(57)【要約】チオエステラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列、その産生方法、チオエステルを形成する方法におけるそれらの使用、および前記チオエステラーゼ酵素を産生できる野生型細菌についてのスクリーニング方法におけるそれらの使用が開示される。本明細書に開示の方法により産生されたチオエステルを含む組成物もまた開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１から４で示される配列のヌクレオチドまたはその機能的同等物を含む、チオエステラーゼ活性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列。
【請求項２】
請求項１に記載のヌクレオチド配列を含む、ベクター
【請求項３】
請求項２に記載のベクターで形質転換される、宿主細胞
【請求項４】
宿主細胞が、細菌または真菌起源である、請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項５】
チオエステラーゼ活性を有する酵素を産生する方法であって、請求項１に記載の配列を発現ベクターに挿入すること、該ベクターで宿主細胞を形質転換すること、および適した培養条件で形質転換された該宿主細胞を生育することを含む、前記方法。
【請求項６】
チオエステルを産生する方法であって、配列番号２、４、６および８で開示される少なくとも一つのアミノ酸を含む少なくとも一つのチオエステラーゼ酵素またはその機能的同等物、および／または配列番号１、３、５および７で開示される少なくとも一つのヌクレオチド配列を含む少なくとも一つの宿主細胞またはその機能的同等物と、少なくとも一つの適した基質とを接触させること、混合物をインキュベートすること、チオエステルを含む粗生成物を単離すること、および粗生成物を精製してチオエステルのみを得ることを含む、前記方法。
【請求項７】
基質が、Ｃ１‐Ｃ８のＳＣＦＡ‐ＣｏＡを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
チオエステルを産生するためのキットであって、配列番号２、４、６および８で開示される少なくとも一つのアミノ酸配列を含む少なくとも一つのチオエステラーゼ酵素またはその機能的同等物、および／または配列番号１、３、５および７で開示される少なくとも一つのヌクレオチド配列を含む少なくとも一つの宿主細胞またはその機能的同等物、および少なくとも一つの適した基質を含む、前記キット。
【請求項９】
チーズにフレーバー付与する方法であって、チーズの製造プロセスの間に、配列番号２、４、６および８で開示される少なくとも一つのアミノ酸を含む少なくとも一つのチオエステラーゼ酵素またはその機能的同等物、および／または配列番号１、３、５および７で開示される少なくとも一つのヌクレオチド配列を含む少なくとも一つの宿主細胞またはその機能的同等物をチーズに加えることを含む、前記方法。
【請求項１０】
チオエステラーゼ酵素および／または宿主細胞が、種培養の一部として加えられる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の方法により得られるまたは生産される、フレーバー付与されたチーズ製品、またはチーズのフレーバーが付与された製品。
【請求項１２】
配列番号１から４で示されるヌクレオチド配列またはその機能的同等物のいずれか１つの使用であって、該ヌクレオチド配列によってコードされるチオエステルまたはその機能的同等物を産生できる生物をスクリーニングする方法におけるマーカーとしての、前記使用。
【請求項１３】
請求項６、７または９のいずれかに記載の方法により得られるまたは産生されるチオエステルを含む、組成物。
【請求項１４】
請求項６、７または９のいずれかに記載の方法によって得られるまたは産生されるチオエステルを含む、消費者製品。
【請求項１５】
消費者製品が、チーズのフレーバーが付与された製品、またはフレーバー付与されたチーズ製品からなる群から選択される、請求項１０に記載の消費者製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
チオエステラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列、それらの産生方法、およびチオエステルを形成する方法におけるそれらの使用が開示されている。
【背景技術】
【０００２】
チオエステルは、とりわけ、チーズ、野菜、肉およびコーヒー製品にとって重要なフレーバー付与化合物である。特に有用なチオエステルは、これに限定されるものではないが、チオ酪酸メチル（以下、「MTB」）、チオ酢酸メチル（以下、「MTA」）およびチオプロピオン酸メチル（以下、「MTP」）を含む。
チオエステルは合成によって作ることができる。しかしながら、食べ物のトレンド、および健康およびウェルネスの関心のため、天然物から直接得られるかまたは生物学的プロセスを通して産生される、チオエステルなどのフレーバー化合物についての特段の需要がある。かかる化合物の特段の利点は、「天然」と称され得、および消費者製品（consumable products）に対して潜在的にそのように表示し得ることである。
【０００３】
様々なバクテリアが発酵の間にチオエステルを産生する。しかしながら、これら既存のプロセスの収量および産生率に影響を及ぼすのは難しい。
したがって、消費者製品に使用することができ、および「天然」と表示することができる、チオエステルを産生する、より予測可能および潜在的により経済的に実行可能な方法を開発することは有益であろう。
【発明の概要】
【０００４】
出願人は今般チオエステラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列を同定した。
この知見は、該ヌクレオチド配列の、消費者製品に加えることができ、および「天然」と表示することができるチオエステルの効果的な産生を可能にする方法における使用を可能にする。さらには、これらのヌクレオチド配列はチオエステルを形成する能力を有する他の野生型の細菌を同定するためのスクリーニング方法において使用し得る。
【０００５】
最初の実例的態様によると、チオエステラーゼ活性を有する酵素をコードし、配列番号１、３、５および７で開示されたヌクレオチド配列、またはその機能的同等物を含むヌクレオチド配列が提供される。
【０００６】
限定することなく、および、例示としてのみで、核酸はBrevibacteriumファミリーに属する細菌から単離されてよい。ある態様によれば、核酸は、Brevibacterium Linens種に属する細菌、非限定的な例はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ここより以下ＡＴＣＣ）９７１４（ＢＬ２）株、から単離されてよい。
ヌクレオチド配列の機能的同等物には、遺伝子コードの縮退により、本明細書に開示されたものと異なるヌクレオチド配列を有するが、同じ活性を有する同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０００７】
機能的同等物は、本明細書に記載の配列ならびに合成のヌクレオチド配列、例えば化学合成または自然に存在しているＤＮＡの組換えによってえられるヌクレオチド配列の、自然発生の変異体を包含する。
機能的同等物の例は、ポリペプチドの活性における変化につながらす、したがって機能的に中立と考えることができる、少なくとも一つの保存されたアミノ酸の置換に起因するセンス変異を含む核酸配列を含む。
【０００８】
機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的な置換のテーブルは、技術分野においてよく知られている。例えば、保存的な置換を選択するための一つの代表的な指針は（元の残基、次に代表的な置換）、ａｌａ／ｇｌｙまたはｓｅｒ；ａｒｇ／ｌｙｓ；ａｓｎ／ｇｌｎまたはｈｉｓ；ａｓｐ／ｇｌｕ；ｃｙｓ／ｓｅｒ；ｇｌｎ／ａｓｎ；ｇｌｙ／ａｓｐ；ｇｌｙ／ａｌａまたはｐｒｏ；ｈｉｓ／ａｓｎまたはｇｌｎ；ｉｌｅ／ｌｅｕまたはｖａｌ；ｌｅｕ／ｉｌｅまたはｖａｌ；ｌｙｓ／ａｒｇまたはｇｌｎまたはｇｌｕ；ｍｅｔ／ｌｅｕまたはｔｙｒまたはｉｌｅ；ｐｈｅ／ｍｅｔまたはｌｅｕまたはｔｙｒ；ｓｅｒ／ｔｈｒ；ｔｈｒ／ｓｅｒ；ｔｒｐ／ｔｙｒ；ｔｙｒ／ｔｒｐまたはｐｈｅ；ｖａｌ／ｉｌｅまたはｌｅｕを含む。代替的な代表的な指針は次の６グループを使用し、それぞれが、お互いに保存的な置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（１）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。別の代替的な指針は、アミノ酸が正であろうと負であろうと、すべての荷電したアミノ酸をお互いに保存的な置換としてすべての荷電したアミノ酸を許容するものである。
【０００９】
コードされた配列において、一つのアミノ酸または小さいパーセンテージ（例えば、２６％まで、２０％まで、１０％までまたは５％まで）のアミノ酸を変化、付加または削除する個々の置換、削除または付加もまた機能的同等物であると考えられている。
機能的同等物の別の非限定の例には、フラグメント、オルソログ、スプライス変異体、一塩基多型および対立遺伝子変異体を含む。
かかる機能的に同等なものは本明細書に開示されたヌクレオチド配列に対して６０％、７５％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上の相同性を有する。
【００１０】
ヌクレオチド配列相同性は配列同一性またはハイブリダイゼーションによって決定されてよい。
配列同一性はbasic local alignment search tool（以下ＢＬＡＳＴ）技術を使用して決定されてよい。ＢＬＡＳＴ技術はhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov.で利用できるプログラムｂｌａｓｔｎに採用されるヒューリスティックな検索アルゴリズムである。
相同性がハイブリダイゼーションによって決定される場合、ヌクレオチド配列が本明細書に開示されているヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズする能力があるという条件で、それらは実質的に相同性があると考えられるべきである。
【００１１】
ハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミド、５×標準クエン酸ナトリウム（以下、ＳＳＣ）および１％ドデシル硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳ）からなる溶液中で４２℃の温度のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で実行されるべきである。洗浄は、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ溶液、６５℃で実行されてよい。
例えばｃＤＮＡ中の、別のヌクレオチド配列の存在のため、バックグラウンドハイブリダイゼーションが起こり得る。標的ＤＮＡとの間で観察される特異的な相互作用の１０倍（10 fold）より小さい強さであるどんなシグナルもバックグラウンドであると考えられるべきである。相互作用の強さは、例えばプローブを、例として３２Ｐで放射性標識することで計測されてもよい。
【００１２】
ヌクレオチド配列はまた、次の１または２以上を含んでもよい：適した５’非翻訳領域、適切な宿主細胞における発現を可能とするプロモーター、適した３’非翻訳領域、ストップコドンおよびタグである。
タグの非限定な例は、これに限定するものではないが、膜外輸送タグ（membrane export tag）および、これに限定するものではないが、Ｈｉｓタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグ（ＧＳＴ）を含む、チオエステラーゼの検出のために使用されるタグを含む。
【００１３】
５’非翻訳領域は、転写または翻訳の効率に影響する他のオペレーターまたはモチーフをからなってよい。３’非翻訳領域は、転写停止のためのシグナルなどの他のシグナルからなってよい。
転写または翻訳に影響するオペレーターまたはモチーフの非限定な例は、これに限定するものではないが、転写産物の効率的なポリアデニル化に必要とされるシグナル、リボソーム結合部位、例としてＥｃｏＲ１などの認識部位を含む。
【００１４】
問題となっている宿主細胞および望む結果に応じて、適した５’および３’非翻訳領域、タグ、ストップコドンおよび、転写または翻訳に影響するオペレーターまたはモチーフを選択することは、十分に当業者のなす範囲内である。本明細書に含まれる例には非限定な例が有されている。
配列番号１、３、５および７に開示されたヌクレオチド配列またはそれらの機能的同等物は、配列番号２、４、６および８に開示されたアミノ酸配列またはそれらの機能的同等物を含むチオエステラーゼ酵素を産生するために使用されてよい。
【００１５】
配列番号２、４、６および８に開示されたアミノ酸配列、またはそれらの機能的同等物を１または２以上含む、チオエステラーゼ活性を持つ酵素の発現は、十分確立されたクローニング技術により果たされてよい。
別の実例的態様によると、配列番号１、３、５および７に開示された１または２以上のヌクレオチド配列、またはそれらの機能的同等物でトランスフェクトされた宿主細胞が提供される。かかる宿主細胞は配列番号２、４、６および８で開示されている１または２以上のアミノ酸配列、またはそれらの機能的同等物を含む、チオエステラーゼ活性をもつ酵素を発現できる。
【００１６】
適した宿主細胞は原核生物および細菌、菌類、植物または動物起源の真核細胞を含む。
実例的態様によると、細胞は細菌または菌の細胞である。
もう一つの実例的態様によると、細胞はEscherichia coli、Brevibacterium、Corynebacterium、Arthrobacter、Pseudomonas、Nocardia, Methylobacteri、Lactobacillus、Lactococcus、Streptococcus、Pediococcus,Oenococcus、Leuconostoc、Weisella、Carnobacterium、および Tetragenococcus、Proprionibacterium sp.、Bifidobacterium spp.、Enterococcus spp、Corynebacteriumglutamicum、Arthrobacter sp.、Micrococcus luteus および Staphylococcus equorum、Geotrichum candidum、Yarrowia lipolytica、Kluyveromyces lactis、Debaryomyces hansenii、Saccharomyces cerevisiaeから選択される一または二以上である。
【００１７】
宿主細胞は、技術分野においてよく知られているようにヌクレオチド配列またはそれらの機能的同等物で、一過的または安定的にトランスフェクトされてもよい。
宿主細胞の中にヌクレオチド配列を導入するための任意の既知の方法が使用されてよい。使用される特定の遺伝子工学手順は、所望のアミノ酸配列またはそれらの機能的同等物を発現できる宿主細胞の中に所望のヌクレオチド配列またはそれらの機能的同等物を成功裏に導入できるということだけが必要である。それらの方法は、クローン化されたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来の遺伝物質を宿主細胞に導入することを伴ってよく、およびリン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、細胞質融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、発現ベクター等の使用を含んでよい。
【００１８】
配列番号１、３、５、および７に開示される少なくとも１つの核酸配列またはそれらの機能的同等物を含む発現ベクターは、個々の発現ベクターとしておよび発現ベクターのライブラリーとしての両方とも、多様な通常の技術により、細胞のゲノム、細胞の細胞質、または細胞の核中に導入され、発現されてよい。
適した技術を選択することは、十分に当業者のなす範囲内である。
【００１９】
実例的態様によると、発現ベクターは、配列番号１、３、５、および７に開示される核酸配列またはそれらの機能的同等物で宿主細胞をトランスフェクトするために使用されてよい。
本発明の別の側面では、配列番号１、３、５、および７に開示される少なくとも一つのヌクレオチド配列またはそれらの機能的同等物かならなるベクターが提供される。
【００２０】
任意の適した発現ベクターが使用されてよい。非限定な例のベクターのタイプはバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクター；ウイルス発現ベクターまたは細菌発現ベクターを含む。
問題となっている宿主細胞および所望の効果に応じて、適した発現ベクターを選択することは十分に当業者のなす範囲内である。
【００２１】
実例的態様では、ベクターはｐＢＬ、ｐＥＴ‐２２ｂ（＋）、Ｐｇｅｍ‐５ｚ、ｐＧＩＶ１から選択される。
トランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞は当該技術分野でよく知られた標準培養条件を使用して培養されてよい。
異なる細胞が、適切な温度および細胞培養培地を含む異なる培養条件を要求することは、当業者に明らかである。問題となっている細胞および所望の最終結果に応じて培養条件を決定することは、十分に当業者のなす範囲内である。
【００２２】
別の側面において、配列番号１、３、５、および７に開示される少なくとも一つのヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列またはそれらの機能的同等物をベクター中に挿入すること；該ベクターで宿主細胞を形質転換すること、および該形質転換された宿主細胞を適した培養培地で生育することを含む、配列番号２、４、６および８に開示される一または二以上のアミノ酸配列またはそれらの機能的同等物を含むチオエステラーゼ活性をもつ酵素を産生する方法が提供される。
【００２３】
上述されるように、異なる細胞が、適切な温度および細胞培養培地を含む異なる培養条件を要求することは当業者に明らかである。問題となっている細胞および所望の最終結果に応じて培養条件を決定することは、十分に当業者のなす範囲内である。
ある細胞に関する適切な培養培地および条件についての情報は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）のウェッブサイト：http://www.lgcstandards-atcc.org/Home/tabid/477/Default.aspxで見出し得る。
【００２４】
特定の実例的態様において、使用された細胞はBrevibacterium、CorynebacteriumまたはE. Coli細胞であり、培養培地は乳製品または乳清ベースのものであった。
別の特定の実例的態様において、細胞はBrevibacterium、CorynebacteriumまたはE. Coli細胞であり、培養培地はトリプチケースソイ（tripticase‐soy）、de Man-Rogosa-Sharpe（ＭＲＳ）、エリカ（Elliker's）、Ｍ１７、ニュートリエントブロスまたはＬＢ培地から選択された。細胞は３７℃で一昼夜インキュベートされた。
【００２５】
チオエステラーゼ酵素の収量を増加させるために、配列番号１、３、５および７に開示されるヌクレオチド配列またはそれらの機能的同等物を、強力な構成的プロモーターのコントロール下に置くことで過剰発現させてよい。
問題となっている宿主細胞およびベクターに応じて、適した構成的プロモーターを選択することは、十分に当業者のなす範囲内である。
【００２６】
所望する場合、配列番号２、４、６および８に開示されるアミノ酸配列またはそれらの機能的同等物を含むチオエステラーゼ酵素は、技術分野においてよく知られている方法を使用し培養培地から単離されてよい。
配列番号２、４、６および８に開示される少なくとも一つのヌクレオチド配列またはそれらの機能的同等物を含む単離されたチオエステラーゼ酵素、または配列番号１、３、５および７に開示される少なくとも一つのヌクレオチド配列またはそれらの機能的同等物を含むトランスフェクトされた宿主細胞は、チオエステルを産生するために使用されてよい。
【００２７】
もう一つの側面では、配列番号２、４、６および８に開示される少なくとも一つのヌクレオチド配列またはそれらの機能的同等物を含む少なくとも一つのチオエステラーゼ酵素、および／または配列番号１、３、５および７に開示される少なくとも一つのヌクレオチド配列またはそれらの機能的同等物を含む少なくとも一つの宿主細胞と、少なくとも一つの適した基質とを接触させること、混合物をインキュベートすること、チオエステルを含む粗生成物を単離することおよび、粗生成物を精製してチオエステルのみを得ることを含む、チオエステルを産生する方法が提供される。
【００２８】
インキュベーションは、２０℃から４０℃の温度、４から９のｐＨ、１から１００時間の範囲の期間で実行されてよい。
実例的態様において、インキュベーションは２５℃から３８℃の温度、６から８のｐＨ、１から７２時間の範囲の期間で実行される。短鎖脂肪酸補酵素Ａ誘導体が配列番号２、４、６および８に開示される少なくとも一つのアミノ酸配列またはそれらの機能的同等物を含むチオエステラーゼ酵素の適した基質であることが、出願人らにより見出された。
【００２９】
実例的態様において、適した基質は短鎖脂肪酸補酵素Ａ（ＳＣＦＡ−ＣｏＡ）を含む。
別の実例的態様において、適した基質はＣ１−Ｃ８のＳＣＦＡ−ＣｏＡを含む。
本発明のトランスフェクトされた宿主細胞、および／または酵素は可動のまたは固定化された形式で使用されてよい。
実例的態様において、酵素および／または宿主細胞は固定化された形式で使用される。
【００３０】
任意の精製技術を、粗生成物を精製するために使用してよく、かかる技術を決定することは十分に当業者のなす範囲内である。精製技術の非限定な例は、アフィニティー精製、遠心分離、クロマトグラフィーを含む。
本発明の別の側面において、本明細書に記載されているような方法により得られるまたは産生されるチオエステルが提供される。
【００３１】
別の側面において、配列番号２、４、６および８に開示される少なくとも一つのアミノ酸配列またはそれらの機能的同等物を含む少なくとも一つのチオエステラーゼ酵素、および／または配列番号１、３、５および７に開示される少なくとも一つのヌクレオチド配列またはそれらの機能的同等物を含む少なくとも一つの宿主細胞、および少なくとも適した基質を含む、チオエステルを産生するためのキットが提供される。
キットは、チオエステルを産生するための、本明細書に開示された方法を実行するために使用されてよい。
実例的態様において、適した基質は短鎖脂肪酸補酵素Ａ（ＳＣＦＡ‐ＣｏＡ）を含む。
【００３２】
別の実例的態様において、適した基質はＣ１‐Ｃ８のＳＣＦＡ‐ＣｏＡを含む。Ｃ１‐Ｃ８のＳＣＦＡ‐ＣｏＡ基質は、０．０１μＭ‐５００μＭ、０．０１μＭ‐２００μＭ、０．０１μＭ‐５０μＭの濃度で提供されてよい。
チーズに存在するチオエステルの量および比率はそのフレーバーに影響することが知られている。チオエステルはその製造及び熟成の間に、チーズに存在する微生物によって産生される。これらの微生物はしばしば種培養としてチーズに加えられる。
【００３３】
別の側面において、チーズに、その製造プロセスの間に配列番号２、４、６および８に開示される少なくとも一つのアミノ酸配列またはそれらの機能的同等物を含む少なくとも一つのチオエステラーゼ酵素、および／または配列番号１、３、５および７に開示される少なくとも一つのヌクレオチド配列またはそれらの機能的同等物を含む少なくとも一つの宿主細胞を加えること含む、チーズにフレーバー付与する方法が提供される。
別の実例的態様において、チオエステラーゼ酵素、および／または宿主細胞は種培養の一部として加えられる。
【００３４】
別の実例的態様において、チオエステラーゼ酵素、および／または宿主細胞は、牛乳に加えられた種培養の一部として加えられる。
別の側面において、上記で定義された方法により得られるまたは、それにしたがって産生されるチーズ製品が提供される。
配列番号１、３、５および７に開示されるヌクレオチド配列、またはそれらの機能的同等物は、配列番号２、４、６および８に開示されるアミノ酸配列によってコードされるチオエステラーゼ酵素をコードする遺伝子またはそれらの機能的同等物を含む野生型の生物をスクリーニングおよび同定するために使用されてよい。
【００３５】
別の側面において、配列番号２、４、６、および８に開示されるアミノ酸配列よってコードされたチオエステラーゼ酵素、またはそれらの機能的同等物を産生する能力がある野生型の生物をスクリーニングするための方法における、配列番号１、３、５および７で開示されたヌクレオチド配列またはそれらの機能的同等物のマーカーとしての使用が提供される。
別の側面において、配列番号１、３、５、および７に開示されるヌクレオチド配列またはそれらの機能的同等物を、スクリーニング方法におけるマーカーとして使用することを含む、配列番号２、４、６および８に開示されるアミノ酸配列によってコードされたチオエステラーゼ酵素またはそれらの機能的同等物を産生することができる生物を同定する方法が提供される。
【００３６】
該方法で同定される生物は、任意の原核生物および真核生物でもよい。
実例的態様において、生物は野生型の生物である。
任意の知られたスクリーニング方法が使用されてよい。よく知られたスクリーニング方法の例は、これに限定されないが、コンピューター作動の公共の配列データベースのヌクレオチドまたはタンパク質相同性検索、ハイスループットシークエンシングを介したヌクレオチドスクリーニング、および、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）スクリーニングを含む。
【００３７】
本明細書に開示される方法により形成されたチオエステルは、多くの組成物および消費者製品にフレーバー付与化合物として使用するために、単離および精製されてよい。
別の側面において、本明細書に記載されている方法によって得られるまたは産生される少なくとも一つのチオエステルを含む組成物が提供される。
別の側面において、組成物のフレーバーを創り出すまたは改変する方法であって、本明細書に開示されるように形成される少なくとも一つのチオエステルを該組成物に加えることを含む、前記方法が提供される。
【００３８】
チオエステルは水を加えない形態（neat form）でまたは溶媒中に、存在または組成物に添加してよく、または初めは例えば、ポリマー、カプセル、マイクロカプセル、ナノカプセル、リポソーム、前駆体、フィルム形成体、例えば炭素ゼオライトを使用することによる吸収剤、環状オリゴ糖およびそれらの混合物などの捕捉物質によって捕捉されることにより修飾されていてよく、または、光、酵素などの外因的刺激の適用によりチオエステルを放出するように適合した基質に化学的に結合されてよい。
【００３９】
一つのタイプのチオエステルが、組成物の唯一のフレーバー付与の成分であってよい。代替的に複数のタイプのチオエステルが、組合せて使用されてよい。
組成物は、加えて、フレーバー組成物で通常使用される別の風味物質成分および賦形剤、例えば運搬物質、を含んでよい。
【００４０】
前記別の風味物質成分には、これに限定されないが、天然フレーバー、人工フレーバー、スパイス、調味料等を含む。例示的なフレーバー付与成分は、合成フレーバー油およびフレーバー付与芳香性物質、および／または油、含油樹脂、精油、蒸留物および植物、葉、花、果実等からの抽出物、および前述の少なくとも一つを含む組合せを含む。
別の風味物質成分のさらなる例は、the National Academy of Sciencesによる“Chemicals Used in Food Processing”、１２７４巻、６３〜２５８頁、で見出すことができる。
【００４１】
フレーバー組成物で通常使用される前記賦形剤には、これに限定されないが、溶媒（水、アルコール、エタノール、油、脂肪、植物油およびミグオールを含む）、結合剤、希釈剤、崩壊剤、潤滑油、フレーバー付与剤、着色剤、保存料、抗酸化剤、乳化剤、安定剤、フレーバー増強剤、アンチケーキング剤等を含む。
【００４２】
フレーバー組成物で通常使用される風味物質成分および賦形剤のさらなる例は、“Perfume and Flavour Materials of Natural Origin”, S. Arctander, Ed., Elizabeth, N.J., 1960；“Perfume and Flavour Chemicals”, S. Arctander, Ed., Vol. I & II, Allured Publishing Corporation, Carol Stream, USA, 1994；“Flavourings”, E. Ziegler and H. Ziegler (ed.), Wiley-VCH Weinheim, 1998, および “CTFA Cosmetic Ingredient Handbook”, J.M. Nikitakis (ed.), 1st ed., The Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, Inc., Washington, 1988 に見出され得る。
【００４３】
フレーバー組成物の他の適した、および望ましい成分は、“Handbook of Industrial Chemical Additives”, ed. M. and I. Ash, 2nd Ed.,(Synapse 2000)等の標準的なテキストに記載されている。
本明細書に開示されるように形成されたチオエステルは、１００％までの濃度で組成物に使用されてよい。ある態様によると、チオエステルは、約０．０１％から約９９％の範囲の濃度で組成物に含まれてよい。他の態様によると、チオエステルは、約１％から約９９％の範囲の濃度で組成物に含まれてよい。
【００４４】
別の側面では、消費者製品のフレーバーを創り出す、増強するまたは改変する方法であって、該消費者製品に本明細書で開示されるように形成された少なくとも一つのチオエステルを加えること含む、前記方法が提供される。
本明細書で開示されるように形成されたチオエステル、または本明細書で開示される少なくとも一つのチオエステルを含む組成物を、消費者製品に該チオエステルまたは組成物を直接混ぜるための通常の技術を使用することで消費者製品に加えることができる。
【００４５】
本明細書で開示されるように形成されたチオエステルが消費者製品に加えられてよい量は、広範な限度で変化してよく、および中でも、消費者製品の特性に、所望の効果に、例えば味覚を増強、および創り出すなどの、本明細書で開示されるように形成されたチオエステルを消費者製品に加えることの目的に、および例えば他のフレーバー成分など、消費者製品に含まれた任意の他の構成成分の量および特性に依存してよい。最終使用および要求される効果に依存して、消費者製品の中に組み込まれる、本明細書に開示されるように形成されたチオエステルの適した量を決定することは、十分に当業者のなす範囲内である。
【００４６】
本明細書で開示されるように形成されたチオエステルの典型的な限定されない濃度は、消費者製品の重量を基にした重量ｐｐｍで、約５００ｐｐｍから約０．０１ｐｐｍであり、より特定的には、約２５０ｐｐｍから約０．０１ｐｐｍであり、さらにより特定的には、約１００ｐｐｍから約０．０１ｐｐｍである。
別の側面において、本明細書に記載される方法により得られるまたは産生される少なくとも一つのチオエステル含む消費者製品が提供される。
【００４７】
本明細書で使用される消費者製品という用語は、口腔内に置かれ摂取されるか、または口内で使用された後捨てられることが意図される任意の製品を意味する。適した消費者製品は、これに限定されないが、ソース、調味料（condiments）、すべての種類の食品、菓子製品、焼成製品、甘味製品、肉のフレーバーを付与されたおよび肉製品、および野菜のフレーバーを付与されたおよび野菜製品を含む食欲をそそる風味のある製品（savoury product）、乳製品、飲料、口腔ケア製品およびそれらの組み合わせを含む。
【００４８】
例示的な食品は、これに限定されないが、冷蔵スナック、甘いおよび食欲をそそる風味のあるスナック、フルーツスナック、チップス／クリスプ、押出成型スナック、トルティーヤ／コーンチップス、ポップコーン、プレッツェル、ナッツ、他の甘いおよび食欲をそそる風味のあるスナック、スナックバー、グラノーラバー、ブレークファーストバー、エナジーバー、フルーツバー、他のスナックバー、ミール・リプレイスメント製品、ダイエット(slimming)製品、回復期用飲料、調理済み食事(ready meal)、缶詰調理済み食事、冷凍調理済み食事、乾燥調理済み食事、冷蔵調理済み食事、ディナーミックス、冷凍ピザ、冷蔵ピザ、スープ、缶詰スープ、乾燥スープ、インスタントスープ、冷蔵スープ、UHTスープ、冷凍スープ、パスタ、缶詰パスタ、乾燥パスタ、冷蔵／生パスタ、麺類、味の付いていない麺類、インスタントヌードル、カップ／ボウルインスタントヌードル、パウチ入りインスタントヌードル、冷蔵ヌードル、スナックヌードル、乾燥食品、デザートミックス、ソース、ドレッシングおよび調味料、ハーブおよびスパイス、スプレッド、ジャムおよびプリザーブ、ハチミツ、チョコレートスプレッド、ナッツベースのスプレッド、およびイーストベースのスプレッドを含む。
【００４９】
例示的な菓子製品は、これに限定されないが、チューインガム（砂糖入りガム、シュガーフリーガム、機能性ガムおよびバブルガムを含む）、フィリング入り菓子、チョコレートおよび他のチョコレート菓子、薬用菓子、薬用キャンディー(lozenge)、タブレット、トローチ（pastilles）、ミント、標準的なミント、パワーミント、チューイーキャンディー、ハードキャンディー、ボイルドキャンディー、ブレスおよび他のオーラルケアフィルムまたはストリップ、キャンディーケイン、ロリポップ、グミ、ゼリー、ファッジキャンディー、キャラメル、ハードおよびソフト糖衣製品（panned goods）、トフィー、タフィー、リコリス、ゼラチンキャンディー、ガムドロップ、ゼリービーンズ、ヌガー、フォンダン、上記の一つまたはそれ以上の組合せ、および上記の一つまたはそれ以上を組み込んだ可食性組成物を含む。
【００５０】
例示的な焼成製品は、これに限定されないが、アルフォーレス、パン、包装された／産業用のパン、包装されてない／職人のパン、ペストリー、ケーキ、包装された／産業用のケーキ、包装されてない／職人のケーキ、クッキー、チョコレート掛けビスケット、サンドイッチビスケット、フィリング入りビスケット、食欲をそそる風味のあるビスケットおよびクラッカー、パン代用品を含む。
例示的な甘い製品は、これに限定されないが、朝食用シリアル、レディー・トゥー・イート（“ｒｔｅ”）シリアル、家族向け朝食用シリアル、フレーク、ミューズリー、他のｒｔｅシリアル、子供向け朝食用シリアル、ホットシリアルを含む。
【００５１】
例示的な食欲をそそる風味のある製品は、これに限定されないが、塩味スナック（ポテトチップス、クリップス、ナッツ、トルティーヤ・トスターダ、プレッツェル、チーズスナック、コーンスナック、ポテトスナック、レディ・トゥー・イートポップコーン、電子レンジ調理可能なポップコーン、ポークラインズ、ナッツ、クラッカー、クラッカースナック、朝食用シリアル、肉、アスピック、塩漬け肉（ハム、ベーコン）、ランチョン／朝食用肉（ホットドッグ、コールドカット、ソーセージ）、トマト製品、マーガリン、ピーナッツバター、スープ（クリア、缶詰、クリーム、インスタント、ＵＨＴ）、缶詰野菜、パスタソースを含む。
【００５２】
例示的な乳製品は、これに限定されないが、アイスクリーム、インパルスアイスクリーム、個包装のの乳製品アイスクリーム、個包装の氷菓(water ice cream)、マルチパック乳製品アイスクリーム、マルチパック氷菓、持ち帰りアイスクリーム、持ち帰り乳製品アイスクリーム、アイスクリームデザート、バルクアイスクリーム、持ち帰り氷菓、フローズンヨーグルト、職人のアイスクリーム、乳製品、牛乳、生／殺菌乳、全脂肪生／殺菌乳、半脱脂生／殺菌乳、長期保存／ＵＨＴ乳、全脂肪長期保存／ＵＨＴ乳、半脱脂長期保存／ＵＨＴ乳、無脂肪長期保存／ＵＨＴ乳、山羊乳、濃縮乳／無糖練乳、味のついていない濃縮乳／無糖練乳、フレーバー付、機能性および他の濃縮乳、フレーバー付乳飲料、乳製品のみのフレーバー付き乳飲料、フルーツジュース入りのフレーバー付乳製品、豆乳、サワーミルク飲料、発酵乳飲料、コーヒーホワイトナー、粉ミルク、フレーバー付粉状乳飲料、クリーム、ヨーグルト、プレーン／ナチュラルヨーグルト、フレーバー付きヨーグルト、果物入りヨーグルト、プロバイオティックヨーグルト、飲むヨーグルト、通常の飲むヨーグルト、プロバイオティック飲むヨーグルト、冷蔵および常温保存可能なデザート、乳製品ベースのデザート、大豆ベースのデザートを含む。
【００５３】
例示的な飲料は、これに限定されないが、フレーバー付きの水、ソフトドリンク、フルーツ飲料、コーヒーベースの飲料、茶ベースの飲料、ジュースベースの飲料（果物および野菜を含む）、乳ベースの飲料、ゲル飲料、炭酸または非炭酸飲料、粉末飲料、アルコールまたはノンアルコール飲料を含む。
チオエステルは、乳製品、特にチーズのフレーバーが付与された製品ににとって、特に重要なフレーバー付与成分である。特に、好ましくはＭＴＡおよび／またはＭＴＰと組み合わせで使用される、チオエステルＭＴＢは、よいフレーバーのインパクトを持つ本物のチーズフレーバーを提供するために望まれる。
【００５４】
実例的態様において、本明細書で開示されるように形成された少なくとも一つのチオエステルを含む消費者製品は、チーズのフレーバー付与がされた製品である。
別の実例的態様では、消費者製品は、本明細書で開示されるように形成されたＭＴＡ、および／またはＭＴＢ、および／またはＭＴＰを含む、チーズのフレーバーが付与された製品である。
【００５５】
配列同定
この発明は、下記の配列番号を参照して説明されている。
配列番号１はチオエステラーゼ酵素４２５をコードするヌクレオチド配列を表現している。
配列番号２はチオエステラーゼ酵素４２５のアミノ酸配列を表現している。
配列番号３はチオエステラーゼのひとつ３３２０をコードするヌクレオチド配列を表現している。
配列番号４はチオエステラーゼ酵素３３２０のアミノ酸配列を表現している。
配列番号５はチオエステラーゼ酵素１８７５をコードするヌクレオチド配列を表現している。
配列番号６はチオエステラーゼ酵素１８７５のアミノ酸配列を表現している。
配列番号７はチオエステラーゼ酵素１８７４をコードするヌクレオチド配列を表現している。
配列番号８はチオエステラーゼ酵素１８７４のアミノ酸配列を表現している。
【００５６】
下記の例は、より詳細に発明を記載するために、および開示の方法および物を例示するために表記される。しかしながら、本例はいかなる手法に限定するものとも解釈されるべきではない。
【００５７】
例
例１−タンパク質発現のためのチオエステラーゼ遺伝子クローニング
チオエステラーゼ酵素（以下ＴＥ）、ＴＥ０４２５、ＴＥ１８７５、ＴＥ３３２０およびＴＥ１８７４のＤＮＡ配列は、遺伝子特異的なプライマー（表１）を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用した増幅により、B.linens株ＡＴＣＣ９１７４から得た。
プライマーは、クローニングされるべき遺伝子内として生じる部位を避けつつ、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ベクター（Novagen）中に遺伝子を方向性（directional）クローニングさせるための制限部位を含む。５’プライマーは、強力なE.coliリボソーム結合部位およびＡＴＧ開始コドンを提供する配列ＡＧＧＡＧＧＡＴＴＡＡＣＡＴＡが後に続く、ＸｂａＩ部位を含む。ＡＴＧコドンの後に、それぞれの５’プライマーは特定のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームの二番目のコドンの最初の塩基で始まる１４−２０塩基のインフレーム遺伝子特異的な配列を含む。
【００５８】
３’プライマーは、ＳａｌＩまたはＸｈｏＩ部位および、ネイティブな終止コドンを除く特定のオープンリーディングフレームの３’配列の１７−２３塩基に相当する遺伝子特定の配列を含む。
ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ベクターは、Novagenによって設計され、E.coliでの誘導発現および、発現タンパク質中に組み込まれたポリヒスチジンドメインのニッケルカラムへの結合によるタンパク質精製の両方を提供する。このベクターにクローニングされた遺伝子の転写には、誘導物質ＩＰＴＧの添加が要求されるように設計されおり、この発明で概説された目的のためのｐＥＴ−２２ｂ（＋）ベクターシステムの使用は、製造者の推奨に完全に従って実行された。
【００５９】
遺伝子発現のために、採用されたｐＥＴ−２２ｂ（＋）ベクターに要求されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する、E.coli  ＢＬ２１（ＤＥ３）宿主細胞が使用された。
ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ベクターへの、得られた遺伝子特異的なＸｂａＩからＳａｌＩまたはＸｈｏＩフラグメントのクローニングは、ベクター骨格からのＣ末のＨｉｓタグドメインをコードするインフレーム配列および終止コドンを有するオープンリーディングフレームを作成した。
【００６０】
【表１】
2013544495.tif 000002
【００６１】
プルーフリーディングＰｗｏおよびＴａｑポリメラーゼ（Expand 20 kbplus PCR System, Roche Diagnostics GmbH）の混合物によるチオエステラーゼのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅に続いて、ＰＣＲ産物は、ｐＧＥＭＴ  Vector System Ｉクローニングキット（Promega Corporation）を使用し、ｐＧＥＭ‐５Ｚベクターに制限消化なしでクローニングされた。
ベクターＤＮＡにライゲーションし、エレクトロポレーションした後、推定の遺伝子挿入物をもつE.coli  ＤＨ５α形質転換体クローンは、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で選択された。ｐＧＥＭ‐５Ｚクローニングは、青／白βガラクトシダーゼ遺伝子不活性スクリーニングを使用した、挿入物のクローンの初期スクリーニングが可能であった。形質転換体はそこで、アンピシリン耐性コロニーから回収されたプラスミドＤＮＡの０．８％アガロースゲル電気泳動により、適切なサイズのプラスミドについてスクリーニングされた。
【００６２】
上記の代替的な方法において、ＰＣＲ産物は、ＰＣＲプライマー配列に含まれる５’および３’制限部位で制限消化の後、直接ｐＥＴ‐２２ｂ（＋）にクローニングされた。
選択されたコロニーからのプラスミドＤＮＡは、その後制限酵素で消化され、消化産物のアガロースゲル電気泳動を使用し、挿入物に隣接する予想される制限部位をもつ挿入ＤＮＡの存在および大きさを確認した。これらのスクリーニングを通過した挿入物は、挿入物に隣接するベクター部位に結合するプライマーを使用し、シークエンシングされた。それらは、ｐＧＥＭ‐５ＺクローンのためのＳＰ６およびＴ７プロモータープライマーおよび、ｐＥＴ‐２２ｂ（＋）のためのＴ７プロモーターおよびＴ７ターミネータープライマーであった。
【００６３】
シークエンシングはビッグダイターミネーター法を使用して行われた。期待される配列をもつクローンは、それぞれのケースで、B.linens株ＡＴＣＣ９１７４ゲノム配列中のそれぞれの遺伝子に、完全なコンピューターベース相同性マッチングにより、同定された。
最初にｐＧＥＭ‐５Ｚベクターにクローニングされた配列について、挿入物を、調製用のアガロースゲルからの抽出により適切な制限消化物から回収し、そこでｐＥＴ‐２２ｂ（＋）の中に移され、上述のとおりスクリーニングされた。E.coliのＤＨ５α細胞中で期待されるｐＥＴ‐２２ｂ（＋）コンストラクトを得た後、プラスミドを回収し、タンパク質発現のためにE.coli  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞へとエレクトロポレーションによって形質転換した。
【００６４】
例２  クローニングされたチオエステラーゼの精製
タンパク質発現を、例１で調製されたE.coli  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中で、前記E.coli細胞を含むバッチ培養物（１００から２５０ｍＬ）への０．５ｍＭのＩＰＴＧの添加を通じて誘導した。
E.coli細胞は、そこで２から４ｈの間インキュベートし、その時間の後、商品名Ni‐NTA Agarose（Invitrogen）として売られているニッケル充填樹脂を使用して、自然の条件下でＨｉｓタグタンパク質の精製を行った。
インキュベートされたE.coli細胞は、こで５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、２０ｍＭのイミダゾール、０．５Ｍの塩化ナトリウムバッファーを含む溶液に加えられ、ガラスビーズとともにボルテックスすることにより破壊された。
【００６５】
破壊された細胞を含む溶液は、そこで、製造者により指示されるように調製された、１．５ｍＬのNi‐NTA Agarose樹脂を含む精製カラムに加えられた。
クローニングされたチオエステラーゼタンパク質は、５０ｍＭイミダゾールを含むバッファーで精製カラムから抽出された。抽出の後、タンパク質はさらに２５０ｍＭの同じバッファーで溶出された。
抽出されたタンパク質は、そこで５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）バッファーで、４℃で透析された。バッファーはプロセスを通して４回変えられた。
【００６６】
それぞれのチオエステラーゼタンパク質を、そこで、製造者によって指示されるように採用された3K Amicon Uitra‐4カートリッジ（Millipore, Inc., Billerica, MA）を使用して濃縮された。
個々のチオエステラーゼタンパク質のそれぞれの濃度は、キット供給者（Sigma）により指示されるように採用されるmicro-Lowryキットを使用し、決定された。
【００６７】
例３−基質としてのＳＦＣＡ
精製されたＴＥ４２５、ＴＥ３３２０、ＴＥ１８７５、およびＴＥ１８７４の、脂肪酸からチオエステルを産生する能力を決定した。別段の記載のない限り、溶液という言葉は、水をベースとした溶液として解釈されるべきである。
それぞれ１０ｍＭの蟻酸（Ｃ１）、酢酸（Ｃ２）、プロピオン酸（Ｃ３）、酪酸およびイソ酪酸（Ｃ４）吉草酸およびイソ吉草酸（Ｃ５）およびヘキサン酸を含む短鎖脂肪酸（以下ＳＣＦＡ）混合物を調製した。この混合物を、そこで希釈し、最終的な総Ｃ１からＣ６ＳＣＦＡ濃度が８０μＭの溶液を得た。
【００６８】
例２に記載されるように精製されたＴＥ４２５、ＴＥ３３２０、ＴＥ１８７５およびＴＥ１８７４タンパク質は、それぞれ別々に希釈され、最終酵素濃度０．３５μＭの別個の溶液を得た。
１００ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．２）、１００μＭのウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡ）、２５μＭのメタンチオール（以下ＭｅＳＨ）、２５μＭの補酵素Ａ（以下ＣｏＡＳＨ）、等量のピリドキサールリン酸、ピリドキサミンおよびピリドキサールを含む２．５μＭの組成物（以下ピリドキサールカクテル）、上記で調製された８０μＭの（Ｃ１‐Ｃ６）ＳＣＦＡ混合物、１０μＭのフルフリルアルコール、および１００μｌの４つの０．３５μＭ酵素液のうち１つを含む、４つのサンプル溶液を調製した。
【００６９】
コントロールサンプルもまた調製した。
コントロール１は、１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．２）、１００μＭのＢＳＡ、２５μＭのＭｅＳＨ、２５μＭのＣｏＡＳＨ、２．５μＭのピリドキサールカクテル、８０μＭの（Ｃ１‐Ｃ６）ＳＣＦＡ混合および１０μＭのフルフリルアルコールを含むが、酵素は含まない溶液であった。
コントロール２から５は、１００ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．２）、１００μＭのＢＳＡ、２５μＭのＭｅＳＨ、２５μＭのＣｏＡＳＨ、２．５μＭのピリドキサールカクテル、８０μＭの（Ｃ１‐Ｃ６）ＳＣＦＡ混合物、１０μＭのフルフリルアルコール、および０．３５μＭ酵素液の４つのうち１つ１００μｌを含むが、８０μＭの（Ｃ１−Ｃ６）ＳＣＦＡ混合物は入ってない溶液であった。
【００７０】
サンプルおよびコントロールの内容は表２に示されている。
【表２】
2013544495.tif 000003
【００７１】
調製の後、すべてンサンプルは、そこで３５分間３７℃でインキュベートされ、同時に固相マイクロ抽出（ＳＰＭＥ）が実行された。
１０μＭフルフリルアルコールは、ＳＰＭＥ変動性を是正するためにサンプルに加えられた。
ＳＰＭＥを行うために、カルボキセン／ポリジメチルシロキサンでコートされたファイバーが使用された。
コーティングの厚さは８５μｍであった。
【００７２】
ＳＰＭＥファイバーに吸収されたまたはコートされた分析物を、そこで、選択された時間間隔でガスクロマトグラフィーおよび質量分析（ＧＣ‐ＭＳ）によって分析した。
いずれの酵素も、これらのアッセイ条件下でチオエステル合成活性を実証しなかった；すなわち、基質としてＳＣＦＡを使用した、チオ酢酸メチル、チオプロピオン酸メチル、チオ酪酸メチルおよびチオ吉草酸メチルの検出可能な産生は記録されなかった。
単一のＳＣＦＡを基質として用いた追加試験もまた、同様の否定的な結果であった。
【００７３】
例４−基質としての補酵素Ａ‐ＳＦＣＡ誘導体
チオエステル合成がＳＣＦＡ基質から検出されなかったため、精製されたＴＥ４２５、ＴＥ３３２０、ＴＥ１８７５およびＴＥ１８７４の、遊離の酪酸の代わりにブチリル補酵素Ａ（以下、ブチリル‐ＣｏＡ）からのＭＴＢ産生を触媒する能力を試験した。
４つのサンプル溶液を、５μＭの４つのチオエステラーゼ酵素のうち１つを、０．２２ｍＭのＢＳＡ、１００ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ８．０）、０．０３ｍＭのブチリル‐ＣｏＡおよび０．０３ｍＭのＭｅＳＨを含む溶液に加えることにより、調製した。
【００７４】
６つのコントロールサンプルもまた調製した； 
コントロール７は、０．２２ｍＭのＢＳＡ、１００ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ８．０）、０．０３ｍＭのブチリル‐ＣｏＡおよび０．０３ｍＭのＭｅＳＨを含むが、酵素は含まない溶液であった。
コントロール８から１１は、０．２２ｍＭのＢＳＡ、１００ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ８．０）および５μＭの４つのチオエステラーゼ酵素を含むが、ブチリル‐ＣｏＡは含まない溶液であった。
コントロール１２は、４０μＭのＭＴＢだけを含む溶液であった。これはＭＴＢのＳＰＭＥ検出のためのコントロールとして使用された。
【００７５】
サンプルおよびコントロールの内容は、表３に示されている。
【表３】
2013544495.tif 000004
【００７６】
調製後、すべてのサンプルは３２℃でインキュベートされた。２時間のインキュベーションの後、ＳＰＭＥを３０分間、手順を通して温度を３２℃に保ったまま実行された。
１０μＭフルフリルアルコールは、ＳＰＭＥ変動性を是正するためにサンプルに加えられた。
ＳＰＭＥを行うために、カルボキセン／ポリジメチルシロキサンでコートされたファイバーが使用された。コーティングの厚さは、８５μｍであった。
【００７７】
ＳＰＭＥファイバーに吸収されたまたはコートされた分析物を、選択された時間間隔で、ＧＣ‐ＭＳを使用して分析した。この分析の結果を、表４に示す。
【表４】
2013544495.tif 000005
【００７８】
コントロール１２はＭＴＢだけを含んでいた。このコントロールは、ＭＴＢの予想されるｍ／ｚ比が１１８であることを示唆した。
コントロール７から１２は１１８でピークを示さず、結果としてそれらのサンプルはいかなるＭＴＢも含まないと推測される（表３）。
【００７９】
サンプル１、２、３および４は、すべて１１８でピークを示す。これは、それぞれのケースでＭＴＢが形成され、結果としてＴＥ４２５、ＴＥ３３２０、ＴＥ１８７５、およびＴＥ１８７４はＣｏＡ−ＳＦＣＡ誘導体からチオエステルを産生する能力を持つチオエステラーゼ酵素であることを示す。
それぞれの酵素によって産生されたＭＴＢの量は、サンプル中のＭＴＢの量におおむね比例するはずであるＭ／Ｚ１１８に対応するＧＣピークエリアから評価できる。すべてのピークエリアおよび対応するＭＴＢ濃度を表４に列挙した。
【００８０】
例５−ＴＥ酵素基質の選択性（preference）および産物プロファイル
精製されたＴＥ４２５およびＴＥ３３２０の、ＳＣＦＡ  ＣｏＡ誘導体の混合物からチオエステル産物を触媒する能力を決定する。
この活性を調査するために、ＣｏＡ−ＳＣＦＡを２段階反応で合成した。
脂肪酸無水物の調整は、以下の方法を通して為された。
１０ｍモルのＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を、５０ｍＬの乾燥四塩化炭素（ＣＣｌ４）（５０ｍＬ）に加えた。この溶液は、そこで１５０ｍＬの乾燥ＣＣｌ４に混合された２０ｍｍｏｌｅのＳＣＦＡを含有する第二の溶液に加えられた。
【００８１】
反応混合物を５時間室温で保持し、その時間の後、ジシクロヘキシル尿素（ＤＣＵ）沈殿物をろ過によって取り除いた。沈殿物中のいかなるＣＣｌ４も減圧下蒸発によって取り除かれた。固体残渣をアセトンから再結晶化した。結晶をＣＣｌ４で洗浄し、微量の化学物質を取り除いた。産物をそこでクロマトグラフィーにより分離し、純粋なＣ２からＣ８のＳＣＦＡ無水物を得た。
ＳＣＦＡ無水物を調製し、分離した後、３０μＭのＣ２からＣ８のＳＣＦＡ無水物のそれぞれを３０ｍＬの氷冷水中の２．５μＭピリドキサールカクテルの４５μｍｏｌの分離溶液に加えた。
【００８２】
それぞれのケースでｐＨ７から７．５であることを保証するため、重炭酸ナトリウムをすべてのサンプルに添加された。すべての混合物を、氷浴中に保持し、６０分間よく振とうした。
Ｃ２からＣ８のＳＣＦＡ−ＣｏＡをトリクロロ酢酸（以下ＴＣＡ）での沈殿によって精製し、酵素活性アッセイのため水に再懸濁した。
一旦ＳＣＦＡ−ＣｏＡを形成した後、異なるチオエステラーゼおよびＳＣＦＡ−ＣｏＡを含むサンプルを、３５μＭチオエステラーゼ酵素の一つ、ＴＥ４２５またはＴＥ３３２０のいずれかと１２０μＭのＣ２からＣ８のＳＣＦＡ−ＣｏＡ混合物を、１００μＭのＢＳＡ、１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．２）、２５μＭのＭｅＳＨおよび２．５μＭのピリドキサールカクテルを含む溶液中に加えることにより調整した。
【００８３】
コントロールサンプルもまた調製した：
コントロール１３は、１２０μＭのＣ２からＣ８のＳＣＦＡ−ＣｏＡ混合物、１００μＭのＢＳＡ、１００ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．２）、２５μＭのメタンチオールおよび２．５μＭのピリドキサールカクテルを含むが、酵素は含まない溶液であった。
コントロール１４から１５は、３５μＭチオエステラーゼ酵素の一つ、ＴＥ４２５またはＴＥ３３２０のいずれか、１００μＭのＢＳＡ、１００ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．２）、２５μＭのメタンチオールおよび２．５μＭのピリドキサールカクテルを含むが、Ｃ２からＣ８のＳＣＦＡ−ＣｏＡ混合物は含まない溶液であった。
【００８４】
サンプルおよびコントロールの内容は表５に示される。
【表５】
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【００８５】
すべてのサンプルを３５分間３７℃でインキュベートし、そこでＳＰＭＥを、カルボキセン／ポリジメチルシロキサンでコートされた（厚さ＝８５μｍ）ファイバーで、３０分間実行した。これは合計４５分のインキュベーション時間という結果になった。
１０μＭフルフリルアルコールは、ＳＰＭＥ変動性を是正するためにサンプルに加えられた。
ＳＰＭＥファイバーに吸収されたまたはコートされた分析物は、選択された時間間隔でＧＣ−ＭＳによって分析された。
【００８６】
ＳＣＦＡ−ＣｏＡ誘導体との等モル混合物をインキュベーションした後の、表６に示された結果は、ＴＥ４２５およびＴＥ３３２０が異なる基質選択性を有するということを確認する。
ＴＥ３３２０はＭＴＢおよびＭＴＶ形成（Ｃ４，Ｃ５）の活性ピークを示し；ブチリルおよびバレリル−ＣｏＡが好ましい基質であることを示唆する。一方、ＴＥ４２５はＭＴＨ形成にわずかなピークを与え、ヘキサノイルＣｏＡ（Ｃ６）がその主要な基質であり得ることを示す。
【００８７】
【表６】
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【００８８】
例６−ＴＥ３３２０による様々なチオエステルの産生
試験サンプルを、０．３５μＭのＴＥ３３２０を含む溶液１００μＬを、１００ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．２）、１００ｍＭのＢＳＡ、２５μＭのメタンチオール、２．５μＭ  ピリドキサールカクテルおよび４．１６μＭのアセチル−ＣｏＡ（Ｃ２）、プロピオニル−ＣｏＡ（Ｃ３）、ブチリル−ＣｏＡ（Ｃ４）、バレリル−ＣｏＡ（Ｃ５）ヘキサノイル−ＣｏＡ（Ｃ６）、およびオクタノイル−ＣｏＡ（Ｃ８）をそれぞれ含む溶液に加えることで調整した。
二つのコントロールサンプルも調製した。
【００８９】
コントロール１６は、１００ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．２）、１００ｍＭのＢＳＡ、２５μＭのメタンチオール、２．５μＭのピリドキサールカクテルおよび４．１６μＭのアセチル−ＣｏＡ（Ｃ２）、プロピオニル−ＣｏＡ（Ｃ３）、ブチリル−ＣｏＡ（Ｃ４）、バレリル−ＣｏＡ（Ｃ５）、ヘキサノイル−ＣｏＡ（Ｃ６）、およびオクタノイル−ＣｏＡ（Ｃ８）をそれぞれ含むが、酵素は含まない溶液であった。。
コントロール１７は、０．３５μＭのＴＥ３３２０を含む溶液１００μＬ、１００ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．２）、１００ｍＭのＢＳＡ、２５μＭのメタンチオールおよび２．５μＭのピリドキサールカクテルを含むが、ＣｏＡ−ＳＦＣＡ誘導体は含まない溶液であった。。
【００９０】
サンプルおよびコントロールの内容は表７に示されている。
【表７】
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【００９１】
サンプルをそこで３２℃でインキュベートした。２時間のインキュベーション後、ＳＰＭＥを実行した。ＳＰＭＥには３０分かかり、この手順の間中、温度は３２℃で保持された。これは、合計２．５時間のインキュベーション時間という結果となった。
１０μＭフルフリルアルコールは、ＳＰＭＥ変動性を是正するためにサンプルに加えられた。
ＳＰＭＥを行うために、カルボキセン／ポリジメチルシロキサンでコートされたファイバーが使用された。コーティングの厚さは８５μｍであった。
ＳＰＭＥファイバーに吸収されたまたはコートされた分析物を、ＧＣ−ＭＳを用いて分析した。
【００９２】
ＧＣ−ＭＳ分析からの結果を表８に示す。
【表８】
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【００９３】
コントロール１６および１７の両方は、どんなチオエステル産物に対応するピークも示さなかった（表８）。ＴＥ３３２０酵素を含むサンプルは、７．９、８．６、９．３、１０．２、１１．１２および１３．３２分で、ｍ／ｚ値が９０、１０４、１１８、１３２、１４６および１７４のピークをそれぞれ示した。
この結果はチオエステルが形成されたことおよびＴＥ３３２０が適切な基質から様々なチオエステルを形成する能力を有するチオエステラーゼであることを証明する。
【００９４】
ＴＥ３３２０によって産生されたそれぞれのチオエステルの量は、対応しているＧＣピークエリアから評価できる。それぞれのピークは特定のチオエステルに対応し、および各ピークのエリアは、サンプル中のそれぞれに対応するチオエステルの量に、おおむね比例するはずである。すべてのピークエリアは表８に列挙されている。
９．３および１０．２分におけるそれぞれｍ／ｚ値１１８および１３２のより大きなピークエリアサイズは、ＴＥ３３２０がＣ４およびＣ５基質に選択性を有することを示し得る。
【００９５】
例７‐B.linensチオエステラーゼの過剰発現
B.linensまたはcorynebacterum属菌の他の種におけるＴＥ４２５、ＴＥ３３２０、ＴＥ１８７５およびＴＥ１８７４の過剰発現は、適したプラスミドベクターの中に本発明のヌクレオチド配列を挿入し、該ベクターで宿主細胞を形質転換することにより、増加した遺伝子コピー数を介して達成され得る。
適したベクターには、B.linens株ＡＴＣＣ９１７４で見出される天然のプラスミドｐＢＬＩＮ１に由来する、ｐＧＩＶ１を含む。ｐＧＩＶ１の特徴には、ｐＢＬＩＮ１複製起点および隣接しているｒｅｐ遺伝子、E.coliにおける複製のためのｐＵＣ複製起点、プロモーター−遺伝子構築物を挿入することができるマルチクローニング部位に隣接した置き換え可能なアンピシリン耐性遺伝子、およびB.linens宿主細胞におけるスクリーニングを促進するためのカナマイシン耐性の遺伝子を含む。
【００９６】
ＴＥ４２５、３３２０、１８７５および１８７４のプロモーター−遺伝子構築物は、転写または翻訳の効果に影響するオペレーターまたはプロモーターモチーフを有する適した５’非翻訳領域、それとＴＥコーディング配列を含む。
適した５’非翻訳（プロモーター）領域の例は、アセト乳酸シンターゼラージサブユニットをコードし、メチオニン付加によって強く上方制御され得る遺伝子ＲＥＢＬ２６４５のすぐ上流の２００ｂｐ領域、ならびに構成的に発現され得るメチオニルアミノペプチダーゼをコードする遺伝子、ＲＢＬＥ０２０６０上流すぐ近くの２００ｂｐ領域を含む（Cholet et al., 2007, Appl. Microbiol. Biotechnol., 74:1320-1332）。
【００９７】
例１に記載の一般的なＰＣＲストラテジーにしたがってプロモーター遺伝子構築物を組み立てた。プロモーターフラグメントは２００ｂｐの長さで、５’末端にＮｏｔＩ部位および３’末端にＥｃｏ３１Ｉ部位を隣接して有する。加えて、３’プロモータープライマーは、ＡＴＧ開始コドン、該スタートコドンの上流１０ヌクレオチドから開始する強いリボソーム結合部位（ＡＧＧＡＧＧ）、およびリボソーム結合部位とスタートコドンとの間の「コンセンサス」配列ＣＣＡＣを含むように構築された。ＡＧＧＡＧＧヘキサマーは、B.linensの１６ＳリボソームＲＮＡ配列の３’末端近くの領域と相補的である。
【００９８】
チオエステラーゼ遺伝子フラグメントは、ＴＥ１８７５については６０３塩基対、ＴＥ３３２０については４３５塩基対である。
両方とも、その５’末端にＥｃｏ３１Ｉ部位および、その３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を隣接して有する。
チオエステラーゼ遺伝子フラグメントの３’末端には、ＨｉｎｄＩＩＩ部位のすぐ５’側にＴＧＡ終止コドンを含む。
それらのフラグメントは、適切なペアの制限酵素で消化され、そのあと、ＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されているｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Stratagene, Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA）中に、トリプルライゲーションでライゲーションされた。ＲＢＬＥ０２０６０およびＲＥＢＬＥ２６４５プロモーターフラグメントは、ＴＥ１８７５およびＴＥ３３２０遺伝子挿入物フラグメントと４対のプロモーター−遺伝子の組合せとしてライゲートされ、E.coli  ＤＨ５アルファ細胞中に形質転換された。
【００９９】
予想されるクローンからのプラスミドＤＮＡにおける、正しく組み立てられたプロモーター−遺伝子の組合せの存在は、ＤＮＡ配列分析によって確かめられた（表９）。
配列確認の後、挿入物フラグメントを、B.linensシャトルベクターのｐＧＩＶ１中に移転するために、ＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントとして回収した。該ベクターは、ＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ酵素で、ポリリンカー領域で消化され、そこで、個々のプロモーター遺伝子挿入物を、ベクターにライゲートし、E.coli  ＤＨ５アルファ細胞中に形質転換した。
【０１００】
予想される形質転換体からの組換えプラスミドＤＮＡ（ｐＧＩＶ１：ＴＥプラスミド）における、クローニングされたプロモーター−遺伝子の組合せの存在は、ＤＮＡ配列分析によって確認された。プラスミドＤＮＡをそこで単離し、参照によって本明細書に組み込まれるLeret et al., 1998（Microbiol.144:2827‐2836）に記載されたプロトコールを使用して、B.linens  ＡＴＣＣ  １９３９１に形質転換した。
ｐＧＩＶ１：ＴＥプラスミドで形質転換されたB.linens  ＡＴＣＣ  １９３９１の代表的な単離物を選択し、ＴＥ４２５、３３２０、１８７５または１８７４の過剰発現は、表１に提供される配列に基づくプライマーを使用し、ＴＥ  ｍＲＮＡ転写物のリアルタイム定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）で確認し得る。かかる配列から適切なＱ−ＰＣＲプライマーを設計し、関連するｍＲＮＡ転写物を定量することは、十分に当業者のなす範囲内である。
【０１０１】
【表９−１】
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【０１０２】
【表９−２】
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【０１０３】
例８−チオエステラーゼの異種発現
他の乳酸細菌である、Lactobacillus caseiにおけるＴＥ４２５、ＴＥ３３２０、ＴＥ１８７５およびＴＥ１８７４の異種発現は、適したプラスミドベクター中に本発明のヌクレオチド配列を挿入し、該ベクターで宿主細胞を形質転換することにより、増加した遺伝子コピー数を介して達成され得る。
異種発現のためのチオエステラーゼ遺伝子構築物プラスミド（以下ＴＥプラスミド）の構築は、ＴＥ遺伝子の異種発現のために適した５’非翻訳領域を含む、適したベクターを用いなければいけないということ以外は、例１に記載される方法にしたがったＰＣＲで行われた。
【０１０４】
適したベクターは、Lactobacillus caseiまたは、他の乳酸菌からのものであり、限定されないが、ｐＨＡＤＨＬ、L.casei  ＡＴＣＣ  ３３４からクローニングされたｄｈｉｃ遺伝子を含むプラスミド（Broadbent et al. 2004, Appl. Environ. Microbiol. 70:4814‐4820）を含み得る。
ｐＨＡＤＨにおける異種発現に適した５’非翻訳領域は、Ｐ１およびＰ２（表１０）プライマーを使用して、推定上のリボソーム結合部位およびｄｈｉｃのためのプロモーターのＰＣＲ増幅により誘導され得、２８５塩基対のＸｂａＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントを得る。ＴＥ３３２０またはＴＥ１８７５のコーディング領域は、Ｂ７１およびＢ７２またはＢ７３およびＢ７４プライマーをそれぞれ使用して、B.linens  ＡＴＣＣ９１７４のゲノムＤＮＡから増幅された。
【０１０５】
それらの反応で、４５６塩基対のＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩフラグメント上の完全なＴＥ３３２０コーディング領域または、６０９塩基対のＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩフラグメント上の完全なＴＥ１８７５コーディング領域を得た。
開始コドンは、ＢｇｌＩＩ部位の１つ（ＴＥ３３２０）または２つ（ＴＥ１８７５）の塩基対下流であった。これら３つの制限酵素（またはＳａｃＩ、下記参照）の認識部位は、ＴＥ遺伝子または、ｄｈｉｃプロモーター領域には存在しない。
【０１０６】
【表１０】
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【０１０７】
ＰＣＲフラグメントはＢｇｌＩＩで消化され、プロモーターはそれぞれのコーディング配列に別個にライゲーションされる。ライゲーションされたＤＮＡサンプルを回収し、Ｐ１／Ｂ７２およびＰ２／Ｂ７４（表１０）のプライマーの組合せでのＰＣＲ増幅によりチェックされる。
プロモーター−ＴＥコーディング領域構築物は、そこで、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化され、同様にＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化されたｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ中にライゲーションされ、E.coli  ＤＨ５アルファに形質転換された。形質転換体における正しく組み立てられたプロモーター遺伝子の組合せの存在は、Ｐ１×Ｂ７２（ＴＥ３３２０）およびＰ１×Ｂ７４（ＴＥ１８７５）プライマーを用いたＰＣＲおよび、組換えプラスミドからの挿入領域のＤＮＡ配列分析により検証された。
【０１０８】
組換えプラスミドをＳａｃＩおよびＢａｍＨＩで消化し、プロモーター−コーディング領域フラグメントをｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔベクターから分離した。挿入物を、ｄｈｉｃをプロモーター−ＴＥコーディング領域に効果的に置き換えるＳａｃＩ／ＢａｍＨＩで消化し、ｐＨＡＤＨ中にライゲーションし、E.coli  ＤＨ５アルファに形質転換された。
形質転換体における正しく組み立てられたプロモーター遺伝子の組合せの存在は、Ｐ１×Ｂ７２（ＴＥ３３２０）およびＰ１×Ｂ７４（ＴＥ１８７５）プライマーを用いたＰＣＲおよび、組換えプラスミドからの挿入領域のＤＮＡ配列分析により検証された。
【０１０９】
組換えプラスミドｐＴＥ３３２０およびｐＴＥ１８７５を、E.coliクローンから回収し、L.casei  ＡＴＣＣ  ３３４または他の乳酸菌中にエレクトロポレーションにより形質転換した。
L. caseiについて、細胞を形質転換するためのいくつかの方法の一つは、定常期の細胞を２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で５００ｍＬのＭＲＳブロス（Difco, Detroit, Mich., USA）に接種し、懸濁液の６００ｎｍ（Ａ６００）の吸光度が０．８に達するまで、３７℃でインキュベートすることにより開始される。
【０１１０】
細胞は、５０００ｇの遠心分離で収集され、滅菌蒸留水で２回洗浄され、滅菌した氷冷の３０％ポリエチレングリコール１４５０（Sigma Chemical Co.）２．５ｍＬに懸濁された。上記で形成された３μｌのＴＥプラスミド構築物は、０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベット中で１００μｌの細胞懸濁液と混合され、３分間氷上におかれる。電気パルスは、次のパラメーターに設定されたBio‐Rad Gene Pulser（Bio‐Rad Laboratories, Richmond, Calif., USA）で供給される：２．５ｋＶ、２５μＦおよび２００Ω。エレクトロポレーション後、０．９ｍＬの暖められた（３７℃）ＭＲＳブロスを加え、細胞を３７℃で２時間インキュベートした。形質転換された細胞は、ｍＬあたり５μｇのＥＲＹ（Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., USA）を含むＭＲＳ寒天上に集められた。
【０１１１】
推定の形質転換体の溶解物におけるＴＥベクターの存在を、トリス酢酸バッファー（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２０ｍＭの酢酸および２ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、ｐＨ８．１）を有する０．６％アガロースゲルでの電気泳動分離により確認された。問題の宿主細胞に依存して、プラスミドＤＮＡを単離するための適切な溶解手順を選択することは、十分に当業者のなす範囲内である。
ｐＴＥ３３２０およびｐＴＥ１８７５形質転換体におけるプロモーター−遺伝子の組合せの忠実度は、Ｐ１×Ｂ７２（ＴＥ３３２０）およびＰ１×Ｂ７４（ＴＥ１８７５）プライマーを用いたＰＣＲおよび、挿入領域のＤＮＡ配列分析により検証された。
【０１１２】
ＴＥ４２５、３３２０、１８７５または１８７４の過剰発現は、関連する遺伝子配列を基にするプライマーを使用したＴＥｍＲＮＡ転写物のリアルタイム定量的ＲＮＡ（Ｑ−ＰＣＲ）で確認された。
代わりに、これらの宿主におけるＴＥ活性は、例４に記載の方法を使用して細胞の溶解物についての酵素アッセイにより実証できる。
【０１１３】
チオエステラーゼ酵素をコードするヌクレオチドおよびアミノ酸配列、ならびにこれに伴う様々な方法は、様々な例示的態様に関連して記載されているが、他の類似の態様が使用し得、またここから逸脱することなく、本明細書に開示される同じ機能を実行するための記載された態様に、改変および付加し得ることが理解されるだろう。所望の特性を与えるために様々な態様が組み合わせ得るため、上記の態様は、別の方法では必ずしも必要ない。それゆえに、本開示は、任意の一つの態様に限定されるべきでなく、むしろ、添付の特許請求の範囲の記載にしたがった広さおよび範囲で解釈されるべきである。
【配列表】
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【国際調査報告】
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2013544495.tif 000015
2013544495.tif 000016
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