(57)【要約】  本発明は、細胞中の興味対象のゲノム遺伝子座で二本鎖破断-誘導変異誘発を増加させる方法に関し、そのことにより、ゲノム工学(治療用途を含む)及び細胞株工学の新たなツールを提供する。より具体的には、本発明は、遺伝情報の喪失を導き、NHEJによる前記興味対象のゲノム遺伝子座の無瘢痕再ライゲーションを防止する、興味対象のゲノム遺伝子座で二本鎖破断-誘導変異誘発を増加させる方法に関する。本発明はまた、この方法を実施するために使用する、遺伝子操作されたエンドヌクレアーゼ(キメラであってもなくても)、ベクター、組成物及びキットに関する。【選択図】図１
2013544082.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
(i)興味対象のゲノム遺伝子座で、１つの稀切断性エンドヌクレアーゼにより切断可能な少なくとも１つのDNA標的配列を同定する工程；
(ii)興味対象のゲノム遺伝子座内の前記DNA標的配列の近辺に遺伝情報の喪失を創出するように前記少なくとも１つの稀切断性エンドヌクレアーゼを遺伝子操作する工程；及び
(iii)前記DNA標的配列を前記少なくとも１つの稀切断性エンドヌクレアーゼと接触させて、興味対象のゲノム遺伝子座内の前記DNA標的配列の近辺に前記遺伝情報の喪失を創出し、そのことにより、前記興味対象のゲノム遺伝子座での二本鎖破断-誘導変異誘発が増加する細胞を取得する工程；
を含んでなる、細胞において興味対象のゲノム遺伝子座で二本鎖破断-誘導変異誘発を増加させる方法。
【請求項２】
前記遺伝子操作された稀切断性エンドヌクレアーゼが、表２(配列番号38〜57)及び表３(配列番号96〜152)から選択される触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなるキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼが、Trex(配列番号145〜149)及びTdt(配列番号201)の群から選択される触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼが配列番号194の触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
以下の工程：
(i)前記興味対象のゲノム遺伝子座で、１つの稀切断性エンドヌクレアーゼにより切断可能な１つのDNA標的配列を同定する工程；
(ii)前記少なくとも１つの稀切断性エンドヌクレアーゼを、興味対象のゲノム遺伝子座において少なくとも２つの近接するDNA二本鎖破断を創出することができるように遺伝子操作する工程；
(iii)前記DNA標的配列を前記少なくとも１つの稀切断性エンドヌクレアーゼと接触させ、そのことにより、前記興味対象のゲノム遺伝子座での二本鎖破断-誘導変異誘発が増加する細胞を取得する工程；
を含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項６】
以下の工程：
(i)前記興味対象のゲノム遺伝子座で、それぞれ１つの稀切断性エンドヌクレアーゼにより切断可能な２つの近接するDNA標的配列を同定する工程；
(ii)興味対象のゲノム遺伝子座で第１のDNA二本鎖破断を創出することができる第１の稀切断性エンドヌクレアーゼを遺伝子操作する工程；
(iii)興味対象のゲノム遺伝子座で第２のDNA二本鎖破断を創出することができる第２の稀切断性エンドヌクレアーゼを遺伝子操作する工程；
(iv)前記DNA標的配列を前記２つの稀切断性エンドヌクレアーゼと接触させ、そのことにより、前記興味対象のゲノム遺伝子座での二本鎖破断-誘導変異誘発が増加する細胞を取得する工程；
を含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記興味対象のゲノム遺伝子座中の前記少なくとも２つの近接するDNA二本鎖破断が12bp〜200bp離間している、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
興味対象のゲノム遺伝子座中に少なくとも２つの近接するDNA二本鎖破断を創出することができる前記稀切断性エンドヌクレアーゼが、少なくとも２つの触媒ドメインを含んでなるキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼである、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼがメガヌクレアーゼと少なくとも１つのヌクレアーゼ触媒ドメインとの融合タンパク質である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヌクレアーゼ触媒ドメインがエンドヌクレアーゼ活性を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヌクレアーゼ触媒ドメインが表２(配列番号38〜57)及び表３(配列番号96〜152)から選択されるか、その機能的変異体、バリアント又は誘導体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヌクレアーゼ触媒ドメインが、Col E7(配列番号97)、I-Tev I(配列番号106又は配列番号60；配列番号107〜108)、NucA(配列番号41及び112)、NucM(配列番号43及び113)、SNase(配列番号45〜47及び116〜118)からなる群より選択されるか、その機能的変異体、バリアント又は誘導体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼが配列番号84のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる融合タンパク質である、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼが配列番号54のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる融合タンパク質である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼが配列番号56又は配列番号57から選択されるタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる融合タンパク質である、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
前記ヌクレアーゼ触媒ドメインがエキソヌクレアーゼ活性を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼがメガヌクレアーゼと２つのヌクレアーゼ触媒ドメインとの融合タンパク質である、請求項８に記載の方法。
【請求項１８】
前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼがメガヌクレアーゼと１つのヌクレアーゼ触媒ドメインと１つの他の触媒ドメインとの融合タンパク質である、請求項８に記載の方法。
【請求項１９】
前記メガヌクレアーゼ及び前記ヌクレアーゼ触媒ドメインが少なくとも１つのペプチド性リンカーにより結合している、請求項８に記載の方法。
【請求項２０】
i)稀切断性エンドヌクレアーゼ；
ii)ペプチド性リンカー；
iii)ヌクレアーゼ触媒ドメイン.
を含んでなる、興味対象のゲノム遺伝子座中に少なくとも２つの近接するDNA二本鎖破断を創出するキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ。
【請求項２１】
前記稀切断性エンドヌクレアーゼがメガヌクレアーゼである、請求項２０に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ。
【請求項２２】
前記稀切断性エンドヌクレアーゼがI-CreIメガヌクレアーゼに由来する、請求項２０に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ。
【請求項２３】
前記稀切断性エンドヌクレアーゼがI-CreIメガヌクレアーゼに由来する単鎖メガヌクレアーゼである、請求項２０に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ。
【請求項２４】
前記ヌクレアーゼ触媒ドメインがエンドヌクレアーゼ活性を有する、請求項２０に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ。
【請求項２５】
前記ヌクレアーゼ触媒ドメインが表２(配列番号38〜57)及び表３(配列番号96〜152)から選択されるか、その機能的変異体、バリアント又は誘導体である、請求項２４に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ。
【請求項２６】
前記ヌクレアーゼ触媒ドメインが、コリシンE7(配列番号97)、I-Tev I(配列番号106又は配列番号60；配列番号107〜108)、NucA(配列番号41及び112)、NucM(配列番号43及び113)、SNase(配列番号45〜47及び116〜118)、それらの機能的変異体、バリアント又は誘導体から選択される、請求項２４に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ。
【請求項２７】
前記ヌクレアーゼ触媒ドメインが配列番号84のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体である、請求項２４に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ。
【請求項２８】
前記ヌクレアーゼ触媒ドメインが配列番号54のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体である、請求項２４に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ。
【請求項２９】
前記ヌクレアーゼ触媒ドメインが配列番号56又は配列番号57から選択されるタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体である、請求項２４に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ。
【請求項３０】
前記ヌクレアーゼ触媒ドメインがエキソヌクレアーゼ活性を有する、請求項２０に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ。
【請求項３１】
前記ヌクレアーゼ触媒ドメインが配列番号145〜149のTrexタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体である、請求項３０に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ。
【請求項３２】
前記ヌクレアーゼ触媒ドメインが配列番号194のTrexタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体である、請求項３０に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ。
【請求項３３】
i)第２のペプチド性リンカー；及び/又は
ii)追加の触媒ドメイン
を更に含んでなる、請求項２０に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ。
【請求項３４】
前記追加の触媒ドメインがヌクレアーゼ活性を有する、請求項３３に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ。
【請求項３５】
細胞の興味対象のゲノム遺伝子座中で二本鎖破断-誘導変異誘発を増加させるための、請求項２０に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ。
【請求項３６】
請求項２０に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼをコードする組換えポリヌクレオチド。
【請求項３７】
請求項３６に記載の組換えポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項３８】
請求項２０に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼとキャリアとを含んでなる組成物。
【請求項３９】
請求項２０に記載のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼと、真核細胞における二本鎖破断-誘導変異誘発の増加に使用するための指示書と、任意に、パッケージング材料、成分用容器及び二本鎖破断-誘導変異誘発の増加に使用する他の構成要素とを含んでなるキット。
【請求項４０】
以下の工程：
(i)興味対象のゲノム遺伝子座で、１つの頻繁切断性エンドヌクレアーゼにより切断可能な１つのDNA標的配列に近接する１つの稀切断性エンドヌクレアーゼにより切断可能な１つのDNA標的配列を同定する工程；
(ii)前記稀切断性エンドヌクレアーゼを、興味対象のゲノム遺伝子座において１つのDNA二本鎖破断を創出することができるように遺伝子操作する工程；
(iii)前記稀切断性エンドヌクレアーゼと前記頻繁切断性エンドヌクレアーゼとの融合タンパク質を作製する工程；
(iv)前記DNA標的配列を前記融合タンパク質と接触させて少なくとも２つの近接する二本鎖破断を創出し、そのことにより、前記興味対象のゲノム遺伝子座での二本鎖破断-誘導変異誘発が増加する細胞を取得する工程；
を含んでなる、細胞において興味対象のゲノム遺伝子座で二本鎖破断-誘導変異誘発を増加させる方法。
【請求項４１】
i)稀切断性エンドヌクレアーゼ；
ii)ペプチド性リンカー；及び
iii)頻繁切断性エンドヌクレアーゼ
を含んでなる、興味対象のゲノム遺伝子座中に少なくとも２つの近接するDNA二本鎖破断を創出する融合タンパク質。
【請求項４２】
前記稀切断性エンドヌクレアーゼがメガヌクレアーゼである、請求項４１に記載の融合タンパク質。
【請求項４３】
前記稀切断性エンドヌクレアーゼがI-CreIメガヌクレアーゼに由来する、請求項４１に記載の融合タンパク質。
【請求項４４】
前記稀切断性エンドヌクレアーゼがI-CreIメガヌクレアーゼに由来する単鎖メガヌクレアーゼである、請求項４１に記載の融合タンパク質。
【請求項４５】
i)第２のペプチド性リンカー；及び/又は
ii)追加の触媒ドメイン
を更に含んでなる、請求項４１に記載の融合タンパク質。
【請求項４６】
前記追加の触媒ドメインがヌクレアーゼ活性を有する、請求項４５に記載の融合タンパク質。
【請求項４７】
細胞の興味対象のゲノム遺伝子座中で二本鎖破断-誘導変異誘発を増加させるための、請求項４５に記載の融合タンパク質。
【請求項４８】
請求項４１に記載の融合タンパク質をコードする単離された、精製された又は組換えのポリヌクレオチド。
【請求項４９】
請求項４８に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項５０】
請求項４１に記載の融合タンパク質とキャリアとを含んでなる組成物。
【請求項５１】
請求項４１に融合タンパク質と、細胞における二本鎖破断-誘導変異誘発の増加に使用するための指示書と、任意に、パッケージング材料、成分用容器及び二本鎖破断-誘導変異誘発の増加に使用する他の構成要素とを含んでなるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、以下の米国仮出願：61/407,339(2010年10月27日出願)、61/472,072(2011年４月５日出願)及び61/505,783(2011年７月８日出願)(各々その全体が参照により本明細書中に組み込まれる)の優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、細胞において興味対象のゲノム遺伝子座での二本鎖破断-誘導変異誘発を増加させる方法に関し、そのことにより、ゲノム工学(治療用途を含む)及び細胞株工学の新たなツールを提供する。より具体的には、本発明は、遺伝情報の喪失を導き、NHEJ(非相同端部連結)による興味対象のゲノム遺伝子座の無瘢痕再ライゲーションを防止する、興味対象のゲノム遺伝子座での二本鎖破断-誘導変異誘発を増加させる方法に関する。本発明はまた、この方法を実施するために使用する、遺伝子操作エンドヌクレアーゼ(キメラであってもなくても)、ベクター、組成物及びキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
哺乳動物のゲノムは、種々のタイプの損傷に継続的に苦しめられているが、その中でも二本鎖破断(DSB)が最も危険であると考えられている(Haber 2000)。例えば、DSBは、複製フォークがニックに遭遇するか、又はその経路に沿ってイオン化放射粒子が反応性酸素種のクラスターを生成するときに生じることがある。これら反応性酸素種はそれ自体がDSBを引き起こし得る。分裂中の培養哺乳動物細胞については、５〜10％が常に少なくとも１つの染色体破断(又は染色分体ギャップ)を有するようである(Lieber及びKaranjawala 2004)。よって、DSBを修復する必要が一般に生じ(Li, Vogelら，2007)、細胞生存に重要である(Haber 2000)。修正の失敗又は不正確な修復は、有害なゲノム再配置、細胞サイクル停止及び/又は細胞死をもたらすことがある。
【０００４】
DSBの修復は、細胞の状況に依存し得る多様な機序を通じて起こり得る。相同組換えによる修復(最も正確なプロセス)は、破断点で元の配列を回復することができる。広範囲の配列相同性に対する厳格な依存性にために、この機序は、姉妹染色分体が極めて接近している細胞サイクルＳ期及びG2期に主に活性であることが示唆されている(Sonoda, Hocheggerら，2006)。単鎖アニーリングは、直列反復間でDSBを修復することにより欠失を促進し得る別の相同性依存プロセスである(Paques及びHaber 1999)。最後に、DNAの非相同端部連結(NHEJ)は、細胞サイクルを通して機能し得、相同染色体を必要としないので、DSB修復の主要経路である(Moore及びHaber 1996)。
【０００５】
NHEJは少なくとも２つの異なるプロセスを含んでなる(Feldmann, Schmiemannら，2000)。主要な、そして最も十分に特徴付けられた機序としては、直接再ライゲーション(Critchlow及びJackson 1998)によるか又はいわゆる微小相同性-媒介端部連結(MMEJ)(Ma, Kimら，2003)を介する、２つのDNA端部の残されたもの同士の再連結が挙げられる。破断端部の完全な再ライゲーションがおそらく最も頻繁な事象であるが、幾つかのヌクレオチドの損失又は獲得を伴うことが有り得る。
【０００６】
ほとんどのDNA修復プロセスと同様に、NHEJ経路によるDSB修復には３つの酵素活性が必要である：(i)損傷したDNAを除去するヌクレアーゼ、(ii)修復を助けるポリメラーゼ、及び(iii)リン酸ジエステル主鎖を修復するリガーゼ。DNA端部の性質に依存して、DNAは単純に再ライゲートされ得るか、又は末端ヌクレオチドが固有の酵素活性(例えば、ホスホキナーゼ及びエキソ-ヌクレアーゼ)により修飾又は除去され得る。欠けているヌクレオチドも、ポリメラーゼμ又はλにより付加され得る。加えて、リガーゼIV及びKu成分に依存せずクラススイッチ及びV(D)J組換えに関与する、代替の又はいわゆるバックアップの経路が記載されている(Ma, Kimら，2003)。全体としては、NHEJは、ヌクレオチドの切除又は挿入という代償を払ってまで、染色体の完全性を修復することを独自のゴールとするフレキシブルな経路とみることができる。
【０００７】
DNA修復は、物理的手段及び化学的手段の両方により誘引され得る。幾つかの化学物質は、DNA傷害を引き起こすことが知られており、慣用される。例えば、放射線類似作用剤(radiomimetic agent)は、DNAの糖部分に対するフリーラジカル攻撃を通して作用する(Povirk 1996)。DNA損傷を誘導する薬物の２つめの群としては、トポイソメラーゼＩ(TopoI)及びII(TopoII)のインヒビターが挙げられる(Burden and N. 1998；Teicher 2008)。他のクラスの化学物質は、DNAに共有結合し、ヌクレオチド切除修復(NER)系により修復される嵩高い付加物を形成する(Nouspikel 2009)。DNA損傷を誘導する化学物質は広範な応用を有する。ある種の薬剤は、特定の修復経路の研究で、より一般的に適用される(例えば、架橋剤はNERの研究に好まれる)が、ほとんどの薬物は同時に種々の傷害を誘発する(Nagy及びSoutoglou 2009)。更に、これら古典的なストラテジーを用いて誘導される変異の全体的発生率は、かなり低く、変異誘発を導くDNA損傷を正確なゲノムDNA配列に標的付けることはできない。
【０００８】
最も広範に使用される部位特異的変異誘発ストラテジーは、相同組換え(HR)を介する遺伝子ターゲッティング(GT)である。酵母及びマウスにおける効率的なGT手順は20年以上も前から利用可能である(Capecchi 1989；Rothstein 1991)。GTはシロイヌナズナ及びイネにおいても成功裡に達成されている(Hanin, Volrathら，2001)(Terada, Urawaら，2002；Endo, Osakabeら，2006；Endo, Osakabeら，2007)。代表的には、GT事象は、処理した哺乳動物細胞のかなり小さな集団で起こり、高等植物細胞では極端に低く、ランダム組込み事象の総数の0.01〜0.1％の範囲である(Terada, Johzuka-Hisatomiら，2007)。種々の生物で報告されている低いGT頻度は、DSB修復についてのHRとNHEJとの競合に起因すると考えられている。結果として、ドナー分子の端部は、HRに関与するよりむしろNHEJにより連結される可能性が高く、よってGT頻度は減少する。NHEJによるDSB修復は、挿入及び/又は欠失を生じる端部連結プロセスに起因してエラーを起こし易いことを示す広範なデータが存在する(Britt 1999)。よって、これらNHEJ-ベースのストラテジーは、細胞中に標的付けられた変異誘発について、HR-ベースのストラテジーより効率的であり得る。
【０００９】
稀切断性エンドヌクレアーゼであるI-SceIの発現は、シロイヌナズナ及びタバコにおいてI-SceI切断部位で変異を導入することが示されている(Kirik, Salomonら，2000)。しかし、エンドヌクレアーゼの使用は、稀に生じる天然の認識部位又は人工的に導入された標的部位に制限される。この問題を克服するため、選択配列に対して操作された特異性を有するメガヌクレアーゼが開発されている。メガヌクレアーゼは、独特な染色体配列を切断することができるが、DNA標的に対して高い特異性を示すので、全体的なゲノムの完全性に影響しない。天然のメガヌクレアーゼは、真核生物、細菌及び古細菌(archae)中に見出される広範なクラスのタンパク質であるホーミングエンドヌクレアーゼによって本質的に代表される(Chevalier及びStoddard, 2001)。I-SceI及びHOホーミングエンドヌクレアーゼの初期の研究により、これらタンパク質の切断活性を使用して生存細胞においてHR事象を開始する方法が示され、染色体DSBの組換え誘発特性(recombinogenic properties)が証明された(Dujon, Colleaux ら，1986；Haber, 1995)。以来、メガヌクレアーゼ-誘導HRは、細菌(Posfai, Kolisnychenkoら，1999)、哺乳動物細胞(Sargent, Brennemanら，1997；Cohen-Tannoudji, Robineら，1998；Donoho, Jasinら，1998)、マウス(Gouble, Smithら，2006)及び植物(Puchta, Dujonら，1996；Siebert及びPuchta, 2002)においてゲノム工学目的に成功裡に使用されている。メガヌクレアーゼは、所望の標的配列を切断するゲノム工学ツールを導くために選択される足場として浮上している(Paques及びDuchateau 2007)。
【００１０】
改変された特異性を有するメガヌクレアーゼの遺伝子操作を可能にするコンビナトリアルアセンブリプロセスは、Arnouldら(Arnould, Chamesら，2006；Arnould, Perezら，2007)；Smithら(Smith, Grizotら，2006)、Grizotら(Grizot, Smithら，2009)により説明されている。簡潔には、これらプロセスは、野生型メガヌクレアーゼのものとは数個のヌクレオチドのみが異なる基質特異性を有する局所的に遺伝子操作されたバリアントの同定に依拠する。別のタイプの特異的ヌクレアーゼは、いわゆるジンク-フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)である。ZFNは、DNA切断ドメインに融合した合成ジンク-フィンガーベースのDNA結合性ドメインから構成されるキメラタンパク質である。ジンク-フィンガーDNA結合性ドメインの改変により、ZFNは、実質的に任意の長ストレッチdsDNA配列を切断するように特異的に設計することができる(Kim, Chaら，1996；Cathomen及びJoung 2008)。NHEJ-ベースの標的付けられた変異誘発ストラテジーが、最近、幾つかの生物について、特異的なゲノム部位でDSBを創出するために合成ZFNを用いることによって開発された(Lloyd, Plaisierら，2005；Beumer, Trautmanら，2008；Doyon, McCammonら，2008；Meng, Noyesら，2008)。その後のNHEJによるDSB修復は連結部位での欠失及び/又は挿入を頻繁に生じる。例えば、ゼブラフィッシュ胚において、遺伝子操作されたZFNをコードするmRNAの注入は、所望の遺伝性変異を有する動物を導いた(Doyon, McCammonら，2008)。植物でも、類似のNHEJ-ベースの標的付けられた変異誘発が成功裡に適用された(Lloyd, Plaisierら，2005)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
これら強力なツールが利用可能であるにもかかわらず、依然として、二本鎖破断-誘導変異誘発を更に改善する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、標的付けられたDSB-誘導変異誘発の効率を増大させる新たなアプローチを開発し、この新たなアプローチを実行するために幾つかの触媒ドメインを含んでなる新たなタイプのメガヌクレアーゼを生み出した。これら新規の酵素が遺伝情報の喪失を導くDNA切断を可能にし、NHEJ経路が標的付けられた変異誘発を生じる。
【００１３】
発明の簡単な要旨
１つの実施形態において、  本発明は、細胞において興味対象のゲノム遺伝子座での二本鎖破断-誘導変異誘発を増加させる方法に関し、そのことにより、ゲノム工学(治療用途を含む)及び細胞株工学の新たなツールを提供する。より具体的には、第１の観点では、本発明は、遺伝情報の喪失を導き、NHEJによる興味対象のゲノム遺伝子座の無瘢痕再ライゲーションを防止する、興味対象のゲノム遺伝子座での二本鎖破断-誘導変異誘発を増加させる方法に関する。
【００１４】
第２の観点では、本発明は、遺伝子操作された酵素、より特定的には、興味対象のゲノム遺伝子座内のDNA配列を標的し、該DNA配列の近辺で少なくとも１つのDNA二本鎖破断及び遺伝情報の喪失を生じさせることができ、よってNHEJによる前記興味対象のゲノム遺伝子座の無瘢痕再ライゲーションを防止するキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼに関する。
第３の観点では、本発明は、興味対象のゲノム遺伝子座で少なくとも２つの近接するDNA二本鎖破断の創出し、NHEJによる興味対象のゲノム遺伝子座の無瘢痕再ライゲーションを防止する方法に関する。
【００１５】
第４の観点では、本発明は、遺伝子操作された酵素、より特定的には、興味対象のゲノム遺伝子座内のDNA配列を標的して、該興味対象の遺伝子座で少なくとも２つの近接するDNA二本鎖破断(DNAフラグメントの除去を少なくとも導く)を創出することができ、よってNHEJによる前記興味対象のゲノム遺伝子座の無瘢痕再ライゲーションを防止する遺伝子操作された稀切断性エンドヌクレアーゼ(キメラであってもなくても)に関する。
第５の観点では、本発明は、興味対象のゲノム遺伝子座で、融合タンパク質により、少なくとも２回の切断(少なくとも遺伝情報の喪失を導き、NHEJによる当該興味対象のゲノム遺伝子座の無瘢痕再ライゲーションを防止する)が可能なDNA標的配列を同定する方法を説明する。
【００１６】
第６の観点では、本発明は、１つの稀切断性エンドヌクレアーゼにより切断可能な１つのDNA標的配列を、１つの頻繁切断性エンドヌクレアーゼにより切断可能な１つのDNA標的配列に近接して含んでなる興味対象のゲノム遺伝子座において、少なくとも２つの近接するDNA二本鎖破断を創出することができる融合タンパク質に関する。
本発明はまた、この方法の実施に使用される特異的ベクター、組成物及びキットに関する。
上記目的は、本発明の或る観点を強調するものである。本発明の追加の目的、観点及び実施形態は、以下の発明の詳細な説明に見出される。
【００１７】
図面の簡単な説明
前述の特徴に加え、本発明は、以下の説明及び添付の図面から明らかになる他の特徴を更に含んでなる。本発明のより完全な認識及び付随する利点の多くは、下記の詳細な説明と併せて図面を参照することによって更に理解されるので、容易に認識される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１：介在配列の消去はDSB-誘導変異誘発を増強する。D21m(又はD21)及びR1m(又はR21)によりそれぞれ認識される22bpのDNA配列をプラスミドに導入する。２つの認識配列の間に10bpの介在配列をクローニングして、メガヌクレアーゼ結合に際しての立体障害を回避する。細胞に、メガヌクレアーゼD21m及びR1mを発現するプラスミドと共に標的プラスミドを導入することにより、２つの標的部位の同時切断が生じる。各標的部位の半分によって挟まれる、10bp配列を含んでなる介在フラグメントが切除される。遺伝情報を喪失したので、その後の、適合性又は不適合性DNA端部の再ライゲーションを介するNHEJは変異誘発事象を導く。
【図２】図２：DSB-誘導変異を検出するために行った分析の概略図。HEK293細胞を、標的プラスミドと１つ又は２つの異なるメガヌクレアーゼ発現プラスミドとで同時トランスフェクトする。トランスフェクションの２日後にDNAを抽出し、特異的PCRを行う。ディープシーケンシングテクノロジー(deep sequencing technology)(454, Roche)を用いてPCR産物を分析する。或いは、変異検出アッセイ(Transgenomic, Inc. USA)を行う。未処理細胞からのPCR産物を、メガヌクレアーゼで処理したPCR産物と混合する(等モル)。融解/アニーリング工程は、CEL-1酵素により認識・切断されるへテロ二重鎖DNAを生じる。消化後、DNAバンドを分析ゲル上で分離し、各バンドをデンシトメトリーにより定量する。
【図３】図３：I-CreIにより認識される標的DNAの配列。C1221は、I-CreIメガヌクレアーゼにより認識・切断されるパリンドロームDNA配列を表す。ヌクレオチドを標的の中心から外向きに(-/+)番号付ける。−２位〜＋２位のヌクレオチドは当該タンパク質と直接接触せず、むしろ該タンパク質の切断活性に干渉する。表は、−２位〜＋２位にヌクレオチド置換を有する試験標的のサブセットを表す。標的に対するI-CreIの結合及び切断活性を示す(++，強力；＋、良好；+/-、弱い；−、活性なし)。活性は、インビトロで決定した。
【図４】図４：DSB-誘導変異誘発を増強するストラテジー。遺伝情報の喪失は、例示として記載した下記ストラテジーの１つ又は任意のバリエーションにより得ることができる(かすかな垂直レーンは特異的DNA認識ドメインを示す)：−２つの異なる特異的稀切断性エンドヌクレアーゼ(Ａ)；−２つのエンドヌクレアーゼ触媒ドメインを有するキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ(二機能性)(Ｂ)；−１つのDNA-結合性ドメイン及び２つのエンドヌクレアーゼ触媒ドメインを有するキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ(二機能性)(Ｃ)；−稀切断性エンドヌクレアーゼとエンドヌクレアーゼ触媒ドメインと頻繁切断性エンドヌクレアーゼとの融合タンパク質(多機能性)(Ｄ)；−DNA端部をプロセシングすることが可能な１つのエキソヌクレアーゼ触媒ドメインを有するキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ(二機能性)(Ｅ)により生じる同時DSB。
【図５】図５：SC_GS-誘導変異誘発性DSB修復に対するTrex2発現の効果。Ａ：SC_GS(配列番号153)と空ベクター(配列番号175)又は漸増量のTrex2発現ベクター(配列番号154)とのトランスフェクション後にNHEJモデルで誘導されるGFP+細胞のパーセンテージ。Ｂ：SC_GS(配列番号153)と空ベクター(配列番号175)又は２つの異なる用量のTrex2コーディングベクター(配列番号154)により誘導された、NHEJモデルに存在するGS_CHO1標的の近傍で検出された変異誘発(挿入及び欠失)のパーセンテージ。Ｃ：SC_GSにより生じた二本鎖破断の端部での２(del2)、３(del3)又は４(del4)ヌクレオチドの欠失(3'オーバーハングの喪失に相当)に対応する事象のパーセンテージ(その他は検出された任意の他の変異誘発性NHEJ事象に対応する)。
【図６】図６：異なる遺伝子操作されたメガヌクレアーゼにより誘導された欠失の性質に対するTrex2発現の効果。  メガヌクレアーゼSC_RAG1(配列番号58、プラスミドpCLS2222(配列番号156)によりコードされる)、SC_XPC4(配列番号190、pCLS2510(配列番号157)によりコードされる)及びSC_CAPNS1(配列番号192、pCLS6163(配列番号158)によりコードされる)のみ(灰色ヒストグラム)で、又はTrex2(配列番号194、pCLS7673(配列番号154)によりコードされる)(黒色ヒストグラム)での処理後に、欠失事象のサイズを分析し、全ての欠失事象の中での示された欠失の頻度を算出した。
【図７】図７：SC_GSとSC_GSとTrex2との融合体発現用プラスミド  全ての融合構築物は、CMVプロモーターにより発現が駆動されるpCLS1853(配列番号175)にクローニングした。
【図８】図８：SC_GS及びTrex2融合SC_GSのSSA活性  CHO-K1細胞を、GS_CHO1.1標的を含有するSSA活性測定プラスミドと漸増量のSC_GS(pCLS2690、配列番号153)、SC_GS-5-Trex2(pCLS8082、配列番号186)、SC_GS-10-Trex2(pCLS8052、配列番号187)、Trex2-5-SC_GS(pCLS8053、配列番号188)又はTrex2-10-SC_GS(pCLS8054、配列番号153)とで同時トランスフェクトした。ONPG及び420nm光学密度検出を使用して、トランスフェクションの72時間後にβ-ガラクトシダーゼ活性を検出した。全体プロセスは自動化Velocity11 BioCelプラットフォームで実行した。
【図９】図９：変異誘発性DSB修復に対するTrex2融合SC_GSの効果  Ａ：漸増用量のSC_GS(pCLS2690、配列番号153)、SC_GS-5-Trex2(pCLS8082、配列番号186)、SC_GS-10-Trex2(pCLS8052、配列番号187)、Trex2-5-SC_GS(pCLS8053、配列番号188)又はTrex2-10-SC_GS(pCLS8054、配列番号189)でのトランスフェクションの３又は４日後に、NHEJモデルで誘導されたGFP+細胞のパーセンテージ。Ｂ：１又は６μgのSC_GS(pCLS2690、配列番号153)又はTrex2-10-SC_GS(pCLS8054、配列番号189)により誘導された欠失事象のディープシーケンシング分析。Ｃ：１又は６μgのSC_GS(pCLS2690、配列番号153)又はTrex2-10-SC_GS(pCLS8054、配列番号189)により生じた二本鎖破断の端部での２(del2)、３(del3)又は４(del4)ヌクレオチドの欠失に対応する欠失事象のパーセンテージ(その他は検出された任意の他の欠失事象に対応する)。
【図１０】図10：293H細胞株における標的付けられた変異誘発に対するTrex-SC_CAPNS1(配列番号197)融合体の効果  パネルＡ：SC_CAPNS1(配列番号192)又はTrex-SC_CAPNS1(配列番号197)でトランスフェクトした293H細胞株において得られる標的化変異誘発[TM]のパーセンテージ。  パネルＢ：SC_CAPNS1(配列番号192)又はTrex-SC_CAPNS1(配列番号197)でトランスフェクトした293H細胞株において得られる標的化変異誘発[TM]の性質。Del2、Del3及びDel4は、CAPNS1の切断部位での２、３及び４塩基対の欠失事象に対応する。「その他」は他の全てのTM事象を表す。
【図１１】図11：293H細胞株における標的付けられた変異誘発に対するTrex-SC_CAPNS1(配列番号197)融合体の効果  パネルＡ：SC_CAPNS1(配列番号192)又はTrex-SC_CAPNS1(配列番号197)でトランスフェクトしたDetroit551細胞株において得られる標的化変異誘発のパーセンテージ。  パネルＢ：SC_CAPNS1(配列番号192)又はTrex-SC_CAPNS1(配列番号197)でトランスフェクトしたDetroit551細胞株において得られる標的化変異誘発の性質。Del2、Del3及びDel4は、CAPNS1の切断部位での２、３及び４塩基対の欠失事象に対応する。「その他」は他の全てのTM事象を表す。
【図１２】図12：NHEJをモニターする細胞株における標的付けられた変異誘発に対するTdt発現の効果  パネルＡ：１μg又は３μgのSC_GS発現プラスミド(配列番号153)とそれぞれ漸増量のTdt発現ベクター(配列番号153)又は２μgのTdt発現プラスミド(配列番号153)とでの同時トランスフェクション後に、NHEJモデルで誘導されたGFP+細胞のパーセンテージ  パネルＢ：SC_GSと空ベクター又は２μgのTdtコーディングベクターとにより誘導された、NHEJモデルに存在するGS_CHO1 DNA標的の近傍でディープシーケンシングにより検出された標的化変異誘発のパーセンテージ。  パネルＣ：３μgのSC_GS発現ベクターと２μgの空ベクター又は２μgのTdtコーディングプラスミドとでのNHEJモデルの同時ランスフェクション後における、標的化変異誘発事象内での挿入事象のパーセンテージ。  パネルＤ：Tdtの存在下(TDT)又は不在下(空)でのサイズの関数としての挿入事象のパーセンテージ。
【図１３】図13：内因性RAG1遺伝子座でSC_RAG1(配列番号58)により誘導された標的付けられた変異誘発に対するTdt発現の効果  パネルＡ：５μgのトータルDNA(左)中又は10μgのトータルDNA(右)中３μgのSC_RAG1コーディングベクター(配列番号156)と種々の量のTdtコーディングベクター(配列番号202)との同時トランスフェクションにより誘導された、SC_RAG1標的の近傍でディープシーケンシングにより検出された標的化変異誘発のパーセンテージ。  パネルＢ：５μgのトータルDNA(左)中又は10μgのトータルDNA(右)中３μgのSC_RAG1コーディングベクター(配列番号156)と種々の量のTdtコーディングベクター(配列番号202)との同時トランスフェクション後における、標的化変異誘発事象内での挿入事象のパーセンテージ。  パネルＣ：５μgのトータルDNA(左)中又は10μgのトータルDNA(右)中３μgのSC_RAG1コーディングベクター(配列番号156)と種々の量のTdtコーディングベクター(配列番号202)との同時トランスフェクション後の内因性RAG1遺伝子座におけるサイズの関数としての挿入事象のパーセンテージ。
【図１４】図14：内因性CAPNS1遺伝子座でSC_CAPNS1(配列番号192)により誘導された標的付けられた変異誘発に対するTdt発現の効果  パネルＡ：１μgのSC_CAPNS1発現ベクター(配列番号158)と２μgのTdtコーディングプラスミド(配列番号202)との同時トランスフェクションにより誘導された、SC_CAPNS1標的の近傍でディープシーケンシングにより検出された標的化変異誘発のパーセンテージ。  パネルＢ：３μgのSC_CAPNS1発現ベクター(配列番号158)と２μgのTdtコーディングプラスミド(配列番号202)との同時トランスフェクション後における、標的化変異誘発事象内での挿入事象のパーセンテージ。  パネルＣ：３μgのSC_CAPNS1発現ベクター(配列番号158)と２μgのTdtコーディングプラスミド(配列番号202)との同時トランスフェクション後のCAPNS1遺伝子座におけるサイズの関数としての挿入事象のパーセンテージ。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
下記で特に定義しない限り、本明細書中で使用する全ての技術的及び科学的用語は、遺伝子治療、生化学、遺伝子学及び分子生物学の分野における当業者が通常理解する意味と同義である。
下記のものと類似の又は等価な全ての方法及び材料を、本発明の実施又は試験に使用することができるが、適切な方法及び材料が本明細書中に記載されている。本明細書中で言及した全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。矛盾する場合には、本明細書(定義を含む)に従う。更に、材料、方法及び例は単なる例示であって、別段の特定がない限り、限定を意図していない。
【００２０】
本発明の実施は、別段の指示がない限り、当業者の能力の範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子導入生物学、微生物学、組換えDNA及び免疫学の従来技法を用いる。このような技法は文献に十分に説明されている。例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA)；Molecular Cloning：A Laboratory Manual, Third Edition (Sambrookら，2001, Cold Spring Harbor, New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編，1984)；Mullisら，米国特許第4,683,195号；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries及びS. J. Higgins編，1984)；Transcription And Translation (B. D. Hames及びS. J. Higgins編，1984)；Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987)；Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986)；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)；the series, Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson及びM. Simon編集責任者，Academic Press, Inc., New York)、具体的には第154巻及び第155巻(Wuら編)及び第185巻，「Gene Expression Technology」(D. Goeddel編)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller及びM. P. Calos編，1987, Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer及びWalker編，Academic Press, London, 1987)；Handbook Of Experimental Immunology，第Ｉ巻〜第IV巻(D. M. Weir及びC. C. Blackwell編，1986)；及びManipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)を参照。
【００２１】
第１の観点によれば、本発明は、以下の工程：
(i)興味対象のゲノム遺伝子座で、１つの稀切断性エンドヌクレアーゼにより切断可能な少なくとも１つのDNA標的配列を同定する工程；
(ii)興味対象のゲノム遺伝子座内の前記DNA標的配列の近辺に遺伝情報の喪失を創出するように前記少なくとも１つの稀切断性エンドヌクレアーゼを遺伝子操作する工程；及び
(iii)前記DNA標的配列を前記少なくとも１つの稀切断性エンドヌクレアーゼと接触させて、興味対象のゲノム遺伝子座内の前記DNA標的配列の周囲に前記遺伝情報の喪失を創出し、そのことにより、前記興味対象のゲノム遺伝子座での二本鎖破断-誘導変異誘発が増加する細胞を取得する工程；
を含んでなる、細胞において興味対象のゲノム遺伝子座で二本鎖破断-誘導変異誘発を増加させる方法である。
【００２２】
好適な実施形態において、前記稀切断性エンドヌクレアーゼは、別の酵素活性により、興味対象のゲノム遺伝子座中に１つのDNA二本鎖破断を創出し、遺伝情報の喪失を生じる。より好適な実施形態において、前記別の酵素活性はヌクレアーゼ活性である。別のより好適な実施形態において、前記別の酵素活性はエキソヌクレアーゼ活性である。この好適な実施形態において、前記稀切断性エンドヌクレアーゼは、DNA端部を導き、そのためエキソヌクレアーゼ活性によりプロセシングされて遺伝情報の喪失を可能にし、前記興味対象のゲノム遺伝子座の無瘢痕再ライゲーションを防止する、１つのDNA二本鎖破断を創出するキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼである。
別の好適な実施形態において、前記稀切断性エンドヌクレアーゼは、DNA端部を導き、そのため(図4Eに示すように)ヌクレアーゼ活性以外の酵素活性(例えば、非限定例としてポリメラーゼ活性(TdT...)、デホスファターゼ活性)によりプロセシングされる１つのDNA二本鎖破断を創出するキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼである。
【００２３】
好適な実施形態において、前記本発明の稀切断性エンドヌクレアーゼは、表２(配列番号38〜57)及び表３(配列番号96〜152)に示される触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなるキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼである。別の好適な実施形態において、前記本発明のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、Trex(配列番号145〜149)及びTdt(配列番号201)からなる群より選択される触媒ドメイン、それらの機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる。
別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号194の触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号194のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体に融合している。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、単鎖メガヌクレアーゼと、配列番号194のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体とを含んでなる融合タンパク質である。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号171〜174及び配列番号197からなる群より選択される。
【００２４】
別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号201の触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号201のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体と融合している。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、単鎖メガヌクレアーゼと、配列番号201のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体とを含んでなる融合タンパク質である。
【００２５】
別の観点において、本発明はまた、遺伝子操作された酵素、より特定的には、興味対象のゲノム遺伝子座内でDNA配列を標的することができるキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼであって、該DNA配列の近辺に別の酵素活性により少なくとも１つのDNA二本鎖破断及び遺伝情報の喪失を生じさせ、よってNHEJによる前記興味対象のゲノム遺伝子座の無瘢痕再ライゲーションを防止するように遺伝子操作されたキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼに関する。例えば、非限定例として、前記本発明のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、興味対象のゲノム遺伝子座内の標的付けられた配列で１つのDNA二本鎖破断を創出してDNA端部を導く稀切断性エンドヌクレアーゼと、該DNA端部をプロセシングして興味対象のゲノム遺伝子座で情報の喪失を生じさせ得るヌクレアーゼドメインとの間の融合タンパク質である。前記ヌクレアーゼドメインは、エキソヌクレアーゼドメインであり得る。別の非限定例として、前記本発明のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、興味対象のゲノム遺伝子座内の標的付けられた配列で１つのDNA二本鎖破断を創出してDNA端部を導く稀切断性エンドヌクレアーゼと、少なくとも１つのDNAフラグメントを付加し、無瘢痕再ライゲーションを防止することによって、該DNA端部をプロセシングして興味対象のゲノム遺伝子座で遺伝情報の喪失を生じさせ得るポリメラーゼ活性(例えば、テンプレート非依存性ポリメラーゼ(TdT、．．．))との間の融合タンパク質である。
【００２６】
好適な実施形態において、前記本発明の稀切断性エンドヌクレアーゼは、表２及び表３に示される触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなるキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼである。別の好適な実施形態において、前記本発明のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、Trex(配列番号145〜149)及びTdt(配列番号201)からなる群より選択される触媒ドメイン、それらの機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる。
別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号194の触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号194のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体に融合している。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、単鎖メガヌクレアーゼと、配列番号194のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体とを含んでなる融合タンパク質である。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号171〜174及び配列番号197からなる群より選択される。
【００２７】
別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号201の触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号201のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体と融合している。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、単鎖メガヌクレアーゼと、配列番号201のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体とを含んでなる融合タンパク質である。
【００２８】
第３の観点において、本発明は、NHEJによる興味対象のゲノム遺伝子座の無瘢痕再ライゲーションを防止するように、興味対象のゲノム遺伝子座での少なくとも２つの近接するDNA二本鎖破断を創出する方法に関する。換言すれば、前記方法は、(図4A〜4Cに示すように)後記少なくとも２つの近接するDNA二本鎖破断が(非限定例としての)介在配列の除去を可能にし、興味対象のゲノム遺伝子座の無瘢痕再ライゲーションを予防するように、少なくとも２つの近接する二本鎖破断を創出することができる少なくとも１つの二本鎖破断創出剤の導入による、前記興味対象のゲノム遺伝子座中への２つの近接するDNA二本鎖破断の創出を含んでなる。
【００２９】
この第３の観点によれば、本発明は、以下の工程：
(i)前記興味対象のゲノム遺伝子座で、１つの稀切断性エンドヌクレアーゼにより切断可能な１つのDNA標的配列を同定する工程；
(ii)前記少なくとも１つの稀切断性エンドヌクレアーゼを、興味対象のゲノム遺伝子座において少なくとも２つの近接するDNA二本鎖破断を創出することができるように遺伝子操作する工程；
(iii)前記DNA標的配列を前記少なくとも１つの稀切断性エンドヌクレアーゼと接触させ、そのことにより、前記興味対象のゲノム遺伝子座での二本鎖破断-誘導変異誘発が増加する細胞を取得する工程；
を含んでなる方法に関する。
【００３０】
この第３の観点の好適な実施形態において、本方法の前記稀切断性エンドヌクレアーゼは、(図4B及び4Cに示すように)興味対象のゲノム遺伝子座において２つの近接するDNA二本鎖破断を創出することができる１つのキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼを提供するように遺伝子操作されている。この第２の観点の別の好適な実施形態において、本方法の前記稀切断性エンドヌクレアーゼは、興味対象のゲノム遺伝子座において２より多い近接するDNA二本鎖破断を創出することができる１つのキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼを提供するように遺伝子操作されている；この好適な実施形態において、前記１つのキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、興味対象のゲノム遺伝子座において３つの近接するDNA二本鎖破断を創出することができる。
【００３１】
好適な実施形態において、前記本発明の稀切断性エンドヌクレアーゼは、表２及び表３に示される触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなるキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼである。別の好適な実施形態において、前記本発明のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、Colicin-E7(配列番号97)、I-TevI(配列番号106又は配列番号60；配列番号107〜108)、NucA(配列番号41及び112)、NucM(配列番号43及び113)、SNase(配列番号45〜47及び116〜118)、BspD6I(配列番号124〜125)からなる群より選択される触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる。
【００３２】
別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号84の触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号84のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体と融合している。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号54のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体と融合している。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼと、配列番号54のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体とを含んでなる融合タンパク質である。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号85〜87及び配列番号91〜93からなる群より選択される。
【００３３】
別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号56及び57からなる群より選択される触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号56の触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号57の触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号56のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体と融合している。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼと、配列番号56のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体とを含んでなる融合タンパク質である。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号57のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体に融合している。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼと、配列番号57のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体とを含んでなる融合タンパク質である。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号61〜66及び配列番号70〜75からなる群より選択される。
【００３４】
この第３の観点の別の実施形態において、本発明は、２つの遺伝子操作された稀切断性エンドヌクレアーゼを示唆し、以下の工程：
(i)興味対象のゲノム遺伝子座で、それぞれ１つの稀切断性エンドヌクレアーゼにより切断可能な２つの近接するDNA標的配列を同定する工程；
(ii)興味対象のゲノム遺伝子座で第１のDNA二本鎖破断を創出することができる第１の稀切断性エンドヌクレアーゼを遺伝子操作する工程；
(iii)興味対象のゲノム遺伝子座で第２のDNA二本鎖破断を創出することができる第２の稀切断性エンドヌクレアーゼを遺伝子操作する工程；
(iv)前記DNA標的配列を前記２つの稀切断性エンドヌクレアーゼと接触させ、そのことにより、前記興味対象のゲノム遺伝子座での二本鎖破断-誘導変異誘発が増加する細胞を取得する工程；
を含んでなる。
【００３５】
好適な実施形態において、興味対象のゲノム遺伝子座でDNA配列をそれぞれ標的する前記２つの遺伝子操作された稀切断性エンドヌクレアーゼは、(図4Aに示されるように)キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼではない。別の好適な実施形態において、興味対象のゲノム遺伝子座でDNA配列をそれぞれ標的する前記２つの遺伝子操作された稀切断性エンドヌクレアーゼは、キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼである。別の好適な実施形態において、興味対象のゲノム遺伝子座でDNA配列をそれぞれ標的する前記２つの遺伝子操作された稀切断性エンドヌクレアーゼの一方のみが、キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼである。
好適な実施形態において、前記興味対象のゲノム遺伝子座に誘導される前記少なくとも２つの近接するDNA二本鎖破断は、少なくとも12bp離間している。別の好適な実施形態において、前記興味対象のゲノム遺伝子座に誘導される前記少なくとも２つの近接するDNA二本鎖破断は、少なくとも20bp、50bp、100、200、500又は1000bp離間している。別の好適な実施形態において、前記興味対象のゲノム遺伝子座に誘導される前記少なくとも２つの近接するDNA二本鎖破断間の距離は、12bp〜1000bp、より好ましくは12bp〜500bp、より好ましくは12bp〜200bpである。
【００３６】
第４の観点において、本発明は、興味対象のゲノム遺伝子座内のDNA配列を標的することができる稀切断性エンドヌクレアーゼであって、(図4A、4C及び4Eに示すように)前記興味対象の遺伝子座で、少なくとも２つの近接するDNA二本鎖破断を創出して少なくともDNAフラグメントの除去を導き、よってNHEJによる該興味対象のゲノム遺伝子座の無瘢痕再ライゲーションを防止するように遺伝子操作された稀切断性エンドヌクレアーゼ、より特定的にはキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼに関する。好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、少なくとも２つの触媒ドメインを含んでなる。より好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、２つのヌクレアーゼドメインを含んでなる。換言すれば、本発明は、以下：
i)稀切断性エンドヌクレアーゼ；
ii)ペプチド性リンカー；
iii)ヌクレアーゼ触媒ドメイン
を含んでなる、興味対象のゲノム遺伝子座に少なくとも２つの近接するDNA二本鎖破断を創出するキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼに関する。
【００３７】
好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼの前記稀切断性エンドヌクレアーゼ部分は、メガヌクレアーゼである；別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼの前記稀切断性エンドヌクレアーゼ部分は、I-CreI由来メガヌクレアーゼである。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼの前記稀切断性エンドヌクレアーゼ部分は、I-CreIメガヌクレアーゼに由来する単鎖メガヌクレアーゼである。
より好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼと少なくとも１つのヌクレアーゼ触媒ドメインとの融合タンパク質である。前記より好適な実施形態において、前記ヌクレアーゼ触媒ドメインはエンドヌクレアーゼ活性を有する；或いは、前記ヌクレアーゼ触媒ドメインはエキソヌクレアーゼ活性を有する。
【００３８】
好適な実施形態において、前記本発明の稀切断性エンドヌクレアーゼは、表２及び表３に示される触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなるキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼである。別の好適な実施形態において、前記本発明のキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、Trex(配列番号145〜149)、コリシンE7(配列番号97)、I-TevI(配列番号106又は配列番号60；配列番号107〜108)、NucA(配列番号41及び112)、NucM(配列番号43及び113)、SNase(配列番号45〜47及び116〜118)、BspD6I(配列番号124〜125)からなる群より選択される触媒ドメイン、それらの機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる。
別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼと、配列番号145〜149、配列番号97、配列番号106又は配列番号60、配列番号107〜108、配列番号41及び112、配列番号43及び113、配列番号45〜47及び116〜118、配列番号124〜125のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体とを含んでなる融合タンパク質である。
【００３９】
別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号194の触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号194のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体に融合している。別の好適な実施形態において、前記稀切断性エンドヌクレアーゼは、単鎖メガヌクレアーゼと配列番号194のタンパク質とを含んでなる融合タンパク質である。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号171〜174及び配列番号197からなる群より選択される。
別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号84の触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号84のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体に融合している。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号54のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体に融合している。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号85〜87及び配列番号91〜93からなる群より選択される。
【００４０】
別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号56及び57からなる群より選択される触媒ドメイン、それらの機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号56の触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号57の触媒ドメイン、その機能的変異体、バリアント又は誘導体を含んでなる。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号56のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体に融合している。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号57のタンパク質、その機能的変異体、バリアント又は誘導体に融合している。別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、配列番号61〜66及び配列番号70〜75からなる群より選択される。
【００４１】
別の好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、第２のペプチド性リンカー及び追加の触媒ドメインを更に含んでなる。換言すれば、本発明は、以下：
i)稀切断性エンドヌクレアーゼ；
ii)ペプチド性リンカー；
iii)ヌクレアーゼ触媒ドメイン.
iv)第２のペプチド性リンカー
v)追加の触媒ドメイン
を含んでなる、興味対象のゲノム遺伝子座に少なくとも２つの近接するDNA二本鎖破断を創出することができる、キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼに関する。
【００４２】
好適な実施形態において、前記追加の触媒ドメインはヌクレアーゼドメインである；この場合、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、稀切断性エンドヌクレアーゼと２つのヌクレアーゼ触媒ドメインとの融合タンパク質である。より好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼと２つのヌクレアーゼ触媒ドメインとの融合タンパク質である。別のより好適な実施形態において、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼと１つのヌクレアーゼ触媒ドメインと１つの他の触媒ドメインとの融合タンパク質である。
２つの近接する二本鎖破断を創出することができ、稀切断性エンドヌクレアーゼのDNA-結合性ドメインと２つの他のヌクレアーゼ触媒ドメインとから構成されるキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼもまた、本発明の範囲内に包含される。
【００４３】
第５の観点において、本発明は、遺伝情報の喪失を少なくとも導き且つNHEJによる興味対象のゲノム遺伝子座の無瘢痕再ライゲーションを予防する融合タンパク質により少なくとも２回切断可能なDNA標的配列を、当該興味対象のゲノム遺伝子座で同定する方法を記載する。より特定的には、この観点は、以下の工程：
(i)興味対象のゲノム遺伝子座で、１つの頻繁切断性エンドヌクレアーゼにより切断可能な１つのDNA標的配列に近接する１つの稀切断性エンドヌクレアーゼにより切断可能な１つのDNA標的配列を同定する工程；
(ii)前記稀切断性エンドヌクレアーゼを、興味対象のゲノム遺伝子座において１つのDNA二本鎖破断を創出することができるように遺伝子操作する工程；
(iii)前記稀切断性エンドヌクレアーゼと前記頻繁切断性エンドヌクレアーゼとの融合タンパク質を作製する工程；
(iv)前記DNA標的配列を前記融合タンパク質と接触させて少なくとも２つの近接する二本鎖破断を創出し、そのことにより、前記興味対象のゲノム遺伝子座での二本鎖破断-誘導変異誘発が増加する細胞を取得する工程；
を含んでなる、細胞において興味対象のゲノム遺伝子座で二本鎖破断-誘導変異誘発を増加させる方法である。
【００４４】
第６の観点において、本発明は、１つの稀切断性エンドヌクレアーゼにより切断可能な１つのDNA標的配列を、１つの頻繁切断性エンドヌクレアーゼにより切断可能な１つのDNA標的配列に近接して含んでなる、興味対象のゲノム遺伝子座中に少なくとも２つの近接するDNA二本鎖破断を創出することができる融合タンパク質に関する。換言すれば、本発明は、以下：
i)稀切断性エンドヌクレアーゼ；
ii)ペプチド性リンカー；
ii)頻繁切断性エンドヌクレアーゼ
を含んでなる融合タンパク質に関する。
好適な実施形態において、前記融合タンパク質の前記稀切断性エンドヌクレアーゼ部分は、メガヌクレアーゼである；別の好適な実施形態において、前記融合タンパク質の前記稀切断性エンドヌクレアーゼ部分は、I-CreI由来メガヌクレアーゼである。別の好適な実施形態において、前記融合タンパク質の前記稀切断性エンドヌクレアーゼ部分は、I-CreIメガヌクレアーゼに由来する単鎖メガヌクレアーゼである。
【００４５】
別の好適な実施形態において、前記更なる融合タンパク質は、第２のペプチド性リンカー及び追加の触媒ドメインを含んでなる。換言すれば、本発明は、１つの稀切断性エンドヌクレアーゼにより切断可能な１つのDNA標的配列を、１つの頻繁切断性エンドヌクレアーゼにより切断可能な１つのDNA標的配列に近接して含んでなり、前記融合タンパク質が以下：
i)稀切断性エンドヌクレアーゼ；
ii)ペプチド性リンカー；
ii)頻繁切断性エンドヌクレアーゼ；
iv)第２のペプチド性リンカー；
v)追加の触媒ドメイン
を含んでなる、興味対象のゲノム遺伝子座中に少なくとも２つの近接するDNA二本鎖破断を創出することができる融合タンパク質に関する。
好適な実施形態において、前記追加の触媒ドメインは(図4Dに示すように)ヌクレアーゼドメインである。別の好適な実施形態において、前記追加の触媒ドメインは非-ヌクレアーゼ触媒ドメインである。
【００４６】
本発明はまた、本発明のエンドヌクレアーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチド、それらをコード及び/又はベクター化する特異的ベクター(ポリヌクレオチド性であるか又はない)、それらを含んでなる組成物及び/又はキットに関する。これらの全ては、細胞において興味対象のゲノム遺伝子座で二本鎖破断-誘導変異誘発を増大させる本発明の方法の全体又は一部の実施に使用される。このようなキットは、細胞における二本鎖破断-誘導変異誘発の増大に使用するための指示書、パッケージング材、成分のための１又はそれより多い容器及び二本鎖破断-誘導変異誘発の増大に使用するその他の構成要素を含有し得る。
【００４７】
定義
−ポリペプチド配列中のアミノ酸残基は、本明細書中では一文字コードに従って指称する。一文字コードでは、例えば、ＱはGln又はグルタミン残基を意味し、ＲはArg又はアルギニン残基を意味し、ＤはAsp又はアスパラギン酸残基を意味する。
−アミノ酸置換は、或るアミノ酸残基の別のアミノ酸残基での置き換えを意味し、例えば、ペプチド配列におけるアルギニン残基のグルタミン残基での置き換えはアミノ酸置換である。
−変更/増強/増大/改善した切断活性とは、標的DNA配列に対する第１のメガヌクレアーゼの活性との比較において、第２のメガヌクレアーゼによる当該標的DNA配列に対するメガヌクレアーゼ切断活性の検出レベルの増加をいう(下記参照)。通常、第２のメガヌクレアーゼは、第１のもののバリアントであり、第１のメガヌクレアーゼと比較して１又はそれより多い置換アミノ酸残基を含んでなる。
【００４８】
−ヌクレオチドは下記のとおり指称する：ヌクレオシドの塩基を指称するために一文字コードを使用する：ａはアデニンであり、ｔはチミンであり、ｃはシトシンであり、ｇはグアニンである。縮重ヌクレオチドに関しては、ｒはｇ又はａ(プリンヌクレオチド)を表し、ｋはｇ又はｔを表し、ｓはｇ又はｃを表し、ｗはａ又はｔを表し、ｍはａ又はｃを表し、ｙはｔ又はｃ(ピリミジンヌクレオチド)を表し、ｄはｇ、ａ又はｔを表し、ｖはｇ、ａ又はｃを表し、ｂはｇ、ｔ又はｃを表し、ｈはａ、ｔ又はｃを表し、ｎはｇ、ａ、ｔ又はｃを表す。
−「メガヌクレアーゼ」により、12〜45bpの二本鎖DNA標的配列を有するエンドヌクレアーゼが意図される。メガヌクレアーゼは、各ドメインが単量体上にある二量体酵素であるか、又は２つのドメインを単一ポリペプチド上に含んでなる単量体酵素である。
【００４９】
−「メガヌクレアーゼドメイン」により、メガヌクレアーゼのDNA標的の一方の半分と相互作用する領域であって、該DNA標的の他方の半分と相互作用する(同メガヌクレアーゼの)他方のドメインと会合して該DNA標的を切断し得る機能的メガヌクレアーゼを形成することができる領域が意図される。
−「メガヌクレアーゼバリアント」又は「バリアント」により、親メガヌクレアーゼのアミノ酸配列中の少なくとも１つの残基を異なるアミノ酸で置き換えることで得られるメガヌクレアーゼが意図される。バリアントとしては、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20又はそれより多いアミノ酸残基の置換を有するものが挙げられる。このようなバリアントは、ベースの又は親のメガヌクレアーゼ配列に対して75、80、85、90、95、97.5、98、99、99.5％又はそれより多い相同性又は同一性(又はこの範囲内の任意の中間値)を有し得る。
【００５０】
−「ペプチドリンカー」、「ペプチド性リンカー」又は「ペプチドスペーサー」は、融合タンパク質における異なる単量体の接続及び該融合タンパク質の活性のための正確なコンホメーションの採用を可能し、且つ標的に関していずれの単量体の特異性も変更しないペプチド配列を意味するものとする。ペプチドリンカーは種々のサイズ(非限定的な例示範囲として３アミノ酸〜50アミノ酸)であり得る。このようなペプチド性リンカーの非限定例を表１に示す。
−(特には、表現「選択した細胞タイプ又は生物に関連する１つの細胞タイプ」における)「に関連する」により、前記選択した細胞タイプ又は前記選択した生物と特徴を共有する細胞タイプ又は生物が意図される；選択した細胞タイプ又は生物に関連するこの細胞タイプ又は生物は、前記選択した細胞タイプ又は生物に由来することもあり、しないこともある。
−「サブドメイン」により、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインの領域であって、ホーミングエンドヌクレアーゼDNA標的のハーフ部位(half-site)の別個の部分と相互作用する領域が意図される。
【００５１】
−「ターゲティングDNA構築物/最小修復マトリクス/修復マトリクス」は、インサイチュでDNA標的の5'側領域及び3'側領域に相同である第１及び第２の部分を含んでなるDNA構築物を意味するものとする。DNA構築物はまた、第１の部分と第２の部分との間に位置し、インサイチュで対応するDNA配列と幾らかの相同性を有するか、或いはインサイチュでDNA標的の5'側領域及び3'側領域と相同性を有さない第３の部分を含んでなる。DNA標的の切断後、興味対象の遺伝子座に含まれる標的付けられた遺伝子を含有するゲノムと修復マトリクスとの間で相同組換え事象が刺激される。ここで、DNA標的を含有するゲノム配列は、修復マトリクスの第３の部分並びに修復マトリクスの第１及び第２の部分の一部分(変動し得る)で置き換わる。
【００５２】
−「機能的バリアント」により、DNA標的配列を切断し得るバリアントが意図される。好ましくは、前記標的は親メガヌクレアーゼにより切断されない新たな標的である。例えば、このようなバリアントは、DNA標的配列と接触するか又は該DNA標的と直接若しくは間接に相互作用する位置にアミノ酸変化を有する。
−「選択」は、観察した特定の表現型(例えば、変更した切断活性)に基づく１又はそれより多いメガヌクレアーゼバリアントの単離を意味するものとする。この選択は、観察がなされるペプチド形態のバリアントの選択であり得、或いは選択したメガヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチドの選択であり得る。
【００５３】
−「スクリーニング」は、特定の表現型(例えば、変更した切断活性)を示す１又はそれより多いメガヌクレアーゼバリアントの逐次又は同時の選択を意味するものとする。
−「に由来(する)」は、親メガヌクレアーゼから創られ、したがってそのペプチド配列が当該親メガヌクレアーゼのペプチド配列に(一次配列レベルで)関連するが、該配列から(変異により)得られるメガヌクレアーゼバリアントを意味するものとする。
−「I-CreI」により、配列表の配列番号１の配列に相当する、pdbアクセッションコード1g9yの配列を有する野生型I-CreIが意図される。
【００５４】
−「新規な特異性を有するI-CreIバリアント」により、親メガヌクレアーゼのものとは異なる切断標的パターンを有するバリアントが意図される。互いに等価であり同様に使用される用語「新規な特異性」、「改変された特異性」、「新規切断特異性」、「新規基質特異性」とは、DNA標的配列のヌクレオチドに対するバリアントの特異性をいう。本特許出願において、記載される全てのI-CreIバリアントは、配列番号195に示されるように、野生型I-CreI配列の第１メチオニンの後に、追加のアラニンを含んでなる。これらバリアントはまた、野生型I-CreI配列の最後のプロリンの後に、２つの追加のアラニン残基及びアスパラギン酸残基を含んでなる。これら追加の残基は、当該酵素の性質に影響しない。混乱を回避するために、これら追加の残基は、本特許出願において言及するI-CreI又はバリアント中の残基の番号付けには影響しない。なぜならば、これらへの言及は、専ら、バリアント中に存在する野生型I-CreI酵素(配列番号１)の残基をいうからである。例えば、I-CreIの残基２は、実際には、最初のメチオニンの後に追加のアラニンを含んでなるバリアントの残基３である。
−「I-CreI部位」により、I-CreIによって切断される22〜24bpの二本鎖DNA配列が意図される。I-CreI部位には、野生型非パリンドロームI-CreIホーミング部位及びC1221とも呼ばれる配列5'-t-12c-11a-10a-9a-8a-7c-6g-5t-4c-3g-2t-1a+1c+2g+3a+4c+5g+6t+7t+8t+9t+10g+11a+12(配列番号２)のような派生パリンドローム配列が含まれる。
【００５５】
−「ドメイン」又は「コアドメイン」により、約100アミノ酸残基の配列に相当する、LAGLIDADGファミリーのホーミングエンドヌクレアーゼに特徴的なαββαββαフォールドである「LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメイン」が意図される。当該ドメインは、DNA標的の一方の半分と相互作用する、逆平行βシートに折り畳まれた４つのβ鎖(β1β2β3β4)を含んでなる。このドメインは、前記DNA標的の他方の半分と相互作用する別のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインと会合して、該DNA標的を切断し得る機能的エンドヌクレアーゼを形成することができる。例えば、二量体ホーミングエンドヌクレアーゼI-CreI(163アミノ酸)の場合には、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインは、残基６〜94に相当する。
−「サブドメイン」により、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインの領域であって、ホーミングエンドヌクレアーゼDNA標的のハーフ部位の異なる部分と相互作用する領域が意図される。
【００５６】
−「キメラDNA標的」又は「ハイブリッドDNA標的」により、２つの親メガヌクレアーゼ標的配列の異なる半分の融合体が意図される。加えて、この標的の少なくとも一方の半分は、少なくとも２つの別個のサブドメインにより結合されたヌクレオチドの組合せを含んでなり得る(組合せのDNA標的)。この定義には、本発明に従うキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼにより認識される、稀切断性エンドヌクレアーゼ標的配列(20〜24bp)及び頻繁切断性エンドヌクレアーゼ標的配列(４〜８bp)を含んでなるDNA標的配列も包含される。
−「βヘアピン」により、ループ又はターンにより接続された、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインの連続する２つのβストランドの逆平行βシート(β1β2又はβ3β4)が意図される。
−「単鎖メガヌクレアーゼ」、「単鎖キメラメガヌクレアーゼ」、「単鎖メガヌクレアーゼ誘導体」、「単鎖キメラメガヌクレアーゼ誘導体」又は「単鎖誘導体」により、WO2009095793に記載のようなペプチド性スペーサーにより連結された２つのLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼドメイン又はコアドメインを含んでなるメガヌクレアーゼが意図される。単鎖メガヌクレアーゼは、親メガヌクレアーゼ標的配列の各々からの異なる１つの半分を含んでなるキメラDNA標的配列を切断することができる。
【００５７】
−「DNA標的」、「DNA標的配列」、「標的配列」、「標的部位」、「標的」、「部位」、「興味対象部位」、「認識部位」、「ポリヌクレオチド認識部位」、「認識配列」、「ホーミング認識部位」、「ホーミング部位」、「切断部位」により、I-CreIのようなLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ若しくはバリアント又はI-CreIに由来する単鎖キメラメガヌクレアーゼで認識・切断される20〜24bpのパリンドローム状、部分的パリンドローム状(偽パリンドローム状)又は非パリンドローム状の二本鎖ポリヌクレオチド配列が意図される。このDNA標的配列は、ゲノム配列内で認識されたときにエンドヌクレアーゼで「切断可能」であることに適格であり、所与のエンドヌクレアーゼ又はそのバリアントのDNA標的配列に相当することが知られている。これら用語は、メガヌクレアーゼにより二本鎖破断(切断)が誘導される独特のDNA位置、好ましくはゲノム位置に言及するものである。DNA標的は、C1221について上記で示したように、二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の5'→3'配列で定義される。DNA標的の切断は、センス鎖及びアンチセンス鎖についてそれぞれ+2位及び-2位のヌクレオチドで生じる。そうでないと記載しない限り、I-CreIメガヌクレアーゼバリアントによるDNA標的の切断が生じる位置は、DNA標的のセンス鎖上の切断部位に相当する。
【００５８】
−「DNA標的ハーフ部位」、「ハーフ切断部位」又は「ハーフ部位」により、各々のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインが結合する、DNA標的の部分が意図される。
−「キメラDNA標的」又は「ハイブリッドDNA標的」により、２つの親メガヌクレアーゼ標的配列の異なる半分の融合体が意図される。加えて、この標的の少なくとも一方の半分は、少なくとも２つの別個のサブドメインが結合したヌクレオチドの組合せを含んでなり得る(組合せのDNA標的)。
【００５９】
−用語「エンドヌクレアーゼ」とは、DNA又はRNA分子内、好ましくはDNA分子内の核酸同士間の結合の加水分解(切断)を触媒し得る任意の野生型の又はバリアントの酵素をいう。エンドヌクレアーゼは、DNA又はRNA分子をその配列とは無関係に切断せず、DNA又はRNA分子を、「標的配列」又は「標的部位」と呼ばれる特異的なポリヌクレオチド配列で認識・切断する。エンドヌクレアーゼは、代表的には約12〜45塩基対(bp)長の、より好ましくは14〜45bp長のポリヌクレオチド認識部位を有するとき、稀切断性エンドヌクレアーゼとして分類され得る。稀切断性エンドヌクレアーゼは、規定の遺伝子座でのDNA二本鎖破断(DSB)を誘導することによってHRを有意に増加させる(Rouet, Smihら，1994；Rouet, Smihら，1994；Choulika, Perrinら，1995；Pingoud及びSilva 2007)。稀切断性エンドヌクレアーゼは、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ(Paques及びDuchateau 2007)、遺伝子操作されたジンクフィンガードメインとFokIのような制限酵素の触媒ドメインとの融合から生じるキメラジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)(Porteus及びCarroll 2005)、又は化学的エンドヌクレアーゼ(Eisenschmidt, Lanioら，2005；Arimondo, Thomasら，2006；Simon, Cannataら，2008)であり得る。化学的エンドヌクレアーゼにおいて、化学的又はペプチド性切断物質は、特異的標的配列を認識する核酸ポリマー又は別のDNAに結合されて、切断活性を特異的配列に対して標的付けられている。化学的エンドヌクレアーゼはまた、オルトフェナントロリンとDNA切断性分子と三重鎖形成性オリゴヌクレオチド(TFO；特異的DNA配列に結合することが知られている)との結合体(Kalish及びGlazer 2005)のような合成ヌクレアーゼを包含する。このような化学的エンドヌクレアーゼは、本発明による用語「エンドヌクレアーゼ」に含まれる。
【００６０】
稀切断性エンドヌクレアーゼはまた、例えば、FokI触媒ドメイン及びXanthomonas属の植物病原因子による感染プロセスで使用されるタンパク質ファミリーである転写アクチベーター様エフェクター(TALE)に由来するDNA結合性ドメインを用いる新たなクラスのキメラヌクレアーゼである、TALENであり得る(Boch, Scholzeら，2009；Moscou及びBogdanove 2009；Christian, Cermakら，2010；Li, Huangら2011)。FokI-ベースのTALE-ヌクレアーゼ(TALEN)の機能的レイアウトは、本質的には、ジンクフィンガーDNA結合性ドメインがTALEドメインで置き換えられているZFNの機能的レイアウトである。このように、TALENによるDNA切断には、非特異的中心領域に接する２つのDNA認識領域が必要である。本発明に包含される稀切断性エンドヌクレアーゼはまた、TALENに由来し得る。
稀切断性エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼの名称でも知られるホーミングエンドヌクレアーゼであり得る。このようなホーミングエンドヌクレアーゼは当該分野で周知である(Stoddard 2005)。ホーミングエンドヌクレアーゼはDNA標的配列を認識し、一本鎖又は二本鎖破断を生じさせる。12〜45塩基対(bp)長、通常は14〜40bp長のDNA標的部位を認識するホーミングエンドヌクレアーゼは高度に特異的である。本発明によるホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、LAGLIDADGエンドヌクレアーゼ、HNHエンドヌクレアーゼ又はGIY-YIGエンドヌクレアーゼに相当し得る。「二本鎖破断創出因子」のような表現が、本発明による稀切断性エンドヌクレアーゼを適格にするために用いられ得る。
【００６１】
野生では、メガヌクレアーゼは、本質的には、ホーミングエンドヌクレアーゼに代表される。ホーミングエンドヌクレアーゼ(HE)は、数百のタンパク質ファミリーを含む天然メガヌクレアーゼの広範なファミリーである(Chevalier及びStoddard 2001)。これらタンパク質は、「ホーミング」と呼ばれるプロセスによって伝播する可動遺伝子エレメントによりコードされる：エンドヌクレアーゼは、可動エレメントが存在しない同族対立遺伝子を切断することにより、レシピエント遺伝子座に可動DNAを複製する相同組換え事象を刺激する。エンドヌクレアーゼは、効力及び特異性に関する例外的な切断特性を考えれば、新規で高度に特異的なエンドヌクレアーゼを誘導するための理想的な足場を努め得る。
HEは４つの主要なファミリーに属する。LAGLIDADGファミリー(これは、触媒中心に関与する保存されたペプチド性モチーフに因んで名付けられた)は、最も広範で、最も特徴付けられた群である。現在、７つの構造が利用可能である。このファミリーのほとんどのタンパク質は単量体であり、２つのLAGLIDADGモチーフを提示する一方で、少数のものは唯１つのモチーフを有し、よって二量体化してパリンドローム又は偽パリンドロームの標的配列を切断する。
【００６２】
LAGLIDADGペプチドがそのファミリーメンバー内で保存された唯一の領域ではあるが、これらタンパク質は非常に類似する構造を有する。触媒コアは、ホモ二量体、例えばI-CreI(Chevalier, Monnatら，2001)、I-MsoI(Chevalier, Turmelら，2003)及びI-CeuI(Spiegel, Chevalierら，2006)に関しては完全な二回転対称であり、単量体、例えばI-SceI(Moure, Gimbleら，2003)、I-DmoI(Silva, Dalgaardら，1999)又はI-AniI(Bolduc, Spiegelら，2003)に関しては偽対称である２つのDNA-結合性ドメインに挟まれている。両単量体とも又は(単量体タンパク質については)両ドメインとも、二価カチオンの周辺に組織化される触媒コアに寄与する。触媒コアの直ぐ上部で、２つのLAGLIDADGペプチドはまた、二量体化界面において本質的な役割を果たしている。DNA結合は、DNA主要溝上に位置する２つの典型的なサドル形状のαββαββαフォールドに依存する。その他のドメインは、例えば、PI-PfuI(Ichiyanagi, Ishinoら，2000)及びPI-SceI(Moure, Gimbleら，2002)のようなインテイン中に見出すことができ、このタンパク質スプライシングドメインもまたDNA結合に関与する。
Ｎ-末端I-DmoIドメインとI-CreI単量体との融合による機能的なキメラメガヌクレアーゼの作製は、LAGLIDADGタンパク質の可塑性を証明している(Chevalier, Kortemmeら，2002；Epinat, Arnouldら，2003)；国際PCT出願WO 03/078619(Cellectis)及びWO 2004/031346(Fred Hutchinson Cancer Research Center, Stoddardら))。
【００６３】
異なるグループもまた、I-CreI(Seligman, Stephensら，1997；Sussman, Chadseyら，2004)；国際PCT出願WO 2006/097784、WO 2006/097853、WO 2007/060495及びWO 2007/049156(Cellectis)；(Arnould, Chamesら，2006；Rosen, Morrisonら，2006；Smith, Grizotら，2006)、I-SceI(Doyon, Pattanayakら，2006)、PI-SceI(Gimble, Moureら，2003)及びI-MsoI(Ashworth, Havranekら，2006)の特異性を局所的に変更する半合理的アプローチを使用している。
加えて、局所的に変更した特異性を有する数百のI-CreI誘導体が、半合理的アプローチ及び高スループットスクリーニングを組み合わせることにより人工的に創り出された：
−  I-CreIの残基Q44、R68及びR70、又はQ44、R68、D75及びI77が変異誘発され、DNA標的の±３〜５位(5NNN DNA標的)で変更した特異性を有するバリアントの一団がスクリーニングにより同定された(国際PCT出願WO 2006/097784及びWO 2006/097853(Cellectis)；(Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)。
−  I-CreIの残基K28、N30及びQ38、又はN30、Y33及びQ38、又はK28、Y33、Q38及びS40が変異誘発され、DNA標的の±８〜10位(10NNN DNA標的)で変更した特異性を有するバリアントの一団がスクリーニングにより同定された(Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)；国際PCT出願WO 2007/060495及びWO 2007/049156(Cellectis))。
【００６４】
２つの異なるバリアントを組み合わせて、各バリアントDNA標的配列の異なる２つの半分の融合から生じたキメラ標的を切断し得る機能的なへテロ二量体エンドヌクレアーゼに組み立てた((Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006)；国際PCT出願WO 2006/097854及びWO 2007/034262)。
更に、I-CreIの残基28〜40及び44〜77は、ホーミングエンドヌクレアーゼの標的ハーフ部位(half-site)の異なる部分に結合し得る２つの部分的に分離可能な機能的サブドメインを形成していることが示された(Smith, Grizotら，2006)；国際PCT出願WO 2007/049095及びWO 2007/057781(Cellectis))。
I-CreIの同じ単量体内の２つのサブドメインからの変異を組み合わせることにより、各サブドメインが結合する±３〜５位及び±８〜10位のヌクレオチドを含んでなるパリンドロームの組合せDNA標的配列を切断し得る新規キメラ分子(ホモ二量体)の設計が可能になった((Smith, Grizotら，2006)；国際PCT出願WO 2007/049095及びWO 2007/057781(Cellectis))。
【００６５】
メガヌクレアーゼバリアントを製造する方法及び哺乳動物細胞又は酵母細胞における切断-誘導組換えに基づくアッセイ(変更した特異性を有するバリアントをスクリーニングするために使用される)は、国際PCT出願WO 2004/067736；(Epinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006)に記載されている。これらアッセイは、標準的な方法によりモニターすることができる機能的なLacZレポーター遺伝子を生じる。
前の２つの工程の組合せにより、４つの異なるサブドメインを含むより大きなコンビナトリアルアプローチが可能になる。この異なるサブドメインは別々に改変されて、選択された特異性を有する完全に再設計されたメガヌクレアーゼバリアント(へテロ二量体又は単鎖分子)が得られるように組み合わされる。第１の工程において、新規なメガヌクレアーゼの二者一組が、切断したい標的に由来するパリンドローム状標的を切断する新たな分子(「ハーフ-メガヌクレアーゼ」)に組み合わされる。その後、この「ハーフ-メガヌクレアーゼ」を組み合せることで、興味対象の標的を切断するへテロ二量体種が生じ得る。４セットの変異の、モデル標的配列又は異なる遺伝子からの配列を切断するへテロ二量体エンドヌクレアーゼへの組立てが、以下のCellectisの国際特許出願：XPC遺伝子(WO2007/093918)、RAG遺伝子(WO2008/010093)、HPRT遺伝子(WO2008/059382)、β-２ミクログロブリン遺伝子(WO2008/102274)、Rosa26遺伝子(WO2008/152523)、ヒトヘモグロビンβ遺伝子(WO2009/13622)及びヒトインターロイキン-２レセプターγ鎖遺伝子(WO2009019614)に記載されている。
【００６６】
これらバリアントは、真性の(genuine)染色体配列を切断するために用いることができ、遺伝子治療を含むいくつかの分野において、新しい展望のための道を切り開く。
このようなエンドヌクレアーゼの例としては、I-Sce I、I-Chu I、I-Cre I、I-Csm I、PI-Sce I、PI-Tli I、PI-Mtu I、I-Ceu I、I-Sce II、I-Sce III、HO、PI-Civ I、PI-Ctr I、PI-Aae I、PI-Bsu I、PI-Dha I、PI-Dra I、PI-Mav I、PI-Mch I、PI-Mfu I、PI-Mfl I、PI-Mga I、PI-Mgo I、PI-Min I、PI-Mka I、PI-Mle I、PI-Mma I、PI-Msh I、PI-Msm I、PI-Mth I、PI-Mtu I、PI-Mxe I、PI-Npu I、PI-Pfu I、PI-Rma I、PI-Spb I、PI-Ssp I、PI-Fac I、PI-Mja I、PI-Pho I、PI-Tag I、PI-Thy I、PI-Tko I、PI-Tsp I、I-MsoIが挙げられる。
ホーミングエンドヌクレアーゼは、LAGLIDADGエンドヌクレアーゼ、例えばI-SceI、I-CreI、I-CeuI、I-MsoI及びI-DmoIであり得る。
【００６７】
前記LAGLIDADGエンドヌクレアーゼは、２つのLAGLIDADGモチーフを含有し単量体として機能し、且つその分子量が唯一のLAGLIDADGモチーフを含有しホモ二量体として機能するI-CreIのような他のファミリーメンバーの分子量の約２倍であるファミリーのメンバーであるI-Sce Iであり得る。
本出願で言及するエンドヌクレアーゼは、野生型(天然に生じる)及びバリアントのエンドヌクレアーゼの両方を包含する。本発明によるエンドヌクレアーゼは、「バリアント」エンドヌクレアーゼ、すなわち天然には存在せず、遺伝子工学的操作又はランダム変異誘発により得られるエンドヌクレアーゼ、すなわち遺伝子操作されたエンドヌクレアーゼであり得る。このバリアントエンドヌクレアーゼは、例えば、野生型の、天然に生じるエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列における少なくとも１つの残基の異なるアミノ酸での置換により得ることができる。前記置換は、例えば、部位-特異的変異誘発及び/又はランダム変異誘発により導入することができる。本発明の枠内で、このようなバリアントエンドヌクレアーゼは依然として機能的である。すなわち、それらは、標的配列を認識し、特異的に切断して遺伝子ターゲッティングプロセスを開始する能力を保持する。
【００６８】
本発明によるバリアントエンドヌクレアーゼは、対応する野生型エンドヌクレアーゼの標的配列とは異なる標的配列を切断する。新規特異性を有するこのようなバリアントエンドヌクレアーゼを取得する方法は、当該分野において周知である。
エンドヌクレアーゼバリアントは、ホモ二量体(２つの同一単量体を含んでなるメガヌクレアーゼ)であってもよいし、へテロ二量体(２つの非同一な単量体を含んでなるメガヌクレアーゼ)であってもよい。
新規特異性を有するエンドヌクレアーゼは、遺伝子を標的することにより興味対象の導入遺伝子をゲノム中に所定の位置で組み込む、本発明による方法において使用することができる。
【００６９】
−「親のメガヌクレアーゼ」は、野生型メガヌクレアーゼ又は該野生型メガヌクレアーゼの同一の性質を有するバリアント、或いは同じメガヌクレアーゼの野生型バージョンと比較して幾らか変更した特徴を有するメガヌクレアーゼを意味するものとする。本発明において、親のメガヌクレアーゼとは、工程(ａ)において第１シリーズのバリアントが由来する当初のメガヌクレアーゼ、又は工程(ｂ)において第２シリーズのバリアントが由来するメガヌクレアーゼ、又は工程(ｋ)において第３シリーズのバリアントが由来するメガヌクレアーゼをいうことができる。
−「送達ベクター」により、本発明で必要とされる因子/化学物質及び分子(タンパク質又は核酸)を細胞に接触させるか又は細胞内若しくは細胞区画内へ送達するために、本発明において使用することができる任意の送達ベクターが意図される。これには、リポソーム送達ベクター、ウイルス送達ベクター、薬剤送達ベクター、化学キャリア、ポリマーキャリア、リポプレックス(lipoplex)、ポリプレックス(polyplex)、デンドリマー、超微粒気泡(超音波造影剤)、ナノ粒子、エマルジョン又は他の適切な移入ベクターが含まれるが、これらに限定されない。これら送達ベクターは、分子、化学物質、高分子(遺伝子、タンパク質)、又は他のベクター、例えばプラスミド、Diatosにより開発されたペプチドの送達を可能にする。これらの場合において、送達ベクターは分子キャリアである。「送達ベクター」により、トランスフェクションを実行するための送達方法もまた意図される。
【００７０】
−用語「ベクター」とは、連結されている別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。本発明における「ベクター」としては、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、又は染色体、非染色体、半-合成若しくは合成の核酸からなり得る線状若しくは環状のDNA若しくはRNA分子が挙げられるが、これらに限定されない。好適なベクターは、自律複製(エピソームベクター)及び/又は連結された核酸の発現(発現ベクター)が可能なものである。多数の適切なベクターが当業者に公知であり、市販されている。
ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス(例えばアデノ関連ウイルス)、コロナウイルス、マイナス鎖RNAウイルス、例えばオルソミクソウイルス(例えば、インフルエンザウイルス)、ラブドウイルス(例えば、狂犬病及び水疱性口内炎ウイルス)、パラミクソウイルス(例えば、麻疹及びセンダイ)、プラス鎖RNAウイルス、例えばピコルナウイルス及びアルファウイルス、及び二本鎖DNAウイルス(アデノウイルス、ヘルペスウイルス(例えば、単純ヘルペスウイルス１型及び２型、エプスタイン-バーウイルス、サイトメガロウイルス)、及びポックスウイルス(例えば、ワクシニア、鶏痘及びカナリア痘)を含む)が挙げられる。他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、及び肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例としては：トリ白血病-肉腫群、哺乳動物Ｃ-型、Ｂ-型ウイルス、Ｄ型ウイルス、HTLV-BLV群、レンチウイルス、スプマウイルス(Coffin, J. M., Retroviridae：The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fieldsら編, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996)が挙げられる。
【００７１】
−「レンチウイルスベクター」は、比較的大きなパッケージング能力、低い免疫原性及び広範囲の異なる細胞タイプを高効率で安定的に形質導入する能力のため、遺伝子送達に非常に有望であるHIV-ベースのレンチウイルスベクターを意味する。レンチウイルスベクターは、通常、産生細胞中への３つ(パッケージング、エンベロープ及び移入)又はそれより多いプラスミドの一過性トランスフェクション後に生じる。HIVと同様に、レンチウイルスベクターは、ウイルス表面糖タンパク質と細胞表面上のレセプターとの相互作用により標的細胞に進入する。進入に際して、ウイルスRNAは、ウイルス逆転写酵素複合体により媒介される逆転写を受ける。逆転写の産物は二本鎖線状ウイルスDNAであり、これが感染細胞のDNAへのウイルス組込みのための基質である。
−「組込みレンチウイルスベクター(又はLV)」は、非限定例として、標的細胞のゲノムに組み込まれ得るベクターを意味する。
−対して、「非組込みレンチウイルスベクター(又はNILV)」は、ウイルスインテグラーゼの作用により標的細胞のゲノムに組み込まれない効率的な遺伝子送達ベクターを意味する。
【００７２】
好適なベクターの１つのタイプは、エピソーム、すなわち、染色体外複製が可能な核酸である。好適なベクターは、自律複製及び/又は連結された核酸の発現が可能なものである。作動可能に連結された遺伝子の発現を導くことができるベクターは、本明細書中で「発現ベクター」と呼ぶ。本発明によるベクターは、YAC(酵母人工染色体)、BAC(細菌人工)、バキュロウイルスベクター、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、又は染色体、非染色体、半-合成若しくは合成のDNAからなり得る線状若しくは環状のDNA若しくはRNA分子を含むが、これらに限定されない。一般には、組換えDNA技法に有用な発現ベクターは、しばしば、一般には(ベクター形態で染色体に結合していない)環状二本鎖DNAループをいう「プラスミド」の形態である。多数の適切なベクターが当業者に公知であり、市販されている。ベクターは選択マーカーを含み得る。例えば：真核細胞培養については、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、ジヒドロフォレートレダクターゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グルタミンシンセターゼ、及びヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ；S. cerevisiaeについてはTRP1；E. coliにおいてはテトラサイクリン、リファンピシン又はアンピシリン耐性。好ましくは、前記ベクターは、興味対象のポリペプチドをコードする配列が該ポリペプチドの産生又は合成を可能にするに適切な転写及び翻訳制御エレメントの制御下に配置されている発現ベクターである。したがって、前記ポリヌクレオチドは発現カセットに含まれる。より具体的には、ベクターは、複製起点、前記コーディングポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーター、リボソーム結合部位、RNA-スプライシング部位(ゲノムDNAを使用する場合)、ポリアデニル化部位及び転写終止部位を含んでなる。これはまた、エンハンサー又はサイレンサーエレメントを含んでなり得る。プロモーターの選択は、ポリペプチドを発現させる細胞に依存する。適切なプロモーターとしては、組織特異的及び/又は誘導性プロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターの例は：重金属レベルの増大により誘導される真核生物性メタロチオニンプロモーター、イソプロピル-β-D-チオガラクト-ピラノシド(IPTG)に応答して誘導される原核生物性lacZプロモーター及び温度上昇により誘導される真核生物性熱ショックプロモーターである。組織特異的プロモーターの例は、骨格筋クレアチンキナーゼ、前立腺-特異的抗原(PSA)、α-アンチトリプシンプロテアーゼ、ヒトサーファクタント(SP)Ａ及びＢタンパク質、β-カゼイン及び酸性ホエータンパク質遺伝子である。
【００７３】
−誘導性プロモーターは、病原体又はストレスにより、より好ましくは低温、高温、UV光、又は高イオン濃度のようなストレスにより誘導され得る(Potenza Cら，2004, In vitro Cell Dev Biol 40:1-22で概説される)。誘導性プロモーターは化学物質により誘導され得る((Moore, Samalovaら，2006)；(Padidam 2003)；(Wang, Zhouら，2003)；(Zuo及びChua 2000)で概説される)。
送達ベクター及びベクターは、ソノポレーション(sonoporation)若しくはエレクトロポレーションのような任意の細胞透過技法又はこれら技法の派生法と組み合わされ得る。
−細胞により、任意の原核生物又は真核生物の生存細胞、インビトロ培養用にこれら生物から導いた細胞株、動物又は植物起源の初代細胞が意図される。
−「初代細胞」により、非常に少数のものしか分裂を経験していないので、連続分裂性(continuous tumorigenic)の又は人工的に不死化した細胞株と比較して、由来する組織の主要な機能的構成要素及び特徴をより代表する、生存組織(すなわち生検材料)から直接取り出し、インビトロ増殖用に樹立した細胞が意図される。よって、これら細胞は、言及するインビボ状態についてより価値のあるモデルである。
【００７４】
−本発明の枠内で、「真核細胞」とは、真菌、植物若しくは動物細胞又は下記に列挙する生物に由来するインビトロ培養用に樹立した細胞株をいう。より好ましくは、真菌は、アスペルギルス属(Aspergillus)、ペニシリウム属(Penicillium)、アクレモニウム属(Acremonium)、トリコデルマ属(Trichoderma)、クリソスポリウム属(Chrysoporium)、モルティエレラ属(Mortierella)、クルイベロマイセス属(Kluyveromyces)又はピキア属(Pichia)のものである；より好ましくは、真菌は、アスぺルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)、ペニシリウム・クリソゲナム(Penicillium chrysogenum)、ペニシリウム・シトリヌム(Penicillium citrinum)、アクレモニウム・クリソゲナム(Acremonium Chrysogenum)、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)、モルティエレラ・アルペン(Mortierella alpine)、クリソスポリウム・ルクノウェンス(Chrysosporium lucknowense)、クルイベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)又はピキア・シフェリイ(Pichia ciferrii)である。
【００７５】
より好ましくは、植物は、アラビドプシス属(Arabidospis)、タバコ属(Nicotiana)、ナス属(Solanum)、アキノノゲシ属(lactuca)、アブラナ属(Brassica)、イネ属(Oryza)、アスパラガス属(Asparagus)、エンドウ属(Pisum)、ウマゴヤシ属(Medicago)、トウモロコシ属(Zea)、オオムギ属(Hordeum)、ライムギ属(Secale)、コムギ属(Triticum)、トウガラシ属(Capsicum)、キュウリ属(Cucumis)、カボチャ属(Cucurbita)、スイカ属(Citrullis)、ミカン属(Citrus)、モロコシ属(Sorghum)のものである；より好ましくは、植物は、次の種：シロイヌナズナ(Arabidospis thaliana)、タバコ(Nicotiana tabaccum)、トマト(Solanum lycopersicum)、ジャガイモ(Solanum tuberosum)、ナス(Solanum melongena)、トマト(Solanum esculentum)、レタス(Lactuca saliva)、セイヨウアブラナ(Brassica napus)、ヤセイカンラン(Brassica oleracea)、ブラッシカ・ラパ(Brassica rapa)、アフリカイネ(Oryza glaberrima)、イネ(Oryza sativa)、アスパラガス(Asparagus officinalis)、エンドウ(Pisum sativum)、ムラサキウマゴヤシ(Medicago sativa)、トウモロコシ(zea mays)、オオムギ(Hordeum vulgare)、ライムギ(Secale cereal)、パンコムギ(Triticum aestivum)、デュラムコムギ(Triticum durum)、カプシカム・サティバス(Capsicum sativus)、ペポカボチャ(Cucurbita pepo)、スイカ(Citrullus lanatus)、メロン(Cucumis melo)、ライム(Citrus aurantifolia)、ザボン(Citrus maxima)、シトロン(Citrus medica)、マンダリン(Citrus reticulata)のものである。
より好ましくは、動物細胞は、ヒト属(Homo)、クマネズミ属(Rattus)、ハツカネズミ属(Mus)、イノシシ属(Sus)、ウシ属(Bos)、ダニオ属(Danio)、イヌ属(Canis)、ネコ属(Felis)、ウマ属(Equus)、タイセイヨウサケ属(Salmo)、タイヘイヨウサケ属(Oncorhynchus)、ヤケイ属(Gallus)、シチメンチョウ属(Meleagris)、ショウジョウバエ属(Drosophila)、カエノラブディティス属(Caenorhabditis)のものである；より好ましくは、動物細胞は、次の種：ヒト(Homo sapiens)、ドブネズミ/ラット(Rattus norvegicus)、ハツカネズミ(Mus musculus)、イノシシ(Sus scrofa)、ウシ(Bos taurus)、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)、タイリクオオカミ(Canis lupus)、イエネコ(Felis catus)、ウマ(Equus caballus)、タイセイヨウサケ(Salmo salar)、ニジマス(Oncorhynchus mykiss)、セキショクヤケイ(Gallus gallus)、シチメンチョウ(Meleagris gallopavo)、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)、カエノラブディティス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)のものである。
【００７６】
−「相同」により、別の配列と、配列間での相同組換えを導くに充分な同一性を有する配列、より具体的には少なくとも95％同一性、好ましくは97％同一性、より好ましくは99％の同一性を有する配列が意図される。
−「同一性」とは、２つの核酸分子又はポリペプチド間の配列同一性をいう。同一性は、比較のために整列させ得る各配列中の位置を比較して決定することができる。比較される配列中の位置が同じ塩基により占められる場合、それら分子は、当該位置において同一である。核酸又はアミノ酸配列間の類似性又は同一性の程度は、核酸配列により共有される位置での同一の又は適合するヌクレオチドの数の関数である。種々のアラインメントアルゴリズム及び/又はプログラム(GCG配列解析パッケージ(University of Wisconsin, Madison, Wis.)の一部として利用可能であるFASTA又はBLASTを含む)を使用して、２つの配列間の同一性を算出してもよく、例えばデフォルト設定で使用することができる。
−「変異」により、ポリヌクレオチド(cDNA、遺伝子)又はポリペプチド配列中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20又はそれより多いヌクレオチド/アミノ酸の置換、欠失、挿入が意図される。変異は、遺伝子のコーディング配列又はその調節配列に影響することがある。これはまた、ゲノム配列の構造又はコードされるmRNAの構造/安定性に影響し得る。
【００７７】
−本発明の枠内で、表現「二本鎖破断-誘導変異誘発」(DSB-誘導変異誘発)とは、エンドヌクレアーゼの切断部位で挿入/欠失を導く、エンドヌクレアーゼ-誘導DSB後のNHEJ事象に続く変異誘発事象をいう。
−「遺伝子」は、特定のタンパク質又はタンパク質セグメントをコードする、染色体に沿って直鎖状様式で整列したDNAセグメントからなる、遺伝の基本単位を意味する。遺伝子は、代表的には、プロモーター、5'非翻訳領域、１又はそれより多いコーディング配列(エキソン)、任意にイントロン、3'非翻訳領域を含む。遺伝子は、ターミネーター、エンハンサー及び/又はサイレンサーを更に含んでなり得る。
−本明細書中で使用する場合、用語「導入遺伝子」とは、ポリペプチドをコードする配列をいう。好ましくは、導入遺伝子によりコードされるポリペプチドは、該導入遺伝子を挿入する細胞、組織又は個体中で発現していないか、又は発現しているが生物学的に活性でない。最も好ましくは、導入遺伝子は、個体の治療に有用である治療用ポリペプチドをコードする。
−用語「興味対象の遺伝子」又は「GOI」とは、既知又は推定の遺伝子産物をコードする任意のヌクレオチド配列をいう。
【００７８】
−本明細書中で使用する場合、用語「遺伝子座」は、染色体上での(例えば遺伝子の)DNA配列の特定の物理的位置である。用語「遺伝子座」とは、通常、染色体上でのエンドヌクレアーゼの標的配列の特定の物理的位置をいう。本発明に従うエンドヌクレアーゼにより認識・切断される標的配列を含んでなる遺伝子座は、「本発明による遺伝子座」と呼ぶ。また、表現「興味対象のゲノム遺伝子座」は、本発明による二本鎖破断の推定の標的であり得るゲノム中の核酸配列を言うために使用する。「興味対象の内因性ゲノム遺伝子座」により、ゲノム中の天然型核酸配列、すなわち、このゲノム遺伝子座に天然に存在する配列又はこの配列の対立遺伝子バリエーションが意図される。考えられる本発明の興味対象のゲノム遺伝子座は２つのオーバーラップする遺伝子間であり得、考えられるエンドヌクレアーゼの標的配列は２つの異なる遺伝子中に位置すると理解される。考えられる本発明の興味対象のゲノム遺伝子座は、細胞の遺伝物質本体中(すなわち、染色体中)に存在する核酸配列だけでなく、前記遺伝物質本体とは独立して存在し得る遺伝物質の一部、例えばプラスミド、エピソーム、ウイルス、トランスポゾン中又は非限定例としてミトコンドリア若しくは葉緑体のような細胞小器官中に存在する核酸配列をもいうと理解される。
【００７９】
−表現「遺伝情報の喪失」により、興味対象のゲノム遺伝子座内で、本発明のエンドヌクレアーゼの認識部位に隣接し、該エンドヌクレアーゼ-切断性部位の近辺で元の配列の変化を導く、少なくとも１つの所与のDNAフラグメント(少なくとも１つのヌクレオチド)又は配列の消去又は付加が理解される。この遺伝情報の喪失は、非限定例として、２つのエンドヌクレアーゼ-切断性部位の間の介在配列の消去であり得る；これはまた、別の非限定例として、独特なエンドヌクレアーゼDNA二本鎖破断後のエキソヌクレアーゼDNA-端部プロセッシング活性の結果であり得る。この最後の場合では、興味対象のゲノム遺伝子座内の遺伝情報の喪失は、「前記DNA標的配列の近辺」、すなわち参照とされるエンドヌクレアーゼ-切断性部位(DSB)の近辺で生じる。これはまた、他の非限定例において、独特なエンドヌクレアーゼDNA二本鎖破断後の他の酵素(例えば、ポリメラーゼ活性(TdT、…)、脱リン酸酵素活性)によるDNA-末端プロセッシング活性の結果であり得る。
【００８０】
−表現 興味対象のゲノム遺伝子座内での「２つの近接するDNA二本鎖破断」は、12bp〜1000bp離れた２つのエンドヌクレアーゼ切断性部位を意味する。
−「無瘢痕再ライゲーション」により、二本鎖破断事象の創出後のNHEJプロセスによる、DNA破断端部の遺伝情報の喪失なし(挿入/欠失事象なし)の、完璧な再ライゲーション事象が意図される。本発明は、このような「無瘢痕再ライゲーション」プロセスを回避することにより二本鎖破断媒介変異誘発を増加させる方法に関する。
−「融合タンパク質」により、元来は別個のタンパク質をコードする２又はそれより多い遺伝子の連結から本質になる当該分野における周知プロセスの結果が意図される。前記「融合遺伝子」の翻訳は、元のタンパク質の各々に由来する機能的特性を有する単一ポリペプチドを生じる。
【００８１】
−「キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ」は、稀切断性エンドヌクレアーゼを含んでなる任意の融合タンパク質を意味する。該稀切断性エンドヌクレアーゼは、前記キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼのＮ-末端部分であり得る；反対に、稀切断性エンドヌクレアーゼは、キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼのＣ-末端部分であってもよい。２つの触媒ドメインを含んでなる本発明による「キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ」は、「二機能性」又は「二機能性メガヌクレアーゼ」と説明することができる。２より多い触媒ドメインを含んでなる本発明による「キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼ」は、「多機能性」又は「多機能性メガヌクレアーゼ」と説明することができる。非限定例として、本発明によるキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、稀切断性エンドヌクレアーゼと１つの触媒ドメインとの融合タンパク質であり得る；本発明によるキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼはまた、稀切断性エンドヌクレアーゼと２つの触媒ドメインとの融合タンパク質であり得る。前記のように、本発明によるキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼの稀切断性エンドヌクレアーゼ部分は、２つの同一の単量体のいずれか、２つの非同一の単量体のいずれか、又は単鎖メガヌクレアーゼを含んでなるメガヌクレアーゼであり得る。本発明によるキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼの稀切断性エンドヌクレアーゼ部分はまた、稀切断性エンドヌクレアーゼのDNA-結合性ドメインであり得る。他の非限定例において、本発明によるキメラ稀切断性エンドヌクレアーゼは、TALE-ヌクレアーゼ(TALEN)、すなわち、転写アクチベータ様エフェクター(TALE)に由来するDNA-結合性ドメインと１つ又は２つの触媒ドメインとの間の融合体に由来し得る。
【００８２】
−「頻繁切断性エンドヌクレアーゼ」により、代表的には約４〜８塩基対(bp)長、より好ましくは４〜６bp長のポリヌクレオチド認識部位を有するエンドヌクレアーゼが意図される。
−「TALE-ヌクレアーゼ」(TALEN)により、転写アクチベータ様エフェクター(TALE)に由来するDNA-結合性ドメインと、二量体化してDNA標的配列を切断する活性実体を形成するに必要である１つのFokI触媒ドメインとからなる融合タンパク質が意図される。
−「触媒ドメイン」により、酵素の活性部位を含有するタンパク質ドメイン又はモジュールが意図される；活性部位により、基質の触媒反応が起きる酵素の部分が意図される。酵素は(その触媒ドメインもまた)、触媒する反応により分類され名付けられる。Enzyme Commission番号(EC番号)は、触媒する化学反応に基く酵素用の番号分類スキームである(http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/)。本発明の範囲では、任意の触媒ドメインを稀切断性エンドヌクレアーゼと融合させて、キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼを作製することができる。このような触媒ドメインの非限定例を表２及び表３に、参照としてのGenBank又はNCBI又はUniProtKB/Swiss-Prot番号と共に示す。
−「ヌクレアーゼ触媒ドメイン」により、エンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼ酵素の活性部位を含んでなるタンパク質ドメインが意図される。このような触媒ドメインの非限定例を表２及び表３に、参照としてのGenBank又はNCBI又はUniProtKB/Swiss-Prot番号と共に示す。
【００８３】
本発明の上記説明は、当業者が本発明の対象を製造し使用することができるように、その様式及び方法を提供する。この実施可能性は、特に、(願書に最初に添付した明細書等を一部を構成する)添付の特許請求の範囲の主題について提供される。
上記で使用するように、句「からなる群より選択される」、「から選択される」などは、特定されたものの組合せを含む。
本明細書中で数値限定又は範囲に言及する場合には終点は含まれる。また、数値限定内の全ての値又は部分的範囲は、あたかも明示的に記載されているように明確に含まれる。
上記の説明は、当業者が本発明の対象を作製し、使用することができるように提示されており、特定の適用及びその要件に関して提供されている。好適な実施形態の種々の改変が、当業者に容易に明らかとなる。本明細書中で規定される包括的原理は、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、他の実施形態及び応用に適用され得る。よって、本発明は、示された実施形態に限定されることを意図しておらず、本明細書中に開示された原理及び特徴と一致する最も広い範囲を意図される。
本発明を概説してきたので、(例示のためだけに提供され、そうでないと記載されない限り限定を意図していない)或る種の具体例を参照することにより更なる理解を得ることができる。
【実施例】
【００８４】
実施例
実施例１
R1又はR1m(配列番号58)及びD21又はD21m(配列番号59)と呼ぶ２つの遺伝子操作された単鎖メガヌクレアーゼを、国際PCT出願WO2003078619、WO2004/067736、WO2006/097784、WO2006/097853、WO2007/060495、WO 2007/049156、WO 2006/097854、WO2007/034262、WO 2007/049095、WO2007/057781及びWO2009095793(Cellectis)並びにChames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006に開示された方法を用いて作製する。I-CreIに由来するこれらメガヌクレアーゼは、２つの異なるDNA配列(これらのいずれも野生型I-CreIにより認識されない)を認識するように設計される。(それぞれの認識配列：tgttctcaggtacctcagccag 配列番号３；及びaaacctcaagtaccaaatgtaa 配列番号４)。これら２つのメガヌクレアーゼの発現は、CMVプロモーター及びポリＡシグナル配列により駆動される。２つの対応する認識部位を近接してクローニングし、標的プラスミドを作製する。例えば、認識部位は10bp離間している(図１)。メガヌクレアーゼによるDNA切断は、特徴的な４-nt 3'-OHオーバーハングを生じる。両部位の同時切断は、介在配列を除去し、したがってNHEJによる「無瘢痕」再ライゲーションを排除すると期待される(図１)。
【００８５】
ヒトHEK293細胞を、R1(配列番号58)及びD21(配列番号59)用の発現カセットを有する２つのプラスミド並びに標的プラスミドで一過性に同時トランスフェクトする。比較のために、HEK293細胞を、標的プラスミド及び唯１つのメガヌクレアーゼ-発現プラスミドで一過性に同時トランスフェクトする。トランスフェクションの２日後にDNAを抽出し、標的化変異誘発を、図２に示すように変異検出アッセイにより評価する(Transgenomic, Inc. USAのサーベイヤーアッセイ)。２つの認識部位を含むDNAの高忠実度PCR増幅は、適切な特異的プライマーを用いて実行する。同じPCR増幅を、標的プラスミド単独でトランスフェクトした細胞から抽出したゲノムDNAについて行う。定量及び精製後、等モル量のPCR産物をアニーリング緩衝液中で混合し、この混合物の一部分を融解/アニーリング工程に供すると、変異体及び野生型のDNAのランダムな再-アニーリングによる歪んだ二重鎖DNAの形成が生じる。CEL-1酵素(Transgenomic, Inc. USAのサーベイヤーアッセイ)を添加して、DNA二重鎖をミスマッチ部位で特異的に切断する。CEL-1切断サンプルを分析ゲル上で分離し、臭化エチジウムで染色し、DNAバンドを、デンシトメトリーを用いて定量する。変異誘発の頻度は、その後、Millerら(2007)に本質的に記載されるように計算し得る。
【００８６】
標的プラスミドと、(ａ)空のプラスミド；(ｂ)１つのメガヌクレアーゼ発現プラスミド；又は(ｃ)それぞれR1(配列番号58)及びD21(配列番号59)を発現する２つのプラスミドとでトランスフェクトした細胞からのPCR産物もまた、高スループット配列決定により分析する(図２)。この場合、PCR増幅は、適切なプライマーを用いて行い、454 sequencing system (454 Life Sciences)での配列決定サービスを提供する会社(GATC Biotech AG, Germany)により提供された特異的アダプター配列(アダプターＡ：5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-NNNN-3'、配列番号５；及びアダプターＢ：5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG-3'、配列番号６)で挟まれたフラグメントを得る。PCRプールあたり約10,000の利用可能な配列を得た後、部位-特異的挿入又は欠失事象の存在について分析する。
本発明者らは、２つのDNA DSBの創出後の介在配列又はマイクロ配列の欠失が、部位-特異的NHEJ-駆動変異率を大きく増大させることを示すことができる。この欠失は、両方のメガヌクレアーゼが細胞中に導入される場合にのみ観察される。
【００８７】
実施例２
本実施例では、I-CreIに由来する遺伝子操作された単鎖メガヌクレアーゼ(国際PCT出願WO2003078619、WO 2004/067736、WO 2006/097784、WO 2006/097853、WO 2007/060495、WO 2007/049156、WO 2006/097854、WO 2007/034262、WO 2007/049095、WO 2007/057781、WO 2008/010093及びWO2009095793(Cellectis)並びにChames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006に記載されたもの)を、種々のヌクレアーゼドメインと融合して二機能性メガヌクレアーゼを作製する。最大活性を得るため、サイズが３〜26アミノ酸の範囲である31の異なるリンカーを試験する(表１)。融合体は、本質的に非特異的なヌクレアーゼ活性を有することに基いて選択される18の異なる触媒ドメイン(表２)を用いて作製する。合わせて、遺伝子操作された単鎖I-CreI-由来メガヌクレアーゼのＮ-又はＣ-末端への融合により1116の異なる構築物のライブラリを作製し、潜在的な二機能性メガヌクレアーゼの集団を創出する。これらキメラメガヌクレアーゼの発現は、CMVプロモーター及びポリＡシグナル配列により駆動される。各キメラタンパク質の活性は、国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006において以前に記載した本発明者らの酵母アッセイを用いて評価する。新たな触媒ドメインの付加により生じるDNA切断活性をモニターするために、野生型メガヌクレアーゼにより結合され得るが切断されないI-CreI DNA標的配列を選択する。この標的は、−２位〜＋２位での４-ヌクレオチド置換を含む(図３)。その後、切断活性を示す酵素を、標的プラスミドがI-CreIメガヌクレアーゼの唯１つの切断部位を有することを除き、実施例１に記載のプロトコルに従って試験する。
【００８８】
二機能性キメラエンドヌクレアーゼにより誘導される高率の部位-特異的変異誘発を更に検証するため、同じストラテジーを、国際PCT出願WO2003078619、WO 2008/010093及びWO2009095793に記載のようにヒトRAG1遺伝子を切断するように設計された遺伝子操作された単鎖メガヌクレアーゼに適用する。二機能性メガヌクレアーゼを、内因性の同族認識部位でNHEJ-駆動変異を誘導する能力について試験する。実施例１に記載したPCR産物の高スループット配列決定により、変異誘発活性を定量する。PCR増幅は、適切なプライマーを用いてメガヌクレアーゼ-トランスフェクト細胞から抽出したゲノムDNAについて行う。
二機能性メガヌクレアーゼは、介在配列が欠失していることにより、NHEJによるDNA端部の「無瘢痕」再ライゲーションが防止されるので、増大した変異率を示した。
【００８９】
【表１−１】
2013544082.tif 000003
【００９０】
【表１−２】
2013544082.tif 000004
【００９１】
【表２−１】
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【００９２】
【表２−２】
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【００９３】
【表２−３】
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【００９４】
【表２−４】
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【００９５】
【表３−１】
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【００９６】
【表３−２】
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【００９７】
【表３−３】
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【００９８】
【表３−４】
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【００９９】
【表３−５】
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【０１００】
【表３−６】
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【０１０１】
【表３−７】
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【０１０２】
【表３−８】
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【０１０３】
【表３−９】
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【０１０４】
【表３−１０】
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【０１０５】
【表３−１１】
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【表３−１２】
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【０１０６】
実施例３
I-TevIの触媒ドメイン(配列番号60)と融合する親足場としてI-CreIメガヌクレアーゼ(配列番号76)を選択した。野生型I-TevIは、GIY-YIGファミリーの単量体切断酵素(cleavase)として機能して、標的DNAにおいてねじれ型(staggered)二本鎖破断を創出する。生化学的及び構造的データを指針に、触媒ドメイン全体及びリンカーの欠失-不耐性領域を含むI-TevIのＮ-末端領域から種々の長さの構築物を設計した(配列番号61〜66)。１つを除き全ての場合で、フラグメントは、介在性の５-残基ポリペプチドリンカー(-QGPSG- = 配列番号67)を用いてI-CreIのＮ-末端に融合した。リンカー無しの融合構築物は、天然に、人工リンカー中のものと類似する残基(-LGPDGRKA- = 配列番号68)を含んでいた。I-CreIはホモ二量体であるので、全ての融合構築物は、３つの触媒中心を含む(図4D)：二量体界面の天然のI-CreI活性部位及び単量体あたり１つのI-TevI活性部位。
【０１０７】
各「三機能性」メガヌクレアーゼの活性は、国際PCT出願WO 2004/067736及びEpinat, Arnouldら，2003；Chames, Epinatら，2005；Arnould, Chamesら，2006；Smith, Grizotら，2006において以前に記載された酵母アッセイを用いて評価した。全ての構築物は、C1221標的DNAを、野生型I-CreIに匹敵する活性で切断することができた(表４)。
I-CreI触媒コアに依存しないI-TevI触媒ドメインの活性を検証するため、D20N点変異体を作製してI-CreI足場を不活化した(配列番号69〜75)。酵母アッセイにおける試験により、不活化されたI-CreI(D20N)変異体タンパク質単独からは明らかな活性は示されなかった(表４)。しかし、切断活性は、I-TevI触媒ドメインを有する融合体について観察することができた(表４)。
【０１０８】
【表４】
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【０１０９】
表４：酵母アッセイにおける、I-TevI/I-CreI融合体についての活性。２つの親タンパク質標的(I-CreIについてC1221及びI-TevIについてTev)に対する野生型及び融合タンパク質の相対活性を示す。最大活性(++++)は、所与の各タンパク質で天然型DNA標的に対して観察される。I-CreI_N20は、野生型I-CreI足場の不活性バリアントである。他の全ての場合で、活性はC1221標的に対してのみ検出される。なぜならば、DNA認識はI-CreI足場により駆動されるからである。「N20」融合バリアントは、I-TevI触媒ドメインに起因する切断活性を示す。
相対活性は、次のように等級分けをする：−、検出可能な活性なし；＋、＜25％活性；++、25％〜＜50％活性；+++、50％〜＜75％活性；++++、75％〜100％活性。
【０１１０】
実施例４
短縮型のI-CreI(配列番号76、I-CreI_X：配列番号77)及び当該タンパク質のＮ-又はＣ-末端に融合した３つの異なるリンカーポリペプチド(配列番号78〜80)に基いて、タンパク質-融合足場を設計した。全ての場合において、DNA結合にも切断活性にもほとんど〜全く影響を有さずにI-CreI親足場表面を横切る「ベースライン」融合リンカーを設計するという目標を有する構造モデルを作製した。２つのＮ-末端融合足場のために、I-CreIの残基２〜153にわたるポリペプチド(リンカー配置を可能にするK82A変異を有する)を使用した。Ｃ-末端融合足場は、野生型I-CreIの残基２〜155を含有する。両融合足場タイプのために、リンカーの「遊離」末端(すなわち、該末端に対してポリペプチドを連結することが可能)は、出発点としてI-CreI/DNA複合体構造(PDB id：1g9z)を用いて構築したモデルから決定したように、DNAに対して近位に設計する。２つのI-CreI Ｎ-末端融合足場(N-terminal fusion scaffold；I-CreI_NFS1 = 配列番号81及びI-CreI_NFS2 = 配列番号82)及び単一のＣ-末端融合足場(C-terminal fusion scaffold；I-CreI_CFS1：配列番号83)を本発明者らの酵母アッセイで試験し(実施例３参照)、これは野生型I-CreIのものと類似する活性を有することが判明した(表５)。
【０１１１】
コリシンE7は、単鎖及び二本鎖のDNAをプロセシングすることができるHNHファミリーの非特異的ヌクレアーゼである。生化学的及び構造的データを指針に、触媒ドメイン全体(配列番号84)を包含するColE7の領域を選択した。このColE7ドメインをI-CreI_NFS1(配列番号81)又はI-CreI_NFS2(配列番号83)のＮ-末端に融合して、それぞれhColE7Cre_D0101(配列番号85)又はhColE7Cre_D0102(配列番号86)を作製した。加えて、I-CreI_CFS1(配列番号83)を用いて、Ｃ-末端融合構築物hCreColE7_D0101(配列番号87)を作製した。I-CreIはホモ二量体であるので、全ての融合構築物は３つの触媒中心を含有する(図4D)：二量体界面の天然I-CreI活性部位及び単量体あたり１つのColE7活性部位。
【０１１２】
各「三機能性」メガヌクレアーゼの活性は、上記の酵母アッセイ(実施例３参照)を用いて評価した。全ての構築物は、C1221標的DNAを、野生型I-CreIに匹敵する活性で切断することができた(表４)。I-CreI触媒コアに依存しないColE7触媒ドメインの活性を検証するために、D20N点変異体を作製してI-CreI足場を不活化した(配列番号88〜93)。本発明者らの酵母アッセイにおける試験により、不活化されたI-CreI(D20N)変異体タンパク質単独からは明らかな活性は示されなかった(表５)。しかし、切断活性は、ColE7触媒ドメインを有する融合体について観察することができた(表５)。
【０１１３】
【表５】
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【０１１４】
表５：酵母アッセイにおける、ColE7/I-CreI融合体についての活性。C1221標的に対する野生型及び融合タンパク質の相対活性を示す。I-CreI_Xは、結晶構造に基づく短縮型のI-CreIを表し、融合足場(I-CreI_NFS1、I-CreI_NFS2及びI-CreI_CFS1)の土台(foundation)として使用した。「N20」構築物は、それぞれのI-CreI-ベース足場の不活性バリアントである。活性は、I-CreI足場が活性である全ての場合で、又はDNA触媒作用がColE7ドメインにより提供されるときに検出される。
相対活性は、次のように等級分けをする：−、検出可能な活性なし；＋、＜25％活性；++、25％〜＜50％活性；+++、50％〜＜75％活性；++++、75％〜100％活性。
【０１１５】
実施例５：メガヌクレアーゼ-誘導変異誘発に対するTrex2又はTREX2(配列番号145)の効果
ヒトTrex2タンパク質(配列番号145)は、3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を示すことが知られている(Mazur及びPerrino，2001)。236アミノ酸の機能型Trex2(配列番号194)を、キメラ稀切断性エンドヌクレアーゼのメガヌクレアーゼ-誘導標的化変異誘発に対する改善効果を測定するために、単鎖メガヌクレアーゼ(SC-MN)に融合した。SC-MN-Trex2により誘導される変異誘発のレベルを、専用細胞モデル及び293H細胞中の内因性遺伝子座において、SC-MN及びTrex2タンパク質を独立して発現するベクターを同時トランスフェクトすることにより誘導される変異誘発のレベルと比較する。
【０１１６】
実施例5A：Trex2(配列番号145)とメガヌクレアーゼとの同時トランスフェクション
Trex2をコードするベクター(pCLS7673、配列番号154)の存在下又は不在下での変異誘発事象をモニターするため、メガヌクレアーゼSC_GSをコードするベクター(pCLS2690、配列番号153)を細胞株に同時トランスフェクトした。SC_GSメガヌクレアーゼは、２つのI-CreIバリアントの融合体に由来する単鎖タンパク質(配列番号193)である。これは、Cricetulus griseusグルタミンシンセターゼ遺伝子の第１エキソンに位置する22bp DNA配列(5'-TGCCCCAGGGTGAGAAAGTCCA-3'：GS_CHO.1標的、配列番号155)を認識する。異なるメガヌクレアーゼ、例えばSC_RAG1(pCLS2222、配列番号156、すなわち、SC_RAG1、配列番号58をコードする発現ベクター)、SC_XPC4(pCLS2510、配列番号157、すなわち、SC_XPC4、配列番号190をコードする発現ベクター)及びSC_CAPNS1(pCLS6163、配列番号158、すなわちSC_CAPNS1、配列番号192をコードする発現ベクター)を、Trex2発現ベクター(pCLS7673、配列番号154)を伴って又は伴わずに同時トランスフェクトして、内因性遺伝子座でのメガヌクレアーゼ-誘導変異誘発に対する効果を分析した。
【０１１７】
材料及び方法
ａ)メガヌクレアーゼ-誘導変異誘発をモニターする細胞モデル
SC_GSメガヌクレアーゼ(pCLS2690、配列番号153)により誘導されるNHEJ修復頻度を定量するためにプラスミドpCLS6810(配列番号159)を設計した。SC_GS-誘導変異誘発の測定に使用した配列は、ATG開始コドンに続く(i)アラニンをコードする２コドン；(ii)HA-タグ配列；(iii)SC_GS認識部位；(iv)ジ-残基グリシン-セリンのストレッチ；(v)(i)と同様なアラニンをコードする追加の２コドン；及び最後に(vi)自身のATG開始コドンを欠くGFPレポーター遺伝子から作られている。GFPレポーター遺伝子は、GS認識部位により導入されたフレームシフトに起因して不活性である。SC_GSメガヌクレアーゼによるDNA二本鎖破断(DSB)の創出に続くエラーを起こし易い(error-prone)NHEJ事象は、ATG開始コドンとインフレームでのGFP遺伝子発現の回復を導き得る。最終構築物を、cGPS(登録商標) Custom Human Full Kit DD (Cellectis Bioresearch)のhsRAG1 Integration Matrix CMV Neoを提供業者の指示に従って用いて、293H細胞株にRAG1遺伝子座にて導入した。このキットを用いて、RAG1遺伝子座に導入遺伝子の単一コピーを含有する安定な細胞株を得た。このように、この細胞株の、Trex2をコードするプラスミド(pCLS7673、配列番号154)を伴うか又は伴わないSC_GSメガヌクレアーゼ発現プラスミドによるトランスフェクション後、GFP陽性細胞のパーセンテージを、トランスフェクトした分子実体が誘導する変異誘発性NHEJ修復の頻度と直接相関させる。
【０１１８】
ｂ)メガヌクレアーゼ-誘導変異誘発をモニターする細胞モデルにおけるトランスフェクション
トランスフェクションの１日前に百万個の細胞を播種した。細胞を、25μlのリポフェクタミン(Invitrogen)を製造業者の指示に従って用いて、10μgのトータルDNA(残りはpUCベクター(pCLS0002、配列番号191)を補充)中１μgのSC_GSコーディングベクター(pCLS2690、配列番号153)と０、２、４、６又は９μgのTrex2コーディングプラスミド(pCLS7673 配列番号154)とで同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４日後、Guava装置を使用するフローサイトメトリ分析用に細胞を採集した。１μgのSC_GS発現プラスミド及び０、４及び９μgのTrex2コーディングプラスミドでトランスフェクトした細胞集団からゲノムDNAを抽出した。遺伝子座特異的PCRを、次のプライマー：5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG(フォワードアダプター配列)-10N-(PCR産物の同定に必要な配列)-GCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCC(遺伝子導入遺伝子座特異的フォワード配列)-3'(配列番号160)及び5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG-(リバースアダプター配列)-TCGATCAGCACGGGCACGATGCC(遺伝子導入遺伝子座特異的リバース配列)(配列番号161)を用いて行い、PCR産物を454 sequencing system (454 Life Sciences)により配列決定した。PCR産物あたり約10,000配列を得た後、部位-特異的挿入又は欠失事象の存在について分析した。
【０１１９】
ｃ)内因性遺伝子座でのメガヌクレアーゼ-誘導変異誘発をモニターするための293H細胞でのトランスフェクション
トランスフェクションの１日前に百万個の細胞を播種した。細胞を、25μlのリポフェクタミン(Invitrogen)を製造業者の指示に従って用いて、５μgのトータルDNA(残りはpUCベクター(pCLS0002、配列番号191)を補充)中３μgのSC_RAG1又はSC_XPC4又はSC_CAPNS1発現プラスミド(それぞれ、pCLS2222、配列番号156；pCLS2510、配列番号157及びpCLS6163、配列番号158)と０又は２μgのTrex2コーディングプラスミド(pCSL7673 配列番号154)とで同時トランスフェクトした。遺伝子座特異的PCRを、次のプライマー：5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-(フォワードアダプター配列)-10N-(PCR産物の同定に必要な配列)-遺伝子座特異的フォワード配列 RAG1用：GGCAAAGATGAATCAAAGATTCTGTCC-3'(配列番号162)、XPC4用：-AAGAGGCAAGAAAATGTGCAGC-3'(配列番号163)及びCAPNS1用：-CGAGTCAGGGCGGGATTAAG-3'(配列番号164)及びリバースプライマー5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG-(リバースアダプター配列)-(内因性遺伝子座特異的リバース配列 RAG1用：-GATCTCACCCGGAACAGCTTAAATTTC-3'(配列番号165)、XPC4用：-GCTGGGCATATATAAGGTGCTCAA-3'(配列番号166)及びCAPNS1用：-CGAGACTTCACGGTTTCGCC-3'(配列番号167)を用いて行った。PCR産物は454 sequencing system (454 Life Sciences)により配列決定した。PCR産物あたり約10,000配列を得た後、部位-特異的挿入又は欠失事象の存在について分析した。
【０１２０】
結果
１−メガヌクレアーゼ-誘導変異誘発を測定する細胞モデルにおいて
GFP+細胞のパーセンテージ(専用細胞モデルにおいてSC_GSメガヌクレアーゼにより誘導される変異誘発事象をモニタリング)は、SC_GS発現プラスミド(pCLS2690 配列番号153)を単独で又は漸増用量のTrex2コーディングベクター(pCLS7673 配列番号154)と共にトランスフェクトした96時間後に分析した。GFP+細胞のパーセンテージは、トランスフェクトしたTrex2発現プラスミドの量と共に増加した。Trex2の不在下、SC_GS発現は0.3％のGFP+細胞を導いた一方、２、４、６及び９μgのTrex2コーディングプラスミドは、それぞれ1.3、2.8、3.4及び4.8％のGFP+を導いた(図5A)。このGFP+細胞の表現型刺激は分子レベルで確証された。SC_GSは2.4％の標的化変異誘発を導いた一方、SC_GS発現プラスミドと４及び９μgのTrex2コーディングベクターとの同時トランスフェクションは、この変異誘発性DSB修復をそれぞれ9.4％及び13.1％に刺激する(図5B)。更に、変異誘発事象の性質を分析した。Trex2の存在下では、変異誘発事象の65％までが、SC_GSメガヌクレアーゼにより創出される3'オーバーハング(欠失２、欠失３及び欠失４)の完全な又は部分的な喪失に対応する。対照的に、Trex2活性の不在下では、このような変異誘発事象は、総変異誘発事象の20％で見出される(図5C)。
【０１２１】
２−内因性遺伝子座において
遺伝子操作されたメガヌクレアーゼにより誘導される変異誘発に対するTrex2効果は、SC_RAG1又はSC_XPC4又はSC_CAPNS1を発現するプラスミドをTrex2コーディングプラスミドを伴って又は伴わずに同時トランスフェクトすることによってRAG1、XPC4及びCAPNS1内因性遺伝子座で測定した。３μgのメガヌクレアーゼ発現ベクターと２μgのTrex2コーディングプラスミドとのトランスフェクション(3/2比)を行った。異なるメガヌクレアーゼにより誘導される変異誘発は、トランスフェクションの３日後に定量及び分析した。これら条件下で、Trex2は、調べた全ての遺伝子座にて、遺伝子座に依存して1.4から５まで変化する刺激係数で変異誘発を刺激する(表６)。変異誘発事象の性質も分析した。それによれば、メガヌクレアーゼにより誘導される欠失のパターンの改変が示された。図６に示されるように、特にRAG1(パネルＡ)及びCAPNS1遺伝子座(パネルＣ)にて、3'オーバーハングの崩壊に相当する小さな欠失の頻度は、Trex2の存在下で有意に増加する。
【０１２２】
【表６】
2013544082.tif 000023
【０１２３】
実施例5B：遺伝子操作されたメガヌクレアーゼのＮ-又はＣ-末端へのヒトTrex2タンパク質の融合
細胞内でのTrex2の発現は、メガヌクレアーゼが標的としていない遺伝子座でのエキソヌクレアーゼ活性を導くことがある。更に、自明な理由から、２つの発現ベクターの同時トランスフェクションにより、両タンパク質の最適発現を制御することが困難になる。この困難を迂回し、Trex2活性をメガヌクレアーゼにより誘導されるDSBに標的付けるために、ヒトTrex2タンパク質を、遺伝子操作されたSC_GSメガヌクレアーゼ(配列番号153)のＮ-又はＣ-末端に融合させた。４つのSC_GS/Trex2融合タンパク質を作製し、標的(GS_CHO.1標的)を切断する能力について試験した。各構築物により誘導される変異誘発のレベルを、実施例5Aに記載した細胞モデルを用いて測定した。
【０１２４】
材料及び方法
ａ)SC_GS/Trex2融合タンパク質の作製
Trex2タンパク質を、SC_GSメガヌクレアーゼとＣ-末端又はＮ-末端で、５アミノ酸のグリシンストレッチ(配列GGGGS)(配列番号169)又は10アミノ酸のグリシンストレッチ(GGGGS)2(配列番号170)をリンカーとして用いて融合した。これにより、それぞれSC_GS-5-Trex、SC_GS-10-Trex、Trex-5-SC_GS、Trex-10-SC_GS(配列番号171〜174)と名付けた４つのタンパク質構築物が生じた。最初に、SC_GS及びTrex2を共に、CMVプロモーターの制御下での興味対象遺伝子の発現を駆動する(pcDNA3.1(Invitrogen)の誘導体である)pCLS1853(図７、配列番号175)のAscI/XhoI制限部位にクローニングした。プラスミド骨格上に位置する、特異的プライマー及びプライマーCMVfor(5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGT-3'；配列番号176)又はV5reverse(5'-CGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGG-3'；配列番号177)を用いて２つのORFを別々に増幅することによって、４つの融合タンパク質構築物を得た。次いで、２つのPCRフラグメントのゲル精製後、CMVfor/V5reverseオリゴヌクレオチドを用いてPCRアセンブリを実現した。次いで、最終PCR産物をAscI及びXhoIにより消化し、これら同じ酵素で消化したpCLS1853にライゲートした。下記の表に、異なる構築物を作製するために使用したオリゴヌクレオチドを示す。
【０１２５】
【表７】
2013544082.tif 000024
【０１２６】
ｂ)染色体外SSA活性
CHO-K1細胞を、興味対象のタンパク質用の発現ベクター及びレポータープラスミドで、Polyfectトランスフェクション試薬の存在下、製造業者のプロトコール(Qiagen)に従ってトランスフェクトした。培養培地をトランスフェクションの72時間後に除去し、β-ガラクトシダーゼ液体アッセイのために溶菌/検出緩衝液を添加した。１リットルの溶菌/検出緩衝液は以下を含有する：100mlの溶菌緩衝液(10mM Tris-HCl pH 7.5、150mM NaCl、0.1％ Triton X100、0.1mg/ml BSA、プロテアーゼインヒビター)、10mlの100X Mg緩衝液(100mM MgCl2、35％ ２-メルカプトエタノール)、110mlの８mg/ml ONPG溶液及び780mlの0.1Ｍリン酸ナトリウム pH 7.5。OD420は、37℃にて２時間のインキュベーション後に測定する。全体プロセスは、96-ウェルプレートフォーマットを使用して、自動化Velocity11 BioCelプラットフォームで行った(Grizot, Epinatら，2009)。
【０１２７】
ｃ)メガヌクレアーゼ-誘導変異誘発
トランスフェクションの１日前に百万個の細胞を播種した。細胞を、25μlのリポフェクタミン(Invitrogen)を製造業者の指示に従って用いて、10μgのトータルDNA(残りはpUCベクター(pUCベクター、配列番号191)を補充)中、漸増量(１μgから９μgまで)の、SC_GS(pCLS2690、配列番号153)又はSC_GS-5-Trex(pCLS8082 配列番号186)、SC_GS-10-Trex(pCLS8052 配列番号187)、Trex-5-SC_GS(pCLS8053 配列番号188)及びTrex-10-SC_GS(pCLS8054 配列番号189)をコードするプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの３〜４日後、Guava装置を使用するフローサイトメトリ分析用に細胞を採集した。１μg及び６μgのSC_GS又はSC_GS-10-Trex2発現プラスミドでトランスフェクトした細胞をゲノムDNA抽出用に採集した。遺伝子座特異的PCRを、次のプライマー：5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG(フォワードアダプター配列)-10N-(PCR産物の同定に必要な配列)-GCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCC(遺伝子導入遺伝子座特異的フォワード配列)-3'(配列番号160)及び5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG-(リバースアダプター配列)-TCGATCAGCACGGGCACGATGCC(遺伝子導入遺伝子座特異的リバース配列)(配列番号161)を用いて行った。PCR産物を454 sequencing system (454 Life Sciences)により配列決定した。PCR産物あたり約10,000配列を得た後、部位-特異的挿入又は欠失事象の存在について分析した。
【０１２８】
結果
４つの融合タンパク質の活性を、先ず、CHO-K1細胞中で染色体外アッセイを用いてモニターした(Grizot, Epinatら，2009)。Trex2とSC_GSとの融合は、実際、フォールディング及び/又は活性を害し得る。図８は、４つの融合タンパク質(SC_GS-5-Trex、SC_GS-10-Trex、Trex-5-SC_GS及びTrex-10-SC_GS、配列番号186〜189のプラスミド中でコードされた配列番号171〜174)はこのアッセイにおいて活性であることを示している。
【０１２９】
１−メガヌクレアーゼ-誘導変異誘発を測定する細胞モデルにおいて
実施例5Aに記載される細胞株を、SC_GS又は４つの異なる融合タンパク質を発現するプラスミドでトランスフェクトした。GFP+細胞のパーセンテージの定量は、トランスフェクションの４日後にフローサイトメトリにより決定した。SC_GSは0.5〜１％のGFP+細胞を誘導した一方、４つの融合構築物は全て、GFP+細胞のパーセンテージを用量依存的に２％から９％までに増強する(図9A)。このストラテジーは同時トランスフェクションストラテジーより効率的であるようである。なぜならば、4.5％のGFP+細胞という最高頻度は９μgのTrex2発現ベクターを用いて得られた(図5A)一方、この頻度は僅か３μgの任意の融合体発現ベクターを用いて得ることができる(図9A)からである。１μg及び６μgのSC_GS又はTrex2-10-SC_GS発現プラスミドの細胞トランスフェクション後、標的付けられた遺伝子座をPCR増幅により分析し、続いて配列決定した。欠失事象は、天然型メガヌクレアーゼと比較して、融合構築物で大きく増強した。１μg又は６μgのTrex2-10-SC_GS発現プラスミドは、24％及び31％の変異誘発事象(全てが欠失に相当)を導いた。これらNHEJ頻度は、同時トランスフェクション実験において４又は９μgのTrex2発現ベクターを用いて得られたもの(それぞれ９％及び13％)より高かった(図5B及び9B)。最後に、分子解析によって、SC_GS又は融合体Trex2-10-SC_GSにより創出される3'オーバーハング(欠失２、欠失３及び欠失４)の完全な又は部分的な喪失がそれぞれ35％及び80％であることが示された。まとめると、これら結果は、融合タンパク質Trex2-SC_GSは、標的付けられた変異誘発性試薬として高度に活性である(得られるGFP+細胞の頻度、ディープシーケンシングにより分析された変異誘発事象の頻度及びTrex2ヌクレアーゼ活性のサイン(signature)の頻度)ことを証明している。
【０１３０】
実施例5C：遺伝子操作されたメガヌクレアーゼと融合したTrex2の、不死化又は初代細胞株における内因性遺伝子座での変異誘発に対する効果
SC_GSと融合したTrex2は、不死化細胞株において遺伝子導入遺伝子座で標的付けられた変異誘発[TM]を刺激することが示された。融合を他の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼに適用し、初代細胞株中でのTMを刺激するために、Trex2をSC_CAPNS1に融合し、TMを不死化細胞株及び初代細胞株中の内因性遺伝子座でモニターした。
【０１３１】
材料及び方法
ｄ)Trex2-SC_CAPNS1融合タンパク質の作製
Trex2タンパク質(配列番号194)を、(GGGGS)2の10アミノ酸リンカー(配列番号170)を用いて、SC_CAPNS1メガヌクレアーゼ(配列番号192)にＮ-末端で融合した。クローニングストラテジーは、融合体Trex-SC_GSについて使用したものと同じであった。最初に、BSC_CAPNS1及びTrex2を共に、CMVプロモーターの制御下での興味対象遺伝子の発現を駆動する(pcDNA3.1(Invitrogen)の誘導体である)pCLS1853(図７、配列番号175)のAscI/XhoI制限部位にクローニングした。下記の特異的プライマーを用いて２つのORFを別々に増幅することによって、融合タンパク質構築物を得た：CAPNS1 Link10GSFor用には、5'-GGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCCAATACCAAATATAACGAAGAGTTC-3' (配列番号184)を、V5リバースプライマー5'-CGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGG-3'(配列番号177)と共に使用した；Trex ORFは、CMVforプライマー5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGT-3'(配列番号176)及びLink10TrexRevプライマー5'-CCTCCACCTCCAGATCCGCCACCTCCAGGAGAGGACTTTTTCTTCTCAGA-3'(配列番号185)を用いて増幅した。
次いで、２つのPCRフラグメントのゲル精製後、CMVfor/V5reverseオリゴヌクレオチドを用いてPCRアセンブリを実現した。次いで、最終PCR産物をAscI及びXhoIにより消化し、これら同じ酵素で消化したpCLS1853プラスミド中にライゲートして、Trex-SC_CAPNS1コーディングベクター(配列番号197のTrex-SC_CAPNS1タンパク質をコードする配列番号196のpCLS8518)を得た。
【０１３２】
ｅ)内因性遺伝子座での変異誘発についてTrex2-メガヌクレアーゼ融合体をモニターするための293H細胞でのトランスフェクション
トランスフェクションの１日前に百万個の細胞を播種した。細胞を、25μlのリポフェクタミン(Invitrogen)を製造業者の指示に従って用いて、５μgのトータルDNA(残りはpUCベクター(pCLS0002、配列番号191)を補充)中100ngのSC_CAPNS1又はTrex-SC_CAPNS1コーディングベクター(それぞれ、配列番号158のpCLS6163によりコードされる配列番号192のタンパク質配列、及び配列番号196のpCLS8518によりコードされる配列番号197のタンパク質配列)でトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、ゲノムDNA抽出用に細胞を採集した。
【０１３３】
ｆ)内因性遺伝子座での変異誘発についてTrex2-メガヌクレアーゼ融合体をモニターするためのDetroit細胞でのトランスフェクション
トランスフェクションの１日前に百万個の細胞を播種した。細胞を、Amaxa(LONZA)を製造業者の指示に従って用いて、10μgのトータルDNA(残りはpUCベクター(pCLS0002、配列番号191)を補充)中６μgのSC_CAPNS1又はTrex-SC_CAPNS1コーディングベクター(それぞれ、配列番号158のpCLS6163及び配列番号196のpCLS8518)で同時トランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、ゲノムDNA抽出用に細胞を採集した。
【０１３４】
ｇ)CAPNS1遺伝子座でのディープシーケンシング
ディープシーケンシングのためのPCRを、次のプライマー：5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-(フォワードアダプター配列)-10N-(PCR産物の同定に必要な配列)-CGAGTCAGGGCGGGATTAAG-3'-(遺伝子座特異的フォワード配列)(配列番号199)及びリバースプライマー5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG-(リバースアダプター配列)-CGAGACTTCACGGTTTCGCC-3'(内因性遺伝子座特異的リバース配列)(配列番号200)を用いて行った。PCR産物は454 sequencing system (454 Life Sciences)により配列決定した。PCR産物あたり約10,000配列を得た後、部位-特異的挿入又は欠失事象の存在について分析した。
【０１３５】
結果
３−不死化293H細胞株において
構築物SC_CAPNS1及びTrex-SC_CAPNS1が内因性遺伝子座での遺伝子操作メガヌクレアーゼ-誘導標的化変異誘発を刺激し得るかどうかを決定するために、野生型293H細胞をSC_CAPNS1又はTrex-SC_CAPNS1によりトランスフェクトした。SC_CAPNS1でのトランスフェクションは1.6％の標的付けられた変異誘発(TM)を導いた一方、融合体Trex-SC_CAPNS1でのトランスフェクションはTMを12.4％までに刺激した(図10、パネルＡ)。更に、変異誘発性配列の分析により、２、３及び４塩基対の小さな欠失事象の割合がSC_CAPNS1でのTM事象の２％から融合体Trex-SC_CAPNS1での67％に増加することが示された(図10、パネルＢ)。
【０１３６】
４−初代Detroit細胞株において
構築物SC_CAPNS1及びTrex-SC_CAPNS1が初代細胞においても内因性遺伝子座での遺伝子操作メガヌクレアーゼ-誘導標的化変異誘発を刺激し得るかどうかを決定するために、野生型Detroit551細胞をSC_CAPNS1又はTrex-SC_CAPNS1によりトランスフェクトした。SC_CAPNS1でのトランスフェクションは1.1％のTMを導いた一方、融合体Trex-CAPNS1でのトランスフェクションはTMを12.5％までに刺激した(図11、パネルＡ)。更に、変異誘発性配列の分析により、２、３及び４塩基対の小さな欠失事象の割合がSC_CAPNS1でのTM事象の35％から融合体Trex-SC_CAPNS1での90％に増加することが示された(図11、パネルＢ)。
【０１３７】
実施例６：メガヌクレアーゼ-誘導変異誘発に対する末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(Tdt)発現の効果
LAGLIDADGファミリー由来のホーミングエンドヌクレアーゼ又はメガヌクレアーゼは、長いDNA配列を認識し、DNA二本鎖を切断して、４ヌクレオチドの3'オーバーハングを生じる。細胞は、主に２つの機序：インタクトの相同テンプレートを用いる相同組換え又は非相同末端連結(NHEJ)により、この二本鎖破断(DSB)を修復することができる。NHEJは、DSB修復後に変異(DNAフラグメントの挿入又は欠失)を誘導することがあるエラーを起こし易い機序であると考えられている。よって、細胞中へのメガヌクレアーゼのトランスフェクション後、メガヌクレアーゼ遺伝子座での変異誘発頻度の測定は、メガヌクレアーゼ活性を評価する１つの方法である。I-CreIタンパク質に由来するメガヌクレアーゼは、ゲノム部位での変異誘発(このために前記メガヌクレアーゼは設計された)を誘導することが示されている(Munozら，2011)。
ヒトTdtタンパク質(配列番号201)は、DNA端部の3'-ヒドロキシ末端へのデオキシヌクレオチドの付加を触媒する508アミノ酸タンパク質である。コードされるタンパク質は、正常及び悪性のプレ-Ｂ及びプレ-Ｔリンパ球の限定された集団において、分化初期の間に発現する。これは、RAG1及びRAG2エンドヌクレアーゼ切断後、DSB部位で非-生殖系列エレメントを合成することによって抗原レセプターの多様性を生み出す。メガヌクレアーゼDSB誘導事象後、この活性は、標的付けられた部位でDNA配列を付加し得、よってメガヌクレアーゼにより誘導される標的化変異誘発を刺激する。
【０１３８】
実施例6A：Tdt(配列番号201)とメガヌクレアーゼとの同時トランスフェクション
この仮説を検証するため、メガヌクレアーゼSC_GSをコードするベクター(pCLS2690、配列番号153)を、Tdtをコードするベクター(配列番号201のタンパク質をコードする配列番号202のpCLS3841f)の存在下又は不在下で、変異誘発性NHEJ事象をモニターする細胞株に同時トランスフェクトした。SC_GSメガヌクレアーゼ(配列番号193)は、２つのI-CreIバリアントが融合した単鎖タンパク質である。これは、Cricetulus griseusグルタミンシンセターゼ遺伝子の第１エキソンに位置する22bpのDNA配列(5'-TGCCCCAGGGTGAGAAAGTCCA-3'：GS_CHO.1標的、配列番号155)を認識する。更に、２つの異なるメガヌクレアーゼSC_RAG1(配列番号58のSC_RAG1をコードするpCLS2222、配列番号156)及びSC_CAPNS1(配列番号192のSC_CAPNS1をコードするpCLS6163、配列番号158)を、Tdt発現プラスミド(pCLS3841、配列番号202)を伴って又は伴わずに同時トランスフェクトし、内因性遺伝子座でのメガヌクレアーゼ-誘導変異誘発に対する効果を、ディープシーケンシングにより分析した。
【０１３９】
材料及び方法
ｄ)メガヌクレアーゼ-誘導変異誘発をモニターするための細胞モデル
SC_GSメガヌクレアーゼ(配列番号193)により誘導されるNHEJ修復頻度を定量するため、プラスミドpCLS6810(配列番号159)設計した。SC_GS-誘導変異誘発の測定に使用した配列は、ATG開始コドンに続く(i)アラニンをコードする２コドン；(ii)HAタグ配列、(iii)SC_GS認識部位、(iv)グリシンセリンストレッチ、(v)(i)と同じアラニンをコードする２コドン及び最後に(vi)自身のATG開始コドンを欠くGFPレポーター遺伝子から作られている。GFPレポーター遺伝子自体は、GS認識部位により導入されたフレームシフトに起因して不活性であるので、SC_GSメガヌクレアーゼによるDNA二本鎖破断(DSB)の創出に続くNHEJによる変異誘発性DSB修復事象は、ATG開始コドンとインフレームでのGFP遺伝子発現の回復を導き得る。これら配列は、cGPS(登録商標) Custom Human Full Kit DD (Cellectis Bioresearch)のhsRAG1 Integration Matrix CMV Neoを用いて、最終構築物を293H細胞株のRAG1遺伝子座に標的するために使用するプラスミド中に配置した。このキットを用いて、導入遺伝子の単一コピーをRAG1遺伝子座に含む安定な細胞株を得た。このように、Tdtをコードするプラスミド(pCLS3841、配列番号202)を伴うか又は伴わないSC_GSメガヌクレアーゼによるこの細胞株のトランスフェクション後、GFP陽性細胞のパーセンテージは、トランスフェクト種により誘導される変異誘発頻度と直接相関する。
【０１４０】
ｅ)メガヌクレアーゼ-誘導変異誘発をモニターする細胞モデルでのトランスフェクション
トランスフェクションの１日前に百万個の細胞を播種した。細胞を、25μlのリポフェクタミン(Invitrogen)を製造業者の指示に従って用いて、５又は10μgのトータルDNA(残りはpUCベクター(pCLS0002、配列番号191)を補充)中それぞれ１μgのSC_GSコーディングベクター(pCLS2690、配列番号153)と０、４、６若しくは９μgのTdtコーディングプラスミド(pCLS3841 配列番号202)、又は３μgのSC_GSコーディングプラスミドと０又は２μgのTdtコーディングベクターとで同時トランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、Guava装置を使用するフローサイトメトリ分析用に細胞を採集した。３μgのSC_GSコーディングベクターと０又は２μgのTdtコーディングプラスミドとに相当する条件を、ゲノムDNA抽出用に採集した。ディープシーケンシングのためのPCRを、次のプライマー：5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG(フォワードアダプター配列)-10N-(PCR産物の同定に必要な配列)-GCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCC(遺伝子導入遺伝子座特異的フォワード配列)-3'(配列番号160)及び5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG-(リバースアダプター配列)-TCGATCAGCACGGGCACGATGCC(遺伝子導入遺伝子座特異的リバース配列)-3'(配列番号161)を用いて行った。PCR産物を454 sequencing system (454 Life Sciences)により配列決定した。PCR産物あたり約10,000配列を得た後、部位-特異的挿入又は欠失事象の存在について分析した。
【０１４１】
ｆ)内因性遺伝子座でのメガヌクレアーゼ-誘導変異誘発をモニターするための293H細胞でのトランスフェクション
トランスフェクションの１日前に百万個の細胞を播種した。細胞を、25μlのリポフェクタミン(Invitrogen)を製造業者の指示に従って用いて、５又は10μgのトータルDNA(残りはpUCベクター(pCLS0002、配列番号191)を補充)中３μgのSC_RAG1コーディングベクター(pCLS2222、配列番号156)とそれぞれ0.5、１及び２μg又は１、３及び７μgのTdtコーディングプラスミド(pCLS3841、配列番号202)とで同時トランスフェクトした。３μgのSC_CAPNS1コーディングベクター(pCLS6163 配列番号158)を、25μlのリポフェクタミン(Invitrogen)を製造業者の指示に従って用いて、２μgの空ベクタープラスミド(pCLS0002、配列番号191)又はTdtコーディングプラスミド(pCSL3841、配列番号202)と同時トランスフェクトした。トランスフェクションの７日後、ゲノムDNA抽出用に細胞を採集した。ディープシーケンシングのためのPCRを、次のプライマー：5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-(フォワードアダプター配列)-10N-(PCR産物の同定に必要な配列)(配列番号５)-遺伝子座特異的フォワード配列：RAG1用にはGGCAAAGATGAATCAAAGATTCTGTCC-3'(配列番号162)、CAPNS1用にはCGAGTCAGGGCGGGATTAAG-3'(配列番号164)及びリバースプライマー5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG-(リバースアダプター配列)(配列番号６)-内因性遺伝子座特異的リバース配列：RAG1用には-GATCTCACCCGGAACAGCTTAAATTTC-3'(配列番号165)、CAPNS1用には-CGAGACTTCACGGTTTCGCC-3'(配列番号167)を用いて行った。PCR産物を454 sequencing system (454 Life Sciences)により配列決定した。PCR産物あたり約10,000配列を得た後、部位-特異的挿入又は欠失事象の存在について分析した。
【０１４２】
結果
１−メガヌクレアーゼ-誘導変異誘発性NHEJ修復を測定する細胞モデルにおいて
SC_GSにより誘導される変異誘発性NHEJ修復を測定する細胞株を作製した。GFP+細胞のパーセンテージ(変異誘発性NHEJ修復のモニタリング)を、SC_GS(pCLS2690、配列番号153)単独又は漸増用量のTdtコーディングベクター(pCLS3841、配列番号202)でのトランスフェクションの96時間後に分析した。SC_GSトランスフェクションはTdtの不在下で0.2±0.1％のGFP+細胞を導いた一方、全ての用量のTdtコーディングプラスミドは1.0±0.4％のGFP+細胞を導いた(図12、パネルＡ)。３μgのSC_GSコーディングプラスミドとpUCベクターとでのトランスフェクションは、0.6±0.1％のGFP+細胞を導いた一方、２μgのTdtコーディングプラスミドの存在下、GFP+細胞のパーセンテージは1.9±0.3％のGFP+細胞に刺激された。３μgのSC_GSと２μgの空ベクター又はTdtコーディングベクターとに相当する条件をディープシーケンシングにより分析した。SC_GSと空ベクターとでのトランスフェクションは3.2％の標的化変異誘発(TM)を導いた一方、Tdt発現プラスミドの存在下、TMは26.0％までに刺激された(図12、パネルＢ)。Tdtの不在下、挿入事象は総TM事象の29％であった一方、Tdtの存在下、これら挿入事象は95.3％までに増大した(図12、パネルＣ)。最後に、Tdtコーディングプラスミドの存在下での挿入サイズの分析により、２〜８bpの範囲の小さな挿入を有する特徴的な挿入が導かれた(図12、パネルＤ)。
【０１４３】
２−内因性RAG1遺伝子座にて
Tdtが遺伝子操作メガヌクレアーゼ-誘導標的化変異誘発を内因性遺伝子座で刺激し得るかどうかを決定するために、野生型293H細胞をSC_RAG1コーディングベクター(pCLS2222、配列番号156)と種々の用量のTdtコーディングプラスミド(pCLS3841、配列番号202)とによりトランスフェクトした。２つの異なるトランスフェクションを、５又は10μgのトータルDNA(残りは空ベクター(pCLS0002、配列番号191)を補充)中３μgのSC_RAG1コーディングベクター(pCLS2222、配列番号156)とそれぞれ0.5、１及び２μg又は１、３及び７μgのTdt発現プラスミド(pCLS3841、配列番号202)とで行った。Tdt発現ベクターの不在下、標的付けられた変異誘発(TM)は0.5〜0.8％の間で変化する。Tdtの存在下、TMは1.6％までに刺激された(図13、パネルＡ)。変異誘発性DSB修復の性質を分析し、これによりメガヌクレアーゼにより誘導されるTM事象のパターンの改変が示された。図13、パネルＢに示されるように、挿入のパーセンテージはTdtの不在下でほとんど０であった一方、Tdt発現ベクターの存在下でこのパーセンテージは、TM事象の50％から70％までである。挿入のサイズもまた分析した。Tdtの存在下で、２〜８bpの範囲の小さな挿入に対応する特異パターンの挿入が見られた(図13、パネルＣ)。最後に、これら挿入物の配列は挿入が見かけ上ランダムであることを示しているようである(表８)。
【０１４４】
【表８】
2013544082.tif 000025
【０１４５】
３−内因性CAPNS1遺伝子座にて
別の内因性遺伝子座でのTdt発現効果を決定するために、野生型293H細胞を３μgのSC_CAPNS1メガヌクレアーゼコーディングプラスミド(pCLS6163、配列番号158)と０又は２μgのTdtコーディングプラスミド(pCLS3841、配列番号202)(５μgのトータルDNA中)とでトランスフェクトした。Tdt発現ベクターの不在下、標的付けられた変異誘発(TM)は7.4％であった。Tdtの存在下、TMは13.9％までに刺激された(図14、パネルＡ)。変異誘発性DSB修復の性質を分析し、これによりメガヌクレアーゼにより誘導されるTM事象のパターンの改変が示された。図14、パネルＢに示されるように、挿入事象はTdtの不在下、総TM事象の10％であった一方、Tdt発現ベクターの存在下、挿入事象は、TM事象の65％であった。挿入のサイズもまた分析した。Tdtの存在下、２〜６bpの範囲の小さな挿入に対応する特異パターンの挿入が見られた。最後に、これら挿入物の配列は挿入が見かけ上ランダムであることを示しているようである(表９)。
【０１４６】
【表９】
2013544082.tif 000026
【０１４７】
実施例6B：ヒトTdtとメガヌクレアーゼとの融合：標的付けられた変異誘発に対する効果
Tdt(配列番号201)とメガヌクレアーゼコーディングプラスミドとの同時トランスフェクションは、メガヌクレアーゼにより誘導される変異誘発の率を増大させることが示された。しかし、このストラテジーは、細胞内での同時に２つのプラスミドの存在を示唆する。更に、メガヌクレアーゼの切断に際して、新たに創出したDSBにてTdt活性を標的することは、有益である。よって、TdT及びメガヌクレアーゼタンパク質を含んでなるキメラタンパク質を工学的に操作する。ヒトTdtタンパク質(配列番号201)を、異なる単鎖の遺伝子操作メガヌクレアーゼSC_MN(例えばSC_GS(配列番号193)、SC_RAG(配列番号58)及びSC_CAPNS1(配列番号192))のＮ-又はＣ-末端に融合する。Tdtタンパク質に融合した２つのSC_MNを作製する：検討するメガヌクレアーゼのＮ末端ドメイン又はＣ末端ドメインで融合。これら構築物を、興味対象の遺伝子座での変異誘発活性を増大する能力について試験する。
【０１４８】
材料及び方法
ｈ)SC_MN/Tdt融合タンパク質の作製
Tdtタンパク質をSC_MNメガヌクレアーゼにＣ-末端又はＮ-末端で10アミノ酸リンカー(GGGGS)2(配列番号170)を用いて融合する。これにより、それぞれSC_MN-Tdt又はTdt-SC_MNと名付けた２つのタンパク質構築物を生じる。最初に、全てのSC_MNを、CMVプロモーターの制御下での興味対象遺伝子の発現を駆動する(pcDNA3.1(Invitrogen)の誘導体である)pCLS1853(図７、配列番号175)のAscI/XhoI制限部位にクローニングした。特異的プライマーを用いて２つのORFを別々に増幅することによって、各SC_MN/Tdt構築物について２つの融合タンパク質を得る。下記の表10に、種々のSC_GS/Tdt構築物を作製するために使用するオリゴヌクレオチド性配列を示す。
【０１４９】
【表１０】
2013544082.tif 000027
【０１５０】
次いで、２つのPCRフラグメントのゲル精製後、TdtとSC_MNとのCter融合体についてはCMVfor(配列番号176)及びTDTRev(配列番号204)オリゴヌクレオチドを用いて、又はTdtとSC_MNとのNter融合体についてはTDTFor(配列番号205)及びV5Rev(配列番号177)を用いてPCRアセンブリを実現する。最終PCR産物をpTOPOベクターにクローニングし、次いでAscI及びXhoIにより消化し、これら同じ酵素で予め消化したpCLS1853ベクター(配列番号175)にライゲートする。
【０１５１】
実施例７：173塩基対(bp)離間する２つの配列を標的する２つのヌクレアーゼでの同時トランスフェクションの、変異誘発頻度に対する影響
２つの近接する部位を標的する２つのヌクレアーゼにより誘導される変異誘発頻度に対する影響を調べるために、RAG1遺伝子内のDNA配列を標的する２つの遺伝子操作されたヌクレアーゼでの同時トランスフェクションを行った。ヌクレアーゼは、pCLS2222(配列番号156)によりコードされる、DNA配列5'-TTGTTCTCAGGTACCTCAGCCAGC-3'(T1)(配列番号207)を切断する遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ(N1)(配列番号216のSC_RAG)と、DNA配列5'-TATATTTAAGCACTTATATGTGTGTAACAGGTATAAGTAACCATAAACA-3'(T2)(配列番号208)を標的するTALEN(N2)とからなる[pCLS8964(配列番号211)及びpCLS8965(配列番号212)によりコードされるそれぞれ配列番号209〜210]。これら２つの認識部位は173bp離れている。
【０１５２】
材料及び方法
細胞トランスフェクション
ヒト293H細胞(ATCC)を、1.2×106細胞/10cmディッシュの密度で、完全培地[DMEMに２mM L-グルタミン、ペニシリン(100IU/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)、アンホテリシンＢ(Fongizone：0.25μg/ml, Invitrogen-Life Science)及び10％ FBSを補充]中にプレートした。翌日、細胞を、両ヌクレアーゼ発現プラスミド(３μgのN1及び0.25μgのN2の各単量体)を含有する10μgのトータルDNAで、リポフェクタミン2000トランスフェクション試薬(Invitrogen)を製造業者のプロトコールに従って用いてトランスフェクトした。コントロールとして、各ヌクレアーゼを単独で発現させた。全ての条件について、サンプルは、空ベクターpCLS0003(配列番号213)で10μgのトータルDNAに仕上げた。
２日後、細胞を採集し、ゲノム抽出を行った。変異誘発頻度をディープシーケンシングにより決定した。T1及びT2標的を、454 sequencing system(454 Life Sciences)でのハイスループット配列決定に必要とされる特異的アダプターに隣接する特異的プライマーを用いて増幅した。
T1及びT2遺伝子座にて、プライマーF_T2：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAGCTTTACATTTACTGAACAAATAAC-3'(配列番号214)及び
R_T1：
5'CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGGATCTCACCCGGAACAGCTTAAATTTC-3'(配列番号215)を使用した。サンプルあたり5,000〜10,000配列を分析した。
【０１５３】
結果
ヌクレアーゼN1及びN2により標的T1及びT2で誘導される変異の率を、ディープシーケンシングにより測定した。結果を表11に示す。N1ヌクレアーゼでトランスフェクトした細胞に相当するサンプル中で、PCRフラグメントの0.63％が変異を有していた。同様に、N2ヌクレアーゼでトランスフェクトした細胞に相当するサンプル中で、PCRフラグメントの1.46％が変異を有していた。誘導された変異誘発の率は、細胞をN1及びN2の両方を発現するプラスミドでトランスフェクトしたとき、T1標的に対しては1.33％まで、T2標的に対しては2.48％まで増大した。このことは、２つの近接する配列を標的する２つのヌクレアーゼの存在が、変異誘発の頻度を約２倍まで刺激することを示している。興味深いことに、唯１つのヌクレアーゼプラスミドでトランスフェクトしたサンプルでは、観察された欠失の多数は小さな欠失である。対照的に、両ヌクレアーゼ発現プラスミドで同時トランスフェクトしたサンプルでは、欠失の大部分は大きな欠失(＞197bp)であり、これは２つの切断部位間の介在配列に相当する。
よって、173bp離間した２つの近接する配列を標的する２つのヌクレアーゼの同時トランスフェクションは、変異誘発頻度を刺激することが認められた。
【０１５４】
【表１１】
2013544082.tif 000028
【０１５５】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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