(57)【要約】  本発明は、清澄化ＤＡＡ含有発酵培地又は清澄化ＭＡＡ含有発酵培地からＡＡを製造する方法であって、水とアンモニアとを含む上部（overhead）、並びに、ＡＡと少なくとも約２０％の水とを含む液体底部（liquid bottoms）を形成するために、＞１００℃〜約３００℃の温度で超大気圧下で培地を蒸留し、底部を液体部分と、実質的に純粋なＡＡである固体部分とに分離させるのに十分な温度まで底部を冷却し、液体部分から固体部分を分離すること、を含む方法を供する。また、本発明の方法は、アンモニア分離溶媒及び／又は水共沸溶媒を発酵培地へ添加することによって、培地の蒸留温度及び圧力を低下する。【選択図】なし
2013524833.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
清澄化ＤＡＡ含有発酵培地からＡＡを製造する方法であって、
（ａ）水とアンモニアとを含む上部（overhead）、並びに、ＡＡと少なくとも約２０％の水とを含む液体底部（liquid bottoms）を形成するために、＞１００℃〜約３００℃の温度で超大気圧下で培地を蒸留し、
（ｂ）底部を液体部分と、実質的に純粋なＡＡである固体部分とに分離させるのに十分な温度及び組成を達成するために、底部を冷却及び／又はエバポレートし、
（ｃ）液体部分から固体部分を分離する、
ことを含む方法。
【請求項２】
発酵培地が、ATCC寄託番号24887のカンジダ・トロピカリス（カステラーニ）バークホウト（Candida tropicalis（Castellani）Berkhout）、無性世代株OH23；ATCC寄託番号69875の大腸菌（E. coli）株AB2834/pKD136/pKD8.243A/pKD8.292；配列番号1によってコードされるシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼを発現しているベクターを含む大腸菌（E. coli）コスミドクローン5B12；配列番号1によってコードされるシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼを発現しているベクターを含む大腸菌（E. coli）コスミドクローン5F5；配列番号1によってコードされるシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼを発現しているベクターを含む大腸菌（E. coli）コスミドクローン8F6；配列番号1によってコードされるシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼを発現しているベクターを含む大腸菌（E. coli）コスミドクローン14D7；及びVerdezyne酵母菌から成る群から選択される微生物の存在下で、炭素源を発酵することによって得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
液体底部が少なくとも幾らかのＭＡＡを含み、固体部分が実質的にアジパミン酸（adipamic acid）、アジピミド及びアジパミドを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＡＡ及び水、任意にはＭＡＡを液体底部から清澄化培地へ再利用することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記液体底部中のＡＡの濃度を増加させるために、液体底部から水を除去することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
培地の蒸留が、ジグリム、トリグリム、テトラグリム、スルホキシド、アミド、スルホン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ブトキシトリグリコール、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、エーテル、及びメチルエチルケトン（ＭＥＫ）からなる群から選択される少なくとも１つのアンモニア分離溶媒の存在下、又はトルエン、キシレン、メチルシクロヘキサン、メチルイソブチルケトン、ヘキサン、シクロヘキサン及びヘプタンからなる群から選択される少なくとも１つの水共沸溶媒の存在下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
清澄化ＤＡＡ含有発酵培地からＡＡを製造する方法であって、
（ａ）アンモニア分離溶媒及び／又は水共沸溶媒を発酵培地へ添加し、
（ｂ）水及びアンモニアを含む上部（overhead）、並びに、ＡＡと少なくとも約２０ｗｔ％の水とを含む液体底部（liquid bottoms）を形成するために、十分な温度及び圧力で培地を蒸留し、
（ｃ）底部を液体部分と、実質的に純粋なＡＡである固体部分とに分離させるのに十分な温度及び組成を達成するために、底部を冷却及び／又はエバポレートし、
（ｄ）液体部分から固体部分を分離する、
ことを含む方法。
【請求項８】
発酵培地が、ATCC寄託番号24887のカンジダ・トロピカリス（カステラーニ）バークホウト（Candida tropicalis（Castellani）Berkhout）、無性世代株OH23；ATCC寄託番号69875の大腸菌（E. coli）株AB2834/pKD136/pKD8.243A/pKD8.292；配列番号1によってコードされるシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼを発現しているベクターを含む大腸菌（E. coli）コスミドクローン5B12；配列番号1によってコードされるシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼを発現しているベクターを含む大腸菌（E. coli）コスミドクローン5F5；配列番号1によってコードされるシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼを発現しているベクターを含む大腸菌（E. coli）コスミドクローン8F6；配列番号1によってコードされるシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼを発現しているベクターを含む大腸菌（E. coli）コスミドクローン14D7；及びVerdezyne酵母菌から成る群から選択される微生物の存在下で、炭素源を発酵することによって得られる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
液体底部が少なくとも幾らかのＭＡＡを含み、固体部分が実質的にアジパミン酸（adipamic acid）、アジピミド及びアジパミドを含まない、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ＡＡ、水、及び溶媒、任意にはＭＡＡを液体底部から清澄化培地へ再利用することを更に含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
培地の蒸留が、ジグリム、トリグリム、テトラグリム、スルホキシド、アミド、スルホン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ブトキシトリグリコール、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、エーテル、及びメチルエチルケトン（ＭＥＫ）からなる群から選択される少なくとも１つのアンモニア分離溶媒の存在下、又はトルエン、キシレン、メチルシクロヘキサン、メチルイソブチルケトン、ヘキサン、シクロヘキサン及びヘプタンからなる群から選択される少なくとも１つの水共沸溶媒の存在下で行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記液体底部中のＡＡの濃度を増加させるために、液体底部から水を除去することを更に含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
清澄化ＭＡＡ含有発酵培地からＡＡを製造する方法であって、
（ａ）水とアンモニアとを含む上部（overhead）、並びに、ＡＡと少なくとも約２０％の水とを含む液体底部（liquid bottoms）を形成するために、＞１００℃〜約３００℃の温度で超大気圧下で培地を蒸留し、
（ｂ）底部を液体部分と、実質的に純粋なＡＡである固体部分とに分離させるのに十分な温度及び組成を達成するために、底部を冷却及び／又はエバポレートし、
（ｃ）液体部分から固体部分を分離する、
ことを含む方法。
【請求項１４】
発酵培地が、ATCC寄託番号24887のカンジダ・トロピカリス（カステラーニ）バークホウト（Candida tropicalis（Castellani）Berkhout）、無性世代株OH23；ATCC寄託番号69875の大腸菌（E. coli）株AB2834/pKD136/pKD8.243A/pKD8.292；配列番号1によってコードされるシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼを発現しているベクターを含む大腸菌（E. coli）コスミドクローン5B12；配列番号1によってコードされるシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼを発現しているベクターを含む大腸菌（E. coli）コスミドクローン5F5；配列番号1によってコードされるシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼを発現しているベクターを含む大腸菌（E. coli）コスミドクローン8F6；配列番号1によってコードされるシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼを発現しているベクターを含む大腸菌（E. coli）コスミドクローン14D7；及びVerdezyne酵母菌から成る群から選択される微生物の存在下で、炭素源を発酵することによって得られる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
液体底部が少なくとも幾らかのＭＡＡを含み、固体部分が実質的にアジパミン酸（adipamic acid）、アジピミド及びアジパミドを含まない、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ＡＡ及び水、任意にはＭＡＡを液体底部から清澄化培地へ再利用することを更に含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記液体底部中のＡＡの濃度を増加させるために、液体底部から水を除去することを更に含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
培地の蒸留が、ジグリム、トリグリム、テトラグリム、スルホキシド、アミド、スルホン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ブトキシトリグリコール、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、エーテル、及びメチルエチルケトン（ＭＥＫ）からなる群から選択される少なくとも１つのアンモニア分離溶媒の存在下、又はトルエン、キシレン、メチルシクロヘキサン、メチルイソブチルケトン、ヘキサン、シクロヘキサン及びヘプタンからなる群から選択される少なくとも１つの水共沸溶媒の存在下で行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
清澄化ＭＡＡ含有発酵培地からＡＡを製造する方法であって、
（ａ）アンモニア分離溶媒及び／又は水共沸溶媒を発酵培地へ添加し、
（ｂ）水及びアンモニアを含む上部（overhead）、並びに、ＡＡと少なくとも約２０ｗｔ％の水とを含む液体底部（liquid bottoms）を形成するために、十分な温度及び圧力で培地を蒸留し、
（ｃ）底部を液体部分と、実質的に純粋なＡＡである固体部分とに分離させるのに十分な温度及び組成を達成するために、底部を冷却及び／又はエバポレートし、
（ｄ）液体部分から固体部分を分離する、
ことを含む方法。
【請求項２０】
発酵培地が、ATCC寄託番号24887のカンジダ・トロピカリス（カステラーニ）バークホウト（Candida tropicalis（Castellani）Berkhout）、無性世代株OH23；ATCC寄託番号69875の大腸菌（E. coli）株AB2834/pKD136/pKD8.243A/pKD8.292；配列番号1によってコードされるシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼを発現しているベクターを含む大腸菌（E. coli）コスミドクローン5B12；配列番号1によってコードされるシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼを発現しているベクターを含む大腸菌（E. coli）コスミドクローン5F5；配列番号1によってコードされるシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼを発現しているベクターを含む大腸菌（E. coli）コスミドクローン8F6；配列番号1によってコードされるシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼを発現しているベクターを含む大腸菌（E. coli）コスミドクローン14D7；及びVerdezyne酵母菌から成る群から選択される微生物の存在下で、炭素源を発酵することによって得られる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
液体底部が少なくとも幾らかのＭＡＡを含み、固体部分が実質的にアジパミン酸（adipamic acid）、アジピミド及びアジパミドを含まない、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ＡＡ、水、及び溶媒、任意にはＭＡＡを液体底部から清澄化培地へ再利用することを更に含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
培地の蒸留が、ジグリム、トリグリム、テトラグリム、スルホキシド、アミド、スルホン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ブトキシトリグリコール、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、エーテル、及びメチルエチルケトン（ＭＥＫ）からなる群から選択される少なくとも１つのアンモニア分離溶媒の存在下、又はトルエン、キシレン、メチルシクロヘキサン、メチルイソブチルケトン、ヘキサン、シクロヘキサン及びヘプタンからなる群から選択される少なくとも１つの水共沸溶媒の存在下で行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記液体底部中のＭＡＳの濃度を増加させるために、液体底部から水を除去することを更に含む、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１０年４月３０日に出願した米国仮出願番号６１／３２９，８００の利益を主張する。この出願の主題は引用により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示発明は、アジピン酸二アンモニウム（ＤＡＡ）、アジピン酸一アンモニウム（ＭＡＡ）及び／又はアジピン酸（ＡＡ）を含む発酵培地からのＡＡの直接製造法に関する。
【背景技術】
【０００３】
糖発酵の炭素質産物の中には、炭素含有化学物質の製造原料として使用される石油由来材料の代替品と見做されているものがある。そのような産物の一つがＡＡである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＤＡＡ含む発酵培地から、実質的に純粋なＡＡを直接製造する方法を提供することが望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は、清澄化ＤＡＡ含有発酵培地からＡＡを製造する方法を提供する。この方法は、水とアンモニアとを含む上部（overhead）、並びに、ＡＡと少なくとも約２０％の水とを含む液体底部（liquid bottoms）を形成するために、＞１００℃〜約３００℃の温度で超大気圧下で培地を蒸留し、底部を液体部分と、実質的に純粋なＡＡである固体部分とに分離させるのに十分な温度及び組成を達成するために、底部を冷却及び／又はエバポレートし、並びに液体部分から固体部分を分離することを含む。
【０００６】
また、本発明者等は、清澄化ＤＡＡ含有発酵培地からＡＡを製造する方法も提供する。この方法は、アンモニア分離溶媒及び／又は水共沸溶媒を発酵培地へ添加し、水及びアンモニアを含む上部（overhead）、並びに、ＡＡと少なくとも約２０ｗｔ％の水とを含む液体底部（liquid bottoms）を形成するために培地を蒸留し、底部を液体部分と、実質的に純粋なＡＡである固体部分とに分離させるのに十分な温度及び組成を達成するために、底部を冷却及び／又はエバポレートし、並びに液体部分から固体部分を分離することを含む。
【０００７】
また、本発明者等は、清澄化ＭＡＡ含有発酵培地からＡＡを製造する方法も提供する。この方法は、水及びアンモニアを含む上部（overhead）、並びに、ＡＡと少なくとも約２０ｗｔ％の水とを含む液体底部（liquid bottoms）を形成するために、＞１００℃〜約３００℃の温度で超大気圧下で培地を蒸留し、底部を液体部分と、実質的に純粋なＡＡである固体部分とに分離させるのに十分な温度及び組成を達成するために、底部を冷却及び／又はエバポレートし、並びに液体部分から固体部分を分離することを含む。
【０００８】
また、本発明者等は、清澄化ＭＡＡ含有発酵培地からＡＡを製造する方法を提供する。この方法は、アンモニア分離溶媒及び／又は水共沸溶媒を発酵培地へ添加し、水とアンモニアとを含む上部、並びに、ＡＡと少なくとも約２０％の水とを含む液体底部を形成するために十分な温度で培地を蒸留し、底部を液体部分と、実質的に純粋なＡＡである固体部分とに分離させるのに十分な温度及び組成を達成するために、底部を冷却及び／又はエバポレートし、液体部分から固体部分を分離することを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ＤＡＡ含有培地からＡＡを製造するための方法の一例のブロック図である。
【００１０】
【図２】図２は、水に対するＡＡの溶解性を、温度の関数として表したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
当然のことではあるが、以下の説明のうち少なくとも一部は、図における例示のために選択された方法の代表例を指すことを意図したものであり、添付の特許請求の範囲を除いて、本開示発明を定義又は限定することを意図したものではない。
【００１２】
本発明の方法は、例えば図１を参照することにより理解される。図１は、本発明の方法の代表例１０をブロック図として表したものである。
【００１３】
生育槽１２は、通常は備え付けの蒸気滅菌可能な発酵槽であって、ＤＡＡ、ＭＡＡ、及び／又はＡＡ含有発酵培地の製造に用いられる微生物培養物（未記載）の培養に使用し得る。そのような生育槽は本技術分野で公知であり、更に言及しない。
【００１４】
この微生物培養物は、炭水化物糖等の発酵性炭素源からＡＡを産生し得る微生物を含んでいてもよい。微生物の代表例としては、これらに限定される訳ではないが、大腸菌（Escherichia coli）、アスペルギルスニガー（Aspergillus niger）、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）（また、ブレビバクテリウムフラバム（Brevibacterium flavum））、エンテロコッカスフェカリス（Enterococcus faecalis）、ベイヨネラパルビュラ（Veillonella parvula）、アクチノバチルススクシノゲネス（Atinobacillus succinogenes）、ペシロマイセスバリオッティ（Paecilomyces Varioti）、サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、カンジダトロピカリス（Candida tropicalis）、バクテロイデスフラジリス（Bacteroides fragilis）、バクテロイデスルミニコラ（Bacteroides ruminicola）、バクテロイデスアミロフィラス（Bacteroides amylophilus）、クレブシエラニューモニエ（Lebsiella pneumonae）、それらの混合物等が挙げられる。
【００１５】
好ましい微生物は、ATCC寄託番号24887のカンジダ・トロピカリス（カステラーニ）バークホウト（Candida tropicalis（Castellani）Berkhout）、無性世代株OH23；ATCC寄託番号69875の大腸菌（E. coli）株AB2834/pKD136/pKD8.243A/pKD8.292；アシネトバクター（Acinetobacter）株SE19由来の配列番号2に示され配列番号1によってコードされるアミノ酸配列を有する、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼを発現しているベクターを含む、5B12、5F5、8F6及び14D7と呼ばれる大腸菌（E. coli）コスミドクローン、及びアルカン及び他の炭素源からAAを生じるVerdezyne, Inc.から購入できる酵母菌株（Carslbad, CA, USA; 以降「Verdezyne酵母菌」と呼ぶ）を含む。
【００１６】
AAを含む発酵培地は、300 mgのNH4H2PO4、200 mgのKH2PO4、100 mgのK2HPO4、50 mgのMgSO4・7H2O、1 μgのビオチン、100 mlの蒸留水の0.1%（w/v）酵母菌抽出物及び約1%（v/v）n-ヘキサデカンを含む液体培地中での32oCの培養によって、ATCC寄託番号24887のカンジダトロピカリス（カステラーニ）バークホウト（Candida tropicalis （Castellani）Berkhout）、無性世代株OH23から作成できる。n-ヘキサデカンを含むYM培地等の他の培地もまた使用できる。n-ヘキサデカンを含む培地から、ATCC寄託番号24887のカンジダ・トロピカリス（カステラーニ）バークホウト（Candida tropicalis（Castellani）Berkhout）、無性世代株OH23を培養することによって、AAを含む発酵培地の作成のための手順は、Okuhura等の、35 Agr. Biol. Chem. 1376（1971）にも記載され、その主題は引用により本明細書に組み込まれる。
【００１７】
AAを含む発酵培地は、ATCC寄託番号69875の大腸菌（E. coli）株AB2834/pKD136/pKD8.243A/pKD8.292からも作成される。これは、次のように行うことができる。IPTG（0.2 mM）、アンピシリン（0.05 g）、クロラムフェニコール（0.02 g）及びスペクチノマイシン（0.05 g）を含む、１リットルのLB培地（4LのErlenmeyer振盪フラスコ中）に、250 rpm、37oCで10時間培養した10 mLの一晩培養の大腸菌（E. coli）株AB2834/pKD136/pKD8.243A/pKD8.292細胞を接種する。細胞を収集し、56 mM D-グルコース、シキミ酸（0.04 g）、IPTG（0.2 mM）、アンピシリン（0.05 g）、クロラムフェニコール（0.02 g）及びスペクチノマイシン（0.05 g）を含む1 LのM9最少培地中で再懸濁する。続いて培養物を37oCのインキュベーションに戻す。最少培地での再懸濁後に、培養物のpHを、特に最初の12時間に亘り厳密にモニターする。培養物がpH6.5に達した場合、5N NaOH又は適量の水酸化アンモニウム等の他の塩基を添加し、pHを調整し約6.8に戻す。48時間の蓄積期間に亘り、培養物はpH 6.3を下回るべきでない。培地で24時間後、12 mMのシス, シス-ムコネート及び1 mMのプロトカテキュ酸が、23 mM D-グルコースと共に培養上清で検出され得る。培地で48時間後に、大腸菌（E. coli）株AB2834/pKD136/pKD8.243A/pKD8.292細胞は、本質的に培地の56 mMのD-グルコースを、17 mMのシス, シス-ムコネートと置換し得る。
【００１８】
AAを含む発酵培地を作成するための、微生物に合成されたシス, シス-ムコネートAAの還元は、続いて以下のように進行できる。炭素（10%）上の50ミリグラムの白金を、約 17.2 mMのシス, シス-ムコネートを含む発酵培地由来の6 mLの無細胞の培養上清に添加する。この試料を続いて、室温で3時間、50 psiの水素圧で水素化し、AAを含む発酵培地を作成する。斯かる方法で作成された発酵培地は、例えば、約 15.1 mMのAAを含み得る。D-グルコースを含む成長培地中での培養によって、大腸菌（E. coli）株AB2834/pKD136/pKD8.243A/pKD8.292細胞を培養することによる、AAを含む発酵培地作成手順は、Draths及びFrostの、116 J. Am. Chem. Soc. 399（1994）; Draths及びFrostの、18 Biotechnol. Prog. 201（2002）、米国特許第5,487,987号及び第5,616,496号にも記載され、それらの主題は引用により本明細書に組み込まれる。
【００１９】
AAを含む発酵培地はまた、0.4%グルコースを炭素源として追加したM9 最少培地で、アシネトバクター（Acinetobacter）株SE19由来の配列番号1によってコードされるシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ配列番号2を発現しているベクターを含む、5B12、5F5、8F6及び14D7と呼ばれる大腸菌（E. coli）コスミドクローンを培養することによって、これらのクローンから作成できる。培地へ330 ppmのシクロヘキサノールを添加し、2時間振盪させながら細胞を30oCで成長させる。これに続いて、さらなる期間、例えば、2、4又は20時間、或いは他の期間さらに30oCでインキュベーションできる。D-グルコース及びシクロヘキサノールを含む成長培地において、アシネトバクター（Acinetobacter）株SE19由来の配列番号1によってコードされるシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼを発現しているベクターを含む、5B12、5F5、8F6及び14D7と呼ばれる大腸菌（E. coli）コスミドクローンを培養することによる、AAを含む発酵培地の作成手順は、米国特許第6,794,165号にもまた記載され、その主題は引用により本明細書に組み込まれる。
【００２０】
AAを含む発酵培地はまた、2010年２月８日に、アルカン又は他の炭素源、例えば糖及び植物ベースの油を含む培地（例えば、SD培地）で培養される場合にAAを産生することが報告された、Verdezyne, Inc.（Carslbad, CA, USA）から購入できるVerdezyne酵母菌株で作成できる。
【００２１】
AAを含む発酵培地はまた、スクシニル-CoA:アセチル-CoAアシルトランスフェラーゼ; 3-ヒドロキシアシル-CoA脱水素酵素; 3-ヒドロキシアジピル-CoAデヒドラターゼ; 5-カルボキシ-2-ペンテノイル-CoA還元酵素; アジピル-CoA合成酵素, ホスホトランスアジピラーゼ/アジピン酸キナーゼ, アジピル-CoAトランスフェラーゼ又はアジピル-CoAヒドロラーゼをコードする核酸で形質転換された大腸菌（E. coli）又は他の微生物から作成できる。AAを含む発酵培地は、スクシニル-CoA:アセチル-CoAアシルトランスフェラーゼ; 3-オキソアジピル-CoAトランスフェラーゼ; 3-オキソアジピン酸還元酵素; 3-ヒドロキシアジピン酸デヒドラターゼ; 及び2-エノエート還元酵素をコードする核酸で形質転換された大腸菌（E. coli）又は他の微生物からさらに作成できる。AAを含む発酵培地はまた、アルファ-ケトアジピル-CoA合成酵素, ホスホトランスケトアジピラーゼ/アルファ-ケトアジピン酸キナーゼ又はアルファ-ケトアジピル-CoA:アセチル-CoAトランスフェラーゼ; 2-ヒドロキシアジピル-CoA脱水素酵素; 2-ヒドロキシアジピル-CoAデヒドラターゼ; 5-カルボキシ-2-ペンテノイル-CoA還元酵素; 及びアジピル-CoA合成酵素, ホスホトランスアジピラーゼ/アジピン酸キナーゼ, アジピル-CoA:アセチル-CoAトランスフェラーゼ又はアジピル-CoAヒドロラーゼをコードする核酸で形質転換された大腸菌（E. coli）又は他の微生物から作成できる。AAを含む発酵培地はさらに、2-ヒドロキシアジピン酸脱水素酵素; 2-ヒドロキシアジピル-CoA合成酵素, ホスホトランスヒドロキシアジピラーゼ/2-ヒドロキシアジピン酸キナーゼ又は2-ヒドロキシアジピル-CoA:アセチル-CoAトランスフェラーゼ; 2-ヒドロキシアジピル-CoAデヒドラターゼ; 5-カルボキシ-2-ペンテノイル-CoA還元酵素; 及びアジピル-CoA合成酵素, ホスホトランスアジピラーゼ/アジピン酸キナーゼ, アジピル-CoA:アセチル-CoAトランスフェラーゼ又はアジピル-CoAヒドロラーゼをコードする核酸で形質転換された大腸菌（E. coli）又は他の微生物から作成できる。
【００２２】
これらの酵素をコードする核酸で形質転換された大腸菌（E. coli）又は他の微生物の発酵は、転換形質の維持に必要な適した抗菌又は栄養サプリメントを添加して、標準培地（例えば、M9最少培地）で、標準条件下で様々な異なる炭素源を使用して行うことができる。これらの酵素をコードする核酸で形質転換された大腸菌（E. coli）又は他の微生物、適した成長培地及び炭素源を培養することによるAAを含む発酵培地の作成手順はまた、米国特許出願第2009/0305364号に記載され、その主題は引用により本明細書に組み込まれる。
【００２３】
サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）及び他の株、微生物株、適した成長培地及び炭素源を培養することによる、AA等のジカルボン酸を含む発酵培地の作成手順はまた、国際公開第2010/003728号に記載され、その主題は引用により本明細書に組み込まれる。
【００２４】
発酵性炭素源（例えば炭水化物及び糖）を、任意により窒素源及び複合栄養素（例えばコーンスティープリカー）、ビタミン、塩、細胞成長及び／又は産物生成を改善し得る他の材料等の追加培地成分、並びに水と共に、微生物培養物の生育及び維持のために生育槽１２に供給してもよい。一般的には、微生物培養物は、酸素富化ガス（例えば空気）の散布により提供される好気性条件下で培養される。一般的には、微生物培養物の培養の間、ｐＨ調節のために酸（例えば硫酸）及び水酸化アンモニウムを供給する。
【００２５】
ある例（未記載）によれば、酸素富化ガスを酸素欠乏ガス（例えば、ＣＯ2等）に変えることにより、生育槽１２内の（酸素富化ガス散布により提供される）好気性条件を、嫌気性条件に変更する。嫌気性環境により、生育槽１２ではインサイチュ（in situ）で、発酵性炭素源からＡＡへの生物変換を誘発できる。発酵性炭素源からＡＡへの生物変換の間、ｐＨ調節のために、水酸化アンモニウムを供給する。水酸化アンモニウムの存在によって、産生されたＡＡの全てでなくても少なくとも一部は中和されてＤＡＡとなり、ＤＡＡを含有する培地が産生される。ＣＯ2の添加は、ＡＡ産生のための更なる炭素源を提供し得る。
【００２６】
他の例によれば、生育槽１２の内容物を、流部（stream）１４を経由して、炭水化物源からＡＡへの生物変換用の別の生物変換槽１６に移送してもよい。ＡＡ産生を生じさせる嫌気性条件を提供するために、生物変換槽１６には酸素欠乏ガス（例えばＣＯ2）を散布する。炭水化物源からＡＡへの生物変換の間、ｐＨ調節のために水酸化アンモニウムを供給する。水酸化アンモニウムの存在により、産生されたＡＡの少なくとも一部は中和されてＤＡＡとなり、ＤＡＡを含有する培地が産生される。ＣＯ２の添加は、ＡＡ産生のための更なる炭素源を提供し得る。
【００２７】
他の例によれば、生物変換を比較的低いｐＨ（例えば３〜６）で行ってもよい。炭水化物源からＡＡへの生物変換の間、ｐＨ調節のために塩基（水酸化アンモニウム又はアンモニア）を供給してもよい。所望のｐＨに応じて、水酸化アンモニウムの存在又は不在により、ＡＡが産生されるか、或いは産生されたＡＡの少なくとも一部が中和されて、ＭＡＡ、ＤＡＡ、又はＡＡ、ＭＡＡ及び／又はＤＡＡを含む混合物となる。即ち、生物変換時に産生されたＡＡは、任意により追加工程としてアンモニア又は水酸化アンモニウムを供給することにより、その後に中和されて、ＤＡＡを含有する培地が産生される。従って、「ＤＡＡ含有発酵培地」とは通常、発酵培地がＤＡＡと共に、添加及び／又は生物変換等により産生された任意の数の他の成分、例えばＭＡＡ及び／又はＡＡを含むことを意味する。同様に、「ＭＡＡ含有発酵培地」とは通常、発酵培地がＭＡＡと共に、添加及び／又は生物変換等により産生された任意の数の他の成分、例えばＤＡＡ及び／又はＡＡを含むことを意味する。
【００２８】
発酵性炭素源の生物変換の結果として（生物変換を行う場所に応じて生育槽１２又は生物変換槽１６で）生じる培地は、通常は不溶性固体、例えば細胞性バイオマスや他の懸濁物等を含む。そこで、蒸留前に流部１８を経由して清澄化装置２０に移送し、不溶性固体を除去して培地を清澄化する。これによって後の蒸留装置の汚損を低減し又は予防する。不溶性固体の除去は、数種の固液分離技術の何れかを単独又は組合せで用いて行うことができる。固液分離技術としては、限定されるものではないが、遠心分離や濾過（限定されるものではないが、限外濾過、精密濾過又は深層濾過が挙げられる。）が挙げられる。濾過技術は公知技術に基づいて選択し得る。可溶性無機化合物は、複数の公知の方法により除去することができる。例としては、限定されるものではないが、イオン交換、物理吸着が挙げられる。
【００２９】
遠心分離の例として、連続ディスクスタック遠心分離が挙げられる。場合によっては、遠心分離後に、デッドエンド濾過やクロスフロー濾過等の研磨濾過（polishing filtration）工程を追加すると有益である。斯かる濾過には、珪藻土等の濾過助剤を使用してもよい。研磨濾過として、より好ましくは限外濾過又は精密濾過である。限外濾過及び精密濾過膜は、例えばセラミックやポリマー等からなる。ポリマー膜の一例として、Koch Membrane System（850 Main Street, Wilmington, MA, USA）製SelRO MPS-U20P（ｐＨ安定限外濾過膜）が挙げられる。これは分子量カットオフ２５０００ダルトンの市販ポリエーテルスルホン膜であって、通常は圧力０．３５〜１．３８ＭＰａ（最大圧力１．５５Ｍｐａ）、最高温度５０℃で使用できる。あるいは、濾過工程は、限外又は精密濾過を用いて単独で使用できる。
【００３０】
こうして清澄化された、実質的に微生物培養物や他の固体を含まないＤＡＡ含有培地又はＭＡＡ含有培地を、流部２２を経由して蒸留装置２４に移送する。
【００３１】
清澄化蒸留培地は、ＤＡＡを、培地中の全ジカルボン酸ニアンモニウム塩の少なくとも大部分、好ましくは少なくとも約７０ｗｔ％、より好ましくは８０ｗｔ％、最も好ましくは少なくとも約９０ｗｔ％の量で含むべきである。ＤＡＡ及び／又はＭＡＡの濃度は、発酵培地中の全ジカルボン酸塩に対する重量パーセント（ｗｔ％）として、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）やその他の公知法により容易に決定できる。
【００３２】
蒸留装置２４から水及びアンモニアが上部（overhead）として除去されるとともに、任意により、少なくとも一部が流部２６を経由して生物変換槽１６（或いは嫌気性モードで操作の場合、生育槽１２）で再利用（recycle）される。
【００３３】
特定の蒸留温度及び圧力は重要ではなく、少なくとも蒸留上部が水及びアンモニアを含み、蒸留底部（bottoms）が好ましくは少なくとも幾らかのＡＡと少なくとも約２０ｗｔ％の水を含むように、蒸留を実施すればよい。水の量は少なくとも約３０ｗｔ％がより好ましく、少なくとも約４０ｗｔ％が更に好ましい。蒸留工程からのアンモニア除去率は、温度を上昇させるに従って増加し、また、蒸留時に蒸気を注入することにより（未記載）増加させることができる。蒸留時のアンモニア除去率は、真空下で蒸留を行い、或いは蒸留装置に空気、窒素等の不活性ガスを散布することによっても増加させることができる。
【００３４】
蒸留工程時の水の除去は、底部が少なくとも約２０％の水を含む限りにおいて、トルエン、キシレン、メチルシクロヘキサン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサン、ヘプタン等の有機共沸剤の使用により促進することができる。水と共沸混合物を形成し得る有機剤の存在下で蒸留を行うと、蒸留によって水相及び有機相を含む二相性底部が生じる。この場合、水相を有機相から分離し、蒸留底部として使用することができる。底部における水のレベルを少なくとも約３０ｗｔ％に維持すれば、アジピミド（adipimide）やアジパミド等の副生物を実質的に避けることができる。
【００３５】
蒸留工程の好ましい温度は、圧力にもよるが、約５０〜約３００℃の範囲である。より好ましい温度範囲は、圧力にもよるが、約１５０〜約２４０℃である。約１７０〜約２３０℃の蒸留温度が好適である。「蒸留温度」とは底部の温度を指す（バッチ蒸留の場合は、最終的に所望量の上部が得られた時点の温度でもよい）。
【００３６】
水混和性有機溶媒又はアンモニア分離溶媒を添加することにより、上述した範囲の蒸留温度及び圧力において、脱アンモニアが容易になる場合がある。斯かる溶媒としては、受動的水素結合を形成し得る非プロトン性、双極性、酸素含有溶媒が挙げられる。例としては、限定されるものではないが、ジグリム、トリグリム、テトラグリム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等のスルホキシド、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びジメチルアセトアミド等のアミド、ジメチルスルホン等のスルホン、γブチロラクトン、スルホラン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ブトキシトリグリコール、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジオキサン等のエーテル、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）等が挙げられる。そのような溶媒は、清澄化培地中のＤＡＡ又はＭＡＡからアンモニアの除去に役立つ。蒸留法によらず、蒸留は、底部に少なくとも幾らかのＭＡＡと、少なくとも約２０ｗｔ％、より有利には少なくとも約３０ｗｔ％の水とが保持されるように行うことが好ましい。蒸留は、大気圧、低大気圧又は超大気圧下で実施できる。
【００３７】
共沸溶媒又はアンモニア分離溶媒なしに蒸留を行うような他の条件下では、蒸留は超大気圧下で、100℃以上〜約300℃の温度で行い、水とアンモニアを含む上部（overhead）とAA及び少なくとも約20 wt%の水を含む液底部を形成する。超大気圧は典型的には、周囲雰囲気以上、約25 気圧以下の範囲内である。水の量は、少なくとも約30 wt%が有益である。
【００３８】
蒸留は、一段フラッシュ（one stage flash）、多段式蒸留（即ち、多段式カラム蒸留）等が挙げられる。一段フラッシュは、任意の種類のフラッシャー（例えば塗膜エバポレーター、薄膜エバポレーター、サーモサイフォンフラッシャー、強制循環フラッシャー等）で行うことができる。多段蒸留カラムは、トレー、充填物（packing）等を用いて達成することができる。充填物は、不規則充填物（例えばラシヒ（Raschig）リング、ポール（Pall）リング、バール（Berl）サドル等）でも、規則充填物（例えばコークスルザー（Koch Sulzer）充填物、インタロックス（Intalox）充填物、メラパック（Mellapak）等）でもよい。トレーは、任意のデザイン（例えばシーブトレー、バルブトレー、バブルカップトレー等）でもよい。蒸留は任意の理論段数で行うことができる。
【００３９】
蒸留装置がカラムの場合、その構成は特に重要ではなく、周知の基準に基づいて設計することができる。カラムは、ストリッピングモード、精留（rectifying）モード、又は分留（fractionation）モードの何れかで操作することができる。蒸留は、バッチモードで行ってもよく、半連続モード又は連続モードで行ってもよい。連続モードでは、培地を蒸留装置に連続的に注入してもよく、また、上部及び底部の形成に伴いこれらを連続的に装置から除去してもよい。蒸留により得られる蒸留物はアンモニア水溶液であり、蒸留底部はＭＡＡ及びＡＡの液体状の水溶液である。これらは更に、他の発酵副生物の塩（即ち、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、乳酸アンモニウム等）や、色素体を含んでもよい。
【００４０】
蒸留底部を、流部２８を経由して冷却装置３０に移送し、常法により冷却してもよい。冷却法は重要ではないが、好ましい技術を以下に記載する。熱交換機（熱回収型）を使用することができる。フラッシュ気化冷却器を用いて底部を約１５℃まで冷却してもよい。１５℃までの冷却には、通常は冷蔵冷却剤を用いる。例としてはグリコール溶液や、それほど好ましくはないが、塩水等が挙げられる。収量の更なる増大を図る目的で、冷却の前に濃縮工程を組み入れてもよい。更に、公知の、例えば、真空エバポレーションと共に、一体型冷却ジャケット及び／又は外部熱交換器を用いた徐熱等を用いて、濃縮及び冷却の両方を組み合わせてもよい。
【００４１】
本発明者等は、液体底部に幾らかのＭＡＡが存在することで、液体状の水溶液たるＭＡＡ含有底部に対するＡＡの溶解性が低下し、これによって底部が容易に、少なくともＡＡ「から実質的になる」（固体部分が少なくとも実質的に純粋な結晶ＡＡであることを意味する）固体部分と、これに接する液体部分とに冷却誘導分離されることを見出した。図２は、水溶液に対するＡＡの溶解性を示す。ここから本発明者等は、ＡＡ水溶液に幾らかのＭＡＡもまた含まれている方が、水溶液からＡＡをより完全に結晶化できることを見出した。斯かる溶液中のＭＡＡの好ましい濃度は、約２０ｗｔ％またはそれ以上の範囲である。この事実によって、ＭＡＡが存在しない場合に必要な温度よりも高い温度で、ＡＡを結晶化する（即ち、蒸留底部の固体部分を形成する）ことが可能となる。
【００４２】
蒸留底部を、固体部分を液体部分から分離するために、流部３２を経由して分離器３４に導入する。分離は、加圧濾過（例えば、Nutsche又はRosenmond型加圧濾過器）、遠心分離等により達成できる。生じた固体産物を産物３６として回収し、所望により標準法で乾燥してもよい。
【００４３】
分離後、固体部分の表面に液体部分が残存することのないように、固体部分を処理することが望ましい。固体部分の表面に残る液体部分の量を最小化するための一つの方法は、分離した固体部分を水洗し、洗浄後の固体部分を乾燥することである（未記載）。固体部分を洗浄するための簡便な方法としては、いわゆる「バスケット遠心分離」の使用が挙げられる（未記載）。適切なバスケット遠心分離機は、The Western States Machine Company（Hamilton, OH, USA）から入手できる。
【００４４】
蒸留底部３４の液体部分（即ち母液）は、残存する溶解ＡＡ、任意の非変換ＭＡＡ、酢酸アンモニウム、乳酸類（lactate）、ギ酸類（formate）等の任意の発酵副生物、その他の微量不純物を含む場合がある。この液体部分を、流部３８を経由して下流装置４０に導入する。一例によれば、装置４０は、混合物を適量の水酸化カリウムで処理することにより、例えばアンモニウム塩をカリウム塩に変換し、解氷剤（de-icer）を作製する手段であってもよい。この反応で生じたアンモニアを回収し、生物変換槽１６（又は嫌気性モードで操作する生育槽１２）で再利用してもよい。得られたカリウム塩混合物は、解氷剤及び防氷剤（anti-icer）として有用である。
【００４５】
ＡＡの回収を促進し、更にはＭＡＡからＡＡへの変換を推進するために、固体分離工程３４由来の母液を、流部４２を経由して、蒸留装置２４で再利用（又はその一部を再利用）してもよい。
【００４６】
冷却誘導結晶化の固体部分は、実質的に純粋なＡＡであり、ひいてはＡＡの公知用途に有用である。
【００４７】
ＨＰＬＣを用いて、アジパミドやアジピミド等の窒素含有不純物の存在を検出してもよい。ＡＡの純度は元素炭素及び窒素分析により決定できる。アンモニア電極を用いてＡＡ純度の粗近似値を決定することも可能である。
【００４８】
状況や種々の操作入力によっては、発酵培地が清澄化ＭＡＡ含有発酵培地又は清澄化ＡＡ含有発酵培地である場合がある。斯かる状況では、実質的に純粋なＡＡの産生を容易にするために、これらの発酵培地にＭＡＡ、ＤＡＡ、及び／又はＡＡ、任意により、アンモニア及び／又は水酸化アンモニウムを添加するのが有利な場合もある。例えば、培地がＭＡＡ含有培地又はＡＡ含有培地となるような方向に、発酵培地のｐＨを操作してもよい。上述した実質的に純粋なＡＡの製造を容易にするために、これらの発酵培地にＭＡＡ、ＤＡＡ、ＡＡ、アンモニア及び／又は水酸化アンモニウムを添加し、培地のｐＨを好ましくは６未満に調整してもよい。ある特定の形態によれば、蒸留工程２４で得られる液体底部から、ＡＡ、ＭＡＡ及び水を発酵培地及び／又は清澄化培地に再導入（recycle）するのが特に有利である。ＭＡＡ含有培地については、そのような培地は通常、発酵培地がＭＡＡと共に、添加及び／又は生物変換等により産生された任意の数の他の成分、例えばＤＡＡ及び／又はＡＡ等を含むことを意味する。
【実施例】
【００４９】
本発明の方法を、以下の非限定的な代表例により説明する。
【００５０】
実際の培地に見られる典型的な発酵副生物の溶解性ゆえに、合成ＤＡＡ溶液の使用は、本発明の方法における実際の培地の挙動を表す良いモデルであると考えられる。発酵時に産生される主な副生物は、酢酸アンモニウム、乳酸アンモニウム及びギ酸アンモニウムである。酢酸アンモニウム、乳酸アンモニウム、及びギ酸アンモニウムは、ＡＡよりも有意に高い水溶性を示し、各々の培地中の濃度はＤＡＡ濃度の１０％未満である。加えて、たとえ蒸留工程時に酸（酢酸、ギ酸及び乳酸）が形成されたとしても、これらは水と混和性であり、水から結晶化しないであろう。これは、母液（即ち液体部分）に溶解した酸不純物を残したまま、ＡＡのみが飽和に達し、溶液から結晶化する（即ち固体部分を形成する）ことを意味する。
【００５１】
実施例１
本実施例は、ＤＡＡのＭＡＡへの変換を示す。
【００５２】
１Ｌの丸底フラスコに、合成４．５％ＤＡＡ溶液８００ｇを入れた。蒸留ヘッドを装着した５トレーのオールダーショウ（Oldershaw）セクションを取り付けた。蒸留物を氷冷レシーバに採取した。フラスコの内容物を加熱マントルで加熱し、マグネチックスターラーで攪拌した。蒸留を開始し、７１９．７ｇの蒸留物を回収した。蒸留物を滴定したところ、アンモニア含量は０．２９％（即ち、ＤＡＡからＭＡＡへの変換率は約６１％）であった。熱い残渣（７６ｇ）をフラスコから取り出し三角フラスコに移し、攪拌しつつ終夜かけて室温まで徐冷した。内容物を攪拌しつつ１５℃まで６０分間かけて冷却した後、１０℃まで更に６０分間かけて冷却し、最後は５℃まで６０分間かけて冷却した。固体を濾過し、真空中７５℃で２時間乾燥させ、１６．２ｇ得た。アンモニア電極でアンモニア含量に関して個体を分析したところ、アンモニアとＡＡのモル比は、ほぼ１：１であることが示された。
【００５３】
実施例２
本実施例は、ＭＡＡのＡＡへの変換を示す。
【００５４】
パール（Parr）オートクレーブ３００ｍＬに、合成ＭＡＡ８０ｇ及び水１２４ｇを入れた。オートクレーブを密閉し、内容物を攪拌し、約２００℃まで加熱した（自発圧力（autogenic pressure）は約２０３ｐｓｉｇであった）。内容物が当該温度に達したら、水を速度約２ｇ／分でオートクレーブに注入し、背圧調整弁で蒸気を速度約２ｇ／分でオートクレーブから除去した。オートクレーブから除去した蒸気を濃縮し、レシーバに採取した。最終的に合計１２１０ｇの水を注入し、合計１１８５ｇの蒸留物を採取するまで、オートクレーブの運転を上記条件で継続した。オートクレーブの内容物（２０９ｇ）の一部を冷却し、反応槽から排出した。スラリーを三角フラスコ（Erlenmeyer flask）内で攪拌下、室温で終夜に亘り静置した。その後、スラリーを濾過し、固体を水２５ｇで洗浄した。湿潤固体を７５℃の真空オーブンで１時間乾燥し、ＡＡ産物５９ｇを得た。アンモニウムイオン電極を用いた分析により、０．０１５ミリモルのアンモニウムイオン／ｇであることが分かった。回収された固体の融点は、１５１〜１５４℃であった。
【００５５】
実施例３
本実施例は、溶媒存在下でのＤＡＡのＭＡＡへの変換を示す。
【００５６】
ビーカーに３６．８ｇの蒸留水と１９．７ｇの濃縮水酸化アンモニウムを入れた。続いて、２３．５ｇのアジピン酸を徐々に添加した。混合物を撹拌して透明な溶液を形成し、続いてそれを撹拌子が接続された５００ｍＬの丸底フラスコに入れた。トリグリム（８０ｇ）を続いて添加した。フラスコに続いて、蒸留ヘッドを装着した５トレー１のオールダーショウ（Oldershaw）カラムセクションを取り付けた。蒸留ヘッドに氷浴氷冷レシーバを取り付けた。蒸留フラスコはまた、１５０ｇの蒸留水を含む追加漏斗を取り付けた。内容物を続いて撹拌し、加熱マントルで加熱した。蒸留物が生じ始めたら、蒸留物除去と同速度で追加漏斗の水をフラスコに液滴で添加した。追加漏斗中の全ての水を添加し、蒸留を停止した。計１５８ｇの蒸留物を回収した。蒸留物を滴定したところ、アンモニア含量は１．６％であった。これは、投入したアンモニアの４６％と同等である。すなわち、残渣はアジピン酸一アンモニウム／アジピン酸二アンモニウムの９１／９の混合物である。室温への冷却後、残渣を２５０ｍＬの三角フラスコに入れ、撹拌しながら徐々に５ｏＣまで冷却した。スラリーを濾過し、続いて湿潤結晶を真空オーブンで２時間乾燥させ、５．５ｇの固体を得た。固体を分析したところ、アンモニウムイオンとアジピン酸イオンとのの比が、ほぼ１：１（すなわち、アジピン酸一アンモニウム）であることが示された。
【００５７】
実施例４
本実施例は、溶媒存在下でのＭＡＡのＡＡへの変換を示す。
【００５８】
ビーカーに４６．７ｇの蒸留水と９．９ｇの濃縮水酸化アンモニウムを入れた。続いて、２３．５ｇのアジピン酸を徐々に添加した。混合物を撹拌し、透明な溶液を形成し、続いてそれを撹拌子が接続された５００ｍＬの丸底フラスコに入れた。トリグリム（８０ｇ）を続いてフラスコに添加した。続いてフラスコに、蒸留ヘッドを装着した５トレー１のオールダーショウ（Oldershaw）カラムセクションを取り付けた。蒸留ヘッドに氷浴氷冷レシーバを取り付けた。蒸留フラスコにはまた、１８００ｇの蒸留水を含む追加漏斗を取り付けた。内容物を続いて撹拌し、加熱マントルで加熱した。蒸留物が生じ始めたら、蒸留物除去と同速度で追加漏斗の水をフラスコに液滴で添加した。追加漏斗中の全ての水を添加し、蒸留を停止した。計１８０６．２ｇの蒸留物を回収した。蒸留物を滴定したところ、アンモニア含量は０．１１％であった。これは、投入したアンモニアの７２％と同等である。すなわち、残渣はアジピン酸／アジピン酸一アンモニウムの７２／２８の混合物である。続いて残渣を三角フラスコに入れ、撹拌しながら０℃まで冷却し、１時間静置させた。スラリーを濾過し、１８．８ｇの湿潤ケーキ及び１１４．３ｇの母液を得た。固体を続いて８０℃で真空下で２時間乾燥させ、１３．５ｇの固体を得た。続いて固体を１１４ｇの温水に溶解し、続いて５℃まで冷却し、４５分間撹拌した。スラリーを濾過し、１３．５ｇの湿潤固体及び１０９．２ｇの母液を得た。固体を８０℃で真空下で２時間乾燥させ、１１．７ｇの乾燥固体を得た。固体を分析したところ、アンモニウムイオン含量が０．０１１７ｍｍｏｌ／ｇ（すなわち、ほぼ純粋アジピン酸）であることが示された。
【００５９】
本発明の方法をその具体的な工程及び態様に即して記載したが、添付の特許請求の範囲に記載した本開示発明の精神及び範囲から逸脱しない限り、本明細書に記載の具体的な要素及び工程に代えて、広範な範囲から選択される均等物を用いてもよい。
【図１】
2013524833.tif 000003
【図２】
2013524833.tif 000004
【配列表】
2013524833000001.app
【国際調査報告】
2013524833.tif 000005
2013524833.tif 000006
2013524833.tif 000007