(57)【要約】  本発明は、アベリノ角膜ジストロフィー診断用システムに関し、より詳細には入力された第１ＰＣＲ増幅値及び第２ＰＣＲ増幅値の比を利用して、正常及びアベリノ角膜ジストロフィーを判別するアベリノ角膜ジストロフィー診断用システムに関するものである。本発明に係るアベリノ角膜ジストロフィー診断用システムは、医師の熟練度に影響されることなく、より簡単でかつ正確な診断を可能にする。特に、全工程がシステム化されて体系的になっており、診断が正確になり、多くの検査対象者を容易に管理できるため有用である。
2013542723.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の手段を含むアベリノ角膜ジストロフィー診断用システムを提供する：
（ａ）ネットワークを介して試料に対する情報及び検査依頼書を、入力手段を含むサーバーに伝送して診断サービスを要請して、そして前記要請に応答して出力手段を含むサーバーから伝えられるアベリノ角膜ジストロフィー判別結果データの提供を受けて保存する少なくとも一つのクライアントを含むクライアントグループ；
（ｂ）前記試料に対する情報、前記検査依頼書、試料ＤＮＡにＴＧＦＢＩ遺伝子のエクソン４部位を増幅できるプライマー対と前記エクソン４部位に突然変異を含まないＴＧＦＢＩ遺伝子を検出できるプローブとを添加して測定した第１ＰＣＲ増幅値、及び試料ＤＮＡにＴＧＦＢＩ遺伝子のエクソン４部位を増幅できるプライマー対と前記エクソン４部位に突然変異を含むＴＧＦＢＩ遺伝子を検出できるプローブとを添加して測定した第２ＰＣＲ増幅値、の入力を受けるための入力手段；
（ｃ）前記第１ＰＣＲ増幅値が、第２ＰＣＲ増幅値の５〜９倍の場合正常と判別し、第１ＰＣＲ増幅値と第２ＰＣＲ増幅値の比が１：１．５〜１．５：１の場合アベリノ角膜ジストロフィー異型接合子と判別し、第２ＰＣＲ増幅値が第１ＰＣＲ増幅値の５〜９倍の場合アベリノ角膜ジストロフィー同型接合子と判別する分析手段；及び
（ｄ）前記分析手段の判別結果を出力するための出力手段。
【請求項２】
前記第１ＰＣＲ増幅値と第２ＰＣＲ増幅値とをそれぞれ２つの軸に沿ってプロットした２次元の形質選別プロットを提供する表示手段をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のアベリノ角膜ジストロフィー診断用システム。
【請求項３】
前記第１ＰＣＲ増幅値及び第２ＰＣＲ増幅値が、試料ＤＮＡに、ＴＧＦＢＩ遺伝子のエクソン４部位を増幅できるプライマー対、前記エクソン４部位に突然変異を含まないＴＧＦＢＩ遺伝子を検出できるプローブ、及び前記エクソン４部位に突然変異を含むＴＧＦＢＩ遺伝子を検出できるプローブを、共に添加してＰＣＲを行うことによって、同時に測定されることを特徴とする請求項１に記載のアベリノ角膜ジストロフィー診断用システム。
【請求項４】
前記試料に対する情報が、試料の種類、依頼者名、依頼機関名、採取日、採取時間及び連絡先のいずれか一つ以上であることを特徴とする請求項１に記載のアベリノ角膜ジストロフィー診断用システム。
【請求項５】
前記試料は、口腔粘膜細胞、血液及び毛根のいずれか一つであることを特徴とする請求項４に記載のアベリノ角膜ジストロフィー診断用システム。
【請求項６】
前記検査依頼書は、遺伝子検査同意書を含むことを特徴とする請求項１に記載のアベリノ角膜ジストロフィー診断用システム。
【請求項７】
前記増幅値を出力するＰＣＲ装置をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のアベリノ角膜ジストロフィー診断用システム。
【請求項８】
前記試料のＤＮＡの２６０ｎｍでの吸光度及び２８０ｎｍでの吸光度を入力して、試料ＤＮＡの濃度及び純度を演算する第１演算手段と、前記プローブ、前記プライマー対及び蒸溜水の量を演算する第２演算手段とをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のアベリノ角膜ジストロフィー診断用システム。
【請求項９】
前記ＴＧＦＢＩ遺伝子のエクソン４部位を増幅できるプライマー対は、配列番号１及び２で表されるプライマー対であることを特徴とする請求項１に記載のアベリノ角膜ジストロフィー診断用システム。
【請求項１０】
前記エクソン４部位に突然変異を含まないＴＧＦＢＩ遺伝子を検出できるプローブは、コドン１２４位置が「ＣＧＣ」であるＴＧＦＢＩ遺伝子を検出できるプローブであることを特徴とする請求項１に記載のアベリノ角膜ジストロフィー診断用システム。
【請求項１１】
前記コドン１２４位置が「ＣＧＣ」であるＴＧＦＢＩ遺伝子を検出できるプローブは、配列番号３で表されるプローブであることを特徴とする請求項１に記載のアベリノ角膜ジストロフィー診断用システム。
【請求項１２】
前記エクソン４部位に突然変異を含むＴＧＦＢＩ遺伝子を検出できるプローブは、コドン１２４位置が「ＣＡＣ」であるＴＧＦＢＩ遺伝子を検出できるプローブであることを特徴とする請求項１に記載のアベリノ角膜ジストロフィー診断用システム。
【請求項１３】
前記コドン１２４位置が「ＣＡＣ」であるＴＧＦＢＩ遺伝子を検出できるプローブは、配列番号４で表されるプローブであることを特徴とする請求項１に記載のアベリノ角膜ジストロフィー診断用システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アベリノ角膜ジストロフィー診断用システムに関し、より詳細には入力された第１ＰＣＲ増幅値及び第２ＰＣＲ増幅値の比を利用して、正常及びアベリノ角膜ジストロフィーを判別するアベリノ角膜ジストロフィー診断用システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
角膜ジストロフィー（corneal dystrophy）は、角膜中心に混濁が生じ、さらに年を取るにつれて、徐々に混濁が多くなって視力が低下する常染色体優性遺伝疾患であり、アベリノ角膜ジストロフィー（Avellino corneal dystrophy）、顆粒状角膜ジストロフィー（Granular corneal dystrophy）、格子状角膜ジストロフィー（lattice type I corneal dystrophy）及び輪状角膜ジストロフィー（Reis-bucklers corneal dystrophy）等があり、βＩＧ−Ｈ３蛋白質をコードする遺伝子の突然変異によって発生する。
【０００３】
これらのうち、アベリノ角膜ジストロフィー患者は、年齢が進むにつれて、異型接合体（heterozygote）は、視力の大幅な損失を示し、同型接合体（homozygote）の場合には６才から失明する。アベリノ角膜ジストロフィーは、従来、顆粒型角膜ジストロフィーと総称された疾患であったが、遺伝子の違いが発見され、１９８８年分離命名された疾患である。世界で最も一般的な角膜ジストロフィーとして知られており、遺伝子検査の結果、国内に１／３４０〜１／１０００の間の有病率（heterozygoteの場合）となっており、かなり一般的な疾病である（Holland, E.J. et al., Ophthalmology, 99:1564, 1992; Kennedy, S.M. et al., Br. J. Ophthalmol., 80:489, 1996;Dolmetsch, A.M. et al., Can. J. Ophthalmol., 31:29, 1996; Afshari, N.A. et al., Arch. Ophthalmol., 119:16, 2001;Stewart, H.S. Hum. Mutat., 14:126, 1999）。
【０００４】
本発明者等は、異型接合体のアベリノ角膜ジストロフィー患者が、レーシック手術を受けると、約２年後から角膜混濁が急激に増加して、失明することを発見した（Jun, RM et al., Ophthalmolgy, 111:463, 2004）。以前は、レーシック、またはエクシマレーザー手術が角膜ジストロフィー患者の混濁を取り除くとの予測を基に多くの手術が行われた。国内のこれまで施術されたレーシック手術は約３０万件と推定され、国内のアベリノ角膜ジストロフィーの異型接合子の頻度を最小限の計算値である１／１０００と見ても３００人が視力を失っていると推測することができる。レーシック手術を受けた患者は、主に２０〜３０代の生産活動を行っている人口で、これらの失明は社会的、経済的に深刻な問題と判断される。また、２０００年以後レーシック手術の手術適用が公表された米国の場合、黒人においてもアベリノ角膜ジストロフィー患者のレーシック手術による失明が発見され始め、世界中の多くの患者が手術を受けた後、疾病が進んでいるものと推測できる。
【０００５】
従って、レーシック手術の施術前に、アベリノ角膜ジストロフィー患者に対する正確な診断を行って、レーシック手術による症状の進行を防止しなければならないが、従来の眼科における眼科医が顕微鏡で眼球混濁を検査することだけで、アベリノ角膜ジストロフィーと診断され、症状が進行していない患者の場合は発見できず、レーシック手術を施行し、失明に発展する場合も度々発生しており、正確でかつ迅速な角膜ジストロフィーの診断方法が切に求められるのが現状である。
それと共に、既存検査は医師の熟練度及び患者の状態といった個人差によって検査結果が変わる場合があって、信頼度と正確性がさらに高い診断方法の開発が求められている。
【０００６】
そこで、本発明者等は、眼科医視力矯正手術前に正確に診断されなければならないアベリノ症を含む角膜ジストロフィーを診断するための新しいシステムを提供しようと鋭意努力した結果、試料のＤＮＡにＴＧＦＢＩ遺伝子（Transforming growth factor b-induced gene）のエクソン４部位を増幅できるプライマー対と前記エクソン４部位に突然変異を含まないＴＧＦＢＩ遺伝子を検出できるプローブを添加して測定した第１ＰＣＲ増幅値と試料ＤＮＡにＴＧＦＢＩ遺伝子のエクソン４部位を増幅できるプライマー対と前記エクソン４部位に突然変異を含むＴＧＦＢＩ遺伝子を検出できるプローブを添加して測定した第２ＰＣＲ増幅値を比較して、前記第１ＰＣＲ増幅値が第２ＰＣＲ増幅値の５〜９倍の場合正常であり、第１ＰＣＲ増幅値と第２ＰＣＲ増幅値の比が１：１．５〜１．５：１の場合アベリノ角膜ジストロフィー異型接合子であり、第２ＰＣＲ増幅値が第１ＰＣＲ増幅値の５〜９倍の場合、アベリノ角膜ジストロフィー同型接合子であることを確認し、本発明を完成した。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の目的は、医師の熟練度に影響されることなく、より簡単でかつ正確な診断が可能なアベリノ角膜ジストロフィー診断のための新しい診断システムを提供するところにある。
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明は、下記の手段を含むアベリノ角膜ジストロフィー診断用システムを提供する：
（ａ）ネットワークを介して試料に対する情報及び検査依頼書を、入力手段を含むサーバーに伝送して診断サービスを要請して、前記要請に応答して出力手段を含むサーバーから伝えられるアベリノ角膜ジストロフィー判別結果データの提供を受けて保存する少なくとも一つのクライアントを含むクライアントグループ；
（ｂ）前記試料に対する情報、前記検査依頼書、試料ＤＮＡにＴＧＦＢＩ遺伝子のエクソン４部位を増幅できるプライマー対と前記エクソン４部位に突然変異を含まないＴＧＦＢＩ遺伝子を検出できるプローブとを添加して測定した第１ＰＣＲ増幅値、及び試料ＤＮＡにＴＧＦＢＩ遺伝子のエクソン４部位を増幅できるプライマー対と前記エクソン４部位に突然変異を含むＴＧＦＢＩ遺伝子を検出できるプローブとを添加して測定した第２ＰＣＲ増幅値の入力を受けるための入力手段；
（ｃ）前記第１ＰＣＲ増幅値が、第２ＰＣＲ増幅値の５〜９倍の場合、正常と判別し、第１ＰＣＲ増幅値と第２ＰＣＲ増幅値の比が１：１．５〜１．５：１の場合アベリノ角膜ジストロフィー異型接合子と判別し、第２ＰＣＲ増幅値が第１ＰＣＲ増幅値の５〜９倍の場合アベリノ角膜ジストロフィー同型接合子と判別する分析手段；及び
（ｄ）前記分析手段の判別結果を出力するための出力手段。
本発明はまた、前記アベリノ角膜ジストロフィー診断用システムを含むコンピュータで読み込み可能な媒体（computer readable medium or media）を提供する。
【０００９】
本発明はまた、前記アベリノ角膜ジストロフィー診断用システムを含むコンピュータを提供する。
本発明は、さらに前記アベリノ角膜ジストロフィー診断用システム、または前記コンピュータで読み込み可能な媒体を利用するアベリノ角膜ジストロフィー診断方法を提供する。
【００１０】
本発明の他の特徴及び具現例は、以下の詳細な説明及び添付された特許請求範囲からより一層明白になる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＰＣＲ増幅データを利用したアベリノ角膜ジストロフィー診断方法の全過程を示した図である。
【図２】システム運営者のサーバーに表示されるオンライン依頼書情報書である。
【図３】生データを利用したＤＮＡ濃度及び純度計算結果を示す。
【図４】第１ＰＣＲ増幅値と第２ＰＣＲ増幅値とを利用した形質選別プロット及びその結果表を示す。
【図５】医療機関用遺伝子分析結果報告書の例示画面である。
【図６】個人用遺伝子分析結果報告書の例示画面である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法及び以下で詳述する実験方法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
【００１３】
本発明の詳細な説明などにおいて使用される主な用語の定義は、下記の通りである。
【００１４】
本願において、「アベリノ角膜ジストロフィー」とは、第２型顆粒型殻膜ジストロフィー（Granular Corneal dystrophy type II）ともいい、両眼角膜中心部に混濁が発生する疾患であり、常染色体優生遺伝をする遺伝疾患で、ＴＧＦＢＩ遺伝子のエクソン４部位のＣＧＣ配列がＣＡＣに突然変異し、ＢＩＧＨ３蛋白質の１２４番目のアミノ酸がアルギニンからヒスチジンに変異（Ｒ１２４Ｈ）する遺伝子異常によって現れる疾患である。
【００１５】
本願において、「異型接合子」とは、親から受け継いだ一対の遺伝子のうちの一つにだけ、突然変異が存在する場合で、「アベリノ角膜ジストロフィー異型接合子」とは、親から受け継いだ一対のＴＧＦＢＩ遺伝子の中一つにだけ突然変異が存在する場合をいう。
【００１６】
本願において、「同型接合子」とは、親から受け継いだ一対の遺伝子全てに突然変異が存在する場合で、「アベリノ角膜ジストロフィー同型接合子」とは、親から受け継いだ一対のＴＧＦＢＩ遺伝子全てに突然変異が存在する場合をいう。
【００１７】
本願において、「プログラム」または「コンピュータプログラム」とは、一般に特定プログラミング言語の規則に符合し、特定機能、任務、または問題を解決したり実行するのに必要な「コードセグメント」に分けられる宣言及び陳述、または命令で構成される統語論的単位を意味する。プログラミング言語は、一般にプログラムを表現するための人工言語である。
【００１８】
本願において、「システム」または「コンピュータシステム」とは、一般に一つ以上のコンピュータ、周辺装置及びデータ処理を行うソフトウェアを意味する。「ユーザー」又は「システム運営者」とは、一般にデータ処理及び情報交換のために「システム運営者装置」（例：コンピュータ、無線装置等）を介してアクセスするコンピュータネットワークを利用する人を含む。「コンピュータ」とは、一般に人の介入なしに数多くの算術演算及び論理演算をはじめとする実質的な計算を行える機能的単位である。
【００１９】
本願において、「コンピュータで読み込み可能な媒体」とは、限定されるものではないが、ハードディスク、フロッピーディスク、コンパクトディスク、マグネト−オプチカルディスク（magneto-optical disc）、ランダムアクセスメモリ（Random Access Memory）、リードオンリーメモリ（Read Only Memory）、またはフラッシュメモリ（flash memory）であってもよい。さらに、本願で用いられるコンピュータで読み込み可能な媒体は、一つのコンピュータ内に含まれてもよく、またはネットワークで分散（distribute）してもよい。この時、ネットワークは、ＬＡＮ（local area network）またはＷＡＮ（wide area network）のような任意の従来のネットワークシステムを用いてもよい。本願で用いられるネットワークやサーバーは、従来知らされたネットワークやサーバーの形態を利用することができ、例えば、Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂアプリケーションを用いてもよく、Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂサーバーであってもよい。
【００２０】
一観点において、本発明は、ＰＣＲ増幅データを利用したアベリノ角膜ジストロフィー診断用システムに関し、下記の手段を含むことを特徴とする：
（ａ）ネットワークを介して試料に対する情報及び検査依頼書を、入力手段を含むサーバーに伝送して診断サービスを要請して、前記要請に応答して出力手段を含むサーバーから伝えられるアベリノ角膜ジストロフィー判別結果データの提供を受けて保存する少なくとも一つのクライアントを含むクライアントグループ；
（ｂ）前記試料に対する情報、前記検査依頼書、試料ＤＮＡにＴＧＦＢＩ遺伝子のエクソン４部位を増幅できるプライマー対と前記エクソン４部位に突然変異を含まないＴＧＦＢＩ遺伝子を検出できるプローブとを添加して測定した第１ＰＣＲ増幅値、及び試料ＤＮＡにＴＧＦＢＩ遺伝子のエクソン４部位を増幅できるプライマー対と前記エクソン４部位に突然変異を含むＴＧＦＢＩ遺伝子を検出できるプローブとを添加して測定した第２ＰＣＲ増幅値、の入力を受けるための入力手段；
（ｃ）前記第１ＰＣＲ増幅値が、第２ＰＣＲ増幅値の５〜９倍の場合、正常と判別し、第１ＰＣＲ増幅値と第２ＰＣＲ増幅値の比が１：１．５〜１．５：１の場合アベリノ角膜ジストロフィー異型接合子と判別し、第２ＰＣＲ増幅値が第１ＰＣＲ増幅値の５〜９倍の場合アベリノ角膜ジストロフィー同型接合子と判別する分析手段；及び
（ｄ）前記分析手段の判別結果を出力するための出力手段。
【００２１】
図１は、ＰＣＲ増幅データを利用したアベリノ角膜ジストロフィー診断方法の全過程を図示した図面であり、以下に図１を参照しながら説明する。
本発明は、好ましくは、ネットワークを介して前記試料に対する情報及び検査依頼書を前記入力手段を含むサーバーに伝送して、診断サービスを要請し、前記要請に応答して前記出力手段を含むサーバーから伝えられるアベリノ角膜ジストロフィー判別結果データの提供を受けて保存する少なくとも一つのクライアントを含むクライアントグループをさらに含んでもよい。
【００２２】
前記試料に対する情報が、試料の種類、依頼者名、依頼機関名、採取日、採取時間及び連絡先のいずれか一つ以上を入力でき、この時、前記試料は、口腔粘膜細胞、血液及び毛根のいずれか一つを利用することができる。さらに、前記検査依頼書は、遺伝子検査同意書を含んでもよい。
【００２３】
さらに、前記試料のＤＮＡの２６０ｎｍでの吸光度及び２８０ｎｍでの吸光度をデータとして入力することができ、第１演算手段は、前記吸光度を利用して、試料ＤＮＡの濃度及び純度を演算する。また、全試料の個数と対照群を考慮して、プローブ、プライマー対及び蒸溜水の量を演算する第２演算手段を含んでもよい。そして、前記演算された前記試料ＤＮＡの濃度及び純度を利用して、試料ＤＮＡの量を決めることができる。
【００２４】
前記プローブは、エクソン４部位に突然変異を含まないＴＧＦＢＩ遺伝子を検出できるプローブとエクソン４部位に突然変異を含むＴＧＦＢＩ遺伝子を検出できるプローブを意味し、前記プライマー対は、ＴＧＦＢＩ遺伝子のエクソン４部位を増幅できるプライマー対を意味する。一方、ＰＣＲを行うための試薬としては、Ｔａｑポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ２、ＰＣＲ緩衝溶液等が用いられる。
【００２５】
この時、前記ＴＧＦＢＩ遺伝子のエクソン４部位を増幅できるプライマー対は、ＴＧＦＢＩ遺伝子のコドン１２４位置を増幅できるプライマー対であり、好ましくは配列番号１及び２で表されるプライマー対である。また、前記エクソン４部位に突然変異を含まないＴＧＦＢＩ遺伝子を検出できるプローブは、コドン１２４位置が「ＣＧＣ」であるＴＧＦＢＩ遺伝子を検出できるプローブであり、好ましくは配列番号３で表されるプローブである。また、前記エクソン４部位に突然変異を含むＴＧＦＢＩ遺伝子を検出できるプローブは、コドン１２４位置が「ＣＡＣ」であるＴＧＦＢＩ遺伝子を検出できるプローブであり、好ましくは配列番号４で表されるプローブである。
ＴＧＦＢＩ遺伝子のコドン１２４位置を増幅するためのプライマー対
配列番号１：５'−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＣＡＧＣＴＧＴＡ−３'
配列番号２：５'−ＣＣＡＴＣＴＣＡＧＧＣＣＴＣＡＧＣＴＴ−３'
コドン１２４位置が「ＣＧＣ」であるＴＧＦＢＩ遺伝子を識別するためのプローブ
配列番号３：５'−ＣＡＣＧＧＡＣＣＧＣＡＣＧＧＡ−３'
コドン１２４位置が「ＣＡＣ」であるＴＧＦＢＩ遺伝子を識別するためのプローブ
配列番号４：５'−ＣＡＣＧＧＡＣＣＡＣＡＣＧＧＡ−３'
【００２６】
本発明に係るアベリノ角膜ジストロフィー診断用システムは、追加的に前記演算されたプローブ、プライマー対及び蒸溜水の量を適用して、試料ＤＮＡにＴＧＦＢＩ遺伝子のエクソン４部位を増幅できるプライマー対と前記エクソン４部位に突然変異を含まないＴＧＦＢＩ遺伝子を検出できるプローブを添加して測定した第１ＰＣＲ増幅値と、試料ＤＮＡにＴＧＦＢＩ遺伝子のエクソン４部位を増幅できるプライマー対と前記エクソン４部位に突然変異を含むＴＧＦＢＩ遺伝子を検出できるプローブを添加して測定した第２ＰＣＲ増幅値を出力するＰＣＲ装置を含んでもよい。前記ＰＣＲ装置は、リアルタイムＰＣＲプログラムがセットされてもよい。
【００２７】
この時、ＰＣＲを行う際に、好ましくは迅速な処理のために試料ＤＮＡにＴＧＦＢＩ遺伝子のエクソン４部位を増幅できるプライマー対、前記エクソン４部位に突然変異を含まないＴＧＦＢＩ遺伝子を検出できるプローブ、及び前記エクソン４部位に突然変異を含むＴＧＦＢＩ遺伝子を検出できるプローブを共に添加してＰＣＲを行うことによって、第１ＰＣＲ増幅値及び第２ＰＣＲ増幅値が同時に測定できる。
【００２８】
前記出力された第１ＰＣＲ増幅値及び第２ＰＣＲ増幅値は、入力手段に入力された後、分析手段で第１ＰＣＲ増幅値が第２ＰＣＲ増幅値の５〜９倍の場合、正常と判別し、第１ＰＣＲ増幅値と第２ＰＣＲ増幅値の比が１：１．５〜１．５：１である場合、アベリノ角膜ジストロフィー異型接合子と判別し、第２ＰＣＲ増幅値が第１ＰＣＲ増幅値の５〜９倍の場合、アベリノ角膜ジストロフィー同型接合子と判別されることになる。この時、好ましくは、前記第１ＰＣＲ増幅値が第２ＰＣＲ増幅値の７〜８倍の場合、正常と判別し、第２ＰＣＲ増幅値が第１ＰＣＲ増幅値の７〜８倍の場合、アベリノ角膜ジストロフィー同型接合子と判別する。
【００２９】
前記第１ＰＣＲ増幅値と第２ＰＣＲ増幅値とをそれぞれ２つの軸に沿ってプロットした２次元の形質選別プロットを提供する表示手段をさらに含んでもよい。この時、前記２次元形質選別プロットは、第１ＰＣＲ増幅値はＸ軸とし、第２ＰＣＲ増幅値はＹ軸として示す場合、プロット上で右側下段に表示される時、正常と判別し、これと対称の位置に表示される時、アベリノ同型接合子と判別する。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当分野において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００３１】
実施例１．アベリノ角膜ジストロフィーの診断例
１−１：試料情報及び検査依頼書の入力
個人クライアント、または個人クライアントの試料を採取した医療機関から構成されるクライアントグループは、試料に対する情報及び検査依頼書をシステム運営者のサーバーに伝送する。
【００３２】
この時、試料に対する情報は、試料の種類、依頼者名、依頼機関名、採取日、採取時間、及び連絡先等を入力し、採取された形態に応じて試料の種類を全血、口腔上皮、及び毛根のいずれか一つを選択した。尚、検査依頼書作成前段階として遺伝子検査同意書の作成を含む。
この時、システム運営者のサーバーに表示されるオンライン依頼書情報は図２のようになる。
【００３３】
１−２：試料ＤＮＡの濃度及び純度演算
本発明に係るアベリノ角膜ジストロフィー診断システムは、試料ＤＮＡの濃度及び純度を算出するための第１演算手段を含む。
【００３４】
試料のＤＮＡの２６０ｎｍでの吸光度及び２８０ｎｍでの吸光度を測定できるＧｅｎｉｏｓ機器（ＴＥＣＡＮ、オーストリア）は、このシステムに連結でき、この時、前記機器と連結されたシステム運営者の装置（コンピュータ）上にＸＦｌｕｏｒ４（ＴＥＣＡＮ、オーストリア）プログラムが実行されて吸光度が測定され、ＤＮＡの濃度と純度が演算されることになる。
【００３５】
即ち、「ＸＦｌｕｏｒ４→Ｅｄｉｔ→Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ」で「Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ」を選択した後、「Ｍｅａｓ．ｐａｒａｍｓ」の吸収波長は２６０ｎｍ、「Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｒｅａｄｓ」は、２回程度指定した後確認ボタンを押す。次に、「ＸＦｌｕｏｒ４→Ｓｔａｒｔ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ」押せば２６０ｎｍでの吸光度が測定される。
【００３６】
再び、「ＸＦｌｕｏｒ４→Ｅｄｉｔ→Ｍｅａｓ．ｐａｒａｍｓ」で吸収波長は、２８０ｎｍ、「Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｒｅａｄｓ」は、２回程度指定した後、確認ボタンを押す。次に、「ＸＦｌｕｏｒ４→Ｓｔａｒｔ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ」を押せば２８０ｎｍでの吸光度が測定される。
【００３７】
ＯＤ２６０＝１である時、二重螺旋ＤＮＡの濃度は、約５０ｎｇ／μＬに該当するため、２６０ｎｍでの値からブランク値を差し引いた後、５０を掛けるとＤＮＡ濃度が算出される。また、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍで吸光度を測定した後、両者の比（ＯＤ２６０／ＯＤ２８０）からＤＮＡの純度が分かるが、一般にＯＤ２６０／ＯＤ２８０の比が、１．８から２．０ならば純度が良いと判定する。
図３は、生データを利用したＤＮＡ濃度及び純度計算結果を示す。
【００３８】
１−３：ＰＣＲ増幅のための試料、プライマー対、蒸溜水等の量演算及びＰＣＲ増幅値の出力
本発明に係るアベリノ角膜ジストロフィー診断システムは、ＰＣＲ増幅のための試料ＤＮＡの量を算出するための第２演算手段及びＰＣＲ装置を含む。
【００３９】
準備前サンプル個数と対照群の正常（Normal、ＮＮ）、アベリノ角膜ジストロフィー異型接合子（Heterozygote、ＨＮ）、アベリノ角膜ジストロフィー同型接合子（homozygote、ＨＨ）、陰性対照群（negative control、ＮＴＣ）を合算して、損失を減らすために０．２μＬを加えて、プローブ、プライマー対及び蒸溜水の量を演算した。試料のＤＮＡの量は、前記演算された試料ＤＮＡの濃度及び純度を利用して決めた。
【００４０】
この時、用いられたＴＧＦＢＩ遺伝子のエクソン４の突然変異部位、即ちコドン１２４位置を増幅するためのプライマー対、変異がない正常遺伝子断片と結合するプローブ、即ちコドン１２４位置が「ＣＧＣ」であるＴＧＦＢＩ遺伝子を識別するためのプローブ及び変異がある遺伝子断片と結合するプローブ、即ちコドン１２４位置が「ＣＡＣ」であるＴＧＦＢＩ遺伝子を識別するためのプローブは、下記のようになる。この時、変異がない正常遺伝子断片と結合するプローブは、ＶＩＣで標識し、変異がある遺伝子断片と結合するプローブは、ＦＡＭで標識し、相補的な遺伝子断片との結合が容易になるようＭＧＢ（minor groove binder）を付着した。
ＴＧＦＢＩ遺伝子のコドン１２４位置を増幅するためのプライマー対
配列番号１：５'−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＣＡＧＣＴＧＴＡ−３'
配列番号２：５'−ＣＣＡＴＣＴＣＡＧＧＣＣＴＣＡＧＣＴＴ−３'
コドン１２４位置が「ＣＧＣ」であるＴＧＦＢＩ遺伝子を識別するためのプローブ
配列番号３：５'−ＣＡＣＧＧＡＣＣＧＣＡＣＧＧＡ−３'
コドン１２４位置が「ＣＡＣ」であるＴＧＦＢＩ遺伝子を識別するためのプローブ
配列番号４：５'−ＣＡＣＧＧＡＣＣＡＣＡＣＧＧＡ−３'
【００４１】
次に、ＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）でＰＣＲ値を得るために、リアルタイムＰＣＲプログラムを実行する。即ち、ＲＴ−ＰＣＲ機器画面のＳｔｅｐ  ｏｎｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖ２．０をダブルクリックした後、「Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｓｅｔｕｐ」を押せば、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」という最初の画面が出る。次に、「Ｓｔｅｐ  Ｏｎｅ（商品名）  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（４８ｗｅｌｌｓ）、Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ」に指定する。「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」の下を見ると「Ｐｌａｔｅ  Ｓｅｔｕｐ」で「ＳＮＰ  Ａｓｓａｙ」を「ＡＣＤ  ｐｒｏｂｅ」に指定して、４８ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅが描かれた画面にＡ列１行にＡＣＤ１、Ａ列２行にＡＣＤ２のような方式で４８ｗｅｌｌを全部指定する。「Ｒｕｎ  Ｍｅｔｈｏｄ」でサイクル数を３６に変える。
【００４２】
ＰＣＲ反応のための反応液のプライマー容量は、０．０６２５μＬになるようにしており、プローブ容量は５μＬになるように、蒸溜水は２．９３７５μＬになるように、試料ＤＮＡは２μＬになるようにして、合わせて１０μＬのマスターミックスを用いて、Ｓｅｐｕｐでは下記の通り実験のためのセットを行った。
＜温度条件＞
Ｐｒｅ−ｒｅａｄ：６０℃、３０秒
Ｈｏｌｄｉｎｇ：９５℃、１０分
Ｃｙｃｌｙｉｎｇ：９５℃、３〜１５秒
６０℃、３０秒〜１分→３６サイクル
Ｐｏｓｔ−ｒｅａｄ：６０℃、３０秒
【００４３】
１−４：ＰＣＲ増幅値を利用したアベリノ角膜ジストロフィー判別
実施例１−３のＶＩＤ陽性値（ＴＧＦＢＩ遺伝子のエクソン４部位を増幅するプライマー対及び正常遺伝子断片と結合するプローブを添加して測定した第１ＰＣＲ増幅値）とＦＡＭ陽性値（ＴＧＦＢＩ遺伝子のエクソン４部位を増幅するプライマー対及び変異遺伝子断片と結合するプローブを添加して測定した第２ＰＣＲ増幅値）を図４のように、形質選別プロットで示した。
【００４４】
この時、本発明のシステムの分析手段は、第１ＰＣＲ増幅値が第２ＰＣＲ増幅値の５〜９倍の場合、正常と判別し、第１ＰＣＲ増幅値と第２ＰＣＲ増幅値の比が１：１．５〜１．５：１の場合、アベリノ角膜ジストロフィー異型接合子と判別し、第２ＰＣＲ増幅値が第１ＰＣＲ増幅値の５〜９倍の場合、アベリノ角膜ジストロフィー同型接合子と判別して、図４の左側に色塗りして正常であるか否かを表示する。
【００４５】
１−５：アベリノ角膜ジストロフィー判別結果の出力及び伝送
実施例１−４の判別結果は、図５とともに、画面出力される。この時、図６と同じように、個人結果紙として判別されることができる。このような結果はネットワークを介して前記試料に対する情報及び検査依頼書を伝送してきたクライアントグループに転送される。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
以上、説明した通り、本発明に係るアベリノ角膜ジストロフィー診断用システムは、医師の熟練度に影響されることなく、より簡単でかつ正確な診断が可能なアベリノ角膜ジストロフィー診断のための新しい診断システムを提供する長所がある。特に、全工程がシステム化されて体系的になっており、診断が正確であり、多くの検査対象者も容易に管理できるため有用である。
【００４７】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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