(57)【要約】  本発明は、前部前腸内胚葉の分化を誘導するin vitroの方法およびかかる方法によって産生された前部前腸内胚葉の濃縮された集団を対象とする。かかる濃縮された集団は、分化中に発生する分子事象の研究、および細胞置換治療用の細胞の生成に有用である。
2013524836.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
前部前腸内胚葉細胞について濃縮された細胞集団。
【請求項２】
少なくとも約50%の前部前腸内胚葉細胞を含む、請求項1に記載の細胞集団。
【請求項３】
前記前部前腸内胚葉細胞が咽頭内胚葉細胞である、請求項1または2に記載の細胞集団。
【請求項４】
前部前腸内胚葉細胞を誘導する方法であって、胚体内胚葉細胞をBMPの阻害剤またはTGF-βシグナル伝達の阻害剤を用いて培養するステップを含む方法。
【請求項５】
前記胚体内胚葉細胞をBMPの前記阻害剤およびTGF-βシグナル伝達の前記阻害剤を用いて培養するステップを含む、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
胚体内胚葉が、アクチビンAの非存在下で培養される、請求項4または5に記載の方法。
【請求項７】
BMPの前記阻害剤が、ノギン、コーディン、またはフォリスタチンである、請求項4〜6のいずれか一項にに記載の方法。
【請求項８】
BMPの前記阻害剤がノギンである、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
TGF-βシグナル伝達の前記阻害剤が、SB431542である、請求項4から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
BMPの前記阻害剤がノギンであり、TGF-βシグナル伝達の前記阻害剤がSB-431542である、請求項4から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記胚体内胚葉細胞が胚様体細胞である、請求項4から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
アクチビンA中で前記胚体内胚葉細胞を培養するステップをさらに含む、請求項4から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記胚体内胚葉細胞が、アクチビンAの非存在下でBMPの前記阻害剤およびTGF-βシグナル伝達の前記阻害剤を用いて培養される、請求項4から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記前部前腸内胚葉細胞がヒト細胞である、請求項4から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記前部前腸内胚葉細胞が多能性細胞に由来する、請求項4から14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記多能性細胞がES細胞である、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記多能性細胞がiPS細胞である、請求項15に記載の方法。
【請求項１８】
前記多能性細胞がヒト細胞である、請求項15から17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記前部前腸内胚葉細胞がFoxa2を発現し、前記胚体内胚葉細胞においてSox2およびCdx2の発現と比べて、Sox2発現のレベルの上昇およびCdx2発現のレベルの低下を含む、請求項4から18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
多能性細胞から前部前腸内胚葉細胞の濃縮された集団を調製する方法であって、
(i)前記多能性細胞を誘導して胚体内胚葉細胞を形成する条件下で前記多能性細胞を培養するステップと、
(ii)前記胚体内胚葉細胞を誘導して前部前腸内胚葉細胞を形成する条件下で前記胚体内胚葉細胞を培養し、それによって、前部前腸内胚葉細胞の前記濃縮された集団を調製するステップと
を含む方法。
【請求項２１】
前記多能性細胞が、前記多能性細胞を誘導して前記胚体内胚葉細胞を形成するためにbFGF、BMP4およびアクチビンAの存在下で培養される、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
前記胚体内胚葉細胞が、前記胚体内胚葉細胞を誘導して前記前部前腸内胚葉細胞を形成するためにBMPの阻害剤またはTGF-βシグナル伝達の阻害剤の存在下およびアクチビンAの非存在下で培養される、請求項20または21に記載の方法。
【請求項２３】
前記胚体内胚葉細胞が、前記胚体内胚葉細胞を誘導して前記前部前腸内胚葉細胞を形成するためにBMPの前記阻害剤およびTGF-βシグナル伝達の前記阻害剤の存在下ならびにアクチビンAの非存在下で培養される、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
BMPの前記阻害剤が、ノギンまたはコーディンである、請求項22または23に記載の方法。
【請求項２５】
BMPの前記阻害剤がノギンである、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
TGF-βシグナル伝達の前記阻害剤が、SB-431542である、請求項22から25のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記多能性細胞が1〜4日間培養される、請求項20から26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記胚体内胚葉細胞が2〜6日間培養される、請求項20から27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記前部前腸内胚葉細胞を単離するステップをさらに含む、請求項20から28のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記多能性細胞がES細胞である、請求項20から29のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記多能性細胞がiPS細胞である、請求項20から29のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記多能性細胞がヒト細胞である、請求項30または31に記載の方法。
【請求項３３】
請求項4から19のいずれか一項に記載の方法によって誘導された前部前腸内胚葉細胞。
【請求項３４】
請求項20から32のいずれか一項に記載の方法によって調製された前部前腸内胚葉細胞の濃縮された集団。
【請求項３５】
前部前腸内胚葉細胞の増殖、分化または生存に影響を与える作用物質を同定する方法であって、試験される作用物質の存在下で請求項1から3のいずれか一項に記載の細胞集団を培養するステップと、前記作用物質の存在下および非存在下で前記細胞の増殖、分化または生存を比較するステップとを含み、前記作用物質の存在下での違いが、前記細胞の増殖、分化または生存に影響を与える作用物質の同定を示している方法。
【請求項３６】
細胞分化に関与する遺伝子を同定する方法であって、胚体内胚葉細胞および前部前腸内胚葉細胞を単離するステップと、前記胚体内胚葉細胞および前記前部前腸内胚葉細胞の遺伝子発現プロフィールを比較するステップとを含み、前記胚体内胚葉細胞および前記前部前腸内胚葉細胞の間で差次的に発現する遺伝子の同定が、細胞分化に関与する遺伝子を示している方法。
【請求項３７】
胚体内胚葉から前部前腸内胚葉への進行の分子マーカーを認識する抗体を同定する方法であって、請求項1に記載の濃縮された細胞集団に対する抗体を産生させるステップと、前記抗体が前記胚体内胚葉に結合するよりも有意に高く前記前部前腸内胚葉に結合する抗体についてスクリーニングするステップとを含む方法。
【請求項３８】
前記抗体が、前記胚体内胚葉に有意に結合しない、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
前記前部前腸内胚葉細胞が、腹側化した前部前腸内胚葉細胞である、請求項1から3のいずれか一項に記載の細胞集団。
【請求項４０】
前部前腸内胚葉の腹側化を誘導する方法であって、Wntリガンド、Wntシグナル伝達アクチベーター、BMP、上皮増殖因子(EGF)および線維芽細胞増殖因子(FGF)からなる群から選択される1種または複数の因子で前記前部前腸内胚葉を培養するステップを含む方法。
【請求項４１】
Wntリガンド、Wntシグナル伝達アクチベーター、BMP、上皮増殖因子(EGF)および線維芽細胞増殖因子(FGF)からなる群から選択される2つ以上の因子で前記前部前腸内胚葉を培養するステップを含む、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
前記因子が、FGF7、FGF10、EGF、BMP-4およびWnt3aからなる群から選択される、請求項40または41に記載の方法。
【請求項４３】
細胞中で肺の運命を誘導する方法であって、前記腹側化した前部前腸内胚葉細胞を誘導して前記肺の運命を示すために、レチノイン酸の存在下で、請求項4から32のいずれか一項に記載の方法によって産生された前部前腸内胚葉細胞を、Wntリガンド、Wntシグナル伝達アクチベーター、BMP、上皮増殖因子(EGF)および線維芽細胞増殖因子(FGF)からなる群から選択される1種または複数の因子で培養するステップを含む方法。
【請求項４４】
前記肺の運命の細胞を示す前記細胞が、1種または複数の肺マーカーを発現する、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
前記1種または複数の肺マーカーが、Gata6またはサーファクタントタンパク質C(SP-C)である、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
前記腹側化した前部前腸内胚葉細胞が、前部前腸内胚葉をWntリガンド、Wntシグナル伝達アクチベーター、BMP、上皮増殖因子(EGF)および線維芽細胞増殖因子(FGF)からなる群から選択される1種または複数の因子で培養することによって誘導された、請求項43に記載の方法。
【請求項４７】
前記腹側化した前部前腸内胚葉細胞が、前部前腸内胚葉をWntリガンド、Wntシグナル伝達アクチベーター、BMP、上皮増殖因子(EGF)および線維芽細胞増殖因子(FGF)からなる群から選択される2つ以上の因子を用いて培養することによって誘導された、請求項46に記載の方法。
【請求項４８】
前記腹側化した前部前腸内胚葉細胞が、前部前腸内胚葉をWntリガンド、Wntシグナル伝達アクチベーター、BMP、上皮増殖因子(EGF)および線維芽細胞増殖因子(FGF)からなる群から選択される2つ以上の因子で培養することによって誘導された、請求項47に記載の方法。
【請求項４９】
細胞中で副甲状腺の運命を誘導する方法であって、腹側化した前部前腸内胚葉細胞をソニックヘッジホッグ(SHH)および線維芽細胞増殖因子(FGF)で培養するステップを含む方法。
【請求項５０】
前記副甲状腺の運命の細胞を示す前記細胞が、副甲状腺マーカーを発現する、請求項49に記載の方法。
【請求項５１】
前記副甲状腺マーカーがGCMBである、請求項50に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、2010年4月25日出願の米国特許仮出願第61/343,272号;2010年10月12日出願の米国特許仮出願第61/392,429号;および2011年1月25日出願の米国特許仮出願第61/436,166号の利益を主張する。前述のすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府に支援された研究または開発
本発明は、米国国立衛生研究所(National Institutes of Health)によって授与された助成金交付番号第5T32CA078207-12の下で政府の支援で行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、少なくとも部分的には、多能性細胞から組織前駆細胞の集団を生成する方法に関し、より具体的には、多能性細胞から前部前腸内胚葉を生成する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
胚性幹(ES)細胞は、胚盤胞の内細胞塊に由来する多能性細胞であり、ヒトおよびマウスにおいて定義された条件で多能性の状態で維持することができる。ES細胞は、理論上、あらゆる体細胞および生殖細胞タイプに分化することができる。したがって、ES細胞を様々な細胞タイプおよび組織に分化させる適切な条件の開発には、将来の細胞置換治療に対する大きな期待がある。多能性細胞はまた、成人体細胞を多能性の状態(例えば、人工多能性幹細胞、すなわち、iPS細胞)にリプログラミングすることによって得ることもでき、ES細胞由来組織の移植に伴う拒絶問題を克服するはずである患者特異的多能性細胞の生成の道を提供する。
【０００５】
発生は、胚盤胞の内細胞塊からの未分化細胞がその間身体のすべての組織を発生する3つの胚葉に分化する原腸形成の過程で開始する。外胚葉は、皮膚およびその付属器、神経系、および副腎組織を生じる。中胚葉は、生殖器-泌尿器系、結合組織、筋肉、骨、軟骨、血管、血液および心臓に発達する。内胚葉は、腸、肝臓、膵臓、食道、気管、肺および咀嚼器を産生し、これは最も多くの前部前腸内胚葉に由来する。
【０００６】
胚の背腹軸、前後軸および左右軸方向の複雑なパターン形成過程が起こり、やがて、ある特定の組織および臓器を生じるこれらの胚葉の特定のドメインの決定をもたらす。パターン形成は、複雑な分子の変化を伴う。したがって、成熟細胞の濃縮されたまたは純粋および機能的な集団を得るために、発生の合図がin vitroで多能性細胞の分化を導くために順次適用される必要があるということが重要であると思われる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kuboら、Development 131巻:1651〜1662頁(2004年)
【非特許文献２】Gadueら、Proc Natl Acad Sci USA 103:16806〜16811頁(2006年)
【非特許文献３】Gouon-Evansら、Nat Biotechnol、24巻:1402〜1411頁(2006年)
【非特許文献４】MaheraliおよびHochedlinger、Cell Stem Cell 3巻:595〜605頁(2008年)
【非特許文献５】Manz、Immunity.26巻:537〜541頁(2007年)
【非特許文献６】Traggiaiら、Science.304巻:104〜107頁(2004年)
【非特許文献７】Legrandら、Methods Mol Biol.415巻:65〜82頁(2008年)
【非特許文献８】Gimenoら、Blood.104巻:3886〜3893頁(2004年)
【非特許文献９】Lanら、Blood.2006年;108巻:487〜492頁
【非特許文献１０】Melkusら、Nat Med.12巻:1316〜1322頁(2006年)
【非特許文献１１】Leeら、Nat.Methods 4巻、359〜365頁(2007年)
【非特許文献１２】D'Amourら、Nat.Biotechnol.24巻、1392〜1401頁(2006年)
【非特許文献１３】Zorn & Wells、Annu.Rev.Cell Dev.Biol.25巻、221〜251頁(2009年)
【非特許文献１４】Yasunagaら、Nat.Biotechnol.23巻、1542〜1550頁(2005年)
【非特許文献１５】Sherwoodら、Dev.Dyn.238巻、29〜42頁(2009年)
【非特許文献１６】Graham、J.Exp.Zoolog.B Mol.Dev.Evol 310巻、336〜344頁(2008年)
【非特許文献１７】Petersら、Genes Dev.12巻、2735〜2747頁(1998年)
【非特許文献１８】Rodewald、Annu.Rev.Immunol.26巻、355〜388頁(2008年)
【非特許文献１９】Spenceら、Nature 470巻、105〜109頁(2010年)
【非特許文献２０】Liら、Genes Dev.22巻、3050〜3063頁(2008年)
【非特許文献２１】Wood & Episkopou、Mech.Dev.86巻、197〜201頁(1999年)
【非特許文献２２】Weinsteinら、Cell 78巻、575〜588頁(1994年)
【非特許文献２３】Chambersら、Nat.Biotechnol.27巻、275〜280頁(2009年)
【非特許文献２４】Vitelliら、Development 129巻、4605〜4611頁(2002年)
【非特許文献２５】Bachillerら、Development 130巻、3567〜3578頁(2003年)
【非特許文献２６】Morrisey & Hogan、Dev.Cell 18巻、8〜23頁(2010年)
【非特許文献２７】Tanakaら、Mol.Cell.Biol.21巻、4391〜4398頁(2001年)
【非特許文献２８】Wallinら、Development 122巻、23〜30頁(1996年)
【非特許文献２９】Chenら、J.Clin.Invest.120巻、2040〜2048頁(2010年)
【非特許文献３０】Moore-Scott & Manley、Dev.Biol.278巻、323〜335頁(2005年)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
少なくとも一部で、本発明は、多能性幹細胞、例えば、ヒト胚性および人工多能性幹細胞から前部前腸内胚葉を生成するための方法の発見に基づいている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
特定の実施形態において、本発明は、前部前腸内胚葉細胞について濃縮された細胞集団を提供する。特定の実施形態において、本発明は、咽頭内胚葉細胞について濃縮された細胞集団を提供する。これらの細胞集団は、本明細書に記載した方法によって得ることができる。本明細書で使用される場合、「細胞集団」という用語は、単離した細胞集団を意味し、正常な発生の結果として動物に存在する細胞の集団を意味しない。
【００１０】
特定の実施形態において、本発明は、前部前腸内胚葉を誘導するための方法であって、BMPの阻害剤またはTGF-βシグナル伝達の阻害剤を用いておよびアクチビンAの非存在下で胚体内胚葉(definitive endoderm)を培養するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、胚体内胚葉は、BMPの阻害剤およびTGF-βシグナル伝達の阻害剤の両方を用いて、アクチビンAの非存在下で培養される。
【００１１】
好ましい実施形態において、BMPの阻害剤はノギンであり、TGF-βの阻害剤は、SB-431542である。
【００１２】
特定の実施形態において、本発明は、ES細胞またはiPS細胞など、前記多能性細胞から前部前腸内胚葉を誘導する方法であって、多能性細胞を誘導して胚体中胚葉(definitive mesoderm)を形成するステップ、例えば、本明細書に記載される通り、マーカーであるEPCAM、CXCR4およびC-KITを発現させるステップと、次いで、本明細書に記載される通り、胚体中胚葉から前部前腸内胚葉を誘導するステップとを含む方法を提供する。
【００１３】
特定の実施形態において、本明細書に記載した方法によって誘導された前部前腸内胚葉細胞は、FOXA2を発現し、胚体内胚葉細胞におけるSOX2およびCDX2の発現と比べて、SOX2発現レベルの上昇およびCDX2発現レベルの低下を含む。
【００１４】
好ましい実施形態において、本発明は、多能性細胞、例えば、ESもしくはiPS細胞、最も好ましくは、ヒトESまたはiPS細胞から前部前腸内胚葉細胞の濃縮された集団を調製する方法であって、
(i)多能性細胞を誘導して胚体内胚葉細胞を形成するために、塩基性FGF(bFGF)、骨形態形成タンパク質4(BMP4)およびアクチビンAの存在下で前記多能性細胞を培養するステップと、
(ii)胚体内胚葉細胞を誘導して前部前腸内胚葉細胞を形成するために、BMPの阻害剤、例えば、ノギンまたはコーディンまたはフォリスタチン、および/またはTGF-βシグナル伝達の阻害剤、例えば、SB-431542の存在下およびアクチビンAの非存在下で胚体内胚葉細胞を培養するステップと
を含む方法を提供する。
【００１５】
特定の実施形態において、本発明は、前部前腸内胚葉細胞の増殖、分化または生存に影響を与える作用物質を同定する方法であって、試験される作用物質の存在下および非存在下で前部前腸内胚葉細胞の濃縮された集団を培養するステップと、前記作用物質の存在下および非存在下で前記細胞の増殖、分化または生存を比較するステップとを含み、前記作用物質の存在下での違いが、前記細胞の増殖、分化または生存に影響を与える作用物質の同定を示している方法を提供する。
【００１６】
特定の実施形態において、本発明は、細胞分化に関与する遺伝子を同定する方法であって、胚体内胚葉細胞および前部前腸内胚葉細胞を単離するステップと、前記胚体内胚葉細胞および前記前部前腸内胚葉細胞の遺伝子発現プロフィールを比較するステップとを含み、前記胚体内胚葉細胞および前記前部前腸内胚葉細胞の間で差次的に発現する遺伝子の同定が、細胞分化に関与する遺伝子を示している方法を提供する。
【００１７】
特定の実施形態において、本発明は、胚体内胚葉から前部前腸内胚葉への進行の分子マーカーを認識する抗体を同定する方法であって、前部前腸内胚葉細胞の濃縮された集団に対する抗体を産生させるステップと、前記抗体が前記胚体内胚葉に結合するよりも有意に高く前記前部前腸内胚葉に結合する抗体についてスクリーニングするステップとを含む方法を提供する。
【００１８】
特定の実施形態において、本発明は、前部/咽頭内胚葉または咽頭嚢の運命において腹側細胞の運命を誘導する方法であって、Wntリガンド、Wntシグナル伝達アクチベーター、BMP、上皮増殖因子(EGF)および線維芽細胞増殖因子(FGF)からなる群から選択される1種または複数の因子を投与するステップを含む方法を提供する。
【００１９】
特定の実施形態において、本発明は、腹側化した前部前腸内胚葉細胞をソニックヘッジホッグ(SHH)および線維芽細胞増殖因子(FGF)を用いて培養することにより細胞中の副甲状腺の運命を誘導する方法を提供する。
【００２０】
特定の実施形態において、本発明は、FGFおよびWntシグナル伝達アクチベーターを含むレチノイン酸の存在下で腹側化した前部前腸内胚葉を培養することにより細胞中の肺の運命を誘導する方法を提供する。
【００２１】
やはり提供されるのは、本明細書に記載した方法によって産生した細胞および細胞の集団(例えば、濃縮された集団)である。
【００２２】
別段定義されない限り、本明細書に用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって普通に理解されるのと同じ意味を有する。方法および材料は、本発明において用いるために本明細書に記載され;当技術分野で公知の他の適当な方法および材料は用いることもできる。材料、方法、および例は、例示的なものにすぎず、限定するものではない。本明細書において挙げられるすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および他の参照は、その全体を参照によって組み込む。矛盾が生じる場合には、定義を含めて本明細書に従うものとする。
【００２３】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図からならびに特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】ノギン/SB-431542で処理された胚体内胚葉中のAFEマーカーの誘導を示す図である。hES細胞中の胚体内胚葉のアクチビンAによって媒介される誘導中のFOXA2、MIXL1、SOX17、SOX2およびCDX2 mRNAの発現。データは、(ACTBとしても公知の)β-アクチンに標準化したmRNAの定量として示し、誘導を最大化するために比例的にスケール変更した。図(棒)の上部に示す通りサイトカインを加えた。
【図１Ｂ】ノギン/SB-431542で処理された胚体内胚葉中のAFEマーカーの誘導を示す図である。アクチビンA誘導の5日目における胚体内胚葉マーカーCXCR4、C-KITおよびEPCAMの代表的なフローサイトメーターによる分析。2つの生物学的に独立した実験を示す。
【図１Ｃ−１】ノギン/SB-431542で処理された胚体内胚葉中のAFEマーカーの誘導を示す図である。胚体内胚葉の誘導後5日目に処理した培養物中での9日目のFOXA2、SOX2、CDX2、PAX9およびTBX1 mRNAの発現(左上パネル参照のこと)であり、列挙した因子は左下パネルにある(n=3生物学的複製;*、他のすべての条件と有意に異なる、P<0.0001;一元配置ANOVA)。d0、分化開始前;d5、5日目。
【図１Ｃ−２】ノギン/SB-431542で処理された胚体内胚葉中のAFEマーカーの誘導を示す図である。胚体内胚葉の誘導後5日目に処理した培養物中での9日目のFOXA2、SOX2、CDX2、PAX9およびTBX1 mRNAの発現(左上パネル参照のこと)であり、列挙した因子は左下パネルにある(n=3生物学的複製;*、他のすべての条件と有意に異なる、P<0.0001;一元配置ANOVA)。d0、分化開始前;d5、5日目。
【図１Ｄ】ノギン/SB-431542で処理された胚体内胚葉中のAFEマーカーの誘導を示す図である。sFRP3(*、P<0.05、n=3生物学的複製)の存在下または非存在下でノギン/SB-431542(SB)を用いた胚体内胚葉の誘導後、5日目に処理した培養物中での9日目のSOX2およびPAX9の発現。
【図１Ｅ】ノギン/SB-431542で処理された胚体内胚葉中のAFEマーカーの誘導を示す図である。前述のように神経外胚葉に分化したhES細胞中の9日目(1日目、ノギン/SB-431542の添加)の、または内胚葉の誘導後(5日目まで内胚葉誘導、その後、ノギン/SB-431542の添加)のBRACHYURYおよびPAX6 mRNAの発現。BRAYCHURYの場合、3.5日目hES細胞は、アクチビンAに曝露し、陽性対照として働く原腸形成を行った(*、P<0.0001、n=3それぞれ3回の生物学的複製からなる実験)。
【図１Ｆ】ノギン/SB-431542で処理された胚体内胚葉中のAFEマーカーの誘導を示す図である。5日目まで胚体内胚葉の誘導後ノギン/SB-431542と並行して処理したまたは肝臓条件で培養した9日目の培養物中のODD1、CDX2、EVX1、CREB313、CEBPA、TBX1、PAX9、SOX2およびFGF8 mRNAの発現(n=3、それぞれ3回の生物学的複製からなる実験)。
【図１Ｇ】ノギン/SB-431542で処理された胚体内胚葉中のAFEマーカーの誘導を示す図である。HDF2およびHDF9 hiPS細胞中のアクチビンA誘導の5日目における胚体内胚葉マーカーCXCR4およびC-KITの代表的なフローサイトメーターによる分析。
【図１Ｈ】ノギン/SB-431542で処理された胚体内胚葉中のAFEマーカーの誘導を示す図である。無血清分化培地(ctrl)またはノギン/SB-431542(n=3、3回の生物学的複製、*培地ctrlと有意に異なる)を用いた、胚体内胚葉の誘導後(左上パネルを参照のこと)、5日目から処理した培養物中での9日目のHFGD2およびHDF9 hiPS細胞中のFOXA2、SOX2およびPAX9 mRNAの発現。
【図１Ｉ】ノギン/SB-431542で処理された胚体内胚葉中のAFEマーカーの誘導を示す図である。無血清分化培地(ctrl)またはノギン/SB-431542(n=3、3回の生物学的複製、*培地ctrlと有意に異なる)を用いた、胚体内胚葉の誘導後(左上パネルを参照のこと)、5日目から処理した培養物中での9日目のHFGD2およびHDF9 hiPS細胞中のFOXA2、SOX2およびPAX9 mRNAの発現。
【図２Ａ】ノギン/SB-431542-誘導AFE細胞の機能的な特性を示す図である。パネルの上部に模式的に表された2つの条件において生成されたHES2-由来細胞中のSOX2、NKX2.1、NKX2.5、PAX1およびP63の発現(n=2つの独立した実験から得られた6つの培養ウェル;*、ノギン/SB-431542と有意に異なる;P<0.05)。WKFBE:WNT3a、KGF、FGF10、BMP4およびEGF。
【図２Ｂ】ノギン/SB-431542-誘導AFE細胞の機能的な特性を示す図である。パネルの上部に模式的に表された3つの条件において生成されたHES2-由来細胞中のNKX2.1、NKX2.5およびPAX1の発現(n=3つの独立した実験から得られた4〜6つの培養ウェル、*、他の条件と有意に異なる;P<0.05)。
【図２Ｃ】ノギン/SB-431542-誘導AFE細胞の機能的な特性を示す図である。腹側AFEの誘導の効率の模式的な概要。WKFBE:WNT3a、KGF、FGF10、BMP4およびEGF。
【図２Ｄ】hESおよびhiPS細胞から生成されたAFEの機能を実証する図である。パネルの上部に模式的に表された条件におけるAFEに分化したHDF2(上グラフ)およびHFD9(下グラフ)hiPS細胞中のSOX1、NKX2.1、およびPAX1 mRNAの発現(n=2つの独立した実験から得られた4〜6つの培養ウェル、*ノギン/SB-431542条件と有意に異なる)。
【図２Ｅ】hESおよびhiPS細胞から生成されたAFEの機能を実証する図である。ノギン/SB-431542、その後WKFBEを用いた、推定上の腹側AFEに分化したHES2細胞中のEPCAMの発現(左ピーク:アイソタイプ対照、右ピーク:EPCAM)。
【図３Ａ】in vitroで生成された腹側AFEから得られた肺および咽頭嚢マーカーの誘導を示す図である。パネルの上部に模式的に表された2つの条件で生成されたHES2-由来細胞中のPAX1、NKX2.1、FOXP2、GATA6およびFOXJ1の発現(n=3つの独立した実験から得られた4〜6つの培養ウェル、*、WKFBE条件と有意に異なる;P<0.05)。WKFBE:WNT3a、KGF、FGF10、BMP4およびEGF。
【図３Ｂ】in vitroで生成された腹側AFEから得られた肺および咽頭嚢マーカーの誘導を示す図である。図に示された因子の存在下で腹側化したAFEにおけるSFTPCおよびGCM2 mRNAの誘導。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
胚形成中、前部および咽頭内胚葉の形成は、ボディープランの確立、ならびに耳、口蓋扁桃、胸腺、副甲状腺、甲状腺、肺、食道および気管の部分などの多臓器系の発達において決定的に重要なステップである。その形成に続いて、胚体内胚葉は、内胚葉サブ系統に次第に分化する。より後部の内胚葉は、中腸および後腸を生じる。肺野から前方の咽頭内胚葉は、咽頭嚢と呼ばれる4つのアウトクロッピングを形成する。それぞれの嚢は、特定の臓器、例えば、耳管および鼓膜の内部リーフレット(第1の嚢)、口蓋扁桃(第2の嚢)、胸腺(前部の第3)、副甲状腺(背部の第3および第4の嚢)、ならびに甲状腺の傍濾胞C細胞(第4の嚢)に発達する。本来の甲状腺は、咽頭の床から発達する。肺、食道および気管は、嚢の遠位にある前部前腸内胚葉に由来する。多能性細胞から前部前腸/咽頭内胚葉細胞の集団を生成する能力は、細胞の成長および分化に影響を与える作用物質についてのアッセイ、ならびに組織の発生および分化に関する研究においてこれらの組織の細胞置換治療に有用であるはずである。しかし、現在、前部前腸内胚葉細胞の集団を多能性細胞から生成するための方法が無く、前部前腸内胚葉形成を制御する分子の機序は、定義が不十分である。これらの形成および組織の発生をより良く理解するために、前部前腸内胚葉細胞集団を得ることが有利であるはずである。前部前腸内胚葉細胞の濃縮された集団を単離するまたは生成することが今まで可能でなかった。
【００２６】
本発明は、多能性細胞を誘導して胚体内胚葉に分化し、その後、胚体内胚葉を前部の運命にパターン形成することにより前部前腸内胚葉の集団を得るための方法を提供する。続いて、前部前腸内胚葉は、それに由来する組織のいずれかに分化するよう誘導することができる。特定の実施形態において、腹側前部前腸内胚葉、副甲状腺および肺マーカーは、前部前腸/咽頭内胚葉から誘導される。したがって、本発明は、多能性細胞から前部前腸内胚葉細胞の集団を生成するための方法を提供する。かかる細胞集団は、細胞の成長および分化に影響を与える作用物質を同定し、組織の発達に関与する遺伝子を同定し、細胞置換治療のために分化した細胞および組織を生成するのに有用である。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「前部前腸内胚葉」は、肝臓を生じる内胚葉よりも前部である内胚葉を意味する。したがって、当業者には、「前部前腸内胚葉」は、例えば、咽頭内胚葉および内胚葉細胞のより高度に分化した他の集団を含み、「前部前腸内胚葉」という用語によって包含される様々な細胞タイプが、分子のマーカーの異なる発現パターンを示し得ることが容易に理解される。当業者には、「前部前腸内胚葉」が、例えば、扁桃、鼓膜、甲状腺、副甲状腺、胸腺、気管、食道、胃、肺および喉頭/咽頭など、様々な組織を生じることが理解される。
【００２８】
例えば、ES細胞などの多能性細胞の胚体内胚葉への方向づけされた分化は、高濃度のアクチビンAを適用することによって得ることができる。この戦略についての科学的根拠は、モルフォゲンであるnodalによるシグナル伝達が、内胚葉形成に必要とされていることである。アクチビンAは、nodalと同じ受容体を活性化するが、可溶性サイトカインとして利用可能である。ES細胞の胚体内胚葉への分化を行うために利用可能な方法にもかかわらず、in vitroで胚体内胚葉を前方化し、前部前腸内胚葉を誘導するまたは単離するのに利用可能な方法は、現在存在しない。
【００２９】
胚組織は、分子のマーカーの特徴的なセットを発現する。内細胞塊細胞は、転写制御因子OCT3/4、NANOG、およびSOX2を発現する。胚体内胚葉細胞は、転写制御因子FOXA2、SOX17およびFOXA3を発現する。前部前腸内胚葉細胞は、転写制御因子FOXA2およびSOX2を発現する。咽頭内胚葉細胞は、転写制御因子TBX1およびSOX2を発現する。第3の咽頭嚢細胞は、転写制御因子PAX1/9、HOXA3およびSIXlを発現する。胸腺上皮細胞は、転写制御因子FOXN1を発現する。前部前腸内胚葉の肺野は、NKX2.1およびGATA6を発現する。
【００３０】
組織中の前部前腸内胚葉マーカーの検出は、それ自体で、ES細胞に由来する前部前腸内胚葉の存在を実証するのに十分ではない。ES細胞は、特定の培養条件下で、未分化状態で維持される。これらの条件を取り除くと、胚様体(EB)を形成するが、これは、自発性の原腸形成を起こし、ランダム分化を起こすすべての胚葉の誘導体のランダム生成をもたらす細胞の球である。ランダム分化を起こすEBは、前部前腸内胚葉用のマーカーを含めた多くの胚組織用のマーカーを発現する。したがって、前部前腸内胚葉としてのES由来組織の妥当な分類は、前部前腸内胚葉用のマーカーの単なる発現以上に組織の追加の特徴付けを要し、前部前腸内胚葉と関連しない細胞運命が抑制されることまたは胚体内胚葉シグナルおよび後部内胚葉シグナルが欠乏することなどが必要とされる。
【００３１】
咽頭および前部前腸内胚葉に由来する組織を生成するための方法は、多能性細胞からの胚体内胚葉の誘導、前部前腸内胚葉を形成するための胚体内胚葉の誘導、それに続いて、例えば、咽頭内胚葉へのさらなる分化および特異的な誘導体の特定化によって進行し得る。
【００３２】
胚体内胚葉の生成
胚体内胚葉のヒトESもしくはiPS細胞からの生成は、マウスES細胞から胚体内胚葉を発生させるために用いられるプロトコールを適合することにより達成され得る。Kuboら、Development 131巻:1651〜1662頁(2004年);Gadueら、Proc Natl Acad Sci USA 103:16806〜16811頁(2006年);Gouon-Evansら、Nat Biotechnol、24巻:1402〜1411頁(2006年)。ヒトES細胞を、低濃度のBMP4(例えば、約0.5〜10ng/ml、例えば、1ng/ml)でパルス標識し、低濃度のBMP4およびbFGF(例えば、約5〜20ng/ml、例えば、約10ng/ml)中で培養し、次いで、組織処理されていないプラスチック上で高濃度のアクチビンA(50〜500ng/ml、例えば、75〜150ng/ml、例えば、約100ng/ml)中で培養し、胚様体(EB)の形成をもたらす。EBは、実質的に均一に内胚葉からなる。内胚葉の発生は、CXCR4およびc-KITの発現によって確認することができる。内胚葉の発生は、5日まで、ESマーカーであるSOX2を喪失し、MIXL1、SOX17およびFOXA2を経時的に獲得することによって達成される。
【００３３】
いくつかの実施形態において、他の多能性幹細胞は、ES細胞の代わりに用いることができる。例えば、成人幹細胞(対象、例えば、治療される対象の、例えば、内耳、骨髄、間葉、皮膚、脂肪、肝臓、筋肉、または血液から得られた成人幹細胞);胚性幹細胞、または胎盤もしくは臍帯から得られた幹細胞;前駆細胞(例えば、内耳、骨髄、間葉、皮膚、脂肪、肝臓、筋肉、または血液に由来する前駆細胞);および人工多能性幹細胞(例えば、iPS細胞)は用いることができる。いくつかの実施形態において、iPS細胞(例えば、MaheraliおよびHochedlinger、Cell Stem Cell 3巻:595〜605頁(2008年)を参照のこと)が用いられる。一般に、ヒト起源の細胞が好ましい。
【００３４】
胚体内胚葉からの前部前腸内胚葉の形成
アクチビンAが内胚葉を誘導するが、アクチビンAは、この組織を後方化することが発見されている。したがって、前部前腸内胚葉の調製は、アクチビンAを低減するまたは除去し、その後、胚体内胚葉を形成することが必要である。したがって、特定の態様において、本発明は、前部前腸内胚葉について濃縮された集団細胞の形成ならびに中間のおよび後部の内胚葉シグナルの欠乏のための方法を提供する。かかる集団は、前部前腸内胚葉に存在する分子マーカーを発現し、前部前腸内胚葉に存在しない分子マーカーが欠乏する。
【００３５】
内胚葉細胞集団は、当技術分野で公知のマーカーによって特徴付けられ、識別される。胚体内胚葉内で、ESマーカーSOX2は、前部前腸内胚葉のマーカーとして再出現し、CDX2は、後部内胚葉(後腸)のマーカーである。アクチビンAにより内胚葉を形成するために4〜5日間誘導された細胞を長期培養すると、CDX2を増加させ、SOX2を喪失させ、これらの条件で後方化することが示唆される。胚体内胚葉の前方化は、アクチビンAを中止するまたは遮断することによりおよび前方化するモルフォゲンを加えることにより達成することができる。好ましい前方化するモルフォゲンは、BMPおよびTGF-βシグナル伝達の阻害剤である。BMPおよびTGF-βシグナル伝達の阻害剤は、単独でまたは組み合わせて用いることができる。好ましくは、BMPおよびTGF-βシグナル伝達の阻害剤は、組み合わせて用いられる。BMP阻害剤の例は、ノギン、コーディンおよびフォリスタチンである。好ましいBMPの阻害剤は、ノギンである。TGF-βシグナル伝達の阻害剤の例は、Ly364947(SD208)、SM16、SB-505124、SB-431542、および抗-TGF-β抗体である。好ましいTGF-βシグナル伝達の阻害剤は、SB-431542である。好ましい実施形態において、ノギンおよびSB-431542の組み合わせは、胚体内胚葉の前方化を誘導するために用いられる。特定の実施形態において、ノギンおよびSB-431542の組み合わせは、培養の4〜5日目に加えられて胚体内胚葉の前方化が誘導される。
【００３６】
ノギンおよびSBによる胚体内胚葉の前方化は、例えば、SOX2、TBX1(咽頭)、PAX9(咽頭、胸腺)、FOXP2(肺、気道上皮)、DLX3(食道)、FOXA2(胚体内胚葉)、および/またはSOX7(早期内胚葉マーカー)の1つまたは複数の発現を、例えば、検出する;場合によっては、PAX6(外胚葉)および/またはBRACHYURY(中胚葉)の発現の欠如を検出することにより確認することができる。
【００３７】
細胞集団
したがって、特定の実施形態において、本発明は、前部前腸内胚葉細胞について濃縮された細胞集団を提供する。前部前腸内胚葉の濃縮された集団は、少なくとも25%、例えば、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%または少なくとも99.9%の前部前腸内胚葉細胞を含む。
【００３８】
特定の実施形態において、本発明は、咽頭内胚葉細胞について濃縮された細胞集団を提供する。咽頭内胚葉の濃縮された集団は、少なくとも25%、例えば、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%または少なくとも99.9%の咽頭内胚葉細胞を含む。
【００３９】
特定の実施形態において、本発明は、前部前腸内胚葉を誘導する方法であって、BMPの阻害剤またはTGF-βシグナル伝達の阻害剤を用いて、アクチビンAの非存在下で胚体内胚葉を培養するステップを含む方法を提供する。好ましい実施形態において、胚体内胚葉は、BMPの阻害剤およびTGF-βシグナル伝達の阻害剤の両方を用いて、アクチビンAの非存在下で培養される。
【００４０】
いくつかの実施形態において、BMPの阻害剤はノギンである。本明細書に記載した方法のいくつかの実施形態において、ノギンは、約1ng/ml〜10μg/ml、10ng/ml〜1μg/ml、10ng/ml〜500ng/ml、10ng/ml〜250ng/ml、または10ng/ml〜100ng/mlの濃度で培養物中に存在する。好ましい実施形態において、ノギンは、約25ng/ml〜150ng/ml、50ng/ml〜150ng/mlまたは75ng/ml〜150ng/mlの濃度で培養物中に存在する。最も好ましい実施形態において、ノギンは、約100ng/mlの濃度で培養物中に存在する。
【００４１】
いくつかの実施形態において、TGF-βの阻害剤は、SB-431542である。本明細書に記載した方法のいくつかの実施形態において、SB-431542は、約0.1μM〜1mM、1μM〜100μM、1μM〜500μM、1μM〜250μM、または1μM〜100μMの濃度で培養物中に存在する。好ましい実施形態において、SB-431542は、約5μM〜250μM、5μM〜100μM、5μM〜50μM、または5μM〜25μMの濃度で培養物中に存在する。最も好ましい実施形態において、SB-431542は、約10μMの濃度で培養物中に存在する。
【００４２】
やはり好ましいのは、本発明の方法において用いられる培養物が、約75ng/ml〜150ng/mlの濃度のノギンおよび約5μM〜25μMの濃度のSB-431542を含む実施形態である。
【００４３】
腹側前部前腸内胚葉の誘導
胸腺、副甲状腺、気管および肺などの最も多くの前部前腸内胚葉に由来するほとんどの臓器は、前部前腸内胚葉の腹側または腹外側の面である。
【００４４】
ノギン/SB431542によって誘導される前部前腸内胚葉は、Wntシグナル伝達、FGFシグナル伝達、BMPシグナル伝達およびEGFシグナル伝達経路の1種または複数のアゴニストで処理することにより腹側化した前部前腸内胚葉を形成するためにさらに誘導することができる。腹側前部前腸内胚葉の有効な誘導は、ノギン/SB431542による処理に依存する。腹側前部前腸内胚葉を形成するために誘導される組織は、例えば、マーカーNKX21およびNKX2.5によって同定することができる。
【００４５】
いくつかの実施形態において、前部前腸内胚葉は、Wntシグナル伝達、FGFシグナル伝達、BMPシグナル伝達およびEGFシグナル伝達経路の2種以上のアゴニストの組み合わせにより腹側化される(すなわち、腹側化した前部前腸内胚葉を形成するために誘導される)。さらに好ましいのは、前部前腸内胚葉が、Wntシグナル伝達、FGFシグナル伝達、BMPシグナル伝達およびEGFシグナル伝達経路の2種以上のアゴニスト、Wntシグナル伝達、FGFシグナル伝達、BMPシグナル伝達およびEGFシグナル伝達経路の3種以上のアゴニスト、Wntシグナル伝達、FGFシグナル伝達、BMPシグナル伝達およびEGFシグナル伝達経路の4種以上のアゴニスト、またはWntシグナル伝達、FGFシグナル伝達、BMPシグナル伝達およびEGFシグナル伝達経路の5種以上のアゴニストの組み合わせにより腹側化される実施形態である。
【００４６】
いくつかの実施形態において、Wntシグナル伝達のアゴニストは、正準のWntシグナル伝達を媒介するWnt3aであり;正準のWntシグナル伝達のいずれかの誘導物質は、用いることができ、例えば、Wnt/β-カテニン経路アゴニストであるグリコーゲン合成酵素キナーゼ3β(GSK3b)阻害剤、またはカゼインキナーゼ1(CK1)阻害剤である。Wntアゴニストの限定しない例には、β-カテニンをコードするDNA(例えば、β-カテニンをコードするネイキッドDNA、β-カテニンをコードするプラスミド発現ベクター、β-カテニンをコードするウイルス発現ベクター)、β-カテニンポリペプチド、(例えば、Wntリガンド、DSH/DVL-1、-2、-3、LRP6N、WNT3A、WNT5A、およびWNT3A、5Aからなる群から選択される)1種または複数のWnt/β-カテニン経路アゴニスト、(例えば、塩化リチウム(LiCl)、プルバラノール(Purvalanol)A、オロモウシン、アルステルパウロン(alsterpaullone)、ケンパウロン(kenpaullone)、ベンジル-2-メチル-1,2,4-チアジアゾリジン-3,5-ジオン(TDZD-8)、2-チオ(3-ヨードベンジル)-5-(1-ピリジル)-[1,3,4]-オキサジアゾール(GSK3阻害剤II)、2,4-ジベンジル-5-オキソチアジアゾリジン-3-チオン(OTDZT)、(2'Z,3'E)-6-ブロモインジルビン-3'-オキシム(BIO)、α-4-ジブロモアセトフェノン(すなわち、タウプロテインキナーゼI(TPKI)阻害剤)、2-クロロ-1-(4,5-ジブロモ-チオフェン-2-イル)-エタノン、N-(4-メトキシベンジル)-N'-(5-ニトロ-1,3-チアゾール-2-イル)尿素(AR-AO14418)、インジルビン-5-スルホンアミド;インジルビン-5-スルホン酸(2-ヒドロキシエチル)-アミドインジルビン-3'-モノキシム;5-ヨード-インジルビン-3'-モノキシム;5-フルオロインジルビン;5,5'-ジブロモインジルビン;5-ニトロインジルビン;5-クロロインジルビン;5-メチルインジルビン、5-ブロモインジルビン、4-ベンジル-2-メチル-1,2,4-チアジアゾリジン-3,5-ジオン(TDZD-8)、2-チオ(3-ヨードベンジル)-5-(1-ピリジル)-[1,3,4]-オキサジアゾール(GSK3阻害剤II)、2,4-ジベンジル-5-オキソチアジアゾリジン-3-チオン(OTDZT)、(2'Z,3'E)-6-ブロモインジルビン-3'-オキシム(BIO)、α-4-ジブロモアセトフェノン(すなわち、タウプロテインキナーゼI(TPKI)阻害剤)、2-クロロ-1-(4,5-ジブロモ-チオフェン-2-イル)-エタノン、(vi)N-(4-メトキシベンジル)-N'-(5-ニトロ-1,3-チアゾール-2-イル)尿素(AR-AO14418)、H-KEAPPAPPQSpP-NH2(L803)およびMyr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2(L803-mts)からなる群から選択される)1種または複数のグリコーゲン合成酵素キナーゼ3β(GSK3β)阻害剤、GSK3β mRNAに特異的に結合する1種もしくは複数のアンチセンスRNAまたはsiRNA、1種または複数のカゼインキナーゼ1(CK1)阻害剤(例えば、CK1 mRNAに特異的に結合するアンチセンスRNAまたはsiRNA)、1種または複数のプロテアーゼ阻害剤、1種または複数のプロテアソーム阻害剤が含まれる。WNT3aが本明細書に記載した方法において用いられるとき、Wnt3aは、約1ng/ml〜10μg/ml、10ng/ml〜1μg/ml、10ng/ml〜500ng/ml、10ng/ml〜250ng/ml、または10ng/ml〜100ng/mlの濃度で培養物中に存在する。好ましい実施形態において、Wnt3aは、約25ng/ml〜150ng/ml、50ng/ml〜150ng/mlまたは75ng/ml〜150ng/mlの濃度で培養物中に存在する。さらに好ましい実施形態において、Wnt3aは、約100ng/mlの濃度で培養物中に存在する。
【００４７】
好ましい実施形態において、FGFシグナル伝達のアゴニストは用いられ、例えば、FGF7、FGF9、またはFGF10である。本明細書に記載した方法における使用の場合、FGF7またはFGF10は、約1ng/ml〜10μg/ml、10ng/ml〜1μg/ml、10ng/ml〜500ng/ml、10ng/ml〜250ng/ml、または10ng/ml〜100ng/mlの濃度で培養物中に存在する。好ましい実施形態において、FGF7またはFGF10は、約25ng/ml〜150ng/ml、50ng/ml〜150ng/mlまたは75ng/ml〜150ng/mlの濃度で培養物中に存在する。最も好ましい実施形態において、FGF7およびFGF10の両方が、約10ng/mlの濃度で培養物中に存在する。いくつかの実施形態において、FGFシグナル伝達の他のアゴニストは、用いることができ、例えば、FGF1、2、3、5、6、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、または23である。
【００４８】
好ましい実施形態において、EGFシグナル伝達のアゴニストは、EGFである。本明細書に記載した方法における使用の場合、EGFは、約1ng/ml〜10μg/ml、10ng/ml〜1μg/ml、10ng/ml〜500ng/ml、10ng/ml〜250ng/ml、または10ng/ml〜100ng/mlの濃度で培養物中に存在する。好ましい実施形態において、EGFは、約25ng/ml〜150ng/ml、50ng/ml〜150ng/mlまたは75ng/ml〜150ng/mlの濃度で培養物中に存在する。最も好ましい実施形態において、両方のEGFは、約20ng/mlの濃度で培養物中に存在する。
【００４９】
好ましい実施形態において、BMPシグナル伝達のアゴニストは、いくつかの実施形態において、別のBMPを用いることができ、例えば、BMP-1〜BMP-20のいずれか、例えば、BMP2〜7のいずれかであるが、BMP-4である。本明細書に記載した方法における使用の場合、BMP-4は、約1ng/ml〜10μg/ml、10ng/ml〜1μg/ml、10ng/ml〜500ng/ml、10ng/ml〜250ng/ml、または10ng/ml〜100ng/mlの濃度で培養物中に存在する。好ましい実施形態において、BMP-4は、約25ng/ml〜150ng/ml、50ng/ml〜150ng/mlまたは75ng/ml〜150ng/mlの濃度で培養物中に存在する。最も好ましい実施形態において、両方のBMP-4は、約10ng/mlの濃度で培養物中に存在する。
【００５０】
非常に最も好ましい実施形態において、FGF7、FGF10、EGF、BMP-4およびWnt3aは、それぞれ10、10、20、10および100ng/mlの濃度で存在する。
【００５１】
腹側化した内胚葉からの早期肺マーカーの誘導
肺マーカーGATA6を発現する腹側化した前部前腸内胚葉は、Wntリガンド、Wntシグナル伝達アクチベーター、BMP、上皮増殖因子(EGF)および線維芽細胞増殖因子(FGF)からなる群から選択される1種または複数の因子と併用したレチノイン酸(RA)で処理することにより誘導することができる。いくつかの実施形態において、肺マーカーの誘導(例えば、肺マーカーを発現する細胞または組織の生成)は、Wnt3a、FGF10、FGF7、BMP4、EGFおよびRAの存在下で胚体内胚葉を培養することにより促進される。
【００５２】
好ましい実施形態において、レチノイン酸は、オール-トランスレチノイン酸(ATRA)である。本明細書に記載した方法における使用の場合、ATRAは、約1nM〜10μM、1nM〜100μM、5nM〜10μM、5nM〜1μM、50nM〜1μMおよび100nM〜5μMの濃度で培養物中に存在する。好ましい実施形態において、ATRAは、約100nM〜1μM、または1μM〜5μMの濃度で培養物中に存在する。最も好ましい実施形態において、ATRAは、約1μMの濃度で培養物中に存在する。いくつかの実施形態において、ATRAは、咽頭領域とは対照的に肺野に偏っている腹側前部前腸を誘導するために前述の因子と併用して用いられる。
【００５３】
末端肺マーカーSP-Cの誘導
19日目までWnt3a、FGF10、FGF7、BMP4、EGFおよびRAで処理を継続することによって、低レベルの末端II型肺胞細胞マーカーSP-Cをもたらした。これらの因子が、11日目にWnt3a、FGF7およびFGF10により置換されたとき、SP-Cの最適な発現は達成された。
【００５４】
好ましい実施形態において、末端肺マーカーSP-Cは、RAの存在下ならびにWntシグナル伝達、FGFシグナル伝達、およびBMPの2種以上のアゴニストの組み合わせにおいて腹側化した前部前腸内胚葉から誘導される。
【００５５】
いくつかの実施形態において、Wntシグナル伝達のアゴニストは、Wnt3aであり;その他は、本明細書に記載した通り用いることもできる。本明細書に記載した方法における使用の場合、Wnt3aは、約1ng/ml〜10μg/ml、10ng/ml〜1μg/ml、10ng/ml〜500ng/ml、10ng/ml〜250ng/ml、または10ng/ml〜100ng/mlの濃度で培養物中に存在する。好ましい実施形態において、Wnt3aは、約25ng/ml〜150ng/ml、50ng/ml〜150ng/mlまたは75ng/ml〜150ng/mlの濃度で培養物中に存在する。さらに好ましい実施形態において、Wnt3aは、約100ng/mlの濃度で培養物中に存在する。
【００５６】
いくつかの実施形態において、FGFシグナル伝達のアゴニストは、FGF7またはFGF10であり;その他は、本明細書に記載した通り用いることもできる。本明細書に記載した方法における使用の場合、FGF7またはFGF10は、約1ng/ml〜10μg/ml、10ng/ml〜1μg/ml、10ng/ml〜500ng/ml、10ng/ml〜250ng/ml、または10ng/ml〜100ng/mlの濃度で培養物中に存在する。好ましい実施形態において、FGF7またはFGF10は、約25ng/ml〜150ng/ml、50ng/ml〜150ng/mlまたは75ng/ml〜150ng/mlの濃度で培養物中に存在する。最も好ましい実施形態において、FGF7およびFGF10の両方が、約10ng/mlの濃度で培養物中に存在する。
【００５７】
非常に最も好ましい実施形態において、FGF7、FGF10、およびWnt3aは、それぞれ10、10、および100ng/mlの濃度で存在する。
【００５８】
特異的な副甲状腺マーカーGCMBの誘導
前部前腸内胚葉が、Wnt3a、FGF10、FGF7、BMP4、EGFの存在下で腹側化され、それに続いて、11日目にこれらの因子を除去し、SHH、FGF8またはその両方を添加したとき、腹側化した前部前腸内胚葉からの特異的な副甲状腺マーカーの誘導は達成された。
【００５９】
好ましい実施形態において、特異的な副甲状腺マーカーSP-Cは、SHHおよびFGF8シグナル伝達の1種または複数のアゴニストの組み合わせにより腹側化した前部前腸内胚葉から誘導される。
【００６０】
好ましい実施形態において、SHHシグナル伝達のアゴニストは、SHHである。本明細書に記載した方法における使用の場合、SHHは、約1ng/ml〜10μg/ml、10ng/ml〜1μg/ml、10ng/ml〜500ng/ml、10ng/ml〜250ng/ml、または10ng/ml〜100ng/mlの濃度で培養物中に存在する。好ましい実施形態において、SHHは、約25ng/ml〜150ng/ml、50ng/ml〜150ng/mlまたは75ng/ml〜150ng/mlの濃度で培養物中に存在する。さらに好ましい実施形態において、Wnt3aは、約100ng/mlの濃度で培養物中に存在する。
【００６１】
好ましい実施形態において、FGFシグナル伝達のアゴニストは、FGF8である。本明細書に記載した方法における使用の場合、FGF8は、約1ng/ml〜10μg/ml、10ng/ml〜1μg/ml、10ng/ml〜500ng/ml、10ng/ml〜250ng/ml、または10ng/ml〜100ng/mlの濃度で培養物中に存在する。好ましい実施形態において、FGF8は、約25ng/ml〜150ng/ml、50ng/ml〜150ng/mlまたは75ng/ml〜150ng/mlの濃度で培養物中に存在する。最も好ましい実施形態において、両方のFGF8は、約10ng/mlの濃度で培養物中に存在する。
【００６２】
非常に最も好ましい実施形態において、FGF8およびSHHは、それぞれ10および100ng/mlの濃度で存在する。
【００６３】
スクリーニングの方法
特定の実施形態において、本発明は、前部前腸内胚葉細胞の増殖、分化または生存に影響を与える作用物質を同定するための方法を提供する。これらの方法は、試験される作用物質の存在下で前部前腸内胚葉細胞の濃縮された集団を培養するステップと、前記作用物質の存在下および非存在下で前記細胞の増殖、分化または生存を比較するステップとを含み、前記作用物質の存在下での違いは、前記細胞の増殖、分化または生存に影響を与える作用物質の同定を示している。
【００６４】
特定の実施形態において、本発明は、細胞分化に関与する遺伝子を同定するための方法を提供する。これらの方法は、胚体内胚葉細胞および前部前腸内胚葉細胞を単離するステップと、前記胚体内胚葉細胞および前記前部前腸内胚葉細胞の遺伝子発現プロフィールを比較するステップとを含み、前記胚体内胚葉細胞および前記前部前腸内胚葉細胞の間で差次的に発現される遺伝子の同定は、細胞分化に関与する遺伝子を示している。遺伝子プロフィールを決定する方法は、当技術分野で周知である。
【００６５】
特定の実施形態において、本発明は、胚体内胚葉から前部前腸内胚葉への進行の分子マーカーを認識する抗体を同定する方法であって、前部前腸内胚葉細胞の濃縮された集団に抗体を産生させるステップと、前記抗体が前記胚体内胚葉に結合するよりも有意に高く前記前部前腸内胚葉に結合する抗体についてスクリーニングするステップとを含む方法を提供する。抗体を産生させる方法およびスクリーニングする方法は、当技術分野で周知である。好ましい抗体は、モノクローナル抗体である。
【００６６】
細胞置換治療
本明細書に記載した方法により誘導され、多能性細胞に由来する前部前腸内胚葉細胞は、それに由来する組織への損傷から起こる状態またはそれに由来する組織の非存在から起こる状態を治療するための細胞置換治療用の細胞または組織の生成に有用であり、その状態とは、例えば、それだけには限らないが、甲状腺が、遺伝子突然変異、自己免疫攻撃または(甲状腺機能亢進症または甲状腺癌の場合)外科的除去のため機能的でない(甲状腺機能低下症);遺伝的原因による、または外科的アブレーション後に起こる副甲状腺機能低下症;肺損傷;例えば、同種造血幹細胞移植(HSCT)によって損傷したまたは先天性疾患(ディジョージ症候群およびNude/SCID症候群)のため存在しない胸腺上皮などであった。
【００６７】
いくつかの実施形態において、細胞、例えば、本明細書に記載した方法によりESまたはiPS細胞に由来する胸腺上皮細胞(TEC)は、ヒト化マウスモデルを改善し得る(図1E)。免疫学における主な課題は、ヒト免疫系のマウスモデルを確立することである。現在、最良のモデルは、ヒト臍帯血造血幹細胞および前駆細胞で新生児期に移植した免疫不全Rag1-'-ilr2g-'-またはNOD-SCIDilr2g-'-マウスである。かかるマウスにおいて、すべての主な造血系統は、再構成され、さらには、第2のリンパ器官の構造は、「ヒト」として現れる。しかし、アロ反応性および末梢T細胞ホメオスタシス異常を除いてヒトT細胞応答は弱い(Manz、Immunity.26巻:537〜541頁(2007年);Traggiaiら、Science.304巻:104〜107頁(2004年);Legrandら、Methods Mol Biol.415巻:65〜82頁(2008年);Gimenoら、Blood. 104巻:3886〜3893頁(2004年))。より頑健なT細胞活性を有するこのモデルを改善したのが、BLTマウスである(Lanら、Blood.2006年;108巻:487〜492頁;Melkusら、Nat Med.12巻:1316〜1322頁(2006年))。これは、腎臓被膜下でヒト胎児胸腺および肝臓を用いて移植し、続いて胎児の肝臓CD34+前駆細胞を用いて移植したNOD-SCIDilr2g-'-マウスである。生得のならびにMHCIおよびIIによって制限されたこれらのマウスにおいて、T細胞-依存性免疫応答が観察された。
【００６８】
興味深いことに、すべてのT細胞発生は、グラフトされたヒト胸腺において起こるが、内因性マウス胸腺においては起こらない。これらのデータにより、ヒト胸腺組織の存在が、ヒト化マウスを開発するのに重要な意味を持ち得ることが示唆される。したがって、TECが胸腺の本質的な機能成分であるため、ESもしくはiPS由来TECは、改善されたヒト化マウスを構成するために用いることもできるということになる。さらに、患者特異的iPS細胞を用いることによって、マウスモデルにおいて疾患感受性における遺伝的多様性およびヒト間の免疫応答の一部を攻略することが可能である。最後に、iPS技術によって、同系のヒト組織の同時移植(co-transplantion)が可能になる。このようなマウスにおいて、自己免疫または感染と関連する臓器もしくは組織特異的免疫応答を研究することができる、あるいはワクチンを試験することができる。一例として、自己免疫または免疫系が関与した疾患(immune-mediated disease)のマウスモデルは、共に自己免疫または免疫系が関与した疾患(例えば、関節リウマチ、糖尿病、多発性硬化症、乾癬、または大腸炎)を有するヒトの対象由来の、本明細書に記載した通りに(例えば、皮膚細胞由来iPS細胞から)誘導した骨髄幹細胞およびTECを免疫不全マウス移植することによって創出することができる。いくつかの実施形態において、骨髄幹細胞およびTECは、同じ対象から得られたものであり、いくつかの実施形態において、これらは、異なる対象から得られたものとなり得る。骨髄血液幹細胞は、ヒト由来胸腺に行き、そこでT細胞になる。これは、マウスにおいて自己免疫疾患(および他の任意の免疫系が関与した疾患)をモデルにするために用いることができる。いくつかの実施形態において、これらの方法は、iPS由来ヒト自己免疫標的組織(例えば、糖尿病の場合では島)を移植するステップがさらに含まれる。
【００６９】
(実施例)
本発明を、以下の実施例においてさらに記載しており、これは特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を制限しない。
【００７０】
(実施例1)
ヒト胚性および人工多能性幹細胞からの前部前腸内胚葉の生成
以下の材料および方法を、本実施例において用いた。
【００７１】
細胞および培養条件。hESC(HES2、ES Cell InternationalからのNational Institutes of HealthコードES02;継代25〜33)を8,000〜12,000細胞/cm2で蒔いたマウス胚線維芽細胞上で培養した。DMEM/F12培地、20%ノックアウト血清置換(Gibco)、0.1mM  β-メルカプトエタノール(Sigma-Aldrich)、およびFGF-2(R&D)20ng/mlを毎日交換した。細胞を、トリプシンで継代培養し、洗浄し、1:5〜1:10の希釈で再び蒔いた。hiPS細胞系であるHDF2およびHDF9をhES2として培養した。hESおよびhiPS培養物を、CO25%/大気環境において維持し、hES分化を、CO25%/O25%/N290%環境で維持した。
【００７２】
内胚葉誘導。マウス胚線維芽細胞を、Y-27632(10μM)を有するマトリゲル(Gibco)上で24h継代まで枯渇させ、胚様体を低粘着性の皿(Costar)上で形成した。胚様体形成および分化中、HES2細胞を同じ濃度(1:1希釈)で再び播種し、HDF2およびHDF9は、効率的な内胚葉生成のためにより高い播種(濃度2:1〜4:1)を必要とした。分化を、N2(Gibco)、B27(Gibco)、アスコルビン酸(50μg/m、Sigma)、Glutamax(2mM、Invitrogen)、モノチオグリセロール(0.4μM、Sigma)を補充したDMEM/F12(Invitrogen)の培地で行った。因子の以下の濃度を、原始線条形成、内胚葉誘導、前部/咽頭内胚葉誘導、その後の前部後部のおよび背腹側のパターン形成のために用いた。すなわち、ヒトBMP-4、1ng/mlおよび10ng/ml;ヒトbFGF、2.5ng/ml;ヒトアクチビンA、100ng/ml;ヒトノギン、200ng/ml;Y-27632、1μM;SB-431542、10μM;ヒトFGF10、10ng/ml;ヒトFGF7、10ng/ml;ネズミEGF20ng/ml;およびヒトWNT3a、100ng/mlである。肝臓の条件は、前述した2通りであり、BMP-4、50ng/ml;bFGF、10ng/ml;VEGF、10ng/ml;HGF、10ng/ml;TGFα、20ng/ml;デキサメタゾン、40ng/mlを含む。すべての因子を、TocrisからのSB-431542およびY-27632、ならびにデキサメタゾン(Sigma)を除いてR&D Systemsから購入した。これらの因子を、以下の順序で加えた。1日目、Y-27632;1〜5日目、BMP4、bFGFおよびアクチビンA;5〜9日目、ノギンおよびSB-431542;7〜19日目WNT3a、FGF10、BMP4、FGF7およびEGF。肝臓の分化の場合、これらの因子を、以下の順序で加えた。1日目、Y-27632;1〜5日目、BMP4、bFGFおよびアクチビンA;5〜9日目、デキサメタゾン、bFGF、HGF、VEGF、EGF、TGFaおよびBMP4。いくつかの実験について、500μMオールトランスレチノイン酸(Sigma)を培養物に加えた。5日目に、胚様体を、トリプシン処理し(Gibco)、ゼラチンでコーティングされた、組織培養処理皿(Fisher)に10,000〜50,000細胞/cm2で蒔いた。
【００７３】
モルフォゲン(図2H)の11日目のスクリーニングには、対で、FGFS(FGF10+FGF7)(R&D Systems)、SU-5402(EMD Chemicals)、Wnt5a(R&D Systems)、WNT3a(R&D Systems)、sFRPl(R&D Systems)、BMP4、ノギン、SHH(R&D Systems)、シクロパミン(EMD Chemicals)、SB-431542、TGF-β1(R&D Systems)、DAPT(EMD Chemicals)、レチノイン酸(Sigma)、DEAB(Sigma)、EGF(R&D Systems)、チロフォスチンAG-1478(EMD Chemicals)およびWP1066(EMD Chemicals)の添加のオーダーがより高いものが含まれていた。
【００７４】
定量的PCR。全RNAを、トリゾール(Invitrogen)、位相ロック管(5' Prime)およびRNeasyキット(Qiagen)を用いて抽出した。全RNA1〜2μgを、DNase I(Qiagen)で処理し、ランダムヘキサマー(random hexamer)およびSuperscript III(Invitrogen)を用いてそれを逆転写した。増幅された材料を、SybrGreen(Invitrogen)を用いて検出した。リアルタイム定量PCRを、95℃で10分のステップで、それに続いて、95℃を15秒間および60℃を1分間の40周期でABI 7900HTサーモサイクラー(Applied Biosystems)で行った。すべての実験を、SYBR GreenER定量的PCR SuperMix(Invitrogen)で3回行った。各遺伝子についての変性曲線を用いてDNA産物の均質性を確認した。絶対定量を、ゲノムDNA希釈シリーズの検量線に対して得た。対照となる遺伝子についての定量化した値を、ハウスキーピング遺伝子GAPDHおよびβ-アクチンによって決定した入力に対して正規化した。各培養ウェルについてのqPCRを3回行った。プライマー配列をTable 1(表1)に挙げる。
【００７５】
【表１】
2013524836.tif 000003
【００７６】
フローサイトメトリー。5日目の胚様体または13日目の単層培養物を、トリプシン/EDTA(2分)で分離した。細胞を、10%血清を補充したIMDM中で、直接結合したCXCR4(Invitrogen)、c-KIT(BD Biosciences)およびEPCAM(BD Biosciences)で染色した。細胞をLSRIIで分析した。Flowjoソフトウェア(Tree Star)をすべての分析に用いた。
【００７７】
免疫蛍光法。7日目、9日目または13日目の培養物を、25℃で30分間新しいパラホルムアルデヒド(4%)で固定し、次いで、PBS中で洗浄した。細胞を透過処理し、0.1%サポニン、0.1%BSA、10%FCS(Gemstar)および10%胎児ロバ血清(Jackson Immunofluorescence)を含む溶液中で遮断した。三次元培養物について、細胞を、前述のように「包埋」および「オン-トップ(on-top)」アッセイを用いてマトリゲル中で5日目に包埋した(Leeら、Nat.Methods4巻、359〜365頁(2007年))。培養物を9日目に最適切断温度(OCT、Tissue Tek)で包埋し、抽出し、薄片を作り、上記の通り処理した。一次抗体を終夜加え、これには、PAX-9(Abcam)、TBX1(Abcam)、SOX2(Stemgent、Santa Cruz)、CDX2(Abcam)、NKX2-1(Invitrogen)およびAIRE(Santa Cruz)が含まれる。細胞を、洗浄し、ロバ抗-マウス全IgG-Dylight488、ロバ抗-ヤギ全IgG-Cy3、およびロバ抗-ウサギ全IgG-Cy5で1時間(h)インキュベートした。細胞を洗浄し、核をDAPI(Invitrogen)で染色した。染色を蛍光顕微鏡(Leica DMI 4000B、Wetzlar、Germany)用いて可視化した。この器具を、蛍光獲得(Leica)用のDFC340 Fx Monochrome冷却デジタルカメラに装着し、可変の対物レンズ(5×-40×)を用いた。フィルターモデルは、A4 UV、11504135;GFP、11532366;YFP 1153267;RFP、11513894;CY.3、1 1600231である。曝露設定は変わるが、並行して、分化し染色した肝臓特定化培養物に基づいて設定した。画像をPBS中で、25℃でLeica Application Suite Advanced Fluorescence Software Package AF6000(Leica)を用いて得た。画像をレンダリングまたは逆重畳せずに示す。画像を、Adobe Photoshop CS4(Adobe)を用いてコントラストおよび明るさのみを変更することによりデジタル処理し、これらの操作を、肝臓特定化および実験条件で同時に行った。定量を20×倍率で最低10のランダム場でカウントすることにより行った。ほとんどのパネル上で、対物レンズによる倍率を示す。
【００７８】
マウス。NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtml Wjl/SzJ(NOD/SCIDIl2rg-/-)マウスをJackson Laboratoryから購入した。動物を、ある特定の病原体がない設備において管理した。実験および動物の世話を、Mount Sinai Institutional Animal Care and Use Committeeに従って行った。100万細胞を腎臓被膜下に注射した。増殖を、切除し、OCTに包埋し、上記と同様に特定の抗原のための形態または免疫蛍光法についてヘマトキシリンおよびエオシン染色を用いて分析した。
【００７９】
統計分析。統計分析について、独立t検定を用い、2つ以上の群を比較する場合は、一元配置ANOVAを用いた。結果を平均±標準誤差として表した。
【００８０】
結果
胚本体の3つの胚葉のうちの1つである、胚体内胚葉は、原腸形成6中の高濃度のアクチビンA、模倣のnodalシグナル伝達によりES細胞から誘導される。定量的PCRによりhES細胞系HES2におけるこの過程の実験により、原始線条マーカーMIXL1、次いで、内胚葉転写因子SOX17およびFOXA2がアップレギュレートされる転写カスケードが明らかになった(図1A)(D'Amourら、Nat.Biotechnol.24巻、1392〜1401頁(2006年);Gouon-Evansetら、Nat.Biotechnol.24巻、1402〜1411頁(2006年);Gadueら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103巻、16806〜16811頁(2006年);Zorn & Wells、Annu.Rev.Cell Dev.Biol.25巻、221〜251頁(2009年);Yasunagaら、Nat.Biotechnol.23巻、1542〜1550頁(2005年))。4dのアクチビンAへの曝露後、細胞の>95%は、胚体内胚葉マーカーCXCR4、c-KITおよびEPCAMを発現した(図1B)(Yasunagaら、Nat.Biotechnol.23巻、1542〜1550頁(2005年))。原腸形成後、胚体内胚葉は、前後軸のアイデンティティーが異なる管を形成する(Zorn & Wells、Annu.Rev.Cell Dev.Biol.25巻、221〜251頁(2009年))。胚体内胚葉内で、多能性マーカーSOX2は、前腸マーカーとして再出現し、CDX2は、後腸を同定する(Sherwoodら、Dev.Dyn.238巻、29〜42頁(2009年))。培養の5日目のアクチビンA除去後、CDX2およびSOX2の両方の発現の増加を観察し(図1A)、前部および後部の胚体内胚葉の混合物の生成が示唆された。したがって、胚体内胚葉の誘導後に付加されたどのシグナルが、前部(SOX2+)内胚葉生成を促進し、後部の(CDX2+)内胚葉生成を抑制するかを実験した。
【００８１】
アクチビンAに曝露された胚様体におけるCXCR4+EPCAM+集団の生成に続いて、胚様体を分離し、単層として蒔いた。5日目にモルフォゲンおよび阻害剤の24の組み合わせを添加して試験し(図1C)、FOXA2、SOX2、CDX2、TBX1(胃より前部の内胚葉)の発現(Graham、J.Exp.Zoolog.B Mol.Dev.Evol 310巻、336〜344頁(2008年);Sherwoodら、Dev.Dyn.238巻、29〜42頁(2009年);Petersら、Genes Dev.12巻、2735〜2747頁(1998年))およびPAX9(咽頭内胚葉)(Rodewald、Annu.Rev.Immunol.26巻、355〜388頁(2008年);Petersら、Genes Dev.12巻、2735〜2747頁(1998年))を、培養の9日目に細胞のアイデンティティーの読み出し情報として用いた。BMPシグナル伝達の生理的阻害剤であるノギンとアクチビンA/nodalおよびTGF-βシグナル伝達の薬理学的阻害剤であるSB-431542の合わせた存在下においてのみ、SOX2発現が誘導され、CDX2発現が抑制され、FOXA2発現が維持された。さらに、この条件のみ、TBX1およびPAX9の強力な発現を誘導した(図1C)。アクチビンA-誘導段階中、細胞数は、4.5-±1.9-倍増加し、ノギン/SB-431542段階中、細胞は、他の1.4-±0.4-倍に拡大した。特に、ノギン/SB-431542処理は、SOX2、PAX9およびTBX1(図1G〜I)の誘導を有する2つのhiPS細胞系(HDF2およびHDF9)において等しく強力であった。発生においてこれらの機能と整合する複数のFGFファミリーメンバーおよびWNT3a(Spenceら、Nature 470巻、105〜109頁(2010年);Gadueら、Proc.Natl Acad.Sci.USA 103巻、16806〜16811頁(2006年);Liら、Genes Dev.22巻、3050〜3063頁(2008年))は、CDX2発現の増加によって示される通り、胚体内胚葉を後方化した(図1C)。しかし、可溶性Frizzled関連タンパク質3(sFRP3)の添加によるWNT拮抗作用は、SOX2を誘導するのに十分でなかった(図1C)。さらに、sFRP3は、ノギン/SB-431542と協同せず、さらに、PAX9およびSOX2の誘導に対して有害であると思われた(図1D)。5/6日目に均一のCXCR4+c-KIT+またはCXCR4+EPCAM+集団の生成直後に処理しただけで、9日目にSOX2+FOXA2+集団を誘導したため、ノギン/SB-431542の添加のタイミングは重要であった。早期投与すると、原腸形成を抑止し、後期投与すると、後部マーカーCDX2をダウンレギュレートしなかった。
【００８２】
FOXA2を、脊索(中胚葉)においてもまた発現し、FOXA2およびSOX2を後脳底板(神経外胚葉)によって同時に発現する(Wood & Episkopou、Mech.Dev.86巻、197〜201頁(1999年);Weinsteinら、Cell 78巻、575〜588頁(1994年))。さらに、アクチビンAによって事前に内胚葉を誘導せずにノギン/SB-431542をhES細胞に直接適用すると、神経外胚葉の運命をもたらす(Chambersら、Nat.Biotechnol.27巻、275〜280頁(2009年))。したがって、これらの代替の運命の存在をアッセイした。予想通り、ノギン/SB-431542を1日目に添加した場合、神経外胚葉マーカーPAX6を培養物中で発現し、脊索および原腸形成細胞のマーカーであるBRACHYURYを早期内胚葉の誘導中に発現した(図1E)。BRACHYURYもPAX6もノギン/SB-431542に曝露した胚体内胚葉において発現せず(図1E)、アクチビンA誘導胚体内胚葉のノギン/SB-431542処理がAFEのみを特定化することを示した。
【００８３】
ノギン/SB-431542-誘導内胚葉細胞が、前述した内胚葉の系統と異なるか否かをさらに評価するために、9日目のノギン/SB-431542で処理した培養物を、肝臓(後部前腸)の運命に好都合に働く条件下で成長した9日目の培養物と比較した。後者は、内胚葉のアクチビンA誘導後にBMP-4およびbFGFを必要とすることを前もって示している(Gouon-Evansetら、Nat.Biotechnol.24巻、1402〜1411頁(2006年))。CDX2、後腸マーカーであるEVX1、肝臓マーカーであるCREB313およびCEBPA、ならびに胃ドメインマーカーであるODD1の発現(Sherwoodら、Dev.Dyn.238巻、29〜42頁(2009年))は、ノギン/SB-431542条件においてよりも「肝臓」条件において高く、これの逆が、前部マーカーであるTBX1、PAX9、SOX2およびFGF8、咽頭嚢内胚葉に特異的な内胚葉内のマーカーで成り立った(Vitelliら、Development 129巻、4605〜4611頁(2002年))(図1F)。したがって、ノギン/SB-431542処理は、肝臓の条件において特定化されるものと異なるAFE細胞を特定化する。
【００８４】
ノギン/SB-431542をアクチビンA-誘導胚体内胚葉に適用すると、空の細胞内腔様または嚢胞様の開口部の周囲の高密度に詰め込まれた細胞のコロニーを生成した。90%を超える細胞は、高密度で蒔いた場合、かかるコロニーにおいて見出された。実質的にすべての細胞は、まれに細胞がFOXA2のみを発現したが、SOX2およびFOXA2を同時発現した。すべてのコロニーは、TBX1、PAX9および咽頭内胚葉マーカーFOXG1に対して陽性に染色された。因子を含まない培地中で細胞を培養したとき、ノギン/SB-431542処理培養物において観察された典型的なコロニーを示さなかった。これらの条件において、細胞の>95%は、FOXA2を発現したが、SOX2+FOXA2+細胞が観察されるのはごく稀であった。この形態を有するコロニーはまた、肝臓の条件において観察されなかった。ノギン/SB-431542または肝臓の条件で並行して培養したHES2-由来内胚葉細胞の比較免疫蛍光法分析では、ノギン/SB-431542培養物だけが、強力なSOX2、PAX9およびTBX1発現を特徴とすることが明らかにされた。
【００８５】
集合的に、これらの発現データは、ノギン/SB-431542がアクチビンA誘導胚体内胚葉においてAFE表現型を有する細胞の高度に濃縮された集団を特定化することを示す。これらの知見は、BMPアンタゴニストコーディンに対してヌルのマウスが、前部トランケーションを示すという事実(Bachillerら、Development 130巻、3567〜3578頁(2003年))と整合し、アクチビンA誘導内胚葉がCDX2+後部内胚葉の大型の画分を含むという観測と整合している(図1A)。
【００８６】
ノギン/SB-431542条件において培養された細胞のin vivoにおける可能性を決定するために、106細胞を、NOD/SCIDIl2rg-/-マウスの腎臓被膜下に移植した。未分化HES2細胞が3つのすべての胚葉に由来する細胞を含む奇形腫を生成し、ノギン/SB-431542処理細胞は、同定可能な外胚葉もしくは中胚葉要素を欠如する成長をもたらした。複数の管腔の構造を観察し、偽重層上皮(上気道上皮の典型)または1〜3層の核を含むより組織的でない上皮によって内側が覆われた構造を観察した。後者は、肺中のII型肺胞細胞に特異的なマーカーであるサーファクタントタンパク質-C(SFTPC)に常に染まった。hES細胞-由来奇形腫において、SFTPC染色を観察しなかった。細胞の残りは、FOXA2に対してほぼ均一に染色された。しかし、管腔の構造を除いて、おそらくFOXA2-末端AFE誘導体への分化または異種移植における異常なFOXA2調節によりFOXA2は細胞質に限局した。PAX9を発現する細胞の島、ならびに(胸腺髄質上皮細胞に特異的な(Rodewald、Annu.Rev.Immunol.26巻、355〜388頁(2008年)))AIREの分離した核の小斑点を示すまれな領域をも検出した。hES-由来奇形腫において、PAX9を軟骨形成のゾーンにおいて観察したにすぎず、AIRE発現を観察しなかった。集合的に、これらのデータによって、ノギン/SB-431542-誘導胚体内胚葉の発生の可能性が、これらの条件においてAFE誘導体に大いに制限されることが示唆される。
【００８７】
次に、これらの細胞をさらに分化した。AFEは、背腹側のパターン形成を経て、腹部の中胚葉から肺芽、WNT、BMPおよびFGFシグナルの特定化をもたらした(Rodewald、Annu.Rev.Immunol.26巻、355〜388頁(2008年);Morrisey & Hogan、Dev.Cell 18巻、8〜23頁(2010年))。この段階で、S0X2発現は、依然として背面に高いままであり、NKX2.1(肺野および甲状腺領域(Zorn & Wells、Annu.Rev.Cell Dev.Biol.25巻、221〜251頁(2009年);Morrisey & Hogan、Dev.Cell 18巻、8〜23頁(2010年)))、NKX2.5(腹部の咽頭内胚葉において一過性に発現した(Tanakaら、Mol.Cell.Biol.21巻、4391〜4398頁(2001年)))およびPAX1(咽頭嚢に特異的に発現した内胚葉内で(Wallinら、Development 122巻、23〜30頁(1996年)))は、特異的な腹部マーカーである。13日目までノギン/SB-431542を用いて処理を拡大すると、SOX2の発現が継続し、背部の運命を示唆し(図2A)、ノギンがAFEにおいて背部で発現し、BMP4が腹部により発現するという事実と整合する(Morrisey & Hogan、Dev.Cell 18巻、8〜23頁(2010年))。対照的に、培養の7日目にノギン/SB-431542をWNT3a、KGF、FGF 10、BMP4およびEGF(すべての因子、WKFBE)と置換すると、SOX2の発現が低くなり、13日目に腹部のマーカーNKX2.1、PAX1およびNKX2.5を誘導した(HES細胞については図2AならびにHDF2およびHDF9 hiPS細胞については図2D)。早期甲状腺マーカー、PAX8の発現は観察しなかったが、NKX2.1誘導が甲状腺の運命よりも肺の運命への関連付けを示していることが示唆された。さらに、気道前駆細胞のマーカーであるP63(Morrisey & Hogan、Dev. Cell 18巻、8〜23頁(2010年))を、強力に誘導し(図2A)、大部分の細胞は、上皮マーカーEPCAMを発現した(図2E)。個別の因子の添加は、この転写誘導に十分でなかった。さらに、ノギン/SB-431542への曝露前のみ、WKFBEによるPAX1、NKX2.1およびNKX2.5のその後のアップレギュレーションが可能であるにすぎず、肝臓カクテルまたは培地単独への曝露前は可能ではなく(図2B)、アクチビンA誘導胚体内胚葉のノギン/SB-431542処理が腹側AFEの運命への分化のために必要とされていることが実証された。9日目でなく7日目に処理した培養物のみがNKX2.1、PAX1およびNKX2.5を発現する適格性があったため、WKFBE腹側化刺激のタイミングは重要であった。この時点で、細胞の92±2%は、FOXA2+SOXA2+であった(図2C)。免疫蛍光法では、WKFBEの誘導後、細胞の37±6%が、NKX2.1を発現することが明らかになった。ノギン/SB-431542、それに続いてアクチビンA誘導内胚葉のWKFBE処理中、細胞は、さらに8.95-±3.3-倍拡大した(図2C)。したがって、ノギン/SB-431542-誘導AFEは、in vitroで腹側化シグナルに応答する特有の形の適格性がある。
【００８８】
ノギン/SB-431542-誘導AFEのWKFBEへの曝露は、培養の13日目または19日目に胸腺、副甲状腺、甲状腺または肺用の最終の分化マーカーの発現をもたらさなかった。これらの細胞がin vivoでSFTPC+細胞を生じる可能性を有したため、in vitroで肺の特定化を達成させることが試みられた。早期肺発生におけるレチノイン酸の決定的に重要な役割と整合して(Chenら、J.Clin.Invest.120巻、2040〜2048頁(2010年))、レチノイン酸をWKFBEカクテルに添加すると、咽頭嚢マーカーであるPAX1の発現が減少したが、肺の運命を示唆する一群のマーカーであるFOXP2、NKX2.1、GATA6およびFOXJ1が増加した(Morrisey & Hogan、Dev.Cell 18巻、8〜23頁(2010年))(図3A)。SFTPC誘導を増強するために、シグナル伝達アゴニストおよびアンタゴニストの組み合わせを、11日目にレチノイン酸の存在下で腹側化したAFEに加えた。試験された>400の組み合わせの中で、WNT3a+FGF10+FGF7は、19日目に高レベルのSFTPC mRNA(図3B)を誘導し、FGF10およびWntシグナル伝達が遠位の肺発生に決定的に重要であるという発生観測と整合する(Morrisey & Hogan、Dev.Cell 18巻、8〜23頁(2010年))。ノギン/SB-431542-誘導AFEが、咽頭嚢誘導体を生成するか否かを評価するために、レチノイン酸の非存在下で、WKFBEで腹側化した培養物をパターン形成することを試みた。副甲状腺発生のためのソニックヘッジホッグ(SHH)およびFGF8の要件と整合し(Moore-Scott & Manley、Dev.Biol.278巻、323〜335頁(2005年))、FGF8またはSHHのAFE培養物への添加は、副甲状腺特異的マーカーであるGCM2を誘導した(図3B)。SHHおよびFGF8の効果は、相加的でなく、ミラーリングin vivoエピスタシス(mirroring in vivo epistasis)研究では、Shhがマウス咽頭嚢発生においてFgf8の上流であることを示した(Moore-Scott & Manley、Dev.Biol.278巻、323〜335頁(2005年))。時間的およびシグナル伝達の並べ換えすべてを余すところなく試験しているわけではないが、これらのデータによれば、ノギン/SB-431542-誘導細胞が、肺野および咽頭嚢を含めて下流系統に分化することができるということを示唆している。
【００８９】
集合的に、データは、hES/hiPS細胞-由来胚体内胚葉におけるBMPおよびTGF-βシグナル伝達を二重に阻害すると、高度に濃縮されたAFE集団を特定化することを示し、in vivoにおけるAFEに由来する細胞タイプおよび組織へのヒト多能性細胞の定方向分化についてのin vitroの手法を提供する。
【００９０】
(参考文献)
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【００９１】
他の実施形態
本発明が、その詳細な説明と併せて記載されており、前述の説明は例証するものであり、添付した特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を制限するものではないということが理解されるべきである。他の態様、利点、および修正形態は、以下の特許請求の範囲内である。
【図１Ｂ】
2013524836.tif 000005
【図１Ｇ】
2013524836.tif 000006
【図１Ａ】
2013524836.tif 000007
【図１Ｃ−１】
2013524836.tif 000008
【図１Ｃ−２】
2013524836.tif 000009
【図１Ｄ】
2013524836.tif 000010
【図１Ｅ】
2013524836.tif 000011
【図１Ｆ】
2013524836.tif 000012
【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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