(57)【要約】本明細書において、関心対象のタンパク質を発現する哺乳動物細胞の培養において使用される培養成分バッチを選択する方法であって、培養において少なくとも2種の異なる成分が用いられ、以下の工程：a)第一分光法によって得られた、第一成分の異なるバッチのスペクトル、および異なる第二分光法によって得られた、第二成分のスペクトル、ならびに第一および第二成分のこれらの異なるバッチの組み合わせを使用する培養において得られる関心対象のタンパク質の培養上清収量を提供する工程、b)スペクトルを処理する工程、スペクトルをフィルタリングする工程、スペクトルを平滑化する工程、および該スペクトルをそれらの一次導関数へ変換する工程、c)スペクトルにおけるパターンを同定する工程、d)d)において同定されたパターンと、培養の収量との関係を同定する工程、e)第一分光法によって得られた第一成分のさらなるバッチのスペクトルおよび第二分光法によって得られた第二成分のさらなるバッチのスペクトルを提供する工程、f)該スペクトルを処理する工程、スペクトルをフィルタリングする工程、スペクトルを平滑化する工程、およびスペクトルをそれらの一次導関数へ変換する工程、g)d)において同定された関係に基づいて予測した培養上清収量が、a)において提供された平均収量の+/-10％以内の場合に、提供された第一成分および提供された第二成分の組み合わせを選択する工程、を含む方法について報告する。2013544353.tif 000014
2013544353.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
関心対象のタンパク質を発現する哺乳動物細胞の培養において使用される培養成分バッチを選択する方法であって、培養において少なくとも2種の異なる成分が用いられ、以下の工程を含む方法：
a)第一分光法によって得られた、第一成分の異なるバッチのスペクトル、および異なる第二分光法によって得られた第二成分のスペクトル、ならびに該第一成分および該第二成分のこれらの異なるバッチの組み合わせを使用する培養において得られる関心対象のタンパク質の培養上清収量を提供する工程、
b)該培養の収量と、スペクトルPCAスコアを計算した後の融合したスペクトルとの関係を同定する工程、
c)該第一分光法によって得られた、該第一成分のさらなるバッチのスペクトルと、第二分光法によって得られた、該第二成分のさらなるバッチのスペクトルとを提供する工程、
d)b)において同定された、スペクトルPCAスコアの計算後の融合スペクトルの関係に基づいて予測した培養上清収量が、a)において提供された平均収量の+/-10％以内の場合に、該提供された第一成分および該提供された第二成分の組み合わせを選択する工程。
【請求項２】
第一および第二分光法が、NIR分光法、MIR分光法、および2D蛍光分光法から選択されることを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記同定する工程が主成分分析によって行われることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項４】
主成分分析が、展開主成分分析であることを特徴とする、請求項3記載の方法。
【請求項５】
展開が最初のモード(試料)の情報を保存することを特徴とする、請求項4記載の方法。
【請求項６】
前記同定する工程が、部分最小二乗分析による、PCAスコアによって融合および圧縮されたスペクトルと収穫時の培養収量との間の関係を同定することであることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
関心対象のタンパク質が、抗体、または抗体断片、または抗体コンジュゲートであることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書において、既にそれを受領し、試験培養の実施の前にかつ試験培養の実施の必要のない、産生物収量に関する培養材料成分の評価方法を報告する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
1980年代前半に、遺伝子組換えDNA技術によって細菌、酵母、または哺乳動物細胞などの異なるタイプの微生物において遺伝子組換えタンパク質を発現させることが可能となって以来、遺伝子組換え生物製剤製品の市場は絶えず成長している。それ以後、これらのタンパク質製品は、幅広い診断用途および薬学的用途において使用されている。
【０００３】
遺伝子組換えタンパク質に対する需要が増えているため、高効率で頑健な製造プロセスが必要となってきている。頑健で再現可能な製造プロセスにとって最も重要な影響因子の1つは、出発材料、例えば培養培地など、の組成である。ほとんどの培養培地は、とりわけ、無機塩、糖、アミノ酸、ビタミン、有機酸、および緩衝液の複雑な混合物である。多くの場合、細胞増殖およびタンパク質産生を促進するために、植物または細菌起源のタンパク質加水分解物のような、複雑で化学的に定義されていない原料が使用される。
【０００４】
一般的に、原料は粉末混合物として供給され、これを水に溶解させて培養培地を形成する。多くの場合、化学的に定義されていないタンパク質加水分解物ならびに化学的に定義された基本培地混合物において、ロット間でかなりの変動を観察することができ、これが、遺伝子組換えによって産生される治療用タンパク質の収量に大きなばらつきを生じさせる。
【０００５】
近赤外、中赤外、ラマン、または2D蛍光分光法のような迅速な分光「フィンガープリント法」技術は、比較的安価であり、複雑な混合物の分析に非常に適している。これらの方法では、主成分分析(PCA)または部分最小二乗(PLS)モデリングのような計量化学法によってのみ取り扱うことができる非常に大量の高次元データが生じる。複雑な分光学的方法および計量化学の組み合わせが、原料の同定試験において、または原料の分類のためのツールとして、一般的に使用されている。
【０００６】
複雑なデータの処理およびモデリングのための主成分分析(PCA)および部分最小二乗(PLS)の使用は、Naes, T.らによって報告されている(Nass, T.ら, NIR Publications, (2002) (非特許文献1))。国際公開公報第2009/086083号(特許文献1)には、PLSを使用してデータを階層的に組織化するための方法が報告されている。生物学的混合物の分画の相対的重要性を特定するための分析機器および方法が、国際公開公報第2008/146059号(特許文献2において報告されている。国際公開公報第2009/061326号(特許文献3)には、クロマトグラフィー材料の評価が報告されている。
【０００７】
米国特許出願公開第2009/0306932号(特許文献4)には、多変量データ配列の迅速な分類法が報告されている。較正モデルを選択するためのスペクトルデータの分析が、EP2128599 (特許文献5)において報告されている。米国特許第5,498,875号(特許文献6)には、試料の化学分析のためのシグナル処理について報告されている。ケイ酸塩材料、ポリマー材料、および/またはナノ材料などの科学的材料の分類方法が、米国特許出願公開第2008/0177481号(特許文献7)において報告されている。米国特許出願公開第2010/0129857号(特許文献8)には、微生物の単離および同定のための方法について報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開公報第2009/086083号
【特許文献２】国際公開公報第2008/146059号
【特許文献３】国際公開公報第2009/061326号
【特許文献４】米国特許出願公開第2009/0306932号
【特許文献５】EP2128599
【特許文献６】米国特許第5,498,875号
【特許文献７】米国特許出願公開第2008/0177481号
【特許文献８】米国特許出願公開第2010/0129857号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Nass, T.ら, NIR Publications, (2002)
【発明の概要】
【００１０】
遺伝子組換えタンパク質のための製造プロセスの性能を、培地成分、例えば、複雑な培養培地の成分として使用されるタンパク質加水分解物および/または化学的に定義された培地調製物などのNIRおよび2D蛍光スペクトルの組み合わせに基づいて予測することができることが見出された。
【００１１】
本明細書において報告される一局面は、関心対象のタンパク質を発現する哺乳動物細胞の培養において使用される培養培地成分のバッチまたはロットを選択するための方法であって、前記培養において少なくとも2種の異なる成分が用いられ、そのような選択ために2種の異なる分光技術の融合スペクトルデータを使用する方法である。
【００１２】
一態様において、関心対象のタンパク質を発現する哺乳動物細胞の培養において使用される培養成分ロットを選択する方法であって、該培養において少なくとも2種の異なる培養成分が用いられる方法は、以下の工程を含む：
a)第一分光法によって得られた、第一成分の異なるロットのスペクトル、該第一分光法とは異なる第二分光法によって得られた、第二成分における異なるロットのスペクトル、ならびに第一および第二成分のこれらの異なるロットの組み合わせを使用する培養において得られる関心対象のタンパク質の培養上清収量を提供する工程、
b)該培養の収量と、スペクトルPCAスコアを計算した後の融合スペクトルとの関係を同定する工程、
c)第一分光法によって得られた、第一成分のさらなるロットのスペクトルおよび/または第二分光法によって得られた、第二成分のさらなるロットのスペクトルを提供する工程、
d)b)において同定された、スペクトルPCAスコアの計算後の融合スペクトルの関係に基づいて予測した培養上清収量が、a)において提供された平均収量の＋/−10％以内の場合に、提供された第一成分および提供された第二成分の組み合わせを選択する工程。
【００１３】
一態様において、関心対象のタンパク質を発現する哺乳動物細胞の培養において使用される培養成分ロットを選択する方法であって、該培養において少なくとも2種の異なる培養成分が用いられる方法は、以下の工程を含む：
a)第一分光法によって得られた、第一成分の異なるロットのスペクトル、該第一分光法とは異なる第二分光法によって得られた、第二成分における異なるロットのスペクトル、ならびに第一および第二成分のこれらの異なるロットの組み合わせを使用する培養において得られる関心対象のタンパク質の培養上清収量を提供する工程、
b)スペクトルを処理する工程、スペクトルをフィルタリングする工程、スペクトルを平滑化する工程、および該スペクトルをそれらの一次導関数へ変換する工程、
c)スペクトルにおけるパターンを同定する工程、
d)c)において同定されたパターンと培養の収量との関係を同定する工程、
e)第一分光法によって得られた、第一成分のさらなるロットのスペクトルおよび/または第二分光法によって得られた、第二成分のさらなるロットのスペクトルを提供する工程、
f)該スペクトルを処理する工程、スペクトルをフィルタリングする工程、スペクトルを平滑化する工程、およびスペクトルをそれらの一次導関数へ変換する工程、
g)d)において特定された関係に基づいて予測した培養上清収量が、a)において提供された平均収量の+/-10％以内の場合に、提供された第一成分および提供された第二成分の組み合わせを選択する工程。
【００１４】
一態様において、第一分光法および第二分光法は、NIR分光法、MIR分光法、および2D蛍光分光法から選択される。
【００１５】
一態様において、スペクトルを処理する工程は、水吸収領域の除去および多重散乱補正の適用を含み、および/またはフィルタリングは、Savitzky-Golayフィルタリングを含む。
【００１６】
一態様において、スペクトルにおけるパターンを同定する工程は、主成分分析によって行われる。一態様において、主成分分析は、展開主成分分析である。一態様において、展開法は、最初のモード(試料)の情報を保存する。一態様において、Savitzky-Golay平滑化は、19点のウインドウおよび二次多項式によって行われる。一態様において、データは平均化され、主成分の最適数がleave-one-out交差検証法を用いて選択される。
【００１７】
一態様において、前記処理する工程は、散乱の領域の排除および除去された点の補間を含む。一態様において、最終スペクトルは、290nm〜594nmの発光波長範囲および230nm〜575nmの励起波長範囲によって作成される。
【００１８】
一態様において、PCAスコアによって融合および圧縮されたスペクトルと収穫時の培養収量との間の関係の同定は、部分最小二乗分析によって行われる。
【００１９】
一態様において、NIRスペクトルは、4,784cm-1〜8,936cm-1の波数領域にわたって収集される。
【００２０】
一態様において、スペクトルの次元数を、1,039の波数から3つの主成分に減じる。
【００２１】
一態様において、関心対象のタンパク質は、抗体、または抗体断片、または抗体コンジュゲートである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
遺伝子組換えタンパク質のための製造プロセスの性能を、培地成分、例えば、複雑な培養培地成分として使用されるタンパク質加水分解物および/または化学的に定義された培地調製物など、のNIRおよび2D蛍光スペクトルに含まれる組み合わされた情報に基づいて予測できることが見出された。
【００２３】
遺伝子組換え生物製剤の発酵において使用される2種の培地成分について得られる(変数減少によりそれらを主成分分析(PCA)スコアに対して加法性にする処理の後の)2種の異なる(直交する)分光技術からのスペクトルを組み合わせて、そのような変換スペクトル(入力)のモデルを使用して、異なる発酵性能に関してロット間の変動を伴う研究された培地成分の混合物に基づいて生物製剤製品の培養の収穫時の収量(出力)を予測する方法について、本明細書において報告する。
【００２４】
(それらの加法性を確実にするために)PCA法との組み合わせにおいて異なる(直交する)分光法を使用し、主要発酵の収穫時の収量に対するそのような培養培地混合物の効果のプロセスモデルを生成することによって、各原料の培地ロットを選択すること、および/またはプロセスの目的を最良に果たす混合物を配合することを可能にする予測能力が実現される。
【００２５】
完全な培養培地を形成する個々の成分における異なるロットは、それらの詳細な配合がわずかに変化するが、依然として、製造元によって提供される仕様内に収まっている。場合によって、単一の原料成分に対してこの変動を追跡することは可能ではあるが、ほとんどの場合、分析的手段によってロット間の変動を検出することはできない。同じ哺乳動物細胞株の比較培養を繰り返し実施することで、産生物収量に対する異なる個々の成分ロットの影響を評価することができる。
【００２６】
本明細書では、大豆タンパク質加水分解物の9つの異なるロット、2つの異なる大豆タンパク質加水分解物ロットの2つの混合物、米タンパク質加水分解物の5つのロット、および化学的に定義された基本培地粉末の6つのロットを、ぞれぞれ発酵培地および流加培地に用いた、56の培養について報告する。
【００２７】
産生物収量に関する異なる大豆タンパク質加水分解物ロットの影響を評価するために、化学的に定義された基本培地および米タンパク質加水分解物の同じロットを発酵培地および流加培地において使用する、比較培養を実施した。結果は、用いた異なる大豆タンパク質加水分解物ロットに従ってグループ分けすることができる。異なるロットの性能は、同様の平均播種細胞密度(ICD)値での産生物収量に基づいて評価した(表1)。
【００２８】
【表１】
2013544353.tif 000003
【００２９】
第二セットの培養に対して得られた結果を表2に一覧する。
【００３０】
【表２】
2013544353.tif 000004
【００３１】
個々の成分における異なるロットは、結果として、異なる産生物収量を生じることが分かる。このシリーズの培養では、異なる平均ICD値も使用した。低いICD値を有するにもかかわらず、ロット1およびロット5を使用する培養では、より高いICD値の培養(ロット3およびロット6)よりもかなり高い産生物収量が得られた。したがって、大豆タンパク質加水分解物の異なるロットは、結果として、異なる産生能力を生じる。
【００３２】
同様に、プロセス性能に対する米タンパク質加水分解物の影響を評価することができる(表3)。
【００３３】
【表３】
2013544353.tif 000005
【００３４】
6つの培養を実施し、これは、それらのそれぞれにおいて使用した米タンパク質加水分解物の異なるロットに従ってグループ分けすることができる。異なる米タンパク質加水分解物ロットの性能は、平均産生物収量に基づいて評価することができる。両方のグループ、すなわち、米タンパク質加水分解物ロットは、同じICD値を有する。
【００３５】
発酵初期培地配合物および流加培地において同じロットの大豆タンパク質加水分解物および米タンパク質加水分解物を用いて培養を実施することにより、産生物収量に対する化学的に定義された基本培地の影響を評価することができる。3つのシリーズの実験を実施した(表4、5、および6)。
【００３６】
第一のシリーズは、発酵培地および流加培地において大豆タンパク質加水分解物のロット3(表3に示される)および米タンパク質加水分解物のロット2(表2に示される)を有する6つの培養を含んだ。培養は、使用した化学的に定義された基本培地のロットに従ってグループ分けした。異なる化学的に定義された基本培地の性能を、産生物収量に基づいて評価した。平均ICDおよび平均産生物収量の両方において、2つの群の間にわずかな違いがあった。より低いICDでは、より低い産生物形成を得ることができる。したがって、化学的に定義された基本培地のロットは、産生物収量に対して、ほとんどまたは全く影響を及ぼさない。
【００３７】
【表４】
2013544353.tif 000006
【００３８】
第二のシリーズは、発酵初期培地配合物および流加培地において大豆タンパク質加水分解物のロット1(表2に示される)を用いる6つの培養を伴う。実験は、使用した化学的に定義された基本培地のロットに従ってグループ分けした。有意なICDの違いは全く見られなかった。したがって、産生物収量における違いは、使用した化学的に定義された基本培地のロットにおける違いによるものである。
【００３９】
【表５】
2013544353.tif 000007
【００４０】
第三のシリーズは、発酵初期培地配合物および流加培地において大豆タンパク質加水分解物のロット2を用いる5つの培養を伴っていた。実験は、使用した化学的に定義された基本培地のロットに従ってグループ分けした。使用したICDおよび得られた産生物濃度の両方において、2つの群の間に違いがあった。
【００４１】
【表６】
2013544353.tif 000008
【００４２】
上記から、原料ロットの特性評価の必要性と、得られたデータを使用して、発酵実験を実施する必要なく、原料ロットが産生物の高収量を生み出すかどうかを予測することができる方法を提供する必要性とが、存在することが分かる。
【００４３】
3種の異なる培養培地成分のすべてのロットのNIR、MIR、および2D蛍光スペクトルを取得することができる。その後、確立された計量化学法により、スペクトル分析を実施することができる。これらの異なる情報源によって得られたスペクトル情報を分析する新規の方法を本明細書において報告し、これは、予測モデリングの目的のために使用することができる。
【００４４】
異なる期間において、3つ組として原料のロットのNIRスペクトルを得た。粉末および不均質な粗試料の場合、NIRスペクトルは、反復の間で変わる。そのような範囲外の反復は、PCAスコアプロット空間におけるそれらの相対的位置(ユークリッド距離)に基づいて排除することができる。
【００４５】
提供されたすべての計測から、大豆タンパク質加水分解物の18のロット、米タンパク質加水分解物の12のロット、および化学的に定義された基本培地の14のロットのNIRスペクトルを選択した。NIRスペクトルは、4,784cm-1〜8,936cm-1において収集した。このスペクトル領域には、ノイズ領域が含まれていない。観測される強いベースラインシフトは、平均粒度分布(粒度)が違う異なる原料ロットに関連する光散乱によるものである。ベースライン補正を行っていない生のスペクトルの分析により、主に物理効果に起因する変動を明確にすることができる。生のスペクトルのPCA分析を、各原料に対して別々に実施した。
【００４６】
図1は、元のNIRスペクトルに基づくPCAによって構築された2次元空間上での、試験した異なる大豆タンパク質加水分解物ロットの分布を示しており、NIRスペクトル分散の94％を捉えている。スペクトルの次元数を、1,039の波数から重要な3つの主成分に減じた。低産生物収量を与えるロットからのこの分析に基づいて、高産生物収量を与えるロットを判断することはできない。さらに、(図2において、異なるNIRスペクトルベースラインによって分かるように) 試料の粒度および湿気含有量(Karl Fischer測定による)も異なっており、任意の単一の特性に従って前記ロットをクラスタ化することを非常に困難にしている。
【００４７】
図3は、試験した米タンパク質加水分解物ロットが、元のNIRスペクトルに基づくPCAによって構築された二次元空間上にどのように分布しているかを示しており、これは、NIRスペクトル分散の92％を捉えている。大豆タンパク質加水分解物の場合のように、高産生物収量を与えるロットを、低産生物収量を与えるロットからのこの分析だけに基づいて判断することはできない。やはり、粒度および試料の湿気がロット間で変わり、クラスタ化に影響を及ぼす。
【００４８】
図4は、元のNIRスペクトルに基づくPCAによって構築された2次元空間上での、化学的に定義された基本培地のロットの分布を示しており、これは、NIRスペクトル分散の98％を捉えている。大豆および米タンパク質加水分解物の場合のように、低産生物収量を与えるロットから、この分析だけに基づいて、高産生物収量を与えるロットを判断することはできない。
【００４９】
得られたNIRスペクトルによって分かるように、分析した3つの培養培地成分は、粒度および湿気含有量において、有意なロット間変動を示している。NIRは、これらの両方の因子に対して非常に敏感である。さらに、これらの両方の因子は、存在するかもしれない、より小さいが依然として重要な化学組成の違いよりも優位に立つ。PCA分析の前に、スペクトルの前処理によって物理情報を除去しなければならない。
【００５０】
水は、NIR領域において、とりわけ、6,900cm-1〜7,150cm-1および5,160cm-1〜5,270cm-1の範囲において、非常に強く吸収する。これらの吸収領域は、それぞれ、O-H伸縮バンドの第一倍音ならびにO-H伸縮バンドおよびO-H変角バンドの結合音によるものである。水の吸収領域は除去することができる。さらに、多重散乱補正(MSC)を適用することによって、ベースラインシフトを排除することができる。試料間の分散を強めるために、Savitzky-Golayフィルタリングおよび平滑法を適用することができ、スペクトルをそれらの一次微分へ変換することができる(25点のウインドウ)。
【００５１】
事前に前処理した大豆タンパク質加水分解物のスペクトルについて、PCA分析を実施した(図5)。プロセス収量に関して非常に良好〜良好な性能のロットのほとんどすべてが、PCAプロットの左側(PC1スコアの負の値)に集まっている。対照的に、不十分な性能と思われるロット4は、プロットの右側の空間を占める。
【００５２】
事前に前処理した米タンパク質加水分解物のスペクトルについて、PCA分析を実施した(図6)。非常に似た収量を与えるロットが一緒に集まっており、したがって、これは、前処理したスペクトルのPCAが適切であること、ならびに、この成分原料の化学組成まで辿ることができるいくらかのロット間の変動が既に存在し、それが粒度または湿気レベルに関係ないことを示している。
【００５３】
化学的に定義された塩基性媒体の前処理されたスペクトルのPCA分析(図7)は、概してすべての非常に良好〜良好な性能のロットがPCAプロットの左側(PC1の負のスコア値)に集まっていることを示している。対照的に、不十分な性能と思われるロット3は、プロットの右側の空間を占めている。それらの結果は、タンパク質加水分解物ロットの場合に得られた結果と比較可能である。
【００５４】
NIRスペクトル以外に、異なる水溶性発酵原料から得た蛍光励起−発光スペクトル(EEM)を分析することができる。x軸に沿った励起波長、y軸に沿った発光波長、およびz軸に沿った強度による3元データ配列を実現することができる。図8に、大豆タンパク質加水分解物ロット試料の蛍光EEMのランドスケープを示す。
【００５５】
大豆タンパク質加水分解物の19のロット、米タンパク質加水分解物の12のロット、および化学的に定義された基本培地の14のロットの2D蛍光スペクトルを得た。スペクトルは、5nm間隔において200nm〜600nmの励起波長、2nmの間隔において同じく200nm〜600nmの発光波長を使用して得ており、これは、合計81の励起波長および201の発光波長を与える。
【００５６】
原料の分析に基づいた培養収量の予測を可能にするために、個々の行列から、各原料に対する3元配列を発生させることができる。
【００５７】
典型的なEEMスペクトルは、レイリーおよびラマン散乱効果によって影響され得、これは、蛍光のランドスケープの情報内容に影響を及ぼす。レイリー効果を打ち消すために、いくつかの戦略および技術：
−励起波長より小さい発光波長をゼロに設定する
−散乱の領域に欠測値を挿入する
−散乱の領域を排除して、除去された点を補間する；または
−バックグラウンドスペクトルを減算する
を使用することができる。
【００５８】
散乱の領域を排除して除去された点を補間することが、本明細書において報告される方法においてもっとも適していることが見出された。したがって、Matlab(著作権)アルゴリズムEEMscatを用いることができる。このアルゴリズムは、ワールドワイドウェブサイト：httt://www.models.kvl.dk/source/EEM_correction/から自由にダウンロードすることができる。この手順により、散乱を完全に除去することができる。さらにスペクトルは、第一励起波長において発光軸全体に沿って顕著なノイズも示している。この領域(200nm〜225nm)は、無情報の発光波長(200nm〜315nmおよび596nm〜600nm)および励起波長(580nm〜600nm)と同様にスペクトルから除去した。結果として得られたスペクトルを図9に示す。
【００５９】
最終的な大豆タンパク質加水分解物スペクトルは、320nm〜594nmの発光波長範囲および230nm〜575nmの励起波長範囲によって作成され、結果として19×138×70要素の配列が得られる。米タンパク質加水分解物および化学的に定義された基本培地のデータセットに対しても同じ手順を行うことができる。したがって、最終的な米タンパク質加水分解物スペクトルは、それぞれ290nm〜594nmおよび230nm〜550nmの発光波長範囲および励起波長範囲で構成され、結果として、12×153×65要素の配列が得られる。最終的な化学的に定義された基本培地スペクトルは、290nm〜594nmの発光波長範囲および230nm〜550nmの励起波長範囲を含み、結果として、14×162×60要素の配列が得られる。
【００６０】
結論として、各原料データセットに対してEEMスペクトルの前処理を実施することにより、信号対ノイズ比を高めることができる。したがって、各原料間の違いが明確になり得、大豆タンパク質加水分解物は、2種または3種のフルオロフォアを含み、米タンパク質加水分解物は3種のフルオロフォアを含み、化学的に定義された基本培地は4種を超えるフルオロフォアを含む。
【００６１】
原料のロット間変動の概要を得るために、各成分の原料に対して、展開された蛍光データ配列のPCAを実施することができる。3元配列の3つのモデルのいずれに対しても、展開手順を適用することができる。ロット間の違いを強めるために、第一モード(試料)の展開保存情報を用いることができる。このようにして、蛍光のランドスケープを、順次、発光スペクトルの列中に展開することができる(図10)。
【００６２】
大豆タンパク質加水分解物配列の次元は、19×138×70(ロット×発光波長×励起波長)である。展開戦略の後、19×9,960のサイズの2元行列を得ることができる。図11は、大豆タンパク質加水分解物の3つの異なるロットについて結果として得られるスペクトルの小部分を示している。最遠の励起波長にノイズが見られる。
【００６３】
これらの逸脱を打ち消すために、いくつかの戦略を使用することができる。ノイズを除去するために19点のウインドウおよび二次多項式を使用したSavitzky-Golay平滑化が最も適しており、ならびにベースラインの変動を排除するためには、多重散乱補正(MSC)が最も適していることが見出された。
【００６４】
大豆タンパク質加水分解物の前処理した行列に展開PCAを適用した。データを平均化し、主成分の最適数を、leave-one-out交差検証法を用いて選択した。図12は、PCAのPC1×PC2のスコアプロットを示しており、展開されたEEMのランドスケープ全体に見出される分散の96％を網羅する。
【００６５】
展開後、結果として得られる米タンパク質加水分解物行列は、12×9,945のサイズを有していた。大豆タンパク質加水分解物の場合に使用したのと同じ前処理を適用した。図13は、3つの主成分を用いたPCAのPC1×PC2のスコアプロットを示しており、展開されたEEMスペクトルにおける分散の98％より多くを網羅する。
【００６６】
化学的に定義された基本培地の、展開された行列のサイズは、14×9,600であった。他の2つの培地成分に適用したのと同じEEMスペクトル前処理手順を使用した。図14は、2つの主成分を用いたPCAのPC1×PC2のスコアプロットを示しており、展開されたEEMスペクトルにおける総分散の92％より多くを網羅する。同じ培地成分に対するNIRスペクトルによる前述のように、高収量を与えるロットが、EEM展開スペクトルのPCAスコアプロットにおいて、低収量を与えるロットから分離されることが見出された。
【００６７】
各培地成分および/またはそれらの組み合わせにおける異なるロットに対して得られるNIRおよび/または蛍光スペクトルに基づいてプロセスの終了時の産生物収量を予測するために、PLSモデルを発展させることができる。該PLSアルゴリズムは、Xブロック(前処理されたスペクトル、変数選択の有無にかかわらない)およびYブロック(産生物パラメータ)を与えると、Yの変化を担うXの変動を見出すことによって両方を相関させる(すなわち、両方のブロックの間の共分散を最大化する)。原料における大部分の異なるロットが包含され得る基本設定が定義され得る。同じロット組み合わせを有する反復バッチから、最も高い産生物収量を与えるものを、較正データセットのために選択した(表7)。
【００６８】
【表７】
2013544353.tif 000009
【００６９】
NIRスペクトルを前述のように前処理することで、異なる粒度分布に由来する物理効果の影響を除去することができる。反復スペクトルを使用しないので、内部検証戦略としてleave-one-out交差検証法を使用した。
【００７０】
得られたモデルは、2つだけのLVから作成されているが、有意でない0.139のR2が得られた。測定値対交差検証予測プロットを図15に示す。
【００７１】
表8に示されるような較正データセットを使用して、化学的に定義された基本培地における異なるロットのNIRスペクトルと、産生物収量とを相関させるPLSモデルを構築することができる。
【００７２】
【表８】
2013544353.tif 000010
【００７３】
得られたモデルは、2つだけのLVによって作成されているが、やはり、有意でない0.04のR2が得られた(図16)。
【００７４】
1つの培地成分だけでなく収量に影響を及ぼす最も関連する2つの培地成分を考慮し、ならびに使用される異なる分光法のそれぞれによって異なる化学情報が取得されることを考慮して、同じ分光法/異なる培地成分の間、ならびに異なる分光法/異なる培地成分の間において、組み合わせ戦略を使用することができる。
【００７５】
較正および検証バッチを選択するために使用される評価基準は、較正の際に可能な最も広い範囲を得ることに基づいた(表9)。
【００７６】
【表９】
2013544353.tif 000011
【００７７】
データセットの3分の1を用いて、外部検証を実施した。較正および検証データ(NIRスペクトル)を、前述と同じ方法で前処理した。得られた予測モデルは、3つのLVに基づいており、得られたR2は、0.88の有意値に達した。
【００７８】
モデルの精度および長期頑健性は、R2が高く、較正および検証誤差が低く、RMSECVとRMSEPとの間の差が小さいことに反映されている(図17)。上記の場合では、予測誤差が低く(RMSEP＝36mg/l)、RMSECV(126mg/l)とそれほど違わなかった。
【００７９】
したがって、産生物収量を、2種の(最も重要な)プロセス原料または培地成分に対する同じ性質の分光情報(NIR)の組み合わせによって得られた、培養培地の異なる化合物からの分光データと相関させることができることが見出された。各スペクトルは944の波数を有し、前記モデルに含まれる較正データセット全体は、18,880の変数によって表される(変数選択後は10試料×2原料×944波数)。必要な作業負荷を減じるために、収容されている情報をいくつかの非相関変数へと変換することによって最初に圧縮されたスペクトルに基づいて、PCA分析を実施した。それよって得られたモデルは、より単純であり、2つだけの潜在変数(LV)を収容しており、ならびに0.81のR2が得られた。
【００８０】
異なる分光法は、相補的化学情報を捉える。2種の異なるタイプの分光情報を使用して、モデルの予測品質を向上させた。したがって、大豆タンパク質加水分解物の蛍光スペクトルおよび化学的に定義された基本培地のNIRスペクトルを使用した(表10)。
【００８１】
【表１０】
2013544353.tif 000012
【００８２】
蛍光スペクトルおよびNIRスペクトルは、前述のように、前処理の後にいくつかの主成分へと圧縮した。得られたモデルは3つの潜在変数だけを有しており、0.90のR2が得られた(図18)。このモデルは、前述のモデルと比較して、より良好な性能を有しており、高いR2値を有するだけでなく、差が非常に小さい低いRMSECVおよびRMSEP値(約90mg/l)も有しているので、より頑健である。
【００８３】
化学的に定義された基本培地に対して、NIRの代わりにMIRを使用してさらなる試験を行った。使用した較正および検証データセットは、上記に示したものと同じであった(表10を参照のこと)。蛍光およびMIRスペクトルを、前述のように前処理した。得られたモデルは、3つの潜在変数、0.88のR2、ならびに差のない低いRMSECVおよびRMSEP値(両方とも約100mg/l)を有しており、したがって、化学的に定義された基本培地のNIRデータによって得られたものに対して、有意な差を示さなかった(図19)。
【００８４】
大豆タンパク質加水分解物のNIRスペクトルおよび化学的に定義された基本培地の蛍光スペクトルを一緒に結合させ、結果として得られたモデルを評価した。モデルを構築するために使用した較正および検証データセットは、前述と同じであった(表10を参照のこと)。得られたモデルは、3つの潜在変数と、非常に似たR2値(0.87)(図20)ならびにRMSECVおよびRMSEP値(それぞれ、124mg/lおよび60mg/l)とを有する。
【００８５】
約60mg/l(平均産生物濃度である1200mg/lの5％)での産生物の基準分析論に対する分析分散により、開発されたほとんどのモデルは、実験的限界に非常に近い予測精度を示した。
【００８６】
結論において、330時間での産生物収量の予測を実現するためには、大豆タンパク質加水分解物および化学的に定義された基本培地の両方のスペクトル情報を使用しなければならない。化学的に定義された基本培地の蛍光分光データの使用では、化学的に定義された基本培地のNIR分光データおよび大豆タンパク質加水分解物の2D蛍光分光データに基づくモデルよりもわずかに低い(が、十分に比較可能である)予測誤差が得られる。
【００８７】
本明細書において報告される方法は、異なる性質のスペクトルの組み合わせ(蛍光スペクトルおよびIRスペクトル)を対象としており、該スペクトルは、本質的に、異なる次元(それぞれ、2次元(2D)および1次元(1D))を有し、最初に各スペクトルを主成分分析スコアへと圧縮する作業と、次に各スペクトルスコアの線形結合を生成する作業を必要とする。異なる性質の該スペクトルを、次元減少およびこれらの減少させた変換済み変数(各スペクトルを圧縮することによって得られたPCAスコア)の線形結合によって組み合わせる。
【００８８】
したがって、本明細書において報告される方法では、2種の異なる発酵原料の混合物における該原料の発酵性能を担っている成分を捉えるために、およびロットの特定の組み合わせに対する発酵収量の予測を立てるために、異なる次元および性質のスペクトルを使用する。
【００８９】
本明細書において報告される方法を用いれば、発酵の収穫時の状態を特定することにより、発酵において使用されるべき2種の異なる原料のスペクトルに基づいて、10〜14日先立って、プロセス性能を予測することが可能である。
【００９０】
以下の実施例および図は、本発明の理解を助けるために提供されるものであり、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲において説明される。本発明の趣旨から逸脱することなく、説明された手順において変更を為すことができることは理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】元のNIRスペクトルに基づくPCAによって構築された2次元空間上での、試験した異なる大豆タンパク質加水分解物ロットの分布。
【図２】異なる大豆タンパク質加水分解物ロットのNIRスペクトル。
【図３】元のNIRスペクトルに基づくPCAによって構築された2次元空間上での、試験した異なる米タンパク質加水分解物ロットの分布。
【図４】元のNIRスペクトルに基づくPCAによって構築された2次元空間上での、試験した異なる化学的に定義された基本培地ロットの分布。
【図５】大豆タンパク質加水分解物ロットの前処理したスペクトルに基づくPCA分析。
【図６】米タンパク質加水分解物ロットの前処理したスペクトルに基づくPCA分析。
【図７】化学的に定義された基本培地ロットの前処理したスペクトルに基づくPCA分析。
【図８】大豆タンパク質加水分解物ロット試料の蛍光EEMのランドスケープ。
【図９】大豆タンパク質加水分解物ロット試料の処理した蛍光EEMのランドスケープ。
【図１０】発光スペクトルの行中の展開された蛍光のランドスケープ。
【図１１】大豆タンパク質加水分解物の3つの異なるロットの、展開されたスペクトルの抜粋。
【図１２】展開されたEEMのランドスケープにおける、大豆タンパク質加水分解物に対するPCAのPC1×PC2のスコアプロット。
【図１３】展開されたEEMのランドスケープにおける、米タンパク質加水分解物に対するPCAのPC1×PC2のスコアプロット。
【図１４】展開されたEEMのランドスケープにおける、化学的に定義された基本培地に対するPCAのPC1×PC2のスコアプロット。
【図１５】測定値対公差検証予測値のプロット。
【図１６】化学的に定義された基本培地の異なるロットのNIRスペクトルと、産生物収量とを相関付けるPLSモデル。
【図１７】大豆タンパク質加水分解物および化学的に定義された基本培地の異なるロットのNIRスペクトルと、産生物収量とを相関付けるPLSモデル。
【図１８】大豆タンパク質加水分解物の異なるロットの蛍光スペクトルおよび化学的に定義された基本培地の異なるロットのNIRスペクトルと、産生物収量とを相関付けるPLSモデル。
【図１９】大豆タンパク質加水分解物の異なるロットの蛍光スペクトルおよび化学的に定義された基本培地の異なるロットのMIRスペクトルと、産生物収量とを相関付けるPLSモデル。
【図２０】大豆タンパク質加水分解物の異なるロットのNIRスペクトルおよび化学的に定義された基本培地の異なるロットの蛍光スペクトルと、産生物収量とを相関付けるPLSモデル。
【図２１】共有結合有機分子の倍音および結合バンドのNIR吸収放射線。
【実施例】
【００９２】
材料および方法
細胞培養：
細胞は、振とうフラスコにおいて、温度、湿度、および二酸化炭素を管理した環境で培養した。異なるロットを比較するために、これらのロットを用いて培地を調製し、これらの培地を収容する振とうフラスコに細胞を播種した。細胞増殖を長持ちさせてより高い産生物濃度を達成するために、毎日、ある特定の容量の流加培地を該振とうフラスコ培養物に加えた。
【００９３】
近赤外分光法(NIR)：
NIRは、米国農務省のKarl Norrisの働きにより、1960年代に分析界に出現した(Sieslerら、2002)。電磁スペクトルにおいて、NIR領域は、中赤外領域と可視領域の間に位置する。波数4,000〜14,000cm-1(それぞれ、波長700〜2,500nm)の範囲において、有機分子のN−H、O−H、およびC−Hなどの共有結合の倍音および結合バンドの吸収放射線(図21)。
【００９４】
NIRスペクトルは、タングステン−ハロゲン源およびInAs検出器を備えたBruker(登録商標) MPA FT-NIRにおいて、平底シンチレーション用バイアルを使用して収集した。各スペクトルは、4,999〜9,003cm-1の波数範囲において、32回のスキャンの平均および8cm-1のスペクトル分解能において記録した。
【００９５】
中赤外分光法(MIR)：
中赤外スペクトルは、Avatar 370 FT-IR(Thermo Fischer, Diamant ATR)においてクォーツキュベットを使用して得た。各スペクトルを、4,000〜400cm-1の波数範囲において記録した。
【００９６】
蛍光分光法：
蛍光分光法は、分子を励起させるためにある特定の波長の放射線照射を使用し、これらの分子は、異なる波長の放射線を放射する。この技術は、多くの場合、マクロ分子の構造および機能、とりわけタンパク質の相互作用を研究するために使用される。タンパク質および核酸において見出される発色団の蛍光特性の暫定的な割り当てを以下の表に示す。
2013544353.tif 000013
【００９７】
細胞培養原料の2D蛍光スペクトルは、5nm間隔において200nm〜600nmの励起波長と、2nm間隔において同じく200nm〜600nmの発光波長とを使用することにより得られ、これは、合計81の励起波長および201の発光波長を与える。発光−励起蛍光スペクトルを、Varian Cary Eclipse Spectrometerを使用して、5nmの間隔において200nm〜600nmの励起波長範囲と、2nmの間隔において同じく200nm〜600nmの発光波長範囲とを測定し、これは、合計81の励起波長および201の発光波長を与える。データは、ソフトウェアCary Eclipse Bio, Package 1.1を使用して収集した。
【００９８】
スペクトル処理および計量化学分析：
スペクトル前処理および計量化学計算を、Matlab(登録商標)  7.2(MathWorks, U.S.A.)において、PLS toolbox 5.5(Eigenvector, U.S.A.)およびSimca P+ 12.01(Umetrics, Sweden)を使用して実施した。EEMscatアルゴリズム(Bahramら、2006)を使用してレイリーおよびラマン散乱を除去した。
【００９９】
PCA(主成分分析)およびPLS(部分最小二乗)を使用して、多変数データ分析を実施した。これらの技術は、データに存在する次元数の減少に基づいており、大量のデータに隠された関連情報の探索を可能にする。元の測定された変数を、主成分と呼ばれる新しい変数へと作り替える。PCA分析を使用して、スペクトルのパターンを見出す。これらのパターンを特定のパラメータに関連付ける目的において、スペクトル情報のみを使用して将来の試料のこれらのパラメータの値の予測を可能にする数学的モデルを構築するために、PLS分析を実施した。
【０１００】
信頼できるモデルを構築するためには、分析的測定の品質が根本的重要性を有する。ノイズおよび求めていない情報が測定に内在するために、得られたスペクトルを前処理する必要がある。
【０１０１】
NIRスペクトルにおけるこれらの問題を解決するための最も一般的な技術の1つは、Savitzky-Golay平滑化フィルタ(Savitzky, A.および Golay, M.J.E., Anal. Chem., 36 (1964) 1627-1639)であり、一般的に、導関数と共に使用され、これは、ベースラインシフトを減じ、スペクトルの重要な特性を強める利点を有する。
【０１０２】
蛍光スペクトルの場合、主な問題は、ラマンおよびレイリー散乱に関連しており、これは、試料の蛍光特性とは関係のない光の偏位によって生じる。散乱によって影響を受ける波長領域は公知であるので、そのような特定の領域において測定された強度を除去して、補間された点で置き換えることができる。
【０１０３】
PLSおよびPCA分析に好適な行列を得るために、3元発光−励起スペクトルを展開した。較正目的のために、Parafacに基づく3元分析も実施した(Bahram, M.ら, J. Chemometrics, 20 (2006) 99-105)。展開アプローチは、これらの3つの次元のうちの2つを連結して、もう1つを固定して維持することからなる。この場合、発光および励起軸は、試料の情報を維持しながら連結される。
【図１】
2013544353.tif 000015
【図２】
2013544353.tif 000016
【図３】
2013544353.tif 000017
【図４】
2013544353.tif 000018
【図５】
2013544353.tif 000019
【図６】
2013544353.tif 000020
【図７】
2013544353.tif 000021
【図８】
2013544353.tif 000022
【図９】
2013544353.tif 000023
【図１０】
2013544353.tif 000024
【図１１】
2013544353.tif 000025
【図１２】
2013544353.tif 000026
【図１３】
2013544353.tif 000027
【図１４】
2013544353.tif 000028
【図１５】
2013544353.tif 000029
【図１６】
2013544353.tif 000030
【図１７】
2013544353.tif 000031
【図１８】
2013544353.tif 000032
【図１９】
2013544353.tif 000033
【図２０】
2013544353.tif 000034
【図２１】
2013544353.tif 000035
【手続補正書】
【提出日】平成25年6月27日(2013.6.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
関心対象のタンパク質を発現する哺乳動物細胞の培養において使用される培養成分バッチを選択する方法であって、培養において少なくとも2種の異なる成分が用いられ、以下の工程を含む方法：
a)NIR分光法およびMIR分光法から選択される第一分光法によって得られた、第一成分の異なるバッチのスペクトル、および2D蛍光分光法によって得られた第二成分のスペクトル、ならびに該第一成分および該第二成分のこれらの異なるバッチの組み合わせを使用する培養において得られる関心対象のタンパク質の培養上清収量を提供する工程、
b)該培養の収量と、スペクトルPCAスコアを計算した後の2種の異なる分光技術の融合したスペクトルとの関係を同定する工程、
c)該第一分光法によって得られた、該第一成分のさらなるバッチのスペクトルと、第二分光法によって得られた、該第二成分のさらなるバッチのスペクトルとを提供する工程、
d)b)において同定された、スペクトルPCAスコアの計算後の融合スペクトルの関係に基づいて予測した培養上清収量が、a)において提供された平均収量の+/-10％以内の場合に、該提供された第一成分および該提供された第二成分の組み合わせを選択する工程。
【請求項２】
前記同定する工程が主成分分析によって行われることを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項３】
主成分分析が、展開主成分分析であることを特徴とする、請求項2記載の方法。
【請求項４】
展開が最初のモード(試料)の情報を保存することを特徴とする、請求項3記載の方法。
【請求項５】
前記同定する工程が、部分最小二乗分析による、PCAスコアによって融合および圧縮されたスペクトルと収穫時の培養収量との間の関係を同定することであることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
関心対象のタンパク質が、抗体、または抗体断片、または抗体コンジュゲートであることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
一態様において、関心対象のタンパク質は、抗体、または抗体断片、または抗体コンジュゲートである。
[本発明1001]
関心対象のタンパク質を発現する哺乳動物細胞の培養において使用される培養成分バッチを選択する方法であって、培養において少なくとも2種の異なる成分が用いられ、以下の工程を含む方法：
a)第一分光法によって得られた、第一成分の異なるバッチのスペクトル、および異なる第二分光法によって得られた第二成分のスペクトル、ならびに該第一成分および該第二成分のこれらの異なるバッチの組み合わせを使用する培養において得られる関心対象のタンパク質の培養上清収量を提供する工程、
b)該培養の収量と、スペクトルPCAスコアを計算した後の融合したスペクトルとの関係を同定する工程、
c)該第一分光法によって得られた、該第一成分のさらなるバッチのスペクトルと、第二分光法によって得られた、該第二成分のさらなるバッチのスペクトルとを提供する工程、
d)b)において同定された、スペクトルPCAスコアの計算後の融合スペクトルの関係に基づいて予測した培養上清収量が、a)において提供された平均収量の+/-10％以内の場合に、該提供された第一成分および該提供された第二成分の組み合わせを選択する工程。
[本発明1002]
第一および第二分光法が、NIR分光法、MIR分光法、および2D蛍光分光法から選択されることを特徴とする、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記同定する工程が主成分分析によって行われることを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1004]
主成分分析が、展開主成分分析であることを特徴とする、本発明1003の方法。
[本発明1005]
展開が最初のモード(試料)の情報を保存することを特徴とする、本発明1004の方法。
[本発明1006]
前記同定する工程が、部分最小二乗分析による、PCAスコアによって融合および圧縮されたスペクトルと収穫時の培養収量との間の関係を同定することであることを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1007]
関心対象のタンパク質が、抗体、または抗体断片、または抗体コンジュゲートであることを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
【国際調査報告】
2013544353.tif 000036
2013544353.tif 000037
2013544353.tif 000038