(57)【要約】【解決手段】本発明は、皮膚のデルマトポンチンを活性化するペプチドに関する。本発明は、デルマトポンチン活性化ペプチドを生理学的に好適な媒体中に包含する化粧品組成物にも関する。本発明は、細胞外マトリックスのタンパク質発現を増大するため及びＵＶ照射によるコラーゲン及び弾性線維の分解を防止するための前記組成物の使用にも関する。本発明は最後に、皮膚の加齢及び光加齢の兆候、特に皮膚の皺、たるみ、並びにボリューム及び弾力性の喪失を防止及び／又は治療することを目的とする美容ケア方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）のペプチド：
Ｒ１−（ＡＡ）ｎ−Ｘ１−Ａｒｇ−Ｘ２−Ｔｒｐ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６（Ｒ３）−（ＡＡ）ｐ−Ｒ２
であって、式中、
Ｘ１は、アスパラギン酸又はアミノ酸なしを表し、
Ｘ２は、グルタミン又はグルタミン酸を表し、
Ｘ３は、アスパラギン又はリシン又はグルタミン又はアミノ酸なしを表し、
Ｘ４は、フェニルアラニン又はチロシン又はアミノ酸なしを表し、
Ｘ５は、チロシン又はアラニン又はアミノ酸なしを表し、
Ｘ６は、システイン又はアミノ酸なしを表し、
ＡＡは、任意のアミノ酸を表し、ｎ及びｐは０〜２の整数であり、
Ｒ１は、遊離した、又はアシル型（Ｒ−ＣＯ−）の基で置換された、Ｎ末端アミノ酸の一級アミン官能基を表し、ここでラジカルＲはアセチル型の飽和若しくは不飽和Ｃ１〜Ｃ３０アルキル鎖、又はベンゾイル、トシル若しくはベンジルオキシカルボニル型の芳香族基のいずれかであり；
Ｒ２は、遊離した、又はＣ１〜Ｃ３０アルキル鎖又は−ＮＨ２、−ＮＨＹ若しくは−ＮＹＹ基（ＹはＣ１〜Ｃ４アルキル鎖又はその塩の１つを表す）から選択される基で置換された、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル官能基のヒドロキシル基を表し；
Ｒ３は、遊離した、又はメチル若しくはアセチル基又は別のシステインで置換されているＸ６位のシステインのチオール官能基を表し、後者の場合この結合はジスルフィド結合であるペプチド。
【請求項２】
式（Ｉ）に対応することを特徴とする請求項１に記載のペプチドであって、
式中、
Ｘ１は、アスパラギン酸又はアミノ酸なしを表し、
Ｘ２は、グルタミン又はグルタミン酸を表し、
Ｘ３は、アスパラギン又はリシン又はグルタミン又はアミノ酸なしを表し、
Ｘ４は、フェニルアラニン又はチロシン又はアミノ酸なしを表し、
Ｘ５は、チロシン又はアラニン又はアミノ酸なしを表し、
Ｘ６は、システイン又はアミノ酸なしを表し、
ＡＡは、アルギニン、システイン、ロイシン、グリシン及びグルタミン酸を除く任意のアミノ酸を表し；ｎ及びｐ＝０又は１であり、ｎはｐと異なり；
Ｒ１は、遊離した、又はアシル型（Ｒ−ＣＯ−）の基で置換された、Ｎ末端アミノ酸の一級アミン官能基を表し、ここでラジカルＲはアセチル型の飽和若しくは不飽和Ｃ１〜Ｃ３０アルキル鎖、又はベンゾイル、トシル若しくはベンジルオキシカルボニル型の芳香族基のいずれかであり；
Ｒ２は、遊離した、又はＣ１〜Ｃ３０アルキル鎖で置換されたヒドロキシル基又は−ＮＨ２、−ＮＨＹ若しくは−ＮＹＹ’基（Ｙ及びＹ’はＣ１〜Ｃ４アルキル鎖又はその塩の１つを表す）のいずれかを有する、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル官能基を表し；
Ｒ３は、遊離した、又はメチル若しくはアセチル基で置換されているか、又はジスルフィド結合によって別のシステインに共有結合している、Ｘ６位のシステインのチオール官能基を表す。
【請求項３】
以下の配列の１つに対応することを特徴とする、請求項１又は２のいずれか一項に記載のペプチド：
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１）：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−ＮＨ２
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２）：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−ＮＨ２
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３）：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−ＮＨ２
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ４）：Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−ＮＨ２
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５）：Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ（Ｃｙｓ）−（ＮＨ２）
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ６）：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−ＮＨ２
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ７）：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−ＮＨ２
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ８）：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｃｙｓ（Ｃｙｓ）−（ＮＨ２）
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ９）：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−ＮＨ２
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１０）：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ（Ｃｙｓ）−（ＮＨ２）
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１１）：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１２）：Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−ＮＨ２
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１３）：Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ
【請求項４】
水、グリセロール、エタノール、プロパンジオール、ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、エトキシ化若しくはプロポキシ化ジグリコール、環状ポリオール又はこれらの溶媒のいずれかの混合物のような１つ以上の生理学的に好適な溶媒に可溶化されることを特徴とする、請求項１〜３のうちいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５】
薬物として使用するための、請求項１〜４のうちいずれか一項に記載の一般式（Ｉ）のペプチド。
【請求項６】
治癒剤として使用するための、請求項１〜５のうちいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項７】
生理学的に好適な媒体中に、請求項１〜４のうちいずれか一項に記載の少なくとも１つのペプチドを、デルマトポンチン活性化剤として包含する化粧品組成物。
【請求項８】
前記ペプチドが、最終組成物の総重量を基準にして１０−９Ｍ〜１０−３Ｍ、好ましくは１０−８Ｍ〜１０−５Ｍの濃度で存在することを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
局所投与を意図することを特徴とする、請求項７又は８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
少なくとも１つのその他の活性化剤も含有することを特徴とする、請求項７〜９のうちいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
その他の活性化剤が、再生剤、抗加齢剤、抗皺剤、肥厚化剤、抗フリーラジカル剤、抗糖化剤、水和剤、抗菌剤、抗真菌剤、角質溶解剤、筋弛緩剤、角質除去剤、及びトーニング剤、真皮巨大分子の合成若しくはエネルギー代謝を刺激する作用剤、皮膚分化、色素沈着若しくは色素脱失を調節する作用剤、爪若しくは毛髪の成長を刺激する作用剤、微小循環を刺激する作用剤、日焼け防止剤又はメタプロテイナーゼ阻害剤から選択されることを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
皮膚の線維芽細胞による細胞外マトリックスのタンパク質の発現を増大するための、活性化剤として請求項１〜４のうちいずれか一項に記載のペプチドを生理学的に好適な媒体中に包含する組成物の美容的使用。
【請求項１３】
真皮の密度及び皮膚の弾力性を増大し、フェイスラインのたるみ若しくはボリューム低下、皮膚菲薄化、弛緩、小皺、深い皺及び皮膚委縮を防止又は抑制するための、活性化剤として請求項１〜４のうちいずれか一項に記載のペプチドを生理学的に好適な媒体中に包含する組成物の美容的使用。
【請求項１４】
ＵＶ照射を受ける皮膚のコラーゲン及び弾性線維の分解を防止するための、活性化剤として請求項１〜４のうちいずれか一項に記載のペプチドを生理学的に好適な媒体中に包含する組成物の美容的使用。
【請求項１５】
ＵＶ照射、より具体的にはＵＶＡ照射によって引き起こされる日光弾性線維症及び／又は弾性線維の組織崩壊に関連する非審美的兆候を防止又は抑制するための、請求項１４に記載の美容的使用。
【請求項１６】
表皮及び真皮の再生を増大するための、活性化剤として請求項１〜４のうちいずれか一項に記載のペプチドを生理学的に好適な媒体中に包含する組成物の美容的使用。
【請求項１７】
請求項７〜１１のうちいずれか一項に記載の組成物が処置すべき皮膚に局所適用されることを特徴とする、皮膚の加齢及び光加齢の兆候を防止及び／又は治療することを目的とする美容ケア方法。
【請求項１８】
組成物が、弾性線維の組織崩壊を防止するために日光暴露の前に適用される、又はコラーゲン及び弾性繊維が受けた損傷を修復するために日光暴露の後に適用されることを特徴とする、請求項１７に記載の美容ケア方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、美容活性成分及び皮膚医薬活性成分並びにそれを含む組成物に関する。
【０００２】
本発明は、皮膚の老化の兆候、特に皺、たるみ、皮膚のボリューム及び弾力性の低下を防止又は抑制するための有用な新規分子を提供することを目的とする。
【０００３】
より具体的には、本発明は、デルマトポンチンの発現を活性化するペプチド、かかるペプチドを含有する化粧品又は医薬組成物、細胞外マトリックスのタンパク質発現を増大するため、及びコラーゲン線維及びＵＶによる弾性線維の劣化を防止するためのかかる組成物の使用、並びに、最後に、皮膚の加齢及び光加齢の兆候を防止及び／又は治療することを目的とする美容ケア方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
皮膚は、複数の層（真皮、真皮表皮接合部、表皮）からなる被覆器官である。真皮は皮膚を支持する組織で、水、エラスチン線維及びコラーゲン線維（真皮線維の７０％）からなり、プロテオグリカンの間質マトリックス内に封入されている。線維芽細胞は真皮の主要細胞成分であり、コラーゲン線維及びエラスチン線維合成の供給源である。
【０００５】
最外部の表皮は、互いに密接に連結した角化細胞から主として多層化した上皮である。表皮の基底面は、主に角化細胞及びメラニン細胞である増殖細胞の層からなり、これが真皮表皮接合部（ＤＥＪ）上に固定されている。ＤＥＪは、真皮と表皮との間の境界面を構成する細胞外トレリス型構造である。
【０００６】
皮膚は、他のすべての器官と同様に、加齢の複雑な生理学的プロセスを経る。内因性又は経時による加齢は、遺伝的にプログラムされた老化の結果であり、内生要因による生物化学的変化とは区別される。皮膚において、加齢は、真皮及び表皮の萎縮、乾燥、弾力性低下、並びに小皺及び皺の出現を招く、細胞及び細胞外マトリックスの再生速度低下によって特徴づけられる。
【０００７】
外因性加齢は、汚染、太陽、疾患、生活習慣などの身体が一生を通して受ける環境的要因によるストレスによるものである。その影響は、太陽に慢性的に暴露する領域において内因性加齢の影響と組み合わされる；これは光加齢と呼ばれる。光加齢に関連する主な変化は、真皮で起こり、次のものがある：色素斑の出現、皺の原因となるコラーゲン線維の減少及び断片化並びに日光弾性線維症の構成要素となるジストロフィー性弾性線維の蓄積。
【０００８】
皮膚加齢を抑制できる活性化剤を識別するために多数の方法の研究が実施され、例えば、環境ストレス（太陽、汚染等）からの保護、細胞再生の活性化、並びに細胞外コラーゲン及びエラスチンマトリックスの強化がある。この研究の結果、多少有効な活性化剤が非常に多く市販されてきた。したがって、皮膚加齢を防止又は抑制できる新規化合物の識別はなお重要である。本発明がより明確に標的とする問題は、加齢又は光加齢中に出現する皮膚細胞外マトリックスのフィブリル構造の崩壊の治療である。
【０００９】
本発明者は、最近、この機能を満足するための有益な分子標的を識別した。それはデルマトポンチンという、チロシンに富む小さな酸性タンパク質で、真皮中、より具体的にはコラーゲン線維の周囲に豊富に存在する。デルマトポンチンはコラーゲン線維の構造化において重要な役割を果たし（非特許文献１）、線維芽細胞（非特許文献２）、角化細胞のインテグリンα３β１及びプロテオグリカン型受容体を介した接着のプロセスに参加する。これらの特性は、デルマトポンチンに治癒における重要な役割を与える（非特許文献３）。
【００１０】
この結果を裏付けて、デルマトポンチン不在の遺伝子改変マウスは、真皮の厚さ及びそのコラーゲン含有量の低下、並びに皮膚の弾力性低下を生じる（非特許文献４）。
【００１１】
その構造的役割とは無関係に、デルマトポンチンはデコリンとの三量体複合体に結合することができ、それゆえＴＧＦ−β１の作用を増強する（非特許文献５）。
【００１２】
特許文献１は、細胞接着及び治癒を促進する作用剤としての、デルマトポンチンから誘導したペプチドの使用を開示している。
【００１３】
特許文献２は、椎間板ヘルニアの生物学的治療という状況においてＴＧＦ−βの活性化を増強するために未変性デルマトポンチンを使用できることを開示している。
【００１４】
しかし、現在まで、活性化皮膚細胞におけるデルマトポンチンの活性化並びに皮膚の加齢及び光加齢の兆候の防止又は修復に関して、本発明によるペプチドが記載されたことはない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特開２００８−２０１７７７号公報
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／００６５０８９号明細書
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｊｏｎａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  １９９３，  ｖｏｌ．２６８，  ｐｐ．１９８２６−１９８３２
【非特許文献２】Ｌｅｗａｎｄｏｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，  １９９１，  ｖｏｌ．９９，  ｐｐ．６５７−６６８
【非特許文献３】Ａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ，  ２０１０，  ｖｏｌ．  ４９，  ｐｐ．１４７−１５５
【非特許文献４】Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  ２００２，  ｖｏｌ．１１９，  ｐｐ．６７８−６８３
【非特許文献５】Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  １９９９  Ｆｅｂ  １；３３７（３）：５３７−４１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者は、以下の一般式（Ｉ）を有するペプチド：
Ｒ１−（ＡＡ）ｎ−Ｘ１−Ａｒｇ−Ｘ２−Ｔｒｐ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６（Ｒ３）−（ＡＡ）ｐ−Ｒ２
が優れたデルマトポンチン活性化剤であることを実証した。その結果、これらのペプチドは皮膚の加齢及び光加齢の抑制に好適である。
【００１８】
本発明のペプチドは、以下の事実を特徴とする：
−デルマトポンチン発現を活性化する、
−Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲン及びフィブロネクチンの発現を増大する、
−ＵＶ照射を受ける皮膚のコラーゲン及び弾性線維のフィブリル構造の分解を防止する。
【００１９】
用語「デルマトポンチンを活性化する又はデルマトポンチンを活性化できるペプチド又は活性化剤」は、遺伝子発現の直接又は間接的調節によりタンパク質合成を増大することによって、又はタンパク質の安定化若しくはメッセンジャーＲＮＡ転写の安定化のようなその他の生物学的プロセスによって、細胞中に存在するデルマトポンチンの量を増大することができる一般式（Ｉ）の全てののペプチドを指す。
【００２０】
皮膚という用語は、皮膚、粘膜及び皮膚付属物を形成するすべての被覆組織を指し、毛髪、睫毛及び眉毛を包含する。
【００２１】
したがって、本発明の第１の目的は、一般式（Ｉ）のペプチドを提供することであり
Ｒ１−（ＡＡ）ｎ−Ｘ１−Ａｒｇ−Ｘ２−Ｔｒｐ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６（Ｒ３）−（ＡＡ）ｐ−Ｒ２
式中、
Ｘ１は、アスパラギン酸又はアミノ酸なしを表し、
Ｘ２は、グルタミン又はグルタミン酸を表し、
Ｘ３は、アスパラギン又はリシン又はグルタミン又はアミノ酸なしを表し、
Ｘ４は、フェニルアラニン又はチロシン又はアミノ酸なしを表し、
Ｘ５は、チロシン又はアラニン又はアミノ酸なしを表し、
Ｘ６は、システイン又はアミノ酸なしを表し、
ＡＡは、任意のアミノ酸を表し、ｎ及びｐは０〜２の整数であり；
Ｒ１は、遊離した、又はアシル型（Ｒ−ＣＯ−）の基で置換されたＮ末端アミノ酸の一級アミン官能基を表し、ここでラジカルＲはアセチル型の飽和若しくは不飽和Ｃ１〜Ｃ３０アルキル鎖、又はベンゾイル、トシル若しくはベンジルオキシカルボニル型の芳香族基のいずれかであり；
Ｒ２は、遊離した、又はＣ１〜Ｃ３０アルキル鎖から選択される基で置換されたヒドロキシル基又は−ＮＨ２、−ＮＨＹ若しくは−ＮＹＹ’基（Ｙ及びＹ’はＣ１〜Ｃ４アルキル鎖を表す）のいずれかを有する、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル官能基を表し；
Ｒ３は、遊離した、又はメチル若しくはアセチル基で置換されているか、ジスルフィド結合によって別のシステインに共有結合している、Ｘ６位のシステインのチオール官能基を表す。
【００２２】
前記一般式（Ｉ）の配列は、３〜１２個のアミノ酸残基からなり、塩の形態であることができる。
【００２３】
本発明の有利な実施形態によると、ペプチドは好ましくは一般式（Ｉ）に対応し、
Ｒ１−（ＡＡ）ｎ−Ｘ１−Ａｒｇ−Ｘ２−Ｔｒｐ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６（Ｒ３）−（ＡＡ）ｐ−Ｒ２
式中、
Ｘ１は、アスパラギン酸又はアミノ酸なしを表し、
Ｘ２は、グルタミン又はグルタミン酸を表し、
Ｘ３は、アスパラギン又はリシン又はグルタミン又はアミノ酸なしを表し、
Ｘ４は、フェニルアラニン又はチロシン又はアミノ酸なしを表し、
Ｘ５は、チロシン又はアラニン又はアミノ酸なしを表し、
Ｘ６は、システイン又はアミノ酸なしを表し、
ＡＡは、アルギニン、システイン、ロイシン、グリシン及びグルタミン酸を除く任意のアミノ酸を表し；ｎ及びｐ＝０又は１であり、ｎはｐと異なり；
Ｒ１は、遊離した、又はアシル型（Ｒ−ＣＯ−）の基で置換された、Ｎ末端アミノ酸の一級アミン官能基を表し、ここでラジカルＲはアセチル型の飽和若しくは不飽和Ｃ１〜Ｃ３０アルキル鎖、又はベンゾイル、トシル若しくはベンジルオキシカルボニル型の芳香族基のいずれかであり；
Ｒ２は、遊離した、又はＣ１〜Ｃ３０アルキル鎖から選択される基で置換されたヒドロキシル基又は−ＮＨ２、−ＮＨＹ若しくは−ＮＹＹ’基（Ｙ及びＹ’はＣ１〜Ｃ４アルキル鎖を表す）のいずれかを有する、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル官能基を表し；
Ｒ３は、遊離した、又はメチル若しくはアセチル基で置換されているか、ジスルフィド結合によって別のシステインに共有結合している、Ｘ６位のシステインのチオール官能基を表す。
【００２４】
前記一般式（Ｉ）の配列は、３〜７個のアミノ酸残基からなり、塩の形態であることができる。
【００２５】
本発明の特に好ましい実施形態によると、ペプチドは以下の配列を有する：
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１）：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−ＮＨ２
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２）：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−ＮＨ２
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３）：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−ＮＨ２
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ４）：Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−ＮＨ２
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５）：Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ（Ｃｙｓ）−（ＮＨ２）
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ６）：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−ＮＨ２
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ７）：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−ＮＨ２
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ８）：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｃｙｓ（Ｃｙｓ）−（ＮＨ２）
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ９）：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−ＮＨ２
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１０）：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ（Ｃｙｓ）−（ＮＨ２）
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１１）：Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１２）：Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−ＮＨ２
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１３）：Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ．
【００２６】
特に有益な実施形態によると、ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５の配列に対応する。
【００２７】
別の特に有益な実施形態によると、ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ９又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１０の配列に対応する。
【００２８】
別のさらに有益な実施形態によると、ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１２又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１３の配列に対応する。
【００２９】
本発明のペプチドを構成し、用語ＡＡによって示されるアミノ酸は、異性体のＬ体及びＤ体のいずれであることもできる。好ましくは、アミノ酸はＬ体である。
【００３０】
用語「ペプチド」は、ペプチド結合によって互いに結合した２つ以上のアミノ酸の鎖を指す。
【００３１】
用語「ペプチド」は、上記のような本発明の天然若しくは合成ペプチド、又はそれがタンパク質分解又は合成のいずれによって得られるかにかかかわらず、少なくとも１つのその断片、又はその配列が全部若しくは部分的に上記のペプチドの配列からなる任意の天然若しくは合成ペプチドも指す。
【００３２】
分解に対する耐性を改善するため、本発明のペプチドの保護形態を使用する必要がある場合がある。好ましくは、Ｎ末端アミノ酸の一級アミン官能基を保護するため、アシル型（Ｒ−ＣＯ−）のＲ１基による置換が使用され、ここでラジカルＲは、アセチル型の飽和若しくは不飽和Ｃ１〜Ｃ３０アルキル鎖、又はベンゾイル、トシル、若しくはベンジルオキシカルボニル型の芳香族基のいずれかであり、さらにより好ましくはアセチル基である。好ましくは、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル官能基を保護するため、Ｃ１〜Ｃ３０アルキル鎖型のＲ２基、又はＮＨ２、ＮＨＹ若しくはＮＹＹ基（ここでＹはＣ１〜Ｃ４アルキル鎖を表す）、さらにより好ましくはＮＨ２基による置換が使用される。
【００３３】
本発明によるペプチドは、Ｎ末端若しくはＣ末端の終端又は両方の終端で保護されてもよい。
【００３４】
本発明によるペプチドの二量体化を阻害するため、Ｃ末端システインのチオール官能基を、メチル若しくはアセチル基、又は別のシステインによって置換することができる。後者の場合、置換により２つのシステイン残基の間にジスルフィド結合が形成される。
【００３５】
したがって、本発明は、本発明によるペプチド及び有利にはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１３の配列のペプチドが保護形態又は非保護形態であり、好ましくはＣ末端終端で保護形態であることを特徴とする、上記の組成物に関する。
【００３６】
本発明による一般式（Ｉ）のペプチドは、古典的な化学合成（固相中又は液体均質相中での）、又は構成アミノ酸からの酵素合成（Ｋｕｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８０，ｖｏｌ．２２５，ｐ．８２３４）のいずれかによって得ることができる。
【００３７】
本発明によるペプチドは、天然由来でも合成由来でもよい。好ましくは本発明によると、ペプチドは合成由来であり、化学合成によって得られる。
【００３８】
本発明によると、活性化剤は単一のペプチドでもペプチドの混合物でもよい。
【００３９】
本発明によるペプチドは、有利には１つ又はそれ以上の生理学的に好適な溶媒、例えば水、グリセロール、エタノール、プロパンジオール、ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、エトキシ化若しくはプロポキシ化ジグリコール、環状ポリオール又はこれらの溶媒のいずれかの混合物に可溶化される。
【００４０】
用語「生理学的に好適な」は、選択された溶媒が毒性又は不耐性反応を生じることなく皮膚への接触に適することを意味する。
【００４１】
希釈されたペプチドは、続いて滅菌濾過により滅菌される。
【００４２】
この希釈段階の後、ペプチドは、リポソームのような化粧品、若しくは、医薬品用ベクター又は化粧品分野で使用されるその他のマイクロカプセルに封入若しくは収容され、又は粉末状有機ポリマー、タルク及びベントナイトのような鉱物担体上に吸着され、より一般的には、生理学的に好適なベクターに可溶化されるか又は結合される。
【００４３】
本発明の第２の主題によると、一般式（Ｉ）のペプチドを薬物として使用できる。
【００４４】
特に有利には、一般式（Ｉ）のペプチドを治癒剤として使用できる。
【００４５】
本発明の別の目的は、本発明によるペプチドを生理学的に好適な媒体中に包含する、医薬治癒組成物を提供することである。
【００４６】
本発明の特定の態様によると、前記ペプチドを、加齢又は早期光加齢に関連する皮膚科学的症状の治療、特に遅延治癒、弛緩及び皮膚委縮、日光弾性線維症並びに真皮表皮接合低下の治療に使用することができる。
【００４７】
有利には、本発明のこの実施形態によると、医薬組成物は局所使用に好適と考えられ、又は皮下若しくは皮内注射に適した液体形態であってもよく、特に複数回の表層局所脂肪溶解型注射に好適である。
【００４８】
本発明の第３の目的は、一般式（Ｉ）のペプチドをデルマトポンチン活性化剤として、生理学的に好適な媒体中に包含する化粧品組成物を提供することである。
【００４９】
本発明の有利な実施形態によると、本発明の活性化剤は本発明の組成物中に、最終組成物の全重量を基準にして約１０−９Ｍ〜１０−３Ｍの濃度、好ましくは１０−８Ｍ〜１０−５  Ｍの濃度、さらにより好ましくは５．１０−５Ｍ〜５．１０−６Ｍで存在する。
この濃度範囲は、所望の分子影響、すなわち、デルマトポンチン、Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲン及びフィブロネクチンの活性化を得るために必要な活性化剤の量を示す。
【００５０】
好ましくは、本発明の組成物は、皮膚に対して生理学的に好適な媒体を包含する局所適用に好適な形態である。「生理学的に好適な」は、皮膚又はヒトの皮膚付属物との接触において、毒性、不適合性、不安定性、アレルギー反応又はその他の副作用の危険なく、使用に好適な媒体を指す。
【００５１】
「局所適用」とは、本発明による活性化剤、又はそれを含有する組成物の皮膚表面上への適用又は塗布を指す。
【００５２】
これらの組成物は、特に、水性、水性アルコール又は油性の溶液；水中油型若しくは油中水型エマルション又は複数のエマルション；水性若しくは無水ゲル；コロイドの形態であってもよい。これらの組成物は、皮膚、粘膜、唇及び／又は皮膚付属物への適用に好適なクリーム、懸濁液、又は粉末の形態であることもできる。これらの組成物は多少流体であってもよく、クリーム、ローション、ミルク、漿液、ポマード、クリーム、ペースト又は泡の外観を有してもよい。さらに、スティックのような固体形態であってもよく、エアロゾル形態で皮膚に適用されてもよい。当該組成物は、ケア製品として及び／又は皮膚のメークアップ製品として使用できる。
【００５３】
さらに、これらの組成物はすべて、想定される使用分野で一般的に使用される添加剤並びにその配合に必要な補助剤、例えば共溶媒（エタノール、グリセロール、ベンジルアルコール、湿潤剤等）、増粘剤、希釈剤、乳化剤、酸化防止剤、着色剤、日焼け防止剤、顔料、充填剤、防腐剤、香料、臭気吸収剤、精油、微量元素、必須脂肪酸、界面活性剤、皮膜形成ポリマー、化学又は鉱物フィルタ、水和剤又は温泉水等を包含する。例として、多糖類のような天然型の水溶性ポリマー、又はポリペプチド、メチルセルロース若しくはヒドロキシプロピルセルロース型のセルロース誘導体、又は合成ポリマー、ポロキサマー、カルボマー、シロキサン、ＰＶＡ又はＰＶＰ、特にＩＳＰカンパニーが販売するポリマーを挙げることができる。
【００５４】
いずれの場合も、当業者は、これらの補助剤並びにその比率が、本発明の組成物が探究する有利な特性を相殺しないように選択されることを確認するであろう。これらの補助剤は、例えば、組成物の総重量の０．０１〜２０％の範囲の濃度で存在してもよい。本発明の組成物がエマルションであるとき、脂肪相は組成物の全重量を基準にして５〜８０重量％、好ましくは５〜５０重量％で存在してもよい。組成物に使用される乳化剤及び共乳化剤は、考慮する分野で従来使用されるものから選択されるであろう。例えば、それらは組成物の全重量を基準にして０．３〜３０重量％の範囲の比率で使用できる。
【００５５】
当然、本発明の活性化剤は、単独でも他の活性化剤と共にでも使用できる。
【００５６】
有利には、本発明にしたがって使用できる組成物は、さらに、皮膚の加齢の兆候の防止及び改善の分野において、本発明の活性化剤の作用を増強することを目的とした少なくとも１つのその他の活性化剤、又は考慮する組成物の特性の範囲拡大を可能にする別の活性化剤を含有する。
【００５７】
非限定的に、以下の分類の成分を挙げることができる：再生剤、抗加齢剤、抗皺剤、肥厚化剤、抗フリーラジカル剤、抗糖化剤、水和剤、抗菌剤、抗真菌剤、角質溶解剤、筋弛緩剤、角質除去剤、及びトーニング剤、真皮巨大分子の合成若しくははエネルギー代謝を刺激する作用剤、皮膚分化、色素沈着若しくは色素脱失を調節する作用剤、爪若しくはは毛髪の成長を刺激する作用剤、微小循環を刺激する作用剤、日焼け防止剤又はメタプロテイナーゼ阻害剤。
【００５８】
本発明の特定の実施形態において、本発明による組成物は、本発明によるペプチドとは別に、以下も包含するであろう
−少なくとも１つのシトクロムｃ活性化化合物、及び／又は
−少なくとも１つの水和化合物、例えばアクアポリン活性化化合物、及び／又は
−少なくとも１つのサーチュイン活性化化合物、及び／又は
−少なくとも１つの細胞付着増大化合物、及び／又は
−少なくとも１つの、マトリックスタンパク質の産生を増大する化合物、例えばコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、グリコサミノグリカン及び／又は
−少なくとも１つのプロテアーゼ活性調節化合物、及び／又は
−少なくとも１つの概日リズム調節化合物、及び／又は
−少なくとも１つのＨＳＰタンパク質調節化合物、及び／又は
−少なくとも１つの細胞エネルギー増加化合物、及び／又は
−少なくとも１つの皮膚色素沈着調節化合物、及び／又は
−少なくとも１つのコエンザイムＱ１０活性化化合物、及び／又は
−少なくとも１つの、バリア機能を改善する化合物、例えばトランスグルタミナーゼ又はＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ活性化化合物、及び／又は
−少なくとも１つのミトコンドリア保護化合物。
【００５９】
前記化合物は、植物のペプチド加水分解物のような天然由来でもよく、又はペプチドのような合成由来でもよい。
【００６０】
その機能とは関係なく、本発明の活性化剤に関連する組成物中のその他の活性化剤は非常に多様な化学構造を有してもよい。非限定的には、ペプチド、ビタミンＣ及びその誘導体、ビタミンＢ群、ＤＨＥＡ（デヒドロエピアンドロステロン（ｄｉｈｙｄｒｏｅｐｉａｎｄｒｏｓｔｅｒｏｎｅ））、フィトステロール、サリチル酸及びその誘導体、レチノイド、フラボノイド、糖アミン、アゾール、金属塩、植物由来のペプチド抽出物又はポリマーが挙げられる。
【００６１】
本発明の第４の目的は、真皮表皮接合部の構造を強化し、真皮表皮接合部の構成成分の発現を刺激し、真皮表皮接合部の支持領域の緻密化を増大し、又はさらには基底角化細胞及び／又はメラニン細胞の真皮表皮接合部への固着を改善するための、活性化剤として一般式（Ｉ）のペプチドを包含する化粧品組成物の使用に関する。
【００６２】
本発明の第５の目的は、皮膚の線維芽細胞による細胞外マトリックスのタンパク質の発現を増大するための、活性化剤として一般式（Ｉ）のペプチドを包含する化粧品組成物の使用に関する。
【００６３】
本発明の有利な態様によると、当該活性化剤は、真皮の密度及び弾力性、したがって皮膚の引き締まりを増大し、フェイスラインのたるみ、ボリュームの低下、皮膚菲薄化、弛緩、小皺、深い皺及び皮膚委縮を防止又は抑制することを可能にする。
【００６４】
本発明の第６の目的は、外的ストレスを受ける皮膚のコラーゲン線維及び弾性線維の分解を防止するための、活性化剤として一般式（Ｉ）のペプチドを包含する化粧品組成物の使用に関する。
【００６５】
「外部ストレス」という表現は、環境によって生じうるストレスを指す。例として、汚染、ＵＶ照射、又は刺激物質のようなストレスを挙げることができる。汚染は、「外的」汚染、例えば、ディーゼル粒子、オゾン又は重金属によるもの、並びに「体内」汚染、特に塗料溶剤、接着剤、若しくは壁紙からの排出物（トルエン、スチレン、キシレン又はベンズアルデヒド等）又はタバコの煙によるものの両方を指す。
【００６６】
活性化剤は、ＵＶ照射、より具体的にはＵＶＡ照射後の弾性線維の分解及び組織崩壊を制限すること及びコラーゲン線維の再構築を刺激することを可能にすることが実証されている。
【００６７】
弾性線維の組織崩壊とは、日光への繰り返しの暴露による変化すべて、並びに日光弾性線維症に典型的なジストロフィー性弾性線維の蓄積を指す。肌の悪化は改善されにくく、加齢に関連する皮膚の下垂又はたるみの一因であり、主に真皮に深く振盪するＵＶＡ照射によって生じる。
【００６８】
本発明の特定の実施形態は、ＵＶ照射、より具体的にはＵＶＡ照射への暴露によって引き起こされる日光弾性線維症及び／又は弾性線維の組織崩壊に関連する非審美的な兆候を防止又は抑制するための、本発明によるペプチドを包含する化粧品組成物の使用に関連する。
【００６９】
本発明の第７の目的は、表皮及び真皮の再生を増大するための、活性化剤として一般式（Ｉ）のペプチドを包含する化粧品組成物の使用に関する。
【００７０】
「表皮及び真皮の再生」という表現は、本発明の有利な態様により、本発明のペプチドが角化細胞及び線維芽細胞の増殖及び移動の増大を引き起こし、それによって表皮の再生の加速、より一般的には皮膚のより良い再生を促進することを意味する。
【００７１】
本発明の第８の目的は、本発明の組成物が処置すべき皮膚に局所適用されることを特徴とする、皮膚の加齢及び光加齢の兆候を防止及び／又は治療することを目的とする美容ケアのための方法に関する。
【００７２】
皮膚の加齢の兆候により、加齢による皮膚及び皮膚付属物の外観のすべての変化が理解される。例えば、皮膚菲薄化、たるみ、弾力性喪失及び弛緩、深い線及び皺、引き締まり及びハリの喪失、皮膚萎縮又はその他のＵＶ照射への暴露の結果生じる皮膚の内的分解等である。
【００７３】
本発明は、特に、ＵＶ照射による肌ストレスから皮膚を保護することを目的とした美容処置の方法に関する。
【００７４】
特定の１つの実施形態において、該当組成物は、弾性線維の組織崩壊を防止するための日焼け前のケア処置として、日光に暴露する前に適用される。
【００７５】
本発明の第２の実施形態において、該当組成物はコラーゲン及び弾性繊維が受けた損傷を修復するための日焼け後ケア処置として、日光暴露の後に適用される。
【００７６】
本発明のその他の利点及び特徴は、例証及び非限定的な目的で提供される以下の実施例を見ることでより明白になるであろう。
【実施例１】
【００７７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ９ペプチドのデルマトポンチン発現に対する活性化作用の実証
【００７８】
本研究の目的は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５ペプチド及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ９ペプチドが線維芽細胞におけるデルマトポンチンの発現に与える影響を明らかにすることである。この目的のため、正常ヒト繊維芽細胞培養及び生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で培養された皮膚で特異的な免疫蛍光標識を実施した。
【００７９】
プロトコル：正常ヒト線維芽細胞を２４又は４８時間培養し、１日１回ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５ペプチド又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ９ペプチドの１０−６Ｍ溶液で処理する。続いて当該細胞を洗浄し、３．７％ホルムアルデヒドを用いて周囲温度にて１０分間固定する。
【００８０】
ヒト皮膚試料を培養液の気液界面に置く。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５ペプチド又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ９ペプチドの１０−６Ｍ溶液を局所適用した後、当該試料を２４時間又は４８時間インキュベートする。続いて前記皮膚試料をホルムアルデヒドで固定してパラフィン中に包埋するか又は−２０℃で凍結することによってＯＣＴで固定する。続いて３〜４μｍの切片を作製する（低温切片の場合は６μｍ）。パラフィン包埋した試料の免疫標識を、特定部位のアンマスキング後に実施する。ＯＣＴ包埋した試料の免疫標識を、３７℃で冷アセトンを用いて固定した後に実施する。
【００８１】
固定された細胞又は切片を、特定のウサギデルマトポンチンポリクローナル抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ  ｇｒｏｕｐ，  Ｒｅｆ：１０５３７−１−ＡＰ）、続いて蛍光マーカーに結合した二次抗体の存在下でインキュベートする。アドホック（ａｄ  ｈｏｃ）培地にマウントした後、細胞を落射蛍光顕微鏡（ニコン  エクリプスＥ６００顕微鏡）で観察する。
【００８２】
結果：試験したすべての条件下で、１０−６ＭのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５ペプチド又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ９ペプチドで処理した線維芽細胞において、対照条件下よりも強い蛍光が観察されている。
ヒトの皮膚は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５ペプチド又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ９ペプチドで処理した試料の真皮において、より強い蛍光を示す。
【００８３】
結論：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ９ペプチドは、真皮の線維芽細胞によるデルマトポンチンの発現を非常に実質的に刺激する。
【実施例２】
【００８４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ５ペプチドで処理した皮膚細胞の超微細構造の研究
【００８５】
本研究の目的は、１０−６ＭのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５ペプチドで処理した角化細胞及び線維芽細胞の細胞内構造を観察することである。
【００８６】
プロトコル：
ＮＨＥＫ又は線維芽細胞をディッシュ又はＴｒａｎｓｗｅｌｌシステム内で培養する、又は生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）培養した皮膚をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５ペプチドの１０−６Ｍ溶液で４８時間処理する（培地は２４時間毎に交換する）。皮膚細胞又は試料をＰＢＳで洗浄した後、カルノフスキー高張固定液（４％パラホルムアルデヒド、５％グルタルアルデヒドを含む０．０８Ｍリン酸バッファー）によって、周囲温度で１時間、その後４℃で２４時間、固定する。細胞をスクレイピングにより基質から剥がし、４℃、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。上清を除去し、０．１Ｍカコジル酸ナトリウムバッファーをペレットに沈着させる。細胞を２％アガーと混合し、その後、四酸化オスミウムによって、１時間後、固定する。次に、検体を、一連のアルコール（５０〜１００％）の連続的通過により脱水する。その後、皮膚細胞又は試料を樹脂でコーティングする。重合を、約１２時間、６０℃で実行する。０．５μｍの準超薄切片を、ウルトラミクロトームを用いて作製する。切片を、下塗りされたスライド（ｓｕｂｂｅｄ  ｓｌｉｄｅ）上に加熱下にて置き、その後、トルイジンブルーで染色する。その後スライドを再度脱水し、好適な培地にマウントする。最適な試験領域を選択した後、ブロックを所望の寸法にサイズ変更し、超薄切片を作製する。「銀白」色及び好適な寸法の切片のみを、酢酸ウラリルおよびクエン酸鉛で二重標識した電子顕微鏡のグリッド上にマウントし、６０又は８０ＫＶで透過電子顕微鏡観察する。
【００８７】
結果：超微細構造研究により、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５ペプチドで処理した角化細胞において、細胞小器官、特にミトコンドリアが集積していることがわかる。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）システムの培養液において、角化細胞間の細胞間接触は、未処理対照よりも接着して見え、嵌合はより染色されて見える。同様に、生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）皮膚培養物では、基底層の細胞間により狭い細胞接触が観察される。
【００８８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５ペプチドで処理した培養物中の線維芽細胞において、カベオラ体、粗面小胞体及びゴルジ体は対照細胞よりも実質的に発達していることが観察される。未処理の対照細胞との比較により、細胞外マトリックスの構成成分のより強い分泌も観察される。
【００８９】
結論：培養物中の角化細胞において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５ペプチドは１０−６Ｍで細胞活性の全体的な刺激を引き起こし、これは特にミトコンドリアの密度増大を伴う。
【００９０】
線維芽細胞において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５ペプチドは、細胞外マトリックスの構成成分の合成の増大を誘発する。
【００９１】
生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）皮膚培養において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５ペプチドは基底角化細胞の細胞間接触を増大する。
【実施例３】
【００９２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５ペプチドのフィブロネクチン発現に対する活性化作用の実証
【００９３】
本発明の目的は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５ペプチドが、線維芽細胞によって合成される細胞外マトリックスのタンパク質であるフィブロネクチンの発現に与える影響を明らかにすることである。そのために、繊維芽細胞培養物及び生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）皮膚培養物で特異的な免疫蛍光標識を実施した。
【００９４】
プロトコル：培養物中のヒト皮膚線維芽細胞を、１日１回、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５ペプチドの１０−６Ｍ溶液で処理する（活性化剤を含有する培地は２４時間毎に交換する）。続いて当該細胞を洗浄し、３．７％ホルムアルデヒドを用いて周囲温度にて１０分間固定する。
【００９５】
ヒト皮膚試料を培養液の気液界面に置く。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５ペプチド又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ９ペプチドの１０−６Ｍ溶液を局所適用した後、当該試料を２４時間又は４８時間インキュベートする。続いて前記皮膚試料をホルムアルデヒドで固定してパラフィン中に包埋するか又は−２０℃で凍結することによってＯＣＴで固定する。続いて３〜４μｍの切片を作製する（低温切片の場合は６μｍ）。パラフィン包埋した試料の免疫標識を、特定部位のアンマスキング後に実施する。ＯＣＴ包埋した試料の免疫標識を、３７℃で冷アセトンを用いて固定した後に実施する。
【００９６】
固定された細胞又は切片を特定のウサギフィブロネクチンポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｒｅｆ：Ｆ−３６４８）、続いて蛍光マーカーに結合した二次抗体の存在下でインキュベートする。続いて、細胞を落射蛍光顕微鏡（ニコン  エクリプスＥ６００顕微鏡）で観察する。
【００９７】
結果：１０−６ＭのＳＥＱ  ＩＮ  ＮＯ５ペプチドで処理した線維芽細胞で、対照細胞よりも強い細胞質蛍光が観察される。
【００９８】
生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）皮膚において、蛍光は主に乳頭真皮の上部の真皮表皮接合部の直下に位置している。
【００９９】
結論：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５ペプチドは、線維芽細胞におけるフィブロネクチンの発現を非常に実質的に刺激する。
【０１００】
ヒトの皮膚において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５ペプチドは真皮表皮接合部の支持領域の緻密化を刺激する。
【実施例４】
【０１０１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５ペプチドのコラーゲンＩ及びコラーゲンＩＩＩ皮膚細胞外マトリックスの分子発現に対する活性化作用の実証
【０１０２】
本研究の目的は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５ペプチドが皮膚細胞外マトリックスの分子発現に与える影響を明らかにすることである。この目的のため、真皮から得たヒト線維芽細胞のコラーゲンＩ及びＩＩＩの発現を試験した。
【０１０３】
プロトコル：正常ヒト線維芽細胞を２４又は４８時間培養し、１日１回ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５ペプチド又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ９ペプチドの１０−６Ｍ溶液で処理する。続いて当該細胞を洗浄し、３．７％ホルムアルデヒドを用いて周囲温度にて１０分間固定する。
【０１０４】
ヒト皮膚試料を培養液の気液界面に置く。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５ペプチド又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ９ペプチドの１０−６  Ｍ溶液を局所適用した後、当該試料を２４時間又は４８時間インキュベートする。続いて前記皮膚試料をホルムアルデヒドで固定してパラフィン中に包埋するか又は−２０℃で凍結することによってＯＣＴで固定する。続いて３〜４μｍの切片を作製する（低温切片の場合は６μｍ）。パラフィン包埋した試料の免疫標識を、特定部位のアンマスキング後に実施する。ＯＣＴ包埋した試料の免疫標識を、３７℃で冷アセトンを用いて固定した後に実施する。
【０１０５】
固定された細胞又は切片を特定のウサギコラーゲンＩポリクローナル抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｒｅｆ：６００−４０１−１０３）又は特定のウサギコラーゲンＩＩＩポリクローナル抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｒｅｆ：６００−４０１−１０５）、続いて蛍光マーカーに結合した二次抗体の存在下でインキュベートする。アドホック（ａｄ  ｈｏｃ）培地にマウントした後、細胞を落射蛍光顕微鏡（ニコン  エクリプスＥ６００顕微鏡）で観察する。
【０１０６】
結果：１０−６ＭのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５ペプチドで処理した培養物及び皮膚切片で、対照条件下よりも強い蛍光が観察されている。
【０１０７】
結論：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５ペプチドは１０−６Ｍにて、皮膚細胞外マトリックスの２つの必須線維状タンパク質であるコラーゲンＩ及びコラーゲンＩＩＩの発現を増大する。
【実施例５】
【０１０８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５ペプチドのＵＶ照射を受けたエラスチン線維に対する保護作用の実証
【０１０９】
本研究の目的は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５ペプチドが真皮中に存在する弾性線維に与える影響を明らかにすることである。この目的のため、生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で培養した皮膚試料で弾性線維の特異的染色を実施した。
【０１１０】
プロトコル：ヒト皮膚試料を培養液の気液界面に置く。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５ペプチドの１０−６Ｍ溶液を局所適用し、当該試料を４８時間インキュベートした後、５Ｊ／ｃｍ２にてＵＶＡ照射する。平行して、未処理の照射対照を作製する。
【０１１１】
前記皮膚試料をホルムアルデヒドで固定した後、パラフィン中に包埋する。続いて４μｍの切片を作製する。前記皮膚切片をパラフィンから連続的に除去した後、別々のキシレン浴及びアルコール浴中で再水和する。エラスチン線維を、Ｅｌａｓｔｉｋａ  ｖａｎ  Ｇｉｅｓｏｎ染色キット（ＶＷＲ，Ｒｅｆ：１．１５９７４）を用いて染色する。染色した皮膚切片を、脱水し、Ｅｕｋｉｔｔ封入剤にマウントし、顕微鏡観察する。
【０１１２】
結果：顕微鏡観察の結果、照射及び１０−６ＭのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５ペプチドで処理した試料は、対照条件下よりも弾性線維の分解が少なく、弾性線維の組織がよく保存された。
【０１１３】
結論：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５ペプチドは１０−６Ｍで、ＵＶ照射によって引き起こされる弾性線維の改変を防止する。
【実施例６】
【０１１４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５ペプチドの再生作用の実証
【０１１５】
本発明の目的は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５ペプチドが皮膚線維芽細胞及び正常ヒト角化細胞（ＮＨＥＫ）に与える再生作用を明らかにすることである。そのために、Ｉｂｉｄｉインビトロ治癒モデル（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｂｉｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ドイツ国ミュンヘン）を使用した。
【０１１６】
プロトコル：この実験は、細胞層の中央における無細胞領域の維持及び、「瘢痕」のいずれかの側に配置された細胞が移動又は増殖して間隙を埋めるのに要する時間の評価からなる。接着性シリコンカルチャーインサートを培養皿のウェルの底に置く。このインサートは厚さ５００  μｍの不透過性の膜で分離された２つの別個のチャンバを具備するという特殊な特徴を有する。２つのチャンバの各々に同じ細胞型の細胞を播種し、コンフルエントまで培養する。続いて、インサートを滅菌鉗子で取り除き、２つの細胞層の間に幅４００μｍの無細胞領域を作る。続いて、細胞を、培地に添加したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５ペプチドの１０−６Ｍ又は３．１０−６Ｍ溶液で、ペプチドを２４時間毎に交換しながら処理する。位相差顕微鏡観察（オリンパスＣＫ４０顕微鏡Ｘ５をオリンパスＥ−５１０カメラに接続）を、増殖及び移動プロセスにより間隙が充填されるまでの異なる時間（０、６、２４、３０及び４８時間）において実施した。
【０１１７】
結果：顕微鏡観察で、１０−６ＭのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５ペプチドで処理したヒト角化細胞により、３０時間後に間隙がすべて充填されることが示される。同時に、対照条件下では、細胞間隙はまだ充填されていない。
【０１１８】
１０−６ＭのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５ペプチドで処理したヒト線維芽細胞では、４８時間後に間隙の全充填が見られる。同時に、対照条件下では、細胞間隙はまだ充填されていない。
【０１１９】
細胞を３．１０−６ＭのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５で処理した場合の方が、間隙が早く充填されることから、このペプチドの作用は用量依存性である。
【０１２０】
結論：線維芽細胞及び正常ヒト角化細胞（ＮＨＥＫ）は、ＳＥＱ  ＩＮ  ＮＯ５ペプチドの存在下で培養した場合、対照条件と比較して、より早く間隙を充填した。
【０１２１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５ペプチドは、線維芽細胞及びＮＨＥＫの増殖及び移動を刺激し、その結果皮膚再生を促進する。
【実施例７】
【０１２２】
組成物の調整
１−日焼け止めクリーム：
【０１２３】
【表１】
2013542950.tif 000002
【０１２４】
Ａ相及びＢ相の構成成分を別々に７０℃〜７５℃で加熱する。Ｂ相をＡ相に撹拌下で乳化する。Ｃ相を、撹拌を増大することによって４５℃にて添加する。続いて、温度が４０℃未満のときにＤ相を添加する。強力に撹拌しながら２５℃まで冷却を継続する。
２−フェイシャルスカルプティングクリーム：
【０１２５】
【表２】
2013542950.tif 000003
【０１２６】
2013542950.tif 000004
【０１２７】
Ａ相を６５〜７０℃にて調製及び溶融する。Ｃ相を６５〜７０℃に加熱する。ＡをＢ中に乳化する直前にＢ相をＡ相に加える。約４５℃で、Ｄ相を添加することによってカルボマーを中和する。続いて、Ｅ相を軽微な撹拌下で添加し、２５℃まで冷却を継続する。続いて、望ましい場合にはＦ相を添加する。
３−日中用保護クリーム：
【０１２８】
【表３】
2013542950.tif 000005
【０１２９】
2013542950.tif 000006
【０１３０】
Ａ相を調製し、撹拌下で７５℃に加熱する。Ｂ相を、カーボポール、続いてキサンタンガムを撹拌下で分散することによって調製する。放置する。７５℃に加熱する。
【０１３１】
該温度にて、ロータ／ステータ撹拌下でＡをＢに乳化する。急速撹拌下でＣ相を中和する。４０℃で冷却した後、Ｄ相、続いてＥ相を添加する。冷却を、軽微な撹拌下で継続し、Ｆ相を添加する。
【配列表】
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【国際調査報告】
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