(57)【要約】本発明はプロテアーゼ活性を検出するための細胞に基づくアッセイを提供する。このアッセイにおいては、この好ましくはそのＣ末端に少なくとも１つのラベルを有するプロテアーゼ基質を発現するように細胞が遺伝子操作される。それを識別するプロテアーゼによる前記基質の切断はC末端フラグメントとＮ末端フラグメントをもたらし、前記ラベルを有するフラグメントはユビキチン・プロテアソームによる分解を受ける。このアッセイはそれが取り付いたフラグメントの分解によるラベルの消失を測定する。プロテアーゼ活性を検出するための細胞を含まないアッセイについても開示されている。この細胞を含まないアッセイにおいては、前記フラグメントの分解に関するユビキチン・プロテアソーム経路の諸要素を含む溶液内で、前記のプロテアーゼ基質が発現される。このアッセイでは、そのプロテアーゼによる切断から生じたフラグメントに付着したラベルの消失が測定される。【選択図】  図１
2013534415.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ボツリヌス神経毒素（BoNT）の活性を評価するための細胞に基づくアッセイにおいて、
遺伝子組み換え細胞を提供するステップであって、前記遺伝子組み換え細胞はBoNT基質を発現し、前記基質はそのＣ末端にラベルを含んでおり、前記BoNT基質は、BoNTによって切断されると、Ｎ末端フラグメントとＣ末端フラグメントを生成し、前記Ｃ末端フラグメントは、前記遺伝子組み換え細胞のユビキチン・プロテアソーム経路によって分解されることを特徴とするステップと、
BoNTの存在下で前記細胞内のラベルの発現を測定するステップと、
を含んでいる、細胞に基づくアッセイ。
【請求項２】
前記Ｎ末端フラグメントがＮ末端ラベルを含んでおり、前記測定ステップがＣ末端ラベルとＮ末端ラベルとの比率を比較するステップを含んでいることを特徴とする、請求項１記載の細胞に基づくアッセイ。
【請求項３】
前記BoNTが前記遺伝子組み換え細胞の細胞膜を通じて移送されることを特徴とする、請求項１記載の細胞に基づくアッセイ。
【請求項４】
前記遺伝子組み換え細胞が、前記BoNTを発現するためのベクターをさらに含んでいることを特徴とする、請求項１記載の細胞に基づくアッセイ。
【請求項５】
前記BoNTの発現が誘導性プロモータによって制御されることを特徴とする、請求項４記載の細胞に基づくアッセイ。
【請求項６】
前記BoNT基質が、25kDのシナプトソーム関連タンパク質(SNAP-25)、SNAP-25 アイソフォーム、小胞関連膜タンパク質(VAMP)、VAMPアイソフォーム、及びこれらと少なくとも80％の類似性を有しており、かつ、前記プロテアーゼによって認識される切断配列を有しているペプチドで構成される群から選択されることを特徴とする、請求項１記載の細胞に基づくアッセイ。
【請求項７】
前記BoNT基質が、SNAP-25、SNAP-25アイソフォーム、またはSNAP-25に対して少なくとも80％の類似性を有しており、BoNT/LC Aによって認識される切断配列を有しており、かつ、切断によって分解性のフラグメントがもたらされるBoNT/LC Aが前記BoNTであることを特徴とする、請求項１記載の細胞に基づくアッセイ。
【請求項８】
前記ペプチドが、VAMP、VAMPアイソフォーム、またはVAMPに対して少なくとも80％の類似性を有しており、BoNT/LC B、BoNT/LC D、またはBoNT/LC Ｆによって認識される切断配列を有しており、かつ、切断によって分解性のフラグメントがもたらされるBoNT/LC B、BoNT/LC D、BoNT/LC Fで構成される群から前記BoNTが選択されることを特徴とする、請求項１記載の細胞に基づくアッセイ。
【請求項９】
前記ラベルが、黄色蛍光タンパク質(YFP)、青色蛍光タンパク質（BFP）、緑色蛍光タンパク質(GFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)、及びそれらの蛍光性変異種で構成される群から選択されることを特徴とする、請求項1記載の細胞に基づくアッセイ。
【請求項１０】
前記ラベルが、ホタル・ルシフェラーゼ、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ及びガウシア・ルシフェラーゼで構成される群から選択される発光性ペプチドであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｎ末端ラベルとＣ末端フラグメントのラベルがFRETペアであることを特徴とする、請求項1記載の細胞に基づくアッセイ。
【請求項１２】
２つのプロテアーゼを区別して識別するための細胞に基づくアッセイにおいて、
遺伝子組み換え細胞を提供するステップで、前記遺伝子組み換え細胞は、第１のプロテアーゼによって第１の箇所で切断されて、第１のＣ末端フラグメント及び第１のＮ末端フラグメントを生成するプロテアーゼ基質を発現するベクターを有しており、かつ、前記Ｃ末端フラグメントは、前記遺伝子組み換え細胞のユビキチン・プロテアソーム経路によって分解される可能性があり、前記プロテアーゼ基質は、第２のプロテアーゼによって第２の箇所でも切断されて、第２のＣ末端フラグメントと第２のＮ末端フラグメントを生成し、かつ、前記第２のＣ末端フラグメントは、前記ユビキチン・プロテアソーム経路によっては分解されないことを特徴とするステップと、
前記プロテアーゼ基質を発現する前記遺伝子組み換え細胞を前記第１のプロテアーゼと接触させて前記ラベルの存在を測定するステップと、
前記プロテアーゼ基質を発現する前記遺伝子組み換え細胞を前記第２のプロテアーゼと接触させて、前記ラベルの存在を測定するステップと、そして、
前記第１のプロテアーゼとの接触後のラベルの存在と前記第２のプロテアーゼとの接触後の前記ラベルの存在との違いを比較するステップ、とで構成される細胞に基づくアッセイ。
【請求項１３】
前記２つのプロテアーゼがBoNT/LC AとBoNT/LC Eであり、前記プロテアーゼ基質がSNAP-25であることを特徴とする、請求項１２記載の細胞に基づくアッセイ。
【請求項１４】
１つ以上の遺伝子操作された細胞を有するサンプルを未同定のプロテアーゼを含むサンプルと接触させ、前記細胞内のラベルの分解を測定することによって前記未同定のプロテアーゼを同定するステップをさらに含む、請求項１２記載の細胞に基づくアッセイ。
【請求項１５】
前記接触ステップが、前記遺伝子組み換え細胞をサンプル中の前記プロテアーゼに曝露させるか、または、ベクターから前記細胞中に前記プロテアーゼの生成を誘導するステップを含んでいることを特徴とする、請求項１２記載の細胞に基づくアッセイ。
【請求項１６】
ボツリヌス神経毒素(BoNT)抑制因子を同定する方法において、
遺伝子組み換え細胞を提供するステップで、前記遺伝子組み換え細胞がBoNTを発現するベクターであって、BoNTによって切断されると、ラベルを有する分解性C末端フラグメントを生成するBoNT基質を発現するベクターを含むことを特徴とするステップと、
前記BoNT及びBoNT基質を発現するステップと、
前記遺伝子組み換え細胞をテスト用分子と接触させるステップと、
前記ラベルの存在を測定するステップと、前記ラベルの信号の増大がBoNT抑制を示すステップを含んでいることを特徴とする方法。
【請求項１７】
さらに、前記ユビキチン・プロテアソーム経路抑制に関してテスト用分子をスクリーニングするステップを含んでいる、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記BoNT基質が、SNAP-25、SNAP-25アイソフォーム、またはSNAP-25と80％の類似性を有しており、BoNT/LC Aによって認識される切断配列を有しており、かつ、前記切断によって分解性のフラグメントがもたらされるBoNT/LC Aが前記BoNTであることを特徴とする、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
前記ペプチドが、VAMP、VAMPアイソフォーム、またはVAMPと80％の類似性を有しており、BoNT/LC B、BoNT/LC D、またはBoNT Fによって認識される切断配列を有しており、かつ、前記切断によって分解性のフラグメントがもたらされるBoNT/LC B、BoNT/LC D、BoNT/LC Fで構成される群から前記BoNTが選択されることを特徴とする、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
前記ラベルが、ホタル・ルシフェラーゼ、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ、及びガウシア・ルシフェラーゼで構成される群から選択されることを特徴とする、請求項１６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的にはプロテアソームによる分解の影響を受けやすいボツリヌス毒素(BoNT)基質Ｃ末端ペプチド・フラグメントに関するものである。より具体的には、本発明はBoNTＣ末端ペプチド・フラグメントを、BoNTの活性の測定とBoNT抑制因子の同定、診断テスト、Ｎ末端ルール分解の影響を受けるＣ末端マーカーの分解を追跡することによる環境サンプル内でのプロテアーゼの相互作用あるいは存在を調べるために用いる方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ボツリヌス神経毒素（BoNT）は現在知られている最も強力な自然の毒素である（１，２）。これらには神経筋接合部での接合部前部末端からのアセチルコリン放出を阻止し、それによって弛緩性麻痺を引き起こす７つの異なったBoNTの血清型（Ａ−Ｇ）が含まれている（２、３）。BoNTのこれら７つの血清型の配列はこの分野ではよく知られている。BoNTはジスルフィド結合によって100kDの重鎖に結合されている50kDの触媒性軽鎖（ＬＣ）を含む亜鉛金属プロテアーゼである（４）。BoNTはそれらの軽鎖が接合部前部で標的とするタンパク質の１つを切断するとシナプス伝達を一時的そして可逆的に抑止する。これらのタンパク質には25kDのシナプトソーム関連タンパク質（SNAP25）、小胞関連膜タンパク質（VAMP）、及びシンタキシンなどがある（４）。BoNT基質の配列はよく知られている。しかしながら、筋肉麻痺の継続時間は血清型によって違っている。BoNT/AとBoNT/Eは両方ともSNAP25を標的とする。BoNT/Aによって発生する筋肉麻痺の継続時間は数か月間続く場合があるのに対して、BoNT/Eの影響は比較的短期間である（５）。
【発明の概要】
【０００３】
本発明の目的は、ボツリヌス神経毒素(BoNT)の活性を評価するための細胞に基づくアッセイを提供することである。このアッセイはそのＣ末端にラベルを有するBoNT基質を発現する遺伝子組み換え細胞を提供するステップを含んでいる。このBoNT基質はBoNTによる切断の結果としてN末端フラグメント及びC末端フラグメントを発生させる。C末端フラグメントはそのユビキチン・プロテアソーム経路によって分解される。このアッセイの最後のステップはBoNT存在下でのその細胞内での前記ラベルの発現の測定である。本発明のいくつかの実施の形態では、BoNTはその細胞の膜を通じて移送される。他の実施の形態では、BoNTはその細胞内のベクターによって発現される。
【０００４】
本発明のさらに別の目的は、２つのBoNT間の相違を見分けるための細胞に基づくアッセイを提供することでN末端フラグメントを発生する第1のプロテアーゼによる第1の箇所で切断されるプロテアーゼ基質を発現するベクターを含む遺伝子組み換え細胞を提供することを内容としており、前記C末端フラグメントはその遺伝子組み換え細胞のユビキチン・プロテアソーム経路によって分解される。このプロテアーゼ基質は第2のC末端フラグメントと第2のN末端フラグメントを発生する第2のプロテアーゼによって第2の箇所でも切断されるが、前記第2のC末端フラグメントはユビキチン・プロテアソーム経路によっては分解されない。この遺伝子組み換え細胞は次に前記第1のプロテアーゼと接触させられて、そのラベルの測定が行われる。この細胞はさらに次に前記第2のプロテアーゼと接触させられて、そのラベルが測定される。１つのプロテアーゼを有するラベルと前記第２のプロテアーゼを有するラベルも存在を比較して、その基質を認識するプロテアーゼの活性を判定する。
【０００５】
ボツリヌス毒素（BoNT）活性を評価する方法。この方法における第1のステップは、そのBoNT基質のC末端にラベルを有しているBoNT基質を提供することである。第2のステップで、このBoNT基質を、ペプチドを分解させることができるユビキチン・プロテアソームの諸成分を含む無細胞溶液から選択される溶液か、あるいは細胞による溶液に入れられて、前記ペプチドがユビキチン・プロテアソームの機能的諸成分を含む細胞の内部に発現される。このBoNT基質はその後少なくとも２つのフラグメントに切断され、その少なくとも２つのフラグメントのうちの少なくとも１つは前記ラベルを含んでいてユビキチン・プロテアソームの成分による分解を受ける。この方法の最後のステップで、そのラベルを含んでいるフラグメントの分解によるそのラベルからの信号のロスが測定される。
【０００６】
請求項１６の方法では、BoNT基質は、25kDのシナプソーム関連タンパク質（SNAP-25 ）、SNAP-25 アイソフォーム、小胞関連膜タンパク質（VAMP）、VAMPアイソフォーム、そして前記組成物と少なくとも８０％の類似性を有し、そのプロテアーゼによって認識され切断箇所を有するペプチドで構成される群から選択される。
【０００７】
本発明の別の目的は、ボツリヌス神経毒素（BoNT）抑制因子を同定するための方法である。この方法の第1のステップは、BoNTを発現するベクターと、BoNTによる切断が発生した場合に、ラベルを有する分解性のC末端フラグメントを生成するBoNT基質である。この方法の第2のステップは、BoNT及びBoNT基質を発現させることである。第3のステップは前記遺伝子組み換え細胞をテスト用分子と接触させることである。第4のステップは前記第1と第2のラベルの存在を測定することである。そのラベルからの信号が増大していれば、それはBoNTの抑制を示している。
【０００８】
当業者であれば、本発明が提供する多数の利点は、以下の図面を参照することによって容易に理解できるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明の１つの実施の形態における、ルシフェラーゼでラベルされたC末端を有し、N末端ルール分解を受けたSNAP-25を示す実験結果を示している。
【図２】図2は、CFPでラベルされたC末端を有しているSNAP-25を示す実験結果を示している。
【図３】図３はSNAP-25C末端フラグメントがBoNT/LC-Aによる切断後に分解することを示す実験結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の１つの具体的な実施の形態に関する以下の説明は人が本発明を実施できるようにするためのもので、本発明の好ましい実施の形態を限定することは意図していない。当業者であれば、本発明と同じ目的を達成するために本発明を修正したり、他の方法を設計するための根拠としてここに開示されている概念と具体的な実施の形態を容易に用いることができるであろう。当業者であれば、同じようなアセンブリが広い意味での本発明の精神と範囲から逸脱しないことも分かるであろう。
【００１１】
本願で用いられる「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」という用語はこの技術分野ではよく理解されており、入れかえも可能である。本発明のいつくかの実施の形態は、当業者がよく理解しているようなペプチド及びそうしたペプチドの変種に関係している。当業者であれば、本発明のいくつかの実施の形態が本明細書に開示されている特定のペプチド配列及びそうしたフラグメントの変種、そして開示されているペプチド配列と類似物及び/又は誘導物に関係するものであることは容易に分かるであろう。特定のペプチド配列変種は少なくとも１つの生物学的機能あるいはその特殊なタンパク質配列の活性を有していることが好ましい。
【００１２】
これらペプチドの変種は、(i) 1つ以上のアミノ酸残基が保存あるいは非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）と置換されており、それらの置換されたアミノ酸残基がその遺伝子配列によってコードされた場合とコードされていない場合があるもの、(ii) １つ以上のアミノ酸残基、例えば置換基の取り付けによって修正されている残基、(iii) 本発明のペプチドの交互スプライシングであるもの、(iv) それらペプチドのフラグメント及び又は(iv) ポリペプチドが以下に説明するような別のポリペプチド、例えば、GFPかルシフェラーゼと融合しているもの、などであってよい。それらの変種には、最初の配列のタンパク質分解による切断（複数の箇所でのタンパク質分解を含む）を介して発生されるペプチドも含まれる。これらの変種は翻訳後に、あるいは化学的に修飾されたものであってもよい。そうした変種のいずれも当業者によって本発明の範囲内にあるとみなされるものである。
【００１３】
この分野で知られているように、２つのペプチドの「類似性」とは、Davydovら（特許7,608,682）が述べているように、アミノ酸及びその保存されているアミノ酸残基と第２のペプチドとの比較によって決められる。前記特許はここで触れたので、その全体が本明細書に組み入れられる。変種は最初の配列とは違ったペプチド配列、好ましくは問題の箇所の残基の４０％未満、より好ましくは問題の箇所の残基の２５％未満、より好ましくは問題の箇所の残基の１０％未満、最も好ましくは問題の箇所あたりに数個の残基だけが違っており、同時に最初の配列の機能性を保持し、あるいはＮ末端ルール経路を介してユビキチル化する点では元の配列と同じであるペプチド配列を含むものと定義される。本発明はここで述べられているアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、９０％、あるいは９５％の類似性あるいは同一性を示すタンパク質配列を含んでいる。種々のプロテアーゼによって認識される好ましい箇所も本発明の範囲内にある。こうした部分はプロテアーゼにより認識され切断されるアミノ酸残基を少なくとも１０、２５、５０、１００、１５０、あるいは２００個含んでいる。当業者であれば、本発明がここで述べられている基質の変種を含み、それらがＮ末端ルールユビキチル化経路によって分解される場合があることは理解できるであろう。
【００１４】
本発明の他の実施の形態は、これらのペプチド（あるいはその変種）と１つ以上の生物学的経路のその他の成分との相互作用による生成物に関係している。さらに別の実施の形態は、これらのペプチド、ペプチドの変種、あるいはそれらペプチドと相互作用する酵素を調整し、抑制し、あるいは増強する生物学的活性を有する物質を識別する方法に関係している。これらのペプチドは医薬品組成物におけるこれら活性物質の使用とも関係している。本発明の他の実施の形態は、これらのペプチド、その関連する生物学的活性、あるいはそれらのペプチドと相互作用する酵素やプロテアーゼの測定を伴う診断方法に関係している。さらに、本発明の他の実施の形態は、以下に述べる方法の実行に役立つ試薬、キット、あるいはアッセイ用組成物に関係している。
【００１５】
本発明の１つの実施の形態において、本出願人はＮ末端ルールに従うプロテアーゼのペプチド基質を同定した。本願では、分解を示すペプチド残基はＮデグロンと称する。分解を促進する残基は「不安定性」残基と称され、分解を促進しない残基は「安定性」残基と呼ばれる。従って、Ｎデグロンはペプチド・フラグメントにおいては「不安定」である。本出願人らは細胞内のユビキチン・プロテアソーム経路によって分解される種々のプロテアーゼ・フラグメントを同定している。
【００１６】
本発明のいくつかの実施の形態で示されているように、プロテアーゼはそのペプチド基質をそれぞれ新しいＮ末端と新しいＣ末端を有する２つのフラグメントに切断する。Ｃ末端フラグメントはユビキチン分解経路によってＮ末端ルール分解を受ける。本願で述べられているように、ペプチド基質とは特定のプロテアーゼが識別して２つ以上のフラグメントに切断し、そのうちの少なくとも１つがＮデグロンを有していて細胞のユビキチン・プロテアソーム系によって分解されることを意味する。そのプロテアーゼが３つ以上のフラグメントを発生させたら、そうしたフラグメントの少なくとも１つがＮデグロンを含んでいると考えられる。
【００１７】
本発明の１つの実施の形態で、プロテアーゼのペプチド基質がそのＣ末端にタグあるいはラベルを有している。『タグ』、『ラベル』、あるいは『インジケータ』という用語は本願においては同じ意味で用いられており、ペプチドに取り付けられてサンプル中のペプチドあるいはペプチド・フラグメントの検出を可能にしてくれるレポーター分子である。本発明のいくつかの実施の形態で用いられるラベルは放射性同位元素、蛍光性［蛍光偏光、黄色蛍光性タンパク質（YFP）、青色蛍光性タンパク質（BFP）、緑色蛍光性タンパク質(GFP)、赤色蛍光性タンパク質(RFP)、及びそれらの蛍光発光突然変種などを含む］、燐光性、発光性［ホタル、ウミシイタケ、ガウシア（海洋生物）ルシフェラーゼなどを含む］、化学発光性及び/又は電気化学発光性（ECL）化合物、酵素、あるいは好ましくはラベルされた結合相手［例えば、ビオチン、ストレプトアビジン、エピトープ・タグ、親和性タグ（His6など）、フレウオレセイン、ハプテン、免疫源、GST及び/又はGFPなど］を含んでいてもよく、これらの物質はこの技術分野ではよく知られている。プロテアーゼ基質のＣ末端にラベリングを行うと、ラベルされた分解する可能性のあるフラグメントが発生する。本発明のさらなる実施の形態においては、プロテアーゼ基質はそのＮ末端に１つのラベルを有しており、そのＣ末端に第２のラベルを有している。それぞれの末端のこれらラベルはサンプル中での各フラグメントの存在を判定するために用いられる。
【００１８】
FRETペアもペプチド基質用のラベルとして使用できる。FRETアッセイはラベルされたペプチドの各末端上のラベル間の近接性に依存している。この方法はペプチド基質の切断及び２つのラベルの分離から生じる信号の変化に基づいている。従来のFRETアッセイは、切断されたフラグメントが溶液中あるいは混合物中に残留していて、誤った否定的結果に導いてしまうことが時々ある。切断されたフラグメントの両方が溶液混合物内に残留して相互作用を続けると、切断が起きていなかったように見える結果をもたらす場合が時々ある。本願で述べられているような、それらフラグメントのうちの１つのＮ末端ルール分解は、FRETペアのうちの１つの構成要素を完全に取り除いてしまうことでこの問題を解決し、正確な結果をもたらす。
【００１９】
本発明の１つの実施の形態においては、プロテアーゼ基質に対して特異性を示すプロテアーゼの存在あるいはその活性のレベルを測定するための方法が述べられている。この方法の第１のステップでは、そのプロテアーゼによって切断されたフラグメントの一方を分解させることができる混合物内にプロテアーゼ基質が入れられる。この方法の第２のステップで、１つのプロテアーゼがその混合物に加えられる。第３のステップで、そのラベルの存在が測定される。別の実施の形態においては、そのプロテアーゼを混合物に加える前に、ラベルの存在についての測定が行われる。さらに別の実施の形態においては、プロテアーゼ基質はそのＮ末端とＣ末端のそれぞれにラベルを有している。この別の実施の形態の第２のステップにおいては、プロテアーゼがその混合物に加えられてから、第３のステップで、Ｎ末端ラベルとＣ末端ラベルの存在の違いについての測定が行われる。
【００２０】
ラベルの存在を測定する方法はこの技術分野ではよく理解されている。放射性同位元素ラベルを用いる場合は、例えば、細胞溶解物をゲル中で流動させ、その放射能ラベルがそのラベルされた標的が位置する帯域を示してくれる。こうした例においては、比較対象と比較した場合のその帯域の欠如がそのラベルの喪失を示す。他の例では、そのラベルに対して特異性を示す抗体を使ったウェスターン・ブロットが用いられる。この場合も比較対象と比較してウェスターン・ブロット内での１つの帯域が消滅した場合に、そのフラグメントの分解が示される。一方、生きた細胞を用いたアッセイでは、生体発光性、蛍光性、及びその他のラベルを用いてリアル・タイムでラベルの存在の評価が行われる。この生きた細胞を用いたアッセイでは、本願においては、ラベルはプロテアーゼがその基質に働きかける前に蛍光顕微鏡で測定される。異なった時間でそれらの細胞を評価することで、そのラベルが発現されたかどうか、それが一定の時間後にも発現され続けるかどうかが判定される。例えば、プロテアーゼの発現がない比較対象ではそのラベルが２４時間後も存在し続ける。一方、そのプロテアーゼが発現されるか、その基質との相互作用ができるようにされると、その蛍光性ラベルはもはや存在しない。しかし、ラベルの存在の測定の他の例ではルシフェラーゼの活性を測定するためにルミノメータが用いられる。当業者であれば、混合物内でのラベルの存在を測定するための他の手段があること、及びそうした方法も本発明の範囲内にあることは容易に理解できるであろう。
【００２１】
本発明のさらに別の実施の形態においては、Davydovら（特許第7,608,682）が述べているウサギ網状赤血球溶解物とRNAポリメラーゼ（SP6あるいはT7）を含んでいる転写−翻訳反応混合物内で、プラスミドDNAから、ラベルされたプロテアーゼ基質がつくりだされる。このペプチド基質はそのペプチド基質に特異性を示すプロテアーゼが存在していない場合に産出される。１つの別の実施の形態においては、そのプロテアーゼが上記混合物に加えられて、そして、ラベルの存在が測定される。さらに別の実施の形態では、プロテアーゼが加えられる前にラベルの存在が測定あるいは同定され、プロテアーゼが加えられた後のラベルの存在の減少度が測定される。この方法の別の実施の形態においては、２つのラベルが用いられ、分解するフラグメント内のラベルのＮ末端フラグメントのラベルとの相対的な変化を測定して、そのプロテアーゼの活性が判定される。
【００２２】
本発明のさらに別の実施の形態においては、サンプル中の標的プロテアーゼの存在を判定するために、上に述べた方法が用いられる。例えば、毒性プロテアーゼに対する露出が疑われる場所での環境性サンプルをテストするために、その方法が用いられる。そうした実施の形態においては、上に述べたペプチド基質がそのラベル信号がすでに測定されている多重ウェル・アレイ内に入れられる。次に、サンプルを各ウェルに加えて、分解性フラグメントの消失が測定される。別の方法ではそのプロテアーゼ基質のＮ末端内とＣ末端でのラベルの違いが測定される。Ｎ末端ラベルのＣ末端ラベルに対する違いが増大すると、そのプロテアーゼの活性が示される。
【００２３】
上に述べた方法のさらに別の実施の形態は、プロテアーゼ抑制因子を識別するために用いられる。この方法は、ラベルされたプロテアーゼ基質を、Ｎ末端分解性フラグメントを分解させることができる混合物に入れる第１のステップを含んでいる。第２のステップで、プロテアーゼ抑制因子あるいはライブラリをその混合物に加える。第３のステップで、単一ラベル化あるいは二重ラベル化した基質に関してフラグメントの分解が上に述べたような方法で評価される。第４のステップで、この技術分野でよく知られている方法でプロテアーゼ抑制活性に関してポジティブな結果がスクリーニングされる。そのプロテアソームを抑制しない結果はBoNT抑制因子の存在を示している。例として言えば、その標的抑制因子は特定のラベルを有するプロテアソーム基質を分解させる細胞系を用いてスクリーニングすることができる。そうした抑制因子の例の１つはGFP-CL-1で、その抑制因子がそのプロテアソーム経路に作用すると、そのGFP-CL-1の信号が保持される。
【００２４】
別の実施の形態で、プロテアソーム抑制因子を識別するためにその方法が用いられる。プロテアーゼ抑制因子をユビキチン・プロテアソーム経路抑制因子と区別するために、プロテアーゼとプロテアーゼ基質の存在下と、そのプロテアーゼによる切断作用を受けないユビキチン・プロテアソーム感作性基質の存在下で、候補となる抑制因子をテストする。非限定的な例として言えば、その抑制因子はBoNT/LC A及び以下に述べるSNAP-25構成物の存在下とユビキチン・プロテアソーム・ペプチド・マーカーGFP-CL-1の存在下でテストされる。その抑制因子がBoNT/LC Aに対して特異性を示す場合は、SNAP-25構成物は切断されず、そのラベル信号が一定の状態のままである。他方、GFP-CL-1構成物に関するラベル信号は、プロテアソームによって分解されるので消失するであろう。その他のユビキチン・プロテアソーム・マーカーにはGFP-CL 1UbG76V-GFP、Ub-R-GFPなどがある。当業者であれば、ラベルはGFP、β‐ガラクトシダーゼ、及びルシフェラーゼで構成される群から選択できることは分かるであろう。
【００２５】
本発明のさらに別の実施の形態は標的プロテアーゼを細胞質内に移入できる遺伝子加工した細胞系を提供する。この細胞系は、そのＣ末端にラベルを有するプロテアーゼのペプチド基質を発現する。そのペプチド基質を発現するのに適した細胞系としては、HEK293、CHO、BHK、HeLa、COS、及びNeuro2A、M17 、PC１２、N18などの神経芽腫細胞などがある。当業者であれば、ここに述べられているプラスミドの発現を可能にしてくれる他の細胞タイプも本発明の範囲内であることは容易に分かるであろう。同様に、１つのプロテアーゼを認識してそれを細胞膜を通じて移送してその細胞内で発現されているプロテアーゼ基質を切断できるようにする細胞タイプが本発明の範囲内にあることは分かるであろう。
【００２６】
さらに別の実施の形態では、このペプチド基質はそのＣ末端及びＮ末端の両方にラベルを含んでいる。このペプチド基質は生体発光、化学発光、蛍光、あるいは上に述べたような技術分野の当業者が知っているその他の方法での測定を可能にしてくれる。
【００２７】
本発明の１つの実施の形態で、プロテアーゼがない場合にそのラベルを測定可能にしてくれるペプチド基質を構成的に発現できるように、細胞株が遺伝子操作される。別の実施の形態で、ペプチド基質発現はこの技術分野の当業者が理解しているような方法で調整される。１つの非限定的な例で、そのペプチドが誘導性ベクターによって細胞内に誘導される。この誘導性ベクターは、誘導因子が存在している場合にのみ、そのペプチドを発現する。そうした誘導性ベクターはこの技術分野ではよく知られている。ペプチド基質が一度発現されると、細胞はそのペプチド・ラベルの測定を可能に出来るような安定した発現状態に達することができ、その遺伝子組み換え細胞を用いて、その基質を特異的に切断するプロテアーゼの活性をテストする。
【００２８】
本発明による方法の１つの実施の形態で、上記標的プロテアーゼがその遺伝子操作された細胞に提供され、そのペプチド基質信号に対するその影響が測定される。そのプロテアーゼ基質が単一のラベルを有しているような本発明の１つの実施の形態で、上に述べたような安定状態が達成された後、その信号の減少が測定される場合がある。ラベルの減少レベルが活性を有するプロテアーゼの存在を示している。別の実施の形態では、そのペプチド基質が２つのラベルを含んでいる場合、Ｎ末端ラベルのＣ末端ラベルに対する比率の違いが測定される。Ｃ末端ラベルのＮ末端ラベルに対する比率の減少は、そのプロテアーゼの活性を示している。さらに別の実施の形態で、特定のプロテアーゼの存在に関して環境性サンプルをテストするために、その細胞系が用いられる。
【００２９】
別の実施の形態で、プロテアーゼを細胞質内に移送できる細胞が提供される。この細胞は、そのプロテアーゼに対するペプチド基質を誘導するベクターでトランスフェクトされる。このベクターは、そのプロテアーゼで切断されてＮ末端フラグメントとＣ末端フラグメントをもたらすペプチド基質を発現する。上に述べたペプチド基質はＮ末端フラグメントとＣ末端フラグメント上にラベルを有している。このプロテアーゼが前記ペプチド基質を切断すると、そのフラグメントの１つが分解される。Ｃ末端ラベルのＮ末端ラベルの比率はそのプロテアーゼの活性を示している。
【００３０】
本発明の１つの実施の形態で、同じ基質を２つの異なった領域で切断する２つのプロテアーゼの活性が測定され、この場合、２つの部分のうちの一方がＮ末端ルール分解の影響を受ける。こうした実施の形態においては、信号の喪失が分解性のフラグメントを発生させるプロテアーゼの存在を示している。そのペプチド基質が切断箇所で分離されるFRETペアによってラベルされていれば、それら２つのプロテアーゼ間の違いの結果を比較することも可能である。従来のFRETアッセイではこれら２つのプロテアーゼを区別することができないが、本願で述べられているＮ末端ルール方法ではそれが可能である。分解性フラグメントの分解による信号の喪失はFRETペアの各成分を分離するペプチド基質の単純な切断と比較して信号のより大きな変化を示す。さらに別の実施の形態では、Ｃ末端ラベルのＮ末端ラベルに対する公知の比較対象比率と比較した場合に、Ｃ末端ラベルのＮ末端ラベルに対する比率が低下することで、そのプロテアーゼの特異性が確認される。
【００３１】
本発明の前記の実施の形態の１つの重要な利点は、プロテアーゼによる特異的な切断による細胞規定システムにおける信号の喪失を、そうした細胞の死など他の要因による信号の喪失と区別することが可能な点である。
【００３２】
本発明のさらに別の実施の形態においては、プロテアーゼ抑制因子を識別する方法が提供される。この方法の第１のステップで、そのアッセイを実行するための細胞系が提供される。その細胞を遺伝子操作して、そのＣ末端に１つのラベルを有していて、ユビキチン・プロテアソーム経路を介しての分解を受けるペプチド基質を発現させる。この細胞をさらに遺伝子操作して、ラベルされユビキチン・プロテアソーム経路を介しての分解を受けるが、そのプロテアーゼの基質ではない第２のペプチドを発現する。この方法の第２のステップで、プロテアーゼ抑制因子の候補組成物をその細胞と接触させる。その抑制因子のサイズに応じて、その細胞内に受動的に組み込まれる場合もあるし、能動的に組み込まれる場合もある。その方法の第３のステップで、上記第１のペプチドと上記第２のペプチドからのラベルの発現が測定される。プロテアーゼ基質ラベルの存在は、その抑制因子が特異的にそのプロテアーゼを抑制することを示すだけである。
【００３３】
本出願人らは、BoNT/LC AがSNAP-25(6)を切断して分解性のフラグメントを発生させることを示した。小胞関連膜タンパク質（VAMP、シナプトブレビンとも呼ばれ、その配列はGebBank:CAA88760; NCBI基準配列：NP−005047で見ることができる）はBoNT/LC B、BoNT/LC F、及びテタヌス毒素（６）によって切断され、分解性のフラグメントを発生させる。第３のBoNT基質はシンタキシン１で、これはBoNT C1で切断されるが、この切断は分解性の基質は発生させない。出願人らの観察によれば、BoNT/LC EはSNAP-25を切断するが、それは分解性のフラグメントを発生させない。
【００３４】
SNAP-25あるいはVAMPの全配列を含むペプチドは、本発明の１つの実施の形態では4、分解性のフラグメントを発生させる。SNAP-25あるいはVAMP、及びSNAP-25あるいはVAMPの変種のフラグメントも分解性フラグメントを発生させるが、種々のBoNT/LCによって認識されるSNAP-25あるいはVAMP内の切断配列は変化しない場合もある。そうした変種はSNAP-25あるいはVAMPのアイソフォーム（同遺伝子系）、それに種々のプロテアーゼによって認識される切断配列を有する公知のSNAP-25あるいはVAMPペプチドに対して80％の類似性を有するその他のペプチドなどである。
【００３５】
本出願人らは、BoNT/AによるSNAP-25の切断に続いて、細胞内のSNAP-25 P9 Ｃ末端の完全な分解が起きることを実証した。さらに、本出願人らはBoNT/Aによる切断によって発生するＣ末端フラグメントが急速に分解することを示した。BoNT/Aが存在する場合と存在しない場合のＮ末端フラグメントの免疫蛍光から対応するＣ末端フラグメントのそれへの変化がプロテアーゼの活性を示している。BoNT/Aによる切断で発生するP9フラグメントは急速に分解されて、細胞内で有意なレベルまで蓄積されることはあり得ないと考えられる。
【００３６】
出願人らはBoNT/LC Aによる切断後にSNAP-25のＣ末端が他の構成物内で完全に分解されることも実証した。図３に示すように、例えば、SBP-CFP-SNAP25-Venus-BD-NFkB及びBoNT/LC Aプラスミドによって共トランスフェクトされた293FT細胞の蛍光顕微鏡写真は、Venus蛍光タンパク質を含むＣ末端フラグメントが切断後に分解されることを示している。図３(a)はCFPを含むＮ末端フラグメントが24時間後に存在していることを示している。図３(b)はVenus YFPを含むＣ末端フラグメントでは信号分解が起きないことを示している。さらに、図３(c)は、CFP-SNAP-25-VENUS-BD-NFkBペプチド（Oyler et al., 米国特許出願第12/962,610参照。この特許は参照することによりその全体が本明細書に組み入れられる）が切断されることを示している。レーン３はその構成物を125kDa帯域で示しており、レーン４は切断後に57kDaフラグメントを示しているだけで、これはSNAP-25のＮ末端フラグメントに対応する。
【００３７】
結果
図１aに示されているように、SNAP-25はBoNT/A及びBoNT/Eからのタンパク質分解性フラグメントをもたらす。図１(b)はBoNT/A及びBoNT/E軽鎖の神経細胞内への共局所化を示しており、Ｎ末端ルール分解がラベルされたSNAP-25からの信号の減少の理由であることを同定するのに役立った。図１(c)は本発明の１つの実施の形態によるBoNTタンパク質分解活性に関するルシフェラーゼ・レポーターの設計を示している。図１(d)は生体発光アッセイにおけるＮ末端ルール分解の影響を示している。細胞がルシフェラーゼ・レポーターとYFP、YFP-LCEあるいはYFP-LCAでトランスフェクトされ、トランスフェクションから３６時間後に発光を発光計で測定した。示されているデータは平均±SEM (n=3; p<0.01 YFP-LCA：YFP)で、相対的発光単位（RLU）で示してある。この結果は、SNAP-25 YFP-LCA感作性フラグメントに関する信号がかなり減少していることを示している。図１(c)はルシフェラーゼ・レポーターと示されたプラスミドによってトランスフェクトされた細胞におけるその効果を示している。細胞をDMSOあるいは20μM MG132で一昼夜処理して、その溶解物を示された抗体でプローブした。
【００３８】
クロストリジウム遺伝子のA/Tカウントを高くすると、哺乳動物細胞でそれらが発現される。この問題を克服すると同時に毒素持続性の根拠を調べるためにBoNT/A LC (LCA)及びBoNT/E LC(LCE)をコードするｃDNAを構成した。生きている細胞内でのLCの局所化を視覚化するのを助けるために、それらを黄色(YFP)あるいは赤色蛍光性タンパク質(RFP)に融合させた。LCA及びLCEの細胞内での局所化を直接比較するために、N18神経芽腫細胞内にYFP-LCE及びRFP-LCAを共トランスフェクトした。LCAは神経芽腫細胞内で発現されると、主に原形質膜内に局所化される（図1b）。LCAはいくつかの細胞内膜及び小胞でも見出すことができる。興味深いことに、LCEも神経芽腫細胞内で同様の分布を示す（図１b)。共焦点で画像化すると、YFP-LCEとRFP-LCAが、事実上、これらの細胞内に共局所化されていることが示された（図１b) 。この結果は、BoNT/A LCの持続性がBoNT/E LCに対しての安定状態での細胞内局所化における違いによっては説明できないことを示唆している。
【００３９】
持続性がSNAP-25のBoNT/LC Aで発生されたより短い方のＣ末端フラグメントの安定性が増強されていることに由来している可能性について調べるために、FLAGでタグしたネズミのSNAP-25のＣ末端に融合されたルシフェラーゼでできているレポーターを構成した（図１c)。BoNT/Aはその構成物を切断して、P197及びルシフェラーゼに融合したP9に対応するＣ末端生成物を発生させる。本出願人らの観察によれば、BoNT/A切断によって発生されたフラグメントを含むP9はN末端Arg(SNAP-25のR197）を含んでおり、急速に分解されたのである。対照的に、BoNT/Eによる切断はP180フラグメントと比較的安定したＣ末端生成物をつくりだす。こうした考え方に沿って、レポーター構成物とBoNT/A LCによる共トランスフェクションを行うと、ルシフェラーゼ活性が10分の１以下に低下するのに対して、BoNT/E LCとの共トランスフェクションではルシフェラーゼ活性に多少の変化があっただけである（図１d)。この構成物のＮ末端に抗体を用いて免疫ブロットを行うと、YFP-LCA及びYFP-LCEによる全長SNAP25ルシフェラーゼ・レポーターのタンパク質分解が行われて、２つのフラグメントが発生することが確認された（図１e、中央のパネル）。このN末端フラグメントは前記の全長レポーターと比較して比較的安定しているように思われた。注目すべき点は、BoNT/Aタンパク質分解によってつくられたC末端フラグメントがほとんど検出されないのに対して、プロテアソームの抑制因子であるMG132の存在下で蓄積されることである（図１e、下側のパネル）。BoNT/A タンパク質分解からのフラグメントを含むP9の急激な喪失は、他のタンパク質(CFP)との融合も同様の結果をもたらすから（図２）、ルシフェラーゼとの融合だけが原因ではなさそうである。これらの結果は、細胞内での我々が用いた遺伝子組み換えBoNT/A及びBoNT/E LCの活性を裏付けるだけでなく、BoNT/Aによって発生させられたP9フラグメントの寿命が短く、そして、BoNT/A活性の優れたインジケータであることも実証している。これらの結果として、上に述べたアッセイはBoNT/LC A活性をBoNT/LC E活性から区別する上で有用である。
【００４０】
素材及び方法
プラスミド
我々は大腸菌及び哺乳動物細胞に対する好ましいコドン使用法に従って、BoNT/A及びE軽鎖（LC)のための合成遺伝子を構成した。ネズミSNAP-25をPCRで発生させ、pcDNA3.1(+)FLAGベクター内にサブクローンさせた。ルシフェラーゼをpcDNA3.1(+)SNAP25にサブクローンして、レポーターを構成した。SNAP-25 Leuヌクレオチド配列を配列番号No.1で示し、SNAP-25 Leu構成物のアミノ酸配列を配列番号No.2で示してある。BoNT LCを標的とするユビキノン・リガーゼを構成するために、我々は最初にBoNT/A及びEタンパク質分解に対して抵抗性を示すSNAP25突然変異種(SNC)を発生させた。このヌクレオチドを配列番号No.3で示し、そのペプチド配列を配列番号No.4で示す。
【００４１】
ボツリヌス神経毒素血清型A及びE(BoNT/A及び/E)軽鎖（LC）に関する合成遺伝子を大腸菌及び哺乳動物細胞で好ましいコドンの使用法を用いて新たに発生させた。簡単に言えば、50-60ntのオリゴヌクレオチドをペアで設計して、12ntの重複領域をそれらの向き合った末端に導入した。これらのペアを、PCRを用いて延長増幅して約100ntのフラグメントをつくりだし、前のPCR増幅で端部に12ntの重複部分を有するプライマーを用いてPCRを連続的に行いブロックを構成した。このタイプの「重複延長」を用いて、PCRは完全な合成遺伝子をつくりだした。DNA配列を同定した後、BoNT/A及び/E  LCを、独特なXhol及びApal箇所を用いてpEYFP-C1、pEGFP-C1、mRFP-C1、pcDNA3.1+、あるいはpCMVTag2C内にサブクローンした。GFP-LCAあるいは-LCEをpcDNA5/TO/Frtにサブクローンすることで、テトラサイクリン誘導性構成物が発生された。レポーター構成物を発生させるために、PCRでFLAG-ネズミ・シナプトソーム関連タンパク質25(SNAP25)を発生させて、pcDNA3.1+内のBamHIとXhol箇所の間にサブクローンした。SNAP25の停止コドンの前にKpnl箇所を遺伝子操作でつくり、そのKpnIとXholI箇所の間にルシフェラーゼを挿入できるようにした。BoNT LCを標的とするユビキチン・リガーゼを構成するために、最初にSNAP25非切断性変異種（SNC）を発生させたが、これは変異部（D179K,R198T）を含んでおり、BoNT/A及び/E両方によるタンパク質分解に対して抵抗性を示す（Quick Change Kit; Invitrogen）。
【００４２】
細胞培養及びトランスフェクション。細胞系を標準培養液内で、37°Cの温度下で、５％CO2インキュベータを用いて培養した。HEK293 細胞を10％（容積比）FBS、２mMグルタミン、及び2％ペニシリン‐ストレプトマイシンを含むDMEM内で成長させた。HEK-Flp-in/T-REX/293細胞（Invitrogen）を10％（容積比）テトラサイクリン非含有FBS(Clontech)、２mMグルタミン、2％ペニシリン‐ストレプトマイシン、100μg/mLゼオシン、及び15μg/mLブラスシジンで補強されたDMEM内で成長させた。ヒト神経芽腫SH-SY5Y細胞を10％（容積比）FBS、２mMグルタミン、2％ペニシリン‐ストレプトマイシンを含むDMEM/F12培養液内で培養した。N18細胞はヒポキサンチン、アミノタンパク質、チミジン培養液、１0％（容積比）FBS、２mMグルタミン、2％ペニシリン‐ストレプトマイシンで補強したDMEM内で培養した。ネズミ神経芽腫Neuro2a細胞は１0％以下（容積比）FBSを含んでいるEMEM内で培養した。細胞培養試薬はInvitrogen社から入手した。トランスフェクションはLipofectamine2000(Invitrogen)あるいはHiperfect(Qiagen)を用いて行った。
【００４３】
代謝性ラベリング  トランスフェクションから30時間後にパルス追跡分析を行った。簡単に説明すると、細胞をメチオニン/システイン(Met/Cys)非含有培養液内で1時間飢餓状態に置いてから、100μCi/mL[35S]-Met/Cys (MP Biogicals)を用いて45分間ラベルした。ラベリングを行った後、細胞をPBSで３回洗浄して、ラベルされていないMetを10倍過剰に含む追跡用培養液内で培養した。指定された時点で、PBSで細胞を３回洗浄してから、RIPA細胞溶解緩衝液[50mM Tris (pH 7.4)、150ｍM NaCl,1％（容積比）Triton X-100、0.5％（重量比）ナトリウム・デオキシコレート、0.1％（重量比）SDS、50μM MG132、及びプロテアーゼ抑制因子(Roche)]を用いて溶解させた。YFP-LCはGFP抗体で免疫沈降させた。細胞溶解緩衝液でよく洗浄してから、免疫沈降されたタンパク質を2xサンプル緩衝液内に溶出させて、SDS PAGEで解像して、STORMホスホイメージャーで分析するための処理を行い、ImageQuantソフトウエア（GE Healthcare Life Sciences）を用いて分析した。
【００４４】
抗体及び試薬。GFP及びRFPに対するウサギ・ポリクローナル抗体はClontech社から、HA抗体はRoche社 から、ルシフェラーゼ抗体はPromega社から、FLAG M2抗体はSigma社から、そして、GFP、TRAF2及びユビキノンに対する抗体はSanta Cruz社から、それぞれ購入した。Myc抗体は9E10ハイブリドーマの培養上澄み液から得た。特別の記述がない限り、すべての化学薬品はSigma-Aldrich社から入手したものである。
【００４５】
蛍光顕微鏡分析  トランスフェクションから３０時間後に、細胞を4％パラホルムアルデヒド内に10分間固定してから、PBSで洗浄し、その後で、 Zeiss LSM 510上で画像処理を行った。すべての画像は、保存のために最小限度の処理をしてある。
【００４６】
ルシフェラーゼ・アッセイ  ルシフェラーゼ・アッセイはトランスフェクションから３６時間後に、Dual-Luchiferaseキット（Promega）を用いて、メーカーの指示に従って行った。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明は生物学的アッセイ及びそれに関連した方法に応用できる。この発明はボツリヌス神経毒素(BoNT)の活性を測定するため、及び、BoNTの抑制因子を識別するための方法を開示している。この方法は産業で用いることができ、生物学の分野で実践することができる。
【００４８】
引例
本明細書本文で引用されている以下の文献は、本明細書で参照されたことにより、その全体が本明細書に組み入れられる。
1:  Simpson, L.L. (2000) Biochinie 82, 943-53
2:  Habermann, E. & Dreyer, F. (1986) Curr Top Microbiol Immunol 129, 93-179
３：  Jahn, R. & Niemann, H (1994)  Ann N Y Acad  SCi 733, 245-55
４：  Monteccucco,C. & Schiavo, G. (1995) Q Rev Biophys 28, 423-72
５：  Eleopra, R., Tugnoli,V., Rossetto,., De Grandis, D. &(1998) Nonteccucco, C. (1998)、Neurosci Lett 256, 135-8
６：  Cesar Montecucco and Giampiero Shiavo, (1994) , Molecular Microbiology 13(1), 1-8
【図１】
2013534415.tif 000003
【図２】
2013534415.tif 000004
【図３】
2013534415.tif 000005
【配列表】
2013534415000001.app
【国際調査報告】
2013534415.tif 000006
2013534415.tif 000007
2013534415.tif 000008
2013534415.tif 000009