(57)【要約】  本発明は、二重標識固定化プローブ及びそのＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する抵抗性を利用して固相でターゲット核酸配列を検出する新規な方法に関する。本発明は、内部ヌクレオチドの塩基成分の標識によるヌクレアーゼに対する抵抗性により、標識が固相基質上に残留するため、固相基質上に標識が残留するよう適した位置を考慮する必要がない。本発明は、プローブ上の内部標識の位置を自由に決定することができるため、プローブ上二重標識システムのクエンチング効率を最大化するに適した部位に標識を位置させることにより、バックグラウンドシグナルを最小化する。【選択図】図１
2013544079.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性を有する二重標識プローブを利用して固相でＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法であって、
（ａ）ターゲット核酸配列を固定化プローブにハイブリッド形成させる工程であって、前記固定化プローブは、前記ターゲット核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、３’−末端を通じて固相基質に固定化された前記プローブは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を有し、前記相互作用的二重標識は、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子間のエネルギークエンチングを誘導できるように前記固定化プローブに位置し、第１標識及び第２標識は、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子から選択され、前記第１標識は、前記固定化プローブの５’−末端に結合し、前記第２標識は、前記第１標識の下流に位置したヌクレオチドの塩基に結合し、このような前記第２標識の結合は、前記ヌクレオチドが前記ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性を有するようにする工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の結果物を前記固定化プローブの切断が発生する条件下で５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと接触させる工程であって、前記ターゲット核酸配列にハイブリッド形成された前記固定化プローブは、前記ＤＮＡポリメラーゼのエキソ核酸切断反応により切断され、前記第１標識が前記固定化プローブから解離して、前記固相基質上のシグナルの変化を引き起こす工程と、
（ｃ）前記ＤＮＡポリメラーゼの前記エキソ切断反応を、前記第２標識で標識された前記ヌクレオチドで終了させる工程であって、前記エキソ核酸切断反応の終了は、前記第２標識が結合した塩基を有する前記ヌクレオチドの抵抗性により誘導され、前記第２標識は、前記固相基質上に残留する工程と、
（ｄ）前記固相基質上におけるシグナルの変化を検出する工程であって、前記固定化プローブの前記切断による前記シグナルの変化は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記第１標識は、クエンチャー分子であり、前記第２標識は、レポーター分子である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１標識は、レポーター分子であり、前記第２標識は、クエンチャー分子である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第２標識は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断される固定化プローブ上の切断部位により前記第１標識から分離する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第２標識は、前記第１標識から２〜２０ヌクレオチド離隔された位置にある請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第２標識は、前記第１標識から４〜１５ヌクレオチド離隔された位置にある請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第１標識は、前記固定化プローブの５’−末端のホスフェート基に結合した請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第２標識は、前記固定化プローブにおけるチミジンヌクレオチドのチミンに結合した請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記方法は、前記工程（ａ）−（ｂ）又は（ａ）−（ｃ）を反復する工程と、その反復サイクルの間に変性過程とをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記工程（ｄ）の前記検出は、リアルタイム方式、エンドポイント方式又は指定時間間隔方式で行う請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する前記ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記工程（ａ）は、前記固定化プローブにハイブリッド形成される前記ターゲット核酸配列を生成するための逆方向プライマーを追加的に含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記固定化プローブは、ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別するようにする下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有するターゲット区別性プローブ（ｔａｒｇｅｔ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｖｅ  ｐｒｏｂｅ：ＴＤプローブ）である請求項１に記載の方法。
５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’  （Ｉ）
（式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリッド形成部位であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’ｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリッド形成部位であり、前記ＴＤプローブは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を有し、前記相互作用的二重標識は、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子間のエネルギークエンチングを誘導できるように前記固定化プローブに位置し、第１標識及び第２標識は、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子から選択され、前記第１標識は、前記５’−第２ハイブリッド形成部位の５’−末端に結合し、前記第２標識は、前記第１標識の下流に位置したヌクレオチドの塩基に結合して、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリッド形成部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリッド形成部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記Ｘ’ｐ、Ｙ’ｑ、Ｚ’ｒの三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリッド形成に関して、前記５’−第２ハイブリッド形成部位が前記３’−第１ハイブリッド形成部位から分割し、これにより、前記ＴＤプローブのハイブリッド形成特異性は、前記５’−第２ハイブリッド形成部位及び前記３’−第１ハイブリッド形成部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＤプローブの全体ハイブリッド形成特異性を向上させ、前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合は、前記５’−第２ハイブリッド形成部位及び前記３’−第１ハイブリッド形成部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリッド形成し、前記５’−第２ハイブリッド形成部位の５’−末端が前記ＤＮＡポリメラーゼのエキソ核酸切断反応により切断され、前記第１標識が前記ＴＤプローブから解離して前記固相基質上のシグナルの変化を引き起こし、前記第２標識が結合した塩基を有する前記ヌクレオチドの抵抗性により、前記第２標識が前記固相基質上に残留し、前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合は、前記５’−第２ハイブリッド形成部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成し、前記５’−第２ハイブリッド形成部位がＤＮＡポリメラーゼにより切断されず、前記固相基質上におけるシグナルの変化を引き起こさず、これにより、前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列及び非ターゲット核酸配列を区別して、前記固相基質上における前記シグナル変化は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す）。
【請求項１４】
前記第２標識は、前記５’−第２ハイブリッド形成部位に存在する請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ターゲット核酸配列は、前増幅された核酸配列である請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み、前記固定化プローブは、少なくとも２種のプローブを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性を有する二重標識プローブを利用して固相でＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するキットであって、
（ａ）固相基質と、
（ｂ）前記ターゲット核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を有する固定化プローブであって、その３’−末端を通じて固相基質上に固定化された前記プローブは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を有し、前記相互作用的二重標識は、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子間のエネルギークエンチングを誘導できるように前記固定化プローブに位置し、第１標識及び第２標識は、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子から選択され、前記第１標識は、前記固定化プローブの５’−末端に結合し、前記第２標識は、前記第１標識の下流に位置したヌクレオチドの塩基に結合し、このような前記第２標識の結合は、前記ヌクレオチドが前記ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性を有するようにする前記固定化プローブと、
（ｃ）５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する前記ＤＮＡポリメラーゼと、
を含むことを特徴とするキット。
【請求項１９】
前記第１標識は、クエンチャー分子であり、前記第２標識は、レポーター分子である請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記第１標識は、レポーター分子であり、前記第２標識は、クエンチャー分子である請求項１８に記載のキット。
【請求項２１】
前記第２標識は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断される固定化プローブ上の切断部位により前記第１標識から分離する請求項１８に記載のキット。
【請求項２２】
前記第２標識は、前記第１標識から２〜２０ヌクレオチド離隔された位置にある請求項１８に記載のキット。
【請求項２３】
前記第２標識は、前記第１標識から４〜１５ヌクレオチド離隔された位置にある請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記第１標識は、前記固定化プローブの５’−末端のホスフェート基に結合した請求項１８に記載のキット。
【請求項２５】
前記第２標識は、前記固定化プローブにおけるチミジンヌクレオチドのチミンに結合した請求項１８に記載のキット。
【請求項２６】
前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する前記ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである請求項１８に記載のキット。
【請求項２７】
前記キットは、前記固定化プローブにハイブリッド形成される前記ターゲット核酸配列を生成するための逆方向プライマーを追加的に含む請求項１８に記載のキット。
【請求項２８】
前記固定化プローブは、ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別するようにする下記一般式Ｉの変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有するターゲット区別性プローブ（ｔａｒｇｅｔ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｖｅ  ｐｒｏｂｅ：ＴＤプローブ）である請求項１８に記載のキット。
５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’  （Ｉ）
（式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリッド形成部位であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’ｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリッド形成部位であり、前記ＴＤプローブは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を有し、前記相互作用的二重標識は、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子間のエネルギークエンチングを誘導できるように前記固定化プローブに位置し、第１標識及び第２標識は、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子から選択され、前記第１標識は、前記５’−第２ハイブリッド形成部位の５’−末端に結合し、前記第２標識は、前記第１標識の下流に位置したヌクレオチドの塩基に結合し、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリッド形成部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリッド形成部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記Ｘ’ｐ、Ｙ’ｑ、Ｚ’ｒの三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリッド形成に関して、前記５’−第２ハイブリッド形成部位が前記３’−第１ハイブリッド形成部位から分割し、これにより、前記ＴＤプローブのハイブリッド形成特異性は、前記５’−第２ハイブリッド形成部位及び前記３’−第１ハイブリッド形成部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＤプローブの全体ハイブリッド形成特異性を向上させて、前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合は、前記５’−第２ハイブリッド形成部位及び前記３’−第１ハイブリッド形成部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリッド形成され、前記５’−第２ハイブリッド形成部位の５’−末端が前記ＤＮＡポリメラーゼのエキソ核酸切断反応により切断され、前記第１標識が前記ＴＤプローブか解離して前記固相基質上のシグナルの変化を引き起こし、前記第２標識が結合した塩基を有する前記ヌクレオチドの抵抗性により、前記第２標識が前記固相基質上に残留し、前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合は、前記５’−第２ハイブリッド形成部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成して、前記５’−第２ハイブリッド形成部位は、ＤＮＡポリメラーゼにより切断されず、前記固相基質上におけるシグナルの変化を引き起こさず、これにより、前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列及び非ターゲット核酸配列を区別して、前記固相基質上における前記シグナル変化は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す）。
【請求項２９】
前記第２標識は、前記５’−第２ハイブリッド形成部位に存在する請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
前記キットは、前記ターゲット核酸配列増幅用プライマーセットを追加的に含み、前記ターゲット核酸配列は、前増幅された核酸配列である請求項１８に記載のキット。
【請求項３１】
前記ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み、前記固定化プローブは、少なくとも２種のプローブを含む請求項１８に記載のキット。
【請求項３２】
前記ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む請求項１８に記載のキット。
【請求項３３】
ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する抵抗性をオリゴヌクレオチドに付与する方法であって、
（ａ）前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する工程と、
（ｂ）前記オリゴヌクレオチドのうち一つのヌクレオチドの塩基に標識を有するオリゴヌクレオチドを合成する工程であって、これにより、前記ヌクレオチドは、前記ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性を有する工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
前記標識が結合した前記塩基を有する前記ヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドの内部ヌクレオチドである請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二重標識固定化プローブ及びそのＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する抵抗性を利用して固相でターゲット核酸配列を検出する新規な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡベースのマイクロアレイ技術は、遺伝子又は遺伝子群の存在、水準又は発現パターンを分析可能な有望なツールとして大きな脚光を浴びている（非特許文献１〜２）。
【０００３】
従来のＤＮＡマイクロアレイは、一般に、標識されたターゲット配列を固相基質に固定されているプローブとハイブリッド形成させて、標識からのシグナルを測定することによりターゲット配列を検出する。しかし、ターゲット配列に直接標識をすることは、費用及び時間的な面で効率的ではなく、ターゲット配列の量（ｌｅｖｅｌ）に影響を及ぼす可能性が高い。
【０００４】
このような従来マイクロアレイ技術の問題点を克服するために、標識されたターゲット配列を利用する代わりに、分子ビーコンプローブ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ  ｐｒｏｂｅ）が提案された（非特許文献３〜４）。ＦＲＥＴ現象を利用する分子ビーコン技術は、前記プローブがターゲット配列にハイブリッド形成される場合にのみ蛍光シグナルを提供するため、ターゲット配列をリアルタイム方式で検出できるようにする。
【０００５】
しかし、ターゲット配列とのハイブリッド形成に大きく依存的な多くの方法は、交差反応（ｃｒｏｓｓ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）による偽陽性データの深刻な問題が発生し、最終ハイブリッド形成シグナルの信頼度を改善しなければならない問題点がある。
【０００６】
固定化された二重標識プローブを利用するハイブリッド形成過程の他に、追加的なエキソヌクレアーゼ反応を利用する幾つかのアプローチ、例えば、固相におけるＴａｑＭａｎプローブ方法が提案された（非特許文献５；Ｌｉｕら）。Ｌｉｕらは、固相基質上に固定化された二重標識プローブを利用しており、前記二重標識プローブでは、プローブの５’−末端にクエンチャー分子、３’−末端に蛍光レポーター分子が連結されている。前記プローブは、上流プライマーの伸長過程の間、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断される。切断反応後、クエンチャー分子は解離して、蛍光レポーター分子は、固相基質に残留するようになり、固相基質で発生する蛍光シグナルを測定することにより、最終的にターゲット配列を検出する。ハイブリッド形成だけではなく、プライマー依存的５’→３’ヌクレアーゼ活性を利用するＴａｑＭａｎプローブアレイ方法は、固相におけるターゲット特異性を向上させると同時に、リアルタイム方式でターゲット配列を検出できるようにする。
【０００７】
しかし、ＴａｑＭａｎプローブアレイ方法におけるＤＮＡポリメラーゼのプライマー依存的５’→３’ヌクレアーゼ活性は、蛍光レポーター分子で標識されたヌクレオチドまで切断する可能性があり、固相基質に蛍光レポーター分子が残留できなくなる可能性がある。このような問題点を克服するために、蛍光レポーター分子がＤＮＡポリメラーゼのプライマー依存的５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断されない非切断部位に位置するように、二重標識プローブをデザインする。プローブ上の非切断部位は、切断反応の間に切断されて短くなるプローブがターゲット核酸配列から変性されることにより生じる。このような目的で、蛍光レポーター分子を３’−末端に位置させる。
【０００８】
したがって、ＴａｑＭａｎプローブアレイ方法では、クエンチャー分子と蛍光レポーター分子間の距離が遠くなる。プローブ上の二重標識の距離が遠いほど、二重標識システムのクエンチング効率は低くなる。低いクエンチング効率は、スポットによって異なるバックグラウンドシグナルの発生を引き起こし、最終的に誤った結果を示す。
【０００９】
しかも、ＴａｑＭａｎプローブアレイ方法は、ＤＮＡポリメラーゼのプライマー依存的５’→３’ヌクレアーゼ活性を利用するため、上流プライマーが必要である。このような追加的なオリゴヌクレオチド（上流プライマー）の使用に係わる制限は、マルチプレックスターゲット検出のためのマイクロアレイ上の反応条件を確立し難くし、これは、偽陽性結果を発生させる要因の一つである。
【００１０】
一方、特許文献１は、ＤＮＡポリメラーゼのプライマー非依存的切断活性を利用するＬＡＴＥ−ＰＣＲ（Ｌｉｎｅａｒ−Ａｆｔｅｒ−Ｔｈｅ−Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ＰＣＲ）におけるターゲット検出方法を開示している。ＤＮＡポリメラーゼのプライマー依存的５’→３’ヌクレアーゼ活性を利用するＴａｑＭａｎプローブベースの方法と異なって、特許文献１におけるＤＮＡポリメラーゼのプライマー非依存的５’→３’ヌクレアーゼ活性は、プライマーの助けを必要としない。さらに、特許文献１は、３個以上のメチレン基（ＣＨ２）による標識とプローブの５’−末端間の結合は、プローブがＤＮＡポリメラーゼのプライマー非依存的５’→３’ヌクレアーゼ活性によってより効率的に切断される状態にする反面、メチレン（ＣＨ２）鎖を利用しない標識とプローブの５’−末端間の結合は、ＤＮＡポリメラーゼのプライマー非依存的５’→３’ヌクレアーゼ活性に対してプローブが抵抗性を有する状態にすることを開示している。
【００１１】
プライマーの助け無しに、プローブの修飾により調節可能なＤＮＡポリメラーゼのプライマー非依存的５’→３’ヌクレアーゼ活性に対する感度又は抵抗性を利用する反応は、追加的な研究及び開発によって、固相におけるターゲット検出に適用できる。
【００１２】
従来のＤＮＡマイクロアレイ方法に係わる問題点を克服し、ターゲット配列、好ましくは、多数のターゲット配列を一つのＤＮＡマイクロアレイ上でより簡便で且つ信頼度及び再現性高く検出できる新規なＤＮＡマイクロアレイ技術開発に対する要求が当業界で依然として残っている。さらに、固相で反応を実施してリアルタイム方式でシグナルを検出する新規なリアルタイムマイクロアレイ方法も、ターゲット核酸配列の定量的分析の分野で必要とされる。
【００１３】
本明細書全体にかけて多数の特許及び文献が参照され、その引用が表示されている。このような特許及び文献の公開は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第２００８／０１１００４号パンフレット
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｓｃｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０：４６７−４７０
【非特許文献２】ＤｅＲｉｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  ｃＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｔｏ  Ａｎａｌｙｓｅ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４：４５７−４６０
【非特許文献３】Ｓｔｅｅｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１８：９１−９４（２０００）
【非特許文献４】Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，２２：１０４１−１０４７（２００７）
【非特許文献５】Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３４：ｅ４（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
このような状況において、本発明者は、相互作用的二重標識を有するプローブを利用して、固相でより簡便な方式で偽陽性及び偽陰性結果無しにターゲット核酸配列を検出、識別及び定量できる新規なターゲット検出技術を開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者は、二重標識プローブ上の標識の結合位置及びパターンを多様に調節した。興味深いことに、本発明者は、ＤＮＡポリメラーゼのプライマー非依存的５’→３’ヌクレアーゼ活性に対する塩基−標識ヌクレオチドの抵抗性を見出し、また、ターゲット核酸配列を検出するために好適に適用できる二重標識プローブ上の標識の結合位置及びパターンを見出して、これは、二重標識のうち、第１標識は、プローブの５’−末端に結合して、第２票式は、第１標識の下流に位置したヌクレオチドの塩基に結合するものである。本発明の独特の標識方式は、プローブがターゲット核酸配列の存在有無によってシグナルを発生（シグナル発生、増加又は減少を含む）するように誘導するだけではなく、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性を有するようにする。
【００１７】
本発明の内的ブロッキング二重標識プローブ（ｉｎｔｅｒｎａｌｌｙ  ｂｌｏｃｋｅｄ  ｄｕａｌ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｐｒｏｂｅ）は、内部標識（即ち、第２標識）の位置を自由に決定できるようにして、偽陽性及び偽陰性データ無しに、再現性あるように固相基質上に最終的に残留した標識からシグナルが得られるようにする。本発明者は、本発明が、プローブを利用して固相基質上でターゲット核酸配列を検出するための、非常に最適化されたプロトコールを提供すると判断する。
【００１８】
したがって、本発明の目的は、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する抵抗性を利用して、固相でターゲット核酸配列を検出する方法を提供することにある。
【００１９】
本発明の他の目的は、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する抵抗性を利用して、固相でＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するキットを提供することにある。
【００２０】
本発明のまた他の目的は、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する抵抗性をオリゴヌクレオチドに付与する方法を提供することにある。
【００２１】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、本発明の過程を図式的に示す図である。
【図２】図２は、プローブのヌクレオチドの塩基成分と標識との結合により付与された、一部ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する抵抗性の結果を示す図である。Ｔａｑ、Ｔｔｈ及びＴｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼを利用した。
【図３】図３は、プローブのヌクレオチドの塩基成分と標識との結合により付与された、一部ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する抵抗性の結果を示す図である。Ｔａｑ、Ｔｔｈ及びＴｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼを利用した。
【図４】図４は、プローブのヌクレオチドの塩基成分と標識との結合により付与された、一部ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する抵抗性の結果を示す図である。Ｔａｑ、Ｔｔｈ及びＴｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼを利用した。
【図５】図５は、マイクロアレイ上で二重標識プローブ及びＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する抵抗性を利用したターゲット核酸配列の検出結果を示す図である。標準的な構造を有する二重標識プローブを利用した。
【図６】図６は、マイクロアレイ上で二重標識プローブ及びＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する抵抗性を利用したターゲット核酸配列の検出結果を示す図である。ｍＤＳＯ構造を有する二重標識プローブを利用した。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、ターゲット検出方法に関し、プローブオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの塩基に標識を結合させることにより付与される、ＤＮＡポリメラーゼのプライマー非依存的５’→３’ヌクレアーゼ活性に対する独特な抵抗性を利用する。
【００２４】
本発明の一様態によると、本発明は、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性を有する二重標識プローブを利用して固相でＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法であって、
（ａ）ターゲット核酸配列を固定化プローブにハイブリッド形成させる工程であって、前記固定化プローブは、前記ターゲット核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、３’−末端を通じて固相基質に固定化された前記プローブは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を有し、前記相互作用的二重標識は、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子間のエネルギークエンチングを誘導できるように前記固定化プローブに位置し、第１標識及び第２標識は、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子から選択され、前記第１標識は、前記固定化プローブの５’−末端に結合し、前記第２標識は、前記第１標識の下流に位置したヌクレオチドの塩基に結合し、このような前記第２標識の結合は、前記ヌクレオチドが前記ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性を有するようにする工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の結果物を前記固定化プローブの切断が発生する条件下で５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと接触させる工程であって、前記ターゲット核酸配列にハイブリッド形成された前記固定化プローブは、前記ＤＮＡポリメラーゼのエキソ核酸切断反応により切断され、前記第１標識が前記固定化プローブから解離して、前記固相基質上のシグナルの変化を引き起こす工程と、
（ｃ）前記ＤＮＡポリメラーゼの前記エキソ切断反応を、前記第２標識で標識された前記ヌクレオチドで終了させる工程であって、前記エキソ核酸切断反応の終了は、前記第２標識が結合した塩基を有する前記ヌクレオチドの抵抗性により誘導され、前記第２標識は、前記固相基質上に残留する工程と、
（ｄ）前記固相基質上におけるシグナルの変化を検出する工程であって、前記固定化プローブの前記切断による前記シグナルの変化は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、
を含む方法を提供する。
【００２５】
本発明者は、相互作用的二重標識を有するプローブを利用して、固相でより簡便な方式で偽陽性及び偽陰性結果無しにターゲット核酸配列を検出、識別及び定量できる新規なターゲット検出技術を開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者は、二重標識プローブ上の標識の結合位置及びパターンを多様に調節した。興味深いことに、本発明者は、ＤＮＡポリメラーゼのプライマー非依存的５’→３’ヌクレアーゼ活性に対する塩基−標識ヌクレオチドの抵抗性を見出し、また、ターゲット核酸配列を検出するに好適に適用できる二重標識プローブ上の標識の結合位置及びパターンを見出し、これは、二重標識のうち、第１標識は、プローブの５’−末端に結合し、第２標識は、第１標識の下流に位置したヌクレオチドの塩基に結合するものである。
【００２６】
本発明の独特の標識方式は、プローブがターゲット核酸配列の存在有無によってシグナルを発生（シグナル発生、増加又は減少を含む）するように誘導するだけではなく、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性を有するようにする。
【００２７】
本発明の内的ブロッキング二重標識プローブ（ｉｎｔｅｒｎａｌｌｙ  ｂｌｏｃｋｅｄ  ｄｕａｌ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｐｒｏｂｅ）は、内部標識（即ち、第２標識）の位置を自由に決定できるようにして、偽陽性及び偽陰性データ無しに、再現性あるように固相基質上に最終的に残留した標識からシグナルが得られるようにする。本発明者は、本発明が、プローブを利用して固相基質上でターゲット核酸配列を検出するために、非常に最適化されたプロトコールを提供すると判断する。
【００２８】
本発明者は、ＤＮＡポリメラーゼのプライマー非依存的５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を調節するために鋭意研究し、興味深いことに、その塩基に標識が結合したヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼのプライマー非依存的５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性を有することを見出した。
【００２９】
このような発見に基づいて、本発明者は、ＤＮＡポリメラーゼのプライマー非依存的５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する抵抗性をオリゴヌクレオチドに付与する新規なアプローチを確立した。
【００３０】
また、本発明者は、このような発見を固定化された二重標識プローブに適用し、標識位置の制限無しに、固相で二重標識プローブを利用した新規なターゲット検出方法を確立した。本発明者が知る限りでは、このようなアプローチは、本発明者によって最初に提示され、これにより、より効率的で正確にターゲット核酸配列が検出されるようになる。
【００３１】
二重標識プローブの切断反応を利用する従来の固相方法において、ターゲット核酸配列は、切断反応でプローブ上の内部ヌクレオチドに結合した標識が固相基質上に残留する場合にのみ検出することができる。ＤＮＡポリメラーゼのプライマー依存的５’→３’ヌクレアーゼ活性を利用するＴａｑＭａｎプローブに基づく方法において、切断反応で徐々に短くなるプローブは、プローブ配列及び反応条件によってターゲット核酸配列から変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）されて、プローブ上に非切断部位の形成を生じることができる。したがって、標識がプローブ上の非切断部位に位置する場合、標識は、最終的に固相基質上に残留することができる。しかし、このような方法は、プローブ上の内部ヌクレオチドに結合した標識が非切断部位上に位置するように反応条件を考慮しなければならないという深刻な問題点がある。このような限界のため、二重標識が非常に離隔されるように二重標識プローブをデザインする必要がある。プローブ上の二重標識の距離が遠いほど、二重標識システムのクエンチング効率は低くなる。低いクエンチング効率は、スポットによって異なるバックグラウンドシグナルの発生を引き起こし、最終的に誤った結果を示す。
【００３２】
本発明は、上述の従来方法の問題点を克服し、二重標識プローブを利用して固相でターゲット核酸配列が検出されるようにする。本発明によると、プローブの内部ヌクレオチドの塩基と標識の結合は、内部ヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼのプライマー非依存的５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性を有するようにする。固相基質上に固定化されたプローブは、ＤＮＡポリメラーゼの切断反応を経て、内部ヌクレオチドの塩基に結合した標識は、抵抗性により固相基質上に残留するようになる。ＤＮＡポリメラーゼのプライマー依存的５’→３’ヌクレアーゼ活性を利用するＴａｑＭａｎプローブベースの方法とは異なって、本発明は、反応条件によって非切断部位を考慮する必要無しに、プローブ上の内部標識の位置を自由に決定できるようにし、プローブ上二重標識システムのクエンチング効率の最大化に適した部位に標識を位置させることにより、バックグラウンドシグナルを最小化する。
【００３３】
好ましくは、本発明に利用される固定化プローブは、固相基質上のその３’−末端を通じて固定化される。相互作用的二重標識の一つは、固定化プローブの５’−末端にある塩基を除いたヌクレオチドの構造にカーボンスペーサーを通じて結合して、他の一つは、内部ヌクレオチドの塩基に連結される。本発明によると、ターゲット核酸配列とハイブリッド形成される固定化プローブは、ＤＮＡポリメラーゼのプライマー非依存的５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、その５’−末端で５’→３’方向に徐々に切断されて、その５’−末端にある第１標識が解離される。前記酵素が塩基成分に標識された内部ヌクレオチドと会うと、その抵抗性により切断反応は終了されて、内部ヌクレオチドの標識は、最終的に固相基質に残留するようになる。
【００３４】
一般に、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、上流ヌクレオチド依存的活性及び上流オリゴヌクレオチド非依存的活性に分類される。上流オリゴヌクレオチドは、プライマー、プライマーの伸長産物及び切断されるオリゴヌクレオチドの上流に位置するプローブを含む。本発明は、上流オリゴヌクレオチド非依存的活性を利用するため、本明細書で使用される用語‘ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性’は、特に言及しない限り、ＤＮＡポリメラーゼの上流オリゴヌクレオチド非依存的５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を意味する。
【００３５】
本発明を詳細に説明すると、以下の通りである。
【００３６】
本発明によると、ターゲット核酸配列は、固相基質上に固定化された二重標識プローブにハイブリッド形成される。
【００３７】
本明細書で使用された用語‘ターゲット核酸’、‘ターゲット核酸配列’又は‘ターゲット配列’は、検出しようとする核酸配列を意味し、ハイブリッド形成、アニーリング又は増幅条件下でプローブ又はプライマーとアニーリング又はハイブリッド形成される。
【００３８】
本明細書で使用される用語‘プローブ（ｐｒｏｂｅ）’は、ターゲット核酸配列に実質的に相補的な部位又は部位を含む一本鎖核酸分子を意味する。好ましくは、プローブは、一本鎖デオキシリボヌクレオチド分子である。また、プローブは、リボヌクレオチドを含むことができる。
【００３９】
本明細書で使用される用語‘プライマー’は、オリゴヌクレオチドを意味するものであり、核酸鎖（鋳型）に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件、即ち、ヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼのような重合剤の存在、そして適した温度とｐＨの条件で合成の開始点として作用できる。好ましくは、プライマーは、増幅において最大効率を有する一本鎖である。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。
【００４０】
本発明で利用されるプローブ又はプライマーは、天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ｄＮＭＰ（即ち、ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰ及びｄＴＭＰ）、修飾ヌクレオチド又は非天然ヌクレオチドが含まれる。修飾ヌクレオチド又は非天然ヌクレオチドは、修飾又は非天然塩基を含むことができる。
【００４１】
プライマーは、重合剤の存在下で伸長産物の合成をプライミングさせることができるほど十分長くなければならない。プライマーの適した長さは、例えば、温度、応用分野及びプライマーのソース（ｓｏｕｒｃｅ）を含む複数の要素によって決定される。本明細書で使用される用語‘アニーリング’又は‘プライミング’は、鋳型核酸にオリゴデオキシヌクレオチド又は核酸が並置（ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ）されることを意味し、前記並置は、ポリメラーゼがヌクレオチドを重合させて、鋳型核酸又はその一部分に相補的な核酸分子を形成するようにする。
【００４２】
本明細書で使用された用語‘ハイブリッド形成（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）’は、相補的な一本鎖核酸が二本鎖核酸を形成することを意味する。ハイブリッド形成は、二つの核酸鎖間の相補性が完全である場合（ｐｅｒｆｅｃｔ  ｍａｔｃｈ）に起こるか、又は一部ミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）塩基が存在しても起こり得る。ハイブリッド形成に必要な相補性の程度は、ハイブリッド形成条件によって変わり、特に温度によって調節され得る。
【００４３】
本明細書で使用された用語‘アニーリング’と‘ハイブリッド形成’に差はなく、本明細書で混用される。
【００４４】
本発明で利用される固定化プローブは、ターゲット核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を有する。用語‘相補的’は、所定のアニーリング条件又は厳格条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下でプライマー又はプローブがターゲット核酸配列に選択的にハイブリッド形成するほど十分相補的なことを意味し、‘実質的に相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）’及び‘完全に相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）’を包括する意味を有し、好ましくは、完全に相補的なことを意味する。
【００４５】
本発明で利用される固定化プローブは、その３’−末端を通じて固相基質上に固定化される。好ましい固相基質は、適した固相又は半−固相支持体を含み、例えば、膜、フィルター、チップ、スライド、ウェハー、ファイバー、磁性又は非磁性ビーズ、ゲル、管、プレート、高分子、極微粒子及び毛細管である。例え一部具現例において、異なる化合物のための合成領域、例えば、ウェル、隆起した領域（ｒａｉｓｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）、ピン、エッチングされた溝（ｅｔｃｈｅｄ  ｔｒｅｎｃｈ）などの領域を物理的に分離させることが望ましいかもしれないが、多数の具現例では、固相基質の少なくとも一つの表面は、実質的に平面であってもよい。本発明の他の具現例によると、固相基質は、ビーズ、樹脂、ゲル、マイクロスフィア、又は他の幾何学的配列の形態を有する。
【００４６】
好ましくは、固相基質は、マイクロアレイを含む。プローブは、固相基質の表面に直接的又は間接的に固定化されて、好ましくは、間接的に固定化される。また、プローブは、共有又は非共有結合方式で固相基質の表面に固定化できる。プローブが間接的に固相基質の表面に固定化される場合、適したリンカーを利用することができる。本発明で使用できるリンカーは、マイクロアレイでプローブを固定化するために利用される如何なるリンカーも含む。例えば、アミン基を有するアルキル又はアリール化合物、又はチオール基を有するアルキル又はアリール化合物がプローブ固定化のためのリンカーとして利用される。また、ポリ（Ｔ）塩基又はポリ（Ａ）塩基がリンカーとして利用されて、酵素作用（例えば、酵素的切断反応）を抑制する可能性の高い空間的妨害（ｓｐａｃｅ  ｈｉｎｄｒａｎｃｅ）を減少させるか、又はハイブリッド形成効率を増加させることができる。ポリ（Ｔ）テール又はポリ（Ａ）テールは、プローブの配列に含まれない。
【００４７】
本発明に利用される固定化プローブは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識システムを有する。
【００４８】
前記相互作用的標識システムは、供与体分子（レポーター分子）及び受容体分子（クエンチャー分子）間にエネルギーが非放射能的（ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｉｖｅｌｙ）に伝達されるシグナル発生システムである。
【００４９】
相互作用的標識システムの代表的例として、ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）標識システムは、レポーター分子（供与体分子）及びクエンチング分子（受容体分子）を含む。ＦＲＥＴにおいて、エネルギー供与体は蛍光性であるが、エネルギー受容体は、蛍光性又は非蛍光性である。
【００５０】
相互作用的標識システムの他の形態において、エネルギー供与体は、非蛍光性、例えば、発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）であり、エネルギー受容体は、蛍光性である。相互作用的標識システムのまた他の形態において、エネルギー供与体は、発光性、例えば、生物発光性、化学発光性又は電気化学発光性であり、受容体は、蛍光性である。
【００５１】
より好ましくは、ターゲット核酸配列を示すシグナルは、相互作用的標識により発生し、最も好ましくは、ＦＲＥＴ標識システムである。
【００５２】
プローブにおいて有用なレポーター分子及びクエンチャー分子は、当業界に知られた如何なる分子でも含むことができる。その例は、下記の通りである：Ｃｙ２ＴＭ（５０６）、ＹＯ−ＰＲＯＴＭ−１（５０９）、ＹＯＹＯＴＭ−１（５０９）、Ｃａｌｃｅｉｎ（５１７）、ＦＩＴＣ（５１８）、ＦｌｕｏｒＸＴＭ（５１９）、ＡｌｅｘａＴＭ（５２０）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１１０（５２０）、Ｏｒｅｇｏｎ  ＧｒｅｅｎＴＭ５００（５２２）、Ｏｒｅｇｏｎ  ＧｒｅｅｎＴＭ４８８（５２４）、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ（５２５）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ＧｒｅｅｎＴＭ（５２７）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １２３（５２９）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ＧｒｅｅｎＴＭ（５３１）、Ｃａｌｃｉｕｍ  ＧｒｅｅｎＴＭ（５３３）、ＴＯ−ＰＲＯＴＭ−１（５３３）、ＴＯＴＯ１（５３３）、ＪＯＥ（５４８）、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０（５５０）、Ｄｉｌ（５６５）、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０（５７０）、Ｃｙ３ＴＭ（５７０）、ＡｌｅｘａＴＭ５４６（５７０）、ＴＲＩＴＣ（５７２）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ＯｒａｎｇｅＴＭ（５７５）、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｒ＆Ｂ（５７５）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（５７５）、Ｃａｌｃｉｕｍ  ＯｒａｎｇｅＴＭ（５７６）、Ｐｙｒｏｎｉｎ  Ｙ（５８０）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ（５８０）、ＴＡＭＲＡ（５８２）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ＲｅｄＴＭ（５９０）、Ｃｙ３．５ＴＭ（５９６）、ＲＯＸ（６０８）、Ｃａｌｃｉｕｍ  ＣｒｉｍｓｏｎＴＭ（６１５）、ＡｌｅｘａＴＭ５９４（６１５）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（６１５）、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ（６２８）、ＹＯ−ＰＲＯＴＭ−３（６３１）、ＹＯＹＯＴＭ−３（６３１）、Ｒ−ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４２）、Ｃ−Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４８）、ＴＯ−ＰＲＯＴＭ−３（６６０）、ＴＯＴＯ３（６６０）、ＤｉＤ  ＤｉｌＣ（５）（６６５）、Ｃｙ５ＴＭ（６７０）、Ｔｈｉａｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ（６７１）、Ｃｙ５．５（６９４）、ＨＥＸ（５５６）、ＴＥＴ（５３６）、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｂｌｕｅ（４４７）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｇｏｌｄ  ５４０（５４４）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｏｒａｎｇｅ  ５６０（５５９）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ５９０（５９１）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０（６１０）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６３５（６３７）、ＦＡＭ（５２０）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（５２０）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｃ３（５２０）、Ｐｕｌｓａｒ  ６５０（５６６）、Ｑｕａｓａｒ  ５７０（６６７）、Ｑｕａｓａｒ  ６７０（７０５）及びＱｕａｓａｒ  ７０５（６１０）。括弧の数字は、ナノメートル単位で表示した最大発光波長である。
【００５３】
適したレポーター−クエンチャー対は、下記のようなたくさんの文献に開示されている：Ｐｅｓｃｅら、ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７１）；Ｗｈｉｔｅら、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７０）；Ｂｅｒｌｍａｎ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒａ  ｏｆ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７１）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｃｏｌｏｒ  ＡＮＤ  Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７６）；Ｂｉｓｈｏｐ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９７２）；Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，１９９２）；Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９４９）；Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．，１９９６；米国特許第３，９９６，３４５号及び第４，３５１，７６０号。
【００５４】
レポーター分子及びクエンチャー分子は、それぞれ蛍光性であり得る。また、レポーター分子は、蛍光性であるが、クエンチャー分子は非蛍光性でありえる。例えば、広範囲波長又は特定波長の蛍光をクエンチングできる非蛍光性ダーククエンチャーを本発明で利用できる。クエンチャー分子が蛍光性である場合、蛍光性クエンチャー分子のシグナル変化からターゲット核酸配列を検出することができる。
【００５５】
固定化プローブ上の二重標識システムにおいて、レポーターは、ＦＲＥＴの供与体を含み、クエンチャーは、ＦＲＥＴのその他のパートナー（受容体）を含む。例えば、フルオレセイン色素（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｙｅ）は、レポーター分子として利用されて、ロダミン色素（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ｄｙｅ）は、クエンチャー分子として利用される。
【００５６】
レポーター分子及びクエンチャー分子は、従来の方法により連結できる。例えば、レポーター分子及びクエンチャー分子は、少なくとも３個の炭素原子を含むスペーサー（例えば、３−炭素スペーサー、６−炭素スペーサー、９−炭素スペーサー又は１２−炭素スペーサー）を通じてプローブに連結され得る。
【００５７】
本発明に利用される固定化プローブにおいて、レポーター分子及びクエンチャー分子から選択された第１標識は、固定化プローブの５’−末端に結合し、レポーター分子及びクエンチャー分子から選択された第２標識は、前記第１標識の下流に位置したヌクレオチドの塩基に結合する。
【００５８】
好ましくは、固定化プローブの５’−末端に結合した第１標識は、５’−末端のホスフェート基に直接的又は間接的（例えば、リンカーを通じて）に結合できる。択一的に、第１標識は、５’−末端のリボース（ｒｉｂｏｓｅ）に結合でき、好ましくは、リボースの５−炭素である。
【００５９】
固定化プローブ上の第２標識は、第１標識の下流に位置したヌクレオチドの塩基に結合する。第２標識は、アデニン、グアニン、シトシン又はチアミンに結合でき、好ましくは、チアミンである。
【００６０】
第２標識による塩基の標識は、塩基が水素結合をする位置以外の位置に結合することが好ましい。例えば、第２標識は、チアミンの５番又は６番炭素に結合でき、好ましくは、チアミンの５番炭素のメチル基である。
【００６１】
興味深いことに、本発明者は、第２標識による塩基の標識は、標識されたヌクレオチドにＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する抵抗性を付与することを見出した。
【００６２】
本明細書で使用される用語‘抵抗性’は、ヌクレオチド分子がＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によりほとんど切断されないか、全く切断されないことを意味し、好ましくは、全く切断されないことである。
【００６３】
本発明の好ましい具現例によると、第１標識は、クエンチャー分子であり、第２標識は、レポーター分子である。択一的に、第１標識は、レポーター分子であり、第２標識は、クエンチャー分子である。
【００６４】
本発明に利用される第１標識及び第２標識は、相互作用的二重標識システムを提供する。二重標識は、特に、固定化プローブが分析しようとする試料の核酸配列にハイブリッド形成されない場合に、二重標識間のエネルギークエンチングが発生し得る、固定化プローブの部位に位置する。
【００６５】
エネルギークエンチングのために、二重標識は、特定距離又は３次元的構造（例えば、ランダムコイル又はヘアピン構造）でプローブ上に位置する。ターゲット核酸配列とハイブリッド形成される固定化プローブは、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によりその５’−末端で５’→３’方向に徐々に切断され、その５’−末端にある第１標識が解離する。最終的に、第２標識は、固相基質に残留するようになり、第１標識及び第２標識間のエネルギークエンチングがそれ以上発生せず、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナル変化（シグナル発生、消滅、増加又は減少）が引き起こされる。
【００６６】
第１標識がクエンチャー分子で、第２標識がレポーター分子である場合、固定化プローブの５’−末端がエキソ核酸切断反応によって切断され、第１標識は解離して、第２標識は固相基質上に残留するようになる。第２標識であるレポーター分子からのシグナルを測定してターゲット核酸配列を検出する。
【００６７】
第１標識がレポーター分子で、第２標識がクエンチャー分子である場合、固定化プローブの５’−末端がエキソ核酸切断反応によって切断され、第１標識は解離して、第２標識は固相基質上に残留するようになる。クエンチャー分子が蛍光性である場合、固相基質上に残留したクエンチャーは、第１標識が解離される前の初期シグナルと異なる蛍光シグナルを発生させ、これによりターゲット核酸配列が検出される。第２標識であるレポーター分子からのシグナルを測定してターゲット核酸配列を検出する。
【００６８】
本発明の最も主要な利点は、制限無しに内部標識の位置を決定することができることである。ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する内部標識起因抵抗性（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｌａｂｅｌ−ｃａｕｓｅｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）のため、内部標識は、固定化プローブの５’−末端から離隔されたどんな位置にも配置することができる。好ましくは、内部標識は、二重標識のクエンチング効率を最大化するに十分な位置に位置する。
【００６９】
本発明の好ましい具現例によると、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が第１標識と第２標識間の部位に作用する程度に、第１標識と第２標識は互いに離隔されている。
【００７０】
本発明の好ましい具現例によると、第２標識は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断される固定化プローブ上の切断部位により第１標識から分離される。
【００７１】
本発明の好ましい具現例によると、第２標識は、特定反応条件下で抵抗性により切断反応を終了させるのに適した位置に位置する。
【００７２】
好ましくは、第２標識は、第１標識から少なくとも２ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも３ヌクレオチド、さらに好ましくは、４ヌクレオチド離隔された位置にある。
【００７３】
好ましくは、第２標識は、第１標識から２−２５ヌクレオチド、２−２０ヌクレオチド、２−１５ヌクレオチド、３−２５ヌクレオチド、３−２０ヌクレオチド、３−１５ヌクレオチド、４−２５ヌクレオチド、４−２０ヌクレオチド又は４−１５ヌクレオチド離隔された位置にある。
【００７４】
本発明の好ましい具現例によると、第２標識は、ターゲット核酸配列から切断されたプローブが変性されることにより切断されなくなる部位（非切断部位）に位置しない。このような理由で、非切断部位は、反応条件又はプローブ配列に依存的であり、これは、第２標識の位置を決定する決定要因になる。
【００７５】
本発明の好ましい具現例によると、第２標識は、固定化プローブの３’−末端から少なくとも１０ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチド、さらに好ましくは、少なくとも２０ヌクレオチド、よりさらに好ましくは、少なくとも２５ヌクレオチド離隔された位置にある。
【００７６】
本発明により検出されるターゲット核酸配列は、特に制限されず、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ又はｃＤＮＡ）又はＲＮＡ分子を含む。また、本発明は、検出及び／又は増幅しようとするターゲット核酸配列が、ある特定配列又は長さを有する必要がない。ｍＲＮＡを初期物質として利用する場合、アニーリング工程の実施以前に逆転写工程が必須であり、これの詳細な内容は、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）；  及びＮｏｏｎａｎ，Ｋ．  Ｆ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：１０３６６  （１９８８）に開示されている。逆転写反応のためには、ランダムヘキサマー又はｍＲＮＡにハイブリッド形成されるオリゴヌクレオチドｄＴプライマーが利用される。本発明で検出できるターゲット核酸配列は、あらゆる天然（Ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）の原核細胞核酸、真核細胞（例えば、原生動物と寄生動物、菌類、酵母、高等植物、下等動物、及び哺乳動物と人間を含む高等動物）核酸、ウイルス（例えば、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス、肝炎ウイルス、ポリオウイルスなど）核酸、又はウイロイド核酸を含む。
【００７７】
プローブ又はプライマーのアニーリング又はハイブリッド形成は、当業界に公知の多様なハイブリッド形成過程により行うことができる。本発明の適したハイブリッド形成条件は、最適化手順により一連の過程で決定できる。温度、成分の濃度、ハイブリッド形成及び洗浄時間、バッファー成分及びこれらのｐＨ及びイオン強度のような条件は、多様な因子、例えば、プローブ及びターゲット核酸配列のようなオリゴヌクレオチドの長さ及びＧＣ量によって多様である。ハイブリッド形成の詳細な条件は、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ５  ，Ｎ．Ｙ．（２００１）；及びＭ．Ｌ．Ｍ．  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｉｎｃ．  Ｎ．Ｙ．（１９９９）で確認できる。
【００７８】
例えば、ターゲット核酸配列と固定化プローブのハイブリッド形成温度は、４０℃〜８０℃であり、より好ましくは、４５℃〜７５℃であって、さらに好ましくは、５０℃〜７２℃である。
【００７９】
ハイブリッド形成反応に続いて、工程（ａ）の結果物を、固定化プローブの切断が発生する条件下で５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと接触させる。固定化プローブがターゲット核酸配列にハイブリッド形成された場合にのみ、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼにより切断され、固定化プローブから第１標識が解離し、これは、固相基質上のシグナルの変化を引き起こす（参照：図１）。このようなシグナルの変化は、ターゲット核酸配列の存在を示す。
【００８０】
本明細書の表現‘固定化プローブの切断が発生する条件’は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼにより固定化プローブの切断が発生する反応条件を意味し、例えば、温度、ｐＨ、イオン強度、緩衝液、プローブ長さと配列及びエキソヌクレアーゼの種類を含む。例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが利用される場合、固定化プローブの切断が発生する条件は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２及び温度を含む。
【００８１】
本発明で利用する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、ターゲット核酸配列とのハイブリッド形成に係わるプローブに作用し、５’→３’方向にエキソ核酸切断反応を促進する酵素を含む。
【００８２】
本発明で利用される５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ及びバクテリオファージＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ）は、好ましくは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであり、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｎｔｒａｎｉｋｉａｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｌａｃｔｅｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｎｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｉｌｖａｎｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｚ０５及びＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｐｓ  １７を含む。
【００８３】
ターゲット核酸配列にハイブリッド形成された固定化プローブは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼにより切断され、固定化プローブから第１標識が解離し、これにより固相基質上のシグナルの変化を引き起こす。
【００８４】
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼによる固定化プローブのエキソ核酸切断反応後、前記反応は、第２標識が結合したヌクレオチドで終了される。エキソ核酸切断反応の終了は、第２標識が結合したヌクレオチドの抵抗性により誘導され、最終的に、第２標識は、固相基質上に残留するようになる。
【００８５】
エキソ核酸切断反応の終了に続いて、固相基質上でシグナルの変化（シグナル増加又は減少）を検出し、固定化プローブの前記切断によるシグナルの変化は、ターゲット核酸配列の存在を示す。
【００８６】
シグナルは、各標識に対する従来の方法により検出又は測定できる。例えば、蛍光シグナルは、従来の方法、例えば、蛍光測定器により検出又は測定できる。
【００８７】
最終的に、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナル変化が固相で検出される。好ましくは、固定化プローブの切断によるシグナル変化は、固相基質上のシグナル増加である。
【００８８】
本発明の反応環境を提供する固相基質、好ましくは、マイクロアレイは、当業界に公知である如何なるマイクロアレイも含む。本発明の全ての過程、即ち、ターゲット配列とのアニーリング、伸長／切断反応及び蛍光の検出は、マイクロアレイ上でなされる。マイクロアレイで固定化プローブは、ハイブリッド形成アレイ要素（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ  ａｒｒａｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ）として利用される。マイクロアレイを製作するための固相基質は、例えば、金属（例えば、金、金と銅の合金、アルミニウム）、金属オキシド、ガラス、セラミック、石英、シリコン、半導体、Ｓｉ／ＳｉＯ２ウェハー、ゲルマニウム、ガリウムアルセニド、カーボン、炭素ナノチューブ、ポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリルアミド）、セファロース、アガロース及びコロイドを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の複数の固定化プローブは、固相基質上の一つのアドレサブル（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）領域（ｒｅｇｉｏｎ）又は複数のアドレサブル領域に固定化されて、固相基質は、２〜１，０００，０００個のアドレサブル領域を含むことができる。フォトリソグラフィー、インクジェッティング、機械的マイクロスポッティング及びその類似方法のような従来の製作技術により、アレイ又は特定応用のためのアレイを提供するために、固定化プローブが製作（ｆａｂｒｉｃａｔｅ）され得る。
【００８９】
本発明は、固相基質上の固定化プローブは、互いに物理的に離隔されているため、一種類の二重標識を利用するとしても、多数のターゲット核酸配列を固相基質上で同時に検出することができる。このような点で、本発明により固相で検出されるターゲット核酸配列の数は制限されない。
【００９０】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の方法は、前記工程（ａ）−（ｂ）又は（ａ）−（ｃ）を反復する工程（好ましくは２回、より好ましくは、少なくとも５回、さらに好ましくは、少なくとも１０回）と、その反復サイクルの間に変性過程とをさらに含む。
【００９１】
工程（ａ）−（ｂ）又は（ａ）−（ｃ）を反復する場合、本発明は、ターゲット核酸配列の二本鎖を一本鎖に変性する過程をさらに含むことが好ましい。
【００９２】
工程（ａ）−（ｂ）又は（ａ）−（ｃ）を反復して反復的エキソ核酸切断反応を誘導する場合、シグナル変化程度は、ターゲット核酸配列の量によって増加し、ターゲット核酸配列の定量を可能にする。本発明を反復的エキソ核酸切断反応によって実施する場合、工程（ｄ）の検出は、反復の終了時点で（即ち、エンドポイント方式）、反復の各サイクルで（即ち、リアルタイム方式）、又は反復の間、所定の時間間隔のそれぞれにおいて実施することができる。リアルタイム検出は、ターゲット核酸配列を定量化するに適している。
【００９３】
洗浄工程は、工程（ｄ）以前に実施できる。しかし、本発明は、固相基質上の二重標識プローブから解離した標識分子の干渉がなく、固相基質を洗浄しない共焦点レーザースキャナのような適した機器を利用して、固相基質上に存在するシグナルのみを検出することができる。
【００９４】
本発明の好ましい具現例によると、工程（ａ）は、固定化プローブにハイブリッド形成されるターゲット核酸配列を生成するための逆方向プライマーを追加的に含む。ターゲット核酸配列の追加的な生成は、シグナル変化が強く発生されるようにする。
【００９５】
例えば、少なくとも２種の増幅プライマーを利用して少なくとも２種のターゲット核酸配列をマルチプレックス増幅して、少なくとも２種の固定化プローブにハイブリッド形成させ、少なくとも２種の逆方向プライマー及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを利用して伸長及び切断反応を実施すると、最終的に、逆方向プライマーを使用しない反応より増加されたシグナル変化を得る。
【００９６】
本発明の好ましい具現例によると、固定化プローブは、修飾二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する。ｍＤＳＯ構造は、標準的なプローブより非常に高いターゲット特異性を有する（参照：ＷＯ２０１１／０２８０４１）。
【００９７】
本発明の好ましい具現例によると、前記固定化プローブは、ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別するようにする下記一般式Ｉの修飾二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有するターゲット区別性プローブ（ｔａｒｇｅｔ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｖｅ  ｐｒｏｂｅ：ＴＤプローブ）である方法を提供する。
５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’  （Ｉ）
（式中、Ｘ’ｐは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第２ハイブリッド形成部位であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つのユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’ｒは、前記ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第１ハイブリッド形成部位であり、前記ＴＤプローブは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を有し、前記相互作用的二重標識は、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子間のエネルギークエンチングを誘導できるように前記固定化プローブに位置し、第１標識及び第２標識は、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子から選択され、前記第１標識は、前記５’−第２ハイブリッド形成部位の５’−末端に結合し、前記第２標識は、前記第１標識の下流に位置したヌクレオチドの塩基に結合して、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−第２ハイブリッド形成部位のＴｍは、前記３’−第１ハイブリッド形成部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記Ｘ’ｐ、Ｙ’ｑ、Ｚ’ｒの三つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記分割部位は、前記ターゲット核酸配列に対するハイブリッド形成に関して、前記５’−第２ハイブリッド形成部位が前記３’−第１ハイブリッド形成部位から分割し、これにより、前記ＴＤプローブのハイブリッド形成特異性は、前記５’−第２ハイブリッド形成部位及び前記３’−第１ハイブリッド形成部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＤプローブの全体ハイブリッド形成特異性を向上させ、前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合は、前記５’−第２ハイブリッド形成部位及び前記３’−第１ハイブリッド形成部位が両方ともターゲット核酸配列とハイブリッド形成し、前記５’−第２ハイブリッド形成部位の５’−末端が前記ＤＮＡポリメラーゼのエキソ核酸切断反応により切断され、前記第１標識が前記ＴＤプローブから解離して前記固相基質上のシグナルの変化を引き起こし、前記第２標識が結合した塩基を有する前記ヌクレオチドの抵抗性により、前記第２標識が前記固相基質上に残留し、前記ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合は、前記５’−第２ハイブリッド形成部位及び前記分割部位が両方とも一本鎖を形成し、前記５’−第２ハイブリッド形成部位がＤＮＡポリメラーゼにより切断されず、前記固相基質上におけるシグナルの変化を引き起こさず、これにより、前記ＴＤプローブが前記ターゲット核酸配列及び非ターゲット核酸配列を区別して、前記固相基質上における前記シグナル変化は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す）。
【００９８】
本明細書で使用される用語‘ターゲット区別性プローブ（Ｔａｒｇｅｔ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｖｅ  ｐｒｏｂｅ）’は、上述のｍＤＳＯ構造を有して、ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列に互いに異なるパターンでハイブリッド形成され、ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列を区別できるようにするプローブを意味する。
【００９９】
前記ｍＤＳＯ構造を有する本発明で利用されるＴＤプローブは、（ｉ）ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列；及び（ｉｉ）ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列の区別に決定的な役割をする５’−第２ハイブリッド形成部位と分割部位を含む。
【０１００】
前記ｍＤＳＯ構造は、ＤＳＯ（ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）構造の新しい修飾形態であって、前記ＤＳＯは、本発明者によって最初に提示された（ＷＯ２００６／０９５９８１）。また、前記ＤＳＯ構造がプライマー役割をする場合は、ｄｕａｌ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ＤＰＯ）と命名される（Ｃｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｕａｌ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＳＮＰ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ＣＹＰ２Ｃ１９  ｇｅｎｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５：６ｅ４０（２００７））。ＤＳＯは、ハイブリッド形成又はアニーリングが分割領域により互いに分離された５’−高Ｔｍ特異性部位（又は５’−第１ハイブリッド形成部位、５’−第１プライミング部位）及び３’−低Ｔｍ特異性部位（又は３’−第２ハイブリッド形成部位、３’−第２プライミング部位）により二重的に決定されるようにする新規な概念を具現したもので、非常に向上されたハイブリッド形成特異性を示す（参照ＷＯ  ２００６／０９５９８１；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｒｅｃｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ｕｓｉｎｇ  ｄｕａｌ−ｐｒｉｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｒｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４９：７６−８４（２００８）；Ｋｉｍ，ｅｔ．  ａｌ．，Ｒａｐｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  １２  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｄｕａｌ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｓｔｅｍ−ｂａｓｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｖｉｒｏｍｅｔ．２００８．１１．００７（２００８）；  Ｈｏｒｉｉ  ｅｔ．  ａｌ．，Ｕｓｅ  ｏｆ  ｄｕａｌ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｓｅｘｕａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ，Ｌｅｔｔｅｒｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｄｏｉ：１０．１１１／ｊ．１４７２−７６５Ｘ２００９．０２６１８ｘ（２００９）））。上述のように、前記ＤＳＯは、互いに異なるハイブリッド形成特性を有する二つの断片を究極的に有するようになる：初期の安定したハイブリッド形成を生じる５’−第１ハイブリッド形成部位；及びターゲット特異性を決定する３’−第２ハイブリッド形成部位。このＤＳＯは、二重的にハイブリッド形成が決定されるため、大いに向上されたハイブリッド形成特異性を示すことができる。
【０１０１】
前記ｍＤＳＯ構造は、前記ＤＳＯ構造が逆転されたものである：ターゲット特異性を決定する５’−第２ハイブリッド形成部位及び初期の安定したハイブリッド形成を生じる３’−第１ハイブリッド形成部位。ＴＤプローブの５’−第２ハイブリッド形成部位がターゲット核酸配列に完璧にハイブリッド形成される場合にのみ、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼによりプローブの５’−末端が切断されて、これは、ＴＤプローブの驚くべきターゲット特異性に寄与する。
【０１０２】
本発明において、ＴＤプローブは、ターゲット核酸配列の検出、特にターゲット核酸配列のマルチプレックス検出において、偽陽性データの除去に部分的に寄与して、これは、ＴＤプローブがターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列に対して明確に異なるハイブリッド形成の性質（ｂｅｈａｖｉｏｒ）を示すからである。
【０１０３】
ＴＤプローブがターゲット核酸配列にハイブリッド形成される場合、ＴＤプローブの５’−第２ハイブリッド形成部位及び３’−第１ハイブリッド形成部位がターゲット核酸配列と二本鎖を形成する。ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列にハイブリッド形成される場合（即ち、非ターゲットハイブリッド形成又は結合）、その３’−第１ハイブリッド形成部位が優勢的に非ターゲット核酸配列に結合するが、５’−第２ハイブリッド形成部位及び分割部位の両方とも、非ターゲット核酸にハイブリッド形成されず、一本鎖を形成するようになる。
【０１０４】
ＴＤプローブがターゲット核酸配列にハイブリッド形成される場合、その５’−第２ハイブリッド形成部位は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼにより切断され、第１標識（例えば、クエンチャー分子）は解離して、シグナル変化が発生する。第２標識で標識されたヌクレオチドの抵抗性のため、第２標識は、固相基質上に残留するようになる。したがって、固相基質上でターゲットか核酸配列の存在を示すシグナル変化が得られ、これによりターゲット核酸配列の存在が決定される。
【０１０５】
これと対照的に、ＴＤプローブが非ターゲット核酸配列にハイブリッド形成される場合、５’−第２ハイブリッド形成部位及び分割部位の両方とも一本鎖を形成し、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼにより切断されない。ＴＤプローブの切断反応が発生しないと、結局シグナル変化も発生しない。
【０１０６】
本発明の好ましい具現例によると、第２標識は、ＴＤプローブの５’−第２ハイブリッド形成部位に位置する。第２標識で標識されたヌクレオチドの抵抗性のため、ＴＤプローブがターゲット核酸配列にハイブリッド形成された後、切断される場合にも、５’−第２ハイブリッド形成部位の第２標識は、切断されず、固相基質上に残留する。
【０１０７】
本発明の好ましい具現例によると、分割部位に位置するユニバーサル塩基は、デオキシイノシン、イノシン、７−デアザ−２’−デオキシイノシン、２−アザ−２’−デオキシイノシン、２’−ＯＭｅイノシン、２’−Ｆイノシン、デオキシ３−ニトロピロール、３−ニトロピロール、２’−ＯＭｅ３−ニトロピロール、２’−Ｆ３−ニトロピロール、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、デオキシ５−ニトロインドール、５−ニトロインドール、２’−ＯＭｅ５−ニトロインドール、２’−Ｆ５−ニトロインドール、デオキシ４−ニトロベンズイミダゾール、４−ニトロベンズイミダゾール、デオキシ４−アミノベンズイミダゾール、４−アミノベンズイミダゾール、デオキシネブラリン、２’−Ｆネブラリン、２’−Ｆ４−ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ−５−イントロインドール、ＰＮＡ−ネブラリン、ＰＮＡ−イノシン、ＰＮＡ−４−ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ−３−ニトロピロール、モルフォリノ−５−ニトロインドール、モルフォリノ−ネブラリン、モルフォリノ−イノシン、モルフォリノ−４−ニトロベンズイミダゾール、モルフォリノ−３−ニトロピロール、ホスホルアミデート−５−ニトロインドール、ホスホルアミデート−ネブラリン、ホスホルアミデート−イノシン、ホスホルアミデート−４−ニトロベンズイミダゾール、ホスホルアミデート−３−ニトロピロール、２’−Ｏ−メトキシエチルイノシン、２’−Ｏ−メトキシエチルネブラリン、２’−Ｏ−メトキシエチル５−ニトロインドール、２’−Ｏ−メトキシエチル４−ニトロ−ベンズイミダゾール、２’−Ｏ−メトキシエチル３−ニトロピロール、及び前記塩基の組み合せからなる群から選択される。より好ましくは、分割領域に位置するユニバーサル塩基は、デオキシイノシン、イノシン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール又は５−ニトロインドールであり、最も好ましくは、デオキシイノシンである。
【０１０８】
好ましくは、前記分割部位は、少なくとも３個のユニバーサル塩基、より好ましくは、少なくとも４個のユニバーサル塩基、最も好ましくは、少なくとも５個のユニバーサル塩基を有するヌクレオチドを含む。より好ましくは、前記分割部位は、少なくとも３個のユニバーサル塩基、より好ましくは、少なくとも４個のユニバーサル塩基、最も好ましくは、少なくとも５個のユニバーサル塩基を有する連続したヌクレオチドを含む。選択的に、分割部位は、３〜１０個、３〜８個、４〜７個又は４〜５個の連続したユニバーサル塩基を含む。
【０１０９】
好ましくは、前記３’−第１ハイブリッド形成部位の長さは、５’−第２ハイブリッド形成部位より長い。３’−第１ハイブリッド形成部位は、好ましくは、１５〜６０ヌクレオチドの長さを有し、より好ましくは、１５〜４０ヌクレオチドの長さを有し、さらに好ましくは、１５〜３０ヌクレオチドの長さを有する。好ましくは、５’−第２ハイブリッド形成部位は、少なくとも３ヌクレオチド、より好ましくは、５ヌクレオチド、さらに好ましくは、６ヌクレオチドの長さを有する。５’−第２ハイブリッド形成部位は、好ましくは、多くとも１５ヌクレオチド、より好ましくは、多くとも１３ヌクレオチド、さらに好ましくは、多くとも１２ヌクレオチドの長さを有する。５’−第２ハイブリッド形成部位は、好ましくは、３〜１５ヌクレオチドの長さを有して、より好ましくは、３〜１３ヌクレオチド、さらに好ましくは、４〜１２ヌクレオチド、最も好ましくは、５〜１１ヌクレオチドの長さを有する。分割部位は、好ましくは、３〜１０ヌクレオチド、より好ましくは、３〜８ヌクレオチド、さらに好ましくは、４〜７ヌクレオチド、最も好ましくは、４〜５ヌクレオチドの長さを有する。５’−第２ハイブリッド形成部位及び分割部位の長さは、少なくとも６ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも９ヌクレオチド、さらに好ましくは、少なくとも１２ヌクレオチド、最も好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有する。
【０１１０】
本発明の好ましい具現例によると、３’−第１ハイブリッド形成部位は、４０℃〜８０℃のＴｍを有して、より好ましくは、４５℃〜７０℃のＴｍを有する。５’−第２ハイブリッド形成部位は、好ましくは、６℃〜４０℃のＴｍを有して、より好ましくは、１０℃〜４０℃のＴｍを有する。前記分割部位は、好ましくは、２℃〜１５℃のＴｍを有し、より好ましくは、３℃〜１５℃のＴｍを有する。
【０１１１】
本発明の好ましい具現例によると、第２標識は、ＴＤプローブの５’−第２ハイブリッド形成部位に位置する。より好ましくは、５’−第２ハイブリッド形成部位上の第２標識は、５’−第２ハイブリッド形成部位の５’−末端に結合した第１標識から２〜１５ヌクレオチド、より好ましくは、２〜１０ヌクレオチド離隔された位置にある。
【０１１２】
本発明の好ましい具現例によると、本発明に利用されるターゲット核酸配列は、増幅用プライマーにより前増幅された核酸配列である。前増幅された核酸配列の利用は、本発明のターゲット検出の感度と特異性を増加させる。
【０１１３】
本発明の好ましい具現例によると、逆方向プライマー又は増幅用プライマーは、二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有する。ＤＰＯ構造は、本明細書全体に参照として取り込まれたＷＯ２００６／０９５９８１で開示したように、標準的なプライマーより非常に高いターゲット特異性を有する。
【０１１４】
プライマー又はプローブを言及しながら使用される用語‘標準的な’は、ｍＤＳＯ構造又はＤＰＯ構造を有しないあらゆるプライマー又はプローブを意味する。それらは、本明細書において標準的なプライマー又はプローブとして説明される。
【０１１５】
本発明は、少なくとも２種のターゲット核酸配列の同時（マルチプレックス）検出にもよく適用される。本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み（より好ましくは、少なくとも３種、さらに好ましくは、少なくとも５種）、プローブ（及び／又は逆方向プライマー）は、少なくとも２種のプローブを含む（より好ましくは、少なくとも３種、さらに好ましくは、少なくとも５種）。
【０１１６】
さらに、本発明は、ヌクレオチド変異の検出にも非常に有用である。本発明で使用される用語‘ヌクレオチド変異（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）’は、連続的ＤＮＡ断片又は配列の類似したＤＮＡ断片において、特定位置に存在するＤＮＡ配列のヌクレオチド多型を意味する。そのような連続的ＤＮＡ断片は、一つの遺伝子又は一つの染色体のある他の部位を含む。例えば、本発明で検出されるヌクレオチド変異は、ＳＮＰ（一塩基多型、ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、欠失、挿入、置換及びトランスロケーションを含む。ヌクレオチド変異の例は、ヒトゲノムにある多様な変異（例えば、ＭＴＨＦＲ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）遺伝子の変異）、病原体の薬剤耐性に係わる変異及び癌発生−関連ヌクレオチドの変異を含む。本発明の好ましい具現例によると、固定化プローブは、ヌクレオチド変異に相補的な又は該当するヌクレオチドを含む。
【０１１７】
本発明の他の様態によると、本発明は、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性を有する二重標識プローブを利用して固相でＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するキットであって、（ａ）固相基質と、（ｂ）前記ターゲット核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を有する固定化プローブであって、その３’−末端を通じて固相基質上に固定化された前記プローブは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を有して、前記相互作用的二重標識は、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子間のエネルギークエンチングを誘導できるように前記固定化プローブに位置して、第１標識及び第２標識は、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子から選択されて、前記第１標識は、前記固定化プローブの５’−末端に結合し、前記第２標識は、前記第１標識の下流に位置したヌクレオチドの塩基に結合して、このような前記第２標識の結合は、前記ヌクレオチドが前記ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性を有するようにする前記固定化プローブと、（ｃ）５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する前記ＤＮＡポリメラーゼと、を含むキットを提供する。
【０１１８】
本発明のキットは、上述の本発明の検出方法を実施するために製作されたもので、その共通する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるためにその記載を省く。
【０１１９】
本発明の好ましい具現例によると、第１標識は、クエンチャー分子であり、第２標識は、レポーター分子である。択一的に、第１標識は、レポーター分子であり、第２標識は、クエンチャー分子である。
【０１２０】
本発明の好ましい具現例によると、第２標識は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断される固定化プローブ上の切断部位により第１標識から分離される。好ましくは、第２標識は、第１標識から２〜２０ヌクレオチド離隔された位置にある。より好ましくは、第２標識は、第１標識から４〜１５ヌクレオチド離隔された位置にある。
【０１２１】
本発明の好ましい具現例によると、第１標識は、固定化プローブの５’−末端のホスフェート基に結合する。
【０１２２】
本発明の好ましい具現例によると、第２標識は、前記固定化プローブにおけるチミジンヌクレオチドのチミンに結合する。
【０１２３】
本発明の好ましい具現例によると、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。
【０１２４】
本発明の好ましい具現例によると、本キットは、固定化プローブにハイブリッド形成されるターゲット核酸配列を生成するための逆方向プライマーを追加的に含む。
【０１２５】
本発明の好ましい具現例によると、固定化プローブは、ターゲット核酸配列と非ターゲット核酸配列とを区別するようにする一般式Ｉの修飾二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有するターゲット区別性プローブ（ｔａｒｇｅｔ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｖｅ  ｐｒｏｂｅ：ＴＤプローブ）である。
【０１２６】
好ましくは、本キットは、ターゲット核酸配列増幅用プライマーセットを追加的に含み、前記ターゲット核酸配列は、前増幅された核酸配列である。
【０１２７】
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み、固定化プローブは、少なくとも２種のプローブを含む。好ましくは、ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む。
【０１２８】
本発明のキットは、バッファー、ＤＮＡポリメラーゼ助因子及びデオキシリボヌクレオチド−５−トリホスフェートのようなターゲット増幅ＰＣＲ反応（例えば、ＰＣＲ反応）に必要な試薬を選択的に含むことができる。選択的に、本発明のキットは、多様なポリヌクレオチド分子、逆転写酵素、多様なバッファー及び試薬、及びＤＮＡポリメラーゼ活性を抑制する抗体を含むことができる。
【０１２９】
また、本発明のキットは、陽性対照群及び陰性対照群反応を実施するために必要な試薬を含むことができる。特定反応で使用される試薬の最適量は、本明細書の開示事項を習得した当業者により容易に決定できる。典型的に、本発明のキットは、上記言及された構成成分を含む別途の包装又は区分で製作される
【０１３０】
本発明のまた他の様態によると、本発明は、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する抵抗性をオリゴヌクレオチドに付与する方法であって、（ａ）前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する工程と、（ｂ）前記オリゴヌクレオチドのうち一つのヌクレオチドの塩基に標識を有するオリゴヌクレオチドを合成する工程（これにより、前記ヌクレオチドは、前記ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性を有する）と、を含む方法を提供する。
【０１３１】
本発明は、上述の検出方法に利用されるＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する塩基−標識ヌクレオチドの抵抗性に係わるもので、その共通する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるためにその記載を省く。
【０１３２】
オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、ターゲット核酸配列に相補的な配列を有するように決定できる。ヌクレオチドがターゲット核酸配列に特異的にハイブリッド形成できる範囲内で、ヌクレオチド配列は、ターゲット核酸配列に対する一つ又はそれ以上のミスマッチヌクレオチドを有することができる。
【０１３３】
本発明の好ましい具現例によると、オリゴヌクレオチドは、プローブである。
【０１３４】
オリゴヌクレオチドの合成は、開示された従来の方法によって実施できる（例えば、Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒらがＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：６１５９−６１６８（１９８４）で開示した自動合成機を利用する固相ホスホラミダイトトリエステル方法（ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  ｔｒｉｅｓｔｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ，Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｓ．，２２（２０）：１８５９−１８６２（１９８１））。
【０１３５】
本発明の好ましい具現例によると、標識が結合した塩基を有するヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの内部ヌクレオチドである。
【０１３６】
ヌクレオチドの塩基成分と標識の結合は、開示された従来の方法によって実施できる（Ｎｅｌｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０（２３）：６２５３−６２５９（１９９２）；米国特許第４，７５７，１４１号、第５，５５９，７６７号及び第５，２３１，１９１号；及びＨａｒａｌａｍｂｉｄｉｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５：４８５６−４８７６（１９８７））。
【０１３７】
標識が結合する塩基成分は、アデニン、グアニン、シトシン及びチアミンを含み、好ましくは、チアミンである。
【０１３８】
標識による塩基成分の標識は、ターゲット核酸配列が水素結合をする位置以外の位置に結合することが好ましい。例えば、標識は、チアミンの５番又は６番炭素に結合でき、好ましくは、チアミンの５番炭素のメチル基である。
【０１３９】
本発明の特徴及び利点を要約すると、以下の通りである：
（ａ）本発明は、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの塩基成分と標識の結合が、オリゴヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性を有するようにするという独特な特徴を利用する。本発明は、固相に固定化されたプローブ上の二重標識システムと共に、このような独特な特徴をターゲット検出システムに適用する。その５’−末端及び内部部位に標識を有する固定化プローブがターゲット核酸配列にハイブリッド形成される場合、固定化プローブは、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、その５’−末端で５’→３’方向に徐々に切断されて、その５’−末端にある標識が解離する。抵抗性により塩基成分に標識された内部ヌクレオチドで切断反応は終了して、結局、内部ヌクレオチドの標識は、固相基質に残留するようになり、最終的に、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナル変化が提供される。
（ｂ）本発明は、内部ヌクレオチドの塩基成分の標識によるＤＮＡポリメラーゼのプライマー非依存的５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する抵抗性により、固相基質上に第２標識が残留するよう適した位置を考慮する必要がない。これとは異なって、ＤＮＡポリメラーゼのプライマー依存的５’→３’ヌクレアーゼ活性を利用する固相基質におけるＴａｑＭａｎプローブに基づく方法は、固相基質に第２標識を残留させるために、反応条件を考慮し、第２標識の位置を厳格に決定しなければならない。
（ｃ）本発明は、プローブ上の内部標識の位置を自由に決定することができるため、二重標識システムのクエンチング効率を最大化するために適したプローブ上の位置に標識を位置させることにより、バックグラウンドシグナルを最小化する。
（ｄ）本発明で使用される好ましいプローブであるｍＤＳＯ構造を有するＴＤプローブは、標準的なプローブが非ターゲット核酸配列に非特異ハイブリッド形成することにより、一般的に発生する偽陽性シグナルの除去に部分的に寄与する。
（ｅ）相互作用的二重標識を利用する本発明は、エンドポイント又はリアルタイム方式で固相におけるシグナル変化（シグナル減少又は増加）を測定することができ、ターゲット核酸配列の定性的分析だけではなく、定量的な分析もできる。
（ｆ）本発明は、プローブ及びターゲット核酸配列間のハイブリッド形成だけではなく、酵素反応（ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による）によるシグナル変化を提供する。即ち、本発明のターゲット特異性は、二重に決定され、プローブの非特異的ハイブリッド形成による偽陽性結果問題が成功的に解決される。しかも、本発明のサイクリック反復は、固定化プローブがシグナル変化を提供するようにして、これにより、シグナルの変化程度を最大化することができる。
（ｇ）本発明は、ＴａｑＭａｎプローブに基づく方法と異なり、プライマーの使用無しに、固定化されたプローブのみを利用して実施できる。したがって、本発明は、多数のオリゴヌクレオチドの配列決定及び反応条件の最適化における困難性及び費用に対する非効率性のような、オリゴヌクレオチドを利用する方法でみられる多くの問題点から完璧に自由である。このような利点は、マルチプレックスターゲット検出において、より明確に認識される。
（ｈ）本発明は、固相基質上の固定化プローブが互いに物理的に離隔されているため、一種類の二重標識を利用するとしても、多数のターゲット核酸配列を固相基質上で同時に検出することができる。
【実施例】
【０１４０】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
【０１４１】
実施例１：ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する抵抗性の評価
本発明者は、その塩基に標識が結合したヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性を有するかどうかを評価した。
【０１４２】
このような評価のために、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）遺伝子の合成オリゴヌクレオチドを鋳型として使用した。５’ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ、Ｔｔｈ及びＴｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼを５’→３’エキソ核酸切断反応（５’→３’ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）に利用した。二重標識プローブをこの評価に利用した。前記プローブは、その５’−末端にあるホスフェート基（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）又はチミジンヌクレオチドのチミン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：３、４、５、６及び７）に結合した蛍光レポーター分子（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ，ＦＡＭ）を有し、その３’−末端には、クエンチャー分子（ＢＨＱ−１）を有する。本実施例で利用されたプローブは、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）から提供してもらった。カーボンスペーサー（Ｃ６スペーサー）を含んでいるＦＡＭをプローブ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）製作に利用した。
【０１４３】
本実施例で利用した合成鋳型及びプローブの配列は、下記の通りである：
ＳＡ−Ｔ  ５’−ＧＧＴＧＴＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＡＡＣＡＡＣＧＣＣＧＴＡＡＡＣＣＧＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＣＡＣＧＧＡＡＴＧＡＡＴＡＡＴＧＴＴＧＡＡ
ＴＴＴＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）
ＳＡ−Ｃｏｎ−Ｍ１  ［ＦＡＭ］ＴＣＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＴＴＴＡＣＧＧＣＧＴＴＧ［ＢＨＱ−１］（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
ＳＡ−Ｃｏｎ−Ｄ０（ｄＴ）  ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＣＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＴＴＴＡＣＧＧＣＧＴＴＧ［ＢＨＱ−１］（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）
ＳＡ−Ｃｏｎ−Ｄ１（ｄＴ）  Ｇ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＣＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＴＴＴＡＣＧＧＣＧＴＴＧ［ＢＨＱ−１］（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）
ＳＡ−Ｃｏｎ−Ｄ３（ｄＴ）  ＴＧＧ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＣＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＴＴＴＡＣＧＧＣＧＴＴＧ［ＢＨＱ−１］（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）
ＳＡ−Ｃｏｎ−Ｄ５（ｄＴ）  ＣＧＴＧＧ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＣＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＴＴＴＡＣＧＧＣＧＴＴＧ［ＢＨＱ−１］（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）
ＳＡ−Ｃｏｎ−Ｄ８（ｄＴ）  ＴＴＣＣＧＴＧＧ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＣＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＴＴＴＡＣＧＧＣＧＴＴＧ［ＢＨＱ−１］（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）
（下線の文字は、蛍光レポーター分子が結合したチミンを示す）
【０１４４】
ＳＡに対する合成鋳型（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）０．５ｐｍｏｌｅ、プローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：２、３、４、５、６又は７）５ｐｍｏｌｅ、１０×反応バッファー（５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）２μＬ、ｄＮＴＰｓそれぞれ５０μＭ、Ｔａｑ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）、Ｔｔｈ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳ）又はＴｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳ）２ｕｎｉｔを含有した２０μＬの最終容量で反復的エキソ核酸切断反応を行った。前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に設置し；前記反応混合物を９５℃で２分間変性させた後、９５℃で２０秒間、５５℃で２０秒間の過程を５０回反復した。各サイクルの５５℃でシグナルを検出した。
【０１４５】
図２、３及び４から分かるように、ターゲット核酸が存在する場合、５’−末端にあるホスフェート基に蛍光レポーター分子が結合したプローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）は、蛍光シグナルが発生した。しかし、ターゲット核酸が存在するとしても、チミジンヌクレオチドのチミンに蛍光レポーター分子が結合したプローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：３、４、５、６及び７）は、蛍光シグナルが発生しなかった。ターゲット核酸がない場合、蛍光シグナルは、発生しなかった。
【０１４６】
このような結果は、塩基に標識を有するヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性を有することを示す。
【０１４７】
実施例２：二重標識プローブ及びＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する抵抗性を利用したマイクロアレイ上におけるターゲット核酸配列の検出
本発明者は、二重標識プローブを利用した固相におけるターゲット核酸配列検出に、塩基に標識が結合したヌクレオチドの抵抗性を適用した。５’−ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを５’→３’エキソ核酸切断反応に利用した。
【０１４８】
二重標識プローブは、その５’−末端にクエンチャー分子（ＢＨＱ−２）を有し、且つ内部チミジンヌクレオチドのチミンに結合した蛍光レポーター分子（Ｑｕａｓａｒ５７０）を有する。カーボンスペーサー（Ｃ６スペーサー）を含んでいるＱｕａｓａｒ５７０を利用して、前記プローブ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を製作した。追加的に挿入されたカーボンスペーサー（Ｃ６スペーサー）を通じてＢＨＱ−２を結合した。プローブの３’−末端にあるアミノ基（ＡｍｉｎｎｏＣ７）を利用してプローブをガラススライド上に固定化させた。５’−末端に蛍光レポーター分子（Ｑｕａｓａｒ５７０）を有するマーカープローブをその３’−末端にあるアミノ基を利用してガラススライド上に固定化させた。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）に対する合成オリゴヌクレオチドを鋳型として利用した。
【０１４９】
本実施例で利用した合成鋳型、二重標識プローブ及びマーカーの配列は、下記の通りである：
ＳＡ−Ｔ  ５’−ＧＧＴＧＴＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＡＡＣＡＡＣＧＣＣＧＴＡＡＡＣＣＧＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＣＡＣＧＧＡＡＴＧＡＡＴＡＡＴＧＴＴＧＡＡ
ＴＴＴＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）
ＳＡ−Ｃｏｎ−Ｍ  ［ＢＨＱ−２］［Ｃ６スペーサー］ＴＣＡＴＴＣＣＧ［Ｔ（Ｑｕａｓａｒ５７０）］ＧＧＴＣＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＴＴＴＡＣＧＧＣＧＴＴＧ
ＴＴＡＣＣＴＴＴＴＴ［ＡｍｉｎｏＣ７］（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）
Ｍａｒｋｅｒ  ［Ｑｕａｓａｒ５７０］ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴ［ＡｍｉｎｏＣ７］（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）
（下線の文字は、蛍光レポーター分子が結合したチミンを示す）
【０１５０】
ＮＳＢ９  ＮＨＳスライド（ＮＳＢＰＯＳＴＥＣＨ、Ｋｏｒｅａ）を前記二重標識プローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）及びマーカー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）の製作に利用した。ＮＳＢスポッティングバッファーで最終濃度５０μＭになるように溶解させた前記二重標識プローブ及びマーカーを、ＰｅｒｓｏｎａｌＡｒｒａｙｅｒＴＭ１６  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｐｏｔｔｅｒ（ＣａｐｉｔａｌＢｉｏ、Ｃｈｉｎａ）を利用してＮＳＢ９  ＮＨＳスライド上にプリントした。前記二重標識プローブ及びマーカーを２×１フォーマット（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ  ｓｐｏｔｓ）で並べてスポッティングして、このようにして製作したスライドを約８５％湿度のチャンバに一晩中インキュベートした。非特異的に結合した二重標識プローブ及びマーカーを除去するために、前記スライドを２×ＳＳＰＥ（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍリン酸水素ナトリウム及び２．０ｍＭ  ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．４及び７．０ｍＭ  ＳＤＳを含有したバッファー溶液に３７℃で３０分間洗浄し、蒸留水で洗浄した。その後、スライド遠心分離機を利用して、前記ＤＮＡ機能化された（ＤＮＡ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）スライドを乾燥させて、使用前まで４℃暗室で保管した。
【０１５１】
ＳＡに対する合成鋳型（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）１０ｐｍｏｌｅ、１０×反応バッファー（６ｍＭ  ＭｇＣｌ２）３μＬ、ｄＮＴＰｓそれぞれ２００μＬ及びＤｉａｓｔａｒ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）１．２ｕｎｉｔを含有した３０μＬの最終容量で、エキソ核酸切断反応を行った；前記二重標識プローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）が交互結合（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ）されたスライドの表面上に組み立てられたチャンバに前記全混合物を適用した。スライドをｉｎ  ｓｉｔｕブロック方式でサーマルサイクラー（Ｇｅｎｅｐｒｏ  Ｂ４Ｉ、Ｃｈｉｎａ）に設置した。前記反応を下記のように実施した：９５℃で２分間変性及び５５℃で６０分間。最終的に前記スライドを１００℃で蒸留水で１分間洗浄した。それぞれ洗浄した後、イメージ獲得は、共焦点レーザースキャナーＡｘｏｎ  ＧｅｎｅＰｉｘ４１００Ａ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳ）を利用し、１０μｍピクセル解像度のスキャニングで行った。蛍光強度は、定量的なマイクロアレイ分析ソフトウェア、ＧｅｎｅＰｉｘ  ｐｒｏ６．０ソフトウェア（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳ）を利用して分析した。蛍光強度は、周辺バックグラウンドを除去した後、スポット−中央値で表現した。再現性を調べるために、各スポットは、２個ずつスポッティングした。蛍光強度を、２個のスポットの平均値で示した。
【０１５２】
図５から分かるように、ターゲット核酸が存在する場合、蛍光シグナルが発生した（ＲＦＵ：６５，４８６±０．７）。ターゲット核酸がない場合は、蛍光シグナルが発生しなかった。
【０１５３】
実施例３：二重標識ＴＤプローブ及びＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する抵抗性を利用したマイクロアレイ上におけるターゲット核酸配列の検出
本発明者は、二重標識ＴＤプローブを利用した固相におけるターゲット核酸配列検出に、塩基に標識が結合したヌクレオチドのＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する抵抗性を適用した。５’−ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを５’→３’エキソ核酸切断反応に利用した。
【０１５４】
二重標識ＴＤプローブは、その５’−末端にクエンチャー分子（ＢＨＱ−２）を有し、且つ５’−第２ハイブリッド形成部位に位置した内部チミジンヌクレオチドのチミンに結合した蛍光レポーター分子（Ｑｕａｓａｒ５７０）を有する。カーボンスペーサー（Ｃ６スペーサー）を含んでいるＱｕａｓａｒ５７０を利用して、前記プローブ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を製作した。追加的に挿入されたカーボンスペーサー（Ｃ６スペーサー）を通じてＢＨＱ−２を結合した。ＴＤプローブの３’−末端にあるアミノ基（ＡｍｉｎｎｏＣ７）を利用してＴＤプローブをガラススライド上に固定化させた。５’−末端に蛍光レポーター分子（Ｑｕａｓａｒ５７０）を有するマーカープローブをその３’−末端にあるアミノ基を利用してガラススライド上に固定化させた。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）に対する合成オリゴヌクレオチドを鋳型として利用した。
【０１５５】
本実施例で利用した合成鋳型、二重標識ＴＤプローブ及びマーカーの配列は、下記の通りである：
ＳＡ−Ｔ  ５’−ＧＧＴＧＴＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＡＡＣＡＡＣＧＣＣＧＴＡＡＡＣＣＧＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＣＡＣＧＧＡＡＴＧＡＡＴＡＡＴＧＴＴＧＡＡ
ＴＴＴＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）
ＳＡ−ＴＤ−Ｍ  ［ＢＨＱ２］［Ｃ６スペーサー］ＴＣＡＴＴＣＣＧ［Ｔ（Ｑｕａｓａｒ５７０）］ＧＧＩＩＩＩＩ  ＣＡＴＴＣＧＧＴＴＴＡＣＧＧＣＧＴＴＧＴＴＡＣＣＴＴＴＴＴ［ＡｍｉｎｏＣ７］（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）
Ｍａｒｋｅｒ  ［Ｑｕａｓａｒ５７０］ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴ［ＡｍｉｎｏＣ７］（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）
（下線の文字は、蛍光レポーター分子が結合したチミンを示す）
【０１５６】
ＮＳＢ９  ＮＨＳスライド（ＮＳＢＰＯＳＴＥＣＨ、Ｋｏｒｅａ）を前記二重標識ＴＤプローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）及びマーカー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）の製作に利用した。ＮＳＢスポッティングバッファー（ＮＳＢ  ｓｐｏｔｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）で最終濃度５０μＭになるように溶解させた前記二重標識ＴＤプローブ及びマーカーを、ＰｅｒｓｏｎａｌＡｒｒａｙｅｒＴＭ１６  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｐｏｔｔｅｒ（ＣａｐｉｔａｌＢｉｏ、Ｃｈｉｎａ）を利用してＮＳＢ９  ＮＨＳスライド上にプリントした。前記二重標識ＴＤプローブ及びマーカーを２×１フォーマット（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ  ｓｐｏｔｓ）で並べてスポッティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）して、このようにして製作されたスライドを約８５％湿度のチャンバに一晩中インキュベートした。非特異的に結合した二重標識ＴＤプローブ及びマーカーを除去するために、前記スライドを２×ＳＳＰＥ（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍリン酸水素ナトリウム及び２．０ｍＭ  ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．４及び７．０ｍＭ  ＳＤＳを含有したバッファー溶液に３７℃で３０分間洗浄して、蒸留水で洗浄した。その後、スライド遠心分離機を利用して、前記ＤＮＡ機能化された（ＤＮＡ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）スライドを乾燥させて、使用前まで４℃暗室で保管した。
【０１５７】
ＳＡに対する合成鋳型（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）１０ｐｍｏｌｅ、１０×反応バッファー（６ｍＭ  ＭｇＣｌ２）３μＬ、ｄＮＴＰｓそれぞれ２００μＬ及びＤｉａｓｔａｒ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）１．２ｕｎｉｔを含有した３０μＬの最終容量で、エキソ核酸切断反応を行った；前記二重標識ＴＤプローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）が交互結合（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ）されたスライドの表面上に組み立てられたチャンバに前記全体混合物を適用した。スライドをｉｎ  ｓｉｔｕブロック方式でサーマルサイクラー（Ｇｅｎｅｐｒｏ  Ｂ４Ｉ、Ｃｈｉｎａ）に設置した。前記反応を下記のように実施した：９５℃で２分間変性及び５５℃で６０分。最終的に前記スライドを１００℃で蒸留水で１分間洗浄した。それぞれ洗浄した後、イメージ獲得は、共焦点レーザースキャナーＡｘｏｎ  ＧｅｎｅＰｉｘ４１００Ａ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳ）を利用し、１０μｍピクセル解像度のスキャニングで行った。蛍光強度は、定量的なマイクロアレイ分析ソフトウェア、ＧｅｎｅＰｉｘ  ｐｒｏ６．０ソフトウェア（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳ）を利用して分析した。蛍光強度は、周辺バックグラウンドを除去した後、スポット−中央値で表現した。再現性を調べるために、各スポットは、２個ずつスポッティングした。蛍光強度を、２個のスポットの平均値で示した。
【０１５８】
図６から分かるように、ターゲット核酸が存在する場合、蛍光シグナルが発生した（ＲＦＵ：６５，４８６±０．０）。ターゲット核酸がない場合は、蛍光シグナルが発生しなかった。
【０１５９】
以上、本発明の望ましい具現例を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。
【図１】
2013544079.tif 000003
【図２】
2013544079.tif 000004
【図３】
2013544079.tif 000005
【図４】
2013544079.tif 000006
【図５】
2013544079.tif 000007
【図６】
2013544079.tif 000008
【配列表】
2013544079000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年6月18日(2013.6.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性を有する二重標識プローブを利用して固相でＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法であって、
（ａ）ターゲット核酸配列を固定化プローブにハイブリッド形成させる工程であって、前記固定化プローブは、前記ターゲット核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、３’−末端を通じて固相基質に固定化された前記プローブは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を有し、前記相互作用的二重標識は、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子間のエネルギークエンチングを誘導できるように前記固定化プローブに位置し、第１標識及び第２標識は、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子から選択され、前記第１標識は、前記固定化プローブの５’−末端に結合し、前記第２標識は、前記第１標識の下流に位置したヌクレオチドの塩基に結合し、このような前記第２標識の結合は、前記ヌクレオチドが前記ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性を有するようにする工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の結果物を前記固定化プローブの切断が発生する条件下で５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと接触させる工程であって、前記ターゲット核酸配列にハイブリッド形成された前記固定化プローブは、前記ＤＮＡポリメラーゼのエキソ核酸切断反応により切断され、前記第１標識が前記固定化プローブから解離して、前記固相基質上のシグナルの変化を引き起こす工程と、
（ｃ）前記ＤＮＡポリメラーゼの前記エキソ切断反応を、前記第２標識で標識された前記ヌクレオチドで終了させる工程であって、前記エキソ核酸切断反応の終了は、前記第２標識が結合した塩基を有する前記ヌクレオチドの抵抗性により誘導され、前記第２標識は、前記固相基質上に残留する工程と、
（ｄ）前記固相基質上におけるシグナルの変化を検出する工程であって、前記固定化プローブの前記切断による前記シグナルの変化は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記第２標識は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断される固定化プローブ上の切断部位により前記第１標識から分離する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２標識は、前記第１標識から２〜２０ヌクレオチド離隔された位置にある請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１標識は、前記固定化プローブの５’−末端のホスフェート基に結合した請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第２標識は、前記固定化プローブにおけるチミジンヌクレオチドのチミンに結合した請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記方法は、前記工程（ａ）−（ｂ）又は（ａ）−（ｃ）を反復する工程と、その反復サイクルの間に変性過程とをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記工程（ｄ）の前記検出は、リアルタイム方式、エンドポイント方式又は指定時間間隔方式で行う請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する前記ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記工程（ａ）は、前記固定化プローブにハイブリッド形成される前記ターゲット核酸配列を生成するための逆方向プライマーを追加的に含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み、前記固定化プローブは、少なくとも２種のプローブを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性を有する二重標識プローブを利用して固相でＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するキットであって、
（ａ）固相基質と、
（ｂ）前記ターゲット核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を有する固定化プローブであって、その３’−末端を通じて固相基質上に固定化された前記プローブは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を有し、前記相互作用的二重標識は、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子間のエネルギークエンチングを誘導できるように前記固定化プローブに位置し、第１標識及び第２標識は、前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子から選択され、前記第１標識は、前記固定化プローブの５’−末端に結合し、前記第２標識は、前記第１標識の下流に位置したヌクレオチドの塩基に結合し、このような前記第２標識の結合は、前記ヌクレオチドが前記ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性を有するようにする前記固定化プローブと、
（ｃ）５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する前記ＤＮＡポリメラーゼと、
を含むことを特徴とするキット。
【請求項１３】
前記第２標識は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断される固定化プローブ上の切断部位により前記第１標識から分離する請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記第２標識は、前記第１標識から２〜２０ヌクレオチド離隔された位置にある請求項１２に記載のキット。
【請求項１５】
前記第１標識は、前記固定化プローブの５’−末端のホスフェート基に結合した請求項１２に記載のキット。
【請求項１６】
前記第２標識は、前記固定化プローブにおけるチミジンヌクレオチドのチミンに結合した請求項１２に記載のキット。
【請求項１７】
前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する前記ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである請求項１２に記載のキット。
【請求項１８】
前記キットは、前記固定化プローブにハイブリッド形成される前記ターゲット核酸配列を生成するための逆方向プライマーを追加的に含む請求項１２に記載のキット。
【請求項１９】
前記ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み、前記固定化プローブは、少なくとも２種のプローブを含む請求項１２に記載のキット。
【請求項２０】
前記ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む請求項１２に記載のキット。
【請求項２１】
ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する抵抗性をオリゴヌクレオチドに付与する方法であって、
（ａ）前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する工程と、
（ｂ）前記オリゴヌクレオチドのうち一つのヌクレオチドの塩基に標識を有するオリゴヌクレオチドを合成する工程であって、これにより、前記ヌクレオチドは、前記ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性を有する工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２２】
前記標識が結合した前記塩基を有する前記ヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドの内部ヌクレオチドである請求項２１に記載の方法。
【国際調査報告】
2013544079.tif 000009
2013544079.tif 000010