(57)【要約】  本発明は、コレステロールの合成または異化に関連する酵素活性を検出することにより、コレステロールの代謝を調節する化合物を同定するための方法に関する。前記方法は、コレステロールレベルの減少が避けるべきである場合、遺伝子操作された酵母の使用により哺乳動物細胞の致死の危険性に可能性を与え、この生存はコレステロールの産生に厳密に依存しない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コレステロール検出段階を含むこと、および検出されたコレステロールレベルが、毒性培地において細胞の成長に反比例することを特徴とする、コレステロールを調節する化合物を同定する方法。
【請求項２】
コレステロール産生細胞と対象となる化合物とを、前記細胞にとって当初は毒性である培地において接触させる段階を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
コレステロールおよびコレステロール合成に参加する酵素の両方を産生する細胞と、対象となる化合物とを、前記細胞にとって当初は毒性である培地において接触させる段階を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
コレステロールおよびコレステロールを異化する酵素の両方を産生する細胞と、対象となる化合物とを、前記細胞にとって当初は毒性である培地において接触させる段階を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
コレステロール産生遺伝子操作酵母の使用を含むことを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）（ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）など）またはピキア・パトリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）からなる群に含まれる酵母の使用を含み、前記酵母がコレステロールを産生するように遺伝子操作されていることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）酵母を、コレステロールおよびコレステロール産生を活性化する酵素の両方を発現するように形質転換する段階、
（ｂ）形質転換された酵母を、対象となる化合物と接触させる段階、および
（ｃ）毒素に対する耐性に関する試験を用いて、発現されたコレステロールのレベルの変化を定量化する段階、
を含むことを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）酵母を、コレステロールおよびコレステロール産生を減少させる酵素の両方を発現するように形質転換する段階、
（ｂ）形質転換された酵母を、対象となる化合物と接触させる段階、および
（ｃ）毒素に対する耐性に関する試験を用いて、発現されたコレステロールのレベルの変化を定量化する段階、
を含むことを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
使用する毒素が、シリンゴマイシンＥ、フィトスフィンゴシン、テロマイシン、イツリンＡ、コレラ菌毒素およびコレステロール依存性毒素からなる群に含まれることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
使用する毒素がシリンゴマイシンＥであることを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子操作された酵母により産生される酵素が、下記の群：ＤＨＣＲ７、ＤＨＣＲ１４、ＤＨＣＲ２４およびΔ８−７ステロールイソメラーゼから選択されることを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
遺伝子操作された酵母が、酵素のアクチベーターとして、ＣＹＰ２７Ａ１、ＣＹＰ４６Ａ１、ＣＹＰ１１Ａ１およびＣＹＰ７Ａ１から選択されるチトクロームＰ４５０を産生することを特徴とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
酵母ステロールをコレステロールに転換できる酵素発現カセットおよびコレステロールの代謝に作用するタンパク質活性に関する発現カセットを含むベクター。
【請求項１４】
ベクターが、プラスミドであることを特徴とする、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
ベクターが、下記のプラスミド：ｐＣＤ６３、ｐＹｅＤＰ６０、ｐＩＭ５６５、ｐＩＭ５７８、ｐＩＭ５８０、ｐＩＭ５８２またはｐＩＭ５８４の１つであることを特徴とする、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１６】
心血管病態または代謝病態の治療における使用のための、請求項１から１２に記載の方法の１つに従って検出される化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の対象は、コレステロールの合成または異化に関連する酵素活性を検出することにより、コレステロールを調節する化合物を同定する方法である。本発明の対象は、さらに心血管病態または代謝病態の治療における検出された化合物の使用である。
【０００２】
コレステロールは、最も重要な動物性ステロールである。コレステロールは、細胞膜の基本成分であり、この流動性を管理し、全ての動物組織および特に脳に存在する。コレステロールの合成およびこの異化に関する機能障害は、多数の病態：アテローム性動脈硬化、狭心症、心血管系事象、メタボリックシンドローム、糖尿病、スミス−レムリ−オピッツ（Ｓｍｉｔｈ−Ｌｅｍｌｉ−Ｏｐｉｔｚ）症候群などに関連する。
【０００３】
従って、体内においてコレステロールレベルを調節できる分子の検出は、これらのすべての病態との闘いにおいて必要な前進である。
【背景技術】
【０００４】
コレステロール合成の阻害因子またはコレステロール異化のアクチベーターは、ＤＨＣＲ１４／ステロール−Δ１４レダクターゼ、ＤＨＣＲ２４／ステロール−Δ２４レダクターゼ、ＤＨＣＲ７／ステロール−Δ７レダクターゼおよびΔ８−７イソメラーゼの阻害因子であるトリパラノール、ＤＨＣＲ７／ステロール−Δ７レダクターゼの阻害因子であるＡＹ９９４４（Ｊ．Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｗａｎｄｅｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２００９）、ステロールΔ８−７イソメラーゼの阻害因子であるＳＲ３１７４７（Ｒ．Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ  １９９８）またはＤＨＣＲ１４／ステロール−Δ１４レダクターゼおよびステロール−Δ８−７イソメラーゼの阻害因子であるアモロルフィン（Ａ．Ｊ．Ｃａｒｒｉｌｌｏ−Ｍｕｎｏｚ  ｅｔ  ａｌ；２００６）などが公知である。
【０００５】
しかしながら、コレステロールに関連する病態は多く、治療のさらなる進歩、従って、コレステロールの代謝および輸送の調節因子候補を研究および検出する新しい方法が必要とされる。
【０００６】
先行技術は、コレステロール濃度を増加することが、毒素、抗生物質および抗真菌剤に対する耐性につながる選択培地の使用を記載している。コレステロール産生細胞をコレステロール合成アクチベーターと接触させることにより、細胞内のコレステロール量が増加する。このことは、使用される選択培地の毒性または使用される抗生物質もしくは抗真菌剤に対する耐性、従って細胞の成長につながる（欧州特許ＥＰ０７２７４８９Ｂ１を参照されたい。）。
【０００７】
同様に、コレステロールを合成する酵素の阻害因子またはコレステロールを異化する酵素のアクチベーターは、細胞死を起こす。コレステロールの消失は、今までのところ細胞の生命に対して、特に、使用される哺乳動物細胞にとって有害である。従って、このことは、コレステロールの代謝または輸送の新しい調節因子の発見を不可能にする。
【０００８】
従って、これらの調節因子を検出する単純で有効な方法を探索する。
【０００９】
驚いたことに本出願人は、酵母を使用して、コレステロールが毒性に対する耐性の軽減につながる逆の選択が出来る培地を用いて、コレステロール調節因子を検出できることを示した。このことは、毒性に対する耐性が観察される場合、コレステロール合成の阻害因子および／またはコレステロール異化のアクチベーターの決定を可能にする。
【００１０】
有利なことに、本試験に使用されるコレステロール産生酵母細胞は、遺伝子操作された酵母である。これは、天然には酵母はエルゴステロールを産生するからである。本出願人は、コレステロールを産生するようにエルゴステロールの産生を転用するために、遺伝子操作された酵母を使用する。
【００１１】
本発明の一実施形態において、酵母は特許ＥＰ０７２７４８９  Ｂ１に述べられたように、または非必須遺伝子であるＥＲＧファミリー（ＥＲＧ６、ＥＲＧ５、ＥＲＧ４、ＥＲＧ２およびＥＲＧ３）の欠失により、改変される。
【００１２】
この型の酵母を得る１つの方法は、国際特許出願ＷＯ２００５／１２１３１５（Ａｖｅｎｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ）にも記載されている。
【００１３】
本出願に記載のエルゴステロールの終了またはコレステロールの合成および異化の酵素は、野生型酵母にもコレステロールを産生するように改変された酵母にも必須ではなく、従って、これらの活性化または阻害はこれらの酵母の成長または死には関係がない。
【００１４】
従って、このことにより、これらの細胞の生存に何の問題もなくコレステロールの調節因子の研究が可能になり、実際、コレステロールがなければ、今までに試験に使用されたこの型の哺乳動物細胞は死亡した。従って、この細胞は、コレステロールレベルが不十分であると間もなく死亡するので、コレステロール合成を減少させる化合物の効果を観察することは不可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】欧州特許第０７２７４８９号明細書
【特許文献２】国際公開第２００５／１２１３１５号
【特許文献３】国際公開第２００２／０６１１０９号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｗａｎｄｅｌｍｅｒ，Ｊ．，Ａ．Ｄａｖａｌｏｓ，Ｅ．Ｈｅｒｒｅｒａ，Ｍ．Ｇｉｅｒａ，Ｓ．Ｃａｎｏ，Ｇ．ｄｅ  ｌａ  Ｐｅｎａ，Ｍ．Ａ．Ｌａｓｕｎｃｉｏｎ，ａｎｄ  Ｒ．Ｂｕｓｔｏ．２００９．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｄｉｓｒｕｐｔｓ  ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔ／ｃａｖｅｏｌａｅ  ａｎｄ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ３Ｔ３−Ｌ１  ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１７８８：１７３１−９．
【非特許文献２】Ｐａｕｌ，Ｒ．，Ｓ．Ｓｉｌｖｅ，Ｎ．Ｄｅ  Ｎｙｓ，Ｐ．Ｈ．Ｄｕｐｕｙ，Ｃ．Ｌ．Ｂｏｕｔｅｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｐ．Ｆｅｒｒａｒａ，Ｇ．Ｌｅ  Ｆｕｒ，Ｐ．Ｃａｓｅｌｌａｓ，ａｎｄ  Ｇ．Ｌｏｉｓｏｎ．１９９８．Ｂｏｔｈ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ  ＳＲ３１７４７  ａｎｄ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｔａｍｏｘｉｆｅｎ  ｂｉｎｄ  ｔｏ  ａｎ  ｅｍｏｐａｍｉｌ−ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｄｅｌｔａ８−Ｄｅｌｔａ７  ｓｔｅｒｏｌ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ．Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．２８５：１２９６−３０２．
【非特許文献３】Ｃａｒｒｉｌｌｏ−Ｍｕｎｏｚ，Ａ．Ｊ．，Ｇ．Ｇｉｕｓｉａｎｏ，Ｐ．Ａ．Ｅｚｋｕｒｒａ，ａｎｄ  Ｇ．Ｑｕｉｎｄｏｓ．２００６．Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ  ａｇｅｎｔｓ：ｍｏｄｅ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｒｅｖ  Ｅｓｐ  Ｑｕｉｍｉｏｔｅｒ．１９：１３０−９．
【非特許文献４】Ｐ．Ｕｒｂａｎ，Ｄ．Ｗｅｒｃｋ−Ｒｅｉｃｈｈａｒｔ，Ｈ．Ｇ．Ｔｅｕｔｓｈ，Ｆ．Ｄｕｒｓｔ，Ｓ．Ｒｅｇｎｉｅｒ，Ｍ．Ｋａｚｍａｉｅｒ  ａｎｄ  Ｄ．Ｐｏｍｐｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｌａｎｔ  ｃｉｎｎａｍａｔｅ  ４−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｐｌａｎｔ  Ｐ４５０  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄ  ｐａｔｈｗａｙ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９４  Ｊｕｎ  １５；２２２（３）：８４３−８５０．
【非特許文献５】Ｐｏｍｐｏｎ，Ｄ．，Ｂ．Ｌｏｕｅｒａｔ，Ａ．Ｂｒｏｎｉｎｅ，ａｎｄ  Ｐ．Ｕｒｂａｎ．１９９６．Ｙｅａｓｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ａｎｄ  ｐｌａｎｔ  Ｐ４５０ｓ  ｉｎ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｒｅｄｏｘ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７２：５１−６４．
【非特許文献６】Ｇｉｅｔｚ，Ｒ．Ｄ．，Ｒ．Ｈ．Ｓｃｈｉｅｓｔｌ，Ａ．Ｒ．Ｗｉｌｌｅｍｓ，ａｎｄ  Ｒ．Ａ．Ｗｏｏｄｓ．１９９５．Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔａｃｔ  ｙｅａｓｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＬｉＡｃ／ＳＳ−ＤＮＡ／ＰＥＧ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ．Ｙｅａｓｔ．１１：３５５−６０．
【非特許文献７】Ｇｉｅｔｚ，Ｒ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｒ．Ａ．Ｗｏｏｄｓ．２００２．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ  ｂｙ  ｌｉｔｈｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ／ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｃａｒｒｉｅｒ  ＤＮＡ／ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｍｅｔｈｏｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３５０：８７−９６．
【非特許文献８】Ｄｕｐｏｒｔ，Ｃ，Ｒ．Ｓｐａｇｎｏｌｉ，Ｅ．Ｄｅｇｒｙｓｅ，ａｎｄ  Ｄ．Ｐｏｍｐｏｎ．１９９８．Ｓｅｌｆ−ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｅｇｎｅｎｏｌｏｎｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  ｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｙｅａｓｔ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：１８６−９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、この問題を、遺伝子操作された酵母の使用を介して解決でき、細胞の生存は、このコレステロールの産生に厳密に依存しない。
【００１８】
従って、本出願の対象である本発明は、コレステロール合成の調節因子を検出する手段の新規な代替手段を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
新規な代替手段は、酵母がコレステロールおよびコレステロールの異化に関連する酵素の両方を産生するように、酵母を遺伝的に形質転換することにある。組換え酵母を、コレステロール産生酵母にとって当初は毒性である培地において、コレステロールを調節する可能性のある化合物と接触させる。酵母の成長の回復の観察、または逆に、酵母の死の観察は、被験化合物が、酵母によるコレステロールの産生を阻害または増加させるかどうかの決定を可能にさせる。
【００２０】
使用する酵母は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）（ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）など）またはピキア・パトリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）であってもよい。
【００２１】
有利には、使用する酵母はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）である。
【００２２】
コレステロール合成の阻害またはコレステロール異化の活性化のいずれかにより、産生されるコレステロールの量の減少を誘導する化合物は、これらの細胞にとって当初は毒性である培地において細胞の成長の回復をもたらす。コレステロール合成に関連する酵素の阻害因子および／またはコレステロール異化のアクチベーターは、従って、コレステロールレベル依存性成長を検出するためのこの方法を用いて実証される。
【００２３】
このような酵素は、コレステロール合成に関してはＤＨＣＲ１４、ＤＨＣＲ２４、ＤＨＣＲ７およびステロールΔ８−Δ７イソメラーゼであってよい。
【００２４】
同様に、本方法は、コレステロールを異化する酵素のアクチベーター、例えばチトクロームＰ４５０（例えば、ＣＹＰ２７Ａ１、ＣＹＰ４６Ａ１、ＣＹＰ１１Ａ１およびＣＹＰ７Ａ１）の同定を可能にする。
【００２５】
本発明に従った毒素は、シリンゴマイシンＥ、フィトスフィンゴシン、テロマイシン、イツリンＡ、コレラ菌毒素およびコレステロール依存性毒素であってよい。
【００２６】
有利には、本発明に従った培地の毒素はシリンゴマイシンＥである。
【００２７】
酵母株は、コレステロール異化に関連する酵素の産生をコードする遺伝子の発現を可能にするベクターを導入することによって形質転換される。
【００２８】
有利には、本出願人は、チトクロームＰ４５０およびこれらの電子輸送補因子の機能発現が最適化された、組換えタンパク質発現ベクターを使用する。
【００２９】
本発明の一実施形態において、これらの組み換えベクターはプラスミドである。
【００３０】
本発明の対象を例示するが、下記の実施例により本発明を限定するものではない。
【００３１】
材料および方法
酵母の培養に使用する培地は、有利には、合計１Ｌに対して培地中６００ｍｌの脱塩Ｈ２Ｏ、５０ｍｌの２０倍濃縮塩溶液（表１）、１０ｇのカザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）または８．９ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４（Ｐｒｏｌａｂｏ  ２１  ３３３．２９６）（窒素源）、２ｍｌの５００倍濃縮ビタミン溶液（Ｍｉｘ２）、０．２ｍｌのＣａＣｌ２およびＦｅＣｌ３の５０００倍濃縮溶液（Ｍｉｘ３）ならびに１００ｍｇ／Ｌのアミノ酸および５０ｍｇ／Ｌの必要とされる塩基（アデニンを除いて１００ｍｇ／ｌ）から構成されるＫａｐｐｅｌｉ培地である。
【００３２】
ｐＨを、濃ＫＯＨを用いて５．５に調整し、その後、体積を９００ｍｌに調整し、０．２２μｍのＮａｌｇｅｎｅフィルターを介してろ過し、１００ｍｌの炭素源を２０％加える（Ｄ−グルコース、Ｐｒｏｌａｂｏ  ２４  ３７０．２９４）。
【００３３】
【表１】
2013534815.tif 000002
2013534815.tif 000003
この溶液のｐＨは２．６から２．７の間である。溶液は、＋４℃で保存し、アリコートは５０ｍｌ／チューブである。
【００３４】
【表２】
2013534815.tif 000004
溶液は−２０℃で保存し、アリコートは２．２ｍｌ／チューブである。
【００３５】
【表３】
2013534815.tif 000005
溶液は＋４℃で保存し、アリコートは５００μＬ／チューブである。
【００３６】
酵母のために使用した胞子形成培地は下記のとおりである：
ＳＰ１胞子形成培地：酵母エキス  ２．５ｇ／Ｌ、酢酸カリウム  ９．８ｇ／Ｌ、グルコース  １ｇ／Ｌ、寒天  ２０ｇ／Ｌ。
【００３７】
ＡＣＫ胞子形成培地：酢酸カリウム  １０ｇ／Ｌ、寒天  ２０ｇ／Ｌ。
【実施例】
【００３８】
［実施例Ａ］
プラスミドベクターの構築：
ＤＨＣＲ２４およびチトクロームＰ４５０のための発現ベクターの構築
このプラスミドは、全く同一のベクター上に、ＤＨＣＲ２４およびＣＹＰ２７Ａ１の活性を介して改変酵母中に、それぞれコレステロールの合成およびこの異化をもたらす、ＤＨＣＲ２４（デヒドロコレステロール−２４−レダクターゼ）、成熟ＣＹＰ２７Ａ１および成熟アドレノドキシン（ＡＤＸ）電子輸送体のための３つの発現カセットを得る目的で構築される。ＡＤＸ（プラスミド上に提供される。）およびＡＤＲ（菌株のゲノム上に担持される。）などの電子輸送体は、ＣＹＰ１１Ａ１（国際特許出願ＷＯ０２／０６１１０９）またはＣＹＰ２７Ａ１などのミトコンドリアのチトクロームＰ４５０の機能活性に必要とされる。
【００３９】
プラスミドｐＩＭ５８０は、当業者には公知である酵母における分子生物学および組み換えの方法により得られる。この発現ベクターは、プラスミドｐＣＤ６３（Ｐｏｍｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９８  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）およびｐＹｅＤＰ６０（Ｐｏｍｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９４  Ｅｕｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）に由来し、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のための２μの複製起点およびＵＲＡ３選択可能マーカー（図７）を含有する。
【００４０】
このベクターを得るために、ｐＣＤ６３のＴＲＰ１選択可能マーカーは、酵母における相同組み換えにより欠失される。このために、ｐＣＤ６３の断片をＢｓｕｌおよびＳｍａｌ制限部位において、ＴＲＰ１選択可能マーカーの配列のレベルで開き、ｐＣＤ６３鋳型において配列番号１および２の配列のプライマーを用いて得られたＰＣＲ断片と接触させ、ＢｇＩＩＩ部位のレベルでＴＲＰ１マーカーのいずれかの側にハイブリダイズさせる。ＤＮＡ断片のこの混合物を、その後Ｗ３０３型の酵母内に、Ｇｉｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ，１９９５および２００２により記載の形質転換方法ＬｉＡｃ／ＰＥＧを用いて導入する。
【００４１】
組み換えクローンを、ＵＲＡ３選択可能マーカーの存在およびＴＲＰ１マーカーの不在に関して、無ウラシル培地において成長することおよび無トリプトファン培地においては成長しないことにより選択する。ＤＮＡを、酵母からザイモリアーゼを用いた溶解により抽出し（１２．５ｍｇ／ｍｌ、１Ｍのソルビトール、０．１Ｍのリン酸バッファーｐＨ７．２、１時間３７℃）、その後、Ｑｉａｇｅｎ  ｋｉｔ整理番号１２１０６を使用するアルカリ溶解、その後既存の分子生物学技術を使用する分析のためにＴＧ１細菌内に移す（Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ  １９８９により適合されたＴＳＢ法）。この新しいベクターをｐＩＭ５６５と名付ける。
【００４２】
次に、ｐＩＭ３３０（ｐＹＸ２１２  ＃ＭＢＶ−０２８−１０  Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍに由来する。）のＮａｅｌ断片が起源であるＴＰＩプロモーター（トリオースリン酸イソメラーゼ）の管理下で、ＤＨＣＲ２４に関する発現カセットを、プラスミドｐＩＭ５７８を形成するようにｐＩＭ５６５のＰｖｕＩＩ部位に導入する。２番目および３番目のコドンに関して改変されたＤＨＣＲ２４に関する発現カセットは、国際特許出願ＷＯ２００５／１２１３１５に記載されている。ここで選択されたプロモーターは、ＣＹＣ１の代わりの構成的プロモーターのＴＰＩプロモーターである。
【００４３】
最終的に、（ｐＣＤ６３を起源とする。）ＣＹＰ１１Ａ１に関する発現カセットと、成熟ＣＹＰ２７Ａ１に関する発現カセット（即ち、ミトコンドリア標的化配列を欠いている。）とを、Ｎａｅｌ部位で開かれたｐＩＭ５７８ベクターと、ｐＩＭ５５８由来のＰＣＲ断片との間の、酵母における相同組み換えにより、成熟ＣＹＰ２７Ａ１の発現カセットを含有する配列番号３および４のプライマーを用いて、ｐＹｅＤＰ６０（Ｄ．Ｐｏｍｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９４および１９９６）由来のＧａｌ１０／ＣＹＣ１キメラプライマーの管理下で交換する。
【００４４】
成熟ＣＹＰ２７Ａ１のｃＤＮＡはＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＭ＿０００７８４のクローンを起源とし、この最初の３３アミノ酸を欠いたＮ末端部を、配列番号５および６のプライマーを用いたＰＣＲにより改変した。
【００４５】
ＤＨＣＲ２４、ＡＤＸおよび成熟ＣＹＰ２７Ａ１の発現カセットを含有する得られたプラスミドは、ｐＩＭ５８０と名付けられる。
【００４６】
ＣＹＰ４６Ａ１のコーディング配列を含有する同等のプラスミドをｐＩＭ５８４と名付け、類似の方法で得る。ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＭ＿００６６６８のクローンに由来するＣＹＰ４６のｃＤＮＡを、ｐＹｅＤＰ６０に導入し、その後、発現カセット（ｐｒｏｍＣＹＣ１／ＧＡＬ１０−ＣＹＰ４６−ＴｅｒｍＰＧＫ）を酵母における相同組み換えによりｐＩＭ５７８に移す。
【００４７】
チトクロームＰ４５０に関するコーディング配列を欠いた対照プラスミドは、類似の手段で、ｐＹｅＤＰ６０に関する発現カセットとＮａｅＩ部位で開かれたｐＩＭ５７８との間の相同組み換えにより得られる。このＰ４５０を含まない対照ベクターを、ｐＩＭ５８２と名付ける。
【００４８】
本発明に使用できるプラスミドを、下記の表１に要約する。
【００４９】
【表４】
2013534815.tif 000006
【００５０】
［実施例Ｂ］
改変酵母株の構築
有利な一実施形態において、コレステロール産生酵母株を下記のように構築した：
ｙＩＭ２６株の構築
ＹＩＭ１２６株を、コレステロールの改変、特にアルファ鎖ＡＲＥ１およびＡＲＥ２のエステル化に関与する２種の酵素ならびにエルゴステロール（ｅｒｇｏｓｔａｓ）およびコレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔａｓ）の側鎖の２２−２３位の不飽和に関与するＥＲＧ５によりコードされる酵素に関連する遺伝子の操作を防ぐように構築した。これらの特徴は、コレステロール産生に必要とされる要素を含有する全く同一の菌株に組み合わされている。
【００５１】
そのために、興味深い特徴を含有する２つの半数体株を、（国際特許出願Ｗ０２００５／１２１３１５に記載のように）非常に富んだ培地で成長させ、次に非常に貧しい培地で成長させることによって、その後胞子形成可能な二倍体株を得るように接触させる。二倍体細胞および子嚢の混合物を、その後、二倍体株を優先的に溶解するために、３０％のエーテルを含有する水性培地と、３および６分間接触させる。生存クローンを、親の形質を組み合わせた半数体株を得るために、続いて特徴探索に従った選択培地に播種する。
【００５２】
このようにして、当業者に公知の方法を使用してさまざまな株を３回連続交配させた半数体クローンの選択により、ｙＩＭ１２６株を得た。
【００５３】
そのために、Ｆｙ１１６７９−２８ｃ株（国際特許出願ＷＯ２００２／０６１１０９）を、ＥＲＴ株（国際特許出願ＷＯ２００５／１２１３１５のＷＧＩＦ０１株）と交配させる。親株の相補的独立栄養に基づき選択された、この交配により得られた二倍体クローンに胞子形成させ、次いで半数体クローンを得るための上述の処理をする。Ｆｙ１６７９−２８ｃのアデニン独立栄養形質およびＥＲＴのｅｒｇ６：ＴＲＰ１崩壊の顕著な特徴である、アデニンおよびトリプトファンを欠いた培地で成長できる半数体株を選択した。クローンの半数性を、対照株のＷ３０３  ＭＡＴａまたはＭＡＴアルファと交配させることによって検証した。トリプトファンＴＲＰ１の選択可能マーカーにより、無傷のＡＤＥ２遺伝子座およびＥＲＧ６遺伝子の崩壊を組み合わせ、得られたクローンを、ｙＩＭ１１０およびｙＩＭ１１１と名付けた。
【００５４】
次に、ｙＩＭ１１０株を、ＣＤＲ０６半数体株と交配させる。ＣＤＲ０６は、ＦＹ１６７９を遺伝的起源とする株であり、このａｄｅ２遺伝子座は、植物のアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のΔ７−ステロールレダクターゼに関する発現カセットの統合を介して非機能性である。ＣＤＲ０６およびＣＤＲ０７（特許出願ＷＯ２００２／０６１１０９またはＤｕｐｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ，２００３に記載）を同じ交配により得、これらはＣＤＲ０６において機能性であるＥＲＧ５遺伝子が存在するという理由で異なる。二倍体クローンｙＩＭ１１０ＸＣＤＲ０６を単離し、その後、胞子産生条件下に置いた。胞子を先に記載したように調製し、富んだ培地において単離し、その後、アデニンの存在下および不在下ならびにＥＲＧ６ｐ活性の機能性の不在およびΔ７−ステロールレダクターゼ活性の存在の組み合わせと関係がある、ナイスタチンに対する菌株の耐性を検証するために、この抗真菌剤の存在下でさまざまな培地において試験する。さらに、鹸化、その後の全ステロールの有機抽出法によりステロール組成物を検証する。ステロールの同一性をＧＣ／ＦＩＤにより分析し、次いでＧＣ／ＭＳにより検証する。国際特許出願ＷＯ２００５／１２１３１５に過去に記載されたように培養し処理した細胞のペレットを使用して、デスモステロールと同じ保持時間を有する生成物の存在が、クローン４および６に観察された。これらのクローン４および６は、ガラクトースが炭素源である場合もまたナイスタチンに対して耐性である。これらの半数体クローン４および６を、それぞれｙＩＭ１１５およびｙＩＭ１１６と名付ける。
【００５５】
最終的に、ｙＩＭ１１６およびＣＡ２３株の３回目の交配を、対象となる３種の遺伝子、即ちＡＲＥ１、ＡＲＥ２およびＥＲＧ５の遮断を、コレステロールおよびさらにチトクロームＰ４５０を機能性にするために必要とされる電子輸送体に関する発現カセットを産生できる菌株に導入する目的で実施する。国際特許出願ＷＯ２００５／１２１３１５に記載のＣＡ２３株は、３種の遺伝子、ＡＲＥ１、ＡＲＥ２およびＥＲＧ５の非機能型およびＬＥＵ２遺伝子座に統合されたアドレノドキシンレダクターゼ（ＡＤＲ）の電子輸送体に関する発現カセットを含有する。ｙＩＭ１１６ＸＣＡ２３二倍体を、トリプトファン、ヒスチジンまたはロイシンを含有しないがアデニンおよびウラシルを含有する最小培地において単離した。この方法において、ｙＩＭ１１６およびＣＡ２３の間の交配を起源とする二倍体細胞のみが成長できるのに反して、交配のパートナーはこれらの条件下では全く成長できない。二倍体クローンは、先に記載の条件下で胞子を形成する。先に記載のように胞子および二倍体株の混合物をエーテルで処理後、約１００の胞子を単離する。これらのクローンを、これらの接合型記号、アデニン、ロイシン、ヒスチジンおよびトリプトファンを含まない培地において成長する能力、３種の抗真菌剤、ナイスタチン、ハイグロマイシンおよびジェネテシンに耐える能力に関して特徴付けた。最終的に、このようにして選択されたクローン４を、ｙＩＭ１２６と名付けた。このクローンはロイシンの不在下で成長でき、機能性ＬＥＵ２遺伝子に関する発現カセットの存在を示す。このクローンは、トリプトファンおよびヒスチジンの不在下でもまた成長でき、ＥＲＧ６およびＡＲＥ２遺伝子の崩壊の可能性を示す。高レベルのナイスタチンおよびジェネテシンに耐性であり、おそらく、それぞれＤＨＣＲ７酵素の存在およびさらにＡＲＥ１遺伝子の崩壊を示している。ＡＲＥ１およびＡＲＥ２遺伝子の生成物の存在を確認または否定するために、遊離またはエステル化されたステロールを分析し、ＥＲＧ６遺伝子の遮断およびＤＨＣＲ７の存在を否定または確認するために、ステロールの性質を分析する。
【００５６】
【表５】
2013534815.tif 000007
【００５７】
［実施例Ｃ］
酵母における、機能性酵素活性を介したコレステロールの産生およびこの異化を組み合わせた菌株の構築
ＤＨＣＲ２４に関する発現カセットを含有し、チトロームＰ４５０およびＡＤＸ電子輸送体を含む、または含まないプラスミドを、ｙＩＭ１２６酵母に、ＬｉＡｃ／ＰＥＧ形質転換法（Ｇｉｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ，１９９５  ａｎｄ  ２００２）を使用して導入する。
【００５８】
このクローンを、無ウラシル培地において選択する。各組み合わせの２つから４つのクローンを、国際特許出願ＷＯ２００５／１２１３１５に記載の手順に従ってＧＣ／ＦＩＤ、その後ＣＧ／ＭＳによる全ステロールの分析のために培養する。このクローンを、４８時間、振とうしながら３０℃において、２％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアデニンを添加したＹＢＮ培地において培養する。光学密度（ＯＤ６００ｎｍ）は、平均値７ユニットに達する。培養体積Ｖから細胞ペレットを回収し、同一体積Ｖの、２０％のカザミノ酸、２％のグルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアデニンを含有するＫａｐｐｅｌｉ培地に移す。これらの培養液を７２時間から９０時間、３０℃においてインキュベートし、６００ｎｍにおける光学密度は４０から５０ユニットに達する。１００光学密度ユニットの体積と同等のペレットを処理し、前記および国際特許出願ＷＯ２００５／１２１３１５に記載のようにガスクロマトグラフィーにより分析する。
【００５９】
酵母試料のステロールプロファイルを、コレステロール（図１Ａ）、デスモステロール（図１Ｂ）、プレグネノロン（図１Ｃ）、２４ＯＨ−コレステロール（図１Ｄ）および２７ＯＨ−コレステロール（図１Ｅ）などの、ＧＣ／ＦＩＤガスクロマトグラフィーによる標準溶液の保持時間と比較し、生成物を、保持時間の類似性により同定する。
【００６０】
ピークの表面積の分析および測定により、ｐＩＭ５８０プラスミドを含有し、Ｐ４５０を含まず、コレステロール／デスモステロール比が３を超えるｙＩＭ１２６株のコレステロール産生が示される。Ｐ４５０の発現構築体を含有するｙＩＭ１２６株は、コレステロールを基質として使用する各Ｐ４５０に特異的なコレステロール誘導体を産生する、即ち、ＣＹＰ１１Ａ１に関してはプレグネノロン（図３）、ＣＰ２７Ａ１に関しては２７ＯＨ−コレステロール（図４）および２７ＯＨ−ステロールおよびＣＹＰ４６Ａ１に関しては２４ＯＨ−コレステロール（図５）の産生である。コレステロール／デスモステロール比は、ＣＹＰ４６の存在下で２倍、およびＣＹＰ１１Ａ１またはＣＹＰ２７Ａ１の存在下で５から６倍減少し、コレステロールがおそらく代謝されたことを示す。２７ＯＨ−デスモステロールなどの２７位においてヒドロキシル化された新しいステロールは、ＣＹＰ２７Ａ１活性の存在下で特異的に現れる（図４）。
【００６１】
［実施例Ｄ］
コレステロール代謝を検出するための、細胞における生物学的方法
ａ）培養培地：
成長に関する、または成長の喪失に関する単純な表現型試験を介して、コレステロール産生酵母とコレステロールを産生しないまたはこれを異化しない酵母とを識別できる培養培地を開発する。この培養培地は、シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）Ｂ−３０１Ｄ（Ｓｉｇｍａ＃Ｓ６９４６）由来のシリンゴマイシンＥ毒素を１５０から２５０ｎｇ／ｍｌで添加した、ＹＰＧ寒天型（ＹＰＧ完全培地：酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）１０ｇ／Ｌ、バクト−ペプトン（ｂａｃｔｏ−ｐｅｐｔｏｎｅ）（Ｄｉｆｃｏ）２０ｇ／Ｌ、グルコース（Ｍｅｒｃｋ）２０ｇ／Ｌ）の富栄養培地である。
【００６２】
固体培地を得るために寒天（２０ｇ／Ｌ）を加える。
【００６３】
ｂ）コレステロール代謝の検出
前記の、ＤＨＣＲ２４およびｐＩＭ５８０などのチトクロームＰ４５０に関する発現ベクターを含有するｙＩＭ１２６酵母株を、４８時間、３０℃において振とうしながら、２％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアデニンを添加したＹＮＢ培地（酵母窒素源ｗ／ｏアミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）６．７ｇ／Ｌ、グルコース（Ｍｅｒｃｋ）２０ｇ／Ｌ）において培養する。
【００６４】
培養により、６００ｎｍにおける光学密度が約７ユニットに達する。細胞ペレットを遠心分離により回収し、２０％カザミノ酸、２％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアデニンを含有する、同一量のＫａｐｐｅｌｉ培地に移し、３０℃において２４時間振とうし、６００ｎｍにおける光学密度は約４０ユニットに達する。
【００６５】
当業者に公知の方法に従って、シリンゴマイシンＥを含有するＹＰＧ寒天における滴下試験を実施するために、培養液を６００ｎｍにおける光学密度が１ユニットに希釈し、その後、１／５０に希釈し、その後２５倍希釈にする。
【００６６】
４８時間から７２時間、３０℃においてインキュベーション後、シリンゴマイシンＥを１７０ｎｇ／ｍｌ含有するＴＰＧ寒天において、コレステロールを産生するｐＩＭ５８２発現ベクターを含有する酵母（Ｐ４５０は含まない、図６、列１）は成長できず、一方、コレステロールを産生し、これを誘導生成物に転換するｐＩＭ５８０発現ベクターを含有する酵母（ＣＹＰ２７Ａ１を含む、図６、列２）は成長できる（図６Ａおよび６Ｂ）。シリンゴマイシンＥを含有するこのＹＰＧ培地の毒性は、ＣＧ／ＦＩＤまたはＣＧ／ＭＳにより観察された、酵母において利用可能なコレステロールの量に依存する。
【００６７】
［実施例Ｅ］
コレステロールの代謝に干渉する生成物を検出するための、細胞における生物学的方法：
コレステロール合成に関して改変された酵母の成長のためのこの試験もまた、コレステロール合成またはコレステロール異化のいずれかに干渉する生成物の同定を可能にする。
【００６８】
ＤＨＣＲ２４の発現プラスミドを含有し、Ｐ４５０を含む、または含まないｙＩＭ１２６酵母を、ＹＮＢ培地、２％グルコース、１００μｇ／ｍｌのアデニンにおいて４８時間、３０℃において培養し、その後上記のようにＫａｐｐｅｌｉ培地において２４時間、３０℃において培養する。
【００６９】
この菌株にとって毒性である用量、即ち、ｐＩＭ５８２プラスミドを含有するｙＩＭ１２６に関しては１６０ｎｇ／ｍｌまたはｐＩＭ５８０プラスミドを含有するｙＩＭ１２６株に関しては２５０ｎｇ／ｍｌでシリンゴマイシンＥを含有するＹＰＧ寒天を接種するために、酵母懸濁液を、６００ｎｍにおける光学密度が０．００５ユニット（１／２００）までＹＮＢ培地で希釈する。
【００７０】
寒天培地の接種を、この表面に流し込み、過剰の液体をすぐに吸引することによって実施する。対象となる生成物を、寒天表面に堆積させ、従って接種し、その後乾燥させる。４８時間から７２時間、３０℃のインキュベーション後、酵母成長のハローが、コレステロール合成またはコレステロール異化に干渉する生成物の堆積物の周りに観察される。コレステロールの合成の阻害またはコレステロールの異化の活性化のいずれかにより、コレステロールの量の減少を誘導する生成物は、当初は毒性であるこの培地において成長の回復をもたらす。ＤＨＣＲ２４、ＤＨＣＲ２７またはΔ８−Δ７ステロールイソメラーゼなどの、コレステロール合成に関連し、野生型酵母またはステロール合成に関して改変された酵母に必須ではない酵素の阻害因子は、従って、コレステロールレベル依存性成長を検出するためのこの方法を用いて容易に実証される。同様に、この方法は、チトクロームＰ４５０などの、コレステロールを異化する酵素のアクチベーター、例えばＣＹＰ２７Ａ１を同定できる。これにより、公知の生成物、例えば、ステロール−Δ１４レダクターゼ、ＤＨＣＲ７およびΔ８−７イソメラーゼを阻害するトリパラノール、ＤＨＣＲ７を阻害するＡＹ９９４４（Ｊ．Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｗａｎｄｅｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２００９）、ステロールΔ８−７イソメラーゼを阻害するＳＲ３１７４７（Ｒ．Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ  １９９８）、またはＤＨＣＲ１４およびステロールΔ８−７イソメラーゼを阻害するアモロルフィン（Ａ．Ｊ．Ｃａｒｒｉｌｌｏ−Ｍｕｎｏｚ  ｅｔ  ａｌ，２００６）を検証でき、同様に、コレステロールの堆積または２７ＯＨ−コレステロールの堆積は、寒天に含まれるシリンゴマイシンＥの毒性に関する保護領域を誘導する（図６）。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１Ａ】ＧＣ／ＦＩＤガスクロマトグラフィーによるコレステロールの保持時間の図である。
【図１Ｂ】ＧＣ／ＦＩＤガスクロマトグラフィーによるデスモステロールの保持時間の図である。
【図１Ｃ】ＧＣ／ＦＩＤガスクロマトグラフィーによるプレグネノロンの保持時間の図である。
【図１Ｄ】ＧＣ／ＦＩＤガスクロマトグラフィーによる２４ＯＨ−コレステロールの保持時間の図である。
【図１Ｅ】ＧＣ／ＦＩＤガスクロマトグラフィーによる２７ＯＨ−コレステロールの保持時間の図である。
【図２】Ｐ４５０活性の不在下でｙＩＭ１２６株のステロールプロファイルが、コレステロール（ＲＴ２１．９８分）およびデスモステロール（ＲＴ２３．１１分）の優勢な存在を示す図である。
【図３】ＣＹＰ１１Ａ１活性の存在下で、ｙＩＭ１２６株のステロールプロファイルが改変され、コレステロール（ＲＴ２１．９７）の比がデスモステロール（ＲＴ２３．１３）のために減少し、プレグネノロン（ＲＴ１４．７３分）に対応するステロールが現れた図である。
【図４】ＣＹＰ２７Ａ１活性の存在下で、ｙＩＭ１２６株のステロールプロファイルが改変され、コレステロール（ＲＴ２１．９６）の比がデスモステロール（ＲＴ２３．１１）のために減少し、２７ＯＨ−コレステロール（ＲＴ３３．５３分）および２７ＯＨ−デスモステロール（ＲＴ３３．９３分）に対応する２種の他のステロールが現れた図である。
【図５】ＣＹＰ４６Ａ１活性の存在下で、ｙＩＭ１２６株のステロールプロファイルが改変され、２４ＯＨ−コレステロール（ＲＴ３０．３８分）に対応するステロールが現れた図である。
【図６Ａ】シリンゴマイシンＥ（ＳＲＧ）を含有するＹＰＧ寒天においてコレステロールを産生および／または異化するさまざまな菌株の成長に関する試験の図である：シリンゴマイシンＥを含まないＹＰＧ寒天に堆積した酵母培養液希釈液（６Ａ）；６００ｎｍにおける希釈液ＯＤは上から下に０．０２／０．０００８／００００３である。
【図６Ｂ】シリンゴマイシンＥ（ＳＲＧ）を含有するＹＰＧ寒天においてコレステロールを産生および／または異化するさまざまな菌株の成長に関する試験の図である：シリンゴマイシンＥを１７０ｎｇ／ｍｌで含むＹＰＧ寒天に堆積した酵母培養液希釈液（６Ｂ）；６００ｎｍにおける希釈液ＯＤは上から下に０．０２／０．０００８／００００３である。
【図７Ａ】コレステロール産生株を接種した、シリンゴマイシンＥを含有するＹＰＧ寒天における成長の回復に関する試験の図である。シリンゴマイシンＥを２５０ｎｇ／ｍｌで含有するＹＰＧ寒天培地の表面にｙＩＭ１２６−ｐＩＭ５８０−ＣＹＰ２７Ａ１酵母懸濁液の被覆を接種する。２μｌの１ｍＭまたは０．１μｇ／ｍｌの生成物を、乾燥させ、接種された表面に堆積する。図７Ａ上から下に：０．１ｍｇ／ｍｌのコレステロール、２７ＯＨ−コレステロールおよびアモロルフィン。
【図７Ｂ】コレステロール産生株を接種した、シリンゴマイシンＥを含有するＹＰＧ寒天における成長の回復に関する試験の図である。シリンゴマイシンＥを２５０ｎｇ／ｍｌで含有するＹＰＧ寒天培地の表面にｙＩＭ１２６−ｐＩＭ５８０−ＣＹＰ２７Ａ１酵母懸濁液の被覆を接種する。２μｌの１ｍＭまたは０．１μｇ／ｍｌの生成物を、乾燥させ、接種された表面に堆積する。図７Ｂ上から下に：１ｍＭのトリパラノール、ＡＹ９９４４、ＳＲ３１７４７。
【図８】ｐＩＭ５８０プラスミドのマップである。
【００７２】
参考文献
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Ｐ．Ｕｒｂａｎ，Ｄ．Ｗｅｒｃｋ−Ｒｅｉｃｈｈａｒｔ，Ｈ．Ｇ．Ｔｅｕｔｓｈ，Ｆ．Ｄｕｒｓｔ，Ｓ．Ｒｅｇｎｉｅｒ，Ｍ．Ｋａｚｍａｉｅｒ  ａｎｄ  Ｄ．Ｐｏｍｐｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｌａｎｔ  ｃｉｎｎａｍａｔｅ  ４−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｐｌａｎｔ  Ｐ４５０  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄ  ｐａｔｈｗａｙ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９４  Ｊｕｎ  １５；２２２（３）：８４３−８５０．
【図１Ａ】
2013534815.tif 000008
【図１Ｂ】
2013534815.tif 000009
【図１Ｃ】
2013534815.tif 000010
【図１Ｄ】
2013534815.tif 000011
【図１Ｅ】
2013534815.tif 000012
【図２】
2013534815.tif 000013
【図３】
2013534815.tif 000014
【図４】
2013534815.tif 000015
【図５】
2013534815.tif 000016
【図６Ａ】
2013534815.tif 000017
【図６Ｂ】
2013534815.tif 000018
【図７Ａ】
2013534815.tif 000019
【図７Ｂ】
2013534815.tif 000020
【図８】
2013534815.tif 000021
【配列表】
2013534815000001.app
【国際調査報告】
2013534815.tif 000022
2013534815.tif 000023
2013534815.tif 000024
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