(57)【要約】  本発明は、自然免疫応答を促進するための細菌ゴースト(BG)の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
自然免疫応答を促進するのに使用するための細菌ゴースト(BG)。
【請求項２】
細菌ゴーストの表面が、フラジェリンモノマーを含まない、請求項1に記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項３】
細菌ゴーストの表面が、フラジェリンを含まない、請求項1又は2に記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項４】
自然免疫応答が、少なくとも1種の自然免疫調節物質の発現及び/又は放出の誘導により促進される、請求項1から3のいずれかに記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項５】
少なくとも1種の自然免疫調節物質の発現及び/又は放出が、上皮細胞において誘導される、請求項4に記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項６】
上皮細胞がケラチノサイトである、請求項5に記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項７】
少なくとも1種の自然免疫調節物質が、抗菌防御分子、炎症性サイトカイン、活性窒素種(RNS)及び活性酸素種(ROS)からなる群から選択される、請求項4から6のいずれかに記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項８】
少なくとも1種の抗菌防御分子の発現が増強される、請求項4から7のいずれかに記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項９】
少なくとも1種の抗菌防御分子が、ソリアシン及びヒトβデフェンシン-2(hBD-2)からなる群から選択される、請求項8に記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項１０】
少なくとも1種の炎症性サイトカインの発現及び/又は放出が増強される、請求項4から9のいずれかに記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項１１】
少なくとも1種の炎症性サイトカインが、インターロイキン-6(IL-6)及びインターロイキン-8(IL-8)からなる群から選択される、請求項10に記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項１２】
少なくとも1種の活性窒素種(RNS)の放出が増強される、請求項4から11のいずれかに記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項１３】
活性窒素種がNOである、請求項12に記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項１４】
自然免疫応答が、哺乳類、好ましくはヒトにおいて促進される、請求項1から13のいずれかに記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項１５】
更なる活性剤と組み合わせて投与される、請求項1から14のいずれかに記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項１６】
薬物がレスベラトロールである、請求項15に記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項１７】
非病原性グラム陰性細菌に由来する、好ましくは大腸菌株に由来する、請求項1から16のいずれかに記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項１８】
大腸菌株が、大腸菌Nissle 1917である、請求項17に記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項１９】
皮膚及び/又は粘膜に投与される、請求項1から18のいずれかに記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項２０】
経口、局所、粘膜、肺及び/又は経鼻投与される、請求項1から19のいずれかに記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項２１】
免疫系が不全の個体に投与される、請求項1から20のいずれかに記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項２２】
自然免疫応答を促進する方法であって、有効量の細菌ゴースト(BG)を、それを必要とする患者、特にヒト患者に投与する方法。
【請求項２３】
自然免疫応答を促進するための細菌ゴースト(BG)の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自然免疫応答を促進するための細菌ゴースト(BG)の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、細菌、ウイルス及び寄生虫等の病原体並びに腫瘍細胞を特定し死滅させることにより、疾患から生物を保護する。病原体を認識し中和するために複数の機序が進化してきた。典型的な脊椎動物免疫系は、特異性が次第に増加する数種の防御ラインを含む。非常に簡潔に言うと、物理的障壁は、病原体が生物に進入するのを防ぐ。病原体がこの障壁を破ると、自然免疫系が、迅速だが非特異的な応答を生じる。病原体が自然免疫応答の回避に成功した場合に、脊椎動物は、保護の第三の層である、自然免疫応答により活性化される獲得免疫系を保有している。そこで免疫系は、その応答を感染の際に適応させて、その病原体認識を改善する。その後、この改善された応答は、病原体が排除された後も免疫記憶の形で保持され、獲得免疫系がこの病原体と遭遇する度により速くより強く反応できるようにする。前記免疫記憶も、免疫化の根底をなす原理である。本発明の文脈において、自然免疫系について特に注目している。
【０００３】
自然免疫系は、非特異的様式で微生物の侵入から宿主を保護する働きをする。例えば、マクロファージ、単球、好中球及び樹状細胞による細菌、ウイルス又は原生動物の食作用により活性化されると、自然免疫系は、一連の宿主防御応答を誘発する(Akiraら、2006.Cell 124:783〜801)。これらの応答の中心的機序は、炎症性サイトカイン、抗菌防御分子、加水分解酵素、活性酸素種(ROS)又は活性窒素種(RNS)の産生及び/又は放出である。病原体関連分子パターン(PAMP)と称される微生物病原体の様々な成分は、自然免疫系のパターン認識受容体(PRR)により認識される。この受容体の中でも、Toll様受容体(TLR)、NOD様受容体(NLR)、RIG様受容体(RLR)及びペプチドグリカン様認識タンパク質(PGRP)は全て、病原体に対する初期宿主防御に寄与する(Creagh and O'Neill、2006.Trends Immunol.27:352〜357;Dziarski and Gupta、2006.Cell Microbiol.8:1059〜1069;Ishiiら、2008.Cell Host.Microbe 3:352〜363)。例えば、鞭毛のモノマーサブユニットである細菌PAMPフラジェリンは、TLR5と結合し、転写因子NF-カッパーBを活性化し(Hayashiら、2001.Nature 410:1099〜1103)、最終的にヒト初代ケラチノサイト(KC)において炎症性サイトカイン並びにソリアシン(S100A7c)及びヒトβ-デフェンシン2(hBD-2)等の抗菌ペプチドを発現させる(Abtinら、2008.FASEB J.7:2168〜2176;Akira and Takeda、2004.Nat.Rev.lmmunol.4:499〜511;Millerら、2005.J.Immunol.174:6137〜6143)。
【０００４】
大腸菌(E.coli)細胞培養上清又は大腸菌株の破砕細胞が、上皮KCにおける抗菌ペプチド、ソリアシン及びhBD-2の発現を誘導及び/又は増強することが報告された(Abtinら、2008.FASEB J.7:2168〜2176;Glaserら、2005.Nat.lmmunol.6:57〜64)。前記応答は、細胞の破片により誘発される。以前に報告された通り、KCによる大腸菌に対する応答性は、TLR5及びそのリガンド、フラジェリンにより媒介される(Abtinら、2008.FASEB J.7:2168〜2176)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Akiraら、2006.Cell 124:783〜801
【非特許文献２】Creagh and O'Neill、2006.Trends Immunol.27:352〜357
【非特許文献３】Dziarski and Gupta、2006.Cell Microbiol.8:1059〜1069
【非特許文献４】Ishiiら、2008.Cell Host.Microbe 3:352〜363
【非特許文献５】Hayashiら、2001.Nature 410:1099〜1103
【非特許文献６】Abtinら、2008.FASEB J.7:2168〜2176
【非特許文献７】Akira and Takeda、2004.Nat.Rev.lmmunol.4:499〜511
【非特許文献８】Millerら、2005.J.Immunol.174:6137〜6143
【非特許文献９】Glaserら、2005.Nat.lmmunol.6:57〜64
【非特許文献１０】Witteら、1990.Biochimie 72:191〜200
【非特許文献１１】Witteら、1990.J.Bacteriol.172:4109〜4114
【非特許文献１２】Mayrら、2005.Adv.Drug Deliv.Rev.57:1381〜1391
【非特許文献１３】Jalavaら、2003.Expert.Rev.Vaccines.2:45〜51
【非特許文献１４】Ekoら、2003.Vaccine 21:3663〜3674
【非特許文献１５】Jechlingerら、2005.Vaccine 23:3609〜3617
【非特許文献１６】Pauknerら、2006.Expert.Opin.Drug Deliv.3:11〜22
【非特許文献１７】Kudelaら、2007.Cancer Lett.1:54〜63
【非特許文献１８】Huterら、1999.Journal of Controlled Release 61:51〜63
【非特許文献１９】Bogdan、C.、2001.Nat Immunol 2(10):907〜16頁
【非特許文献２０】Bogdan、C.、2000. Immunol Rev.173:17〜26頁
【非特許文献２１】Bogdanら、2000. Curr Opin Immunol.12(1):64〜76頁
【非特許文献２２】Sharmaら、2007.Inflammopharmacology 15(6):252〜9頁
【非特許文献２３】Chakravortty and Hensel, 2003.Microbes Infect.5(7):621〜7頁
【非特許文献２４】Sum-mersgillら、1992. J Leukoc Biol.52(6):625〜9頁
【非特許文献２５】Aggarwalら、2004.Anticancer Res.24(5A):2783〜840頁
【非特許文献２６】Gaoら、2003.Biochem Pharmacol.66(12):2427〜35頁
【非特許文献２７】Falchettiら、2001.Life Sci.70(1):81〜96頁
【非特許文献２８】Saikoら、2008.Mutat Res.658(1〜2):68〜94頁
【非特許文献２９】Chan、2002.Biochem Pharmacol.63(2):99〜104頁
【非特許文献３０】Faithら、2006.Antiviral Res.72(3):242〜51頁
【非特許文献３１】Schrieverら、2003. Atherosclerosis.171(2):379〜80頁
【非特許文献３２】Leiroら、2004. Dis Aquat Organ.59(2):171〜4頁
【非特許文献３３】Leiroら、2004. Antimicrob Agents Chemother.48(7):2497〜501頁
【非特許文献３４】Kedzierskiら、2007.Parasitol Res.102(1):91〜7頁
【非特許文献３５】Kedzierskiら、2009.Curr Med Chem.16(5):599〜614頁
【非特許文献３６】Rendlら、2002.J.Invest Dermatol.119:1150〜1155
【非特許文献３７】Pfaffl.2001.Nucleic Acids Res.29:e45
【非特許文献３８】Batesら、2005.Mol.Microbiol.57:380〜391
【非特許文献３９】Mildnerら、2006.Biochem.Biophys.Res.Commun.348:76〜82
【非特許文献４０】Rasband、W.S.、ImageJ、U.S.NIH、米国メリーランド州ベテスダ;http://rsb.info.nih.gov/ij/、1997〜2009
【非特許文献４１】Kudelaら、2005.J.lmmunother.28:136〜143
【非特許文献４２】Malteniら、Cancer Lett.235(2006)、75〜83
【非特許文献４３】Dunzendorferら、J.Immunol.173(2004)、1166〜1170
【非特許文献４４】Witteら、1992.Arch Microbiol.157(4):381〜8頁
【非特許文献４５】Mayrら、2005.Infect Immun 73(8):4810〜7頁
【非特許文献４６】Greenら、1982 Anal Biochem.126(1):131〜8頁
【非特許文献４７】Repettoら、2008.Nat Protoc、2008.3(7):1125〜31頁
【非特許文献４８】Tsaiら、1999. Br J Pharmacol.126(3):673〜80頁
【非特許文献４９】Haslbergerら、2000.J Biotechnol.83(1〜2):57〜66頁
【非特許文献５０】Pauknerら、2003. J Drug Target 11(3):151〜61頁
【非特許文献５１】Applequistら、2003.Int Immunol.14(9):1065〜74頁
【非特許文献５２】Panaroら、1999.Int J Clin Lab Res.29(3):122〜7頁
【非特許文献５３】Ebensenら、2004.J Immunol.172(11):6858〜65頁
【非特許文献５４】Linら、2006 Faseb J.20(10):1742〜4頁
【非特許文献５５】Hirohashi and Morrison、1996.Infect Immun.64(3):1011〜5頁
【非特許文献５６】Maderら、1997.Vaccine.15(2):195〜202頁
【非特許文献５７】Udenigweら、2008.Nutr Rev.66(8):445〜54頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、自然免疫防御系、特に皮膚の自然免疫防御系を増強することである。従って、自然免疫調節物質の発現を刺激するべきである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従って、一態様において、本発明は、自然免疫応答を促進するための細菌ゴースト(BG)の使用に関する。
【０００８】
本発明によれば、驚くべきことに、KCによって細菌ゴースト(BG)の外被構造が認識され、自然免疫応答を促進することが判明した。特に、自然免疫応答が、天然又はほぼ天然の外被構造を有する細菌ゴーストにより促進され得ることが判明した。
【０００９】
BGは、細胞質内容物を欠く、細菌、特にグラム陰性細菌由来の非生細胞外被標本である。BGは、例えば、細菌におけるプラスミドにコードされた溶菌遺伝子の制御された発現により、例えば、グラム陰性細菌におけるプラスミドにコードされたバクテリオファージψΧ174の溶菌遺伝子Eの発現により産生することができる。遺伝子Eは、内膜及び外膜を融合してE特異的溶解トンネルを形成することができる膜タンパク質をコードし、全細胞質内容物はE特異的溶解トンネルを通して排出される(Witteら、1990.Biochimie 72:191〜200;Witteら、1990.J.Bacteriol.172:4109〜4114)。生存していない細菌外被であるBGは、天然の細菌の完全な細胞形態を維持する。外膜タンパク質、アドヘシン、リポ多糖(LPS)及びペプチドグリカンを含むあらゆる細胞表面構造は、BGに保存されている(Mayrら、2005.Adv.Drug Deliv.Rev.57:1381〜1391)。
【００１０】
BGが獲得免疫系を刺激できることが以前に示された。特に、BGは、それ自体の外被構造に対する免疫化のために用いても、外来標的抗原の抗原送達系として用いてもよい(Jalavaら、2003.Expert.Rev.Vaccines.2:45〜51;Mayrら、2005.Adv.Drug Deliv.Rev.57:1381〜1391)。コレラ菌(Vibrio cholerae)ゴーストによる免疫化は、ウサギ動物モデルにおいて、完全に病原性のあるコレラ菌に曝露した後の下痢及び死亡から保護する(Ekoら、2003.Vaccine 21:3663〜3674)、或いは、大腸菌BG表面におけるB型肝炎ウイルスのコア抗原の取り込みは、マウスにおける該コア抗原に対する有意な免疫応答を生じる(Jechlingerら、2005.Vaccine 23:3609〜3617)。BGは、ドキソルビシン(Pauknerら、2006.Expert.Opin.Drug Deliv.3:11〜22)等の活性物質の送達媒体として又はDNA(Kudelaら、2007.Cancer Lett.1:54〜63)や酵素(Huterら、1999.Journal of Controlled Release 61:51〜63)の担体として用いてもよい。
【００１１】
本発明において、細菌ゴーストは、自然免疫防御系、特に皮膚の自然免疫防御系を増強することも判明した。従って、細菌ゴースト(BG)を、自然免疫応答を促進するのに使用した。
【００１２】
本発明の好ましい実施形態において、細菌ゴーストの表面は、フラジェリンモノマーを含まない。
【００１３】
別の好ましい実施形態において、細菌ゴーストの表面は、フラジェリンを含まない。
【００１４】
フラジェリンは、重合して細菌鞭毛のフィラメントを形成する約30,000〜60,000ダルトンのタンパク質である。タンパク質フラジェリンは、細菌鞭毛の主要置換成分であり、殆ど全ての鞭毛細菌に大量に存在する。哺乳類において、獲得免疫応答、即ちT細胞応答及び抗体応答は、鞭毛抗原に対して、従って鞭毛細菌に対してよく産生される。これは恐らく、フラジェリンが鞭毛細菌において非常に豊富なタンパク質であり、更には、フラジェリンを認識する特異的自然免疫受容体、TLR5が存在するという事実によるものであろう。
【００１５】
表面にフラジェリンを含まない細菌ゴーストは、フラジェリンを発現することができない細菌株、例えばフラジェリン欠失変異体に由来し得る。或いは、前記細菌ゴーストは、フラジェリンを細胞表面に輸送することのできない細菌株に由来し得る。表面にフラジェリンを含まない細菌ゴーストを得るため、本技術分野において公知の任意の適切な遺伝子工学的方法を用いてよい。例えば、フラジェリンタンパク質をコードする遺伝子の欠失は、フラジェリン欠失変異体を生じる。或いは、フラジェリンの発現は、本技術分野において公知の任意の適切な方法により、例えば、RNAiを用いて抑制することができる。更に、フラジェリンタンパク質をコードする遺伝子に突然変異、例えば、未成熟終止コドンを導入して切断型タンパク質を発現させてもよい。フラジェリン遺伝子の発現制御配列の欠失及び/又は突然変異も機能喪失型遺伝子を生じ、よって、フラジェリンを発現できない細菌株を生じることができる。フラジェリンを細胞表面に輸送できない変異体細菌株は、例えば、個々のフラジェリン遺伝子配列の欠失及び/又は突然変異によって得ることもできる。前記技法は、当業者によく知られている。
【００１６】
フラジェリンが、自然免疫応答及び獲得免疫応答両方の刺激に重要な細菌成分であることを理解すると、フラジェリンを欠くBGも自然免疫応答の促進に効果的であることは、より一層驚くべきことであった。
【００１７】
自然免疫応答は、好ましくは、少なくとも1種の自然免疫調節物質の発現及び/又は放出の誘導により促進される。
【００１８】
免疫調節物質は、例えば免疫強化において、免疫抑制において又は免疫寛容誘導において、免疫応答を所望のレベルへ調整するのに関与する。本発明によれば、免疫強化、即ち、免疫応答の増強が望ましい。免疫応答は、その発生のスピード及び程度を増加させること並びにその持続期間を延長させることにより増強され得る。
【００１９】
自然免疫調節物質は、自然免疫応答に関与する、上に定義する免疫調節物質である。自然免疫調節物質の例として、炎症性サイトカイン、活性窒素種(RNS)及び活性酸素種(ROS)が挙げられる。
【００２０】
本発明によれば、抗菌防御分子、炎症性サイトカイン、活性窒素種(RNS)及び活性酸素種(ROS)からなる群から選択される少なくとも1種の自然免疫調節物質の発現及び/又は放出が誘導されることが好ましい。
【００２１】
抗菌ペプチド又は宿主防御ペプチドとしても知られる抗菌防御分子は、強力な広域抗生物質である。前記分子は、グラム陰性細菌及びグラム陽性細菌、マイコバクテリア、外被を有するウイルス、真菌並びに更にはトランスフォーム細胞又は癌性細胞を死滅させることが立証された。従来の抗生物質の大多数とは異なり、抗菌ペプチドは、免疫調節物質として機能することにより免疫を増強させる能力をも有し得る。抗菌防御分子の例として、ソリアシン及びヒトβデフェンシン-2(hBD-2)が挙げられる。
【００２２】
本発明によれば、ソリアシン及びヒトβデフェンシン-2(hBD-2)からなる群から選択される少なくとも1種の抗菌防御分子の発現が増強される。
【００２３】
炎症性サイトカインは、全身性炎症を促進するサイトカインである。炎症性サイトカインの例として、TNF-アルファ、インターロイキン-1(IL-1)、インターロイキン-6(IL-6)及びインターロイキン-8(IL-8)が挙げられる。
【００２４】
本発明によれば、インターロイキン-6(IL-6)及びインターロイキン-8(IL-8)からなる群から選択される少なくとも1種の炎症性サイトカインの発現及び/又は放出が増強される。
【００２５】
活性窒素種(RNS)は、それぞれ誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)及びNADPHオキシダーゼの酵素活性により産生された一酸化窒素(NO)及びスーパーオキシド(O2-)に由来する抗菌分子のファミリーである。iNOSは、サイトカイン及び微生物生成物、特にインターフェロン-ガンマ(IFN-γ)及びリポ多糖(LPS)による誘導後に、主にマクロファージにおいて発現される。しかし、一酸化窒素(NO)の生成は、貪食細胞だけの特色という訳ではない。免疫反応に関与する他の細胞、例えば上皮細胞又はケラチノサイトも、これらのラジカルを産生することができる(Bogdan、C.、2001.Nat Immunol 2(10):907〜16頁;Bogdan、C.、2000 Immunol Rev.173:17〜26頁;Bogdanら、2000 Curr Opin Immunol.12(1):64〜76頁)。
【００２６】
NOは、およそ6秒の急速な半減期を有する多義的な内在性の役割を示す多用途分子であることが示された(Sharmaら、2007.Inflammopharmacology 15(6):252〜9頁)。これは一方では、様々な細胞機能の重大なメディエーター分子を表すが、酸化的バースト条件下等、過剰量が産生されると、細胞傷害性及び変異原性作用を生じ得る(Sharmaら、2007.Inflammopharmacology 15(6):252〜9頁)。
【００２７】
NOは抗菌剤として作用するため、これは、サルモネラ菌(Salmonella enterica)、トリパノソーマ・ムスクリ(Trypanosoma musculi)、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)又は森林型熱帯リーシュマニア(Leishmania major)等、細胞内病原体と戦うために絶対に必要である(Chakravortty and Hensel, 2003.Microbes Infect.5(7):621〜7頁;Sum-mersgillら、1992 J Leukoc Biol.52(6):625〜9頁)。
【００２８】
高反応性NOは、多くの疾患の病態生理に関与する。しかし、様々なエフェクター及び免疫調節機能、例えば、抗菌、抗腫瘍及びアポトーシス活性、或いはそのサイトカイン及びT細胞分化の調節特性のため、NOは、免疫系において重要な役割を果たす。低濃度のNOは、特定の細菌病原体に対する抗菌活性に寄与するが、高濃度では、炎症及び発癌における役割を果たすことが判明した。実際には、構成的に発現される神経細胞NOS(nNOS又はNOS1としても知られる)及び内皮NOS(eNOs又はNOS3)、並びに誘導型アイソフォーム(iNOS又はNOS2)として知られる、3種の主要な一酸化窒素合成酵素(NOS)アイソフォームが存在する。後者は、マクロファージ及びケラチノサイトにおけるNO産生に関与する。3種のNOSは全て、1分子のL-アルギニンのグアニジン窒素を酸化して酸化型中間体とし、1分子のNO及びL-シトルリンを生じる(Bogdan、C.、2001.Nat Immunol 2(10):907〜16頁; Bogdan、C.、2000 Immunol Rev.173:17〜26頁;Bogdanら、2000 Curr Opin Immunol.12(1):64〜76頁;Sharmaら、2007.Inflammopharmacology 15(6):252〜9頁)。
【００２９】
細菌のリポ多糖(LPS)は、iNOS誘導に最も重要な刺激の一つである。保存された細菌成分のマクロファージセンサーは、その主要アゴニストLPSの結合により自然免疫系を誘発することができるTLR4によって表される(Ishiiら、2008 Cell Host Microbe.3(6):352〜63頁)。
【００３０】
NFカッパーb等の転写因子の結合部位は、iNOS遺伝子のプロモーター領域に存在する。マクロファージをLPSに曝露してそれを活性化すると、発現が増強される(Bogdanら、2000 Curr Opin Immunol.12(1):64〜76頁)。
【００３１】
本発明によれば、少なくとも1種の活性窒素種、例えばNOの放出が増強される。
【００３２】
活性酸素種(ROS)は、酸素原子を含有するフリーラジカルである。これは、不対原子価殻電子が存在するため高反応性である。ROSは、正常な酸素代謝の天然副産物として発生し、細胞シグナル伝達において重要な役割を有する。しかし、環境ストレス(例えば、UV又は熱曝露)を受けるとROSレベルは劇的に増加して、細胞構造に有意な損傷を生じ得る。これが積み重なり、酸化ストレスとして知られる状況となる。
【００３３】
本発明によれば、少なくとも1種の活性酸素種の放出が増強される。
【００３４】
活性窒素種は、活性酸素種(ROS)と共働して細胞に損傷を与え、ニトロソ化ストレスを生じる。従って、これら2種はしばしばROS/RNSと総称される。
【００３５】
本発明の別の好ましい実施形態において、更なる活性剤、例えば、薬物及び/又は他の生物学的物質を、細菌ゴーストと組み合わせて投与することができる。活性剤が細菌ゴーストに実質的に取り込まれるよう、前記活性剤を細菌ゴーストに添加することができる。或いは、活性剤は、単に細菌ゴーストの近傍に存在する。活性剤は、免疫調節物質、即ち、免疫系の増強に適した薬物及び/又は物質、特に、自然免疫系、獲得免疫系又はその両方における効果を呈する薬物及び/又は物質となり得る。或いは、前記活性剤は、その他のプロドラッグ又は薬物となり得る。当業者であれば、種々の適切なプロドラッグ及び薬物を理解している。細菌ゴーストと共に用いるための特定の活性剤は、患者の自然免疫系を刺激するため、細菌ゴーストを投与される患者の特異的な状況を考慮しつつ決定されるであろう。活性剤は、ポリフェノール、例えばレスベラトロール等の抗酸化剤であってもよい。
【００３６】
レスベラトロールは、広範囲の免疫調節活性を示す、様々な植物種、特にブドウ、ピーナッツ及び液果類の皮に存在するトランス又はシス異性体型のいずれかで自然発生するポリフェノール化合物である。多くの研究が、レスベラトロールに様々な生物における抗癌、抗酸化及び心臓保護特性並びに寿命延長を割り振った(Aggarwalら、2004.Anticancer Res.24(5A):2783〜840頁;Gaoら、2003.Biochem Pharmacol.66(12):2427〜35頁;Falchettiら、2001.Life Sci.70(1):81〜96頁;Saikoら、2008.Mutat Res.658(1〜2):68〜94頁)。更に、レスベラトロールは、動物及びヒトの種々の感染症の治療において高い治療可能性を保有する。その活性は、皮膚糸状菌(Chan、2002.Biochem Pharmacol.63(2):99〜104頁)及びウイルス様単純ヘルペス(Herpes simplex)(Faithら、2006.Antiviral Res.72(3):242〜51頁)に対し立証された。レスベラトロールの増殖阻害効果は、急性気道感染の原因となる細胞内肺炎クラミジア(Chlamydia pneumoniae)等、広範な細菌種に対し実証された(Chan、2002.Biochem Pharmacol.63(2):99〜104頁;Schrieverら、2003 Atherosclerosis.171(2):379〜80頁)。更に、レスベラトロールにより、魚類の疾患の原因となる原生動物種の感染力減少が達成され(Leiroら、2004 Dis Aquat Organ.59(2):171〜4頁;Leiroら、2004 Antimicrob Agents Chemother.48(7):2497〜501頁)、ごく最近では、皮膚リーシュマニア症の原因である細胞内皮膚病原体森林型熱帯リーシュマニア(L.major)の排除が立証された(Kedzierskiら、2007.Parasitol Res.102(1):91〜7頁;Kedzierskiら、2009.Curr Med Chem.16(5):599〜614頁)。
【００３７】
本発明に従って用いられる細菌ゴーストは、種々の細菌に由来し得る。好ましくは、細菌ゴーストは、非病原性グラム陰性細菌、より好ましくは大腸菌株に由来する。いかなる大腸菌株を用いてもよい。適切な大腸菌株の一例は、大腸菌Nissle 1917である。
【００３８】
上に概略する通り、皮膚等の表面障壁は、感染に対する第一の防御ラインである機械的障壁の例である。更に、皮膚及び気道は、抗菌ペプチド、例えばβ-デフェンシンを分泌し、これにより感染から保護する化学的障壁として機能する。従って、自然免疫応答は、好ましくは、皮膚及び/又は粘液性膜(mucous membrane)とも命名される粘膜(mucosa)において促進される。粘膜の例として、口腔、頬側、食道、胃、腸、呼吸器、気管支、鼻、嗅覚器、子宮、陰茎粘膜及び子宮内膜が挙げられる。
【００３９】
皮膚及び粘膜は、上皮細胞からなる。上皮細胞は、身体中の構造の腔及び表面を裏打ちする細胞で構成された組織を表す上皮を形成する。
【００４０】
ケラチノサイトは、表皮、即ち皮膚外層の主成分である。ケラチノサイトは、休止状態ではIL-4及びTGFβ等、阻害性サイトカインを分泌することにより免疫応答の統合性を維持する必須免疫調節物質であるが、ケラチノサイトは、誘発されるとTNFα及び1L-1β分泌により皮膚炎症及びランゲルハンス細胞活性化を刺激する。
【００４１】
本発明によれば、少なくとも1種の自然免疫調節物質の発現及び/又は放出は、好ましくは上皮細胞において誘導される。好ましくは、上皮細胞はケラチノサイトである。
【００４２】
自然免疫応答の刺激は、他の生物による感染に対する宿主防御を非特異的様式で増強すると考えられる。従って、本発明によれば、自然免疫応答が、哺乳類、好ましくはヒト、より好ましくは感染に対して感受性が高い個体又は免疫系が不全の個体において促進されることが好ましい。
【００４３】
本発明の更なる態様において、細菌ゴーストは、哺乳類、好ましくはヒトに投与される。細菌ゴーストは、皮膚及び/又は粘膜に投与されることが好ましい。
【００４４】
細菌ゴーストの適切な投与様式として、経口、局所、粘膜、経鼻及び/又は肺投与が挙げられる。
【００４５】
適切な医薬製剤は、例えば、ガム、吸入器、経鼻スプレー、皮膚パッチ、軟膏、ローション、エアロゾル、坐剤、灌注、ゲル状液体、懸濁液、練り歯磨きの形態である。
【００４６】
本発明によれば、細菌ゴーストは任意の個体に投与することができる。好ましくは、細菌ゴーストは、乳児、幼児、高齢者、慢性疾患個体、免疫系が不全の個体、例えばAIDS患者、被移植者に投与される。
【００４７】
更なる態様において、本発明は、自然免疫応答を促進する方法であって、細菌ゴースト(BG)を患者に投与する方法に関する。細菌ゴーストの適切な投与様式及び適切な医薬形態/剤形/製剤は、上述の通りである。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】BGが、ヒト初代KCにおける抗菌ソリアシンの発現を誘導することを示す図である。フラジェリン(10ng/ml)、IL-1α(10ng/ml)又は2×106〜2×108粒子/mlで変動する野生型大腸菌BGと共に、或いは刺激なし(NC)でKCを24時間インキュベートし、その後、全RNAを単離してcDNAに逆転写した。抗菌ソリアシンの相対発現をqRT-PCRにより決定した。未処理細胞(NC)に対する平均値を表示する。相対遺伝子発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子β-2-ミクログロブリンの発現に対し正規化した。データは、三回複製試料の平均±SDを表す。
【図２】野生型及びΔFliC大腸菌BGによるKCにおけるソリアシンの誘導を示す図である。1×106〜2×109粒子/mlの野生型及びΔFliC大腸菌BGと共に、KCを48時間インキュベートした。フラジェリン(10ng/ml)、IL-1α(10ng/ml)、非刺激細胞(NC)、非馴化細菌培養用培地(CM)並びに野生型大腸菌(CS 野生型)及びΔFliC大腸菌(CS  ΔFliC)の培養上清による刺激は、対照として用いた。刺激48時間後に、KCの細胞ライセートをソリアシン産生のイムノブロット解析に付した(A)。ソリアシンタンパク質発現のイムノブロット(A)を、KCのIL-1α刺激に対し正規化した濃度測定解析により定量化した(B)。3回行った実験のうち代表的な一実験を示す。
【図３】BGが、炎症性サイトカインの分泌を誘導することを示す図である。1×106〜2×109粒子/mlの野生型大腸菌及びΔFliC大腸菌BGと共に並びに野生型及びΔFliC大腸菌の培養上清(CS)の存在下で、KCを48時間インキュベートした。非刺激細胞(NC)及び非馴化細菌培養用培地(CM)の存在下でインキュベートした細胞を陰性対照とした。インキュベーション期間の後、KCの培養用培地を収集し、IL-6(A)及びIL-8(B)の濃度をELISAにより決定した。データは、三回複製して行った3回の独立的実験の平均±SDを表す。
【図４】ヒト初代KCによるBG内部移行の比較フローサイトメトリー解析を示す図である。FITC標識BG(1×103/細胞)-野生型大腸菌(A)及びΔFliC大腸菌(B)BG(白ヒストグラム-実線)と共に2時間+37℃で、KCをインキュベートした。BGなし(網掛けヒストグラム)、或いは非標識BG(白ヒストグラム-点線)と共にインキュベートした細胞を対照とした。値は、FITC標識BGと共にインキュベートした陽性細胞のパーセンテージから、BGなし又は非標識BGと共にインキュベートした蛍光増加細胞のパーセンテージを差し引いて算出した。各バーは、4回の独立的実験の平均±SDを表す(C)。
【図５】RV負荷(loading)溶液と、負荷された大腸菌NM522ゴーストから回収された量との間の相関を示す図である。RV負荷溶液及びエタノール抽出後のRV量の直接相関は、直線回帰により示される。HPCL測定により値を得た(A)。図(B)は、適用したFITC標識BGと、RAW264.7細胞と20分間同時インキュベーションした後に会合したFITC標識BGとの間の直線回帰を示す。値は、4回の独立的測定値の平均を表し、これは、材料と方法に記載されている通りに算出された。
【図６】マウスマクロファージによるBGの付着及び取り込みを示す図である。ゴースト対細胞比1000でFITC標識大腸菌NM522ゴーストとマクロファージをインキュベーションした後に、共焦点レーザー走査顕微鏡観察を行った。RAW264.7細胞をテキサスレッドファロイジンで染色した。細胞内部に位置するFITC標識BGは黄色に見え、取り込まれていないBGは緑色を呈する。画像は、様々な光学切片の代表的な単一z-stackを表示する。20分間のインキュベーション後に、20倍の対物レンズを用いて(A)、或いは40分間のインキュベーション後に63×油浸(oil)対物レンズを用いて(Bの)写真を撮影した。画像処理工程は為されていない。
【図７】NO産生の誘導を示す図である。RAW264.7細胞を様々なLPS濃度で20時間処理した(A)。20分間処理し、20時間更にインキュベーションした後の、NO産生の刺激における様々な量のBGの影響(B)。用量依存的誘導は、MOI 1000まで観察することができる。更に量が多くなっても、影響が更に大きくなることはなかった。後者の実験において20分間処理を行い、20時間後、材料と方法に記載されているグリース(Griess)アッセイによりNO濃度を決定した。バーは、平均値+SDを示す。各実験ポイントは、三回複製した4回の独立的培養測定の値を表す。
【図８】様々なBG量によって誘導されたマクロファージ細胞系RAW264.7におけるNO産生におけるRV及びRV負荷BGの影響を示す図である。様々なRV濃度により同時処理した後のBG(BG対細胞比500)により誘導されたNO産生の低下を示す(A)。BG対細胞比100における処理後のNO産生の低下を図(B)に示す。NO刺激における非常に有意な減少が比率1000で見られた(C)。細胞会合BGからの計算に基づくと、BG対細胞比100及び1000は、それぞれRV濃度0.48+0.25μM及び8.86+2.21μMに相当する。BG負荷RVが、NO産生の誘導を有意に低下させたことが認められる。比較すると、外部に配置されたRVは、MOI 100における化学送達BGの量よりもおよそ6倍多い量であっても全く影響がない。全実験において20分間の処理を行い、20時間後、材料と方法に記載されている通り、グリースアッセイによりNO濃度(A〜C)を決定した。バーは、平均値+SDを示す。各実験ポイントは、三回複製した4回の独立的培養測定の値を表す。アスタリスクは、その個々の対照と有意差のある値を示す(p<0.05)。独立両側スチューデントt検定(unpaired two tailed Student's t-test)により解析を行った。
【図９】RAW264.7マクロファージの生存率における空の大腸菌NM522 BGの影響を示す図である(A)。3種の異なるBG対細胞比(10、100、1000)で細胞を20分間インキュベートした後20時間の回復期間(白いバー)に付した、或いは24時間インキュベートした。ニュートラルレッドアッセイを用いて細胞生存率を評価した。RV負荷BG(46μg RV/1×1010BG)の意味するところとは対照的な、RVの細胞傷害性効果を示す(B)。15μMのRVは対照と変わらないが、30μMのRVは生存率の20%減少をもたらした。10及び100のMOIのRV-BGによる処理後にマクロファージの刺激性増殖が観察された。ゴースト対細胞比1000における同時インキュベーションは、細胞生存率の有意な減少をもたらした(P=0.0462)。バーは、平均値+SDを示す。各実験ポイントは、三回複製した4回の独立的培養測定の値を表す。アスタリスクは、その個々の対照と有意差のある値を示す(p<0.05)。独立両側スチューデントt検定により解析を行った。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
次に、非限定的な実施例により本発明を更に説明する。
【００５０】
(実施例)
(実施例1)
細菌ゴーストはヒトケラチノサイトにおける自然免疫応答を促進する
上皮細胞、特にヒトKCによる自然免疫調節物質の発現を誘導するBGの能力について、殆ど知られていない。本研究において、ヒト初代KCにおける抗菌ペプチド及び炎症性サイトカイン発現を誘導する大腸菌BGの能力が調査された。得られた結果は、BG表面におけるフラジェリンの存在が、ヒトKCによる抗菌ソリアシン及びhBD-2の発現並びにインターロイキン(IL)-6及びIL-8の放出を増強することを立証する。
【００５１】
材料と方法
細胞培養
新生児包皮から調製されたヒト初代KCをClonetics(米国カリフォルニア州サンディエゴ)から入手し、以前に記載された通りに(Rendlら、2002.J.Invest Dermatol.119:1150〜1155)無血清ケラチノサイト増殖培地(KGM、Clonetics)において培養した。刺激のため、3回継代KCを12ウェル組織培養プレート(Corning Incorporated、米国ニューヨーク州コーニング)において培養し、60〜70%コンフルエンスで用いた。ケラチノサイト基本培地(KBM、Clonetics)において刺激を行った。
【００５２】
RNA単離及びqRT-PCR
刺激後に、細胞をリン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄し、TRIzol(登録商標)試薬(Invitrogen、米国カリフォルニア州カールズバッド)を用いてメーカーの説明書に従ってRNAを単離した。cDNA合成のために、Gene Amp RNA PCRキット(Applied Biosystems、米国カリフォルニア州フォスターシティ)及びオリゴdTプライマー(Roche Diagnostics、スイス、バーゼル)を用いてMuLV逆転写酵素によりRNAを逆転写した。研究対象の遺伝子のcDNA配列をGenBankから得た。Whitehead Institute for Biomedical Research(米国マサチューセッツ州ケンブリッジ)のPRIMER3ソフトウェアを用いてプライマーを設計した。次の遺伝子に次のフォワード(F)及びリバース(R)イントロンスパニング(intron-spanning)プライマーを用いた。
β-2-ミクログロブリン(B2M):F,5'-GATGAGTATGCCTGCCGTGTG-3';
R,5’-CAATCCAAATGCGGCATCT-3';
ソリアシン:F,5’-GGAGAACTTCCCCAACTTCCTT-3';
R,5'-GGAGAAGACATTTTATTGTTCCT-3'-
増幅及び検出のためのFast Start SYBR Green Iキット(Roche Diagnostics)を用いてLightCycler技術によりqRT-PCRを行った。全アッセイにおいて、標準化プログラム(10分間の変性工程並びに55サイクルの95℃5秒、65℃15秒及び72℃15秒;0.1℃刻みの融点解析;最後に冷却工程)を用いてcDNAを増幅した。各LightCyclerキャピラリーに、1.5μlのDNAマスターミックス;1.8μlのMgCl2(25mM);10.2μlのH20;及び0.5μlの各プライマー(10μM)を添加した。Pfafflの数理モデル(Pfaffl.2001.Nucleic Acids Res.29:e45)を用いて標的遺伝子発現の相対的定量化及び増幅効率の決定を行った。標的遺伝子の発現は、ハウスキーピング遺伝子β-2-ミクログロブリンの発現に対し正規化した。全リアルタイムPCRは、三回複製して行った。PCR反応の特異性は、PCR産物の配列決定により確認した。
【００５３】
BG産生及びKC刺激
大腸菌NK9373(野生型)及びfliC遺伝子内にインフレーム欠失を有するフラジェリン欠損株である大腸菌NK9375(ΔfliC)(Batesら、2005.Mol.Microbiol.57:380〜391)は、David Bates博士(ベイラー医科大学(Baylor College of Medicine)、テキサス州ヒューストン)のご厚意により分譲して頂いた。溶解プラスミドpGLysivb(未発表)を有する大腸菌株を、ゲンタマイシン(20μg/ml)を含有する動物質不含Lennox Broth(LBv;10g/l大豆ペプトン(sojapeptone)、5g/l酵母エキス、5g/l NaCl)において35℃で増殖させた。単一の形質転換体コロニーに由来する4mlのグリセリンストックを2リットルの培地に接種し、一晩インキュベーションした後、発酵前培養物として用いた。発酵は、Techfors S発酵槽(Infors Ag、スイス、ボットミンゲン)を用いて20ｌの培地で行った。次のパラメータ、温度、流動、撹拌機、pH、p02、起泡性並びに酸、塩基及び消泡剤のためのポンプを記す。細菌の増殖及び溶解に続き、スパイラルプレーター(WASP system、Don Whitley Scientific Limited、英国ウェストヨークシャー)を用いたコロニー形成単位の決定及び定期的に採取した試料の顕微鏡観察により光学密度(OD600)の測定を行った。pH7.2に調整したLBv培地においてエアレーション及び撹拌(プログラムされたシーケンスにより制御された流動及び撹拌)しつつ、細菌を対数増殖中期(mid-logarithmic stage)まで増殖させた。42℃へと温度上昇させることにより、溶解タンパク質Eの発現を誘導した。溶解プロセスが完了した後(p02レベルがプラトーに達する)、ベータ-プロピオラクトン(BPL)を添加して残存する無傷細菌を死滅させた。30分間の時間間隔を置きつつ、等しい2用量で合計0.075%のBPLを添加した。BPLとのインキュベーションのため、撹拌速度を600rpmに設定した。分離器(CTC1、GEA Westfalia Separator GmbH、ドイツ、エルデ)による収集のため、温度を16℃に設定し、約200ml/分の流速を用いた。BGペレットを再懸濁する前に、5Lの滅菌蒸留水でシステムをリンスし、その後、Hermle ZK 401遠心分離機(Hermle Labortechnik GmbH、ドイツ、ヴェーインゲン)を用いた8,000分-1、4℃、15分間の再懸濁/遠心分離サイクル5回により、総容量7.5Lの蒸留水でBGを洗浄した。最終ペレットを200mlの蒸留水に再懸濁し、凍結乾燥ボトルに分注して-80℃で保存した。Lyolab B(LSL Secfroid、スイス、アクラン)凍結乾燥機を用いて、試料を約60時間凍結乾燥した。KCに適用する前に、大腸菌NM522、大腸菌NK9373(野生型)及び大腸菌NK9375(ΔfliC)の凍結乾燥BGをKBM培地に再懸濁した。in vitroアッセイのため、組換えIL-1α(R&D Systems、米国ミネソタ州ミネアポリス)及びネズミチフス菌(S.typhimurium)由来の精製フラジェリン(Invitrogen)を用いた。Abtinら(FASTEB J 22(2008)、2168〜2176)に記載されている通り、野生型及びΔFliC大腸菌の培養上清を調製した。KC刺激前に、培養上清をKBMに1:100希釈した。
【００５４】
サイトカイン測定
刺激したKCの培養上清は、遠心分離により脱離細胞又は細胞破片を枯渇させ、解析まで-20℃で保存した。酵素結合免疫吸着測定法(ELISA;R&D Systems)によりメーカーの説明書に従ってIL-6及びIL-8の濃度を決定した。
【００５５】
イムノブロット解析
タンパク質発現解析のため、SDS-PAGEローディングバッファー(50mM Tris、pH7.4、2%SDS)にKCを溶解した。超音波処理の後、遠心分離により不溶性細胞デブリを除去し、BCA(ビシンコニン酸)法(Pierce、米国イリノイ州ロックフォード)によりタンパク質濃度を測定した。以前に記載された通りに(Mildnerら、2006.Biochem.Biophys.Res.Commun.348:76〜82)ウエスタンブロット解析を行った。タンパク質ライセートの添加量が等しいことをメンブレンのポンソーS染色により確認した。次の一次(first step)抗体、マウスモノクローナルIgG1抗ソリアシンクローン47C1068(1:500希釈;Abｃam、英国ケンブリッジ)を用いた。Chemiglow試薬(Alpha Innotech、米国カリフォルニア州サンリアンドロ)を用いてメーカーの説明書に従ってメンブレンを現像した。
【００５６】
ImageJソフトウェアに基づく解析を適用して、イムノブロット解析により得られたバンドの密度を定量化した(Rasband、W.S.、ImageJ、U.S.NIH、米国メリーランド州ベテスダ;http://rsb.info.nih.gov/ij/、1997〜2009)。様々な粒子濃度の野生型及びΔFliC大腸菌BGによるKCの刺激後に得られたソリアシン発現の値を、組換えIL-1αによるKC刺激後に得られたソリアシン発現の値に対し正規化した。
【００５７】
フルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識BGの取り込み
以前に記載された通りに(Kudelaら、2007.Cancer Lett.1:54〜63;Kudelaら、2005.J.lmmunother.28:136〜143)ヒト初代KCのエンドサイトーシス活性の効率を測定した。即ち、24ウェルプレートにおいて培養したヒト初代KC(2×105細胞/ウェル)をFITC-BG(細胞当たり1000)と共に2時間+37℃でインキュベートした。インキュベーションの後、細胞をPBSで3回洗浄して過剰なBGを除去した。最後に、TrypLE(商標)Express(Invitrogen)を用いて細胞を脱離させ、PBSで2回洗浄し、PBSに溶解した冷1.5%パラホルムアルデヒド(Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス)において固定し、BD FACSCanto(商標)フローサイトメーター(BD Biosciences、Pharmingen、米国サンノゼ)において解析した。
【００５８】
統計解析
GraphPad Prismバージョン5(GraphPadソフトウェア、カリフォルニア州ラホヤ)により得られた結果を解析した。2群間の差の統計的有意性をスチューデントt検定により評価し、3群以上の間の差は一元配置ANOVAにより評価した。p<0.05の差が有意であると考慮された。
【００５９】
結果
BGによるヒト初代KCにおける抗菌ペプチドの発現
大腸菌培養上清が、上皮KCにおける抗菌ペプチドソリアシン及びhBD-2の発現を誘導すると報告された(Abtinら、2008.FASEB J.7:2168〜2176;Glaserら、2005.Nat.lmmunol.6:57〜64)。上皮細胞による自然免疫応答を誘発するBGの能力を調査するため、野生型大腸菌から作製された様々な粒子濃度のBGでヒト初代KCを24時間刺激した。フラジェリン(10ng/ml)及びIL-1α(10ng/ml)によるKCの刺激は、解析する抗菌ペプチドの上方制御の陽性対照とし、未処理細胞は陰性対照とした。定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)により抗菌ソリアシンの相対mRNA上方制御を決定した。図1に示し得るように、KCにおけるソリアシンのmRNA発現は、BGとインキュベーションした後に上方制御された。刺激されたソリアシンmRNA産生は、BG粒子依存的であり、2×108BG粒子/mlで最も強い上方制御が観察され、2×108粒子/mlを下回るBG濃度に効果はなかった(図1)。
【００６０】
本発明者らは、KCにおけるソリアシンの誘導が、大腸菌によるフラジェリン発現に依存的であると以前に報告した(Abtinら、2008.FASEB J.7:2168〜2176)。BGのフラジェリンが同様の効果を有するか調査するため、本発明者らは、野生型(wt)NK9373及び同質遺伝子的フラジェリン欠損(ΔfliC)NK9375大腸菌株からBGを作製した。陽性対照として、フラジェリン、IL-1α及び野生型大腸菌の培養上清でKCを刺激した。非馴化細菌培養用培地、ΔFliC大腸菌の培養上清の存在下及び刺激なしでインキュベートしたKCは陰性対照とした。KCを48時間刺激し、後にイムノブロットによりソリアシンタンパク質産生を解析した。mRNAデータとは対照的に、ソリアシンはタンパク質レベルでは2×107BG粒子/mlでかすかなバンドが検出された(図2A)。野生型(NK9373)大腸菌BGにより、2×108粒子/mlでソリアシンの強い誘導が観察され、これは2×109粒子/mlで更に強くなった。同質遺伝子的ΔfliC(NK9375)株に関し、ソリアシンは2×108BG粒子/mlからかすかなバンドが検出され、2×109BG粒子/mlで顕著な発現レベルが観察された(図2A、B)。
【００６１】
BG処理後のヒト初代KCにおけるサイトカインの発現
BGと48時間インキュベーションした後のKCによる炎症性サイトカインIL-6及びIL-8の分泌をELISAにより調査した。野生型(NK9373)及びΔｆliC(NK9375)大腸菌BGとインキュベーションした後のKCによるIL-6及びIL-8の放出は、BG源及び用いた粒子数に依存的であった(図3A、B)。得られた結果は、IL-6及びIL-8放出における野生型(NK9373)大腸菌BGの効果が、濃度2×107粒子/mlから検出できることを示した。2×107粒子/mlを下回る濃度はほぼ無効であったが、2×109粒子/mlは、それぞれIL-6の分泌を2pg/ml(未処理)から600pg/mlに、IL-8の分泌を60pg/ml(未処理)から1350pg/mlに強力に増強した(図3A、B)。しかし、ΔｆliC(NK9375)大腸菌BGは、2×109粒子/mlを用いた場合のみ、両サイトカインの分泌をそれぞれ134pg/ml及び750pg/mlのIL-6及びIL-8へと増加させ、一方、これを下回るBG濃度は、両サイトカインの放出において有意な効果がなかった(図3A、B)。更に、野生型大腸菌の培養上清と比較して、ΔFliC大腸菌の培養上清の存在下でKCをインキュベーションした後にサイトカイン産生がほぼ1桁低くなる場合、フラジェリンの存在に関するIL-6及びIL-8両方の分泌における有意差は、KCと野生型大腸菌及びΔFliC大腸菌の培養上清とのインキュベーション後に検出された(図3A、B)。これらの結果全体として、BGの無傷外被表面構造の重要性及び自然免疫系の刺激におけるフラジェリンの役割を強調する。
【００６２】
ヒト初代KCによる野生型(NK9373)及びΔfliC(NK9375)大腸菌BGのエンドサイトーシス
上に述べた通り、KCによる抗菌ソリアシンの上方制御及び炎症性サイトカイン放出の増強は、BG表面におけるフラジェリンの存在に依存的である。KCによるBG取り込みにおけるフラジェリンの役割を更に調査するため、野生型(NK9373)及びΔfliC(NK9375)大腸菌BGのエンドサイトーシスを比較、解析した。BG表面にフラジェリンを欠くと、KCがBGと結合しエンドサイトー―シスを行う(endocyte)能力を有意に低下(ほぼ6倍少なく)させる。FACS解析は、FITC標識野生型大腸菌BG(図4A)及びΔFliC大腸菌BG(図4B)の内部移行の間の差を明示した。図4Cに示す通り、無傷フラジェリンの存在により、KCが野生型大腸菌BGと結合し内部移行させる能力は、ΔFliC大腸菌BGと比較しておよそ6倍増加することが観察された。
【００６３】
考察
BGは、その細胞形態及び天然の表面抗原構造は保存されているが、細胞質内容物を欠くグラム陰性細菌由来の非生細胞外被標本である[40]。本研究において、ヒト初代KCを用いて自然免疫調節物質の制御におけるBGの効果を決定した。非病原性大腸菌から作製されたBGとヒトKCとのインキュベーションは、抗菌ソリアシンの発現を上方制御した。この結果は、大腸菌株の培養上清又は破砕細胞が、抗菌ペプチドの発現を増強したという以前の報告と一致した[2]。従って、本研究は、フラジェリンを含むBGの外被構造が完全に機能的且つ無傷であり、KCによって認識されて、以前の研究で用いられた細菌化合物と同様に自然免疫応答を促進することを確認した[2]。
【００６４】
以前に報告された通り、KCによる大腸菌に対する応答性は、TLR5及びそのリガンド、フラジェリンに媒介される[2]。野生型大腸菌は、ソリアシン産生のBG濃度依存性誘導を呈示したが(図1)、一方、ΔFliC大腸菌は、野生型株よりも1桁高いBG濃度におけるソリアシンの発現を示した(図2)。従って、ΔFliC変異体株と比較すると、炎症性サイトカインIL-6及びIL-8の放出から得られたデータは、BG標本におけるフラジェリンの存在の意義を強調した(図3)。シャド(shad)フラジェリン及び/又は精製フラジェリンの供給源としての大腸菌上清による以前の研究から、フラジェリンが、ヒトKCにおけるソリアシンの主要な誘導因子であることは明らかである[2]。しかし、ΔFliC BGもソリアシン誘導できるため、追加のFliC非依存的経路が存在すると思われる。
【００６５】
更に、KCによる野生型大腸菌及びΔFliC大腸菌に由来するBG取り込みの調査は、有鞭毛株のBGが、ΔFliC BGよりも概して1桁優れて吸収されることを示した(図4)。この観察は、BG表面におけるフラジェリンの存在が、KCによるBGの結合及び内部移行に寄与することを示唆する。更に、ソリアシン産生並びにIL-6及びIL-8分泌の誘導におけるフラジェリンの重要な役割は、ΔFliC大腸菌BGとのインキュベーション又はΔFliC大腸菌培養上清とのインキュベーション後のこれらタンパク質の産生におけるKCの応答減少によって反映される。表面における他の成分、例えば、ΔFliC大腸菌BGのLPSが、抗菌ペプチド及び/又は炎症性サイトカインの産生のためのシグナル伝達活性を有するか疑問が残る。しかし、BG粒子数との直接相関は検出できなかったため、KCによるIL-6及びIL-8の放出は、フラジェリンの存在に対する感受性が高かった(図3)。ΔFliC BGとインキュベーションした後のKCによる、IL-6と比較してより高度なIL-8の分泌(図3)及びΔFliC大腸菌のBGの部分的内部移行(図4)は、BGの殻におけるLPSの存在と関連し得る。培養上清に出現する破砕細菌細胞由来のLPSの存在は、ΔFliC大腸菌の培養上清とのインキュベーション後のKCによる低分泌IL-8の検出を説明することができる(図3B)。LPSによる皮膚メラノーマ細胞の活性化が、IL-8の産生増強及び細胞接着をもたらすことが以前に示された(Malteniら、Cancer Lett.235(2006)、75〜83)。TLR4は、内皮細胞による細胞LPS取り込みに関与しないことが報告されているが、LPSによるTLR4媒介性上皮KC活性化と、その食作用活性との間の連絡を定義する必要がある(Dunzendorferら、J.Immunol.173(2004)、1166〜1170)。KC表面におけるTLR4の機能的発現は、一部の研究者により観察された以外に報告がないという事実にもかかわらず[2]、BGの外被における無傷LPSは、KC等のヒト皮膚細胞による細菌成分の認識における複雑なプロセスに寄与し得る。従って、LPSシグナル伝達を介した上皮KCの活性化に関与する正確な役割及び機序を決定する必要がある。
【００６６】
KCのリソソーム区画における野生型大腸菌BGに存在する鞭毛の酸分解がモノマー型フラジェリンを生じ、これがTLR5と結合してサイトカインIL-6及びIL-8の発現並びにソリアシンの産生を刺激する可能性もある。TLR5と結合するフラジェリン[2]はΔFliC BGによって生成されず、その結果この結合によるシグナル伝達が誘導されないため、NF-カッパーB誘導性ソリアシン発現をもたらす内部シグナル伝達の他の経路が、KCにおいてBGにより誘導される必要がある。フラジェリン発現に関係なくBG又はBG構成成分の存在を感知し得る細胞内受容体候補は、NOD1又はNOD2等、NLRである。近年の研究は、KCにおけるペプチドグリカン断片によるNOD1[22]及びNOD2[2]の機能的発現を報告した。特に、NOD1は、アミノ酸、メソジアミノピメリン酸(meso-diaminopimelic acid)を含有するペプチドグリカン断片の感知を媒介し、NOD2は、ムラミルジペプチド[2]の感知を媒介し、これら断片は両者共に大腸菌BGの未だ無傷のペプチドグリカンの分解産物である[60]。初代KCにおけるムラミルジペプチド(MDP)によるNOD2の活性化と、抗菌ペプチド産生の増加との間の連絡が報告されており[2]、本発明者らの研究において、ソリアシンを誘導するためのBGの使用が立証された。従って、得られた結果は、皮膚の自然免疫防御系を増強するための治療アプローチにおける生存していない安全なBGの理想的な使用を立証する。BGの潜在的な治療効果は、薬物又は他の生物活性物質をBGにパッケージングすることにより組み合わせ、これを更なる有益な健康効果の刺激のために細胞内に送達することができる[2]。
【００６７】
(実施例2)
レスベラトロール負荷細菌ゴーストによるRAW264.7におけるNO産生の調節作用
以前の研究において立証された通り、BGは、サイトカイン分泌及び抗菌ペプチド発現等、自然免疫系のパラメータにおいてかなりの影響を有する。自然免疫における重要な役割を有する分子であるNOのiNOS誘導性産生が、LPSによって刺激されることを考慮して、本発明者らは、BG刺激によるラジカル放出の程度を試験した。更に、化学薬品が原因の抗炎症性(NO産生の減少)及び抗増殖性活性の調節に関して、RV負荷ゴーストの影響を調査した。
【００６８】
材料&方法
化学薬品
他に断りがなければ、あらゆる化学薬品はSigma Aldrichから入手した。
【００６９】
細胞培養
アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection)(ATCC、米国)から得られたRAW264.7細胞を、2mM L-グルタミン(Lonza Bio Whittaker)及び10%熱失活ウシ胎仔血清(Gibco;Invitrogen)を補充した4.5g/Lグルコース(DMEM;Lonza BioWhittaker;W/O Glut P-red)含有ダルベッコ変法基本培地において培養した。更に、100U Pen-Strep(Lonza)を培養培地に添加した。生存率評価のために別の培地を用いた。そこで、10%熱失活ウシ胎仔血清(FCS)、ペニシリン(104μg/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)、200mM L-グルタミン、HEPESバッファー(10mM)、10%非必須アミノ酸(NEAA)及びプラスモシン(plasmocin)(5μg/ml、Lonza)を補充したロズウェルパーク記念研究所培地(Roswell Park Memorial Institute Medium)(RPMI)1640において細胞を培養した。コンフルエント状態に達するまで細胞を45〜48時間培養した(37℃;5%CO2)。様々な実験の解析に用いた培地は、抗生物質のみを含有した。
【００７０】
細菌ゴースト産生
他に記載されている(Witteら、1992.Arch Microbiol.157(4):381〜8頁;Mayrら、2005.Infect Immun 73(8):4810〜7頁)ファージ由来の溶解タンパク質Eの制御された発現により、大腸菌NM522(pGLysivb;240106-5/6)由来のBGを産生した。抗生物質を添加することにより、溶解されていない細菌の不活化を行った。凍結乾燥BGを室温にて保存した(1mg凍結乾燥重量は1 .27*1010粒子を含有)。処理実験前にBGを試験培地に再懸濁した。
【００７１】
BGのレスベラトロール負荷
12〜24mg量の凍結乾燥BGを様々なレスベラトロール濃度(1〜35mg RV/mlメタノール)に懸濁し、激しく振盪(800rpm)しつつ30分間28℃でインキュベートした。13000rpmで15分間遠心分離することにより負荷されたBGを収集し、ペレットを水で3回洗浄した。1mgのBGのアリコートを-20℃で使用まで保存した。
【００７２】
亜硝酸塩アッセイ
RAW264.7細胞を96ウェルプレートに播種し、2日間培養した。続いて、ウェル当たりおよそ3*105マクロファージを、200μlの規定濃度の空BG(陽性対照)で、レスベラトロール負荷ゴースト(46μg RV/1×1010BG)で、或いは空の細菌ゴースト+外部に投与された規定のレスベラトロール濃度で20分間刺激した。その後、PBSで2回洗浄することにより細菌ゴースト懸濁液を除去し、更に20時間、暗所で37℃、5%CO2にて細胞をインキュベートした。純粋LPS(Fluka;大腸菌血清型055:B5)刺激の影響を調査するため、様々なLPS濃度による長期インキュベーション実験を20時間行った。
【００７３】
NO産生の指標として、グリース反応の使用によりマクロファージの上清における亜硝酸塩濃度を測定した(Greenら、1982 Anal Biochem.126(1):131〜8頁)。要約すると、100μlの各上清を、5%H3P04に溶解した1%スルファニルアミド(Fluka)(90μl)及び水に溶解したN-(１-ナフチル)エチレンジアミン二塩酸塩(90μl)と混合した。ELISA読み取り装置(Tecan Sunrise)で550nmの吸光度を決定した。
【００７４】
取り込み試験
FITC標識BGのRAW264.7への適用及び検出
エンドサイトーシス性レスベラトロール送達の指標として、解析された細胞系においてFITC標識BGの取り込みを決定した。このため、凍結乾燥細菌ゴースト(5〜15mg)を1.5mlの0.1M Na2CO3;pHほぼ9.0に再懸濁した。その後、25μlのFITC原液(2mg FITC/1ml DMSO)をBG懸濁液に添加し、2時間暗所にて16℃で振盪した。PBSによる5回の洗浄工程(5分間;14000rpm)及び陽性標識のチェックの後、再度炭酸ナトリウムバッファー中にゴーストペレットを再懸濁し、-20℃で使用まで保存した。RAW264.7の培養及び処理は、一部変更した以外は亜硝酸塩アッセイと同じである。規定量の空BGと20分間インキュベーションした後、マクロファージをPBSで2回洗浄し、洗浄溶液を隣接する空ウェルに収集した。続いて、Tecan Geniospro蛍光光度計により励起及び発光波長485/535(ゲイン40)で蛍光を記録した。総蛍光値は適用したゴースト量の100%とし、取り込みはマクロファージ当たりの得られた蛍光から算出した。
【００７５】
細胞傷害性アッセイ
ニュートラルレッドアッセイを用いて、RAW264.7細胞の生存率における空BG又はRV負荷BGと共に化学薬品それ自体の影響を試験した。ニュートラルレッド(3-アミノ-m-ジメチルアミノ-2メチル-フェナジン塩酸塩)は、生細胞のリソソームにおいて選択的に蓄積し(Repettoら、2008.Nat Protoc、2008.3(7):1125〜31頁)、従って、生存率の定量的な評価を可能にする。
【００７６】
96ウェルプレートの個々のウェルに1.25×105細胞を接種して、一晩付着させた。異なるBG対細胞比(10、100、1000)のRV負荷及び非負荷BG(全てsf培地に再懸濁)を含有する200μlの培地で、或いはRV単独でマクロファージを20分間処理し、続いて20時間の回復期間又は24時間置いた。2種のRV濃度(15μM及び30μM)に同一条件を適用した。Triton X-100(0.01%)を陽性対照とし、試験培地で処理した細胞は陰性対照を表す。処理後に、細胞をPBSで2回洗浄し、培養用培地と20時間インキュベート、或いは直接的に100μlのNR(80μg/ml最終濃度)と更に2時間(37℃;5%CO2)インキュベートした。その後、色素を廃棄し、ウェルをPBSで2回洗浄した。100μlの酸性脱染溶液(1ml酢酸、73ml 96%エタノール及び26ml脱イオン水)を添加することにより色素の抽出を行った。プレートを10分間振盪し、プレートリーダー(Dynex OpsysMR)により570nm(参照波長690nm)にて発色を測定した。
【００７７】
統計
GraphPad Prism(バージョン5、GraphPad Software、Inc;米国カリフォルニア州サンディエゴ)を用いて全結果を解析した。データは平均+SDとして表す。スチューデントt検定を用いて統計解析を行った。P値<0.05を統計的に有意であると考慮した。
【００７８】
結果
BGのRV負荷
単にBGを所望のRV溶液に再懸濁することにより、凍結乾燥大腸菌NM522のBGにRVを負荷した。BGにおけるRVの量を決定するため、エタノール抽出を行ってHPLCにより解析した。結果を図5Aに示す。RV負荷濃度と回収されたRVとの間に明確な依存性が観察できた(相関係数r2=0.9980)。凍結乾燥BGを35mg/ml RV溶液に懸濁した後に最高負荷効率を得た。1×1010BGの抽出後に平均して46μgのRVを検出することができた。当初の凍結乾燥ゴースト量から計算しておよそ4%の原液を回収した。
【００７９】
マウスマクロファージによるFITC標識BGの付着及び取り込み
短時間の同時インキュベーション後に細胞と会合又はマウスマクロファージにより取り込まれたBG量を調査するため、蛍光定量による定量化実験を行った。図5Bは、20分間の同時インキュベーション及び2回の洗浄工程後にRAW264.7及び大腸菌NM522 BGの蛍光定量的測定により得られた結果を示す。適用したゴーストと、細胞と会合したゴーストに明確な用量依存性が見られ、殆ど完全な直線回帰(相関係数r2=0.998)を生じる。更に、96又は24ウェルプレートにおいて実験を行った場合で、差は観察されなかった(データ図示せず)。適用したゴーストの平均して25%は、この短いインキュベーション時間の後に、マクロファージと会合した。
【００８０】
この期間内にBGが既にマウスマクロファージにより取り込まれているかも明らかにするため、内部移行を視覚的に検査する共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)試験を行った。このため、20及び40分後のFITC標識大腸菌NM522ゴーストとRAW264.7細胞とのインキュベーション後にz-stacksを行った。細胞のF-アクチン骨格と選択的に結合するテキサスレッドファロイジンでマクロファージを染色した。様々な光学切片の代表的な単一のz-stacksを表示する画像を図6A及び図6Bに示す。細胞(赤色に染色)により既に内部移行しているFITC標識BGが黄色に見えることが認められる。緑色のBGは、取り込まれておらず、細胞外部に付着したBGを表す。更に、BG対細胞比1000において、本発明者らは、各マクロファージにおいて、摂取されたBGと共に内部移行したBGクラスターを観察した。
【００８１】
NO産生の誘導
iNOSはLPSにより誘導されるため、様々な濃度のLPSによるRAW264.7細胞の20時間の刺激後にNO産生を調査した。図7Aに示す通り、1〜1000ng/mlのLPSによる処理は、1ng/mlから有意な感度のNO産生をもたらした。BGが、外被において結合しているそのLPS分子を完全に維持するという事実から、BGがどの程度までNO産生を刺激できるか決定するための実験を行った。ゴースト対細胞比10は、遊離LPS 1ng/mlと同様のレベルのNO産生の有意な誘導(P=0.0005)に優に十分であることが判明した。MOI 100〜1000の空BGで細胞を処理した場合、NO産生の明確な粒子依存性刺激が達成された。しかし、より高濃度のBG(細胞当たり2000及び5000粒子)は、更なる影響を全く示さなかった。
【００８２】
外部に配置されたRVとは対照的な、BG自体及びRV負荷BGによるNO刺激の調節能力
図7Bに既に示した通り、BGは、100〜1000の間のBG対細胞比でマクロファージに適用されると、用量依存的様式でNO産生を刺激することができる。多くの研究が、RVがLPS誘導性NO産生を低下できることを示したため(Saikoら、2008.Mutat Res.658(1〜2):68〜94頁;Tsaiら、1999 Br J Pharmacol.126(3):673〜80頁)、RVがBG誘導性NO産生を調節する可能性を調べるための実験を行った。このため、空の大腸菌NM522 BGを比率500で細胞に適用した。同時に、3種の異なる濃度のRVを細胞培養物に添加した。20分間の同時インキュベーション及び2回の洗浄工程の後、NO産生を20時間後に測定した。結果を図8Aに示す。0.3μM及び0.3μM RVと空の大腸菌NM522ゴーストとの同時処理が、BG誘導性NO産生に影響を及ぼさないことが認められる。30μM RVによる処理後に統計的有意差が観察できた(P=0.0078)。
【００８３】
BGに封入されているRV量(図5A)及び20分間の処理後にマクロファージと会合している(細胞に接着しそれに取り込まれた)BG数(図5B)に基づき、BGにより送達されたレスベラトロール粒子を決定することができた。RAW264.7細胞におけるNO誘導の刺激は、MOI 100及び1000における最高のRV収率(46μg RV/1×1010BG)を有するBGにより行ったため、算出されたBGによるRV送達値は、0.48+0.25μM及び8.86+2.21μMレスベラトロール(5.8×1013及び1.07×1015RV粒子/200μl)に相当するであろう。
【００８４】
BGにおいて結合しているRVが、NO産生における調節様式を持ち得るか調査するため、同一量の空ゴースト対RV負荷ゴーストの影響を解析した。更に、空BG及び3μM RV(3.61×1014RV粒子/200μl)の同時適用によるラジカル放出を評価した。
【００８５】
外部適用されたRVと空の大腸菌NM522 BGが、RV負荷ゴーストと同程度に効果的にラジカル放出を減少できなかったことが認められる。本発明者らの知見から、有意な亜硝酸塩低下がBG対細胞比100におけるRV負荷ゴーストにより見出されたが(P=0.0048)、3μM RVには効果がなかった(図8B)ことが示される。他方で、MOI 1000におけるマクロファージの処理後に得られた結果は、両方の変種による低下をもたらした。それにもかかわらず、BG単独による処理と比較した場合、RVゴーストをRAW264.7細胞に適用すると、空BGと同時に投与した3μM RVよりも有意に低い量のNOが産生された(P=0.0002対P=0.0158)(図8C)。
【００８６】
細胞生存率の決定
RAW264.7マクロファージの細胞生存率における空及びRV負荷BG(46μg RV/1×1010BG)の影響を調査するため、3種の異なるBG対細胞比(10、100、1000)による2種の異なる処理条件を試験した。NO測定に記載されているのと同じ仕方で第一の試験を行った、即ち、20分間の処理及び続く20時間後の測定。第二の解析は、24時間の長期インキュベーションの効果に関係した。図9Aに示す通り、大腸菌NM522ゴーストそれ自体は、この期間内に細胞傷害性影響を及ぼさなかった。それにもかかわらず、MOI 10におけるマクロファージとBGとの24時間インキュベーションは、有意な増殖刺激効果をもたらしたが(P=0.0016)、より高いBG濃度は、無血清培地処理対照と変わらなかった。RV負荷ゴーストとの又は化学薬品それ自体との短期同時インキュベーション後に効果は見られなかったが(データ図示せず)、24時間後のMOIが10及び100(P=0.0008及び0.0111)のRV-BGとの処理後に代謝活性の増強が見られた(図9B)。
【００８７】
本発明者らは、24時間インキュベーション後のBGの細胞会合量を決定しなかったため、BGにより送達されたRV濃度に関する適切な記述は為されない。
【００８８】
理論的には、MOI 1000で適用された全BGがマクロファージによって取り込まれる場合、30μMのレベルが達成される。しかし、本発明者らは、顕微鏡検査からこれが正しくないことを知っている。この期間でBG量の半量が取り込まれると仮定すると、算出された濃度15μMレスベラトロールが得られる。従って、ゴースト対細胞比1000で適用されたBGにおいて結合しているRV(46μg RV/1×1010BG)と対比して、細胞生存率における15μM及び30μM RVの影響が調査される比較実験を行った。最低化学薬品濃度は全く影響がなかったが、30μM RVによる処理後に細胞生存率は大幅に減少した(81.23+10.6%)。RV-BGによる細胞生存率の有意な減少も観察された(P=0.0462)。平均として、送達された化学薬品により10%の細胞が死滅した(図9B)。
【００８９】
考察  
本研究において、本発明者らは、BGがマクロファージによるNO生成を誘導しており、この活性がRV負荷BGにより調節できることを立証した。
【００９０】
病原体による疾患、例えば、リーシュマニア症又は結核を治癒するためのiNOS活性及びNO放出における依存性が数例の研究において立証された(Bogdan、C.、2000 Immunol Rev.173:17〜26頁;Sharmaら、2007.Inflammopharmacology 15(6):252〜9頁;Chakravortty and Hensel、2003.Microbes Infect.5(7):621〜7頁)。病原体は、自然免疫系の細胞により貪食されることが一般に知られている。他の研究の結果は、BGがこれらの細胞により優先的に取り込まれることを立証し、様々なマクロファージ細胞系及び樹状細胞に関する取り込みが報告された(Haslbergerら、2000.J Biotechnol.83(1〜2):57〜66頁;Kudelaら、2005.J Immunother.28(2):136〜43頁;Pauknerら、2003 J Drug Target 11(3):151〜61頁)。以前の知見によると、取り込みは、BGの短期同時インキュベーション後にRAW264.7マクロファージ細胞系において確認することができた。興味深いことに、CLSMによる顕微鏡観察は、マクロファージが、単一のゴーストと共にゴーストクラスターを取り込み得ることを示した。
【００９１】
BGは、その天然状態の細菌(counterpart)と同様にその病原体関連分子パターン(PAMP)を全て保有するため、BGは、その対応する宿主自然免疫受容体、例えば、Toll様受容体(TLR)によって認識される。従って、細菌LPSはTLR4と、フラジェリンはTLR5と相互作用する(Ishiiら、2008 Cell Host Microbe.3(6):352〜63頁)。マウスRAW264.7マクロファージ細胞系におけるBGの取り込みは、この細胞系はTLR5を殆ど発現しないため、主としてTLR4に関係する(Applequistら、2003.Int Immunol.14(9):1065〜74頁)。一方、実施例1において、大腸菌BGは、フラジェリン依存性TLR5経路及び他の取り込み機序により初代ケラチノサイトに進入することが示される。ヒトマクロファージを用いたPanaroらの研究は、LPS誘導性NO産生と間の直接相関を立証する。i-NOSの競合的阻害剤であるL-NMMAが存在すると、両方のパラメータにおいて有効性が有意に低下した(Panaroら、1999.Int J Clin Lab Res.29(3):122〜7頁)。
【００９２】
LPSは、TLR-4との相互作用を介したiNOSの誘導に関して著名なため(Bogdan、C.、2001.Nat Immunol 2(10):907〜16頁)、本発明者らは、RAW264.7細胞における遊離LPSとの長期インキュベーション(20時間)と、様々な量のBGとの短期インキュベーション(20分間インキュベーションし、その20時間後にNO放出を決定)との間の比較実験を行った。MOI 10の大腸菌ゴーストによるマクロファージの処理が、Panaroら(Panaroら、1999.Int J Clin Lab Res.29(3):122〜7頁)によって寄生虫の排除に効能があることが分かった100ng/ml LPSと同じ効果を示すことが判明した。更に、本発明者らは、NO放出の程度と関連して観察された粒子依存性BG細胞との間の関係を解析し、有意な正の相関を見出した(スピアマンr=1;P値=0.0167)。
【００９３】
NO産生以外に、サイトカイン等の他の因子が、細胞内病原体に対する自然免疫応答を誘発する。IFNγ等、I型インターフェロンは種々の細胞によって産生され、強力な抗菌活性を発揮する。以前の研究において、BGがサイトカイン産生を刺激する特色を保有することが立証された。例えば、Ebensenらは、マンヘミア・ヘモリチカ(M. haemolytica)BGの適用が、免疫化マウスにおける脾臓IFN-γ産生細胞の量の増大を生じることを立証した(Ebensenら、2004.J Immunol.172(11):6858〜65頁)。別の動物実験において、脾臓IFNγレベルは、大腸菌0157:H7 BGによる免疫化の後に有意に増加した(Mayrら、2005.Infect Immun 73(8):4810〜7頁)。IL-12がIFNγ産生を増強し、Th1細胞発達において中心的な役割を果たすことが知られているため、Haslbergerら(Haslbergerら、2000.J Biotechnol.83(1〜2):57〜66頁)によってBGを用いた研究が行われ、抗原提示細胞におけるIL-12産生の効果的な刺激が報告された。
【００９４】
NO産生に話題を戻すと、レスベラトロールによる研究の結果は、iNOS誘導に対する抑制的な特性を立証した(Saikoら、2008.Mutat Res.658(1〜2):68〜94頁;Tsaiら、1999 Br J Pharmacol.126(3):673〜80頁)。従って、本研究において、空BGとコインキュベートされた、或いはBGにおいて細胞内で結合しているレスベラトロールの、RAW264.7マクロファージによるBG誘導性NO産生に対する効果を決定した。BGにおいて結合しているRVの適用により、その空バージョンと比較して高度に有意なラジカル放出の減少が得られた。更に、外部に添加された濃度レベル3μMの純粋化合物(MOI 100で細胞会合ゴーストにより送達される濃度よりも概して6倍高い)は、ラジカル放出を約15%低下させたBG負荷適用と比較してNO産生に影響がなかった。
【００９５】
本発明者らの知る限りにおいて、レスベラトロールの細胞取り込み機序は依然として不明である。現在のところ、この薬物に対する特異的受容体は発見されていない。その構造から、レスベラトロールは、エストロゲン受容体又はインテグリン等の細胞表面受容体と相互作用することができる(Saikoら、2008.Mutat Res.658(1〜2):68〜94頁;Linら、2006 Faseb J.20(10):1742〜4頁)。しかし、本発明者らの知見や、マクロファージによる取り込み後のRV負荷BGによるレスベラトロールの細胞内送達の事実によると、内部レスベラトロール受容体が存在する可能性は非常に高い。本発明者らは、このような仮説上の受容体に対する用語として、BGRVを提唱する。
【００９６】
細菌LPSが、多種多様な哺乳類細胞における数多くの病態生理学的効果の原因であることが知られている。最悪の事態において、その結果、内毒素ショック及び多臓器不全に続き死亡する可能性もある。この内毒素性は、腫瘍壊死因子アルファ(TNF-アルファ)、インターロイキン1、IL-6及び一酸化窒素等、多数の生理活性メディエーターを産生する宿主免疫及び炎症性細胞、特に単核貪食細胞の活性化により媒介される(Hirohashi and Morrison、1996.Infect Immun.64(3):1011〜5頁)。
【００９７】
グラム陰性細菌の内毒素性内容物もBGに存在するため、BGの安全性及び毒性試験が過去10年間行われてきた。病原性大腸菌(Escherichia coli)O26:B6及びネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)C5に由来する細菌ゴースト標本は、標準アメリカカブトガニ属(Limulus)アメボサイトライセート(LAL)アッセイ及び2-ケト-3-デオキシオクタン酸(deoxyoctonate)(KDO)アッセイの使用により、その内毒素活性に関して調査される実験が為された(Haslbergerら、2000.J Biotechnol.83(1〜2):57〜66頁;Maderら、1997.Vaccine.15(2):195〜202頁)。平均として、どちらのゴースト種も、ウマ流産菌(S. abortus equi.)の遊離LPSと比較して2〜5%の内毒素活性しか呈示しなかった。RAW264.7細胞による細胞培養実験は、腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)分泌及びプロスタグランジンE2(PGE2)合成に、遊離LPSと比較して100倍多いBGが必要とされることを明らかにした。著者らは、ウサギにおける測定可能な免疫応答の誘導に十分な用量<250ng kg-1のBGをi.v.投与した場合、ウサギにおいて有意により少ない応答が記録されていないことについても脚光を当てた(Maderら、1997.Vaccine.15(2):195〜202頁)。
【００９８】
本研究において細胞傷害性研究も行った。インキュベーションが最大24時間行われた場合であっても、大腸菌BGそれ自体の殺傷効果は観察されなかった。よって、iNOS発現及び大量のNO産生のためのBG関連の連続的刺激が、in vitroで細胞死をもたらさないことが明示された。
【００９９】
しかし、細胞を低BG、MOI 10でインキュベートした場合、増殖刺激効果が観察された。同一処理条件下において、RVを粒子内部に負荷した場合、このプラスの影響は更に増強された。それにもかかわらず、細胞当たり1000 BG比の24時間適用後に、BG送達されたRVによる細胞傷害性効果が更に立証され得る。これは、細胞生存率のおよそ10%減少をもたらし、BGによる効果的なRV送達の別の証拠を示す。
【０１００】
抗炎症性効果、即ちiNOS抑制に加えて、RVは、in vitroにおける抗菌(Chan、2002.Biochem Pharmacol.63(2):99〜104頁;Faithら、2006.Antiviral Res.72(3):242〜51頁;Schrieverら、2003 Atherosclerosis.171(2):379〜80頁;Kedzierskiら、2007.Parasitol Res.102(1):91〜7頁)活性をもたらすことを示し、様々な研究においてその癌化学療法効力が見いだされた(総説に関して、Saikoら、2008.Mutat Res.658(1〜2):68〜94頁を参照)。
【０１０１】
食事由来のレスベラトロール含有量に関する短い概要は、Udenigweらに記載されている。赤ワインにおいて、2.3〜46.3μMの範囲に亘る最高濃度が見出された(Udenigweら、2008.Nutr Rev.66(8):445〜54頁)。このような値は、本研究におけるBGにおいて結合し、マクロファージに送達されるRV含有量に相当する。しかし、言及されている濃度は、この飲料の1リットル消費を必要とする。更に、RVは、in vivoでは8〜14分間以内に腸及び肝臓において急速に代謝されることが知られている(Saikoら、2008.Mutat Res.658(1〜2):68〜94頁)。効果は、RAW264.7細胞との20分間の短時間同時インキュベーション後のRV-BGにより観察できるため、本発明者らは、この代謝が恐らくゴースト外被による該物質の保護により回避でき、細胞特異的送達の遅延がin vivoで誘発され得ると考える。
【０１０２】
本研究において立証された通り、BGは、マクロファージにおけるin vitroでのNO産生の刺激において非常に有意な影響を有し、これは、RVがBG内部と結合している場合に改変されることが示された。NO放出と共に、RVが抗菌及び抗癌性効果に寄与すること、BGが細胞のサイトカイン分泌及び抗菌ペプチドを増強するという事実を考慮することは、細胞内病原体又は癌の治療的処置における使用のための該システムに脚光を当てる。
（参考文献）
2013534220.tif 000002
2013534220.tif 000003
2013534220.tif 000004
2013534220.tif 000005
2013534220.tif 000006
2013534220.tif 000007
【図６Ａ】
2013534220.tif 000008
【図６Ｂ】
2013534220.tif 000009
【図１】
2013534220.tif 000010
【図２】
2013534220.tif 000011
【図３】
2013534220.tif 000012
【図４】
2013534220.tif 000013
【図５】
2013534220.tif 000014
【図７】
2013534220.tif 000015
【図８】
2013534220.tif 000016
【図９】
2013534220.tif 000017
【配列表】
2013534220000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年9月11日(2012.9.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸菌株に由来する、自然免疫応答を促進するのに使用するための細菌ゴースト(BG)。
【請求項２】
細菌ゴーストの表面が、フラジェリンモノマーを含まない、請求項1に記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項３】
細菌ゴーストの表面が、フラジェリンを含まない、請求項1又は2に記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項４】
自然免疫応答が、少なくとも1種の自然免疫調節物質の発現及び/又は放出の誘導により促進される、請求項1から3のいずれかに記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項５】
少なくとも1種の自然免疫調節物質の発現及び/又は放出が、上皮細胞において誘導される、請求項4に記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項６】
上皮細胞がケラチノサイトである、請求項5に記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項７】
少なくとも1種の自然免疫調節物質が、抗菌防御分子、炎症性サイトカイン、活性窒素種(RNS)及び活性酸素種(ROS)からなる群から選択される、請求項4から6のいずれかに記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項８】
少なくとも1種の抗菌防御分子の発現が増強される、請求項4から7のいずれかに記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項９】
少なくとも1種の抗菌防御分子が、ソリアシン及びヒトβデフェンシン-2(hBD-2)からなる群から選択される、請求項8に記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項１０】
少なくとも1種の炎症性サイトカインの発現及び/又は放出が増強される、請求項4から9のいずれかに記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項１１】
少なくとも1種の炎症性サイトカインが、インターロイキン-6(IL-6)及びインターロイキン-8(IL-8)からなる群から選択される、請求項10に記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項１２】
少なくとも1種の活性窒素種(RNS)の放出が増強される、請求項4から11のいずれかに記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項１３】
活性窒素種がNOである、請求項12に記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項１４】
自然免疫応答が、哺乳類、好ましくはヒトにおいて促進される、請求項1から13のいずれかに記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項１５】
更なる活性剤と組み合わせて投与される、請求項1から14のいずれかに記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項１６】
薬物がレスベラトロールである、請求項15に記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項１７】
大腸菌株が、大腸菌Nissle 1917である、請求項1から16のいずれかに記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項１８】
皮膚及び/又は粘膜に投与される、請求項1から17のいずれかに記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項１９】
経口、局所、粘膜、肺及び/又は経鼻投与される、請求項1から18のいずれかに記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項２０】
免疫系が不全の個体に投与される、請求項1から19のいずれかに記載の細菌ゴースト(BG)。
【請求項２１】
自然免疫応答を促進する方法であって、有効量の細菌ゴースト(BG)を、それを必要とする患者、特にヒト患者に投与する方法。
【請求項２２】
自然免疫応答を促進するための細菌ゴースト(BG)の使用。
【国際調査報告】
2013534220.tif 000018
2013534220.tif 000019
2013534220.tif 000020