(57)【要約】  本発明は、生体機能化刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルに関する。本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルは、少なくとも1つの多機能性融合タンパク質であって、好ましくは、構成要素として、基質結合ペプチド(SBP)、好ましくは繰り返しRGD結合ペプチドおよび/またはZZ結合ドメイン、好ましくは精製用タグならびに少なくとも1つのN末端および/またはC末端リンカーを含む前記多機能性融合タンパク質を含むように修飾されたPEGポリマーのマトリックスを含む。本発明は、さらに、病変の治療、外科的包帯、創傷治療、軟組織および硬組織再生、口腔の創傷治療、眼科学分野、歯周欠損分野などにおける本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルの使用に関する。本発明はまた、前記疾患の治療方法を記載する。さらに、本発明は、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルおよび場合によりさらなる成分を含むキットを提供する。【選択図】          図４
2013544248.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルであって、
該刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルがPEGポリマーのマトリックスを含み、
該PEGポリマーが少なくとも１つの多機能性融合タンパク質を含むように修飾されており、
該多機能性融合タンパク質が、構成要素として基質結合ペプチド(SBP)、繰り返しRGD結合ペプチド、少なくとも1つのN末端および/またはC末端リンカーならびに好ましくは精製用タグを含み、
該少なくとも1つの多機能性融合タンパク質が該PEGポリマーと共有結合している
前記刺激応答性可溶性PEGハイドロゲル。
【請求項２】
PEGポリマーがマルチアームPEGスターポリマーであり、好ましくは3〜15アームPEGスターポリマーである、請求項1に記載の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲル。
【請求項３】
基質結合ペプチド(SBP)が、エシェリキア・コリからのDNAジャイレースサブユニットB(GyrB)のN末端配列、配列番号2のエシェリキア・コリからのDNAジャイレースサブユニットBのN末端配列もしくは配列番号2に記載の配列に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、よりさらに好ましくは少なくとも97,5%の同一性を示すアミノ酸配列またはタンパク質、FKBP、FM、ToxT、DHFR、Cyp、E、PIP、TetR、ArgR、ArsR、HucR、FRB、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラアビジン、ステロイドホルモン受容体、ステロイドホルモン、ヘパリン結合性タンパク質、リポカリンファミリーのメンバー、FluA、配列番号55に記載のFluA、DigA、配列番号57に記載のDigA、SABP2、配列番号59もしくは61に記載のSABP2または配列番号64に記載のFKBP42または配列番号69に記載のscFv断片またはこれらの基質結合ペプチド(SBP)をコードする核酸あるいはこれらの配列に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、よりさらに好ましくは少なくとも97,5%の同一性を示す配列から選択される、請求項1または2に記載の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲル。
【請求項４】
繰り返しRGD結合ペプチドが式(RGD)n(式中、nは1、2、3、4または5である)を有し、ここでRGD配列が、配列番号3〜33のいずれかに記載のアミノ酸配列または配列番号3〜33のいずれかに記載の配列に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、よりさらに好ましくは少なくとも97,5%の同一性を示すアミノ酸配列から選択される、請求項1〜3の1つに記載の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲル。
【請求項５】
PEGポリマーが、チオエーテル結合によって少なくとも1つの多機能性融合タンパク質に共有結合(架橋)することが可能であるように修飾される、請求項1〜4の1つに記載の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲル。
【請求項６】
リンカーが、チオール含有部分、チオール修飾もしくはチオール含有アミノ酸、システイン、N末端システイン、ホモシステイン、マレイミドに連結されたチオール、ビニルスルホン部分、ペプチド配列、ペプチド結合、ハロタグ、SNAPタグ、CLIPタグ、トランスグルタミナーゼ反応結合、アミノ酸またはキレート形成物質NTAまたは多価金属イオンに結合するポリヒスチジンから選択されるか、またはそれを含み、あるいは、リジン、グルタミン、アミンまたはカルボキシル基から選択されることができるか、またはそれを含む、請求項1〜5の1つの請求項に記載の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲル。
【請求項７】
精製用タグが、His6タグ、FLAGタグ、HAタグまたはMYCタグから選択される、請求項1〜6の1つに記載の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲル。
【請求項８】
多機能性融合タンパク質が、構成要素として、基質結合ペプチド(SBP)、繰り返しRGD結合ペプチド(RGDn)、精製用タグおよび少なくとも1つのN末端および/またはC末端リンカー部分を含む、請求項1〜7の1つに記載の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲル。
【請求項９】
PEGハイドロゲルが、構成要素として基質結合ペプチド(SBP)、ZZドメイン、精製用タグおよび少なくとも1つのN末端および/またはC末端リンカーを含む融合タンパク質でさらに修飾される、かつ/または構成要素として増殖因子、場合によりリンカー、場合によりFcドメインおよび場合により精製用タグを含む融合タンパク質でさらに修飾される、請求項1〜8の1つの請求項に記載の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲル。
【請求項１０】
幹細胞、ヒト幹細胞、成人幹細胞、胚性幹細胞、操作されたまたは操作されていない幹細胞、初代または不死化幹細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞、セメント芽細胞、結合組織由来の線維芽細胞、歯肉線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、角膜線維芽細胞、単独または歯根膜線維芽細胞との併用、歯根膜線維芽細胞、ケラチノサイト、歯肉ケラチノサイト、口腔、上気道消化管、皮膚または眼表面由来の角化細胞、中枢神経系の細胞、神経細胞、脈管および角膜組織の内皮細胞、周皮細胞、筋細胞、脂肪細胞、アストロサイトならびにメラノサイトから選択される細胞が刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルに組み込まれる、請求項1〜9の1つに記載の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲル。
【請求項１１】
細胞、タンパク質、ポリペプチド、増殖因子、プロテアーゼ、抗生物質、抗体、抗菌剤ポリマーならびに(i)アセチルサリチル酸、(ii)アリールプロピオン酸、(iii)アリール酢酸、(iv)インドール酢酸、(v)アントラニル酸およびオキシカムの誘導体ならびにCOX-2選択的阻害薬を含む臨床使用が認められた非ステロイド系抗炎症剤から選択されるさらなる構成要素が刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルに組み込まれる、請求項1〜10の1つに記載の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲル。
【請求項１２】
a)本明細書に記載の少なくとも1つの多機能性融合タンパク質および請求項1〜11のいずれかに記載のPEGポリマーを提供し、ここで少なくとも1つの多機能性融合タンパク質はPEGポリマーに共有結合しており;
b)段階a)で得られた、本明細書に記載の少なくとも1つの多機能性融合タンパク質およびPEGポリマーと、請求項1〜11のいずれかに記載の基質結合タンパク質(SBP)の基質とを混合し、それによってPEGハイドロゲルを形成させる
段階を含む、請求項1〜11の1つに記載の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルの製造方法。
【請求項１３】
請求項1〜11のいずれかに記載の多機能性融合タンパク質。
【請求項１４】
医薬、医療デバイスまたは医療製品として使用するための、請求項1〜11の1つに記載の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲル。
【請求項１５】
インプラント学、上気道消化管における癌腫の治療における皮膚科学、耳鼻咽喉科学もしくは耳鼻咽頭科医学、口腔の創傷の治療、腫瘍性疾患による口腔の創傷治療、口腔手術および顎顔面外科手術、歯槽骨造成、抜歯後の歯槽突起予防、歯根膜を含む歯周欠損の治療、眼科学分野における疾患の治療、治療を受ける患者における(ヒト)角膜、好ましくは角膜の内皮もしくは上皮層の疾患の治療、フックス角膜内皮変性症の治療、熱傷被覆材、外科用パッチ、病変の治療、外科的包帯、創傷治療、インプラント学の分野における軟組織および硬組織再生、全体的にもしくは部分的に損傷したもしくは悪いもしくは除去された組織を再生もしくは再建するための細胞インプラントの調製、全体的にもしくは部分的に神経組織を再生もしくは再建するための神経細胞としての中枢神経系細胞のインプラントの調製、あるいは、in vitro、in vivoおよび/またはex vivo用途のための薬物送達デバイスもしくは細胞マトリックスに使用するための請求項1〜11の1つに記載の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲル。
【請求項１６】
請求項1〜11の1つに記載の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲル、場合により請求項1〜11の1つに記載のPEGハイドロゲルへの組み込みのためのさらなる成分および場合により使用説明書を含むキット、好ましくはパーツのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体機能化刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルに関する。本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲル（stimulus-responsive dissolvable PEG-hydrogel）は、少なくとも1つの多機能性融合タンパク質（at least one multifunctional fusion protein）であって、好ましくは、構成要素として、基質結合ペプチド(SBP)、好ましくは繰り返しRGD結合ペプチドおよび/またはZZ結合ドメイン、好ましくは精製用タグならびに少なくとも1つのN末端および/またはC末端リンカーを含む前記多機能性融合タンパク質を含むように修飾されたPEGポリマーのマトリックスを含む。本発明は、さらに、病変の治療、外科的包帯、創傷治療、軟組織および硬組織再生、口腔の創傷治療、眼科学分野、歯周欠損分野などにおける本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルの使用に関する。本発明はまた、前記疾患の治療方法を記載する。さらに、本発明は、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルおよび場合によりさらなる成分を含むキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
骨格系における皮膚、結合組織または骨などの生体系は複雑系であり、その再生および/または修復は、空間的および時間的に制御された調和のとれた統合によって行われる。創傷を治癒するために、例えば、組織再生中の皮膚の破壊された部分を置換するために、あるいは骨成長を誘導もしくは維持するために、無数のシグナルおよび細胞が時空間的に作用する。これらの場合の多くにおいて、軟組織および/または硬組織の損失を防ぐために、あるいはそれらの顕著な減少、またはさらにはそれらの崩壊を防ぐために、穴は充填されなければならない。しかしながら、このような治療に適した担体またはマトリックスを構築するために用いられる多くの現行の生体材料の有効性は、これらの生体系の固有の動力学を補完する多機能構造を欠くために限定されている。
【０００３】
これに関連して、in vitroおよびin vivoで、組織再生中に、協同しておよび/または相乗的に細胞機能に作用する多数の物理的、化学的および生物学的手掛かりが知られている。従って、組織再生の促進に成功する生体材料を設計するためには、標的細胞/組織とこれらの環境因子との間の相互作用を注意深く考慮しなければならない。重要な因子は、通例、可溶性増殖因子、細胞-細胞および細胞-材料相互作用ならびにその微小環境の機械的特性である(例えば、Lin and Anseth, Expert Review, “PEG hydrogels for the controlled Release of Biomolecules in Regenerative Medicine”, Pharmaceutical Research, Vol. 26, No. 3, March 2009 を参照のこと)。
【０００４】
これらの必要条件を考慮して、生体活性分子の送達および適切な担体の探索が集中的な研究の対象となってきた。なぜなら、標的分子は多様であり、低分子量薬物、核酸、ペプチド、増殖因子およびホルモンならびに、組織の再生促進のためのタンパク質が含まれるからである。
【０００５】
この領域における有望なアプローチの1つは、いわゆるハイドロゲルの使用に基づく。ハイドロゲルは、細胞および生体分子を同時に含むという多くの利点を有する材料のクラスを代表する。ゲルの物理的構造および化学構造の系変化により放出特性を厳密に制御することを可能にする多くの可能性もまた存在する(例えば、C. C. Lin, and A. T. Metters. Hydrogels in controlled release formulations: Network design and mathematical modeling. Adv. Drug Deliv. Rev. 58:13791408 (2006) を参照のこと)。その可変特性のために、ハイドロゲルは、天然の組織および組織モデルの構造と類似するいわゆる合成”刺激応答性“ポリマーの製造を可能にするために用いられてきた。その化学的および物理的特性に基づいて、これらの合成”刺激応答性“ポリマーは、‘刺激応答性’ポリマー、‘スマート’ポリマー、‘環境感受性’ポリマー、‘インテリジェント’ポリマーなどの種々の名称がつけられている。(Brawa et al., Biomed. Mater. 4 (2009) 022001 (15pp)を参照のこと)。これらの刺激応答性ポリマーの顕著な特性は、親水性状態から疎水性状態へそれらの微細構造を急速に変化させるそれらの能力であり、その変化は環境の小さな変化によって引き起こされる。生じる肉眼的変化は可逆的であり、従って、トリガーが除去されたとき、この系はその初期状態に戻ることができる。これらの変化をもたらす通常の刺激は、さらに、外部刺激または内部刺激のいずれかに分類される。外部制御システムは、種々の刺激生成装置の助けを借りて生成される外部印加刺激に依存し、これらの刺激によって、最終的には、パルスドラッグデリバリーがもたらされる。内部制御システムは、自己制御装置としても知られ、その放出速度は、ポリマーネットワークの構造変化を制御し、外部からの介入なしに所望の薬物放出を示すために体内でもたらされるフィードバック機構によって制御される。”刺激応答性“ポリマーの刺激は、例えば、溶媒、pH、温度、電流、磁場または機械的負荷の変化であることができる。これらの刺激に対する応答は、形状、表面特性、溶解性および複雑な分子集合体の形成またはゾル-ゲル転移の変化として生じることができる(Brawa et al., Biomed. Mater. 4 (2009) 022001 (15pp)を参照のこと)。
【０００６】
合成”刺激応答性“ポリマーとして用いることができるハイドロゲルは、ポリ(エチレングリコール)(PEG)、ポリ(ビニルアルコール)(PVA)、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)(ポリ(NiPAAm))などの合成ポリマーをベースとすることができる。このようなハイドロゲルは、多くの再生用途に用いられている(例えば、N. A. Peppas, P. Bures, W. Leobandung, and H. Ichikawa. Hydrogels in pharmaceutical formulations. Eur. J. Pharm. Biopharm. 50:27-46 (2000)を参照のこと)。
【０００７】
これに関連して、Schmaljohannら(Schmaljohann, D., Nitschke, M., Schulze, R., Werner, C., Eichhorn, K.-J., “Patterning of stimuli-responsive hydrogels”, Polymer Preprints 45, 380-381, December 2004)は、ポリ(NiPAAm-co-PEGMA)前駆体をベースとする熱応答性ハイドロゲルを開示している。この材料は、細胞接着および細胞剥離挙動において、温度誘導変化を示すことが明らかにされている。
【０００８】
同様に、Voitら(Voit, B.; Schmaljohann, D.; Gramm, S., Nitschke, M., Werner, C., “Stimuli-responsive polymer layers for advanced cell culture technologies”, International Journal of Materials Research 98, 646-650, August 2007)は、ポリマー骨格中の熱応答性構成要素としてのポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)およびポリ(エチレングリコール)側鎖からなる一連のグラフト共重合体を開示している。表面固定されたハイドロゲルは、可溶性ポリマーの下限臨界溶液温度に相当する32〜35℃の範囲において、部分崩壊から完全膨潤への転移を示す。ハイドロゲルコーティングされた担体は、細胞の接着、伸展および増殖を許容し、無傷の細胞シートまたは多細胞型の迅速で効果的な温度依存性剥離を可能にする。
【０００９】
しかしながら、温度感受性ゲルは、一部の細胞ベースのin vitro用途には適しているものの、in vivo投与には適していない。なぜなら、治療を受ける患者への刺激応答性ハイドロゲルの投与中または投与後に、患者内で、またはその投与部位において温度刺激が与えられなければならないからである。刺激が、溶媒、pH、電流、磁場または機械的負荷の変化から選択される刺激応答性ハイドロゲルを用いる場合にも、同様な問題が生じる。このような温度感受性またはpH感受性ハイドロゲルは、例えば、WO2009/144569およびWO2010/068728に記載されている。
【００１０】
刺激応答性ハイドロゲルに適したハイドロゲルは、架橋によって形成されることもできる。架橋は、分子量の見かけの増加または真の増加によって粘度の増加を示すようにゲルを修飾するための適切な方法を提供するが、これは多くの場合、ゲルの形成をもたらす。架橋は、共有結合の形成によって化学的に達成することもできるし、例えば水素結合またはイオン相互作用の形成によって物理的に達成することもできる。明らかに、架橋はまた、化学的かつ物理的に達成することもできる。ハイドロゲルを得るためには、親水性ポリマーの化学架橋が一般的かつ多く用いられる方法である。これらのゲルが投与または加工されることができるように、プレポリマーは水に溶解され、次いで重合されてin situでハイドロゲル形成が行われる。ハイドロゲル化手順は、多くの場合、それらの固有の毒性のために、そして、それらが通例、補助の潜在的に有害な重合開始剤を必要とするため(生体医学)用途には好ましくないアクリルまたはメタクリルマクロモノマーの使用をベースとする。さらに、化学的に架橋されたハイドロゲルは可逆性を欠き、ポリ(アクリレート)およびポリ(メタクリレート)は生体分解性ではないため、それらの分解挙動は限定されている。
【００１１】
例えば、米国特許第5,410,016号は、in situで架橋される、ペンダントアクリレート官能基を含む、ポリ(エチレングリコール)とポリ(DL-ラクチド)との共重合体をベースとするハイドロゲルを開示している。WO01/44307は、in situで化学的に架橋されるペンダントアクリレート基およびメタクリレート基で修飾されたポリビニルアルコールをベースとするハイドロゲルを開示している。故に、これらの先行技術文献に従って、反応性基を含む水加工性プレポリマーから出発して、不可逆的に架橋されたハイドロゲルが得られる。
【００１２】
ポリアミノ酸、糖質、ポリエステル、ポリアミド、ポリエーテル、ビニルポリマーおよびそれらの共重合体を含む水溶性高分子などの合成ポリマー種(例えばUS2009/0117656参照)を相互に連結させるために可逆的ジスルフィド結合を用いるさらなる架橋アプローチの1つがUS2009/0117656に記載されている。この目的のために、架橋剤として、反応性化合物、例えばシスタミン、シスチン、2-ヒドロキシエチルジスルフィド、3,3'-ジチオジプロピオン酸(DTDP)、グルタチオンジスルフィド、3,3'-ジチオプロピオヒドラジド、それらの誘導体などを用いることができる。次いで、反応性化合物による合成ポリマーの修飾に続いて、通例、水性媒体中で自己組織化によって該ペプチドが生成される。
【００１３】
この種のさらなるアプローチは、アクリロイル化デキストリンとホモ官能性、単官能性および2官能性活性分子、例えばその末端に1つまたは2つのシステインを有するペプチドとを架橋させることによって製造されるデキストランポリマーのハイドロゲルに関する(US2007/0167354参照)。より正確には、US2007/0167354は、細胞遊走を誘導するマトリックスであって、2つのペプチド、すなわち天然プロテアーゼ、例えば組織マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)によって切断可能な第1ペプチドおよび細胞誘引性ペプチド、例えばRGDペプチドを含む第2ペプチドがマトリックスに共有結合した前記マトリックスを開示している。これらの2つのペプチドは、細胞により誘導される接着およびハイドロゲルの酵素分解を促進する。全有効架橋に対するこれら2つのペプチドの百分組成を変えることによって、ゲルを通した細胞接着および遊走の程度を制御することができる。しかしながら、このアプローチもやはり、生体医学用途には好ましくないアクリルまたはメタクリルマクロモノマーを用いる。
【００１４】
架橋ハイドロゲルの特定の形態は、いわゆるヘパリン機能化ハイドロゲルに代表される。Nieら(Ting Nie, Aaron Baldwin, Nori Yamaguchi, Kristi L. Kiick, Production of heparin-functionalized hydrogels for the development of responsive and controlled growth factor delivery systems“, Journal of Controlled Release 122 (2007) 287296 を参照のこと)は、主にタンパク質送達およびECMミメティック材料の製造に興味を持って、応答性可逆的注入型ドラッグデリバリーシステムの手段としてヘパリン化材料の非共有結合集合体に関して報告している。これに関連して、ヘパリン結合性ペプチドで機能化したポリ(エチレングリコール)スターポリマー（poly(ethylene glycol) star polymers）を、ヘパリンと直接に混合して、可変特性を有する粘弾性溶液を生じさせることもできるし、スターポリ(エチレングリコール)-ヘパリンコンジュゲートと混合して、ハイドロゲルの侵食によって増殖因子を送達することができる非共有結合ハイドロゲルを形成させることもできる。このような侵食戦略は、受動的ではあるが、増殖因子とヘパリン化高分子の共放出による、増殖因子活性を改善するための他にない機会を提供することができる。Nieらはまた、PEG-ヘパリンコンジュゲートは、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)などの二量体のヘパリン結合性増殖因子との相互作用によって弾性ハイドロゲルを形成する能力があることを報告している。重要なことに、これらのハイドロゲルは、VEGF受容体VEGFR-2に対する暴露によって受容体依存性VEGF放出およびハイドロゲル侵食が可能であり、VEGFR-2の主な役割が血管内皮細胞の増殖および遊走の制御にあるとすれば、これらの結果は、脈管および創傷治癒治療における薬物の標的送達のための重要な戦略を示唆している。
【００１５】
増殖因子の結合および送達のためにヘパリン機能化ハイドロゲルを用いる、ヘパリン機能化ハイドロゲルのさらなる例の1つは、Kimら(2007)によって開示されている。より正確には、Kimら(2007)は、ヘパリンとヘパリン結合性ペプチドまたは増殖因子との間の相互作用によるハイドロゲルの非共有結合集合体ばかりでなく、受動的または受容体依存性マトリックス侵食によるこれらのマトリックスからの増殖因子の送達もまた報告している。これに関連して、ヘパリンで修飾された4アームスターポリ(エチレングリコール)(PEG)は、ヘパリン結合性ペプチドで修飾されたスターPEGと混合されるときハイドロゲルを形成することが報告されている。用いられたペプチドは、ヘパリン-相互作用タンパク質(HIP)、アンチトロンビンIII(ATIII)または血小板第4因子(PF4ZIP)由来であった。このような修飾ポリマーは、非共有結合、すなわち主として静電相互作用によってハイドロゲルを形成し、そのハイドロゲルは、治療に関連した増殖因子が負荷されることができる。
【００１６】
このようなヘパリン機能化ハイドロゲルの機械強度は、種々のヘパリン結合性ペプチドおよびポリマー組成物を選択することによって制御することができる。さらに、マトリックス全体への荷電ヘパリンの分布によって、送達ビヒクルへの増殖因子の均一な組み込み容易にすることもできる。好都合には、ゲル内での毒性架橋剤の欠如とそれらの非侵襲的投与(例えば注射投与)の潜在能力とを結びつけることにより、多数の臨床用途および治療用途におけるそれらの使用を可能にすることができる。さらに、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)などの増殖因子は、それが1分子当たり2つの架橋点を提供するため、これらのハイドロゲルネットワークの集合体における架橋として用いることができる。標的部位への投与時に、増殖因子は、その受容体との結合およびそれに続く受容体依存性エンドサイトーシスによってゲルから取り除かれることができ、適切な分子量のPEG分子を用いた場合、理論上はポリマーマトリックスの除去が可能であろう。このようなデリバリーシステムは、マトリックスに用いられる所望の増殖因子に応じて柔軟に用いることができる。理論上は、単一のマトリックスにおいて、ヘパリンに対する増殖因子の親和性に基づいて、複数の期間で送達および侵食を可能にする複数の増殖因子を用いることもできる。この系は、いくつかの望ましいかつ有利な特性を提供するにもかかわらず、もっぱらin vitroまたはin vivoにおける増殖因子の提供に向けられている。組織の増殖および、このようなハイドロゲルへの特定の因子または細胞の組み込みは取り組まれていない。
【００１７】
架橋ハイドロゲルのもう1つの特定の形態はWO2009/146929に示されている。WO2009/146929は、ポリマー、特定の第1ポリペプチドおよび第1ポリペプチドと同一であっても異なっていてもよい特定のポリペプチド結合パートナーを用いる特異的に架橋されたハイドロゲルを開示している。両方のポリペプチドは前記ポリマーに共有結合的または非共有結合的に結合され、第1ポリペプチドとポリペプチド結合パートナーとの間の相互作用によってハイドロゲルを形成することができる。WO2009/146929において用いられている特定のポリペプチドは、例えばGyrB、FKBP、FRB、FM、ToxT、DHFRおよびCypである。しかしながら、WO2009/146929は、すでに薬物およびエフェクター物質の組み込みを可能にしているが、このような化合物は、一般的には、比較的短い期限内に溶脱される。さらに、このようなハイドロゲルは、マトリックス上への、またはさらにはマトリックス内への細胞の組み入れの維持には不十分である。従って、WO2009/146929に記載のゲルは、長期治療または少なくとも反復投与を必要とする治療、例えば組織の維持または再構成中に、例えば術後に、あるいは一般に組織の増殖または組織の増殖の補充に適しているとは言えない。これに関連して、実際、十分に有効ではないにしても、組織の増殖および、マトリックス上への、またはさらにはマトリックス内への細胞の組み入れの維持ならびにこのようなマトリックスの適用を可能にする、当該技術分野で公知の系はわずかしかない。
【００１８】
種々のハイドロゲルの中で、ゲル特性を合わせるために、非イオン性親水性PEGゲル系は多くの可能性を提供すると考えられる。非イオン性親水性PEGゲル系は、さらに、無毒であり、優れた生物適合性を示すと考えられている。その結果として、これらのポリ(エチレングリコール)(PEG)ハイドロゲルは、過去数十年にわたって、ドラッグデリバリーを制御するためのマトリックスとしてばかりでなく、組織再生を促進する細胞送達ビヒクルとしても広範に議論されてきた。従って、制御された送達の視点から、適切に設計されたPEGハイドロゲルは、生存、接着、増殖、マトリックス合成、分泌性およびさらには分化にとって重要な細胞機能の指示に重要な役割を果たすことができる。この目的およびこの目的のための設計原理は2つの面を有する。ローディングした治療薬の局所放出および徐放性を提供することならびに、治療効果を補い、有害反応を減らし、治療薬の生体活性を保護することである。これらの目的を達成するために、標的細胞および組織の生理学的環境、ゲル化および分子ローディング/放出機構、送達される治療薬の分子特性ならびにポリマーハイドロゲルとの潜在的相互作用を含むいくつかの不可欠要因を注意深く考慮しなければならない。
【００１９】
PEGハイドロゲルは、細胞含有支持体として特有のニッチを提供する。なぜなら、それらは、適当な重合条件下で、細胞に対して生体適合性が高いからである。他の高分子との共重合により、細胞の生存および機能を抑制または促進するために、複数の機能部分を導入することができる。例えば、骨芽細胞などの接着依存性細胞の生存を促進するために、さもなければ生物学的に不活性なPEGハイドロゲル内にペンダント官能基としてインテグリン結合性ペプチドArg-Gly-Asp(すなわちRGD)を導入することができる(J. A. Burdick, and K. S. Anseth. Photoencapsulation of osteoblasts in injectable RGD-modified PEG hydrogels for bone tissue engineering. Biomaterials. 23:43154323 (2002))。
【００２０】
しかしながら、PEGハイドロゲル環境は、一般に透過性が高く、栄養素の容易な拡散が可能であるが、この特性は、多くの場合、封入される細胞を標的にする可溶性因子の局所送達および治療効果を妨げる。なぜなら、この不活性ゲルネットワークは、共封入された治療薬に対しても等しく透過性であるからである。従って、PEGハイドロゲルネットワーク内に封入された細胞に時空間的に生体活性分子が提供される手段は、ハイドロゲルデリバリーシステムの設計において、今でも大きなチャレンジであり、現在、集中した研究の対象となっている。
【００２１】
上記を要約すれば、近年、多くの好都合で有望なアプローチが議論されている。それにもかかわらず、これらのアプローチには、簡単で迅速なアプローチの範囲内で、in vivo応用に優れた適合性を有し、ハイドロゲルに種々の因子および/または細胞を効果的に結合させ、これらを放出させる十分な柔軟性を有するハイドロゲルを提供すると考えられるものがない。さらにまた、これらのハイドロゲルには、治療を受ける患者における細胞内殖および/または組織再生のためのin vitroおよび/またはin vivo応用のための一種の細胞および/または組織マトリックスとしてさらに適切であると考えられるものがない。
【００２２】
従って、簡単で迅速なアプローチの範囲内で、in vivo応用に優れた適合性を有し、ハイドロゲルに種々の因子および/または細胞を効果的に結合させ、これらを放出させる十分な柔軟性を有する新規手段、好ましくは新規刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルマトリックスおよびその製造方法を提供することが本発明の基礎をなす目的であった。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２３】
この目的は、添付の特許請求の範囲の主題事項によって解決される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】RGD配列を含む本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルおよびこのハイドロゲル上のヒト歯肉線維芽細胞の広がり、それに続く位相コントラスト顕微鏡検査および播種された細胞の特定の形態を示す図である。図に示すように、歯肉線維芽細胞は、RGD配列を含む本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲル上に連続的に広がっており、24時間のインキュベーション時間内に連続的増殖した細胞叢(cell lawn)をもたらす。特に、歯肉線維芽細胞に関して細胞増殖の有意な増加が認められ、歯肉線維芽細胞はそれらの天然の紡錘体形形態を維持している。対照的に、RGD配列を含まない刺激応答性可溶性PEGハイドロゲル上に播種された細胞は、24時間のインキュベーション時間内には、細胞の連続的な増殖を示さない。これらの細胞はゲルから排除され、続いてアポトーシスを受ける。
【図２】RGD配列を含む本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルおよびこのハイドロゲル上のヒト歯肉線維芽細胞および角化細胞の、それに続くファロイジン染色およびその結果形成されるアクチンフィラメントを示す図である。図に示すように、歯肉線維芽細胞および角化細胞は、RGD配列を含む本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲル上に連続的に広がっており、24時間のインキュベーション時間内に連続的に増殖した細胞叢をもたらす。特に、歯肉線維芽細胞に関して細胞増殖の有意な増加を認めることができ、歯肉線維芽細胞はそれらの天然の紡錘体形形態を維持している。対照的に、RGD配列を含まない刺激応答性可溶性PEGハイドロゲル上に播種された歯肉細胞は、24時間のインキュベーション時間内には、細胞の連続的な増殖およびアクチンフィラメントの適切な形成を示さない。これらの細胞はゲルから排除され、続いてアポトーシスを受ける。
【図３】RGD配列を含む本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルおよびこのハイドロゲル上へのヒト歯肉線維芽細胞および角化細胞の接着、それに続くインテグリン-βb1染色およびRGD配列への細胞の結合(接触点の形成)を示す図である。図に示すように、歯肉線維芽細胞は、RGD配列を含む本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲル上に連続的に広がっており、24時間のインキュベーション時間内に、主にインテグリン受容体サブユニットβ1のこのハイドロゲルに組み込まれたRGD配列への適切な接着によって引き起こされる連続的に増殖する細胞叢をもたらす。特に、歯肉線維芽細胞に関して細胞増殖の有意な増加を認めることができ、歯肉線維芽細胞はそれらの天然の紡錘体形形態を維持している。対照的に、RGD配列を含まない刺激応答性可溶性PEGハイドロゲル上に播種された細胞は、24時間のインキュベーション時間内には、細胞の連続的な細胞増殖を示さず、接触点が欠けている。これらの細胞はゲルから排除され、続いてアポトーシスを受ける。
【図４】基礎をなすPEGゲルを修飾するために本発明の多機能性融合タンパク質にGyrBを用いる場合の、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルの例示的な形成を示す図である。このPEGハイドロゲルの形成は、基質クーママイシンの添加によって誘導され、このPEGハイドロゲルは、抗生物質化合物ノボビオシンを用いて、制御しながら再び破壊されることができる。
【図５】GyrBの核酸配列およびそれに対応するアミノ酸配列(aa1〜220)を示す図である。
【図６】本発明の多量体融合タンパク質pRG107の核酸配列およびそれに対応するアミノ酸配列を示す図である。そのサブユニットは以下で示される:AA1:開始メチオニンAA2:PEG-VSにカップリングさせるためのシステイン1AA3〜221:GyrB(1〜220)AA222〜233:二重GRGDSPモチーフAA234〜239:ヘキサヒスチジンタグAA240:PEG-VSにカップリングさせるためのシステイン2
【図７】本発明の多量体融合タンパク質pRG111の核酸配列およびそれに対応するアミノ酸配列を示す図である。そのサブユニットは以下で示される:AA1〜129:pEZZ-18(市販ベクター、GEヘルスケア社)由来のZZ結合ドメインAA130〜349:GyrB(1〜220)AA350-355:ヘキサヒスチジンタグAA356:PEG-VSにカップリングさせるためのシステイン
【図８】本発明の多量体融合タンパク質pRG116の核酸配列およびそれに対応するアミノ酸配列を示す図である。そのサブユニットは以下で示される:サブユニット:AA1〜220:GyrB(1〜220)AA221〜232:二重GRGDSPモチーフAA233〜238:ヘキサヒスチジンタグAA239:PEG-VSにカップリングさせるためのシステイン2
【図９】融合タンパク質FGF-7-Fc-Hisの核酸配列およびそれに対応するアミノ酸配列を示す図である。そのサブユニットは以下で示される:サブユニット:AA1〜106:FGF-7(=KGF)AA107〜122:セリン-グリシンリンカーAA123〜354:FcドメインAA355〜360:ヘキサヒスチジンタグ
【図１０】図において実験設定のウェル配置を示す図である。本図は、RGDの有無によるハイドロゲルおよび播種される細胞型の配置を示す。
【図１１】-RGD(RGDを含まない)ハイドロゲル上で培養した、48時間後の歯肉線維芽細胞の倒立顕微鏡位相コントラスト画像を示す図である。細胞培養支持体周囲のハイドロゲルのさらに好ましいプラスチック表面によって、細胞増殖の境界線が生じている。-RGDハイドロゲル表面上では、細胞増殖はほぼ不可能である。
【図１２】+RGDハイドロゲル上で培養した、48時間時間後の歯肉線維芽細胞の倒立顕微鏡位相コントラスト画像を示す図である。ハイドロゲルの縁は識別できなかった。好ましい+RGDハイドロゲル表面は、培養48時間後に、完全な細胞被覆を媒介する。
【図１３】-RGD(RGDを含まない)ハイドロゲル上で培養した、48時間後の歯肉角化細胞の倒立顕微鏡位相コントラスト画像である。細胞増殖の境界線は、細胞培養プラスチック支持体であっても、-RGDハイドロゲル表面よりも歯肉角化細胞に対して優れた増殖表面であることを明確に示している。この細胞忌避表面には単一細胞のみが接着可能である。
【図１４】+RGDハイドロゲル上の歯肉角化細胞の、48時間時間後の倒立顕微鏡位相コントラスト画像である。この細胞の発育増殖は島で進行し、天然細胞形態は、歯肉角化細胞に対する好ましい環境(+RGDハイドロゲル)を示している。
【図１５】DAB西洋ワサビペルオキシダーゼ沈降法で、サイトケラチン19に対して免疫組織化学的に染色した歯肉角化細胞を示す図である。+RGDハイドロゲル表面上の細胞の染色パターンは、完全な細胞伸展を示し、従ってハイドロゲル表面への適切な細胞接着を示している。対照的に、-RGDハイドロゲル表面上で培養した希薄にしか分布していない細胞は、ほとんど細胞伸展を示さず、非天然球形細胞形態を示している。
【図１６】DAB西洋ワサビペルオキシダーゼ沈降法でサイトケラチン19に対して免疫組織化学的に染色した、RGD配列を含むハイドロゲル上に播種した歯肉角化細胞での結果を高倍率画像で例示する図を示す。この高倍率画像は、完全な細胞伸展および、この細胞の細胞質における細胞特異的ケラチン19分布を強調している。
【図１７】DAB西洋ワサビペルオキシダーゼ沈降法を用いてインテグリンβ3に対して免疫組織化学的に染色した歯肉線維芽細胞を示す図である(明るく輝く領域は、上に横たわる半透明のハイドロゲルによって引き起こされた照明効果によるものであった)。+RGDハイドロゲル表面で培養した細胞は、完全な細胞伸展およびゲル表面への適切な細胞接着を示す。対照的に、-RGDハイドロゲル表面に播種された細胞は希薄にしか分布せず、非天然形態を示し、細胞分枝は、細胞接着部分が利用可能ではないことを明確に示している。
【図１８】FluA-フルオレセイン(FluA_A45I_R95K_S114R)の核酸配列(上部配列)(配列番号54)およびアミノ酸配列(下部配列)(配列番号55)を示す図である。
【図１９】DigA(DigA_16)の核酸配列(上部配列)(配列番号56)およびアミノ酸配列(下部配列)(配列番号57)を示す図である。
【図２０】サリチル酸結合タンパク質2(SABP2)の核酸配列(上部配列)(配列番号58)およびアミノ酸配列(下部配列)(配列番号59)を示す図である。
【図２１】サリチル酸結合タンパク質2(SABP2 S81A)の核酸配列(上部配列)(配列番号60)およびアミノ酸配列(下部配列)(配列番号61)を示す図である。
【図２２】アラビドプシスFK506結合タンパク質(FKBP42)の核酸配列(上部配列)(配列番号62)、アラビドプシスFK506結合タンパク質(FKBP42(aa1〜163))の核酸配列(中央配列)(配列番号63)およびアラビドプシスFK506結合タンパク質(FKBP42(aa1〜163))のアミノ酸配列(下部配列)(配列番号64)を示す図である。
【図２３】アラビドプシス多剤耐性様ABCトランスポーターAtPGP1の核酸配列(上部配列)(配列番号65)およびアミノ酸配列(下部配列)(配列番号66)を示す図である。
【図２４】アラビドプシス多剤耐性様ABCトランスポーターAtPGP1(aa980〜1286)の核酸配列(上部配列)(配列番号67)およびアミノ酸配列(下部配列)(配列番号68)を示す図である。
【図２５】フルオレセインに対するFluAの親和性をベースとする刺激感知ハイドロゲルを示す図である。
【図２６】ジゴキシンに対するDigAの親和性をベースとする刺激感知ハイドロゲルを示す図である。
【図２７】サリチル酸に対するSABP2の親和性をベースとする刺激感知ハイドロゲルを示す図である。
【図２８】ケルセチンによるFKBP42とAtPGP1とのタンパク質間相互作用の破壊をベースとする刺激感知ハイドロゲルを示す図である。
【図２９】RGD配列を含むハイドロゲル(上部グラフ)およびRGDを含まないハイドロゲル(下部グラフ)の周波数依存性粘弾性特性の試験の実施例7の結果を示す図である(結果はヘルツ(Hz)で示されている)。
【図３０】RGD配列を含むハイドロゲル(上部グラフ)およびRGDを含まないハイドロゲル(下部グラフ)の周波数依存性粘弾性特性の実施例7の試験結果を示す図である(結果は角振動数ω(rad/sec)で示されている)。
【図３１】合成体液中のGyrB-PEGハイドロゲルの分解キネティクスからの結果を示す図である。
【図３２】GyrBおよびマルチアームPEGを含む実施例1に記載の本発明のハイドロゲルの長期安定性試験(4℃での貯蔵)からの結果を示す図である。
【図３３】実験の部において例示的に用いられたscFvのアミノ酸配列(配列番号69)を示す図である。このscFv断片は、フルオレセインおよびその誘導体に指向されている(Vaughan et al., (1996), Nat. Biotechnol 14 (3), S. 309-314 を参照のこと)。このscFvは、確立された発現系においてC末端ヘキサヒスチジンタグ付きバージョンとして組換えにより製造された。これは、(Pedrazzi et al., (1997), FEBS Lett 415 (3), S. 289-293)( E.コリのペリプラズムにおける発現)(Rippmann et asl., (1998), Appl. Environ. Microbiol 64 (12), S. 4862-4869)(プロテウス・ミラビリスのL型細胞における発現)に記載されている。産生されるscFvのアミノ酸配列は、ペリプラズムのシグナル配列の除去後が示されている。
【図３４】実施例10に記載のscFvハイドロゲルの検証を示す図である。その結果、1mMフルオレセインでのハイドロゲルのインキュベーションは、ハイドロゲルの分解および分解への組み込まれたタンパク質の放出(Bradford法を用いて1日後に定量)をもたらしたが、フルオレセインなし(0mM)でのインキュベーションは、ハイドロゲル分解およびタンパク質放出を明確には示さなかった(Bradford法を用いて1日後に定量)ことが認められた。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
第1の特定の実施形態によれば、本発明の基礎をなす目的は、少なくとも1つの多機能性融合タンパク質であって、好ましくは、構成要素として、基質結合ペプチド(SBP)、好ましくは繰り返しRGD結合ペプチドおよび/またはZZ結合ドメイン、好ましくは精製用タグならびに少なくとも1つのN末端および/またはC末端リンカーを含む前記多機能性融合タンパク質を含むように修飾されたPEGポリマーのマトリックスを含む刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルによって解決される。
【００２６】
好都合には、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルは、コスト効率よく製造することができ、優れた可変性を提供する。このゲルは、基質結合ペプチド(SBP)と共有結合でグラフトされた薬学的に認可されたポリエチレングリコールポリマーをベースにして製造されることができる。ゲル形成は、本明細書に記載の基質結合ペプチド(SBP)の好ましくは特異的基質を介した相互作用または、基質結合ペプチド(SBP)のその特異的基質への結合、例えばクーママイシンによる2つのGyrBサブユニットの二量体化もしくはGyrBのクーママイシンへの結合によって容易に達成される。アンタゴニスト作用を持つ化合物または基質、例えばGyrBの場合におけるノボビオシンを過剰に添加することによって、ハイドロゲルの分解を調節することが可能である。例えば、繰り返しRGD結合ペプチド(RGDn)(RGDnまたは(RGD)nとしても書かれる)の形での細胞接着モチーフの融合タンパク質配列への組み込みよって、ハイドロゲル上での細胞増殖が可能になる。例えばZZ結合ドメインを介してハイドロゲルに組み込まれた増殖因子、例えばFGF-7(線維芽細胞増殖因子-7またはKGF、角化細胞増殖因子)は、誘導物質ノボビオシンによって時間制御的に、かつ用量反応的に放出されることができる。
【００２７】
第1の実施形態によれば、PEGマトリックスのPEGポリマーを修飾するために用いられる本発明の多機能性融合タンパク質は、好ましくは、構成要素として、基質結合ペプチド(SBP)、好ましくは繰り返しRGD結合ペプチド、例えば(RGDn)(RGDnまたは(RGD)nとも定義される)ならびに/またはZZ結合ドメイン、好ましくは精製用タグならびに少なくとも1つのN末端および/またはC末端リンカーを含む。
【００２８】
一般的には、本発明の多機能性融合タンパク質の基質結合ペプチド(SBP)は、その特異的基質またはその基質結合ペプチド(SBP)または異なる基質結合ペプチド(SBP)に結合できるタンパク質またはポリペプチドから選択されるタンパク質またはポリペプチドであることができる。本発明においては、このような基質結合ペプチド(SBP)は、例えば特異的基質を介して相互作用するか、または特異的基質に直接に結合するタンパク質またはポリペプチドから選択されることができる。従って、場合により特異的基質を介してPEGポリマーに結合されるとき、少なくとも2つのこのような基質結合ペプチド(SBP)は、その単一PEGポリマー種を“架橋する”ことによって、複雑な分子集合体の形成またはゾル-ゲル転移およびハイドロゲル形成を行うことが可能になる。あるいは、すでにPEGポリマーに結合された基質結合ペプチド(SBP)を、同様にさらなるPEGポリマーに結合されたその特異的基質に結合させることによって、ハイドロゲル形成を行うことが可能である。従って、好ましくはホモまたはヘテロ多量体、例えばホモまたはヘテロ二量体またはさらにはホモまたはヘテロ三量体などを形成する傾向を有するペプチドから適切な基質結合ペプチド(SBP)が選択されることができる。あるいは、適切な基質結合ペプチド(SBP)は、好ましくは特異的基質に特異的に結合するタンパク質またはポリペプチドから選択されることができる。より好ましくは、いずれの場合も、特異的基質を介する2以上の基質結合ペプチド(SBP)の相互作用またはその特異的基質への基質結合ペプチド(SBP)の相互作用は、特異的基質の添加または除去(または置換)によって誘導または再分解することができる。このような特異的基質は、例えば核酸分子、ペプチド、小有機分子などであることができ、好ましくは本明細書に記載の基質結合ペプチド(SBP)によって特異的に結合されている。特異的基質なしに、もしくはそれのと結合によって、あるいは基質結合ペプチド(SBP)とその特異的基質との組み合わせによってホモまたはヘテロ多量体を形成する傾向を有する2以上の基質結合ペプチド(SBP)の組み合わせは、本発明においては“結合パートナー”と呼ぶことができる。
【００２９】
従って、少なくとも2以上の基質結合ペプチド(SBP)が互いに相互作用する上記の意味の範囲内の結合パートナーは、好ましくは、限定するものではないが、例えば基質結合ペプチド(SBP)-基質結合ペプチド(SBP)組み合わせまたは基質結合ペプチド(SBP)-特異的基質組み合わせから選択される。好ましくは、いずれの場合も、基質結合ペプチド(SBP)は本発明の多機能性融合タンパク質の構成要素となり、全多機能性融合タンパク質にその結合特性を付与する。このような基質結合ペプチド(SBP)-基質結合ペプチド(SBP)組み合わせまたは基質結合ペプチド(SBP)-特異的基質組み合わせは、限定するものではないが、例えばヘパリン結合性タンパク質(HBP)-ヘパリン結合性タンパク質(HBP)、ヘパリン結合性タンパク質(HBP)-ヘパリン、GyrB-GyrB(ジャイレースサブユニットB)、FKBP-FRB(FK結合タンパク質-脂質キナーゼタンパク質ホモログFRAPのドメイン(FRB)(FKBP-ラパマイシン結合タンパク質))、FM-FM(FK結合タンパク質のF36M変異)、ToxT-ToxT(V.コレラエ(V.cholerae)のToxTタンパク質)、DHFR-DHFR(ジヒドロ葉酸還元酵素)、FKBP-FKBP(FK結合タンパク質)、FKBP-Cyp(FK結合タンパク質-シクロフィリン)およびCyp-Cyp(シクロフィリン)から選択されることができる。このような結合パートナーは、上記の基質結合ペプチド(SBP)の少なくとも2つのホモ多量体またはヘテロ多量体であることもできる。対応する特異的基質は、限定するものではないが、例えばヘパリン、クマリン抗生物質(GyrB-GyrBに対する)、ラパマイシンまたはFK506および誘導体(例えばラパログ、mTOR阻害薬)(FKBP-FRBおよびFMに対する)、シクロスポリンおよび誘導体(Cypに対する)、FK506(FKBP-FRBおよびFMに対する)、ビルツスタチン(ToxTに対する)ならびにメトトレキサートおよびその誘導体(例えば葉酸拮抗剤)(DHFR-DHFRに対する)から選択されることができ、かつ/または小有機化合物、例えば分子量100〜5,000g/mol、特に100〜2,000g/molの化合物から選択されることができる。
【００３０】
特定の側面によれば、基質結合ペプチド(SBP)は、二量体を形成する傾向を有する基質結合ペプチド(SBP)から選択されることができる。このような基質結合ペプチド(SBP)の特定例は、好ましくは、限定するものではないが、例えばGyrB、FM、ToxT、FKBPおよびDHFRから選択される。これらの基質結合ペプチド(SBP)の二量体化の誘導を可能にする特異的基質は、限定するものではないが、クマリン抗生物質、ラパマイシンおよび誘導体、ビルスタチン、FK1012およびメトトレキサートならびにそれらの誘導体から選択されることができる。これらの特異的基質はまた、これらの基質結合ペプチド(SBP)間の相互作用を誘導および/または分解し、それによって両方の結合パートナー間の相互作用を中和することを可能にする化合物から選択されることができる。なぜなら、その中和によって、両方の基質結合ペプチド(SBP)の相互作用を、例えば競合的に実質的に低下させることができるからである。このような化合物は、例えば、実質的に過剰に用いられた場合の上記の特異的基質であるか、あるいは好ましくは、他の、同じクラスの二量化する化合物の異なる代表、例えばクマリン抗生物質のクラス、ラパマイシンおよび誘導体ならびにメトトレキサート、葉酸拮抗剤およびそれらの誘導体であり、またFK506である。
【００３１】
本明細書に記載の基質結合ペプチド(SBP)の結合パートナーおよびそれらの特異的基質としての核酸は、例えば、E-ETR(E.コリ(E. coli)のMphR(A)タンパク質およびそのオペレーターETR)、PIP-PIR(ストレプトミセス・プリスチナエスピラリス(Streptomyces pristinaespiralis)のPIPタンパク質およびそのオペレーターPIR)、TetR-tetO(Tn10由来テトラサイクリンリプレッサーTetRおよびそのオペレーターtetO)、ArgR-argO(アルギニン応答性リプレッサーおよびそのオペレーターargO)、ArsR-arsO(ヒ素応答性リプレッサーおよびそのオペレーターarsO)ならびにHucR-hucO(尿酸応答性リプレッサーおよびそのオペレーターhucO)である。他のこのような対には、Ramos J. L.ら(Microbiol MoI Biol Rev 69, 326-56, 2005)、Martinez-Bueno M.ら (Bioinformatics 20, 2787-91, 2004)によって記載されているものおよびデータベースBacT調節因子(http://www.bactregulators.org/)に列挙されているものがある。これらの配列は、参照によりその全体が本願に組み込まれる。本発明の多機能性融合タンパク質の構成要素としてこのような基質結合ペプチド(SBP)を用いる場合、その特異的基質は、好ましくは本明細書で使用するPEGポリマーに結合される。このような結合パートナーを用いる場合、相互作用、すなわち本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルを分解するのに適切な特定の化合物は、例えば、マクロライド系抗生物質(E-ETRに対する)、ストレプトグラミン抗生物質(PIP-PIRに対する)、テトラサイクリン抗生物質(TetR-tetOに対する)、アルギニン(ArgR-argOに対する)、重金属(ArsR-arsOに対する)および尿酸(HucR-hucOに対する)である。
【００３２】
本明細書に記載の基質結合ペプチド(SBP)の結合パートナーおよびそれらの特異的基質としての小分子は、例えば、GyrB-クマリン抗生物質、FKBP-mTOR阻害薬、FRB-mTOR阻害薬、FM-mTOR阻害薬、Cyp-シクロスポリン、Cyp-アスコマイシン、DHFR-葉酸代謝拮抗薬、ストレプトアビジン-ビオチンアナログ、アビジン-ビオチンアナログ、ニュートラアビジン-ビオチンアナログ、ステロイドホルモン受容体-ステロイドホルモンおよびそのアナログならびにToxT-ビルスタチン(いずれの場合にも“基質結合ペプチド-特異的基質”で示される)である。特異的基質が小分子の場合、好ましくは、小分子は、好ましくは5,000g/mol未満の分子量、特に100〜5,000g/molの分子量を有する。これに関連して、クマリンおよびアミノクマリン抗生物質は、例えば、ノボビオシン、クロロビオシン、クーママイシンおよびジヒドロノボビオシンを含むことができる。シクロスポリンまたはアスコマイシンは、例えば、シクロスポリンA(NEORAL(登録商標))、ISAtx-247、FK506(タクロリムス)、FK778、ABT-281またはASM981であることができる。mTOR阻害薬は、例えば、ラパマイシンまたはその誘導体、例えばシロリムス(RAPAMUNE(登録商標))、デフォロリムス、テムシロリムス、ゾタロリムス、エベロリムス(Certican(登録商標))、CCI779、ABT578、バイオリムス-7、バイオリムス-9、ラパログ、例えばAP23573、アザチオプリン、campath 1H、S1P受容体モジュレーター、例えばFTY720またはそのアナログであることができる。ラパログは、特に、ラパマイシンに対して以下の修飾の1以上を有するラパマイシンのバリアントを含むことができる:脱メチル化、C7、C42および/またはC29におけるメトキシ基の除去または置換;C13、C43および/またはC28におけるヒドロキシ基の除去、誘導体化または置換;C14、C24および/またはC30におけるケトン官能基の還元、除去または誘導体化;5員ピロリニル環による6員ピペコラート環の置換;ならびにシクロヘキシル環上の代替置換またはシクロヘキシル環の置換シクロペンチル環での置換。考慮されるさらなる修飾は、米国特許第5,525,610号;第5,310,903号および第5,362,718号、さらには米国特許第5,527,907号における背景技術の項に記載されている。C28ヒドロキシ基の選択的エピマー化(WO01/14387)もまた考慮される。WO03/064383およびWO05/16252に記載されているような、種々のリン含有部分を含むラパマイシンアナログの使用もまた考慮される。考慮される他のラパログは、米国特許第6,984,635号、米国特許第6,649,595号および米国特許第7,091,213号に記載されている。葉酸拮抗剤は、例えば、メトトレキサート、トリメトプリムのようなDHFRに結合する化合物、ブロジモプリムおよびエピロプリムまたイクラプリムなどのジアミノピリミジンを含むことができる。考慮される他のDHFR阻害薬は、Hawser S. er al., Biochemical Pharmacology 71, 941-948, 2006 に記載されている。最後に、ビオチンアナログは、例えば、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンまたはアビジンに結合する化合物、例えば、ビオチン、HABA、デスチオビオチン、イミノビオチンまたはジアミノビオチンを含むことができる。好ましくは、本明細書に記載の基質結合ペプチド(SBP)の特異的基質としての上記の小分子は、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルのために本明細書で使用するPEGポリマーに結合させるのに適した誘導体化に供されることができる。��のような誘導体化は、特異的基質へのアミン、アミド、チオール、ヒドロキシル、アルデヒド、アジド、アルキン、ケトン、エポキシドまたはカルボキシ官能基の導入を含むことができる。
【００３３】
本発明においては、特に好ましい基質結合ペプチド(SBP)およびそれらの組み合わせならびにそれらの特異的基質は、好ましくは、以下の基質結合ペプチド(SBP)の組み合わせおよびそれらの特異的基質から選択される:GyrB-GyrBおよびそれらの特異的基質としてのアミノクマリン抗生物質(例えばクーママイシン、ノボビオシンなど)、FM-FMおよびFKBP-FRBならびにそれらの特異的基質としてのラパマイシン、FK506およびその誘導体AP21998およびAP22542など、より好ましくは、組み合わせGyrB-GyrB、FM-FMおよび/またはFKBP-FRBを用いる場合、最も好ましくはGyrB-GyrBおよび/またはFM-FMを用いる場合。
【００３４】
極めて特定の選択肢によれば、本発明の多機能性融合タンパク質の構成要素としての基質結合ペプチド(SBP)はGyrBであることができる。本発明においては、GyrBは、好ましくはエシェリキア・コリ(Escherichia coli)からのDNAジャイレースサブユニットB由来のタンパク質であり、好ましくは、例えば、ノボビオシン、クロロビオシン、クーママイシンおよびジヒドロノボビオシン、好ましくはクーママイシンを含むアミノクマリン抗生物質から選択されるその基質に特異的に結合する。クーママイシンは、2つのGyrB結合部位を有する長いアミノクマリン分子であり、抗生物質としての用途を有するそのIUPAC系統名は、[(3R,4S,5R)-5-ヒドロキシ-6-[2-ヒドロキシ-3-[[4-[[2-ヒドロキシ-7-[(3R,4S,5R)-3-ヒドロキシ-5-メトキシ-6,6-ジメチル-4-(5-メチル-1H-ピロール-2-カルボニル)オキシオキサン-2-イル]オキシ-8-メチル-4-オキソクロ-メン-3-イル]カルバモイル]-3-メチル-1H-ピロール-2-カルボニル]アミノ]-8-メチル-4-オキソクロメン-7-イル]オキシ-3-メトキシ-2,2-ジメチルオキサン-4-イル]5-メチル-1H-ピロール-2-カルボキシラートである。クーママイシンは、GyrBに対する2つの結合部位を含むため、クーママイシンは、同時に2つのGyrBサブユニットに結合することによって、同時に2つのGyrBサブユニットを二量体化することが可能である。この特有の特性は、GyrBのクーママイシンによる二量体化を互いに用いることによって、GyrBタンパク質またはペプチドに連結された2つの基質を架橋するために用いることができる。形成された“二量体”は、例えばさらなるアミノクマリン抗生物質である抗生物質ノボビオシン(IUPAC系統名4-ヒドロキシ-3-[4-ヒドロキシ-3-(3-メチルブト-2-エニル)ベンズアミド]-8-メチルクマリン-7-イル3-O-カルバモイル-5,5-di-C-メチル-α-l-リキソフラノシドを有する)を添加することによりその2つのモノマーGyrBサブユニットに再分解されることができる。ノボビオシンは、GyrBに対してただ1つの結合部位を含む。従って、GyrB/クーママイシン系は、クーママイシンの添加により、GyrBサブユニットを含む本発明の多機能性融合タンパク質で修飾されたPEGポリマーを効率的に架橋し、PEGポリマーのゲル化およびタンパク質-基質-タンパク質相互作用にのみ基づく刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルの形成をもたらすために用いることができる。このような刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルはまた、抗生物質ノボビオシンまたは他のアミノクマリン抗生物質を添加されたとき、特異的に再分解されることができる。なぜなら、これらのアミノクマリン抗生物質は、競合的に特異的にクーママイシンと置換し、従ってタンパク質-基質-タンパク質相互作用を遮断するからである。
【００３５】
本発明においては、本発明の基質結合ペプチド(SBP)としてのGyrBは、エシェリキア・コリからのDNAジャイレースサブユニットB、より好ましくはエシェリキア・コリからのDNAジャイレースサブユニットBのN末端配列、よりさらに好ましくは、配列番号2に記載のエシェリキア・コリからのDNAジャイレースサブユニットBのN末端配列(図5もまた参照のこと)または、配列番号2に記載の配列に対して少なくとも50、60、70もしくは80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、よりさらに好ましくは少なくとも97,5%の同一性を示すアミノ酸配列から選択される。さらに、前記GyrBは、配列番号1に記載の核酸配列(図5もまた参照のこと)または、配列番号1に記載の配列に対して少なくとも50、60、70もしくは80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、よりさらに好ましくは少なくとも97,5%の同一性を示す核酸配列によってコードされることができる。
【００３６】
さらに極めて特定の選択肢によれば、本発明の基質結合ペプチド(SBP)は、ヘパリン結合性タンパク質(HBP)であることができる。このようなヘパリン結合性タンパク質は、例えば(ヒト)ヘパリン結合性増殖因子1(HBGF-1)、(ヒト)ヘパリン結合性増殖因子2(HBGF-2)、(ヒト)ヘパリン結合性増殖因子2(HBGF-2、Genbank NM_002006)、FGF4(Genbank NM_002007)、アズロシジン(Genbank NM_001700)または37kDaのカチオン性抗菌タンパク質(CAP37)などから選択されることができる。前記で定義されているように、ヘパリン結合性タンパク質(HBP)は、好ましくは本発明の多機能性融合タンパク質の一部であり、一般的には基質としてのヘパリンに結合する。従って、前記で定義されているように、ヘパリン結合性タンパク質(HBP)は、基質(単数または複数)としての1つの(またはそれ以上の)ヘパリン分子(単数または複数)による2以上のヘパリン結合性タンパク質の二量体化またはさらには多量体化を可能にする。従って、このようなヘパリン結合性分子は、本発明の多機能性融合タンパク質に含まれた場合、ヘパリンの添加によって、ヘパリン結合性タンパク質を含む融合タンパク質で修飾されたPEGポリマーを効率的に架橋させ、PEGポリマーのゲル化およびタンパク質-基質-タンパク質相互作用のみに基づく刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルの形成をもたらすために用いることができる。このような刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルはまた、競合基質、例えば、過剰量の、すなわちヘパリン結合性タンパク質の各ヘパリン結合性部位を飽和するのに十分な量のヘパリンを添加するとき、特異的に再分解されることもできる。刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルはさらに、競合ヘパリン結合性タンパク質、例えば前記のヘパリン結合性タンパク質または例えば多量体化に用いられるヘパリンに特異的に結合するヘパリン結合性タンパク質受容体2(HBPR2)のいずれかを添加することによって特異的に分解されることができる。このような競合的基質および/またはヘパリン結合性タンパク質が添加されるとき、タンパク質-基質-タンパク質相互作用は遮断され、ゲルは分解される。
【００３７】
さらなる大変特定な選択肢によれば、本発明の基質結合ペプチド(SBP)(およびそのそれぞれの基質)は、リポカリンファミリーの任意のメンバー、または特異的基質に結合するさらなる適切なタンパク質、特に以下のタンパク質/基質組み合わせのタンパク質:FluA-フルオレセイン、DigA-ビオチン-ジゴキシンコンジュゲート、サリチル酸結合タンパク質2(SABP2)-サリチル酸、または互いに相互作用するタンパク質、例えばコンペティターとしてさらにケルセチンと相互作用するFKBP42およびPGP1のいずれかから選択されることができる。これらのタンパク質/基質組み合わせは本発明の生体機能化刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルを提供するために用いることができ、これらは、ヒトへの使用が認可され、ヒト生物体に有害ではない刺激を用いて形成されおよび/または分解することができる。
【００３８】
リポカリンファミリーは、200を超えるメンバーを含み(Darren R. Flower, “The lipocalin protein family: structure and function.” The Biochemical journal 318 (1996) 1-14、これら引用されたリポカリンタンパク質ファミリーのメンバーおよび上記のDarren R. Flower (1996)に記載の配列は、参照により本願に組み込まれる)、その有名なメンバーはFluAおよびDigAである。大部分のリポカリンは、少量の不溶性または化学的に反応性の高い有機化合物のための貯蔵タンパク質または輸送タンパク質である。このファミリーメンバーの全構造は、低い配列同一性にもかかわらず高度に保存されている。しかしながら、結合ポケットを形成するループ領域は著しく異なり、全タンパク質構造に影響を与えることなく特定のリガンドのための基質特異性を得るためにさらに操作されることができる(Steffen Schlehuber, “Anticalins: promising tools for clinical diagonstics.” cli-online.com (2004))。
【００３９】
本発明との関連において、FluAは、好ましくは、フルオレセインに対する高い基質特異性を有する人工のリポカリンとして理解される。リポカリンは、通例、生理学的に重要な化合物の貯蔵タンパク質または輸送タンパク質として役立つ。このタンパク質ファミリーの種々のメンバーは、すべて、ループ領域によって連結された8本のβ-バレルのストランドからなる。このループ領域は大変多様であり、基質結合ポケットを形成する。FluAが操作され、ランダムおよび合理的変異誘発の組み合わせによって改善された。例えば、人工のFluAのフルオレセインに対する基質親和性は1nMである(Beste, G. Schmidt, F. S. Stibora, T.; Skerra, A. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1999, 96, 1898-903Beste et al. 1999; Vopel et. al. 2005; Vopel, S. Muuhlbach, H.; Skerra, A. Biological chemistry 2005, 386, 1097-104)。薬学的に認可されたポリエチレングリコールポリマーは、E.コリ内で過剰発現されたFluAと共有結合でグラフトされ、フルオレセインで標識される(図25参照)。ハイドロゲル形成は、もう1つのタンパク質のフルオレセイン標識、好ましくは本明細書に記載のさらなるFluA分子によって結合されたフルオレセイン標識に対するFluAの結合によって達成される。遊離フルオレセインの添加は、好ましくは、FluAの結合部位との競合的相互作用によってハイドロゲルの用量依存的分解をもたらす。好ましくは、FluAは、配列番号55に記載のアミノ酸配列(図18もまた参照のこと)または配列番号54もしくは55に記載の配列に対して少なくとも50、60、70もしくは80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、よりさらに好ましくは少なくとも97,5%の同一性を示すアミノ酸配列から選択される。さらに、前記FluAは、配列番号54に記載の核酸配列(図18もまた参照のこと)または、配列番号54に記載の配列に対して少なくとも50、60、70もしくは80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、よりさらに好ましくは少なくとも97,5%の同一性を示す核酸配列によってコードされることができる。
【００４０】
さらにまた、本発明においては、DigAは、好ましくは、ジゴキシンに対する操作された親和性を含む人工のリポカリンとして理解される。これは、FluAであるピエリス・ブラシカ(Pieris brassicae)からの天然リポカリンであるビリン結合タンパク質(BBP)に由来した。ジゴキシンに対するおおよそ31nMの基質親和性を達成することができた(Steffen Schlehuber, Gerald Beste, Arne Skerra. “A novel type of receptor protein, based on the lipocalin scaffold, with specificity for digoxigenin.” Journal of Molecular Biology 297 (2000) 1105-20)。図26は、このハイドロゲルの形成および分解を示す。基本的な機構は、FluA-フルオレセインに関して記載したものと同じである。簡潔に言えば、薬学的に認可されたポリエチレングリコールポリマーはDigAと共有結合でグラフトされる。ハイドロゲル形成は、ビオチン-ジゴキシンコンジュゲートおよびストレプトアビジンの添加によって駆動される一方で、DigAはジゴキシンと高親和性で結合し、ストレプトアビジンはビオチンと結合する。本願との関係において、この構築物は、基質結合ペプチド(SBP)(DigA)がその基質(ビオチン-ジゴキシンコンジュゲートおよびストレプトアビジン)に結合したものと考えられる。分解は、ビオチン結合部位と競合する遊離ビオチンの添加によって達成されることができる。ビオチンは種々の代謝反応を促進し、従って高用量で投与することができる。好ましくは、DigAは、配列番号57に記載の配列(図19もまた参照のこと)または、配列番号57に記載の配列に対して少なくとも50、60、70もしくは80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、よりさらに好ましくは少なくとも97,5%の同一性を示すアミノ酸配列から選択される。さらに、前記DigAは、配列番号56に記載の核酸配列(図19もまた参照のこと)または、配列番号56に記載の配列に対して少なくとも50、60、70もしくは80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、よりさらに好ましくは少なくとも97,5%の同一性によってコードされることができる。
【００４１】
さらに、SABP2はSABP2/SABP2様ファミリーに属する。このファミリーは、サリチル酸には結合しないいくつかのメンバーを含む。ジャスモン酸またはアブシジン酸などのようなストレスホルモンに対して親和性を示すものもある。さらに、配列分析によって、植物のいくつかのヒドロキシニトリルリアーゼおよび動物からのレシチン(ホスファチジルコリン)コレステロールアシルトランスフェラーゼがSABP2Lタンパク質に分類されることが見出された。
【００４２】
本発明においては、サリチル酸結合タンパク質2(SABP2)は、好ましくはタバコに由来し、動物における免疫応答に類似する植物の全身獲得抵抗性(SAR)に重要な役割を果たしている。SARは、病原菌に対する長期持続性の広域スペクトル抵抗性を提供する。SABP2は、サリチル酸(SA;Kd=90nM)に対して高親和性を有するサリチル酸メチル(MeSA)エステラーゼであり、サリチル酸は、そのエステラーゼ活性のフィードバック阻害剤として機能する(Farhad Forouhar, Yang Yue, Dhirendra Kumar, Yang Chen, Eyal Fridman, Sang Wook Park, Yiwen Chiang, et al. “Structural and biochemical studies identify tobacco SABP2 as a methyl salicylate esterase and implicate it in plant innate immunity.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102 (2005) 1773-8)。図27は、ハイドロゲル形成のためにどのようにしてSABP2が用いられるかを示す。SABP2はE.コリで過剰発現され、ホモ二量体で精製され、タンパク質1分子当たり2つのSA結合部位を生じる(Farhad Forouhar et al, 2005、前出)。薬学的に認可されたポリエチレングリコールポリマーは3-アミノ-SAとグラフトされる。ハイドロゲル形成は、活性部位へのPEG化3-アミノ-SAの結合により駆動される。遊離SAの添加により結合ポケットから3-アミノ-SAが置換され、従ってハイドロゲルの分解が生じる。SAは、アスピリンの主代謝物であるため、SAはアセチルサリチル酸(アスピリン)の形で投与されることができる。1日当たり8gまでのアスピリンを摂取することができる。好ましくは、SABP2は、配列番号59に記載のアミノ酸配列(図20もまた参照のこと)、配列番号61に記載のアミノ酸配列(図21もまた参照のこと)または、配列番号59もしくは61に記載の配列に対して少なくとも50、60、70もしくは80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、よりさらに好ましくは少なくとも97,5%の同一性を示すアミノ酸配列から選択される。さらに、前記SABP2は、配列番号58に記載の核酸配列(図20もまた参照のこと)、配列番号60に記載の核酸配列(図21もまた参照のこと)または、配列番号58もしくは60に記載の配列に対して少なくとも50、60、70もしくは80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、よりさらに好ましくは少なくとも97,5%の同一性を示す核酸配列によってコードされることができる。配列番号61(アミノ酸配列)は、前記で定義されているように、SABP2に記載の配列にS81A変異を含む。配列番号60は、コードする核酸配列である。
【００４３】
さらに、FKBPファミリーメンバーの大部分はFK506に結合し、ペプチジルプロリルシス/トランス異性化酵素(PPIアーゼ)活性を示す(Kang, Cong Bao, Ye Hong, Sirano Dhe-Paganon, Ho Sup Yoon. “FKBP family proteins: immunophilins with versatile biological functions.” Neuro-Signals 16 (2008) 318-25)。FKBP42はFK506結合タンパク質である。PGP1は、フルサイズABCトランスポーターのサブグループである多剤耐性タンパク質(MDR)またはP糖タンパク質のファミリーに属する。ABCトランスポーターは、解毒およびイオン調節過程ばかりでなく、植物成長過程にも関与している(Enrico Martinoia, Markus Klein, Markus Geisler, Lucien Bovet, Cyrille Forestier, Uner Kolukisaoglu, Bernd Muller-Rober, Burkhard Schulz. “Multifunctionality of plant ABC transporters - more than just detoxifiers.” Planta 214, (2002) 345-355)。
【００４４】
本発明においては、タンパク質FKBP42は、好ましくはアラビドプシス(Arabidopsis)FK506結合タンパク質(FKBP42)であり、これはアラビドプシスの多剤耐性様ABCトランスポーターAtPGP1のC末端ドメインと相互作用する。両方のタンパク質は植物成長にとって重要である。例えば、AtPGP1は、オーキシン輸送およびオーキシンによる成長に関与する。この相互作用はその一次アミノ酸配列に依存し、グリコシル化は必要がないことが明らかにされた(Rodolphe Bouchard, Karla Billion, Markus Geisler, Joachim Berger, Beate Saal, Nathalie Frangne, Zsuzsanna Koncz-ka, “TWISTED DWARF1 , a Unique Plasma Membrane- anchored Immunophilin-like Protein , Interacts with Arabidopsis Multidrug Resistance-like Transporters AtPGP1 and AtPGP19.” Molecular Biology of the Cell 14 (2003) 4238  4249)。さらにまた、Baillyら(Aurelien Bailly, Valpuri Sovero, Vincent Vincenzetti, Diana Santelia, Dirk Bartnik, Bernd W Koenig, Stefano Mancuso, Enrico Martinoia, and Markus Geisler. “Modulation of P-glycoproteins by auxin transport inhibitors is mediated by interaction with immunophilins.” The Journal of biological chemistry 283 (2008) 21817-26)は、その相互作用が、フラボノイドケルセチンによって、〜200nMのIC50で破壊されることができることを測定した。FKBP42およびAtPGP1を薬学的に認可されたポリエチレングリコールポリマーに結合させることによって、ハイドロゲル形成が達成される(図28参照)。ケルセチンの添加によってこのタンパク質-タンパク質相互作用が破壊され、それによってハイドロゲルが分解される。ケルセチンは抗酸化物質であり、ヒトの健康に多くの有益な効果を有すると考えられる。一般的には、臨床には、経口用量400〜500mg、1日3回が用いられている(Gideon Rodan, “Mechanisms of Action of Bisphosphonates.” Annual Review of Pharmacology and Toxicology 38 (1998) 375-388)。好ましくは、FKBP42は、配列番号62に記載の核酸配列(図22もまた参照のこと)によってコードされるかまたはそれによってコードされるアミノ酸配列から選択され、または配列番号62に記載の核酸配列に対して少なくとも50、60、70もしくは80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、よりさらに好ましくは少なくとも97,5%の同一性を示す核酸配列によってコードされるかまたはそれによってコードされるアミノ酸配列から選択される。さらに、前記FKBP42は、配列番号64に記載のアミノ酸配列(図22もまた参照のこと)または、配列番号64に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも50、60、70もしくは80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、よりさらに好ましくは少なくとも97,5%の同一性を示すアミノ酸配列から選択されることができるか、または、配列番号63に記載の核酸配列(図22もまた参照のこと)または、配列番号63に記載の配列に対して少なくとも50、60、70もしくは80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、よりさらに好ましくは少なくとも97,5%の同一性を示す核酸配列によってコードされることができる。前記で定義されているように、配列番号64(アミノ酸配列)は、配列番号62に記載のコードされたaa配列のaa1〜163を含む。配列番号63はコードする核酸配列に相当する。
【００４５】
同様に、好ましくは、AtPGP1は、配列番号66に記載のアミノ酸配列(図23もまた参照のこと)、配列番号68に記載のアミノ酸配列(図24もまた参照のこと)または、配列番号66もしくは68に記載の配列に対して少なくとも50、60、70もしくは80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、よりさらに好ましくは少なくとも97,5%の同一性を示すアミノ酸配列から選択される。さらに前記AtPGP1は、配列番号65に記載の核酸配列(図23もまた参照のこと)、配列番号67に記載の核酸配列(図24もまた参照のこと)または、配列番号65もしくは67に記載の配列に対して少なくとも50、60、70もしくは80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、よりさらに好ましくは少なくとも97,5%の同一性を示す核酸配列によってコードされることができる。配列番号68(アミノ酸配列)は、前記で定義されているように、配列番号66に記載のアミノ酸配列の980〜1286を含む。配列番号67はコードする核酸配列に相当する。
【００４６】
本発明においては、AtPGP1およびFKBP42は、共に、基質結合タンパク質(SBP)または基質として用いることができる。正確には、本発明においては、FKBP42は基質結合タンパク質(SBP)として用いることができ、AtPGP1は、この基質結合タンパク質(SBP)の基質として用いることができる。あるいは、本発明においては、AtPGP1は基質結合タンパク質(SBP)として用いることができ、FKBP42は、この基質結合タンパク質(SBP)の基質として用いることができる。ケルセチンの添加によってタンパク質-タンパク質相互作用は破壊され、それによってハイドロゲルは分解される。いずれの場合においても、基質として用いられるタンパク質は、好ましくは二量体として提供され、ここでこのような二量体は、リンカー、好ましくは本明細書に記載のリンカー、より好ましくはペプチドリンカーと2つのこのようなタンパク質を連結させるか、あるいは化学架橋剤を用いてこれらのタンパク質を適切に架橋することによって提供されることができる。このようなタンパク質の製造の目的で、単量体タンパク質の製造後、例えば細菌発現によるモノマー(一本鎖)タンパク質の発現後に、あるいは例えば細菌発現による、コードされるペプチドリンカー(1つのリーディングフレーム内の2つのコードされる基質タンパク質の間に位置する)を含む二量体タンパク質の発現によって、あるいは例えば化学架橋法またはペプチドリンカーを用いる単量体タンパク質の二量体化または架橋によってこれらの二量体を製造することができる。ペプチドリンカーは、好ましくは、4、5、5〜10または10〜約25アミノ酸の短いリンカーペプチドから選択される。リンカーは、通例、柔軟性のためにグリシンに富み、溶解性のためにセリンまたはトレオニンに富む。さらに、前記リンカーは、任意の適切な位置、好ましくはこれに関連して用いられる単量体タンパク質のN末端もしくはC末端のいずれかに位置することができる。あるいは、このようなリンカーは、本明細書に記載のマルチアームPEGまたは、好ましくは本明細書に記載のPEGから選択された非分岐PEGのいずれかの本明細書に記載のPEGであることができる。
【００４７】
これらのタンパク質、特にリポカリン、FluA、DigA、SABP2、AtPGP1およびFKBP42は、好ましくは、それらの対応するタンパク質ファミリーの、好ましくは、リポカリンファミリー、SABP2/SABP2様ファミリー、FKBPファミリーなどの単なる代表に過ぎない。故に、本発明においては、適切な基質結合タンパク質(または適用可能な場合、適切な基質)は、前記タンパク質ファミリーのさらなるメンバーをさらに含むことができる。このような、これらのタンパク質ファミリーのさらなるメンバーは、好ましくは、これらのタンパク質のホモログ、例えば(他の)植物のホモログ、そして好ましくは、上記の範囲内のより具体的に特定されたタンパク質リポカリン、FluA、DigA、SABP2、AtPGP1およびFKBP42のいずれかに配列同一性を示すホモログを含む。故に、それぞれのハイドロゲルの設定において、前記タンパク質は、前記ファミリーのこのような他のメンバーおよびそれらの個々の結合パートナーによって置換されることができる。
【００４８】
さらなる好ましい側面によれば、本発明の多機能性融合タンパク質の基質結合ペプチド(SBP)は、抗体フラグメント、好ましくは抗体の一本鎖抗体(scFv)、好ましくは基質に結合することができるものであることができ、この基質は、同じタイプの抗体のさらなる一本鎖抗体(scFv)によってさらに結合されることができる。これに関連して、抗体の一本鎖抗体(scFv)は、好ましくは、4、5、5〜10または10〜約25アミノ酸の短いリンカーペプチドで連結された、免疫グロブリンのH鎖(VH)およびL鎖(VL)の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは、通例、柔軟性のためにグリシンに富み、溶解性のためにセリンまたはトレオニンに富む。さらに、前記リンカーは、VHのN末端とVLのC末端を連結させることもできるし、逆もまた同様である。このタンパク質は、定常領域の除去およびリンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持している。本発明においては、特に好ましい一本鎖抗体(scFv)は、一般的には医療に用いられ、より好ましくは診断医療などに用いられる造影剤に対する特異性を含むことができる。これに関連して、特に好ましい造影剤は、特に、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、FITC(フルオレセインイソチオシアネート)またはそれらの誘導体などであり、これらはさらに、本明細書に記載の対応する基質結合ペプチドa(SBP)の基質、特にこのような特異性を有する一本鎖抗体(scFv)の基質として用いることができる。例示的な一本鎖抗体(scFv)は、例えば、Vaughanら(1996)(Vaughan et al., (1996), Nat. Biotechnol 14 (3), S. 309-314 を参照のこと)で公表されているFITC-E2と名付けられたフルオレセインに対するscFvであることができる。このようなscFvは、例えばPedrazzi et al, (1997), FEBS Lett 415 (3), S. 289-293)(E.コリのペリプラズムにおいて発現を示す)またはRippmann et al., (1998), Appl. Environ. Microbiol 64 (12), S. 4862-4869)(プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)のL型細胞において発現を示す)において、C末端ヘキサヒスチジンタグ付きバージョンとして組換えにより製造されることができる。E.コリまたはプロテウス・ミラビリスのいずれかにおける発現が特に好ましい。好ましいタンパク質配列は、図33(配列番号69)に示すように製造されたscFvのアミノ酸配列(ペリプラズムのシグナル配列の除去後の配列)または、配列番号69に記載の配列に対して少なくとも50、60、70もしくは80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、よりさらに好ましくは少なくとも97,5%の同一性を示すアミノ酸配列であることができる。
【００４９】
さらにまた、このような基質結合タンパク質および同様に特異的scFv断片(前記で定義されているようにSBPとして機能する)を含むこのような多機能性融合タンパク質によって結合される基質は、例えばフルオレセイン、FITC、またはそれらの誘導体であることができる。この基質は、さらに、ウシ血清アルブミン(BSA)またはアミン修飾マルチアームPEG誘導体に結合されることができる。さらに、任意のこのような基質または基質構築物を、本発明の生体機能化刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルの形成に用いることができる。基質または基質構築物は、BSA-フルオレセイン、BSA-FITC、PEG-フルオレセイン、PEG-FITCなどで示すことができ、さらにそれは、本発明の多機能性融合タンパク質と結合したPEGと接する本発明の概念の範囲内の架橋剤として機能する。ポリマーとしては、好ましくはマルチアームPEG-VSが用いられ、これはscFvまたは本明細書に記載の対応する多機能性融合タンパク質、例えばシステインを含むもの(例えば、GyrBハイドロゲルに関して示したようにC末端に)で機能化されることができる。
【００５０】
本発明の多機能性融合タンパク質のscFvは、それ自身で架橋することができるように、フルオレセイン、FITCまたはそれらの誘導体で、さらに直接に修飾されることができる。これに代えて、あるいはこれに加えて、本明細書に記載の増殖因子を、多機能性融合タンパク質内のscFvと融合タンパク質を形成させるために用いることができる。このような増殖因子は、本明細書に記載の融合タンパク質に組み込まれることができる。
【００５１】
本発明の多機能性融合タンパク質のためのscFvと同様な適切なタンパク質の他の例は、ラクダ/サメ抗体、アドネクチン、タンパク質Zドメイン(本明細書を参照のこと)、ダルピン(darpin)、アンチカリンなどを含むことができる。
【００５２】
本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルのPEGポリマーを修飾するために用いられる多機能性融合タンパク質は、さらに、繰り返しRGD結合ペプチドを含むことができ、好ましくは式(RGDn)(RGDnまたは(RGD)nとしても定義される)を含むものを含むことができる。一般的には、式(RGDn)(式(RGDn)(RGDnまたは(RGD)nとしても定義される)の多機能性融合タンパク質のこのような繰り返しRGD結合ペプチドは、少なくとも1つのRGDペプチド配列、好ましくは少なくとも2つのRGDペプチド配列、またはさらには3つ、4つ、5つまたはそれ以上のRGDペプチド配列を含むペプチドであることができ、すなわちnは1、2、3、4、5またはさらにはそれ以上であることができ、好ましくは、nは1〜5、1〜4、1〜3、2〜5、2〜4、2〜3または3〜5、3〜4または4〜5である。これに関連して、RGDペプチド配列は、一般的には3(連続)アミノ酸RGD("アルギニン-グリシン-アスパラギン酸”のための1文字アミノ酸コードの略語である)を好ましくは示された順序で含む配列である。繰り返し回数の数は、好ましくは、上記の整数nによって決定される。このようなRGD配列は、一般的には、細胞外マトリックスタンパク質に対するインテグリン認識配列の一部に相当する。これに関連して、インテグリンは、細胞とその周囲の組織、例えば他の細胞または細胞外マトリックス(ECM)との間の接着を媒介する受容体として知られている。インテグリンはまた、細胞のシグナル伝達にも関与し、それによって細胞形状、移動性を定め、細胞周期を制御する。インテグリンを介して多価融合タンパク質への細胞の結合を可能にする本発明の目的のために用いることができるRGD配列は、一般的にはECMタンパク質またはRGDペプチド配列を含むペプチドまたは合成配列に由来し、いずれの場合にも、アミノ酸配列アルギニン-グリシン-アスパラギン酸(1文字アミノ酸コードでは"RGD")を含む。本発明の多機能性融合タンパク質に組み込まれることができるこのような細胞特異的接着配列は、例えばHerselら(2003)(Hersel et al., Biomaterials 24 (2003), 4385-4415)によって概説され、リストされている。このような特異的RGDペプチド配列に関するHerselら(2003、前出)におけるそれぞれの開示および、そこに開示された特異的RGD配列は、好ましくはその全体が参照により本願に組み込まれる。よりさらに好ましくは、このようなRGD配列は、限定するものではないが、以下のアミノ酸配列の少なくとも1つから選択されることができ:
RGD(もしくはRGDnもしくは(RGD)n)(配列番号3)、RGDS(配列番号4)、(RGDS)n(配列番号5)(式中、nは好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上である)、GRGD(配列番号6)、RGDV(配列番号7)、RGDT(配列番号8)、GRGDG(配列番号9)、GRGDS(配列番号10)、GRGDY(配列番号11)、GRGDF(配列番号12)、YRGDS(配列番号13),YRGDG(配列番号14)、YGRGD(配列番号15)、GRGDSP(配列番号16)、GRGDSG(配列番号17)、GRGDSP(配列番号18)、GRGDSY(配列番号19)、GRGDVY(配列番号20)、GRGDSPK(配列番号21)、CGRGDSPK(配列番号22)、CGRGDSY(配列番号23)、YAVTGRGDS(配列番号24)(RGDミメティックチロシン足場)、AcCGGNGEPRGD(配列番号25)、YRAY-NH2(配列番号26)、AcGCGYGRGDSPG(配列番号27)、RGDSPASSKP(配列番号28)、AcGRGDSPASSKG(配列番号29)、
あるいは環式RGD配列、例えば、βAXEPRGDNYRC(配列番号30)(式中、Xは、修飾アミノ酸Dap(2,3-ジアミノプロピオン酸)を表し、βAはb-アラニンを表し、この環式RGD配列は以下の構造:
2013544248.tif 000003
を有する)、KRGDf(配列番号31)(式中、fはフェニルアラニンのD-アミノ酸バリアントを表し、この環式RGD配列は以下の構造:
2013544248.tif 000004
を有する)、GPenGRGDSPCA(配列番号32)(式中、Penはペニシリンを表し、この環式RGD配列は以下の構造:
2013544248.tif 000005
を有する)、vRGDE(配列番号33)(式中、vはバリンのD-アミノ酸バリアントを表し、この環式RGD配列は以下の構造:
2013544248.tif 000006
を有する)などから選択されることができ、あるいは配列番号3〜33のいずれかに記載の配列に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、よりさらに好ましくは少なくとも97,5%の同一性を示すアミノ酸配列から選択されることができる。
【００５３】
本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルのPEGポリマーを修飾するために用いられる本発明の多機能性融合タンパク質は、さらに、少なくとも1つのN末端および/またはC末端リンカーを含むことができる。従って、リンカーは、本発明の多機能性融合タンパク質のN末端、C末端またはN末端およびC末端に位置することができる。このようなN末端および/またはC末端リンカーは、共有結合または(強力、特異的な)非共有結合によって、本発明の多機能性融合タンパク質を、本明細書に記載のPEGポリマーに(または(さらに)本明細書に記載のさらなる構成要素に)結合させるために用いることができる。本発明の意味において、(強力かつ特異的な)非共有結合は、生理的条件下で105M未満の解離定数を有する結合である。本発明における適切なリンカーは、好ましくは、例えば、多価金属イオンに結合するNTAおよびポリヒスチジンなどのキレート形成物質、アミノ酸、チオール含有部分、例えばチオール修飾もしくはチオール含有アミノ酸など、システイン、ホモシステイン、任意のさらなるチオール含有部分、マレイミドに連結されたチオール、ビニルスルホン部分、ペプチド配列、ペプチド結合、ハロタグ(Los G.V. et al., Methods MoI Biol. 356, 195-208, 2007)、SNAPタグもしくはCLIPタグ(Gautier A. et al., Chem Biol. 15, 128-36, 2008) またはトランスグルタミナーゼ反応結合 (Ehrbar M. et al., Biomaterials 29, 1720-9, 2008)を含むかまたは含有する。この目的のために、本発明に従って用いられるPEGポリマーは、好ましくは、本発明の多機能性融合タンパク質へのこのようなリンカーの共有結合または非共有結合を可能にするために、本発明の多機能性融合タンパク質の導入の前に相応じて修飾されている。
【００５４】
本発明の多機能性融合タンパク質が、例えば本発明の多機能性融合タンパク質のN末端またはC末端にただ1つのリンカーを含む場合、このリンカーは、好ましくは、本発明の多機能性融合タンパク質を、好ましくは共有結合によって共有結合指させるのに用いられる。本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルのPEGポリマーを修飾するために用いられる本発明の多機能性融合タンパク質が、例えば本発明の多機能性融合タンパク質のN末端およびC末端に2つのリンカーを含む場合、第1リンカーは、好ましくは共有結合によってPEGポリマーに本発明の多機能性融合タンパク質を共有結合させるのに用いるのが好ましく、第2リンカーは、好ましくは共有結合によって、本発明の多機能性融合タンパク質にさらなる構成要素を共有結合させるのに用いられるのが好ましい。
【００５５】
極めて特定の側面によれば、本発明の多機能性融合タンパク質は、チオール含有部分、例えばチオール修飾もしくはチオール含有アミノ酸、システイン、ホモシステイン、任意のさらなるチオール含有部分、マレイミドに連結されたチオール、ビニルスルホン部分などを含むかまたはそれらから選択される。チオール含有部分を用いる場合、結合、好ましくはPEGポリマーまたはさらなる構成要素への結合は共有結合によって行われ、好ましくはチオエーテル結合によって行われる。この目的のために、例えば本発明に従って用いられるPEGポリマー(またはさらなる構成要素)は、好ましくは、例えばチオエーテル結合によってチオール含有部分と本発明の多機能性融合タンパク質の対応する反応性基との共有結合を可能にするために、本発明の多機能性融合タンパク質を導入されるまえに相応じて修飾されている。例えばチオエーテル結合によって、さらなる構成要素と本発明の多機能性融合タンパク質とを共有結合させるために、少なくとも1つのN末端および/またはC末端チオール含有部分もまた用いることができる。本発明の多機能性融合タンパク質がただ1つのチオール含有部分、例えばシステイン部分を含む場合、チオール含有部分は、好ましくは、チオエーテル結合によって、本発明の多機能性融合タンパク質とPEGポリマーとを共有結合させるために用いられる。本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルのPEGポリマーを修飾するために用いられる本発明の多機能性融合タンパク質が、2つのチオール含有部分、すなわち本発明の多機能性融合タンパク質のN末端およびC末端における2つのチオール含有部分を含む場合、第1チオール含有部分は、好ましくは、チオエーテル結合によって、本発明の多機能性融合タンパク質とPEGポリマーとを共有結合させるために用いられ、第2チオール含有部分は、好ましくは、チオエーテル結合によって、さらなる構成要素と本発明の多機能性融合タンパク質とを共有結合させるために用いられる。これに関連して、このようなさらなる構成要素は、本明細書に記載の細胞、本明細書に記載のタンパク質、本明細書に記載の融合タンパク質、本明細書に記載のさらなるPEGポリマーまたは本明細書に記載の任意の他の構成要素であることができ、ここで、さらなる構成要素は、好ましくは、例えばチオエーテル結合によって本発明の多機能性融合タンパク質のチオール含有部分との共有結合を可能にするこのような結合を調製する前に相応じて修飾されている。
【００５６】
さらなる特定の側面によれば、本発明の多機能性融合タンパク質のリンカーは、以下の表に記載の共役リンカーを含むかまたはそれらから選択されることができる。好ましくは、リンカーは、例えばアミン、チオール含有部分(例えばチオール、システイン)、リジン、グルタミン、N末端システイン、アミン、アミンまたはカルボキシル基などの1以上から選択されることができる。このような目的のために、PEGポリマーは、好ましくは、例えば、アミンの場合は例えばN-ヒドロキシルスクシンイミド(NHS)によって、チオール含有部分(例えばチオール、システイン)の場合は例えば前記のようにマレイミドもしくはビニルスルホンによって、リジンの場合は例えばグルタミンによって、グルタミンの場合は例えばリジンによって、N末端システインの場合は例えばチオエステルによって、アミンの場合は例えばアルデヒドによって、カルボキシル基の場合は例えばアミンによって相応に修飾される。これに関連して、共有結合は、当業者に公知の任意の化学、例えばLottspeichおよびEngels(2006)第6.1章および第6.3.1章に概説されている化学を用いて実施することができる(Lottspeich, Friedrich; Engels, Joachim W. (2006): Bioanalytik. 2. Aufl. Munchen, Heidelberg: Elsevier, Spektrum, Akad. Verl. を参照のこと)。
【００５７】
限定するものではないが、リンカーの特定例および本明細書に記載のPEGポリマーの好ましい官能基化を以下の表に示す:
【表１】
2013544248.tif 000007
【００５８】
本発明の多機能性融合タンパク質は、精製用タグ(精製タグまたはタグ)、すなわちその特有の親和性によって融合タンパク質の回収を可能にする、本発明の多機能性融合タンパク質に付加されたアミノ酸のストレッチを含むこともできる。好ましくは、精製タグは、その近づきやすさを確実にし、融合タンパク質またはペプチドの種々の構成要素のタンパク質フォールディングを乱さないように、融合タンパク質またはペプチドのN末端またはC末端のいずれか(またはそれらの近く、例えばN末端またはC末端のいずれかと決定された場合、融合ペプチドの第2構成要素として)に付加される。本発明の文脈内の精製タグは、例えば、His6タグ、FLAGタグ、HAタグ、MYCタグなどを含む。これに関連して、Hisタグは、好ましくは、6ヒスチジン(His)残基(His6タグ)からなるタグであり、これは、本発明の多機能性融合タンパク質を、ニッケルまたはコバルト段に対する親和性によって回収することを可能にする。FLAGタグは、好ましくは、例えば配列DYKDDDDK(配列番号34)またはさらなる配列を含み、これは、本発明の多機能性融合タンパク質の特異的抗体による回収を可能にする。本発明の文脈内のHAタグは、一般的には、インフルエンザタンパク質ヘマグルチニン(HA)由来のエピトープ:例えばYPYDVP(配列番号35)との融合体であり、HA抗体による回収を可能にする。最後に、MYCタグは、通例、ヒトプロトオンコプロテインMYC由来のエピトープ:例えばILKKATAYIL(配列番号36)、EQKLISEEDL(配列番号37)との融合体であり、MYC抗体による回収を可能にする。さらなる精製タグは当業者に公知であり、本発明における多機能性融合タンパク質に適合させ、適切に用いることができる。
【００５９】
本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルのPEGポリマーを修飾するために用いられる多機能性融合タンパク質は、Fcドメインを結合させ、それによってFcドメインを介したZZドメインへのさらなる(ペプチドまたはタンパク質)構成要素の結合を可能にするさらなる結合ドメイン、例えばZZドメインを含むこともできる。本発明の目的に適したこのようなZZドメインは、例えばベクターpEZZ-18(GEヘルスケア社)に記載のZZドメインまたはIshikawa-Sakuraiら(2004)(Ishikawa-Sakurai et al., Human Molecular Genetics, 2004, Vol. 13, No. 7 693702 参照)に記載のZZドメイン、好ましくはジストロフィン(配列番号38)およびユートロフィン(配列番号39)のZZドメインを示す配列AKHQAKCNICKECPIIGFRYRSLKHFNYDICQSCFFSGR(配列番号38)もしくは配列AKHQAKCNICKECPIVGFRYRSLKHFNYDVCQSCFFSGR(配列番号39)、または配列(M)AQHDEAVDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLL AEAKKLNDAQAPKVDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKVDANSS(配列番号40(図7のアミノ酸1または2〜129)もまた参照のこと)、あるいは、配列番号38〜40のいずれかに記載の配列に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、よりさらに好ましくは少なくとも97,5%の同一性を示すアミノ酸配列から選択されることができる。
【００６０】
本発明に記載の本発明の多機能性融合タンパク質(および場合により特異的基質または任意のさらなる化合物)の、例えば上記のリンカーを介した本明細書に記載のPEGポリマーへの結合は、構成要素と混合することによって、好ましくは本明細書に記載の範囲内で、結合される構成要素の濃度を変えることによって行うことができる。これによって、好ましくは、構成要素が互いに相互作用することを可能にし、それによって結合を形成させる。
【００６１】
本発明の多機能性融合タンパク質を、場合により特異的基質または任意のさらなる化合物をPEGポリマーに結合させ、それによってこのポリマーを架橋させてPEGハイドロゲルを形成させるのに適切な、上記のこのようなリンカーに付け加えて、本発明の刺激応答性PEGハイドロゲル、従って本発明に記載の多機能性融合タンパク質に用いられるPEGポリマーにさらなる(クロス)リンカーを導入することができる。これによって、本発明の刺激応答性PEGハイドロゲルのさらなる(化学)架橋を可能にすることができる。適切なクロスリンカーは、例えば、もう1つの分子、例えばBioconjugate Technique (Greg T. Hermanson著(第2版)、Academic Press、2008)に記載の分子に結合するための少なくとも2つの部位を示す任意のホモまたはヘテロ官能化化合物である。
【００６２】
PEGポリマーを修飾するために用いられる本発明の多機能性融合タンパク質の構成要素は、本発明の多機能性融合タンパク質のN末端および/またはC末端に決定された場合、その融合タンパク質のいずれの位置に位置することもできる。しかしながら、本発明の多機能性融合タンパク質は、それらの特異的基質との相互作用による基質結合ペプチド(SBP)の効果的な多量体化またはその特異的基質への基質結合ペプチド(SBP)の結合および並行して細胞の効果的な結合の両方を可能にするように構成されることが好ましい。さらにまた、場合により、それは例えばさらなる結合配列によりさらなる分子の結合を可能にするものとする。
【００６３】
従って、本発明の多機能性融合タンパク質は、限定するものではないが、基質結合ペプチド(SBP)、上記の繰り返しRGD結合ペプチドおよび少なくとも1つのN末端および/またはC末端リンカーを、例えば以下の順序(N末端からC末端まで(N-または-Cで記載される))の少なくとも1つで含むことができる:
2013544248.tif 000008
など。
【００６４】
さらにまた、本発明の多機能性融合タンパク質は、限定するものではないが、基質結合ペプチド(SBP)、繰り返しRGD結合ペプチドならびに少なくとも1つのN末端および/またはC末端リンカーならびに精製用タグを、例えば以下の順序(N末端からC末端まで(N-または-Cで記載される))の少なくとも1つで含むことができる:
2013544248.tif 000009
など。
【００６５】
本発明の多機能性融合タンパク質はまた、限定するものではないが、基質結合ペプチド(SBP)、繰り返しRGD結合ペプチドならびに少なくとも1つのN末端および/またはC末端リンカー、本明細書に記載のZZ結合ドメインならびに場合により精製用タグを、例えば以下の順序(N末端からC末端まで(N-または-Cで記載される))の少なくとも1つで含むことができる:
2013544248.tif 000010
など。
【００６６】
これに加えて、あるいはこれに代えて、PEGポリマーを修飾するために用いられる少なくとも1つの多機能性融合タンパク質は、構成要素として、上記の基質結合ペプチド(SBP)、好ましくは上記のZZドメイン、好ましくは上記の精製用タグならびに少なくとも1つのN末端および/またはC末端リンカーを含むことができる。従って、本発明の多機能性融合タンパク質は、限定するものではないが、構成要素として、上記の基質結合ペプチド(SBP)、好ましくは上記のZZドメイン、好ましくは上記の精製用タグならびに少なくとも1つのN末端および/またはC末端リンカーを、例えば以下の順序(N末端からC末端まで(N-または-Cで記載される))の少なくとも1つで含むことができる:
2013544248.tif 000011
など。
【００６７】
同様にさらに、本明細書に記載のPEGポリマーは、構成要素として好ましくは上記のZZドメイン、好ましくは上記の精製用タグならびに少なくとも1つのN末端および/またはC末端リンカーを含む少なくとも1つの多機能性融合タンパク質を用いて修飾することができる。従って、本発明の多機能性融合タンパク質は、限定するものではないが、構成要素として、上記のZZドメイン、好ましくは上記の精製用タグならびに少なくとも1つのN末端および/またはC末端リンカーを、例えば以下の順序(N末端からC末端まで(N-または-Cで記載される))の少なくとも1つで含むことができる:
2013544248.tif 000012
など。
【００６８】
本発明に記載の少なくとも1つの多機能性融合タンパク質の種々の構成要素は、好ましくは、互いに直接に連結されるか、またはスペーサーを介して連結される。多機能性融合タンパク質の種々の構成要素がスペーサーを介して連結される場合、スペーサーは好ましくはペプチドスペーサーである。ペプチドスペーサーは、一般的には、1〜20、好ましくは1〜10アミノ酸、より好ましくは1〜5、よりさらに好ましくは1〜3アミノ酸の長さを有する。場合によっては、ペプチドスペーサー配列は、より長いことができ、21〜50アミノ酸を含むことができる。ペプチドスペーサーは、種々のアミノ酸配列で構成されることができる。従って、このようなペプチドスペーサーは、好ましくは、本発明に記載の多機能性融合タンパク質の少なくとも2つの構成要素の間、より好ましくは、本発明に記載の多機能性融合タンパク質の3つ、4つまたはさらには5つまたはすべての構成要素の間にペプチド結合によって挿入される。好ましくは、ペプチドスペーサーは、連結される多機能性融合タンパク質の単一構成要素の間にいくらかの構造的柔軟性を導入する。このようなスペーサーを導入することにより、例えば、ペプチドスペーサー配列内に、好ましくは少なくとも30%、より好ましくは少なくとも40%よりさらに好ましくは少なくとも60、70、75、80、85、90またはさらには95または100%のプロリンおよび/またはグリシン残基ならびにペプチドスペーサー配列内に場合により1〜10、1〜20、1〜30もしくは1〜40%のセリン残基を有する、種々のグリシンまたはプロリン残基および場合によりセリン残基を含むペプチドスペーサー、例えば、(SGGG)n(配列番号41)、(SGGGG)n(配列番号42)または(SGGGGG)n(配列番号43)に記載の配列(式中、nは好ましくは1、2、3、4、5などである)を示すスペーサーを有することにより、構造的柔軟性が得られる。さらにまた、このようなスペーサーにより、必要に応じて、多機能性融合タンパク質の他の構成要素に対する十分な距離を提供することができる。その構造(ペプチドスペーサー)とは関係なく、スペーサーは、好ましくは免疫学的に不活性であることができる。
【００６９】
本明細書に記載の特に好ましい本発明の多機能性融合タンパク質は、pRG107(核酸配列:配列番号44をコードする、タンパク質配列:配列番号45)、pRG111(核酸配列:配列番号46をコードする、タンパク質配列:配列番号47)もしくはpRG116(核酸配列:配列番号48をコードする、タンパク質配列:配列番号49)、または配列番号45、47もしくは49のいずれかに記載の配列に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、よりさらに好ましくは少なくとも97,5%の同一性を示すアミノ酸配列、または配列番号44、46もしくは48のいずれかに記載の配列に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、よりさらに好ましくは少なくとも97,5%の同一性を示す核酸配列によってコードされるアミノ酸配列に記載の多機能性融合タンパク質から選択されることができる(図6、7および8もまた参照のこと)。
【００７０】
本明細書に記載の2つのペプチドまたはタンパク質配列が同一である百分率を決定するために、続いて互いに比較するために、配列をアラインメントすることができる。従って、例えば第1配列の配列にギャップを挿入することができ、第2配列の対応する位置における構成要素を比較することができる。第1配列における位置が、第2配列における位置でも同じ構成要素で占められていれば、2つの配列はこの位置で同一である。2つの配列が同一である百分率は、位置の総数で同じ位置の数を割った関数である。2つの配列が同一である百分率は、数学的アルゴリズムを用いて決定できる。好ましいが、限定するものではない、使用できる数学的アルゴリズムは、Karlin et al.,  (1993), PNAS USA, 90:5873-5877 またはAltschul et al. (1997), Nucleic avids Res., 25:3389-3402 のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、BLASTプログラムに組み込まれている。本発明に記載の配列と一定程度同一である配列は、このプログラムによって同定することができる。核酸配列に対しても、同じことが同様に適用される。
【００７１】
本発明はまた、上記の多機能性融合タンパク質をコードする核酸配列、ベクター配列、特に発現ベクターおよび、このような核酸配列でトランスフェクトされた細胞を提供する。核酸配列は、DNA、RNA、一本鎖、二本鎖、環状および/または線状であることができる。
【００７２】
本発明の多機能性融合タンパク質は、例えば、合成法を用いて製造することもでき、一般的には当該技術分野で公知の多機能性融合タンパク質またはその配列をコードする発現ベクターもしくは発現プラスミドを用いる細菌発現法を用いて製造することもでき、あるいは当業者に公知の任意のさらなる方法を用いて製造することもできる。ハイドロゲル形成に用いることができる、本発明における特に好ましい多機能性融合タンパク質は、一般的には細菌発現系、例えばE.コリ、プロテウス・ミラビリスなどにおいて発現される。
【００７３】
本発明の多機能性融合タンパク質の上記の選択肢のいずれもが、PEGポリマーを修飾するために、そして本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲル、例えば、構成要素として基質結合ペプチド(SBP)、好ましくは繰り返しRGD結合ペプチド、例えば(RGDn)もしくはRGDnもしくは(RGD)nおよび/またはZZ結合ドメイン、好ましくは精製用タグならびに少なくとも1つのN末端および/またはC末端システイン部分を含む多機能性融合タンパク質または構成要素として上記の基質結合ペプチド(SBP)、好ましくは上記のZZドメイン、好ましくは上記の精製用タグならびに上記の少なくとも1つのN末端および/またはC末端システイン部分などを含む多機能性融合タンパク質を形成させるために用いることができる。
【００７４】
本発明に記載の種々の多機能性融合タンパク質のタイプおよび/または量に応じて、より正確には、種々の多機能性融合タンパク質のそれぞれにおいて含まれる特定のリンカーの数に応じて、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルの架橋度は影響を受けることができる。さらに、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルにおけるさらなる構成要素の内容、例えば構成要素、例えば本発明の多機能性融合タンパク質内の本明細書に記載のRGD配列に結合している細胞の内容またはさらなる構成要素の結合、例えばさらなる構成要素(ペプチドもしくはタンパク質)のそのFcドメインを介したZZドメインの結合は、相応して変えることができる。
【００７５】
本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルの架橋度を変えるための本発明の多機能性融合タンパク質として特に好ましいものは、上記の多機能性融合タンパク質であり、よりさらに好ましくは、以下から選択される:
a)上記のただ1つのリンカーを有する、本明細書に記載の多機能性融合タンパク質;
b)上記の2つのリンカーを有する、本明細書に記載の多機能性融合タンパク質;
c)上記のただ1つのリンカーを有する、本明細書に記載の多機能性融合タンパク質および、上記の2つのリンカーを有する本明細書に記載の多機能性融合タンパク質の組み合わせ。
【００７６】
特に好ましいものは、前記の本発明の多機能性融合タンパク質を含むさらなる本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルである。
【００７７】
これに関連して、特に好ましいものは、上記のただ1つのリンカーを有する本明細書に記載の多機能性融合タンパク質および上記の2つのリンカーを有する本明細書に記載の多機能性融合タンパク質の組み合わせであるが、上記のただ1つのリンカーを有する本明細書に記載の多機能性融合タンパク質および2つのリンカーを有する本明細書に記載の多機能性融合タンパク質は、単独で使用することができる。
【００７８】
好ましくは、選択肢c)に記載の多機能性融合タンパク質は、前記の多機能性融合タンパク質のいずれか、より好ましくは上記のただ1つのリンカーを有し、基質結合タンパク質(SBP)、RGD配列、例えば(RGDn)もしくはRGDnもしくは(RGD)n、場合により精製用タグおよびN末端もしくはC末端リンカーを含む本明細書に記載の多機能性融合タンパク質ならびに、上記の2つのリンカーを有し、基質結合タンパク質(SBP)、RGD配列、例えば(RGDn)もしくはRGDnもしくは(RGD)n、場合により精製用タグならびにN末端およびC末端リンカーを含む本明細書に記載の多機能性融合タンパク質の混合物または組み合わせから選択されることができる。
【００７９】
これに関連して、上記のただ1つのリンカーを有する本明細書に記載の例示的な多機能性融合タンパク質は、限定するものではないが、以下の少なくとも1つ:
2013544248.tif 000013
から選択されることができ、より好ましくは、
2013544248.tif 000014
から選択されることができ、あるいは、
2013544248.tif 000015
から選択されることができる。
【００８０】
さらにまた、上記の2つのリンカーを有する本明細書に記載の例示的な多機能性融合タンパク質は、限定するものではないが、以下の1つ:
2013544248.tif 000016
から選択されることができ、より好ましくは、 
2013544248.tif 000017
から選択されることができ、あるいは、
2013544248.tif 000018
から選択されることができる。
【００８１】
本明細書に記載の例示的な多機能性融合タンパク質のいずれにおいても、N末端の位置およびC末端の位置は、互いに交換される(すなわち例示的な多機能性融合タンパク質の構成要素の順序が逆転したものである)ことができる。さらに、これらの例示的な多機能性融合タンパク質のいずれにおいても、RGDドメインはZZドメインによって置換されることができる。
【００８２】
本発明に記載の本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルは、好ましくは、上記の少なくとも1つの多機能性融合タンパク質を含むように修飾されたPEGポリマーのマトリックスを含む。本明細書においては、PEGはポリエチレングリコール(PEG)と定義され、これは工業生産から医療までにおいて多くの用途を有するポリエーテル化合物である。PEGは、好ましくはその分子量に応じて、ポリエチレンオキシド(PEO)またはポリオキシエチレン(POE)としても知られる。PEG、PEOまたはPOEは同義で用いられる場合もあり、エチレンオキシドのオリゴマーまたはポリマーを指す。これら3つの名称は、化学的には同義であるが、歴史的には、PEGは分子量20,000g/mol未満のオリゴマーおよびポリマーを、PEOは分子量20,000g/molを超えるポリマーを、POEは任意の分子量のポリマーを指す傾向にあった。PEGおよびPEOは、一般的には、それらの分子量に応じて液体または低融点の固体である。PEGはエチレンオキシドの重合によって製造され、300g/mol〜10,000,000g/molの広範囲の分子量にわたって市販されている。種々の分子量を有するPEGおよびPEOは、種々の用途で使用され、種々の物理的特性、例えば鎖長効果による粘度を有するが、それらの化学的特性はほぼ同一である。重合プロセスに使われる開始剤に応じて種々の形のPEGが入手可能であり、その最も一般的なものは単官能性メチルエーテルPEG(メトキシポリ(エチレングリコール))であり、これはmPEGと略記される。純オリゴマーとして低分子量PEGもまた入手可能であり、単分散、均一または不均一と呼ばれる。異なる幾何学的形態を有するPEGもまた入手可能である。分岐またはスターPEG（Star PEGs）は、中心コア基から放射状に広がった約3〜100PEG鎖(アーム)を有する。櫛状PEGは、通常はポリマー骨格にグラフトされた複数のPEG鎖を有する。上記の本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルに、任意のこのようなPEGポリマーを用いることができる。本発明においては、用語“PEG”または“PEGポリマー”は、好ましくは、上記のポリマーのいずれかを含み、より好ましくは、前記のPEG、PEOおよびPOEポリマーを含む。
【００８３】
故に、本発明においては、上記の本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルに使用するためのPEGポリマーは、好ましくは、上記のPEGポリマー、PEOポリマーおよび/またはPOEポリマー、好ましくは約300g/mol〜10,000,000g/molの分子量、より好ましくは約300〜50,000Daの分子量、よりさらに好ましくは約300〜38,000Daなどの分子量、最も好ましくは約10〜約50kDaの分子量、例えば約20〜約40kDaの分子量、約30〜約40kDaの分子量、例えば約35〜約40kDaの分子量、例えば37.5kDaのポリマーから選択されることができる。より好ましくは、上記の本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルに使用するためのPEGポリマーは、上記の任意のPEGポリマー、好ましくは種々の幾何学的形態を有するPEGポリマー、例えば分岐PEG、例えば中心コア基から放射状に広がった約3〜10PEG鎖を有するPEGポリマー、または例えば本明細書に記載の中心コア基から放射状に広がった約10〜100PEG鎖を有するスターPEGを有するPEGポリマーから選択されることができる。よりさらに好ましくは、上記の本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルに使用するためのPEGポリマーは、本明細書に記載の任意のこのようなPEGポリマー、より好ましくは上記の分子量を有するPEGポリマー、好ましくは本明細書に記載の種々の幾何学的形態を有するPEGポリマー、例えばスターPEG、例えば中心コア基から放射状に広がった約3〜約100PEG鎖(アーム)を有するPEGポリマー、好ましくは中心コア基から放射状に広がった約3〜約50、3〜約30または3〜約20PEG鎖(アーム)を有するPEGポリマーから選択されることができる。上記の本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルに使用するための特に好ましいスターPEGは、中心コア基から放射状に広がった3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14もしくは15またはそれ以上の鎖(アーム)を有する上記のPEGポリマー、すなわち3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15アームPEGスターポリマーであることができる。このようなPEGポリマーは、マルチアームスターPEG、例えば3〜15マルチアームスターPEGとも呼ばれる。
【００８４】
本発明においては、上記の本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルに使用するためのPEGポリマーは、本明細書に記載の本発明の多機能性融合タンパク質への共有結合または非共有結合を可能にするように修飾されることができる。このような共有結合または非共有結合は、好ましくは上記の共有結合または非共有結合である。好ましい場合において、このような結合は共有結合である。より好ましくは、このような結合はチオエーテル結合である。このようなチオエーテル結合は、上記の本発明の多機能性融合タンパク質のSH部分またはチオール含有部分と、例えばシステインの、チオエーテル結合の形成を可能にするビニルスルホン部分または任意のさらなる部分との反応によって形成されることができる。この目的のために、上記の本発明の多機能性融合タンパク質のSH部分またはチオール含有部分は、ビニルスルホン部分またはさらなる部分との反応の前に、還元剤、好ましくはTCEPを用いて還元されている。この段階により、チオール部分が反応してジスルフィド結合を形成するのを防ぎ、チオエーテル結合の形成が可能になる。これに関連して、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルに使用するためのPEGポリマーは、好ましくは、チオエーテル結合の形成を可能にする、チオエーテル結合のための少なくとも1つの遊離ビニルスルホン部分または任意のさらなる部分を提供する。従って、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルは、このような修飾を導入するために、架橋する前に修飾されることができる。修飾は、例えば、上記のPEGポリマーのPEG-OHポリマー、好ましくは上記のマルチアームスターPEGから出発することができる。例示的な修飾反応を以下に示す:
2013544248.tif 000019
【００８５】
特定の一側面によれば、このような修飾は、上記のPEGポリマーのPEG-OHポリマー、好ましくは上記のマルチアームスターPEGをスルホン化することによって、一般的にはスターPEG-ビニルスルホン(PEG-VS)に導くことによって行うことができる。極めて特定のプロトコルによれば、マルチアームスターPEG-ビニルスルホン(PEG-VS)は、8アームPEG-OH(Shearwater polymers社、ハンツヴィル、アラバマ州)から出発して、Lutolfら(2003)(Lutolf MP, Hubbell JA., 2003, Synthesis and physicochemical characterization of end-linked poly(ethylene glycol)-co-peptide hydrogels formed by Michael-type addition. Bio-macromolecules 4(3):713-22 参照)に従って合成することができる。マルチアームPEG-VSは、例えば、PEG-OHと過剰のジビニルスルホン(Aldrich社、ブーフス、スイス)とをカップリングさせることによって合成することができる。例として、PEG-OHは、溶媒、例えばジクロロメタンに溶解することができ、あるいは場合によっては、反応を開始させる前に、例えばディーン・スターク・トラップを用いて、例えばトルエンでの共沸蒸留によってPEGを乾燥させることができる。ジクロロメタンに溶解したPEGに、好ましくはアルゴン雰囲気下で、好ましくはOH基に対してモル過剰量で、例えば4〜6倍量で、例えば5倍量でNaOHを加えることができる。水素発生後、次に、OH基に対してモル過剰量で、好ましくは50〜100倍量でジビニルスルホンを加えることができる。この反応は、一般的には、室温で、好ましくは1〜3日間、例えば2〜3またはさらには3日間、好ましくはアルゴン雰囲気下で一定に撹拌しながら行われる。その後、反応溶液は一般的には、好ましくは濃酸、例えば酢酸で中和され、濾過され、少量に濃縮される。次いで、残りの溶液に氷冷したジエチルエーテルを加えることによって、PEGを沈殿させることができる。次いで、濾過によりポリマーを回収し、例えばジエチルエーテルで洗浄し、好ましくは減圧下で乾燥することができる。次いで、この乾燥ポリマーを、塩化ナトリウムを含む脱イオン水に溶解し、ジクロロメタンで抽出することができる。この溶液を炭酸ナトリウムで乾燥し、その容量を蒸発によって減少させることができる。最後に、生成物を沈殿させ、例えばジエチルエーテルで洗浄して残りのすべてのジビニルスルホンを除去することができる。最終生成物を減圧下で乾燥し、不活性ガス下、例えばアルゴン下、好ましくは20℃で保存することができる。誘導体化は、1H NMR(CDCl3)で確認することができる。NMRによって示される末端基変換率は、好ましくは90〜99%の範囲であり、より好ましくは95〜98%の範囲である。出発材料(PEG-OH)と末端機能化PEG-VSが同一の分子量分布を有することを確認するために、さらにゲル浸透クロマトグラフィーを用いることができる。
【００８６】
前述の任意の結合または任意の他の可能な化学結合、例えばアミド形成(例えばカルボン酸、スルホン酸、アミンなど)、マイケル付加(例えばマレインイミド部分、不飽和カルボニルなど)、クリックケミストリー(例えばアジドもしくはアルキン)、アルケン/アルキンメタセシス反応(例えばアルケンもしくはアルキン)、イミンもしくはヒドラゾン形成(アルデヒドもしくはケトン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、アミン)、錯体形成反応(アビジン、ビオチン、プロテインG)による化学結合または、Sn型置換反応を可能にする構成要素(例えばハロゲンアルカン、チオール、アルコール、アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、スルホン酸エステル、オキシホスホニウム塩)、またはさらなる構成要素の結合に用いることができる他の化学的部分によって、さらなる化学化合物を本明細書に記載のPEGポリマーに結合させることもできる。このような他の可能な化学結合を、本明細書に記載のさらなる構成要素、例えば本発明の多機能性融合タンパク質、さらなる構成要素、細胞などを本明細書に記載のPEGポリマーに共有結合させるために用いることもできる。
【００８７】
本発明においては、上記の本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルに使用するためのPEGポリマーは、限定するものではないが、本発明の多機能性融合タンパク質のリンカーとの関係において前述した修飾およびそれらの指摘されたPEG修飾/官能基化から選択される修飾のいずれかによって、本明細書に記載の本発明の多機能性融合タンパク質への共有結合を可能なように修飾されることもできる。このようなPEG修飾/官能基化は、例えば、好ましくはアミンを含むリンカーによる、N-ヒドロキシルスクシンイミド(NHS)を用いる官能基化(ここで、N-ヒドロキシルスクシンイミド(NHS)は、一般的には、タンパク質のアミン基と結合し、安定なアミド結合を生じる);好ましくは上記のチオール(例えばシステイン)を含むリンカーによる、マレイミドを用いる官能基化;好ましくはチオール(例えばシステイン)を含むリンカーによる、ビニルスルホン(VS)を用いる官能基化(ここで、ビニルスルホンは、一般的にはマイケル型付加でチオールと反応し、安定なチオエーテル結合を生じる);好ましくはリジンを含むリンカーによる、グルタミンを用いる官能基化(ここで、反応は一般的にはトランスグルタミナーゼ反応である);好ましくはグルタミンを含むリンカーによる、リジンを用いる官能基化(ここで、反応は一般的にはトランスグルタミナーゼ反応である);好ましくはN末端システインを含むリンカーによる、チオエステルを用いる官能基化(ここで、反応は、一般的には天然化学ライゲーションである);好ましくはアミンを含むリンカーによる、アルデヒドを用いる官能基化(ここで、反応は一般的にはシッフ塩基反応である);好ましくはアミンを含むリンカーによる、カルボキシル基を用いる官能基化(ここで、反応は、一般的にはEDC(1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド)によって媒介され、アミド結合が生成される);好ましくはカルボキシル基を含むリンカーによる、アミンを用いる官能基化(ここで、反応は、一般的にはEDC(1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド)によって形成され、アミド結合が生成される);などを含むことができる。
【００８８】
本発明の多機能性融合タンパク質または得られた本発明の生体機能化刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルが基質結合タンパク質としてscFv断片を含む場合、得られた本発明の生体機能化刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルは、好ましくは以下の方法の1つ:物理的エントラップメント(physical entrapment)、FITCでの分子の官能基化およびハイドロゲルへの混合、本明細書に記載のZZドメインによって媒介されるFcタグ付き分子、同じ化学による、もしくはscFvとしてのリンカーによるハイドロゲルへの増殖因子のカップリングおよび/またはscFvとの融合タンパク質の形成による、例えば本明細書に記載の増殖因子または本明細書に記載の他の(治療)分子/タンパク質の組み込みによってさらに修飾されることができる。それぞれの分子に結合するscFvを選択し、フルオレセインまたはFITCに関して行ったのと同様にポリマー上に標的分子を固定することによる、選り抜きの任意の小分子、ペプチドもしくはタンパク質標的の添加によって、このようなハイドロゲルをさらに修飾することができる。例えば架橋は、ビオチン結合scFvおよびビオチン-修飾ポリマー(例えばビオチン-マルチアーム-PEG)によって媒介されることができる。
【００８９】
本発明の基礎をなす目的は、さらに、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲル、好ましくは上記の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルの製造方法によって解決される。一般的には、上記のPEGポリマーのマトリックスを含む本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルは、以下の段階に従って製造することができる:
a)本明細書に記載の少なくとも1つの多機能性融合タンパク質を提供し、
b)段階a)に記載の少なくとも1つの多機能性融合タンパク質と上記の基質結合タンパク質(SBP)の基質とを混合し;
c)本明細書に記載のPEGポリマーに、段階b)に従って得られた混合物を加え;それによって好ましくはPEGハイドロゲルを形成させること。
【００９０】
本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルの製造方法の段階a)において、少なくとも1つの多機能性融合タンパク質が提供される。すでに上記で示したように、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルの架橋度は、本発明に記載の種々の多機能性融合タンパク質の特定のタイプおよび/または量を選択的に用いることによって、より正確には、本明細書に記載のただ1つまたは2つのリンカー、例えば1つまたは2つのチオール含有部分、システインまたはホモシステインを有する本明細書に記載の多機能性融合タンパク質を用いることによって、影響されることができる。容易に理解されるように、ただ1つのリンカーを有する本明細書に記載の多機能性融合タンパク質は、通例、2つのリンカーを有する本明細書に記載の多機能性融合タンパク質よりも種々のタイプの架橋をもたらす。
【００９１】
従って、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルの製造方法の段階a)において、種々の官能基を導入するためにばかりでなく、好ましくは本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルのタイプおよび架橋度を修飾するためにも、本明細書に記載の種々の本発明の多機能性融合タンパク質を提供することができる。従って、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルの製造方法の段階a)において、好ましくは、
a)上記のただ1つのリンカーを有する、本明細書に記載の多機能性融合タンパク質;
b)上記の2つのリンカーを有する、本明細書に記載の多機能性融合タンパク質;および/または
c)上記のただ1つのリンカーを有する、本明細書に記載の多機能性融合タンパク質および、上記の2つのリンカーを有する本明細書に記載の多機能性融合タンパク質
を用いることができる。特に好ましいものは選択肢c)であり、すなわち、上記のただ1つのリンカーを有する本明細書に記載の多機能性融合タンパク質および、上記の2つのリンカーを有する本明細書に記載の多機能性融合タンパク質の混合物または組み合わせである。
【００９２】
これに関連して、限定するものではないが、上記のただ1つのリンカーを有する、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルの製造方法の段階a)のための本明細書に記載の例示的な多機能性融合タンパク質は、最も好ましくは、例えば以下から選択されることができる:
2013544248.tif 000020
【００９３】
さらにまた、限定するものではないが、上記の2つのリンカーを有する本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルの製造方法の段階a)のための本明細書に記載の例示的な多機能性融合タンパク質は、最も好ましくは、以下から選択されることができる:
2013544248.tif 000021
【００９４】
好ましくは、本発明の方法の段階a)に用いることができる、2つのリンカーを有する多機能性融合タンパク質に対するただ1つのリンカーを有する多機能性融合タンパク質のモル比は、好ましくは、約20対約1、約10対約1、約5対約1、約4対約1、約3対約1、約2対約1、約1対約1、約1対約2、約1対約3、約1対約4、約1対約5、約1対約10またはさらには約1対約20である。より好ましくは、2つのリンカーを有する多機能性融合タンパク質に対するただ1つのリンカーを有する多機能性融合タンパク質のモル比は、約10対約1、約5対約1、約4対約1、約3対約1、約2対約1または約1対約1であり、最も好ましくは約5対約1である。
【００９５】
さらにまた、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルの製造方法の段階a)で提供されるこれらの多機能性融合タンパク質(単数または複数)のタンパク質最終濃度(好ましくはハイドロゲル形成の前の溶液における)は、限定するものではないが、約1〜約500μg/μl、約10〜約300μg/μl、約20〜約250μg/μl、約30〜約200μg/μl、約40〜約175μg/μl、約50〜約150μg/μl、より好ましくは約60〜約140μg/μl、約70〜約130μg/μl、約80〜約120μg/μlまたは約90〜約110μg/μlであることができる。
【００９６】
架橋度に加えて、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルにおけるさらなる構成要素の内容、例えば本発明の多機能性融合タンパク質内の本明細書に記載のRGD配列に結合する細胞または、例えばFcドメインを介してZZドメインに結合しているさらなるペプチドもしくはタンパク質構成要素を相応に修飾することができる。従って、上記のZZドメインを含むこのような本発明の多機能性融合タンパク質を本発明のPEGハイドロゲルにさらに導入することもまた好ましい場合がある。
【００９７】
従って、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルの製造方法の段階a)において、本明細書に記載のZZドメインを含むこのような本発明の多機能性融合タンパク質をさらに提供することができる。一般に、本明細書に記載のZZドメインを含む任意の多機能性融合タンパク質を、この目的のために用いることができる。これに関連して、限定するものではないが、ZZドメインを含む本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルの製造方法の段階a)のための本明細書に記載の例示的な多機能性融合タンパク質は、最も好ましくは、以下の1つから選択されることができる:
2013544248.tif 000022
【００９８】
上記のZZドメインを含む本発明の多機能性融合タンパク質が本発明のPEGハイドロゲルに組み込まれる場合、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルの本発明の製造方法の段階a)で提供される(すべての)多機能性融合タンパク質(単数または複数)のタンパク質最終濃度は、すでに上記で示した範囲とおよそ同じ範囲であることができる。しかしながら、ZZドメインを含む本発明の多機能性融合タンパク質のタンパク質最終濃度を別々に決定することが好ましい場合があり、例えば限定するものではないが、約0.001〜約100μg/μl、約0.001〜約50μg/μl、約0.001〜約25μg/μl、約0.001〜約20μg/μl、約0.001〜約10μg/μl、約0.001〜約5μg/μlであり、より好ましくは約0.01〜約2.5μg/μlまたは約0.1〜約2μg/μlである。
【００９９】
本発明に記載の種々の多機能性融合タンパク質のタイプおよび/または量に応じて、より正確には、種々の多機能性融合タンパク質において含まれる特定のリンカーの数に応じて、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルの架橋度は影響を受けることができる。さらに、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルにおけるさらなる構成要素の内容、例えば構成要素、例えば本発明の多機能性融合タンパク質内の本明細書に記載のRGD配列に結合している細胞の内容またはさらなる構成要素の結合、例えばさらなるペプチドもしくはタンパク質構成要素のそのFcドメインを介したZZドメインの結合は、相応して修飾することができる。
【０１００】
本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルの本発明の製造方法の段階b)において、段階a)において提供された少なくとも1つの多機能性融合タンパク質と上記の基質結合タンパク質(SBP)の基質とが互いに混合される。
【０１０１】
上記の基質結合タンパク質(SBP)の特異的基質は、共有結合しているPEGポリマーの二量体化もしくは多量体化を可能にするために、あるいは基質結合タンパク質(SBP)による基質のまさに特異的な結合を可能にするために、上記の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つの基質結合タンパク質(SBP)によって結合されていることができる、本明細書に記載の任意の適切な基質であることができる。例えば、上記の基質結合タンパク質GyrBの特異的基質は、(1つまたは)2つのGyrBサブユニットによって結合されている抗生物質クーママイシンである。さらにまた、上記のヘパリン結合性タンパク質(HBP)は、その基質としてヘパリンに結合することができ、ここで、好ましくは少なくとも1つの、好ましくは少なくとも2つのヘパリン結合性タンパク質(HBP)が同じ基質に結合することができる。同様に、上記の任意のさらなる基質結合タンパク質(SBP)を使用することができる。従って、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルの本発明の製造方法の段階b)において、その基質に対して等モル量の、またはさらには2倍モル過剰量の、またはさらにはさらに高いモル過剰量の基質結合タンパク質(SBP)を使用することが必要である場合がある。すなわち、ヘパリン結合性タンパク質(HBP)とその基質のモル比は、好ましくは約1:1または2:1であり、またはさらにはそれ以上である。特定例として、使用されるGyrB含有多機能性融合タンパク質とその基質クーママイシンのモル比は、好ましくは約2:1である。同様に、使用されるヘパリン結合性タンパク質(HBP)含有多機能性融合タンパク質とその基質のモル比は、好ましくは約2:1であり、またはさらには1:1である。
【０１０２】
段階b)で得られた混合物は、混合後、好ましくはインキュベートして、十分な混合および好ましくは混合物の構成要素の相互作用を可能にする。特に、インキュベーションは、基質結合タンパク質(SBP)のその特異的基質に対する結合、例えば、それぞれがGyrBサブユニットを含む1または2以上の多機能性融合タンパク質のその特異的基質である抗生物質クーママイシンに対する結合、または例えば、それぞれがヘパリン結合性タンパク質を含む1つまたは2つの多機能性融合タンパク質のその特異的基質ヘパリンに対する結合を可能にすることができる。
【０１０３】
本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルの製造方法の段階c)において、段階b)で提供される混合物、すなわち、本明細書に記載の少なくとも1つの多機能性融合タンパク質および上記の基質結合タンパク質(SBP)の基質の混合物は、好ましくは、同時にまたは種々の時点で交互に、例えば本明細書に記載の少なくとも1つの多機能性融合タンパク質を最初に、上記の基質結合タンパク質(SBP)の基質を次にして(逆もまた同様)、本明細書に記載のPEGポリマーに添加される。本明細書に記載のPEGポリマーへの、段階b)で提供される混合物の添加は、一般的には、約15℃〜約50℃の温度範囲、より好ましくは約15℃〜約40℃の温度範囲、例えばおよそ室温(RT、例えば約20〜25℃、例えば20℃もしくは25℃)または約37℃で行われる。すでに上記で示したように、PEGポリマーは、チオエーテル結合、例えばビニルスルホン部分の形成を可能にするチオール含有部分または任意のさらなる部分を含むように修飾されることもできるし、本明細書に記載のリンカーに結合するような任意のさらなる官能基化を含むように修飾されることもできる。
【０１０４】
本発明の方法の段階c)で提供されるPEGポリマーの反応性(チオエーテル形成またはリンカーのさらなる官能基化)部分に対する本明細書に記載の多機能性融合タンパク質(基質結合タンパク質(SBP)を含む)のモル比は、好ましくは約1:1であり、例えば約0.75:1〜約1:0.75、約0.8:1〜約1:0.8、約0.85:1〜約1:0.85、約0.9:1〜約1:0.9、約0.95:1〜約1:0.95または約1:1である。好ましくは、PEGポリマーの濃度は、w/vもしくはv/vもしくはw/wのいずれかで、0.5〜15%、例えば約0.5〜約5%、約2.5〜約7.5%、約5〜約10%、約7.5〜約12.5%または約10〜約15%であることができ、これらの値のいずれか2つによって形成される範囲であることもできる。
【０１０５】
本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルの本発明の製造方法の段階c)に記載のハイドロゲル形成は、好ましくは、乾燥を防ぎ、それによって新しく形成されたPEGハイドロゲルの収縮を防ぐために加湿雰囲気中で行われる。
【０１０６】
本発明の方法の大変好ましい選択肢によれば、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルは、少なくとも1つの本発明の多機能性融合タンパク質、例えば本発明の方法の第1段階a)におけるものを提供することによって製造することができる。少なくとも1つの本発明の多機能性融合タンパク質は、好ましくは、1つのリンカーを含む上記の本発明の多機能性融合タンパク質を1つおよび好ましくは上記の2つのリンカーを含むさらなる本発明の多機能性融合タンパク質を、一般的には約10〜約1、約5〜約1、約4〜約1、約3〜約1、約2〜約1、約1〜約1、例えば約5〜約1のモル量で、好ましくは約60〜約140μg/μl、約70〜約130μg/μl、約80〜約120μg/μlまたは約90〜約110μg/μl、例えば約100μg/μlのタンパク質最終濃度で含む。さらなる修飾のために、段階a)中に、本明細書に記載のZZドメインを含む多機能性融合タンパク質を、約0.001〜約10μg/μl、約0.001〜約5μg/μl、より好ましくは約0.01〜約2.5μg/μlまたは約0.1〜約2μg/μl、例えば1μg/μlの最終濃度で加えることができる。大変好ましい選択肢の第2段階b)において、次いでタンパク質溶液は、好ましくは、基質結合タンパク質(SBP)の基質、例えばクーママイシン(Sigma Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州、カタログ番号C9270、50mg/mlのDMSO溶液)と、多機能性融合タンパク質における基質結合タンパク質としてGyrBが用いられる場合は、好ましくはSBB:基質のモル比約2:1で混合される。インキュベーション後、好ましくは約15℃〜約40℃の温度範囲、例えばRTまたは37℃で、好ましくは約1時間、大変好ましい選択肢の第3段階c)において本明細書に記載のPEGポリマーを添加することができる。基質結合タンパク質(SBP)を含む本明細書に記載の多機能性融合タンパク質とPEGポリマーの反応性(チオエーテル形成またはリンカーのさらなる官能基化)部分は、好ましくは約1:1のモル比である。次いで、ハイドロゲル形成は、好ましくは、段階c)で得られた混合物を、好ましくは約15℃〜約40℃の温度範囲、例えばRT(室温)または37℃で、好ましくは約5〜15時間、例えば10時間、好ましくは加湿雰囲気中でインキュベーションすることによって達成される。
【０１０７】
あるいは、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルは、例えば、
a)本明細書に記載の少なくとも1つの多機能性融合タンパク質および本明細書に記載のPEGポリマーを提供し、ここで、本明細書に記載の少なくとも1つの多機能性融合タンパク質は、好ましくは本明細書に記載のPEGポリマーに(共有)結合しており;
b)段階a)で得られた、本明細書に記載の少なくとも1つの多機能性融合タンパク質およびPEGポリマーと、本明細書に記載の基質結合タンパク質(SBP)の基質とを混合し、それによって好ましくはPEGハイドロゲルを形成させること
によって、上記の段階を交替にすることによって製造することもできる。
反応条件は、好ましくは、段階a)、b)およびc)に関して前述したものと同様である。本明細書に記載の少なくとも1つの多機能性融合タンパク質と本明細書に記載のPEGポリマーは、さらに好ましくは、第1の方法段階c)に前記されているモル比および反応条件を用いて本明細書に記載されているように互いに共有結合している。
【０１０８】
さらなる選択肢によれば、例えば、
a)本明細書に記載の少なくとも1つの多機能性融合タンパク質および本明細書に記載のPEGポリマーを提供し、ここで本明細書に記載の基質結合タンパク質(SBP)の基質はPEGポリマーに結合されており;
b)段階a)で得られた本明細書に記載の少なくとも1つの多機能性融合タンパク質およびPEGポリマーと本明細書に記載の基質結合タンパク質(SBP)の基質とを混合し、それによって、好ましくはPEGハイドロゲルを形成させること
によって、上記の段階を交替することによって、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルを製造することもできる。
反応条件は、好ましくは段階a)、b)およびc)に関して前述したものと同様である。
【０１０９】
本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲル、好ましくは上記のハイドロゲル、好ましくは上記の本発明の方法に従って製造されたハイドロゲルは、細胞、タンパク質、ポリペプチド、抗生物質、抗体、抗菌剤ポリマーならびに(i)アセチルサリチル酸（acelylsalicylacid）、(ii)アリールプロピオン酸（arylpropionacid）、(iii)アリール酢酸（arylacticacid）、(iv)インドール酢酸（indolaceticacid）、(v)アントラニル酸（anthranilacid）およびオキシカム（Oxicams）の誘導体ならびにCOX-2選択的阻害薬を含む臨床使用が認められた非ステロイド系抗炎症剤から選択されるさらなる構成要素が組み込まれることによってさらに修飾されることができる。
【０１１０】
本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルに組み込まれることができるタンパク質は、限定するものではないが、例えば増殖因子から選択されることができる。これに関連して、限定するものではないが、増殖因子は、例えば、アドレノメデュリン(AM)、オートクリン運動性因子、骨形成因子(BMP)、上皮増殖因子(EGF)、エリスロポエチン(EPO)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、例えばFGF-7、顆粒球-コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、増殖分化因子9(GDF9)、肝細胞増殖因子(HGF)、肝癌由来増殖因子(HDGF)、ヘパリン結合性増殖因子(HBGF)、インスリン様成長因子(IGF)、遊走刺激因子、ミオスタチン(GDF-8)、神経成長因子(NGF)および他のニューロトロフィン、血小板由来増殖因子(PDGF)、トロンボポエチン(TPO)、トロンボスポンジン(TPS)、トランスフォーミング増殖因子α(TGF-α)、トランスフォーミング増殖因子β(TGF-β)、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、胎盤増殖因子(PlGF)、[ウシ胎児ソマトトロフィン(Foetal Bovine Somatotrophin)](FBS)、IL-3およびIL-6のIL-1補因子(T細胞を活性化する)、IL-2-T細胞増殖因子(IL-1合成を促進し、B細胞およびNK細胞活性化する)、IL-3(すべての非リンパ系細胞の産生を促進する)、IL-4(活性化B細胞、休止期T細胞およびマスト細胞の増殖因子)、IL-5(活性化B細胞および好酸球の分化を誘導する)、IL-6(Ig合成を促進する、形質細胞の増殖因子)、IL-7(前駆B細胞の増殖因子)、腫瘍壊死因子(TNF-a)、アンギオスタチン(血管新生を抑制する)などから選択されることができる。特に好ましい増殖因子は、例えばFFG-7であり、より好ましくは配列番号50に記載の増殖因子である(図9、aa1〜106もまた参照のこと)。本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルに組み込むことができるよりさらに好ましい上記のタンパク質は、上記の増殖因子、場合により上記のリンカー、好ましくは本明細書に記載のFcドメインおよび場合により上記の精製用タグを含む融合タンパク質から選択される。最も好ましくは、このような融合タンパク質は、配列番号52に記載の配列(本明細書においてはFGF-7-Fc-Hisと呼ぶ)または、配列番号52に記載の配列に対して少なくとも50、60、70もしくは80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、よりさらに好ましくは少なくとも97.5%の同一性を示すアミノ酸配列から選択される(図9もまた参照のこと)。あるいは、このような融合タンパク質は、配列番号51に記載の核酸配列または、配列番号51に記載の配列に対して少なくとも50、60、70もしくは80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、よりさらに好ましくは少なくとも97.5%の同一性を示す核酸配列によってコードされる(図9もまた参照のこと)。
【０１１１】
本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルに組み込まれることができる上記のタンパク質は、例えば上記の組み込まれた本発明の多機能性融合タンパク質のZZドメインによってPEGハイドロゲルに結合されることができる。この目的のために、組み込まれるタンパク質は、一般的には、ZZドメインの結合パートナー、例えばFcドメイン、例えば配列番号53に記載の配列、または配列番号53に記載の配列に対して少なくとも50、60、70もしくは80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、よりさらに好ましくは少なくとも97.5%の同一性を示すアミノ酸配列に融合される(図9、aa123〜354もまた参照のこと)。
【０１１２】
本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルに組み込まれるタンパク質は、好ましくは、上記のタンパク質と上記のZZドメインの結合パートナーの間に位置する特異的プロテアーゼ認識配列にさらに融合されることができる。このアプローチは、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルへのタンパク質の組み込みおよび、特異的タンパク質、例えば特異的増殖因子の、特異的トリガーによる本発明のハイドロゲルからの特異的放出を可能にする。このようなトリガーは、特異的プロテアーゼ認識配列として、上記のタンパク質と上記のZZドメインの結合パートナーを結合させるために用いられるアミノ酸配列を有するプロテアーゼであることができる。このようなプロテアーゼ認識配列は、マトリックスメタロプロテアーゼのような内因的に産生されたプロテアーゼ(MMP、例えば、Ehrbar et al., (2007) Biomaterials 28, 3856-3866 に記載のもの)または、ハイドロゲル投与と同時または他の時点で外部から添加されることができるプロテアーゼのいずれかに特異的であることができる。従って、この側面に用いられるプロテアーゼは、このような内因的に産生されるプロテアーゼもしくはマトリックスメタロプロテアーゼまたは好ましくは、例えば、第Xa因子、カスパーゼもしくはタバコエッチウイルス(TEV)プロテアーゼから選択されるプロテアーゼを含むことができる。
【０１１３】
同様に、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルに組み込まれる本発明の文脈のタンパク質は、上記のプロテアーゼであることができる。
【０１１４】
該タンパク質は、本発明のハイドロゲルの形成の前またはそれと並行して本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルに組み込まれることもできるし、本明細書に記載の(容易に形成される)PEGハイドロゲルと該タンパク質をインキュベートすることによって組み込まれることもできる。インキュベーションは、好ましくは、約15℃〜約40℃の温度範囲、例えばRTまたは37℃で行われることができる。インキュベーションは、さらに、好ましくは、約60〜約140ng/μl、約70〜約130ng/μl、約80〜約120ng/μlまたは約90〜約110ng/μl、例えば約100ng/μlのタンパク質最終濃度で行われることができる。
【０１１５】
本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルに組み込まれるために用いることができる細胞は、限定するものではないが、例えば、幹細胞、例えばヒト幹細胞、成人幹細胞、胚性幹細胞、操作されたまたは操作されていない幹細胞、初代もしくは不死化(細胞株)幹細胞、好ましくは間葉系幹細胞、骨芽細胞、セメント芽細胞、すべての結合組織の線維芽細胞、例えば歯肉および/または皮膚および角膜線維芽細胞、単独または歯根膜線維芽細胞との併用（either alone or together with periodontal ligament fibroblasts）、ケラチノサイト、例えば歯肉ケラチノサイトおよび口腔、上気道消化管、皮膚または眼表面由来の角化細胞、中枢神経系の細胞、神経細胞、脈管および角膜組織の内皮細胞、周皮細胞、筋細胞、脂肪細胞、アストロサイトならびにメラノサイトなどから選択されることができる。上記の細胞は、好ましくは自家細胞、すなわち治療を受ける患者由来の細胞である。
【０１１６】
好都合には、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルは、特異的刺激によって分解/破壊されることができる。このような特異的刺激は、例えば、上記の基質結合タンパク質(SBP)の特異的基質またはアンタゴニストの添加であることができる。例として、GyrBが、PEGハイドロゲルを架橋させるために用いられる多機能性融合タンパク質に含まれている場合、このPEGハイドロゲルは、特異的抗生物質ノボビオシンの添加によって破壊されることができる。分解/破壊は、場合により、例えば本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルへの、上記の基質結合タンパク質(SBP)の基質またはアンタゴニストの低速投与によって時間差で行うことができる。分解/破壊は、通例、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルの投与部位で行われる。
【０１１７】
さらなる特定の実施形態によれば、本発明の基礎をなす目的は、医薬、医療デバイスまたは医療製品としての本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルの使用によって解決される。特にそれらの化学組成物、それらの生体活性を調節するそれらの可能性およびインテグリン認識配列を有するバイオミメティックパラメータならびに標的特異的増殖因子の組み込みは、多くの臨床応用において、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルを重要かつ有益な手段たらしめている。好都合には、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルは、多くの臨床応用において用いることができる。
【０１１８】
限定するものではないが、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルのこのような臨床応用、好ましくは医薬、医療デバイスまたは医療製品の形での臨床応用は、例えば、インプラント学、皮膚科学および上気道消化管における癌腫(例えば耳鼻咽喉科学もしくは耳鼻咽頭科医学に際して)ならびに口腔の創傷(例えば、口腔手術および顎顔面手術に際して)の分野における治療ならびに歯槽骨造成治療を含む。より正確には、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルのこのような臨床応用は、再生医療、歯科学および歯科医術の分野における、例えば創傷被覆剤、組織支持用途または組織再生用途を含む。このような用途の中で、例えば慢性潰瘍性創傷は皮膚科学の分野において治療されることができ、創傷、特に上気道消化管の癌腫の外科的切除に際して(例えば耳鼻咽喉科学もしくは耳鼻咽頭医学に際して)生じることがある創傷ならびに口腔の創傷(例えば、口腔手術および顎顔面手術に際して)およびバリア機能としての歯槽骨造成の分野における再生医療で治療されることができる。潰瘍性創傷の場合、これはしばしば糖尿病患者の下肢に生じるが、自己ケラチノサイトは、照射細胞分裂不活化皮膚線維芽細胞の存在下で、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲル上、in vitroで、あらかじめ形成された上皮が得られるまで培養することができる。このような自己ケラチノサイトは、一般的には、例えば外毛根鞘に由来し、従って容易に入手できる。続いて、このような自家細胞が培養された本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルは、好ましくは、その細胞が由来する同じ患者のあらかじめ治療された創傷に投与される。好ましくは、以前治療された患者の創傷への本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルの投与は、一般的には、好ましくは創傷の治癒を開始させ、好ましくは周辺組織および輸液からの栄養素で細胞の維持を可能にする密度およびサイズで行われる。本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルの投与はまた、PEGハイドロゲルの指向性および系統的な分解ならびに特定のタンパク質、例えば角化細胞促進増殖因子、例えばEGFまたはFGF-7(KGF)のもたらされた放出によって創傷の閉塞を支持する。上記の上気道消化管の癌腫に関しては(例えば耳鼻咽喉科学または耳鼻咽頭医学に際して)、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルを適用されるケラチノサイトは、一般的にはいわゆる“前腕皮弁”に由来する。この場合は、前腕の内側の一部の全皮膚片を除去し、結合組織の線維芽細胞および上皮ケラチノサイトをin vitroで増殖させる。このような腫瘍を有する患者は、一般的には、創傷治癒障害を患っており、従って相応じて肉芽組織の障害を示すため、このような患者の治療および外科的包帯は、好都合には、上皮細胞および線維芽細胞を含む本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルの“互い違いに配置された(staggered)”投与に基づいて行われる。
【０１１９】
このような“互い違いに配置された”本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルは、本明細書に記載の1つまたは2つの種々の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルのいずれかに“サンドイッチ”状に上皮細胞および線維芽細胞を含むことができる。このような“サンドイッチ”は、例えば、初めに表面に本明細書に記載の細胞、例えば線維芽細胞を前培養し、これは“下面”と呼ぶことができ、一方でさらなる細胞、例えば角化細胞を一日遅らして播種し、このハイドロゲルの“上面”で増殖させることによって調製することができる。拡散性の増殖因子による両方の細胞型の相互作用によって、一般に経時的に層別の上皮形成または組織形成を生じるが、両方の細胞型は直接の細胞-細胞接触を欠いている。好都合には、“サンドイッチ”刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルとも呼ばれるこのような“互い違いに配置された”本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルは、好ましくは、上皮組織の場合特に、拡散性増殖因子による線維芽細胞との相互作用によって、予め形成された(上皮)組織の栄養を提供する。このアプローチを用いれば、上皮の閉塞下の創傷治癒は、純粋な予め形成された上皮よりも優れた結果を示す。この場合は、血管新生増殖因子例えばVEGFを本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルに組み込むことができる。これは、このゲルの分解によって、創傷組織または肉芽組織の新生血管にプラスの影響を与える。
【０１２０】
好ましくは医薬、医療デバイスまたは医療製品の形の本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルのさらに好都合な臨床応用は、治療を受ける患者における抜歯後の歯槽突起の予防を含む。このような用途は、歯科学および歯科医術における歯科インプラントの審美的および機能的成功に決定的に寄与することができる。ドイツにおいては、毎年、1400万の歯が抜歯されている。抜歯および歯の欠損に続いて、欠損した歯の支持骨は、多かれ少なかれある程度は衰弱(委縮)する。従って、これに関連して、種々の程度の骨量減少または委縮が認められる。歯槽骨の委縮によって、審美的な外観が損なわれる恐れがある。さらに悪いことに、インプラント学の必要条件およびさらなる義歯リハビリテーションが障害を受ける。機能および審美的外観を改善するための造成手段が通例必要であり、従って、通例、侵襲性手術手順に対して金銭上の費用および手術の作業量は増加する。従って、抜歯または歯の欠損後の直接の本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルの特定の用途は、このような費用およびその後の治療を避けるための適切で費用効率の高いツールを代表する。
【０１２１】
好ましくは医薬、医療デバイスまたは医療製品の形の本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルのさらに好都合な臨床応用は、治療を受ける患者におけるヒト角膜の疾患の治療を含む。このような用途は、角膜、すなわち上皮、結合組織/線維芽細胞および内皮の疾患の治療において実施されることができる。角膜縁の疾患(“角膜縁幹細胞不全”)において、一般的には疾患に冒された患者における結合組織(結膜)の濁った上皮を有する角膜は透明角膜となる。このような疾患の従来の治療は、一般的には、透明角膜上皮の前駆体細胞である角膜縁幹細胞による置換を必要とする。角膜縁の一方だけの疾患の場合、疾患に冒されていない眼からの生きた角膜縁組織を疾患に冒された眼に移植することによって治療を行うことができる。両側の場合には、このような治療は不可能であり、より問題が多い。このような場合において、少なくとも片方の眼に輪部機能が残っている場合、少量の細胞試料をベースとして、適切な担体マトリックス例えば本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲル上で集密的細胞層を増殖させることができる。次いで、集密的細胞層を疾患に冒された眼に移植することができる。今日まで、担体マトリックスとしてヒト羊膜またはフィブリンゲルが用いられてきたが、抽出された細胞試料からの増殖細胞(幹細胞)数は、このようなex vivo培養の最も重要な側面であった。残念なことに、長期観察によって、現在用いられている担体マトリックス、なわちヒト羊膜またはフィブリンゲル上の幹細胞数は少ないことが明らかとなった。この不首尾の理由は、これらの担体マトリックスが、このような幹細胞に対する最適の細胞外環境を提供しないという事実によるものであると考えられた。従って、これらの幹細胞は、最適の細胞増殖に必要なニッチを形成することができない。これに関連して、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルは、これらの幹細胞の必要条件に対して設計することができるそれらの個々に適合させうる特性によって最適の環境を提供する。
【０１２２】
好ましくは医療デバイスの形の本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルのさらに好都合な臨床応用は、角膜の内皮の疾患の治療を含む。これに関連した特定の用途は、例えばフックス角膜内皮変性症の治療である。この疾患において、さらに他の疾患との関係においても、アポトーシスによって角膜内皮の細胞の劇的な減少が起こり、濁った角膜を生じる。本治療は、角膜のすべての層の移植または置換を含む角膜の移植を含む。代替治療は、ドナーからの内皮層の特定の移植による罹患細胞の置換を含む。移植材料はHLAが同一の材料ではないため、組織移植は拒絶されるおそれがあり、内皮層の顕著な損傷がもたらされる。これに関連して、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルは、治療を受ける患者からの内皮細胞を抜き取り、少量細胞試料をベースとして、適切な担体マトリックス例えば本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲル上で集密的細胞層を増殖させることによって、上記と同様なこれらの内皮細胞を富化する可能性を提供する。再度、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルは、これらの幹細胞の必要条件に対して設計することができるそれらの個々に適合させうる特性によってこれらの細胞に対する最適の環境を提供する。次いで、これらの細胞を、角膜の後部に担体として本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルと共に移植することができ、従って移植片の拒絶を避けることができる。
【０１２３】
好ましくは医薬、医療デバイスまたは医療製品の形での本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルは、例えば、熱傷被覆材、外科用パッチ、病変の治療、外科的包帯、創傷治療、例えばインプラント学の分野における軟組織および硬組織再生、例えば腫瘍性疾患による口腔の創傷治療、眼科学分野、全体的にもしくは部分的に再生もしくは再建する損傷したもしくは悪いもしくは除去された組織、特に筋肉、心筋、結合、骨、腱もしくは靱帯、肝、腎、角膜、真皮もしくは表皮、関節軟骨組織の細胞インプラントの調製、歯根膜などを含む歯周欠損分野、全体的にもしくは部分的に再生もしくは再建するための神経細胞としての中枢神経系細胞のインプラントを調製するための神経組織、特に中枢神経系組織、神経組織、例えばパーキンソン病もしくは脊髄損傷もしくは腫瘍疾患もしくはアルツハイマー病の結果として損傷した神経組織、神経組織、例えば外科手術後に除去もしくはアブレーションした神経組織にさらに用いることができる。本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルは、さらに、薬物送達デバイス、in vitro、in vivoおよび/またはex vivo用途のための細胞マトリックス、組織モデルの調製のために、細胞移植マトリックスとして使用することができる。
【０１２４】
もう1つの特定の実施形態によれば、本発明の基礎をなす目的は、上記の疾患もしくは疾病状態の治療、一般の治療に、本明細書に記載の治療における本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルを使用することによって解決される。より好ましくは、本明細書に記載の本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルは、上記の疾患の治療のための医薬、医療デバイスまたは医療製品の製造において使用することができる。
【０１２５】
最後の特定の実施形態によれば、本発明の基礎をなす目的は、さらに、本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲル、場合により上記のPEGハイドロゲルへの組み込みのためのさらなる構成要素および場合により使用説明書を含むキット、好ましくはパーツのキットによって解決される。このようなキットは、本明細書に記載のように、かつ上記のように疾患もしくは疾病状態の治療、一般の治療に使用することができる。本キットは、好ましくは、キットの種々のパーツに種々の構成要素を含む。例えば、あるパーツは本発明の刺激応答性可溶性PEGハイドロゲルを含み、少なくとも1以上のパーツはさらなる構成要素の1以上を含む。
【０１２６】
本発明において、特記しない限り、選択肢および実施形態の種々の特徴は、互いに結び付けることができる。さらにまた、用語“含んでいる(comprising)”は、特記しない限り、“からなっている(consisting of)”を意味すると解釈してはならない。しかしながら、本発明においては、用語“含んでいる(comprising)”は、適切な場合には、用語“からなっている(consisting of)”と置き換えることができる。
以下の図面によって前述の発明をさらに詳細に説明するが、これらの図面は、請求項の範囲をそれらに限定することを意図するものではない。
【０１２７】
以下の実施例によって前述の発明をさらに詳細に説明するが、以下の実施例は請求項の範囲をそれらに限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【０１２８】
ポリマーの合成および修飾
8アーム-ポリエチレングリコール-ビニルスルホン(PEG-VS、分子量37.5kDa)は、8アームPEG-OH(Shearwater polymers社、ハンツヴィル、アラバマ州)から出発して、Lutolf MP, Hubbell JA., 2003, Synthesis and physicochemical characterization of end-linked poly(ethylene glycol)-co-peptide hydrogels formed by Michael-type addition. Bio-macromolecules 4(3):713-22 に従って合成した。
【０１２９】
マルチアームPEG-VSは、PEG-OHと過剰のジビニルスルホン(Aldrich社、ブーフス、スイス)とをカップリングさせることによって合成した。PEG-OH(およそ5g)はそのまま使用し、乾燥ジクロロメタン(予めモレキュラーシーブで乾燥した)300mLに直接に溶解するか、または場合により、反応開始前に、ディーン・スターク・トラップを用い、トルエンで共沸蒸留することによってPEGを乾燥した。ジクロロメタンに溶解したPEGに、アルゴン雰囲気下で、OH基に対して5倍モル過剰量でNaHを加えた。水素発生後、OH基に対して50〜100倍のモル過剰量で素早くジビニルスルホンを加えた。アルゴン雰囲気下で室温で一定に撹拌しながら、3日間この反応を行った。その後、反応溶液を濃酢酸で中和し、紙で透明になるまで濾過し、回転蒸発により少量(およそ10mL)になるまで濃縮した。残りの溶液に氷冷したジエチルエーテルを滴下してPEGを沈殿させた。濾過によりポリマーを回収し、ジエチルエーテルで洗浄し、減圧下で乾燥した。次いで、塩化ナトリウムおよそ5gを含む脱イオン水200mLにこの乾燥ポリマーを溶解し、ジクロロメタン200mLで3回抽出した。この溶液を炭酸ナトリウムで乾燥し、回転蒸発により再度容量を減少させた。最後に、生成物を再沈殿させ、ジエチルエーテルで十分に洗浄して残りのジビニルスルホンをすべて除いた。最終生成物を減圧下で乾燥し、アルゴン雰囲気下-20℃で保存した。
【化１】
2013544248.tif 000023
NMRによって示される末端基変換率は95〜98%であった。出発材料(PEG-OH)と末端機能化PEG-VSが同一の分子量分布を示すことをゲル浸透クロマトグラフィーを用いて確認した。
【実施例２】
【０１３０】
例示的な本発明の多機能性融合タンパク質の製造
以下の例示的な多機能性融合タンパク質(本明細書においてはまたGyrBバリアントと決定された)をクローニングし、発現させた:
2013544248.tif 000024
【０１３１】
プラスミドpRG116は、E.コリ・ジャイレースBのN末端配列(aa1〜220)に続いて、二重RGD配列(2x GRGDSP)、精製のためのヘキサヒスチジンタグおよびPEG-VSにカップリングさせるためのシステイン残基を含む。
【０１３２】
プラスミドpRG107は、pRG116に加えてN末端システイン残基を含む。プラスミドpRG111は、プロテインA由来の2つの合成Fc結合Zドメイン(ZZ、ベクターpEZZ-18由来、GEヘルスケア社)に続いて、E.コリ・ジャイレースBのN末端配列(aa1〜220)、ヘキサヒスチジン精製用タグおよびPEG-VSにカップリングさせるためのシステイン残基を含む。
【０１３３】
対応するGyrB発現プラスミド(pRG107、pRG111、pRG116)をE.コリBL21 STAR(登録商標)(DE3)(Invitrogen社、カールズバッド、カリフォルニア州、カタログ番号C601003)にトランスフォームし、1mM IPTGを用い、37℃で3時間OD600=1でタンパク質産生を誘導した。細胞ペレットをPBS(初期培養液量1000ml当たり40ml、50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10mMイミダゾール、pH8.0)に再懸濁し、フレンチプレス(Thermo Fisher Scientific社、ウォルサム、マサチューセッツ州)を用いて破壊し、細胞の破片を30,000x gの遠心分離で30分間除去した。透明にした細胞溶解物を、NTA-アガロースSuperflowカラム(Qiagen社、ヒルデン、ドイツ、カタログ番号30210)に添着し、続いてこれを10カラム体積のPBS、10カラム体積の洗浄用緩衝液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、20mMイミダゾール、pH8.0)で洗浄し、2カラム体積の溶出緩衝液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、250mMイミダゾール、pH8.0)で溶出した。この溶出液に、最終濃度10mMになるまで500mM EDTA(pH8)を加えた。
【実施例３】
【０１３４】
ハイドロゲル集合体
本発明の多機能性融合タンパク質をPEG-VSポリマーにカップリングさせる前に、本発明の多機能性融合タンパク質を、還元剤、好ましくはTCEPを用いて還元した。この段階は、チオール部分が反応してジスルフィド結合になるのを防ぎ、本発明の多機能性融合タンパク質をPEG-VSにカップリングさせるのに必要である。本発明の多機能性融合タンパク質の還元剤との反応に続いて、本発明の多機能性融合タンパク質は、好ましくは、カップリング反応中の、還元剤、例えばTCEPの、還元された多機能性融合タンパク質および/またはPEG-VSポリマーに対する妨害を防ぐために、還元剤を除去または少なくとも実質的に除去するように精製される。
【０１３５】
これに関連して、20倍モル過剰量のTCEP(トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩、Sigma Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州、カタログ番号C4706)を対応するタンパク質溶出液に加え、室温で1時間インキュベートした。続いて、サイズ排除カラム(Thermo Fisher Scientific社、ウォルサム、マサチューセッツ州、カタログ番号43233)による2回の分離によって、還元されたタンパク質試料の緩衝液をPBS(2mM EDTA pH8)に交換し、継続する窒素雰囲気下で限外濾過(10kDa MWCO、Sartorius社、ゲッティンゲン、ドイツ、カタログ番号VS0202)によって150μg/μlの濃度まで濃縮した。
【０１３６】
5モル量の還元されたGyrB116と1モル量の還元されたGyrB107を混合してタンパク質最終濃度100μg/μlにしてハイドロゲルを製造した。還元されたGyrB111を最終濃度1μg/μlまで加えた。次いでこのタンパク質溶液を、GyrB:クーママイシン=2:1のモル比でクーママイシン(Sigma Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州、カタログ番号C9270、50mg/ml DMSO溶液)と混合した。RTで1時間のインキュベーション後、GyrB:VS基=1:1のモル比でPEG-VSを加えた。37℃、加湿雰囲気中10時間のインキュベーションによってハイドロゲル形成が達成された。
【実施例４】
【０１３７】
増殖因子の組み込み
C末端ヘキサヒスチジンおよびFcタグを有する増殖因子を哺乳動物細胞(HEK293-T)で産生させる。そのFcサブユニットによって、GyrB111のZZドメインへの結合によって、この増殖因子はハイドロゲルに組み込まれることができる。ハイドロゲル分解を導くノボビオシンの添加によって、この増殖因子はまた放出される。
【実施例５】
【０１３８】
細胞接着実験
開発されたRGD機能化ハイドロゲルの最適化された細胞接着能を評価するために、口腔の2つの細胞型、ヒト歯肉線維芽細胞(hGF)および不死化ヒト歯肉角化細胞(IHGK)をハイドロゲル当たり5x104個の細胞密度で播種し、標準的な細胞培養条件下で24時間培養した。位相コントラスト顕微鏡検査(PCM)によって、細胞増殖の挙動および形態について記録を行った。実験条件は、RGD官能基化の有り無しでハイドロゲル上で培養した2つの異なる細胞型の比較を含む。RGD配列なしのハイドロゲルでのPCMにより、hGFおよびIHGKの非定型形態が明らかとなった。両方の細胞型とも、それらの形態によって示されるように、ハイドロゲル表面への接着が少ないのは明らかであり、小さな細胞島のみの形成によって確認されるように、大変低い増殖率を示した(図1、左段)。これとは明らかに異なり、RGD配列を有するハイドロゲル(RGD官能基化)上での細胞挙動は、このタイプの修飾が、研究中の細胞型に対して快適な環境をもたらすことを明らかにした。さらに詳細には、hGFおよびIHGKは、それらの天然の細胞形態を示し、RGD配列なしのハイドロゲル上で増殖した細胞とは対照的に、増殖率の劇的な増加を示したが、これは、PCMモードによって明らかにされたほぼ完全な細胞カーペットによって証明された(図1、右段)。適切な細胞接着および通常の細胞形態を確かめるために、両方のハイドロゲル配置(+/-RGD)上でhGFおよびIHGKを培養し、パラホルムアルデヒドで固定し、免疫染色プロトコルに供した。細胞形態を明示するために、細胞骨格のアクチンフィラメントに特異的にインターカレートする染色色素(ファロイジン)で細胞を処理した。ハイドロゲル配置(+/-RGD)上のhGFおよびIHGKの赤色蛍光染色パターンの比較により、位相コントラスト顕微鏡検査からの観察が確認され、RGD配列なしのハイドロゲル上の不規則な円い形の細胞形態が明らかとなった(図2、左段)。対照的に、ハイドロゲル+RGD配列上で培養したhGFおよびIHGKは、同様にそれらの規則的な細胞形態を示し、これは、細胞の周辺におけるアクチンフィラメント配向の観察によって強調された(図2、右段)。
【０１３９】
RGD配列は、細胞外マトリックスにおける細胞接着部分であり、マトリックス分子I型コラーゲンおよびフィブロネクチンの構成要素である。細胞は、インテグリンサブユニットβ1を含む特定のインテグリンサブユニットを介してこれらのRGD配列に接着することができる。従って、2つのハイドロゲル配置(+/-RGD)上に播種したhGFおよびIHGKにおけるインテグリンサブユニットβ1の分布を分析した。インテグリンβ1特異的緑色蛍光シグナルの分布の比較によって、同様に、適切な細胞接着、接触点の形成および規則的な細胞形態の発達を示す、+RGDハイドロゲル配置上の細胞周辺における集積が明らかになった(図3、右段)。対照的に、-RGDハイドロゲル配置上で培養した細胞におけるインテグリンβ1の分布は、その細胞が表面上に適切な接着部分を見出すことができず、従って不規則な円い形の形態のままであったことを示唆している(図3、左段)。さらに、インテグリンβ1特異的緑色蛍光シグナルは大変弱いままであったが、これは、接着部位を欠くことによるインテグリンβ1の発現の低下を示している(図3、左段)。要約すれば、RGD配列のハイドロゲルへの組み込みは、hGFおよびIHGKの増殖および接着に関する本発明の医療デバイスの最適化に相当する。
【実施例６】
【０１４０】
本発明のハイドロゲルでのさらなる細胞接着実験
目的
実施例1に従って製造されたRGD(Arg-Gly-Asp)配列の有無による、本発明のハイドロゲル上に播種された歯肉線維芽細胞および歯肉(または角膜)角化細胞の形態学的変化、増殖および増殖特性を観察すること。
【０１４１】
方法
ハイドロゲル
本実施例に用いたハイドロゲルは、実施例1に概略を述べたプロトコルに従って、上記の前記実施例において記載され製造された様にジャイレースBタンパク質で“スター”PEG(ポリエチレングリコール)分子を官能基化することによって製造した。GyrBは細菌内のDNAのフォールディングに関与し、それとして、抗生物質ノボビオシンの標的である。従って、ハイドロゲルは、ジャイレースB機能化スターPEG分子が、概念上ノボビオシン二量体に類似し、近位ジャイレースBタンパク質と結合して3Dゲルネットワークを形成するのに役立つ分子であるクーママイシンと混合されるとき製造される。ジャイレースB部分に競合的親和性を有する分子であるノボビオシンのハイドロゲルへの添加によって、ハイドロゲルは分解されることができる。細胞がハイドロゲルに接着するための結合部位を提供するために、RGD配列がハイドロゲルに組み込まれた。
【０１４２】
視野位相差顕微鏡
各ウェルに、半分がRGD配列を含み(+RGD)、半分がRGD配列を含まない(-RGD)ハイドロゲルを40μL含む12ウェルプレートに入れた培地2mlに、1x105歯肉線維芽細胞(GF)および歯肉角化細胞(GK)細胞を播種した。細胞を48時間インキュベートし、その後倒立顕微鏡を用いてコンフルエンスおよび形態を検査した。
【０１４３】
免疫組織化学染色
西洋ワサビペルオキシダーゼによる沈降
12ウェルプレートに6x-RGDおよび4x+RGDハイドロゲル(各40uL)を製造した。1x105細胞/ウェルでゲルにGFおよびGK細胞をプレーティングし、24時間インキュベートした。次いで培地を吸引し、ゲルをPBS 2mLで2回洗浄した。染色のための抗体溶液を下記の表1に示すように調製した。
【表２】
2013544248.tif 000025
【０１４４】
12ウェルプレートにおいて、細胞を4%ホルムアルデヒド(PBSで希釈)で20分間固定した。次いで、このゲルをPBS 2mLで3回洗浄した。続いて、ウェルの底からハイドロゲルをこそげ、〜2cm平方のパラフィルムに乗せた抗体溶液50μL上に逆さにした。ハイドロゲルを1時間放置して1次抗体溶液に浸漬し、その後、スパチュラによって溶液から穏やかに引き揚げ、もう一片のパラフィルムに逆さにした。続いて、PBS溶液500μLでハイドロゲルを3回洗浄した。その後、適切な2次抗体(ウサギ、ヤギ)100μLをハイドロゲル上にピペッティングし、40分間放置した。次いで、2次抗体を吸引し、ハイドロゲルをPBS 500μLで3回洗浄した。事前調製されたDAB溶液100μL(DAB希釈剤1mL中にDAB 20μL)をハイドロゲル上にピペッティングし、10分間放置した。DAB溶液の除去後、ハイドロゲルを水で洗浄し、グリセリンを付けたカバークリップ上に乗せた。
【０１４５】
角膜角化細胞および歯肉線維芽細胞のF-アクチンに対するファロイジン-ローダミン免疫組織化学染色
実施例1に従って製造した、12ウェルシリコーンプレートにプレーティングしたハイドロゲル(40μL)を図10に示すように配置した。歯肉角化細胞の代わりに角膜角化細胞(C-K)を用いた。ハイドロゲルの上部に、3.5x104細胞/ウェルと同等の7x103細胞/ウェルを培地200μLで、GFおよびC-K細胞をプレーティングした。細胞を5日間放置して増殖させ、その後、細胞を検査し、さらなる処理の前に倒立顕微鏡で写真を撮った。
【０１４６】
ハイドロゲルを含むウェルの上部から培地を吸引し、ハイドロゲルをPBS 200μLで2回洗浄し、次いで細胞を4%ホルムアルデヒド200μLで半時間固定した。ホルムアルデヒドの除去後、ハイドロゲルをPBS 200μLで2回洗浄し、次いで薄めてないウシ血清アルブミン(BSA)で3時間処理した。その後、BSAを吸引し、ハイドロゲルをPBS 200μLで2回洗浄した。次いで、1:40に希釈したローダミン-ファロイジン30μLで各ハイドロゲル上の細胞を20分間処理した。続いて、ローダミン-ファロイジン溶液を吸引し、ウェル内のハイドロゲルをPBS溶液200μLで3回洗浄した。次いで、細胞を300nM DAPI 30μLで10分間染色し、続いてPBS 200μLで3回洗浄した。次いで、それが接着していたスライドガラスからシリコーンウェル構造物を取り除き、ハイドロゲルをVectorshieldに乗せ、ハイドロゲルの上部にスライドガラスを置いた。試料を観察し、60xオイル対物レンズを備えた蛍光顕微鏡を用いて写真を撮影した。
【０１４７】
歯肉角化細胞および歯肉線維芽細胞のインテグリンαVおよびインテグリンβ1免疫組織化学染色
図10に示すように、シリコーンウェル中にハイドロゲルを配置した。ハイドロゲル上に、歯肉線維芽細胞および歯肉角化細胞を、ウェル当たり7x103細胞/培地200μLで播種した。細胞を24時間インキュベートし、倒立顕微鏡下で検査し、倒立顕微鏡を用いて写真を撮影した。その後、以下の表2に概略を述べるようにして、抗体を用いて細胞を免疫化学的に染色した。
【表３】
2013544248.tif 000026
【０１４８】
染色プロトコル:培地を除去し、各ウェルをPBS 200μLで2回洗浄した。その後、細胞を4%パラホルムアルデヒド(PF)で半時間固定した。PFを除去し、細胞をPBSで2回洗浄した。その後、PBSを除去し、BSA 200μLを細胞上にピペッティングし、1時間放置した。BSAを除去し、ゲルをPBSで洗浄した。一次抗体をPBT(PBSおよびツイーン)で1:50に希釈し、二次抗体を1:300に希釈した。各一次抗体30μLをゲル上にピペッティングし、4℃で終夜放置した。
【０１４９】
結果
視野位相コントラスト倒立顕微鏡検査
ハイドロゲル上の細胞の倒立顕微鏡画像は、-RGDハイドロゲルと比較して、+RGDハイドロゲル上の強い増殖および/または接着を示した。これを図11に示すが、-RGDハイドロゲルは上部左に見える。ハイドロゲルの周辺のウェル表面と比較して、ハイドロゲル表面上で増殖している線維芽細胞がないことが明確に見て取れる。これとはまったく対照的に、+RGDハイドロゲルでは、図12に示すように、細胞の連続したカーペットが観察され、ハイドロゲルの縁は識別できない。
【０１５０】
増殖および/または接着のこのパターンは、歯肉角化細胞の外観に反映されていた。ハイドロゲルの縁は角化細胞のほぼ集密的なカーペットによって覆われていたが、ハイドロゲル表面上の細胞のまばらな密度はこれとは著しく対照的であった。これは図13に示されており、図14とは対照的である。ハイドロゲル上で増殖している細胞はプレート表面上で増殖しているものよりは密集していない。しかしながら、これは-RGDハイドロゲル表面上で増殖している細胞を著しく超える。
【０１５１】
免疫組織化学沈降染色-西洋ワサビペルオキシダーゼ
+RGDおよび-RGDハイドロゲルの顕微鏡画像をそれぞれ左および右に示す図15に示すように、サイトケラチン19免疫組織化学染色は、+RGDハイドロゲルおよび-RGDハイドロゲル上で増殖している歯肉角化細胞の形態における著しい対照が明らかとなった。
【０１５２】
図16における歯肉角化細胞のK19染色の高倍率写真は、ケラチン19タンパク質の分布を大変詳細に示している。
【０１５３】
DABキット西洋ワサビペルオキシダーゼ系を用いたインテグリンβ3に対する歯肉線維芽細胞の免疫組織化学染色は、以下の図17に示すように、+RGDハイドロゲルおよび-RGDハイドロゲル上で増殖している細胞間で形態における大きな差異を示した。+RGDハイドロゲル上のほぼ完全な細胞のカーペットは、-RGDハイドロゲル上の非定型形態のまれにしか存在しない細胞の外観とは対照的であった。
【０１５４】
ファロイジン-ローダミン染色によって、歯肉線維芽細胞および角膜角化細胞に関して、図2に示すように、蛍光顕微鏡下で細胞内のF-アクチンフィラメントが示された。両方の細胞型に関して、+RGDハイドロゲル上で増殖している細胞は、-RGDハイドロゲル上で増殖している細胞と比較して、顕著により膨張性の形態を示した。
【０１５５】
20x/0,75 Plan Apo Objectiveによって蛍光顕微鏡検査を行った。顕著な非特異的バックグラウンド蛍光のために、高解像性は達成することが困難であった。これにもかかわらず、インテグリンβ1染色は、-RGD細胞と比較して+RGDハイドロゲル上で培養した細胞の形態、増殖および伸展における明白な差異を明らかにした。これを図3に示す。
【０１５６】
GK細胞に関するインテグリンαV免疫化学染色は、GF細胞のインテグリンβ1に関して見られたものと同様に、+RGDおよび-RGDハイドロゲル上で培養した細胞間で同様な不均衡を示した。この差異は、図3において明確にみられる。
【０１５７】
考察
製造された本発明のPEGハイドロゲルのあらゆる種類の解析は、歯肉線維芽細胞および歯肉角化細胞(1つの分析において角膜角化細胞)の両方が、+RGDハイドロゲル上に接着し、そこで増殖したことを示した。歯肉線維芽細胞の場合は、図12に示すように、ハイドロゲルとプレート底面との間の境界線の非存在によって示されるように、プレート底面での細胞の増殖率と増殖率が同様であると思われた。図13および図14に示すように、このことは歯肉角化細胞の場合には当てはまらないと思われた。この場合、+RGDハイドロゲル上で増殖しているものよりも、-RGDハイドロゲルの周辺当たりでみられる細胞カーペットの方が密集していた。しかしながら、この現象は、凸状のディスクであるハイドロゲルの形状を考慮することによっても説明される。従って、細胞定着時に、PEG材料に接着する限定された能力によって、多くの細胞は-RGDハイドロゲルから転がり落ち、ハイドロゲル周辺のプレート表面への細胞の濃縮効果をもたらした可能性がある。一方、+RGDハイドロゲルへの細胞の接着は、全体の細胞の密度分布に平準化効果を示したと考えられる。DAB西洋ワサビペルオキシダーゼ法を用いるサイトケラチン19(K19)染色は、+RGDおよび-RGDハイドロゲル上で培養したGK間の形態の対比に有用であった。ここで、-RGDハイドロゲル上での、まばらにしか見られない球状の細胞と比較して、+RGDハイドロゲル上での、正常な形態を有する多くの細胞が見られる。K19は、角質化角化細胞においては通常発現されないが、非角質化上皮基底細胞(Schon, M. and J. G. Rheinwald (1996), "A Limited Role for Retinoic Acid and Retinoic Acid Receptors RAR[agr] and RAR[beta] in Regulating Keratin 19 Expression and Keratinization in Oral and Epidermal Keratinocytes." 107(3): 428-438 を参照のこと)ならびに正常および良性過形成非角質化基底粘膜細胞の両方(Lindberg, K. and J. G. Rheinwald (1989), American Journal of Pathology 134(1): 89-98) を参照のこと)において見られる。HPV-16不死化子宮膣部および包皮角化細胞におけるサイトケラチン19発現増加(Sun, Q., K. Tsutumi, et al. (1993), International Journal of Cancer 54: 656-662を参照のこと)ならびにHPV-16不死化歯肉角化細胞における胎児性ケラチンK19(Oda, D., L.Bigler, et al. (1996), Experimental Cell Research 10(1): 164-169を参照のこと)の根拠も見られる。現在提示されている結果において見られるK19の発現は、これらの著者の観察と矛盾しない。同様に、+RGDハイドロゲル上のGF細胞の細胞接着タンパク質インテグリンβ3の染色は、ハイドロゲル表面上にこのタンパク質のほぼ完全な被覆を明らかにしており、包括的な細胞接着を示している。しかしながら、-RGDハイドロゲルは、高度に非定型形態の細胞をほとんど示さなかった。GFおよび角膜角化細胞上のF-アクチンのローダミン-ファロイジン染色もまた、+RGDおよび-RGDハイドロゲル上の細胞間の差異を強調し、+RGD上の細胞では、細胞を通じてF-アクチンの正規分布が示された。GKの免疫組織化学染色では、-RGDハイドロゲル上よりも、+RGDハイドロゲル上の細胞からの接着タンパク質αVのシグナルの方がより顕著に示された。αVβ6インテグリンは、粘膜損傷状態およびin vitroでの継代培養後に角化細胞によって発現される(Haapasalmi, K., K. Zhang, et al. (1996). "Keratinocytes in Human Wounds Express [agr]v[beta]6 Integrin." 106(1): 42-48 を参照のこと)。大量のバックグラウンド蛍光が観察されたが、インテグ���ンβ1染色によって、-RGDハイドロゲルと比較して+RGDハイドロゲル上の方が、この接着タンパク質がかなり多く存在することが示された。インテグリンβ1は歯肉線維芽細胞において発現されることが示されており、エナメル基質タンパク質への接着にとって重要であり(Van Der Pauw, M. T. M., V. Everts, et al. (2002), Journal of Periodontal Research 37(5): 317-323 を参照のこと)、その代謝および分布は、たばこの煙におけるニコチンによって影響を受けることが示されており、歯周付着を弱める可能性が示されている(Snyder, H., G. Caughman, et al. (2002), Journal of Periodontology J Periodontol 73(5): 505-10 を参照のこと)。
【０１５８】
結論
本発明に記載のRGD配列を有する、ジャイレースBおよびクーママイシンによって形成される自己放出型(self-releasing)PEGハイドロゲルは、RGDを含まないハイドロゲルと比較して大変優れた細胞培養支持体であり、細胞培養プレートに匹敵することが証明された。
【実施例７】
【０１５９】
RGD配列を含むハイドロゲルおよびRGDを含まないハイドロゲルの粘弾性特性の試験
さらなる試験において、実施例1の記載に従って製造されたRGD配列を含む本発明のPEGハイドロゲルおよびPEG-RGDを含まない比較上のハイドロゲルの粘弾性特性を試験した(図29〜30参照)。機械的なハイドロゲルの解析のために、2つのシリコン化ガラス製カバースリップの間にハイドロゲルディスク(容量40μl、高さ1mm)を製造し、合成体液中1時間膨張させた。タンパク質動的粘弾性測定装置II(protein adcanced rheometry system II)(Thermo Scientific社)を用い、20℃で20mm平行スチールプレートおよびギャップサイズ0.5mmを用いて小歪交番剪断実験で貯蔵弾性率および損失弾性率(G’およびG’’)を得た。機械的スペクトルを得るために、周波数応答関数(0.1〜10Hz)として定歪(20%)モードで測定を行った。これに関連して、図29は、RGD配列を含むハイドロゲル(上部グラフ)およびRGDを含まない比較上のハイドロゲル(下部グラフ)の周波数依存性粘弾性特性の試験結果を示す(結果はヘルツ(Hz)で示されている)。図30は、RGD配列を含むハイドロゲル(上部グラフ)およびRGDを含まない比較上のハイドロゲル(下部グラフ)の周波数依存性粘弾性特性の試験結果を示す(結果は角振動数ω(rad/sec)で示されている)。両方の試験は、実施例1に従って製造されたRGD配列の有無による本発明のPEGハイドロゲルのゲル様特性を証明している。
【実施例８】
【０１６０】
合成体液中のGyrB-PEGハイドロゲルの分解キネティクス
さらなる実施例において、ノボビオシンの種々の濃度に依存した合成体液中の本発明のGyrB-PEGハイドロゲルの分解キネティクスが研究された(図31参照)。非結合構成要素を除くために、最初にハイドロゲルを合成体液中4℃で24時間インキュベートした。その後、ハイドロゲルを対応する濃度のノボビオシンを含む合成体液に移し、4℃でインキュベートした。Bradford法を用い、上清に放出されたタンパク質を定量することによってハイドロゲルの分解をモニターした。この結果は、本発明のGyrB-PEGハイドロゲルの用量調整分解キネティクスを証明している。本発明のGyrB-PEGハイドロゲルは、実施例1に従って製造されたRGD配列を含む本発明のPEGハイドロゲルである。
【実施例９】
【０１６１】
ハイドロゲルの長期安定性(4℃での貯蔵)
さらに、実施例1に従って製造されたRGD配列を含む本発明のPEGハイドロゲルのハイドロゲル長期安定性(4℃での貯蔵)を研究した。この目的のために、このゲルを合成体液中4℃で24時間インキュベートした。次いで、このハイドロゲルを合成体液に移し、4℃で25日間保存した。25日後に1mMノボビオシンを添加することによってハイドロゲルの完全な分解を起こったが、これはBradford法を用い、上清に放出されたタンパク質を定量することによってモニターされた。ノボビオシンなしでのインキュベーションはハイドロゲルの分解をもたらさなかった。その結果、実施例1に従って製造されたハイドロゲルは、長期保存期間にわたって安定であり、かつその後にノボビオシンによって分解されることができることが明らかとなった(図32参照)。
【実施例１０】
【０１６２】
scFvハイドロゲルの製造
序論
本実施例のハイドロゲル設計は、フルオレセイン(眼科学における通常の造影剤)およびその誘導体の一部、例えばフルオレセインイソチオシアネート(FITC)に特異的に結合する一本鎖抗体(scFv)にグラフトされた分岐ポリマーをベースとする。FITC修飾ウシ血清アルブミン(BSA)によって媒介されるscFVタンパク質の架橋によってゲル形成が達成される。フルオレセインの添加によって、ハイドロゲルの用量および時間調節分解が可能である。
【０１６３】
ポリマー合成
本実施例との関係において用いるポリマーとして、対応するPEGポリマーの特性の見積もりのためにポリ(AAm-co-Ni2+-NTA-AAm)を用いた。このポリマーは最初に合成された。ポリ(AAm-co-Ni2+-NTA-AAm)の合成は、(Ehrbar et al., (2008), Nat Mater 7 (10), S. 800-804)に記載されている。対応する本発明のPEGポリマーの製造は後に続く。
【０１６４】
タンパク質産生
さらにまたscFv断片を製造した。これらのscFvはフルオレセインに指向され、FITC-E2と名付けられ、Vaughanら(1996)(Vaughan et al., (1996), Nat. Biotechnol 14 (3), S. 309-314)によって公表されている。産生のために、このscFvは、確立された発現系においてC末端ヘキサヒスチジンタグ付きバージョンとして組換えにより製造された。これは、例えば、
-(Pedrazzi et al., (1997), FEBS Lett 415 (3), S. 289-293)( E.コリのペリプラズムにおける発現)
- (Rippmann et asl., (1998), Appl. Environ. Microbiol 64 (12), S. 4862-4869)(プロテウス・ミラビリスのL型細胞における発現)
に記載されている。産生されるscFvのタンパク質配列を図33(配列番号69)に示す(ペリプラズムのシグナル配列の除去後)。
【０１６５】
発現後、細胞ペレットをPBS(初期培養液量1000ml当たり40ml、50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10mMイミダゾール、pH8.0)に再懸濁し、フレンチプレス(Thermo Fisher Scientific社、ウォルサム、マサチューセッツ州)を用いて破壊し、細胞の破片を30,000x gの遠心分離で30分間除去した。透明にした細胞溶解物を、NTA-アガロースSuperflowカラム(Qiagen社、ヒルデン、ドイツ、カタログ番号30210)に添着し、続いてこれを10カラム体積のPBS、10カラム体積の洗浄用緩衝液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、20mMイミダゾール、pH8.0)で洗浄し、2カラム体積の溶出緩衝液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、250mMイミダゾール、pH8.0)で溶出した。サイズ排除カラム(Thermo Fisher Scientific社、ウォルサム、マサチューセッツ州、カタログ番号43233)による2回の分離によって、タンパク質溶出液の緩衝液を50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10mMイミダゾール、pH8.0に交換し、限外濾過(10kDa MWCO、Sartorius社、ゲッティンゲン、ドイツ、カタログ番号VS0202)によって40mg/mlに濃縮した。
【０１６６】
FITC-BSA産生
ウシ血清アルブミン(BSA、Sigma Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州、カタログ番号05479、1mg/ml;100mM炭酸ナトリウム緩衝液、pH9)を10倍モル過剰量のフルオレセインイソチオシアネート(FITC、Sigma Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州、カタログ番号F3651、1mg/ml in無水DMSO)と混合し、4℃で12時間インキュベートした。NH4Clを最終濃度50mMになるまで添加して反応を停止させ、続いて、サイズ排除カラム(Thermo Fisher Scientific社、ウォルサム、マサチューセッツ州、カタログ番号43233)による2回の分離によって、緩衝液を50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10mMイミダゾール、pH8.0に交換し、限外濾過(10kDa MWCO、Sartorius社、ゲッティンゲン、ドイツ、カタログ番号VS0202)によって100mg/mlに濃縮した。BSAに対するFITCのカップリングにより得られたモル比は2.9〜1であり、これはそれぞれ495nmおよび280nmの吸光度を測定することによって決定された。
【０１６７】
ハイドロゲル集合体
5倍量精製scFv([50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10mMイミダゾール、pH8.0]中40mg/ml)を1倍量のFITC-BSA([50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10mMイミダゾール、pH8.0]中100mg/ml)および2倍量のポリ(AAm-co-Ni2+-NTA-AAm)([50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10mMイミダゾール、pH8.0]中0.6%w/v溶液)に加え、穏やかに撹拌することによって混合した。ハイドロゲルは直ちに形成され、さらに加湿雰囲気中、RTで12時間インキュベートした。
【０１６８】
scFvハイドロゲルの検証
非結合構成要素を除くために、最初にハイドロゲルを[50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10mMイミダゾール、pH8.0]1ml中RTで24時間インキュベートし、その後、ハイドロゲルを、1mMフルオレセイン(および対照として0mMフルオレセインをそれぞれ)を含む[50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10mMイミダゾール、pH8.0]1mlに移した。1日後、Bradford法を用いて、上清に放出されたタンパク質を定量した(図34参照)。
【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図１１】
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【図１３】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【国際調査報告】
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