(57)【要約】被験体における免疫反応を調節する方法が提供される。好ましい実施形態は、被験体、好ましくはヒト被験体における移植拒絶反応を軽減または阻害するための方法および組成物を提供する。免疫細胞の生物学的活性を阻害もしくは低減するか、または移植部位における炎症促進性分子の量を低減するのに有効な量のＢ７−Ｈ４ポリペプチド、その断片、またはその融合体を投与することにより、被験体における移植拒絶反応を阻害または軽減することができる。Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、およびＴｈ２２細胞は、炎症を阻害または軽減するのに、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質、またはその断片による阻害の標的となりうる例示的なＴ細胞である。
2013503205.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における移植拒絶反応を阻害または軽減するための方法であって、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、または炎症性分子を分泌するか、もしくは他の細胞に炎症性分子を分泌させる他の細胞からなる群から選択される免疫細胞の分化、増殖、活性、または前記免疫細胞によるサイトカインの生成もしくは分泌を、コントロールと比べて移植拒絶反応を阻害または軽減するのに有効な量だけ阻害または低減するのに有効な量のＢ７−Ｈ４タンパク質を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記Ｂ７−Ｈ４タンパク質が、ナイーブＴ細胞の、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ１細胞、またはＴｈ２２細胞への発達を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｂ７−Ｈ４タンパク質が、前記被験体における免疫細胞によるＩＦＮγの生成を阻害する、請求項４に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｂ７−Ｈ４タンパク質が、前記被験体における免疫細胞によるＩＬ−１７またはＩＬ−２２の生成を阻害する、請求項６に記載の方法。
【請求項５】
被験体における移植拒絶反応を阻害または軽減するための方法であって、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、または炎症性分子を分泌するか、もしくは他の細胞に炎症性分子を分泌させる他の細胞からなる群から選択される２種類以上の免疫細胞の分化、増殖、活性、ならびに／または２種類以上の前記免疫細胞によるサイトカインの生成および／もしくは分泌を、コントロールと比べて移植拒絶反応を阻害または軽減するのに有効な量だけ阻害または低減するのに有効な量のＢ７−Ｈ４タンパク質を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項６】
被験体における移植拒絶反応を阻害または軽減するための方法であって、Ｔｈ１７経路に対するＴｒｅｇの抑制効果を、移植拒絶反応を阻害または軽減するのに有効な量で増強するのに有効な量のＢ７−Ｈ４タンパク質を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項７】
被験体における移植拒絶反応を阻害または軽減するための方法であって、ＴｒｅｇによるＩＬ−１０の生成を、前記被験体における移植拒絶反応をコントロールと比べて阻害または軽減するのに有効な量だけ促進または増強するのに有効な量のＢ７−Ｈ４タンパク質を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項８】
被験体における移植拒絶反応を阻害または軽減するための方法であって、Ｔｒｅｇの数を、前記被験体における移植拒絶反応をコントロールと比べて阻害もしくは軽減するか、または移植される組織領域におけるＴｒｅｇ細胞の動員もしくは増殖を増強するのに有効な量だけ増大させるのに有効な量のＢ７−Ｈ４タンパク質を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項９】
被験体における移植拒絶反応を阻害または軽減するための方法であって、前記被験体における移植拒絶反応をコントロールと比べて阻害もしくは軽減するのに有効な量だけ、Ｔｈ１経路およびＴｈ１７経路を阻害し、Ｔｒｅｇと共に作用して、Ｔｈ１７経路に対するその抑制効果を増強するか、またはＴｒｅｇによるＩＬ−１０の分泌を促進もしくは増強するのに有効な量のＢ７−Ｈ４タンパク質を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項１０】
被験体におけるサイトカインの生成を低減するための方法であって、前記被験体における１または複数のサイトカインの生成を阻害するのに有効な量のＢ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質、Ｂ７−Ｈ４アゴニスト性抗体、またはその断片を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項１１】
第２の治療剤を投与するステップをさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２の治療剤が、グルココルチコイド、フルチカゾン、サルメテロール（ｓａｌｍｅｔｅｒｏａｌ）；ＩＬ−１２に対する抗体、ＩＬ−６に対する抗体、ＩＦＮ−γに対する抗体、ＩＬ−２３に対する抗体、ＩＬ−２２に対する抗体、ＩＬ−２１に対する抗体、およびＩＬ−４に対する抗体；ビタミンＤ３；ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ、ベラタセプト；デキサメタゾン、ならびにその組合せからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
被験体における移植拒絶反応を阻害または軽減する方法であって、Ｔｈ０細胞が、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、またはＴｈ２２細胞のうちの１または複数に分化することを、前記被験体における移植拒絶反応をコントロールと比べて阻害または軽減するのに有効な量だけ阻害するのに有効な量のＢ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質、Ｂ７−Ｈ４アゴニスト性抗体、またはその断片を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項１４】
前記移植が、同種異系移植である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記移植が、皮膚移植、組織移植、臓器移植、または骨髄移植である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質が、移植前、移植後、またはその両方において、移植される細胞、組織、または器官に直接的に投与される、請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質が、免疫器官に直接的に投与される、請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
被験体における移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の１または複数の症状を処置するための方法であって、移植片を受けた被験体または移植片を受ける被験体に、ＧＶＨＤの１または複数の症状を緩和するのに有効な量のＢ７−Ｈ４ポリペプチド、その融合タンパク質、またはその断片を投与するステップを含む、方法。
【請求項１９】
糖尿病を処置するための方法であって、それを必要とする被験体に、インスリン生成細胞を移植するステップと、糖尿病に随伴する１または複数の症状を緩和するのに有効な量のＢ７−Ｈ４ポリペプチド、その融合タンパク質、またはその断片を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項２０】
被験体における慢性移植拒絶反応を阻害または軽減するための方法であって、コントロールと比べて移植片の慢性拒絶反応を阻害または軽減するのに有効な量のＢ７−Ｈ４融合タンパク質を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項２１】
患者が移植を拒絶する可能性を予測するための方法であって、
（ａ）前記患者におけるｓＨ４レベルを決定するステップと、
（ｂ）前記患者におけるｓＨ４レベルを、移植を受けた１または複数の他の患者におけるｓＨ４レベルと比較して、（ａ）において決定されたｓＨ４レベルを有する前記他の患者における移植拒絶反応の頻度を決定するステップと
を含む、方法。
【請求項２２】
移植について患者を選択するための方法であって、
（ａ）請求項２１に記載の方法と、
（ｂ）移植拒絶反応の可能性が３０％以下である患者を選択するステップと
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２００９年８月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／２３８，６０５号、２００９年１２月４日に出願された米国仮特許出願第６１／２６６，８５４号、２００９年１０月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／２５４，９３０号、２００９年１２月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／２８６，５３７号、および２０１０年８月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／３７８，３６１号に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明の分野は一般に、免疫学の領域にあり、特に、移植拒絶反応（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）を処置するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
外科術および免疫抑制療法の持続的な進歩は、臓器移植が、移植を必要とする患者にとって、極めて成功の可能性の高い処置選択肢となることを可能としている。１９７０年代におけるシクロスポリンの革命的な発見と共に始められた免疫抑制レジメンは、大きく進化し、心臓、腎臓、および骨髄など、多くの種類の臓器移植および組織移植の生存率を著明に増大させている。例えば、最新の統計は、１年間の肝臓移植片生存率が８０％を超えることを確認している（Ｐｉｌｌａｉら、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ、１５巻（３４号）：４２２５〜４２３３頁（２００９年））。
【０００４】
器官および組織の手術による移植の成功は、医師が、移植レシピエントの免疫反応を調節する能力に大きく依存する。移植された外来組織を生存および機能させようとするならば、これらの組織を指向する免疫反応を制御しなければならない。移植拒絶反応時には、移植レシピエントの正常に機能する免疫系が、移植された器官を「非自己」組織として認識し、以後、移植された器官に対する免疫反応をもたらす。調査されずに放置されれば、免疫反応はその結果として最終的に、移植された器官の生物学的機能の喪失または死滅をもたらす多数の細胞およびタンパク質を生成し、また、移植レシピエントにおいて、他の重篤な毒性副作用ももたらしうる。
【０００５】
移植拒絶反応は、依然として、ヒトにおける長期にわたる移植片の生存に対する主要な障害である。
【０００６】
移植拒絶反応においては、Ｔ細胞が、中心的な役割を演じる（Ｇａｎｄｈｉ，  Ａ．ら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｒｇａｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、１３巻：６２２〜６２６頁（２００８年））。移植拒絶反応を防止する大半の療法は、Ｔ細胞活性化の阻害を焦点とする。ナイーブＴ細胞は、その完全な活性化に２つのシグナルを必要とする（Ｖｉｎｃｅｎｎｔｉ，  Ｆ．ら、Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２１巻（２号）：２９９〜３０６頁）。第１のシグナルは、抗原特異的であり、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣおよび抗原性ペプチドの複合体と相互作用するＴ細胞受容体によりもたらされる。第２のシグナル、または共刺激シグナルは、ＡＰＣ上のＣＤ８０およびＣＤ８６などの分子と、ナイーブＴ細胞上の同族受容体（ｃｏｇｎａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）との相互作用によりもたらされる。ＩＬ−２を含めたサイトカインの存在が、その結果としてＴ細胞を増殖させる活性化の過程を刺激する。この経路の遮断のためにＴ細胞が共刺激シグナルを受け取らなければ、Ｔ細胞は、アネルギー性となり、アポトーシスを受ける。
【０００７】
ＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）は、共刺激分子のＢ７スーパーファミリーのメンバーである。これらは、各々、刺激性のＣＤ２８受容体および阻害性のＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）受容体と関与しうる。Ｔ細胞受容体を介するシグナル伝達と共に、ＣＤ２８によるライゲーションは、抗原特異的なＴ細胞増殖を増大させ、サイトカインの生成を増強し、Ｔ細胞の分化およびエフェクター機能を刺激し、かつＴ細胞の生存を促進する（非特許文献１；非特許文献２；ならびに非特許文献３）。これに対し、ＣＴＬＡ−４を介するシグナル伝達は、Ｔ細胞の増殖、ＩＬ−２の生成、ならびに細胞周期の進行を阻害する、負のシグナルを送達すると考えられている（非特許文献４；ならびに非特許文献５）。
【０００８】
現行の免疫抑制剤には、シクロスポリンおよびタクロリムスなどのカルシニューリン阻害剤が含まれる。これらの薬剤は、もっぱらＴ細胞に限られるわけではない、細胞内プロテアーゼであるカルシニューリンを阻害する。カルシニューリンは、他の種類の細胞にも存在するため、カルシニューリン阻害剤は、他の組織において副作用を引き起こす。シロリムスなどのｍＴＯＲ阻害剤も同様に、Ｔ細胞に特異的なわけではないシグナル伝達経路を阻害するため、他の組織において副作用を引き起こす（Ｅｍａｍａｕｌｌｅｅ，  Ｊ．ら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｌ．  Ｔｈｅｒ．、９巻（６号）：７８９〜７９６頁（２００９年））。Ｔ細胞上の受容体に結合する抗体ベースの薬剤は、カルシニューリン阻害剤を上回る選択性をもたらすが、免疫系に対するより強力な阻害効果をもたらすことが多く、これは数カ月間にわたり持続しうる。
【０００９】
Ｔ細胞が活性化した後では、ＣＴＬＡ−４が発現し、Ｔ細胞反応を下方制御するように作用する。ＣＴＬＡ−４は、ＣＤ２８よりもＣＤ８０リガンドおよびＣＤ８６リガンドに対してより高いアビディティーで結合し、ＣＤ２８と競合して、Ｔ細胞の活性を下方制御する。ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインを伴う融合タンパク質は、ＣＤ２８を介するＴ細胞の活性化を選択的に阻止することが示されている（Ａｌｅｇｒｅ，  Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ、１２巻：１４９〜１６０頁）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｌｅｎｓｈｏｗら、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９６年）１４巻：２３３〜２５８頁
【非特許文献２】ＣｈａｍｂｅｒｓおよびＡｌｌｉｓｏｎ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７年）９巻：３９６〜４０４頁
【非特許文献３】ＲａｔｈｍｅｌｌおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９年）１７巻：７８１〜８２８頁
【非特許文献４】ＫｒｕｍｍｅｌおよびＡｌｌｉｓｏｎ、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．（１９９６年）１８３巻：２５３３〜２５４０頁
【非特許文献５】Ｗａｌｕｎａｓら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．（１９９６年）１８３巻：２５４１〜２５５０頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、本発明の目的は、移植拒絶反応を阻害または軽減するための方法および組成物を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、同種異系移植片の生存を延長するための方法および組成物を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、移植片対宿主病を阻害または軽減するための方法および組成物を提供することである。
【００１４】
本発明の別の目的は、Ｔ細胞に特異的な免疫抑制剤を提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、ナイーブＴ細胞の、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、またはＴｈ２２細胞への発生を阻害することにより、移植拒絶反応を阻害するための方法および組成物を提供することである。
【００１６】
本発明の別の目的は、炎症促進性分子（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の生成を阻害または低減し、それにより移植拒絶反応を阻害または軽減することにより、移植拒絶反応を阻害するための方法および組成物を提供することである。
【００１７】
本発明の目的は、Ｔ細胞の増殖を阻害し、Ｔ細胞による炎症促進性分子の生成を低減または阻害し、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、またはＴｈ２２細胞の分化およびエフェクター機能を低減または阻害し、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、またはＴｈ２２細胞の生存を低減または阻害する、移植拒絶反応を阻害するための方法および組成物を提供することである。
【００１８】
本発明の別の目的は、Ｔｒｅｇの抑制作用を増強することにより、移植拒絶反応を阻害するための方法および組成物を提供することである。
【００１９】
本発明の別の目的は、Ｔｈ１経路、Ｔｈ１７経路、およびＴｈ２２経路に対するＴｒｅｇの抑制作用を増強して、生成されるＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１７、ならびに他の炎症性分子のレベルを低減し、それにより炎症、同種異系反応性（ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）、および移植拒絶反応を阻害または軽減することにより、移植拒絶反応を阻害するための方法および組成物を提供することである。
【００２０】
本発明の別の目的は、Ｔｒｅｇに直接的に作用して、ＩＬ−１０の生成を促進または増強し、炎症性分子の生成をさらに抑制し、それにより移植拒絶反応を阻害または軽減する薬剤を投与することにより、移植拒絶反応を阻害するための方法および組成物を提供することである。
【００２１】
本発明の別の目的は、Ｔｒｅｇの活性を増大させるかもしくは促進するか、ナイーブＴ細胞のＴｒｅｇへの分化を増大させるか、Ｔｒｅｇの数を増大させるか、またはＴｒｅｇの生存を増大させる、移植拒絶反応を阻害するための方法および組成物を提供することである。
【００２２】
Ｔｈ１  Ｔ細胞、Ｔｈ１７  Ｔ細胞、またはＴｈ２２  Ｔ細胞の炎症促進活性を調節しながら、同時に、Ｔｒｅｇの活性を増大させるかまたは促進するための組成物および方法を提供することが、本発明の別の目的である。
【００２３】
本発明の別の目的は、移植拒絶反応を阻害するための組合せ療法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
被験体における免疫反応を調節するための方法が提供される。好ましい実施形態は、免疫細胞の生物学的活性を阻害もしくは低減するか、または炎症促進性分子、例えば、炎症促進性サイトカインの量を低減するのに有効な量のＢ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合タンパク質を投与することにより、被験体、好ましくはヒト被験体における移植拒絶反応を軽減または阻害するための方法および組成物を提供する。最も好ましい実施形態は、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質である。例示的な炎症促進性分子には、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２１、およびＭＭＰが含まれるがこれらに限定されない。Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、およびＴｈ２２細胞は、炎症を阻害または軽減するのに、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質、またはこれらの断片による阻害の標的となりうる例示的なＴ細胞である。Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合タンパク質はまた、炎症性分子を分泌するか、または他の細胞に炎症性分子を分泌させる他の細胞を標的とするのにも用いることができる。加えて、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質、またはこれらの断片は、Ｔｒｅｇを標的として、ＩＬ−１７などの炎症性分子の生成に対する抑制作用を増強することも可能である。Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体はまた、Ｔｒｅｇに直接的に作用して、ＩＬ−１０の生成を促進または増強し、炎症性分子の生成をさらに抑制するか、またはＴｒｅｇの抑制作用を増強し、それにより移植拒絶反応を阻害または軽減することも可能である。
【００２５】
Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体は、複数の経路の複数の地点において作用する。例えば、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体は、ナイーブＴ細胞が、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、または炎症性分子を分泌するか、もしくは他の細胞に炎症性分子を分泌させる他の細胞に発達することを阻害しうる。代替的に、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体は、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、および／または他の細胞と相互作用して、炎症促進性分子の生成を阻害または低減することも可能であり、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、またはＴｈ２２細胞の増殖を阻害することも可能である。加えて、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体は、Ｔｒｅｇと共に作用して、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、および／またはＴｈ２２細胞に対する抑制効果を増強させ、生成されるＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−１７のレベルを低減することも可能である。Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体はまた、Ｔｒｅｇに直接的に作用して、ＩＬ−１０の生成を促進または増強し、Ｔｈ１経路および／またはＴｈ１７経路を抑制することも可能である。加えて、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体は、移植された組織領域におけるＴｒｅｇ細胞の分化、動員、および／または増殖を増強することによっても作用しうる。
【００２６】
処理される移植材料は、細胞、組織、器官、四肢、手足指、または身体の部分、好ましくはヒト身体の部分でありうる。移植片は、同種異系または異種であることが典型的である。Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体は、全身投与することもでき、局所投与することもできる。一部の実施形態では、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体を、移植前、移植時、または移植後において、移植部位に投与する。一実施形態では、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体を、移植部位に、皮下注射などにより非経口投与する。他の実施形態では、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体を、移植される細胞、組織、または器官に、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて直接的に投与する。一実施形態では、移植材料を、移植前、移植後、またはその両方において、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体と接触させる。他の実施形態では、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体を、リンパ節または脾臓などの免疫組織または免疫器官に投与する。また、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドをコードするベクターも提供される。これらのベクターを用いて、Ｂ７−Ｈ４を、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて局所的に、例えば、膵島細胞に送達することができる。例示的なベクターはアデノウイルスベクターである。
【００２７】
Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体は、他のリンパ球表面マーカー（例えば、ＣＤ４０）もしくはサイトカインに対する抗体；他の融合タンパク質、例えば、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ（Ｏｒｅｎｃｉａ（登録商標））、ＴＮＦＲ−Ｉｇ（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））；または他の免疫抑制薬；抗増殖剤；細胞傷害剤；あるいは免疫抑制の一助となりうる他の化合物が含まれるがこれらに限定されない、１または複数のさらなる治療剤と組み合わせて投与することができる。一実施形態では、さらなる治療剤が、ＣＴＬＡ−４融合タンパク質、例えば、ＣＴＬＡ−４Ｉｇ（アバタセプト）である。好ましい実施形態では、さらなる治療剤が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてそのＣＤ８６に対するアビディティーを顕著に増大させる、２つのアミノ酸置換（Ｌ１０４ＥおよびＡ２９Ｙ）を含有する、ベラタセプトとして公知のＣＴＬＡ−４−Ｉｇ融合タンパク質である。
【００２８】
さらに別の実施形態は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）に随伴する１または複数の症状を緩和するのに有効な量のＢ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体を投与することにより、それを必要とする被験体における、ＧＶＨＤの１または複数の症状を処置するための方法および組成物を提供する。
【００２９】
別の実施形態は、それを必要とする被験体にインスリン生成細胞を移植し、該インスリン生成細胞に対する移植拒絶反応を阻害または軽減するのに有効な量のＢ７−Ｈ４ポリペプチド、その融合体、またはＢ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはＢ７−Ｈ４融合タンパク質をコードするベクターを投与することにより、糖尿病を処置するための方法を提供する。
【００３０】
また、慢性移植拒絶反応を阻害または軽減するための方法も提供される。該方法は、それを必要とする被験体に、コントロールと比べて、移植片の慢性拒絶反応を阻害または軽減するのに有効な量のＢ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体を投与するステップを包含する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、糖尿病の誘導、ならびに同種異系の膵島細胞移植と、０日目、２日目、４日目、６日目、および８日目におけるＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（０．２５ｍｇ）の投与とを伴う処置を概略的に例示する図である。
【図２】図２は、百分率による膵島の生存を、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処置したマウスにおける移植後の日数（実線）またはコントロールにおける移植後の日数（点線）と対比させる折れ線グラフである。
【図３】図３は、移植片対宿主病アッセイの実験デザインについての概略的な図である。４群のマウスを、骨髄移植にかけた。第Ｉ群には、同系骨髄移植を施した。第ＩＩ群には、同種異系骨髄移植を施し、０日目、１日目、７日目、および１４日目にコントロールＩｇＧ（０．５ｍｇ）で処置した。第ＩＩＩ群には、同種異系骨髄移植を施し、０日目、１日目、７日目、および１４日目にＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（０．５ｍｇ）で処置した。第ＩＶ群には、同種異系骨髄移植を施し、０日目、１日目、７日目、および１４日目にリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）で処置した。
【図４】図４Ａは、図３で処置された第ＩＩ群および第ＩＩＩ群のマウスによる下痢の臨床スコアを示す棒グラフである：コントロールＩｇＧ（黒色の影）群；Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ（白色ボックス）群を示す。図４Ｂは、図３で処置された第ＩＩ群および第ＩＩＩ群のマウスの百分率による体重の低減を示す棒グラフである：コントロールＩｇＧ（黒色の影）群を示す。
【図５】図５は、図３で処置されたマウスの百分率による生存を、骨髄移植後の日数と対比させて示す折れ線グラフである。同系移植（黒四角）、コントロールＩｇＧで処置した同種異系移植（白三角）、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処置した同種異系移植（黒三角）、リン酸緩衝生理食塩液で処置した同種異系移植（白丸）を示す。表示されるタンパク質は、矢印により表示される通り、０日目、１日目、７日目、および１４日目に０．５ｍｇで注射された。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
Ｉ．定義
「同系」という用語は、遺伝子的に同一であるか、または密接に類縁である生物、細胞、組織、器官などを指す。
【００３３】
「同種異系」という用語は、同じ種の個体に由来する（ｆｒｏｍ、またはｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ）生物、細胞、組織、器官などをいうが、ここで、この生物、細胞、組織、器官などは、互いと遺伝子的に異なる。
【００３４】
「異種移植」という用語は、ドナーとレシピエントとの種が異なる移植を指す。
【００３５】
「移植拒絶反応」という用語は、移植レシピエントの表面または内部において、移植された細胞、組織、器官などが部分的または完全に破壊されることを指す。
【００３６】
「宿主」または「被験体」という用語は、移植される細胞、組織、器官などのレシピエントである生物（生物は哺乳動物であることが好ましい）、組織、器官などを指す。本明細書では、移植の宿主、被験体、またはレシピエントを指す場合の「宿主」、「レシピエント」、または「被験体」を互換的に用いる。
【００３７】
「移植拒絶反応を阻害するのに治療的に有効な量」とは、移植レシピエントに投与されると、処置されないコントロールと比べて、移植拒絶反応を部分的または完全に阻害するＢ７−Ｈ４−Ｉｇの量を指す。
【００３８】
本明細書で用いられる「炎症性分子」とは、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２１、およびＭＭＰが含まれるがこれらに限定されない、サイトカイン、メタロプロテアーゼ、ならびに他の分子を指す。
【００３９】
ＩＩ．Ｂ７−Ｈ４ならびにその融合タンパク質
Ａ．Ｂ７−Ｈ４
Ｂ７−Ｈ４は、タンパク質のＢ７ファミリーのメンバーであり、Ｔ細胞シグナル伝達経路に関与する。ナイーブＴ細胞は、その完全な活性化に２つのシグナルを必要とする（Ｖｉｎｃｅｎｎｔｉ，  Ｆ．ら、Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２１巻（２号）：２９９〜３０６頁）。第１のシグナルは、抗原特異的であり、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣおよび抗原性ペプチドの複合体と相互作用するＴ細胞受容体によりもたらされる。第２のシグナル、または共刺激シグナルは、ＡＰＣ上のＣＤ８０およびＣＤ８６などの分子と、ナイーブＴ細胞上のＣＤ２８などの同族受容体との相互作用によりもたらされる。最も広範にわたり特徴づけられているＴ細胞共刺激経路は、Ｂ７−ＣＤ２８経路であり、ここでは、Ｂ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）の各々が、刺激性のＣＤ２８受容体および阻害性のＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）受容体に結合（ｅｎｇａｇｅ）しうる。Ｔ細胞受容体を介するシグナル伝達と共に、ＣＤ２８の連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）は、抗原特異的なＴ細胞増殖を増大させ、サイトカインの生成を増強し、Ｔ細胞の分化およびエフェクター機能を刺激し、Ｔ細胞の生存を促進する（Ｌｅｎｓｈｏｗら、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４巻：２３３〜２５８頁（１９９６年）；ＣｈａｍｂｅｒｓおよびＡｌｌｉｓｏｎ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９巻：３９６〜４０４頁（１９９７年）；ならびにＲａｔｈｍｅｌｌおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７巻：７８１〜８２８頁（１９９９年））。これに対し、ＣＴＬＡ−４を介するシグナル伝達は、Ｔ細胞の増殖、ＩＬ−２の生成、ならびに細胞周期の進行を阻害する、負のシグナルを送達すると考えられている（ＫｒｕｍｍｅｌおよびＡｌｌｉｓｏｎ、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１８３巻：２５３３〜２５４０頁（１９９６年）；ならびにＷａｌｕｎａｓら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１８３巻：２５４１〜２５５０頁（１９９６年））。Ｂ７ファミリーの他のメンバーには、Ｂ７−Ｈ１（Ｄｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、５巻：１３６５〜１３６９頁（１９９９年）；ならびにＦｒｅｅｍａｎら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１９２巻：１〜９頁（２０００年））、Ｂ７−ＤＣ（Ｔｓｅｎｇら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１９３巻：８３９〜８４６頁（２００１年）；ならびにＬａｔｃｈｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２巻：２６１〜２６８頁（２００１年））、Ｂ７−Ｈ２（Ｗａｎｇら、Ｂｌｏｏｄ、９６巻：２８０８〜２８１３頁（２０００年）；Ｓｗａｌｌｏｗら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１１巻：４２３〜４３２頁（１９９９年）；ならびにＹｏｓｈｉｎａｇａら、Ｎａｔｕｒｅ、４０２巻：８２７〜８３２頁（ｌ９９９年））、Ｂ７−Ｈ３（Ｃｈａｐｏｖａｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２巻：２６９〜２７４頁（２００１年））、およびＢ７−Ｈ４（Ｃｈｏｉら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７１巻：４６５０〜４６５４頁（２００３年）；Ｓｉｃａら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１８巻：８４９〜８６１頁（２００３年）；Ｐｒａｓａｄら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１８巻：８６３〜８７３頁（２００３年）；ならびにＺａｎｇ���、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、１００巻：１０３８８〜１０３９２頁（２００３年））が含まれる。Ｂ７−Ｈ１およびＢ７−ＤＣは、ＰＤ−１のリガンドであり、Ｂ７−Ｈ２はＩＣＯＳのリガンドであり、Ｂ７−Ｈ３およびＢ７−Ｈ４は、現時点では、オーファンリガンドである（Ｄｏｎｇら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｓ．、２８巻：３９〜４８頁（２００３年））。
【００４０】
Ｂ７−Ｈ４は、Ｔ細胞反応に対する負の制御因子である。ヒトＢ７−Ｈ４とマウスＢ７−Ｈ４とが８７％のアミノ酸同一性を共有することから、進化において保存された重要な機能が示唆される。ヒトおよびマウスのＢ７−Ｈ４  ｍＲＮＡは、リンパ系器官（脾臓および胸腺）および非リンパ系器官（肺、肝臓、精巣、卵巣、胎盤、骨格筋、膵臓、および小腸を含めた）のいずれにおいても、広範に発現しているが、Ｂ７−Ｈ４タンパク質は通常のヒト組織において、免疫組織化学によって検出されない。Ｂ７−Ｈ４タンパク質の発現についての限られた研究は、Ｂ７−Ｈ４が、単離されたばかりのヒトＴ細胞、Ｂ細胞、ＤＣ、および単球上では発現せず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて刺激された後のこれらの細胞型において誘導されうることを示唆する。免疫組織化学染色は、Ｂ７−Ｈ４が、肺の腫瘍、卵巣の腫瘍、および頭頚部の腫瘍で高度に発現することを示し、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による解析はまた、マウスＢ７−Ｈ４も、前立腺癌、肺癌、および結腸癌を含めた多数の腫瘍細胞系において高度に発現することを示唆する。
【００４１】
Ｂ７−Ｈ４のトランスフェクト体（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）ならびに固定されたＢ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質を用いる機能研究は、Ｂ７−Ｈ４が、ＴＣＲを介するＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖、細胞周期の進行、ならびにＩＬ−２の生成を阻害するシグナルを送達することを裏付けている。Ｂ７−１による共刺激は、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇにより誘導される阻害を凌駕することができない。Ｂ７−Ｈ４ノックアウトマウスが自己免疫を発生させることは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける活性と符合する。
【００４２】
Ｂ．例示的なＢ７−Ｈ４ポリペプチドおよびＢ７−Ｈ４融合タンパク質
他のポリペプチドと連結されて融合タンパク質を形成するＢ７−Ｈ４ポリペプチドを含有する融合タンパク質が提供される。Ｂ７−Ｈ４融合ポリペプチドは、（ｉ）第２のポリペプチドに直接的に融合するか、または（ｉｉ）必要に応じて上記第２のポリペプチドに融合するリンカーペプチド配列に融合するＢ７−Ｈ４タンパク質のうちの全部または一部を含む、第１の融合パートナーを有する。その融合タンパク質は、必要に応じて、２つ以上の融合タンパク質を二量体化または多量体化するように機能するドメインを含有する。そのペプチド／ポリペプチドリンカードメインは、別個のドメインの場合もあり、代替的に、上記融合タンパク質の他のドメインのうちの１つのうちの１つ（Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドまたは第２のポリペプチド）の内部に含有される場合もある。同様に、上記融合タンパク質を二量体化または多量体化するように機能するドメインは、別個のドメインの場合もあり、代替的に、上記融合タンパク質の他のドメイン（Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、第２のポリペプチド、またはペプチド／ポリペプチドリンカードメイン）のうちの１つのうちの１つ内に含有される場合もある。一実施形態では、上記二量体化／多量体化ドメインと、上記ペプチド／ポリペプチドリンカードメインとが同じである。
【００４３】
本明細書で開示される融合タンパク質は、式Ｉ：
Ｎ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｃ
［式中、「Ｎ」は、融合タンパク質のＮ末端を表わし、「Ｃ」は、融合タンパク質のＣ末端を表わす］の融合タンパク質であり、「Ｒ１」が、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドであり、「Ｒ２」が、任意選択のペプチド／ポリペプチドリンカードメインであり、「Ｒ３」が、第２のポリペプチドである。代替的に、Ｒ３は、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドであることが可能であり、Ｒ１は、上記第２のポリペプチドでありうる。
【００４４】
上記融合タンパク質は、二量体化または多量体化され得る。二量体化または多量体化は、二量体化ドメインまたは多量体化ドメインを介して、２つ以上の融合タンパク質間で生じうる。代替的に、融合タンパク質の二量体化または多量体化は、化学的な架橋形成によっても生じうる。形成される二量体または多量体は、ホモ二量体／ホモ多量体の場合もあり、ヘテロ二量体／ヘテロ多量体の場合もある。
【００４５】
Ａ．Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド
好ましい実施形態では、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドが、哺乳動物種に由来する。最も好ましい実施形態では、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドが、マウス、非ヒト霊長動物（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ、およびＭａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、またはヒト起源のものである。有用なマウスＢ７−Ｈ４ポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１７８５９４またはＡＹ２８０９７３である核酸によりコードされるＢ７−Ｈ４ポリペプチドに対して、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列同一性を有する。有用なマウスＢ７−Ｈ４ポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号がＡＡＨ３２９２５．１またはＮＰ＿８４８７０９．２によるＢ７−Ｈ４ポリペプチドに対して、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列同一性を有する。有用なヒトＢ７−Ｈ４ポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号がＡＫ０２６０７１である核酸によりコードされるＢ７−Ｈ４ポリペプチドに対して、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列同一性を有する。有用なヒトＢ７−Ｈ４ポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０７８９０２．２またはＢＡＢ１５３４９．１によるＢ７−Ｈ４ポリペプチドに対して、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％の配列同一性を有する。
【００４６】
マウスＢ７−Ｈ４ポリペプチドは、
【００４７】
【化１】
2013503205.tif 000003
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされうる。
【００４８】
マウスＢ７−Ｈ４ポリペプチドは、
【００４９】
【化２】
2013503205.tif 000004
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有しうる。
【００５０】
ヒトＢ７−Ｈ４ポリペプチドは、
【００５１】
【化３】
2013503205.tif 000005
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされうる。
【００５２】
ヒトＢ７−Ｈ４ポリペプチドは、
【００５３】
【化４】
2013503205.tif 000006
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有しうる。
【００５４】
非ヒト霊長動物Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドは、
【００５５】
【化５】
2013503205.tif 000007
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有しうる（配列番号１５および１６は、チンパンジー（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）のポリペプチド配列であり、配列番号１７および１８は、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）のポリペプチド配列であり、配列番号１９および２０は、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）のポリペプチド配列である）。
【００５６】
Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドをコードする核酸は、好まれる発現宿主における発現について最適化することができる。コドンは、Ｂ７−Ｈ４核酸配列が由来する哺乳動物と上記発現宿主の間でのコドン使用の違いを考慮して、同じアミノ酸をコードする代替のコドンで置換することができる。このようにして、発現宿主に好ましいコドンを用いて、核酸を合成することができる。
【００５７】
１．Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドの断片
上記Ｂ７−Ｈ４タンパク質は、抗体の可変ドメインおよび定常ドメインと類縁の、２つの免疫グロブリンドメインである、ＩｇＶドメイン（またはＶドメイン）およびＩｇＣドメイン（またはＣドメイン）を、その細胞外ドメイン内に含有する。当業者は、ファミリーデータベースおよびドメインデータベースを検索することにより、上記ドメインを同定することができる。単離ＩｇＶドメインに由来する機能的データに基づき、ならびに他のＢ７ファミリーメンバーとの類比により、上記ＩｇＶドメインが、受容体との結合に関与すると考えられる。細胞外ドメインの各Ｉｇドメインは、このフォールドに典型的であり、かつ、構造−機能にとって重要でありうる通り、ドメイン内のシステイン残基間で形成される１つのジスルフィド結合を含む。配列番号２、５、９、および１２では、これらのシステインが、ＩｇＶドメインでは残基５６および１３０に位置し、ＩｇＣドメインでは残基１６８および２２５に位置する。加えて、ＩｇＶドメインでは、１つのＮ連結されたグリコシル化部位の存在が予測され、上記ＩｇＣドメインでは、６つのグリコシル化部位の存在が予測されており、これらは、マウスＢ７−Ｈ４配列と、ヒトＢ７−Ｈ４配列とで保存されている。
【００５８】
一実施形態では、上記第１の融合パートナーが、Ｂ７−Ｈ４の断片である。本明細書で用いられるＢ７−Ｈ４断片とは、全長タンパク質より少なくとも１アミノ酸短いポリペプチドの任意のサブセットを指す。有用な断片は、それらの１つ以上の天然の受容体に結合する能力を保持する断片である。全長Ｂ７−Ｈ４の断片であるＢ７−Ｈ４ポリペプチドは、全長Ｂ７−Ｈ４と比較して、その天然の受容体（複数可）に結合する能力が、典型的には少なくとも２０パーセント、３０パーセント、４０パーセント、５０パーセント、６０パーセント、７０パーセント、８０パーセント、９０パーセント、９５パーセント、９８パーセント、９９パーセント、１００パーセント、なおまたは１００パーセント超である。
【００５９】
Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドの断片には、可溶性断片が含まれる。可溶性のＢ７−Ｈ４ポリペプチド断片とは、それらを生成させる細胞から漏出するか、分泌されるか、または他の方法で抽出されうる、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドの断片である。Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドの可溶性断片は、上記受容体ポリペプチドの細胞外ドメインの一部または全部を含み、かつ、細胞内ドメインおよび／または膜貫通ドメインの一部または全部を欠く。一実施形態では、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド断片が、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドの細胞外ドメインの全体を含む。他の実施形態では、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドの可溶性断片が、Ｂ７−Ｈ４の生物学的活性を保持する細胞外ドメインの断片を含む。上記細胞外ドメインは、上記膜貫通ドメインに由来する１、２、３、４、もしくは５の連続するアミノ酸、ならびに／またはそのシグナル配列に由来する１、２、３、４、もしくは５の連続するアミノ酸を含みうる。代替的に、上記細胞外ドメインは、Ｃ末端、Ｎ末端、またはこれらの両方から取り出された、１、２、３、４、５以上のアミノ酸を有しうる。一部の実施形態では、上記細胞外ドメインが、ＩｇＶドメインのみであるか、または全長タンパク質の残基５６および１３０に位置するＩｇＶドメインの保存システイン間の領域である。
【００６０】
一般に、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドまたはそれらの断片は、シグナル配列をコードする配列を含む核酸から発現される。一般に、そのシグナル配列が未成熟ポリペプチドから切断されて、上記シグナル配列を欠く成熟ポリペプチドが生成される。配列番号４、７、１１、１４、１６、１８、および２０は、各々が、シグナルペプチドを欠く。標準的な分子生物学の技法を用いて、Ｂ７−Ｈ４のシグナル配列を、別のポリペプチドのシグナル配列で置換して、そのポリペプチドの発現レベル、分泌、可溶性、または他の特性に影響を及ぼすことができる。上記Ｂ７−Ｈ４のシグナル配列を置換するのに用いられるシグナル配列は、当技術分野で公知の任意のシグナル配列でありうる。配列番号２、３、５、６、９、１０、１２、１３、１５、１７、および１９は、各々が、シグナルペプチドを含有する。
【００６１】
好ましい実施形態では、上記融合タンパク質が、Ｉｇ  Ｆｃ領域に融合した、Ｂ７−Ｈ４またはその断片の細胞外ドメインを含む。組換えＢ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質は、既に説明されている通り（Ｃｈａｐｏｖａｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．、４５巻：２４７〜２５５頁（２０００年））、Ｂ７−Ｈ４またはその断片の細胞外ドメインのコード領域を、ヒトＩｇＧ１またはマウスＩｇＧ２ａのＦｃ領域と融合させることにより、調製することができる。
【００６２】
ａ．マウスＢ７−ＤＣ細胞外ドメイン融合パートナー
一実施形態では、上記融合タンパク質の第１の融合パートナーが、マウスＢ７−Ｈ４またはその断片の細胞外ドメインを含む。上記第１の融合パートナーは、
【００６３】
【化６】
2013503205.tif 000008
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされうる。
【００６４】
別の実施形態では、上記第１の融合パートナーが、マウスアミノ酸配列：
【００６５】
【化７】
2013503205.tif 000009
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有しうる。
【００６６】
成熟タンパク質では、シグナル配列が除去される。加えて、他のポリペプチドまたは他の生物に由来するシグナルペプチドを用いて、作製時における宿主からの融合タンパク質の分泌を増強することができる。配列番号２８は、上記シグナル配列を伴わない、配列番号２４および配列番号２６のマウスアミノ酸配列：
【００６７】
【化８】
2013503205.tif 000010
を示す。
【００６８】
配列番号２９は、上記シグナル配列を伴わない、配列番号２５および配列番号２７のマウスアミノ酸配列：
【００６９】
【化９】
2013503205.tif 000011
を示す。
【００７０】
別の実施形態では、上記融合タンパク質の第１の融合パートナーが、マウスＢ７−Ｈ４のＩｇＶドメインを含む。一実施形態では、上記ＩｇＶドメインが、少なくとも、配列番号２または配列番号５の５６位におけるシステイン〜配列番号２または配列番号５の１３０位におけるシステインを含む。別の実施形態では、上記ＩｇＶドメインが、このアミノ酸範囲により定められるポリペプチドの少なくとも２５または５０アミノ酸の断片を含有する。
【００７１】
上記第１の融合パートナーは、例示的なＩｇＶドメインをコードする以下のヌクレオチド配列：
【００７２】
【化１０】
2013503205.tif 000012
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされうる。
【００７３】
上記第１の融合パートナーは、マウスアミノ酸配列：
【００７４】
【化１１】
2013503205.tif 000013
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有しうる。
【００７５】
ｂ．ヒト細胞外ドメイン融合パートナー
別の実施形態では、上記融合タンパク質の第１の融合パートナーが、ヒトＢ７−Ｈ４またはその断片の細胞外ドメインを含む。上記第１の融合パートナーは、
【００７６】
【化１２】
2013503205.tif 000014
【００７７】
【化１３】
2013503205.tif 000015
【００７８】
【化１４】
2013503205.tif 000016
【００７９】
【化１５】
2013503205.tif 000017
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされうる。
【００８０】
別の実施形態では、上記第１の融合パートナーが、ヒトアミノ酸配列：
【００８１】
【化１６】
2013503205.tif 000018
【００８２】
【化１７】
2013503205.tif 000019
【００８３】
【化１８】
2013503205.tif 000020
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有しうる。
【００８４】
成熟タンパク質では、シグナル配列が除去される。加えて、他のポリペプチドまたは他の生物に由来するシグナルペプチドを用いて、作製時における宿主からの融合タンパク質の分泌を増強することができる。配列番号５５は、上記シグナル配列を伴わない、配列番号４３および配列番号４９のヒトアミノ酸配列：
【００８５】
【化１９】
2013503205.tif 000021
を示す。
【００８６】
配列番号５６は、上記シグナル配列を伴わない、配列番号４６および配列番号５２のヒトアミノ酸配列：
【００８７】
【化２０】
2013503205.tif 000022
を示す。
【００８８】
配列番号５７は、上記シグナル配列を伴わない、配列番号４４および配列番号５０のヒトアミノ酸配列：
【００８９】
【化２１】
2013503205.tif 000023
を示す。
【００９０】
配列番号５８は、上記シグナル配列を伴わない、配列番号４７および配列番号５３のヒトアミノ酸配列：
【００９１】
【化２２】
2013503205.tif 000024
を示す。
【００９２】
配列番号５９は、上記シグナル配列を伴わない、配列番号４５および配列番号５１のヒトアミノ酸配列：
【００９３】
【化２３】
2013503205.tif 000025
を示す。
【００９４】
配列番号６０は、上記シグナル配列を伴わない、配列番号４８および配列番号５４のヒトアミノ酸配列：
【００９５】
【化２４】
2013503205.tif 000026
を示す。
【００９６】
他の実施形態では、配列番号４５、４８、５１、５４、５９、および６０から、最後のアラニン残基およびセリン残基が除去される。
【００９７】
別の実施形態では、上記融合タンパク質の第１の融合パートナーが、ヒトＢ７−Ｈ４のＩｇＶドメインを含む。一実施形態では、上記ＩｇＶドメインが、少なくとも、配列番号９または配列番号１２の５６位におけるシステイン〜配列番号９または配列番号１２の１３０位におけるシステインを含む。別の実施形態では、上記ＩｇＶドメインが、このアミノ酸範囲により定められるポリペプチドの少なくとも２５または５０アミノ酸の断片を含有する。
【００９８】
上記第１の融合パートナーは、例示的なＩｇＶドメインをコードする以下のヌクレオチド配列：
【００９９】
【化２５】
2013503205.tif 000027
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされうる。
【０１００】
上記第１の融合パートナーは、ヒトアミノ酸配列：
【０１０１】
【化２６】
2013503205.tif 000028
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有しうる。
【０１０２】
ｃ．非ヒト霊長動物細胞外ドメイン融合パートナー
別の実施形態では、上記融合タンパク質の第１の融合パートナーが、非ヒト霊長動物Ｂ７−Ｈ４またはその断片の細胞外ドメインを含む。例示的な非ヒト霊長動物には、チンパンジー（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）、およびカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）が含まれるがこれらに限定されない。
【０１０３】
上記第１の融合パートナーは、チンパンジー（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）アミノ酸配列：
【０１０４】
【化２７】
2013503205.tif 000029
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有しうる。
【０１０５】
成熟タンパク質では、シグナル配列が除去される。加えて、他のポリペプチドまたは他の生物に由来するシグナルペプチドを用いて、作製時における宿主からの融合タンパク質の分泌を増強することができる。
【０１０６】
配列番号６８は、上記シグナル配列を伴わない、配列番号６５のチンパンジーアミノ酸配列：
【０１０７】
【化２８】
2013503205.tif 000030
を示す。
【０１０８】
配列番号６９は、上記シグナル配列を伴わない、配列番号６６のチンパンジーアミノ酸配列：
【０１０９】
【化２９】
2013503205.tif 000031
を示す。
【０１１０】
配列番号７０は、上記シグナル配列を伴わない、配列番号６７のチンパンジーアミノ酸配列：
【０１１１】
【化３０】
2013503205.tif 000032
を示す。
【０１１２】
上記第１の融合パートナーは、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）アミノ酸配列：
【０１１３】
【化３１】
2013503205.tif 000033
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有しうる。
【０１１４】
成熟タンパク質では、シグナル配列が除去される。加えて、他のポリペプチドまたは他の生物に由来するシグナルペプチドを用いて、作製時における宿主からの融合タンパク質の分泌を増強することができる。
【０１１５】
配列番号７４は、上記シグナル配列を伴わない、配列番号７１のアカゲザルアミノ酸配列：
【０１１６】
【化３２】
2013503205.tif 000034
を示す。
【０１１７】
配列番号７５は、上記シグナル配列を伴わない、配列番号７２のアカゲザルアミノ酸配列：
【０１１８】
【化３３】
2013503205.tif 000035
を示す。
【０１１９】
配列番号７６は、上記シグナル配列を伴わない、配列番号７３のアカゲザルアミノ酸配列：
【０１２０】
【化３４】
2013503205.tif 000036
を示す。
【０１２１】
上記第１の融合パートナーは、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）アミノ酸配列：
【０１２２】
【化３５】
2013503205.tif 000037
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有しうる。
【０１２３】
成熟タンパク質では、シグナル配列が除去される。加えて、他のポリペプチドまたは他の生物に由来するシグナルペプチドを用いて、作製時における宿主からの融合タンパク質の分泌を増強することができる。
【０１２４】
配列番号８０は、上記シグナル配列を伴わない、配列番号７７のカニクイザルアミノ酸配列：
【０１２５】
【化３６】
2013503205.tif 000038
を示す。
【０１２６】
配列番号８１は、上記シグナル配列を伴わない、配列番号７８のカニクイザルアミノ酸配列：
【０１２７】
【化３７】
2013503205.tif 000039
を示す。
【０１２８】
配列番号８２は、上記シグナル配列を伴わない、配列番号７９のカニクイザルアミノ酸配列：
【０１２９】
【化３８】
2013503205.tif 000040
を示す。
【０１３０】
他の実施形態では、配列番号６７、７０、７３、７６、７９、および８２から、最後のアラニン残基およびセリン残基が除去される。
【０１３１】
別の実施形態では、上記融合タンパク質の第１の融合パートナーが、チンパンジーＢ７−Ｈ４のＩｇＶドメインを含む。一実施形態では、上記ＩｇＶドメインが、少なくとも、配列番号１５の５２位におけるシステイン〜配列番号１５の１２６位におけるシステインを含む。別の実施形態では、上記ＩｇＶドメインが、このアミノ酸範囲により定められるポリペプチドの少なくとも２５または５０アミノ酸の断片を含有する。
【０１３２】
上記第１の融合パートナーは、以下の例示的なＩｇＶドメインの以下のチンパンジーアミノ酸配列：
【０１３３】
【化３９】
2013503205.tif 000041
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有しうる。
【０１３４】
別の実施形態では、上記融合タンパク質の第１の融合パートナーが、アカゲザルＢ７−Ｈ４のＩｇＶドメインを含む。一実施形態では、上記ＩｇＶドメインが、少なくとも、配列番号１７の５６位におけるシステイン〜配列番号１７の１３０位におけるシステインを含む。別の実施形態では、上記ＩｇＶドメインが、このアミノ酸範囲により定められるポリペプチドの少なくとも２５または５０アミノ酸の断片を含有する。
【０１３５】
上記第１の融合パートナーは、以下の例示的なＩｇＶドメインのアカゲザルアミノ酸配列：
【０１３６】
【化４０】
2013503205.tif 000042
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有しうる。
【０１３７】
別の実施形態では、上記融合タンパク質の第１の融合パートナーが、カニクイザルＢ７−Ｈ４のＩｇＶドメインを含む。一実施形態では、上記ＩｇＶドメインが、少なくとも、配列番号１９の５６位におけるシステイン〜配列番号１９の１３０位におけるシステインを含む。別の実施形態では、上記ＩｇＶドメインが、このアミノ酸範囲により定められるポリペプチドの少なくとも２５または５０アミノ酸の断片を含有する。
【０１３８】
上記第１の融合パートナーは、以下の例示的なＩｇＶドメインのカニクイザルアミノ酸配列：
【０１３９】
【化４１】
2013503205.tif 000043
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有しうる。
【０１４０】
ｄ．Ｂ７−Ｈ４細胞外ドメイン断片
Ｂ７−Ｈ４細胞外ドメインは、Ｂ７−Ｈ４のシグナルペプチドまたは推定膜貫通ドメインに由来する、１つ以上のアミノ酸を含有しうる。分泌時において、切断される上記シグナルペプチドのアミノ酸数は、発現系および宿主に応じて変化しうる。加えて、Ｃ末端またはＮ末端に由来する１つ以上のアミノ酸を逸失しながら、Ｂ７−Ｈ４受容体に対する結合能を保持するＢ７−Ｈ４細胞外ドメインの断片も、本開示される融合タンパク質の融合パートナーとして用いることができる。
【０１４１】
例えば、第１の融合パートナーとして用いうる、適切なマウスＢ７−Ｈ４断片には、
配列番号２６もしくは配列番号２７の、
３２−２５７、３２−２５６、３２−２５５、３２−２５４、３２−２５３、３２−２５２、３２−２５１、３２−２５０、３２−２４９、
３１−２５７、３１−２５６、３１−２５５、３１−２５４、３１−２５３、３１−２５２、３１−２５１、３１−２５０、３１−２４９、
３０−２５７、３０−２５６、３０−２５５、３０−２５４、３０−２５３、３０−２５２、３０−２５１、３０−２５０、３０−２４９、
２９−２５７、２９−２５６、２９−２５５、２９−２５４、２９−２５３、２９−２５２、２９−２５１、２９−２５０、２９−２４９、
２８−２５７、２８−２５６、２８−２５５、２８−２５４、２８−２５３、２８−２５２、２８−２５１、２８−２５０、２８−２４９、
２７−２５７、２７−２５６、２７−２５５、２７−２５４、２７−２５３、２７−２５２、２７−２５１、２７−２５０、２７−２４９、
２６−２５７、２６−２５６、２６−２５５、２６−２５４、２６−２５３、２６−２５２、２６−２５１、２６−２５０、２６−２４９、
２５−２５７、２５−２５６、２５−２５５、２５−２５４、２５−２５３、２５−２５２、２５−２５１、２５−２５０、２５−２４９、
２４−２５７、２４−２５６、２４−２５５、２４−２５４、２４−２５３、２４−２５２、２４−２５１、２４−２５０、２４−２４９、または
配列番号２４もしくは配列番号２５の、
２４−２４９、２４−２４８、２４−２４７、２４−２４６、２４−２４５、２４−２４４、２４−２４３、２４−２４２、２４−２４１、
２３−２４９、２３−２４８、２３−２４７、２３−２４６、２３−２４５、２３−２４４、２３−２４３、２３−２４２、２３−２４１、
２２−２４９、２２−２４８、２２−２４７、２２−２４６、２２−２４５、２２−２４４、２２−２４３、２２−２４２、２２−２４１、
２１−２４９、２１−２４８、２１−２４７、２１−２４６、２１−２４５、２１−２４４、２１−２４３、２１−２４２、２１−２４１、
２０−２４９、２０−２４８、２０−２４７、２０−２４６、２０−２４５、２０−２４４、２０−２４３、２０−２４２、２０−２４１、
１９−２４９、１９−２４８、１９−２４７、１９−２４６、１９−２４５、１９−２４４、１９−２４３、１９−２４２、１９−２４１、
１８−２４９、１８−２４８、１８−２４７、１８−２４６、１８−２４５、１８−２４４、１８−２４３、１８−２４２、１８−２４１、
１７−２４９、１７−２４８、１７−２４７、１７−２４６、１７−２４５、１７−２４４、１７−２４３、１７−２４２、１７−２４１、
１６−２４９、１６−２４８、１６−２４７、１６−２４６、１６−２４５、１６−２４４、１６−２４３、１６−２４２、１６−２４１
が含まれるがこれらに限定されない。
【０１４２】
さらなる適切なマウスＢ７−Ｈ４断片には、
必要に応じて、シグナルペプチドのうちの１〜５アミノ酸をそのＮ末端に結合させた、
配列番号２または配列番号５の、
２８−２５７、２８−２５８、２８−２５９、２８−２６０、２８−２６１、２８−２６２、２８−２６３、
２９−２５７、２９−２５８、２９−２５９、２９−２６０、２９−２６１、２９−２６２、２９−２６３、
３０−２５７、３０−２５８、３０−２５９、３０−２６０、３０−２６１、３０−２６２、３０−２６３、
３１−２５７、３１−２５８、３１−２５９、３１−２６０、３１−２６１、３１−２６２、３１−２６３、
３２−２５７、３２−２５８、３２−２５９、３２−２６０、３２−２６１、３２−２６２、３２−２６３
が含まれるがこれらに限定されない。上記シグナルペプチドは、配列番号２、３、５、６、９、１０、１２、１３、１５、１７、および１９内に含有されるシグナルペプチドを含め、本明細書で開示される任意のシグナルペプチドの場合もあり、当技術分野において公知である任意のシグナルペプチドの場合もある。
【０１４３】
さらなる適切なマウスＢ７−Ｈ４断片には、配列番号３２または配列番号３３に示されるＩｇＶドメインのうちの、少なくとも２５、２０、７５、１００、または１２５アミノ酸を含有する断片が含まれるがこれらに限定されない。
【０１４４】
例示的な断片には、必要に応じて、シグナルペプチドのうちの１〜５アミノ酸をそのＮ末端に結合させた、
配列番号２４もしくは配列番号２５の、
１６−１４４、１６−１４５、１６−１４６、１６−１４７、１６−１４８、１６−１４９、１６−１５０、１６−１５１、１６−１５２、
１７−１４４、１７−１４５、１７−１４６、１７−１４７、１７−１４８、１７−１４９、１７−１５０、１７−１５１、１７−１５２、
１８−１４４、１８−１４５、１８−１４６、１８−１４７、１８−１４８、１８−１４９、１８−１５０、１８−１５１、１８−１５２、
１９−１４４、１９−１４５、１９−１４６、１９−１４７、１９−１４８、１９−１４９、１９−１５０、１９−１５１、１９−１５２、
２０−１４４、２０−１４５、２０−１４６、２０−１４７、２０−１４８、２０−１４９、２０−１５０、２０−１５１、２０−１５２、
２１−１４４、２１−１４５、２１−１４６、２１−１４７、２１−１４８、２１−１４９、２１−１５０、２１−１５１、２１−１５２、
２２−１４４、２２−１４５、２２−１４６、２２−１４７、２２−１４８、２２−１４９、２２−１５０、２２−１５１、２２−１５２、
２３−１４４、２３−１４５、２３−１４６、２３−１４７、２３−１４８、２３−１４９、２３−１５０、２３−１５１、２３−１５２、
２４−１４４、２４−１４５、２４−１４６、２４−１４７、２４−１４８、２４−１４９、２４−１５０、２４−１５１、２４−１５２、または
配列番号２６もしくは配列番号２７の、
２４−１５２、２４−１５３、２４−１５４、２４−１５５、２４−１５６、２４−１５７、２４−１５８、２４−１５９、２４−１６０、
２５−１５２、２５−１５３、２５−１５４、２５−１５５、２５−１５６、２５−１５７、２５−１５８、２５−１５９、２５−１６０、
２６−１５２、２６−１５３、２６−１５４、２６−１５５、２６−１５６、２６−１５７、２６−１５８、２６−１５９、２６−１６０、
２７−１５２、２７−１５３、２７−１５４、２７−１５５、２７−１５６、２７−１５７、２７−１５８、２７−１５９、２７−１６０、
２８−１５２、２８−１５３、２８−１５４、２８−１５５、２８−１５６、２８−１５７、２８−１５８、２８−１５９、２８−１６０、
２９−１５２、２９−１５３、２９−１５４、２９−１５５、２９−１５６、２９−１５７、２９−１５８、２９−１５９、２９−１６０、
３０−１５２、３０−１５３、３０−１５４、３０−１５５、３０−１５６、３０−１５７、３０−１５８、３０−１５９、３０−１６０、
３１−１５２、３１−１５３、３１−１５４、３１−１５５、３１−１５６、３１−１５７、３１−１５８、３１−１５９、３１−１６０、
３２−１５２、３２−１５３、３２−１５４、３２−１５５、３２−１５６、３２−１５７、３２−１５８、３２−１５９、３２−１６０
が含まれるがこれらに限定されない。上記シグナルペプチドは、配列番号２、３、５、６、９、１０、１２、１３、１５、１７、および１９内に含有されるシグナルペプチドを含め、本明細書で開示される任意のシグナルペプチドの場合もあり、当技術分野において公知である任意のシグナルペプチドの場合もある。
【０１４５】
第１の融合パートナーとして用いうる、例示的である適切なヒトＢ７−Ｈ４断片には、
配列番号４９もしくは配列番号５２の、
３２−２４９、３２−２４８、３２−２４７、３２−２４６、３２−２４５、３２−２４４、３２−２４３、３２−２４２、３２−２４１、
３１−２４９、３１−２４８、３１−２４７、３１−２４６、３１−２４５、３１−２４４、３１−２４３、３１−２４２、３１−２４１、
３０−２４９、３０−２４８、３０−２４７、３０−２４６、３０−２４５、３０−２４４、３０−２４３、３０−２４２、３０−２４１、
２９−２４９、２９−２４８、２９−２４７、２９−２４６、２９−２４５、２９−２４４、２９−２４３、２９−２４２、２９−２４１、
２８−２４９、２８−２４８、２８−２４７、２８−２４６、２８−２４５、２８−２４４、２８−２４３、２８−２４２、２８−２４１、
２７−２４９、２７−２４８、２７−２４７、２７−２４６、２７−２４５、２７−２４４、２７−２４３、２７−２４２、２７−２４１、
２６−２４９、２６−２４８、２６−２４７、２６−２４６、２６−２４５、２６−２４４、２６−２４３、２６−２４２、２６−２４１、
２５−２４９、２５−２４８、２５−２４７、２５−２４６、２５−２４５、２５−２４４、２５−２４３、２５−２４２、２５−２４１、
２４−２４９、２４−２４８、２４−２４７、２４−２４６、２４−２４５、２４−２４４、２４−２４３、２４−２４２、２４−２４１、または
配列番号５０もしくは配列番号５３の、
３２−２４５、３２−２４４、３２−２４３、３２−２４２、３２−２４１、３２−２４０、３２−２３９、３２−２３８、３２−２３７、
３１−２４５、３１−２４４、３１−２４３、３１−２４２、３１−２４１、３１−２４０、３１−２３９、３１−２３８、３１−２３７、
３０−２４５、３０−２４４、３０−２４３、３０−２４２、３０−２４１、３０−２４０、３０−２３９、３０−２３８、３０−２３７、
２９−２４５、２９−２４４、２９−２４３、２９−２４２、２９−２４１、２９−２４０、２９−２３９、２９−２３８、２９−２３７、
２８−２４５、２８−２４４、２８−２４３、２８−２４２、２８−２４１、２８−２４０、２８−２３９、２８−２３８、２８−２３７、
２７−２４５、２７−２４４、２７−２４３、２７−２４２、２７−２４１、２７−２４０、２７−２３９、２７−２３８、２７−２３７、
２６−２４５、２６−２４４、２６−２４３、２６−２４２、２６−２４１、２６−２４０、２６−２３９、２６−２３８、２６−２３７、
２５−２４５、２５−２４４、２５−２４３、２５−２４２、２５−２４１、２５−２４０、２５−２３９、２５−２３８、２５−２３７、
２４−２４５、２４−２４４、２４−２４３、２４−２４２、２４−２４１、２４−２４０、２４−２３９、２４−２３８、２４−２３７、または
配列番号５１もしくは配列番号５４の、
３２−２５９、３２−２５８、３２−２５７、３２−２５６、３２−２５５、３２−２５４、３２−２５３、３２−２５２、３２−２５１、
３１−２５９、３１−２５８、３１−２５７、３１−２５６、３１−２５５、３１−２５４、３１−２５３、３１−２５２、３１−２５１、
３０−２５９、３０−２５８、３０−２５７、３０−２５６、３０−２５５、３０−２５４、３０−２５３、３０−２５２、３０−２５１、
２９−２５９、２９−２５８、２９−２５７、２９−２５６、２９−２５５、２９−２５４、２９−２５３、２９−２５２、２９−２５１、
２８−２５９、２８−２５８、２８−２５７、２８−２５６、２８−２５５、２８−２５４、２８−２５３、２８−２５２、２８−２５１、
２７−２５９、２７−２５８、２７−２５７、２７−２５６、２７−２５５、２７−２５４、２７−２５３、２７−２５２、２７−２５１、
２６−２５９、２６−２５８、２６−２５７、２６−２５６、２６−２５５、２６−２５４、２６−２５３、２６−２５２、２６−２５１、
２５−２５９、２５−２５８、２５−２５７、２５−２５６、２５−２５５、２５−２５４、２５−２５３、２５−２５２、２５−２５１、
２４−２５９、２４−２５８、２４−２５７、２４−２５６、２４−２５５、２４−２５４、２４−２５３、２４−２５２、２４−２５１、または
配列番号４３もしくは配列番号４６の、
２４−２４１、２４−２４０、２４−２３９、２４−２３８、２４−２３７、２４−２３６、２４−２３５、２４−２３４、２４−２３３、
２３−２４１、２３−２４０、２３−２３９、２３−２３８、２３−２３７、２３−２３６、２３−２３５、２３−２３４、２３−２３３、
２２−２４１、２２−２４０、２２−２３９、２２−２３８、２２−２３７、２２−２３６、２２−２３５、２２−２３４、２２−２３３、
２１−２４１、２１−２４０、２１−２３９、２１−２３８、２１−２３７、２１−２３６、２１−２３５、２１−２３４、２１−２３３、
２０−２４１、２０−２４０、２０−２３９、２０−２３８、２０−２３７、２０−２３６、２０−２３５、２０−２３４、２０−２３３、
１９−２４１、１９−２４０、１９−２３９、１９−２３８、１９−２３７、１９−２３６、１９−２３５、１９−２３４、１９−２３３、
１８−２４１、１８−２４０、１８−２３９、１８−２３８、１８−２３７、１８−２３６、１８−２３５、１８−２３４、１８−２３３、
１７−２４１、１７−２４０、１７−２３９、１７−２３８、１７−２３７、１７−２３６、１７−２３５、１７−２３４、１７−２３３、
１６−２４１、１６−２４０、１６−２３９、１６−２３８、１６−２３７、１６−２３６、１６−２３５、１６−２３４、１６−２３３、または
配列番号４４もしくは配列番号４７の、
２４−２３７、２４−２３６、２４−２３５、２４−２３４、２４−２３３、２４−２３２、２４−２３１、２４−２３０、２４−２２９、
２３−２３７、２３−２３６、２３−２３５、２３−２３４、２３−２３３、２３−２３２、２３−２３１、２３−２３０、２３−２２９、
２２−２３７、２２−２３６、２２−２３５、２２−２３４、２２−２３３、２２−２３２、２２−２３１、２２−２３０、２２−２２９、
２１−２３７、２１−２３６、２１−２３５、２１−２３４、２１−２３３、２１−２３２、２１−２３１、２１−２３０、２１−２２９、
２０−２３７、２０−２３６、２０−２３５、２０−２３４、２０−２３３、２０−２３２、２０−２３１、２０−２３０、２０−２２９、
１９−２３７、１９−２３６、１９−２３５、１９−２３４、１９−２３３、１９−２３２、１９−２３１、１９−２３０、１９−２２９、
１８−２３７、１８−２３６、１８−２３５、１８−２３４、１８−２３３、１８−２３２、１８−２３１、１８−２３０、１８−２２９、
１７−２３７、１７−２３６、１７−２３５、１７−２３４、１７−２３３、１７−２３２、１７−２３１、１７−２３０、１７−２２９、
１６−２３７、１６−２３６、１６−２３５、１６−２３４、１６−２３３、１６−２３２、１６−２３１、１６−２３０、１６−２２９、または
配列番号４５もしくは配列番号４８の、
２４−２５１、２４−２５０、２４−２４９、２４−２４８、２４−２４７、２４−２４６、２４−２４５、２４−２４４、２４−２４３、
２３−２５１、２３−２５０、２３−２４９、２３−２４８、２３−２４７、２３−２４６、２３−２４５、２３−２４４、２３−２４３、
２２−２５１、２２−２５０、２２−２４９、２２−２４８、２２−２４７、２２−２４６、２２−２４５、２２−２４４、２２−２４３、
２１−２５１、２１−２５０、２１−２４９、２１−２４８、２１−２４７、２１−２４６、２１−２４５、２１−２４４、２１−２４３、
２０−２５１、２０−２５０、２０−２４９、２０−２４８、２０−２４７、２０−２４６、２０−２４５、２０−２４４、２０−２４３、
１９−２５１、１９−２５０、１９−２４９、１９−２４８、１９−２４７、１９−２４６、１９−２４５、１９−２４４、１９−２４３、
１８−２５１、１８−２５０、１８−２４９、１８−２４８、１８−２４７、１８−２４６、１８−２４５、１８−２４４、１８−２４３、
１７−２５１、１７−２５０、１７−２４９、１７−２４８、１７−２４７、１７−２４６、１７−２４５、１７−２４４、１７−２４３、
１６−２５１、１６−２５０、１６−２４９、１６−２４８、１６−２４７、１６−２４６、１６−２４５、１６−２４４、１６−２４３
が含まれるがこれらに限定されない。
【０１４６】
さらなる適切なヒトＢ７−Ｈ４断片には、
必要に応じて、シグナルペプチドのうちの１〜５アミノ酸をそのＮ末端に結合させた、
配列番号９または配列番号１２の、
２７−２４９、２７−２５０、２７−２５１、２７−２５２、２７−２５３、２７−２５４、２７−２５５、２７−２５６、２７−２５７、２７−２５９、２７−２６０、
２８−２４９、２８−２５０、２８−２５１、２８−２５２、２８−２５３、２８−２５４、２８−２５５、２８−２５６、２８−２５７、２８−２５９、２８−２６０、
２９−２４９、２９−２５０、２９−２５１、２９−２５２、２９−２５３、２９−２５４、２９−２５５、２９−２５６、２９−２５７、２９−２５９、２９−２６０、
３０−２４９、３０−２５０、３０−２５１、３０−２５２、３０−２５３、３０−２５４、３０−２５５、３０−２５６、３０−２５７、３０−２５９、３０−２６０、
３１−２４９、３１−２５０、３１−２５１、３１−２５２、３１−２５３、３１−２５４、３１−２５５、３１−２５６、３１−２５７、３１−２５９、３１−２６０、
３２−２４９、３２−２５０、３２−２５１、３２−２５２、３２−２５３、３２−２５４、３２−２５５、３２−２５６、３２−２５７、３２−２５９、３２−２６０
が含まれるがこれらに限定されない。上記シグナルペプチドは、配列番号２、３、５、６、９、１０、１２、１３、１５、１７、および１９内に含有されるシグナルペプチドを含め、本明細書で開示される任意のシグナルペプチドの場合もあり、当技術分野において公知である任意のシグナルペプチドの場合もある。
【０１４７】
さらなる適切なヒトＢ７−Ｈ４断片には、配列番号６３または配列番号６４に示されるＩｇＶドメインのうちの、少なくとも２５、２０、７５、１００、または１２５アミノ酸を含有する断片が含まれるがこれらに限定されない。例示的な断片には、必要に応じて、シグナルペプチドのうちの１〜５アミノ酸をそのＮ末端に結合させた、
配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、もしくは配列番号４８のうちのいずれかの、
１６−１４４、１６−１４５、１６−１４６、１６−１４７、１６−１４８、１６−１４９、１６−１５０、１６−１５１、１６−１５２、
１７−１４４、１７−１４５、１７−１４６、１７−１４７、１７−１４８、１７−１４９、１７−１５０、１７−１５１、１７−１５２、
１８−１４４、１８−１４５、１８−１４６、１８−１４７、１８−１４８、１８−１４９、１８−１５０、１８−１５１、１８−１５２、
１９−１４４、１９−１４５、１９−１４６、１９−１４７、１９−１４８、１９−１４９、１９−１５０、１９−１５１、１９−１５２、
２０−１４４、２０−１４５、２０−１４６、２０−１４７、２０−１４８、２０−１４９、２０−１５０、２０−１５１、２０−１５２、
２１−１４４、２１−１４５、２１−１４６、２１−１４７、２１−１４８、２１−１４９、２１−１５０、２１−１５１、２１−１５２、
２２−１４４、２２−１４５、２２−１４６、２２−１４７、２２−１４８、２２−１４９、２２−１５０、２２−１５１、２２−１５２、
２３−１４４、２３−１４５、２３−１４６、２３−１４７、２３−１４８、２３−１４９、２３−１５０、２３−１５１、２３−１５２、
２４−１４４、２４−１４５、２４−１４６、２４−１４７、２４−１４８、２４−１４９、２４−１５０、２４−１５１、２４−１５２
または
配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、もしくは配列番号５４のうちのいずれかの、
２４−１５２、２４−１５３、２４−１５４、２４−１５５、２４−１５６、２４−１５７、２４−１５８、２４−１５９、２４−１６０、
２５−１５２、２５−１５３、２５−１５４、２５−１５５、２５−１５６、２５−１５７、２５−１５８、２５−１５９、２５−１６０、
２６−１５２、２６−１５３、２６−１５４、２６−１５５、２６−１５６、２６−１５７、２６−１５８、２６−１５９、２６−１６０、
２７−１５２、２７−１５３、２７−１５４、２７−１５５、２７−１５６、２７−１５７、２７−１５８、２７−１５９、２７−１６０、
２８−１５２、２８−１５３、２８−１５４、２８−１５５、２８−１５６、２８−１５７、２８−１５８、２８−１５９、２８−１６０、
２９−１５２、２９−１５３、２９−１５４、２９−１５５、２９−１５６、２９−１５７、２９−１５８、２９−１５９、２９−１６０、
３０−１５２、３０−１５３、３０−１５４、３０−１５５、３０−１５６、３０−１５７、３０−１５８、３０−１５９、３０−１６０、
３１−１５２、３１−１５３、３１−１５４、３１−１５５、３１−１５６、３１−１５７、３１−１５８、３１−１５９、３１−１６０、
３２−１５２、３２−１５３、３２−１５４、３２−１５５、３２−１５６、３２−１５７、３２−１５８、３２−１５９、３２−１６０
が含まれるがこれらに限定されない。上記シグナルペプチドは、配列番号２、３、５、６、９、１０、１２、１３、１５、１７、および１９内に含有されるシグナルペプチドを含め、本明細書で開示される任意のシグナルペプチドの場合もあり、当技術分野において公知である任意のシグナルペプチドの場合もある。
【０１４８】
第１の融合パートナーとして用いうる、例示的である適切な非ヒト霊長動物Ｂ７−Ｈ４断片には、
配列番号７１もしくは配列番号７７の、
３２−２４９、３２−２４８、３２−２４７、３２−２４６、３２−２４５、３２−２４４、３２−２４３、３２−２４２、３２−２４１、
３１−２４９、３１−２４８、３１−２４７、３１−２４６、３１−２４５、３１−２４４、３１−２４３、３１−２４２、３１−２４１、
３０−２４９、３０−２４８、３０−２４７、３０−２４６、３０−２４５、３０−２４４、３０−２４３、３０−２４２、３０−２４１、
２９−２４９、２９−２４８、２９−２４７、２９−２４６、２９−２４５、２９−２４４、２９−２４３、２９−２４２、２９−２４１、
２８−２４９、２８−２４８、２８−２４７、２８−２４６、２８−２４５、２８−２４４、２８−２４３、２８−２４２、２８−２４１、
２７−２４９、２７−２４８、２７−２４７、２７−２４６、２７−２４５、２７−２４４、２７−２４３、２７−２４２、２７−２４１、
２６−２４９、２６−２４８、２６−２４７、２６−２４６、２６−２４５、２６−２４４、２６−２４３、２６−２４２、２６−２４１、
２５−２４９、２５−２４８、２５−２４７、２５−２４６、２５−２４５、２５−２４４、２５−２４３、２５−２４２、２５−２４１、
２４−２４９、２４−２４８、２４−２４７、２４−２４６、２４−２４５、２４−２４４、２４−２４３、２４−２４２、２４−２４１、または
配列番号７２もしくは配列番号７８の、
３２−２４５、３２−２４４、３２−２４３、３２−２４２、３２−２４１、３２−２４０、３２−２３９、３２−２３８、３２−２３７、
３１−２４５、３１−２４４、３１−２４３、３１−２４２、３１−２４１、３１−２４０、３１−２３９、３１−２３８、３１−２３７、
３０−２４５、３０−２４４、３０−２４３、３０−２４２、３０−２４１、３０−２４０、３０−２３９、３０−２３８、３０−２３７、
２９−２４５、２９−２４４、２９−２４３、２９−２４２、２９−２４１、２９−２４０、２９−２３９、２９−２３８、２９−２３７、
２８−２４５、２８−２４４、２８−２４３、２８−２４２、２８−２４１、２８−２４０、２８−２３９、２８−２３８、２８−２３７、
２７−２４５、２７−２４４、２７−２４３、２７−２４２、２７−２４１、２７−２４０、２７−２３９、２７−２３８、２７−２３７、
２６−２４５、２６−２４４、２６−２４３、２６−２４２、２６−２４１、２６−２４０、２６−２３９、２６−２３８、２６−２３７、
２５−２４５、２５−２４４、２５−２４３、２５−２４２、２５−２４１、２５−２４０、２５−２３９、２５−２３８、２５−２３７、
２４−２４５、２４−２４４、２４−２４３、２４−２４２、２４−２４１、２４−２４０、２４−２３９、２４−２３８、２４−２３７、または
配列番号７３もしくは配列番号７９の、
３２−２５９、３２−２５８、３２−２５７、３２−２５６、３２−２５５、３２−２５４、３２−２５３、３２−２５２、３２−２５１、
３１−２５９、３１−２５８、３１−２５７、３１−２５６、３１−２５５、３１−２５４、３１−２５３、３１−２５２、３１−２５１、
３０−２５９、３０−２５８、３０−２５７、３０−２５６、３０−２５５、３０−２５４、３０−２５３、３０−２５２、３０−２５１、
２９−２５９、２９−２５８、２９−２５７、２９−２５６、２９−２５５、２９−２５４、２９−２５３、２９−２５２、２９−２５１、
２８−２５９、２８−２５８、２８−２５７、２８−２５６、２８−２５５、２８−２５４、２８−２５３、２８−２５２、２８−２５１、
２７−２５９、２７−２５８、２７−２５７、２７−２５６、２７−２５５、２７−２５４、２７−２５３、２７−２５２、２７−２５１、
２６−２５９、２６−２５８、２６−２５７、２６−２５６、２６−２５５、２６−２５４、２６−２５３、２６−２５２、２６−２５１、
２５−２５９、２５−２５８、２５−２５７、２５−２５６、２５−２５５、２５−２５４、２５−２５３、２５−２５２、２５−２５１、
２４−２５９、２４−２５８、２４−２５７、２４−２５６、２４−２５５、２４−２５４、２４−２５３、２４−２５２、２４−２５１、または
配列番号６５の、
２８−２４５、２８−２４４、２８−２４３、２８−２４２、２８−２４１、２８−２４０、２８−２３９、２８−２３８、２８−２３７、
２７−２４５、２７−２４４、２７−２４３、２７−２４２、２７−２４１、２７−２４０、２７−２３９、２７−２３８、２７−２３７、
２６−２４５、２６−２４４、２６−２４３、２６−２４２、２６−２４１、２６−２４０、２６−２３９、２６−２３８、２６−２３７、
２５−２４５、２５−２４４、２５−２４３、２５−２４２、２５−２４１、２５−２４０、２５−２３９、２５−２３８、２５−２３７、
２４−２４５、２４−２４４、２４−２４３、２４−２４２、２４−２４１、２４−２４０、２４−２３９、２４−２３８、２４−２３７、
２３−２４５、２３−２４４、２３−２４３、２３−２４２、２３−２４１、２３−２４０、２３−２３９、２３−２３８、２３−２３７、
２２−２４５、２２−２４４、２２−２４３、２２−２４２、２２−２４１、２２−２４０、２２−２３９、２２−２３８、２２−２３７、
２１−２４５、２１−２４４、２１−２４３、２１−２４２、２１−２４１、２１−２４０、２１−２３９、２１−２３８、２１−２３７、
２０−２４５、２０−２４４、２０−２４３、２０−２４２、２０−２４１、２０−２４０、２０−２３９、２０−２３８、２０−２３７、または
配列番号６６の、
２８−２４１、２８−２４０、２８−２３９、２８−２３８、２８−２３７、２８−２３６、２８−２３５、２８−２３４、２８−２３３、
２７−２４１、２７−２４０、２７−２３９、２７−２３８、２７−２３７、２７−２３６、２７−２３５、２７−２３４、２７−２３３、
２６−２４１、２６−２４０、２６−２３９、２６−２３８、２６−２３７、２６−２３６、２６−２３５、２６−２３４、２６−２３３、
２５−２４１、２５−２４０、２５−２３９、２５−２３８、２５−２３７、２５−２３６、２５−２３５、２５−２３４、２５−２３３、
２４−２４１、２４−２４０、２４−２３９、２４−２３８、２４−２３７、２４−２３６、２４−２３５、２４−２３４、２４−２３３、
２３−２４１、２３−２４０、２３−２３９、２３−２３８、２３−２３７、２３−２３６、２３−２３５、２３−２３４、２３−２３３、
２２−２４１、２２−２４０、２２−２３９、２２−２３８、２２−２３７、２２−２３６、２２−２３５、２２−２３４、２２−２３３、
２１−２４１、２１−２４０、２１−２３９、２１−２３８、２１−２３７、２１−２３６、２１−２３５、２１−２３４、２１−２３３、
２０−２４１、２０−２４０、２０−２３９、２０−２３８、２０−２３７、２０−２３６、２０−２３５、２０−２３４、２０−２３３、または
配列番号６７の、
２８−２５５、２８−２５４、２８−２５３、２８−２５２、２８−２５１、２８−２５０、２８−２４９、２８−２４８、２８−２４７、
２７−２５５、２７−２５４、２７−２５３、２７−２５２、２７−２５１、２７−２５０、２７−２４９、２７−２４８、２７−２４７、
２６−２５５、２６−２５４、２６−２５３、２６−２５２、２６−２５１、２６−２５０、２６−２４９、２６−２４８、２６−２４７、
２５−２５５、２５−２５４、２５−２５３、２５−２５２、２５−２５１、２５−２５０、２５−２４９、２５−２４８、２５−２４７、
２４−２５５、２４−２５４、２４−２５３、２４−２５２、２４−２５１、２４−２５０、２４−２４９、２４−２４８、２４−２４７、
２３−２５５、２３−２５４、２３−２５３、２３−２５２、２３−２５１、２３−２５０、２３−２４９、２３−２４８、２３−２４７、
２２−２５５、２２−２５４、２２−２５３、２２−２５２、２２−２５１、２２−２５０、２２−２４９、２２−２４８、２２−２４７、
２１−２５５、２１−２５４、２１−２５３、２１−２５２、２１−２５１、２１−２５０、２１−２４９、２１−２４８、２１−２４７、
２０−２５５、２０−２５４、２０−２５３、２０−２５２、２０−２５１、２０−２５０、２０−２４９、２０−２４８、２０−２４７
が含まれるがこれらに限定されない。
【０１４９】
さらなる適切な非ヒト霊長動物Ｂ７−Ｈ４断片には、
必要に応じて、シグナルペプチドのうちの１〜５アミノ酸をそのＮ末端に結合させた、
配列番号１７または配列番号１９の、
２７−２４９、２７−２５０、２７−２５１、２７−２５２、２７−２５３、２７−２５４、２７−２５５、２７−２５６、２７−２５７、２７−２５９、２７−２６０、
２８−２４９、２８−２５０、２８−２５１、２８−２５２、２８−２５３、２８−２５４、２８−２５５、２８−２５６、２８−２５７、２８−２５９、２８−２６０、
２９−２４９、２９−２５０、２９−２５１、２９−２５２、２９−２５３、２９−２５４、２９−２５５、２９−２５６、２９−２５７、２９−２５９、２９−２６０、
３０−２４９、３０−２５０、３０−２５１、３０−２５２、３０−２５３、３０−２５４、３０−２５５、３０−２５６、３０−２５７、３０−２５９、３０−２６０、
３１−２４９、３１−２５０、３１−２５１、３１−２５２、３１−２５３、３１−２５４、３１−２５５、３１−２５６、３１−２５７、３１−２５９、３１−２６０、
３２−２４９、３２−２５０、３２−２５１、３２−２５２、３２−２５３、３２−２５４、３２−２５５、３２−２５６、３２−２５７、３２−２５９、３２−２６０
が含まれるがこれらに限定されない。上記シグナルペプチドは、配列番号２、３、５、６、９、１０、１２、１３、１５、１７、および１９内に含有されるシグナルペプチドを含め、本明細書で開示される任意のシグナルペプチドの場合もあり、当技術分野において公知である任意のシグナルペプチドの場合もある。
【０１５０】
さらなる適切な非ヒト霊長動物Ｂ７−Ｈ４断片には、
必要に応じて、シグナルペプチドのうちの１〜５アミノ酸をそのＮ末端に結合させた、
配列番号１５の、
２３−２４５、２３−２４６、２３−２４７、２３−２４８、２３−２４９、２３−２５０、２３−２５１、２３−２５２、２３−２５３、２３−２５４、２３−２５５、
２４−２４５、２４−２４６、２４−２４７、２４−２４８、２４−２４９、２４−２５０、２４−２５１、２４−２５２、２４−２５３、２４−２５４、２４−２５５、
２５−２４５、２５−２４６、２５−２４７、２５−２４８、２５−２４９、２５−２５０、２５−２５１、２５−２５２、２５−２５３、２５−２５４、２５−２５５、
２６−２４５、２６−２４６、２６−２４７、２６−２４８、２６−２４９、２６−２５０、２６−２５１、２６−２５２、２６−２５３、２６−２５４、２６−２５５、
２７−２４５、２７−２４６、２７−２４７、２７−２４８、２７−２４９、２７−２５０、２７−２５１、２７−２５２、２７−２５３、２７−２５４、２７−２５５、
２８−２４５、２８−２４６、２８−２４７、２８−２４８、２８−２４９、２８−２５０、２８−２５１、２８−２５２、２８−２５３、２８−２５４、２８−２５５
が含まれるがこれらに限定されない。上記シグナルペプチドは、配列番号２、３、５、６、９、１０、１２、１３、１５、１７、および１９内に含有されるシグナルペプチドを含め、本明細書で開示される任意のシグナルペプチドの場合もあり、当技術分野において公知である任意のシグナルペプチドの場合もある。
【０１５１】
さらなる適切な非ヒト霊長動物Ｂ７−Ｈ４断片には、配列番号８３、配列番号８４、または配列番号８５に示されるＩｇＶドメインのうちの、少なくとも２５、２０、７５、１００、または１２５アミノ酸を含有する断片が含まれるがこれらに限定されない。例示的な断片には、必要に応じて、シグナルペプチドのうちの１〜５アミノ酸をそのＮ末端に結合させた、配列番号６５、配列番号６６、もしくは配列番号６７のうちのいずれかの、
２０−１４８、２０−１４９、２０−１５０、２０−１５１、２０−１５２、２０−１５３、２０−１５４、２０−１５５、２０−１５６、
２１−１４８、２１−１４９、２１−１５０、２１−１５１、２１−１５２、２１−１５３、２１−１５４、２１−１５５、２１−１５６、
２２−１４８、２２−１４９、２２−１５０、２２−１５１、２２−１５２、２２−１５３、２２−１５４、２２−１５５、２２−１５６、
２３−１４８、２３−１４９、２３−１５０、２３−１５１、２３−１５２、２３−１５３、２３−１５４、２３−１５５、２３−１５６、
２４−１４８、２４−１４９、２４−１５０、２４−１５１、２４−１５２、２４−１５３、２４−１５４、２４−１５５、２０−１５６、
２５−１４８、２５−１４９、２５−１５０、２５−１５１、２５−１５２、２５−１５３、２５−１５４、２５−１５５、２５−１５６、
２６−１４８、２６−１４９、２６−１５０、２６−１５１、２６−１５２、２６−１５３、２６−１５４、２６−１５５、２６−１５６、
２７−１４８、２７−１４９、２７−１５０、２７−１５１、２７−１５２、２７−１５３、２７−１５４、２７−１５５、２７−１５６、
２８−１４８、２８−１４９、２８−１５０、２８−１５１、２８−１５２、２８−１５３、２８−１５４、２８−１５５、２８−１５６、または
配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７７、配列番号７８、もしくは配列番号７９のうちのいずれかの、
２４−１５２、２４−１５３、２４−１５４、２４−１５５、２４−１５６、２４−１５７、２４−１５８、２４−１５９、２４−１６０、
２５−１５２、２５−１５３、２５−１５４、２５−１５５、２５−１５６、２５−１５７、２５−１５８、２５−１５９、２５−１６０、
２６−１５２、２６−１５３、２６−１５４、２６−１５５、２６−１５６、２６−１５７、２６−１５８、２６−１５９、２６−１６０、
２７−１５２、２７−１５３、２７−１５４、２７−１５５、２７−１５６、２７−１５７、２７−１５８、２７−１５９、２７−１６０、
２８−１５２、２８−１５３、２８−１５４、２８−１５５、２８−１５６、２８−１５７、２８−１５８、２８−１５９、２８−１６０、
２９−１５２、２９−１５３、２９−１５４、２９−１５５、２９−１５６、２９−１５７、２９−１５８、２９−１５９、２９−１６０、
３０−１５２、３０−１５３、３０−１５４、３０−１５５、３０−１５６、３０−１５７、３０−１５８、３０−１５９、３０−１６０、
３１−１５２、３１−１５３、３１−１５４、３１−１５５、３１−１５６、３１−１５７、３１−１５８、３１−１５９、３１−１６０、
３２−１５２、３２−１５３、３２−１５４、３２−１５５、３２−１５６、３２−１５７、３２−１５８、３２−１５９、３２−１６０
が含まれるがこれらに限定されない。上記シグナルペプチドは、配列番号２、３、５、６、９、１０、１２、１３、１５、１７、および１９内に含有されるシグナルペプチドを含め、本明細書で開示される任意のシグナルペプチドの場合もあり、当技術分野において公知である任意のシグナルペプチドの場合もある。
【０１５２】
２．Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド改変体
有用な改変体には、本明細書で説明されるアッセイのうちのいずれかにより示されるような、生物学的活性を増大させるか、またはそのタンパク質の半減期もしくは安定性を増大させる改変体が含まれる。Ｂ７−Ｈ４の活性を有する、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドおよびＢ７−Ｈ４断片、またはこれらの融合物を操作して、生物学的活性を増大させることができる。好ましい実施形態では、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドまたはＢ７−Ｈ４融合タンパク質が、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞に対するその分子の結合を増大させ、上記Ｔ細胞に阻害シグナルを伝達する、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失、または挿入により改変されている。
【０１５３】
他の好ましい改変体は、他の免疫細胞と対比して、１つのＴ細胞型に選択的に結合するように操作されたＢ７−Ｈ４ポリペプチドである。例えば、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドを操作して、Ｔｒｅｇ、Ｔｈ０細胞、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、またはＴｈ２２細胞に優先的に結合させることができる。優先的結合とは、１つの細胞型について、別の細胞型を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上上回る結合を指す。
【０１５４】
Ｂ７−Ｈ４のさらに他の改変体を操作して、免疫細胞に対する結合性を野生型Ｂ７−Ｈ４と比べて低減することができる。これらの改変体を、より強力な結合特性を有する改変体と組合わせて用いて、影響が中程度であるように免疫反応を調節することができる。
【０１５５】
最後に、改変体のＢ７−Ｈ４ポリペプチドを操作して、半減期を野生型と比べて延長することができる。これらの改変体は、酵素的分解に耐性であるように改変することが典型的である。例示的な改変には、酵素的分解に耐性である、改変アミノ酸残基および改変ペプチド結合が含まれる。当技術分野では、これを達成するための各種の修飾が公知である。例えば、Ｂ７−Ｈ４の膜近傍領域は、例えば、プロテアーゼのプロタンパク質コンベルターゼファミリーのメンバーによるならば、認識および切断される可能性がありうる二塩基性のモチーフである、ＫＲＲＳモチーフを含む。このモチーフ（ＫＲＲＳ）を除去して、半減期を延長することができる。上記改変体を改変して、受容体に対する親和性が、血清のｐＨならびにエンドソームのｐＨにおいて、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４断片、またはこれらの融合物の半減期に対して及ぼす影響について調整することもできる。
【０１５６】
Ｂ．第２のポリペプチド
上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドは、第２のポリペプチドに融合させることができる。上記第２のポリペプチドの存在は、上記Ｂ７−Ｈ４融合ポリペプチドの可溶性、安定性、親和性、および／または価数を変化させうる。本明細書で用いられる「価数」とは、分子１個当たりで利用可能な結合部位の数を指す。一実施形態では、上記第２のポリペプチドが、異なる供給源または異なるタンパク質に由来するポリペプチドである。
【０１５７】
一実施形態では、上記第２のポリペプチドが、ヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域に対応するか、またはマウス免疫グロブリンＣγ２ａ鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域に対応するアミノ酸配列を有することが好ましい、免疫グロブリン重鎖定常領域のうちの１つ以上のドメインを含有する。配列番号８８および８９は、ヒト免疫グロブリンＣγ１のヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の例示的な配列を示す。
【０１５８】
好ましい二量体融合タンパク質では、その二量体は、二量体化した通常のＩｇ重鎖内でジスルフィド結合するＣｙｓ残基と同じＣｙｓ残基である、上記Ｉｇ重鎖の２つからのヒンジ領域内のシステイン残基が共有結合することから生じる。このようなタンパク質を、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇと称する。
【０１５９】
一実施形態では、上記免疫グロブリン定常ドメインが、特定の細胞型への結合性を増強するか、バイオアベイラビリティーを増大させるか、またはＢ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質、またはこれらの断片の安定性を増大させる、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を含有しうる。上記で説明した通り、適切なアミノ酸置換には、保存的置換および非保存的置換が含まれる。
【０１６０】
別の実施形態では、上記第２のポリペプチドが、それを介してさらなる分子が、上記Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質に結合されうる、コンジュゲーションドメインを有しうる。このような一実施形態では、そのコンジュゲートされる分子が、特定の器官または組織を上記融合タンパク質の標的とすることが可能である。このような別の実施形態では、上記コンジュゲートされる分子が、上記Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質の効果を増強するかまたは増進させることができる別の免疫調節剤である。別の実施形態では、上記コンジュゲートされる分子が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
【０１６１】
上記融合タンパク質のＦｃ部分は、アイソタイプもしくはサブクラスにより異なる場合があり、キメラ体もしくはハイブリッド体とすることが可能であり、かつ／または、例えば、エフェクター機能、半減期の調節、組織への結合可能性を改善し、安定性などの生物物理的な特徴を増強し、生産の効率を改善する（ならびにより廉価とする）ように改変することができる。当技術分野では、開示される融合タンパク質を構築するのに有用な多くの改変、ならびにそれらを行う方法が当該分野で公知であり、例えば、Ｍｕｅｌｌｅｒら、Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎ．、３４巻（６号）：４４１〜４５２頁（１９９７年）；  Ｓｗａｎｎら、Ｃｕｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎ．、２０巻：４９３〜４９９頁（２００８年）；ならびにＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎ．、２０巻：４６０〜４７０頁（２００８年）を参照されたい。一部の実施形態では、上記Ｆｃ領域が、天然のＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ２  Ｆｃ領域、またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、上記Ｆｃ領域が、ハイブリッド体、例えば、ＩｇＧ２  Ｆｃ定常領域／ＩｇＧ４  Ｆｃ定常領域からなるキメラ体である。上記Ｆｃ領域に対する改変には、Ｆｃガンマ受容体および補体への結合を防止するようにＩｇＧ４を修飾すること；１つ以上のＦｃガンマ受容体への結合を改善するようにＩｇＧ１を改変すること；エフェクター機能を最小化するようにＩｇＧ１を改変すること（アミノ酸の変化）；ＩｇＧ１のグリカンを変化させる／取り除くこと（典型的には、発現宿主を変更することによる）；ならびにＦｃＲｎに対するＩｇＧ１のｐＨ依存性結合を変化させることが含まれるがこれらに限定されない。上記Ｆｃ領域は、ヒンジ領域の全体を含む場合もあり、全体には満たないヒンジ領域を含む場合もある。
【０１６２】
非ホジキンリンパ腫またはワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症に対し、リツキシマブ（ＣＤ２０に対するマウス／ヒトキメラＩｇＧ１モノクローナル抗体）で処置された患者における治療結果は、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに対し固有の親和性を有するＦｃγ受容体の対立遺伝子改変体を上記個体が発現することと相関した。特に、低親和性の活性化Ｆｃ受容体であるＣＤ１６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）について、高親和性の対立遺伝子を有する患者は、高い奏効率を示し、非ホジキンリンパ腫の場合には、無増悪生存が改善された。別の実施形態では、上記Ｆｃドメインが、低親和性の阻害性Ｆｃ受容体であるＣＤ３２Ｂ（ＦｃγＲＩＩＢ）への結合性を低減する、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を含有することが可能であり、かつ、低親和性の活性化Ｆｃ受容体であるＣＤ１６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）に対する野生型の結合レベルを保持するか、またはこれに対する結合性を増強しうる。
【０１６３】
別の実施形態は、ＦｃＲへの結合性が低度であるＩｇＧ２−４ハイブリッド体およびＩｇＧ４変異体を含み、これにより、その半減期が延長される。代表的なＩｇＧ２−４ハイブリッド体およびＩｇＧ４変異体は、Ａｎｇａｌ，  Ｓ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３０巻（１号）：１０５〜１０８頁（１９９３年）；  Ｍｕｅｌｌｅｒ，  Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｏｎｏｌｏｇｙ、３４巻（６号）：４４１〜４５２頁（１９９７年）；ならびにＷａｎｇらに対する米国特許第６，９８２，３２３号において記載されている。一部の実施形態では、上記ＩｇＧ１ドメインおよび／またはＩｇＧ２ドメインが欠失しており、例えば、Ａｎｇａｌらは、セリン２４１がプロリンで置換されたＩｇＧ１およびＩｇＧ２について記載している。
【０１６４】
好ましい実施形態では、上記Ｆｃドメインが、ＣＤ１６Ａに対する結合性を増強する、アミノ酸の挿入、欠失、または置換を含有する。当技術分野では、ＣＤ１６Ａに対する結合を増大させ、かつ、ＣＤ３２Ｂに対する結合性を低減する、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインにおける多数の置換が公知であり、Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５７巻（１８号）：８８８２〜９０頁（２００７年）において記載されている。ＣＤ３２Ｂに対する結合性を低減し、かつ／またはＣＤ１６Ａに対する結合性を増大させる、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインの例示的な改変体は、Ｆ２４３Ｌ置換、Ｒ９２９Ｐ置換、Ｙ３００Ｌ置換、Ｖ３０５Ｉ置換、またはＰ２９６Ｌ置換を含有する。これらのアミノ酸置換は、任意の組合せで、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン内に存在しうる。一実施形態では、上記ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインの改変体が、Ｆ２４３Ｌ置換、Ｒ９２９Ｐ置換、およびＹ３００Ｌ置換を含有する。別の実施形態では、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインの改変体が、Ｆ２４３Ｌ置換、Ｒ９２９Ｐ置換、Ｙ３００Ｌ置換、Ｖ３０５Ｉ置換、およびＰ２９６Ｌ置換を含有する。別の実施形態では、Ｎ２９７Ｑ置換によってＦｃＲへの結合性が消失するので、上記ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインの改変体が、この変異を含有する。
Ｃ．ペプチドリンカードメインまたはポリペプチドリンカードメイン
本開示されるＢ７−Ｈ４融合タンパク質は、必要に応じて、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドを、第２のポリペプチドから隔てる、ペプチドリンカードメインまたはポリペプチドリンカードメインを含有する。
【０１６５】
１．抗体のヒンジ領域
一実施形態では、上記リンカードメインが、免疫グロブリンのヒンジ領域を含有する。好ましい実施形態では、上記ヒンジ領域が、ヒト免疫グロブリンに由来する。上記ヒンジが由来しうる、適切なヒト免疫グロブリンには、ＩｇＧ、ＩｇＤ、およびＩｇＡが含まれる。好ましい実施形態では、上記ヒンジ領域が、ヒトＩｇＧに由来する。当技術分野では、免疫グロブリンのヒンジ領域ならびに他のドメインのアミノ酸配列が周知である。
【０１６６】
一実施形態では、Ｂ７−Ｈ４融合ポリペプチドが、
【０１６７】
【化４２】
2013503205.tif 000044
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸によりコードされる、ヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含有する。
【０１６８】
配列番号８６によりコードされるヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域は、以下のアミノ酸配列：
【０１６９】
【化４３】
2013503205.tif 000045
を有する。
【０１７０】
配列番号８７によりコードされるヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域は、以下のアミノ酸配列：
【０１７１】
【化４４】
2013503205.tif 000046
を有する。
【０１７２】
上記ヒンジをさらに短縮して、配列番号８９のアミノ酸１、２、３、４、５、またはこれらの組合せを除去することができる。一実施形態では、配列番号８９のアミノ酸１および２を欠失させる。
【０１７３】
別の実施形態では、上記Ｂ７−Ｈ４融合ポリペプチドが、
【０１７４】
【化４５】
2013503205.tif 000047
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸によりコードされる、マウス免疫グロブリンＣγ２ａ鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含有する。
【０１７５】
配列番号９０によりコードされるマウス免疫グロブリンＣγ２ａ鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域は、以下のアミノ酸配列：
【０１７６】
【化４６】
2013503205.tif 000048
を有する。
【０１７７】
別の実施形態では、上記リンカードメインが、上記で説明した免疫グロブリンのヒンジ領域を含有し、かつ、１つ以上のさらなる免疫グロブリンドメインをさらに含む。
２．他のペプチド／ポリペプチドリンカードメイン
他の適切なペプチド／ポリペプチドリンカードメインは、天然または非天然のペプチドまたはポリペプチドを含む。ペプチドリンカーの配列は、少なくとも２アミノ酸の長さである。上記ペプチドまたはポリペプチドドメインは、可撓性のペプチドまたはポリペプチドである。本明細書における「可撓性リンカー」とは、ペプチド結合（複数可）によって連結された２つ以上のアミノ酸残基を含有するペプチドまたはポリペプチドであって、上記結合によって連結した２つのポリペプチドにその結合が与える回転自由度が、上記可撓性リンカーが存在しない２つの連結したポリペプチドが有する回転自由度より大きい、ペプチドまたはポリペプチドを指す。このような回転自由度により、可撓性リンカーにより連結した２つ以上の抗原結合部位の各々が、より効率的に標的抗原（複数可）に接近することが可能となる。例示的な可撓性ペプチド／ポリペプチドには、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号９２）、Ａｌａ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号９３）、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３（配列番号９４）、および（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）４（配列番号９５）が含まれるがこれらに限定されない。当技術分野では、さらなる可撓性ペプチド／ポリペプチド配列が周知である。
Ｄ．二量体化ドメイン、多量体化ドメイン、および標的化ドメイン
本明細書で開示される融合タンパク質は、必要に応じて、２つ以上の融合タンパク質を二量体化または多量体化するように機能する、二量体化ドメインまたは多量体化ドメインを含有する。上記融合タンパク質を二量体化または多量体化するように機能するドメインは、上記融合タンパク質の別個のドメインの場合もあり、代替的に、上記融合タンパク質の他のドメイン（Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、第２のポリペプチド、またはペプチド／ポリペプチドリンカードメイン）のうちの１つの内部に含有される場合もある。
【０１７８】
１．二量体化ドメイン
「二量体化ドメイン」は、少なくとも２つのアミノ酸残基、または少なくとも２つのペプチドもしくはポリペプチド（アミノ酸配列が同じ場合もあり、アミノ酸配列が異なる場合もある）が会合することにより形成される。上記ペプチドまたはポリペプチドは、共有結合および／または非共有結合による会合（複数可）を介して、互いと相互作用しうる。好ましい二量体化ドメインは、そのパートナーの融合タンパク質におけるシステインと分子間ジスルフィド結合を形成することが可能な、少なくとも１つのシステインを含有する。上記二量体化ドメインは、そのパートナーの融合タンパク質間でジスルフィド結合（複数可）が形成されうるように、１つ以上のシステイン残基を含有しうる。一実施形態では、二量体化ドメインが、１、２、または３〜約１０のシステイン残基を含有する。好ましい実施形態では、上記二量体化ドメインが、免疫グロブリンのヒンジ領域である。
【０１７９】
さらなる例示的な二量体化ドメインは、当技術分野において公知である任意の二量体化ドメインであることが可能であり、これらには、コイルドコイルドメイン；酸性残基のパッチ（ａｃｉｄ  ｐａｔｃｈ）；亜鉛フィンガードメイン；カルシウムハンドドメイン；ＣＨ１−ＣＬ対ドメイン；米国特許第５，８２１，３３３号に記載される、操作された「ノブ」および／または「隆起」を伴う「インターフェース」ドメイン；ロイシンジッパードメイン（例えば、ｊｕｎおよび／またはｆｏｓ由来）（米国特許第５，９３２，４４８号）；ＳＨ２（ｓｒｃ相同体２）ドメイン；ＳＨ３（ｓｒｃ相同体３）ドメイン（Ｖｉｄａｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４３巻、７３３６〜４４頁（２００４年））；ホスホチロシン結合（ＰＴＢ）ドメイン（Ｚｈｏｕら、Ｎａｔｕｒｅ、３７８巻：５８４〜５９２頁（１９９５年））；ＷＷドメイン（Ｓｕｄｏｌ、Ｐｒｏｇ．  Ｂｉｏｃｈｙｓ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．、６５巻：１１３〜１３２頁（１９９６年））；ＰＤＺドメイン（Ｋｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ、３７８巻：８５〜８８頁（１９９５年）；  Ｋｏｍａｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６９巻：１７３７〜１７４０頁（１９９５年））；１４−３−３ドメイン；ＷＤ４０ドメイン（Ｈｕら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２７３巻、３３４８９〜３３４９４頁（１９９８年））；ＥＨドメイン；Ｌｉｍドメイン；イソロイシンジッパードメイン；受容体の二量体対（例えば、インターロイキン８受容体（ＩＬ−８Ｒ）；ならびにＬＦＡ−１およびＧＰＩＩＩｂ／ＩＩＩａなどのインテグリンヘテロ二量体）、またはそれらの二量体化領域（複数可）によるドメイン；二量体のリガンドポリペプチド（例えば、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＤＧＦのメンバー、および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（Ａｒａｋａｗａら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６９巻（４５号）：２７８３３〜２７８３９頁（１９９４年）；ならびにＲａｄｚｉｅｊｅｗｓｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３２巻（４８号）：１３５０頁（１９９３年））によるドメインが含まれるがこれらに限定されず、また、その親和性を変化させるこれらのドメインの改変体でもありうる。上記ポリペプチド対は、酵母ツーハイブリッド法によるスクリーニングを含め、当技術分野において公知の方法により同定することができる。酵母ツーハイブリッド法によるスクリーニングは、米国特許第５，２８３，１７３号および同第６，５６２，５７６号において説明されている。相互作用するドメイン対間の親和性は、Ｋａｔａｈｉｒａら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７７巻、９２４２〜９２４６頁（２００２年）において記載される方法を含め、当技術分野において公知の方法を用いて決定することができる。代替的に、例えば、ＷＯ０１／００８１４において記載される方法を用いて、ペプチド配列のライブラリーを、ヘテロ二量体化についてスクリーニングすることもできる。タンパク質間相互作用に有用な方法はまた、例えば、米国特許第６，７９０，６２４号においても記載されている。
【０１８０】
２．多量体化ドメイン
「多量体化ドメイン」とは、３つ以上のペプチドまたはポリペプチドを、共有結合および／または非共有結合による会合（複数可）を介して互いと相互作用させるドメインである。適切な多量体化ドメインには、コイルドコイルドメインが含まれるがこれに限定されない。コイルドコイルとは、通常、７アミノ酸（ヘプタッドリピート）または１１アミノ酸（ウンデカドリピート）の配列内において、３および４残基の間隔を置いた、主に疎水性の残基が連続するパターンを伴うペプチド配列であり、多量体によるヘリックスバンドルを形成するように構築される（フォールドする）。配列が、一部不規則に分布する３および４残基の間隔を含む、コイルドコイルもまた意図される。疎水性残基とは、特に、疎水性アミノ酸のＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、およびＴｒｐである。「主に疎水性」とは、上記残基のうちの少なくとも５０％が、言及された疎水性アミノ酸から選択されなければならないことを意味する。
【０１８１】
コイルドコイルドメインは、ラミニンに由来しうる。細胞外腔では、ヘテロ三量体のコイルドコイルタンパク質であるラミニンが、基底膜の形成において重要な役割を果たす。ラミニンの機能に、多機能性のオリゴマー構造が要求されることは、明らかである。コイルドコイルドメインはまた、３本の鎖が連結されるトロンボスポンジン（ＴＳＰ−１およびＴＳＰ−２）または５本鎖の鎖が連結されるトロンボスポンジン（ＴＳＰ−３、ＴＳＰ−４、およびＴＳＰ−５）に由来する場合もあり、パラレルな５本鎖のコイルドコイル（Ｍａｌａｓｈｋｅｖｉｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４巻：７６１〜７６５頁（１９９６年））へとフォールドするＣＯＭＰ（ＣＯＭＰｃｃ）（Ｇｕｏら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９９８年、１７巻：５２６５〜５２７２頁）に由来する場合もある。
【０１８２】
当技術分野では、他のタンパク質に由来するさらなるコイルドコイルドメイン、ならびにポリペプチドの多量体化を媒介する他のドメインが公知であり、本開示される融合タンパク質において用いるのに適している。
【０１８３】
別の実施形態では、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質、またはこれらの断片を、抗体などの第２の多価ポリペプチドに結合させることにより、多量体を形成するように誘導することができる。Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質、またはこれらの断片を多量体化する目的で用いるのに適する抗体には、ＩｇＭ抗体、ならびに架橋多価ＩｇＧ複合体、架橋多価ＩｇＡ複合体、架橋多価ＩｇＤ複合体、または架橋多価ＩｇＥ複合体が含まれるがこれらに限定されない。
【０１８４】
３．標的化ドメイン
上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドおよびＢ７−Ｈ４融合タンパク質は、体内の特定の部位を上記分子の標的とするための標的化ドメインを含有しうる。好ましい標的化ドメインは、炎症領域を上記分子の標的とする。例示的な標的化ドメインは、炎症組織またはＩＬ１７、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、およびＩＬ−２３が含まれるがこれらに限定されない炎症促進性サイトカインに特異的な抗体またはそれらの抗原結合断片である。多発性硬化症などの神経学的障害の場合において、上記標的化ドメインは、ＣＮＳを上記分子の標的とする場合もあり、血管内皮（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）のＶＣＡＭ−１に結合する場合もある。さらなる標的化ドメインは、炎症促進性分子に特異的なペプチドアプタマーでありうる。他の実施形態では、上記Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質が、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の表面上に提示されるポリペプチドに特異的な結合パートナーを含みうる。さらに他の実施形態では、上記標的化ドメインが、活性化免疫細胞を特異的に標的とする。標的とするのに好ましい免疫細胞には、Ｔｈ０細胞、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、およびＴｈ２２細胞、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２１、およびＭＭＰが含まれるがこれらに限定されない炎症性分子を分泌するか、もしくは他の細胞にこれらを分泌させる他の細胞、ならびにＴｒｅｇが含まれる。例えば、Ｔｒｅｇの標的化ドメインは、ＣＤ２５に特異的に結合しうる。
【０１８５】
別の実施形態では、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、その断片、またはその融合体が、移植される器官または組織を上記分子の標的とする標的化ドメインを含有しうる。例えば、標的化ドメインは、移植される器官または組織の種類に特異的な細胞の表面上に提示されるポリペプチドに特異的な抗体、その抗原結合断片、または別の結合パートナーでありうる。
【０１８６】
Ｅ．例示的な融合タンパク質
代表的なマウスＢ７−Ｈ４融合タンパク質は、
【０１８７】
【化４７】
2013503205.tif 000049
【０１８８】
【化４８】
2013503205.tif 000050
【０１８９】
【化４９】
2013503205.tif 000051
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸によりコードされる。
【０１９０】
別の実施形態では、代表的なマウスＢ７−Ｈ４融合タンパク質が、
【０１９１】
【化５０】
2013503205.tif 000052
【０１９２】
【化５１】
2013503205.tif 000053
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。
【０１９３】
シグナル配列を伴わない、配列番号９９および配列番号１０１のマウスＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は、
【０１９４】
【化５２】
2013503205.tif 000054
である。
【０１９５】
シグナル配列を伴わない、配列番号１００および配列番号１０２のマウスＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は、
【０１９６】
【化５３】
2013503205.tif 000055
である。
【０１９７】
代表的なヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質は、
【０１９８】
【化５４】
2013503205.tif 000056
【０１９９】
【化５５】
2013503205.tif 000057
【０２００】
【化５６】
2013503205.tif 000058
【０２０１】
【化５７】
2013503205.tif 000059
【０２０２】
【化５８】
2013503205.tif 000060
【０２０３】
【化５９】
2013503205.tif 000061
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸によりコードされる。
【０２０４】
別の実施形態では、代表的なヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質が、
【０２０５】
【化６０】
2013503205.tif 000062
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。
【０２０６】
別の実施形態では、代表的なヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質が、
【０２０７】
【化６１】
2013503205.tif 000063
【０２０８】
【化６２】
2013503205.tif 000064
【０２０９】
【化６３】
2013503205.tif 000065
【０２１０】
【化６４】
2013503205.tif 000066
に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。
【０２１１】
シグナル配列を伴わない、配列番号１１４および配列番号１２２のヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は、
【０２１２】
【化６５】
2013503205.tif 000067
である。
【０２１３】
シグナル配列を伴わない、配列番号１１５および配列番号１２３のヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は、
【０２１４】
【化６６】
2013503205.tif 000068
である。
【０２１５】
シグナル配列を伴わない、配列番号１１６および配列番号１２４のヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は、
【０２１６】
【化６７】
2013503205.tif 000069
である。
【０２１７】
シグナル配列を伴わない、配列番号１１７および配列番号１２５のヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は、
【０２１８】
【化６８】
2013503205.tif 000070
である。
【０２１９】
シグナル配列を伴わない、配列番号１１８および配列番号１２６のヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は、
【０２２０】
【化６９】
2013503205.tif 000071
である。
【０２２１】
シグナル配列を伴わない、配列番号１１９および配列番号１２７のヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は、
【０２２２】
【化７０】
2013503205.tif 000072
である。
【０２２３】
シグナル配列を伴わない、配列番号１２０および配列番号１２８のヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は、
【０２２４】
【化７１】
2013503205.tif 000073
である。
【０２２５】
シグナル配列を伴わない、配列番号１２１および配列番号１２９のヒトＢ７−Ｈ４融合タンパク質のアミノ酸配列は、
【０２２６】
【化７２】
2013503205.tif 000074
である。
【０２２７】
上記の例示的な融合タンパク質は、本明細書に記載される改変体の任意の組合せを組み込みうる。別の実施形態では、上記の例示的な融合タンパク質の末端のリシンを欠失させる。
【０２２８】
本開示される融合タンパク質は、標準的な分子生物学の技法を用いて単離することができる。例えば、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有する発現ベクターを、リン酸カルシウム沈殿により２９３細胞へとトランスフェクトし、無血清ＤＭＥＭ中で培養する。７２時間後にその上清を回収し、プロテインＧまたは好ましくはプロテインＡ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）により、上記融合タンパク質を精製する。
【０２２９】
Ｆ．融合タンパク質の二量体および多量体
Ｂ７−Ｈ４融合ポリペプチドは、二量体化することもでき、多量体化することもできる。二量体化または多量体化は、上記で説明した二量体化ドメインまたは多量体化ドメインを含め、二量体化ドメインまたは多量体化ドメインを介した２つ以上の融合タンパク質間で生じうる。代替的に、融合タンパク質の二量体化または多量体化は、化学的な架橋形成によっても生じうる。融合タンパク質の二量体は、ホモ二量体の場合もあり、ヘテロ二量体の場合もある。融合タンパク質の多量体は、ホモ多量体の場合もあり、ヘテロ多量体の場合もある。
【０２３０】
本明細書で開示される融合タンパク質の二量体は、式ＩＩ：
Ｎ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｃ
Ｎ−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｃ
または、代替的に、式ＩＩＩ：
Ｎ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｃ
Ｃ−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｎ
の二量体である［式中、式ＩＩにより示される二量体の融合タンパク質を、パラレルな配向性にあると定義し、式ＩＩＩにより示される二量体の融合タンパク質を、アンチパラレルな配向性にあると定義する。また、パラレルな二量体およびアンチパラレルな二量体を、それぞれ、シス二量体およびトランス二量体とも称する。「Ｎ」および「Ｃ」は、それぞれ、上記融合タンパク質のＮ末端およびＣ末端を表わす。融合タンパク質の構成要素である「Ｒ１」、「Ｒ２」、および「Ｒ３」は、式Ｉに関して上記で定義された通りである。式ＩＩおよび式ＩＩＩの両方に関して、「Ｒ４」は、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドまたは第２のポリペプチドであり、「Ｒ５」は、任意選択のペプチド／ポリペプチドリンカードメインであり、「Ｒ６」は、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドまたは第２のポリペプチドであり、ここで、「Ｒ４」が第２のポリペプチドである場合は、「Ｒ６」がＢ７−Ｈ４ポリペプチドであり、「Ｒ４」がＢ７−Ｈ４ポリペプチドである場合は、「Ｒ６」が第２のポリペプチドである。一実施形態では、「Ｒ１」がＢ７−Ｈ４ポリペプチドであり、「Ｒ４」もまたＢ７−Ｈ４ポリペプチドであり、「Ｒ３」および「Ｒ６」のいずれもが第２のポリペプチドである］。
【０２３１】
「Ｒ１」＝「Ｒ４」、「Ｒ２」＝「Ｒ５」、ならびに「Ｒ３」＝「Ｒ６」であるときの式ＩＩの融合タンパク質二量体を、ホモ二量体と定義する。同様に、「Ｒ１」＝「Ｒ６」、「Ｒ２」＝「Ｒ５」、ならびに「Ｒ３」＝「Ｒ４」であるときの式ＩＩＩの融合タンパク質二量体を、ホモ二量体と定義する。任意の理由でこれらの条件が満たされないときの融合タンパク質二量体を、ヘテロ二量体と定義する。例えば、ヘテロ二量体は、これらの条件を満たすドメイン配向性を含有しうる（すなわち、式ＩＩによる二量体では、「Ｒ１」および「Ｒ４」が両方ともＢ７−Ｈ４ポリペプチドであり、「Ｒ２」および「Ｒ５」が両方ともペプチド／ポリペプチドリンカー（ｌｉｋｅｒ）ドメインであり、「Ｒ３」および「Ｒ６」が両方とも第２のポリペプチドである）が、これらのドメインのうちの１つ以上の種が同一ではない。例えば、「Ｒ３」および「Ｒ６」のいずれもがＢ７−Ｈ４ポリペプチドでありうるが、一方のポリペプチドは野生型のＢ７−Ｈ４アミノ酸配列を含有しうるのに対し、他方のポリペプチドは改変体のＢ７−Ｈ４ポリペプチドでありうる。例示的な改変体のＢ７−Ｈ４ポリペプチドは、標的細胞に対する結合性が増大または減少し、免疫細胞に対する活性が増大し、半減期が延長または短縮されるか、または安定性が増大または減少するように修飾したＢ７−Ｈ４ポリペプチドである。免疫グロブリンのＣＨ１領域またはＣＬ領域を、ポリペプチドリンカードメインの一部として含有する融合タンパク質の二量体は、その二量体の一方の融合タンパク質がＣＨ１領域を含有し、その二量体の他方の融合タンパク質がＣＬ領域を含有する、ヘテロ二量体を形成することが好ましい。
【０２３２】
また、融合タンパク質を用いて、多量体を形成することもできる。二量体と同様に、多量体も、上記多量体うちのすべての融合タンパク質が、それらのＮ末端およびＣ末端に関して同じ配向性で整列する、パラレルな多量体でありうる。多量体は、上記多量体うちの融合タンパク質が、代替的に、それらのＮ末端およびＣ末端に関して反対の配向性で整列する、アンチパラレルな多量体でもありうる。多量体（パラレルな多量体またはアンチパラレルな多量体）は、ホモ多量体の場合もあり、ヘテロ多量体の場合もある。
【０２３３】
Ｇ．ペプチドおよびポリペプチドの修飾
上記融合タンパク質は、通常の細胞環境においてポリペプチドに存在しうる化学的部分により、例えば、リン酸化、メチル化、アミド化、硫酸化、アシル化、グリコシル化、ＳＵＭＯ化、およびユビキチン化により修飾することができる。融合タンパク質はまた、放射性同位体および蛍光化合物が含まれるがこれらに限定されない、検出可能なシグナルを直接的または間接的に与えることが可能な標識により修飾することもできる。
【０２３４】
融合タンパク質はまた、細胞環境においては通常ポリペプチドに付加されない化学的部分によっても修飾することができる。例えば、本開示される融合タンパク質はまた、ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧ）鎖が含まれるがこれらに限定されないポリマー鎖を共有結合させること（すなわち、ＰＥＧ化）が含まれるがこれらに限定されないポリマー鎖の共有結合によっても修飾することができる。ＰＥＧへの高分子のコンジュゲーションは、近年、各種の薬物の薬物動態（ＰＫ）プロファイルを変化させ、これにより、それらの治療剤としての能力を改善するのに有効な戦略として行われている。ＰＥＧコンジュゲーションは、酵素による消化に対して保護し、腎臓による濾過を遅延させ、かつ、中和抗体の生成を低減することにより、その循環における薬物の貯留を増大させる。加えて、ＰＥＧコンジュゲーションはまた、上記融合タンパク質の多量体化を可能とするためにも用いることができる。
【０２３５】
上記ポリペプチドのうちで標的とされるアミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応することが可能な有機誘導剤と反応させることにより、分子内に修飾を導入することができる。別の修飾は、上記タンパク質の環化である。
【０２３６】
上記ポリペプチドの化学的誘導体の例には、コハク酸無水物または他のカルボン酸無水物で誘導体化されたリシニル残基およびアミノ末端残基が含まれる。環状カルボン酸無水物（ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）による誘導体化には、上記リシニル残基の電荷を逆転させる効果がある。アミノ含有残基を誘導体化するのに適する他の試薬には、メチルピコリンイミデートなどのイミドエステル；ピリドキサールリン酸；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソウレア；２，４ペンタンジオン；ならびにグリオキシル酸塩とのトランスアミナーゼ触媒反応物が含まれる。カルボキシル側鎖基であるアスパルチルまたはグルタミルは、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどのカルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応により選択的に修飾することができる。さらに、アスパルチル残基およびグルタミル残基は、アンモニアとの反応により、アスパラギニル残基およびグルタミニル残基へと転換することもできる。融合タンパク質はまた、１つ以上のＬ−アミノ酸を置換する、１つ以上のＤ−アミノ酸も含みうる。
【０２３７】
Ｈ．結合特性の修飾
Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、それらの断片、ならびにそれらの融合物（集合的に、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドと称する）の結合特性は、投与される用量および投与レジメンに関連する。一実施形態では、本開示されるＢ７−Ｈ４ポリペプチドが、免疫細胞の受容体分子の他のリガンドと比べ、上記受容体分子をより長期にわたり、またはより高い百分率で占有することを証明する結合特性を、Ｔ細胞上の少なくとも１つの受容体に対して有する。他の実施形態では、本開示されるＢ７−Ｈ４ポリペプチドが示すＴ細胞上の受容体に対する結合親和性が、野生型のＢ７−Ｈ４と比べて低く、上記タンパク質が、投与後３カ月、２カ月、１カ月、３週間、２週間、１週間、または数日間未満の期間で解離することを可能とする。
【０２３８】
一部の実施形態では、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、もしくはそれらの断片、またはそれらの融合物の、その受容体に対する親和性が比較的高く、したがって、解離速度が比較的遅い。他の実施形態では、上記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドを、数日間、数週間、または数カ月の期間にわたり間欠的に投与し、次回の投与前の回復を可能とする程度に免疫反応を弱めるが、これを用いて、免疫反応を完全に止めることなしに免疫反応を軽減することができ、かつ、長期間にわたる副作用を回避することができる。
【０２３９】
ＩＩＩ．単離核酸分子
本明細書では、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、それらの断片、ならびにそれらの融合物をコードする単離核酸配列が開示される。本明細書で用いられる「単離核酸」とは、哺乳動物のゲノム内に存在する他の核酸分子から分離される核酸を指し、これには、通常、哺乳動物ゲノム内の上記核酸の片側または両側に隣接する核酸（例えば、Ｂ７−Ｈ４以外のタンパク質をコードする核酸）が含まれる。任意の非天然核酸配列は、天然では見出されず、天然のゲノム内では直接隣接する配列を有さないので、核酸に関して本明細書で用いられる「単離」という用語はまた、このような非天然核酸配列との組合せも包含する。
【０２４０】
単離核酸は、例えば、天然のゲノム内において、通常、あるＤＮＡ分子に直接隣接して見出される核酸配列のうちの１つが除去されるかまたは存在しないと仮定した場合のＤＮＡ分子でありうる。したがって、限定なしに述べると、単離核酸には、他の配列とは独立した個別の分子（例えば、化学的に合成された核酸、またはＰＣＲもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理により作製されたｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ断片）の他、自律複製プラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）であるベクター内、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ内に組み込まれた組換えＤＮＡとして存在するＤＮＡ分子が含まれる。加えて、単離核酸には、ハイブリッド核酸または融合核酸の一部である組換えＤＮＡ分子など、操作された核酸も含まれうる。例えば、ｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムライブラリー、またはゲノムＤＮＡの制限酵素消化物を含有するゲルスライス内の数百〜数百万の他の核酸中に存在する核酸は、単離核酸と考えるべきでない。
【０２４１】
Ｂ７−Ｈ４融合ポリペプチドをコードする核酸は、好まれる発現宿主における発現について最適化することができる。コドンは、Ｂ７−Ｈ４核酸配列が由来する哺乳動物と上記発現宿主の間でのコドン使用の違いを考慮して、同じアミノ酸をコードする代替のコドンで置換することができる。このようにして、発現宿主に好ましいコドンを用いて、核酸を合成することができる。
【０２４２】
核酸は、センス配向性の場合もあり、アンチセンス配向性の場合もあり、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドをコードする基準配列に相補的な場合もある。核酸は、ＤＮＡの場合もあり、ＲＮＡの場合もあり、核酸類似体の場合もある。核酸類似体は、塩基部分で修飾される場合もあり、糖部分で修飾される場合もあり、リン酸塩骨格で修飾される場合もある。このような修飾は、例えば、上記核酸の安定性、ハイブリダイゼーション、または可溶性を改善しうる。上記塩基部分における修飾には、デオキシチミジンに対するデオキシウリジン、ならびにデオキシシチジンに対する５−メチル−２’−デオキシシチジンまたは５−ブロモ−２’−デオキシシチジンが含まれうる。上記糖部分に対する修飾には、２’−Ｏ−メチル糖または２’−Ｏ−アリル糖を形成する、リボース糖の２’ヒドロキシルに対する修飾が含まれうる。リン酸デオキシリボース骨格を修飾して、各塩基部分がモルホリノ６員環に連結されるモルホリノ核酸、またはデオキシリン酸塩骨格が偽ペプチド骨格で置換されるが４つの塩基は保持されるペプチド核酸を作製することができる。例えば、ＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒ（１９９７年）、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．、７巻：１８７〜１９５頁；ならびにＨｙｒｕｐら（１９９６年）、Ｂｉｏｏｒｇａｎ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．、４巻：５〜２３頁を参照されたい。加えて、上記デオキシリン酸塩骨格を、例えば、ホスホロチオエート骨格もしくはホスホロジチオエート骨格、ホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄｉｔｅ）骨格、またはアルキルホスホトリエステル骨格で置換することもできる。
【０２４３】
ポリペプチドをコードする核酸は、それらを必要とする被験体に投与することができる。核酸の送達は、細胞内に「外来」核酸を導入すること、ならびに、最終的には、生きた動物に「外来」核酸を導入することを伴う。当技術分野では、被験体に核酸を送達するための組成物および方法が公知である（「Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｌｅｍｏｉｎｅ，  Ｎ．Ｒ．編、ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、２００８年を参照されたい）。
【０２４４】
ＩＶ．ベクターおよび宿主細胞
Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、それらの断片、ならびにそれらの融合物をコードするベクターもまた提供される。上記で説明した核酸などの核酸は、ベクターへと挿入して、細胞内で発現させることができる。本明細書で用いられる「ベクター」とは、挿入されたセグメントの複製をもたらすように、その中に別のＤＮＡセグメントを挿入しうる、プラスミド、ファージ、ウイルスまたはコスミドなどのレプリコンである。ベクターは、発現ベクターでありうる。「発現ベクター」とは、１つ以上の発現調節配列を含むベクターであり、「発現調節配列」とは、別のＤＮＡ配列の転写および／または翻訳を調節するかつ制御するＤＮＡ配列である。
【０２４５】
ベクター内の核酸は、１つ以上の発現調節配列に作動可能に連結されうる。本明細書で用いられる「作動可能に連結される」とは、発現調節配列が、対象のコード配列の発現を効果的に調節するように、遺伝子構築物内に組み込まれることを意味する。発現調節配列の例には、プロモーター、エンハンサー、および転写終結領域が含まれる。プロモーターとは、転写が開始される地点（一般には、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始部位近傍）の１００ヌクレオチド以内上流であることが典型的なＤＮＡ分子の領域からなる。コード配列をプロモーターの調節下に置くには、上記ポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位を、上記プロモーターの１〜約５０ヌクレオチド下流に配置することが必要である。エンハンサーは、時間、位置、およびレベルに関して発現特異性をもたらす。プロモーターとは異なり、エンハンサーは、転写部位から種々の距離に配置されても機能しうる。エンハンサーはまた、転写開始部位の下流に配置することもできる。ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡへと転写することが可能であり、次いで、ｍＲＮＡを、そのコード配列によりコードされるタンパク質へと翻訳しうる場合、このコード配列は、「作動可能に連結されて」おり、細胞内の発現調節配列の「調節下」にある。
【０２４６】
限定なしに述べると、適切な発現ベクターには、例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルス、タバコモザイクウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスに由来するプラスミドおよびウイルスベクターが含まれる。Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）などの企業から、多数のベクターおよび発現系が市販されている。
【０２４７】
発現ベクターは、タグ配列を含みうる。タグ配列は、コードされるポリペプチドとの融合物として発現させることが典型的である。このようなタグは、カルボキシル末端またはアミノ末端を含めた、上記ポリペプチド内の任意の部位に挿入することができる。有用なタグの例には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン、ｃ−ｍｙｃ、ヘマグルチニン、Ｆｌａｇ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、およびプロテインＡが含まれるがこれらに限定されない。一実施形態では、Ｂ７−Ｈ４融合ポリペプチドをコードする核酸分子が、好ましくは、ヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域に対応するアミノ酸配列を有するＩｇ重鎖定常領域のうちの１つ以上のドメインをコードする核酸を含有するベクター内に存在する。
【０２４８】
発現させる核酸を含有するベクターは、宿主細胞内に移入することができる。「宿主細胞」という用語は、その中に組換え発現ベクターを導入しうる、原核生物細胞および真核生物細胞を含むことを意図する。本明細書で用いられる「形質転換」および「トランスフェクト」とは、多数の技法のうちの１つにより、核酸分子（例えば、ベクター）を細胞内に導入することを包含する。特定の技法に限定されないが、当技術分野では、これらの技法のうちの多くが十分に確立されている。例えば、電気穿孔法または塩化カルシウムを介する形質転換により、原核生物細胞を核酸で形質転換することができる。例えば、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストランを介するトランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔法、またはマイクロインジェクションを含めた技法により、核酸を哺乳動物細胞へとトランスフェクトすることができる。例えば、本明細書に記載されるＢ７−Ｈ４融合ポリペプチドを作製するには、宿主細胞（例えば、原核生物細胞、またはＣＨＯ細胞などの真核生物細胞）を用いることができる。
【０２４９】
記載したベクターを用いて、細胞内、例えば、膵島細胞など、移植される細胞内でＢ７−Ｈ４を発現させることができる。例示的なベクターには、アデノウイルスベクターが含まれるがこれに限定されない。１つの手法は、培養物中の初代細胞内に核酸を導入した後、これらのｅｘ  ｖｉｖｏで形質転換された細胞を、宿主の全身に、または宿主の特定の器官もしくは組織内に自家移植することを含む。ｅｘ  ｖｉｖｏ法は、例えば、被験体から細胞を採取する工程と、その細胞を培養する工程と、その細胞に発現ベクターを形質導入する工程と、コードされるポリペプチドの発現に適する条件下に細胞を維持する工程とを含みうる。分子生物学の技術分野では、これらの方法が公知である。例えば、リン酸カルシウムによる遺伝子移入、リポフェクションによる遺伝子移入、電気穿孔法による遺伝子移入、ウイルス感染による遺伝子移入、ならびに遺伝子銃による遺伝子移入を含めた、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける遺伝子治療に用いられる任意の標準的な手段により、上記形質導入工程を達成することができる。代替的に、リポソームまたはポリマー製マイクロ粒子を用いることもできる。次いで、形質導入に成功した細胞は、例えば、コード配列の発現、または薬剤耐性遺伝子の発現について選択することができる。次いで、上記細胞を致死線量で放射線照射し（所望の場合）、被験体内に注射するかまたは植え込むことができる。一実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸を含有する発現ベクターを、それを必要とする被験体へと投与される細胞内にトランスフェクトする。
【０２５０】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける核酸療法は、機能的に活性なＤＮＡを、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、哺乳動物の体細胞組織または器官へと直接移入することにより達成することができる。例えば、本明細書で開示されるポリペプチドをコードする核酸は、リンパ系組織または腫瘍へと直接投与することができる。代替的に、Ｂリンパ球特異的転写制御エレメント（ＴＲＥ）、Ｔリンパ球特異的ＴＲＥ、または樹状細胞特異的ＴＲＥなどのリンパ系組織特異的ＴＲＥを用いて、リンパ系組織特異的な標的化を達成することもできる。当技術分野では、リンパ組織特異的ＴＲＥが公知である。
【０２５１】
核酸はまた、ウイルス性の手段によって、ｉｎ  ｖｉｖｏで投与することもできる。融合タンパク質をコードする核酸分子は、当技術分野において周知の、複製欠損レトロウイルスを生成させるパッケージング細胞系を用いて、レトロウイルスベクターへとパッケージングすることができる。また、非複製性とされうる、組換えアデノウイルスおよび組換えワクシニアウイルスを含めた他のウイルスベクターも用いることができる。裸のＤＮＡもしくは裸のＲＮＡ、またはウイルスベクターに加えて、操作された細菌も、ベクターとして用いることができる。
【０２５２】
核酸はまた、リポソーム、ポリマー製マイクロ粒子およびポリマー製ナノ粒子、ならびにアシアロ糖タンパク質／ポリリシンなどのポリカチオンを含めた他のキャリアにより送達することもできる。
【０２５３】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、ウイルス媒介の遺伝子移入、ならびにキャリア媒介の遺伝子移入に加えて、プラスミドＤＮＡの投与ならびに粒子ボンバードメント媒介の遺伝子移入を含め、当技術分野において周知の物理的手段も、ＤＮＡの直接的導入に用いることができる。
【０２５４】
Ｖ．薬学的組成物
本明細書で開示される融合ポリペプチドを含む薬学的組成物が提供される。ペプチドまたはポリペプチドを含有する薬学的組成物は、非経口投与経路（筋肉内注射、腹腔内注射、静脈内（ＩＶ）注射、または皮下注射）、経皮投与経路（受動的に、またはイオン導入法もしくは電気穿孔法を用いる）、または経粘膜投与経路（鼻腔内投与経路、膣内投与経路、直腸内投与経路、または舌下投与経路）により投与することもでき、生体崩壊性挿入物を用いて投与することもでき、かつ、各投与経路に適切な剤形で処方することができる。
【０２５５】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける一部の手法では、本明細書で開示される組成物を、治療有効量で被験体に投与する。本明細書で用いられる「有効量」または「治療有効量」という用語は、処置される障害の１つ以上の症状を処置、阻害、もしくは緩和するか、または他の方法で所望の薬理学的効果および／または生理学的効果をもたらすのに十分な投与量を意味する。正確な投与量は、被験体に依存する変数（例えば、年齢、免疫系の健康など）、疾患、ならびに行われる処置など、種々の因子により異なる。
【０２５６】
本明細書で開示されるポリペプチド組成物、ならびに上記ポリペプチドをコードする核酸については、さらなる研究が行われるにつれて、種々の患者における種々の状態を処置するのに適切な投与量のレベルについての情報が明らかになり、当業者は、レシピエントの治療的状況、年齢、ならびに全般的な健康を考慮して、適正な投薬について確実にすることができる。選択される投与量は、所望の治療効果、投与経路、ならびに所望の処置期間に依存する。一般に、哺乳動物には、毎日体重１ｋｇ当たり０．００１ｍｇ〜１０ｍｇのレベルの投与量を投与する。一般に、静脈内注射または静脈内注入の場合、投与量は低量でありうる。
【０２５７】
ある特定の実施形態では、例えば、処置される部位に直接注射することにより、上記ポリペプチド組成物を局所に投与する。その注射は、全身投与により達成されうるものより高い上記ポリペプチド組成物の局所濃度の増加をもたらすことが典型的である。臓器移植の場合は、そのタンパク質を移植された臓器近傍の部位へと局所投与することができる。上記ポリペプチド組成物を、上記で説明したマトリックスと組み合わせて、処置される部位の外部への上記ポリペプチドの受動拡散を低減することにより、そのポリペプチド組成物の局所濃度の増大を補助することができる。
【０２５８】
１．非経口投与のための製剤
好ましい実施形態では、ペプチドおよびポリペプチドを含有する組成物を含めた、本明細書で開示される組成物を、水溶液中で非経口注射により投与する。製剤はまた、懸濁液またはエマルジョンの形態でもありうる。一般に、薬学的組成物は、有効量のペプチドまたはポリペプチドを含めて提供され、必要に応じて、薬学的に許容される希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、および／またはキャリアを含む。このような組成物は、希釈剤、滅菌水、各種の緩衝剤内容物（例えば、トリス−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ、およびイオン強度による緩衝食塩液；必要に応じて、洗浄剤および可溶化剤（例えば、ＴＷＥＥＮ  ２０、ＴＷＥＥＮ  ８０、ポリソルベート−２０またはポリソルベート−８０とも呼ばれる））、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、ならびに防腐剤（例えば、Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ、ベンジルアルコール）および増量剤（例えば、ラクトース、マンニトール）などの添加剤を含む。非水性溶媒または非水性ビヒクルの例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油およびトウモロコシ油などの植物油、ゼラチン、ならびにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。上記製剤は、凍結乾燥させ、かつ、使用直前に再溶解／再懸濁させることができる。上記製剤は、例えば、細菌保持（ｂａｃｔｅｒｉａ  ｒｅｔａｉｎｉｎｇ）フィルターを介する濾過により、滅菌剤を組成物中に組み込むことにより、上記組成物に照射することにより、または組成物を加熱することにより滅菌することができる。
【０２５９】
２．局所投与のための製剤
本明細書で開示される融合タンパク質は、局所適用することができる。局所投与は、とりわけ、肺粘膜、鼻腔粘膜、口腔（舌下、頬）粘膜、膣粘膜、または直腸粘膜に適用される場合に有効でありうるが、大半のペプチド製剤については良好に作用しない。
【０２６０】
組成物を吸入しながら肺へと送達することができ、空気動力学的直径が約５ミクロン未満である、エアゾールまたは噴霧乾燥粒子として送達される場合、肺上皮層に浸透して血流へと達しうる。
【０２６１】
それらのすべてが当業者にはよく知られている、噴霧器、定量吸入器、および粉末吸入器が含まれるがこれらに限定されない、治療用生成物を肺送達するためにデザインされた広範にわたる機械的デバイスを用いることができる。市販されるデバイスの一部の具体例は、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ噴霧器（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）；Ａｃｏｒｎ  ＩＩ噴霧器（Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ、Ｃｏｌｏ．）；Ｖｅｎｔｏｌｉｎ定量吸入器（Ｇｌａｘｏ  Ｉｎｃ．、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、Ｎ．Ｃ．）；およびＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器（Ｆｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．）である。Ｎｅｋｔａｒ、Ａｌｋｅｒｍｅｓ、およびＭａｎｎｋｉｎｄはいずれも、吸入用インスリン粉末調製物の承認を受けているか、またはそれらを臨床試験中であり、これらの技術は、本明細書に記載される製剤に適用されうる。
【０２６２】
上記粘膜に投与するための製剤は、噴霧乾燥薬物粒子であることが典型的ではあるが、錠剤、ゲル、カプセル、懸濁液、またはエマルジョンに組み込むこともできる。標準的な薬学的賦形剤が任意の処方者（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒ）から入手可能である。経口製剤は、チューインガム、ゲルストリップ、錠剤、またはロゼンジの形態でありうる。
【０２６３】
経皮製剤もまた、調製しうる。これらは、軟膏、ローション、スプレー、またはパッチであることが典型的であり、それらのすべては、標準的な技法を用いて調製することができる。経皮製剤は、浸透増強剤の含有が求められる。
【０２６４】
３．制御送達用ポリマーマトリックス
本明細書で開示される融合タンパク質はまた、放出制御製剤で投与することもできる。放出制御用ポリマーデバイスは、ポリマーデバイスの植込み（ロッド、シリンダー、フィルム、ディスク）後または注射（マイクロ粒子）後の長期間にわたり、全身に放出されるように作製することができる。マトリックスは、マイクロスフェアなどのマイクロ粒子の形態であることが可能であり、この場合、固体のポリマー製マトリックス中またはマイクロカプセル内にペプチドを分散させるが、そこでは、コアがポリマー殻とは異なる材料であり、その性状が液体の場合もあり固体の場合もあるこのコア内に上記ペプチドを分散または懸濁させる。本明細書で別段に定義しない限り、マイクロ粒子、マイクロスフェア、およびマイクロカプセルは、互換的に用いられる。代替的に、上記ポリマーは、数ナノメートル〜４センチメートルの薄型のスラブまたはフィルムとして成形することもでき、粉砕または他の標準的な技法により作製される粉末の場合もあり、ハイドロゲルなどのゲルの場合さえもある。
【０２６５】
融合ポリペプチドまたはその融合ポリペプチドをコードする核酸を送達するには、非生体分解性マトリックスを用いることもでき、生体分解性マトリックスを用いることもできるが、生体分解性マトリックスが好ましい。生体分解性マトリックスは、天然ポリマーの場合もあり、合成ポリマーの場合もあるが、分解プロファイルおよび放出プロファイルの特徴がより良好であるため、合成ポリマーが好ましい。上記ポリマーは、放出が所望される期間に基づいて選択される。いくつかの場合には、直線的放出が最も有用でありうるが、他の場合には、パルス放出または「バルク放出」がより有効な結果をもたらしうる。上記ポリマーは、ハイドロゲルの形態であることが可能であり（水の重量で約９０％まで吸収することが典型的である）、必要に応じて、多価イオンまたはポリマーで架橋することができる。
【０２６６】
上記マトリックスは、溶媒を蒸発させることにより、噴霧乾燥させることにより、溶媒で抽出することにより、かつ、当業者に公知の他の方法より形成することができる。例えば、ＭａｔｈｉｏｗｉｔｚおよびＬａｎｇｅｒ、Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、５巻：１３〜２２頁（１９８７年）；  Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、６巻：２７５〜２８３頁（１９８７年）；ならびにＭａｔｈｉｏｗｉｔｚら、Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉ．、３５巻：７５５〜７７４頁（１９８８年）により記載される通り、薬物送達のためのマイクロスフェアを作製するために開発された方法のうちのいずれかを用いて、生体崩壊性マイクロスフェアを調製することができる。
【０２６７】
上記デバイスは、植込み領域または注射領域を処置する局所放出用（これらは、全身を処置するための投与量よりはるかに少ない投与量を送達することが典型的である）に処方することもでき、全身送達用に処方することもできる。これらは、皮下に植え込むかまたは注射することもでき、筋肉内、脂肪内に植え込むかまたは注射することもでき、嚥下させることもできる。
【０２６８】
別の実施形態では、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体を、マトリックス内に封入された移植細胞と共に投与して、移植領域内において、ある期間にわたり、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体の放出を可能とする。マトリックスは、細胞の封入に適する任意のポリマーを用いて作製されるポリマーマトリックスでありうる。細胞を封入するのに適する例示的なポリマー材料には、アルギナート、アガロース、ヒアルロン酸、コラーゲン、合成単量体、アルブミン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、デキストラン、硫酸デキストラン、硫酸コンドロイチン、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、キチン、キトサン、ヘパラン、硫酸ヘパラン、またはこれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない。例えば、糖尿病を処置するには、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体を、膵島細胞と共にポリマーマトリックス内に封入することができる。膵島細胞の封入については、例えば、Ｂａｒｎｅｔｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１３巻（８号）：９８６〜９１頁（２００７年）において説明されている。
【０２６９】
ＶＩ．製造方法
Ａ．融合タンパク質を作製するための方法
単離融合タンパク質は、例えば、化学合成により得ることもでき、宿主細胞における組換えによる産生によって得ることもできる。組換えにより融合タンパク質を生産するためには、上記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸を用いて、細菌宿主細胞または真核生物宿主細胞（例えば、昆虫細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞）を形質転換することもでき、これに形質導入することもでき、これにトランスフェクトすることもできる。一般に、核酸構築物は、上記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された制御配列を含む。制御配列（本明細書ではまた、発現調節配列とも称する）は、遺伝子産物をコードしないが、代わりに、それらが作動可能に連結された核酸配列の発現に影響を及ぼすことが典型的である。
【０２７０】
当技術分野では、ポリペプチドを発現させ、かつ産生させるのに有用な原核生物細胞系および真核生物細胞系が周知であり、これらには、例えば、ＢＬ−２１株などのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ菌株、ならびにＣＨＯ細胞などの培養哺乳動物細胞が含まれる。
【０２７１】
真核生物宿主細胞では、多数のウイルスベースの発現系を用いて、融合タンパク質を発現させることができる。当技術分野では、ウイルスベースの発現系が周知であり、これらには、バキュロウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター、レトロウイルスベクター、またはワクシニアベースのウイルスベクターが含まれるがこれらに限定されない。
【０２７２】
適切な調節エレメントおよび選択マーカーを伴う発現ベクターを用いて、改変体の融合タンパク質を安定的に発現する哺乳動物細胞系を作製することができる。例えば、真核生物発現ベクターであるｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびｐ９１０２３（Ｂ）（Ｗｏｎｇら（１９８５年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２８巻：８１０〜８１５頁を参照されたい）は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ−１細胞、ヒト胚性腎臓２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＭＤＣＫ細胞、およびヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）における改変体共刺激ポリペプチドの発現に適する。さらなる適切な発現系には、Ｌｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．を介して入手可能なＧＳ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）が含まれる。
【０２７３】
電気穿孔法、リポフェクション、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウムによる共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、または他の適切なトランスフェクション法により発現ベクターを導入した後、安定的な細胞系を選択することができる（例えば、代謝的選択による場合もあり、Ｇ４１８、カナマイシン、またはハイグロマイシンに対する抗生剤耐性による場合もあり、グルタミン合成酵素−ＮＳ０系を使用する代謝的選択による場合もある）。対象のポリペプチドを発現させ、例えば、細胞培養物上清または溶解させた細胞から上記ポリペプチドを回収しうるように、トランスフェクトされた細胞を培養することができる。代替的に、（ａ）増幅された配列を、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの哺乳動物発現ベクターへとライゲーションし、かつ、（ｂ）小麦胚芽抽出物またはウサギ網状赤血球溶解物を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて転写および翻訳することにより、融合タンパク質を作製することもできる。
【０２７４】
融合タンパク質は、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、およびヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法を用いて単離することができる。一部の実施形態では、上記ポリペプチドを、アフィニティーマトリックスへと捕捉させるアミノ酸配列を含有するさらなるドメインを含有するように、融合タンパク質を操作することができる。例えば、プロテインＡカラムを用いて、細胞培養上清中または細胞質抽出物中のＦｃ融合ポリペプチドを単離することができる。加えて、ｃ−ｍｙｃ、ヘマグルチニン、ポリヒスチジン、またはＦｌａｇ（商標）（Ｋｏｄａｋ）などのタグを用いて、ポリペプチドの精製を補助することもできる。このようなタグは、カルボキシル末端またはアミノ末端を含め、上記ポリペプチド内の任意の位置に挿入することができる。有用でありうる他の融合物には、アルカリホスファターゼなど、上記ポリペプチドの検出を促進する酵素が含まれる。また、イムノアフィニティークロマトグラフィーも、共刺激ポリペプチドを精製するのに用いることができる。加えて、その中でそれが生成する細胞に融合タンパク質を分泌させる分泌シグナルを含有する（予め分泌シグナルが存在するのではない場合）ように、その融合タンパク質を操作することもできる。次いで、分泌された融合タンパク質を細胞培地から慣習的に単離することができる。
【０２７５】
Ｂ．単離核酸分子を作製するための方法
一般的な分子クローニング法ならびに化学的な核酸合成法が含まれるがこれらに限定されない標準的な技法により、単離核酸分子を作製することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、改変体共刺激ポリペプチドをコードする単離核酸を得ることができる。ＰＣＲとは、標的核酸を酵素的に増幅する技法である。対象領域またはこれを超える領域の末端に由来する配列情報を使用して、増幅される鋳型の対向鎖と配列が同一であるオリゴヌクレオチドプライマーをデザインすることができる。ＰＣＲを用いて、全ゲノムＤＮＡまたは全細胞ＲＮＡに由来する配列を含め、ＤＮＡならびにＲＮＡに由来する特定の配列を増幅することができる。プライマーは、１４〜４０ヌクレオチドの長さであることが典型的であるが、１０ヌクレオチド〜数百ヌクレオチドの範囲の長さでありうる。一般的なＰＣＲ法については、例えば、「ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５年において記載されている。ＲＮＡを鋳型の供給源として用いる場合は、逆転写酵素を用いて、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鎖を合成することができる。また、リガーゼ鎖反応、鎖置換増幅、自家持続配列複製、または核酸配列ベースの増幅を用いて、単離核酸を得ることもできる。例えば、Ｌｅｗｉｓ（１９９２年）、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ、１２巻：１頁；  Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８７巻：１８７４〜１８７８頁；ならびにＷｅｉｓｓ（１９９１年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４巻：１２９２〜１２９３頁を参照されたい。
【０２７６】
単離核酸は、単一の核酸分子として化学合成することもでき、オリゴヌクレオチドの配列として（例えば、３’から５’方向における自動ＤＮＡ合成のためのホスホルアミダイト法を用いて）化学合成することもできる。例えば、所望の配列を含有し、オリゴヌクレオチド対がアニーリングしたときに二重鎖が形成されるように、各対が、短鎖の相補性セグメント（たとえば、約１５ヌクレオチド）を含有する長鎖オリゴヌクレオチド（例えば、＞１００ヌクレオチド）の１つ以上の対を合成することができる。ＤＮＡポリメラーゼを用いて上記オリゴヌクレオチドを伸長させ、その結果として、１つのオリゴヌクレオチド対当たり単一の二本鎖核酸分子を得、次いで、これをベクターへとライゲーションすることができる。単離核酸はまた、変異誘発により得ることもできる。ＰＣＲを介するオリゴヌクレオチド特異的変異誘発および／または部位特異的変異誘発を含めた標準的な技法を用いて、融合タンパク質をコードする核酸を変異させることができる。「Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、８章、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９２年を参照されたい。修飾されうるアミノ酸位置の例には、本明細書で説明される位置が含まれる。
【０２７７】
ＶＩＩ．使用方法
本明細書で開示されるＢ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体は、治療剤として有用である。一実施形態は、宿主に有効量のＢ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体を投与することにより、該宿主における移植拒絶反応を阻害または軽減するための方法を提供する。ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、免疫細胞、好ましくはＴ細胞を、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドと接触させて、移植拒絶反応が含まれるがこれに限定されない免疫反応を軽減または阻害することができる。Ｂ７−Ｈ４融合ポリペプチドと接触させるＴ細胞は、α／β型Ｔ細胞受容体およびγ／δ型Ｔ細胞受容体を含めたＴ細胞受容体を発現させる任意の細胞でありうる。Ｔ細胞は、ＣＤ４を発現させるＴ細胞のサブセット、ならびにＣＤ８を発現させるＴ細胞のサブセットを含め、ＣＤ３を発現させるすべての細胞を包含する。Ｔ細胞は、ナイーブ細胞およびメモリー細胞の両方を包含し、ＣＴＬなどのエフェクター細胞も包含する。Ｔ細胞はまた、Ｔｈ１細胞、Ｔｃ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｃ２細胞、Ｔｈ３細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、ならびにＴｒｅｇ細胞、およびＴｒ１細胞などの制御性細胞も包含する。例えば、組成物を用いて、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、またはＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２１、およびＭＭＰが含まれるがこれらに限定されない炎症性分子を分泌するか、もしくは他の細胞に炎症性分子を分泌させる他の細胞を調節することができる。Ｔ細胞はまた、ＮＫＴ細胞ならびに、これと類似する、Ｔ細胞系列の固有のクラスも包含する。組成物はまた、Ｔｒｅｇの活性を増大させるかもしくは促進するか、ＴｒｅｇからのＩＬ−１０などのサイトカインの生成を増大させるか、Ｔｒｅｇの分化を増大させるか、Ｔｒｅｇの数を増大させるか、またはＴｒｅｇの生存を増大させるのにも用いることができる。
【０２７８】
開示されるＢ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質、またはその断片により処置されうる他の免疫細胞には、Ｔ細胞の前駆体、抗原提示細胞、Ｂ細胞、またはその組合せが含まれる。Ｂ細胞を、これらによる抗体の生成をコントロールと比べて阻害または低減するのに有効な量のＢ７−Ｈ４組成物と接触させることにより、これらによる抗体の生成を調節するのに、Ｂ７−Ｈ４組成物を用いることができる。Ｂ７−Ｈ４組成物はまた、Ｂ細胞によるサイトカインの生成も調節しうる。
【０２７９】
Ａ．移植拒絶反応を処置する方法
好ましい実施形態は、被験体、好ましくはヒト被験体における移植拒絶反応を軽減または阻害するための方法を提供する。免疫細胞の生物学的活性を阻害もしくは低減するか、または移植部位における炎症を随伴するかもしくはこれを促進する炎症促進性サイトカインもしくは他の分子の量を低減するのに有効な量のＢ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体を投与することにより、被験体における移植拒絶反応を阻害または軽減することができる。例示的な炎症促進性分子には、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２１、およびＭＭＰが含まれるがこれらに限定されない。
【０２８０】
Ｔｈ１およびＴｈ１７は、炎症を阻害または軽減するＢ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質、またはその断片による阻害の標的となりうる、例示的なＴ細胞である。Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質は、以下：Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、ならびに／または炎症性分子を分泌するか、もしくは他の細胞に炎症性分子を分泌させる他の細胞の分化を阻害または低減すること；Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、ならびに／または炎症性分子を分泌するか、もしくは他の細胞に炎症性分子を分泌させる他の細胞の活性を阻害または低減すること；Ｔｈ１経路および／またはＴｈ１７経路を阻害または低減すること；Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、ならびに／または炎症性分子を分泌するか、もしくは他の細胞に炎症性分子を分泌させる他の細胞によるサイトカインの生成および／または分泌を阻害または低減すること；Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、ならびに／または炎症性分子を分泌するか、もしくは他の細胞に炎症性分子を分泌させる他の細胞の増殖を阻害または低減することのうちのいずれかまたはすべてにより、炎症を処置するのに有用である。
【０２８１】
加えて、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質、またはその断片は、Ｔｒｅｇに、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、ならびに／または炎症性分子を分泌するか、もしくは他の細胞に炎症性分子を分泌させる他の細胞に対する抑制作用を増強させて、生成されるＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−１７のレベルを低減することも可能である。Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質、またはその断片はまた、Ｔｒｅｇに対して直接的に作用して、ＩＬ−１０の生成を促進または増強し、Ｔｈ１経路および／またはＴｈ１７経路を抑制するか、またはＴｒｅｇの数を増大させることも可能である。
【０２８２】
Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質、またはその断片は、複数の経路内の複数の地点で作用する。例えば、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質、またはその断片は、ナイーブＴ細胞が、Ｔｈ１細胞またはＴｈ１７細胞に発達することを阻害しうる。代替的に、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質、またはその断片は、Ｔｈ１細胞もしくはＴｈ１７細胞、またはその両方と相互作用して、炎症促進性分子の生成を阻害または低減することも可能である。加えて、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質、またはその断片は、Ｔｒｅｇを標的として、Ｔｈ１経路および／またはＴｈ１７経路に対する抑制作用を増強させて、生成されるＩＮＦ−γおよび／またはＩＬ−１７のレベルを低減することも可能である。Ｂ７−Ｈ４組成物はまた、Ｔｒｅｇに直接的に作用して、ＩＬ−１０の生成を促進または増強し、Ｔｈ１経路および／またはＴｈ１７経路を抑制することも可能である。加えて、Ｂ７−Ｈ４組成物は、移植される組織の領域内または末梢部位におけるＴｒｅｇ細胞の動員または増殖（またはその両方）を増強することによっても作用しうる。
【０２８３】
１．Ｔｈ１経路の阻害
ａ．Ｔｈ１発達の阻害
移植拒絶反応を阻害または軽減するための一方法は、それを必要とする被験体において、ナイーブＴ細胞がＴｈ１細胞に発達することを、コントロールと比べて移植拒絶反応を阻害または軽減するのに有効な量だけ阻害または遮断するのに有効な量のＢ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体を投与するステップを包含する。Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体もしくはその改変体を投与することを介して、ナイーブＴ細胞のＴｈ１細胞への分化を遮断することにより、移植拒絶反応を阻害または軽減しうることが発見されている。一実施形態では、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体が、ナイーブＴ細胞に対するＴｒｅｇの抑制能を増大させて、ナイーブＴ細胞がＴｈ１細胞に分化することを阻害または低減し、それにより被験体におけるＴｈ１細胞の数を低減する。代替的に、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体は、Ｔｈ１細胞の増殖を阻害または低減する。被験体において発達しうるＴｈ１細胞の数を制限することにより、ＩＮＦ−γなど、生成される炎症促進性分子の量を低減するかまたは抑えることができる。ＩＮＦ−γは、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、およびＭＭＰを含めた、他の炎症促進性分子の生成または放出を刺激する。したがって、被験体におけるＴｈ１細胞の数を制御することにより、これらの他の炎症促進性分子のレベルを制御することができ、それにより移植拒絶反応を軽減することができる。
【０２８４】
ｂ．炎症促進性分子の阻害
別の実施形態は、Ｔｈ１細胞による炎症促進性分子の生成を、被験体における移植拒絶反応を阻害または軽減するのに有効な量だけ阻害または低減するのに有効な量のＢ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体を該被験体に投与することにより、該被験体における移植拒絶反応を阻害または軽減する方法を提供する。Ｔｈ１細胞により生成される、例示的な炎症促進性分子には、ＩＦＮ−γが含まれる。この実施形態では、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体が、Ｔｈ１細胞と直接的に相互作用し、Ｔｈ１細胞によるＩＦＮ−γの生成を阻害または低減することが可能である。この実施形態では、Ｔｈ１細胞集団ではなくて、炎症促進性分子の量を制御する。
【０２８５】
２．Ｔｈ１７経路の阻害
ａ．Ｔｈ１７発達の阻害
また、ナイーブＴ細胞がＴｈ１７細胞に発達することを、被験体における移植拒絶反応をコントロールと比べて阻害または軽減するのに有効な量だけ阻害または遮断するのに有効な量のＢ７−Ｈ４ポリペプチド、もしくはその断片、またはその融合体を投与することにより、該被験体における移植拒絶反応を阻害または軽減することもできる。一実施形態では、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体が、ナイーブＴ細胞のＴｈ１７細胞への分化に対するＴｒｅｇの抑制活性を、被験体におけるＴｈ１７細胞の数を低減するのに十分な量だけ増大させる。代替的に、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体は、Ｔｈ１７細胞の増殖を阻害または低減する。被験体におけるＴｈ１７細胞の集団を低減することにより、生成されるＩＬ−１７のほか、ＩＬ−２２およびＩＬ−２１の量も低減することができる。ＩＬ−１７とは、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、およびＭＭＰなど、他の炎症促進性分子を増大させる炎症促進性分子である。したがって、ＩＬ−１７の量を低減することにより、これらの他の炎症促進性分子も低減することができ、それにより移植拒絶反応を軽減または阻害することができる。
【０２８６】
ｂ．ＩＬ−１７の生成の阻害
さらに別の実施形態は、Ｔｈ１７細胞によるＩＬ−１７の生成のほか、ＩＬ−２２およびＩＬ−２１の生成も、コントロールと比べて移植拒絶反応を阻害または軽減するのに有効な量だけ阻害するのに有効な量のＢ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体を投与することにより、被験体における移植拒絶反応を阻害または軽減するための方法を提供する。この実施形態では、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドまたはＢ７−Ｈ４融合タンパク質が、例えば、Ｔｈ１７細胞に結合し、その結果として、これらのＴｈ１７細胞によるＩＬ−１７（またはＩＬ−２２およびＩＬ−２１）を阻害することにより、Ｔｈ１７細胞に直接的に作用することが可能である。上述の通り、ＩＬ−１７（ならびにＩＬ−２２またはＩＬ−２１）を阻害または低減すると、他の炎症促進性分子が低減され、それにより移植拒絶反応が軽減または阻害される。
【０２８７】
３．Ｔｈ１経路およびＴｈ１７経路の阻害
開示されるＢ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体を用いて、Ｔｈ１経路およびＴｈ１７経路の両方を同時に阻害することができる。１つの抗炎症剤を用いて２つの別個の経路を阻害することにより、免疫反応に対するより頑健な阻害または低減がもたらされ、それにより移植拒絶反応が軽減または阻害される。Ｔｈ１経路およびＴｈ１７経路を阻害すると、好中球の動員が阻害または低減され、それにより１または複数の炎症症状が軽減されうる。一実施形態では、Ｔｈ１経路およびＴｈ１７経路により、好中球および／またはマクロファージの増殖が低減または阻害される。
【０２８８】
４．Ｔｒｅｇ
炎症はまた、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体を、ＩＬ−１０を生成するＴｒｅｇを標的としてＴｈ１経路および／またはＴｈ１７経路に対する抑制活性を増強するのに有効な量で被験体に投与することにより処置することも可能である。この実施形態では、開示されるＢ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体が、単独のＴｒｅｇと比べて、ＩＬ−１７の生成に対する抑制効果を増大させ、それによりコントロールと比べて移植拒絶反応を阻害または軽減する。
【０２８９】
別の実施形態は、ＴｒｅｇによるＩＬ−１０の生成を増大させるのに有効な量のＢ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体を投与することにより、移植拒絶反応を阻害または軽減するための方法を提供する。ＩＬ−１０の生成が増大すると、その結果として、Ｔｈ１７細胞によるＩＬ−１７の生成が低減し、Ｔｈ１細胞によるＩＦＮ−αの生成が低減する。この実施形態では、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体が、Ｔｒｅｇと直接的に相互作用して、ＴｒｅｇによるＩＬ−１０の生成を増大させ、それにより被験体における移植拒絶反応をコントロールと比べて阻害または軽減することが可能である。
【０２９０】
加えて、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、もしくはその断片、またはその融合体は、移植された組織領域におけるＴｒｅｇ細胞の動員または増殖（またはその両方）を増強することによっても作用しうる。したがって、別の実施形態は、移植された組織領域におけるＴｒｅｇ細胞の動員を増強するのに有効な量のＢ７−Ｈ４−Ｉｇ融合タンパク質を被験体に投与することにより、該被験体における移植拒絶反応を阻害または軽減するための方法を提供する。移植された組織へのＴｒｅｇ細胞の浸潤を増大させると、ＩＬ−１０レベルを局所的に上昇させることができ、その結果として、Ｔｈ１７細胞によるＩＬ−１７の生成を低減し、移植部位でＴｈ１細胞によるＩＦＮ−αの生成を低減することができる。これは、移植片の生存を延長し、移植片に対する拒絶を低減しうる。
【０２９１】
さらに別の実施形態は、Ｔｈ１経路、Ｔｈ１７経路を阻害するか、またはこれらに干渉して、ＴｒｅｇによるＴｈ１７経路に対する抑制効果を、被験体における移植拒絶反応をコントロールと比べて阻害または軽減するのに有効な量だけ増強するのに有効な量のＢ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体を投与することにより、該被験体における移植拒絶反応を阻害または軽減するための方法を提供する。
【０２９２】
Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質、ならびにその断片はまた、Ｔｒｅｇ細胞の集団または数を増大させるのに十分な量で被験体に投与することも可能である。
【０２９３】
Ｔｒｅｇを、Ｂ７−Ｈ４活性を有する、有効量のＢ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体と接触させることにより、ＴｒｅｇによるＩＬ−１０およびＴＧＦ−βの生成を、コントロールと比べて増大させることができる。増大は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生じる場合もあり、ｉｎ  ｖｉｖｏで生じる場合もある。
【０２９４】
５．可溶性Ｂ７−Ｈ４
可溶性Ｂ７−Ｈ４（ｓＨ４）は、Ｂ７−Ｈ４受容体に結合し、内因性Ｂ７−Ｈ４がその受容体に結合することを遮断しうる、デコイ分子として作用する。ｓＨ４は、細胞表面Ｂ７−Ｈ４のように阻害シグナルを送達することがない。Ｂ７−Ｈ４は、抗原による刺激の存在下において、Ｔ細胞の細胞周期の進行を阻害する。Ｂ７−Ｈ４は、好中球の前駆細胞の増殖を抑制することにより、先天免疫を阻害しうる。ｓＨ４レベルの上昇は、内因性Ｂ７−Ｈ４の阻害効果を遮断すると考えられている。
【０２９５】
したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｓＨ４の生物学的活性に干渉することにより、例えば、それを必要とする個体に、ｓＨ４がＢ７−Ｈ４受容体に結合する能力を阻害もしくは低減するか、または内因性の阻害性Ｂ７−Ｈ４分子の活性を増進させるのに有効な量の薬剤を投与することにより、移植拒絶反応を阻害または軽減することができる。ｓＨ４の生物学的活性に対する干渉は、本明細書で開示されるＢ７−Ｈ４融合ポリペプチドを投与することにより達成することができる。
【０２９６】
投与は、既存の状態、疾患、または障害（すなわち、既存の炎症性疾患もしくは炎症性障害または自己免疫疾患もしくは自己免疫障害）に対する処置に限定されず、また、個体においてこのような疾患が発生する危険性を防止または低下させるのにも、すなわち、予防的使用にも用いることができる。したがって、開示される組成物は、移植前、移植時、および移植後において投与することができる。
【０２９７】
６．移植片
移植材料は、細胞、組織、器官、四肢、手足指、または身体の部分、好ましくはヒト身体の部分でありうる。移植は、典型的には、同種異系または異種である。開示されるＢ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質、またはその断片を、移植拒絶反応を軽減または阻害するのに有効な量で被験体に投与する。Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質、またはその断片は、任意の許容可能な投与経路により、全身投与することもでき、局所投与することもできる。一部の実施形態では、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体を、移植前、移植時、または移植後において、移植部位に投与する。一実施形態では、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体を、移植部位に、皮下注射などにより非経口投与する。
【０２９８】
他の実施形態では、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質、またはその断片を、移植される細胞、組織、または器官に、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて直接的に投与する。一実施形態では、移植材料を、移植前、移植後、またはそれらの両方において、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、その融合タンパク質、ならびにその断片と接触させる。
【０２９９】
他の実施形態では、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体を、リンパ節または脾臓などの免疫組織または免疫器官に投与する。
【０３００】
移植前に、移植材料を改変することができる。例えば、移植材料を遺伝子改変して、移植拒絶反応を阻害または軽減する一助となるタンパク質を発現させることができる。好ましい実施形態では、移植材料を遺伝子改変して、移植レシピエントにおける移植拒絶反応を阻害または軽減するのに有効な量で、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体を発現させる。
【０３０１】
移植材料を、移植拒絶反応などの免疫反応に関与することについて公知であるかまたはこれが疑われる細胞表面のタンパク質、炭水化物、または脂質を除去する酵素または他の物質により処理することができる。
【０３０２】
Ｂ７−Ｈ４は、炎症経路の複数の地点において、高レベルで作用し、それによりＴＮＦ−αなどのエフェクター性サイトカインの発現および／または活性に対する影響を制御する主要な制御因子として作用する。したがって、本明細書で説明されるＢ７−Ｈ４組成物は、Ｅｎｂｒｅｌ、Ｒｅｍｉｃａｄｅ、Ｃｉｍｚｉａ、およびＨｕｍｉｒａなどのＴＮＦ−α遮断剤が奏効しない患者を処置するのに特に有用である。加えて、炎症経路における主要な制御因子としてのその活性のために、開示されるＢ７−Ｈ４組成物は、慢性移植拒絶反応を処置するのに特に有用である。
【０３０３】
ａ．細胞
任意の種類の細胞集団を被験体に移植することができる。細胞は、同種細胞の場合もあり、異種細胞の場合もある。異種細胞とは、その細胞集団が、複数種類の細胞を含有することを意味する。例示的な細胞には、ドナーから採取し、被験体に移植しうる、幹細胞および多能性細胞などの前駆細胞が含まれる。細胞は、場合によって、上述の通り、移植前に処理することができる。このような処理は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、細胞に、それらがｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでＢ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体を発現することを可能とする核酸構築物をトランスフェクトするステップを包含する。当技術分野では、細胞にトランスフェクトする方法が周知である。
【０３０４】
ｅｘ  ｖｉｖｏにおける核酸送達法は、例えば、被験体から細胞を採取するステップと、細胞を培養するステップと、細胞に発現ベクターを形質導入するステップと、コードされるポリペプチドの発現に適する条件下に細胞を維持するステップとを包含しうる。分子生物学の技術分野では、これらの方法が公知である。例示的な核酸ベクターには、アデノウイルスベクターが含まれるがこれに限定されない。例えば、リン酸カルシウムによる遺伝子導入、リポフェクションによる遺伝子導入、電気穿孔による遺伝子導入、ウイルス感染による遺伝子導入、ならびに遺伝子銃による遺伝子導入（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）を含めた、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける遺伝子治療に用いられる任意の標準的な手段により、形質導入ステップを達成することができる。代替的に、リポソームまたはポリマー製マイクロ粒子を用いることもできる。次いで、形質導入に成功した細胞は、例えば、コード配列の発現、または薬剤耐性遺伝子の発現について選択することができる。次いで、細胞を致死線量で放射線照射し（所望の場合）、被験体内に注射するかまたは植え込むことができる。移植されうる他の例示的な細胞には、膵島細胞、造血細胞、筋肉細胞、心臓細胞、神経細胞、胚性幹細胞、成体幹細胞、Ｔ細胞、リンパ球、真皮細胞、中胚葉細胞、内胚葉細胞、および外胚葉細胞が含まれるがこれらに限定されない。
【０３０５】
ｂ．組織
任意の組織を、移植片として用いることができる。例示的な組織には、皮膚組織；脂肪組織；静脈、動脈、毛細血管、血管弁などの心血管組織；神経組織；骨髄組織；肺組織；角膜および水晶体などの眼組織；軟骨組織；骨組織；ならびに粘膜組織が含まれる。組織は、上記で論じた通りに改変することができる。
【０３０６】
ｃ．器官
移植に用いうる例示的な器官には、腎臓、肝臓、心臓、脾臓、膀胱、肺、胃、眼、舌、膵臓、腸などが含まれるがこれらに限定されない。上記で論じた通り、移植される器官もまた、移植前に改変することができる。
【０３０７】
一実施形態は、コントロールと比べて慢性移植拒絶反応を阻害または軽減するのに有効な量のＢ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体を投与することにより、被験体における慢性移植拒絶反応を阻害または軽減するための方法を提供する。この文脈では、Ｔｒｅｇ細胞に対するＢ７−Ｈ４ポリペプチド、その融合タンパク質、ならびにその断片の効果が特に重要である。
【０３０８】
Ｂ．移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）
開示されるＢ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体はまた、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）に随伴する１または複数の症状を緩和するのに有効な量のＢ７−Ｈ４ポリペプチド、その融合タンパク質、またはその断片を投与することにより、ＧＶＨＤを処置するのにも用いることができる。ＧＶＨＤとは、同種異系の造血幹細胞の移植に随伴する主要な合併症であり、移植された骨髄中の機能性免疫細胞が、レシピエントを「外来者」として認識し、免疫攻撃をもたらす。ＧＶＨＤはまた、特定の状況下にある輸血においても生じうる。ＧＶＨＤの症状には、皮膚の発疹または皮膚の色もしくはきめの変化、下痢、悪心、肝機能の異常、皮膚の黄色化、易感染性の増大、ドライアイ（ｄｒｙ）、眼の刺激、ならびに口腔過敏（ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｕｔｈ）またはドライマウスが含まれる。
【０３０９】
Ｄ．糖尿病
Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドならびにその融合タンパク質はまた、糖尿病を処置するのにも用いることができる。該方法は、被験体にインスリン生成細胞を移植するステップと、移植拒絶反応を軽減または阻害するのに有効な量のＢ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体を該被験体に投与するステップとを包含する。インスリン生成細胞は、ベータ細胞または膵島細胞であることが好ましい。ある実施形態では、インスリン生成細胞が、インスリンを生成するように操作された組換え細胞である。インスリン生成細胞はまた、本明細書で説明されるＢ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体を生成するように遺伝子改変することもできる。
【０３１０】
インスリン生成細胞は、アルギナート、アガロース、ヒアルロン酸、コラーゲン、合成単量体、アルブミン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、デキストラン、硫酸デキストラン、硫酸コンドロイチン、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、キチン、キトサン、ヘパラン、硫酸ヘパラン、またはその組合せが含まれるがこれらに限定されない適切なポリマーを用いるポリマーマトリックスなどのマトリックス内に封入することができる。
【０３１１】
Ｄ．組合せ療法
Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドまたは断片、あるいはその融合物は、単独で用いることもでき、さらなる治療剤と組み合わせて用いることもできる。上記さらなる治療剤には、免疫抑制剤（例えば、他のリンパ球表面マーカー（例えば、ＣＤ４０、アルファ−４インテグリン）またはサイトカインに対する抗体）；他の融合タンパク質（例えば、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ（Ｏｒｅｎｃｉａ（登録商標））、ＴＮＦＲ−Ｉｇ（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）））；Ｅｎｂｒｅｌ、Ｒｅｍｉｃａｄｅ、Ｃｉｍｚｉａ、およびＨｕｍｉｒａなどのＴＮＦ−α遮断剤；シクロホスファミド（ＣＴＸ）（すなわち、Ｅｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（商標））；メトトレキサート（ＭＴＸ）（すなわち、Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ（登録商標）、Ｔｒｅｘａｌｌ（登録商標））；ベリムマブ（すなわち、Ｂｅｎｌｙｓｔａ（登録商標））；もしくは他の免疫抑制薬（例えば、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６様化合物、ラパマイシン化合物、またはステロイド類）；抗増殖剤；細胞傷害剤；または免疫抑制を補助し得る他の化合物が含まれるがこれらに限定されない。
【０３１２】
好ましい実施形態では、上記さらなる治療剤が、別個の経路を介して、Ｔ細胞の活性化およびサイトカインの産生を阻害するかまたは低減するように機能する。このような一実施形態では、上記さらなる治療剤が、ＣＴＬＡ−４  Ｉｇ（アバタセプト）などのＣＴＬＡ−４融合タンパク質である。ＣＴＬＡ−４  Ｉｇ融合タンパク質は、抗原提示細胞上におけるＣＤ８０／ＣＤ８６（Ｂ７−１／Ｂ７−２）への結合について、Ｔ細胞上の共刺激受容体であるＣＤ２８と競合し、このために、Ｔ細胞の活性化を阻害するように機能する。好ましい実施形態では、上記さらなる治療剤が、ベラタセプトとして公知のＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質である。ベラタセプトは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣＤ８６に対するそのアビディティーを顕著に増大させる２つのアミノ酸置換（Ｌ１０４ＥおよびＡ２９Ｙ）を含有する。別の実施形態では、上記さらなる治療剤が、Ｍａｘｙ−４である。
【０３１３】
別の実施形態では、第２の治療剤が、慢性移植拒絶反応またはＧｖＨＤを優先的に処置し、それにより治療レジメンが、急性移植拒絶反応または急性ＧｖＨＤならびに慢性移植拒絶反応または慢性ＧｖＨＤの両方を標的とする。好ましい実施形態では、第２の治療剤が、ＴＮＦ−α遮断剤である。
【０３１４】
別の実施形態では、上記第２の治療剤が、血清中におけるアデノシン量を増加させる（例えば、ＷＯ０８／１４７４８２を参照されたい）。好ましい実施形態では、上記第２の治療剤が、ＣＤ７３−Ｉｇ、組換えＣＤ７３、またはＣＤ７３の発現を増大させる他の薬剤（例えば、サイトカインまたはモノクローナル抗体または低分子）である（例えば、ＷＯ０４／０８４９３３を参照されたい）。別の実施形態では、上記第２の治療剤が、インターフェロン−ベータである。
【０３１５】
好ましい実施形態では、上記組成物は、Ｔｒｅｇの活性または生成を増大させる化合物と組み合わせて、またはこれらの化合物と逐次的に用いられる。例示的なＴｒｅｇ増強剤には、グルココルチコイドであるフルチカゾン、サルメテロール（ｓａｌｍｅｔｅｒｏａｌ）、ＩＬ−１２に対する抗体、ＩＦＮ−γに対する抗体、およびＩＬ−４に対する抗体；ビタミンＤ３、およびデキサメタゾン、ならびにこれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない。他の炎症促進性分子に対する抗体もまた、開示されるＢ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質、またはこれらの断片と組み合わせて、またはこれらと交互に用いることができる。ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、またはＩＬ−２１に結合する抗体が好ましい。
【０３１６】
本明細書で用いられる「ラパマイシン化合物」という用語は、中性の三環系化合物であるラパマイシン、ラパマイシン誘導体、ラパマイシン類似体、ならびにラパマイシンと同じ作用機構（例えば、サイトカイン機能の阻害）を有すると考えられる他のマクロライド化合物を含む。「ラパマイシン化合物」という表現は、ラパマイシンと構造的類似性を有する化合物、例えば、それらの治療有効性を増強するように改変された類似の大環状構造物を有する化合物を含む。当技術分野では、例示的なラパマイシン化合物が公知である（例えば、ＷＯ９５１２２９７２；ＷＯ９５１１６６９１；ＷＯ９５１０４７３８；米国特許第６，０１５，８０９号；同第５，９８９，５９１号；米国特許第５，５６７，７０９号；同第５，５５９，１１２号；同第５，５３０，００６号；同第５，４８４，７９０号；同第５，３８５，９０８号；同第５，２０２，３３２号；同第５，１６２，３３３号；同第５，７８０，４６２号；同第５，１２０，７２７号を参照されたい）。
【０３１７】
「ＦＫ５０６様化合物」という表現は、ＦＫ５０６、およびＦＫ５０６誘導体およびＦＫ５０６類似体、例えば、ＦＫ５０６と構造的類似性を有する化合物、例えば、それらの治療有効性を増強するように改変された類似の大環状構造物を有する化合物を含む。ＦＫ５０６様化合物の例には、例えば、ＷＯ００１０１３８５に記載されている化合物が含まれる。本明細書で用いられる「ラパマイシン化合物」という表現は、ＦＫ５０６様化合物を含めないことが好ましい。
【０３１８】
他の適切な治療剤には、抗炎症剤が含まれるがこれらに限定されない。上記抗炎症剤は、非ステロイド系の場合もあり、ステロイド系の場合もあり、これらの組合せの場合もある。一実施形態は、約１％（ｗ／ｗ）〜約５％（ｗ／ｗ）、典型的には約２．５％（ｗ／ｗ）の抗炎症剤を含有する経口組成物を提供する。限定なしに述べると、非ステロイド系抗炎症剤の代表例には、ピロキシカム、イソキシカム、テノキシカム、スドキシカムなどのオキシカム；アスピリン、ジサルシド、ベノリレート、トリリセート、サファプリン、ソルプリン、ジフルニサル、およびフェンドサルなどのサリチル酸塩およびエステル；ジクロフェナク、フェンクロフェナク、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、イソキセパック、フロフェナク、チオピナク、ジドメタシン、アセマタシン、フェンチアザク、ゾメピラク、クリンダナク、オキセピナク、フェルビナク、およびケトロラクなどの酢酸誘導体；メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、ニフルミン酸、およびトルフェナム酸などのフェナム酸塩およびエステル；イブプロフェン、ナプロキセン、ベノキサプロフェン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、フェノプロフェン、フェンブフェン、インドプロフェン、ピルプロフェン、カルプロフェン、オキサプロジン、プラノプロフェン、ミロプロフェン、チオキサプロフェン、スプロフェン、アルミノプロフェン、およびチアプロフェン酸（ｔｉａｐｒｏｆｅｎｉｃ）などのプロピオン酸誘導体；フェニルブタゾン、オキシフェンブタゾン、フェプラゾン、アザプロパゾン、およびトリメタゾンなどのピラゾールが含まれる。また、これらの非ステロイド系抗炎症剤の混合物も使用することができる。
【０３１９】
限定なしに述べると、ステロイド系抗炎症薬の代表例には、ヒドロコルチゾン、ヒドロキシルトリアムシノロン、アルファ−メチルデキサメタゾン、リン酸デキサメタゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、吉草酸クロベタゾール、デソニド、デソキシメタゾン、酢酸デソキシコルチコステロン、デキサメタゾン、ジクロリゾン、二酢酸ジフロラゾン、吉草酸ジフルコルトロン、フルアドレノロン、フルクロロロンアセトニド、フルドロコルチゾン、フルメタゾンピバレート、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルコルチンブチルエステル、フルオコルトロン、酢酸フルプレドニデン（フルプレドニリデン）、フルランドレノロン、ハルシノニド、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロンアセトニド、コルチゾン、コルトドキソン、フルセトニド、フルドロコルチゾン、二酢酸ジフルオロオゾン、フルラドレノロン、フルドロコルチゾン、二酢酸ジフルロゾン、フルラドレノロンアセトニド、メドリゾン、アムシナフェル、アムシナフィド、ベタメタゾンおよびそのエステルの残りのもの（ｔｈｅ  ｂａｌａｎｃｅ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｅｓｔｅｒｓ）、クロロプレドニゾン、酢酸クロロプレドニゾン（ｃｈｌｏｒｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ  ａｃｅｔａｔｅ）、クロコルテロン、クレシノロン、ジクロリゾン、ジフルルプレドネート、フルクロロニド、フルニゾリド、フルオロメタロン、フルペロロン、フルプレドニゾロン、吉草酸ヒドロコルチゾン、シクロペンチルプロピオン酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルタメート、メプレドニゾン、パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、トリアムシノロン、ならびにこれらの混合物などのコルチコステロイドが含まれる。
【０３２０】
別の実施形態では、さらなる治療剤に、ｓＨ４活性を阻害するかまたはこれに干渉して、被験体における炎症性障害を処置する組成物が含まれる。一実施形態では、炎症性疾患を処置するために、ｓＨ４を微量有するかまたはそれが検出不能である被験体にＢ７−Ｈ４融合ポリペプチドを投与する。別の実施形態では、Ｂ７−Ｈ４融合ポリペプチドを投与して、ｓＨ４レベルが高い被験体における炎症性疾患の１つ以上の症状を処置する。ｓＨ４レベルの上昇は、炎症性障害を有することが公知の被験体におけるｓＨ４レベルを、炎症性障害を有さない被験体におけるｓＨ４レベルと比較することにより決定することができる。
【０３２１】
Ｆ．移植候補者の選択
ｓＨ４およびＢ７−Ｈ４の検出を用いて、移植候補者を評価することができる。ｓＨ４レベルが上昇すると、内因性Ｂ７−Ｈ４の阻害効果が遮断され、したがって、血清中のｓＨ４レベルによって、患者が移植材料を拒絶する可能性が予測されうると考えられる。Ｂ７−Ｈ４は、Ｔ細胞反応の負の制御因子であるので、細胞表面において発現するＢ７−Ｈ４のレベルによっても、患者が移植材料を拒絶する可能性が予測されうる。個体に由来する生物学的試料中に存在するｓＨ４レベルは、移植前に決定することができる。異なるレベルの重症度を含めた移植拒絶反応と相関するｓＨ４の量は、移植に成功した患者におけるｓＨ４、ならびに移植に失敗した患者におけるｓＨ４を定量化することにより、あらかじめ決定することができる。移植候補者の生物学的試料中に存在するｓＨ４レベルは、他の個体に由来する生物学的試料中に存在する、所定の基準ｓＨ４レベルと比較することができ、これらを用いて、該候補者が移植に成功する可能性を予測することができる。例えば、ｓＨ４レベルが約「ｘ」である患者のうちの７５％が、移植片拒絶を経験していれば、ｓＨ４レベルが約「ｘ」である患者は、移植を拒絶する確率が７５％でありうる。当技術分野では、患者が移植を拒絶する可能性に影響しうる他の因子が公知であり、患者が移植を拒絶する確率を決定するときにこれらを考慮することができる。例えば、ドナーの年齢、レシピエントの糖尿病、レシピエントの性別、慢性ＧＶＨＤ、ならびにＴ細胞のレベルもまた考慮することができる。
【０３２２】
患者が移植に成功する可能性を用いて、患者を、移植について選択することができる。例えば、そのｓＨ４レベルが、０％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％の拒絶可能性に対応する患者は、移植の良好な候補者でありうるのに対し、そのｓＨ４レベルが、８０％、９０％、または１００％の拒絶可能性に対応する患者は、移植の良好な候補者ではない可能性がある。それに加えて、その代わりに、移植候補者の生物学的試料中のｓＨ４レベルを、炎症反応または自己免疫疾患の異なる病期の指標となるｓＨ４量と比較することもできる。
【０３２３】
代替的に、ｓＨ４量を、好中球レベルと相関させることができる。好中球は、早期の同種異系移植拒絶反応の一因をなすと考えられている（Ｈｅａｌｙら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ、２９巻：７６０〜７６６頁（２００６年））。したがって、ある個体では、好中球レベルの上昇によって、移植拒絶反応、特に、急性拒絶が予測されうる。したがって、個体におけるｓＨ４レベルを、好中球レベルと相関させることができる。特定の好中球レベルに対応するｓＨ４レベルは、被験体におけるｓＨ４レベルをアッセイし、該被験体における好中球レベルをアッセイすることにより、あらかじめ決定することができる。基準レベルを決定したら、被験体に由来する生物学的試料を、ｓＨ４レベルについてアッセイすることができる。次いで、結果として得られるｓＨ４レベルを、特定の好中球レベルと相関させた所定のｓＨ４レベルと比較する。結果として得られるｓＨ４レベルを、所定のレベルと照合（ｍａｔｃｈ）して、被験体における好中球レベルを決定する。健康な個体における好中球数は、約１５，０００細胞／μｌ〜約２０，０００細胞／μｌの範囲にある。
【０３２４】
試料中におけるｓＨ４量は、酵素結合イムノソルベント検定法、質量分析、分光測光法、またはその組合せなど、従来の技法を用いて決定することができる。
【０３２５】
生物学的試料中におけるｓＨ４の存在を検出するための方法、ならびに／または生物学的試料中におけるｓＨ４レベルを測定するための方法は、ｓＨ４特異的抗体または抗Ｂ７−Ｈ４抗体の使用を包含しうる。該抗体は、配列番号２〜７、９〜２０、２４〜３３、４２〜８０によりコードされるポリペプチドのうちのいずれか１つにおけるエピトープを認識することが好ましい。該方法は一般に、
ａ）試料を、ｓＨ４に特異的な抗体と接触させるステップと、
ｂ）抗体と試料の分子との結合を検出するステップと
を包含する。
【０３２６】
適切なコントロールと比較して、ｓＨ４特異的抗体の特異的結合を検出することから、試料中にｓＨ４が存在することが示唆される。適切なコントロールには、ｓＨ４を含有しないことが公知である試料、ならびにｓＨ４に特異的でない抗体、例えば、抗イディオタイプ抗体と接触させた試料が含まれる。
【０３２７】
当技術分野では、特異的な抗体−抗原相互作用を検出するための各種の方法が公知であり、標準的な免疫組織化学法、免疫沈降、酵素イムノアッセイ、およびラジオイムノアッセイが含まれるがこれらに限定されない方法において用いることができる。一般に、ｓＨ４特異的抗体は、直接的または間接的に、検出可能に標識される。直接的な標識には、放射性同位元素；その生成物が検出可能である酵素（例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼなど）；蛍光標識（例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン、ロダミン、フィコエリトリンなど）；ＥＤＴＡなどの金属キレート化基を介して抗体に結合させた蛍光発光金属、例えば、１５２Ｅｕ、またはランタニド系列の他の元素；化学発光化合物、例えば、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウム塩など；生物発光化合物、例えば、ルシフェリン、イクオリン（緑色蛍光タンパク質）などが含まれる。抗体は、ポリスチレン製のプレートまたはビーズなど、不溶性の支持体に結合させる（連結する）ことができる。間接的標識には、ｓＨ４特異的抗体に特異的な第２の抗体が含まれ、該第２の抗体は、上記で説明した通りに標識され、場合によって、特異的な結合対、例えば、ビオチン−アビジンのメンバーを含有する。細胞、細胞粒子、または可溶性タンパク質を固定化することが可能な、ニトロセルロースなど、固体の支持体または担体と生物学的試料を接触させ、これに固定化することができる。次いで、支持体を適切な緩衝液で洗浄した後、検出可能に標識されたｓＨ４特異的抗体と接触させることができる。
【０３２８】
さらに他の実施形態は、生物学的試料中におけるｓＨ４の存在を検出するための方法、ならびに／または生物学的試料中におけるｓＨ４レベルを測定するための方法を提供する。該方法は一般に、
ａ）試料を、ｓＨ４リガンド、例えば、ｓＨ４に結合するＢ７−Ｈ４受容体またはその断片と接触させるステップと、
ｂ）Ｂ７−Ｈ４受容体と試料の分子との結合を検出するステップと
を包含する。
【０３２９】
Ｂ７−Ｈ４受容体の特異的な結合を検出することから、試料中にｓＨ４ポリペプチドが存在することが示唆される。
【０３３０】
当技術分野では、Ｂ７−Ｈ４受容体とｓＨ４との結合を検出するための方法が公知であり、これらには、その抗体がＢ７−Ｈ４受容体−ｓＨ４の結合を破壊しない限りにおいて、Ｂ７−Ｈ４受容体に特異的な抗体を用いる、Ｂ７−Ｈ４受容体−リガンド複合体の免疫沈降が含まれる。代替的に、用いられるＢ７−Ｈ４受容体は、その融合パートナーに特異的な免疫沈降、酵素的検出、蛍光シグナル（例えば、緑色蛍光タンパク質）をもたらす融合タンパク質でもありうる。Ｂ７−Ｈ４受容体は、上記で説明した任意の検出可能な標識で標識することができる。Ｂ７−Ｈ４受容体を、直接的に、またはリンカーを介して、不溶性の支持体（例えば、ポリスチレン製のビーズ、磁気ビーズなど）に結合させ、それにより生物学的試料からｓＨ４／受容体複合体を分離し、その後、ｓＨ４の存在を検出し、かつ／またはｓＨ４の量（レベル）を測定するための手段を提供することができる。
【実施例】
【０３３１】
（実施例１）
同種異系の膵島移植片（ｉｓｌｅｔ  ｇｒａｆｔ）の移植におけるＢ７−Ｈ４−Ｉｇの効果
レシピエントとしてのＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウス、ならびに膵島ドナーとしてのＢＡＬＢ／ｃマウスによる同種異系移植モデルを用いて、移植レシピエントによる膵島移植片の生存延長におけるｉｎ  ｖｉｖｏのＢ７−Ｈ４−Ｉｇ効果を調べた。膵島細胞に特異的に毒性であり、その結果として永続的な高血糖状態をもたらす、広範に用いられる薬物であるストレプトゾトシン（ＳＴＺ；２００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）投与することにより、雌Ｂ６マウスのレシピエント（ｎ＝４）を糖尿病とした。ＳＴＺを注射した後、Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ  Ｅｌｉｔｅによりマウスを血中グルコースレベル（ＢＧＬ）について調べ、糖尿病の徴候について調べた。ＳＴＺ投与から２〜３日後、糖尿病の徴候を示すＢ６マウスを、移植レシピエントとして用いた。同種異系移植用の膵島細胞は、コラゲナーゼ消化（ドナーの膵臓を、コラゲナーゼを伴う総胆管（ｃｏｍｍｏｎ  ｄｕｃｔ）を介して、ｉｎ  ｓｉｔｕの胆汁存在下において還流した）の後、非連続的なＦｉｃｏｌｌ勾配で分離し、実体顕微鏡下で手で選別すること（ｈａｎｄｐｉｃｋｉｎｇ）によって精製することにより、８〜１０週齢のＢＡＬＢ／ｃドナーマウスの膵臓から単離した。次いで、膵島細胞（ｉｓｌｅｔ）５００個の群を、各レシピエントの左腎被膜下に移植した。次いで、０日目に、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ（２５０μｇ）のｉ．ｐ．注射により、移植レシピエントを処置した。この後、２、４、６、および８日目に、それぞれ同量ずつの試薬を注射した。隔日でＢＧＬを測定した。無作為のＢＧＬ読み取り値が、３日連続で＞２５０ｍｇ／ｄｌであることを、糖尿病の臨床的再発として定義したが、膵島細胞の生存は、マウスが、２５０ｍｇ／ｄｌ未満のＢＧＬ読み取り値を維持する能力により決定する。糖尿病を有するＢ６マウスにおける膵島移植に対するＢ７−Ｈ４−Ｉｇ注射の効果を決定するため、カプラン−マイヤー解析により、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇ処置群の移植片生存曲線と、非処置群の移植片生存曲線とを比較した。図１は、レシピエントＢ６マウスにおける糖尿病の誘導、ならびにＢ７−Ｈ４−Ｉｇの投与を伴う、同種異系の膵島移植を示す。図２は、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇを注射したところ、移植拒絶反応が緩徐化し、同種異系の膵島移植レシピエントのＢ６マウスにおける移植片の生存が延長された、この実験の結果を示す。
【０３３２】
（実施例２）
Ｂ７−Ｈ４−ＩｇはＧｖＨＤの同種異系移植マウスモデルにおける生存性を増大させる
移植および処置のプロトコール
レシピエントのＢａｌｂ／Ｃマウスを、８．４Ｇｙの線量で致死的に照射し、Ｃ５７Ｂ／６に由来する５×１０６個の同種異系骨髄（ＢＭ）細胞＋脾臓細胞（１．５×１０７個）または５×１０６個の同系骨髄細胞を単回静脈内接種することにより、４時間以内に回復させた（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ）。ケージ関連効果に由来する偏りを回避するため、異なる群内の動物を、ケージ間で無作為化した。４群のマウスを含んだ。第Ｉ群は、Ｂａｌｂ／Ｃマウスに由来するＢＭ細胞を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスに導入した同系ＢＭ移植であり、陰性コントロールとして用いた。第ＩＩ群は、０日目、１日目、７日目、および１４日目にコントロールＩｇＧ（０．５ｍｇ）を投与した同種異系骨髄移植とした。第ＩＩＩ群は、０日目、１日目、７日目、および１４日目にＢ７−Ｈ４−Ｉｇ（０．５ｍｇ）を投与した同種異系骨髄移植とした。第ＩＶ群は、０日目、１日目、７日目、および１４日目にリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）で処置した同種異系骨髄移植とした。陰性コントロールである同系ＢＭ移植群のマウスは４匹とし、他の３群のマウスは８匹ずつとした。図３は、移植片対宿主病アッセイの実験デザインについての概略的な図である。
【０３３３】
結果
図４Ａは、移植後７日目において、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処置した同種異系ＢＭ移植マウスが、コントロールＩｇＧで処置した同種異系ＢＭ移植マウスと比較して、下痢の臨床スコアを有意に低下させたことを示す。図４Ｂは、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇで処置した同種異系ＢＭ移植マウスが、コントロールＩｇＧで処置した同種異系移植マウスと比較して、体重低減を軽減したことを示す。図５は、一過的にＢ７−Ｈ４−Ｉｇで処置した同種異系ＢＭ移植マウスが、コントロールと比較して、より長く生存したことを示す。まとめると、結果は、用量レジメンを最適化すると、Ｂ７−Ｈ４−Ｉｇが、同種異系ＢＭ移植に潜在的に有用でありうることを示す。
【０３３４】
別段に定義されない限り、本明細書で用いられるすべての技術用語および科学用語は、開示される発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
【０３３５】
当業者は、日常的な実験だけを用いて、本明細書で説明される本発明の特定の実施形態に対する多くの同等物を実施しうることを認識するか、または確認しうるであろう。このような同等物は、以下の特許請求の範囲により包含されることを意図する。
【図２】
2013503205.tif 000075
【図４】
2013503205.tif 000076
【図５】
2013503205.tif 000077
【図１】
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【図３】
2013503205.tif 000079
【配列表】
2013503205000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年5月2日(2012.5.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
また、慢性移植拒絶反応を阻害または軽減するための方法も提供される。該方法は、それを必要とする被験体に、コントロールと比べて、移植片の慢性拒絶反応を阻害または軽減するのに有効な量のＢ７−Ｈ４ポリペプチドもしくはその断片、またはその融合体を投与するステップを包含する。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
被験体における移植拒絶反応を阻害または軽減するための方法であって、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、または炎症性分子を分泌するか、もしくは他の細胞に炎症性分子を分泌させる他の細胞からなる群から選択される免疫細胞の分化、増殖、活性、または上記免疫細胞によるサイトカインの生成もしくは分泌を、コントロールと比べて移植拒絶反応を阻害または軽減するのに有効な量だけ阻害または低減するのに有効な量のＢ７−Ｈ４タンパク質を上記被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目２）
上記Ｂ７−Ｈ４タンパク質が、ナイーブＴ細胞の、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ１細胞、またはＴｈ２２細胞への発達を阻害する、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記Ｂ７−Ｈ４タンパク質が、上記被験体における免疫細胞によるＩＦＮγの生成を阻害する、項目４に記載の方法。
（項目４）
上記Ｂ７−Ｈ４タンパク質が、上記被験体における免疫細胞によるＩＬ−１７またはＩＬ−２２の生成を阻害する、項目６に記載の方法。
（項目５）
被験体における移植拒絶反応を阻害または軽減するための方法であって、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、または炎症性分子を分泌するか、もしくは他の細胞に炎症性分子を分泌させる他の細胞からなる群から選択される２種類以上の免疫細胞の分化、増殖、活性、ならびに／または２種類以上の上記免疫細胞によるサイトカインの生成および／もしくは分泌を、コントロールと比べて移植拒絶反応を阻害または軽減するのに有効な量だけ阻害または低減するのに有効な量のＢ７−Ｈ４タンパク質を上記被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目６）
被験体における移植拒絶反応を阻害または軽減するための方法であって、Ｔｈ１７経路に対するＴｒｅｇの抑制効果を、移植拒絶反応を阻害または軽減するのに有効な量で増強するのに有効な量のＢ７−Ｈ４タンパク質を上記被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目７）
被験体における移植拒絶反応を阻害または軽減するための方法であって、ＴｒｅｇによるＩＬ−１０の生成を、上記被験体における移植拒絶反応をコントロールと比べて阻害または軽減するのに有効な量だけ促進または増強するのに有効な量のＢ７−Ｈ４タンパク質を上記被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目８）
被験体における移植拒絶反応を阻害または軽減するための方法であって、Ｔｒｅｇの数を、上記被験体における移植拒絶反応をコントロールと比べて阻害もしくは軽減するか、または移植される組織領域におけるＴｒｅｇ細胞の動員もしくは増殖を増強するのに有効な量だけ増大させるのに有効な量のＢ７−Ｈ４タンパク質を上記被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目９）
被験体における移植拒絶反応を阻害または軽減するための方法であって、上記被験体における移植拒絶反応をコントロールと比べて阻害もしくは軽減するのに有効な量だけ、Ｔｈ１経路およびＴｈ１７経路を阻害し、Ｔｒｅｇと共に作用して、Ｔｈ１７経路に対するその抑制効果を増強するか、またはＴｒｅｇによるＩＬ−１０の分泌を促進もしくは増強するのに有効な量のＢ７−Ｈ４タンパク質を上記被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目１０）
被験体におけるサイトカインの生成を低減するための方法であって、上記被験体における１または複数のサイトカインの生成を阻害するのに有効な量のＢ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質、Ｂ７−Ｈ４アゴニスト性抗体、またはその断片を上記被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目１１）
第２の治療剤を投与するステップをさらに含む、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
上記第２の治療剤が、グルココルチコイド、フルチカゾン、サルメテロール（ｓａｌｍｅｔｅｒｏａｌ）；ＩＬ−１２に対する抗体、ＩＬ−６に対する抗体、ＩＦＮ−γに対する抗体、ＩＬ−２３に対する抗体、ＩＬ−２２に対する抗体、ＩＬ−２１に対する抗体、およびＩＬ−４に対する抗体；ビタミンＤ３；ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ、ベラタセプト；デキサメタゾン、ならびにその組合せからなる群から選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
被験体における移植拒絶反応を阻害または軽減する方法であって、Ｔｈ０細胞が、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞、またはＴｈ２２細胞のうちの１または複数に分化することを、上記被験体における移植拒絶反応をコントロールと比べて阻害または軽減するのに有効な量だけ阻害するのに有効な量のＢ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質、Ｂ７−Ｈ４アゴニスト性抗体、またはその断片を上記被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目１４）
上記移植が、同種異系移植である、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
上記移植が、皮膚移植、組織移植、臓器移植、または骨髄移植である、項目１から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
上記Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質が、移植前、移植後、またはその両方において、移植される細胞、組織、または器官に直接的に投与される、項目１から１５のいずれかに記載の方法。
（項目１７）
上記Ｂ７−Ｈ４融合タンパク質が、免疫器官に直接的に投与される、項目１から１５のいずれかに記載の方法。
（項目１８）
被験体における移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の１または複数の症状を処置するための方法であって、移植片を受けた被験体または移植片を受ける被験体に、ＧＶＨＤの１または複数の症状を緩和するのに有効な量のＢ７−Ｈ４ポリペプチド、その融合タンパク質、またはその断片を投与するステップを含む、方法。
（項目１９）
糖尿病を処置するための方法であって、それを必要とする被験体に、インスリン生成細胞を移植するステップと、糖尿病に随伴する１または複数の症状を緩和するのに有効な量のＢ７−Ｈ４ポリペプチド、その融合タンパク質、またはその断片を上記被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目２０）
被験体における慢性移植拒絶反応を阻害または軽減するための方法であって、コントロールと比べて移植片の慢性拒絶反応を阻害または軽減するのに有効な量のＢ７−Ｈ４融合タンパク質を上記被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目２１）
患者が移植を拒絶する可能性を予測するための方法であって、
（ａ）上記患者におけるｓＨ４レベルを決定するステップと、
（ｂ）上記患者におけるｓＨ４レベルを、移植を受けた１または複数の他の患者におけるｓＨ４レベルと比較して、（ａ）において決定されたｓＨ４レベルを有する上記他の患者における移植拒絶反応の頻度を決定するステップと
を含む、方法。
（項目２２）
移植について患者を選択するための方法であって、
（ａ）項目２１に記載の方法と、
（ｂ）移植拒絶反応の可能性が３０％以下である患者を選択するステップと
を含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における移植組織または移植器官の拒絶反応を阻害または軽減するための薬学的な製剤であって、
前記薬学的な製剤は、第２のポリペプチドに融合した、または第２のポリペプチドに融合したリンカーペプチドに融合した、配列番号６３または配列番号６４のＩｇＶドメインを含むＢ７−Ｈ４ポリペプチドを含む融合タンパク質を含み、
前記融合タンパク質は、コントロールと比べて前記被験体においてＴｈ１経路またはＴｈ１７経路に対するＴｒｅｇの抑制効果を増強し、前記被験体における移植された組織または器官の拒絶反応を軽減するのに有効な量で存在する、
薬学的な製剤。
【請求項２】
被験体における移植組織または移植器官の拒絶反応を阻害または軽減するための薬学的な製剤であって、
前記薬学的な製剤は、第２のポリペプチドに融合した、または第２のポリペプチドに融合したリンカーペプチドに融合した、配列番号６３または配列番号６４のＩｇＶドメインを含むＢ７−Ｈ４ポリペプチドを含む融合タンパク質を含み、
前記第２のポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含み、
前記融合タンパク質は、コントロールと比べて前記被験体においてＴｈ１経路またはＴｈ１７経路に対するＴｒｅｇの抑制効果を増強し、前記被験体における移植された組織または器官の拒絶反応を軽減するのに有効な量で存在する、
薬学的な製剤。
【請求項３】
前記融合タンパク質が、コントロールと比べて前記被験体において前記Ｔｈ１７経路に対するＴｒｅｇの抑制効果を増強するのに有効な量で存在する、請求項１または２に記載の薬学的な製剤。
【請求項４】
コントロールと比べて前記被験体においてＴｈ１７細胞の数を低減させる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の薬学的な製剤。
【請求項５】
コントロールと比べて前記被験体においてＴｈ１細胞の数を低減させる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の薬学的な製剤。
【請求項６】
コントロールと比べて前記被験体においてＩＬ−１７のレベルを低減させる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の薬学的な製剤。
【請求項７】
第２の治療剤をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の薬学的な製剤。
【請求項８】
前記第２の治療剤が、グルココルチコイド、フルチカゾン、サルメテロール（ｓａｌｍｅｔｅｒｏａｌ）；ＩＬ−１２に対する抗体、ＩＬ−６に対する抗体、ＩＦＮ−γに対する抗体、ＩＬ−２３に対する抗体、ＩＬ−２２に対する抗体、ＩＬ−２１に対する抗体、およびＩＬ−４に対する抗体；ビタミンＤ３；ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ、ベラタセプト；デキサメタゾン、ならびにその組合せからなる群から選択される、請求項７に記載の薬学的な製剤。
【請求項９】
前記移植が、同種異系移植である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の薬学的な製剤。
【請求項１０】
前記移植が、皮膚移植、組織移植、臓器移植、または骨髄移植である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の薬学的な製剤。
【請求項１１】
被験体における移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の１または複数の症状を処置するための薬学的な製剤であって、
前記薬学的な製剤は、第２のポリペプチドに融合した、または第２のポリペプチドに融合したリンカーペプチドに融合した、配列番号６３または配列番号６４のＩｇＶドメインを含むＢ７−Ｈ４ポリペプチドを含む融合タンパク質を含み、
前記融合タンパク質は、前記被験体においてＧＶＨＤの１または複数の症状を緩和するのに有効な量で存在する、
薬学的な製剤。
【請求項１２】
被験体における移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の１または複数の症状を処置するための薬学的な製剤であって、
前記薬学的な製剤は、第２のポリペプチドに融合した、または第２のポリペプチドに融合したリンカーペプチドに融合した、配列番号６３または配列番号６４のＩｇＶドメインを含むＢ７−Ｈ４ポリペプチドを含む融合タンパク質を含み、
前記第２のポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含み、
前記融合タンパク質は、前記被験体においてＧＶＨＤの１または複数の症状を緩和するのに有効な量で存在する、
薬学的な製剤。
【請求項１３】
コントロールと比べて前記Ｔｈ１７経路に対するＴｒｅｇの抑制効果を増強することによって、被験体における移植拒絶反応を阻害する方法で使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の薬学的な製剤。
【国際調査報告】
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