(57)【要約】本発明は、増強されたまたは所望の特性を有するＡＤＡＭＴＳ１３製剤に関する。したがって本発明は、医薬投与に適した液体および凍結乾燥ＡＤＡＭＴＳ１３製剤を提供する。また本発明は特に、被検体におけるＶＷＦおよび／またはＡＤＡＭＴＳ１３機能不全に関連した様々な疾患または状態を治療する方法も提供する。様々な疾患および状態の治療に有用なＡＤＡＭＴＳ１３製剤を含むキットも本明細書で提供される。（ａ）０．０５ｍｇ／ｍｌ〜１０．０ｍｇ／ｍｌのＡＤＡＭＴＳ１３と、（ｂ）０ｍＭ〜２００ｍＭの薬学的に許容される塩と、（ｃ）０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウムと、（ｄ）糖および／または糖アルコールと、（ｅ）非イオン性界面活性剤と、（ｆ）ｐＨを６．０〜８．０の間に維持するための緩衝剤とを含む、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤もまた提供される。【選択図】図２【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）０．０５ｍｇ／ｍｌ〜１０．０ｍｇ／ｍｌのＡＤＡＭＴＳ１３と、
（ｂ）０ｍＭ〜２００ｍＭの薬学的に許容される塩と、
（ｃ）０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウムと、
（ｄ）糖および／または糖アルコールと、
（ｅ）非イオン性界面活性剤と、
（ｆ）ｐＨを６．０〜８．０の間に維持するための緩衝剤と
を含む、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤。
【請求項２】
（ｇ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性と、
（ｈ）０ｍＭ〜２００ｍＭの薬学的に許容される塩と、
（ｉ）０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウムと、
（ｊ）糖および／または糖アルコールと、
（ｋ）非イオン性界面活性剤と、
ｐＨを６．０〜８．０の間に維持するための緩衝剤と
を含む、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤。
【請求項３】
１ｍＬ当たり約５０単位〜約１０００単位の間のＡＤＡＭＴＳ１３活性を含む、請求項１または２に記載の製剤。
【請求項４】
約１００ｍＭ未満の塩を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項５】
前記塩が塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項６】
１．０〜１０．０ｍＭの間のカルシウムを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項７】
２．０〜４．０ｍＭの間のカルシウムを含む、請求項６に記載の製剤。
【請求項８】
２％〜６％の間の糖および／または糖アルコールを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項９】
前記糖および／または糖アルコールが、ショ糖、トレハロース、マンニトールおよびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１０】
前記糖および／または糖アルコールがショ糖とマンニトールとを含む、請求項９に記載の製剤。
【請求項１１】
０．０１％〜０．１％の間の非イオン性界面活性剤を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１２】
前記界面活性剤が、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、プルロニックＦ−６８およびＢＲＩＪ３５からなる群より選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１３】
５ｍＭ〜１００ｍＭの間の緩衝剤を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１４】
前記緩衝剤がヒスチジンまたはＨＥＰＥＳである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１５】
前記製剤のｐＨが７．０±０．２である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１６】
（ａ）０．０５ｍｇ／ｍｌ〜１０．０ｍｇ／ｍｌのＡＤＡＭＴＳ１３と、
（ｂ）０〜６０ｍＭのＮａＣｌと、
（ｃ）２ｍＭ〜４ｍＭのカルシウムと、
（ｄ）２％〜４％のマンニトールと、
（ｅ）０．５％〜２％のショ糖と、
（ｆ）０．０２５〜０．１％のポリソルベート８０と、
（ｇ）１０ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ７．０±０．２）と
を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１７】
（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性と、
（ｂ）０〜６０ｍＭのＮａＣｌと、
（ｃ）２ｍＭ〜４ｍＭのカルシウムと、
（ｄ）２％〜４％のマンニトールと、
（ｅ）０．５％〜２％のショ糖と、
（ｆ）０．０２５〜０．１％のポリソルベート８０と、
（ｇ）１０ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ７．０±０．２）と
を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１８】
０．５μＭ〜２０μＭの間の亜鉛をさらに含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１９】
４℃で少なくとも６ヶ月間安定である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項２０】
４℃で少なくとも６ヶ月間の保管後に少なくとも約９０％のＡＤＡＭＴＳ１３活性を維持する、請求項１９に記載の製剤。
【請求項２１】
４℃で少なくとも６ヶ月間の保管後に少なくとも約９５％のＡＤＡＭＴＳ１３活性を維持する、請求項２０に記載の製剤。
【請求項２２】
４℃で少なくとも６ヶ月間の保管後に少なくとも約９８％のＡＤＡＭＴＳ１３活性を維持する、請求項２１に記載の製剤。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の液体製剤から凍結乾燥される、凍結乾燥ＡＤＡＭＴＳ１３製剤。
【請求項２４】
３７℃で少なくとも６ヶ月間安定である、請求項２３に記載の製剤。
【請求項２５】
３７℃で少なくとも６ヶ月間の保管後に少なくとも約８０％のＡＤＡＭＴＳ１３活性を維持する、請求項２４に記載の製剤。
【請求項２６】
３７℃で少なくとも６ヶ月間の保管後に少なくとも約９０％のＡＤＡＭＴＳ１３活性を維持する、請求項２５に記載の製剤。
【請求項２７】
３７℃で少なくとも６ヶ月間の保管後に少なくとも約９５％のＡＤＡＭＴＳ１３活性を維持する、請求項２６に記載の製剤。
【請求項２８】
前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質が少なくとも８０％の純度である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項２９】
前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質が少なくとも約９０％の純度である、請求項２８に記載の製剤。
【請求項３０】
前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質が少なくとも約９５％の純度である、請求項２９に記載の製剤。
【請求項３１】
前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質が少なくとも約９９％の純度である、請求項３０に記載の製剤。
【請求項３２】
単量体ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項３３】
ＡＤＡＭＴＳ１３凝集体の含有量が５％未満である、請求項３２に記載の製剤。
【請求項３４】
ＡＤＡＭＴＳ１３凝集体の含有量が、少なくとも６ヶ月間の保管後に５％未満に維持されている、請求項３３に記載の製剤。
【請求項３５】
ＡＤＡＭＴＳ１３凝集体の含有量が２．５％未満である、請求項３３に記載の製剤。
【請求項３６】
ＡＤＡＭＴＳ１３凝集体の含有量が、少なくとも６ヶ月間の保管後に２．５％未満に維持されている、請求項３５に記載の製剤。
【請求項３７】
ＡＤＡＭＴＳ１３二量体の含有量が１０％未満である、請求項３２に記載の製剤。
【請求項３８】
ＡＤＡＭＴＳ１３二量体の含有量が、少なくとも６ヶ月間の保管後に１０％未満に維持されている、請求項３７に記載の製剤。
【請求項３９】
ＡＤＡＭＴＳ１３二量体の含有量が５％未満である、請求項３７に記載の製剤。
【請求項４０】
ＡＤＡＭＴＳ１３二量体の含有量が、少なくとも６ヶ月間の保管後に５％未満に維持されている、請求項３９に記載の製剤。
【請求項４１】
前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の比活性が、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質１ｍｇ当たり少なくとも約６００ＵのＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性である、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項４２】
前記比活性が、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質１ｍｇ当たり少なくとも約８００ＵのＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性である、請求項４１に記載の製剤。
【請求項４３】
前記比活性が、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質１ｍｇ当たり少なくとも約１０００ＵのＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性である、請求項４２に記載の製剤。
【請求項４４】
前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質がヒトＡＤＡＭＴＳ１３である、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項４５】
前記ヒトＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質が組換えＡＤＡＭＴＳ１３である、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項４６】
安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤を製造するための方法であって、
（ａ）約２μＭ〜約１２μＭの濃度の亜鉛と約０．５ｍＭ〜約１．５ｍＭの濃度のカルシウムとを含む培地中で培養されている細胞内で、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質またはその生物学的に活性な誘導体を発現させる段階と、
（ｂ）前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を精製する段階と、
（ｃ）請求項１〜４５のいずれか１項に記載の製剤を調製する段階と
を含む方法。
【請求項４７】
前記培地が約１ｍｇ／Ｌ〜約２０ｍｇ／Ｌの濃度のビタミンＢ３も含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質が哺乳動物細胞系において発現される、請求項４６または４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記哺乳動物細胞系が、ＣＨＯ細胞系、ＢＨＫ細胞系およびＨＥＫ細胞系からなる群より選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
請求項１〜４５のいずれか１項に記載の安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤を含むキット。
【請求項５１】
約４０ＩＵのＡＤＡＭＴＳ１３活性〜４０００ＩＵのＡＤＡＭＴＳ１３活性の間を含む、請求項５０に記載のキット。
【請求項５２】
ＡＤＡＭＴＳ１３またはＶＷＦ機能不全に関連した疾患または状態を治療または予防する方法であって、請求項１〜４５のいずれか１項に記載のＡＤＡＭＴＳ１３製剤を、それを必要とする被検体に投与することを含む方法。
【請求項５３】
血栓の形成および／または存在に関連した疾患または状態を治療または予防する方法であって、請求項１〜４５のいずれか１項に記載のＡＤＡＭＴＳ１３製剤を、それを必要とする被検体に投与することを含む方法。
【請求項５４】
梗塞を治療または予防する方法であって、請求項１〜４５のいずれか１項に記載のＡＤＡＭＴＳ１３製剤を、それを必要とする被検体に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、あらゆる目的においてその内容全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる、２００９年９月２１日に出願された米国特許仮出願第６１／２４４，３５３の利益を主張する。
【０００２】
連邦支援による研究または開発の下で行われた発明に対する権利に関する記述
該当なし
【０００３】
コンパクトディスクで提出された「配列表」、表、またはコンピュータプログラムの付表の参照
該当なし
【背景技術】
【０００４】
ＡＤＡＭＴＳ（トロンボスポンジン１型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ）タンパク質は、亜鉛依存性触媒ドメイン、システインリッチドメイン、ディスインテグリン様ドメイン、および少なくとも１つの、多くの場合は複数のトロンボスポンジン１型リピートを含めた多数の保存されたドメインを含む、メタロプロテイナーゼのファミリーである（概説はＮｉｃｈｏｌｓｏｎら，ＢＭＣ  Ｅｖｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００５  Ｆｅｂ  ４；５（１）：１１（非特許文献１）を参照されたい）。メタロプロテイナーゼのＡＤＡＭおよびＭＭＰファミリーと進化的に関連するこれらのタンパク質は、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）（Ｍｏａｋｅ  ＪＬ，Ｓｅｍｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００４  Ｊａｎ；４１（１）：４−１４）、結合組織障害、癌、炎症（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら）および重症熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）マラリア（Ｌａｒｋｉｎら，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．２００９  Ｍａｒ；５（３）：ｅ１０００３４９）を含めた数多くの疾患および状態と関連付けられている分泌酵素である。このような関係を理由として、ＡＤＡＭＴＳ酵素は、数多くの病態の潜在的な治療標的として認識されてきた（Ｊｏｎｅｓ  ＧＣ，Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６  Ｆｅｂ；７（１）：２５−３１）。
【０００５】
ＡＤＡＭＴＳファミリーメンバーの１つであるＡＤＡＭＴＳ１３は、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）を残基Ｔｙｒ１６０５とＭｅｔ１６０６の間で切断する。ＡＤＡＭＴＳ１３活性の喪失は数多くの状態、例えばＴＴＰ  （Ｍｏａｋｅ  ＪＬ，Ｓｅｍｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００４  Ｊａｎ；４１（１）：４−１４）、急性および慢性炎症（Ｃｈａｕｈａｎら，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００８  Ｓｅｐ  １；２０５（９）：２０６５−７４）、ならびにごく最近では重症熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）マラリア（Ｌａｒｋｉｎら，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．２００９  Ｍａｒ；５（３）：ｅ１０００３４９）と関連付けられている。
【０００６】
血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）は、様々な程度の組織虚血および梗塞を引き起こし得る血栓性微小血管症、血小板減少症および毛細血管血栓症を特徴とする障害である。臨床的には、ＴＴＰ患者は血小板減少症、分裂赤血球（赤血球断片）および乳酸デヒドロゲナーゼレベル上昇のような症状により診断される（Ｍｏａｋｅ  Ｊ  Ｌ．Ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｍｉｃｒｏａｎｇｉｏｐａｔｈｉｅｓ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００２；３４７：５８９−６００；Ｍｏａｋｅ  Ｊ  Ｌ．ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ，ＡＤＡＭＴＳ−１３，ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ．Ｓｅｍｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００４；４１：４−１４；Ｓａｄｌｅｒ  Ｊ  Ｅ，Ｍｏａｋｅ  Ｊ  Ｌ，Ｍｉｙａｔａ  Ｔ，Ｇｅｏｒｇｅ  Ｊ  Ｎ．Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ（Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｅｄｕｃ  Ｐｒｏｇｒａｍ）．２００４：４０７−４２３；Ｓａｄｌｅｒ  Ｊ  Ｅ．Ｎｅｗ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ．２００５；５６：１７３−１９１）。
【０００７】
１９８２年にＭｏａｋｅらは、慢性再発性ＴＴＰを有する患者の血漿中に異常に巨大なフォン・ヴィルブランド因子（ＵＬ−ｖＷＦ）多量体を見出した（Ｍｏａｋｅ  Ｊ  Ｌ，Ｒｕｄｙ  Ｃ  Ｋ，Ｔｒｏｌｌ  Ｊ  Ｈ，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  Ｍ  Ｊ，Ｃｏｌａｎｎｉｎｏ  Ｎ  Ｍ，Ａｚｏｃａｒ  Ｊ，Ｓｅｄｅｒ  Ｒ  Ｈ，Ｈｏｎｇ  Ｓ  Ｌ，Ｄｅｙｋｉｎ  Ｄ．  Ｕｎｕｓｕａｌｌｙ  ｌａｒｇｅ  ｐｌａｓｍａ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ：ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｒｅｌａｐｓｉｎｇ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．１９８２；３０７：１４３２−１４３５）。ＵＬ−ｖＷＦとＴＴＰの間の関連は、ＴＴＰに罹患している大部分の患者が、現在はＡＤＡＭＴＳ１３として知られる、ｖＷＦを切断する血漿メタロプロテアーゼが欠損しているというＦｕｒｌａｎらおよびＴｓａｉとＬｉａｎによる独立した発見により裏付けられた（Ｆｕｒｌａｎ  Ｍ，Ｒｏｂｌｅｓ  Ｒ，Ｓｏｌｅｎｔｈａｌｅｒ  Ｍ，Ｗａｓｓｍｅｒ  Ｍ，Ｓａｎｄｏｚ  Ｐ，Ｌａｅｍｍｌｅ  Ｂ．  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ−ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｒｅｌａｐｓｉｎｇ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ．Ｂｌｏｏｄ．１９９７；８９：３０９７−３１０３；Ｔｓａｉ  Ｈ  Ｍ，Ｓｕｓｓｍａｎ，ＩＩ，Ｇｉｎｓｂｕｒｇ  Ｄ，Ｌａｎｋｈｏｆ  Ｈ，Ｓｉｘｍａ  Ｊ  Ｊ，Ｎａｇｅｌ  Ｒ  Ｌ．Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｔｙｐｅ  ２Ａ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｍｕｔａｎｔｓ  Ｒ８３４Ｗ  ａｎｄ  Ｒ８３４Ｑ：ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ  ａｎｄ  ｂｙ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＶＰ−１．Ｂｌｏｏｄ．１９９７；８９：１９５４−１９６２；Ｔｓａｉ  Ｈ  Ｍ，Ｌｉａｎ  Ｅ  Ｃ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ−ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．１９９８；３３９：１５８５−１５９４）。
【０００８】
ＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼは、主として肝臓により産生される１９０ｋＤａのグリコシル化タンパク質である（Ｌｅｖｙ  Ｇ  Ｇ，Ｎｉｃｈｏｌｓ  Ｗ  Ｃ，Ｌｉａｎ  Ｅ  Ｃ，Ｆｏｒｏｕｄ  Ｔ，ＭｃＣｌｉｎｔｉｃｋ  Ｊ  Ｎ，ＭｃＧｅｅ  Ｂ  Ｍ，Ｙａｎｇ  Ａ  Ｙ，Ｓｉｅｍｉｅｎｉａｋ  Ｄ  Ｒ，Ｓｔａｒｋ  Ｋ  Ｒ，Ｇｒｕｐｐｏ  Ｒ，Ｓａｒｏｄｅ  Ｒ，Ｓｈｕｒｉｎ  Ｓ  Ｂ，Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋａｒａｎ  Ｖ，Ｓｔａｂｌｅｒ  Ｓ  Ｐ，Ｓａｂｉｏ  Ｈ，Ｂｏｕｈａｓｓｉｒａ  Ｅ  Ｅ，Ｕｐｓｈａｗ  Ｊ  Ｄ，Ｊｒ．，Ｇｉｎｓｂｕｒｇ  Ｄ，Ｔｓａｉ  Ｈ  Ｍ．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＤＡＭＴＳ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｃａｕｓｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ．Ｎａｔｕｒｅ．２００１；４１３：４８８−４９４；Ｆｕｊｉｋａｗａ  Ｋ，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｈ，ＭｃＭｕｌｌｅｎ  Ｂ，Ｃｈｕｎｇ  Ｄ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ−ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｎｅｗ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ．Ｂｌｏｏｄ．２００１；９８：１６６２−１６６６；Ｚｈｅｎｇ  Ｘ，Ｃｈｕｎｇ  Ｄ，Ｔａｋａｙａｍａ  Ｔ  Ｋ，Ｍａｊｅｒｕｓ  Ｅ  Ｍ，Ｓａｄｌｅｒ  Ｊ  Ｅ，Ｆｕｊｉｋａｗａ  Ｋ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ−ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＡＤＡＭＴＳ１３），ａ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００１；２７６：４１０５９−４１０６３；Ｓｏｅｊｉｍａ  Ｋ，Ｍｉｍｕｒａ  Ｎ，Ｈｉｒａｓｈｉｍａ  Ｍ，Ｍａｅｄａ  Ｈ，Ｈａｍａｍｏｔｏ  Ｔ，Ｎａｋａｇａｋｉ  Ｔ，Ｎｏｚａｋｉ  Ｃ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ：ｐｏｓｓｉｂｌｙ，ｔｈｅ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ−ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｐｒｏｔｅａｓｅ；Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）．２００１；１３０：４７５−４８０；Ｇｅｒｒｉｔｓｅｎ  Ｈ  Ｅ，Ｒｏｂｌｅｓ  Ｒ，Ｌａｍｍｌｅ  Ｂ，Ｆｕｒｌａｎ  Ｍ．Ｐａｒｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ−ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｐｒｏｔｅａｓｅ．Ｂｌｏｏｄ．２００１；９８：１６５４−１６６１）。
【０００９】
ＡＤＡＭＴＳ１３遺伝子の変異がＴＴＰを引き起こすことが示されている（Ｌｅｖｙ  Ｇ  Ｇ，Ｎｉｃｈｏｌｓ  Ｗ  Ｃ，Ｌｉａｎ  Ｅ  Ｃ，Ｆｏｒｏｕｄ  Ｔ，ＭｃＣｌｉｎｔｉｃｋ  Ｊ  Ｎ，ＭｃＧｅｅ  Ｂ  Ｍ，Ｙａｎｇ  Ａ  Ｙ，Ｓｉｅｍｉｅｎｉａｋ  Ｄ  Ｒ，Ｓｔａｒｋ  Ｋ  Ｒ，Ｇｒｕｐｐｏ  Ｒ，Ｓａｒｏｄｅ  Ｒ，Ｓｈｕｒｉｎ  Ｓ  Ｂ，Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋａｒａｎ  Ｖ，Ｓｔａｂｌｅｒ  Ｓ  Ｐ，Ｓａｂｉｏ  Ｈ，Ｂｏｕｈａｓｓｉｒａ  Ｅ  Ｅ，Ｕｐｓｈａｗ  Ｊ  Ｄ，Ｊｒ．，Ｇｉｎｓｂｕｒｇ  Ｄ，Ｔｓａｉ  Ｈ  Ｍ．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＤＡＭＴＳ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｃａｕｓｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ．Ｎａｔｕｒｅ．２００１；４１３：４８８−４９４）。ＡＤＡＭＴＳ−１３活性を阻害する自己抗体によりしばしば引き起こされる特発性ＴＴＰは、成人および年長児において生じる最も一般的な障害であり、１１〜３６％の患者において定期的に再発し得る（Ｔｓａｉ  Ｈ  Ｍ，Ｌｉａｎ  Ｅ  Ｃ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ−ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．１９９８；３３９：１５８５−１５９４；Ｆｕｒｌａｎ  Ｍ，Ｌａｍｍｌｅ  Ｂ．Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ−ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎ  ｆａｍｉｌｉａｌ  ａｎｄ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ．Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．１９９８；１１：５０９−５１４）。
【００１０】
また非中和自己抗体も、循環からの排除を誘導することによりＡＤＡＭＴＳ活性を阻害し得る（Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ  Ｆ，Ｋｎｏｂｌ  Ｐ，Ｔｒａｔｔｎｅｒ  Ｂ，Ｐｌａｉｍａｕｅｒ  Ｂ，Ｍｏｈｒ  Ｇ，Ｄｏｃｋａｌ  Ｍ，Ｄｏｒｎｅｒ  Ｆ，Ｒｉｅｇｅｒ  Ｍ．Ｎｏｎｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ＩｇＭ  ａｎｄ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ−ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＡＤＡＭＴＳ−１３）ｉｎ  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ．Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０２：３２４１−３２４３）。健常成人における血漿ＡＤＡＭＴＳ１３活性は５０％〜１７８％である（Ｍｏａｋｅ  Ｊ  Ｌ．Ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｕｒｅｍｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ．２００２；１２６：１４３０−１４３３）。家族性または後天性ＴＴＰを有する患者の大部分では、血漿ＡＤＡＭＴＳ１３活性が存在しないか、または正常の５％未満である。治療を行わなければ死亡率は９０％を超えるが、血漿療法により死亡率は約２０％まで減少している（Ｍｏａｋｅ  Ｊ  Ｌ．Ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｕｒｅｍｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ．２００２；１２６：１４３０−１４３３）。
【００１１】
巨核球および内皮細胞内で合成されたｖＷＦは、超巨大ｖＷＦ（ＵＬ−ｖＷＦ）としてそれぞれ血小板顆粒およびバイベル・パラーデ小体中に貯蔵される（Ｍｏａｋｅ  Ｊ  Ｌ，Ｒｕｄｙ  Ｃ  Ｋ，Ｔｒｏｌｌ  Ｊ  Ｈ，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  Ｍ  Ｊ，Ｃｏｌａｎｎｉｎｏ  Ｎ  Ｍ，Ａｚｏｃａｒ  Ｊ，Ｓｅｄｅｒ  Ｒ  Ｈ，Ｈｏｎｇ  Ｓ  Ｌ，Ｄｅｙｋｉｎ  Ｄ．Ｕｎｕｓｕａｌｌｙ  ｌａｒｇｅ  ｐｌａｓｍａ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ：ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｒｅｌａｐｓｉｎｇ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．１９８２；３０７：１４３２−１４３５；Ｗａｇｎｅｒ  Ｄ  Ｄ，Ｏｌｍｓｔｅｄ  Ｊ  Ｂ，Ｍａｒｄｅｒ  Ｖ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｗｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅ  ｂｏｄｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９８２；９５：３５５−３６０；Ｗａｇｎｅｒ  Ｄ  Ｄ，Ｂｏｎｆａｎｔｉ  Ｒ．ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ．Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒｏｃ．１９９１；６６：６２１−６２７；Ｓｐｏｒｎ  Ｌ  Ａ，Ｍａｒｄｅｒ  Ｖ  Ｊ，Ｗａｇｎｅｒ  Ｄ  Ｄ．ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｌｅａｓｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｗｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅ  ｂｏｄｉｅｓ  ｂｉｎｄｓ  ｍｏｒｅ  ａｖｉｄｌｙ  ｔｏ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｔｈａｎ  ｔｈａｔ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ．Ｂｌｏｏｄ．１９８７；６９：１５３１−１５３４；Ｔｓａｉ  Ｈ  Ｍ，Ｎａｇｅｌ  Ｒ  Ｌ，Ｈａｔｃｈｅｒ  Ｖ  Ｂ，Ｓｕｓｓｍａｎ，ＩＩ．Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｈｉｇｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓ  ｃｏｎｖｅｒｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｕｌｔｉｍｅｒ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｂｙ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９８９；１５８：９８０−９８５；Ｔｓａｉ  Ｈ  Ｍ，Ｎａｇｅｌ  Ｒ  Ｌ，Ｈａｔｃｈｅｒ  Ｖ  Ｂ，Ｓｕｓｓｍａｎ，ＩＩ．Ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ．Ｂｌｏｏｄ．１９８９；７３：２０７４−２０７６）。内皮細胞から分泌されると、これらのＵＬ−ｖＷＦ多量体は、循環中でＡＤＡＭＴＳ１３によりｖＷＦ分子内の特定の切断部位で分解されて、一連のより小型の多量体になる（Ｔｓａｉ  Ｈ  Ｍ，Ｎａｇｅｌ  Ｒ  Ｌ，Ｈａｔｃｈｅｒ  Ｖ  Ｂ，Ｓｕｓｓｍａｎ，ＩＩ．Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｈｉｇｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓ  ｃｏｎｖｅｒｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｕｌｔｉｍｅｒ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｂｙ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕ���．１９８９；１５８：９８０−９８５；Ｄｅｎｔ  Ｊ  Ａ，Ｇａｌｂｕｓｅｒａ  Ｍ，Ｒｕｇｇｅｒｉ  Ｚ  Ｍ．Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ  ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔ  ｓｕｂｕｎｉｔ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９９１；８８：７７４−７８２；Ｆｕｒｌａｎ  Ｍ，Ｒｏｂｌｅｓ  Ｒ，Ａｆｆｏｌｔｅｒ  Ｄ，Ｍｅｙｅｒ  Ｄ，Ｂａｉｌｌｏｄ  Ｐ，Ｌａｍｍｌｅ  Ｂ．Ｔｒｉｐｌｅｔ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｆｌｅｃｔｓ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９３；９０：７５０３−７５０７）。
【００１２】
ＡＤＡＭＴＳ１３は、成熟ｖＷＦサブユニットの中心Ａ２ドメイン中のＴｙｒ８４２−Ｍｅｔ８４３結合で切断し、活性には亜鉛またはカルシウムを必要とする。（Ｄｅｎｔ  Ｊ  Ａ，Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚ  Ｓ  Ｄ，Ｗａｒｅ  Ｊ，Ｋａｓｐｅｒ  Ｃ  Ｋ，Ｒｕｇｇｅｒｉ  Ｚ  Ｍ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＡ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９０；８７：６３０６−６３１０）。ｖＷＦは、電子顕微鏡法による観察では「毛糸玉」および線維状形態で存在する（Ｓｌａｙｔｅｒ  Ｈ，Ｌｏｓｃａｌｚｏ  Ｊ，Ｂｏｃｋｅｎｓｔｅｄｔ  Ｐ，Ｈａｎｄｉｎ  Ｒ  Ｉ．Ｎａｔｉｖｅ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ａｎｄ  ｑｕａｓｉ−ｅｌａｓｔｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ．Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８５；２６０：８５５９−８５６３）。さらに原子間力顕微鏡法により、ｖＷＦは、安定状態では球状立体構造で、ずり応力に曝された後にはアンフォールドした線維状態で存在することが確認される（Ｓｉｅｄｌｅｃｋｉ  Ｃ  Ａ，Ｌｅｓｔｉｎｉ  Ｂ  Ｊ，Ｋｏｔｔｋｅ−Ｍａｒｃｈａｎｔ  Ｋ  Ｋ，Ｅｐｐｅｌｌ  Ｓ  Ｊ，Ｗｉｌｓｏｎ  Ｄ  Ｌ，Ｍａｒｃｈａｎｔ  Ｒ  Ｅ．Ｓｈｅａｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ．Ｂｌｏｏｄ．１９９６；８８：２９３９−２９５０）。このことは、ｖＷＦフィラメントの一端が表面に固定されている場合にも起こり得る。
【００１３】
ＴＴＰ患者の血栓は、フィブリンがほとんどなく、主としてｖＷＦおよび血小板から構成され、このことは血栓症の原因としてのｖＷＦ仲介による血小板凝集を示唆している（Ａｓａｄａ  Ｙ，Ｓｕｍｉｙｏｓｈｉ  Ａ，Ｈａｙａｓｈｉ  Ｔ，Ｓｕｚｕｍｉｙａ  Ｊ，Ｋａｋｅｔａｎｉ  Ｋ．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｌｅｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ，ｗｉｔｈ  ｓｐｅｃｉａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｒｅｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ．１９８５；３８：４６９−４７９）。再発性ＴＴＰの患者は血漿中に超巨大な多量体を有する。阻害物質（抗ＡＤＡＭＴＳ１３  Ａｂ）の残存がＡＤＡＭＴＳ１３活性を低下させるため、ＵＬ−ｖＷＦ多量体は徐々に蓄積される。ＵＬ−ｖＷＦ多量体は活動亢進性で、ずり応力の結果、アンフォールドしており、血小板凝集を生じて血管内血栓症を引き起こす（Ｔｓａｉ  Ｈ  Ｍ．Ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ，ＡＤＡＭＴＳ１３，ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２００２；８０：６３９−６４７；Ｔｓａｉ  Ｈ  Ｍ．Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ＡＤＡＭＴＳ−１３  ｉｎ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ．Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．２００３；１：２０３８−２０４０；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ２０４０−２０３５）。
【００１４】
ＡＤＡＭＴＳ１３欠損による血漿中における活動亢進性なＵＬ−ｖＷＦ多量体の存在は、冠動脈心疾患に関連した動脈血栓症のリスク増加と関連し得る。
【００１５】
したがって、ＡＤＡＭＴＳ１３およびＶＷＦ機能不全に関連した様々な疾患および状態の治療に適したＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の医薬製剤が当該技術分野において必要とされている。本発明は、特に医薬投与に適したＡＤＡＭＴＳ１３製剤、ならびにＡＤＡＭＴＳ１３およびＶＷＦ機能不全に関連した疾患または状態を有する被検体の治療法を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら，ＢＭＣ  Ｅｖｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００５  Ｆｅｂ  ４；５（１）：１１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
一態様では、本発明は、医薬投与に適したＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ１３）製剤を提供する。有利には、いくつかの実施形態では、本発明は、活性を失わずにまたは過度に凝集せずに長期間保管し得るＡ１３製剤を提供する。特定の実施形態では、本発明の製剤は、少なくとも約３７℃以下の温度で少なくとも６ヶ月間保管し得る。
【００１８】
一態様では、本発明は、（ａ）０．０５ｍｇ／ｍｌ〜１０．０ｍｇ／ｍｌのＡＤＡＭＴＳ１３；（ｂ）０ｍＭ〜２００ｍＭの薬学的に許容される塩；（ｃ）０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウム；（ｄ）糖および／または糖アルコール；（ｅ）非イオン性界面活性剤；および（ｆ）ｐＨを６．０〜８．０の間に維持するための緩衝剤を含む、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ１３）製剤を提供する。
【００１９】
関連する一態様では、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ１３）の安定化凍結乾燥製剤を提供し、この製剤は、（ａ）０．０５ｍｇ／ｍｌ〜１０．０ｍｇ／ｍｌのＡＤＡＭＴＳ１３；（ｂ）０ｍＭ〜２００ｍＭの薬学的に許容される塩；（ｃ）０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウム；（ｄ）糖および／または糖アルコール；（ｅ）非イオン性界面活性剤；および（ｆ）ｐＨを６．０〜８．０の間に維持するための緩衝剤を含む液体製剤から凍結乾燥される。
【００２０】
本発明の一態様では、医薬投与に適した組換えＡＤＡＭＴＳ１３（ｒＡ１３）製剤を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される製剤は高い比活性を有し、かつ長期間の保管に際して安定である。
【００２１】
本発明の別の態様では、Ａ１３およびｒＡ１３の二量体化または凝集が減少している製剤を提供する。特定の実施形態では、本明細書で提供される製剤は、長期間保管される場合、Ａ１３およびｒＡ１３二量体の形成を遅らせる。いくつかの実施形態では、これらの製剤は医薬投与に適している。
【００２２】
一態様では、本発明は、１つ以上の血栓の形成および／または存在に関連した障害の治療法または予防法、ならびに１つ以上の血栓の分解を必要とする患者においてそれを行う方法に関する。１つ以上の血栓の形成および／または存在に関連した障害の例は、遺伝性血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、後天性ＴＴＰ、動脈血栓症、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、脳卒中、敗血症および播種性血管内凝固（ＤＩＣ）である。一実施形態では、治療法または予防法は、本明細書で提供されるＡ１３またはｒＡ１３製剤の投与を含む。
【００２３】
別の態様では、本発明は、梗塞の治療または予防を必要とする患者においてそれを行う方法を提供する。特定の実施形態では、心筋梗塞（心臓発作）、肺塞栓症、脳卒中のような脳血管事象、末梢動脈閉塞性疾患（壊疽など）、抗リン脂質症候群、敗血症、巨細胞性動脈炎（ＧＣＡ）、ヘルニアおよび腸捻転を非限定的に含めた、梗塞に関連する疾患または状態の治療または予防のための方法を提供する。一実施形態では、治療法または予防法は、本明細書で提供されるＡ１３またはｒＡ１３製剤の投与を含む。
【００２４】
一態様では、本発明は、高い安定性および／または高い比活性を有するＡ１３またはｒＡ１３の製剤化法を提供する。特定の実施形態では、この方法は、医薬投与に望ましい高い比活性を失わずに、少なくとも約３７℃以下の温度で長期間保管し得る溶液および凍結乾燥物の製剤化に有用である。
【００２５】
別の態様では、Ａ１３またはｒＡ１３の医薬投与のためのキットが本明細書で提供される。特定の実施形態では、本発明キットは、長期間保管し得る液体または凍結乾燥製剤を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】１５０ｍＭのＮａＣｌ、２％のショ糖、０．０５％のポリソルベート８０を含有し、（１）ヒスチジン、（２）リン酸緩衝液または（３）クエン酸ナトリウムから選択される緩衝剤２０ｍＭによりｐＨが７．０である緩衝液で、組換えＡＤＡＭＴＳ１３を製剤化した。溶液を４℃または３７℃で最大６ヶ月間保管した。ＥＬＩＳＡにより測定される（Ａ）ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性および（Ｂ）ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質濃度を表示の時点で決定した。
【図２】１５０ｍＭのＮａＣｌ、２％のショ糖、０．０５％のポリソルベート８０を含有し、（１）ヒスチジン、（２）リン酸緩衝液または（３）クエン酸ナトリウムから選択される緩衝剤２０ｍＭによりｐＨが７．０である緩衝液で組換えＡＤＡＭＴＳ１３を製剤化し、凍結乾燥した。凍結乾燥製剤を４℃または３７℃で最大６ヶ月間保管した。ＡＤＡＭＴＳ１３製剤を滅菌水で復元し、ＥＬＩＳＡにより測定される（Ａ）ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性および（Ｂ）ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質濃度を表示の時点で決定した。
【図３】１５０ｍＭのＮａＣｌ、２％のショ糖、０．０５％のポリソルベート８０を含有し、（１）ヒスチジン、（２）リン酸緩衝液または（３）クエン酸ナトリウムから選択される緩衝剤２０ｍＭによりｐＨが７．０である緩衝液で組換えＡＤＡＭＴＳ１３を製剤化し、試料を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６ゲルろ過カラムに直接負荷するか、または凍結乾燥し滅菌水で復元してから負荷した。次いで、ＡＤＡＭＴＳ１３製剤をゲルろ過により分析した。
【図４】１５０ｍＭのＮａＣｌ、２％のショ糖、０．０５％のポリソルベート８０および２０ｍＭのヒスチジンを含有するｐＨ７．０の緩衝液で組換えＡＤＡＭＴＳ１３を製剤化した。溶液を（Ａ）４℃または（Ｂ）３７℃で最大６ヶ月間保管した。次いで、表示の時点でＡＤＡＭＴＳ１３製剤をゲルろ過により分析した。
【図５】１５０ｍＭのＮａＣｌ、２％のショ糖、０．０５％のポリソルベート８０および２０ｍＭのヒスチジンを含有するｐＨ７．０の緩衝液で組換えＡＤＡＭＴＳ１３を製剤化してから、凍結乾燥した。次いで、凍結乾燥製剤を（Ａ）４℃または（Ｂ）３７℃で最大６ヶ月間保管した。表示の時点でＡＤＡＭＴＳ１３製剤を滅菌水中で復元し、ゲルろ過により分析した。
【図６】１５０ｍＭのＮａＣｌ、２％のショ糖、０．０５％のポリソルベート８０および２０ｍＭのヒスチジンを含有するｐＨ７．０の緩衝液で組換えＡＤＡＭＴＳ１３を製剤化し、次いで、（Ａ）溶液でまたは（Ｂ）凍結乾燥させて、４℃または３７℃で最大６ヶ月間保管した。凍結乾燥製剤を滅菌水中で復元し、試料を溶液で保管し、凍結乾燥製剤を動的光散乱分析により特徴付けた。
【図７】１５０ｍＭのＮａＣｌ、２％のショ糖、０．０５％のポリソルベート８０および２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤を含有するｐＨ７．０の緩衝液で組換えＡＤＡＭＴＳ１３を製剤化し、次いで、（Ａ）溶液でまたは（Ｂ）凍結乾燥させて、４℃または３７℃で最大６ヶ月間保管した。凍結乾燥製剤を滅菌水中で復元し、試料を溶液で保管し、凍結乾燥製剤を動的光散乱分析により特徴付けた。
【図８】１５０ｍＭのＮａＣｌ、２％のショ糖、０．０５％のポリソルベート８０および２０ｍＭのトリ−クエン酸ナトリウム緩衝剤を含有するｐＨ７．０の緩衝液で組換えＡＤＡＭＴＳ１３を製剤化し、次いで、（Ａ）溶液でまたは（Ｂ）凍結乾燥させて、４℃または３７℃で最大６ヶ月間保管した。凍結乾燥製剤を滅菌水中で復元し、試料を溶液で保管し、凍結乾燥製剤を動的光散乱分析により特徴付けを行った。
【図９】１５０ｍＭのＮａＣｌ、２％のショ糖、０．０５％のポリソルベート８０および２０ｍＭのヒスチジンを含有するｐＨ７．０の緩衝液で組換えＡＤＡＭＴＳ１３を製剤化してから、凍結乾燥させた。凍結乾燥試料を４℃または３７℃で３ヶ月間保管し、次いで滅菌水中で復元した。次いで、ＡＤＡＭＴＳ１３試料をフーリエ変換赤外分光法により特徴付けし、結果を新たに製剤化され凍結乾燥された試料と比較した。
【図１０】１５０ｍＭのＮａＣｌ、２％のショ糖、０．０５％のポリソルベート８０を含有し、（１）ヒスチジン、（２）リン酸緩衝液または（３）クエン酸ナトリウムから選択される緩衝剤２０ｍＭによりｐＨが７．０である緩衝液で組換えＡＤＡＭＴＳ１３を製剤化した。溶液を４℃または３７℃で６ヶ月間保管した。凍結乾燥製剤を滅菌水で復元し、全試料の純度を逆相ＨＰＬＣ分析により決定した。
【図１１】１５０ｍＭのＮａＣｌ、２％のショ糖、０．０５％のポリソルベート８０を含有し、（１）ヒスチジン、（２）リン酸緩衝液または（３）クエン酸ナトリウムから選択される緩衝剤２０ｍＭによりｐＨが７．０である緩衝液で組換えＡＤＡＭＴＳ１３を製剤化した。溶液製剤の試料も凍結乾燥し、滅菌水で復元した。溶液製剤および復元凍結乾燥製剤を示差走査熱量測定分析により特徴付けた。
【図１２】１５０ｍＭのＮａＣｌ、２％のショ糖、０．０５％のポリソルベート８０を含有し、（１）ヒスチジン、（２）リン酸緩衝液または（３）クエン酸ナトリウムから選択される緩衝剤２０ｍＭによりｐＨが７．０である緩衝液で組換えＡＤＡＭＴＳ１３を製剤化した。製剤中のＡＤＡＭＴＳ１３のｚ平均径を動的光散乱分析により特徴付けた。
【図１３】１５０ｍＭのＮａＣｌ、０％〜２％のショ糖、０％〜３％のマンニトール、０ｍＭ〜２ｍＭのカルシウム、０．０５％のポリソルベート８０および２０ｍＭのヒスチジンを含有するｐＨ７．０の緩衝液で組換えＡＤＡＭＴＳ１３を製剤化し、ゲルろ過により分析した。全クロマトグラフをパネル（Ａ）に示し、二量体ピークの拡大部分をパネル（Ｂ）に示す。
【図１４】１５０ｍＭのＮａＣｌおよび２０ｍＭのヒスチジンを含有し、ｐＨ５．５、６．５、７．５、８．５および９．５である緩衝液で組換えＡＤＡＭＴＳ１３を製剤化した。製剤を４℃または４０℃で２４時間保管した。次いで、ＥＬＩＳＡにより測定されるＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性およびＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質濃度を表示のｐＨの製剤に対して決定した。
【図１５】１５０ｍＭのＮａＣｌ、２％のショ糖、０．０５％のポリソルベート８０および２０ｍＭのヒスチジンを含有し、２ｍＭのＣａＣｌ２を加えた（１２Ｂおよび１２Ｄ）または加えない（１２Ａおよび１２Ｃ）ｐＨ７．０の緩衝液で、組換えＡＤＡＭＴＳ１３を製剤化した。液体製剤を２５℃（１２Ａおよび１２Ｂ）または３７℃（１２Ｃおよび１２Ｄ）で３週間保管した。表示の時点で酵素安定性をＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３アッセイにより測定した。
【図１６】（Ａ）２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）および５００ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ６  ＧＬゲルろ過カラムに組換えＡＤＡＭＴＳ１３を負荷し、サイズおよび形状により分子種を分離した。凝集Ａ１３（プール１）、二量体Ａ１３（プール２）および単量体Ａ１３（プール３）に対応する３つの溶出プールを作製した。次いで、各プールのＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性を判定した。（Ｂ）プールした画分のオリゴマー状態および多分散性を動的光散乱分析によりさらに評価した。
【図１７】２％のショ糖、０．０５％のポリソルベート８０、ｐＨ７．０の２０ｍＭのヒスチジンおよび（Ａ）０ｍＭ、（Ｂ）３０ｍＭ、（Ｃ）６０ｍＭ、（Ｄ）９０ｍＭ、（Ｅ）１２０ｍＭまたは（Ｆ）１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液で組換えＡＤＡＭＴＳ１３を製剤化した。次いで、製剤化したＡＤＡＭＴＳ１３組成物を凍結乾燥させ、得られた凍結乾燥ケークの外観を視覚的に調べた。
【図１８】０〜１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する製剤から生成された組換えＡＤＡＭＴＳ１３凍結乾燥ケークを水中で復元した。復元したＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の凝集状態をゲルろ過分析により判定した。
【図１９】０．０５％のポリソルベート８０、ｐＨ７．０の２０ｍＭのヒスチジン、５ｍＭ〜２０ｍＭの濃度のショ糖および０〜１５０ｍＭの濃度のＮａＣｌを含有する緩衝液で組換えＡＤＡＭＴＳ１３を製剤化した。各製剤中のＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の活性をＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３アッセイにより判定した。
【図２０】高塩および低塩緩衝液を凍結乾燥させた。高塩緩衝液（Ａ）は、２０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２％のショ糖、０．０５％のポリソルベート８０および２ｍＭのＣａＣｌ２を含有していたのに対し、低塩緩衝液（Ｂ）は、２０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ７．０）、３０ｍＭのＮａＣｌ、１％のショ糖、３％のマンニトール、０．０５％のポリソルベート８０および２ｍＭのＣａＣｌ２を含有していた。次いで、２つの製剤を標準条件下で凍結乾燥させた後、得られた凍結乾燥ケークを視覚的に調べた。
【図２１】ゲルろ過の（Ａ）前および（Ｂ）後に陽イオン交換クロマトグラフィーにより単離された組換えＡＤＡＭＴＳ１３の多量体状態を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６  ＧＬカラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。
【図２２Ａ】図２２。ゲルろ過の（Ａ）前および（Ｂ）後に陽イオン交換クロマトグラフィーにより単離された組換えＡＤＡＭＴＳ１３の多量体状態を、動的光散乱により分析した。
【図２２Ｂ】図２２。ゲルろ過の（Ａ）前および（Ｂ）後に陽イオン交換クロマトグラフィーにより単離された組換えＡＤＡＭＴＳ１３の多量体状態を、動的光散乱により分析した。
【図２３】ｒＡＤＡＭＴＳ１３製剤の凍結乾燥のための（Ａ）標準的なおよび（Ｂ）長期間のプロトコールを示す図である。
【図２４Ａ】図２４。（Ａ）標準的な凍結乾燥プロトコールを用いたｒＡ１３製剤１〜４、（Ｂ）長期間の凍結乾燥プロトコールを用いたｒＡ１３製剤１〜４、（Ｃ）標準的な凍結乾燥プロトコールを用いたｒＡ１３製剤５〜８および（Ｄ）長期間の凍結乾燥プロトコールを用いたｒＡ１３製剤５〜８の凍結乾燥により生成されたｒＡＤＡＭＴＳ１３凍結乾燥ケークの比較を示す図である。このデータを作成するために使用した製剤および凍結乾燥プロトコールは、実施例１２に見ることができる。［図２４］標準的な（Ａ  ＬＹＯ）または長期間の（Ｂ  ＬＹＯ）凍結乾燥プロトコールの下で（Ａ）３０ｍＭのＮａＣｌまたは（Ｂ）６０ｍＭのＮａＣｌを含有する製剤から生成された組換えＡＤＡＭＴＳ１３凍結乾燥ケークを水中で復元した。復元されたＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の凝集状態を動的光散乱分析により判定した。
【図２４Ｂ】図２４。（Ａ）標準的な凍結乾燥プロトコールを用いたｒＡ１３製剤１〜４、（Ｂ）長期間の凍結乾燥プロトコールを用いたｒＡ１３製剤１〜４、（Ｃ）標準的な凍結乾燥プロトコールを用いたｒＡ１３製剤５〜８および（Ｄ）長期間の凍結乾燥プロトコールを用いたｒＡ１３製剤５〜８の凍結乾燥により生成されたｒＡＤＡＭＴＳ１３凍結乾燥ケークの比較を示す図である。このデータを作成するために使用した製剤および凍結乾燥プロトコールは、実施例１２に見ることができる。［図２４］標準的な（Ａ  ＬＹＯ）または長期間の（Ｂ  ＬＹＯ）凍結乾燥プロトコールの下で（Ａ）３０ｍＭのＮａＣｌまたは（Ｂ）６０ｍＭのＮａＣｌを含有する製剤から生成された組換えＡＤＡＭＴＳ１３凍結乾燥ケークを水中で復元した。復元されたＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の凝集状態を動的光散乱分析により判定した。
【図２４Ｃ】図２４。（Ａ）標準的な凍結乾燥プロトコールを用いたｒＡ１３製剤１〜４、（Ｂ）長期間の凍結乾燥プロトコールを用いたｒＡ１３製剤１〜４、（Ｃ）標準的な凍結乾燥プロトコールを用いたｒＡ１３製剤５〜８および（Ｄ）長期間の凍結乾燥プロトコールを用いたｒＡ１３製剤５〜８の凍結乾燥により生成されたｒＡＤＡＭＴＳ１３凍結乾燥ケークの比較を示す図である。このデータを作成するために使用した製剤および凍結乾燥プロトコールは、実施例１２に見ることができる。［図２４］標準的な（Ａ  ＬＹＯ）または長期間の（Ｂ  ＬＹＯ）凍結乾燥プロトコールの下で（Ａ）３０ｍＭのＮａＣｌまたは（Ｂ）６０ｍＭのＮａＣｌを含有する製剤から生成された組換えＡＤＡＭＴＳ１３凍結乾燥ケークを水中で復元した。復元されたＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の凝集状態を動的光散乱分析により判定した。
【図２４Ｄ】図２４。（Ａ）標準的な凍結乾燥プロトコールを用いたｒＡ１３製剤１〜４、（Ｂ）長期間の凍結乾燥プロトコールを用いたｒＡ１３製剤１〜４、（Ｃ）標準的な凍結乾燥プロトコールを用いたｒＡ１３製剤５〜８および（Ｄ）長期間の凍結乾燥プロトコールを用いたｒＡ１３製剤５〜８の凍結乾燥により生成されたｒＡＤＡＭＴＳ１３凍結乾燥ケークの比較を示す図である。このデータを作成するために使用した製剤および凍結乾燥プロトコールは、実施例１２に見ることができる。［図２４］標準的な（Ａ  ＬＹＯ）または長期間の（Ｂ  ＬＹＯ）凍結乾燥プロトコールの下で（Ａ）３０ｍＭのＮａＣｌまたは（Ｂ）６０ｍＭのＮａＣｌを含有する製剤から生成された組換えＡＤＡＭＴＳ１３凍結乾燥ケークを水中で復元した。復元されたＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の凝集状態を動的光散乱分析により判定した。
【図２５】標準的なまたは長期間のプロトコールによる凍結乾燥の後、（Ａ）３０ｍＭのＮａＣｌまたは（Ｂ）６０ｍＭのＮａＣｌで製剤化したＡＤＡＭＴＳ１３組成物のオリゴマー状態および多分散性を動的光散乱分析により評価した。
【図２６】ヒトフォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）切断プロテアーゼＡＤＡＭＴＳ１３のドメイン構造を示す図である。前駆体ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチドは、シグナルペプチド（Ｓ）、プロペプチド（Ｐ）、その後に続く触媒メタロプロテアーゼドメイン、ディスインテグリン様ドメイン、トロンボスポンジン１型（ＴＳＰ１）モチーフ、システインリッチおよびスペーサードメイン、さらに７個のＴＳＰ１リピートおよび２個のＣＵＢドメインを含む成熟ポリペプチドの構造的特性からなる。１０個の潜在的なＮ−グリコシル化部位を閉環で示す。
【図２７】動的光散乱分析（ＤＬＳ）により決定された、異なる緩衝剤で製剤化したＡＤＡＭＴＳ１３組成物の流体力学直径を示す図である。
【図２８】動的光散乱分析（ＤＬＳ）により判定された、組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３に対するずり応力の影響を示す図である。
【図２９】ＦＲＥＴＳ活性により判定された、組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３の凍結融解安定性を示す図である。
【図３０】動的光散乱分析（ＤＬＳ）により判定された、組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３の凍結融解安定性を示す図である。
【図３１】ＳＥ−ＨＰＬＣにより判定された、凍結乾燥組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３の光安定性を示す図である。
【図３２】動的光散乱分析（ＤＬＳ）により判定された、液体および凍結乾燥組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３の光安定性を示す図である。
【図３３】ＦＲＥＴＳ活性により判定された、液体および凍結乾燥組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３の光安定性を示す図である。
【図３４】組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３のＦＲＥＴＳ活性に対するカルシウムおよび亜鉛の影響を示す図である。
【図３５】ＳＥ−ＨＰＬＣにより判定された、凍結乾燥組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３製剤のオリゴマー状態に対する塩および糖含有量の影響を示す図である。各製剤の糖含有量は、モル濃度ではなくｇ／Ｌで報告されるべきである（例えば、２０ｍＭ＝２０ｇ／Ｌ）。
【図３６】表１５に従って製剤化された組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３の凍結乾燥により生成された凍結乾燥ケークを示す図である。
【図３７】標準的な３日間の凍結乾燥プログラムにより凍結乾燥させ、４℃（最上段パネル）；３０℃（中段パネル）；および４０℃（下段パネル）で６ヶ月間保管した組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３のオリゴマー状態の動的光散乱（ＤＬＳ）分析を示す図である。
【図３８】長期間の１０日間の凍結乾燥プログラムにより凍結乾燥させ、４℃（最上段パネル）；３０℃（中段パネル）；および４０℃（下段パネル）で６ヶ月間保管した組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３のオリゴマー状態の動的光散乱（ＤＬＳ）分析を示す図である。
【図３９】異なるタンパク質濃度で製剤化された組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３の、４℃、３０℃および４０℃での保管後のオリゴマー状態の動的光散乱（ＤＬＳ）分析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
Ｉ．緒言
ＡＤＡＭＴＳ１３は、フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）多量体を切断し、血小板凝集におけるその活性を下方制御する血漿メタロプロテアーゼである。血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）は、異常に巨大な、止血において活動亢進性なフォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）および重度のＡＤＡＭＴＳ−１３欠損に関連した重篤な疾患である。ＡＤＡＭＴＳ１３欠損によるＴＴＰの治療のための組換えタンパク質置換療法としての組換えＡＤＡＭＴＳ１３製品候補が開発されてきた（Ｐｌａｉｍａｕｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ，Ｓｅｍｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００４  Ｊａｎ；４１（１）：２４−３３；Ｐｌａｉｍａｕｅｒ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆ．Ｂｌｏｏｄ．２００２  Ｎｏｖ  １５；１００（１０）：３６２６−３２．Ｅｐｕｂ  ２００２  Ｊｕｌ  １２；ａｎｄ  Ｂｒｕｎｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．２００５  Ｍａｙ；３（５）：１０６４−７３；これらの開示はすべて、あらゆる目的においてその内容全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる）。
【００２８】
本発明は、日米ＥＵ医薬品規制調和国際会議（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｈａｒｍｏｎｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｕｓｅ）（ＩＣＨ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ  Ｑ８（Ｒ２），２００５）により示される要件を満たす、安定性が増加した精製ＡＤＡＭＴＳタンパク質の液体および凍結乾燥製剤の発見に一部基づく。
【００２９】
ＶＷＦの止血活性は多量体のサイズに大きく依存する。血漿メタロプロテアーゼＡＤＡＭＴＳ１３は、ＶＷＦの多量体サイズを生理的に制御することが確認されている主要なプロテアーゼである。ＡＤＡＭＴＳ１３はＶＷＦのＡ２ドメイン中のＴｙｒ１６０５とＭｅｔ１６０６の間を切断して、循環中に見られる典型的な１７６ｋＤａおよび１４０ｋＤａの切断フラグメントならびにより小型のＶＷＦ多量体を生じる。ヒトＡＤＡＭＴＳ１３遺伝子は２９のエクソンを含み、染色体９ｑ３４上で約３７ｋｂに及ぶ。４．７ｋｂ転写産物は主として肝星細胞内で合成されるが、血管内皮細胞および血小板内でも合成され、１４２７アミノ酸残基の一次翻訳産物をコードする。前駆体ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチドは、シグナルペプチドおよびＣ末端が切断のための潜在的なフューリン部位で終わっているプロペプチド、それに続く成熟ＶＷＦ切断プロテアーゼの配列からなる。成熟ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド（１３５３アミノ酸残基）は、すべてのＡＤＡＭＴＳファミリーメンバーに特徴的な構造的特性：レプロリシン様メタロプロテアーゼドメイン、ディスインテグリン様ドメイン、中心のトロンボスポンジン１型（ＴＳＰ１）リピート、インテグリン相互作用に重要であると思われるＲＧＤモチーフを有するシステインリッチドメインおよびスペーサードメイン、その後に続く固有の７個の連続するＴＳＰ１リピート（ＴＳＰ１／＃２〜８）および２個のＣＵＢドメインを含む（図２６）。
【００３０】
成熟ＡＤＡＭＴＳ１３は約１４５ｋＤａの算出分子質量を有するが、精製された血漿由来ＡＤＡＭＴＳ１３は約１８０ｋＤａの見かけの分子質量を有し、これは存在する１０個の潜在的Ｎ−グリコシル化部位ならびにＴＳＰ１リピート内のいくつかのＯ−グリコシル化部位および１つのマンノシル化部位に対するコンセンサス配列と合致する、翻訳後修飾に起因すると思われる。ＡＤＡＭＴＳ１３のＶＷＦタンパク質分解活性は二価陽イオンに大きく依存する。メタロプロテアーゼドメイン中の活性部位モチーフは、触媒Ｚｎ２＋イオンを配位する３個のヒスチジン残渣を有する高度に保存されたＨＥＸＸＨＸＸＧＸＸＨＤモチーフならびにＧｌｕ８３、Ａｓｐ１７３、Ｃｙｓ２８１およびＡｓｐ２８４により配位されると提唱されている予測カルシウム結合部位を含む。ＡＤＡＭＴＳ１３ドメインの機能的役割は主としてインビトロアッセイ系を用いて研究されており、メタロプロテアーゼからスペーサードメインまでのＮ末端領域がＶＷＦ切断に重要であることが示されている。Ｃ末端ＴＳＰ１リピートおよびＣＵＢドメインは、ＶＷＦ基質認識および内皮細胞上のＣＤ３６のような潜在的な表面受容体との結合に重要であると思われる。
【００３１】
タンパク質製剤開発の１つの主な結果は、各タンパク質の不活性化経路および凝集または分解経路の特定である。４０℃、液体製剤において、組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の１週間以内の完全に時間依存的な不活性化がＦＲＥＴＳ活性により観察された。本明細書に開示されるように、この不活性化は、２ｍＭのＣａ２＋の存在下で低下し得ることが見出された。２５℃では、Ｃａ２＋の存在下でＦＲＥＴＳ活性はもう低下しなかった。４℃では、Ｃａ２＋の非存在下でＡＤＡＭＴＳ１３液体製剤の活性は２４週間安定であった。
【００３２】
さらに、同一の凍結乾燥された製剤においては、製剤が４０℃、Ｃａ２＋の非存在下で保管された場合、不活性化はごくわずかに生じたか、または全く生じないことが見出された。２ｍＭまたは４ｍＭのＣａ２＋の添加は４０℃での安定性に影響を与えなかった。
【００３３】
したがって、本発明者らは、液体製剤中（例えば、４０℃で保管）におけるＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の時間依存性の凝集が、酵素活性の低下および／または喪失の主な原因であることを見出した。重要なことに、本発明により提供されるように、この凝集は凍結乾燥によりおよび／または液体製剤へのＣａ２＋添加により、実質的に減少し得る。さらに、非イオン性界面活性剤（例えば、０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０）の添加が凍結乾燥製剤におけるＡＤＡＭＴＳ１３凝集体の形成を減少させることが見出された。さらに、１つ以上の糖および／または糖アルコールの存在が、凍結乾燥の間にＡＤＡＭＴＳ１３を著しく安定化させ、改善された凍結乾燥ケークの形成を促進することが見出された。
【００３４】
ＩＩ．定義
本明細書で使用される「ＡＤＡＭＴＳ１３」または「Ａ１３」は、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）を残基Ｔｙｒ１６０５とＭｅｔ１６０６の間で切断するＡＤＡＭＴＳ（トロンボスポンジン１型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ）ファミリーのメタロプロテアーゼを指す。本発明との関連においては、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は任意のＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質、例えば、哺乳動物、例えば霊長類、ヒト（ＮＰ＿６２０５９４）、サル、ウサギ、ブタ、ウシ（ＸＰ＿６１０７８４）、げっ歯類、マウス（ＮＰ＿００１００１３２２）、ラット（ＸＰ＿３４２３９６）、ハムスター、スナネズミ、イヌ、ネコ、カエル（ＮＰ＿００１０８３３３１）、ニワトリ（ＸＰ＿４１５４３５）などに由来するＡＤＡＭＴＳ１３およびその生物学的に活性な誘導体を包含する。活性を有する変異体およびバリアントＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質も包含され、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の機能的フラグメントおよび融合タンパク質も同様に包含される。さらに、本発明のＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、精製、検出またはその両方を容易にするタグをさらに含み得る。本明細書に記載のＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、治療部分またはインビトロもしくはインビボイメージングに適した部分によりさらに修飾されていてもよい。
【００３５】
ヒトＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質としては、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿６２０５９４のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそのプロセシングされたポリペプチド、例えば、シグナルペプチド（アミノ酸１〜２９）および／またはプロペプチド（アミノ酸３０〜７４）が除去されたポリペプチドが非限定的に挙げられる。ヒトＡＤＡＭＴＳ１３の数多くの天然バリアントが当該技術分野で公知であり、かつ本発明の製剤に包含されるが、その一部のものは、Ｒ７Ｗ、Ｖ８８Ｍ、Ｈ９６Ｄ、Ｒ１０２Ｃ、Ｒ１９３Ｗ、Ｔ１９６Ｉ、Ｈ２３４Ｑ、Ａ２５０Ｖ、Ｒ２６８Ｐ、Ｗ３９０Ｃ、Ｒ３９８Ｈ、Ｑ４４８Ｅ、Ｑ４５６Ｈ、Ｐ４５７Ｌ、Ｐ４７５Ｓ、Ｃ５０８Ｙ、Ｒ５２８Ｇ、Ｐ６１８Ａ、Ｒ６２５Ｈ、Ｉ６７３Ｆ、Ｒ６９２Ｃ、Ａ７３２Ｖ、Ｅ７４０Ｋ、Ａ９００Ｖ、Ｓ９０３Ｌ、Ｃ９０８Ｙ、Ｃ９５１Ｇ、Ｇ９８２Ｒ、Ｃ１０２４Ｇ、Ａ１０３３Ｔ、Ｒ１０９５Ｗ、Ｒ１０９５Ｗ、Ｒ１１２３Ｃ、Ｃ１２１３Ｙ、Ｔ１２２６Ｉ、Ｇ１２３９ＶおよびＲ１３３６Ｗから選択される変異を含む。さらに、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、例えば、非必須のアミノ酸における１つ以上の保存的変異により変異した天然および組換えタンパク質を含む。ＡＤＡＭＴＳ１３の酵素活性に必須のアミノ酸は変異していないことが好ましい。これらは、例えば、金属結合に必須であることが既知であるかまたは推定されている残基、例えば残基８３、１７３、２２４、２２８、２３４、２８１および２８４など、ならびに酵素の活性部位に見られる残基、例えば残基２２５を含む。同様に、本発明との関連において、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質はアイソフォーム、例えば、完全長ヒトタンパク質のアミノ酸２７５〜３０５および／または１１３５〜１１９０を欠くアイソフォームを含む。
【００３６】
本明細書で使用される「生物学的に活性な誘導体」という用語は、実質的にＡＤＡＭＴＳ１３と同じ生物学的機能を有する任意のポリペプチドを指す。生物学的に活性な誘導体のポリペプチド配列は、その非存在、存在および／または置換がそれぞれ、ポリペプチドの生物学的活性に対して実質的な負の影響を全く有さない１つ以上のアミノ酸の欠失、付加および／または置換を含み得る。上記ポリペプチドの生物学的活性は、例えば、内皮への血小板粘着の減少もしくは遅延、血小板凝集の減少もしくは遅延、ひも状の血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｓｔｒｉｎｇｓ）形成の減少もしくは遅延、血栓形成の減少もしくは遅延、血栓成長の減少もしくは遅延、血管閉塞の減少もしくは遅延、ｖＷＦのタンパク質分解性切断、血栓の崩壊により、またはペプチド基質、例えばＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３ペプチド（Ｋｏｋａｍｅら，Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．２００５  Ａｐｒ；１２９（１）：９３−１００）もしくはそのバリアントの切断により測定し得る。
【００３７】
同様にＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、例えば、翻訳後修飾（例えば、ヒト残渣１４２、１４６、５５２、５７９、６１４、６６７、７０７、８２８、１２３５、１３５４から選択される１つ以上のアミノ酸におけるグリコシル化、または天然もしくは人工修飾部位）により、またはグリコシル化、水溶性ポリマーによる修飾（例えば、ＰＥＧ化、シアリル化、ＨＥＳ化など）、タグ化などを非限定的に含めたエキソビボでの化学的もしくは酵素的修飾によりさらに修飾されていてもよい。
【００３８】
本明細書で使用される「１単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性」は、使用するアッセイに関係なく、プールされた正常ヒト血漿１ｍｌ中における活性量と定義される。例えば、１単位のＡＤＡＭＴＳ１３  ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性とは、プールされた正常ヒト血漿１ｍｌにより切断されるのと同じ量のＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３基質（Ｋｏｋａｍｅら，Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．２００５  Ａｐｒ；１２９（１）：９３−１００）を切断するのに必要な活性量のことである。
【００３９】
本明細書で使用される「ＡＤＡＭＴＳ１３」および「生物学的に活性な誘導体」という用語はそれぞれ、組換えＤＮＡ技術により得られるポリペプチドも包含する。組換えＡＤＡＭＴＳ１３（「ｒＡＤＡＭＴＳ１３」）、例えば組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３（「ｒ−ｈｕ−ＡＤＡＭＴＳ１３」）は、当該技術分野で公知の任意の方法により作製し得る。１つの特定の例が、組換えＡＤＡＭＴＳ１３作製法に関して参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第０２／４２４４１号に開示されている。これは、（Ｉ）遺伝子工学により、例えばＲＮＡの逆転写および／またはＤＮＡの増幅を介して組換えＤＮＡを産生し、（ＩＩ）トランスフェクションにより、すなわち、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションを介して、原核または真核細胞内へ組換えＤＮＡを導入し、（ＩＩＩ）上記形質転換細胞を、例えば連続法またはバッチ法で培養し、（ＩＶ）例えば構成的にまたは導入時にＡＤＡＭＴＳ１３を発現させ、（Ｖ）例えば培地から、または形質転換細胞の採取により上記ＡＤＡＭＴＳ１３を単離して、（ＶＩ）例えば陰イオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティクロマトグラフィーにより、実質的に精製された組換えＡＤＡＭＴＳ１３を得るための当該技術分野で公知の任意の方法を含み得る。また「生物学的に活性な誘導体」という用語は、例えば、哺乳動物、特にヒトの循環系におけるＡＤＡＭＴＳ１３半減期のような生物学的／薬理学的特性を向上させるために、例えばＩｇと組み合わせた、ＡＤＡＭＴＳ１３（またはその生物学的に活性な誘導体）のようなキメラ分子も包含する。またＩｇは、任意に変異したＦｃ受容体と結合する部位も有し得る。
【００４０】
本明細書で使用される「血栓」という用語は、血餅、特に血餅を含む血小板、微小血栓および／または塞栓を指す。上記血栓は、動脈または静脈血管に付着する場合もしない場合もあり、また動脈または静脈血管における血流を部分的にまたは完全に阻止し得る。
【００４１】
本明細書で使用される「ビタミンＢ３」、「ニコチンアミド」、「ナイアシンアミド、「ナイアシン」および「ニコチン酸」は、ビタミンのＢ３ファミリーの任意のメンバーを指すために互換的に使用され得る。
【００４２】
本明細書で使用される「治療有効量または用量」または「十分な量または用量」は、投与する目的である効果をもたらす用量を指す。正確な用量は治療の目的によって決まり、また公知の技術を使用する当業者により確認される（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ（第１〜３巻，１９９２）；Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ  Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）；Ｐｉｃｋａｒ，Ｄｏｓａｇｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，第２０版，２００３，Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓを参照されたい）。
【００４３】
本明細書で使用される、塩の「生理的濃度」は、薬学的に許容される塩の約１００ｍＭ〜約２００ｍＭの間の塩濃度を指す。薬学的に許容される塩の非限定的な例としては、塩化ナトリウムおよび塩化カリウム、酢酸ナトリウムおよび酢酸カリウム、クエン酸ナトリウムおよびクエン酸カリウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カリウムが非限定的に挙げられる。
【００４４】
本明細書で使用される、塩の「生理的濃度未満」は、薬学的に許容される塩の約１００ｍＭ未満の塩濃度を指す。好適な実施形態では、生理的濃度未満の塩は、約８０ｍＭ未満の薬学的塩である。別の好適な実施形態では、生理的濃度未満の塩は、約６０ｍＭ未満の薬学的塩である。
【００４５】
本明細書で使用される「約」という用語は、特定数値±１０％の近似範囲を表す。例えば、「約２０％」という語句は、１８〜２２％の範囲を包含する。また本明細書で使用される「約」は正確な量も包含する。したがって、「約２０％」は「約２０％」および「２０％」も意味する。
【００４６】
本明細書で使用される「保管」は、製剤を調製して直ちに被検体に投与せず、使用前に特定の条件（例えば、特定の温度など）下で一定期間保持することを意味する。例えば、液体または凍結乾燥製剤を、被検体へ投与する前に冷蔵（０℃〜１０℃）または室温（例えば、３２℃以下）のような様々な温度下で、数日間、数週間、数ヶ月間または数年間保持し得る。
【００４７】
本明細書で使用される「既知組成培地」という用語は、すべての成分のアイデンティティおよび濃度が既知である合成増殖培地を指す。既知組成培地は、細菌、酵母、動物または植物抽出物を含有しないが、個々の植物または動物由来成分（例えば、タンパク質、ポリペプチドなど）を含んでも含まなくてもよい。市販の既知組成培地の非限定的な例としては、種々のＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）培地（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ）、種々のＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ（ＤＭＥ）培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ；ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ）、Ｈａｍ’ｓ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ；ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ）などが挙げられる。既知組成培地の調製法は、例えば、その開示があらゆる目的においてその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１７１，８２５号および同第６，９３６，４４１号、国際公開第２００７／０７７２１７号、ならびに米国特許出願第２００８／０００９０４０号および同第２００７／０２１２７７０号において、当該技術分野で公知である。
【００４８】
本明細書で使用される「無オリゴペプチド培地」という用語は、例えばタンパク質加水分解物由来のオリゴペプチドのようなオリゴペプチドを含まない、無タンパク質培地を指す。一実施形態では、培地は２０個以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。本発明の一実施形態では、培地は１５個以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。本発明の別の実施形態では、培地は１０個以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。一実施形態では、培地は７個以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。別の実施形態では、培地は５個以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。さらに別の実施形態では、培地は３個以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。本発明のさらなる実施形態に従えば、培地は２個以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。無オリゴペプチド培地の調製法は、例えば、その開示があらゆる目的においてその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１７１，８２５号および同第６，９３６，４４１号、国際公開第２００７／０７７２１７号、ならびに米国特許出願第２００８／０００９０４０号および同第２００７／０２１２７７０号において、当該技術分野で公知である。
【００４９】
本明細書で使用される「無血清培地」という用語は、動物血清を補充しない培地を指す。多くの場合、無血清培地は既知組成培地であるが、無血清培地に個別の動物または植物タンパク質またはタンパク質断片を補充してもよい。無血清培地の調製法は、例えば、その開示があらゆる目的においてその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１７１，８２５号および同第６，９３６，４４１号、国際公開第２００７／０７７２１７号、ならびに米国特許出願第２００８／０００９０４０号および同第２００７／０２１２７７０号において、当該技術分野で公知である。
【００５０】
本明細書で使用される「無動物タンパク質培地」という用語は、動物の血清、タンパク質またはタンパク質断片を補充しない培地を指す。多くの場合、無動物タンパク質培地は既知組成培地であるが、無動物タンパク質培地は植物または酵母加水分解物を含有してもよい。無動物タンパク質培地の調製法は、例えば、その開示があらゆる目的においてその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１７１，８２５号および同第６，９３６，４４１号、国際公開第２００７／０７７２１７号、ならびに米国特許出願第２００８／０００９０４０号および同第２００７／０２１２７７０号において、当該技術分野で公知である。
【００５１】
「発現ベクター」とは、宿主細胞内で特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを有する、組換えまたは合成により作製された核酸構築物のことである。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスまたは核酸フラグメントの一部であり得る。通常、発現ベクターは、プロモーターと作動可能に連結された転写される核酸を含む。
【００５２】
核酸の一部分に関して使用される「異種性」という用語は、天然において互いに同じ関係で見出されない２つ以上の配列を含む核酸を表す。例えば、新たな機能的核酸を生成するために配置された無関係な遺伝子由来の２つ以上の配列、例えば、１つの源に由来するプロモーターと別の源に由来するコード領域とを有する核酸は通常、組換えにより作製される。同様に異種タンパク質は、天然において互いに同じ関係で見出されない２つ以上の配列を含むタンパク質（例えば、融合タンパク質）を表す。
【００５３】
「プロモーター」は、核酸の転写を指令する一連の核酸制御配列として定義される。本明細書で使用されるプロモーターは、例えばポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合はＴＡＴＡエレメントなど、転写開始部分付近の必要な核酸配列を含む。またプロモーターは、転写開始部位から数千塩基対もの位置に存在し得る遠位エンハンサーまたはリプレッサーも任意に含む。「構成的」プロモーターとは、大部分の環境および発生条件下で活性なプロモーターのことである。「誘導性」プロモーターとは、環境または発生による制御下で活性なプロモーターのことである。「作動可能に連結された」という用語は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーターまたは一連の転写因子結合部位など）と第二の核酸配列との間の機能的連結を指し、ここでは発現制御配列が第二の配列に対応する核酸の転写を指令する。
【００５４】
ＩＩＩ．ＡＤＡＭＴＳ１３組成物および製剤
一態様では、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ１３）およびｒＡＤＡＭＴＳ１３（ｒＡ１３）タンパク質の安定化製剤を提供する。一実施形態では、本発明の製剤は、少なくとも約４０℃以下の温度で少なくとも約６ヶ月間保管した場合に安定である。他の実施形態では、本明細書で提供される製剤は、長期間保管された場合に著しいＡＤＡＭＴＳ１３活性を保持する。さらに他の実施形態では、本発明の製剤は、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の二量体化、オリゴマー化および／または凝集を減少または遅延させる。
【００５５】
一実施形態では、本発明は、治療有効量または用量のＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質、生理的濃度未満から生理的濃度の薬学的に許容される塩、安定化作用のある濃度の１つ以上の糖および／または糖アルコール、非イオン性界面活性剤、製剤に中性ｐＨをもたらす緩衝剤ならびに任意にカルシウムおよび／または亜鉛の塩を含む、ＡＤＡＭＴＳ１３製剤を提供する。一般に、本明細書で提供される安定化Ａ１３製剤は医薬投与に適している。好適な実施形態では、Ａ１３タンパク質は、ヒトＡＤＡＭＴＳ１３またはその生物学的に活性な誘導体もしくはフラグメントである。
【００５６】
特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は液体製剤である。他の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、本明細書で提供される液体製剤から凍結乾燥された凍結乾燥製剤である。
【００５７】
本明細書で提供される製剤の特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、ヒトＡＤＡＭＴＳ１３（ｈＡ１３）もしくは組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３（ｒｈＡ１３）、またはその生物学的に活性な誘導体もしくはフラグメントである。一実施形態では、ｈＡ１３のアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿６２０５９４のアミノ酸配列である。別の実施形態では、ｈＡ１３のアミノ酸配列は、ＮＰ＿６２０５９４のアミノ酸７５〜１４２７、その天然もしくは保存的バリアント、またはその生物学的に活性なフラグメントを含む。
【００５８】
特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３は約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの間の治療有効量で提供される。他の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３は約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの間の濃度で存在する。さらに他の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３は約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬの間の濃度で存在する。別の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３は約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２ｍｇ／ｍＬの間の濃度で存在する。さらに他の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３は約０．０１ｍｇ／ｍＬまたは約０．０２ｍｇ／ｍＬ、０．０３ｍｇ／ｍＬ、０．０４ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．０６ｍｇ／ｍＬ、０．０７ｍｇ／ｍＬ、０．０８ｍｇ／ｍＬ、０．０９ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．６ｍｇ／ｍＬ、０．７ｍｇ／ｍＬ、０．８ｍｇ／ｍＬ、０．９ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、１．１ｍｇ／ｍＬ、１．２ｍｇ／ｍＬ、１．３ｍｇ／ｍＬ、１．４ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬ、１．６ｍｇ／ｍＬ、１．７ｍｇ／ｍＬ、１．８ｍｇ／ｍＬ、１．９ｍｇ／ｍＬ、２．０ｍｇ／ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬ、３．０ｍｇ／ｍＬ、３．５ｍｇ／ｍＬ、４．０ｍｇ／ｍＬ、４．５ｍｇ／ｍＬ、５．０ｍｇ／ｍＬ、５．５ｍｇ／ｍＬ、６．０ｍｇ／ｍＬ、６．５ｍｇ／ｍＬ、７．０ｍｇ／ｍＬ、７．５ｍｇ／ｍＬ、８．０ｍｇ／ｍＬ、８．５ｍｇ／ｍＬ、９．０ｍｇ／ｍＬ、９．５ｍｇ／ｍＬ、１０．０ｍｇ／ｍＬ以上で存在し得る。一実施形態では、比較的純粋なＡＤＡＭＴＳ１３製剤の濃度を分光測定法（すなわち、Ａ２８０で測定される総タンパク質）またはその他の容積決定法（例えば、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ、銀染色、凍結乾燥粉末重量など）により決定し得る。他の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の濃度をＡＤＡＭＴＳ１３  ＥＬＩＳＡアッセイにより決定し得る（例えば、ｍｇ／ｍＬ抗原）。
【００５９】
さらに他の実施形態では、本発明により提供される製剤中のＡＤＡＭＴＳ１３濃度を酵素活性レベルとして表し得る。例えば、一実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、約１０単位のＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性〜約１０，０００単位のＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性の間またはその他の適当なＡ１３酵素単位（ＩＵ）を含有し得る。他の実施形態では、製剤は、約２０単位のＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３（ＵＦＶ７３）活性〜約８，０００単位のＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性の間、または約３０ＵＦＶ７３〜約６，０００ＵＦＶ７３の間、または約４０ＵＦＶ７３〜約４，０００ＵＦＶ７３の間、または約５０ＵＦＶ７３〜約３，０００ＵＦＶ７３の間、または約７５ＵＦＶ７３〜約２，５００ＵＦＶ７３の間、または約１００ＵＦＶ７３〜約２，０００ＵＦＶ７３の間、または約２００ＵＦＶ７３〜約１，５００ＵＦＶ７３の間、またはそれらの中の他のおよその範囲を含有し得る。好適な実施形態では、本明細書で提供されるＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、約１５０〜約６００の間のＵＦＶ７３を含有する。特定の実施形態では、製剤は約１０単位のＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性、または約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，１００、２，２００、２，３００、２，４００、２，５００、２，６００、２，７００、２，８００、２，９００、３，０００、３，１００、３，２００、３，３００、３，４００、３，５００、３，６００、３，７００、３，８００、３，９００、４，０００、４，１００、４，２００、４，３００、４，４００、４，５００、４，６００、４，７００、４，８００、４，９００、５，０００、５，１００、５，２００、５，３００、５，４００、５，５００、５，６００、５，７００、５，８００、５，９００、６，０００、６，１００、６，２００、６，３００、６，４００、６，５００、６，６００、６，７００、６，８００、６，９００、７，０００、７，１００、７，２００、７，３００、７，４００、７，５００、７，６００、７，７００、７，８００、７，９００、８，０００、８，１００、８，２００、８，３００、８，４００、８，５００、８，６００、８，７００、８，８００、８，９００、９，０００、９，１００、９，２００、９，３００、９，４００、９，５００、９，６００、９，７００、９，８００、９，９００、１０，０００以上の単位のＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性を含有する。
【００６０】
同様に特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の濃度は、単位体積当たりの酵素活性、例えば１ｍＬ当たりのＡ１３酵素単位（ＩＵ／ｍＬ）で表し得る。例えば一実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は約１０ＩＵ／ｍＬ〜約１０，０００ＩＵ／ｍＬの間を含有し得る。他の実施形態では、製剤は約２０ＩＵ／ｍＬ〜約８，０００ＩＵ／ｍＬの間、または約３０ＩＵ／ｍＬ〜約６，０００ＩＵ／ｍＬの間、または約４０ＩＵ／ｍＬ〜約４，０００ＩＵ／ｍＬの間、または約５０ＩＵ／ｍＬ〜約３，０００ＩＵ／ｍＬの間、または約７５ＩＵ／ｍＬ〜約２，５００ＩＵ／ｍＬの間、または約１００ＩＵ／ｍＬ〜約２，０００ＩＵ／ｍＬの間、または約２００ＩＵ／ｍＬ〜約１，５００ＩＵ／ｍＬの間、またはそれらの中の他のおよその範囲を含有し得る。好適な実施形態では、本明細書で提供されるＡＤＡＭＴＳ１３製剤は約１５０ＩＵ／ｍＬ〜約６００ＩＵ／ｍＬの間を含有する。別の好適な実施形態では、本明細書で提供されるＡＤＡＭＴＳ１３製剤は約１００ＩＵ／ｍＬ〜約１，０００ＩＵ／ｍＬの間を含有する。特定の実施形態では、製剤は約１０ＩＵ／ｍＬ、または約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，１００、２，２００、２，３００、２，４００、２，５００、２，６００、２，７００、２，８００、２，９００、３，０００、３，１００、３，２００、３，３００、３，４００、３，５００、３，６００、３，７００、３，８００、３，９００、４，０００、４，１００、４，２００、４，３００、４，４００、４，５００、４，６００、４，７００、４，８００、４，９００、５，０００、５，１００、５，２００、５，３００、５，４００、５，５００、５，６００、５，７００、５，８００、５，９００、６，０００、６，１００、６，２００、６，３００、６，４００、６，５００、６，６００、６，７００、６，８００、６，９００、７，０００、７，１００、７，２００、７，３００、７，４００、７，５００、７，６００、７，７００、７，８００、７，９００、８，０００、８，１００、８，２００、８，３００、８，４００、８，５００、８，６００、８，７００、８，８００、８，９００、９，０００、９，１００、９，２００、９，３００、９，４００、９，５００、９，６００、９，７００、９，８００、９，９００、１０，０００以上のＩＵ／ｍＬを含有する。
【００６１】
特定の実施形態では、本発明により提供される安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、生理的濃度未満から生理的塩濃度、例えば、０ｍＭ〜約２００ｍＭの間の薬学的に許容される塩を含有する。一実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、生理的濃度の塩、例えば、約１００ｍＭ〜約２００ｍＭの間の薬学的に許容される塩を含有する。他の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は約０ｍＭ、または約５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭ、１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍＭ、２００ｍＭ以上の薬学的に許容される塩を含有する。好適な実施形態では、塩は塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである。
【００６２】
有利には、生理的濃度未満の薬学的に許容される塩を含有するＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、表面の滑らかで密な凍結乾燥ケークを形成することが見出されている。さらに、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の低塩凍結乾燥製剤は、生理濃度の塩で調製した製剤に比べてタンパク質凝集を減少させるということが見出されている。したがって好適な実施形態では、本発明は、生理的濃度未満の薬学的に許容される塩、例えば約１００ｍＭ未満の薬学的に許容される塩を含有する低塩ＡＤＡＭＴＳ１３製剤を提供する。一実施形態では、本明細書で提供される低塩ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は約１００ｍＭ未満の薬学的塩を含有する。好適な実施形態では、本明細書で提供される低塩ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は約８０ｍＭ未満の薬学的塩を含有する。別の好適な実施形態では、本明細書で提供される低塩ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は約６０ｍＭ未満の薬学的塩（すなわち、約０ｍＭ〜約６０ｍＭの間の塩）を含有する。別の好適な実施形態では、低塩ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は約３０ｍＭ〜約６０ｍＭの間の薬学的に許容される塩を含有する。さらに他の実施形態では、低塩ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は約０ｍＭ、または約５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭもしくは１００ｍＭの薬学的に許容される塩を含有する。好適な実施形態では、低塩ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は凍結乾燥製剤である。好適な実施形態では、塩は塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである。
【００６３】
また中程度のレベル（すなわち、約２％〜約６％の間）の１つ以上の糖および／または糖アルコールを含むことが、表面の滑らかで密な凍結乾燥ケークの調製を補助し、かつ凍結乾燥の際にＡＤＡＭＴＳ１３を安定化するのに役立つことも見出されている。したがって一実施形態では、本発明は、約２％〜約６％の間の１つ以上の糖および／または糖アルコールを含有するＡＤＡＭＴＳ１３製剤を提供する。単糖、二糖もしくは多糖または水溶性グルカンのような任意の糖、例えば、フルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、ショ糖、デキストラン、トレハロース、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプンおよびカルボキシメチルセルロースを含めた糖を使用し得る。特定の実施形態では、糖添加物としてショ糖またはトレハロースを使用する。糖アルコールは、約４個〜約８個の間の炭素原子とヒドロキシル基とを有する炭化水素として定義される。本明細書で提供されるＡＤＡＭＴＳ１３製剤で使用し得る糖アルコールの非限定的な例としては、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトールおよびアラビトールが挙げられる。一実施形態では、糖アルコール添加物としてマンニトールを使用する。好適な実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は糖および糖アルコール添加物の両方を含有する。
【００６４】
糖および糖アルコールは、別々にまたは組み合わせて使用し得る。いくつかの実施形態では、糖、糖アルコールまたはそれらの組合せが約０．５％〜約７％の間の濃度で製剤中に存在する。一実施形態では、製剤の糖および／または糖アルコール含有量は、約０．５％〜約５％の間である。特定の実施形態では、糖、糖アルコールまたはそれらの組合せが約１％〜約５％の間の濃度で存在する。好適な実施形態では、糖、糖アルコールまたはそれらの組合せが約２％〜約６％の間の濃度で存在する。別の好適な実施形態では、糖、糖アルコールまたはそれらの組合せが約３％〜約５％の間の濃度で存在する。特定の実施形態では、最終濃度は約０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６．０％、６．５％または７．０％の糖、糖アルコールまたはそれらの組合せであり得る。特定の実施形態では、本明細書で提供される製剤は、糖を約０．５％〜約５．０％の濃度で、および糖アルコールを約０．５％〜約５．０％の濃度で含み得る。糖と糖アルコールの濃度の任意の組合せ、例えば、約０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６．０％、６．５％または７．０％の濃度で存在する糖と、約０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６．０％、６．５％または７．０％の濃度で存在する糖アルコールとの任意の組合せを使用し得る。
【００６５】
有利なことに、非イオン性界面活性剤を含むことがＡＤＡＭＴＳ１３製剤の凝集を実質的に減少させることも見出されている。したがって一実施形態では、安定化作用のある濃度の非イオン性界面活性剤を含有するＡＤＡＭＴＳ１３製剤が提供される。本発明の製剤において使用し得る薬学的に許容される非イオン性界面活性剤は薬学分野において公知であり、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、およびプルロニックＦ−６８を含めた種々のポロキサマーもしくはプルロニック、およびＢＲＩＪ３５、またはそれらの混合物が非限定的に挙げられる。好適な実施形態では、本発明の医薬製剤において使用する非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０である。特定の実施形態では、本明細書で提供される製剤において、界面活性剤を約０．００１％〜約０．２％の間の濃度で使用し得る。好適な実施形態では、界面活性剤を約０．０１％〜約０．１％の間の濃度で使用する。別の好適な実施形態では、界面活性剤を約０．０５％の濃度で使用する。例えば特定の実施形態では、製剤は、非イオン性界面活性剤を約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１２５％、０．１５％、０．１７５％、０．２％などの濃度で含み得る。
【００６６】
さらに、ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、約６．５〜約７．５の間の中性ｐＨで製剤化された場合に安定化されることが見出された。したがって特定の実施形態では、製剤を中性ｐＨに維持するのに適した緩衝剤を含有するＡＤＡＭＴＳ１３製剤が提供される。薬学的に許容される緩衝剤は当該技術分野で公知であり、リン酸緩衝剤、ヒスチジン、クエン酸ナトリウム。ＨＥＰＥＳ、トリス、ビシン、グリシン、Ｎ−グリシルグリシン、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、グリシルグリシン、リジン、アルギニン、リン酸ナトリウムおよびそれらの混合物が非限定的に挙げられる。好適な実施形態では、緩衝剤は、ヒスチジン、リン酸緩衝剤、ＨＥＰＥＳおよびクエン酸ナトリウムから選択される。好適な一実施形態では、緩衝剤はヒスチジンまたはＨＥＰＥＳである。特定の実施形態では、緩衝剤はヒスチジンである。別の特定の実施形態では、緩衝剤はＨＥＰＥＳである。一実施形態では、本明細書で提供される製剤のｐＨは約６．５〜約９．０の間である。特定の実施形態では、製剤のｐＨは約６．５、または約６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９もしくは９．０である。好適な実施形態では、Ａ１３製剤のｐＨは約６．０〜約８．０の間である。より好適な実施形態では、Ａ１３製剤のｐＨは約６．５〜約７．５の間である。特定の実施形態では、Ａ１３製剤のｐＨは約７．０である。別の特定の実施形態では、Ａ１３製剤のｐＨは７．０±０．２である。
【００６７】
カルシウムを含むことがさらにＡＤＡＭＴＳ１３製剤を安定化することも本明細書で示されている。したがって特定の実施形態では、約０．５ｍＭ〜約２０ｍＭの間のカルシウム（例えば、塩化カルシウム）を含有する安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤が提供される。任意の薬学的に許容されるカルシウム塩を、本明細書で提供される製剤において使用し得る。使用し得るカルシウム塩の非限定的な例としては、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＣＯ３、Ｃａ（Ｃ６Ｈ１１Ｏ７）２、Ｃａ３（ＰＯ４）２、Ｃａ（Ｃ１８Ｈ３５Ｏ２）２などが挙げられる。一実施形態では、本発明のＡＤＡＭＴＳ１３製剤中にカルシウムが約０．５ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度で存在する。別の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３製剤中にカルシウムが約２ｍＭ〜約５ｍＭの間の濃度で存在する。好適な実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３製剤中にカルシウムが約２ｍＭ〜約４ｍＭの濃度で存在する。特定の実施形態では、カルシウムの濃度は約０．５ｍＭ、または約１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭもしくは２０ｍＭである。特定の実施形態では、カルシウムの濃度は約２ｍＭである。別の好適な実施形態では、カルシウムの濃度は約３ｍＭである。さらに別の好適な実施形態では、カルシウムの濃度は約４ｍＭである。
【００６８】
同様に、特定の条件下では、亜鉛を含むことが本明細書で提供されるＡＤＡＭＴＳ１３製剤をさらに安定化することが見出されている。例えば、図３４は、約２μＭ〜約１０μＭの間の亜鉛を含むことが、カルシウム含有ＡＤＡＭＴＳ１３製剤をさらに安定化することを示している。任意の薬学的に許容される亜鉛塩を、本明細書で提供される製剤において使用し得る。使用し得る亜鉛塩の非限定的な例としては、例えば、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ＺｎＳＯ３・２Ｈ２Ｏ、Ｚｎ３（ＰＯ４）２および（Ｃ６Ｈ５Ｏ１１）２Ｚｎ３・２Ｈ２Ｏなどが挙げられる。一実施形態では、本明細書で提供されるＡＤＡＭＴＳ１３製剤においてＺｎＳＯ４を使用する。いくつかの実施形態では、本発明のＡＤＡＭＴＳ１３製剤中に、亜鉛が約０．５μＭ〜約２０．０μＭの濃度で存在する。好適な実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３製剤中に、亜鉛が約０．５μＭ〜約１０．０μＭの間の濃度で含まれる。特定の実施形態では、亜鉛の濃度は約０．５μＭ、または約１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭもしくは１０μＭである。
【００６９】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、担体および／または希釈剤をさらに含み得る。さらに本明細書で提供される製剤は、その他の薬剤、担体、補助剤、希釈剤、組織透過促進剤、可溶化剤などをさらに含み得る。医薬投与のための組成物および製剤の調製法は当業者に公知である（例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，第１８版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９０）を参照されたい）。
【００７０】
一実施形態では、本明細書で提供されるＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、約２００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ〜約４００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌの間の範囲または約２５０〜約３５０Ｏｓｍｏｌ／Ｌの間の範囲の浸透圧を有する。特定の実施形態では、本明細書で提供されるＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、例えば、約２００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、または約２１０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、２２０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、２３０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、２４０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、２５０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、２６０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、２７０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、２８０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、２９０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、３００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、３１０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、３２０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、３３０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、３４０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、３５０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、３６０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、３７０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、３８０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、３９０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌもしくは４００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌの浸透圧を有する。
【００７１】
本明細書で提供される製剤で使用し得る浸透圧剤の例としては、塩化ナトリウム、デキストロース、ショ糖、キシリトール、フルクトース、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、トレハロース、塩化カリウム、マンノース、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、その他の無機塩、その他の糖、その他の糖アルコールおよびそれらの組合せが非限定的に挙げられる。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、少なくとも１つの浸透圧剤、または少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ以上の浸透圧剤を含み得る。
【００７２】
本明細書で提供されるＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、既知の方法、例えば、静脈内投与（例えば、ボーラスとして、または長時間にわたる持続注入による）、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、髄腔内、経口、局所または吸入経路による方法を介した投与のために製剤化し得る。特定の実施形態では、本明細書で提供されるＡＤＡＭＴＳ１３製剤を全身的または局所的に投与し得る。全身投与としては、経口、真皮下、腹腔内、皮下、経鼻、舌下または直腸内経路の投与が非限定的に挙げられる。局所投与全身投与としては、局所、皮下、筋肉内および腹腔内経路の投与が非限定的に挙げられる。
【００７３】
本発明の一態様では、単量体ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の組成物が提供される。特定の実施形態では、単量体ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の組成物は凝集ＡＤＡＭＴＳ１３、二量体ＡＤＡＭＴＳ１３または凝集および二量体ＡＤＡＭＴＳ１３の両方を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、単量体組成物は、凝集および／または二量体ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を含有する同様の組成物よりも高い比活性を有する。特定の実施形態では、単量体ＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、ゲルろ過またはサイズ排除クロマトグラフィーを含む方法により作製される。特定の一実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、ヒトＡＤＡＭＴＳ１３（ｈＡ１３）もしくは組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３（ｒｈＡ１３）またはその生物学的に活性な誘導体もしくはフラグメントである。
【００７４】
別の態様では、単量体ＡＤＡＭＴＳ１３組成物の製剤が提供される。一実施形態では、製剤は単量体ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の薬学的に許容される製剤である。特定の実施形態では、製剤は凝集ＡＤＡＭＴＳ１３、二量体ＡＤＡＭＴＳ１３または凝集および二量体ＡＤＡＭＴＳ１３の両方を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、単量体ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、凝集および／または二量体ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を含有する同様の製剤よりも高い比活性を有する。特定の実施形態では、単量体ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、ゲルろ過またはサイズ排除クロマトグラフィーを含む方法により作製される。特定の一実施形態では、製剤中のＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、ヒトＡＤＡＭＴＳ１３（ｈＡ１３）もしくは組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３（ｒｈＡ１３）またはその生物学的に活性な誘導体もしくはフラグメントである。特定の実施形態では、単量体ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、本明細書で提供される製剤によって製剤化される。
【００７５】
実施形態では、本発明は、約０．０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１０．０ｍｇ／ｍｌのＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質、約０ｍＭ〜約２００ｍＭの薬学的に許容される塩、糖および／または糖アルコール、非イオン性界面活性剤ならびに緩衝剤を含む、ＡＤＡＭＴＳ１３製剤を提供する。特定の実施形態では、製剤はカルシウムおよび／または亜鉛をさらに含み得る。別の実施形態では、製剤は約６．５〜９．０の間のｐＨに緩衝され得る。特定の実施形態では、Ａ１３製剤は医薬投与に適している。
【００７６】
特定の実施形態では、本発明は、０．０５ｍｇ／ｍｌ〜１０．０ｍｇ／ｍｌのＡＤＡＭＴＳ１３；０ｍＭ〜２００ｍＭの薬学的に許容される塩；０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウム；糖および／または糖アルコール；非イオン性界面活性剤；ならびに約６．５〜約７．５のｐＨを維持するための緩衝剤を含む、ＡＤＡＭＴＳ１３安定化製剤を提供する。好適な実施形態では、薬学的に許容される塩は塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである。
【００７７】
一実施形態では、０．０５ｍｇ／ｍｌ〜１０．０ｍｇ／ｍｌのＡＤＡＭＴＳ１３；０ｍＭ〜２００ｍＭの薬学的に許容される塩；０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウム；糖および／または糖アルコール；非イオン性界面活性剤；ならびに約６．５〜約７．５の間のｐＨを維持するための緩衝剤を含み、１ｍＬ当たり約５０単位〜１ｍＬ当たり約１０００単位の間のＡＤＡＭＴＳ１３活性を含有する安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤が提供される。好適な実施形態では、薬学的に許容される塩は塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである。
【００７８】
別の実施形態では、本発明は、０．０５ｍｇ／ｍｌ〜１０．０ｍｇ／ｍｌのＡＤＡＭＴＳ１３；０ｍＭ〜２００ｍＭの薬学的に許容される塩；１ｍＭ〜１０ｍＭのカルシウム；糖および／または糖アルコール；非イオン性界面活性剤；ならびに約６．５〜約７．５の間のｐＨを維持するための緩衝剤を含む、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤を提供する。好適な実施形態では、製剤は約２ｍＭ〜約４ｍＭの間のカルシウムを含有する。好適な実施形態では、薬学的に許容される塩は塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである。
【００７９】
別の実施形態では、本発明は、０．０５ｍｇ／ｍｌ〜１０．０ｍｇ／ｍｌのＡＤＡＭＴＳ１３；０ｍＭ〜２００ｍＭの薬学的に許容される塩；０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウム；約２％〜約６％の間の糖および／または糖アルコール；非イオン性界面活性剤；ならびに約６．５〜約７．５の間のｐＨを維持するための緩衝剤を含む、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤を提供する。特定の実施形態では、糖および／または糖アルコールは、ショ糖、トレハロース、マンニトールおよびそれらの組合せからなる群より選択される。好適な実施形態では、糖および／または糖アルコールはショ糖とマンニトールの混合物である。特定の実施形態では、ショ糖とマンニトールの混合物は、約１％のショ糖および約３％のマンニトールからなる。特定の実施形態では、製剤は、約１ｍＭ〜約１０ｍＭの間のカルシウム、好ましくは約２ｍＭ〜約４ｍＭの間のカルシウムを含む。好適な実施形態では、薬学的に許容される塩は塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである。
【００８０】
別の実施形態では、本発明は、０．０５ｍｇ／ｍｌ〜１０．０ｍｇ／ｍｌのＡＤＡＭＴＳ１３；０ｍＭ〜２００ｍＭの薬学的に許容される塩；０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウム；糖および／または糖アルコール；約０．０１％〜０．１％の間の非イオン性界面活性剤；ならびに約６．５〜約７．５の間のｐＨを維持するための緩衝剤を含む、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤を提供する。特定の実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、プルロニックＦ−６８、ＢＲＩＪ３５およびそれらの組合せからなる群より選択される。好適な実施形態では、糖および／または糖アルコールはショ糖とマンニトールの混合物である。特定の実施形態では、界面活性剤はポリソルベート８０である。特定の実施形態では、製剤は、約１ｍＭ〜約１０ｍＭの間のカルシウム、好ましくは約２ｍＭ〜約４ｍＭの間のカルシウムを含む。好適な実施形態では、薬学的に許容される塩は塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである。
【００８１】
別の実施形態では、本発明は、０．０５ｍｇ／ｍｌ〜１０．０ｍｇ／ｍｌのＡＤＡＭＴＳ１３；０ｍＭ〜２００ｍＭの薬学的に許容される塩；０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウム；糖および／または糖アルコール；非イオン性界面活性剤；ならびに約６．５〜約７．５の間のｐＨを維持するための緩衝剤を含み、緩衝剤がヒスチジンまたはＨＥＰＥＳである安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤を提供する。特定の実施形態では、緩衝剤は、約５ｍＭ〜約１００ｍＭの間の濃度、好ましくは約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの間の濃度で存在する。別の好適な実施形態では、製剤のｐＨは７．０±０．２である。特定の実施形態では、製剤は約１ｍＭ〜約１０ｍＭの間のカルシウム、好ましくは約２ｍＭ〜約４ｍＭの間のカルシウムを含む。好適な実施形態では、薬学的に許容される塩は塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである。
【００８２】
別の実施形態では、本発明は、０．０５ｍｇ／ｍｌ〜１０．０ｍｇ／ｍｌのＡＤＡＭＴＳ１３；０ｍＭ〜２００ｍＭの薬学的に許容される塩；０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウム；糖および／または糖アルコール；非イオン性界面活性剤；ならびに約６．５〜約７．５の間のｐＨを維持するための緩衝剤を含む、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤を提供する。特定の実施形態では、製剤は約０．５μＭ〜約２０μＭの間の亜鉛をさらに含む。特定の実施形態では、製剤は約１ｍＭ〜約１０ｍＭの間のカルシウム、好ましくは約２ｍＭ〜約４ｍＭの間のカルシウムを含む。好適な実施形態では、薬学的に許容される塩は塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである。
【００８３】
好適な実施形態では、本発明は、０．０５ｍｇ／ｍｌ〜１０．０ｍｇ／ｍｌのＡＤＡＭＴＳ１３；０〜６０ｍＭのＮａＣｌ；２ｍＭ〜４ｍＭのカルシウム；２％〜４％のマンニトール；０．５％〜２％のショ糖；０．０２５〜０．１％のポリソルベート８０；および１０ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ７．０±０．２）を含む、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤を提供する。一実施形態では、製剤は約０．５μＭ〜約２０μＭの間の亜鉛をさらに含む。
【００８４】
別の実施形態では、０．０５ｍｇ／ｍｌ〜１０．０ｍｇ／ｍｌのＡＤＡＭＴＳ１３；約１００ｍＭ未満の薬学的に許容される塩；０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウム；糖および／または糖アルコール；非イオン性界面活性剤；ならびに約６．５〜７．５の間のｐＨを維持するための緩衝剤を含む、安定化低塩ＡＤＡＭＴＳ１３製剤が提供される。好適な実施形態では、薬学的に許容される塩は塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである。好適な実施形態では、低塩ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は凍結乾燥製剤である。
【００８５】
一実施形態では、０．０５ｍｇ／ｍｌ〜１０．０ｍｇ／ｍｌのＡＤＡＭＴＳ１３；約１００ｍＭ未満の薬学的に許容される塩；０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウム；糖および／または糖アルコール；非イオン性界面活性剤；ならびに約６．５〜約７．５の間のｐＨを維持するための緩衝剤を含み、１ｍＬ当たり約５０単位〜１ｍＬ当たり約１０００単位の間のＡＤＡＭＴＳ１３活性を含有する安定化低塩ＡＤＡＭＴＳ１３製剤が提供される。好適な実施形態では、薬学的に許容される塩は塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである。好適な実施形態では、低塩ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は凍結乾燥製剤である。
【００８６】
別の実施形態では、本発明は、０．０５ｍｇ／ｍｌ〜１０．０ｍｇ／ｍｌのＡＤＡＭＴＳ１３；約１００ｍＭ未満の薬学的に許容される塩；１ｍＭ〜１０ｍＭのカルシウム；糖および／または糖アルコール；非イオン性界面活性剤；ならびに約６．５〜約７．５の間のｐＨを維持するための緩衝剤を含む、安定化低塩ＡＤＡＭＴＳ１３製剤を提供する。好適な実施形態では、製剤は約２ｍＭ〜約４ｍＭの間のカルシウムを含む。好適な実施形態では、薬学的に許容される塩は塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである。好適な実施形態では、低塩ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は凍結乾燥製剤である。
【００８７】
別の実施形態では、本発明は、０．０５ｍｇ／ｍｌ〜１０．０ｍｇ／ｍｌのＡＤＡＭＴＳ１３；約１００ｍＭ未満の薬学的に許容される塩；０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウム；約２％〜約６％の間の糖および／または糖アルコール；非イオン性界面活性剤；ならびに約６．５〜約７．５の間のｐＨを維持するための緩衝剤を含む、安定化低塩ＡＤＡＭＴＳ１３製剤を提供する。特定の実施形態では、糖および／または糖アルコールは、ショ糖、トレハロース、マンニトールおよびそれらの組合せからなる群より選択される。好適な実施形態では、糖および／または糖アルコールはショ糖とマンニトールの混合物である。特定の実施形態では、ショ糖とマンニトールの混合物は、約１％のショ糖および約３％のマンニトールからなる。特定の実施形態では、製剤は約１ｍＭ〜約１０ｍＭの間のカルシウム、好ましくは約２ｍＭ〜約４ｍＭの間のカルシウムを含む。好適な実施形態では、薬学的に許容される塩は塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである。好適な実施形態では、低塩ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は凍結乾燥製剤である。
【００８８】
別の実施形態では、本発明は、０．０５ｍｇ／ｍｌ〜１０．０ｍｇ／ｍｌのＡＤＡＭＴＳ１３；約１００ｍＭ未満の薬学的に許容される塩；０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウム；糖および／または糖アルコール；約０．０１％〜０．１％の間の非イオン性界面活性剤；ならびに約６．５〜約７．５の間のｐＨを維持するための緩衝剤を含む、安定化低塩ＡＤＡＭＴＳ１３製剤を提供する。特定の実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、プルロニックＦ−６８、ＢＲＩＪ３５およびそれらの組合せからなる群より選択される。好適な実施形態では、糖および／または糖アルコールはショ糖とマンニトールの混合物である。特定の実施形態では、界面活性剤はポリソルベート８０である。特定の実施形態では、製剤は約１ｍＭ〜約１０ｍＭの間のカルシウム、好ましくは約２ｍＭ〜約４ｍＭの間のカルシウムを含む。好適な実施形態では、薬学的に許容される塩は塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである。好適な実施形態では、低塩ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は凍結乾燥製剤である。
【００８９】
別の実施形態では、本発明は、０．０５ｍｇ／ｍｌ〜１０．０ｍｇ／ｍｌのＡＤＡＭＴＳ１３；約１００ｍＭ未満の薬学的に許容される塩；０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウム；糖および／または糖アルコール；非イオン性界面活性剤；ならびに約６．５〜約７．５の間のｐＨを維持するための緩衝剤を含み、緩衝剤がヒスチジンまたはＨＥＰＥＳである安定化低塩ＡＤＡＭＴＳ１３製剤を提供する。特定の実施形態では、緩衝剤は約５ｍＭ〜約１００ｍＭの間の濃度、好ましくは約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの間の濃度で存在する。別の好適な実施形態では、製剤のｐＨは７．０±０．２である。特定の実施形態では、製剤は約１ｍＭ〜約１０ｍＭの間のカルシウム、好ましくは約２ｍＭ〜約４ｍＭの間のカルシウムを含む。好適な実施形態では、薬学的に許容される塩は塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである。好適な実施形態では、低塩ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は凍結乾燥製剤である。
【００９０】
別の実施形態では、本発明は、０．０５ｍｇ／ｍｌ〜１０．０ｍｇ／ｍｌのＡＤＡＭＴＳ１３；約１００ｍＭ未満の薬学的に許容される塩；０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウム；糖および／または糖アルコール；非イオン性界面活性剤；ならびに約６．５〜約７．５の間のｐＨを維持するための緩衝剤を含む、安定化低塩ＡＤＡＭＴＳ１３製剤を提供する。特定の実施形態では、製剤は約０．５μＭ〜約２０μＭの間の亜鉛をさらに含む。特定の実施形態では、製剤は約１ｍＭ〜約１０ｍＭの間のカルシウム、好ましくは約２ｍＭ〜約４ｍＭの間のカルシウムを含む。好適な実施形態では、薬学的に許容される塩は塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである。好適な実施形態では、低塩ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は凍結乾燥製剤である。
【００９１】
好適な実施形態では、本発明は、０．０５ｍｇ／ｍｌ〜１０．０ｍｇ／ｍｌのＡＤＡＭＴＳ１３；約１００ｍＭ未満のＮａＣｌ；２ｍＭ〜４ｍＭのカルシウム；２％〜４％のマンニトール；０．５％〜２％のショ糖；０．０２５〜０．１％のポリソルベート８０；および１０ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ７．０±０．２）を含む、安定化低塩ＡＤＡＭＴＳ１３製剤を提供する。一実施形態では、製剤は約０．５μＭ〜約２０μＭの間の亜鉛をさらに含む。好適な実施形態では、低塩ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は凍結乾燥製剤である。
【００９２】
一実施形態では、本発明は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性（すなわち、ＦＲＥＴＳ−ｖＷＦ７３活性）；（ｂ）０ｍＭ〜２００ｍＭの薬学的に許容される塩；（ｃ）０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウム；（ｄ）糖および／または糖アルコール；（ｅ）非イオン性界面活性剤；ならびに（ｆ）ｐＨを６．０〜８．０の間に維持するための緩衝剤を含む、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ１３）製剤を提供する。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも２００単位のＡ１３活性を含む。別の実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも４００単位のＡ１３活性を含む。好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも６００単位のＡ１３活性を含む。より好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも８００単位のＡ１３活性を含む。さらに別の好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１０００単位のＡ１３活性を含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり約１００単位〜約２０００単位の間のＡＤＡＭＴＳ１３活性を含む。
【００９３】
安定化Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約１．０ｍＭ〜約１０．０ｍＭの間のカルシウムを含む。好適な実施形態では、製剤は約２．０〜約４．０ｍＭの間のカルシウムを含有する。
【００９４】
安定化Ａ１３製剤の別の実施形態では、製剤は約２％〜約６％の間の糖および／または糖アルコールを含む。好適な実施形態では、製剤は約３％〜約５％の間の糖および／または糖アルコールを含む。特定の実施形態では、製剤は約４％の糖および／または糖アルコールを含む。一実施形態では、糖および／または糖アルコールは、ショ糖、トレハロース、マンニトールおよびそれらの組合せからなる群より選択される。好適な実施形態では、糖および／または糖アルコールはショ糖とマンニトールの混合物である。
【００９５】
安定化Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．０１％〜約０．１％の間の非イオン性界面活性剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約０．０５％の非イオン性界面活性剤を含む。一実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、プルロニックＦ−６８およびＢＲＩＪ３５からなる群より選択される。好適な実施形態では、界面活性剤はポリソルベート８０である。
【００９６】
安定化Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約５ｍＭ〜約１００ｍＭの間の緩衝剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの間の緩衝剤を含む。別の実施形態では、緩衝剤はヒスチジンまたはＨＥＰＥＳである。好適な実施形態では、緩衝剤はヒスチジンである。一実施形態では、製剤のｐＨは約６．５〜７．５の間である。好適な実施形態では、製剤のｐＨは７．０±０．２である。
【００９７】
安定化Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．５μＭ〜２０μＭの間の亜鉛をさらに含む。
【００９８】
特定の実施形態では、本発明は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性；（ｂ）０〜２００ｍＭのＮａＣｌ；（ｃ）２ｍＭ〜４ｍＭのカルシウム；（ｄ）２％〜４％のマンニトール；（ｅ）０．５％〜２％のショ糖；（ｆ）０．０２５〜０．１％のポリソルベート８０；および（ｇ）１０ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ７．０±０．２）を含む、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ１３）製剤を提供する。
【００９９】
一実施形態では、本発明は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性（すなわち、ＦＲＥＴＳ−ｖＷＦ７３活性）；（ｂ）０ｍＭ〜１００ｍＭの薬学的に許容される塩；（ｃ）０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウム；（ｄ）糖および／または糖アルコール；（ｅ）非イオン性界面活性剤；ならびに（ｆ）ｐＨを６．０〜８．０の間に維持するための緩衝剤を含む、安定化低塩ＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ１３）製剤を提供する。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも２００単位のＡ１３活性を含む。別の実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも４００単位のＡ１３活性を含む。好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも６００単位のＡ１３活性を含む。より好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも８００単位のＡ１３活性を含む。さらに別の好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１０００単位のＡ１３活性を含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり約１００単位〜約２０００単位の間のＡＤＡＭＴＳ１３活性を含む。
【０１００】
安定化低塩Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約１．０ｍＭ〜約１０．０ｍＭの間のカルシウムを含む。好適な実施形態では、製剤は約２．０〜約４．０ｍＭの間のカルシウムを含有する。
【０１０１】
安定化低塩Ａ１３製剤の別の実施形態では、製剤は約２％〜約６％の間の糖および／または糖アルコールを含む。好適な実施形態では、製剤は約３％〜約５％の間の糖および／または糖アルコールを含む。特定の実施形態では、製剤は約４％の糖および／または糖アルコールを含む。一実施形態では、糖および／または糖アルコールは、ショ糖、トレハロース、マンニトールおよびそれらの組合せからなる群より選択される。好適な実施形態では、糖および／または糖アルコールはショ糖とマンニトールの混合物である。
【０１０２】
安定化低塩Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．０１％〜約０．１％の間の非イオン性界面活性剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約０．０５％の非イオン性界面活性剤を含む。一実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、プルロニックＦ−６８およびＢＲＩＪ３５からなる群より選択される。好適な実施形態では、界面活性剤はポリソルベート８０である。
【０１０３】
安定化低塩Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約５ｍＭ〜約１００ｍＭの間の緩衝剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの間の緩衝剤を含む。別の実施形態では、緩衝剤はヒスチジンまたはＨＥＰＥＳである。好適な実施形態では、緩衝剤はヒスチジンである。一実施形態では、製剤のｐＨは約６．５〜７．５の間である。好適な実施形態では、製剤のｐＨは７．０±０．２である。
【０１０４】
安定化低塩Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．５μＭ〜２０μＭの間の亜鉛をさらに含む。
【０１０５】
特定の実施形態では、本発明は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性；（ｂ）０〜６０ｍＭのＮａＣｌ；（ｃ）２ｍＭ〜４ｍＭのカルシウム；（ｄ）２％〜４％のマンニトール；（ｅ）０．５％〜２％のショ糖；（ｆ）０．０２５〜０．１％のポリソルベート８０；および（ｇ）１０ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ７．０±０．２）を含む、安定化低塩ＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ１３）製剤を提供する。
【０１０６】
関連する実施形態では、本発明はＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ１３）の安定化凍結乾燥製剤を提供し、製剤は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性（すなわち、ＦＲＥＴＳ−ｖＷＦ７３活性）；（ｂ）０ｍＭ〜２００ｍＭの薬学的に許容される塩；（ｃ）０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウム；（ｄ）糖および／または糖アルコール；（ｅ）非イオン性界面活性剤；ならびに（ｆ）ｐＨを６．０〜８．０の間に維持するための緩衝剤を含む液体製剤から凍結乾燥される。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも２００単位のＡ１３活性を含む。別の実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも４００単位のＡ１３活性を含む。好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも６００単位のＡ１３活性を含む。より好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも８００単位のＡ１３活性を含む。さらに別の好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１０００単位のＡ１３活性を含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり約１００単位〜約２０００単位の間のＡＤＡＭＴＳ１３活性を含む。
【０１０７】
安定化凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約１．０ｍＭ〜約１０．０ｍＭの間のカルシウムを含む。好適な実施形態では、製剤は約２．０〜約４．０ｍＭの間のカルシウムを含有する。
【０１０８】
安定化凍結乾燥Ａ１３製剤の別の実施形態では、製剤は約２％〜約６％の間の糖および／または糖アルコールを含む。好適な実施形態では、製剤は約３％〜約５％の間の糖および／または糖アルコールを含む。特定の実施形態では、製剤は約４％の糖および／または糖アルコールを含む。一実施形態では、糖および／または糖アルコールは、ショ糖、トレハロース、マンニトールおよびそれらの組合せからなる群より選択される。好適な実施形態では、糖および／または糖アルコールはショ糖とマンニトールの混合物である。
【０１０９】
安定化凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．０１％〜約０．１％の間の非イオン性界面活性剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約０．０５％の非イオン性界面活性剤を含む。一実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、プルロニックＦ−６８およびＢＲＩＪ３５からなる群より選択される。好適な実施形態では、界面活性剤はポリソルベート８０である。
【０１１０】
安定化凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約５ｍＭ〜約１００ｍＭの間の緩衝剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの間の緩衝剤を含む。別の実施形態では、緩衝剤はヒスチジンまたはＨＥＰＥＳである。好適な実施形態では、緩衝剤はヒスチジンである。一実施形態では、製剤のｐＨは約６．５〜７．５の間である。好適な実施形態では、製剤のｐＨは７．０±０．２である。
【０１１１】
安定化凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．５μＭ〜２０μＭの間の亜鉛をさらに含む。
【０１１２】
特定の実施形態では、本発明はＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ１３）の安定化凍結乾燥製剤提供し、製剤は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性；（ｂ）０〜２００ｍＭのＮａＣｌ；（ｃ）２ｍＭ〜４ｍＭのカルシウム；（ｄ）２％〜４％のマンニトール；（ｅ）０．５％〜２％のショ糖；（ｆ）０．０２５〜０．１％のポリソルベート８０；および（ｇ）１０ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン（７．０±０．２）を含む液体製剤から凍結乾燥される。
【０１１３】
関連する実施形態では、本発明はＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ１３）の安定化低塩凍結乾燥製剤を提供し、製剤は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性（すなわち、ＦＲＥＴＳ−ｖＷＦ７３活性）；（ｂ）０ｍＭ〜１００ｍＭの薬学的に許容される塩；（ｃ）０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウム；（ｄ）糖および／または糖アルコール；（ｅ）非イオン性界面活性剤；ならびに（ｆ）ｐＨを６．０〜８．０の間に維持するための緩衝剤を含む液体製剤から凍結乾燥される。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも２００単位のＡ１３活性を含む。別の実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも４００単位のＡ１３活性を含む。好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも６００単位のＡ１３活性を含む。より好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも８００単位のＡ１３活性を含む。さらに別の好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１０００単位のＡ１３活性を含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり約１００単位〜約２０００単位の間のＡＤＡＭＴＳ１３活性を含む。
【０１１４】
安定化低塩凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約１．０ｍＭ〜約１０．０ｍＭの間のカルシウムを含む。好適な実施形態では、製剤は約２．０〜約４．０ｍＭの間のカルシウムを含有する。
【０１１５】
安定化低塩凍結乾燥Ａ１３製剤の別の実施形態では、製剤は約２％〜約６％の間の糖および／または糖アルコールを含む。好適な実施形態では、製剤は約３％〜約５％の間の糖および／または糖アルコールを含む。特定の実施形態では、製剤は約４％の糖および／または糖アルコールを含む。一実施形態では、糖および／または糖アルコールは、ショ糖、トレハロース、マンニトールおよびそれらの組合せからなる群より選択される。好適な実施形態では、糖および／または糖アルコールはショ糖とマンニトールの混合物である。
【０１１６】
安定化低塩凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．０１％〜約０．１％の間の非イオン性界面活性剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約０．０５％の非イオン性界面活性剤を含む。一実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、プルロニックＦ−６８およびＢＲＩＪ３５からなる群より選択される。好適な実施形態では、界面活性剤はポリソルベート８０である。
【０１１７】
安定化低塩凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約５ｍＭ〜約１００ｍＭの間の緩衝剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの間の緩衝剤を含む。別の実施形態では、緩衝剤はヒスチジンまたはＨＥＰＥＳである。好適な実施形態では、緩衝剤はヒスチジンである。一実施形態では、製剤のｐＨは約６．５〜７．５の間である。好適な実施形態では、製剤のｐＨは７．０±０．２である。
【０１１８】
安定化低塩凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．５μＭ〜２０μＭの間の亜鉛をさらに含む。
【０１１９】
特定の実施形態では、本発明はＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ１３）の安定化低塩凍結乾燥製剤を提供し、製剤は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性；（ｂ）０〜６０ｍＭのＮａＣｌ；（ｃ）２ｍＭ〜４ｍＭのカルシウム；（ｄ）２％〜４％のマンニトール；（ｅ）０．５％〜２％のショ糖；（ｆ）０．０２５〜０．１％のポリソルベート８０；および（ｇ）１０ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン（７．０±０．２）を含む液体製剤から凍結乾燥される。
【０１２０】
ＩＶ．ＡＤＡＭＴＳ１３製剤の安定性
特定の実施形態では、本明細書で提供されるＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、特定の温度、例えば、約−８０℃、−２０℃、４℃、１８℃、室温、２５℃、３０℃、３５℃、３７℃、４０℃以上で保管された場合に長期間安定であり得る。いくつかの実施形態では、長期間とは少なくとも約１週間のことである。別の実施形態では、長期間は、少なくとも約２週間、または少なくとも約３週間、または少なくとも約１ヶ月、または少なくとも約２ヶ月、または少なくとも約３、４、５、６、７、８，９，１０、１１、１２、１４、１６もしくは１８ヶ月を含み得る。さらに別の実施形態では、本発明の製剤は、少なくとも約２、３、４、５年間以上安定であり得る。
【０１２１】
本発明の特定の実施形態では、安定性は、製剤中のＡ１３またはｒＡ１３タンパク質の１つ以上の生物物理的および／または酵素的特性により測定し得る。安定性の評価に使用し得る特性の非限定的な例としては、タンパク質の酵素活性、比活性、単分散度または多分散度、タンパク質の二量体化、オリゴマー化または凝集の程度、タンパク質のアンフォールディングの程度が挙げられる。
【０１２２】
ゲルろ過、動的または静的光散乱、分析用超遠心法、ｒｐ−ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、フーリエ変換赤外分光法、熱量測定、示差走査熱量測定、ＮＭＲ分光測定法、質量分析法、小角Ｘ線散乱、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などを非限定的に含めた、ＡＤＡＭＴＳ１３製剤の安定性を評価するために使用し得るその他の安定性測定は、当業者に容易にわかるであろう。
【０１２３】
一実施形態では、本発明は、長期間の保管後に総ＡＤＡＭＴＳ１３活性の少なくとも約５０％を保持するＡ１３またはｒＡ１３製剤を提供する。他の実施形態では、長期間の保管後に総ＡＤＡＭＴＳ１３活性の少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％を保持する製剤が提供される。
【０１２４】
別の実施形態では、長期間の保管後にＡＤＡＭＴＳ１３比活性の少なくとも約５０％を保持する製剤が提供される。他の実施形態では、長期間の保管後にＡＤＡＭＴＳ１３比活性の少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％を保持する製剤が提供される。
【０１２５】
別の実施形態では、本発明の製剤は、長期間の保管後に、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質１ｍｇ当たり少なくとも約６００ＵのＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性の比活性を有する。他の実施形態では、本明細書で提供される製剤は、長期間の保管後に少なくとも約７００Ｕ／ｍｇのＡ１３、または少なくとも約８００Ｕ／ｍｇ、９００Ｕ／ｍｇ、１０００Ｕ／ｍｇ、１１００Ｕ／ｍｇ、１２００Ｕ／ｍｇ、１３００Ｕ／ｍｇ、１４００Ｕ／ｍｇ、１５００Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有する。
【０１２６】
一実施形態では、本明細書で提供されるＡ１３製剤は、長期間の保管後に、動的光散乱分析により測定される約５０％未満の多分散性を有する。他の実施形態では、Ａ１３製剤は、長期間の保管後に、動的光散乱分析により測定される約４５％未満の多分散性、または約４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％未満の多分散性を有する。
【０１２７】
本発明の別の実施形態では、本明細書で提供されるＡ１３製剤は、長期間の保管後に、少なくとも約５０％のＡ１３単量体からなるＡ１３タンパク質集団を有する。別の実施形態では、製剤は少なくとも約６０％のＡ１３単量体、または少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のＡ１３単量体を有し得る。
【０１２８】
Ｖ．ＡＤＡＭＴＳ１３の発現および精製
特定の実施形態では、本明細書で提供される製剤で使用するＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を、例えば、すべてがあらゆる目的においてその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，９２６，８９４号、米国特許出願公開第２００５／０２６６５２８号、同第２００７／００１５７０３号、米国特許出願第１２／４３７，３８４号、同第１２／８４７，９９９号および国際公開第２００２／４２４４１号で既に開示されている方法に従って、発現させ、産生させまたは精製し得る。
【０１２９】
Ａ．宿主細胞およびベクター
組換えＡＤＡＭＴＳタンパク質は、任意の適当な原核または真核宿主系における発現により産生され得る。真核細胞の例としては、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＳＫ−ＨｅｐおよびＨｅｐＧ２など；昆虫細胞、例えば、ＳＦ９細胞、ＳＦ２１細胞、Ｓ２細胞およびＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞；ならびに酵母細胞、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）細胞が非限定的に挙げられる。一実施形態では、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、哺乳動物細胞などにおいて発現され得る。例えば、ヒト細胞系、ハムスター細胞系またはマウス細胞系において。特定の一実施形態では、細胞系はＣＨＯ、ＢＨＫまたはＨＥＫ細胞系である。好適な実施形態では、細胞系はＣＨＯ細胞系である。
【０１３０】
一実施形態では、細胞は、好ましくは製造工程（すなわち、少なくとも１リットル）において培養され、ＡＤＡＭＴＳ１３のような所望のＡＤＡＭＴＳタンパク質を産生することができる、任意の哺乳動物細胞であり得る。例としては、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系；ヒト胎児腎臓系（懸濁培養中での増殖のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；ＤＵＫＸ−Ｂ１１サブクローンのようなチャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ＵｒｉａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ，２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒトヘパトーマ系（ＨｅｐＧ２）が挙げられる。好ましくは、細胞系はげっ歯類細胞系、特にＣＨＯまたはＢＨＫのようなハムスター細胞系である。
【０１３１】
多種多様なベクターをＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）の発現に使用することができ、また真核および原核発現ベクターから選択することができる。特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）の発現での使用にプラスミドベクターが考えられる。一般に、宿主細胞と適合性のある種に由来する、レプリコンおよび制御配列を含むプラスミドベクターが上記宿主に関連して使用される。ベクターは複製部位のみならず、形質転換細胞において表現型選択を行うことができる標識配列も運ぶことができる。プラスミドは、１つ以上の制御配列、例えばプロモーターと作動可能に連結された、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１３２】
組換えＡＤＡＭＴＳタンパク質を発現する安定なＣＨＯ細胞クローンの好適な調製法は、以下の通りである。基本的には、米国特許第５，２５０，４２１号（Ｋａｕｆｍａｎら，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．）に記載されているように、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞系であるＤＵＫＸ−Ｂ１１にＤＨＦＲ発現ベクターをトランスフェクトして、関連する組換えタンパク質を発現させる。無ヒポキサンチン／チミジン（ＨＴ）培地での増殖および組換えＡＤＡＭＴＳタンパク質の発現をコードする関連領域の増幅により選択を行い、濃度漸増メトトレキサート中での細胞の増殖によりＤＨＦＲ遺伝子を得る。必要に応じて、基本的には、米国特許第６，１００，０６１号（Ｒｅｉｔｅｒら，ｌｍｍｕｎｏ  Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ）に記載されているように、ＣＨＯ細胞系を無血清および／または無タンパク質培地での増殖に順応させてもよい。
【０１３３】
別の好適な実施形態では、ヒグロマイシン選択性マーカーを含む構築物をトランスフェクトして、抗生物質耐性により形質転換細胞を選択することにより、安定なＨＥＫ２９３細胞を調製する。
【０１３４】
ある種のウイルスは、細胞に感染するかまたは受容体介在性エンドサイトーシスを介して細胞に侵入し、ウイルス遺伝子を宿主細胞ゲノム内に組み込み、安定かつ効率的に発現させるその能力により、外来核酸の細胞（例えば、哺乳動物細胞）内へのトランスファーの魅力的な候補とされている。したがって特定の実施形態では、ウイルスベクターを用いて、発現用の宿主細胞内にＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードするヌクレオチド配列を導入する。ウイルスベクターは、１つ以上の制御配列、例えばプロモーターと作動可能に連結した、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードするヌクレオチド配列を含む。あるいは、ウイルスベクターは、ＡＤＡＭＴＳタンパク質の発現を駆動するために、制御配列を含まず、代わりに宿主細胞内の制御配列に依存し得る。核酸を送達するために使用し得るウイルスベクターの非限定的な例としては、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクターおよびレトロウイルスベクターが挙げられる。
【０１３５】
一実施形態では、アデノウイルス発現ベクターは、構築物のパッケージングを補助し、最終的にはそこでクローンされたＡＤＡＭＴＳ構築物を発現するのに十分なアデノウイルス配列を含む構築物を含む。アデノウイルスベクターでは７ｋｂまでの外来配列の導入が可能である（Ｇｒｕｎｈａｕｓら，Ｓｅｍｉｎａｒ  ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００（２）：５３５−５４６，１９９２）。
【０１３６】
別の実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を用いて、発現用の宿主細胞内にＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードするヌクレオチド配列を導入し得る。ＡＡＶ系は既に記載されており、一般的に当該技術分野で公知である（ＫｅｌｌｅｈｅｒおよびＶｏｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１７（６）：１１１０−７，１９９４；Ｃｏｔｔｅｎら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８９（１３）：６０９４−６０９８，１９９２；Ｃｕｒｉｅｌ，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎ，１３（２−３）：１４１−６４，１９９４；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５８：９７−１２９，１９９２）。ｒＡＡＶベクターの作製および使用に関する詳細は、例えば、それぞれあらゆる目的においてその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，１３９，９４１号および同第４，７９７，３６８号に記載されている。
【０１３７】
一実施形態では、レトロウイルス発現ベクターを用いて、発現用の宿主細胞内にＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードするヌクレオチド配列を導入し得る。これらの系は既に記載されており、一般的に当該技術分野で公知である（Ｍａｎｎら，Ｃｅｌｌ，３３：１５３−１５９，１９８３；ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ，ＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＤｅｎｈａｒｄｔ編，Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，ｐｐ．４９４−５１３，１９８８；Ｔｅｍｉｎ，Ｉｎ：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ（編），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１４９−１８８，１９８６）。特定の実施形態では、レトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターである（例えば、Ｎａｌｄｉｎｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２（５２５９）：２６３−２６７，１９９６；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１５（９）：８７１−８７５，１９９７；Ｂｌｏｍｅｒら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．，７１（９）：６６４１−６６４９，１９９７；米国特許第６，０１３，５１６号および同第５，９９４，１３６号を参照されたい）。
【０１３８】
原核発現用ベクターの非限定的な例としては、ｐＲＳＥＴ、ｐＥＴ、ｐＢＡＤなどのようなプラスミドが挙げられ、原核発現ベクターで使用されるプロモーターとしては、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ａｒａＢＡＤなどが挙げられる。真核発現用ベクターの例としては：（Ｉ）酵母での発現用に、ＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＧＡＬ１、ＡＵＧ１などのようなプロモーターを用いた、ｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、ｐＭＥＴのようなベクター；（ＩＩ）昆虫細胞での発現用に、ＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐＩＥ２、ｇｐ６４、ｐｏｌｈなどのようなプロモーターを用いた、ｐＭＴ、ｐＡｃ５、ｐＩＢ、ｐＭＩＢ、ｐＢＡＣなどのようなベクター；ならびに（ＩＩＩ）哺乳動物細胞での発現用に、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−１、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶおよびβ−アクチンのようなプロモーター用いた、ｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＢＰＶなどのようなベクターおよびワクチニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスなどのようなウイルス系に由来するベクターが挙げられる。
【０１３９】
特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３の細胞培養発現はマイクロキャリアの使用を含み得る。本発明は特に、大規模なＡＤＡＭＴＳタンパク質発現の方法を提供する。いくつかの実施形態では、実施形態の細胞培養を、大容量に特有の培養表面積を得るのに適した条件下において大型のバイオリアクター内で行って、高い細胞密度およびタンパク質発現を達成することができる。このような増殖条件を提供するための１つの手段は、攪拌タンクバイオリアクターでの細胞培養にマイクロキャリアを使用することである。別の実施形態では、このような増殖の必要条件は懸濁細胞培養の使用により満たされる。
【０１４０】
Ｂ．培養法
特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３発現は、バッチ方式または連続方式操作の下で操作される細胞培養システムの使用を含み得る。例えば、バッチ細胞培養を用いる場合、それらは単一バッチ、フェドバッチまたは反復バッチ方式の下で操作され得る。同様に、連続細胞培養は、例えば、灌流、タービドスタットまたはケモスタット法式の下で操作され得る。バッチおよび連続細胞培養は、懸濁または付着いずれかの条件下で行い得る。懸濁条件下で操作する場合、細胞を培地内で自由に懸濁させて混合する。あるいは付着条件下では、細胞を固相、例えば、マイクロキャリア、多孔性マイクロキャリア、ディスクキャリア、磁器カートリッジ、ホローファイバー、フラットシート、ゲルマトリックスなどに結合させる。
【０１４１】
バッチ培養は通常、細胞接種物をタンクまたは発酵槽内で最大密度まで培養し、単一バッチとして採取および処理する大規模な細胞培養である。フェドバッチ培養は通常、新たな栄養素（例えば、増殖制限基質）または添加物（例えば、生成物の前駆体）のいずれかを添加するバッチ培養である。供給液は通常、バイオリアクターの希釈を避けるために非常に濃縮されている。反復バッチ培養では、細胞を培地に播き、所望の細胞密度まで増殖させる。次いで衰退期および細胞死の開始を避けるために、細胞が最大濃度に達する前に培養物を完全増殖培地で希釈する。希釈の量および頻度は非常に様々であり、細胞系の増殖特性および培養プロセスの都合によって決まる。このプロセスを必要な回数だけ反復し、細胞および培地を継代の時点で破棄しない場合、希釈を行う度に培養容積が段階的に増加する。容積の増加には、容器内での希釈が可能な十分な大きさの反応器にするか、または希釈された培養物をいくつかの容器に分割することにより対処し得る。このタイプの培養の理論的根拠は、細胞を指数的に増殖する状態に維持することである。連続継代培養は、培養容積が常に段階的に増加すること、複数回の採取を行い得ること、細胞が増殖し続けること、およびプロセスを所望の長さだけ継続し得ることを特徴とする。特定の実施形態では、バッチ培養物の上清を採取した後にＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を回収し得る。
【０１４２】
連続培養は、新たな培地の流入により栄養素を連続的に供給する懸濁培養であり得、培養容積は通常、使用済みの培地を同時に除去することにより一定に保たれる。ケモスタットおよびタービドスタット法では、抜き取られた培地は細胞を含有する。したがって、細胞培養容器内に残っている細胞を増殖させて、安定状態を維持しなければならない。ケモスタット法では、増殖率は通常、希釈率、すなわち新たな培地を加える速度を制御することにより制御される。培養物中の細胞の増殖率は、希釈率を変化させることにより、例えば、最大下の増殖率で制御される。これに対しタービドスタット法では、ｐＨおよび温度のような所与の操作条件で細胞が達し得る最大増殖率が可能になるように、希釈率を設定する。
【０１４３】
灌流培養では、細胞が、例えば培養物中に細胞が再導入されるろ過または遠心分離法により培養容器内に保持され、抜き取られた培地には含まれない。しかし通常は、ろ過に使用される膜は細胞を１００％保持するわけではないため、一部は培地が抜き取られるときに除去される。大部分の細胞が培養容器内に保持されるため、非常に高い増殖率で灌流培養を操作することはそれほど重要ではないであろう。
【０１４４】
懸濁または付着方式で操作するバッチおよび連続細胞培養に、攪拌槽型反応器システムを使用することができる。一般に攪拌槽型反応器システムは、Ｒｕｓｈｔｏｎ、ハイドロフォイル、傾斜翼またはマリンのような任意のタイプの攪拌器を備えた任意の従来型攪拌槽型反応器と同様に操作することができる。
【０１４５】
Ｃ．培地
ＡＤＡＭＴＳ１３を、外部から添加されたタンパク質を含まない培地中で発現させ得る。「無タンパク質培地」および関連する用語は、増殖中に自然にタンパク質が失われ、培養中の細胞に対して外来であるかまたはその細胞以外の源由来のタンパク質を欠く培地を指す。一実施形態では、外部から添加されたタンパク質を含まず（すなわち、無タンパク質）、かつ亜鉛、カルシウムおよび／またはニコチンアミド（ビタミンＢ３）が補充された培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を発現させ得る。特定の実施形態では、無タンパク質培地はポリアミンを含有する。例えば、少なくとも２ｍｇ／Ｌの濃度で、またはちょうどもしくは約２ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌの間、またはちょうどもしくは約２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌの間で含有する。特定の実施形態では、ポリアミンはプトレシンである。典型的な無タンパク質培地は、その開示があらゆる目的においてその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１７１，８２５号および同第６，９３６，４４１号、国際公開第２００７／０７７２１７号、米国特許出願公開第２００８／０００９０４０号および同第２００７／０２１２７７０号、ならびに米国特許出願第１２／８４７，９９９号において教示されている。
【０１４６】
無動物タンパク質培地および既知組成培地の調製法は、例えば、その開示があらゆる目的においてその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１７１，８２５号および同第６，９３６，４４１号、国際公開第２００７／０７７２１７号、ならびに米国特許出願公開第２００８／０００９０４０号および同第２００７／０２１２７７０号において、当該技術分野で公知である。一実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を発現させるために使用する培地は、無動物タンパク質または無オリゴペプチド培地である。特定の実施形態では、培地は既知組成であり得る。特定の実施形態では、培地は、少なくとも１つのポリアミンを約０．５ｍｇ／Ｌ〜約１０ｍｇ／Ｌの濃度で含有し得る。
【０１４７】
またＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を、外部から添加されたオリゴペプチドを含まない培地中でも発現させ得る。一実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３を、外部から添加されたオリゴペプチドを含まず（すなわち、無ポリペプチド）、かつ亜鉛、カルシウムおよび／またはニコチンアミド（ビタミンＢ３）が補充された培地中で発現させる。特定の実施形態では、無オリゴペプチド培地はポリアミンを含有する。例えば、少なくとも２ｍｇ／Ｌの濃度で、またはちょうどもしくは約２ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌの間、またはちょうどもしくは約２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌの間で含有する。特定の実施形態では、ポリアミンはプトレシンである。典型的な無オリゴペプチド培地は、その開示があらゆる目的においてその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１７１，８２５号および同第６，９３６，４４１号、国際公開第２００７／０７７２１７号、米国特許出願公開第２００８／０００９０４０号および同第２００７／０２１２７７０号、ならびに米国特許出願第１２／８４７，９９９号において教示されている。
【０１４８】
またＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を、血清を含まない培地中でも発現させ得る。一実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３を、外部から添加された血清を含まず（すなわち、無血清）、かつ亜鉛、カルシウムおよび／またはニコチンアミド（ビタミンＢ３）が補充された培地中で発現させる。特定の実施形態では、無血清培地はポリアミンを含有する。例えば、少なくとも２ｍｇ／Ｌの濃度で、またはちょうどもしくは約２ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌの間、またはちょうどもしくは約２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌの間で含有する。特定の実施形態では、ポリアミンはプトレシンである。典型的な無血清培地は、その開示があらゆる目的においてその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１７１，８２５号および同第６，９３６，４４１号、国際公開第２００７／０７７２１７号、米国特許出願公開第２００８／０００９０４０号および同第２００７／０２１２７７０号、ならびに米国特許出願第１２／８４７，９９９号において教示されている。
【０１４９】
またＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を、動物タンパク質を含まない培地中でも発現させ得る。一実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３を、外部から添加された動物タンパク質またはポリペプチドを含まず（すなわち、無動物タンパク質）、かつ亜鉛、カルシウムおよび／またはニコチンアミド（ビタミンＢ３）が補充された培地中で発現させる。特定の実施形態では、無動物タンパク質培地はポリアミンを含有する。例えば、少なくとも２ｍｇ／Ｌの濃度で、またはちょうどもしくは約２ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌの間、またはちょうどもしくは約２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌの間で含有する。特定の実施形態では、ポリアミンはプトレシンである。典型的な無動物タンパク質培地は、その開示があらゆる目的においてその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１７１，８２５号および同第６，９３６，４４１号、国際公開第２００７／０７７２１７号、米国特許出願公開第２００８／０００９０４０号および同第２００７／０２１２７７０号、ならびに米国特許出願第１２／８４７，９９９号において教示されている。
【０１５０】
またＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を、その開示があらゆる目的においてその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１２／８４７，９９９号に記載のような、追加のカルシウム、亜鉛および／またはビタミンＢ３を補充した培地中でも発現させ得る。特定の実施形態では、培地は無動物タンパク質、無オリゴペプチドまたは既知組成培地であり得る。特定の実施形態では、無動物タンパク質または無オリゴペプチド培地を、その開示があらゆる目的においてその内容全体が参照により本明細書に組み込まれ、共にあらゆる目的においてその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１７１，８２５号および同第６，９３６，４４１号、国際公開第２００７／０７７２１７号、ならびに米国特許出願公開第２００８／０００９０４０号および同第２００７／０２１２７７０号において教示されているように調製し、追加のカルシウム、亜鉛および／またはビタミンＢ３を補充する。特定の実施形態では、既知組成培地は、培地中で培養されている細胞内で発現されるＡＤＡＭＴＳタンパク質の比活性を増加させるために追加のカルシウム亜鉛および／またはビタミンＢ３が補充されている、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）と同様のものであり得る。さらに他の実施形態では、培地は無動物成分である。別の実施形態では、培地はタンパク質、例えば、ウシ胎仔血清のような血清由来の動物タンパク質を含有する。別の実施形態では、培養物は外部から添加された組換えタンパク質を有する。別の実施形態では、タンパク質は認定された無病原体動物に由来する。
【０１５１】
Ｄ．ＡＤＡＭＴＳ１３精製
プールされた血漿からの天然ＡＤＡＭＴＳ１３の精製法は当該技術分野で公知である。同様に、組換えＡＤＡＭＴＳ１３の発現および精製のための法も当該技術分野で公知である。例えば、組換え発現および精製は、その開示がすべて、あらゆる目的においてその内容全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる、ＰｌａｉｍａｕｅｒおよびＳｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ，Ｓｅｍｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００４  Ｊａｎ；４１（１）：２４−３３；Ｐｌａｉｍａｕｅｒ  Ｂら，Ｆ．Ｂｌｏｏｄ．２００２  Ｎｏｖ  １５；１００（１０）：３６２６−３２．Ｅｐｕｂ  ２００２  Ｊｕｌ  １２；Ｂｒｕｎｏ  Ｋら，Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．２００５  Ｍａｙ；３（５）：１０６４−７３ならびに米国特許出願第１２／８４７，９９９号により教示されている。
【０１５２】
さらに本開示は、組換えＡＤＡＭＴＳ１３精製のためのさらなる方法を提供する。一実施形態では、組換えＡＤＡＭＴＳ１３を組換えＣＨＯ細胞内で発現させ、得られた馴化培地からＰＯＲＯＳ  ＨＳ陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製する。望ましくない二量体、単量体および／または凝集ＡＤＡＭＴＳ１３を除去するために、次いで組成物をサイズ排除ゲルろ過に供する。ＡＤＡＭＴＳ１３組成物は一般に、少なくとも１つ、好ましくは２つのウイルス除去または不活化段階にも供する。
【０１５３】
特定の実施形態では、ＡＤＡＭＴＳ１３製剤調製のための本明細書で提供される方法は、少なくとも１つのウイルス不活化または除去段階をさらに含む。特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、少なくとも２つまたは少なくとも３つのウイルス不活化または除去段階を含む。本明細書で提供される方法で使用し得るウイルス不活化または除去段階の非限定的な例としては、溶媒界面活性剤処理（その開示があらゆる目的においてその内容全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる、Ｈｏｒｏｗｉｔｚら，Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  １９９４（５  Ｓｕｐｐｌ  ３）：Ｓ２１−Ｓ２８およびＫｒｅｉｌら，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ２００３（４３）：１０２３−１０２８）、ナノろ過（その開示があらゆる目的においてその内容全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる、Ｈａｍａｍｏｔｏら，Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ  １９８９（５６）２３０−２３６およびＹｕａｓａら，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．１９９１（７２（ｐｔ  ８））：２０２１−２０２４）が挙げられる。好適な実施形態では、本発明は、溶媒界面活性剤処理およびナノろ過を含む、ＡＤＡＭＴＳ１３製剤調製のための方法を提供する。
【０１５４】
一実施形態では、ウイルスに関して安全なＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質製剤を得るための方法が提供され、この方法は、（ａ）ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を有する細胞を培地中で培養する段階；（ｂ）ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を含有する一部の培地上清を回収する段階；（ｃ）クロマトグラフィー段階によりＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を濃縮する段階；（ｄ）少なくとも１つのウイルス不活化または除去段階を行う段階；および（ｅ）本明細書で提供される製剤によって濃縮ＡＤＡＭＴＳ１３組成物を製剤化することにより、ウイルスに関して安全なＡＤＡＭＴＳ１３製剤を得る段階を含む。一実施形態では、培地は亜鉛、カルシウムおよび任意にニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する。好適な実施形態では、細胞を培養する段階は、連続培養（例えば、灌流またはケモスタット培養）を含む。別の好適な実施形態では、培養物を３４℃〜３７℃の間の温度に維持する。さらに別の好適な実施形態では、培養物を６．９〜７．２の間のｐＨに維持する。一実施形態では、ウイルス除去段階はナノろ過である。
【０１５５】
一実施形態では、本発明は、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤を製造するための方法を提供し、この方法は：（ａ）約２μＭ〜約１２μＭの濃度の亜鉛および約０．５ｍＭ〜約１．５ｍＭの濃度のカルシウムを含む培地中で培養されている細胞内で、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質またはその生物学的に活性な誘導体を発現させる段階；（ｂ）ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を精製する段階；および（ｃ）本明細書で提供される製剤のいずれか１つによる製剤を調製する段階を含む。
【０１５６】
一実施形態では、本発明は、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤を製造するための方法を提供し、この方法は：（Ｉ）約２μＭ〜約１２μＭの濃度の亜鉛および約０．５ｍＭ〜約１．５ｍＭの濃度のカルシウムを含む培地中で培養されている細胞内で、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質またはその生物学的に活性な誘導体を発現させる段階；（ＩＩ）ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を精製する段階；ならびに（ＩＩＩ）（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性（すなわち、ＦＲＥＴＳ−ｖＷＦ７３活性）；（ｂ）０ｍＭ〜２００ｍＭの薬学的に許容される塩；（ｃ）０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウム；（ｄ）糖および／または糖アルコール；（ｅ）非イオン性界面活性剤；ならびに（ｆ）ｐＨを６．０〜８．０の間に維持するための緩衝剤を含む製剤を調製する段階を含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも２００単位のＡ１３活性を含む。別の実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも４００単位のＡ１３活性を含む。好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも６００単位のＡ１３活性を含む。より好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも８００単位のＡ１３活性を含む。さらに別の好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１０００単位のＡ１３活性を含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり約１００単位〜約２０００単位の間のＡＤＡＭＴＳ１３活性を含む。
【０１５７】
安定化Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約１．０ｍＭ〜約１０．０ｍＭの間のカルシウムを含む。好適な実施形態では、製剤は約２．０〜約４．０ｍＭの間のカルシウムを含有する。
【０１５８】
安定化Ａ１３製剤の別の実施形態では、製剤は約２％〜約６％の間の糖および／または糖アルコールを含む。好適な実施形態では、製剤は約３％〜約５％の間の糖および／または糖アルコールを含む。特定の実施形態では、製剤は約４％の糖および／または糖アルコールを含む。一実施形態では、糖および／または糖アルコールは、ショ糖、トレハロース、マンニトールおよびそれらの組合せからなる群より選択される。好適な実施形態では、糖および／または糖アルコールはショ糖とマンニトールの混合物である。
【０１５９】
安定化Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．０１％〜約０．１％の間の非イオン性界面活性剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約０．０５％の非イオン性界面活性剤を含む。一実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、プルロニックＦ−６８およびＢＲＩＪ３５からなる群より選択される。好適な実施形態では、界面活性剤はポリソルベート８０である。
【０１６０】
安定化Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約５ｍＭ〜約１００ｍＭの間の緩衝剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの間の緩衝剤を含む。別の実施形態では、緩衝剤はヒスチジンまたはＨＥＰＥＳである。好適な実施形態では、緩衝剤はヒスチジンである。一実施形態では、製剤のｐＨは約６．５〜７．５の間である。好適な実施形態では、製剤のｐＨは７．０±０．２である
【０１６１】
安定化Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．５μＭ〜２０μＭの間の亜鉛をさらに含む。
【０１６２】
特定の実施形態では、本発明は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性；（ｂ）０〜２００ｍＭのＮａＣｌ；（ｃ）２ｍＭ〜４ｍＭのカルシウム；（ｄ）２％〜４％のマンニトール；（ｅ）０．５％〜２％のショ糖；（ｆ）０．０２５〜０．１％のポリソルベート８０；および（ｇ）１０ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン（７．０±０．２）を含む安定化ＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ１３）製剤を提供する。
【０１６３】
一実施形態では、本発明は、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤を製造するための方法を提供し、この方法は：（Ｉ）約２μＭ〜約１２μＭの濃度の亜鉛および約０．５ｍＭ〜約１．５ｍＭの濃度のカルシウムを含む培地中で培養されている細胞内で、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質またはその生物学的に活性な誘導体を発現させる段階；（ＩＩ）ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を精製する段階；ならびに（ＩＩＩ）（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性（すなわち、ＦＲＥＴＳ−ｖＷＦ７３活性）；（ｂ）０ｍＭ〜１００ｍＭの薬学的に許容される塩；（ｃ）０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウム；（ｄ）糖および／または糖アルコール；（ｅ）非イオン性界面活性剤；ならびに（ｆ）ｐＨを６．０〜８．０の間に維持するための緩衝剤を含む製剤を調製する段階を含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも２００単位のＡ１３活性を含む。別の実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも４００単位のＡ１３活性を含む。好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも６００単位のＡ１３活性を含む。より好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも８００単位のＡ１３活性を含む。さらに別の好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１０００単位のＡ１３活性を含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり約１００単位〜約２０００単位の間のＡＤＡＭＴＳ１３活性を含む。
【０１６４】
安定化低塩Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約１．０ｍＭ〜約１０．０ｍＭの間のカルシウムを含む。好適な実施形態では、製剤は約２．０〜約４．０ｍＭの間のカルシウムを含有する。
【０１６５】
安定化低塩Ａ１３製剤の別の実施形態では、製剤は約２％〜約６％の間の糖および／または糖アルコールを含む。好適な実施形態では、製剤は約３％〜約５％の間の糖および／または糖アルコールを含む。特定の実施形態では、製剤は約４％の糖および／または糖アルコールを含む。一実施形態では、糖および／または糖アルコールは、ショ糖、トレハロース、マンニトールおよびそれらの組合せからなる群より選択される。好適な実施形態では、糖および／または糖アルコールはショ糖とマンニトールの混合物である。
【０１６６】
安定化低塩Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．０１％〜約０．１％の間の非イオン性界面活性剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約０．０５％の非イオン性界面活性剤を含む。一実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、プルロニックＦ−６８およびＢＲＩＪ３５からなる群より選択される。好適な実施形態では、界面活性剤はポリソルベート８０である。
【０１６７】
安定化低塩Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約５ｍＭ〜約１００ｍＭの間の緩衝剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの間の緩衝剤を含む。別の実施形態では、緩衝剤はヒスチジンまたはＨＥＰＥＳである。好適な実施形態では、緩衝剤はヒスチジンである。一実施形態では、製剤のｐＨは約６．５〜７．５の間である。好適な実施形態では、製剤のｐＨは７．０±０．２である。
【０１６８】
安定化低塩Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．５μＭ〜２０μＭの間の亜鉛をさらに含む。
【０１６９】
特定の実施形態では、本発明は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性；（ｂ）０〜６０ｍＭのＮａＣｌ；（ｃ）２ｍＭ〜４ｍＭのカルシウム；（ｄ）２％〜４％のマンニトール；（ｅ）０．５％〜２％のショ糖；（ｆ）０．０２５〜０．１％のポリソルベート８０；および（ｇ）１０ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン（７．０±０．２）を含む安定化低塩ＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ１３）製剤を提供する。
【０１７０】
一実施形態では、本発明は、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤を製造するための方法を提供し、この方法は：（ｉ）約２μＭ〜約１２μＭの濃度の亜鉛および約０．５ｍＭ〜約１．５ｍＭの濃度のカルシウムを含む培地中で培養されている細胞内で、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質またはその生物学的に活性な誘導体を発現させる段階；（ｉｉ）ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を精製する段階；ならびに（ＩＩＩ）（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性（すなわち、ＦＲＥＴＳ−ｖＷＦ７３活性）；（ｂ）０ｍＭ〜２００ｍＭの薬学的に許容される塩；（ｃ）０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウム；（ｄ）糖および／または糖アルコール；（ｅ）非イオン性界面活性剤；ならびに（ｆ）ｐＨを６．０〜８．０の間に維持するための緩衝剤を含む製剤を調製する段階を含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも２００単位のＡ１３活性を含む。別の実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも４００単位のＡ１３活性を含む。好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも６００単位のＡ１３活性を含む。より好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも８００単位のＡ１３活性を含む。さらに別の好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１０００単位のＡ１３活性を含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり約１００単位〜約２０００単位の間のＡＤＡＭＴＳ１３活性を含む。
【０１７１】
安定化凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約１．０ｍＭ〜約１０．０ｍＭの間のカルシウムを含む。好適な実施形態では、製剤は約２．０〜約４．０ｍＭの間のカルシウムを含有する。
【０１７２】
安定化凍結乾燥Ａ１３製剤の別の実施形態では、製剤は約２％〜約６％の間の糖および／または糖アルコールを含む。好適な実施形態では、製剤は約３％〜約５％の間の糖および／または糖アルコールを含む。特定の実施形態では、製剤は約４％の糖および／または糖アルコールを含む。一実施形態では、糖および／または糖アルコールは、ショ糖、トレハロース、マンニトールおよびそれらの組合せからなる群より選択される。好適な実施形態では、糖および／または糖アルコールはショ糖とマンニトールの混合物である。
【０１７３】
安定化凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．０１％〜約０．１％の間の非イオン性界面活性剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約０．０５％の非イオン性界面活性剤を含む。一実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、プルロニックＦ−６８およびＢＲＩＪ３５からなる群より選択される。好適な実施形態では、界面活性剤はポリソルベート８０である。
【０１７４】
安定化凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約５ｍＭ〜約１００ｍＭの間の緩衝剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの間の緩衝剤を含む。別の実施形態では、緩衝剤はヒスチジンまたはＨＥＰＥＳである。好適な実施形態では、緩衝剤はヒスチジンである。一実施形態では、製剤のｐＨは約６．５〜７．５の間である。好適な実施形態では、製剤のｐＨは７．０±０．２である。
【０１７５】
安定化凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．５μＭ〜２０μＭの間の亜鉛をさらに含む。
【０１７６】
特定の実施形態では、本発明はＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ１３）の安定化凍結乾燥製剤提供し、製剤は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性；（ｂ）０〜２００ｍＭのＮａＣｌ；（ｃ）２ｍＭ〜４ｍＭのカルシウム；（ｄ）２％〜４％のマンニトール；（ｅ）０．５％〜２％のショ糖；（ｆ）０．０２５〜０．１％のポリソルベート８０；および（ｇ）１０ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン（７．０±０．２）を含む液体製剤から凍結乾燥される。
【０１７７】
一実施形態では、本発明は、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤を製造するための方法を提供し、この方法は：（ｉ）約２μＭ〜約１２μＭの濃度の亜鉛および約０．５ｍＭ〜約１．５ｍＭの濃度のカルシウムを含む培地中で培養されている細胞内で、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質またはその生物学的に活性な誘導体を発現させる段階；（ｉｉ）ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を精製する段階；ならびに（ＩＩＩ）（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性（すなわち、ＦＲＥＴＳ−ｖＷＦ７３活性）；（ｂ）０ｍＭ〜１００ｍＭの薬学的に許容される塩；（ｃ）０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウム；（ｄ）糖および／または糖アルコール；（ｅ）非イオン性界面活性剤；ならびに（ｆ）ｐＨを６．０〜８．０の間に維持するための緩衝剤を含む製剤を調製する段階を含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも２００単位のＡ１３活性を含む。別の実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも４００単位のＡ１３活性を含む。好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも６００単位のＡ１３活性を含む。より好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも８００単位のＡ１３活性を含む。さらに別の好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１０００単位のＡ１３活性を含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり約１００単位〜約２０００単位の間のＡＤＡＭＴＳ１３活性を含む。
【０１７８】
安定化低塩凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約１．０ｍＭ〜約１０．０ｍＭの間のカルシウムを含む。好適な実施形態では、製剤は約２．０〜約４．０ｍＭの間のカルシウムを含有する。
【０１７９】
安定化低塩凍結乾燥Ａ１３製剤の別の実施形態では、製剤は約２％〜約６％の間の糖および／または糖アルコールを含む。好適な実施形態では、製剤は約３％〜約５％の間の糖および／または糖アルコールを含む。特定の実施形態では、製剤は約４％の糖および／または糖アルコールを含む。一実施形態では、糖および／または糖アルコールは、ショ糖、トレハロース、マンニトールおよびそれらの組合せからなる群より選択される。好適な実施形態では、糖および／または糖アルコールはショ糖とマンニトールの混合物である。
【０１８０】
安定化低塩凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．０１％〜約０．１％の間の非イオン性界面活性剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約０．０５％の非イオン性界面活性剤を含む。一実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、プルロニックＦ−６８およびＢＲＩＪ３５からなる群より選択される。好適な実施形態では、界面活性剤はポリソルベート８０である。
【０１８１】
安定化低塩凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約５ｍＭ〜約１００ｍＭの間の緩衝剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの間の緩衝剤を含む。別の実施形態では、緩衝剤はヒスチジンまたはＨＥＰＥＳである。好適な実施形態では、緩衝剤はヒスチジンである。一実施形態では、製剤のｐＨは約６．５〜７．５の間である。好適な実施形態では、製剤のｐＨは７．０±０．２である。
【０１８２】
安定化低塩凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．５μＭ〜２０μＭの間の亜鉛をさらに含む。
【０１８３】
特定の実施形態では、本発明はＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ１３）の安定化低塩凍結乾燥製剤を提供し、製剤は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性；（ｂ）０〜６０ｍＭのＮａＣｌ；（ｃ）２ｍＭ〜４ｍＭのカルシウム；（ｄ）２％〜４％のマンニトール；（ｅ）０．５％〜２％のショ糖；（ｆ）０．０２５〜０．１％のポリソルベート８０；および（ｇ）１０ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン（７．０±０．２）を含む液体製剤から凍結乾燥される。
【０１８４】
１．溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）処理
ＡＤＡＭＴＳ１３製剤中に存在し得る様々なウイルス夾雑物を不活化するために、１つ以上のＡＤＡＭＴＳ１３中間体溶液を溶媒界面活性剤（Ｓ／Ｄ）処理に供し得る。溶液の溶媒界面活性剤処理の方法は当該技術分野で公知である（概説には、その開示があらゆる目的においてその内容全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる、Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ＪＰら，Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．２００６；１９（１）：２０５−４２を参照されたい）。一般に、任意の標準的Ｓ／Ｄ処理を、本明細書で提供される方法と組み合わせて使用し得る。例えば、Ｓ／Ｄ処理のための典型的なプロトコールを以下に記載する。
【０１８５】
一実施形態では、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０およびトリ（ｎ−ブチル）リン酸（ＴＮＢＰ）をそれぞれ、ちょうどまたは約１．０％、０．３％および０．３％の最終濃度でＡＤＡＭＴＳ１３中間体溶液に加える。次いで、混合物をちょうどまたは約１８℃〜２５℃の間の温度で少なくとも約１時間攪拌する。
【０１８６】
２．ナノろ過および限外ろ過／ダイアフィルトレーション
本明細書で提供されるＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質製剤のウイルス負荷を減少させるために、製剤または中間体組成物を、適当なナノろ過装置を用いてナノろ過し得る。特定の実施形態では、ナノろ過装置は、ちょうどまたは約１５ｎｍ〜２００ｎｍの間の平均細孔径を有する。この使用に適したナノフィルターの例としては、ＤＶＤ、ＤＶ５０、ＤＶ２０（Ｐａｌｌ）、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ  ＮＦＰ（登録商標）、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ  ＮＦＲ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｐｌａｎｏｖａ（登録商標）１５Ｎ、２０Ｎ、３５Ｎおよび７５Ｎ（Ｐｌａｎｏｖａ）が非限定的に挙げられる。特定の実施形態では、ナノフィルターは、ちょうどもしくは約１５〜７２ｎｍの間、またはちょうどもしくは約１９〜３５ｎｍの間、またはちょうどもしくは約１５ｎｍ、１９ｎｍ、２０ｎｍ、３５ｎｍもしくは７２ｎｍの平均細孔径を有する。好適な実施形態では、Ａｓａｈｉ  ＰＬＡＮＯＶＡ（登録商標）２０ＮもしくはＰＬＡＮＯＶＡ（登録商標）３５Ｎフィルターまたはその同等物のようなナノフィルターは、ちょうどまたは約１９ｎｍ、２０ｎｍまたは３５ｎｍの平均細孔径を有する。
【０１８７】
ナノろ過の後に、ろ液を任意に限外ろ過により濃縮し得る、および／または緩衝液組成をダイアフィルトレーションにより調整し得る。特定の実施形態では、オープンチャネルスクリーンを備えたカセット内で限外ろ過を行い、限外ろ過膜は、ちょうどもしくは約１７５ｋＤａ未満、またはちょうどもしくは約１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０ｋＤａ以下未満の名目分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）を有する。好適な実施形態では、限外ろ過膜は３０ｋＤａ以下のＮＭＷＣＯを有する。別の好適な実施形態では、限外ろ過膜は３０ｋＤａ以下のＮＭＷＣＯを有する。
【０１８８】
３．凍結乾燥および熱処理
さらに別の実施形態では、既にナノろ過のような他のウイルス不活化または除去段階に供した凍結乾燥ＡＤＡＭＴＳ１３製剤のウイルス活性を、凍結乾燥組成物の熱処理によりさらに減少させる。血液因子中のウイルス負荷不活化のための熱処理は当該技術分野で公知である（例えば、Ｐｉｓｚｋｉｅｗｉｃｚら，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ．１９８７  Ｊｕｌ  １５；４７（２）：２３５−４１；Ｐｉｓｚｋｉｅｗｉｃｚら，Ｃｕｒｒ  Ｓｔｕｄ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｔｒａｎｓｆｕｓ．１９８９；（５６）：４４−５４；ＥｐｓｔｅｉｎおよびＦｒｉｃｋｅ，Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ．１９９０  Ｍａｒ；１１４（３）：３３５−４０を参照されたい）。
【０１８９】
ＶＩ．投与および治療法
治療的または予防的処置のために製剤を投与し得る。一般に治療適用には、製剤を、ＡＤＡＭＴＳ１３もしくはＶＷＦ機能不全に関連した疾患または状態を有するか、またはそれを必要とする被検体に「治療有効量」で投与する。こうした使用に有効な製剤および量は、疾患または状態の重症度および患者の健康状態の全般的状態によって決まる。患者により必要とされ許容される用量および頻度に応じて、単回または複数回の製剤投与を行い得る。
【０１９０】
本発明の目的における「患者」または「被検体」は、ヒトおよびその他の動物、特に哺乳動物の両方を包含する。したがって、組成物、製剤および方法はヒト治療および獣医学適用の両方に適用可能である。特定の実施形態では、患者は哺乳動物であり、一実施形態ではヒトである。ＡＤＡＭＴＳ１３またはＶＷＦ機能不全と関連した状態に対するその他の既知の処置および治療法を、本発明により提供される製剤および方法と組み合わせて使用し得る。
【０１９１】
本発明の一態様では、高い比活性を有する安定化ｒＡ１３製剤の作製法が提供される。一実施形態では、この方法は、約２μＭ〜約１２μＭの濃度の亜鉛および約０．５ｍＭ〜約１．５ｍＭの濃度のカルシウムを含む培地中で培養されている細胞内でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質またはその生物学的に活性な誘導体を発現させる段階、Ａ１３タンパク質を生成する段階、ならびに上記製剤を調製する段階を含む。特定の実施形態では、培地に約１ｍｇ／Ｌ〜約２０ｍｇ／Ｌの濃度のビタミンＢ３をさらに補充する。
【０１９２】
別の態様では、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ１３またはＶＷＦ機能不全に関連した疾患または状態を治療または予防する方法を提供する。別の実施形態では、１つ以上の血栓の形成および／または存在に関連した疾患または状態を治療または予防する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、１つ以上の血栓の分解を必要とする被検体においてそれを行う方法を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、梗塞の治療または予防を必要とする被検体においてそれを行う方法を提供する。一般に本発明により提供される方法は、本明細書で提供されるＡＤＡＭＴＳ１３製剤を、それを必要とする被検体に投与することを含む。
【０１９３】
１つ以上の血栓の形成および／または存在に関連した障害の非限定的な例は、遺伝性血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、後天性ＴＴＰ、動脈血栓症、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、脳卒中、敗血症および播種性血管内凝固（ＤＩＣ）である。
【０１９４】
梗塞に関連した障害の非限定的な例としては、心筋梗塞（心臓発作）、肺塞栓症、脳卒中のような脳血管事象、末梢動脈閉塞性疾患（壊疽など）、抗リン脂質症候群、敗血症、巨細胞性動脈炎（ＧＣＡ）、ヘルニアおよび腸捻転が非限定的に挙げられる。
【０１９５】
Ａ．ＡＤＡＭＴＳ１３およびｖＷＦ機能不全の治療および予防
一実施形態では、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ１３またはＶＷＦ機能不全に関連した疾患または状態を治療または予防するための方法を提供し、この方法は、本明細書で提供される製剤のいずれか１つによるＡＤＡＭＴＳ１３製剤を、それを必要とする患者に投与することを含む。
【０１９６】
一実施形態では、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ１３またはＶＷＦ機能不全に関連した疾患または状態を治療または予防するための方法を提供し、この方法は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性（すなわち、ＦＲＥＴＳ−ｖＷＦ７３活性）；（ｂ）０ｍＭ〜２００ｍＭの薬学的に許容される塩；（ｃ）０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウム；（ｄ）糖および／または糖アルコール；（ｅ）非イオン性界面活性剤；ならびに（ｆ）ｐＨを６．０〜８．０の間に維持するための緩衝剤を含むＡＤＡＭＴＳ１３製剤を、それを必要とする被検体に投与することを含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも２００単位のＡ１３活性を含む。別の実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも４００単位のＡ１３活性を含む。好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも６００単位のＡ１３活性を含む。より好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも８００単位のＡ１３活性を含む。さらに別の好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１０００単位のＡ１３活性を含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり約１００単位〜約２０００単位の間のＡＤＡＭＴＳ１３活性を含む。
【０１９７】
安定化Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約１．０ｍＭ〜約１０．０ｍＭの間のカルシウムを含む。好適な実施形態では、製剤は約２．０〜約４．０ｍＭの間のカルシウムを含有する。
【０１９８】
安定化Ａ１３製剤の別の実施形態では、製剤は約２％〜約６％の間の糖および／または糖アルコールを含む。好適な実施形態では、製剤は約３％〜約５％の間の糖および／または糖アルコールを含む。特定の実施形態では、製剤は約４％の糖および／または糖アルコールを含む。一実施形態では、糖および／または糖アルコールは、ショ糖、トレハロース、マンニトールおよびそれらの組合せからなる群より選択される。好適な実施形態では、糖および／または糖アルコールはショ糖とマンニトールの混合物である。
【０１９９】
安定化Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．０１％〜約０．１％の間の非イオン性界面活性剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約０．０５％の非イオン性界面活性剤を含む。一実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、プルロニックＦ−６８およびＢＲＩＪ３５からなる群より選択される。好適な実施形態では、界面活性剤はポリソルベート８０である。
【０２００】
安定化Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約５ｍＭ〜約１００ｍＭの間の緩衝剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの間の緩衝剤を含む。別の実施形態では、緩衝剤はヒスチジンまたはＨＥＰＥＳである。好適な実施形態では、緩衝剤はヒスチジンである。一実施形態では、製剤のｐＨは約６．５〜７．５の間である。好適な実施形態では、製剤のｐＨは７．０±０．２である。
【０２０１】
安定化Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．５μＭ〜２０μＭの間の亜鉛をさらに含む。
【０２０２】
特定の実施形態では、本発明は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性；（ｂ）０〜２００ｍＭのＮａＣｌ；（ｃ）２ｍＭ〜４ｍＭのカルシウム；（ｄ）２％〜４％のマンニトール；（ｅ）０．５％〜２％のショ糖；（ｆ）０．０２５〜０．１％のポリソルベート８０；および（ｇ）１０ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン（７．０±０．２）を含む安定化ＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ１３）製剤を提供する。
【０２０３】
一実施形態では、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ１３またはＶＷＦ機能不全に関連した疾患または状態を治療または予防するための方法を提供し、この方法は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性（すなわち、ＦＲＥＴＳ−ｖＷＦ７３活性）；（ｂ）０ｍＭ〜１００ｍＭの薬学的に許容される塩；（ｃ）０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウム；（ｄ）糖および／または糖アルコール；（ｅ）非イオン性界面活性剤；ならびに（ｆ）ｐＨを６．０〜８．０の間に維持するための緩衝剤を含むＡＤＡＭＴＳ１３製剤を、それを必要とする被検体に投与することを含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも２００単位のＡ１３活性を含む。別の実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも４００単位のＡ１３活性を含む。好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも６００単位のＡ１３活性を含む。より好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも８００単位のＡ１３活性を含む。さらに別の好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１０００単位のＡ１３活性を含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり約１００単位〜約２０００単位の間のＡＤＡＭＴＳ１３活性を含む。
【０２０４】
安定化低塩Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約１．０ｍＭ〜約１０．０ｍＭの間のカルシウムを含む。好適な実施形態では、製剤は約２．０〜約４．０ｍＭの間のカルシウムを含有する。
【０２０５】
安定化低塩Ａ１３製剤の別の実施形態では、製剤は約２％〜約６％の間の糖および／または糖アルコールを含む。好適な実施形態では、製剤は約３％〜約５％の間の糖および／または糖アルコールを含む。特定の実施形態では、製剤は約４％の糖および／または糖アルコールを含む。一実施形態では、糖および／または糖アルコールは、ショ糖、トレハロース、マンニトールおよびそれらの組合せからなる群より選択される。好適な実施形態では、糖および／または糖アルコールはショ糖とマンニトールの混合物である。
【０２０６】
安定化低塩Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．０１％〜約０．１％の間の非イオン性界面活性剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約０．０５％の非イオン性界面活性剤を含む。一実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、プルロニックＦ−６８およびＢＲＩＪ３５からなる群より選択される。好適な実施形態では、界面活性剤はポリソルベート８０である。
【０２０７】
安定化低塩Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約５ｍＭ〜約１００ｍＭの間の緩衝剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの間の緩衝剤を含む。別の実施形態では、緩衝剤はヒスチジンまたはＨＥＰＥＳである。好適な実施形態では、緩衝剤はヒスチジンである。一実施形態では、製剤のｐＨは約６．５〜７．５の間である。好適な実施形態では、製剤のｐＨは７．０±０．２である。
【０２０８】
安定化低塩Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．５μＭ〜２０μＭの間の亜鉛をさらに含む。
【０２０９】
特定の実施形態では、本発明は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性；（ｂ）０〜６０ｍＭのＮａＣｌ；（ｃ）２ｍＭ〜４ｍＭのカルシウム；（ｄ）２％〜４％のマンニトール；（ｅ）０．５％〜２％のショ糖；（ｆ）０．０２５〜０．１％のポリソルベート８０；および（ｇ）１０ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン（７．０±０．２）を含む安定化低塩ＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ１３）製剤を提供する。
【０２１０】
一実施形態では、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ１３またはＶＷＦ機能不全に関連した疾患または状態を治療または予防するための方法を提供し、この方法は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性（すなわち、ＦＲＥＴＳ−ｖＷＦ７３活性）；（ｂ）０ｍＭ〜２００ｍＭの薬学的に許容される塩；（ｃ）０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウム；（ｄ）糖および／または糖アルコール；（ｅ）非イオン性界面活性剤；ならびに（ｆ）ｐＨを６．０〜８．０の間に維持するための緩衝剤を含むＡＤＡＭＴＳ１３製剤を、それを必要とする被検体に投与することを含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも２００単位のＡ１３活性を含む。別の実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも４００単位のＡ１３活性を含む。好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも６００単位のＡ１３活性を含む。より好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも８００単位のＡ１３活性を含む。さらに別の好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１０００単位のＡ１３活性を含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり約１００単位〜約２０００単位の間のＡＤＡＭＴＳ１３活性を含む。
【０２１１】
安定化凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約１．０ｍＭ〜約１０．０ｍＭの間のカルシウムを含む。好適な実施形態では、製剤は約２．０〜約４．０ｍＭの間のカルシウムを含有する。
【０２１２】
安定化凍結乾燥Ａ１３製剤の別の実施形態では、製剤は約２％〜約６％の間の糖および／または糖アルコールを含む。好適な実施形態では、製剤は約３％〜約５％の間の糖および／または糖アルコールを含む。特定の実施形態では、製剤は約４％の糖および／または糖アルコールを含む。一実施形態では、糖および／または糖アルコールは、ショ糖、トレハロース、マンニトールおよびそれらの組合せからなる群より選択される。好適な実施形態では、糖および／または糖アルコールはショ糖とマンニトールの混合物である。
【０２１３】
安定化凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．０１％〜約０．１％の間の非イオン性界面活性剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約０．０５％の非イオン性界面活性剤を含む。一実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、プルロニックＦ−６８およびＢＲＩＪ３５からなる群より選択される。好適な実施形態では、界面活性剤はポリソルベート８０である。
【０２１４】
安定化凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約５ｍＭ〜約１００ｍＭの間の緩衝剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの間の緩衝剤を含む。別の実施形態では、緩衝剤はヒスチジンまたはＨＥＰＥＳである。好適な実施形態では、緩衝剤はヒスチジンである。一実施形態では、製剤のｐＨは約６．５〜７．５の間である。好適な実施形態では、製剤のｐＨは７．０±０．２である。
【０２１５】
安定化凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．５μＭ〜２０μＭの間の亜鉛をさらに含む。
【０２１６】
特定の実施形態では、本発明はＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ１３）の安定化凍結乾燥製剤提供し、製剤は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性；（ｂ）０〜２００ｍＭのＮａＣｌ；（ｃ）２ｍＭ〜４ｍＭのカルシウム；（ｄ）２％〜４％のマンニトール；（ｅ）０．５％〜２％のショ糖；（ｆ）０．０２５〜０．１％のポリソルベート８０；および（ｇ）１０ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン（７．０±０．２）を含む液体製剤から凍結乾燥される。
【０２１７】
一実施形態では、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ１３またはＶＷＦ機能不全に関連した疾患または状態を治療または予防するための方法を提供し、この方法は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性（すなわち、ＦＲＥＴＳ−ｖＷＦ７３活性）；（ｂ）０ｍＭ〜１００ｍＭの薬学的に許容される塩；（ｃ）０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウム；（ｄ）糖および／または糖アルコール；（ｅ）非イオン性界面活性剤；ならびに（ｆ）ｐＨを６．０〜８．０の間に維持するための緩衝剤を含むＡＤＡＭＴＳ１３製剤を、それを必要とする被検体に投与することを含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも２００単位のＡ１３活性を含む。別の実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも４００単位のＡ１３活性を含む。好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも６００単位のＡ１３活性を含む。より好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも８００単位のＡ１３活性を含む。さらに別の好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１０００単位のＡ１３活性を含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり約１００単位〜約２０００単位の間のＡＤＡＭＴＳ１３活性を含む。
【０２１８】
安定化低塩凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約１．０ｍＭ〜約１０．０ｍＭの間のカルシウムを含む。好適な実施形態では、製剤は約２．０〜約４．０ｍＭの間のカルシウムを含有する。
【０２１９】
安定化低塩凍結乾燥Ａ１３製剤の別の実施形態では、製剤は約２％〜約６％の間の糖および／または糖アルコールを含む。好適な実施形態では、製剤は約３％〜約５％の間の糖および／または糖アルコールを含む。特定の実施形態では、製剤は約４％の糖および／または糖アルコールを含む。一実施形態では、糖および／または糖アルコールは、ショ糖、トレハロース、マンニトールおよびそれらの組合せからなる群より選択される。好適な実施形態では、糖および／または糖アルコールはショ糖とマンニトールの混合物である。
【０２２０】
安定化低塩凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．０１％〜約０．１％の間の非イオン性界面活性剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約０．０５％の非イオン性界面活性剤を含む。一実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、プルロニックＦ−６８およびＢＲＩＪ３５からなる群より選択される。好適な実施形態では、界面活性剤はポリソルベート８０である。
【０２２１】
安定化低塩凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約５ｍＭ〜約１００ｍＭの間の緩衝剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの間の緩衝剤を含む。別の実施形態では、緩衝剤はヒスチジンまたはＨＥＰＥＳである。好適な実施形態では、緩衝剤はヒスチジンである。一実施形態では、製剤のｐＨは約６．５〜７．５の間である。好適な実施形態では、製剤のｐＨは７．０±０．２である。
【０２２２】
安定化低塩凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．５μＭ〜２０μＭの間の亜鉛をさらに含む。
【０２２３】
特定の実施形態では、本発明はＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ１３）の安定化低塩凍結乾燥製剤を提供し、製剤は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性；（ｂ）０〜６０ｍＭのＮａＣｌ；（ｃ）２ｍＭ〜４ｍＭのカルシウム；（ｄ）２％〜４％のマンニトール；（ｅ）０．５％〜２％のショ糖；（ｆ）０．０２５〜０．１％のポリソルベート８０；および（ｇ）１０ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン（７．０±０．２）を含む液体製剤から凍結乾燥される。
【０２２４】
Ｂ．血栓性疾患および状態の治療および予防
一実施形態では、本発明は、血栓の形成および／または存在を伴う疾患または状態を治療または予防するための方法を提供し、この方法は、本明細書で提供される製剤のいずれか１つによるＡＤＡＭＴＳ１３製剤を、それを必要とする被検体に投与することを含む。
【０２２５】
一実施形態では、本発明は、血栓の形成および／または存在に関連した疾患または状態を治療または予防するための方法を提供し、この方法は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性（すなわち、ＦＲＥＴＳ−ｖＷＦ７３活性）；（ｂ）０ｍＭ〜２００ｍＭの薬学的に許容される塩；（ｃ）０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウム；（ｄ）糖および／または糖アルコール；（ｅ）非イオン性界面活性剤；ならびに（ｆ）ｐＨを６．０〜８．０の間に維持するための緩衝剤を含むＡＤＡＭＴＳ１３製剤を、それを必要とする被検体に投与することを含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも２００単位のＡ１３活性を含む。別の実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも４００単位のＡ１３活性を含む。好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも６００単位のＡ１３活性を含む。より好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも８００単位のＡ１３活性を含む。さらに別の好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１０００単位のＡ１３活性を含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり約１００単位〜約２０００単位の間のＡＤＡＭＴＳ１３活性を含む。
【０２２６】
安定化Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約１．０ｍＭ〜約１０．０ｍＭの間のカルシウムを含む。好適な実施形態では、製剤は約２．０〜約４．０ｍＭの間のカルシウムを含有する。
【０２２７】
安定化Ａ１３製剤の別の実施形態では、製剤は約２％〜約６％の間の糖および／または糖アルコールを含む。好適な実施形態では、製剤は約３％〜約５％の間の糖および／または糖アルコールを含む。特定の実施形態では、製剤は約４％の糖および／または糖アルコールを含む。一実施形態では、糖および／または糖アルコールは、ショ糖、トレハロース、マンニトールおよびそれらの組合せからなる群より選択される。好適な実施形態では、糖および／または糖アルコールはショ糖とマンニトールの混合物である。
【０２２８】
安定化Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．０１％〜約０．１％の間の非イオン性界面活性剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約０．０５％の非イオン性界面活性剤を含む。一実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、プルロニックＦ−６８およびＢＲＩＪ３５からなる群より選択される。好適な実施形態では、界面活性剤はポリソルベート８０である。
【０２２９】
安定化Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約５ｍＭ〜約１００ｍＭの間の緩衝剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの間の緩衝剤を含む。別の実施形態では、緩衝剤はヒスチジンまたはＨＥＰＥＳである。好適な実施形態では、緩衝剤はヒスチジンである。一実施形態では、製剤のｐＨは約６．５〜７．５の間である。好適な実施形態では、製剤のｐＨは７．０±０．２である。
【０２３０】
安定化Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．５μＭ〜２０μＭの間の亜鉛をさらに含む。
【０２３１】
特定の実施形態では、本発明は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性；（ｂ）０〜２００ｍＭのＮａＣｌ；（ｃ）２ｍＭ〜４ｍＭのカルシウム；（ｄ）２％〜４％のマンニトール；（ｅ）０．５％〜２％のショ糖；（ｆ）０．０２５〜０．１％のポリソルベート８０；および（ｇ）１０ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン（７．０±０．２）を含む、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ１３）製剤を提供する。
【０２３２】
一実施形態では、本発明は、血栓の形成および／または存在に関連した疾患または状態を治療または予防するための方法を提供し、この方法は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性（すなわち、ＦＲＥＴＳ−ｖＷＦ７３活性）；（ｂ）０ｍＭ〜１００ｍＭの薬学的に許容される塩；（ｃ）０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウム；（ｄ）糖および／または糖アルコール；（ｅ）非イオン性界面活性剤；ならびに（ｆ）ｐＨを６．０〜８．０の間に維持するための緩衝剤を含むＡＤＡＭＴＳ１３製剤を、それを必要とする被検体に投与することを含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも２００単位のＡ１３活性を含む。別の実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも４００単位のＡ１３活性を含む。好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも６００単位のＡ１３活性を含む。より好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも８００単位のＡ１３活性を含む。さらに別の好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１０００単位のＡ１３活性を含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり約１００単位〜約２０００単位の間のＡＤＡＭＴＳ１３活性を含む。
【０２３３】
安定化低塩Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約１．０ｍＭ〜約１０．０ｍＭの間のカルシウムを含む。好適な実施形態では、製剤は約２．０〜約４．０ｍＭの間のカルシウムを含有する。
【０２３４】
安定化低塩Ａ１３製剤の別の実施形態では、製剤は約２％〜約６％の間の糖および／または糖アルコールを含む。好適な実施形態では、製剤は約３％〜約５％の間の糖および／または糖アルコールを含む。特定の実施形態では、製剤は約４％の糖および／または糖アルコールを含む。一実施形態では、糖および／または糖アルコールは、ショ糖、トレハロース、マンニトールおよびそれらの組合せからなる群より選択される。好適な実施形態では、糖および／または糖アルコールはショ糖とマンニトールの混合物である。
【０２３５】
安定化低塩Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．０１％〜約０．１％の間の非イオン性界面活性剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約０．０５％の非イオン性界面活性剤を含む。一実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、プルロニックＦ−６８およびＢＲＩＪ３５からなる群より選択される。好適な実施形態では、界面活性剤はポリソルベート８０である。
【０２３６】
安定化低塩Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約５ｍＭ〜約１００ｍＭの間の緩衝剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの間の緩衝剤を含む。別の実施形態では、緩衝剤はヒスチジンまたはＨＥＰＥＳである。好適な実施形態では、緩衝剤はヒスチジンである。一実施形態では、製剤のｐＨは約６．５〜７．５の間である。好適な実施形態では、製剤のｐＨは７．０±０．２である。
【０２３７】
安定化低塩Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．５μＭ〜２０μＭの間の亜鉛をさらに含む。
【０２３８】
特定の実施形態では、本発明は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性；（ｂ）０〜６０ｍＭのＮａＣｌ；（ｃ）２ｍＭ〜４ｍＭのカルシウム；（ｄ）２％〜４％のマンニトール；（ｅ）０．５％〜２％のショ糖；（ｆ）０．０２５〜０．１％のポリソルベート８０；および（ｇ）１０ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン（７．０±０．２）を含む、安定化低塩ＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ１３）製剤を提供する。
【０２３９】
一実施形態では、本発明は、血栓の形成および／または存在に関連した疾患または状態を治療または予防するための方法を提供し、この方法は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性（すなわち、ＦＲＥＴＳ−ｖＷＦ７３活性）；（ｂ）０ｍＭ〜２００ｍＭの薬学的に許容される塩；（ｃ）０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウム；（ｄ）糖および／または糖アルコール；（ｅ）非イオン性界面活性剤；ならびに（ｆ）ｐＨを６．０〜８．０の間に維持するための緩衝剤を含むＡＤＡＭＴＳ１３製剤を、それを必要とする被検体に投与することを含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも２００単位のＡ１３活性を含む。別の実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも４００単位のＡ１３活性を含む。好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも６００単位のＡ１３活性を含む。より好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも８００単位のＡ１３活性を含む。さらに別の好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１０００単位のＡ１３活性を含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり約１００単位〜約２０００単位の間のＡＤＡＭＴＳ１３活性を含む。
【０２４０】
安定化凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約１．０ｍＭ〜約１０．０ｍＭの間のカルシウムを含む。好適な実施形態では、製剤は約２．０〜約４．０ｍＭの間のカルシウムを含有する。
【０２４１】
安定化凍結乾燥Ａ１３製剤の別の実施形態では、製剤は約２％〜約６％の間の糖および／または糖アルコールを含む。好適な実施形態では、製剤は約３％〜約５％の間の糖および／または糖アルコールを含む。特定の実施形態では、製剤は約４％の糖および／または糖アルコールを含む。一実施形態では、糖および／または糖アルコールは、ショ糖、トレハロース、マンニトールおよびそれらの組合せからなる群より選択される。好適な実施形態では、糖および／または糖アルコールはショ糖とマンニトールの混合物である。
【０２４２】
安定化凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．０１％〜約０．１％の間の非イオン性界面活性剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約０．０５％の非イオン性界面活性剤を含む。一実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、プルロニックＦ−６８およびＢＲＩＪ３５からなる群より選択される。好適な実施形態では、界面活性剤はポリソルベート８０である。
【０２４３】
安定化凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約５ｍＭ〜約１００ｍＭの間の緩衝剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの間の緩衝剤を含む。別の実施形態では、緩衝剤はヒスチジンまたはＨＥＰＥＳである。好適な実施形態では、緩衝剤はヒスチジンである。一実施形態では、製剤のｐＨは約６．５〜７．５の間である。好適な実施形態では、製剤のｐＨは７．０±０．２である。
【０２４４】
安定化凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．５μＭ〜２０μＭの間の亜鉛をさらに含む。
【０２４５】
特定の実施形態では、本発明はＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ１３）の安定化凍結乾燥製剤提供し、製剤は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性；（ｂ）０〜２００ｍＭのＮａＣｌ；（ｃ）２ｍＭ〜４ｍＭのカルシウム；（ｄ）２％〜４％のマンニトール；（ｅ）０．５％〜２％のショ糖；（ｆ）０．０２５〜０．１％のポリソルベート８０；および（ｇ）１０ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン（７．０±０．２）を含む液体製剤から凍結乾燥される。
【０２４６】
一実施形態では、本発明は、血栓の形成および／または存在に関連した疾患または状態を治療または予防するための方法を提供し、この方法は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性（すなわち、ＦＲＥＴＳ−ｖＷＦ７３活性）；（ｂ）０ｍＭ〜１００ｍＭの薬学的に許容される塩；（ｃ）０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウム；（ｄ）糖および／または糖アルコール；（ｅ）非イオン性界面活性剤；ならびに（ｆ）ｐＨを６．０〜８．０の間に維持するための緩衝剤を含むＡＤＡＭＴＳ１３製剤を、それを必要とする被検体に投与することを含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも２００単位のＡ１３活性を含む。別の実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも４００単位のＡ１３活性を含む。好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも６００単位のＡ１３活性を含む。より好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも８００単位のＡ１３活性を含む。さらに別の好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１０００単位のＡ１３活性を含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり約１００単位〜約２０００単位の間のＡＤＡＭＴＳ１３活性を含む。
【０２４７】
安定化低塩凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約１．０ｍＭ〜約１０．０ｍＭの間のカルシウムを含む。好適な実施形態では、製剤は約２．０〜約４．０ｍＭの間のカルシウムを含有する。
【０２４８】
安定化低塩凍結乾燥Ａ１３製剤の別の実施形態では、製剤は約２％〜約６％の間の糖および／または糖アルコールを含む。好適な実施形態では、製剤は約３％〜約５％の間の糖および／または糖アルコールを含む。特定の実施形態では、製剤は約４％の糖および／または糖アルコールを含む。一実施形態では、糖および／または糖アルコールは、ショ糖、トレハロース、マンニトールおよびそれらの組合せからなる群より選択される。好適な実施形態では、糖および／または糖アルコールはショ糖とマンニトールの混合物である。
【０２４９】
安定化低塩凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．０１％〜約０．１％の間の非イオン性界面活性剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約０．０５％の非イオン性界面活性剤を含む。一実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、プルロニックＦ−６８およびＢＲＩＪ３５からなる群より選択される。好適な実施形態では、界面活性剤はポリソルベート８０である。
【０２５０】
安定化低塩凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約５ｍＭ〜約１００ｍＭの間の緩衝剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの間の緩衝剤を含む。別の実施形態では、緩衝剤はヒスチジンまたはＨＥＰＥＳである。好適な実施形態では、緩衝剤はヒスチジンである。一実施形態では、製剤のｐＨは約６．５〜７．５の間である。好適な実施形態では、製剤のｐＨは７．０±０．２である。
【０２５１】
安定化低塩凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．５μＭ〜２０μＭの間の亜鉛をさらに含む。
【０２５２】
特定の実施形態では、本発明はＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ１３）の安定化低塩凍結乾燥製剤を提供し、製剤は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性；（ｂ）０〜６０ｍＭのＮａＣｌ；（ｃ）２ｍＭ〜４ｍＭのカルシウム；（ｄ）２％〜４％のマンニトール；（ｅ）０．５％〜２％のショ糖；（ｆ）０．０２５〜０．１％のポリソルベート８０；および（ｇ）１０ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン（７．０±０．２）を含む液体製剤から凍結乾燥される。
【０２５３】
Ｃ．梗塞の治療および予防
一実施形態では、本発明は、梗塞を治療または予防するための方法を提供し、この方法は、本明細書で提供される製剤のいずれか１つによるＡＤＡＭＴＳ１３製剤を、それを必要とする被検体に投与することを含む。
【０２５４】
一実施形態では、本発明は、梗塞を治療または予防するための方法を提供し、この方法は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性（すなわち、ＦＲＥＴＳ−ｖＷＦ７３活性）；（ｂ）０ｍＭ〜２００ｍＭの薬学的に許容される塩；（ｃ）０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウム；（ｄ）糖および／または糖アルコール；（ｅ）非イオン性界面活性剤；ならびに（ｆ）ｐＨを６．０〜８．０の間に維持するための緩衝剤を含むＡＤＡＭＴＳ１３製剤を、それを必要とする被検体に投与することを含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも２００単位のＡ１３活性を含む。別の実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも４００単位のＡ１３活性を含む。好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも６００単位のＡ１３活性を含む。より好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも８００単位のＡ１３活性を含む。さらに別の好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１０００単位のＡ１３活性を含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり約１００単位〜約２０００単位の間のＡＤＡＭＴＳ１３活性を含む。
【０２５５】
安定化Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約１．０ｍＭ〜約１０．０ｍＭの間のカルシウムを含む。好適な実施形態では、製剤は約２．０〜約４．０ｍＭの間のカルシウムを含有する。
【０２５６】
安定化Ａ１３製剤の別の実施形態では、製剤は約２％〜約６％の間の糖および／または糖アルコールを含む。好適な実施形態では、製剤は約３％〜約５％の間の糖および／または糖アルコールを含む。特定の実施形態では、製剤は約４％の糖および／または糖アルコールを含む。一実施形態では、糖および／または糖アルコールは、ショ糖、トレハロース、マンニトールおよびそれらの組合せからなる群より選択される。好適な実施形態では、糖および／または糖アルコールはショ糖とマンニトールの混合物である。
【０２５７】
安定化Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．０１％〜約０．１％の間の非イオン性界面活性剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約０．０５％の非イオン性界面活性剤を含む。一実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、プルロニックＦ−６８およびＢＲＩＪ３５からなる群より選択される。好適な実施形態では、界面活性剤はポリソルベート８０である。
【０２５８】
安定化Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約５ｍＭ〜約１００ｍＭの間の緩衝剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの間の緩衝剤を含む。別の実施形態では、緩衝剤はヒスチジンまたはＨＥＰＥＳである。好適な実施形態では、緩衝剤はヒスチジンである。一実施形態では、製剤のｐＨは約６．５〜７．５の間である。好適な実施形態では、製剤のｐＨは７．０±０．２である。
【０２５９】
安定化Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．５μＭ〜２０μＭの間の亜鉛をさらに含む。
【０２６０】
特定の実施形態では、本発明は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性；（ｂ）０〜２００ｍＭのＮａＣｌ；（ｃ）２ｍＭ〜４ｍＭのカルシウム；（ｄ）２％〜４％のマンニトール；（ｅ）０．５％〜２％のショ糖；（ｆ）０．０２５〜０．１％のポリソルベート８０；および（ｇ）１０ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン（７．０±０．２）を含む、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ１３）製剤を提供する。
【０２６１】
一実施形態では、本発明は、梗塞を治療または予防するための方法を提供し、この方法は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性（すなわち、ＦＲＥＴＳ−ｖＷＦ７３活性）；（ｂ）０ｍＭ〜１００ｍＭの薬学的に許容される塩；（ｃ）０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウム；（ｄ）糖および／または糖アルコール；（ｅ）非イオン性界面活性剤；ならびに（ｆ）ｐＨを６．０〜８．０の間に維持するための緩衝剤を含むＡＤＡＭＴＳ１３製剤を、それを必要とする被検体に投与することを含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも２００単位のＡ１３活性を含む。別の実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも４００単位のＡ１３活性を含む。好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも６００単位のＡ１３活性を含む。より好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも８００単位のＡ１３活性を含む。さらに別の好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１０００単位のＡ１３活性を含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり約１００単位〜約２０００単位の間のＡＤＡＭＴＳ１３活性を含む。
【０２６２】
安定化低塩Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約１．０ｍＭ〜約１０．０ｍＭの間のカルシウムを含む。好適な実施形態では、製剤は約２．０〜約４．０ｍＭの間のカルシウムを含有する。
【０２６３】
安定化低塩Ａ１３製剤の別の実施形態では、製剤は約２％〜約６％の間の糖および／または糖アルコールを含む。好適な実施形態では、製剤は約３％〜約５％の間の糖および／または糖アルコールを含む。特定の実施形態では、製剤は約４％の糖および／または糖アルコールを含む。一実施形態では、糖および／または糖アルコールは、ショ糖、トレハロース、マンニトールおよびそれらの組合せからなる群より選択される。好適な実施形態では、糖および／または糖アルコールはショ糖とマンニトールの混合物である。
【０２６４】
安定化低塩Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．０１％〜約０．１％の間の非イオン性界面活性剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約０．０５％の非イオン性界面活性剤を含む。一実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、プルロニックＦ−６８およびＢＲＩＪ３５からなる群より選択される。好適な実施形態では、界面活性剤はポリソルベート８０である。
【０２６５】
安定化低塩Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約５ｍＭ〜約１００ｍＭの間の緩衝剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの間の緩衝剤を含む。別の実施形態では、緩衝剤はヒスチジンまたはＨＥＰＥＳである。好適な実施形態では、緩衝剤はヒスチジンである。一実施形態では、製剤のｐＨは約６．５〜７．５の間である。好適な実施形態では、製剤のｐＨは７．０±０．２である。
【０２６６】
安定化低塩Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．５μＭ〜２０μＭの間の亜鉛をさらに含む。
【０２６７】
特定の実施形態では、本発明は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性；（ｂ）０〜６０ｍＭのＮａＣｌ；（ｃ）２ｍＭ〜４ｍＭのカルシウム；（ｄ）２％〜４％のマンニトール；（ｅ）０．５％〜２％のショ糖；（ｆ）０．０２５〜０．１％のポリソルベート８０；および（ｇ）１０ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン（７．０±０．２）を含む、安定化低塩ＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ１３）製剤を提供する。
【０２６８】
一実施形態では、本発明は、梗塞を治療または予防するための方法を提供し、この方法は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性（すなわち、ＦＲＥＴＳ−ｖＷＦ７３活性）；（ｂ）０ｍＭ〜２００ｍＭの薬学的に許容される塩；（ｃ）０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウム；（ｄ）糖および／または糖アルコール；（ｅ）非イオン性界面活性剤；ならびに（ｆ）ｐＨを６．０〜８．０の間に維持するための緩衝剤を含むＡＤＡＭＴＳ１３製剤を、それを必要とする被検体に投与することを含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも２００単位のＡ１３活性を含む。別の実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも４００単位のＡ１３活性を含む。好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも６００単位のＡ１３活性を含む。より好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも８００単位のＡ１３活性を含む。さらに別の好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１０００単位のＡ１３活性を含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり約１００単位〜約２０００単位の間のＡＤＡＭＴＳ１３活性を含む。
【０２６９】
安定化凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約１．０ｍＭ〜約１０．０ｍＭの間のカルシウムを含む。好適な実施形態では、製剤は約２．０〜約４．０ｍＭの間のカルシウムを含有する。
【０２７０】
安定化凍結乾燥Ａ１３製剤の別の実施形態では、製剤は約２％〜約６％の間の糖および／または糖アルコールを含む。好適な実施形態では、製剤は約３％〜約５％の間の糖および／または糖アルコールを含む。特定の実施形態では、製剤は約４％の糖および／または糖アルコールを含む。一実施形態では、糖および／または糖アルコールは、ショ糖、トレハロース、マンニトールおよびそれらの組合せからなる群より選択される。好適な実施形態では、糖および／または糖アルコールはショ糖とマンニトールの混合物である。
【０２７１】
安定化凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．０１％〜約０．１％の間の非イオン性界面活性剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約０．０５％の非イオン性界面活性剤を含む。一実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、プルロニックＦ−６８およびＢＲＩＪ３５からなる群より選択される。好適な実施形態では、界面活性剤はポリソルベート８０である。
【０２７２】
安定化凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約５ｍＭ〜約１００ｍＭの間の緩衝剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの間の緩衝剤を含む。別の実施形態では、緩衝剤はヒスチジンまたはＨＥＰＥＳである。好適な実施形態では、緩衝剤はヒスチジンである。一実施形態では、製剤のｐＨは約６．５〜７．５の間である。好適な実施形態では、製剤のｐＨは７．０±０．２である。
【０２７３】
安定化凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．５μＭ〜２０μＭの間の亜鉛をさらに含む。
【０２７４】
特定の実施形態では、本発明はＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ１３）の安定化凍結乾燥製剤提供し、製剤は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性；（ｂ）０〜２００ｍＭのＮａＣｌ；（ｃ）２ｍＭ〜４ｍＭのカルシウム；（ｄ）２％〜４％のマンニトール；（ｅ）０．５％〜２％のショ糖；（ｆ）０．０２５〜０．１％のポリソルベート８０；および（ｇ）１０ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン（７．０±０．２）を含む液体製剤から凍結乾燥される。
【０２７５】
一実施形態では、本発明は、梗塞を治療または予防するための方法を提供し、この方法は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性（すなわち、ＦＲＥＴＳ−ｖＷＦ７３活性）；（ｂ）０ｍＭ〜１００ｍＭの薬学的に許容される塩；（ｃ）０．５ｍＭ〜２０ｍＭのカルシウム；（ｄ）糖および／または糖アルコール；（ｅ）非イオン性界面活性剤；ならびに（ｆ）ｐＨを６．０〜８．０の間に維持するための緩衝剤を含むＡＤＡＭＴＳ１３製剤を、それを必要とする被検体に投与することを含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも２００単位のＡ１３活性を含む。別の実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも４００単位のＡ１３活性を含む。好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも６００単位のＡ１３活性を含む。より好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも８００単位のＡ１３活性を含む。さらに別の好適な実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１０００単位のＡ１３活性を含む。一実施形態では、安定化ＡＤＡＭＴＳ１３製剤は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり約１００単位〜約２０００単位の間のＡＤＡＭＴＳ１３活性を含む。
【０２７６】
安定化低塩凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約１．０ｍＭ〜約１０．０ｍＭの間のカルシウムを含む。好適な実施形態では、製剤は約２．０〜約４．０ｍＭの間のカルシウムを含有する。
【０２７７】
安定化低塩凍結乾燥Ａ１３製剤の別の実施形態では、製剤は約２％〜約６％の間の糖および／または糖アルコールを含む。好適な実施形態では、製剤は約３％〜約５％の間の糖および／または糖アルコールを含む。特定の実施形態では、製剤は約４％の糖および／または糖アルコールを含む。一実施形態では、糖および／または糖アルコールは、ショ糖、トレハロース、マンニトールおよびそれらの組合せからなる群より選択される。好適な実施形態では、糖および／または糖アルコールはショ糖とマンニトールの混合物である。
【０２７８】
安定化低塩凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．０１％〜約０．１％の間の非イオン性界面活性剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約０．０５％の非イオン性界面活性剤を含む。一実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、プルロニックＦ−６８およびＢＲＩＪ３５からなる群より選択される。好適な実施形態では、界面活性剤はポリソルベート８０である。
【０２７９】
安定化低塩凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約５ｍＭ〜約１００ｍＭの間の緩衝剤を含む。好適な実施形態では、製剤は約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの間の緩衝剤を含む。別の実施形態では、緩衝剤はヒスチジンまたはＨＥＰＥＳである。好適な実施形態では、緩衝剤はヒスチジンである。一実施形態では、製剤のｐＨは約６．５〜７．５の間である。好適な実施形態では、製剤のｐＨは７．０±０．２である。
【０２８０】
安定化低塩凍結乾燥Ａ１３製剤の一実施形態では、製剤は約０．５μＭ〜２０μＭの間の亜鉛をさらに含む。
【０２８１】
特定の実施形態では、本発明はＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ１３）の安定化低塩凍結乾燥製剤を提供し、製剤は、（ａ）１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３当たり少なくとも１００単位のＡＤＡＭＴＳ１３活性；（ｂ）０〜６０ｍＭのＮａＣｌ；（ｃ）２ｍＭ〜４ｍＭのカルシウム；（ｄ）２％〜４％のマンニトール；（ｅ）０．５％〜２％のショ糖；（ｆ）０．０２５〜０．１％のポリソルベート８０；および（ｇ）１０ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン（７．０±０．２）を含む液体製剤から凍結乾燥される。
【０２８２】
ＶＩＩ．ＡＤＡＭＴＳ１３キット
本発明の別の態様では、ＡＤＡＭＴＳ１３またはＶＷＦ機能不全に関連した疾患または状態の治療のためのキットが提供される。一実施形態では、キットは上記のようなＡ１３またはｒＡ１３製剤を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、１用量以上の本明細書で提供される液体または凍結乾燥製剤を含み得る。キットが凍結乾燥Ａ１３またはｒＡ１３製剤を含む場合、一般にキットは、液体製剤の復元に適した液体、例えば、滅菌水または薬学的に許容される緩衝液も含む。いくつかの実施形態では、キットは、医療専門家による投与または自宅使用のためのシリンジ内に充填されたＡＤＡＭＴＳ１３製剤を含み得る。
【０２８３】
一実施形態では、約１０単位のＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性〜約１０，０００単位のＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性の間を含むキットが提供される。別の実施形態では、キットは、例えば、約２０単位のＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３（ＵＦＶ７３）活性〜約８，０００単位のＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性の間、または約３０ＵＦＶ７３〜約６，０００ＵＦＶ７３の間、または約４０ＵＦＶ７３〜約４，０００ＵＦＶ７３の間、または約５０ＵＦＶ７３〜約３，０００ＵＦＶ７３の間、または約７５ＵＦＶ７３〜約２，５００ＵＦＶ７３の間、または約１００ＵＦＶ７３〜約２，０００ＵＦＶ７３の間、または約２００ＵＦＶ７３〜約１，５００ＵＦＶ７３の間、またはそれらの中の他のおよその範囲の間を提供し得る。特定の実施形態では、キットは、約１０単位のＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性、または約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，１００、２，２００、２，３００、２，４００、２，５００、２，６００、２，７００、２，８００、２，９００、３，０００、３，１００、３，２００、３，３００、３，４００、３，５００、３，６００、３，７００、３，８００、３，９００、４，０００、４，１００、４，２００、４，３００、４，４００、４，５００、４，６００、４，７００、４，８００、４，９００、５，０００、５，１００、５，２００、５，３００、５，４００、５，５００、５，６００、５，７００、５，８００、５，９００、６，０００、６，１００、６，２００、６，３００、６，４００、６，５００、６，６００、６，７００、６，８００、６，９００、７，０００、７，１００、７，２００、７，３００、７，４００、７，５００、７，６００、７，７００、７，８００、７，９００、８，０００、８，１００、８，２００、８，３００、８，４００、８，５００、８，６００、８，７００、８，８００、８，９００、９，０００、９，１００、９，２００、９，３００、９，４００、９，５００、９，６００、９，７００、９，８００、９，９００、１０，０００単位以上のＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性を提供し得る。
【０２８４】
特定の実施形態では、キットはＡＤＡＭＴＳ１３の単回投与または用量のためのものである。他の実施形態では、キットは投与のための複数用量のＡＤＡＭＴＳ１３を含み得る。一実施形態では、キットは、医療専門家による投与または自宅使用のためのシリンジ内に充填されたＡＤＡＭＴＳ１３製剤を含み得る。
【実施例】
【０２８５】
ＶＩＩＩ．実施例
Ａ．実施例１：組換えＡＤＡＭＴＳ１３（ｒＡ１３）の発現
ヒトＡＤＡＭＴＳ１３を発現する組換えＣＨＯ細胞系＃６４０−２のケモスタット細胞培養物を、追加の亜鉛およびビタミンＢ３を補充した既知組成ＢＡＣＤ−Ａ１３培地中で増殖させた。１０Ｌの培養物を５３日間維持し、ｒＡ１３タンパク質および活性の産生を経時的にモニターした。
【０２８６】
ヒトＡＤＡＭＴＳ１３を発現する組換えＣＨＯ細胞を既知組成の独自の培地（ＢＣＳ培地）に順応させた。ＤＷＣＢを融解させ、ＢＣＳ培地中で細胞接種物を調製した。ｒＡ１３発現クローン＃６４０−２から増殖した細胞を、Ｒｕｓｈｔｏｎ型の攪拌翼を供えた１０Ｌのバイオリアクターに移し、インライン制御された、７．１５〜７．２０のｐＨ、３７℃、２０％空気飽和度の溶存酸素濃度の下、独自のＢＡＣＤ−Ａ１３培地を用いた反復バッチ培養で培養した。２つのバッチ培養物を最終稼動体積１０Ｌまで増殖させた後、５日目にバイオリアクターを連続培地供給に切り替え、ケモスタット方式でさらに４８日間操作した。
【０２８７】
バイオリアクターからの上清試料を週１回採取し、ＥＬＩＳＡによりｒＡ１３タンパク質産生を、またＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３アッセイによりｒＡ１３活性を解析した。細胞数をＮｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ法により決定した。希釈率を測定して、増殖率および容積生産性の算出に用いた。
【０２８８】
亜鉛およびニコチンアミドを１．４３２ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ４７Ｈ２Ｏおよび７．０２ｍｇ／Ｌのニコチンアミドの最終濃度で補充した既知組成ＢＡＣＤ−Ａ１３培地を用いた連続培養条件下で、０．９〜１．３ｍｇ／（Ｌ・日）の間の高レベルのｒＡ１３タンパク質産生および約８００〜１１００ｍＵ／μｇの間のｒＡ１３の比活性が達成された（表１）。注目すべきことに、容積および細胞比生産性が長期培養において経時的に増加したが、経時的な増殖および希釈率の増加によるものと思われる。発現ｒＡ１３の高い比活性を、培養物をケモスタット条件下で増殖させた少なくとも全７日にわたり、少なくとも常に高レベルで維持することができた。実際、培養物中で産生されたｒＡ１３の比活性は、２週間目の約８００ｍＵ／μｇのＡ１３から７週間目の約１１００ｍＵ／μｇのＡ１３まで実際に増加した。
【０２８９】
【表１】
2013505270.tif 000002
【０２９０】
Ｂ．実施例２：精製組換えＡＤＡＭＴＳ１３（ｒＡ１３）の製剤
組換えＡＤＡＭＴＳ１３を組換えＣＨＯ細胞内で発現させ、陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。精製ｒＡ１３は、約７５０μｇ／ｍｌの最終濃度、約８５０ｍＵ／μｇの比活性であった。ｒＡ１３を、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２％のショ糖、０．０５％のポリソルベート８０を含有し、（１）ヒスチジン、（２）リン酸緩衝剤または（３）クエン酸ナトリウムから選択される２０ｍＭの緩衝剤によりｐＨが７．０である緩衝液で製剤化した。次いで試料を二等分して、半分を凍結乾燥させた。
【０２９１】
凍結乾燥試料を凍結乾燥前の製剤の体積に等しい最終体積まで滅菌水で復元した。次いで各液体および凍結乾燥製剤の単一アリコートを、試料をＳｕｐｅｒｏｓｅ６  ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷してゲルろ過により特徴付けた。図３に見られるように、すべての製剤は、ゲルろ過により単量体ｒＡ１３タンパク質に対応する単一ピークとして移動するＡＤＡＭＴＳ１３試料を生じた。
【０２９２】
Ｃ．実施例３：４℃および３７℃で保管したｒＡ１３製剤の活性保持の特徴付け
実施例２のように製剤化して分取したｒＡ１３試料を、４℃または３７℃で最大６ヶ月間保管した。０、１、２、３、１２および２４週間目に、ＥＬＩＳＡにより決定されるｒＡ１３タンパク質濃度およびＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３アッセイにより判定されるｒＡ１３活性に関して、溶液製剤を解析した（図１）。凍結乾燥試料を凍結乾燥前の製剤の体積に等しい最終体積まで滅菌水で復元し、同様に０、２、４、８、１２および２４週間目に解析した（図２）。
【０２９３】
４℃で保管したｒＡ１３液体製剤は、６ヶ月までの時点で抗原含有量、すなわちタンパク質濃度、またはＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性の喪失を示さなかった。図１に見られるように、このことは、それぞれヒスチジン、リン酸およびクエン酸ナトリウムで緩衝した３つの製剤すべてに当てはまった。逆に、ヒスチジンまたはクエン酸ナトリウムで緩衝した液体製剤は、３７℃で１週間後にほぼ完全な活性喪失を示した（図１Ａ；◇＝ヒスチジン、□＝クエン酸ナトリウム）。この活性喪失は、１週間目にこれらの試料で抗原含有量の急上昇を伴っていたが、このことはｒＡ１３タンパク質が変性していたことを示している。ｒＡ１３のヒスチジン液体製剤は、３ヶ月および６ヶ月目に急激な抗原含有量の減少を示したが、このことはタンパク質が分解されていたことを示している。リン酸緩衝剤で製剤化した液体ｒＡ１３が、３７℃で保管した場合に３週間目に著しい活性を示したことは注目すべきである（図１Ａ；○＝リン酸緩衝剤）。この製剤の抗原含有量は一貫して遅い速度で増加したが、このことは、リン酸緩衝剤で製剤化した場合にｒＡ１３変性が遅延することを示している。
【０２９４】
ｒＡ１３凍結乾燥製剤は、４℃または３７℃のいずれかで保管した場合、少なくとも６ヶ月間は安定であるようだった（図２）。リン酸緩衝剤で製剤化した凍結乾燥ｒＡ１３は、３７℃で保管した場合は緩やかな活性喪失を示し（６ヶ月目で３０％）、４℃では活性喪失を示さなかったが、この活性喪失は、ＥＬＩＳＡによる抗原アベイラビリティの増加を伴わなかった（図２；○＝リン酸緩衝剤）。他の凍結乾燥製剤はいずれも、４℃または３７℃で保管した場合、活性喪失または抗原アベイラビリティの増加を示さなかった。
【０２９５】
Ｄ．実施例４：４℃および３７℃で保管した製剤におけるｒＡ１３の立体配座安定性
実施例２のように製剤化して分取したｒＡ１３試料を、４℃または３７℃のいずれかで最大６ヶ月間保管した。製剤化し溶液および凍結乾燥状態で保管したｒＡ１３の全体的な立体配座を、実施例３に記載されている時点でゲルろ過により特徴付けた。ヒスチジン製剤化ｒＡ１３で、０、１、２、３および２４週間目に液体製剤に関して（図４）、ならびに０、２、４、８、１２および２４週間目に凍結乾燥製剤に関して（図５）行ったゲルろ過実験の結果を示す。
【０２９６】
４℃で最大６ヶ月間保管した、ヒスチジンによる液体製剤は、ゲルろ過では主に単量体として移動したが（図４Ａ）、このことはタンパク質が４℃において溶液で非常に安定であることを示している。この結果は、ヒスチジンで製剤化し４℃で最大６ヶ月まで溶液で保管したｒＡ１３がＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性の喪失を全く示さなかった、実施例３に記載の結果と一致する。逆に、ヒスチジンで製剤化し３７℃で保管したｒＡ１３は、溶出容積／保持時間の減少により示されるように、高次で／部分的または完全に変性した種として移動した（図４Ｂ）。３７℃で６ヶ月間保管したヒスチジン製剤化Ａ１３は、大部分が分解しているようであったが、これは実施例３に見られる結果と一致している。
【０２９７】
４℃および３７℃で保管した各製剤に関してゲルろ過実験を繰り返し、溶出ピーク下の相対面積を総合して、製剤中の単量体ｒＡ１３（３）、二量体ｒＡ１３（２）および凝集／変性ｒＡ１３（１）の相対的占有率を決定した。４℃および３７℃で６ヶ月間保管した３つの凍結乾燥製剤に関して行ったゲルろ過実験の結果を表２に記載する。ゲルろ過による分析の前に、凍結乾燥試料を凍結乾燥前の製剤の体積に等しい最終体積まで滅菌水で復元した。
【０２９８】
【表２】
2013505270.tif 000003
【０２９９】
凍結乾燥ｒＡ１３製剤は、４℃で少なくとも６ヶ月間保管した後に、二量体または凝集／変性種の量の増加を全く示さなかったが、これは実施例３に見られる結果と一致している。同様に、ヒスチジンまたはクエン酸ナトリウムを用いて製剤化および凍結乾燥したｒＡ１３は、３７℃で少なくとも６ヶ月間保管した場合、わずかなレベルの二量体化を示すのみであった。さらに、これらの製剤のいずれも凝集および／または変性のレベル増加を生じるということが示されなかった。逆に、リン酸緩衝剤を用いて製剤化および凍結乾燥したｒＡ１３は、３７℃で少なくとも６ヶ月間保管した場合、かなりのレベルの二量体化ならびに凝集および／または変性を示した。
【０３００】
Ｅ．実施例５：４℃および３７℃で保管したｒＡ１３製剤の生物物理的特徴付け
実施例２のように製剤化して分取したｒＡ１３試料を、４℃または３７℃のいずれかで最大６ヶ月間保管した。上記のように製剤化したｒＡ１３タンパク質の立体配座安定性の尺度としてストークス半径を、ヒスチジン（図６）、リン酸緩衝剤（図７）およびクエン酸ナトリウム（図８）を用いた溶液ｒＡ１３製剤（Ａ）および凍結乾燥ｒＡ１３製剤（Ｂ）に関して、示される各時点で動的光散乱により決定した。
【０３０１】
さらに、各液体製剤に対する導出カウント値を保管前に動的光散乱により決定した。図１２に見られるように、ヒスチジンおよびクエン酸ナトリウム製剤では約３５℃より上、およびリン酸製剤では約４０℃より上で、ストークス半径、すなわちｒＡ１３安定性の変化に不連続性がある。さらに、リン酸製剤は、約３７℃より低い温度ではヒスチジンまたはクエン酸ナトリウム製剤よりもストークス半径が大きいが、約４０℃〜５０℃の間の温度では、リン酸製剤の方がわずかに安定性が高いと思われる。
【０３０２】
ヒスチジンで製剤化した凍結乾燥試料を４℃または３７℃で３ヶ月間保管し、次いで滅菌水中で復元した。復元したｒＡ１３において局所的または全体的な立体配座変化が生じたか否かを特徴付けるために、４℃および３７℃で３ヶ月間保管した試料に関してフーリエ変換赤外分光法を行い、新たに製剤化および凍結乾燥したＡ１３と比較した。図９に見られるように、３つの試料すべての吸収スペクトルはほぼ完全に重なり、このことは、ヒスチジンでの凍結乾燥製剤として４℃または３７℃で３ヶ月間保管したｒＡ１３において立体配座転移が全く生じていないことを示している。
【０３０３】
また４℃または３７℃で６ヶ月間保管したｒＡ１３製剤を、逆相−高速液体クロマトグラフィー（ｒｐ−ＨＰＬＣ）によっても特徴付けた。ｒｐ−ＨＰＬＣでは密接に関連したタンパク質分子の分離が可能であり、したがって多くの場合、同じポリペプチドの修飾型、例えば、荷電修飾された、部分的に分解されたまたは部分的にアンフォールドしたものを識別することができる。図１０に見られるように、すべてのｒＡ１３製剤が４℃で少なくとも６ヶ月間は安定であると思われ、上で見られるいくつかの結果と一致している。
【０３０４】
次に、実施例２のように製剤化したｒＡ１３試料を示差走査熱量測定により分析して、各種製剤におけるｒＡ１３タンパク質の安定性をさらに特徴付けた。図１１で作成された熱容量曲線の二峰性は、タンパク質の２つのドメインが互いに別々にアンフォールドし、最初のアンフォールディング転移が約５４〜５５℃の間の温度で生じ得ることを示している。ｒＡ１３のアンフォールディング温度は各種製剤において同様である。しかし、リン酸製剤および程度は少ないにせよクエン酸製剤の比較的大きな吸熱下面積により示されるように、転移のエンタルピーの増加はＡ１３製剤のわずかな安定化を示している。
【０３０５】
Ｆ．実施例６：ｒＡ１３製剤における二量体形成の特徴付け
溶液中のｒＡ１３のオリゴマー状態に対する安定化剤の効果を判定するために、ショ糖（０％〜２％）、マンニトール（０％〜３％）およびカルシウム（０ｍＭまたは２ｍＭ）の異なる組合せを加えた、２０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび０．０５％のポリソルベート８０でｒＡ１３を製剤化した。次いで、各種製剤をＳｅｐｈａｒｏｓｅ６  ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのゲルろ過により分析した。図１３に見られるように、安定化剤の様々な組合せにより、Ａ１３二量体形成量を約５０％減少させることができた。各製剤の凝集体、二量体／オリゴマーおよび単量体のパーセンテージを表１４に記載する。
【０３０６】
【表３】
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【０３０７】
Ｇ．実施例７：ＡＤＡＭＴＳ１３製剤の安定性に対するｐＨの効果
溶液中のｒＡ１３の安定性に対するｐＨの影響を判定するために、２０ｍＭのヒスチジンおよび１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液中にｒＡ１３を透析し、５．５〜９．５の間のｐＨ範囲に調節して、４℃または４０℃で２４時間保管した。２４時間目に、ＥＬＩＳＡにより決定されるｒＡ１３抗原濃度およびＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３アッセイにより判定されるｒＡ１３活性により安定性を測定した。表３および図１４に見られるように、５．５〜９．５の間のｐＨの溶液で製剤化した場合、ｒＡＤＡＭＴＳ１３は４℃で２４時間は比較的安定である。
【０３０８】
【表４】
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【０３０９】
【表５】
2013505270.tif 000006
【０３１０】
Ｈ．実施例８：ＡＤＡＭＴＳ１３製剤の安定性に対する低レベルＣａＣｌ２の効果
溶液中のｒＡ１３の安定性に対する低レベルＣａＣｌ２の効果を判定するために、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２％のショ糖、０．０５％のポリソルベート８０および２０ｍＭのヒスチジンを含有するｐＨ７．０の緩衝液で、２ｍＭのＣａＣｌ２を加えて（１２Ｂおよび１２Ｄ）および加えずに（１２Ａおよび１２Ｃ）ｒＡ１３を製剤化した。液体製剤を２５℃または３７℃のいずれかで３週間保管した。次いで、０、１、２および３週間目に相対的ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性を判定することにより製剤の安定性を評価した。図１５に見られるように、２ｍＭのＣａＣｌ２の添加により、２５℃および３７℃で保管した液体ｒＡＤＡＭＴＳ１３製剤が共に様々な程度で安定化された。ＣａＣｌ２を加えない製剤で見られる８０％の活性喪失に比べ、２５℃で保管したｒＡＤＡＭＴＳ１３液体製剤への低レベルのＣａＣｌ２の添加が、３週間の約９５％の酵素活性の安定性をもたらしたことは注目すべきである。
【０３１１】
Ｉ．実施例９：組換えＡＤＡＭＴＳ１３のオリゴマー種のＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性
精製中に単離されたＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の異なるオリゴマー種の酵素活性を判定するために、２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）および５００ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ６  ＧＬゲルろ過カラムにｒＡ１３を負荷した。次いで、ＡＤＡＭＴＳ１３分子種をサイズおよび形状により分離した。カラムから溶出した画分をその見かけのオリゴマー状態、例えば、凝集Ａ１３（プール１）、二量体Ａ１３（プール１２）および単量体Ａ１３（プール１３）に従ってプールした（図１６Ａ）。各プール中のタンパク質の平均ストークス半径を動的光散乱により決定することで、ＡＤＡＭＴＳ１３のオリゴマー状態をさらに確認した（図１６Ｂ）。
【０３１２】
次いで、各プールの酵素活性をＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３アッセイにより判定した。図１６に見られるように、凝集Ａ１３種の容量活性は約２１８ｍＵ／ｍｌ、二量体Ａ１３の活性は約１．４３５Ｕ／ｍｌ、および単量体Ａ１３の活性は約９７．９０５Ｕ／ｍｌであった。プールの体積に対して活性を標準化した後、単量体タンパク質に対応する溶出プールにおいて、全活性の９９％を超える活性が見られる。次いで、活性をタンパク質全量に対して標準化した場合、単量体タンパク質プールが二量体タンパク質プールおよび凝集タンパク質プールの両方よりも高い比活性を有することがわかる。
【０３１３】
Ｊ．実施例１０：ＡＤＡＭＴＳ１３製剤の凍結乾燥に対するＮａＣｌ濃度の効果
凍結乾燥ケーク生成に対するＮａＣｌ濃度の効果を判定するために、様々な濃度のＮａＣｌ（０〜１５０ｍＭ）を加えた、２％のショ糖、０．０５％のポリソルベート８０および２０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ７．０）を含有する緩衝液で組換えＡＤＡＭＴＳ１３を製剤化した。次いでＡＤＡＭＴＳ１３製剤を標準条件下で凍結乾燥させ、得られた凍結乾燥ケークの品質を視覚的に調べた（図１７）。低塩濃度を含有するＡＤＡＭＴＳ１３製剤から生成された凍結乾燥ケーク（０〜６０ｍＭ；図１７Ａ〜１７Ｃ）は、表面が滑らかで密な構造を有していたのに対し、高塩製剤から生成された凍結乾燥ケーク（１２０ｍＭおよび１５０ｍＭのＮａＣｌ；図１７Ｅおよび１７Ｆ）は、多孔質で密ではなく、糸状のまたは砕けた外観を有していた。中間レベルのＮａＣｌを含有するＡＤＡＭＴＳ１３製剤（９０ｍＭ；図１７Ｄ）は、部分的には密であり、半多孔質のまたはクレーター様の表面を有していた。
【０３１４】
多孔質で密でない凍結乾燥ケークは、凍結乾燥工程の間の融解を示している。一般に、最初の乾燥工程の間に凍結材料の部分融解を生じ得る崩壊温度（またはガラス温度）低下させるために、高塩濃度を使用する。このことがタンパク質凝集レベルおよび／または酵素活性の回復に悪影響を及ぼし得る。したがって、良好な凍結乾燥ケークの外観は通常、それぞれの製剤化タンパク質のより優れた活性回復およびより少ない凝集と関連する。有利には、本発明は、高品質の凍結乾燥ケークの生成を可能にするＡＤＡＭＴＳ１３製剤を提供する。特定の実施形態では、本明細書で提供される本発明の製剤は、特に凍結乾燥の間に安定であり、高品質の凍結乾燥ケークの形成をもたらす低塩ＡＤＡＭＴＳ１３製剤を可能にする。
【０３１５】
低塩タンパク質製剤の使用に関する懸念の１つは、タンパク質凝集の増加が生じ得るということである。これが低塩ＡＤＡＭＴＳ１３製剤に当てはまるか否かを判定するために、上で生成された凍結乾燥ケークを脱イオン水中で復元し、復元されたＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の凝集状態をサイズ排除クロマトグラフィーにより解析した。図１８に見られるように、凍結乾燥製剤の塩濃度は、復元されたＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の凝集状態に対する効果を有していた（０ｍＭのＮａＣｌと１５０ｍＭのＮａＣｌを比較されたい）。
【０３１６】
低塩ＡＤＡＭＴＳ１３製剤の使用の有効性をさらに確認するために、０〜１５０ｍＭのＮａＣｌの範囲の各種製剤のＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性を判定した。図１９に見られるように、ＡＤＡＭＴＳ１３製剤のショ糖濃度のみならず塩濃度も組換えＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の活性に影響を与えなかった。これらの結果は、液体および凍結乾燥組換えＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の低塩（すなわち、０〜１００ｍＭのＮａＣｌ）製剤が製薬学的用途に十分に適することを示している。
【０３１７】
Ｋ．実施例１１：高塩および低塩緩衝液の凍結乾燥ＡＤＡＭＴＳ１３製剤
組換えＡＤＡＭＴＳ１３の凍結乾燥製剤を比較するために、高塩（１５０ｍＭのＮａＣｌ）および低塩（３０ｍＭのＮａＣｌ）製剤を調製した。高塩および低塩製剤は共に、２０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のポリソルベート８０および２ｍＭのＣａＣｌ２を含有していた。高塩製剤は２％のショ糖および１５０ｍＭのＮａＣｌをさらに含有していたのに対し、低塩製剤は１％のショ糖、３％のマンニトールおよび３０ｍＭのＮａＣｌをさらに含有していた。次いで、２つの製剤を標準条件下で凍結乾燥させた。高塩ＡＤＡＭＴＳ１３製剤から生成されて生じた凍結乾燥ケークは、密ではなく、不均一で、塊状かつ多孔質であったのに対し（図２０Ａ）、低塩ＡＤＡＭＴＳ１３製剤から生成された凍結乾燥ケークは、密で、非常に均一であり、かつ滑らかな表面を有していた（図２０Ｂ）。これらの結果は、凍結乾燥ＡＤＡＭＴＳ１３の低塩製剤が製薬学的用途に十分に適することを示している。
【０３１８】
Ｌ．実施例１２：凍結乾燥製剤のためのｒＡＤＡＭＴＳ１３精製
組換えＡＤＡＭＴＳ１３を組換えＣＨＯ細胞内で発現させ、得られた馴化培地からＰＯＲＯＳ  ＨＳ陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。次いでＨＳカラムから溶出されたｒＡＤＡＭＴＳ１３の収集画分を、ゲルろ過の前および後にサイズ排除クロマトグラフィー（それぞれ、図２１Ａおよび２１Ｂ）および動的光散乱（それぞれ、図２２Ａおよび２２Ｂ）により、二量体化および凝集に関して、ｓｕｐｅｒｏｓｅ６  ＧＬ：ＴＣ１０／３０カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより解析した。図２１Ａに見られるように、ゲルろ過前のＨＳ溶出画分中の全ｒＡＤＡＭＴＳ１３のほぼ２０％が、望ましくない二量体、単量体または凝集状態であった。これに対し、ゲルろ過段階からプールされたｒＡＤＡＭＴＳ１３のほぼすべてが単量体であった（図２１Ｂ）。同様に、ＨＳ溶出ｒＡＤＡＭＳ１３の平均流体力学的半径（約２０．５ｎｍ；図２２Ａ）は、サイズ排除クロマトグラフィー後に回収されたｒＡＤＡＭＴＳの半径（約１２〜１３ｎｍ；図２２Ｂ）のほぼ２倍であった。
【０３１９】
Ｍ．実施例１３：ｒＡＤＡＭＴＳ１３製剤の凍結乾燥のための標準的なプロトコールと長期間のプロトコールの比較
異なる低塩（３０ｍＭおよび６０ｍＭのＮａＣｌ）、カルシウム（２ｍＭおよび４ｍＭのＣａＣｌ２）および糖（１％のショ糖および１％のトレハロース）濃度を含有するｒＡＤＡＭＴＳ１３製剤の凍結乾燥を比較するために、ｒＡＤＡＭＴＳ１３を上記のように陽イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーにより精製し、塩、カルシウムおよび糖の上に挙げた８つのすべての組合せを加えた、２０ｍＭのヒスチジン、３％のマンニトール、０．０５％のポリソルベート８０で製剤化した。すべてのバイアルには同じ濃度のＡＤＡＭＴＳ１３（１９０μｇ／ｍＬ抗原）が含まれていた。次いで、ｒＡ１３製剤１〜８（表５および６）を、標準的な（３日間；図２３Ａ）または長期間の（１１日間；図２３Ｂ）凍結乾燥プロトコールのいずれかを用いて凍結乾燥させた。凍結乾燥後、凍結乾燥ケークを所望の品質に関して視覚的に調べた（図２４）。
【０３２０】
【表６】
2013505270.tif 000007
【０３２１】
【表７】
2013505270.tif 000008
【０３２２】
各製剤中のＡＤＡＭＴＳ１３の多量体状態を判定するために、凍結乾燥タンパク質を脱イオン水中で復元し、動的光散乱により解析した。図２５に見られるように、標準的なおよび長期間の凍結乾燥プロトコールを用いて調製された凍結乾燥製剤は共に、復元後に主として単量体ＡＤＡＭＴＳ１３分子（約１２〜１３ｎｍにおけるピーク）を生じた。凝集タンパク質に対応するＡＤＡＭＴＳ１３ピーク（１００〜１１０ｎｍの間）は単量体ピークの約半分の高さに見えるが、ｙ軸は全質量ではなく強度を測定しているため、グラフは凝集したＡＤＡＭＴＳ１３種のパーセンテージを大幅に強調していることを当業者は理解するであろう。脱イオン水中での復元後、長期間の凍結乾燥プロトコールにより調製された製剤（破線）の方が標準的な凍結乾燥プロトコールにより調製された製剤（実線）よりも少ない凝集ＡＤＡＭＴＳ１３を含有していることもわかる。
【０３２３】
上に記載した各製剤中の凍結乾燥ｒＡＤＡＭＴＳ１３の安定性を評価するために、標準的なおよび長期間のプロトコールにより生成された凍結乾燥ケークを用いて、様々な温度下における最大３６ヶ月間の保管用に一連のバイアルを調製した。表７にまとめたように、＋２〜＋８℃（すなわち、標準的な冷蔵条件下）、３０℃（室温）および４０℃での保管用に５ｍｇまたは１０ｍｇの凍結乾燥ｒＡＤＡＭＴＳ１３を含むバイアルを調製した。すべてのバイアルをＦＴＩＲ、ＳＥ−ＨＰＬＣおよびＤＬＳにより試験した。またＦＲＥＴＳ活性およびＡＤＡＭＴＳ１３抗原もすべての試料に関して試験した。次いで、上でまとめたように、表示の時点で凍結乾燥ＡＤＡＭＴＳ１３製剤をＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性および抗原安定性について試験し、各種凍結乾燥製剤中のタンパク質の安定性を判定することができる。標準的なおよび長期間の凍結乾燥プロトコールにより生成された復元ＡＤＡＭＴＳ１３製剤のＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性アッセイの結果を、それぞれ表８および９に記載する。同様に、標準的なおよび長期間の凍結乾燥プロトコールにより生成された試料に関して、抗原回収率をそれぞれ表１０および１１に記載する。
【０３２４】
【表８】
2013505270.tif 000009
【０３２５】
【表９】
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【０３２６】
【表１０】
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【０３２７】
【表１１】
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【０３２８】
【表１２】
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【０３２９】
表１７および１８は、ｒＡＤＡＭＴＳ０２２−１製剤のための異なる凍結乾燥プログラムのＦＴＩＲの結果をまとめたものである。時間も温度も共に二次構造に大きな影響は与えなかった。また凍結乾燥プログラムも、長期間の凍結乾燥プログラムＢでは見られなかった、標準的なプログラムＡでの４０℃におけるアルファへリックスの明らかな減少を除けば、構造的要素を変化させなかった。
【０３３０】
【表１３】
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【０３３１】
【表１４】
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【０３３２】
１Ａおよび１Ｂ凍結乾燥製剤中のＡＤＡＭＴＳ１３のオリゴマー状態を、４℃、３０℃および４０℃での保管の６ヶ月間にわたり動的光散乱により解析した。図３７および３８に見られるように、長期間の凍結乾燥プログラムにより調製した試料において、より高レベルの凝集が見られた。しかし、凝集レベルは保管期間にわたって実質的には増加しなかった。
【０３３３】
同様に、サイズ排除ＨＰＬＣは、６ヵ月後にｒＡＤＡＭＴＳ０２２製剤の異なる凍結乾燥プログラム間に大きな相違を示さなかった。解析は、４℃、３０℃および４０℃での３ヶ月間にわたる保管後に凝集が誘導されなかったことを示している。
【０３３４】
Ｎ．実施例１４：組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３の発現および精製
懸濁培養での発酵工程において、組換えチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞クローンにより組換えＡＤＡＭＴＳ−１３を作製した。増殖培地は、Ｂａｘｔｅｒにより開発され、ヒトまたは動物由来の物質および組換えタンパク質を共に含まない。ＡＤＡＭＴＳ１３の発現に有用なこれらのタイプの増殖培地は、例えば、米国特許出願第１２／８４７，９９９号に見ることができる。製造工程では連続（ケモスタット）細胞培養法を用いる。精製工程は、ろ過による始原細胞除去段階から始まる。続く４日以内の無細胞生成物を合わせて１つの下流バッチを作製する。プールし、ろ過した採取物を限外ろ過／ダイアフィルトレーションにより濃縮した後、溶媒界面活性剤ウイルス不活化段階に供する。さらなる精製は、クロマトグラフィー捕捉段階（陰イオン交換）、ナノろ過段階（第二のウイルス削減段階）、負クロマトグラフィー段階（ヒドロキシアパタイト）とそれに続く混合モードクロマトグラフィー（Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ）、ならびに最終的なクロマトグラフィーによる濃縮および製剤化前段階（陽イオン交換）を含む。製剤化前の原体薬剤物質（ＢＤＳ）を温度調節された冷凍庫中、−６０℃で凍結させる。
【０３３５】
Ｏ．実施例１５：ＡＤＡＭＴＳ１３活性のＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３アッセイ
消光性蛍光基質（ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ；Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）に対するＡＤＡＭＴＳ１３のタンパク質分解活性を、製造者のアッセイ説明書に従って測定した。簡潔には、５ｍＭのビス‐トリス、２５ｍＭのＣａＣｌ２および０．００５％のＴｗｅｅｎ２０を含有する緩衝液でｒＡＤＡＭＴＳ１３試料を希釈し（総体積１００μＬ）、黒色のマイクロタイタープレート中に移した。試料を希釈ヒト血漿試料の参照曲線（８０〜５ｍＵ／ｍＬの血漿のもの）に対して測定した。基質（１００μＬ、ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３；２μＭの最終濃度）の添加により反応を開始させ、３０℃、ｌｅｘ＝３６０ｎｍおよびｌｅｍ＝４６０の蛍光分光光度計（ＦＬｘ８００、Ｂｉｏ  Ｔｅｋ）内で、２分ごとに４５分間蛍光を測定した。活性の結果をヒト血漿の参照曲線から読み取った。データを単位／ｍＬとして表す。正常ヒト血漿を１単位／ｍＬとした。
【０３３６】
Ｐ．実施例１６：ＡＤＡＭＴＳ１３抗原ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ヒトＡＤＡＭＴＳ１３に対するポリクローナルウサギＩｇＧを捕捉抗体として、および検出抗体としてのその標識型で用いて、ＡＤＡＭＴＳ１３含有試料を解析する。試料中に存在するＡＤＡＭＴＳ１３抗原を、９６ウェルマイクロタイタープレート上にコーティングされたＡＤＡＭＴＳ１３特異的抗体により捕捉する。試料を緩衝液（２５０ｍＭのＴｒｉｓ、３５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のＢＳＡ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０）で希釈し、コーティングされたマイクロタイターウェルに移した。結合したＡＤＡＭＴＳ１３抗原を、基質としてＴＭＢを用いて、ＨＲＰコンジュゲートウサギ抗ＡＤＡＭＴＳ１３  ＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ａｒｔ：＃３４０２１）で検出した。吸光度を分光光度計（ＴＥＣＡＮ  ＳｐｅｃｔｒａＦｌｕｏｒＰｌｕｓ、Ｔｅｃａｎ  Ｓａｌｅｓ  Ａｕｓｔｒｉａ，Ｇｒｏｄｉｎｇ（「ｏ」にウムラウト有り），Ａｕｓｔｒｉａ）によりｌ＝４５０ｎｍで測定した。ＡＤＡＭＴＳ１３抗原濃度（μｇ／ｍＬで表す）を、安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の培養採取物から精製した組換えＡＤＡＭＴＳ１３の２５０〜７．８１ｎｇ／ｍＬの範囲の希釈物を用いて参照標準から算出した。
【０３３７】
Ｑ．実施例１７：ＡＤＡＭＴＳ１３のサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）分析
ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ「９００シリーズ」（「Ａ」にウムラウト有り）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＳＥ−ＨＰＬＣを行った。このシステムは、室温で毎分０．３ｍＬの一定の流速で流れるＳｕｐｅｒｏｓｅ１２  ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＴＣ１０／３０）を備えていた。移動緩衝液として２０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのナトリウム酢酸、５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４を用いた。試料を１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４１５Ｃ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）、オートサンプラーにより１００μＬを自動的に加えた。カラム溶出液の吸光度を２８０ｎｍで連続的に測定した。
【０３３８】
Ｒ．実施例１８：ＡＤＡＭＴＳ１３の動的光散乱（ＤＬＳ）分析
Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ  Ｅｎｉｇｍａ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｐａｒｋ，Ｇｒｏｖｅｗｏｏｄ  Ｒｏａｄ，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ．ＷＲ１４  １ＸＺ）および緩衝液粘度測定用に直径６０ｍｍ／角度０．５°のコーンを備えたＨａａｋｅ  Ｒｈｅｏｓｔｒｅｓｓ  １（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて動的光散乱（ＤＬＳ）を行った。
【０３３９】
すべての試料を１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離（してＣｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４１５Ｃ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）、タンパク質の流体力学的直径を決定した。６０μＬの試料をＺＥＮ００４０使い捨てマイクロキュベット中に満たし、緩衝液の粘度をＲｈｅｏｓｔｒｅｓｓ  １により決定した。このパラメーターをＤＬＳによるタンパク質の有効径の解析に用いる。作動温度は２５℃で、平衡時間が２分であった。タンパク質の角度を１７３°の後方散乱に設定してサイズを測定し、１試料当たり３回行って結果を平均した。
【０３４０】
試料を温度上昇モードで測定して、タンパク質に対する温度の影響をモニターした。測定手順は、１５℃〜８０℃まで１℃／分の値上昇による異なる温度および２分の平衡時間以外は、通常のサイズ測定と同様であった。これらの温度傾斜にはＤＴＳ２１４５低容積ガラスキュベットを用いた。
【０３４１】
Ｓ．実施例１９：ＡＤＡＭＴＳ１３のフーリエ変換赤外分光（ＦＴＩＲ）分析
減衰全反射法モードで作動する、ＢｉｏＡＴＲ  ＩＩセルを備えたＦＴＩＲ分光器ＴＥＮＳＯＲ  ２７（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｏｐｔｉｋ  ＧｍｂＨ，７６２７５  Ｅｔｔｌｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてフーリエ変換赤外分光法を行った。この機器構成を用いて、タンパク質製剤の立体配座を解析することができる。
【０３４２】
２０℃の作動温度の間に、２０μＬの水をセル内に満たし、バックグラウンドスキャン用に測定した。その後に、２０μＬ緩衝液をセル内に満たしてバックグランドスキャンに対して測定し、緩衝液から水を差し引いた。この手順を、試料測定のためのバックグラウンドとして緩衝液で繰り返した（周波数の測定範囲：４０００〜６５０ｃｍ−１）。インターフェログラムを作成して透過スペクトルに変換した。異なるスペクトルを同じオフセットに関して補正し、同じタンパク質濃度に正規化した。さらに、タンパク質の二次構造（αへリックスの％、βシートの％）を、二次構造が既知の約４０種のタンパク質のデータベースを含む評価ソフトウェア（ＯＰＵＳ  ６．０／Ｂｒｕｋｅｒ）により算出した。
【０３４３】
Ｔ．実施例２０：ＡＤＡＭＴＳ１３安定性の光照射分析
ＳＯＰ  ＶＮ−０９−４５０５８ＴＢに従い、Ａｔｌａｓ  Ｓｕｎｔｅｓｔ  ＣＰＳ＋Ｐｈｏｔｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｃｈａｍｂｅｒ（Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）を用いて光安定性試験を行った。ＣＰＳ＋は、照度、ブラック標準温度およびチャンバ内空気温度をモニターし制御する。ずりおよび凍結融解実験に使用したものと同じ製剤において光安定性を試験した（表１２）。試料および対照をＤＬＳおよびＳＥ−ＨＰＬＣにより試験した。結果を図３１および図３２に示す。両製剤（液体および凍結乾燥）はＳＥ−ＨＰＬＣにより同じ結果を示した。照射時間と共に単量体ＡＤＡＭＴＳ１３ピークは減少し、二量体ピークは増加した。液体および凍結乾燥製剤の流体力学的直径も時間と共にわずかに増加した（図３２）。１０時間（ＩＣＨ  Ｑ１Ｂによる推奨）照射した凍結乾燥製剤は、光保護対照に対する違いを全く示さなかった。図３３に示されるように、光照射中にモニターしたＦＲＥＴＳ活性は、液体製剤では急速に減少したが、凍結乾燥製剤ではそれほど減少しなかった。ＩＣＨガイドラインＱ１Ｂにより推奨され４．８Ｍルクス時に相当する、４倍の光照射量の後でも５０％を超えるＦＲＥＴＳ活性が残っていた。
【０３４４】
光曝露を排除するために「対照」バイアルをアルミニウムホイルに包み、試験試料と共に光安定性チャンバ内に置いた。すべての試料は水平に置いた。１０時間の照射時間は、１２０万〜１８０万ルクス時および７６５Ｗ／ｍ２のＵＶ光に相当した。１０時間後に試料を光安定性チャンバから取り出し、スペクトル（１９０〜８００ｎｍ）およびｐＨ値を測定した。
【０３４５】
Ｕ．実施例２１：ＡＤＡＭＴＳ１３安定性の機械的応力解析
Ｈａａｋｅ  Ｒｈｅｏｓｔｒｅｓｓ１（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ  ＧｍｂＨ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｍａｎｙ）により直径６０ｍｍおよび角度０．５°のコーンを用いて、ずり応力を加えた。温度は２５．０℃に設定した。
【０３４６】
簡潔には、上記のように調製した組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３を表１２のように製剤化した。１回当たり５００μＬのＡＤＡＭＴＳ１３試料を加え、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、５００および６００ｒｐｍで１５分間応力を加えた。次いで、試料をエッペンドルフバイアルに移した。ＤＬＳ測定を行って、潜在的なずり応力誘導による部分的アンフォールディングまたは凝集をモニターした。図２８に示されるように、２００ｒｐｍのずり応力で凝集体が形成された。
【０３４７】
【表１５】
2013505270.tif 000016
【０３４８】
Ｖ．実施例２２：ＡＤＡＭＴ１３製剤に対する各種緩衝剤の効果
各種緩衝液がＡＤＡＭＴＳ１３製剤の安定性および立体配座に対して有する効果を判定するために、上記のように発現および精製された組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３を、異なる緩衝液に対して透析し（表１３）、動的光散乱（ＤＬＳ）により分析してＡＤＡＭＴＳ１３の基本的な緩衝液選択性を特定した。図２７に見られるように、タンパク質がヒスチジンまたはＨＥＰＥＳ緩衝液のいずれかで製剤化された場合に、ＡＤＡＭＴＳ１３の最小の流体力学的直径が見られた。
【０３４９】
【表１６】
2013505270.tif 000017
【０３５０】
Ｗ．実施例２３：ＡＤＡＭＴＳ１３安定性の凍結融解解析
ずり応力実験に使用したものと同じ製剤（表１２）を再び用いて、凍結融解ストレスの間のタンパク質の挙動を調べた。２つの凍結融解条件、−２０℃／ＲＴおよび−８０℃／＋３７℃を選択した。ＦＲＥＴＳ活性測定の結果を図２９にまとめる。すべての試料がアッセイ変動（２５％の相対標準偏差）の範囲内で安定である。５回の凍結融解サイクルの後でもＦＲＥＴＳ活性の喪失は見られなかった。この液体製剤におけるＢＡＸ９３０の安定性は、ＤＬＳおよびＳＥ−ＨＰＬＣ測定の結果により確認される。ＤＬＳによる凝集ピーク（１００〜１０００ｎｍの間）の強度において、凍結融解条件と無関係な増加は見られなかった（図３０）。同様に、ＳＥ−ＨＰＬＣは、−８０℃／＋３７℃では凍結融解サイクル反復後の凝集レベルの増加を示さなかったが、−２０℃／ＲＴではいくらかの増加を示した（データ不掲載）。
【０３５１】
Ｘ．実施例２４：ＡＤＡＭＴＳ１３のＦＲＥＴＳ活性に対するカルシウムおよび亜鉛の効果
上記のように調製した組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３を１０ｍＭのＥＤＴＡで処理した後、２０ｍＭのヒスチジンおよび１９０ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析した。透析後、ＣａＣｌ２およびＺｎＣｌ２を異なる濃度で製剤に追加した。次いで、異なる濃度のカルシウムおよび亜鉛を含有するＡＤＡＭＴＳ１３製剤の活性を、上記のようにＦＲＥＴ活性に関して試験した。図３４に見られるように、カルシウムレベルの増加がＦＲＥＴＳ活性の回復を増加させた。亜鉛の存在下および非存在下の両方において、ほぼ最大の活性が４ｍＭのＣａＣｌ２を含むことにより得られた。中間濃度のカルシウム（２ｍＭおよび４ｍＭ）では、亜鉛の添加がＦＲＥＴＳ活性のわずかな増加をもたらした。
【０３５２】
Ｙ．実施例２５：凍結乾燥ＡＤＡＭＴＳ１３製剤における凝集に対する塩および糖濃度の影響
塩および糖濃度がＡＤＡＭＴＳ１３の凍結乾燥製剤に対して有する効果をさらに調べるために、いくつかの凍結乾燥製剤のオリゴマー状態を、脱イオン水による復元後に判定した。簡潔には、組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３を上記のように作製した。次いで、表１５に記載されている塩化ナトリウムおよびショ糖レベルで、２０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ７．０）、２ｍＭの塩化カルシウムおよび０．０５％のポリソルベート８０により試料を製剤化した。次いで製剤を上記のように凍結乾燥させ、脱イオン水で復元した。次いで、ＳＥ−ＨＰＬＣ分析によりオリゴマー特性を決定し、その結果を表１５および表３５に示す。低糖濃度を含有する製剤において見られるように、高塩レベル（１５０ｍＭ）は、製剤のＡＤＡＭＴＳ１３凝集を増加させ単量体含有量を減少させる。
【０３５３】
【表１７】
2013505270.tif 000018
【０３５４】
次いで、表１５に示される同じ製剤を用いて、ＡＤＡＭＴＳ１３製剤の凍結乾燥後に生成された凍結乾燥ケークの品質を評価した。表１６にまとめたように、また図３６に示されるように、高濃度の塩化ナトリウム（１５０ｍＭ）の存在により凍結乾燥ケークは全く生じなかった。逆に、２％のショ糖の存在下で０ｍＭ〜６０ｍＭの間の塩化ナトリウムを含有する製剤で最も優れた凍結乾燥ケークが得られた。
【０３５５】
【表１８】
2013505270.tif 000019
【０３５６】
Ｚ．実施例２６：長期間の温度ストレス試験
凍結乾燥ＡＤＡＭＴＳ１３製剤の安定性をさらに特徴付けるために、第二の長期間のストレス試験を開始した。この試験では、組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３を表１９による３つの最終タンパク質濃度で製剤化した。第二の糖（マンニトール）が凍結乾燥の間にタンパク質を安定化させることが見出されたため、これを製剤中に含ませて、滑らかな表面の密な凍結乾燥ケークを得た。すべてのストレス試験試料をＤＬＳ（図３９）、ＳＥ−ＨＰＬＣ（表２０）およびＦＴＩＲにより特徴付けた。ＦＲＥＴＳ活性（表２１）およびＡ１３抗原ＥＬＩＳＡ（表２２）もすべての製剤に関して経時的に測定した。
【０３５７】
【表１９】
2013505270.tif 000020
【０３５８】
【表２０】
2013505270.tif 000021
【０３５９】
【表２１】
2013505270.tif 000022
【０３６０】
【表２２】
2013505270.tif 000023
【０３６１】
本明細書に記載されている実施例および実施形態は単に例示的目的のものであること、またそれを踏まえた様々な修正または改変が当業者に対して示され、かつ本願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれ得ることが理解される。本明細書に引用されるすべての刊行物、特許および特許出願は、あらゆる目的においてその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
2013505270.tif 000024
【図２】
2013505270.tif 000025
【図３】
2013505270.tif 000026
【図４】
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【図５】
2013505270.tif 000028
【図６】
2013505270.tif 000029
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【国際調査報告】
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