(57)【要約】  本開示は、ＤＮＡ試料の供給源の迅速かつ費用効果の優れた同定のための手法に関する。未知または未認識の組織または細胞型から得られたＤＮＡ試料は、本明細書に記載されている手法に従って解析され、組織および／または細胞型供給源の同定をもたらす。同定は、メチル化感受性／依存性制限およびポリメラーゼ連鎖反応を含む連続的生化学的手順と、それに続くデータ解析に基づく。全ての生化学的ステップは、１本の試験管内で行われる。本開示は、生物性の染みから得られたＤＮＡの組織供給源の同定のための科学捜査において即時適用できる。本開示は、また、同定のための癌診断において即時適用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ試料の供給源を同定するための方法であって、
（ａ）ＤＮＡ試料をメチル化感受性および／またはメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼにより消化するステップと、
（ｂ）消化されたＤＮＡを少なくとも第一および第二の制限座位により増幅して、これにより各制限座位の増幅産物を生成するステップと、
（ｃ）各増幅産物のシグナル強度を決定するステップと、
（ｄ）２種の制限座位に対応するシグナル強度間の少なくとも１個のメチル化比を計算するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）において計算されたメチル化比を、公知の組織および／または細胞型のＤＮＡから得られた参照メチル化比のセットと比較するステップと、
（ｆ）各組織および／または細胞型がＤＮＡの供給源である尤度の決定に基づき、ＤＮＡ試料の供給源を同定するステップと
を含み、最大尤度を有する組織／細胞型が、ＤＮＡ試料の供給源であると決定される方法。
【請求項２】
前記供給源が組織または細胞型である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＤＮＡ消化および増幅が、１本の試験管における１回の生化学反応で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記１本の試験管が、ＤＮＡテンプレート、消化および増幅酵素、バッファー、プライマーならびに付属成分を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記１本の試験管が、密閉され、サーマルサイクラーに置かれ、そこで１回の反応が行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼが、その認識配列がメチル化されている場合、ＤＮＡを切断または消化できない、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼが、ＡａｔＩＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＡｃｃＩ、ＡｃｉＩ、ＡＣｌＩ、ＡｆｅＩ、ＡｇｅＩ、ＡｐａＩ、ＡｐａＬＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｉＳＩ、ＡｖａＩ、ＡｖａＩＩ、ＢａｅＩ、ＢａｎＩ、ＢｂｅＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢｆｕＣＩ、ＢｇｌＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＢＩ、ＢｓａＨＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＹＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｌＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＤＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｓＫＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ、Ｃａｃ８Ｉ、ＣｌａＩ、ＤｐｎＩ、ＤｒｄＩ、ＥａｅＩ、ＥａｇＩ、Ｅａｇｌ−ＨＦ、ＥｃｉＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩ−ＨＦ、ＦａｕＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＦｓｅＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩ、ＨｇａＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｆＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｐａＩ、ＨｐａＩＩ、Ｈｐｙ１６６ｉｉ、Ｈｐｙ１８８ｉｉｉ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＫａｓＩ、ＭｌｕＩ、ＭｍｅＩ、ＭｓｐＡ１Ｉ、ＭｗｏＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＮｇｏＮＩＶ、Ｎｈｅ−ＨＦＩ、ＮｈｅＩ、ＮｌａＩＶ、ＮｏｔＩ、ＮｏｔＩ−ＨＦ、ＮｒｕＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、ＰｌｅＩ、ＰｍｅＩ、ＰｍｌＩ、ＰｓｈＡＩ、ＰｓｐＯＭＩ、ＰｖｕＩ、ＲｓａＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳａｌＩ−ＨＦ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｓａｕ９６Ｉ、ＳｃｒＦＩ、ＳｆｉＩ、ＳｆｏＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｎａＢＩ、ＴｆｉＩ、ＴｓｃＩ、ＴｓｅＩ、ＴｓｐＭＩおよびＺｒａＩからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼが、ＨｈａＩである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記メチル化依存性制限エンドヌクレアーゼが、メチル化ＤＮＡのみを消化する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記メチル化依存性制限エンドヌクレアーゼが、ＭｃｒＢＣ、ＭｃｒＡまたはＭｒｒＡである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記尤度が、ステップ（ｄ）のメチル化比を公知の組織／細胞型から増幅された同一座位の参照比とマッチさせることにより決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記組織および／または細胞型が、血液、唾液、精液または表皮である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記制限座位が、特定の組織および／または細胞型に対し別個のメチル化比を生じるように選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＤＮＡ試料が哺乳類ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳類ＤＮＡが、ヒト、類人猿、サル、ラット、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、ヒツジおよびウマからなる群から選択される哺乳類由来のＤＮＡである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳類ＤＮＡがヒトＤＮＡである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ヒトＤＮＡが男性由来のものである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ヒトＤＮＡが女性由来のものである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記増幅が蛍光標識されたプライマーを用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
シグナル強度が、前記増幅産物をキャピラリー電気泳動により分離し、続いて蛍光シグナルを定量化することにより決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
シグナル強度の増幅および決定が、リアルタイムＰＣＲによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記供給源が特定の生理学的／病理学的状態である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記供給源が特定の年齢または年齢層である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記供給源が男性である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記供給源が女性である、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
血液、唾液、精液および皮膚の表皮から得られたＤＮＡ試料の間を識別するための方法であって、
（ａ）ＤＮＡ試料をＨｈａＩにより消化するステップと、
（ｂ）消化されたＤＮＡを、配列番号２６〜３１に表記されている６種の座位のフォワードおよびリバースプライマーにより増幅して、これにより各制限座位の増幅産物を生成するステップと、
（ｃ）各増幅産物のシグナル強度を決定するステップと、
（ｄ）全座位ペア組み合わせのメチル化比を計算するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）において計算されたメチル化比を、血液、唾液、精液および皮膚の表皮由来のＤＮＡから得られた参照メチル化比のセットと比較するステップと、
（ｆ）血液、唾液、精液および皮膚の表皮のそれぞれがＤＮＡの供給源である尤度を計算するステップと、
を含み、最大尤度を有する組織／細胞型が、ＤＮＡ試料の供給源であると決定される方法。
【請求項２７】
血液における座位ペアの配列番号２９／配列番号３０の参照メチル化比が、約０．２９である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
精液における座位ペアの配列番号２９／配列番号３０の参照メチル化比が、約２．８である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
表皮における座位ペアの配列番号２９／配列番号３０の参照メチル化比が、約０．７８である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
（ａ）ＤＮＡ消化および特定のゲノム座位のプライマーを用いた増幅のための１本の試験管と、（ｂ）少なくとも１個のメチル化比を計算し、それを参照メチル化比と比較するための説明書とを含む、ＤＮＡ試料の供給源を決定するためのキット。
【請求項３１】
前記プライマーが、配列番号２６〜３１に表記されている遺伝子座位のためのフォワードおよびリバースプライマーを含む、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
（ａ）ＤＮＡ試料をメチル化感受性および／またはメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼにより消化するステップと、
（ｂ）消化されたＤＮＡを少なくとも第一および第二の制限座位により増幅して、これにより各制限座位の増幅産物を生成するステップと、
（ｃ）各増幅産物のシグナル強度を決定するステップと、
（ｄ）２種の制限座位に対応するシグナル強度間の少なくとも１個のメチル化比を計算するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）において計算されたメチル化比を、公知の組織および／または細胞型のＤＮＡから得られた参照メチル化比のセットと比較するステップと、
（ｆ）他の組織および／または細胞型の尤度スコアと比較した血液の尤度スコアに基づき、ＤＮＡ試料が血液に由来するか決定するステップと
を含む、ＤＮＡ試料が血液に由来するか決定するための方法。
【請求項３３】
（ａ）ＤＮＡ試料をメチル化感受性および／またはメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼにより消化するステップと、
（ｂ）消化されたＤＮＡを少なくとも第一および第二の制限座位により増幅して、これにより各制限座位の増幅産物を生成するステップと、
（ｃ）各増幅産物のシグナル強度を決定するステップと、
（ｄ）２種の制限座位に対応するシグナル強度間の少なくとも１個のメチル化比を計算するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）において計算されたメチル化比を、公知の組織および／または細胞型のＤＮＡから得られた参照メチル化比のセットと比較するステップと、
（ｆ）他の組織および／または細胞型の尤度スコアと比較した精液の尤度スコアに基づき、ＤＮＡ試料が精液に由来するか決定するステップと
を含む、ＤＮＡ試料が精液に由来するか決定するための方法。
【請求項３４】
（ａ）ＤＮＡ試料をメチル化感受性および／またはメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼにより消化するステップと、
（ｂ）消化されたＤＮＡを少なくとも第一および第二の制限座位により増幅して、これにより各制限座位の増幅産物を生成するステップと、
（ｃ）各増幅産物のシグナル強度を決定するステップと、
（ｄ）２種の制限座位に対応するシグナル強度間の少なくとも１個のメチル化比を計算するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）において計算されたメチル化比を、公知の組織および／または細胞型のＤＮＡから得られた参照メチル化比のセットと比較するステップと、
（ｆ）他の組織および／または細胞型の尤度スコアと比較した皮膚の表皮の尤度スコアに基づき、ＤＮＡ試料が皮膚の表皮に由来するか決定するステップと
を含む、ＤＮＡ試料が皮膚の表皮に由来するか決定するための方法。
【請求項３５】
（ａ）ＤＮＡ試料をメチル化感受性および／またはメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼにより消化するステップと、
（ｂ）消化されたＤＮＡを少なくとも第一および第二の制限座位により増幅して、これにより各制限座位の増幅産物を生成するステップと、
（ｃ）各増幅産物のシグナル強度を決定するステップと、
（ｄ）２種の制限座位に対応するシグナル強度間の少なくとも１個のメチル化比を計算するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）において計算されたメチル化比を、公知の組織および／または細胞型のＤＮＡから得られた参照メチル化比のセットと比較するステップと、
（ｆ）他の組織および／または細胞型の尤度スコアと比較した唾液の尤度スコアに基づき、ＤＮＡ試料が唾液に由来するか決定するステップと
を含む、ＤＮＡ試料が唾液に由来するか決定するための方法。
【請求項３６】
（ａ）ＤＮＡ試料をメチル化感受性および／またはメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼにより消化するステップと、
（ｂ）消化されたＤＮＡを少なくとも第一および第二の制限座位により増幅して、これにより各制限座位の増幅産物を生成するステップと、
（ｃ）各増幅産物のシグナル強度を決定するステップと、
（ｄ）２種の制限座位に対応するシグナル強度間の少なくとも１個のメチル化比を計算するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）において計算されたメチル化比を、公知の組織および／または細胞型のＤＮＡから得られた参照メチル化比のセットと比較するステップと、
（ｆ）他の組織および／または細胞型の尤度スコアと比較した唾液の尤度スコアに基づき、ＤＮＡ試料が尿に由来するか決定するステップと
を含む、ＤＮＡ試料が尿に由来するか決定するための方法。
【請求項３７】
（ａ）ＤＮＡ試料をメチル化感受性および／またはメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼにより消化するステップと、
（ｂ）消化されたＤＮＡを少なくとも第一および第二の制限座位により増幅して、これにより各制限座位の増幅産物を生成するステップと、
（ｃ）各増幅産物のシグナル強度を決定するステップと、
（ｄ）２種の制限座位に対応するシグナル強度間の少なくとも１個のメチル化比を計算するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）において計算されたメチル化比を、公知の組織および／または細胞型のＤＮＡから得られた参照メチル化比のセットと比較するステップと、
（ｆ）他の組織および／または細胞型の尤度スコアと比較した唾液の尤度スコアに基づき、ＤＮＡ試料が月経血に由来するか決定するステップと
を含む、ＤＮＡ試料が月経血に由来するか決定するための方法。
【請求項３８】
（ａ）ＤＮＡ試料をメチル化感受性および／またはメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼにより消化するステップと、
（ｂ）消化されたＤＮＡを少なくとも第一および第二の制限座位により増幅して、これにより各制限座位の増幅産物を生成するステップと、
（ｃ）各増幅産物のシグナル強度を決定するステップと、
（ｄ）２種の制限座位に対応するシグナル強度間の少なくとも１個のメチル化比を計算するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）において計算されたメチル化比を、公知の組織および／または細胞型のＤＮＡから得られた参照メチル化比のセットと比較するステップと、
（ｆ）他の組織および／または細胞型の尤度スコアと比較した唾液の尤度スコアに基づき、ＤＮＡ試料が腟組織に由来するか決定するステップと
を含む、ＤＮＡ試料が腟組織に由来するか決定するための方法。
【請求項３９】
（ａ）ＤＮＡ試料をメチル化感受性および／またはメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼにより消化するステップと、
（ｂ）消化されたＤＮＡを少なくとも第一および第二の制限座位により増幅して、これにより各制限座位の増幅産物を生成するステップと、
（ｃ）各増幅産物のシグナル強度を決定するステップと、
（ｄ）２種の制限座位に対応するシグナル強度間の少なくとも１個のメチル化比を計算するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）において計算されたメチル化比を、公知の組織および／または細胞型のＤＮＡから得られた参照メチル化比のセットと比較するステップと、
（ｆ）ＤＮＡの供給源に寄与する各組織および／または細胞型の尤度を決定するステップと、
（ｇ）ステップ（ｆ）において得られた尤度に基づき、供給源ＤＮＡの組成を決定するステップと
を含む、ＤＮＡ試料の複数の供給源の組成を同定するための方法。
【請求項４０】
前記ＤＮＡ試料が、血液、精液、唾液、皮膚の表皮、尿、月経血、腟組織のうち１種類を超える組織に由来するＤＮＡの混合物を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
細胞試料のメチル化プロファイルを作成するための方法であって、（ａ）ＤＮＡを細胞試料から単離し、それをメチル化感受性および／またはメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼにより消化するステップと、（ｂ）消化されたＤＮＡを少なくとも第一および第二の制限座位により増幅して、これにより各制限座位の増幅産物を生成するステップと、（ｃ）各増幅産物のシグナル強度を決定するステップと、（ｄ）２種の制限座位に対応するシグナル強度間の少なくとも１個のメチル化比を計算するステップとを含み、計算されたメチル化比が、細胞試料のメチル化プロファイルを含む方法。
【請求項４２】
細胞試料のメチル化プロファイルを、少なくとも１種類の細胞参照の公知のメチル化プロファイルと比較するステップと、プロファイルにおける類似性または相違性が、細胞試料の同一性または汚染状態を示すか決定するステップとを含む、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示の分野
本開示は、ＤＮＡ試料の迅速かつ費用効果の優れたメチル化プロファイリングのための手法を包含する。ＤＮＡ試料のメチル化プロファイルは、本明細書に記載されている手法に従って得られ、同一性、生理学的および病理学的特徴等、ＤＮＡ試料に関する情報をもたらす。
【背景技術】
【０００２】
序文
細胞培養物および細胞株は、細胞、組織および器官発生の研究を行い、疾患を探求し、治療薬を同定するための重要なツールである。例えば、ＡＴＣＣは、９５０種の癌細胞株、１，０００種のハイブリドーマおよび数種の幹細胞株等の特殊な細胞コレクションを含む、８０を超える生物種の３，４００を超える細胞株を維持する。ＤＳＭＺ−ドイツ微生物および細胞培養物コレクション（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）もまた、多数のヒトおよび動物細胞株、特に白血病およびリンパ腫に関連する細胞株を維持する。
【０００３】
メチル化プロファイリングを利用した方法等、本明細書に記載されているプロファイリング方法は、とりわけ、細胞および細胞株の機能的性質および起源と、細胞および細胞株が相互汚染されているか、微生物に汚染されているか、あるいは誤同定されているかを利用者に通知する、細胞型および細胞株特異的信頼性プロファイルの作成に有用である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
概要
一態様において、細胞または細胞株から得られたＤＮＡ試料のメチル化プロファイリングのための方法であって、（ａ）ＤＮＡ試料をメチル化感受性および／またはメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼにより消化するステップと、（ｂ）消化されたＤＮＡを少なくとも第一および第二の制限座位により増幅して、これにより各制限座位の増幅産物を生成するステップと、（ｃ）各増幅産物のシグナル強度を決定するステップと、（ｄ）２種の制限座位に対応するシグナル強度間の少なくとも１個のメチル化比（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｒａｔｉｏ）を計算するステップとを含み、計算されたメチル化比（複数可）が、ＤＮＡ試料のメチル化プロファイルを含む方法が提供される。
【０００５】
別の一態様において、ＤＮＡ試料の供給源を同定するための方法であって、（ａ）ＤＮＡ試料をメチル化感受性および／またはメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼにより消化するステップと、（ｂ）消化されたＤＮＡを少なくとも第一および第二の制限座位により増幅して、これにより各制限座位の増幅産物を生成するステップと、（ｃ）各増幅産物のシグナル強度を決定するステップと、（ｄ）２種の制限座位に対応するシグナル強度間の少なくとも１個のメチル化比を計算するステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）において計算されたメチル化比を、公知の組織および／または細胞型のＤＮＡから得られた参照メチル化比のセットと比較するステップと、（ｆ）各組織および／または細胞型がＤＮＡの供給源である尤度（ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ）の決定に基づき、ＤＮＡ試料の供給源を同定するステップとを含み、最大尤度を有する組織／細胞型がＤＮＡ試料の供給源であると決定される方法が提供される。
【０００６】
一実施形態において、供給源は組織または細胞型である。別の一実施形態において、供給源は、特定の生理学的／病理学的状態である。別の一実施形態において、供給源は、特定の年齢または年齢層である。別の一実施形態において、供給源は男性（ｍａｌｅ）である。別の一実施形態において、供給源は女性である。
【０００７】
別の一実施形態において、ＤＮＡ消化および増幅は、１本の試験管における１回の生化学反応で行われる。さらに別の一実施形態において、１本の試験管は、ＤＮＡテンプレート、消化および増幅酵素、バッファー、プライマーならびに付属成分を含む。さらにまた別の一実施形態において、１本の試験管は密閉され、サーマルサイクラーに置かれ、そこで１回の反応が行われる。
【０００８】
別の一実施形態において、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、その認識配列がメチル化されている場合、ＤＮＡを切断または消化できない。別の一実施形態において、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、ＡａｔＩＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＡｃｃＩ、ＡｃｉＩ、ＡＣｌＩ、ＡｆｅＩ、ＡｇｅＩ、ＡｐａＩ、ＡｐａＬＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｉＳＩ、ＡｖａＩ、ＡｖａＩＩ、ＢａｅＩ、ＢａｎＩ、ＢｂｅＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢｆｕＣＩ、ＢｇｌＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＢＩ、ＢｓａＨＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＹＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｌＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＤＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｓＫＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ、Ｃａｃ８Ｉ、ＣｌａＩ、ＤｐｎＩ、ＤｒｄＩ、ＥａｅＩ、ＥａｇＩ、Ｅａｇｌ−ＨＦ、ＥｃｉＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩ−ＨＦ、ＦａｕＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＦｓｅＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩ、ＨｇａＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｆＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｐａＩ、ＨｐａＩＩ、Ｈｐｙ１６６ｉｉ、Ｈｐｙ１８８ｉｉｉ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＫａｓＩ、ＭｌｕＩ、ＭｍｅＩ、ＭｓｐＡ１Ｉ、ＭｗｏＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＮｇｏＮＩＶ、Ｎｈｅ−ＨＦＩ、ＮｈｅＩ、ＮｌａＩＶ、ＮｏｔＩ、ＮｏｔＩ−ＨＦ、ＮｒｕＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、ＰｌｅＩ、ＰｍｅＩ、ＰｍｌＩ、ＰｓｈＡＩ、ＰｓｐＯＭＩ、ＰｖｕＩ、ＲｓａＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳａｌＩ−ＨＦ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｓａｕ９６Ｉ、ＳｃｒＦＩ、ＳｆｉＩ、ＳｆｏＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｎａＢＩ、ＴｆｉＩ、ＴｓｃＩ、ＴｓｅＩ、ＴｓｐＭＩおよびＺｒａＩからなる群から選択される。さらに別の一実施形態において、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼはＨｈａＩである。
【０００９】
別の一実施形態において、メチル化依存性制限エンドヌクレアーゼは、メチル化ＤＮＡのみを消化する。さらに別の一実施形態において、メチル化依存性制限エンドヌクレアーゼは、ＭｃｒＢＣ、ＭｃｒＡまたはＭｒｒＡである。
【００１０】
別の一実施形態において、尤度は、ステップ（ｄ）のメチル化比を、公知の組織／細胞型から増幅された同一座位の参照比（複数可）とマッチさせることによって決定される。
【００１１】
別の一実施形態において、組織および／または細胞型は、血液、唾液、精液または表皮である。
【００１２】
別の一実施形態において、制限座位は、特定の組織および／または細胞型に対し別個のメチル化比を生じるよう選ばれる。
【００１３】
別の一実施形態において、ＤＮＡ試料は哺乳類ＤＮＡである。さらに別の一実施形態において、哺乳類ＤＮＡは、ヒト、類人猿、サル、ラット、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、ヒツジおよびウマから選択される哺乳類由来のＤＮＡである。さらにまた別の一実施形態において、哺乳類ＤＮＡは、ヒトＤＮＡである。さらになお別の一実施形態において、ヒトＤＮＡは男性由来のものである。さらになお別の一実施形態において、ヒトＤＮＡは女性由来のものである。
【００１４】
別の一実施形態において、増幅ステップは、蛍光標識されたプライマーを用いて行われる。別の一実施形態において、シグナル強度は、前記増幅産物をキャピラリー電気泳動により分離し、続いて蛍光シグナルを定量化することによって決定される。別の一実施形態において、シグナル強度の増幅および決定は、リアルタイムＰＣＲによって行われる。
【００１５】
血液、唾液、精液および皮膚の表皮から得られたＤＮＡ試料の間を識別するための方法であって、（ａ）ＤＮＡ試料をＨｈａＩにより消化するステップと、（ｂ）消化されたＤＮＡを、配列番号２６〜３１に表記されている６種の座位のフォワードおよびリバースプライマーにより増幅して、これにより各制限座位の増幅産物を生成するステップと、（ｃ）各増幅産物のシグナル強度を決定するステップと、（ｄ）全座位ペア組み合わせのメチル化比を計算するステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）において計算されたメチル化比を、血液、唾液、精液および皮膚の表皮由来のＤＮＡから得られた参照メチル化比のセットと比較するステップと、（ｆ）血液、唾液、精液および皮膚の表皮のそれぞれがＤＮＡの供給源である尤度を計算するステップとを含み、最大尤度を有する組織／細胞型がＤＮＡ試料の供給源であると決定される方法が提供される。
【００１６】
一実施形態において、血液における座位ペアの配列番号２９／配列番号３０の参照メチル化比は、約０．２９である。別の一実施形態において、精液における座位ペアの配列番号２９／配列番号３０の参照メチル化比は、約２．８である。別の一実施形態において、表皮における座位ペアの配列番号２９／配列番号３０の参照メチル化比は、約０．７８である。
【００１７】
別の一態様において、（ａ）ＤＮＡ消化および特定のゲノム座位（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｌｏｃｉ）のためのプライマーを用いた増幅のための１本の試験管と、（ｂ）少なくとも１個のメチル化比を計算し、それを参照メチル化比と比較するための説明書とを含む、ＤＮＡ試料の供給源を決定するためのキットが提供される。一実施形態において、プライマーは、配列番号２６〜３１に表記されている遺伝子座位（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｌｏｃｉ）のためのフォワードおよびリバースプライマーを含む。
【００１８】
別の一態様において、（ａ）ＤＮＡ試料をメチル化感受性および／またはメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼにより消化するステップと、（ｂ）消化されたＤＮＡを少なくとも第一および第二の制限座位により増幅して、これにより各制限座位の増幅産物を生成するステップと、（ｃ）各増幅産物のシグナル強度を決定するステップと、（ｄ）２種の制限座位に対応するシグナル強度間の少なくとも１個のメチル化比を計算するステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）において計算されたメチル化比を、公知の組織および／または細胞型のＤＮＡから得られた参照メチル化比のセットと比較するステップと、（ｆ）他の組織および／または細胞型の尤度スコアと比較した血液の尤度スコアに基づき、ＤＮＡ試料が血液に由来するか決定するステップとを含む、ＤＮＡ試料が血液に由来するか決定するための方法が提供される。
【００１９】
別の一態様において、（ａ）ＤＮＡ試料をメチル化感受性および／またはメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼにより消化するステップと、（ｂ）消化されたＤＮＡを少なくとも第一および第二の制限座位により増幅して、これにより各制限座位の増幅産物を生成するステップと、（ｃ）各増幅産物のシグナル強度を決定するステップと、（ｄ）２種の制限座位に対応するシグナル強度間の少なくとも１個のメチル化比を計算するステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）において計算されたメチル化比を、公知の組織および／または細胞型のＤＮＡから得られた参照メチル化比のセットと比較するステップと、（ｆ）他の組織および／または細胞型の尤度スコアと比較した精液の尤度スコアに基づき、ＤＮＡ試料が精液に由来するか決定するステップとを含む、ＤＮＡ試料が精液に由来するか決定するための方法が提供される。
【００２０】
別の一態様において、（ａ）ＤＮＡ試料をメチル化感受性および／またはメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼにより消化するステップと、（ｂ）消化されたＤＮＡを少なくとも第一および第二の制限座位により増幅して、これにより各制限座位の増幅産物を生成するステップと、（ｃ）各増幅産物のシグナル強度を決定するステップと、（ｄ）２種の制限座位に対応するシグナル強度間の少なくとも１個のメチル化比を計算するステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）において計算されたメチル化比を、公知の組織および／または細胞型のＤＮＡから得られた参照メチル化比のセットと比較するステップと、（ｆ）他の組織および／または細胞型の尤度スコアと比較した皮膚の表皮の尤度スコアに基づき、ＤＮＡ試料が皮膚の表皮に由来するか決定するステップとを含む、ＤＮＡ試料が皮膚の表皮に由来するか決定するための方法が提供される。
【００２１】
別の一態様において、（ａ）ＤＮＡ試料をメチル化感受性および／またはメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼにより消化するステップと、（ｂ）消化されたＤＮＡを少なくとも第一および第二の制限座位により増幅して、これにより各制限座位の増幅産物を生成するステップと、（ｃ）各増幅産物のシグナル強度を決定するステップと、（ｄ）２種の制限座位に対応するシグナル強度間の少なくとも１個のメチル化比を計算するステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）において計算されたメチル化比を、公知の組織および／または細胞型のＤＮＡから得られた参照メチル化比のセットと比較するステップと、（ｆ）他の組織および／または細胞型の尤度スコアと比較した唾液の尤度スコアに基づき、ＤＮＡ試料が唾液に由来するか決定するステップとを含む、ＤＮＡ試料が唾液に由来するか決定するための方法が提供される。
【００２２】
別の一態様において、（ａ）ＤＮＡ試料をメチル化感受性および／またはメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼにより消化するステップと、（ｂ）消化されたＤＮＡを少なくとも第一および第二の制限座位により増幅して、これにより各制限座位の増幅産物を生成するステップと、（ｃ）各増幅産物のシグナル強度を決定するステップと、（ｄ）２種の制限座位に対応するシグナル強度間の少なくとも１個のメチル化比を計算するステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）において計算されたメチル化比を、公知の組織および／または細胞型のＤＮＡから得られた参照メチル化比のセットと比較するステップと、（ｆ）他の組織および／または細胞型の尤度スコアと比較した唾液の尤度スコアに基づき、ＤＮＡ試料が尿に由来するか決定するステップとを含む、ＤＮＡ試料が尿に由来するか決定するための方法が提供される。
【００２３】
別の一態様において、（ａ）ＤＮＡ試料をメチル化感受性および／またはメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼにより消化するステップと、（ｂ）消化されたＤＮＡを少なくとも第一および第二の制限座位により増幅して、これにより各制限座位の増幅産物を生成するステップと、（ｃ）各増幅産物のシグナル強度を決定するステップと、（ｄ）２種の制限座位に対応するシグナル強度間の少なくとも１個のメチル化比を計算するステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）において計算されたメチル化比を、公知の組織および／または細胞型のＤＮＡから得られた参照メチル化比のセットと比較するステップと、（ｆ）他の組織および／または細胞型の尤度スコアと比較した唾液の尤度スコアに基づき、ＤＮＡ試料が月経血に由来するか決定するステップとを含む、ＤＮＡ試料が月経血に由来するか決定するための方法が提供される。
【００２４】
別の一態様において、（ａ）ＤＮＡ試料をメチル化感受性および／またはメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼにより消化するステップと、（ｂ）消化されたＤＮＡを少なくとも第一および第二の制限座位により増幅して、これにより各制限座位の増幅産物を生成するステップと、（ｃ）各増幅産物のシグナル強度を決定するステップと、（ｄ）２種の制限座位に対応するシグナル強度間の少なくとも１個のメチル化比を計算するステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）において計算されたメチル化比を、公知の組織および／または細胞型のＤＮＡから得られた参照メチル化比のセットと比較するステップと、（ｆ）他の組織および／または細胞型の尤度スコアと比較した唾液の尤度スコアに基づき、ＤＮＡ試料が腟組織に由来するか決定するステップとを含む、ＤＮＡ試料が腟組織に由来するか決定するための方法が提供される。
【００２５】
別の一態様において、（ａ）ＤＮＡ試料をメチル化感受性および／またはメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼにより消化するステップと、（ｂ）消化されたＤＮＡを少なくとも第一および第二の制限座位により増幅して、これにより各制限座位の増幅産物を生成するステップと、（ｃ）各増幅産物のシグナル強度を決定するステップと、（ｄ）２種の制限座位に対応するシグナル強度間の少なくとも１個のメチル化比を計算するステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）において計算されたメチル化比を、公知の組織および／または細胞型のＤＮＡから得られた参照メチル化比のセットと比較するステップと、（ｆ）ＤＮＡの供給源に寄与する各組織および／または細胞型の尤度を決定するステップと、（ｇ）ステップ（ｆ）において得られた尤度に基づき、供給源ＤＮＡの組成を決定するステップとを含む、ＤＮＡ試料の複数の供給源の組成を同定するための方法が提供される。一実施形態において、ＤＮＡ試料は、血液、精液、唾液、皮膚の表皮、尿、月経血、腟組織のうち１種類を超える組織に由来するＤＮＡの混合物を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】単一のメチル化比決定の図式的概観を示す図である。図示されている消化されるＤＮＡの供給源は、例えば、その同一性、機能性、信頼性、起源または汚染状態の評価がなされている細胞または細胞株から単離することができる。
【図２】単一のメチル化比決定の図式的詳細を示す図である。図示されている消化されるＤＮＡの供給源は、例えば、その同一性、信頼性、起源または汚染状態の評価がなされている細胞または細胞株から単離することができる。
【図３】精液および血液ＤＮＡ試料における特定の座位ペアのメチル化比を示す図である。精液において、メチル化比は約２．５であり、一方、血液において、メチル化比は約０．２５である。各ピークの隣の数値は、該ピークの相対蛍光単位（ｒｆｕ）レベルである。メチル化比が、絶対ｒｆｕレベルに依存しないことに留意されたし。
【図４】メチル化比の正規化を示す図である。上部および下部パネルは、単一の電気泳動図の２個のチャネルを表す。下チャネルにおけるシグナルは、線形適合（ｌｉｎｅａｒ  ｆｉｔ）（灰色の線）を得るために用いた。各ｒｆｕの割り算により、上部パネルにおける２座位の非正規化メチル化比（ＭＲ）を計算した。非正規化メチル化比に、線形適合における座位の突出から得られた対応する比の逆数（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ）を掛けることにより、上部パネルにおける座位の正規化メチル化比も計算した。
【図５】皮膚の表皮由来のＤＮＡ試料の組織同定およびＤＮＡプロファイリングの組み合わせを示す図である。組織同定に用いられる座位に対応するピークは、＜１１０ｂｐ（上部および中央パネル）の範囲で見られ、一方、他のピークは、ＤＮＡプロファイリングに用いられる座位に対応する。
【図６】３個体の精液、血液および表皮から抽出された９種のＤＮＡ試料のキャピラリー電気泳動の電気泳動図である。解析された座位の異なる強度により、精液、血液および表皮における差次的なメチル化が証明される。
【図７】血液、唾液、皮膚、精液、月経血、腟組織および尿から抽出された１１種のＤＮＡ試料のキャピラリー電気泳動の電気泳動図である。解析された座位の異なる強度により、血液、唾液、皮膚、精液、月経血、腟組織および尿における差次的なメチル化が証明される。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
詳細な説明
本開示は、とりわけ、細胞の機能面が同一型の別の細胞と同一であるか異なるかを利用者に通知する、細胞型および細胞株特異的「機能性」プロファイルの作成に有用なメチル化プロファイリング方法に関する。本発明のメチル化プロファイリング技法のこの特定の用途は、既存の従来の細胞プロファイリング技法からでは得られない、あるいは推察できない特定の細胞試料に関する情報をもたらすため有益である。
【００２８】
このメチル化プロファイリング技法は、メチル化、非メチル化および部分的にメチル化したゲノム領域にわたる座位の同定であるところの、本発明の別の技術側面を利用する。個々のメチル化座位状態が現在公知のものである座位のこのような収集は、任意の細胞試料のメチル化状態の調査およびプロファイリングに有用である。本明細書に記載されている通り、細胞試料の対応するメチル化プロファイルを作成することにより、試料から得られた細胞が、正常な健康細胞と同じ仕方で機能するか、すなわち同じ種類の細胞または細胞型の公知の試料と比較して正常なメチル化プロファイルを示すか、あるいは異なった、恐らくは異常なメチル化プロファイルを示すか決定することができる。同様に、試料から得られた細胞が、特定の器官または組織から得られた正常な健康細胞と同じ仕方で機能するか、すなわち器官または組織特異的メチル化プロファイルを示すか決定することができる。このように、本発明のメチル化プロファイリング技法は、特定の細胞試料の病原性または生理学的状態の決定に役立つ。
【００２９】
特に、本明細書に記載されている本発明のメチル化比は、任意の数のゲノム座位のメチル化状態の比較解析から計算され、細胞試料の細胞起源、機能的同一性、年齢同定、生理学的プロファイリングおよび病理学的状態を決定するための細胞のメチル化プロファイルの作成に有用である。さらに、各事例において、メチル化プロファイリング技法は、得られたメチル化プロファイルが、例えば、別の細胞株または微生物増殖のいずれかによる混入細胞の存在を反映しているか、また、特定の細胞試料が誤同定されているかの確認に用いることもできる。
【００３０】
細胞または細胞株のメチル化プロファイリングは、例えば、（ａ）細胞試料からＤＮＡを単離し、それをメチル化感受性および／またはメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼにより消化し、（ｂ）消化された細胞ＤＮＡを少なくとも第一および第二の制限座位により増幅し、これにより各制限座位の増幅産物を生成し、（ｃ）各増幅産物のシグナル強度を決定し、（ｄ）２種の制限座位に対応するシグナル強度間の少なくとも１個のメチル化比を計算することにより、本発明によって容易に得ることができる。計算されたメチル化比（複数可）は、該細胞試料から得られたＤＮＡ試料のメチル化プロファイルの一例である。
【００３１】
プロファイルを同一起源および同一種の公知の細胞と、あるいは汚染されていない対応する細胞株由来の公知の細胞と比較することにより、そのメチル化プロファイルに基づき細胞試料の同一性や、例えば、公知の細胞と機能的に類似または同一であるか否かを決定することが可能である。従って、ヒト肝細胞株を購入、作成、あるいは改変して、本明細書に記載されている本細胞メチル化プロファイリング技法を用いて、公知の肝細胞参照プロファイルと比較した細胞株の機能的特徴を決定することができる。
【００３２】
この点において、本発明の細胞メチル化プロファイリング方法は、後述する既存の細胞同定技法に優る数点の利点を有する。ヒトゲノムにおけるメチル化は、５−メチルシトシンの形態で生じ、配列ＣＧの一部であるシトシン残基に限局する（他の配列の一部であるシトシン残基はメチル化されない）。ヒトゲノムにおける一部のＣＧジヌクレオチドがメチル化され、その他はメチル化されない。メチル化は、特異的なＣＧジヌクレオチドが特定の細胞においてメチル化され、同時に異なる細胞においては非メチル化され得るような、あるいは特定の組織においてメチル化され、同時に異なる組織においては非メチル化され得るような、細胞および組織特異的である。特異的座位におけるメチル化は、細胞毎に変動し得るため、複数の細胞、例えば法医学的試料から抽出されたＤＮＡのメチル化状態を解析する場合、シグナルは混合されて、変動的な比率のメチル化および非メチル化シグナルの両方を示し得る。ＤＮＡメチル化データの検索または保存のため、様々なデータ源を利用でき、これらのデータは、例えば「ＤＮＡメチル化データベース（ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ）」（ＭｅｔＤＢ）（ｗｗｗ．ｍｅｔｈｄｂ．ｎｅｔ）に一般公開されており容易に利用できる。
【００３３】
本発明の細胞メチル化プロファイリング方法は、従来のプロファイリング体制に固有の問題を最小化し、効果的に排除するため、既存の細胞プロファイリング技法よりも有利（ａｄｖａｎｔａｇｏｕｓ）である。第一に、上述の通り、メチル化プロファイリング技法は、メチル化座位レベルの決定に依存せず、むしろ２種のゲノム座位間のメチル化比を作成する本発明の概念を利用する。従って、先行技術方法とは異なり、本明細書に記載されている細胞メチル化プロファイルは、試料サイズに限定されない、あるいは解析される試料の量または含量の差の影響を受けない。
【００３４】
よって、第二に、メチル化プロファイルは、参照細胞のメチル化プロファイルと比較して、由来する細胞または細胞株の同一性の検証に役立てることができる。例えば、２種の細胞株が同一個体から得られる場合、従来のＤＮＡプロファイリングでは両者を識別できない。しかし、本発明の細胞メチル化プロファイリング技法は、該個体に由来する異なる組織からまたは異なる時点で得られた２種の細胞型を区別できる。
【００３５】
第三に、本発明の細胞メチル化プロファイリング技法は、細胞株の機能的同一性の樹立に用いることができる。よって、この技法は、候補細胞株の細胞メチル化プロファイルが肝臓の細胞メチル化プロファイルと一致するか決定できるため、例えば、特定の候補細胞株が、肝臓のモデル細胞株としての使用に適切であるかの決定に用いることができる。
【００３６】
第四に、細胞メチル化プロファイルは年齢と共に変化するため、細胞メチル化プロファイルは、ＤＮＡ試料の年齢の決定に有用である。
【００３７】
第五に、細胞メチル化プロファイルは、細胞または細胞株の生理学的状態の決定に有用である。例えば、メチル化プロファイルは、月経周期のいずれのステージにおいて、細胞およびＤＮＡ試料が個体から得られたかを表示することができる。
【００３８】
第六に、また本明細書に記載されている通り、細胞メチル化プロファイルは、病理学的解析において、例えば組織が炎症等、様々なストレス要因に付されると、また、癌等、疾患によって負荷が与えられると生じる細胞および組織変化の同定に用いることができる。
【００３９】
よって、任意の数のゲノム座位のメチル化状態の比較から計算された本発明のメチル化比を利用できる用途は、上に例示されている通り多数あり、細胞の起源、機能的同一性、年齢同定、生理学的プロファイリングおよび病理学的状態を決定するための細胞メチル化プロファイルの使用等が挙げられるが、これらに限定されない。メチル化プロファイリング技法は、得られたメチル化プロファイルが、例えば、別の細胞株による、あるいは望ましくない微生物増殖による混入細胞の存在を反映するかの確認に用いることもできる。
【００４０】
本メチル化プロファイリング方法の追加的な利点は、特定のゲノム座位における実際のメチル化レベルを決定する従来のメチル化解析方法とは対照的に、本明細書に記載されている手法が、多くの場合、異なる個体間で高度に可変的なこのようなレベル決定に依存しないことである。その代わりに、細胞のゲノム座位の間の実際のメチル化レベルが可変性であっても、本発明のアッセイは、細胞型または細胞株の機能属性の指標としてのメチル化比の使用を可能にし、また、細胞試料の供給源、質および汚染状態の同定の補助も可能にする。
【００４１】
従って、本細胞メチル化プロファイリングアッセイの根底を為す態様は、最終的に数的比率をもたらす、細胞から得られ消化されたＤＮＡ試料から増幅された少なくとも２種の座位のシグナルの比較である。次に、この比率は、検査細胞としての同一の型および種の純粋かつ汚染されていない細胞の参照比値と比較することができる。
【００４２】
よって、一実施形態において、本技術は、（１）細胞培養物または細胞株由来の１または複数の細胞からＤＮＡを得て、（２）細胞ＤＮＡをメチル化感受性および／またはメチル化依存性酵素により消化して、（３）消化されたＤＮＡを座位特異的プライマーによりＰＣＲ増幅して、（４）座位特異的増幅産物のシグナル強度を測定して、メチル化比を決定することを企図する。２種の増幅産物間の数的比率が、公知の参照細胞から増幅された同一座位の参照比とマッチする、あるいは近似している場合、細胞試料の機能的信頼性、あるいは、例えば細胞または細胞株の試料が、試料のメチル化プロファイルを変質させる他のいずれかの細胞供給源によって汚染されているかについて結論することができる。
【００４３】
本技法は、細胞試料のメチル化プロファイルを、少なくとも１種類の細胞参照の公知のメチル化プロファイルと比較するステップと、プロファイルの類似性または相違性が、細胞試料の機能的、生理学的または病理学的同一性を表示するか決定するステップとをさらに含むことができる。細胞参照とは、細胞試料のメチル化プロファイルと直接的に比較することができる公知かつ均等の細胞型、例えば肝臓、脳、肺、卵巣のメチル化プロファイル、あるいは細胞参照は、種々の異なる種、器官または癌等の病理学的疾患状態の公知のメチル化プロファイルのライブラリーを含み、その後に細胞試料と最も酷似したメチル化プロファイルを同定することができることのいずれかを意味する。よって、細胞株が得られ、例えばヒト肝細胞株と称する場合、本技法は、該ヒト肝細胞株のメチル化プロファイルを公知のヒト肝細胞株と比較して、得られたヒト肝細胞株の同一性または機能的同一性を確認または検証することができる。あるいは、未知の供給源の細胞試料の１または複数のメチル化プロファイルが得られ、様々な種、器官または病理学的疾患状態の公知のメチル化プロファイルのライブラリーと比較して、その起源を決定することができる。
【００４４】
本明細書において、哺乳類、魚類、爬虫類、鳥類、細菌、微生物、両生類、昆虫、真菌、ウイルス、作物植物由来の細胞等が挙げられるがこれらに限定されない任意の種類の細胞が、本発明の技術によって解析できる。従って、本細胞プロファイリング技法は、例えば、ヒト細胞、ラット細胞、マウス細胞、サル細胞、霊長類細胞、ゼブラフィッシュ細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、ウシ細胞、ウサギ細胞、ハムスター細胞の機能的同一性の確証に有用である。細胞プロファイリング技法は、肝細胞、腎細胞、膵細胞、肺細胞、心臓細胞、卵巣細胞、骨髄、脳細胞、乳腺細胞、舌細胞、網膜細胞、結腸細胞、頸部細胞、胚細胞および皮膚細胞の機能的信頼性等が挙げられるがこれらに限定されない、器官特異的細胞型の信頼性の確認または検証にも有用である。細胞プロファイリング技法は、メラノーマ細胞、神経膠芽腫細胞、白血病細胞、Ｂリンパ腫細胞、頭頚部癌細胞、神経芽細胞腫細胞、腺癌細胞、転移性リンパ節細胞、肝細胞腫細胞、Ｔ細胞白血病細胞、リンパ芽球様細胞、乳癌細胞、頸癌細胞ならびに他の種類の癌細胞および細胞株等が挙げられるがこれらに限定されない、特定の細胞の疾患または癌同一性の確認にも有用である。
【００４５】
この点に関し、細胞、細胞培養物および細胞株という語句の使用は、本明細書に記載されている様々なプロファイリング方法の記載に関して互換的である。個体から直接的に培養された細胞は初代細胞であり、これは通常、一定回数の集団倍加の継代後に分裂を停止する。樹立または不死化細胞株は、無制限に増殖できる細胞株である。本発明の細胞メチル化プロファイリング技法は、このような単離細胞および細胞株のいずれかの機能的同一性、生理学的または病原性状態、信頼性、組織起源および汚染状態の確認に用いることができる。従って、本開示における、ある細胞または細胞株の言及は、他の細胞または細胞株における記載されている技法の使用の除外を限定せず、それを意味しないことを理解されたし。
【００４６】
一般的な細胞株の例として、ヒトＤＵ１４５(前立腺癌)、ヒトＬｎｃａｐ(前立腺癌）、ヒトＭＣＦ−７(乳癌）、ヒトＭＤＡ−ＭＢ−４３８(乳癌）、ヒトＰＣ３(前立腺癌）、ヒトＴ４７Ｄ(乳癌）、ヒトＴＨＰ−１(急性骨髄性白血病）、ヒトＵ８７(神経膠芽腫）、ヒトＳＨＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞腫細胞、ヒトＳａｏｓ−２細胞(骨癌）；霊長類ベロ(アフリカミドリザル、クロロセブス属(Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ）腎臓上皮細胞株、１９６２年開始）；ＧＨ３(下垂体腫瘍）およびＰＣ１２(褐色細胞腫）等、ラット腫瘍細胞株；ＭＣ３Ｔ３(胚性頭蓋冠）等、マウス細胞株；タバコＢＹ−２細胞等、植物細胞株；ならびにゼブラフィッシュＺＦ４およびＡＢ９細胞、メイディン・ダービー・イヌ腎臓(ＭＤＣＫ）上皮細胞株およびアフリカツメガエル(Ｘｅｎｏｐｕｓ）Ａ６腎臓上皮細胞等、他の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本メチル化プロファイリング技法によってプロファイルできる腫瘍細胞株の種類の例は、例えば、ＡＴＣＣのウェブサイト、ａｔｃｃ．ｏｒｇ／Ｐｏｒｔａｌｓ／１／ＴｕｍｏｒＬｉｎｅｓ．ｐｄｆ、ＤＳＭＺウェブサイト、ｄｓｍｚ．ｄｅ／ｈｕｍａｎ＿ａｎｄ＿ａｎｉｍａｌ＿ｃｅｌｌ＿ｌｉｎｅｓ／ｃｅｌｌ＿ｌｉｎｅ＿ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐおよびＥＭＢＬ−ＥＳＴＤＡＢデータベース、ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｐｄ／ｅｓｔｄａｂ／ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ．ｈｔｍｌに見出すことができる。
【００４７】
上述その他の細胞株に伴う別の問題は、細胞株が、無関係な細胞の増殖、他の細胞株による相互汚染または微生物による汚染等によって汚染され得ることである。Ｄｒｅｘｌｅｒら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、１３、１６０１〜１６０７頁（１９９９）、Ｄｒｅｘｌｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、９８（１２）、３４９５〜３４９６頁（２００１）およびＣａｂｒｅｒａら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５１（２）、４５〜５０頁（２００６）を参照されたい。さらに、別の問題は、細胞株は、時に誤ってまたは不正確に同定されることがあり、これにより、実験結果およびデータの解釈に問題を生じ得ることである。本メチル化プロファイリング方法は、本明細書に記載されている通り、細胞試料の汚染状態の確認に用いることもできる。
【００４８】
従って、本明細書に記載されているアッセイは、細胞および細胞株の同定および機能的特性評価ならびに細胞またはＤＮＡ試料の供給源の検証を要求するいずれの設定にも適用できる、強力、マルチプレックス、正確かつ安価な技法である。よって、本アッセイは、法医学的能力における警察；診断および治療目的の医療産業；遺伝情報差別禁止法（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｎｏｎｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  Ａｃｔ）（Ｈ．Ｒ．４９３）等、対差別遺伝子法（ａｎｔｉ−ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｌａｗ）に従った申し立てを検証するための保険産業；刑事裁判ならびに民事手続および訴訟における証拠目的のための検事および弁護人；ならびにブドウやコーヒーの入手先等、食肉、作物および植物の整合性を検証するための食品産業および農業が挙げられるがこれらに限定されない多くの目的のために用いることができる。本技術は、これらの排他的ではないが代表的な適用に限定されない。
【００４９】
本開示の重要な一態様は、これが、既存の市販ＤＮＡプロファイリングキットの有用性を容易に補完および拡大して、特定の対象のＤＮＡのプロファイルを超えるものを為すことができることである。詳細に後述するメチル化比アッセイ等、本明細書に開示されているアッセイと、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＰｏｗｅｒＰｌｅｘ（登録商標）１６キットとの組み合わせは、個体のＤＮＡ組成のプロファイルのみならず、該個体のＤＮＡ供給源の決定も可能にする。決して限定することなく、例として、本技術は、ＤＮＡ試料が、血液、唾液または精液等、特定の組織および／または細胞型に由来するかの決定を可能にする。
【００５０】
本明細書に記されている特定の組成物、方法および／または実施形態は、本技術の単なる説明のためのものである。当業者であれば本明細書の教示に基づき、これら組成物、方法または実施形態の変種を容易に理解でき、従って、これは本開示の一部として包含される。
【００５１】
本技術は、分子生物学および組換えＤＮＡにおける多くの従来技法を用いる。これらの技法は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ編（１９９７）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第二版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー、１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩおよびＩＩ巻、Ｇｌｏｖｅｒ編（１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｇａｉｔ編（１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ｈａｍｅｓ＆Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ、Ｈａｍｅｓ＆Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）；Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；シリーズ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８４）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ、Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｃａｌｏｓ編、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク、１９８７）；ならびにＭｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５４および１５５巻、それぞれＷｕ＆ＧｒｏｓｓｍａｎおよびＷｕ編に説明されている。
【００５２】
定義
本技術の説明において、多くの専門用語が用いられている。他に規定がなければ、本明細書に用いられている全ての専門用語および科学用語は、一般に、本技術が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意義を有する。本明細書において、他に断りがなければ、単数形「１つの(ａ)」、「１つの(ａｎ)」および「その(ｔｈｅ)」は複数形の言及を包含する。よって、例えば「１つの(ａ)核酸」の言及は、１つまたは複数の核酸の言及である。
【００５３】
本明細書において、用語「アレル」は、ＤＮＡセグメントに関連する遺伝的変種、すなわち、同一座位を占めるＤＮＡ配列の２種以上の代替形式のうち１種として企図されている。
【００５４】
本明細書において、用語「生物試料」または「検査試料」は、対象に由来する任意の生物試料を意味するが、これに限定されない。試料は、核酸を適宜含有する。一部の実施形態において、試料は、対象から直接回収されず、環境、例えば、犯罪現場または強姦被害者から収集される。このような試料の例として、液体、組織、細胞試料、臓器、生検等が挙げられる。適切な試料は、血液、血漿、唾液、尿、精子、毛髪等である。生物試料は、血液滴、乾燥血痕、乾燥唾液斑、乾燥下着染み(例えば、下着、ナプキン(Pad)、タンポン、おむつにおける染み)、衣類、デンタルフロス、耳垢(ear wax)、電気カミソリで切った毛(electric razor clipping)、ガム、毛髪、舐めた封筒、爪、パラフィン包埋組織、死後(post mortem)組織、剃刀、歯、歯ブラシ、爪楊枝、乾燥臍帯であってもよい。ゲノムＤＮＡは、本技術分野で公知の方法に従ってこのような試料から抽出することができる。
【００５５】
本明細書において、用語「キャピラリー電気泳動ヒストグラム」または「電気泳動図」は、ゲノム座位から蛍光プライマーにより増幅されたＰＣＲ産物のキャピラリー電気泳動から得られたヒストグラムを意味する。
【００５６】
本明細書において、用語「メチル化された」は、血液、唾液、精液、表皮、鼻汁、頬側細胞、毛髪、切り取った爪、月経性排泄物(menstrual excretion)、腟細胞、尿および糞便等、組織の細胞のＤＮＡにおいて少なくとも８０％のレベルでメチル化された(すなわち、ＤＮＡ分子の少なくとも８０％がメチル化された)ことを意味する。
【００５７】
本明細書において、用語「部分的にメチル化された」は、血液、唾液、精液、表皮、鼻汁、頬側細胞、毛髪、切り取った爪、月経性排泄物、腟細胞、尿および糞便等、組織の細胞のＤＮＡにおいて２０〜８０％の間のレベルでメチル化された（すなわち、ＤＮＡ分子の２０〜８０％の間がメチル化された）ことを意味する。
【００５８】
本明細書において、用語「非メチル化された」は、血液、唾液、精液、表皮、鼻汁、頬側細胞、毛髪、切り取った爪、月経性排泄物、腟細胞、尿、骨および糞便等、組織の細胞のＤＮＡにおいて２０％未満のレベルでメチル化された（すなわち、ＤＮＡ分子の２０％未満がメチル化された）ことを意味する。本明細書に提供されている方法は、血液、唾液、精液、表皮、鼻汁、頬側細胞、毛髪、切り取った爪、月経性排泄物、腟細胞、尿、骨および糞便等、様々な組織および細胞型における核酸座位のメチル化および非メチル化型を識別することを示した。
【００５９】
用語「決定」、「測定」、「査定」、「アッセイ」および「評価」は、任意の形態の定量的または定性的測定を意味するよう互換的に用いられ、特徴、形質または特色が存在するか否かの決定を包含する。査定は、相対的であっても絶対的であってもよい。「の存在の査定」は、存在するあるものの量の決定と共に、それが存在するか不在であるかの決定を包含する。
【００６０】
本明細書において、用語「法医学的」または「科学捜査」は、法制度にとって対象となる同一性問題の解決を目的とする広範囲の方法の適用を意味する。例えば、そのＤＮＡが犯罪現場に残された証拠とマッチし得る容疑者候補の同定、犯罪の濡れ衣を着せられた人物の容疑を晴らすこと、犯罪および災害犠牲者の同定または父性その他の家族関係の確立である。
【００６１】
用語「座位（ｌｏｃｕｓ）」（複数形；ｌｏｃｉ）は、遺伝子または他の遺伝的エレメントの染色体上の位置を意味する。座位は、該位置におけるＤＮＡも意味し得る。所定の座位におけるＤＮＡ配列のバリアントをアレルと称する。座位のアレルは、相同染色体の同一部位に位置する。対照座位は、プロファイルの一部ではない座位である。対照座位は、プロファイル座位のように同時に制限座位となることができる。制限座位は、増幅され、その後に座位アンプリコンの一部となる制限酵素認識配列を含む座位である。本明細書において、用語「天然のＤＮＡ」または「天然の核酸」は、修飾または増幅されていない対象の細胞に直接的に由来する核酸を意味するがこれに限定されない。
【００６２】
本明細書において、用語「核酸」は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、断片化された核酸およびミトコンドリア等の細胞内小器官から得られた核酸を意味するが、これらに限定されない。さらに、核酸として合成核酸またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写産物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
本明細書において、用語「核酸に基づく解析手順」は、核酸の解析、例えば、ＤＮＡプロファイリングに基づく任意の同定手順を意味する。
【００６４】
本明細書において、用語「ＳＴＲプライマー」は、ＰＣＲによる生物試料から標的核酸配列の増幅に用いることのできる、任意の市販のまたは実験室製の(made-in-the-lab)ヌクレオチドプライマーを意味する。およそ１５０万種の非ＣＯＤＩＳ  ＳＴＲ座位が存在する。上述の非限定的な例は、次のウェブサイト、ｗｗｗ．ｃｓｔｌ．ｎｉｓｔ．ｇｏｖ／ｂｉｏｔｅｃｈ／ｓｔｒｂａｓｅ／ｓｔｒ＿ｒｅｆ．ｈｔｍに掲示されており、これは現在、科学、法医学的およびそれらを越えるものに利用されているＳＴＲの３１５６種の参照を含有する。発表されているプライマー配列に加えて、ＳＴＲプライマーは、数百種のＳＴＲ座位を増幅するため（例えば、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍリンケージマッピングセット−ＭＤ１０−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および数千種のＳＮＰ座位を増幅するため（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＢｅａｄＡｒｒａｙリンケージマッピングパネル）の市販のキットから得ることができる。本明細書において、用語「ＣＯＤＩＳ  ＳＴＲプライマー」は、ＦＢＩの「複合ＤＮＡインデックス方式（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ＤＮＡ  Ｉｎｄｅｘ  Ｓｙｓｔｅｍ）」によって命名された１３種のコアＳＴＲ座位、特に、ＴＨ０１、ＴＰＯＸ、ＣＳＦ１ＰＯ、ＶＷＡ、ＦＧＡ、Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１８Ｓ５１およびＤ２１Ｓ１１の反復配列ならびにアメロゲニン座位のうちいずれかを増幅するよう設計されたＳＴＲプライマーを意味する。
【００６５】
「シグナル強度」は、ゲノム座位の増幅産物に対応するシグナルの強度および／または量を意味する。例えば、キャピラリー電気泳動において、特定の座位のシグナル強度は、その対応するピークの相対蛍光単位（ｒｆｕ）の数値である。
【００６６】
メチル化比（「観察されたメチル化比」とも言う）は、座位ペア間の相対シグナル強度を意味する。メチル化比は、座位ペアにおける第一の座位のシグナル強度を該ペアにおける第二の座位のシグナル強度で割ることにより計算される。ペアにおける第二の座位のシグナル強度がゼロである場合、任意の低強度シグナルが割り当てられる（ゼロによる割り算を避けるため）。他に表示がなければ、メチル化比は、未知の起源のＤＮＡ試料から計算される。
【００６７】
参照メチル化比（「経験的メチル化比（Ｅｍｐｉｒｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｒａｔｉｏ）」とも言う）は、参照ＤＮＡとも言う公知の供給源のＤＮＡの試料から得られたメチル化比である。メチル化比と同様に、参照メチル化比は、例えば、座位ペアにおける第一の座位のシグナル強度を、該ペアにおける第二の座位のシグナル強度で割ることにより決定することができる。公知の供給源のＤＮＡから参照メチル化比が決定されるため、ゲノム座位の様々なペア間の公知の比のライブラリーを作製することができる。
【００６８】
確率スコアは、観察されたメチル化比を参照メチル化比と比較することによって計算される。ある特定のメチル化比におけるある特定のカテゴリー（例えば、血液）のためのある特定のＤＮＡ試料の確率スコアは、該カテゴリーの参照メチル化比の分布に対する観察されたメチル化比の相対位置に基づき、ＤＮＡ試料が該カテゴリーに由来する尤度の測定を可能にする。
【００６９】
各組織／細胞型の複合確率スコア（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  Ｓｃｏｒｅ）は、例えば、単一の確率スコアの積のｎ乗根（式中、ｎは、メチル化比の数である）を計算することにより、単一の確率スコアから計算することができる。
【００７０】
尤度：組織／細胞型毎に、尤度スコア（ＬＳ）は、ＤＮＡ試料が該組織／細胞型に由来する尤度を表す。各組織／細胞型の尤度スコアは、例えば、次の通り計算することができる
ＬＳ（組織）＝ＣＰＳ（組織）／［全組織のＣＰＳの合計］。
【００７１】
Ａ．ＤＮＡ試料の選択および単離
本開示は、その一態様において、ＤＮＡ試料の組織／細胞型供給源を決定するための手法を提供する。例えば、未知の起源のＤＮＡ試料は、１または複数の生化学的ステップと、それに続くシグナル検出とを含む手順を経る。シグナル検出後に、シグナルは解析されて、ＤＮＡ試料の供給源を決定する。これらの方法は、犯罪現場で発見された体液斑由来のＤＮＡまたは未知の起源の癌性病変由来のＤＮＡが挙げられるがこれらに限定されない、いずれかの問題ＤＮＡ試料に利用される。
【００７２】
生物試料からの核酸（例えばＤＮＡ）の単離は、本技術分野で公知の様々な方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨークを参照）によって達成することができる。ＤＮＡ試料の供給源の決定は、次節に記載する戦略等、様々な戦略を用いて達成することができる。
【００７３】
本発明者らは、メチル化比プロファイルをＤＮＡ試料の供給源の決定に用いることができることを見出した。
【００７４】
Ｂ．ゲノム座位のメチル化レベルを決定するための手法
ゲノム座位のメチル化レベルを決定するために数通りの異なる方法が存在する。通常用いられる方法の例は、バイサルファイト配列決定(bisulfite sequencing)、メチル化特異的ＰＣＲおよびメチル化感受性エンドヌクレアーゼ消化である。
【００７５】
バイサルファイト配列決定。バイサルファイト配列決定は、バイサルファイト処理したＤＮＡの配列決定によるそのメチル化パターンの決定である。この方法は、亜硫酸水素ナトリウムによるＤＮＡの処理が、非メチル化シトシン残基のウラシルへの転換をもたらすが、メチル化シトシン残基には影響しないとの事実に基づく。亜硫酸水素ナトリウムによる転換の後、ＤＮＡの特異的領域がＰＣＲによって増幅され、ＰＣＲ産物が配列決定される。ポリメラーゼ連鎖反応において、ウラシル残基がチミン残基であるかのように増幅されるため、本来のＤＮＡにおける非メチル化シトシン残基は、配列決定されたＰＣＲ産物においてチミン残基として現れ、一方、本来のＤＮＡにおけるメチル化シトシン残基は、配列決定されたＰＣＲ産物においてシトシン残基として現れる。
【００７６】
メチル化特異的ＰＣＲ：メチル化特異的ＰＣＲは、バイサルファイト配列決定と同じくバイサルファイト処理したＤＮＡにおいて行われるが、対象ゲノム領域の配列決定の必要を回避したメチル化解析方法である。その代わりに、バイサルファイト処理したＤＮＡにおける選択された領域は、同一ゲノム標的とアニールするよう設計された２セットのプライマーを用いたＰＣＲによって増幅される。プライマー対は、非転換５−メチルシトシンのみを補完する配列を含むことにより「メチル化特異的」となるよう、あるいは逆に、非メチル化シトシンから転換されたチミンを補完する「非メチル化特異的」となるよう設計される。メチル化は、増幅達成における異なるプライマー対の相対効率によって決定される。
【００７７】
本開示に鑑みて、メチル化特異的ＰＣＲが、ＰＣＲによって増幅された全ゲノム領域ではなく、プライマー配列のみにおけるＣＧジヌクレオチドのメチル化レベルを決定することを理解されたし。従って、増幅された配列に存在するが、プライマー配列には存在しないＣＧジヌクレオチドは、ＣＧ座位に含まれない。
【００７８】
メチル化感受性エンドヌクレアーゼ消化：メチル化感受性エンドヌクレアーゼによるＤＮＡの消化は、バイサルファイト転換を行う必要なくゲノムＤＮＡに直接的に適用できるメチル化解析のための方法を表す。この方法は、メチル化感受性エンドヌクレアーゼが、非メチル化ＤＮＡのみを消化し、一方、メチル化ＤＮＡはインタクトに維持するとの事実に基づく。消化後に、ＤＮＡは、ゲル電気泳動および特異的座位のＰＣＲ増幅等、種々の方法によりメチル化レベルを解析することができる。
【００７９】
メチル化感受性エンドヌクレアーゼ消化において、各ＣＧ座位は、本手順に用いられるメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ(複数可)の認識配列(複数可)の一部である１または複数のＣＧジヌクレオチドを有する。増幅されたゲノム領域に存在するが、エンドヌクレアーゼ(複数可)の認識配列(複数可)に存在しないＣＧジヌクレオチドは、ＣＧ座位に含まれない。
【００８０】
一実施形態において、検出される１または複数のＣＧ座位は、天然のＤＮＡにおいて部分的にメチル化されているが、人工ＤＮＡにおいては非メチル化されている。部分的メチル化は、照合された位置にＴおよびＣの混合物を生じると予想される。ハイブリダイゼーションは、ヘテロ接合性ＳＮＰの検出と同様に、Ｔ特異的プローブ／プライマーおよびＣ特異的プローブ／プライマーの両方に対し観察される。相対量のハイブリダイゼーションは、相対量のメチル化の決定に用いることができる。あるいは、ＣおよびＴの両方は、バイサルファイト配列決定により観察される。あるいは、メチル化または部分的にメチル化されたＣＧ座位の増幅産物に対応する蛍光シグナルを検出することができる。
【００８１】
Ｃ．メチル化比アッセイ
上述の通り、本開示の特定の一アッセイは、制限消化されたＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応によって生成された座位特異的増幅産物ペアのシグナル強度の定量的比較に関与する。例えば、図１および図２を参照されたい。強度の数的比率により、ＤＮＡ試料の組織／細胞型供給源の同定が可能になる。例えば、一実施形態において、座位１および座位２は、蛍光標識プライマーを用いて増幅し、電気泳動により分離することができ、シグナル強度は、該座位に対応するピークの相対蛍光単位(ｒｆｕ)である。例えば、図３を参照されたい。シグナル強度は、供給源ＤＮＡテンプレートから座位１および座位２の増幅の成功度に対応するであろう。２種の増幅産物間のｒｆｕを比較することにより、別の増幅産物よりも多いまたは少ない増幅産物が存在するかを反映する比率を計算することができる。
【００８２】
しかし、その上、本アッセイの一態様は、様々な種類の組織／細胞型の予想されるメチル化比の予めの決定を包含する。よって、解析に付されるテンプレートＤＮＡは、先ず、ＰＣＲ増幅プロトコールのサイクルを経る前にメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼにより消化される。両方のプライマー対が同様の増幅効率を有する必要も、絶対メチル化レベルの知識を有する必要もない。観察されたメチル化比と特異的組織／細胞型とを相関させることができるようにするために、当業者は、観察された比率と公知起源のＤＮＡ試料から経験的に得られた比率とを比較することができる。
【００８３】
この前提により、本アッセイは、ＤＮＡ試料をメチル化感受性および／またはメチル化依存性酵素により消化するステップと、消化されたＤＮＡのＰＣＲ増幅反応を行うステップと、座位特異的増幅産物のシグナル強度を決定するステップとを含む。記載されている通り、シグナル強度は、蛍光ＰＣＲを用いることにより定量化または測定することができる。２種の増幅産物間の数的比率が、公知の組織／細胞型から増幅された同一座位の参照比の比率とマッチまたは近似する場合、検査ＤＮＡ試料は、該組織／細胞型であると決定される。
【００８４】
この特定のメチル化比アッセイは、選択された座位の絶対メチル化画分またはレベルの測定値の同定または取得に依存しない。その上、この特定のメチル化比アッセイは、用いたプライマー対の効率に依存せず、この両方のプライマー対が同様の効率を有する必要がなく、インプットテンプレートＤＮＡの量に依存せず、特定のサーモサイクラー装置および反応条件に依存しない。むしろ、本アッセイは、異なる座位におけるメチル化レベルの比率に対応する２種のシグナル間の比率を決定する。この方式によると、試料における出発ＤＮＡ材料の含量または濃度は、解析と無関係であり、アウトプット結果を歪めない。すなわち、ＰＣＲのテンプレートとしていかなる量のＤＮＡが用いられるかにかかわらず、また、ＰＣＲサーモサイクラーにおいて実施される増幅サイクル数にかかわらず、第一の座位および第二の座位の間のシグナルレベルの比率は一定を維持するであろう。例えば、座位１および２の間のメチル化比１０は、インプットＤＮＡが、メチル化レベル０．９および０．０９(座位１における９０％メチル化および２における９％)を表すにしろ、０．５および０．０５(座位１において５０％メチル化および２における５％)等を表すにしろ、同じ値を維持するであろう。
【００８５】
本開示のメチル化比アッセイは、メチル化を解析するための他のアプローチに優る数点の利点を有する。例えば、本アッセイは、メチル化レベルの絶対定量化に依存する場合、固有の様々な「ノイズ」要因に対し非感受性であるが、この理由として、このような定量化は、ノイズに対し感受性であり、テンプレートＤＮＡ濃度、サーモサイクラーのメーカー、ＰＣＲ条件および阻害剤の存在の変化の結果変動するためである。それに対し、解析された座位が同一反応において同時増幅され、従ってこのような不同性の効果の影響下にあるため、本発明において計算されるメチル化比は、このような要因に対し非感受性である。よって、本手法は、ゲノム標的またはアンプリコンの絶対的定量化を必要とせず、本アッセイは、検量線またはいかなる外部対照も必要としない単一の独立型反応である。
【００８６】
メチル化比アッセイは、１回の生化学反応において極少量のＤＮＡで行うことができ、従って、例えばＤＮＡ試料の組織／細胞型供給源を樹立するための安価で、迅速で、強力な方法である。本方法の設計の重要な特色は、１回の生化学反応においてＤＮＡプロファイリング等、他のＰＣＲに基づく手順と組み合わせることができることである。
【００８７】
その上、本アッセイは、有用な生物学的情報を検出することができ、実際のメチル化レベルの単純決定が失敗した場合にＤＮＡの供給源を同定する役割を果たすことができる。本アッセイは、異なる個体間で相対的に一定な試料間のメチル化比に依存し、異なる個体間で非常に顕著に変動する任意の特定の座位の実際のメチル化レベルに依存しない。
【００８８】
従って、本アッセイは、一例として、異なるＤＮＡ供給源の間の区別に用いられ得る数的比率の形態の有用な生化学的マーカーを提供する。この例示的なアッセイのより具体的な詳細を下に記す。
【００８９】
（１）座位特異的増幅のためのプライマー
従って、本開示の一態様は、蛍光ＰＣＲから生成されたＤＮＡ座位の増幅産物のシグナル強度を互いに比較して、座位ペア間、例えば、座位＃１対座位＃２、座位＃１対座位＃３、座位＃１対座位＃４、座位＃２対座位＃３、座位＃２対座位＃４等の比率を計算した、「メチル化比（ＭＲ）」を得ることに関する。本技法が、ＤＮＡ試料の供給源の決定に用いられる場合、メチル化比増幅反応において用いられるプライマーは、様々な組織／細胞型において差次的にメチル化された座位のペアを増幅するよう選ばれる。
【００９０】
プライマーの２組のペア（第一のペアおよび第二のペア）のいずれを２種の座位（１）および（２）の増幅に用いるか選択するための一考察は、様々な組織／細胞型における２種の座位の差次的なメチル化の度合いである。よって、例えば、そのメチル化比がある組織／細胞型において１を超え、他の全組織／細胞型において１未満である座位のペアは、メチル化比増幅アッセイのためのプライマーの設計に用いることができる。
【００９１】
（２）増幅のための座位の選択
ゲノム座位のペアが本手法において用いられるための唯一の要件は、それぞれが、メチル化感受性／依存性酵素（例えば、ＨｈａＩの場合はＧＣＧＣ）のための少なくとも１種類の認識配列を含有し、メチル化比が、全組織／細胞型にわたって均一でないことである。
【００９２】
座位に関する他の要件はない。特に、座位は、例えば任意の特定の染色体またはゲノム位置に位置する必要がなく、特定の長さである必要はなく、ゲノムにおいてシングルコピーである必然性がない。
【００９３】
特定のエンドヌクレアーゼのための認識配列を見出すため、当業者は、任意の所望のゲノムをダウンロードし、ゲノムの一続きの配列全体における認識配列の部分列の位置である（例えば、ＨｈａＩに対しＧＣＧＣ）、任意の特定のエンドヌクレアーゼの位置を発見することができる。
【００９４】
そのメチル化比が異なる組織／細胞型において均一であると予想されない、従って「情報価値がある」ゲノム座位の候補ペアを同定するため、当業者は、ゲノム座位をランダムに選び、アッセイに対するそれらの有用性を経験的に検査する、あるいは異なる組織／細胞型における特定のゲノム領域の差次的なメチル化に関する発表データを検索することができる。Ｅｃｋｈａｒｄｔら、「ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ６，２０  ａｎｄ  ２２」（２００６）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３８、１３７８〜１３８５およびＳｔｒａｕｓｓｍａｎら、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ」（２００９）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６、５６４〜５７１を参照されたい。
【００９５】
様々なゲノム領域におけるメチル化レベルに関する発表データが存在する。しかし、メチル化レベルそれ自体は、本明細書に記載されているアッセイの文脈において無意味であり、メチル化比に関する発表データは存在しない。メチル化比は、メチル化レベルに関するデータから理論的に推定することができるが、実際には、本アッセイの文脈において、これは実行可能ではない。その理由として、（１）発表されたメチル化レベルは、定量的ではなくむしろ定性的であり（すなわち、メチル化対非メチル化）、数的な値が必要とされる比率のためのものであり、（２）組織間のメチル化レベルは、特異的ＣＧではなくむしろ領域（数個のＣＧを含有）のメチル化に関するからである。例えば、Ｓｔｒａｕｓｓｍａｎらにおいて、多くのＣＧを含有するアイランド＃２は、精液よりも血液においてよりメチル化されていると報告された。しかし、この結果は、該アイランド内の任意の特異的ＣＧが、精液に対し血液においてよりメチル化されていることを意味せず、従って、任意の特異的ＣＧに対しメチル化比を経験的にチェックする必要がある。（３）既存のデータは、少量の試料セットかプールされたＤＮＡ由来のいずれかであり、いずれの場合においても、これは、ヒト集団全体に関する統計的結論を導くには不十分である。メチル化比は、統計的有意性に達するのに十分に大規模に多くの個体から得られるべきである。
【００９６】
選ばれるゲノム座位は、いかなる長さであってもよいが、より短いアンプリコンは分解ＤＮＡにおいてインタクトである可能性があるため、相対的に短いアンプリコン（ほぼ１００ｂｐ未満）を用いることが有利である。その上、アッセイが、ＤＮＡプロファイリングと併せた使用を対象とする場合、このような短いアンプリコンは、そのサイズがＤＮＡプロファイリングに通常用いられる断片のサイズと重複しないため、有用となり得る。
【００９７】
（３）メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ
本手法の第二の考察は、メチル化感受性および／またはメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼによって切断または消化される、あるいは切断または消化されない座位の選択である。エンドヌクレアーゼは、例えば、該座位におけるその認識配列がメチル化されているとＤＮＡ鎖を切断できなければ選択される。よって、メチル化されている座位（１）と、メチル化されていない座位（２）に関して、ＨｈａＩまたはＨｐａＩＩ等のエンドヌクレアーゼは、座位（１）を消化しないが、座位（２）を消化するであろう。従って、メチル化比アッセイにおける増幅のための座位の選択は、各座位内のメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ認識配列の存在を考慮することもできる。
【００９８】
従って、先述に鑑み、適切な座位ペアの例示的な特徴は、（Ａ）異なる組織／細胞型におけるそれらの比較メチル化比と、（Ｂ）どちらの座位も、同一メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによって認識される少なくとも１個の認識配列を含有することとを含む。別の一実施形態において、各座位は、短い縦列反復配列（ＳＴＲ）をさらに含む。
【００９９】
続いて、フォワードおよびリバースプライマーは、座位の認識配列に隣接するＤＮＡ領域とアニールするよう設計することができる。
【０１００】
従って、メチル化感受性酵素の場合、座位がメチル化されている場合、座位は（Ａ）消化されないが（Ｂ）増幅されるであろう。逆に、座位が非メチル化されている場合、座位は（Ａ）消化されるが（Ｂ）増幅されないであろう。メチル化依存性酵素の場合、状況はその逆である。
【０１０１】
（４）参照分布の作成
参照分布は、公知の供給源のＤＮＡの試料から得られたメチル化比の分布である。例えば、ＳＥＱ２６／ＳＥＱ３１の唾液における参照分布は、異なる５０個体から得られた唾液試料から観察・計算された５０種のＳＥＱ２６／ＳＥＱ３１メチル化比からなることができる。
【０１０２】
よって、異なる組織／細胞型の参照比を考案するため、当業者は、例えば、（１）それぞれエンドヌクレアーゼ（メチル化感受性またはメチル化依存性のいずれか）の認識配列を含有し、異なる組織／細胞型にわたって不均一なメチル化比であることが公知の座位のペアを同定し、（２）公知の組織／細胞型由来のＤＮＡの試料を消化し、（３）第一および第二の座位を増幅するよう設計されたＰＣＲプライマーによりＰＣＲ増幅反応を行い、（４）増幅シグナル強度を決定することができる。
【０１０３】
次に、メチル化比は、第一の座位増幅産物の強度を第二の座位増幅産物で割ることにより、あるいはその逆により計算される。増幅が蛍光ＰＣＲにより行われる場合、各増幅産物のシグナル強度を容易に測定し、その相対蛍光単位（ｒｆｕ）の単位で報告することができる。この場合、メチル化比は、第一の座位増幅産物のｒｆｕ数値を第二の座位増幅産物のｒｆｕで割って、参照ＤＮＡ試料由来の２個の公知の選択された座位間のメチル化比を反映する単一の数字を算出することによって得られる。蛍光シグナルの測定は自動的に行うことができ、シグナル強度比の計算はコンピュータソフトウェアによって行われる。０による割り算の問題を回避するため、分母のシグナルが０となる場合、これに小さな正の値を任意に割り当ててよい。
【０１０４】
先述は、いかにして当業者が、公知の組織／細胞型のＤＮＡから選択される２種の座位間のメチル化比を系統的に決定し得るかの一例である。これを為すため、当業者は、ゲノム座位の様々な公知のペア間の公知の比率のライブラリーを作成することができる。
【０１０５】
（５）ＤＮＡの組織／細胞型供給源の決定
当業者は、例えば、次の通りにメチル化比のリストから最も可能性の高い供給源組織／細胞型を決定することができる。
１．観察されたメチル化比それぞれにつき、組織／細胞型毎に１個の確率スコア（０〜１の間）を計算する。特定の組織の確率スコアを計算する仕方の一つは、次の通りである。１マイナス２掛ける０．５と観察されたメチル化比における（該組織／細胞型の）対応する参照分布の累積分布関数値との間の絶対差。これは、観察されたメチル化比と特異的参照分布の平均との近さを測定する。
２．組織／細胞型毎に、次の通り、該組織／細胞型の全確率スコアに基づいて複合確率スコア（ＣＰＳ）を計算する。
ＣＰＳ＝全確率スコアの積のｎ乗根（式中、ｎは、確率スコアの数）
３．組織／細胞型毎に、次の通り尤度スコア（ＬＳ）を計算する。
ＬＳ（組織）＝ＣＰＳ（組織）／［全組織のＣＰＳの合計］
４．最も可能性の高い組織は、最高尤度スコアの組織である。
【０１０６】
（６）キャピラリー電気泳動
解析の速さは、例えば、標的座位の複数のペアの増幅から生成された多数の増幅産物を分離するためのキャピラリー電気泳動の使用を考慮することにより明らかである。上述の通り、本メチル化比アッセイは、複数の座位に対して行うことができ、いずれの場合においても、メチル化比は、各座位ペアに対して別個に計算される。例えば、反応において４種の座位（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）が同時増幅される場合、６通りの異なるメチル化比、すなわち、Ａ／Ｂ、Ａ／Ｃ、Ａ／Ｄ、Ｂ／Ｃ、Ｂ／Ｄ、Ｃ／Ｄを計算できる。
【０１０７】
従って、「ｎ」種の座位が同時増幅される場合、（ｎ２−ｎ）／２通りの異なる比率を計算できる。従って、本メチル化アッセイによってもたらされる情報量は、解析される座位の数に伴い指数関数的に上昇する。キャピラリー電気泳動は、リアルタイムＰＣＲ増幅方法とは対照的に、１回の実験で多数の座位の間を識別できる。例えば、ＤＮＡプロファイリングのため、特定のＤＮＡ試料から１７種のゲノム座位がルーチンに同時増幅され、同時解析される。その結果、全１７座位における本メチル化比アッセイの実行は、１３６通りの独立したメチル化比を生じる。リアルタイムＰＣＲは、１３６通りの比率を生じるのに必要な数の個別の増幅産物を１回の反応で同時に識別できない。リアルタイムＰＣＲによって約４種の座位を識別できるが、これは、６通りの比率の計算にしか対応しない。
【０１０８】
それに対し、キャピラリー電気泳動は、１７種の座位の全ペア並べ替えから増幅産物を容易に分離でき、従って、１回の反応で全１３６通りのメチル化比を同時計算するためのデータを容易に作成することができる。理論的に、数百種の座位を同時に実験し、１回のキャピラリー電気泳動で分離することができる。
【０１０９】
（７）座位、プライマーおよび市販のプロファイリングキット
本開示に従って、メチル化比を計算するためにいずれの座位ペアを用いてもよい。本明細書の他の部分に記されている通り、適切な座位ペアの例示的な特徴は、（Ａ）異なる組織において不均一なメチル化比を示すことと、（Ｂ）どちらの座位も、同一メチル化感受性および／またはメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼによって認識される少なくとも１種類の認識配列を含有することと、必要に応じて、（Ｃ）各座位が短い縦列反復（ＳＴＲ）配列を含有することとを含む。
【０１１０】
ＤＮＡプロファイリングに用いられ、本方法において用いることのできる座位のコレクションの一例は、米国連邦捜査局（ＦＢＩ）の複合ＤＮＡインデックス方式（ＣＯＤＩＳ）である。ここに本明細書の一部を構成するものとして援用するｗｗｗ．ｆｂｉ．ｇｏｖ／ｈｑ／ｌａｂ／ｈｔｍｌ／ｃｏｄｉｓ１．ｈｔｍを参照されたい。ＣＯＤＩＳは、短い(または単純)縦列反復（ＳＴＲ）コア配列を含有するヒトゲノムから同定された１３種の座位のコレクションである。ＳＴＲは、ヌクレオチドの二量体、三量体、四量体、五量体および六量体型縦列反復を含み得る。米国特許第５，８４３，６４７号明細書（単純縦列反復）を参照されたい。
【０１１１】
ＣＯＤＩＳ座位は、Ｄ１６Ｓ５３９（配列番号１）、Ｄ７Ｓ８２０（配列番号２）、Ｄ１３Ｓ３１７（配列番号３）、Ｄ５Ｓ８１８（配列番号４）、ＣＳＦ１ＰＯ（配列番号５）、ＴＰＯＸ（配列番号６）、ＴＨ０１（配列番号７）、ｖＷＡ（配列番号８）、ＦＧＡ（配列番号９）、Ｄ２１Ｓ１１（配列番号１０）、Ｄ８Ｓ１１７９（配列番号１１）、Ｄ１８Ｓ５１（配列番号１２）およびＤ３Ｓ１３５８（配列番号１３）として知られている。配列番号１〜１３は、本明細書に提供されている。
【０１１２】
ＣＯＤＩＳコレクションに含まれていないが、本開示において用いることのできる他の座位として、Ｐｅｎｔａ  Ｄ（配列番号１４）、Ｐｅｎｔａ  Ｅ（配列番号１５）およびアメロゲニン（配列番号１６および１７）；ならびにＤ２Ｓ１３３８（配列番号１８）、Ｄ１９Ｓ４３３（配列番号１９）、ＡＣＴＢＰ２ＳＥ３３（配列番号２０）、Ｄ１０Ｓ１２４８（配列番号２１）、Ｄ１Ｓ１６５６（配列番号２２）、Ｄ２２Ｓ１０４５（配列番号２３）、Ｄ２Ｓ４４１（配列番号２４）およびＤ１２Ｓ３９１（配列番号２５）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１３】
ＤＮＡプロファイリング解析用に販売される市販のキットは、全ＣＯＤＩＳおよび一部の非ＣＯＤＩＳ座位を増幅するよう設計されたＰＣＲ増幅プライマーを提供する。Ｐｒｏｍｅｇａ社のＰｏｗｅｒＰｌｅｘ（登録商標）１６ＤＮＡプロファイリングシリーズは、Ｐｅｎｔａ  Ｅ、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ２１Ｓ１１、ＴＨ０１、Ｄ３Ｓ１３５８、ＦＧＡ、ＴＰＯＸ、Ｄ８Ｓ１１７９、ｖＷＡ、アメロゲニン、Ｐｅｎｔａ  Ｄ、ＣＳＦ１ＰＯ、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７およびＤ５Ｓ８１８として同定された１６種の座位を増幅するための市販のプライマーコレクションの一例である。ここに本明細書の一部を構成するものとして援用するｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｈｍｎｉｄ／ｐｒｏｄｕｃｔｐｒｏｆｉｌｅｓ／ｐｐ１６／を参照されたい。ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ（登録商標）１６キットは、欧州警察ネットワーク、ＩＮＴＥＲＰＯＬ、欧州鑑識科学機構（ＥＮＦＳＩ）、ＧＩＴＡＤ（イベロアメリカＤＮＡ解析ワーキンググループ（Ｇｒｕｐｏ  Ｉｂｅｒｏａｍｅｒｉｃａｎｏ  ｄｅ  Ｔｒａｂａｊｏ  ｅｎ  Ａｎａｌｉｓｉｓ  ｄｅ  ＤＮＡ））および米国連邦捜査局（ＦＢＩ）による法医学的ＤＮＡプロファイリング用途に認可されているため、特に有用である。
【０１１４】
下でより詳細に説明する通り、本開示は、キット内に含有されていない追加的な座位を増幅するための１または複数のプライマーと併せた、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ（登録商標）１６プロファイリングキット等のキットの使用を包含する。非限定的な例として、様々な組織／細胞型において差次的にメチル化されていることが知られているため、これらの追加的な座位を選択することができる。このような追加的な座位の例として、配列番号２６〜３１が挙げられるが、これらに限定されない。よって、本明細書に記載されているメチル化比アッセイを踏まえて、当業者であれば、これらの座位における非メチル化ＨｈａＩ制限部位の適切な結合および切断のために、ＨｈａＩ等のメチル化感受性酵素を想定するであろう。
【０１１５】
本開示の別の一態様において、特定の座位または座位ペアの配列またはメチル化特徴に関する従前の知識は、本明細書に記載されているアッセイの実施に必須ではない。すなわち、本開示のアッセイは、座位のランダムな選択と、それに続く制限消化されたＤＮＡ試料から増幅されたランダム座位ペアの比較により、例えば、ＤＮＡ試料の組織／細胞型供給源を表示する対照または閾値の比率値に対し比較できる比率を得ることを包含する。
【０１１６】
Ｄ．ＣＯＤＩＳ、キットおよびメチル化アッセイの組み合わせ
従って、ＣＯＤＩＳまたはＰｏｗｅｒＰｌｅｘ（登録商標）１６キットと追加的な座位との組み合わせは、ＤＮＡ試料の同時プロファイルおよび試料の組織／細胞型供給源の決定を可能にする。例えば、本手法は、ＤＮＡ試料のＨｈａＩによる消化と、配列番号２６〜３１由来の座位のプライマーを加えたＰｏｗｅｒＰｌｅｘ（登録商標）１６キットによるＤＮＡの増幅とを企図する。
【０１１７】
上述の通り、座位配列番号２６〜３１の解析は、ＤＮＡ試料の組織／細胞型供給源の決定をもたらし、一方、プロファイリング座位（例えば、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ１６座位）の解析は、ＤＮＡプロファイルの決定をもたらすであろう。
【０１１８】
よって、本発明の技術の強力な一態様は、特定の対象のＤＮＡのプロファイルを超える、既存の市販のＤＮＡプロファイリングキットの有用性を変換および拡大するその能力である。メチル化比アッセイ等、本明細書に開示されている本発明のアッセイと、例えば、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ（登録商標）１６キットとの組み合わせは、利用者によるプロファイルされたＤＮＡの検査およびＤＮＡの組織／細胞型供給源の決定を可能にする。
【０１１９】
（１）ＤＮＡプロファイリングキット
ＤＮＡ試料の組織／細胞型供給源も決定するためのその有用性が増強され得るＤＮＡプロファイリングキットの他の例として、ＳＧＭ、ＳＧＭ＋、ＡｍｐＦｌＳＴＲ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｌｅｒ、ＡｍｐＦｌＳＴＲ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ、ＡｍｐＦｌＳＴＲ  ＰｒｏｆｉｌｅｒＰｌｕｓ、ＡｍｐＦｌＳＴＲ  ＰｒｏｆｉｌｅｒＰｌｕｓＩＤ、ＡｍｐＦｌＳＴＲ  ＳＥｆｉｌｅｒ、ＡｍｐＦｌＳＴＲ  ＳＥｆｉｌｅｒ  Ｐｌｕｓ、ＡｍｐＦｌＳＴＲ  Ｃｏｆｉｌｅｒ、ＡｍｐＦｌＳＴＲ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｌｅｒ  Ｄｉｒｅｃｔ、ＡｍｐＦｌＳＴＲ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｌｅｒ  Ｐｌｕｓ、ＡｍｐＦｌＳＴＲ  ＮＧＭ、ＡｍｐＦｌＳＴＲ  Ｙ−ｆｉｌｅｒ、ＡｍｐＦｌＳＴＲ  Ｍｉｎｉｆｉｌｅｒ、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ１．１、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ２．１、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ１６、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘＥＳ、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘＥＳＸ１６、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘＥＳＩ１６、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘＥＳＸ１７およびＰｏｗｅｒＰｌｅｘＥＳＩ１７が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２０】
（２）配列
プロファイリングに通常用いられる様々なＣＯＤＩＳ、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ（登録商標）１６および他の座位のための本明細書に提供されている配列、すなわち、配列番号１〜２５は、（１）全シトシン−グアニン（ＣＧ）ジヌクレオチドの位置と、（２）該特定の座位のメチル化感受性およびメチル化依存性制限酵素プロファイルとを決定するために本明細書において解析された。従って、本願の本文中に含まれる配列リストは、比率生成アッセイ方法を踏まえて用いることのできる、特定のメチル化感受性およびメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼの同定に関する指針を当業者に提供する。
【０１２１】
本明細書に提供されている配列情報により、当業者は、ＣＧおよび制限部位に隣接する選択された座位の領域とアニールするフォワードおよびリバース増幅プライマーを設計することもできる。よって、市販のプライマーの使用および入手可能性は、本信頼アッセイの実施のためのより簡便かつ費用効果の優れたオプションとなり得るが、本開示は、これらの市販のプライマーのみを用いた例えばＣＯＤＩＳ座位の増幅に限定されない。
【０１２２】
（３）「スキースロープ(ski-slope）」効果の補正
一部の電気泳動図トレースアウトプットによく見られる問題は、「スキースロープ」として知られるアーチファクトである。「スキースロープ」は、電気泳動図において時に観察され、アンプリコンサイズおよびシグナル強度の間の反比例関係で現れるアーチファクトに与えられた名称である。このような電気泳動図において、シグナルは、そのトレースが右方に下がる(runs down and to the right)「スキースロープ」テールに類似する。このアーチファクトは、いくつかの要因、例えば、試料のオーバーロード（ＰＣＲにおける過剰のＤＮＡテンプレート）または分解ＤＮＡによってもたらされ得る。
【０１２３】
本アッセイは、正規化ステップを行うことにより、メチル化比の計算においてこのアーチファクトを補正する。通常、正規化プロセスは、（１）座位サブセット由来の試料の線形適合の取得と、（２）（１）において得られた線形適合に対する全ピーク値の正規化と、（３）正規化されたピーク値に基づくメチル化比の計算とを伴う。本明細書において、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ（登録商標）１６における線形適合の計算に用いた特異的座位を、Ｄ３Ｓ１３５８、ＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｐｅｎｔａ＿Ｅとして決定した。
【０１２４】
いずれの座位サブセットが線形適合の計算に有用であるか決定するための判断基準は、座位が、検査された性質に対し情報価値がないか否かである。特に、この座位は、アッセイに用いられる制限酵素の認識配列を含有するべきではなく、さもなければ、全ての関連する組織において類似のメチル化比を有するべきである。例えば、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ１６キットに関し、本明細書において、このサブセットが、座位Ｄ３Ｓ１３５８、ＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｐｅｎｔａ＿Ｅからなることが判明した。座位サブセットが決定されると、例えば、この特定の座位サブセットの相対蛍光単位（ｒｆｕ）シグナルにおける最小二乗法の実行により、線形適合を計算することができる。その後、例えば、ピークのｒｆｕを同じＸ軸座標（サイズ、ｂｐ）における線形適合の値で割ることにより、ピーク値の正規化を達成できる。例えば、図４を参照されたい。
【０１２５】
（４）アルゴリズムおよびソフトウェア
一実施形態において、メチル化比の計算は、キャピラリー電気泳動装置において泳動される蛍光ＰＣＲの増幅産物のシグナル強度の解析に基づき行われる。キャピラリー電気泳動装置のアウトプットは、バイナリーコンピュータファイル（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓキャピラリー電気泳動装置の場合、例えばＦＳＡファイル）である。このファイルは、各サンプリング時点(データポイントと言う)の関数としての各フルオロフォアの相対蛍光単位(ｒｆｕ)であるチャネルデータ等、キャピラリー電気泳動の実行に関する情報を含む。
【０１２６】
本開示は、キャピラリー電気泳動装置の実行のアウトプットであるファイルをインプットとして受け付ける、その増幅産物がキャピラリー電気泳動装置において泳動される座位セットの蛍光強度を計算するソフトウェアプログラムについても記載する。これらの強度に基づき、ソフトウェアは、それに対し比率が計算されると定義された所定の座位ペアのセットに基づきメチル化比を計算する。最後に、ソフトウェアは、ＤＮＡ試料の供給源として最も可能性の高い組織／細胞型をアウトプットする。
【０１２７】
次に、ソフトウェアプログラムによって実行されるこの解析の図式を記す
１．各フルオロフォアのチャネルデータを読み取る。この操作は、キャピラリー電気泳動アウトプットファイルにチャネルデータがコード化された特定フォーマットの知識を必要とする。ＦＳＡファイルの場合、フォーマットは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって作成された文書（ｗｗｗ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｓｕｐｐｏｒｔ／ｓｏｆｔｗａｒｅ＿ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ／ＡＢＩＦ＿Ｆｉｌｅ＿Ｆｏｒｍａｔ．ｐｄｆにおいてオンライン入手できる）において詳細に説明されており、当業者であれば、コンピュータプログラムを作成して、このファイルからチャネルデータ（および泳動に関する他の情報）を得ることができる。
【０１２８】
２．各フルオロフォアのチャネルデータのベースライン低下を行う。各フルオロフォアは、基底蛍光強度レベルを有し、これは、該フルオロフォアによって標識された増幅産物が、ある特定のデータポイントで検出されない場合であっても、該フルオロフォアのｒｆｕレベルは、該データポイントでゼロ以外のものとなることを意味する。補正解析を行うため、全時点においてベースラインレベルをｒｆｕレベルから低下させることにより、各フルオロフォアのベースラインレベルを取り除く必要がある。例えば、該フルオロフォアの増幅産物がない泳動の一部において該フルオロフォアのｒｆｕレベルを平均することによって、各フルオロフォアのベースラインレベルを得ることができる。通常、キャピラリー電気泳動の多くは増幅産物を欠くため、このような領域を見出すことは、当業者とって困難な仕事ではない。
【０１２９】
３．フルオロフォア間のスペクトル重複を取り除く。キャピラリー電気泳動において用いられる蛍光色素は、それぞれ別個の最大発光波長を有するが、それにもかかわらず、蛍光色素は重複する発光スペクトルを有する。この事実は、ある特定の色素が、他の色素を「引き出し（ｐｕｌｌ−ｕｐ）」、他の色素におけるアーチファクトなｒｆｕレベルを生じることを意味する。補正解析を行うため、このような引き出しの除去が必要とされる。この操作は、引き出しのｎ＊ｎマトリクス（式中、ｎは色素の数である）を理解することにより行うことができ、（ｉ，ｊ）エレメントは、色素ｉが色素ｊを引き出す分率である。このマトリクスは、スペクトルキャリブレーション手順でキャピラリー電気泳動装置において色素セットを泳動することにより得ることができる。
【０１３０】
４．検出ピーク。チャネルデータのある特定の部分は、それぞれ特異的増幅産物に対応するピークシグナルである。増幅産物は、例えば、プロファイリング座位、対照座位のアレルまたは検量線のピークに対応し得る。キャピラリー電気泳動データにおけるピークは、その検出を可能にする別個のパターンを有し、当業者は、この別個のパターンを理解している。これに基づき、ピーク検出のアルゴリズムを設計できる。このようなピーク検出アルゴリズムの一例は次の通りである。全局所極大(local maxima)（すなわち、ｒｆｕレベルが、２個の隣接データポイント両方のｒｆｕレベルを超えるデータポイント）を検出し、このような局所極大のそれぞれを、局所極大ポイントにおけるｒｆｕレベルと等しい高さのピークとして定義する。局所極大の全てがピークに対応する訳ではないため、過剰なピークを除去する必要がある。過剰なピークを除去する仕方の一つは、例えば、ピークが、そのごく近傍（そのＸ隣接データポイント内）において最高ｒｆｕレベルでなければならないとの着想に基づく。これに基づき、過剰なピークは、全ピークにわたりこれを行い、別のより高いピーク近傍の（Ｘデータポイント（Ｘは、ある所定のパラメータ）内の）任意のピークを除去することにより取り除かれる。
【０１３１】
５．塩基対サイズをピークに割り当てる。フルオロフォア毎のチャネルデータは、データポイントの関数としてのｒｆｕレベルのセットとして得られる。データポイントは、塩基対と相関するが、両者の間で相関する正確な関数を決定する必要がある。この目的のため、試料増幅産物（その長さは未知）と共に、検量線（公知の塩基対長の増幅産物のセット）を実験する。検量線ピークに基づき、データポイントおよび塩基対と相関する適合を得る。この適合は、本技術分野で公知の数通りの方法のうちの一方法を用いて、例えば、最小二乗法を用いて得ることができる。適合が得られると、全検出ピークは、その塩基対サイズを割り当てられる。
【０１３２】
６．解析に用いた座位のシグナル強度を得る。解析された座位それぞれの予想されるサイズは、事前に知られている。座位は、多型であってよく（例えば、プロファイリングに用いられるように）、この場合、その予想されるサイズは、該座位のアレル候補のセットに基づくある特定の範囲内に収まる。他の座位は、非多型（例えば、対照座位）であり、この場合、その予想されるサイズは、より小さな範囲内に収まる。各座位のシグナル強度は、座位の範囲内の非アーチファクトピーク（例えば、プロファイリング座位の２種のアレルに対応する２個のピーク）のｒｆｕの合計である。
【０１３３】
７．メチル化比を得る。全座位のシグナル強度が計算されると、座位ペア間のメチル化比は、ペアにおける第一の座位のシグナル強度の、ペアにおける第二の座位のシグナル強度による割り算である。
【０１３４】
８．確率および複合確率スコアを計算する。確率スコアは、メチル化比と、異なる組織／細胞型から得られたメチル化比の参照分布との比較に基づき計算することができる。続いて、例えば単一の確率スコアの積のｎ乗根（式中、ｎはメチル化比の数である）を計算することにより、各組織／細胞型の複合確率スコア（ＣＰＳ）を単一の確率スコアから計算することができる。
【０１３５】
９．尤度スコアを計算する。組織／細胞型毎に、ＤＮＡ試料が該組織／細胞型に由来する尤度を表す尤度スコア（ＬＳ）を計算する。組織／細胞型毎の尤度スコアは、例えば次の通りに計算することができる。
ＬＳ（組織）＝ＣＰＳ（組織）／［全組織のＣＰＳの合計］。
【０１３６】
１０．最高ＬＳを有する組織／細胞型をアウトプットする。
【０１３７】
（５）混合ＤＮＡ試料の供給源の決定
一部の事例において、ＤＮＡ試料は、純粋な供給源のものではなく、むしろ２種以上の供給源の混合物である（例えば、５０％血液および５０％精液）。本発明は、次の解析を行うことにより、このような試料の供給源の構成を決定することもできる。
（ａ）ＤＮＡ試料をメチル化感受性および／またはメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼにより消化し、
（ｂ）消化されたＤＮＡを少なくとも第一および第二の制限座位により増幅して、これにより各制限座位の増幅産物を生成し、
（ｃ）各増幅産物のシグナル強度を決定し、
（ｄ）２種の制限座位に対応するシグナル強度間の少なくとも１個のメチル化比を計算し、
（ｅ）ステップ（ｄ）において計算されたメチル化比を、公知の組織および／または細胞型のＤＮＡから得られた参照メチル化比のセットと比較し、
（ｆ）ＤＮＡの供給源に寄与する各組織および／または細胞型の尤度を決定し、
（ｇ）ステップ（ｆ）において得られた尤度に基づき、供給源ＤＮＡの組成を決定する。
【実施例】
【０１３８】
例１：ゲノム座位に基づく組織同定アッセイ
本例において、血液、精液および皮膚の表皮から得られたＤＮＡ試料の間を識別できる組織同定アッセイを開発した。アッセイは、それぞれ配列番号２６〜３１に表記されている６種の特異的なゲノム座位の解析に基づく。各座位は、ＨｈａＩ制限部位（ＧＣＧＣ）を含有するサイズ７０〜１０５ｂｐの断片である。酵素ＨｈａＩは、その認識配列が非メチル化されているときのみ開裂させるため、アッセイは、認識配列におけるメチル化の相違のみに基づく。６種のゲノム座位は、それぞれ、そのメチル化状態がアッセイに無関係な追加的なＣＧを含有する。認識配列のメチル化のみが関与する。６種のゲノム座位の配列は次の通りである。
【０１３９】
【数１】
2013524805.tif 000002
【０１４０】
プライマー配列は、下線を引き影を付け、ＨｈａＩ認識配列は太字で示す。
【０１４１】
異なる３個体の精液、表皮および血液（合計９種の試料）から抽出されたＤＮＡ試料においてアッセイを行った。各ＤＮＡ試料の１ナノグラムを、１本の微量遠心チューブ内でＨｈａＩ、Ｔａｑポリメラーゼ、６種の座位の配列番号２６〜３１のフォワード（蛍光標識）およびリバースプライマー、ｄＮＴＰならびに反応バッファーと混合した。次に、チューブをサーモサイクラーに置き、最初の消化ステップ（３７℃）を含む１回のプログラムに付し、続いて消化産物をＰＣＲ増幅した。制限−増幅反応後、生成物のアリコートをキャピラリー電気泳動装置にて泳動した。図６は、９種の試料のキャピラリー電気泳動の電気泳動図を示す。各電気泳動図において、それぞれ１種の座位に対応する６個のピークが見られる。次に、９種の試料の電気泳動図から得られたデータを次の通り解析した。試料毎に、各座位におけるシグナル強度（ｒｆｕ）を定量化し、全１５通りの座位ペア組み合わせ（例えば、配列番号２６／配列番号２８）のメチル化比（例えば、座位２のｒｆｕで割った座位１のｒｆｕ）を計算した。
【０１４２】
表１は、全試料のこのようなメチル化比１５通りのうちの２通り（配列番号２９／配列番号３０および配列番号２８／配列番号２６）の値を示す。試料毎に、血液、精液および表皮におけるその参照分布の累積分布関数（血液、精液および表皮由来の大きなセットのＤＮＡ試料から経験的に得られる）に対し各メチル化比を比較した。
【０１４３】
【表１】
2013524805.tif 000003
【０１４４】
表２は、２通りのメチル化比（血液、精液および表皮由来の大きなセットのＤＮＡ試料から経験的に得られる）の参照分布の平均および標準偏差を示す。
【０１４５】
【表２】
2013524805.tif 000004
【０１４６】
組織／細胞型毎に、観察されたメチル化比および累積分布関数におけるその対応する値の間の各比較は、確率スコアを生じ、これは次の通り計算される。
ＰＳ（血液、ＳＥＱ２６／２８）＝１−［２＊ａｂｓ（ｆ（ＯＭＲ）−０．５）］
（式中、ｆは、血液におけるＳＥＱ２６／２８の参照分布の累積分布関数であり、ＯＭＲは、試料におけるＳＥＱ２６／２８の観察されたメチル化比である）
ＰＳ（精液、ＳＥＱ２６／２８）およびＰＳ（表皮、ＳＥＱ２６／２８）を同様の仕方で計算した。
【０１４７】
次に、全メチル化比に基づき組織型毎の複合確率スコア（ＣＰＳ）を次の通りに計算した。
ＣＰＳ（血液）＝［ＬＳ（血液、メチル化比＃１）＊ＬＳ（血液、メチル化比＃２）＊…＊ＬＳ（血液、メチル化比＃ｎ）］のｎ乗根
（式中、ｎはメチル化比の数である）
ＣＰＳ（精液）およびＣＰＳ（表皮）も同様の仕方で計算した。
【０１４８】
最後に、複合確率スコアから尤度スコア（ＬＳ）を次の通り計算した。
ＬＳ（血液）＝ＣＰＳ（血液）／［ＣＰＳ（血液）＋ＣＰＳ（精液）＋ＣＰＳ（表皮）］
ＬＳ（精液）およびＬＳ（表皮）も同様の仕方で計算した。
【０１４９】
各組織／細胞型の尤度スコアは、ＤＮＡ試料が該特定の組織／細胞型に由来する尤度を表す。
【０１５０】
表３は、全９種のＤＮＡ試料の全メチル化比に基づく３種の組織の尤度スコアを示す。
【０１５１】
【表３】
2013524805.tif 000005
【０１５２】
同様に、また、図７に示す通り、血液、唾液、皮膚、精液、月経血、腟スワブおよび尿由来の１１種の異なるＤＮＡ試料において１０座位マルチプレックスを用いて組織同定アッセイを行った。解析は、４５通りのメチル化比（例えば、座位１／座位２、座位１／座位３等）に基づいた。解析される座位の異なる強度により、血液、唾液、皮膚、精液、月経血、腟組織および尿にわたる差次的なメチル化を証明する。アッセイは、全試料の供給源組織を正確に同定した。例えば、また、図７に示す通り、月経血に由来するＤＮＡは、唾液に由来するＤＮＡから区別することができる。
【０１５３】
【数２−１】
2013524805.tif 000006
【０１５４】
【数２−２】
2013524805.tif 000007
【０１５５】
【数２−３】
2013524805.tif 000008
【０１５６】
【数２−４】
2013524805.tif 000009
【０１５７】
【数２−５】
2013524805.tif 000010
【０１５８】
【数２−６】
2013524805.tif 000011
【０１５９】
【数２−７】
2013524805.tif 000012
【０１６０】
【数２−８】
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【０１６１】
【数２−９】
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【０１６２】
【数２−１０】
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【０１６３】
【数２−１１】
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【０１６４】
【数２−１２】
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【０１６５】
【数２−１３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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