(57)【要約】固相ペプチド合成法を開示する。本方法は、α，β−不飽和スルホンで構成されるミカエルアクセプター部位を含有する保護基で保護されている、保護形態のアミノ基を、水、アルコール、及び水とアルコールの混合物からなる群から選ばれる溶媒中で脱保護し；脱保護された酸を、水、アルコール、及び水とアルコールの混合物からなる群から選ばれる溶媒中で洗浄し；脱保護された酸を、水、アルコール、及び水とアルコールの混合物からなる群から選ばれる溶媒中で、樹脂ベースのペプチド又は樹脂ベースのアミノ酸に結合させ；そして、結合組成物を、水、アルコール、及び水とアルコールの混合物からなる群から選ばれる溶媒中で洗浄するステップを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相ペプチド合成法において、改良が、
α，β−不飽和スルホンで構成されるミカエルアクセプター部位を含有する保護基で保護されている、保護形態のアミノ基を脱保護し；そして
脱保護された酸を、水、アルコール、及び水とアルコールの混合物からなる群から選ばれる溶媒中で洗浄する
ことを含む方法。
【請求項２】
保護アミノ酸を、水、アルコール、及び水とアルコールの混合物からなる群から選ばれる溶媒中で脱保護することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
脱保護された酸を、水、アルコール、及び水とアルコールの混合物からなる群から選ばれる溶媒中で、樹脂ベースのペプチド又は樹脂ベースのアミノ酸に結合させることを含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
保護基が、Ｂｓｍｏｃ、Ｎｓｍｏｃ、Ｂｓｐｏｃ、及びＭｓｐｏｃからなる群から選ばれる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
脱保護された酸及び溶媒を、洗浄ステップ中にマイクロ波照射で照射することをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
保護された酸を溶媒に可溶性の塩基で脱保護することを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
洗浄ステップが水とアルコールの混合物中で実施され、アルコールが、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、及びｔｅｒｔ−ブタノールからなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
保護アミノ酸を、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、炭酸ナトリウム、ピペリジン、４−（アミノメチル）ピペリジン、ピペラジン及びアルキル水酸化物からなる群から選ばれる塩基で脱保護することを含む、請求項１又は請求項７に記載の方法。
【請求項９】
第二の保護酸のために、
脱保護；
洗浄；
結合；及び
洗浄
のステップを繰り返すことを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
第三及びその後の一連の複数の保護酸のために脱保護及び結合ステップを繰り返し、ペプチド鎖を形成することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ペプチド鎖を固相樹脂から切断することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
切断ステップ中に組成物をマイクロ波で照射することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
固相樹脂と溶液の混合物を含む組成物であって、
前記溶液は、アミノ酸及びアミノ酸保護基を含み、どちらも同じ溶媒中に溶解されており；
前記保護基は、α，β−不飽和スルホンで構成されるミカエルアクセプター部位を含有し；そして
前記溶媒は、水、アルコール、及び水とアルコールの混合物からなる群から選ばれる
組成物。
【請求項１４】
前記保護基が、Ｂｓｍｏｃ、Ｎｓｍｏｃ、Ｂｓｐｏｃ、及びＭｓｐｏｃからなる群から選ばれる、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、炭酸ナトリウム、ピペリジン、４−（アミノメチル）ピペリジン、ピペリジン及びアルキル水酸化物からなる群から選ばれる水溶性塩基をさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[001]関連出願
[002]本願は、２０１０年８月１６日出願の米国仮出願第６１／３７３，９８９号；２０１０年９月１４日出願の米国仮出願第６１／３８２，５５０号；２０１１年２月１０日出願の米国仮出願第６１／４４１，３９０号及び２０１１年３月３１日出願の米国仮出願第６１／４６９，８８１号、並びに２０１１年８月１５日出願の米国出願第１３／２０９，９６０号に基づく優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
[003] 背景
[004]本発明は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）及び水溶液中でＳＰＰＳ反応を実施する方法に関する。
【０００３】
[005]ペプチドはアミノ酸の連結鎖であり、これは次に大部分の生命体の基本構成要素（ビルディングブロック）となる。ペプチドは、タンパク質すなわちアミノ酸の長大複合鎖の前駆体でもある。ペプチド及びタンパク質は、ヒト及び動物生命の根幹を成すものであり、様々な天然プロセスを駆動し、影響を及ぼし、又は制御している。その結果、ペプチド及びタンパク質の研究、そしてペプチド及びタンパク質の合成可能性は、生物科学及び医学において重大な関心事である。
【０００４】
[006]固相ペプチド合成は、初期アミノ酸を固体粒子に連結し、次に追加のアミノ酸を第一の酸に付加してペプチド鎖を形成する技術である。鎖が粒子に結合されているので、区別された(discrete)容器内に保持された状態で、追加の溶媒又は濯ぎ剤で洗浄及び別の場合では処理でき、（少なくともある程度）固体として取り扱うことができる。このように、ＳＰＰＳは、固体を取り扱う利便性を一部有する様式で液相化学を実施することを可能にする。
【０００５】
[007]従来のＳＰＰＳは、ほぼ典型的には、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及びジクロロメタン（ＤＣＭ）のような極性有機溶媒中で実施される。ＤＣＭは典型的にはＤＭＦ又はＮＭＰと混合される。なぜならば、ＳＰＰＳで頻繁に使用されるＮ−アルファ保護基のＦｍｏｃ（例えばフルオレニルメチルオキシカルボニルクロリド）及びＢｏｃ（例えばｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）は通常疎水性で水に不溶だからである。Ｆｍｏｃ及びＢｏｃ（例えばｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）合成法は、ＳＰＰＳに大きな影響を及ぼしてきたが、どちらも高価で有毒な有機溶媒を必要とするという難点を有している。
【０００６】
【化１】
2013534247.tif 000002
【０００７】
[008]これらの毒性溶媒は、反応を完全にドラフト又は同等の装置下で実施するといった特別な実験技術の使用を必要とする。ドラフトのスペースは、実験室環境(laboratory context)においては限られるため、貴重である。その結果、これらの溶媒を使用するＳＰＰＳは、ランドスケープの観点から高価となる。
【０００８】
[009]これらの有機溶媒は攻撃的な傾向にあり、グレードの高い装置を必要とする。それらの廃棄は環境上危険有害であり、最低限でも規制されている。
[0010]従来のＳＰＰＳでは、Ｆｍｏｃ基は、ＳＰＰＳ中のβ脱離反応において第二級アミン（ピペリジン、ピペラジン、モルホリン）によって除去される。この機構の望ましくない特徴は、反応性ジベンゾフルベン（ＤＢＦ）が生成し、これが過剰のピペリジンによって捕捉されることである。しかしながら、ＤＢＦは、遊離アミン基とも反応し、ペプチド鎖の末端を効果的にキャッピングし得る。一部の脱保護は、ほとんどのＤＢＦを反応容器から洗い流すための短時間の初期脱保護ステップを採用した後、新鮮なピペリジン溶液による第二の長時間脱保護を使用して、この潜在的副反応を削減している。しかしながら、この手法は不要であるかもしれない。というのは、典型的な２０％脱保護溶液は、潜在的ＤＢＦに対して大過剰のピペリジンを有するからである。例えば、ＤＭＦ中２０％ピペリジン溶液７ｍＬを使用する０．１ｍｍｏｌスケールでの合成の場合、ピペリジン対全潜在的ＤＢＦの比率は、およそ７１０：１になるであろう。
【０００９】
[0011]これら及びその他の因子に基づくと、ペプチド合成、特にＳＰＰＳのための水性ベースの、すなわち水溶性のスキームが、価値ある目下の技術目標である。
[0012]一つの試みとして、一部の著者は、微粉末の又は微粉砕された試薬が関連ＳＰＰＳ組成物の水溶性を増大できると示唆しているが、そのような結果は、これまで確認又は再現が困難である。
【００１０】
[0013]別の試みとして、Ｇａｌａｎｉｓ（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．２０，ｐｐ．４４８８−４４９１（２００９））は、特定の樹脂、リンカー、活性化剤及び両性イオン界面活性剤(zwitterion detergent)の存在下で従来のＢｏｃ保護基を使用し、単一の例証的Ｌｅｕ−エンケファリンペプチドを製造した。
【００１１】
[0014]より有望な選択肢として、水溶性の保護基が試みられている。Ｈｏｊｏ（Ｈｏｊｏら；Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．５２，４２２−４２７  ２００４；Ｈｏｊｏ，Ｋ；Ｍａｅｄａ，Ｍ；Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｋ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４５，９２９３  ２００４）は、この目的のために、２−（フェニル（メチル）スルホニオルエチルオキシカルボニルテトラフルオロボレート（Ｐｍｓ）、エタンスルホニルエトキシカルボニル（Ｅｓｃ）、及び２−（４−スルホフェニルスルホニル）エトキシカルボニル（Ｓｐｓ）を含むいくつかの保護基を開発した。
【００１２】
[0015]これらの報告は、当然ながら、包括的というより例示的なものである。
[0016]これらの保護基を持つアミノ酸は水溶性であるが、該基は、それらの日常的使用をより困難にする他の困難をもたらす。Ｐｍｓ基はオニウム塩であるので、従来の保護基よりも著しく不安定である。ＥｓｃはＰｍｓより安定で、中程度の水溶性を提供する。しかしながら、Ｅｓｃ基の出発材料は比較的高価である。さらに、Ｅｓｃ−Ｃｌ基は不安定であるので、アミノ酸と使用するためには該基をエタンスルホニルエチル−４−ニトロフェニルカーボネート（ＥＳＣ−ＯＮｐ）に変換しなければならない。
【００１３】
[0017]Ｓｐｓは、Ｅｓｃに匹敵する溶解性を有しているが、Ｅｓｃの合成はより複雑で高価なようである。さらに、システイン（Ｃｙｓ）及びメチオニン（Ｍｅｔ）のためにはそれらの硫黄基の酸化を避けるために、異なる合成スキームを使用しなければならない。
【００１４】
[0018]二次的な考慮事項として、保護基分子中のより多数の芳香環は、従来のモニター目的のためのＵＶ吸収を増強することができる。しかしながら、追加の環は、水溶性も最小化する又は失わせる。
【００１５】
[0019]従来のモニター法では、反応生成物を脱保護ステップの後に抜き取り、ＵＶ吸収下で測定する。Ｆｍｏｃは、その濃度に比例した量で特徴的なＵＶ波長（例えば３００ナノメートル）を吸収するので、検出されたＦｍｏｃの量は、脱保護の進行程度の指標を提供する。
【００１６】
[0020]Ｐｍｓ、Ｅｓｃ、及びＳｐｓは、それらの分子構造のために、一定の水溶性の利益を有するが、Ｐｍｓ及びＥｓｃは、従来のＵＶモニター法で従来のＦｍｏｃと同様に追跡できない。ＳｐｓはＵＶでモニターできるが、その困難で費用のかかる合成は、その使用を思いとどまらせがちである。その結果、これらの化合物の増大した水溶性は、総合的な意味においてあまり役に立たない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｇａｌａｎｉｓ，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．２０，ｐｐ．４４８８−４４９１（２００９）
【非特許文献２】Ｈｏｊｏら；Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．５２，４２２−４２７  ２００４
【非特許文献３】Ｈｏｊｏ，Ｋ；Ｍａｅｄａ，Ｍ；Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｋ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４５，９２９３  ２００４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
[0021]そこで、一般にペプチド合成、特に固相ペプチド合成のための改良された水溶性（水性ベース）反応系を求める需要が引き続き存在している。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
[0022]概要
[0023]本発明は固相ペプチド合成における改良である。広い側面において、本発明は、アミノ酸（水溶性で保護形態であり、そしてミカエル反応ドナーの存在下でミカエル反応アクセプターとして働く保護基で保護されている）を脱保護し、脱保護された酸を、水、アルコール、及び水とアルコールの混合物からなる群から選ばれる溶媒中で洗浄するステップを含む。
【００２０】
[0024]例示的側面において、本発明は、アルファ，ベータ（α，β）不飽和スルホンで構成されるミカエルアクセプター部位を含有する保護基で保護されている、保護形態のアミノ基を脱保護し、次いで脱保護された酸を、水、アルコール、及び水とアルコールの混合物からなる群から選ばれる溶媒中で洗浄するステップを含む。
【００２１】
[0025]例示的側面において、保護基は、Ｂｓｍｏｃ、Ｎｓｍｏｃ、Ｂｓｐｏｃ及びＭｓｐｏｃからなる群から選ばれ、Ｂｓｍｏｃが典型的である。
[0026]別の側面において、本発明は、Ｂｓｍｏｃ保護アミノ酸を脱保護し、次いで脱保護された酸を、水、アルコール、及び水とアルコールの混合物からなる群から選ばれる溶媒中で洗浄するという改良を含む固相ペプチド合成法である。
【００２２】
[0027]別の側面において、本発明は、α，β−不飽和スルホンで構成されるミカエルアクセプター部位を含有する保護基で保護されている、保護形態のアミノ基を、水、アルコール、及び水とアルコールの混合物からなる群から選ばれる溶媒中で脱保護するという改良を含む固相ペプチド合成法である。
【００２３】
[0028]別の側面において、本発明は、α，β−不飽和スルホンで構成されるミカエルアクセプター部位を含有する保護基で保護されている、保護形態のアミノ基を脱保護し、次いで脱保護された酸を、水、アルコール、及び水とアルコールの混合物からなる群から選ばれる溶媒中で、樹脂ベースのペプチド又は樹脂ベースのアミノ酸に結合させるという改良を含む固相ペプチド合成法である。
【００２４】
[0029]別の側面において、本発明は、α，β−不飽和スルホンで構成されるミカエルアクセプター部位を含有する保護基で保護されている、保護形態のアミノ基を、水、アルコール、及び水とアルコールの混合物からなる群から選ばれる溶媒中で脱保護し；脱保護された酸を、水、アルコール、及び水とアルコールの混合物からなる群から選ばれる溶媒中で洗浄し；脱保護された酸を、水、アルコール、及び水とアルコールの混合物からなる群から選ばれる溶媒中で、樹脂ベースのペプチド又は樹脂ベースのアミノ酸に結合させ；そして結合組成物を、水、アルコール、及び水とアルコールの混合物からなる群から選ばれる溶媒中で洗浄するステップを含む固相ペプチド合成法である。
【００２５】
[0030]別の側面において、本発明は、固相樹脂と溶液の混合物を含む組成物である。溶液は、アミノ酸及びアミノ酸保護基を含み、どちらも同じ溶媒中に溶解されている。保護基は、α，β−不飽和スルホンで構成されるミカエルアクセプター部位を含有し、溶媒は、水、アルコール、及び水とアルコールの混合物からなる群から選ばれる。
【００２６】
[0031]別の側面において、本発明は、ペプチドの固相合成を促進するためのプロセスである。この側面において、本発明は、α，β−不飽和スルホンで構成されるミカエルアクセプター部位を含有する保護基で保護され、固相樹脂粒子に連結されている、保護形態の第一のアミノ基のアルファ−アミノ基を、その保護され連結された酸をマイクロ波透過性容器中で脱保護溶液と混合しながら、混合された酸と溶液をマイクロ波で照射することによって脱保護し；第二のアミノ酸を、当該第二の酸及び活性化溶液を同じ容器に加えることによって活性化し；当該第二のアミノ酸を、同じ容器中で組成物をマイクロ波で照射しながら第一の酸に結合させ；そして、同じマイクロ波透過性容器中で、複数のアミノ酸を、逐次的に脱保護し、活性化し、及び結合させてペプチドにする（サイクルの合間に同じ容器からペプチドを取り出すことなしに）ステップを含む。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
[0032]詳細な説明
[0033]広い側面において、本発明は、改良が、アミノ酸（水溶性で保護形態であり、そしてミカエル反応ドナーの存在下でミカエル反応アクセプターとして働く保護基で保護されている）を、水、アルコール、及び水とアルコールの混合物からなる群から選ばれる溶媒中で脱保護することを含む固相ペプチド合成法である。
【００２８】
[0034]別の側面において、本発明は、改良が、α，β−不飽和スルホンで構成されるミカエルアクセプター部位を含有する保護基で保護されているその保護形態のアミノ基を脱保護し、脱保護された酸を、水、アルコール、及び水とアルコールの混合物からなる群から選ばれる溶媒中で洗浄することを含む固相合成法である。
【００２９】
[0035]例示的側面において、保護基は、Ｂｓｍｏｃ、Ｎｓｍｏｃ、Ｂｓｐｏｃ及びＭｓｐｏｃからなる群から選ばれ、Ｂｓｍｏｃが典型的である。
[0036]当業者にはよく理解されているとおり、ミカエル付加反応は、アルファ，ベータ不飽和カルボニル化合物への求核試薬の求核付加反応である。求核試薬はミカエルドナー（例えばピペリジン）であり、アルファ，ベータ不飽和カルボニル化合物はミカエルアクセプター（例えばアルケン）である。
【００３０】
[0037]本発明の例示的態様において、アミノ酸保護基は、アルファ，ベータ−不飽和スルホンを含むミカエルアクセプター部位を有する。
[0038]本明細書中で詳細に説明するとおり、そのような組成物は、本明細書中でＢｓｍｏｃ、Ｎｓｍｏｃ、Ｂｓｐｏｃ及びＭｓｐｏｃと略記される化合物を含む（必ずしもこれらに限定されない）。
【００３１】
[0039]本明細書において、“水溶性で保護形態”というような語句は、組成物が、所望の反応を水性溶媒系で進行させるために必要な程度の溶解度を有することを意味することも理解されるであろう。どの組成物の場合でもそうであるように、“可溶性”という用語は、何らかの量又はすべての量の無制限の溶解度を意味しない。
【００３２】
[0040]別の側面において、酸はＢｓｍｏｃで保護され、水、アルコール、及び水とアルコールの混合物からなる群から選ばれる溶媒中で脱保護される。本明細書において、略語Ｂｓｍｏｃは、１，１−ジオキソベンゾ［ｂ］チフェン−２−イルメチルオキシカルボニルのことである。Ｂｓｍｏｃは、“通称”によってベンゾ［ｂ］チオフェンスルホン−２−メチルオキシカルボニルとも呼ばれる。Ｂｓｍｏｃは、典型的には下記式：
【００３３】
【化２】
2013534247.tif 000003
【００３４】
によって表される。
[0041]ＳＰＰＳ合成中のアミノ酸の保護基としてのＢｓｍｏｃの初期の検討は、ＣａｒｐｉｎｏらによってＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９９，６４（１２）の４３２４〜４３３８ページに示されている。
【００３５】
[0042]標準Ｂｓｍｏｃアミノ酸誘導体のうちの４つは室温での取扱いが困難である［Ｂｓｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｂｓｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｂｓｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｂｓｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ］。それらは油状物であるか又は低い融点を有しているからである（Ａｓｐ−ｍ．ｐ．〜４３℃）。１６のその他のＢｓｍｏｃ誘導体は室温で固体で、融点は９０℃より高い。従って、取扱いがより困難な４つのＢｓｍｏｃ誘導体に関しては、より高分子量誘導体Ｎｓｍｏｃ（例えば、１，１−ジオキソナフト［１，２−ｂ］チオフェン−２−メチルオキシカルボニル；“α−Ｎｓｍｏｃ”）の使用が勧められる。
【００３６】
【化３】
2013534247.tif 000004
【００３７】
[0043]全２０の標準アミノ酸のＮｓｍｏｃ誘導体は首尾よく製造され、ＳＰＰＳで使用されている。Ｎｓｍｏｃ基はＢｓｍｏｃ基に類似した利益を示すが、その追加の６員炭素環のために製造が多少高価になるようである。Ｎｓｍｏｃ基はＢｓｍｏｃ基より低いアシル化率をもたらすことも予測されるが、Ｆｍｏｃ基とはそれらの類似したサイズのために同等である。更なる可能性として（当業者には知られているように）、二つの他のＮｓｍｏｃ異性体が製造できる。すなわち、第二の芳香環がＳＯ２基に対して異なる位置にある異性体である。
【００３８】
[0044]ミカエルアクセプターとして機能できる関連保護基は、２−ｔｅｒｔ−ブチルスルホニル−２−プロペノキシカルボニル（Ｂｓｐｏｃ）及び２−メチルスルホニル−３−フェニル−１−プロパ−２−エニルオキシカルボニル（Ｍｓｐｏｃ）を含む。例えば、Ｃａｒｐｉｎｏら，２−メチルスルホニル−３−フェニル−１−プロパ−２−エニルオキシカルボニル（Ｍｓｐｏｃ）アミノ保護基(The 2-methylsulfonyl-3-phenyl-1-prop-2-enyloxycarbonyl(Mspoc) Amino Protecting Group)，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９９，６４，８３９９−８４０１参照。
【００３９】
[0045]
【００４０】
【化４】
2013534247.tif 000005
【００４１】
[0046]一般的観点として、ＳＰＰＳの基本的側面は当該技術分野において及び当業者によって一般的に良く理解されている。従って、それらを本明細書中で必ずしも詳細に繰り返す必要はないであろう。そのような側面は、樹脂及び樹脂特性の選択を含み、これらは、当業者には馴染み深いことで、市販の選択肢の中から必要以上の実験をせずとも適切な樹脂を選択することができる。
【００４２】
[0047]本発明の利点の一つは、水のみ、アルコールのみ、又は水−アルコール混合物のみを使用する、すなわち他の溶解度増大添加剤を使用しない可能性(capability)であることは理解されるであろう。
【００４３】
[0048]また、水、アルコール、及び水−アルコール混合物（並びに任意の所定混合物の水：アルコール比）の中からの溶媒の選択は、多かれ少なかれ、標的ペプチドのために所望されるアミノ酸、又は脱保護のために選択される塩基、又はこれらの因子の組合せに依存するであろうことも理解されるであろう。本発明の単純明快な性質は、当業者が、ケースバイケースで、そして必要以上の実験なしに選択をすることを可能にする。
【００４４】
[0049]例示的態様において、本方法は、脱保護ステップ中に、酸及び溶媒をマイクロ波で照射することを含むこともできる。ＳＰＰＳ状況下でのマイクロ波照射に適切な装置の詳細な説明は、同一出願人による米国特許第７，３９３，９２０号（及びいくつかの関連特許及び公開出願）に示されている。
【００４５】
[0050]典型的には、脱保護は、水、アルコール又は混合溶媒系に可溶性の塩基を用いて実施される。例示的態様において、塩基は、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、炭酸ナトリウム、ピペラジン、ピペリジン、４−（アミノメチル）ピペリジン（ＡＭＰ）及びその他のアルキル（例えばＣ１〜Ｃ３）水酸化物からなる群から選ぶことができる。一般に、単純有機塩基（アミンなど）の溶解性は単純アルコールのそれと類似している。従って、１〜３個の炭素原子を有するアミンが適切でありうる。その他の可溶性アミン（例えばピペリジン）も多くの状況において適切である。
【００４６】
[0051]例示的態様において、保護アミノ酸は、関連保護基、例えばＢｓｍｏｃで保護された場合も水溶性を保持している必須アミノ酸の一つである。この態様においては、水が溶媒として使用され、水溶性の塩基が酸の脱保護に必要な量で及び必要な程度に使用される。特定の有機塩基の溶解度は、水、アルコール又は混合溶媒中で使用できる量を制限するかもしれないが、塩基は、所望の脱保護を実施するのに足る割合がその溶媒系に溶解するならば、容認可能であることは理解されるであろう。
【００４７】
[0052]方法はさらに、脱保護された酸を、水、アルコール、及び水とアルコールの混合物からなる群から選ばれる溶媒中で洗浄することを含みうる。その後、洗浄された脱保護酸は、ここでも、水、アルコール、及び水とアルコールの混合物からなる群から選ばれる溶媒中で、樹脂ベースのペプチド又は樹脂ベースのアミノ酸に結合させることができる。
【００４８】
[0053]次に、結合された組成物は、同じ溶媒系、すなわち水、又はアルコール、又は水とアルコールの混合物中で洗浄できる。
[0054]適切なペプチド合成に従って、本方法は、第二の保護酸のための脱保護、洗浄、結合、及び洗浄ステップの反復を含むことができる。その後、ステップを繰り返して第三の保護アミノ酸、及びその後一連の保護アミノ酸を付加して所望のペプチドを製造することができる。
【００４９】
[0055]脱保護ステップを水とアルコールの混合物中で実施する場合、水と混和性があり、それ以外に進行中の反応を妨害しない又は出発材料もしくは中間体もしくは最終ペプチド鎖を妨害しない任意のアルコールが適切である。ほとんどの場合、アルコールは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール及びｔｅｒｔ−ブタノールからなる群から選ぶことができる。一般的に、５個以上の炭素を有するアルコールは、炭化水素のように挙動しがちで、水に混和しない。
【００５０】
[0056]別の側面において、そして潜在的に脱保護ステップと無関係に、本発明は、改良が、α，β−不飽和スルホンで構成されるミカエルアクセプター部位を含有する保護基で保護されているその保護形態のアミノ基を脱保護し、次いで、脱保護された酸を、水、アルコール、及び水とアルコールの混合物からなる群から選ばれる溶媒中で洗浄するステップを含む固相ペプチド合成法である。この態様においては、水又はアルコール又は混合溶媒系の利益を、その溶媒系を脱保護ステップに使用したかどうかに関わりなく、洗浄ステップに使用することができる。
【００５１】
[0057]例示的態様において、酸は、Ｂｓｍｏｃ、Ｎｓｍｏｃ、Ｂｓｐｏｃ及びＭｓｐｏｃからなる群から選ばれる保護基で保護され、Ｂｓｍｏｃ保護アミノ酸が最も典型的である。
【００５２】
[0058]脱保護ステップの場合と同様、洗浄ステップも、必要に応じて又は所望に応じてマイクロ波照射の存在下で実施できる。洗浄ステップが水とアルコールの混合物中で実施される場合、このアルコールも、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、及びｔｅｒｔ−ブタノールからなる群から選ぶことができる。
【００５３】
[0059]さらに別の側面において、そして脱保護及び第一の洗浄ステップと無関係に、本発明は、α，β−不飽和スルホンで構成されるミカエルアクセプター部位を含有する保護基で保護されている保護形態の、そして脱保護されたアミノ基を、水、アルコール及び水とアルコールの混合物からなる群から選ばれる溶媒中で、樹脂ベースのペプチド又は樹脂ベースのアミノ酸に結合させるステップを含むことができる。結合ステップは、所望又は必要に応じてマイクロ波照射の適用下で実施できる。アルコールと水の混合物が使用される場合、前記アルコールが最も適切なアルコールの仲間である。
【００５４】
[0060]他の態様においてと同様、この態様においても、酸は、Ｂｓｍｏｃ、Ｎｓｍｏｃ、Ｂｓｐｏｃ及びＭｓｐｏｃからなる群から選ばれる保護基で保護され、Ｂｓｍｏｃ保護酸が例示的である。
【００５５】
[0061]同様に、この結合ステップも、水、アルコール又は混合物溶媒系での前述の塩基を用いる脱保護ステップの実施と完全に調和する。
[0062]さらに別の側面において、本発明は、α，β−不飽和スルホンで構成されるミカエルアクセプター部位を含有する保護基で保護されている、保護形態のアミノ基を脱保護し、脱保護された酸を樹脂ベースのペプチド又は樹脂ベースのアミノ酸に結合させ、そして、結合組成物を、水、アルコール、及び水とアルコールの混合物からなる群から選ばれる溶媒中で洗浄するステップを含む固相ペプチド合成法である。プロセスの他のステップに関してと同様、水、アルコール又は混合物溶媒系の使用は、場合によっては、結合組成物の洗浄ステップに限定することができ、脱保護又は結合ステップ自体を同じ溶媒系で実施することを必要としない。
【００５６】
[0063]Ｂｓｍｏｃ、Ｎｓｍｏｃ、Ｂｓｐｏｃ及びＭｓｐｏｃ保護アミノ酸がここでも例示的である。
[0064]実際、各ステップは、溶媒系のいずれか一つ又は複数において実施でき、又はさらには所望又は必要に応じて非水性溶媒系でも実施できる。
【００５７】
[0065]結合組成物の洗浄ステップは、同様に、状況によってはマイクロ波照射の使用によって増強できる。水−アルコール混合物溶媒系に使用されるアルコールは前述のものであり得、保護アミノ酸の脱保護に使用される塩基は前に名前を挙げた塩基でありうる。
【００５８】
[0066]別の側面において、本発明は、下記ステップ、すなわち、α，β−不飽和スルホンで構成されるミカエルアクセプター部位を含有する保護基で保護されている保護形態のアミノ基を、水、アルコール、及び水とアルコールの混合物からなる群から選ばれる溶媒系中で脱保護し；脱保護された酸を、水、アルコール、及び水とアルコールの混合物からなる群から選ばれる溶媒中で洗浄し；脱保護された酸を、水、アルコール、及び水とアルコールの混合物からなる群から選ばれる溶媒中で、樹脂ベースのペプチド又は樹脂ベースのアミノ酸に結合させ；そして結合組成物を、水、アルコール、及び水とアルコールの混合物からなる群から選ばれる溶媒中で洗浄するステップを含む固相ペプチド合成法である。
【００５９】
[0067]他の態様においてと同様、Ｂｓｍｏｃ、Ｎｓｍｏｃ、Ｂｓｐｏｃ及びＭｓｐｏｃ保護アミノ酸がここでも例示的である。
[0068]反応を増強するために、脱保護ステップ中、又は単一酸同士を結合させるステップもしくは配列酸を樹脂ベースのペプチド又は樹脂ベースのアミノ酸に結合させるステップを含む結合ステップ中に、マイクロ波を適用することができる。
【００６０】
[0069]前の態様においてと同様、適切なアルコールは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、及びｔｅｒｔ−ブタノールを含みうる。
【００６１】
[0070]任意の適切な塩基が関連アミノ酸の脱保護に使用できるが、Ｂｓｍｏｃ保護酸を含む例示的態様において、塩基は、弱アルキル（例えばＣ１〜Ｃ３）水酸化物塩基、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、炭酸ナトリウム、ピペリジン、４−（アミノメチル）ピペリジン及びピペリジンの中から選ばれる。
【００６２】
[0071]脱保護、結合及び洗浄ステップは、同様にＢｓｍｏｃで初期保護されている第二のアミノ酸を第一のアミノ酸に付加するために繰り返すことができる。該ステップを第三及びその後の一連の複数のＢｓｍｏｃ保護酸のために繰り返し、ペプチド鎖を形成することができる。
【００６３】
[0072]方法はさらに、ペプチド鎖を固相樹脂から切断するステップを含むことができ、切断ステップを増強するためにマイクロ波照射を適用することができる。
[0073]別の側面において、本発明は組成物である。この側面において、組成物は固相樹脂と溶液の混合物を含む。溶液は固相樹脂と溶液の混合物を包含する。溶液は、アミノ酸及びアミノ酸保護基を含み、どちらも同じ溶媒中に溶解されている。保護基は、ミカエル反応ドナーの存在下でミカエル反応アクセプターとして働く（すなわち関連官能基（一つ又は複数）を含む）。溶媒は、水、アルコール、及び水とアルコールの混合物からなる群から選ばれる。
【００６４】
[0074]例示的態様において、組成物はさらに、溶媒系に可溶性の塩基を含む。特別の態様において、塩基は水のみに可溶性である。組成物に適切な水溶性塩基は、弱アルキル水酸化物塩基、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、炭酸ナトリウム、ピペリジン、４−（アミノメチル）ピペリジン及びピペラジンを含む。
【００６５】
[0075]例示的態様において、Ｂｓｍｏｃ（又はＮｓｍｏｃ、ＢｓｐｏｃもしくはＭｓｐｏｃ）及びアミノ酸は同じ溶媒中に溶解されている。
[0076]組成物中のアルコールは、例示的態様において、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、及びｔｅｒｔ−ブタノールからなる群から選ぶことができる。
【００６６】
[0077]一部の態様において、脱保護は、保護酸を水性ベースの溶媒系に可溶性にするのに足る量の界面活性剤(detergent)の存在下で実施することもできる。用語“可溶性”は、本明細書中ではその通常の意味で使用される。すなわち保護酸の所望量又は必要量が溶媒系に完全に溶解するという意味である。化学分野の当業者であれば、当然ながら、溶解性（度）は、特定の溶媒中に溶解する特定の材料の量に基づいて定量化することもできる相対的用語であることは分かるであろう。従って、本発明の目的のために、各組成物は、固相ペプチド合成を首尾よく実施するのに典型的に必要とされる量で水中に溶解すれば、可溶性と見なされる。
【００６７】
[0078]脱保護反応の進行は、典型的には、溶液中の保護基の量の紫外線測定を用いて、定期サンプル方式でモニターされるので、界面活性剤は、保護基に特徴的な波長で保護基のＵＶ吸収を妨害しないようにすべきである。
【００６８】
[0079]界面活性剤は、それらの親水又は疎水特性（又はそれぞれの程度）及びそれらのイオン基に従って分類される水溶性分子である。これらの特徴は、保護基、ペプチド鎖、及び個別アミノ酸に対する界面活性剤の挙動を確立する。
【００６９】
[0080]多くの場合、界面活性剤は、他の分子（脂質、タンパク質）と会合してミセルを形成する、又は他の分子と凝集する、又は他の分子と相互作用する疎水性尾部を有している。溶液中では、界面活性剤は、凝集体を解離することによって、及び大型分子をアンフォールドする(unfolding)ことによって、分子を溶液中に保つのに役立つ。
【００７０】
[0081]役に立つ典型的界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、及び両性イオン性界面活性剤を含む。有用な特別の界面活性剤は、オクチルフェニルエチレンオキシド；ラウリル硫酸ナトリウム；及びドデシル硫酸ナトリウムなどである。
【００７１】
[0082]従来のＳＰＰＳと一致する様式で、当該方法は、水性溶媒系に可溶性の活性化剤を用いて脱保護酸を活性化することを含みうる。適切な利益を実行する（すなわち酸素をより良好な脱離基にする）、及び他の点では総合的なＳＰＰＳ反応と調和する任意の活性化剤が適切である。代表的な活性化剤は、水溶性カルボジイミド及びトリアゾールなどである。他の従来的活性化剤は、Ｏ−ベンゾトリアゾリル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、Ｂｏｃ−ヒスチジン（トシル）；ＢＯＰ及びＢＯＰ−Ｃｌなどでありうる。
【００７２】
[0083]さらに別の側面において、本発明は、ペプチドの固相合成を促進するためのプロセスである。この態様において、本発明は、α，β−不飽和スルホンで構成されるミカエルアクセプター部位を含有する保護基で保護され、固相樹脂粒子に連結されている保護形態のアミノ基のアルファ−アミノ基を、その保護され連結された酸をマイクロ波透過性容器中で脱保護溶液と混合しながら、混合された酸と溶液をマイクロ波で照射することによって脱保護することを含む。方法は、第二のアミノ酸を活性化し、次いで第二のアミノ酸を、同じ容器中で組成物をマイクロ波で照射しながら第一のアミノ酸に結合させることを含む。その後、方法は、複数のアミノ酸を、逐次的に脱保護し、活性化し、及び結合させてペプチドにする（サイクルの合間に同じ容器からペプチドを取り出すことなしに）ことを含む。
【００７３】
[0084]例示的態様において、アミノ酸は、Ｂｓｍｏｃ、Ｎｓｍｏｃ、Ｂｓｐｏｃ又はＭｓｐｏｃで保護される。
[0085]方法に使用するのに適切な装置は、同一出願人による米国特許第７，３９３，９２０号に詳細に記載されている。同じ記載は、分割及び継続出願に由来するその他の同一出願人による米国特許にも示され、欧州でも、例えばＥＰ１４９１５５２及びＥＰ１９２３３９６として公開されている。これらの記載は、本方法を実施するのに役立つ情報を当業者に提供する。
【００７４】
[0086]方法はさらに、マイクロ波エネルギーによる蓄熱によって固相担体又はペプチドが劣化するのを防止するために、脱保護、活性化、及び結合ステップのいずれか一つ又は複数の最中に容器を冷却することを含みうる。
【００７５】
[0087]方法は、連続した３個以上のアミノ酸のために脱保護、活性化、及び結合ステップを周期的に繰り返し、それによって所望のペプチドを合成することを含みうる。
[0088]特に、そして米国特許第７，３９３，９２０号に記載されているステップと合致する様式で、方法は、逐次的な脱保護、活性化、結合及び切断ステップを、単一容器中で、ペプチド又は固相樹脂をサイクルの合間に容器から取り出すことなく実施することを含む。
【００７６】
[0089]脱保護、活性化、結合及び切断ステップの一つ又は複数の最中に、混合物を窒素又は別の適切な不活性ガスで撹拌してもよい。多くの場合、方法はさらに、アミノ酸の側鎖の脱保護を含み、一部の場合、側鎖はＴ−ブタノール系側鎖保護基で保護されている。従って、側鎖は、その目的のために適切な組成物で脱保護される。
【００７７】
[0090]ペプチド（意図する又は所望の）が完成したら、本明細書中に記載のいずれの方法も、典型的には、リンクペプチドを切断組成物と混合することによって、連結ペプチドを固相樹脂から切断することを含む。一部の態様において、切断は、同じ容器中で組成物をマイクロ波で照射しながら実施される。
【００７８】
[0091]当業者には分かる通り、切断組成物とプロトコルは、ある程度、ペプチド鎖内のアミノ酸によって、及び場合によってはそれらのアミノ酸が有しうる側鎖保護基によって決まる。ほとんどの場合、酸を使用して切断ステップを実施する。一般に、酸は、所望のペプチドやペプチド内のアミノ酸に結合されている何らかの所望の基（例えば側鎖保護基）に悪影響を与えたり又は妨害することなく、必要な切断を実行すべきである。
【００７９】
[0092]トリフルオロ酢酸及びフッ化水素酸（ＨＦ）が一般的な切断剤であるが、水、フェノール及びエタンジチオール（ＥＤＴ）などの少割合の補充組成物と混合されることが多い。一部の場合では、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳＡ）又はトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（ＴＭＳＯＴｆ）が切断剤として使用されることもある。これらは、当然ながら、切断組成物の可能性の例示であって制限ではない。切断されたペプチド（溶液中）は、切断された樹脂からろ過によって分離でき、ペプチドは次いで、蒸発又は溶媒駆動(solvent-driven)沈殿などの従来ステップによって、ろ液から回収できる。
【００８０】
[0093]切断は、典型的には、切断ステップの最中又は後に望まざる副反応からペプチドを保護する掃去剤（スカベンジャー）組成物（例えば、水、フェノール、ＥＤＴ）の存在下で実施される。当業者には分かる通り、掃去剤は一般的に、存在する保護基に基づいて選択される。従って、選択は当業者によってある程度カスタマイズされており、当業者は必要以上の実験をせずとも適切な掃去剤を選択することができる。
【００８１】
[0094]本明細書中に記載の他の態様においてと同様、方法は、第一のアミノ酸（又は後続アミノ酸のいずれか）を、水、アルコール及び水とアルコールの混合物からなる群から選ばれる溶媒中で脱保護することを含みうる。水とアルコールの混合物が溶媒として使用される場合、アルコールは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、ｎ−プロパノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、及びｔｅｒｔ−ブタノールからなる群から選ぶことができる。
【００８２】
[0095]前述の態様においてと同様、脱保護ステップは、適切な溶媒系に可溶性の塩基を用いて実施できる。非水性溶媒系において、塩基は（例）を含むことができ、水性又は水−アルコール混合物溶媒系では、塩基は、弱アルキル水酸化物塩基、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、炭酸ナトリウム、ピペリジン、４−（アミノメチル）ピペリジン及びピペラジンからなる群から選ばれる。
【００８３】
[0096]Ｂｓｍｏｃの合成
[0097]Ｂｓｍｏｃは、市販の１−ベンゾチオフェンから、ヒドロキシメチル化の後、過酸酸化によって合成される。出発材料の１−ベンゾチオフェンは、適度の価格で容易に入手できる。
【００８４】
[0098]脱離対ミカエル付加機構
[0099]本発明の方法において、保護基（例えばＢｓｍｏｃ）は、第二級アミンからミカエル付加機構によって除去される。前述のように、ミカエル付加反応は、アルファ，ベータ不飽和カルボニル化合物への求核試薬の求核付加反応である。求核試薬はミカエルドナー（例えばピペリジン）であり、アルファ，ベータ不飽和カルボニル化合物はミカエルアクセプター（例えばアルケン）である。
【００８５】
[00100]Ｃａｒｐｉｎｏによって開発された保護基（Ｂｓｍｏｃ、Ｍｓｐｏｃ、Ｂｓｐｏｃ、Ｎｓｍｏｃ）は、ミカエルアクセプター基を含有している。これらの化合物のミカエルアクセプター基は、活性化アルケン基である。ミカエルドナー（典型的には、ピペリジン又はピペラジンのような塩基）は、反応を開始し、保護基とミカエル付加体を形成する。ミカエル付加体の形成は、保護基をアミノ酸から切断する分子内転位をもたらす。
【００８６】
[00101]ミカエル付加機構において、脱保護は掃去作用としての役割も果たすので、遊離アミン基と反応するような反応性中間体は何ら存在しない。Ｂｓｍｏｃ基は、Ｆｍｏｃ基よりも第二級アミンによる攻撃に対する反応性も高い。これら二つの因子は、Ｂｓｍｏｃ保護に関する脱保護反応に必要とされる必要塩基を低減する。このことは、脱保護中の塩基触媒副反応の最小化、試薬コストの削減、及び廃棄物毒性の低減に有益である。
【００８７】
[00102]増大した水溶性
[00103]Ｆｍｏｃと比べて、Ｂｓｍｏｃの構造は、存在するＳＯ２基を有するそのヘテロ環式５員環に基づくと、より水溶性のようである。Ｂｓｍｏｃは、追加の６員炭素環を１個しか含有しないので、より可溶性のようである。Ｆｍｏｃ及びＢｓｍｏｃ化合物間の比較は、迅速液相合成で観察されている。このタイプの合成では、ＴＡＥＡ（トリス（２−アミノエチル）アミン）が脱保護に使用され、そのＢｓｍｏｃとの付加体は水溶性であるのに対し、そのＦｍｏｃとの付加体はそうではない。
【００８８】
[00104]Ｂｓｍｏｃ試薬のための可能性ある水溶性の方法は、マイクロ波エネルギー支援の有無にかかわらず実施できる。
[00105]Ｂｓｍｏｃのモニター可能性
[00106]本明細書中に記載のスルホン含有保護基（例えばＢｓｍｏｃ）は、脱保護及び結合反応のいずれか又は両方の完了後、モニターのための機会を提供する。これらの化合物中の単一ＳＯ２基は、ペプチドの逐次構築(step-wise assembly)中に使用される他の試薬に対して独自である。このＳＯ２基は、各反応の終了時に存在するＢｓｍｏｃ（又はＮｓｍｏｃ、ＢｓｐｏｃもしくはＭｓｐｏｃ）の定量的な量を決定するために、赤外線（ＩＲ）によってモニターすることができる。ＳＯ２基の証拠は、脱保護終了時におけるＢｓｍｏｃの不完全な除去の判定に使用することができる。このことは、比較のために反応を２回実施する必要がないという点でＵＶ手法に対して有利である。
【００８９】
[00107]結合反応は、ＩＲ吸収によって二つの可能な方法でモニターすることができる。第一の方法は、アミノ酸及び活性化剤の添加直後にＩＲ吸収を測定することである。これにより、反応容器中にユーザー定義過剰で存在する全Ｂｓｍｏｃ（Ｎｓｍｏｃ、Ｂｓｐｏｃ、Ｍｓｐｏｃ）のベースラインが提供される。結合反応及びその後の洗浄が終了したら、ＩＲ吸収を再度測定し、初期値と比較する（比較のために、アミノ酸活性化剤溶液に同一容量の純溶媒を添加することが必要となりうる）。１００％完全な結合反応は、使用された過剰量に比例するＩＲ吸収比をもたらすはずである。この手法は、結合反応を一度に実施することしか要求しないので有益である。第二の手法は、Ｆｍｏｃ脱保護ステップをモニターするためにＵＶによって現在使用されているのと同一の様式で、二つの後続結合反応後のＩＲ吸収を比較することであろう。
【００９０】
[00108]当業者であれば、本発明は多数の可能性を含み、そのいずれも、当業者によって及び必要以上の実験をせずとも実施可能であることは分かるであろう。従って、脱保護は、Ｂｓｍｏｃ、Ｎｓｍｏｃ、Ｂｓｐｏｃ及びＭｓｐｏｃ（これらに限定されない）を含むミカエル付加アクセプター化合物で保護されたアミノ酸を用いて実施できる。脱保護、洗浄、活性化、結合又は切断ステップのいずれか一つ又は複数（又はすべて）は、水又は水−アルコール系において、界面活性剤を使用して又は使用せずに実施できる。これらのステップのいずれか一つ又は複数（又はすべて）は、同様にマイクロ波照射の適用によって増強できる。
【００９１】
[00109]本明細書において、本発明の好適な態様を示してきた。具体的用語が使用されているが、それらは一般的及び説明的意味で使用されているに過ぎず、制限を目的としたものではない。本発明の範囲は特許請求の範囲に定義されている。
【国際調査報告】
2013534247.tif 000006
2013534247.tif 000007
2013534247.tif 000008
2013534247.tif 000009