Ｌ３１５Ｍ／Ｔ３１７Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ｋ３３６Ｒ／Ｌ３３７Ｉ／Ａ３４５Ｔ／Ｅ３４８Ｓ／Ｇ３５７Ｒ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｅ４８４Ｄ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ／；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｐ９１Ｎ／Ｉ９２Ｓ／Ｙ９３Ｆ／Ｉ９４Ｈ／Ｓ９６Ｃ／Ｒ９８Ｄ／Ａ９９Ｍ／−−−→Ｇ１０１／−−−→Ｄ１０２／Ｋ１２５→Ｑ１２７／Ｋ１７３→Ｑ１７５／Ｋ１８４→Ｒ１８６／Ｆ２０９→Ｉ２１１／Ｍ２１２→Ｒ２１４／Ｎ２１４→Ｄ２１６／Ｈ２１９→Ｄ２２１／Ｙ２２１→Ｖ２２３／Ｅ２３８→Ｄ２４０／Ｋ２５２→Ｑ２５４／Ｑ２９２→Ｋ２９４／Ｑ３２１→Ａ３２３／Ｅ３３３→Ｄ３３５／Ａ３４５→Ｔ３４７／Ｎ３６９→Ｉ３７１／Ｓ３７７→Ｙ３７９／Ｔ４０５→Ｒ４０７／Ｎ４２９→Ｇ４３１／Ａ４３６→Ｓ４３８／Ｔ５０１→Ｐ５０３／Ｄ５３６→Ｅ５３８；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｉ８２Ｖ／Ｋ８８Ｑ／Ｐ９１Ｎ／Ｉ９２Ｓ／Ｙ９３Ｆ／Ｉ９４Ｈ／Ｓ９６Ｃ／Ｒ９８Ｄ／Ａ９９Ｍ／−−−→Ｇ１０１／−−−→Ｄ１０２／Ｋ１２５→Ｑ１２７／Ｋ１７３→Ｑ１７５／Ｋ１８４→Ｒ１８６／Ｆ２０９→Ｉ２１１／Ｍ２１２→Ｒ２１４／Ｎ２１４→Ｄ２１６／Ｈ２１９→Ｄ２２１／Ｙ２２１→Ｖ２２３／Ｅ２３８→Ｄ２４０／Ｋ２５２→Ｑ２５４／Ｑ２９２→Ｋ２９４／Ｑ３２１→Ａ３２３／Ｅ３３３→Ｄ３３５／Ａ３４５→Ｔ３４７／Ｎ３６９→Ｉ３７１／Ｓ３７７→Ｙ３７９／Ｌ３９９→Ｓ４０１／Ｔ４０５→Ｒ４０７／Ｎ４２９→Ｇ４３１／Ａ４３６→Ｓ４３８／Ｔ５０１→Ｐ５０３／Ｄ５３６→Ｅ５３８；
Ｓ３Ｔ／Ｇ４Ｑ／Ｅ５Ｖ／−−−→Ｓ６／−−−→Ａ７／−−−→Ｓ８／−−−→Ｓ９／−−−→Ｌ１０／−−−→Ａ１１／−−−→Ｑ１２／−−−→Ｉ１３／−−−→Ｐ１４／−−−→Ｑ１５／−−−→Ｐ１６／Ｔ６→Ｋ１７／Ｆ７→Ｎ１８／Ｔ１０→Ｖ２１／Ｄ１２→Ｎ２３／Ｓ１６→Ｎ２７／Ｌ１７→Ｉ２８／Ｒ１９→Ｇ３０／Ｎ２０→Ｄ３１／Ｈ２１→Ｑ３２／Ｌ２３→Ｉ３４／Ｋ２４→Ｔ３５／Ｇ２５→Ｙ３６／Ａ２６→Ｔ３７／Ｓ２７→Ｐ３８／Ｄ２８→Ｅ３９／Ｆ２９→Ｄ４０／Ｔ３１→−−−／Ｄ３３→Ｔ４３／Ｈ３４→Ｒ４４／Ｔ３５→Ａ４５／Ａ３６→Ｃ４６／Ｔ３７→Ｋ４７／Ｑ３８→Ｅ４８／Ｒ４０→Ｑ５０／Ｈ４１→Ｉ５１／Ｖ４８→Ｉ５８／Ｔ５３→Ｌ６３／Ｄ５４→Ａ６４／Ａ５５→Ｔ６５／Ｅ５６→Ｇ６６／Ｄ５７→Ｒ６７／Ｖ６０→Ｉ７０／Ｉ８６→Ｌ９６／Ｋ８８→Ｈ９８／Ｌ８９→Ｉ９９／Ｐ９１→Ｎ１０１／Ｉ９２→Ｓ１０２／Ｙ９３→Ｆ１０３／Ｉ９４→Ｈ１０４／Ｓ９６→Ｃ１０６／Ｒ９８→Ｄ１０８／Ａ９９→Ｍ１０９／−−−→Ｇ１１１／−−−→Ｄ１１２／Ｈ１０２→Ｙ１１４／Ｉ１１６→Ｙ１２８／Ｋ１１７→Ｔ１２９／Ｖ１２２→Ｉ１３４／Ｅ１２４→Ｎ１３６／Ｋ１２７→Ｔ１３９／Ｄ１２９→Ｅ１４１／Ｅ１３０→Ｒ１４２／Ｓ１３５→Ｅ１４７／Ｓ１３６→Ａ１４８／Ｎ１３９→Ｓ１５１／Ｑ１４２→Ｒ１５４／Ｓ１４６→Ｇ１５８／Ｋ１７３→Ｑ１８５／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１８８／Ｄ１７９→Ｐ１８９／Ｖ１８１→Ｌ１９１／Ｔ１８２→Ｋ１９２／Ｐ１８３→Ｓ１９３／Ｋ１８４→Ｐ１９４／Ｆ２０９→Ｉ２１９／Ｍ２１２→Ｖ２２２／Ｉ２１３→Ｙ２２３／Ｎ２１４→−−−／Ｓ２１５→−−−／Ｔ２１６→Ｑ２２４／Ｓ２１７→Ｄ２２５／Ｄ２１８→Ｅ２２６／Ｈ２１９→Ａ２２７／Ｌ２２０→Ｆ２２８／Ｙ２２１→Ｈ２２９／Ｅ２３８→Ｄ２４６／Ｋ２５２→Ｑ２６０／Ｐ２８１→Ｓ２８９／Ｑ２９２→Ｋ３００／Ｌ３１３→Ｃ３２１／Ｓ３１４→Ｔ３２２／Ｌ３１５→Ｍ３２３／Ｔ３１７→Ｓ３２５／Ｑ３２１→Ａ３２９／Ｅ３３３→Ｄ３４１／Ｋ３３６→Ｒ３４４／Ｌ３３７→Ｉ３４５／Ａ３４５→Ｔ３５３／Ｇ３５７→Ｒ３６５／Ｎ３６９→Ｉ３７７／Ｓ３７７→Ｙ３８５／Ｔ４０５→Ｒ４１３／Ｎ４２９→Ｇ４３７／Ａ４３６→Ｓ４４４／Ｅ４８４→Ｄ４９２／Ｔ５０１→Ｐ５０９／Ｄ５３６→Ｅ５４４；
Ｓ３Ｔ／Ｇ４Ｑ／Ｅ５Ｖ／−−−→Ｓ６／−−−→Ａ７／−−−→Ｓ８／−−−→Ｓ９／−−−→Ｌ１０／−−−→Ａ１１／−−−→Ｑ１２／−−−→Ｉ１３／−−−→Ｐ１４／−−−→Ｑ１５／−−−→Ｐ１６／Ｔ６→Ｋ１７／Ｆ７→Ｎ１８／Ｔ１０→Ｖ２１／Ｄ１２→Ｎ２３／Ｓ１６→Ｎ２７／Ｌ１７→Ｉ２８／Ｒ１９→Ｇ３０／Ｎ２０→Ｄ３１／Ｈ２１→Ｑ３２／Ｌ２３→Ｉ３４／Ｋ２４→Ｔ３５／Ｇ２５→Ｙ３６／Ａ２６→Ｔ３７／Ｓ２７→Ｐ３８／Ｄ２８→Ｅ３９／Ｆ２９→Ｄ４０／Ｔ３１→−−−／Ｄ３３→Ｔ４３／Ｈ３４→Ｒ４４／Ｔ３５→Ａ４５／Ａ３６→Ｃ４６／Ｔ３７→Ｋ４７／Ｑ３８→Ｅ４８／Ｒ４０→Ｑ５０／Ｈ４１→Ｉ５１／Ｔ５３→Ｌ６３／Ｄ５４→Ａ６４／Ａ５５→Ｔ６５／Ｅ５６→Ｇ６６／Ｄ５７→Ｒ６７／Ｖ６０→Ｉ７０／Ｉ８６→Ｌ９６／Ｋ８８→Ｈ９８／Ｌ８９→Ｉ９９／Ｐ９１→Ｎ１０１／Ｉ９２→Ｓ１０２／Ｙ９３→Ｆ１０３／Ｉ９４→Ｈ１０４／Ｓ９６→Ｃ１０６／Ｒ９８→Ｄ１０８／Ａ９９→Ｍ１０９／−−−→Ｇ１１１／−−−→Ｄ１１２／Ｋ１２５→Ｑ１３７／Ｋ１７３→Ｑ１８５／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１８８／Ｄ１７９→Ｐ１８９／Ｖ１８１→Ｌ１９１／Ｔ１８２→Ｋ１９２／Ｐ１８３→Ｓ１９３／Ｋ１８４→Ｐ１９４／Ｆ２０９→Ｉ２１９／Ｍ２１２→Ｖ２２２／Ｉ２１３→Ｙ２２３／Ｎ２１４→−−−／Ｓ２１５→−−−／Ｔ２１６→Ｑ２２４／Ｓ２１７→Ｄ２２５／Ｄ２１８→Ｅ２２６／Ｈ２１９→Ａ２２７／Ｌ２２０→Ｆ２２８／Ｙ２２１→Ｈ２２９／Ｅ２３８→Ｄ２４６／Ｋ２５２→Ｑ２６０／Ｐ２８１→Ｓ２８９／Ｑ２９２→Ｋ３００／Ｌ３１３→Ｃ３２１／Ｓ３１４→Ｔ３２２／Ｌ３１５→Ｍ３２３／Ｔ３１７→Ｓ３２５／Ｑ３２１→Ａ３２９／Ｅ３３３→Ｄ３４１／Ｋ３３６→Ｒ３４４／Ｌ３３７→Ｉ３４５／Ａ３４５→Ｔ３５３／Ｇ３５７→Ｒ３６５／Ｎ３６９→Ｉ３７７／Ｓ３７７→Ｙ３８５／Ｔ４０５→Ｒ４１３／Ｎ４２９→Ｇ４３７／Ａ４３６→Ｓ４４４／Ｅ４８４→Ｄ４９２／Ｔ５０１→Ｐ５０９／Ｄ５３６→Ｅ５４４；および
Ｓ３Ｔ／Ｇ４Ｑ／Ｅ５Ｖ／−−−→Ｓ６／−−−→Ａ７／−−−→Ｓ８／−−−→Ｓ９／−−−→Ｌ１０／−−−→Ａ１１／−−−→Ｑ１２／−−−→Ｉ１３／−−−→Ｐ１４／−−−→Ｑ１５／−−−→Ｐ１６／Ｔ６→Ｋ１７／Ｆ７→Ｎ１８／Ｔ１０→Ｖ２１／Ｄ１２→Ｎ２３／Ｓ１６→Ｎ２７／Ｌ１７→Ｉ２８／Ｒ１９→Ｇ３０／Ｎ２０→Ｄ３１／Ｈ２１→Ｑ３２／Ｌ２３→Ｉ３４／Ｋ２４→Ｔ３５／Ｇ２５→Ｙ３６／Ａ２６→Ｔ３７／Ｓ２７→Ｐ３８／Ｄ２８→Ｅ３９／Ｆ２９→Ｄ４０／Ｔ３１→−−−／Ｄ３３→Ｔ４３／Ｈ３４→Ｒ４４／Ｔ３５→Ａ４５／Ａ３６→Ｃ４６／Ｔ３７→Ｋ４７／Ｑ３８→Ｅ４８／Ｒ４０→Ｑ５０／Ｈ４１→Ｉ５１／Ｔ５３→Ｌ６３／Ｄ５４→Ａ６４／Ａ５５→Ｔ６５／Ｅ５６→Ｇ６６／Ｄ５７→Ｒ６７／Ｖ６０→Ｉ７０／Ａ８５→Ｍ９５／Ｉ８６→Ｌ９６／Ｑ８７→Ｄ９７／Ｋ８８→Ｈ９８／Ｌ８９→Ｉ９９／Ｃ９０→Ｙ１００／−−−→Ｒ１０１／−−−→Ａ１０２／−−−→Ｄ１０３／Ｉ９２→Ｙ１０５／Ｙ９３→Ｆ１０６／Ｉ９４→Ｅ１０７／Ｄ９５→Ａ１０８／Ｓ９６→Ｈ１０９／Ｎ９７→Ｅ１１０／Ｒ９８→Ｙ１１１／Ａ９９→Ｎ１１２／Ｋ１２５→Ｑ１３８／Ｋ１７３→Ｑ１８６／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１８９／Ｄ１７９→Ｐ１９０／Ｖ１８１→Ｌ１９２／Ｔ１８２→Ｋ１９３／Ｐ１８３→Ｓ１９４／Ｋ１８４→Ｐ１９５／Ｆ２０９→Ｉ２２０／Ｍ２１２→Ｖ２２３／Ｉ２１３→Ｙ２２４／Ｎ２１４→−−−／Ｓ２１５→−−−／Ｔ２１６→Ｑ２２５／Ｓ２１７→Ｄ２２６／Ｄ２１８→Ｅ２２７／Ｈ２１９→Ａ２２８／Ｌ２２０→Ｆ２２９／Ｙ２２１→Ｈ２３０／Ｅ２３８→Ｄ２４７／Ｋ２５２→Ｑ２６１／Ｐ２８１→Ｓ２９０／Ｑ２９２→Ｋ３０１／Ｌ３１３→Ｃ３２２／Ｓ３１４→Ｔ３２３／Ｌ３１５→Ｍ３２４／Ｔ３１７→Ｓ３２６／Ｑ３２１→Ａ３３０／Ｅ３３３→Ｄ３４２／Ｋ３３６→Ｒ３４５／Ｌ３３７→Ｉ３４６／Ａ３４５→Ｔ３５４／Ｇ３５７→Ｒ３６６／Ｎ３６９→Ｉ３７８／Ｓ３７７→Ｙ３８６／Ｔ４０５→Ｒ４１４／Ｎ４２９→Ｇ４３８／Ａ４３６→Ｓ４４５／Ｅ４８４→Ｄ４９３／Ｔ５０１→Ｐ５１０／Ｄ５３６→Ｅ５４５
に対応する改変の中から選択される置換を含有する改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドをコードするものがある。
【００３９】
配列番号２０３、３５２−３５３、７０２、７０３、７１３−７１５、７７６−７９９、８０１−８０９、８９１−８９４、８９６、９４５、９４７、９４９、９５１、９５３、９５５、９５７、９５９、９６１、９６３、９６５、９６７、９６９、９７１、９７３、９７５、９７７、９７９、９８１、９８３、９８５、９８７、９８９、９９１、９９３、９９５、９９７および９９９のいずれかに示される核酸の配列を有する核酸分子が、本明細書において提供される。また、配列番号２０３、３５２−３５３、７０２、７０３、７１３−７１５、７７６−７９９、８０１−８０９、８９１−８９４、８９６、９４５、９４７、９４９、９５１、９５３、９５５、９５７、９５９、９６１、９６３、９６５、９６７、９６９、９７１、９７３、９７５、９７７、９７９、９８１、９８３、９８５、９８７、９８９、９９１、９９３、９９５、９９７および９９９のいずれかに対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸の配列を有する核酸分子も本明細書において提供される。また、配列番号２０３、３５２−３５３、７０２、７０３、７１３−７１５、７７６−７９９、８０１−８０９、８９１−８９４、８９６、９４５、９４７、９４９、９５１、９５３、９５５、９５７、９５９、９６１、９６３、９６５、９６７、９６９、９７１、９７３、９７５、９７７、９７９、９８１、９８３、９８５、９８７、９８９、９９１、９９３、９９５、９９７および９９９のいずれかに縮重する核酸の配列を有する核酸分子も本明細書において提供される。例えば、配列番号２０３、３５２−３５３、７０２、７０３、７１３−７１５、７７６−７９９、８０１−８０９、８９１−８９４、８９６、９４５、９４７、９４９、９５１、９５３、９５５、９５７、９５９、９６１、９６３、９６５、９６７、９６９、９７１、９７３、９７５、９７７、９７９、９８１、９８３、９８５、９８７、９８９、９９１、９９３、９９５、９９７および９９９のいずれかに示される核酸の配列を有する核酸分子が本明細書において提供される。
【００４０】
配列番号６７、３５０、３５１、７３２〜７３３、７４３〜７４５、８３３〜８５６、８５８〜８６６、８８７〜８９０および８９５のいずれかに示されるアミノ酸の配列を有する改変されたバレンセンシンターゼをコードする核酸分子が、本明細書において提供される。また、配列番号６７、３５０、３５１、７３２〜７３３、７４３〜７４５、８３３〜８５６、８５８〜８６６、８８７〜８９０および８９５のいずれかに示されるアミノ酸の配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を有する改変されたバレンセンシンターゼをコードする核酸分子が、本明細書において提供される。例えば、配列番号６７、３５０、３５１、７３２〜７３３、７４３〜７４５、８３３〜８５６、８５８〜８６６、８８７〜８９０および８９５のいずれかに示されるアミノ酸の配列を有する改変されたバレンセンシンターゼをコードする核酸分子が、本明細書において提供される。
【００４１】
一例では、本明細書において提供される核酸分子は、Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｖ３２０Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３２６Ｋ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；およびＫ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｒ５０Ｇ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｖ３２０Ｇ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅの中から選択されるアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換、ならびに１種または複数のさらなるアミノ酸置換を有する改変されたバレンセンシンターゼをコードし得る。
【００４２】
非改変バレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号２〜４、２８９〜２９１、３４６、３４７、７５２、８８２および８８３のいずれかに示されるアミノ酸の配列を有する改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドをコードする核酸分子が、本明細書において提供される。
【００４３】
改変されたバレンセンシンターゼが、柑橘類由来バレンセンシンターゼと比較してアミノ酸の相違を含有する改変された柑橘類バレンセンシンターゼをコードする核酸分子が、本明細書において提供される。一部の例では、核酸は、改変されたバレンセンシンターゼが、グレープフルーツ由来またはオレンジ由来バレンセンシンターゼと比較してアミノ酸の相違を含有する、改変されたグレープフルーツまたはオレンジバレンセンシンターゼをコードする。一態様では、柑橘類由来バレンセンシンターゼは、配列番号２、２８９〜２９１、７５２および８８６のいずれかに示されるアミノ酸の配列を有する。一部の実施形態では、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、融合タンパク質またはキメラタンパク質である。
【００４４】
一部の実施形態では、本明細書において提供される核酸分子は、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼと比較して、増大した触媒活性を示す改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドをコードする。その他の実施形態では、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼと比較して、変更した基質特異性を示す。さらなる実施形態では、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼと比較して、変更した生成物分布を示す。
【００４５】
例えば、上記のように、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを発現する細胞は、配列番号２に示される野生型バレンセンシンターゼを発現する細胞と比較して、増大したバレンセンを生成する。テルペン生成物が、ＦＰＰを生成する宿主細胞においてシンターゼによって生成される、一部の例では、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドはまた、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼから、同一宿主細胞において生成される同一テルペン生成物（例えば、テルペン副生成物またはそれに由来する生成物）のパーセンテージと比較して、低減したパーセンテージのバレンセン以外のテルペン生成物（例えば、テルペン副生成物またはそれに由来する生成物）を生成する。例えば、生成され得るバレンセン以外のテルペン生成物として、それだけには限らないが、β−セリネン、τ−セリネン、エレモフィロン、７−エピ−α−セリネン、ゲルマクレンＡまたはβ−エレメンが挙げられる。例えば、ゲルマクレンＡは、その自然分解生成物β−エレメンとして検出され、これは、ゲルマクレンＡ副生成物に由来する生成物であり、熱によって誘導された再配列を受けてβ−エレメンを形成する。特定の例では、テルペン生成物は、β−エレメンである。例えば、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示される野生型バレンセンシンターゼによって生成されるものの９５％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％以下のレベルのβ−エレメンを生成する。提供された改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドによって生成される総テルペン生成物のパーセンテージとしてのバレンセン以外のテルペン生成物のパーセンテージは、０．０１％〜９０％、例えば、１％〜８０％、５％〜８０％、１０％〜６０％または０．０１％〜２０％減少する。例えば、総テルペンのパーセンテージとしてのバレンセン以外のテルペン生成物のパーセンテージは、少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上または少なくとも約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上減少する。このような核酸分子の例示として、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対するＣＶＳ番号付けを用いて、位置２８１、３１３、３１４、３１５、３１７、３３６、３３７、３４７または３５７に対応する位置でのアミノ酸置換（単数または複数）を含有する改変バレンセンポリペプチドをコードする核酸分子がある。例えば、アミノ酸置換は、Ｐ２８１Ｓ、Ｐ２８１Ｈ、Ｐ２８１Ｋ、Ｐ２８１Ａ、Ｐ２８１Ｗ、Ｐ２８１Ｌ、Ｐ２８１Ｙ、Ｌ３１３Ｃ、Ｓ３１４Ｔ、Ｌ３１５Ｍ、Ｔ３１７Ｓ、Ｋ３３６Ｒ、Ｌ３３７Ｉ、Ｎ３４７Ｌおよび／またはＧ３５７Ｒである。一部の例では、核酸分子は、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対する番号付けを用いて位置２８１、３１３、３１４、３１５、３１７、３３６、３３７および３５��に置換を含有する改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドをコードする。さらなる例では、核酸分子はまた、位置３４７にアミノ酸置換を含有し得る。例えば、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、置換Ｐ２８１Ｓ、Ｌ３１３Ｃ、Ｓ３１４Ｔ、Ｌ３１５Ｍ、Ｔ３１７Ｓ、Ｋ３３６Ｒ、Ｌ３３７ＩおよびＧ３５７Ｒを含有する。別の例では、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、置換Ｐ２８１Ｓ、Ｌ３１３Ｃ、Ｓ３１４Ｔ、Ｌ３１５Ｍ、Ｔ３１７Ｓ、Ｋ３３６Ｒ、Ｌ３３７Ｉ、Ｎ３４７ＬおよびＧ３５７Ｒを含有する。コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドはまた、β−エレメンなどのテルペン生成物の生成が減少する限り、その他のアミノ酸置換を含有してもよい。
【００４６】
また、本明細書において提供される核酸分子のいずれかによってコードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドも、本明細書において提供される。
【００４７】
また、本明細書において提供される核酸分子を含有するベクターも提供される。ベクターは、原核生物、ウイルスおよび真核生物ベクター、例えば、酵母発現ベクターを含めた酵母ベクターなどを含む。ベクターを含有する、細菌細胞などの原核細胞および酵母、昆虫、植物または哺乳動物細胞などの真核細胞を含めた細胞が提供される。一例では、細胞は、酵母細胞、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の細胞またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属の細胞である。例示的実施形態では、酵母細胞は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞である。別の例では、細胞は、細菌細胞、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞である。本明細書において提供される細胞は、ＦＰＰを生成する。特定の実施形態では、細胞は、改変されていない細胞よりも多くのＦＰＰを生成するよう改変されている。例えば、細胞は、スクアレンシンターゼをコードする遺伝子中に改変を含有し、それによって、細胞において発現されるスクアレンシンターゼの量または細胞において発現されるスクアレンシンターゼの活性が、非改変細胞と比較して低下する。また、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを発現する細胞が、本明細書において提供される。また、本明細書において提供される細胞によって生成された、改変されたバレンセンシンターゼも、本明細書において提供される。
【００４８】
また、本明細書において提供されるベクターを含有するトランスジェニック植物も、本明細書において提供される。一部の例では、トランスジェニック植物は、柑橘類植物である。その他の例では、トランスジェニック植物は、タバコである。
【００４９】
本明細書において提供される核酸分子またはベクターを、細胞に導入し、細胞を、核酸またはベクターによってコードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドの発現に適した条件下で培養する、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを生成する方法が、本明細書において提供される。また、本明細書において提供される核酸分子またはベクターを、細胞に導入し、細胞を、核酸またはベクターによってコードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが改変されている、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを生成する方法も、本明細書において提供される。一部の例では、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを単離する。
【００５０】
非環式ピロリン酸テルペン前駆体からのバレンセンの形成に適した条件下で、非環式ピロリン酸テルペン前駆体を、本明細書において提供される任意の改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドまたは本明細書において提供される任意の核酸分子によってコードされる任意の改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドと接触させる、バレンセンを生成する方法が、本明細書において提供される。また、非環式ピロリン酸テルペン前駆体からのバレンセンの形成に適した条件下で、非環式ピロリン酸テルペン前駆体を、本明細書において提供される任意の改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドまたは本明細書において提供される任意の核酸分子によってコードされる任意の改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドと接触させ、それによってバレンセンが単離される、バレンセンを生成する方法が、本明細書において提供される。一実施形態では、非環式ピロリン酸テルペン前駆体を、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドと接触させる工程は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）またはインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で達成される。本明細書において提供される方法において使用される非環式ピロリン酸テルペン前駆体は、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）およびゲラニル−ゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）の中から選択され得る。特定の実施形態では、非環式ピロリン酸テルペン前駆体は、ＦＰＰである。
【００５１】
本明細書において提供される核酸分子またはベクターで形質転換された、非環式ピロリン酸テルペン前駆体を生成する細胞を培養し、核酸分子またはベクターによってコードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが発現され、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、非環式ピロリン酸テルペン前駆体からのバレンセンの形成を触媒することによって、バレンセンを生成する方法が、本明細書において提供される。本明細書において提供される方法において使用される非環式ピロリン酸テルペン前駆体は、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）およびゲラニル−ゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）の中から選択され得る。特定の実施形態では、非環式ピロリン酸テルペン前駆体は、ＦＰＰであり得る。本明細書において提供される方法では、細胞は、細菌、酵母、昆虫、植物または哺乳動物細胞の中から選択され得る。特定の実施形態では、細胞は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞である酵母細胞である。本明細書において提供される細胞は、ＦＰＰを生成する。特定の実施形態では、細胞は、改変されていない細胞よりも多くのＦＰＰを生成するよう改変される。例えば、細胞は、スクアレンシンターゼをコードする遺伝子中に改変を含有し、それによって、細胞において発現されるスクアレンシンターゼの量または細胞において発現されるスクアレンシンターゼの活性が、非改変細胞と比較して低下する。
【００５２】
本明細書において提供される核酸分子またはベクターで形質転換された細胞を培養することによって、バレンセンを生成する方法の一実施形態では、生成されるバレンセンの量は、同一宿主細胞種が、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼをコードする核酸で形質転換される場合に同一条件下で生成されるバレンセンの量よりも多い。例えば、生成されるバレンセンの量は、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼによって同一条件下で生成されるバレンセンの量よりも少なくともまたは約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、５００％またはそれ以上多い。別の例では、生成されるバレンセンの量は、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼによってＦＰＰから生成されるバレンセンの量よりも１０％〜５００％、１０％〜２５０％、５０％〜２５０％、１００％〜５００％多いか、または１００％〜２５０％多い。別の実施形態では、細胞培養上清中の生成されるバレンセンの量は、酵母細胞培養培地中、少なくともまたは約０．１ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ、０．３ｇ／Ｌ、０．４ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、０．６ｇ／Ｌ、０．７ｇ／Ｌ、０．８ｇ／Ｌ、０．９ｇ／Ｌ  １．０ｇ／Ｌ、１．１ｇ／Ｌ、１．２ｇ／Ｌ、１．３ｇ／Ｌ、１．４ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、２．０ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４．０ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌまたは５．０ｇ／Ｌ；または０．１ｇ／Ｌから５．０ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌから３．０ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌから５．０ｇ／Ｌ、１．０ｇ／Ｌから５．０ｇ／Ｌまたは１．０から３．０ｇ／Ｌである。
【００５３】
本明細書において提供される方法の特定の実施形態では、バレンセンは単離される。別の実施形態では、バレンセンは酸化されて、ヌートカトンが生じる。酸化は、生合成によって、または化学的に実施できる。別の実施形態では、ヌートカトンが単離される。
【００５４】
第１のテルペンシンターゼのドメインのすべてまたは連続する部分が、第２のテルペンシンターゼ中の対応するドメインのすべてまたは連続する部分で置換され、第１のテルペンシンターゼおよび第２のテルペンシンターゼのドメインまたはドメインの連続する部分のアミノ酸配列は、少なくとも１個のアミノ酸残基で異なり、ドメインは、不定形ループ１、αヘリックス１、不定形ループ２、αヘリックス２、不定形ループ３、αヘリックス３、不定形ループ４、αヘリックス４、不定形ループ５、αヘリックス５、不定形ループ６、αヘリックス６、不定形ループ７、αヘリックス７、不定形ループ８、αヘリックス８、不定形ループ９、αヘリックスＡ、Ａ−Ｃループ、αヘリックスＣ、不定形ループ１１、αヘリックスＤ、不定形ループ１２、αヘリックスＤ１、不定形ループ１３、αヘリックスＤ２、不定形ループ１４、αヘリックスＥ、不定形ループ１５、αヘリックスＦ、不定形ループ１６、αヘリックスＧ１、不定形ループ１７、αヘリックスＧ２、不定形ループ１８、αヘリックスＨ１、不定形ループ１９、αヘリックスＨ２、不定形ループ２０、αヘリックスＨ３、不定形ループ２１、αヘリックスａ−１、不定形ループ２２、αヘリックスＩ、不定形ループ２３、αヘリックスＪ、Ｊ−Ｋループ、αヘリックスＫおよび／または不定形ループ２５の中から選択され、連続する部分は、少なくとも３個のアミノ酸残基を含有し、それによって、改変テルペンシンターゼの特性が、第１のテルペンシンターゼと比較して変更される、異種ドメインを含む改変テルペンシンターゼを生成する方法が、本明細書において提供される。例えば、改変テルペンシンターゼの特性は、第１のテルペンシンターゼと比較して改善される。
【００５５】
本方法の一実施形態では、第１のテルペンシンターゼのドメインに由来する少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０個またはそれ以上のアミノ酸残基が、第２のテルペンシンターゼの対応するドメインに由来する少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０個またはそれ以上のアミノ酸残基で置換される。一態様では、第１のテルペンシンターゼのドメインに由来するアミノ酸残基のすべてが、第２のテルペンシンターゼの対応するドメインに由来するアミノ酸残基のすべてで置換される。
【００５６】
本明細書において提供される方法の一実施形態では、不定形ループ１は、配列番号２のアミノ酸１〜２９に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックス１は、配列番号２のアミノ酸３０〜３９および４４〜５２に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ２は、配列番号２のアミノ酸５３〜５８に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックス２は、配列番号２のアミノ酸５９〜７１に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ３は、配列番号２のアミノ酸７２〜７８に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックス３は、配列番号２のアミノ酸７９〜９３に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ４は、配列番号２のアミノ酸９４〜１００に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックス４は、配列番号２のアミノ酸１０１〜１１４に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ５は、配列番号２のアミノ酸１１５〜１４１に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックス５は、配列番号２のアミノ酸１４２〜１５２に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ６は、配列番号２のアミノ酸１５３〜１６２に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックス６は、配列番号２のアミノ酸１６３〜１７３に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ７は、配列番号２のアミノ酸１７４〜１８４に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックス７は、配列番号２のアミノ酸１８５〜１９４に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ８は、配列番号２のアミノ酸１９５〜２０１に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックス８は、配列番号２のアミノ酸２０２〜２１２に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ９は、配列番号２のアミノ酸２１３〜２２２に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックスＡは、配列番号２のアミノ酸２２３〜２５３に対応するアミノ酸残基を含有し、Ａ−Ｃループは、配列番号２のアミノ酸２５４〜２６６に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックスＣは、配列番号２のアミノ酸２６７〜２７６に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ１１は、配列番号２のアミノ酸２７７〜２８３に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックスＤは、配列番号２のアミノ酸２８４〜３０５に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ１２は、配列番号２のアミノ酸３０６〜３０９に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックスＤ１は、配列番号２のアミノ酸３１０〜３２２に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ１３は、配列番号２のアミノ酸３２３〜３２８に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックスＤ２は、配列番号２のアミノ酸３２９に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ１４は、配列番号２のアミノ酸３３０〜３３２に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックスＥは、配列番号２のアミノ酸３３３〜３５１に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ１５は、配列番号２のアミノ酸３５２〜３６２に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックスＦは、配列番号２のアミノ酸３６３〜３８５に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ１６は、配列番号２のアミノ酸３８６〜３９０に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックスＧ１は、配列番号２のアミノ酸３９１〜３９５に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ル���プ１７は、配列番号２のアミノ酸３９６〜４０４に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックスＧ２は、配列番号２のアミノ酸４０５〜４１３に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ１８は、配列番号２のアミノ酸４１４〜４２１に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックスＨ１は、配列番号２のアミノ酸４２２〜４２８に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ１９は、配列番号２のアミノ酸４２９〜４３１に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックスＨ２は、配列番号２のアミノ酸４３２〜４４７に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ２０は、配列番号２のアミノ酸４４８〜４５０に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックスＨ３は、配列番号２のアミノ酸４５１〜４５５に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ２１は、配列番号２のアミノ酸４５６〜４６１に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックスａ−１は、配列番号２のアミノ酸４６２〜４７９に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ２２は、配列番号２のアミノ酸４７１〜４７３に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックスＩは、配列番号２のアミノ酸４７４〜４９５に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ２３は、配列番号２のアミノ酸４９６〜５０８に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックスＪは、配列番号２のアミノ酸５０９〜５２１に対応するアミノ酸残基を含有し、Ｊ−Ｋループは、配列番号２のアミノ酸５２２〜５３４に対応するアミノ酸残基を含有し、αヘリックスＫは、配列番号２のアミノ酸５３５〜５４１に対応するアミノ酸残基を含有し、不定形ループ２５は、配列番号２のアミノ酸５４２〜５４８に対応するアミノ酸残基を含有する。
【００５７】
提供される方法の一実施形態では、第１のテルペンシンターゼの２つ以上のドメインのすべてまたは連続する部分が、第２のテルペンシンターゼの対応するドメインのすべてまたは連続する部分で置換される。本明細書において提供される方法では、第１のテルペンシンターゼ中のドメインに隣接する１個または複数のさらなる残基が置換される。例えば、第１のテルペンシンターゼ中のドメインに隣接する少なくともまたは約１、２、３、４、５個またはそれ以上のさらなる残基が置換される。
【００５８】
本明細書において提供される方法の一実施形態では、第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２のアミノ酸５３〜５８に対応するアミノ酸が、第２のテルペンシンターゼに由来する対応する領域で置換される。別の実施形態では、第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２のアミノ酸８５〜９９に対応するアミノ酸が、第２のテルペンシンターゼに由来する対応する領域で置換される。別の実施形態では、第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２のアミノ酸１１５〜１４６に対応するアミノ酸が、第２のテルペンシンターゼに由来する対応する領域で置換される。さらに別の実施形態では、第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２のアミノ酸１５３〜１６２または１５２〜１６３に対応するアミノ酸が、第２のテルペンシンターゼに由来する対応する領域で置換される。さらなる実施形態では、第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２のアミノ酸１７４〜１８４に対応するアミノ酸が、第２のテルペンシンターゼに由来する対応する領域で置換される。別の実施形態では、第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２のアミノ酸２１２〜２２２または２１２〜２２１または２１３〜２２２に対応するアミノ酸が、第２のテルペンシンターゼに由来する対応する領域で置換される。一実施形態では、第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２のアミノ酸３１０〜３２２に対応するアミノ酸が、第２のテルペンシンターゼに由来する対応する領域で置換される。別の実施形態では、第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２のアミノ酸５２２〜５３４に対応するアミノ酸が、第２のテルペンシンターゼに由来する対応する領域で置換される。さらに別の実施形態では、第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２のアミノ酸５３〜５８に対応するアミノ酸が、配列番号２９５または９４１で示されるＴＥＡＳポリペプチドのアミノ酸５８〜６３で置換される。
【００５９】
方法の一実施形態では、第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２のアミノ酸８５〜８９に対応するアミノ酸が、配列番号９４２に示されるＨＰＳポリペプチドのアミノ酸９３〜９７で置換される。別の実施形態では、第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２のアミノ酸８５〜９９に対応するアミノ酸が、配列番号３４６に示される．ブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）バレンセンシンターゼのアミノ酸９６〜１１３で置換される。別の実施形態では、第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２のアミノ酸１１５〜１４６に対応するアミノ酸が、配列番号３４６に示されるブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）バレンセンシンターゼのアミノ酸１２８〜１５９で置換される。さらに別の実施形態では、第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２のアミノ酸１５２〜１６３に対応するアミノ酸が、配列番号９４２に示されるＨＰＳポリペプチドのアミノ酸１６３〜１７４で置換される。別の実施形態では、第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２のアミノ酸１７４〜１８４に対応するアミノ酸が、配列番号９４２に示されるＨＰＳポリペプチドのアミノ酸１８５〜１９３で置換される。さらに別の実施形態では、ここで、第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２のアミノ酸２１２〜２２２または２１２〜２２１に対応するアミノ酸が、配列番号９４２に示されるＨＰＳポリペプチドのアミノ酸２２１〜２２８または２２１〜２２９で置換される。
【００６０】
本方法の一実施形態では、第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２のアミノ酸３１０〜３２２に対応するアミノ酸が、配列番号９４２に示されるＨＰＳポリペプチドのアミノ酸３１７〜３２９で置換される。別の実施形態では、第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２のアミノ酸５２２〜５３４に対応するアミノ酸が、配列番号９４２に示されるＨＰＳポリペプチドのアミノ酸５２７〜５４１で置換される。本方法のさらに別の実施形態では、第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドのアミノ酸２１２〜２２１または２１２〜２２２に対応するアミノ酸が、配列番号２９５に示されるＴＥＡＳポリペプチドのアミノ酸２１３〜２２１で置換される。本方法の一実施形態では、第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドのアミノ酸２１２〜２２１または２１２〜２２２が、配列番号３４６に示されるブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）バレンセンシンターゼのアミノ酸２２３〜２３０で置換される。本方法の別の実施形態では、第１のテルペンシンターゼ中の配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドのアミノ酸３〜４１に対応するアミノ酸が、配列番号３４６に示されるブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）バレンセンシンターゼのアミノ酸３〜５１で置換される。
【００６１】
本明細書において提供される方法の一実施形態では、第１のテルペンは、セスキテルペンである。別の実施形態では、第２のテルペンは、セスキテルペンである。例えば、セスキテルペンは、バレンセンシンターゼ、サンタラン（ｓａｎｔａｌａｎｅ）シンターゼ、ＴＥＡＳおよびＨＰＳの中から選択され得る。一例では、サンタレン（ｓａｎｔａｌｅｎｅ）シンターゼは、配列番号４８１〜４８５の中から選択されるアミノ酸の配列を有する。本明細書において提供される方法の別の実施形態では、テルペンシンターゼ中の複数のドメインが、２種以上のその他のテルペンに由来する対応するドメインで置換される。
【００６２】
本明細書において提供される方法では、改変テルペンシンターゼの特性が、第１のテルペンシンターゼと比較して改善され得る。例えば、第１のテルペンシンターゼと比較して改善される改変テルペンシンターゼの特性は、総テルペン収量、特定のテルペン収量、触媒活性、生成物分布および基質特異性の中から選択される。
【００６３】
また、本明細書において提供される方法のいずれかによって生成された、改変テルペンシンターゼも、本明細書において提供される。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は、スイートオレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）（配列番号２；２８９；８８６）およびグレープフルーツ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｘ  ｐａｒａｄｉｓｅ）（配列番号２９０；２９１；７５２）由来の柑橘類バレンセンシンターゼを含めた、種変異体および改変されたバレンセンシンターゼを含めた種々の柑橘類バレンセンシンターゼ（ＣＶＳ）のアラインメントである。また、アミノ酸置換（配列番号３として示されるＶ１８および配列番号４として示されるＶ１９）を含有する、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼも含まれる。「＊」とは、その列中の残基またはヌクレオチドが、アラインメント中のすべての配列において同一であることを意味し、「：」とは、保存された置換が観察されたことを意味し、「．」とは、半保存された置換が観察されることを意味する。本明細書においておよび図４に記載されたように、配列番号２中の位置に対応する残基は、関連シンターゼまたは変異体シンターゼ間およびその間でアラインされた遺伝子座で生じる残基としてＣＶＳ番号付けに基づいて同定され得る。
【図２】図２は、配列番号２に示される柑橘類バレンセンシンターゼに対して、例示的シンターゼ（例えば、配列番号３４６に示されるブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）由来バレンセンシンターゼ、配列番号９４１に示されるタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）に由来する５−エピ−アリストロチェンシンターゼ（ＴＥＡＳ）および配列番号９４２に示されるヒオシアムス・ムチクス（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ  ｍｕｔｉｃｕｓ）に由来するプレムナスピロジエンシンターゼ（ＨＰＳ））間およびその間の対応する領域を同定するアラインメントである。アラインメントは、不定形ループ１（ＵＬ１；配列番号２のアミノ酸１〜２９に対応する）、αヘリックス１（ＡＨ１；配列番号２のアミノ酸３０〜３９および４４〜５２に対応する）、不定形ループ２（ＵＬ２；配列番号２のアミノ酸５３〜５８に対応する）、αヘリックス２（ＡＨ２；配列番号２のアミノ酸５９〜７１に対応する）、不定形ループ３（ＵＬ３；配列番号２のアミノ酸７２〜７８に対応する）、αヘリックス３（ＡＨ３；配列番号２のアミノ酸７９〜９３に対応する）、不定形ループ４（ＵＬ４；配列番号２のアミノ酸９４〜１００に対応する）、αヘリックス４（ＡＨ４；配列番号２のアミノ酸１０１〜１１４に対応する）、不定形ループ５（ＵＬ５；配列番号２のアミノ酸１１５〜１４１に対応する）、αヘリックス５（ＡＨ５；配列番号２のアミノ酸１４２〜１５２に対応する）、不定形ループ６（ＵＬ６；配列番号２のアミノ酸１５３〜１６２に対応する）、αヘリックス６（ＡＨ６；配列番号２のアミノ酸１６３〜１７３に対応する）、不定形ループ７（ＵＬ７；配列番号２のアミノ酸１７４〜１８４に対応する）、αヘリックス７（ＡＨ７；配列番号２のアミノ酸１８５〜１９４に対応する）、不定形ループ８（ＵＬ８；配列番号２のアミノ酸１９５〜２０１に対応する）、αヘリックス８（ＡＨ８；配列番号２のアミノ酸２０２〜２１２に対応する）、不定形ループ９（ＵＬ９；配列番号２のアミノ酸２１３〜２２２に対応する）、αヘリックスＡ（ＡＨ  Ａ；配列番号２のアミノ酸２２３〜２５３に対応する）、Ａ−Ｃループ（配列番号２のアミノ酸２５４〜２６６に対応する）、αヘリックスＣ（ＡＨ  Ｃ；配列番号２のアミノ酸２６７〜２７６に対応する）、不定形ループ１１（ＵＬ１１；配列番号２のアミノ酸２７７〜２８３に対応する）、αヘリックスＤ（ＡＨ  Ｄ；配列番号２のアミノ酸２８４〜３０５に対応する）、不定形ループ１２（ＵＬ１２；配列番号２のアミノ酸３０６〜３０９に対応する）、αヘリックスＤ１（ＡＨ  Ｄ１；配列番号２のアミノ酸３１０〜３２２に対応する）、不定形ループ１３（ＵＬ１３；配列番号２のアミノ酸３２３〜３２８に対応する）、αヘリックスＤ２（ＡＨ  Ｄ２；配列番号２のアミノ酸３２９に対応する）、不定形ループ１４（ＵＬ１４；配列番号２のアミノ酸３３０〜３３２に対応する）、αヘリックスＥ（ＡＨ  Ｅ；配列番号２のアミノ酸３３３〜３５１に対応する）、不定形ループ１５（ＵＬ１５；配列番号２のアミノ酸３５２〜３６２に対応する）、αヘリックスＦ（ＡＨ  Ｆ；配列番号２のアミノ酸３６３〜３８５に対応する）、不定形ループ１６（ＵＬ１６；配列番号２の���ミノ酸３８６〜３９０に対応する）、αヘリックスＧ１（ＡＨ  Ｇ１；配列番号２のアミノ酸３９１〜３９５に対応する）、不定形ループ１７（ＵＬ１７；配列番号２のアミノ酸３９６〜４０４に対応する）、αヘリックスＧ２（ＡＨ  Ｇ２；配列番号２のアミノ酸４０５〜４１３に対応する）、不定形ループ１８（ＵＬ１８；配列番号２のアミノ酸４１４〜４２１に対応する）、αヘリックスＨ１（ＡＨ  Ｈ１；配列番号２のアミノ酸  ４２２〜４２８に対応する）、不定形ループ１９（ＵＬ１９；配列番号２のアミノ酸４２９〜４３１に対応する）、αヘリックスＨ２（ＡＨ  Ｈ２；配列番号２のアミノ酸４３２〜４４７に対応する）、不定形ループ２０（ＵＬ２０；配列番号２のアミノ酸４４８〜４５０に対応する）、αヘリックスＨ３（ＡＨ  Ｈ３；配列番号２のアミノ酸４５１〜４５５に対応する）、不定形ループ２１（ＵＬ２１；配列番号２のアミノ酸４５６〜４６１に対応する）、αヘリックスａ−１（ＡＨ  ａ−１；配列番号２のアミノ酸４６２〜４７０に対応する）、不定形ループ２２（ＵＬ２２；配列番号２のアミノ酸４７１〜４７３に対応する）、αヘリックスＩ（ＡＨ  Ｉ；配列番号２のアミノ酸４７４〜４９５に対応する）、不定形ループ２３（ＵＬ２３；配列番号２のアミノ酸４９６〜５０８に対応する）、αヘリックスＪ（ＡＨ  Ｊ；配列番号２のアミノ酸５０９〜５２１に対応する）、Ｊ−Ｋループ（配列番号２のアミノ酸５２２〜５３４に対応する）、αヘリックスＫ（ＡＨ  Ｋ；配列番号２のアミノ酸５３５〜５４１に対応する）および不定形ループ２５（ＵＬ２５；配列番号２のアミノ酸５４２〜５４８に対応する）を含めた構造ドメインを示す。灰色の四角は、任意の二次構造ドメインの一部ではないアミノ酸残基を示す。「＊」とは、その列中の残基またはヌクレオチドが、アラインメント中のすべての配列において同一であることを意味し、「：」とは、保存された置換が観察されたことを意味し、「．」とは、半保存された置換が観察されることを意味する。本明細書において記載されるように、配列番号２中の構造領域に対応する残基は、その他のシンターゼにおいて、シンターゼ間およびその間でアラインされた遺伝子座で生じる残基として同定され得る。例えば、バレンセンシンターゼの不定形ループ２（配列番号２のアミノ酸５３〜５８）は、配列番号９４１に示されるタバコエピアリストロチェンシンターゼ（ＴＥＡＳ）ポリペプチドのアミノ酸５８〜６３に対応する。
【図３】図３は、バレンセンおよびヌートカトンの生成の反応スキームである。バレンセンシンターゼは、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）をセスキテルペンバレンセンに変換するクラス１植物テルペンシクラーゼまたはシンターゼである。次いで、バレンセンは、酸化によってヌートカトンに変換され得る。
【図４】図４は、種々のテルペンシンターゼのＣＶＳ番号付けを示すアラインメントを示す。図４Ａ．配列番号２９５および９４１に示されるタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）由来の５−エピ−アリストロチェンシンターゼ（ＴＥＡＳ）ならびに配列番号２に示される柑橘類バレンセンシンターゼのアラインメントを示す。図４Ｂ．配列番号２９６および９４２に示されるヒオシアムス・ムチクス（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ  ｍｕｔｉｃｕｓ）由来のプレムナスピロジエンシンターゼ（ＨＰＳ）ならびに配列番号２に示される柑橘類バレンセンシンターゼのアラインメントを示す。図４Ｃ．配列番号３４６および３４７に示されるブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）由来のバレンセンシンターゼならびに配列番号２に示される柑橘類バレンセンシンターゼのアラインメントを示す。図４Ｄ．配列番号８８７に示されるＶ２７７および配列番号２に示される柑橘類バレンセンシンターゼのアラインメントを示す。「＊」とは、その列中の残基またはヌクレオチドが、アラインメント中のすべての配列において同一であることを意味し、「：」とは、保存された置換が観察されたことを意味し、「．」とは、半保存された置換が観察されることを意味する。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
詳細な説明
Ａ．定義
Ｂ．バレンセンシンターゼ
１．構造
２．機能
３．柑橘類バレンセンシンターゼ
Ｃ．改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドおよびコーディング核酸分子
１．改変されたバレンセンシンターゼポリペプチド−例示的アミノ酸置換
２．ドメイン交換
３．生成物分布突然変異体
Ｄ．改変テルペンシンターゼおよびコーディング核酸分子を生成する方法
Ｅ．改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドおよびコーディング核酸分子の生成
１．テルペンシンターゼをコードする核酸の単離
２．突然変異体または改変核酸の作製
３．ベクターおよび細胞
４．発現系
ａ．原核細胞
ｂ．酵母細胞
ｃ．植物および植物細胞
ｄ．昆虫および昆虫細胞
ｅ．哺乳動物細胞
５．精製
６．融合タンパク質
Ｆ．バレンセンシンターゼを使用し、評価する方法
１．バレンセンの生成
ａ．バレンセン生成のための例示的細胞
ｂ．バレンセン生成のための細胞の培養
ｃ．バレンセンの単離および評価
２．ヌートカトンの生成
Ｇ．実施例
【００６６】
Ａ．定義
別段に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。すべての特許、特許出願、公開された出願および刊行物、ＧＥＮＢＡＮＫ配列、ウェブサイトおよび本明細書における全開示内容を通じて参照されるその他の公開された材料は、別段記載されない限り、その全体が参照により組み込まれる。本明細書における用語について複数の定義がある場合には、この節におけるものが優先する。ＵＲＬまたはその他のこのような識別子またはアドレスが参照される場合には、このような識別子は変わり得ることおよびインターネットに関する特定の情報は移り変わる場合があるが、インターネットおよび／または適当なデータベースを検索することなどによって同等の情報を知り、容易にアクセスできることは理解される。それに対する参照によって、このような情報の利用の可能性および一般への普及が証明される。
【００６７】
本明細書において、非環式ピロリン酸テルペン前駆体とは、ファルネシル−ピロリン酸（ＦＰＰ）、ゲラニル−ピロリン酸（ＧＰＰ）およびゲラニルゲラニル−ピロリン酸（ＧＧＰＰ）を含めた少なくとも１種のテルペンの生成の前駆体である任意の非環式ピロリン酸化合物であるが、これらに限定されない。したがって、非環式ピロリン酸テルペン前駆体は、テルペンシンターゼの基質である。
【００６８】
本明細書において、テルペンは、イソプレン単位（Ｃ５Ｈ８）に基づき、一般式Ｃ５ｘＨ８ｘ、例えば、Ｃ１０Ｈ１６を有する不飽和炭化水素である。テルペンへの言及は、非環式、単環式および多環式テルペンを含む。テルペンは、それだけには限らないが、１０個の炭素原子を含有するモノテルペン、１５個の炭素原子を含有するセスキテルペン、２０個の炭素原子を含有するジテルペンおよび３０個の炭素原子を含有するトリテルペンを含む。テルペンへの言及はまた、テルペンの立体異性体も含む。
【００６９】
本明細書において、テルペンシンターゼは、非環式ピロリン酸テルペン前駆体、例えば、ＦＰＰ、ＧＰＰまたはＧＧＰＰからの１種または複数のテルペンの形成を触媒できるポリペプチドである。
【００７０】
本明細書において、バレンセンは、以下の構造
【化１】
2013544084.tif 000002
を有するセスキテルペンである。バレンセンへの言及は、それだけには限らないが、（＋）−バレンセンを含めたその任意の異性体への言及を含む。
【００７１】
本明細書において、「バレンセンシンターゼ」または「バレンセンシンターゼポリペプチド」とは、非環式ピロリン酸テルペン前駆体、通常、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）からのバレンセンの形成を触媒できるポリペプチドである。通常、バレンセンシンターゼは、配列番号２に示されるバレンセン（ｖａｌｅｎｃｅ）シンターゼと、６３％、６５％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を超えるまたは、約６３％、６５％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を超える、または６３％、６５％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する。バレンセンは、非環式ピロリン酸テルペン前駆体の、バレンセンシンターゼとの反応から形成される唯一の生成物である場合も、生成物の混合物の１種である場合もある。バレンセンシンターゼの、非環式ピロリン酸テルペン前駆体との反応から生成されるバレンセンの量は、通常、反応において生成されるテルペンの総量の少なくともまたは少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上である。一部の例では、バレンセンは、生成される主なテルペンである（すなわち、非環式ピロリン酸テルペン前駆体の、バレンセンシンターゼとの反応から生成される任意のその他の単一テルペンよりも多い量で存在する）。
【００７２】
バレンセンシンターゼへの言及は、それだけには限らないが、組換えによって生成されたポリペプチド、合成によって生成されたポリペプチドならびに細胞およびそれだけには限らないが、柑橘類の皮を含めた植物から抽出または単離されたバレンセンシンターゼポリペプチドを含めた任意のバレンセンシンターゼポリペプチドを含む。例示的バレンセンシンターゼポリペプチドとして、柑橘類の果実、ブドウの木の花（例えば、ブドウゲヴェルツトラミネール種（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ  Ｌ．ｃｖ．Ｇｅｗｕｅｒｚｔｒａｍｉｎｅｒ）およびブドウカベルネ・ソーヴィニヨン種（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ  Ｌ．ｃｖ．Ｃａｂｅｒｎｅｔ  Ｓａｕｖｉｇｎｏｎ）（Lucker et al.、(2004) Phytochemistry 65(19):2649-59およびMartin et al.、(2009) Proc. Natl. Acad. Sci、USA 106:7245-7250参照のこと）配列番３４６および３４７）およびシソ属（青紫蘇）から単離されたものが挙げられる。バレンセンシンターゼの例示として、それだけには限らないが、スイートオレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）（スイートオレンジ）（配列番号２、２８９および７５２）およびグレープフルーツ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｘ  ｐａｒａｄｉｓｉ）（グレープフルーツ）（配列番号２、２９０および２９１）由来のバレンセンシンターゼを含めた柑橘類バレンセンシンターゼ（ＣＶＳ）がある。その他の例示的バレンセンシンターゼポリペプチドとして、ブドウゲヴェルツトラミネール種（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ  Ｌ．ｃｖ．Ｇｅｗｕｒｚｔｒａｍｉｎｅｒ）およびブドウカベルネ・ソーヴィニヨン種（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ  Ｌ．ｃｖ．Ｃａｂｅｒｎｅｔ  Ｓａｕｖｉｇｎｏｎ）を含めたブドウの木の花から単離されたバレンセンシンターゼ（配列番号３４６および３４７）およびアラスカヒノキペンデュラ（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ  ｐｅｎｄｕｌａ）から単離されたバレンセンシンターゼ（配列番号８８２および８８３）が挙げられる。バレンセンシンターゼへの言及は、任意の属または種に由来するバレンセンシンターゼおよび含まれる対立遺伝子または種変異体、スプライシング変異体によってコードされる変異体ならびに配列番号２に示されるバレンセンシンターゼに対して、少なくともまたは少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドを含めたそれらのその他の変異体を含む。バレンセンシンターゼはまた、バレンセンシンターゼ活性を保持するその断片も含む。
【００７３】
本明細書において、「バレンセンシンターゼ活性」（本明細書において、触媒活性とも呼ばれる）とは、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）などの非環式ピロリン酸テルペン前駆体からのバレンセンの形成を触媒する能力を指す。シンターゼの、ＦＰＰなどの非環式ピロリン酸テルペン前駆体との反応からのバレンセン形成を評価する方法は、当技術分野で周知であり、本明細書に記載されている。例えば、シンターゼを、ＦＰＰも生成する酵母細胞などの宿主細胞において発現させることができる。次いで、例えば、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）を使用して（以下の実施例を参照のこと）、バレンセンの生成を評価および定量化できる。シンターゼは、反応から生成されたバレンセンの量が、反応において生成されたテルペンの総量の少なくともまたは少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上である場合に、バレンセンシンターゼ活性またはＦＰＰなどの非環式ピロリン酸テルペン前駆体からのバレンセンの形成を触媒する能力を示すと考えられる。
【００７４】
本明細書において、バレンセンシンターゼの活性に関して「増大した触媒活性」とは、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）などの非環式ピロリン酸テルペン前駆体からのバレンセンの形成を触媒する能力が増大し、それによって、バレンセンの形成の増大がもたらされることを意味する。本明細書における目的上、バレンセンシンターゼは、改変されたバレンセンシンターゼによってＦＰＰから生成されたバレンセンの量が、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼによってＦＰＰから生成されるバレンセンの量よりも１０％〜５００％、１０％〜２５０％、５０％〜２５０％、１００％〜５００％多いか、または１００％〜２５０％多い、例えば、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼによってＦＰＰから生成されるバレンセンの量よりも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、５００％またはそれ以上多い場合に、増大した触媒活性を示す。例えば、バレンセンシンターゼは、改変されたバレンセンシンターゼによってＦＰＰから生成されたバレンセンの量が、同一条件下で配列番号２に示される野生型バレンセンシンターゼによってＦＰＰから生成されたバレンセンの量の少なくともまたはおよそ少なくとも１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、５００％、１５００％、２０００％、３０００％、４０００％、５０００％である場合に、増大した触媒活性を示す。
【００７５】
本明細書において、バレンセンシンターゼに関して「野生型」または「天然の」とは、植物を含めた生物中に実際に存在する対立遺伝子変異体を含めた、天然の、または天然に存在するバレンセンシンターゼ遺伝子によってコードされるバレンセンシンターゼポリペプチドを指す。種を考慮しない野生型バレンセンシンターゼへの言及は、任意の種の野生型バレンセンシンターゼを包含するものとする。例示的バレンセンシンターゼのアミノ酸配列は、配列番号２（バレンシアオレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  ｃｖ．Ｖａｌｅｎｃｉａ）、カラカラオレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  ｃｖ．Ｃａｒａ  Ｃａｒａ）およびグレープフルーツ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｘ  ｐａｒａｄｉｓｉ）から単離された）、配列番号２８９（バレンシアオレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  ｃｖ．Ｖａｌｅｎｃｉａ）から単離された）および配列番号２９０（グレープフルーツ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｐａｒａｄｉｓｉ）から単離された）および配列番号２９１（グレープフルーツ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｘ  ｐａｒａｄｉｓｉ）から単離された）に示されている。
【００７６】
本明細書において、種変異体とは、スイートオレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）およびグレープフルーツ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｘ  ｐａｒａｄｉｓｉ）のような異なる柑橘類種を含めた、異なる種間のポリペプチドにおける変異体を指す。
【００７７】
本明細書において、対立遺伝子変異体とは、同一種のメンバー間のコードされるタンパク質における変動を指す。
【００７８】
本明細書において、スプライシング変異体とは、２種以上のｍＲＮＡをもたらすゲノムＤＮＡの一次転写物の差次的プロセシングによって生じた変異体を指す。
【００７９】
本明細書において、「改変されたバレンセンシンターゼポリペプチド」とは、非改変または野生型バレンセンシンターゼポリペプチドと比較して、１個または複数のアミノ酸の相違を有するバレンセンシンターゼポリペプチドを指す。１個または複数のアミノ酸の相違は、１個または複数のアミノ酸置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ）（置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ））、挿入または欠失などのアミノ酸突然変異である場合も、ドメイン全体の挿入または欠失である場合も、それらの任意の組合せである場合もある。通常、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、非改変または野生型バレンセンシンターゼポリペプチドと比較して、一次配列中に１つまたは複数の改変を有する。例えば、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、非改変バレンセンシンターゼポリペプチドと比較して、少なくとも１、５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５個またはそれ以上のアミノ酸の相違を有し得る。得られるポリペプチドが、例えば、触媒活性、ＦＰＰと結合する能力および／またはＦＰＰからのバレンセンの形成を触媒する能力などの野生型バレンセンシンターゼポリペプチドと関連する少なくとも１種のバレンセンシンターゼ活性を示す限り、任意の改変が考慮される。
【００８０】
本明細書において、野生型バレンセンシンターゼなどの参照バレンセンシンターゼによってＦＰＰから生成されるバレンセンの量よりも多い量での、ＦＰＰからバレンセンを生成する改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドへの言及は、改変されたバレンセンシンターゼが、参照バレンセンシンターゼが生成するよりも、ＦＰＰから少なくともまたは約１０％多いバレンセンを生成することを示す。例えば、このような改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、参照バレンセンシンターゼによってＦＰＰから生成されるバレンセンの量と比較して、ＦＰＰから少なくともまたは少なくとも約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、２０００％、５０００％またはそれより多いバレンセンを生成できる。バレンセンシンターゼによってＦＰＰから生成されるバレンセンの量は、当技術分野で公知の任意の方法によって評価できる。改変されたバレンセンシンターゼおよび参照バレンセンシンターゼ、例えば、野生型バレンセンシンターゼなどの２種のバレンセンシンターゼによってＦＰＰから生成されるバレンセンの量を比較する場合には、アッセイは、各シンターゼに対して同一条件下で実施されるということは理解される。一例では、改変されたバレンセンシンターゼおよび参照バレンセンシンターゼなどの２種のバレンセンシンターゼによってＦＰＰから生成されるバレンセンの量を、ＦＰＰも生成する同一株の酵母細胞において、改変されたバレンセンシンターゼおよび参照バレンセンシンターゼを別個にを発現させること（ここで、発現は、同一発現ベクターからである）およびバレンセンが生成される同一条件下で細胞を培養することによって評価する。当技術分野で周知の定量化法、例えば、ＧＣ−ＭＳを使用して、改変されたバレンセンシンターゼを発現する細胞培養物中で生成されるバレンセンの量を、参照バレンセンシンターゼを発現する細胞培養物中で生成されるバレンセンの量と比較する。
【００８１】
本明細書において、「ＣＶＳ番号付け」とは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼのアミノ酸番号付けを指す。配列番号２に示されるもの以外のシンターゼ中のアミノ酸残基は、その他のテルペンシンターゼの、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼとのアラインメントによって、ＣＶＳ番号付けによって同定され得る。このような例では、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼのアミノ酸とアラインするか、または対応するテルペンシンターゼのアミノ酸（すなわち、対応する残基）が、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼアミノ酸の番号付けによって同定される。図１は、バレンセンシンターゼポリペプチドのＣＶＳ番号付けを表す。図４は、例示的なその他のテルペンシンターゼのＣＶＳ番号付けを表す。例えば、図１では、図は、配列番号２に基づくＣＶＳ番号付けによって、アミノ酸残基２４が、配列番号２９０、２９１、７５２、２８９および８８６に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドではＫ（Ｌｙｓ）であり、配列番号３に示されるバレンセンシンターゼではＡ（Ａｌａ）であり、配列番号４に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドではＱであることを表す。図４に関しては、図は、配列番号２に基づくＣＶＳ番号付けによって、アミノ酸残基２４は、配列番号２９５または９４１に示されるＴＥＡＳではＳであり、配列番号９４２に示されるＨＰＳではＳであり、配列番号３４６または３４７に示されるブドウ属（Ｖｉｔｉｓ）由来のバレンセンシンターゼではＴであり、配列番号８８７に示されるＶ２７７変異体バレンセンシンターゼではＴであることを表す。
【００８２】
本明細書において、対応する残基とは、アラインされた遺伝子座で生じる残基を指す。関連ポリペプチドまたは変異体ポリペプチドは、当業者に公知の任意の方法によってアラインされる。このような方法は、通常、マッチを最大にし、手作業によるアラインメントを使用することならびに利用可能な多数のアラインメントプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ）および当業者に公知のその他のものを使用することによるなどの方法を含む。ポリペプチドの配列をアラインすることによって、当業者ならば、ガイドとして保存されたアミノ酸残基および同一のアミノ酸残基を使用して対応する残基を同定できる。対応する位置はまた、例えば、コンピュータシミュレーションしたタンパク質構造のアラインメントを使用することによって、構造アラインメントを基にしてもよい。例えば、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼのアミノ酸残基Ｒ２６４、Ｗ２７３、Ｔ４０３、Ｙ４０４、Ｃ４４１およびＤ４４５は、配列番号２９５に示されるタバコエピアリストロチェンシンターゼのアミノ酸残基Ｒ２６４、Ｗ２７３、Ｔ４０３、Ｙ４０４、Ｃ４４０およびＤ４４４に対応する。別の例では、配列番号２のアミノ酸位置２２１におけるチロシン（Ｙ２２１）は、配列番号２８９のアミノ酸位置２２１におけるシステイン（Ｃ２２１）に対応する。その他の例では、対応する領域が同定され得る。例えば、バレンセンシンターゼの不定形ループ２（配列番号２のアミノ酸５３〜５８）は、配列番号２９５に示されるタバコエピアリストロチェンシンターゼ（ＴＥＡＳ）ポリペプチドのアミノ酸５８〜６３に対応する（図２参照のこと）。
【００８３】
本明細書における目的上、「配列番号２に基づくＣＶＳ番号付けを用いる、位置・・・に対応する」のような改変への言及または同様の語句は、改変されている同定されたアミノ酸残基が、配列番号２中のアミノ酸番号によって示されるようなアミノ酸残基および別のシンターゼ中のこのような残基とアラインするアミノ酸残基であることを意味する。したがって、例えば、配列番号２中のＹ２２１Ｖに対応するアミノ酸置換などの改変への言及は、配列番号２の位置２２１のチロシンのバリンでのアミノ酸置換を含み、任意のその他の同様のポリペプチドまたは関連ポリペプチド中の配列番号２の位置２２１に対応する（またはそれとアラインする）位置の内因性アミノ酸残基の、チロシンでの置換も含む。例えば、配列番号２８９の位置２２１のシステインの、チロシンでの置換（Ｃ２２１Ｖ）も含まれる。
【００８４】
本明細書において、ドメインまたは領域（通常、３個以上、一般に、５または７個以上のアミノ酸の配列）とは、分子のその他の部分とは構造的および／または機能的に別個であり、同定可能であるタンパク質またはコーディング核酸などの分子の一部を指す。タンパク質は、１つまたは２つ以上の別個のドメインを有し得る。例えば、ドメインは、その他のテルペンシンターゼなどの関連ファミリーメンバーとの、その中の配列の相同性によって、同定、定義または区別され得る。ドメインは、アミノ酸の直線配列である場合も、アミノ酸の非直線配列である場合もある。多数のポリペプチドが、複数のドメインを含有する。このようなドメインは、当業者によって、公知であり、同定され得る。本明細書における例示のために、定義が提供されるが、名称によって特定のドメインを認識することは、十分に、当技術分野における技術の範囲内であるということは理解される。ドメインを同定するために、必要に応じて、適当なソフトウェアを使用してもよい。例えば、上記で論じたように、当技術分野で周知のツールおよびアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ）を使用してなど、配列アラインメントによって異なるテルペンシンターゼ中の対応するドメインを同定できる。
【００８５】
本明細書において、機能性ドメインとは、触媒活性などの機能活性によって認識されるポリペプチドの部分を指す。機能性ドメインは、触媒活性によってなど、その機能によって、または基質結合もしくは金属結合などの生体分子と相互作用する能力によって区別され得る。一部の例では、ドメインは、独立に、生物学的機能または特性を示すことができ、その結果、ドメインは、独立にか、または別の分子と融合して、例えば、触媒活性または基質結合などの活性を実施できる。
【００８６】
本明細書において、構造ドメインとは、１つまたは複数の構造モチーフで構成されているタンパク質内で独立にフォールディングされる構造を形成できるポリペプチド鎖の部分を指す。
【００８７】
本明細書において、アミノ酸または核酸配列に関して「異種」とは、天然のポリペプチドには存在しないか、または天然のポリヌクレオチドによってコードされない配列の部分を指す。例えば、バレンセンシンターゼのポリペプチドのアミノ酸の一部、例えば、ドメインまたは領域またはその一部は、このようなアミノ酸が、天然または野生型バレンセンシンターゼ（例えば、配列番号２に示されるような）中に存在しない場合に、またはそれをコードするポリヌクレオチドによってコードされない場合にそれに対して異種である。このような異種アミノ酸を含有するポリペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドは、それぞれ、「キメラポリペプチド」または「キメラポリヌクレオチド」と呼ばれる。
【００８８】
本明細書において、語句「改変テルペンシンターゼの特性が、第１のテルペンシンターゼと比較して改善されている」とは、改変（単数または複数）を含有しないテルペンシンターゼと比較した、改変テルペンシンターゼの特性における望ましい変化を指す。通常、特性（単数または複数）は、基質の、改変テルペンシンターゼとの反応から生成される所望のテルペンの量が、基質の、そのように改変されていないテルペンシンターゼとの反応から生成される所望のテルペンの量と比較して増大されるよう改善される。改変テルペンシンターゼにおいて改善され得る例示的特性として、例えば、テルペン生成、触媒活性、生成物分布、基質特異性、位置選択性および立体選択性が挙げられる。特性が改善されている（すなわち、所望のテルペン（単数または複数）の生成にとってより望ましいものであるよう変更されている）かどうかを調べるために、当技術分野で周知の方法を使用して１種または複数の特性を評価できる。
【００８９】
本明細書において、テルペン生成（テルペン収量とも呼ばれる）とは、非環式ピロリン酸テルペン前駆体の、テルペンシンターゼとの反応から生成されるテルペンの量（重量または重量／容量での）を指す。総テルペン生成への言及は、反応から生成されるすべてのテルペンの総量を指し、一方で、特定のテルペン生成への言及とは、反応から生成される特定のテルペン（例えば、バレンセン）の量をを指す。
【００９０】
本明細書において、改善されたテルペン生成とは、非環式ピロリン酸テルペン前駆体の、改変されたテルペンシンターゼとの反応から生成される、同一非環式ピロリン酸テルペン前駆体の、そのように改変されていないテルペンシンターゼとの反応から生成される量と比較した、テルペンの総量（すなわち、改善された総テルペン生成）の増大または特定のテルペンの量（すなわち、改善された特定のテルペン生成）の増大を指す。非環式ピロリン酸テルペン前駆体の、改変テルペンシンターゼとの反応から生成される（総または特定の）テルペンの量は、同一非環式ピロリン酸テルペン前駆体の、同一条件下での、そのように改変されていないテルペンシンターゼとの反応から生成されるテルペンの量と比較して、少なくともまたは少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはそれ以上増大させることができる。
【００９１】
本明細書において、基質特異性とは、バレンセンシンターゼの、ある標的基質に対する、別のものを上回る、例えば、ある非環式ピロリン酸テルペン前駆体（例えば、ファルネシル−ピロリン酸（ＦＰＰ）、ゲラニル−ピロリン酸（ＧＰＰ）またはゲラニルゲラニル−ピロリン酸（ＧＧＰＰ））に対する別のものを上回る優先傾向を指す。基質特異性は、ｋｃａｔ／Ｋｍを算出するものなどの当技術分野で周知の方法を使用して評価できる。例えば、基質特異性は、種々の基質（例えば、ＧＰＰ、ＦＰＰ、ＧＧＰＰ）の酵素の触媒効率の尺度である、相対Ｋｃａｔ／Ｋｍを比較することによって評価できる。
【００９２】
本明細書において、変更された特異性とは、改変テルペンシンターゼポリペプチド（改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドなど）の、そのように改変されていないテルペンシンターゼ（例えば、野生型バレンセンシンターゼなど）と比較した基質特異性の変化を指す。ＦＰＰ、ＧＰＰまたはＧＧＰＰなどの基質に対する改変テルペンシンターゼポリペプチドの特異性（例えば、ｋｃａｔ／Ｋｍ）は、出発バレンセンシンターゼの、同一基質に対する特異性と比較して、少なくともまたは少なくとも約１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはそれ以上変更することができる。
【００９３】
本明細書において、改善された基質特異性とは、基質特異性の、より所望の特異性への変化または変更を指す。例えば、改善された基質特異性は、改変テルペンシンターゼポリペプチドの、ＦＰＰ、ＧＰＰまたはＧＧＰＰなどの所望の基質に対する基質特異性の増大を含み得る。改変テルペンシンターゼポリペプチドの、ＦＰＰ、ＧＰＰまたはＧＧＰＰなどの基質に対する特異性（例えば、ｋｃａｔ／Ｋｍ）は、そのように改変されていないテルペンシンターゼの特異性と比較して、少なくともまたは少なくとも約１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはそれ以上増大させることができる。
【００９４】
本明細書において、「生成物分布」とは、ＦＰＰなどの非環式ピロリン酸テルペン前駆体と、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを含めたテルペンシンターゼの間の反応から生成される種々のテルペンの相対量を指す。生成されたテルペンの量は、テルペンシンターゼによって生成された総生成物のパーセンテージとして表すことができる。例えば、ＦＰＰの、バレンセンシンターゼとの反応から得られる生成物分布は、９０％（重量／容量）バレンセンおよび１０％（重量／容量）ゲルマクレンＡであり得る。溶液中のテルペンの種類および量を評価する方法は、当技術分野で周知であり、本明細書に記載されており、これとして、例えば、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）（以下の実施例を参照のこと）が挙げられる。
【００９５】
本明細書において、変更された生成物分布とは、ＦＰＰなどの非環式ピロリン酸テルペン前駆体と、バレンセンシンターゼなどのテルペンシンターゼ間の反応から生成された個々のテルペンの相対量の変化を指す。通常、変化は、第１のシンターゼ（例えば、野生型シンターゼ）を使用して非環式ピロリン酸テルペン前駆体から生成された個々のテルペンの相対量を決定すること、次いで、それを第２のシンターゼ（例えば、改変シンターゼ）を使用して生成された個々のテルペンの相対量に対して比較することによって評価する。変更された生成物分布は、任意の１種または複数のテルペンの相対量が、少なくともまたは少なくとも約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０またはそれ以上増大または減少している場合に起こると考えられる。
【００９６】
本明細書において、改善された生成物分布とは、より望ましいもの、すなわち、より望ましい相対量のテルペンを含有するものへの生成物分布の変化を指す。例えば、改善された生成物分布は、増大した量の所望のテルペンおよび減少した量のそのように所望ではないテルペンを含有し得る。改善された生成分布における所望のテルペンの量は、少なくともまたは少なくとも約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはそれ以上増大させることができる。改善された生成分布における所望ではないテルペンの量は、少なくともまたは少なくとも約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはそれ以上減少させることができる。
【００９７】
本明細書において、核酸または核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）を含めたその類似体およびそれらの混合物を含む。核酸は、一本鎖であっても、二本鎖であってもよい。所望により、蛍光または放射標識などの検出可能な標識などで標識されていてもよい、プローブまたはプライマーへ言及する場合には、一本鎖分子が考慮される。このような分子は、ライブラリーをプロービングまたはプライミングするために、通常、その標的が統計上独特であるような長さのものであり、低コピー数（通常、５未満、一般に、３未満）のものである。一般に、プローブまたはプライマーは、対象とする遺伝子に対して相補的または同一である、少なくとも１４、１６または３０個の連続したヌクレオチドの配列を含有する。プローブおよびプライマーは、１０、２０、３０、５０、１００またはそれより長い核酸長であり得る。
【００９８】
本明細書において、用語ポリヌクレオチドとは、５’から３’末端に読まれるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡおよびＤＮＡを含み、天然の供給源から単離される場合も、インビトロで合成される場合も、または天然分子および合成分子の組合せから調製される場合もある。ポリヌクレオチド分子の長さは、ヌクレオチド（「ｎｔ」と略された）または塩基対（「ｂｐ」と略された）の用語で本明細書において与えられている。用語ヌクレオチドは、文脈が許す場合には、一本鎖および二本鎖分子に対して使用される。この用語が、二本鎖分子に適用される場合には、長さ全体を示すよう使用され、用語塩基対と同等であると理解される。当業者ならば、二本鎖ポリヌクレオチドの２つの鎖の長さがわずかに異なる場合もあることおよびその末端がずれている場合もあり、したがって、二本鎖ポリヌクレオチド分子内のすべてのヌクレオチドが対を形成していない場合もあることは認識されよう。このような不対末端は、一般に、２０ヌクレオチド長を超えない。
【００９９】
本明細書において、異種核酸とは、それが発現される細胞によって、普通は、インビボで生成されないか、または細胞によって生成されるが異なる遺伝子座にあるか、もしくは異なって発現されるか、または転写、翻訳もしくはその他の調節可能な生化学的プロセスに影響を及ぼすことによって、ＤＮＡなどの内因性核酸の発現を変更するメディエーターを媒介するか、もしくはコードする核酸である。異種核酸は、一般に、それが導入されている細胞にとって内因性ではなく、別の細胞から得られたか、または合成によって調製されたものである。異種核酸は、内因性である場合もあるが、異なる遺伝子座から発現されるか、その発現が変更されている核酸である。一般に、必ずしもそうではないが、このような核酸は、普通は、それが発現される細胞によって生成されないか、その細胞では同じ方法で生成されないＲＮＡおよびタンパク質をコードする。異種核酸、例えば、ＤＮＡはまた、外来核酸、例えば、ＤＮＡとも呼ばれることがある。したがって、異種核酸または外来核酸は、対応物核酸分子、例えば、ＤＮＡとして正確な配向または位置で存在しない核酸分子を含み、ゲノム中に見られる。別の生物または種に由来する（すなわち、外因性）核酸分子を指す場合もある。
【０１００】
当業者が、核酸が発現される細胞にとって異種または外来と認識し、考える任意の核酸、例えば、ＤＮＡが、異種核酸によって本明細書に包含され、異種核酸は、外因的に添加され、同様に内因的に発現される核酸も含む。異種核酸の例として、それだけには限らないが、薬物耐性を付与するタンパク質などの追跡可能なマーカータンパク質をコードする核酸、治療上有効な物質、例えば、抗癌剤、酵素およびホルモンをコードする核酸およびその他の種類のタンパク質、例えば、抗体をコードするＤＮＡなどの核酸が挙げられる。異種核酸によってコードされる抗体は、異種核酸が導入されている細胞の表面に分泌または発現され得る。
【０１０１】
本明細書において、ペプチドとは、２〜４０個のアミノ酸長であるポリペプチドを指す。
【０１０２】
本明細書において、本明細書において提供されるアミノ酸の種々の配列中に生じるアミノ酸は、その公知の三文字または一文字略語に従って同定される（表１）。種々の核酸断片中に生じるヌクレオチドは、当技術分野で日常的に使用される標準的な一文字命名を用いて命名されている。
【０１０３】
本明細書において、「アミノ酸」とは、アミノ基およびカルボン酸基を含有する有機化合物である。ポリペプチドは、２個以上のアミノ酸を含有する。本明細書における目的上、アミノ酸は、２０種の天然に存在するアミノ酸、非天然アミノ酸およびアミノ酸類似体（すなわち、α−炭素が側鎖を有するアミノ酸）を含む。
【０１０４】
J. Biol. Chem., 243:3557-3559 (1968)に記載され、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１−１．８２２に採用された標準ポリペプチド命名法を踏まえて、アミノ酸残基の略語は、表１に示されている。
【０１０５】
【表１】
2013544084.tif 000003
【０１０６】
式によって本明細書において表されるすべてのアミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシル末端の従来方向に左から右の配向を有するということは、留意しなくてはならない。さらに、語句「アミノ酸残基」は、対応表（表１）に列挙されるアミノ酸および３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１−１．８２２に参照され、本明細書において参照により組み込まれるものなどの改変されたアミノ酸および普通でないアミノ酸を含むよう広く定義される。さらに、アミノ酸残基配列の始めまたは最後のダッシュ記号は、１個または複数のアミノ酸残基のさらなる配列との、ＮＨ２などのアミノ末端基との、またはＣＯＯＨなどのカルボキシル末端基とのペプチド結合を示すことは留意しなければならない。
【０１０７】
本明細書において、「天然に存在するアミノ酸」とは、ポリペプチド中に生じる２０種のＬ−アミノ酸を指す。
【０１０８】
本明細書において、「非天然アミノ酸」とは、表１に列挙される天然に存在するアミノ酸のうち１種ではない、アミノ基およびカルボン酸基を含有する有機化合物を指す。したがって、天然に存在しないアミノ酸は、例えば、アミノ酸または２０種の天然に存在するアミノ酸以外のアミノ酸の類似体を含み、それだけには限らないが、アミノ酸のＤ−イソステレオマー（ｉｓｏｓｔｅｒｅｏｍｅｒｓ）を含む。例示的非天然アミノ酸は、当業者に公知であり、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチド中に含まれ得る。
【０１０９】
本明細書において、改変は、ポリペプチドのアミノ酸の配列または核酸分子中のヌクレオチドの配列の改変に関連しており、それぞれ、アミノ酸およびヌクレオチドの欠失、挿入および置換を含む。本明細書における目的上、アミノ酸置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ）（または置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ））、欠失および／または挿入は、本明細書において提供されるバレンセンシンターゼのいずれにおいても行うことができる。改変は、保存的アミノ酸置換およびまた非保存的アミノ酸置換を行うことによって行うことができる。例えば、バレンセンシンターゼの特性を望ましくか、または有利に変更するアミノ酸置換を行うことができる。例えば、得られた改変されたバレンセンシンターゼが、非改変バレンセンシンターゼと比較して、ＦＰＰから、より多くのバレンセンを生成できるようなアミノ酸置換を、バレンセンシンターゼに行うことができる。
【０１１０】
考慮されるアミノ酸置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ）または置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）として、それだけには限らないが、表２に示されるものを含めた保存的置換が挙げられる。アミノ酸の適した保存的置換は、当業者に公知であり、一般に、ポリペプチドのコンホメーションまたは活性を変更することなく行うことができる。当業者ならば、一般に、ポリペプチドの非必須領域中の単一のアミノ酸置換は、生物活性を実質的に変更しないことを認識している（例えば、Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., p.224参照のこと）。保存的アミノ酸置換は、例えば、以下の表２に示されるものに従って行われる：
【０１１１】
【表２】
2013544084.tif 000004
【０１１２】
その他の保存的置換も許容され、経験的にまたは公知の保存的置換に従って決定され得る。このような置換の効果は、Altschul(J. Mol. Biol. 219:55565 (1991))に論じられるＰＡＭ１２０、ＰＡＭ−２００およびＰＡＭ−２５０のような置換スコアマトリックスを使用して算出できる。
【０１１３】
本明細書において、「一次配列」とは、ポリペプチド中のアミノ酸残基の配列を指す。
【０１１４】
本明細書において、２種のタンパク質または核酸間の「類似性」とは、タンパク質のアミノ酸の配列または核酸のヌクレオチド配列間の関連性を指す。類似性は、それに含有される残基の配列の同一性および／または相同性の程度に基づき得る。タンパク質または核酸間の類似性の程度を評価する方法は、当業者に公知である。例えば、配列類似性を評価する一方法では、２種のアミノ酸またはヌクレオチド配列を配列間で最大レベルの同一性を生じる様式でアラインする。「同一性」とは、アミノ酸またはヌクレオチド配列が不変である程度を指す。アミノ酸配列およびある程度までは、ヌクレオチド配列のアラインメントも、アミノ酸（またはヌクレオチド）における保存的相違および／または頻繁な置換を考慮し得る。保存的相違とは、関与する残基の物理化学的特性を保つものである。アラインメントは、グローバル（配列の全長にわたり、すべての残基を含む比較される配列のアラインメント）またはローカル（最も類似した領域または複数の領域のみを含む配列の一部のアラインメント）であり得る。
【０１１５】
本明細書において、用語「相同性」および「同一性」とは、ポリペプチド（またはコーディング核酸分子）間およびそれらの間の関連性を説明するために使用される。同一性とは、同一な配列を指し、相同性は、保存的アミノ酸変化を含み得る。一般に、対応する位置を同定するために、最高次のマッチが得られるようアミノ酸の配列をアラインする（:Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M.、およびGriffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987;ならびにSequence Analysis Primer, Gribskov, M.およびDevereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073参照のこと)。
【０１１６】
本明細書において、「配列同一性」とは、試験および参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の比較における、同一なアミノ酸（またはヌクレオチド塩基）の数を指す。相同ポリペプチドとは、所定数の同一アミノ酸残基または保存的アミノ酸残基を有する２種以上のペプチドを指す。相同性はまた、コードされるアミノ酸を変化させない置換（すなわち、「サイレント置換」）を含む。配列同一性は、各供給業者によって確立されたデフォルトギャップペナルティーを用いて使用される標準的なアラインメントアルゴリズムプログラムによって決定できる。相同核酸分子とは、所定数の同一または相同なヌクレオチドを有する２種以上のヌクレオチドを指す。実質的に相同な核酸分子は、通常、核酸の長さのすべてに沿ってか、または対象とする全長核酸分子の少なくとも約７０％、８０％または９０％に沿って、中程度のストリンジェンシーで、または高ストリンジェンシーでハイブリダイズする。また、ハイブリダイズする核酸分子中のコドンの代わりに縮重コドンを含有する核酸分子も考慮される。（タンパク質の相同性を決定するために、保存的アミノ酸ならびに同一アミノ酸をアラインしてもよい。この場合には、同一性のパーセンテージおよびパーセンテージ相同性は変わる）。任意の２種の核酸分子が、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％「同一である」ヌクレオチド配列を有するかどうか（または任意の２種のポリペプチドが、アミノ酸配列を有するかどうか）、例えば、Pearson et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444(1988)におけるようなデフォルトパラメータを使用する「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの既知コンピュータアルゴリズムを使用して決定できる（その他のプログラムとして、ＧＣＧプログラムパッケージ(Devereux, J. et al. (1984) Nucleic Acids Research 12(I):387(1984)、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ(Altschul, S.F. et al. J. Molec. Biol. 215:403(1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, (1994)およびCarrillo et al. SIAM J Applied Math 48:1073(1988))が挙げられる）。例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎデータベースのＢＬＡＳＴ関数を使用して同一性を決定できる。その他の市販の、または公的に入手可能なプログラムとして、ＤＮＡＳｔａｒ「ＭｅｇＡｌｉｇｎ」プログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  （ＵＷＧ）「Ｇａｐ」プログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）が挙げられる。タンパク質および／または核酸分子の相同性または同一性パーセントは、例えば、ＧＡＰコンピュータプログラム（例えば、SmithおよびWaterman(Adv. Appl. Math. 2:482(1981)によって修正されたようなNeedleman et al. J. Mol. Biol.48:443 (1970))を使用して配列情報を比較することによって決定できる。手短には、ＧＡＰプログラムは、２種の配列のうち短いほうの記号の総数によって除された、類似であるアラインされた記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数として類似性を規定する。ＧＡＰプログラムのデフォルトパラメータは：（１）単項比較マトリックス（同一性に対して１および非同一性に対して０の値を含有する）ならびにSchwartzおよびDayhoff, eds.,Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation、pp. 353-358 (1979)によって記載される、Gribskov et al. Nucl. Acids Res. 14:6745 (1986)の加重比較マトリックス；（２）各ギャップに対して３．０のペナルティーおよび各ギャップ中の各記号に対してさらなる０．１０のペナルティーならびに（３）末端ギャップに対するペナルティーなしを含む。Ｃｌｕｓｔａｌ分析を使用して、ヌクレオチドまたはタンパク質配列のいずれかをアラインし、その同一性および類似性のレベルをスコア化してもよい（ebi.ac.uk/Tools/msa/clusalw2/またはebi.ac.uk/ebisearch/search.ebi?db=medline&t=clustal*で入手可能）。
【０１１７】
したがって、本明細書において、用語「同一性」とは、試験および参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の比較を表す。１つの限定されない例では、「と少なくとも９０％同一である」とは、参照ポリペプチドに対して９０〜１００％の同一性パーセントを指す。９０％またはそれより高いレベルの同一性は、例示目的で、１００個のアミノ酸の試験および参照ポリペプチドの長さが比較されると仮定して、試験ポリペプチド中のアミノ酸の１０％（すなわち、１００個のうち１０個）以下が参照ポリペプチドのものとは異なっているという事実を示す。試験および参照ポリヌクレオチド間で同様の比較を行うことができる。このような相違は、アミノ酸配列の全長にわたって無作為に分配された点突然変異として表される場合もあり、または最大の許容可能な、例えば、１０／１００のアミノ酸の相違（およそ９０％の同一性）までの変動する長さの１つまたは複数の位置に密集している場合もある。相違は、核酸またはアミノ酸置換、挿入または欠失として定義される。約８５〜９０％を上回る相同性または同一性のレベルでは、結果は、プログラムおよびギャップパラメータセットとは無関係であるはずであり、このような高レベルの同一性は、多くの場合、ソフトウェアに頼らずに容易に評価できる。
【０１１８】
本明細書において、用語「実質的に同一」または「類似している」は、関連技術分野の当業者によって理解されるように文脈に応じて変わるが、当業者ならばこのようなものを評価できるということも理解される。
【０１１９】
本明細書において、アラインされた配列とは、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列において対応する位置をアラインするための、相同性（類似性および／または同一性）の使用を指す。通常、５０％以上の同一性によって関連している２種以上の配列がアラインされる。アラインされた配列のセットとは、対応する位置でアラインされている２種以上の配列を指し、ゲノムＤＮＡ配列とアラインされた、ＥＳＴおよびその他のｃＤＮＡなどのＲＮＡに由来するアラインしている配列を含み得る。
【０１２０】
本明細書において、単離または精製されたポリペプチドまたはタンパク質またはその生物学的に活性な部分は、タンパク質が由来する組織の細胞に由来する細胞物質もしくはその他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、または化学的に合成される場合には化学前駆体もしくはその他の化学物質を実質的に含まない。調製物は、このような純度を評価するために当業者によって使用される、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの分析の標準法によって決定されるように、容易に検出可能な不純物を含まないと思われる場合に、実質的に含まないと決定され得るか、またはさらなる精製が、物質の、タンパク質分解活性および生物活性などの物理的および化学的特性を検出可能に変更しないよう十分に純粋であると決定され得る。実質的に化学的に純粋な化合物を生成するための化合物の精製方法は、当業者に公知である。しかし、実質的に化学的に純粋な化合物は、立体異性体の混合物であり得る。このような例では、さらなる精製は、化合物の比活性を増大し得る。
【０１２１】
用語、細胞物質を実質的に含まないとは、バレンセンシンターゼまたはテルペンが、それが単離または生成される細胞の細胞成分から分離されているバレンセンシンターゼまたはテルペン生成物の調製物を含む。一実施形態では、用語、細胞物質を実質的に含まないとは、約３０％、２０％、１０％、５％（乾重で）未満（ｌｅｓｓ  ｔｈａｔ）またはそれより少ない、細胞培養培地を含めた非バレンセンシンターゼまたはテルペンタンパク質または生成物を有する、バレンセンシンターゼまたはテルペン生成物の調製物を含む。
【０１２２】
本明細書において、組換えＤＮＡ法を使用することによる組換え法による生成とは、クローニングされたＤＮＡによってコードされるタンパク質を発現するための分子生物学の周知の方法の使用を指す。
【０１２３】
本明細書において、ベクター（またはプラスミド）とは、異種核酸をその発現または複製いずれかのために細胞中に導入するために使用される別個のＤＮＡエレメントを指す。通常、ベクターは、エピソームのままであるが、遺伝子またはその一部のゲノムの染色体への組み込みを達成するよう設計できる。また、細菌人工染色体、酵母人工染色体および哺乳動物人工染色体などの人工染色体であるベクターも考慮される。このような媒体の選択および使用は、当業者には周知である。
【０１２４】
本明細書において、発現とは、核酸がｍＲＮＡに転写され、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。核酸がゲノムＤＮＡに由来する場合には、発現は、適当な真核細胞宿主細胞または生物が選択される場合には、ｍＲＮＡのスプライシングなどのプロセシングを含む。
【０１２５】
本明細書において、発現ベクターは、プロモーター領域などの調節配列と作動可能に連結しているＤＮＡを発現できるベクターを含み、プロモーター領域などの調節配列は、このようなＤＮＡ断片の発現を達成できる。このようなさらなるセグメントは、プロモーターおよび終結配列を含むことができ、所望により、１種または複数の複製起点、１種または複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどを含み得る。発現ベクターは、一般に、プラスミドまたはウイルスＤＮＡに由来するか、または両方のエレメントを含有し得る。したがって、発現ベクターとは、プラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは適当な宿主細胞に導入するとクローニングされたＤＮＡの発現をもたらすその他のベクターなどの組換えＤＮＡまたはＲＮＡコンストラクトを指す。適当な発現ベクターは、当業者には周知であり、真核細胞および／または原核細胞において複製可能であるものおよびエピソームのままであるものまたは宿主細胞ゲノムに組み込まれるものが挙げられる。
【０１２６】
本明細書において、ベクターはまた、「ウイルスベクター」または「ウイルス性ベクター」を含む。ウイルス性ベクターとは、（媒体またはシャトルとして）外因性遺伝子を細胞中に移入するよう、外因性遺伝子と作動可能に連結されている操作されたウイルスである。
【０１２７】
本明細書において、アデノウイルスとは、ヒトにおいて結膜炎および上気道感染を引き起こす、ＤＮＡを含有するウイルスの任意の群を指す。
【０１２８】
本明細書において、裸のＤＮＡとは、ワクチンおよび遺伝子療法のために使用できるヒストンを含まないＤＮＡを指す。裸のＤＮＡは、形質転換またはトランスフェクションと呼ばれる遺伝子移入プロセスの際に細胞から細胞に伝えられる遺伝物質である。形質転換またはトランスフェクションでは、レシピエント細胞によって取り込まれる精製ＤＮＡまたは裸のＤＮＡが、レシピエント細胞に新規特徴または表現型をもたらす。
【０１２９】
本明細書において、ＤＮＡセグメントを指す場合に、作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）または作動可能に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結されたとは、セグメントがその意図される目的に合わせて機能する、例えば、転写が、プロモーターで始まり、コーディングセグメントを通って、ターミネーターまで進行するよう配置されていることを意味する。
【０１３０】
本明細書において、「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」とは、異なるポリペプチドと作動可能に連結されたポリペプチドを指す。本明細書において提供されるキメラまたは融合タンパク質は、１種または複数のバレンセンシンターゼポリペプチドまたはその一部と、転写／翻訳制御シグナル、シグナル配列、局在性のためのタグ、精製のためのタグ、免疫グロブリンＧのドメインの一部および／または標的化薬剤のうちいずれか１種または複数に対する１種または複数のその他のポリペプチドとを含み得る。キメラバレンセンシンターゼポリペプチドはまた、別のポリペプチドと交換されたポリペプチドのその内因性ドメインまたは領域を有するものも含む。これらのキメラまたは融合タンパク質は、融合タンパク質として組換え手段によって生成されたもの、例えば、スルフヒドリル基とのカップリングによる化学的カップリングなどの化学的手段によって生成されたものおよび少なくとも１種のポリペプチド（すなわち、バレンセンシンターゼ）またはその一部が、リンカー（単数または複数）によって別のポリペプチドと直接的または間接的に連結される任意のその他の方法によって生成されたものを含む。
【０１３１】
本明細書において、ポリペプチドがアミノ酸の列挙された配列から「本質的になる」という列挙は、全長ポリペプチドの列挙された部分またはその断片のみが存在することを意味する。ポリペプチドは、所望により、また、一般に、別の供給源に由来するさらなるアミノ酸を含むか、または別のポリペプチド中に挿入され得る。
【０１３２】
本明細書において、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上、別段の明確な指示のない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「１つのアミノ酸置換」を含むポリペプチドへの言及は、１つまたは複数のアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。
【０１３３】
本明細書において、範囲および量は、「約」特定の値または範囲として表現され得る。約はまた、正確な量も含む。したがって、「約５％」とは、「約５％」および「５％」も意味する。
【０１３４】
本明細書において、「任意選択の」または「所望により」とは、続いて記載される事象または状況が起こるか起こらないことおよび記載が前記事象または状況が起こる場合および起こらない場合を含むことを意味する。例えば、所望により、バレンセンを単離する工程とは、バレンセンが単離されるか、単離されないことを意味する。
【０１３５】
本明細書において、任意の保護基、アミノ酸およびその他の化合物の略語は、別段の指示のない限り、その一般的な使用、認識されている略語または生化学命名法に関するＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ委員会（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）（(1972) Biochem. 11:1726参照のこと）を踏まえる。
【０１３６】
Ｂ．バレンセンシンターゼ
バレンセンシンターゼは、ファルネシル二リン酸をセスキテルペンバレンセンに変換する、クラス１植物テルペンシクラーゼまたはテルペンシンターゼ、イソプレノイドシンターゼまたはテルペノイドシクラーゼである。次いで、バレンセンは、酸化によってヌートカトンに変換され得る。バレンセンおよびヌートカトンの両方とも、オレンジおよびグレープフルーツなどのかんきつ油の天然成分であり、香水およびフレーバー工業において広く使用される成分である。
【０１３７】
バレンセンは、柑橘類の果実、ブドウの木の花、セロリ（Ａｐｉｕｍ  ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ  ｉｎｄｉｃａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐｅａ）およびサンゴにおいて同定されている。今日までに、バレンセンシンターゼは、柑橘類の果実、ブドウの木の花およびシソ属（青紫蘇）から単離されている。柑橘類バレンセンシンターゼ（ＣＶＳ）は、スイートオレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）（スイートオレンジ）のフラベド（外皮）（配列番号２、２８９、２９０）およびグレープフルーツ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｘ  ｐａｒａｄｉｓｉ）（グレープフルーツ）（配列番号２９１および７５２）において同定されている(Chappell (2004) Trends Plant  Sci., 9:266; Sharon-Asa et al.，(2003) The Plant Journal 36:664-674; AF411120および米国特許第７，２７３，７３５号；同７，４４２，７８５号；同７，７９０，４２６号；および国際ＰＣＴ出願ＷＯ２００５０２１７０５およびＷＯ２００３０２５１９３参照のこと）。アミノ酸置換Ａ５１７Ｉ／Ｉ５１８Ｖを含有する変異体バレンセンシンターゼが記載されている(Eyal, E. Masters Thesis, Department of Plant Sciences, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel; January, 2001;配列番号８８６に示されている）。バレンセンシンターゼはまた、ブドウゲヴェルツトラミネール種（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ  Ｌ．ｃｖ．Ｇｅｗｕｒｚｔｒａｍｉｎｅｒ）およびブドウカベルネ・ソーヴィニヨン種（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ  Ｌ．ｃｖ．Ｃａｂｅｒｎｅｔ  Ｓａｕｖｉｇｎｏｎ）を含めたブドウの木の花から同定され、単離されている(Lucker et al., (2004) Phytochemistry 65(19):2649-59およびMartin et al., (2009) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 106:7245-7250参照のこと）（配列番号３４６および３４７）。バレンセンシンターゼはまた、アラスカヒノキペンデュラ（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ  ｐｅｎｄｕｌａ）から単離されている（例えば、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１０７４９５４；配列番号８８２および８８３およびそれぞれ、配列番号８８４および８８５に示されるコーディング核酸を参照のこと）。
【０１３８】
ａ．構造
クラス１植物テルペンシクラーゼは、クラス１テルペノイドシクラーゼフォールドと呼ばれる一般的なαヘリックス構築を共有する単量体テルペンシンターゼの多様な群を含む（例えば、Christianson,D.W., (2008) Curr Opin Chem Biol 12(2):141-150およびBohlmann et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:4126-4133参照のこと）。比較的に小さい全体の配列類似性しか存在しないが、クラス１植物テルペンシクラーゼは、相同構造およびいくつかの高度に保存されたモチーフおよび／または残基を有する。その触媒部位では、各テルペンシクラーゼは、環化すると、特定の分子内炭素間結合が形成されるような配向およびコンホメーションを有する可動性イソプレノイド基質と結合する鋳型を提供する。したがって、各酵素の触媒部位の構造が、得られる環状モノテルペン、ジテルペンおよびセスキテルペンを決定する。
【０１３９】
タバコ５−エピ−アリストロチェンシンターゼおよびペンタレネンシンターゼのＸ線結晶構造から、クラス１植物テルペンシクラーゼは、もっぱら短い接続ループおよびターンによって相互接続されたαヘリックスからなるということが示された（例えば、Starks et al., (1997), Science 277:1815-1820およびLesburg et al., (1997), Science 277:1820-1824参照のこと；図２も参照のこと）。これらの酵素は、２つの別個の構造ドメイン、その構造が、グリコシルヒドロラーゼ（ｈｙｄｒｏｌｙｓａｓｅｓ）の触媒コアと似ているが、その機能は大部分が未知であるＮ末端ドメインおよびＣ末端触媒ドメインを含有する。触媒ドメインは、２つの保存された金属結合モチーフ、すなわち、酵素触媒活性に関与しているアスパラギン酸リッチな領域を含有する。触媒部位は、反対側の壁に位置する２つのアスパラギン酸リッチな領域を有する、ほとんど逆並行のαヘリックスによって形成される大きな中央腔を含有する。アスパラギン酸リッチな領域は、Ｍｇ２＋イオンを架橋することによって二リン酸基質の結合を媒介する。基質のその後の結合は、Ｎ末端領域が、活性部位を溶媒に対して封鎖する触媒コア上のキャップを形成するようなコンホメーション変化を誘導し、それによって反応性カルボカチオン中間体を安定化する。
【０１４０】
保存されたαヘリックスＣ、Ｄ、Ｆ、ＧおよびＨは、クラス１植物テルペンシンターゼの触媒部位または活性部位を作り上げる。活性部位は、基質のオレフィン鎖を収容するよう芳香族残基によって裏打ちされた疎水性ポケットである。芳香族残基は、πカチオン相互作用によってカルボカチオン中間体を安定化する。アスパラギン酸リッチな領域１は、ヘリックスＤ上に位置し、保存された配列ＤＤｘｘＤを特徴とし、また、Ｍｇ２＋と結合するよう機能する（例えば、Starks et al., (1997), Science 277:1815-1820参照のこと）。第２の保存された金属結合領域は、ヘリックスＨ上に位置し、保存された配列［Ｎ／Ｄ］ｘｘｘ［Ｓ／Ｔ］ｘｘｘＥを特徴とし、また、「ＮＳＥ／ＤＴＥモチーフ」とも呼ばれる。これらの２種の保存された金属結合モチーフは、３個のＭｇ２＋イオンのイソプレノイド二リン酸との結合を調整する。
【０１４１】
ｂ．機能
バレンセンシンターゼは、真菌および動物ではメバロン酸依存性イソプレノイド生合成経路および細菌および高等植物では非メバロン酸依存性イソプレノイド生合成経路の一部として生成される遍在するピロリン酸中間体ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）からのバレンセンの形成を触媒する。バレンセン（１，２，３，５，６，７，８，８ａ−オクタヒドロ−７−イソプロペニル−１，８ａ−ジメチル−ナフタレン）は、次いで、酸化によって、ヌートカトン（４，４ａ，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−６−イソプロペニル−４，４−ａ−ジメチル−２（３Ｈ）−ナフタレノン）に変換される。図３は、生化学経路を表す。
【０１４２】
バレンセンシンターゼなどのクラス１植物テルペンシクラーゼは、ゲラニル二リン酸、ファルネシル二リン酸およびゲラニル−ゲラニル二リン酸などの直鎖オールトランスイソプレノイド二リン酸を、環状モノテルペン、ジテルペンおよびセスキテルペンへ変換する金属依存性シクラーゼである。環化反応は、新規炭素間一重結合が、高度に反応性の電子欠乏性アリルカルボカチオンと電子の豊富な炭素間二重結合の反応によって形成される求電子アルキル化によって進行する。
【０１４３】
テルペンシンターゼは、酵素触媒に必要である酵素の活性中心に、二価金属イオン、通常、Ｍｇ２＋イオンまたは時には、Ｍｎ２＋を含有する。より詳しくは、それらは、ピロリン酸離脱に必要である。一般に、酵素は、２個のＭｇ２＋イオンの結合を調整するアスパラギン酸リッチなＤＤｘｘＤモチーフおよび３番目のＭｇ２＋イオンを調製するＮＳＥ／ＤＴＥモチーフを含めた、触媒部位を裏打ちする２つの保存された金属結合モチーフを含有する（Starks et al., (1997), Science 277:1815-1820およびLesburg et al., (1997), Science 277:1820-1824参照のこと）。触媒活性部位のアスパラギン酸リッチな領域は、Ｍｇ２＋イオンを架橋することによってプレニル二リン酸の結合を媒介する。（Ｍｇ２＋）３−ＰＰｉの結合は、Ｎ末端領域が触媒コア上にキャップを形成し、したがって、バルク溶媒を含まない閉鎖されたコンホメーションに活性部位を安定化するようなコンホメーション変化を誘導する。酵素が結合している基質からのピロリン酸（ＰＰｉ）の喪失が、高度に反応性のアリルカルボカチオンをもたらし、これがテルペン鎖のさらに先の分子内二重結合を求電子性に攻撃して、閉環を達成する。ＰＰｉアニオンは、閉じたシンターゼコンホメーションで結合される場合には、保存された塩基性残基からの水素結合を受容し、芳香族残基によって裏打ちされた疎水性ポケットが、プレニル側鎖を包み込み、恐らくは、特定の基質コンホメーションを強制することおよびπスタッキング相互作用によってカルボカチオンを安定化することによって環化反応の鋳型となる（Noel et al., (2010) ACS Chemical Biology 5(4):377-392)。
【０１４４】
ｃ．柑橘類バレンセンシンターゼ
柑橘類バレンセンシンターゼは、オールトランスファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）を、セスキテルペンバレンセンに変換するオレンジおよびグレープフルーツなどの柑橘類果実において見られるセスキテルペンシンターゼである。今日までに、いくつかの柑橘類バレンセンシンターゼが同定および単離されている。柑橘類バレンセンシンターゼのアミノ酸配列は、特定の種（例えば、スイートオレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ））から単離されたシンターゼが、同一種から単離された別のシンターゼのものと同一または異なる配列を有し得、また、異なる種（例えば、グレープフルーツ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｐａｒａｄｉｓｉ））から単離されたシンターゼと同一または異なる配列を有し得るので、必ずしも種特異的ではない。
【０１４５】
今日までに単離および配列決定された柑橘類バレンセンシンターゼとして、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する５４８アミノ酸のポリペプチドである（配列番号１に示されるｃＤＮＡ配列によってコードされる）、バレンシアオレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  ｃｖ．Ｖａｌｅｎｃｉａ）（バレンシアオレンジ）から単離され、本明細書に記載されたバレンセンシンターゼが挙げられる（実施例１参照のこと）。このシンターゼは、グレープフルーツ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｐａｒａｄｉｓｉ）（グレープフルーツ：米国特許第７，２７３，７３５号参照のこと）から単離されたバレンセンシンターゼと、また、ネーブルオレンジ（カラカラオレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  ｃｖ．Ｃａｒａ  Ｃａｒａ）；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＣＸ７０１５５）から単離されたバレンセンシンターゼと１００％のヌクレオチド配列同一性を共有する。これらのテルペンシンターゼの３種すべてを記載するヌクレオチド配列が、配列番号１（また、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＧＱ９８８３８４）に示されている。対応するポリペプチドアミノ酸配列が、配列番号２に示されている。グレープフルーツ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｐａｒａｄｉｓｉ）由来の第２のバレンセンシンターゼはまた、米国特許第７，２７３，７３５号に記載されており、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼと比較して、４つのアミノ酸置換；Ｉ９２Ｎ、Ｄ９５Ｈ、Ｒ９８ＳおよびＡ９９Ｐを含有する（配列番号７５２、配列番号７５３に示されるｃＤＮＡによってコードされる）。バレンシアオレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  ｃｖ．Ｖａｌｅｎｃｉａ）のフラベド（外皮）から単離された別のバレンセンシンターゼは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼと比較して、２つのアミノ酸置換；Ｖ１２３ＧおよびＹ２２１Ｃを有する（配列番号２８９、配列番号２９２に示されるｃＤＮＡによってコードされる；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＱ０４６０８およびＡＦ４４１１２４；Sharon-Asa et al., (2003) The Plant Journal 36:664-674参照のこと）。グレープフルーツ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｘ  ｐａｒａｄｉｓｉ）から単離されたさらなるバレンセンシンターゼは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼと比較して、２つの異なるアミノ酸置換；Ｑ８７ＬおよびＬ２３９Ｐを有し（配列番号２９０、配列番号２９３に示されるｃＤＮＡによってコードされる；米国特許第７，４４２，７８５号参照のこと）；グレープフルーツ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｘ  ｐａｒａｄｉｓｉ）から単離された別のバレンセンシンターゼは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼと比較して、さらに１つの（合計３つの）アミノ酸置換；Ｑ８７Ｌ、Ｌ２３９ＰおよびＮ４９３Ｄを有する（配列番号２９１、配列番号２９４に示されるｃＤＮＡによってコードされる；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＭ００４２６およびＡＦ４１１１２０参照のこと）。
【０１４６】
上記のように、柑橘類バレンセンシンターゼは、Ｎ末端ドメイン（配列番号２のａａ１〜２６６）およびＣ末端触媒ドメイン（配列番号２のａａ２６７〜５４８）を含有する。バレンセンシンターゼは、その他のテルペンシンターゼと高いパーセンテージの相同性を必ずしも共有しないが、触媒ドメインは、一般的な３次元構造（例えば、米国特許第６，４６５，７７２号、同６，４９５，３５４号および同６，５５９，２９７号に記載される）をその他のテルペンシンターゼと共有する。タバコ５−エピ−アリストロチェンシンターゼ（ＴＥＡＳ； Starks et al. (1999) Science 277:1815-1820に記載される）の構造とアラインし、比較すると、柑橘類バレンセンシンターゼが、以下の構造ドメイン：不定形ループ１（配列番号２のアミノ酸１〜２９に対応する）、αヘリックス１（配列番号２のアミノ酸３０〜３９および４４〜５２に対応する）、不定形ループ２（配列番号２のアミノ酸５３〜５８に対応する）、αヘリックス２（配列番号２のアミノ酸５９〜７１に対応する）、不定形ループ３（配列番号２のアミノ酸７２〜７８に対応する）、αヘリックス３（配列番号２のアミノ酸７９〜９３に対応する）、不定形ループ４（配列番号２のアミノ酸９４〜１００に対応する）、αヘリックス４（配列番号２のアミノ酸１０１〜１１４に対応する）、不定形ループ５（配列番号２のアミノ酸１１５〜１４１に対応する）、αヘリックス５（配列番号２のアミノ酸１４２〜１５２に対応する）、不定形ループ６（配列番号２のアミノ酸１５３〜１６２に対応する）、αヘリックス６（配列番号２のアミノ酸１６３〜１７３に対応する）、不定形ループ７（配列番号２のアミノ酸１７４〜１８４に対応する）、αヘリックス７（配列番号２のアミノ酸１８５〜１９４に対応する）、不定形ループ８（配列番号２のアミノ酸１９５〜２０１に対応する）、αヘリックス８（配列番号２のアミノ酸２０２〜２１２に対応する）、不定形ループ９（配列番号２のアミノ酸２１３〜２２２に対応する）、αヘリックスＡ（配列番号２のアミノ酸２２３〜２５３に対応する）、Ａ−Ｃループ（配列番号２のアミノ酸２５４〜２６６に対応する）、αヘリックスＣ（配列番号２のアミノ酸２６７〜２７６に対応する）、不定形ループ１１（配列番号２のアミノ酸２７７〜２８３に対応する）、αヘリックスＤ（配列番号２のアミノ酸２８４〜３０５に対応する）、不定形ループ１２（配列番号２のアミノ酸３０６〜３０９に対応する）、αヘリックスＤ１（配列番号２のアミノ酸３１０〜３２２に対応する）、不定形ループ１３（配列番号２のアミノ酸３２３〜３２８に対応する）、αヘリックスＤ２（配列番号２のアミノ酸３２９に対応する）、不定形ループ１４（配列番号２のアミノ酸３３０〜３３２に対応する）、αヘリックスＥ（配列番号２のアミノ酸３３３〜３５１に対応する）、不定形ループ１５（配列番号２のアミノ酸３５２〜３６２に対応する）、αヘリックスＦ（配列番号２のアミノ酸３６３〜３８５に対応する）、不定形ループ１６（配列番号２のアミノ酸３８６〜３９０に対応する）、αヘリックスＧ１（配列番号２のアミノ酸３９１〜３９５に対応する）、不定形ループ１７（配列番号２のアミノ酸３９６〜４０４に対応する）、αヘリックス���２（配列番号２のアミノ酸４０５〜４１３に対応する）、不定形ループ１８（配列番号２のアミノ酸４１４〜４２１に対応する）、αヘリックスＨ１（配列番号２のアミノ酸４２２〜４２８に対応する）、不定形ループ１９（配列番号２のアミノ酸４２９〜４３１に対応する）、αヘリックスＨ２（配列番号２のアミノ酸４３２〜４４７に対応する）、不定形ループ２０（配列番号２のアミノ酸４４８〜４５０に対応する）、αヘリックスＨ３（配列番号２のアミノ酸４５１〜４５５に対応する）、不定形ループ２１（配列番号２のアミノ酸４５６〜４６１に対応する）、αヘリックスａ−１（配列番号２のアミノ酸４６２〜４７０に対応する）、不定形ループ２２（配列番号２のアミノ酸４７１〜４７３に対応する）、αヘリックスＩ（配列番号２のアミノ酸４７４〜４９５に対応する）、不定形ループ２３（配列番号２のアミノ酸４９６〜５０８に対応する）、αヘリックスＪ（配列番号２のアミノ酸５０９〜５２１に対応する）、Ｊ−Ｋループ（配列番号２のアミノ酸５２２〜５３４に対応する）、αヘリックスＫ（配列番号２のアミノ酸５３５〜５４１に対応する）、および不定形ループ２５（配列番号２のアミノ酸５４２〜５４８に対応する）を含有することが明らかである。構造ドメインは、図２に表されている。
【０１４７】
アスパラギン酸リッチな領域１および２を含有する保存された金属結合部位は、Ｃ末端触媒ドメイン内にある。保存されたＤＤｘｘＤモチーフを含有するアスパラギン酸リッチな領域１は、配列番号２のアミノ酸Ｄ３０１、Ｄ３０２、Ｔ３０３、Ｙ３０４およびＤ３０５に対応する。Ａｓｐ３０１およびＡｓｐ３０５は、Ｍｇ２＋との協調によってＦＰＰの二リン酸部分と結合する。ＮＳＥ／ＤＴＥモチーフを含有するアスパラギン酸リッチな領域２は、配列番号２のアミノ酸Ｄ４４５、Ｄ４４６、Ｍ４４７、Ｑ４４８、Ｇ４４９、Ｈ４５０、Ｅ４５１、Ｆ４５２およびＥ４５３と対応する。この領域は、アミノ酸Ａｓｐ４４５、Ｇｌｙ４４９およびＧｌｕ４５３によってさらなるＭｇ２＋イオンと結合する。
【０１４８】
上記のように、バレンセンシンターゼの活性部位基質結合ポケットは、疎水性であり、芳香族残基を含有する。アスパラギン酸リッチな領域に由来するアミノ酸残基Ｄ３０１、Ｄ３０５、Ｄ４４５、Ｇ４４９およびＥ４５３ならびに配列番号２のアミノ酸残基Ｒ２６４、Ｗ２７３、Ｎ２９４、Ｉ２９６、Ｌ２９７、Ｓ２９８、Ｙ３７６、Ｃ４０２、Ｃ４４１、Ｒ４４２、Ｌ４４３、Ｄ４４６、Ｙ５２２、Ｄ５２６およびＹ５２８が、バレンセンシンターゼの基質結合ポケットを形成する。これらの残基は、ファルネシル側鎖を包み込み、基質をバレンセンの生成をもたらすコンホメーションに強制する。（Ｍｇ２＋）３−ＰＰｉ結合の際、バレンセンシンターゼは、開いたから閉じた活性部位に構造変化を受け、それによってＮ末端領域が活性部位上にキャップまたは蓋を形成する。活性部位蓋残基は、配列番号２のＮ末端ドメインアミノ酸残基Ｒ８、Ｐ９、Ｔ１０、Ａ１１、Ｄ１２、Ｆ１３、Ｈ１４およびＰ１５ならびに配列番号２のＣ末端ドメインアミノ酸残基Ｆ４５２、Ｅ４５３、Ｋ４５５、Ｒ４５６、Ｇ４５７、Ａ４６０、Ｓ４６１、Ａ４６２、Ｉ４６３、Ｄ５２５、Ｄ５２６、Ｇ５２７およびＹ５２８に対応する。
【０１４９】
バレンセンシンターゼ活性部位の付近にあり、エレモフィロン型セスキテルペン内に保存されているさらなる残基として、配列番号２のアミノ酸残基Ｌ２７０、Ｙ３７６、Ｓ４０１、Ｃ４０２、Ａ４０３、Ｙ４０４、Ｖ４０７、Ｃ４４１、Ｉ５１８、Ｉ５２１およびＴ５２９が挙げられる（Greenhagen et al., (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:9826-9831および米国特許第７，４４２，７８５号参照のこと）。これらの残基は、バレンセンが優位に形成される生成物であるように反応中間体の位置決めを補助する。ＦＰＰからバレンセンシンターゼによって生成され得るその他の生成物として、それだけには限らないが、ゲルマクレンＡ、β−エレメン（β−エレメンは、ゲルマクレンＡの自然分解によって形成される）、β−セリネン、τ−セリネンおよび７−エピ−α−セリネンが挙げられる。配列番号２のアミノ酸残基Ａ５１７およびＩ５１８は、それらのＡ５１７Ｉ／Ｉ５１８Ｖへの突然変異が、正常な反応の中断によってゲルマクレンから誘導され得るβ−エレメン反応生成物をもたらしたので、Ｃ１−Ｃ１０環化後の反応の後期において役割を果たすとして同定された（例えば、Eran Eyal (2001) Computer Modelling of the Enzymatic Reaction Catalysed by 5-epi-aristolochene cyclase. Doctoral Dissertation. Retrieved from Library Catalog Wiezmann Institute of Science.（システム番号００００８３２１４）参照のこと）。
【０１５０】
Ｃ．改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドおよびコーディング核酸分子
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが本明細書において提供される。また、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子も本明細書において提供される。本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、それだけには限らないが、ＦＰＰ、ＧＰＰおよびＧＧＰＰを含めた任意の適した非環式ピロリン酸テルペン前駆体からのバレンセンおよび／またはその他のテルペンの形成を触媒する。通常、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、ＦＰＰからのバレンセンの形成を触媒する。改変は、提供されるバレンセンシンターゼの任意の領域またはドメインで行うことができ、得られる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、バレンセンシンターゼ活性（すなわち、非環式ピロリン酸テルペン前駆体、通常、ＦＰＰからのバレンセンの形成を触媒する能力）を少なくとも保持する。
【０１５１】
改変は、単一アミノ酸置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ）（置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ））、挿入または欠失などの単一アミノ酸改変であっても、複数のアミノ酸置換、挿入または欠失などの複数のアミノ酸改変であってもよい。一部の例では、全体または部分ドメインまたは領域、例えば、以下に本明細書に記載された任意のドメインまたは領域が、別のテルペンシンターゼに由来する対応するドメインまたは領域またはその一部で交換される。改変の例示として、単一または複数のアミノ酸置換を含めたアミノ酸置換がある。例えば、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、改変を含有しないバレンセンシンターゼポリペプチドと比較して、少なくともまたは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０またはそれ以上の改変された位置を含有し得る。
【０１５２】
本明細書に記載された改変は、任意のバレンセンシンターゼポリペプチド中にあり得る。通常、改変は、柑橘類由来の柑橘類バレンセンシンターゼ（ＣＶＳ）において行われる。例えば、本明細書に記載された改変は、配列番号２、２８９〜２９１、３４６、３４７、７５２、８８２または８８３のいずれかに示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する当技術分野で記載されるいずれかのものを含めた、配列番号２、２８９〜２９１、３４６、３４７、７５２、８８２または８８３のいずれかまたはその任意の変異体に示されるようなバレンセンシンターゼにおいてであり得る。変異体バレンセンシンターゼの例示は、配列番号８８６に示されている。特に、配列番号２、２８９〜２９１、７５２または８８６のいずれかに示されるバレンセンシンターゼポリペプチドと比較して、１つまたは複数の改変を含有する改変された柑橘類由来バレンセンシンターゼポリペプチドが、本明細書において提供される。また、配列番号３〜１２７、３５０、３５１、７２３〜７３１、７３２〜７４５、７４６〜７５１、８１０〜８６６、８８７〜８９０、８９５、９４４、９４６、９４８、９５０、９５２，９５４、９５６、９５８、９６０、９６２、９６４、９６６、９６８、９７０、９７２、９７４、９７６、９７８、９８０、９８２、９８４、９８６、９８８、９９０、９９２、９９４、９９６および９９８に示される変異体のいずれかが、例えば、本明細書に記載された改変のいずれかを含むことによってさらに改変され得るということは理解される。
【０１５３】
特に、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに関して、アミノ酸置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ）または置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）、付加または欠失、末端切断またはそれらの組合せを含有する。一般に、アミノ酸置換を含めた改変のための位置およびアミノ酸への言及は、本明細書では、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼに関するＣＶＳ番号付けによってである。バレンセンシンターゼポリペプチド、例えば、配列番号２、２８９〜２９１、３４６、３４７、７５２、８８２もしくは８８３またはそれらの任意の変異体に示されるいずれかにおいてこのような改変を行うことは、当業者のレベル内である。例えば、図１および図４は、例示的バレンセンシンターゼポリペプチド間およびそれらの間のＣＶＳ番号付けおよび対応する位置を表す。この記載に基づいて、いずれか１つまたは複数の記載された突然変異を含有するバレンセンシンターゼを作製することおよび本明細書に記載されたようにバレンセンシンターゼ活性について各々を試験することは当業者のレベル内である。
【０１５４】
また、一部の例では、本明細書において提供された改変のいずれかを含有するバレンセンシンターゼポリペプチドの改変された活性断片が、本明細書において提供される。このような断片は、野生型バレンセンシンターゼの１つまたは複数の特性を保持する。一般に、改変された活性断片は、バレンセンシンターゼ活性を示す（すなわち、ＦＰＰなどの非環式ピロリン酸テルペン前駆体からのバレンセンの形成を触媒する）。
【０１５５】
また、バレンセンシンターゼポリペプチドにおける改変を行って、一次配列の改変およびポリペプチドの一次配列においてではない改変を含めたその他の改変も含有するバレンセンシンターゼポリペプチドにしてもよい。例えば、本明細書に記載された改変は、異なるバレンセンシンターゼポリペプチドまたは異なるテルペンシンターゼポリペプチドのハイブリッド（例えば、別のテルペンシンターゼに由来する１つまたは複数のドメインまたは領域を含有する）を含めた、融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドおよびまた組換えによって調製されたか、または既知ポリペプチドの配列に基づいて当技術分野で公知のその他の方法によって合成もしくは構築された合成バレンセンシンターゼポリペプチドであるバレンセンシンターゼポリペプチドにおいてであり得る。
【０１５６】
本明細書において提供されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、一般に、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対して少なくとも６２％のアミノ酸配列同一性を示す。例えば、本明細書において提供されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、一般に、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対して、少なくともまたは少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９５％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を示す。特定の例では、バレンセンシンターゼポリペプチドはまた、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対して９５％未満の配列同一性を示す。したがって、例えば、本明細書において提供されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対して、少なくとも６２％または６２％を超える配列同一性を示し、配列番号２に示される野生型バレンセンシンターゼポリペプチドと、９４．７％、９４．６％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８４％、８３％、８２％、８１％  ７９％、７８％、７７％、７６％、７４％、７３％、７２％または７１％未満または約９４．７％、９４．６％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８４％、８３％、８２％、８１％  ７９％、７８％、７７％、７６％、７４％、７３％、７２％または７１％未満の配列同一性を示す。一般に、本明細書において提供された、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸の配列に対して、７５％から９５％の間もしくはおよそその間、７５％から９４％の間もしくはおよそその間、７４％から９３％の間もしくはおよそその間、７５％から９２％の間もしくはおよそその間、８０％から９５％の間もしくはおよそその間、８０％から９４％の間もしくはおよそその間、８０％から９３％の間もしくはおよそその間、８０％から９２％の間もしくはおよそその間、８５％から９５％の間もしくはおよそその間、８５％から９４％の間もしくはおよそその間、８５％から９３％の間もしくはおよそその間または８５％から９２％の間もしくはおよそその間（各々を含む）の配列同一性を示す。
【０１５７】
一部の例では、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号３に示される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドに対して、１００％未満または１００％の同一性を有する。その他の例では、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号４に示される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドに対して、１００％未満または１００％の同一性を有する。さらなる例では、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号５に示される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドに対して、１００％未満または１００％の同一性を有する。例えば、配列番号３または配列番号４に示される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドに対して、少なくとも８０％の同一性、例えば、配列番号３または配列番号４に示される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドに対して、少なくともまたは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性などである、アミノ酸の配列を有する改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、本明細書において提供される。
【０１５８】
同一性パーセントは、当業者によって、標準アラインメントプログラムを使用して決定できる。例えば、当業者によって、標準アラインメントプログラムを使用して決定できるように、３７のアミノ酸置換（例えば、Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｐ２８１Ｓ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１３Ｃ／Ｓ３１４Ｔ／Ｌ３１５Ｍ／Ｔ３１７Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ｋ３３６Ｒ／Ｌ３３７Ｉ／Ａ３４５Ｔ／Ｇ３５７Ｒ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ、例えば、以下に記載される配列番号５に示されるＶ７５と名づけられた改変されたバレンセンシンターゼポリペプチド）を含有する改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼに対して、約９３．２％の相同性を示す。その他の例では、本明細書において提供された改変バレンセンシンターゼポリペプチドは、少なくとも８０、８１、８２、８３または８４の置換、挿入および／または欠失を含めた改変を含有し、その結果、得られたポリペプチドは、配列番号２に示される野生型バレンセンシンターゼポリペプチドに対して、８５％未満同一であるか、または８５％同一であるか、または約８５％同一である。別の例では、本明細書において提供された改変バレンセンポリペプチドは、少なくとも１０７、１０８、１０９、１１０または１１１の改変（例えば、置換、挿入および／または欠失）を含有し、その結果、得られたポリペプチドは、配列番号２に示される野生型バレンセンシンターゼポリペプチドに対して、８０％未満同一であるか、８０％同一であるか、または約８０％同一である。
【０１５９】
改変は、Ｎ末端ドメイン（配列番号２のアミノ酸１〜２６６に対応する）において、および／またはＣ末端触媒ドメイン（配列番号２のアミノ酸２６７〜５４８に対応する）における１つまたは複数の改変であり得る。一部の例では、改変は、アミノ酸置換である。さらなる例では、本明細書において提供された改変バレンセンシンターゼポリペプチドは、不定形ループ１（配列番号２のアミノ酸１〜２９に対応する）、αヘリックス１（配列番号２のアミノ酸３０〜３９および４４〜５２に対応する）、不定形ループ２（配列番号２のアミノ酸５３〜５８に対応する）、αヘリックス２（配列番号２のアミノ酸５９〜７１に対応する）、不定形ループ３（配列番号２のアミノ酸７２〜７８に対応する）、αヘリックス３（配列番号２のアミノ酸７９〜９３に対応する）、不定形ループ４（配列番号２のアミノ酸９４〜１００に対応する）、αヘリックス４（配列番号２のアミノ酸１０１〜１１４に対応する）、不定形ループ５（配列番号２のアミノ酸１１５〜１４１に対応する）、αヘリックス５（配列番号２のアミノ酸１４２〜１５２に対応する）、不定形ループ６（配列番号２のアミノ酸１５３〜１６２に対応する）、αヘリックス６（配列番号２のアミノ酸１６３〜１７３に対応する）、不定形ループ７（配列番号２のアミノ酸１７４〜１８４に対応する）、αヘリックス７（配列番号２のアミノ酸１８５〜１９４に対応する）、不定形ループ８（配列番号２のアミノ酸１９５〜２０１に対応する）、αヘリックス８（配列番号２のアミノ酸２０２〜２１２に対応する）、不定形ループ９（配列番号２のアミノ酸２１３〜２２２に対応する）、αヘリックスＡ（配列番号２のアミノ酸２２３〜２５３に対応する）、Ａ−Ｃループ（配列番号２のアミノ酸２５４〜２６６に対応する）、αヘリックスＣ（配列番号２のアミノ酸２６７〜２７６に対応する）、不定形ループ１１（配列番号２のアミノ酸２７７〜２８３に対応する）、αヘリックスＤ（配列番号２のアミノ酸２８４〜３０５に対応する）、不定形ループ１２（配列番号２のアミノ酸３０６〜３０９に対応する）、αヘリックスＤ１（配列番号２のアミノ酸３１０〜３２２に対応する）、不定形ループ１３（配列番号２のアミノ酸３２３〜３２８に対応する）、αヘリックスＤ２（配列番号２のアミノ酸３２９に対応する）、不定形ループ１４（配列番号２のアミノ酸３３０〜３３２に対応する）、αヘリックスＥ（配列番号２のアミノ酸３３３〜３５１に対応する）、不定形ループ１５（配列番号２のアミノ酸３５２〜３６２に対応する）、αヘリックスＦ（配列番号２のアミノ酸３６３〜３８５に対応する）、不定形ループ１６（配列番号２のアミノ酸３８６〜３９０に対応する）、αヘリックスＧ１（配列番号２のアミノ酸３９１〜３９５に対応する）、不定形ループ１７（配列番号２のアミノ酸３９６〜４０４に対応する）、αヘリックスＧ２（配列番号２のアミノ酸４０５〜４１３に対応する）、不定形ループ１８（配列番号２のアミノ酸４１４〜４２１に対応する）、αヘリックスＨ１（配列番号２のアミノ酸４２２〜４２８に対応する）、不定形ループ１９（配列番号２のアミノ酸４２９〜４３１に対応する）、αヘリックスＨ２（配列番号２のアミノ酸４３２〜４���７に対応する）、不定形ループ２０（配列番号２のアミノ酸４４８〜４５０に対応する）、αヘリックスＨ３（配列番号２のアミノ酸４５１〜４５５に対応する）、不定形ループ２１（配列番号２のアミノ酸４５６〜４６１に対応する）、αヘリックスａ−１（配列番号２のアミノ酸４６２〜４７０に対応する）、不定形ループ２２（配列番号２のアミノ酸４７１〜４７３に対応する）、αヘリックスＩ（配列番号２のアミノ酸４７４〜４９５に対応する）、不定形ループ２３（配列番号２のアミノ酸４９６〜５０８に対応する）、αヘリックスＪ（配列番号２のアミノ酸５０９〜５２１に対応する）、Ｊ−Ｋループ（配列番号２のアミノ酸５２２〜５３４に対応する）、αヘリックスＫ（配列番号２のアミノ酸５３５〜５４１に対応する）、および／または不定形ループ２５（配列番号２のアミノ酸５４２〜５４８に対応する）などの構造ドメイン中に１つまたは複数の改変を含有する。本明細書において別の場所に記載されるように、ドメインまたは構造ドメインにおける改変は、別のテルペンシンターゼに由来する対応する異種残基の置換によってであり得る。
【０１６０】
バレンセンシンターゼ活性を保持するために、改変は、通常、変化に対してあまり寛容でない位置では行われない。このような位置は、ＦＰＰからのバレンセンの触媒および／または基質結合にとって必要であるドメインまたは領域内にあり得る。一部の例では、位置は、金属結合性アスパラギン酸リッチモチーフ（ＤＤｘｘＤ）などの高度に保存されている領域中にある。例えば、実施例３．Ｃにおいて実証されるように、第１の金属結合性アスパラギン酸リッチモチーフの一部であるか、またはそれに隣接する、配列番号２の位置３０１、３０２、３０３、３０５および３０６に対応する位置ならびに第２のアスパラギン酸リッチな領域の一部である位置４４５、４４６および４４９に対応する位置は、一般に、改変に対してあまり寛容ではなく、通常、バレンセンシンターゼ活性が低下したポリペプチドとなる。同様に、基質結合ポケットの形成に関与している可能性が高い、配列番号２の２６７、２６９、２７０、２７１、２７３、２９５、２９８、４４１および４４２に対応する位置も、一般に、改変に対してあまり寛容ではなく、通常、バレンセンシンターゼ活性が低下したポリペプチドとなる。実施例３．Ｃにおいて、変化に対してあまり寛容ではないと示されているその他の位置として、それだけには限らないが、配列番号２の位置８、９、１７８、２０３、２７７、２８７、３１２、３９４、３９８、４０１、４０２、４０３、４０４、４０７、４０８、４５４および４５７に対応する位置が挙げられる。
【０１６１】
したがって、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチド、特に、バレンセン収量の増大を示し、配列番号２のアミノ酸残基８、９、１７８、２０３、２６７、２６９、２７０、２７１、２７３、２７７、２８７、２９５、２９８、３０１、３０２、３０３、３０５、３０６、３１２、３９４、３９８、４０１、４０２、４０３、４０４、４０７、４０８、４４１、４４２、４４５、４４６、４４９、４５４および４５７のいずれかで改変（単数または複数）（例えば、アミノ酸置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）または置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ））を含有しない改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、本明細書において提供される。一部の例では、変化に対してあまり寛容ではない可能性が高いその他の位置として、例えば、位置２０、２６４、２６６、３７６、４３６、４４８、５１２、５１５、５１６、５１９、５２０、５２７、５２８および５２９を挙げることができる（米国特許公開番号ＵＳ２０１００２１６１８６）。一部の例では、バレンセン収量が増大した本明細書において提供された改変バレンセンシンターゼは、通常、配列番号２の位置２０、１７８、２０３、２６４、２６６、２６７、２６９、２７０、２７１、２７３、２７７、２８７、２９５、２９８、３０１、３０２、３０３、３０５、３０６、３１２、３７６、３９４、３９８、４０１、４０２、４０３、４０４、４０７、４０８、４３６、４４１、４４２、４４５、４４６、４４８、４４９、４５４、４５７、５１２、５１５、５１６、５１９、５２０、５２７、５２８および５２９に対応する位置のいずれかに改変を含有しない。これは単に指針であって、これらの位置の改変は、一般に、野生型バレンセンシンターゼと比較して、活性の低下したバレンセンシンターゼをもたらすものの、このような改変が、本明細書において提供された改変バレンセンシンターゼのいずれかの中に含まれる場合があるということは理解される。例えば、当業者ならば、保存的アミノ酸置換、例えば、表２に提供されるものを使用して、野生型バレンセンシンターゼと比較した、ＦＰＰから生成されるバレンセンの量の低減などの活性の低下をもたらす改変の可能性を低減することができることは理解している。また、一部の例では、改変が、別のシンターゼポリペプチドの対応するドメインに示されるアミノ酸とのドメインスワップによるものである場合には、改変をこれらの位置のいずれか１つで行うことができる。
【０１６２】
したがって、例えば、アミノ酸置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）または置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）によって改変され得る例示的位置として、それだけには限らないが、配列番号２に示されるアミノ酸位置に関するＣＶＳ番号付けによって、位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、５０、５３、５４、５５、５６、５７、５８、６０、６２、６９、７７、７８、８２、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１８、１２０、１２１、１２２、１２４、１２５、１２７、１２９、１３０、１３２、１３５、１３６、１３８、１３９、１４１、１４２、１４４、１４６、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６２、１６３、１６５、１６６、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２７、２２８、２２９、２３８、２５２、２５７、２６３、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０５、３０６、３０７、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２９、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７５、３７７、３７８、３８０、３８１、３８２、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４２２、４２３、４２４、４２８、４２９、４３４、４３５、４３６、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５１、４５２、４５４、４５７、４６５、４６８、４７３、４７４、４８４、４９２、４９５、４９６、４９９、５００、５０１、５０６、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３６および／または５３９に対応する位置が挙げられる。
【０１６３】
改変のためのこれらの位置は、単に例示的なものである。バレンセンシンターゼポリペプチド中の多数のその他の位置が、ＦＰＰからバレンセンを生成するポリペプチドの能力に悪影響を及ぼすことなく改変され得ることは理解される。例えば、不定形ループ中のその他の位置（不定形ループ１から２５のいずれかを含む）は、バレンセン生成に悪影響を及ぼすことなく改変され得る。
【０１６４】
改変は、アミノ酸置換、挿入または欠失であり得る。通常、改変は、アミノ酸置換であり、これは表２に示されるものなどの保存的置換である場合も、非保存的置換である場合もある。当業者ならば、一般に、保存的アミノ酸置換は、野生型バレンセンシンターゼと比較して、ＦＰＰから生成されるバレンセンの量の低下など、活性に悪影響を及ぼす改変の可能性を低減するということは理解している。反対に、非保存的置換は、一般に、活性に影響を及ぼし、それによって野生型バレンセンシンターゼと比較した、ＦＰＰから生成されるバレンセンの量の増大または低減をもたらす可能性がより高い。ＦＰＰからのバレンセンの生成の増大をもたらす改変は、本明細書に記載され、当技術分野で周知のアッセイを使用して同定でき、したがって、ＦＰＰからバレンセンを生成する能力の改善された改変バレンセンシンターゼポリペプチドの同定が可能となる。
【０１６５】
提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチド中に含まれ得る例示的アミノ酸置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）（または置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ））として、それだけには限らないが、配列番号２に示される位置に関するＣＶＳ番号付けによってＭ１Ｔ、Ｓ２Ｒ、Ｓ２Ｋ、Ｓ２Ｅ、Ｓ２Ｑ、Ｓ２Ｐ、Ｓ２Ｔ、Ｓ２Ｌ、Ｓ２Ｈ、Ｓ２Ａ、Ｓ２Ｖ、Ｓ２Ｎ、Ｓ２Ｃ、Ｓ２Ｇ、Ｓ３Ｄ、Ｓ３Ｒ、Ｓ３Ｇ、Ｓ３Ｉ、Ｓ３Ｅ、Ｓ３Ｖ、Ｓ３Ａ、Ｓ３Ｔ、Ｓ３Ｌ、Ｓ３Ｍ、Ｓ３Ｐ、Ｓ３Ｎ、Ｇ４Ｋ、Ｇ４Ｖ、Ｇ４Ｎ、Ｇ４Ｉ、Ｇ４Ｒ、Ｇ４Ｓ、Ｇ４Ｐ、Ｇ４Ａ、Ｇ４Ｅ、Ｇ４Ｆ、Ｇ４Ｃ、Ｇ４Ｔ、Ｇ４Ｌ、Ｇ４Ｑ、Ｅ５Ａ、Ｅ５Ｇ、Ｅ５Ｓ、Ｅ５Ｔ、Ｅ５Ｄ、Ｅ５Ｈ、Ｅ５Ｉ、Ｅ５Ｐ、Ｅ５Ｌ、Ｅ５Ｎ、Ｅ５Ｖ、Ｅ５Ｒ、Ｔ６Ｒ、Ｔ６Ｖ、Ｔ６Ｄ、Ｔ６Ｌ、Ｔ６Ａ、Ｔ６Ｅ、Ｔ６Ｋ、Ｔ６Ｓ、Ｔ６Ｇ、Ｔ６Ｃ、Ｔ６Ｍ、Ｔ６Ｙ、Ｔ６Ｉ、Ｆ７Ｃ、Ｆ７Ａ、Ｆ７Ｑ、Ｆ７Ｋ、Ｆ７Ｓ、Ｆ７Ｇ、Ｆ７Ｔ、Ｆ７Ｌ、Ｆ７Ｒ、Ｆ７Ｐ、Ｆ７Ｎ、Ｆ７Ｄ、Ｆ７Ｅ、Ｆ７Ｖ、Ｔ１０Ｖ、Ａ１１Ｔ、Ｄ１２Ｎ、Ｓ１６Ｎ、Ｌ１７Ｉ、Ｒ１９Ｋ、Ｒ１９Ｐ、Ｒ１９Ｇ、Ｎ２０Ｄ、Ｈ２１Ｑ、Ｌ２３Ｉ、Ｌ２３Ｓ、Ｋ２４Ａ、Ｋ２４Ｑ、Ｋ２４Ｙ、Ｋ２４Ｔ、Ｇ２５Ｙ、Ａ２６Ｔ、Ｓ２７Ｐ、Ｄ２８Ｇ、Ｄ２８Ｅ、Ｆ２９Ｄ、Ｄ３３Ｔ、Ｈ３４Ｒ、Ｔ３５Ａ、Ａ３６Ｃ、Ｔ３７Ｋ、Ｑ３８Ｖ、Ｑ３８Ａ、Ｑ３８Ｎ、Ｑ３８Ｅ、Ｒ４０Ｑ、Ｈ４１Ｉ、Ｒ５０Ｇ、Ｔ５３Ｌ、Ｔ５３Ｒ、Ｄ５４Ａ、Ｄ５４Ｐ、Ｄ５４Ｃ、Ａ５５Ｔ、Ａ５５Ｐ、Ａ５５Ｒ、Ａ５５Ｖ、Ａ５５Ｑ、Ｅ５６Ｇ、Ｅ５６Ｐ、Ｅ５６Ｆ、Ｅ５６Ａ、Ｅ５６Ｔ、Ｅ５６Ｑ、Ｄ５７Ｒ、Ｄ５７Ｐ、Ｄ５７Ｓ、Ｄ５７Ｑ、Ｄ５７Ａ、Ｋ５８Ｑ、Ｋ５８Ｒ、Ｋ５８Ｐ、Ｋ５８Ｅ、Ｋ５８Ａ、Ｖ６０Ｉ、Ｖ６０Ｇ、Ｋ６２Ｒ、Ｖ６９Ｉ、Ｆ７８Ｌ、Ｉ８２Ｖ、Ａ８５Ｍ、Ｉ８６Ｌ、Ｑ８７Ｄ、Ｋ８８Ｑ、Ｋ８８Ａ、Ｋ８８Ｈ、Ｌ８９Ｉ、Ｃ９０Ｙ、Ｐ９１Ｎ、Ｉ９２Ｙ、Ｉ９２Ｎ、Ｉ９２Ｓ、Ｙ９３Ｈ、Ｙ９３Ｆ、Ｙ９３Ｆ、Ｉ９４Ｅ、Ｉ９４Ｈ、Ｄ９５Ａ、Ｓ９６Ｈ、Ｓ９６Ｃ、Ｎ９７Ｄ、Ｎ９７Ｅ、Ｒ９８Ｋ、Ｒ９８Ｙ、Ｒ９８Ｄ、Ａ９９Ｎ、Ａ９９Ｍ、Ｈ１０２Ｙ、Ｌ１０６Ａ、Ｌ１０６Ｓ、Ｌ１０６Ｋ、Ｌ１０６Ｆ、Ｌ１１１Ｓ、Ｑ１１３Ｒ、Ｉ１１６Ｙ、Ｋ１１７Ｔ、Ｖ１２２Ｉ、Ｅ１２４Ｎ、Ｋ１２５Ａ、Ｋ１２５Ｑ、Ｋ１２７Ｔ、Ｄ１２９Ｅ、Ｅ１３０Ｒ、Ｒ１３２Ｇ、Ｓ１３５Ｅ、Ｓ１３６Ａ、Ｎ１３９Ｓ、Ｑ１４２Ｒ、Ｓ１４６Ｇ、Ｙ１５２Ｈ、Ｍ１５３Ｎ、Ｍ１５３Ｇ、Ｈ１５９Ｑ、Ｈ１５９Ｋ、Ｈ１５９Ｒ、Ｅ１６３Ｄ、Ｋ１７３Ｅ、Ｋ１７３Ｑ、Ｋ１７３Ａ、Ｑ１７８Ａ、Ｄ１７９Ｐ、Ｖ１８１Ｌ、Ｔ１８２Ｋ、Ｐ１８３Ｓ、Ｋ１８４Ｒ、Ｋ１８４Ｐ、Ｑ１８８Ｒ、Ｉ１８９Ａ、Ｉ１８９Ｖ、Ｉ１８９Ｐ、Ｔ２００Ｑ、Ｐ２０２Ｓ、Ｆ２０９Ｉ、Ｆ２０９Ｈ、Ｆ２０９Ｅ、Ｆ２０９Ｌ、Ｆ２０９Ｔ、Ｍ２１０Ｔ、Ｍ２１２Ｒ、Ｍ２１２Ｄ、Ｍ２１２Ｎ、Ｍ２１２Ｓ、Ｍ２１２Ａ、Ｍ２１２Ｙ、Ｍ２１２Ｋ、Ｍ２１２Ｆ、Ｍ２１２Ｈ、Ｍ２１２Ｑ、Ｍ２１２Ｉ、Ｍ２１２Ｓ、Ｍ２１２Ｖ、Ｉ２１３Ｙ、Ｉ２１３Ｍ、Ｉ２１３Ａ、Ｉ２１３Ｒ、Ｉ２１３Ｓ、Ｉ２１３Ｌ、Ｉ２１３Ｆ、Ｉ２１３Ｓ、Ｉ２１３Ｐ、Ｉ２１３Ｑ、Ｉ２１３Ｎ、Ｉ２１３Ｋ、Ｉ２１３Ｖ、Ｉ２１３Ｙ、Ｎ２１４Ｄ、Ｎ２１４Ｅ、Ｎ２１４Ｓ、Ｎ２１４Ｌ、Ｎ２１４Ｙ、Ｎ２１４Ｖ、Ｎ２１４Ｐ、Ｎ２１４Ｈ、Ｎ２１４Ｃ、Ｎ２１４Ａ、Ｎ２１４Ｔ、Ｎ２１４Ｒ、Ｎ２１４Ｙ、Ｎ２１４Ｑ、Ｓ２１５Ｈ、Ｓ２１５Ｇ、Ｓ２１５Ｋ、Ｓ２１５Ｒ、Ｓ２１５Ｐ、Ｓ２１５Ａ、Ｓ２１５Ｎ、Ｓ２１５Ｔ、Ｓ２１５Ｌ、Ｓ２１５Ｖ、Ｓ２１５Ｑ、Ｓ２１５Ｄ、Ｔ２１６Ｑ、Ｔ２１６Ｙ、Ｔ２１６Ｅ、Ｔ２１６Ｐ、Ｔ２１６Ｒ、Ｔ２１６Ｃ、Ｔ２１６Ｖ、Ｔ２１６Ｋ、Ｔ２１６Ｄ、Ｔ２１６Ａ、Ｔ２１６Ｓ、Ｔ２１６Ｋ、Ｓ２１７Ｒ、Ｓ２１７Ｋ、Ｓ２１７Ｆ、Ｓ２１７Ｉ、Ｓ２１７Ｔ、Ｓ２１７Ｇ、Ｓ２１７Ｙ、Ｓ２１７Ｎ、Ｓ２１７Ｈ、Ｓ２１７Ｅ、Ｓ２１７Ｆ、Ｓ２１７Ｃ、Ｓ２１７Ｅ、Ｓ２１７Ｄ、Ｄ２１８Ｉ、Ｄ２１８Ｇ、Ｄ２１８Ｖ、Ｄ２１８Ｃ、Ｄ２１８Ｐ、Ｄ２１８Ｍ、Ｄ２１８Ｒ、Ｄ２１８Ｌ、Ｄ２１８Ｓ、Ｄ２１８Ａ、Ｄ２１８Ｙ、Ｄ２１８Ｋ、Ｄ２１８Ｅ、Ｈ２１９Ｄ、Ｈ２１９Ａ、Ｈ２１９Ｌ、Ｈ２１９Ｃ、Ｈ２１９Ｗ、Ｈ２１９Ｒ、Ｈ２１９Ｓ、Ｈ２１９Ｆ、Ｈ２１９Ｅ、Ｈ２１９Ｇ、Ｈ２１９Ｑ、Ｈ２１９Ａ、Ｌ２２０Ｖ、Ｌ２２０Ｓ、Ｌ２２０Ｔ、Ｌ２２０Ｐ、Ｌ２２０Ｍ、Ｌ２２０Ａ、Ｌ２２０Ｈ、Ｌ２２０Ｅ、Ｌ２２０Ｇ、Ｌ２２０Ｄ、Ｌ２２０Ｆ、Ｙ２２１Ｃ、Ｙ２２１Ｖ、Ｙ２２１Ｑ、Ｙ２２１Ｆ、Ｙ２２１Ｓ、Ｙ２２１Ｎ、Ｙ２２１Ｔ、Ｙ２２１Ｐ、Ｙ２２１Ｌ、Ｙ２２１Ｋ、Ｙ２２１Ｗ、Ｙ２２１Ｅ、Ｙ２２１Ｖ、Ｙ２２１Ｈ、Ｎ２２７Ｓ、Ｅ２３８Ｄ、Ｋ２５２Ａ、Ｋ２５２Ｑ、Ｔ２５７Ａ、Ｄ２７４Ｍ、Ｄ２７４Ｎ、Ｄ２７４Ｓ、Ｄ２７４Ｆ、Ｄ２７４Ｇ、Ｄ２７４Ｈ、Ｄ２７４Ｅ、Ｆ２７９Ｓ、Ｆ２７９Ｉ、Ｆ２７９Ｐ、Ｆ２７９Ｄ、Ｆ２７９Ｌ、Ｆ２７９Ｎ、Ｆ２７９Ｍ、Ｆ２７９Ｈ、Ｆ２７９Ｃ、Ｆ２７９Ａ、Ｆ２７９Ｇ、Ｆ２７９Ｗ、Ｅ２８０Ｌ、Ｐ２８１Ｓ、Ｐ２８１Ｈ、Ｐ２８１Ｋ、Ｐ２８１Ａ、Ｐ２８１Ｗ、Ｐ２８１Ｌ、Ｐ２８１Ｙ、Ｑ２８２Ｌ、Ｑ２８２Ｓ、Ｑ２８２Ａ、Ｑ２８２Ｉ、Ｑ２８２Ｒ、Ｑ２８２Ｙ、Ｑ２８２Ｇ、Ｑ２８２Ｗ、Ｑ２８２Ｐ、Ｑ２８２Ｅ、Ｙ２８３Ｆ、Ｙ２８３Ｎ、Ａ２８４Ｔ、Ａ２８４Ｇ、Ａ２８４Ｐ、Ａ２８４Ｖ、Ａ２８４Ｒ、Ａ２８４Ｄ、Ａ２８４Ｅ、Ａ２８４Ｓ、Ａ２８４Ｈ、Ａ２８４Ｋ、Ａ２８４Ｉ、Ａ２８４Ｗ、Ａ２８４Ｍ、Ｑ２９２Ｋ、Ｉ２９９Ｙ、Ｙ３０７Ｈ、Ｌ３１０Ｈ、Ｅ３１１Ｐ、Ｅ３１１Ｔ、Ｌ３１３Ｃ、Ｓ３１４Ａ、Ｓ３１４Ｔ、Ｌ３１５Ｍ、Ｆ３１６Ｌ、Ｔ３１７Ｓ、Ｅ３１８Ｋ、Ａ３１９Ｔ、Ｖ３２０Ｄ、Ｖ３２０Ｇ、Ｖ３２０Ｓ、Ｑ３２１Ａ、Ｗ３２３Ｒ、Ｎ３２４Ｓ、Ｉ３２５Ｔ、Ｅ３２６Ｋ、Ｅ３３３Ｄ、Ｋ３３６Ｒ、Ｌ３３７Ｉ、Ｌ３４３Ｖ、Ａ３４５Ｖ、Ａ３４５Ｔ、Ｎ３４７Ｌ、Ｎ３４７Ｓ、Ｅ３４８Ａ、Ｅ３４８Ｓ、Ｅ３５０Ｋ、Ｇ３５７Ｒ、Ｈ３６０Ｌ、Ｈ３６０Ａ、Ｃ３６１Ｒ、Ｖ３６２Ａ、Ｅ３６７Ｇ、Ｎ３６９Ｉ、Ｑ３７０Ｄ、Ｑ３７０Ｈ、Ｑ３７０Ｇ、Ｋ３７１Ｇ、Ａ３７５Ｄ、Ｓ３７７Ｙ、Ｙ３８７Ｃ、Ｉ３９７Ｖ、Ｌ３９９Ｓ、Ｔ４０５Ｒ、Ｔ４０９Ｇ、Ｎ４１０Ｓ、Ｆ４２４Ｌ、Ｎ４２９Ｓ、Ｎ４２９Ｇ、Ａ４３６Ｓ、Ｖ４３９Ｌ、Ｑ４４８Ｌ、Ｃ４６５Ｓ、Ｋ４６８Ｑ、Ｓ４７３Ｙ、Ｋ４７４Ｔ、Ｅ４８４Ｄ、Ｉ４９２Ｖ、Ｅ４９５Ｇ、Ｋ４９９Ｅ、Ｐ５００Ｌ、Ｔ５０１Ｐ、Ｐ５０６Ｓ、Ｄ５３６Ｅ、またはＡ５３９Ｖに対応するアミノ酸置換が挙げられる。
【０１６６】
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、列挙されたアミノ酸置換のうちいずれか１つまたは複数を、任意の組合せで、さらなる改変を伴ってか、または伴わずに含有し得る。一般に、改変されたポリペプチドが、それだけには限らないが、ＦＰＰ、ＧＰＰおよびＧＧＰＰを含めた任意の適した非環式ピロリン酸テルペン前駆体からバレンセンおよび／またはその他のテルペンの形成を触媒する能力を保持する限り、当業者によって、本明細書において提供された複数の改変を組み合わせることができる。通常、得られた改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、野生型バレンセンシンターゼと比較して、同様のまたは増大したＦＰＰからのバレンセン生成を示す。一部の例では、得られた改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、野生型バレンセンシンターゼと比較して、ＦＰＰからのバレンセン生成の低減を示す。
【０１６７】
また、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子が、本明細書において提供される。特定の例では、核酸配列は、例えば、コードされる配列の発現レベルを増大するよう最適化されたコドンであり得る。特定のコドン利用は、改変されたポリペプチドが発現される宿主生物に応じて変わる。当業者ならば、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を含めた細菌または酵母における発現に最適なコドンに精通している。例えば、コドン利用情報は、ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ．ｃｏｄｏｎで入手可能であるＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅから入手可能である（データベースの説明については、Richmond (2000) Genome Biology, 1:241参照のこと)。また、Forsburg (2004) Yeast, 10:1045-1047;Brown et al. (1991) Nucleic Acids Research, 19:4298;Sharp et al. (1988) Nucleic Acids Res., 12:8207-8211;Sharp et al. (1991) Yeast，657-78も参照のこと。本明細書における例では、本明細書において提供される核酸配列は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるコドン利用に基づいて最適化されたコドンである。
【０１６８】
本明細書において提供される改変されたポリペプチドおよびコーディング核酸分子は、当業者に公知の標準組換えＤＮＡ技術によって生成できる。標的タンパク質中の任意の１個または複数のアミノ酸の突然変異を達成するための当技術分野で公知の任意の方法を使用してもよい。方法として、コーディング核酸分子の標準的な部位特異的またはランダム突然変異誘発または固相ポリペプチド合成法が挙げられる。例えば、本明細書に記載されるように、バレンセンシンターゼポリペプチドをコードする核酸分子は、コーディング核酸のエラープローンＰＣＲによるランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、オーバーラップＰＣＲ、遺伝子シャッフリングまたはその他の組換え法などの突然変異誘発に付すことができる。次いで、ポリペプチドをコードする核酸を、異種的に発現される宿主細胞中に導入することができる。したがって、また、本明細書において提供される改変されたポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子も、本明細書において提供される。一部の例では、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、固相または溶液相ペプチド合成を使用するなどの合成によって生成される。
【０１６９】
本明細書において提供された、コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、バレンセンシンターゼ活性を示す。コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、以下に記載される任意のものなどの適当なアッセイ（同一条件下）において試験された場合に、配列番号２に示される野生型バレンセンシンターゼポリペプチドと比較して、ＦＰＰからおよそ同じ量または増大した量またはそれ以上のバレンセンを生成できる。例えば、本明細書において提供された改変バレンセンポリペプチドは、一般に、配列番号２で生成される野生型バレンセンシンターゼによってＦＰＰから生成されるバレンセンの量と比較して、ＦＰＰからのバレンセンの量の少なくとも４０％、例えば、量の少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％または１２０％を生成する。
【０１７０】
通常、本明細書において提供された、改変されたポリペプチドは、配列番号２に示される野生型バレンセンシンターゼによる生成と比較して、ＦＰＰからのバレンセンの増大した生成を示す。例えば、本明細書において提供された、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、適当なアッセイ（同一条件下）において試験された場合に、配列番号２に示される野生型バレンセンシンターゼポリペプチドと比較して、ＦＰＰからより多くの（ｍｏｒｅ）またはより多くの（ｇｒｅａｔｅｒ）または増大したバレンセンを生成する。一部の例では、本明細書において提供された、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２で生成される野生型バレンセンシンターゼによってＦＰＰから生成されるバレンセンの量と比較して、ＦＰＰからのバレンセンの量の１１０％〜５０００％、例えば、１５０％〜２０００％など、１５０％〜１０００％、５００％〜２０００％または２００％〜５００％など、その量を超えるものを生成できる。例えば、本明細書において提供された、改変バレンセンポリペプチドは、ＦＰＰからバレンセンを、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼによってＦＰＰから生成されるバレンセンの量より少なくともまたは少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、５００％またはそれ以上増大している量で生成する。バレンセン生成における１０％の増大またはそれより多いバレンセン生成は、例えば、改変されたポリペプチドによって生成されるバレンセンのレベルが、配列番号２に示される野生型バレンセンシンターゼによって生成されるバレンセンのレベルの１１０％または約１１０％であることを意味するということは理解される。生成されるバレンセンの増大倍数としては、本明細書において提供された、改変バレンセンポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼによってＦＰＰから生成されるバレンセンの量の少なくとも１．１倍、一般に、少なくとも１．５倍または少なくとも２倍を生成する。例えば、本明細書において提供された、改変バレンセンポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼによってＦＰＰから生成されるバレンセンの量の、少なくともまたはおよそ少なくともまたは１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍．１．７倍、１．８倍、１．９倍．、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはそれ以上の量を生成する。
【０１７１】
本明細書における記載に基づいて、野生型バレンセンシンターゼから生成されるより多くのバレンセンを生成する改変されたバレンセンシンターゼを同定することは、当業者のレベル内にある。例えば、本明細書に記載されるように、野生型バレンセンシンターゼによる生成と比較して、ＦＰＰからのバレンセンの増大した生成をもたらす改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを選択できる。これは、本明細書における実施例において例示されている。例えば、実施例３は、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドをコードする突然変異体バレンセンシンターゼ核酸分子の作製および野生型遺伝子を含有するものと比較して、上昇したレベルのバレンセンを生成した形質転換体の選択を記載する。選択した形質転換体から得たＤＮＡを配列決定して、増大した特性を付与した、コードされる変異体バレンセンシンターゼにおけるアミノ酸変化（単数または複数）を調べた。本明細書に記載されたように変更された特性を有するものを選択するように、突然変異体を作製しスクリーニングすることは当業者のレベルの範囲内である。節Ｆには、例えば、バレンセンまたはヌートカトンの生成を含めた種々の特性および活性を評価するためのアッセイが記載されている。
【０１７２】
一部の例では、本明細書において提供された、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、野生型バレンセンシンターゼと比較して、変更された基質特異性および／または生成物選択性、および／または変更された生成物分布（すなわち、テルペンの変更された相対量および／または種類）を示す。その他の例では、本明細書において提供された、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号３（Ｖ１８）または配列番号４（Ｖ１９）に示される変異体バレンセンシンターゼポリペプチドと比較して、変更された基質特異性および／または生成物選択性および／または変更された生成物分布（すなわち、テルペンの変更された相対量および／または種類）を示す。野生型バレンセンシンターゼによって生成されたテルペンの生成物分布は、バレンセンならびに例えば、β−セリネン、τ−セリネン、エレモフィロン、７−エピ−α−セリネン、ゲルマクレンＡおよびβ−エレメンを含めたいくつかのその他のテルペン生成物（例えば、テルペン副生成物またはそれに由来する生成物）を含む。本明細書において実施例８に記載されるように、野生型バレンセンシンターゼによって生成される総テルペンのパーセンテージとしてのテルペン生成物分布の割合は、配列番号３または配列番号４に示される変異体バレンセンシンターゼポリペプチドと同様である。
【０１７３】
本明細書において提供された、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、テルペン生成物の総パーセンテージとして、より大きなパーセンテージのバレンセンが生成され、低減したパーセンテージの別のテルペン生成物（単数または複数）（例えば、テルペン副生成物（単数または複数）またはそれに由来する生成物）が生成されるよう変更された生成物分布を示すものを含む。例えば、生成されるテルペンの総量のパーセンテージとして、配列番号２に示される野生型バレンセンシンターゼによって生成されるものよりも大きなパーセンテージのバレンセンを生成する改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、本明細書において提供される。総テルペンのパーセンテージとして、生成されるバレンセンの量は、０．０１％〜９０％、例えば、１％〜１０％、例えば、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％より多く、または約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％増大される。一部の例では、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、バレンセン以外のテルペン生成物を、配列番号２に示される野生型バレンセンシンターゼまたは配列番号３または４に示される変異体バレンセンシンターゼポリペプチドが生成するものよりも総テルペンのパーセンテージとして少なく生成する。バレンセン以外の生成物のパーセンテージは、０．０１％〜９０％、１％〜８０％、５％〜８０％、１０％〜６０％もしくは０．０１％〜２０％より多くまたは約０．０１％〜９０％、１％〜８０％、５％〜８０％、１０％〜６０％もしくは０．０１％〜２０％または０．０１％〜９０％、１％〜８０％、５％〜８０％、１０％〜６０％もしくは０．０１％〜２０％、例えば、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくはそれ以上より多くまたは約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくはそれ以上、低減され得る。例えば、本明細書において提供された、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、生成される総テルペンのパーセンテージとして、配列番号２、３または４に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドが生成するものよりも低減したパーセンテージのβ−エレメンを生成する。生成される総テルペンのパーセンテージとして、β−エレメンのパーセンテージは、０．０１％〜５０％より多くまたは約０．０１％〜５０％または０．０１％〜５０％（すなわち、０．０１％〜５０％のβ−エレメンの量の減少）、０．０１％〜２０％、例えば、１％〜１０％、低減され得る、例えば、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％より多くまたは約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％低減される。本明細書において、また実施例８における記載に基づいて、このような改変されたバレンセンシンターゼを同定することは当業者のレベルの範囲内である。変更された生成物分布、例えば、β−エレメンの低減された形成を示すこのような改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドの例示は、以下の節Ｃ．３に示されている。
【０１７４】
本明細書において提供される改変バレンセンポリペプチドはまた、その他の活性および／または特性を示し得る。改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、例えば、増大した触媒活性、増大した基質（例えば、ＦＰＰ）結合、増大した安定性および／または増大した宿主細胞における発現を示し得る。このような変更された活性および特性は、ＦＰＰからの増大したバレンセン生成をもたらし得る。その他の例では、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、任意の適した基質、例えば、ＦＰＰ、ＧＰＰ、ＧＧＰＰなどからのバレンセン以外のテルペンの形成を触媒し得る。例えば、改変されたバレンセンシンターゼは、１種もしくは複数のモノテルペンもしくはジテルペンまたはバレンセン以外の１種もしくは複数のセスキテルペンを生成し得る。一般に、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、任意のその他のテルペンよりも多くのバレンセンを生成する。
【０１７５】
以下の小節では、本明細書において提供される例示的な改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドおよびコーディング核酸分子が記載される。
【０１７６】
１．改変されたバレンセンシンターゼポリペプチド−例示的アミノ酸置換
バレンセンシンターゼポリペプチド中に１つまたは複数のアミノ酸置換を含有し、バレンセンシンターゼ活性を示す改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、本明細書において提供される。改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、アミノ酸置換を含有しないバレンセンシンターゼポリペプチドと比較して、および／または配列番号２に示される野生型バレンセンシンターゼポリペプチドと比較して、５０％〜５０００％、例えば、５０％〜１２０％、１００％〜５００％または１１０％〜２５０％のＦＰＰからのバレンセン生成を示し得る。
【０１７７】
通常、本明細書において提供された、改変バレンセンポリペプチドは、アミノ酸置換を含有しないバレンセンシンターゼポリペプチドと比較して、例えば、配列番号２に示される野生型バレンセンシンターゼと比較して、増大したＦＰＰからのバレンセン生成を示す。例えば、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、同一条件下で配列番号２に示される野生型バレンセンシンターゼによってＦＰＰから生成されるバレンセンの量の少なくともまたはおよそ少なくとも１０１％、１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、５００％、１５００％、２０００％、３０００％、４０００％、５０００％である量で、ＦＰＰからバレンセンを生成し得る。例えば、バレンセン生成は、少なくともまたはおよそ少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍またはそれ以上増大される。
【０１７８】
特定の例では、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、バレンセン生成の増大と関連していると同定されている１つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸置換を含有する。このような位置は、バレンセン生成の増大をもたらす位置を同定するための、突然変異誘発および選択またはスクリーニング法を使用して同定できる。例えば、本明細書において、実施例３に記載されるように、バレンセンシンターゼ突然変異体およびコーディング核酸を、エラープローンＰＣＲによって作製し、スクリーニングして、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼによって生成されるバレンセンと比較して、バレンセンのレベルの上昇をもたらすものを同定した。このような突然変異の組合せを含有するとして作製された変異体Ｖ１８およびＶ１９は、野生型と比較して、バレンセンの少なくとも１０倍多い生成を示す（実施例３Ｂを参照のこと）。さらなる例示的突然変異体は、Ｖ１８およびＶ１９および／または配列番号２に示される野生型バレンセンシンターゼポリペプチドと比較して、増大したバレンセン生成を示す実施例に記載されている。
【０１７９】
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、少なくともまたは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５３、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、５９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８２、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５またはそれ以上のアミノ酸置換を含有し得る。挿入または欠失などのさらなる改変も含まれ得る。改変されたポリペプチドは、一般に、少なくとも２９のアミノ酸置換を含有する。アミノ酸置換は、配列番号２、２８９〜２９１、３４６、３４７、７５２、８８２もしくは８８３のいずれかまたはその任意の変異体に示されるバレンセンシンターゼにおいてであり得る。例えば、置換は、任意の柑橘類バレンセンシンターゼポリペプチド、例えば、配列番号２、２８９〜２９１、７５２もしくは８８６またはその変異体のいずれかに示されるいずれかにおいてであり得る。上記のように、本明細書における例では、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼに対して、９５％未満の配列同一性、例えば、６２％〜９４．９％の間またはおよそその間の配列同一性を示し、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対して、少なくとも７５％の配列同一性および８０％、８１％、８２％、８３％、８５％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％または９４％未満の配列同一性を含有し得る。例えば、本明細書において提供された、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼに対して、少なくとも８２％または約８２％および９５％未満の配列同一性を示す。
【０１８０】
例えば、本明細書において提供された、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２のバレンセンシンターゼの位置１、２、３、４、５、６、７、１１、１９、２０、２３、２４、２８、３８、５０、５３、５４、５５、５６、５７、５８、６０、６２、６９、７８、８２、８８、９３、９７、９８、１０２、１０６、１１１、１１３、１２５、１３２、１５２、１５３、１５９、１６３、１７３、１８４、１８８、１８９、２００、２０２、２０９、２１０、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２７、２３８、２５２、２５７、２７４、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２９２、２９７、２９９、３０７、３１０、３１１、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２３、３２４、３２５、３２６、３３３、３３６、３３７、３４３、３４５、３４７、３４８、３５０、３５７、３６０、３６１、３６２、３６７、３６９、３７０、３７１、３７５、３７７、３８７、３９７、３９９、４０５、４０９、４１０、４２４、４２９、４３６、４３９、４４８、４６５、４６８、４７３、４７４、４８４、４９２、４９５、４９９、５００、５０１、５０６、５３６または５３９に対応する１つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）（置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ））を含有する。
【０１８１】
例えば、本明細書において提供された改変バレンセンポリペプチドは、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼに関するＣＶＳ番号付けによって、位置Ｍ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｇ４、Ｅ５、Ｔ６、Ｆ７、Ａ１１、Ｒ１９、Ｎ２０、Ｌ２３、Ｋ２４、Ｄ２８、Ｑ３８、Ｒ５０、Ｔ５３、Ｄ５４、Ａ５５、Ｅ５６、Ｄ５７、Ｋ５８、Ｖ６０、Ｋ６２、Ｖ６９、Ｆ７８、Ｉ８２、Ｋ８８、Ｙ９３、Ｎ９７、Ｒ９８、Ｈ１０２、Ｌ１０６、Ｌ１１１、Ｑ１１３、Ｋ１２５、Ｒ１３２、Ｙ１５２、Ｍ１５３、Ｈ１５９、Ｅ１６３、Ｋ１７３、Ｋ１８４、Ｑ１８８、Ｉ１８９、Ｔ２００、Ｐ２０２、Ｆ２０９、Ｍ２１０、Ｍ２１２、Ｉ２１３、Ｎ２１４、Ｓ２１５、Ｔ２１６、Ｓ２１７、Ｄ２１８、Ｈ２１９、Ｌ２２０、Ｙ２２１、Ｎ２２７、Ｅ２３８、Ｋ２５２、Ｔ２５７、Ｄ２７４、Ｆ２７９、Ｅ２８０、Ｐ２８１、Ｑ２８２、Ｙ２８３、Ａ２８４、Ｑ２９２、Ｎ２９７、Ｉ２９９、Ｙ３０７、Ｌ３１０、Ｅ３１１、Ｌ３１３、Ｓ３１４、Ｌ３１５、Ｆ３１６、Ｔ３１７、Ｅ３１８、Ａ３１９、Ｖ３２０、Ｑ３２１、Ｗ３２３、Ｎ３２４、Ｉ３２５、Ｅ３２６、Ｅ３３３、Ｋ３３６、Ｌ３３７、Ｌ３４３、Ａ３４５、Ｎ３４７、Ｅ３４８、Ｅ３５０、Ｇ３５７、Ｈ３６０、Ｃ３６１、Ｖ３６２、Ｅ３６７、Ｎ３６９、Ｑ３７０、Ｋ３７１、Ａ３７５、Ｓ３７７、Ｙ３８７、Ｉ３９７、Ｌ３９９、Ｔ４０５、Ｔ４０９、Ｎ４１０、Ｆ４２４、Ｎ４２９、Ｖ４３９、Ａ４３６、Ｑ４４８、Ｃ４６５、Ｋ４６８、Ｓ４７３、Ｋ４７４、Ｅ４８４、Ｉ４９２、Ｅ４９５、Ｋ４９９、Ｐ５００、Ｔ５０１、Ｐ５０６、Ｄ５３６またはＡ５３９に対応する１つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）（置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ））を含有する。本明細書において記載された任意のアミノ酸置換は、例えば、配列番号２、２８９〜２９１、７５２もしくは８８６のいずれかに示されるバレンセンシンターゼポリペプチドまたはその変異体を含めた、その他のバレンセンシンターゼポリペプチド中の対応する位置にある天然または内因性残基に行うことができるということは理解される。対応する位置およびアミノ酸置換は、図１に表されるような配列番号２とのアラインメントによって決定できる。任意のアミノ酸残基を使用して、その位置の天然または内因性残基を置換できる。通常、アミノ酸残基は、酵素活性を低減または排除しないものである。一部の例では、アミノ酸置換は、表２に示される置換などの保存的置換である。その他の例では、アミノ酸置換は、保存的置換ではない。例えば、アミノ酸は、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、プロリン（Ｐ）、トレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グリシン（Ｇ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、システイン（Ｃ）、フェニルアラニン（Ｆ）、メチオニン（Ｍ）、チロシン（Ｙ）またはトリプトファン（Ｗ）によって置換され得る。
【０１８２】
提供された改変されたバレンセンシンターゼポリペプチド中に含まれ得る例示的アミノ酸置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）（または置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ））として、それだけには限らないが、配列番号２に示される位置に関するＣＶＳ番号付けによって、Ｍ１Ｔ、Ｓ２Ｒ、Ｓ２Ｋ、Ｓ２Ｅ、Ｓ２Ｑ、Ｓ２Ｐ、Ｓ２Ｔ、Ｓ２Ｌ、Ｓ２Ｈ、Ｓ２Ａ、Ｓ２Ｖ、Ｓ３Ｄ、Ｓ３Ｒ、Ｓ３Ｇ、Ｓ３Ｉ、Ｓ３Ｅ、Ｓ３Ｖ、Ｓ３Ａ、Ｓ３Ｔ、Ｓ３Ｌ、Ｓ３Ｍ、Ｓ３Ｎ、Ｇ４Ｋ、Ｇ４Ｖ、Ｇ４Ｎ、Ｇ４Ｉ、Ｇ４Ｒ、Ｇ４Ｓ、Ｇ４Ｐ、Ｇ４Ａ、Ｇ４Ｅ、Ｇ４Ｆ、Ｇ４Ｃ、Ｇ４Ｔ、Ｇ４Ｌ、Ｅ５Ａ、Ｅ５Ｇ、Ｅ５Ｓ、Ｅ５Ｔ、Ｅ５Ｄ、Ｅ５Ｈ、Ｅ５Ｉ、Ｅ５Ｐ、Ｅ５Ｌ、Ｅ５Ｎ、Ｔ６Ｒ、Ｔ６Ｖ、Ｔ６Ｄ、Ｔ６Ｌ、Ｔ６Ａ、Ｔ６Ｅ、Ｔ６Ｋ、Ｔ６Ｓ、Ｔ６Ｇ、Ｔ６Ｃ、Ｔ６Ｍ、Ｔ６Ｙ、Ｆ７Ｃ、Ｆ７Ａ、Ｆ７Ｑ、Ｆ７Ｋ、Ｆ７Ｓ、Ｆ７Ｇ、Ｆ７Ｔ、Ｆ７Ｌ、Ｆ７Ｒ、Ｆ７Ｐ、Ａ１１Ｔ、Ｒ１９Ｋ、Ｒ１９Ｐ、Ｎ２０Ｄ、Ｌ２３Ｓ、Ｋ２４Ａ、Ｋ２４Ｑ、Ｋ２４Ｙ、Ｄ２８Ｇ、Ｑ３８Ｖ、Ｑ３８Ａ、Ｑ３８Ｎ、Ｒ５０Ｇ、Ｔ５３Ｌ、Ｔ５３Ｒ、Ｄ５４Ａ、Ｄ５４Ｐ、Ｄ５４Ｃ、Ａ５５Ｔ、Ａ５５Ｐ、Ａ５５Ｒ、Ａ５５Ｖ、Ａ５５Ｑ、Ｅ５６Ｇ、Ｅ５６Ｐ、Ｅ５６Ｆ、Ｅ５６Ａ、Ｅ５６Ｔ、Ｅ５６Ｑ、Ｄ５７Ｒ、Ｄ５７Ｐ、Ｄ５７Ｓ、Ｄ５７Ｑ、Ｄ５７Ａ、Ｋ５８Ｑ、Ｋ５８Ｒ、Ｋ５８Ｐ、Ｋ５８Ｅ、Ｋ５８Ａ、Ｖ６０Ｉ、Ｖ６０Ｇ、Ｋ６２Ｒ、Ｖ６９Ｉ、Ｆ７８Ｌ、Ｉ８２Ｖ、Ｋ８８Ｑ、Ｋ８８Ａ、Ｙ９３Ｈ、Ｎ９７Ｄ、Ｒ９８Ｋ、Ｈ１０２Ｙ、Ｌ１０６Ａ、Ｌ１０６Ｓ、Ｌ１０６Ｋ、Ｌ１０６Ｆ、Ｌ１１１Ｓ、Ｑ１１３Ｒ、Ｋ１２５Ａ、Ｋ１２５Ｑ、Ｒ１３２Ｇ、Ｙ１５２Ｈ、Ｍ１５３Ｎ、Ｍ１５３Ｇ、Ｈ１５９Ｑ、Ｈ１５９Ｋ、Ｈ１５９Ｒ、Ｅ１６３Ｄ、Ｋ１７３Ｅ、Ｋ１７３Ｑ、Ｋ１７３Ａ、Ｋ１８４Ｒ、Ｑ１８８Ｒ、Ｉ１８９Ａ、Ｉ１８９Ｖ、Ｉ１８９Ｐ、Ｔ２００Ｑ、Ｐ２０２Ｓ、Ｆ２０９Ｉ、Ｆ２０９Ｈ、Ｆ２０９Ｅ、Ｆ２０９Ｌ、Ｆ２０９Ｔ、Ｍ２１０Ｔ、Ｍ２１２Ｒ、Ｍ２１２Ｄ、Ｍ２１２Ｎ、Ｍ２１２Ｓ、Ｍ２１２Ａ、Ｍ２１２Ｙ、Ｍ２１２Ｋ、Ｍ２１２Ｆ、Ｍ２１２Ｈ、Ｍ２１２Ｑ、Ｉ２１３Ｙ、Ｉ２１３Ｍ、Ｉ２１３Ａ、Ｉ２１３Ｒ、Ｉ２１３Ｓ、Ｉ２１３Ｌ、Ｉ２１３Ｆ、Ｉ２１３Ｓ、Ｉ２１３Ｐ、Ｉ２１３Ｑ、Ｉ２１３Ｎ、Ｉ２１３Ｋ、Ｉ２１３Ｖ、Ｎ２１４Ｄ、Ｎ２１４Ｅ、Ｎ２１４Ｓ、Ｎ２１４Ｌ、Ｎ２１４Ｙ、Ｎ２１４Ｖ、Ｎ２１４Ｐ、Ｎ２１４Ｈ、Ｎ２１４Ｃ、Ｎ２１４Ａ、Ｎ２１４Ｔ、Ｎ２１４Ｒ、Ｓ２１５Ｈ、Ｓ２１５Ｇ、Ｓ２１５Ｋ、Ｓ２１５Ｒ、Ｓ２１５Ｐ、Ｓ２１５Ａ、Ｓ２１５Ｎ、Ｓ２１５Ｔ、Ｓ２１５Ｌ、Ｓ２１５Ｖ、Ｓ２１５Ｑ、Ｔ２１６Ｑ、Ｔ２１６Ｙ、Ｔ２１６Ｅ、Ｔ２１６Ｐ、Ｔ２１６Ｒ、Ｔ２１６Ｃ、Ｔ２１６Ｖ、Ｔ２１６Ｋ、Ｔ２１６Ｄ、Ｔ２１６Ａ、Ｔ２１６Ｓ、Ｓ２１７Ｒ、Ｓ２１７Ｋ、Ｓ２１７Ｆ、Ｓ２１７Ｉ、Ｓ２１７Ｔ、Ｓ２１７Ｇ、Ｓ２１７Ｙ、Ｓ２１７Ｎ、Ｓ２１７Ｈ、Ｓ２１７Ｅ、Ｓ２１７Ｆ、Ｓ２１７Ｃ、Ｄ２１８Ｉ、Ｄ２１８Ｇ、Ｄ２１８Ｖ、Ｄ２１８Ｃ、Ｄ２１８Ｐ、Ｄ２１８Ｍ、Ｄ２１８Ｒ、Ｄ２１８Ｌ、Ｄ２１８Ｓ、Ｄ２１８Ａ、Ｄ２１８Ｙ、Ｄ２１８Ｋ、Ｈ２１９Ｄ、Ｈ２１９Ａ、Ｈ２１９Ｌ、Ｈ２１９Ｃ、Ｈ２１９Ｗ、Ｈ２１９Ｒ、Ｈ２１９Ｓ、Ｈ２１９Ｆ、Ｈ２１９Ｅ、Ｌ２２０Ｖ、Ｌ２２０Ｓ、Ｌ２２０Ｔ、Ｌ２２０Ｐ、Ｌ２２０Ｍ、Ｌ２２０Ａ、Ｌ２２０Ｈ、Ｌ２２０Ｅ、Ｌ２２０Ｇ、Ｌ２２０Ｄ、Ｙ２２１Ｃ、Ｙ２２１Ｖ、Ｙ２２１Ｑ、Ｙ２２１Ｆ、Ｙ２２１Ｓ、Ｙ２２１Ｎ、Ｙ２２１Ｔ、Ｙ２２１Ｐ、Ｙ２２１Ｌ、Ｙ２２１Ｋ、Ｙ２２１Ｗ、Ｙ２２１Ｅ、Ｙ２２１Ｖ、Ｎ２２７Ｓ、Ｅ２３８Ｄ、Ｋ２５２Ａ、Ｋ２５２Ｑ、Ｔ２５７Ａ、Ｄ２７４Ｍ、Ｄ２７４Ｎ、Ｄ２７４Ｓ、Ｄ２７４Ｆ、Ｄ２７４Ｇ、Ｄ２７４Ｈ、Ｄ２７４Ｅ、Ｆ２７９Ｓ、Ｆ２７９Ｉ、Ｆ２７９Ｐ、Ｆ２７９Ｄ、Ｆ２７９Ｌ、Ｆ２７９Ｎ、Ｆ２７９Ｍ、Ｆ２７９Ｈ、Ｆ２７９Ｃ、Ｆ２７９Ａ、Ｆ２７９Ｇ、Ｆ２７９Ｗ、Ｅ２８０Ｌ、Ｐ２８１Ｓ、Ｐ２８１Ｈ、Ｐ２８１Ｋ、Ｐ２８１Ａ、Ｐ２８１Ｗ、Ｐ２８１Ｌ、Ｐ２８１Ｙ、Ｑ２８２Ｌ、Ｑ２８２Ｓ、Ｑ２８２Ａ、Ｑ２８２Ｉ、Ｑ２８２Ｒ、Ｑ２８２Ｙ、Ｑ２８２Ｇ、Ｑ２８２Ｗ、Ｑ２８２Ｐ、Ｑ２８２Ｅ、Ｙ２８３Ｆ、Ｙ２８３Ｎ、Ａ２８４Ｔ、Ａ２８４Ｇ、Ａ２８４Ｐ、Ａ２８４Ｖ、Ａ２８４Ｒ、Ａ２８４Ｄ、Ａ２８４Ｅ、Ａ２８４Ｓ、Ａ２８４Ｈ、Ａ２８４Ｋ、Ａ２８４Ｉ、Ａ２８４Ｗ、Ａ２８４Ｍ、Ｑ２９２Ｋ、Ｉ２９９Ｙ、Ｙ３０７Ｈ、Ｌ３１０Ｈ、Ｅ３１１Ｐ、Ｅ３１１Ｔ、Ｌ３１３Ｃ、Ｓ３１４Ａ、Ｓ３１４Ｔ、Ｌ３１５Ｍ、Ｆ３１６Ｌ、Ｔ３１７Ｓ、Ｅ３１８Ｋ、Ａ３１９Ｔ、Ｖ３２０Ｄ、Ｖ３２０Ｇ、Ｖ３２０Ｓ、Ｑ３２１Ａ、Ｗ３２３Ｒ、Ｎ３２４Ｓ、Ｉ３２５Ｔ、Ｅ３２６Ｋ、Ｅ３３３Ｄ、Ｋ３３６Ｒ、Ｌ３３７Ｉ、Ｌ３４３Ｖ、Ａ３４５Ｖ、Ａ３４５Ｔ、Ｎ３４７Ｌ、Ｎ３４７Ｓ、Ｅ３４８Ａ、Ｅ３４８Ｓ、Ｅ３５０Ｋ、Ｇ３５７Ｒ、Ｈ３６０Ｌ、Ｈ３６０Ａ、Ｃ３６１Ｒ、Ｖ３６２Ａ、Ｅ３６７Ｇ、Ｎ３６９Ｉ、Ｑ３７０Ｄ、Ｑ３７０Ｈ、Ｑ３７０Ｇ、Ｋ３７１Ｇ、Ａ３７５Ｄ、Ｓ３７７Ｙ、Ｙ３８７Ｃ、Ｉ３９７Ｖ、Ｌ３９９Ｓ、Ｔ４０５Ｒ、Ｔ４０９Ｇ、Ｎ４１０Ｓ、Ｆ４２４Ｌ、Ｎ４２９Ｓ、Ｎ４２９Ｇ、Ａ４３６Ｓ、Ｖ４３９Ｌ、Ｑ４４８Ｌ、Ｃ４６５Ｓ、Ｋ４６８Ｑ、Ｓ４７３Ｙ、Ｋ４７４Ｔ、Ｅ４８４Ｄ、Ｉ４９２Ｖ、Ｅ４９５Ｇ、Ｋ４９９Ｅ、Ｐ５００Ｌ、Ｔ５０１Ｐ、Ｐ５０６Ｓ  Ｄ５３６ＥまたはＡ５３９Ｖが挙げられる。
【０１８３】
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、列挙されたアミノ酸置換のうち任意の１つまたは複数を、任意の組合せで、さらなる改変を伴ってか、または伴わずに含有し得る。
【０１８４】
一部の例では、本明細書において提供された改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示される位置に関して、位置６０、９７、２０９、２１２、２１４、２２１、２３８、２９２、３３３、３４５、３６９、４０５、４２９、４７３および／または５３６に対応する１つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸置換を含有する。例えば、提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドに含まれ得るアミノ酸置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）（または置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ））として、それだけには限らないが、配列番号２に示される位置に関するＣＶＳ番号付けによって、Ｖ６０Ｉ、Ｖ６０Ｇ、Ｎ９７Ｄ、Ｆ２０９Ｉ、Ｆ２０９Ｈ、Ｆ２０９Ｅ、Ｆ２０９Ｌ、Ｆ２０９Ｔ、Ｍ２１２Ｒ、Ｍ２１２Ｄ、Ｍ２１２Ｎ、Ｍ２１２Ｓ、Ｍ２１２Ａ、Ｍ２１２Ｙ、Ｍ２１２Ｋ、Ｍ２１２Ｆ、Ｍ２１２Ｈ、Ｍ２１２Ｑ、Ｎ２１４Ｄ、Ｎ２１４Ｅ、Ｎ２１４Ｓ、Ｎ２１４Ｌ、Ｎ２１４Ｙ、Ｎ２１４Ｖ、Ｎ２１４Ｐ、Ｎ２１４Ｈ、Ｎ２１４Ｃ、Ｎ２１４Ａ、Ｎ２１４Ｔ、Ｎ２１４Ｒ、Ｙ２２１Ｃ、Ｙ２２１Ｖ、Ｙ２２１Ｑ、Ｙ２２１Ｆ、Ｙ２２１Ｓ、Ｙ２２１Ｎ、Ｙ２２１Ｔ、Ｙ２２１Ｐ、Ｙ２２１Ｌ、Ｙ２２１Ｋ、Ｙ２２１Ｗ、Ｙ２２１Ｅ、Ｙ２２１Ｖ、Ｅ２３８Ｄ、Ｑ２９２Ｋ、Ｎ９７Ｄ、Ｅ３３３Ｄ、Ａ３４５Ｖ、Ａ３４５Ｔ、Ｎ３６９Ｉ、Ｔ４０５Ｒ、Ｎ４２９Ｓ、Ｎ４２９Ｇ、Ｓ４７３Ｙ、および／またはＤ５３６Ｅが挙げられる。
【０１８５】
その他のアミノ酸置換もまた、本明細書において提供された改変されたバレンセンシンターゼポリペプチド中に含まれ得る。例えば、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示される位置に関して、位置２４、３８、５８、６０、８８、９３、９７、９８、１２５、１７３、１８４、２０９、２１２、２１４、２１９、２２１、２３８、２５２、２９２、３２１、３３３、３４５、３６９、３７７、４０５、４２９、４３６、５０１および／または５３６に対応する１つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸置換を含有する。本明細書において実施例３に記載されるように、このようなアミノ酸位置は、突然変異誘発のための標的にされる残基であると経験的にか、またはモデリングによって同定される。例えば、残基は、表面残基として位置している、および／または寛容である（例えば、酵素活性に対して中立的効果を有する）か、もしくは改善されたバレンセン生成をもたらすのいずれかであると同定される。例えば、提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチド中に含まれ得るアミノ酸置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）（または（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ））として、それだけには限らないが、配列番号２に示される位置に関するＣＶＳ番号付けによって、Ｋ２４Ａ、Ｋ２４Ｑ、Ｄ２８Ｇ、Ｑ３８Ｖ、Ｑ３８Ａ、Ｑ３８Ｎ、Ｋ５８Ｑ、Ｋ５８Ｒ、Ｋ５８Ｐ、Ｋ５８Ｅ、Ｋ５８Ａ、Ｖ６０Ｉ、Ｖ６０Ｇ、Ｋ８８Ｑ、Ｋ８８Ａ、Ｙ９３Ｈ、Ｎ９７Ｄ、Ｒ９８Ｋ、Ｋ１２５Ａ、Ｋ１２５Ｑ、Ｋ１７３Ｅ、Ｋ１７３Ｑ、Ｋ１７３Ａ、Ｋ１８４Ｒ、Ｆ２０９Ｉ、Ｆ２０９Ｈ、Ｆ２０９Ｅ、Ｆ２０９Ｌ、Ｆ２０９Ｔ、Ｍ２１２Ｒ、Ｍ２１２Ｄ、Ｍ２１２Ｎ、Ｍ２１２Ｓ、Ｍ２１２Ａ、Ｎ２１４Ｄ、Ｎ２１４Ｅ、Ｎ２１４Ｓ、Ｎ２１４Ｌ、Ｎ２１４Ｙ、Ｎ２１４Ｖ、Ｍ２１２Ｙ、Ｍ２１２Ｋ、Ｍ２１２Ｆ、Ｍ２１２Ｈ、Ｍ２１２Ｑ、Ｈ２１９Ｄ、Ｈ２１９Ａ、Ｈ２１９Ｌ、Ｈ２１９Ｃ、Ｈ２１９Ｗ、Ｈ２１９Ｒ、Ｈ２１９Ｓ、Ｈ２１９Ｆ、Ｈ２１９Ｅ、Ｙ２２１Ｃ、Ｙ２２１Ｖ、Ｙ２２１Ｑ、Ｙ２２１Ｆ、Ｙ２２１Ｓ、Ｙ２２１Ｎ、Ｙ２２１Ｔ、Ｙ２２１Ｐ、Ｙ２２１Ｌ、Ｙ２２１Ｋ、Ｙ２２１Ｗ、Ｙ２２１Ｅ、Ｙ２２１Ｖ、Ｎ２２７Ｓ、Ｅ２３８Ｄ、Ｋ２５２Ｑ、Ｑ２９２Ｋ、Ｑ３２１Ａ、Ｅ３３３Ｄ、Ａ３４５Ｖ、Ａ３４５Ｔ、Ｎ３６９Ｉ、Ｓ３７７Ｙ、Ｔ４０５Ｒ、Ｎ４２９Ｓ、Ｎ４２９Ｇ、Ａ４３６Ｓ、Ｔ５０１Ｐ、および／またはＤ５３６Ｅが挙げられる。
【０１８６】
本明細書における一部の例では、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、位置６０、２０９、２３８および２９２にアミノ酸置換を含有する。例えば、提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチド中に含まれ得るアミノ酸置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）（または置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ））として、それだけには限らないが、各々、配列番号２に示される位置に関するＣＶＳ番号付けによって、位置Ｖ６０での置換、例えば、アミノ酸置換Ｖ６０ＩまたはＶ６０Ｇ；位置Ｆ２０９での置換、例えば、アミノ酸置換Ｆ２０９Ｉ、Ｆ２０９Ｈ、Ｆ２０９Ｅ、Ｆ２０９Ｌ、Ｆ２０９Ｔ；位置Ｅ２３８での置換、例えば、アミノ酸置換Ｅ２３８Ｄ；および位置Ｑ２９２での置換、例えば、アミノ酸置換Ｑ２９２Ｋが挙げられる。本明細書におけるその他の例では、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、位置６０、１２５、１７３、２０９、２３８、２５２および２９２にアミノ酸置換を含有する。例えば、提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチド中に含まれ得るアミノ酸置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）（または置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ））として、それだけには限らないが、各々、配列番号２に示される位置に関して、位置Ｖ６０での置換、例えば、アミノ酸置換Ｖ６０ＩまたはＶ６０Ｇ；位置Ｋ１２５での置換、例えば、アミノ酸置換Ｋ１２５ＡまたはＫ１２５Ｑ；位置Ｋ１７３での置換、例えば、アミノ酸置換Ｋ１７３Ｅ、Ｋ１７３ＱまたはＫ１７３Ａ；位置Ｆ２０９での置換、例えば、アミノ酸置換Ｆ２０９Ｉ、Ｆ２０９Ｈ、Ｆ２０９Ｅ、Ｆ２０９Ｌ、Ｆ２０９Ｔ；位置Ｅ２３８での置換、例えば、アミノ酸置換Ｅ２３８Ｄ；位置Ｋ２５２での置換、例えば、アミノ酸置換Ｋ２５２Ｑ；および位置Ｑ２９２での置換、例えば、アミノ酸置換Ｑ２９２Ｋが挙げられる。
【０１８７】
表３は、配列番号２に示されるようなバレンセンシンターゼポリペプチドのアミノ酸位置に対応する同定された位置の例示的アミノ酸置換の限定されない例を提供する。これらの中には、例示的な単一のおよび組み合わせた突然変異が含まれる。このような突然変異に関して、第１のアミノ酸（１文字略語）は、置換されているアミノ酸に対応し、数字は、配列番号２に関するバレンセンシンターゼポリペプチド配列中の位置に対応し、第２のアミノ酸（１文字略語）は、その位置の第１のアミノ酸を置換する選択されたアミノ酸に対応する。これらの突然変異は、例えば、配列番号２、２８９〜２９１、７５２もしくは８８６に示される野生型バレンセンシンターゼまたはそれらの変異体を含めた任意のバレンセンシンターゼ中に組み込むことができる。一部の例では、改変が、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼ中に組み込まれる。これは、表中に提供された例示的バレンセンシンターゼ突然変異体およびコーディング核酸分子をもたらす。また、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドの例示的アミノ酸配列およびコーディング核酸配列を示す配列識別子（配列番号）も提供される。
【０１８８】
【表３−１】
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【表３−２】
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【０１８９】
【表３−３】
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【表３−４】
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【０１９０】
【表３−５】
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【表３−６】
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【０１９１】
【表３−７】
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【表３−８】
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【０１９２】
【表３−９】
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【表３−１０】
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【０１９３】
【表３−１１】
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【表３−１２】
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【０１９４】
【表３−１３】
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【表３−１４】
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【０１９５】
２．ドメインスワップ
その中の１つまたは複数の（ｏｎｅ  ｏｆ  ｍｏｒｅ）ドメインまたは領域のアミノ酸残基またはその一部の欠失およびアミノ酸の異種配列の挿入によるスワップ（欠失および挿入）を含有するキメラポリペプチドである、改変テルペンシンターゼポリペプチド、特に、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが本明細書において提供される。一部の例では、異種配列は、アミノ酸のランダム化された配列である。その他の例では、異種配列は、別のテルペンシンターゼポリペプチドに由来する対応するドメインもしくは領域またはその一部のアミノ酸の連続配列である。置換または挿入される異種配列は、一般に、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０個またはそれ以上のアミノ酸を含む。異種配列が、別のテルペンシンターゼの対応するドメインまたはその一部に由来する例では、異種配列は、一般に、対応するドメインもしくは領域または一部の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上の連続するアミノ酸を含む。このような一例では、異種の対応するドメインもしくは領域またはその一部に隣接する残基もまた、本明細書において提供された改変バレンセンポリペプチド中に含まれ得る。
【０１９６】
本明細書において提供されたスワップ突然変異体の一例では、バレンセンシンターゼポリペプチドの少なくとも１つのドメインもしくは領域またはその一部が、別のテルペンシンターゼポリペプチドに由来する対応するドメインもしくは領域またはその一部のアミノ酸の連続する配列で置換される。一部の例では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のドメインもしくは領域またはその一部が、別のテルペンシンターゼポリペプチドに由来する対応するドメインもしくは領域またはその一部のアミノ酸の連続する配列で置換される。
【０１９７】
バレンセンシンターゼポリペプチドの任意のドメインもしくは領域またはその一部が、アミノ酸の異種配列、例えば、別のテルペンに由来する対応するドメインまたは領域に由来する異種配列で置換され得る。ドメインまたは領域は、構造ドメインである場合も、機能性ドメインである場合もある。当業者ならば、テルペンシンターゼ中のドメインまたは領域に精通している。機能性ドメインとして、例えば、触媒ドメインまたはその一部が挙げられる。機能性ドメインとしてまた、基質特異性および生成物分布と関連していると同定された機能性ドメイン、例えば、アリストロチェン特異的ドメイン、比率決定ドメイン、ベチスピラジエン（Ｖｅｓｔｉｓｐｉｒａｄｉｅｎｅ）特異的ドメイン、基質結合ドメインまたはヒヨス属特異的ドメインまたはその他のシンターゼ中のその他の類似のドメインなどを挙げることができる（例えば、米国特許第５，８２４，７７４号参照のこと）。構造ドメインは、不定形ループ１、αヘリックス１、不定形ループ２、αヘリックス２、不定形ループ３、αヘリックス３、不定形ループ４、αヘリックス４、不定形ループ５、αヘリックス５、不定形ループ６、αヘリックス６、不定形ループ７、αヘリックス７、不定形ループ８、αヘリックス８、不定形ループ９、αヘリックスＡ、Ａ−Ｃループ、αヘリックスＣ、不定形ループ１１、αヘリックスＤ、不定形ループ１２、αヘリックスＤ１、不定形ループ、αヘリックスＤ２、不定形ループ１４、αヘリックスＥ、不定形ループ１５、αヘリックスＦ、不定形ループ１６、αヘリックスＧ１、不定形ループ１７、αヘリックスＧ２、不定形ループ１８、αヘリックスＨ１、不定形ループ１９、αヘリックスＨ２、不定形ループ２０、αヘリックスＨ３、不定形ループ２１、αヘリックスａ−１、不定形ループ２２、αヘリックスＩ、不定形ループ２３、αヘリックスＪ、Ｊ−Ｋループ、αヘリックスＫおよび／または不定形ループ２５のすべてまたは一部を含み得る（例えば、図２参照のこと）。
【０１９８】
当業者ならば、種々のテルペンシンターゼに精通しており、対応するドメインもしくは領域またはそのアミノ酸の一部を同定できる。以下の表５Ｂは、例示的テルペンシンターゼの配列を示す。本明細書における特定の例では、本明細書において提供された改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドドメインスワップ突然変異体は、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）バレンセンシンターゼ（配列番号３４６および３４７）、タバコ５−エピ−アリストロチェンシンターゼ（ＴＥＡＳ；配列番号２９５または９４１）またはヒオシアムス・ムチクス（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ  ｍｕｔｉｃｕｓ）プレムナスピロジエンシンターゼ（ＨＰＳ；配列番号２９６または９４２）であるテルペンシンターゼポリペプチドの対応するドメインもしくは領域またはその一部に由来する異種配列を含有する。
【０１９９】
通常、得られた改変されたバレンセンシンターゼは、バレンセンシンターゼ活性およびＦＰＰからバレンセンを生成する能力を示す。例えば、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、改変（例えば、ドメインまたは領域のアミノ酸残基のアミノ酸置換またはスワップ）を含有しないバレンセンシンターゼポリペプチドと比較して、および／または配列番号２に示される野生型バレンセンシンターゼポリペプチドと比較して、５０％〜５０００％、例えば、５０％〜１２０％、１００％〜５００％または１１０％〜２５０％のＦＰＰからのバレンセン生成を示す。通常、本明細書における実施例において実証されるように、改変バレンセンポリペプチドは、改変を含有しないバレンセンシンターゼポリペプチドと比較して、例えば、配列番号２に示される野生型バレンセンシンターゼと比較して、増大したＦＰＰからのバレンセン生成を示す。例えば、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、同一条件下で、改変を含有しない野生型バレンセンシンターゼによるＦＰＰから生成されるバレンセンの量の、少なくともまたは約１０１％、１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、５００％、１５００％、２０００％、３０００％、４０００％、５０００％である量で、ＦＰＰからバレンセンを生成できる。例えば、バレンセン生成は、少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍またはそれ以上増大される。
【０２００】
本明細書における特定の例では、本明細書において提供された改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、１つまたは複数の構造ドメインのすべてまたは一部が、別のテルペンポリペプチドの対応する構造ドメインで置換されているスワップ突然変異体である。以下の表４Ａは、それぞれ、ＴＥＡＳまたはＣＶＳを用いるシンターゼのアラインメントに基づいた、すべてのテルペンシンターゼに対する一般的な番号付けスキームである、ＴＥＡＳ番号付けまたはＣＶＳ番号付けに基づいた番号付けを用いて構造ドメインを同定する（例えば、図４参照のこと）。したがって、その他のテルペンシンターゼ中の対応するドメインを同定できる。本明細書において図２は、例示的テルペンシンターゼ中の構造ドメインおよび領域ならびに各々の対応するアミノ酸残基をさらに表す。
【０２０１】
【表４】
2013544084.tif 000019
【０２０２】
表４Ｂは、本明細書において提供された改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドにおいて置換される例示的構造ドメイン（単数または複数）またはその一部を示し、また、その他のテルペンシンターゼに由来する例示的な対応する置換残基を同定する。バレンセンシンターゼ中の以下のドメインもしくは領域またはその一部のいずれも、それだけには限らないが、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）バレンセンシンターゼ（配列番号３４６および３４７）、ＴＥＡＳ（配列番号２９５および９４１）またはＨＰＳ（配列番号２９６および９４２）を含めた別のテルペンシンターゼに由来する対応する領域で置換され得る。
【０２０３】
【表５】
2013544084.tif 000020
【０２０４】
例えば、本明細書において提供された改変バレンセンポリペプチドでは、バレンセンシンターゼの不定形ループ１およびαヘリックス１（配列番号２のアミノ酸３〜４１に対応する）の部分の１つまたは複数が、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）に由来する対応する領域（配列番号３４６のアミノ酸３〜５１に対応する）で置換され得、バレンセンシンターゼの不定形ループ２（配列番号２のアミノ酸５３〜５８に対応する）が、ＴＥＡＳに由来する対応する領域（配列番号２９５または９４１のアミノ酸５８〜６３に対応する）で置換され得；αヘリックス３の部分（配列番号２のアミノ酸８５〜８９に対応する）が、ＨＰＳ（配列番号９４２）のアミノ酸残基９３〜９７で置換され；αヘリックス３および不定形ループ４の部分（配列番号２のアミノ酸８５〜９９に対応する）が、ＨＰＳ（配列番号９４２）のアミノ酸残基９３〜１１０で置換され；バレンセンシンターゼの不定形ループ５および隣接する残基（配列番号２のアミノ酸１１５〜１４６に対応する）が、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）に由来する対応する領域（配列番号３４６のアミノ酸１２８〜１５９に対応する）で置換され；不定形ループ６および隣接する残基（配列番号２のアミノ酸１５２〜１６３に対応する）が、ＨＰＳに由来する対応する領域（配列番号９４２のアミノ酸１６３〜１７４に対応する）で置換され；不定形ループ７（配列番号２のアミノ酸１７４〜１８４に対応する）が、ＨＰＳに由来する対応する領域（配列番号９４２のアミノ酸１８５〜１９３に対応する）で置換され；不定形ループ９および隣接する残基（配列番号２のアミノ酸２１２〜２２１に対応する）が、ＨＰＳに由来する対応する領域（配列番号９４２のアミノ酸２２１〜２２８に対応する）で置換され；αヘリックスＤ１（配列番号２のアミノ酸３１０〜３２２に対応する）が、ＨＰＳに由来する対応する領域（配列番号９４２のアミノ酸３１７〜３２９に対応する）で置換され；および／またはＪ−Ｋループ（配列番号２のアミノ酸５２２〜５３４に対応する）が、ＨＰＳに由来する対応する領域（配列番号９４２のアミノ酸５２７〜５４１に対応する）で置換される。得られる改変は、アミノ酸挿入、欠失またはアミノ酸置換であり得る。例えば、例示的アミノ酸置換として、それだけには限らないが、配列番号２に示される位置に関するＣＶＳ番号付けによって、Ｓ３Ｔ、Ｇ４Ｑ、Ｅ５Ｖ、Ｔ６Ｋ、Ｆ７Ｎ、Ｔ１０Ｖ、Ｄ１２Ｎ、Ｓ１６Ｎ、Ｌ１７Ｉ、Ｒ１９Ｇ、Ｎ２０Ｄ、Ｈ２１Ｑ、Ｌ２３Ｉ、Ｋ２４Ｔ、Ｇ２５Ｙ、Ａ２６Ｔ、Ｓ２７Ｐ、Ｄ２８Ｅ、Ｆ２９Ｄ、Ｄ３３Ｔ、Ｈ３４Ｒ、Ｔ３５Ａ、Ａ３６Ｃ、Ｔ３７Ｋ、Ｑ３８Ｅ、Ｒ４０Ｑ、Ｈ４１Ｉ、Ｔ５３Ｌ、Ｄ５４Ａ、Ａ５５Ｔ、Ｅ５６Ｇ、Ｄ５７Ｒ、Ａ８５Ｍ、Ｉ８６Ｌ、Ｑ８７Ｄ、Ｋ８８Ｈ、Ｌ８９Ｉ、Ｃ９０Ｙ、Ｐ９１Ｎ、Ｉ９２Ｙ、Ｉ９２Ｎ、Ｉ９２Ｓ、Ｙ９３Ｆ、Ｙ９３Ｆ、Ｉ９４Ｅ、Ｉ９４Ｈ、Ｄ９５Ａ、Ｓ９６Ｈ、Ｓ９６Ｃ、Ｎ９７Ｅ、Ｒ９８Ｙ、Ｒ９８Ｄ、Ａ９９Ｎ、Ａ９９Ｍ、Ｉ１１６Ｙ、Ｋ１１７Ｔ、Ｖ１２２Ｉ、Ｅ１２４Ｎ、Ｋ１２７Ｔ、Ｄ１２９Ｅ、Ｅ１３０Ｒ、Ｓ１３５Ｅ、Ｓ１３６Ａ、Ｎ１３９Ｓ、Ｑ１４２Ｒ、Ｓ１４６Ｇ、Ｑ１７８Ａ、Ｄ１７９Ｐ、Ｖ１８１Ｌ、Ｔ１８２Ｋ、Ｐ１８３Ｓ、Ｋ１８４Ｐ、Ｍ２１２Ｉ、Ｍ２１２Ｓ、Ｍ２１２Ｖ、Ｉ２１３Ｙ、Ｎ２１４Ｙ、Ｎ２１４Ｑ、Ｓ２１５Ｄ、Ｔ２１６Ｋ、Ｓ２１７Ｅ、Ｓ２１７Ｄ、Ｄ２１８Ｅ、Ｈ２１９Ｇ、Ｈ２１９Ｑ、Ｈ２１９Ａ、Ｌ２２０Ｆ、Ｙ２２１ＫまたはＹ２２１Ｈが挙げられる。
【０２０５】
例示的スワップ改変、すなわち、バレンセンシンターゼ中のドメインまたは領域の欠失および別のテルペンシンターゼに由来する対応するドメインまたは領域の異種アミノ酸の挿入が、表４Ｃに示されている。配列番号２に示されるバレンセンシンターゼ中の残基に対応する置換される（欠失される）アミノ酸ならびにその他のテルペンシンターゼの対応するドメインまたは領域に由来する挿入されるアミノ酸が示されている。この表は、配列番号２に示されるＣＶＳ番号付けによってバレンセンシンターゼのアミノ酸位置を参照するが、対応するアミノ酸残基および領域を同定することによって、その他のバレンセンシンターゼにおいて、特に、その他の柑橘類由来バレンセンシンターゼにおいて、同様のスワップを行うことができるということは理解される（例えば、図１および図２参照のこと）。したがって、野生型バレンセンシンターゼ、例えば、配列番号２、２８９〜２９１、３４６、３４７、７５２、８８２もしくは８８３またはその任意の変異体に示される任意のものにおいてこのような改変を行うことができる。例えば、上記の表３中に示される任意のバレンセンシンターゼポリペプチドにおいてスワップを行うことができる。例えば、配列番号３〜６６、６８〜１２７、３４８、７２３〜７３１、７３４〜７４２、７４６〜７５１、８１０〜８３２または８５７に示される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドのいずれかにおいて、上記のドメイン置換を行うことができる。一例では、配列番号４に示される改変されたシンターゼに、上記のドメイン置換を行う。
【０２０６】
【表６】
2013544084.tif 000021
【０２０７】
キメラポリペプチドを作製するための当技術分野で公知の任意の方法を使用して、第１のテルペンシンターゼの（ｏｒ）ドメインのすべてまたは連続する部分を、第２のシンターゼの対応するドメインのすべてまたは連続する部分で置換することができる。例えば、任意の２種のテルペンシンターゼの対応するドメインまたは領域を、当技術分野で公知の任意の適した組換え法を使用して、またはインビトロ合成によって交換できる。組換え法の例示として、実施例３．Ｄに記載されるものなどの２段階オーバーラップＰＣＲ法が挙げられる。このような方法では、第１のテルペンシンターゼ中の標的とされるドメインまたはその一部をコードする核酸中の複数のコドン位置に突然変異を導入するプライマーを使用でき、これでは、突然変異は一緒になって異種領域（すなわち、第２のテルペンシンターゼに由来する対応する領域）を形成する。あるいは、例えば、ランダム化されたアミノ酸を用いて、特定のドメインまたは領域を置換できる。クローニングまたは組換え法におけるプライマーエラー、ＰＣＲエラーおよび／またはその他のエラーが、得られたスワップまたは置換された領域またはドメインが、第２のテルペンシンターゼに由来する対応する領域と同一であるアミノ酸配列を示さないようなエラーをもたらし得ることは理解される。
【０２０８】
例示的なＰＣＲに基づく方法では、第１段階のＰＣＲは、（ｉ）置換されている領域の下流とアニーリングする下流プライマー（例えば、実施例５に記載されるプライマー７−１０．４；配列番号３３９）を、標的遺伝子中に移入される予定の領域の両端に位置する、交換またはランダム化される予定のドメインまたは領域の各々の側の相同配列のおよそ１５のヌクレオチド（またはアニーリングを達成するのに有効な数、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２０、２５のヌクレオチドまたはそれ以上）を含む変異原性プライマーとともに、（ｉｉ）置換されている領域の上流とアニーリングする上流プライマー（例えば、実施例５に記載されるプライマー７−１０．３；配列番号３３８）を、同様に、標的遺伝子中に移入される予定の領域の両端に位置する交換またはランダム化される予定のドメインまたは領域の各々の側の相同配列のおよそ１５のヌクレオチド（またはアニーリングを達成するのに有効な数、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２０、２５のヌクレオチドまたはそれ以上）を含む反対の鎖の変異原性プライマーと一緒に使用する。第１のテルペンシンターゼ遺伝子のドメインまたは領域が、第２のテルペンシンターゼに由来する対応するドメインまたは領域で置換される置換が実施される場合には、第１のテルペンシンターゼに由来するそれぞれの両端に位置する領域の間の変異原性プライマー中のヌクレオチドは、第２のテルペンシンターゼの対応する領域のコドンを含有する。ドメインまたは領域中のアミノ酸がランダム化される例では、第１のテルペンシンターゼに由来するそれぞれの両端に位置する領域の間の変異原性プライマーのヌクレオチドは、ランダムヌクレオチドを含有する。次いで、オーバーラップＰＣＲを実施し、上流および下流オリゴ（例えば、プライマー７−１０．３および７−１０．４）を使用して２つの断片を接続する。次いで、改変されたテルペンシンターゼの発現のために、得られたＰＣＲ産物を任意の適したベクター中にクローニングしてもよい。
【０２０９】
さらに、本明細書におけるスワップ突然変異を含有する改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドのいずれも、１つまたは複数のさらなるアミノ酸置換を含有し得る。提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチド中に含まれ得る例示的アミノ酸置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）（または置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ））として、それだけには限らないが、配列番号２に示される位置に関するＣＶＳ番号付けによってＭ１Ｔ、Ｓ２Ｒ、Ｓ２Ｋ、Ｓ２Ｅ、Ｓ２Ｑ、Ｓ２Ｐ、Ｓ２Ｔ、Ｓ２Ｌ、Ｓ２Ｈ、Ｓ２Ａ、Ｓ２Ｖ、Ｓ３Ｄ、Ｓ３Ｒ、Ｓ３Ｇ、Ｓ３Ｉ、Ｓ３Ｅ、Ｓ３Ｖ、Ｓ３Ａ、Ｓ３Ｔ、Ｓ３Ｌ、Ｓ３Ｍ、Ｓ３Ｎ、Ｇ４Ｋ、Ｇ４Ｖ、Ｇ４Ｎ、Ｇ４Ｉ、Ｇ４Ｒ、Ｇ４Ｓ、Ｇ４Ｐ、Ｇ４Ａ、Ｇ４Ｅ、Ｇ４Ｆ、Ｇ４Ｃ、Ｇ４Ｔ、Ｇ４Ｌ、Ｅ５Ａ、Ｅ５Ｇ、Ｅ５Ｓ、Ｅ５Ｔ、Ｅ５Ｄ、Ｅ５Ｈ、Ｅ５Ｉ、Ｅ５Ｐ、Ｅ５Ｌ、Ｅ５Ｎ、Ｔ６Ｒ、Ｔ６Ｖ、Ｔ６Ｄ、Ｔ６Ｌ、Ｔ６Ａ、Ｔ６Ｅ、Ｔ６Ｋ、Ｔ６Ｓ、Ｔ６Ｇ、Ｔ６Ｃ、Ｔ６Ｍ、Ｔ６Ｙ、Ｆ７Ｃ、Ｆ７Ａ、Ｆ７Ｑ、Ｆ７Ｋ、Ｆ７Ｓ、Ｆ７Ｇ、Ｆ７Ｔ、Ｆ７Ｌ、Ｆ７Ｒ、Ｆ７Ｐ、Ａ１１Ｔ、Ｒ１９Ｋ、Ｒ１９Ｐ、Ｎ２０Ｄ、Ｌ２３Ｓ、Ｋ２４Ａ、Ｋ２４Ｑ、Ｋ２４Ｙ、Ｄ２８Ｇ、Ｑ３８Ｖ、Ｑ３８Ａ、Ｑ３８Ｎ、Ｒ５０Ｇ、Ｔ５３Ｌ、Ｔ５３Ｒ、Ｄ５４Ａ、Ｄ５４Ｐ、Ｄ５４Ｃ、Ａ５５Ｔ、Ａ５５Ｐ、Ａ５５Ｒ、Ａ５５Ｖ、Ａ５５Ｑ、Ｅ５６Ｇ、Ｅ５６Ｐ、Ｅ５６Ｆ、Ｅ５６Ａ、Ｅ５６Ｔ、Ｅ５６Ｑ、Ｄ５７Ｒ、Ｄ５７Ｐ、Ｄ５７Ｓ、Ｄ５７Ｑ、Ｄ５７Ａ、Ｋ５８Ｑ、Ｋ５８Ｒ、Ｋ５８Ｐ、Ｋ５８Ｅ、Ｋ５８Ａ、Ｖ６０Ｉ、Ｖ６０Ｇ、Ｋ６２Ｒ、Ｖ６９Ｉ、Ｆ７８Ｌ、Ｉ８２Ｖ、Ｋ８８Ｑ、Ｋ８８Ａ、Ｙ９３Ｈ、Ｎ９７Ｄ、Ｒ９８Ｋ、Ｈ１０２Ｙ、Ｌ１０６Ａ、Ｌ１０６Ｓ、Ｌ１０６Ｋ、Ｌ１０６Ｆ、Ｌ１１１Ｓ、Ｑ１１３Ｒ、Ｋ１２５Ａ、Ｋ１２５Ｑ、Ｒ１３２Ｇ、Ｙ１５２Ｈ、Ｍ１５３Ｎ、Ｍ１５３Ｇ、Ｈ１５９Ｑ、Ｈ１５９Ｋ、Ｈ１５９Ｒ、Ｅ１６３Ｄ、Ｋ１７３Ｅ、Ｋ１７３Ｑ、Ｋ１７３Ａ、Ｋ１８４Ｒ、Ｑ１８８Ｒ、Ｉ１８９Ａ、Ｉ１８９Ｖ、Ｉ１８９Ｐ、Ｔ２００Ｑ、Ｐ２０２Ｓ、Ｆ２０９Ｉ、Ｆ２０９Ｈ、Ｆ２０９Ｅ、Ｆ２０９Ｌ、Ｆ２０９Ｔ、Ｍ２１０Ｔ、Ｍ２１２Ｒ、Ｍ２１２Ｄ、Ｍ２１２Ｎ、Ｍ２１２Ｓ、Ｍ２１２Ａ、Ｍ２１２Ｙ、Ｍ２１２Ｋ、Ｍ２１２Ｆ、Ｍ２１２Ｈ、Ｍ２１２Ｑ、Ｉ２１３Ｙ、Ｉ２１３Ｍ、Ｉ２１３Ａ、Ｉ２１３Ｒ、Ｉ２１３Ｓ、Ｉ２１３Ｌ、Ｉ２１３Ｆ、Ｉ２１３Ｓ、Ｉ２１３Ｐ、Ｉ２１３Ｑ、Ｉ２１３Ｎ、Ｉ２１３Ｋ、Ｉ２１３Ｖ、Ｎ２１４Ｄ、Ｎ２１４Ｅ、Ｎ２１４Ｓ、Ｎ２１４Ｌ、Ｎ２１４Ｙ、Ｎ２１４Ｖ、Ｎ２１４Ｐ、Ｎ２１４Ｈ、Ｎ２１４Ｃ、Ｎ２１４Ａ、Ｎ２１４Ｔ、Ｎ２１４Ｒ、Ｓ２１５Ｈ、Ｓ２１５Ｇ、Ｓ２１５Ｋ、Ｓ２１５Ｒ、Ｓ２１５Ｐ、Ｓ２１５Ａ、Ｓ２１５Ｎ、Ｓ２１５Ｔ、Ｓ２１５Ｌ、Ｓ２１５Ｖ、Ｓ２１５Ｑ、Ｔ２１６Ｑ、Ｔ２１６Ｙ、Ｔ２１６Ｅ、Ｔ２１６Ｐ、Ｔ２１６Ｒ、Ｔ２１６Ｃ、Ｔ２１６Ｖ、Ｔ２１６Ｋ、Ｔ２１６Ｄ、Ｔ２１６Ａ、Ｔ２１６Ｓ、Ｓ２１７Ｒ、Ｓ２１７Ｋ、Ｓ２１７Ｆ、Ｓ２１７Ｉ、Ｓ２１７Ｔ、Ｓ２１７Ｇ、Ｓ２１７Ｙ、Ｓ２１７Ｎ、Ｓ２１７Ｈ、Ｓ２１７Ｅ、Ｓ２１７Ｆ、Ｓ２１７Ｃ、Ｄ２１８Ｉ、Ｄ２１８Ｇ、Ｄ２１８Ｖ、Ｄ２１８Ｃ、Ｄ２１８Ｐ、Ｄ２１８Ｍ、Ｄ２１８Ｒ、Ｄ２１８Ｌ、Ｄ２１８Ｓ、Ｄ２１８Ａ、Ｄ２１８Ｙ、Ｄ２１８Ｋ、Ｈ２１９Ｄ、Ｈ２１９Ａ、Ｈ２１９Ｌ、Ｈ２１９Ｃ、Ｈ２１９Ｗ、Ｈ２１９Ｒ、Ｈ２１９Ｓ、Ｈ２１９Ｆ、Ｈ２１９Ｅ、Ｌ２２０Ｖ、Ｌ２２０Ｓ、Ｌ２２０Ｔ、Ｌ２２０Ｐ、Ｌ２２０Ｍ、Ｌ２２０Ａ、Ｌ２２０Ｈ、Ｌ２２０Ｅ、Ｌ２２０Ｇ、Ｌ２２０Ｄ、Ｙ２２１Ｃ、Ｙ２２１Ｖ、Ｙ２２１Ｑ、Ｙ２２１Ｆ、Ｙ２２１Ｓ、Ｙ２２１Ｎ、Ｙ２２１Ｔ、Ｙ２２１Ｐ、Ｙ２２１Ｌ、Ｙ２２１Ｋ、Ｙ２２１Ｗ、Ｙ２２１Ｅ、Ｙ２２１Ｖ、Ｎ２２７Ｓ、Ｅ２３８Ｄ、Ｋ２５２Ａ、Ｋ２５２Ｑ、Ｔ２５７Ａ、Ｄ２７４Ｍ、Ｄ２７４Ｎ、Ｄ２７４Ｓ、Ｄ２７４Ｆ、Ｄ２７４Ｇ、Ｄ２７４Ｈ、Ｄ２７４Ｅ、Ｆ２７９Ｓ、Ｆ２７９Ｉ、Ｆ２７９Ｐ、Ｆ２７９Ｄ、Ｆ２７９Ｌ、Ｆ２７９Ｎ、Ｆ２７９Ｍ、Ｆ２７９Ｈ、Ｆ２７９Ｃ、Ｆ２７９Ａ、Ｆ２７９Ｇ、Ｆ２７９Ｗ、Ｅ２８０Ｌ、Ｐ２８１Ｓ、Ｐ２８１Ｈ、Ｐ２８１Ｋ、Ｐ２８１Ａ、Ｐ２８１Ｗ、Ｐ２８１Ｌ、Ｐ２８１Ｙ、Ｑ２８２Ｌ、Ｑ２８２Ｓ、Ｑ２８２Ａ、Ｑ２８２Ｉ、Ｑ２８２Ｒ、Ｑ２８２Ｙ、Ｑ２８２Ｇ、Ｑ２８２Ｗ、Ｑ２８２Ｐ、Ｑ２８２Ｅ、Ｙ２８３Ｆ、Ｙ２８３Ｎ、Ａ２８４Ｔ、Ａ２８４Ｇ、Ａ２８４Ｐ、Ａ２８４Ｖ、Ａ２８４Ｒ、Ａ２８４Ｄ、Ａ２８４Ｅ、Ａ２８４Ｓ、Ａ２８４Ｈ、Ａ２８４Ｋ、Ａ２８４Ｉ、Ａ２８４Ｗ、Ａ２８４Ｍ、Ｑ２９２Ｋ、Ｉ２９９Ｙ、Ｙ３０７Ｈ、Ｌ３１０Ｈ、Ｅ３１１Ｐ、Ｅ３１１Ｔ、Ｌ３１３Ｃ、Ｓ３１４Ａ、Ｓ３１４Ｔ、Ｌ３１５Ｍ、Ｆ３１６Ｌ、Ｔ３１７Ｓ、Ｅ３１８Ｋ、Ａ３１９Ｔ、Ｖ３２０Ｄ、Ｖ３２０Ｇ、Ｖ３２０Ｓ、Ｑ３２１Ａ、Ｗ３２３Ｒ、Ｎ３２４Ｓ、Ｉ３２５Ｔ、Ｅ３２６Ｋ、Ｅ３３３Ｄ、Ｋ３３６Ｒ、Ｌ３３７Ｉ、Ｌ３４３Ｖ、Ａ３４５Ｖ、Ａ３４５Ｔ、Ｎ３４７Ｌ、Ｎ３４７Ｓ、Ｅ３４８Ａ、Ｅ３４８Ｓ、Ｅ３５０Ｋ、Ｇ３５７Ｒ、Ｈ３６０Ｌ、Ｈ３６０Ａ、Ｃ３６１Ｒ、Ｖ３６２Ａ、Ｅ３６７Ｇ、Ｎ３６９Ｉ、Ｑ３７０Ｄ、Ｑ３７０Ｈ、Ｑ３７０Ｇ、Ｋ３７１Ｇ、Ａ３７５Ｄ、Ｓ３７７Ｙ、Ｙ３８７Ｃ、Ｉ３９７Ｖ、Ｌ３９９Ｓ、Ｔ４０５Ｒ、Ｔ４０９Ｇ、Ｎ４１０Ｓ、Ｆ４２４Ｌ、Ｎ４２９Ｓ、Ｎ４２９Ｇ、Ａ４３６Ｓ、Ｖ４３９Ｌ、Ｑ４４８Ｌ、Ｃ４６５Ｓ、Ｋ４６８Ｑ、Ｓ４７３Ｙ、Ｋ４７４Ｔ、Ｅ４８４Ｄ、Ｉ４９２Ｖ、Ｅ４９５Ｇ、Ｋ４９９Ｅ、Ｐ５００Ｌ、Ｔ５０１Ｐ、Ｐ５０６Ｓ、Ｄ５３６Ｅ、またはＡ５３９Ｖが挙げられる。
【０２１０】
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、本明細書において上記に記載されるスワップ改変に加えて、列挙されたアミノ酸置換のうち任意の１種または複数を、任意の組合せで含有し得る。
【０２１１】
以下の表５Ａは、１つまたは複数のスワップ改変を含有する例示的な改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを示す。第１のアミノ酸（１文字略語）は、配列番号２に関するバレンセンシンターゼポリペプチド配列中の位置に対応するＣＶＳ番号付けを用いて置換されるアミノ酸に対応し、第２のアミノ酸（１文字略語）は、その位置の第１のアミノ酸を置換する選択されたアミノ酸に対応する。新規ドメインまたは領域のスワップおよび挿入によって、改変されたバレンセンシンターゼは、スワップを含有しない非改変バレンセンシンターゼと比較して、より多いか、またはより少ないアミノ酸を有し得るということは理解される。したがって、置換のためのアミノ酸番号付けは、変更され得る。本明細書における目的上、アミノ酸置換への言及は、ＣＶＳ番号付けに関してである（例えば、図４参照のこと）。したがって、例えば、Ｖ２３９と表される突然変異体では、表５Ａ中、Ｆ２０９→Ｉ２１０と表されるアミノ酸置換は、配列番号７４３に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに関して突然変異Ｆ２１０ＩまたはＣＶＳ番号付けによるＦ２０９Ｉを有する。また、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドの例示的アミノ酸配列およびコーディング核酸配列を示す配列識別子（配列番号）も提供される。
【０２１２】
【表７−１】
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【表７−２】
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【０２１３】
【表７−３】
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【表７−４】
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【０２１４】
【表７−５】
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【表７−６】
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【０２１５】
【表７−７】
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【表７−８】
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【０２１６】
【表７−９】
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【表７−１０】
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【０２１７】
【表７−１１】
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【表７−１２】
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【０２１８】
【表７−１３】
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【表７−１４】
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【０２１９】
【表７−１５】
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【０２２０】
３．生成物分布突然変異体
上記のように増大したバレンセン生成を達成することの代わりに、またはそれに加えて、本明細書において提供される改変バレンセンポリペプチドは、その他の変更された特性を示し得る。例えば、配列番号２に示される野生型バレンセンシンターゼと比較して、変更された基質特異性および／または生成物選択性および／または変更された生成物分布（すなわち、変更されたテルペンの相対量および／または種類）を示す改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、本明細書において提供される。その他の例では、配列番号３（Ｖ１８）または配列番号４（Ｖ１９）に示される変異体バレンセンシンターゼポリペプチドと比較して、変更された基質特異性および／または生成物選択性および／または変更された生成物分布（すなわち、変更されたテルペンの相対量および／または種類）を示す改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、本明細書において提供される。このような改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、例えば、その他のテルペン生成物と比較してバレンセンの生成物分布を増大することによって、バレンセンの生成および／または作製を改善するための方法において使用され得る。これは、増大または改善した純度のバレンセン組成物、反応培地からのバレンセンの増大または改善した回収率および／またはバレンセンを単離する方法の容易さをもたらす方法をもたらし得る。また、これは、バレンセンの酸化による、ヌートカトンの増大した回収率ももたらす方法をもたらし得る。
【０２２１】
例えば、配列番号２、３または４に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドによる総テルペンのパーセンテージとしての、生成されるβ−エレメンと比較して、総テルペンのパーセンテージとして減少したβ−エレメンを生成する改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、本明細書において提供される。β−エレメンは、ゲルマクレンＡの分解生成物であり、生成されるゲルマクレンＡの尺度となる。したがってまた、配列番号２、３または４に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドによる総テルペンのパーセンテージとしての、生成されるゲルマクレンＡと比較して、総テルペンのパーセンテージとして減少したゲルマクレンＡを生成する改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、本明細書において提供される。例えば、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは配列番号２に示される野生型バレンセンシンターゼによって生成されるものよりも、９５％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％またはそれより少ないレベルのβ−エレメン、ひいては、ゲルマクレンＡを生成する。総テルペン生成物のパーセンテージとしてのβ−エレメン、ひいては、ゲルマクレンＡのパーセンテージは、０．０１％〜９０％、例えば、１％〜８０％、５％〜８０％、１０％〜６０％もしくは０．０１％〜２０％より多く、または約０．０１％〜９０％、例えば、１％〜８０％、５％〜８０％、１０％〜６０％もしくは０．０１％〜２０％または０．０１％〜９０％、例えば、１％〜８０％、５％〜８０％、１０％〜６０％または０．０１％〜２０％減少し得る。例えば、総テルペンのパーセンテージとしてのテルペンβ−エレメン生成物、ひいては、ゲルマクレンＡのパーセンテージは、少なくともまたは少なくとも約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくはそれ以上減少する。本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼは、配列番号２に示される野生型バレンセンシンターゼと比較して、反応において生成される総テルペンのパーセンテージとして、増大または改善したバレンセンの生成をもたらす。生成または回収されるバレンセンの重量によるパーセンテージは、６８％を超える、例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％もしくはそれ以上を超えるか、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％もしくはそれ以上である。
【０２２２】
このような改変バレンセンポリペプチドの例示として、配列番号２に示される位置に関するＣＶＳ番号付けによって、残基２８１、３１３、３１４、３１５、３１７、３３６、３３７および／または３５７に対応する位置にアミノ酸改変を含有するポリペプチドがある。例えば、アミノ酸置換は、Ｐ２８１Ｓ、Ｐ２８１Ｈ、Ｐ２８１Ｋ、Ｐ２８１Ａ、Ｐ２８１Ｗ、Ｐ２８１Ｌ、Ｐ２８１Ｙ、Ｌ３１３Ｃ、Ｓ３１４Ｔ、Ｌ３１５Ｍ、Ｔ３１７Ｓ、Ｋ３３６Ｒ、Ｌ３３７Ｉ、Ｎ３４７Ｌおよび／またはＧ３５７Ｒである上記の位置のいずれかでの置換であり得る。例示的アミノ酸置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）（単数または複数）または置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）（単数または複数）は、配列番号２に示される位置に関するＣＶＳ番号付けによって、Ｐ２８１Ｓ、Ｌ３１３Ｃ、Ｓ３１４Ｔ、Ｌ３１５Ｍ、Ｔ３１７Ｓ、Ｋ３３６Ｒ、Ｌ３３７Ｉ、Ｎ３４７Ｌおよび／またはＧ３５７Ｒに対応する。例えば、減少または低減したβ−エレメン形成を示す、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示される位置に関するＣＶＳ番号付けによって、Ｐ２８１Ｓ、Ｌ３１３Ｃ、Ｓ３１４Ｔ、Ｌ３１５Ｍ、Ｔ３１７Ｓ、Ｋ３３６Ｒ、Ｌ３３７ＩおよびＧ３５７Ｒに対応するアミノ酸置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）（置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ））を含有する。一部の例では、減少または低減したβ−エレメン形成を示す本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、配列番号２に示される位置に関するＣＶＳ番号付けによって、Ｐ２８１Ｓ、Ｌ３１３Ｃ、Ｓ３１４Ｔ、Ｌ３１５Ｍ、Ｔ３１７Ｓ、Ｋ３３６Ｒ、Ｌ３３７Ｉ、Ｎ３４７ＬおよびＧ３５７Ｒに対応するアミノ酸置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）（置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ））を含有する。改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、変更された生成物分布を示す限り、さらなるまたは追加のアミノ酸改変が含まれ得ることは理解される。
【０２２３】
例えば、変更された生成物分布および低減したβ−エレメン形成を示す例示的バレンセンシンターゼポリペプチドは、以下に示されるものを含む。したがって、例示的バレンセンシンターゼポリペプチドはまた、より少ないゲルマクレンＡを生成する。例えば：
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｐ２８１Ｓ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１３Ｃ／Ｓ３１４Ｔ／Ｌ３１５Ｍ／Ｔ３１７Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ｋ３３６Ｒ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３４７Ｌ  Ｇ３５７Ｒ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｐ２８１Ｓ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１３Ｃ／Ｓ３１４Ｔ／Ｌ３１５Ｍ／Ｔ３１７Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ｋ３３６Ｒ／Ｌ３３７Ｉ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３４７Ｌ／Ｇ３５７Ｒ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｐ２８１Ｓ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１３Ｃ／Ｓ３１４Ｔ／Ｌ３１５Ｍ／Ｔ３１７Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ｋ３３６Ｒ／Ｌ３３７Ｉ／Ａ３４５Ｔ／Ｇ３５７Ｒ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｔ／Ｅ５６Ｇ／Ｄ５７Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｐ２８１Ｓ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１３Ｃ／Ｓ３１４Ｔ／Ｌ３１５Ｍ／Ｔ３１７Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ｋ３３６Ｒ／Ｌ３３７Ｉ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３４７Ｌ／Ｇ３５７Ｒ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｔ／Ｅ５６Ｇ／Ｄ５７Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｐ２８１Ｓ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１３Ｃ／Ｓ３１４Ｔ／Ｌ３１５Ｍ／Ｔ３１７Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ｋ３３６Ｒ／Ｌ３３７Ｉ／Ａ３４５Ｔ／Ｇ３５７Ｒ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｒ１９Ｋ／Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｔ／Ｅ５６Ｇ／Ｄ５７Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ａ８５Ｍ／Ｉ８６Ｌ／Ｑ８７Ｄ／Ｋ８８Ｈ／Ｌ８９Ｉ／Ｃ９０Ｙ／−−−→Ｒ９１／−−−→Ａ９２／−−−→Ｄ９３／Ｉ９２→Ｙ９５／Ｙ９３→Ｆ９６／Ｉ９４→Ｅ９７／Ｄ９５→Ａ９８／Ｓ９６→Ｈ９９／Ｎ９７→Ｅ１００／Ｒ９８→Ｙ１０１／Ａ９９→Ｎ１０２／Ｋ１２５→Ｑ１２８／Ｋ１７３→Ｑ１７６／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１７９／Ｄ１７９→Ｐ１８０／Ｖ１８１→Ｌ１８２／Ｔ１８２→Ｋ１８３／Ｐ１８３→Ｓ１８４／Ｋ１８４→Ｐ１８５／Ｆ２０９→Ｉ２１０／Ｍ２１２→Ｒ２１３／Ｎ２１４→Ｄ２１５／Ｈ２１９→Ｄ２２０／Ｙ２２１→Ｖ２２２／Ｅ２３８→Ｄ２３９／Ｋ２５２→Ｑ２５３／Ｐ２８１→Ｓ２８２／Ｑ２９２→Ｋ２９３／Ｌ３１３→Ｃ３１４／Ｓ３１４→Ｔ３１５／Ｌ３１５→Ｍ３１６／Ｔ３１７→Ｓ３１８／Ｑ３２１→Ａ３２２／Ｅ３３３→Ｄ３３４／Ｋ３３６→Ｒ３３７／Ｌ３３７→Ｉ３３８／Ａ３４５→Ｔ３４６／Ｇ３５７→Ｒ３５８／Ｎ３６９→Ｉ３７０／Ｓ３７７→Ｙ３７８／Ｔ４０５→Ｒ４０６／Ｎ４２９→Ｇ４３０／Ａ４３６→Ｓ４３７／Ｅ４８４→Ｄ４８５／Ｔ５０１→Ｐ５０２／Ｄ５３６→Ｅ５３７；および／または
Ｓ３Ｔ／Ｇ４Ｑ／Ｅ５Ｖ／−−−→Ｓ６／−−−→Ａ７／−−−→Ｓ８／−−−→Ｓ９／−−−→Ｌ１０／−−−→Ａ１１／−−−→Ｑ１２／−−−→Ｉ１３／−−−→Ｐ１４／−−−→Ｑ１５／−−−→Ｐ１６／Ｔ６→Ｋ１７／Ｆ７→Ｎ１８／Ｔ１０→Ｖ２１／Ｄ１２→Ｎ２３／Ｓ１６→Ｎ２７／Ｌ１７→Ｉ２８／Ｒ１９→Ｇ３０／Ｎ２０→Ｄ３１／Ｈ２１→Ｑ３２／Ｌ２３→Ｉ３４／Ｋ２４→Ｔ３５／Ｇ２５→Ｙ３６／Ａ２６→Ｔ３７／Ｓ２７→Ｐ３８／Ｄ２８→Ｅ３９／Ｆ２９→Ｄ４０／Ｔ３１→−−−／Ｄ３３→Ｔ４３／Ｈ３４→Ｒ４４／Ｔ３５→Ａ４５／Ａ３６→Ｃ４６／Ｔ３７→Ｋ４７／Ｑ３８→Ｅ４８／Ｒ４０→Ｑ５０／Ｈ４１→Ｉ５１／Ｔ５３→Ｌ６３／Ｄ５４→Ａ６４／Ａ５５→Ｔ６５／Ｅ５６→Ｇ６６／Ｄ５７→Ｒ６７／Ｖ６０→Ｉ７０／Ａ８５→Ｍ９５／Ｉ８６→Ｌ９６／Ｑ８７→Ｄ９７／Ｋ８８→Ｈ９８／Ｌ８９→Ｉ９９／Ｃ９０→Ｙ１００／−−−→Ｒ１０１／−−−→Ａ１０２／−−−→Ｄ１０３／Ｉ９２→Ｙ１０５／Ｙ９３→Ｆ１０６／Ｉ９４→Ｅ１０７／Ｄ９５→Ａ１０８／Ｓ９６→Ｈ１０９／Ｎ９７→Ｅ１１０／Ｒ９８→Ｙ１１１／Ａ９９→Ｎ１１２／Ｋ１２５→Ｑ１３８／Ｋ１７３→Ｑ１８６／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１８９／Ｄ１７９→Ｐ１９０／Ｖ１８１→Ｌ１９２／Ｔ１８２→Ｋ１９３／Ｐ１８３→Ｓ１９４／Ｋ１８４→Ｐ１９５／Ｆ２０９→Ｉ２２０／Ｍ２１２→Ｖ２２３／Ｉ２１３→Ｙ２２４／Ｎ２１４→−−−／Ｓ２１５→−−−／Ｔ２１６→Ｑ２２５／Ｓ２１７→Ｄ２２６／Ｄ２１８→Ｅ２２７／Ｈ２１９→Ａ２２８／Ｌ２２０→Ｆ２２９／Ｙ２２１→Ｈ２３０／Ｅ２３８→Ｄ２４７／Ｋ２５２→Ｑ２６１／Ｐ２８１→Ｓ２９０／Ｑ２９２→Ｋ３０１／Ｌ３１３→Ｃ３２２／Ｓ３１４→Ｔ３２３／Ｌ３１５→Ｍ３２４／Ｔ３１７→Ｓ３２６／Ｑ３２１→Ａ３３０／Ｅ３３３→Ｄ３４２／Ｋ３３６→Ｒ３４５／Ｌ３３７→Ｉ３４６／Ａ３４５→Ｔ３５４／Ｇ３５７→Ｒ３６６／Ｎ３６９→Ｉ３７８／Ｓ３７７→Ｙ３８６／Ｔ４０５→Ｒ４１４／Ｎ４２９→Ｇ４３８／Ａ４３６→Ｓ４４５／Ｅ４８４→Ｄ４９３／Ｔ５０１→Ｐ５１０／Ｄ５３６→Ｅ５４５。
【０２２４】
このようなポリペプチドの例示として、配列番号５、６１、６３、３５０、３５１、７４４または８８７に示される任意のもの、または配列番号１３０、１９７、１９８、３５２、３５３、７１４または８９１のいずれかに示される核酸の配列もしくはそれらの縮重コドンによってコードされる任意のものが挙げられる。
【０２２５】
Ｄ．改変されたテルペンシンターゼおよびコーディング核酸分子を生成する方法
改変されたテルペンシンターゼポリペプチドを生成する方法が提供される。本方法を使用して、それだけには限らないが、ＦＰＰ、ＧＰＰまたはＧＧＰＰなどの非環式ピロリン酸テルペン前駆体との反応の際の増大したテルペン生成、変更された生成物分布、変更された基質特異性および／または変更された位置選択性および／または立体選択性を含めた、所望の特性を有するテルペンシンターゼを作製できる。改変されたテルペンシンターゼは、当技術分野で公知の任意の方法を使用して生成し、所望により、所望の特性についてスクリーニングできる。特定の例では、本明細書に例示される方法に従って突然変異によって所望の特性を有する改変されたテルペンシンターゼを作製する。したがって、本明細書に記載された方法を使用して生成される、改変されたテルペンシンターゼおよび改変されたテルペンシンターゼをコードする核酸分子が、本明細書において提供される。
【０２２６】
本明細書において提供される方法の例示として、改変されたテルペンシンターゼが、第１のテルペンシンターゼの１つまたは複数の内因性ドメインまたは領域を、第２のテルペンシンターゼに由来する対応するドメイン（単数または複数）または領域（単数または複数）（すなわち、異種ドメインまたは領域）で置換することによって生成されるものがある。さらなる例では、第１のテルペンシンターゼの２以上の内因性ドメインまたは領域が、２以上のその他のテルペンシンターゼ、例えば、第２、第３、第４、第５，第６、第７、第８、第９または第１０のテルペンシンターゼに由来する対応する異種ドメイン（単数または複数）または領域（単数または複数）で置換される。したがって、得られる改変されたテルペンシンターゼは、１、２、３、４、５、６、７、８、９種またはそれ以上の異なるテルペンシンターゼに由来する異種ドメインまたは領域を含み得る。さらなる例では、本方法はまた、または代わりに、第１のテルペンシンターゼの１以上のドメインまたは領域の、ランダム化されたアミノ酸残基との置換を含む。
【０２２７】
本明細書において提供される方法において、任意のテルペンシンターゼを使用できる。第１のテルペンシンターゼ（すなわち、改変される予定のテルペンシンターゼ）は、第２の（または第３、第４、第５など）テルペンシンターゼ（すなわち、異種ドメイン（単数または複数）または領域（単数または複数）が由来するテルペンシンターゼ（単数または複数））と同一または異なるクラスのものであり得る。例えば、改変される予定のテルペンシンターゼが、モノテルペン、ジテルペンまたはセスキテルペンシンターゼであり、１つまたは複数の異種ドメインまたは領域が由来するテルペンシンターゼ（単数または複数）が、モノテルペン、ジテルペンまたはセスキテルペンシンターゼであるものが、本明細書において提供される方法の中に含まれる。一部の例では、本明細書において提供される方法において使用されるテルペンシンターゼのすべてが、セスキテルペンシンターゼである。例示的セスキテルペンシンターゼとして、それだけには限らないが、バレンセンシンターゼ、ＴＥＡＳ、ＨＰＳおよびサンタレンシンターゼが挙げられる。本明細書における方法において使用できる例示的テルペンシンターゼは、その例示的アミノ酸および核酸配列を含めて、それだけには限らないが、表５Ｂに示される任意のものを含む。
【０２２８】
【表８−１】
2013544084.tif 000037
【表８−２】
2013544084.tif 000038
【０２２９】
【表８−３】
2013544084.tif 000039
【表８−４】
2013544084.tif 000040
【０２３０】
【表８−５】
2013544084.tif 000041
【表８−６】
2013544084.tif 000042
【０２３１】
【表８−７】
2013544084.tif 000043
【表８−８】
2013544084.tif 000044
【０２３２】
本明細書において提供される方法では、第１のテルペンシンターゼの内因性ドメインのすべてまたは連続する部分が、第２のテルペンシンターゼに由来する対応する異種ドメインのすべてまたは連続する部分で置換され得る。例えば、第１のシンターゼ中のドメインまたは領域に由来する３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上の連続するアミノ酸が、第２のテルペンシンターゼに由来する対応する領域に由来する３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上の連続するアミノ酸で置換されてもよい。一部の例では、第１のテルペンシンターゼの内因性ドメインに隣接する１個または複数のアミノ酸残基も置換され、および／または異種ドメインに隣接する１個または複数のアミノ酸残基も置換に使用される。さらに、本明細書において提供される方法はまた、第１のドメインのすべてまたは連続する部分および第２の隣接するドメインのすべてまたは連続する部分が、別のテルペンシンターゼに由来する対応するドメイン（またはその一部）で置換される方法も含む。
【０２３３】
置換され得るドメインまたは領域として、機能性ドメインまたは構造ドメインが挙げられる。本明細書に記載された方法を使用して、テルペンシンターゼ中の置換され得る例示的ドメインまたは領域として、それだけには限らないが、不定形ループ１（配列番号２のアミノ酸１〜２９に対応する）、αヘリックス１（配列番号２のアミノ酸３０〜３９および４４〜５２に対応する）、不定形ループ２（配列番号２のアミノ酸５３〜５８に対応する）、αヘリックス２（配列番号２のアミノ酸５９〜７１に対応する）、不定形ループ３（配列番号２のアミノ酸７２〜７８に対応する）、αヘリックス３（配列番号２のアミノ酸７９〜９３に対応する）、不定形ループ４（配列番号２のアミノ酸９４〜１００に対応する）、αヘリックス４（配列番号２のアミノ酸１０１〜１１４に対応する）、不定形ループ５（配列番号２のアミノ酸１１５〜１４１に対応する）、αヘリックス５（配列番号２のアミノ酸１４２〜１５２に対応する）、不定形ループ６（配列番号２のアミノ酸１５３〜１６２に対応する）、αヘリックス６（配列番号２のアミノ酸１６３〜１７３に対応する）、不定形ループ７（配列番号２のアミノ酸１７４〜１８４に対応する）、αヘリックス７（配列番号２のアミノ酸１８５〜１９４に対応する）、不定形ループ８（配列番号２のアミノ酸１９５〜２０１に対応する）、αヘリックス８（配列番号２のアミノ酸２０２〜２１２に対応する）、不定形ループ９（配列番号２のアミノ酸２１３〜２２２に対応する）、αヘリックスＡ（配列番号２のアミノ酸２２３〜２５３に対応する）、Ａ−Ｃループ（配列番号２のアミノ酸２５４〜２６６に対応する）、αヘリックスＣ（配列番号２のアミノ酸２６７〜２７６に対応する）、不定形ループ１１（配列番号２のアミノ酸２７７〜２８３に対応する）、αヘリックスＤ（配列番号２のアミノ酸２８４〜３０５に対応する）、不定形ループ１２（配列番号２のアミノ酸３０６〜３０９に対応する）、αヘリックスＤ１（配列番号２のアミノ酸３１０〜３２２に対応する）、不定形ループ１３（配列番号２のアミノ酸３２３〜３２８に対応する）、αヘリックスＤ２（配列番号２のアミノ酸３２９に対応する）、不定形ループ１４（配列番号２のアミノ酸３３０〜３３２に対応する）、αヘリックスＥ（配列番号２のアミノ酸３３３〜３５１に対応する）、不定形ループ１５（配列番号２のアミノ酸３５２〜３６２に対応する）、αヘリックスＦ（配列番号２のアミノ酸３６３〜３８５に対応する）、不定形ループ１６（配列番号２のアミノ酸３８６〜３９０に対応する）、αヘリックスＧ１（配列番号２のアミノ酸３９１〜３９５に対応する）、不定形ループ１７（配列番号２のアミノ酸３９６〜４０４に対応する）、αヘリックスＧ２（配列番号２のアミノ酸４０５〜４１３に対応する）、不定形ループ１８（配列番号２のアミノ酸４１４〜４２１に対応する）、αヘリックスＨ１（配列番号２のアミノ酸４２２〜４２８に対応する）、不定形ループ１９（配列番号２のアミノ酸４２９〜４３１に対応する）、αヘリックスＨ２（配列番号２のアミノ酸４３２〜４４７に対応する）、不定形ループ２０（配列番号２のアミノ酸４４８〜４５０に対応する）、αヘリックスＨ３（配列番号��のアミノ酸４５１〜４５５に対応する）、不定形ループ２１（配列番号２のアミノ酸４５６〜４６１に対応する）、αヘリックスａ−１（配列番号２のアミノ酸４６２〜４７０に対応する）、不定形ループ２２（配列番号２のアミノ酸４７１〜４７３に対応する）、αヘリックスＩ（配列番号２のアミノ酸４７４〜４９５に対応する）、不定形ループ２３（配列番号２のアミノ酸４９６〜５０８に対応する）、αヘリックスＪ（配列番号２のアミノ酸５０９〜５２１に対応する）、Ｊ−Ｋループ（配列番号２のアミノ酸５２２〜５３４に対応する）、αヘリックスＫ（配列番号２のアミノ酸５３５〜５４１に対応する）、および不定形ループ２５（配列番号２のアミノ酸５４２〜５４８に対応する）に対応する構造ドメインまたは領域が挙げられる。これらのドメインまたは領域のうちいずれか１種または複数またはその一部は、本明細書において提供される方法を使用して別のテルペンシンターゼに由来する対応するドメインで置換され得る。これらのドメインは、当技術分野で周知の方法を使用して、例えば、当業者に公知の方法を使用するアラインメントなどによって、任意のテルペンシンターゼ中で同定できる領域である（例えば、図２参照のこと）。このような方法は、通常、マッチを最大にし、手作業によるアラインメントを使用することならびに利用可能な多数のアラインメントプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ）および当業者に公知のその他のものを使用することによるなどの方法を含む。配列番号２に示されるバレンセンシンターゼの配列をアラインすることによって、任意のその他のテルペンシンターゼ、上記で列挙されたドメインまたは領域のいずれも、任意のテルペンシンターゼ中で同定できる。
【０２３４】
本明細書において提供される方法の一部の例では、第１のテルペンシンターゼ中のバレンセンシンターゼの不定形ループ１およびαヘリックス１の一部（配列番号２のアミノ酸３〜４１に対応する）に対応する領域が、第２のテルペンシンターゼに由来する対応する領域で置換され；第１のテルペンシンターゼ中の不定形ループ２（配列番号２のアミノ酸５３〜５８に対応する）に対応する領域が、第２のテルペンシンターゼに由来する対応する領域で置換され；第１のテルペンシンターゼ中のαヘリックス３の一部（配列番号２のアミノ酸８５〜８９に対応する）に対応する領域が、第２のテルペンシンターゼ中の対応する領域で置換され；第１のテルペンシンターゼ中のαヘリックス３および不定形ループ４の一部に対応する領域（配列番号２のアミノ酸８５〜９９に対応する）が、第２のテルペンシンターゼに由来する対応する領域で置換され；第１のテルペンシンターゼ中の不定形ループ６および隣接する残基（配列番号２のアミノ酸１５２〜１６３に対応する）に対応する領域が、第２のテルペンシンターゼに由来する対応する領域で置換され；第１のテルペンシンターゼ中の不定形ループ７（配列番号２のアミノ酸１７４〜１８４に対応する）に対応する領域が、第２のテルペンシンターゼに由来する対応する領域で置換され；第１のテルペンシンターゼ中の不定形ループ９および隣接する残基（配列番号２のアミノ酸２１２〜２２１に対応する）に対応する領域が、第２のテルペンシンターゼに由来する対応する領域で置換され；第１のテルペンシンターゼ中のαヘリックスＤ１（配列番号２のアミノ酸３１０〜３２２に対応する）に対応する領域が、第２のテルペンシンターゼに由来する対応する領域で置換され；および／または第１のテルペンシンターゼ中のＪ−Ｋループ（配列番号２のアミノ酸５２２〜５３４に対応する）に対応する領域が、第２のテルペンシンターゼに由来する対応する領域で置換される。
【０２３５】
例えば、バレンセンシンターゼの不定形ループ１およびαヘリックス１の一部（配列番号２のアミノ酸３〜４１に対応する）が、配列番号３４６に示されるブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）のアミノ酸３〜５１で置換される；第１のテルペンシンターゼの不定形ループ２（配列番号２のアミノ酸５３〜５８に対応する）に対応する領域が、配列番号２９５または９４１に示されるＴＥＡＳポリペプチドのアミノ酸５８〜６３で置換される；αヘリックス３の一部（配列番号２のアミノ酸８５〜８９に対応する）に対応する領域が、配列番号９４２に示されるＨＰＳのアミノ酸残基９３〜９７で置換される；第１のテルペンシンターゼのαヘリックス３および不定形ループ４の一部（配列番号２のアミノ酸８５〜９９に対応する）に対応する領域が、配列番号９４２に示されるＨＰＳのアミノ酸残基９３〜１１０で置換される；第１のテルペンシンターゼの不定形ループ６および隣接する残基（配列番号２のアミノ酸１５２〜１６３に対応する）に対応する領域が、配列番号９４２に示されるＨＰＳのアミノ酸１６３〜１７４で置換される；第１のテルペンシンターゼの不定形ループ７（配列番号２のアミノ酸１７４〜１８４に対応する）に対応する領域が、配列番号９４２に示されるＨＰＳのアミノ酸１８５〜１９３で置換される；第１のテルペンシンターゼの不定形ループ９および隣接する残基（配列番号２のアミノ酸２１２〜２２１に対応する）に対応する領域が、配列番号９４２に示されるＨＰＳのアミノ酸２２１〜２２８で置換される；第１のテルペンシンターゼのαヘリックスＤ１（配列番号２のアミノ酸３１０〜３２２に対応する）に対応する領域が、配列番号９４２に示されるＨＰＳのアミノ酸３１７〜３２９で置換される；および／または第１のテルペンシンターゼのＪ−Ｋループ（配列番号２のアミノ酸５２２〜５３４に対応する）が、配列番号９４２に示されるＨＰＳのアミノ酸５２７〜５４１で置換される方法が、本明細書において提供される。
【０２３６】
本明細書において提供される方法では、第１のテルペンシンターゼの内因性ドメインのすべてまたは連続する部分が、節Ｃ．２において上記で論じられるように当技術分野で公知の適した組換え法を使用して、第２のテルペンシンターゼに由来する対応する異種ドメインのすべてまたは連続する部分で置換され得る。
【０２３７】
Ｅ．改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドおよびコーディング核酸分子の生成
バレンセンシンターゼポリペプチドおよびその活性断片を含めたテルペンシンターゼポリペプチドおよびその活性断片は、組換えタンパク質作製および発現のための当技術分野で周知の方法によって得ることができる。このようなポリペプチドを使用して、シンターゼが発現される宿主細胞において、または、シンターゼの精製後に、インビトロで、ＦＰＰ、ＧＰＰまたはＧＧＰＰなどの任意の適した非環式ピロリン酸テルペン前駆体からバレンセンを生成できる。所望の遺伝子をコードする核酸を同定するための当業者に公知の任意の方法を使用して、テルペンシンターゼ、例えば、バレンセンシンターゼをコードする核酸を得ることができる。例えば、非改変または野生型バレンセンシンターゼポリペプチドをコードする核酸は、植物供給源、例えば、柑橘類（例えば、オレンジまたはグレープフルーツ）から周知の方法を使用して得ることができる。次いで、本明細書に記載された任意の方法、例えば、エラープローンＰＣＲによるコーディング核酸のランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、オーバーラップＰＣＲまたはその他の組換え法を含めた、非改変または野生型バレンセンシンターゼに突然変異を導入するための当技術分野で公知の任意の方法を使用して、改変バレンセンポリペプチドを操作することができる。次いで、ポリペプチドをコードする核酸を、異種的に発現される宿主細胞中に導入できる。
【０２３８】
一部の例では、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを含めた本明細書において提供されるテルペンシンターゼが、固相または溶液相ペプチド合成などを使用して合成的に生成される。
【０２３９】
１．テルペンシンターゼをコードする核酸の単離
バレンセンシンターゼなどのテルペンシンターゼをコードする核酸は、核酸分子をクローニングおよび単離するための当技術分野で公知の任意の利用可能な方法を使用してクローニングまたは単離できる。このような方法として、核酸のＰＣＲ増幅および核酸ハイブリダイゼーションスクリーニングを含めた、ライブラリーのスクリーニングが挙げられる。一部の例では、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を含めた、核酸を増幅するための方法を使用して、バレンセンシンターゼポリペプチドをコードする核酸分子を単離できる。核酸を含有する物質を、バレンセンシンターゼをコードする核酸分子がそれから単離され得る出発物質として使用できる。例えば、それだけには限らないが、オレンジ（スイートオレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ））およびグレープフルーツ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｐａｒａｄｉｓｉ）を含めた柑橘類果実から得たＤＮＡおよびｍＲＮＡ調製物を使用して、バレンセンシンターゼ遺伝子を得ることができる。核酸ライブラリーも、出発物質の供給源として使用できる。プライマーは、バレンセンシンターゼをコードする分子などのテルペンシンターゼをコードする分子を増幅するよう設計できる。例えば、プライマーを、テルペンシンターゼ、例えば、バレンセンシンターゼをコードする公知の核酸配列、例えば、配列番号１および２９２〜２９４に示されるものに基づいて、またはバレンセンシンターゼアミノ酸配列の逆翻訳から設計できる。増幅によって作製された核酸分子は、配列決定し、バレンセンシンターゼポリペプチドをコードすると確認できる。
【０２４０】
合成遺伝子をベクター、例えば、タンパク質発現ベクターまたはコアタンパク質コーディングＤＮＡ配列の増幅のために設計されたベクター中にクローニングする目的で、バレンセンシンターゼをコードする核酸分子に、制限エンドヌクレアーゼ部位を含有するリンカー配列を含めたさらなるヌクレオチド配列をつなげることができる。さらに、機能的ＤＮＡエレメントを特定するさらなるヌクレオチド配列を、バレンセンシンターゼをコードする核酸分子に作動可能に連結することができる。さらに、その他の部分またはドメインをコードする核酸も含まれる場合があり、その結果、得られるシンターゼは、融合タンパク質である。例えば、ＦＰＰシンターゼなどのその他の酵素またはＨｉｓタグなどのタグをコードする核酸。
【０２４１】
２．突然変異体（ｍｕａｎｔ）または改変された核酸の作製
改変されたテルペンシンターゼ、例えば、改変されたバレンセンシンターゼをコードする核酸は、突然変異を達成するための当技術分野で公知の任意の方法を使用して調製または作製できる。改変のための方法は、コーディング核酸分子の標準的な合理的および／またはランダム突然変異誘発を含む（例えば、エラープローンＰＣＲ、ランダム部位特異的飽和突然変異誘発、または合理的部位特異的突然変異誘発、例えば、突然変異誘発キット（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能であるＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ）などを使用して）。さらに、日常的な組換えＤＮＡ技術を使用して、異種アミノ酸を含有するポリペプチドをコードする核酸を作製できる。例えば、異種アミノ酸配列を含有するキメラポリペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸を、上記および実施例５において記載されるものなどの２段階ＰＣＲ法を使用して、ならびに／または所望のキメラポリペプチド成分の日常的なサブクローニングのための制限酵素およびクローニング法を使用して作製できる。
【０２４２】
作製すると、核酸分子を、当技術分野で公知の任意の方法を使用して、細胞において発現させて、改変されたテルペンシンターゼポリペプチドを作製することができる。改変されたテルペンシンターゼポリペプチド、例えば、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを、次いで、所望の特性または活性についての、例えば、基質からテルペンを生成する能力についてのスクリーニングによって評価できる。特定の例では、所望の特性を有する改変されたテルペンシンターゼを突然変異によって作製し、本明細書に例示された例に従って特性についてスクリーニングする。通常、改変されたバレンセンシンターゼが作製される場合には、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、ＦＰＰからバレンセンを生成する。
【０２４３】
したがって、上記および本明細書に記載された改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドのいずれかを含めた、本明細書に記載された改変されたテルペンシンターゼのいずれかをコードする核酸が、本明細書において提供される。本明細書において提供される核酸分子のいずれも、当技術分野で周知の方法を使用して単離または精製でき、またはベクターもしくは細胞中に含めることができる。本明細書において提供される核酸分子の例示として、表３または５Ａに示されるいずれか、またはその縮重配列がある。例えば、本明細書において提供される核酸分子の例示として、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドをコードするいずれか、例えば、配列番号３〜１２７、３５０、３５１、７２３〜７３１、７３２〜７４５、７４６〜７５１、８１０〜８６６、８８７〜８９０および８９５のいずれかに示されるポリペプチドをコードするいずれか、またはその縮重配列がある。一実施形態では、本明細書において提供される核酸分子は、少なくとも５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５または９９％の配列同一性を有するか、または本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドをコードする任意の核酸の全長の少なくとも７０％に沿って、中または高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする。例えば、本明細書において提供される核酸分子は、配列番号１に示される核酸配列に対して、少なくともまたは少なくとも約少なくとも５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５または９９％の配列同一性を有する。別の実施形態では、核酸分子は、本明細書において提供されるバレンセンシンターゼポリペプチドのいずれかをコードする縮重コドン配列を有するものを含み得る。表３および５Ａは、本明細書において提供される例示的な改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドの例示的核酸配列を示す。
【０２４４】
３．ベクターおよび細胞
１種または複数の本明細書において提供される、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを含めた、改変されたテルペンシンターゼポリペプチドの組換え発現のために、シンターゼをコードするヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含有する核酸を、適当な発現ベクター、すなわち、挿入されたンパク質コード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含有するベクターに挿入できる。使用される発現系に応じて、必要な転写および翻訳シグナルはまた、バレンセンシンターゼ遺伝子の天然プロモーターおよび／またはそのそれぞれの両端に位置する領域によって供給され得る。したがって、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドをコードする核酸を含有するベクターも本明細書において提供される。ベクターを含有する原核および真核細胞を含めた細胞も提供される。このような細胞として、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、古細菌、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞が挙げられる。特定の例では、細胞は、ＦＰＰなどの非環式ピロリン酸テルペン前駆体を発現するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母である。細胞は、細胞によってコードされるバレンセンシンターゼが発現される条件下で上記の細胞を増殖させることによって、バレンセンシンターゼポリペプチドまたは改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドなどのテルペンシンターゼを生成するために使用される。一部の例では、発現されたシンターゼを精製する。その他の例では、発現されたシンターゼ、例えば、バレンセンシンターゼが、宿主細胞でＦＰＰを１種または複数のテルペン（例えば、バレンセン）に変換する。
【０２４５】
ＤＮＡ断片をベクター中に挿入するための当業者に公知の任意の方法を使用して、適当な転写／翻訳制御シグナルおよびタンパク質コード配列を含有するキメラ遺伝子を含有する発現ベクターを構築できる。これらの方法は、インビトロ組換えＤＮＡおよび合成技術およびインビボ組換え体（遺伝子組換え）を含み得る。バレンセンシンターゼポリペプチドまたは改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドまたはドメイン、その誘導体、断片または相同体をコードする核酸配列の発現は、遺伝子またはその断片が、組換えＤＮＡ分子（単数または複数）で形質転換された宿主において発現されるように第２の核酸配列によって調節され得る。例えば、タンパク質の発現は、当技術分野で公知の任意のプロモーター／エンハンサーによって制御され得る。特定の実施形態では、プロモーターは、バレンセンシンターゼタンパク質の遺伝子の天然のものではない。使用され得るプロモーターとして、それだけには限らないが、原核生物、酵母、哺乳動物および植物プロモーターが挙げられる。プロモーターの種類は、以下により詳細に記載される使用される発現系に応じて変わる。
【０２４６】
特定の実施形態では、バレンセンシンターゼポリペプチドまたは改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドまたはドメイン、その断片、誘導体または相同体、１つ以上の複製起点および所望により、１種または複数の選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含有するベクターが、使用される。バレンセンシンターゼポリペプチドの発現のためのベクターおよび系が記載されている。
【０２４７】
４．発現系
バレンセンシンターゼポリペプチド（改変されたおよび改変されていない）を含めたテルペンシンターゼポリペプチドは、インビトロおよびインビボ法、例えば、インビボ生成またはインビトロでのテルペンシンターゼ（例えば、バレンセンシンターゼ）をコードする核酸分子からの発現のための、テルペンシンターゼ（例えば、バレンセンシンターゼ）をコードする核酸分子を宿主細胞または宿主植物への導入などを含めた、タンパク質生成のための当技術分野で公知の任意の方法によって生成できる。バレンセンシンターゼおよび改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドなどのテルペンシンターゼは、必要な量および形態のシンターゼポリペプチドを生成するのに適した任意の生物において発現させることができる。発現宿主として、原核および真核細胞生物、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、植物、昆虫細胞、ヒト細胞株およびトランスジェニック動物を含めた哺乳動物細胞が挙げられる。発現宿主は、そのタンパク質生成レベルならびに発現されたタンパク質に存在する翻訳後修飾（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の種類において異なり得る。発現宿主の選択は、これらおよび法的考察および安全性考察、生成コストおよびニーズおよび精製方法などのその他の因子に基づいて行うことができる。
【０２４８】
真核生物宿主における発現は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））およびピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属（例えば、ピキア・パストリア（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉａ））に由来するものなどの酵母、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞および鱗翅目細胞などの昆虫細胞、柑橘類、タバコ、トウモロコシ、コメ、藻類およびアオウキクサ属などの植物および植物細胞における発現を含み得る。発現のための真核細胞としてまた、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞などの哺乳動物細胞株が挙げられる。真核生物発現宿主としてまた、例えば、血清、乳および卵における生成を含めた、トランスジェニック動物における生成が挙げられる。
【０２４９】
バレンセンシンターゼなどのテルペンシンターゼの発現のために、多数の発現ベクターが、利用可能であり、当業者に公知である。発現ベクターの選択は、宿主発現系の選択によって影響を受ける。このような選択は、十分に当業者のレベルの範囲内である。一般に、発現ベクターは、転写プロモーターおよび所望により、エンハンサー、翻訳シグナルならびに転写および翻訳終結シグナルを含み得る。安定な形質転換に使用される発現ベクターは、通常、形質転換された細胞の選択および維持を可能にする選択マーカーを有する。いくつかの場合には、複製起点を使用して、細胞中のベクターのコピー数を増幅できる。  
【０２５０】
バレンセンシンターゼおよび改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを含めたテルペンシンターゼはまた、タンパク質融合物として利用または発現させてもよい。例えば、ポリペプチドにさらなる機能性を加えるために融合物を作製してもよい。融合タンパク質の例として、それだけには限らないが、シグナル配列、局在性などのためのタグ、例えば、ｈｉｓ６タグもしくはｍｙｃタグまたは精製のためのタグ、例えば、ＧＳＴ融合物ならびにタンパク質分泌および／または膜会合を指示するための配列の融合物が挙げられる。その他の例では、バレンセンシンターゼまたは改変されたバレンセンシンターゼなどのセスキテルペンシンターゼポリペプチドを、Brodelius et al.(Eur. J. Biochem. (2002) 269:3570-3579）に記載されるＦＰＰシンターゼと融合してもよい。
【０２５１】
バレンセンシンターゼポリペプチドを含めたテルペンシンターゼポリペプチドを生成する方法は、宿主細胞におけるＦＰＰなどの非環式ピロリン酸テルペン前駆体の同時発現を含み得る。一部の例では、宿主細胞は、天然に、ＦＰＰを発現する。このような細胞は、より多量のＦＰＰを発現するよう改変され得る（例えば、ＵＳ６５３１３０３参照のこと）。その他の例では、ＦＰＰを天然に生成しない宿主細胞が、ＦＰＰを生成するよう遺伝子改変される。
【０２５２】
ａ．原核細胞
原核生物、特に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、多量の、本明細書において提供された改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを生成する系を提供する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換は、当業者に周知の簡単で、迅速な技術である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の形質転換のための例示的発現ベクターとして、例えば、ｐＧＥＭ発現ベクター、ｐＱＥ発現ベクターおよびｐＥＴ発現ベクターが挙げられる（米国特許第４，９５２，４９６号参照；ＮＯＶＡＧＥＮ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩから入手可能；この系を説明するＮｏｖａｇｅｎから公開された文献も参照のこと）。このようなプラスミドとして、Ｔ７ｌａｃプロモーター、Ｔ７ターミネーター、誘導性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃオペレーターおよびｌａｃレプレッサー遺伝子を含有するｐＥＴ  １１ａ；Ｔ７プロモーター、Ｔ７ターミネーターおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｏｍｐＴ分泌シグナルを含有するｐＥＴ  １２ａ−ｃ；ならびにＨｉｓカラムを用いる精製において使用するためのＨｉｓ−Ｔａｇ（商標）リーダー配列およびカラムでの精製後の切断を可能にするトロンビン切断部位、Ｔ７−ｌａｃプロモーター領域およびＴ７ターミネーターを含有する、ｐＥＴ  １５ｂおよびｐＥＴ１９ｂ  （ＮＯＶＡＧＥＮ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）が挙げられる。
【０２５３】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のための発現ベクターは、高レベルのタンパク質発現を誘導するのに、また、宿主細胞に対して幾分かの毒性を示すタンパク質を発現させるのに有用である誘導プロモーターを含有し得る。例示的原核生物プロモーターとして、例えば、β−ラクタマーゼプロモーター (Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543) およびｔａｃプロモーター (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983)) が挙げられる; Scientific American 242:79-94 (1980) 中の「Useful Proteins from Recombinnt Bacteria」も参照のこと。誘導プロモーターの例として、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ハイブリッドｔａｃプロモーター、Ｔ７およびＳＰ６  ＲＮＡプロモーターならびに温度によって調節されるλＰＬプロモーターが挙げられる。
【０２５４】
バレンセンシンターゼを含めたテルペンシンターゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞質環境において発現させることができる。細胞質は、還元環境であり、一部の分子にとっては、このことが、不溶性の封入体の形成をもたらし得る。ジチオトレイトールおよびβ−メルカプトエタノールなどの還元剤ならびに変性剤（例えば、グアニジン−ＨＣｌおよび尿素など）を使用して、タンパク質を再可溶化することができる。代替アプローチとして、可溶性タンパク質の生成につながる、酸化環境ならびにシャペロニン様およびジスルフィドイソメラーゼを提供する、細菌の細胞膜周辺腔におけるバレンセンシンターゼの発現がある。通常、タンパク質を周辺質に向けるリーダー配列が、発現される予定のタンパク質に融合される。次いで、リーダーは、周辺質の内側のシグナルペプチダーゼによって除去される。原形質周辺をターゲッティングするリーダー配列の例として、ペクチン酸リアーゼ遺伝子に由来するｐｅｌＢリーダーおよびアルカリホスファターゼ遺伝子に由来するリーダーが挙げられる。一部の場合には、原形質周辺の発現によって、発現されるタンパク質の培養培地への漏出が可能となる。タンパク質の分泌によって、培養上清からの迅速な簡単な精製が可能となる。分泌されないタンパク質は、浸透圧性溶解によって周辺質から得ることができる。細胞質発現と同様に、タンパク質が不溶性になり得る場合には、変性剤および還元剤を使用して、可溶化および再折りたたみを促進することができる。誘導および増殖の温度もまた、発現レベルおよび溶解度に影響を及ぼし得る。通常、２５℃から３７℃の間の温度が使用される。また、突然変異を使用して、発現されたタンパク質の溶解度を高めることもできる。通常、細菌は、グリコシル化されていない（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）タンパク質を生成する。
【０２５５】
ｂ．酵母細胞
サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に由来するもの（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、クロイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母を使用して、テルペンシンターゼ、例えば、本明細書において提供される、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを含めたバレンセンシンターゼポリペプチドを発現させることができる。酵母は、エピソーム複製ベクターを用いて、または相同組換えによる安定な染色体組込みによって形質転換できる。一部の例では、遺伝子発現を調節するために誘導プロモーターが使用される。酵母におけるバレンセンシンターゼポリペプチドの発現のための例示的プロモーター配列として、中でも、メタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター（Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073、1980）またはエノラーゼ、グリセルアルデヒドリン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼなどのその他の解糖酵素 (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; およびHolland et al., Biochem. 17:4900, 1978) が挙げられる。
【０２５６】
酵母発現において使用するためのその他の適したベクターおよびプロモーターは、Hitzeman, EPA-73,657に、またはFleer et al.，Gene, 107:285-195 (1991);およびvan den Berg et al., Bio/Technology, 8:135-139 (1990)にさらに記載されている。別の代替法として、それだけには限らないが、Russell et al. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) およびBeier et al. (Nature 300:724, 1982) に記載されたグルコース抑制可能なＡＤＨ２プロモーターまたは改変されたＡＤＨ１プロモーターが挙げられる。酵母および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の両方で複製可能なシャトルベクターは、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における選択および複製のためのｐＢＲ３２２に由来するＤＮＡ配列（Ａｍｐｒ遺伝子および複製起点）を、上記のに酵母ベクター中に挿入することによって構築できる。酵母シャトルベクターの例示として、以下の実施例１に記載されるＹＥｐ−ＣＶＳ−ｕｒａがある。
【０２５７】
酵母発現ベクターは、形質転換されたＤＮＡの選択および維持のためにＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３およびＵＲＡ３などの選択マーカーを含み得る。酵母において発現されたタンパク質は、可溶性であることが多く、Ｂｉｐなどのシャペロニンおよびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとの同時発現によって、発現レベルおよび溶解度が改善され得る。さらに、酵母において発現されたタンパク質は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）由来の酵母交配型α−因子分泌シグナルなどの分泌シグナルペプチド融合およびＡｇａ２ｐ交配接着受容体またはアークスラ・アデニニボランス（Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）グルコアミラーゼなどの酵母細胞表面タンパク質との融合を使用して分泌に向けることができる。プロテアーゼ切断部位（例えば、Ｋｅｘ−２プロテアーゼ）を、分泌経路を出るときにポリペプチドから融合された配列を除去するよう操作することができる。
【０２５８】
酵母は、メバロン酸依存性イソプレノイド生合成経路のための、ＦＰＰシンターゼ（ＦＰＰを生成できる）を含めた必要なタンパク質を天然に発現する。したがって、酵母細胞における、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを含めた改変されたテルペンシンターゼの発現は、ＦＰＰからのバレンセンなどのテルペンの生成をもたらし得る。改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを含めたテルペンシンターゼの発現のための例示的酵母細胞として、増大したレベルのＦＰＰを発現するよう改変された酵母が挙げられる。例えば、酵母細胞を、より少ないスクアレンシンターゼまたはより少ない活性スクアレンシンターゼ（例えば、ｅｒｇ９突然変異体；例えば、米国特許第６，５３１，３０３号および同６，６８９，５９３号参照のこと）を生成するよう改変してもよい。これは、野生型酵母細胞と比較して高レベルでの宿主細胞におけるＦＰＰの蓄積をもたらし、これが、次いで、テルペン（例えば、バレンセン）の収率の増大をもたらし得る。例示的な改変された酵母細胞として、それだけには限らないが、改変されたサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＣＡＬＩ５−１（ｕｒａ３、ｌｅｕ２、ｈｉｓ３、ｔｒｐ１、Δｅｒｇ９：：ＨＩＳ３、ＨＭＧ２ｃａｔ／ＴＲＰ１：：ｒＤＮＡ、ｄｐｐ１、ｓｕｅ）、ＡＬＸ７−９５（ｕｒａ３、ｈｉｓ３、ｔｒｐ１、Δｅｒｇ９：：ＨＩＳ３、ＨＭＧ２ｃａｔ／ＴＲＰ１：：ｒＤＮＡ、ｄｐｐ１  ｓｕｅ）、ＡＬＸ１１−３０（ｕｒａ３、ｔｒｐ１、ｅｒｇ９ｄｅｆ２５、ＨＭＧ２ｃａｔ／ＴＲＰ１：：ｒＤＮＡ、ｄｐｐ１、ｓｕｅ）および米国特許第６，５３１，３０３号、同６，６８９，５９３号に記載されるものおよび米国特許出願ＵＳ２００４０２４９２１９に公開されるものが挙げられる。
【０２５９】
ｃ．植物および植物細胞
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを含めたテルペンシンターゼの発現のために、トランスジェニック植物細胞および植物を使用できる。発現コンストラクトは、通常、微粒子銃およびプロトプラストへのＰＥＧ媒介性移入などの直接ＤＮＡ移入を使用して、またアグロバクテリウム媒介性形質転換を用いて植物に移入される。発現ベクターは、プロモーターおよびエンハンサー配列、転写終結エレメントおよび翻訳制御エレメントを含み得る。発現ベクターおよび形質転換技術は、通常、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）およびタバコなどの双子葉植物宿主と、トウモロコシおよびコメなどの単子葉植物宿主間で分かれている。発現のために使用される植物プロモーターの例として、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、リボースビスホスフェートカルボキシラーゼプロモーターならびにユビキチンおよびＵＢＱ３プロモーターが挙げられる。形質転換された細胞の選択および維持を容易にするために、ハイグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼなどの選択マーカーが使用される。形質転換された植物細胞は、細胞、凝集体（カルス組織）として培養で維持される場合も、全植物体に再生される場合もある。トランスジェニック植物細胞としてまた、タンパク質を生成するよう操作された藻類を挙げることができる（例えば、Mayfield et al. (2003) PNAS 100:438-442参照のこと）。形質転換される植物として、例えば（ｆｏｅ  ｅｘａｍｐｌｅ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ）族、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ）属、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）属、ウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）属（アルファルファ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）属（ワタ）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）属（セイヨウアブラナ）から選択される植物が挙げられる。一部の例では、植物は、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）の種に属し、米国特許公開番号２００９０１２３９８４号に記載されるものなどのバレンセンシンターゼおよびファルネシル二リン酸シンターゼを過剰発現するベクターで形質転換される。
【０２６０】
ｄ．昆虫および昆虫細胞
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを含めたテルペンシンターゼを発現するために、特に、バキュロウイルス発現系を使用する昆虫および昆虫細胞を使用できる（例えば、Muneta et al. (2003) J. Vet. Med. Sci. 65(2):219-23参照のこと）。血リンパにおける発現を含めた昆虫細胞および昆虫幼虫は、高レベルのタンパク質を発現し、高等真核生物によって使用される翻訳後修飾のほとんどが可能である。バキュロウイルスは、真核細胞発現の安全性を改善し、規制上の懸念を低減する制限的宿主域を有する。通常、発現ベクターは、高レベル発現のためのバキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターなどのプロモーターを使用する。よく使用されるバキュロウイルス系として、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多核体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）およびボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）核多核体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）などのバキュロウイルスならびにスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来Ｓｆ９、ヨトウガ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｕｎｉｐｕｎｃｔａ）（Ａ７Ｓ）およびオオカバマダラ（Ｄａｎａｕｓ  ｐｌｅｘｉｐｐｕｓ）（ＤｐＮ１）などの昆虫細胞株が挙げられる。高レベル発現のためには、発現される分子のヌクレオチド配列を、ウイルスのポリヘドリン開始コドンのすぐ下流に融合する。哺乳動物分泌シグナルは、昆虫細胞において正確にプロセシングされ、発現されたタンパク質を培養培地中に分泌するために使用できる。さらに、細胞株ヨトウガ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｕｎｉｐｕｎｃｔａ）（Ａ７Ｓ）およびオオカバマダラ（Ｄａｎａｕｓ  ｐｌｅｘｉｐｐｕｓ）（ＤｐＮ１）は、哺乳動物細胞系と同様のグリコシル化パターンを有するタンパク質を生成する。
【０２６１】
昆虫細胞における代替発現系は、安定に形質転換された細胞の使用である。シュナイダー（Ｓｃｈｎｉｅｄｅｒ）２（Ｓ２）およびＫｃ細胞（キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ））およびＣ７細胞（ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ））などの細胞株を発現のために使用できる。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）メタロチオネインプロモーターを使用して、カドミウムまたは銅を用いる重金属誘導の存在下で高レベルの発現を誘導できる。発現ベクターは、通常、ネオマイシンおよびハイグロマイシンなどの選択マーカーの使用によって維持される。
【０２６２】
ｅ．哺乳動物発現
哺乳動物発現系を使用して、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを含めたテルペンシンターゼを発現させることができる。発現コンストラクトを、アデノウイルスなどのウイルス感染によって、またはリポソーム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランなどの直接ＤＮＡ移入によって、またエレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションなどの物理的手段によって哺乳動物細胞に移入することができる。哺乳動物細胞の発現ベクターは、通常、ｍＲＮＡキャップ部位、ＴＡＴＡボックス、翻訳開始配列（コザックコンセンサス配列）およびポリアデニル化エレメントを含む。このようなベクターは、高レベル発現のための転写プロモーター−エンハンサー、例えば、ＳＶ４０プロモーター−エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長い末端反復配列を含むことが多い。これらのプロモーター−エンハンサーは、多数の細胞種において活性である。組織および細胞種プロモーターおよびエンハンサー領域も、発現のために使用できる。例示的プロモーター／エンハンサー領域として、それだけには限らないが、エラスターゼＩ、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳癌ウイルス、アルブミン、αフェトプロテイン、α１アンチトリプシン、βグロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖２および性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御などの遺伝子に由来するものが挙げられる。選択マーカーを使用して、発現コンストラクトを有する細胞を選択および維持できる。選択マーカー遺伝子の例として、それだけには限らないが、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼおよびチミジンキナーゼが挙げられる。ＴＣＲ−ζおよびＦｃεＲＩ−γなどの細胞表面シグナル伝達分子との融合によって、細胞表面で活性な状態でタンパク質の発現を指示できる。
【０２６３】
哺乳動物発現には、マウス、ラット  ヒト、サルおよびニワトリおよびハムスター細胞を含めて多数の細胞株が利用可能である。例示的細胞株として、それだけには限らないが、ＢＨＫ（すなわち、ＢＨＫ−２１細胞）、２９３−Ｆ、ＣＨＯ、ＣＨＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＣＨＯＸ；  Ｅｘｃｅｌｌｇｅｎｅ）、Ｂａｌｂ／３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＭＴ２、マウスＮＳ０（非分泌性）およびその他の骨髄腫細胞株、ハイブリドーマおよびヘテロハイブリドーマ細胞株、リンパ球、線維芽細胞、Ｓｐ２／０、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、２９３Ｓ、２９３Ｔ、２Ｂ８およびＨＫＢ細胞が挙げられる。細胞培養培地からの分泌タンパク質の精製を促進する血清不含培地に適応された細胞株もまた、利用可能である。このような一例として、血清不含ＥＢＮＡ−１細胞株がある(Pham et al., (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42.)。
【０２６４】
５．精製
宿主細胞からの、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを含めたバレンセンシンターゼなどのテルペンシンターゼの精製方法は、選択される宿主細胞および発現系に応じて異なる。分泌された分子については、タンパク質は、一般に、細胞を除去した後に、培養培地から精製される。細胞内発現については、細胞を溶解させ、抽出物からタンパク質を精製できる。トランスジェニック植物および動物などのトランスジェニック生物が、発現に使用される場合には、組織または臓器を、溶解された細胞抽出物を生成するための出発材料として使用できる。さらに、トランスジェニック動物生成は、乳または卵におけるポリペプチドの生成を含む場合があり、これは集めることができ、必要に応じて、当技術分野における標準方法を使用して、タンパク質を抽出し、さらに精製できる。
【０２６５】
バレンセンシンターゼを含めたテルペンシンターゼは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ分画およびサイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、キレートクロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーを含めた当技術分野で公知の標準タンパク質精製技術を使用して精製できる。また、発現コンストラクトを、タンパク質に、ｍｙｃエピトープ、ＧＳＴ融合物またはＨｉｓ６などのアフィニティータグを加えるよう操作し、それぞれ、ｍｙｃ抗体、グルタチオン樹脂およびＮｉ樹脂を用いてアフィニティー精製してもよい。純度は、ゲル電気泳動および染色および分光光度的技術を含めた当技術分野で公知の任意の方法によって評価できる。
【０２６６】
６．融合タンパク質
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを含めた改変されたテルペンシンターゼおよび１種または複数のその他のポリペプチドを含有する融合タンパク質も提供される。テルペンシンターゼポリペプチドと別のポリペプチドとの連結は、直接的にか、またはリンカーを介して間接的に達成できる。一例では、連結は、例えば、ヘテロ二官能性薬剤を介する化学的連結またはチオール連結またはその他のこのような連結によってであり得る。融合はまた、組換え手段によっても達成され得る。バレンセンシンターゼポリペプチドなどのテルペンシンターゼの、別のポリペプチドとの融合は、バレンセンシンターゼポリペプチドのＮ末端またはＣ末端にであり得る。
【０２６７】
融合タンパク質は、標準組換え技術によって生成され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片を、例えば、連結、制限酵素消化に、平滑末端の、またはねじれ型末端の末端を使用して適当な末端を提供すること、必要に応じて付着末端を埋めること、望ましくない接続を避けるためのアルカリホスファターゼ処理および酵素的連結によって、従来技術に従ってインフレームに一緒に連結できる。別の実施形態では、自動化ＤＮＡシンセサイザーを含めた従来技術によって融合遺伝子を合成できる。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、２種の連続した遺伝子断片間に相補的なオーバーハングを生じさせ、続いて、これらがアニーリングされ、再増幅されて、キメラ遺伝子配列を生成させるアンカープライマーを使用して実施できる（例えば、Ausubel et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons、1992参照のこと）。さらに、融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をすでにコードする多数の発現ベクターが市販されている。バレンセンシンターゼポリペプチドをコードする核酸は、融合部分がバレンセンシンターゼタンパク質にインフレームで連結されるような発現ベクターにクローニングできる。
【０２６８】
Ｆ．テルペンシンターゼを使用し、評価する方法
本明細書において提供される改変されたテルペンシンターゼを使用し、その能力について評価して、それだけには限らないが、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）またはゲラニル−ゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）を含めた適した非環式ピロリン酸テルペン前駆体からモノテルペン、ジテルペンおよびセスキテルペンを含めたテルペンを生成することができる。通常、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドは、ＦＰＰからのバレンセンの形成を触媒する。当業者に公知の任意の方法を使用して、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼなどの改変されたテルペンシンターゼを用いてバレンセンを含めたテルペンを生成できる。本明細書において提供される改変されたシンターゼのＦＰＰまたはその他の基質からのバレンセンまたはその他のテルペンの形成を触媒する能力は、これらの方法を使用して評価され得る。一部の例では、改変されたシンターゼを使用してＦＰＰまたは別の基質から生成されたバレンセンなどのテルペンの量を、野生型または非改変シンターゼを使用して、同じ基質から生成されたバレンセンなどのテルペンの量と比較する。
【０２６９】
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドなどの改変されたテルペンシンターゼのその他の活性および特性はまた、当技術分野で周知の方法およびアッセイを使用して評価できる。改変されたシンターゼの活性およびテルペンの形成を触媒するその能力を評価することに加えて、反応の速度論、改変された位置化学または立体化学、野生型または非改変テルペンシンターゼと比較して変更された基質利用および／または変更された生成物分布（すなわち、ＦＰＰまたは別の基質から生成される種々のテルペンの変更された量）を、当技術分野で周知の方法を使用して評価できる。例えば、改変されたテルペンシンターゼポリペプチドによってＦＰＰ、ＧＰＰまたはＧＧＰＰから生成される種々のテルペンの種類および量は、以下および実施例５に記載されるものなどのガスクロマトグラフィー法（例えば、ＧＣ−ＭＳ）によって評価できる。一部の例では、ＦＰＰから改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドによって生成され得るテルペンとして、それだけには限らないが、バレンセン、ゲルマクレンＡ、β−エレメン、β−セリネン、τ−セリネンおよび７−エピ−α−セリネンが挙げられる。
【０２７０】
本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼを使用してＦＰＰからバレンセンおよびヌートカトンを生成する方法が、以下に提供される。このような方法を、本明細書において提供されるその他の改変されたテルペンシンターゼによって、ＦＰＰ、ＧＰＰおよび／またはＧＧＰＰからその他のテルペンを生成および評価するよう、当業者によって適応させることができる。
【０２７１】
１．バレンセンの生成
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを使用して、ＦＰＰなどの非環式ピロリン酸テルペン前駆体からのバレンセンの形成を触媒することができる。一部の例では、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼは、ＦＰＰを生成または過剰生成する細胞において発現され、その結果、バレンセンが上記の経路によって生成される。その他の例では、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼが、節Ｄに記載されたものなどの任意の適した宿主細胞から発現および精製される。次いで、精製されたシンターゼをインビトロでＦＰＰと組み合わせてバレンセンを生成する。
【０２７２】
一部の例では、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼは、上記の節Ｄに記載されたように過剰発現および精製される。次いで、改変されたバレンセンシンターゼを基質ファルネシル二リン酸とともにインキュベートし、バレンセンを生成する。ＦＰＰおよびバレンセンシンターゼを含有する溶液のｐＨは、生成されるバレンセンの量に影響を及ぼし得る（例えば、米国特許公開番号２０１００２１６１８６号参照のこと）。分析のために、バレンセンを有機相に分配するために有機溶媒を加える。次いで、内部標準を使用するガスクロマトグラフィー（例えば、ＧＣ−ＭＳ）などの本明細書において提供される任意の方法を使用して、バレンセンの生成および生成物の量の定量化が決定される。あるいは、改変されたバレンセンシンターゼは、同様にＦＰＰを生成し、バレンセンの生成をもたらす宿主細胞において発現される。次いで、バレンセンを有機溶媒を用いて細胞培養培地から抽出し、続いて、カラムクロマトグラフィーまたはＨＰＬＣなどの任意の公知の方法によって単離および精製してもよく、回収されたバレンセン量および純度を評価する。一部の例では、バレンセンは、精製前または精製後のいずれかで、酸化によってヌートカトンに変換される。
【０２７３】
ａ．バレンセン生成のための例示的細胞
メバロン酸依存性イソプレノイド生合成経路（例えば、酵母細胞を含めた真菌および動物細胞）またはメバロン酸非依存性イソプレノイド生合成経路（例えば、細菌および高等植物）の一部としてＦＰＰを生成する細胞株において、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを発現させることによって、バレンセンを生成できる。特定の例では、ＦＰＰを過剰生成するよう改変されている細胞株において、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを発現させることによってバレンセンを生成する。このような細胞の例示として、改変された酵母細胞がある。例えば、より少ないスクアレンシンターゼまたはより少ない活性スクアレンシンターゼを生成するよう改変されている酵母細胞（例えば、ｅｒｇ９突然変異体；例えば、米国特許第６，５３１，３０３号および同６，６８９，５９３号参照のこと）が、本明細書において提供される方法においてバレンセンを生成するのに有用である。低減されたスクアレンシンターゼ活性は、野生型酵母細胞と比較して高レベルでの宿主細胞におけるＦＰＰの蓄積をもたらし、次いで、これが、バレンセン生成の収量の増大をもたらし得る。例示的な改変された酵母細胞として、それだけには限らないが、改変されたサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＣＡＬＩ５−１（ｕｒａ３、ｌｅｕ２、ｈｉｓ３、ｔｒｐ１、Δｅｒｇ９：：ＨＩＳ３、ＨＭＧ２ｃａｔ／ＴＲＰ１：：ｒＤＮＡ、ｄｐｐ１）、ＡＬＸ７−９５（ｕｒａ３、ｈｉｓ３、ｔｒｐ１、Δｅｒｇ９：：ＨＩＳ３、ＨＭＧ２ｃａｔ／ＴＲＰ１：：ｒＤＮＡ、ｄｐｐ１、ｓｕｅ）、ＡＬＸ１１−３０（ｕｒａ３、ｔｒｐ１、ｅｒｇ９ｄｅｆ２５、ＨＭＧ２ｃａｔ／ＴＲＰ１：：ｒＤＮＡ、ｄｐｐ１、ｓｕｅ）ならびに米国特許第６，５３１，３０３号および同６，６８９，５９３号および公開された米国特許公開番号ＵＳ２００４０２４９２１９に記載されるものが挙げられる。
【０２７４】
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＣＡＬＩ５−１は、それ自体は野生型株ＡＴＣＣ２８３８３（ＭＡＴａ）に由来する、ＳＷ２３Ｂ＃７４（米国特許第６，５３１，３０３号および同６，６８９，５９３号ならびにTakahashi et al. (2007) (Biotechnol Bioeng. 97(1): 170-181に記載される）の誘導体である。ＣＡＬＩ５−１は、Ｄｐｐ１ホスファターゼの低下した活性を有するよう作製された（例えば、米国公開出願ＵＳ２００４０２４９２１９参照のこと）。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＣＡＬＩ５−１は、その他の突然変異の中でも、ｅｒｇ９突然変異（Δｅｒｇ９：：ＨＩＳ３  対立遺伝子）ならびに好気的ステロール取り込み増強を支援する突然変異（ｓｕｅ）を含有する。また、およそ８コピーの末端切断型ＨＭＧ２遺伝子も含有する。ＨＭＧ２の末端切断型は、ＧＰＤプロモーターによって駆動され、したがって、もはや厳しい調節下にはなく、ＦＰＰへの炭素流動の増大を可能にする。ジアシルグリセロールピロリン酸（ＤＧＰＰ）ホスファターゼ酵素（ｄｐｐ１）をコードする遺伝子に欠失も含有し、これが、ＦＰＰの脱リン酸化を制限する。
【０２７５】
ＡＬＸ７−９５およびＡＬＸ１１−３０．１は、ＣＡＬＩ５−１の誘導体である。ＡＬＸ７−９５は、ロイシンが培地に供給される必要がないように、機能的ｌｅｕ遺伝子を用いてＣＡＬＩ５−１のΔｌｅｕ２の欠乏を補正することによってＣＡＬＩ５−１から誘導された（例えば、ＵＳ２０１０／０１５１５１９参照のこと）。ＡＬＸ１１−３０は、以下の実施例２に記載される数段階で、ＣＡＬ５−１から構築された。
【０２７６】
ｂ．バレンセン生成のための細胞の培養
例示的方法では、本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼは、ファルネシル二リン酸を過剰発現するよう改変されている宿主細胞株において発現され、それによって、改変されたバレンセンシンターゼが発現されると、ファルネシル二リン酸が、バレンセンに変換される。宿主細胞を、当技術分野で周知の任意の適した方法を使用して培養する。一部の例では、種々の改変されたバレンセンシンターゼを発現する細胞のハイスループットスクリーニングなどのために、改変されたバレンセンシンターゼを発現する細胞を、９６ウェルプレートの個々のウェルで培養する（例えば、以下の実施例３Ｃを参照のこと）。宿主細胞が酵母であるその他の例では、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドおよびＦＰＰを発現する細胞を、以下の実施例に記載されたものなどの発酵法を使用して培養する。
【０２７７】
本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを発現する酵母細胞からのバレンセンの生成のために、種々の発酵法を使用できる。例えば、バッチまたは連続発酵のいずれかによって、大規模生成を達成できる。古典的なバッチ発酵は、培地の組成が、発酵の開始時に設定され、発酵の間は人為的な変更に付されない閉鎖系である。したがって、発酵の開始時に、培地に所望の微生物（単数または複数）を播種し、発酵が栄養分のさらなる追加を伴わずに起こることが可能となる。通常、バッチ発酵における炭素供給源の濃度は制限され、ｐＨおよび酸素濃度などの因子は管理される。バッチ系では、系の代謝産物およびバイオマス組成は、発酵が停止される時間まで絶えず変わる。バッチ培養内では、細胞は、通常、静止遅滞期（ｓｔａｔｉｃ  ｌａｇ  ｐｈａｓｅ）から高増殖対数期（ｈｉｇｈ  ｇｒｏｗｔｈ  ｌｏｇ  ｐｈａｓｅ）へ、最後に、定常期に変調し、ここで、増殖速度が減少または停止される。未処理の場合には、定常期にある細胞は、最終的に死滅する。
【０２７８】
標準バッチ系の変法として、発酵が進行するにつれて栄養分が添加される点を除いて通常のバッチ系と同様であるフェドバッチ系がある。異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向にある場合および培地中に制限された量の基質を有することが望ましい場合には、フェドバッチ系は有用である。また、栄養分を与える能力は、バッチ発酵プロセスと比較して、フェドバッチ発酵プロセスにおいてより高い細胞密度をもたらすことが多い。フェドバッチ発酵では、ｐＨ、溶存酸素、栄養分濃度およびＣＯなどの廃ガスの分圧などの因子が、通常、測定および制御される。
【０２７９】
バレンセンの生成はまた、連続発酵を用いて達成することもできる。連続発酵は、処理のために、バイオリアクターに規定の発酵培地が継続的に添加され、同時に等量のコンディショニング培地が除去される開放系である。この系は、一般に、培養物を一定の高密度で維持し、これでは、細胞は主にその増殖の対数期にある。連続発酵は、細胞増殖または最終生成物濃度に影響を及ぼす任意の数の因子の調節を可能にする。例えば、１つの方法は、炭素供給源または窒素レベルなどの制限的栄養分を固定された割合に維持し、すべてのその他のパラメータを調節することを可能にする。その他の系では、培地濁度によって測定される細胞濃度を一定に維持しながら、増殖に影響を及ぼすいくつかの因子を絶えず変更することができる。連続系は、定常状態増殖条件を維持することを目的とし、したがって、培地除去による細胞喪失は、発酵における細胞増殖速度に対してバランスがとられなければならない。連続発酵プロセスのために栄養分および増殖因子を調節する方法ならびに生成物形成速度を最大化する技術は、当技術分野で周知である。
【０２８０】
細胞培養後、次いで、細胞培養培地を回収して生成されたバレンセンを得ることができる。
【０２８１】
１つの例示的方法では、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを発現する宿主細胞（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＣＡＬＩ５−１、ＡＬＸ７−９５またはＡＬＸ１１−３０）を、０および１ｇ／Ｌの間でグルコースを維持しながら、３Ｌの発酵タンク中、２８℃、ｐＨ４．５でおよそ１３２時間増殖させる（実施例２参照のこと）。発酵後、硫酸ナトリウムを１０〜１５の最終濃度に添加する。ダイズ油も添加し、撹拌し、遠心分離によってバレンセン（およびその他のテルペン）を含有する油を回収する。
【０２８２】
ｃ．バレンセンの単離および評価
本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを用い、上記の方法を使用して生成されたバレンセンを、当技術分野で公知の任意の方法によって単離および評価できる。一例では、細胞培養培地を、有機溶媒を用いて抽出して、生成されたバレンセンおよび任意のその他のテルペンを有機層に分配する。バレンセン生成は、例えば、ガスクロマトグラフィーなどの当技術分野で公知の任意の方法を使用して、評価でき、および／またはバレンセンをその他の生成物から単離できる。例えば、内部標準としてセドレンおよびヘキサデカンを使用してガスクロマトグラフィーによって有機層を分析できる。この方法は、以下の実施例２に例示される。
【０２８３】
生成されるバレンセンの量は、有機化合物を分離および分析するのに有用な任意の公知の標準的なクロマトグラフィー技術によって決定できる。例えば、バレンセン生成は、それだけには限らないが、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）、フレームイオン化検出器を使用するガスクロマトグラフィー（ＧＣ−ＦＩＤ）、キャピラリーＧＣ−ＭＳ、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびカラムクロマトグラフィーを含めた、バレンセンおよびその他のテルペンなどの炭化水素の検出および定量化にとって有用な任意の公知のクロマトグラフィー技術によってアッセイできる。通常、これらの技術は、生成されたテルペンの量を定量化するために使用される既知内部標準、例えば、セドレンまたはヘキサデカンの存在下で実施される。例えば、バレンセンなどのセスキテルペンを含めたテルペンは、質量分析検出を伴うガスクロマトグラフィーにおいて標品のものと、保持時間および質量スペクトルを比較することによって同定できる。通常の標準として、それだけには限らないが、セドレンおよびヘキサデカンが挙げられる。その他の例では、定量化は、既知量の標品を用いるフレームイオン化検出を用い、較正曲線に基づくガスクロマトグラフィーおよび内部標準のピーク面積に対する正規化によって達成できる。これらのクロマトグラフィー技術によって、有機層中に存在する任意のテルペン、例えば、ゲルマクレンＡ、β−セリネン、τ−セリネンおよび７−エピ−α−セリネン（例えば、実施例８を参照のこと）を含めた、例えば、改変されたバレンセンシンターゼによって生成されるその他のテルペンの同定が可能となる。
【０２８４】
特定の例では、ＦＰＰから本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドによって生成されるバレンセンの量は、配列番号２に示される野生型バレンセンシンターゼポリペプチドによってＦＰＰから生成されるバレンセンの少なくともまたは約１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％またはそれ以上である。通常、上記および以下の実施例において例示される方法を使用して生成されるバレンセンの量は、少なくともまたは約０．１ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ、０．３ｇ／Ｌ、０．４ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、０．６ｇ／Ｌ、０．７ｇ／Ｌ、０．８ｇ／Ｌ、０．９ｇ／Ｌ  １．０ｇ／Ｌ、１．１ｇ／Ｌ、１．２ｇ／Ｌ、１．３ｇ／Ｌ、１．４ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、２．０ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４．０ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌまたは５．０ｇ／Ｌまたはそれ以上である。
【０２８５】
一部の例では、バレンセン生成の動力学は、３Ｈ  ＦＰＰまたは１４Ｃ  ＦＰＰなどの放射性イソプレノイド基質が種々の濃度のシンターゼとともに使用されるシンターゼアッセイによって決定できる。生成物を有機層に抽出し、放射能を液体シンチレーションカウンターを使用して測定する。速度定数は、データに対するミカエリスメンテン方程式の直接フィットから決定される。
【０２８６】
２．ヌートカトンの生成
本明細書において提供される改変されたバレンセンシンターゼは、バレンセンを生成し、次いで、これが、ヌートカトンに酸化され得る。優勢なグレープフルーツの芳香であるヌートカトンは、バレンセンの酸化生成物である。バレンセンは、位置選択的水酸化を受けて、２−ヒドロキシバレンセンを形成し得、これがさらに酸化されて、ヌートカトンを形成する。バレンセンの酸化は、化学的手段または生合成手段によって実施できる（例えば、米国特許第５，８４７，２２６号、欧州特許番号ＥＰ１０８３２３３； Girhard et al., (2009) Microb. Cell. Fact. 8:36; Fraatz et al., (2009) Appl Microbiol Biotechnol. 83(1):35-41; Furusawa et al. (2005) Chem Pharm. Bull. 53:1513-1514; Salvador et al., (2002) Green Chemistry, 4、352-356を参照)。生化学的酸化は、ラッカーゼ、ヒドロキシラーゼまたはその他の酸化酵素によって達成され得る。一部の例では、バレンセンは、三酸化クロムまたはリン酸シリカによって固定されたクロム（ＩＩＩ）触媒を使用してヌートカトンに変換される（例えば、実施例７参照のこと）。ヌートカトン形成は、本明細書に記載されたクロマトグラフィー技術のいずれかによって確認および／または定量化できる。
【実施例】
【０２８７】
Ｇ．実施例
以下の実施例は、単に例示目的で含まれるのであって、本発明の範囲を制限しようとするものではない。
【実施例１】
【０２８８】
野生型バレンセンシンターゼのクローニング
米国特許第７，４４２，７８５号の実施例１に先に記載された手順を使用して、新たに収穫されたバレンシアオレンジの果汁小胞から単離したＲＮＡから、バレンシアオレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  ｃｖ．Ｖａｌｅｎｃｉａ）（バレンシアオレンジ）に由来するバレンセンシンターゼ遺伝子（ＣＶＳ）をクローニングした。
【０２８９】
まず、ａｔｔＲ１−ＣｍＲ−ｃｃｄＢ遺伝子−ａｔｔＲ２の形態(Hartley et al., (2000) Genome Res. 10:1788-1795)を有するｇａｔｅｗａｙクローニングカセット（ＲｆＢ）を、ＵＲＡ３選択マーカー、ＡＤＨ１プロモーターおよび２つのＢａｍＨＩ部位（一方は、ＡＤＨ１プロモーターの５’、もう一方は、ＡＤＨターミネーターの３’）の両端に位置するＡＤＨ１ターミネーター、２−ミクロンｏｒｉ、アンピシリン耐性遺伝子およびｃｏｌＥ１複製起点を含有するＹＥｐ３５２−ＵＲＡ（配列番号６９２、Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）のＳｍａＩ制限部位に挿入することによって、Ｙｅｐ−ＧＷ−ＵＲＡ（Takahashi et al., (2007) Biotechnol Bioeng. 97(1):170-181)を作製した。得られたベクターは、ＹＥｐ−ＣＶＳ−ＵＲＡと指定した。
【０２９０】
次いで、ＣＶＳ遺伝子（配列番号１に示される、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする）を、酵母シャトル発現ベクターＹｅｐ−ＧＷ−ＵＲＡへのサブクローニングのための制限部位を含有するよう新たに収穫されたバレンシアオレンジの果汁小胞から単離したＲＮＡから増幅した。Ｙｅｐ−ＧＷ−ＵＲＡをＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化した後、増幅産物を酵母シャトル発現ベクターＹＥｐ−ＧＷ−ＵＲＡにクローニングした。
【０２９１】
ＹＥｐ−ＣＶＳ−ｕｒａベクターは、２８℃でウラシルを欠くＳＤ最小培地で選択することによってＳ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中で維持した。ベクターはまた、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢ培地でアンピシリンに対する耐性を選択することによって大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）中でも維持した。
【実施例２】
【０２９２】
バレンセンの生成
バレンセンの生成についてスクリーニングするために、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母細胞株ＣＡＬＩ５−１（ｕｒａ３、ｌｅｕ２、ｈｉｓ３、ｔｒｐ１、Δｅｒｇ９：：ＨＩＳ３、ＨＭＧ２ｃａｔ／ＴＲＰ１：：ｒＤＮＡ、ｄｐｐ１、ｓｕｅ）、ＡＬＸ７−９５（ｕｒａ３、ｈｉｓ３、ｔｒｐ１、Δｅｒｇ９：：ＨＩＳ３、ＨＭＧ２ｃａｔ／ＴＲＰ１：：ｒＤＮＡ、ｄｐｐ１、ｓｕｅ）またはＡＬＸ１１−３０（ｕｒａ３、ｔｒｐ１、ｅｒｇ９ｄｅｆ２５、ＨＭＧ２ｃａｔ／ＴＲＰ１：：ｒＤＮＡ、ｄｐｐ１、ｓｕｅ）を使用した。
【０２９３】
ＣＡＬＩ５−１株（米国公開出願ＵＳ２００４０２４９２１９；米国特許第６，５３１，３０３号および同６，６８９，５９３号を参照のこと）は、Δｌｅｕ２欠失を有し、その培地へのロイシンの導入を必要とした。ＡＬＸ７−９５は、ＣＡＬＩ５−１のΔｌｅｕ２欠失を機能的ＬＥＵ２遺伝子を用いて補正することによってＣＡＬＩ５−１から導いた（米国公開出願ＵＳ２０１０／０１５１５１９参照のこと）。
【０２９４】
ＡＬＸ１１−３０は、ＵＳ２０１０／０１５１５１９に記載されるようにＡＬＸ７−１７５．１から、いくつかの工程でＣＡＬＩ５−１から構築した。手短には、ヒオシアムス・ムチクス（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ  ｍｕｔｉｃｕｓ）プレムナスピロジエンシンターゼ（ＨＰＳ）を含有するプラスミドを、ＡＬＸ７−９５株に形質転換することによって、ＡＬＸ７−９５  ＨＰＳを得た。ＨＰＳの遺伝子をＹｅｐ−ＧＷ−ＵＲＡにクローニングして、ＹＥｐ−ＨＰＳ−ｕｒａ（ＹＥｐ−ＨＰＳ）を得ることによってＹＥｐ−ＨＰＳプラスミドを得た。次いで、ＥＲＧ９遺伝子のエラープローンＰＣＲ反応を実施し、得られたＤＮＡをＹＥｐＨＰＳを有するＡＬＸ７−９５に形質転換した。形質転換体をエルゴステロールを欠くＹＰ培地にプレーティングし、プレムナスピロジエン生成についてスクリーニングした。高レベルのプレムナスピロジエンを生成したものを保存した。１種の株、ＡＬＸ７−１６８．２５［ｕｒａ３、ｔｒｐ１、ｈｉｓ３、ｅｒｇ９ｄｅｆ２５、ＨＭＧ２ｃａｔ／ＴＲＰ１：：ｒＤＮＡ、ｄｐｐ１、ｓｕｅ、ＹＥｐＨＰＳ］を、完全ＨＩＳ３遺伝子のＰＣＲ断片で形質転換して、機能的ＨＩＳ３遺伝子を作製した。培地中のヒスチジンの不在下で増殖できる形質転換体を単離した。この形質転換から、ＡＬＸ７−１７５．１を単離した［ｕｒａ３、ｔｒｐ１、ｅｒｇ９ｄｅｆ２５、ＨＭＧ２ｃａｔ／ＴＲＰ１：：ｒＤＮＡ、ｄｐｐ１、ｓｕｅ  ＹＥｐＨＰＳ］。最後に、ＡＬＸ７−１７５．１を、ＹＰＤ（１０ｇ／Ｌ  酵母抽出物、２０ｇ／Ｌペプトン、２０ｇ／Ｌグルコース）中で数世代増殖させることおよび細胞をＹＰＤプレートにプレーティングすることによって、プラスミドＹＥｐＨＰＳを除去した。ウラシルを含まないＳＤ培地（０．６７のアミノ酸を含まないＢａｃｔｏ酵母窒素源基礎培地、２％グルコース、０．１４％のウラシルを含まない酵母合成ドロップアウト培地）で増殖できなかったコロニーを同定した。この株は、ＡＬＸ１１−３０と指定した。
【０２９５】
バレンセンシンターゼまたは突然変異体によるバレンセンの生成についてのスクリーニングのために、ＣＶＳ遺伝子またはＣＶＳ遺伝子の改変された形を含有するＹＥｐ−ＣＶＳ−ｕｒａプラスミドを、酢酸リチウム酵母形質転換キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して上記の酵母株に形質転換した。ＡＬＸ７−９５およびＡＬＸ１１−３０株は、全般的に、ＣＡＬＩ５−１株よりも多くのバレンセンを生成した。ＣＡＬＩ５−１を、バイアルにおける最初のスクリーニング（実施例３に記載される）および発酵槽における生成のために使用した。続いて、ＡＬＸ７−９５またはＡＬＸ１１−３０を、バイアルおよび発酵槽におけるスクリーニングのために使用した。通常、ＡＬＸ７−９５を、バイアルにおけるスクリーニングのために使用し、ＡＬＸ１１−３０を発酵槽のために使用した。
【０２９６】
形質転換体を、ＳＤＥ−ｕｒａ培地（０．６７％の、アミノ酸を含まないＢａｃｔｏ酵母窒素源基礎培地、２％グルコース、０．１４％のウラシルを補給されていない酵母合成ドロップアウト培地および必要に応じて４０ｍｇ／Ｌエルゴステロール）で選択した。コロニーを選び、以下に記載したミクロ培養アッセイを使用してバレンセン生成についてスクリーニングした。
【０２９７】
バレンセンの生成は、３−Ｌ発酵タンク（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｂｉｏｆｌｏｗ  １１０）で実施した。１リットルの発酵培地を調製し、発酵タンク中でオートクレーブ処理した（２０ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｇのＫＨ２ＰＯ４、１ｇのＮａＣｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４ｇのソルリスコーンスティープソリッド（Ｓｏｌｕｌｙｓ  ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｓｏｌｉｄｓ）（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ））。次いで、以下の成分を添加した：２０ｍｌの無機溶液（０．０２８％のＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０２９％のＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００８％のＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０２４％のＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０２４％のＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１７％のＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、１ｍＬのＨＣｌ）；１０ｍＬの５０％グルコース；３０ｍＬのビタミン溶液（０．００１％のビオチン；０．０１２％のパントテン酸カルシウム、０．０６％のイノシトール、０．０１２％のピリドキシン−ＨＣｌ、０．０１２％のチアミン−ＨＣｌ）；１０ｍＬの１０％ＣａＣｌ２および２０ｍＬのオートクレーブ処理したダイズ油（地方の食料品店から購入した）。ＣＡＬＩ５−１およびＡＬＸ７−９５を含めたステロール要求株に対しては、培地に、５０ｍｇ／Ｌのコレステロールまたは４０ｍｇ／Ｌのエルゴステロールを含めた。
【０２９８】
５０ｍＬのＳＤＥ−ｕｒａ−ｔｒｐ培地（実施例３．Ｃ．２．参照のこと）に、ＹＥｐ−ＣＶＳ−ｕｒａプラスミドを含有する、ＣＡＬＩ５−１、ＡＬＸ７−９５またはＡＬＸ１１−３０を播種することによって、発酵培地に播種するための種培養物を調製した。この培養物を、定常期初期（２４〜４８時間）まで２８℃で増殖させた。この培養物１ｍＬを、５００ｍＬのＳＤＥ−ｕｒａ−ｔｒｐ培地に播種し、２８℃で２４時間増殖させた。５０−ｍＬのアリコート（５％播種材料）を使用して、発酵タンク中の培地に播種した。
【０２９９】
発酵槽は、２８℃で維持した。エアフローは、１ｖｖｍとし、ｄＯ２は、撹拌を調整することによって３０％超で維持した。ｐＨは、リン酸およびＮａＯＨまたはＮＨ４ＯＨを使用して４．５で維持した。
【０３００】
グルコース濃度が１ｇ／Ｌ未満に低下した時点で、発酵槽中のグルコースが、０から１ｇ／Ｌの間で維持されるよう供給計画を開始した。グルコース供給は、６０％グルコース（ｗ／ｖ）からなっていた。
【０３０１】
発酵の最後、一般に、播種の約１３２時間後に、硫酸ナトリウムを１０〜１５％の最終濃度に、さらなる５０ｍＬのダイズ油も同様に添加し、発酵槽の内容物を１時間撹拌した。発酵容器の内容物を沈降させた後、遠心分離によって油を回収し、油中のバレンセン含量を決定した。
【０３０２】
バレンセンをアッセイするために、バイアルに３ｍＬの懸濁液を入れ、それに、２０ｍｇ／Ｌのセドレンを含有するアセトン３ｍＬを添加した。ボルテックス処理した後、１０ｍｇ／Ｌのヘキサデカンを含有するヘキサン６ｍＬを用いて混合物を抽出し、続いて、さらにボルテックス処理した。それぞれ、抽出効率および注入のために、セドレンおよびヘキサデカンを内部標準として使用するガスクロマトグラフィーによる分析のために、有機相を第２のバイアルに移した。Ｙｅｐ−ＣＶＳ−ｕｒａを含有し、バレンセンシンターゼを発現する、ＣＡＬＩ５−１、ＡＬＸ７−９５またはＡＬＸ１１−３０  Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、バレンセンを生成するとわかった。
【実施例３】
【０３０３】
バレンセンシンターゼ突然変異体の作製
バレンセンシンターゼ遺伝子のエラープローンＰＣＲ（ｅｐＰＣＲ）によってバレンセンシンターゼ突然変異体を作製した。次いで、ハイスループットスクリーニングアッセイを使用して、突然変異体を、そのバレンセンを生成する能力についてスクリーニングした。
【０３０４】
Ａ．ｅｐＰＣＲによるバレンセンシンターゼ突然変異体の作製
ＣＶＳ遺伝子のエラープローンＰＣＲのために、全ＹＥｐ−ＣＶＳ−ｕｒａプラスミドまたはプラスミドから切り出し、ゲル精製した、ＣＶＳ遺伝子を含有する３ｋｂのＢａｍＨＩ  ＤＮＡ断片のいずれかを使用した。ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＩＩランダム突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用し、２７０から３６０ｎｇの間のＣＶＳ遺伝子に相当するＤＮＡを、エラープローンＰＣＲの鋳型として使用した。ＰＣＲ条件は、フォワードプライマーＣＶＳｐｃｒＦ１（５’−ＣＡＴＴＣＡＣＧＣＡＣＡＣＴＡＣＴＣＴＣＴ−３’、配列番号３４４）およびリバースプライマーＣＶＳｐｃｒＲ１（５’−ＧＣＣＧＡＣＡＡＣＣＴＴＧＡＴＴＧＧＡＧ−３’、配列番号３４５）を使用する、９６℃、１分間、５５℃でのアニーリング１分間、７２℃での伸長２分間の３０サイクルとした。ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩを使用するＰＣＲ反応生成物の消化によって、突然変異誘発されたＣＶＳ遺伝子のライブラリーが提供され、これを使用し、同一制限エンドヌクレアーゼを使用してＹＥｐ−ＣＶＳ−ｕｒａの野生型ＣＶＳ遺伝子を置換した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を介してＤＮＡを継代することによって、プラスミドライブラリーを調製した。次いで、このＤＮＡライブラリーを使用して、酵母株ＣＡＬＩ５−１またはＡＬＸ７−９５を形質転換した。酵母形質転換体を、実施例２に記載したようにスクリーニングした。野生型遺伝子を含有する形質転換体と比較して、上昇したレベルのバレンセン（＞１１０％）を生成した形質転換体（野生型レベルの１１０％、すなわち、野生型に対して１０％増大）を、バイアル、振盪フラスコおよび発酵培養において再試験して、バレンセンのより高いレベルの生成を確認した。より高いレベルのバレンセンを生成すると確認された株から得たプラスミドＤＮＡを単離し、配列決定して、変異体バレンセンシンターゼ酵素におけるアミノ酸変化を調べた。
【０３０５】
表６は、エラープローンＰＣＲを使用して生成されたバレンセンシンターゼ突然変異体を示す。表は、ヌクレオチド突然変異および得られたアミノ酸突然変異（あるとすれば）および野生型バレンセンシンターゼと比較した、バレンセンの生成における増大パーセンテージ（シェーカーフラスコ中で培養された形質転換体を使用して評価された）を含む。シェーカーフラスコ中で培養された場合は、クローンＶ８は、野生型ＣＶＳよりも２８７％多いバレンセンを生成した。
【０３０６】
【表９】
2013544084.tif 000045
【０３０７】
次いで、表７に示されるさらなるバレンセンシンターゼ突然変異体を、さまざまな方法を使用して生成した。第１の方法では、標準的な組換えＤＮＡおよびＰＣＲ法を使用して、突然変異体Ｖ１およびＶ２におけるアミノ酸突然変異を組み合わせて、Ｖ９と指定される変異体を生成した。同様に、変異体Ｖ１０を、Ｖ１、Ｖ２およびＶ３における突然変異の組換えによって作製した。Ｖ９およびＶ１０のいずれも、Ｖ１に見られたＳ４７３Ｙ突然変異を含有していなかったが、これは、Ｖ１を、Ｖ２またはＶ３と組み合わせるために使用された制限消化の際に、この突然変異が排除されたからである。次いで、変異体Ｖ９から得たプラスミドＤＮＡを、上記の方法を使用するエラープローンＰＣＲに付して、変異体Ｖ１２、Ｖ１３、Ｖ１４およびＶ１５を生成した。次いで、変異体Ｖ１２から得たプラスミドＤＮＡを、位置４２９での飽和突然変異誘発に付して、変異体Ｖ１６を生成し、変異体Ｖ１６から得たプラスミドＤＮＡを、続いて、位置２２１での飽和突然変異誘発に付して変異体Ｖ１７を生成した。表７は、組み合わせた突然変異を有するバレンセンシンターゼ突然変異体を示し、ヌクレオチド突然変異および得られたアミノ酸突然変異（あるとすれば）および野生型バレンセンシンターゼと比較した、またはＶ９およびＶ１０についてはＶ１変異体と比較した（シェーカーフラスコ中で培養された形質転換体を使用して評価された）、または変異体Ｖ１６についてはＶ１２と比較した、または変異体Ｖ１７についてはＶ１６と比較したバレンセンの生成における増大パーセンテージを含む。シェーカーフラスコ中で培養された場合は、クローンＶ１０は、クローンＶ１よりも８８％多いバレンセンを生成した。
【０３０８】
【表１０−１】
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【表１０−２】
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【０３０９】
以下の表８は、３Ｌ発酵槽における野生型ＣＶＳおよび発酵について上記で同定されたいくつかのＣＶＳ変異体のｇ／Ｌでの発酵力価を示す。各実験について、変異体は、ＣＡＬＩ５−１において発現され、発酵条件は同一とした。したがって、同一実験内で、バレンセン発酵収量において観察された相違は、発現されているバレンセンシンターゼ遺伝子における相違に起因するものであり得る。表８に示されるように、すべてのＣＶＳ変異体が、野生型ＣＶＳと比較して増大した量のバレンセンを生成した。
【０３１０】
【表１１】
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【０３１１】
突然変異体バレンセンシンターゼ遺伝子を含有する酵母形質転換体による増大したバレンセン生成は、アミノ酸位置６０、９７、２０９、２１２、２１４、２２１、２３８、２９２、３３３、３４５、３６９、４０５、４２９、４７３および５３６での突然変異は、単独または組合せで、許容されるか、または改善されたバレンセン生成をもたらすのいずれかであるということを示した。これらの位置の一部は、独立した変異体中で複数回同定された。例えば、野生型酵素の位置６０のバリンは、変異体Ｖ１２におけるイソロイシンまたは変異体Ｖ１５におけるグリシンで置換されており；位置３４５のアラニンは、変異体Ｖ１２におけるトレオニンまたは変異体Ｖ３におけるバリンのいずれかで置換されており；位置２２１のチロシンは、変異体Ｖ４におけるシステインまたは変異体Ｖ１７におけるバリンのいずれかで置換されている。位置６０、９７、２０９、２１２、２１４、２２１および２３８は、グリコシルヒドロラーゼに対して相同性を有する、酵素の非触媒ドメイン中に位置している。
【０３１２】
Ｂ．突然変異の組合せを有するバレンセンシンターゼ突然変異体の作製
上記の実施例３．Ａ．において、および同様の上記のエラープローンＰＣＲ実験同定されたアミノ酸変更を、単一の酵素において組み合わせた。また、バレンセンシンターゼの三次元構造のモデルに従って、タンパク質の表面上にある配列番号２に示されるバレンセンシンターゼの位置２４、３８、５８、８８、１２５、１７３および２５２での突然変異も含まれた。各々２９のアミノ酸変化を有する２種の変異体酵素を合成した。変異体ＣＶＳ  Ｖ１８（配列番号３）およびＣＶＳ  Ｖ１９（配列番号４）は、エラープローンＰＣＲによって、酵素活性に対して有益または中性の効果を有すると先に同定された２２種の突然変異およびまた表面残基における７種の突然変異を各々含有していた。Ｖ１８は、表面残基の各々のアラニンへの突然変異を含有しており、Ｖ１９は、表面残基の各々のグルタミンまたはアスパラギンへの突然変異を含有していた。表９は、標的とされた位置でのアミノ酸残基を示す。表１０は、野生型ＣＶＳと比較したＣＶＳ  Ｖ１９におけるアミノ酸およびヌクレオチド変化を示す。表１１は、野生型ＣＶＳ（配列番号１）と比較した、コドン最適化されたＣＶＳ  Ｖ１９（配列番号１２９）におけるサイレントヌクレオチド変化を示す。
【０３１３】
コドン最適化されたＣＶＳ  Ｖ１８（配列番号１２８）およびＣＶＳ  Ｖ１９（配列番号１２９）遺伝子を、ＹＥｐ−ＣＶＳ−ｕｒａプラスミドにクローニングし、ＡＬＸ１１−３０  Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に形質転換した。上記の実施例２に記載されるように、発酵後、各形質転換体によるバレンセン生成を評価した。各形質転換体は、バレンセンを変異体Ｖ１２に匹敵するレベルで生成した。変異体Ｖ１２によるバレンセン生成は、ＣＡＬＩ５−１細胞において実施されたが、ＡＬＸ７−９５細胞における生成は、２種の株における唯一の相違がｌｅｕマーカーの存在下にあるので、同様であると予測される。各形質転換体はまた、野生型バレンセンシンターゼを発現するＡＬＸ７−９５  Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）よりもおよそ１０倍多い力価でバレンセンを生成した。通常、突然変異体によるバレンセンの生成は、野生型ＣＶＳの生成レベルの１０〜２０倍である。
【０３１４】
【表１２】
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【０３１５】
【表１３】
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【０３１６】
【表１４−１】
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【表１４−２】
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【０３１７】
【表１４−３】
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【表１４−４】
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【０３１８】
【表１４−５】
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【表１４−６】
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【０３１９】
Ｃ．ＣＶＳ  Ｖ１８およびＶ１９の飽和突然変異誘発
ＣＶＳ  Ｖ１８遺伝子を、Ｎ末端ドメインおよびＣ末端触媒ドメインの一部（アミノ酸２６７〜４６２）の種々の残基の飽和突然変異誘発に付し、変更を受け入れられ、バレンセンの生産性によって測定されるような、活性に対して陽性または中性の効果を提供するアミノ酸を同定した。突然変異誘発後、突然変異体遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡを、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＡＬＸ７−９５に形質転換した。次いで、形質転換体コロニーを、バレンセン生成についてスクリーニングした。次いで、ＣＶＳ  Ｖ１８遺伝子を含有する形質転換体からのバレンセン生成よりも１１０％より多いバレンセン生成を示した形質転換体に由来するプラスミドＤＮＡを配列決定した。
【０３２０】
１．突然変異誘発
オーバーラップＰＣＲを使用して、遺伝子の種々の位置で突然変異を作製した。突然変異させる各位置について、一対の相補的変異原性プライマーを合成し、各々、突然変異させるアミノ酸位置の各側で相同性の各々１５塩基対および突然変異誘発のために標的にされるコドンでランダムヌクレオチドを含有する。
【０３２１】
所望のコドン変化のための変異原性プライマーを、上流プライマー１１−１５７．７（５’−ＡＡＧＧＴＡＣＣＡＴＴＴＡＡＡＡＡＡＡＴＧＴＣ−３’；配列番号２９７）または下流プライマー１１−１５７．８（５’−ＴＴＴＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＡＡＡＴＧＧＡＡＣＡ−３’；配列番号２９８）のいずれかを用いるＰＣＲ反応において使用して、各々、所望のコドンでランダムヌクレオチドを含有する２種のＰＣＲ産物を作製した。２種のＰＣＲ断片を、２種の断片を等モル比で混合し、５サイクルのプライマーを含まないＰＣＲ増幅に付すオーバーラップＰＣＲ反応を使用してつなげた。ＰＣＲ条件は、９６℃で２分間の１サイクル、次いで、９４℃で３０秒、３８℃で３０秒および７２℃で２分間の５サイクルとした。次いで、２０〜３０のさらなるサイクルを、プライマー１１−１５７．７および１１−１５７．８の存在下、同一ＰＣＲ条件下で実施した。
【０３２２】
ＰＣＲ反応物を、０．１容積の３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．８および２容積の１００％エタノールを混合し、微量遠心管中で１５分間遠心することによってエタノール沈殿させた。得られたＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄した。ＤＮＡを、１６μＬのミリＱ精製水に溶解し、その後、１μＬのＫｐｎＩ、１μＬのＸｂａＩおよび２μＬの１０×消化バッファーと組み合わせた。次いで、消化反応物３７℃でインキュベートした。完了した後、制限消化物を１％アガロースゲルで流し、ゲルから１．６ｋｂの断片を切り出した。次いで、Ｆｒｅｅｚｅ  ｎ  Ｓｑｕｅｅｚｅ溶出カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してＤＮＡを溶出した。ＤＮＡ断片をＹＥｐ−ＣＶＳ−ｕｒａ  のＫｐｎＩおよびＸｂａＩ部位にライゲーションし、得られたプラスミドをＤＨ１０Ｂ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にエレクトロポレーションした。形質転換培養物の１／１０容積を、ＬＢアンピシリンプレート（１００μｇ／ｍＬ）上にプレーティングし、残りの細胞を、プラスミドＤＮＡの調製のために液体ＬＢアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）に播種した。プレートおよび培養物を、３７℃で一晩増殖させた。ＬＢアンピシリンプレート上で２００を超えるコロニーを有する形質転換について、プラスミドＤＮＡの抽出のために３ｍｌのＬＢ培養物を遠心分離した。得られたプラスミドＤＮＡ調製物の各々は、変異体遺伝子のプールを含有しており、各プールは、同じ単一のコドンのヌクレオチドにおいてランダム突然変異を有する。
【０３２３】
各プールから得たプラスミドＤＮＡを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製の酢酸リチウム酵母形質転換キットを使用してサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＡＬＸ７−９５に形質転換した。形質転換体を、２８〜３０℃で３日増殖させた後、ＳＤＥ寒天培地（０．６７％の、アミン酸を含まないＢａｃｔｏ酵母窒素源基礎培地、２％グルコース、０．１４％のウラシル、ロイシン、ヒスチジン、トリプトファンを含まない酵母合成ドロップアウト培地、４０ｍｇ／Ｌのエルゴステロール）上で選択した。
【０３２４】
２．スクリーニング
形質転換体を、バレンセン生成についてスクリーニングするために、マイクロバイアル培養を使用するハイスループットスクリーニング手順を使用した。形質転換体酵母コロニーを、２００μＬのＳＤＥで満たした、９６ウェルのマイクロタイタープレートの個々のウェルに播種した。プレートを２８℃で２〜３日間増殖させた。飽和まで増殖させた後、各ウェルから得た１０μＬを使用して、２５０μＬの増殖およびバレンセン生成に適した培地を含有する２ｍＬのガラスバイアルに播種した。バイアルを血清ストッパー付きキャップで密閉し、次いで、振盪しながら、２８℃で２〜３日間インキュベートした。生成物をまず、２５０μＬのアセトンを血清ストッパーを通して入れることおよびボルテックス処理することと、続いて、５００μＬのｎ−ヘキサンを添加することおよびボルテックス処理することによって抽出した。相分離後、バイアルをガスクロマトグラフィーオートサンプラーのサンプルトレイに入れ、これがセスキテルペンの分析のために１マイクロリットルの有機相を除去した。抽出のために使用されたアセトンおよびヘキサンは、各々、サンプルの定量化に役立つよう内部標準を添加した。抽出されたサンプルを、ガスクロマトグラフィーによって分析し、ピーク面積からバレンセンの量を算出した。
【０３２５】
ＣＶＳ  Ｖ１８に対して＞１１０％のバレンセンを生成した突然変異体をまた、振盪フラスコにおいてスクリーニングした。１０ｍＬのＳＤＥ培地中の種培養を、２４時間増殖させ、２．５ｍＬを使用して、２５０バッフルなしフラスコ中の、５０ｍＬの発酵培地（２％硫酸アンモニウム、２％リン酸カリウム、０．１％  ＮａＣｌ、０．６％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．４％  酵母抽出物、１ｍＬ無機溶液［ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０２８％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０２９％、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．００８％、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０．０２４％、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０．０２４％、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ  ０．０１７％、ＨＣｌ  １ｍＬ］、０．５ｍｌの５０％グルコース、１．５ｍｌのビタミン溶液［ビオチン  ０．００１％、パントテン酸Ｃａ  ０．０１２％、イノシトール  ０．０６％、ピリドキシン−ＨＣｌ  ０．０１２％、チアミン−ＨＣｌ  ０．０１２％］、０．５ｍｌ  １０％  ＣａＣｌ２）に播種した。培養物を２８℃で増殖させた。１６時間インキュベートした後、培養物に３．６ｍｌの５０％グルコースおよび０．６６７ｍｌの１２．５％酵母抽出物を供給した。供給は、最初の供給の２４毎後に行った。培養物のｐＨを、２４時間毎に、３０％  ＮａＯＨを添加して４．５に調整した。およそ８８時間インキュベーションした後、０．１ｍｌのＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０を添加し、培養物を振盪しながらインキュベートして、植物油を十分に乳化させた。３０分後、２ｍＬの培養サンプルを採取した。サンプルを、２ｍＬのアセトン／セドレン溶液を用いて抽出し、次いで、４ｍＬのヘキサン／ヘキサデカン溶液を用いて抽出した。アリコートを、ＧＣによって分析し、バレンセンの量を決定した。
【０３２６】
３．結果
ａ．突然変異に対する許容性についての最初のスクリーニング
以下の表１２は、アミノ酸位置およびそのバレンセン生成によって決定されるような、突然変異に対するその一般的な許容度のまとめを提供する。表１２は、突然変異したアミノ酸の位置、各アミノ酸の存在する二次構造ならびに親ＣＶＳ  Ｖ１８によって生成されたバレンセンのパーセンテージと比較して、＜３０％のバレンセンおよび＞９０％のバレンセンを生成したサンプルのパーセンテージを示す。親ＣＶＳ  Ｖ１８と比較して、サンプルの≧５０％が＜３０％または＞９０％バレンセンを生成した生成したアミノ酸位置を強調した。例えば、アミノ酸位置２７１では、親ＣＶＳ  Ｖ１８によるバレンセンの生成と比較して、試験された９６サンプルのうち７２サンプル（７５％）が、＜３０％のバレンセンを生成し、試験された９６サンプルのうち３サンプル（３．１３％）が、＞９０％のバレンセンを生成した。したがって、この位置を不変またはほぼ不変と考えた。対照的に、アミノ酸位置２８２では、サンプルの９１．５６％（８８サンプル）が、親ＣＶＳ  Ｖ１８と比較して、＞９０％のバレンセンを生成し、４．１７％のみが＜３０％のバレンセンを生成した。この位置は、変化に対して中程度に耐容性であると考えた。したがって、以下の表１２に示されるように、アミノ酸位置２６７、２６９、２７０、２７１、２７３、２９５、２９８、３０１、３０２、３０３、３０５、３０６、３１２、４０３、４０４、４０７、４４２、４４５および４４６は、低活性の変異体の占める割合が高く、これらの位置は、比較的不変であると考えた。対照的に、アミノ酸位置９２、１６６、１７１、１８４、２０２、２１８、２８１、２８２、２９３、３２０、３３３、３３７、３４４、３４７、３５２、３５３、３５５、３５７、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６６、３６７、３８６、４１５および４２８は、高活性を有する変異体の割合が高く、これらの位置は、変化に対して特に許容性であると考えた。
【０３２７】
【表１５−１】
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【表１５−２】
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【０３２８】
【表１５−３】
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【表１５−４】
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【０３２９】
【表１５−５】
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【表１５−６】
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【０３３０】
【表１５−７】
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【０３３１】
ｂ．不変および許容性アミノ酸のさらなる分析
ランダム化の全体的な有効性を調べるために、アミノ酸２７０で突然変異した１９種の独立した細菌クローンを、無作為に選択し、配列決定して突然変異を同定した。これらの１９種の独立した細菌単離物のうち、１種も元のコドンを保持していなかった。２種の単離物が、変化したコドンによって野生型アミノ酸ロイシンをコードしており（サイレント突然変異）、１種の単離物がアミノ酸２７０に停止コドンを有していた。残りのクローンは、種々のその他のアミノ酸をコードしていた。
【０３３２】
アミノ酸残基２７０、不変であるかまたはほぼ不変であると決定されたアミノ酸での、個々の突然変異体単離物をさらに分析した。上記の表に示されるように、アミノ酸２７０では、１１．４６％の単離物しか、親ＣＶＳ  Ｖ１８レベルと比較して３０％を超えるバレンセンを生成しなかった。これらのサンプルのうち２種は、２種のＣＶＳ  Ｖ１８対照であった。したがって、９４種の突然変異体サンプルのうち１０種（１０．６３％）しか、有意なレベルのバレンセンを生成しなかった。これらの単離物および１種のバレンセンを生成しない単離物を、その突然変異体プラスミドのＤＮＡ配列決定に付した。バレンセンを生成する単離物のうち９（９）種が、ロイシンをコードしていたが、元のコドンは、ＴＴＧから、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＴまたはＴＴＡに突然変異していた。唯一のその他のバレンセンを生成する単離物は、野生型Ｌｅｕ２７０をコードしていたが、アミノ酸２６９に、ＤＮＡプライマー配列内の明らかなエラーによる、またはＰＣＲ増幅の際に導入された突然変異を有していた。配列決定した、バレンセンを生成しない単離物は、突然変異Ｌ２７０Ｅを含有していた。
【０３３３】
飽和突然変異誘発スクリーニングにおいて変化に対して中程度の許容性と同定された５種のアミノ酸位置から得た個々の突然変異体単離物をさらに分析した。アミノ酸位置２７４、２７９、２８１、２８２および２８４について同定された最高にバレンセンを生成する突然変異体単離物を、マイクロバイアル培養において再増殖させ、上記の実施例３．Ｃ．２に記載されるようにそのバレンセン生成を調べた。さらに、最大２４種の独立したクローンを配列決定して、正確なアミノ酸突然変異を調べた。
【０３３４】
表１３は、同定された突然変異体を示す。これらの突然変異の各々は、ＣＶＳ  Ｖ１８に存在する２９種の突然変異（上記の実施例３．Ｂに記載される）に加えて存在する。最初のミクロ培養において生成されたバレンセンの量およびＣＶＳ  Ｖ１８によって生成されたレベルに対する、バレンセン生成レベル（３以上のマイクロバイアル培養の平均から得た）も、表に含まれている。一部の例では、野生型アミノ酸コドンが維持されていた。その他の例では、核酸突然変異はサイレントであり、その結果、得られたバレンセンシンターゼのアミノ酸配列は、ＣＶＳ  Ｖ１８のものと同一であった。サイレント突然変異は、イタリック体で示されている。その他の例では、突然変異は、標的とされる突然変異に加えて観察され、ＰＣＲ増幅の際に導入されたエラーによる可能性が高い。
【０３３５】
最初のスクリーニングでは、アミノ酸残基２７４でスクリーニングされた９４種の突然変異体のうち６７．７１％が、親のＣＶＳ  Ｖ１８によるバレンセンの生成と比較して＞９０％のバレンセンを生成した。同定された突然変異体の多数が、親のＣＶＳ  Ｖ１８突然変異体で形質転換された細胞から生成されたバレンセンの正常より低い量の結果である可能性が高かった。ＣＶＳ  Ｖ１８で形質転換した細胞から生成されたバレンセンの量が、より通常である反復スクリーニングを実施し、より少ない突然変異体が同定された。反復試験では、同定された１４種の独立した突然変異体単離物を配列決定することによって、親のＣＶＳ  Ｖ１８と比較して＞９０％のバレンセン生成を有する単離物のみが、野生型残基Ｄ２７４を含有するものであることを示した（例えば、突然変異体Ｖ８４およびＶ９２参照のこと）。全体で、７種の異なる突然変異が同定され、１４種の突然変異体単離物のうち８種が、突然変異Ｄ２７４Ｍ、Ｄ２７４ＮまたはＤ２７４Ｇを含有する。
【０３３６】
最初のスクリーニングでは、アミノ酸残基２７９でスクリーニングされた９４種の突然変異体のうち５４．１７％が、親のＣＶＳ  Ｖ１８によるバレンセンの生成と比較して＞９０％のバレンセンを生成した。２４種の独立した突然変異体単離物の反復試験および配列決定によって、１１種の異なるアミノ酸をコードする２３種の反復培養のうち１９種が、親のＣＶＳ  Ｖ１８と比較して＞９０％のバレンセンを生成することが示された。
【０３３７】
最初のスクリーニングでは、アミノ酸残基２８１でスクリーニングされた９４種の突然変異体のうち８８．５４％が、親のＣＶＳ  Ｖ１８によるバレンセンの生成と比較して＞９０％のバレンセンを生成し、変化に対して中程度に許容性であると考えられた。２０種の独立した突然変異体単離物の反復試験によって、すべての突然変異体単離物が親のＣＶＳ  Ｖ１８と比較して≧９０％のバレンセンを生成することが示された。２０種の突然変異体単離物のうち１１（１１）種が、突然変異Ｐ２８１Ａ、Ｐ２８１Ｌ、Ｐ２８１ＳまたはＰ２８１Ｋを含有していた。
【０３３８】
最初のスクリーニングでは、アミノ酸残基２８２でスクリーニングされた９４種の突然変異体のうち９１．６７％が、親のＣＶＳ  Ｖ１８によるバレンセンの生成と比較して＞９０％のバレンセンを生成した。１８種の独立した突然変異体単離物の配列決定によって、１８種の突然変異体単離物のうち１１種が、アミノ酸突然変異Ｑ２８２Ｓ、Ｑ２８２Ａ、Ｑ２８２Ｒ、Ｑ２８２ＰまたはＱ２８２Ｌを含有していることが示された。
【０３３９】
最初のスクリーニングでは、アミノ酸残基２８４でスクリーニングされた９４種の突然変異体のうち４０．６３％が、親のＣＶＳ  Ｖ１８によるバレンセンの生成と比較して＞９０％のバレンセンを生成した。２３種の独立した突然変異体単離物の反復試験および配列決定によって、１１種の異なるアミノ酸をコードする２３種の反復培養物のうち１４種が、親のＣＶＳ  Ｖ１８と比較して＞９０％のバレンセンを生成することが示された。３種の単離物は、野生型アミノ酸Ａ２８４をコードしていた。
【０３４０】
【表１６−１】
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【表１６−２】
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【０３４１】
【表１６−３】
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【表１６−４】
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【０３４２】
ｃ．増大したバレンセンを生成する単離物
ＣＶＳ  Ｖ１８遺伝子を含有する形質転換体に対して１１０％超のバレンセンを生成する（すなわち、ＣＶＳ  Ｖ１８に対して１０％増大）と、上記の実験において同定された形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出し、ＣＶＳ遺伝子の核酸配列を調べた。以下の表１４は、この基準を満たす単離された突然変異体の結果を示す。表１４は、配列決定によって見られたアミノ酸およびヌクレオチド変化を示す。これらの突然変異の各々は、ＣＶＳ  Ｖ１８において存在する２９種の突然変異に加えて存在する（上記の実施例３．Ｂに記載される）。ＣＶＳ  Ｖ１８によって生成されたレベルに対するバレンセン生成レベル（振盪フラスコにおける培養から測定された）も、表中に含まれている。一部の例では、核酸突然変異は、サイレントであり、その結果、得られたバレンセンシンターゼのアミノ酸配列は、ＣＶＳ  Ｖ１８のものと同一であった。サイレント突然変異は、イタリック体で示されている。その他の例では、突然変異は、標的とされる突然変異に加えて観察され、ＰＣＲ増幅の際に導入されたエラーによる可能性が高い。クローンＶ４０は、アミノ酸突然変異Ａ３８Ｖを含有する。親遺伝子ＣＶＳ  Ｖ１８は、突然変異Ｑ３８Ａを含有する。したがって、クローンＶ４０中の突然変異は、野生型ＣＶＳのＱ３８Ｖに対応する。
【０３４３】
【表１７−１】
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【表１７−２】
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【実施例４】
【０３４４】
組合せ突然変異体
この例では、実施例３で同定された突然変異の組合せを含有するＣＶＳ変異体を作製した。さらに、種々のさらなる突然変異体を作製した。
【０３４５】
Ａ．飽和突然変異誘発によって同定された有益な突然変異の組合せ
上記の実施例３に記載されるように同定された有益な突然変異を、オーバーラップＰＣＲ法（Xiong et al., (2004) Nucleic Acids Research 32(12):e98）を使用して、鋳型としてＣＶＳ  Ｖ１９を用いて組み合わせた。表１５は、上記の表１４において同定された位置に突然変異を含有する作製された一連の３８種のオリゴを示す。表１５に列挙されたオリゴは、ユニークな内部ＮｄｅＩ制限部位から始まりユニークなＢｇｌＩＩ制限部位までのＶ１９遺伝子の領域に及ぶ。各オリゴは、８種の重複する配列群のうちの１種に属する。配列群は、以下の表１６に示されている。単一の配列群内の各オリゴは、示されたアミノ酸の野生型コドンまたは突然変異体コドン（単数または複数）のいずれかを提供する。群間の配列重複は、４０〜５０℃の融点を生じるよう設計した。
【０３４６】
ＮｄｅＩおよびＢｇｌＩＩ領域の完全な突然変異誘発されたＤＮＡ断片を得るために、８種の配列群各々に由来する１種または複数のオリゴを、種々のＰＣＲ反応において組み合わせた。各ＰＣＲ反応では、群１および８に由来するオリゴ（単数または複数）を、５０μＬの反応物あたり３０ｐｍｏｌの総濃度で使用した。群２から７のオリゴは、オリゴ群あたり、５０μＬの反応物あたり１．５ｐｍｏｌの総濃度で使用した。最初の変性サイクルは、９５℃で２分とした。「タッチダウンＰＣＲ」熱サイクリングプロトコールを使用し、これでは、４６℃の最初のアニーリング温度を、３８℃の最後のアニーリング温度が達成されるまで、２サイクル毎に２℃低下させた。３８℃のアニーリング温度を用いる２２サイクルを含めた合計３０のＰＣＲサイクルを完了した。各サイクルは、３０秒の変性工程、３０秒のアニーリング工程および２分間の伸長工程からなっていた。ＰＣＲプロトコールは、７分の伸長工程で終了した。完了したＰＣＲ反応生成物を、Ｑｉａ−ｑｕｉｃｋゲル抽出カラム（Ｑｉａｇｅｎ）またはＦｒｅｅｚｅ  ａｎｄ  Ｓｑｕｅｅｚｅカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のいずれかを使用して１．２％アガロースゲルからゲル精製した。浄化したＰＣＲ産物を制限酵素ＮｄｅＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、ＹＥｐ−ＣＶＳ−ＵＶＡのＮｄｅＩおよびＢｇｌＩＩ部位にライゲーションした。ライゲーションを、上記の実施例３．Ｃ．２に記載されるように大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ細胞にエレクトロポレーションした。
【０３４７】
【表１８−１】
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【表１８−２】
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【０３４８】
【表１９】
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【０３４９】
上記の実施例３．Ｃ．２に記載されるマイクロバイアル法を使用して突然変異体をスクリーニングし、Ｖ１９の＞１１０％のバレンセン生産性を有する突然変異体を、振盪フラスコ培養においてさらにスクリーニングした。上記の実施例３．Ｃ．２に記載されるマイクロバイアル法を使用し、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＡＬＸ１１−３０（ｕｒａ３、ｔｒｐ１、ｅｒｇ９ｄｅｆ２５、ＨＭＧ２ｃａｔ／ＴＲＰ１：：ｒＤＮＡ、ｄｐｐ１、ｓｕｅ）株を使用して、種々の突然変異をさらにスクリーニングした。
【０３５０】
以下の表１７は、核酸およびアミノ酸突然変異を含めた同定された突然変異体ならびにＣＶＳ  Ｖ１９遺伝子を含有する形質転換体のバレンセン生成に対する振盪フラスコ培養におけるバレンセン生成を示す。表中に示される突然変異は、上記の実施例３．Ｂに記載される、ＣＶＳ  Ｖ１９中に存在する２９種の突然変異に加えたものである。一部の例では、核酸突然変異はサイレントであるので、その結果、得られたバレンセンシンターゼのアミノ酸配列は、ＣＶＳ  Ｖ１９のものと同一である。サイレント突然変異は、イタリック体で示されている。例えば、ＡＬＸ７−９５細胞では、変異体Ｖ５８は、ＣＶＳ  Ｖ１９のバレンセン生成と比較して９９．９１％のバレンセンを生成する。配列決定の結果、Ｖ１８０およびＶ１８１の部分的な配列データのみが得られた。
【０３５１】
【表２０−１】
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【表２０−２】
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【０３５２】
【表２０−３】
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【０３５３】
Ｂ．さらなるバレンセンシンターゼ突然変異体の作製
次いで、標準的な組換えＤＮＡおよびＰＣＲ法を使用して、表１９に示されるさらなるバレンセンシンターゼ突然変異体を生成した。表に示される突然変異は、上記の実施例３．Ｂに記載されるＣＶＳ  Ｖ１９中に存在する２９種の突然変異に加えたものである。突然変異体Ｖ４６、Ｖ４３およびＶ４１（上記の表１４参照のこと）において同定されたアミノ酸突然変異を、標準的な組換えＤＮＡおよびＰＣＲ法を使用して組み合わせて、Ｖ１８４およびＶ１８５と指定される変異体を生成した。Ｖ１８４およびＶ１８５を作製するために、プライマー２１−７３．３９および７−１０．４（以下の表１８参照のこと）を、鋳型として突然変異体Ｖ４１に由来するプラスミドＤＮＡを用いる単一のＰＣＲ反応において使用した。
【０３５４】
変異体Ｖ７３およびＶ７４は、Ｖ６２およびＶ６６における突然変異の組換えによって作製した。変異体Ｖ７５およびＶ７６は、Ｖ６２およびＶ６７における突然変異の組換えによって作製した。変異体Ｖ７３、Ｖ７４、Ｖ７５およびＶ７６はすべて、以下の例外を入れて、実施例３Ｃに記載されるオーバーラップＰＣＲ技術を使用して作製した。第１の段階では、プライマー７−１０．３および２１−７１．４２を、一反応において使用してＶ６２の部分を増幅し、部分ＰＣＲ（ｓｅｃｔｉｏｎ  ＰＣＲ）においてプライマー２１−７１．４１および７−１０．４を使用して、Ｖ６６またはＶ６７いずれかの部分を増幅した。次いで、プライマー７−１０．３および７−１０．４を使用して、２種の第１段階産物から全長遺伝子を作製した。
【０３５５】
【表２１】
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【０３５６】
上記の実施例３．Ｃ．２に記載されたマイクロバイアル法を使用し、ＡＬＸ７−９５またはＡＬＸ１１−３０のいずれかにおいて突然変異体をスクリーニングし、Ｖ１９の＞１１０％のバレンセン生産性を有する（すなわち、野生型より１０％多いバレンセンが生成された）突然変異体を、振盪フラスコ培養においてさらにスクリーニングした。以下の表１９は、核酸およびアミノ酸突然変異を含めた同定された突然変異体ならびにＣＶＳ  Ｖ１９遺伝子を含有する形質転換体のバレンセン生成に対する振盪フラスコ培養におけるバレンセン生成を示す。表中に示される突然変異は、上記の実施例３．Ｂに記載される、ＣＶＳ  Ｖ１９中に存在する２９種の突然変異に加えたものである。一部の例では、核酸突然変異はサイレントであり、その結果、得られたバレンセンシンターゼのアミノ酸配列は、ＣＶＳ  Ｖ１９のものと同一である。サイレント突然変異は、イタリック体で示されている。Ｖ７５変異体は、生成物分布の改善を有し、その結果、β−エレメンとして測定される副生成物ゲルマクレンＡの生成のおおよそ５０％の低減をもたらすとわかった。
【０３５７】
【表２２】
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【０３５８】
Ｃ．さらなるバレンセンシンターゼ突然変異体の作製
種々の方法を使用して、さらなる追加のバレンセンシンターゼ突然変異体を生成した。突然変異体は、小節ａ−ｅにおいて以下に記載されるように作製した。
【０３５９】
作製された突然変異体のすべてを、上記の実施例３．Ｃ．２に記載したマイクロバイアル法を使用して、ＡＬＸ７−９５においてスクリーニングし、ＣＶＳ  Ｖ１９の＞１１０％のバレンセン生産性（すなわち、ＣＶＳ  Ｖ１９に対してバレンセンの１０％増大）を有する突然変異体を、振盪フラスコ培養においてさらにスクリーニングした。一部の例では、Ｖ１９力価の少なくとも９０％を有していた突然変異体または酵素特異性の増大などのその他の望ましい特徴を有していた突然変異体を、振盪フラスコ培養においてスクリーニングした。同定された突然変異体を配列決定した。以下の表２０〜２４は、核酸およびアミノ酸突然変異を含めた同定された突然変異体ならびにＣＶＳ  Ｖ１９遺伝子を含有する形質転換体のバレンセン生成に対する最初のミクロ培養および振盪フラスコ培養におけるバレンセン生成パーセント（％）を示す。
【０３６０】
示される場合には、表中に示される突然変異は、上記の実施例３．Ｂにおいて記載されたＣＶＳ  Ｖ１９中に存在する２９種の突然変異に加えたものである。一部の例では、核酸突然変異はサイレントであり、その結果、得られたバレンセンシンターゼのアミノ酸配列は、ＣＶＳ  Ｖ１９のものと同一であった。さらに、突然変異体ＣＶＳ  Ｖ１９をコードする核酸（配列番号１２９）は、酵母に対してコドン最適化されている。したがって、サイレント突然変異の一部は、野生型ＣＶＳのものと同一であるコドンをもたらした。例えば、突然変異体Ｖ１８２では、ロイシン２９３は、野生型ＣＶＳコドンＴＴＡによってコードされているが、親ＣＶＳ  Ｖ１９コドンは、ＴＴＧであった。すべてのサイレント突然変異は、イタリック体で示されている。いくつかの突然変異体は、突然変異Ｑ５８Ｋを含有する。親の遺伝子ＣＶＳ  Ｖ１９は、突然変異Ｋ５８Ｑを含有する。したがって、この突然変異は、野生型ＣＶＳと比較して、核酸コドンの変化を有するとしても（野生型ＣＶＳではＡＡＧ、突然変異体ＣＶＳではＡＡＡ）サイレントである。
【０３６１】
ａ．Ｖ１８６、Ｖ７７、Ｖ１８７、Ｖ７８、Ｖ１８８、Ｖ１８９、Ｖ１９０、Ｖ７９、Ｖ１９１、Ｖ１９２、Ｖ１９３、Ｖ１９４およびＶ１９５
ＣＶＳ変異体Ｖ１８６、Ｖ７７、Ｖ１８７、Ｖ７８、Ｖ１８８、Ｖ１８９、Ｖ１９０、Ｖ７９、Ｖ１９１、Ｖ１９２、Ｖ１９３、Ｖ１９４およびＶ１９５を、フォワードオリゴｍｕｔＣＶＳ２−７（配列番号３３７）およびリバースオリゴ７−１０．４（配列番号３３９）を使用して、ＣＶＳ  Ｖ１９遺伝子から単一ＰＣＲ反応によって作製した。ＰＣＲ精製、制限消化、ライゲーション、形質転換および試験は、上記の節Ａに記載したように実施した。突然変異は、上記の実施例３．Ｂにおいて記載したＣＶＳ  Ｖ１９（配列番号４）中に存在する２９種の突然変異に加えたものであった。変異体が、野生型ＣＶＳおよびＣＶＳ  Ｖ１９の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化ならびにＣＶＳ  Ｖ１９に対するバレンセン生成％を含めて、以下の表２０に示されている。
【０３６２】
【表２３−１】
2013544084.tif 000078
【表２３−２】
2013544084.tif 000079
【０３６３】
ｂ．Ｖ１９６、Ｖ１９７、Ｖ１９８、Ｖ２００、Ｖ２０１、Ｖ２０２、Ｖ２０３、Ｖ２０４、Ｖ２０５、Ｖ２０６、Ｖ２０７、Ｖ２１２、Ｖ２１３、Ｖ２１４、Ｖ２１５、Ｖ２１６およびＶ２１７
ＣＶＳ変異体Ｖ１９６、Ｖ１９７、Ｖ１９８、Ｖ２００、Ｖ２０１、Ｖ２０２、Ｖ２０３、Ｖ２０４、Ｖ２０５、Ｖ２０６、Ｖ２０７、Ｖ２１２、Ｖ２１３、Ｖ２１４、Ｖ２１５、Ｖ２１６およびＶ２１７は、Ｌ１０６、Ｒ１３２、Ｍ１５３、Ｈ１５９、Ｑ１８８、Ｉ１８９、Ｐ２０２、Ｉ２１３、Ｈ２１９、Ｉ３９７およびＫ４７４を含めた種々のアミノ酸で突然変異を含有する。これらの突然変異体を、それぞれ、プライマー１１−１５７．７および１１−１５７．８の代わりに、アウタープライマー７−１０．３および７−１０．４（表１８参照のこと）を使用した点を除いて、実施例３Ｃ．１に記載したように、ＣＶＳ  Ｖ１９遺伝子のアミノ末端非触媒ドメインの単一アミノ酸位置の飽和突然変異誘発によって作製した。ＰＣＲ精製、制限消化、ライゲーション、形質転換および試験は、上記の節Ａに記載したように実施した。変異体が、野生型ＣＶＳおよびＣＶＳ  Ｖ１９の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化ならびにＣＶＳ  Ｖ１９に対するバレンセン生成％を含めて、以下の表２１に示されている。突然変異は、変異体Ｖ２０２を除いて、上記の実施例３．Ｂにおいて記載したＣＶＳ  Ｖ１９（配列番号４）中に存在する２９種の突然変異に加えたものであった。以下の表２１に示されるように、野生型ＣＶＳは、残基２１９にヒスチジンを含有し、ＣＶＳ  Ｖ１９は、残基２１９にアスパラギン酸を含有するのに対し、Ｖ２０２は、残基２１９にアラニンを含有する。
【０３６４】
【表２４】
2013544084.tif 000080
【０３６５】
ｃ．Ｖ１９９、Ｖ２０８、Ｖ２０９、Ｖ２１０およびＶ２１１
ＣＶＳ変異体Ｖ１９９、Ｖ２０８、Ｖ２０９、Ｖ２１０およびＶ２１１は、アミノ酸５３から５８に突然変異を含有し、フォワードオリゴ２１−１０８−１（配列番号３４０）およびリバースオリゴ２１−１０８−２（配列番号３４１）（表１８を参照のこと）を使用して、ＣＶＳ  Ｖ１９遺伝子から単一ＰＣＲ反応によって作製した。変異体が、野生型ＣＶＳおよびＣＶＳ  Ｖ１９の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化ならびにＣＶＳ  Ｖ１９に対するバレンセン生成％を含めて、以下の表２２に示されている。Ｖ２０９は、ＰＣＲ増幅の際に導入された、Ｌ１０６の突然変異をさらに含有する。
【０３６６】
【表２５−１】
2013544084.tif 000081
【０３６７】
【表２５−２】
2013544084.tif 000082
【０３６８】
【表２５−３】
2013544084.tif 000083
【表２５−４】
2013544084.tif 000084
【０３６９】
ｄ．Ｖ２２０、Ｖ２２１、Ｖ２２２、Ｖ２２３、Ｖ２２４、Ｖ２２５およびＶ２２６
ＣＶＳ変異体Ｖ２２０、Ｖ２２１、Ｖ２２２、Ｖ２２３、Ｖ２２４およびＶ２２５を、Ｖ７５遺伝子を鋳型として使用して、実施例４．Ｃ．ａにおけるものと同様の、２段階オーバーラップＰＣＲプロトコールによって作製した。Ｖ２２６は、鋳型としてＶ７５を使用して生成した変異体に対する比較として、鋳型としてＶ１９遺伝子を使用した。第１段階ＰＣＲ反応は、アウタープライマー７−１０．４とともの変異原性プライマー２１−１４０．１またはアウタープライマー７−１０．３とともの変異原性プライマー２１−１４０．２のいずれかを使用した（表１８参照のこと）。これらの変異原性プライマーは、Ｖ７５を含めたＣＶＳ  Ｖ１９のアミノ酸２１２〜２２１のコドンまたはその誘導体を同時にランダム化する。第２段階ＰＣＲ反応は、プライマー７−１０．３および７−１０．４を使用した。ＰＣＲ精製、制限消化、ライゲーション、形質転換および試験は、上記の節Ａに記載したように実施した。変異体が、野生型ＣＶＳおよびＣＶＳ  Ｖ１９の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化ならびにＣＶＳ  Ｖ１９に対するバレンセン生成％を含めて、以下の表２３に示されている。Ｖ２２３は、Ｖ７５に見られたＰ２８１Ｓ突然変異を含有せず、Ｖ２２４は、Ａ３１９Ｔのさらなる突然変異を有する。これらの突然変異は、ＰＣＲ増幅の際に導入された。
【０３７０】
【表２６−１】
2013544084.tif 000085
【表２６−２】
2013544084.tif 000086
【０３７１】
【表２６−３】
2013544084.tif 000087
【表２６−４】
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【０３７２】
【表２６−５】
2013544084.tif 000089
【表２６−６】
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【０３７３】
【表２６−７】
2013544084.tif 000091
【０３７４】
ｅ．ＣＶＳ変異体Ｖ２２７
ＣＶＳ変異体Ｖ２２７を、アミノ酸残基Ｆ２０９に突然変異を導入するフォワードおよびリバースプライマーを使用して、Ｖ７５遺伝子から単一のＰＣＲ反応によって作製した。野生型ＣＶＳおよびＣＶＳ  Ｖ１９両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化を含めたＣＶＳ変異体Ｖ２２７ならびにＣＶＳ  Ｖ１９に対するバレンセン生成％が、以下の表２４に示されている。
【０３７５】
【表２７】
2013544084.tif 000092
【実施例５】
【０３７６】
その他のテルペンシンターゼに由来するドメインまたは領域を含有する変異体
この例では、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）から得た５−エピ−アリストロチェンシンターゼ（ＴＥＡＳ、配列番号９４１）、ヒオシアムス・ムチクス（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ  ｍｕｔｉｃｕｓ）に由来するプレムナスピロジエンシンターゼ（ＨＰＳ、配列番号９４２）またはブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）に由来するバレンセンシンターゼ（配列番号３４６）に由来する異種アミノ酸を含有するＣＶＳ変異体を作製した。突然変異体を、以下および小節ａ−ｋに記載したように作製した。
【０３７７】
一般に、ＣＶＳ変異体は、複数のコドン位置に突然変異を同時に導入するプライマーを使用して、上記の実施例３．Ｃ．１．に記載されたようなＰＣＲ法の改変によって作製した。
【０３７８】
オーバーラップＰＣＲを使用して、Ｖ７５、Ｖ１９の特定の表面ループに複数の突然変異またはこれらの変異体のうち後者の誘導体を作製した。突然変異させる各ループについて、一対の相補的変異原性プライマーを合成し、各プライマーは、スワップされるアミノ酸位置の各側で配列同一性の１５〜２０塩基対を含有していた。一部の例では、突然変異誘発の標的とされるループ中にランダムヌクレオチドが存在していた。
【０３７９】
所望のループ変化のための変異原性プライマーを、上流プライマー１１−１５４．３（配列番号９２８）または下流プライマー１１−１５４．４（配列番号９２７）のいずれかを用いるＰＣＲ反応において使用して、各々、所望のコドンで異種バレンセンシンターゼ遺伝子に由来するランダムヌクレオチドまたはコドンのいずれかを含有する２種のＰＣＲ産物を作製した。ＰＣＲ条件は、９６℃で２分間の１サイクル、次いで、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒および７２℃で２分間の２０〜３０サイクルとした。各反応に対して、一段階のＰＣＲのみを実施した。得られたＰＣＲによって作製された遺伝子断片は、各々、外側末端でＹＥｐ−ＣＶＳ−ｕｒａベクターとの、また内側末端で適合するＰＣＲ産物との重複の３０〜２００ヌクレオチドを有していた。
【０３８０】
ＰＣＲ反応物を１％アガロースゲルに流し、設計された断片の大きさを含有するバンドをゲルから切り出した。次いで、Ｑｉａｑｕｉｃｋカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡを溶出した。ＹＥｐ−ＣＶＳ−ｕｒａベクターを、制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｂａＩで消化し、１％アガロースゲルで精製し、約６．４ｋｂの断片を含有するバンドをゲルから切り出した。次いで、ＤＮＡを、Ｑｉａｑｕｉｃｋカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して溶出した。
【０３８１】
およそ２５０ｎｇの他の物質が入っていない、消化されたプラスミドＤＮＡおよび他の物質が入っていないＰＣＲ産物各々の２５０ｎｇを混合し、混合物を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製の酢酸リチウム酵母形質転換キットを使用して、直接、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株Ａｌｘ７−９５に形質転換した。酵母相同組換えによって完全なプラスミドを作製した形質転換体を、ＳＤＥ寒天培地（０．６７％の、アミノ酸を含まないＢａｃｔｏ酵母窒素源基礎培地、２％グルコース、０．１４％の、ウラシル、ロイシン、ヒスチジン、トリプトファンを含まない酵母合成ドロップアウト培地、４０ｍｇ／Ｌエルゴステロール）で、２８〜３０℃で３日間増殖させた後、選択した。
【０３８２】
作製された突然変異体のすべてを、上記の実施例３．Ｃ．２に記載されたマイクロバイアル法を使用してＡＬＸ７−９５においてスクリーニングし、ＣＶＳ  Ｖ１９の＞１１０％のバレンセン生産性（すなわち、ＣＶＳ  Ｖ１９に対してバレンセンの１０％増大）を有する突然変異体を、振盪フラスコ培養においてさらにスクリーニングした。同定された突然変異体を配列決定した。以下の表２６〜３７は、核酸およびアミノ酸突然変異を含めた同定された突然変異体ならびにＣＶＳ  Ｖ１９遺伝子を含有する形質転換体のバレンセン生成に対する、最初のミクロ培養および振盪フラスコ培養におけるバレンセン生成パーセント（％）を示す。
【０３８３】
一部の例では、核酸突然変異はサイレントであり、その結果、得られたバレンセンシンターゼのアミノ酸配列は、ＣＶＳ  Ｖ１９のものと同一であった。さらに、突然変異体ＣＶＳ  Ｖ１９をコードする核酸（配列番号１２９）は、酵母に対してコドン最適化されている。ＣＶＳ  Ｖ１９において見られるものとは異なるサイレント突然変異（表１１参照のこと）は、イタリック体で示されている。いくつかの突然変異体は、突然変異Ｑ５８Ｋを含有する。親遺伝子ＣＶＳ  Ｖ１９は、突然変異Ｋ５８Ｑを含有する。したがって、この突然変異は、野生型ＣＶＳと比較して、核酸コドンの変化を有するとしても（野生型ＣＶＳではＡＡＧ、突然変異体ＣＶＳではＡＡＡ）サイレントである。以下の表では、ダッシュ記号は、欠失または挿入を示す。例えば、Ｌ１７５およびＶ１７６に対応するヌクレオチドは、Ｖ２３２では欠失しており、したがって、得られる変異体は、野生型ＣＶＳよりも２アミノ酸短い。反対に、Ｖ２３９は、残基Ｒ９１、Ａ９２およびＤ９３で３アミノ酸の挿入を含有する。
【０３８４】
【表２８−１】
2013544084.tif 000093
【表２８−２】
2013544084.tif 000094
【０３８５】
ａ．Ｖ２２８、Ｖ２２９、Ｖ２３０およびＶ２３１
ＣＶＳ変異体Ｖ２２８、Ｖ２２９、Ｖ２３０およびＶ２３１では、プライマー７−１０．４および７−１０．３（表２５参照のこと）を用いて、上記のように、ＣＶＳのアミノ酸５３〜５８を、ＴＥＡＳ（配列番号２９５）のアミノ酸５８〜６３によって置換した。ＣＶＳ変異体Ｖ２２９は、標準的な組換えＤＮＡおよびＰＣＲ法を使用して、変異体Ｖ２２８およびＶ７３における突然変異の組換えによって作製した。ＣＶＳ変異体Ｖ２３０およびＶ２３１は、変異体Ｖ２２８およびＶ７５における突然変異の組換えによって作製した。変異体が、野生型ＣＶＳおよびＣＶＳ  Ｖ１９の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化ならびにＣＶＳ  Ｖ１９に対するバレンセン生成％を含めて、以下の表２６〜２７に示されている。
【０３８６】
【表２９】
2013544084.tif 000095
【０３８７】
【表３０−１】
2013544084.tif 000096
【表３０−２】
2013544084.tif 000097
【０３８８】
ｂ．Ｖ２３２、Ｖ２３３、Ｖ２３４、Ｖ２３５、Ｖ２３６、Ｖ２３７およびＶ２３８
ＣＶＳ変異体Ｖ２３２、Ｖ２３３、Ｖ２３４、Ｖ２３５、Ｖ２３６、Ｖ２３７およびＶ２３８では、アミノ酸１７４〜１８４を、アウタープライマー１１−１５４．３および１１−５４．４とともに変異原性プライマー２１−１３４．９および２１−１３４．１０を使用して（表２５参照のこと）、上記の直接酵母組換え法によって、ＨＰＳに由来する同等なアミノ酸（配列番号９４２のアミノ酸１８５〜１９３）によって置換した。ＣＶＳ変異体Ｖ２３２、Ｖ２３３、Ｖ２３４、Ｖ２３５およびＶ２３６は、鋳型としてＶ７５（配列番号１３０）を使用して作製した。ＣＶＳ変異体Ｖ２３７は、Ｖ２３５およびＶ２３６における突然変異の組換えによって作製した。この変異体は、ランダムＰＣＲエラーによって生じたＥ４８４での突然変異をさらに含有していた。Ｖ２３７を、Ａｌｘ７−９５から単離し、配列決定した。並行して、Ｖ２３７を、Ａｌｘ１１−３０における試験のために、その株に形質転換した。Ｖ２３８を、Ａｌｘ１１−３０から再度単離した。変異体が、野生型ＣＶＳおよびＣＶＳ  Ｖ１９の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化ならびにＣＶＳ  Ｖ１９に対するバレンセン生成％を含めて、以下の表２８に示されている。ＨＰＳの対応する配列は、ＣＶＳのものよりも２アミノ酸短いので、これらのＣＶＳ変異体のすべてが、２個のアミノ酸の欠失を含有する。
【０３８９】
【表３１−１】
2013544084.tif 000098
【表３１−２】
2013544084.tif 000099
【０３９０】
ｃ．Ｖ２３９、Ｖ２４０およびＶ２４１
ＣＶＳ変異体Ｖ２３９、Ｖ２４０およびＶ２４１では、上記のような直接酵母組換えによって、アミノ酸５３〜５８を、ＴＥＡＳ（配列番号９４１）のアミノ酸５８〜６３によって置換し、アミノ酸８５〜９９を、ＨＰＳ（配列番号９４２）のアミノ酸９３〜１１０によって置換し、アミノ酸１７４〜１８４を、ＨＰＳ（配列番号９４２）のアミノ酸１８５〜１９３またはＴＥＡＳ（配列番号９４１）の１７７〜１８５によって置換した（表２５参照のこと）。ＨＰＳのアミノ酸１８５〜１９３は、ＴＥＡＳのアミノ酸１７７〜１８５と同一である。これらの突然変異体は、２種のＰＣＲ断片から作製した。第１の断片を作製するために、オリゴ１１−１５４．３および変異原性プライマー２１−１３０．４を用い、Ｖ２２８変異体を鋳型として使用した。第２の断片を作製するために、アウターオリゴ１１−１５４．４および変異原性プライマー２１−１３０．３を用い、Ｖ２３７／Ｖ２３８を鋳型として使用した。
【０３９１】
変異体が、野生型ＣＶＳおよびＣＶＳ  Ｖ１９の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化ならびにＣＶＳ  Ｖ１９に対するバレンセン生成％を含めて、以下の表２９に示されている。アミノ酸８５〜９９および１７４〜１８４を置換するためのＨＰＳループの使用は、それぞれ、３個のアミノ酸残基の付加および２個のアミノ酸残基の欠失をもたらし、結果として、野生型ＣＶＳよりも１個のアミノ酸長いタンパク質が得られる。Ｖ２２８およびＶ２３７／Ｖ２３８に由来する設計された突然変異に加えて、Ｖ２３９は、ＰＣＲエラーの結果であると思われる、Ｌ１１１での突然変異を含有する。同様に、Ｖ２４０もまた、Ｒ１９での突然変異を有する。
【０３９２】
【表３２−１】
2013544084.tif 000100
【表３２−２】
2013544084.tif 000101
【０３９３】
【表３２−３】
2013544084.tif 000102
【表３２−４】
2013544084.tif 000103
【０３９４】
【表３２−５】
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【０３９５】
ｄ．Ｖ２４２
ＣＶＳ変異体Ｖ２４２では、アミノ酸２１２〜２２２を、上記の直接酵母組換えによってＨＰＳのアミノ酸２２１〜２２８によって置換した（表２５参照のこと）。このＣＶＳ変異体は、変異原性プライマー２１−１４１．６を用い、アウタープライマー１１−１５４．３を使用して、変異原性プライマー２１−１４１．５を用い、１１−１５４．４を使用して、鋳型としてのＶ７５から作製した。変異体が、野生型ＣＶＳおよびＣＶＳ  Ｖ１９の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化ならびにＣＶＳ  Ｖ１９に対するバレンセン生成％を含めて、以下の表２８に示されている。変異体が、野生型ＣＶＳおよびＣＶＳ  Ｖ１９の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化ならびにＣＶＳ  Ｖ１９に対するバレンセン生成％を含めて、以下の表３０に示されている。ＨＰＳの対応する配列が、ＣＶＳのものよりも２アミノ酸短いので、この変異体は、２個のアミノ酸欠失を含有する。
【０３９６】
多数のクローンのスクリーニングによって、Ｖ２４２以外のすべてが、Ｖ１９の約７７％の力価を有するのに対し、Ｖ２４２は、Ｖ１９力価の９５％の力価を有することが示された。配列決定によって、突然変異体Ｖ２４２は、配列ＩＹＥＥＥＧＦＫを含有するのに対し、ＨＰＳのアミノ酸２２１〜２２８は、ＩＹＥＥＥＥＦＫであることが示された。この矛盾は、オリゴ合成の際に生じる可能性が最も高かった。
【０３９７】
【表３３】
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【０３９８】
ｅ．Ｖ２４３、Ｖ２４４、Ｖ２４５およびＶ２５５
ＣＶＳ変異体Ｖ２４３、Ｖ２４４、Ｖ２４５およびＶ２５５では、上記のような直接酵母組換えによって、アミノ酸５３〜５８を、ＴＥＡＳ（配列番号９４１）のアミノ酸５８〜６３によって置換し、アミノ酸８５〜９９を、ＨＰＳ（配列番号９４２）のアミノ酸９３〜１１０によって置換し、アミノ酸１７４〜１８４を、ＨＰＳ（配列番号９４２）のアミノ酸１８５〜１９３またはＴＥＡＳ（配列番号２９５）の１７７〜１８５によって置換した（表２７参照のこと）。これらの変異体は、Ｖ７５からの突然変異をさらに含有する。さらに、アミノ酸２１２〜２２１を、１）ＴＥＡＳのアミノ酸２１３〜２２１または２）ブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）バレンセンシンターゼ（配列番号３４６）のアミノ酸２２３〜２３０によって置換した。これらのＣＶＳ変異体は、上記の表２５に示されるプライマーを用い、Ｖ２４０を鋳型として使用して作製した。
【０３９９】
Ｖ２４３およびＶ２４４は、変異原性プライマー２１−１４５．１および２１−１４５．５を、アウターオリゴ１１−１５４．３および１１−１５４．４と一緒に用い、Ｖ２４０を鋳型として使用して作製した（表２５参照のこと）。Ｖ２４５およびＶ２５５  ＣＶＳ変異体は、上記の表２５に示されるような、変異原性プライマー２１−１４５．３および２１−１４５．４を用い、Ｖ２４０を鋳型として使用して作製した。
【０４００】
変異体が、野生型ＣＶＳおよびＣＶＳ  Ｖ１９の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化ならびにＣＶＳ  Ｖ１９に対するバレンセン生成％を含めて、以下の表３１に示されている。Ｖ２４４は、おそらくは、ＰＣＲの際に導入された、Ｖ２４３には見られない突然変異Ｉ３２５Ｔを含有する。各々、ＣＶＳ位置２１２〜２２１にブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）バレンセンシンターゼ配列を有する変異体Ｖ２４５およびＶ２５５は、おそらくは、ＰＣＲの際に生じた単一ヌクレオチド変化によって異なり、これは、Ｖ２５５において予期しないＱ４４８からＬ４４７への突然変異をもたらす。
【０４０１】
【表３４−１】
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【表３４−２】
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【０４０２】
【表３４−３】
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【表３４−４】
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【０４０３】
【表３４−５】
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【表３４−６】
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【０４０４】
【表３４−７】
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【０４０５】
ｆ．Ｖ２４６、Ｖ２４７、Ｖ２４８、Ｖ２４９、Ｖ２５０、Ｖ２５１、Ｖ２５２、Ｖ２５３、Ｖ２５４およびＶ２７２
ＣＶＳ変異体Ｖ２４６、Ｖ２４７、Ｖ２４８、Ｖ２４９、Ｖ２５０、Ｖ２５１、Ｖ２５２、Ｖ２５３、Ｖ２５４およびＶ２７２では、上記のように、アミノ酸５３〜５８を、ＴＥＡＳ（配列番号９４１）のアミノ酸５８〜６３によって置換し、アミノ酸８５〜９９を、ＨＰＳ（配列番号９４２）のアミノ酸９３〜１１０によって置換し、アミノ酸１７４〜１８４を、ＨＰＳ（配列番号９４２）のアミノ酸１８５〜１９３またはＴＥＡＳ（配列番号９４１）の１７７〜１８５によって置換した。さらに、アミノ酸２１２〜２２２を、ランダムアミノ酸によって置換した。
【０４０６】
ＣＶＳ変異体Ｖ２４６、Ｖ２４７、Ｖ２４８、Ｖ２４９、Ｖ２５０、Ｖ２５３およびＶ２５４を、Ｖ２４０およびＶ１９を、上記の表２５に示されるオリゴを用いる２つのＰＣＲ反応の鋳型として使用して、実施例４Ｃ．ｄ．に記載されたように作製した。例えば、Ｖ２４６は、アミノ酸位置２１２〜２２１を改変するために、アウターオリゴ１１−１５４．３および１１−１５４．４を用い、ランダム変異原性オリゴ２１−１４０．１および２１−１４０．２を使用して生成した。１１−１５４．３および２１−１４０．２を用いるＰＣＲ反応は、Ｖ２４０を鋳型として使用したが、第２の反応は、Ｖ１９を鋳型として使用した。ＣＶＳ変異体Ｖ２５１およびＶ２５２は、Ｖ２４１およびＶ１９を２つのＰＣＲ反応の鋳型として使用して、実施例４．Ｃ．ａ．に記載されたように作製した。Ｖ２７２は、Ｖ２４０を両ＰＣＲ反応における鋳型として使用した以外は、実施例４Ｃ．ｄ．におけるように作製した。
【０４０７】
変異体が、野生型ＣＶＳおよびＣＶＳ  Ｖ１９の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化ならびにＣＶＳ  Ｖ１９に対するバレンセン生成％を含めて、以下の表３２に示されている。ＣＶＳ  Ｖ１９のバレンセン力価のおよそ７７％を生成するが、多量のｂ−エレメンをさらに生成するいくつかのさらなる単離物を同定した。
【０４０８】
【表３５−１】
2013544084.tif 000113
【表３５−２】
2013544084.tif 000114
【０４０９】
【表３５−３】
2013544084.tif 000115
【表３５−４】
2013544084.tif 000116
【０４１０】
【表３５−５】
2013544084.tif 000117
【表３５−６】
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【０４１１】
【表３５−７】
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【表３５−８】
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【０４１２】
【表３５−９】
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【表３５−１０】
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【０４１３】
【表３５−１１】
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【表３５−１２】
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【０４１４】
【表３５−１３】
2013544084.tif 000125
【０４１５】
ｇ．Ｖ２５６、Ｖ２５７、Ｖ２５８、Ｖ２５９、Ｖ２６１、Ｖ２６３、Ｖ２６４、Ｖ２６２、Ｖ２６０、Ｖ２６５、Ｖ２６６およびＶ２７３
ＣＶＳ変異体Ｖ２５６、Ｖ２５７、Ｖ２５８、Ｖ２５９、Ｖ２６１、Ｖ２６３、Ｖ２６４、Ｖ２６２、Ｖ２６０、Ｖ２６５、Ｖ２６６およびＶ２７３では、上記のように、アミノ酸５３〜５８を、ＴＥＡＳ（配列番号９４１）のアミノ酸５８〜６３によって置換し、アミノ酸８５〜９９を、ＨＰＳ（配列番号９４２）のアミノ酸９３〜１１０によって置換し、アミノ酸１７４〜１８４を、ＨＰＳ（配列番号９４２）のアミノ酸１８５〜１９３またはＴＥＡＳ（配列番号９４１）の１７７〜１８５によって置換した。Ｖ２４３またはＶ２４４を鋳型として使用して作製した一部の変異体はまた、ＴＥＡＳのアミノ酸２１３〜２２１によって置換されたアミノ酸２１２〜２２１を含有していた。これらの変異体は、Ｖ７５からの突然変異をさらに含有する。さらに、アミノ酸２〜７を、ランダムアミノ酸によって置換した。これらのＣＶＳ変異体は、変異原性プライマーｍｕｔＣＶＳ２−７およびｒｅｖＡＡ２−７ｒｎｄ（表１８参照のこと）を使用する直接酵母組換えによって、Ｖ２４０、Ｖ２４３またはＶ２４４を鋳型として使用して作製した。変異体が、野生型ＣＶＳおよびＣＶＳ  Ｖ１９の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化ならびにＣＶＳ  Ｖ１９に対するバレンセン生成％を含めて、以下の表３３に示されている。
【０４１６】
【表３６−１】
2013544084.tif 000126
【表３６−２】
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【０４１７】
【表３６−３】
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【表３６−４】
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【０４１８】
【表３６−５】
2013544084.tif 000130
【表３６−６】
2013544084.tif 000131
【０４１９】
【表３６−７】
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【表３６−８】
2013544084.tif 000133
【０４２０】
【表３６−９】
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【表３６−１０】
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【０４２１】
【表３６−１１】
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【表３６−１２】
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【０４２２】
【表３６−１３】
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【表３６−１４】
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【０４２３】
【表３６−１５】
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【０４２４】
ｈ．Ｖ２６７、Ｖ２６８、Ｖ２６９、Ｖ２７０およびＶ２７１
ＣＶＳ変異体Ｖ２６７、Ｖ２６８、Ｖ２６９、Ｖ２７０およびＶ２７１では、上記のように、アミノ酸５３〜５８を、ＴＥＡＳ（配列番号９４１）のアミノ酸５８〜６３によって置換し、アミノ酸８５〜９９を、ＨＰＳ（配列番号９４２）のアミノ酸９３〜１１０によって置換し、アミノ酸１７４〜１８４を、ＨＰＳ（配列番号９４２）のアミノ酸１８５〜１９３またはＴＥＡＳ（配列番号９４１）の１７７〜１８５によって置換した。これらの変異体は、Ｌ１０６（Ｖ２６７）またはＦ２０９（Ｖ２６８〜Ｖ２７１）でのランダム突然変異をさらに含有する。ＣＶＳ変異体Ｖ２６７、Ｖ２６８、Ｖ２６９、Ｖ２７０およびＶ２７１は、上記の表２５に示されるプライマーを用い、Ｖ２４０を鋳型として使用して作製した。変異体が、野生型ＣＶＳおよびＣＶＳ  Ｖ１９の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化ならびにＣＶＳ  Ｖ１９に対するバレンセン生成％を含めて、以下の表３４に示されている。
【０４２５】
【表３７−１】
2013544084.tif 000141
【表３７−２】
2013544084.tif 000142
【０４２６】
【表３７−３】
2013544084.tif 000143
【表３７−４】
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【０４２７】
【表３７−５】
2013544084.tif 000145
【表３７−６】
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【０４２８】
【表３７−７】
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【０４２９】
ｉ．Ｖ２７４およびＶ２７７
ＣＶＳ変異体Ｖ２７４およびＶ２７７では、アミノ酸３〜４１を、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎａｆｅｒａ）（配列番号３４６）のアミノ酸３〜５１によって置換し、アミノ酸５３〜５８を、ＴＥＡＳ（配列番号９４１）のアミノ酸５８〜６３によって置換し、アミノ酸８５〜９９をＨＰＳ（配列番号９４２）のアミノ酸９３〜１１０によって置換し、アミノ酸１７４〜１８４をＨＰＳ（配列番号９４２）のアミノ酸１８５〜１９３またはＴＥＡＳ（配列番号９４１）の１７７〜１８５によって置換した。ＣＶＳ変異体Ｖ２７４は、上記の表２５に示されるプライマーを用い、Ｖ２４０を鋳型として使用する直接酵母組換えによって作製した。ＣＶＳ変異体Ｖ２７７は、上記の表２５に示されるプライマーを用い、Ｖ２４５を鋳型として使用する直接酵母組換えによって作製した。変異体が、野生型ＣＶＳおよびＣＶＳ  Ｖ１９の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化ならびにＣＶＳ  Ｖ１９に対するバレンセン生成％を含めて、以下の表３５に示されている。
【０４３０】
【表３８−１】
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【表３８−２】
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【０４３１】
【表３８−３】
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【表３８−４】
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【０４３２】
【表３８−５】
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【表３８−６】
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【０４３３】
ｊ．Ｖ２７５およびＶ２７６
ＣＶＳ変異体Ｖ２７５およびＶ２７６では、上記のように、アミノ酸８５〜９９を、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）（配列番号３４６）のアミノ酸９６〜１１３によって置換した（表２５参照のこと）。ＣＶＳ変異体Ｖ２７５およびＶ２７６は、Ｖ７５を鋳型として使用する直接酵母組換えによって作製した。上記の表２５に示されるオリゴを用い、オリゴ１１−１５４．４を用いる単一のＰＣＲ反応において変異原性オリゴ２１−１４１．７を使用し、オリゴ１１−１５４．３を用いる単一のＰＣＲ反応において変異原性オリゴ２１−１４１．８を使用した。変異体が、野生型ＣＶＳおよびＣＶＳ  Ｖ１９の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化ならびにＣＶＳ  Ｖ１９に対するバレンセン生成％を含めて、以下の表３６に示されている。Ｖ２７５およびＶ２７６は、１つの突然変異、Ｖ２７６におけるＹ３８７→Ｃ３８９で異なる。
【０４３４】
【表３９−１】
2013544084.tif 000154
【表３９−２】
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【０４３５】
【表３９−３】
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【０４３６】
ｋ．Ｖ２７８、Ｖ２７９、Ｖ２８０およびＶ２８１
ＣＶＳ変異体Ｖ２７８、Ｖ２７９、Ｖ２８０およびＶ２８１を、以下の例外を入れて、実施例３．ａに記載されたように、Ｖ２４０およびＶ２４５を鋳型として使用してエラープローンＰＣＲによって作製した。第１に、プライマー１１−１５４．３および１１−１５４．４（表２５参照のこと）を、ＰＣＲ反応において使用した。第２に、実施例５．１におけるような直接酵母組換えによってクローニングを達成した。変異体が、野生型ＣＶＳおよびＣＶＳ  Ｖ１９の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化ならびにＣＶＳ  Ｖ１９に対するバレンセン生成％を含めて、以下の表３７に示されている。
【０４３７】
【表４０−１】
2013544084.tif 000157
【表４０−２】
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【０４３８】
【表４０−３】
2013544084.tif 000159
【表４０−４】
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【０４３９】
【表４０−５】
2013544084.tif 000161
【表４０−６】
2013544084.tif 000162
【実施例６】
【０４４０】
さらなるバレンセンシンターゼ突然変異体の作製およびスクリーニング
なおさらなるバレンセンシンターゼ突然変異体を、種々の方法を使用して生成した。突然変異体を、小節ａ〜ｆにおいて以下に記載されるように作製した。
【０４４１】
上記の実施例３．Ｃ．２において記載したマイクロバイアル法を使用し、ＡＬＸ７−９５において突然変異体をスクリーニングし、ＣＶＳ  Ｖ１９の＞１１０％のバレンセン生産性（すなわち、ＣＶＳ  Ｖ１９に対してバレンセンの１０％増大）を有する突然変異体を、振盪フラスコ培養においてさらにスクリーニングした。以下の表３８〜４０は、設計された配列に基づくアミノ酸変化を示し、突然変異体を配列決定しようと試みたが、成功しなかった。表はまた、ＣＶＳ  Ｖ１９遺伝子を含有する形質転換体のバレンセン生成に対する、最初のミクロ培養および振盪フラスコ培養におけるバレンセン生成パーセント（％）も示す。
【０４４２】
ａ．Ｖ２８２
ＣＶＳ  Ｖ１９（配列番号１２９）を鋳型として使用してＶ２８２を作製した。ＣＶＳ変異体Ｖ２８２では、上記のように、アミノ酸５３〜５８を、ＴＥＡＳ（配列番号９４１）のアミノ酸５８〜６３によって置換し、アミノ酸８５〜９９を、ＨＰＳ（配列番号９４２）のアミノ酸９３〜１１０によって置換し、アミノ酸１７４〜１８４を、ＨＰＳ（配列番号９４２）のアミノ酸１８５〜１９３またはＴＥＡＳ（配列番号９４１）の１７７〜１８５によって置換し、アミノ酸２１２〜２２１を、ランダムアミノ酸によって置換した（表２７参照）。この突然変異体は、実施例５ｆにおいて上記で記載されるように調製した。
【０４４３】
【表４１】
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【０４４４】
ｂ．Ｖ２８３
ＣＶＳ変異体Ｖ２８３を、Ｖ２４１を鋳型として使用し、ＣＶＳ変異体Ｖ２４６について上記の実施例５ｆに記載されたように作製した。ＣＶＳ  Ｖ１９と比較して＞７７％のバレンセンを生成するが、多量のｂ−エレメンをさらに生成するいくつかのさらなる単離物を同定した。
【０４４５】
【表４２】
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【０４４６】
ｃ．Ｖ２８４およびＶ２８５
ＣＶＳ変異体Ｖ２８４およびＶ２８５を、Ｖ２４０を鋳型として使用し、ＣＶＳ変異体Ｖ２４６について実施例５ｆにおいて記載したように作製した。ＣＶＳ  Ｖ１９のバレンセン力価のおよそ７７％超を生成するが、多量のｂ−エレメンをさらに生成するいくつかのさらなる単離体を同定した。
【０４４７】
【表４３】
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【０４４８】
ｄ．アミノ酸２１２〜２２１からランダム化された残基を含有する変異体
ＣＶＳ  Ｖ１９およびＶ７５を鋳型として使用して、アミノ酸２１２〜２２１からランダム化された残基を含有するさらなるＣＶＳ変異体を作製した。これらの突然変異体は、上記の実施例５ｆにおいて先に記載したように作製した。ＣＶＳ  Ｖ１９を鋳型として使用して作製した８種の単離物を、ＣＶＳ  Ｖ１９と比較して＞８０％のバレンセンを生成すると同定した。Ｖ７５を鋳型として使用して作製した１２種の単離物を、ＣＶＳ  Ｖ１９と比較して＞７４％のバレンセンを生成すると同定した。
【０４４９】
ｅ．定方向点突然変異を含有する変異体
上記の表２５に示されるフォワードおよびリバースオリゴを使用して鋳型遺伝子から単一ＰＣＲ反応によって以下に示されるように位置Ｌ３１０、Ｈ３６０またはＱ３７０に点突然変異を含有するさらなるＣＶＳ変異体を作製した。
【０４５０】
点Ｌ３１０Ｈを含有する変異体を作製し、それによって、Ｖ７５およびＶ２４０を、突然変異Ｌ３１０Ｈを有するよう改変した。それらの変異体を、バレンセンの生成についてミクロ培養で試験した。結果は、Ｖ７５＋Ｌ３１０Ｈは、変異体Ｖ１９のバレンセン生成の平均９５．５％であるのに対し、Ｖ２４０＋Ｌ３１０Ｈは、変異体Ｖ１９のバレンセン生成の平均７７．７％であるということを示した。結果は、Ｌ３１０Ｈ突然変異は、Ｖ２４０バックグラウンドにおいてプラスの影響を有さないことを示唆した。
【０４５１】
さらに、Ｖ１９を鋳型として使用して、アミノ酸Ｈ３６０またはＱ３７０で点突然変異を作製し、８種の個々の単離物を、ＣＶＳ  Ｖ１９と比較して６８〜１００％のバレンセンを生成すると同定した。
【０４５２】
ｆ．Ｎ末端にスワップを含有する変異体
ＣＶＳの最Ｎ末端にスワップを含有するさらなるＣＶＳ変異体を、ＣＶＳの残基１〜１５をコードするヌクレオチドを、３種の異種テルペンシンターゼ遺伝子の各々に由来する対応する配列で置換することによって作製した。３種の異種テルペンシンターゼ遺伝子は、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）由来のｔｒ５−エピ−アリストロチェンシンターゼ（ＴＥＡＳ、配列番号９４１）、ヒオシアムス・ムチクス（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ  ｍｕｔｉｃｕｓ）由来のプレムナスピロジエンシンターゼ（ＨＰＳ、配列番号９４２）またはブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）由来のバレンセンシンターゼ（配列番号３４６）とした。ＣＶＳ変異体Ｖ２４０、Ｖ２４３およびＶ２４５を鋳型として使用して、突然変異体を作製した。バレンセンの生成を調べたところ、結果は、突然変異体は、Ｖ１９と比較してバレンセンの生成の減少をもたらすことを示した。
【実施例７】
【０４５３】
ヌートカトン（Ｎｏｏｋａｔｏｎｅ）の生成
実施例２に記載されたように発酵によって生成されたバレンセンを含有するダイズ油を、１００℃および３５０ｍＴｏｒｒでのワイプドフィルム（ｗｉｐｅｄ−ｆｉｌｍ）蒸留を使用して濃縮し、精製して、およそ６８重量％のバレンセンを含有する油を作製した。この物質を、以下に記載される２つの異なる方法によってヌートカトンに変換した。
【０４５４】
Ａ．三酸化クロムを使用するバレンセンのヌートカトンへの酸化
上記のように生成されたバレンセン留出物を、以下のように、三酸化クロムおよびジクロロメタン中のピリジンを使用してヌートカトンに酸化した。５Ｌのジクロロメタン中のピリジン（５８４ｇ、７．４ｍｏｌ、４４当量）の溶液に、三酸化クロム（３６９ｇ、３．６９ｍｏｌ、２２当量）を少しずつ添加した。混合物を１０分間撹拌し、５０グラムのバレンセン留出物（６８％  ｗ／ｗ、０．１６７ｍｏｌ、１当量）を、４分かけて添加し、混合物を２２℃で１８時間撹拌した。酒を容器から排出し、固体を２Ｌのメチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）で２回洗浄した。合わせた有機層を２ＬのＭＴＢＥでさらに希釈し、続いて、１．２５Ｌの５％水酸化ナトリウムで３回、２Ｌの５％塩酸で２回、２Ｌのブラインで１回洗浄した。有機相を２００グラムの無水硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、蒸発によって濃縮すると、３６．８グラムの粗ヌートカトンが得られた（４８％  ｗ／ｗ、０．０８１ｍｏｌ、収率４８％）。
【０４５５】
Ｂ．リン酸シリカ固定化クロム（ＩＩＩ）触媒を使用するバレンセンのヌートカトンへの酸化
リン酸シリカクロム（ＩＩＩ）樹脂（４８．９ｇ、ＰｈｏｓｐｈｏｎｉｃＳ、Ｌｔｄ．）を、冷却器、サーモウェル、オーバーヘッドスターラーおよびスパージ管を備えた、５Ｌの丸底フラスコに入れた。２（２）Ｌのｔ−ブタノールおよびバレンセン留出物（６８％、５００ｇ、１．６７モル、１当量）を添加し、内容物を４５℃に加熱し、不均一な懸濁液を、酸素が溶液中をスパージされるように（約１．５Ｌ／分）攪拌させ、窒素をヘッドスペース上に流した。溶液に、水中、７０％のｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ＴＢＨＰ、３１５ｇ、２．４５モル、１．４７当量）を２時間かけて添加し、その間反応物の温度を６０±５℃に加熱し、維持した。バレンセンの＞９０％が消費されたとガスクロマトグラフィーによって決定されるまで、反応物を攪拌させた。次いで、反応物を室温に冷却し、濾過によってシリカ触媒を除去した。フラスコおよび樹脂を、５００ｍＬのイソプロパノールで洗浄した。合わせた有機溶液（ｔ−ブタノールおよびイソプロパノール）に、１（１）Ｌの脱イオン水を添加し、蒸発によって混合物を減圧下で濃縮すると、コハク色の油が得られた。油を３Ｌのトルエンに溶解し、激しく撹拌しながら、３．１２５Ｌの１５％硫酸で１５分間洗浄した。水層を除去し、１Ｌのトルエンを用いて再抽出した。次いで、合わせたトルエン層を、２．５Ｌの１Ｍ水酸化ナトリウムで３回、５００ｍＬの飽和塩化ナトリウムで２回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水した。濾過後、溶媒を蒸発によって減圧下で除去すると、３７８ｇの粘稠性のコハク色の油（３３重量％ヌートカトン、０．５７モル、収率３４％）が得られた。
【実施例８】
【０４５６】
ＣＶＳ変異体のテルペン生成物分布の分析
この例では、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を使用して、変異体バレンセンシンターゼによって生成されたテルペンの生成物分布を調べた。ガスクロマトグラフィーによる、バレンセンシンターゼを発現する酵母株によって生成された生成物の分析は、酵素がバレンセンを主生成物として生成することを示す。ピーク１（暫定的に、β−セリネンと同定される）、ピーク２（暫定的に、τ−セリネンと同定される）、ピーク３（エレモフィレンとして同定される）、ピーク４（７−エピ−α−セリネンとして同定される）およびピーク５（未同定）と呼ばれる化合物、ならびにβ−エレメンおよびいくつかの微量のさらなる生成物を含めた、いくつかの副生成物も生成された。β−エレメンは、ほぼ間違いなく、Ｃｏｐｅ再配列によって形成される、機構的中間体ゲルマクレンＡの分解生成物である（de Kraker et al. (2001)Plant Physiol. 125:1930-1940）。
【０４５７】
結果は、以下の表４１および４２に示されており、これは、ＧＣピーク面積によって測定される、バレンセン、β−エレメンおよびピーク１から５の量の合計として本明細書において定義される、生成されたテルペンの総量のパーセンテージとしてのテルペン生成物の分布を示す。以下の表４１は、振盪フラスコ培養から生成された変異体ＣＶＳ  Ｖ１９、Ｖ７１、Ｖ７３、Ｖ７５、Ｖ２２９およびＶ２３１（上記の表１９および２７を参照のこと）の生成物の分布を示す。変異体Ｖ７１、Ｖ７３およびＶ７５では、テルペンの総量のパーセンテージとしての生成されたバレンセンの量は、変異体ＣＶＳ  Ｖ１９の６６％と比較して、約７１％であった。これらの変異体において形成されるβ−エレメンの量の対応する低減が観察され、これは、変異体酵素は、ゲルマクレンＡ中間体で停止することよりも、反応を完了に推し進めることにおいてより効率的であることを示唆した。バレンセンシンターゼ変異体から得られた残りの副生成物の分布は、変異体酵素間で類似していた。変異体Ｖ２２９およびＶ２３１では、バレンセンは、再び、変異体ＣＶＳ  Ｖ１９によって生成されたもの（６７．６６％）よりも生成物混合物の大きな割合に相当した（７２．８％）。Ｖ２２９およびＶ２３１を用いた場合には、β−エレメンおよびピーク３両方のパーセンテージの減少が観察された。
【０４５８】
以下の表４２は、３Ｌ発酵培養において増殖させたバレンセンシンターゼ変異体を発現する酵母株の同様の比較を示す。発酵槽培養において、変異体ＣＶＳ  Ｖ１９から得られた生成物分布は、振盪フラスコ培養において見られた生成物分布と同様であるが、同一ではないことが観察された。変異体Ｖ７３およびＶ７５は、総生成物の大きなパーセンテージがバレンセンに相当することにつながる、変更された生成物分布を有していた。これらの各変異体では、観察されたβ−エレメンの量は、変異体ＣＶＳ  Ｖ１９について観察されたものよりも少なく、やはり、酵素は、中間体ゲルマクレンＡで停止することよりも、反応を完了に推し進めることにおいてより効率的であることを示唆した。これらの変異体によって生成されたピーク１から４の量は、ＣＶＳ  Ｖ１９変異体とすべて類似していた。興味深いことに、より多くのピーク５化合物が、変異体ＣＶＳ  Ｖ１９と比較して変異体Ｖ７５によって生成されたが、Ｖ７３によって、より少ないピーク５生成物が生成された。これは、培養条件の変動も、この同定されていない副生成物に関する生成物分布に影響を及ぼす可能性があることを示唆した。
【０４５９】
【表４４】
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【０４６０】
概して、いくつかの変異体バレンセンシンターゼによって生成された生成物の割合は、野生型酵素またはその生成物プロフィールが野生型バレンセンシンターゼと類似している変異体Ｖ１８およびＶ１９によって生成されたものとは異なっていることが観察された。特に、いくつかの変異体によって生成されたバレンセンの割合は、Ｖ１９において観察されたものよりも高かった。これらのデータは、バレンセンシンターゼに突然変異を導入することによって、生成物選択性が変更された変異体が生成され得ることおよびいくつかの変異体が、生成物混合物中に高い割合のバレンセンを生成することを示した。
【０４６１】
【表４５】
2013544084.tif 000167
【実施例９】
【０４６２】
さらなるバレンセンシンターゼ突然変異体
突然変異を複数のコドン位置に同時に導入するプライマーを使用する、上記のものと同様のエラープローンＰＣＲおよびオーバーラップＰＣＲ法を使用して、上記のバレンセンシンターゼをさらなるアミノ酸置換またはスワップをを導入するための鋳型として使用して、さらなるバレンセンシンターゼ突然変異体を生成した。例えば、バレンセンシンターゼＶ１９、Ｖ２４０またはＶ２４５を、表２５に示されるプライマーを使用するＰＣＲ反応（単数または複数）において鋳型として使用して、いくつかのさらなる突然変異体を作製した。作製した突然変異体を、上記のようにバレンセン生成についてスクリーニングした。以下の表は、作製した変異体を、野生型ＣＶＳおよびＣＶＳ  Ｖ１９の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化、ならびにＣＶＳ  Ｖ１９に対するバレンセン生成％を含めて示す。
【０４６３】
ＣＶＳ変異体Ｖ２９３、Ｖ２９９、Ｖ３００、Ｖ３０４、Ｖ３０５、Ｖ３０６、Ｖ３０７およびＶ３０８は、鋳型配列としてＶ２４０から、変異体が、上記のように、ＴＥＡＳ（配列番号９４１）のアミノ酸５８〜６３によって置換されたアミノ酸５３〜５８、ＨＰＳ（配列番号９４２）のアミノ酸９３〜１１０によって置換されたアミノ酸８５〜９９、ＨＰＳ（配列番号９４２）のアミノ酸１８５〜１９３またはＴＥＡＳ（配列番号９４１）の１７７〜１８５によって置換されたアミノ酸１７４〜１８４を有するよう作製した。さらに、変異体はすべて、Ｖ２４０と比較して、Ｍ１Ｔ、Ｓ２Ａ、Ｓ３Ｇ、Ｇ４Ｅ、Ｅ５Ａ、Ｆ７Ｇ、Ａ１１Ｔ、Ｎ２０Ｄ、Ｌ２３Ｓ、Ｙ１５２Ｈ（Ｙ１５２→Ｈ１５５）、Ｅ１６３Ｄ（Ｅ１６３→Ｄ１６６）、Ｋ１７３Ｅ（Ｋ１７３→Ｅ１７６）、Ｍ２１０Ｔ（Ｍ２１０→Ｔ２１１）、Ｃ３６１Ｒ（Ｃ３６１→Ｒ３６２）、Ｑ４４８Ｌ（Ｑ４４８→Ｌ４４９）、Ｃ４６５Ｓ（Ｃ４６５→Ｓ４６６）、Ｋ４６８Ｑ（Ｋ４６８→Ｑ４６９）、Ｋ４９９Ｅ（Ｋ４９９→Ｅ５００）、Ｐ５００Ｌ（Ｐ５００→Ｌ５０１）および／またはＡ５３９Ｖ（Ａ５３９→Ｖ５４０）などの１つまたは複数のその他のアミノ酸置換を含有するよう作製した。
【０４６４】
ＣＶＳ変異体Ｖ２９２は、鋳型配列としてＶ２４５から、上記のように、ＴＥＡＳ（配列番号９４１）のアミノ酸５８〜６３によって置換されたアミノ酸５３〜５８、ＨＰＳ（配列番号９４２）のアミノ酸９３〜１１０によって置換されたアミノ酸８５〜９９、ＨＰＳ（配列番号９４２）のアミノ酸１８５〜１９３またはＴＥＡＳ（配列番号９４１）の１７７〜１８５によって置換されたアミノ酸１７４〜１８４、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ）（配列番号３４６）のアミノ酸２２３〜２３０によって置換されたアミノ酸２１２〜２２１を有するよう作製した。さらに、変異体は、Ｖ２４５と比較して、アミノ酸置換Ｖ４３９Ｌ（Ｖ４３９→Ｌ４３８）を含有するよう作製した
【０４６５】
ＣＶＳ変異体Ｖ３１１およびＶ３１２は、鋳型配列としてＶ１９から作製した。さらに、変異体では、鋳型としてＶ１９を使用し、上記のように、直接酵母組換えによって、ＣＶＳのアミノ酸９０〜９９を、配列番号３４６に示されるブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）のアミノ酸１０１〜１１３によって置換した（表２５参照のこと）。オリゴ１１−１５４．４を用いる単回ＰＣＲ反応において、変異原性オリゴ２１〜１４１．３を使用し、オリゴ１１−１５４．３を用いる、上記の表２５に示されるオリゴを用いる単回ＰＣＲ反応において変異原性オリゴ２１−１４１．４を使用した。Ｖ３１１およびＶ３１２は、２つの突然変異、Ｖ３１２中のＩ８２ＶおよびＬ３９９→Ｓ４０１で異なっている。
【０４６６】
ＣＶＳ変異体Ｖ３１４では、上記のように、直接酵母組換えによって、アミノ酸３〜４１がブドウ（Ｖｉｔｉｓ）（配列番号３４６）のアミノ酸３〜５１によって置換され、アミノ酸５３〜５８がＴＥＡＳ（配列番号９４１）のアミノ酸５８〜６３によって置換され、アミノ酸８５〜９９がブドウ（Ｖｉｔｉｓ）（配列番号３４６）のアミノ酸９６〜１１２によって置換され、アミノ酸１７４〜１８４がＨＰＳ（配列番号９４２）のアミノ酸１８５〜１９３またはＴＥＡＳ（配列番号９４１）の１７７〜１８５によって置換され、アミノ酸２１２〜２２１がブドウ（Ｖｉｔｉｓ）（配列番号３４６）のアミノ酸２２３〜２３０によって置換された（表２５参照のこと）。
【０４６７】
ＣＶＳ変異体Ｖ２９７およびＶ３１３を、それぞれ鋳型としてＶ２４０またはＶ３１４を使用し、アミノ酸１１５〜１４６をブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）（配列番号３４６）のアミノ酸１２８〜１５９によって置換することによって作製した。３種のＰＣＲ断片を、上記のように、直接組換えによって組み合わせた（表２５参照のこと）。第１のＰＣＲ断片は、鋳型としてＶ２４０またはＶ３１４のいずれかを用い、オリゴ１１−１５４．３および変異原性プライマー２１−１４５．３０を使用した。第２のＰＣＲ断片は、鋳型としてブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）（配列番号３４６）を用い、変異原性プライマー２１−１４５．２９および２１−１４５．４０を使用した。第３のＰＣＲ断片は、鋳型としてＶ２４０を用い、オリゴ１１−１５４．４および変異原性オリゴ２１−１４５．３９を使用した。したがって、ＣＶＳ変異体Ｖ３１３については、Ｖ３１４について上に記載したスワップに加えて、Ｖ３１３では、上記のような、直接酵母組換えによって、アミノ酸１１４〜１４６が、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ）（配列番号３４６）のアミノ酸１２８〜１５９によって置換された（表２５参照のこと）。さらに、Ｖ３１４と比較してアミノ酸置換Ｈ１０２Ｙ（Ｈ１０２→Ｙ１１４）を含有するよう変異体を作製した。鋳型配列としてＶ２４０から作製したＣＶＳ変異体Ｖ２９７は、ＴＥＡＳ（配列番号９４１）のアミノ酸５８〜６３によって置換されたアミノ酸５３〜５８、ＨＰＳ（配列番号９４２）のアミノ酸９３〜１１０によって置換されたアミノ酸８５〜９９、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ）（配列番号３４６）のアミノ酸１２８〜１５９によって置換されたアミノ酸１１４〜１４６およびＨＰＳ（配列番号９４２）のアミノ酸１８５〜１９３またはＴＥＡＳ（配列番号９４１）の１７７〜１８５によって置換されたアミノ酸１７４〜１８４を有する。
【０４６８】
Ｖ２６０（Ｖ２５９）、Ｖ２６３およびＶ２７７を鋳型として使用して、アミノ酸１９６、１９７、１９８、２００、３４８または３９９で点突然変異を作製して、ＣＶＳ変異体Ｖ２８７、Ｖ２８８、Ｖ２８９、Ｖ２９０、Ｖ２９４、Ｖ２９５、Ｖ２９６、Ｖ２９８、Ｖ３０１、Ｖ３０２、Ｖ３０３、Ｖ３０９、Ｖ３１０、Ｖ３１５を作製した。設計された突然変異戦略によって作製された得られた同定された突然変異の一部は、鋳型からの相違をもたらさなかったか、サイレント突然変異または野生型配列への復帰をもたらした。
【０４６９】
上記の変異体の各々が、野生型ＣＶＳおよびＣＶＳ  Ｖ１９の両方に対するアミノ酸およびヌクレオチド変化ならびに振盪フラスコ培養において評価されるＣＶＳ  Ｖ１９に対するバレンセン生成％を含めて、以下の表４３に示されている。変異体Ｖ２９９、Ｖ３００、Ｖ３０４、Ｖ３０５、Ｖ３０６、Ｖ３０７、Ｖ３０８のバレンセン生成についてのデータが提供されていないが、これは、これらの変異体を、バレンセン生成のための振盪フラスコではなく、ミクロ培養においてのみ試験したからである。
【０４７０】
【表４６−１】
2013544084.tif 000168
【表４６−２】
2013544084.tif 000169
【０４７１】
【表４６−３】
2013544084.tif 000170
【表４６−４】
2013544084.tif 000171
【０４７２】
【表４６−５】
2013544084.tif 000172
【表４６−６】
2013544084.tif 000173
【０４７３】
【表４６−７】
2013544084.tif 000174
【表４６−８】
2013544084.tif 000175
【０４７４】
【表４６−９】
2013544084.tif 000176
【表４６−１０】
2013544084.tif 000177
【０４７５】
【表４６−１１】
2013544084.tif 000178
【表４６−１２】
2013544084.tif 000179
【０４７６】
【表４６−１３】
2013544084.tif 000180
【表４６−１４】
2013544084.tif 000181
【０４７７】
【表４６−１５】
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【表４６−１６】
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【０４７８】
【表４６−１７】
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【表４６−１８】
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【０４７９】
【表４６−１９】
2013544084.tif 000186
【表４６−２０】
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【０４８０】
【表４６−２１】
2013544084.tif 000188
【表４６−２２】
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【０４８１】
【表４６−２３】
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【表４６−２４】
2013544084.tif 000191
【０４８２】
【表４６−２５】
2013544084.tif 000192
【表４６−２６】
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【０４８３】
【表４６−２７】
2013544084.tif 000194
【表４６−２８】
2013544084.tif 000195
【０４８４】
【表４６−２９】
2013544084.tif 000196
【表４６−３０】
2013544084.tif 000197
【０４８５】
【表４６−３１】
2013544084.tif 000198
【表４６−３２】
2013544084.tif 000199
【０４８６】
【表４６−３３】
2013544084.tif 000200
【表４６−３４】
2013544084.tif 000201
【０４８７】
【表４６−３５】
2013544084.tif 000202
【表４６−３６】
2013544084.tif 000203
【０４８８】
【表４６−３７】
2013544084.tif 000204
【表４６−３８】
2013544084.tif 000205
【０４８９】
【表４６−３９】
2013544084.tif 000206
【表４６−４０】
2013544084.tif 000207
【０４９０】
【表４６−４１】
2013544084.tif 000208
【表４６−４２】
2013544084.tif 000209
【０４９１】
改変は当業者には明白であるので、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ制限されると意図される。
【図１−１】
2013544084.tif 000210
【図１−２】
2013544084.tif 000211
【図１−３】
2013544084.tif 000212
【図１−４】
2013544084.tif 000213
【図２Ａ】
2013544084.tif 000214
【図２Ｂ】
2013544084.tif 000215
【図２Ｃ】
2013544084.tif 000216
【図３】
2013544084.tif 000217
【図４Ａ】
2013544084.tif 000218
【図４Ｂ】
2013544084.tif 000219
【図４Ｃ】
2013544084.tif 000220
【図４Ｄ】
2013544084.tif 000221
【配列表】
2013544084000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年6月25日(2013.6.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドをコードする核酸分子であって、
前記改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、バレンセンシンターゼポリペプチド中にアミノ酸改変を含み、
前記改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号３に示される改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドに対して１００％未満または１００％の同一性を有するアミノ酸の配列を含み、
前記改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対して９５％未満の同一性および７５％超の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含み、
前記改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、同一条件下で、同一宿主細胞において配列番号２に示されるバレンセンシンターゼによってファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）から生成されたバレンセンの量よりも多い量で、ＦＰＰを生成する宿主細胞において、ＦＰＰからのバレンセンの形成を触媒する、核酸分子。
【請求項２】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼが、配列番号２に示されるアミノ酸位置に関するＣＶＳ番号付けによって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、５０、５３、５４、５５、５６、５７、５８、６０、６２、６９、７７、７８、８２、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１８、１２０、１２１、１２２、１２４、１２５、１２７、１２９、１３０、１３２、１３５、１３６、１３８、１３９、１４１、１４２、１４４、１４６、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６２、１６３、１６５、１６６、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２７、２２８、２２９、２３８、２５２、２５７、２６３、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０５、３０６、３０７、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２９、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７５、３７７、３７８、３８０、３８１、３８２、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４２２、４２３、４２４、４２８、４２９、４３４、４３５、４３６、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５１、４５２、４５４、４５７、４６５、４６８、４７３、４７４、４８４、４９２、４９５、４９６、４９９、５００、５０１、５０６、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３６および５３９の中から選択される位置に対応する位置で、バレンセンシンターゼポリペプチド中に少なくとも１つのアミノ酸改変を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号２に示される位置に関するＣＶＳ番号付けによってＭ１Ｔ、Ｓ２Ｒ、Ｓ２Ｋ、Ｓ２Ｅ、Ｓ２Ｑ、Ｓ２Ｐ、Ｓ２Ｔ、Ｓ２Ｌ、Ｓ２Ｈ、Ｓ２Ａ、Ｓ２Ｖ、Ｓ３Ｄ、Ｓ３Ｒ、Ｓ３Ｇ、Ｓ３Ｉ、Ｓ３Ｅ、Ｓ３Ｖ、Ｓ３Ａ、Ｓ３Ｔ、Ｓ３Ｌ、Ｓ３Ｍ、Ｓ３Ｎ、Ｇ４Ｋ、Ｇ４Ｖ、Ｇ４Ｎ、Ｇ４Ｉ、Ｇ４Ｒ、Ｇ４Ｓ、Ｇ４Ｐ、Ｇ４Ａ、Ｇ４Ｅ、Ｇ４Ｆ、Ｇ４Ｃ、Ｇ４Ｔ、Ｇ４Ｌ、Ｇ４Ｑ、Ｅ５Ａ、Ｅ５Ｇ、Ｅ５Ｓ、Ｅ５Ｔ、Ｅ５Ｄ、Ｅ５Ｈ、Ｅ５Ｉ、Ｅ５Ｐ、Ｅ５Ｌ、Ｅ５Ｎ、Ｅ５Ｖ、Ｔ６Ｒ、Ｔ６Ｖ、Ｔ６Ｄ、Ｔ６Ｌ、Ｔ６Ａ、Ｔ６Ｅ、Ｔ６Ｋ、Ｔ６Ｓ、Ｔ６Ｇ、Ｔ６Ｃ、Ｔ６Ｍ、Ｔ６Ｙ、Ｆ７Ｃ、Ｆ７Ａ、Ｆ７Ｑ、Ｆ７Ｋ、Ｆ７Ｓ、Ｆ７Ｇ、Ｆ７Ｔ、Ｆ７Ｌ、Ｆ７Ｒ、Ｆ７Ｐ、Ｆ７Ｎ、Ｔ１０Ｖ、Ａ１１Ｔ、Ｄ１２Ｎ、Ｓ１６Ｎ、Ｌ１７Ｉ、Ｒ１９Ｋ、Ｒ１９Ｐ、Ｒ１９Ｇ、Ｎ２０Ｄ、Ｈ２１Ｑ、Ｌ２３Ｉ、Ｌ２３Ｓ、Ｋ２４Ａ、Ｋ２４Ｑ、Ｋ２４Ｙ、Ｋ２４Ｔ、Ｇ２５Ｙ、Ａ２６Ｔ、Ｓ２７Ｐ、Ｄ２８Ｇ、Ｄ２８Ｅ、Ｆ２９Ｄ、Ｄ３３Ｔ、Ｈ３４Ｒ、Ｔ３５Ａ、Ａ３６Ｃ、Ｔ３７Ｋ、Ｑ３８Ｖ、Ｑ３８Ａ、Ｑ３８Ｎ、Ｑ３８Ｅ、Ｒ４０Ｑ、Ｈ４１Ｉ、Ｒ５０Ｇ、Ｔ５３Ｌ、Ｔ５３Ｒ、Ｄ５４Ａ、Ｄ５４Ｐ、Ｄ５４Ｃ、Ａ５５Ｔ、Ａ５５Ｐ、Ａ５５Ｒ、Ａ５５Ｖ、Ａ５５Ｑ、Ｅ５６Ｇ、Ｅ５６Ｐ、Ｅ５６Ｆ、Ｅ５６Ａ、Ｅ５６Ｔ、Ｅ５６Ｑ、Ｄ５７Ｒ、Ｄ５７Ｐ、Ｄ５７Ｓ、Ｄ５７Ｑ、Ｄ５７Ａ、Ｋ５８Ｑ、Ｋ５８Ｒ、Ｋ５８Ｐ、Ｋ５８Ｅ、Ｋ５８Ａ、Ｖ６０Ｉ、Ｖ６０Ｇ、Ｋ６２Ｒ、Ｖ６９Ｉ、Ｆ７８Ｌ、Ｉ８２Ｖ、Ａ８５Ｍ、Ｉ８６Ｌ、Ｑ８７Ｄ、Ｋ８８Ｑ、Ｋ８８Ａ、Ｋ８８Ｈ、Ｌ８９Ｉ、Ｃ９０Ｙ、Ｐ９１Ｎ、Ｉ９２Ｙ、Ｉ９２Ｎ、Ｉ９２Ｓ、Ｙ９３Ｈ、Ｙ９３Ｆ、Ｙ９３Ｆ、Ｉ９４Ｅ、Ｉ９４Ｈ、Ｄ９５Ａ、Ｓ９６Ｈ、Ｓ９６Ｃ、Ｎ９７Ｄ、Ｎ９７Ｅ、Ｒ９８Ｋ、Ｒ９８Ｙ、Ｒ９８Ｄ、Ａ９９Ｎ、Ａ９９Ｍ、Ｈ１０２Ｙ、Ｌ１０６Ａ、Ｌ１０６Ｓ、Ｌ１０６Ｋ、Ｌ１０６Ｆ、Ｌ１１１Ｓ、Ｑ１１３Ｒ、Ｉ１６６Ｙ、Ｋ１１７Ｔ、Ｖ１２２Ｉ、Ｅ１２４Ｎ、Ｋ１２５Ａ、Ｋ１２５Ｑ、Ｋ１２７Ｔ、Ｄ１２９Ｅ、Ｅ１３０Ｒ、Ｒ１３２Ｇ、Ｓ１３５Ｅ、Ｓ１３６Ａ、Ｎ１３９Ｓ、Ｑ１４２Ｒ、Ｓ１４６Ｇ、Ｙ１５２Ｈ、Ｍ１５３Ｎ、Ｍ１５３Ｇ、Ｈ１５９Ｑ、Ｈ１５９Ｋ、Ｈ１５９Ｒ、Ｅ１６３Ｄ、Ｋ１７３Ｅ、Ｋ１７３Ｑ、Ｋ１７３Ａ、Ｑ１７８Ａ、Ｄ１７９Ｐ、Ｖ１８１Ｌ、Ｔ１８２Ｋ、Ｐ１８３Ｓ、Ｋ１８４Ｒ、Ｋ１８４Ｐ、Ｑ１８８Ｒ、Ｉ１８９Ａ、Ｉ１８９Ｖ、Ｉ１８９Ｐ、Ｔ２００Ｑ、Ｐ２０２Ｓ、Ｆ２０９Ｉ、Ｆ２０９Ｈ、Ｆ２０９Ｅ、Ｆ２０９Ｌ、Ｆ２０９Ｔ、Ｍ２１０Ｔ、Ｍ２１２Ｒ、Ｍ２１２Ｄ、Ｍ２１２Ｎ、Ｍ２１２Ｓ、Ｍ２１２Ａ、Ｍ２１２Ｙ、Ｍ２１２Ｋ、Ｍ２１２Ｆ、Ｍ２１２Ｈ、Ｍ２１２Ｑ、Ｍ２１２Ｉ、Ｍ２１２Ｓ、Ｍ２１２Ｖ、Ｉ２１３Ｙ、Ｉ２１３Ｍ、Ｉ２１３Ａ、Ｉ２１３Ｒ、Ｉ２１３Ｓ、Ｉ２１３Ｌ、Ｉ２１３Ｆ、Ｉ２１３Ｓ、Ｉ２１３Ｐ、Ｉ２１３Ｑ、Ｉ２１３Ｎ、Ｉ２１３Ｋ、Ｉ２１３Ｖ、Ｉ２１３Ｙ、Ｎ２１４Ｄ、Ｎ２１４Ｅ、Ｎ２１４Ｓ、Ｎ２１４Ｌ、Ｎ２１４Ｙ、Ｎ２１４Ｖ、Ｎ２１４Ｐ、Ｎ２１４Ｈ、Ｎ２１４Ｃ、Ｎ２１４Ａ、Ｎ２１４Ｔ、Ｎ２１４Ｒ、Ｎ２１４Ｙ、Ｎ２１４Ｑ、Ｓ２１５Ｈ、Ｓ２１５Ｇ、Ｓ２１５Ｋ、Ｓ２１５Ｒ、Ｓ２１５Ｐ、Ｓ２１５Ａ、Ｓ２１５Ｎ、Ｓ２１５Ｔ、Ｓ２１５Ｌ、Ｓ２１５Ｖ、Ｓ２１５Ｑ、Ｓ２１５Ｄ、Ｔ２１６Ｑ、Ｔ２１６Ｙ、Ｔ２１６Ｅ、Ｔ２１６Ｐ、Ｔ２１６Ｒ、Ｔ２１６Ｃ、Ｔ２１６Ｖ、Ｔ２１６Ｋ、Ｔ２１６Ｄ、Ｔ２１６Ａ、Ｔ２１６Ｓ、Ｔ２１６Ｋ、Ｓ２１７Ｒ、Ｓ２１７Ｋ、Ｓ２１７Ｆ、Ｓ２１７Ｉ、Ｓ２１７Ｔ、Ｓ２１７Ｇ、Ｓ２１７Ｙ、Ｓ２１７Ｎ、Ｓ２１７Ｈ、Ｓ２１７Ｅ、Ｓ２１７Ｆ、Ｓ２１７Ｃ、Ｓ２１７Ｅ、Ｓ２１７Ｄ、Ｄ２１８Ｉ、Ｄ２１８Ｇ、Ｄ２１８Ｖ、Ｄ２１８Ｃ、Ｄ２１８Ｐ、Ｄ２１８Ｍ、Ｄ２１８Ｒ、Ｄ２１８Ｌ、Ｄ２１８Ｓ、Ｄ２１８Ａ、Ｄ２１８Ｙ、Ｄ２１８Ｋ、Ｄ２１８Ｅ、Ｈ２１９Ｄ、Ｈ２１９Ａ、Ｈ２１９Ｌ、Ｈ２１９Ｃ、Ｈ２１９Ｗ、Ｈ２１９Ｒ、Ｈ２１９Ｓ、Ｈ２１９Ｆ、Ｈ２１９Ｅ、Ｈ２１９Ｇ、Ｈ２１９Ｑ、Ｈ２１９Ａ、Ｌ２２０Ｖ、Ｌ２２０Ｓ、Ｌ２２０Ｔ、Ｌ２２０Ｐ、Ｌ２２０Ｍ、Ｌ２２０Ａ、Ｌ２２０Ｈ、Ｌ２２０Ｅ、Ｌ２２０Ｇ、Ｌ２２０Ｄ、Ｌ２２０Ｆ、Ｙ２２１Ｃ、Ｙ２２１Ｖ、Ｙ２２１Ｑ、Ｙ２２１Ｆ、Ｙ２２１Ｓ、Ｙ２２１Ｎ、Ｙ２２１Ｔ、Ｙ２２１Ｐ、Ｙ２２１Ｌ、Ｙ２２１Ｋ、Ｙ２２１Ｗ、Ｙ２２１Ｅ、Ｙ２２１Ｖ、Ｙ２２１Ｈ、Ｎ２２７Ｓ、Ｅ２３８Ｄ、Ｋ２５２Ａ、Ｋ２５２Ｑ、Ｔ２５７Ａ、Ｄ２７４Ｍ、Ｄ２７４Ｎ、Ｄ２７４Ｓ、Ｄ２７４Ｆ、Ｄ２７４Ｇ、Ｄ２７４Ｈ、Ｄ２７４Ｅ、Ｆ２７９Ｓ、Ｆ２７９Ｉ、Ｆ２７９Ｐ、Ｆ２７９Ｄ、Ｆ２７９Ｌ、Ｆ２７９Ｎ、Ｆ２７９Ｍ、Ｆ２７９Ｈ、Ｆ２７９Ｃ、Ｆ２７９Ａ、Ｆ２７９Ｇ、Ｆ２７９Ｗ、Ｅ２８０Ｌ、Ｐ２８１Ｓ、Ｐ２８１Ｈ、Ｐ２８１Ｋ、Ｐ２８１Ａ、Ｐ２８１Ｗ、Ｐ２８１Ｌ、Ｐ２８１Ｙ、Ｑ２８２Ｌ、Ｑ２８２Ｓ、Ｑ２８２Ａ、Ｑ２８２Ｉ、Ｑ２８２Ｒ、Ｑ２８２Ｙ、Ｑ２８２Ｇ、Ｑ２８２Ｗ、Ｑ２８２Ｐ、Ｑ２８２Ｅ、Ｙ２８３Ｆ、Ｙ２８３Ｎ、Ａ２８４Ｔ、Ａ２８４Ｇ、Ａ２８４Ｐ、Ａ２８４Ｖ、Ａ２８４Ｒ、Ａ２８４Ｄ、Ａ２８４Ｅ、Ａ２８４Ｓ、Ａ２８４Ｈ、Ａ２８４Ｋ、Ａ２８４Ｉ、Ａ２８４Ｗ、Ａ２８４Ｍ、Ｑ２９２Ｋ、Ｉ２９９Ｙ、Ｙ３０７Ｈ、Ｌ３１０Ｈ、Ｅ３１１Ｐ、Ｅ３１１Ｔ、Ｌ３１３Ｃ、Ｓ３１４Ａ、Ｓ３１４Ｔ、Ｌ３１５Ｍ、Ｆ３１６Ｌ、Ｔ３１７Ｓ、Ｅ３１８Ｋ、Ａ３１９Ｔ、Ｖ３２０Ｄ、Ｖ３２０Ｇ、Ｖ３２０Ｓ、Ｑ３２１Ａ、Ｗ３２３Ｒ、Ｎ３２４Ｓ、Ｉ３２５Ｔ、Ｅ３２６Ｋ、Ｅ３３３Ｄ、Ｋ３３６Ｒ、Ｌ３３７Ｉ、Ｌ３４３Ｖ、Ａ３４５Ｖ、Ａ３４５Ｔ、Ｎ３４７Ｌ、Ｎ３４７Ｓ、Ｅ３４８Ａ、Ｅ３４８Ｓ、Ｅ３５０Ｋ、Ｇ３５７Ｒ、Ｈ３６０Ｌ、Ｈ３６０Ａ、Ｃ３６１Ｒ、Ｖ３６２Ａ、Ｅ３６７Ｇ、Ｎ３６９Ｉ、Ｑ３７０Ｄ、Ｑ３７０Ｈ、Ｑ３７０Ｇ、Ｋ３７１Ｇ、Ａ３７５Ｄ、Ｓ３７７Ｙ、Ｙ３８７Ｃ、Ｉ３９７Ｖ、Ｌ３９９Ｓ、Ｔ４０５Ｒ、Ｔ４０９Ｇ、Ｎ４１０Ｓ、Ｆ４２４Ｌ、Ｎ４２９Ｓ、Ｎ４２９Ｇ、Ａ４３６Ｓ、Ｖ４３９Ｌ、Ｑ４４８Ｌ、Ｃ４６５Ｓ、Ｋ４６８Ｑ、Ｓ４７３Ｙ、Ｋ４７４Ｔ、Ｅ４８４Ｄ、Ｉ４９２Ｖ、Ｅ４９５Ｇ、Ｋ４９９Ｅ、Ｐ５００Ｌ、Ｔ５０１Ｐ、Ｐ５０６Ｓ、Ｄ５３６ＥおよびＡ５３９Ｖに対応するアミノ酸置換の中から選択されるアミノ酸置換である少なくとも１つの改変を含む、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項４】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、アミノ酸置換である少なくとも１つの改変を含み、少なくとも１つのアミノ酸置換が、配列番号２に示される位置に関するＣＶＳ番号付けによって１、２、３、４、５、６、７、１１、１９、２０、２３、２４、２８、３８、５０、５３、５４、５５、５６、５７、５８、６０、６２、６９、７８、８２、８８、９３、９７、９８、１０２、１０６、１１１、１１３、１２５、１３２、１５２、１５３、１５９、１６３、１７３、１８４、１８８、１８９、２００、２０２、２０９、２１０、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２７、２３８、２５２、２５７、２７４、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２９２、２９７、２９９、３０７、３１０、３１１、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２３、３２４、３２５、３２６、３３３、３３６、３３７、３４３、３４５、３４７、３４８、３５０、３５７、３６０、３６１、３６２、３６７、３６９、３７０、３７１、３７５、３７７、３８７、３９７、３９９、４０５、４０９、４１０、４２４、４２９、４３６、４３９、４４８、４６５、４６８、４７３、４７４、４８４、４９２、４９５、４９９、５００、５０１、５０６、５３６および５３９の中から選択される位置に対応する位置である、請求項１または請求項２に記載の核酸分子。
【請求項５】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号２に示される位置に関するＣＶＳ番号付けによってＭ１Ｔ、Ｓ２Ｒ、Ｓ２Ｋ、Ｓ２Ｅ、Ｓ２Ｑ、Ｓ２Ｐ、Ｓ２Ｔ、Ｓ２Ｌ、Ｓ２Ｈ、Ｓ２Ａ、Ｓ２Ｖ、Ｓ３Ｄ、Ｓ３Ｒ、Ｓ３Ｇ、Ｓ３Ｉ、Ｓ３Ｅ、Ｓ３Ｖ、Ｓ３Ａ、Ｓ３Ｔ、Ｓ３Ｌ、Ｓ３Ｍ、Ｓ３Ｎ、Ｇ４Ｋ、Ｇ４Ｖ、Ｇ４Ｎ、Ｇ４Ｉ、Ｇ４Ｒ、Ｇ４Ｓ、Ｇ４Ｐ、Ｇ４Ａ、Ｇ４Ｅ、Ｇ４Ｆ、Ｇ４Ｃ、Ｇ４Ｔ、Ｇ４Ｌ、Ｅ５Ａ、Ｅ５Ｇ、Ｅ５Ｓ、Ｅ５Ｔ、Ｅ５Ｄ、Ｅ５Ｈ、Ｅ５Ｉ、Ｅ５Ｐ、Ｅ５Ｌ、Ｅ５Ｎ、Ｔ６Ｒ、Ｔ６Ｖ、Ｔ６Ｄ、Ｔ６Ｌ、Ｔ６Ａ、Ｔ６Ｅ、Ｔ６Ｋ、Ｔ６Ｓ、Ｔ６Ｇ、Ｔ６Ｃ、Ｔ６Ｍ、Ｔ６Ｙ、Ｆ７Ｃ、Ｆ７Ａ、Ｆ７Ｑ、Ｆ７Ｋ、Ｆ７Ｓ、Ｆ７Ｇ、Ｆ７Ｔ、Ｆ７Ｌ、Ｆ７Ｒ、Ｆ７Ｐ、Ａ１１Ｔ、Ｒ１９Ｋ、Ｒ１９Ｐ、Ｎ２０Ｄ、Ｌ２３Ｓ、Ｋ２４Ａ、Ｋ２４Ｑ、Ｋ２４Ｙ、Ｄ２８Ｇ、Ｑ３８Ｖ、Ｑ３８Ａ、Ｑ３８Ｎ、Ｒ５０Ｇ、Ｔ５３Ｌ、Ｔ５３Ｒ、Ｄ５４Ａ、Ｄ５４Ｐ、Ｄ５４Ｃ、Ａ５５Ｔ、Ａ５５Ｐ、Ａ５５Ｒ、Ａ５５Ｖ、Ａ５５Ｑ、Ｅ５６Ｇ、Ｅ５６Ｐ、Ｅ５６Ｆ、Ｅ５６Ａ、Ｅ５６Ｔ、Ｅ５６Ｑ、Ｄ５７Ｒ、Ｄ５７Ｐ、Ｄ５７Ｓ、Ｄ５７Ｑ、Ｄ５７Ａ、Ｋ５８Ｑ、Ｋ５８Ｒ、Ｋ５８Ｐ、Ｋ５８Ｅ、Ｋ５８Ａ、Ｖ６０Ｉ、Ｖ６０Ｇ、Ｋ６２Ｒ、Ｖ６９Ｉ、Ｆ７８Ｌ、Ｉ８２Ｖ、Ｋ８８Ｑ、Ｋ８８Ａ、Ｙ９３Ｈ、Ｎ９７Ｄ、Ｒ９８Ｋ、Ｈ１０２Ｙ、Ｌ１０６Ａ、Ｌ１０６Ｓ、Ｌ１０６Ｋ、Ｌ１０６Ｆ、Ｌ１１１Ｓ、Ｑ１１３Ｒ、Ｋ１２５Ａ、Ｋ１２５Ｑ、Ｒ１３２Ｇ、Ｙ１５２Ｈ、Ｍ１５３Ｎ、Ｍ１５３Ｇ、Ｈ１５９Ｑ、Ｈ１５９Ｋ、Ｈ１５９Ｒ、Ｅ１６３Ｄ、Ｋ１７３Ｅ、Ｋ１７３Ｑ、Ｋ１７３Ａ、Ｋ１８４Ｒ、Ｑ１８８Ｒ、Ｉ１８９Ａ、Ｉ１８９Ｖ、Ｉ１８９Ｐ、Ｔ２００Ｑ、Ｐ２０２Ｓ、Ｆ２０９Ｉ、Ｆ２０９Ｈ、Ｆ２０９Ｅ、Ｆ２０９Ｌ、Ｆ２０９Ｔ、Ｍ２１０Ｔ、Ｍ２１２Ｒ、Ｍ２１２Ｄ、Ｍ２１２Ｎ、Ｍ２１２Ｓ、Ｍ２１２Ａ、Ｍ２１２Ｙ、Ｍ２１２Ｋ、Ｍ２１２Ｆ、Ｍ２１２Ｈ、Ｍ２１２Ｑ、Ｉ２１３Ｙ、Ｉ２１３Ｍ、Ｉ２１３Ａ、Ｉ２１３Ｒ、Ｉ２１３Ｓ、Ｉ２１３Ｌ、Ｉ２１３Ｆ、Ｉ２１３Ｓ、Ｉ２１３Ｐ、Ｉ２１３Ｑ、Ｉ２１３Ｎ、Ｉ２１３Ｋ、Ｉ２１３Ｖ、Ｎ２１４Ｄ、Ｎ２１４Ｅ、Ｎ２１４Ｓ、Ｎ２１４Ｌ、Ｎ２１４Ｙ、Ｎ２１４Ｖ、Ｎ２１４Ｐ、Ｎ２１４Ｈ、Ｎ２１４Ｃ、Ｎ２１４Ａ、Ｎ２１４Ｔ、Ｎ２１４Ｒ、Ｓ２１５Ｈ、Ｓ２１５Ｇ、Ｓ２１５Ｋ、Ｓ２１５Ｒ、Ｓ２１５Ｐ、Ｓ２１５Ａ、Ｓ２１５Ｎ、Ｓ２１５Ｔ、Ｓ２１５Ｌ、Ｓ２１５Ｖ、Ｓ２１５Ｑ、Ｔ２１６Ｑ、Ｔ２１６Ｙ、Ｔ２１６Ｅ、Ｔ２１６Ｐ、Ｔ２１６Ｒ、Ｔ２１６Ｃ、Ｔ２１６Ｖ、Ｔ２１６Ｋ、Ｔ２１６Ｄ、Ｔ２１６Ａ、Ｔ２１６Ｓ、Ｓ２１７Ｒ、Ｓ２１７Ｋ、Ｓ２１７Ｆ、Ｓ２１７Ｉ、Ｓ２１７Ｔ、Ｓ２１７Ｇ、Ｓ２１７Ｙ、Ｓ２１７Ｎ、Ｓ２１７Ｈ、Ｓ２１７Ｅ、Ｓ２１７Ｆ、Ｓ２１７Ｃ、Ｄ２１８Ｉ、Ｄ２１８Ｇ、Ｄ２１８Ｖ、Ｄ２１８Ｃ、Ｄ２１８Ｐ、Ｄ２１８Ｍ、Ｄ２１８Ｒ、Ｄ２１８Ｌ、Ｄ２１８Ｓ、Ｄ２１８Ａ、Ｄ２１８Ｙ、Ｄ２１８Ｋ、Ｈ２１９Ｄ、Ｈ２１９Ａ、Ｈ２１９Ｌ、Ｈ２１９Ｃ、Ｈ２１９Ｗ、Ｈ２１９Ｒ、Ｈ２１９Ｓ、Ｈ２１９Ｆ、Ｈ２１９Ｅ、Ｌ２２０Ｖ、Ｌ２２０Ｓ、Ｌ２２０Ｔ、Ｌ２２０Ｐ、Ｌ２２０Ｍ、Ｌ２２０Ａ、Ｌ２２０Ｈ、Ｌ２２０Ｅ、Ｌ２２０Ｇ、Ｌ２２０Ｄ、Ｙ２２１Ｃ、Ｙ２２１Ｖ、Ｙ２２１Ｑ、Ｙ２２１Ｆ、Ｙ２２１Ｓ、Ｙ２２１Ｎ、Ｙ２２１Ｔ、Ｙ２２１Ｐ、Ｙ２２１Ｌ、Ｙ２２１Ｋ、Ｙ２２１Ｗ、Ｙ２２１Ｅ、Ｙ２２１Ｖ、Ｎ２２７Ｓ、Ｅ２３８Ｄ、Ｋ２５２Ａ、Ｋ２５２Ｑ、Ｔ２５７Ａ、Ｄ２７４Ｍ、Ｄ２７４Ｎ、Ｄ２７４Ｓ、Ｄ２７４Ｆ、Ｄ２７４Ｇ、Ｄ２７４Ｈ、Ｄ２７４Ｅ、Ｆ２７９Ｓ、Ｆ２７９Ｉ、Ｆ２７９Ｐ、Ｆ２７９Ｄ、Ｆ２７９Ｌ、Ｆ２７９Ｎ、Ｆ２７９Ｍ、Ｆ２７９Ｈ、Ｆ２７９Ｃ、Ｆ２７９Ａ、Ｆ２７９Ｇ、Ｆ２７９Ｗ、Ｅ２８０Ｌ、Ｐ２８１Ｓ、Ｐ２８１Ｈ、Ｐ２８１Ｋ、Ｐ２８１Ａ、Ｐ２８１Ｗ、Ｐ２８１Ｌ、Ｐ２８１Ｙ、Ｑ２８２Ｌ、Ｑ２８２Ｓ、Ｑ２８２Ａ、Ｑ２８２Ｉ、Ｑ２８２Ｒ、Ｑ２８２Ｙ、Ｑ２８２Ｇ、Ｑ２８２Ｗ、Ｑ２８２Ｐ、Ｑ２８２Ｅ、Ｙ２８３Ｆ、Ｙ２８３Ｎ、Ａ２８４Ｔ、Ａ２８４Ｇ、Ａ２８４Ｐ、Ａ２８４Ｖ、Ａ２８４Ｒ、Ａ２８４Ｄ、Ａ２８４Ｅ、Ａ２８４Ｓ、Ａ２８４Ｈ、Ａ２８４Ｋ、Ａ２８４Ｉ、Ａ２８４Ｗ、Ａ２８４Ｍ、Ｑ２９２Ｋ、Ｉ２９９Ｙ、Ｙ３０７Ｈ、Ｌ３１０Ｈ、Ｅ３１１Ｐ、Ｅ３１１Ｔ、Ｌ３１３Ｃ、Ｓ３１４Ａ、Ｓ３１４Ｔ、Ｌ３１５Ｍ、Ｆ３１６Ｌ、Ｔ３１７Ｓ、Ｅ３１８Ｋ、Ａ３１９Ｔ、Ｖ３２０Ｄ、Ｖ３２０Ｇ、Ｖ３２０Ｓ、Ｑ３２１Ａ、Ｗ３２３Ｒ、Ｎ３２４Ｓ、Ｉ３２５Ｔ、Ｅ３２６Ｋ、Ｅ３３３Ｄ、Ｋ３３６Ｒ、Ｌ３３７Ｉ、Ｌ３４３Ｖ、Ａ３４５Ｖ、Ａ３４５Ｔ、Ｎ３４７Ｌ、Ｎ３４７Ｓ、Ｅ３４８Ａ、Ｅ３４８Ｓ、Ｅ３５０Ｋ、Ｇ３５７Ｒ、Ｈ３６０Ｌ、Ｈ３６０Ａ、Ｃ３６１Ｒ、Ｖ３６２Ａ、Ｅ３６７Ｇ、Ｎ３６９Ｉ、Ｌ３９９Ｓ、Ｑ３７０Ｄ、Ｑ３７０Ｈ、Ｑ３７０Ｇ、Ｋ３７１Ｇ、Ａ３７５Ｄ、Ｓ３７７Ｙ、Ｙ３８７Ｃ、Ｉ３９７Ｖ、Ｔ４０５Ｒ、Ｔ４０９Ｇ、Ｎ４１０Ｓ、Ｆ４２４Ｌ、Ｎ４２９Ｓ、Ｎ４２９Ｇ、Ａ４３６Ｓ、Ｖ４３９Ｌ、Ｑ４４８Ｌ、Ｃ４６５Ｓ、Ｋ４６８Ｑ、Ｓ４７３Ｙ、Ｋ４７４Ｔ、Ｅ４８４Ｄ、Ｉ４９２Ｖ、Ｅ４９５Ｇ、Ｋ４９９Ｅ、Ｐ５００Ｌ、Ｔ５０１Ｐ、Ｐ５０６Ｓ、Ｄ５３６ＥおよびＡ５３９Ｖに対応するアミノ酸置換の中から選択されるアミノ酸置換である少なくとも１つの改変を含む、請求項１から４のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項６】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼが、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対する番号付けを用いて６０、９７、２０９、２１２、２１４、２２１、２３８、２９２、３３３、３４５、３６９、４０５、４２９、４７３および／または５３６の中から選択される位置に対応する位置でアミノ酸置換を含む、請求項１から５のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項７】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号２に示される位置に関するＣＶＳ番号付けによってＶ６０Ｉ、Ｖ６０Ｇ、Ｎ９７Ｄ、Ｆ２０９Ｉ、Ｆ２０９Ｈ、Ｆ２０９Ｅ、Ｆ２０９Ｌ、Ｆ２０９Ｔ、Ｍ２１２Ｒ、Ｍ２１２Ｄ、Ｍ２１２Ｎ、Ｍ２１２Ｓ、Ｍ２１２Ａ、Ｍ２１２Ｙ、Ｍ２１２Ｋ、Ｍ２１２Ｆ、Ｍ２１２Ｈ、Ｍ２１２Ｑ、Ｎ２１４Ｄ、Ｎ２１４Ｅ、Ｎ２１４Ｓ、Ｎ２１４Ｌ、Ｎ２１４Ｙ、Ｎ２１４Ｖ、Ｎ２１４Ｐ、Ｎ２１４Ｈ、Ｎ２１４Ｃ、Ｎ２１４Ａ、Ｎ２１４Ｔ、Ｎ２１４Ｒ、Ｙ２２１Ｃ、Ｙ２２１Ｖ、Ｙ２２１Ｑ、Ｙ２２１Ｆ、Ｙ２２１Ｓ、Ｙ２２１Ｎ、Ｙ２２１Ｔ、Ｙ２２１Ｐ、Ｙ２２１Ｌ、Ｙ２２１Ｋ、Ｙ２２１Ｗ、Ｙ２２１Ｅ、Ｙ２２１Ｖ、Ｅ２３８Ｄ、Ｑ２９２Ｋ、Ｅ３３３Ｄ、Ａ３４５Ｖ、Ａ３４５Ｔ、Ｎ３６９Ｉ、Ｔ４０５Ｒ、Ｎ４２９Ｓ、Ｎ４２９Ｇ、Ｓ４７３Ｙ、および／またはＤ５３６Ｅの中から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項８】
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドをコードする核酸分子であって、
前記改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対する番号付けを用いて６０、９７、２０９、２１２、２１４、２２１、２３８、２９２、３３３、３４５、３６９、４０５、４２９、４７３および／または５３６の中から選択される位置に対応する位置でアミノ酸置換を含み、
前記改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号２８９〜２９１、３４６、３４７、７５２、８８２、８８３または８８６のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含有せず、
前記改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼと比較してアミノ酸改変を含み、それによって、前記改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼポリペプチドに対して、１００％未満の同一性かつ７５％超の同一性を有するアミノ酸の配列を含み、かつ
前記改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、同一条件下で、同一宿主細胞において配列番号２に示されるバレンセンシンターゼによってファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）から生成されたバレンセンの量よりも多い量で、ＦＰＰを生成する宿主細胞においてＦＰＰからバレンセンを生成する、核酸分子。
【請求項９】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号２に示される位置に関するＣＶＳ番号付けによってＶ６０Ｉ、Ｖ６０Ｇ、Ｎ９７Ｄ、Ｆ２０９Ｉ、Ｆ２０９Ｈ、Ｆ２０９Ｅ、Ｆ２０９Ｌ、Ｆ２０９Ｔ、Ｍ２１２Ｒ、Ｍ２１２Ｄ、Ｍ２１２Ｎ、Ｍ２１２Ｓ、Ｍ２１２Ａ、Ｍ２１２Ｙ、Ｍ２１２Ｋ、Ｍ２１２Ｆ、Ｍ２１２Ｈ、Ｍ２１２Ｑ、Ｎ２１４Ｄ、Ｎ２１４Ｅ、Ｎ２１４Ｓ、Ｎ２１４Ｌ、Ｎ２１４Ｙ、Ｎ２１４Ｖ、Ｎ２１４Ｐ、Ｎ２１４Ｈ、Ｎ２１４Ｃ、Ｎ２１４Ａ、Ｎ２１４Ｔ、Ｎ２１４Ｒ、Ｙ２２１Ｃ、Ｙ２２１Ｖ、Ｙ２２１Ｑ、Ｙ２２１Ｆ、Ｙ２２１Ｓ、Ｙ２２１Ｎ、Ｙ２２１Ｔ、Ｙ２２１Ｐ、Ｙ２２１Ｌ、Ｙ２２１Ｋ、Ｙ２２１Ｗ、Ｙ２２１Ｅ、Ｙ２２１Ｖ、Ｅ２３８Ｄ、Ｑ２９２Ｋ、Ｅ３３３Ｄ、Ａ３４５Ｖ、Ａ３４５Ｔ、Ｎ３６９Ｉ、Ｔ４０５Ｒ、Ｎ４２９Ｓ、Ｎ４２９Ｇ、Ｓ４７３Ｙ、および／またはＤ５３６Ｅの中から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１０】
改変されたバレンセンシンターゼが、配列番号２に示される位置に対する番号付けを用いる柑橘類バレンセンシンターゼ（ＣＶＳ）番号付けによってＮ２１４Ｄ／Ｓ４７３Ｙ；Ｔ４０５Ｒ；Ａ３４５Ｖ／Ｄ５３６Ｅ；Ｙ２２１Ｃ；Ｅ２３８Ｄ；Ｆ２０９Ｉ；Ｎ９７Ｄ；Ｅ３３３Ｄ／Ｎ３６９Ｉ；Ｎ２１４Ｄ／Ｔ４０５Ｒ；Ｎ２１４Ｄ／Ａ３４５Ｖ／Ｔ４０５Ｒ／Ｄ５３６Ｅ；Ｒ９８Ｋ／Ｎ２１４Ｄ／Ｎ２２７Ｓ／Ｔ４０５Ｒ；Ｖ６０Ｉ／Ｎ２１４Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｔ４０５Ｒ；Ｎ２１４Ｄ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｓ；Ｎ２１４Ｄ／Ｑ２９２Ｋ／Ｔ４０５Ｒ；Ｖ６０Ｇ／Ｎ２１４Ｄ／Ｔ４０５Ｒ；Ｖ６０Ｉ／Ｎ２１４Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｓ；Ｖ６０Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ａ３４５Ｔ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇに対応する置換の中から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項８または請求項９に記載の核酸分子。
【請求項１１】
改変されたバレンセンシンターゼによってＦＰＰから生成されたバレンセンの量が、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼによってＦＰＰから生成されたバレンセンの量よりも、１０％から５００％多い、または
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドによって生成されたバレンセンの量が、酵母細胞培養培地中、０．１ｇ／Ｌから５．０ｇ／Ｌである、請求項１から１０のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項１２】
改変されたバレンセンシンターゼが、各々、配列番号２に示される位置に対する番号付けを用いて、
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｖ３２０Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３２６Ｋ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｒ５０Ｇ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｖ３２０Ｇ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１５Ｍ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｖ３２０Ｇ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｇ３５７Ｒ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｅ３６７Ｇ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｑ３７０Ｄ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｉ２９９Ｙ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｈ３６０Ｌ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｔ３１７Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｖ３２０Ｄ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ｖ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｔ４０９Ｇ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｅ４９５Ｇ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｐ２８１Ｓ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ｌ３３７Ｉ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ａ３７５Ｄ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ｋ３３６Ｒ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｅ３１１Ｐ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｑ３７０Ｈ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ｌ３４３Ｖ／Ａ３４５Ｔ／Ｈ３６０Ａ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２８２Ｓ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｋ３７１Ｇ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３４７Ｌ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｅ３１１Ｔ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２８２Ｌ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｓ３１４Ｔ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｑ３７０Ｇ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１０Ｈ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｖ３６２Ａ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｆ７８Ｌ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１３Ｃ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｐ２８１Ｓ／Ｑ２９２Ｋ／Ｉ２９９Ｙ／Ｌ３１０Ｈ／Ｅ３１１Ｐ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｐ２８１Ｓ／Ｑ２８２Ｌ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１０Ｈ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｐ２８１Ｓ／Ｑ２８２Ｌ／Ｑ２９２Ｋ／Ｉ２９９Ｙ／Ｅ３１１Ｐ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｐ２８１Ｓ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１３Ｃ／Ｓ３１４Ｔ／Ｌ３１５Ｍ／Ｔ３１７Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｐ２８１Ｓ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ｋ３３６Ｒ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３４７Ｌ／Ｇ３５７Ｒ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１０Ｈ／Ｅ３１１Ｔ／Ｌ３１３Ｃ／Ｓ３１４Ｔ／Ｌ３１５Ｍ／Ｔ３１７Ｓ／Ｖ３２０Ｇ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｐ２８１Ｓ／Ｑ２９２Ｋ／Ｔ３１７Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ｋ３３６Ｒ／Ｌ３３７Ｉ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３４７Ｌ／Ｇ３５７Ｒ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
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Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｐ２８１Ｓ／Ｑ２９２Ｋ／Ｔ３１７Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ｋ３３６Ｒ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３４７Ｌ／Ｇ３５７Ｒ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
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Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｌ１０６Ａ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｌ１０６Ｓ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｌ１０６Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｐ／Ｅ５６Ｐ／Ｄ５７Ｐ／Ｋ５８Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｍ１５３Ｎ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｋ４７４Ｔ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｉ２１３Ｓ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ａ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｑ１８８Ｒ／Ｉ１８９Ｖ／Ｐ２０２Ｓ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｍ１５３Ｎ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｋ４７４Ｔ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｈ１５９Ｒ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｈ１５９Ｋ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｉ１８９Ｐ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ｐ／Ａ５５Ｒ／Ｅ５６Ｆ／Ｄ５７Ｓ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｖ／Ｅ５６Ａ／Ｄ５７Ｑ／Ｋ５８Ｐ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｌ１０６Ｆ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｒ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｑ／Ｅ５６Ｔ／Ｄ５７Ａ／Ｋ５８Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｒ／Ｄ５４Ｃ／Ａ５５Ｖ／Ｅ５６Ｑ／Ｄ５７Ｐ／Ｋ５８Ｅ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｒ１３２Ｇ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｈ１５９Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｍ１５３Ｇ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｉ３９７Ｖ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｉ１８９Ａ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１０Ｈ／Ｅ３１１Ｐ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｎ／Ｉ２１３Ｙ／Ｎ２１４Ｌ／Ｓ２１５Ｒ／Ｔ２１６Ｒ／Ｓ２１７Ｉ／Ｄ２１８Ｐ／Ｈ２１９Ａ／Ｌ２２０Ｄ／Ｙ２２１Ｓ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｐ２８１Ｓ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１３Ｃ／Ｓ３１４Ｔ／Ｌ３１５Ｍ／Ｔ３１７Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ｋ３３６Ｒ／Ｌ３３７Ｉ／Ａ３４５Ｔ／Ｇ３５７Ｒ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｑ１１３Ｒ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｄ／Ｉ２１３Ｙ／Ｎ２１４Ｅ／Ｓ２１５Ｈ／Ｔ２１６Ｑ／Ｄ２１８Ｉ／Ｈ２１９Ｌ／Ｌ２２０Ｖ／Ｙ２２１Ｑ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｐ２８１Ｓ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１３Ｃ／Ｓ３１４Ｔ／Ｌ３１５Ｍ／Ｔ３１７Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ｋ３３６Ｒ／Ｌ３３７Ｉ／Ａ３４５Ｔ／Ｇ３５７Ｒ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｓ／Ｉ２１３Ｌ／Ｎ２１４Ｅ／Ｓ２１５Ｐ／Ｔ２１６Ｐ／Ｓ２１７Ｆ／Ｄ２１８Ｍ／Ｌ２２０Ｐ／Ｙ２２１Ｃ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１３Ｃ／Ｓ３１４Ｔ／Ｌ３１５Ｍ／Ｔ３１７Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ｋ３３６Ｒ／Ｌ３３７Ｉ／Ａ３４５Ｔ／Ｇ３５７Ｒ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ａ／Ｎ２１４Ｙ／Ｓ２１５Ａ／Ｔ２１６Ｒ／Ｓ２１７Ｔ／Ｄ２１８Ｇ／Ｈ２１９Ｒ／Ｌ２２０Ｍ／Ｙ２２１Ｎ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１３Ｃ／Ｓ３１４Ｔ／Ｌ３１５Ｍ／Ｔ３１７Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ｋ３３６Ｒ／Ｌ３３７Ｉ／Ａ３４５Ｔ／Ｇ３５７Ｒ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｎ／Ｉ２１３Ｍ／Ｎ２１４Ｓ／Ｔ２１６Ｙ／Ｓ２１７Ｒ／Ｄ２１８Ｇ／Ｈ２１９Ｃ／Ｌ２２０Ｓ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｐ２８１Ｓ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１３Ｃ／Ｓ３１４Ｔ／Ｌ３１５Ｍ／Ｔ３１７Ｓ／Ａ３１９Ｔ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ｋ３３６Ｒ／Ｌ３３７Ｉ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｄ／Ｉ２１３Ａ／Ｓ２１５Ｇ／Ｔ２１６Ｅ／Ｓ２１７Ｋ／Ｄ２１８Ｖ／Ｈ２１９Ｌ／Ｌ２２０Ｓ／Ｙ２２１Ｆ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｐ２８１Ｓ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１３Ｃ／Ｓ３１４Ｔ／Ｌ３１５Ｍ／Ｔ３１７Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ｋ３３６Ｒ／Ｌ３３７Ｉ／Ａ３４５Ｔ／Ｇ３５７Ｒ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｓ／Ｉ２１３Ｒ／Ｎ２１４Ｓ／Ｓ２１５Ｋ／Ｔ２１６Ｐ／Ｓ２１７Ｆ／Ｄ２１８Ｃ／Ｈ２１９Ｗ／Ｌ２２０Ｔ／Ｙ２２１Ｓ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；および
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｈ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｐ２８１Ｓ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１３Ｃ／Ｓ３１４Ｔ／Ｌ３１５Ｍ／Ｔ３１７Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ｋ３３６Ｒ／Ｌ３３７Ｉ／Ａ３４５Ｔ／Ｇ３５７Ｒ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ
に対応する置換の中から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項１から１１のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項１３】
核酸分子が、配列番号１２８〜２０２、２０４〜２８８、６９３〜７０１、７０４〜７１２、７１６〜７２２、７５４〜７７５および８００のいずれかに示される核酸の配列；または配列番号１２８〜２０２、２０４〜２８８、６９３〜７０１、７０４〜７１２、７１６〜７２２、７５４〜７７５および８００のいずれかに示される核酸の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸の配列；ならびにそれらの縮重配列を含み、あるいは、
核酸分子にコードされる改変されたバレンセンシンターゼが、配列番号３〜６６、６８〜１２７、７２３〜７３１、７３４〜７４２、７４６〜７５１、８１０〜８３２および８５７のいずれかに示されるアミノ酸の配列、または配列番号３〜６６、６８〜１２７、７２３〜７３１、７３４〜７４２、７４６〜７５１、８１０〜８３２および８５７のいずれかに示されるアミノ酸の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む、請求項１から１２のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項１４】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、１種または複数のテルペンシンターゼに由来する１種または複数の異種ドメインまたはその一部を含み、前記ドメインが、不定形ループ１、αヘリックス１、不定形ループ２、αヘリックス２、不定形ループ３、αヘリックス３、不定形ループ４、αヘリックス４、不定形ループ５、αヘリックス５、不定形ループ６、αヘリックス６、不定形ループ７、αヘリックス７、不定形ループ８、αヘリックス８、不定形ループ９、αヘリックスＡ、Ａ−Ｃループ、αヘリックスＣ、不定形ループ１１、αヘリックスＤ、不定形ループ１２、αヘリックスＤ１、不定形ループ１３、αヘリックスＤ２、不定形ループ１４、αヘリックスＥ、不定形ループ１５、αヘリックスＦ、不定形ループ１６、αヘリックスＧ１、不定形ループ１７、αヘリックスＧ２、不定形ループ１８、αヘリックスＨ１、不定形ループ１９、αヘリックスＨ２、不定形ループ２０、αヘリックスＨ３、不定形ループ２１、αヘリックスａ−１、不定形ループ２２、αヘリックスＩ、不定形ループ２３、αヘリックスＪ、Ｊ−Ｋループ、αヘリックスＫ、および／または不定形ループ２５の中から選択される、請求項１から１３のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項１５】
異種ドメインが、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）バレンセンシンターゼ、タバコエピアリストロチェンシンターゼ（ＴＥＡＳ）およびヒオシアムス・ムチクス（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ  ｍｕｔｉｃｕｓ）プレムナスピロジエンシンターゼ（ＨＰＳ）の中から選択されるテルペンシンターゼに由来する、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項１６】
改変されたバレンセンシンターゼが、
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｔ／Ｅ５６Ｇ／Ｄ５７Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｑ２９２Ｋ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｔ／Ｅ５６Ｇ／Ｄ５７Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｐ２８１Ｓ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１３Ｃ／Ｓ３１４Ｔ／Ｌ３１５Ｍ／Ｔ３１７Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ｋ３３６Ｒ／Ｌ３３７Ｉ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３４７Ｌ／Ｇ３５７Ｒ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｔ／Ｅ５６Ｇ／Ｄ５７Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｐ２８１Ｓ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１３Ｃ／Ｓ３１４Ｔ／Ｌ３１５Ｍ／Ｔ３１７Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ｋ３３６Ｒ／Ｌ３３７Ｉ／Ａ３４５Ｔ／Ｇ３５７Ｒ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／
Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１７６／Ｄ１７９→Ｐ１７７／Ｖ１８１→Ｌ１７９／
Ｔ１８２→Ｋ１８０／Ｐ１８３→Ｓ１８１／Ｋ１８４→Ｐ１８２／Ｆ２０９→Ｉ２０７／Ｍ２１２→Ｒ２１０／Ｎ２１４→Ｄ２１２／Ｈ２１９→Ｄ２１７／Ｙ２２１→Ｖ２１９／Ｅ２３８→Ｄ２３６／Ｋ２５２→Ｑ２５０／Ｐ２８１→Ｓ２７９／Ｑ２９２→Ｋ２９０／Ｌ３１３→Ｃ３１１／Ｓ３１４→Ｔ３１２／Ｌ３１５→Ｍ３１３／Ｔ３１７→Ｓ３１５／Ｑ３２１→Ａ３１９／Ｅ３３３→Ｄ３３１／Ｋ３３６→Ｒ３３４／Ｌ３３７→Ｉ３３５／Ａ３４５→Ｔ３４３／Ｇ３５７→Ｒ３５５／Ｎ３６９→Ｉ３６７／Ｓ３７７→Ｙ３７５／Ｔ４０５→Ｒ４０３／Ｎ４２９→Ｇ４２７／Ａ４３６→Ｓ４３４／Ｔ５０１→Ｐ４９９／Ｄ５３６→Ｅ５３４；
Ｓ２Ｒ／Ｓ３Ｄ／Ｇ４Ｋ／Ｅ５Ｇ／Ｆ７Ｃ／Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１７６／Ｄ１７９→Ｐ１７７／
Ｖ１８１→Ｌ１７９／Ｔ１８２→Ｋ１８０／Ｐ１８３→Ｓ１８１／Ｋ１８４→Ｐ１８２／Ｆ２０９→Ｉ２０７／Ｍ２１２→Ｒ２１０／Ｎ２１４→Ｄ２１２／Ｈ２１９→Ｄ２１７／Ｙ２２１→Ｖ２１９／Ｅ２３８→Ｄ２３６／Ｋ２５２→Ｑ２５０／Ｐ２８１→Ｓ２７９／Ｑ２９２→Ｋ２９０／Ｌ３１３→Ｃ３１１／Ｓ３１４→Ｔ３１２／Ｌ３１５→Ｍ３１３／Ｔ３１７→Ｓ３１５／Ｑ３２１→Ａ３１９／Ｅ３３３→Ｄ３３１／Ｋ３３６→Ｒ３３４／Ｌ３３７→Ｉ３３５／Ａ３４５→Ｔ３４３／Ｇ３５７→Ｒ３５５／Ｎ３６９→Ｉ３６７／Ｓ３７７→Ｙ３７５／Ｔ４０５→Ｒ４０３／Ｎ４２９→Ｇ４２７／Ａ４３６→Ｓ４３４／Ｅ４８４→Ｄ４８２／Ｔ５０１→Ｐ４９９／Ｄ５３６→Ｅ５３４；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｔ／Ｅ５６Ｇ／Ｄ５７Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ａ８５Ｍ／Ｉ８６Ｌ／Ｑ８７Ｄ／Ｋ８８Ｈ／Ｌ８９Ｉ／Ｃ９０Ｙ／−−−→Ｒ９１／−−−→Ａ９２／−−−→Ｄ９３／Ｉ９２→Ｙ９５／Ｙ９３→Ｆ９６／Ｉ９４→Ｅ９７／
Ｄ９５→Ａ９８／Ｓ９６→Ｈ９９／Ｎ９７→Ｅ１００／Ｒ９８→Ｙ１０１／Ａ９９→Ｎ１０２／Ｌ１１１→Ｓ１１４／Ｋ１２５→Ｑ１２８／Ｋ１７３→Ｑ１７６／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１７９／Ｄ１７９→Ｐ１８０／
Ｖ１８１→Ｌ１８２／Ｔ１８２→Ｋ１８３／Ｐ１８３→Ｓ１８４／Ｋ１８４→Ｐ１８５／Ｆ２０９→Ｉ２１０／Ｍ２１２→Ｒ２１３／Ｎ２１４→Ｄ２１５／Ｈ２１９→Ｄ２２０／Ｙ２２１→Ｖ２２２／Ｅ２３８→Ｄ２３９／Ｋ２５２→Ｑ２５３／Ｐ２８１→Ｓ２８２／Ｑ２９２→Ｋ２９３／Ｌ３１３→Ｃ３１４／Ｓ３１４→Ｔ３１５／Ｌ３１５→Ｍ３１６／Ｔ３１７→Ｓ３１８／Ｑ３２１→Ａ３２２／Ｅ３３３→Ｄ３３４／Ｋ３３６→Ｒ３３７／Ｌ３３７→Ｉ３３８／Ａ３４５→Ｔ３４６／Ｇ３５７→Ｒ３５８／Ｎ３６９→Ｉ３７０／Ｓ３７７→Ｙ３７８／Ｔ４０５→Ｒ４０６／Ｎ４２９→Ｇ４３０／Ａ４３６→Ｓ４３７／Ｅ４８４→Ｄ４８５／Ｔ５０１→Ｐ５０２／Ｄ５３６→Ｅ５３７；
Ｒ１９Ｋ／Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｔ／Ｅ５６Ｇ／Ｄ５７Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ａ８５Ｍ／Ｉ８６Ｌ／Ｑ８７Ｄ／Ｋ８８Ｈ／Ｌ８９Ｉ／Ｃ９０Ｙ／−−−→Ｒ９１／−−−→Ａ９２／−−−→Ｄ９３／Ｉ９２→Ｙ９５／Ｙ９３→Ｆ９６／
Ｉ９４→Ｅ９７／Ｄ９５→Ａ９８／Ｓ９６→Ｈ９９／Ｎ９７→Ｅ１００／Ｒ９８→Ｙ１０１／Ａ９９→Ｎ１０２／Ｋ１２５→Ｑ１２８／Ｋ１７３→Ｑ１７６／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１７９／Ｄ１７９→Ｐ１８０／
Ｖ１８１→Ｌ１８２／Ｔ１８２→Ｋ１８３／Ｐ１８３→Ｓ１８４／Ｋ１８４→Ｐ１８５／Ｆ２０９→Ｉ２１０／Ｍ２１２→Ｒ２１３／Ｎ２１４→Ｄ２１５／Ｈ２１９→Ｄ２２０／Ｙ２２１→Ｖ２２２／Ｅ２３８→Ｄ２３９／Ｋ２５２→Ｑ２５３／Ｐ２８１→Ｓ２８２／Ｑ２９２→Ｋ２９３／Ｌ３１３→Ｃ３１４／Ｓ３１４→Ｔ３１５／Ｌ３１５→Ｍ３１６／Ｔ３１７→Ｓ３１８／Ｑ３２１→Ａ３２２／Ｅ３３３→Ｄ３３４／Ｋ３３６→Ｒ３３７／Ｌ３３７→Ｉ３３８／Ａ３４５→Ｔ３４６／Ｇ３５７→Ｒ３５８／Ｎ３６９→Ｉ３７０／Ｓ３７７→Ｙ３７８／Ｔ４０５→Ｒ４０６／Ｎ４２９→Ｇ４３０／Ａ４３６→Ｓ４３７／Ｅ４８４→Ｄ４８５／Ｔ５０１→Ｐ５０２／Ｄ５３６→Ｅ５３７；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｔ／Ｅ５６Ｇ／Ｄ５７Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ａ８５Ｍ／Ｉ８６Ｌ／Ｑ８７Ｄ／Ｋ８８Ｈ／Ｌ８９Ｉ／Ｃ９０Ｙ／−−−→Ｒ９１／−−−→Ａ９２／−−−→Ｄ９３／Ｉ９２→Ｙ９５／Ｙ９３→Ｆ９６／Ｉ９４→Ｅ９７／Ｄ９５→Ａ９８／Ｓ９６→Ｈ９９／Ｎ９７→Ｅ１００／Ｒ９８→Ｙ１０１／Ａ９９→Ｎ１０２／Ｋ１２５→Ｑ１２８／Ｋ１７３→Ｑ１７６／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１７９／Ｄ１７９→Ｐ１８０／Ｖ１８１→Ｌ１８２／Ｔ１８２→Ｋ１８３／Ｐ１８３→Ｓ１８４／Ｋ１８４→Ｐ１８５／Ｆ２０９→Ｉ２１０／Ｍ２１２→Ｒ２１３／Ｎ２１４→Ｄ２１５／Ｈ２１９→Ｄ２２０／Ｙ２２１→Ｖ２２２／Ｅ２３８→Ｄ２３９／Ｋ２５２→Ｑ２５３／Ｐ２８１→Ｓ２８２／Ｑ２９２→Ｋ２９３／Ｌ３１３→Ｃ３１４／Ｓ３１４→Ｔ３１５／Ｌ３１５→Ｍ３１６／Ｔ３１７→Ｓ３１８／Ｑ３２１→Ａ３２２／Ｅ３３３→Ｄ３３４／Ｋ３３６→Ｒ３３７／Ｌ３３７→Ｉ３３８／Ａ３４５→Ｔ３４６／Ｇ３５７→Ｒ３５８／Ｎ３６９→Ｉ３７０／Ｓ３７７→Ｙ３７８／Ｔ４０５→Ｒ４０６／Ｎ４２９→Ｇ４３０／Ａ４３６→Ｓ４３７／Ｅ４８４→Ｄ４８５／Ｔ５０１→Ｐ５０２／Ｄ５３６→Ｅ５３７；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ｑ／Ｋ１７３Ｑ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｉ／Ｉ２１３Ｙ／Ｎ２１４Ｅ／Ｓ２１５→−−−／Ｔ２１６→−−−／Ｓ２１７→Ｅ２１５／Ｄ２１８→Ｅ２１６／Ｈ２１９→Ｇ２１７／Ｌ２２０→Ｆ２１８／Ｙ２２１→Ｋ２１９／Ｅ２３８→Ｄ２３６／Ｋ２５２→Ｑ２５０／Ｐ２８１→Ｓ２７９／Ｑ２９２→Ｋ２９０／Ｌ３１３→Ｃ３１１／Ｓ３１４→Ｔ３１２／Ｌ３１５→Ｍ３１３／Ｔ３１７→Ｓ３１５／Ｑ３２１→Ａ３１９／Ｅ３３３→Ｄ３３１／Ｋ３３６→Ｒ３３４／Ｌ３３７→Ｉ３３５／Ａ３４５→Ｔ３４３／Ｇ３５７→Ｒ３５５／Ｎ３６９→Ｉ３６７／Ｓ３７７→Ｙ３７５／Ｔ４０５→Ｒ４０３／Ｎ４２９→Ｇ４２７／Ａ４３６→Ｓ４３４／Ｔ５０１→Ｐ４９９／Ｄ５３６→Ｅ５３４；
Ｒ１９Ｋ／Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｔ／Ｅ５６Ｇ／Ｄ５７Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ａ８５Ｍ／Ｉ８６Ｌ／Ｑ８７Ｄ／
Ｋ８８Ｈ／Ｌ８９Ｉ／Ｃ９０Ｙ／−−−→Ｒ９１／−−−→Ａ９２／−−−→Ｄ９３／Ｉ９２→Ｙ９５／Ｙ９３→Ｆ９６／
Ｉ９４→Ｅ９７／Ｄ９５→Ａ９８／Ｓ９６→Ｈ９９／Ｎ９７→Ｅ１００／Ｒ９８→Ｙ１０１／Ａ９９→Ｎ１０２／Ｋ１２５→Ｑ１２８／Ｋ１７３→Ｑ１７６／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１７９／Ｄ１７９→Ｐ１８０／Ｖ１８１→Ｌ１８２／
Ｔ１８２→Ｋ１８３／Ｐ１８３→Ｓ１８４／Ｋ１８４→Ｐ１８５／Ｆ２０９→Ｉ２１０／Ｍ２１２→Ｓ２１３／Ｎ２１４→Ｙ２１５／Ｓ２１５→Ｄ２１６／Ｔ２１６→Ｋ２１７／Ｓ２１７−−／Ｄ２１８Ｅ／Ｈ２１９Ｑ／Ｌ２２０Ｓ／Ｙ２２１Ｋ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｐ２８１Ｓ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１３Ｃ／Ｓ３１４Ｔ／Ｌ３１５Ｍ／Ｔ３１７Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ｋ３３６Ｒ／Ｌ３３７Ｉ／Ａ３４５Ｔ／Ｇ３５７Ｒ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｅ４８４Ｄ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｒ１９Ｋ／Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｔ／Ｅ５６Ｇ／Ｄ５７Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ａ８５Ｍ／Ｉ８６Ｌ／Ｑ８７Ｄ／Ｋ８８Ｈ／Ｌ８９Ｉ／Ｃ９０Ｙ／−−−→Ｒ９１／−−−→Ａ９２／−−−→Ｄ９３／Ｉ９２→Ｙ９５／Ｙ９３→Ｆ９６／Ｉ９４→Ｅ９７／Ｄ９５→Ａ９８／
Ｓ９６→Ｈ９９／Ｎ９７→Ｅ１００／Ｒ９８→Ｙ１０１／Ａ９９→Ｎ１０２／Ｋ１２５→Ｑ１２８／Ｋ１７３→Ｑ１７６／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１７９／Ｄ１７９→Ｐ１８０／Ｖ１８１→Ｌ１８２／Ｔ１８２→Ｋ１８３／Ｐ１８３→Ｓ１８４／Ｋ１８４→Ｐ１８５／Ｆ２０９→Ｉ２１０／Ｍ２１２→Ｓ２１３／Ｎ２１４→Ｙ２１５／Ｓ２１５→Ｄ２１６／Ｔ２１６→Ｋ２１７／Ｓ２１７−−／Ｄ２１８Ｅ／Ｈ２１９Ｑ／Ｌ２２０Ｓ／Ｙ２２１Ｋ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ｑ／Ｐ２８１Ｓ／Ｑ２９２Ｋ／Ｌ３１３Ｃ／Ｓ３１４Ｔ／Ｌ３１５Ｍ／Ｔ３１７Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｉ３２５Ｔ／Ｅ３３３Ｄ／Ｋ３３６Ｒ／Ｌ３３７Ｉ／Ａ３４５Ｔ／Ｇ３５７Ｒ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｅ４８４Ｄ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；
Ｒ１９Ｋ／Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｔ／Ｅ５６Ｇ／Ｄ５７Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ａ８５Ｍ／Ｉ８６Ｌ／Ｑ８７Ｄ／Ｋ８８Ｈ／Ｌ８９Ｉ／Ｃ９０Ｙ／−−→Ｒ９１／−−→Ａ９２／−−→Ｄ９３／Ｉ９２→Ｙ９５／Ｙ９３→Ｆ９６／Ｉ９４→Ｅ９７／Ｄ９５→Ａ９８／Ｓ９６→Ｈ９９／Ｎ９７→Ｅ１００／Ｒ９８→Ｙ１０１／Ａ９９→Ｎ１０２／Ｋ１２５→Ｑ１２８／Ｋ１７３→Ｑ１７６／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１７９／Ｄ１７９→Ｐ１８０／Ｖ１８１→Ｌ１８２／Ｔ１８２→Ｋ１８３／Ｐ１８３→Ｓ１８４／Ｋ１８４→Ｐ１８５／Ｆ２０９→Ｉ２１０／Ｍ２１２→Ｖ２１３／Ｉ２１３→Ｙ２１４／Ｎ２１４→−−／Ｓ２１５→−−／Ｔ２１６→Ｑ２１５／Ｓ２１７→Ｄ２１６／Ｄ２１８→Ｅ２１７／Ｈ２１９→Ａ２１８／Ｌ２２０→Ｆ２１９／Ｙ２２１→Ｈ２２０／Ｅ２３８→Ｄ２３７／Ｋ２５２→Ｑ２５１／Ｐ２８１→Ｓ２８０／Ｑ２９２→Ｋ２９１／Ｌ３１３→Ｃ３１２／Ｓ３１４→Ｔ３１３／Ｌ３１５→Ｍ３１４／Ｔ３１７→Ｓ３１６／Ｑ３２１→Ａ３２０／Ｅ３３３→Ｄ３３２／Ｋ３３６→Ｒ３３５／Ｌ３３７→Ｉ３３６／Ａ３４５→Ｔ３４４／Ｇ３５７→Ｒ３５６／Ｎ３６９→Ｉ３６８／Ｓ３７７→Ｙ３７６／Ｔ４０５→Ｒ４０４／Ｎ４２９→Ｇ４２８／Ａ４３６→Ｓ４３５／Ｅ４８４→Ｄ４８３／Ｔ５０１→Ｐ５００／Ｄ５３６→Ｅ５３５／
Ｒ１９Ｋ／Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｔ／Ｅ５６Ｇ／Ｄ５７Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ａ８５Ｍ／Ｉ８６Ｌ／Ｑ８７Ｄ／Ｋ８８Ｈ／Ｌ８９Ｉ／Ｃ９０Ｙ／−−−→Ｒ９１／−−−→Ａ９２／−−−→Ｄ９３／Ｉ９２→Ｙ９５／Ｙ９３→Ｆ９６／
Ｉ９４→Ｅ９７／Ｄ９５→Ａ９８／Ｓ９６→Ｈ９９／Ｎ９７→Ｅ１００／Ｒ９８→Ｙ１０１／Ａ９９→Ｎ１０２／Ｋ１２５→Ｑ１２８／Ｋ１７３→Ｑ１７６／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１７９／Ｄ１７９→Ｐ１８０／Ｖ１８１→Ｌ１８２／Ｔ１８２→Ｋ１８３／Ｐ１８３→Ｓ１８４／Ｋ１８４→Ｐ１８５／Ｆ２０９→Ｉ２１０／Ｍ２１２→Ｙ２１３／Ｉ２１３→Ｓ２１４／Ｎ２１４→Ｐ２１５／Ｓ２１５→Ｎ２１６／Ｔ２１６→Ｖ２１７／Ｓ２１７→Ｉ２１８／Ｈ２１９→Ｌ２２０／Ｌ２２０→Ａ２２１／Ｙ２２１→Ｐ２２２／Ｅ２３８→Ｄ２３９／Ｋ２５２→Ｑ２５３／Ｑ２９２→Ｋ２９３／Ｑ３２１→Ａ３２２／Ｅ３３３→Ｄ３３４／Ａ３４５→Ｔ３４６／Ｎ３６９→Ｉ３７０／Ｓ３７７→Ｙ３７８／Ｔ４０５→Ｒ４０６／Ｎ４２９→Ｇ４３０／Ａ４３６→Ｓ４３７／Ｔ５０１→Ｐ５０２／Ｄ５３６→Ｅ５３７；
Ｒ１９Ｋ／Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｔ／Ｅ５６Ｇ／Ｄ５７Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ａ８５Ｍ／Ｉ８６Ｌ／Ｑ８７Ｄ／Ｋ８８Ｈ／Ｌ８９Ｉ／Ｃ９０Ｙ／−−−→Ｒ９１／−−−→Ａ９２／−−−→Ｄ９３／Ｉ９２→Ｙ９５／Ｙ９３→Ｆ９６／Ｉ９４→Ｅ９７／Ｄ９５→Ａ９８／Ｓ９６→Ｈ９９／Ｎ９７→Ｅ１００／Ｒ９８→Ｙ１０１／Ａ９９→Ｎ１０２／Ｋ１２５→Ｑ１２８／Ｋ１７３→Ｑ１７６／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１７９／Ｄ１７９→Ｐ１８０／Ｖ１８１→Ｌ１８２／Ｔ１８２→Ｋ１８３／Ｐ１８３→Ｓ１８４／Ｋ１８４→Ｐ１８５／Ｆ２０９→Ｉ２１０／Ｍ２１２→Ｋ２１３／Ｉ２１３→Ｐ２１４／Ｎ２１４→Ｖ２１５／Ｓ２１５→Ｔ２１６／Ｔ２１６→Ｒ２１７／Ｄ２１８→Ｌ２１９／Ｈ２１９→Ｓ２２０／Ｌ２２０→Ａ２２１／Ｙ２２１→Ｌ２２２／Ｅ２３８→Ｄ２３９／Ｋ２５２→Ｑ２５３／Ｑ２９２→Ｋ２９３／Ｖ３２０→Ａ３２１／Ｑ３２１→Ａ３２２／Ｅ３３３→Ｄ３３４／Ａ３４５→Ｔ３４６／Ｎ３６９→Ｉ３７０／Ｓ３７７→Ｙ３７８／Ｔ４０５→Ｒ４０６／Ｎ４２９→Ｇ４３０／Ａ４３６→Ｓ４３７／Ｔ５０１→Ｐ５０２／Ｄ５３６→Ｅ５３７；
Ｒ１９Ｋ／Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｔ／Ｅ５６Ｇ／Ｄ５７Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ａ８５Ｍ／Ｉ８６Ｌ／Ｑ８７Ｄ／Ｋ８８Ｈ／Ｌ８９Ｉ／Ｃ９０Ｙ／−−−→Ｒ９１／−−−→Ａ９２／−−−→Ｄ９３／Ｉ９２→Ｙ９５／Ｙ９３→Ｆ９６／Ｉ９４→Ｅ９７／Ｄ９５→Ａ９８／Ｓ９６→Ｈ９９／Ｎ９７→Ｅ１００／Ｒ９８→Ｙ１０１／Ａ９９→Ｎ１０２／Ｋ１２５→Ｑ１２８／Ｋ１７３→Ｑ１７６／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１７９／Ｄ１７９→Ｐ１８０／Ｖ１８１→Ｌ１８２／Ｔ１８２→Ｋ１８３／Ｐ１８３→Ｓ１８４／Ｋ１８４→Ｐ１８５／Ｆ２０９→Ｉ２１０／Ｉ２１３→Ｑ２１４／Ｎ２１４→Ｈ２１５／Ｓ２１５→Ｌ２１６／Ｔ２１６→Ｃ２１７／Ｓ２１７→Ｆ２１８／Ｄ２１８→Ｓ２１９／Ｈ２１９→Ｒ２２０／Ｌ２２０→Ｈ２２１／Ｙ２２１→Ｋ２２２／Ｅ２３８→Ｄ２３９／Ｋ２５２→Ｑ２５３／Ｑ２９２→Ｋ２９３／Ｑ３２１→Ａ３２２／Ｅ３３３→Ｄ３３４／Ａ３４５→Ｔ３４６／Ｎ３６９→Ｉ３７０／Ｓ３７７→Ｙ３７８／Ｔ４０５→Ｒ４０６／Ｎ４２９→Ｇ４３０／Ａ４３６→Ｓ４３７／Ｔ５０１→Ｐ５０２／Ｄ５３６→Ｅ５３７；
Ｒ１９Ｋ／Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｔ／Ｅ５６Ｇ／Ｄ５７Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ａ８５Ｍ／Ｉ８６Ｌ／Ｑ８７Ｄ／Ｋ８８Ｈ／Ｌ８９Ｉ／Ｃ９０Ｙ／−−−→Ｒ９１／−−−→Ａ９２／−−−→Ｄ９３／Ｉ９２→Ｙ９５／Ｙ９３→Ｆ９６／Ｉ９４→Ｅ９７／Ｄ９５→Ａ９８／Ｓ９６→Ｈ９９／Ｎ９７→Ｅ１００／Ｒ９８→Ｙ１０１／Ａ９９→Ｎ１０２／Ｋ１２５→Ｑ１２８／Ｋ１７３→Ｑ１７６／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１７９／Ｄ１７９→Ｐ１８０／Ｖ１８１→Ｌ１８２／Ｔ１８２→Ｋ１８３／Ｐ１８３→Ｓ１８４／Ｋ１８４→Ｐ１８５／Ｆ２０９→Ｉ２１０／Ｍ２１２→Ｆ２１３／Ｉ２１３→Ｎ２１４／Ｎ２１４→Ｃ２１５／Ｓ２１５→Ｖ２１６／Ｔ２１６→Ｋ２１７／Ｓ２１７→Ｙ２１８／Ｄ２１８→Ａ２１９／Ｈ２１９→Ｆ２２０／Ｌ２２０→Ｔ２２１／Ｙ２２１→Ｑ２２２／Ｅ２３８→Ｄ２３９／Ｋ２５２→Ｑ２５３／Ｑ２９２→Ｋ２９３／Ｑ３２１→Ａ３２２／Ｅ３３３→Ｄ３３４／Ａ３４５→Ｔ３４６／Ｎ３６９→Ｉ３７０／Ｓ３７７→Ｙ３７８／Ｔ４０５→Ｒ４０６／Ｎ４２９→Ｇ４３０／Ａ４３６→Ｓ４３７／Ｔ５０１→Ｐ５０２／Ｄ５３６→Ｅ５３７；
Ｒ１９Ｋ／Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｔ／Ｅ５６Ｇ／Ｄ５７Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ａ８５Ｍ／Ｉ８６Ｌ／Ｑ８７Ｄ／Ｋ８８Ｈ／Ｌ８９Ｉ／Ｃ９０Ｙ／−−−→Ｒ９１／−−−→Ａ９２／−−−→Ｄ９３／Ｉ９２→Ｙ９５／Ｙ９３→Ｆ９６／Ｉ９４→Ｅ９７／Ｄ９５→Ａ９８／Ｓ９６→Ｈ９９／Ｎ９７→Ｅ１００／Ｒ９８→Ｙ１０１／Ａ９９→Ｎ１０２／Ｋ１２５→Ｑ１２８／Ｋ１７３→Ｑ１７６／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１７９／Ｄ１７９→Ｐ１８０／Ｖ１８１→Ｌ１８２／Ｔ１８２→Ｋ１８３／Ｐ１８３→Ｓ１８４／Ｋ１８４→Ｐ１８５／Ｆ２０９→Ｉ２１０／Ｍ２１２→Ｙ２１３／Ｉ２１３→Ｒ２１４／Ｎ２１４→Ｌ２１５／Ｓ２１５→Ｎ２１６／Ｔ２１６→Ｄ２１７／Ｓ２１７→Ｎ２１８／Ｄ２１８→Ｙ２１９／Ｈ２１９→Ａ２２０／Ｌ２２０→Ｅ２２１／Ｙ２２１→Ｗ２２２／Ｅ２３８→Ｄ２３９／Ｋ２５２→Ｑ２５３／Ｑ２９２→Ｋ２９３／Ｑ３２１→Ａ３２２／Ｅ３３３→Ｄ３３４／Ａ３４５→Ｔ３４６／Ｎ３６９→Ｉ３７０／Ｓ３７７→Ｙ３７８／Ｔ４０５→Ｒ４０６／Ｎ４２９→Ｇ４３０／Ａ４３６→Ｓ４３７／Ｔ５０１→Ｐ５０２／Ｄ５３６→Ｅ５３７；
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Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｔ５３Ｌ／Ｄ５４Ａ／Ａ５５Ｔ／Ｅ５６Ｇ／Ｄ５７Ｒ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ６２Ｒ／Ａ８５Ｍ／Ｉ８６Ｌ／Ｑ８７Ｄ／Ｋ８８Ｈ／Ｌ８９Ｉ／Ｃ９０Ｙ／−−−→Ｒ９１／−−−→Ａ９２／−−−→Ｄ９３／Ｉ９２→Ｙ９５／Ｙ９３→Ｆ９６／Ｉ９４→Ｅ９７／Ｄ９５→Ａ９８／Ｓ９６→Ｈ９９／Ｎ９７→Ｅ１００／Ｒ９８→Ｙ１０１／Ａ９９→Ｎ１０２／Ｋ１２５→Ｑ１２８／Ｋ１７３→Ｑ１７６／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１７９／Ｄ１７９→Ｐ１８０／Ｖ１８１→Ｌ１８２／Ｔ１８２→Ｋ１８３／Ｐ１８３→Ｓ１８４／Ｋ１８４→Ｐ１８５／Ｆ２０９→Ｉ２１０／Ｍ２１２→Ｓ２１３／Ｉ２１３→Ｌ２１４／Ｎ２１４→Ｖ２１５／Ｓ２１５→Ｒ２１６／Ｔ２１６→Ｓ２１７／Ｓ２１７→Ｅ２１８／Ｄ２１８→Ｋ２１９／Ｈ２１９→Ｄ２２０／Ｌ２２０→Ｐ２２１／Ｙ２２１→Ｎ２２２／Ｅ２３８→Ｄ２３９／Ｋ２５２→Ｑ２５３／Ｑ２９２→Ｋ２９３／Ｑ３２１→Ａ３２２／Ｅ３３３→Ｄ３３４／Ａ３４５→Ｔ３４６／Ｎ３６９→Ｉ３７０／Ｓ３７７→Ｙ３７８／Ｔ４０５→Ｒ４０６／Ｎ４２９→Ｇ４３０／Ａ４３６→Ｓ４３７／Ｔ５０１→Ｐ５０２／Ｄ５３６→Ｅ５３７；
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Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ｑ／Ｐ９１Ｎ／Ｉ９２Ｓ／Ｙ９３Ｆ／Ｉ９４Ｈ／Ｓ９６Ｃ／Ｒ９８Ｄ／Ａ９９Ｍ／−−−→Ｇ１０１／−−−→Ｄ１０２／Ｋ１２５→Ｑ１２７／Ｋ１７３→Ｑ１７５／Ｋ１８４→Ｒ１８６／Ｆ２０９→Ｉ２１１／Ｍ２１２→Ｒ２１４／Ｎ２１４→Ｄ２１６／Ｈ２１９→Ｄ２２１／Ｙ２２１→Ｖ２２３／Ｅ２３８→Ｄ２４０／Ｋ２５２→Ｑ２５４／Ｑ２９２→Ｋ２９４／Ｑ３２１→Ａ３２３／Ｅ３３３→Ｄ３３５／Ａ３４５→Ｔ３４７／Ｎ３６９→Ｉ３７１／Ｓ３７７→Ｙ３７９／Ｔ４０５→Ｒ４０７／Ｎ４２９→Ｇ４３１／Ａ４３６→Ｓ４３８／Ｔ５０１→Ｐ５０３／Ｄ５３６→Ｅ５３８；
Ｋ２４Ｑ／Ｑ３８Ｎ／Ｋ５８Ｑ／Ｖ６０Ｉ／Ｉ８２Ｖ／Ｋ８８Ｑ／Ｐ９１Ｎ／Ｉ９２Ｓ／Ｙ９３Ｆ／Ｉ９４Ｈ／Ｓ９６Ｃ／Ｒ９８Ｄ／Ａ９９Ｍ／−−−→Ｇ１０１／−−−→Ｄ１０２／Ｋ１２５→Ｑ１２７／Ｋ１７３→Ｑ１７５／Ｋ１８４→Ｒ１８６／Ｆ２０９→Ｉ２１１／Ｍ２１２→Ｒ２１４／Ｎ２１４→Ｄ２１６／Ｈ２１９→Ｄ２２１／Ｙ２２１→Ｖ２２３／Ｅ２３８→Ｄ２４０／Ｋ２５２→Ｑ２５４／Ｑ２９２→Ｋ２９４／Ｑ３２１→Ａ３２３／Ｅ３３３→Ｄ３３５／Ａ３４５→Ｔ３４７／Ｎ３６９→Ｉ３７１／Ｓ３７７→Ｙ３７９／Ｌ３９９→Ｓ４０１／Ｔ４０５→Ｒ４０７／Ｎ４２９→Ｇ４３１／Ａ４３６→Ｓ４３８／Ｔ５０１→Ｐ５０３／Ｄ５３６→Ｅ５３８；
Ｓ３Ｔ／Ｇ４Ｑ／Ｅ５Ｖ／−−−→Ｓ６／−−−→Ａ７／−−−→Ｓ８／−−−→Ｓ９／−−−→Ｌ１０／−−−→Ａ１１／−−−→Ｑ１２／−−−→Ｉ１３／−−−→Ｐ１４／−−−→Ｑ１５／−−−→Ｐ１６／Ｔ６→Ｋ１７／Ｆ７→Ｎ１８／Ｔ１０→Ｖ２１／Ｄ１２→Ｎ２３／Ｓ１６→Ｎ２７／Ｌ１７→Ｉ２８／Ｒ１９→Ｇ３０／Ｎ２０→Ｄ３１／Ｈ２１→Ｑ３２／Ｌ２３→Ｉ３４／Ｋ２４→Ｔ３５／Ｇ２５→Ｙ３６／Ａ２６→Ｔ３７／Ｓ２７→Ｐ３８／Ｄ２８→Ｅ３９／Ｆ２９→Ｄ４０／Ｔ３１→−−−／Ｄ３３→Ｔ４３／Ｈ３４→Ｒ４４／Ｔ３５→Ａ４５／Ａ３６→Ｃ４６／Ｔ３７→Ｋ４７／Ｑ３８→Ｅ４８／Ｒ４０→Ｑ５０／Ｈ４１→Ｉ５１／Ｖ４８→Ｉ５８／Ｔ５３→Ｌ６３／Ｄ５４→Ａ６４／Ａ５５→Ｔ６５／Ｅ５６→Ｇ６６／Ｄ５７→Ｒ６７／Ｖ６０→Ｉ７０／Ｉ８６→Ｌ９６／Ｋ８８→Ｈ９８／Ｌ８９→Ｉ９９／Ｐ９１→Ｎ１０１／Ｉ９２→Ｓ１０２／Ｙ９３→Ｆ１０３／Ｉ９４→Ｈ１０４／Ｓ９６→Ｃ１０６／Ｒ９８→Ｄ１０８／Ａ９９→Ｍ１０９／−−−→Ｇ１１１／−−−→Ｄ１１２／Ｈ１０２→Ｙ１１４／Ｉ１１６→Ｙ１２８／Ｋ１１７→Ｔ１２９／Ｖ１２２→Ｉ１３４／Ｅ１２４→Ｎ１３６／Ｋ１２７→Ｔ１３９／Ｄ１２９→Ｅ１４１／Ｅ１３０→Ｒ１４２／Ｓ１３５→Ｅ１４７／Ｓ１３６→Ａ１４８／Ｎ１３９→Ｓ１５１／Ｑ１４２→Ｒ１５４／Ｓ１４６→Ｇ１５８／Ｋ１７３→Ｑ１８５／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１８８／Ｄ１７９→Ｐ１８９／Ｖ１８１→Ｌ１９１／Ｔ１８２→Ｋ１９２／Ｐ１８３→Ｓ１９３／Ｋ１８４→Ｐ１９４／Ｆ２０９→Ｉ２１９／Ｍ２１２→Ｖ２２２／Ｉ２１３→Ｙ２２３／Ｎ２１４→−−−／Ｓ２１５→−−−／Ｔ２１６→Ｑ２２４／Ｓ２１７→Ｄ２２５／Ｄ２１８→Ｅ２２６／Ｈ２１９→Ａ２２７／Ｌ２２０→Ｆ２２８／Ｙ２２１→Ｈ２２９／Ｅ２３８→Ｄ２４６／Ｋ２５２→Ｑ２６０／Ｐ２８１→Ｓ２８９／Ｑ２９２→Ｋ３００／Ｌ３１３→Ｃ３２１／Ｓ３１４→Ｔ３２２／Ｌ３１５→Ｍ３２３／Ｔ３１７→Ｓ３２５／Ｑ３２１→Ａ３２９／Ｅ３３３→Ｄ３４１／Ｋ３３６→Ｒ３４４／Ｌ３３７→Ｉ３４５／Ａ３４５→Ｔ３５３／Ｇ３５７→Ｒ３６５／Ｎ３６９→Ｉ３７７／Ｓ３７７→Ｙ３８５／Ｔ４０５→Ｒ４１３／Ｎ４２９→Ｇ４３７／Ａ４３６→Ｓ４４４／Ｅ４８４→Ｄ４９２／Ｔ５０１→Ｐ５０９／Ｄ５３６→Ｅ５４４；
Ｓ３Ｔ／Ｇ４Ｑ／Ｅ５Ｖ／−−−→Ｓ６／−−−→Ａ７／−−−→Ｓ８／−−−→Ｓ９／−−−→Ｌ１０／−−−→Ａ１１／−−−→Ｑ１２／−−−→Ｉ１３／−−−→Ｐ１４／−−−→Ｑ１５／−−−→Ｐ１６／Ｔ６→Ｋ１７／Ｆ７→Ｎ１８／Ｔ１０→Ｖ２１／Ｄ１２→Ｎ２３／Ｓ１６→Ｎ２７／Ｌ１７→Ｉ２８／Ｒ１９→Ｇ３０／Ｎ２０→Ｄ３１／Ｈ２１→Ｑ３２／Ｌ２３→Ｉ３４／Ｋ２４→Ｔ３５／Ｇ２５→Ｙ３６／Ａ２６→Ｔ３７／Ｓ２７→Ｐ３８／Ｄ２８→Ｅ３９／Ｆ２９→Ｄ４０／Ｔ３１→−−−／Ｄ３３→Ｔ４３／Ｈ３４→Ｒ４４／Ｔ３５→Ａ４５／Ａ３６→Ｃ４６／Ｔ３７→Ｋ４７／Ｑ３８→Ｅ４８／Ｒ４０→Ｑ５０／Ｈ４１→Ｉ５１／Ｔ５３→Ｌ６３／Ｄ５４→Ａ６４／Ａ５５→Ｔ６５／Ｅ５６→Ｇ６６／Ｄ５７→Ｒ６７／Ｖ６０→Ｉ７０／Ｉ８６→Ｌ９６／Ｋ８８→Ｈ９８／Ｌ８９→Ｉ９９／Ｐ９１→Ｎ１０１／Ｉ９２→Ｓ１０２／Ｙ９３→Ｆ１０３／Ｉ９４→Ｈ１０４／Ｓ９６→Ｃ１０６／Ｒ９８→Ｄ１０８／Ａ９９→Ｍ１０９／−−−→Ｇ１１１／−−−→Ｄ１１２／Ｋ１２５→Ｑ１３７／Ｋ１７３→Ｑ１８５／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１８８／Ｄ１７９→Ｐ１８９／Ｖ１８１→Ｌ１９１／Ｔ１８２→Ｋ１９２／Ｐ１８３→Ｓ１９３／Ｋ１８４→Ｐ１９４／Ｆ２０９→Ｉ２１９／Ｍ２１２→Ｖ２２２／Ｉ２１３→Ｙ２２３／Ｎ２１４→−−−／Ｓ２１５→−−−／Ｔ２１６→Ｑ２２４／Ｓ２１７→Ｄ２２５／Ｄ２１８→Ｅ２２６／Ｈ２１９→Ａ２２７／Ｌ２２０→Ｆ２２８／Ｙ２２１→Ｈ２２９／Ｅ２３８→Ｄ２４６／Ｋ２５２→Ｑ２６０／Ｐ２８１→Ｓ２８９／Ｑ２９２→Ｋ３００／Ｌ３１３→Ｃ３２１／Ｓ３１４→Ｔ３２２／Ｌ３１５→Ｍ３２３／Ｔ３１７→Ｓ３２５／Ｑ３２１→Ａ３２９／Ｅ３３３→Ｄ３４１／Ｋ３３６→Ｒ３４４／Ｌ３３７→Ｉ３４５／Ａ３４５→Ｔ３５３／Ｇ３５７→Ｒ３６５／Ｎ３６９→Ｉ３７７／Ｓ３７７→Ｙ３８５／Ｔ４０５→Ｒ４１３／Ｎ４２９→Ｇ４３７／Ａ４３６→Ｓ４４４／Ｅ４８４→Ｄ４９２／Ｔ５０１→Ｐ５０９／Ｄ５３６→Ｅ５４４；および
Ｓ３Ｔ／Ｇ４Ｑ／Ｅ５Ｖ／−−−→Ｓ６／−−−→Ａ７／−−−→Ｓ８／−−−→Ｓ９／−−−→Ｌ１０／−−−→Ａ１１／−−−→Ｑ１２／−−−→Ｉ１３／−−−→Ｐ１４／−−−→Ｑ１５／−−−→Ｐ１６／Ｔ６→Ｋ１７／Ｆ７→Ｎ１８／Ｔ１０→Ｖ２１／Ｄ１２→Ｎ２３／Ｓ１６→Ｎ２７／Ｌ１７→Ｉ２８／Ｒ１９→Ｇ３０／Ｎ２０→Ｄ３１／Ｈ２１→Ｑ３２／Ｌ２３→Ｉ３４／Ｋ２４→Ｔ３５／Ｇ２５→Ｙ３６／Ａ２６→Ｔ３７／Ｓ２７→Ｐ３８／Ｄ２８→Ｅ３９／Ｆ２９→Ｄ４０／Ｔ３１→−−−／Ｄ３３→Ｔ４３／Ｈ３４→Ｒ４４／Ｔ３５→Ａ４５／Ａ３６→Ｃ４６／Ｔ３７→Ｋ４７／Ｑ３８→Ｅ４８／Ｒ４０→Ｑ５０／Ｈ４１→Ｉ５１／Ｔ５３→Ｌ６３／Ｄ５４→Ａ６４／Ａ５５→Ｔ６５／Ｅ５６→Ｇ６６／Ｄ５７→Ｒ６７／Ｖ６０→Ｉ７０／Ａ８５→Ｍ９５／Ｉ８６→Ｌ９６／Ｑ８７→Ｄ９７／Ｋ８８→Ｈ９８／Ｌ８９→Ｉ９９／Ｃ９０→Ｙ１００／−−−→Ｒ１０１／−−−→Ａ１０２／−−−→Ｄ１０３／Ｉ９２→Ｙ１０５／Ｙ９３→Ｆ１０６／Ｉ９４→Ｅ１０７／Ｄ９５→Ａ１０８／Ｓ９６→Ｈ１０９／Ｎ９７→Ｅ１１０／Ｒ９８→Ｙ１１１／Ａ９９→Ｎ１１２／Ｋ１２５→Ｑ１３８／Ｋ１７３→Ｑ１８６／Ｌ１７５→−−−／Ｖ１７６→−−−／Ｑ１７８→Ａ１８９／Ｄ１７９→Ｐ１９０／Ｖ１８１→Ｌ１９２／Ｔ１８２→Ｋ１９３／Ｐ１８３→Ｓ１９４／Ｋ１８４→Ｐ１９５／Ｆ２０９→Ｉ２２０／Ｍ２１２→Ｖ２２３／Ｉ２１３→Ｙ２２４／Ｎ２１４→−−−／Ｓ２１５→−−−／Ｔ２１６→Ｑ２２５／Ｓ２１７→Ｄ２２６／Ｄ２１８→Ｅ２２７／Ｈ２１９→Ａ２２８／Ｌ２２０→Ｆ２２９／Ｙ２２１→Ｈ２３０／Ｅ２３８→Ｄ２４７／Ｋ２５２→Ｑ２６１／Ｐ２８１→Ｓ２９０／Ｑ２９２→Ｋ３０１／Ｌ３１３→Ｃ３２２／Ｓ３１４→Ｔ３２３／Ｌ３１５→Ｍ３２４／Ｔ３１７→Ｓ３２６／Ｑ３２１→Ａ３３０／Ｅ３３３→Ｄ３４２／Ｋ３３６→Ｒ３４５／Ｌ３３７→Ｉ３４６／Ａ３４５→Ｔ３５４／Ｇ３５７→Ｒ３６６／Ｎ３６９→Ｉ３７８／Ｓ３７７→Ｙ３８６／Ｔ４０５→Ｒ４１４／Ｎ４２９→Ｇ４３８／Ａ４３６→Ｓ４４５／Ｅ４８４→Ｄ４９３／Ｔ５０１→Ｐ５１０／Ｄ５３６→Ｅ５４５
に対応する改変の中から選択される改変を含む、請求項１から１５のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項１７】
配列番号２０３、３５２〜３５３、７０２、７０３、７１３〜７１５、７７６〜７９９、８０１〜８０９、８９１〜８９４、８９６、９４５、９４７、９４９、９５１、９５３、９５５、９５７、９５９、９６１、９６３、９６５、９６７、９６９、９７１、９７３、９７５、９７７、９７９、９８１、９８３、９８５、９８７、９８９、９９１、９９３、９９５、９９７および９９９のいずれかに示されるヌクレオチドの配列；または配列番号２０３、３５２〜３５３、７０２、７０３、７１３〜７１５、７７６〜７９９、８０１〜８０９、８９１〜８９４、８９６、９４５、９４７、９４９、９５１、９５３、９５５、９５７、９５９、９６１、９６３、９６５、９６７、９６９、９７１、９７３、９７５、９７７、９７９、９８１、９８３、９８５、９８７、９８９、９９１、９９３、９９５、９９７および９９９のいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチドの配列；ならびにその縮重配列を含み、あるいは、
核酸分子によってコードされる改変されたバレンセンシンターゼが、配列番号６７、３５０、３５１，７３２〜７３３、７４３〜７４５、８３３〜８５６、８５８〜８６６、８８７〜８９０、８９５、９４４、９４６、９４８、９５０、９５２、９５４、９５６、９５８、９６０、９６２、９６４、９６６、９６８、９７０、９７２、９７４、９７６、９７８、９８０、９８２、９８４、９８６、９８８、９９０、９９２、９９４、９９６および９９８のいずれかに示されるアミノ酸の配列；または配列番号６７、３５０、３５１、７３２〜７３３、７４３〜７４５、８３３〜８５６、８５８〜８６６、８８７〜８９０、８９５、９４４、９４６、９４８、９５０、９５２、９５４、９５６、９５８、９６０、９６２、９６４、９６６、９６８、９７０、９７２、９７４、９７６、９７８、９８０、９８２、９８４、９８６、９８８、９９０、９９２、９９４、９９６および９９８のいずれかに示されるアミノ酸の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む、請求項１４から１６のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項１８】
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｖ３２０Ｓ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３２６Ｋ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ；および
Ｋ２４Ａ／Ｑ３８Ａ／Ｒ５０Ｇ／Ｋ５８Ａ／Ｖ６０Ｉ／Ｋ８８Ａ／Ｙ９３Ｈ／Ｎ９７Ｄ／Ｒ９８Ｋ／Ｋ１２５Ａ／Ｋ１７３Ａ／Ｋ１８４Ｒ／Ｆ２０９Ｉ／Ｍ２１２Ｒ／Ｎ２１４Ｄ／Ｈ２１９Ｄ／Ｙ２２１Ｖ／Ｅ２３８Ｄ／Ｋ２５２Ａ／Ｑ２９２Ｋ／Ｖ３２０Ｇ／Ｑ３２１Ａ／Ｅ３３３Ｄ／Ａ３４５Ｔ／Ｎ３６９Ｉ／Ｓ３７７Ｙ／Ｔ４０５Ｒ／Ｎ４２９Ｇ／Ａ４３６Ｓ／Ｔ５０１Ｐ／Ｄ５３６Ｅ
の中から選択されるアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換、ならびに
１種または複数のさらなるアミノ酸置換を含む、請求項１から１７のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項１９】
非改変バレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号２〜４、２８９〜２９１、３４６、３４７、７５２、８８２、８８３および８８６のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含む、請求項１から１８のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項２０】
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼによって生成された同一テルペン生成物のパーセンテージと比較して、低減したパーセンテージのバレンセン以外のテルペン生成物を生成し、それによって、ＦＰＰを生成する宿主細胞においてシンターゼがテルペン生成物の形成を触媒する、請求項１から１９のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項２１】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、融合タンパク質またはキメラタンパク質である、請求項１から２０のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項２２】
コードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、配列番号２に示されるバレンセンシンターゼと比較して、増大した触媒活性、変更された基質特異性または変更された生成物分布を示す、請求項１から２１のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項２３】
請求項１から２２のいずれかに記載の核酸分子によってコードされる、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチド。
【請求項２４】
請求項１から２２のいずれかに記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２５】
前記ベクターが原核生物ベクター、ウイルス性ベクターまたは真核生物ベクターである、請求項２４に記載のベクター。
【請求項２６】
前記ベクターが酵母ベクターである、請求項２４または請求項２５に記載のベクター。
【請求項２７】
請求項２４から２６のいずれかに記載のベクターを含む細胞。
【請求項２８】
原核細胞または真核細胞である、請求項２７に記載の細胞。
【請求項２９】
細菌、酵母、昆虫、植物または哺乳動物細胞の中から選択される、請求項２７または請求項２８に記載の細胞。
【請求項３０】
酵母細胞であり、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属細胞またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属細胞である、請求項２９に記載の細胞。
【請求項３１】
ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）を生成する、または、非改変細胞と比較して、より多くのＦＰＰを生成するよう改変されている、請求項２７から３０のいずれかに記載の細胞。
【請求項３２】
スクアレンシンターゼをコードする遺伝子中に改変を含有し、それによって、細胞において発現されるスクアレンシンターゼの量または細胞において発現されるスクアレンシンターゼの活性が、非改変細胞と比較して低下する、請求項２７から３１のいずれかに記載の細胞。
【請求項３３】
請求項２４から２６のいずれかに記載のベクターを含むトランスジェニック植物。
【請求項３４】
柑橘類植物またはタバコ植物である、請求項３３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３５】
改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを生成する方法であって、
請求項１から２２のいずれかに記載の核酸分子または請求項２４から２６のいずれかに記載のベクターを細胞に導入すること、
前記核酸またはベクターによってコードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドの発現に適した条件下で細胞を培養すること、および、
任意に、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドを単離すること
を含む、方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法によって生成された、改変されたバレンセンシンターゼ。
【請求項３７】
バレンセンを生成する方法であって、
非環式ピロリン酸テルペン前駆体を、非環式ピロリン酸テルペン前駆体からのバレンセンの形成に適した条件下で、請求項２３もしくは請求項３６に記載の、または請求項１から２２のいずれかに記載の核酸分子によってコードされる、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドと接触させること、および
任意に、バレンセンを単離すること
を含む、方法。
【請求項３８】
非環式ピロリン酸テルペン前駆体を、改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドと接触させる工程が、インビトロまたはインビボで達成される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
バレンセンを生成する方法であって、
請求項１から２２のいずれかに記載の核酸分子または請求項２４から２６のいずれかに記載のベクターで形質転換された細胞を培養すること
を含み、それによって、
細胞が、非環式ピロリン酸テルペン前駆体を生成し、
前記核酸分子またはベクターによってコードされる改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが発現され、かつ
前記改変されたバレンセンシンターゼポリペプチドが、非環式ピロリン酸テルペン前駆体からのバレンセンの形成を触媒する、方法。
【請求項４０】
バレンセンを単離することをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
培地からバレンセンが回収され、かつ
バレンセンの回収が、有機溶媒を用いる抽出によって達成される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
回収されたバレンセンが、６８重量％超のバレンセン溶液である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
非環式ピロリン酸テルペン前駆体が、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）およびゲラニル−ゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）の中から選択される、請求項３７、３８または３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
非環式ピロリン酸テルペン前駆体がＦＰＰである、請求項３７、３８、３９または請求項４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
細胞が、細菌、酵母、昆虫、植物または哺乳動物細胞の中から選択される、請求項３９から４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
細胞が、酵母細胞であり、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞である、請求項３９から４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
細胞が、非改変細胞と比較して、より多くのＦＰＰを生成するよう改変されている、請求項３９から４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
細胞が、スクアレンシンターゼをコードする遺伝子中に改変を含有し、それによって、細胞において発現されるスクアレンシンターゼの量または細胞において発現されるスクアレンシンターゼの活性が、非改変細胞と比較して低下する、請求項３９から４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
バレンセンを酸化してヌートカトンを生成することをさらに含む、請求項３９から４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
ヌートカトンを単離することをさらに含む、請求項４９に記載の方法。
【国際調査報告】
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