(57)【要約】  本発明は、認知を保持するかまたは向上させ、減少した樹状突起棘形態に関連する疾患および嗜癖および統合失調症などの精神的障害、又は自閉症、レット症候群、トゥレット症候群および脆弱Ｘ症候群のような認知障害に関連する疾患を治療する手段としての、樹状突起棘の密度を増やす方法に関する。
2013510871.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＲ６インヒビターまたはｐ７５インヒビターの有効量を患者に投与することを含む、認知又は精神的な障害を持つ患者のニューロンにおける樹状突起棘の密度を増加させる方法。
【請求項２】
前記ＤＲ６インヒビターがＤＲ６のエピトープと結合し、ＤＲ６の機能を阻害する抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｐ７５インヒビターがｐ７５のエピトープと結合し、ｐ７５の機能を阻害する抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体が、３Ｆ４.４.８、４Ｂ６.９.７、１Ｅ５.５.７およびこれらの抗原結合性フラグメントからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体が、キメラ又はヒト化の３Ｆ４.４.８、４Ｂ６.９.７ないしは１Ｅ５.５.７、又は３Ｆ４.４.８、４Ｂ６.９.７ないしは１Ｅ５.５.７と同じエピトープと結合する抗体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＤＲ６インヒビターが、前記ニューロンのＤＲ６シグナル伝達を低減するか又は予防する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ｐ７５インヒビターが、前記ニューロンのｐ７５シグナル伝達を低減するか又は予防する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
樹状突起棘の減少と関係している認知又は精神的障害を有する患者を識別し、ＤＲ６アンタゴニストまたはｐ７５アンタゴニストの治療上有効量を患者に投与することを含む、治療が必要な患者の認知又は精神的障害の治療方法。 
【請求項９】
前記精神的又は認知障害は、例えば、レット症候群、トゥレット症候群、自閉症、統合失調症および脆弱Ｘ精神障害からなる群から選択される、請求項１又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＤＲ６インヒビターが、ＤＲ６のエピトープと結合し、ＤＲ６の機能を阻害する抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｐ７５インヒビターが、ｐ７５のエピトープと結合し、ｐ７５の機能を阻害する抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体が、３Ｆ４.４.８、４Ｂ６.９.７、１Ｅ５.５.７およびこれらの抗原結合性フラグメントからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体が、キメラ又はヒト化の３Ｆ４.４.８、４Ｂ６.９.７ないしは１Ｅ５.５.７、又は３Ｆ４.４.８、４Ｂ６.９.７ないしは１Ｅ５.５.７と同じエピトープと結合する抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
加齢の間に被検体の認知を維持する方法であって、被検体の樹状突起棘の密度を促すために有効な量のＤＲ６インヒビターまたはｐ７５インヒビターを被検体に投与することを含み、これによって該被検体の認知を維持する方法。
【請求項１５】
前記ＤＲ６インヒビターが、ＤＲ６のエピトープと結合し、ＤＲ６の機能を阻害する抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体が、３Ｆ４.４.８、４Ｂ６.９.７、１Ｅ５.５.７およびこれらの抗原結合性フラグメントからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体が、キメラ又はヒト化の３Ｆ４.４.８、４Ｂ６.９.７ないしは１Ｅ５.５.７、又は３Ｆ４.４.８、４Ｂ６.９.７ないしは１Ｅ５.５.７と同じエピトープと結合する抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ｐ７５インヒビターが、ｐ７５のエピトープと結合し、ｐ７５の機能を阻害する抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
ＤＲ６アンタゴニストがＤＲ６活性を阻害する認知又は精神的障害を有する患者に使用するための医薬の調製における、ＤＲ６アンタゴニストの使用。
【請求項２０】
前記ＤＲ６アンタゴニストが、ＤＲ６のエピトープと結合する抗体である、請求項１５に記載のＤＲ６アンタゴニストの使用。
【請求項２１】
前記抗体が、３Ｆ４.４.８、４Ｂ６.９.７、１Ｅ５.５.７およびこれらの抗原結合性フラグメントからなる群から選択される、請求項１６に記載のＤＲ６アンタゴニストの使用。
【請求項２２】
前記抗体が、キメラ又はヒト化の３Ｆ４.４.８、４Ｂ６.９.７ないしは１Ｅ５.５.７、又は３Ｆ４.４.８、４Ｂ６.９.７ないしは１Ｅ５.５.７と同じエピトープと結合する抗体である、請求項１６に記載のＤＲ６アンタゴニストの使用。
【請求項２３】
ｐ７５アンタゴニストがｐ７５活性を阻害する認知又は精神的障害を有する患者に使用するための医薬の調製における、ｐ７５アンタゴニストの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００９年１１月１２日出願の米国特許仮出願第６１／２６０８１５号と２０１０年１月１１日出願の米国特許仮出願第６１／２９４０２０号の優先権を主張する。これら出願の開示内容は出典明記によって全体がここに援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明はニューロンの樹状突起棘の密度を促す方法に関する。より具体的には、本発明は、ＤＲ６および／またはｐ７５を阻害することによってシナプスを増加させること、および認知障害の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＤＲ６レセプターと呼ばれるＴＮＦＲファミリーメンバー(文献において、「ＴＲ９」とも呼ばれ、またＴＮＦレセプタースーパーファミリーメンバー２１又はＴＮＦＲＳＦ２１として知られる)は、４つの細胞外システインリッチモチーフおよび１つの細胞質デスドメイン構造を有するＩ型膜貫通レセプターとして紹介されている(Pan等, FEBS Lett., 431:351-356 (1998)；更には米国特許第６３５８５０８号、同第６６６７３９０号、同第６９１９０７８号、同第６９４９３５８号参照のこと)。形質移入された特定の細胞株におけるＤＲ６の過剰発現により、ＮＦ−ｋＢおよびＪＮＫ両方のアポトーシスおよび活性化が引き起こされることが報告されている(Pan等, FEBS Letters, 431:351-356 (1998))。
ＤＲ６を欠損するマウスモデルでは、Ｔ細胞はＪＮＫ活性化において実質的に正常に機能せず、ＤＲ６(−／−)マウスにタンパク質抗原を投与すると、それらのＴ細胞は過剰増殖し、Ｔｈ２応答への強い偏向を示すことが分かった(一方で、Ｔｈ１分化には同等の影響は無かった)(Zhao等, J. Exp. Med., 194:1441-1448 (2001)。更に、ＤＲ６の標的とされた破壊により、インビトロでのＴヘルパー２(Ｔｈ２)の分化が強まった(Zhao等、上掲)。Ｂ細胞によって媒介される状態の調節におけるＤＲ６アゴニスト又はアンタゴニストの様々な使用法は、２００５年３月３１日公開の米国特許出願公開第２００５／００６９５４０号に記載されている。ＤＲ６レセプターは、ＯＶＡによって誘発された喘息のマウスモデルにおける気道炎症の制御に関与していると思われる(Venkataraman等, Immunol. Lett., 106:42-47 (2006))。ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(ＭＯＧ(３５−５５))によって誘発された実験的自己免疫性脳脊髄炎のモデルを使用したところ、ＤＲ６−／−マウスは、野生型(ＷＴ)の同腹仔と比較して、ＣＮＳ疾患の発症および進行の両方に高い耐性を示した。つまり、ＤＲ６は、白血球の浸潤に関与し、実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘発と進行に機能している可能性がある(Schmidt等, J. Immunol., 175:2286-2292 (2005))。
【０００４】
様々なＴＮＦリガンドおよびレセプターファミリーメンバーが逆の生物学的活性および特性を持つものとして同定されている一方で、神経学に関連する機能に関与するこのようなリガンドおよびレセプターはこれまで殆ど報告されていない。例えば、２００４年８月２６日公開の国際公開第２００４／０７１５２８号には、脊髄の傷害を治療するための、マウスモデルにおけるＣＤ９５(Ｆａｓ)リガンド／レセプター複合体の阻害が開示されている。近年、Nikolaev等は、ＡＰＰのＮ末端フラグメントがＤＲ６に対するリガンドであることを示した(Nilolaev et al. (2009) Nature 457:981-989)。
【０００５】
神経細胞は、樹状突起上の「樹状突起棘」に生じるシナプスで互いにやりとりしている。樹状突起棘は、樹状突起から突出している樹状突起の膜性領域であり、（一般に）軸索の単一シナプスと接触している。単一の樹状突起上に何千もの棘がありうる。棘は軸索から興奮性入力と阻害性入力の両方を受け取るが、興奮性入力の方が一般的である。樹状突起棘の先端付近には、シナプス後肥厚領域(ＰＳＤ)と称される電子密度の高い領域がある。この領域の中には、ＰＳＤのマーカーであるＰＳＤ−９５と称される構造タンパク質がある。棘はグルタミン酸レセプター（例えばＡＭＰＡおよびＮＭＤＡレセプター）に豊富に存在する。ＴｒｋＢレセプターなどの他のレセプターは、棘の生存にいくらか役割があると考えられている。
化学的シナプスはニューロンと連結し、情報の処理と貯蔵をすることができる機能的回路を形成する。適切な機能の喪失又はこれらの連結の安定性は、多くの精神的疾患および神経変性疾患の基礎をなすと考えられる。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、患者にＤＲ６インヒビターおよび／またはｐ７５インヒビターの有効量を投与することを含む、認知又は精神的な疾患を持つ患者の樹状突起棘の密度を増加させる方法を提供する。インヒビターは、例えば、ＤＲ６のエピトープと結合してＤＲ６の機能を阻害する抗体、又はｐ７５のエピトープと結合してｐ７５の機能を阻害する抗体であってよい。阻害性抗ＤＲ６抗体の例には、限定するものではないが、３Ｆ４.４.８、４Ｂ６.９.７、１Ｅ５.５.７およびこれらの抗原結合性フラグメントが含まれる。よって、抗体は、キメラ又はヒト化の抗体、例えばキメラ又はヒト化の３Ｆ４.４.８、４Ｂ６.９.７又は１Ｅ５.５.７、又は３Ｆ４.４.８、４Ｂ６.９.７又は１Ｅ５.５.７と同じエピトープと結合する抗体であってよい。ＤＲ６のインヒビターは、ニューロンでのＤＲ６シグナル伝達を低減するか又は予防する。
本発明はまた、樹状突起棘の減少と関係している認知又は精神的障害を有する患者を識別し、患者にＤＲ６アンタゴニストおよび／またはｐ７５アンタゴニストの治療上有効量を投与することを含む、治療が必要な患者の認知又は精神的障害の治療方法を提供する。精神的又は認知障害は、例えば、レット症候群、トゥレット症候群、自閉症、統合失調症又は脆弱Ｘ精神障害であってよい。インヒビターは、例えば、ＤＲ６のエピトープと結合し、ＤＲ６の機能を阻害する抗体、および／またはｐ７５のエピトープと結合し、ｐ７５の機能を阻害する抗体であってよい。抗体は、例えば３Ｆ４.４.８、４Ｂ６.９.７、１Ｅ５.５.７、又はこれらの抗原結合性フラグメントであってよい。抗体は、キメラ又はヒト化の抗体、例えばキメラ又はヒト化の３Ｆ４.４.８、４Ｂ６.９.７又は１Ｅ５.５.７、又は３Ｆ４.４.８、４Ｂ６.９.７又は１Ｅ５.５.７と同じエピトープと結合する抗体であってよい。
【０００７】
本発明は、さらに、加齢の間に被検体の認知を維持する方法であって、被検体の樹状突起棘の密度を促すために有効な量のＤＲ６および／またはｐ７５インヒビターを被検体に投与することを含み、これによって該被検体の認知を維持する方法を提供する。インヒビターは、例えば、ＤＲ６のエピトープと結合し、ＤＲ６の機能を阻害する抗体、および／またはｐ７５のエピトープと結合し、ｐ７５の機能を阻害する抗体であってよい。抗体は、例えば３Ｆ４.４.８、４Ｂ６.９.７、１Ｅ５.５.７、又はこれらの抗原結合性フラグメントであってよい。抗体は、キメラ又はヒト化の抗体、例えばキメラ又はヒト化の３Ｆ４.４.８、４Ｂ６.９.７又は１Ｅ５.５.７、又は３Ｆ４.４.８、４Ｂ６.９.７又は１Ｅ５.５.７と同じエピトープと結合する抗体であってよい。
したがって、本発明は、樹状突起棘密度を増やし、減少した樹状突起棘密度と関係する認知又は精神的障害を有する患者を治療するための医薬の調製における、ＤＲ６アンタゴニストおよび／またはｐ７５アンタゴニストの使用を提供する。 
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】子宮内電気穿孔法による表層２／３興奮性ニューロンの標的化標識を示す。パネルＡ：妊娠中のマウスからのＥ１６胚を曝し、右側の側脳室におよそ１μｌのＤＮＡを注射し、電位を与えた。パネルＢ：層２／３興奮性ニューロン細胞質体とその突起が組織学的に観察されうる。ニューロンは、ＤｓＲｅｄＥｘｐｒｅｓｓおよびＰＳＤ−９５−ｐａＧＦＰにて同時に標識した。パネルＣ：移植された頭蓋窓。パネルＤ：頭蓋窓からの光子顕微鏡画像(１４日目および４４日目)。
【図２】コントロール動物と比較したときの、生後６０日ＤＲ６−／−動物の樹状突起棘の増加した密度および幅を示す(パネルＡ)。密度は、同群内のすべての動物全体の細胞あたりの棘の全数／樹状突起長の平均を出すことによって算出した。ＤＲ６＋／−に２６細胞／７動物、およびＤＲ６＋／＋に２６細胞／６動物に対して、合計２８細胞／８動物にＤＲ６−／−を付した(パネルＢ)。棘の幅と長さは、遺伝子型ごとに分析した棘の全体の累積的なプロットとしてプロットした(パネルＣ)。
【図３】０μｇ／ｍｌのＮ−ＡＰＰ(コントロール)(パネルＡおよびＢ)、１μｇ／ｍｌのＮ-ＡＰＰ(パネルＣ)、３μｇ／ｍｌのＮ-ＡＰＰ(パネルＤ)、１０μｇ／ｍｌのＮ-ＡＰＰ(パネルＥ)、および３０μｇ／ｍｌのＮ-ＡＰＰ(パネルＦ)にて処理した後の培養物におけるＥ１６皮質ニューロンを示す。
【図４】１、３、１０および３０μｇ／ｍｌのＮ−ＡＰＰによる（コントロールと比較したときの）処理の結果としてのＰＳＤ９５斑の減少を示す。
【図５】ＰＳＤ９５斑点密度のＮ−ＡＰＰが誘導する減少はＤＲ６機能に依存していることを示す。０．１、０．３、１．０又は３．０ｕｇ／ｍｌのＮ−ＡＰＰ(酸性尾部なし)又は完全長Ｎ−ＡＰＰ(Ｎ-ＡＰＰ ＦＬ)の添加による無処理のニューロンにおけるコントロールの割合(１００ｕｍあたりの斑点)。１つの群は、３０ｕｇ／ｍｌの抗ＤＲ６.１抗体にて(示すように)さらに処置した。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（発明の詳細な説明）
本明細書中に記載又は参照の技術および手順は一般的に十分理解されるものであり、例えばSambrook 等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載の広く利用される分子クローニング方法論などの、当分野の技術者による従来の方法論を用いて通常行われるものである。好ましくは、市販のキットや試薬の使用を伴う手順は、特に明記しない限り、プロトコルおよび／又はパラメータを定義する製造者に従って一般的に行われる。
本方法やアッセイを開示する前に、本発明は、ここに記載の特定の方法論、プロトコル、細胞株、動物種や属、コンストラクトおよび試薬に限定されるものではなく、変更されてもよいことを理解されたい。また、本明細書中で用いる用語は特定の実施態様のみを開示するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の権利範囲を限定するものでないことを理解されたい。
【００１０】
本明細書で用いられるおよび添付の特許請求の範囲中の単数形「ａ」、「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」には、明らかな記載がない限り複数形も含まれる。ゆえに、例えば「一般的な変更」なる用語には複数の変更が含まれ、「プローブ」なる用語は一ないし複数のプローブおよび当分野の技術者に公知のその等価物などを含む。本明細書および請求の範囲において引用される数字(例えば、アミノ酸２２−８１、１−３５４等)は全て、語頭に「約」という語が付くものとする。
本明細書中で引用するすべての出版物は、該出版物が引用される方法および／又は材料を開示および記載するために、出典明記によって本明細書中に組み込まれる。本明細書中で引用する出版物は、本出願の提出日前の開示について言及するものである。発明者等は、早い優先日又はより前の発明日のために先行する出版物に権利が与えられないことが認められると解釈されるものではない。さらに、実際の出版日は明記されているものと異なり、個々に検証が必要であろう。
【００１１】
「アミロイド前駆体タンパク質」又は「ＡＰＰ」なる用語は、ＡＰＰ  ｍＲＮＡ前駆体によりコードされているさまざまなポリペプチドイソフォーム、例えばそれぞれ配列番号３−５に記載されているＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１およびＡＰＰ７７０イソフォーム(ＡＰＰ  ｍＲＮＡ前駆体の選択的にスプライスされた転写産物から翻訳されたものであるイソフォーム)、およびＡＰＰイソフォームの翻訳後にプロセスされた部分を含む。周知のように、ＡＰＰ遺伝子から転写されたＡＰＰ  ｍＲＮＡ前駆体は、選択的エキソン・スプライシングを受けて、たくさんのイソフォームを産生する(例えば、Sandbrink等, Ann NY Acad. Sci. 777: 281-287 (1996); PubMed NCBI protein locus accession P05067に関連する情報を参照) 。このオルターナティブエキソン・スプライシングは、６９５（配列番号３）、７５１（配列番号４）、および７７０（配列番号５）アミノ酸長の３つの主要なイソフォームを産生する(Kang等, Nature 325: 733-736 (1987); Kitaguchi等, Nature 331: 530-532 (1988); Ponte等, Nature 331: 525-527 (1988)；およびTanzi 等, Nature 331: 528-532 (1988))。これらのイソフォームの２つ(ＡＰＰ７５１およびＡＰＰ７７０)は、セリンプロテアーゼインヒビター(ＫＰＩ)のクーニッツ(Kunitz)ファミリーと高度に相同的である５６残基の挿入を含み、偏在的に発現する。対照的に、ＫＰＩモチーフを欠いている短いイソフォームＡＰＰ６９５は神経系において、例えばニューロンおよびグリア細胞において主に発現し、この理由により「ニューロンのＡＰＰ」と呼ばれる場合が多い(例えば、Tanzi等, Science 235: 880-884 (1988); Neve等, Neuron 1: 669-677 (1988); and Haas等, J. Neurosci 11: 3783-3793 (1991)を参照)。６９５、７５１および７７０を含むＡＰＰイソフォームは、著しい翻訳後のプロセッシングイベントを受ける(例えば、Esch等、1990 Science 248:1122-1124; Sisodia等、1990 Science 248:492-495)。例えば、これらのイソフォームの各々は、さまざまな分泌酵素および／又は分泌酵素複合体により切断され、イベントはＡＰＰ外部ドメインを含むＮ末端分泌ポリペプチドを含むＡＰＰ断片を生じる(ｓＡＰＰαおよびｓＡＰＰβ)。α分泌酵素による、あるいはβ分泌酵素による切断は可溶性Ｎ末端ＡＰＰポリペプチド、ｓＡＰＰαおよびｓＡＰＰβ、をそれぞれ生成して細胞外放出し、対応する膜アンカーＣ末端断片Ｃ８３およびＣ９９の保持を導く。γ分泌酵素によるＣ８３の次のプロセッシングは、Ｐ３ポリペプチドを産出する。これは、主要な分泌経路であり、非アミロイド形成的である。あるいは、Ｃ９９のプレセニリン／ニカストリン介在性γ分泌酵素プロセッシングは、アミロイドベータポリペプチドであるアミロイドベータ４０(Ａβ４０)およびアミロイドベータ４２(Ａβ４２)、アミロイドプラークの主要成分、および細胞毒性Ｃ末端断片であるγＣＴＦ(５０)、γＣＴＦ(５７)およびγＣＴＦ(５９)を放出する。エビデンスは、各切断イベントの相対的重要性が細胞型に依存することを示唆する。例えば、非神経細胞は、優先して、α分泌酵素経路によりＡＰＰを処理してＡβ配列内でＡＰＰを切断し、それによりＡβの形成を排除する(例えば、Esch等. 1990 Science 248:1122-1124; Sisodia等. 1990 Science 248:492- 495)。これに対して、神経細胞は、β分泌酵素経路によりＡＰＰ６９５の非常に大きな部分を処理し、少なくとも２つの酵素クラ��の混合性活性により完全なＡβを生成する。神経細胞では、β分泌酵素は、Ａβドメインのアミノ末端でＡＰＰ６９５を切断し、独特なＮ末端断片(ｓＡＰＰβ)を放出する。加えて、γ分泌酵素は、カルボキシ末端の選択的部位でＡＰＰを切断し、４０(Ａβ４０)又は４２アミノ酸長(Ａβ４２)のＡβの種を生成する(例えばSeubert等. 1993 Nature 361:260-263; Suzuki 等. 1994 Science 264:1336-1340; およびTurner等. 1996 J. Biol. Chem. 271:8966-8970を参照)。栄養喪失がＡＰＰのＢＡＣＥ切断を引き起こし、およそ１００ｋＤａのｓＡＰＰβが生じ、これには更なる切断（一又は複数）が起こり、およそ５５ｋＤａのカルボキシ末端フラグメント（抗ｓＡＰＰβ抗体にて検出される）とアミノ末端のおよそ３５ｋＤａのフラグメント（抗Ｎ−ＡＰＰ（ポリクローナル抗体）にて検出される）が生じると考えられており、これを我々は「Ｎ−ＡＰＰ」と称する。更なる切断(一又は複数)の部位は知られていないが、フラグメントのサイズを基に、ＡＰＰの「酸性」と「Ｅ２」ドメイン(アミノ酸２８６)との間の接合部付近であると予測され、実際、Ｎ-ＡＰＰと同様に、組換えＡＰＰ[１−２８６]はおよそ３５ｋＤａに流れ、抗Ｎ−ＡＰＰ(ポリ)にて検出された。
【００１２】
「ＡＰＰ」、「ＡＰＰタンパク質」および「ＡＰＰポリペプチド」なる用語は、本明細書で使用される場合、天然ＡＰＰ配列およびＡＰＰ変異体および処理されたその断片を含む。これらの用語は、ヒトを含めたさまざまな哺乳動物で発現するＡＰＰを含む。ＡＰＰは、さまざまなヒト組織系統で天然に存在する場合は内生的に発現されてもよく、又は組換え体又は合成方法によって発現されてもよい。「天然配列ＡＰＰ」は、天然由来のＡＰＰと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む(例えば、６９５、７５１および７７０イソフォーム又はその処理された部分)。従って、天然配列ＡＰＰは、ヒトを含む任意の哺乳動物で天然に存在するＡＰＰのアミノ酸配列を有することができる。当該天然配列ＡＰＰは自然から単離されうるか、又は組換え体又は合成手段により製造されうる。「天然配列ＡＰＰ」なる用語は、特に、天然に存在する処理されたおよび／又は分泌された形態(例えば、細胞外ドメイン配列を含む可溶型)、天然に存在する変異体型(例えば、選択的にスプラスされた形態および／又はタンパク質分解で処理された形態)および天然に存在する対立遺伝子変異体を含む。ＡＰＰ変異体は、天然配列ＡＰＰの断片又は欠失突然変異体を含んでもよい。
【００１３】
本発明の実施態様で有用なＡＰＰポリペプチドは、上記のものおよび以下の非限定的な例を含む。これらの説明された形態は本発明のさまざまな実施態様に使用されるために選択されうる。本発明のいくつかの実施態様では、ＡＰＰポリペプチドは、配列番号３−５にそれぞれ示すＡＰＰ６９５および／又はＡＰＰ７５１および／又はＡＰＰ７７０イソフォーム等の全長ＡＰＰイソフォームを含む。本発明の他の実施態様では、ＡＰＰポリペプチドは、ＡＰＰの翻訳後に処理されたイソフォーム、例えばα分泌酵素、β分泌酵素又はγ分泌酵素のような分泌酵素により切断を受けたＡＰＰポリペプチドを含む(例えば、ｓＡＰＰα又はｓＡＰＰβのような可溶性Ｎ末端断片)。本発明の関係する実施態様において、ＡＰＰポリペプチドは、Ｎ末端外部ドメイン(例えば、Quast等, FASEB J. 2003; 17(12):1739-41を参照)、ヘパリン結合ドメイン(例えば、Rossjohn等, Nat Struct Biol. 1999 Apr;6(4):327-31を参照)、銅タイプＩＩ(例えば、Hesse等, FEBS Letters 349(1): 109-116 (1994)を参照)又はクーニッツ(Kunitz)プロテアーゼ・インヒビター・ドメイン(例えば、Ponte等, Nature; 331(6156):525-7 (1988)を参照)のような１又は複数の特異的なドメインを含むように選択することができる。本発明のいくつかの実施態様において、ＡＰＰポリペプチドは、抗体又はＤＲ６イムノアドヘシンのような本明細書で開示されたＤＲ６アンタゴニストによって認識されるエピトープ、例えばＡＰＰ６９５のアミノ酸２２−８１、を含むことが認められた配列、モノクローナル抗体２２Ｃ１１により結合されるエピトープを含む配列(例えば、Hilbich等, Journal of Biological Chemistry, 268(35): 26571-26577 (1993)を参照)を含む。
【００１４】
本発明のいくつかの実施態様において、例えばクーニッツプロテアーゼ・インヒビター・ドメインを含まないＡＰＰポリペプチド(例えば、ＡＰＰ６９５)、又はアルツハイマーのβアミロイドタンパク質(Ａβ)配列を含まないＡＰＰポリペプチド(例えば、ｓＡＰＰβ、Ａβ４０および／又はＡβ４２配列を含まないポリペプチド) (例えば、Bond等, J. Struct Biol. 2003 Feb;141(2):156-70を参照)のように、ＡＰＰポリペプチドは１又は複数の特定のドメイン又は配列を含まない。本発明の他の実施態様において、本発明の実施態様で使用されるＡＰＰポリペプチドは、１又は複数のドメイン又は配列を含むが、他のドメイン又は配列は含まず、例えば、βアミロイド(Ａβ)配列のような１又は複数の分泌酵素切断部位について、ＡＰＰポリペプチドはＮ末端外部ドメイン(又は、少なくとも、モノクローナル抗体２２Ｃ１１のようなＤＲ６アンタゴニストにより結合されることが認められるその部分)を含むが、Ｃ末端であるドメイン又は配列を含まない(例えば、ｓＡＰＰα又はｓＡＰＰβ)。
【００１５】
「細胞外ドメイン」「外部ドメイン」又は「ＥＣＤ」なる用語は、ＡＰＰの形態を指し、膜貫通又は細胞質ドメインを基本的に含まない。通常、可溶性ＥＣＤは、１％未満の当該膜貫通又は細胞質ドメインを有し、好ましくは０．５％未満の当該ドメインを有する。本発明のポリペプチドで確認されたあらゆる膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのタイプを同定するために当分野で通常使用されている判定基準に準じて同定されることが理解される。膜貫通ドメインの正確な境界は、最初に同定されたドメインのどちらの端でも、変化してもよいが、多くの場合、約５アミノ酸程度であるようだ。好ましい実施態様において、ＥＣＤは、ポリペプチドの可溶性細胞外ドメイン配列からなり、膜貫通および細胞質又は細胞内ドメインを含まない(そして、膜結合型でない)。
【００１６】
「ＡＰＰ変異体」なる用語は、下に定義するように、配列番号３、４又は５に示すアミノ酸配列を有するヒトＡＰＰと、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、より好ましくは約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、もっとも好ましくは約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するＡＰＰポリペプチド、又はその可溶性断片、又はその可溶性細胞外ドメインを意味する。当該変異体は、例えばＡＰＰの完全長又は成熟配列のＮ末端又はＣ末端に１又は複数のアミノ酸残基を付加した又は欠失させたＡＰＰポリペプチド、又はポリペプチドの内部配列又はドメインに１又は複数のアミノ酸残基が挿入又は欠失させられたＡＰＰポリペプチドを含み、他種由来の変異体を含んでいるが天然配列ＡＰＰポリペプチドは除外される。
【００１７】
「ＤＲ６」又は「ＤＲ６レセプター」は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列が知られている当分野で引用されるレセプターを含む。Ｐａｎ等は、「ＤＲ６」又は「ＴＲ９」と称されるＴＮＦレセプターファミリーの一員のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を記載した(Pan等, FEBS Lett., 431:351-356 (1998); 又、米国特許第6358508号; 6667390号; 6919078号; 6949358号)。ヒトＤＲ６レセプターは、推定シグナル配列(アミノ酸１−４１)、細胞外ドメイン(アミノ酸４２―３４９)、膜貫通ドメイン(アミノ酸３５０−３６９)、続いて細胞質ドメイン(アミノ酸３７０−６５５)を有する６５５アミノ酸タンパク質(配列番号１)である。ＤＲ６のｃＤＮＡ配列は配列番号２に示す。「ＤＲ６レセプター」なる用語は、本明細書で使用される場合、天然配列レセプターおよびレセプター変異体を含む。これらの用語は、ヒトを含む、さまざまな哺乳動物において発現するＤＲ６レセプターを含む。ＤＲ６レセプターは、さまざまなヒト組織系統において天然に存在するとき内生的に発現されてもよく、又は組換え体又は合成方法によって発現されてもよい。「天然配列ＤＲ６レセプター」は、天然由来のＤＲ６レセプターと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。従って、天然配列ＤＲ６レセプターは、ヒトを含む任意の哺乳動物由来の天然に存在するＤＲ６レセプターのアミノ酸配列を有しうる。当該天然配列ＤＲ６レセプターは、自然から単離されうるか、又は組換え体又は合成手段によって製造されうる。「天然配列ＤＲ６レセプター」なる用語は、特に、レセプターの天然に存在する切断型又は分泌型(例えば、細胞外ドメイン配列を含む可溶型)、天然に存在する変異体型(例えば、選択的にスプラスされた形態)および天然に存在する対立遺伝子変異体を含む。レセプター変異体は、天然配列ＤＲ６レセプターの断片又は欠失突然変異体を含んでもよい。
【００１８】
「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」なる用語は、ＤＲ６レセプターの形態を指し、膜貫通又は細胞質ドメインを基本的に含まない。通常、可溶性ＥＣＤは、１％未満の当該膜貫通又は細胞質ドメインを有し、好ましくは０．５％未満の当該ドメインを有する。本発明のポリペプチドで確認されたあらゆる膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのタイプを同定するために当分野で通常使用されている判定基準に準じて同定されることが理解される。膜貫通ドメインの正確な境界は、最初に同定されたドメインのどちらの端でも、変化してもよいが、多くの場合、約５アミノ酸程度であるようだ。好ましい実施態様において、ＥＣＤは、ポリペプチドの可溶性細胞外ドメイン配列からなり、膜貫通および細胞質又は細胞内ドメインを含まない(そして、膜結合型でない)。
【００１９】
「ＤＲ６変異体」なる用語は、下に定義するように、配列番号１に示す予測されるアミノ酸配列を有するヒトＤＲ６と、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、より好ましくは約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、もっとも好ましくは約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するＡＰＰポリペプチド、又はその可溶性断片、又はその可溶性細胞外ドメインを意味する。当該変異体は、例えば配列番号１の完全長又は成熟配列のＮ末端又はＣ末端に１又は複数のアミノ酸残基を付加した又は欠失させたＤＲ６ポリペプチド、又はポリペプチドの内部配列又はドメインに１又は複数のアミノ酸残基が挿入又は欠失させられたＤＲ６ポリペプチドを含み、他種由来の変異体を含むが、天然配列ＤＲ６ポリペプチドは除外される。場合によっては、ＤＲ６変異体は、最高１０までの保存的なアミノ酸置換を有する配列番号１のアミノ酸１−３４９又は４２−３４９を含むＤＲ６レセプターの可溶型を含む。好ましくは、下に定義するように、当該変異体はＤＲ６アンタゴニストとして作動する。
【００２０】
「ＤＲ６アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味に使用され、インビトロ、インサイツ、インビボ又はエクスビボの何れかで、神経細胞又は組織において、１又は複数の細胞内シグナル又は細胞内シグナル伝達経路を活性化するか、又は同族リガンド、好ましくは同族リガンドＡＰＰを結合するＤＲ６レセプターの能力を、部分的に又は完全に、遮断、抑制、又は中和化する任意の分子を含む。例えば、ＤＲ６アンタゴニストは、神経細胞又は組織のアポトーシス又は細胞死に結果としてなる神経細胞又は組織において、１又は複数の細胞内シグナル又は細胞内シグナル伝達経路を活性化するＤＲ６の能力を、部分的に又は完全に、遮断、抑制又は中和化してもよい。ＤＲ６アンタゴニストは、同族リガンドのＤＲ６への結合の遮断、抑制、又は中和化、ＤＲ６と同族リガンド(例えば、ＡＰＰ)との間の複合体の形成、ＤＲ６レセプターのオリゴマー形成、ＤＲ６レセプターと異種コレセプターとの間の複合体の形成、同族リガンドのＤＲ６レセプター／異種コレセプター複合体への結合、又はＤＲ６レセプターと異種コレセプターとその同族リガンドとの間の複合体の形成を含むがこれに限定されないさまざまな機構によって、ＤＲ６を、部分的に又は完全に、遮断、抑制、又は中和化するために作動してもよい。ＤＲ６アンタゴニストは、直接的又は間接的な方法で機能してもよい。本発明により意図されるＤＲ６アンタゴニストは、ＡＰＰ抗体、ＤＲ６抗体、イムノアドヘシン, ＤＲ６イムノアドヘシン、ＤＲ６融合タンパク質、ＤＲ６の共有結合修飾型、ＤＲ６変異体およびその融合タンパク質、又はＤＲ６の高次オリゴマー型(二量体、凝集体)又はＤＲ６のホモ又はヘテロポリマー型、ＪＵＮ  Ｎ末端キナーゼＪＮＫ活性の小分子およびペプチドインヒビター、信号変換経路においてＪＮＫの上流で機能するタンパク質キナーゼＭＬＫｓおよびＭＫＫｓの薬理的インヒビター、ＪＮＫの裏打ちタンパク質ＪＩＰ-１への結合の薬理的インヒビター、ｃ-Ｊｕｎ又はＡＰ-１転写因子複合体のような基質へのＪＮＫの結合の薬理的インヒビター、ＪＮＫ結合性ドメイン(ＪＢＤ)ペプチドおよび／又はＪＮＫの基質結合性ドメインおよび／又はＪＮＫ基質リン酸化部位を含むペプチドインヒビターのような基質のＪＮＫ介在性リン酸化の薬理的インヒビター、ＪＮＫへのＡＴＰ結合を遮断する小分子、およびＪＮＫへの基質の結合を遮断する小分子を含むＪＮＫシグナル伝達カスケードの薬理的インヒビターのような小分子を含むがこれらに限定されない。
【００２１】
ＤＲ６アンタゴニストが、神経細胞又は組織において１又は複数の細胞内シグナル又は細胞内シグナル伝達経路を活性化するＤＲ６レセプターの能力を部分的に又は完全に遮断、抑制又は中和化するか否かを調べるために、例えばさまざまな神経細胞又は組織において、およびインビボモデルにおいて、ＤＲ６アンタゴニストの効果を評価するためにアッセイを実施してもよい。さまざまなアッセイは、下記のように又は当該分野で知られており文献に記載されているような既知のインビトロ又はインビボアッセイフォーマットで実施されてもよい。ＤＲ６アンタゴニストが、神経細胞又は組織において、１又は複数の細胞内シグナル又は細胞内シグナル伝達経路を活性化するＤＲ６レセプターの能力を部分的に又は完全に遮断、抑制又は中和化するか否かを調べるためのアッセイの一実施態様は、ＤＲ６アンタゴニスト又は潜在的ＤＲ６アンタゴニスト(すなわち、興味がある分子)の存在下又は非存在下においてＤＲ６とＡＰＰとを結合させること、次にこのＤＲ６アンタゴニスト又は潜在的ＤＲ６アンタゴニストの存在下でＤＲ６のＡＰＰへの結合の抑制を検出することを含む。
【００２２】
「核酸」は、任意のＤＮＡ又はＲＮＡを含むことを意味する。例えば、染色体性核酸、ミトコンドリア核酸、ウイルス核酸および／又は細菌性核酸が組織試料中に存在する。「核酸」なる用語は、二本鎖の核酸分子の何れか又は両鎖を包含し、原型の核酸分子の任意の断片又は部分を包含する。
【００２３】
「遺伝子」は、タンパク質をコードする又は転写する、あるいは他の遺伝子発現を調節する際に機能的に働く任意の核酸配列又はその一部を意味する。遺伝子は、機能的なタンパク質のコード化を担うすべての核酸又はタンパク質のコードあるいは発現を担う核酸の一部のみを構成してもよい。核酸配列は、エクソン、イントロン、開始領域又は終末領域、プロモータ配列、他の調節配列又は遺伝子に近接する特定の領域内に遺伝的な異常を含有してもよい。
【００２４】
「アミノ酸」および「アミノ酸類(amino acids)」なる用語は、すべて天然に存在するＬ-α-アミノ酸を指す。この定義は、ノルロイシン、オルニチン、およびホモシステインを含むと定める。アミノ酸は、１文字又は３文字表記のどちらかで特定される：
Ａｓｐ    Ｄ    アスパラギン酸      Ｉｌｅ    Ｉ    イソロイシン
Ｔｈｒ    Ｔ    トレオニン          Ｌｅｕ    Ｌ    ロイシン
Ｓｅｒ    Ｓ    セリン              Ｔｙｒ    Ｙ    チロシン
Ｇｌｕ    Ｅ    グルタミン酸        Ｐｈｅ    Ｆ    フェニルアラニン
Ｐｒｏ    Ｐ    プロリン            Ｈｉｓ    Ｈ    ヒスチジン
Ｇｌｙ    Ｇ    グリシン            Ｌｙｓ    Ｋ    リシン
Ａｌａ    Ａ    アラニン            Ａｒｇ    Ｒ    アルギニン
Ｃｙｓ    Ｃ    システイン          Ｔｒｐ    Ｗ    トリプトファン
Ｖａｌ    Ｖ    バリン              Ｇｌｎ    Ｑ    グルタミン
Ｍｅｔ    Ｍ    メチオニン          Ａｓｎ    Ｎ    アスパラギン酸
【００２５】
「単離された」とは、ここで開示された種々のペプチド又はタンパク質を記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離されおよび／又は回収されたペプチド又はタンパク質を意味する。その自然環境の汚染成分とは、タンパク質の診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ペプチド又はタンパク質は、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、Ｎ末端あるいは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるように十分なほど、又は(３)質量分光分析又はペプチドマッピング技術による均一性が得られるように十分なほど精製される。その自然環境の少なくとも一の成分が存在しないため、単離された材料には、組換え細胞内のインサイツのペプチド又はタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたペプチド又はタンパク質は少なくとも一の精製工程により調製される。
【００２６】
ここで同定されている配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法により達成可能であり、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。ここでの目的のために、パーセントアミノ酸配列同一性値は、ジェネンテク社によって作成され、ソースコードは米国著作権庁, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている配列比較コンピュータプログラムALINE-2を用いて得ることができる。ALIGN-2プログラムはジェネンテク社、South San Francisco, CAを通して公的に入手可能である。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
【００２７】
「プライマー」又は「複数のプライマー」なる用語は、相補的なＲＮＡ又はＤＮＡ標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズして、例えばポリメラーゼ連鎖反応で起こるような、ヌクレオチジルトランスフェラーゼの働きによってモノヌクレオチドからポリヌクレオチドの段階的な合成の開始点となるオリゴヌクレオチド配列を指す。
【００２８】
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を称す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、およびリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが知られている。
【００２９】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００３０】
本明細書中で用いられる「標識」なる用語は、核酸プローブや抗体などの試薬に直接的又は間接的にコンジュゲートないしは融合され、コンジュゲートないしは融合した試薬の検出を容易にする化合物又は組成物を指す。標識自体が検出可能なもの(例えば放射性標識又は蛍光性標識)であってもよく、酵素標識の場合、検出可能な基質化合物ないしは組成物の化学的変化を触媒するものであってもよい。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質(「アドヘシン」)の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを結合した抗体様分子を示す。 構造的に、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識および結合部位以外である(すなわち、「異種」である)アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ(ＩｇＡ-１およびＩｇＡ-２を含む)、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭ等の任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【００３２】
「ＤＲ６レセプター抗体」、「ＤＲ６抗体」、又は「抗ＤＲ６抗体」は、ＤＲ６レセプター、好ましくは、配列番号１に示すＤＲ６配列又はその細胞外ドメイン配列等のヒトＤＲ６レセプターの少なくとも一形態に結合する抗体を指すために広義に使用される。場合によっては、ＤＲ６抗体は異種性配列又は分子に融合又は結合される。好ましくは、異種性配列は、抗体がより高次の又はオリゴマー複合体を形成することを許容又は補助する。「抗ＤＲ６抗体」なる用語および文法的に相当する言葉は、特に、後述のＤＲ６モノクローナル抗体を含む。場合によっては、ＤＲ６抗体はＤＲ６レセプターに結合するが、腫瘍壊死因子ファミリーの任意の更なるレセプター(例えばＤＲ４、ＤＲ５、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｆａｓ) と結合又は交差反応をしない。 場合によっては、本発明のＤＲ６抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイで測定した場合、約０．０６７ｎＭから約０．０３３μＭの濃度範囲で、ＤＲ６レセプターに結合する。
【００３３】
「抗ＡＰＰ抗体」、「ＡＰＰ抗体」なる用語および文法的に相当する言葉は、広義に使用され、本明細書に特に記載するＡＰＰポリペプチドイソフォーム等のＡＰＰ、好ましくはヒトＡＰＰの少なくとも一形態に結合する抗体を指すために使用される。好ましくは、ＡＰＰ抗体はＤＲ６アンタゴニスト抗体である。例えば、本願明細書に開示するＤＲ６アンタゴニストを作成および／又は同定する方法において、ＡＰＰおよび／又はそのタンパク質の１又は複数のイソフォームは、動物(例えば、モノクローナル抗体を作成するための方法の一環としてマウス)を免疫化するための免疫原として、および／又は化合物のライブラリー(例えば、組換え抗体ライブラリー)をスクリーニングするためのプローブとして使用されうる。本発明の実施態様で有用である典型的なＡＰＰポリペプチドは、以下の非限定的な例を含む。これら具体的な形態は、本発明のさまざまな実施態様において使用するために選択されうる。本発明のいくつかの実施態様において、ＡＰＰポリペプチドは、それぞれ配列番号３、４および５に示すＡＰＰ６９５および／又はＡＰＰ７５１および／又はＡＰＰ７７０イソフォーム等の全長ＡＰＰイソフォームを含む。本発明の他の実施態様において、ＡＰＰポリペプチドは、ＡＰＰの翻訳後に処理されたイソフォーム、例えば、α分泌酵素、β分泌酵素又はγ分泌酵素等の分泌酵素によって切断を受けたＡＰＰポリペプチド(例えば、ｓＡＰＰα又はｓＡＰＰβ等の可溶性Ｎ末端断片)を含む。本発明の関係する実施態様において、ＡＰＰポリペプチドは、Ｎ末端外部ドメイン(例えば、Quast等, FASEB J. 2003; 17(12):1739-41を参照)、ヘパリン結合ドメイン(例えば、Rossjohn等, Nat Struct Biol. 1999 Apr;6(4):327-31を参照)、銅タイプＩＩ(例えば、Hesse等, FEBS Letters 349(1): 109-116 (1994)を参照)又はクーニッツ(Kunitz)プロテアーゼ・インヒビター・ドメイン(例えば、Ponte等, Nature; 331(6156):525-7 (1988)を参照)のような１又は複数の特異的なドメインを含むように選択されうる。本発明のいくつかの実施態様において、ＡＰＰポリペプチドは、抗体又はＤＲ６イムノアドヘシンのような本明細書で開示されたＤＲ６アンタゴニストによって認識されるエピトープ、例えばＡＰＰ６９５のアミノ酸２２−８１、を含むことが認められた配列、モノクローナル抗体２２Ｃ１１により結合されるエピトープを含む配列(例えば、Hilbich等, Journal of Biological Chemistry, 268(35): 26571-26577 (1993)を参照)を含む。本発明のいくつかの実施態様において、例えば特定のＮ末端又はＣ末端アミノ酸を含まないＡＰＰポリペプチド、クーニッツプロテアーゼ・インヒビター・ドメインを含まないＡＰＰポリペプチド(例えば、ＡＰＰ６９５)、又はアルツハイマーのβアミロイドタンパク質(Ａβ)配列を含まないＡＰＰポリペプチド(例えば、ｓＡＰＰβ、Ａβ４０および／又はＡβ４２配列を含まないポリペプチド) (例えば、Bond等, J. Struct Biol. 2003 Feb;141(2):156-70を参照)のように、ＡＰＰポリペプチドは１又は複数の特定のドメイン又は配列を含まない。本発明の他の実施態様において、本発明の実施態様で使用されるＡＰＰポリペプチドは、１又は複数のドメイン又は配列を含むが、他のドメイン又は配列は含まず、例えば、βアミロイド(Ａβ)配列(例えば、ｓＡＰＰα又はｓＡＰＰβ)のような１��は複数の分泌酵素切断部位について、ＡＰＰポリペプチドはＮ末端外部ドメイン(又は、少なくとも、モノクローナル抗体２２Ｃ１１のようなＤＲ６アンタゴニストにより結合されることが認められるそれらの部分)を含むが、Ｃ末端であるドメイン又は配列を含まない。場合によっては、抗ＡＰＰ抗体はＮ−ＡＰＰポリペプチドのＤＲ６への結合を阻害し、本明細書に記載のように、および／又は定量的細胞ベース結合アッセイで測定した場合、１０μｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌの濃度でＮ−ＡＰＰポリぺプチドに結合する。
【００３４】
ここで「抗体」なる用語は、広い意味で用いられ、特に無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷の抗体から形成した多特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、および所望の生物学的活性を有する限りにおける抗体断片の範囲にわたる。
【００３５】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくはその抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２およびＦｖ断片；ダイアボディ；線形抗体；一本鎖抗体分子；および抗体断片から形成された多特異性抗体が含まれる。
「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖および２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖および重鎖可変ドメイン間のインターフェイスを形成すると考えられている。
【００３６】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性および特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖および重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域又は相補性決定領域と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つの高頻度可変領域により連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖の高頻度可変領域は、ＦＲによって近接して結合され、他の鎖の高頻度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabatら, Sequence of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, BEthesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞媒介性障害活性(ＡＤＣＣ)への抗体の関与を示す。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ')２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
【００３７】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖および一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの３つの高頻度可変領域は相互に作用してＶＨ-ＶＬ二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つの高頻度可変領域が抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つの高頻度可変領域のみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(ＣＨ１)を有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも一つの遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。また、抗体断片の他の化学結合も知られている。
【００３８】
任意の脊椎動物種からの抗体(イムノグロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)およびラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、抗体は異なるクラスが割り当てられる。無傷の抗体には５つの主なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、更にそれらは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２等のサブクラス(イソ型)に分かれる。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。イムノグロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元立体配位はよく知られている。
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、ＦｖポリペプチドはＶＨおよびＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, RosenburgおよびMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
【００３９】
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成が可能であるリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディーは、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公報９３／１１１６１；およびHollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる自然に生じる可能性がある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。更に、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含む従来の(ポリクローナル)抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体はハイブリドーマ培養により合成され、他のイムノグロブリンの混入がないという利点がある。「モノクローナル」との修飾語句は、実質的に均一な抗体の集団から得たものとしての抗体の性質を表すものであり、抗体が何か特定の方法による生成を必要として構築したものであることを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature, 256:495 (1975)に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作ることができる(例えば米国特許第４８１６５６７号を参照のこと)。また「モノクローナル抗体」は、例えば、Clackson等, Nature, 352：624-628 (1991)およびMarks等, J. Mol. biol. 222: 581-597 (1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから作成することもできる。
【００４０】
ここで言うモノクローナル抗体は、特に「キメラ」抗体(免疫グロブリン)を含み、それは特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体が持つ配列に一致する又は類似する重鎖および／又は軽鎖の一部を含むものであり、残りの鎖は、所望の生物学的活性を表す限り、抗体断片のように他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体が持つ配列に一致する又は類似するものである(米国特許第４８１６５６７号；およびMorrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。ここで対象とするキメラ抗体には、非ヒト霊長類(例えば、ヒヒ、アカゲザル又はカニクイザルなどの旧世界サル)由来の可変ドメイン抗原結合配列とヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を含む(米国特許第５６９３７８０号)。
【００４１】
非ヒト(例えばマウス)の抗体の「ヒト化」型は、非ヒトイムノグロブリン(免疫グロブリン)に由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)からの高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。例として、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ヒト免疫グロブリン配列の高頻度可変ループがＦＲのすべて又は実質的にすべてである少なくとも一又は一般的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。また、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の一部、一般的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。更なる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988)；およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。
【００４２】
ここで使用されるところの「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合に寄与する抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は一般には「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基(例えば、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)および８９−９７(Ｌ３)、および重鎖可変ドメインの３１−３５(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)および９５−１０２(Ｈ３)；Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest,５版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))および／又は「高頻度可変ループ」からの残基(例えば、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)および９１−９６(Ｌ３)および重鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｈ２)および９６−１０１(Ｈ３)；ChothiaおよびLesk J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987))を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基はここで定義するように高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
目的の抗原に「結合する」抗体とは、抗体が抗原発現細胞を標的とした治療薬又は診断剤として有用となるように十分な親和性および／又は結合活性を有して抗原に結合することができるものである。
ここでの目的のための「免疫治療」とは、抗体を用いた哺乳動物(好ましくはヒト患者)の治療方法を意味し、この抗体はコンジュゲートされたもの又は「ネイキッド」抗体でもよいし、又は一又は複数の細胞障害性剤などの薬剤やヘテロ分子とコンジュゲート又は融合して、それによって「免疫コンジュゲート」を生成してもよい。
【００４３】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離されおよび／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分は、抗体の診断又は治療への使用を妨害しうる物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様においては、抗体は、(１)ローリー(Lowry)法により定量して、抗体が９５重量％より多くなるほど、最も好ましくは９９重量％より多くなるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、Ｎ末端あるいは内部アミノ酸配列の少なくとも１５の残基を得るのに十分な程度まで、あるいは、(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるように十分な程度まで精製される。抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
ここで使用される場合の「タグ化」なる用語は、「タグポリペプチド」に融合した、抗体、又はポリペプチドを含有するキメラ分子を称す。タグポリペプチドは、その抗体が産生するエピトープを提供するか、又はオリゴマー化(例えば、ロイシンジッパードメインを有するペプチドと生じるような)等の他のいくつかの機能を提供するのに十分な残基を有しているが、その長さは、一般的に抗体又はポリペプチドの活性を阻害しないよう十分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、タグ特異性抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０のアミノ酸残基)を有する。
【００４４】
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを表す。好適なＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(γレセプター)に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIおよびＦｃγＲIIIサブクラスのレセプターを含むものであり、これらのレセプターの対立遺伝子変異体および選択的スプライシング型を含む。ＦｃγＲIIレセプターは、ＦｃγＲIIＡ(「活性化レセプター」)およびＦｃγＲIIＢ(「阻害レセプター」)を含み、それらは、主としてその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲIIＡは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース活性化モチーフ(ＩＴＡＭ)を有する。阻害レセプターＦｃγＲIIＢは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース阻害モチーフ(ＩＴＩＭ)を有する(Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234(1997)参照)。ＦｃＲはRavetchおよびKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capelら, Immunomethods 4:25-34 (1994)；およびde Haasら, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)において概説されている。将来同定されるものも含む他のＦｃＲが、ここにおける「ＦｃＲ」なる用語によって包含される。この用語は胎児への母性ＩｇＧの移動の原因である新生児レセプター、ＦｃＲｎもまた含む(Guyerら, J. Immumol. 117:587 (1976)およびKimら, J. Immunol. 24:249 (1994))。本明細書中のＦｃＲはＦｃγＲIIIａをコードする遺伝子内に遺伝的二形性などの多型を含有し、それによってＩｇＧ１に結合するレセプターの領域内に位置するアミノ酸位置１５８がフェニルアラニン(Ｆ)又はバリン(Ｖ)となる。ホモ接合体バリンＦｃγＲIIIａ(ＦｃγＲIIIａ-１５８Ｖ)は、ホモ接合体フェニルアラニンＦｃγＲIIIａ(ＦｃγＲIIIａ-１５８Ｆ)又はヘテロ(ＦｃγＲIIIａ-１５８Ｆ／Ｖ)レセプターと比較してインビトロでのＡＤＣＣ媒介を増加し、ヒトＩｇＧ１に対する親和性も高いことが示された。
【００４５】
ここで使用される場合の「ポリオール」という用語は広義に多価アルコール化合物を意味する。ポリオールは例えば任意の水可溶型ポリ(アルキレンオキシド)ポリマーであり得、直鎖又は分枝鎖を有しうる。好適なポリオールには、一又は複数のヒドロキシル位置に化学基、例えば１から４の炭素を有するアルキル基が置換されているものが含まれる。典型的には、ポリオールはポリ(アルキレングリコール)、好ましくはポリ(エチレングリコール)(ＰＥＧ)である。しかし、当業者であれば、他のポリオール、例えばポリ(プロピレングリコール)およびポリエチレン−ポリプロピレングリコールコポリマーを、ここでＰＥＧについて記載した抱合技術を使用して用いることができることが分かるであろう。ポリオールには当該分野でよく知られたものおよび公的に入手可能なもの、例えばNectar(登録商標) Corporationといった商業的に利用可能な供給源からのものが含まれる。
「抱合(コンジュゲート)」という用語は、ここではその最も広い定義で使用され、共に接合(joined)又は結合(linked)されていることを意味する。分子は、接合されているように作用又は機能する場合、「抱合」されている。
【００４６】
「有効量」という用語は、問題の疾患又は症状を予防、寛解又は治療するのに効果的な薬剤(例えば、ＤＲ６アンタゴニスト)の量を意味する。本発明のＤＲ６アンタゴニストは、樹状突起棘の密度およびＰＳＤ−９５の貯留の促進に有用であると考えられる。
ここで使用される「処置する」又は「処置」又は「治療」とは、治癒的治療、予防的治療又は防止的治療を称する。連続的治療又は投与とは、一又は複数の日数、治療を中断することなく、少なくとも毎日であることを基本とし治療を行うことを称する。断続的治療又は投与、もしくは断続的な方法での治療又は投与とは、連続させることなく、むしろ本質的には周期的に治療することを称する。
ここで使用される場合、「疾患」なる用語は、本明細書に記載のＤＲ６アンタゴニストによる治療により利益を得る任意の症状を指す。これには、慢性および急性の疾患、並びに問題の疾患に哺乳動物を罹患させやすくする病理状態が含まれる。
【００４７】
「神経細胞又は組織」は、通常、運動ニューロン、非限定的に交連ニューロンを含む介在ニューロン、非限定的に後根神経節ニューロンを含む感覚ニューロン、黒質のドーパミン(ＤＡ)ニューロン、線条体ＤＡニューロン、皮質ニューロン、脳幹ニューロン、脊椎介在ニューロンおよび運動ニューロン、非限定的に海馬のＣＡＩ錐体ニューロンを含む海馬ニューロン、および前脳ニューロンを指す。神経細胞又は組織なる用語は、本明細書において細胞体、軸索および樹状突起からなる神経細胞、および当該神経細胞の一部分を形成してもよい軸索又は樹状突起を指すことを意図する。
「精神的障害」は、統合失調症および嗜癖のような疾患を含む状態を指すためにここで用いる。「認知障害」は、自閉症、トゥレット症候群、レット症候群、および脆弱Ｘ症候群精神障害のような疾患を含む。
【００４８】
「被検体」又は「患者」は、ヒトを含む、治療が望まれる任意の単一の被検体を意味する。また、臨床試験に用いられる疾患の臨床的な特徴を全く示さない任意の被検体、又は疫学的な研究に用いられる被検体、又はコントロールとして用いられる被検体も被検体に含まれる。
本明細書中で用いられる「哺乳動物」なる用語は、哺乳動物と分類される任意の哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ウマ、イヌおよびネコを意味する。本発明の好適な実施態様では、哺乳動物がヒトである。
【００４９】
化学的シナプスはニューロンと連結し、情報の処理と貯蔵をすることができる機能的回路を形成する。適切な機能の喪失又はこれらの連結の安定性は、多くの精神的障害および認知障害の基礎をなすと考えられる。樹状突起棘の喪失又は樹状突起棘の不安定、およびＰＳＤ−９５のような樹状突起棘関連タンパク質の変更が、レット症候群、トゥレット症候群、統合失調症、自閉症、嗜癖および脆弱Ｘ症候群といった疾患と関係していると考えられている。
驚くべきことに、出願人は、ＴＮＦＲファミリーの一員であるＤＲ６が、脊髄の大脳皮質、海馬、運動ニューロンおよび介在ニューロンを含む胚のおよび成体の中枢神経系において、高度に発現することを発見した。下の実施例に記載するように、出願人は、生体内でのシナプス安定性におけるＤＲ６の役割を調査するために、さまざまな実験分析を行った。
【００５０】
出願人はさらに、一部のアミロイド前駆体タンパク質(Ｎ−ＡＰＰ)がＤＲ６レセプターの同族リガンドであるので、ＡＰＰもシナプス安定性での役割があると仮定する。Bittner, et al. (Bittner, T., et al. (2009) J. Neurosci. 29(33): 10405-10409)による最近の論文において、著者は、樹状突起棘密度がＡＰＰ＋／−において野生型マウスより高く、ＡＰＰ−／−マウスにおいてさらに高いことを示した。アミロイド前駆体タンパク質は、アルツハイマー病において、完全ではないがいくらか役割があることが既に仮定されている(Selkoe, J. Biol. Chem. 271:18295 (1996)；Scheuner; et al., Nature Med. 2: 864 (1996)；Goate, et al., Nature 349:704 (1991))。
ＤＲ６および／またはＡＰＰインヒビターが様々な精神的および認知障害を治療する際に特に有用であると考えられている。このようなインヒビターは、また、加齢の間の認知を向上させる又は認知を維持する際に有用となりうる。
【００５１】
したがって、本発明は、ＤＲ６および／またはＡＰＰアンタゴニスト組成物、およびＤＲ６および／またはＡＰＰアンタゴニストの有効量の投与を含む哺乳動物のＤＲ６および／またはＡＰＰの活性を阻害するか、遮断するかまたは、中和する方法を提供する。好ましくは、使用したＤＲ６および／またはＡＰＰアンタゴニストの量は、樹状突起棘の密度を促し、健康なシナプスを維持するのに有効な量であろう。また、使用されるアンタゴニストの量は、樹状突起棘におけるＰＤＳ−９５の発現を増やすかまたは貯留を向上しうる。場合によって、ＤＲ６および／またはＡＰＰアンタゴニストと併せて又はとは別に、ｐ７５のアンタゴニストを使用することが有益となりうる。
この方法に使用されうるＤＲ６アンタゴニストは、ＤＲ６および／又はＡＰＰイムノアドヘシン、ＤＲ６および／又はＡＰＰを含む融合タンパク質、ＤＲ６および／ＡＰＰの共有結合修飾形態、ＤＲ６および／又はＡＰＰ変異体、その融合タンパク質、およびＤＲ６および／又はＡＰＰ抗体を含むが、これらに限定されるものではない。この方法に使用されうるｐ７５アンタゴニストは、ｐ７５イムノアドヘシン、ｐ７５を含む融合タンパク質、ｐ７５の共有結合修飾形態、ｐ７５変異体、その融合タンパク質、およびｐ７５抗体を含むが、これらに限定されるものではない。抗ｐ７５抗体は当分野で公知であってよい。ｐ７５のタンパク質配列は配列番号：６として示す。アンタゴニストを作製するために行われうる様々な技術を本明細書中に記載する。例えば、ＤＲ６、ｐ７５およびＡＰＰポリペプチドを調製するための方法および技術が記載される。また、ＤＲ６、ｐ７５およびＡＰＰポリペプチドの更なる修飾、およびＤＲ６、ｐ７５およびＡＰＰに対する抗体も記載される。
【００５２】
本明細書で開示される本発明は多くの実施態様を有する。本発明は、ＤＲ６のＡＰＰへの結合が阻害される条件下で、１又は複数のＤＲ６アンタゴニストにＤＲ６ポリペプチドおよび／又はＡＰＰポリぺプチドを暴露することを含む、ＤＲ６のＡＰＰへの結合を阻害する方法を提供する。本発明の関係する実施態様は、配列番号１のアミノ酸１−６５５を含むＤＲ６ポリペプチドと配列番号３のアミノ酸６６−８１を含むＡＰＰポリペプチド(例えば、ｓＡＰＰβ)の結合を阻害する方法であり、ＤＲ６ポリペプチドおよびＡＰＰポリペプチドをＤＲ６又はＡＰＰを結合する単離されたアンタゴニストと組合わせることを含む方法であって、単離されたアンタゴニストは、ＡＰＰを結合する抗体、ＤＲ６を結合する抗体、および配列番号１のアミノ酸１−３５４を含む可溶性ＤＲ６ポリペプチドの少なくとも１つから選択され、単離されたアンタゴニストはＤＲ６とＡＰＰの結合を阻害する能力により選択されることを含んでなり、それによりＤＲ６のＡＰＰへの結合が阻害される方法を提供する。
また、本発明は、ＤＲ６およびｐ７５のＡＰＰへの結合が阻害される条件下で、１又は複数のＤＲ６アンタゴニストおよび一又は複数のｐ７５アンタゴニストにＤＲ６ポリペプチド、ｐ７５ポリペプチドおよび、場合によってＡＰＰポリぺプチドを暴露することを含む、ＤＲ６のＡＰＰへの結合を阻害し、ｐ７５のＡＰＰへの結合を阻害する方法を提供する。本発明の関係する実施態様は、配列番号１のアミノ酸１−６５５を含むＤＲ６ポリペプチドと配列番号３のアミノ酸６６−８１を含むＡＰＰポリペプチド(例えば、ｓＡＰＰβ)の結合を阻害する方法であり、ＤＲ６ポリペプチドおよびＡＰＰポリペプチドをＤＲ６又はＡＰＰを結合する単離されたアンタゴニスト、およびｐ７５を結合するアンタゴニストと組合わせることを含む方法であって、単離されたＤＲ６アンタゴニストは、ＡＰＰを結合する抗体、ＤＲ６を結合する抗体、および配列番号１のアミノ酸１−３５４を含む可溶性ＤＲ６ポリペプチドの少なくとも１つから選択され、単離されたＤＲ６アンタゴニストはＤＲ６とＡＰＰの結合を阻害する能力により選択されることを含んでなり、それによりＤＲ６のＡＰＰへの結合が阻害される、方法を提供する。単離されたｐ７５アンタゴニストは、ｐ７５を結合する抗体、およびｐ７５の細胞外ドメインのアミノ酸(例えば配列番号：６のアミノ酸２９−２５０)を含む可溶性ｐ７５ポリペプチドの少なくとも１から選択され、単離されたｐ７５アンタゴニストは、ｐ７５およびＡＰＰの結合を阻害する能力について選別され、その結果ｐ７５のＡＰＰへの結合が阻害される。
【００５３】
当該方法では、場合によっては、１又は複数のＤＲ６アンタゴニストが、ＤＲ６を結合する抗体(例えば、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ-８０９５、ＰＴＡ-８０９４、又はＰＴＡ-８０９６として寄託されているハイブリドーマ細胞株により製造される、それぞれ、３Ｆ４．４．８、４Ｂ６．９．７、又は１Ｅ５．５．７モノクローナル抗体の結合を競合的に阻害するＤＲ６を結合する抗体)、配列番号１のアミノ酸配列１−３５４を含む可溶性ＤＲ６ポリペプチド(例えば、ＤＲ６イムノアドヘシン)、又はＡＰＰを結合する抗体(例えば、モノクローナル抗体２２Ｃ１１)から選択される。本発明のある実施態様では、ＤＲ６アンタゴニストは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールおよびポリオキシアルキレンからなる群から選択される１又は複数の非タンパク性ポリマーに結合されるＤＲ６を結合する抗体、ＡＰＰを結合する抗体又は可溶性ＤＲ６ポリペプチドである。また、ｐ７５アンタゴニストは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールおよびポリオキシアルキレンからなる群から選択される１又は複数の非タンパク性ポリマーに結合しうる。
【００５４】
これらの方法の任意の実施態様では、ＤＲ６ポリペプチドは、単独又はｐ７５ポリペプチドと併せて、１又は複数の哺乳動物の細胞(例えば、交連ニューロン細胞、感覚ニューロン細胞又は運動ニューロン細胞)の細胞表面上で発現し、当該１又は複数のＤＲ６アンタゴニストおよび／またはｐ７５アンタゴニストの結合はＤＲ６活性化又はシグナル伝達および／またはｐ７５活性化又はシグナル伝達を阻害する。
本発明の更なる実施態様では、ＤＲ６、場合によってはｐ７５のＡＰＰへの結合を阻害する方法は、精神的な状態又は障害あるいは認知障害を有する哺乳動物において生体内で実施されてよい。場合によって、精神的な状態又は障害は統合失調症又は嗜癖である。あるいは、認知状態又は障害は、トゥレット症候群、レット症候群、脆弱Ｘ症候群又は自閉症を含む。
本発明の更なる実施態様は、有効量の一又は複数のＤＲ６アンタゴニスト単独あるいは一又は複数のｐ７５アンタゴニストとの併用を哺乳動物に投与することを含む、状態又は障害を有する哺乳動物の治療方法を提供する。一般的にこのような方法では、一又は複数のＤＲ６アンタゴニストは、ＤＲ６を結合する抗体、配列番号１のアミノ酸１−３５４を含む可溶性ＤＲ６ポリペプチド、ＤＲ６イムノアドヘシンおよびＡＰＰを結合する抗体から選択される。一又は複数のｐ７５アンタゴニストは、ｐ７５を結合する抗体、ｐ７５イムノアドヘシン、および配列番号６のアミノ酸２９−２５０を含む可溶性ｐ７５ポリペプチドから選択される。本発明の任意の実施態様では、前記状態又は障害は、自閉症、脆弱Ｘ症候群、レット症候群、トゥレット症候群、嗜癖および統合失調症である。本発明の様々な実施態様では、一又は複数の他の治療剤が前記哺乳動物に投与される。本発明のある例示的な実施態様では、前記の一又は複数の他の治療剤は、ＮＧＦ、アポトーシスインヒビター、ＥＧＦＲインヒビター、β分泌酵素インヒビター、γ分泌酵素インヒビター、コリンエステラーゼインヒビター、抗Ａβ抗体およびＮＭＤＡレセプターアンタゴニストから選択される。場合によって、一又は複数のＤＲ６アンタゴニスト、ｐ７５アンタゴニストおよび／または他の治療剤が、注射、注入又は灌流により哺乳動物に投与される。
【００５５】
ここに開示される完全長天然配列ＤＲ６、ｐ７５およびＡＰＰポリペプチドに加え、ＤＲ６、ｐ７５およびＡＰＰポリペプチド変異体が調製可能であることも考慮される。ＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰ変異体は、コード化ＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入すること、および／又は所望のポリペプチドを合成することにより調製できる。本技術分野の当業者が周知のように、例えばグリコシル化部位の数又は位置の変化、或いは膜固着特性の変更等のアミノ酸変化により、ＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰポリペプチドの翻訳後のプロセスが変化し得る。
ここに開示されるＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰポリペプチドの変異形態を、例えば米国特許第５３６４９３４号に記載されているような保存的および非保存的突然変異のための技術およびガイドのいずれかを用いて作成することができる。変異とは、天然配列ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を生じさせるような、ポリペプチドをコードする１以上のコドンを置換、削除又は挿入することであってよい。場合によっては、少なくとも１つのアミノ酸を置換し、それ以外のアミノ酸がＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰポリペプチドの１以上のドメインにあると変異となる。所望の活性に逆効果を与えることなく、どのアミノ酸残基を挿入、置換又は削除したらよいかの判断は、ＤＲ６、ｐ７５および／またはＡＰＰポリペプチドの配列を既知の相同なタンパク質の配列と比較し、相同性の高い領域においてはアミノ酸配列の変更数を最小限にすれば指標となる。アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を同様の構造および／又はキメラ特性を有する別のアミノ酸で置き換えること、例えばロイシンをセリンに置き換える、つまり保存的なアミノ酸の置き換えとしてよい。場合によっては、挿入又は削除は約１−５のアミノ酸の範囲で行われる。可能な変異は、配列中のアミノ酸を体系的に挿入、削除又は置換し、ＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰアンタゴニスト活性に関して結果的に生じる変異を試験することにより決定できる。
【００５６】
ここにＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰポリペプチド断片が提供される。そのような断片は、完全長天然タンパク質と比較したとき、例えば、Ｎ末端又はＣ末端で切断されているか、又は内部残基を欠損している。一部の断片は所望のＤＲ６ポリペプチドの生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
ＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰポリペプチド断片は、多数の従来技術のいずれかにより調製できる。所望のペプチド断片を化学的に合性することができる。別の方法では、酵素消化、例えば特定のアミノ酸残基によって画定される部位においてタンパク質を切断することが知られている酵素を用いてタンパク質を処理すること、又は適切な制限酵素を用いてＤＮＡを消化し、所望の断片を単離することにより、ポリペプチド断片を生成する。また別の適切な技術では、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により所望のポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片の単離と増幅を行う。ＰＣＲにおいて、ＤＮＡ断片の所望の終端を画定するオリゴヌクレオチドを５'および３'プライマーが使用される。
【００５７】
特定の実施態様における、対象となる保存的置換を以下の表の好ましい置換の欄に示す。このような置換の結果生物学的活性が変化すれば、表の例示的置換の欄に示した置換、又はアミノ酸の分類に関して後述するような置換をさらに導入し、産出物をスクリーニングする。
表
2013510871.tif 000003
ＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰポリペプチドの機能又は免疫学的同一性の実質的な修飾は、(a) 置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又はヘリックス構造、(b) 標的部位における分子の電荷又は疎水性、又は(c) 側鎖の嵩の維持に対して大きく効果を異にする置換基を選択することにより達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる。
(1) 疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
(2) 中性の親水性：cys, ser, thr;
(3) 酸性：asp, glu;
(4) 塩基性：asn, gln, his, lys, arg;
(5) 鎖配向に影響する残基：gly, pro; および
(6) 芳香族：trp, tyr, phe
【００５８】
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。このようにして置換された残基も、保存的置換部位、又はさらに好ましくは残りの(非保存的)部位に挿入することができる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介(部位特異的)変異、アラニンスキャンニング、およびＰＣＲ変異などの、この分野で知られた方法を用いて行うことができる。部位特異的変異［Carter等, Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)］、カセット変異［Wells等, Gene, 34:315 (1985)］、制限選択変異［Wells等, Philos. Trans.R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)］又は他の周知の技術などをクローニングされたＤＮＡに対して行ってＤＲ６ポリペプチド変異ＤＮＡを生産することができる。
【００５９】
また、隣接する配列に沿って１つ又は複数のアミノ酸を同定するのに、スキャニングアミノ酸分析も用いることができる。好ましいスキャニングアミノ酸は、比較的小さい中性のアミノ酸である。このようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、およびシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し、変異体の主鎖高次構造を変える可能性が低いので、これらの群の中の典型的に好適なスキャンニングアミノ酸である[CunninghamおよびWells, Science, 244:1081-1085(1989)]。また、アラニンは、最も普通のアミノ酸であるので典型的に好ましい。さらに、隠れたおよび露出した位置の両方で頻繁に見いだされる［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)］。アラニン置換が適当な量の変異を生じない場合、アイソテリック(isoteric)なアミノ酸を用いることができる。
また、ＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰポリペプチドの適当な構造を維持するのに関与しない任意のシステイン残基は、通常、セリンで置換することで、分子の酸化的安定性を向上させ、異常な架橋を防ぐことができる。逆に、システイン結合をＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰポリペプチドに付加することにより、その安定性を向上させることができる。
【００６０】
本願明細書で開示される発明の実施態様は、幅広くさまざまなＡＰＰポリペプチドに適用する。例えば、本発明のいくつかの実施態様において、ＡＰＰはそれぞれ配列番号３−５に示す全長６９５、７５０又は７７０ＡＰＰイソフォームである。本発明の他の実施態様において、ＡＰＰは、ＡＰＰ外部ドメインを有するＡＰＰのｎ末端部分を含み、翻訳後のプロセッシングイベントから生成される(例えば、ｓＡＰＰα又はｓＡＰＰβ)。例えば、場合によっては、ＡＰＰは、分泌酵素による切断の結果として生じる６９５、７５０又は７７０ＡＰＰイソフォームの一つの可溶型、例えばβ分泌酵素による切断により生じる神経ＡＰＰ６９５の可溶型を含んでもよい。特定の例示的実施態様において、ＡＰＰはＡＰＰ６９５のアミノ酸２０−５９１を含む(例えば、Jin等, J. Neurosci., 14(9): 5461-5470 (1994)を参照)。本発明の別の実施態様において、ＡＰＰはモノクローナル抗体２２Ｃ１１(例えば、Chemicon International Inc., Temecula, CA, U.S.A.より入手可能)により認識されるエピトープを有するポリペプチドを含む。場合によっては、ＡＰＰは、ＡＰＰ６９５の２２Ｃ１１エピトープを含む領域である残基６６−８１を含む(例えば、Hilbrich, J.B.C. Vol. 268, No. 35: 26571-26577 (1993)を参照)。
【００６１】
以下の説明は、主として、ＤＲ６、ｐ７５および／またはＡＰＰポリペプチドコード化核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによるＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰポリペプチドの生産に関する。勿論、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰポリペプチドを調製することができると考えられている。例えば、適切なアミノ酸配列、又はその一部分を、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生成してもよい［例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., サンフランシスコ, カリフォルニア(1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動技術を使用することによって又は自動によりインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機(フォスター  シティー, カリフォルニア)を用いて、製造者の指示によって実施してもよい。ＤＲ６および／又はＡＰＰポリペプチドの種々の部分を別々に化学的に合成し、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて所望するＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰポリペプチドを生成させてもよい。
開示される方法および技術は、ＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰ変異体、ＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰおよびＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰ抗体の修飾形態にも同様に適用可能である。
【００６２】
ＤＲ６および／又はＡＰＰポリペプチドをコードするＤＮＡの単離
ＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰポリペプチドをコードするＤＮＡは、ＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰポリペプチドｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。従って、ヒトＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰポリペプチドＤＮＡは、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから簡便に得ることができる。またＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰポリペプチド-コード化遺伝子は、ゲノムライブラリーから又は公知の合成方法(例えば、自動核酸合成法)により得ることもできる。
ライブラリーは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(少なくとも約２０〜８０塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(ニューヨーク: コールド  スプリング  ハーバー研究所出版, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。ＤＲ６ポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の方法は、ＰＣＲ法を使用するものである［Sambrook等,上掲；Dieffenbach等, PCR Primer：A Laboratory Manual(コールド  スプリング  ハーバー研究所出版, 1995)］。
【００６３】
ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための技術は、当該分野で良く知られている。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、疑陽性が最小化されるよう十分な長さであり、十分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリー内のＤＮＡとのハイブリダイゼーション時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識ＡＴＰのような放射性標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用を含む。中程度のストリンジェンシーおよび高度のストリンジェンシーを含むハイブリダイゼーション条件は、上掲のSambrook等に示されている。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、GenBankらの公共データベース又は他の個人の配列データベースに寄託され利用可能となっている他の周知の配列と比較およびアラインメントすることができる。分子の決定された領域内の又は完全長配列に渡っての(アミノ酸又はヌクレオチドレベルのいずれかでの)配列同一性は、当該分野で知られ、ここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されていないｍＲＮＡの生成中間体および先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸長法を使用して、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。
【００６４】
宿主細胞の選択および形質転換
宿主細胞を、ここに記載したＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰポリペプチド生成のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に修正された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、および実際の技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)および上掲のSambrook等に見出すことができる。
真核生物細胞形質移入および原核生物細胞形質転換の方法、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介およびエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315(1983)および1989年6月29日公開の国際公開89/05859に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Grahamおよびvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が用いられる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4399216号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van Solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)およびHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞との細菌プロトプラスト融合、又は例えばポリブレン、ポリオルニチン等のポリカチオンもまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)および Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【００６５】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物には、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性微生物、例えば大腸菌のような腸内細菌科が含まれる。種々の大腸菌株が公に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)；大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１５３７)；大腸菌株Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)およびＫ５７７２(ＡＴＣＣ５３６３５)である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌属、例えば大腸菌(E. coli)、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えばネズミチフス菌(Salmonella Typhimurium)、セラチア、例えばセラチア・マルセサンス(Serratia marcescans) 、および赤痢菌、並びに桿菌、例えばバチルス・スブチルス(B. subtilis)およびバチルス・リチェニフォルミス(B. licheniformis)(例えば、1989年4月12日公開のＤＤ２６６７１０に記載されたバチルス・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス、例えば緑膿菌およびストレプトマイセス、などの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生成物発酵のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０を、宿主にとって内因性のタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子変異をもたらすように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  (ａｒｇＦ−ｌａｃ)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｋａｎrを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７(ＡＴＣＣ  ５５，２４４)；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  (ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７  ｉｌｖＧ  ｋａｎrを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；および1990年8月7日発行の米国特許第4946783号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。
【００６６】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＤＲ６ポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)(BeachおよびNurse, Nature, 290: 140 [1981]；1985年5月2日公開の欧州特許第139383号)；クリュイベロミセス宿主(Kluyveromyces hosts)(米国特許第4943529号; Fleer等, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991))、例えばクリュイベロミセスラクチス(K. lactis)(MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等, J. Bacteriol., 154(2): 737-742 [1983])、クリュイベロミセス・フラギリス(K. fragilis)(ＡＴＣＣ１２４２４)、クリュイベロミセス・ブルガリクス(K. bulgaricus)(ＡＴＣＣ１６０４５)、クリュイベロミセス・ウィケラミイ(K. wickeramii)(ＡＴＣＣ２４１７８)、クリュイベロミセス・ワルチイ(K. waltii)(ＡＴＣＣ５６５００)、クリュイベロミセス・ドロソフィラルム(K. drosophilarum)(ＡＴＣＣ３６９０６； Van den Berg等, Bio/Technology, 8: 135 (1990))、クリュイベロミセス・テモトレランス(K. thermotolerans)およびクリュイベロミセス・マルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)(欧州特許第402226号)；ピシア・パストリス(Pichia pastoris)(欧州特許第183070号； Sreekrishna等, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988])；カンジダ；トリコデルマ・レーシア(Trichoderma reesia)(欧州特許第244234号)；アカパンカビ(Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979])；シュワニオマイセス(Schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)(1990年10月31日公開の欧州特許第394538号)；および糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)(1991年1月10日公開の国際公開91/00357)；およびアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルス・ニダランス(Ballance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]；Tilburn等, Gene, 26: 205-221 [1983]；Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984])およびアスペルギルス・ニガー(KellyおよびHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985])が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(Ｃ１化合物資化性、Methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピシア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、およびロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されたメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
【００６７】
グリコシル化ＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物由来のものである。非脊椎動物細胞の例には、植物細胞、例えば綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマトおよびタバコの細胞培養と同様に、ショウジョウバエＳ２およびヨトウ(spodoptera)Ｓｆ９等の昆虫細胞が含まれる。多くのバキュロウイルス株および変異体、およびヨトウガ(Spodoptera frugiperda)(幼虫(caterpillar))、ネッタイシマカ(蚊)、ヒトスジシマカ(蚊)、キイロショウジョウバエ(ショウジョウバエ)、およびカイコ等の宿主に対応する許容性昆虫宿主細胞が同定されている。種々のトランスフェクション用のウィルス株、例えばオートグラファ・カルフォルニカ(Autographa californica)ＮＰＶのＬ−１変異株、カイコＮＰＶのＢｍ-５株が公に入手でき、このようなウィルスは、本発明に係るウィルスとして、特に、ヨトウガ細胞のトランスフェクションのために使用してもよい。
しかし、最大の関心は脊椎動物細胞に向けられ、培養(組織培養)した脊椎動物細胞の増殖がルーチン作業となった。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０(ＣＯＳ-７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１)で形質転換させたサル腎ＣＶ１細胞株；ヒト胚芽腎細胞株(２９３又は懸濁培養で成長するようにサブクローン化された２９３細胞，Graham等,J.Gen Virol.,36:59(1977))；ベビーハムスター腎細胞(ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チヤイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ，Urlaub等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216 (1980))；マウスセルトリ細胞(ＴＭ４，Mather,Biol.Reprod.,23：243-251 (1980))；サル腎細胞(ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザル腎細胞(ＶＥＲＯ-７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト頚管腫瘍細胞(ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞(ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞(ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞(Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞(Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞(ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝臓癌細胞(ＨｅｐＧ２)である。
宿主細胞は、ＤＲ６および／又はＡＰＰポリペプチド生成のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘発し、形質転換体を選出し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に修正した通常の栄養培地で培養される。
【００６８】
複製可能なベクターの選択および使用
ＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰポリペプチドをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列を含む。これらの成分の１つ又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
ＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰは組換え手法によって直接産生されるだけではなく、シグナル配列、あるいは成熟タンパク質ないしポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである、異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても産生される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰポリペプチド-コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)およびクリュイベロミセス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5010182号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行の欧州特許第362179号)、又は1990年11月15日に公開された国際公開90/13646に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【００６９】
発現およびクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母およびウイルスについてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現およびクローニングベクターは、典型的には、選択マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a) アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b) 栄養要求性欠陥を補い、又は(c) 例えばバチルスのＤ-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子などの、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質、をコードする。
【００７０】
哺乳動物細胞に適切な選択マーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、ＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰポリペプチド-コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcomb等, Nature, 282: 39(1979)；Kingsman等, Gene, 7: 141(1979)；Tschemper等, Gene, 10: 157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファンで成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
発現およびクローニングベクターは、通常、ＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰポリペプチド-コード化核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を方向付けるプロモーターを含む。種々の有能な宿主細胞により認識されるプロモーターが知られている。原核生物宿主との使用に適したプロモーターはβ-ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系［Chang等, Nature, 275:615 (1978)；Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980)；欧州特許第36,776号］、およびハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモーターもまたＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰポリペプチドをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(Ｓ.Ｄ.)配列を有する。
【００７１】
酵母宿主との使用に適したプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17: 4900(1978)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸フォスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモーターは欧州特許第７３６５７号に更に記載されている。
【００７２】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰポリペプチド転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開の英国特許第2211504号)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルスおよびサルウィルス４０(ＳＶ４０)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、およびヒートショックプロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
より高等の真核生物によるＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテインおよびインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサーおよびアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰポリペプチドコード化配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
【００７３】
また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５'、時には３'の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、ＤＲ６ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰポリペプチドの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクターおよび宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981)；Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979)；欧州特許第117060号；および欧州特許第117058号に記載されている。
【００７４】
宿主細胞の培養
本発明のＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰポリペプチドを生成するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((MEM),シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)およびダルベッコの改良イーグル培地((DMEM),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第4767704号；同4657866号；同4927762号；同4560655号；又は同5122469号；国際公開第90/03430号；国際公開第87/00195号；又は米国特許再発行第30985号に記載された任意の培地も宿主細胞に対する培養培地として使用できる。これらの培地はいずれも、ホルモンおよび／又は他の増殖因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は上皮増殖因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオシド(例えばアデノシンおよびチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシン(商品名)薬)、微量元素(マイクロモル範囲の最終濃度で通常は存在する無機化合物として定義される)およびグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【００７５】
遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅および／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリダイゼーションによって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。ついで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果、表面での二本鎖の形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量化する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色および細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色および／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＤＲ６ポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＲ６配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＤＲ６ ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【００７６】
ＤＲ６ポリペプチドの精製
ＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰポリペプチドの様々な形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)を用いて又は酵素的切断により膜から引き離すことができる。ＤＲ６ポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
ＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰポリペプチドは、組換え細胞タンパク質又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィ；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；およびＤＲ６および／又はＡＰＰポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, ニューヨーク (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生成方法および特に生成される特定のＤＲ６ポリペプチドの性質に依存する。
【００７７】
ＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰの可溶性型を本方法においてＤＲ６アンタゴニストまたはｐ７５アンタゴニストとして使用することができる。このようなＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰの可溶性型は、以下に示すような変形を含む(イムノグロブリン、エピトープタグ又はロイシンジッパーへの融合によるものなど)。イムノアドヘシン分子は、ここに開示の方法におけるさらなる使用が考慮される。ＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰイムノアドヘシンは、完全長ポリペプチド、並びに可溶性の、細胞外ドメイン型又はその断片のような、ＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰの様々な形態を含んでもよい。ある実施態様において、分子は、ＤＲ６ポリペプチドと免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定の領域との融合体を含んでもよい。イムノアドヘシンの二価の形体に対して、そのような融合は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対して行われてもよい。Ｉｇ融合は、好適には、Ｉｇ分子の少なくとも１の可変領域に代えて、ポリペプチドの可溶性型(膜貫通ドメイン欠失又は不活性化型)で置換することを含む。特に好適な実施態様において、イムノグロブリンの融合は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む。イムノグロブリン融合体の生産については、1995年6月27日発行の米国特許第5,428,130号、およびChamow等, TIBTECH, 14:52-60(1996)も参照のこと。
随意的なイムノアドヘシン設計は、アドヘシン(例えばＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰ外部ドメイン)の結合ドメインと免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域を組み合わせる。通常、本発明のイムノアドヘシンを調整する場合、アドヘシンの結合ドメインをコードする核酸をＣ末端でイムノグロブリン定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸に融合させるが、Ｎ末端融合は不可能である。
【００７８】
典型的には、そのような融合において、コード化されるキメラポリペプチドは免疫グロブリン重鎖の定常ドメインの機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを保持する。融合はまた定常ドメインのＦｃ領域のＣ末端、又は重鎖のＣＨ１又は軽鎖の対応する領域にＮ末端に直ぐになされる。融合がなされる正確な部位は重要なものではない；特定の部位がよく知られており、イムノアドヘシンの生物活性、分泌、又は結合特性を最適化するために選択されうる。
好ましい実施態様では、アドヘシン配列が免疫グロブリンＧ１(ＩｇＧ１)のＦｃ領域のＮ末端に融合される。アドヘシン配列に重鎖定常領域全体を融合させることができる。しかし、より好ましくは、ＩｇＧのＦｃを化学的に定めるパパイン切断部位の直ぐ上流のヒンジ領域に始まる配列(すなわち、重鎖定常領域の最初の残基を１１４として残基２１６)、又は他の免疫グロブリンの類似部位が融合において使用される。特に好適な実施態様では、アドヘシンアミノ酸配列はＩｇＧ重鎖の(a)ヒンジ領域およびＣＨ２およびＣＨ３又は(b)ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに融合される。
【００７９】
二重特異的イムノアドヘシンについては、イムノアドヘシンは多量体として、特にヘテロ二量体又はヘテロ四量体として組み立てられる。一般には、これらの組み立てられた免疫グロブリンは既知の単位構造を有している。基本的な四鎖構造単位はＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＥが存在する型である。四鎖単位はより高分子量の免疫グロブリンにおいて繰り返される；ＩｇＭは一般にジスルフィド結合によって一緒に保持される四つの基本単位の五量体として存在する。ＩｇＡグロブリン、そして時折ＩｇＧグロブリンが血清中に多量体型で存在しうる。多量体の場合、四つの単位の各々は同じでも異なっていてもよい。
ここに記載した範囲内の様々な組み立てられたイムノアドヘシンの例は以下に概略的に模式化される： 
(a) ＡＣＬ-ＡＣＬ； 
(b) ＡＣＨ-(ＡＣＨ, ＡＣＬ-ＡＣＨ, ＡＣＬ-ＶＨＣＨ, 又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；
(c) ＡＣＬ-ＡＣＨ-(ＡＣＬ-ＡＣＨ, ＡＣＬ-ＶＨＣＨ, ＶＬＣＬ-ＡＣＨ, 又はＶＬＣＬ-ＶＨＣＨ)；
(d) ＡＣＬ-ＶＨＣＨ-(ＡＣＨ, 又はＡＣＬ-ＶＨＣＨ, 又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；
(e) ＶＬＣＬ-ＡＣＨ-(ＡＣＬ-ＶＨＣＨ, 又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；および
(f) (Ａ-Ｙ)ｎ-(ＶＬＣＬ-ＶＨＣＨ)２；
ここで、各Ａは同一又は異なったアドヘシンアミノ酸配列を示し；
ＶＬは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨは免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨは免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ｎは１より大きい整数であり；
Ｙは共有結合架橋剤の残基を示す。
【００８０】
簡略化のため、先の構造はキーとなる特徴を示しているのみである；これらは、免疫グロブリンの結合する(Ｊ)又は他のドメインを示していないしジスルフィド結合も示していない。しかし、そのようなドメインが結合活性に対して必要である場合は、それらを構築して、免疫グロブリン分子にそれらが占める通常の位置に存在させることができる。
あるいは、アドヘシン配列は、キメラ重鎖を含んでなる免疫グロブリンが得られるように、免疫グロブリン重鎖と軽鎖配列の間に挿入することができる。この実施態様では、アドヘシン配列は免疫グロブリンの各アームの免疫グロブリンの重鎖の３'末端に、ヒンジとＣＨ２ドメインの間、又はＣＨ２とＣＨ３ドメインの間の何れかで融合される。同様な作成物がHoogenboom等, Mol.Immunol.28:1027-1037(1991)によって報告されている。
【００８１】
免疫グロブリン軽鎖の存在は本発明のイムノアドヘシンにおいて必要ではないけれども、免疫グロブリン軽鎖はアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合的に結合するか、アドヘシンに直接的に融合されるかもしれない。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは典型的にはアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡと同時発現される。分泌時にハイブリッドの重鎖および軽鎖が共有結合的に結合されて、２つのジスルフィド結合で結合した免疫グロブリン重鎖-軽鎖対を含んでなる免疫グロブリン様構造を提供する。そのような構造の調製に好適な方法は、例えば1989年3月28日に発行された米国特許第4,816,567号に開示されている。
イムノアドヘシンは最も簡便には免疫グロブリンｃＤＮＡ配列にインフレームでアドヘシン部分をコードするｃＤＮＡ配列を融合させることにより構築される。しかし、ゲノム免疫グロブリン断片への融合もまた使用することができる(例えば、Aruffo等,Cell61:1303-1313(1990)；およびStamenkovic等,Cell66:1133-1144(1991)を参照されたい)。融合の後者のタイプは、発現に対してＩｇ調節配列の存在を必要とする。ＩｇＧ重鎖定常領域をコードするｃＤＮＡは、脾臓又は末梢血リンパ球から取り出されたｃＤＮＡライブラリーからの公開されている配列に基づいて、ハイブリダイゼーションにより、又はポリメラーゼ鎖反応(ＰＣＲ)法により単離することができる。「アドヘシン」をコードするｃＤＮＡとイムノアドヘシンの免疫グロブリンが、選ばれた宿主細胞において効率的な発現を指示するプラスミドベクター内にタンデムに挿入される。
【００８２】
他の実施態様において、ＤＲ６アンタゴニストは、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法で、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンのうち一つに、又はポリグルタミン酸のような同様の分子に、ポリペプチドを連結させることにより共有結合的に修飾される。このようなペグ化形態は当該技術分野において既知の方法を用いて調製してもよい。
また、これらの分子のロイシンジッパー形態も本発明によって考慮される。「ロイシンジッパー」は当該技術分野において、その融合相手(例えば、ロイシンジッパーが融合するか、又は連結する配列又は分子)の二量体化又は三量体化を増強し、促進し、又は引き起こすロイシンに富む配列のことを意味するために使用される語句である。様々なロイシンジッパーポリペプチドは当該分野において記述されている。例えば、Landschulz等, Science 240:1759 (1988)；米国特許第5,716,805号；国際公開公報94/10308；Hoppe等, FEBS Letters 344:1991 (1994)；Maniateis等, Nature, 341:24 (1989)；Maniatis等, Nature 341:24 (1989)を参照されたい。当業者であれば、ロイシンジッパー配列をＤＲ６分子の５'末端又は３'末端に融合しうることは理解するであろう。
【００８３】
また、本発明のＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に該ポリペプチドを融合することによりキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。好ましくは、そのような異種性ポリペプチド又はアミノ酸配列は、キメラ分子をオリゴマー化するように作用するものである。一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドと本発明のＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的には本発明のポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってＷＩＳＰポリペプチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチドおよびそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン(poly-his)又はポリ−ヒスチジン−グリシン(poly-his-gly)タグ；flu HAタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグおよびそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体[Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]；および単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ(gD)タグおよびその抗体[Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド[Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]；ＫＴ３エピトープペプチド[Martin等, Science, 255:192-194 (1992)]；α-チューブリンエピトープペプチド[Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ[Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)]を含む。
【００８４】
抗ＤＲ６、抗ｐ７５および抗ＡＰＰ抗体
本発明の他の実施態様において、ＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰ抗体が提供される。例示的な抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性、およびヘテロコンジュゲート抗体を含む。いくつかの実施態様では、これらの抗ＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰ抗体は、好ましくはＤＲ６アンタゴニスト抗体である。
【００８５】
ポリクローナル抗体
本発明の抗体はポリクローナル抗体を含んでよい。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、および所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤および／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、ＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰポリペプチド(例えば、ＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰ  ＥＣＤ)又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に結合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例には、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリンおよび大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバントおよびＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコルは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。次いで、哺乳動物から採血し、血清のアッセイによりＤＲ６および／又はＡＰＰ抗体価を求めることができる。必要に応じて、抗体かが増大又は安定するまで哺乳動物を免疫追加することができる。
【００８６】
モノクローナル抗体
あるいは、本発明の抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、KohlerおよびMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫剤は、典型的には対象とするＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰポリペプチド(例えば、ＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰ  ＥＣＤ)又はその融合タンパク質、例えばＤＲ６  ＥＣＤ−ＩｇＧ、ｐ７５  ＥＣＤ−ＩｇＧおよび／又はＡＰＰ ｓＡＰＰ−ＩｇＧ融合タンパク質を含む。
一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、およびヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は増殖を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプテリンおよびチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【００８７】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやヴァージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。そのようなマウス骨髄腫細胞株の一例は、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１(ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８０)である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫およびマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., ニューヨーク, (1987) pp. 51-63］。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰに対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術およびアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunsonおよびPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード解析法によって、又はＢｉａＣｏｒｅ分析によって、測定することができる。
【００８８】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法で増殖させることができる［Goding, 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地又はRPMI-1640倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として増殖させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィ等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
【００８９】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［Morrison等, Proc. Nat. Acad. Sci. 81, 6851 (1984)］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このようにして、ここに開示される抗ＤＲ６モノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」又は「ハイブリッド」抗体が調製される。
このような非免疫グロブリンポリペプチドは典型的に、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、ＤＲ６の特異性を持つ１つの抗原結合部位、および異なる抗原に対する特異性を持つ部位を有するキメラ性二価抗体を生成する。
【００９０】
キメラ又はハイブリッド抗体も、架橋剤を用いる合成タンパク質化学における既知の方法を用いてインビトロで調製できる。例えば、ジスルフィド交換反応を用いることにより、又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を構築できる。この目的のための適切な試薬の例は、イミノチオラートおよびメチル-４-メルカプトブチルイミダートである。
一本鎖Ｆｖ断片を、Iliades等, FEBS Letters, 409:437-441 (1997)に記載に従って生産できる。様々なリンカーを使用したこのような一本鎖断片の結合は、Kortt等, Protein Engineering, 10:423-433 (1997)に開示されている。抗体の組換え生産および操作の様々な技術が当技術分野において既知である。当業者によって利用されるそのような技術の例示的実施例を以下に詳述する。
【００９１】
ヒト化抗体
一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は、基本的に、ウィンター(Winter)および共同研究者(Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988))の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。
よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基および場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【００９２】
更に、抗体を、抗原に対する高結合親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列および様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をコンセンサスおよび移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【００９３】
ヒト抗体
ヒトモノクローナル抗体はハイブリドーマ法により作成することができる。ヒトモノクローナル抗体の生成のためのヒト骨髄腫およびマウス−ヒト異種骨髄腫の細胞系は、例えば、Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984), およびBrodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., ニューヨーク, 1987)に記載されている。
内在性の免疫グロブリン産生がない状態で、免疫化によりヒト抗体のレパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが現在では可能である。例えば、キメラおよび生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の移入は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993)を参照のこと。
【００９４】
Mendez等(Nature Genetics 15: 146-156 [1997年])はこの技術をさらに改良し、抗原を投与すると親和性の高い完全ヒト抗体を生成する「ゼノマウスII(Xenomouse II)」と称する系列のトランスジェニックマウスを生成した。これは、上述のように、内因性ＪＨセグメントに欠陥を有するマウスに、メガベースのヒト重鎖遺伝子座および軽鎖遺伝子座を生殖系に統合組み込みすることにより達成された。ゼノマウスIIは、約６６ＶＨ遺伝子、完全なＤＨおよびＪＨ領域および３つの異なる定常領域(μ、δおよびχ)を含む１，０２０ｋｂのヒト重鎖遺伝子座を有し、また３２Ｖκ遺伝子、ＪκセグメントおよびＣκ遺伝子を含む８００ｋｂのヒトκ遺伝子座を有する。これらのマウスに生成された抗体は、遺伝子再配列、構成、およびレパートリーを含め、ヒトに見られる抗体に全ての面で非常に類似している。ヒト抗体は、好ましくは、マウス座における遺伝子再配列を抑制する内因性ＪＨセグメントの欠損により、内因性抗体全体にわたって発現する。
【００９５】
別法として、ファージディスプレイ技術(McCafferty等, Nature 348：552-553, 1990)を使用して、非免疫化ドナーの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体および抗体断片を生産させることができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を、フレーム単位で、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３又はｆｄの、メジャー又はマイナーコートタンパク質遺伝子のどちらかでクローンし、ファージ粒子の表面で機能的抗体断片として表示させる。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づく選択によっても、結果としてこれらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択が成される。よって、このファージはＢ細胞のいくつかの特性を模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. およびChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照せよ。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源を、ファージディスプレイのために使用できる。Clackson等, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化したマウス脾臓由来のＶ遺伝子の小さいランダムなコンビナトリアルライブラリから、多様で多くの抗-オキサゾロン抗体を単離した。非免疫化ヒトドナーのＶ遺伝子のレパートリーが構成可能であり、多様で多くの抗原(自己抗原を含む)に対する抗体は、Marks等, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffith等, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術にそのまま従うことで単離することができる。自然な免疫応答において、抗体遺伝子は高い率で突然変異を蓄積する(体細胞過剰変異)。導入された変化の一部は高い親和性を提供し、親和性の高い表面免疫グロブリンを示すＢ細胞は、その後の抗原曝露の間に優先的に複製され、分化される。このような自然の工程を、「チェーンシャフリング」として知られる技術(Marks等, Bio/Technol. 10, 779-783, 1992)を使用することにより模倣することができる。この方法では、重鎖Ｖ領域遺伝子と軽鎖Ｖ領域遺伝子を、順に、非免疫化ドナーから取得したＶドメイン遺伝子の自然に生じる変異体(レパートリー)のレパートリーで置換することにより、ファージディスプレイによって得られた「一次」ヒト抗体の親和性を改善することができる。この技術により、ｎＭ範囲での親和性を有する抗体および抗体断片の生産が可能である。非常に大きなファージ抗体のレパートリー(「マザーオブオール ライブラリー(the Mother-of-all libraries)」とも呼ばれる)を作る方法が、WaterhouseらによるNucl. Acids Res. 21, 2265-2266 (1993)に開示されている。また、遺伝子シャフリングは、ヒト抗体が元になっている齧歯類の抗体と類似した親和性および特性を有している場合、齧歯類の抗体からヒト抗体を得るために使用することもできる。「エピトープインプリンティング」と呼ばれるこの方法により、ファージディスプレイ技術により得られた齧歯類抗体の重鎖Ｖドメイン遺伝子と軽鎖Ｖドメイン遺伝子をヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置換し、齧歯類−ヒトキメラを作成する。抗原を選択することにより、機能的抗原結合部位を回復することができるヒト可変部が単離される、つまり、エピトープがパートナーの選択をつかさどる(インプリントする)。残りの齧歯類Ｖドメインを置換するためにこの工程を繰り返すと、ヒ��抗体が得られる(1993年4月1日公開のPCT特許出願国際公開公報93/06213を参照)。伝統的なＣＤＲ移植による齧歯類抗体のヒト化と異なり、この技術により、齧歯類起源のフレームワーク又はＣＤＲ残基を全く持たない完全なヒト抗体が得られる。
【００９６】
下記に詳述するように、本発明の抗体は、状況に応じて、一量体抗体、二量体抗体、ならびに抗体の多価形態を含んでよい。当業者は、当分野で既知の技術により、ここに開示されるＤＲ６および／又はＡＰＰ抗体を用いて、そのような二量体又は多価形態を構築することができる。一価抗体を調製する方法もまた、当技術分野で周知である。例えば、一方法では、免疫グロブリン軽鎖と修飾された重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般にFc領域の任意の点で切断され、重鎖の架橋が形成されることが防止される。あるいは、関連するシステイン残基を別のアミノ酸残基で置換するか、又は削除し、よって架橋結合を防止する。
【００９７】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合、結合特異性の一方はＤＲ６レセプターに対してであり、他方は他の任意の抗原に対して、好ましくは別のレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。一実施態様では、他の抗原はｐ７５である。二重特異性抗体を作製する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の発現に基づく。MillsteinおよびCuello, Nature, 305:537-539 (1983)。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィ工程によって通常達成されるが、幾分扱いにくく、生産性が低い。同様の手順が1993年5月13日公開の国際公開公報93/08829、およびTraunecker等, EMBO,10:3655-3659 (1991)に開示されている。
【００９８】
さらに好ましい別の方法により、所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコード化するＤＮＡ、および望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、組立に使用される３つのポリペプチド鎖の等しくない比率が所最適な収率をもたらす実施態様において、３つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性がもたらされる。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率があまり影響がないときは、２又は３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を１つの発現ベクターに挿入することが可能である。この手法の好ましい実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、1994年3月3日公開の国際公開公報94/04690に開示されている。
二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
【００９９】
ヘテロ抱合抗体
ヘテロ抱合抗体も本発明の範囲に含まれる。ヘテロ抱合抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため(米国特許第4,676,980号)およびＨＩＶ感染の治療のために(国際公開公報91/00360；国際公開公報92/200373；欧州特許第03089号)提案されている。ヘテロ抱合抗体は、任意の簡便な架橋法を使用して、調製することができる。適切な架橋剤は当技術分野において既知であり、複数の架橋技術と共に、米国特許第4,676,980号に開示されている。
【０１００】
抗体断片
一部の実施態様においては、抗ＤＲ６、抗ｐ７５および／又は抗ＡＰＰ抗体(マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、および抗体変異体を含む)は抗体断片である。抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されている(例えば、Morimoto等, J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-117 (1992)およびBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他の実施態様では、ロイシンジッパーGCN4を使用してＦ(ａｂ')２を形成し、Ｆ(ａｂ')２分子の構築を促進する。別の実施態様では、組換え宿主細胞の培地からＦｖ、Ｆａｂ又はＦ(ａｂ')２断片を直接分離することができる。抗体断片を生産するための他の技術は当業者には明らかである。例えば、パパインを使用して消化を行うことができる。パパイン消化の例は、１９９４年１２月２２日公開の国際公開公報９４／２９３４８および米国特許第４３４２５６６号に開示されている。抗体のパパイン消化は、通常、Ｆａｂ断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を生成する。各Ｆａｂ断片は単一の抗原結合部位、および残存性Ｆｃ断片を持つ。ペプシン処理により、２つ抗原結合部位を持ち、抗原に架橋結合する能力のあるＦ(ａｂ')２が生成される。
抗原消化で生成されるＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一定常ドメイン(ＣＨ１)も含む。Ｆａｂ’断片は、それに加えて、抗原ヒンジ領域由来の１以上のシステインを含む重鎖のＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に少数の残基を持つ点においてＦａｂ断片と異なる。本発明では、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持つＦａｂ'として、ここではＦａｂ'-ＳＨと記載する。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、もともとそれらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生成されたものである。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
【０１０１】
抗体のグリコシル化変異体
抗体をその定常領域の保存位置でグリコシル化する(JefferisおよびLund, Chem. Immunol. 65:111-128, 1997年; WrightおよびMorrison, TibTECH 15:26-32, 1997)。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能(Boyd他., Mol. Immunol. 32:1311-1318, 1996年; WittweおよびHoward, Biochem. 29:4175-4180, 1990)、および、糖タンパク質の高次構造および提示される三次元表面に影響しうる糖タンパク質の部分同士の分子内相互作用(HefferisおよびLund, 上掲; Wyss and Wagner, Current Opin. Biotech. 7:409-416, 1996)に作用する。オリゴ糖はまた、特異的な認識構造に基づいて任意の糖タンパク質を特定の分子に標的化するのに役立つ。例えば、非ガラクトシル化ＩｇＧにおいて、オリゴ糖部分はＣＨ２内空間の外に「とび出し(flip)」、末端Ｎ−アセチルグリコサミン残基がマンノース結合タンパク質に結合できるようになることが報告されている(Malhotra等, Nature Med. 1:237-243, 1995)。チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞において、オリゴ糖のグリコペプチダーゼによるＣＡＭＰＡＴＨ-１Ｈ(ヒトリンパ球のＣＤｗ５２抗原を認識する組換えヒト化マウスモノクローナルＩｇＧ１抗体)からの除去を実行した結果、補体媒介性溶解(ＣＭＣＬ)が完全に低減したが(Boyd等, Mol. Immunol. 32:1311-1318, 1996)、ノイラミニダーゼを使用してシアル酸残基を選択的に除去した結果、ＤＭＣＬの低減は見られなかった。抗体のグリコシル化はまた、抗体依存性の細胞の細胞障害性(ＡＤＣＣ)に影響することが報告されている。特に、バイセクティングＧｌｃＮＡｃの形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼである、β(１,４)-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(ＧｎＴIII)のテトラサイクリン制御発現を持つＣＨＯ細胞で、ＡＤＣＣ活性が向上したことが報告されている(Umana等, Mature Biotech. 17:176-180, 1999)。
抗体のグリコシル化変異体は、抗体のグリコシル化のパターンが変更された変異体である。変更するとは、抗体に見られる１以上の炭水化物部分を除去し、抗体に１以上の炭水化物部分を加え、グリコシル化の組成(グリコシル化パターン)、グリコシル化の範囲、その他を変更することを意味する。グリコシル化変異体は、例えば、抗体をコードする核酸配列について、１以上のグリコシル化部位の、除去、変更、および/又は付加を行うことにより調製することができる。
【０１０２】
抗体のグリコシル化は、通常、Ｎ−結合かＯ−結合である。Ｎ−結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物成分の付与を指す。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン(ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸)は、炭水化物成分のアスパラギン側鎖への酵素的付与の認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらトリペプチド配列のいずれかが存在することにより、潜在的グリコシル化部位が創造される。Ｏ−結合のグリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンへの、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの糖類のうち１つの付着を指すが、５−ヒロドキシプロリン、又は５−ヒドロキシリジンを使用してもよい。
抗体へのグリコシル化部位の付加は、(Ｎ−結合グリコシル化部位について)上述のトリペプチド配列の１又は複数を有するようにアミノ酸配列を変更することにより常套的に達成される。変更は、また、(Ｏ−結合グリコシル化部位について)元の抗体の配列に対して１以上のセリン又はスレオニン残基を付加又は置換することにより行ってもよい。
【０１０３】
抗体のグリコシル化(グリコシル化パターンを含む)は、内在するヌクレオチド配列を変更することなく変更可能である。グリコシル化は抗体を発現するために使用される宿主細胞に大きく依存する。潜在的治療剤として、抗体などの組換え糖タンパク質の発現に使用される細胞の種類が、まれに天然の細胞であることから、抗体のグリコシル化パターンは大きく変化することが予想される(例えばHse等, J. Biol. Chem. 272:9062-9070, 1997年参照)。宿主細胞の選択に加えて、抗体の組換え産生の間のグリコシル化に影響を与える因子には、増殖形態、媒地組成、培養密度、酸素添加、ｐＨ、精製スキームなどが含まれる。オリゴ等製造に関わるある種の酵素の導入又は過剰発現を含む、特定の宿主生物においてなされたグリコシル化パターンを変えるための様々な方法が提案されている(米国特許第５０４７３３５号、米国特許第５５１０２６１号および米国特許第５２７８２９９号)。グリコシル化、又は特定の種類のグリコシル化は、例えばエンドグリコシダーゼＨ(Endo H)の使用により、糖タンパク質から酵素学的に除去することができる。加えて、組換え宿主細胞を遺伝学的に設計することができ、例えば多糖類の特定種のプロセシングにおいて欠損をつくることができる。これら同様の技術は当技術分野において既知である。
抗体のグリコシル化構造は、レクチンクロマトグラフィ、ＮＭＲ、質量分析、ＨＰＬＣ、ＧＰＣ、単糖成分分析、連続酵素消化、および高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィを使用して電荷に基づきオリゴ糖を分離するＨＰＡＥＣ-ＰＡＤなどの、炭水化物分析を行う従来技術により容易に分析できる。分析的な目的のためにオリゴ糖を遊離させる方法も知られており、それらには、限定はしないが、酵素的処理(通常ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼ Ｆ／エンド−β−ガラクトシダーゼを使用して行う)、主にＯ−結合構造を遊離するための強アルカリ環境を使用しての除去、およびＮ−結合とＯ−結合両方のオリゴ糖を遊離させるための無水ヒドラジンを使用する化学的方法が含まれる。
【０１０４】
例示的抗体
下の実施例に記載のとおり、抗ＤＲ６モノクローナル抗体が同定された。任意の実施態様において、本発明のＤＲ６抗体は、本明細書で特に開示された抗ＤＲ６、抗ｐ７５および／又は抗ＡＰＰ抗体の何れかと同じ生物学的特性を有する。
「生物学的特性」なる用語は、ＤＲ６に特異的に結合する能力又はＤＲ６活性を遮断、抑制又は中和化する能力等の、モノクローナル抗体のインビトロおよび／又はインビボ活性又は特性を指すために使用される。ＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰ抗体の特性および活性化は、下の実施例において更に記載される。
場合によっては、本発明のモノクローナル抗体は、下の実施例で具体的に特徴づけられた抗体の何れかと同じ生物学的特性を有し、および／又はこれらの抗体と同じエピトープに結合する。これは、本明細書および実施例に記載したようなさまざまなアッセイによって測定することができる。例えば、モノクローナル抗体が特に本明細書で言及したＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰ抗体と同じ特異性を有するかどうかを測定するために、競合的結合アッセイでその活性を比較することができる。加えて、特定の抗ＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰ抗体が結合するエピトープは、問題のＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰと抗体との間の複合体の結晶学的研究によって測定することができる。
【０１０５】
ＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰ抗体は、本明細書で記載されたとおり、好ましくは所望のＤＲ６、ｐ７５またはＡＰＰアンタゴニスト活性を有する。当該抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および親和性成熟抗体を含むがこれらに限定されるものではない。上に記載のとおり、ＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰ抗体は、これらの所望の活性又は特性を達成するためにさまざまな技術を使用して構築または設計されてもよい。
本発明の追加の実施態様は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびポリオキシアルキレンからなる群から選択される１又は複数の非タンパクポリマーに結合された、本明細書に開示する抗ＤＲ６レセプター、抗ｐ７５および／又は抗ＡＰＰリガンド抗体を含む。場合によっては、本明細書に開示する抗ＤＲ６レセプター、抗ｐ７５および／又は抗ＡＰＰリガンド抗体は、グリコシル化あるいは非グリコシル化される。
【０１０６】
本発明の抗体は、「架橋結合」ＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰ抗体を含む。「架橋結合」なる用語は本明細書で使用される場合、少なくとも２つのＩｇＧ分子を一つに結合し、一つの(又は単一の)分子を形成することを指す。ＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰ抗体は、さまざまなリンカー分子を使用して共有結合されてもよく、好ましくはＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰ抗体は抗ＩｇＧ分子、補体、化学的修飾又は分子工学を使用して共有結合されてもよい。ひとたび抗体が細胞表面膜に結合すると、補体が抗体分子に比較的高い親和性を有することは当業者に重宝されている。従って、補体は、細胞表面膜に結合する２以上の抗ＤＲ６抗体を結合するための共有結合分子として使用されてもよいと考えられる。
【０１０７】
また、本発明は、本明細書に開示されるＤＲ６、ｐ７５および／又はＡＰＰ抗体をコードする単離された核酸、核酸を含むベクターおよび宿主細胞、および抗体を作成するための組換え体技術を提供する。
抗体の組換え体作製のために、それをコードする核酸は単離され、更なるクローニング(ＤＮＡの増幅)のため又は発現のために複製可能なベクターに挿入される。抗体をコードするＤＮＡは容易に単離され、従来の手順を使用して(例えば、抗体をコードする遺伝子に特に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって)配列決定される。多くのベクターが入手可能である。ベクターの構成は、通常、以下の１つ又は複数を含むがこれらに限定されない：シグナル配列、複製起点、１又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結配列。
【０１０８】
本明細書の方法は、抗ＤＲ６、抗ｐ７５および／又は抗ＡＰＰ抗体軽鎖又は重鎖(又は軽鎖および重鎖の両方)をコードするＤＮＡ配列を含むベクターを提供する工程、宿主細胞にベクターを形質移入又は形質転換する工程、および組換え体抗ＤＲ６抗体、抗ｐ７５抗体および／又は抗ＡＰＰ抗体産生物を作製するために十分な条件下で宿主細胞を培養する工程を含む、キメラ又は組換え体の抗ＤＲ６および／又はＡＰＰ抗体を作製する方法を含む。
【０１０９】
ＤＲ６アンタゴニストの製剤
本明細書の典型的な製剤の調製において、使用される成分の推奨の量又は「グレード」は製剤の最終的使用に依存する。治療的使用のために、医薬品への添加物として、許容可能なグレード(「ＧＲＡＳ」等)の成分が好ましい。
ある実施態様において、ＤＲ６、場合によってｐ７５のアンタゴニストおよび、ＤＲ６アンタゴニストの溶解性および／又は安定性を促進するために十分なイオン強度を提供する１又は複数の賦形剤を含む組成物であって、ｐＨ６(又は約６)からｐＨ９(又は約９)を有する組成物が提供される。ＤＲ６およびｐ７５アンタゴニストは、例えば、上の方法に従って、タンパク質の所望の純度を達成するのに適した任意の方法によって調整されてもよい。いくつかの実施態様において、アンタゴニストは宿主細胞において組換えにより発現されるか、又は化学的合成により調製される。製剤中のＤＲ６およびｐ７５アンタゴニストの濃度は、例えば、製剤の意図する使用に大いに依存してもよい。当業者は、過度の実験をすることなく、ＤＲ６またはｐ７５アンタゴニストの所望の濃度を決定することができる。
【０１１０】
ＤＲ６またはｐ７５アンタゴニストの溶解性および／又は安定性を促進するために十分なイオン強度を提供する製剤中の１又は複数の賦形剤は、場合により、多イオン有機又は無機酸、アスパラギン酸、硫酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ＣａｐｔｉｓｏｌＴＭ、トリス、アルギニン塩又は他のアミノ酸、糖およびトレハロースおよびショ糖などのポリオールである。好ましくは、十分なイオン強度を提供する製剤中の１又は複数の賦形剤は塩である。使用されてもよい塩は、ナトリウム塩およびアルギニン塩を含むがこれらに限定されるものではない。使用されてもよい塩の種類および塩の濃度は、好ましくは、製剤が比較的高いイオン強度を有し、製剤中のＤＲ６アンタゴニストが安定であることを可能にするものである。場合によっては、塩は製剤中に約２０ｍＭから約０．５Ｍの濃度で存在する。
【０１１１】
組成物は、好ましくは、ｐＨ６(又は約６)から９(又は約９)、より好ましくは約６．５から約８．５、さらにより好ましくは約７から約７．５を有する。この実施態様の好ましい態様において、組成物は、組成物のｐＨを少なくとも約６から約８に維持するためのバッファーを更に含む。使用されてもよいバッファーの例は、トリス、ＨＥＰＥＳ、およびヒスチジンを含むがこれらに限定されるものではない。トリスを使用する場合、ｐＨは、場合により、約７から８．５に調節されてもよい。Ｈｅｐｅｓ又はヒスチジンを使用する場合、ｐＨは、場合により、約６．５から７に調節されてもよい。場合によっては、バッファーは製剤中、約５ｍＭから約５０ｍＭの濃度で使用される。
特に液剤(又は、再構成された凍結乾燥製剤)の場合は、組成物中に１又は複数の界面活性剤を含むことが望ましい場合がある。例えば、当該界面活性剤は、ＴＷＥＥＮＴＭ又はＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ等の非イオン界面活性剤(例えば、ポリソルベート又はポロキサマー)を含んでもよい。好ましくは、界面活性剤はポリソルベート２０(「Ｔｗｅｅｎ２０」)を含む。場合によっては、界面活性剤は約０．００５％から約０．２％の濃度で使用される。
【０１１２】
本発明の製剤は、ＤＲ６アンタゴニストおよび上記の成分に加えて、更にさまざまな他の賦形剤または成分を含んでもよい。場合によっては、製剤は、非経口的投与のために、薬学的に又は非経口的に許容可能な担体、すなわち使用される用量および濃度において受容者に対し非毒性であって製剤の他の材料と適合する物を含んでもよい。場合によっては、担体は、受容者の血液と等浸透圧である溶液等の非経口担体である。当該担体ビヒクルの例は、水、生理食塩水又はリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)等の緩衝溶液、リンゲル溶液、ブドウ糖溶液を含む。さまざまな任意の薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤は、更にRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A.編. (1980)に記載されている。
【０１１３】
また、本明細書の製剤は、１又は複数の防腐剤を含んでもよい。例には、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム(アルキル基が長鎖化合物であるアルキルベンジルジメチル塩化アンモニウムの混合物)、および塩化ベンゼトニウムが含まれる。防腐剤の他の種類には、芳香族アルコール、メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン、およびｍ-クレゾールを含む。抗酸化剤はアスコルビン酸およびメチオニン；防腐剤(塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；ブチルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール; シクロへキサノール；3-ペンタノール；およびｍ-クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖、二糖類、および他の炭水化物；ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)を含む。
【０１１４】
本発明の組成物は、液剤(液体溶液又は液体懸濁液)および、凍結乾燥製剤、および懸濁製剤を含む。
最終製剤は、液体ならば、好ましくは、２０℃以下で凍結保存される。あるいは、製剤は凍結乾燥されて、場合によっては２−３０℃で保存されてもよい、注射用の水でもどされる粉末として提供されうる。
治療的投与に使用される製剤は、無菌でなければならない。無菌性は、除菌膜(例えば、０．２ミクロンの膜)を介して濾過することにより、容易に達成できる。治療用組成物は、通常、無菌のアクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針で穴を開けることができるストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルの中に入れられる。
組成物は、通常、水性溶液として又は再構成のための凍結乾燥製剤として、一単位で又は複数回投与容器に、例えば密封されたアンプル又はバイアルに保存される。容器は、当分野で入手可能な何れの容器であってもよく、従来の方法を使用して注入される。場合によっては、製剤は、製剤の治療用送達に適した、当技術分野で入手可能であるような(例えば、米国特許第５３７０６２９号を参照)注射用ペン型装置(又はペン型装置に合うカートリッジ)中に含められる。注射溶液は、例えば注射用の水を使用して、凍結乾燥ＤＲ６アンタゴニスト製剤をもどすことによって調製することができる。
【０１１５】
ＤＲ６アンタゴニストを使用する治療
本発明のＤＲ６アンタゴニストはさまざまな効用を有する。ＤＲ６アンタゴニストは精神的障害の診断および治療に有用である。本明細書に記載のさまざまな病的状態の哺乳動物の診断は、医師によって行われる。診断技術は、例えば、哺乳動物のさまざまな精神的障害の診断又は検出を可能にする当分野の技術を利用可能である。
本発明による治療に意図される精神的な障害には、嗜癖および統合失調症が含まれる。本発明による治療に意図される認知障害には、トゥレット症候群、レット症候群、脆弱Ｘ症候群、および自閉症が含まれる。本発明の組成物および方法を用いて、正常な高齢化患者を治療して、加齢中の認知を維持し、おそらく改善することができると考える。
【０１１６】
本発明の方法において、ＤＲ６アンタゴニストは哺乳動物に、好ましくは担体で；好ましくは薬学的に許容可能な担体で投与される。適した担体およびその製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., 1980, Mack Publishing Co., Osol等編に記載されている。典型的には、適切な量の薬学的に許容可能な塩が、製剤の等張性を与えるために、製剤中に使用される。担体の例は、生理食塩水、リンガル溶液およびブトウ糖液を含む。溶液のｐＨは好ましくは約５から約８であり、より好ましくは約７から約７．５である。更に担体は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックス等の除放性製剤を含み、マトリックスは造形品、例えばフィルム、リポソーム又は微粒子である。例えば投与されるＤＲ６アンタゴニストの投与経路および濃度に応じて、特定の担体がより好ましいことは当業者にとっては明らかである。
【０１１７】
ＤＲ６アンタゴニストは哺乳動物に注射(例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、門脈内)により、経口的に、又は注入のような効率的形態で血流に送達されることが保証される他の方法により、投与することができる。また、ＤＲ６アンタゴニストは、局所的治療効果を発揮させるために、分離組織灌流などの分離灌流技術により、くも膜下腔内に、眼内に、又は腰椎穿刺により投与されてもよい。血液脳関門を容易に渡らないＤＲ６アンタゴニストは直接的に、例えば脳内に又は脊髄腔中に又は他に与えられ、それらを関門を超えて輸送する。ＤＲ６アンタゴニストを投与するための効果的な用量およびスケジュールは実験的に決定されてもよく、当該決定を行うことは当業者の守備範囲である。投与しなければならないＤＲ６アンタゴニストの用量が、例えばアンタゴニストを受ける哺乳動物、投与経路、使用されるアンタゴニストの特定の種類および哺乳動物に投与される他の薬物に、大いに依存することを、当業者であれば理解する。適切な用量を選択するための指針は、例えば抗体の治療的使用に関する文献、例えば、Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone等編, Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985) ch. 22 およびpp. 303-357; Smith等, Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber等編, Raven Press, New York (1977) pp. 365-389を参照されたい。単独で使用されるＤＲ６抗体の典型的な１日用量は、上記の要因に応じて、1日あたり体重につき約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。
【０１１８】
また、ＤＲ６アンタゴニストは、一又は複数の他の治療薬と併用して哺乳動物に投与されてよい。ＡＰＰもｐ７５に少なからず結合するようである（ＥＬＩＳＡによるとＥＣ５０＝およそ３００ｎＭ）。ゆえに、ＤＲ６アンタゴニスト並びにｐ７５アンタゴニストとの併用によって精神的および認知障害を治療することは有益となりうる。他の治療薬はさらに、ＤＲ６アンタゴニストと、場合によってｐ７５アンタゴニストと併用されてよい。当該他の治療薬の例は、上皮増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)インヒビター、例えばＴａｒｃｅｖａ、Ｃ２２５のような抗体、ｃｅｔｕｘｉｍａｂおよびＥｒｂｉｔｕx(登録商標)(ImClone Systems Inc.)、完全ヒトＡＢＸ−ＥＧＦ (panitumumab, Abgenix Inc.)、および米国特許第６２３５８８３号に記載されているＥ１．１、Ｅ２．４、Ｅ２．５、Ｅ６．２、Ｅ６．４、Ｅ２．１１、Ｅ６．３およびＥ７．６．３として知られている完全ヒト抗体等のＥＧＦＲに結合するか又は直接作用してシグナル伝達活性を防ぐか又は減じる化合物；ＭＤＸ−４４７(Medarex Inc)、および米国特許第５６１６５８２号、米国特許第５４５７１０５号、米国特許第５４７５００１号、米国特許第５６５４３０７号、米国特許第５６７９６８３号、米国特許第６０８４０９５号、米国特許第６２６５４１０号、米国特許第６４５５５３４号、米国特許第６５２１６２０号、米国特許第６５９６７２６号、米国特許第６７１３４８４号、米国特許第５７７０５９９号、米国特許第６１４０３３２号、米国特許第５８６６５７２号、米国特許第６３９９６０２号、米国特許第６３４４４５９号、米国特許第６６０２８６３号、米国特許第６３９１８７４、国際公開９８１４４５１、国際公開９８５００３８、国際公開９９０９０１６、国際公開９９２４０３７、米国特許第６３４４４５５号、米国特許第５７６００４１号、米国特許第６００２００８号、米国特許第５７４７４９８に記載されているようなＥＧＦＲ小分子インヒビター；ＯＳＩ−７７４(CP-358774, erlotinib,  OSI Pharmaceuticals)を含む特定の小分子ＥＧＦＲインヒビター；ＰＤ１８３８０５(ＣＩ１０３３、２-プロペンアミド、Ｎ-[４-[(３-クロロ-４-フルオロフェニル)アミノ]-７-[３-(４-モルホリニル)プロポキシ]-６-キナゾリニル]-、ジハイドロクロリド、ファイザーＩｎｃ.)；Ｉｒｅｓｓａ(ＺＤ１８３９、ゲフィチニブ、４-(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-７-メトキシ-６-(３-モルホリノプロポキシ)キナゾリン、アストラゼネカ)；ＺＭ１０５１８０((６-アミノ-４-(３-メチルフェニル-アミノ)キナゾリン、ゼネカ)；ＢＩＢＸ−１３８２(Ｎ８-(３-クロロ-４-フルオロ-フェニル)-Ｎ２-(１-メチル-ピペリジン-４-イル)-ピリミド[５,４-ｄ]ピリミジン-２,８-ジアミン、ベーリンガーインゲルハイム)；ＰＫＩ−１６６((Ｒ)-４-[４-[(１-フェニルエチル)アミノ]-１Ｈ-ピロロ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-イル]フェノール)；(Ｒ)-６-(４-ヒドロキシフェニル)-４-[(１-フェニルエチル)アミノ]-７Ｈ-ピロロ[２,３-ｄ]ピリミジン)；ＣＬ−３８７７８５(Ｎ[４-[(３-ブロモフェニル)アミノ]-６-キナゾリニル]-２-ブチンアミド)；およびＥＫＢ−５６９(Ｎ[４-[(３-クロロ-４-フルオロフェニル)アミノ]-３-シアノ-７-エトキシ-６-キナゾリニル]-４-(ジメチルアミノ)-２-ブテンアミド)を含む。使用されてもよい他の治療薬��、アポトーシスインヒビター、特に細胞内アポトーシスインヒビター、例えばカスパーゼ３、カスパーゼ６、又はカスパーゼ８インヒビター等のカスパーゼインヒビター、Ｂｉｄインヒビター、Ｂａｘインヒビター又はそれらの組合せを含む。適切なインヒビターの例は、通常はカスパーゼインヒビター、ジペプチドインヒビター、カルバミン酸インヒビター、置換アスパラギン酸アセタール、ヘテロシクリルジカルバミド、キノリン(ジ-、トリ-、テトラペプチド)誘導体、置換２-アミノベンズアミド・カスパーゼ・インヒビター、置換ａ-ヒドロキシ酸カスパーゼインヒビター、ニトロシル化による阻害；ＣＡＳＰ-１；ＣＡＳＰ-３：タンパク質インヒビター、アンチセンス分子、ニコチニル-アスパルチル-ケトン、y-ケト酸ジペプチド誘導体、ＣＡＳＰ−８：アンチセンス分子、相互作用タンパク質ＣＡＳＰ-９、ＣＡＳＰ２：アンチセンス分子；ＣＡＳＰ-６：アンチセンス分子；ＣＡＳＰ-７：アンチセンス分子；およびＣＡＳＰ-１２インヒビターである。更なる例は、Ｂｃｌ-２調節因子、Ｂａｄ由来ののＢｃｌ-２突然変異ペプチド、Ｂａｄ、ＢＨ３相互作用ドメイン・デス・アゴニスト、Ｂａｘインヒビタータンパク質およびＢＬＫ遺伝子および遺伝子産物などのミトコンドリアインヒビターである。アポトーシスの適切な細胞内修飾因子は、ＣＡＳＰ９／Ａｐａｆ-１会合、Ａｐａｆ-１発現のアンチセンス修飾因子、アポトーシス阻害用ペプチド、ヘルペス・シンプレクス(Herpes Simplex)ウイルスのＲ１サブセットを含む抗アポトーシス組成物、ＭＥＫＫ１およびその断片、スルビビン修飾因子、アポトーシスおよびＨＩＡＰ２のヒンヒビターの修飾因子である。これらの作用剤の更なる例は、ミトコンドリアからのチトクロームＣ放出を抑制し、カスパーゼ３  ｍＲＮＡ上方制御を制御するミノサイクリン(Neuroapoptosis Laboratory)、ｐ５３インヒビターであるピフィスリンα(ＵＩＣ)、ＪＮＫ経路インヒビターであるＣＥＰ-１３４６(Cephalon Inc.)、プロアポトーシスのＧＡＰＤＨシグナル伝達を阻害するＴＣＨ３４６(Novartis)、汎カスパーゼインヒビターであるＩＤＮ６５５６(Idun Pharmaceuticals)；カスパーゼ３インヒビターであるＡＺＱｓ(アストラゼネカ)、カスパーゼ１／４インヒビターであるＨＭＲ-３４８０(Aventis Pharma)、血栓を溶解するＡｃｔｉｖａｓｅ／ＴＰＡ(ジェネンテック)(血栓溶解薬)である。
【０１１９】
ＤＲ６アンタゴニストに加えて投与されてもよい他の適切な作用剤は、ＢＡＣＥインヒビター、コリンエステラーゼインヒビター(ドネペジル、ガランタミン、リバスチグミン、タクリン等)、ＮＭＤＡレセプターアンタゴニスト(メマンチン)Ａβ凝集インヒビター、抗酸化剤、γ分泌酵素修飾因子、ＮＧＦ模倣体又はＮＧＦ遺伝子治療、ＰＰＡＲγアンタゴニスト、ＨＭＧ-ＣｏＡ還元酵素インヒビター(スタチン)、アンパカイン、カルシウムチャネル遮断薬、ＧＡＢＡレセプターアンタゴニスト、グリコーゲン合成酵素キナーゼインヒビター、免疫グロブリン静注、ムスカリンレセプターアゴニスト、ニコチン受容体修飾因子、能動的又は受動的Ａβ免疫化、ホスホジエステラーゼインヒビター、セロトニンレセプターアンタゴニストおよび抗Ａβ抗体(例えば、国際公開２００７／０６２８５２；国際公開２００７／０６４９７２；国際公開２００３／０４０１８３；国際公開１９９９／０６０６６；国際公開２００６／０８１１７１；国際公開１９９３／２１５２６；欧州特許０２７６７２３Ｂ１；国際公開２００５／０２８５１１；国際公開２００５／０８２９３９を参照)を含む。
ＤＲ６アンタゴニストは１又は複数の他の治療薬と連続して又は同時に投与されてもよい。ＤＲ６アンタゴニストおよび治療薬の量は、例えば使用される薬剤がどんな種類か、治療される病的状態、および投与のスケジュールおよび経路に依存するが、それぞれを個々に使用する場合よりも通常は少ない。
哺乳動物へのＤＲ６アンタゴニストおよび場合によってｐ７５アンタゴニストの投与に続いて、哺乳動物の生理学的状態が臨床医がよく知っているさまざまな方法でモニターされうる。
本発明のＤＲ６アンタゴニストおよび場合によってｐ７５アンタゴニストの治療的効果は、インビトロアッセイで、およびインビボ動物モデルを使用して調べられうる。
【０１２０】
キットおよび製造品
本発明の更なる実施態様において、精神的障害および認知障害を治療する為に有用な材料を含む製造品およびキットが提供される。製造品は、ラベルを有する容器を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、および試験管を含む。容器は、ガラス又はプラスチック等のさまざまな材料から形成されてもよく、好ましくは滅菌される。容器には、精神的障害および認知障害を治療するために効果的な活性剤を有する組成物が入る。組成物中の活性剤は、ＤＲ６アンタゴニストであり、好ましくは抗ＤＲ６モノクローナル抗体又は抗ＡＰＰモノクローナル抗体である。いくつかの実施態様では、前記組成物中の他の活性剤はｐ７５アンタゴニストであり、好ましくは抗ｐ７５モノクローナル抗体又は抗ＡＰＰモノクローナル抗体を含む。容器のラベルは、組成物が精神的障害および認知障害を治療する為に使用されることを表示し、また上記のようなインビボまたはインビトロの使用の指示が表示されてもよい。製造品またはキットは、場合によっては、適応症、用途、用量、投与、禁忌、包装された製品と組合わされている他の治療用製品、および／または当該治療用製品の使用に関する警告などについての情報を含む、治療用製品の商業用パッケージに習慣的に含まれる指示を示す添付文書を更に含む。
本発明のキットは、上記の容器およびバッファーを含む第２の容器を含む。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含む、商業上のおよび利用者の立場から望ましい他の材料を含んでもよい。
【実施例】
【０１２１】
さらに、本発明の様々な態様を以下の実施例によって記載し、例示する。これらは本発明の権利範囲を減縮するためのものではない。
【０１２２】
シナプスは、常在性頭蓋窓による２-光子電子顕微鏡法を使用して生体内で視覚化されうる(図１を参照)。この手法を利用して、我々は、(１)興奮性シナプスの形態学的な関連がある樹状突起棘の密度、そして(２)樹状突起棘の形態を評価することができる。
【０１２３】
実施例１：生体内でＰＳＤ−９５貯留のモニタリング
材料と方法
子宮内電気穿孔法。  Ｌ２／３始原細胞を、子宮内電気穿孔法により移入した(Saito T. and N. Nakatsuji (2001) Dev. Biol. 240:237-246；Tabata, H. and K. Nakajima (2001) Neurosci. 103:865-872)。妊娠Ｅ１６時期のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス(Charles River, Wilmington, Massachusetts, United States)を、イソフルラン-酸素混合物を使用して深く麻酔をかけた。子宮角を曝し、およそ１μｌのＤＮＡ溶液(ＤｓＲｅｄ-Ｅｘｐｒｅｓｓを発現するプラスミドを含有する、１ｕｇ／ｕｌおよびFast Green [Sigma, St. Louis, Missouri, United States])を、ガラスキャピラリーチューブにて各々の胚の右側脳室に圧力注入した。各胚の頭部をオーダーメードのピンセット電極間に置き、陽極プレートを頭部の右側と接触させた。電気穿孔法は、５つの方形波にて達成された(継続期間＝５０ｍｓ、頻度＝１Ｈｚ、４０Ｖ)。同時移入効率は６０〜７０％であった。図１を参照のこと。
外科的手術。  画像窓はＰ８に又はＰ６０後に体性感覚皮質より上に導入した。マウスは、イソフルラン-酸素混合物にて深く麻酔をかけた。開頭(直径４〜５ｍｍ)は、右の体性感覚皮質上方(仔体／成体についてそれぞれブレグマから０．５／１．５ｍｍ後部、正中から３．０／３．５ｍｍ外側)で行い、硬膜を完全なままにした。硬膜は、ＨＥＰＥＳ緩衝人工脳脊髄液に溶解した１％アガロース(Type-IIIA, Sigma)にて覆い、歯科用アクリルにて所定の位置に密封される５ｍｍオーダーメイドカバーガラス(No.1)にて覆った。また、動物に２０μｌの４％デキサメサゾン(Phoenix Scientific, St. Joseph, Missouri, United States of America)を注射した。１時間の回復期の後、成体はケージに戻し、仔体は同腹仔と代理母と共に収容した。
【０１２４】
画像。  高分解能画像は、オーダーメードの２-レーザー２光子レーザースキャン顕微鏡(２ＰＬＳＭ)にて撮像した。画像のための光源は、固形状チタンサファイアレーザー（対物後焦点面においておよそ１００ｍＷ；λおよそ１０２０）(Spectra Physics, Fremont, California, United States)とし、赤色蛍光光子はバンドパスフィルター(６１０／９０；Chroma Technology)を使用して分離した。シグナルは、光電子増倍管(３８９６；Hamamatsu, Hamamatsu City, Japan)を使用して集めた。対物レンズ(４０、０．８ＮＡ)およびｔｒｉｎｏｃはOlympus (Tokyo, Japan)製であった。
我々は、脈管構造および樹状分枝のパターンを使用して、毎日対象とする領域を識別した。画像セッションは、９０分にわたる一連の画像スタックから成り立つ。画像スタックは、軸方向に１μｍ分離した個体切片(５１２×５１２ピクセル；ピクセルサイズ、０．０８μｍ)からなる。画像セッションの後、マウスは、加温毛布上でおよそ３０分間回復させて、同腹仔および代理母と共に収容した。成体動物はケージに戻した。
データ分析。  個々の棘を識別し、印を付し、Ｍａｔｌａｂ(Mathworks)のオーダーメイド分析慣例を用いて時間を追って調べた。棘存続時間、密度および長さは、カスタムソフトウェア(Holtmaat A.J. et al. (2005) Neuron 45:279-291)を使用して計測した。
【０１２５】
結果
我々は、ＤＲ６＋／−およびＤＲ６＋／＋動物と比較したときのＤＲ６−／−動物における樹状突起棘の増加した密度および幅を観察した(図２)。密度は、同群内のすべての動物全体の細胞あたりの棘の全数／樹状突起長の平均を出すことによって算出した。ＤＲ６＋／−に２６細胞／７動物、およびＤＲ６＋／＋に２６細胞／６動物に対して、合計２８細胞／８動物にＤＲ６−／−を付した。棘の幅と長さは、遺伝子型ごとに分析した棘の全体の累積的なプロットとしてプロットした。
上掲のBittner等の結果は、ＡＰＰがＤＲ６の同族リガンドであるという我々の先の所見と同様に、ＡＰＰは樹状突起棘密度において同様に役割を有することを示す。
【０１２６】
実施例２：インビトロでの樹状突起棘に対するＮ−ＡＰＰの効果
材料と方法
細胞培養：  ＰＤＬ／ラミニンコート８ウェルスライド(Becton, Dickinson and Company)は、１ウェル当たり５００μｌの神経基礎培地(Invitrogen)＋５０ｎｇ／ｍｌの各組み換えＢＤＮＦおよびＮＴ−３(Chemicon)、＋Ｂ−２７添加物Ｘ５０(Invitrogen)、＋Ｐｅｎ ＳｔｒｅｐグルタミンＸ１００(Cat. No. 10378-016; Gibco)＋グルコースＸ１００にて満たした。Ｅ１６皮質ニューロン移植片を各ウェルに配置し、３７℃のインキュベーターに２１日間置いた。２１日目に、培養物を、０、１、３、１０又は３０μｇ／ｍｌのＮ−ＡＰＰにて処理した。培養物を２４時間インキュベートした。次いで、ニューロンは、固定し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ(登録商標)４８８(Molecular Probes)にコンジュゲートさせた二次抗体(ヤギ-抗マウスＩｇＧ)とマウス抗ＰＳＤ９５抗体を使用して染色することによって電子顕微鏡法のために処理した。結果を図３に示す。
ニューロン１ｍｍあたりの斑点を定量化し、未処置の皮質ニューロン(コントロール)の１パーセントの変化として斑点／ｍｍの変化としてプロットした。結果を図４に示す。
異なる実験において、培養物中の皮質細胞を、３０ｕｇ／ｍｌの抗ＤＲ６抗体ａＤＲ６.１の添加又は無添加での、０ｕｇ／ｍｌのＮ−ＡＰＰ(コントロール)、又は０．１、０．３、１．０又は３．０ｕｇ／ｍｌの濃度の酸性尾部の無いＮ−ＡＰＰ(Ｎ-ＡＰＰ(−)酸性尾部)又は完全長Ｎ−ＡＰＰ(Ｎ-ＡＰＰ ＦＬ)に曝した。結果を図５に示す。
【０１２７】
結果
図３は、Ｎ−ＡＰＰがＰＳＤ９５斑点の減少を引き起こすことを示す。ＰＳＤ９５斑点の減少は、図４に示すように濃度依存性であった。結果は、神経変性および／または神経突起(軸索又は樹状突起)長および枝分れの減少を引き起こすＤＲ６とのＮ−ＡＰＰ相互作用と一致しており、樹状突起棘の喪失はＰＳＤ９５斑の減少で示される。図５は、ＰＳＤ９５斑のＮ−ＡＰＰが誘導する減少がＤＲ６に依存していたことを示す。
【図４】
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【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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