(57)【要約】  高リスクＨＰＶ核酸に特異的な戦略的に切断されたプローブ、並びにこれを作製及び使用する方法を本明細書中で開示する。開示のプローブ及びその使用方法は、交差反応を殆ど生じることなく、臨床サンプル中のヒトパピローマウイルスの迅速かつ信頼性のある検出を可能にする。【選択図】図１９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドプローブであって、高リスクＨＰＶ核酸のＬ１、Ｌ２、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ６及びＥ７の各々の少なくとも１００個の連続塩基に対して７０％〜１００％の相補性を有する少なくとも１つの配列を含み、低リスクＨＰＶ核酸と交差反応しない、ポリヌクレオチドプローブ。
【請求項２】
低リスクＨＰＶ核酸の少なくとも１００個の連続塩基に対して約７０％〜１００％の相補性を有する少なくとも１００個の連続塩基の任意の配列を含有しないことを条件とする、請求項１に記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項３】
低リスクＨＰＶ核酸が、配列番号１８〜配列番号４３及びそれらの相補体からなる群から選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項４】
高リスクＨＰＶ核酸が、配列番号１〜配列番号１７、配列番号１０４〜配列番号１１０、配列番号１１６及びそれらの相補体からなる群から選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項５】
配列番号４４〜配列番号５７、配列番号１１１〜配列番号１１５及びそれらの相補体に対して約７０％〜１００％の同一性を有する任意の配列を含まない、請求項１に記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項６】
配列番号９７〜配列番号１０３、配列番号１１７及びそれらの相補体からなる群から選択される配列に対して約７０％〜１００％の同一性を有する配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項７】
配列番号９７〜配列番号１０３、配列番号１１７及びそれらの相補体からなる群から選択される配列から本質的になる、請求項１に記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項８】
配列番号９７〜配列番号１０３、配列番号１１７及びそれらの相補体からなる群から選択される配列からなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項９】
少なくとも１つの請求項１に記載のポリヌクレオチドプローブを含むキット。
【請求項１０】
高リスクＨＰＶ核酸に特異的なポリヌクレオチドプローブを生成する方法であって、
ａ）該高リスクＨＰＶ核酸の少なくとも一部分と約７０％〜１００％の同一性を有する、少なくとも１キロベース長の配列を含む鋳型核酸を準備することと、
ｂ）該鋳型核酸の配列を少なくとも１つの低リスク核酸と比較することと、
ｃ）該鋳型核酸を切断して、該低リスクＨＰＶ核酸の領域と１００個の連続塩基対にわたって約７０％〜１００％の同一性を有する、該鋳型核酸の任意の領域を除去する、切断することと、
を含む、高リスクＨＰＶ核酸に特異的なポリヌクレオチドプローブを生成する方法。
【請求項１１】
鋳型核酸を、欠失プライマーを用いて該鋳型核酸を増幅することによって切断する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
鋳型核酸を、該鋳型核酸を増幅する前にメチル化する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
メチル化された鋳型核酸を選択的に消化する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項９に記載の方法に従って生成されるポリヌクレオチドプローブ。
【請求項１５】
請求項１に記載のポリヌクレオチドプローブを断片化することによって生成される核酸プローブセット。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸プローブセットを含むキット。
【請求項１７】
サンプル中の標的核酸の存在を決定する方法であって、
ａ）請求項１〜８及び１３のいずれか一項に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブを標的核酸分子とハイブリダイズさせ、二本鎖核酸ハイブリッドを形成する、ポリヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせることと、
ｂ）該二本鎖核酸ハイブリッドを、二本鎖核酸ハイブリッドに特異的な第１の抗体を含む支持体上に捕捉させることと、
ｃ）該標的核酸分子を検出することと、
を含む、サンプル中の標的核酸の存在を決定する方法。
【請求項１８】
二本鎖核酸ハイブリッドがＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
標的核酸が高リスクＨＰＶ核酸である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
サンプルが生物学的サンプルである、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中の核酸の存在を決定するための方法、試薬、ハイスループットシステム及びキットに関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本出願は２０１０年５月２５日付けで出願された米国仮特許出願第６１／３４７，９４１号（その内容全体が参照により本明細書に援用される）に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
特定の核酸配列及び配列変化の検出及び特性化は、感染の指標となるウイルス又は細菌の核酸配列の存在の検出、疾患及びがんに関連する哺乳動物遺伝子の変異体又は対立遺伝子の存在の検出、並びに法医学的サンプル中に見られる核酸の由来の特定に、並びに父子鑑定に利用されている。
【０００４】
例えば、多くの微生物及びウイルスのＲＮＡ又はＤＮＡが単離され、シークエンシングされている。核酸プローブが多数の感染について検査されている。試験サンプル中の相補的なＲＮＡ配列又はＤＮＡ配列とハイブリダイズする、検出可能な核酸配列がこれまでに利用されている。プローブの検出は、そのプローブに特異的な試験サンプル中の特定の核酸配列の存在を示す。科学研究の助けとなることに加えて、ＤＮＡプローブ又はＲＮＡプローブは、患者サンプルにおけるウイルス並びに細菌、酵母及び原虫等の微生物、並びに特定の障害と関係する遺伝子突然変異の存在を検出するために使用することができる。
【０００５】
核酸ハイブリダイゼーションプローブは、他の検出方法に比べて高い感度及び特異性の利点を有し、生きた生物を必要としない。ハイブリダイゼーションプローブは例えば、容易に検出することのできる放射性物質、又は例えばその捕捉及び検出を可能にするビオチン等の生化学的マーカーによって標識することができる。高感度の戦略的に切断されたプローブは、望ましくない又は不要な領域との交差反応性を示す配列領域を取り除くことによって構築することもできる。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド又はＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含み得るＤＮＡハイブリッドに特異的な第１の抗体に核酸分子を捕捉させてもよい。ハイブリッドを続いて、例えばアルカリホスファターゼ等の生化学的マーカー、又は検出可能な任意の他のマーカーで標識され得る第２の標識抗体によって検出することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ヒト及び病原菌に由来する遺伝子の核酸配列データは蓄積されているため、迅速で費用効果の高い簡便な試験の需要が増大している。サンプル中の標的核酸を更に迅速に決定するための新規の効果的な方法、組成物及びキットを提供する必要がある。本発明の方法及びアッセイはこれらの要求を満たし、ハイスループットの自動化されたシステムに使用することができる。別の態様では、方法及びアッセイは部分的に自動化されたシステムで実施することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、本開示は、高リスクＨＰＶ核酸とハイブリダイズすることが可能であるが、低リスクＨＰＶ核酸と交差反応しない、少なくとも１キロベース長のポリヌクレオチドプローブに関する。一態様では、ポリヌクレオチドプローブは、高リスクＨＰＶ核酸のＬ１、Ｌ２、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ６及びＥ７の各々の少なくとも１００個の連続塩基に対して７０％〜１００％の相補性を有する少なくとも１つの配列を含む。更なる態様では、ポリヌクレオチドプローブは、低リスクＨＰＶ核酸の少なくとも１００個の連続塩基に対して約７０％〜１００％の相補性を有する少なくとも１００個の連続塩基の任意の配列を含有しない。別の態様では、ポリヌクレオチドプローブは、配列番号４４〜配列番号５７、配列番号１１１〜配列番号１１５及びそれらの相補体に対して約７０％〜１００％の同一性を有する任意の配列を含まない。また更なる態様では、ポリヌクレオチドプローブは、配列番号１〜配列番号１７及び配列番号１０４〜配列番号１１０、配列番号１１６又はそれらの相補体からなる群から選択される高リスクＨＰＶ核酸に特異的である。別の態様では、ポリヌクレオチドプローブは、配列番号９７〜配列番号１０３又はそれらの相補体からなる群から選択される配列に対して約７０％〜１００％の同一性を有する配列を含む。また別の態様では、ポリヌクレオチドプローブは配列番号９７〜配列番号１０３又はそれらの相補体からなる群から選択される配列から本質的になるか、又はそれからなる。
【０００８】
一態様では、本開示は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１６、配列番号１１７又はそれらの相補体に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は１００％の同一性を有する、少なくとも１キロベース長の配列を含む核酸を提供するが、但し、上記核酸は配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７又はそれらの相補体に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は１００％の同一性を有する任意の配列を含まない。
【０００９】
本開示は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１６、配列番号１１７又はそれらの相補体に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は１００％の同一性を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる１つ又は複数のプローブのプローブセットを提供するが、但し、上記核酸は配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７又はそれらの相補体に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は１００％の同一性を有する任意の配列を含まない。
【００１０】
一態様では、本開示は、サンプル中の標的核酸分子の存在を決定する方法であって、
ａ）サンプルを回収媒体に懸濁することと、
ｂ）標的核酸分子をサンプルから回収媒体に放出させることと、
ｃ）二本鎖標的核酸分子を一本鎖標的核酸分子に変換することと、
ｄ）１つ又は複数のポリヌクレオチドプローブを、ポリヌクレオチドプローブと標的一本鎖標的核酸分子とがハイブリダイズして二本鎖核酸ハイブリッドを形成することを可能にする条件下で、一本鎖標的核酸分子に接触させることと、
ｅ）二本鎖核酸ハイブリッドを捕捉させることと、
ｆ）二本鎖核酸ハイブリッドを、結合していない一本鎖標的核酸分子から分離することと、
ｇ）二本鎖核酸ハイブリッドを検出し、それにより標的核酸の存在が示される、二本鎖核酸ハイブリッドを検出することと、
を含む、サンプル中の標的核酸分子の存在を決定する方法を提供する。
【００１１】
一態様では、ポリヌクレオチドプローブは、欠失部分が低リスクＨＰＶ型に対して高い配列同一性又は交差反応性を有する、高リスクＨＰＶ核酸に特異的な戦略的に切断されたプローブである。一態様では、戦略的に切断された高リスクＨＰＶプローブは、ＨＰＶ１６型、１８型、２６型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型、６６型、６８型、７３型及び８２型の１つ又は複数に特異的であるか、又はそれとハイブリダイズすることが可能であり、欠失部分が低リスクＨＰＶ１型、２型、３型、４型、５型、６型、８型、１１型、１３型、３０型、３４型、４０型、４２型、４３型、４４型、５３型、６１型、６７型、６９型、７０型、７１型、７２型、７４型、８１型、８３型、８４型及び８９型の１つ又は複数に対して交差反応性又は特異性を示す。別の態様では、プローブの欠失部分は、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は１００％の同一性を有する配列を含む。別の態様では、ポリヌクレオチドプローブは、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３若しくは（or）配列番号１１７、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５又はそれらの相補体に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は１００％の同一性を有する核酸配列である。
【００１２】
別の態様は、本明細書中で開示されるプローブを用いたサンプル中の標的核酸分子の迅速な検出に関する。検出方法は完全に自動化されているか、又は部分的に自動化されている（言い換えると、一部人手による入力を必要とする）、自動化されたものであり得る。
【００１３】
別の態様は、本明細書中で開示されるプローブを用いた、例えば機械又は一連の機械内で同時の又は非常に短い期間での、複数のサンプル中の標的核酸分子の検出に関する。
【００１４】
別の態様は、本明細書中で開示されるプローブを含む、サンプル中の標的核酸分子を検出するためのキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１−１】ＨＰＶ３３に特異的な戦略的に切断されたプローブを生成するために使用することのできる例示的な鋳型の配列を示す図である。下線を引いた文字列は欠失プライマーの結合部位を示す。点線の下線は欠失プライマーの重複部位を示す。小文字の文字列は、切断に選択される配列を示す。鋳型配列は、配列番号５（ベクター配列を含む）及び配列番号１０４（ＨＰＶ配列のみ）に見ることができる。
【図１−２】つづき
【図１−３】つづき
【図１−４】つづき
【図２−１】ＨＰＶ３９に特異的な戦略的に切断されたプローブを生成するために使用することのできる例示的な鋳型の配列を示す図である。下線を引いた文字列は欠失プライマーの結合部位を示す。点線の下線は欠失プライマーの重複部位を示す。小文字の文字列は、切断に選択される配列を示す。鋳型配列は、配列番号７（ベクター配列を含む）及び配列番号１０５（ＨＰＶ配列のみ）に見ることができる。
【図２−２】つづき
【図２−３】つづき
【図３−１】ＨＰＶ５２に特異的な戦略的に切断されたプローブを生成するために使用することのできる例示的な鋳型の配列を示す図である。下線を引いた文字列は欠失プライマーの結合部位を示す。点線の下線は欠失プライマーの重複部位を示す。小文字の文字列は、切断に選択される配列を示す。鋳型配列は、配列番号１０（ベクター配列を含む）及び配列番号１０６（ＨＰＶ配列のみ）に見ることができる。
【図３−２−１】つづき
【図３−２−２】つづき
【図３−３】つづき
【図３−４】つづき
【図４−１】ＨＰＶ５６に特異的な戦略的に切断されたプローブを生成するために使用することのできる例示的な鋳型の配列を示す図である。下線を引いた文字列は欠失プライマーの結合部位を示す。点線の下線は欠失プライマーの重複部位を示す。小文字の文字列は、切断に選択される配列を示す。鋳型配列は、配列番号１１（ベクター配列を含む）及び配列番号１０７（ＨＰＶ配列のみ）に見ることができる。
【図４−２】つづき
【図４−３】つづき
【図５−１】ＨＰＶ５８に特異的な戦略的に切断されたプローブを生成するために使用することのできる例示的な鋳型の配列を示す図である。下線を引いた文字列は欠失プライマーの結合部位を示す。点線の下線は欠失プライマーの重複部位を示す。小文字の文字列は、切断に選択される配列を示す。鋳型配列は、配列番号１２（ベクター配列を含む）及び配列番号１０８（ＨＰＶ配列のみ）に見ることができる。
【図５−２−１】つづき
【図５−２−２】つづき
【図５−３】つづき
【図５−４】つづき
【図６−１】ＨＰＶ６６に特異的な戦略的に切断されたプローブを生成するために使用することのできる例示的な鋳型の配列を示す図である。下線を引いた文字列は欠失プライマーの結合部位を示す。点線の下線は欠失プライマーの重複部位を示す。小文字の文字列は、切断に選択される配列を示す。鋳型配列は、配列番号１４（ベクター配列を含む）及び配列番号１０９（ＨＰＶ配列のみ）に見ることができる。
【図６−２−１】つづき
【図６−２−２】つづき
【図６−３】つづき
【図７−１】ＨＰＶ６８に特異的な戦略的に切断されたプローブを生成するために使用することのできる例示的な鋳型の配列を示す図である。下線を引いた文字列は欠失プライマーの結合部位を示す。点線の下線は欠失プライマーの重複部位を示す。小文字の文字列は、切断に選択される配列を示す。鋳型配列は、配列番号１５（ベクター配列を含む）及び配列番号１１０（ＨＰＶ配列のみ）に見ることができる。
【図７−２】つづき
【図７−３−１】つづき
【図７−３−２】つづき
【図８−１】ＨＰＶ２６（配列番号１１６）に特異的な戦略的に切断されたプローブを生成するために使用することのできる例示的な鋳型の配列を示す図である。下線を引いた文字列は欠失プライマーの結合部位を示す。点線の下線は欠失プライマーの重複部位を示す。小文字の文字列は、切断に選択される配列を示す。
【図８−２】つづき
【図８−３】つづき
【図９−１】ＨＰＶ７３に特異的な戦略的に切断されたプローブを生成するために使用することのできる例示的な鋳型の配列を示す図である。下線を引いた文字列は欠失プライマーの結合部位を示す。点線の下線は欠失プライマーの重複部位を示す。小文字の文字列は、切断に選択される配列を示す。
【図９−２】つづき
【図９−３】つづき
【図９−４】つづき
【図９−５】つづき
【図１０−１】戦略的に切断されたＨＰＶ２６ＸＸプローブの制限酵素地図及びその配列（配列番号１１７）を示す図である。欠失プライマーの結合部位を一重下線によって示し、プライマーの重複部を点線の下線によって示す。プロモーター部位は二重下線を引いた太字のイタリック体の文字列によって示す。網掛けした文字列はプローブ配列を示す。
【図１０−２】つづき
【図１０−３】つづき
【図１０−４】つづき
【図１１−１】戦略的に切断されたＨＰＶ３３Ｘプローブの制限酵素地図及びその配列を示す図である。欠失プライマーの結合部位を一重下線によって示し、プライマーの重複部を点線の下線によって示す。プロモーター部位は二重下線を引いた太字のイタリック体の文字列によって示す。網掛けした文字列はプローブ配列を示す。
【図１１−２】つづき
【図１１−３】つづき
【図１１−４】つづき
【図１１−５】つづき
【図１２−１】戦略的に切断されたＨＰＶ３９ＸＸプローブの制限酵素地図及びその配列を示す図である。欠失プライマーの結合部位を一重下線によって示し、プライマーの重複部を点線の下線によって示す。プロモーター部位は二重下線を引いた太字のイタリック体の文字列によって示す。網掛けした文字列はプローブ配列を示す。
【図１２−２】つづき
【図１２−３】つづき
【図１２−４】つづき
【図１２−５】つづき
【図１３−１】戦略的に切断されたＨＰＶ５２Ｘプローブの制限酵素地図及びその配列を示す図である。欠失プライマーの結合部位を一重下線によって示し、プライマーの重複部を点線の下線によって示す。プロモーター部位は二重下線を引いた太字のイタリック体の文字列によって示す。網掛けした文字列はプローブ配列を示す。
【図１３−２】つづき
【図１３−３】つづき
【図１３−４】つづき
【図１３−５】つづき
【図１４−１】戦略的に切断されたＨＰＶ５６ＸＸプローブの制限酵素地図及びその配列を示す図である。欠失プライマーの結合部位を一重下線によって示し、プライマーの重複部を点線の下線によって示す。プロモーター部位は二重下線を引いた太字のイタリック体の文字列によって示す。網掛けした文字列はプローブ配列を示す。
【図１４−２】つづき
【図１４−３】つづき
【図１４−４】つづき
【図１４−５】つづき
【図１５−１】戦略的に切断されたＨＰＶ５８Ｘプローブの制限酵素地図及びその配列を示す図である。欠失プライマーの結合部位を一重下線によって示し、プライマーの重複部を点線の下線によって示す。プロモーター部位は二重下線を引いた太字のイタリック体の文字列によって示す。網掛けした文字列はプローブ配列を示す
【図１５−２】つづき
【図１５−３】つづき
【図１５−４】つづき
【図１６−１】戦略的に切断されたＨＰＶ６６ＸＸプローブの制限酵素地図及びその配列を示す図である。欠失プライマーの結合部位を一重下線によって示し、プライマーの重複部を点線の下線によって示す。「＊＊＊」が、プライマーｐＨＰＶ６６ＸＦ１（配列番号７６）及びｐＨＰＶ６６ＸＲ１（配列番号７７）が鋳型に結合し得る部位を示すことに留意されたい。プロモーター部位は二重下線を引いた太字のイタリック体の文字列によって示す。網掛けした文字列はプローブ配列を示す。
【図１６−２】つづき
【図１６−３】つづき
【図１６−４】つづき
【図１６−５】つづき
【図１７−１】戦略的に切断されたＨＰＶ６８ＸＸプローブの制限酵素地図及びその配列を示す図である。欠失プライマーの結合部位を一重下線によって示し、プライマーの重複部を点線の下線によって示す。プロモーター部位は二重下線を引いた太字のイタリック体の文字列によって示す。網掛けした文字列はプローブ配列を示す。
【図１７−２】つづき
【図１７−３】つづき
【図１７−４】つづき
【図１７−５】つづき
【図１８−１−１】戦略的に切断されたＨＰＶ７３ＸＸプローブの制限酵素地図及びその配列を示す図である。欠失プライマーの結合部位を一重下線によって示し、プライマーの重複部を点線の下線によって示す。プロモーター部位は二重下線を引いた太字のイタリック体の文字列によって示す。網掛けした文字列はプローブ配列を示す。
【図１８−１−２】つづき
【図１８−２】つづき
【図１８−３】つづき
【図１８−４】つづき
【図１８−５】つづき
【図１９】切断されたＨＲ−ＨＰＶプローブを生成するためのサンプルの概略を示す図である。図１９に示すように、欠失プローブを含むプラスミドを以下の工程に従って生成する：１．標的ＨＰＶ鋳型プラスミドをメチル化する。２．重複尾部を有する２つのプライマー（欠失プライマー）を用いて、標的の欠失を除いてプラスミドを増幅する。３．得られるＰＣＲ産物は、欠失の標的となるセグメントを除いた線状二本鎖ＤＮＡである。４．ＰＣＲプラスミド混合物を野生型大腸菌（E. coli）に形質転換する。宿主細胞は欠失したプラスミドを環状化し、発現されるＭｃｒＢＣヌクレアーゼが元のメチル化標的プラスミドを消化する。これにより、複製された非メチル化切断プラスミドのみが残る。次いで、例えば図３１の例示的な方法によって、切断プラスミドから線状プローブを生成することができる。
【図２０】戦略的に切断されたＨＰＶ２６ＸＸプローブを生成するためのサンプルの概略を実証する図である。１．ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ７４４７２によるＨＰＶ２６配列を保有するメチル化プラスミドを、Ａに記載のプライマー対ｐ２６Ｆ及びｐ２６Ｒ１によって増幅し、単一の戦略的に切断されたプラスミドＨＰＶ２６Ｘを生成し、これを次いでクローニングする。各々のプライマーの結合部位をプラスミドＨＰＶ２６  ｖ２上に示す。２．クローニング後、ＨＰＶ２６Ｘを、プライマー対ｐ２６ＸＦ３及びｐ２６ＸＲ３を用いて増幅し、ＨＰＶ２６ＸＸを生成する。各々のプライマーの結合部位をプラスミドＨＰＶ２６Ｘ上に示す。
【図２１】戦略的に切断されたＨＰＶ２６ＸＸプラスミドの制限酵素地図及びサンプル消化を示す図である。
【図２２】戦略的に切断されたＨＰＶ３３Ｘプラスミドを生成するためのサンプルの概略を実証する図である。
【図２３】戦略的に切断されたＨＰＶ５２Ｘプラスミドを生成するためのサンプルの概略を実証する図である。
【図２４】戦略的に切断されたＨＰＶ５８Ｘプラスミドを生成するためのサンプルの概略を実証する図である。
【図２５】戦略的に切断されたＨＰＶ３９ＸＸプラスミドを生成するためのサンプルの概略を実証する図である。
【図２６】戦略的に切断されたＨＰＶ５６ＸＸプラスミドを生成するためのサンプルの概略を実証する図である。
【図２７】戦略的に切断されたＨＰＶ６６ＸＸプラスミドを生成するためのサンプルの概略を実証する図である。
【図２８】戦略的に切断されたＨＰＶ６８ＸＸプラスミドを生成するためのサンプルの概略を実証する図である。
【図２９】戦略的に切断されたＨＰＶ７３ＸＸプラスミドを生成するためのサンプルの概略を実証する図である。
【図３０】Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  １０．３．０ソフトウェア（Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA）を用いた、高リスクＨＰＶ型と低リスクＨＰＶ型との配列アラインメントの結果を実証する図である。網掛けしたセルは、交差反応の高いリスクを有する配列を示す。約７０％〜１００％の配列同一性を有する配列が、交差反応の高いリスクを有するとみなされる。約７５％〜１００％の配列同一性を有する配列が、交差反応の中程度に高いリスクを有するとみなされる。約８０％〜１００％の配列同一性を有する配列が、交差反応の非常に高いリスクを有するとみなされる。
【図３１】切断プラスミドから線状化プローブを生成する例示的なスキームを実証する図である。均一性を導入するために、各々の鋳型を、プロモーター配列（ｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｃｇａａｔｔｇｇ）（配列番号９６）を有するＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ断片のようにＬ２からＬ１へクローニングする。このようにクローニングすると、全てのＨＰＶ核酸が同じ方向となり、ＲＮＡ転写前に１つの酵素ＸｈｏＩで線状化することができる。Ｔ７ポリメラーゼによってプロモーター配列でＲＮＡ転写が開始し、これはＬ１の末端で終了して、いずれのベクター配列も含まない完全長プローブが作製される。このように生成した各々の線状化ＲＮＡプローブの配列を、配列番号９７〜配列番号１０５に記載する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本開示は、サンプル中の核酸分子の存在を迅速に決定するための方法、組成物、試薬、システム及びキットを含む。方法、組成物、試薬、システム及びキットは、病原菌の検出及び同定、並びに特定の疾患に対する遺伝的素因の検出を含むが、これらに限定されない臨床診断目的で使用することができる。
【００１７】
一態様では、第２のＨＰＶ核酸と実質的に交差反応することなく、第１のＨＰＶ核酸を検出する能力を有する核酸プローブを開示する。
【００１８】
一態様では、上記核酸プローブは、ａ）第１の核酸と約７０％〜１００％の同一性を有する、少なくとも１キロベース長の配列を含む鋳型核酸を準備することと、ｂ）該鋳型核酸の配列を第２の核酸の配列と比較することと、ｃ）第２の核酸の領域と約７０％〜１００％の同一性を有する鋳型核酸の任意の領域を切断することとを含む方法によって生成する。
【００１９】
一態様では、本開示は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１６、配列番号１１７又はそれらの相補体に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は１００％の同一性を有する、少なくとも１キロベース長の配列を含む核酸を提供するが、但し、上記核酸は配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５又はそれらの相補体に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は１００％の同一性を有する任意の配列を含まない。
【００２０】
本開示は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１６、若しくは配列番号１１７又はそれらの相補体に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は１００％の同一性を有する、核酸を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる１つ又は複数のプローブのプローブセットも提供するが、但し、上記核酸は配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５又はそれらの相補体に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は１００％の同一性を有する任意の配列を含まない。
【００２１】
更なる態様では、プローブセットが、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、若しくは配列番号１０３、若しくは配列番号１１７、配列番号１１７又はそれらの相補体に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は１００％の同一性を有する、配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる少なくとも１つの拡散プローブを含む。
【００２２】
一態様では、本開示は、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、若しくは配列番号１１７、配列番号１１７又はそれらの断片若しくは相補体に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は１００％の同一性を有する配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる核酸を提供する。
【００２３】
一態様では、本開示は、サンプル中の標的核酸分子の存在を決定する方法を提供する。この方法は、
ａ）洗剤を含む回収媒体にサンプルを懸濁することと、
ｂ）標的核酸分子を変性させることと、
ｃ）１つ又は複数のポリヌクレオチドプローブを、プローブと標的核酸分子とがハイブリダイズすることにより二本鎖核酸ハイブリッドを形成することを可能にする条件下で、標的核酸分子に接触させることと、
ｄ）二本鎖核酸ハイブリッドを、二本鎖ハイブリッド核酸ハイブリッドに特異的な第１の抗体をコーティングした固体支持体上に捕捉させ、それにより二本鎖核酸ハイブリッド／固体支持体複合体を形成する、二本鎖核酸ハイブリッドを捕捉させることと、
ｅ）二本鎖核酸ハイブリッド／固体支持体複合体を、結合していない核酸から分離することと、
ｆ）複合体に、二本鎖核酸ハイブリッドに特異的であるか、又は第１の抗体に特異的である、検出可能なマーカーで標識した第２の抗体をコンジュゲートし、二本鎖核酸ハイブリッド／固体支持体抗体複合体を形成する、第２の抗体をコンジュゲートすることと、
ｇ）二本鎖核酸ハイブリッド／固体支持体抗体複合体を、洗剤を含む洗浄バッファで洗浄することと、
ｈ）第２の抗体上の標識を検出することであって、検出が標的核酸分子の存在を示す、標識を検出すること、
とを含む。
【００２４】
別の態様では、本開示は、サンプル中の標的核酸分子の存在を決定する方法であって、洗剤を含む回収媒体にサンプルを懸濁することと、標的核酸分子を変性させることと、１つ又は複数のポリヌクレオチドプローブを、プローブと標的核酸分子とがハイブリダイズ又は結合することを可能にする条件下で、標的核酸分子に接触させることと、二本鎖核酸ハイブリッドを、二本鎖ハイブリッド核酸ハイブリッドに特異的な第１の抗体をコーティングした固体支持体上に捕捉させることとを含む、サンプル中の標的核酸分子の存在を決定する方法を提供する。
【００２５】
一態様では、本開示は、サンプル中の標的核酸分子の存在を決定する方法であって、洗剤を含む回収媒体にサンプルを懸濁することと、標的核酸分子を変性させることと、１つ又は複数のポリヌクレオチドプローブを、プローブと標的核酸分子とがハイブリダイズ又は結合することを可能にする条件下で、標的核酸分子に接触させることと、二本鎖核酸ハイブリッドを、二本鎖ハイブリッド核酸ハイブリッドに特異的な第１の抗体をコーティングした固体支持体上に捕捉させることとと、二本鎖核酸ハイブリッド／固体支持体複合体を、結合していない核酸から分離することとを含む、サンプル中の標的核酸分子の存在を決定する方法を提供する。
【００２６】
別の態様では、本開示は、サンプル中の標的核酸分子の存在を決定する方法であって、洗剤を含む回収媒体にサンプルを懸濁することと、標的核酸分子を変性させることと、１つ又は複数のポリヌクレオチドプローブを、プローブと標的核酸分子とがハイブリダイズ又は結合することを可能にする条件下で、標的核酸分子に接触させることと、二本鎖核酸ハイブリッドを、二本鎖ハイブリッド核酸ハイブリッドに特異的な第１の抗体をコーティングした固体支持体上に捕捉させること、それにより二本鎖核酸ハイブリッド／固体支持複合体を形成する、二本鎖核酸ハイブリッドを捕捉することと、二本鎖核酸ハイブリッド／固体支持体複合体を、結合していない核酸から分離することと、複合体に、二本鎖核酸ハイブリッドに特異的であるか、又は第１の抗体に特異的である第２の抗体をコンジュゲートし、二本鎖核酸ハイブリッド／固体支持体抗体複合体を形成する、第２の抗体をコンジュゲートすることとを含む、サンプル中の標的核酸分子の存在を決定する方法を提供する。
【００２７】
別の態様では、本開示は、サンプル中の標的核酸分子の存在を決定する方法であって、洗剤を含む回収媒体にサンプルを懸濁することと、標的核酸分子を変性させることと、１つ又は複数のポリヌクレオチドプローブを、プローブと標的核酸分子とがハイブリダイズ又は結合することを可能にする条件下で、標的核酸分子に接触させることと、二本鎖核酸ハイブリッドを、二本鎖ハイブリッド核酸ハイブリッドに特異的な第１の抗体をコーティングした固体支持体上に捕捉させること、それにより二本鎖核酸ハイブリッド／固体支持複合体を形成する、二本鎖核酸ハイブリッドを捕捉することと、二本鎖核酸ハイブリッド／固体支持体複合体を、結合していない核酸から分離することと、複合体に、二本鎖核酸ハイブリッドに特異的であるか、又は第１の抗体に特異的である第２の抗体をコンジュゲートし、二本鎖核酸ハイブリッド／固体支持体抗体複合体を形成する、第２の抗体をコンジュゲートすることと、二本鎖核酸ハイブリッド／固体支持体抗体複合体を、洗剤を含む洗浄バッファで洗浄することとを含む、サンプル中の標的核酸分子の存在を決定する方法を提供する。
【００２８】
別の態様では、本開示は、サンプル中の標的核酸分子の存在を決定する方法であって、
ａ）洗剤を含む回収媒体にサンプルを懸濁することと、
ｂ）サンプル中の標的核酸分子を変性させることと、
ｃ）少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブを標的核酸分子に接触させることによって、二本鎖核酸ハイブリッドを形成することと、
ｄ）二本鎖核酸ハイブリッドを、第１の抗体を含む支持体上に捕捉させることによって、二本鎖核酸ハイブリッド−支持体複合体を形成することと、
ｅ）二本鎖核酸ハイブリッド−支持体複合体に、検出可能なマーカーで標識した第２の抗体を接触させることによって、二本鎖核酸ハイブリッド−支持体−第２の抗体の複合体を形成することと、
ｆ）二本鎖核酸ハイブリッド−支持体−第２の抗体の複合体を洗浄バッファで洗浄することと、
ｇ）第２の抗体上のマーカーを検出することであって、検出が標的核酸分子の存在を示す、マーカーを検出することと、
を含む、サンプル中の標的核酸分子の存在を決定する方法を提供する。
【００２９】
一態様では、本明細書に記載の方法に使用されるポリヌクレオチドプローブは、戦略的に切断された高リスクＨＰＶプローブである。別の態様では、ポリヌクレオチドプローブは、高リスクＨＰＶプローブであり、欠矢部分は高い配列同一性又は低リスクＨＰＶ型との交差反応を示す。一態様では、高リスクＨＰＶプローブは、ＨＰＶ１６型、１８型、２６型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型、６６型、６８型、７３型及び８２型の１つ又は複数に特異的であるか、又はそれとハイブリダイズすることが可能であり、欠失部分が低リスクＨＰＶ１型、２型、３型、４型、５型、６型、８型、１１型、１３型、３０型、３４型、４０型、４２型、４３型、４４型、５３型、６１型、６７型、６９型、７０型、７１型、７２型、７４型、８１型、８３型、８４型及び８９型の１つ又は複数に対して交差反応性又は特異性を有する。別の態様では、ポリヌクレオチドプローブは、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、若しくは配列番号１０３若しくは配列番号１１７、配列番号１１７又はそれらの断片若しくは相補体に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は１００％の同一性を有する配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。
【００３０】
一態様では、固体支持体は、二本鎖ハイブリッド核酸に免疫特異的な第１の抗体をコーティングするか、又は付着させた改質常磁性ビーズを含む。磁場を用いて、結合していない核酸から二本鎖核酸−磁性ビーズ−抗体複合体を分離することができる。
【００３１】
一態様では、方法はサンプルの前処理工程を含まない。例えば、洗剤ベースの回収媒体によってサンプル調製時間の短縮が可能となり、それにより標的核酸分子の検出の加速がもたらされ得る。サンプルは本開示の方法、アッセイ又は装置によって直接アッセイ法で分析することができる。一例では、本開示のアッセイを用いた評価の前に、サンプルに対する精製工程を行わない。一態様では、本開示の方法、アッセイ又は装置によって粗溶解物を直接分析する。別の態様では、サンプルは標的増幅工程を受けない。
【００３２】
一態様は、本明細書中で提供される方法、キット、アッセイ及び装置を利用することによって、がんを診断する方法に関する。一態様では、ＨＰＶ及びＨＰＶ変異体に関連する核酸分子を同定することによって、子宮頸がんを検出する。別の態様では、本明細書中で提供される方法、キット、アッセイ及び装置を用いて、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）をスクリーニングすることができる。続いて、検出されたがんを本明細書中で提供される方法、キット、アッセイ及び装置によって診断した（beingdiagnosed）後、治療することができる。一態様では、診断されたがんは、子宮頸がん及びその変異型であり得る。
【００３３】
一態様では、本開示は、
（ａ）約０．５％〜約２．０％のＮＰ−４０、約０．１０％〜約０．４０％のデオキシコール酸ナトリウム、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭのＥＤＴＡ、約５０ｍＭ〜約２００ｍＭのＮａＣｌ及び約０．０１％〜約０．１０％のアジ化ナトリウムに懸濁した生物学的サンプルと、
（ｂ）１つ又は複数のポリヌクレオチドプローブと、
を含む組成物を提供する。
【００３４】
一態様では、本開示は、
（ａ）約０．５％〜約２．０％のＮＰ−４０、約０．１０％〜約０．４０％のデオキシコール酸ナトリウム、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭのＥＤＴＡ、約５０ｍＭ〜約２００ｍＭのＮａＣｌ及び約０．０１％〜約０．１０％のアジ化ナトリウムを含む回収媒体に懸濁した生物学的サンプルと、
（ｂ）１つ又は複数のポリヌクレオチドプローブと、
（ｃ）第１の抗体と、
を含む組成物を提供する。
【００３５】
一態様では、本開示は、
（ａ）約０．５％〜約２．０％のＮＰ−４０、約０．１０％〜約０．４０％のデオキシコール酸ナトリウム、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭのＥＤＴＡ、約５０ｍＭ〜約２００ｍＭのＮａＣｌ及び約０．０１％〜約０．１０％のアジ化ナトリウムを含む回収媒体に懸濁した生物学的サンプルと、
（ｂ）１つ又は複数のポリヌクレオチドプローブと、
（ｃ）第１の抗体と、
（ｄ）第２の抗体と、
を含む組成物を提供する。
【００３６】
一態様では、本開示は、
（ａ）約０．５％〜約２．０％のＮＰ−４０、約０．１０％〜約０．４０％のデオキシコール酸ナトリウム、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭのＥＤＴＡ、約５０ｍＭ〜約２００ｍＭのＮａＣｌ及び約０．０１％〜約０．１０％のアジ化ナトリウムを含む回収媒体に懸濁した生物学的サンプルと、
（ｂ）１つ又は複数のポリヌクレオチドプローブと、
（ｃ）第１の抗体をコーティングした支持体と、
（ｄ）第２の抗体と、
を含む組成物を提供する。
【００３７】
一態様では、本開示は、
（ａ）少なくとも１つの洗剤を含む回収媒体に懸濁した生物学的サンプルと、
（ｂ）変性試薬と、
（ｃ）１つ又は複数のポリヌクレオチドプローブと、
（ｄ）第１の抗体をコーティングした支持体と、
（ｅ）検出可能なマーカーで標識した第２の抗体と、
を含む組成物を提供する。
【００３８】
一態様では、本明細書に記載の組成物に使用されるポリヌクレオチドプローブは、戦略的に切断された高リスクＨＰＶプローブである。別の態様では、ポリヌクレオチドプローブは、高リスクＨＰＶプローブであり、欠矢部分は高い配列同一性又は低リスクＨＰＶ型との交差反応を示す。一態様では、高リスクＨＰＶプローブは、ＨＰＶ１６型、１８型、２６型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型、６６型、６８型、７３型及び８２型の１つ又は複数に特異的であるか、又はそれとハイブリダイズすることが可能であり、欠失部分が低リスクＨＰＶ１型、２型、３型、４型、５型、６型、８型、１１型、１３型、３０型、３４型、４０型、４２型、４３型、４４型、５３型、６１型、６７型、６９型、７０型、７１型、７２型、７４型、８１型、８３型、８４型及び８９型の１つ又は複数に対して交差反応性又は特異性を有する。別の態様では、ポリヌクレオチドプローブは、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、若しくは配列番号１０３若しくは配列番号１１７、配列番号１１７又はそれらの断片若しくは相補体に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は１００％の同一性を有する核酸配列である。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、「高リスクＨＰＶ」という語句は、がんを発症するリスクの上昇に関連する、当業者に既知のＨＰＶ型を指す。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、「低リスクＨＰＶ」という語句は、がんを発症するリスクの上昇に関連しない、当業者に既知のＨＰＶ型を指す。
【００４１】
一態様では、上記のいずれの組成物も、本明細書中に記載のいずれの回収媒体とともに使用してもよい。一態様では、上記の組成物中の生物学的サンプルは、子宮頸部細胞サンプル又はヒト子宮頸部細胞サンプルである。別の態様では、生物学的サンプル中の核酸分子を変性させる。上記の組成物中の生物学的サンプルは、回収媒体中で少なくとも２１日間３３℃で貯蔵した場合に安定性を示すことができる。一態様では、検出可能なマーカーで第２の抗体を標識する。
【００４２】
生物学的サンプル
本開示の方法を用いて、生物学的サンプル及び環境サンプルを含む、検体又は培養物（例えば細胞培養物、微生物培養物及びウイルス培養物）を含むが、これらに限定されないサンプルから標的核酸分子の存在を検出することができる。生物学的サンプルはヒトを含む動物由来のもの、流体、固体（例えば糞便）、又は組織、並びに乳製品、野菜、食肉及び食肉副産物等の液体又は固体の食品及び飼料の製品及び原料、並びに廃棄物であり得る。環境サンプルとしては、表層物質、土壌、水及び産業サンプル等の環境物質、並びに食品及び乳製品の加工用の機器、装置、設備、器具、使い捨て及び使い捨てではない（non-disposable）製品から得られるサンプルが挙げられる。
【００４３】
生物学的サンプルとしては、子宮頸部上皮細胞（例えば、子宮頸部スワブから得られるサンプル）、アデノイド細胞、肛門上皮細胞、血液、唾液、脳脊髄液、胸膜液、乳汁、リンパ液、喀痰及び精液を挙げることができるが、これらに限定されない。サンプルは二本鎖核酸分子を含んでいても、又は一本鎖核酸分子を含んでいてもよい。二本鎖核酸分子が存在する場合、例えばアルカリを使用して、プロテイナーゼＫ／ＳＤＳ、カオトロピック塩を使用して、当該技術分野で既知の様々な方法によってハイブリダイゼーション分析のためにこれを調製することができる。ハイブリダイゼーション分析のために二本鎖核酸分子を調製するプロセスは一般に、二本鎖核酸分子を一本鎖核酸分子に変換することを伴う。このプロセスは一般に変性として知られる。しかしながら、例えば三本鎖構築物によって、変性を行うことなく二本鎖核酸分子が検出され得ることも企図される。
【００４４】
サンプルにおける標的核酸分子はＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はＤＮＡ及びＲＮＡの両方であってもよい。標的核酸分子はより大きな核酸分子内に含有されていてもよい。標的核酸分子又は標的核酸分子を含むより大きな核酸分子のいずれの検出も本開示で企図される。
【００４５】
生物学的サンプルは子宮頸部細胞、特にヒト子宮頸部細胞を含み得る。サンプルは、ＤＡＣＲＯＮチップスワブ等の化学的に不活性の回収デバイスを含む、当該技術分野で既知の任意の方法又はデバイスによって回収することができる。綿棒、子宮頸部ブラシ、フロックスワブ（ＤＡＣＲＯＮスワブのような形状であるが、より多くの細胞の回収及び細胞のより容易な放出を可能にするナイロン繊維で作られているスワブ）、子宮頸部ブルーム、ミニブルーム、洗浄液、又はパップスメア試験によく使用される任意の回収デバイスを含むが、これらに限定されない他の許容可能な回収デバイスを使用することができる。
【００４６】
一態様では、方法は、少なくとも３０歳の女性からサンプルを回収することを含む。方法は、パップスメア試験又は同等の試験によって、少なくとも３０歳の女性からサンプルを回収することも含み得る。パップスメア試験又は同等の試験によって回収されるサンプルは、子宮頸部細胞サンプルであり得る。
【００４７】
サンプルを回収した後、サンプルをサンプル管に入れることができる。汚染を防ぐために管を密封することができる。回収デバイス（スワブ、ブラシ等）は、それをサンプル管内に入れた後に動かすことのできる機構を更に含有し得る。一態様では、回収デバイスは、磁石を用いて動かすことのできるインサートを含有する。一態様では、このインサートは金属を含む。別の態様では、このインサートは磁性材料を含む。磁性材料は常磁性、強磁性及び反磁性の材料を含む。回収デバイスをサンプル管内に入れた後に動かすことの利点の一つは、回収デバイスが任意のサンプル抽出デバイス又はサンプル検出デバイスに接触するのを回避することである。サンプル抽出デバイスの例としては、ピペット、自動分注器及びピペットチップが挙げられる。サンプル検出デバイスの例としては、プローブ及びプローブチップが挙げられる。
【００４８】
サンプル管
任意のタイプのサンプル管を使用することができる。汚染を最小限に抑えるためにサンプル管を閉鎖又は密封してもよい。クロージャーは永久的なものであっても、又は取り外し可能なものであってもよい。取り外し可能なクロージャーの例としては、スナップキャップ、スクリューキャップ、ゴム隔膜、ホイル及びフィルムが挙げられる。クロージャーは、穴を開けた場合に再封鎖可能な１つ又は複数の開口又は穿孔を含有し得る。かかる開口又は穿孔を含有するクロージャーの利点の一つは、例えばサンプル抽出デバイス又はサンプル検出デバイスによって穴を開けた場合に、クロージャーが無効にならないことである。サンプル抽出デバイス又はサンプル検出デバイスを取り外すと、クロージャーは再封鎖され、それにより汚染が最小限に抑えられる。
【００４９】
生物学的サンプルの貯蔵
サンプルをサンプル管内に入れた後、基質とともに、若しくは保存媒体中で、又はその両方で乾燥させることによって、サンプルを貯蔵することができる。乾燥保存（Desiccation）は加圧乾燥又は化学物質を用いた乾燥によって達成される。これによって水分の大部分が除去され、長期安定性に好適となる。代替的に、サンプルの安定性を確保するために、サンプルをトレハロース等の基質とともに凍結乾燥（フリーズドライ）してもよい。
【００５０】
別の可能性は、サンプルを当業者に既知であり、明らかな保存媒体に懸濁することによって貯蔵し得ることである。保存媒体の目的は、分解し得る生物学的成分を保護することである。例えば、サンプル細胞、プローブ混合物、捕捉工程に使用される抗体：ビーズ複合体、及び検出工程に使用される二次抗体は全て分解を起こしやすい。回収の初期段階の保存媒体は、サンプルの安定性及び完全性をもたらすことが理想とされ、核酸を捕捉及び検出するプロセスの下流の工程に影響を及ぼし得る。
【００５１】
回収媒体
一態様では、サンプルを回収媒体に回収及び貯蔵することができる。回収媒体は、保存媒体と同様に核酸を保存すること、及び分析前の核酸の分解を防止するためにヌクレアーゼを阻害することを含む幾つかの機能を有する。一態様では、回収媒体は少なくとも１つの洗剤を含有する。別の態様では、回収媒体は少なくとも２つの洗剤、少なくとも３つの洗剤又は少なくとも４つの洗剤を含有する。一態様では、洗剤は各々異なる。別の態様では、洗剤ベースの回収媒体は、バックグラウンドシグナルを制御することが可能な或る洗剤と、磁性ビーズの挙動、例えば粘性サンプル中での移動、回収（すなわち磁性ビーズがサンプルウェルの底部にどの程度集合するか）、及び保持（すなわちサンプルを含有する容器から上清を除去する際に、磁性ビーズがどの程度適所に留まるか）を改善する別の洗剤の２つの異なる洗剤を含む。
【００５２】
一態様では、アッセイのハイブリダイゼーション工程、捕捉工程及び検出工程中に熱を用いる。洗剤及び加熱を用いても、アッセイに使用される抗体は機能的であり続ける。
【００５３】
洗剤ベースの回収媒体は、１つ、２つ、３つ若しくは４つ、又はそれ以上の洗剤を含んでいても、それから本質的になっていても、又はそれからなっていてもよい。洗剤は当該技術分野で既知であり、臭化セチルピリジニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム（総じてセトリモニウム化合物として知られる）、及び塩化アルキルベンジルジメチルアンモニウム（総じてベンザルコニウム化合物として知られる）、及びアルキルトリメチルアンモニウム塩等であるが、これらに限定されない陽イオン性洗剤、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及びサルコシル等であるが、これらに限定されない陰イオン性洗剤、並びにＮＰ−４０等の非変性洗剤、並びに他の洗剤を挙げることができるが、これらに限定されない。ＮＰ−４０は、ノニルフェノキシルポリエトキシルエタノールであるＴｅｒｇｉｔｏｌタイプのＮＰ−４０としても知られる。ＮＰ−４０は核膜を破壊するほど強力ではないが、細胞膜を破壊することができる。そのため、ＮＰ−４０を使用して、細胞培養物の細胞質内容物を得ることができる。
【００５４】
他の洗剤及び洗剤の組合せを使用してもよく、その組合せによって、バックグラウンドノイズを制御する能力、及び磁性ビーズの挙動を改善する能力（用いられる固体支持体が磁性ビーズを含む場合）がもたらされる。或る特定の態様では、一方の洗剤が陰イオン性洗剤であり、第２の洗剤が非陰イオン性洗剤である。例えば一態様では、非イオン性洗剤と陰イオン性洗剤との組合せは、低バックグラウンドノイズを維持するのに役立つ。一態様では、洗剤ベースの回収媒体は、バックグラウンドノイズを制御するデオキシコール酸ナトリウム等の陰イオン性洗剤と、磁性ビーズの挙動を改善し得るＮＰ−４０とを含む。
【００５５】
これら２つのタイプの洗剤の組合せは、２つの洗剤を合わせた単純な組合せに比べて、バックグラウンドノイズの制御、より良好なビーズの挙動、及びアッセイ速度の増加という相乗的な利益をもたらす。（洗剤ベースの回収媒体中の）これらの洗剤の存在は、より迅速なアッセイ結果を達成する能力をもたらすが、下流の分析工程中に核酸又は捕捉抗体に悪影響を及ぼさない。
【００５６】
加えて、洗剤ベースの回収媒体は、サンプルがより容易に溶解するために、回収デバイスからの検体の取り出しを改善する。加えて、洗剤ベースの回収媒体は、ＰＲＥＳＥＲＶＣＹＴ（４０％メタノール溶液を用いる）、ＳＴＭ（カオトロピック剤を用いる）及びアルコール等であるが、これらに限定されない他の回収媒体と比較して、サンプルの均一性を改善する。洗剤ベースの回収媒体はまた、（手動又は自動での）混合後のサンプルの粘度を低下させる。
【００５７】
回収媒体中のＮＰ−４０の濃度は、約０．５％〜約２．０％、約０．１％〜約１．０％の範囲、及び列挙した範囲内の任意の濃度であり得る。或る特定の態様では、ＮＰ−４０は約０．８％〜約１．５％、約０．９％〜約１．２％の濃度で存在し、或る特定の態様では約１．０％である。別の態様では、ＮＰ−４０は約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％又は約２．０％の濃度で存在する。回収媒体中のデオキシコール酸ナトリウムの濃度は、約０．１０％〜約０．４０％、約０．２０％〜約０．３０％の範囲、及び列挙した範囲内の任意の濃度であり得る。一態様では、デオキシコール酸ナトリウムの濃度は、約０．１０％、約０．１５％、約０．２０％、約０．２５％、約０．３０％、約０．３５％又は約０．４０％である。
【００５８】
洗剤ベースの回収媒体はバッファ、２つの洗剤、キレート剤及び防腐剤を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなっていてもよい。バッファは、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭ、約３０ｍＭ〜約６０ｍＭ、約４０ｍＭ〜約５０ｍＭ、及び約４５ｍＭ〜約５５ｍＭ、並びに列挙した範囲内の任意の濃度のＴｒｉｓ−ＨＣｌであり得る。バッファはまた、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ又は約７５ｍＭの濃度のＴｒｉｓ−ＨＣｌであり得る。
【００５９】
任意の防腐剤を使用することができ、その選択は所望の機能性、副作用の最小化、コスト等の因子に依存し得る。好適な防腐剤としては、ゲンタマイシン（gentamicin）、ＰｒｏＣｌｉｎ、ｄｉｍｅｒｓｏｌ及びアジ化ナトリウムが挙げられる。回収媒体中の防腐剤の濃度は、防腐剤のタイプ、その効力、その副作用等の因子に依存する。例えば、アジ化ナトリウムについては、アジ化ナトリウムの濃度は、約０．０１％〜約０．１％、約０．０２５％〜約０．０７５％、及び約０．０４％〜約０．０６％の範囲、並びに列挙した範囲内の任意の濃度であり得る。防腐剤、例えばアジ化ナトリウムは、約０．０１％、約０．０２％、約０．０３％、約０．０４％、０．０５％、約０．０６％、約０．０７％、約０．０８％、約０．０９％又は約０．１０％存在していてもよい。
【００６０】
一態様では、洗剤ベースの回収媒体は、１．０％のＮＰ−４０、０．２５％のデオキシコール酸ナトリウム、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２５ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び０．０９％のアジ化ナトリウムを含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる。別の態様では、洗剤ベースの回収媒体は、約０．５％〜約２．０％のＮＰ−４０、約０．１０％〜約０．４０％のデオキシコール酸ナトリウム、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭのＥＤＴＡ、約５０ｍＭ〜約２００ｍＭのＮａＣｌ、及び約０．０１％〜約０．１０％のアジ化ナトリウムを含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる。他の態様では、洗剤ベースの回収媒体は、約０．８％〜約１．５％のＮＰ−４０、約０．２０％〜約０．４０％のデオキシコール酸ナトリウム、約３０ｍＭ〜約６０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、約２０ｍＭ〜約４０ｍＭのＥＤＴＡ、約１００ｍＭ〜約２００ｍＭのＮａＣｌ、及び約０．０２５％〜約０．０７５％のアジ化ナトリウムを含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる。また別の態様では、洗剤ベースの回収媒体は、約０．９％〜約１．２％のＮＰ−４０、約０．２０％〜約０．３０％のデオキシコール酸ナトリウム、約３０ｍＭ〜約６０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、約２０ｍＭ〜約３０ｍＭのＥＤＴＡ、約１００ｍＭ〜約１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び約０．０４％〜約０．０６％のアジ化ナトリウムを含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる。
【００６１】
一態様では、回収媒体はＮＰ−４０及びＥＤＴＡを含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる。別の態様では、回収媒体はＮＰ−４０、ＥＤＴＡ及びアジ化ナトリウムを含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる。一態様では、回収媒体はデオキシコール酸ナトリウム、ＥＤＴＡ及びアジ化ナトリウムを含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる。一態様では、回収媒体はＮＰ−４０、デオキシコール酸ナトリウム、ＥＤＴＡ及びアジ化ナトリウムを含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる。一態様では、回収媒体はＮＰ−４０、デオキシコール酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ及びアジ化ナトリウムを含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる。
【００６２】
別の態様では、回収媒体は、０．５％〜約２．０％のＮＰ−４０及び１０ｍＭ〜約５０ｍＭのＥＤＴＡを含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる。別の態様では、回収媒体は、０．５％〜約２．０％のＮＰ−４０、１０ｍＭ〜約５０ｍＭのＥＤＴＡ、及び約０．０１％〜約０．１０％のアジ化ナトリウムを含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる。一態様では、回収媒体は、約０．１０％〜約０．４０％のデオキシコール酸ナトリウム、１０ｍＭ〜約５０ｍＭのＥＤＴＡ、及び約０．０１％〜約０．１０％のアジ化ナトリウムを含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる。一態様では、回収媒体は、約０．５％〜約２．０％のＮＰ−４０、約０．１０％〜約０．４０％のデオキシコール酸ナトリウム、１０ｍＭ〜約５０ｍＭのＥＤＴＡ、及び約０．０１％〜約０．１０％のアジ化ナトリウムを含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる。一態様では、回収媒体は、約０．５％〜約２．０％のＮＰ−４０、約０．１０％〜約０．４０％のデオキシコール酸ナトリウム、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭのＥＤＴＡ、及び約０．０１％〜約０．１０％のアジ化ナトリウムを含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる。
【００６３】
一態様では、回収媒体は非カオトロピック媒体である。すなわち、例えば回収媒体はカオトロピック媒体又はカオトロピック塩を含まない。限定されるわけではないが、一態様では、回収媒体は塩酸グアニジン又は尿素を含まない。非カオトロピック（non-chaotropic）回収媒体を使用することの潜在的利点は、カオトロピック媒体又はカオトロピック塩を含む媒体に比べて、より良好なサンプルの再懸濁、より再現性のある試験、及びより均一な試験アリコートである。
【００６４】
洗剤ベースの回収媒体を使用することの利点は、それによりサンプルの安定性が保存されることである。開示のように洗剤ベースの回収媒体中で貯蔵したサンプルは、少なくとも３１日間安定であり、１５℃〜３３℃の温度で保持した場合に、少なくとも２１日間安定である。一態様では、サンプルは、−２０℃の洗剤ベースの回収媒体中で凍結した場合に少なくとも６ヶ月間安定である。別の態様では、子宮頸部細胞サンプルは、少なくとも３１日間、１５℃〜３３℃の温度で保持した場合に少なくとも２１日間、また、−２０℃の洗剤ベースの回収媒体中では少なくとも６ヶ月間安定である。
【００６５】
洗剤ベースの回収媒体はまた、変性剤を含有する回収媒体に比べて、厳しいハイブリダイゼーション条件及び捕捉条件下（例えば６５℃〜７５℃の温度）でのアッセイのパフォーマンスの改善をもたらす。
【００６６】
１つ、２つ、３つ、４つ又はそれ以上の洗剤の存在によってサンプルの粘度を低減することができ、これは磁性ビーズからの液相の除去の助けとなり、サンプルの混合の助けとなる。
【００６７】
一態様では、血液又は剥離子宮頸部細胞検体等のサンプルを、洗剤ベースの回収媒体に回収し、懸濁することができる。サンプルは、ＤＡＣＲＯＮチップスワブ等の化学的に不活性の回収デバイスを用いて回収することができる。ナイロン繊維スワブ等の任意の他の好適なスワブを使用してもよい。分析前の核酸の分解を防止し、サンプルの安定性を維持するために、洗剤ベースの回収媒体中にサンプルを貯蔵することができる。
【００６８】
サンプルを他の既知の回収媒体に回収した後、本明細書中に記載の方法に使用することができる。他の回収媒体の例としては、ＰＲＥＳＥＲＶＣＹＴ、ＳＵＲＥＰＡＴＨ、ＤＩＧＥＮＥ回収媒体（「ＤＣＭ」）及びＳＴＭ（サンプル／検体輸送媒体）が挙げられる。或る特定の回収媒体は核酸に特異的である。例えば、標的核酸がＲＮＡである場合にはＤＣＭは使用されない。これらの媒体の一部に回収されたサンプルは、サンプル中の核酸を検出及び分析する前に処理を必要とし得る。サンプルを処理する様々な方法（サンプルの調製としても知られる）が当該技術分野で既知である。例えば、細胞学的分析のためにＰＲＥＳＥＲＶＣＹＴ等の媒体に回収した子宮頸部細胞サンプルを、洗剤ベースの溶解バッファと合わせ、続いて核酸結合表面を備える磁性ビーズを添加してもよい。加えて、他の既知の一般に入手可能な回収媒体に回収した他の細胞サンプルを、洗剤ベースの溶解バッファと合わせ、続いて核酸結合表面を備える磁性ビーズを添加してもよい。
【００６９】
別の態様では、溶解バッファは、１５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８．０）、０．０９％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム、６％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ  ｘ−１００、３００ｍＭのジエタノールアミン（ｗ／ｖ）を、９．３〜約９．５の最終ｐＨで含む。また別の態様では、溶解バッファは、約１００ｍＭ〜約２００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ約７．５〜約８．５）、約０．０５％（ｗ／ｖ）〜約０．１０％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム、約２．５％（ｖ／ｖ）〜約７．５％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ  ｘ−１００、及び約２００ｍＭ〜約４００ｍＭのジエタノールアミン（ｗ／ｖ）を、９．０〜約１０．０の最終ｐＨで含む。
【００７０】
前処理
一態様では、アッセイはサンプルの前処理調製工程を含まない。別の態様では、洗剤ベースの回収媒体を使用する場合、アッセイはサンプルの前処理調製を含まない。例えば、洗剤ベースの回収媒体が約０．５％〜約２．０％のＮＰ−４０、約０．１０％〜約０．４０％のデオキシコール酸ナトリウム、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭのＥＤＴＡ、約５０ｍＭ〜約２００ｍＭのＮａＣｌ、及び約０．０１％〜約０．１０％のアジ化ナトリウムを含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる場合、サンプルの前処理調製は必要とされない。これらの成分の任意の組合せも企図される。
【００７１】
別の態様では、ＰＲＥＳＥＲＶＣＹＴ又はＳＵＲＥＰＡＴＨを回収媒体として使用する場合、アッセイはサンプルの前処理調製工程を含み得る。前処理は手作業で行なっても、又は自動化されていてもよい。
【００７２】
自動化前処理機械の一例は、液状化検体細胞診（ＬＢＣ）サンプルを含む生物学的サンプルを処理して、抽出されたサンプルの核酸を含有する標準的な９６ウェルプレートとするのに適合させた事前分析システム（ＰＡＳ）機器である。ＰＡＳにおいては、抽出管ユニット（ＥＴＵ）と呼ばれる一連の（a strip of）８本の試験管内で処理する。各々のＥＴＵは９６ウェルプレートの列に対応する。一態様では、システムのスループットは、最初のＥＴＵの完了まで約３５分かかり、後続のＥＴＵが約２分間隔で完了するようなものである。
【００７３】
スループット要件を満たすために、機器はＥＴＵを並行して処理するものであってもよい。各々のＥＴＵは、処理が完了する前に１０個の工程を経る。これらの工程は、同様の工程毎にまとめられ、ステーション記号で識別される６個の処理モジュールが作られる。ＥＴＵは、６軸ロボットによって６個のステーション間を約２分間隔で行き来する。インキュベーション時間のために、一部の工程では、ＥＴＵが約２分よりも長くステーションに留まることが必要とされる。この場合、先入先出プロセスに対応するために、更なる位置がステーションに設けられる。
【００７４】
ＰＡＳは、１）ＥＴＵ輸送機構、２）ＥＴＵ及びＥＴＵグリッパー、３）常磁性ビーズを引き付ける磁気ステーション、並びに４）濃縮された核酸をＥＴＵからプレートへ移動させる分注器ステーション等の幾つかの部品を備えていてもよい。ＰＡＳにおいては、標的核酸分子の存在を決定する方法を行うように設計された機器内での続く分析のために、液状化検体細胞診サンプルから抽出されたＤＮＡの最大１０個の９６ウェルプレートを、５時間足らずで作成することができる。ＰＡＳは、必要とされるサンプルの容量（４ｍＬ）、自動化の制限、及び手動のサンプル変換プロトコルの低いスループットを含む、液状化検体細胞診試験サンプルからＤＮＡを抽出することの現在の課題の一部に対処するように設計されている。
【００７５】
標的核酸分子
標的核酸分子としては、生物学的サンプル及び環境サンプルを含む検体又は培養物（例えば細胞培養物、微生物培養物及びウイルス培養物）中に見られる核酸分子が挙げられるが、これに限定されない。標的核酸分子は、ヒトを含む動物に由来する生物学的サンプル、流体、固体（例えば糞便）又は組織、並びに乳製品、野菜、食肉及び食肉副産物等の液体又は固体の食品及び飼料の製品及び原料、並びに廃棄物中に見られるものであり得る。標的核酸分子は環境サンプル中に見られるものであってもよく、環境サンプルには、表層物質、土壌、水及び産業サンプル等の環境物質、並びに食品及び乳製品の加工用の機器、装置、設備、器具、使い捨て及び使い捨てではない製品から得られるサンプルが挙げられる。
【００７６】
生物学的サンプル中に見られる標的核酸分子としては、子宮頸部サンプル（例えば、子宮頸部スワブから得られるサンプル）又は子宮頸部細胞サンプル、アデノイド細胞、肛門上皮細胞、血液、唾液、脳脊髄液、胸膜液、乳汁、リンパ液、喀痰、尿及び精液中に見られるものが挙げられるが、これに限定されない。標的核酸分子は、他のウイルス（virus）、細菌、抗酸菌又は変形体、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス、ＨＩＶウイルス、Ｈ１Ｎ１ウイルス、クラミジア、淋菌（gonorrhea）、トリコモナス・バギナリス（Trichomonasvaginalis）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、結核菌、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス又はインフルエンザウイルスに由来するものであってもよい。一態様では、標的核酸分子は、子宮頸部サンプル（例えば、子宮頸部スワブから得られるサンプル）又は子宮頸部細胞サンプル、アデノイド細胞、肛門上皮細胞、血液、唾液、脳脊髄液、胸膜液、乳汁、リンパ液、喀痰、尿及び精液、他のウイルス、細菌、抗酸菌又は変形体、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス、ＨＩＶウイルス、Ｈ１Ｎ１ウイルス、クラミジア、淋菌、ナイセリア・ゴノレア（Neisseria gonorrhoeae）（ＧＣ）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydiatrachomatis）（ＣＴ）、トリコモナス・バギナリス、スタフィロコッカス・アウレウス、結核菌、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス又はインフルエンザウイルスのいずれか１つに関連する核酸分子に７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は１００％同一である。
【００７７】
一態様では、標的核酸分子はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に由来し、ＨＰＶの遺伝的変異体に由来するものを含む。変異体としては、多型、突然変異体、誘導体、標的核酸の修飾形態、変形形態等が挙げられる。一態様では、標的核酸はＨＰＶ核酸である。別の態様では、ＨＰＶ核酸は、高リスクＨＰＶ型のＨＰＶ  ＤＮＡである。別の態様では、ＨＰＶ核酸は高リスクＨＰＶ型のＨＰＶ  ＲＮＡである。別の態様では、標的核酸は、高リスクＨＰＶ１６型、１８型、２６型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型、６６型、６８型、７３型及び８２型のいずれか１つ、又は低リスクＨＰＶ１型、２型、３型、４型、５型、６型、８型、１１型、１３型、３０型、３４型、４０型、４２型、４３型、４４型、５３型、６１型、６７型、６９型、７０型、７１型、７２型、７４型、８１型、８３型、８４型及び８９型のいずれか１つに由来するものである。
【００７８】
別の態様では、標的核酸分子は、ＨＰＶ、ＨＰＶの遺伝的変異体、高リスクＨＰＶ型のＨＰＶ  ＤＮＡ、又は高リスクＨＰＶ型のＨＰＶ  ＲＮＡのいずれか１つに関連する核酸分子と７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は１００％同一（identical）である。別の態様では、標的核酸は、高リスクＨＰＶ１６型、１８型、２６型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型、６６型、６８型、７３型及び８２型のいずれか１つ、又は低リスクＨＰＶ１型、２型、３型、４型、５型、６型、８型、１１型、１３型、３０型、３４型、４０型、４２型、４３型、４４型、５３型、６１型、６７型、６９型、７０型、７１型、７２型、７４型、８１型、８３型、８４型及び８９型のいずれか１つに関連する核酸分子と７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は１００％同一である。
【００７９】
先に述べたように、標的核酸分子はＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。標的核酸分子がＤＮＡである場合、プローブは好ましくはＲＮＡであり、標的核酸がＲＮＡである場合、プローブは好ましくはＤＮＡである。しかしながら、ＤＮＡプローブをＤＮＡ標的核酸分子とともに使用することができ、ＲＮＡプローブをＲＮＡ標的核酸分子とともに使用することができる。同様に前述したように、標的核酸分子によって、使用される回収媒体を決定することができる。
【００８０】
変性
上記のようにサンプルを洗剤ベースの回収媒体に回収した後、サンプルを変性試薬で処理して、標的核酸分子をハイブリダイゼーションに利用しやすいものにしてもよい。一態様では、サンプルをアルカリ性溶液で変性させる。溶液のｐＨを約ｐＨ１２、約ｐＨ１３又は約ｐＨ１４にすることができる任意のアルカリを使用することができる。さらに、溶液のｐＨを約ｐＨ１２〜約ｐＨ１３、約ｐＨ１２〜約ｐＨ１４、及び約ｐＨ１３〜約ｐＨ１４の範囲にすることができる任意のアルカリを使用することができる。アルカリの好適な濃度としては、約１．０Ｎ〜約２．０Ｎ、約１．２５Ｎ〜約１．７５Ｎ、及び約１．２５Ｎ〜約１．５Ｎ、及び約１．５Ｎ、並びに列挙した範囲内の任意の濃度が挙げられる。限定されるわけではないが、好適なアルカリとしてはＮａＯＨ及びＫＯＨが挙げられる。
【００８１】
一例では、洗剤ベースの回収媒体に懸濁したサンプルを、約半分の容量の１．７５Ｎ  ＮａＯＨ溶液で処理することができる。例えば、或る特定の態様では、およそ５０μｌアリコートを、洗剤ベースの回収媒体に懸濁したサンプルから取り出し、およそ２５μｌの１．７５Ｎ  ＮａＯＨ溶液を、この５０μｌのアリコートサンプルに添加する。変性試薬で処理したサンプルを、手作業での混合、又は約８００ｒｐｍ、約９００ｒｐｍ、約１０００ｒｐｍ、約６００ｒｐｍ〜約１０００ｒｐｍ、若しくは約６００ｒｐｍ〜１２００ｒｐｍでの機械的振盪によって混合することができる。一態様では、変性試薬の添加後のサンプルのｐＨは約１４であり得る。別の態様では、ｐＨは約ｐＨ１２又はｐＨ１３であり得る。かかる塩基性ｐＨは、検体中の核酸の大部分に切れ目を入れ、変性させる。加えて、アルカリ処理は、ペプチドと核酸との間の相互作用を妨げ、標的核酸の利用可能性を改善し、タンパク質を分解することができる。
【００８２】
タンパク質のアルカリ処理により、検体が効率的にホモジナイズされ、所与のサンプルの分析結果の再現性が確保される。このアルカリ処理は、サンプルの粘度を低減し、動態を増大させ、サンプルをホモジナイズし、サンプルにおける任意の内因性の一本鎖ＲＮＡ核酸、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド又はＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを破壊することによりバックグラウンドを低減させることもできる。またこのアルカリ処理は、サンプルに存在し得るＲＮアーゼ及びＤＮアーゼ等の酵素を不活性化するのを助ける。当業者は、ＲＮＡが標的核酸である場合（ＤＮＡではない（as opposed to））、フェノール抽出及びＴＣＡ／アセトン沈殿、並びにチオシアン酸グアニジン−フェノール−クロロホルム抽出用の試薬を含むが、これらに限定されない異なる試薬が好まれ得ることを理解するであろう。
【００８３】
加熱工程を利用する、例えばサンプルを約９５℃に加熱して、核酸の鎖を分離するといったような他の変性方法を用いることができる。ヘリカーゼ等の酵素を使用することもできる。油はシリコーン油であり得る。一実施形態では、油又は油系物質を加熱前にサンプルに添加する。油は約０．５Ｃｓｔ〜約２０Ｃｓｔ、約１．０Ｃｓｔ〜約１０Ｃｓｔ、又は約２．０Ｃｓｔ〜約５Ｃｓｔの粘度を有し得る。一態様では、容量は約５Ｃｓｔである。一態様では、約１０μｌ〜約４５μｌの上記のシリコーン油を、１ｍＬ以上の回収媒体に添加し、自動化プラットフォーム上で評価する。油を添加することの利点の一つは、サンプルがより均等に加熱されることである。
【００８４】
一態様では、１．５Ｎ〜２．０ＮのＮａＯＨをサンプルに添加し、加熱する。別の態様では、１．７５ＮのＮａＯＨをサンプルに添加し、加熱する。変性試薬を含むサンプルは、約６０℃〜約８０℃に約３０分間、約６５℃〜約７５℃に約３０分間、約６７℃〜約７０℃に約３０分間、若しくは約７０℃に約３０分間、又は列挙した範囲内の任意の温度に加熱することができる。別の態様では、変性試薬を含むサンプルを、約６０℃〜約８０℃に約２０分間〜約４０分間、若しくは約６５℃〜約７５℃に約２０分間〜約４０分間、約６７℃〜約７０℃に約２０分間〜約４０分間、若しくは約７０℃に約３０分間、又は列挙した範囲内の任意の温度に加熱することができる。記載の時間条件及び温度条件の目的は、残りのハイブリダイゼーション、捕捉、洗浄及び検出の工程を行うのに好適な条件に標的核酸を置いたままで、最低限の時間で最大限のサンプルの変性をもたらすことである。したがって、サンプルを変性試薬中、約５分間〜約１２０分間、約１０分間〜約６０分間、約２０分間〜約４０分間、約３０分間、又は列挙した範囲内の任意の時間で加熱することができる。当業者であれば、より低い温度でより長いインキュベーション期間、又はより高い温度でより短いインキュベーション期間によって均衡をとって、本明細書中に記載の条件に同様の効果をもたらすことができることを容易に理解するであろう。
【００８５】
ハイブリダイゼーション及びプローブの結合
核酸を含有するサンプルを変性させた後、１つ又は複数のポリヌクレオチドプローブと、１つ又は複数のポリヌクレオチドプローブがサンプル中の標的核酸とハイブリダイズして、二本鎖核酸ハイブリッドを形成するのに十分な条件下で接触させる。プローブは完全長ＤＮＡ、切断ＤＮＡ若しくは合成ＤＮＡ、又は完全長ＲＮＡ、切断ＲＮＡ若しくは合成ＲＮＡであり得る。標的核酸がＤＮＡであれば、プローブはＲＮＡとすることができ、標的核酸がＲＮＡであれば、プローブはＤＮＡとすることができる。好ましくは、１つ又は複数のポリヌクレオチドプローブを、（塩基性変性試薬を中和する）中和ハイブリダイゼーションバッファとしても働くことができる（塩基性変性試薬を中和する）プローブ希釈剤で希釈する。
【００８６】
ＤＮＡプローブ又はＲＮＡプローブに使用されるプローブ希釈剤は、ＲＮＡの安定性に対してＤＮＡで必要される要件が異なることから、異なり得る。例えば、プローブがＲＮＡである場合、ＮａＯＨがＲＮＡを破壊する可能性があるため、サンプルを初めに中和し、次いでプローブを添加するのが好ましく、又は代替的にはＲＮＡプローブ及び中和剤（プローブ希釈剤）をサンプルに同時に添加することができる。プローブ希釈剤は、プローブを溶解及び希釈するために使用することができ、ハイブリダイゼーションにより好都合な環境をもたらすために、サンプルをおよそ中性のｐＨ、例えば約ｐＨ６〜約ｐＨ９に戻すのにも役立つ。十分な容量のプローブ希釈剤、好ましくは２分の１容量のサンプルを用いて、塩基処理サンプルを中和することができる。
【００８７】
一態様では、プローブ希釈剤はバッファ、ポリアクリル酸、ＮａＯＨ及びアジ化ナトリウムを含む。プローブ希釈剤は酢酸を含んでいてもよい。一態様では、プローブ希釈剤は、２．２ＭのＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸）、２．６％のポリアクリル酸（ＰＡＡ）、０．７ＮのＮａＯＨ及び０．０９％のアジ化ナトリウムを含む。プローブ希釈剤は、約１．２Ｍ〜約２．６ＭのＢＥＳ、約１．５Ｍ〜約２．５ＭのＢＥＳ、約１．７５Ｍ〜約２．２５ＭのＢＥＳ、約２Ｍ〜２．４ＭのＢＥＳ、又は約２．２ＭのＢＥＳ、及び列挙した範囲内の任意の濃度のＢＥＳを含有し得る。一態様では、プローブ希釈剤は、約２％〜約３．０％のＰＡＡ、及び列挙した範囲内の任意の濃度のＰＡＡを含有し得る。別の態様では、ＰＡＡ濃度は約２．２％〜約２．７％である。また別の態様では、ＰＡＡ濃度は約２．６％である。更なる態様では、プローブ希釈剤は、約０．６Ｎ〜約０．８ＮのＮａＯＨ、例えば約０．７ＮのＮａＯＨを含有し得る。ＮａＯＨの濃度は一般に、ＢＥＳの量が増大するにつれて増大する。
【００８８】
プローブ希釈剤は、自動分注法によるその正確な分配を可能とする粘度を有する。言い換えると、プローブ希釈剤の粘度は、所望の容量が正確かつ自動的に分注されるように調整する。粘度が低過ぎると、プローブ希釈剤は安定な液滴を形成することができない。一方、粘度が高過ぎると、プローブ希釈剤の液滴は大きくなり過ぎる。かかる液滴がサンプル管に入ると、（例えば、サンプル管の壁への液飛びによって）サンプル管内に既に存在する内容物の顕著な撹乱を引き起こし得る。
【００８９】
完全長プローブでは、加熱したアルカリ溶液をサンプルに添加し、次いでプローブ希釈剤を室温でサンプルに添加した後、サンプルを再加熱するものとする。かかるプロセスは二次構造が形成されるのを抑えることができる。抗体は二次構造を有する構造体と不可逆的に結合する傾向がある。切断プローブ又は合成プローブ等の不完全長プローブを使用する場合、二次構造の問題が存在しないため、溶液又はサンプルの加熱の必要はないとされる。一態様では、切断プローブ又は合成プローブとともに使用する場合、サンプルは加熱しない。
【００９０】
変性試薬による処理の後、一定量の中和バッファ、一態様では１つ又は複数のプローブが溶解した記載のプローブ希釈剤を、プローブと少なくとも１つの標的核酸とのハイブリダイゼーション又は結合が起こるのに適切な条件下でサンプルに添加することができる。中和バッファは単一緩衝塩を含有し得る。一態様では、中和バッファは単一緩衝塩以外含有しない。ハイブリダイゼーション条件は、サンプルにおいて１つ又は複数のポリヌクレオチドプローブを、存在する場合に対応する相補的な核酸配列とアニーリングして、二本鎖核酸ハイブリッドを形成するのに十分なものである。
【００９１】
本明細書に記載される特定のプローブ及び希釈剤に好適なハイブリダイゼーション条件が利用される。例えば、プローブ及びサンプル核酸を、ハイブリダイゼーション時間、好ましくは少なくとも約５分間〜約３０分間、約５分間〜約２０分間、又は約７分間〜約１５分間、又は約１０分間、及び１つ又は複数のポリヌクレオチドプローブが対応する相補的な核酸配列とアニーリングするのに十分な上述の範囲内のいずれかの時間（number）、インキュベートすることができる。ハイブリダイゼーション条件には、少なくとも約６５℃、約６８．５℃及び約６７℃〜約７０℃、並びに上述の範囲内のいずれかの温度（number）のハイブリダイゼーション温度が含まれ得る。所与の標的核酸及び所与のプローブでは、当業者は、日常的な実験により所望のハイブリダイゼーション条件を容易に決定することができる。当業者は更に、ハイブリダイゼーションの時間と温度とを互いに最適化させなければならないことを理解するであろう。このため、より高いハイブリダイゼーション温度であれば、より短期間でハイブリダイゼーションを行うことができ、その逆もまた同様である。限定するものではないが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、温度の増大、０．５Ｍ超へのイオン条件の増大（例えばＮａＣｌ）、又はＰＡＡの濃度の低減により制御することができる。非限定的な例として、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、高温、例えば少なくとも約６５℃、少なくとも約６８．５℃、約６７℃〜約７０℃、及び約６９℃〜約７０℃の高温でハイブリダイゼーション反応を行うことが含まれ得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、高温、例えば少なくとも約６５℃、少なくとも約６８．５℃、約６７℃〜約７０℃の高温も含まれ得る。
【００９２】
非限定的な態様では、プローブは、ＨＰＶ、ＨＰＶの遺伝的変異体、高リスクＨＰＶ型のＨＰＶ  ＤＮＡ、又は高リスクＨＰＶ型のＨＰＶ  ＲＮＡ、又は高リスクＨＰＶ１６型、１８型、２６型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型、６６型、６８型、７３型及び８２型のいずれか１つ、又は低リスクＨＰＶ１型、２型、３型、４型、５型、６型、８型、１１型、１３型、３０型、３４型、４０型、４２型、４３型、４４型、５３型、６１型、６７型、６９型、７０型、７１型、７２型、７４型、８１型、８３型、８４型及び８９型のいずれか１つに関連する核酸分子と７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は１００％同一な核酸分子とハイブリダイズ又は結合することが可能である。別の態様では、プローブは、ＨＰＶ、ＨＰＶの遺伝的変異体、高リスクＨＰＶ型のＨＰＶ  ＤＮＡ、高リスクＨＰＶ型のＨＰＶ  ＲＮＡ、又は高リスクＨＰＶ１６型、１８型、２６型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型、６６型、６８型、７３型及び８２型のいずれか１つ、又は低リスクＨＰＶ１型、２型、３型、４型、５型、６型、８型、１１型、１３型、３０型、３４型、４０型、４２型、４３型、４４型、５３型、６１型、６７型、６９型、７０型、７１型、７２型、７４型、８１型、８３型、８４型及び８９型のいずれか１つと相補的である。別の態様では、プローブは、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、若しくは配列番号９５、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、若しくは配列番号１０３、若しくは配列番号１１７、又はそれらの相補体と７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は１００％同一な戦略的に切断されたプローブである。
【００９３】
一態様では、サンプルを洗剤ベースの回収媒体に懸濁し、標的核酸を、変性試薬を用いて変性させ、中和バッファに懸濁した核酸プローブとハイブリダイズする。別の態様では、中和バッファは本発明のプローブ希釈剤である。プローブ希釈剤は、２．２Ｍ  ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸）、２．６％ポリアクリル酸、０．７Ｎ  ＮａＯＨ及び０．０９％アジ化ナトリウムを含む。
【００９４】
捕捉
プローブを標的核酸分子とハイブリダイズさせ、二本鎖核酸ハイブリッドを形成した後、二本鎖核酸ハイブリッドに特異的な分子によってハイブリッドを捕捉させる。二本鎖核酸ハイブリッドに特異的な分子としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、タンパク質（ＲＮアーゼ（RNase）Ｈ等であるが、これに限定されない）、核酸（アプタマーを含むが、これに限定されない）、又は配列特異的な核酸が挙げられるが、これらに限定されない。アプタマーは、標的とハイブリダイズし、ハイブリダイズしたアプタマーを増幅して、この選抜プロセスを繰り返すことにより、配列のライブラリーから連続的に選択したランダム配列の短いストレッチである。一態様では、二本鎖核酸ハイブリッドに特異的な分子は、抗ハイブリッド抗体として知られる抗体により捕捉される。
【００９５】
一態様では、第１の抗ハイブリッド抗体を、当該技術分野で標準的な技法を用いて支持体に固定する。好適な支持体への結合の例としては、共有結合若しくは吸着、例えばタンパク質間相互作用、プロテインＧビーズ、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用、カルボキシル基若しくはトシル基等へのＥＤＡＣの結合、又はアフィニティーカラム内での例えば配列特異的な核酸を用いた固体支持体への直接のハイブリダイゼーションが挙げられる。
【００９６】
支持体としては、ビーズ、磁性ビーズ（先に示されるように常磁性ビーズ、反磁性ビーズ、強磁性ビーズ、強磁性ビーズ、反磁性ビーズを含む）、カラム、プレート、ろ紙、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）及びディップスティックが挙げられるが、これらに限定されない。液相の抽出が可能であり、結合抗体と結合していない抗体とを分離する能力があれば、あらゆる支持体を使用することができる。ビーズを固定するのに、磁場を印加する場合、磁性ビーズが、溶液中に残り、液相を抽出又はデカンテーションすることができるという点で特に有用である。小さく、高い表面積を有するビーズ、例えば直径が約１μｍのビーズが好ましい。電荷の切り替え又はシリカ捕捉を利用する（磁場を印加しない）他のビーズを使用することもできる。
【００９７】
固定された抗ハイブリッド抗体が二本鎖核酸ハイブリッドを捕捉するのに十分な時間、ハイブリッドを支持体に付着した抗ハイブリッド抗体とインキュベートする。一態様では、支持体はビーズである。
【００９８】
抗ハイブリッド抗体はモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり得る。一態様では、抗体はモノクローナル抗体である。一態様では、抗体は、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＡＣ）リンカーにより支持体に結び付く。一態様では、支持体はポリスチレンビーズである。一態様では、抗体と結び付いた支持体又はビーズをビーズ希釈バッファで希釈する。ビーズ希釈バッファは、ビーズ上のタンパク質変性を最小限に抑えるのに有用である。ビーズ希釈バッファの一例は、６％カゼイン、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．０５％アジ化ナトリウムを含む。
【００９９】
一態様では、抗ハイブリッド抗体でコーティングされたビーズを、約６７℃〜約７０℃で約３０分間、サンプルとインキュベートする。別の態様では、ビーズ及びサンプルを約６８℃〜約６９℃で約３０分間、インキュベートする。更に別の態様では、ビーズ及びサンプルを約６８．５℃で３０分間インキュベートする。インキュベーション時間は、約５分間〜約６０分間、約１５分間〜約４５分間、約２０分間〜約４０分間、又は上述の範囲内のいずれかの時間の範囲とすることができ、一般的に温度とは反比例関係である。インキュベーション時間、温度及び／又は振盪条件を、所望のように代替的な捕捉動態を達成するように変更することができることが、当業者により理解されるであろう。
【０１００】
上記のような標的核酸／プローブハイブリッドの捕捉の後に、捕捉されていない核酸を洗い流すことにより、残りのサンプルから捕捉されたハイブリッドを分離することができる。
【０１０１】
コンジュゲーション
方法の別の工程は、同様に二本鎖核酸ハイブリッドに特異的な、又は代替的には第１の抗体に特異的な第２の抗体を調製することを含み得る。第２の抗体は直接的又は関接的に検出可能に標識することができ、モノクローナル抗体であっても、又はポリクローナル抗体であってもよい。一態様では、第２の抗体はモノクローナル抗体である。別の態様では、第２の抗体は検出可能なマーカーで直接標識され、モノクローナル抗体である。第２の抗体は、二本鎖核酸ハイブリッドの存在を検出するために使用される。一態様では、第２の抗体は、基質と反応して、検出することのできるシグナルを生じる必要のある標識を有する。第２の抗体は好適なバッファに溶解することができる。一態様では、バッファは１００ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．５ＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２、１．０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２５％のＴｗｅｅｎ  ２０、０．２ｍｇ／ｍｌのＲＮアーゼ  Ａ、４％のヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（シクロデキストリン）、先に論考した３０％のビーズ希釈バッファ、０．０５％のヤギＩｇＧ、０．０９％のアジ化ナトリウムを含む。一態様では、コンジュゲーション反応は室温で行われる。別の態様では、コンジュゲーション反応は約３７℃、約４５℃又は約５０℃で行われる。一態様では、コンジュゲーション反応は約３７℃、約４５℃又は約５０℃、３５℃〜約４０℃、４０℃〜約５０℃で約２０分間〜４０分間行われる。一態様では、コンジュゲーション反応は約３７℃、約４５℃又は約５０℃で約２０分間〜４０分間行われる。別の態様では、コンジュゲーション反応は約４５℃で約３０分間行われる。
【０１０２】
当業者であれば、例えば酵素、放射性分子、蛍光分子、又は金粒子等の金属粒子であるが、これらに限定されない任意の検出可能な標識を使用することができることを理解するであろう。或る特定の態様では、検出可能な標識はアルカリホスファターゼである。標識を抗体にコンジュゲートする方法は既知である。例えば、抗体をジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元して、一価抗体断片を得ることができる。次いで、Ishikawa et al., J. Immunoassay 4:209-237 (1983)及びMeans et al., Chem. 1: 2-12 (1990)の方法（その各々の内容全体が参照により本明細書中に援用される）によって、還元抗体をマレイン化アルカリホスファターゼに直接コンジュゲートすることができ、得られるコンジュゲートをＨＰＬＣによって精製することができる。任意のタイプのサイズ排除クロマトグラフィーを用いてコンジュゲートを精製してもよい。精製の利益の一つは、或るタンパク質と或る抗体とのコンジュゲートを、他のタンパク質対抗体比を有するこれらのコンジュゲートから分離することができることである。
【０１０３】
別の態様では、二本鎖核酸ハイブリッドは、直接標識されない第２の抗ハイブリッド抗体を用いて検出することができる。例えば、第２の抗体は、標識したヤギ抗マウス抗体によって検出されるマウス免疫グロブリンであり得る。
【０１０４】
洗浄
第２の抗体とのコンジュゲーション後、サンプルを塩基性の（based）洗浄バッファで洗浄する。洗浄バッファは１つ若しくは複数の洗剤を含有していても、又は洗剤を含まなくてもよい。洗浄バッファが洗剤を含有する場合、洗剤はイオン性洗剤であっても、又は非イオン性洗剤であってもよい。非イオン性洗剤の一例はＴｒｉｔｏｎ−Ｘである。洗剤は洗浄バッファ中に、約０．０５％〜約１．５％、若しくは約０．０７５％〜約１．０％、若しくは約０．１％〜約０．７５％、若しくは約０．５％、又は列挙した範囲内の任意の濃度で存在し得る。好適な洗浄バッファの一例は、４０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．２）、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００及び０．０５％のアジ化ナトリウムを含む。
【０１０５】
一態様では、洗浄バッファは、約７．５〜約８．５のｐＨで、０．５ｍＭ〜約２．０ｍＭのＴｒｉｓ及び０．０２％〜０．１０％のアジ化ナトリウムを含有する。別の態様では、洗浄バッファは、約７．５〜約８．５のｐＨで、約０．５ｍＭ〜約２．０ｍＭのＴｒｉｓ及び０．０２％〜０．１０％のアジ化ナトリウムを含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる。また別の態様では、洗浄バッファは、約１．０ｍＭのＴｒｉｓ及び約０．０９％のアジ化ナトリウムを含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる。一態様では、洗浄バッファは約７．６〜約８．４のｐＨを有する。
【０１０６】
サンプルは、１回〜１０回、若しくは３回〜７回、若しくは４回〜６回、４回、若しくは５回、又は列挙した範囲内の任意の回数で、洗浄バッファで洗浄することができる。一態様では、サンプルを２つの異なる洗浄バッファで少なくとも４回洗浄する。別の態様では、サンプルを、或るバッファを用いて行う３回の洗浄及び異なるバッファを用いて行う別の洗浄工程によって少なくとも４回洗浄する。サンプルはまた、単一の洗浄バッファ又は複数の洗浄バッファで洗浄することができる。各々の洗浄に同じ洗浄バッファを使用しても、又は異なる洗浄バッファを使用してもよい。例えば、洗剤を含有する洗浄バッファを或る洗浄に使用し、洗剤を含まない洗浄バッファを別の洗浄に使用してもよい。一態様では、洗浄バッファのうち１つがＴｒｉｔｏｎを含まない。
【０１０７】
検出
第２若しくは第３、又はそれ以上の抗体に存在する標識が検出されることにより、標的核酸分子の存在が示される。様々な標識を検出する方法が当該技術分野で既知である。例えば、比色分析、放射能、表面プラズモン共鳴又は化学発光法が、例えばCoutlee et al., J. Clin. Microbiol. 27:1002-1007 (1989)（その内容全体が参照により本明細書中に援用される）によって記載されている。
【０１０８】
例えば、結合したアルカリホスファターゼコンジュゲートを、検出器、例えばＥ／ＬＵＭＩＮＡ照度計（Source Scientific Systems, Inc.，Garden Grove，CA）、ＯＰＴＯＣＯＭＰ  Ｉ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（MGM Instruments，Hamden，CT）等、例えばTurnerBiosystems製のＶｅｒｉｔａｓ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを用いて、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ  ５３０試薬（Lumigen，Detroit，MI）又はＤＲ２（Applied Biosystems，Foster City，CA）等の試薬による化学発光によって検出することができる。一態様では、コンジュゲートを検出するために蛍光光度計を使用してもよい。多重検出法を順に又は並行して使用してもよい。例えば、コンジュゲートは化学発光及び蛍光によって検出することができる。別の態様では、コンジュゲートは化学発光によって検出することができる。
【０１０９】
異なるコンジュゲート検出法を用いた検出器を、サンプル中の標的核酸分子の存在を決定する方法を行うことが可能な機械に、例えばモジュール方式で可逆的に（reversibly）又は不可逆的に取り付けてもよい。
【０１１０】
本明細書中に記載されるように、第２の抗体上の標識の検出は、サンプル中の１つ又は複数のプローブに相補的な標的核酸分子の１つ又は複数の存在を示す。洗浄の後、サンプルを、例えば第２の抗体上の標識の基質を含有する検出バッファに懸濁する。
【０１１１】
一態様では、サンプルは子宮頸部細胞を含む。子宮頸部細胞のサンプル中の標的核酸分子の存在を決定する方法は、サンプルを洗剤ベースの回収媒体に懸濁することと、手作業での混合によって混合することとを含む。別の態様では、混合は機械によるものである。およそ５０μｌアリコートのサンプルを取り出し、約２５μｌの変性試薬と混合する。サンプルを手作業での混合又は機械的振盪によって、約６００ｒｐｍ〜約１２００ｒｐｍで約３０秒間〜約６０秒間混合し、約７０℃で約３０分間加熱する。高リスクＨＰＶ  ＲＮＡプローブを希釈剤中で調製し、約３７５ｎｇ／ｍｌに希釈する。約４０μｌの希釈したプローブを、７０℃の加熱ブロック上のサンプルに添加する。サンプルを約１１５０ｒｐｍで約３０分間振盪しながら、およそ６８．５℃で更にインキュベートする。上清は、ドロッパーボトル又は他のローテクデバイスによって除去することができる。約３５μｌの検出試薬をサンプルに添加する。検出試薬は標識された第２の抗体を含有する。第２の抗体は二本鎖核酸ハイブリッドに特異的である。検出試薬を含有するサンプルを、約４５℃で約３０分間インキュベートし、約３０秒間〜３分間磁気ラック上に置き、上清をデカンテーションする。別の態様では、検出試薬を含有するサンプルを室温でインキュベートする。次いで、サンプルを洗浄バッファで約４回又は５回洗浄する。
【０１１２】
抗ハイブリッド抗体
本発明に従って形成した二本鎖核酸ハイブリッドを捕捉させ、二本鎖核酸ハイブリッドに特異的な抗体を用いて検出することができる。抗体は、ＲＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡ及びその模倣物等であるが、これらに限定されない二本鎖ハイブリッドに特異的であり、ここで模倣物とは、ＲＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡ又はＲＮＡ−ＲＮＡのハイブリッドと同様に振る舞う分子を指す。利用される抗二本鎖核酸ハイブリッド抗体、すなわち抗ハイブリッド抗体は、形成される二本鎖核酸ハイブリッドのタイプによって異なる。一態様では、抗ハイブリッド抗体はＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに免疫特異的である。
【０１１３】
当業者であれば、ポリクローナル又はモノクローナルの抗ハイブリッド抗体を、下記に記載されるように本発明のアッセイにおいて使用し、及び／又はビーズに連結し、及び／又は支持体に固定することができることを理解するであろう。標準的な技法を用いて調製したモノクローナル抗体を、ポリクローナル抗体の代わりに使用することができる。モノクローナル抗体は、当該技術分野で標準的な方法によって作製することができる。一態様では、標的核酸の捕捉及び検出に使用される抗体はモノクローナル抗体である。一態様では、モノクローナル抗体は、捕捉工程における高ストリンジェンシーのインキュベーション温度を支持する。限定されるわけではないが、捕捉工程における高ストリンジェンシーのインキュベーション温度は、約６５℃〜約７５℃又は約６８℃〜約７５℃であり得る。第１及び第２の抗体は、捕捉及び検出について同じであっても（すなわち、同じハイブリッド骨髄腫細胞株によって産生される）、又は異なっており、異なるハイブリッド骨髄腫細胞株によって産生されたものであってもよい。一態様では、捕捉及び／又は検出に使用される第１及び第２のモノクローナル抗体は同じであり、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに特異的である。抗体の結合領域を含有する、二本鎖ハイブリッドに特異的な抗体の免疫断片又は誘導体も含まれる。
【０１１４】
例えば、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドで免疫化した脾臓細胞と融合させた骨髄腫細胞から誘導された、モノクローナル抗ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド抗体を使用することができる。ハイブリッド特異的抗体は、例えばKitawaga et al., Mol. Immunology, 19:413 (1982)及び米国特許第４，７３２，８４７号（その各々の内容全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されるように、固体支持体に固定したＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに対するアフィニティー精製によって精製することができる。
【０１１５】
例えば組換え抗体（例えば一本鎖Ｆｖ若しくはＦａｂ、又はそれらの他の断片）をライブラリから選択する方法、又はヒト抗体レパートリーを産生することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）の免疫化に基づく方法（例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)、Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993)、並びに米国特許第５，５４５，８０６号及び米国特許第５，５４５，８０７号（その各々の内容全体が参照により本明細書中に援用される）を参照されたい）を含むヒト抗体又は人工抗体を含む抗体を作製又は単離する他の好適な方法を使用することができる。
【０１１６】
一態様では、検出対象の標的核酸はＤＮＡ（例えば、ＨＰＶのゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、核ＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、ヘテロ核ＲＮＡ）であり、１つ又は複数のポリヌクレオチドプローブは、それぞれポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドである。好ましい態様では、二本鎖核酸ハイブリッドは、標的ＤＮＡとプローブＲＮＡとのハイブリダイゼーションによって形成されたＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであり、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに免疫特異的な抗体を用いて検出することができる。
【０１１７】
本発明の一態様では、ハイブリドーマ細胞株から誘導されたモノクローナル抗ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド抗体が使用される。かかるハイブリドーマ細胞株は、米国特許第４，８６５，９８０号、米国特許第４，７３２，８４７号及び米国特許第４，７４３，５３５号（その各々の内容全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されている。ハイブリッド特異的モノクローナル抗体は、当該技術分野で標準的な技法を用いて調製することができる。ハイブリッド特異的モノクローナル抗体は、標的核酸の捕捉及び検出の両方に使用することができる。
【０１１８】
任意の脊椎動物を、ポリクローナル抗ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド抗体の調製に用いることができるが、ヤギ又はウサギが好ましい。好ましくは、従来の注射手順に従ってハイブリッドを動物に注射することによって、ヤギ又はウサギを合成ポリ（Ａ）−ポリ（ｄＴ）ハイブリッドで免疫化する。既知の抗体単離法に従って、免疫化した動物の種に特異的な抗体を含む動物の血液からポリクローナル抗体を回収し、精製することができる。モノクローナル抗体の作製については、十分な時間経過の後、動物から脾臓を取り出し、脾細胞を適切な骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマを作製することができる。次いで、ハイブリドーマを、抗ハイブリッド抗体を分泌する能力についてスクリーニングすることができる。次いで、選択したハイブリドーマを、腹水の産生のために第２の動物の腹腔内への注射に使用してもよく、腹水を抽出し、参照により本明細書中に援用される所望のモノクローナル抗体の濃縮供給源として使用することができる。
【０１１９】
ポリヌクレオチドプローブ
ポリヌクレオチドプローブは、標的核酸分子とハイブリダイズ又は結合するように設計される。別の態様では、ポリヌクレオチドプローブは標的核酸分子に結合するように設計される。一態様では、プローブは、ＨＰＶ及びＨＰＶ高リスク変異体とハイブリダイズ又は結合することが可能である。更なる態様では、ポリヌクレオチドプローブはＨＰＶ及びＨＰＶ高リスク変異体に特異的である。高リスク（ＨＲ）核酸プローブは、高リスクＨＰＶ１６型、１８型、２６型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型、６６型、６８型、７３型及び８２型のプローブを含み得る。別の態様では、高リスク核酸プローブは、高リスクＨＰＶ１６型、１８型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型、６６型、６８型及び８２型のプローブを含み得る。他の態様では、ＲＮＡプローブ又はＤＮＡプローブは断片である。一態様では、プローブは長さ約６キロベース〜約８キロベース、約７．５キロベースであり、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴベクターを用いたプラスミド鋳型を用いて作製することができる。しかしながら、他のプラスミド、ベクター及び方法が当該技術分野で既知であり、同様に本明細書中に記載のＲＮＡプローブを作製するために使用することができる。
【０１２０】
プローブの量は、アッセイ毎に１つのＨＰＶ型当たり約７．５ｎｇ〜約６０ｎｇ、若しくはアッセイ毎に１つのＨＰＶ型当たり約２０ｎｇ〜約４５ｎｇと異なっていてもよく、又はアッセイ毎に各ＨＰＶ型のプローブ約３０ｎｇが使用される。このため、一態様では、ＨＲプローブは高リスクＨＰＶ１６型、１８型、２６型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型、６６型、６８型、７３型及び８２型、又は低リスクＨＰＶ１型、２型、３型、４型、５型、６型、８型、１１型、１３型、３０型、３４型、４０型、４２型、４３型、４４型、５３型、６１型、６７型、６９型、７０型、７１型、７２型、７４型、８１型、８３型、８４型及び８９型の１つ又は複数のプローブからなるか、又はそれから本質的になり、各プローブ約３０ｎｇが標的核酸分子の検出のためのアッセイ毎に使用される。
【０１２１】
別の態様では、核酸分子の組合せ又はセットが標的とされる。例えば、標的核酸分子のセットは高リスクＨＰＶ１６型、１８型及び４５型を含み得る。一態様では、標的とされる核酸分子のセットは、高リスクＨＰＶ１６型、１８型及び４５型のみを含む。さらに、標的核酸分子のセットは、高リスクＨＰＶ１６型、１８型及び４５型とハイブリダイズするか、又はそれらに特異的なポリヌクレオチドプローブを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、本明細書中で開示される方法のいずれにも使用することができる。
【０１２２】
ＲＮＡプローブは、標的核酸分子のみに特異的に結合する短い合成ＲＮＡプローブであってもよい。２００９年４月１７日付けで出願された米国特許出願公開第１２／４２６，０７６号（その内容全体が参照により本明細書中に援用される）に例が記載されている。
【０１２３】
或る特定の態様では、所望の標的核酸の混合物のいずれか１つを同時にスクリーニングするために、複数セットのプローブを含むプローブ混合物が使用される。例えば、生物学的サンプルを任意のＨＲ  ＨＰＶ型の存在についてスクリーニングすることが望ましい場合がある。かかる状況では、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、又は配列番号９５、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、又は配列番号１０３、又は配列番号１１７、配列番号１１７と７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は１００％同一なプローブセットが使用され得る。例えば、プローブ混合物を、全てのＨＲ  ＨＰＶについてプローブセットを提供するように設計することができ、１回の試験を行うことによって、サンプルが任意のＨＲ  ＨＰＶ標的核酸を有するか否かを同定することができる。
【０１２４】
戦略的に切断されたプローブ
一態様では、戦略的に切断されたプローブは、高リスクＨＰＶ型とハイブリダイズする、結合することが可能であるか、又はそれに特異的である。別の態様では、戦略的に切断されたプローブは、高リスクＨＰＶ型とハイブリダイズする、結合することが可能であるか、又はそれに特異的であり、欠失部分は低リスクＨＰＶ型に対して高い配列同一性又は交差反応性を示す。別の態様では、戦略的に切断されたプローブは、ＬＲ型との同一性が最も高い傾向がある、ＨＰＶ配列のＥ１位置及びＥ２位置の両方で切断されたものである（図１〜図９を参照されたい）。戦略的に切断されたプローブは、低リスク型と高い配列同一性を示すＨＰＶゲノムの領域において、プラスミドのＥ１位置、Ｅ２位置及びＬ１位置で切断されていても（図１、図４、図７〜図８を参照されたい）、又はプラスミドのＥ１位置、Ｅ２位置及びＬ２位置で切断されていてもよい（図９を参照されたい）。
【０１２５】
更なる態様では、１つ（Ｘ）又は２つ（ＸＸ）の欠失中の欠失配列の総量は、およそ１．４Ｋｂ〜２．４Ｋｂの範囲である。別の態様では、欠失は約１００塩基対〜約２００塩基対、約１５０塩基対〜約３００塩基対、約２００塩基対〜約５００塩基対、約５００塩基対〜約１０００塩基対、約１２００塩基対〜約１５００塩基対、又は約１０００塩基対〜約２０００塩基対である。別の態様では、第１の欠失は約１５０塩基対〜約３００塩基対、又は約２００塩基対〜約５００塩基対であり、第２の欠失は約１２００塩基対〜約１５００塩基対、又は約１０００塩基対〜約２０００塩基対である。別の態様では、欠失部分は低リスクＨＰＶ型、例えば低リスクＨＰＶ１型、２型、３型、４型、５型、６型、８型、１１型、１３型、３０型、３４型、４０型、４２型、４３型、４４型、５３型、６１型、６７型、６９型、７０型、７１型、７２型、７４型、８１型、８３型、８４型及び８９型に対して高い配列同一性、交差反応性を示すか、又はそれとハイブリダイズする。
【０１２６】
別の態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１１６、又は配列番号１１７と約７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は１００％同一な戦略的に切断されたプローブである。一態様では、戦略的に切断されたプローブは、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１１６又は配列番号１１７の連続塩基対長が約１００塩基対〜約２００塩基対、約１５０塩基対〜約３００塩基対、約２００塩基対〜約５００塩基対、約５００塩基対〜約１０００塩基対、約１２００塩基対〜約１５００塩基対、又は約１０００塩基対〜約２０００塩基対の断片である。
【０１２７】
一態様では、１つ又は複数のポリヌクレオチドプローブは、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、若しくは配列番号１０３、若しくは配列番号１１６若しくは配列番号１１７に対して少なくとも約７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は１００％の同一性を有する１つ又は複数のプローブのプローブセットである。本開示は、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上又は５つ以上の本明細書中に記載のプローブを含むプローブセットも提供する。
【０１２８】
一態様では、戦略的に切断されたプローブは、低リスクＨＰＶ型との交差反応、ハイブリダイゼーション又は結合を低減することが可能である。別の態様では、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２又は配列番号１０３の１つ又は（or）複数の戦略的に切断されたプローブは、１つ又は複数の低リスクＨＰＶ１型、２型、３型、４型、５型、６型、８型、１１型、１３型、３０型、３４型、４０型、４２型、４３型、４４型、５３型、６１型、６７型、６９型、７０型、７１型、７２型、７４型、８１型、８３型、８４型及び８９型との交差反応性を低減することが可能である。
【０１２９】
一態様では、本開示は、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、若しくは配列番号１０３若しくは配列番号１１７又はそれらの断片若しくは相補体に対して約５０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は１００％同一性である単離ポリヌクレオチドを提供する。
【０１３０】
一態様では、本開示は、配列番号８７又は配列番号９７（２６ＸＸ）、それらの断片又は相補体と５０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は１００％同一な配列を含む、ＨＰＶ２６とハイブリダイズするか、又は特異的に結合することが可能な単離ポリヌクレオチド；配列番号８８又は配列番号９８（３３Ｘ）、それらの断片又は相補体と少なくとも５０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は１００％同一な配列を含む、ＨＰＶ３３とハイブリダイズするか、又は特異的に結合することが可能な単離ポリヌクレオチド；配列番号８９又は配列番号９９（３９ＸＸ）、それらの断片又は相補体と少なくとも５０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は１００％同一な配列を含む、ＨＰＶ３９とハイブリダイズするか、又は特異的に結合することが可能な単離ポリヌクレオチド；配列番号９０又は配列番号１００（５２Ｘ）、それらの断片又は相補体と５０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は１００％同一な配列を含む、ＨＰＶ５２とハイブリダイズするか、又は特異的に結合することが可能な単離ポリヌクレオチド；配列番号９１又は配列番号１０１（５６ＸＸ）、それらの断片又は相補体と５０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は１００％同一な配列を含む、ＨＰＶ５６とハイブリダイズするか、又は特異的に結合することが可能な単離ポリヌクレオチド；配列番号９２又は配列番号１０２（５８Ｘ）、それらの断片又は相補体と５０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は１００％同一な配列を含む、ＨＰＶ５８とハイブリダイズするか、又は特異的に結合することが可能な単離ポリヌクレオチド；配列番号９３又は配列番号１０３（６６ＸＸ）、それらの断片又は相補体と５０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は１００％同一な配列を含む、ＨＰＶ６６とハイブリダイズするか、又は特異的に結合することが可能な単離ポリヌクレオチド；配列番号９４又は配列番号１０４（６８ＸＸ）、それらの断片又は相補体と５０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は１００％同一な配列を含む、ＨＰＶ６８とハイブリダイズするか、又は特異的に結合することが可能な単離ポリヌクレオチド；及び配列番号９５又は配列番号１０５（７３ＸＸ）、それらの断片又は相補体と５０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は１００％同一な配列を含む、ＨＰＶ７３とハイブリダイズするか、又は特異的に結合することが可能な単離ポリヌクレオチドを提供する。
【０１３１】
別の態様では、低リスクＨＰＶ配列に対して交差反応性又は特異性を示す高リスクＨＰＶ配列を標的欠失のために同定する。交差反応性は、任意の既知の配列同定データベース、例えば本明細書中に記載のバイオインフォマティクスツールのいずれかを用いた配列アラインメントによる同一度（percent identity）によって予測することができる。一態様では、低リスクＨＰＶ配列に対して交差反応性又は同一性を示す高リスクＨＰＶ配列を、標的欠失のために同定した後、低リスクＨＰＶ配列に対して交差反応性又は同一性を示す配列部分を除去する。第１の欠失後も顕著な交差反応性が存在する場合に、第２、第３、第４、第５又はそれ以上の欠失を行なってもよい。別の態様では、InvitrogenのＧｅｎｅＴａｉｌｏｒ（商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて欠失を開始する。
【０１３２】
バイオインフォマティクスツールを用いて、１つ又は複数のポリヌクレオチドプローブを決定することができる。例えば、特異的なオリゴヌクレオチドを設計するソフトウェアプログラムであるＯｌｉｇｏａｒｒａｙ  ２．０を利用することができる。Ｏｌｉｇｏａｒｒａｙ  ２．０は、Rouillard et al., Nucleic Acids Research, 31: 3057-3062 (2003)（参照により本明細書中に援用される）によって記載されている。Ｏｌｉｇｏａｒｒａｙ  ２．０は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）及びＭｆｏｌｄ（Genetics Computer Group，Madison，WI）の機能性を兼ね備えたプログラムである。Karlin and Altschulによる統計的マッチング理論（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264 (1990)、Proc.Natl. Acad. Sci. USA 90:5873 (1993)）を実行するＢＬＡＳＴは、所与のクエリ配列にマッチするヌクレオチド配列を迅速に検出するために広く使用されているプログラムである。当業者であれば、例えば高リスク及び低リスクのＨＰＶ１型、２型、３型、４型、５型、６型、８型、１１型、１３型、１６型、２６型、３０型、３１型、３３型、３４型、３５型、３９型、４０型、４２型、４３型、４４型、４５型、５１型、５２型、５３型、５４型、５６型、５８型、５９型、６１型、６２型、６６型、６７型、６８型、６９型、７０型、７１型、７２型、７３型、７４型、８１型、８２型、８３型、８４型及び８９型に対して照合される配列のデータベースを準備することができる。次いで、関心の標的配列、例えばＨＰＶ１８を、そのデータベースに対するＢＬＡＳＴにかけ、同一性の任意の領域を検索する。次いで、融解温度（Ｔｍ）及び％ＧＣを特定の長さの１つ又は複数のポリヌクレオチドプローブについて計算し、パラメータと比較することができる、その後二次構造を検査することもできる。関心の全てのパラメータが満足された後、交差ハイブリダイゼーションを、ＢＬＡＳＴによって決定された類似性を用いて、Ｍｆｏｌｄパッケージによって照合することができる。様々なプログラムを適合させて、所望の特異性要件を満たす１つ又は複数のポリヌクレオチドプローブを決定することができる。例えば、プログラムのパラメータは、２５ｎｔの長さ、５５℃〜９５℃のＴｍ範囲、３５％〜６５％のＧＣ範囲であり、５５℃以下で二次構造又は交差ハイブリダイゼーションを有しないポリヌクレオチドが作製されるように設定することができる。
【０１３３】
交差反応性
本発明は、ＨＰＶ  ＨＲプローブセットと低リスクＨＰＶ型との間の交差反応性が、ＦＤＡに認可された標準的なＨＰＶのアッセイ及びプローブセットと比較して劇的に低減したアッセイ組成物、プローブ及び条件も提供する。一態様では、ＨＰＶ  ＨＲプローブセットは、高リスクＨＰＶ１６型、１８型、２６型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型、６６型、６８型、７３型及び８２型、又は低リスクＨＰＶ１型、２型、３型、４型、５型、６型、８型、１１型、１３型、３０型、３４型、４０型、４２型、４３型、４４型、５３型、６１型、６７型、６９型、７０型、７１型、７２型、７４型、８１型、８３型、８４型及び８９型からなる群から選択される。本発明のアッセイをこれらのＨＲ  ＨＰＶプローブと用いると、低リスクＨＰＶ型と高リスクＨＰＶプローブとの間の交差反応性が低減する。例えば、米国特許出願公開第１２／４２６，０７６号を参照されたい。
【０１３４】
本発明は、サンプル中のＨＰＶ等の標的核酸分子の存在を、上記で論考した方法を用いて、少なくとも１０個のサンプルについて約２時間以内、約２．５時間以内、約３時間以内、約３．５時間以内、約４時間以内、約５時間以内、約６時間以内、約７時間以内、約８時間以内、約１２時間以内、約２４時間以内、他の態様では約３．５時間未満で決定する方法も提供する。ＨＰＶ又は他の標的核酸分子の存在を短時間で決定することができる理由の一つは、この方法では標的核酸分子を検出前に増幅しないことである。標的増幅の代わりに、シグナル増幅を、ＨＰＶ又は他の標的核酸分子の存在を正確に検出するために使用することができる。一態様では、本開示の方法はシグナル増幅工程を含み得る。一態様では、本開示の方法は標的増幅工程を含まない。別の態様では、本開示の方法はシグナル増幅工程を含むが、標的増幅工程を含まないものであり得る。
【０１３５】
本開示は、サンプル中のＨＰＶ等の標的核酸分子の存在を、上記で論考した方法及びアッセイを用いて、少なくとも１０個のサンプルについて約２時間以内、約２．５時間以内、約３時間以内、約３．５時間以内、約４時間以内、約５時間以内、約６時間以内、約７時間以内、約８時間以内、約１２時間以内、約２４時間以内、他の態様では約３．５時間未満で検出することによって、がん、例えば子宮頸がんを検出する方法及びアッセイも提供する。
【０１３６】
当業者であれば、本発明を管、ディップスティック、マイクロアレイ、マイクロプレート、３８４ウェルプレート、他のマイクロタイタープレート及びマイクロ流体システムを含むが、これらに限定されない多数のプラットフォーム上で行うことができることを理解するであろう。当業者であれば、本発明の方法を自動化することができることを理解するであろう。
【０１３７】
本発明の別の態様は、標的核酸を含有するサンプルを回収する回収媒体を提供する。回収媒体は数日間、数週間又は数ヶ月間のサンプル安定性をもたらす。例えば、回収媒体は、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、約１週間〜約４週間、約１ヶ月間〜約３ヶ月間、約３ヶ月間〜約４ヶ月間、又は約３ヶ月間〜６ヶ月間のサンプル安定性をもたらすことができる。別の態様では、回収媒体は、３３℃で少なくとも２１日間、又は２０℃で少なくとも６ヶ月間のサンプル安定性をもたらす。一態様では、上記のサンプルは、子宮頸部細胞サンプル又はヒト子宮頸部細胞サンプルである。好適な回収媒体は本明細書中に記載される。一態様では、回収媒体はＮＰ−４０、デオキシコール酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ及びアジ化ナトリウムを含むか、それらからなるか、又はそれらから本質的になる。他の態様では、回収媒体は１．０％のＮＰ−４０、０．２５％のデオキシコール酸ナトリウム、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２５ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．０９％のアジ化ナトリウムを含むか、それらからなるか、又はそれらから本質的になる。
【０１３８】
別の態様は、４０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．２）、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％〜０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、及び０．０９％のアジ化ナトリウムを含むか、それらからなるか、又はそれらから本質的になる、洗剤を含有する洗浄バッファである。また別の態様は、４０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．２）、１００ｍＭのＮａＣｌ、及び０．０９％のアジ化ナトリウムを含むか、それらからなるか、又はそれらから本質的になる、洗剤を含まない洗浄バッファである。
【０１３９】
ハイスループットアッセイ
一態様は、本明細書中に記載の方法又は組成物のいずれかを用いて実行することが可能なハイスループットアッセイ及び装置に関する。ハイスループットアッセイは、多数のサンプルを短期間で正確かつ迅速に処理することが可能である。
【０１４０】
一態様では、ハイスループットアッセイは、少なくとも３００個のサンプルを３時間未満で、９００個のサンプルを約５時間で、少なくとも１０００個のサンプルを約６時間で、又は少なくとも１５００個のサンプルを約８時間で処理することが可能である。別の態様では、ハイスループットアッセイは、少なくとも１０個のマイクロタイタープレート（例えば９６ウェルプレート）を約５時間で、少なくとも１５個のマイクロタイタープレート（例えば９６ウェルプレート）を約７時間で、又は少なくとも２０個のマイクロタイタープレート（例えば９６ウェルプレート）を約８時間で処理することが可能である。一態様では、サンプルの処理は、方法又はアッセイの初めから完了まで行われる。
【０１４１】
キット
サンプル中の標的核酸分子の検出のためのキットであって、
ａ）回収媒体と、
ｂ）変性試薬と、
ｃ）ポリヌクレオチドプローブと、
ｄ）第１の抗ハイブリッド抗体をコーティングしたビーズと、
ｅ）検出可能に標識された第２の抗ポリハイブリッド抗体を含む検出試薬と、
ｆ）洗浄バッファと、
ｇ）第２の抗体上の標識の基質を含む第２の検出試薬と、
を含むか、それらからなるか、又はそれらから本質的になる、キットも提供する。
【０１４２】
回収媒体、変性試薬、ビーズ、第１及び第２の抗体、ポリヌクレオチドプローブ、検出試薬並びに洗浄バッファについては先に記載している。
【０１４３】
一態様では、キットは１つ又は複数のＨＰＶ高リスクプローブを含み（includes）、欠失部分は低リスクＨＰＶ型に対して高い配列同一性又は交差反応性を有する。一態様では、ＨＰＶ高リスクプローブはＨＰＶ１６型、１８型、２６型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型、６６型、６８型、７３型及び８２型の１つ又は複数に特異的であるか、又はそれとハイブリダイズすることが可能であり、欠失部分は低リスクＨＰＶ１型、２型、３型、４型、５型、６型、８型、１１型、１３型、３０型、３４型、４０型、４２型、４３型、４４型、５３型、６１型、６７型、６９型、７０型、７１型、７２型、７４型、８１型、８３型、８４型及び８９型の１つ又は複数と交差反応性又は特異性を有する。別の態様では、ポリヌクレオチドプローブは、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３又は配列番号１１７に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は１００％の同一性を有する核酸配列である。
【０１４４】
装置
一態様は、本明細書中に記載の方法又は組成物のいずれかを用いて実行することが可能なハイスループット装置に関する。一態様では、本明細書中に記載の組成物、方法、アッセイ及びキットを、米国特許出願公開第１２／５０８，３０４号、米国特許出願公開第１２／５０８，３０６号、米国特許出願公開第１２／６２２，１３１号、米国特許出願公開第１２／６０５，５４０号及び同第１２／６０５，６０５号（その各々の内容全体が参照により本明細書中に援用される）に記載の装置とともに使用する。米国特許出願公開第１２／５０８，３０４号、米国特許出願公開第１２／５０８，３０６号、米国特許出願公開第１２／６２２，１３１号、米国特許出願公開第１２／６０５，５４０号及び同第１２／６０５，６０５号に記載の機器は広範にわたる用途を有し、多数のサンプルを短期間で正確かつ迅速に処理することが可能である。限定されるわけではないが、米国特許出願公開第１２／５０８，３０４号、米国特許出願公開第１２／５０８，３０６号、米国特許出願公開第１２／６２２，１３１号、米国特許出願公開第１２／６０５，５４０号及び同第１２／６０５，６０５号に記載のシステム及び機器は、子宮頸部サンプル（例えば、子宮頸部スワブから得られるサンプル）又は子宮頸部細胞サンプル、アデノイド細胞、肛門上皮細胞、血液、唾液、脳脊髄液、胸膜液、乳汁、リンパ液、喀痰、尿及び精液、他のウイルス、細菌、抗酸菌又は変形体、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス、ＨＩＶウイルス、Ｈ１Ｎ１ウイルス、クラミジア、淋菌、ナイセリア・ゴノレア（ＧＣ）、クラミジア・トラコマチス（ＣＴ）、トリコモナス・バギナリス、スタフィロコッカス・アウレウス、結核菌、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス又はインフルエンザウイルスのいずれか１つに関連する核酸分子を検出及び分析するために使用することができる。さらに、米国特許出願公開第１２／５０８，３０４号、米国特許出願公開第１２／５０８，３０６号、米国特許出願公開第１２／６２２，１３１号、米国特許出願公開第１２／６０５，５４０号及び同第１２／６０５，６０５号に記載のシステム及び機器は、ＨＰＶ、ＨＰＶの遺伝的変異体、高リスクＨＰＶ型のＨＰＶ  ＤＮＡ、高リスクＨＰＶ型のＨＰＶ  ＲＮＡ、又は高リスクＨＰＶ１６型、１８型、２６型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型、６６型、６８型及び８２型のいずれか１つ、又は低リスクＨＰＶ１型、２型、３型、４型、５型、６型、８型、１１型、１３型、３０型、３４型、４０型、４２型、４３型、４４型、５３型、６１型、６７型、６９型、７０型、７１型、７２型、７４型、８１型、８３型、８４型及び８９型のいずれか１つに関連する核酸分子を検出及び分析するために使用することができる。
【実施例】
【０１４５】
実施例１
ＬＲ−ＨＰＶと交差反応するリスクが最小のＨＲ−ＨＰＶに特異的なプローブを生成するために、各々のＨＲ−ＨＰＶゲノムの欠失プラスミドを生成した。これらの戦略的に切断されたプラスミドは、ＬＲ−ＨＰＶ核酸と比較的高度の相同性を有する或る特定の領域を除いた各々のＨＲ−ＨＰＶの完全長配列を含む。
【０１４６】
１．欠失の標的の選択
１５個のＨＲ−ＨＰＶ型（ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６６、ＨＰＶ６８及びＨＰＶ８２）と、２８個のＬＲ−ＨＰＶ型（ＨＰＶ１、ＨＰＶ２、ＨＰＶ３、ＨＰＶ４、ＨＰＶ５、ＨＰＶ６、ＨＰＶ８、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１３、ＨＰＶ３０、ＨＰＶ３４、ＨＰＶ４０、ＨＰＶ４２、ＨＰＶ４３、ＨＰＶ４４、ＨＰＶ５３、ＨＰＶ５４、ＨＰＶ６１、ＨＰＶ６７、ＨＰＶ６９、ＨＰＶ７０、ＨＰＶ７１、ＨＰＶ７２、ＨＰＶ７４、ＨＰＶ８１、ＨＰＶ８３、ＨＰＶ８４及びＨＰＶ８９）とを比較する配列アラインメントを行い、全体的な配列類似性を決定する。使用するＨＲ−ＨＰＶ配列及びＬＲ−ＨＰＶ配列を下記表１に記載する。
【０１４７】
【表１−１】
2013534810.tif 000003
【表１−２】
2013534810.tif 000004
【０１４８】
この配列アラインメントの結果を図３０に示す。ＬＲ型と最も高率の同一性を示すＨＲ配列を標的の欠失に特定する。これに基づき、ＨＰＶ２６、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ６６、ＨＰＶ６８及びＨＰＶ７３を、ＬＲ交差反応性を低減する配列除去の候補プラスミドとして選択する。
【０１４９】
２．部位特異的突然変異誘発
ＨＲ／ＬＲ配列アラインメントの結果に基づいて、各々のＨＲ−ＨＰＶにおいて最も相同な領域を初めに欠失させる。関心の完全長ＨＲ−ＨＰＶ配列を含むＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドを、３７℃で１時間メチル化する。次いで、重複増幅プライマーを用いてプラスミドを増幅する。増幅プライマーの一方は欠失に選択される標的の領域と重複するが、他方は重複しない。これにより得られる増幅産物は、欠失に選択される配列を除いた標的配列に対応する非メチル化線状アンプリコンである。次いで、標的配列及びアンプリコンを、メチル化された標的を消化し、非メチル化線状アンプリコンを環状化及び増幅する大腸菌株にトランスフェクトする。この方法の例示的なワークフローを図２２〜図２９に実証する。
【０１５０】
欠失の標的とした部位の配列を、下記表２に記載する。
【０１５１】
【表２−１】
2013534810.tif 000005
【表２−２】
2013534810.tif 000006
【表２−３】
2013534810.tif 000007
【表２−３−２】
2013534810.tif 000008
【表２−４】
2013534810.tif 000009
【表２−５】
2013534810.tif 000010
【表２−６】
2013534810.tif 000011
【表２−７−１】
2013534810.tif 000012
【表２−７−２】
2013534810.tif 000013
【表２−８】
2013534810.tif 000014
【表２−９】
2013534810.tif 000015
【０１５２】
次いで、プラスミドから線状プローブを生成する。これは、プラスミドを例えば制限エンドヌクレアーゼで切断すること、及び／又はプラスミドの一部分を、例えば配列特異的ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することを含むが、これらに限定されない多数の方法で達成することができる。
【０１５３】
一実施形態では、プローブを、（１）制限エンドヌクレアーゼを用いてプラスミドを線状化した後、（２）ポリメラーゼ及びポリメラーゼ特異的プロモーターを用いてプラスミドのプローブ部分を増幅することによって生成する。例えば、線状化ＲＮＡプローブは、図２２〜図２９のプラスミドから、初めにプラスミドをＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼで切断し、次いでＨＰＶ核酸に特異的な部分をＴ７  ＲＮＡポリメラーゼで転写することによって生成することができる。これを図３１に示す。
【０１５４】
３．ＬＲ−ＨＰＶとの交差反応性の試験
切断プラスミドから生成したｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡプローブセットを、プローブセットに対する実施例１に記載の方法に従って試験し、ＬＲ−ＨＰＶとの交差反応性が低減又は排除されているか否かを決定した。第１の欠失後も顕著な交差反応性が依然として明らかな場合に第２の欠失を作り出した。欠失プライマー配列を以下の表に記載する。
【０１５５】
【表３】
2013534810.tif 000016
【０１５６】
選択したプラスミドのうち、１つ（Ｘ）又は２つ（ＸＸ）の欠失に含有される欠失配列の総量は、およそ１．４Ｋｂ〜２．４Ｋｂの範囲であった。最終プラスミド構築物は、単一の欠失を有するＨＰＶ３３Ｘ、ＨＰＶ５２Ｘ、ＨＰＶ５８Ｘ、並びに二重欠失を有するＨＰＶ２６ＸＸ、ＨＰＶ３９ＸＸ、ＨＰＶ５６ＸＸ、ＨＰＶ６６ＸＸ、ＨＰＶ６８ＸＸ及びＨＰＶ７３ＸＸを生じた。プラスミドの制限酵素地図及び得られたプローブを図１０〜図１８に記載する。例示的な欠失を上記の表２に示す。
【０１５７】
４．ＨＰＶ２６の二重欠失のための例示的なワークフロー
二重の戦略的に切断されたＨＰＶ２６プラスミドを生成するこのワークフローの一例を図１９及び図２０に示す。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ７４４７２によるＨＰＶ２６配列を保有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）プラスミドを、出発物質として使用した。メチル化の後、以下の欠失プライマー対を用いてプラスミドを増幅する：
フォワードプライマー（配列番号５８）：
５’  ＧＴＡＴＴＴＣＡＡＴＴＧＣＣＴＧＣＣＡＴＧＣＣＧＴＧＴＡＡＣＡＣＴＧＴＴＴＡＣＡＴＧＴＧＴＧＴＣ  ３’
リバースプライマー（配列番号１１８）：
５’  ＡＣＧＧＣＡＴＧＧＣＡＧＧＣＡＡＴＴＧＡＡＡＴＡＣＡＴＡＴＡＧＣＡＴＴＧＣＡＧＴＣＧ  ３’
【０１５８】
この増幅の結果、プラスミドの１５１０塩基対部分が欠失し、Ｅ１領域及びＥ２領域の切断が生じた。次いで、このアンプリコンを、活性形態のＭｃｒＢＣヌクレアーゼを保有するＤＨ５α（商標）−Ｔ１Ｒ大腸菌の株（Invitrogen Corp.，Carlsbad，California）にトランスフェクトし、戦略的に切断されたＨＰＶ２６Ｘプラスミドを生成する。
【０１５９】
次いで第２の増幅は、以下の欠失プライマー対を用いて実行される：
フォワードプライマー（配列番号６０）：
５’  ＧＴＴＴＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＡＣＣＡＧＴＡＴＧＧＣＴＴＡＴＴＡＡＡＴＡＧＴＴＧＴ  ３’
リバースプライマー（配列番号１１９）：
５’  ＡＣＴＧＧＴＴＡＣＡＣＧＧＣＣＧＡＡＡＣＴＡＧＧＣＡＣＣＡＡＡＣＧＴＣＣＣＴＴＡ  ３’
【０１６０】
この増幅の結果、プラスミドの４９０塩基対部分が欠失し、Ｌ１領域の切断が生じた。
【０１６１】
次いで、このアンプリコンを、活性形態のＭｃｒＢＣヌクレアーゼを保有するＤＨ５α（商標）−Ｔ１Ｒ大腸菌の株（Invitrogen Corp.，Carlsbad，California）にトランスフェクトした。ＭｃｒＢＣがメチル化した鋳型を消化する一方で、大腸菌によってアンプリコンが環状化され、戦略的に切断されたＨＰＶ２６ＸＸプラスミドが生成する。
【０１６２】
ＨＰＶ２６ＸＸプラスミドを制限酵素地図化し、構造及びサイズを確認した。プラスミドを、（１）ＸｈｏＩのみ、（２）ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ、（３）ＢａｍＨＩ及びＳｐｅＩ、並びに（４）ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。結果を図２１に示す。このプラスミドは下記表３に記載の特徴を有する。
【０１６３】
【表４】
2013534810.tif 000017
【０１６４】
実施例２：子宮頸部サンプル及びＨＰＶプローブを用いたアッセイ
合計３２４個の医師によって採取された子宮頸部サンプルを、洗剤ベースの回収媒体に回収し、高リスクＨＰＶの存在について試験した。
【０１６５】
１ｍｌのサンプルをボルテックスしてサンプルをホモジナイズし、５０μｌアリコートを取り出し、アッセイマイクロプレート内の２５μｌの変性試薬（１．７５ＮのＮａＯＨ）と合わせた。これを振盪して混合し、７０℃で３０分間インキュベートして一本鎖ＤＮＡを作り出した。これに、１６個のＨＰＶ型に対するＲＮＡプローブを含有する４０μｌの中和バッファ（プローブ希釈剤；２．２ＭのＢＥＳ、２．６％のＰＡＡ、０．７ＮのＮａＯＨ及び０．０９％のアジ化ナトリウム）を添加して中性ｐＨを生じさせ、６８．５℃で１０分間インキュベートした。
【０１６６】
その後、１０μｌの抗体コンジュゲート常磁性ビーズ（およそ１μｍのThermo Fisher製カルボキシル化ＳＥＲＡＤＹＮビーズ）を反応混合物に添加し、６８．５℃で更に３０分間インキュベートした。互いに相補的なＲＮＡプローブとＤＮＡ標的分子とが結合し、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドが生じる。次いで、常磁性ＳＥＲＡＤＹＮビーズにコーティングしたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド特異的抗体によってハイブリッドを捕捉させた。
【０１６７】
インキュベーションの後、常磁性ビーズを磁場への曝露によって液相／上清から分離する。デカンテーションによって上清廃液を除去し、３５μｌの検出試薬１（アルカリホスファターゼにコンジュゲートしたモノクローナル抗ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド抗体を含む二次抗体コンジュゲート酵素）を添加し、４５℃で３０分間インキュベートする。二次抗体は、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド抗体コンジュゲート常磁性ビーズ複合体に結合する。結合していない二次抗体を、洗剤ベースの洗浄バッファ（４０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．２）、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００、及び０．０９％のアジ化ナトリウム）を用いて洗い流した。
【０１６８】
基質（ＤＣＰ  Ｓｔａｒと呼ばれるABI製のジオキセタンベースの基質、Ｅｍｅｒａｌｄ  ＩＩエンハンサーを添加）を洗浄したビーズに添加すると、高リスクＨＰＶ  ＤＮＡを含有するウェルは、照度計によって検出可能であり、ＲＬＵ（相対発光量）で測定される光を生じる。１ｐｇ／ｍｌのＨＰＶ  ＤＮＡを含有するアッセイ陽性標準を用いて、陽性カットオフを確立する。全てのサンプルのＲＬＵ値を陽性標準のＲＬＵ値で除し、ＲＬＵ／ＣＯ（カットオフ値に対するＲＬＵ）を得る。結果をＲＬＵ／ＣＯで報告し、１．０以上の値を陽性とみなす。
【０１６９】
実施例３：安定性試験
初期試験に続いて、サンプルを室温及び３３℃で貯蔵し、サンプルの安定性を観察した。回収後２１日目まで試験を行った。図３及び図４は、各々のサンプルのＲＬＵ／ＣＯ値が２１日目まで経時的に変化しないことを実証する。ベースラインの結果と、２１日間の貯蔵後の結果とを比較する２×２分析、及び散布図分析によって、ＲＬＵ／ＣＯ値の経時的な直線性が実証された。これらのデータに基づいて、回収し、室温又は３３℃で２１日目まで貯蔵したサンプルが、ベースラインでの試験と同等のＲＬＵ／ＣＯ値をもたらすと結論付けることが可能である。貯蔵温度に対するＲＬＵ／ＣＯ値の線形混合モデル比較を用いると、Ｐ値は室温については０．８８０３、３３℃で貯蔵したサンプルについては０．９５１７であり、これらの値が同等であることが示される。
【０１７０】
実施例４
本実施例では、検出限界（ＬＯＤ）、Ｃ９５濃度、並びに再設計したＨＹＢＲＩＤ  ＣＡＰＴＵＲＥ化学、並びに高リスク（ＨＲ）及び低リスク（ＬＲ）のＨＰＶプラスミドＤＮＡ構築物を用いた交差反応性実験について記載する。ＬＯＤは、ウイルスが検出されるか否かを特定するのに必要とされるコピー数として定義される。Ｃ９５濃度は、９５％の時間で検体のシグナルが推定臨床カットオフを超えるか否かを特定するのに必要とされるコピー数として定義される。
【０１７１】
ＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８、及びＨＰＶ４５のＤＮＡとハイブリダイズする完全長相補的ＲＮＡプローブを用いた２回の独立したアッセイを行った。ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及びＨＰＶ４５のゲノムＤＮＡの段階希釈、並びに相補的ＲＮＡプローブによる試験を用いて、ＬＯＤ及びＣ９５濃度を決定した。１反応当たりおよそ１×１０７コピーまで希釈した、ＬＲ及びＨＲのＨＰＶ型に由来するゲノムＤＮＡ、並びにＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及びＨＰＶ４５のＲＮＡプローブによる試験を用いて、交差反応性を決定した。
【０１７２】
表５：検出限界及びＣ９５濃度
【表５】
2013534810.tif 000018
【０１７３】
表６：高リスク型の交差反応性
【表６】
2013534810.tif 000019
【０１７４】
表７：低リスク型の交差反応性
【表７】
2013534810.tif 000020
【０１７５】
子宮頸部検体を外部臨床現場で採取し、日常的な臨床手順によってｄｉｇｅｎｅ回収媒体（ＤＣＭ）に入れた。検体をハイブリッド捕捉ＨＲ  ＨＰＶ  ＤＮＡスクリーニングアッセイを用いて試験し、反応性の検体、及び非反応性の検体のサブセットを、ハイブリッド捕捉ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８／ＨＰＶ４５ジェノタイピングアッセイを用いてアッセイした。反応性の検体のサブセットを、同様にＧＰ５＋／６＋  ＰＣＲに続くＬｕｍｉｎｅｘ検出によるＨＰＶジェノタイピングを用いて評価した。本明細書中に記載の洗剤ベースの回収媒体のいずれを使用してもよい。例えば、媒体は１．０％のＮＰ−４０、０．２５％のデオキシコール酸ナトリウム、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２５ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び０．０５％のアジ化ナトリウムを含有し得る。
【０１７６】
【表８】
2013534810.tif 000021
【０１７７】
実施例５
本実施例は、８個の低リスクＨＰＶ型について、戦略的に切断されたプローブカクテル（Ｂ１７ＸＸ）と比較した１７完全長（Ｂ１７ＦＬ）プローブカクテルの交差反応性の低下を実証する。低リスクＨＰＶプラスミド３０型、４０型、５３型、６１型、６７型、６９型、７１型及び８１型を、試験される濃度：０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ及び２ｎｇ／ｍＬで標的として使用した。結果を下記表９にまとめる。
【０１７８】
【表９】
2013534810.tif 000022
【０１７９】
読み取り値はＲＬＵ／ＣＯで示す。１以上のＲＬＵ／ＣＯを有する全ての反応を、高度の交差反応性を有するものとみなす。明らかなように、全ての場合で、完全長プローブカクテルは、対応する戦略的に切断されたプローブカクテルよりも高い交差反応性を示した。加えて、以下の完全長プローブは高度の交差反応性を示した：２ｎｇ／ｍＬでのＨＰＶ３０、１ｎｇ／ｍＬでのＨＰＶ５３、及び０．５ｎｇ／ｍＬ未満でのＨＰＶ６７。この高い交差反応性は、戦略的に切断されたプローブによって低減又は排除された。
【図１−１】
2013534810.tif 000023
【図１−２】
2013534810.tif 000024
【図１−３】
2013534810.tif 000025
【図１−４】
2013534810.tif 000026
【図２−１】
2013534810.tif 000027
【図２−２】
2013534810.tif 000028
【図２−３】
2013534810.tif 000029
【図３−１】
2013534810.tif 000030
【図３−２−１】
2013534810.tif 000031
【図３−２−２】
2013534810.tif 000032
【図３−３】
2013534810.tif 000033
【図３−４】
2013534810.tif 000034
【図４−１】
2013534810.tif 000035
【図４−２】
2013534810.tif 000036
【図４−３】
2013534810.tif 000037
【図５−１】
2013534810.tif 000038
【図５−２−１】
2013534810.tif 000039
【図５−２−２】
2013534810.tif 000040
【図５−３】
2013534810.tif 000041
【図５−４】
2013534810.tif 000042
【図６−１】
2013534810.tif 000043
【図６−２−１】
2013534810.tif 000044
【図６−２−２】
2013534810.tif 000045
【図６−３】
2013534810.tif 000046
【図７−１】
2013534810.tif 000047
【図７−２】
2013534810.tif 000048
【図７−３−１】
2013534810.tif 000049
【図７−３−２】
2013534810.tif 000050
【図８−１】
2013534810.tif 000051
【図８−２】
2013534810.tif 000052
【図８−３】
2013534810.tif 000053
【図９−１】
2013534810.tif 000054
【図９−２】
2013534810.tif 000055
【図９−３】
2013534810.tif 000056
【図９−４】
2013534810.tif 000057
【図９−５】
2013534810.tif 000058
【図１０−１】
2013534810.tif 000059
【図１０−２】
2013534810.tif 000060
【図１０−３】
2013534810.tif 000061
【図１０−４】
2013534810.tif 000062
【図１１−１】
2013534810.tif 000063
【図１１−２】
2013534810.tif 000064
【図１１−３】
2013534810.tif 000065
【図１１−４】
2013534810.tif 000066
【図１１−５】
2013534810.tif 000067
【図１２−１】
2013534810.tif 000068
【図１２−２】
2013534810.tif 000069
【図１２−３】
2013534810.tif 000070
【図１２−４】
2013534810.tif 000071
【図１２−５】
2013534810.tif 000072
【図１３−１】
2013534810.tif 000073
【図１３−２】
2013534810.tif 000074
【図１３−３】
2013534810.tif 000075
【図１３−４】
2013534810.tif 000076
【図１３−５】
2013534810.tif 000077
【図１４−１】
2013534810.tif 000078
【図１４−２】
2013534810.tif 000079
【図１４−３】
2013534810.tif 000080
【図１４−４】
2013534810.tif 000081
【図１４−５】
2013534810.tif 000082
【図１５−１】
2013534810.tif 000083
【図１５−２】
2013534810.tif 000084
【図１５−３】
2013534810.tif 000085
【図１５−４】
2013534810.tif 000086
【図１６−１】
2013534810.tif 000087
【図１６−２】
2013534810.tif 000088
【図１６−３】
2013534810.tif 000089
【図１６−４】
2013534810.tif 000090
【図１６−５】
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【図１７−１】
2013534810.tif 000092
【図１７−２】
2013534810.tif 000093
【図１７−３】
2013534810.tif 000094
【図１７−４】
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【図１７−５】
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【図１８−１−１】
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【図１８−１−２】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１８−５】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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