(57)【要約】チャイニーズハムスターからのグリコシルトランスフェラーゼ、および関連方法が記載される。第１の態様では、本発明は、チャイニーズハムスターまたはＣＨＯ細胞のＧｇｔａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または例えば本明細書に記載されるＧｇｔａ１活性などの１つ以上のＧｇｔａ１活性を有するその活性部分を含んでなる、単離された核酸分子を特徴とする。一実施形態では、本明細書に記載されるＧｇｔａ１ポリペプチドをコードする単離された核酸分子は、異種性アミノ酸配列に結合しており、例えばそれは例えばエピトープ標識されたＧｇｔａ１などのＧｇｔａ１融合タンパク質をコードする。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２、もしくは配列番号４もしくは配列番号７のアミノ酸残基配列をコードする配列を有するＤＮＡ分子、またはその生物学的活性断片と、あるいは（ｂ）前記（ａ）のＤＮＡ分子の補体と、少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号２、または配列番号４または配列番号７の配列をコードする、単離された核酸分子。
【請求項３】
配列番号１または配列番号３または配列番号５または配列番号６の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、単離された核酸分子。
【請求項４】
高ストリンジェンシー条件下で、配列番号１、配列番号３、配列番号５もしくは配列番号６の配列を有する核酸分子またはその補体とハイブリッド形成する、単離された核酸分子。
【請求項５】
配列番号１もしくは配列番号３、配列番号５もしくは配列番号６のヌクレオチド配列、またはその補体を含んでなる、単離された核酸分子。
【請求項６】
Ｇｇｔａ１ポリペプチドをコードする前記核酸分子が異種アミノ酸配列に結合している、請求項１〜５の何れか一項に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
（ａ）配列番号１の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドでありかつ５００個未満の連続するヌクレオチド、またはその補体からなるオリゴヌクレオチド、
（ｂ）配列番号３の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドでありかつ５００個未満の連続するヌクレオチド、またはその補体からなるオリゴヌクレオチド、
（ｃ）配列番号５の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドでありかつ５００個未満の連続するヌクレオチド、またはその補体からなるオリゴヌクレオチド、
（ｄ）配列番号６の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドでありかつ５００個未満の連続するヌクレオチド、またはその補体からなるオリゴヌクレオチド、
（ｄ）表２に示される配列を含んでなる、１０個〜５００個のヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、
（ｅ）表４に示される配列を含んでなる、１０個〜５００個のヌクレオチドのオリゴヌクレオチド
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか一項に記載の核酸分子またはオリゴヌクレオチド配列を含んでなる、核酸コンストラクト。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか一項に記載の核酸分子、オリゴヌクレオチド、または核酸コンストラクトを用いて形質移入された、単離された宿主細胞。
【請求項１０】
前記宿主細胞が、前記宿主細胞の親細胞によって生成される治療用組換え糖タンパク質と比較して、末端ガラクトース−α１，３−ガラクトースグリカンレベルが増大している前記治療用組換え糖タンパク質を産生する、請求項９に記載の単離された宿主細胞。
【請求項１１】
前記宿主細胞が、前記宿主細胞の親細胞によって生成される治療用組換え糖タンパク質と比較して、末端ガラクトース−α１，３−ガラクトースグリカンレベルがより低い前記治療用組換え糖タンパク質を産生する、請求項９に記載の単離された宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１０または請求項１１に記載の宿主細胞を、糖タンパク質を発現するのに十分な条件下で培養するステップを含んでなる、ＣＨＯ細胞内で産生された治療用組換え糖タンパク質のグリカン構造を調節する方法。
【請求項１３】
配列番号２、配列番号４もしくは配列番号７と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、またはその生物学的活性断片を含んでなる、単離ポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号２、配列番号４もしくは配列番号７、またはその生物学的活性断片と、１個以上かつ２０個未満のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含んでなる、単離ポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号２、配列番号４または配列番号７のアミノ酸配列を含んでなる、単離ポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１３、１４または１５に記載のポリペプチドと特異的に結合する、単離された抗体、またはその抗原結合性断片。
【請求項１７】
ＣＨＯ細胞集団からの核酸サンプルを、請求項１〜５の何れか一項に記載の核酸分子または請求項７に記載のオリゴヌクレオチドと接触せしめ、それにより前記ＣＨＯ細胞集団内のＧｇｔａ１発現または活性を検出するステップを含んでなる、ＣＨＯ細胞集団内でＧｇｔａ１発現または活性を検出する方法。
【請求項１８】
ＰＣＲを使用して、前記核酸サンプル中の核酸配列を増幅するステップを含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＣＨＯ細胞集団内のＧｇｔａ１発現レベルを定量するステップをさらに含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＣＨＯ細胞集団内のＧｇｔａ１発現レベルを、基準レベル、対照レベル、所定のレベルまたは第２のＣＨＯ細胞集団によって示されるレベルと比較するステップをさらに含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＣＨＯ細胞集団からのサンプルを請求項１３、１４もしくは１５に記載のポリペプチドと、または請求項１６に記載の抗体もしくはその断片と接触せしめ、それにより前記ＣＨＯ細胞集団内のＧｇｔａ１発現または活性を検出するステップを含んでなる、ＣＨＯ細胞集団内でＧｇｔａ１の発現または活性を検出する方法。
【請求項２２】
前記ＣＨＯ細胞集団内のＧｇｔａ１発現レベルを定量するステップをさらに含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＣＨＯ細胞集団内のＧｇｔａ１発現レベルを、基準レベル、対照レベル、所定のレベルまたは第２のＣＨＯ細胞集団によって示されるレベルと比較するステップをさらに含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
複数のアドレスを有する二次元配列であって、前記複数の各アドレスは、前記複数のアドレスと互いに位置的に区別でき、前記複数の各アドレスはユニークな捕捉プローブを有し、前記複数のアドレスの少なくとも１つは、請求項１〜５の何れか一項に記載の核酸分子または請求項７に記載のオリゴヌクレオチドを含んでなる捕捉プローブを有する、二次元配列。
【請求項２５】
複数のアドレスを有する二次元配列であって、前記複数の各アドレスは、前記複数のアドレスと互いに位置的に区別でき、前記複数の各アドレスはユニークな捕捉プローブを有し、前記複数のアドレスの少なくとも１つは、請求項１６に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含んでなる捕捉プローブを有する、二次元配列。
【請求項２６】
サンプルを請求項２４または２５の配列と接触せしめるステップを含んでなる、ＣＨＯ細胞からのサンプルを分析する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、その開示全体を参照によって本明細書に援用する、２００９年１１月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／２６０，２３２号明細書の優先権を主張する。３７ＣＦＲ１．５２（ｅ）（５）に従って、テキストファイル形態の配列表（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」と題され、２０１０年１１月１０日に作成され、４１キロバイト）は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００２】
末端ガラクトース−α１，３−ガラクトースグリカン（本明細書中でＧａｌ−α−Ｇａｌと称される）は、異種由来生物学的治療薬上に存在する場合のヒトにおける免疫原性から判断して、Ｎ−グリコシル化タンパク質に対する機能的に必然の修飾であり得る。内在性タンパク質上のこの炭水化物エピトープの存在は高度に種特異的なようであり、例えばブタ、マウス、およびラット中に検出されるが、霊長類には不在である。したがってエピトープは、特定生物（例えばマウスＮＳ０またはＳＰ／２細胞、遺伝子導入ブタ）に由来する細胞発現系において産生される組換え生物製剤上に存在し得る。モノクローナル抗体セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））は、マウス由来細胞系において産生されるこのような市販のタンパク質製剤の一例であり、Ｇａｌ−α−Ｇａｌ炭水化物エピトープを含有することも報告されている（非特許文献１）。Ｇａｌ−α１，３−Ｇａｌグリカンの酵素的生合成は、１，３グリコシルトランスフェラーゼ−１（本明細書中でＧｇｔａ１と称される）によるものとされている（非特許文献２；非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５８：１１０９−１１１７
【非特許文献２】Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １３：３２７−３３７
【非特許文献３】Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６５：６２２５−６２３４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、ＣＨＯ細胞がそれに由来するチャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）と、組換えタンパク質生成のために使用されるＣＨＯ細胞系との双方における、α−１，３グリコシルトランスフェラーゼ−１（Ｇｇａｔ１）遺伝子配列の発見に少なくとも部分的に基づく。したがって本発明は、発見された遺伝子に関連する核酸およびポリペプチド組成物、および関連ベクターと細胞（例えばＧｇｔａ１活性を低下させ、排除しまたは増大させるように遺伝子改変されたＣＨＯ細胞、およびこのような細胞の生成に有用なベクター）に関する。さらに本発明は、例えばＣＨＯ細胞をＧａｌ−α−Ｇａｌ構造産生能力についてスクリーニングするための、ＣＨＯ細胞内のＧｇｔａ１活性（Ｇｇｔａ１転写活性および／または酵素活性を含む）を検出する方法、または例えば治療用糖タンパク質産生のために使用される細胞であるＣＨＯ細胞内のＧｇｔａ１発現または活性を同定および定量化する方法などの、様々な方法における同定された配列の使用に関する。
【０００５】
本明細書で開示されるＧｇｔａ１配列を表１に列挙する。
【０００６】
【表１】
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【０００７】
したがって第１の態様では、本発明は、チャイニーズハムスターまたはＣＨＯ細胞のＧｇｔａ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または例えば本明細書に記載されるＧｇｔａ１活性などの１つ以上のＧｇｔａ１活性を有するその活性部分を含んでなる、単離された核酸分子を特徴とする。
【０００８】
一実施形態では、単離された核酸分子は、（ａ）配列番号２、または配列番号４または配列番号７のアミノ酸残基配列をコードする配列を有するＤＮＡ分子に対して、あるいは（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体に対して、少なくとも約７５％の配列同一性、または少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約８５％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９１％の配列同一性、または少なくとも約９２％の配列同一性、または少なくとも約９３％の配列同一性、または少なくとも約９４％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９６％の配列同一性、または少なくとも約９７％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列を含んでなる。単離された核酸分子は、１つ以上のＧｇｔａ１活性を有するポリペプチドをコードし得る。一実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号２、または配列番号４または配列番号７の配列をコードする。
【０００９】
一実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号１または配列番号３、配列番号５または配列番号６の配列と、少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９１％の配列同一性、または少なくとも約９２％の配列同一性、または少なくとも約９３％の配列同一性、または少なくとも約９４％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９６％の配列同一性、または少なくとも約９７％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。単離された核酸分子は、１つ以上のＧｇｔａ１活性を有するポリペプチドをコードし得る。
【００１０】
一実施形態では、単離された核酸分子は、高ストリンジェンシー条件下で、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号６のヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子と、ハイブリッド形成する。
【００１１】
一実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号１または配列番号３、配列番号５または配列番号６のヌクレオチド配列を含んでなる。
【００１２】
本発明の単離された核酸分子は、例えば発現されるＧｇｔａ１タンパク質をコードする天然ＣＨＯ核酸配列などの天然核酸分子に相当してもよい。いくつかの実施形態では、核酸分子は、核酸分子が天然であるかどうかに関わらず、１つ以上のＧｇｔａ１活性を有するポリペプチドをコードし得る。例えば単離された核酸分子は、チャイニーズハムスターまたはＣＨＯ細胞Ｇｇｔａ１配列の非天然変異型である。一実施形態では、単離された核酸分子は、アンチセンス核酸分子、ＲＮＡｉ分子（例えばｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）、リボザイム、またはペプチド核酸であり、アンチセンス分子は本明細書に記載されるＧｇｔａ１の産生を阻害する。
【００１３】
一実施形態では、本明細書に記載されるＧｇｔａ１ポリペプチドをコードする単離された核酸分子は、異種性アミノ酸配列に結合しており、例えばそれは例えばエピトープ標識されたＧｇｔａ１などのＧｇｔａ１融合タンパク質をコードする。
【００１４】
第２の態様では、本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号６の少なくとも１０個の連続するヌクレオチド（例えば少なくとも１２個、１５個、１８個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個もしくは５０個の連続するヌクレオチド）でありかつ５００個未満の連続するヌクレオチド（例えば４５０個、４００個、３５０個、３００個、２５０個、２００個、１８０個、１６０個、１４０個、１３０個、１２５個、１２０個、１００個、９０個、８０個、７５個、６０個、もしくは５０個未満の連続するヌクレオチド）、またはその各補体を含んでなるオリゴヌクレオチドを特徴とする。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが１０〜２００ヌクレオチド、長さが２０〜２００ヌクレオチド、長さが２０〜１００ヌクレオチド、長さが１５〜１００ヌクレオチド、長さが１０〜１００ヌクレオチド、長さが２０〜７５ヌクレオチド、長さが２５〜５０ヌクレオチド、長さが２０〜５０ヌクレオチド、長さが１５〜５０ヌクレオチド、長さが１０〜５０ヌクレオチド、長さが１０〜４０ヌクレオチド、長さが１０〜３０ヌクレオチド、または長さが１０〜２５ヌクレオチドである。このようなオリゴヌクレオチドは、（例えばＰＣＲ、ＤＮＡチップ、または遺伝子発現連続解析（ＳＡＧＥ）などの方法を使用して）ＣＨＯ細胞内のＧｇｔａ１発現を検出および／または測定する方法において、例えばプライマー、タグまたはプローブとして使用し得る。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、表２または表４に示す配列を有し、またはそれを含む。
【００１５】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは以下の特徴の１つ以上を有する。ＧＣ含量５０〜６５％、実質的二次構造の欠如、融点（Ｔｍ）５０〜６０℃、３塩基よりも長いＧＣ反復なし、末端にＧＣ対、イントロン−エクソン境界に広がる。
【００１６】
一実施形態では、本発明は、例えばＰＣＲにより、ＣＨＯ細胞に由来するＧｇｔａ１  ＤＮＡの少なくとも一部を共同して増幅できる、２つのこのようなオリゴヌクレオチドの組（例えばプライマー対）を特徴とする。プライマーの組の一具体例としては、Ｇｇｔａ１核酸分子コード鎖にアニールする順方向プライマー、およびＧｇｔａ１核酸分子の非コード鎖にアニールする逆方向プライマーが挙げられる。
【００１７】
別の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、調節要素と作動的に連結する（例えばベクターコンストラクト中のプロモーターと作動的に連結する）。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはセンス方向にある。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドはアンチセンス方向にある。
【００１８】
第３の態様では、本発明は、発現またはクローニングのために、例えばプロモーターなどの少なくとも１つの調節要素と作動的に連結する、本明細書に記載される核酸分子またはオリゴヌクレオチドの配列を含む、ベクター（例えばプラスミド、コスミド、ウィルス粒子またはファージ）などの核酸コンストラクトを特徴とする。ベクターは、エンハンサー、シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、および転写終結配列の１つ以上などの追加的要素を含んでもよい。
【００１９】
一実施形態では、ベクターは、宿主細胞（例えば原核生物（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））または真核細胞（例えばＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞））中における、本明細書に記載される、チャイニーズハムスターまたはＣＨＯ細胞Ｇｇｔａ１ポリペプチドの発現のために設計される。
【００２０】
一実施形態では、ベクターは、アンチセンス方向で発現ベクターにクローンされた、本発明のＤＮＡ分子を含む。
【００２１】
一実施形態では、ベクターは、宿主細胞のゲノムの特定部位に組換えされるように構成された、例えば宿主細胞内の内在性Ｇｇｔａ１遺伝子を修飾、中断またはノックアウトするように構成された、例えば本明細書に記載されるチャイニーズハムスターまたはＣＨＯ細胞Ｇｇｔａ１核酸分子などの、本明細書に記載される核酸分子を含有する。
【００２２】
第４の態様では、本発明は、本明細書に記載される核酸分子、オリゴヌクレオチド、または核酸コンストラクトを用いて形質移入された、単離された宿主細胞を特徴とする。宿主細胞は、原核生物（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））または真核生物（例えば植物細胞、酵母細胞またはＣＨＯなどの哺乳類細胞）であってもよい。一実施形態では宿主細胞はさらに遺伝子改変されて、治療用組換え糖タンパク質を発現する。
【００２３】
一実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載される核酸分子、オリゴヌクレオチド、または核酸コンストラクトを用いて形質移入されたＣＨＯ細胞（例えば本明細書に記載されるＧｇｔａ１−ａ、Ｇｇｔａ１−ｂまたはＧｇｔａ１−ｃコード配列を含むベクター）であり、ＣＨＯ細胞は、親ＣＨＯ細胞と比較して増大したレベルのＧｇｔａ１を発現する。このような実施形態では、宿主細胞は、親細胞と比較して、末端ガラクトース−α１，３−ガラクトースグリカンのレベルが増大している糖タンパク質（例えば治療用組換え糖タンパク質）を産生できてもよい。このような宿主細胞を用いて糖タンパク質を生成することで、末端ガラクトース−α１，３−ガラクトースグリカンレベルが増大している糖タンパク質（例えば治療用組換え糖タンパク質）を生成する方法もまた、本発明によって提供される。
【００２４】
別の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載される核酸分子、オリゴヌクレオチド、または核酸コンストラクトを用いて形質移入された（例えばＧｇｔａ１−ａ、Ｇｇｔａ１−ｂまたはＧｇｔａ１−ｃ  ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはノックアウトベクターを用いて形質移入された）ＣＨＯ細胞であり、ＣＨＯ細胞は、非形質転換ＣＨＯ細胞と比較して、本明細書に記載されるＧｇｔａ１の発現が低下しており、例えば宿主細胞は、Ｇｇｔａ１ノックダウンまたはノックアウト細胞である。このような実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞の親細胞と比較して、末端ガラクトース−α１，３−ガラクトースグリカンのレベルがより低い糖タンパク質（例えば治療用組換え糖タンパク質）を産生できてもよい。このような宿主細胞を用いて糖タンパク質を生成することで、末端ガラクトース−α１，３−ガラクトースグリカンのレベルがより低い糖タンパク質（例えば治療用組換え糖タンパク質）を生成する方法もまた、本発明によって提供される。
【００２５】
第５の態様では、本発明は、例えば治療用組換え糖タンパク質中に存在する末端ガラクトース−α１，３−ガラクトースグリカンレベルを調節するなど、例えば治療用組換え糖タンパク質などの糖タンパク質中のグリカン構造を調節する方法を提供する。本方法は、本明細書に記載される宿主細胞（例えばＧｇｔａ１形質移入、またはＧｇｔａ１ノックダウンまたはノックアウト宿主細胞）を糖タンパク質発現に適した条件下で培養するステップを含む。
【００２６】
第６の態様では、本発明は、本明細書に記載されるＧｇｔａ１のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、またはその活性断片を提供する。一実施形態では、ポリペプチドは、本明細書に記載される単離された核酸配列の何れかによってコードされるアミノ酸配列を含む。
【００２７】
特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４または配列番号７の配列を含んでなるアミノ酸配列を含む。
【００２８】
別の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４または配列番号７のアミノ酸残基配列と、少なくとも約９０％の配列同一性、例えば少なくとも約９１％の配列同一性、例えば少なくとも約９２％の配列同一性、例えば少なくとも約９３％の配列同一性、例えば少なくとも約９４％の配列同一性、例えば少なくとも約９５％の配列同一性、例えば少なくとも約９６％の配列同一性、例えば少なくとも約９７％の配列同一性、例えば少なくとも約９８％の配列同一性、例えば少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ポリペプチドは、１つ以上のＧｇｔａ１活性を有してもよい。
【００２９】
別の実施形態では、Ｇｇｔａ１ポリペプチド、またはその断片は、配列番号２、配列番号４または配列番号７の対応する配列と異なる。一実施形態では、それは、１個以上かつ２０個未満、１５個未満、１０個未満または５個未満のアミノ酸残基が異なる。別の実施形態では、それは配列番号２、配列番号４または配列番号７中の対応する配列と、１個以上かつ１０％未満または５％未満の残基が異なる。一実施形態では、差異は保存的置換を含む。別の実施形態では、差異は非保存的置換を含む。ポリペプチドは１つ以上のＧｇｔａ１活性を有してもよい。
【００３０】
一実施形態では、本明細書に記載されるＧｇｔａ１ポリペプチドは異種性アミノ酸配列に結合しており、例えばポリペプチドはＧｇｔａ１融合タンパク質であり、例えばエピトープ標識されたＧｇｔａ１である。
【００３１】
第７の態様では、本発明は、本明細書に記載されるＣＨＯ細胞またはチャイニーズハムスターＧｇｔａ１ポリペプチドと特異的に結合する、抗体またはその抗原結合性断片を提供する。任意選択により、抗体はモノクローナル抗体、機能性抗体断片（例えばＦａｂ断片）または一本鎖抗体である。
【００３２】
一実施形態では、抗体またはその機能性断片は、マウス、ラット、ウシまたはイヌの１種以上からの天然Ｇｇｔａ１よりも大きな結合親和力で、ＣＨＯ細胞またはチャイニーズハムスターＧｇｔａ１に結合する。例えば抗体またはその機能性断片は、マウス、ラット、ウシまたはイヌの１種以上からの天然Ｇｇｔａ１よりも２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％またはそれより大きな親和力で、ＣＨＯ細胞またはチャイニーズハムスターＧｇｔａ１に結合する。一実施形態では、抗体またはその機能性断片は、本明細書に記載されるＣＨＯ細胞またはチャイニーズハムスターＧｇｔａ１に結合し、マウス、ラット、ウシまたはイヌのうち１種以上からの天然Ｇｇｔａ１に結合しない。結合親和力は、例えば放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、またはカラム担体形態中の結合などの、当該技術分野で知られている方法によって測定され得る。解離は変性条件を増大させることで、または関連リガンドとの競合によって実施される。解離定数Ｋｄは、スキャッチャードプロットによって判定される。
【００３３】
第８の態様では、本発明は、ＣＨＯ細胞内でＧｇｔａ１発現および／または活性を検出し、任意選択により定量化する方法を特徴とする。
【００３４】
一実施形態では、本方法は、ＣＨＯ細胞集団からの核酸サンプルを、本明細書に記載されるチャイニーズハムスターまたはＣＨＯ細胞Ｇｇｔａ１オリゴヌクレオチドまたは単離された核酸分子と接触させて、ＣＨＯ集団内のＧｇｔａ１発現または活性レベルの値（例えば相対または絶対値）を得るステップを含む。一実施形態では、本方法として、ハイブリダイゼーション法（例えばサザンまたはノーザンブロット法）、原位置ハイブリダイゼーション（例えば蛍光原位置ハイブリダイゼーションまたはＦＩＳＨ）、アレイハイブリダイゼーション、ＰＣＲ（例えばＲＴ−ＰＣＲ、ｑＰＣＲ）分析、遺伝子発現連続解析（ＳＡＧＥ）、ＲＮＡａｓｅ保護、分枝ＤＮＡサンドイッチ核酸ハイブリダイゼーション（例えばＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ（登録商標）システム）における、本明細書に記載されるＧｇｔａ１プローブまたはプライマーまたは核酸分子の使用が挙げられる。一実施形態では、ＣＨＯ細胞は、治療用組換え糖タンパク質を発現する。このような方法を使用して、例えばＧｇｔａ１遺伝子の差次的発現についてＣＨＯ細胞クローンをスクリーニングし得る。
【００３５】
別の実施形態では、本方法は、ＣＨＯ細胞集団からのタンパク質サンプルを、本明細書に記載されるチャイニーズハムスターまたはＣＨＯ細胞Ｇｇｔａ１ポリペプチドまたは抗体と接触させて、ＣＨＯ集団中のＧｇｔａ１の存在、発現または活性レベルの値（例えば相対または絶対値）を得るステップを含む。一実施形態では、本方法として、例えば酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、免疫蛍光、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、ウエスタンブロット分析、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などの抗体ベースの検出法における、本明細書に記載されるＧｇｔａ１抗体またはその断片の使用が挙げられる。一実施形態では、ＣＨＯ細胞は、治療用組換え糖タンパク質を発現する。このような方法は、例えばＣＨＯ細胞クローンをＧｇｔａ１の示差的存在、発現または活性についてスクリーニングするのに使用できる。
【００３６】
一実施形態では、本方法は、定量的リアルタイムＰＣＲ反応（ｑＰＣＲ）を実施して、ＣＨＯ細胞調製品中のＧｇｔａ１発現を評価するステップを含む。一実施形態では、ｑＰＣＲ法は、本明細書に記載されるＧｇｔａ１オリゴヌクレオチドの一組を用い、例えば本明細書に記載されるプライマー対（例えば表２または表４に記載されるプライマー対）を用いる。
【００３７】
一実施形態では、ＣＨＯ集団内のＧｇｔａ１発現または活性のレベルについて得られた値を、例えば対照値、規定値、または第２のＣＨＯ細胞集団内のＧｇｔａ１発現または活性値などの基準値と比較する。例えば得られた値を、異なる培地調合物および／または規模などの、異なるバイオプロセス条件下で成長させたＣＨＯ細胞から得た値と比較してもよい。
【００３８】
第９の態様では、本発明は、ＣＨＯ細胞に由来するサンプルを評価する方法を特徴とする。本方法としては、例えば治療用組換え糖タンパク質を発現するＣＨＯ細胞などのＣＨＯ細胞に由来する核酸サンプルを提供するステップと、サンプルの遺伝子発現プロフィールを判定するステップが挙げられ、プロフィールとしては、ＣＨＯ細胞内におけるＧｇｔａ１の発現レベルを表す値、およびＣＨＯ細胞内における別の遺伝子の発現（例えば別の酵素）レベルを表す値が挙げられる。本方法は、サンプルを本明細書に記載される１つ以上のＧｇｔａ１核酸分子またはプローブまたはプライマーと接触させるステップを含んでもよい。本方法は、値またはプロフィール（すなわち複数の値）を、基準値または基準プロフィールと比較するステップをさらに含み得る。サンプルの遺伝子発現プロフィールは、本明細書に記載される方法の何れかによって（例えばサンプルから核酸を提供し、核酸を本明細書に記載されるＧｇｔａ１プローブを含む配列と接触させることにより）得られる。本方法を使用して、その他の遺伝子の発現または活性レベル中で、ＣＨＯ細胞内のＧｇｔａ１発現または活性レベルを判定し得る。
【００３９】
第１０の態様では、本発明は、複数アドレスを有する二次元配列を特徴とし、複数アドレスの各アドレスは位置的に互いに区別でき、複数アドレスの各アドレスは、例えば核酸またはペプチド配列または抗体などのユニークな捕捉プローブを有する。複数アドレスの少なくとも１つは、本明細書に記載されるＧｇｔａ１分子（例えば本明細書に記載されるＧｇｔａ−１、Ｇｇｔａ１−ｂまたはＧｇｔａ１−ｃ分子）を認識する捕捉プローブを有する。一実施形態では、捕捉プローブは、例えばＧｇｔａ１核酸配列に相補的なプローブなどの核酸である。別の実施形態では、捕捉プローブは、例えば本明細書に記載されるＧｇｔａ１ポリペプチドに対して特異的な抗体などの抗体である。サンプルを前述の配列と接触させ、サンプルと配列の結合を検出することで、サンプル（例えばＣＨＯ細胞からのサンプル）を分析する方法もまた特徴である。本発明のその他の徴群および利点は、以下の詳細な説明から、そして特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】チャイニーズハムスター脳（レーン３）、腎臓（レーン４）、卵巣（レーン５）、および脾臓（レーン６）から作成された、ｃＤＮＡプールからの増幅されたＧｇｔａ１ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動分離の写真である。レーン１および２はサイズ標準をｋＢで示す。ＤＮＡは、臭化エチジウム染色によって視覚化される。
【図２】ラット（ＮＭ＿１４５６７４、エクソン５および６欠失）、マウス（ＮＭ＿０１０２８３、全長）、ウシ（ＮＭ＿１７７５１１、全長）、イヌ（ＸＭ＿５４８４７８、全長）、チャイニーズハムスター卵巣（共通配列）、チャイニーズハムスター脾臓（共通配列）からのＧｇｔａ１、およびＣＨＯ細胞エクソン８および９のアミノ酸レベルにおける多重配列アラインメントである。ＮＣＢＩ登録番号を括弧内に記載する。
【図３Ａ−１】チャイニーズハムスター卵巣由来ｃＤＮＡからクローンされたＧｇｔａ１−ａの配列である。配列は１１１０塩基対（配列番号１）であり、３７０個のアミノ酸（配列番号２）で、予測分子量４４，００２ダルトンのタンパク質に翻訳される。
【図３Ａ−２】チャイニーズハムスター卵巣由来ｃＤＮＡからクローンされたＧｇｔａ１−ａの配列である。配列は１１１０塩基対（配列番号１）であり、３７０個のアミノ酸（配列番号２）で、予測分子量４４，００２ダルトンのタンパク質に翻訳される。
【図３Ｂ】チャイニーズハムスター卵巣由来ｃＤＮＡからクローンされたＧｇｔａ１−ａの配列である。配列は１１１０塩基対（配列番号１）であり、３７０個のアミノ酸（配列番号２）で、予測分子量４４，００２ダルトンのタンパク質に翻訳される。
【図４Ａ−１】チャイニーズハムスター由来由来（ｄｅｒｉｖｅｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ）ｃＤＮＡからクローンされたＧｇｔａ１−ｂの配列である。配列は１１１０塩基対（配列番号３）であり、３７０個のアミノ酸（配列番号４）で、予測分子量４４，０１６ダルトンのタンパク質に翻訳される。
【図４Ａ−２】チャイニーズハムスター由来由来（ｄｅｒｉｖｅｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ）ｃＤＮＡからクローンされたＧｇｔａ１−ｂの配列である。配列は１１１０塩基対（配列番号３）であり、３７０個のアミノ酸（配列番号４）で、予測分子量４４，０１６ダルトンのタンパク質に翻訳される。
【図４Ｂ】チャイニーズハムスター由来由来（ｄｅｒｉｖｅｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ）ｃＤＮＡからクローンされたＧｇｔａ１−ｂの配列である。配列は１１１０塩基対（配列番号３）であり、３７０個のアミノ酸（配列番号４）で、予測分子量４４，０１６ダルトンのタンパク質に翻訳される。
【図５Ａ−１】ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞系から増幅されたＧｇｔａ１ゲノム配列である。配列は、介在性イントロン（小文字）がある、エクソン８および９（大文字）からなる（配列番号５）。
【図５Ａ−２】ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞系から増幅されたＧｇｔａ１ゲノム配列である。配列は、介在性イントロン（小文字）がある、エクソン８および９（大文字）からなる（配列番号５）。
【図５Ｂ−１】ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞系から増幅されたＧｇｔａ１ゲノム配列である。配列は、介在性イントロン（小文字）がある、エクソン８および９（大文字）からなる（配列番号５）。
【図５Ｂ−２】ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞系から増幅されたＧｇｔａ１ゲノム配列である。配列は、介在性イントロン（小文字）がある、エクソン８および９（大文字）からなる（配列番号５）。
【図６−１】ＣＨＯ細胞系Ｇｇｔａ１エクソン８および９の翻訳されたアミノ酸配列である。配列は２７６個のアミノ酸（配列番号６）で、予測分子量３２，５９７ダルトンである。
【図６−２】ＣＨＯ細胞系Ｇｇｔａ１エクソン８および９の翻訳されたアミノ酸配列である。配列は２７６個のアミノ酸（配列番号６）で、予測分子量３２，５９７ダルトンである。
【図７】図７Ａは、ＣＨＯ細胞系クローン中におけるＧｇｔａ１遺伝子の差次的発現を評価するために、ｑＰＣＲによってスクリーニングされた選択クローンのＰＣＲサイクリングプロフィールを示す。図７Ｂは、プライマー特異性のアセスメントとしてのＴｍ分析を示す。
【図８】増幅されたＧｇｔａ１ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動分離の写真である。プライマー８６３および８３０を使用して、ＣＨＯ（ＤＨＦＲ−）細胞系（レーン２〜５）からのゲノムＤＮＡまたは同一細胞系に由来するｃＤＮＡ（レーン６および７）を増幅した。
【図９】増幅されたＧｇｔａ１ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動分離の写真である。２つのエクソン（エクソン８および９）にまたがり、発現遺伝子とゲノムコピーを識別するように設計された、Ｇｇｔａ１特異的プライマー８７５（順方向）および８５５（逆方向）を使用して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇを発現するＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞系の３つの異なる増幅クローンをプロファイルした。クローンを希釈によって単離し、メトトレキサートによる増幅がそれに続いた。Ｇｇｔａ１ＰＣＲ産物（ｃＤＮＡから特異的に増幅されたもの）の予期されるサイズは、３２４ｂｐである。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
組換え糖タンパク質上の末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基（Ｇａｌ−α−Ｇａｌ）の存在は、主にエピトープの免疫原性および（その結果としての）生物製剤開発および製造における調節的重要性の理由から、一般に重要な翻訳後の修飾に相当する。しかしＧｇｔａ１遺伝子または遺伝子産物の発現、あるいは酵素活性はいずれも、治療用生物製剤の商業生産のための歴史的に好ましい哺乳類の発現プラットフォームである、いかなるＣＨＯ細胞系中でも起きないことが報告されている。実のところ科学文献は逆を示唆し、すなわちチャイニーズハムスターゲノム中におけるＧｇｔａ１遺伝子の機能性コピー、または十分なレベルでのその発現のどちらかが欠けているために、ＣＨＯ細胞は末端Ｇａｌ−α−Ｇａｌ構造があるＮ−グリカンを生成できないようである（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６５：６２２５−６２３４３，４）；Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：７８１９−７８２２）。
【００４２】
ＣＨＯ細胞内で産生される糖タンパク質中の意外な末端Ｇａｌ−α−Ｇａｌ残基の存在については、特に本出願の譲受人に譲渡された国際出願整理番号ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３１６７８号明細書（国際公開第２０１０／０８５２５１号パンフレット）に記載される。本明細書に記載されるように、チャイニーズハムスターからのそしてＣＨＯ細胞からの１，３グリコシルトランスフェラーゼ−１（Ｇｇｔａ１）の同定およびクローニングは、生物学的製剤中のＧａｌ−α−Ｇａｌ含有グリカンを検出、測定、および調節するために、本明細書に記載される方法で使用される有益なツールを提供する。
【００４３】
定義
本明細書での用法では、「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、およびＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を含む。ＤＮＡまたはＲＮＡ類似体は、ヌクレオチド類似体から合成し得る。核酸分子は一本鎖または二本鎖であり得る。
【００４４】
「単離された核酸分子」または「精製された核酸分子」という用語は、天然核酸原料中に存在するその他の核酸分子から分離された核酸分子を含む。例えばゲノムＤＮＡに関して、「単離された」という用語は、それにゲノムＤＮＡが天然に結合している染色体から分離された核酸分子を含む。「単離された」核酸は、核酸がそれに由来する生物ゲノムＤＮＡ中で核酸の側面に天然で位置する配列（すなわち核酸の５’および／または３’末端に位置する配列）を含まないことが好ましい。例えば様々な実施形態では、単離された核酸分子は、核酸がそれに由来する細胞のゲノムＤＮＡ中の核酸分子側面に天然で位置する、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満の５’および／または３’ヌクレオチド配列を含有し得る。さらにｃＤＮＡ分子などの「単離された」核酸分子は、組換え技術によって生成される場合はその他の細胞物質または培地を実質的に含まず、または化学的に合成される場合は化学物質前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まないこともあり得る。
【００４５】
本明細書での用法では、「高ストリンジェンシー下でハイブリッド形成する」という用語は、ハイブリダイゼーション反応を実施する上での、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件について記述する。このような条件は、参照によって援用するＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（２００７），Ｕｎｉｔ  ６．３にある。水性および非水性方法についてはこの参考文献に記載され、どちらでも使用し得る。本明細書で言及される特定のハイブリダイゼーション条件は、次のとおりである。１）６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で約４５℃の後、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で少なくとも５０℃（洗浄温度は低ストリンジェンシー条件では５５℃に増大し得る）での２回の洗浄の低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、２）６×ＳＳＣ中で約４５℃の後、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６０℃の１回以上の洗浄の中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、３）６×ＳＳＣ中で約４５℃の後、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６５℃の１回以上の洗浄の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、そして４）非常に高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳで６５℃の後、０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで６５℃の１回以上の洗浄である。
【００４６】
本明細書での用法では、「天然」核酸分子は、自然界で生じるヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子を指す。例えば天然核酸分子は、野性型細胞によって発現される天然タンパク質をコードし得る。
【００４７】
本明細書での用法では、「遺伝子」および「組換え遺伝子」という用語は、Ｇｇｔａ１タンパク質をコードする少なくとも１つの読み取り枠を含む核酸分子を指す。遺伝子は、任意選択により、例えば制御配列およびイントロンなどの非コード配列をさらに含み得る。
【００４８】
「単離された」または「精製された」ポリペプチドまたはタンパク質は、タンパク質がそれに由来する細胞または組織原料からの、細胞物質またはその他の汚染タンパク質を実質的に含まず、または化学的に合成される場合は化学物質前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まない。「実質的に含まない」とは、Ｇｇｔａ１タンパク質の調製品が少なくとも５０重量％Ｇｇｔａ１タンパク質であることを意味する。好ましい実施形態では、Ｇｇｔａ１タンパク質調製品は（乾燥重量で）約３０％、２０％、１０％、より好ましくは５％未満の非Ｇｇｔａ１タンパク質（本明細書で「汚染タンパク質」としても言及される）、または化学物質前駆体または非Ｇｇｔａ１化学物質を有する。Ｇｇｔａ１タンパク質または生物学的に活性のその一部が組換え的に生成される場合、それはまた好ましくは実質的に培地を含まず、すなわち培地はタンパク質調製品体積の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、および最も好ましくは約５％未満に相当する。
【００４９】
「Ｇｇｔａ１ポリペプチド」は、本明細書での用法では、（１）配列番号２、４、または７の１つ以上に対して、少なくとも約９０％の全体的配列同一性を示し、（２）配列番号２、４、または７に見られる少なくとも１つの特徴的な配列要素を含み、および／または（３）配列番号２、４、または７のポリペプチドに見られる少なくとも１つの生物学的活性を共有する、ポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、Ｇｇｔａ１ポリペプチドは、配列番号２、４、または７の１つ以上に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％以上の全体的配列同一性を示す。いくつかの実施形態では、Ｇｇｔａ１ポリペプチドは、配列番号２、４、または７に見られる少なくとも１つの配列要素特徴的な配列要素（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を含み、また配列番号２、４、または７に対して、少なくとも約少なくとも約（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ａｂｏｕｔ  ａｔ  ｌｅａｓｔ  ａｂｏｕｔ）９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％またはそれ以上の全体的配列同一性もまた示す。いくつかの実施形態では、Ｇｇｔａ１ポリペプチドは、配列番号２、４、または７の長さの少なくとも約少なくとも約（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ａｂｏｕｔ  ａｔ  ｌｅａｓｔ  ａｂｏｕｔ）７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％以上の長さを有する。いくつかの実施形態では、Ｇｇｔａ１ポリペプチドは、配列番号２、４、または７の断片である。いくつかの実施形態（ｅｍｂｏｄｉｍｅｔｎｓ）では、Ｇｇｔａ１ポリペプチドは、配列番号２、４、または７の断片に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％またはそれ以上の同一性を示す。このようないくつかの実施形態では、断片は、アミノ酸が少なくとも約５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個またはそれ以上の長さである。
【００５０】
「保存的アミノ酸置換」は、その中でアミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。類似した側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーについては、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のあるアミノ酸が挙げられる。したがってＧｇｔａ１タンパク質中の予測される非必須アミノ酸残基は、好ましくは同一側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換される。代案として、別の実施形態では、飽和変異誘発などによって、Ｇｇｔａ１コード配列の全部または一部に沿って変異を無作為に導入し得て、得られた変異体をＧｇｔａ１活性についてスクリーニングし、活性を保持する変異体を同定し得る。変異誘発に続いて、コードされたタンパク質を組換え的に発現し得て、タンパク質活性を測定し得る。
【００５１】
「％配列同一性」とは、最大％配列同一性を達成するために配列を整列化して、必要ならばギャップを導入した後に、本明細書で同定された配列と比較して、参照配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドと同一である、候補配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドの百分率と定義される。（例えば最適アライメントのために、第１および第２のアミノ酸または核酸配列の片方または双方の中にギャップを導入することができ、比較目的では非相同的配列は無視し得る）。％配列同一性を判定する目的のアライメントは、例えばＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当該技術分野の技術範囲内である様々なやり方で達成し得る。当業者は、比較される配列全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要なあらゆるアルゴリズムをはじめとする、アライメントを測定するための適切なパラメータを判定し得る。一実施形態では、比較目的で整列化された参照配列の長さは、参照配列長さの少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％である。次に対応するアミノ酸位置の、またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められる場合、分子はその位置で同一である。
【００５２】
「特徴的な配列要素」は、本明細書の用法では、そのアイデンティティと互いの相対位置が、特定のポリペプチドに、関心のある１つ以上の活性または特徴を与えるアミノ酸の組を指す。いくつかの実施形態では、特徴的な配列要素は、特定のポリペプチドにユニークなものであり、それは活性または特徴を欠いている既知のポリペプチドには見られない。いくつかの実施形態では、特徴的な配列要素は、少なくとも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個またはそれ以上のアミノ酸を含んでなる。いくつかの実施形態では、特徴的な配列要素に関与する一部または全部のアミノ酸は互いに隣接する。いくつかの実施形態では、特徴的な配列要素内の特定残基は、線形順序で１つ以上のその他の残基から離れていてもよい。いくつかの実施形態では、特徴的な配列要素は、ポリペプチド鎖が折りたたまれた際に、三次元空間で互いに近くに位置する残基を含んでなる。
【００５３】
「細胞調製品」は、本明細書での用法では、生体外細胞調製品を指す。多細胞生物（例えば植物および動物）からの細胞の場合、精製された細胞調製品は、無処置生物全体でなく、生物から得られた細胞のサブセットである。単細胞微生物（例えば培養細胞および微生物細胞）の場合、それは対象細胞の少なくとも１０％、およびより好ましくは５０％の調製品からなる。
【００５４】
本発明の様々な態様について、下でさらに詳細に記述する。
【００５５】
Ｇｇｔａ１核酸分子
一態様では、本発明は、本明細書に記載される単離または精製されたＧｇｔａ１核酸分子を提供する。提供される核酸分子は、本明細書に記載されるＧｇｔａ１ポリペプチド、例えば全長Ｇｇｔａ１タンパク質またはその活性断片（例えば触媒的に活性なその断片）をコードしてもよい。機能性タンパク質をコードしないかもしれないが、例えば内在性Ｇｇｔａ１遺伝子の配列をノックアウトまたは修飾する、例えば内在性チャイニーズハムスターまたはＣＨＯ細胞Ｇｇｔａ１遺伝子を標的とするベクターを構築するのに使用し得る、Ｇｇｔａ１核酸分子またはその断片もまた含まれる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、提供されるＧｇｔａ１核酸分子は、チャイニーズハムスターまたはＣＨＯ細胞に由来する。いくつかの実施形態では、提供されるＧｇｔａ１核酸分子は、チャイニーズハムスターまたはＣＨＯ細胞に由来するＧｇｔａ１核酸分子のそれと同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、提供されるＧｇｔａ１核酸分子は、チャイニーズハムスターまたはＣＨＯ細胞に由来するＧｇｔａ１ポリペプチドをコードする。
【００５７】
一実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１、３、５または６のヌクレオチド配列、またはこれらのヌクレオチド配列の何れかの一部を有する。いくつかの実施形態では、核酸分子は、コード配列のみを含む。別の実施形態では、核酸分子は、５’未翻訳配列またはイントロン配列などの非コード配列を含む。センスおよびアンチセンス配列の双方が含まれる。
【００５８】
プローブ、タグ、またはプライマーとして使用して、例えばＧｇｔａ１発現を検出および／または定量化するのに適した、オリゴヌクレオチドまたは核酸分子断片もまた含まれる。このようなオリゴヌクレオチドまたは断片は、配列番号１、３、５または６の少なくとも約１０個、１２個または１５個、約２０個または２５個、または約３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、または７５個の連続するヌクレオチドであってもよい。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが約５００、４００、３００、２００、１５０、１２０、または１００ヌクレオチド未満である。一実施形態では、プローブまたはプライマーは、例えば本明細書に記載される固体担体などの固体担体に付着する。別の実施形態では、例えばＰＣＲ反応で使用するのに適したプライマーなどのプライマーの組が提供され、それは例えば本明細書に記載されるドメイン、領域、部位またはその他の配列などの、Ｇｇｔａ１配列の選択された領域を増幅するのに使用し得る。プライマーは、長さが少なくとも５、１０、または５０塩基対であってもよく、長さが１００塩基対未満、または２００塩基対未満であってもよい。プライマーは、本明細書で開示される配列と、または天然変異型と、同一であるか、または塩基が１個異なるべきである。例えば本明細書に記載されるＧｇｔａ１配列の全部または一部を増幅するのに適したプライマーが、表２および表４で明らかにされる。一実施形態では、プライマーのキットは、コード鎖をアニールする順方向プライマー、および配列番号１、３、５または６の非コード鎖をアニールする逆方向プライマーを含む。
【００５９】
本明細書に記載される核酸オリゴヌクレオチド、例えばプローブ、タグまたはプライマーは標識し得る。典型的には、このような標識は、化学発光、蛍光性、放射性、または比色分析標識である。
【００６０】
本発明の核酸は、組換え的に生成されてもよく、または合成的に生成されてもよい。
【００６１】
Ｇｇｔａ１核酸変異体：
本発明は、本明細書で配列番号１、３、５または６として開示されるヌクレオチド配列と異なる核酸分子を包含する。例えば本発明の単離された核酸分子は、例えば特定レベルの配列同一性によって、または高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする能力によって関連性があるなど、配列番号１、３、５または６に、またはこれらのヌクレオチド配列の何れかの一部に関連性のある配列を有し得る。本発明の核酸は天然配列（例えば天然対立遺伝子変異体または突然変異体の配列）を有してもよく、またはそれは非天然配列を有してもよい。一実施形態では、差異は例えば遺伝コードの縮重に起因し得る（そして本明細書で開示されるヌクレオチド配列によってコードされるものと同一のＧｇｔａ１タンパク質をコードする核酸をもたらす）。本発明者の核酸は、特定の発現系にとって好ましい、または好ましくない、コドンを有するように選択し得る。例えば核酸は、その中で例えば少なくとも１０％、または２０％のコドンなどの少なくとも１つのコドンが、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、ヒト、昆虫、またはＣＨＯ細胞などの特定のシステム中での発現のために、配列が最適化されるように改変されているものであり得る。
【００６２】
核酸変異体は、対立遺伝子変異体（同一遺伝子座）、相同体（異なる遺伝子座）など天然であることができ、または非天然であることができる。非天然変異体は、ポリヌクレオチド、細胞、または生物に適用されるものをはじめとする、変異誘発技術によって作成し得る。変異体は、ヌクレオチドの置換、欠失、反転、および挿入を含有し得る。変異はコード領域と非コード領域の片方または双方で起こり得る。変異は、保存的および非保存的アミノ酸置換の双方を生じ得る（コード生成物で比較される）。核酸修飾および変異誘発技術は、当該技術分野で知られている。
【００６３】
例えばＣＨＯ  Ｇｇｔａ１などのＧｇｔａ１の対立遺伝子変異体は、機能性および非機能性タンパク質の双方を含む。機能性対立遺伝子変異体は、酵素機能を提供する能力を保持する、Ｇｇｔａ１タンパク質の変異体をコードする天然ヌクレオチド配列である。機能性対立遺伝子変異体は、典型的には配列番号２、４または７の１つ以上のアミノ酸の保存的置換、またはタンパク質の非重要領域内の重大でない残基の置換、欠失または挿入を含有する。非機能性対立遺伝子変異体は、酵素的機能を保存しないＧｇｔａ１ポリペプチドをコードする天然ヌクレオチド配列変異体である。非機能性対立遺伝子変異体は、典型的には配列番号２、４または７のアミノ酸配列の非保存的置換、欠失、または挿入、または早発性トランケーションを含有し、またはタンパク質の重要残基または重要領域内の置換、挿入、または欠失を含有する。
【００６４】
Ｇｇｔａ１アンチセンス分子：
本明細書に記載されるチャイニーズハムスターまたはＣＨＯ細胞Ｇｇｔａ１に対してアンチセンスである単離された核酸分子もまた、本発明に含まれる。アンチセンス作用因子の主要な種類は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）、リボザイム、ＤＮＡザイム、およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）である。このような分子を、Ｇｇｔａ１活性を例えばＣＨＯ細胞内で阻害するための方法で使用し得る。「アンチセンス」核酸は、標的核酸に相補的なヌクレオチド配列を有する。アンチセンス核酸は、それがＧｇｔａ１  ｍＲＮＡの全コード領域に相補的であるように設計し得るが、より好ましくは、それはＧｇｔａ１  ｍＲＮＡのコードまたは非コード領域の一部のみに対してアンチセンスである、オリゴヌクレオチドである。例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば関心のある標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０〜＋１０領域などの、Ｇｇｔａ１  ｍＲＮＡの翻訳開始部位周囲の領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが、例えば約７、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０ヌクレオチド以上であり得る。アンチセンス分子は、本明細書に記載されるＧｇｔａ１産生を阻害する。
【００６５】
本発明のアンチセンス核酸は、当該技術分野で知られている手順を使用して、化学合成および酵素的連結反応を使用して構築し得る。例えばアンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然ヌクレオチドを使用して、または分子の生物学的安定性を増大させ、またはアンチセンスおよびセンス核酸間に形成された二本鎖の物理的安定性を増大させるように設計された様々に修飾されたヌクレオチドを使用して、化学的に合成し得て、例えばホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用し得る。アンチセンス核酸はまた、その中に核酸がアンチセンス方向にサブクローニングされた発現ベクターを使用して、生物学的に生成し得る。アンチセンス核酸分子は、本明細書に記載されるベクターを使用して細胞に送達し得る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、その中にアンチセンス核酸分子が配置されるベクターコンストラクトは、強力なｐｏｌ  ＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの制御下にあり得る。
【００６６】
アンチセンス分子を作成して使用し、生物学的活性を調節する方法については当該技術分野で知られており、例えばＰａｎ  ａｎｄ  Ｃｌａｗｓｏｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ（２００６）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．９８（１）：１４−３５；Ｓｉｏｕｄ  ａｎｄ  Ｉｖｅｒｓｅｎ，  Ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ，ＤＮＡｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ａｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（２００５）Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ６（６）：６４７−５３；Ｂｈｉｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｏｔｈｅｒｓ  ｉｎ  ａｒｍｓ：ＤＮＡ  ｅｎｚｙｍｅｓ，ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ，ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｗａｖｅ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（２００７）Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１７１（４）：１０７９−８８を参照されたい。
【００６７】
Ｇｇｔａ１ポリペプチド
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される（ｄｅｓｃｒｉｂｅ  ｄｈｅｒｅｉｎ）単離されたＧｇｔａ１ポリペプチドまたはタンパク質（またはその生物学的に活性の断片）を特徴とする。典型的には、Ｇｇｔａ１タンパク質の生物学的に活性の断片は、以下の特徴の１つ以上を有する。それはＧａｌ−α１，３−Ｇａｌグリカンの合成を触媒する能力を有する。それはＵＤＰ−Ｇａｌを用いて、Ｇａｌ−α−Ｇａｌ構造およびＵＤＰを生じるように、Ｇａｌを含有する既存のＮ連結グリカン上にガラクトース部分を転移する。それはＵＤＰ−Ｇａｌを使用して、Ｇａｌ−α−Ｇａｌ構造およびＵＤＰを生じるようにＧａｌを含有する既存のＯ連結グリカン上にガラクトース部分を転移する。それはＵＤＰ−Ｇａｌを使用して、Ｇａｌ−α−Ｇａｌ構造およびＵＤＰを生じるように、Ｇａｌを含有する既存の糖脂質上にガラクトース部分を転移する。ＵＤＰ−Ｇａｌおよびガラクトース末端グリカンに結合する。Ｇａｌ−α−Ｇａｌを含有する構造に結合する。ＵＤＰ−ＧａｌをＧａｌに加水分解する。真核細胞に形質移入され発現されるとゴルジ体領域に限局化する。チャイニーズハムスター特異的またはＣＨＯ細胞特異的抗Ｇｇｔａ１抗体に結合する。化学的に修飾されたＵＤＰ−Ｇａｌ類似体（例えば３Ｈ、Ｃ１４，３３Ｐ、３２Ｐなどで放射化学標識されたチオ糖、トリニトロフェニル、２デオキシ、２アジド）を利用して、ガラクトース部分を既存のＮ連結またはＯ連結グリカン上に転移し得る。
【００６８】
Ｇｇｔａ１ポリペプチドまたはタンパク質（またはその断片）は、標準タンパク質精製技術を使用して細胞または組織原料から単離し得る。いくつかの実施形態では、Ｇｇｔａ１ポリペプチドまたはタンパク質は、チャイニーズハムスターまたはＣＨＯ細胞から単離される。Ｇｇｔａ１ポリペプチドまたはタンパク質（またはその断片）は、組換えＤＮＡ技術によって生成され、または化学的に合成される得る。
【００６９】
本発明のポリペプチドは、同義遺伝子、代案の転写事象、代案のＲＮＡスプライシング事象、および代案の翻訳および翻訳後事象の存在の結果として発生したものを含む。ポリペプチドは、天然細胞内で発現されたポリペプチドが発現された場合に（ｗｈｅｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）存在するのと実質的に同一の翻訳後修飾をもたらす、例えば培養細胞などのシステム中で発現され得て、またはポリペプチドは、天然細胞内で発現された場合に存在する例えばグリコシル化または切断などの翻訳後修飾の変更または省略をもたらすシステム中で発現され得る。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本発明のＧｇｔａ１ポリペプチドは、配列番号２、４または７の配列またはその機能性断片を有する。その他の実施形態としては、配列番号２、４または７と異なるアミノ酸残基を、少なくとも１個かつ１０％以下で含有するタンパク質が挙げられる。差異は、活性にとって必須でないアミノ酸残基中にあることもできる。いくつかの実施形態では、差異は保存的置換、または非必須残基の差異または変化である。特定の％配列同一性によって、配列番号２、４または７と高度に関連性のあるポリペプチド配列もまた、含まれる。
【００７１】
本発明は、Ｇｇｔａ１キメラまたは融合タンパク質を含む。本明細書での用法では、Ｇｇｔａ１「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非Ｇｇｔａ１ポリペプチドに結合しているＧｇｔａ１ポリペプチドを含む。非Ｇｇｔａ１ポリペプチドは、Ｇｇｔａ１ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合し得て、または内的に融合し得る。一例では融合タンパク質は、リガンドに対する高親和性を有する部分を包含し得る。例えば融合タンパク質は、その中でＧｇｔａ１配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合する、ＧＳＴ−Ｇｇｔａ１融合タンパク質であり得る。このような融合タンパク質は、組換えＧｇｔａ１の精製を促進し得る。融合部分（例えばＧＳＴポリペプチド）をコードする発現ベクターは、市販されている。Ｇｇｔａ１をコードする核酸は、融合部分がインフレームでＧｇｔａ１タンパク質と連結されるように、このような発現ベクターにクローンし得る。
【００７２】
代案としては、融合タンパク質は、Ｎ末端に異種性シグナル配列を含有するＧｇｔａ１タンパク質であり得る。特定の宿主細胞（例えば哺乳類の宿主細胞）では、Ｇｇｔａ１の発現および／または分泌は、異種性シグナル配列の使用を通じて増大させ得る。
【００７３】
融合タンパク質は、例えばＩｇＧ定常部、またはヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質の全部または一部を包含し得る。
【００７４】
Ｇｇｔａ１ポリペプチドの変異体：
別の態様では、本発明は、例えば作動薬（模倣剤）としてまたは拮抗薬として機能する、Ｇｇｔａ１ポリペプチドの変異体もまた特徴とする。Ｇｇｔａ１タンパク質の変異体は、例えば配列の離散点突然変異、挿入または欠失、あるいはＧｇｔａ１タンパク質のトランケーションなどの変異誘発によって生成し得る。Ｇｇｔａ１タンパク質の作動薬は、Ｇｇｔａ１タンパク質の天然形態と実質的に同一の、またはその部分集合の生物学的活性を保持し得る。Ｇｇｔａ１タンパク質の拮抗薬は、例えばＧｇｔａ１タンパク質のＧｇｔａ１媒介活性を競合的に調節することで、天然形態のＧｇｔａ１タンパク質の活性の１つ以上を阻害し得る。
【００７５】
いくつかの実施形態では、Ｇｇｔａ１ポリペプチドの変異体は、「親」Ｇｇｔａ１ポリペプチド（または変異体Ｇｇｔａ１ポリペプチド）のアミノ酸配列を共有するが、親ポリペプチドと比較して１つ以上の共有結合の修飾を含む。例えばいくつかの実施形態では、変異体は、ＰＥＧ化され、グリコシル化され、リン酸化される。
【００７６】
Ｇｇｔａ１タンパク質の変異体は、例えばＧｇｔａ１タンパク質のトランケーション変異体などの変異体のコンビナトリアルライブラリーを、作動薬または拮抗薬活性についてスクリーニングすることで同定し得る。
【００７７】
Ｇｇｔａ１ポリペプチドのようなＧｇｔａ１ポリペプチドの変異体は、融合タンパク質として生成されてもよい。
【００７８】
Ｇｇｔａ１抗体および抗体の生成
別の態様では、本発明は、本明細書に記載されるようなＧｇｔａ１ポリペプチド（および／またはＧｇｔａ１ポリペプチド変異体）と特異的に結合する抗体を提供する。本発明はまた、このような抗体を生成する方法も提供する。「抗体」という用語は、チャイニーズハムスターまたはＣＨＯ  Ｇｇｔａ１抗原と結合できる、少なくとも１つの免疫グロブリン可変領域または免疫グロブリン可変領域配列を含むタンパク質を指す。例えば抗体は、重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書でＶＨと略記する）、および軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書でＶＬと略記する）を包含し得る。別の例では、抗体は、２本の重（Ｈ）鎖可変領域および２本の軽（Ｌ）鎖可変領域を含む。したがって「抗体」という用語は、ポリクローナル、単一特異性、モノクローナル、一価、キメラ、ヒト化、ヒト、二重特異性、およびヘテロ共役抗体、ならびにそれらの抗原結合性断片を包含する。
【００７９】
全長抗体の「抗原結合性断片」という用語は、本明細書での用法では、関心のある標的と特異的に結合する能力を保持する、全長抗体の１つ以上の断片を指す。このような断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域のジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片、および（ｖｉ）機能性を保持する単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。
【００８０】
（変異体をはじめとする）単離されたＧｇｔａ１タンパク質、またはその抗原性断片は、このような抗体を産生、スクリーニングまたは選択するための抗原として使用し得る。抗体およびその抗原結合性断片は、従来のハイブリドーマ技術、組換え技術、コンビナトリアル方法、ファージディスプレイ技術、および当業者に知られているその他の技術をはじめとする、あらゆる適切な技術を使用して得られる。例えばＡｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｂｅｎｎｙ  Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，Ｅｄ．（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００３）；Ｍａｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  Ｇａｒｙ  Ｈｏｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｍａｔｔｈｅｗ  Ｋａｓｅｒ，Ｅｄｓ．（ＣＲＣ，２００６）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ｐｈｉｌｉｐｐａ  Ｏｂｒｉｅｎ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔ  Ａｉｔｋｅｎ，Ｅｄｓ．（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍａｈｅｒ  Ａｌｂｉｔａｒ，Ｅｄ．（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００７）を参照されたい。
【００８１】
本発明の抗体は、第２の機能性部分と共役し得て、例えば抗体は、例えば蛍光性標識、放射性標識、造影剤などの標識と共役し得る。
【００８２】
いくつかの実施形態では、タンパク質の存在、レベル、存在量または発現パターンを検出して任意選択により測定するために、抗Ｇｇｔａ１抗体を使用して、（例えば細胞溶解産物または細胞上清中の）Ｇｇｔａ１ポリペプチドを検出し得る。検出は、抗体を検出可能な物質（すなわち抗体標識）にカップリングする（すなわち物理的に連結する）ことで促進し得る。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光性材料、発光材料、生物発光材料、および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β（．ｂｅｔａ．）ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる。適切な蛍光性材料の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられる。発光材料の一例としては、ルミノールが挙げられる。生物発光材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられる。
【００８３】
組換え発現ベクター
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される核酸を含有するベクター（例えば発現ベクター、ノックアウトベクター、またはアンチセンス配列を駆動するベクター）を含む。本明細書での用法では、「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送できる核酸分子を指し、プラスミド、コスミドまたはウィルスベクターを包含し得る。ベクターは自律複製でき、またはそれは宿主ＤＮＡに組み込まれ得る。
【００８４】
ベクターは、宿主細胞内の核酸の発現に適した形態で、チャイニーズハムスターまたはＣＨＯ細胞Ｇｇｔａ１核酸を包含し得る。好ましくは組換え発現ベクターは、発現される核酸配列と作動可能なように結合している、１つ以上の制御配列を含む。「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー、およびその他の発現制御要素（例えばポリアデニル化シグナル）を含む。制御配列としては、ヌクレオチド配列、ならびに組織特異的制御および／または誘導配列の構成的発現を誘導するものが挙げられる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベルなどの要因に左右され得る。本発明の発現ベクターは宿主細胞内に導入され得て、その結果、本明細書に記載される核酸によってコードされる融合タンパク質またはポリペプチドをはじめとする、タンパク質またはポリペプチドが生成される（例えばＧｇｔａ１タンパク質、Ｇｇｔａ１タンパク質の変異型、融合タンパク質など）。
【００８５】
本発明の組換え発現ベクターは、原核または真核細胞内のＧｇｔａ１ポリペプチド発現のために設計し得る。例えば本発明のポリペプチドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（例えばバキュロウィルス発現ベクターを使用）、酵母細胞、または好ましくはＣＨＯ細胞である哺乳類細胞内で発現され得る。哺乳類細胞内で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、ウィルス性調節要素によって提供され得る。例えば通常使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウィルス２、サイトメガロウィルス、およびシミアンウィルス４０に由来する。
【００８６】
原核生物中におけるタンパク質の発現は、ほとんどの場合、融合タンパク質または非融合タンパク質のどちらかの発現を誘導する構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で実施される。融合ベクターは、いくつかのアミノ酸を、その中でコードされるタンパク質に、通常は組換えタンパク質のアミノ末端で付加する。このような融合ベクターは、典型的には次の３つの目的を果たす。１）組換えタンパク質の発現を増大させ、２）組換えタンパク質の溶解度を上昇させ、３）親和性精製においてリガンドとして作用することで、組換えタンパク質の精製を助ける。頻繁に、タンパク質分解的切断部位が、融合部分と組換えタンパク質との接合部に導入されて、融合タンパク質の精製に引き続いて、融合部分から組換えタンパク質を分離できるようにする。このような酵素、およびそれらの同族の認識配列としては、因子Ｘａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。典型的な融合発現ベクターとしては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはタンパク質Ａをそれぞれ標的組換えタンパク質に融合させる、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）、およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。精製された融合タンパク質はＧｇｔａ１活性試験で使用し得て（例えば直接アッセイまたは競合アッセイ）、または抗体に対して特異的なＧｇｔａ１タンパク質を作成するのに使用し得る。
【００８７】
別の実施形態では、プロモーターは、例えばステロイドホルモンにより、ポリペプチドホルモンにより（例えば情報伝達経路の手段による）、または異種ポリペプチド（例えばテトラサイクリン誘導系、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，ＣＡ．からの「Ｔｅｔ−Ｏｎ」および「Ｔｅｔ−Ｏｆｆ」により調節されるプロモーターなどの誘導性プロモーターである。
【００８８】
本発明は、発現ベクターにアンチセンス方向でクローンされた本発明のＤＮＡ分子を含んでなる、組換え発現ベクターをさらに提供する。アンチセンス方向でクローンされた核酸と作動可能なように結合している制御配列（例えばウィルスプロモーターおよび／またはエンハンサー）を選択し得て、それは多様な細胞型中におけるアンチセンスＲＮＡの構成的、組織特異的または細胞型特異的発現を誘導する。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウィルスの形態であり得る。
【００８９】
本発明の別の態様は、例えば本明細書に記載されるチャイニーズハムスターまたはＣＨＯ細胞Ｇｇｔａ１核酸分子などの、本明細書に記載される核酸分子を含有するベクターを提供し、それは宿主細胞ゲノムの特異的部位に相同的に組換えられるように構成され、例えば宿主細胞内の内在性Ｇｇｔａ１遺伝子を修飾、中断またはノックアウトするように構成される。
【００９０】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換または形質移入技術を通じて宿主細胞に導入され得る。本明細書での用法では、「形質転換」および「形質移入」という用語は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介形質移入、リポフェクション、または電気穿孔をはじめとする、外来性核酸（例えばＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための、多様な当該技術分野において承認されている技術を指すことが意図される。
【００９１】
代案として、例えばＴ７プロモーター制御配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して、組換え発現ベクターを生体外転写および翻訳し得る。
【００９２】
核酸を含むベクターを作成して使用する方法は本明細書に記載され、当該技術分野で知られている。例えば本方法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００７，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｐｒｉｎｔ  ＩＳＳＮ：１９３４−３６３９）で提供される。
【００９３】
宿主細胞／遺伝子改変細胞
宿主細胞（例えば本明細書に記載される何れかのベクターを含有する宿主細胞）は、あらゆる原核のまたは真核細胞であり得る。例えばＧｇｔａ１タンパク質は、細菌細胞（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）など）、植物細胞、昆虫細胞、酵母または哺乳類細胞（ＣＨＯ細胞など）内で発現され得る。その他の適切な宿主細胞は、当業者に知られている。
【００９４】
本発明の単離された細胞は、親細胞と比較して、増大したレベルのチャイニーズハムスターまたはＣＨＯ細胞Ｇｇｔａ１を発現するように、遺伝子改変された細胞であり得る。したがって本発明はまた、本発明の宿主細胞を使用して、Ｇｇｔａ１タンパク質を生成する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、Ｇｇｔａ１タンパク質が産生されるように、適切な培地内で、（その中にＧｇｔａ１タンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入されている）本発明の宿主細胞を培養するステップを含む。別の実施形態では、本方法は、培地または宿主細胞から、Ｇｇｔａ１タンパク質を単離するステップをさらに含む。
【００９５】
別の態様では、本発明は、チャイニーズハムスターまたはＣＨＯ細胞Ｇｇｔａ１導入遺伝子を含む、さもなければＧｇｔａ１を誤発現する、細胞または精製された細胞調製品を特徴とする。例えば本発明の単離された細胞は、親細胞よりも低レベルのＧｇｔａ１を発現するように遺伝子改変された細胞（例えばＣＨＯ細胞）であり、例えば細胞はＧｇｔａ１ノックアウトまたはノックダウンＣＨＯ細胞である。内在性タンパク質の発現を低減または抑制するためのノックアウトまたはノックダウン細胞の作成は、既知の技術である。例えばＣＨＯノックアウト細胞については、最近、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ  ８７：６１４−６２２に記載されている。
【００９６】
細胞調製品は、例えばハムスター由来、マウスまたはラット細胞などの齧歯類細胞、ウサギ細胞、またはブタ細胞などの単離されたヒトまたは非ヒト細胞、あるいは例えばＣＨＯ細胞系などの細胞系からなり得る。本発明の宿主細胞として有用なＣＨＯ細胞としては、ＣＨＯ  Ｋ１（ＡＴＣＣＣＣＬ−６１）、ＣＨＯ  ｐｒｏ３−、ＣＨＯＤＧ４４、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ  Ｐ１２またはｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞系ＤＵＫ−ＢＩＩをはじめとする、あらゆるＣＨＯ株の細胞が挙げられる（Ｃｈａｓｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ７７，１９８０，４２１６−４２２０）。
【００９７】
本発明の宿主細胞を作成して使用する方法、そしてこのような宿主細胞内で治療用糖タンパク質を産生する方法は、当該技術分野で知られている。例えば本方法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （２００７，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｐｒｉｎｔ  ＩＳＳＮ：１９３４−２５００）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｐｒｉｎｔ  ＩＳＳＮ：１９３４−３６５５）；Ｗｕｒｍ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２２：１３９３−１３９８；Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｍａｌｅｓ  ａｎｄ  Ｊａｍｅｓ，ｅｄｓ．（２００５，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ−１０：１５８８２９３９０４）で提供される。
【００９８】
Ｇｇｔａ１発現または活性を検出する方法
Ｎ−グリカンへのＧａｌ−α−Ｇａｌエピトープの酵素的付加に関与する、α−１，３グリコシルトランスフェラーゼ−１（Ｇｇｔａ１）の発現および／または活性をモニターする能力は、特定の細胞系またはクローン集団におけるエピトープの存在可能性を予測する、有益なツールである。したがって本発明は、ＣＨＯ細胞内のＧｇｔａ１発現を評価する方法もまた特徴とする。本方法は、ＣＨＯ細胞集団からのサンプルを提供するステップと、サンプルを本明細書に記載されるＧｇｔａ１核酸または抗体と接触させるステップを含む。
【００９９】
これらの方法を使用して、背景またはクローン表現型が潜在的に異なる細胞内における、相対Ｇｇｔａ１発現をプロファイルし得る。同様に、それを使用して、このような細胞を培地配合および／または規模などの異なるバイオプロセス下で培養した場合における、遺伝子発現の変化を評価し得る。例えばこのような方法を使用して、治療用糖タンパク質を発現または産生するＣＨＯ細胞集団内における、Ｇｇｔａ１活性またはＧａｌ−α−Ｇａｌ存在またはレベルを評価し得る。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞集団は例えば商業的バイオリアクターなどのバイオリアクター内の集団である。このような方法を使用して、例えば製造工程中にＧｇｔａ１発現をモニターし得る。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞集団は、Ｇｇｔａ１活性についてスクリーニングされた複数のＣＨＯ細胞集団の１つである。スクリーニングされた複数のＣＨＯ細胞は、多様に異なっていてもよく、例えばそれらは、遺伝的背景、成長条件などが異なってもよい。このようなスクリーニング法では、ＣＨＯ細胞は、Ｇｔａ１活性レベルに基づいて選択され得て、例えば特定の治療的糖タンパク質を産生する適切な宿主として選択される。評価されるＣＨＯ細胞内のＧｇｔａ１活性は、例えば対照レベル、所定のレベル、または第２のＣＨＯ細胞集団内のレベルに相当するレベルなどのＧｇｔａ１活性基準レベルと比較され得る。
【０１００】
ハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイを包含する核酸ベースの検出法としては、サザンまたはノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応分析（例えば定量的ＰＣＲ）、ＳＡＧＥ分析、プローブ配列またはオリゴヌクレオチド配列が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１０１】
Ｇｇｔａ１発現を検出する一方法は、ＣＨＯ細胞集団からの単離ｍＲＮＡサンプルを、Ｇｇｔａ１遺伝子によってコードされるｍＲＮＡとハイブリダイズし得る本明細書に記載される核酸分子（例えばプローブ）と接触させるステップを伴う。Ｇｇｔａ１発現を検出する別の方法は、ＣＨＯ細胞集団からのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡサンプルを、本明細書に記載されるプライマー対と接触させてＧｇｔａ１配列を増幅するステップを伴う。サンプル中のＧｇｔａ１  ｍＲＮＡのレベルは、例えばｒｔＰＣＲ、ｑＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応、自家持続配列複製法、ローリングサークル複製、またはあらゆるその他の核酸増幅法と、それに続く当該技術分野で知られている技術を使用した増幅された分子の検出によって、評価し得る。リアルタイム定量的ＰＣＲ（またはｑＰＣＲ）は、限られた細胞数でＧｇｔａ１の遺伝子発現レベルを定量化する、特異的かつ高感度の分子プロファイリング法の一例である。
【０１０２】
本明細書での用法では、適切なプライマー対は、間の領域を画定する遺伝子の５’および３’領域（それぞれプラスおよびマイナス鎖、またはその逆）にアニールし得る、オリゴヌクレオチド対と定義される。一般に増幅プライマーはヌクレオチド長が約１０〜３０であり、ヌクレオチド長が約５０〜２００である領域の側面に位置する。適切な条件下で適切な試薬を用いれば、このようなプライマーは、プライマーで挟まれたヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子の増幅を可能にする。
【０１０３】
細胞（例えばＣＨＯ細胞）内のＧｇｔａ１遺伝子発現のレベルは、原位置または生体外形式のどちらでも測定し得る。一形式では、例えば単離されたｍＲＮＡをアガロースゲルに通過させ、ｍＲＮＡをゲルからニトロセルロースなどの膜に移動させることで、ｍＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）を表面に固定してプローブと接触させる。代替形態では、プローブを表面に固定して、例えば下述の二次元遺伝子チップアレイ内で、ｍＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）をプローブと接触させる。当業者は、Ｇｇｔａ１遺伝子によってコードされるｍＲＮＡレベルの検出で使用するために、既知のｍＲＮＡ検出法を応用し得る。原位置法では、細胞または組織サンプルを調製／処理し、典型的にはスライドガラスである担体上に固定して、次に分析されるＧｇｔａ１遺伝子とハイブリダイズし得るプローブと接触させ得る。
【０１０４】
別の実施形態では、本方法は、対照サンプルを、Ｇｇｔａ１  ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出できる化合物または作用因子と接触させて、対照サンプル中のＧｇｔａ１  ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を、試験サンプル中のＧｇｔａ１  ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在と比較するステップをさらに含む。なおも別の実施形態では、例えば米国特許第５，６９５，９３７号明細書に記載されるような遺伝子発現連続解析を使用して、Ｇｇｔａ１転写物レベルを検出する。
【０１０５】
Ｇｇｔａ１タンパク質を検出する抗体ベース技術としては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、免疫蛍光、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、ウエスタンブロット分析、表面プラズモン共鳴が挙げられる。その他の方法としては、ＬＣ−ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）をはじめとするが、これに限定されるものではない、質量分光測定に基づく方法を使用したＧｇｔａ１ペプチドまたはその断片の検出が挙げられる。
【０１０６】
一実施形態では、本明細書に記載される検出方法は、サンプルの遺伝子発現プロフィール判定の一部であり、プロフィールは、少なくとも１つの別の遺伝子の発現に対する少なくとも１つの別の値の中で、Ｇｇｔａ１発現レベルを表す値を含む。本方法は、値またはプロフィール（すなわち複数の値）を、基準値または基準プロフィールと比較するステップをさらに含み得る。サンプルの遺伝子発現プロフィールは、本明細書に記載される方法の何れかによって、（例えばサンプルからの核酸を提供して核酸を配列と接触させることによって）得られる。本方法を使用して、ＣＨＯ細胞を評価またはスクリーニングし得る。
【０１０７】
別の態様では、本発明は、複数のデジタルコード化したデータ記録を有するコンピュータ記憶媒体を特徴とする。各データ記録は、サンプル中のチャイニーズハムスターまたはＧｇｔａ１（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｒ  Ｇｇｔａ１）発現レベルを表す値、およびサンプルの説明を含む。サンプルの説明は、例えばサンプルがそれに由来する細胞型（例えばＣＨＯ細胞株）、またはサンプル原料の細胞が培養された細胞培養条件などのサンプルの識別子であり得る。一実施形態では、データ記録は、Ｇｇｔａ１以外の遺伝子（例えばグリカン合成と関係があるその他の遺伝子、または配列上のその他の遺伝子）の発現レベルを表す値をさらに含む。データ記録は、例えば関係データベース（例えばＯｒａｃｌｅのＳＱＬデータベースまたはＳｙｂａｓｅデータベース環境）などのデータベースの一部である表などの表として構築し得る。
【０１０８】
配列およびその使用
本発明はまた、複数のアドレスを有する二次元配列を特徴とし、複数の各アドレスは、複数のアドレスと互いに位置的に区別できる。複数の各アドレスは、例えば本明細書に記載される核酸またはポリペプチド配列または抗体などのユニークな捕捉プローブを有する。複数のアドレスの少なくとも１つは、本明細書に記載されるチャイニーズハムスターまたはＣＨＯ細胞Ｇｇｔａ１分子（例えば本明細書に記載されるａ  Ｇｇｔａ−１（ａ  Ｇｇｔａ−１）、Ｇｇｔａ１−ｂまたはＧｇｔａ１−ｃ分子）を認識する捕捉プローブを有する。一実施形態では、捕捉プローブは、例えばＧｇｔａ１核酸配列に相補的なプローブなどの核酸である。別の実施形態では、捕捉プローブは、例えば本明細書に記載されるＧｇｔａ１ポリペプチドに特異的な抗体などの抗体である。サンプルを前述の配列と接触させ、サンプルの配列への結合を検出することにより、サンプル（例えばＣＨＯ細胞からのサンプル）を分析する方法もまた特徴とされる。
【０１０９】
配列は、ｃｍ２あたり、少なくとも（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｔｈａｎ）１０個、５０個、１００個、２００個、５００個、１，０００個、２，０００個、または１０，０００個またはそれ以上のアドレス、およびその間の範囲の密度を有し得る。好ましい実施形態では、複数のアドレスは、少なくとも１０個、１００個、５００個、１，０００個、５，０００個、１０，０００個、５０，０００個のアドレスを含む。好ましい実施形態では、複数のアドレスは、１０個、１００個、５００個、１，０００個、５，０００個、１０，０００個、または５０，０００個以下のアドレスを含む。基材は、スライドガラスやウエハ（例えばシリカまたはプラスチック）や質量分光分析プレートなどの二次元基材、またはゲルパッドなどの三次元基材であり得る。複数アドレスに加えて、配列上にアドレスを配置させ得る。
【０１１０】
配列は、例えば写真平版方法（例えば米国特許第５，１４３，８５４号明細書、米国特許第５，５１０，２７０号明細書、および米国特許第５，５２７，６８１号明細書を参照）、機械的方法（例えば米国特許第５，３８４，２６１号明細書に記載される定向流（ｄｉｒｅｃｔｅｄ−ｆｌｏｗ）法））、ピンベースの方法（例えば米国特許第５，２８８，５１４号明細書に記載）、およびビーズベースの技術（例えば国際出願ＰＣＴＵＳ／９３／０４１４５号明細書に記載）などの様々な方法によって作成され得る。
【０１１１】
別の態様では、本発明は、Ｇｇｔａ１の発現を分析する方法を特徴とする。本方法は、上述のような配列を提供するステップと、配列をサンプルと接触させてａ  Ｇｇｔａ１−（ａ  Ｇｇｔａ１−）分子（例えば核酸またはポリペプチド）と配列の結合を検出するステップを含む。好ましい実施形態では、配列は核酸配列である。任意選択により、本方法は、配列を接触させる前にまたはその最中に、サンプルからの核酸を増幅するステップをさらに含む。
【０１１２】
別の実施形態では、配列を使用して、細胞集団（例えばＣＨＯ細胞集団）内の遺伝子発現、特にＧｇｔａ１発現をアッセイし得る。十分な数の多様なサンプルが分析されるならば、クラスター形成（例えば階層的なクラスター形成、ｋ−ｍｅａｎｓクラスター形成、Ｂａｙｅｓｉａｎクラスター形成など）を使用して、Ｇｇｔａ１と同時制御されるその他の遺伝子を同定し得る。例えば配列は、同義遺伝子発現の定量化のために使用し得る。したがって細胞型特異性だけでなく、組織内の一連の遺伝子の発現レベルもまた確認することもできる。定量的なデータを使用して、それらの組織発現それ自体、およびその組織内の発現レベルに基づいて、（例えばクラスター）遺伝子を分類し得る。
【０１１３】
一例では、遺伝子発現の配列分析を使用して、Ｇｇｔａ１発現に対する異なる細胞培養条件の影響を評価し得る。第１の細胞集団は第１の条件の組の下で培養し得て、第２の細胞集団は第２の条件の組の下で培養し得て、このような配列上で複数の集団からの核酸を分析し得る。この文脈で、生物学的応答に対する培養物条件の影響が判定される。同様に、異なる遺伝的背景を有するＣＨＯ細胞を比較し得る。
【０１１４】
糖タンパク質グリカン構造を調節する方法
本発明は、ＣＨＯ細胞内で糖タンパク質を生成する方法を特徴とし、糖タンパク質は、例えば先行技術の糖タンパク質と比較して、例えば治療用糖タンパク質として市販される糖タンパク質と比較して、改変されたレベルのＧａｌ−α−Ｇａｌグリカン構造を有する。本方法は、本明細書に記載された宿主細胞（例えばＧｇｔａ１形質移入またはＧｇｔａ１ノックダウンまたはノックアウト宿主細胞）を、糖タンパク質発現に適した条件下で培養するステップを含む。糖タンパク質は、表５に記載されるものから選択し得る。
【０１１５】
一実施形態では、同一のまたは高類似性のポリペプチド配列（例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一のポリペプチド配列）を有する先行技術の糖タンパク質と比較して、Ｇａｌ−α−Ｇａｌグリカン構造レベルが増大している糖タンパク質が生成される。本方法は、親細胞（例えばＧｇｔａ１過剰発現ＣＨＯ細胞）と比較して、増大したレベルのチャイニーズハムスターまたはＣＨＯ細胞Ｇｇｔａ１を産生するように遺伝子改変されている、本明細書に記載されるＣＨＯ宿主細胞を培養するステップと、得られた培養細胞からの治療用糖タンパク質を精製するステップを含み、宿主細胞もまた、治療用糖タンパク質をコードする導入遺伝子を含有する。
【０１１６】
一実施形態では、同一のまたは高類似性のポリペプチド配列（例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一のポリペプチド配列）を有する先行技術の糖タンパク質と比較して、Ｇａｌ−α−Ｇａｌグリカン構造レベルが低下している糖タンパク質が生成される。本方法は、親細胞（例えば本明細書に記載されるＧｇｔａ１ノックアウトまたはノックダウンＣＨＯ細胞）と比較して、低下したレベルのチャイニーズハムスターまたはＣＨＯ細胞Ｇｇｔａ１を産生するように遺伝子改変されている、本明細書に記載されるＣＨＯ宿主細胞を培養するステップと、得られた培養細胞からの治療用糖タンパク質を精製するステップを含み、宿主細胞は、治療用糖タンパク質をコードする導入遺伝子を含有する。上に述べたようにして生成されるこのような糖タンパク質は、市販の治療用糖タンパク質の改良版を提供し得る。
【０１１７】
【表５−１】
2013510574.tif 000004
【０１１８】
【表５−２】
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【０１１９】
【表５−３】
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【０１２０】
【表５−４】
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【０１２１】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【０１２２】
制限と解釈すべきではない以下の実施例によって、本発明をさらに例証する。本出願全体を通じて引用された全ての参考文献、特許および公開特許公報の内容は、参照によって本出願に援用する。
【実施例】
【０１２３】
実施例１：チャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）組織から、およびＣＨＯ細胞からのＧｇｔａ１のｃＤＮＡクローニング
ラットまたはマウスＧｇｔａ１コード配列のどちらかとの相同性に基づいて、オリジナルのオリゴヌクレオチドプライマーセットを設計した（例えば表２参照）。これらのプライマーを使用して、ＰＣＲにより、ＣＨＯ細胞由来ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）からのＧｇｔａ１配列の少なくとも一部を増幅する最初の再三の試みは、失敗に終わった。したがって本発明は、標準ハイブリダイゼーションのアプローチが、ＣＨＯ  Ｇｇｔａ１をクローニングするには不十分かもしれないという認識を包含する。
【０１２４】
具体的には、これらの同一プライマーの組のサブセットを使用して、（ＣＨＯ細胞系ではなく）チャイニーズハムスターの脳、脾臓、腎臓、および卵巣に由来する４種の組織特異的ｃＤＮＡプールをスクリーニングした。これらのｃＤＮＡプールは、２つの別個の、性別で分けた動物に由来した（ｃＤＮＡ脳および脾臓プールはオスのチャイニーズハムスターから、およびｃＤＮＡ腎臓および卵巣プールはメスのチャイニーズハムスターから）。ｃＤＮＡプールは、ＰＣＲによって、既知対照ＣＨＯ特異的遺伝子配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーの組を使用して、チャイニーズハムスターに特異的であることを確認した。４つのｃＤＮＡプールは全て、特異的な１．１ｋｂの生成物の増幅をもたらした（図１参照）。ＰＣＲ産物は、ＤＮＡ配列決定により、マウスおよびラットＧｇｔａ１翻訳配列との配列相同性に基づいて、推定上のチャイニーズハムスターのＧｇｔａ１オルソログに対応することが確認された（図２）。
【０１２５】
卵巣からのチャイニーズハムスターＧｇｔａ１のコード配列（本明細書でＧｇｔａ１−ａと称される）を配列番号１として、そのアミノ酸配列を配列番号２として図３に示す。脾臓からのチャイニーズハムスターＧｇｔａ１のコード配列（本明細書でＧｇｔａ１−ｂと称される）を配列番号３として、そのアミノ酸配列を配列番号４として図４に示す。上述のように、これらの２つの配列は、別個のチャイニーズハムスター「ドナー」（すなわちメスおよびオス）に由来した。２つのクローンは完全長のようであり、マウスＧｇｔａ１遺伝子のエクソン構造との比較に基づいて、全ての予測されたエクソン（４〜９）を含む。
【０１２６】
Ｇｇｔａ１−ａおよびＧｇｔａ１−ｂコード配列は、９９％を超えて互いに同一であり、１１１０ｂｐのコード配列の内、６つのヌクレオチドのみが分化している。これらのヌクレオチドの差異の内５つは、サイレントであり、１つのみが保存的アミノ酸変化（Ｉｌｅ６９Ｖａｌ）をもたらす。したがって、Ｇｇｔａ１−ａおよびＧｇｔａ１−ｂアミノ酸配列は、９９．５％を超えて同一である。
【０１２７】
Ｇｇｔａ１−ａおよびＧｇｔａ１−ｂヌクレオチド配列は、ラット配列とそれぞれ７９．４および７９．６％同一であり、マウス配列とそれぞれ８７．２％および８７．５％同一であり、ウシ配列とそれぞれ７７．５％および７７．７％同一であり、イヌ配列とそれぞれ８２．２％および８２．３％同一である。アミノ酸レベルでは、Ｇｇｔａ１−ａおよびＧｇｔａ１−ｂ配列はラット配列と８１％と同一であり、マウス配列と８６％同一であり、ウシ配列と７３％同一であり、およびイヌ配列と７７％同一である。
【０１２８】
最も高度に保存された領域は、リガンド結合および触媒活性にとって推定的に必要とされるものであり、配列番号２または４のアミノ酸残基Ｉｓｏ−８２〜Ｖａｌ−３７０に対応する。（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（２０００）１４８０：２２２−２３４を参照されたい）図２を参照されたい。アミノ酸レベルでは、Ｇｇｔａ１−ａおよびＧｇｔａ１−ｂ配列は、触媒領域にかけてラット配列と９１％同一であり、マウス配列と９０．３％同一であり、ウシ配列と８３％同一であり、およびイヌ配列と７９％同一である。Ｇｇｔａ１−ａおよびＧｇｔａ１−ｂの触媒領域は、９５％を超えてＧｇｔａ１−ｃの触媒領域と同一である。
【０１２９】
マウスおよびラット遺伝子配列と同様に、チャイニーズハムスターＧｇｔａ１遺伝子の代案のスプライシングもまた気付かれた（データ示さず）。特に、少なくとも１つのクローンでは、エクソン６が切除されたようである（配列番号２のＩｓｏ−４０〜Ｇｌｙ−６０に対応する）。この欠失は、アガロースゲル電気泳動法で視覚化した際に、より小さな増幅ＤＮＡ断片をもたらしたＰＣＲによって識別可能であった（図１レーン３〜６の二重線に注目されたい）。
【０１３０】
上記組織特異的ＤＮＡプールに由来するチャイニーズハムスターＧｇｔａ１配列に基づいて、ＰＣＲによってＣＨＯ細胞系から作成されたｃＤＮＡからのＧｇｔａ１を増幅するのに使用する意図で、追加的なｑＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーの組を設計した。しかしそのための努力は、最初は成功しなかった。より驚いたことには、これらのプライマーはまた、遺伝子のいかなるゲノムのコピーを増幅するのにも失敗した（ｃＤＮＡスクリーニングのために使用したのと同じＣＨＯ細胞源から単離されたゲノムＤＮＡを使用した場合）。特定の理論による拘束は望まないが、本発明者らは、問題が、（Ｇｇｔａ１−ａおよびＧｇｔａ１−ｂ配列をクローンするのに使用される）ｃＤＮＡプールが独立してそれに由来する、親チャイニーズハムスターのゲノムと比較して、ＣＨＯ細胞系Ｇｇｔａ１遺伝子のゲノムコピー中に存在するＤＮＡ配列が多様であることに起因するかもしれないことを提案した。さらに触媒領域の大部分をコードするエクソン９は、最初我々に、それが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（クローニングのために使用される細菌細胞）に有毒であると信じさせた特徴を示し、ＣＨＯ細胞から成功裏にクローニングする取り組みを一層困難にした。
【０１３１】
５，８７７塩基対でエクソン８、９（および介在性イントロン）からなる部分的遺伝子配列のＣＨＯ細胞ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）からの成功裏の増幅は、合理的に設計されたＰＣＲプライマーの組を使用して、究極的に達成された（表２）。この部分的Ｇｇｔａ１ゲノム配列を図５（配列番号５）に示し、対応するアミノ酸配列を図６（配列番号６）に示す。いくつかのクローン配列分析は、ＤＮＡ多形性（元のＧｇｔａ１−ａおよびＧｇｔａ１−ｂ配列と比較して）の存在を確認した。特に卵巣由来ｃＤＮＡチャイニーズハムスターｃＤＮＡプールから最初にクローンされた配列と比較して、（２７５残基中）１３のアミノ酸変化が、エクソンＧｇｔａ１遺伝子の８−９領域内で気付かれた。この多形性は２つの遺伝子配列を比較すると、およそ５％のタンパク質配列の差異（ヌクレオチドレベルで６．５％の差異）に等しい。対照的にＰＣＲによって同様に増幅された、４つの組織特異的チャイニーズハムスターｃＤＮＡプールからの無関係の対照ＣＨＯ配列は全て、ＣＨＯ細胞由来ｃＤＮＡ配列と直接比較すると、１００％の塩基対同一性を示した。この観察は、遺伝的多型性における遺伝子特異的バイアスを示唆する。
【０１３２】
要約すれば、ＣＨＯ細胞からのＧｇｔａ１のクローニングは、技術的に困難であった。マウス、ラット、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、その他をはじめとするいくつかの種のＧｇｔａ１遺伝子配列は公的にアクセス可能であったが、通例の相同性クローニングによってＣＨＯ細胞からＧｇｔａ１遺伝子を得るための、これらの関連配列の使用は成功しなかった。ＣＨＯ細胞内のＧｇｔａ１活性の存在を支持する文献の欠如と相まって、他の人々はＣＨＯ  Ｇｇｔａ１は存在しないと結論付けたかもしれない。本発明者らはそうせずに、遭遇した問題の根源を認識し、究極的にＣＨＯ細胞からのＧｇｔａ１  ｃＤＮＡクローニングを可能にするツールを提供するために、チャイニーズハムスター組織およびゲノムＤＮＡからのＧｇｔａ１遺伝子のクローニングを達成しようと努めた。とりわけ、ＣＨＯ細胞からのＧｇｔａ１  ｃＤＮＡクローニングを調査する研究者らが直面した困難さとしては、（１）ＣＨＯ細胞はＧｇｔａ１活性を含まないという文献における一般共通認識、（２）齧歯類配列間のＤＮＡ配列相同性の特異な分化（例えばその中で２つの各Ｇｇｔａ１遺伝子配列がおよそ９％分化するマウス対ラット）、および（３）ＣＨＯ細胞Ｇｇｔａ１遺伝子配列の遺伝的多型性が挙げられる。本発明者らはこれらの困難さを特定し、それらに対するストラテジーを開発し、ＣＨＯ  Ｇｇｔａ１配列を成功裏にクローンした。
【０１３３】
実施例２：ＣＨＯ細胞系クローン中のＧｇｔａ１遺伝子の差次的発現をスクリーニングするためのｑＰＣＲによる転写プロファイリングの使用
成功裏のＰＣＲの使用には、厳密な検討、すなわち検出する目標遺伝子配列に対して相補的ヌクレオチド配列がある、注意深く設計されたオリゴヌクレオチドプライマーの使用が必要である。ＣＨＯ細胞内のＧｇｔａ１遺伝子発現を具体的にプロファイリングするのためのこれらの配列マッチプライマーの設計は、最初、まず上述のようにＣＨＯ  Ｇｇｔａ１遺伝子の正確な配列を判定することなしには不可能だった。上述のクローン化ＣＨＯ細胞Ｇｇｔａ１配列の知識に基づいて、次に追加的プライマーを注意深く設計し、ＣＴＬＡ４−Ｉｇを発現するＣＨＯ細胞のクローン集団のＧｇｔａ１遺伝子の相対発現レベルをｑＰＣＲによって定量化した。これらのプライマーは、Ｇｇｔａ１エクソン９配列の領域で特異的にハイブリダイズするように設計され、複数の配列アラインメントを通じて、それらの各ヌクレオチド配列が完璧に保存されていることが示される（表２）。プライマーは、対照ＤＮＡテンプレートを使用して、効率、特異性および感度に基づいて適格とされた。これらのプライマーのダイナミックレンジは８桁を超え、原則としてＧｇｔａ１  ｍＲＮＡレベルを細胞あたり一桁のコピーまで検出するそれらの能力が示唆された。
【０１３４】
ｑＰＣＲの結果は、図７に要約される。ＣＴＬＡ４−Ｉｇを発現するＣＨＯ細胞系のＤＨＦＲベースの増幅に続く希釈によって、クローンを単離した。エクソン９特異的プライマー８４５（順方向）および８４６（逆方向）（配列を表２に示す）を使用して、ｑＰＣＲによってＧｇｔａ１発現を定量化した。図７Ａは、選択されたクローンのＰＣＲサイクルプロフィールを示す。図７Ｂは、Ｔｍ分析によるプライマー特異性のアセスメントを示す。表３は、３つの例証的なクローンのサイクル閾値（Ｃｔ）を示す。これらの結果は、特定生成物（増幅産物の融解温度分析に基づく、図７Ｂ）の増幅を示唆する。さらにこれらの結果は、Ｇｇｔａ１遺伝子相対発現レベルに基づいて、単一親ＣＨＯ細胞系に由来するユニークなクローンを識別するためのこれらのプライマーの使用もまた実証する（表３）。
【０１３５】
さらに我々は、隣接エクソンにマッピングすることで、ゲノムとＧｇｔａ１遺伝子の転写（ｃＤＮＡ）コピーとを識別するプライマーを設計した（すなわち順方向プライマー、エクソン８；逆方向プライマー、エクソン９）。ｃＤＮＡテンプレート対ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）テンプレートに対応する、Ｇｇｔａ１配列の差次的増幅を図８に示す。これらのプライマーの組は、ゲノムのコピー内で２つのエクソンを物理的に隔てるが、引き続いてスプライスされ除去されて成熟Ｇｇｔａ１  ｍＲＮＡ転写物を形成する、大きな（＞５ｋｂ）介在性イントロン配列の存在のために、使用されるｑＰＣＲ条件下ではＧｇｔａ１のゲノムのコピーを増幅しない。本明細書で開示されるその他のプライマーを同様に使用して、Ｇｇｔａ１遺伝子の差次的発現についてＣＨＯ細胞クローンをスクリーニングする。図９は、（ｃＤＮＡから特異的に増幅された）Ｇｇｔａ１ＰＣＲ産物が３２４ｂｐであることを示す。このようなプライマーは、ゲノムＤＮＡ持ち越し汚染に起因する偽陽性結果のあらゆる可能性を排除する特定の様式で、低いＧｇｔａ１遺伝子発現レベルを明解に検出するおよび／または定量化する必要性などの特定用途において、特に有用である。
【０１３６】
【表２】
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【０１３７】
【表３】
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【０１３８】
【表４】
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【０１３９】
拡張例および代替例
特許、特許出願、記事、書籍、論文、およびウェブページをはじめとするが、これに限定されるものではない、本出願に引用された全ての文献および類似資料は、このような文献および類似資料の形態に関わりなく、明示的にその内容全体を参照によって援用する。定義された用語、用語の使用法、記載の技術をはじめとするが、これに限定されるものではない、援用された文献および類似資料の１つ以上が、本出願と異なりまたは矛盾する場合、本出願が優先される。本明細書で使用されるセクション表題は、構成の目的のみで存在し、記載されている主題をどのようにも制限すると解釈されるものではない。本方法は、様々な実施形態および実施例と関連して記載されているが、本方法はこのような実施形態または実施例に限定されることを意図しない。反対に、本方法は、当事者であれば理解しているように、様々な代替物、修正および同等物を包含する。
【図３Ａ−１】
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【図３Ａ−２】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ−１】
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【図４Ａ−２】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ−１】
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【図５Ａ−２】
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【図５Ｂ−１】
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【図５Ｂ−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図１】
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【図２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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