(57)【要約】本発明は、1-ヘキセンまたはブタジエンのような、α-オレフィンを合成できるポリケチドシンターゼ(PKS)を提供する。本発明は、PKSを含みかつ培養時にα-オレフィンを生成する宿主細胞もまた提供する。2013544500.tif 000047
2013544500.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
α-オレフィンを合成できる、天然に存在しないポリケチドシンターゼ(PKS)、またはその機能的変種。
【請求項２】
α-オレフィンが、天然のPKSによって合成される化合物ではない、請求項1記載のPKS。
【請求項３】
2種またはそれより多いPKS由来の、モジュール、ドメイン、および/もしくはその一部、またはその機能的変種を含むハイブリッドPKSである、請求項1記載のPKS。
【請求項４】
リングビヤ マジュスキュラ(Lyngbya majuscula) CurMの、STおよびTE、またはその機能的変種を含んだ末端モジュールを含む、請求項3記載のPKS。
【請求項５】
リングビヤ マジュスキュラCurMの、KR、ACP、ST、およびTE、またはその機能的変種を含んだ末端モジュールを含む、請求項4記載のPKS。
【請求項６】
リングビヤ マジュスキュラCurMの、AT、KR、ACP、ST、およびTE、またはその機能的変種を含んだ末端モジュールを含む、請求項5記載のPKS。
【請求項７】
表2〜4に記述されているSTおよびTE、またはその機能的変種を含んだ少なくとも1つの末端モジュールを含む、請求項3記載のPKS。
【請求項８】
アクリリル-CoAを組み入れたローディングモジュールを含む、請求項3記載のPKS。
【請求項９】
アクリリル-CoAを受容するよう修飾されているDEBSプロピオニル-CoA特異的ローディングドメインであるローディングモジュールを含む、請求項3記載のPKS。
【請求項１０】
末端炭素が、後に酸化されるメチル基として組み入れられたモジュールを含む、請求項9記載のPKS。
【請求項１１】
α-オレフィンが以下の化学構造を有する、請求項1記載のPKS:
2013544500.tif 000043
式中、各R1は独立して-Hまたは-CH3であり、各R2は独立して-Hまたは-OHであり、nは1〜10の整数であり、αβは(1) 単結合または(2) 二重結合であり、ただしαβが二重結合であるなら、対応するR2はHである。
【請求項１２】
α-オレフィンが1-ヘキセン、1-デセン、または(E)-デカ-1,5-ジエンである、請求項11記載のPKS。
【請求項１３】
α-オレフィンが、以下の化学構造を有する芳香族α-オレフィンである、請求項1記載のPKS:
2013544500.tif 000044
式中、R3は-H、-OH、-NH3、または-NO2である。
【請求項１４】
α-オレフィンが以下の化学構造を有する、請求項1記載のPKS:
2013544500.tif 000045
式中、Rは以下の構造：
2013544500.tif 000046
の1つである。
【請求項１５】
請求項1〜13記載のポリケチドシンターゼ(PKS)をコードする組換え核酸。
【請求項１６】
宿主細胞中での安定的な維持能力がある、組換え核酸14を含むレプリコン。
【請求項１７】
プラスミドまたはベクターである、請求項16記載のレプリコン。
【請求項１８】
ベクターが発現ベクターである、請求項17記載のレプリコン。
【請求項１９】
請求項15記載の組換え核酸を含む宿主細胞。
【請求項２０】
請求項16〜18記載のレプリコンを含む宿主細胞。
【請求項２１】
培養時に、α-オレフィンを生成する、請求項19または20記載の宿主細胞。
【請求項２２】
アクリリル-ACPスターターを含むローディングモジュールを含んだ、ブタジエンを生成するPKSを含み、かつ
プロピオニル-CoAリガーゼ(シンテターゼ) (EC 6.2.1.17)およびアシル-CoAデヒドロゲナーゼ(哺乳類) (EC 1.3.99.3)、またはその機能的変種をコードする1種または複数種の核酸をさらに含み、
培養時にかつ任意でプロピオネートの提供時に、PKSがアクリリル-CoAを合成できかつブタジエンを生成できる、請求項21記載の宿主細胞。
【請求項２３】
アクリリル-ACPスターターを含むローディングモジュールを含んだ、ブタジエンを生成するPKSを含み、かつ
ラクテートデヒドロゲナーゼ(EC 6.2.1.17)、ラクテートCoAトランスフェラーゼ(EC 2.8.3.1)、プロピオニル-CoAリガーゼ(シンテターゼ) (EC 6.2.1.17)、およびラクトイル-CoAデヒドラターゼ(EC 4.2.164)、またはその機能的変種をコードする1種または複数種の核酸をさらに含み、
培養時にかつ任意でプロピオネートおよびグルコースの提供時に、PKSがアクリリル-CoAを合成できかつブタジエンを生成できる、請求項21記載の宿主細胞。
【請求項２４】
アクリリル-ACPスターターを含むローディングモジュールを含んだ、ブタジエンを生成するPKSを含み、かつ
アセチル-CoAカルボキシラーゼ(EC 6.4.1.2)、マロニル-CoAレダクターゼ(EC 1.2.1.-)、3-ヒドロキシプロピオネート:CoAリガーゼおよび3-ヒドロキシプロピオニル-CoAヒドラターゼ(EC 4.2.1.17)、またはその機能的変種をコードする1種または複数種の核酸をさらに含み、
培養時に、PKSがアクリリル-CoAを合成できかつブタジエンを生成できる、請求項21記載の宿主細胞。
【請求項２５】
アクリリル-ACPスターターを含むローディングモジュールを含んだ、ブタジエンを生成するPKSを含み、かつ
プロピオニル-CoAリガーゼ(シンテターゼ) (EC 6.2.1.17)、AccA/PccB遺伝子産物およびラクトイル-CoAデヒドラターゼ(EC 4.2.164)、ならびにラクテートデヒドロゲナーゼ(EC 6.2.1.17)、ラクテートCoAトランスフェラーゼ(EC 2.8.3.1)、プロピオニル-CoAリガーゼ(シンテターゼ) (EC 6.2.1.17)およびラクトイル-CoAデヒドラターゼ(EC 4.2.164)もしくはアシル-CoAデヒドロゲナーゼ、またはその機能的変種をコードする1種または複数種の核酸をさらに含み、
培養時にかつ任意でプロピオネートの提供時に、PKSがアクリリル-CoAを合成できかつブタジエンを生成できる、請求項21記載の宿主細胞。
【請求項２６】
請求項21〜25のいずれか一項記載の宿主細胞を提供する段階、およびα-オレフィンが生成されるような適当な培地中で該宿主細胞を培養する段階を含む、α-オレフィンを生成する方法。
【請求項２７】
α-オレフィンを単離する段階をさらに含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
重合体を生成するためにα-オレフィンを重合させる段階をさらに含む、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
α-オレフィンがポリオレフィンである、請求項26〜28のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
ポリオレフィンがブタジエン、イソプレン、または(E)-デカ-1,5-ジエンである、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
請求項21〜25のいずれか一項記載の宿主細胞から単離されたα-オレフィン、ならびに宿主細胞の微量残留物および/または夾雑物を含む組成物。
【請求項３２】
α-オレフィンがポリオレフィンである、請求項31記載の組成物。
【請求項３３】
ポリオレフィンがブタジエン、イソプレン、または(E)-デカ-1,5-ジエンである、請求項32記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2010年9月28日付で出願された米国仮特許出願第61/387,435号の優先権を主張するものであり、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
政府支援の表明
本発明は、米国エネルギー省が与えた契約第DE-AC02-05CH11231号および全米科学財団が与えた助成番号0540879の下で政府支援により行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は概して、ポリケチドシンターゼを用いたα-オレフィンの生成に関し、そのため、化学、微生物学および分子生物学の分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
I型ポリケチドシンターゼ(PKS)は、脂肪酸シンターゼ(FAS)の触媒能の全てを保有しうる、プログラム可能な多機能酵素である。しかしながら、炭化水素骨格の伸長のたびに産生されるβ-カルボニルを反復的に伸長しかつ完全に還元するFAS酵素とは異なり、PKS系では、新生鎖の伸長および還元ごとに別々の酵素ドメインのセットを利用する。通常、モジュールと呼ばれるこれらのセットは、異なる側鎖を生ずる種々のエクステンダー単位を組み入れることができる。これらはまた、成長中のポリケチド鎖のβ位に、ケトン、ヒドロキシ、二重結合または完全飽和した炭素をそれぞれもたらす、FASに関連した0〜3つの還元ドメインをコードすることができる(Hopwood and Sherman. 1990. Annual Review of Genetics 24:37-66（非特許文献１）)。
【０００５】
PKS系は、そのモジュール性によって、「非天然の」天然産物の生成のために広く探求されてきた(Weissman and Leadlay. 2005. Nature Reviews Microbiology 3:925-936（非特許文献２）)。基本的なラクトンから修飾型の薬物および薬物様の化合物にまで及ぶ、何百ものこれらの分子が生成されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Hopwood and Sherman. 1990. Annual Review of Genetics 24:37-66
【非特許文献２】Weissman and Leadlay. 2005. Nature Reviews Microbiology 3:925-936
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、α-オレフィンを合成できるポリケチドシンターゼ(PKS)、それらを生成するための組換え発現ベクター、それらを発現しかつ所望のα-オレフィンを生成する組換え宿主細胞、α-オレフィンを産生するための方法、および該方法によって生成されるα-オレフィンを提供する。本発明のPKSは天然に存在しないため「組換え」PKS酵素といわれる。本発明のいくつかの態様において、α-オレフィンは、天然のPKSによって合成される化合物ではない。本発明のいくつかの態様において、PKSは、2種、3種、4種またはそれより多い天然のPKS由来の、モジュールおよび/またはその一部を含むハイブリッドPKSである。ハイブリッドPKSは、2種以上の天然のPKS由来の天然のモジュールを含有することができ、かつ/またはハイブリッドPKSは、その同じ天然のPKS由来であるかまたは2種以上の天然のPKS由来であるかあるいはその両方の、2つ以上のモジュールの、無傷のドメインを含む部分から構成される1つまたは複数のモジュールを含有することができる。本発明のいくつかの態様において、天然または組換えのどちらであってもよい、CurMモジュールまたはその一部を含む組換え核酸が利用される。
【０００８】
本発明は、本発明のPKSをコードする組換え核酸を提供する。組換え核酸は、本発明のPKSの一部または全部を含む核酸、プロモーターならびに翻訳開始および終結配列のような調節配列をさらに含む核酸を含み、宿主細胞における安定した維持を促進する配列、すなわち、複製起点の機能を提供する配列、または相同組換えによる宿主細胞染色体DNAもしくは他のDNAへの組み込みを促進する配列をさらに含むことができる。いくつかの態様において、組換え核酸は宿主細胞の染色体へ安定的に組み込まれる。いくつかの態様において、組換え核酸はプラスミドである。したがって本発明は、本発明の組換え核酸を含む発現ベクターを含むベクターもまた提供する。本発明は、本発明の組換え核酸および/またはPKSのいずれかを含む宿主細胞もまた提供する。いくつかの態様において、宿主細胞は、適当な条件下で培養された場合、α-オレフィンを生成することができる。これらの宿主細胞は、例えば非限定的に、大腸菌(E. coli)種、バチルス(Bacillus)属の種、ストレプトマイセス(Streptomyces)属の種、ミクソバクテリア属の種のような原核生物、ならびに酵母および真菌株を含むがこれらに限定されない真核生物を含む。
【０００９】
したがって、本発明は、本発明の組換え核酸および/またはPKSの1種または複数種を含む多種多様の宿主細胞を提供する。本発明の核酸が存在しなければ生成されないかまたはより低いレベルでの生成となるα-オレフィンを、いくつかの態様において、該宿主細胞は培養時に生成することができる。
【００１０】
本発明は、α-オレフィンを生成するための方法であって、概して、本発明の宿主細胞を提供する段階、およびα-オレフィンが生成されるような適当な条件の下、適当な培地中で該宿主細胞を培養する段階を含む該方法を提供する。
【００１１】
本発明は、α-オレフィンを生成した宿主細胞由来のα-オレフィンを含んだ、およびいくつかの態様において、宿主細胞の微量残留物および/または他の成分を含んでもよい組成物もまた提供する。そのような微量残留物および/または他の成分は、例えば、宿主細胞の溶解によって生成された細胞物質を含みうる。本発明は、α-オレフィンを精製する方法、およびα-オレフィンを他の有用な生成物に変換するための方法もまた提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
本発明の上記の局面および態様ならびに他のものは、添付の図面と併読した場合に、例示的な態様に関する以下の詳細な記述から、当業者には容易に理解されるであろう。
【００１３】
【図１】本発明による1-ヘキセンの合成に適した生合成経路のモジュール構造化の例示的な例を示す。この例示において、提唱するモジュールは、エリスロマイシンPKS由来のDEBS1のローディングモジュール、ニスタチンPKS NysC由来のモジュール5、およびクラシンPKSの末端モジュールCurMから供給される。本発明の別の態様において、ニスタチンPKSモジュール5はインダノマイシンPKS由来のモジュール9および10の部分と置き換えられる。 この代替的な態様を実際に用いて、1-ヘキセンを生成した。
【図２】利用されるモジュールの種類およびポリケチド鎖への組み入れに使用される対応する前駆体を示す。ローディングモジュールはSと指定されている。任意の適当な(アセテートおよび安息香酸をロードするものなどの)ローディングドメインを使用できるが、この図には2つの例だけを例示する。残りの化合物は、エクステンダーモジュールA〜Pを利用して成長中のポリケチド鎖に組み入れられる構造にあたる。破線はクライゼン縮合を通じて形成されたC-C結合を示す。結合の右側にある原子および破線の左側のC原子は、利用されるモジュールによって決定される構造にあたる。R基は、モジュールによって決定される組み入れ前の既存のアシル鎖にあたる。
【図３】図3Aは、 本発明によって1-ヘキセンを生成するために用いられうるPKS系、図3B は、いかにしてさらなるモジュールを加えて、さらに長い偶数鎖α-オレフィンを得ることができるか、および図3C は、いかにしてローディングモジュールを変化させて(マロニル-CoAから)アセテートを組み入れるかによって、本発明の方法による飽和した直鎖状の奇数鎖α-オレフィンを得られると考えられるかを示す。
【図４】アベルメクチンPKSローディングモジュールの使用を例示する本発明の態様を示す。例示される側鎖は単なる例にすぎず、本発明の方法および教示によりアベルメクチンローディングモジュール(または類似のローディングモジュール)を用いて組み入れることができる側鎖のプール全体を構成するものではない。
【図５】図5Aは、3-メチレンペント-4-エン酸への例示的な経路の例、本発明の方法によりPKSを用いて利用できるカルボキシル化されたブタジエン誘導体の例、およびさらなるPKSモジュールの使用によってジエンとカルボキシレート部分との間の距離をいかにして増加させることができるかを示す。図5Bは、ジャマイカミド経路からのエキソメチレン生合成に関して提唱される機構を示す(Edwards et al. 2004. Chem Biol. 11(6):817-33を参照のこと; 参照により本明細書に組み入れられる)。
【図６】本発明の方法によってブタジエンを生成するためのPKSを示す。本発明は、本明細書において引用されまたは示される、提唱するいずれかの作用機構によっていずれの形にせよ限定されるべきではないが、この図は、簡単にするために、ヒドロキシル基の喪失を水分子として例示しており、酵素機構はスルフェートを脱離基として使用している。
【図７Ａ】本発明の方法によってブタジエンを生成するためのPKSを示す。図7Aは、アクリリル-CoAを受容するよう修飾されているDEBSプロピオニル-CoA特異的ローディングドメインを用いたアクリリル-CoAのローディングを示す。
【図７Ｂ】本発明の方法によってブタジエンを生成するためのPKSを示す。図7Bは、アクリリル-CoAを受容するよう修飾されているDEBSプロピオニル-CoA特異的ローディングドメインを用いたアクリリル-CoAのローディングを示す。
【図７Ｃ】本発明の方法によってブタジエンを生成するためのPKSを示す。図7Cは、KSドメインへのアクリレート部分のチオ移動を示す。
【図７Ｄ】本発明の方法によってブタジエンを生成するためのPKSを示す。図7Dは、マロニル-CoAの結合およびACPドメインへの移動を示す。
【図７Ｅ】本発明の方法によってブタジエンを生成するためのPKSを示す。図7Eは、CO2を放出して前記部分の縮合を触媒するKSを示す。
【図７Ｆ】本発明の方法によってブタジエンを生成するためのPKSを示す。図7Fは、β-カルボニル基の還元を触媒するKRを示す。
【図７Ｇ】本発明の方法によってブタジエンを生成するためのPKSを示す。図7Gは、最終段階、ならびにブタジエン、CO2および水の放出を示す(図6と同様、ヒドロキシル基の喪失は水分子として例示されているが、酵素機構はスルフェートを脱離基として使用している)。
【図８】プロピオネートを外因的に供給すること、ならびにPrpEおよびアシル-CoAデヒドロゲナーゼ活性を発現させることを含め、アクリリル-CoAを生成するための本発明の方法および材料によって利用できる酵素経路を示す。この系を含む宿主細胞はプロピオネートを与えられるが、プロピオネートが生成用に選択した宿主細胞によって内因的に生成されない場合は、その宿主細胞に外因的に供給されうる。
【図９】プロピオネートおよびグルコースを外因的に供給することを含む、アクリリル-CoAを生成するための本発明の方法および材料によって利用できる酵素経路を示す。この系を含む宿主細胞は、上記のように、外因的供給によるかまたはプロピオネート生合成経路の導入によりプロピオネートを与えられ、かつ宿主細胞が直接的または間接的にピルベートへと変換できる適当な有機分子を与えられよう。例えば、宿主細胞が大腸菌であるなら、該適当な有機分子はグルコースでありうる。この経路では中心的代謝中間体であるピルベートを使用して、ラクテートデヒドロゲナーゼによりラクテートを生成する。ラクテートは次いで、プロピオニル-CoAを補因子として使用し、プロピオネートを放出して、ラクテートCoAトランスフェラーゼによりラクトイル(lacoyl)-CoAに変換される。ラクトイル-CoAを次に、ラクトイル-CoAデヒドラターゼを用いて脱水し、アクリリル-CoAを得る。本発明の1つの態様では、大腸菌由来のラクテートデヒドロゲナーゼLdhA、クロストリジウム プロポニカム(Clostridium proponicum)由来のラクテートCoAトランスフェラーゼPct、ならびにC.プロポニカム由来のラクトイル-CoAデヒドラターゼ酵素EIおよびEIIを含む。ジエン(例えばブタジエン)生成のための大腸菌または酵母へのこの経路の導入は、これらの酵素の新規の用途にあたる。本発明の1つの態様は、PKSに基づくアクリレート生成のためのこの経路の使用である。
【図１０】共通の代謝前駆体マロニル-CoAから出発してアクリリル-CoAを生成するための、本発明の方法および材料によって利用できる酵素経路を示す。この経路では、アセチル-CoAカルボキシラーゼ、アセチル-CoAおよびCO2を用いてマロニル-CoAを産生する。マロニル-CoAは次に、マロニル-CoAレダクターゼにより還元され、マロニルセミアルデヒドを放出する。マロニルセミアルデヒドは、基質特異的なオキシドレダクターゼを用いて3-ヒドロキシプロピオネートに変換される。3-ヒドロキシプロピオネートCoAリガーゼは、3-ヒドロキシプロピオニル-CoAの形成を触媒する。この中間体は次いで、3-ヒドロキシプロピオニル-CoAヒドラターゼの逆反応によりアクリリル-CoAに脱水される。本発明の1つの態様において、これらの酵素は、大腸菌由来のアセチル-CoAカルボキシラーゼ複合体(AccA/AccD)、マロニル-CoAレダクターゼである(ジエン(例えばブタジエン)生成のための大腸菌または酵母へのこの経路の導入は、これらの酵素の新規の用途にあたり、本発明に特有の態様である。本発明の1つの態様は、PKSに基づくアクリレート生成のためのこの経路の使用である。
【図１１】メバロネート経路によりイソプレンを生成するための本発明の方法および材料によって利用できる酵素経路を示す。
【図１２】イソプレンを生成するための本発明により提供されるPKSによって利用できる例示的な経路の例を示す。図12Aは、アクリリル-CoAを受容するよう修飾されているDEBSプロピオニル-CoA特異的ローディングドメインを用いたアクリリル-CoAのローディング、およびβ-ケトACP結合中間体を形成させるためのマロニル-CoAによる伸長を示す。図12B〜Dは、枯草菌(Bacillus subtilis) PKSX (バシラエン)クラスタ(Butcher, et al. 2007. Proc Natl Acad Sci U S A. 104(5): 1506-9; 参照により本明細書に組み入れられる)由来のPKS酵素を用いたβ-カルボニル基のメチル基との置き換えに関わるHMG-CoA様の機構を示す。本発明は、本明細書において示される、提唱するいずれかの機構によって限定されるべきではない。この態様において、最後から2番目の生成物は、遊離酸として放出され、その後、デカルボキシラーゼまたは細胞外の化学触媒作用/熱分解のどちらかにより、本発明の方法によってイソプレンに脱カルボキシル化される。
【図１３】(E)-ペンタ-1,3-ジエンを生成するための本発明により提供されるPKSを示す。この図は、ヒドロキシル基の喪失を水分子として例示しているが、酵素機構はスルフェートを脱離基として使用している。
【図１４】前記の図に記述されている通りの、アクリリル-CoA、および[2S]-メチルマロニル-CoAを生成するための大腸菌における前駆体供給経路を示す。描かれている各酵素は宿主細胞において発現されることができ、ここで各酵素は独立して、宿主細胞にとって内因性もしくは天然であるか、または組換え体に導入されるかのいずれかであることができる。
【図１５】大腸菌における前駆体供給経路を最大限に生かすための本発明により提供される方法および材料を示す。アクリリル-CoAを最大限に生かすための手段は、PrpC活性の「ノッキングアウト」(PrpC活性の発現の排除または低減)、YgfH活性のノッキングアウト、プロピオネートの外因的供給(またはプロピオネートの内因的生成)、プロピオニル-CoAの細胞質プールを増加させるためのPrpE活性の過剰発現のうち、1つまたは複数を含むことができる。この中間体から、プロピオニル-CoAカルボキシラーゼ複合体(AccA/PccB)の導入によってメチルマロニル-CoAが得られよう(Pfeifer, et al. Science. 2001 Mar 2;291(5509): 1790-2; 参照により本明細書に組み入れられる)。このプロピオニル-CoAのプールは、図8および9に記述されている経路において使用することもできる。
【図１６】3-ヒドロキシ-1-オクテンを生成するための本発明により提供される例示的なPKSを示す。PKSは、以下のエレメントを含む。(i) PikA1 (ピクロマイシン)由来のロード（Load）モジュールおよびKS1、引き続いて(ii) モジュール1およびKS2: ニスタチンPKS由来のKS6ドメインおよびモジュール5からのAT-ACPセグメント、(iii) モジュール2: セレウス菌(Bacillus cereus) ZmaA (ズウィッターマイシンPKS)由来のヒドロキシマロネート特異的ATおよび連続的ACPドメイン、ナンチャングマイシンPKSモジュール2由来のDH、ERおよびKRドメイン、ならびに(iv) モジュール3: CurMモジュール(クラシンPKS)のAT-TEセグメント。前駆体ヒドロキシマロニル-ACPの生成の場合、酵素ZmaD、ZmaGおよびZmaEは同様に、宿主菌株により生成され、または宿主菌株に提供される。この図では、ヒドロキシル基の喪失を水分子として例示しているが、酵素機構はスルフェートを脱離基として使用していることに留意すべきである。
【図１７】1-デセンを生成するための本発明により提供される例示的なPKSを示す。PKSは、以下のエレメントを含む。 (i) PikA1由来のロードモジュールおよびKS1、引き続いて(ii) モジュール1およびKS2: ニスタチンPKS由来のKS6ドメインおよびモジュール5からのAT-ACPセグメント、(iii) モジュール2およびKS3: ニスタチンPKS由来のKS16ドメインおよびモジュール15からのAT-ACPセグメント、(iv) モジュール3およびKS4: オリゴマイシンPKS由来のK4ドメインおよびモジュール3からのAT-ACPセグメント、ならびに(v) モジュール4: CurM由来のAT-TEセグメント。この図では、ヒドロキシル基の喪失を水分子として例示しているが、酵素機構はスルフェートを脱離基として使用していることに留意すべきである。
【図１８】1-オクテンを生成するための本発明により提供される例示的なPKSを示す。PKSは、以下のエレメントを含む。 (i) PikA1由来のローディングモジュールおよびKS1、引き続いて(ii) モジュール1およびKS2: ニスタチンPKS由来のKS6ドメインおよびモジュール5からのAT-ACPセグメント モジュール2、(iii) およびKS3: ニスタチンPKS由来のKS16ドメインおよびモジュール15からのAT-ACPセグメント、ならびに次いで(iv) モジュール3: CurMモジュール由来のAT-STセグメント。この図では、ヒドロキシル基の喪失を水分子として例示しているが、酵素機構はスルフェートを脱離基として使用していることに留意すべきである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
詳細な説明
本発明は、記述される特定の態様に限定されるわけではなく、したがって、当然ながら、変動しうる。本明細書において用いられる用語は、特定の態様のみを記述するためのものであり、限定を意図するものではなく、これは本発明の範囲が添付の特許請求の範囲のみにより限定されるためである。
【００１５】
ある範囲の値が与えられる場合、その範囲の上限と下限との間の、文脈上別途明確な断りがない限りは下限の単位の10分の1までの各介在値も具体的に開示される。規定範囲内の任意の規定値または介在値とその規定範囲内の任意の他の規定値または介在値との間の各々のより小さい範囲も、本発明内に包含される。
【００１６】
別途定義しない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解される意味を有する。本明細書において記述されるものと類似または同等の任意の方法および材料を本発明の実践に使用できるが、適当な方法および材料をここに記述する。引用される全ての刊行物は、その中の方法および/または材料および/または結果を開示および記述するために、参照により本明細書に組み入れられる。
【００１７】
本明細書においておよび添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「一つ（a）」、「一つ（and）」および「その（the）」は、文脈上別途明確な断りがない限り複数の参照対象を含む。したがって、例えば「α-オレフィン」に対する言及は、複数のそのようなα-オレフィンなどを含む。
【００１８】
「偶数鎖α-オレフィン」という用語は、いずれの官能基または置換基も無視して、偶数の炭素原子を持った炭素骨格を有するα-オレフィンをいう。
【００１９】
「奇数鎖α-オレフィン」という用語は、いずれの官能基または置換基も無視して、奇数の炭素原子を持った炭素骨格を有するα-オレフィンをいう。
【００２０】
「機能的変種」という用語は、本明細書において記述される酵素と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%または99%同一であるポリペプチド配列を有する酵素について記述する。「機能的変種」酵素は、天然の酵素について保存されていると認識されるアミノ酸残基を保持することもあり、および/または非保存アミノ酸残基を有することもある。アミノ酸が天然酵素と比べて、置換され(異なる)、挿入され、または欠失されうるが、変種は、本明細書において記述される酵素と比べて概して類似の酵素活性を有する。「機能的変種」酵素は天然に見出されることもあり、または遺伝子操作されたその変異体(組換え体)であることもある。
【００２１】
本発明の目的、利点および特徴は、下記にさらに十分に記述される本発明の詳細を読めば、当業者には明らかになるであろう。
【００２２】
ポリケチドシンターゼ(PKS)
本発明は、α-オレフィンを合成できる組換えポリケチドシンターゼ(PKS)酵素を提供する。本発明のPKS酵素は、天然のPKSではない。本発明のいくつかの態様において、α-オレフィンは、天然のPKSによって合成される化合物ではない。本発明のいくつかの態様において、PKSは、2種以上のPKS由来の、モジュール、ドメイン、および/もしくはその一部、またはその機能的変種を含むハイブリッドPKSである。そのようなα-オレフィンは、ジケチドおよびトリケチド、ならびに4つ、5つもしくは6つまたはそれ以上のケチド単位のような、4つ以上のケチド単位のポリケチドを含む。α-オレフィンは、それらを特徴付ける二重結合に加えて1つまたは複数の官能基をさらに含むことができる。そのような官能基は、エチル、メチルおよびヒドロキシ側鎖、内部オレフィン、ならびにケトンを含むが、これらに限定されることはない。
【００２３】
本発明のいくつかの態様において、α-オレフィンは、以下の化学構造を有する偶数鎖α-オレフィンである:
2013544500.tif 000003
式中、各R1は独立して-Hまたは-CH3であり、各R2は独立して-Hまたは-OHであり、nは整数であり、およびαβは単結合または二重結合であり、ただしαβが二重結合であるなら、対応するR2はHである。本発明のいくつかの態様において、nは1〜10の整数である。nはα-オレフィンの炭素骨格中の2炭素鎖サブユニットの数を示す。多サブユニットα-オレフィンの各2炭素サブユニット内のR1、R2およびαβは、分子中の他の任意の2炭素サブユニットのR1、R2およびαβから独立している。しかしながら、いくつかの態様において、1つまたは複数の、最大で全ての、サブユニットが同一のR1、R2およびαβを有する。
【００２４】
本発明のいくつかの態様において、α-オレフィンは以下の化学構造を有する:
2013544500.tif 000004
式中、nは1〜10の整数である。
【００２５】
1つの態様において、本発明は、ポリプロピレン、アシロニトリル、酸化プロピレン、アルコール、クメン、アクリル酸、注入成型プラスチック、電子機器、電気器具、家庭用品、ボトルキャップ、玩具、旅行かばん、フィルム、繊維、カーペット、衣類、ロープ、パイプ、導管、ワイア、ケーブル、弾性重合体、アクリル繊維、ニトリルゴム、アクリロニトリルブタジエンスチレン(ABS)樹脂、スチレンアクリロニトリル(SAN)樹脂、アクリルアミド、アジポニトリル、ポリエーテルポリオール、ポリウレタン、軟質フォーム、硬質フォーム、絶縁体、プロピレングリコール、ポリエステル樹脂、不凍剤、解凍液、プロピレン グリコール エーテル、ペンキ、コーティング、インク、樹脂、洗浄剤、イソプロパノール、化粧品、医薬品、食品、インク、接着剤、2-エチルヘキサノール、フタル酸エステル系可塑剤、フェノール、アセトン、ポリカーボネート、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、メタクリル酸メチル(MMA)、およびアクリル酸エステルを含むがこれらに限定されない、C3-α-オレフィンプロピレン(プロペン)ならびにそれに由来する重合体および生成物を産生するための方法、宿主細胞、および核酸を提供する。
【００２６】
1つの態様において、本発明は、ポリブチレン、エチレンおよび/またはプロペンとの共重合体、熱溶融性接着剤、合成ゴム、ディーゼル燃料、ならびにジェット燃料を含むがこれらに限定されない、C4-α-オレフィンブテンならびにそれに由来する重合体および生成物を産生するための方法、宿主細胞、および核酸を提供する。
【００２７】
1つの態様において、本発明は、スチレンブタジエンゴム(SBR)、ポリブタジエンゴム、アクリロニトリルブタジエンスチレン(ABS)、スチレン ブタジエン(SB)共重合体ラテックス、ニトリルゴム、アジポニトリル、クロロプレン、ブタンジオール、テトラヒドロフラン、タイヤ、接着剤、コーティング、高衝撃ポリスチレン、熱可塑性樹脂、工学ナイロン(C12ラクタム由来)、紙コーティング、ガスケットおよびシール、ホース、グローブ、ナイロン繊維、重合体、ウエットスーツ、電気絶縁体、ポリブチレン テレフタレート、スパンデックス、ならびにバインダを含むがこれらに限定されない、C4ジオレフィンブタジエンならびにそれに由来する重合体および生成物を産生するための方法、宿主細胞、および核酸を提供する。ブタジエンは以下の化学構造を有する。
2013544500.tif 000005
【００２８】
1つの態様において、本発明は、ガソリン、重合体、接着剤、シーラント、ディーゼル燃料、およびジェット燃料を含むがこれらに限定されない、C5 α-オレフィン: 1-ペンテンならびにそれに由来する重合体および生成物を産生するための方法、宿主細胞、および核酸を提供する。
【００２９】
1つの態様において、本発明は、コモノマー、ポリエチレン、重合体、高密度ポリエチレン(HDPE)、直鎖状低密度ポリエテン(LLDPE)、1-ヘプタナール、ヘプタン酸、樹脂、フィルム、プラスチックパイプ、容器、ディーゼル燃料、およびジェット燃料を含むがこれらに限定されない、C6 α-オレフィン(図1、実施例を参照のこと): 1-ヘキセンならびにそれに由来する重合体および生成物を産生するための方法、宿主細胞、および核酸を提供する。1-ヘキセンは以下の化学構造:
2013544500.tif 000006
を有し、1-ヘキセンを生成するPKSの例図を図1に提供する。
【００３０】
1つの態様において、本発明は、界面活性製剤、直鎖状アルキルベンゼン(LAB)、直鎖状アルキルベンゼンスルホネート(LABS)、ポリアルファオレフィン合成潤滑剤基原料(PAO)、熱収縮材料、電気絶縁材の袖、衣服のラッシュガード、ポリオレフィンエラストマー(POE)、軟質フォーム、履き物、シートクッション、肘掛け、枕、レーダークーラント、糸、ポリオールエステル、界面活性剤アルコール、可塑剤アルコール、特殊化学製品、エポキシド、その誘導体、コモノマー、エポキシド生成の中間体、アミン、オキソアルコール、合成潤滑油、合成脂肪酸、アルキル化芳香族、乳化剤、パフォーマンスワックス、美容製剤、粘度調節剤、溶剤、デセンブテン共重合体、バインダ、皮膜形成剤(film forming)、デセン/PVP共重合体、食品添加物、艶出し剤、消泡剤、抗粉塵剤(anti-dusting agent)、白色鉱油代替物、研磨材、坑井流体、α-オレフィンオリゴマーなどを含むがこれらに限定されない、C10 α-オレフィン: 1-デセンならびにそれに由来する重合体および生成物を産生するための方法、宿主細胞、および核酸を提供する。1-デセンは以下の化学構造を有する。
2013544500.tif 000007
【００３１】
1つの態様において、本発明は、ホモ重合体、共重合体、ポリスチレン、発泡性ポリスチレン(EPS)、アクリロニトリルブタジエンスチレン(ABS)、樹脂、スチレンアクリロニトリル(SAN)、アクリロニトリルスチレンアクリレート(ASA)、スチレンブタジエン、スチレンブタジエンゴム、無水マレイン酸との共重合体、テレフタラート、不飽和ポリエステル樹脂、容器、栓、ふたおよびコップ、構造物(construction); 電気部品および電子部品; 屋内電気器具および住宅; 家財道具および家具; ならびに玩具、スポーツ用品およびレクリエーション品、包装、熱可塑性物質、刃物類、CD、絶縁材、重合体接合爆薬、消費者製品、再生可能プラスチック、再生可能製品、ヘルメット、タイヤなどを含むがこれらに限定されない、C8芳香族α-オレフィン: スチレンならびにそれに由来する重合体および生成物を産生するための方法、宿主細胞、および核酸を提供する。本発明のいくつかの態様において、芳香族α-オレフィンは以下の化学構造:
2013544500.tif 000008
を有し、式中、R3は-H、-OH、-NH3または-NO2である。
【００３２】
α-オレフィンは化粧品およびスキンケア産業においてよく用いられており、本発明はそれゆえ、化粧品およびスキンケア製品を産生するのに有用な出発材料を提供する。例えば、α-オレフィンスルホネート、スルフェートを含まない個人用洗浄剤、石鹸、共重合体マレイン酸などは、これらの産業において全て用いられており、本発明によって提供される。本発明によって提供されるα-オレフィンは、香辛料および香水産業において用いることもできる。例えば、3-ヒドロキシ-1-オクテンおよび3-オキソ-1-オクテンは、本発明の方法および材料を用いて産生することができ、キノコ香辛料/香水が所望とされる用途において用いられる。
【００３３】
本発明を用いて医薬品の合成において有用な中間体を産生することもできる。これらのオレフィンをオレフィンメタセシスにより、互いにまたは従来の化学合成により得られた他のオレフィン中間体にカップリングさせて、薬物として有用な生物活性分子を得ることができる。
【００３４】
いくつかの態様において、本発明によって生成されるα-オレフィンは、以下の化学構造:
2013544500.tif 000009
を有する、(E)-デカ-1,5-ジエンである。
【００３５】
いくつかの態様において、本発明によって生成されるα-オレフィンは、以下の化学構造:
2013544500.tif 000010
を有し、式中、Rは以下の構造:
2013544500.tif 000011
の1つである。
【００３６】
いくつかの態様において、本発明によって生成されるα-オレフィンは、化学構造(I)を有し、かつ少なくとも2つ、3つ、4つ、5つまたはそれ以上のC-C二重結合を含むポリオレフィンである。そのようなα-オレフィンは、炭素骨格上に2つのC-C二重結合を有するジオレフィンのようなジオレフィンを含むが、これらに限定されることはない。そのようなジオレフィンはブタジエン、イソプレンおよびペンタ-1,3-ジエンを含むが、これらに限定されることはない。ブタジエンは、上記の[0027]に示される化学構造を有する。
【００３７】
いくつかの態様において、本発明によって生成されるα-オレフィンは、以下の化学構造:
2013544500.tif 000012
を有する、イソプレンである。
【００３８】
いくつかの態様において、本発明によって生成されるα-オレフィンは、以下の化学構造:
2013544500.tif 000013
を有する、ペンタ-1,3-ジエンである。
【００３９】
複合ポリケチドは、細菌(主に放線菌ファミリー; 例えばストレプトマイセスのメンバー)、真菌および植物において合成される天然物の大きいクラスを構成する。ポリケチドは、抗生物質(例えばエリスロマイシン、タイロシン)、抗真菌薬(例えばニスタチン)、抗がん剤(例えばエポチロン)、免疫抑制薬(例えばラパマイシン)などのような、多数の臨床的に重要な薬物の大環状ラクトン成分を形成する。これらの化合物は、構造または作用様式のいずれも互いに似ていないが、ポリケチドシンターゼと称する酵素の群が行うそれらの生合成について共通の基礎を共有する。
【００４０】
ポリケチドシンターゼ(PKS)は、ポリケチドを生成するクライゼン縮合反応において短鎖脂肪酸アシルCoAを利用する。スターターとしてのアセチルCoAおよびエクステンダー単位としてのマロニルCoAを使用し、かつ新生アシル鎖を生成するために単一のモジュールを反復的に用いる脂肪酸シンターゼとは異なり、PKSは、単一段階の鎖成長を各々触媒する別々のモジュールから構成される。モジュールは組成が互いに異なりうるため、全般的には、その一部が立体特異的メチル(またはエチル)側鎖を含むいくつかの異なるスターター(例えばアセチルCoA、プロピオニルCoA)およびエクステンダーをポリケチドに組み入れることができる。さらに、PKSモジュールは、縮合により形成される3-カルボニルを必ずしも還元するわけではないが、それを未還元(ケトン)、部分還元(ヒドロキシル、2,3-エン)または完全還元(3-メチレン)のいずれかの状態にしうる。多くのPKSは、ポリケチド合成用のスターターとしてマロニルCoAまたは[S]-2-メチルマロニルCoAを利用する。そのような場合、通常、末端カルボキシル基は、PKSのローディングドメインのN-末端に存在するデカルボキシラーゼドメインにより除去される。ひいては、α-炭素およびβ-カルボニルの構造(およびキラリティー)は、特定の各段階での成長中の鎖の合成において利用されるPKSのモジュールにより決定される。合成において用いられるモジュールと、生成されるポリケチドの構造との間に対応があるため、ポリケチドシンターゼの選択および遺伝子操作により、所望の構造の化合物を生成するPKS合成をプログラムすることが可能である。
【００４１】
図2は、対象となる範囲の化合物を生じさせるために対応する新生アシル(ポリケチド)鎖に組み入れるための、各種モジュール、および各モジュールが利用する前駆体を示す。下記表1は、図2における各モジュール用の例示的なPKS供給源を示す。各PKS供給源(アミノ酸配列および対応するコード配列)は当業者に周知であり、容易に入手可能である。さらに、表1中の各モジュールについて、使用できる他のPKSからの(または組換えDNA技術からの)他のモジュールが存在する。さらに、表1および図2に示されていない他の構造をケチドまたはポリケチドに組み入れることができる。例えば、有用なローディングモジュールは、ソラフェンPKSのベンゾエートローディングモジュール、リポマイシンPKSおよびバフィロマイシンPKSのイソブチレートローディングモジュール、ならびにジフィシジン経路由来のアクリレートローディングモジュールを含む。ジフィシジンPKS由来のアクリレートローディングモジュールは、酵素difA-Eの使用によりヒドロキシプロピオネート分子をロードかつ脱水して、アリールイル-ACPを有するPKSを得る(Chen, 2006, J. Bact. 188:4024-4036; 参照により本明細書に組み入れられる)。
【００４２】
本発明は、PKSモジュール、ドメインおよびその一部の機能的変種の使用もまた企図する。1つの重要な態様において、本発明は、CurMモジュールによって行われる同一の酵素反応を行う種々の組換えモジュールを提供する。
【００４３】
（表１）各種モジュールのPKS供給源
2013544500.tif 000014
【００４４】
全てのエクステンダーモジュールは、エクステンダーと成長中のポリケチド鎖との間の脱炭酸縮合段階を実行する、β-アシルACPシンターゼ(一般にケトシンターゼまたはKSと呼ぶ)ドメインと、成長中のアシル鎖を保有しかつβ-カルボニルの還元用の同族還元ドメインに対してそれを提示する、アシル担体タンパク質(ACP)ドメインとを保有する。モジュールは組成が互いに異なりうるため、その一部が立体特異的側鎖(例えばメチル、エチル、プロピレン)を含むいくつかの異なるスターターおよびエクステンダー単位を組み入れることができる。各モジュールのアシルトランスフェラーゼ(AT)ドメインは、組み入れられるエクステンダー単位(例えばマロニルCoA、メチルマロニルCoAなど)を決定する。さらに、図2に示すように、PKSモジュールは、縮合により形成されるβ-カルボニルを必ずしも還元するわけではないが、それを未還元(ケトン)、部分還元(ヒドロキシル、2,3-エン)または完全還元(3-メチレン)のいずれかの状態にしうる。ケトレダクターゼ(KR)ドメインはケトンをOH官能基に還元し(立体特異的に)、デヒドラターゼ(DH)ドメインはαおよびβ炭素から水を除去してα，βトランス二重結合にし、エノイルレダクターゼ(ER)ドメインはこの二重結合をβ-メチレン中心に還元し、それゆえ、β-カルボニルの還元状態は、対応するモジュール内の機能還元ドメインの存在により決定される。それほど一般的ではないが、モジュールはさらなるC-メチル化ドメイン(エポチロンと同様にさらなるα-メチル側鎖を与える)を含みうる。
【００４５】
クラシンA鎖終結モジュールはCurMと記す。CurMは(マロニル-CoA由来の)アセテートによる新生ポリケチド分子の伸長を触媒する。結果として生じるβカルボニルは、KRドメインによってヒドロキシル基に還元される。結果として生じるβヒドロキシル基は次に、STドメインによって(共通の代謝前駆体3'-ホスホアデノシン-5'-ホスホ硫酸から)スルホン化される。TEドメインは3-スルホポリケチドを放出し、これが次にスルフェートの喪失および脱カルボキシル化を起こして、末端オレフィン部分を形成する。本発明のPKSの鎖終結モジュールは、CurM鎖終結モジュールのSTおよびTEドメイン、ならびに類似の活性を有するその変種を含むことができる。スルホトランスフェラーゼ(pfam00685)/チオエステラーゼの組み合わせを保有するさらなるPKSモジュールが天然において特定されており、本発明のさらなる態様において用いられうる。1つのそのようなオレフィン化モジュール(Ols)がシネココックス(Synechococcus)種菌株PCC 7002から特徴付けられている(Mendez-Perez et al. 2011. Appl. Env. Microbiol. 77:4264-4267 2011)。その他には、シアノセイス(Cyanothece)種PCC 7424、シアノセイス種PCC 7822、プロクロロン ジデムニ(Prochloron didemni) P1-Palau、シュードモナス エントモフィラ(Pseudomonas entomophila) L48、およびハリアンギウム オクラセウム(Haliangium ochraceum) DSM 14365由来のPKSが含まれるが、これらに限定されることはない。本発明は、これらの天然の配列とは異なるが、類似の酵素活性をコードするコンセンサス配列もまた提供する。
【００４６】
それゆえ、PKSの構成は、組み入れられるスターターおよびエクステンダーアシル単位の選択、各縮合段階での還元の程度、ならびに鎖に付加される単位の総数を決定する。天然に見られるポリケチドの多種多様な構造はしたがって、PKS酵素の多様性に起因する。
【００４７】
本発明のPKSに使用できるPKSアミノ酸および対応する核酸コード配列の、限定ではなく例示のための部分的リストは、アンブルチシン(米国特許第7,332,576号); アベルメクチン(米国特許第5,252,474号; MacNeil et al., 1993, Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, Baltz, Hegeman, & Skatrud, eds. (ASM), pp. 245-256; MacNeil et al., 1992, Gene 115: 119-25); カンジシジン(FRO008)(Hu et al., 1994, Mol. Microbiol. 14: 163-72); クラシンA(Chang et al., 2004, J. Nat. Prod., 67 (8), pp 1356-1367; Gu et al., 2009, J. Am. Chem. Soc., 131 (44), pp 16033-16035)、エポチロン(米国特許第6,303,342号); エリスロマイシン(WO 93/13663号; 米国特許第5,824,513号; Donadio et al., 1991, Science 252:675-79; Cortes et al., 1990, Nature 348:176-8); FK506 (Motamedi et al., 1998, Eur. J. Biochem. 256:528-34; Motamedi et al., 1997, Eur. J. Biochem. 244:74-80); FK520またはアスコマイシン(米国特許第6,503,737号; Nielsen et al., 1991, Biochem. 30:5789-96も参照); ジェランゴリド(Jerangolid)(米国特許第7,285,405号); レプトマイシン(米国特許7,288,396号); ロバスタチン(米国特許第5,744,350号); ネマデクチン(Nemadectin)(MacNeil et al., 1993, 前掲論文); ニッダマイシン(Niddamycin)(Kakavas et al., 1997, J. Bacteriol. 179:7515-22); オレアンドマイシン(Swan et al., 1994, Mol. Gen. Genet. 242:358-62; 米国特許第6,388,099号; Olano et al., 1998, Mol. Gen. Genet. 259:299-308); ペデリン(Pederin)(PCT公開第WO 2003/044186号); ピクロマイシン(Xue et al., 2000, Gene 245:203-211); プリマリシン(PCT公開第WO 2000/077222号); プラテノリド(Platenolide)(欧州特許出願第791,656号); ラパマイシン(Schwecke et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7839-43); Aparicio et al., 1996, Gene 169:9-16); リファマイシン(August et al., 1998, Chemistry & Biology, 5: 69-79); ソラフェン(米国特許第5,716,849号; Schupp et al., 1995, J. Bacteriology 177: 3673-79); スピラマイシン(米国特許第5,098,837号); およびタイロシン(EP 0 791,655号; Kuhstoss et al., 1996, Gene 183:231-36; 米国特許第5,876,991号)を含み、前記の参考文献の各々が参照により本明細書に組み入れられる。さらなる適当なPKSコード配列(PKS coding)は、当業者が容易に(例えば、ポリケチド生成生物由来のDNAのクローニングおよび配列決定により、またはGenBankを参照することにより)入手可能である。
【００４８】
100を超えるPKS研究や科学文献にて報告されているものから、生成されるポリケチドの生合成において用いられるモジュールと生成されるポリケチドの構造との間の対応は、PKSのタンパク質配列と対応する遺伝子のDNA配列との両方のレベルで理解される。モジュールの構成とポリケチド構造との対応は、アミノ酸および/または核酸配列の決定によって特定することができる。かくして、所望のモジュールに対応するDNA配列をクローニング(または合成)し、完全に機能する単位としてそれらを大腸菌のような他の非ポリケチド生成宿主(Pfeifer, et al., Science 291, 1790 (2001); 参照により本明細書に組み入れられる)、およびストレプトマイセスのようなポリケチド生成宿主(Kao et al., Science 265, 509 (1994); 参照により本明細書に組み入れられる)を含む、異種宿主に移動させることができる。
【００４９】
ポリケチド生合成に利用されるさらなる遺伝子も特定されている。ポリケチド生成宿主に一般に存在する、ACPドメインの4-ホスホパンテテイン補助因子を移動させるホスホパンテテイン:タンパク質トランスフェラーゼ(PPTアーゼ)を決定する遺伝子が、大腸菌および他の宿主にクローニングされている(Weissman et al., Chembiochem 5, 116 (2004); 参照により本明細書に組み入れられる)。単一のPKSの遺伝子操作、または2つもしくはそれ以上の供給源由来のモジュールから構成されるハイブリッドPKSの構築のいずれかにより所望の構造の化合物を生成するようポリケチド生合成を再プログラムすることも可能である(Weissman et al., 前記を参照のこと)が、本発明は、組換えPKSによってα-オレフィンを産生するための第1の手段を提供する。
【００５０】
本発明のPKSを産生するためにモジュラーPKS遺伝子を操作するための組換え方法は、米国特許第5,672,491号; 同第5,843,718号; 同第5,830,750号; 同第5,712,146号; および同第6,303,342号; ならびにPCT公開第WO 98/49315号および同第WO 97/02358号に記述されており、これらの各々が参照により本明細書に組み入れられる。ポリケチドの構造を操作して新規ポリケチドを生成できることを実証するために、いくつかの遺伝子操作戦略が各種PKSとともに用いられている(上記で参考文献として挙げた特許公開、ならびにHutchinson, 1998, Curr Opin Microbiol. 1:319-329およびBaltz, 1998, Trends Microbiol. 6:76-83を参照のこと; 参照により本明細書に組み入れられる)。いくつかの態様において、機能PKSタンパク質中にポリペプチドの集合体を指向させるポリペプチド間リンカーを有するポリペプチド上に、ハイブリッドPKSの成分が配置されており、したがってPKSは、天然PKSで観察されるものと同一の、ポリペプチド内のモジュールの配置を有する必要がない。適当な、ポリペプチドを連結するポリペプチド間リンカー、およびポリペプチド内のモジュールを連結するポリペプチド内リンカーは、参照により本明細書に組み入れられるPCT公開第WO 00/47724号に記述されている。
【００５１】
これまでに解明された多数のポリケチド経路および本発明は相まって、本発明によるα-オレフィンを生成するための種々の異なる選択肢を提供する。生成物はサイズおよび官能性が大きく異なりうるが、どれも、PKSおよび対応するコード配列を調製するために、ならびに、所望のα-オレフィンを生成するために類似の方法を利用する。非同族酵素パートナー間の界面は、臨機応変に最適化されうる。対象となるタンパク質からのACP-リンカー-KSおよびACP-リンカー-TE領域を整列させて、ハイブリッドシンターゼの最も分裂的でない融合点を検査する。遺伝子の「瘢痕」の組み入れを排除するために、遺伝子構築では、配列および核酸連結と無関係なクローニング(SLIC)、または他の配列と無関係なクローニング技法を利用する。
【００５２】
いくつかの態様において、対象となるα-オレフィンを生成するPKSは、リングビヤ マジュスキュラ(Lyngbya majuscula) CurM由来のスルホトランスフェラーゼ(ST)-チオエステラーゼ(TE)ドメインもしくは別の天然のPKS由来の類似のドメインまたは本発明によって提供される組換えドメインの1つを含む。本発明によって生成されうるα-オレフィンは、ジケチド; プロピレン、1-ブテンおよびスチレンならびにトリケチド; 1-ヘキセンおよび1-ペンテンを含むが、これらに限定されることはない。本発明の1つの局面において、宿主細胞はアクリレートを供給されもしくは外因的に提供されまたは内因的に生成し、そのため、1,5-ヘキサジエンおよびブタジエンのようなジオレフィンを生成する。別の局面において、本発明のPKSを含む宿主細胞に対する安息香酸の供給もしくは外因的提供または内因的生成は、スチレン誘導体の生成を可能にする。
【００５３】
いくつかの態様において、ジオレフィンを生成できる宿主細胞は、アクリレートまたはアクリリル-CoA/ACPを生成することもでき、したがって、外因性アクリレートの必要性を排除することができる。これらの前駆体経路由来のアクリレートのローディングモジュールと、多くのPKSチオエステラーゼドメインの1つを連結することにより、PKS系はアクリル酸を生成することができる。アクリル酸は、本発明によって非PKSヒドロラーゼを用いることによってアクリリル-CoAまたはアクリリル-ACPから得ることもできる。本発明のいくつかの態様において、ジオレフィンを生成できる宿主細胞は、ベンゾエートを生成することもできる。
【００５４】
L.マジュスキュラCurM ST-TEドメインは、以下のアミノ酸配列を含む。
2013544500.tif 000015
【００５５】
L.マジュスキュラCurM STドメインは、以下のアミノ酸配列を含む。
2013544500.tif 000016
【００５６】
L.マジュスキュラCurM TEドメインは、以下のアミノ酸配列を含む。
2013544500.tif 000017
【００５７】
いくつかの態様において、本発明のPKSは、L.マジュスキュラCurMと機能的に類似の、しかし同一ではない、天然のスルホトランスフェラーゼ-チオエステラーゼ(ST-TE)ドメイン、またはSTもしくはTEドメインを含む。いくつかの態様において、本発明のPKSは、表2〜4に記述されているタンパク質/ペプチドのいずれかのSTおよび/もしくはTE、またはその機能的変種のアミノ酸配列を含む。当業者は、利用可能なバイオインフォマティクス プログラムを用いてそのようなL.マジュスキュラCurM様STおよび/またはTEドメインを特定することができる。例えば、L.マジュスキュラCurM ST-TEは、その結晶構造およびタンパク質BLASTのようなプログラムでの触媒境界のアノテーションに依存することによって2つの別々に機能的な部分に分けることができ、その配列を、アンカリングの鋳型としてL.マジュスキュラCurM ST-TEを用い、相同モデル化して触媒ドメインの境界の理解を深めることができる。まとめて、そのような方法を利用して、触媒活性およびいっそう大きなタンパク質内の重要なアミノ酸領域に関する確かな予測をすることができる。
【００５８】
いくつかの態様において、STおよび/もしくはTEドメイン、またはその機能的変種は、(参照配列としてL.マジュスキュラCurMを用い)以下のアミノ酸残基: R205、H266、S100、E124、N211およびN267の1つまたは複数を含む。いくつかの態様において、STおよび/もしくはTEドメイン、またはその機能的変種は、(参照配列としてL.マジュスキュラCurMを用い)以下のアミノ酸残基: R205およびH266を含み、任意でS100、E124、N211およびN267の1つまたは複数を含んでもよい。いくつかの態様において、PKSは、2つの異なる生物または供給源に由来するかまたはそれから得られるSTドメインおよびTEドメインを含む。
【００５９】
（表２）CurM様ST-TEドメインを含むタンパク質/ペプチドのリスト
2013544500.tif 000018
【００６０】
（表３）CurM様STドメインを含むタンパク質/ペプチドのリスト
2013544500.tif 000019
2013544500.tif 000020
2013544500.tif 000021
2013544500.tif 000022
【００６１】
（表４）CurM様TEドメインを含むタンパク質/ペプチドのリスト
2013544500.tif 000023
2013544500.tif 000024
2013544500.tif 000025
【００６２】
本発明のいくつかの態様において、プロピオネートまたはアクリレートのような前駆体分子をPKSに与えて、対象となるポリケチドを生成する。前駆体分子は、PKSを含む宿主細胞に供給されるかもしくは外因的に提供されてもよく、またはPKSを含む宿主細胞によって内因的に生成されてもよく、あるいは宿主細胞に供給されるかもしくは外因的に提供されてもよい単純な分子または宿主細胞が生来内因的に生成する単純な分子から前駆体分子を生合成できる酵素を、宿主細胞が生成してもよい。例えば、ストレプトマイセス種はその先天的な代謝作用の一端としてプロピオニル-CoAを生成し、したがって、外因性プロピオネートの提供の必要性が排除される。
【００６３】
本発明のいくつかの態様において、対象となるα-オレフィンを生成できるPKSは、CurM、つまりクラシン生合成経路由来の末端PKS (Chang, 2004)または類似のモジュールを含む。CurMは、特異なスルホトランスフェラーゼドメインを含んだモノモジュールPKSタンパク質である。このドメインは最後から2番目の生成物のβヒドロキシル基をスルホン化し、ST-TEドメインの組み合わせは脱カルボキシル化および官能基脱水(スルフェートを脱離基として)を触媒して、末端オレフィンを生ずる。図1は、本発明の方法および材料によって、1-ヘキセンのような、α-オレフィンを生成するために、いかにしてCurM由来のドメインを他のPKS酵素と連結させることができるかを図解している。図1に示される例では、第1のPKS ORFは、(CoAによって)プロピオネートに特異的なローディングモジュールおよび(マロニル-CoAによって)アセテートを組み入れかつβ-カルボニルを完全に還元する伸長モジュールをコードする。図1に示されるこの例では、ローディングドメインはエリスロマイシンPKS (Donadio et al. 1991. Science 675-679; 参照により本明細書に組み入れられる)由来であり、モジュール5はニスタチンPKS (Brautaset et al. 2000. Chemistry & Biology 7:395-403; 参照により本明細書に組み入れられる)由来であるが、同じ生成物を提供するために使用できる他のモジュールが存在する。この例において多サブユニットPKSを構成する第2および第3のタンパク質は、クルシンPKSおよび対応する遺伝子クラスタに由来する(Chang et al. 2004. Journal of Natural Products 67: 1356-1367; Gu et al. J Am Chem Soc. 2009 Nov 11;131(44): 16033-5において更新されている配列を参照のこと; この両方が参照により本明細書に組み入れられる)。このPKSを用い、最初の2つのモジュールを十分に特徴付けられているいくつかのモジュールのいずれかと置き換えて、数十の異なるα-オレフィンを得ることができる。上流のモジュールの数を3つまたはそれ以上に増やすことで、異なる生成物の数が数百およびそれ以上に増やされる。
【００６４】
この例および関連する例での2つのPKSタンパク質間の適切な相互作用を確実にするために、アシル担体タンパク質(ACP)およびCurMの天然酵素パートナーCurL由来のC末端を用いることができる。概して、天然のC末端およびN末端ドッキングパートナーを本発明の組み合わせPKS酵素において用いることができる。異なるPKS酵素由来の他の同族ドメインを用いることもできる。
【００６５】
図3Aは、トリケチドα-オレフィンを生成するための例示的なPKSを示す。図3Bおよび3Cは、このモデルの例示的な拡張を示し、いかにしてさらなるモジュールを利用して、さらに長い、完全に飽和した、直鎖状α-オレフィンを得ることができるかを実証している。
【００６６】
本発明のPKSへのアベルメクチン ローディングドメインの組み入れにより、いくつかの他のα-オレフィンが手に入れられる。公知のα-オレフィンおよび新規のα-オレフィンの両方を産生するための本発明のこの局面のいくつかの例が、図4に示されている。
【００６７】
いくつかの態様において、本発明のPKSは、ペンダント酸部分を有するブタジエンを生成し、したがってこのブタジエンはその後の架橋結合に適している。図5は、いくつかのPKS酵素および対応する遺伝子クラスタにおいて見出されるHMG様の系を含んだ酵素のセットを含む、そのようなPKSを示す。この系はβ-カルボニルをいくつかの異なる化学部分、最も適切には、エキソメチレンに変換する。手短に言えば、アクリレート スターター(DEBS (Donadio et al. 1991. 前記)またはジフィシジン(Chen et al. 2006. J Bacteriol. 188(11):4024-36; 参照により本明細書に組み入れられる)ローディングモジュール)を組み入れるための既述の系の1つを、ジャマイカミド クラスタ由来のJamEのような、HMG様モジュール(Edwards et al. 2004. Chem Biol. 11(6):817-33; 参照により本明細書に組み入れられる)、およびTEドメインにC末端で融合させることができる。そのようなバイモジュールPKS酵素を、所望の化学的性質の組み入れのために必要な付属タンパク質をコードする遺伝子と共発現させることができる。この例において、これらの酵素はJamH、JamGおよびJamIである(Edwards et al., 2004, 前記)。
【００６８】
本発明のいくつかの態様において、PKSは、リングビヤ マジュスキュラCurMのCurM鎖終結モジュールまたは機能的に等価なモジュールを含む。本発明のいくつかの態様において、PKSは、CurM鎖終結モジュールのSTおよびTEドメインならびに異なるCurMモジュールまたは完全に別のPKSに由来する配列を含む。本発明のいくつかの態様において、PKSは、CurM鎖終結モジュールのKR、ACP、STおよびTEドメインならびに異なるCurMモジュールまたは完全に別のPKSに由来する配列を含む。本発明のいくつかの態様において、PKSは、CurM鎖終結モジュールのAT、KR、ACP、STおよびTEドメインならびに異なるCurMモジュールまたは完全に別のPKSに由来する配列を含む。
【００６９】
いくつかの態様において、本発明のPKSは、酵素difA-Eを伴ってヒドロキシプロピオネート前駆体よりアクリリル部分を組み入れる、ジフィシジンPKS (Chen et al., 2006, 前記)由来のアクリレート ローディングモジュールのような、アクリレート ローディングモジュールを含む。
【００７０】
本発明は、チオエステラーゼドメインと連結したアクリレート ローディングモジュールを含むPKSであって、アクリレート(アクリル酸)を生成できるPKSもまた提供する。エリスロマイシンPKSは、例えばおよび非限定的に、そのような適当なモジュールおよびドメインを含む。
【００７１】
以下は、SEQ ID NO:1〜9のアミノ酸配列を描く。
【００７２】
L.マジュスキュラCurM (GenBank: ACV42478.1)は、以下のアミノ酸配列(SEQ ID NO:1)を有する。
2013544500.tif 000026
【００７３】
HexORF1は、以下のアミノ酸配列(SEQ ID NO:2)を有する。
2013544500.tif 000027
【００７４】
HexORF1'は、以下のアミノ酸配列(SEQ ID NO:3)を有する。
2013544500.tif 000028
2013544500.tif 000029
【００７５】
HexORF2は、以下のアミノ酸配列(SEQ ID NO:4)を有する。
2013544500.tif 000030
【００７６】
1-ブテンを生成できるPKSのアミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列(SEQ ID NO:5)を有する。
2013544500.tif 000031
【００７７】
プロペンを生成できるPKSのアミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列(SEQ ID NO:6)を有する。
2013544500.tif 000032
【００７８】
スチレンを生成できるPKSのアミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列(SEQ ID NO:7)を有する。
2013544500.tif 000033
【００７９】
ペンテンを生成できるPKSのアミノ酸配列(ペンテンORF1)は、以下のアミノ酸配列(SEQ ID NO:8)を有する。
2013544500.tif 000034
【００８０】
ペンテンを生成できるPKSのアミノ酸配列(ペンテンORF2)は、以下のアミノ酸配列(SEQ ID NO:9)を有する。
2013544500.tif 000035
【００８１】
PKSをコードする核酸
本発明は、本発明のPKSをコードする組換え核酸を提供する。組換え核酸は、二本鎖および一本鎖DNAならびにそれに由来するRNAを含む。本発明の組換え核酸は、本発明のPKSのオープンリーディングフレーム(ORF)をコードするものを含む。本発明の組換え核酸は、種々の態様において、適当な宿主細胞中でORFを転写するためのプロモーター配列も含む。本発明の組換え核酸は、いくつかの態様において、宿主細胞中での安定的な維持能力があるレプリコンを提供する配列または宿主細胞の染色体への核酸の相同的組換えを指令する配列のような、組換え核酸を宿主細胞中で安定に複製させるのに十分な配列を含む。いくつかの態様において、核酸は、複製起点を含んだプラスミドを含むがこれに限定されないプラスミドである。本発明は、本発明の別の組換え核酸を含む、発現ベクターのようなベクターもまた提供する。本発明は、組換え核酸のいずれかを含む、かつ/または本発明のPKSを発現できる宿主細胞を提供する。いくつかの態様において、宿主細胞は、適当な条件下での培養時に、本発明のα-オレフィンを生成することができる。
【００８２】
種々の組換えベクターを本発明の実践において利用できることは、当業者には明らかであろう。本明細書において用いられる場合、「ベクター」は、発現もしくは複製のいずれか(または両方)のため組換え核酸を細胞に導入するために用いられるポリヌクレオチドエレメントをいう。そのようなベクターの選択および使用は当技術分野において日常的である。「発現ベクター」は、プロモーターのような調節配列と機能的に連結されている、DNAコード配列(および対応するmRNA)を発現できる(DNAコード配列(および対応するmRNA)によってコードされるタンパク質を生成できる)組換え核酸である。したがって発現ベクターは、適切な宿主細胞への導入によって、適切な条件下での培養時にDNAコード配列の発現をもたらす、プラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクターのような、組換えDNAまたはRNA構築体をいう。本発明によって用いるのに適した適切な発現ベクターエレメントは当業者に周知であり、真核細胞および/もしくは原核細胞中で複製可能なもの、ならびにエピソームのままであるものの他、宿主細胞ゲノムに組み込まれるものを含む。
【００８３】
本発明のベクターは、コード配列の発現が適切な宿主中で行われうるように、得られるコード配列に機能的に連結されている制御配列を含むよう選択されたものを含む。適当な制御配列は、真核および原核宿主細胞において機能するものを含む。PKS遺伝子を得るために利用されるクローニングベクターが、PKSをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されている発現用の制御配列を欠いているなら、このヌクレオチド配列を適切な発現ベクターに挿入する。これは個々に行うか、または「宿主」ベクターに挿入できる、単離されたコード化ヌクレオチド配列のプールを用いて行うことができ、得られたベクターは宿主細胞に形質転換または形質移入され、得られた細胞は個々のコロニーにプレーティングされる。各種微生物の単一の細胞培養用の適当な制御配列は、当技術分野において周知である。酵母中での発現用の制御系は広範に利用可能であり、日常的に用いられている。制御エレメントは、オペレーター配列を任意で含んでよいプロモーター、およびリボソーム結合部位のような、宿主の性質に依存する他のエレメントを含む。原核生物宿主に特に有用なプロモーターは、I型または芳香族(II型) PKS遺伝子クラスタ由来のものを含む、ポリケチドを二次代謝物として生成させるPKS遺伝子クラスタ由来のものを含む。例としてはactプロモーター、tcmプロモーター、スピラマイシンプロモーターなどがある。しかしながら、ガラクトース、ラクトース(lac)およびマルトースを代謝するものなどの、糖代謝酵素をコードする遺伝子に由来するものなどの、他の細菌プロモーターも有用である。さらなる例としては、トリプトファン(trp)生合成のための酵素をコードするものなどの生合成酵素をコードする遺伝子に由来するプロモーター、β-ラクタマーゼ(bla)遺伝子プロモーター、バクテリオファージλPLプロモーター、およびT5プロモーターが挙げられる。さらに、tacプロモーター(米国特許第4,551,433号; 参照により本明細書に組み入れられる)のような、合成プロモーターを用いて、本発明の発現ベクターを構築することができる。
【００８４】
特に有用な制御配列は、それ自体または適当な調節系とともに、栄養菌糸体において増殖期から定常期への移行中に発現を活性化するものであるということに留意されたい。これらの種類の例示的な制御配列、ベクターおよび宿主細胞としては、PCT公開第WO 96/40968号に記述の修飾ストレプトマイセス セリカラー(Streptomyces coelicolor) CH999およびベクター、ならびにストレプトマイセス リビダンス(Streptomyces lividans)の同様の菌株が挙げられる。米国特許第5,672,491号; 同第5,830,750号; 同第5,843,718号; および同第6,177,262号を参照されたく、これらの各々が参照により本明細書に組み入れられる。他の調節配列も望ましいことがある; これらは、宿主細胞の増殖に対してPKS配列の発現の調節を可能にするものを含む。調節配列は当業者に公知であり、例としては、調節化合物の存在を含めて、化学的または物理的刺激に応答して遺伝子の発現を開始または停止させるものが挙げられる。他の種類の調節エレメント、例えば、エンハンサー配列もベクター中に存在してよい。
【００８５】
選択可能なマーカーを本発明の組換え発現ベクターに含めることもできる。形質転換細胞系の選択に有用な種々のマーカーが公知である。これらは一般に、細胞を適切な選択培地中で増殖させる場合に、発現が形質転換細胞に選択可能な表現型を与える任意の遺伝子である。そのようなマーカーは、例えば、宿主細胞に抗生物質耐性または抗生物質感受性を与える遺伝子を含む。
【００８６】
各種PKSヌクレオチド配列またはそのような配列の混合物を1つまたは複数の組換えベクターに、個々のカセットとして、別の調節エレメントとともにまたは単一のプロモーターの制御下で、クローニングすることができる。PKSをコードするサブユニットまたは成分は、他のPKSをコードするサブユニットの容易な欠失および挿入を可能にするフランキング制限部位を含むことができる。そのような制限部位のデザインは当業者に公知であり、部位指向性変異誘発およびPCRのような、科学文献に記述されている技法を用いて達成することができる。本発明の組換えベクターを適当な宿主に導入するための方法は、当業者に公知であり、CaCl2または二価カチオンのような、他の作用物質の使用、リポフェクション、DMSO、プロトプラスト形質転換、抱合、および電気穿孔を含む。
【００８７】
PKSを含む宿主細胞
本発明は、本発明の組換え核酸および/またはPKSを含む宿主細胞を提供する。多くの態様において、宿主細胞は、培養時に、α-オレフィンを生成することができる。宿主細胞は真核細胞または原核細胞であることができる。適当な真核細胞は、サッカロマイセス(Saccharomyces)、カンジダ(Candida)またはシゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属由来のものなどの酵母細胞を含む。サッカロマイセス属由来の適当な種はサッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である。シゾサッカロマイセス属由来の適当な種はシゾサッカロマイセス ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)である。適当な原核細胞は、グラム陰性の大腸菌(Escherichia coli)ならびにグラム陽性のストレプトマイセス種、例えばS.セリカラーおよびS.リビダンスを含むが、これらに限定されることはない。
【００８８】
本発明のPKSは宿主中であってもよく、単離かつ精製されてもよい。PKSは、α-オレフィンをインビボで(宿主細胞中で)またはインビトロで(細胞抽出物中でまたは必要な全ての化学成分もしくは出発材料が提供されるところで)合成することができる。本発明は、これらのいずれかをインビボまたはインビトロでの手段を用いてα-オレフィンを生成する方法を提供する。
【００８９】
本発明のいくつかの態様において、宿主細胞は、アクリリル-CoAを受容するよう修飾されているDEBSプロピオニル-CoA特異的ローディングドメインのような、アクリリル-ACPスターターを含むローディングモジュールを含んだ、ブタジエンを生成するPKS、およびプロピオネートからアクリリル-CoAを合成するための生合成酵素をコードしかつそれを発現できる1種または複数種の核酸を含む（図8参照）。そのような酵素のセットの一例は、プロピオニル-CoAリガーゼ(シンテターゼ) (EC 6.2.1.17)およびアシル-CoAデヒドロゲナーゼ(哺乳類) (EC 1.3.99.3)、ならびにその機能的変種である。いくつかの態様において、宿主細胞は、プロピオネートをプロピオニル-CoAに変換できる酵素またはその機能的変種、およびプロピオニル-CoAをアクリリル-CoAに変換できる酵素またはその機能的変種をコードしかつそれらを発現できる核酸を含む。プロピオネートをプロピオニル-CoAに変換できる酵素は、サルモネラ ティフィムリウム(Salmonella typhimurium)のprpE遺伝子によってコードされるプロピオニル-CoAリガーゼである。プロピオニル-CoAをアクリリル-CoAに変換できる酵素は、哺乳類アシル-CoAデヒドロゲナーゼである。この系を含む宿主細胞は、例えばプロピオネートを宿主細胞に外因的に供給することにより、プロピオネートを与えられ、または内因的にプロピオネートを生成する。
【００９０】
サルモネラ ティフィムリウムにおけるprpE遺伝子によってコードされるプロピオニル-CoAリガーゼのアミノ酸配列(GenBankアクセッション番号NP_459366)は、以下を含む。
2013544500.tif 000036
【００９１】
ハツカネズミ(Mus musculus)のアシル-CoAデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列(GenBankアクセッション番号Q07417)は、以下を含む。
2013544500.tif 000037
【００９２】
いくつかの態様において、本発明の宿主細胞は、ブタジエンを生成しかつアクリリル-CoAを受容するよう修飾されているDEBSプロピオニル-CoA特異的ローディングドメインのような、アクリリル-ACPスターターを含むローディングモジュールを含むPKS、およびピルベートからアクリリル-CoAを合成するための生合成酵素をコードしかつそれを発現できる1種または複数種の核酸を含む(図9参照)。そのような酵素のセットの一例は、ラクテートデヒドロゲナーゼ(EC 6.2.1.17)、ラクテートCoAトランスフェラーゼ(EC 2.8.3.1)、プロピオニル-CoAリガーゼ(シンテターゼ) (EC 6.2.1.17)およびラクトイル-CoAデヒドラターゼ(EC 4.2.164)、またはその機能的変種である。いくつかの態様において、宿主細胞は、これらの4種の酵素をコードしかつそれらを発現できる1種または複数種の核酸を含む。この系を含む宿主細胞は、プロピオネート、および宿主細胞がピルベートに直接的または間接的に変換できる適当な有機分子を与えられ、これらの化合物は宿主細胞に外因的に供給されるかまたは宿主細胞によって生成されるかのどちらかである。例えば、宿主細胞が大腸菌であるなら、適当な有機分子はグルコースである。
【００９３】
大腸菌のldhA遺伝子によってコードされるラクテートデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列(GenBankアクセッション番号CAQ31881)は、以下を含む。
2013544500.tif 000038
【００９４】
クロストリジウム プロポニカムのpct遺伝子によってコードされる乳酸CoAトランスフェラーゼのアミノ酸配列(GenBankアクセッション番号CAB77207)は、以下を含む。
2013544500.tif 000039
【００９５】
クロストリジウム プロポニカムのpct遺伝子によってコードされるラクトイル-CoAデヒドラターゼのアミノ酸配列(GenBankアクセッション番号CAB77206)は、以下を含む。
2013544500.tif 000040
【００９６】
いくつかの態様において、本発明の宿主細胞は、ブタジエンを生成しかつアクリリル-CoAを受容するよう修飾されているDEBSプロピオニル-CoA特異的ローディングドメインのような、アクリリル-ACPスターターを含むローディングモジュールを含むPKS、およびアセチルCoAからアクリリル-CoAを合成するための生合成酵素をコードしかつそれを発現できる1種または複数種の核酸を含む(図10参照)。そのような酵素のセットの一例は、アセチル-CoAカルボキシラーゼ(EC 6.4.1.2)、マロニル-CoAレダクターゼ(EC 1.2.1.75)、3-ヒドロキシプロピオネート:CoAリガーゼおよび3-ヒドロキシプロピオニル-CoAヒドラターゼ(EC 4.2.1.17)、またはその機能的変種である。いくつかの態様において、宿主細胞は、記述した4種の酵素をコードしかつそれらを発現できる1種または複数種の核酸を含む。この系を含む宿主細胞を遺伝子操作して、さらに増した力価のアセチル-CoAを生成することができる。
【００９７】
いくつかの態様において、本発明の宿主細胞は、ブタジエンを生成しかつアクリリル-CoAを受容するよう修飾されているDEBSプロプリオニル-CoA特異的ローディングドメインのような、アクリリル-ACPスターターを含むローディングモジュールを含むPKS、およびプロピオネートからアクリリル-CoAを合成するための生合成酵素をコードしかつそれを発現できる1種または複数種の核酸を含む(図15参照)。そのような酵素のセットの一例は、プロピオニル-CoAリガーゼ(シンテターゼ) (EC 6.2.1.17)、ラクトイル-CoAデヒドラターゼ(EC 4.2.164)、ラクテートデヒドロゲナーゼ(EC 6.2.1.17)、ラクテートCoAトランスフェラーゼ(EC 2.8.3.1)、またはその機能的変種である。この系を含む宿主細胞は外因的供給によりまたは内因的生成により、プロピオネートを与えられる。
【００９８】
いくつかの態様において、本発明の宿主細胞は、3-メチル-2,4-ペンタジエン酸を生成しかつアクリリル-CoAを受容するよう修飾されているDEBSプロプリオニル-CoA特異的ローディングドメインのような、アクリリル-ACPスターターを含むローディングモジュールを含めて、図12に示したモジュールを含むPKS、およびアクリリル-CoAを合成するための生合成酵素をコードしかつそれを発現できる1種または複数種の核酸を含む(図12参照)。宿主細胞が上記のアクリリル-CoAを合成することを可能にするためのいくつかの方法が存在する。3-メチル-2,4-ペンタジエン酸はイソプレンに酵素によって、触媒によってまたは熱分解によって変換されうる。
【００９９】
PKSを用いてα-オレフィンを生成する方法
本発明は、本発明の宿主細胞を提供する段階、およびα-オレフィンが生成されるような適当な培地中で該宿主細胞を培養する段階を含む、α-オレフィンを生成する方法を提供する。この方法は、α-オレフィンを宿主細胞および/または培地から単離する段階をさらに含むことができる。この方法は、α-オレフィンをそれ自体と、および/またはC-C二重結合を含んだ他の化合物を含むがこれに限定されない、任意の他の適当な有機分子と重合させる段階をさらに含むことができる。PKS遺伝子の異種発現のための種々の方法ならびにこれらの遺伝子の発現およびポリケチドの生成に適した宿主細胞は、例えば、米国特許第5,843,718号; 同第5,830,750号および同第6,262,340号; WO 01/31035、WO 01/27306およびWO 02/068613; ならびに米国特許出願公開第20020192767号および同第20020045220号に記述されており、これらの各々が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１００】
本発明は、α-オレフィンが生成されている宿主細胞から単離されたα-オレフィン、ならびに宿主細胞の微量残留物および/または夾雑物を含む組成物を提供する。そのような微量残留物および/または夾雑物は、宿主細胞の溶解によって生成された細胞物質を含む。本発明は、実質的に純粋な形態のα-オレフィンもまた提供する。
【０１０１】
本発明のPKSによって生成されるある種のα-オレフィンは燃料として用いることができる。本発明のいくつかの態様において、本発明によって生成されたα-オレフィンは、「環境に優しい」ジェット燃料として用いることができる。α-オレフィンは触媒によってオリゴマー化されてもよく、限定されるものではないが、例えば、二量体化されてもよく、任意で精製されてもよい。得られた生成物を再び二量体化して、分枝分子の混合物を得ることができ、これをその後、触媒によって水素化する。例えば、本発明のPKSによって生成された1-ブテンは、触媒によって二量体化され、精製されることができる。得られたオクテン生成物を再び二量体化して、分枝C16分子の混合物を得ることができ、これをその後、触媒によって水素化する。ブテンのオリゴマーは米国海軍により、ジェット燃料代替物およびディーゼル燃料代替物の両方として確証されている(Harvey, 2011. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 86(1): 2-9.)。さらなる便益は、本明細書において記述されるように、アベルメクチン(または他の)ローディングモジュールを用いて分枝α-オレフィン、または芳香族α-オレフィンを産生することから生じうる。
【０１０２】
かくして、とりわけ本発明は、以下の利点: (1) ある種の化学物質を生成するのに油への依存を低減する、ならびに(2) 大気からの炭素の捕捉および隔離の手段として働くという利点の1つまたは複数を有する。
【０１０３】
本発明を記述してきたが、本発明を限定するためではなく、例示するために以下の実施例を提示する。
【実施例】
【０１０４】
構築体はアミノ酸レベルで好都合にデザインすることができ、その後、DNA 2.0のような、サービス会社によって商業的に提示されているものなどの、戻し翻訳およびDNA合成を行って所望の核酸を得ることができ、これは特定の宿主細胞種での発現のために最適化されてもよい。その後のプラスミドアセンブリは標準的な分子生物学技法を用いて行うことができる。
【０１０５】
実施例1 PKSに基づく酵素系を用いた1-ヘキセンの生成
本発明の1つの態様において、3種の異なる生物由来のPKSモジュールを用いて、1-ヘキセンの生成のためにデザインされたトリケチド経路を構築した。この態様では、1-ヘキセンシンターゼは2つのORFからなる。HexORF1ではEryA1ローディングモジュール + KS1およびIdmO由来のAT-ACPを組み合わせており、HexORF2ではIdmP由来のKSドメインおよびCurM由来のAT-TEドメインを利用している。本発明の別の態様において、HexORF1におけるインダノマイシン由来ACPのループI領域
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は、EryA1のすぐ後に続くACPのセグメント
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と交換される。これらのデザインのどちらも、大腸菌での発現を最適化するためにデザインされたソフトウェアを用いて戻し翻訳された。これらの遺伝子を合成し、2組の適合性の、大腸菌発現ベクターに核酸連結し、これらをその後、大腸菌BAP-1へ形質転換する。HexORF1、HexORF1'およびHexORF2に対応するアミノ酸配列は、それぞれ、SEQ ID NO: 2〜4として提供されている。
【０１０６】
実験を行って、外因的に加えられたプロピオネートを大腸菌BAP-1が利用することを実証した。1-ヘキセン生成の両方の例において、単一のコロニーから増殖させたpBbA7C-HexORF1' (またはpBbA7C-HexORF1) + pBbS7k-HexORF2同時形質転換株の終夜培養物を用いて、250 mLのスクリューキャップ(非密封)フラスコ中の、0.5%グルコースおよび10%グリセロールを補充したLB培地の50 mLカルチャー3つに(1% v/v)植菌した。培養物をOD600＝1.0〜1.2まで増殖させ、50 uM IPTGで誘導し、さらに3時間(30℃)増殖させた。その後100 mMのプロピオネートを培養物に補充し、テフロン膜を用いてキャップを密封した。次に培養物を20℃で24時間増殖させ、その後固相マイクロ抽出に続きGC-MSを用いて培養物の上部空間において1-ブテンを検出できた。
【０１０７】
実施例2 PKSに基づく酵素系を用いたブタジエンの生成
ブタジエンを生成するためのPKS系の一例を図6および7に示す。下記の、1-ブテンを生成するために作り上げられた系にアクリレートを供給して、ブタジエンを生成した。その他の点では、実験の詳細は全て、上記の1-ブテン生成に関する詳細に記述の通りである。検出の限界はこの場合には生産性について判定するには不十分であったが、本発明は、アクリレート特異的なCoAリガーゼを宿主菌株に加えること、アクリレート取り込み輸送体を宿主菌株に加えること、および/またはアクリレートの毒性に対して感受性が低い宿主菌株を利用することを含めて、ブタジエンの生産性の増大のためのいくつかの経路を提供する。
【０１０８】
実施例3 PKSに基づく酵素系を用いた1-ブテンの生成
1-ブテンを生成するための例示的なPKS系は、CurM由来のAT-TE PKSドメインおよびEryA1由来のプロピオニル-CoAに対するローディングモジュール + KS1を用いて行った。インビボでの1-ブテン生成のため、pBbS7k-ブテン(SEQ ID NO: 5として提供されているPKSタンパク質配列)を保有する大腸菌BAP1の単一のコロニーから増殖させた終夜培養物を用いて、250 mLのスクリューキャップ(非密封)フラスコ中の、0.5%グルコースおよび10%グリセロールを補充したLB培地の50 mLカルチャー3つに(1% v/v)植菌した。培養物をOD600＝1.0〜1.2まで増殖させ、50 uM IPTGで誘導し、さらに3時間(30℃)増殖させた。その後100 mMのプロピオネートを培養物に補充し、テフロン膜を用いてキャップを密封した。次に培養物を20℃で24時間増殖させ、その後固相マイクロ抽出に続きGC-MSを用いて培養物の上部空間において1-ブテンを検出できた。
【０１０９】
実施例4 PKSに基づく酵素系を用いたイソプレンの生成
イソプレンを生成するためのPKS系の一例を図12に示す。
【０１１０】
実施例5 PKSに基づく酵素系を用いた(E)-ペンタ-1,3-ジエンの生成
(E)-ペンタ-1,3-ジエンを生成するためのPKS系の一例を図13に示す。
【０１１１】
実施例6 PKSに基づく酵素系を用いたプロペン(プロピレン)の生成
本発明の例示的なプロペンシンターゼは、CurM (Chang, 2004; Gu, 2009)由来のAT-TEドメインと融合されたニダマイシンPKS (Kakavas, 1997)由来のローディングモジュール + KS1からなる単一の酵素である(この構築体に対応するアミノ酸配列は、SEQ ID NO:6として提供されている)。インビボでのプロペン生成のため、pBbS7k-プロペンを保有する大腸菌BAP1の単一のコロニーから増殖させた終夜培養物を用いて、250 mLのスクリューキャップ(非密封)フラスコ中の、0.5%グルコースおよび10%グリセロールを補充したLB培地の50 mLカルチャー3つに(1% v/v)植菌した。培養物をOD600＝1.0〜1.2まで増殖させ、50 uM IPTGで誘導し、さらに3時間(30℃)で増殖させた。その後テフロン膜を用いてキャップを密封した。次に培養物を20℃で24時間増殖させ、その後固相マイクロ抽出に続きGC-MSを用いて培養物の上部空間においてプロペンを検出できた。
【０１１２】
実施例7 PKSに基づく酵素系を用いたスチレンの生成
本発明の例示的なスチレンシンターゼは、CurM由来のSTおよびTEドメインをソラフェンPKS (Schupp, 1995; Wilkinson, 2001)由来のローディングモジュールおよび第1の伸長モジュール上へ融合させることによって構築した。この構築体に対応するアミノ酸配列は、SEQ ID NO:7として提供されている。例示した系でのスチレン生合成の場合、ベンゾイル-CoAのプールが提供される。この必須前駆体の生成を容易にするために、スチレンシンターゼ構築体を、ロドシュードモナス パルストリス(Rhodopseudomonas palustris)由来のベンゾエート-CoAリガーゼをコードする大腸菌コドン最適化遺伝子badA (Egland, et al., J Bacteriol. 1995 Nov;177(22):6545-51.)と共発現させ、外因性のベンゾエートを供給した。インビボでのスチレン生成のため、pBbS7k-SS1 (SS1はSEQ ID NO:7をコードする)を保有する大腸菌BAP1の単一のコロニーから増殖させた終夜培養物を用いて、250 mLのスクリューキャップ(非密封)フラスコ中の、0.5%グルコースおよび10%グリセロールを補充したLB培地の50 mLカルチャー3つに(1% v/v)植菌した。培養物をOD600＝1.0〜1.2まで増殖させ、50 uM IPTGで誘導し、さらに3時間(30℃)で増殖させた。その後100 mMの安息香酸を培養物に補充し、テフロン膜を用いてキャップを密封した。次に培養物を20℃で24時間増殖させ、その後固相マイクロ抽出に続きGC-MSを用いて培養物の上部空間においてスチレンを検出できた。
【０１１３】
実施例8 PKSに基づく酵素系を用いたペンテンの生成
本発明の例示的なペンテンシンターゼは、2つのORFとしてデザインした。第1のORFは、スピノサドAT-ACP PKSモジュール2と融合されたカルコマイシンPKSローディングモジュール + KS1を用いて構築されている。第2のORFは、シネココックス種PCC7002 (Mendez-Perez, et al., Appl Environ Microbiol. 2011 Jun;77(12):4264-7)由来のオレフィン化モジュール(Ols)と融合されたスピノサドM3由来のKSである。これらのキメラタンパク質に対応するアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 8および9として提供されている。
【０１１４】
本発明をその具体的な態様を参照して記述してきたが、さまざまな変更が行われうること、ならびに本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく等価物が置き換えられうることは当業者によって理解されるはずである。さらに、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセスの段階を本発明の目的、趣旨および範囲に適応させるために、多くの修正を行いうる。そのような全ての修正は、本明細書に添付の特許請求の範囲内であると意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2013544500.tif 000064
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年5月29日(2013.5.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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