(57)【要約】  マイクロ流体多重温度反応デバイス（ＭＭＲ）の製造、並びに、デバイス上で種々の分子生物学的方法を駆動するための装置の設計及び製造が提供される。デバイスは、例えば、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ等）増幅、細胞溶解、逆転写に、並びに、他の酵素温度感受性及びまた温度サイクリング反応に、適用可能である。
2013545475.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を受けるように構成されたカセットと、
１つ又は複数の温度制御要素と、
を備え、生物学的反応を行うためのデバイスであって、前記１つ又は複数の温度制御要素が、前記試料に少なくとも１つの温度帯を提供するように構成され、
前記カセットが、前記少なくとも１つの温度帯を経て前記試料を移動させるように構成された１つ又は複数のチャネルを備え、
前記デバイスが、携帯型又はハンドヘルドであるデバイス。
【請求項２】
前記デバイスが、ポリメラーゼ連鎖反応、ヘリカーゼ依存性増幅、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、核酸配列決定、溶解反応、イムノアッセイ、代謝アッセイ、及び、検出反応から成る群から選択された生物学的反応を行うように構成されている請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記１つ又は複数の温度制御要素の各々が、個別に制御される請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
前記１つ又は複数の温度制御要素の各々が、熱伝導性金属を含む請求項１に記載のデバイス。
【請求項５】
前記１つ又は複数の温度制御要素の各々が、アルミニウムを含む請求項１に記載のデバイス。
【請求項６】
前記１つ又は複数の温度制御要素の各々が、熱伝導性ポリマーを含む請求項１に記載のデバイス。
【請求項７】
前記１つ又は複数の温度制御要素の各々が、カプトンヒータによって加熱される請求項１に記載のデバイス。
【請求項８】
前記１つ又は複数の温度制御要素の各々が、ペルチェヒータによって加熱される請求項１に記載のデバイス。
【請求項９】
前記１つ又は複数の温度制御要素の各々が温度センサによって監視され、前記温度センサは、制御電子機器が前記温度制御要素の各々を所望の温度に維持することを可能にするためにフィードバックループを提供する請求項１に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記１つ又は複数の温度制御要素が、３つ以上の個々の温度制御要素を備える請求項１に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記１つ又は複数の温度制御要素が、直線的に配列されている請求項１に記載のデバイス。
【請求項１２】
前記１つ又は複数の温度制御要素が、非直線的配置に配列されている請求項１に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記１つ又は複数の温度制御要素が、携帯型デバイス内に組み込まれている請求項１に記載のデバイス。
【請求項１４】
前記カセットが、マクロ流体デバイス、マイクロ流体デバイス、ナノ流体デバイス、及びピコ流体デバイスから成る群から選択された請求項１に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記カセットが、ポリカーボネート材料を含む請求項１４に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記ポリカーボネート材料が、ガラス及びＰＤＭＳから成る群から選択された請求項１５に記載のデバイス。
【請求項１７】
前記カセットのチャネルの表面が、試料及び／又は反応試薬に対する低下した結合性を有するように構成されている請求項１４に記載のデバイス。
【請求項１８】
前記カセットがさらに反応試薬を含む請求項１に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記カセットがさらに、試料受けチャンバ、試料収集チャンバ、及び貯蔵チャンバから成る群から選択された１つ又は複数を備える請求項１に記載のデバイス。
【請求項２０】
前記カセットが、単一のフロースルーマクロ流体デバイス、フロースルーマイクロ流体デバイス、フロースルーナノ流体デバイス、又はフロースルーピコ流体デバイスである請求項１に記載のデバイス。
【請求項２１】
前記デバイスが核酸増幅反応を行うために使用される場合、前記１つ又は複数の温度制御要素の各々の温度を、反応あたり複数回変更する必要がない請求項１に記載のデバイス。
【請求項２２】
前記カセットが、前記試料の溶解及び／又は前記試料からの核酸の抽出を行うように構成されている請求項１に記載のデバイス。
【請求項２３】
請求項１に記載のデバイスの前記カセットに試料を供給するステップと、
前記１つ又は複数の温度制御要素の各々の温度を制御することによって、前記試料に少なくとも１つの温度帯を提供するステップと、
を備える生物学的反応を行う方法。
【請求項２４】
前記生物学的反応は、ポリメラーゼ連鎖反応、ヘリカーゼ依存増幅、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、ヌクレオチド配列決定、溶解反応、イムノアッセイ、代謝アッセイ、及び、検出反応から成る群から選択される請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記方法が核酸増幅反応に使用される場合、前記１つ又は複数の温度制御要素の各々の温度を、反応あたり複数回変更する必要がない請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１に記載のデバイスで使用されるカセットを製造する方法であって、
前記カセットの２つのハーフを成形するステップと、
前記成形されたカセットの２つのハーフを組み立てるステップと、
を備える方法。
【請求項２７】
前記組み立てるステップの前又は後に、試料及び／又は反応試薬の１つ又は複数のチャネルへの結合を低減するために前記カセットを処理するステップをさらに備える請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記処理するステップは、
前記カセットの１つ又は複数のチャネルを通して、ウシ血清及びポリメラーゼ酵素から成る群から選択された物質を流すステップと、
前記カセットの１つ又は複数のチャネルの表面上に、フルオロカーボン、テフロン（登録商標）、及びポリアクリレートから成る群から選択された親水性材料又は疎水性材料を形成するステップと、
前記カセットの１つ又は複数のチャネルの表面をＵＶでコーティングするステップと、
前記カセットの１つ又は複数のチャネルの表面上にポリマーブラシを配置するステップとのうちの１つ又は複数のステップを備える請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記方法はさらに、前記カセットの１つ又は複数の表面に酵素を付着させるステップを備える請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[関連出願の参照]
本出願は、２０１０年１１月３０日に出願した米国仮出願第６１／４１８，２７２号の米国特許法第１１９条（ｅ）（１）による優先権を主張するものである。
【０００２】
[配列表、表、又はコンピュータプログラムリストへの参照]
本出願は、参照により、ＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出される配列表を組み込む。配列表は、７８７バイトのサイズのテキストファイルとして提供される。
【０００３】
本開示の種々の実施形態は、全体として、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ等）増幅、細胞溶解、逆転写、並びに、他の酵素温度感受性及びまた温度サイクリング反応のための、マイクロ流体多重温度反応デバイス（ＭＭＲ）の製造と、デバイス上で分子生物学的方法を駆動するための装置の設計及び製造とに関する。
【背景技術】
【０００４】
分子生物学は、分子レベルでの生物学の研究である。一側面では、分子生物学は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質間の相互作用を含む細胞の種々のシステム間の相互作用を理解すること、ならびに分子種の相互作用、メカニズム、及び動力学（dynamics）をその調整とともに学ぶことに関する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願第６１／０９４，００６号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一態様によれば、生物学的反応を行うための携帯型デバイスが提供される。デバイスは、カセット、及び、１つ又は複数の温度制御要素を含んでもよい。温度制御要素は、試料に少なくとも１つの温度帯（temperature zone）を提供するように構成されてよい。デバイスは、携帯型又はハンドヘルド（handheld）であってよい。カセットは、試料を移動させるように構成されてよい。カセットは、少なくとも１つの温度帯を経て試料を移動させるように構成されてよい１つ又は複数のチャネルを備えてよい。いくつかの実施形態では、デバイスは、ポリメラーゼ連鎖反応、ヘリカーゼ依存性増幅、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、核酸配列決定、溶解反応、イムノアッセイ、代謝アッセイ、及び、検出反応から成る群から選択された生物学的反応を行うように構成されてよい。いくつかの他の実施形態では、１つ又は複数の温度制御要素の各々は、個別に制御されてよい。
【０００７】
いくつかの実施形態では、上記のデバイスの１つ又は複数の温度制御要素は、熱伝導性金属を備えてよい。いくつかの他の実施形態では、１つ又は複数の温度制御要素は、アルミニウムを備えてよい。いくつかの代替の実施形態では、１つ又は複数の温度制御要素は、熱伝導性ポリマーを備えてよい。特定のいくつかの実施形態では、１つ又は複数の温度制御要素は、カプトンヒータによって加熱されてよい。いくつかの他の実施形態では、１つ又は複数の温度制御要素は、ペルチェヒータによって加熱されてよい。
【０００８】
いくつかの実施形態では、上記のデバイスの１つ又は複数の温度制御要素の各々の温度は、温度センサによって監視されてよく、温度センサは、制御電子機器が温度制御要素の各々を所望の温度に維持することを可能にするためにフィードバックループを提供してよい。いくつかの他の実施形態では、１つ又は複数の温度制御要素は、３つ以上の個々の温度制御要素を備えてよい。さらにいくつかの他の実施形態では、１つ又は複数の温度制御要素は、直線的に配列されてよい。代替として、１つ又は複数の温度制御要素は、非直線的配置に配列されてよい。
【０００９】
特定の実施形態によれば、上記のデバイスの１つ又は複数の温度制御要素は、携帯型デバイス内に組み込まれてよい。さらに、いくつかの実施形態では、カセットは、マクロ流体デバイス、マイクロ流体デバイス、ナノ流体デバイス、及びピコ流体デバイスから成る群から選択されてよい。いくつかの他の実施形態では、カセットはポリカーボネート材料を含んでもよい。さらにいくつかの他の実施形態では、ポリカーボネート材料は、ガラス及びＰＤＭＳから成る群から選択されてよい。
【００１０】
いくつかの代替の実施形態では、カセットのチャネルの表面が、試料及び／又は反応試薬に対する低下した結合性（reduced binding）を有するように構成されてよい。さらに、いくつかの他の実施形態では、カセットはさらに反応試薬を含んでもよい。さらにいくつかの他の実施形態では、カセットはさらに、試料受けチャンバ、試料収集チャンバ、及び貯蔵チャンバから成る群から選択された１つ又は複数を備えてよい。特定の実施形態では、カセットは、単一のフロースルーマクロ流体デバイス、フロースルーマイクロ流体デバイス、フロースルーナノ流体デバイス、又はフロースルーピコ流体デバイスであってよい。
【００１１】
さらにいくつかの代替の実施形態では、デバイスが核酸増幅反応を行うために使用される場合、１つ又は複数の温度制御要素の各々の温度を、反応あたり複数回変更する必要はない。さらに、いくつかの他の実施形態では、カセットは、試料の溶解及び／又は試料からの核酸の抽出を行うように構成されてよい。
【００１２】
本発明の他の態様によれば、生物学的反応を行う方法が提供される。方法は、上記のデバイスのカセットに試料を供給するステップと、１つ又は複数の温度制御要素の各々の温度を制御することによって、試料に少なくとも１つの温度帯を提供するステップと、を備える。いくつかの実施形態では、方法によって行われる生物学的反応は、ポリメラーゼ連鎖反応、ヘリカーゼ依存増幅、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、ヌクレオチド配列決定、溶解反応、イムノアッセイ、代謝アッセイ、及び、検出反応から成る群から選択されてよい。さらに、いくつかの他の実施形態では、方法が核酸増幅反応に使用される場合、前記１つ又は複数の温度制御要素の各々の温度を、反応あたり複数回変更する必要はない。
【００１３】
本発明のさらに他の態様によれば、上記のデバイスで使用されるカセットを製造する方法が提供される。方法は、カセットの２つのハーフ（two halves）を成形するステップと、成形されたカセットの２つのハーフを組み立てるステップと、を備える。いくつかの実施形態では、方法はさらに、組み立てるステップの前又は後に、試料及び／又は反応試薬の１つ又は複数のチャネルの表面への結合を低減するためにカセットを処理するステップを備えてよい。特定のいくつかの実施形態では、カセットの処理は、以下、すなわち、カセットの１つ又は複数のチャネルを通して物質を流すこと、カセットの１つ又は複数のチャネルの表面上に親水性材料又は疎水性材料を形成すること、カセットの１つ又は複数のチャネルの表面をＵＶでコーティングすること、及び、カセットの１つ又は複数のチャネルの表面上にポリマーブラシを配置すること、のうちの１つ又は複数を含んでもよい。いくつかの実施形態では、カセットのチャネルを通して流れる物質は、ウシ血清及び／又はポリメラーゼ酵素であってよい。いくつかの他の実施形態では、表面上に形成される親水性又は疎水性材料は、フルオロカーボン、テフロン（登録商標）、ポリアクリレート、及び／又はそれらの混合物であってよい。さらにいくつかの他の実施形態では、方法はさらに、カセットの１つ又は複数のチャネルの表面に酵素を付着させるステップを備えてよい。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明のいくつかの実施形態によるマイクロ流体熱反応器カセットで使用されるマイクロ流体プロセスを示す。
【図２】本発明のいくつかの実施形態による抽出カートリッジの分解図を示す。
【図３】本発明のいくつかの実施形態によるデバイスを示す。この特定の図では、マイクロ流体熱反応器カセットが配置されて処理される。
【図４】本発明のいくつかの実施形態によるデバイスの分解図を示す。この特定の図では、マイクロ流体熱反応器カセットが配置されて処理される。
【図５】本発明のいくつかの実施形態によるデバイスで使用されるヒータブロックを示す。
【図６】本発明のいくつかの実施形態によるデバイス内に配置されたマイクロ流体熱反応器カセットを示す。
【図７】本発明のいくつかの実施形態によるマイクロ流体熱反応器カセット内のマイクロ流体チャネルの図を示す。
【図８】本発明のいくつかの実施形態によるマイクロ流体熱反応器カセット内のマイクロ流体チャネルの図を示す。
【図９】本発明のいくつかの実施形態によるマイクロ流体熱反応器カセット内のマイクロ流体チャネルの図を示す。
【図１０】図１０ａは、本発明のいくつかの実施形態に従って行われたＰＣＲ実験の結果を示すゲル画像を示す。図１０ｂは、ＰＣＲ実験に使用されたプライマーの配列を示す。
【図１１】図１１ａは、本発明のいくつかの実施形態に従って行われたＰＣＲ実験の結果を示す他のゲル画像を示す。図１１ｂは、ＰＣＲ実験に使用されたプライマーの配列を示す。
【図１２】本発明のいくつかの実施形態に従って行われた逆転写ＰＣＲ実験の結果を示す。
【図１３】本発明のいくつかの実施形態によるハンドヘルド診断のために設計されたマイクロ流体カセットを示す。
【図１４】いくつかの実施形態によるハンドヘルド配列決定のために設計されたマイクロ流体カセット設計を示す。
【図１５】本発明のいくつかの実施形態による治療現場のデバイス及びマイクロ流体カセットの実例を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、全体として、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ等）増幅、細胞溶解、逆転写、並びに、他の酵素温度感受性及びまた温度サイクリング反応のための、マイクロ流体多重温度反応デバイス（ＭＭＲ）の製造と、デバイス上で分子生物学的方法を駆動するための装置の設計及び製造とに関する。いくつかの態様によれば、本発明は、多くの生物学的実験手順によって要求されるような熱サイクリングを可能にするために、携帯型、ハンドヘルドデバイスで実施されるような、低コスト、低電力消費技術を提供することができる。
【００１６】
ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質間の相互作用、メカニズム、及び動力学を、並びに、それらが、定義された臨床状態にどのように関連するかを理解することによって、臨床診断のためにそれらの解析を使用することができる。したがって、分子診断は、分子レベルでの臨床的に関連するマーカーの研究によって、診断を記述することができる。
【００１７】
ＤＮＡは、分子診断の目標の１つであってよく、ヌクレオチドと呼ばれる単位から成る長鎖ポリマーから構成され得る。ＤＮＡポリマーは単一の単位から成る長い鎖であり、この鎖は一緒になって核酸と呼ばれる分子を形成する。ヌクレオチドは、４つのサブユニット（アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）及びチミン（Ｔ））の１つであってもよく、これらはポリマーとなって、細胞内の遺伝情報を運ぶことができる。ＤＮＡはしばしば、４つの異なるヌクレオチド塩基（例えば、ＡＧＴＣＡＴＣＧＴＡＧＣＴ．．．等）と、糖とリン酸基がエステル結合によって結合した主鎖とを含むヌクレオチドの２本の長鎖が、ねじれて二重らせんになり、相補的ヌクレオチド間の水素結合（Ａが反対側の鎖のＴに、及びＣが反対側の鎖のＧに水素結合する）によって結合している。主鎖に沿ったヌクレオチド塩基の配列は、個々の遺伝的特性を決定する可能性がある。
【００１８】
分子生物学のセントラルドグマは、一般的に、生体情報の通常の流れを説明する。すなわち、ＤＮＡをＤＮＡに複製することができ、ＤＮＡ中の遺伝情報をｍＲＮＡに「転写」することができ、翻訳と呼ばれるプロセスでｍＲＮＡの情報からタンパク質に翻訳することができ、このプロセスでは、ｔＲＮＡ（各ｔＲＮＡはその配列に応じて特定のアミノ酸を運ぶ）のｍＲＮＡへの結合によって、タンパク質サブユニット（アミノ酸）が順番（ｍＲＮＡ、したがってＤＮＡの配列によって規定される）に結合できるように十分に近づけられる。
【００１９】
したがって、医療診断は、一部の又はすべての形式の生物学的分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質を利用することができる。これらの分子の多くを解析するための１つの方法は、試料を調製し、それらの反応を実行することであってよい。いくつかの場合では、試料は調製されてよく（抽出されたＤＮＡ、又はいくつかのタンパク質アッセイのために遠心分離され、希釈された試料）、反応が実行されてよい。また、いくつかの他の場合では、この反応は、常に室温ではない可能性がある規定された温度を必要とする可能性があり、しばしば、２つ以上の温度を必要とする可能性がある。
【００２０】
試料からのＤＮＡ又はＲＮＡの配列及び生物学的性質を研究するために、臨床的又は生物学的試料から核酸を抽出又は分離することが必要である場合がある。これを現在、試験管又はマルチウェルプレートにおけるいくつもの方法によって行うことができるが、これらの方法は、より自動化された技術に置き換えられる可能性があり、ナノ又はマイクロ流体カセット／チップ内で展開される可能性がある。抽出に続いて、ＤＮＡの標的領域は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、リコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）のような増幅技法を使用して、検出可能なレベルまで増幅されてよい。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用してＤＮＡを増幅する場合では、試料及び試薬の混合物は、少なくともいくつかの用途では、３つの異なる温度帯を経て約２５〜３５回循環してよい。その後、例えば、特定の温度でのハイブリダイゼーション（例えば、サザンブロット法、マイクロアレイ、発現アレイ等）によって、又は、ＤＮＡの増幅された標的領域に特有の蛍光タグの蓄積を監視することによって、検出が行われてよい。代わりに、検出は、ＤＮＡのこの増幅された領域を配列決定することによって行われてよい。
【００２１】
これらの手法は、チューブ又はマルチウェルプレート内で展開されてよく、オペレータ時間のかなりの人手、複数のステップ、並びに、大型でかさばる高価な装置を必要とする可能性がある。本発明のいくつかの態様は、小型で安価で使い捨てのマイクロ流体素子及び多目的カセット／チップでの、分子生物学的ワークフローの一部に関する解決法を提供できる。試料調製カセット／チップ及び検出カセット／チップと統合された場合、少なくともいくつかの実施形態に従って、強力であり、自動の、安価であり、簡単な、携帯型の解決法を、費用のかかる分子生物学研究室に提供することができる。
【００２２】
一態様では、本出願は、多くの生物学的実験手順（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、ＰＣＲのための熱サイクリング）に含まれる可能性がある熱サイクリングを可能にするために、携帯型、ハンドヘルドデバイスで実施されるような、低コスト、低電力消費の手法を提供するものである。現在、ＰＣＲのような実験のための熱サイクリングは、反応混合物及び試料を４０回（ＰＣＲに関して）も加熱及び冷却させる必要があり、この一定の加熱及び冷却は、非常に電力を消費すると考えられる。等温手法は、単一の温度への反応の加熱を必要とし、実験の期間中、反応をその温度に保持することを必要とするため、治療現場の携帯型デバイスで最近支持を得ている可能性がある。しかしながら、これらの等温方法は、（ＰＣＲを超える、ＬＡＭＰ、ＲＰＡ、ＨＡＤ等の等温ＤＮＡ増幅法の多重化可能性に対する制限のように）それらの範囲を制限される可能性がある。したがって、本発明者らは、ヒータ要素を反応あたり複数回加熱及び冷却することを必要とせず、ハンドヘルドデバイスでのＰＣＲ及び他のプロトコールの使用を容易にするために、本発明の少なくともいくつかの実施形態で提示される技術を開発した。
【００２３】
核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ等）増幅、細胞溶解、逆転写、並びに、他の酵素温度感受性及びまた温度サイクリング反応のための、マイクロ流体デバイスの設計、デバイス上で分子生物学的方法を駆動するための装置の設計及び製造、並びにこれらの反応を実行する際のデバイスの使用が、本発明のいくつかの実施形態に従って開示される。方法は、マイクロ流体カセットの設計、並びに流体流及び温度帯を提供するための装置の設計及び製造を含んでもよい。さらに、方法は、すべてカセット上での、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、溶解、並びに、タンパク質アッセイ及び代謝アッセイを含むデバイスの使用方法を含んでもよく、また反応を効率的に、且つ反応生成物の下流での（すなわち、比色分析若しくは蛍光検出デバイス、ナノポア、カーボンナノチューブ、ナノギャップ、又はナノワイヤバイオセンサでの）使用を容易にする標準に従って実行する。
【００２４】
マイクロ流体多重温度反応デバイスの要素／特徴の１つは、加熱ブロックのアレイ、及び、ヒータブロックのこれらのアレイによって形成される温度帯を経て反応混合物又は試料を通過させる手法である。ヒータブロックは、任意の熱伝導性材料で形成されてもよく、ブロックを加熱する任意の制御された方法を使用して加熱されてもよい。温度は、ブロックが所望の温度に保たれることを確実にするために、温度情報を加熱モジュールにフィードバックするセンサによって調整されてもよい。反応のため、ヒータブロックは、それらの設定温度に加熱され、実験を通してその温度に維持されることが可能であり、試料は、（例えば、ＰＣＲに必要な熱サイクリングのような）反応のための熱的条件を形成するために、これらのヒータブロックによって形成される温度帯を経て移動される、流される、往復される、その他が可能である。
【００２５】
一実施形態では、ヒータブロックのアレイによって形成される異なる温度帯を経て試料反応混合物を流すための方法は、関連する温度帯を実験によって必要とされる順序で通過することができるループするチャネルから成る単一のフロースルーマクロ流体カセット、フロースルーマイクロ流体カセット、フロースルーナノ流体カセット、又はフロースルーピコ流体カセットであってよい。
【００２６】
単一のフロースルーマクロ流体カセット、フロースルーマイクロ流体カセット、フロースルーナノ流体カセット、又はフロースルーピコ流体カセットにさらに加えて、試料チャンバ及び収集チャンバを含んでよい。他の実施形態は、試薬、又は、チャネル内に配置された凍結乾燥試薬を復元することができる水を含むことができる試薬リザーバを、カセット上に有してよい。
【００２７】
いくつかの実施形態によれば、マイクロ流体熱反応器カセットがデバイス内に配置され、処理されてよい。図３に関連して、例えば、マイクロ流体熱反応器カセットは、Ａ．流体入口ポート、Ｂ．ブロックヒータ、及びＣ．ポゴ（Ｐｏｇｏ（登録商標））ピンアレイ、又は、カセット内に埋設されたバイオセンサを測定する他の方法を備えてよい。
【００２８】
いくつかの実施形態では、単一のフロースルーマクロ流体マイクロ流体多重温度反応デバイスカセット、フロースルーマイクロ流体マイクロ流体多重温度反応デバイスカセット、フロースルーナノ流体マイクロ流体多重温度反応デバイスカセット、又はフロースルーピコ流体マイクロ流体多重温度反応デバイスカセットは、ポリカーボネート又は他の材料のシェルの２つのハーフを、それらが所望のループレイアウトを形成するように射出成形することによって、又は他のプロセスによって、製造されてよい。射出成形プロセスのための金型は、最終的なデバイスの正常機能のための機能的要素を組み込むように設計されたポリマーマスタを電鋳することによって製造されてよい。すべての構成要素は、組み立て前に十分に洗浄され、乾燥されてよい。カセットの２つのハーフは、積層又は油圧プレスによってチャネル構造上に薄層封止膜で熱的に結合されてよい。カートリッジ構成要素は、圧力ベースのシステム（例えば、積層、油圧プレス）を使用して互いにしっかりと結合されてよい。他の結合手法が他の実施形態で用いられてよい。
【００２９】
デバイスのいくつかの実施形態では、カセットは、ポリカーボネート又は他の生体適合性プラスチック材料から射出成形され、又はミリングされてよい。他の実施形態では、カセットは、ガラス若しくはＰＤＭＳ、又は他の生体適合性材料から成形され、又はミリングされてよい。
【００３０】
これらのフロースルーカセットのようなデバイスに関する問題の１つは、高い体積対表面積比の問題である可能性がある。これは、酵素のような生物学的に活性な反応成分を表面上に結合させて変性させる可能性があり、したがって、それらを不活性にして実験に有害に影響する可能性がある、大きい疎水性の表面積を提供する可能性がある。したがって、いくつかの実施形態によれば、酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等）の表面上での変性からの予防又は低減が好ましい可能性がある。
【００３１】
単一のフロースルーマクロマイクロ流体多重温度反応デバイスカセット、フロースルーマイクロマイクロ流体多重温度反応デバイスカセット、フロースルーナノマイクロ流体多重温度反応デバイスカセット、又はフロースルーピコ流体マイクロ流体多重温度反応デバイスカセットのいくつかの実施形態では、チャネルの表面は、任意の反応又は試料成分の材料内及び材料上への吸収及び吸着を防ぐ又は低減するように処理されてよい。このような表面処理は、チャネルを介して犠牲物質（sacrificial substance）を流し、それにより、材料の損失を減らすこと、ウシ血清、ポリメラーゼ酵素、若しくは他のこのような材料などの生体物質で表面を処理すること、又は、表面を化学的に処理することにより損失を防ぐことを含むがこれらに限定されない方法を含んでよい。処理は、よりスムーズな流れを可能にするように親水性又は疎水性表面を形成することができる材料の配置を含んでよいが、これに限定されない。いくつかの他の実施形態では、フルオロカーボン及び同様の材料（疎水性障壁（hydrophobic barrier）として作用する例としてテフロン（登録商標）、又はポリアクリレート）が、チャネルの表面上に形成されてもよい。ＵＶコーティング、及び、表面から化学的に成長されるポリマーブラシのような他の手法も、本発明に含まれてもよい。さらに他の実施形態では、カートリッジが製造される材料は、表面上への又は表面内への材料の損失を防止又は低減するために、その設計及び材料構成で選択又は適合されることがある。
【００３２】
上記で概説したもののような表面の化学的性質は、マイクロ流体チャネルの表面上で酵素が変性するのを防ぐために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、この処理は、酵素の性能を実際に向上させることができ、又は、酵素のさらなる安定性を可能にする。
【００３３】
他の実施形態では、酵素は、材料の変性又は損失を防止する又は低減するために、化学的又は生物学的リンカーを使用して表面に付着されてよい。このようなリンカーは、二硫化物リンカー、ビスアミンリンカー、シラン化学反応、ペプチド認識部分、ヒスチジンタグ付けリンカー、イオン認識部分、並びに、表面及び／又は酵素自体との親和性を示すことができる生物学的種を含んでよいが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、酵素（例としてＴａｑポリメラーゼ）は、表面種と結合するように、又は、このような特性を有する酵素と結合されるように特に適合されていてよい。さらに他の実施形態では、カートリッジが製造される材料は、酵素の変性に対して、又は、酵素のさらなる安定性若しくは性能の向上のために、その設計及び材料構成で選択又は適合されてよい可能性がある。
【００３４】
いくつかの実施形態では、酵素の配置は、増幅が起こるための最適な条件を提供するために、マイクロ流体チャネルの特定の領域で特異的に行われてよい。酵素の配置は、印刷技術を使用して行われてよく、又は、表面は、特定の領域で、これらの領域に存在する酵素を最大にするように処理されていてよい。いくつかの実施形態では、この配置は、チャネル内の特定の領域への酵素の親和性を高めることによって、又は、材料を配置する必要がない表面上の領域を遮断することによって行われてよい。このような技術の例は、上記で概説されており、これらの領域での表面への付着を促進又は低下させるために使用されてよい。印刷技術は、材料のより正確な形成を提供し、且つ廃棄物を最小にするために使用されてよく、又は、材料を表面に付着させるためのその場手法（in situ methodologies）を行うために使用されてもよい。
【実施例】
【００３５】
以下は、本開示のいくつかの実施形態のいくつかの例示的且つ非限定的な例である。
【００３６】
（実施例１  ＤＮＡ配列決定）
マイクロ流体チャネルの全体に渡ってバイオセンサ（例えば、ＦＥＴ、ナノワイヤＦＥＴ、カーボンナノチューブ、ＬＥＤ、及び他の小型蛍光検出器等）を配列することによって、チャネルの各々の長さごとに変化を感知することができる。１つ又は複数の（同じ配列の）ＤＮＡ分子がチャネルを通って引き伸ばされる場合、チャネルは、特許文献１に記載のような合成による配列決定を使用することによって、又は、ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）及びＲｏｃｈｅ（登録商標）によって使用されるピロシーケンス法の１つを使用することによって、異なる位置で異なる塩基を感知することができる。温度制御は、ＤＮＡの変性及びＤＮＡの重合を支援することができる。
【００３７】
（実施例２  ＰＣＲ）
多くの分子診断手法、Ｃｅｐｈｅｉｄ（Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標））、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｅｌｅｒ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ）、ＢｅａｄＸｐｒｅｓｓ（登録商標）及びＥｃｏ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、７５００リアルタイムＰＣＲシステム（ＡＢＩ）、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）システム（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標））では、ＤＮＡの特定の領域をそれらが検出され得るレベルに増幅させるためのＰＣＲ反応を行うために、サイクル反応混合物は、ＤＮＡテンプレート、プライマー、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ、及びＭｇＣｌ２を含む。しかしながら、現在までの技術のすべては、温度を上昇及び下降させるヒータ（通常はペルチェヒータ）を用いる。本発明のいくつかの態様によれば、これは、エネルギーの浪費、コスト、及び、暑い周囲温度内での冷却の難しさのため、現場に配備される携帯型ハンドヘルドデバイスには不適切である。
【００３８】
いくつかの例示的な実施形態を示す図１に関して、特定の設計は、３つの異なる温度帯（この場合では、９５℃、５５℃及び７２℃）を示すように、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）実験を行うものである。カセット外（off-cassette）の異なる熱ブロックを異なる温度に設定する能力のために、異なる用途に対して多数の異なる構成及び温度が存在する可能性がある。例えば、すべての熱ブロックは、逆転写反応のための６８℃、又はイムノアッセイのための室温／３７℃のような、単一の温度に設定されてよい。他の構成では、２つの温度、例えば、凍結融解サイクルのための０℃及び９０℃、又は、より複雑な実験のためのより多くの温度を認めることができる。
【００３９】
代替の実施形態を図７に示す。この実施形態では、第１の加熱ブロック（左手側）は５５℃である。次の３つは７２℃に設定され、次のブロックは９５℃に設定される。次の３つのブロックは再び７２℃に設定され、右側の最後のブロックは５５℃に設定される。これは、９５℃でのＤＮＡの変性、５５℃でのプライマーのテンプレートＤＮＡへのアニーリング、及び、７２℃での伸長を可能にするＰＣＲのための構成である。従来のＰＣＲに通常は含まれない追加の伸長段階が存在するが、これは、フロースルー法の機能であり、ＰＣＲ反応効率に有害に影響しないことに注意されたい。これはしたがって１：３：２（変性、アニール及び伸長）の比率であり、これは９５℃の熱ブロックが１つだけ、７２℃が３つ、及び、最後に湾曲部が５５℃であり、したがって、反応混合物が温度帯で費やす時間のため、２つとみなすことができることによる。
【００４０】
さらに他の実施形態を図８に示す。図中の図表は、特に、さらなる柔軟性を提供するために流体流量も変更される場合に、デバイスが柔軟であり且つ多くの異なる熱プログラムの要求を満たすことを可能にする、異なる構成を示す。
【００４１】
図９を参照すると、図９は、特に、さらなる柔軟性を提供するために流体流量も変更される場合に、デバイスが柔軟であり且つ多くの異なる熱プログラムの要求を満たすことを可能にする、さらに異なる構成を示す。
【００４２】
図１０及び図１１は、ＨＩＶ遺伝子のｐｏｌ領域のＰＣＲ増幅のための本発明の特定の実施形態の成功した適用を示す。ゲル画像は、ＨＩＶｐｏｌ遺伝子の領域が増幅され（標的がポジティブコントロールＤＮＡプラスミド挿入）、加熱ブロック上のマイクロ流体熱反応器カセット内で実行されたＰＣＲ実験の結果を示す。３つの異なる流体流量が試験され、結果として生じた溶出液がＱｕａｎｔ−ＩＴ（登録商標）システムで定量化された。
【００４３】
（実施例３  ＲＴ−ＰＣＲ）
他の例では、解析すべき特定の標的分子はＲＮＡであってよく、マイクロ流体熱反応器カセット内で逆転写ＰＣＲ実験を行う必要がある可能性がある。
【００４４】
図１２は、本発明のいくつかの実施形態に従って得られた逆転写ＰＣＲ実験結果を示す。反応は、マイクロ流体熱反応器カセット内で実行され、ｃＤＮＡライブラリがテンプレートとして全血から生成された。反応は、ハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴの領域を増幅した。
【００４５】
（実施例４  ハンドヘルド配列決定及び診断デバイス）
いくつかの実施形態では、特定の標的ＤＮＡ配列が、ＤＮＡが配列決定される（図１３）単一のフロースルーマイクロ流体カセット内のさらに下流のプロセスに通じることができるマイクロ流体チャネル内で抽出されてよい。いくつかの実施形態では、試料からのＤＮＡの溶解及び抽出に必要なすべての試薬は、マイクロ流体チャネル内に格納されてよく、各洗浄溶液及び溶解緩衝液は、気泡、若しくは、試薬を分離する他の方法によって分離されてよく、又は、試薬は、ブリスターパック、凍結乾燥、若しくは、試薬をマイクロチャネル内に格納する他の方法で格納されてよい。
【００４６】
いくつかの実施形態では、標的ウイルスＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡの小さい特定の領域が、配列決定のために抽出されてよく、したがって、特定のウイルス、細菌、又は（ＳＮＰのような）遺伝子配列の有無について診断されてよく、並びに、遺伝子型、突然変異（既知の又は未知の）、薬剤耐性状態等への付加価値情報を提供することができる。
【００４７】
本開示に関連して使用した少なくともいくつかの実施形態は、配列決定反応前にＤＮＡを抽出するために必要なかさばる機器を必要としない可能性があるため、それ自体ハンドヘルド配列決定に適している。
【００４８】
一実施形態では、プローブ配列が、高感度検出ナノ構造（この場合ではナノワイヤ）上に固定されてもよく、配列決定されるべきテンプレート一本鎖ＤＮＡ分子は、プローブ配列にハイブリダイズすることができ、プローブ配列は、合成反応による配列決定のためのプライマーとして作用することができる。他の実施形態では、テンプレート一本鎖ＤＮＡは、高感度検出ナノ構造に固定されてもよく、遊離のプライマーオリゴヌクレオチドによって配列決定のためにプライミングされてもよい。
【００４９】
例示的な実施形態を図１３に示す。この特定の例では、Ｑ−ＰＯＣ使い捨てカセットが、ａ．試料受けと、ｂ．試料溶解と、を含んでよい。プロジェクトＩＰＲが、特定の溶解緩衝液／条件のためにｎｅｘｔｔｅｃ（登録商標）（ドイツ）と協働して求められてよい。ｃ．試料調製が、例えば、いくつかの実施形態では、ｎｅｘｔｔｅｃの吸着剤フィルタをマイクロ流体チャネル内に充填する方法によって行われてよい。ｄ．ＤＮＡの濃縮が、いくつかの実施形態では、例えば、ＤＮＡ抽出によって行われてよい。凍結乾燥された試薬の復元（乾燥試薬を使用する場合）ＰＣＲ試薬も、このチャンバ内で、又は混合試薬若しくは湿式試薬内で生じることになる。ｅ．熱サイクリング。ｆ．マイクロ流体素子。ｇ．いくつかの実施形態の後で若しくは実施形態内に配列される、ナノワイヤ、又は他のバイオセンサ。ｈ．電子機器がバイオセンサからの信号を読み取りデバイスにリンクするために使用される。ｉ．廃棄物（waste）は単に空のマイクロ流体リザーバである。
【００５０】
他の例示的な実施形態を図１４に示す。この特定の例では、デバイスは以下のものを備えることができる。ａ．試料受け−この要素は、血液バキュテイナー（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）（登録商標）上にあってよいゴムによく似て、漏れ出る試料のための障壁として作用することができ依然として試料を受けることができる。ｂ．溶解チャンバ−これは、細胞を破壊し、ゲノムＤＮＡを遊離させるために溶解試薬を含む、比較的シンプルなマイクロ反応器、チャンバを示す。この部分は、標的ヌクレオチドポリマーが血清中で遊離し得る場合、血液細胞を除去するためのフィルタに似ていてもよい。ｃ．核酸試料調製−試料のヌクレオチドポリマーフラクションを試料成分の残りの部分（タンパク質、炭水化物、脂質等）から分離及び抽出することができる。これを、当業者に周知のいくつかの方法によって達成することができる。例えば、このｍａｃｏ流体チャンバは、Ｎｅｘｔｔｅｃのフィルタ技術を含んでもよい。ｄ．標的ヌクレオチドポリマーの増幅−この部分は、必要とされる熱サイクリング、又は、試料の加熱を必要としない可能性がある等温増幅方法（例えば、ＬＡＭＢ、ＲＰＡ等）を行うために、加熱素子、若しくは、ＰＣＲに必要な異なる温度を経て反応混合物を循環させる他の周知の戦略を用いてよい、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、標的ヌクレオチドポリマーを増幅することができる。ｅ．試料処理−これは、少なくともいくつかの実施形態では、核酸を濃縮するために、又は、配列決定前に、バックグラウンド信号を生じる可能性がある「オーバーハング」ヌクレオチド鎖を除去するために、必要とされる可能性がある。ｆ．一般的なマイクロ流体素子−これは、いくつかの実施形態で使用されるチャネル、流体流、バルブ及び制御、材料、並びにバルブの、サイズを記述する。ｇ．金属コネクタ−これらのコネクタは、いくつかの実施形態では、高感度検出ナノ構造（この場合、ナノワイヤ）を検出デバイスに接続する。ｈ．高感度検出ナノ構造アレイ−マイクロ流体チャネルは、（ナノワイヤ又はカーボンナノチューブのような）密接に配列された高感度検出ナノ構造であってもよい。チャネル内のＤＮＡを位置決めする２つの方法が用いられてよく、すなわち、１．緊密なチャネルが、ＤＮＡの長い範囲を、必要に応じて長い読み取り長を可能にすることができるチャネルにほどき、移動させ、引き伸ばすことを可能にし、２．タイリングプローブ／プライマーが、ナノワイヤクラスタ上に配置されてもよく、短い複数の並列配列決定反応がチャネル全体で行われる。ｉ．この縫うように進む（weaving）マイクロ流体チャネルに、いくつかの実施形態では、気泡によって分離された試薬を充填することができる。このマイクロ流体チャネルはポンプで汲み上げることができ、又は、小さいアクチュエータが試薬を移動させるため、マイクロ流体チャネル内の試薬の配列は、合成反応による配列決定を実行することができる。代わりに、試薬貯蔵のこの方法は、リザーバ又はブリスターパック、及び、反応液自体によって復元される凍結乾燥試薬にも置き換えられてもよい。
【００５１】
他の実施形態を示す図１５を参照すると、デバイスは、カセット内のＤＮＡ抽出及び分画デバイスを含んでよい。
【００５２】
（実施例５  溶解）
他の例では、実験は溶解ステップであってよい。これは、いくつかの実施形態では、室温で細胞壁を破壊して開くために高塩濃度緩衝液を使用して行われてよい。しかしながら、以下の様な他の手法が使用されてよい。
【００５３】
凍結／融解サイクル。本発明のいくつかの実施形態によるデバイスは、試料を急速に加熱及び冷却し、それによって、急速凍結融解サイクリングに必要な条件を形成することに適している可能性がある。
【００５４】
酵素溶解。溶解での酵素の使用は、十分に文書化されているが、溶解のこの用法は、マイクロ流体素子内ではまだ十分に行われていない。本発明のいくつかの実施形態によるデバイスは、急速に反応を酵素によって要求される温度にすることができ、また、マイクロチャネル内の変更された動力学により、チューブベースのシステムと比較して、溶解ステップをスピードアップすることができるため、酵素溶解を行うことができる。
【００５５】
（実施例６  イムノアッセイ）
イムノアッセイは、通常は抗体を使用して、物質の複雑な混合物を含むことが多い溶液中の物質の存在又は濃度を測定する生物学的試験であり、最適な反応温度が、抗体−抗原結合プロファイルによって規定されてよい。したがって、いくつかの場合では、特に複数の抗体が使用される場合、反応は、単一の温度、又は代わりに一連の温度に維持される可能性がある。このことはしたがって、少なくともいくつかの実施形態によれば１つの反応で９つの異なる結合温度を提供することができるため、デバイスをきわめて多目的にすることができる。
【００５６】
（ＬＥＤのような）比色分析若しくは蛍光検出デバイス、ナノポア、ナノギャップ、又はカーボンナノチューブ、及び、マイクロ流体チャネルに沿った鉄道軌道上の寝台車のように配列されたナノワイヤＦＥＴバイオセンサのような検出デバイスが、少なくともいくつかの実施形態によるデバイス内に組み込まれてよい。
【符号の説明】
【００５７】
ａ  試料受け
ｂ  溶解チャンバ
ｃ  試料調製
ｄ  標的ヌクレオチドポリマーの増幅
ｅ  試料処理
ｆ  一般的なマイクロ流体素子
ｇ  金属コネクタ
ｈ  高感度検出ナノ構造アレイ
Ａ  流体入口ポート
Ｂ  ブロックヒータ
Ｃ  ピンアレイ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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