(57)【要約】  細胞中の特異的内在性ｍｉＲＮＡの存在下でのみ、目的の外因性ポリヌクレオチドの発現を活性化する組成物と方法が提供される。さらに提供されるのは、例えば、標的細胞集団中でのみ選択的に毒素を発現させることによる、種々の状態および傷害の治療および診断のためのこの組成物の使用である。【選択図】なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
特異的内在性ｍｉＲＮＡを発現している細胞中でのみ目的の外因性タンパク質の発現を指示するための１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記１つまたは複数のポリヌクレオチドが外因性ＲＮＡ分子をコードし、その外因性ＲＮＡ分子が：
ａ）目的の外因性タンパク質をコードする配列；
ｂ）目的の外因性タンパク質の発現を阻害できる阻害配列；および
ｃ）前記特異的内在性ｍｉＲＮＡ用の結合部位、
を含み、それにより、前記特異的内在性ｍｉＲＮＡの存在下でのみ、外因性ＲＮＡ分子が切断部位で切断され、その結果、目的の外因性タンパク質をコードする配列から阻害配列が放出され、目的の外因性タンパク質が発現可能となる組成物。
【請求項２】
前記切断部位が前記結合部位内に位置し、その切断部位が阻害配列および目的の外因性タンパク質をコードする配列の間に位置する請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記特異的内在性ｍｉＲＮＡが切断部位での前記外因性ＲＮＡ分子の切断を指示するために、特異的内在性ｍｉＲＮＡ用前記結合部位が前記特異的内在性ｍｉＲＮＡ内の配列に対し充分な相補性を有する請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記特異的内在性ｍｉＲＮＡが、細胞マイクロＲＮＡ、ウイルスマイクロＲＮＡ、または両方である請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記内在性マイクロＲＮＡが、腫瘍性細胞中でのみ発現する請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ウイルスマイクロＲＮＡが、二本鎖ＤＮＡウイルス、単鎖ＤＮＡウイルス、二本鎖ＲＮＡウイルス、二本鎖ＲＮＡウイルス、単鎖（プラス鎖）ウイルス、単鎖（マイナス鎖）ウイルスおよびレトロウイルス、からなる群より選択されるウイルスにより発現する請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
目的の外因性タンパク質が毒素である請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記毒素が、リシン、リシンＡ鎖、アブリン、アブリンＡ鎖、ジフテリア毒素Ａ鎖およびこれらの改変型、からなる群より選択される請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記毒素が、アルファ毒素、サポリン、トウモロコシＲＩＰ、オオムギＲＩＰ、コムギＲＩＰ、ｃｏｍ  ＲＩＰ、ライムギＲＩＰ、亜麻ＲＩＰ、志賀毒素、志賀様ＲＩＰ、モモルジン、チミジンキナーゼ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、シュードモナス外毒素、シュードモナス外毒素Ａ、大腸菌シトシンデアミナーゼおよびこれらの改変型、からなる群より選択される請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記阻害配列が切断部位の上流に配置され、前記阻害配列が、前記外因性ＲＮＡ分子からの前記目的の外因性タンパク質の翻訳の効率を低減させる請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記阻害配列が複数の開始コドンを含む請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
各前記開始コドンおよび前記目的の外因性タンパク質をコードする配列が同じ読み枠にはない請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
各前記開始コドンが５’−ＡＵＧ−３’を基本的に含む請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記開始コドンがコザックコンセンサス配列内に配置される請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記阻害配列がポリペプチドに結合でき、前記ポリペプチドが、前記外因性ＲＮＡ分子からの前記目的の外因性タンパク質の翻訳の効率を低減させる請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが翻訳リプレッサータンパク質であり、前記翻訳リプレッサータンパク質が内在性翻訳リプレッサータンパク質、または組成物の１つまたは複数のポリヌクレオチドによりコードされる翻訳リプレッサータンパク質である請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記阻害配列が細胞内局在のためのＲＮＡ局在化シグナル、内在性ｍｉＲＮＡ結合部位、または両方を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物が、直接または間接的に内在性エキソヌクレアーゼの発現を阻害できる機能性ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
充分な相補性が少なくとも３０％の相補性である請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
充分な相補性が少なくとも９０％の相補性である請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
特異的内在性ｍｉＲＮＡ用の前記結合部位が、同じまたは異なる内在性ｍｉＲＮＡ対し複数の結合部位であり、前記切断部位が複数の切断部位である請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ポリヌクレオチドが１つまたは複数のＤＮＡ分子、１つまたは複数のＲＮＡ分子またはこれらの組み合わせを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記特異的内在性ｍｉＲＮＡが下記からなる群より選択される請求項１に記載の組成物：ｈｓｖ１−ｍｉＲ−Ｈ１、ｈｓｖ１−ｍｉＲ−Ｈ２、ｈｓｖ１−ｍｉＲ−Ｈ３、ｈｓｖ１−ｍｉＲ−Ｈ４、ｈｓｖ１−ｍｉＲ−Ｈ５、ｈｓｖ１−ｍｉＲ−Ｈ６、ｈｓｖ２−ｍｉＲ−Ｉ、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ２２Ａ、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ３６、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ７０、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬｌ１２、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ１４８Ｄ、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ４、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ５−Ｉ、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ５−２、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ２５−１、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ２５−２、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ３３、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−１、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−２、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−３、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−４、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−５、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−６、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−７、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−８、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−９、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−１０ａ、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−１０ｂ、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−１１、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−１２、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ２、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ３、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ４、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ５、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ６、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ７、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ８、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ９、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１０、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１１、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１２、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１４、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１５、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１６、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１７、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１８、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ２０、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＨＲＦ１−１、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＨＲＦ１−２、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＨＲＦ１−３、ｂｋｖ−ｍｉＲ−Ｂ１、ｊｃｖ−ｍｉＲ−Ｊ１、ｈｉｖ１−ｍｉＲ−Ｈ１、ｈｉｖ１−ｍｉＲ−Ｎ３６７、ｈｉｖ１−ｍｉＲ−ＴＡＲ、ｓｖ４０−ｍｉＲ−Ｓ１、ＭＣＰｙＶ−ｍｉＲ−Ｍ１、ｈｓｖ１−ｍｉＲ−ＬＡＴ、ｈｓｖ１−ｍｉＲ−ＬＡＴ−ＩＣＰ３４．５、ｈｓｖ２−ｍｉＲ−ＩＩ、ｈｓｖ２−ｍｉＲ−ＩＩＩ、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ２３、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ３６−１、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ５４−１、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ７０−１、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ２２Ａ−１、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ１１２−１、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ１４８Ｄ−１、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ４−１、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ２４、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ３３−１、ｈｃｍｖ−ＲＮＡβ２．７、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１−１、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１−２、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１−３、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＨＦＲ１、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＨＦＲ２、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＨＦＲ３、ｈｉｖ１−ｍｉＲ−ＴＡＲ−５ｐ、ｈｉｖ１−ｍｉＲ−ＴＡＲ−ｐ、ｈｉｖ１−ＨＡＡｍｉＲＮＡ、ｈｉｖ１−ＶｍｉＲＮＡｌ、ｈｉｖ１−ＶｍｉＲＮＡ２、ｈｉｖ１−ＶｍｉＲＮＡ３、ｈｉｖ１−ＶｍｉＲＮＡ４、ｍｉｒ−６７５、ｈｉｖ１−ＶｍｉＲＮＡ５、ｈｉｖ２−ｍｉＲ−ＴＡＲ２−���ｐ、ｈｉｖ２−ｍｉＲ−ＴＡＲ２−３ｐ、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ１、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ２、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ３、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ４、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ５、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ６、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ７、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ８、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ９、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ１０、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ１１、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ１２、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ１３、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ１４、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ１５、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ１６、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ１７、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ１８、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ１９、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ２０、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ２１、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ２２、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ２３、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ２４、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ２５、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ２６、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ２７、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ２８、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ２９、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ３０、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−Ｍ２３−１、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−Ｍ２３−２、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−Ｍ４４−１、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−Ｍ５５−ｌ、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−Ｍ８７−１、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−Ｍ９５−１、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−ｍ０１−１、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−ｍ０１−２、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−ｍ０１−３、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−ｍ０１−４、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−ｍ２１−１、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−ｍ２２−１、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−ｍ５９−１、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−ｍ５９−２、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−ｍ８８−１、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−Ｍ１０７−１、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−Ｍ１０８−１、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−Ｍ１０８−２、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−１、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−２、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−３、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−４、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−５、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−６、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−７、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−８、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−９、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−１０、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−１１、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−１２、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−１３、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−１４、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−１５、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−１６、ｒｒｖ−ｍｉＲ−ｒＲ１−１、ｒｒｖ−ｍｉＲ−ｒＲ１−２、ｒｒｖ−ｍｉＲ−ｒＲ１−３、ｒｒｖ−ｍｉＲ−ｒＲ１−４、ｒｒｖ−ｍｉＲ−ｒＲ１−５、ｒｒｖ−ｍｉＲ−ｒＲ１−６、ｒｒｖ−ｍｉＲ−ｒＲ１−７、ｍｇｈｖ−ｍｉＲ−Ｍ１−１、ｍｇｈｖ−ｍｉＲ−Ｍ１−２、ｍｇｈｖ−ｍｉＲ−Ｍ１−３、ｍｇｈｖ−ｍｉＲ−Ｍ１−４、ｍｇｈｖ−ｍｉＲ−Ｍ１−５、ｍｇｈｖ−ｍｉＲ−Ｍ１−６、ｍｇｈｖ−ｍｉＲ−Ｍ１−７、ｍｇｈｖ−ｍｉＲ−Ｍ１−８、ｍｇｈｖ−ｍｉＲ−Ｍ１−９およびｓｖ４０−ｍｉＲ−Ｓ１。
【請求項２４】
前記外因性ＲＮＡ分子が、開始コドンおよび前記目的のタンパク質をコードする配列の出発コドンの間に位置する停止コドンをさらに含み、前記停止コドンおよび前記開始コドンが同じ読み枠にあり、前記停止コドンが、５’−ＵＡＡ−３’、５’−ＵＡＧ−３’および５’−ＵＧＡ−３’、からなる群より選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記阻害配列が目的の外因性タンパク質をコードする配列の上流に配置され、阻害配列が−３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満の折り畳み自由エネルギーを有する二次構造を形成でき、それにより、前記二次構造が、スキャニングリボソームが前記目的の外因性タンパク質の出発コドンに到達するのを阻止するのに充分である請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
前記細胞が、ヒト細胞、動物細胞、培養細胞および植物細胞、からなる群より選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物が細胞中に導入される請求項１に記載の組成物。
【請求項２８】
前記細胞が生物体中に存在する請求項１に記載の組成物。
【請求項２９】
請求項１の組成物を含む診断キット。
【請求項３０】
請求項１の組成物および１つまたは複数の賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項３１】
標的細胞の死滅を標的にする方法であって、標的細胞中に請求項１の組成物の導入を含み、標的細胞が特異的内在性ｍｉＲＮＡを含む方法。
【請求項３２】
外因性ＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターであって、前記外因性ＲＮＡ分子が、
ａ）目的の外因性タンパク質をコードする配列；
ｂ）目的の外因性タンパク質の発現を阻害できる阻害配列；および
ｃ）特異的内在性ｍｉＲＮＡ用の結合部位、
を含むベクター。
【請求項３３】
前記ベクターがウイルスベクターである請求項３２に記載のベクター。
【請求項３４】
前記ベクターが非ウイルスベクターである請求項３２に記載のベクター。
【請求項３５】
ベクターを前記特異的内在性ｍｉＲＮＡを含む細胞中に導入するに場合に、特異的内在性ｍｉＲＮＡが切断部位での前記外因性ＲＮＡ分子の切断を指示するために、特異的内在性ｍｉＲＮＡ用の前記結合部位が特異的内在性ｍｉＲＮＡ内の配列に対し充分な相補性である請求項３２に記載のベクター。
【請求項３６】
前記切断部位が特異的内在性ｍｉＲＮＡ用の前記結合部位内に位置し、切断部位が阻害配列および目的の外因性タンパク質をコードする配列の間に位置する請求項３２に記載のベクター。
【請求項３７】
特異的内在性ｍｉＲＮＡが細胞マイクロＲＮＡ、ウイルスマイクロＲＮＡ、または両方である請求項３６に記載のベクター。
【請求項３８】
前記内在性マイクロＲＮＡが腫瘍細胞中でのみ発現する請求項３２に記載の組成物。
【請求項３９】
前記ウイルスマイクロＲＮＡが、二本鎖ＤＮＡウイルス、単鎖ＤＮＡウイルス、二本鎖ＲＮＡウイルス、二本鎖ＲＮＡウイルス、単鎖（プラス鎖）ウイルス、単鎖（マイナス鎖）ウイルスおよびレトロウイルス、からなる群より選択されるウイルスにより発現する請求項３７に記載の組成物。
【請求項４０】
目的の外因性タンパク質が、毒素である請求項３２に記載の組成物。
【請求項４１】
前記毒素が、リシン、リシンＡ鎖、アブリン、アブリンＡ鎖、ジフテリア毒素Ａ鎖およびこれらの改変型、からなる群より選択される請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記毒素が、アルファ毒素、サポリン、トウモロコシＲＩＰ、オオムギＲＩＰ、コムギＲＩＰ、ｃｏｍ  ＲＩＰ、ライムギＲＩＰ、亜麻ＲＩＰ、志賀毒素、志賀様ＲＩＰ、モモルジン、チミジンキナーゼ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、シュードモナス外毒素、シュードモナス外毒素Ａ、大腸菌シトシンデアミナーゼおよびこれらの改変型、からなる群より選択される請求項４０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞中の特異的内在性ｍｉＲＮＡの存在下のみで、目的の外因性のポリヌクレオチドの発現を活性化する組成物に関する。本発明は、さらに、標的細胞集団中でのみ毒素の発現を選択的に活性化する場合の例に見られるような、様々な状態および傷害の治療および診断に対するこの組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスは、地球上で最も種類の豊富な生物学的実体であり、また、ウイルスは、ヒトの癌の発生に対する２番目に重要なリスク因子であると思われる。ＷＨＯ（世界保健機関）国際癌研究機関は、２００２年に、ヒト癌の約１５％が７つの異なるウイルスが原因であると推定した。ウイルスは、それらのゲノム中の癌遺伝子に起因して発癌性である可能性がある。レトロウイルスは、また、遺伝子を切断する部位、または強力なウイルスのシス作用性調節配列の制御下に遺伝子を置く部位での組込みに起因して、発癌性である可能性がある。ＷＨＯによると、２００６年には、世界中でＨＩＶ患者は約３９５０万人であった。ＨＩＶを含む多くのウイルスが休止または潜伏期を示し、その間、タンパク質合成はほとんど、または全く行われない。この間、ウイルス感染は、基本的に免疫系には不可視である。現在の抗ウイルス療法は、潜在型ウイルス保有細胞の除去に対しては概して効果がない［１］。
【０００３】
米国癌学会によると、２００７年に世界中で７６００万人が癌で死亡した。各腫瘍は、平均で９０変異体遺伝子を含み［２］、それぞれの腫瘍は、ただ1つの創始細胞から開始される［３３］。癌治療の本質、および癌治療に対する基本的手法は、常に変化している。放射線療法、手術および血管新生の抑制、等の癌治療のための手法は、多くの小さな転移に対しては有用ではない。細胞分裂の抑制および細胞分裂中の細胞の破壊、等の癌治療のための手法は、特異的ではなく、従って、患者を死に至らしめる有害な副作用を引き起こす。腫瘍組織分化の誘導、癌遺伝子の抑制、癌細胞に固有の膜受容体タンパク質に対するリガンドを含むウイルス、免疫系の操作および免疫毒素療法（ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）、等の癌治療のための手法は、治療指数が小さく、通常、十分に効果的ではない。癌抑制遺伝子を使った癌治療のための手法や、癌細胞中で独自に活性化しているプロモーター下での毒素を使った癌治療のための手法は、治療指数が小さく、また、有害な副作用を引き起こす可能性が大きく、通常、充分に効果的ではない。
【０００４】
リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）は、植物または微生物の由来のタンパク質毒素である。ＲＩＰは、リボソームを不活化することによりタンパク質合成を阻害する。最近の調査は、ＲＩＰは、また、アポトーシスによる細胞死を誘導できることを示唆している。２型ＲＩＰは、ジスルフィド結合で一緒に連結された毒性Ａ鎖およびレクチン様サブユニット（Ｂ鎖）を含む。Ｂ鎖は、触媒的に不活性であるが、Ａ−Ｂタンパク質複合体のサイトゾルへの移行を媒介する役割を果たす。リシン、アブリンおよびジフテリア毒素は、非常に強力な２型ＲＩＰである。サイトゾルに到達したリシンまたはアブリンのただ1つの分子でも、その細胞を死滅させることができることが報告されている［３、４］。さらに、細胞中に導入されたジフテリア毒素断片Ａのただ1つの分子でも、細胞を死滅させることができる［５］。
【０００５】
哺乳動物細胞では、キャップ（７−メチルグアノシンキャップ）のｍＲＮＡの５’末端への付加が、ｍＲＮＡの翻訳を３５〜５０倍増加させる。さらに、ｍＲＮＡの３’末端へのポリ（Ａ）テールの付加は、ｍＲＮＡの翻訳を１１４〜１５５倍増加させる［６］。哺乳動物細胞中のポリ（Ａ）テールは、機能性ｍＲＮＡの半減期を２．６倍しか増加させず、キャップは、機能性ｍＲＮＡの半減期を１．７倍しか増加させない［６］。ヒトＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＣ（Ｈ２ａｃ）遺伝子は、ヒストンＨ２Ａファミリーのメンバーをコードする。この遺伝子の転写物は、ポリ（Ａ）テールを欠くが、代わりに、３’−ＵＴＲで保存されたステムループ構造を形成する回文構造終端配列（５’−ＧＧＣＵＣＵＵＵＵＣＡＧＡＧＣＣ−３’）を含み、これは、ｍＲＮＡのプロセッシングおよび安定性に重要な役割を果たす［７］。
【０００６】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、その機能が阻害されるべき標的遺伝子の特定の領域に相同なセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡから構成されるｄｓＲＮＡが、標的遺伝子転写物の相同領域の切断に影響を与える現象である。哺乳動物では、ｄｓＲＮＡは、アポトーシスによる細胞死の原因となる可能性のあるインターフェロン応答の誘導を避けるために、３１塩基対より短くなければならない。この技術が持つ治療に対する大きな可能性を理由として、２００６年のノーベル医学生理学賞は、ＲＮＡｉ分野に贈呈された。しかし、ＲＮＡｉ技術は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を利用して転写後遺伝子発現を調節するという天然の機序に基づいている［８］。ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡステムループ構造の形成が想定される７０〜９０ヌクレオチド（ｎｔ）前駆物質に由来するように見える約２１ヌクレオチド長さの非常に小さなＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、線虫、ショウジョウバエ、ヒトおよび植物、等の多様な生物中で発現する。
【０００７】
哺乳動物では、ｍｉＲＮＡは、通常、ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより転写され、得られた１次転写物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）は、局所的ステムループ構造を含み、これは、ドローシャ−ＤＧＣＲ８複合体により切断される。この切断の産物は、１つまたは複数の（クラスターの場合には）前駆物質ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）である。Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、通常、強力なステムループ構造を有する７０〜９０ヌクレオチド長を有し、それらは、通常、３’末端に２ヌクレオチドオーバーハングを含む［９］。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、エクスポーチン−５により細胞質に運ばれる。細胞質では、ＲＮａｓｅＩＩＩファミリーのエンドリボヌクレアーゼであるダイサー酵素が、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ中のステムをｄｓＲＮＡとして認識し、切断し、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの３’および５’末端から２１ｂｐのｄｓＲＮＡ（二本鎖ｍｉＲＮＡ）を放出する。２つの二本鎖はダイサー−ＴＲＢＰ複合体により相互から分離され、熱力学的に弱い５’末端を有する鎖はＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中に組み込まれる［１０］。この鎖が、成熟ｍｉＲＮＡである。ＲＩＳＣに組み込まれない鎖は、ｍｉＲＮＡ＊鎖と呼ばれ、分解される［８］。成熟ｍｉＲＮＡは、ＲＩＳＣをｍＲＮＡ内の標的部位に導く。標的部位が成熟ｍｉＲＮＡに対し完全な相補性に近い場合は、ｍＲＮＡは、標的部位の３’末端から約１０ヌクレオチド上流の位置で切断される［１０］。切断後、ＲＩＳＣ−成熟ｍｉＲＮＡ鎖複合体は、別の作用のためにリサイクルされる［１１］。標的部位が成熟ｍｉＲＮＡに対しより低い相補性である場合は、ｍＲＮＡは、標的部位で切断されないが、ｍＲＮＡの翻訳は、抑制される。これまでヒトで約５３０のｍｉＲＮＡが特定されてきたが、脊椎動物ゲノムは、１，０００にも達する固有のｍｉＲＮＡをコードすると推定されており、これらは、遺伝子の少なくとも３０％の発現を調節すると予想されている（［１２］および図１）。
【０００８】
マイクロＲＮＡは、ヒト癌の開始と進行に重要な役割を果たすと思われ、癌にある種の役割を有するこれらのものは、発癌性ｍｉＲＮＡ（ｏｎｃｏｍｉＲ）と表記される［１２］。経済的に発展した国々の成人で最も多い癌の１つである肺癌では、ｍｉＲＮＡクラスターｍｉＲ−１７−９２の発現が強く上方制御されており、ｍｉＲ−１７−９２の想定される標的は、２つの既知の癌抑制遺伝子ＰＴＥＮとＲＢ２である［８］。甲状腺乳頭癌（ＰＴＣ）では、３つのｍｉＲＮＡｓ：ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２およびｍｉＲ−１４６が、対応する健康組織中よりも高いレベルで蓄積している［８］。最も多い脳癌の形態である多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）では、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２１が、正常組織中よりも高いレベルで蓄積している［８］。リンパ球の癌であるＢ細胞由来リンパ腫では、ｍｉＲ−１５５が、正常なリンパ球細胞中よりも極めて高いレベルで蓄積している［８］。転移性乳癌では、転写因子Ｔｗｉｓｔが、健康な、または非転移性腫瘍化細胞に比べて、ｍｉＲ−１０ｂ発現を上方制御している。ｍｉＲ−１０ｂの標的はＨＯＸＤ１０であり、ＨＯＸＤ１０レベルの低減は、より高いレベルのＲＨＯＣをもたらし、これは、癌細胞運動性を刺激する［８］。
【０００９】
コンピュータ手法および高スループット検証により可能となったゲノム全体での選別により、ウイルスによりコードされた約１４１マイクロＲＮＡ前駆物質が見つかっており［３４、３５］、これらのマイクロＲＮＡの大部分は、ヘルペスウイルス、カポジ肉腫ヘルペスウイルスまたはエプスタインバーウイルスのような多くのヒト発癌性ウイルスを含むヘルペスウイルスファミリーによりコードされている［１３］。多くのウイルス性ｍｉＲＮＡは、潜在型転写に関連するゲノム領域中および周辺のクラスター内に位置している［２０］。３つのα−ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス−１（ＨＳＶ−１）ならびにマレック病ウイルス−１および２（ＭＤＶ−１およびＭＤＶ−２）は、３つ全てのウイルスの潜伏感染の間に検出されたノンコーディングＲＮＡである少数の潜伏関連転写物の近く、またはその中のｍｉＲＮＡをコードすることが示された［２０］。複数のｍｉＲＮＡが、γ−ヘルペスウイルスに属するエプスタインバーウイルスの２つのゲノム領域で特定されており、形質転換されたＢ細胞株の潜伏感染の間に発現する［２０］。マウスｙ−ヘルペスウイルス−６８（ＭＨＶ−６８）では、以前に潜在型マーカーとして特定されたｔＲＮＡ−様転写物は、多くのｍｉＲＮＡをコードすることが明らかになり、一方、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）による大部分のｍｉＲＮＡ発現は、同様に潜在型遺伝子発現に関連するただ1つの転写物から処理される［２０］。他の調査は、潜伏感染への罹患、および／またはその感染の維持におけるＨＩＶコードマイクロＲＮＡの役割を示唆している［１、１４］。
【００１０】
癌の原因となる多くのウイルスがｍｉＲＮＡをコードし、潜伏感染の原因となりうる。例えば、ＫＳＨＶウイルスは、カポジ肉腫の原因となり、１３のｍｉＲＮＡをエンコードする［１３］。例えば、ＳＶ４０（サル空胞ウイルス４０）は、腫瘍の原因となる可能性があるが、多くの場合、潜伏感染として存続する。ＳＶ４０は、２つのコードされた、その遺伝子に対し完全にアンチセンスなｍｉＲＮＡを介してそのラージＴ抗原の発現を調節し、これらのｍｉＲＮＡの発現は、ラージＴ抗原転写物の切断に繋がる［２０］。例えば、ＥＢＶは、２３のｍｉＲＮＡをコードし、ＥＢＶｍｉＲＮＡの発現は、Ｂ細胞バーキットリンパ腫、ＥＢＶおよびＥＢＶ関連胃癌（ＥＢＶａＧＣ）に感染した上咽頭癌細胞で観察された［１３、２１］。例えば、ＨＣＭＶは、１５のｍｉＲＮＡをコードし、最近の調査は、特定の悪性腫瘍、例えば、結腸癌、悪性神経膠腫、前立腺癌、および乳癌の患者の９０％を越える腫瘍細胞中に、ＨＣＭＶのゲノムおよび抗原の存在を示している（しかし、隣接する正常組織中には存在しない）［３６］。さらに、神経膠腫の異なる組織型におけるＨＣＭＶの検出により、多形神経膠芽腫中のＨＣＭＶ陽性細胞は、低級腫瘍の４８％に比べて、７９％であることが示された［３６］。ＨＣＭＶは、多くの利害（例えば、ヌクレオチド合成、ＤＮＡ複製、免疫系からの回避およびアポトーシスからの回避）を共有しているために、腫瘍細胞の悪性度を高める可能性がある。現在の抗ウイルス治療法の多くは、潜在型ウイルス保有細胞の除去に対して有効でない［１］。
【００１１】
一部のウイルスｍｉＲＮＡは、ｏｎｃｏｍｉＲ（癌に関与すると解っているｍｉＲＮＡ）のオーソログ（共通の先祖であるために、相互に類似である異なる種の遺伝子）である［３５］。オルソロガスなウイルスｍｉＲＮＡの例は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５のオーソログであるＫＳＨＶのＫＳＨＶ−ｍｉＲ−Ｋ１２−１１である。これは、Ｂ細胞リンパ腫、白血病、膵臓癌および乳癌で高発現している［３５］。別の例は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ａ／ｂのオーソログであるＥＢＶのＥＢＶ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ５である。ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ａ／ｂは、肺癌、組織非形成性甲状腺癌細胞およびヒトＢ細胞リンパ腫で高発現しているｈｓａ−ｍｉＲ−１７−９２クラスターからコードされている［３５］。
【００１２】
ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）は、多発性硬化症、心筋炎、脳炎および熱性痙攣の病原体の可能性があるとして特定された。側頭葉切除術検体の調査により、ＭＴＳ（内側側頭葉硬化症）患者の約２／３で海馬星状細胞中の活性ＨＨＶ６Ｂ複製の証拠が示された［３７］。ＨＨＶ６は、ベータヘルペスウイルス亜科（ヘルペスウイルス科のサブファミリー）のメンバーであり、これは、また、ＨＣＭＶ（１５のｍｉＲＮＡを含む）を含み、従って、ＨＨＶ６も多くのｍｉＲＮＡを含むことができる。
【００１３】
いくつかのｍｉＲＮＡを使った治療の可能性を提案してきた。１つの手法は、標的細胞のウイルス転写物または癌遺伝子転写物中の超保存領域に対してマイクロＲＮＡまたは低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を論理的に構築することである［８］。しかし、この手法では、ウイルス転写物または癌遺伝子転写物の切断は、通常、標的細胞を死滅させない。他の手法は、抗ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＡＭＯ）を使って発癌性またはウイルスｍｉＲＮＡを遮断することである。ＡＭＯは、ｍｉＲＮＡに相補的配列を有しｍｉＲＮＡを定量除去できる強力な結合が得られる化学的修飾を含む。１つのタイプの修飾は、ＲＮＡヌクレオチドの２’−Ｏ−メチル化であり、他のタイプの修飾は、ロックド核酸（ＬＮＡ）ＤＮＡヌクレオチドである［８］。しかし、この手法には、少なくとも２つの問題がある：一つ目は、ＡＭＯによる発癌性またはウイルスｍｉＲＮＡの遮断は、通常、標的細胞を死滅させないことであり、２つ目は、ＡＭＯは、細胞中で転写されることができず、従って、大部分のｍｉＲＮＡコピー数を定量除去するために、各標的細胞に対しＡＭＯの大量の挿入が必要である事である。例えば、国際公開第０７／０００６８号で開示の別の手法は、遺伝子ベクターを対象とし、対応するｍｉＲＮＡを含む細胞中の導入遺伝子の発現を防ぐか、または減らすためのｍｉＲＮＡ配列標的およびその使用を含む。また、例えば、国際公開第２０１０／０５５４１３号では、導入遺伝子に機能的に連結された調節配列を含む末梢器官細胞中での導入遺伝子の一過性発現に適合された遺伝子ベクターが開示され、調節配列が造血系細胞中の前記導入遺伝子の発現を防ぐか、または減らす。
【００１４】
従って、使用に際し、強力で、信頼性があり、特異的および安全であり、また、特異的内在性ｍｉＲＮＡを含む特異的標的細胞中でのみ目的の外因性のタンパク質を選択的に発現および／または活性化することができ、特異的内在性ｍｉＲＮＡを含まない他の細胞中ではそれができない新規組成物を開発するニーズがある。この組成物は、特異的内在性ｍｉＲＮＡを含まない他の細胞には何らの影響も与えず、特異的内在性ｍｉＲＮＡを含む標的細胞を選択的に死滅させることができるのが好ましい。
【発明の概要】
【００１５】
いくつかの実施形態に従って、細胞中の特異的内在性細胞またはウイルスｍｉＲＮＡの存在に応答して、目的の外因性タンパク質を発現させる組成物が提供される。組成物は、下記を含む外因性のＲＮＡ分子を含むか、または転写する：
（ａ）目的の外因性タンパク質をコードする配列；
（ｂ）目的の外因性タンパク質の発現を阻害できる阻害配列；および
（ｃ）特異的内在性ｍｉＲＮＡの成熟ｍｉＲＮＡ鎖に対し、切断部位で外因性ＲＮＡ分子の切断を指示するのに充分に相補性である結合部位。所定の標的切断部位は、阻害配列および目的の外因性タンパク質をコードする配列の間に配置されるように設計される。
【００１６】
従って、細胞中の特異的内在性ｍｉＲＮＡの存在下、外因性ＲＮＡ分子は、特異的内在性ｍｉＲＮＡにより切断部位で切断され、阻害配列が目的の外因性タンパク質をコードする配列から切り離されて、その結果、目的の外因性タンパク質が発現できる。
【００１７】
一部の実施形態では、目的の外因性タンパク質は、限定されないが、タンパク質毒素、リシン、アブリンおよびジフテリア毒素、タンパク質毒素含有融合タンパク質、等から選択できる。特異的内在性ｍｉＲＮＡは、細胞中で発現する、例えば、限定されないが、細胞ｍｉＲＮＡ、発癌性ｍｉＲＮＡ、ウイルスｍｉＲＮＡ、等、またはこれらのいずれかの組み合わせ、等のいずれかのｍｉＲＮＡから選択できる。阻害配列は、切断部位の下流または上流に配置できる。
【００１８】
一部の実施形態では、切断部位の上流に位置する阻害配列は、例えば、限定されないが、複数の開始コドンであってもよく、この場合、それぞれの開始コドンは、コザックコンセンサス配列（または他のいずれかの翻訳開始配列）内に配置されても、また、それぞれの開始コドンおよび目的の外因性タンパク質をコードする配列が同じ読み枠中になくてもよい。このような設定では、これらの開始コドンは、目的の外因性タンパク質の発現を抑制する。本発明の別の実施形態では、切断部位の上流に配置される阻害配列は、例えば、限定されないが、選別グシグナル、細胞内局在のためのＲＮＡ局在化シグナル、ユビキチン分解シグナル、ＡＵリッチ領域（ＡＲＥ）、翻訳リプレッサー認識部位、リボソームスキャニングの阻止に充分な２次構造、等、またはこれらの組み合わせ、であってもよい。１つの代表的実施形態では、外因性ＲＮＡ分子は、切断部位のすぐ上流に配置される阻害配列領域の第１の配列を含み、この第１の配列が、切断部位のすぐ下流に配置される第２の配列に結合できる。従って、インタクト外因性ＲＮＡ分子では、第１および第２の配列がリボソームスキャニングを阻止できる２次構造を形成し、また、特に、切断された外因性ＲＮＡ分子中で、第２の配列は、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）構造を形成できる。
【００１９】
さらなる実施形態では、切断部位の上流に阻害配列を有する外因性ＲＮＡ分子配列は、また、直接または間接的に阻害配列の上流の部位での外因性ＲＮＡ分子の切断に影響を与えることができる配列または成分を含む。従って、これは、インタクト外因性ＲＮＡ分子の翻訳の効率を下げることができる。
【００２０】
さらなる実施形態では、本発明の組成物は、５’末端で切断されうる外因性ＲＮＡ分子の翻訳の効率を上げることができる１つまたは複数の追加の構造をさらに含んでもよい。１つまたは複数の追加の構造は、限定されないが、例えば、切断された外因性ＲＮＡ分子の環状化の形成が可能な、従って、切断された外因性ＲＮＡ分子の翻訳の効率を上げることができるヌクレオチド配列、であってもよい。
【００２１】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、様々な適用、方法および技術に使用でき、例えば、限定されないが、遺伝子発現の調節、種々の状態および傷害、例えば、健康関連状態の種々の疾患診断を含む様々な状態および傷害の治療、形質転換体の形成、例えば癌等の増殖性疾患の治療のための自殺遺伝子治療；ＨＩＶ等の遺伝的感染症の治療のための自殺遺伝子治療、等に使用できる。
【００２２】
一部の実施形態では、特異的内在性ｍｉＲＮＡを発現する細胞中でのみ目的の外因性タンパク質の発現を指示する１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む組成物が提供され、前記１つまたは複数の外因性ＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドが：目的の外因性タンパク質をコードする配列；目的の外因性タンパク質の発現を阻害できる阻害配列；および前記特異的内在性ｍｉＲＮＡ用結合部位を含み、それにより、前記特異的内在性ｍｉＲＮＡの存在下でのみ、外因性ＲＮＡ分子が切断部位で切断されて目的の外因性タンパク質をコードする配列から阻害配列が切り離され、その結果、目的の外因性タンパク質が発現されうる。一部の実施形態では、充分な相補性は、少なくとも３０％の相補性である。他の実施形態では、充分な相補性は、少なくとも９０％の相補性である。
【００２３】
一部の実施形態では、切断部位は、結合部位内に配置され、切断部位は、前記阻害配列および目的の外因性タンパク質をコードする配列の間に配置される。
【００２４】
一部の実施形態では、特異的内在性ｍｉＲＮＡ用結合部位は、前記特異的内在性ｍｉＲＮＡが前記外因性ＲＮＡ分子の切断部位での切断を指示するために、前記特異的内在性ｍｉＲＮＡ内の配列に対し充分な相補性である。
【００２５】
さらなる実施形態では、特異的内在性ｍｉＲＮＡは、細胞マイクロＲＮＡ、ウイルスマイクロＲＮＡ、または両方である。一部の実施形態では、細胞マイクロＲＮＡは、腫瘍細胞中でのみ発現する。一部の実施形態では、ウイルスマイクロＲＮＡは、二本鎖ＤＮＡウイルス、単鎖ＤＮＡウイルス、二本鎖ＲＮＡウイルス、二本鎖ＲＮＡウイルス、単鎖（プラス鎖）ウイルス、単鎖（マイナス鎖）ウイルスおよびレトロウイルス、からなる群より選択されるウイルスにより発現される。
【００２６】
一部の実施形態では、目的の外因性タンパク質は、毒素である。毒素は、リシン、リシンＡ鎖、アブリン、アブリンＡ鎖、ジフテリア毒素Ａ鎖およびそれらの改変型、からなる群より選択されてもよい。一部の実施形態では、毒素は、アルファ毒素、サポリン、トウモロコシＲＩＰ、オオムギＲＩＰ、コムギＲＩＰ、ｃｏｍ  ＲＩＰ、ライムギＲＩＰ、亜麻ＲＩＰ、志賀毒素、志賀様ＲＩＰ、モモルジン、チミジンキナーゼ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、シュードモナス外毒素、シュードモナス外毒素Ａ、大腸菌シトシンデアミナーゼおよびそれらの改変型、からなる群より選択される。
【００２７】
さらなる実施形態では、阻害配列は、切断部位の上流に配置でき、また、阻害配列は、直接、または間接的に外因性ＲＮＡ分子からの前記目的の外因性タンパク質の翻訳の効率を小さくすることができる。
【００２８】
一部の実施形態では、阻害配列は、複数の開始コドンを含む。さらなる実施形態では、それぞれの開始コドンおよび目的の外因性タンパク質をコードする配列は、同じ読み枠中にはない。一部の実施形態では、それぞれの前記開始コドンは、基本的に５’−ＡＵＧ−３’から構成される。一部の実施形態では、それぞれの開始コドンは、コザックコンセンサス配列内に配置できる。
【００２９】
さらなる実施形態では、阻害配列は、ポリペプチドに結合でき、ポリペプチドは、直接、または間接的に、外因性ＲＮＡ分子からの前記目的の外因性タンパク質の翻訳の効率を下げることができる。ポリペプチドは、翻訳リプレッサータンパク質であってもよく、この場合、翻訳リプレッサータンパク質は、内在性翻訳リプレッサータンパク質であるか、または組成物の１つまたは複数のポリヌクレオチドによりコードされる。
【００３０】
一部の実施形態では、阻害配列は、細胞内局在のためのＲＮＡ局在化シグナルまたは内在性ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
【００３１】
一部の実施形態では、組成物の１つまたは複数のポリヌクレオチドは、直接、または間接的に内在性エキソヌクレアーゼの発現を阻害できる機能性ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。
【００３２】
一部の実施形態では、特異的内在性ｍｉＲＮＡ用結合部位は、同じまたは異なる内在性ｍｉＲＮＡ用の複数の結合部位であり、この場合、前記切断部位は、複数の切断部位である。
【００３３】
一部の実施形態では、特異的内在性ｍｉＲＮＡは、下記からなる群より選択される：ｈｓｖ１−ｍｉＲ−Ｈ１、ｈｓｖ１−ｍｉＲ−Ｈ２、ｈｓｖ１−ｍｉＲ−Ｈ３、ｈｓｖ１−ｍｉＲ−Ｈ４、ｈｓｖ１−ｍｉＲ−Ｈ５、ｈｓｖ１−ｍｉＲ−Ｈ６、ｈｓｖ２−ｍｉＲ−Ｉ、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ２２Ａ、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ３６、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ７０、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ１１２、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ１４８Ｄ、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ４、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ５−１、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ５−２、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ２５−ｌ、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ２５−２、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ３３、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−１、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−２、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−３、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−４、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−５、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−６、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−７、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−８、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−９、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−１０ａ、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−１０ｂ、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−１１、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−１２、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ２、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ３、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ４、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ５、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ６、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ７、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ８、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ９、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１０、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１１、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１２、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１４、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１５、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１６、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１７、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１８、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ２０、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＨＲＦ１−１、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＨＲＦ１−２、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＨＲＦ１−３、ｂｋｖ−ｍｉＲ−Ｂ１、ｊｃｖ−ｍｉＲ−Ｊ１、ｈｉｖ１−ｍｉＲ−Ｈ１、ｈｉｖ１−ｍｉＲ−Ｎ３６７、ｈｉｖ１−ｍｉＲ−ＴＡＲ、ｓｖ４０−ｍｉＲ−Ｓ１、ＭＣＰｙＶ−ｍｉＲ−Ｍ１、ｈｓｖ１−ｍｉＲ−ＬＡＴ、ｈｓｖ１−ｍｉＲ−ＬＡＴ−ＩＣＰ３４．５、ｈｓｖ２−ｍｉＲ−ＩＩ、ｈｓｖ２−ｍｉＲ−ＩＩＩ、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ２３、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ３６−１、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ５４−１、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ７０−１、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ２２Ａ−１、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ１１２−１、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ１４８Ｄ−１、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ４−１、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ２４、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ３３−１、ｈｃｍｖ−ＲＮＡ／７２．７、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１−１、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１−２、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１−３、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＨＦＲ１、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＨＦＲ２、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＨＦＲ３、ｈｉｖ１−ｍｉＲ−ＴＡＲ−５ｐ、ｈｉｖ１−ｍｉＲ−ＴＡＲ−ｐ、ｈｉｖ１−ＨＡＡｍｉＲＮＡ、ｈｉｖ１−ＶｍｉＲＮＡ１、ｈｉｖ１−ＶｍｉＲＮＡ２、ｈｉｖ１−ＶｍｉＲＮＡ３、ｈｉｖ１−ＶｍｉＲＮＡ４、ｍｉｒ−６７５、ｈｉｖ１−ＶｍｉＲＮＡ５、ｈｉｖ２−ｍｉＲ−ＴＡＲ２−５ｐ、ｈｉｖ２−ｍｉＲ−ＴＡＲ２−３ｐ、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ１、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ２、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ３、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ４、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ５、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ６、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ７、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ８、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ９、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ１０、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ１１、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ１２、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ１３、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ１４、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ１５、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ１６、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ１７、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ１８、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ１９、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ２０、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ２１、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ２２、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ２３、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ２４、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ２５、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ２６、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ２７、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ２８、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ２９、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ３０、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−Ｍ２３−１、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−Ｍ２３−２、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−Ｍ４４−１、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−Ｍ５５−１、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−Ｍ８７−１、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−Ｍ９５−１、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−ｍ０１−１、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−ｍ０１−２、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−ｍ０１−３、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−ｍ０１−４、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−ｍ２１−１、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−ｍ２２−１、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−ｍ５９−１、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−ｍ５９−２、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−ｍ８８−１、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−Ｍ１０７−１、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−Ｍ１０８−１、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−Ｍ１０８−２、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−１、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−２、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−３、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−４、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−５、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−６、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−７、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−８、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−９、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−１０、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−１１、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−１２、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−１３、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−１４、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−１５、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−１６、ｒｒｖ−ｍｉＲ−ｒＲ１−１、ｒｒｖ−ｍｉＲ−ｒＲ１−２、ｒｒｖ−ｍｉＲ−ｒＲ１−３、ｒｒｖ−ｍｉＲ−ｒＲ１−４、ｒｒｖ−ｍｉＲ−ｒＲ１−５、ｒｒｖ−ｍｉＲ−ｒＲ１−６、ｒｒｖ−ｍｉＲ−ｒＲ１−７、ｍｇｈｖ−ｍｉＲ−Ｍ１−１、ｍｇｈｖ−ｍｉＲ−Ｍ１−２、ｍｇｈｖ−ｍｉＲ−Ｍ１−３、ｍｇｈｖ−ｍｉＲ−Ｍ１−４、ｍｇｈｖ−ｍｉＲ−Ｍ１−５、ｍｇｈｖ−ｍｉＲ−Ｍ１−６、ｍｇｈｖ−ｍｉＲ−Ｍｌ−７、ｍｇｈｖ−ｍｉＲ−Ｍ１−８、ｍｇｈｖ−ｍｉＲ−Ｍ１−９およびｓｖ４０−ｍｉＲ−Ｓ１。これらの命名法および配列は、データベースｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／で定義されている。
【００３４】
一部の実施形態では、外因性ＲＮＡ分子は、開始コドンと前記目的のタンパク質をコードする配列の出発コドンの間に配置される停止コドンをさらに含み、前記停止コドンおよび前記開始コドンは、同じ読み枠にあり、前記停止コドンは、５’−ＵＡＡ−３’、５’−ＵＡＧ−３’および５’−ＵＧＡ−３’、からなる群より選択される。
【００３５】
さらなる実施形態では、阻害配列は、目的の外因性タンパク質をコードする配列の上流に配置され、阻害配列は、−３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満の折り畳み自由エネルギーを有する２次構造を形成でき、また、前記２次構造は、スキャニングリボソームが前記目的の外因性タンパク質の出発コドンへ到達するのを阻止するのに充分である。
【００３６】
さらなる実施形態では、組成物の１つまたは複数のポリヌクレオチドは、１つまたは複数のＤＮＡ分子、１つまたは複数のＲＮＡ分子またはそれらの組み合わせを含む。
【００３７】
さらなる実施形態では、細胞は：ヒト細胞、動物細胞、培養細胞および植物細胞、からなる群より選択される。一部の実施形態では、細胞は、腫瘍性細胞である。さらなる実施形態では、細胞は、生物体中に存在する。
【００３８】
一部の実施形態では、組成物は、細胞に導入される。細胞は、腫瘍性細胞であってもよく、また、それは生物体中に存在してもよい。
【００３９】
一部の実施形態では、さらに、組成物を含む診断キットが提供される。
【００４０】
さらなる実施形態では、組成物を含む医薬組成物が提供され、これは、１つまたは複数のポリヌクレオチド、および１つまたは複数の賦形剤を含む。
【００４１】
さらなる実施形態では、特異的内在性ｍｉＲＮＡを含む標的細胞の死滅を標的にする方法が提供され、この方法は、標的細胞中に１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む組成物の導入を含む。
【００４２】
一部の実施形態では、外因性ＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターが提供され、前記外因性ＲＮＡ分子は、目的の外因性タンパク質をコードする配列；目的の外因性タンパク質の発現を阻害できる阻害配列；および特異的内在性ｍｉＲＮＡに用結合部位、を含む。ベクターは、ウイルスベクターであってもよい。ベクターは、非ウイルスベクターであってもよい。一部の実施形態では、特異的内在性ｍｉＲＮＡ用結合部位は、ベクターの前記特異的内在性ｍｉＲＮＡ含有細胞中への導入に際し、特異的内在性ｍｉＲＮＡが前記外因性ＲＮＡ分子の切断部位での切断を指示するために、特異的内在性ｍｉＲＮＡ内の配列に対し充分に相補性である。さらなる実施形態では、切断部位は、特異的内在性ｍｉＲＮＡ用結合部位内に配置でき、また、切断部位は、阻害配列および目的の外因性タンパク質をコードする配列の間に配置できる。さらなる実施形態では、特異的内在性ｍｉＲＮＡは、細胞マイクロＲＮＡ、ウイルスマイクロＲＮＡ、または両方である。細胞マイクロＲＮＡは、腫瘍性細胞中でのみ発現できる。ウイルスマイクロＲＮＡは、二本鎖ＤＮＡウイルス、単鎖ＤＮＡウイルス、二本鎖ＲＮＡウイルス、二本鎖ＲＮＡウイルス、単鎖（プラス鎖）ウイルス、単鎖（マイナス鎖）ウイルスおよびレトロウイルス、からなる群より選択されるウイルスにより発現される。
【００４３】
さらなる実施形態では、目的の外因性タンパク質は、毒素である。毒素は、リシン、リシンＡ鎖、アブリン、アブリンＡ鎖、ジフテリア毒素Ａ鎖およびこれらの改変型、からなる群より選択できる。さらなる実施形態では、毒素は、アルファ毒素、サポリン、トウモロコシＲＩＰ、オオムギＲＩＰ、コムギＲＩＰ、ｃｏｍ  ＲＩＰ、ライムギＲＩＰ、亜麻ＲＩＰ、志賀毒素、志賀様ＲＩＰ、モモルジン、チミジンキナーゼ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、シュードモナス外毒素、シュードモナス外毒素Ａ、大腸菌シトシンデアミナーゼおよびこれらの改変型、からなる群より選択できる。
【００４４】
本発明の目的と利点は、以下の説明から明確となろう。以下の図は、例示の目的で提供されており、限定するためではない。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の生合成および作用を表すモデルの模式図である。
【図２】図２は、一部の実施形態に従い、外因性ＲＮＡ分子中の阻害配列が、外因性ＲＮＡ分子中の切断部位の上流に配置されるような、内在性ｍｉＲＮＡによる外因性ＲＮＡ分子の活性化を示す模式図である。
【図３】図３は、一部の実施形態に従い、外因性ＲＮＡ分子中の阻害配列が、外因性ＲＮＡ分子中の切断部位の下流に配置されるような、内在性ｍｉＲＮＡによる外因性ＲＮＡ分子の活性化を示す模式図である。
【図４】図４Ａは、一部の実施形態に従い、切断部位の上流に配置され、目的の外因性タンパク質をコードする配列と同じ読み枠にはないＡＵＧを含む外因性ＲＮＡ分子中の阻害配列の例を示す模式図である。図４Ｂは、一部の実施形態に従い、切断部位の上流に配置され、目的の外因性タンパク質をコードする配列と同じ読み枠にはないコザックコンセンサス配列（５−ＡＣＣＡＵＧＧ−３’（配列番号２５））を含む外因性ＲＮＡ分子中の阻害配列の例を示す模式図である。図４Ｃは、一部の実施形態に従い、切断部位の上流に配置され、目的の外因性タンパク質をコードする配列と同じ読み枠にはない２つのコザックコンセンサス配列を含む外因性ＲＮＡ分子中の阻害配列の例を示す模式図である。
【図５】図５Ａは、一部の実施形態に従い、切断部位の上流に配置され、同じ読み枠にあるＡＵＧおよび下流の停止コドンを含む外因性ＲＮＡ分子中の阻害配列の例を示す模式図である。図５Ｂは、一部の実施形態に従い、切断部位の上流に配置され、ＡＵＧおよび細胞内局在のための下流の選別グシグナルまたはタンパク質分解シグナルを含む外因性ＲＮＡ分子中の阻害配列の例を示す模式図である。図５Ｃは、一部の実施形態に従い、切断部位の上流に配置され、ＡＵＧおよび下流の目的の外因性タンパク質の生物学的機能を阻害できるアミノ酸をコードする下流配列を含む外因性ＲＮＡ分子中の阻害配列の例を示す模式図である。図５Ｄは、一部の実施形態に従い、外因性ＲＮＡ分子がナンセンス変異依存分解機構（ＮＭＤ）の標的となるような、切断部位の上流に配置され、ＡＵＧ、ＡＵＧと同じ読み枠にある下流停止コドンおよび下流イントロンを含む外因性ＲＮＡ分子中の阻害配列の例を示す模式図である。
【図６】図６Ａは、一部の実施形態に従い、切断部位の上流に配置され、翻訳リプレッサー用の結合部位を含む外因性ＲＮＡ分子中の阻害配列の例を示す模式図である。図６Ｂは、一部の実施形態に従い、切断部位の上流に配置され、細胞内局在のためのＲＮＡ局在化シグナルを含む外因性ＲＮＡ分子中の阻害配列の例を示す模式図である。図６Ｃは、一部の実施形態に従い、切断部位の上流に配置され、ＡＵリッチ領域またはエンドヌクレアーゼ認識部位であるＲＮＡ不安定化配列を含む外因性ＲＮＡ分子中の阻害配列の例を示す模式図である。図６Ｄは、一部の実施形態に従い、切断部位の上流に配置され、二次構造を含む外因性ＲＮＡ分子中の阻害配列の例を示す模式図である。
【図７】図７は、一部の実施形態に従い、阻害配列が翻訳を阻止する二次構造を作り、ｍｉＲＮＡによる切断がＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）を作り出すような、内在性ｍｉＲＮＡによる外因性ＲＮＡ分子を活性化する例を示す模式図である。
【図８】図８Ａは、一部の実施形態に従い、追加の構造がＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）であるような、５’末端で切断された外因性ＲＮＡ分子の翻訳の効率を高める追加の構造の例を示す模式図である。図８Ｂは、一部の実施形態に従い、追加の構造がステムループ構造であるような、５’末端で切断された外因性ＲＮＡ分子の翻訳の効率を高める追加の構造の例を示す模式図である。図８Ｃは、一部の実施形態に従い、追加の構造が細胞質ポリアデニル化配列であるような、５’末端で切断された外因性ＲＮＡ分子の翻訳の効率を高める追加の構造の例を示す模式図である。図８Ｄは、一部の実施形態に従い、追加の構造が、相互に結合し、特に、外因性ＲＮＡ分子が切断部位で切断される場合に、外因性ＲＮＡ分子に環状構造を形成させるヌクレオチド配列であるような、５’末端で切断された外因性ＲＮＡ分子の翻訳の効率を高める追加の構造の例を示す模式図である。
【図９】図９Ａは、一部の実施形態に従い、追加の構造が、本発明の組成物によりコードされるポリペプチドであり、このポリペプチドがポリＡおよび外因性ＲＮＡ分子内の配列に結合でき、従って、特に、外因性ＲＮＡ分子が切断部位で切断される場合に、外因性ＲＮＡ分子に環状構造を形成させるような、５’末端で切断された外因性ＲＮＡ分子の翻訳の効率を高める追加の構造の例を示す模式図である。図９Ｂは、一部の実施形態に従い、外因性ＲＮＡ分子が切断部位で切断される場合に、追加の構造が、本発明の組成物にコードされ、外因性ＲＮＡ分子に結合でき、これにより、それにキャップを付加する追加のＲＮＡ分子であるような、５’末端で切断された外因性ＲＮＡ分子の翻訳の効率を高める追加の構造の例を示す模式図である。図９Ｃは、一部の実施形態に従い、追加の構造が、インタクト外因性ＲＮＡ分子からキャップ構造を取り除くシス作用性リボザイムであるような、インタクト外因性ＲＮＡ分子の翻訳の効率を下げる追加の構造の例を示す模式図である。
【図１０】図１０Ａは、非常に効率的なシス作用性ハンマーヘッド型リボザイムのｓｎｏｒｂｏｚｙｍｅ（配列番号６３）［１５］の配列を示す模式図である。図１０Ｂは、非常に効率的なシス作用性ハンマーヘッド型リボザイムのＮ１１７（配列番号６４）［１６］の配列を示す模式図である。
【図１１】図１１Ａは、一部の実施形態に従い、外因性ＲＮＡ分子がナンセンス変異依存分解機構（ＮＭＤ）の標的であるような、切断部位の下流に配置され、イントロンを含む外因性ＲＮＡ分子中の阻害配列の例を示す模式図である。図１１Ｂは、一部の実施形態に従い、切断部位の下流に配置され、翻訳リプレッサー用の結合部位を含む外因性ＲＮＡ分子中の阻害配列の例を示す模式図である。図１１Ｃは、一部の実施形態に従い、切断部位の下流に配置され、細胞内局在のためのＲＮＡ局在化シグナルを含む外因性ＲＮＡ分子中の阻害配列の例を示す模式図である。図１１Ｄは、一部の実施形態に従い、切断部位の下流に配置され、ＡＵリッチ領域またはエンドヌクレアーゼ認識部位であるＲＮＡ不安定化配列を含む外因性ＲＮＡ分子中の阻害配列の例を示す模式図である。図１１Ｅは、一部の実施形態に従い、切断部位の下流に配置され、二次構造を含む外因性ＲＮＡ分子中の阻害配列の例を示す模式図である。
【図１２】図１２Ａは、一部の実施形態に従い、阻害配列が翻訳を阻止する二次構造を作るような、目的の外因性タンパク質をコードする配列の下流に配置される外因性ＲＮＡ分子中の阻害配列の例を示す模式図である。図１２Ｂは、一部の実施形態に従い、追加の構造がＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）であるような、３’末端で切断された外因性ＲＮＡ分子の翻訳の効率を高める追加の構造の例を示す模式図である。図１２Ｃは、一部の実施形態に従い、追加の構造がステムループ構造であるような、３’末端で切断された外因性ＲＮＡ分子の翻訳の効率を高める追加の構造の例を示す模式図である。図１２Ｄは、一部の実施形態に従い、追加の構造が細胞質ポリアデニル化配列であるような、３’末端で切断された外因性ＲＮＡ分子の翻訳の効率を高める追加の構造の例を示す模式図である。
【図１３】図１３Ａは、一部の実施形態に従い、外因性ＲＮＡ分子が切断部位で切断される場合に、追加の構造が、相互に結合でき、外因性ＲＮＡ分子に環状構造を形成させることができるヌクレオチド配列であるような、３’末端で切断された外因性ＲＮＡ分子の翻訳の効率を高める追加の構造の例を示す模式図である。図１３Ｂは、一部の実施形態に従い、追加の構造が、本発明の組成物によりコードされるポリペプチドであり、ポリペプチドがキャップおよび外因性ＲＮＡ分子内の配列に結合でき、特に、外因性ＲＮＡ分子が切断部位で切断される場合に、外因性ＲＮＡ分子に環状構造を形成させるような、３’末端で切断された外因性ＲＮＡ分子の翻訳の効率を高める追加の構造の例を示す模式図である。図１３Ｃは、一部の実施形態に従い、特に、外因性ＲＮＡ分子が切断部位で切断される場合に、追加の構造が、本発明の組成物によりコードされ、外因性ＲＮＡ分子に結合でき、従って、それにポリＡを付加する追加のＲＮＡ分子であるような、３’末端で切断された外因性ＲＮＡ分子の翻訳の効率を高める追加の構造の例を示す模式図である。図１３Ｄは、一部の実施形態に従い、追加の構造が、インタクト外因性ＲＮＡ分子からポリＡを取り除くシス作用性リボザイムであるような、インタクト外因性ＲＮＡ分子の翻訳の効率を低下させる追加の構造の例を示す模式図である。
【図１４】図１４Ａは、一部の実施形態に従い、阻害配列が、切断部位の上流に配置されるような、異なる内在性ｍｉＲＮＡ用の２つの結合部位を含む外因性ＲＮＡ分子の例を示す模式図である。図１４Ｂは、一部の実施形態に従い、阻害配列が切断部位の上流に配置されるような、同じ内在性ｍｉＲＮＡ用の２つの結合部位を含む外因性ＲＮＡ分子の例を示す模式図である。図１４Ｃは、一部の実施形態に従い、阻害配列が、切断部位の下流に配置されるような、異なる内在性ｍｉＲＮＡ用の２つの結合部位を含む外因性ＲＮＡ分子の例を示す模式図である。図１４Ｄは、一部の実施形態に従い、阻害配列が切断部位の下流に配置されるような、同じ内在性ｍｉＲＮＡ用の２つの結合部位を含む外因性ＲＮＡ分子の例を示す模式図である。
【図１５】図１５Ａは、一部の実施形態に従い、外因性ＲＮＡ分子が目的の外因性タンパク質をコードする配列の上流のｍｉＲＮＡ用の追加の結合部位およびその追加の結合部位の上流の開始コドンをさらに含み、その開始コドンが目的の外因性タンパク質をコードする配列と同じ読み枠にないような、目的の外因性タンパク質をコードする配列の下流に配置された阻害配列を有する外因性ＲＮＡ分子の例を示す模式図である。図１５Ｂは、一部の実施形態に従い、開始コドンが目的の外因性タンパク質をコードする配列と同じ読み枠になく、外因性ＲＮＡ分子が５’末端にシス作用性リボザイムをさらに含むような、目的の外因性タンパク質をコードする配列の下流の阻害配列を有し、目的の外因性タンパク質をコードする配列の上流のｍｉＲＮＡ用の追加の結合部位、およびその追加の結合部位の上流の開始コドンをさらに含む外因性ＲＮＡ分子の例を示す模式図である。図１５Ｃは、一部の実施形態に従い、２つのｍｉＲＮＡ結合部位の間に目的の外因性タンパク質をコードする配列を含み、さらに２つの阻害配列を、１つは５’末端に、もう一つは３’末端に含む外因性ＲＮＡ分子の例を示す模式図である。図１５Ｄは、一部の実施形態に従い、２つの異なるｍｉＲＮＡ結合部位の間に目的の外因性タンパク質をコードする配列を含み、さらに２つの阻害配列を、１つは５’末端に、もう一つは３’末端に含む外因性ＲＮＡ分子の例を示す模式図である。
【図１６】図１６Ａは、一部の実施形態に従い、切断部位の下流に配置され、細胞内局在のためのＲＮＡ局在化シグナルの機能を阻害できる外因性ＲＮＡ分子中の阻害配列の例を示す模式図である。図１６Ｂは、一部の実施形態に従い、切断部位の上流に配置され、細胞内局在のためのＲＮＡ局在化シグナルの機能を阻害できる外因性ＲＮＡ分子中の阻害配列の例を示す模式図である。図１６Ｃは、一部の実施形態に従い、切断部位の上流に配置され、ＡＵＧ、および目的の外因性タンパク質の細胞内局在のための選別グシグナルの機能を阻害できるアミノ酸をコードする下流配列を含む外因性ＲＮＡ分子中の阻害配列の例を示す模式図である。図１６Ｄは、一部の実施形態に従い、外因性ＲＮＡ分子が目的の外因性タンパク質をコードする配列の出発コドンの下流の停止コドンを含まないような、ｍｉＲＮＡ結合部位の下流に配置された外因性ＲＮＡ分子中の阻害配列の例を示す模式図である。阻害配列は、ペプチド配列（標的細胞中のプロテアーゼにより切断されうるように上流でコードされている）の切断を阻害できるアミノ酸配列をコードしている。
【図１７】図１７は、一部の実施形態に従い、内在性ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１を含むバーキットリンパ腫癌細胞、ＥＢＶ関連胃癌細胞および上咽頭癌細胞を死滅させるための本発明の組成物の使用を示す模式図である。
【図１８】図１８は、一部の実施形態に従い、内在性ｈｉｖ１−ｍｉＲ−Ｎ３６７を含むＨＩＶ−１感染細胞を死滅させるための本発明の組成物の使用例を示す模式図である。
【図１９】図１９は、一部の実施形態に従い、内在性ｍｉＲ−１０ｂを含む転移性の乳癌細胞を死滅させるための本発明の組成物の使用例を示す模式図である。
【図２０】図２０は、一部の実施形態に従い、内在性ｍｉＲ−ＬＡＴを含む細胞を死滅させるための本発明の組成物の使用例を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
発明の詳細な説明
下記の詳細な説明では、参照用語、例えば：前記の（ｓａｉｄ）、ｔｈｅ、最後の（ｔｈｅ  ｌａｓｔ）および、前記の（ｔｈｅ  ｆｏｒｍｅｒ）が使われる場合、それは、上述の明確な用語を参照する（例えば、「Ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ」という場合、それは、上述の核酸配列（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を参照し、上述のヌクレオチド配列を参照しない）．さらに、下記の発明の詳細な説明では、他の実施形態を参照する各実施形態は、別々のユニットとして、それらと一緒に定義される。
【００４７】
下記は、説明全体を通して使用される用語であり、種々の実施形態においては下記を意味すると理解されるべきである：
【００４８】
本明細書で言及される用語の「ポリヌクレオチド分子」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「ヌクレオチド」配列は、本明細書では同義に使用できる。この用語は、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）ポリマー、および別々の断片の形の、またはさらに大きな構築物、直鎖または分岐、単鎖、二本鎖、三本鎖、またはこれらの複合物の成分としてのそれらの改変型に関する。この用語は、また、ＲＮＡ／ＤＮＡ複合物も包含する。ポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡのセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列であってもよい。ＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、限定されないが、例えば、相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、組換えＤＮＡ、もしくはそれらの複合物またはＲＮＡ分子、例えば、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、等であってもよい。従って、本明細書に使用される用語の「ポリヌクレオチド分子」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「ヌクレオチド」配列は、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の両方を指すことが意図されている。この用語は、天然塩基、糖、および共有結合ヌクレオシド間結合から構成されるオリゴヌクレオチド、ならびにそれぞれの天然の成分と類似的に機能する非天然部分を有するオリゴヌクレオチドをさらに含む。
【００４９】
用語の「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書では同義に使用され、アミノ酸残基のポリマーを意味する。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工の化学的類似体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーに適用される。
【００５０】
本明細書で言及される用語の「相補性」は、核酸の鎖間の塩基対形成を意味する。当技術分野で知られているように、核酸の各鎖は、鎖間の塩基対が２つまたは３つの水素結合を介して非共有結合で結合されるという点において別の鎖に対し相補的でありうる。水素結合により結合される相補的な核酸鎖上の向かい合っている２つのヌクレオチドは、塩基対と呼ばれる。ワトソン−クリックＤＮＡ塩基対形成に従って、アデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）と、グアニン（Ｇ）は、シトシン（Ｃ）と塩基対をつくる。ＲＮＡでは、チミンは、ウラシル（Ｕ）で置換される。２つの核酸の鎖間の相補性の程度は、鎖間で塩基対を形成するヌクレオチドの数（またはパーセンテージ）に応じて変わってもよい。例えば、「１００％相補性」は、各鎖中の全てのヌクレオチドが相補鎖と塩基対を形成することを示す。例えば、「９５％相補性」は、各鎖中の９５％のヌクレオチドが相補鎖と塩基対を形成することを示す。用語の「充分な相補性」は、約３０％〜約１００％の範囲の任意のパーセンテージの相補性を含むことができる。
【００５１】
本明細書で使われる用語の「構築物」は、人工で構築されたまたは単離された核酸分子を指し、１つまたは複数の核酸配列を含んでもよく、核酸配列は、コード配列（すなわち、最終産物をコードする配列）、調節配列、非コード配列、またはこれらのいずれかの組み合わせであってもよい。用語の構築物は、例えば、ベクターを含むが、それに限定されると見なされるべきではない。
【００５２】
「発現ベクター」は、異質細胞中で異種の核酸断片（ＤＮＡのような）を組み込み、発現させる能力を有するベクターを指す。換言すれば、発現ベクターは、転写可能な核酸配列／断片（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、等）を含む。多くのウイルス、原核生物および真核生物の発現ベクターが既知であり、および／または市販されている。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内で可能である。
【００５３】
本明細書で使われる用語の「上流」および「下流」は、ヌクレオチド配列、例えば、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列、中の相対的位置を意味する。よく知られているように、ヌクレオチド配列は、５’末端および３’末端（ヌクレオチド骨格の糖（デオキシリボースまたはリボース）環上の炭素に対し、そのように呼ばれる）を有する。従って、ヌクレオチド配列上の位置に対して、用語の下流は、配列の３’末端に向かう領域に関連する。用語の上流は、鎖の５’末端に向かう領域に関連する。
【００５４】
本明細書で使われる用語の「プロモーターエレメント（ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」、「プロモーター」または「プロモーター配列（ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、通常、コード配列の５’末端に配置される（すなわち、先行する、上流に配置される）ヌクレオチド配列を指し、スイッチとして機能し、コード配列の発現を活性化する。コード配列が活性化される場合は、転写されると言われる。転写は、通常、コード配列からのＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）の合成を伴う。従って、プロモーターは、転写調節配列として機能し、また、ｍＲＮＡへのコード配列の転写の開始部位を与える。プロモーターは、天然ソースからそのまま得ても、または天然の異なるプロモーター由来の異なる配列から構成されても、またはさらに合成ヌクレオチドセグメントを含んでもよい。当業者には、異なるプロモーターは、異なる組織または細胞型で、または異なる成長の段階で、または異なる環境条件に応答して、または種々の発現レベルで、遺伝子の発現を指示してもよいことは理解されよう。ほとんどの細胞型中でほぼ必ず遺伝子を発現させるプロモーターは、通常、「構成的プロモーター」と呼ばれる。特異的組織中で遺伝子発現を誘導するプロモーターは、「組織特異的プロモーター」と呼ばれる。
【００５５】
本明細書で言及される用語の「外因性ＲＮＡ分子」は、標的細胞中に導入される、および／または標的細胞中で発現する組換え型ＲＮＡ分子を意味する。外因性ＲＮＡ分子は、インタクト（すなわち、完全長分子）であっても、または細胞内で、１つまたは複数の切断部位で切断されてもよい。
【００５６】
本明細書で言及される用語の「目的のタンパク質」および「目的の外因性タンパク質」は、同義に使用できる。この用語は、細胞内で外因性ＲＮＡ分子から翻訳されるペプチド配列を指す。一部の実施形態では、ペプチド配列は、１つまたは複数の別々のタンパク質または融合タンパク質であってもよい。
【００５７】
本明細書で言及される用語の「特異的内在性ｍｉＲＮＡ」および「特異的ｍｉＲＮＡ」は、同義に使用できる。この用語は、細胞内マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子／配列を指す。特異的内在性ｍｉＲＮＡは、細胞のゲノムによりコードされてもよく（細胞ｍｉＲＮＡ）、および／または細胞内に存在する外来性ゲノム由来、例えば、細胞内に存在するウイルス由来（ウイルスｍｉＲＮＡ）であってもよい。特異的ｍｉＲＮＡは、外因性ＲＮＡ分子の標的細胞中への導入／発現の前に標的細胞内に存在する。
【００５８】
本明細書で使用される用語の「発現」は、標的細胞での所望の最終産物分子の産生を意味する。最終産物分子は、例えば、ＲＮＡ分子；ペプチドまたはタンパク質、等；またはこれらの組み合わせであってもよい。
【００５９】
本明細書で言及される用語の「読み枠」（「ＯＲＦ」）は、出発コドンおよび停止コドンを含むコーディング領域を意味する。
【００６０】
本明細書で言及される用語の「コザック配列」は、当技術分野でよく知られており、翻訳開始部位としてリボソームにより認識されるｍＲＮＡ分子上の配列を指す。用語の「コザックコンセンサス配列」、「コザックコンセンサス」または「コザック配列」は、真核生物のｍＲＮＡ上で出現し、コンセンサス（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧ（配列番号２４）を有する配列である。ここで、Ｒは、別の「Ｇ」がその後に続く出発コドン（ＡＵＧ）の３つの塩基上流のプリン（アデニンまたはグアニン）である。一部の実施形態では、コザック配列は、配列ＲＮＮＡＵＧＧ（配列番号８３）を有する。
【００６１】
本明細書で使われる用語の「導入」および「形質移入」は、同義に使用でき、例えば、核酸、ポリヌクレオチド分子、ベクター、等の分子を、標的細胞中に、さらに具体的には、標的細胞の膜に囲まれた空隙の内部に、移入することを意味する。分子は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）、で教示のように、当業者に既知のいずれかの手段によって、標的細胞中に「導入」できる。この文献の内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。分子を細胞中に「導入」する手段には、例えば、限定されないが、熱ショック、リン酸カルシウム形質移入、ＰＥＩ形質移入、電気穿孔、リポフェクション、形質移入試薬、ウイルス媒介移入、等、またはこれらの組み合わせが含まれる。細胞の形質移入は、例えば、ヒト細胞、動物細胞、直物細胞、等のいずれの起原の細胞のいずれのタイプの細胞にも行うことができる。細胞は、単離細胞、組織培養細胞、細胞株、生物体内に存在する細胞、等であってよい。
【００６２】
細胞／細胞集団に関する用語の「死滅させる」は、その細胞／細胞集団の死亡に繋がると思われるいずれかのタイプの操作を含むことを意味する。
【００６３】
本明細書で言及される用語の「疾患の治療」または「状態の治療」は、組成物を投与することを意味し、この組成物は、疾患に関連する症状を回復させる、重症度を下げるもしくは疾患を治癒する、または疾患の発症を防ぐために有効な少なくとも１つの試薬（例えば、１つまたは複数のポリヌクレオチド分子、１つまたは複数の発現ベクター、１つまたは複数の物質／成分、等であってよい）を含む。投与には、いずれの投与経路を含めてもよい。
【００６４】
用語の「検出」、「診断」は、疾患、症状、傷害、病理学的または正常な状態の検出の方法；疾患、症状、傷害、病理学的状態の分類方法；疾患、症状、傷害、病理学的状態の重症度の判定方法；疾患、症状、傷害、病理学的状態の進行のモニタリング方法；転帰、および／またはその回復の見通しの予測方法、を意味する。
【００６５】
１．本発明の組成物の基本的構造
一部の実施形態では、特異的内在性ｍｉＲＮＡを含む細胞中でのみ、目的の外因性タンパク質を発現するための組成物が提供される。内在性ｍｉＲＮＡは、細胞ｍｉＲＮＡ、ウイルスｍｉＲＮＡおよび／または細胞中に存在するいずれのタイプのｍｉＲＮＡであってもよい。目的の外因性タンパク質は、例えば、毒素、等のいずれのタイプのペプチドまたはタンパク質であってもよい。
【００６６】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、１つまたは複数のポリヌクレオチド分子、例えば、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、または両方、を含んでもよい。
【００６７】
一部の実施形態では、組成物は、少なくとも下記の配列を含むＲＮＡ分子である外因性ＲＮＡ分子を含むか、またはコードする：
ａ）目的の外因性タンパク質をコードする配列；
ｂ）目的の外因性タンパク質の発現を阻害することができる阻害配列；および
ｃ）特異的内在性ｍｉＲＮＡが外因性ＲＮＡ分子の切断部位での切断を指示するために、特異的内在性ｍｉＲＮＡの成熟ｍｉＲＮＡ鎖に対し、充分な相補性であるように設計されている結合部位。
切断部位は、阻害配列と目的の外因性タンパク質をコードする配列の間に配置されるように設計されている。
【００６８】
従って、細胞中での特異的内在性ｍｉＲＮＡの存在下でのみ、外因性ＲＮＡ分子は特異的内在性ｍｉＲＮＡにより切断部位で切断されて、阻害配列が目的の外因性タンパク質をコードする配列から切り離され、目的の外因性タンパク質が発現できる。これは、例えば、図２と３に示されている。
【００６９】
一部の実施形態では、特異的内在性ｍｉＲＮＡの選択は、標的細胞である特異的細胞タイプ内のその発現に応じて関連付けられる、および／または決定できる。従って、特定的細胞タイプ中で発現した特異的内在性ｍｉＲＮＡの選択は、選択細胞型（標的細胞）中での、目的の外因性タンパク質の標的化された発現の機序を提供できる。特異的細胞は、例えば、限定されないが、ウイルスまたは他の感染性病原体に感染した細胞；良性または悪性細胞、免疫系の成分を発現している細胞、から選択できる。特異性は、特異的内在性ｍｉＲＮＡが標的細胞中で外因性ＲＮＡ分子の切断を指示するために、特異的内在性ｍｉＲＮＡが成熟ｍｉＲＮＡ鎖に対し、充分に相補的であるように組成物の外因性ＲＮＡ分子の結合部位の改変することにより実現できる。
【００７０】
キャップまたはポリＡテールが無いｍＲＮＡでも、タンパク質を翻訳できることは、当技術分野で知られている。哺乳動物細胞では、キャップの付加は、ｍＲＮＡの翻訳を３５〜５０倍増加させ、ポリ（Ａ）テールの付加は、ｍＲＮＡの翻訳を１１４〜１５５倍増加させる［６］。哺乳動物細胞のポリ（Ａ）テールは、機能的ｍＲＮＡ半減期を２．６倍しか増加させず、キャップは、機能的ｍＲＮＡ半減期を１．７倍しか増加させない。
【００７１】
さらに、一部のタンパク質は、細胞当たり１つのタンパク質の濃度でさえも、細胞に対し生物学的効果を及ぼすことができることが当技術分野で知られている。例えば、細胞のサイトゾルに到達したリシンまたはアブリンのただ一個のタンパク質でも、細胞を死滅させることができることが報告された［３、４］。さらに、細胞に導入されたジフテリア毒素断片Ａ（ＤＴＡ）のただ１個のタンパク質で、細胞を死滅させることができる［５］。一部の実施形態では、目的の外因性タンパク質は、いずれのタンパク質またはペプチド、例えば、限定されないが、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、等またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００７２】
一部の実施形態では、目的の外因性タンパク質は、２つのタンパク質の融合体であるポリペプチドであってもよく、それらの間に切断部位を持つことができ、細胞内で２つのタンパク質の分離が可能となる。例えば、目的の外因性タンパク質は、リシンおよびＤＴＡの融合タンパク質であってもよく、それにより、例えば、特異的プロテアーゼによる融合タンパク質の切断により、細胞中でＤＴＡとリシンタンパク質を別々に作製することができる。一部の実施形態では、目的の外因性タンパク質は、組成物により発現されうる２つの別々のタンパク質であってもよい。例えば、目的の外因性ＲＮＡは、２つの別々の目的の外因性タンパク質、例えば、リシンとＤＴＡをコードしてもよい。
【００７３】
２． 切断部位の上流に配置された阻害配列を有する外因性ＲＮＡ分子の構造
２．１．切断部位の上流に配置された阻害配列の構造
一部の実施形態では、外因性ＲＮＡ分子中の阻害配列は、切断部位の上流または下流に配置できる。このセクションでは、外因性ＲＮＡ分子中の切断部位の上流に配置される阻害配列の構造について記載する。これは、例えば、図２に示されている。
【００７４】
一部の実施形態では、切断部位の上流に配置される阻害配列は、例えば、開始コドンであってもよい。開始コドンおよび目的の外因性タンパク質をコードする配列は、同じ読み枠に無く、それにより、開始コドンは、コード配列が下流にある目的の外因性タンパク質のフレームシフト変異の原因となる可能性がある。これは、例えば、図４Ａに示されている。一実施形態では、開始コドンは、コザックコンセンサス配列内に配置されてもよい。さらに、翻訳のイニシエータとして機能する能力を維持している改変コザックコンセンサス配列も使用可能である。例えば、図４Ｂを参照。一部の実施形態では、ヒトのコザックコンセンサス配列は、５’−ＡＣＣＡＵＧＧ−３’（配列番号２５）であり、開始コドンは、５’−ＡＵＧ−３’である。
【００７５】
一部の実施形態では、開始コドンは、ＴＩＳＵモチーフ内に配置されても、または１つまたは複数のＴＩＳＵモチーフを持ってもよい。ＴＩＳＵ（短い５’ＵＴＲの翻訳イニシエータ（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ  ｏｆ  Ｓｈｏｒｔ  ５’ＵＴＲ））モチーフは、非常に短い５’ＵＴＲを使った効率的で正確なｍＲＮＡからの翻訳開始を指示する固有の能力によりコザックコンセンサスとは区別される［３８］。
【００７６】
別の実施形態では、切断部位の上流に配置される阻害配列は、複数の開始コドンを持つことができ、それぞれの開始コドンおよび目的の外因性タンパク質をコードする配列は、同じ読み枠中には存在しない。開始コドンは、コード配列が下流にある目的の外因性タンパク質のフレームシフト変異の原因となる可能性がある。さらに、それぞれの開始コドンは、コザックコンセンサス配列または翻訳イニシエータとして機能する能力を維持している改変コザックコンセンサス配列内に配置されてもよい。例えば、図４Ｃを参照されたい。
【００７７】
別の実施形態では、切断部位の上流に配置される阻害配列は、開始コドンを含んでもよい。外因性ＲＮＡ分子は、開始コドンと目的の外因性タンパク質をコードする配列の出発コドンとの間に停止コドンを含んでもよく、この場合、停止コドンと開始コドンは、同じ読み枠にある。このような実施形態では、下流の目的の外因性タンパク質をコードする配列の翻訳の効率を低下させる可能性のある上流の読み枠（ｕＯＲＦ）が作られる。例えば、図５Ａを参照。一部の実施形態では、停止コドンは、例えば、５’−ＵＡＡ−３’または５’−ＵＡＧ−３’または５’−ＵＧＡ−３’であってよい。
【００７８】
一部の実施形態では、強力なステムおよびループは、ｍｉＲＮＡ用の標的配列（切断部位）の上流または下流の位置で、上流のＯＲＦに対して下流に配置できる。このようなステムおよびループの形成は、停止コドンに到達したにもかかわらず、リボソームの小さいサブユニットがｍＲＮＡから切り離されず、ｍＲＮＡを走査し続ける状態を支援することができる。リボソームの小さいサブユニットは、強力なＲＮＡ二次構造を開くことができない。さらに、これらのステムとループが、標的配列の下流に配置される場合、それらは、例えば、ＸＲＮ１エキソリボヌクレアーゼにより行うことができる切断ｍＲＮＡの分解を阻止することができる。
【００７９】
別の実施形態では、切断部位の上流に配置される阻害配列は、開始コドンおよび細胞内局在のための選別グシグナルをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。ヌクレオチド配列は、開始コドンの下流に配置でき、ヌクレオチド配列と開始コドンは、同じ読み枠にある。一部の実施形態では、選別グシグナルにより指示される目的の外因性タンパク質の細胞内局在は、目的のタンパク質の生物学的機能を阻害できる。細胞内局在のための選別グシグナルは、例えば、限定されないが、ミトコンドリア用選別グシグナル、核用選別グシグナル、エンドソーム用選別グシグナル、リソソーム用選別グシグナル、ペルオキシソーム用選別グシグナル、ＥＲ用選別グシグナル、等であってもよい。細胞内局在用選別グシグナルは、例えば、ペルオキシソームターゲティングシグナル２［（Ｒ／Ｋ）（Ｌ／Ｖ／Ｉ）Ｘ５（Ｑ／Ｈ）（Ｌ／Ａ）］（配列番号２６）またはＨ２Ｎ---ＲＬＲＶＬＳＧＨＬ（配列番号２７）（ヒトアルキルジヒドロキシアセトンホスファートシンターゼの）であってもよい［２８］。これは、例えば、図５Ｂに示される。
【００８０】
本発明の別の実施形態では、切断部位の上流に配置される阻害配列は、開始コドンおよびタンパク質分解シグナルをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。ヌクレオチド配列は、開始コドンの下流に配置され、それにより、ヌクレオチド配列および開始コドンは、同じ読み枠に存在できる。ンパク質分解シグナルは、例えば、限定されないが、ユビキチン分解シグナルであってもよい。例えば、図５Ｂを参照されたい。
【００８１】
本発明の別の実施形態では、切断部位の上流に配置される阻害配列は、開始コドンならびに開始コドンおよび目的の外因性タンパク質をコードする配列と同じ読み枠にある開始コドンの下流のヌクレオチド配列を含むように設計でき、そのヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列が目的の外因性タンパク質に融合される場合、目的の外因性タンパク質の生物学的機能が阻害されうる。例えば、図５Ｃを参照されたい。
【００８２】
本発明の別の実施形態では、切断部位の上流に配置される阻害配列は、開始コドンを含んでもよく、また、外因性ＲＮＡ分子が開始コドンの下流の停止コドンをさらに含むことができ、それにより、停止コドンおよび開始コドンが同じ読み枠に存在することができる。さらに、外因性ＲＮＡ分子は、停止コドンの下流のイントロンを追加で含むことができ、それにより、外因性ＲＮＡ分子が外因性ＲＮＡ分子を分解できるナンセンス変異依存分解機構（ＮＭＤ）のための標的となりうる［２９］。例えば、図５Ｄを参照されたい。
【００８３】
別の実施形態では、切断部位の上流に配置される阻害配列は、翻訳リプレッサータンパク質に結合できる配列を含んでもよい。一部の実施形態では、翻訳リプレッサータンパク質は、内在性翻訳リプレッサータンパク質である。一部の実施形態では、翻訳リプレッサータンパク質は、組成物によりコードされてもよい。翻訳リプレッサータンパク質は、目的の外因性タンパク質の翻訳の効率を、直接、または間接的に低減させることができる［２４］。例えば、翻訳リプレッサータンパク質に結合できる配列には、限定されないが、ＳＭＡＵＧリプレッサータンパク質（５’−ＵＧＧＡＧＣＡＧＡＧＧＣＵＣＵＧＧＣＡＧＣＵＵＵＵＧＣＡＧＣＧ−３’）［２５］（配列番号２８）に結合する配列が含まれる。例えば、図６Ａを参照されたい。
【００８４】
別の実施形態では、切断部位の上流に配置される阻害配列は、細胞内局在のためのＲＮＡ局在化シグナル（例えば、同時翻訳移入（ｃｏ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｉｍｐｏｒｔ）を含む）または内在性ｍｉＲＮＡ結合部位を含むことができ、その結果、外因性ＲＮＡ分子の細胞内局在により、目的の外因性タンパク質の翻訳を阻害でき、また、外因性ＲＮＡ分子半減期を短縮できる。ＲＮＡ局在化シグナルは、例えば、限定されないが、ＲＮＡ局在化シグナルは、ミエリン形成末梢、ミエリンコンパートメント、ミトコンドリア、ラメラの前縁、核周囲の細胞質［２２］、等のためのものであってもよい。例えば、ＲＮＡ局在化シグナルは、ミエリン形成末梢５’−ＧＣＣＡＡＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＣＡＵＧ−３’（配列番号２９）または５’−ＧＣＣＡＡＧＧＡＧＣＣ−３’（配列番号３０）［２７］のためのＲＮＡ局在化シグナルであってもよい。例えば、図６Ｂを参照されたい。
【００８５】
別の実施形態では、切断部位の上流に配置される阻害配列は、外因性ＲＮＡ分子の分解を刺激できるＲＮＡ不安定化配列を含むことができる。ＲＮＡ不安定化配列は、例えば、ＡＵリッチ領域（ＡＲＥ）、エンドヌクレアーゼ認識部位、等であってもよい。ＡＵリッチ領域は、例えば、少なくとも約３５ヌクレオチド長のＡＵリッチ領域であってもよい。例えば、ＡＵリッチ領域は、５’−ＡＵＵＵＡ−３’（配列番号３１）、５’−ＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）−３’（配列番号３２）または５’−ＡＵＵＵ−３’（配列番号３３）［２６］であってもよい。例えば、図６Ｃを参照されたい。
【００８６】
別の実施形態では、切断部位の上流に配置される阻害配列は、下流にある目的の外因性タンパク質の翻訳の効率を低下させることができる二次構造を形成可能な配列を含んでもよい。一部の実施形態では、二次構造の折り畳み自由エネルギーは、−３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満（例えば、−５０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、−８０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）であってもよく、従って、二次構造は、スキャニングリボソームが目的の外因性タンパク質をコードする領域の下流にある出発コドンに到達するのを阻止するのに充分である。例えば、図６Ｄを参照されたい。
【００８７】
さらなる実施形態では、切断部位の上流に配置される阻害配列は、切断部位のすぐ上流に配置されたヌクレオチド配列を含むことができ、この場合、ヌクレオチド配列は、二次構造の形成のために切断部位のすぐ下流に配置されたヌクレオチド配列に結合でき、それにより、二次構造が、下流にある目的の外因性タンパク質の翻訳の効率を直接、または間接的に低減させることができる。
【００８８】
二次構造の折り畳み自由エネルギーは、−３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満（例えば、−５０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、−８０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）であってもよく、従って、この二次構造は、スキャニングリボソームが目的の外因性タンパク質の出発コドンに到達するのを阻止するのに充分でありうる。別の実施形態では、切断部位は、二次構造の単鎖領域内またはループ領域内に配置でき、それにより、単鎖領域またはループ領域は、例えば、限定されないが、少なくとも約１５ヌクレオチド長の領域でありうる。別の実施形態では、外因性ＲＮＡ分子は、切断部位の下流で、目的の外因性タンパク質をコードする配列の上流に配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列をさらに含むことができ、それにより、ＩＲＥＳ配列が、インタクト外因性ＲＮＡ分子の場合に比べ、切断された外因性ＲＮＡ分子内でさらに機能的となる。別の実施形態では、少なくとも一部のＩＲＥＳ配列を、切断部位のすぐ下流にあるヌクレオチド配列内に配置できる。例えば、図７を参照されたい。
【００８９】
ＩＲＥＳ配列は、例えば、限定されないが、下記から選択できる：ピコルナウイルスＩＲＥＳ、口蹄疫ウイルスＩＲＥＳ、脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳ、肝炎ＡウイルスＩＲＥＳ、肝炎ＣウイルスＩＲＥＳ、ヒトライノウイルスＩＲＥＳ、ポリオウイルスＩＲＥＳ、ブタ水疱病ウイルスＩＲＥＳ、カブモザイクポチウイルスＩＲＥＳ、ヒト繊維芽細胞増殖因子２ｍＲＮＡＩＲＥＳ、ペスチウイルスＩＲＥＳ、リーシュマニアＲＮＡウイルスＩＲＥＳ、モロニーマウス白血病ウイルスＩＲＥＳ、ヒトライノウイルス１４ＩＲＥＳ、アフトウイルスＩＲＥＳ、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質ｍＲＮＡＩＲＥＳ、ショウジョウバエアンテナペディアｍＲＮＡ  ＩＲＥＳ、ヒト繊維芽細胞増殖因子２ｍＲＮＡ  ＩＲＥＳ、肝炎ＧウイルスＩＲＥＳ、トバモウイルスＩＲＥＳ、血管内皮細胞増殖因子ｍＲＮＡ  ＩＲＥＳ、コクサッキーＢウイルスＩＲＥＳ、ｃ−ｍｙｃプロトオンコジーンｍＲＮＡ  ＩＲＥＳ、ヒトＭＹＴ２  ｍＲＮＡ  ＩＲＥＳ、ヒトパレコウイルス１型ウイルスＩＲＥＳ、ヒトパレコウイルス２型ウイルスＩＲＥＳ、真核生物開始因子４ＧＩ  ｍＲＮＡ  ＩＲＥＳ、チャバネアオカメムシ腸管ウイルスＩＲＥＳ、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルスＩＲＥＳ、ウシエンテロウイルスＩＲＥＳ、コネキシン４３  ｍＲＮＡ  ＩＲＥＳ、ホメオドメインタンパク質Ｇｔｘ  ｍＲＮＡ  ＩＲＥＳ、ＡＭＬ１転写因子ｍＲＮＡ  ＩＲＥＳ、ＮＦ−カッパＢリプレッシング因子ｍＲＮＡ  ＩＲＥＳ、アポトーシスのＸ連鎖阻害剤  ｍＲＮＡ  ＩＲＥＳ、コオロギ麻痺ウイルスＲＮＡ  ＩＲＥＳ、ｐ５８（ＰＩＴＳＬＲＥ）プロテインキナーゼｍＲＮＡ  ＩＲＥＳ、オルニチンデカルボキシラーゼｍＲＮＡ  ＩＲＥＳ、コネキシン３２  ｍＲＮＡ  ＩＲＥＳ、ウシウイルス性下痢症ウイルスＩＲＥＳ、インスリン様増殖因子Ｉ受容体ｍＲＮＡ  ＩＲＥＳ、ヒト免疫不全ウイルス１型ｇａｇ遺伝子ＩＲＥＳ、ブタコレラウイルスウイルスＩＲＥＳ、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスＩＲＥＳ、ランダムオリゴヌクレオチドライブラリーから選択される短いＩＲＥＳ、Ｊｅｍｂｒａｎａ病ウイルスＩＲＥＳ、アポトーシスプロテアーゼ活性化因子１  ｍＲＮＡ  ＩＲＥＳ、ムギクビレアブラムシウイルスＩＲＥＳ、カチオン性アミノ酸輸送体ｍＲＮＡ  ＩＲＥＳ、ヒトインスリン様増殖因子ＩＩリーダー２  ｍＲＮＡ  ＩＲＥＳ、ジアルジアウイルスＩＲＥＳ、Ｓｍａｄ５  ｍＲＮＡ  ＩＲＥＳ、ブタテスコウイルス‐１タルファンＩＲＥＳ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｈａｉｒｌｅｓｓ  ｍＲＮＡ  ＩＲＥＳ、ｈＳＮＭ１  ｍＲＮＡ  ＩＲＥＳ、Ｃｂｆａｌ／Ｒｕｎｘ２  ｍＲＮＡ  ＩＲＥＳ、エプスタインバーウイルスＩＲＥＳ、ハイビスカスクロロティックリングスポットウイルスＩＲＥＳ、ラット下垂体バソプレシンＶ１ｂ受容体ｍＲＮＡ  ＩＲＥＳまたはヒトｈｓｐ７０  ｍＲＮＡ  ＩＲＥＳ。
【００９０】
２．２．５’末端で切断された外因性ＲＮＡ分子の翻訳の効率を高めることが可能な追加の構造。
このセクションでは、切断された外因性ＲＮＡ分子の翻訳の効率を高めることができる追加の構造の実施形態について詳述する。ここでは、切断された外因性ＲＮＡ分子の切断部位は、５’末端である。
【００９１】
一部の実施形態では、外因性ＲＮＡ分子は、目的の外因性タンパク質をコードする配列のすぐ上流の固有の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を含む配列を含み、それにより、固有のＩＲＥＳ配列は、切断された外因性ＲＮＡ分子からの目的の外因性タンパク質の翻訳の効率を高めることができる。例えば、図８Ａを参照されたい。
【００９２】
別の実施形態では、外因性ＲＮＡ分子は、目的の外因性タンパク質をコードする配列のすぐ下流に固有のヌクレオチド配列を含むことができ、それにより、固有のヌクレオチド配列は、固有のステムループ構造を含み、その固有のステムループ構造は、直接または間接的に、切断された外因性ＲＮＡ分子からの目的の外因性タンパク質の翻訳の効率および外因性ＲＮＡ分子の半減期を増加させることができる。固有のステムループ構造は、例えば、限定されないが、ヒトヒストン遺伝子３’−ＵＴＲの保存ステムループ構造またはその機能性誘導体であってもよい。ヒトヒストン遺伝子３’−ＵＴＲの保存ステムループ構造は、例えば、５’−ＧＧＣＵＣＵＵＵＵＣＡＧＡＧＣＣ−３’（配列番号３４）であってもよい。例えば、図８Ｂを参照されたい。
【００９３】
さらなる実施形態では、外因性ＲＮＡ分子は、目的の外因性タンパク質をコードする配列のすぐ下流に固有のヌクレオチド配列を含むことができ、これにより、その固有のステムループ構造は、直接または間接的に、切断された外因性ＲＮＡ分子からの目的の外因性タンパク質の翻訳の効率および外因性ＲＮＡ分子の半減期を増加させることができる細胞質ポリアデニル化配列を含む。細胞質ポリアデニル化配列は、例えば、限定されないが、５’−ＵＵＵＵＡＵ−３’（配列番号３５）、５’−ＵＵＵＵＵＡＵ−３’（配列番号３６）、５’−ＵＵＵＵＡＡＵ−３’（配列番号３７）、５’−ＵＵＵＵＵＵＡＵＵ−３’（配列番号３８）、５’−ＵＵＵＵＡＵＵ−３’（配列番号３９）または５’−ＵＵＵＵＵＡＵＡＡＡＧ−３’（配列番号４０）［２３］であってもよい。
【００９４】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、いずれの細胞中でもｈＣＰＥＢを発現するために、ヒト細胞質ポリアデニル化配列結合タンパク質（ｈＣＰＥＢ）、またはその相同体をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含むことができる。例えば、図８Ｃを参照されたい。
【００９５】
さらなる実施形態では、外因性ＲＮＡ分子は、切断部位の下流で、目的の外因性タンパク質をコードする配列の上流に位置する固有のヌクレオチド配列含むことができ、それにより、固有のヌクレオチド配列は、目的の外因性タンパク質をコードする配列の下流に位置する配列に結合できる。この実施形態では、切断された外因性ＲＮＡ分子は、環状構造を作ることができ、これは、切断された外因性ＲＮＡ分子からの目的の外因性タンパク質の翻訳の効率を高めることができる。例えば、図８Ｄを参照されたい。
【００９６】
別の実施形態では、外因性ＲＮＡ分子は、切断部位の下流で、目的の外因性タンパク質をコードする配列の上流に位置する固有のヌクレオチド配列を含むことができる。固有のヌクレオチド配列は、切断された外因性ＲＮＡ分子中のポリ（Ａ）テールに直接または間接的に結合できる固有のポリペプチドに結合できる。固有のポリペプチドは、また、本発明の組成物によりコードされてもよい。この実施形態では、固有のポリペプチドおよび切断された外因性ＲＮＡ分子は、環状構造を形成し、これは、切断された外因性ＲＮＡ分子からの目的の外因性タンパク質の翻訳の効率を高めることができる。例えば、図９Ａを参照されたい。
【００９７】
別の実施形態では、本発明の組成物は、追加のポリヌクレオチド配列をさらに含むことができ、これは、切断部位の下流で、目的の外因性タンパク質をコードする配列の上流に位置する配列に結合できる固有のヌクレオチド配列を５’末端に含む追加のＲＮＡ分子をコードする。追加のポリヌクレオチド配列の発現は、例えば、ポリメラーゼＩＩベースのプロモーターにより進行させることができる。一部の実施形態では、本発明の組成物は、直接または間接的に追加のＲＮＡ分子の固有のヌクレオチド配列の下流の位置での切断に影響を与えることができる切断成分をさらに含んでもよい。切断成分は、例えば、以下であってもよい：
(a)  追加のＲＮＡ分子内に位置する固有の核酸配列であって、限定されないが、エンドヌクレアーゼ認識部位、内在性ｍｉＲＮＡ結合部位、シス作用性リボザイム、回文構造終止配列もしくはｍｉＲＮＡ配列であってもよい固有の核酸配列；または
(b)  本発明の組成物によりコードされる固有の阻害性ＲＮＡであって、限定されないが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ラリアート型ＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ発現ドメイン、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはリボザイムであってもよい固有の阻害性ＲＮＡ。
【００９８】
この実施形態では、追加のＲＮＡ分子は、切断された外因性ＲＮＡ分子に結合でき、切断された外因性ＲＮＡ分子からの目的の外因性タンパク質の翻訳の効率を高めることができるキャップ構造をそれに与える。例えば、図９Ｂを参照されたい。
【００９９】
一部の実施形態では、ｖｐｇ認識配列が導入でき、それにより、切断の際に、５’切断末端がｖｐｇ認識配列を含むことができる。ｖｐｇ認識配列に対し、ＶＰＧタンパク質が結合でき、それにより、キャップを置換する。ｖｐｇタンパク質は、本発明の組成物または阻害配列の最初のＯＲＦによりコードされうる。
【０１００】
理論または機序に拘泥する意図はないが、一部の実施形態では、シス作用性リボザイムの使用が好都合である。理由は、シス作用性リボザイムを含む追加のＲＮＡ分子は、それ自体で切断され得る［１５］ためである。シス作用性リボザイムは、例えば、限定されないが、非常に効率的なシス作用性ハンマーヘッド型リボザイムのｓｎｏｒｂｏｚｙｍｅ［１５］またはＮ１１７［１６］であってもよい。図１０Ａ、１０Ｂを参照されたい。
【０１０１】
別の実施形態では、外因性ＲＮＡ分子は、目的の外因性タンパク質をコードする配列のすぐ上流にヌクレオチド配列をさらに含むことができ、それにより、ヌクレオチド配列が切断された外因性ＲＮＡ分子の分解を低減することができるステムループ構造を含む。一実施形態では、ステムループ構造は、ヒトヒストン遺伝子３’−ＵＴＲの保存ステムループ構造（５’−ＧＧＣＵＣＵＵＵＵＣＡＧＡＧＣＣ−３’（配列番号３４））またはその機能的誘導体である。
【０１０２】
２．３．インタクト外因性ＲＮＡ分子の翻訳の効率を低減させることが可能な追加の構造
このセクションでは、追加の構造に関する種々の実施形態が記載され、これらの追加の構造は、インタクト（すなわち、外因性ＲＮＡ分子が切断される前の）外因性ＲＮＡ分子の翻訳の効率を低下させることができる。
【０１０３】
一部の実施形態では、組成物は、切断部位の上流に位置する阻害配列の上流の位置での外因性ＲＮＡ分子の切断に直接または間接的に影響を与えることができる特定の切断成分を含むことができる。特定の切断成分は、例えば、下記であってもよい：
(a)  外因性ＲＮＡ分子内に位置する特定の核酸配列であって、例えば、限定されないが、エンドヌクレアーゼ認識部位、内在性ｍｉＲＮＡ結合部位、シス作用性リボザイムもしくはｍｉＲＮＡ配列であってもよい特定の核酸配列；または
(b)   本発明の組成物によりコードされる特定の阻害性ＲＮＡであって、例えば、限定されないが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ラリアート型ＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ発現ドメイン、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはリボザイムであってもよい特定の阻害性ＲＮＡ。
【０１０４】
このような実施形態では、特定の切断成分は、インタクト外因性ＲＮＡ分子から目的の外因性タンパク質への翻訳の効率を低減させるために、インタクト外因性ＲＮＡ分子からキャップ構造を取り外すことができる。例えば、図９Ｃを参照されたい。
【０１０５】
別の実施形態では、切断部位の上流に配置される阻害配列は、１つまたは複数の開始コドンをさらに含むことができ、それにより、各開始コドンおよび目的の外因性タンパク質をコードする配列は、同じ読み枠に存在せず、各開始コドンは、コザックコンセンサス配列内に配置される。
【０１０６】
３  切断部位の下流に位置する阻害配列を有する外因性ＲＮＡ分子の構造
３．１．切断部位の下流に位置する阻害配列の構造
一部の実施形態では、外因性ＲＮＡ分子中の阻害配列は、切断部位の上流または下流に配置できる。このセクションでは、阻害配列が外因性ＲＮＡ分子の切断部位の下流に配置される場合の実施形態に関し記載する。例えば、図３を参照されたい。
【０１０７】
一部の実施形態では、切断部位の下流に位置する阻害配列は、例えば、イントロンを含んでもよい。外因性ＲＮＡ分子は、従って、外因性ＲＮＡ分子を分解するナンセンス変異依存分解機構（ＮＭＤ）の標的となりうる［２９］。例えば、図１１Ａを参照されたい。
【０１０８】
一実施形態では、切断部位の下流に位置する阻害配列は、翻訳リプレッサータンパク質に結合できる配列を含むことができ、翻訳リプレッサータンパク質は、内在性翻訳リプレッサータンパク質であるか、または組成物によりコードされ、それにより、翻訳リプレッサータンパク質が、外因性ＲＮＡ分子内から目的の外因性タンパク質への翻訳の効率を直接または間接的に低減させることができる［２４］。翻訳リプレッサータンパク質に結合できる配列は、例えば、限定されないが、ｓｍａｕｇリプレッサータンパク質（５’−ＵＧＧＡＧＣＡＧＡＧＧＣＵＣＵＧＧＣＡＧＣＵＵＵＵＧＣＡＧＣＧ−３’（配列番号２８））［２５］の結合配列であってもよい。例えば、図１１Ｂを参照されたい。
【０１０９】
別の実施形態では、切断部位の下流に位置する阻害配列は、細胞内局在のためのＲＮＡ局在化シグナル（同時翻訳移入を含む）または内在性ｍｉＲＮＡ結合部位を含むことができ、外因性ＲＮＡ分子の細胞内局在により、目的の外因性タンパク質の翻訳を阻害でき、また、外因性ＲＮＡ分子の半減期を短くできる。ＲＮＡ局在化シグナルは、例えば、限定されないが、ミエリン形成末梢、ミエリンコンパートメント、ラメラの前縁、ミトコンドリアまたは核周囲細胞質のためのＲＮＡ局在化シグナルを含むことができる［２２］。ＲＮＡ局在化シグナルは、例えば、限定されないが、ミエリン形成末梢のためのＲＮＡ局在化シグナル５’−ＧＣＣＡＡＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＣＡＵＧ−３’（配列番号２９）または５’−ＧＣＣＡＡＧＧＡＧＣＣ−３’（配列番号３０）［２７］であってもよい。例えば、図１１Ｃを参照されたい。
【０１１０】
別の実施形態では、切断部位の下流に位置する阻害配列は、外因性ＲＮＡ分子の分解を刺激することができるＲＮＡ不安定化配列を含むことができ、ＲＮＡ不安定化配列は、ＡＵリッチ領域（ＡＲＥ）またはエンドヌクレアーゼ認識部位であってもよい。ＡＵリッチ領域は、例えば、限定されないが、少なくとも約３５ヌクレオチド長のＡＵリッチ領域であってもよい。ＡＵリッチ領域は、例えば、５’−ＡＵＵＵＡ−３’（配列番号３１）、５’−ＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）−３’（配列番号３２）または５’−ＡＵＵＵ−３’（配列番号３３）［２６］であってもよい。例えば、図１１Ｄを参照されたい。
【０１１１】
別の実施形態では、切断部位の下流に位置する阻害配列は、上流にある目的の外因性タンパク質の翻訳の効率を低減できる二次構造を形成できる配列を含むことができる。例えば、図１１Ｅを参照されたい。
【０１１２】
別の実施形態では、切断部位の下流に位置する阻害配列は、二次構造の形成のために、切断部位のすぐ上流に位置するヌクレオチド配列に結合できる切断部位のすぐ下流の配列を含むことができる。二次構造は、上流にある目的の外因性タンパク質の翻訳の効率を直接または間接的に低減できる。一部の実施形態では、二次構造の折り畳み自由エネルギーは、−３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満（例えば、−５０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、−８０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）である可能性があり、従って、この二次構造は、スキャニングリボソームが目的の外因性タンパク質の停止コドンに到達するのを阻止するのに充分である。別の実施形態では、切断部位は、二次構造の単鎖領域またはループ領域内に位置し、単鎖領域またはループ領域は、例えば、限定されないが、少なくとも約１５ヌクレオチド長の領域であってもよい。例えば、図１２Ａを参照されたい。
【０１１３】
３．２．３’末端の切断部位で切断された外因性ＲＮＡ分子の翻訳の効率を高めることが可能な追加の構造
このセクションでは、追加の構造の実施形態に関して記載され、これらの追加の構造が切断された外因性ＲＮＡ分子の翻訳の効率を高めることができ、この場合、切断された外因性ＲＮＡ分子の切断部位は、３’末端である。
【０１１４】
一部の実施形態では、外因性ＲＮＡ分子は、目的の外因性タンパク質をコードする配列のすぐ上流にある固有の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を有する配列を含むことができ、それにより、固有のＩＲＥＳ配列は、切断された外因性ＲＮＡ分子から目的の外因性タンパク質への翻訳の効率を高めることができる。例えば、図１２Ｂを参照されたい。
【０１１５】
本発明の別の実施形態では、外因性ＲＮＡ分子は、目的の外因性タンパク質をコードする配列のすぐ下流に固有のヌクレオチド配列を含むことができ、固有のヌクレオチド配列が固有のステムループ構造を含み、固有のステムループ構造は、切断された外因性ＲＮＡ分子の目的の外因性タンパク質への翻訳の効率および外因性ＲＮＡ分子の半減期を直接または間接的に増加させることができる。固有のステムループ構造は、例えば、限定されないが、ヒトヒストン遺伝子３’−ＵＴＲの保存ステムループ構造またはその機能的誘導体であってもよい。ヒトヒストン遺伝子３−ＵＴＲの保存ステムループ構造は、５’−ＧＧＣＵＣＵＵＵＵＣＡＧＡＧＣＣ−３’（配列番号３４）である。例えば、図１２Ｃを参照されたい。
【０１１６】
本発明の一実施形態では、セクション３．１または１で記載されている外因性ＲＮＡ分子は、目的の外因性タンパク質をコードする配列のすぐ下流に固有のヌクレオチド配列を含むことができ、それにより、固有のヌクレオチド配列が、細胞質ポリアデニル化配列を含み、切断された外因性ＲＮＡ分子の目的の外因性タンパク質への翻訳の効率、および外因性ＲＮＡ分子の半減期を直接または間接的に増加させる。細胞質ポリアデニル化配列は、例えば、限定されないが、５’−ＵＵＵＵＡＵ−３’（配列番号３５）、５’−ＵＵＵＵＵＡＵ−３’（配列番号３６）、５’−ＵＵＵＵＡＡＵ−３’（配列番号３７）、５’−ＵＵＵＵＵＵＡＵＵ−３’（配列番号３８）、５’−ＵＵＵＵＡＵＵ−３’（配列番号３９）または５’−ＵＵＵＵＵＡＵＡＡＡＧ−３’（配列番号４０）［２３］であってもよい。本発明の組成物は、また、ヒト細胞質ポリアデニル化配列結合タンパク質（ｈＣＰＥＢ）、または任意の細胞中でｈＣＰＥＢを発現させるためにその相同体をコードするポリヌクレオチド配列を含んでもよい。例えば、図１２Ｄを参照されたい。
【０１１７】
一部の実施形態では、外因性ＲＮＡ分子は、切断部位の上流で、目的の外因性タンパク質をコードする配列の下流に位置する固有のヌクレオチド配列を含むことができ、それにより、固有のヌクレオチド配列が目的の外因性タンパク質をコードする配列の上流に位置する配列に結合できる。この実施形態では、切断された外因性ＲＮＡ分子は、切断された外因性ＲＮＡ分子から目的の外因性タンパク質への翻訳の効率を高めることができる環状構造を作ることができる。例えば、図１３Ａを参照されたい。
【０１１８】
別の実施形態では、外因性ＲＮＡ分子は、切断部位の上流で、目的の外因性タンパク質をコードする配列の下流に位置する固有のヌクレオチド配列を含むことができる。固有のヌクレオチド配列は、切断された外因性ＲＮＡ分子中のキャップ構造に間接または直接的に結合できる固有のポリペプチドに結合できる。固有のポリペプチドは、また、本発明の組成物によりコードされてもよい。この実施形態では、固有のポリペプチドおよび切断された外因性ＲＮＡ分子は、切断された外因性ＲＮＡ分子から目的の外因性タンパク質への翻訳の効率を高めることができる環状構造を作ることができる。例えば、図１３Ｂを参照されたい。
【０１１９】
さらなる実施形態では、本発明の組成物は、追加のポリヌクレオチド配列を含むことができ、これは、切断部位の上流で、目的の外因性タンパク質をコードする配列の下流に位置する配列に結合できるヌクレオチド配列を３’末端に有する追加のＲＮＡ分子をコードできる。追加のポリヌクレオチド配列の発現は、ポリメラーゼＩＩベースプロモーターにより進行させることができる。この実施形態では、追加のＲＮＡ分子は、切断された外因性ＲＮＡ分子に結合でき、それに、切断された外因性ＲＮＡ分子から目的の外因性タンパク質への翻訳の効率を高めることができるポリＡテールを与える。例えば、図１３Ｃを参照されたい。
【０１２０】
３．３．インタクト外因性ＲＮＡ分子の翻訳の効率を低減させることが可能な追加の構造
このセクションでは、切断される前のインタクト外因性ＲＮＡ分子の翻訳の効率を低減させることができる追加の構造に関する実施形態について記載する。
【０１２１】
一部の実施形態では、組成物は、阻害配列の下流の位置の外因性ＲＮＡ分子の切断に直接または間接的に影響を与えることができる特定の切断成分をさらに含むことができ、この場合、阻害配列は、切断部位の下流に配置される。この特定の切断成分は、例えば下記を含むことができる：
(a)  外因性ＲＮＡ分子内に位置する特定の核酸配列であって、限定されないが、エンドヌクレアーゼ認識部位、内在性ｍｉＲＮＡ結合部位、シス作用性リボザイムまたはｍｉＲＮＡ配列から選択してもよい特定の核酸配列；または
(b)  本発明の組成物によりコードされる特定の阻害性ＲＮＡであって、限定されないが、：マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ラリアート型ＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ発現ドメイン、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはリボザイムから選択してもよい特定の阻害性ＲＮＡ。
【０１２２】
この実施形態では、特定の切断成分は、インタクト外因性ＲＮＡ分子から目的の外因性タンパク質への翻訳の効率を低減させるために、インタクト外因性ＲＮＡ分子からポリＡテールを取り除くことができる。例えば、図１３Ｄを参照されたい。
【０１２３】
４．明確化および追加の実施形態
用語の「充分な相補性」は、限定されないが、結合ができること、または少なくとも部分的に相補的であることを含むことができる。一部の実施形態では、用語の充分な相補性は、約３０〜１００％の範囲である。例えば、一部の実施形態では、用語の充分な相補性は、少なくとも３０％相補性である。例えば、一部の実施形態では、用語の充分な相補性は、少なくとも５０％相補性である。例えば、一部の実施形態では、用語の充分な相補性は、少なくとも７０％相補性である。例えば、一部の実施形態では、用語の充分な相補性は、少なくとも９０％相補性である。例えば、一部の実施形態では、用語の充分な相補性は、約１００％相補性である。
【０１２４】
一部の実施形態では、本発明の組成物が挿入／導入できる細胞は、例えば、限定されないが、ヒト細胞、動物細胞、培養細胞、植物細胞、一次細胞、生物体中に存在する細胞であってもよい。
【０１２５】
一部の実施形態では、外因性ＲＮＡ分子を切断する特異的内在性ｍｉＲＮＡは、例えば、限定されないが、特定細胞タイプ固有のマイクロＲＮＡ、腫瘍性細胞に固有のｍｉＲＮＡ、ウイルスマイクロＲＮＡ、等であってもよい。ウイルスｍｉＲＮＡをコードするウイルスは、例えば、限定されないが、二本鎖ＤＮＡウイルス、単鎖ＤＮＡウイルス、二本鎖ＲＮＡウイルス、二本鎖ＲＮＡウイルス、単鎖（プラス鎖）ウイルス、単鎖（マイナス鎖）ウイルスまたはレトロウイルスから選択できる。
【０１２６】
一部の代表的実施形態では、外因性ＲＮＡ分子を切断できる特異的内在性ｍｉＲＮＡは、例えば、限定されないが、下記から選択できる：ｍｉＲ−１７−９２、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１５５、ｍｉｒ−６７５、ｍｉＲ−１０ｂ、ｈｓｖ１−ｍｉＲ−Ｈ１、ｈｓｖ１−ｍｉＲ−Ｈ２、ｈｓｖ１−ｍｉＲ−Ｈ３、ｈｓｖ１−ｍｉＲ−Ｈ４、ｈｓｖ１−ｍｉＲ−Ｈ５、ｈｓｖ１−ｍｉＲ−Ｈ６、ｈｓｖ２−ｍｉＲ−Ｉ、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ２２Ａ、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ３６、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ７０、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ１１２、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ１４８Ｄ、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ４、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ５−ｌ、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ５−２、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ２５−１、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ２５−２、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ３３、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−１、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−２、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−３、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−４、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−５、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−６、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−７、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−８、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−９、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−１０ａ、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−１０ｂ、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−１１、ｋｓｈｖ−ｍｉＲ−Ｋ１２−１２、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ２、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ３、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ４、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ５、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ６、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ７、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ８、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ９、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１０、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１１、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１２、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１３、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１４、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１５、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１６、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１７、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１８、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１９、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ２０、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＨＲＦ１−１、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＨＲＦ１−２、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＨＲＦ１−３、ｂｋｖ−ｍｉＲ−Ｂ１、ｊｃｖ−ｍｉＲ−Ｊ１、ｈｉｖ１−ｍｉＲ−Ｈ１、ｈｉｖ１−ｍｉＲ−Ｎ３６７、ｈｉｖ１−ｍｉＲ−ＴＡＲ、ｓｖ４０−ｍｉＲ−Ｓ１、ＭＣＰｙＶ−ｍｉＲ−Ｍ１、ｈｓｖ１−ｍｉＲ−ＬＡＴ、ｈｓｖ１−ｍｉＲ−ＬＡＴ−ＩＣＰ３４．５、ｈｓｖ２−ｍｉＲ−ＩＩ、ｈｓｖ２−ｍｉＲ−ＩＩＩ、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ２３、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ３６−１、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ５４−１、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ７０−１、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ２２Ａ−１、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ１１２−１、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＬ１４８Ｄ−１、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ４−１、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ２４、ｈｃｍｖ−ｍｉＲ−ＵＳ３３−１、ｈｃｍｖ−ＲＮＡβ２．７、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１−１、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１−２、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＡＲＴ１−３、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＨＦＲ１、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＨＦＲ２、ｅｂｖ−ｍｉＲ−ＢＨＦＲ３、ｈｉｖ１−ｍｉＲ−ＴＡＲ−５ｐ、ｈｉｖ１−ｍｉＲ−ＴＡＲ−ｐ、ｈｉｖ１−Ｈ���ＡｍｉＲＮＡ、ｈｉｖ１−ＶｍｉＲＮＡ１、ｈｉｖ１−ＶｍｉＲＮＡ２、ｈｉｖ１−ＶｍｉＲＮＡ３、ｈｉｖ１−ＶｍｉＲＮＡ４、ｈｉｖ１−ＶｍｉＲＮＡ５、ｈｉｖ２−ｍｉＲ−ＴＡＲ２−５ｐ、ｈｉｖ２−ｍｉＲ−ＴＡＲ２−３ｐ、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ１、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ２、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ３、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ４、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ５、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ６、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ７、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ８、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ９、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ１０、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ１１、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ１２、ｍｄｖ１−ｍｉＲ−Ｍ１３、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ１４、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ１５、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ１６、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ１７、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ１８、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ１９、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ２０、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ２１、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ２２、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ２３、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ２４、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ２５、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ２６、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ２７、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ２８、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ２９、ｍｄｖ２−ｍｉＲ−Ｍ３０、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−Ｍ２３−１、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−Ｍ２３−２、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−Ｍ４４−１、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−Ｍ５５−１、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−Ｍ８７−１、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−Ｍ９５−１、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−ｍ０１−１、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−ｍ０１−２、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−ｍ０１−２、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−ｍ０１−４、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−ｍ２１−１、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−ｍ２２−１、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−ｍ５９−ｌ、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−ｍ５９−２、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−ｍ８８−１、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−ｍ１０７−１、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−ｍ１０８−１、ｍｃｍｖ−ｍｉＲ−ｍｌ０８−２、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−１、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−２、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−３、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−４、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−５、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−６、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−７、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−８、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−９、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−１０、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−１１、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−１２、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−１３、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−１４、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−１５、ｒｌｃｖ−ｍｉＲ−ｒＬ１−１６、ｒｒｖ−ｍｉＲ−ｒＲ１−１、ｒｒｖ−ｍｉＲ−ｒＲ１−２、ｒｒｖ−ｍｉＲ−ｒＲ１−３、ｒｒｖ−ｍｉＲ−ｒＲ１−４、ｒｒｖ−ｍｉＲ−ｒＲ１−５、ｒｒｖ−ｍｉＲ−ｒＲ１−６、ｒｒｖ−ｍｉＲ−ｒＲ１−７、ｍｇｈｖ−ｍｉＲ−Ｍ１−１、ｍｇｈｖ−ｍｉＲ−Ｍ１−２、ｍｇｈｖ−ｍｉＲ−Ｍ１−３、ｍｇｈｖ−ｍｉＲ−Ｍ１−４、ｍｇｈｖ−ｍｉＲ−Ｍ１−５、ｍｇｈｖ−ｍｉＲ−Ｍ１−６、ｍｇｈｖ−ｍｉＲ−Ｍ１−７、ｍｇｈｖ−ｍｉＲ−Ｍ１−８、ｍｇｈｖ−ｍｉＲ−Ｍ１−９またはｓｖ４０−ｍｉＲ−Ｓｌ［３４、３５］。種々のｍｉＲＮＡ分子の命名法および配列は、データベースｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／で定義されている。
【０１２７】
一部の実施形態では、外因性ＲＮＡ分子によりコードされる目的の外因性タンパク質は、任意のタイプのタンパク質であってよい。例えば、目的の外因性タンパク質は、限定されないが、下記から選択できる：アルファ毒素、サポリン、トウモロコシＲＩＰ、オオムギＲＩＰ、コムギＲＩＰ、ｃｏｍ  ＲＩＰ、ライムギＲＩＰ、亜麻ＲＩＰ、志賀毒素、志賀様ＲＩＰ、モモルジン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、シュードモナス外毒素、シュードモナス外毒素Ａまたはこれらの改変型、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、ジフテリア毒素断片Ａまたはこれらの改変型、蛍光タンパク質、酵素（例えば、ルシフェラーゼ）、構造タンパク質、等。
【０１２８】
一部の実施形態では、目的の外因性タンパク質は、隣接する細胞に影響を及ぼすことができる毒素であってもよい。例えば、毒素は、限定されないが、完全型のリシン、アブリン、ジフテリア毒素またはその改変型から選択してもよい。一部の実施形態では、目的の外因性タンパク質は、例えば、その生成物が隣接する細胞も死滅させることができる酵素であってもよい。このような酵素は、例えば、限定されないが、ＨＳＶ１チミジンキナーゼであってもよい。一部の実施形態では、本発明の組成物は、ＨＳＶ１チミジンキナーゼの基質であるプロドラッグのガンシクロビルをさらに含むことができる。一部の代表的実施形態では、酵素は、大腸菌シトシンデアミナーゼであってもよく、また、組成物は、プロドラッグの５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）をさらに含んでもよい。
【０１２９】
一部の実施形態では、目的の外因性タンパク質をコードする配列は、目的の外因性タンパク質のコーディング領域に加えて、目的のタンパク質の発現を増やせる１つまたは複数のイントロンを含むことができる。一部の実施形態では、イントロンは、目的のタンパク質コードする天然の遺伝子の一部であるイントロンであってもよい。一部の実施形態では、イントロンは、無関係遺伝子のイントロンであってもよい。一部の実施形態では、外因性ＲＮＡ分子は、任意の発現ベクターにコードされてもよい。例えば、外因性ＲＮＡ分子が、ウイルスベクターによりコードされ、目的の外因性タンパク質がウイルスベクターの繁殖に必要な遺伝子の産物であってもよく、それにより、細胞中の特異的内在性ｍｉＲＮＡの存在に応答してウイルスベクターが繁殖し、繁殖のプロセスの間にその細胞を死滅させることができる。ウイルスベクターは、また、例えば、細胞中に特異的分子（例えば、ＴｅｔＲ−ＶＰ１６／ドキシサイクリン）が存在する場合に、ウイルスベクターの繁殖を停止できる遺伝子を含むことができる。ウイルスベクターが特異的内在性ｍｉＲＮＡを含まない細胞中での繁殖のために充分な変異ができると推定できる場合は、特異的分子は、身体中での全てのウイルスベクターの繁殖を停止させるために投与でき、身体中で、ほとんどのウイルスベクターの分解後、新規ウイルスベクターを再度投与できる。また、特異的プロドラッグ（例えば、チミジンキナーゼ／ガンシクロビル）が存在する場合は、ウイルスベクターは、例えば、細胞を死滅させる遺伝子を含むことができ、それにより、ウイルスベクターが、特異的内在性ｍｉＲＮＡを含まない細胞中での繁殖のために充分な変異が得られると想定される場合は、特異的プロドラッグは、身体中の全てのウイルスベクターを死滅させるために投与でき、その後、新規ウイルスベクターを再度投与できる。
【０１３０】
一部の代表的実施形態では、外因性ＲＮＡ分子は、繁殖プロセスの間に細胞を死滅させる方法で繁殖させられるウイルスベクターによりコードできる。この実施形態では、特異的内在性ｍｉＲＮＡは、患者の標的細胞（例えば、癌細胞）中には存在しないが、むしろ、特異的内在性ｍｉＲＮＡは、患者の大抵の正常なまたは非転移性腫瘍化細胞中には存在する。この例では、目的の外因性タンパク質は、毒素、例えば、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、ジフテリア毒素断片Ａまたはこれらの改変型である。ウイルスベクターが正常なまたは非転移性腫瘍化細胞に入ると、細胞を死滅させ、また、ウイルスベクターが標的細胞（癌細胞）中に入ると、ウイルスベクター繁殖プロセスの間に癌細胞を死滅させ、従って、大部分のウイルスベクターは、腫瘍領域に存在する。また、特異的分子（例えば、ＴｅｔＲ−ＶＰ１６／ドキシサイクリン）が細胞中に存在する場合は、このウイルスベクターは、ウイルスベクターの繁殖を停止できる遺伝子を含むことができる。ウイルスベクターが特異的内在性ｍｉＲＮＡを含む細胞中で繁殖のための充分な変異が得られる場合は、特異的分子を、身体中で全てのウイルスベクターの繁殖を停止するために投与でき、身体中の大部分のウイルスベクターを分解後、体細胞中で、新規ウイルスベクターを再度投与できる。また、特異的プロドラッグ（例えば、チミジンキナーゼ／ガンシクロビル）が存在する場合は、このウイルスベクターは、細胞を死滅させることができる遺伝子を含むことができ、それにより、ウイルスベクターが特異的内在性ｍｉＲＮＡを含まない細胞中での繁殖のために充分な変異を得ることができると想定される場合に、特異的プロドラッグを身体中の全てのウイルスベクターを死滅させるために投与でき、その後、新規ウイルスベクターを再度投与できる。
【０１３１】
一部の実施形態では、阻害配列は、目的の外因性タンパク質をコードする配列から切り離されるときに、目的の外因性タンパク質が発現されうる配列または配列の一部であってもよい。阻害配列が目的の外因性タンパク質をコードする配列から切り離されない場合に、阻害配列が外因性ＲＮＡ分子中の特異的構成内にある場合には、それは目的の外因性タンパク質の発現を阻害できる。阻害配列は、また、上述のいずれかの阻害配列の特異的構成内の一部のみを含んでもよい。例えば、読み枠外５’−ＡＵＧ−３’阻害配列の代わりに、阻害配列は、それぞれ、−−ＵＧ−３’または−−Ｇ−３’の構成中のＡまたは５’−ＡＵ−３’部分のみであってもよい（すなわち、外因性ＲＮＡ分子は、５’末端に読み枠外５’−ＡＵＧ−３’を含むが、切り離される予定の配列は、５’−ＡＵ−３’部分のみである）。
【０１３２】
本発明の別の実施形態では、本発明の組成物は、内在性エキソヌクレアーゼの発現を直接または間接的に阻害できる特異的機能性ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含むことができる。その特異的機能性ＲＮＡは、例えば、限定されないが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ラリアート型ＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ発現ドメイン、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはリボザイムであってもよい。
【０１３３】
本発明の別の実施形態では、上述の結合部位は、同じまたは異なるｍｉＲＮＡ用の複数の結合部位であってもよく、この場合、「切断部位の上流」という場合、また、「全ての切断部位の上流」を包含する。同様に、「切断部位の下流」という場合は、包含する「全ての切断部位の下流」をも包含する。一部の実施形態では、複数の結合部位が異なる内在性ｍｉＲＮＡ用である場合、ｍｉＲＮＡの１つしか細胞内に存在しない場合でも、目的の外因性タンパク質は発現できる。例えば、図１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃ、１４Ｄを参照されたい。
【０１３４】
本発明の一部の実施形態では、外因性ＲＮＡ分子は、１つまたは複数の特異的内在性ｍｉＲＮＡ用の追加の結合部位をさらに含み、各追加の結合部位は、特異的内在性ｍｉＲＮＡがＲＮＡ干渉によって固有の切断部位で外因性ＲＮＡ分子の切断を指示するのに充分な相補性である。各固有の切断部位は、それぞれの追加の結合部位内に位置してもよく、また、各固有の切断部位は、目的の外因性タンパク質をコードする配列の上流に位置してもよい。外因性ＲＮＡ分子は、全ての固有の切断部位の上流の１つまたは複数の開始コドンをさらに含むことができ、それにより、各開始コドンおよび目的の外因性タンパク質をコードする配列が読み枠に存在する。開始コドンは、例えば、基本的に５’−ＡＵＧ−３’から構成でき、それにより、少なくとも１つの開始コドンが、コザックコンセンサス配列内、またはいずれかの他の翻訳開始配列内に配置される。開始コドンは、例えば、ＴＩＳＵ配列［３８］であってもよい。一部の実施形態では、組成物の特異的内在性ｍｉＲＮＡを含む細胞への導入に続いて、外因性ＲＮＡ分子が転写され、特異的内在性ｍｉＲＮＡにより切断部位および各固有の切断部位で切断され、それにより、目的の外因性タンパク質をコードする配列が阻害配列および各開始コドンから切り離されて目的の外因性タンパク質が発現できる。例えば、図１５Ａを参照されたい。
【０１３５】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、直接または間接的に各開始コドンの上流の位置の外因性ＲＮＡ分子の切断に影響を与えることができる切断成分をさらに含むことができ、そのような切断成分は、例えば、下記に示すものである：
(a)  外因性ＲＮＡ分子内に位置する核酸配列であって、エンドヌクレアーゼ認識部位、内在性ｍｉＲＮＡ結合部位、シス作用性リボザイムまたはｍｉＲＮＡ配列である核酸配列；または
(b)  組成物によりコードされる阻害性ＲＮＡであって、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ラリアート型ＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ発現ドメイン、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはリボザイムである阻害性ＲＮＡ。例えば、図１５Ｂ参照。
【０１３６】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、１つまたは複数のポリヌクレオチド分子、例えば、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、または両方を含んでもよい。一実施形態では、組成物は、細胞中の特異的内在性ｍｉＲＮＡの存在下でのみ、細胞中で目的の外因性タンパク質を発現するためのＤＮＡ分子を含んでもよく、特異的内在性ｍｉＲＮＡは、例えば、細胞ｍｉＲＮＡ、ウイルスｍｉＲＮＡ、等であってもよい。ＤＮＡ分子は、外因性ＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド配列を含んでもよく、外因性ＲＮＡ分子は、以下を含むＲＮＡ分子である：目的の外因性タンパク質をコードする配列、目的の外因性タンパク質をコードする配列の上流の特異的内在性ｍｉＲＮＡ用の結合部位、目的の外因性タンパク質をコードする配列の下流の特異的内在性ｍｉＲＮＡ用の追加の結合部位、および１つは外因性ＲＮＡ分子の５’末端に、残りは外因性ＲＮＡ分子の３’末端に位置する少なくとも２つの阻害配列（それぞれの阻害配列が、目的の外因性タンパク質の発現を阻害できる）。従って、特異的内在性ｍｉＲＮＡが細胞中に存在する場合のみ、２つの阻害配列が、目的の外因性タンパク質をコードする配列から切り離されることができ、目的の外因性タンパク質が細胞中で発現できる。阻害配列は、上述のいずれの配列であってもよい。例えば、図１５Ｃを参照されたい。
【０１３７】
さらなる実施形態では、組成物は、細胞中の２つの特異的内在性ｍｉＲＮＡの存在下でのみ、目的の外因性タンパク質を細胞中で発現するためのＤＮＡ分子を含むことができる。ＤＮＡ分子は、外因性ＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド配列を含んでもよく、外因性ＲＮＡ分子は、以下を含むＲＮＡ分子である：目的の外因性タンパク質をコードする配列、目的の外因性タンパク質をコードする配列の上流の第１の特異的内在性ｍｉＲＮＡ用の結合部位、目的の外因性タンパク質をコードする配列の下流の第２の特異的内在性ｍｉＲＮＡ用のもう一つの結合部位、および１つは外因性ＲＮＡ分子の５’末端に、残りは外因性ＲＮＡ分子の３’末端にある少なくとも２つの阻害配列。各阻害配列は、目的の外因性タンパク質の発現を阻害することができ、また、２つの特異的内在性ｍｉＲＮＡが細胞中に存在する場合は、２つの阻害配列は、目的の外因性タンパク質をコードする配列から切り離され、目的の外因性タンパク質が細胞中で発現できる。阻害配列は、上述のいずれの配列であってもよい。例えば、図１５Ｄを参照されたい。
【０１３８】
追加の実施形態では、目的の外因性タンパク質のみを発現する必要がある場合で、複数の異なるｍｉＲＮＡが細胞中に同時に存在する場合には、本発明の組成物は、複数の外因性ＲＮＡ分子を含むかまたはコードでき、この場合、各外因性ＲＮＡ分子の構造は、上述のようであってよい。外因性ＲＮＡ分子は、類似であっても、異なってもよい。それぞれのこれらの外因性ＲＮＡ分子は、異なるｍｉＲＮＡ結合部位および異なる目的のタンパク質をコードする異なる配列を含むことができ、それにより、全ての異なる目的のタンパク質が、新規機能を細胞中で一緒に作り出すことができる。例えば、複数の異なるｍｉＲＮＡが３つの異なるｍｉＲＮＡを含む場合には、３つの異なる外因性ＲＮＡ分子から発現した３つの異なる目的のタンパク質が、感染防御抗原（ＰＡ）、浮腫因子（ＥＦ）および致死因子（ＬＦ）から選択でき、それにより、３つの異なるｍｉＲＮＡが同時に細胞中に存在する場合、３つのタンパク質：感染防御抗原（ＰＡ）、浮腫因子（ＥＦ）および致死因子（ＬＦ）が発現し、細胞死を誘導できる炭疽毒素を一緒に作り出すことができる。
【０１３９】
別の実施形態では、外因性ＲＮＡ分子は、切断部位および目的の外因性タンパク質をコードする配列の間に細胞内局在（同時翻訳移入を含む）のためのＲＮＡ局在化シグナルをさらに持つことができ、それにより、阻害配列が、細胞内局在のためのＲＮＡ局在化シグナルの機能を阻害できるが、目的の外因性タンパク質の適切な発現のために外因性ＲＮＡ分子の細胞内局在が必要である。例えば、図１６Ａ、１６Ｂを参照されたい。
【０１４０】
さらなる実施形態では、阻害配列は、切断部位の上流の開始コドンを含んでもよく、この場合、開始コドンは、基本的に５’−ＡＵＧ−３’から構成される。阻害配列は、開始コドンのすぐ下流にアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をさらに含むことができ、それにより、ヌクレオチド配列および目的の外因性タンパク質をコードする配列が同じ読み枠になる。アミノ酸配列は、目的の外因性タンパク質の細胞内局在のための選別グシグナルの機能を阻害でき、適切な発現のために目的の外因性タンパク質の細胞内局在が必要である。例えば、図１６Ｃを参照されたい。
【０１４１】
本発明の別の実施形態では、外因性ＲＮＡ分子は、目的の外因性タンパク質をコードする配列の出発コドンの下流の停止コドンを含まない。阻害配列は、目的の外因性タンパク質をコードする配列の下流に配置でき、阻害配列および目的の外因性タンパク質をコードする配列が同じ読み枠になり、阻害配列は、下記からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする：
(a)  目的の外因性タンパク質の機能を阻害できるアミノ酸配列；
(b)  細胞内局在の選別グシグナルアミノ酸配列；
(c)  タンパク質分解シグナルであるアミノ酸配列；
(d)  目的の外因性タンパク質の細胞内局在のための選別グシグナルの機能を阻害できるアミノ酸配列；および
(e)  切断部位および目的の外因性タンパク質をコードする配列の出発コドンの間に位置するヌクレオチド配列によりコードされるペプチド配列の切断を阻害できるアミノ酸配列であって、ヌクレオチド配列および目的の外因性タンパク質をコードする配列が、同じ読み枠にあり、ペプチド配列が哺乳動物細胞中のプロテアーゼにより切断されうるアミノ酸配列。（ヒト細胞では、停止コドンのない切断型ｍＲＮＡの翻訳の間に、リボソームは、末端コドンで停止し、同族ｔＲＮＡ分子は、ポリペプチド鎖およびリボソームに結合したまま残るが、しかし、翻訳の最中に、小胞体シグナルペプチダーゼによって、ペプチジル−ｔＲＮＡ種の必要な処理がなされうることが報告されている［３２］）。例えば、図１６Ｄを参照されたい。
【０１４２】
本発明の組成物の合成
一部の実施形態では、上記で詳述したように、組成物は、外因性ＲＮＡ分子を含むか、またはそれをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド分子を含んでもよい。ポリヌクレオチド分子は、１つまたは複数のＤＮＡ分子、１つまたは複数のＲＮＡ分子、またはこれらの組み合わせであってもよい。一部の代表的実施形態では、組成物は、外因性ＲＮＡ分子をコードする１つまたは複数のＤＮＡ分子を含んでもよい。外因性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子は、組換え操作により種々の宿主ベクター系／構築物中に挿入でき、これは、また、大規模なＤＮＡの複製を与え、外因性ＲＮＡ分子の転写を指示するための必要な配列を含むことができる。このようなベクターの標的細胞への導入は、細胞内で充分な量の外因性ＲＮＡ分子の転写をもたらす。例えば、ベクターは、インビボで導入でき、細胞に取り込まれ、外因性ＲＮＡ分子の転写を指示する。このようなベクターは、所望の外因性ＲＮＡ分子を産生するために転写されうる間は、エピソームとして残るか、または染色体に統合される。このようなベクターは、当技術分野でよく知られた組換えＤＮＡ技術で構築されるか、またはＤＮＡ分子合成用の当技術分野で既知のいずれかの方法により調製できる。
【０１４３】
一部の実施形態では、外因性ＲＮＡ分子をコードする組換えＤＮＡ構築物は、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルスベクター、または、所望の標的細胞（例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞、マウス細胞）、鳥類細胞、植物細胞、等）中で複製および発現に使われる当技術分野で既知のいずれかの他のベクターを含むことができる。外因性ＲＮＡ分子の発現は、当技術分野で既知の所望の標的細胞中で働くいずれかのプロモーターにより調節できる。このようなプロモーターは、誘導性でも、または構成的であってもよい。このようなプロモーターには、例えば、限定されないが、ＳＶ４０初期プロモーター領域、ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列に含まれるプロモーター、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター、メタロチオネイン遺伝子の調節配列、ウイルスＣＭＶプロモーター、ヒト絨毛性ゴナドトロピンベータプロモーター、等が含まれる。一部の実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター（すなわち、ＲＮＡＰｏｌ．Ｉにより認識されるプロモーター）、例えば、リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）遺伝子のプロモーターであってもよい。このような実施形態では、目的の外因性ＲＮＡ分子の終止シグナルは、ＲＮＡＰｏｌ．Ｉ終止シグナルまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩ終止シグナル（例えば、ポリＡシグナル）であってもよい。いずれのタイプのプラスミド、コスミド、ＹＡＣまたはウイルスベクターも標的細胞／細胞集団または組織部位に直接的に導入可能な組換えＤＮＡ構築物の調製に使用できる。あるいは、選択的に所望の標的細胞に感染するウイルスベクターは、使用可能である。
【０１４４】
一部の実施形態では、ウイルス性感染症または癌に抵抗性の形質転換体の形成のために、外因性ＲＮＡ分子をコードするベクターは、選択可能マーカーを持つのが望ましい。限定されないが、それぞれ、ｔｋ、ｈｇｐｒｔまたはａｐｒｔ欠損細胞中の単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼおよびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼタンパク質の発現のための選択を含む多数の選択系が使用可能である。また、抗代謝耐性は、メトトレキサートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸トランスフェラーゼ（ｄｈｆｒ）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するネオマイシン（ｎｅｏ）；およびヒグロマイシンに対する耐性を付与するヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒｏ）のための選択の基準として使用できる。
【０１４５】
一部の実施形態では、本発明の実施で使用するベクターは、いずれの発現ベクターであってもよい。一部の代表的実施形態では、外因性ＲＮＡ分子は、ウイルス発現ベクターによりコードされる。ウイルス発現ベクターは、限定されないが、下記から選択できる：ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科、パピローマウイルス科、パルボウイルス科、ヘパドナウイルス科、レトロウイルス科、レオウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、ニューモウイルス亜科、ラブドウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ハンタウイルス科、ピコルナウイルス科、カリシウイルス科、トガウイルス科、フラビウイルス科、アレナウイルス科、コロナウイルス科、またはヘパシウイルス属。ウイルス発現ベクターには、また、限定されないが、その細胞屈性が繊維タンパク質のアデノウイルス末端ノブドメイン（ＨＩループ）の置換により改変されて、これが繊維表面に露出されているアデノウイルスベクターも含まれる。
【０１４６】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、１つまたは複数のＲＮＡ分子を含んでもよく、これは、例えば、外因性ＲＮＡ分子それ自体または誘導体またはそれらの改変体、単鎖または二本鎖であってもよい。外因性ＲＮＡ分子は、限定されないが、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオシド、リン酸ジエステル結合、改変結合または５つの生物学的に発生する塩基以外の塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）等のヌクレオチドを有してもよい。
【０１４７】
一部の実施形態では、外因性ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子の合成用の当技術分野で既知の方法により合成できる。例えば、外因性ＲＮＡ分子は、市販の試薬およびシンセサイザーを使って、当技術分野でよく知られた方法により化学的に合成できる。あるいは、外因性ＲＮＡ分子は、外因性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボ転写により作製できる。このようなＤＮＡ配列は、適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーター、例えば、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターを組み込んだ各種のベクター中に組み込むことができる。外因性ＲＮＡ分子は、プラスミド、例えば、ＳＰＳ６５を使ってインビトロ転写を介して高収率で産生出来る。さらに、Ｑベータ増幅、等のＲＮＡ増幅方法を利用して、外因性ＲＮＡ分子を産生出来る。
【０１４８】
一部の実施形態では、外因性ＲＮＡ分子または外因性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子は、塩基部分、糖部分、またはリン酸塩骨格の位置で改変して、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーション、細胞中への輸送、等を改善できる。さらに、改変を行って、ヌクレアーゼ分解に対する感受性を減らすことができる。外因性ＲＮＡ分子または外因性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子は、他の付加基、例えば、ペプチド（例えば、宿主細胞受容体のインビボ標的化のための）、または細胞膜または血液脳関門を通過して輸送を促進する薬剤、ハイブリダイゼーション誘発切断薬剤または挿入剤を有してもよい。種々の他のよく知られた改変が、細胞内の安定性および半減期の増加の手段として、導入できる。可能な改変には、限定されないが、リボまたはデオキシヌクレオチドの隣接配列の分子の５’および／または３’末端への付加が含まれる。安定性の増加が所望である一部の環境では、改変ヌクレオシド間結合、例えば、２’−Ｏ−メチル化を有する核酸が、好ましと思われる。改変ヌクレオシド間結合を含む核酸は、当技術分野でよく知られた試薬と方法を使って合成できる。
【０１４９】
さらなる実施形態では、外因性ＲＮＡ分子または外因性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子は、当技術分野でよく知られたいずれかの適切な手段（例えば、逆相クロマトグラフィーまたはゲル電気泳動法）で精製できる。
【０１５０】
一部の実施形態では、外因性のＲＮＡをコードするウイルスベクターを産生する細胞は、また、患者の身体での連続治療のための移植に使用できる。これらの細胞は、血液中の特異的分子（例えば、ＨＳＶ１チミジンキナーゼ／ガンシクロビル）の存在下でそれらの脂肪を誘導できる特異的遺伝子を保有できる。
【０１５１】
一部の実施形態では、外因性ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子または複製ＲＮＡ分子であってもよい。複製ＲＮＡ分子は、外因性ＲＮＡ分子に相補的な配列を含むＲＮＡ分子であり、それにより、複製ＲＮＡ分子は、外因性ＲＮＡ分子の形成のために細胞中で複製されうる。
【０１５２】
６．本発明の組成物の使用と投与
一部の実施形態では、本発明の組成物は、例えば、限定されないが、遺伝子発現の調節、標的細胞死、例えば、癌等の増殖性疾患の治療、ＨＩＶ等の感染症の治療、形質転換体の形成、自殺遺伝子治療、等の種々の状態および傷害の治療、等の様々な異なる用途があり得る。組成物は、例えば、哺乳動物（ヒト、マウス、等）、鳥類、植物、等の種々の生物に使用できる。組成物は、種々の細胞（培養および／またはインビボで）、組織、器官、および／または生物体に対し使用できる。
【０１５３】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、ウイルスｍｉＲＮＡを発現する癌細胞の死滅のために、またはウイルス感染細胞を死滅させるために、このウイルスｍｉＲＮＡである特異的内在性ｍｉＲＮＡを発現する細胞中で、毒性遺伝子を発現、および／または活性化するために使用できる。本発明の別の実施形態では、本発明の組成物は、特異的内在性ｍｉＲＮＡとして発癌性ｍｉＲＮＡ（癌細胞中で強力に発現上昇しているｍｉＲＮＡ）を含む細胞を死滅させるために、これらの細胞中で毒性遺伝子を発現、および／または活性化するために使用できる。
【０１５４】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、ウイルス性感染症または癌のような疾患の診断のために、ウイルス性または発癌性ｍｉＲＮＡの存在下、レポーター遺伝子を発現、および／または活性化するために使用できる。別の実施形態では、外因性ＲＮＡ分子をコードするベクターを安定に形質移入された細胞が、ウイルス性感染症または癌に対し抵抗性の形質転換体の形成のために使用できる。別の実施形態では、ウイルス性感染疾患の診断のために、レポーター遺伝子を活性化できる形質転換体の形成を目的として、ウイルスｍｉＲＮＡの存在下、本発明の組成物を使用して細胞に安定に形質移入できる。さらに別の実施形態では、本発明の組成物を使用して、細胞中のｍｉＲＮＡの機能をリアルタイムでモニターでき、また、細胞中のｍｉＲＮＡの形成または発現上昇を伴う疾患（例えば、癌およびウイルス性感染症）の診断を行うことができる。
【０１５５】
一部の実施形態では、種々のデリバリーシステムが既知であり、本発明の組成物を細胞中に移入するために使用できる。このデリバリーシステムには、例えば、リポソーム内封入、微粒子、マイクロカプセル、組成物を発現できる組換え細胞、受容体依存性エンドサイトーシス、ウイルスベクターまたは複製プロセスの間に細胞を死滅させることなく複製できる本発明の組成物を含む他のベクターやウイルスベクター、複製できず本発明の組成物を含むウイルスベクターの一部としての本発明の組成物の構築、本発明の組成物を含むウイルスベクターを産生する細胞の注入、ＤＮＡの注入、電気穿孔、リン酸カルシウム媒介形質移入、等、または当技術分野で既知もしくは将来開発される見込みのいずれかの他の方法、がある。
【０１５６】
一部の実施形態では、理論または機序に拘泥する意図はないが、本発明の組成物と方法は、特異的かつ標的にしている細胞の「全か無かの」応答を与えることができる。換言すれば、本発明の組成物と方法は、外因性ＲＮＡ分子が特異的内在性ｍｉＲＮＡを含む標的細胞中でのみ切断され（そして、その結果、目的の外因性タンパク質が発現、活性化される）、一方、その内在性ｍｉＲＮＡを含まない細胞は、本発明の組成物により影響を受けない方法である。本発明の組成物と方法は、従って、内在性ｍｉＲＮＡを含まない細胞中で目的の外因性タンパク質の発現の漏出性が観察されないため、強化された安全性および制御が提供できる。
【０１５７】
一部の実施形態では、特異的細胞集団を死滅させる方法が提供され、その細胞集団は、これらの細胞に対し固有で、特異的である特異的内在性ｍｉＲＮＡを含む。この方法は、細胞に本発明の組成物を導入することを含み、その組成物は、特異的内在性ｍｉＲＮＡを発現している細胞中でのみ、目的の外因性タンパク質の発現を指示するための１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む。ここで、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、外因性ＲＮＡ分子を含むか、またはそれをコードし、また、外因性ＲＮＡ分子は、目的の外因性タンパク質をコードする配列；目的の外因性タンパク質の発現を阻害できる阻害配列；および前記特異的内在性ｍｉＲＮＡ用の結合部位を含む。
【０１５８】
一部の実施形態では、目的の外因性タンパク質は、細胞機能に損傷を与えることができ、結果として、細胞の死亡に繋がるいずれのタイプのタンパク質であってもよい。タンパク質は、限定されないが、次のようなタンパク質から選択できる：毒素、細胞阻害剤、細胞増殖モジュレーター、細胞シグナル伝達経路阻害剤、細胞シグナル伝達経路モジュレーター、細胞透過性モジュレーター、細胞プロセスモジュレーター、等。
【０１５９】
一部の実施形態では、例えば、発現ベクター（ウイルスベクターまたは非ウイルスベクター）等のベクターが提供され、これは、外因性ＲＮＡ分子をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド配列を含み、前記外因性ＲＮＡ分子は、目的の外因性タンパク質をコードする配列；目的の外因性タンパク質の発現を阻害できる阻害配列；および特異的内在性ｍｉＲＮＡ用結合部位を含む。特異的内在性ｍｉＲＮＡ用の結合部位は、ベクターが特異的内在性ｍｉＲＮＡを含む細胞中に導入される場合に、特異的内在性ｍｉＲＮＡが切断部位での外因性ＲＮＡ分子の切断を指示するために、特異的内在性ｍｉＲＮＡ内の配列に対し充分な相補性である。切断部位は、特異的内在性ｍｉＲＮＡ用の結合部位内に位置してもよく、また、さらに、切断部位は、阻害配列および目的の外因性タンパク質をコードする配列の間に位置してもよい。一部の実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列である。一部の実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列である。当技術分野で既知のように、ベクターは、その操作に必要な種々の他のポリヌクレオチド配列（例えば、調節配列、非コード配列、構造配列、等）をさらに含むことができる。
【０１６０】
さらなる実施形態では、本発明は、また、有効量の本発明の組成物および薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物を提供する。用語の「薬学的に許容可能な」は、動物、さらに具体的にはヒトに使用するために、連邦または州政府の規制当局により承認されている、または米国薬局方または他の一般的に認められている薬局方に挙げられていることを意味する。用語の「キャリア」は、治療薬と一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビークル、を意味する。
【０１６１】
一部の実施形態では、医薬組成物は、例えば、限定されないが、腸内、非経口、注射、局所的、等の既知のいずれかの投与経路により、必要としている対象に投与できる。一部の実施形態では、治療の必要な標的領域に局所的に本発明の医薬組成物を投与するのが望ましい可能性がある。これは、例えば、限定されないが、手術の間の局所注入、局所的投与により、（例えば、手術後の創傷被覆と併せて）、注射により、カテーテルを使って、坐剤を使って、またはインプラント（膜、例えば、サイラスティック膜、または繊維を含む多孔性、非多孔性、またはゼラチン状材料製）を使って実現できる。局所投与は、また、制御放出薬剤デリバリーシステム、例えば、ナノ粒子、徐放型ポリマーまたはヒドロゲル等のマトリックスにより実現できる。
【０１６２】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、標的細胞／組織中で所望の効果を得るのに有効な量を投与できる。本発明の組成物の有効用量は、生物学的半減期、バイオアベイラビリティおよび毒性としてこれらのパラメーターを処理するこれらの技術分野でよく知られた方法により決定できる。本発明の組成物の有効な量は、治療される疾患または傷害の性質に依存し、標準的臨床的技術により決定できる。さらに、任意選択で、インビトロアッセイを採用して、最適用量範囲の特定を支援することができる。投与手段には、また、限定されないが、患者の血流への本発明の組成物の常置または連続注入が含まれる。
【０１６３】
一部の実施形態では、組成物およびそれを含む医薬組成物は、例えば、哺乳動物、鳥類、植物、等の種々の生物体に投与できる。例えば、組成物およびそれを含む医薬組成物は、ヒト、および動物に投与できる。
【０１６４】
さらなる実施形態では、本発明は、また、１つまたは複数の本発明の医薬組成物成分を入れた１つまたは複数の容器を含む医薬品パックまたはキットを提供する。任意選択で、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売規制行政機関により指示された形式の、ヒトまたは動物への投与のためのその製造、使用または販売機関の承認を反映した通知をこのような容器に添付してもよい。
【０１６５】
実施例
以下の実施例は、例示の目的で提示され、限定する意図はなく、また、本発明の最良の実施形態の例である。
実施例１  外因性のＲＮＡによりコードされた目的の外因性タンパク質の特異的発現
実施例１に記載の実験用の一般的プロトコル：
形質移入の前日に、ウエル当たり約１２０，０００のＴ２９３細胞を２４ウエルプレートに播種し、形質移入の日に、各ウエルを下記を使って同時形質移入した：
１.   
ウミシイタケ／ルシフェラーゼプラスミド−ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子およびホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現している１７０ｎｇのプラスミド（プラスミドＥ１１、Ｐｓｖ４０−ＩＮＴＲＯＮ−ＭＣＳ−ＲＬｕｃ−Ｐｈｓｖｔｋ−Ｆｌｕｃ（配列番号２２）またはプラスミドＥ６５、Ｐｓｖ４０−ＩＮＴＲＯＮ−Ｔｓｐ−ＴＤ１−ＴＬａｃＺ−ＲＬｕｃ−ＰＴＳ−６０ＡＴＧ−Ｐｈｓｖｔｋ−ＦＬｕｃ（配列番号２３））。
２.   
試験済みプラスミド＝３０ｎｇの試験済みプラスミド（詳細は下記）。
３.   
ｓｉＲＮＡ＋またはｓｉＲＮＡ−＝試験済みプラスミドによりコードされたｍＲＮＡの切断を誘導できる（ｓｉＲＮＡ＋）または切断を誘導できない（ｓｉＲＮＡ−）１０ｐｍｏｌｅのｓｉＲＮＡ二本鎖分子（詳細は下記）。
【０１６６】
形質移入を、リポフェクタミン２０００形質移入試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使って、メーカーのプロトコルに従って行った。形質移入の４８時間後、ジュアルルシフェラーゼレポーターアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびルミノメーター（ｇｌｏｍａｘ２０／２０  ｐｒｏｍｅｇａ）を使ってウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子発現を測定し、相対発光量（ＲＬＵ）を求めた。
【０１６７】
試験済みプラスミドは、下記のプラスミドの内のいずれのタイプでもよい：
陰性対照＝ジフテリア毒素（ＤＴＡ）をコードしていないプラスミド；
陽性対照＝構成的にジフテリア毒素（ＤＴＡ）をコードしているプラスミド；
試験プラスミド＝本発明の組成物のプラスミド、すなわち、阻害配列およびジフテリア毒素（ＤＴＡ）をコードする下流の配列の間にｓｉＲＮＡ＋用の標的部位を含むプラスミド。試験プラスミドに対しては、同時形質移入されたｓｉＲＮＡ＋が、試験プラスミドの阻害配列を切断する場合、ジフテリア毒素を発現でき、発現している細胞を死滅させ、それにより、ウミシイタケの発現および全体のＲＬＵ測定値を低減させる。
【０１６８】
試験済みプラスミドは、２つの異なるｓｉＲＮＡｓ＋および２つの異なるｓｉＲＮＡｓ−で別々に、それぞれ、３回繰り返して試験された。
結果は、以下のように計算される：
活性化の倍数＝試験プラスミド（６ウエル）を含むそれぞれ２つのｓｉＲＮＡ−の存在下の測定ＲＬＵ（相対発光量）の平均を、試験プラスミド（３ウエル）を含むｓｉＲＮＡ＋の１つを使ったＲＬＵの平均で割った値。
漏出倍数＝陰性対照プラスミドを含む全てのｓｉＲＮＡｓ−／＋を使ったＲＬＵの平均を、試験プラスミドを含む各２つのｓｉＲＮＡ−を使ったＲＬＵの平均で割った値。
ｓｉＲＮＡ＋／−ＲＬＵ＝１つの同時形質移入ｓｉＲＮＡ＋の存在下、または２つの同時形質移入ｓｉＲＮＡ−の存在下、独立に測定したＲＬＵの平均。
【０１６９】
プラスミドは、分子生物学の技術分野で行われている通常の、既知の方法を使って構築した。以下に本明細書に記載の構築プラスミドのためのバックボーンベクターは：ｐｓｉＣＨＥＣＫ（登録商標）−２ベクター（ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ８０２１）またはｐｃｍｖ６−Ａ−ＧＦＰ（ＯｒｉＧｅｎｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＰＳ１０００２６）である。各プラスミドの付加名は、プラスミド配列内に含まれる配列を示す。これについては、試験プラスミドに関して、下記でさらに詳述する。
【０１７０】
ｓｉＲＮＡ配列：
１.   
ＲＬ  Ｄｕｐｌｅｘ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ−００２０７０−０１−２０）（配列番号６５（センス鎖）および配列番号６６（アンチセンス鎖））。
２.   
ＧＦＰＤｕｐｌｅｘ  ＩＩ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ−００２０４８−０２−２０）、（配列番号６７（センス鎖）および配列番号６８（アンチセンス鎖））。
３.   
ｓｉＲＮＡ−対照（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＶＣ３０００２  ００００１０）、（配列番号６９（センス鎖）および配列番号７０、（アンチセンス鎖））。
４.   
抗βＧａｌ  ｓｉＲＮＡ−１（（標的部位：Ｔｌａｃｚ（配列番号７１））、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ−００２０７０−０１−２０）（配列番号７２（センス鎖）および配列番号７３（アンチセンス鎖））。
５.   
ルシフェラーゼＧＬ３  Ｄｕｐｌｅｘ（（標的部位：Ｔｆｌｕｃ（配列番号７４））、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｄ−００１４００−０１−２０）、（配列番号７５（センス鎖）および配列番号７６（アンチセンス鎖））。
６.   
ＧＦＰＤｕｐｌｅｘ  Ｉ（（標的部位：ＴＤ１、（配列番号７７））、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ−００２０４８−０１−２０）、（配列番号７８（センス鎖）および配列番号７９（アンチセンス鎖））。
７.   
ＴＣＴＬ（（標的部位：ＴＣＴＬ（配列番号８０））、配列番号８１（センス鎖）および配列番号８２（アンチセンス鎖））。
【０１７１】
各実験では、試験プラスミド中に標的部位を有するｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ＋として使用され、試験済みプラスミド中に対応する標的部位を持たないその他のｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ−として使用された。
【０１７２】
陰性対照プラスミド：
１.   
Ｅ３４（配列番号１０）−Ｐｃｍｖ−４ＯＲＦ＾−ＴＤ１−Ｔｆｌｕｃ---Ｐｓｖ４０−ＴＧＦＰ。
２.   
Ｅ７１（配列番号１７）−Ｐｓｖ４０−ＩＮＴＲＯＮ−４ＯＲＦ＾---Ｐｈｓｖｔｋ−Ｆｌｕｃ。
３.   
Ｅ３８−３ＣＡＲｚ−４Ｓ＆Ｌ。Ｅ３８（配列番号１９）の挿入は、ｐａｃＩおよびＸｈｏＩ制限酵素部位でＰＭＫシャトルベクター（ＧｅｎｅＡｒｔ）中に連結される。
【０１７３】
陽性対照プラスミド：
１.   
Ｅ２８（配列番号１１）−Ｐｃｍｖ−Ｔｆｌｕｃ−ＴＤ１−ｃＤＴＡＷＴ−Ｐｓｖ４０−ＴＧＦＰ．
２.   
Ｅ２０（配列番号１２）−Ｐｃｍｖ−ｎｓＤＴＡ---Ｐｓｖ４０−ＴＧＦＰ
３.   
Ｅ７０（配列番号１３）−Ｐｓｖ４０−ＩＮＴＲＯＮ−ｃＤＴＡＷＴ---Ｐｈｓｖｔｋ−Ｆｌｕｃ
４.   
Ｅ３（配列番号１４）−Ｐｃｍｖ−ＫＤＴＡ---Ｐｓｖ４０−ＴＧＦＰ
５.   
Ｅ８９（配列番号１５）−Ｐｃｍｖ−−−ＤＴ＾Ａ---Ｐｓｖ４０−ＴＧＦＰ
６.   
Ｅ１１０（配列番号１６）−Ｐｃｍｖ−Ｄ５＾ＴＡ---Ｐｓｖ４０−ＴＧＦＰ
７.   
Ｅ４（配列番号１８）−Ｐｃｍｖ−ＫＤＴＡ---Ｐｓｖ４０−Ｈｙｇｒｏ
８.   
Ｅ１０（配列番号２０）−Ｐｅｆｌ−ＤＴＡ２４---ＺＥＯ：：ＧＦＰ−Ｐｃｍｖ
９.   
Ｅ１４３（配列番号２１）−３ＰｏｌｙＡ−Ｐｒｐ１１９−ｃＤＴＡＷＴ---Ｐｈｓｖｔｋ−Ｆｌｕｃ
【０１７４】
試験プラスミド
１. Ｅ８０（配列番号１）−Ｐｃｍｖ−４ＯＲＦ＾−ＴＤ１−Ｔｆｌｕｃ−Ｓ−ｃＤＴＡＷＴ---Ｐｓｖ４０−ＴＧＦＰ（ｐＣＭＶプロモーター（配列番号１のｎｔ．４２０〜９３８）；４ＯＲＦ＾＝４連続ＯＲＦ（配列番号１のｎｔ．１０２７〜３５４７）中の隣接ＡＴＧコドン間の５７、５７、３６、３６、２１、２１、２１、および２１ｎｔを有する９ＴＩＳＵ配列および５７コザック配列から構成される阻害配列。第１のＯＲＦ（配列番号１のｎｔ．１０３１〜１６５１）は、６２１ｎｔで、ＴＩＳＵ（配列番号１のｎｔ．１０２７〜１０３８）から翻訳され、また、次の３ＯＲＦ＾（配列番号１のｎｔ．１６６２〜２９９６、ｎｔ．２３０６〜２９４１およびｎｔ．２９５１〜３５４７）は、コザック配列から翻訳される。最後のＯＲＦ（配列番号１のｎｔ．２９５１〜３５４７）は、野性型ＤＴＡ（ｃＤＴＡｗｔ＝ｗｔ  ＤＴＡコード配列、プロモーター／スプライシング／終端／ポリＡ部位がなく、コザック配列（配列番号１のｎｔ．３５６８〜４１５５）を含む；次に、ＳＶ４０プロモーターの制御下のＴＧＦＰコード配列が続く）のコード配列の前で停止する）。プラスミドは、標的部位ＴＤ１（配列番号７７）およびＴｆｌｕｃ（配列番号７４）をさらに含む。
２. Ｅ５４（配列番号２）−Ｐｃｍｖ−４ＣＡＲＺ−ＰＴＳ−６０ＡＴＧ＾−３ＯＲＦ＾−ＴＤｌ−Ｔｆｌｕｃ−ｉｎｃＤＴＡＷＴ---Ｐｓｖ４０−ＴＧＦＰ（ｐＣＭＶプロモーター（配列番号２のヌクレオチド（ｎｔ．）４２０〜９３８）；４ＣＡＲ＝４シス作用性リボザイム（配列番号２のｎｔ．１０１３〜１３７３）；ＰＴＳ＝ペルオキシソームターゲティングシグナル（配列番号２のｎｔ．１４２０〜１５００）；６０ＡＴＧ＾＝６１ＡＴＧ、４６は、ほぼ２ＡＴＧ毎の間の５３ｎｔ（配列番号２のｎｔ．１５３４〜４５５４）およびＤＴＡコード配列（配列番号２のｎｔ．６７４５〜７３３２）の内側の停止コドンを含むコザック配列中にある；ｐｓｖ４０プロモーター（配列番号２のｎｔ．８０９２〜８３９９）の制御下のＴＧＦＰコード配列（配列番号２のｎｔ．８４５２〜９１４３））。プラスミドは、標的部位ＴＤ１（配列番号７７）およびＴｆｌｕｃ（配列番号７４）をさらに含む。
３. Ｅ１１３（配列番号３）−Ｐｃｍｖ−４ＯＲＦ＾−ＴＤ１−Ｔｆｌｕｃ−ＰＫ−Ｄ５＾ＴＡ---Ｐｓｖ４０−ＴＧＦＰ（ｐＣＭＶプロモーター（配列番号３のｎｔ．４２０〜９３８）；４ＯＲＦ＾（配列番号３のｎｔ．１０２７〜３５４７）；ＰＫ＝シュードノットステムおよびループで、ループの６ｎｔは、ＤＴＡ（配列番号３のｎｔ３５６１〜３６１１）の出発コドンとハイブリッド形成する；５＾＝ＤＴＡのコード配列（配列番号３のｎｔ．３６０９〜３８０６）内に位置する５つのヒトイントロン（配列番号３のｎｔ．３７１２〜３８０１、３８５６〜３９６０、４０６６〜４１７３、４３８０〜４５１９および４６１７〜４７８３）で、ＲＮＡポリメラーゼ１および／または３転写の終止用のＴリッチ領域を含み、イントロンは、ｃＤＴＡｗｔコード配列中に埋め込まれている；ｐｓｖ４０プロモーター（配列番号３のｎｔ．５５４６〜５８５３）の制御下のＴＧＦＰコード配列（配列番号３のｎｔ５９０６〜６５９７））。プラスミドは、標的部位ＴＤ１（配列番号７７）およびＴｆｌｕｃ（配列番号７４）をさらに含む。
４. Ｅ９１（配列番号４）−Ｐｃｍｖ−４ＯＲＦ＾−ＴＤ１−Ｔｆｌｕｃ−ＤＴ＾Ａ---Ｐｓｖ４０−ＴＧＦＰ（ｐＣＭＶプロモーター（配列番号４のｎｔ．４２０〜９３８）、４ＯＲＦ＾（配列番号４のｎｔ．１０２７〜３５０７）；ＤＴ＾Ａ＝ヒトコラーゲン１６Ａ１遺伝子由来のイントロンを含み、プロモーター／スプライシング／ポリＡシグナルを含まないコザックＤＴＡ（配列番号４のｎｔ．３５２０〜４４４４）；ｐＳＶ４０プロモーター（ｎｔ．５１８４〜５４９１）の制御下のＴＧＦＰコード配列（配列番号４のｎｔ．５５４４〜６２３５））。プラスミドは、標的部位ＴＤ１（配列番号７７）およびＴｆｌｕｃ（配列番号７４）をさらに含む。
５.Ｅ１１２（配列番号５）−Ｐｃｍｖ−４ＯＲＦ＾−２ｘＴＬａｃＺｉｎＩＮＴＲＯＮ−８Ｘ［ＴＣＴＬ＋ＴＤ１］−ＰＫ−Ｄ５＾ＴＡ---Ｐｓｖ４０−ＴＧＦＰ（ｐＣＭＶプロモーター（配列番号５のｎｔ．４２０〜９３８）、４ＯＲＦＡ（配列番号５のｎｔ．１０２７〜３４３６）；２ｘＴＬａｃＺｉｎＩＮＴＲＯＮ＝市販プラスミドｐＳＥＬＥＣＴ−ＧＦＰｚｅｏ−ＬａｃＺのイントロン中のＴＬａｃＺの２つの標的（配列番号５のｎｔ．３４３８〜３６３８）；８Ｘ［ＴＣＴＬ＋ＴＤ１］（配列番号５のｎｔ．３６４７〜４０５２）；ＰＫ＝シュードノットステムおよびループで、ループの６ｎｔは、ＤＴＡの出発コドンとハイブリッド形成する（配列番号５のｎｔ．４０５９〜４１０９）；５＾＝ＤＴＡのコード配列（配列番号５のｎｔ．４１０７〜５３０４）内に位置し、ＲＮＡポリメラーゼ１および／または３転写を終止用のＴリッチ領域を含む５ヒトイントロン（配列番号５のｎｔ．４２１０〜４２９９、４３５４〜４４５８、４５６４〜４６７１、４８７８〜５０１７および５１１５〜５２８１）で、イントロンは、ｃＤＴＡｗｔコード配列中に埋め込まれている；ｐｓｖ４０プロモーター（配列番号５のｎｔ．６０４４〜６３５１）制御下のＴＧＦＰコード配列（配列番号５のｎｔ．６４０４〜７０９５））。プラスミドは、標的部位ＴＤ１（配列番号７７）の８つのコピー、ＴＣＴＬ（配列番号８０）およびＴＬａｃＺ（配列番号７１）の２つのコピーをさらに含む。
６. Ｅ８７（配列番号６）−Ｐｃｍｖ−４ＯＲＦ＾−ＴＤ１−３ＴＬａｃＺ−Ｔｃｔｌ−ＢＧｌｏｂ−２５Ｇ−ＸＲＮ１Ｓ＆Ｌ−ＤＴ＾Ａ---Ｐｓｖ４０−ＴＧＦＰ（ｐＣＭＶプロモーター（配列番号６のｎｔ．４２０〜９３８）；４ＯＲＦ＾（配列番号６のｎｔ．１０２７〜３４３０）；ＢＧｌｏｂ＝キャッピングされたベータグロビン５’切断型末端（配列番号６のｎｔ．３５７７〜３６５５）、２５Ｇ＝ＸＲＮエキソリボヌクレアーゼ酵素で遮断／妨害できる一続きの２５連続Ｇヌクレオチド（配列番号６のｎｔ．３６６０〜３６８４）；ＸＲＮ１Ｓ＆Ｌ＝ＸＲＮ１エキソリボヌクレアーゼを遮断できる黄熱病ウイルス３’ＵＴＲのステムおよびループ構造（配列番号６のｎｔ．３６８７〜３７６７）、ＤＴ＾Ａ＝ヒトコラーゲン１６Ａ１遺伝子由来のイントロンを含み、プロモーター／スプライシング／ポリＡシグナルを持たないコザックＤＴＡ（配列番号６のｎｔ．３７８７〜４７１１）；ｐｓｖ４０プロモーター（配列番号６のｎｔ．５８１１〜６５０２）の制御下のＴＧＦＰコード配列（配列番号６のｎｔ．６４０４〜７０９５））。プラスミドは、ＴＤ１（配列番号７７）、ＴＬａｃｚ（配列番号７１）の３つのコピーおよびＴＣＴＬ標的部位（配列番号８０）をさらに含む。
７. Ｅ１２３（配列番号７）−Ｐｓｖ４０−ＩＮＴＲＯＮ−４ＯＲＦ＾−３Ｘ［ＴＤ１−ＴＬａｃＺ］−４ＰＴＥ−ＳＶ４０ｉｎｔｒｏｎ−ＨＢＢ−ＤＴＡ---Ｐｈｓｖｔｋ−Ｆｌｕｃ（ｐＳＶ４０プロモーター（配列番号７のｎｔ．７〜４１９）、４ＯＲＦ＾＝９ＴＩＳＵ配列および４連続ＯＲＦ（配列番号７のｎｔ．７２２〜２３８７）中の隣接ＡＴＧコドンの間の５７、５７、３６、３６、２１、２１、２１、および２１ｎｔを含む５７コザック配列；４ＰＴＥ＝回文構造終止配列（配列番号７のｎｔ．３３１８〜３４７３）の４種のステムおよびループ構造、ＳＶ４０ｉｎｔｒｏｎ＝ＳＶ４０小ｔ抗原イントロン（配列番号７のｎｔ．３５０５〜３５９６）；ＨＢＢ＝ＡＴＧが無く、その最初のイントロンを含むヘモグロビンベータｍＲＮＡ（配列番号７のｎｔ．３６２７〜４４０６）；ｃＤＴＡｗｔコード配列（配列番号７のｎｔ．４４３１〜５０１４）；ＨＳＫＶＫプロモーター（配列番号７のｎｔ．５１０６〜５８５８）およびホタルルシフェラーゼコード配列（配列番号７のｎｔ．５８９４〜７５４６））。プラスミドは、ＴＤ１（配列番号７７）の３つのコピーおよびＴＬａｃｚ標的部位（配列番号７１）をさらに含む。
８. Ｅ３０（配列番号８）−Ｐｃｍｖ−４ＯＲＦ＾−ＴＤ１−Ｔｆｌｕｃ−ｉｎｃＤＴＡＷＴ---Ｐｓｖ４０−ＴＧＦＰ（ｐＣＭＶプロモーター（配列番号８のｎｔ．４２０〜９３８）；４ＯＲＦ＾＝９ＴＩＳＵ配列および４つの連続ＯＲＦ中の隣接ＡＴＧコドンの間に、５７、５７、３６、３６、２１、２１、２１、および２１ｎｔを含む５７コザック配列（配列番号８のｎｔ１０２７〜３５４７）；最初のＯＲＦ（配列番号８のｎｔ．１０３１〜１６５１）は、ＴＩＳＵ（配列番号８のｎｔ．１０２７〜１０３８）から翻訳され、次の３ＯＲＦ＾（配列番号８のｎｔ．１６６２〜２９９６、ｎｔ．２３０６〜２９４１およびｎｔ．２９５１〜３５４７）は、コザック配列から翻訳される。最後のＯＲＦ（配列番号８のｎｔ．２９５１〜３５１６）は、野性型ＤＴＡ（ｃＤＴＡｗｔ＝ｗｔＤＴＡコーディング領域、プロモーター／スプライシング／終止／ポリＡ部位が無く、コザック配列（配列番号８のｎｔ３５６８〜４１５５）を含む；次に、ＳＶ４０プロモーターの制御下ＴＧＦＰコード配列が続く）のコード配列の内側で停止する）。プラスミドは、標的部位ＴＤ１（配列番号７７）およびＴｆｌｕｃ（配列番号７４）をさらに含む。
９. Ｅ１４２（配列番号９）−３ポリＡ−Ｐｒｐ１１９−４ＯＲＦ＾Ｄ１−Ｔｆｌｕｃ−Ｓ−ｃＤＴＡＷＴ---Ｐｈｓｖｔｋ−Ｆｌｕｃ．（３ポリＡ＝ＨＳＶポリＡ、ＳＶ４０ポリＡ、合成ポリＡ（配列番号９のｎｔ．６０〜２４７）；Ｐｒｐｌｌ９＝その最初のイントロンと共に取り込んだＲＰＬ１９（リボソームタンパク質Ｌ１９）のプロモーター（配列番号９のｎｔ．２４８〜１９４１）；４ＯＲＦ＾＝９ＴＩＳＵ配列および、４連続ＯＲＦ中の隣接ＡＴＧコドンの間の５７、５７、３６、３６、２１、２１、２１、および２１ｎｔを含む５７コザック配列（配列番号９のｎｔ．１９４８〜４３６６）；野性型ＤＴＡのコード配列（配列番号９のｎｔ．４４５７〜５０４４）；ＨＳＫＶＫプロモーター（配列番号９のｎｔ．５１３６〜５８８８）およびホタルルシフェラーゼコード配列（配列番号９のｎｔ．５９２４〜７５７６））。プラスミドは、標的部位ＴＤ１（配列番号７７）およびＴｆｌｕｃ（配列番号７４）をさらに含む。
【０１７５】
結果：
結果を下表１〜５および６Ａ〜Ｃに示す。結果は、表示されたプラスミドおよびｓｉＲＮＡ分子を形質移入された細胞を使って種々の実験条件下、測定されたＲＬＵを示す。使用されたｓｉＲＮＡ＋分子は、試験済みプラスミド内の対応する標的配列に結合できるｓｉＲＮＡ分子である。
【表１】
2013544511.tif 000002
【表２】
2013544511.tif 000003
【表３】
2013544511.tif 000004
【表４】
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【表５】
2013544511.tif 000006
【表６】
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【表７】
2013544511.tif 000008
【表８】
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【０１７６】
上記表１〜５および６Ａ〜６Ｃで示された結果は、目的の外因性のＲＮＡの切断を誘導できるｓｉＲＮＡ分子下で、目的の外因性タンパク質（ＤＴＡ）が発現し、これが、次に細胞死の増加をもたらすことを明確に示している。増加した細胞死により、ルシフェラーゼ遺伝子を発現／産生する細胞がより少なくなるために、ウエル中の全体ＲＬＵ測定値が低減する。この結果は、これらの細胞中でのみ、目的の外因性ＲＮＡの切断部位での切断が誘導され、それにより、目的の外因性タンパク質の細胞中での発現が可能となるために、実際に、特異的ｓｉＲＮＡを含む細胞中でのみ、目的の外因性タンパク質（この例ではＤＴＡ）が発現されることを示している。
【０１７７】
実施例２：ＥＢＶ関連胃癌細胞、上咽頭癌細胞およびバーキットリンパ腫細胞を死滅させるための本発明の組成物の使用。
世界中で、胃癌は肺癌の次に多い癌で、死亡率と罹患率に影響する主要原因である。５年生存率は、２０％未満である。世界中で、胃癌の症例の約６〜１６％にエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）が関係していおり、ほとんど全ての腫瘍細胞中に認められる［２１］。バーキットリンパ腫は、顎骨に影響を与えることが多いタイプの非ホジキンリンパ腫で、巨大腫瘍塊を形成する。ＥＢＶで不死化したＢ細胞は、最終的にバーキットリンパ腫に繋がる第１ステップである。上咽頭癌は、上気道で見つかった癌で、上咽頭に最も多くみられ、ＥＢＶウイルスとの関係が強い。
【０１７８】
移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＰＤ）は、ＡＩＤＳまたは関連免疫抑制を伴う臓器移植を受けている人、等の免疫無防備状態の患者に発生するもう一つのＢ細胞リンパ腫であり、従って、ＥＢＶに関連していると想定されている。悪性患者の平滑筋腫瘍、およびホジキンリンパ腫もＥＢＶに関連している。
【０１７９】
米国では、３５〜４０才の内の９５％もの多くの成人が、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶまたはＨＨＶ−４）に感染している。
【０１８０】
エプスタインバーウイルスは、腫瘍調節およびアポトーシス抑制の作用をする２３のｍｉＲＮＡをコードする［１３］。複数のｍｉＲＮＡがエプスタインバーウイルスの２つのゲノム領域内で特定されており、形質転換されたＢ細胞株の潜伏感染の間に発現する［２０］。
【０１８１】
ＥＢＶ  ｍｉＲＮＡのｍｉＲ−ＢＡＲＴ１（配列番号４１）の発現がＥＢＶ感染Ｂ細胞バーキットリンパ腫、上咽頭癌細胞、およびＥＢＶ関連胃癌（ＥＢＶａＧＣ）中で観察された［２１］。従って、本発明の組成物を使ってｍｉＲ−ＢＡＲＴ１を発現する細胞を死滅させて、これらの癌を、死滅させることができる。
【０１８２】
ＥＢＶ−ｍｉｒ−ＢＡＲＴ１の成熟内在性ｍｉＲＮＡ鎖は、５’−ＵＣＵＵＡＧＵＧＧＡＡＧＵＧＡＣＧＵＧＣＵＧＵＧ−３’（配列番号４２）であり、実施例の外因性ＲＮＡ分子の結合部位は、ＥＢＶ−ｍｉｒ−ＢＡＲＴ１の成熟内在性ｍｉＲＮＡ鎖に１００％相補的な配列：３’−ＡＧＡＡＵＣＡＣＣＵＵＣＡＣＵＧＣＡＣＧＡＣＡＣ−５’（配列番号４３）を含むように設計される。例えば、図１７を参照されたい。
【０１８３】
目的の外因性タンパク質をコードする配列は、ジフテリア毒素断片Ａ（ＤＴ−Ａ）をコードするように設計され、また、外因性ＲＮＡ分子のＥＢＶ−ｍｉｒ−ＢＡＲＴ１結合部位の下流に位置するように設計される。細胞に導入されたジフテリア毒素断片Ａのただ1つの分子でも、その細胞を死滅させることができ［５］、また、哺乳動物細胞では、キャップの除去により、ｍＲＮＡの翻訳を３５〜５０倍低減し、機能的ｍＲＮＡの半減期を１．７倍だけ短くする［６］。例えば、図１７を参照されたい。
【０１８４】
阻害配列は、ＥＢＶ−ｍｉｒ−ＢＡＲＴ１結合部位の上流に位置し、ヒトコザックコンセンサス配列：５’−ＡＣＣＡＵＧＧ−３’（配列番号２５）内の位置の出発コドンを含むように設計され、ＤＴ−Ａの開始コドンと同じ読み枠にはない。例えば、図１７を参照されたい。
【０１８５】
実施例の外因性ＲＮＡ分子は、ＥＢＶ−ｍｉｒ−ＢＡＲＴ１により切断される前に、外因性ＲＮＡ分子の翻訳の効率を低減させるために、非常に効率的なシス作用性ハンマーヘッド型リボザイムのｓｎｏｒｂｏｚｙｍｅ［１５］を５’末端にさらに含む。シス作用性ハンマーヘッド型リボザイムのｓｎｏｒｂｏｚｙｍｅは、また、２つの開始コドンを含むが、それらの内のそれぞれは、ＤＴ−Ａの出発コドンと同じ読み枠にはない。例えば、図１７を参照されたい。
【０１８６】
実施例の外因性ＲＮＡ分子は、また、ＤＴ−Ａをコードする配列の下流の、ヒトＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＣ（Ｈ２ａｃ）遺伝子３’ＵＴＲ（５’−ＧＧＣＵＣＵＵＵＵＣＡＧＡＧＣＣ−３’（配列番号３４））由来の回文構造終端配列（ＰＴＥ）を含む。ＰＴＥは、ｍＲＮＡ処理および安定性に関し重要な役割を果たす［７］。ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＣ遺伝子からの転写物は、ポリ（Ａ）テールを欠くが、それでも、ＰＴＥのおかげで安定である。例えば、図１７を参照されたい。
【０１８７】
図１７で図示されているこの実施例では、外因性ＲＮＡ分子が、強力なウイルスＣＭＶプロモーターの制御下でウイルスベクターにより転写される。この実施例の全体外因性ＲＮＡ分子の配列は、配列番号４４似設定される。
【０１８８】
この実施例の、外因性ＲＮＡ分子をコードするベクターで導入される外因性ＲＮＡ分子の標的細胞中での転写後、シス作用性リボザイムが、外因性ＲＮＡ分子の全ての翻訳を減らすために、５’末端からキャップを取り除き、回文構造終端配列が外因性ＲＮＡ分子を安定化させ、分解から保護する。読み枠外の開始コドンがＤＴ−Ａの翻訳を防ぐが、標的細胞中の内在性ＥＢＶ−ｍｉｒ−ＢＡＲＴ１の存在下では、実施例の外因性ＲＮＡ分子は切断され（切断された配列は、配列番号４５に設定される）、読み枠外開始コドンが切り離され、それにより、ＤＴ−Ａが翻訳されて、少なくとも１つのそのタンパク質のコピーが発現し、これで細胞死を起こさせるのに充分である。例えば、図１７を参照されたい。
【０１８９】
実施例３：ＨＩＶ−１感染細胞を死滅させるための本発明の組成物の使用
世界保健機関によれば、２００６年に世界中でＨＩＶ患者が約３９５０万人に達した。国連共同エイズ計画の推計によると、ＨＩＶは、アフリカの９０００万人に感染し、少なく見積もっても、１８００万人の孤児が発生することになる。ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）になる可能性がある。ＨＩＶの２つの種：ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２がヒトに感染する。ＨＩＶ−１がより毒性が強く、比較的容易に伝染し、世界中の大部分のＨＩＶ感染の原因である。ＨＩＶ−２は、ＨＩＶ−１より伝染力が低く、ほぼ西アフリカに限定される。
【０１９０】
ＨＩＶを含む多くのウイルスは、休止状態または潜伏期を示し、その間、タンパク質合成は、ほとんど、または全く行われない。ウイルス性感染症は、このような期間中、免疫系には基本的に不可視である。現在の大抵の抗ウイルス治療法は、潜在型ウイルス保有細胞の除去には効果がない［１］。
【０１９１】
計算機手法およびハイスループット検証により可能となった近年のゲノム全体での選別により、ウイルスによりコードされた１０９のマイクロＲＮＡ前駆物質が明らかになった［１３］。近年の調査は、ＨＩＶ−１をコードしたマイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−Ｎ３６７）の潜伏感染に影響を与える役割、および／またはそれを維持する役割を示唆している［１、１４および１９］。
【０１９２】
ＨＩＶ−１の転写は、ヒトＴ細胞中のｎｅｆ−発現ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ−Ｎ３６７（配列番号４６）、により抑制されている［１９］。ｍｉＲ−Ｎ３６７は、５’−ＬＴＲのＵ３領域の負の応答配列を介してＨＩＶ−１  ＬＴＲプロモーター活性を低減させる［１９］。従って、ＨＩＶ−１感染細胞中で産生されたｎｅｆ−ｍｉＲＮＡは、転写後経路および転写新経路の両方を介して、ＨＩＶ−１転写を下方制御できる［１９］。図１８に図示されているこの実施例では、本発明の組成物は、内在性ｍｉＲ−Ｎ３６７（ｈｉｖ１−ｍｉｒ−Ｎ３６７）を含み、従って、また、ＨＩＶ−１を含む細胞を死滅させるように設計される。
【０１９３】
ｍｉＲ−Ｎ３６７の成熟内在性ｍｉＲＮＡ鎖は：５’−ＡＣＵＧＡＣＣＵＵＵＧＧＡＵＧＧＵＧＣＵＵＣＡＡ−３’（配列番号４７）であり、この実施例の外因性ＲＮＡ分子の結合部位は、ｍｉＲ−Ｎ３６７の成熟ｍｉＲＮＡ鎖に１００％相補的な配列５’−ＵＵＧＡＡＧＣＡＣＣＡＵＣＣＡＡＡＧＧＵＣＡＧＵ−３’（配列番号４８）を含むように設計される（図１８に示すように）。目的の外因性タンパク質をコードする配列は、ジフテリア毒素（ＤＴ）タンパク質をコードするように設計され、また、外因性ＲＮＡ分子中のｍｉＲ−Ｎ３６７結合部位の下流に配置されるように設計される（図１８）。
【０１９４】
阻害配列は、ｍｉＲ−Ｎ３６７結合部位の上流に位置し、２つの開始コドンを含み、その内の１つが、ヒトコザックコンセンサス配列：５’−ＡＣＣＡＵＧＧ−３’（配列番号２５）内に位置するように設計され、それらのそれぞれは、ＤＴの出発コドンと同じ読み枠にはない（図１８）。
【０１９５】
外因性ＲＮＡ分子は、また、ｍｉＲ−Ｎ３６７結合部位の下流で、ＤＴタンパク質をコードする配列の上流の２２ヌクレオチドのヌクレオチド配列（配列番号４９）を含み、それにより、ヌクレオチド配列は、ＤＴをコードする配列の下流に位置する２２ヌクレオチドの配列（配列番号５０）に結合でき、特に、外因性ＲＮＡ分子が切断された場合に、外因性ＲＮＡ分子がＤＴの翻訳の効率を高める環状構造を形成する。
【０１９６】
外因性ＲＮＡ分子は、また、外因性ＲＮＡ分子の翻訳の効率を低減させるために、内在性ｍｉＲＮＡにより切断される前に、５’末端に非常に効率的なシス作用性ハンマーヘッド型リボザイムのＮ１１７［１６］を含む。シス作用性ハンマーヘッド型リボザイムのＮ１１７は、また、２つの開始コドンを含み、そのどちらもＤＴタンパク質の出発コドンと同じ読み枠にはない。例えば、図１８を参照されたい。
【０１９７】
この実施例では、外因性ＲＮＡ分子は、強力なウイルスＣＭＶプロモーターの制御下でウイルスベクターにより転写される。この実施例の全体の外因性ＲＮＡ分子の配列は、配列番号５１に設定される。
【０１９８】
外因性ＲＮＡ分子をコードするベクターで導入された、この実施例の外因性ＲＮＡ分子を標的細胞中で転写後、シス作用性リボザイムは、外因性ＲＮＡ分子による全ての翻訳を低減させるために５’末端からキャップを取り外す。読み枠外の開始コドンは、ＤＴの翻訳を防ぐが、しかし、細胞中に内在性ｍｉＲ−Ｎ３６７（またはＨＩＶ−１）の存在下では、外因性ＲＮＡ分子は、切断され（切断された配列は、配列番号５２に設定される）、読み枠外の開始コドンがタンパク質をコードする配列から切り離され、それによりＤＴが発現できる。ＤＴタンパク質をコードする配列を含むＲＮＡ部分は、ＨＩＶ−１感染細胞を死滅させる目的で、環状構造を形成し、ＤＴタンパク質の翻訳を増加させる。例えば、図１８を参照されたい。
【０１９９】
実施例のウイルスベクターは、また、ＨＩＶ−１感染細胞中のＨｉｖ１−ｍｉＲ−Ｎ３６７の転写を強化することができる転写因子（例えば、ＮＦ−κＢ）をコードしてもよい。ウイルスベクターは、また、新規ＨＩＶ−１粒子の産生を防ぐことができる遺伝子（例えば、Ｒｅｖで、これはＨＩＶ−１ｍＲＮＡスプライシングを防ぐ）をコードしてもよい。
【０２００】
実施例４：転移性の乳癌細胞を死滅させるための本発明の組成物の使用
転移性の乳癌細胞では、ｍｉＲ−１０ｂ（配列番号５３）の発現が、健康なまたは非転移性腫瘍化細胞に比べて、上方制御されている［８］。ｍｉＲ−１０ｂの発現は、転写因子Ｔｗｉｓｔにより上方制御されている［８］。ｍｉＲ−１０ｂの標的は、ＨＯＸＤ１０であり、さらに、ＨＯＸＤ１０レベルの減少は、高レベルのＲＨＯＣを生じ、より高いレベルのＲＨＯＣが、癌細胞運動性を刺激する［８］。
【０２０１】
図１９に示されているこの実施例では、本発明の組成物は、転移性の乳癌細胞に特有の内在性ｍｉＲ−１０ｂを含む細胞を死滅させるように設計されている。
【０２０２】
ｍｉＲ−１０ｂの成熟内在性ｍｉＲＮＡ鎖は：５’−ＵＡＣＣＣＵＧＵＡＧＡＡＣＣＧＡＡＵＵＵＧＵＧ−３’（配列番号５４）であり、実施例の外因性ＲＮＡ分子は、ｍｉＲ−１０ｂ用の２つの結合部位含むように設計され、それらの内のそれぞれ１つが、配列：５’−ＣＡＣＡＡＡＵＵＣＧＧＵＵＣＵＡＣＡＧＧＧＵＡ−３’（配列番号５５）を含み、これはｍｉＲ−１０ｂの成熟ｍｉＲＮＡ鎖に１００％相補的である［３１］。（図１９）。
【０２０３】
目的の外因性タンパク質をコードする配列は、ジフテリア毒素断片Ａ（ＤＴ−Ａ）タンパク質をコードするように設計され、また、外因性ＲＮＡ分子中のｍｉＲ−１０ｂ用の２つの結合部位の間に配置されるように設計される。哺乳動物細胞では、細胞に導入されたジフテリア毒素断片Ａのただ１つの分子でも、その細胞を死滅させることができる［５］。
【０２０４】
この実施例の外因性ＲＮＡ分子は、２つの阻害配列を、１つは５’末端に、もう一つは３’末端に、含む。
【０２０５】
外因性ＲＮＡ分子の５’末端に位置する阻害配列は、３つの開始コドンを含むように設計され、その内の１つは、ヒトコザックコンセンサス配列：５’−ＡＣＣＡＵＧＧ−３’（配列番号２５）内に配置され、これらのいずれも、ＤＴ−Ａをコードする配列の出発コドンと同じ読み枠にはなく、また、３つの全ての開始コドンは、同じ読み枠に存在する。
【０２０６】
外因性ＲＮＡ分子の５’末端に位置する阻害配列は、また、３つの開始コドンの下流で、ｍｉＲ−１０ｂ用の２つの結合部位の上流のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、３つの開始コドンと同じ読み枠にあり、また、ヌクレオチド配列は、細胞内局在のための選別グシグナルをコードする。このシグナルは、ヒトアルキルジヒドロキシアセトンホスファートシンターゼのペルオキシソームターゲティングシグナル２である（Ｈ２Ｎ---ＲＬＲＹＬＳＧＨＬ（配列番号２７））［２８］。哺乳動物細胞では、細胞内局在のための選別グシグナルを有するタンパク質は、それらのｍＲＮＡから翻訳される間に、細胞内定位に配置することができる。
【０２０７】
外因性ＲＮＡ分子の３’末端に位置する阻害配列は、ｍｉＲ−１０ｂ用の２つの結合部位の下流のＨＳＶ１  ＬＡＴイントロンを含むように設計され、それにより、外因性ＲＮＡ分子が、外因性ＲＮＡ分子中のコード配列の下流のイントロンを含む外因性ＲＮＡ分子を分解するナンセンス変異依存分解機構（ＮＭＤ）の標的となる［２９］。
【０２０８】
外因性ＲＮＡ分子の３’末端に位置する阻害配列は、また、３’末端に外因性ＲＮＡ分子の分解を刺激するＡＵリッチ領域を含む。ＡＵリッチ領域は、４７ヌクレオチド長で、配列：５’−ＡＵＵＵＡ−３’（配列番号３１）および５’−ＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）−３’（配列番号３２）［２６］を含む。
【０２０９】
この実施例では、外因性ＲＮＡ分子は、強力なウイルスＣＭＶプロモーターの制御下のウイルスベクターにより転写される。この実施例の全体の外因性ＲＮＡ分子の配列は、配列番号５６に設定される。
【０２１０】
外因性ＲＮＡ分子をコードするベクターで導入された、この実施例の外因性ＲＮＡ分子を標的細胞中で転写後、読み枠外の開始コドンは、ＤＴ−Ａの翻訳を防ぐが、ペルオキシソームターゲティングシグナル２が、誤ったタンパク質および外因性ＲＮＡ分子をペルオキシソームに送出し、イントロンが外因性ＲＮＡ分子を標的にしてナンセンス変異依存分解機構（ＮＭＤ）による分解を起こさせ、また、ＡＵリッチ領域も外因性ＲＮＡ分子の分解を刺激する。しかし、細胞中の内在性ｍｉＲ−１０ｂの存在下では、外因性ＲＮＡ分子は、切断され（切断された配列は、配列番号５７に設定される）、全ての阻害配列は、切り離され、それにより、ＤＴ−Ａタンパク質は、少なくともそのタンパク質の１つのコピーが翻訳され、発現する。これで細胞死を起こさせるには充分である。
【０２１１】
実施例５：ＨＳＶ−１感染細胞を死滅させるための本発明の組成物の使用
ＨＳＶ−１（単純疱疹ウイルス−１）を含む多くのウイルスが休止状態または潜伏期を示し、その間、タンパク質合成は行われない。ウイルス性感染症は、このような期間中は、免疫系に対し基本的に不可視である。現在の抗ウイルス治療法は、潜在型ウイルス保有細胞の除去に関してはほとんど効果がない［１］。
【０２１２】
単純疱疹ウイルス−１（ＨＳＶ−１）の潜伏関連転写物（ＬＡＴ）は、ニューロンへの潜伏感染の間に発現したウイルス遺伝子であるに過ぎない。ＬＡＴは、アポトーシスを抑制し、感染したニューロンの生存を促進することにより潜在性を維持する。ＬＡＴ遺伝子はいかなるタンパク質も産生しない。調査は、ＨＳＶ−１  ＬＡＴ遺伝子によりコードされるｍｉＲＮＡのｍｉＲ−ＬＡＴ（配列番号５７）が、アポトーシス耐性を与えることを示唆する［１７］。ｍｉＲ−ＬＡＴは、ＨＳＶ−１  ＬＡＴ遺伝子のエキソン１領域から生成され、従って、ｍｉＲ−ＬＡＴは、潜伏感染の間に発現する［１７］。
【０２１３】
図２に示されているこの実施例では、本発明の組成物は、内在性ｍｉＲ−ＬＡＴを含み、従って、ＨＳＶ−１も含む細胞を死滅させるように設計されている。
【０２１４】
ｍｉＲ−ＬＡＴの成熟内在性ｍｉＲＮＡ鎖は：５’−ＵＧＧＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＧＧＣＣ−３’（配列番号５９）であり、この実施例の外因性ＲＮＡ分子は、ｍｉＲ−ＬＡＴ用の２つの結合部位を含むように設計され、結合部位のそれぞれ１つが、ｍｉＲ−ＬＡＴの成熟ｍｉＲＮＡ鎖に１００％相補的な配列：５’−ＧＧＣＣＣＣＧＧＧＣＣＧＧＧＣＣＧＣＣＡ−３’（配列番号６０）を含む［１７］。
【０２１５】
目的の外因性タンパク質をコードする配列は、ジフテリア毒素（ＤＴ）タンパク質をコードするように設計され、また、外因性ＲＮＡ分子中の２つのｍｉＲ−ＬＡＴ用結合部位の間に位置するように設計される（図２０）。
【０２１６】
外因性ＲＮＡ分子は、また、２つの阻害配列を、１つは５’末端に、もうひとつは３’末端に含む。
【０２１７】
外因性ＲＮＡ分子の５’末端に位置する阻害配列は、２つの開始コドンを含むように設計され、それらの内のそれぞれ１つがヒトコザックコンセンサス配列：５’−ＡＣＣＡＵＧＧ−３’（配列番号２５）中に配置され、それらのいずれもＤＴタンパク質の出発コドンと同じ読み枠にはない（図２０）。
【０２１８】
外因性ＲＮＡ分子の３’末端に位置する阻害配列は、２つのｍｉＲ−ＬＡＴ結合部位の下流の翻訳リプレッサーｓｍａｕｇ認識配列（ＳＲＥ）：５’−ＵＧＧＡＧＣＡＧＡＧＧＣＵＣＵＧＧＣＡＧＣＵＵＵＵＧＣＡＧＣＧ−３’（配列番号２８）を含むように設計される。Ｓｍａｕｇ１は、ヒト染色体１４中でコードされ、ＳＲＥ含有メッセンジャーの翻訳を阻止できる［２４、２５］。マウスＳｍａｕｇ１は、脳で発現し、シナプトノイロゾーム（翻訳がシナプスの刺激により厳重に調節されている細胞内領域）で豊富に存在する［２４］。
【０２１９】
外因性ＲＮＡ分子の３’末端に位置する阻害配列は、また、ミエリン形成末梢のためのＲＮＡ局在化シグナル（Ａ２ＲＥ−核リボ核タンパク質Ａ２応答配列）：５’−ＧＣＣＡＡＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＣＡＵＧ−３’（配列番号２９）を３’末端に含む［２７］。Ａ２ＲＥは、ＭＢＰ（ミエリン塩基性タンパク質）ｍＲＮＡの３’−非翻訳領域に位置するシス作用性配列であり、オリゴデンドロサイトのミエリン形成末梢へのＭＢＰ  ｍＲＮＡの輸送のために充分であり、また、必要である［２７］。ｈｎＲＮＰ（異種核リボ核タンパク質）Ａ２は、Ａ２ＲＥに結合し、ＭＢＰの輸送を媒介する［２７］。
【０２２０】
外因性ＲＮＡ分子は、また、ＤＴタンパク質をコードする配列のすぐ下流の細胞質ポリアデニル化配列（ＣＰＥ）を含む。ＣＰＥは、ＤＴタンパク質をコードする配列のすぐ下流の配列５’−ＵＵＵＵＵＵＡＵＵ−３’（配列番号３８）およびＤＴタンパク質をコードする配列の９１ヌクレオチド下流の配列５’−ＵＵＵＵＡＵＵ−３’（配列番号３９）を含む［２３］。哺乳動物では、ＣＰＥＢ（細胞質ポリアデニル化配列結合タンパク質）が海馬樹状層（長期記憶に関与する脳の一部）中に存在する［３０］。哺乳類海馬ニューロンのシナプトデンドリックコンパートメント中で、ＣＰＥＢは、ポリアデニル化誘導翻訳によりＣＰＥを含むα−ＣａＭＫＩＩ  ｍＲＮＡの翻訳を刺激するように思われる［３０］。
【０２２１】
この実施例では、外因性ＲＮＡ分子は、強力なウイルスＣＭＶプロモーターの制御下にあるウイルスベクターにより転写される。この例の全体の外因性ＲＮＡ分子の配列は、配列番号６１に設定される。
【０２２２】
外因性ＲＮＡ分子をコードするベクターにより導入される、この実施例の外因性ＲＮＡ分子の標的細胞中での転写後、読み枠外の開始コドンが、ＤＴタンパク質の翻訳を防ぎ、Ｓｍａｕｇ１（翻訳リプレッサー）がｓｍａｕｇ認識配列（ＳＲＥ）に結合してＤＴタンパク質の翻訳を抑制し、ｈｎＲＮＰ  Ａ２がＡ２ＲＥに結合して外因性ＲＮＡ分子のミエリン形成末梢への輸送を媒介する。しかし、標的細胞の内在性ｍｉＲ−ＬＡＴ（ＨＳＶ−１の）の存在下では、外因性ＲＮＡ分子は、切断され（切断された配列は、配列番号６２に設定される）、２つの阻害配列が切り離され、それにより、ＣＰＥＢ（細胞質ポリアデニル化配列結合タンパク質）がＣＰＥに結合し、切断された外因性ＲＮＡ分子中のポリアデニンテールの伸長を促進し、ＤＴが発現できるようになり、従って、その細胞ならびに隣接細胞を死滅させる。
【０２２３】
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３２.  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓ．Ｗｏｌｌｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｓａｎｆｏｒｄ  Ｍ．Ｓｉｍｏｎ、２００４、「リボソームおよびトランスロコンからの放出の前のペプチジルｔＲＮＡのシグナル配列切断」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：２４９１９−２４９２２．
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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