(57)【要約】本発明は、マイクロ流体デバイスの内部のサンプル物質を分析反応プロセス中に画像化するシステムおよび方法に関する。本発明の特定の態様によれば、ピクセル配列を用いて画像が形成され、ピクセル配列の中に対象領域（「ＲＯＩ」）が定義される。蛍光強度などの画像値は、ＲＯＩの内部の個々のピクセル値の平均として計算され得る。ＲＯＩが、不均一な加熱など不均一な状態であるときには、ＲＯＩを、内部の状態が均一な十分に小さいサブＲＯＩに分割することができる。
2013544490.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ流体デバイスのマイクロ流路の内部の反応の画像を生成するように構成されたイメージングシステムであって、
マイクロ流路の少なくとも一部分の記憶可能な画像を生成するように構成されたセンサー素子と、
前記センサー素子に対して配置され、前記センサー素子によって画像化されるマイクロ流体チップの一部分を照光するように構成された複数の照明素子とを備え、
前記照明素子の少なくとも１つが照明アセンブリを備え、該照明アセンブリが、
ＬＥＤと、
前記ＬＥＤの前に配置され、前記照明アセンブリによって照光される領域を制御するように開口が形成されているマスクと、
前記照明アセンブリによって発せられた光のスペクトル成分を制御するための、前記照明アセンブリの光路に沿ったフィルタと、
前記照明アセンブリによって発せられた光を有する領域を画像化するためのレンズとを備え、
前記ＬＥＤ、前記マスク、前記フィルタ、および前記レンズが、前記照明アセンブリの光学軸に沿って整列しているイメージングシステム。
【請求項２】
前記照明素子のうち少なくとも２つが、前記マイクロ流体チップの別々の部分を照光するように構成されている請求項１に記載のイメージングシステム。
【請求項３】
前記センサー素子がデジタル一眼レフカメラを備える請求項１に記載のイメージングシステム。
【請求項４】
前記照明素子のそれぞれがＬＥＤを備える請求項１に記載のイメージングシステム。
【請求項５】
前記センサー素子のまわりに９０度の角度増分で配置された４つの照明素子を備える請求項１に記載のイメージングシステム。
【請求項６】
前記センサー素子がＣＭＯＳセンサーを備える請求項１に記載のイメージングシステム。
【請求項７】
前記ＣＭＯＳセンサーが、５６１６×３７４４ピクセル以上までのピクセル配列を有する請求項６に記載のイメージングシステム。
【請求項８】
前記センサー素子がピクセル配列を含み、前記システムが、前記ピクセル配列の前記ピクセルの一部分のみの画像を検出するように構成された論理素子をさらに備える請求項１に記載のイメージングシステム。
【請求項９】
前記センサー素子が複数の画像を生成するように構成されている請求項１に記載のイメージングシステム。
【請求項１０】
前記センサー素子が、ＪＰＥＧフォーマットを有する画像を生成するように構成されている請求項１に記載のイメージングシステム。
【請求項１１】
マイクロ流路の少なくとも一部分とともに前記センサー素子によって画像化されるように配置された基準蛍光物質をさらに備える請求項１に記載のイメージングシステム。
【請求項１２】
前記センサーと前記マイクロ流路の間に少なくとも１つの延長チューブをさらに備える請求項１に記載のイメージングシステム。
【請求項１３】
前記センサーと前記マイクロ流路の間に配置され、選択された波長の光信号しか前記センサーに到達させないように構成された放射フィルタをさらに備える請求項１に記載のイメージングシステム。
【請求項１４】
前記マイクロ流路が第１のゾーンおよび第２のゾーンを備え、
前記ＬＥＤのうち第１のＬＥＤが、第２のゾーンを照光するように配置して配向されており、
前記ＬＥＤのうち第２のＬＥＤと第３のＬＥＤが、互いから１８０度離隔して前記センサーの反対側に配置され、前記第１のゾーンを照光するように配置して配向されており、
前記ＬＥＤのうち第４のＬＥＤが、前記第１のゾーンと前記第２のゾーンの両方を照光するように配置して配向されている請求項５に記載のイメージングシステム。
【請求項１５】
前記複数の照明素子のそれぞれが、前記マイクロ流体チップの一部分を、定められた波長で照光するように構成されている請求項１に記載のイメージングシステム。
【請求項１６】
サンプル物質に対して核酸の診断分析を遂行するシステムであって、
サンプル物質を運んで、マイクロ流路の１つまたは複数の部分の内部のサンプル物質に対して、ＰＣＲ増幅および熱融解解析のうち少なくとも１つを含む分析プロセスを遂行することを可能にする、前記マイクロ流路を含むマイクロ流体手段と、
前記マイクロ流体手段の前記マイクロ流路にサンプル物質を導入するための、前記マイクロ流体手段と動作協調する手段と、
前記マイクロ流体手段の各マイクロ流路を通してサンプル物質を移動させるための、前記マイクロ流体手段と動作協調する手段と、
前記マイクロ流体手段の１つまたは複数の部分を、１つまたは複数の選択された温度へと加熱および／または冷却する熱的手段と、
イメージング手段によって生成された画像に関連するデータを記憶する手段を含む、それぞれの前記マイクロ流路の１つまたは複数の部分の内部のサンプル物質を画像化するイメージング手段とを備えるシステム。
【請求項１７】
前記イメージング手段によって生成された画像に関連するデータを処理して、前記ＰＣＲ増幅および前記熱融解解析のうち少なくとも１つの結果に関連するデータを生成する処理手段をさらに備える請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
サンプル物質を導入する前記手段、サンプル物質を移動する前記手段、前記熱的手段、前記イメージング手段、および前記処理手段の動作を制御する制御手段をさらに備える請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
前記イメージング手段が、前記マイクロ流路の内部のサンプル物質からの定められた波長の蛍光放射を検出するように構成され、
定められた励起波長の励起信号を前記マイクロ流路の一部分に導く手段と、
前記マイクロ流路の一部分の内部の前記サンプル物質から、定められた放射波長の蛍光放射の画像を取得する手段とを備える請求項１６に記載のシステム。
【請求項２０】
マイクロ流体デバイスのマイクロ流路の内部の反応の画像から熱融解データを解析するための、コンピュータで実施される方法であって、
前記マイクロ流路の少なくとも一部分を照光すること、
ピクセル配列のセンサーを用いて、前記マイクロ流路の前記照光された部分の内部の物質が発する蛍光の画像を生成することであって、前記画像の各ピクセルがＪＰＥＧ値を有すること、
前記ピクセル配列の前記ピクセルの一部分を含む対象領域（「ＲＯＩ」）を定義すること、および
前記ＲＯＩの前記ピクセルのすべてのＪＰＥＧ値の平均をとることにより、前記マイクロ流路の内部の物質が発する蛍光の強度を計算することを含む方法。
【請求項２１】
各ピクセルが、第１の色の２つのサブピクセルおよび第２の色の１つのサブピクセルを有し、各ピクセルの前記ＪＰＥＧ値が（２×第１の色のサブピクセル＋１×第２の色のサブピクセル）／３として計算される請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＲＯＩの少なくとも一部分を１つまたは複数のサブＲＯＩに分割して、前記サブＲＯＩの前記ピクセルのすべてのＪＰＥＧ値の平均をとることにより、各サブＲＯＩの内部の蛍光強度を計算することをさらに含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記生成するステップが、ＣＭＯＳセンサーを用いて遂行される請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＣＭＯＳセンサーがデジタル一眼レフカメラを備える請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記生成するステップおよび前記計算するステップを、ある期間にわたって１回または複数回繰り返して、計算された蛍光強度の変化を、ある期間にわたって監視することをさらに含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記マイクロ流路の前記照光された部分の内部の物質が発する蛍光の画像を２つの別々の時間に生成し、
前記画像のフィーチャが、１つの画像と次の画像の間で変位するのを検出して、
１つの画像から次の画像への時間の経過を計算することにより、前記マイクロ流路の内部の流体流れを監視することを含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記マイクロ流路に隣接して配置された基準蛍光物質を照光し、
ピクセル配列のセンサーを用いて、前記基準蛍光物質が発する蛍光の画像を生成して、
１つのＲＯＩが前記マイクロ流路の一部分を包含し、第２のＲＯＩが前記基準蛍光物質の一部分を包含する、少なくとも２つのＲＯＩを定義することをさらに含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記基準蛍光物質を包含する前記ＲＯＩの前記ピクセルのすべてのＪＰＥＧ値の平均をとることにより、前記基準蛍光物質が発する蛍光の前記強度を計算して、
前記基準蛍光物質が発する蛍光の前記強度に基づいて、前記マイクロ流路の内部の物質が発する蛍光の前記強度を調節することをさらに含む請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
マイクロ流路の内部のサンプル物質からの熱融解データを解析するためのコンピュータで実施される方法であって、
イメージングシステムを用いて、前記イメージングシステムによって生成されたＪＰＥＧ画像をタイムスタンプとともに保存することにより、熱融解の画像データを時間の関数として記録すること、
温度制御システムを用いて、温度データを時間の関数として記録すること、および
静的記録信号を前記イメージングシステムへ送って、前記イメージングシステムに、熱融解が始まる前に静止画像データを記録させ、前記静止画像データの時間を記録し、そして、前記温度データを前記静止画像データの時間と同期させることにより、前記温度データを前記熱融解データと同期させることを含む方法。
【請求項３０】
前記熱融解の画像データと、前記温度制御システムによって制御される加熱器とが同時にスタートするように、初期の加熱器信号が前記温度制御システムに送られるのと同時に前記イメージングシステムに前記静止画像信号を送り、次いで、前記静止画像データの前記時間と、前記熱融解の画像データの前記ＪＰＥＧ画像の前記タイムスタンプおよび前記温度データを記録した時間との関係に基づいて、前記温度データと前記熱融解画像データを同期させることを含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
熱画像データを記録することが、
前記マイクロ流路の少なくとも一部分を照光すること、
ピクセル配列のセンサーを用いて、前記マイクロ流路の前記照光された部分の内部の物質が発する蛍光の画像を生成することであって、前記画像の各ピクセルがＪＰＥＧ値を有すること、
前記ピクセル配列の前記ピクセルの一部分を含む対象領域（「ＲＯＩ」）を定義すること、および
前記ＲＯＩの前記ピクセルのすべてのＪＰＥＧ値の平均をとることにより、前記マイクロ流路の内部の物質が発する蛍光の強度を計算することを含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
各ピクセルが、第１の色の２つのサブピクセルおよび第２の色の１つのサブピクセルを有し、各ピクセルの前記ＪＰＥＧ値が（２×第１の色のサブピクセル＋１×第２の色のサブピクセル）／３として計算される請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＲＯＩの少なくとも一部分を１つまたは複数のサブＲＯＩに分割して、前記サブＲＯＩの前記ピクセルのすべてのＪＰＥＧ値の平均をとることにより、各サブＲＯＩの内部の蛍光強度を計算することをさらに含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記生成するステップが、ＣＭＯＳセンサーを用いて遂行される請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＣＭＯＳセンサーがデジタル一眼レフカメラを備える請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記生成するステップおよび前記計算するステップを、ある期間にわたって１回または複数回繰り返して、計算された蛍光強度の変化をある期間にわたって監視することをさらに含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記マイクロ流路の前記照光された部分の内部の物質が発する蛍光の画像を２つの別々の時間に生成し、画像のフィーチャが１つの画像と次の画像の間で変位するのを検出して、
１つの画像から次の画像への時間の経過を計算することにより、前記マイクロ流路の内部の流体流れを監視することを含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記マイクロ流路に隣接して配置された基準蛍光物質を照光し、
ピクセル配列のセンサーを用いて、前記基準蛍光物質が発する蛍光の画像を生成して、
１つのＲＯＩが前記マイクロ流路の一部分を包含し、第２のＲＯＩが前記基準蛍光物質の一部分を包含する、少なくとも２つのＲＯＩを定義することをさらに含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
前記基準蛍光物質を包含する前記ＲＯＩの前記ピクセルのすべてのＪＰＥＧ値の平均をとることにより、前記基準蛍光物質が発する蛍光の前記強度を計算すること、および
前記基準蛍光物質が発する蛍光の前記強度に基づいて、前記マイクロ流路の内部の物質が発する蛍光の前記強度を調節することをさらに含む請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記センサー素子が、３０Ｈｚ以下の周波数で複数の画像を生成するように構成される請求項９に記載のイメージングシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年８月３１日出願の米国特許仮出願第６１／３７８，４７１号の優先権の利益を主張するものであり、その開示全体が参照によってここで組み込まれる。
【０００２】
本発明は、マイクロ流体デバイスの内部のサンプル物質を分析反応プロセス中に画像化するシステムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
核酸の検出は、医学、法科学、生産加工、作物および動物育種、ならびに他の多くの分野の中核をなす。疾病症状（例えば癌）、感染性微生物（例えばＨＩＶ）、遺伝系統、遺伝標識などの検出能力は、疾病診断および予後、マーカー利用選択、犯罪現場の特徴の正確な識別、工業生物を繁殖させる能力ならびに他の多くの技法に関する普遍的技術である。対象の核酸の完全性の測定が、感染または癌の病理学に関連することがある。少量の核酸を検出する最も強力かつ基本的な技術の１つに、核酸配列のうちのいくらかまたはすべてを何度も複製し、次いで増幅産物を解析するものがある。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＤＮＡを増幅するための周知の技法である。
【０００４】
ＰＣＲを用いると、単一のテンプレートＤＮＡ分子から始めて、ＤＮＡの何百万ものコピーを急速に生成することができる。ＰＣＲは、ＤＮＡの単一ストランドへの変性、プライマーの変性ストランドへのアニール、および熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素によるプライマーの伸長の３段階の温度サイクルを含む。プロセスの終了時点には、検出して解析するのに十分なコピーが存在するように、このサイクルを複数回繰り返す。ＰＣＲに関する全般的な詳細については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（３ｒｄ  Ｅｄ．）、Ｖｏｌｓ．  １−３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ＰｒｏｔｏｃｏｌｓはＧｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．の間の合弁事業、（２００５年まで補足された）、および「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）を参照されたい。
【０００５】
いくつかの用途では、増幅プロセスの進行に伴うＤＮＡ産物の蓄積を監視することが重要である。リアルタイムＰＣＲは、一般にＰＣＲサイクルごとに１回、反応の進行に従って、増幅されたＤＮＡ産物の形成を測定する、発展中の一連の技法を指す。時間にわたって増幅プロセスを監視すると、プロセスの効率を求めること、ならびにＤＮＡテンプレート分子の初期濃度を推定することが可能になる。リアルタイムＰＣＲに関する全般的な詳細については、「Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ：  Ａｎ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｇｕｉｄｅ」、Ｋ．Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｏｒｗｉｃｈ、Ｕ．Ｋ．（２００４）を参照されたい。
【０００６】
最近になって、ＰＣＲおよび他の増幅反応を実施する複数の高スループットの手法が開発されており、例えば、マイクロ流体デバイス中の増幅反応、ならびにデバイス内またはデバイス上で増幅された核酸を検出して解析する方法を含む。増幅のための供試体の熱サイクルは、通常２つの方法のうちの１つで行われる。第１の方法では、デバイスにサンプル溶液が充填され、従来のＰＣＲ機器によく似て、温度は時間で循環される。第２の方法では、サンプル溶液は、空間的に、様々な温度領域を通って連続的に送られる。例えば、Ｌａｇａｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．、（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７３：５６５〜５７０頁（２００１））、Ｋｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．、（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１０４６〜１０４８頁（１９９８））、Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．、（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７５：６０２９〜６０３３頁（２００３））、Ｈａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．、（国際公開第２００５／０７５６８３号）、Ｅｎｚｅｌｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、（米国特許第６，９６０，４３７号）およびＫｎａｐｐ  ｅｔ  ａｌ．、（米国特許出願公開第２００５／００４２６３９号）を参照されたい。
【０００７】
ＰＣＲおよび他の増幅反応を遂行する高生産性手法のためのシステム、方法、および装置のさらなる実例が、本開示の内容と関連する以下の出版物で説明されている。
【０００８】
その開示が参照によってここで組み込まれる、Ｏｗｅｎらの「Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ」という名称の米国特許出願公開第２００８／０１７６２３０号（「‘２３０号公開」）は、マイクロ流路の内部のＤＮＡサンプルのリアルタイムの増幅および解析のためのシステムおよび方法を説明している。
【０００９】
その開示が参照によってここで組み込まれる、Ｈａｓｓｏｎらの「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏ−ｃｈａｎｎｅｌｓ」という名称の米国特許第７，６２９，１２４号（「‘１２４号特許」）は、分散媒によって分離された試験液のボーラスを、マイクロ流路を通して連続的に移動させ、各ボーラスに対してＰＣＲなどのプロセスを遂行して、流路の定義された区間に沿った別々の位置で蛍光信号などの信号を測定することによるマイクロ流路のリアルタイムＰＣＲを遂行するシステムおよび方法を説明している。
【００１０】
その開示が参照によってここで組み込まれる、Ｈａｓｓｏｎらの「Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」という名称の米国特許第７，５９３，５６０号（「‘５６０号特許」）は、マイクロ流体流路内部の反応を監視するためのセンサーの使用を説明している。このセンサーは、画像データを収集するための定義されたピクセル配列を有し、ピクセルの選択ウィンドウからの画像データ（全体の配列のサブセット）は、マイクロ流路の対象の部分を包含するものであり、マイクロ流路のそれぞれについて処理され、かつ記憶される。
【００１１】
一旦元のＤＮＡ分子のコピーの十分な数があれば、ＤＮＡを特徴づけることができる。ＤＮＡを特徴づける方法の１つに、ＤＮＡが温度上昇に伴って２本鎖のＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）から１本鎖のＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に移行する、ＤＮＡの解離挙動を調査するものがある。ＤＮＡをｄｓＤＮＡからｓｓＤＮＡへ移行させるプロセスは、「高分解能の温度（熱）融解（ＨＲＴｍ）」プロセス、または単に、「高分解能の融解」プロセスと称されることがある。
【００１２】
ＰＣＲプロセスおよび／または融解プロセスを（定量的かつ／または定性的に）監視するために、染料の蛍光など、光学的に検出可能な特性を測定するのにイメージングシステムを利用してよく、染料は、サンプル物質に内蔵され、元のＤＮＡ分子のコピーの数が増加するにつれて、かつ／またはＤＮＡが温度上昇に伴って２本鎖のＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）から１本鎖のＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）へと移行するにつれて、検出可能な変化が生じる。核酸分析の精度および信頼性は、大体において、このようなイメージングシステムの精度および正確さに依拠する。そのうえ、このようなイメージングシステムのコストは、核酸分析を遂行する全体の機器のコストの重要な部分である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第２００５／０７５６８３号
【特許文献２】米国特許第６，９６０，４３７号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５／００４２６３９号
【特許文献４】米国特許出願公開第２００８／０１７６２３０号
【特許文献５】米国特許第７，６２９，１２４号
【特許文献６】米国特許第７，５９３，５６０号
【特許文献７】米国特許出願公開第２００９−０２４８３４９号
【特許文献８】米国特許出願公開第２０１１−００４８５４７号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（３ｒｄ  Ｅｄ．）、Ｖｏｌｓ．  １−３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００）
【非特許文献２】「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ＰｒｏｔｏｃｏｌｓはＧｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．の間の合弁事業、（２００５年まで補足された）
【非特許文献３】「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）
【非特許文献４】「Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ：  Ａｎ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｇｕｉｄｅ」、Ｋ．Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｏｒｗｉｃｈ、Ｕ．Ｋ．（２００４）
【非特許文献５】Ｌａｇａｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．、（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７３：５６５〜５７０頁（２００１））
【非特許文献６】Ｋｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．、（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１０４６〜１０４８頁（１９９８））
【非特許文献７】Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．、（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７５：６０２９〜６０３３頁（２００３））
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、核酸の診断分析および他の生物学的プロセスを監視するイメージングシステムの精度、正確さ、および費用対効果の改善が、絶えず必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
蛍光源を画像化するのに２次元のＣＭＯＳセンサーまたはＣＣＤセンサーを使用することは、生物学的研究において既知である。通常、蛍光源を科学技術のＣＭＯＳ／ＣＣＤセンサーに画像化するのに顕微鏡レンズが使用される。本発明の態様によれば、イメージングデバイスとしてデジタル一眼レフ（「ＤＳＬＲ」）カメラを使用し、規定された構成のＬＥＤ励起源および本明細書に説明された機構と組み合わせて、改善された画像化および／または低コストのイメージングシステムが実現される。このようなイメージングシステムには、以下を含む多くの利点がある。
【００１７】
（１）ＤＳＬＲカメラの大きなＣＭＯＳセンサーにより、同一のカメラを使用して流れ追跡および熱融解測定の両方が可能になる。
【００１８】
（２）ＤＳＬＲカメラの８ビットＪＰＥＧフォーマットにより、１４ビットのＲＡＷデータと比較して、データ転送の帯域幅およびハードディスクのスペースが節約される。ビット深度は、多くのピクセルの平均をとることにより回復することができる。
【００１９】
（３）このようなＤＳＬＲカメラの大きなピクセル密度を有するセンサーにより、マイクロ流体流路における反応を観測することができる。ＰＣＲおよび熱融解プロセスのより優れた制御を得るために、気泡形成などの情報が取得され得る。
【００２０】
（４）ＤＳＬＲカメラのＣＭＯＳセンサー・サイズが大きいので、光源および加熱器からの変動を補正して除去するために、基準蛍光物質を使用してよい。
【００２１】
したがって、本発明の態様は、マイクロ流体デバイスのマイクロ流路の内部の反応の画像を生成するように構成されたイメージングシステムで実施される。一実施形態では、イメージングシステムは、マイクロ流路の少なくとも一部分の記憶可能な画像を生成するように構成されたセンサー素子と、センサー素子に対して配置され、センサー素子によって画像化されるマイクロ流体チップの一部分を照光するように構成された複数の照明素子とを備える。照明素子のうち少なくとも１つが、照明アセンブリを備え、該照明アセンブリが、ＬＥＤと、ＬＥＤの前に配置され、照明アセンブリによって照光される領域を制御するように開口が形成されているマスクと、照明アセンブリによって発せられた光のスペクトル成分を制御するための、照明アセンブリの光路に沿ったフィルタと、照明アセンブリによって発せられた光を有する領域を画像化するためのレンズとを備える。ＬＥＤ、マスク、フィルタ、およびレンズは、照明アセンブリの光学軸に沿って整列している。
【００２２】
一実施形態では、照明素子のうち少なくとも２つが、マイクロ流体チップの別々の部分を照光するように構成されている。
【００２３】
別の実施形態では、センサー素子がデジタル一眼レフカメラを備える。
【００２４】
別の実施形態では、照明素子のそれぞれがＬＥＤを備える。
【００２５】
別の実施形態では、イメージングシステムは、センサー素子のまわりに９０度の角度の増分で配置された４つの照明素子を備える。
【００２６】
別の実施形態では、マイクロ流路は第１のゾーンおよび第２のゾーンを備え、第１のＬＥＤが第２のゾーンを照光するように配置して配向され、第２のＬＥＤと第３のＬＥＤが、互いから１８０度離隔してセンサーの反対側に配置され、第１のゾーンを照光するように配置して配向されており、第４のＬＥＤが、第１のゾーンと第２のゾーンの両方を照光するように配置して配向されている。
【００２７】
別の実施形態では、センサー素子がＣＭＯＳセンサーを備える。
【００２８】
別の実施形態では、ＣＭＯＳセンサーは、５６１６×３７４４ピクセル以上までのピクセル配列を有する。
【００２９】
別の実施形態では、センサー素子がピクセル配列を含み、このシステムは、ピクセル配列のピクセルの一部分のみの画像を検出するように構成された論理素子をさらに備える。
【００３０】
別の実施形態では、センサー素子は、３０Ｈｚ以上までの周波数で複数の画像を生成するように構成される。
【００３１】
別の実施形態では、センサー素子は、８ビットのＪＰＥＧフォーマットを有する画像を生成するように構成される。
【００３２】
別の実施形態では、このイメージングシステムは、マイクロ流路の少なくとも一部分とともにセンサー素子によって画像化されるように配置された基準蛍光物質をさらに備える。
【００３３】
別の実施形態では、このイメージングシステムは、センサーとマイクロ流路の間に、少なくとも１つの延長チューブをさらに備える。他の実施形態では、延長チューブの代わりにレンズの組合せが使用されてもよい。
【００３４】
別の実施形態では、このイメージングシステムには、センサーとマイクロ流路の間に配置され、選択された波長の光信号しかセンサーに到達させないように構成された放射フィルタがさらに備わっている。
【００３５】
別の実施形態では、複数の照明素子のそれぞれが、マイクロ流体チップの一部分を、定められた波長で照光するように構成される。
【００３６】
本発明のさらなる態様は、サンプル物質に対して核酸の診断分析を遂行するシステムで実施される。一実施形態では、このシステムには、サンプル物質を運んで、マイクロ流路の１つまたは複数の部分の内部のサンプル物質に対する分析プロセスの遂行を可能にする、マイクロ流路を含むマイクロ流体手段が備わっている。分析プロセスは、ＰＣＲ増幅および／または熱融解解析のうち少なくとも１つを含む。このシステムは、マイクロ流体手段のマイクロ流路にサンプル物質を導入するための、マイクロ流体手段と動作協調する手段と、マイクロ流体手段の各マイクロ流路を通してサンプル物質を移動させるための、マイクロ流体手段と動作協調する手段と、マイクロ流体手段の１つまたは複数の部分を、１つまたは複数の選択された温度へと加熱および／または冷却する熱的手段と、イメージング手段によって生成された画像に関連するデータを記憶する手段を含む、各マイクロ流路の１つまたは複数の部分の内部のサンプル物質を画像化するイメージング手段とをさらに含む。
【００３７】
別の実施形態では、このシステムは、イメージング手段によって生成された画像に関連するデータを処理して、ＰＣＲ増幅および熱融解解析のうち少なくとも１つの結果に関連するデータを生成する処理手段をさらに備える。
【００３８】
別の実施形態では、このシステムは、サンプル物質を導入する手段、サンプル物質を移動する手段、熱的手段、イメージング手段、及び処理手段の動作を制御する制御手段をさらに備える。
【００３９】
別の実施形態では、イメージング手段は、マイクロ流路の内部のサンプル物質からの定められた波長の蛍光放射を検出するように構成されており、定められた励起波長の励起信号をマイクロ流路の一部分に導く手段と、マイクロ流路の一部分の内部のサンプル物質から、定められた放射波長の蛍光放射の画像を取得する手段とを備える。
【００４０】
本発明のさらなる態様は、マイクロ流体デバイスのマイクロ流路の内部の反応の画像から熱融解データを解析するための、コンピュータで実施される方法で実施される。一実施形態では、この方法は、マイクロ流路の少なくとも一部分を照光するステップと、ピクセル配列のセンサーを用いて、マイクロ流路の照光された部分の内部の物質が発する蛍光の画像を生成するステップであって、画像の各ピクセルがＪＰＥＧ値を有するステップと、ピクセル配列のピクセルの一部分を含む対象領域（「ＲＯＩ」）を定義するステップと、ＲＯＩのすべてのピクセルのＪＰＥＧ値の平均をとることにより、マイクロ流路の内部の物質が発する蛍光の強度を計算するステップとを含む。
【００４１】
別の実施形態では、各ピクセルは、第１の色の２つのサブピクセルおよび第２の色の１つのサブピクセルを有し、各ピクセルのＪＰＥＧ値は（２×第１の色のサブピクセル＋１×第２の色のサブピクセル）／３として計算される。
【００４２】
別の実施形態では、この方法は、ＲＯＩの少なくとも一部分を１つまたは複数のサブＲＯＩに分割すること、サブＲＯＩのすべてのピクセルのＪＰＥＧ値の平均をとることにより、各サブＲＯＩの内部の蛍光強度を計算することをさらに含む。
【００４３】
別の実施形態では、生成するステップは、ＣＭＯＳセンサーを用いて遂行される。
【００４４】
別の実施形態では、ＣＭＯＳセンサーはデジタル一眼レフカメラを備える。
【００４５】
別の実施形態では、この方法は、生成するステップと計算するステップとを、ある期間にわたって１回または複数回繰り返して、計算された蛍光強度の変化を、ある期間にわたって監視するステップをさらに含む。
【００４６】
別の実施形態では、この方法は、マイクロ流路の照光された部分の内部の物質が発する蛍光の画像を２つの別々の時間に生成することにより、マイクロ流路の内部の流体流れを監視するステップと、画像のフィーチャが、１つの画像と次の画像の間で変位するのを検出するステップと、１つの画像から次の画像への時間の経過を計算するステップとをさらに含む。
【００４７】
別の実施形態では、この方法は、マイクロ流路に隣接して配置された基準蛍光物質を照光するステップと、ピクセル配列のセンサーを用いて基準蛍光物質が発する蛍光の画像を生成するステップと、１つのＲＯＩがマイクロ流路の一部分を包含し、第２のＲＯＩが基準蛍光物質の一部分を包含する、少なくとも２つのＲＯＩを定義するステップとをさらに含む。
【００４８】
別の実施形態では、この方法は、基準蛍光物質を包含するＲＯＩのすべてのピクセルのＪＰＥＧ値の平均をとることにより、基準蛍光物質が発する蛍光の強度を計算すること、基準蛍光物質が発する蛍光の強度に基づいて、マイクロ流路の内部の物質が発する蛍光の強度を調節することをさらに含む。
【００４９】
本発明のさらなる態様は、コンピュータで実施される、熱融解データを解析する方法で実施される。一実施形態では、この方法は、イメージングシステムを用いて、イメージングシステムによって生成されたＪＰＥＧ画像をタイムスタンプとともに保存することにより、熱融解の画像データを時間の関数として記録すること、温度制御システムを用いて、温度データを時間の関数として記録すること、および静的記録信号をイメージングシステムへ送って、イメージングシステムに、熱融解が始まる前に静止画像データを記録させ、静止画像データの時間を記録し、そして、温度データを静止画像データの時間と同期させることにより、温度データを熱融解データと同期させることを含む。
【００５０】
別の実施形態では、この方法は、熱融解の画像データと温度制御システムによって制御される加熱器とが同時にスタートするように、初期の加熱器信号が温度制御システムに送られるのと同時にイメージングシステムに静止画像信号を送ること、次いで、静止画像データの時間と、熱融解の画像データのＪＰＥＧ画像のタイムスタンプおよび温度データを記録した時間との関係に基づいて、温度データと熱融解画像データを同期させることを含む。
【００５１】
当業者には、本発明のこれらおよび他の特徴、態様および利点が、以下の詳細な説明、添付の特許請求の範囲および添付図面を考慮に入れた後に明らかになるであろう。
【００５２】
添付図面は、本明細書に組み込まれて本明細書の一部分を形成するものであり、本発明の様々な実施形態を示す。これらの図面では、同じ参考番号は、同一の要素または機能的に類似した要素を示す。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】本発明の態様を内蔵するイメージングシステムを組み込むことができるシステムを示すブロック図である。
【図２】本発明の一実施形態によるセンサーおよびＬＥＤのレイアウトを含むイメージングシステムの斜視図である。
【図３】本発明の一実施形態によるセンサーおよびＬＥＤのレイアウトを含むイメージングシステムの側面図である。
【図４】本発明の一実施形態によるイメージングシステムのＬＥＤアセンブリの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
前述の‘２３０号公開、‘５６０号特許で説明されているシステム、および前述の‘１２４号特許で説明されているリアルタイムＰＣＲ構成など、１つまたは複数のマイクロ流路を有するマイクロ流体チップを使用する核酸解析用システムは、試験液の増幅産物および流速など、マイクロ流路を流れるサンプルの光学的に検出可能な特性を検出するためのイメージセンサー（または光イメージングシステム）を含む。各マイクロ流路を通って流れる試験液は、‘１２４号特許で説明されているように、分散媒によって分離された試料液の個々のボーラスの形態であってよい。
【００５５】
図１は、本発明の様々な態様を具現するように構成することができる、複数の核酸分析を迅速に順次処理するためのシステム１００を示すブロック図である。システム１００は、マイクロ流体デバイス１０２を含んでよい。マイクロ流体デバイス１０２は、１つまたは複数のマイクロ流体流路１０４を含んでよい。示された実例では、デバイス１０２は、流路１０４ａおよび流路１０４ｂの、２つのマイクロ流体流路を含む。例示的実施形態では２つの流路だけが示されているが、デバイス１０２は、２つ未満の流路または２つより多くの流路を有してよいように企図されている。例えば、いくつかの実施形態では、デバイス１０２は８つの流路１０４を含む。
【００５６】
一実施形態では、デバイス１０２は、２つのＤＮＡ加工ゾーン、ＤＮＡ増幅ゾーン１３１（別称ＰＣＲゾーン１３１）およびＤＮＡ熱融解ゾーン１３２を含んでよい。ＰＣＲゾーン１３１を通って進むＤＮＡサンプルはＰＣＲを受けてよく、熱融解ゾーン１３２を通過するＤＮＡサンプルは高分解能熱融解を受けてよい。図１に示されるように、ＰＣＲゾーン１３１は流路１０４の第１の部分を含み、熱融解ゾーン１３２は、流路１０４の第１の部分から下流にある第２の部分を含む。
【００５７】
デバイス１０２は、ストロー１０８も含んでよい。ストロー１０８は、中空チューブの形でよい。ストロー１０８は、注入口１０９に接続される近位端を有し、この注入口は、ストロー１０８の近位端を流路１０４に結合する。このシステムは、ストロー１０８の代わりに、またはストロー１０８に加えて、試薬および／またはサンプル混合物を、マイクロ流体カートリッジ１０２へと吸引し、混合し、かつ分配するための少なくとも１つのロボットのピペットを備える液体取扱いシステムを含んでよい。
【００５８】
デバイス１０２は、注入口１０９に接続された共通の試薬ウェル１０６も含んでよい。デバイス１０２は、各流路１０４向けの遺伝子座特異の試薬ウェル１０５も含んでよい。例えば、示された実施形態では、デバイス１０２は、流路１０４ａに接続された遺伝子座特異の試薬ウェル１０５ａを含み、流路１０４ｂに接続された遺伝子座特異の試薬ウェル１０５ｂを含んでよい。デバイス１０２は、各流路１０４向けの廃棄物ウェル１１０も含んでよい。
【００５９】
共通の試薬ウェル１０６に保管される溶液は、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ酵素、塩類、緩衝剤、表面安定剤、分子を検出する１つまたは複数の非特異性の蛍光ＤＮＡ、流体マーカーなどを含んでよい。遺伝子座特異の試薬ウェル１０５に保管される溶液は、ＰＣＲプライマー、配列特異的蛍光ＤＮＡプローブまたはマーカー、塩類、緩衝剤、表面安定剤などを含んでよい。
【００６０】
流路１０４へサンプル溶液を導入するために、システム１００は、複数のウェル１９８を含むウェルプレート１９６を含んでよく、それらのうち少なくともいくつかはサンプル溶液（例えば核酸サンプルを含む溶液）を含む。示された実施形態では、ウェルプレート１９６は、主コントローラ１３０に接続されている位置決めシステム１９４に接続される。
【００６１】
限定的でない一実施形態では、主コントローラ１３０は、テキサス州オースティンのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能な、ＰＸＩ−８１０５コントローラを使用して実施することができる。限定的でない一実施形態では、位置決めシステム１９４は、ステッピング駆動の制御のためにウェルプレート１９６を位置決めするための位置決め装置（例えばペンシルバニア州のＰａｒｋｅｒ  Ｈａｎｎｉｆｉｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（「Ｐａｒｋｅｒ」）から入手可能なＭＸ８０位置決め装置）、位置決め装置を駆動するためのステップ駆動装置（例えばＰａｒｋｅｒから入手可能なＥ−ＡＣ  Ｍｉｃｒｏｓｔｅｐｐｉｎｇ  Ｄｒｉｖｅ）、およびコントローラ（例えばＰａｒｋｅｒから入手可能な６Ｋ４コントローラ）を含んでよい。
【００６２】
一実施形態では、流路１０４へサンプル溶液を導入するために、位置決めシステム１９４は、ウェル１９８のうちの１つに保管されたサンプル溶液にストロー１０８の遠位端が沈められるようにウェルプレート１９６を移動するように制御される。図１は、ウェル１９８ｎに保管されたサンプル溶液中に沈められている１０８の遠位端を示す。
【００６３】
サンプル溶液を、ストローの上方へ、そして流路１０４内へ強制的に移動させるために、真空マニホールド１１２およびポンプ１１４が利用されてよい。真空マニホールド１１２は、デバイス１０２の一部分に動作可能に接続されてよく、ポンプ１１４は、マニホールド１１２に動作可能に接続されてよい。ポンプ１１４が起動されると、ポンプ１１４は圧力差を生成し（例えばポンプ１１４は廃棄物ウェル１１０から空気を抜き取ることができる）、ウェル１９８ｎ内に保管されたサンプル溶液は、この圧力差によって、ストロー１０８を上方へ流れ、注入流路１０９を通って流路１０４の中へ流れる。そのうえ、この圧力差によって、ウェル１０６および１０５内の試薬が流路の中へ流れる。したがって、ポンプ１１４は、流路１０４を通してサンプル溶液およびリアルタイムＰＣＲ試薬を強制的に流すように機能する。図１に示されるように、融解ゾーン１３２はＰＣＲゾーン１３１から下流に配置される。したがって、サンプル溶液は、まずＰＣＲゾーンを通って流れ、次いで融解ゾーンを流れる。
【００６４】
戻ってウェルプレート１９６を参照すると、ウェルプレート１９６は緩衝液ウェル１９８ａを含んでよい。一実施形態では、緩衝液ウェル１９８ａは緩衝液１９７を収容する。緩衝液１９７は、従来のリアルタイム（ＲＴ）ＰＣＲ緩衝剤など、従来のＰＣＲ緩衝剤を含んでよい。従来のＰＣＲ緩衝剤は、例えばＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ他を含む複数の製造業者から入手可能である。
【００６５】
緩衝液ウェル１９８ａに緩衝液１９７を補充するために、システム１００は、緩衝液保管容器１９０と、容器１９０からウェル１９８ａへ緩衝液１９７を送るためのポンプ１９２とを含んでよい。そのうえ、ポンプ１９２は、ウェル１９８ａに溶液１９７を追加するだけでなくウェル１９８ａから溶液１９７を除去し、それによって溶液１９７を再循環させるように構成されてよい。
【００６６】
‘１２４号特許で説明されている構成の１つでは、このシステムは試験液貯蔵器を含み、これは、前述のように、複数のウェル、各ウェルが例えば試験サンプルといった別々の試験液を含んでいるマイクロプレート１９６など、複数の試験液を含む貯蔵器でよい。このシステムは、分散媒貯蔵器をさらに含む。一実施形態では、この試験液は、必要なリアルタイムＰＣＲ試薬をすべて含んでいることを除けば、実質的に分散媒と同一である。リアルタイムＰＣＲ混合物は、ＰＣＲプライマー、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ酵素、塩分、緩衝剤、表面安定剤などを含んでよい。さらに、リアルタイムＰＣＲ試薬の混合物は、非特異性の蛍光ＤＮＡを検出する分子、配列特異的蛍光ＤＮＡプローブまたはマーカーを含んでよい。さらなる実施形態では、分散媒は、オイル、フッ素化された液体、またはその他の非水性もしくは疎水性の溶剤など、混合しない流体である。分散媒の目的は、物質が１つの試験ボーラスから別のボーラスへと移転するのを防止することである。分散媒の別の目的は、流路の中の流体流れを追跡するために用いられ得るボーラス間の識別可能な遷移をもたらすことである。一実施形態では、分散媒はマーカーを含んでよい。
【００６７】
一実施形態では、試験液および分散媒は、主コントローラ１３０に制御されているスイッチ（図示せず）により、分散媒および試験液が、マイクロ流路１０４ａ、１０４ｂの中に順次に交番して導入され、分散媒によって互いから分離された試験液の個々のボーラスを形成するように、マイクロ流路１０４ａ、１０４ｂの中に導入される。マイクロ流路１０４ａ、１０４ｂの中に導入される試験液および分散媒の体積は、マイクロ流路１０４ａ、１０４ｂによる試験液と分散媒の間の移動中の混合が最小限になるように選択される。
【００６８】
したがって、それぞれが分散媒によって分離された別々の試験液のボーラスの、マイクロ流路１０４ａ、１０４ｂを通る連続的な移動の結果として、連続した多数の反応（すなわち順次の反応）が、マイクロ流路１０４ａ、１０４ｂのそれぞれの中で実行され得る。マイクロ流路１０４ａ、１０４ｂを通る分散媒および試験液ボーラスの流速は、マイクロ流路１０４ａ、１０４ｂの中の試験液ボーラスおよび分散媒の流速を調節するために、主コントローラ１３０の制御下のポンプ１１４によって制御される。流速は、試験液ボーラスがマイクロ流路１０４ａ、１０４ｂのＰＣＲゾーン１３１を通るとき、所望数のＰＣＲサイクルが遂行されるように調節されてよい。
【００６９】
ＰＣＲゾーン１３１を流れるＤＮＡサンプル向けのＰＣＲを実現するためにサンプルの温度を循環させる必要があるが、これは当技術で周知のことである。したがって、いくつかの実施形態では、システム１００は温度制御システム１２０を含む。温度制御システム１２０は、温度センサー、加熱器／冷却器および温度コントローラを含んでよい。いくつかの実施形態では、主コントローラ１３０がＰＣＲゾーンおよび融解ゾーンを流れるサンプルの温度を制御することができるように、温度制御システム１２０が主コントローラ１３０とインターフェースされる。全体のマイクロチップ１０２に対して１つの温度制御システム１２０しか示されていないが、温度制御システム１２０は、例えば温度センサー、加熱器／冷却器および温度コントローラをそれぞれが備えている個別の温度制御サブシステムを、ＰＣＲゾーン１３１および融解ゾーン１３２向けに備えてよい。
【００７０】
主コントローラ１３０は、グラフィカル・ユーザ・インターフェースを表示するための表示デバイスに接続されてよい。主コントローラ１３０はユーザ入力デバイス１３４に接続されてもよく、このデバイスによって、ユーザは、主コントローラ１３０へデータおよび命令を入力することができる。
【００７１】
ＰＣＲゾーン１３１で生じるＰＣＲ処理および融解ゾーン１３２で生じる融解処理を監視するために、システム１００はイメージングシステム１１８を含んでよい。イメージングシステム１１８は、励起源、画像取込みデバイス、コントローラおよび画像記憶装置を含んでよい。本発明の一実施形態によれば、イメージングシステム１１８は、一実施形態において既製のデジタル一眼レフ（ＤＳＬＲ）カメラの一部分を備え得る大型ＣＭＯＳセンサー（例えば２４ｍｍ×３６ｍｍなど）を有するＣＭＯＳセンサーを備える。視界は、顕微鏡レンズを利用する従来システムよりはるかに大きく、マイクロ流体チップの全体の画像化を可能にする。イメージングシステム１１８は、マイクロ流体システムの流れ追跡および熱融解信号検出の両方に対して使用されてよい。
【００７２】
流れ追跡の方法、すなわちマイクロ流路１０４ａ、１０４ｂを通る流速を測定する方法は、‘１２４号特許に説明されている。例えば、一実施形態では、平均流速は、流路からの反応依存性蛍光信号の順次画像を比較することによって測定される。第２の実施形態では、平均流速は、流路からの反応非依存性流れマーカーの順次画像を比較することによって測定される。より具体的には、このシステムは、流路の内容の１つまたは複数の画像を取得する。これらの画像データおよび取得時間は、後の解析のためにデータベースに記憶される。流体が、１つの画像から後続の画像へと流路に沿ってどれくらい遠くまで移動したのか求めるために、例えば流路からの反応依存性蛍光信号の順次画像または流路からの反応非依存性流れマーカーの順次画像といった、２つ以上の順次画像の特徴が比較されてよい。平均変位を経過時間で割ると、平均流速が得られる。別の実施形態では、反応非依存性流れマーカーからの散乱光は、波長スペクトルによって反応依存性蛍光から分解可能である。代替実施形態では、反応非依存性流れマーカーからの散乱光は、蛍光寿命に基づいて反応依存性蛍光から分解可能である。別の実施形態では、反応非依存性流れマーカーは、試験ボーラスの流れ分散を求めるのにさらに用いられる。さらなる実施形態では、反応依存性蛍光の画像が、ＰＣＲサイクルごとに少なくとも１回取得される。一実施形態では、反応依存性蛍光の画像は、１つのＰＣＲサイクルの持続時間より短い時間スケールで流路の全長を走査することにより、順次に取得される。代替実施形態では、反応依存性蛍光の画像は、流路に沿った複数の点からの信号を同時に取得することによって取得される。別の実施形態では、流速測定は、流速を調節するためのフィードバック・ループの一部分である。さらなる実施形態では、流速は、サンプルのボーラスが、流路の定義された区間に入ってから出て来るのを検出することによって測定される。
【００７３】
いくつかの実施形態では、求められた流速は、ポンプ１１４を制御するためのフィードバック流量制御ループにおいて、主コントローラ１３０によって入力として用いられてよい。
【００７４】
より具体的には、本発明の一実施形態では、マイクロ流体チップの高分解能熱融解および流れ追跡に、デジタル一眼レフ（ＤＳＬＲ）カメラが利用される。限定的でない実例では、ＤＳＬＲカメラは、Ｃａｎｏｎ  ＥＯＳ  ５Ｄ  Ｍａｒｋ  ＩＩであり得る。ＤＳＬＲカメラは、適用可能であれば、（例えば‘１２４号特許で説明されたように）リアルタイムＰＣＲ情報を取得するのにも適切である。通常、デジタル・カメラは、ＲＡＷフォーマットまたはＪＰＥＧフォーマットで画像を保存する。高速のフレームレートを実現するために、通常はＪＰＥＧフォーマットが採用される。限定的でない一実施形態では、ＤＳＬＲカメラは、ベイヤー・パターン（Ｂａｙｅｒ  ｐａｔｔｅｒｎ）（各ピクセルにつき２つの緑色サブピクセル、１つの青色サブピクセル、１つの赤色サブピクセル）に配置された５６１６×３７４４以上のピクセル配列を有する２４ｍｍ×３６ｍｍのＣＭＯＳセンサーを有する。
【００７５】
ＤＮＡ熱融解の間中、長時間にわたって蛍光変化を記録するのに、高フレームレートが好ましい。一実施形態では、検出器は、例えば２０〜３０フレーム／秒などのビデオ・フレームレートでデータを記録することができるデジタル・カラーカメラであり得る。例えばＣａｎｏｎ  ＥＯＳ  ５Ｄ  Ｍａｒｋ  ＩＩなどの適切なＤＳＬＲカメラのライブビュー機能は、３０ｆｐｓのフレームレートを提供する。もちろん、特定の実施形態では、より高いフレームレートまたはより低いフレームレートを有する適切なＤＳＬＲカメラも同様に使用されてよい。限定的でない実例では、ライブビュー機能からのファイルが、次の２つの解像度の選択肢を伴ってＪＰＥＧフォーマットで保存される。
【００７６】
ａ．サブサンプリングされたピクセルを有するフル・センサー画像。画像サイズ１０２４×６８０（１倍ズーム）。
【００７７】
ｂ．フルピクセル解像度を有するセンサー群。画像サイズ１１２０×７５２（５倍ズーム）。
【００７８】
一実施形態では、１倍ズームは、ＰＣＲおよび熱融解が生じるマイクロ流体チップの各部分と、液体処理のためのマイクロ流体チップに結合されるインターフェース・チップの一部分とを含み得る比較的大きな領域を（低下されたピクセル密度で）画像化するので、流れ追跡用には１倍ズームが用いられる。一実施形態では、マイクロ流体チップの小部分の解像度の向上（詳細）が必要とされる熱融解検出用には、５倍ズームが用いられる。好ましい実施形態では、画像化された領域のピクセルがすべて保存されるので、より優れた信号対雑音比（ＳＮＲ）を実現することができる。他の実施形態では、流れ追跡または熱融解検出のいずれかに対して様々なズーム値を用いてよい。
【００７９】
ＪＰＥＧ画像フォーマットは、８ビットの解像度、すなわち各ピクセルにつき２５６のデジタル・レベルを提供する。いくつかの実施形態では、８ビットを上回る解像度を実現するために、対象領域（「ＲＯＩ」）の多くのピクセルの平均をとることにより、より大きなビット深度が実現され得る。
【００８０】
‘５６０号特許で説明されているように、センサーのピクセル配列は、特定のＲＯＩに対応する対象ゾーンへと分割されてよい。すなわち、イメージセンサーは、ピクセル配列の所定の部分を読み出す能力または「窓を付ける（ｗｉｎｄｏｗ）」能力（これは「ウィンドウイング（ｗｉｎｄｏｗｉｎｇ）」として知られている）を有する。熱融解の画像化のために、マイクロ流路１０４ａ、１０４ｂの融解ゾーン１３２は、高出力ＬＥＤで均一に照光されて約１：１の比でＣＭＯＳセンサーの中に画像化される。熱融解が測定される融解ゾーン１３２では、蛍光強度が、ＲＯＩのすべてのピクセルのＪＰＥＧ値の平均をとることによって計算される。一実施形態では、蛍光強度は、２０００個を上回る数のピクセルのＪＰＥＧ値の平均をとることによって計算される。多数のピクセルを有するＲＯＩのピクセルのＪＰＥＧ値（８ビット）の平均をとることにより、１１ビットより優れた解像度が実現され得る。
【００８１】
ＲＯＩのピクセルの平均をとることからの別の利益には、信号対雑音比（「ＳＮＲ」）の改善がある。
【００８２】
ＬＣ  Ｇｒｅｅｎ（高分解能融解のために用いられるＤＮＡ結合染料）からの蛍光は、ＣＭＯＳセンサーの緑色ピクセルと青色ピクセルによってほぼ等しく感知される。したがって、センサーの特定のピクセル上の蛍光強度を表すのに、緑色ピクセルと青色ピクセルの平均が用いられる。一実施形態によるセンサーの前のベイヤー・フィルタ（Ｂａｙｅｒ  ｆｉｌｔｅｒ）は、各ピクセルに２つの緑色ピクセルおよび１つの青色ピクセルがある。したがって次式となる。
【００８３】
ピクセルの蛍光強度＝（２×Ｇｒｅｅｎ＋１×Ｂｌｕｅ）／３。
【００８４】
実際には、ＧｒｅｅｎとＢｌｕｅのウェイトは、別のカメラ設定によって２：１の比から外れてもよい。ＧｒｅｅｎとＢｌｕｅの比に対して影響を及ぼすことができるこのような設定の１つには、ホワイトバランスがある。ホワイトバランスは、画像を様々な照明状態に適応させるように、緑色、青色、および赤色のピクセルのＪＰＥＧ値を操作する。ＳＮＲを測定基準として用いて、ホワイトバランス設定および緑色と青色の比の最適化された状態を計算する、または測定することが可能になり得る。
【００８５】
本発明の一実施形態によるイメージングシステム１０が、図２および図３に示されている。イメージングシステム１０は、一実施形態では例えばＣａｎｏｎ  ＥＯＳ  ５Ｄ  Ｍａｒｋ  ＩＩなどのＤＳＬＲカメラといったカメラ１２の本体１４の中に収容されたＣＭＯＳセンサー３６と、１つまたは複数のレンズ３２を含んでいる鏡筒１６とを含む。本発明の実施形態では、イメージングシステム１０は、熱融解測定および流れ追跡用に使用され得る。一実施形態では、イメージングシステム１０は、流れ追跡および熱融解解析のために、毎秒複数の画像を生成して記録するように構成される。例えば、Ｃａｎｏｎ  ＥＯＳ  ５Ｄ  Ｍａｒｋ  ＩＩは、ボーラスがマイクロ流体流路の中を流れている間に流れを追跡するために、約１ＨｚでＪＰＥＧ画像を生成して記録するのに用いられるライブビュー・モードを含む。ライブビュー・モードは、リアルタイムＰＣＲのためにも用いられ得る。特定の実施形態では、熱融解のデータを記録するために、ＪＰＥＧファイルなどの画像は、約３０Ｈｚのレートにて約３３ミリ秒の積分時間（すなわち積分時間間隔は周波数の逆数として計算される）で記録される。動作環境およびハードウェアの能力次第で、他のフレームレートおよび対応する積分時間間隔を用いてもよいが、フレームレートは、好ましくは１０Ｈｚ以上である。
【００８６】
一実施形態では、より優れた光子収集のために、市販のＦ／１．２レンズを使用してよい。Ｆ／＃がより小さいレンズは、より高度な光収集能力を有する。
【００８７】
レンズ１６と画像化されるマイクロ流体チップの間の距離をできるだけ近くするために、延長チューブ１５、１３が使用されてよい。光収集は、レンズと蛍光源の間の距離の２乗に比例する。一実施形態では、延長チューブは、２５ｍｍおよび１２ｍｍの長さを有し、延長部の合計の長さが３７ｍｍになり、これは、レンズ１６と画像化されるマイクロ流体チップの間の距離を約６ｃｍ程度に近づけることができる。例えば２５ｍｍおよび２５ｍｍなどの、他の延長チューブ長さが使用されてもよい。さらに、２つ未満または２つより多くの延長チューブを使用することができる。例えば、他の実施形態は、２５ｍｍ、２５ｍｍおよび１２ｍｍの３本の延長チューブまたは２５ｍｍ、２５ｍｍおよび２５ｍｍの３本の延長チューブを含んでよい。延長チューブがより長ければ、レンズとマイクロ流体チップの間の距離がより短くなり、より多くの光をレンズに入れることができ、センサー上の画像もより大きくなり得る。延長チューブの選択は、具体的な機械的設計および視野の配慮に依拠してよい。延長チューブを使用することの代案として、マイクロ流体チップ内のサンプル物質のより近くへレンズを移動して、より大きな画像をもたらすという同じ目標を達成するのに、レンズの組合せを使用してもよい。
【００８８】
センサーは、デュアル・バンド放射フィルタ３４を含んでよく、同フィルタは、選択された波長だけがセンサーに到達し得るように、延長チューブ１５、１３のうちの１つに取り付けられてよい。一実施形態では、フィルタは、ＬＣ  ＧｒｅｅｎおよびＡｌｅｘａ  ６４７（またはＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ）の追跡染料からの蛍光だけがセンサーに到達し得るように構成される。例示の一実施形態では、放射フィルタは、Ｉｄａｈｏ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＤＮＡ結合染料ＬＣ  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｌｕｓ向けの通過帯域と、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＡｌｃｘａＦｌｕｏｒ  ６４７などの赤色流れ追跡染料向けの通過帯域とを有するデュアル・バンドパスフィルタである。しかし、蛍光染料の適切な代替の組合せ向けに代替フィルタが置換されてよい。ＬＣ  Ｇｒｅｅｎからの蛍光は、ＣＭＯＳセンサーの青色ピクセルと緑色ピクセルの両方で感知される青緑色を有する。しかし、カメラの緑色フィルタが青色光子を遮断し、カメラの青色フィルタが緑色光子を遮断するので、光子の少なくとも半分がいずれのフィルタによって除去される。一実施形態では、フィルタが、（例えば青緑色の波長へと）シフトされたスペクトルを有し、したがって、すべての光子がフィルタを通ってセンサーのピクセルに到達する。カメラの赤色フィルタは不変に保つことができるので、「デュアル・カラー」センサーは、２つの別々の染料を用いて、引き続き流れ追跡と熱融解検出の両方を行なうことができる。
【００８９】
一実施形態では、イメージングシステム１０は、マイクロ流体チップの照明用にＬＥＤ１、ＬＥＤ２、ＬＥＤ３、ＬＥＤ４の４つを含む。これらのＬＥＤは、リアルタイムＰＣＲ中の増幅産物と、熱融解解析中の解離挙動とを検出するため、ならびに／あるいはマイクロ流路１０４ａおよび／または１０４ｂの中の試験液の流速を監視するように存在し得るマーカーを検出するために用いられるラベルを励起するために、所望の波長で光を生成する励起源である。上記で説明されたように、チップのＰＣＲゾーン１３１はＰＣＲ用であり、融解ゾーン１３２は熱融解用である。イメージングデバイス１０の、センサー１２およびＬＥＤ１、ＬＥＤ２、ＬＥＤ３、ＬＥＤ４のレイアウトの実施形態が、図２および図３に示されている。図２は、センサー（例えばカメラ）１２およびＬＥＤレイアウトを含むイメージングデバイス１０の説明である。図示された実施形態に示されるように、ＬＥＤ１、ＬＥＤ２、ＬＥＤ３、ＬＥＤ４は、レンズ１６のまわりに、９０°の角度間隔で、１つまたは複数のレンズ１６（鏡筒）に隣接して配置されている。ＬＥＤ２とＬＥＤ３は、レンズ１６に関して相対して配置されており、ＬＥＤ１とＬＥＤ４は、レンズ１６に関して相対して配置されている。
【００９０】
例示的実施形態では、ＬＥＤ１は、スロット開口およびイメージングレンズを有するアセンブリを備え、融解ゾーン１３２（熱融解）の照明用に配置され、かつ配向されている。ＬＥＤ２およびＬＥＤ３は、ＰＣＲゾーン１３１（ＰＣＲ）の加熱器の較正のために配置され、かつ配向されており、また、必要に応じてゾーン１３１のＰＣＲプロセスおよび融解を監視するのに使用することができる。ＬＥＤ４は、全体のチップ１０２の流れ追跡染料を励起するように配置され、かつ配向されている。一実施形態では、目標は、ＬＥＤ４の照明をＰＣＲゾーン１３２に限定して、熱融解を行なうとき融解ゾーン１３１の光退色を防止することである。
【００９１】
図４は、一実施形態による、融解ゾーン１３２のＬＥＤ（ＬＥＤ１）アセンブリの概略図である。図４に示されるように、ＬＥＤ１は、実際には、ＬＥＤ３０と、マスク２８と、フィルタ２６と、光学軸２２に沿って整列したレンズ２４とを含むアセンブリである。マスク２８は、ＬＥＤ３０からの照明を、マイクロ流体チップ１０２の熱融解ゾーン１３２に限定するためのスロットを含んでいる。フィルタ２６は、チップ１０２に導かれる励起光のスペクトル成分を制御し、レンズ２４は、融解ゾーン１３２上への光の帯域を画像化する。融解ゾーン１３２は、ＬＥＤアセンブリ１のマスク２８からの帯状光で照光される。このＬＥＤ（青色ＬＥＤ）は、ＰＣＲゾーン１３１の染料の光退色を防止するように、帯状光を用いて融解ゾーン１３２のみを照光する。このアセンブリは、ヒートシンクおよびファンも含んでよい。
【００９２】
一実施形態では、ゾーン１３１における加熱器較正用のＬＣ  Ｇｒｅｅｎを励起するために、２つの高性能の青色ＬＥＤ（２、３）がＰＣＲゾーン１３１の両側に設置される。１つまたは複数のマイクロ流路を有するマイクロ流体チップを使用する核酸解析用システムの一実施形態では、加熱素子は、例えば米国特許出願公開第２００９−０２４８３４９号の「Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｒｅｓｉｓｔｉｖｅ  Ｈｅａｔｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ  Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｓｕｃｈ  Ｈｅａｔｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ」および米国特許出願公開第２０１１−００４８５４７号の「Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ」に開示されているような、マイクロ流路に隣接して配置された金属ワイヤまたはフィラメントを備えてよく、これらの開示の全体が、参照によってここで組み込まれる。
【００９３】
一実施形態では、ＰＣＲゾーン１３１における加熱要素によって影が生じるのを防止するために、ＬＥＤ２とＬＥＤ３が、マイクロ流体チップ１０２の両側に配置される。さらに、ＬＥＤ２およびＬＥＤ３のこの配置により、すべての流路にわたってより均一な照明が生じる。加熱器の較正は、マイクロ流路１０４ａ、１０４ｂに、既知の核酸濃度を有する物質を通し、ＬＥＤ１を用いて融解ゾーン１３２を照光して、既知の核酸濃度に対して予期された熱融解曲線と比較する熱融解曲線とを生成することによって遂行され得る。いくつかの実施形態では、ＬＥＤ２およびＬＥＤ３は、ゾーン１３１におけるＰＣＲおよび熱融解を監視するのにも使用されてよい。
【００９４】
一実施形態では、ＬＥＤ４（赤色ＬＥＤ）は、流れ追跡に使用され得る全体のチップ１０２を照光する。
【００９５】
好ましい実施形態では、ＬＥＤ１、ＬＥＤ２、ＬＥＤ３、ＬＥＤ４のすべておよびセンサー１２は上向きであり、マイクロ流体チップ１０２の透明な側は下向きである。この配置により、液体取扱いシステム（例えばロボットのピペット）がチップ１０２の上の空間を利用することに対する障害を、最小限にすることができる。
【００９６】
好ましい実施形態では、ＬＥＤ１、ＬＥＤ２、ＬＥＤ３、ＬＥＤ４は、イメージングシステム１１８のコントローラおよび／または限定的でない実例ではＮａｔｉｏｎａｌ  ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのＬａｂｖｉｅｗで書かれた制御アルゴリズムを実行する主コントローラ１３０によって制御される。当業者に既知の他の制御アルゴリズムも用いられ得る。
【００９７】
イメージングシステム１０のＣＭＯＳセンサーは、ＤＳＬＲカメラでなくてもよいことが理解される。本発明の実施形態では、イメージングシステム１０のＣＭＯＳセンサーは、本明細書に説明された特性を有する別の適切なセンサーであり得る。
【００９８】
特定の実施形態では、加熱器が均一でないとき、融解ゾーン１３２の小部分のみをＲＯＩ（熱的に均一な部分）として用いてよい。一般に、融解ゾーン１３２の均一な部分は、較正された加熱素子で加熱された融解ゾーン１３２の部分に相当し、融解ゾーン１３２の不均一な周辺部分は、較正されていない加熱素子を含んでいる。不均一な加熱条件下では、融解ゾーン１３２の不均一なＲＯＩ部分を、それぞれが均一な温度を有することができるほど十分に小さいいくつかのより小さな「サブＲＯＩ」に分割することにより、より大きく効果的なＲＯＩを生成することができる。いくつかの実施形態では、それぞれの小さなサブＲＯＩに対して融解曲線がプロットされ、次いで、較正されていないサブＲＯＩの融解曲線を、融解ゾーン１３２の較正された部分のＲＯＩの融解曲線と関連づけるために、ＲＯＩの温度較正された領域へと数学的にシフトする。より大きく効果的なＲＯＩを用いて、ＳＮＲを改善することができる。あるいは、加熱器が較正される一実施形態では、加熱器の均一に加熱された区間にわたるＲＯＩが用いられるので、この特定のＲＯＩの温度は、較正されて正確なものであると想定することができる。加熱器の縁端部は、通常、較正されたＲＯＩとは異なる温度を有する。加熱器の縁端部の領域と較正されたＲＯＩの間の温度差は、計算することができる。例えば、較正されたＲＯＩの中の物質が７０℃で融解し、縁端部における物質が８０℃（ＲＯＩを用いて較正された加熱器温度の読取り値）で融解するとき、縁端部は、較正されたＲＯＩより、温度が１０℃低いことが分かる。加熱器の縁端部は後に融解することになるが、温度差データを用いて温度軸を調節することができる。したがって、加熱器の縁端部は、較正されたＲＯＩと同一の温度軸を有し得る。加熱器に沿ったより多くのＲＯＩの融解曲線が、較正されたＲＯＩへとシフトされ得て、より優れたＳＮＲを有する融解曲線を生成するために積算される。
【００９９】
光源からの変動を識別して除去することができるように、基準蛍光物質は、サンプルの近くに（サンプルからの蛍光と干渉しないように）設置されてよい。すなわち、サンプル物質から測定された蛍光信号を補正することができるように、基準蛍光物質の予期された蛍光信号からの変動が識別され得る。さらに、システムをデバッグするときに、歪みが光源に由来するのかそれとも加熱器に由来するのか識別するために、基準蛍光物質が用いられてよい。すなわち、基準蛍光物質とサンプル物質の両方が示す歪みは、恐らく励起光源の歪みによるものであるが、基準蛍光物質ではなくサンプル物質が示す歪みは、恐らく加熱器の歪みによるものである。このような基準物質は、イメージングシステム１０によって励起して検出することができる任意の蛍光物質であり得る。適切な、限定的でない実例には、Ｓｙｔｏｘ  ｂｌｕｅ、ＣＦＰ、Ａｌｅｘａ  ６４７、Ｃｙ５、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５、または様々な量子ドットが含まれる。さらに、蛍光基準としてマイクロ流体器具のプラスチックも用いられてよい。
【０１００】
一実施形態では、マイクロ流体チップとヒートシンクを結合するのに用いられる接着剤（例えばペンシルバニア州ハットフィールドのＳｕｍｍｅｒｓ  Ｏｐｔｉｃａｌから入手可能なＬｅｎｓ  Ｂｏｎｄ  Ｔｙｐｅ  ＳＫ−９）を基準として用いることができる。
【０１０１】
基準蛍光物質は、温度に依拠するように選択することができる。このような基準蛍光物質を用いて、加熱器の変動を識別して除去することができる。例えば、温度に左右される蛍光強度を有する適切な物質（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、フルオレセインなどのほとんどの染料の蛍光強度は温度に左右される）が選択されたとき、基準染料の蛍光を用いて、加熱器の温度変動を監視することができる。加熱器の温度が変化するとき、基準染料の蛍光強度が温度変化に追従することになる。基準物質が十分な強度および面積を有するとき、基準物質測定からの蛍光信号は十分なＳＮＲを有することになるため、加熱器の温度変動が蛍光強度の変化に反映され得る。このために、特定の実施形態では、基準物質は加熱器に十分近く配置されてよい。温度依存性は、測定下のサンプルと同一でなくてもよい。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、サンプルの蛍光と基準蛍光の両方を測定するのに必要な検出器は１つだけである。
【０１０３】
一実施形態では、熱融解データは、イメージングシステム１１８によって時間の関数として記録される（それらの時間スタンプをファイル名としてＪＰＥＧが保存される）。温度も、温度制御システム１２０により、時間の関数として記録される。これによって、画像対時間データの組および温度対時間データの組といった２つのデータの組が生成される。好ましくは、これら２組のデータは、正確な融解温度を与えるために正確に同期される。
【０１０４】
２つの独立したデータの組を同期させるのに、多くのやり方がある。ＤＳＬＲを用いる一実施形態では、静止画像を得るために、熱融解が始まる直前に、ＰＣからカメラの遠隔撮影の制御ポートに信号を送ることができる。例えば、初期の加熱器信号が送られるのと同時に静止画像信号を送ることができる。したがって、画像と加熱器の両方が同一の開始時刻を有することになる。静止画像が取得される時間は、ＰＣ時間（温度時間）およびカメラのライブビュー画像のタイムスタンプの両方と既知の関係があるので、温度と画像は、場合によっては３０ミリ秒未満の分解能で同期させることができる。
【０１０５】
均一な対象を画像化するとき、通常、画像は理想的に均一なものではない。中心は縁端部より高い強度を有するはずである。融解データをより優れたものにするために、マイクロ流体チップは、融解ゾーン１３２（ここで熱融解が起こる）が画像の中心にできるだけ接近するように移動され得る。
【０１０６】
本発明の態様は、制御および計算のハードウェア構成要素、ユーザが作成したソフトウェア、データ入力構成要素、およびデータ出力構成要素によって実現される。ハードウェア構成要素は、１つまたは複数の入力値を受け取り、入力値を操作して、または入力値に作用して、１つまたは複数の出力値を出力するための命令を与える、固定機械可読媒体に記憶された１つまたは複数のアルゴリズム（例えばソフトウェア）を実行することによって計算および／または制御のステップを遂げるように構成された主コントローラ１３０など、マイクロプロセッサおよびコンピュータなど、計算および制御のモジュールを含む。このような出力は、例えば表示デバイス１３２に表示されてよく、そうでなければ、ユーザに対して、例えば機器の状態またはそれによって遂行されているプロセスに関する情報といった情報を提供するために、ユーザに示されてよく、あるいは、このような出力は、他のプロセスおよび／または制御アルゴリズムに対する入力を含んでよい。データ入力構成要素が備える要素により、制御および計算のハードウェア構成要素が用いるデータが入力される。このようなデータ入力は、位置センサーおよび電動機エンコーダと、キーボード、タッチスクリーン、マイクロホン、スイッチ、手動操作スキャナなどといったユーザ入力デバイス１３４による手動入力要素とを含んでよい。データ出力構成要素は、ハードドライブまたは他の記憶媒体、モニタ、プリンタ、表示灯、または可聴信号要素（例えばブザー、警笛、ベルなど）を備えてよい。ソフトウェアは、固定コンピュータ可読媒体に記憶された命令を含み、制御および計算のハードウェアは、これらの命令を実行することにより、１つまたは複数の自動プロセスまたは半自動プロセスを遂行する。
【０１０７】
本発明の実施形態が、上記で図面を参照しながら十分に説明されてきた。本発明が、特徴の様々な組合せおよび副次的組合せを含む特定の例示的実施形態を参照しながら、かなり詳細に説明され、示されてきたが、当業者なら、他の実施形態および変形形態および変更形態が本発明の範囲内に包含されるものと容易に理解するであろう。そのうえ、このような実施形態、組合せ、および副次的組合せの説明は、本発明が、特許請求の範囲で明白に列挙されたもの以外の特徴または特徴の組合せを必要とすると示唆するようには意図されていない。したがって、本発明は、以下の添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲内に包含されるすべての変更形態および変形形態を含むものと認められる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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