(57)【要約】  この発明は、炎症及び／又は過度の血液凝固の処置又は予防における使用のための、血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質に由来するアミノ酸配列、又はその断片、変異体、融合体又は誘導体、あるいは前記断片の融合体、その変異体又は誘導体を含んで成るか、又はこれらから成るポリペプチドを提供する。本発明の関連局面は、抗炎症及び／又は抗凝固活性を示す、配列番号１〜１１のアミノ酸配列、又はその断片、変異体、融合体又は誘導体、あるいは前記断片の融合体、その変異体又は誘導体を含んでなるか、又はこれらから成る単離されたポリペプチド、並びにそれを製造する単離された核酸分子、ベクター及び宿主細胞を提供する。これに加えて、本発明のポリペプチドを含んでなる医薬組成物、並びに炎症及び／又は過度の血液の凝固の処置及び／又は予防におけるその使用方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症及び／又は過度の凝固の処置又は予防における使用のための、血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質（ヘパリンコファクターII又はトロンビン以外のもの）に由来するアミノ酸配列、又はその断片、変異体、融合体若しくは誘導体、又は該断片の融合体、その変異体若しくは誘導体を含んでなるか、又はこれらから成るポリペプチドであって、該断片、変異体、融合体若しくは誘導体は、抗炎症及び／又は抗凝固活性を示す、上記ポリペプチド。
【請求項２】
ポリペプチドが天然に存在するタンパク質ではない、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質がヒトタンパク質である、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質が、セリンプロテイナーゼインヒビター（セルピン）、組織因子経路インヒビター（例えば、ＴＦＰＩ−１及びＴＦＰＩ−２）及びヒスチジンリッチグリコプロテイン（ＨＲＧ）から成る群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質がセルピンである、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
セルピンがアンチトロンビンIIIである、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
アンチトロンビンIIIが、スイスプロットアクセション番号Ｐ０１００８（Swiss Port Accession NO. P01008）である、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
配列番号１又は２のアミノ酸配列：
“ＦＦＦ２１”：  ＦＦＦＡＫＬＮＣＲＬＹＲＫＡＮＫＳＳＫＬＶ［配列番号１］
“ＡＫＬ２２”：  ＡＫＬＮＣＲＬＹＲＫＡＮＫＳＳＫＬＶＳＡＮＲ［配列番号２］、又は配列番号１又は２の抗炎症活性及び／又は抗凝固活性を保持している、その断片、変異体、融合体若しくは誘導体又は該断片の融合体、その変異体若しくは誘導体を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項６又は７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
配列番号１又は２のアミノ酸配列を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
セルピンがプロテインＣインヒビター（ＰＣＩ）である、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
プロテインＣインヒビターがスイスプロットアクセション番号Ｐ０５１５４である、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号３のアミノ酸配列：
“ＳＥＫ２０”：  ＳＥＫＴＬＲＫＷＬＫＭＦＫＫＲＱＬＥＬＹ［配列番号３］、
又は配列番号３の抗炎症活性及び／又は抗凝固活性を保持している、その断片、変異体、融合体若しくは誘導体又は該断片の融合体、その変異体若しくは誘導体を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項１０又は１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号３のアミノ酸配列を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項１２に記載の
ポリペプチド。
【請求項１４】
血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質が、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）である、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
組織因子経路インヒビターがＴＦＰＩ−１である、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
ＴＦＰＩ−１がスイスプロットアクセッション番号Ｐ１０６４６である、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号４〜６のいずれか１つのアミノ酸配列：
“ＧＧＬ２７”：ＧＧＬＩＫＴＫＲＫＲＫＫＱＲＶＫＩＡＹＥＥＩＦＶＫＮＭ［配列番号４］
“ＬＩＫ１７”：ＬＩＫＴＫＲＫＲＫＫＱＲＶＫＩＡＹ［配列番号５］
“ＴＫＲ２２”：ＴＫＲＫＲＫＫＱＲＶＫＩＡＹＥＥＩＦＶＫＮＭ［配列番号６］、
又は配列番号４〜６のいずれか１つの抗炎症活性及び／又は抗凝固活性を保持している、その断片、変異体、融合体若しくは誘導体又は該断片の融合体、その変異体若しくは誘導体を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項１５又は１６に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
配列番号４〜６のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項１７に記載のポリペプチド
【請求項１９】
組織因子経路インヒビターがＴＦＰＩ−２である、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
ＴＦＰＩ−２がスイスプロットアクセッション番号Ｐ４８３０７である、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号７又は８のアミノ酸配列：
“ＡＬＫ２５”：ＡＬＫＫＫＫＫＭＰＫＬＲＦＡＳＲＩＲＫＩＲＫＫＱＦ［配列番号７］
“ＥＤＣ３４”：ＥＤＣＫＲＡＣＡＫＡＬＫＫＫＫＫＭＰＫＬＲＦＡＳＲＩＲＫＩＲＫＫＱＦ［配列番号８］、
又は配列番号７又は８の抗炎症活性及び／又は抗凝固活性を保持している、その断片、変異体、融合体若しくは誘導体又は該断片の融合体、その変異体若しくは誘導体を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項１９又は２０に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
配列番号７又は８のアミノ酸配列を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質が、ヒスチジンリッチグリコプロテイン（ＨＲＧ）である、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
ＨＲＧがスイスプロットアクセッション番号Ｐ０４１９６である、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
配列番号９のアミノ酸配列：
（Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5）n    ［配列番号９］
［上式において、
Ｘ1及びＸ4は、独立して、Ｇ、Ｐ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｔ、Ｖ、Ｙ又はＷを表し；
Ｘ2、Ｘ3及びＸ5は、独立して、Ｈ、Ｒ又はＫを表し；そして
‘ｎ’は、２〜６の整数である］、
又は配列番号９の抗炎症活性及び／又は抗凝固活性を保持している、その断片、変異体、融合体若しくは誘導体又は該断片の融合体、その変異体若しくは誘導体を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項２３又は２４に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
配列番号１０のアミノ酸配列：
（ＧＨＨＰＨ）n    ［配列番号１０］
［上式において、‘ｎ’は、２〜６の整数である］、
又は配列番号１０の抗炎症活性及び／又は抗凝固活性を保持している、その断片、変異体、融合体若しくは誘導体又は該断片の融合体、その変異体若しくは誘導体を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
配列番号１１のアミノ酸配列：
“ＧＨＨ２５”：ＧＨＨＰＨＧＨＨＰＨＧＨＨＰＨＧＨＨＰＨＧＨＨＰＨ  ［配列番号１１］、
又は配列番号１１の抗炎症活性及び／又は抗凝固活性を保持している、その断片、変異体、融合体若しくは誘導体又は該断片の融合体、その変異体若しくは誘導体を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
配列番号：９、１０又は１１のアミノ酸配列を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
ポリペプチド、又はその断片、変異体、融合体若しくは誘導体が、Ｌ−アミノ酸を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
ポリペプチド、又はその断片、変異体、融合体若しくは誘導体が、修飾されているか、又は誘導体化されている１つ又はそれより多いアミノ酸を含んでなる、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
１つ又はそれより多いアミノ酸が、ＰＥＧ化、アミド化、エステル化、アシル化、アセチル化及び／又はアルキル化によって、修飾されているか又は誘導体化されている、請求項３０に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
ポリペプチドが、配列番号１〜１１のアミノ酸配列のいずれか１つの断片を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
断片が、配列番号３の少なくとも５個の連続したアミノ酸、例えば少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６又は２７個の連続したアミノ酸を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項３２に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
ポリペプチドが、配列番号１〜１１のいずれか１つのアミノ酸配列のいずれか１つの変異体を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
変異体が、配列番号１〜１１のいずれか１つのアミノ酸配列と、アミノ酸配列で少なくとも５０％の同一性、例えば少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有する、請求項３４に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
ポリペプチドが、１０〜２００個のアミノ酸の長さ、例えば１０〜１５０個、１５〜１００個、１５〜５０個、１５〜３０個、１７〜３０個、又は１７〜２８個のアミノ酸の長さである、請求項１〜３５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
ポリペプチドが少なくとも１７個のアミノ酸の長さである、請求項３６に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
ポリペプチドが線状である、請求項１〜３７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
ポリペプチドが組み換えポリペプチドである、請求項１〜３８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
ポリペプチドが、ヒト単球由来のマクロファージに起源する１つ又はそれより多い炎症誘発性サイトカインの放出を抑制することができる、請求項１〜３９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
炎症誘発性サイトカインが、マクロファージ阻害因子、ＴＮＦ−α、ＨＭＧＢ１、Ｃ５ａ、ＩＬ−１７、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＩＦＮ−γ、Ｉｌ−６、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−１２から成る群より選択される、請求項３３に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
ポリペプチドが、血小板活性化を遮断することができる、請求項１〜４１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
ポリペプチドが、白血球、上皮細胞（ケラチノサイトを含む）及び／又は間葉細胞（線維芽細胞を含む）におけるトル様受容体（ＴＬＲ）シグナル伝達を妨害することができる、請求項１〜４２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
ポリペプチドが、１つ又はそれより多い以下のモデル：
（ａ）刺激剤として、ＬＰＳ、ＬＴＡ、ザイモサン、フラジェリン、ダニ、ウイルス若しくは細菌のＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はペプチドグリカンを用いるインビトロマクロファージモデル；
（ｂ）エンドトキシン・ショックのインビボマウスモデル；
及び／又は
（ｃ）抗微生物療法と組み合わせるか、又は単独で与える、インビボ感染症モデル；
において抗炎症活性を示す、請求項１〜４３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
ポリペプチドが抗凝固活性を示す、請求項１〜４４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
炎症及び凝固の併用処置又は予防に使用するための請求項４５に記載のポリペプチド。
【請求項４７】
該ポリペプチドがトル様受容体（ＴＬＲ）遮断活性を示す、請求項１〜４６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４８】
ポリペプチドが感染症に関連する炎症の処置又は予防に使用するための、請求項１〜４７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４９】
下記から選択される疾患、状態又は適応の処置又は予防に使用するための請求項１〜４８のいずれか１項に記載のポリペプチド：
ｉ）感染性要素の有無にかかわらず、急性全身性炎症疾患、例えば全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、ＡＲＤＳ、敗血症、重症敗血症、及び敗血症性ショック；丹毒、髄膜炎、関節炎、トキシックショック症候群、憩室炎、中垂炎、膵炎、胆嚢炎、大腸炎、蜂巣炎、火傷感染症、肺炎、尿路感染症、術後感染症、及び腹膜炎を含む、他の全身性又は限局性で侵襲性の感染性及び炎症性疾患：
ｉｉ）下記を含む慢性炎症性及び／又は感染性疾患；嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ及び他の肺疾患、慢性皮膚及び胃潰瘍を含む胃腸疾患、アトピー性皮膚炎、口腔内潰瘍（アフタ性潰瘍）、陰部潰瘍及び炎症性変化、歯周炎、結膜炎及び角膜炎を含む眼の炎症、外耳炎、中耳炎、泌尿生殖器の炎症などの他の上皮炎症性及び／又は感染性疾患：
ｉｉｉ）術後炎症；血栓症、ＤＩＣ、術後凝固異常、並びに体外循環及び生体材料の使用を含む異物との接触に関連する凝固異常を含む、炎症性疾患及び凝固異常；更に、血管炎関連炎症性疾患、並びにアレルギー性鼻炎及び喘息を含むアレルギー：
ｉｖ）過度の接触活性化及び／又は脳卒中（これらに限定されない）に関連する凝固：
ｖ）抗微生物剤処置との併用での過度の炎症；使用される抗微生物剤は、種々のルートによって投与することができる；静脈内（ｉｖ）、動脈内、硝子体内、皮下（ｓｃ）、筋肉内（ｉｍ）、腹腔内（ｉｐ）、膀胱内、髄こう内、硬膜外、経腸（経口、直腸、胃内、及び他の経腸ルートを含む）、又は局所的（皮膚、鼻への適用、例えば滴剤による眼又は耳内の適用、及び肺吸入を含む）；薬剤の例には、ペニシリン系、セファロスポリン系、カルバセフェム系、セファマイシン系、カルバペネム系、モノバクタム系、アミノグリコシド系、グリコペプチド系、キノロン系、テトラサイクリン系、マクロライド系、及びフルオロキノロン系がある；防腐剤には、ヨウ素、銀、銅、クロルヘキシジン、ポリヘキサニド及び他のビグアニド類、キトサン、酢酸、及び過酸化水素が含まれる。
【請求項５０】
急性炎症、敗血症、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、喘息、アレルギー性及び他のタイプの鼻炎、皮膚血管炎及び全身性血管炎、血栓症及び播種性血管内凝固（ＤＩＣ）の処置又は予防に使用するための、請求項１〜４９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５１】
敗血症の処置又は予防に使用するための、請求項５０に記載のポリペプチド。
【請求項５２】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の処置又は予防に使用するための、請求項５０に記載のポリペプチド。
【請求項５３】
１つ又はそれより多い別の治療薬と組み合わせて使用するための、請求項１〜５２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５４】
別の治療薬が、抗生剤、抗真菌剤、防腐剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、血管作用薬、受容体遮断薬、受容体作動薬及び防腐剤から成る群より選択される、請求項５３に記載のポリペプチド。
【請求項５５】
抗生剤が、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤及び駆虫剤から成る群より選択される、請求項５４に記載のポリペプチド。
【請求項５６】
血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質に由来するアミノ酸配列、又はその断片、変異体、融合体若しくは誘導体、又は該断片の融合体、その変異体若しくは誘導体を含んでなるか、又はこれらから成り、抗炎症活性及び／又は抗凝固活性を示す、単離されたポリペプチドであって、
血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質は、セルピン（ヘパリンコファクターII以外）、ヒスチジンリッチグリコプロテイン（ＨＲＧ）及び組織因子経路インヒビター（例えば、ＴＦＰＩ−１及びＴＦＰＩ−２）から成る群より選択され、但し、該ポリペプチドは天然に存在するタンパク質ではないことを条件とする、上記単離されたポリペプチド。
【請求項５７】
血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質が、ヒトタンパク質である、請求項５６に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質が、セリンプロテイナーゼインヒビター（セルピン）、組織因子経路インヒビター（例えば、ＴＦＰＩ−１及びＴＦＰＩ−２）及びヒスチジンリッチグリコプロテイン（ＨＲＧ）から成る群より選択される、請求項５６又は５７に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質が、セルピンである、請求項５８に記載のポリペプチド。
【請求項６０】
セルピンがアンチトロンビンIIIである、請求項５９に記載のポリペプチド。
【請求項６１】
アンチトロンビンIIIがスイスプロットアクセッション番号Ｐ０１００８である、請求項６０に記載のポリペプチド。
【請求項６２】
配列番号１又は２のアミノ酸配列：
“ＦＦＦ２１”：ＦＦＦＡＫＬＮＣＲＬＹＲＫＡＮＫＳＳＫＬＶ  ［配列番号１］
“ＡＫＬ２２”：ＡＫＬＮＣＲＬＹＲＫＡＮＫＳＳＫＬＶＳＡＮＲ  ［配列番号２］、又は配列番号１又は２の抗炎症活性及び／又は抗凝固活性を保持している、その断片、変異体、融合体若しくは誘導体又は該断片の融合体、その変異体若しくは誘導体を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項６０又は６１に記載のポリペプチド。
【請求項６３】
配列番号１又は２のアミノ酸配列を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項６４】
セルピンがプロテインＣインヒビター（ＰＣＩ）である、請求項５９に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
プロテインＣインヒビターが、スイスプロットアクセッション番号Ｐ０５１５４である、請求項６４に記載のポリペプチド。
【請求項６６】
配列番号３のアミノ酸配列：
“ＳＥＫ２０”：ＳＥＫＴＬＲＫＷＬＫＭＦＫＫＲＱＬＥＬＹ  ［配列番号３］、
又は配列番号３の抗炎症活性及び／又は抗凝固活性を保持している、その断片、変異体、融合体若しくは誘導体又は該断片の融合体、その変異体若しくは誘導体を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項６４又は６５に記載のポリペプチド。
【請求項６７】
配列番号３のアミノ酸配列を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質が、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）である、請求項５８に記載のポリペプチド。
【請求項６９】
組織因子経路インヒビターがＴＦＰＩ−１である、請求項６８に記載のポリペプチド。
【請求項７０】
ＴＦＰＩ−１が、スイスプロットアクセッション番号Ｐ１０６４６である、請求項６９に記載のポリペプチド。
【請求項７１】
配列番号４〜６のいずれか１つのアミノ酸配列：
“ＧＧＬ２７” ：ＧＧＬＩＫＴＫＲＫＲＫＫＱＲＶＫＩＡＹＥＥＩＦＶＫＮＭ  ［配列番号４］
“ＬＩＫ１７”：ＬＩＫＴＫＲＫＲＫＫＱＲＶＫＩＡＹ  ［配列番号５］
“ＴＫＲ２２”：ＴＫＲＫＲＫＫＱＲＶＫＩＡＹＥＥＩＦＶＫＮＭ  ［配列番号６］、又は配列番号４〜６のいずれか１つの抗炎症活性及び／又は抗凝固活性を保持している、その断片、変異体、融合体若しくは誘導体又は該断片の融合体、その変異体若しくは誘導体を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項６８又は６９に記載のポリペプチド。
【請求項７２】
配列番号４〜６のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項７１に記載のポリペプチド。
【請求項７３】
組織因子経路インヒビターがＴＦＰＩ−２である、請求項６８に記載のポリペプチド。
【請求項７４】
ＴＦＰＩ−２が、スイスプロットアクセッション番号Ｐ４８３０７である、請求項７３に記載のポリペプチド。
【請求項７５】
配列番号７又は８のアミノ酸配列：
“ＡＬＫ２５”：ＡＬＫＫＫＫＫＭＰＫＬＲＦＡＳＲＩＲＫＩＲＫＫＱＦ  ［配列番号７］
“ＥＤＣ３４” ：ＥＤＣＫＲＡＣＡＫＡＬＫＫＫＫＫＭＰＫＬＲＦＡＳＲＩＲＫＩＲＫＫＱＦ  ［配列番号８］、
又は配列番号７又は８の抗炎症活性及び／又は抗凝固活性を保持している、その断片、変異体、融合体若しくは誘導体又は該断片の融合体、その変異体若しくは誘導体を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項７３又は７４に記載のポリペプチド。
【請求項７６】
配列番号７又は８のアミノ酸配列を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項７５に記載のポリペプチド。
【請求項７７】
血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質が、ヒスチジンリッチグリコプロテイン（ＨＲＧ）である、請求項５８に記載のポリペプチド。
【請求項７８】
ＨＲＧが、スイスプロットアクセッション番号Ｐ０４１９６である、請求項７７に記載のポリペプチド。
【請求項７９】
配列番号９のアミノ酸配列：
（Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5）n    ［配列番号９］
［上式において、
Ｘ1及びＸ4は、独立して、Ｇ、Ｐ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｔ、Ｖ、Ｙ又はＷを表し；
Ｘ2、Ｘ3及びＸ5は、独立して、Ｈ、Ｒ又はＫを表し；そして
‘ｎ’は、２〜６の整数である］、
又は配列番号９の抗炎症活性及び／又は抗凝固活性を保持している、その断片、変異体、融合体若しくは誘導体又は該断片の融合体、その変異体若しくは誘導体を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項７７又は７８に記載のポリペプチド。
【請求項８０】
配列番号１０のアミノ酸配列：
（ＧＨＨＰＨ）n    ［配列番号１０］
［上式において、‘ｎ’は、２〜６の整数である］、
又は配列番号１０の抗炎症活性及び／又は抗凝固活性を保持している、その断片、変異体、融合体若しくは誘導体又は該断片の融合体、その変異体若しくは誘導体を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項７７〜７９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８１】
配列番号１１のアミノ酸配列：
“ＧＨＨ２５”：ＧＨＨＰＨＧＨＨＰＨＧＨＨＰＨＧＨＨＰＨＧＨＨＰＨ  ［配列番号１１］、
又は配列番号１１の抗炎症活性及び／又は抗凝固活性を保持している、その断片、変異体、融合体若しくは誘導体又は該断片の融合体、その変異体若しくは誘導体を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項７７〜８０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８２】
配列番号９、１０又は１１のアミノ酸配列を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項７７〜８１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８３】
ポリペプチド、又はその断片、変異体、融合体若しくは誘導体が、Ｌ−アミノ酸を含んでなるか、又はこれらから成る、請求項５６〜８２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８４】
ポリペプチド、又はその断片、変異体、融合体若しくは誘導体が、修飾されているか、又は誘導体化されている１つ又はそれより多いアミノ酸を含んでなる、請求項５６〜８３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８５】
１つ又はそれより多いアミノ酸が、ＰＥＧ化、アミド化、エステル化、アシル化、アセチル化及び／又はアルキル化によって、修飾されているか又は誘導体化されている、請求項８４に記載のポリペプチド。
【請求項８６】
ポリペプチドが、１０〜２００個のアミノ酸の長さ、例えば１０〜１５０、１５〜１００、１５〜５０、１５〜３０、１７〜３０、又は１７〜２８個のアミノ酸の長さである、請求項５６〜８５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８７】
ポリペプチドが、少なくとも１７個のアミノ酸の長さである、請求項８６に記載のポリペプチド。
【請求項８８】
ポリペプチドが線状である、請求項５６〜８７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８９】
ポリペプチドが、組み換えポリペプチドである、請求項５６〜８８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９０】
ポリペプチドが、ヒト単球由来のマクロファージに起源する１つ又はそれより多い炎症誘発性サイトカインの放出を阻害することができる、請求項５６〜８９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９１】
炎症誘発性サイトカインが、マクロファージ阻害因子、ＴＮＦ−α、ＨＭＧＢ１、Ｃ５ａ、ＩＬ−１７、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＩＦＮ−γ、Ｉｌ−６、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−１２から成る群より選択される、請求項９０に記載のポリペプチド。
【請求項９２】
ポリペプチドが、血小板活性化を遮断することができる、請求項５６〜９１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９３】
ポリペプチドが、白血球、上皮細胞（ケラチノサイトを含む）及び／又は間葉細胞（線維芽細胞を含む）におけるトル様受容体（ＴＬＲ）シグナル伝達を妨害することができる、請求項５６〜９２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９４】
ポリペプチドが、１つ又はそれより多い以下のモデル：
（ａ）刺激剤として、ＬＰＳ、ＬＴＡ、ザイモサン、フラジェリン、ダニ、ウイルス若しくは細菌のＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はペプチドグリカンを用いるインビトロマクロファージモデル；
（ｂ）エンドトキシン・ショックのインビボマウスモデル；
及び／又は
（ｃ）抗微生物療法と組み合わせるか、又は単独で与える、インビボ感染症モデル；
において抗炎症活性を示す、請求項５６〜９３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９５】
ポリペプチドが抗凝固活性を示す、請求項５６〜９４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９６】
ポリペプチドがトル様受容体（ＴＬＲ）遮断活性を示す、請求項５６〜９５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９７】
請求項５６〜９６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項９８】
請求項９７に記載の核酸分子を含んでなる、ベクター。
【請求項９９】
ベクターが発現ベクターである、請求項９８に記載のベクター。
【請求項１００】
請求項９７に記載の核酸分子、又は請求項９８又は９９に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項１０１】
前記ポリペプチドが発現される条件下で、請求項１００に記載の宿主細胞の集団を培養し、そしてそれからポリペプチドを単離することを含んでなる、請求項５６〜８６のいずれか１項に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項１０２】
ポリペプチドの液相又は固相合成を含んでなる、請求項５６〜８６のいずれか１項に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項１０３】
請求項５６〜８６のいずれか１項に記載のポリペプチドを、製薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、担体、バッファー又はアジュバントと一緒に含んでなる、医薬組成物。
【請求項１０４】
局所、眼内、経鼻、経肺、口腔、非経口（静脈内、皮下、髄こう内及び筋肉内）、経口、膣内及び直腸から成る群より選択される経路を介して投与するのに適している、請求項１０３に記載の医薬組成物。
【請求項１０５】
インプラントを介する投与に適している、請求項１０３に記載の医薬組成物。
【請求項１０６】
医薬組成物が、医療に使用されるデバイス又は材料に関連する、請求項１０３〜１０５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０７】
デバイスが、バイパス手術、体外循環、創傷ケア及び／又は透析において使用されるデバイスである、請求項１０６に記載の医薬組成物。
【請求項１０８】
医薬組成物が、縫合糸、人工補綴物、インプラント、創傷被覆材、カテーテル、レンズ、皮膚移植片、代用皮膚、フィブリン接着剤又は包帯に、被覆されるか、塗られるか、噴霧されるか、又はその他の方法で適用される、請求項１０６又は１０７に記載の医薬組成物。
【請求項１０９】
デバイス又は材料が、ポリマー、金属、金属酸化物及び／又はセラミックを含んでなるか、又はこれらから成る、請求項１０６〜１０８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１０】
医療に使用するための、請求項５６〜８６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１１１】
急性及び／又は慢性炎症の処置及び／又は予防に使用するための、請求項１１０に記載のポリペプチド。
【請求項１１２】
微生物感染症（例えば、細菌感染症）の処置及び／又は予防に使用するための、請求項１１０に記載のポリペプチド。
【請求項１１３】
血液凝固のモジュレーションに使用するための、請求項１１０に記載のポリペプチド。
【請求項１１４】
創傷の処置に使用するための、請求項１１０に記載のポリペプチド。
【請求項１１５】
下記から選択される疾患、状態又は適応の処置又は予防に使用するための請求項１１０又は１１４に記載のポリペプチド：
ｉ）感染性要素の有無にかかわらず、急性全身性炎症疾患、例えば全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、ＡＲＤＳ、敗血症、重症敗血症、及び敗血症性ショック；丹毒、髄膜炎、関節炎、トキシックショック症候群、憩室炎、中垂炎、膵炎、胆嚢炎、大腸炎、蜂巣炎、火傷感染症、肺炎、尿路感染症、術後感染症、及び腹膜炎を含む、他の全身性又は限局性で侵襲性の感染性及び炎症性疾患：
ｉｉ）下記を含む慢性炎症性及び／又は感染性疾患；嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ及び他の肺疾患、慢性皮膚及び胃潰瘍を含む胃腸疾患、アトピー性皮膚炎、口腔内潰瘍（アフタ性潰瘍）、陰部潰瘍及び炎症性変化、歯周炎、結膜炎及び角膜炎を含む眼の炎症、外耳炎、中耳炎、泌尿生殖器の炎症などの他の上皮炎症性及び／又は感染性疾患：
ｉｉｉ）術後炎症；血栓症、ＤＩＣ、術後凝固異常、並びに体外循環、及び生体材料の使用を含む異物との接触に関連する凝固異常を含む、炎症性疾患及び凝固異常；更に、血管炎関連炎症性疾患、並びにアレルギー性鼻炎及び喘息を含むアレルギー：
ｉｖ）過度の接触活性化及び／又は脳卒中（これらに限定されない）に関連する凝固：
ｖ）抗微生物剤処置との併用での過度の炎症；使用される抗微生物剤は、種々のルートによって投与することができる；静脈内（ｉｖ）、動脈内、硝子体内、皮下（ｓｃ）、筋肉内（ｉｍ）、腹腔内（ｉｐ）、膀胱内、髄こう内、硬膜外、経腸（経口、直腸、胃内、及び他の経腸ルートを含む）、又は局所的（皮膚、鼻への適用、例えば滴剤による眼又は耳内の適用、及び肺吸入を含む）；薬剤の例には、ペニシリン系、セファロスポリン系、カルバセフェム系、セファマイシン系、カルバペネム系、モノバクタム系、アミノグリコシド系、グリコペプチド系、キノロン系、テトラサイクリン系、マクロライド系、及びフルオロキノロン系がある；防腐剤には、ヨウ素、銀、銅、クロルヘキシジン、ポリヘキサニド及び他のビグアニド類、キトサン、酢酸、及び過酸化水素が含まれる。
【請求項１１６】
炎症及び／又は過度の凝固の処置又は予防のための薬剤の製造における、請求項５６〜８６のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１１７】
薬剤が、急性炎症、敗血症、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、喘息、アレルギー性及び他のタイプの鼻炎、皮膚血管炎及び全身性血管炎、血栓症及び播種性血管内凝固（ＤＩＣ）の処置又は予防における使用のためである、請求項１１６に記載の使用。
【請求項１１８】
薬剤が敗血症の処置又は予防における使用のためである、請求項１１４に記載の使用。
【請求項１１９】
薬剤が慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の処置又は予防における使用のためである、請求項１１４に記載の使用。
【請求項１２０】
薬剤が１つ又はそれより多い別の治療薬と組み合わせて使用するためである、請求項１１６〜１１９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２１】
別の治療薬が、抗生剤、抗真菌剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、血管作用薬及び防腐剤から成る群より選択される、請求項１２０に記載の使用。
【請求項１２２】
抗生剤が、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤及び駆虫剤から成る群より選択される、請求項１２１に記載の使用。
【請求項１２３】
別の治療薬がステロイドである、請求項１２１に記載の使用。
【請求項１２４】
患者の炎症を処置又は予防する方法であって、治療的に有効な量の請求項１〜８６のいずれか１項に記載のポリペプチド、又は請求項１０３〜１０９のいずれか１項に記載の医薬組成物を患者に投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項１２５】
患者がヒトである、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
急性炎症、敗血症、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、喘息、アレルギー性及び他のタイプの鼻炎、皮膚血管炎及び全身性血管炎、血栓症及び播種性血管内凝固（ＤＩＣ）の処置又は予防のための、請求項１２４又は１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
敗血症の処置又は予防のための、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の処置又は予防のための、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２９】
１つ又はそれより多い別の治療薬を患者に更に投与する、請求項１２４〜１２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３０】
別の治療薬が、抗生剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、血管作用薬、受容体遮断剤、受容体作動薬及び防腐剤から成る群より選択される、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
抗生剤が、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤及び駆虫剤から成る群より選択される、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
別の治療薬がステロイドである、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３３】
明細書及び図面を参照して実質的にここに記載されている、ポリペプチド。
【請求項１３４】
明細書及び図面を参照して実質的にここに記載されている、医薬組成物。
【請求項１３５】
明細書及び図面を参照して実質的にここに記載されている、医療用インプラント若しくはデバイス、又は生体材料に使用するための、医療用インプラント若しくはデバイス、又は生体材料。
【請求項１３６】
明細書及び図面を参照して実質的にここに記載されている、ポリペプチドの使用。
【請求項１３７】
明細書及び図面を参照して実質的にここに記載されている、炎症を処置又は予防する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ポリペプチド及びその使用
発明の分野
この発明は、血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質に由来する新規なポリペプチド、及び炎症及び／又は過度の凝固の処置及び予防におけるその使用に関する。特に、本発明は、医療、例えば、炎症及び／又は過度の凝固の処置又は予防における使用のための、配列番号１〜１１のアミノ酸配列、又はその断片、変異体、融合体若しくは誘導体、又は前記断片の融合体、その変異体若しくは誘導体を含んでなるか、又はこれらから成るポリペプチドを提供する。
【背景技術】
【０００２】
序論
主として抗菌ペプチドによる自然免疫系は、侵入する微生物に対する防御の最前線を提供している（非特許文献１; ２; ３; ４; ５）。ここ数年で、デフェンシン及びカテリシジンなどの多くのカチオン性及び両親媒性抗菌ペプチドは、多機能性であり、また免疫調節的役割及び血管新生を媒介しており（非特許文献６; ７; ８）、従って、自然免疫系のこうした構成員のための宿主防御ペプチド（ＨＤＰ）の新しい、より広い定義の動機になっていることが次第に明らかとなってきている。ＨＤＰのファミリーは最近になって、炎症性及び走化性ケモカイン（非特許文献９）、神経ペプチド（非特許文献１０）、ペプチドホルモン（非特許文献１１; １２）、成長因子（非特許文献１３）、アナフィラトキシンペプチドＣ３ａ（非特許文献１４; １５）、及びキニノゲン誘導ペプチド（非特許文献１６; １７; １８）を含む、抗菌活性を有する様々な生物活性ペプチドを包含することが示されてきている。
【０００３】
血液凝固カスケード（coagulation cascade）はまた、傷害及び感染に応答して活性化された基本組織系を表す（非特許文献１９; ２０）。一連のカスケード様プロテイナーゼ活性段階を通じてトロンビンが形成され、そしてフィブリノゲン分解及びクロット形成がもたらされる。この血液凝固カスケードは、セリンプロテイナーゼ阻害剤（すなわち、“セルピン”）であるヘパリンコファクターII（ＨＣII）、アンチトロンビンIII（ＡＴIII）、及びプロテインＣインヒビターなどの種々の調節タンパク質によって、並びに組織因子プロテイナーゼインヒビター（ＴＦＰＩ）によって制御されている。更に、ヒスチジンリッチグリコプロテイン（histidine-rich glycoprotein）は、フィブリノゲン及びプラスミノゲンと相互作用することによって血液凝固をモジュレートしうる。
【０００４】
この発明は、医療における、例えば、炎症及び／又は過度の凝固の処置又は予防における使用のための、止血に関与している分子に由来する新規なポリペプチド作用物質を提供しようとするものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Lehrer, R.I. and T. Ganz, Curr Opin Hematol, 2002. 9(1): p. 18-22
【非特許文献２】Harder, J., R. Glaser, and J.M. Schroeder, J Endotoxin Res, 2007. 13(6): p. 317-38
【非特許文献３】Zasloff, M., Nature, 2002. 415(6870): p. 389-95
【非特許文献４】Tossi, A., L. Sandri, and A. Giangaspero, Biopolymers, 2000. 55(1): p. 4-30
【非特許文献５】Yount, N.Y., et al., Biopolymers, 2006
【非特許文献６】Zanetti, M., J Leukoc Biol, 2004. 75(1): p. 39-48
【非特許文献７】Elsbach, P., J Clin Invest, 2003. 111(11): p. 1643-5
【非特許文献８】Ganz, T., Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity. Nat Rev Immunol, 2003. 3(9): p. 710-20
【非特許文献９】Cole, A.M., et al., J Immunol, 2001. 167(2): p. 623-7
【非特許文献１０】Brogden, K.A., Nat Rev Microbiol, 2005. 3(3): p. 238-50
【非特許文献１１】Kowalska, K., D.B. Carr, and A.W. Lipkowski, Life Sci, 2002. 71(7): p. 747-50
【非特許文献１２】Mor, A., M. Amiche, and P. Nicolas, Biochemistry, 1994. 33(21): p. 6642-50
【非特許文献１３】Malmsten, M., et al., Growth Factors, 2007. 25(1): p. 60-70
【非特許文献１４】Nordahl, E.A., et al., Natl Acad Sci U S A, 2004. 101(48): p. 16879-84
【非特許文献１５】Pasupuleti, M., et al., J Biol Chem, 2007. 282(4): p. 2520-8
【非特許文献１６】Frick, I.M., et al., Embo J, 2006. 25(23): p. 5569-78
【非特許文献１７】Nordahl, E.A., et al., Domain 5 of high molecular weight kininogen is antibacterial. J Biol Chem, 2005. 280(41): p. 34832-9
【非特許文献１８】Rydengard, V., E. Andersson Nordahl, and A. Schmidtchen, Zinc potentiates the antibacterial effects of histidine-rich peptides against Enterococcus faecalis. Febs J, 2006. 273(11): p. 2399-406
【非特許文献１９】Davie, E.W. and J.D. Kulman, Semin Thromb Hemost, 2006. 32 Suppl 1: p. 3-15
【非特許文献２０】Bode, W., Semin Thromb Hemost, 2006. 32 Suppl 1: p. 16-31
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本発明の第一の局面は、炎症及び／又は過度の凝固の処置又は予防における使用のための、血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質（ヘパリンコファクターII又はトロンビン以外のもの）に由来するアミノ酸配列、又はその断片、変異体、融合体若しくは誘導体、又は前記断片の融合体、その変異体若しくは誘導体を含んでなるか、又はこれらから成るポリペプチドであって、該断片、変異体、融合体若しくは誘導体は、抗炎症及び／又は抗凝固活性を示す、上記ポリペプチドを提供する。
【０００７】
本発明は、血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質は、それらのＣ末端及び／又は他の内部領域内に“クリプティックペプチド（cryptic peptides）”を含んでおり、これは抗炎症活性を示すという本発明者による予測できない発見に由来する。こうしたペプチドは、傷害及び生理学的な他のチャレンジに応答して親であるペプチダーゼホロタンパク質の切断によって‘放出され（released）’うるということが信じられている。すなわち、本発明のポリペプチドは、炎症に関連する障害及び状態に対して治療可能性を有する、新規であり、かつ以前に開示されていない種類のＨＤＰを構成する。
【０００８】
我々が、“血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質（naturally occurring protein which modulates blood coagulation）”というのは、血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質をすべて含み、血液凝固プロセスをポジティブに、又はネガティブにモジュレートすることを含んでいる。こうしたモジュレート（調節）活性（modulatory activity）は、当技術分野で周知の方法によって、例えば、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）試験、プロトロンビン時間（ＰＴ）試験、又はトロンビン凝固時間（ＴＣＴ）試験を用いて決定することができる。更に、プレカリクレイン活性、又は第Ｘ因子及び他の血液凝固因子の活性に関する特定の測定が行なわれうる。天然に存在するタンパク質が直接的、又は間接的に血液凝固をモジュレートしうることは当技術分野の当業者であれば理解するところである。
【０００９】
血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質は、ヒトタンパク質であることが有利である。
【００１０】
我々が、血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質に“由来する（derived from）”アミノ酸配列というのは、該アミノ酸配列が、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列内に見出されることを意味している。例えば、一実施態様では、該アミノ酸配列は、血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質のＣ末端領域に起源しうる。我々が、“Ｃ末端領域（C-terminal region）”というのは、天然に存在するタンパク質のＣ末端に隣接する１００個のアミノ酸の領域を意味している。別の実施態様では、該アミノ酸配列は、血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質のうちで最高１００個までのアミノ酸の内部領域に起源しうる。
【００１１】
我々が、“抗炎症活性（anti-inflammatory activity）”というのは、炎症事象に関連する１つ又はそれより多い生物学的プロセスを減少又は予防することができることを意味している。ポリペプチドのこうした抗炎症活性は、当技術分野で周知の方法を用いて、例えば、ＬＰＳ誘発性のマクロファージからの（例えば、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＦ−γ）、又は好中球からの（下記の実施例参照）炎症誘発性サイトカイン（pro-inflammatory cytokines）の放出を測定することによって決定されうる。関連する他のアッセイは、上記系におけるリポタイコ酸、ザイモサン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、フラジェリン、ペプチドグリカンの影響、並びに転写レベル（例えば、ジーンアレイ、ｑＰＣＲなど）での調節の判定を含む。更に、樹状細胞活性又は栓球（血小板）の活性もまた、抗炎症活性の測定として使用することができる。
【００１２】
我々が、“抗凝固活性（anti-coagulant activity）”というのは、プロトロンビン時間（ＰＴ）、トロンビン凝固時間（ＴＣＴ）、及び／又は活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を増加させることができることを意味している。あるいは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）を、ペプチド及び組織因子を加えるか又は加えずにエッシェリヒア・コリ（E. coli）（大腸菌）ＬＰＳによって刺激し、そしてヒト血漿を添加した後クロット形成を起こさせることができ、又は、全血液の凝固時間（clotting time）を測定することができる。
【００１３】
本発明は、血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質に由来するアミノ酸配列含んでなるか、又はこれらから成るポリペプチド、並びに抗炎症活性を維持しているこうしたアミノ酸配列の断片、融合体及び誘導体を包含するということは当技術分野の当業者によって理解されるところである。しかしながら、好ましくは、このポリペプチドは、天然に存在するタンパク質、例えば、ホロタンパク質（holoprotein）ではない（但し、このポリペプチドが天然に存在するタンパク質の不完全な部分又は断片を構成する場合があることは当然であることは理解されるところである）。
【００１４】
本発明のポリペプチドの一実施態様では、このポリペプチドは、ヘパリン結合ドメインを含んでなる。我々が、“ヘパリン結合ドメイン（heparin-binding domain）”というのは、生理学的な条件下でヘパリンに結合することができるポリペプチド内のアミノ酸配列を意味する。こうした配列は、しばしば、ＸＢＢＸＢ及びＸＢＢＢＸＸＢ（上記において、Ｂ＝塩基性残基であり、そしてＸ＝ヒドロパシック（hydropathic）又は電荷を持たない残基である）を含むか、又は塩基性アミノ酸（ＸＢＸ、ＸＢＢＸ、ＸＢＢＢＸ）のクラスターを含んでなる。非塩基性残基（ＢＸＢ、ＢＸＸＢ）のこうしたクラスターの間隔もまた出現しうる。これに加えて、塩基性アミノ酸の間の２０Åの距離は、ヘパリン結合の必須要件を構成している。
【００１５】
血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質は、ヒト又は非ヒトの供給源からのものでありうることは当技術分野の当業者によって理解されるところである。例えば、血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質は、類人猿（例えば、チンパンジー、ピグミーチンパンジー、ゴリラ、テナガザル及びオランウータン）、サル（例えば、マカク、ヒヒ及びコロブス属）、げっし動物（例えば、マウス、ラット）又は有蹄動物（例えば、ブタ、ウマ及びウシ）などの非ヒト哺乳類から取り出す（直接的又は間接的に）ことができる。
【００１６】
本発明のポリペプチドの好ましい実施態様では、血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質は、ヒトタンパク質である。
【００１７】
すなわち、血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質は、セリンプロテイナーゼ阻害剤（セルピン）、組織因子経路インヒビター（例えば、ＴＦＰＩ−１及びＴＦＰＩ−２）及びヒスチジンリッチグリコプロテイン（ＨＲＧ）から成る群より選択されうる。
【００１８】
一実施態様では、血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質は、セルピンである。
【００１９】
例えば、セルピンは、アンチトロンビンIII（ＡＴIII；例えば、スイスプロットアクセション番号Ｐ０１００８（Swiss Port Accession No. P01008）参照）でありうる。
【００２０】
かくして、このポリペプチドは、配列番号１又は２のアミノ酸配列：
“ＦＦＦ２１”：ＦＦＦＡＫＬＮＣＲＬＹＲＫＡＮＫＳＳＫＬＶ［配列番号１］
“ＡＫＬ２２”：ＡＫＬＮＣＲＬＹＲＫＡＮＫＳＳＫＬＶＳＡＮＲ［配列番号２］
又は配列番号１又は２の抗炎症活性及び／又は抗凝固活性を保持している、その断片、変異体、融合体若しくは誘導体又は前記断片の融合体、その変異体若しくは誘導体を含んでなりうるか、又はこれらから成りうる。
【００２１】
代替的実施態様では、セルピンは、タンパク質Ｃインヒビター（ＰＣＩ；例えば、スイスプロットアクセション番号Ｐ０５１５４（Swiss Port Accession No. P05154）参照）でありうる。
【００２２】
例えば、このポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列：
“ＳＥＫ２０”：ＳＥＫＴＬＲＫＷＬＫＭＦＫＫＲＱＬＥＬＹ［配列番号３］
又は配列番号３の抗炎症活性及び／又は抗凝固活性を保持している、その断片、変異体、融合体若しくは誘導体又は前記断片の融合体、その変異体若しくは誘導体を含んでなりうるか、又はこれらから成りうる。
【００２３】
更なる実施態様では、血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質は、組織因子経路インヒビター−１（ＴＦＰＩ−１；例えば、スイスプロットアクセション番号Ｐ１０６４６（Swiss Port Accession No. P10646）参照）である。
【００２４】
例えば、このポリペプチドは、配列番号４〜６のいずれか１つのアミノ酸配列：
“ＧＧＬ２７”：ＧＧＬＩＫＴＫＲＫＲＫＫＱＲＶＫＩＡＹＥＥＩＦＶＫＮＭ［配列番号４］
“ＬＩＫ１７”：ＬＩＫＴＫＲＫＲＫＫＱＲＶＫＩＡＹ［配列番号５］
“ＴＫＲ２２” ：ＴＫＲＫＲＫＫＱＲＶＫＩＡＹＥＥＩＦＶＫＮＭ［配列番号６］
又は配列番号４〜６の抗炎症活性及び／又は抗凝固活性を保持している、その断片、変異体、融合体若しくは誘導体又は前記断片の融合体、その変異体若しくは誘導体を含んでなりうるか、又はこれらから成りうる。
【００２５】
なお更なる代替的実施態様では、血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質は、組織因子経路インヒビター２（ＴＦＰＩ−２；例えば、スイスプロットアクセション番号Ｐ４８３０７（Swiss Port Accession No. P48307）参照）である。
【００２６】
例えば、このポリペプチドは、配列番号７又は８のアミノ酸配列：
“ＡＬＫ２５”：ＡＬＫＫＫＫＫＭＰＫＬＲＦＡＳＲＩＲＫＩＲＫＫＱＦ［配列番号７］
“ＥＤＣ３４”：ＥＤＣＫＲＡＣＡＫＡＬＫＫＫＫＫＭＰＫＬＲＦＡＳＲＩＲＫＩＲＫＫＱＦ［配列番号８］
又は配列番号７又は８の抗炎症活性及び／又は抗凝固活性を保持している、その断片、変異体、融合体若しくは誘導体又は前記断片の融合体、その変異体若しくは誘導体を含んでなりうるか、又はこれらから成りうる。
【００２７】
なお更なる代替的実施態様では、血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質は、ヒスチジンリッチグリコプロテイン（ＨＲＧ；例えば、スイスプロットアクセション番号Ｐ０４１９６（Swiss Port Accession No. P04196）参照）である。
【００２８】
例えば、このポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列；
（Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5）n    ［配列番号９］
［上式において、
Ｘ1及びＸ4は、独立して、Ｇ、Ｐ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｔ、Ｖ、Ｙ又はＷを表し；
Ｘ2、Ｘ3及びＸ5は、独立して、Ｈ、Ｒ又はＫを表し；そして
‘ｎ’は、２〜６の整数である］
又は配列番号９の抗炎症活性及び／又は抗凝固活性を保持している、その断片、変異体、融合体若しくは誘導体又は前記断片の融合体、その変異体若しくは誘導体を含んでなりうるか、又はこれらから成りうる。
【００２９】
かくして、このポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列：
（ＧＨＨＰＨ）n    ［配列番号１０］
［上式において、‘ｎ’は、２〜６の整数である］
又は配列番号１０の抗炎症活性及び／又は抗凝固活性を保持している、その断片、変異体、融合体若しくは誘導体又は前記断片の融合体、その変異体若しくは誘導体を含んでなりうるか、又はこれらから成りうる。
【００３０】
例えば、このポリペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列：
“ＧＨＨ２５”：ＧＨＨＰＨＧＨＨＰＨＧＨＨＰＨＧＨＨＰＨＧＨＨＰＨ［配列番号１１］
又は配列番号１１の抗炎症活性及び／又は抗凝固活性を保持している、その断片、変異体、融合体若しくは誘導体又は前記断片の融合体、その変異体若しくは誘導体を含んでなりうるか、又はこれらから成りうる。
【００３１】
本明細書中で使用される際には、用語‘アミノ酸（amino acid）’は、標準的な２０個の遺伝的にコードされたアミノ酸及びそれらの対応する‘Ｄ’型の立体異性体（天然の‘Ｌ’型と比較して）、他の天然に存在するアミノ酸、オメガ−アミノ酸、非在来型アミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸など）、並びに化学的に誘導化されたアミノ酸（下記参照）を含んでいることが、当技術分野の当業者に理解されるところである。
【００３２】
‘アラニン（alanine）’又は‘Ａｌａ’又は‘Ａ’のように、アミノ酸が具体的に列挙されるときには、この用語は、別段明確に述べられていない限り、Ｌ−アラニンとＤ−アラニンはどちらも意味する。他の非在来型アミノ酸もまた、所望の機能特性がポリペプチドによって維持されている限り、この発明のポリペプチドの適切な構成要素でありうる。ペプチドが示される場合には、それぞれのコードされたアミノ酸残基は、適宜、在来アミノ酸の慣用名に相当する１つの文字記号表示によって表される。
【００３３】
一実施態様では、本発明のポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸を含んでなるか、又はこれらから成る。
【００３４】
ポリペプチドが参照配列（例えば、配列番号１〜１１）によるアミノ酸配列を含む場合には、これはそのＮ末端及び／又はＣ末端で、参照配列のアミノ酸のほかに追加のアミノ酸を含むことができ、例えば、このポリペプチドは、Ｎ末端で追加のアミノ酸を含んでなることができる。同様に、ポリペプチドが参照配列によるアミノ酸配列の断片、変異体若しくは誘導体を含む場合には、これはそのＮ末端及び／又はＣ末端で、追加のアミノ酸を含むことができる。
【００３５】
更なる実施態様では、ポリペプチドは、参照配列（例えば、配列番号１〜１１）によるアミノ酸配列の断片を含んでなるか、又はこれらから成る。すなわち、このポリペプチドは、参照配列の少なくとも５個の連続したアミノ酸を含んでなるか、又はこれらから成りえ、例えば、配列番号１〜１１の少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１個の連続したアミノ酸を含んでなりうるか、又はこれらから成りうる。
【００３６】
一実施態様では、このポリペプチド断片は、配列番号１のアミノ酸残基１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５及び１６番から選択されるアミノ酸残基で開始する。また／加えて、このポリペプチド断片は、配列番号１のアミノ酸残基５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０番から選択されるアミノ酸残基で終了しうる。
【００３７】
本発明のポリペプチドは、参照配列（例えば、配列番号１）によるアミノ酸配列の変異体、又は前記変異体の断片を含んでなりうるか、又はこれらから成りうるということは、当技術分野の当業者によって理解されるところである。こうした変異体は天然に存在しないものでありうる。
【００３８】
我々が、ポリペプチドの‘変異体（variants）’というのは、挿入、欠失、及び保存性（conservative）あるいは非保存性（non-conservative）置換を含んでいる。例えば、保存性置換とは、同じクラス内の別のアミノ酸による、同じ一般的クラス内のアミノ酸（例えば、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、非極性アミノ酸、極性アミノ酸又は芳香族アミノ酸）の置換を意味する。すなわち、保存性アミノ酸置換及び非保存性アミノ酸置換の意味するところは、当技術分野で周知である。特に、我々は、抗炎症活性を示すポリペプチドの変異体を含めている。
【００３９】
更なる実施態様では、この変異体は、参照配列（例えば、配列番号１）又はその断片によるアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％の同一性（identity）、例えば、少なくとも、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有している。
【００４０】
２つのポリペプチド間の配列の同一性％は、適切なコンピュータープログラム、例えば、University of Wisconsin Genetic Computing GroupのＧＡＰプログラムを用いて決定することができ、同一性パーセントは、その配列を最適にアラインメントしたポリペプチドと比較して算出されることは理解されるところである。
【００４１】
このアラインメントは、これに代えて、クラスタルＷ プログラム（Clustal W program）（Thompson et al., 1994, Nuc. Acid Res. 22：4673-4680中に述べられた通りであり、これは引用によって本明細書中に組み込まれる）を用いて行うことができる。
【００４２】
使用されるパラメーターは次の通りでありうる：
高速ペアワイズアラインメントパラメーター（Fast pairwise alignment parameters）：Ｋ−タプル（ワード）サイズ（K-tuple(word) size）；１，ウィンドウ・サイズ（window size）；５，ギャップペナルティ（gap penalty）；３，トップダイアゴナルの数（number of top diagonals）；５．スコアリング法（scoring method）；ｘパーセント（x percent）。
マルティプルアラインメントパラメーター（Multiple alignment parameters）：ギャップ開始ペナルティ（gap open penalty）；１０，ギャップ伸長ペナルティ（gap extension penalty）；０．０５。
スコアリングマトリックス（Scoring matrix）：BLOSUM。
【００４３】
ほかには、BESTFITプログラムが配列のローカルアラインメント（local sequence alignments）を決定するのに用いられうる。
【００４４】
一実施態様では、上記参照配列に起源するアミノ酸は、ポリペプチドのタンパク質分解を減少させるために、例えば、Ｉ、ＦからＷへの置換（modifications）によって変異させうる（Stroemstedt et al, Antimicrobial Agents Chemother 2009, 53, 593参照）。
【００４５】
更なる実施態様では、このポリペプチドは、ＡＴIIIのうちの配列番号１（“ＦＦＦ２１”）の配列に相当するＡＴIII以外のセルピンに起源するアミノ酸配列を含んでなるか、又はこれらから成る。こうした配列の例は、下記の表１に示されている。
【００４６】
【表１】
2013505286.tif 000002
【００４７】
【表２】
2013505286.tif 000003
【００４８】
代替の実施態様では、このポリペプチドは、ＰＣＩのうちの配列番号３（“ＳＥＫ２０”）の配列に相当するＰＣＩ以外のセルピンに起源するアミノ酸配列を含んでなるか、又はこれらから成る。こうした配列の例は、下記の表２に示されている。
【００４９】
【表３】
2013505286.tif 000004
【００５０】
【表４】
2013505286.tif 000005
【００５１】
我々が、上記の表１及び表２に関連して、配列番号１又は３に“相当する（corresponds）”配列というのは、ポリペプチドが種々のヒトセルピンの範囲内の等価なアミノ酸配列に相当する、すなわち、ポリペプチドが配列番号１又は３に対して最大の配列同一性を示す（例えば、ＧＡＰ又はＢＬＡＳＴ配列比較によって測定して）ということを含んでいる。通例、相当するポリペプチドは、参照配列（すなわち、配列番号１又は３）と同じ長さであろう。
【００５２】
変異体は、組換えポリヌクレオチドを用いる当技術分野で周知のプロテインエンジニアリング及び特定部位の突然変異誘発方法を用いて作製される（例えば、引用によって本明細書中に組み込まれるMolecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rd edition, Sambrook & Russell, 2000, Cold Spring Harbor Laboratory Press参照）。
【００５３】
一実施態様では、このポリペプチドは、上記のアミノ酸配列（例えば、配列番号１〜１１）のいずれか１つの１種のホモログであるアミノ酸を含んでなるか、又はこれらから成る。我々が、“ホモログ種（species homologue）”というのは、ポリペプチドが非ヒト種に起源する等価のタンパク質内の同じアミノ酸配列に相当し、すなわち、このポリペプチドは、配列番号１〜１１のいずれか１つと最大の配列同一性を示す（例えば、ＧＡＰ又はＢＬＡＳＴ配列比較によって判定される）ということを含んでいる。通例、このホモログ種ポリペプチドは、ヒト参照配列（すなわち、配列番号１〜１１）と同じ長さであろう。
【００５４】
なお更なる実施態様では、このポリペプチドは、融合タンパク質を含んでなるか、又はこれらから成る。
【００５５】
我々が、ポリペプチドの‘融合体（fusion）’というのは、他の任意のポリペプチドに融合した参照配列に相当するアミノ酸配列を含めている（例えば、配列番号１、又はその断片又はその変異体）。例えば、前記ポリペプチドは、前記ポリペプチドの精製を容易にするためにグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）又はプロテインＡなどのポリペプチドに融合しうる。こうした融合体の例は、当技術分野の当業者に周知である。同様に、前記ポリペプチドは、Ｈｉｓ６などのオリゴヒスチジンタグに、又は周知のＭｙｃエピトープタグ（Myc tag epitope）などの抗体が認識するエピトープに融合しうる。これに加えて、疎水性オリゴペプチド末端タグを含んでなる融合体が使用されうる。前記ポリペプチドの任意の変異体又は誘導体との融合体もまた、本発明の範囲内に含まれる。抗炎症活性などの望ましい特性を維持している融合体（又はその変異体若しくは誘導体）が好ましいことは理解されるところである。
【００５６】
この融合体は、望ましい特徴を前記本発明のポリペプチドに与える更なる部分を含めることができる；例えば、この部分はポリペプチドを検出し、若しくは単離し、又はポリペプチドの細胞内取り込みを促進する際に有用でありうる。この部分は、例えば、当技術分野の当業者に周知であるように、ビオチンモイエティ、ストレプトアビジンモイエティ、放射性モイエティ、蛍光モイエティ、例えば、小蛍光体（small fluorophore）又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）蛍光体でありうる。このモイエティは、当技術分野の当業者に知られているような免疫原性タグ（immunogenic tag）、例えば、Ｍｙｃタグでありえ、あるいは、当技術分野の当業者に知られているように、ポリペプチドの細胞内取り込みを促進することができる親油性分子又はポリペプチドドメインでありうる。
【００５７】
本発明のポリペプチドは、例えば、ＰＥＧ化、アミド化、エステル化、アシル化、アセチル化及び／又はアルキル化によって修飾されるか、又は誘導体化されている１つ又はそれより多いアミノ酸を含むことができることは、当技術分野の当業者が理解しているところである。
【００５８】
当技術分野において理解されているように、ＰＥＧ化タンパク質は、腎クリアランス及びタンパク質分解の低下、毒性の減少、免疫原性の減少及び溶解性の増大を示すことができる［２１，２２］。ＰＥＧ化は、最初のＰＥＧ化分子であるアスパラギナーゼ及びアデノシンデアミナーゼを含む、いくつかのタンパク質ベース薬物のために使用されてきた［２２，２３］。
【００５９】
半減期を最大に増加させ、かつ生物活性を維持したＰＥＧ化タンパク質を得るのを成功させるためには、結果に影響しうるいくつかのパラメーターが重要であり、かつ考慮されるべきである。このＰＥＧ分子類では異なりえ、そしてタンパク質のＰＥＧ化のために使用されているＰＥＧ変異体（PEG variant）には、ＰＥＧ及びモノメトキシ−ＰＥＧが含まれる。これに加えて、これらは線状であるか、又は分岐鎖状でありうる［２４］。使用されるＰＥＧ分子のサイズは変化しえ、１と４０ｋＤａの間のサイズ範囲のＰＥＧモイエティがタンパク質にリンクしている［２４〜２７］。加えて、タンパク質に結合しているＰＥＧ分子の数は変化しえ、１と６個の間のＰＥＧ単位がタンパク質に結合している例が報告されている［２４，２６］。更に、ＰＥＧ間のリンカーの存在若しくは不存在、並びに結合のための様々な反応性基が利用されてきた。すなわち、ＰＥＧは、直接的か、あるいはリンカーとしてγ−アミノ酪酸を用いることによって、Ｎ末端アミノ基にリンクすることもできるし、又は反応性アミノ基若しくはヒドロキシル基を有するアミノ酸残基（Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｙｒ）にリンクすることもできる。これに加えて、ＰＥＧは、カルボキシル（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｃ末端）、又はスルフヒドリル（Ｃｙｓ）基に結合することができる。最後に、Ｇｌｎ残基は、とりわけ酵素であるトランスグルタミナーゼを用いてＰＥＧ化することができ、そしてＰＥＧのアルキルアミン誘導体については述べられている［２５］。
【００６０】
ＰＥＧ化の程度を増加させると、インビボでの半減基を増加させることになることが示されている。しかしながら、ＰＥＧ化プロセスには、個々のベースで特定のタンパク質のために最適化することが必要であることは当技術分野の当業者が理解しているところである。
【００６１】
ＰＥＧは、ＷＯ ２００５／００７１９７中で述べられているように、天然に存在するジスルフィド結合の場所で結合することができる。ジスルフィド結合は、タンパク質の三次構造を傷つけない化学架橋を加えることすることによって安定化させることができる。これはＰＥＧの部位特異的結合のための架橋を作り出すのに使用されるジスルフィド結合を含んで、２つの硫黄のコンジュゲートに与るチオール選択性を可能にする。この結果、標的分子に結合させるため、ペプチドの中に残基を作製する必要性は回避される。
【００６２】
種々の代替的ブロックコポリマーはまた、ＷＯ ２００３／０５９９７３中に述べられているように共有結合でコンジュゲートすることができる。治療ポリマーコンジュゲートによって、熱特性の改善、結晶化、粘着、膨潤、被覆、ｐＨ依存性コンフォメーション（conformation）及び体内分布が発揮されうる。更に、これらは、長期循環、ピノシトーシスによるコンジュゲートの細胞内取り込み後の二次リソソームのタンパク質分解及び酸性環境での生物活性の放出、並びに大きな分子の特徴による、より好都合な物理化学的特性（例えば、生体液中の薬物溶解性の増加）を達成することができる。親水性及び疎水性ブロックを含むブロックコポリマーは、溶液中で高分子ミセルを形成する。ミセル解離すると、個々のブロックコポリマー分子は安全に排出される。
【００６３】
１つ又はそれより多いアミノ酸の化学的誘導体（chemical derivatives）はまた、官能側基との反応によって達成することができる。こうした誘導化分子は、例えば、遊離のアミノ基が誘導体化されて、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボキシベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基又はホルミル基を形成するそうした分子を含む。遊離カルボキシル基は誘導体化されて、塩、メチル及びエチルエステル又は他のタイプのエステル及びヒドラジドを形成し得る。遊離ヒドロキシル基は誘導体化されて、Ｏ−アシル又はＯ−アルキル誘導体を形成し得る。また、化学的誘導体として、２０の標準アミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体を含むそうしたペプチドも含まれる。例えば：４−ヒドロキシプロリンはプロリンと置換し得る；５−ヒドロキシリシンはリシンと置換し得る；３−メチルヒスチジンはヒスチジンと置換し得る；ホモセリンはセリンと、そしてオルニチンはリシンと置換し得る。誘導体にはまた、必須活性が維持される限り、１つ若しくは複数の付加又は欠失を含むペプチドが含まれる。他に含まれる修飾には、アミド化、アミノ末端アシル化（例えば、アセチル化又はチオグリコール酸アミド化）、末端カルボキシルアミド化（例えば、アンモニア又はメチルアミンと共に）、及び同様の末端修飾がある。
【００６４】
更に、ペプチド模倣化合物もまた有用であり得ることは当技術分野の当業者に理解されているところである。従って、我々が‘ポリペプチド（polypeptide）’というのは、抗炎症活性を有するペプチド模倣化合物（peptidomimetic compounds）を含んでいる。用語‘ペプチド模倣薬（peptidomimetic）’とは、治療剤として特定のペプチドのコンフォメーション及び望ましい特徴を模倣する化合物を意味する。
【００６５】
例えば、本発明のポリペプチドは、アミノ酸残基がその中でペプチド（−ＣＯ−ＮＨ−）結合により連結している分子だけでなく、ペプチド結合がその中で反転している分子をも含む。こうしたレトロ−インベルソペプチド模倣薬（retro-inverso peptidomimetics）は、当技術分野で知られている方法、例えば、引用によって本明細書中に組み込まれるMeziere et al. (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237に記載の方法を用いて製造することができる。このアプローチでは、主鎖が関与する変化を含み、そして側鎖の配向性に関係しない擬ペプチド（pseudopeptides）を製造することが必要である。ＣＯ−ＮＨペプチド結合の代わりにＮＨ−ＣＯ結合を含有するレトロ−インバースペプチド（retro-inverse peptides）は、タンパク質分解に対してずっと抵抗性がある。これに代えて、本発明のポリペプチドは、１つ又はそれより多いアミノ酸残基が、一般に行なわれているアミド結合の代わりに−ｙ（ＣＨ2ＮＨ）−結合によって結合する、ペプチド模倣化合物であってもよい。
【００６６】
更にほかでは、アミノ酸残基の炭素原子間に間隔（spacing）を維持する適切なリンカー部分を使用するならば、ペプチド結合は全くなくてもよく；リンカー部分がペプチド結合と、実質的に同じ電荷分布を有し、かつ実質的に同じ平面性を有するならば、有利でありうる。
【００６７】
ポリペプチドは、好都合には、外部タンパク質分解消化に対する感受性を減少させるのに役立つように、Ｎ末端又はＣ末端領域でブロックされてもよいことは理解されるところである。
【００６８】
Ｄ−アミノ酸及びＮ−メチルアミノ酸などの種々の非コード化又は修飾アミノ酸はまた、哺乳動物ペプチドを修飾するのに使用されている。これに加えて、推定される生物活性コンフォメーションは、環化などの共有結合修飾によって、又はラクタムの取り込み若しくは他のタイプの架橋によって安定化しうるが、例えば、引用によって本明細書中に組み込まれる、Veber et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75：2636 and Thursell et al., 1983, Biochem. Biophys. Res. Comm. 111:166を参照されたい。
【００６９】
多くの合成ストラティジーの中で共通のテーマは、ペプチドベース骨格へのある種の環状部分の導入である。環状部分はペプチド構造のコンフォメーション空間を制限し、そしてこのことによって、頻繁に特定の生物学的受容体に対するペプチドの特異性（specificity）の増加がもたらされる。このストラティジーの別の利点は、ペプチドへの環状部分の導入ではまた、細胞ペプチダーゼに対する感受性の低下を有するペプチドがもたらされうるということである。
【００７０】
従って、本発明の例示となるポリペプチドは、末端システインアミノ酸を含んでなる。こうしたポリペプチドは、末端システインアミノ酸中のメルカプチド基のジスルフィド結合形成による、ヘテロデチック（heterodetic）環状形態、又は末端アミノ酸間のアミドペプチド結合形成によるホモデチック（homodetic）形態で存在しうる。上記に示した通り、Ｎ−及びＣ末端領域のシステイン間でのジスルフィド又はアミド結合を介した小分子ペプチドの環化は、タンパク質分解を減少させ、またより高い特異性化合物を生じさせうる構造剛性（rigidity）を増加させることにより、線状ペプチド（linear peptides）でときどき観察される特異性及び半減期の問題を回避することができる。ジスルフィド結合によって環化したポリペプチドは、タンパク質分解（proteolytic degradation）に依然として感受性を有しうる遊離アミノ及びカルボキシ末端を有し、一方、Ｎ末端アミンとＣ末端カルボキシル間のアミド結合の形成により環化したペプチドは、従ってもはや遊離アミノ又はカルボキシ末端を含まない。すなわち、この発明のペプチドは、Ｃ−Ｎ結合か又はジスルフィド結合によって連結しうる。
【００７１】
この発明は、ペプチドの環化方法によって決して限定されるものではなく、その環状構造が、任意の適切な合成方法によって達成されうるペプチドをも包含しうる。従って、ヘテロデチック結合は、ジスルフィド、アルキレン又はスルフィド架橋を介する形成を含みうるが、これに限定されない。ジスルフィド、スルフィド及びアルキレン架橋を含む、環状ホモデチックペプチド及び環状ヘテロデチックペプチドの合成方法は、引用により本明細書中に組み込まれる、米国特許第５，６４３，８７２号に開示されている。環化方法の他の例には、クリックケミストリーによる環化、エポキシド、アルデヒド−アミン反応、並びに引用により本明細書中に組み込まれる、米国特許第６，００８，０５８号に開示されている方法が含まれる。
【００７２】
環状安定化ペプチド模倣化合物の合成の更なるアプローチは、閉環メタセシス（ＲＣＭ）である。この方法では、ペプチド前駆体を合成する工程、そしてそれをＲＣＭ触媒と接触させてコンフォメーションが制限されたペプチドを生じさせる工程が必要である。適切なペプチド前駆体は、２つ又はそれより多い不飽和Ｃ−Ｃ結合を含有しうる。この方法は、固相ペプチド合成法を用いて行うことができる。この実施態様では、固体支持体に固定した前駆体をＲＣＭ触媒と接触させ、次いで生成物を固体支持体から切断してコンフォメーションが制限されたペプチドを生ぜしめる。
【００７３】
引用によって本明細書中に組み入れられる、D. H. Rich in Protease Inhibitors, Barrett and Selveson, eds., Elsevier (1986）によって開示されている別のアプローチでは、酵素阻害剤の設計における遷移状態アナログ・コンセプトの応用によって、ペプチド模倣体を設計することである。例えば、スタリン（staline）の第二級アルコールが、ペプシン基質の切断することができるアミド結合の４面体遷移状態に類似していることが知られている。
【００７４】
要約すれば、周知の通り、末端修飾はプロテイナーゼ消化により感受性を低下させ、それ故、溶液中、特にプロテアーゼが存在しうる生体液中のペプチドの半減期を延長するのに有用である。ポリペプチド環化はまた、環化によって形成される安定な構造のために、そして環状ペプチドの場合に観察される生物学的活性から鑑みて有用な修飾である。
【００７５】
従って、一実施態様では本発明の第一の局面のポリペプチドは、線状である。しかしながら、代替的実施態様では、このポリペプチドは環状である。
【００７６】
本発明のポリペプチドは、種々の長さでありうることは当技術分野の当業者が理解しているところである。しかしながら、通例、このポリペプチドは、１０〜２００個のアミノ酸の長さであり、例えば、１０〜１５０個、１５〜１００個、１５〜５０個、１５〜３０個、１７〜３０個、又は１７〜２８個のアミノ酸の長さである。例えば、このポリペプチドは、少なくとも１７個のアミノ酸の長さでありうる。
【００７７】
はじめに述べたように、抗炎症活性が本発明のポリペプチドに共通の特徴である。一実施態様では、このポリペプチドは、単球由来マクロファージなどのヒト単球由来マクロファージからの、マクロファージ阻害因子、ＴＮＦ−α、ＨＭＧＢ１、Ｃ５ａ、ＩＬ−１７、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＩＦＮ−γ、Ｉｌ−６、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−１２を含む、１つ又はそれより多い炎症誘発性サイトカインの放出を抑制することができる。抗炎症性のＩＬ−１０は、影響を受けないか、又は一時的に増加しうる。
【００７８】
他のマーカーもまた影響を受けうる：こうしたものには、単球及び内皮細胞上の組織因子、プロカルシトニン、ＣＲＰ、活性酸素種（reactive oxygen species）、ブラディキニン、一酸化窒素、ＰＧＥ１、血小板活性化因子、アラキドン酸代謝物、ＭＡＰキナーゼ活性化（MAP kinase activation）が含まれる。
【００７９】
特に、このポリペプチドは、１つ又はそれより多い下記のモデルにおいて抗炎症活性を示しうる：
（ｉ）刺激剤（stimulants）として、ＬＰＳ、ＬＴＡ、ザイモサン、フラジェリン、ダニ（dust mites）、ウイルス若しくは細菌ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はペプチドグリカンを用いるインビトロマクロファージモデル；
（ｉｉ）エンドトキシン・ショックのインビボマウスモデル；
（ｉｉｉ）抗微生物療法と組み合わせるか、又は単独で与える、インビボ感染症モデル。
【００８０】
本発明の更なる実施態様では、このポリペプチドは抗凝固活性を示す。
【００８１】
我々が、“抗凝固活性（anti-coagulant activity）”というのは、凝固（すなわち、血液の凝固）又は関連するシグナル又は影響を減少させるか、又は予防することができることを意味している。こうした活性は当技術分野で周知である方法によって、例えば、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）試験、プロトロンビン時間（ＰＴ）試験、又はトロンビン凝固時間（ＴＣＴ）試験を用いて決定することができる。更に、プレカリクレイン活性化、又は第Ｘ因子及び他の血液凝固因子の活性に関する特定の測定が行なわれうる。このポリペプチドは、外因系凝固経路及び／又は内因系凝固経路を阻害しうることは当業者であれば理解するところである。しかしながら、好ましい実施態様では、このポリペプチドは内因系凝固経路を（少なくとも一部分）阻害する。
【００８２】
本発明のなお更なる実施態様では、このポリペプチドは、トル（Toll）様受容体（ＴＬＲ）遮断活性を示す。こうした受容体遮断活性は、当技術分野で周知である方法を用いて測定することができ、例えば、ｉＮＯＳ、核内因子κＢ及びサイトカインなどの適切な下流エフェクターを分析することによる。
【００８３】
抗炎症活性を有していることに基づいて、本発明の第一局面のポリペプチドは、炎症の処置又は予防における使用を意図している。
【００８４】
我々が、“炎症の処置又は予防（treatment or prevention of inflammation）”というのは、本発明のポリペプチドが、炎症を構成しているか、又は炎症に関連している１つ又はそれより多い症状、シグナル又は影響を予防するか、又は抑制する（少なくとも一部）ことができるということを意味している。
【００８５】
炎症を抑制することが全部又は一部分でありうることは、当技術分野の当業者であれば理解するところである。好ましい実施態様では、このポリペプチドは、１つ又はそれより多い炎症のマーカーを、このポリペプチドの作用を受けていない細胞又は個体と比較して２０％以上、例えば、少なくとも３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上抑制することができる。
【００８６】
有利なことには、本発明のポリペプチドは、炎症を選択的に処置又は予防することができる。
【００８７】
我々が、‘選択的に（selectively）’というのは、このポリペプチドが、それが生物学的な他の機能をモジュレートするのと比較して、より大きな程度に至るまで炎症を抑制し、又は予防するということを意味している。このポリペプチド、又はその断片、変異体、融合体若しくは誘導体は、炎症のみを抑制し、又は予防することが好ましい。
【００８８】
しかしながら、更なる実施態様では、このポリペプチドはまた（あるいは、ほかに）、血液の凝固を抑制し、又は予防する。上記の通り、凝固の抑制は全部又は一部でありうることは当技術分野の当業者であれば理解するところである。好ましい実施態様では、このポリペプチドは、１つ又はそれより多い凝固の尺度及び／又はマーカーを、このポリペプチドの作用を受けていない細胞又は個体と比較して２０％以上、例えば、少なくとも３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上抑制することができる。
【００８９】
一実施態様では、このポリペプチドは、感染症に関連する（すなわち、感染症によって引き起こされているか、又は単に感染症を併発している過ぎない）炎症の処置又は予防の際に使用する目的のためにある。
【００９０】
本発明の好ましいが、非限定的な実施態様では、このポリペプチドは、下記から選択される疾患、状態又は適応の処置又は予防の際に使用する目的のためにある：
ｉ）感染性要素の有無にかかわらず、急性全身性炎症疾患、例えば全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、ＡＲＤＳ、敗血症、重症敗血症、及び敗血症性ショック。丹毒、髄膜炎、関節炎、トキシックショック症候群、憩室炎、中垂炎、膵炎、胆嚢炎、大腸炎、蜂巣炎、火傷感染症、肺炎、尿路感染症、術後感染症、及び腹膜炎を含む、他の全身性又は限局性で侵襲性の感染性及び炎症性疾患。
ｉｉ）下記を含む慢性炎症性及び／又は感染性疾患；嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ及び他の肺疾患、慢性皮膚及び胃潰瘍を含む胃腸疾患、アトピー性皮膚炎、口腔内潰瘍（アフタ性潰瘍）、陰部潰瘍及び炎症性変化、歯周炎、結膜炎及び角膜炎を含む眼の炎症、外耳炎、中耳炎、泌尿生殖器の炎症などの他の上皮炎症性及び／又は感染性疾患。
ｉｉｉ）術後炎症。血栓症、ＤＩＣ、術後凝固異常、並びに体外循環及び生体材料の使用を含む異物との接触に関連する凝固異常を含む、炎症性疾患及び凝固異常；更に、血管炎関連炎症性疾患、並びにアレルギー性鼻炎及び喘息を含むアレルギー。
ｉｖ）過度の接触活性化及び／又は脳卒中（これらに限定されない）に関連する凝固。
ｖ）抗微生物剤処置との併用での過度の炎症。使用される抗微生物剤は、種々のルートによって投与することができる；静脈内（ｉｖ）、動脈内、硝子体内、皮下（ｓｃ）、筋肉内（ｉｍ）、腹腔内（ｉｐ）、膀胱内、髄こう内、硬膜外、経腸（経口、直腸、胃内、及び他の経腸ルートを含む）、又は局所的（皮膚、鼻への適用、例えば滴剤による眼又は耳内の適用、及び肺吸入を含む）。薬剤の例には、ペニシリン系、セファロスポリン系、カルバセフェム系、セファマイシン系、カルバペネム系、モノバクタム系、アミノグリコシド系、グリコペプチド系、キノロン系、テトラサイクリン系、マクロライド系、及びフルオロキノロン系がある；防腐剤には、ヨウ素、銀、銅、クロルヘキシジン、ポリヘキサニド及び他のビグアニド類、キトサン、酢酸、及び過酸化水素が含まれる。
【００９１】
例えば、このポリペプチドは、急性炎症、敗血症、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、傷、喘息、アレルギー性及び他のタイプの鼻炎、皮膚及び全身性血管炎、血栓症及び／又は播種性血管内凝固（ＤＩＣ）の処置又は予防に使用されうる。
【００９２】
一実施態様では、このポリペプチドは、抗炎症及び抗凝固活性を示し、炎症及び凝固を同時に処置又は予防するのに用いることができる。こうしたポリペプチドは、炎症と凝固進行の双方を同時に抑制することが望ましい状態、例えば、敗血症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、血栓症、ＤＩＣ及び急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の処置及び予防に特に適しうる。更に、過度の炎症及び凝固病変に関連する他の疾患、例えば、嚢胞性線維症、喘息、アレルギー性及び他のタイプの鼻炎、皮膚及び全身性血管炎は、このポリペプチドによる処置の利益を享受することができる。
【００９３】
更なる実施態様では、本発明のポリペプチドは、１つ又はそれより多い更なる治療薬と組み合わせて使用される。例えば、本発明のポリペプチドは、抗生剤、抗炎症剤、免疫抑制剤及び／又は防腐剤と、並びに血管作用薬及び／又は受容体遮断剤又は受容体作動薬と組み合わせて投与することができる。使用される抗微生物剤は、ｉｖ、ｓｃ、ｉｍ、髄こう内、経口、又は局所的に適用することができる。薬剤の例には、ペニシリン系、セファロスポリン系、カルバセフェム系、セファマイシン系、カルバペネム系、モノバクタム系、アミノグリコシド系、グリコペプチド系、キノロン系、テトラサイクリン系、マクロライド系、及びフルオロキノロン系がある。防腐剤には、ヨウ素、銀、銅、クロルヘキシジン、ポリヘキサニド及び他のビグアニド類、キトサン、酢酸、及び過酸化水素が含まれる。例えば、本発明のペプチドは、例えば、ＬＰＳ作用を抑制するために傷を銀／ＰＨＭＢ処置で処置する、防腐剤処置のアジュバントとして機能を果たしうる。
【００９４】
従って、本発明のペプチドは、内部及び外部感染症（例えば、丹毒、真菌感染を含む肺感染症、敗血症、ＣＯＰＤ、傷、及び他の上皮感染症）の抗生物質、防腐剤及び／又は抗真菌剤処置を（炎症を阻止するために）補完するアジュバントとしての機能を果たしうる。同様に、本発明のペプチドは、例えば、ＬＰＳ作用を抑制するために傷を銀／ＰＨＭＢ処置で処置する、防腐剤処置のアジュバントとして機能を果たしうる。
【００９５】
一実施態様では、本発明のポリペプチドは、ステロイド、例えば、グルココルチコイド（例えば、デキサメタゾン）と組み合わせて使用する。
【００９６】
本発明の第二の関連する局面では、血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質に由来するアミノ酸配列、又はその断片、変異体、融合体若しくは誘導体、又は前記断片の融合体、その変異体若しくは誘導体を含んでなるか、又はこれらから成る単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは抗炎症及び／又は抗凝固活性を示し、上記において、血液凝固をモジュレートする天然に存在するタンパク質は、セルピン（ヘパリンコファクターII以外の）、ヒスチジンリッチグリコプロテイン（ＨＲＧ）及び組織因子経路インヒビター（例えば、ＴＦＰＩ−１及びＴＦＰＩ−２）から成る群より選択され、該ポリペプチドは天然に存在するタンパク質（例えば、ホロタンパク質）ではないことを条件とする、上記ポリペプチドが提供される。
【００９７】
我々が、この文脈で“天然に存在するタンパク質（naturally occurring protein）”というのは、このポリペプチドがデノボ（de novo）合成されるということを意味している。しかしながら、インビボで生じるこうした天然に存在するホロタンパク質の断片は排除されていない。
【００９８】
断片、変異体、融合体若しくは誘導体のような用語は、本発明の第一の局面に関連して上記で議論された通り解釈されるべきであることは当技術分野の当業者であれば理解するところである。
【００９９】
一実施態様では、このポリペプチドは、配列番号１〜１１、又は前記配列の断片、変異体、融合体若しくは誘導体、又は前記断片の融合体、その変異体若しくは誘導体から成る群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるか、又はこれらから成る。例えば、このポリペプチドは、配列番号１〜１１から成る群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるか、又はこれらから成りうる。
【０１００】
本発明の第一の局面でのポリペプチドに関連して上記で議論された所望の特徴はまた、本発明の第二の局面の関連するポリペプチドに該当するということは当技術分野の当業者であれば理解するところである。
【０１０１】
例えば、１つの好ましい実施態様では、このポリペプチドは、ヒト単球由来のマクロファージに起源する１つ又はそれより多い炎症誘発性サイトカイン（例えば、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＩＬ−１及び／又はＩＬ−１８）の放出を阻害する
ことができる。
【０１０２】
別の好ましい実施態様では、このポリペプチドは、抗凝固活性を示す。
【０１０３】
この発明はまた、上述したポリペプチドの製薬学的に許容される酸又は塩基付加塩をも含む。この発明において有用な、上述の塩基化合物の製薬学的に許容される酸付加塩を調製するのに使用される酸は、とりわけ、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩（acid phosphate）、酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酸性クエン酸塩（acid citrate）、酒石酸塩、酒石酸水素塩（bitartrate）、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、サッカラート（saccharate）、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩及びパモン酸塩［すなわち、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトアート）］塩などの非毒性酸付加塩、すなわち、薬理学的に許容されるアニオンを含有する塩を形成する酸である。
【０１０４】
製薬学的に許容される塩基付加塩もまた、このポリペプチドの製薬学的に許容される塩の形態を製造するのに使用しうる。事実上酸性であるこの発明の化合物の製薬学的に許容される塩基塩を調製するための試薬として使用することができる化学塩基は、こうした化合物と非毒性の塩基塩を形成する塩基である。こうした非毒性塩基塩には、とりわけ、アルカリ金属カチオン（例えば、カリウム及びナトリウム）及びアルカリ土類金属カチオン（例えば、カルシウム及びマグネシウム）などのそうした薬理学的に許容されるカチオンから誘導される塩基塩、アンモニウム又はＮ−メチルグルカミン（メグルミン）などの水溶性アミン付加塩、並びに低級アルカノールアンモニウム及び製薬学的に許容される有機アミンの他の塩基塩が含まれるが、それらに限定されない。
【０１０５】
本発明のポリペプチドは、保存のために、例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥、スプレー冷却によって、又は超臨界二酸化炭素に起源する粒子形成（沈殿）を使用することによって、凍結乾燥することができ、そして使用前に適切な担体中で復元することができるということは理解されるところである。あらゆる適切な凍結乾燥（lyophilisation）方法（例えば、フリーズドライ（freeze-drying）、噴霧乾燥、ケーキ乾燥（cake drying））及び／又は復元手法を使用することができる。凍結乾燥及び復元は、様々な程度の活性損失をもたらしうるということ、そして使用レベルによってそれを補うように上方に調節する必要があることは当技術分野の当業者であれば理解するところである。好ましくは、この凍結乾燥（フリーズトライ）したこのポリペプチドの損失は、元にもどしたとき、その活性（凍結乾燥前）の約１％に過ぎないか、あるいは元にもどしたとき、その活性（凍結乾燥前）の約５％、１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％にすぎないか、あるいは約５０％にすぎない。
【０１０６】
本発明のポリペプチドの製造方法は、当技術分野で周知である。
【０１０７】
好都合には、このポリペプチドは、組み換えポリペプチドであるか、又は組み換えポリペプチドを含んでなる。こうした組み換えポリペプチドの適切な製造方法は、当技術分野において周知であり、例えば、原核生物又は真核生物の宿主細胞内で発現させる（例えば、Sambrook & Russell, 2000, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照されたい。なお、この書籍中の該当する開示は引用することにより本明細書中に組み込まれる）。
【０１０８】
本発明のポリペプチドはまた、商業上入手可能なインビトロの翻訳システムを用いて製造することができ、例えば、ウサギ網状赤血球溶解液（rabbit reticulocyte lysate）又は小麦胚芽溶解液（wheatgerm lysate）（Promegaから入手可能）がある。好ましくは、
この翻訳システムは、ウサギ網状赤血球溶解液である。好都合なことには、この翻訳システムは、ＴＮＴ転写／翻訳システム（Promega）などの翻訳システムと連動させることができる。このシステムは、コード化しているＤＮＡポリヌクレオチドから適切なｍＲＮＡ転写物を、翻訳と同じ反応で作製する利点を有する。
【０１０９】
あるいは、本発明のポリペプチドは人工的に、例えば、周知の液相又は固相合成手法（例えば、ｔ−Ｂｏｃ又はＦｍｏｃ固相ペプチド合成）を用いて合成することができることは当技術分野の当業者であれば理解するところである。
【０１１０】
従って、この発明の範囲内には、下記が含まれる：
（ａ）本発明の第三の局面は、本発明の第二の局面によるポリペプチドをコードしている、単離された核酸分子を提供する；
（ｂ）本発明の第四の局面は、本発明の第三の局面による核酸分子を含んでなるベクター（例えば、発現ベクター）を提供する；
（ｃ）本発明の第五の局面は、本発明の第三の局面による核酸分子、又は本発明の第四の局面によるベクターを含んでなる宿主細胞を提供する；そして
（ｄ）本発明の第六の局面は、本発明の第二の局面によるポリペプチドを製造する方法であって、本発明の第五の局面による宿主細胞の集団を、前記ポリペプチドが発現される条件下で培養すること、そしてそれからポリペプチドを単離することを含んでなる、上記方法を提供する。
【０１１１】
本発明の第七の局面は、本発明の第一の局面によるポリペプチドを、製薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と一緒に含んでなる、医薬組成物を提供する。
【０１１２】
本明細書中で使用されている際は、‘医薬組成物（pharmaceutical composition）’とは、炎症に関連する障害及び状態の処置又は予防における使用のための治療的に有効な製剤を意味する。
【０１１３】
本明細書中で使用されている際は、‘医薬組成物（pharmaceutical composition）’とは、炎症に関連する障害及び状態の処置又は予防における使用のための治療的に有効な製剤を意味する。
【０１１４】
別のペプチド、低分子量免疫調節剤、受容体アゴニスト及びアンタゴニスト、及び抗微生物剤などの更なる化合物もまた、医薬組成物中に含みうる。他の例には、ＥＤＴＡ、シトラート（citrate）、ＥＧＴＡ又はグルタチオンなどのキレート化剤が含まれる。
【０１１５】
十分に保存安定性があり、かつヒト及び動物に投与するのに適しているこの医薬組成物は、当技術分野において知られている方法で製造することができる。医薬組成物は、例えば、フリーズドライ、噴霧乾燥、スプレー冷却によって、又は超臨界粒子形成に起源する粒子形成を使用することによって、凍結乾燥することができる。
【０１１６】
我々が、“製薬学的に許容される（pharmaceutically acceptable）”というのは、活性成分、すなわち、抗炎症性ポリペプチドの生物学的活性の有効性が減少しない非毒性成分を意味している。こうした製薬学的に許容される緩衝液、担体又は賦形剤は、当技術分野において周知である（Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A.R Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990) and handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed ., Pharmaceutical Press (2000）参照）。
【０１１７】
用語“バッファー（buffer）”は、酸塩基混合物を、ｐＨを安定させる目的で含む水溶液を意味することを意図している。緩衝液の例には、トリズマ（Trizma）、ビシン、トリシン、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＢＳ、トリス（Tris）、ヘペス（Hepes）、ＨＥＰＢＳ、ＭＥＳ、ホスファート、カルボナート、アセタート、シトラート、グリコラート、ラクタート、ボラート、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、タートラート、ＡＭＰ、ＡＭＰＤ、ＡＭＰＳＯ、ＢＥＳ、ＣＡＢＳ、カコジラート、ＣＨＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＥＰＰＳ、エタノールアミン、グリシン、ＨＥＰＰＳＯ、イミダゾール、イミダゾール乳酸、ＰＩＰＥＳ、ＳＳＣ、ＳＳＰＥ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＢＳ、ＴＡＰＳＯ及びＴＥＳがある。
【０１１８】
用語“希釈剤（diluent）”は、医薬製剤中のペプチドを希釈する目的の、水溶液又は非水溶液を意味することを意図している。この希釈剤は、１つ又はそれより多い生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール又は油類（例えば、サフラワー油、コーンオイル、ピーナツ油、綿実油又はゴマ油）でありうる。
【０１１９】
用語“アジュバント（adjuvant）”は、ペプチドの生物学的作用を増加させるために製剤に加えられる任意の化合物を意味することを意図している。このアジュバントには、１つ又はそれより多いコロイド銀又は金、又は種々のアニオンとの亜鉛、銅又は銀塩がありえ、例えば、フルオリド、クロリド、ブロミド、ヨージド、チオシアナート、亜硫酸塩、ヒドロキシド、ホスファート、カルボナート、ラクタート、グリコラート、シトラート、ボラート、タートラート、及び種々のアシル成分のうちのアセタート（acetates of different acyl composition）があるが、これらに限定されない。このアジュバントはまた、カチオン性セルロースエーテル、カチオン性セルロースエステル、脱アセチル化ヒアルロン酸、キトサン、カチオン性デンドリマー、ポリ（ビニルイミダゾール）などのカチオン性合成ポリマー及びポリヒスチジンなどのカチオン性ポリペプチド、ポリリシン、ポリアルギニン、及びこうしたアミノ酸を含むペプチドなどのカチオン性ポリマーでありうる。
【０１２０】
賦形剤には、１つ又はそれより多い炭水化物、ポリマー、脂質及びミネラルがありうる。炭水化物の例には、乳糖、スクロース、マンニトール、及びシクロデキストリンが含まれ、これらはこの組成物に、例えば、凍結乾燥を容易にするために加えられる。ポリマーの例には、澱粉、セルロースエーテル、セルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、エチルセルロース、メチルセルロース、プロピルセルロース、アルギナート、カラギーナン、ヒアルロン酸及びその誘導体、ポリアクリル酸、ポリスルホナート、ポリエチレングリコール／ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドコポリマー、ポリビニルアルコール／種々の程度の加水分解されたポリビニルアセタート、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）又は種々の成分とのそのコポリマー、及びポリビニルピロリドンがあるが、これらはすべて、種々の分子量であり、例えば、粘性制御のため、生物接着を得るため、又は化学分解及びタンパク質分解から活性成分（Ａ〜Ｃにも適用される）を保護するためにこの組成物に加えられる。脂質の例には、脂肪酸、リン脂質、モノ−、ジ−、及びトリグリセリド、セラミド、スフィンゴ脂質及び糖脂質（これらはすべて、種々のアシル鎖長さ及び飽和度がある）、卵黄レシチン、大豆レシチン、水素添加卵黄及び大豆レシチンがあり、これらはポリマーのそれと同様な理由で組成物に加えられる。ミネラルの例には、タルク、酸化マグネシウム、酸化亜鉛及び酸化チタンがあり、これらは液体貯留の減少又は着色剤特性を有利にするなどの効果を得るために組成物に加えられる。
【０１２１】
この医薬組成物はまた、１つ又はそれより多い単糖類又は二糖類、例えば、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、ラクチトール（lactitiol）、イソマルト、マルチトール若しくはキシロシド、及び／又はモノラウリンなどのモノアシルグリセロールを含む。この担体の特徴は、投与ルートに左右されることである。１つの投与ルートは、局所投与である。例えば、局所投与の場合に好ましい担体は、活性ペプチドを含んでなる乳剤性クリームであるが、ある種のワセリン／ミネラルベース及び植物ベース軟膏、並びにポリマーゲル、液晶相及びマイクロエマルションなどの一般的な他の担体を使用することができる。
【０１２２】
この医薬組成物は、１つ又はそれより多い本発明のポリペプチド、例えば、１つ、２つ、３つ又は４つの異なったペプチドを含めることができるということは理解されるところである。異なるペプチドの組み合わせ物を使用することによって抗炎症作用が増強されうる。
【０１２３】
上記で議論したように、このポリペプチドは、塩、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、臭化水素酸、リン酸、過塩素酸、チオシアン酸、ホウ酸などの無機酸との酸付加物、あるいはギ酸、酢酸、ハロ酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、クエン酸、酒石酸、琥珀酸、グルコン酸、乳酸、マロン酸、フマル酸、アントラニル酸、安息香酸、桂皮酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、スルファニル酸などの有機酸との酸付加物として提供されうる。すべて対応するアニオンと一緒になる一価のナトリウム、カリウム又は二価の亜鉛、マグネシウム、銅、カルシウムなどの無機塩は、抗菌組成物の生物学的活性を改善するために加えられうる。
【０１２４】
本発明の医薬組成物はまた、その中でポリペプチドが、製薬学的に許容される担体のほかに、ミセル、不溶単分子層及び液晶のように凝集した形態で存在する脂質などの両親媒性剤と結合するリポソームの形態でありうる。リポソーム製剤のための適切な脂質には、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などが含まれるが、これらに限定されない。適切な脂質にはまた、血流循環時間を長くするために極性頭基をポリ（エチレングリコール）修飾した上記の脂質が含まれる。こうしたリポソーム製剤の調製は、例えば、米国特許第４，２３５，８７１号中に見い出すことができる。
【０１２５】
本発明の医薬組成物はまた、生体分解性のマイクロスフェアの形態でありうる。ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ＰＬＡとＰＧＡのコポリマー（ＰＬＧＡ）又はポリ（カルプロラクトン）（ＰＣＬ）、及びポリ無水物などの脂肪族ポリエステルが、マイクロスフェアを製造する際、生体分解性ポリマーとして広く使用されている。こうしたマイクロスフェアの調製は、米国特許第５，８５１，４５１号及びＥＰ ２１３３０３中に見出すことができる。
【０１２６】
本発明の医薬組成物はまた、界面活性剤及びブロックコポリマーによって形成されるミセル系、好ましくは、血流循環時間を長くするためにポリ（エチレンオキシド）部分を含むミセル系を用いて製剤化することができる。
【０１２７】
本発明の医薬組成物はまた、ポリマーゲルの形態でありえ、その場合、澱粉、セルロースエーテル、セルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、エチルセルロース、メチルセルロース、プロピルセルロース、アルギナート、キトサン、カラギーナン、ヒアルロン酸及びその誘導体、ポリアクリル酸、ポリビニルイミダゾール、ポリスルホナート、ポリエチレングリコール／ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドコポリマー、ポリビニルアルコール／種々の程度の加水分解されたポリビニルアセタート、及びポリビニルピロリドンなどのポリマーがペプチドを含む溶液を増粘するために使用される。このポリマーはまた、ゼラチン又はコラーゲンを含んでいてもよい。
【０１２８】
他に、本発明のポリペプチドは、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール又は油類（例えば、サフラワー油、コーンオイル、ピーナツ油、綿実油又はゴマ油）、トラガントゴム、及び／又は様々なバッファーに溶解させてもよい。
【０１２９】
この医薬組成物はまた、抗炎症性ポリペプチドの作用の増強のためにイオン類を含んでいてもよく、そしてｐＨを規定することを含んでいてもよい。
【０１３０】
本発明の組成物は、滅菌などの一般に行なわれている製薬操作に付されてもよく、及び／又は、例えば、本明細書中のいずれかで開示されている保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、バッファー、増量剤など一般に使用されているアジュバントを含有していてもよい。
【０１３１】
本発明の医薬組成物は、局所的、又は全身的に投与することができるということは当技術分野の当業者に理解されるところである。投与ルートには、局所、眼、鼻、肺、口腔、非経口（静脈内、皮下、及び筋肉内）、経口、膣及び直腸が含まれる。また、インプラント投与も可能である。適切な製剤形態には、例えば、顆粒、散剤、錠剤、コーティング錠剤、（マイクロ）カプセル、座剤、シロップ、エマルション、マイクロエマルション（水、油及び界面活性剤から成る光学的に等方性の熱力学的に安定な系と定義される）、液晶相（短距離無秩序以外の長距離秩序を特徴とする系と定義される）（例には、ラメラ、ヘキサゴナル及びキュービック相が含まれる（水連続相あるいは油連続相））、又はそれらが分散したカウンターパート、ゲル、軟膏、分散系、懸濁液、クリーム、エアロゾル、液滴又はアンプル形態の注入可能な溶液及び、活性化合物の遅延放出を備えた製剤もあり、こうした製剤には、賦形剤、希釈剤、アジュバント又は担体が通例、上記に述べられているように使用される。この医薬組成物はまた、包帯、プラスター中、あるいは縫合糸中などにも提供が可能でありうる。
【０１３２】
好ましい実施態様では、この医薬組成物は、非経口投与又は局所投与に適している。
【０１３３】
これに代わる好ましい実施態様では、この医薬組成物は、肺投与又は鼻内投与に適している。
【０１３４】
例えば、本発明の医薬組成物は、鼻内又は吸入によって投与することができ、そして適切なプロペラント、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ １３４Ａ３又は１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ ２２７ＥＡ３）などのヒドロフルオロアルカン、炭酸ガス又は他の適切なガスを使用して、乾燥粉末吸入器あるいは加圧容器、ポンプ、スプレー又はネブライザーからのエアロゾルスプレー供給の形態で送達するのが好都合である。加圧エアロゾルの場合には、投与単位は、計量を送達するバルブを供給することによって決定することができる。この加圧容器、ポンプ、スプレー、又はネブライザーは、例えば、エタノールと溶媒としてのプロペラントの混合物を用いる活性化合物の溶液又は懸濁液を含むことができ、これには、更に、滑沢剤、例えば、ソルビタントリオレアートを含めることができる。吸入器又は吹きつけ器（insufflator）で使用するためのカプセル及びカートレッジ（例えば、ゼラチンから作られる）は、本発明のポリペプチドと乳糖又は澱粉などの適切な粉末ベースの粉末ミックスを含むように製剤化することができる。
【０１３５】
エアロゾル又は乾燥粉末製剤は、好ましくは、各計量用量又は‘パフ（puff）’が患者に供給するために本発明のポリペプチドを少なくとも０．１ｍｇ含むように準備しておくことが好ましい。１つのエアロゾルで一日の全投与量は、患者によって異なるが、一日を通じて、単回投与によるか、又はより普通には、分割投与によって投与することができることは理解されるところである。
【０１３６】
この医薬組成物は、医薬的に有効な投与量で患者に投与するものである。“医薬的に有効な投与量（pharmaceutically effective dose）”というのは、投与される条件に応じて、所望の効果をもたらすために十分な投与量を意味している。正確な投与量は、化合物の活性、投与方法、障害の性質及び重篤度、異なった投与量が必要とされうる患者の年齢及び体重によって左右される。この用量投与は、個々の投与単位、さもなければ、いくつかのより少ない投与単位の形で単回投与によって、並びにまた特定の間隔をおいて細分割した投与量の複数回投与による双方で行うことができる。
【０１３７】
本発明の医薬組成物は、単独、又は別の治療剤と組み合わせて投与することができ、別の治療薬には、例えば、更なる抗生物質、抗炎症剤、免疫抑制剤、血管作用薬、及び／又は防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、及び抗寄生虫剤）がある。適切な抗菌剤の例には、ペニシリン系、セファロスポリン系、カルバセフェム系、セファマイシン系、カルバペネム系、モノバクタム系、アミノグリコシド系、グリコペプチド系、キノロン系、テトラサイクリン系、マクロライド系、及びフルオロキノロン系が含まれる。防腐剤には、ヨウ素、銀、銅、クロルヘキシジン、ポリヘキサニド及び他のビグアニド類、キトサン、酢酸、及び過酸化水素が含まれる。同様に、医薬組成物はまた、ステロイド及びマクロラクタム誘導体などの更なる抗炎症薬を含むことができる。
【０１３８】
一実施態様では、本発明の医薬組成物はステロイド、例えば、グルココルチコイド（例えば、デキサメタゾン）と組み合わせて投与される。
【０１３９】
更なる治療剤は、同じ医薬組成物の一部分として組み込まれることができるか、あるいは別々に投与されることができることは当技術分野の当業者であれば理解するところである。
【０１４０】
本発明の第七の局面の一実施態様では、この医薬組成物は、医療に使用されるデバイス又は材料と‘関連している（associated with）’（体外又は体内に）。我々が‘関連している（associated with）’というのは、本発明の医薬組成物（又はそのポリペプチド）を、被覆する、染み込ませる（impregnated）、共有結合で結合させる、又はそうでなければ混合させるデバイス又は材料を含んでいる。
【０１４１】
例えば、この組成物は、バイパス手術、体外循環、傷のケア、及び／又は透析において使用されるデバイスなどのヒトの体又はその構成部分（例えば、血液）に接触するデバイスの表面に被覆することができる。すなわち、この組成物は、縫合糸、人工補綴物、インプラント、創傷被覆材、カテーテル、レンズ、皮膚移植片、代用皮膚、フィブリン接着剤又は包帯などに被覆すること、塗ること、噴霧すること、あるいはその他の方法で塗布するか、又は混合することができる。そうすることにより、この組成物は該デバイス又は材料に抗炎症及び／又は抗凝固特性の改善を付与することができる。
【０１４２】
好ましくは、このデバイス又は材料は、本発明の医薬組成物（又は、そのポリペプチド成分）で被覆される。我々が、‘被覆された（coated）’というのは、この医薬組成物が、デバイス又は材料の表面に塗布されているということを意味している。すなわち、このデバイス又は材料は、本発明の医薬組成物（又は、そのポリペプチド）を含んでなる溶液を塗るか、又は噴霧することができる。これに代えて、このデバイス又は材料は、本発明のポリペプチドを含んでなる溶液のリザーバ（reservoir）に浸漬することができる。
【０１４３】
有利には、このデバイス又は材料には、本発明の医薬組成物（又は、そのポリペプチド）が染み込まれている。我々が、‘染み込まれた（impregnated）’というのは、医薬組成物が全体にわたって分布されているように、医薬組成物が取り込まれているか、そうでなければこのデバイス又は材料と混合していることを意味している。
【０１４４】
例えば、このデバイス又は材料は、本発明のポリペプチドを含んでなる溶液中、４℃で終夜インキュベートすることができる。これに代えて、本発明の医薬組成物（又は、そのポリペプチド）が、蒸発によるか、又は室温でインキュベーションされることによってデバイス又は材料の表面上で固定することができる。
【０１４５】
代替的実施態様では、本発明のポリペプチドは、デバイス又は材料に、例えば、デバイス又は材料の外部表面で共有結合によって結合している。すなわち、共有結合が、このポリペプチドの適切な官能基と、デバイス又は材料上の官能基の間で形成される。例えば、ポリペプチドをポリマー支持体と共有結合させる方法には、ペプチド結合の形成によって、結合タンパク質上のフェノール、アミン及びスルフヒドリル（sulphydryl）基のアルキル化によって、多官能性中間体、例えば、グルタルジアルデヒド（glutardialdehyde）を用いることによって、ジアゾニウム中間体を介して共有結合すること、並びに他の様々な方法、例えば、トリアルコキシシランの反応が、ガラス表面を多くの異なった官能基で誘導体化することを可能にするシリル化したガラス又は石英を用いることが含まれる。詳細は、Enzyme immobilisation by Griffin, M., Hammonds, E.J. and Leach, C.K. (1993) In Technological Applications of Biocatalysts (BIOTOL SERIES), pp. 75-118, Butterworth-Heinemannを参照されたい。また、次の表題がつけられている総説も参照されたい：'Biomaterials in Tissue Engineering' by Hubbell, J.A. (1995) Science 13:565-576。
【０１４６】
好ましい実施態様では、このデバイス又は材料は、ポリマーを含んでなるか、又はこれから成る。このポリマーは、ポリエステル（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸又は種々の組成のポリ乳酸−グリコール酸コポリマー）、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリウレア、ポリカーボネート（polycarbonates）、ポリウレタン、ポリアミド）及び多糖類成分（polysaccharide materials）（例えば、架橋アルギナート（cross-linked alginates）、ヒアルロン酸、カラギーナン、ゼラチン、澱粉、セルロース誘導体）から成る群より選択することができる。
【０１４７】
これに代えて、あるいはこれに加えて、このデバイス又は材料は、金属（例えば、チタン、ステンレス鋼、金、チタン）、金属酸化物（酸化シリコン、酸化チタン）及び／又はセラミック（アパタイト、ヒドロキシアパタイト）を含んでなるか、又はこれらから成ってもよい。
【０１４８】
こうした材料は、化学的又は物理化学的に架橋したゲルのように、多孔性材料のように、又は粒子のように、巨視的固体／モノリスの形態でありうる。
【０１４９】
すなわち、この発明は更に医療において使用される本発明のポリペプチド又はそれを含んでなる、医薬組成物が適用されたデバイス及び材料を提供する。
【０１５０】
こうしたデバイス及び材料は、当技術分野において周知の方法を用いて作製することができる。
【０１５１】
本発明の第八の局面は、本発明の第二の局面によるポリペプチド、又は医療における使用のための本発明の第七の局面による医薬組成物を提供する。
【０１５２】
好ましい実施態様では、本発明の第二の局面によるポリペプチド、又は本発明の第七の局面による医薬組成物が使用される：
（ａ）急性及び／又は慢性炎症の処置及び／予防；
（ｂ）微生物感染症（例えば、細菌感染症）の処置及び／予防；
（ｃ）血液凝固の調節（モジュレーション：modulation）；及び／又は
（ｄ）傷の処置。
【０１５３】
例えば、本発明の第二の局面によるポリペプチド、又は本発明の第七の局面による医薬組成物は、下記から選択される疾患、状態又は適応を処置及び／予防する際の使用でありうる：
ｉ）感染性要素の有無にかかわらず、急性全身性炎症疾患、例えば全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、ＡＲＤＳ、敗血症、重症敗血症、及び敗血症性ショック。丹毒、髄膜炎、関節炎、トキシックショック症候群、憩室炎、中垂炎、膵炎、胆嚢炎、大腸炎、蜂巣炎、火傷感染症、肺炎、尿路感染症、術後感染症、及び腹膜炎を含む、他の全身性又は限局性で侵襲性の感染性及び炎症性疾患。
ｉｉ）下記を含む慢性炎症性及び／又は感染性疾患；嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ及び他の肺疾患、慢性皮膚及び胃潰瘍を含む胃腸疾患、アトピー性皮膚炎、口腔内潰瘍（アフタ性潰瘍）、陰部潰瘍及び炎症性変化、歯周炎、結膜炎及び角膜炎を含む眼の炎症、外耳炎、中耳炎、泌尿生殖器の炎症などの他の上皮炎症性及び／又は感染性疾患。
ｉｉｉ）術後炎症。血栓症、ＤＩＣ、術後凝固異常、並びに体外循環、及び生体材料の使用を含む異物との接触に関連する凝固異常を含む、炎症性及び凝固異常；更に、血管炎関連炎症性疾患、並びにアレルギー性鼻炎及び喘息を含むアレルギー。
ｉｖ）過度の接触活性化及び／又は脳卒中（これらに限定されない）に関連する凝固。
ｖ）抗微生物剤処置との併用での過度の炎症。使用される抗微生物剤は、種々のルートによって投与することができる；静脈内（ｉｖ）、動脈内、硝子体内、皮下（ｓｃ）、筋肉内（ｉｍ）、腹腔内（ｉｐ）、膀胱内、髄こう内、硬膜外、経腸（経口、直腸、胃内、及び他の経腸ルートを含む）、又は局所的（皮膚、鼻への適用、例えば滴剤による眼又は耳内の適用、及び肺吸入を含む）。薬剤の例には、ペニシリン系、セファロスポリン系、カルバセフェム系、セファマイシン系、カルバペネム系、モノバクタム系、アミノグリコシド系、グリコペプチド系、キノロン系、テトラサイクリン系、マクロライド系、及びフルオロキノロン系がある；防腐剤には、ヨウ素、銀、銅、クロルヘキシジン、ポリヘキサニド及び他のビグアニド類、キトサン、酢酸、及び過酸化水素が含まれる。
【０１５４】
従って、このポリペプチドは、急性炎症、敗血症、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、傷、喘息、アレルギー性及び他のタイプの鼻炎、皮膚及び全身性血管炎、血栓症及び／又は播種性血管内凝固（ＤＩＣ）の処置又は予防に使用されうる。
【０１５５】
本発明の関連する第九の局面は、炎症及び／又は過度の凝固（上記で述べられている通り）を処置又は予防するための薬剤の製造における、本発明の第二の局面によるポリペプチド、又は本発明の第七の局面による医薬組成物の使用を提供する。
【０１５６】
本発明の第十の局面は、患者における炎症及び／又は凝固を処置し、または予防する方法であって、その方法が、治療的に有効な量の本発明の第二の局面によるポリペプチド、又は本発明の第七の局面による医薬組成物（上記で述べられている通り）を、患者に投与することを含んでなる、上記方法を提供する。好ましいが、しかし非限定的実施態様では、この方法は、急性炎症、敗血症、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、喘息、アレルギー性及び他のタイプの鼻炎、皮膚及び全身性血管炎、血栓症及び／又は播種性血管内凝固（ＤＩＣ）を処置又は予防するためである。
【０１５７】
更に、当技術分野の当業者は、この発明の使用及び方法が医学及び獣医学双方の分野に有用性を有することを理解するところである。すなわち、このポリペプチド薬剤は、ヒト及び非ヒト動物（例えば、ウマ、イヌ及びネコ）の双方の処置に使用することができる。
しかしながら、有利には、患者はヒトである。
【０１５８】
本発明の好ましい局面は、次の図に準拠して次の非限定的な実施例に述べられている：
【０１５９】
図１：ＴＦＰＩのＣ末端ペプチドのＮＯブロッキング作用。
ＲＡＷ ２６４．７マクロファージを、１０ｎｇ／ｍｌのエッシェリヒア・コリ ＬＰＳ（E.coli LPS）で刺激し、そして１０μＭのペプチド ＧＧＬ２７、ＬＩＫ１７及びＴＫＲ２２を加えた。ＮＯをグリエス（Griess）試薬を用いて測定した。
【０１６０】
図２：ヘパリンコファクターIIのペプチドのＮＯブロッキング作用。
ＲＡＷマクロファージを、１０ｎｇ／ｍｌのエッシェリヒア・コリ ＬＰＳ（E.coli LPS）で刺激し、そしてペプチドＫＹＥ２８、ＮＬＦ２０、及びＫＹＥ２１を指定用量で加えた。ＬＬ−３７をポジティブコントロールとして提示した。ＮＯを、グリエス試薬を用いて測定した。
【０１６１】
図３：ヘパリンコファクターIIのペプチドの抗炎症作用。
ＫＹＥ２８、ＫＹＥ２１及びＮＬＦ２０は、種々の微生物生産物で刺激されたＲＡＷ２６４．７マクロファージのＮＯ産生をブロックする。細胞は、指定濃度のエッシェリヒア・コリ ＬＰＳ（E.coli LPS）、スタフィロコッカス・アウレウス（S.aureus）に起源するリポタイコ酸（ＬＴＡ）及びペプチドグリカン（ＰＧＮ）、並びにサッカロミセス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に起源するザイモサンＡに処された。ＮＯ産生を、１０μＭ ＧＫＹ２５を加えるか、又は加えずに、グリエス試薬を用いることによって決定した。
【０１６２】
図４：ＨＲＧは、ＬＰＳに結合する。
２及び５μｇのＨＲＧをニトロセルロース膜上に塗布し、引き続いて、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、又は１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．５中のヨード処理したＬＰＳと、ＮａＣｌ添加（０．１５Ｍ）又は無添加で、インキュベーションした。放射能をphosphorimager systemを用いて可視化した。
【０１６３】
図５：ＨＲＧは、マウスマクロファージに起源するＬＰＳ媒介性ＮＯ放出を増加させる。
ＲＡＷマクロファージを、１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳと、ＬＬ−３７及びＨＲＧは添加（２及び１０μＭ）又は無添加で、２４時間インキュベートした。この上清を吸引し、そしてＮＯを、グリエス法を用いて測定した。ＨＲＧは、用量依存の形でＬＰＳ媒介性ＮＯ放出を有意に増加させた（ｎ＝６，ｐ＝０．００１）。
【０１６４】
図６：ＴＬＲ４に対する抗体はＮＯ放出をブロックする。
ＲＡＷマクロファージを、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳと、ＨＲＧ（２μＭ）は添加又は無添加、及び抗マウスＴＬＲ４ポリクローナル抗体（polyclonal anti mouse TRL4）（５μｇ／ｍｌ）は添加又は無添加で、２４時間インキュベートした。この上清を吸引し、そしてＮＯを、グリエス法を用いて測定した。抗マウスＴＬＲ４は、ＬＰＳ及びＨＲＧ媒介性ＮＯ放出を有意にブロックすることができた。（ｎ＝６，ｐ＝０．００１）。
【０１６５】
図７：Ｈｒｇ-/-マウスでのＬＰＳによって誘発された敗血症における生存の増加。
ＬＰＳチャレンジ後のＨｒｇ-/-マウスの生存の増加。野生型（破線）及びＨｒｇ-/-(実線）マウスに、エッシェリヒア・コリ（E. coli）ＬＰＳをi.p.注入し、そして動物生存を７日間にわたって追跡した。ＨＲＧ欠損マウス（ｎ＝８）は、野生型動物と比較して有意に生存を増加させることが示された（ｎ＝９，ｐ＝０．００２）。
【０１６６】
図８：ＬＰＳチャレンジの１８時間後の目視による観察スコア。
野生型（ｗｔ）及びＨｒｇ-/-マウスの状態をＬＰＳチャレンジの１８時間後に目視で観察した（逆立った毛衣（ruffled fur）、猫背及び死直前（hunched and pre-mortal））。野生型マウスは、目視で有意に病的であり、野生型（ｗｔ）及びＨｒｇ-/-マウスの状態をＬＰＳチャレンジの１８時間後に目視で観察した（逆立った毛衣［黒色］、猫背［淡灰色］及び死直前［濃灰色］）。野生型マウスは、Ｈｒｇ-/-マウスと比較して目視で有意に病的であった。（ｐ＝０．００１，ｎ＝１０）。
【０１６７】
図９：ＬＰＳチャレンジ後、野生型動物と比較してＨｒｇ-/-マウスの肺では血管漏出が減少する。
野生型（ｗｔ）及びＨｒｇ-/-マウスの肺を、ＬＰＳをi.p.注入後、走査型電子顕微鏡検査法によって解析した。Ａ）は野生型 Ｂ）はＨｒｇ-/-、Ｃ）は、ＬＰＳ処理の２４時間後の野生型（ｗｔ）、Ｄ）は、ＬＰＳ処理の２４時間後のＨｒｇ-/-である。スケールバーは、５０μｍを表す。代表的な肺切片が示されている。
【０１６８】
図１０：マウスマクロファージにおいて、ＧＨＨ２５は、ＨＲＧ及びＬＰＳによって誘発された応答を抑制する。
ＲＡＷマクロファージを、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳと、ＨＲＧ（２μＭ）及びＧＨＨ２５（１０及び１００μＭ）は添加又は無添加で、２４時間インキュベートした。この上清を吸引し、そしてＮＯを、グリエス法を用いて測定した。ＧＨＨ２５は、用量依存の形でＬＰＳ及びＨＲＧ媒介性ＮＯ放出を有意に減少させた。（ｎ＝６，ｐ＝０．００１）。
【０１６９】
図１１：ヒトマクロファージにおいて、ＧＨＨ２５は、ＨＲＧ及びＬＰＳによって誘発された応答を抑制する。
ヒトマクロファージを、１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳと、ＧＨＨ２５（１０及び１００μＭ）は添加又は無添加で、そしてＨＲＧ（２μＭ）は添加又は無添加で、２４時間インキュベートした。上清を吸引し、そしてＴＮＦ−αを測定した。
【０１７０】
図１２：ＧＨＨ２５での処置後のＬＰＳによって誘発された敗血症における健康状態の改善と生存の増加。
ＧＨＨ２５での処置後の野生型マウスの生存の増加。野生型動物にエッシェリヒア・コリ（E. coli）ＬＰＳをi.p.注入し、そして３０分後に１ｍｇのＧＨＨ２５（破線）、又はバッファーのみ（実線）を注入した。動物の生存を７日間にわたって追跡した。ＧＨＨ２５で処置したマウス（ｎ＝１３）は、未処置の動物と比較して有意に生存を増加させたことが示された（ｎ＝１２，ｐ＝０．０３）。
【０１７１】
図１３：ＬＰＳチャレンジの１８時間後の目視での観察スコア。
野生型（ｗｔ）及びＨｒｇ-/-マウスの状態を、ＬＰＳチャレンジの１８時間後に目視で観察した（逆立った毛衣（ruffled fur）、猫背）。野生型マウスは、目視で有意に病的であり、野生型（ｗｔ）及びＨｒｇ-/-マウスの状態をＬＰＳチャレンジの１８時間後に目視で観察した（逆立った毛衣［黒色］、猫背［淡灰色］及び死直前［濃灰色］）。野生型マウスは、Ｈｒｇ-/-マウスと比較して目視で有意に病的であった。（ｐ＝０．００４，ｎ＝１２）。
【０１７２】
図１４：ＴＦＰＩのＣ末端ペプチドは、凝固をブロックする。
（Ａ）ＴＦＰＩのＣ末端ペプチド；ＧＧＬ２７、ＬＩＫ１７、及びＴＫＲ２２は、正常ヒト血漿における凝固の外因系経路を弱める。これは活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を測定することによって決定した。ＧＧＬ２７及びＬＩＫ１７はまた、凝固の内因系経路をモニタリングするプロトロンビン時間（ＰＴ）に影響を与えた。トロンビン誘発フィブリンネットワーク形成を測定するトロンビン凝固時間（ＴＣＴ）は、ペプチド類によっては有意に影響されなかったが、（Ｂ）ＧＧＬ−２７では、用量依存の形で凝固を弱め、このことは正常ヒト血漿におけるａＰＴＴ、ＰＴ及びＴＣＴを測定することによってモニタリングされた。
【０１７３】
図１５：ヘパリンコファクターIIのペプチドは、凝固をブロックする。
ＫＹＥ２８及びＮＬＦ２０は、正常ヒト血漿における凝固の内因系経路を弱め、このことは活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を測定することによって決定された。ＫＹＥ２１は、ａＰＴＴのわずかなブロックを示したに過ぎなかった。凝固システムの他の部分では、凝固の外因系経路をモニタリングするプロトロンビン時間（ＰＴ）、及びトロンビン誘発フィブリンネットワーク形成を測定するトロンビン凝固時間（ＴＣＴ）によって判断して、顕著には影響が与えられなかった。
【０１７４】
図１６：ＴＦＰＩの構造を図解している略画。
酵素による切断部位が指定されている。
【０１７５】
図１７：ＴＦＰＩに由来するペプチドの抗微生物活性。
指定微生物に対する選択されたペプチド（１００μＭ（ＲＤＡ中））の抗微生物活性。抗微生物活性を決定するために、エッシェリヒア・コリ（E. coli） ATCC 25922、スタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus） ATCC 29213分離株（isolates）（４×１０6cfu）又はカンジダ・パラプシロシス（C. parapsilosis）ATCC 90018（１×１０5cfu）を０．１％ＴＳＢ アガロースゲル中に接種した。それぞれ、４ｍｍ直径のウェルに６μｌのペプチドをローディングした。３７℃で１８〜２４時間インキュベーションした後、クリアランスゾーンがそれぞれのペプチドの抑制効果に相当する（平均値が提示される、ｎ＝３）。
【０１７６】
図１８：ＴＦＰＩに由来するペプチドの抗菌活性。
生菌数アッセイ（viable count assays）において、エッシェリヒア・コリ（E. coli）、シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）、及びストレプトコッカス・アウレウス（S. aureus）に対するＴＦＰＩに由来するペプチド及びＬＬ−３７の作用。２×１０6ｃｆｕ／ｍｌの細菌を、正常又は加熱不活性化した２０％ヒト血漿を含んでいる、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４バッファー（Ｔｒｉｓ）中、あるいは０．１５ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中、ペプチドを指定濃度で含む５０μｌ中でインキュベートした（ｎ＝３、ＳＤは指定されている）。
【０１７７】
図１９：速度論分析。
２０％血漿を含んでいる０．１５ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中のＴＦＰＩに由来するペプチド（６μＭ［左方パネル］及び３０μＭ［右方パネル］）による時間依存的殺菌をエッシェリヒア・コリ（E.coli）を用いる生菌数アッセイによって分析した。
【０１７８】
図２０：細菌膜に対する作用。
（Ａ）シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）及びエッシェリヒア・コリ（E. coli）に対するペプチドの透過性作用。（Ａ）細菌を指定のペプチドと共にインキュベートし、そして、透過性を不透過性プローブＦＩＴＣを用いて評価した。（Ｂ）電子顕微鏡分析。シュードモナス・エルギノーサ及びスタフィロコッカス・アウレウス細菌を、３０μＭのＧＫＹ２５及びＬＬ−３７で、３７℃で２時間インキュベートし、そして電子顕微鏡で解析した。スケールバーは１μｍであった。コントロール；バッファーコントロール。
【０１７９】
図２１：ＴＦＰＩペプチド ＬＩＫ１７の構造。
マイナスに荷電されたリポソーム（ＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ）の存在下でのＴＦＰＩに由来するＣ末端ペプチドのへリックス含量。ＬＩＫ１７構造は、リポソームの添加によってほとんど影響されなかった。
【０１８０】
図２２：トリスバッファー中及びＬＰＳの存在下でのＬＩＫ１７のＣＤスペクトル。
コントロールのために、バッファーとＬＰＳのみのＣＤスペクトルも提示された。
【０１８１】
図２３：リポソーム漏出（liposome leakage）に対する指定ペプチドの作用。
膜透過性作用は、ＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ（マイナスに荷電されている）リポソームに起源するカルボキシフルオレセインの蛍光放出を測定することによって記録した。この実験は、１０ｍＭトリスバッファー、ｐＨ７．４中で行なわれた。値は３連のサンプルの平均に相当する。
【０１８２】
図２４：真核生物細胞に対する活性。
指定ペプチドの溶血作用。細胞をこのペプチドの種々の濃度でインキュベートし、２％トリトンＸ−１００（Sigma-Aldrich）をポジティブコントロールとして機能させた。ヘモグロビン放出の吸光度をλ５４０ｎｍで測定し、そしてトリトンＸ−１００で誘発された溶血の％として表現した（ｙ軸のスケールに留意する）。ＬＬ−３７の作用を比較のために示す。
【０１８３】
図２５：ＨａＣａＴケラチノサイトを指定ＴＦＰＩ−ペプチド並びにＬＬ−３７に処した。細胞の透過性作用をＬＤＨベースＴＯＸ−７キットによって測定した。細胞からのＬＤＨ放出は、λ４９０ｎｍでモニタリングし、そして全ＬＤＨ放出％としてプロットした。
【０１８４】
図２６：ＭＴＴアッセイを、指定ペプチドの存在下（６０μＭ）で、ＨａＣａＴケラチノサイトの生存能力を測定するのに使用した。このアッセイでは、ＭＴＴは、代謝活性に関連する酵素によって、１つの色素、青色のホルマザンに変化する。色素の吸光度をλ５５０ｎｍで測定した。
【０１８５】
図２７：ヘパリンコファクターIIに由来するペプチドの抗微生物活性。
ＲＤＡにおける選択されたペプチド（１００μＭ）の指定の微生物に対する抗微生物活性。エッシェリヒア・コリ（E. coli）ATCC 25922、スタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus） ATCC 29213分離株（４×１０6cfu）又はカンジダ・パラプシロシス（C. parapsilosis）ATCC 90018（１×１０5cfu）を、０．１％ ＴＳＢアガロースゲル中に接種した。それぞれ、４ｍｍ直径のウェルに６μｌのペプチドをローディングした。３７℃で１８〜２４時間インキュベーションした後、クリアランスゾーンがそれぞれのペプチドの抑制効果に相当する（平均値が提示される、ｎ＝３）。
【０１８６】
図２８：（上方）生菌数アッセイにおけるヘパリンコファクターIIに由来するペプチド及びＬＬ−３７のエッシェリヒア・コリ（E. coli）に対する抗菌作用。２×１０6ｃｆｕ／ｍｌの細菌を、ペプチドを指定された濃度で、２０％ヒト血漿を含んでいる、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４バッファー（Ｔｒｉｓ）中、あるいは０．１５ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中、ペプチドを指定濃度で含む５０μｌ中でインキュベートした（ｎ＝３、ＳＤは指定されている）。（下方）２０％血漿を含んでいる０．１５ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中のヘパリンコファクターIIに由来するペプチド（６及び３０μＭで）による時間依存的殺菌をE.coliを用いる生菌数アッセイによって解析した。ＬＬ−３７（３０μＭ）が比較のために使用された。
【０１８７】
図２９：細菌膜に対する作用。
（Ａ）シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）及びエッシェリヒア・コリ（E. coli）に対するペプチドの透過性作用。（Ａ）細菌を指定のペプチドと共にインキュベートし、そして、透過性を、不透過性プローブＦＩＴＣを用いて評価した。（Ｂ）電子顕微鏡分析。シュードモナス・エルギノーサ及びスタフィロコッカス・アウレウス細菌を、３０μＭのＮＬＦ２０及びＬＬ−３７と共に３７℃で２時間インキュベートし、そして電子顕微鏡で解析した。スケールバーは１μｍであった。コントロール；バッファーコントロール。
【０１８８】
図３０：リポソームに対する構造及び作用。
（Ａ）マイナスに荷電されたリポソーム（ＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ）の存在下でのヘパリンコファクターIIに由来するＣ末端ペプチドのへリックス含量。（Ｂ）リポソーム漏出に対するＮＬＦ２０の作用。膜透過性作用は、ＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ（マイナスに荷電されている）リポソームに起源するカルボキシフルオレセインの蛍光放出を測定することによって記録した。（Ｃ）Ｔｒｉｓバッファー中及びＬＰＳの存在下でのＮＬＦ２０のＣＤスペクトル。コントロールのために、バッファーとＬＰＳのみの場合のＣＤスペクトルも提示された。この実験は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ７．４中で行なわれた。値は３連のサンプルの平均に相当する。
【０１８９】
図３１：シュードモナス・エルギノーサ敗血症の動物モデルにおけるＮＬＦ２０の作用。
トロンビンＨＣIIペプチドＮＬＦ２０は、生存を顕著に増加させた。マウスに、i.p.でシュードモナス・エルギノーサ細菌を注入し、引き続いて、１時間後、及びその後次の３日間にわたって２４時間間隔でＮＬＦ２０又はバッファーのみを皮下注入した。このペプチドでの処理は、顕著に生存を増加させた。
【０１９０】
図３２：真核生物細胞に対する活性。
（Ａ）指定ペプチドの溶血作用。細胞を種々の濃度のこのペプチドでインキュベートし、２％ トリトンＸ−１００（Sigma-Aldrich）をポジティブコントロールとして機能させた。ヘモグロビン放出の吸光度をλ５４０ｎｍで測定し、そしてトリトンＸ−１００で誘発された溶血の％として表現した（ｙ軸のスケールに留意する）。ＬＬ−３７の作用を比較のために示す。（Ｂ）ＨａＣａＴケラチノサイトを指定ＨＣII−ペプチド並びにＬＬ−３７に処した。細胞の透過性作用をＬＤＨベースＴＯＸ−７キットによって測定した。細胞からのＬＤＨ放出は、λ４９０ｎｍでモニタリングし、そして全ＬＤＨ放出の％としてプロットした。（Ｃ）ＭＴＴアッセイを、指定ペプチドの存在下（６０μＭで）で、ＨａＣａＴケラチノサイトの生存能力を測定するのに使用した。このアッセイでは、ＭＴＴは、代謝活性に関連する酵素によって、１つの色素、青色のホルマザンに変化する。色素の吸光度をλ５５０ｎｍで測定した。右パネルは、２０％血漿（溶血）又は２０％血清（ＬＤＨ及びＭＴＴ）の存在下での結果を示す。
【０１９１】
図３３：アンチトロンビンIIIに由来するペプチドＦＦＦ２１は凝固をブロックする。
ＦＦＦ２１は、正常ヒト血漿における凝固の内因系経路を弱め、このことは活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を測定することによって決定された。凝固システムの他の部分では、凝固の外因系経路をモニタリングするプロトロンビン時間（ＰＴ）、及びトロンビン誘発フィブリンネットワーク形成を測定するトロンビン凝固時間（ＴＣＴ）によって判断して、顕著には影響が与えられなかった。
【０１９２】
図３４：ＴＦＰＩに由来するペプチドの抗微生物活性。
（Ａ）ＴＦＰＩの構造を図解している略画。酵素切断部位が示されている。（Ｂ）抗微生物活性（指定の微生物に対する選択されたペプチドのＲＤＡを用いる）。抗微生物活性を決定するために、エッシェリヒア・コリ（E. coli）ATCC 25922、シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）ATCC 27853、スタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）ATCC 29213又はバチルス・サブチリス（B. subtilis）ATCC 6633分離株（４×１０6ｃｆｕ）又はカンジダ・アルビカンス（C. albicans）ATCC 90028及びカンジダ・パラプシロシス（C. parapsilosis）ATCC 90018（１×１０5ｃｆｕ）を、０．１％ ＴＳＢアガロースゲル中に接種した。各４ｍｍ直径のウェルに６μｌのペプチド（１００μＭ）をローディングした。３７℃で１８〜２４時間インキュベーションした後、クリアランスゾーンがそれぞれのペプチドの抑制効果に相当する（平均値が提示される、ｎ＝３）。（Ｃ）生菌数アッセイにおけるＴＦＰＩに由来するペプチド及びＬＬ−３７の、エッシェリヒア・コリ（E. coli）ATCC 25922に対する抗菌作用。細菌２×１０6ｃｆｕ／ｍｌを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４バッファー中で、指定濃度のペプチドと共に５０μｌ中でインキュベートし、ｃｆｕを決定した。
【０１９３】
図３５：細菌膜に対する作用。
（Ａ）細菌表面へのＴＥＰＩの結合。指定細菌（１〜２×１０9ｃｆｕ／ｍｌ）をヒト血漿５００μｌ中の３μＭのＴＡＭＲＡ標識ＧＧＬ２７ペプチドと共にインキュベートし、サンプルをＦＡＣＳによって解析した。（Ｂ）エッシェリヒア・コリ（E. coli）に対するペプチドの透過性作用。細菌を指定ペプチドと共にインキュベートし、そして透過性を、不透過性プローブＦＩＴＣを用いて評価した。（Ｃ）電子顕微鏡分析。シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）細菌を、３０μＭのＬＩＫ１７及びＬＬ−３７と共に、３７℃で２時間インキュベートし、そして逆染色法によって可視化した。スケールバーは１μｍであった。コントロール；バッファーコントロール。
【０１９４】
図３６：リポソームに対する構造及び作用。
（Ａ）リポソーム漏出に対する指定ペプチドの作用。膜透過性作用は、ＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ（マイナスに荷電されている）リポソームに起源するカルボキシフルオレセインの蛍光放出を測定することによって記録した。この実験は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー中で行なわれた。値は３連のサンプルの平均に相当する。（Ｂ）リポソームからのＣＦ放出の速度論。１μＭのペプチドが使用された。（Ｃ）マイナスに荷電されているリポソーム（ＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ）の存在下でのＴＦＰＩに由来するＣ末端ＬＩＫ１６及びＧＧＬ２７ペプチドのヘリックス含量。ＬＩＫ１７及びＧＧＬ２７の構造はリポソーム添加によってほとんど影響を受けなかった。（Ｄ）Ｔｒｉｓバッファー中及びＬＰＳの存在下でのＬＩＫ１７及びＧＧＬ２７のＣＤスペクトル。コントロールのために、バッファーとＬＰＳのみの場合のＣＤスペクトルも提示された。
【０１９５】
図３７：真核生物細胞に対する活性。
（Ａ）指定ペプチドの溶血作用。細胞をこのペプチドの種々の濃度でインキュベートし、２％ トリトンＸ−１００（Sigma-Aldrich）をポジティブコントロールとして機能させた。ヘモグロビン放出の吸光度をλ５４０ｎｍで測定し、そしてトリトンＸ−１００で誘発された溶血の％として表現した（ｙ軸のスケールに留意する）。ＬＬ−３７の作用を比較のために示す。（Ｂ）上方パネル：ＨａＣａＴケラチノサイトを指定のＴＦＰＩ−ペプチド並びにＬＬ−３７に曝した。細胞の透過性作用をＬＤＨベースＴＯＸ−７キットによって測定した。細胞からのＬＤＨ放出は、λ４９０ｎｍでモニタリングし、そして全ＬＤＨ放出％としてプロットした。下方パネル：ＭＴＴアッセイを、指定のペプチドの存在下（６０μＭ）で、ＨａＣａＴケラチノサイトの生存を測定するのに使用した。このアッセイでは、ＭＴＴは、代謝活性に関連する酵素によって、１つの色素、青色のホルマザンに変化する。色素の吸光度をλ５５０ｎｍで測定した。
【０１９６】
図３８：ＴＦＰＩに由来するＣ末端ペプチドの活性。
（Ａ）ＴＦＰＩに由来するペプチド及びＬＬ−３７の、エッシェリヒア・コリ（E. coli）又はシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）に対する生菌数アッセイにおける抗菌作用。２×１０6ｃｆｕ／ｍｌの細菌を、２０％ヒトクエン酸血漿（ＣＰ）を含む、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４（バッファー）、又は０．１５ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中、又は加熱不活性化したヒトクエン酸血漿（ＨＣＰ）を加えたほかは同じバッファー中で、指定された濃度のペプチドと共に、５０μｌ中でインキュベートした（ｎ＝３，ＳＤは指定されている）。（Ｂ）指定の細菌の分離株を、バッファー、自然血漿（native plasma）（CP）、又は加熱不活性化した血漿（ＨＣＰ）中、３μＭでＧＧＬ２７及びＬＩＫ１７に２時間曝し、そしてｃｆｕ数を決定した。
【０１９７】
図３９：ＴＦＰＩのＣ末端ペプチドＧＧＬ２７は、Ｃ１ｑ、Ｃ３ａ及びＭＡＣのエッシェリヒア・コリ（E. coli）への結合を強化する。
（Ａ）エッシェリヒア・コリ（E. coli）ATCC 25922及びシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）15159細菌を洗浄し、再懸濁し、そしてクエン酸血漿単独で加えるか、あるいはこれにＧＧＬ２７（３μＭ）を補充して、３７℃で３０分間、又は１時間インキュベートした。この細菌細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、そして結合タンパク質及び相当する上清を、還元性条件下でTris-Tricine ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、引き続いてＣ１ｑ又はＣ５ｂ−９を識別する抗体を用いて免疫ブロット法に処した。ＣＰ；クエン酸血漿、Ｓ；上清又は非結合細菌、Ｐ；細菌細胞に結合するペレット又は成分。（Ｂ）（Ａ）と同様であるが、Ｃ３ａに対する抗体を用いた（２５）。（Ｃ）（左方パネル）クエン酸血漿中（コントロール；黒色のカラム）及びＧＧＬ２７を補充した血漿中（灰色のカラム）、Ｃ１ｑ／Ｃ３ａ結合にポジティブな細菌の平均比率の比較。（右方カラム）Ｃ１ｑ及びＣ３ａの、エッシェリヒア・コリ（E. coli）及びシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）株に結合する度合いの比較であり、平均蛍光指数として表現されている（ＦＩ；Ｃ１ｑ／Ｃ３ａ結合の平均強度を乗じたＣ１ｑ／Ｃ３ａがポジティブな細菌の比率）。（＊；ｐ＜０．０５；＊＊；ｐ＜０．０１，＊＊＊；ｐ＜０．００１，ｔ−検定）。（Ｄ）クエン酸血漿中及びＧＧＬ２７を補充した血漿中のエッシェリヒア・コリ（E. coli）及びシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）へのＣ１ｑ／Ｃ３ａ結合のフローサイトメトリーヒストグラムの例。
【０１９８】
図４０：ヒト皮膚及び傷におけるＴＦＰＩの同定。
（Ａ）正常皮膚、急性創傷（ＡＷ）、及び慢性静脈下肢潰瘍（chronic venous leg ulcer）組織（慢性創傷；ＣＷ）におけるＴＦＰＩの免疫組織化学的同定。皮膚生検が、正常皮膚（正常皮膚；ｎ＝３）、急性創傷（ＡＷ−１及びＡＷ−２；それぞれ、創傷の５及び８日後）から、そして慢性静脈潰瘍に罹患している患者の創縁（ＣＷ；ｎ＝３）から取られた。典型的な切片が示されている。正常皮膚では、ＴＦＰＩが表皮の基底層に主として発見されている。ＡＷ及びＣＷでは、ＴＦＰＩは、表皮層のすべてから遍在的に見出だされる。スケールバーは１００μｍである。（Ｂ）ＴＦＰＩに由来するペプチドがヒト創傷に見出される。ＴＦＰＩのＣ末端ペプチド（C-terminal TFPI peptides）のシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）感染慢性創傷表面に起源するフィブリン瘡蓋に見出される細菌への結合の可視化。このペプチドはフィブリン（Ａ）、細菌（Ｂ，Ｃ）、及びマクロファージ内の細菌（Ｄ）に結合する。（Ｅ）及び（Ｆ）では、ＴＦＰＩ及びＣ３ａペプチドは、それぞれ、ＴＦＰＩ（２０ｎｍ）のＣ３ａ（１０ｎｍ）及びＣ末端部分（C-termini）に特異的な、異なるサイズの金標識抗体を用いる免疫金によって可視化した。５０の細菌プロフィールの評価によれば、ＴＦＰＩ分子の約７０％がＣ３ａに関連していることが示された。例示のための差込を参照されたい。
【０１９９】
図４１：ＧＧＬ２７のインビトロ及びインビボの作用。
（Ａ）２×１０6ｃｆｕ／ｍｌのエッシェリヒア・コリ（E. coli）を、２０％ヒトクエン酸血漿（ＣＰ）を含む、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４バッファー（バッファー）中、又は０．１５ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中、又はマウスクエン酸血漿を含むことのほかは同じバッファー（Ｂａｌｂ／ｃ若しくはＣ５７Ｂ／６）中、指定された濃度でＧＧＬ２７ペプチドと共に、５０μｌ中でインキュベートした（ｎ＝３，ＳＤは指定されている）。（Ｂ）このＧＧＬ２７ペプチドは、エッシェリヒア・コリ（E. coli）及びシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）感染マウスで生存を延長した。マウスにエッシェリヒア・コリ（E. coli）又はシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）細菌をｉ．ｐ．注入した。エッシェリヒア・コリ（E. coli）感染モデルでは、ＧＧＬ２７（２００μｇ）又はバッファーのみを、３０分後i.p.注入した（ｎ＝１０（各グループ）、Ｐ＜０．００１、カプラン・マイヤー生存時間分析ログ・ランク検定法（Kaplan-Meier Survival Analysis Log-Rank test））。シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）感染モデルでは、ＧＧＬ２７（５００μｇ）又はバッファーのみを、１時間後にs.c.注入した（ｎ＝８（各グループ）、Ｐ＜０．００１、カプラン・マイヤー生存時間分析ログ・ランク検定法（Kaplan-Meier Survival Analysis Log-Rank test））。（Ｃ）ＧＧＬ２７は、ＮＯ産生を抑制する。ＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージを、ＧＧＬ２７又は２つのコントロールペプチドＧＧＬ２７（Ｓ）及びＤＳＥ２５の存在下、指定濃度で、エッシェリヒア・コリ（E. coli）（左方パネル）又はシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）（右パネル）に起源するＬＰＳで刺激した。ＧＧＬ２７とこのコントロールペプチドの差は、統計的に有意であった（Ｐ＜０．０１）。（Ｄ）ＧＧＬ２７は、ＬＰＳによって誘発されたショックにおける生存を顕著に延長させた。マウスにエッシェリヒア・コリ（E. coli）ＬＰＳを注入し、引き続いてＧＧＬ２７（５００μｇ）を腹腔内投与した。バッファー及びペプチドＧＧＬ２７（Ｓ）及びＤＳＥ２５（５００μｇ）はコントロールとして機能した。生存を７日間にわたって追及した（ＧＧＬ２７；ｎ＝１６、バッファー；ｎ＝１５，ＧＧＬ２７（Ｓ）；ｎ＝８，ＤＳＥ２５；ｎ＝８）。ＧＧＬ２７とバッファー、又はコントロールペプチドとの間の差は、有意であった。Ｐ＜０．０１、カプラン・マイヤー生存時間分析ログ・ランク検定法（Kaplan-Meier Survival Analysis Log-Rank test）。＊は、ＧＧＬ２７（Ｓ）、ＤＳＥ２５、及びバッファーの線がオーバーレイしていることを示している。（Ｅ）ＧＧＬ２７は、炎症誘発性サイトカインを弱める。別の実験では、マウスをＬＰＳのi.p.注入の２０時間後に犠死させ、引き続いてＧＧＬ２７（５００μｇ）、バッファー又はコントロールペプチド ＧＧＬ２７（Ｓ）又はＤＳＥ２５を用いて上記と同様な処置をし、そして表示のサイトカインを血液中で分析した（コントロール；ｎ＝８；ＧＧＬ２７、ｎ＝１２；ＧＧＬ２７（Ｓ）、ｎ＝７；ＤＳＥ２５；ｎ＝８）。すべてのケースにおいて、ＧＧＬ２７処置動物とバッファーの間の差は、顕著であった。それぞれのサイトカインのＰ値は、ＩＬ−６；０．００２３、ＴＮＦ−α；０．００１８��ＩＦＮ−γ；０．０００２、ＭＣＰ−１；０．０００２、ＩＬ−１０；０．００２３であった。ＩＦＮ−γに関しては、コントロールとＧＧＬ２７（Ｓ）の間には有意な差があった。（Ｆ）ＬＰＳのi.p.注入、引き続いてＧＧＬ２７（５００μｇ）又はバッファーでの処置の２０時間後に、肺を解析した。組織化学的解析によれば、ＧＧＬ２７処置の肺では炎症変化が著しく弱められていることが示された（１つの代表的な肺切片が示されている）。
【０２００】
図４２：ＴＦＰＩの進化（evolution）。
系統樹及び配列類似性では、ホモ・サピエンス（Homo sapiens）、スマトラオランウータン（Pongo abelii）及びスース・スクローファ（Sus scrofa）におけるＴＦＰＩが密接に関連していることが示されている。
【０２０１】
図４３：ペプチドＧＧＬ２７、及び中央のＫ／Ｒ残基がＳによって置き換えられているコントロールペプチドＧＧＬ２７（Ｓ）、及びＴＦＰＩのＮ末端に起源するペプチドＤＳＥ２５が、指示されている細菌及び真菌に対する抗微生物活性を有しているかどうかを分析した。これらのペプチドの阻害ゾーンが示されている。抗微生物活性を決定する場合には、細菌（４×１０6ｃｆｕ）又は真菌（１×１０5ｃｆｕ）が、０．１％ＴＳＢアガロースゲル中に接種された。各４ｍｍ直径ウェルに６μｌのペプチド（１００μＭ）をローディングした。クリアランスゾーンは、３７℃で１８〜２４時間インキュベーションした後の各ペプチドの阻止作用に相当する（平均値が呈示されている，ｎ＝３）。＊は、値がゼロであることを示している。
【０２０２】
図４４：細菌をＧＧＬ２７と共にインキュベートし、そして透過性を、不透過性プローブＦＩＴＣを用いて評価した。
【０２０３】
図４５：指定されているＴＦＰＩに由来するペプチド（３０μＭ）による殺菌の時間依存性を、２０％血漿を含む０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中、エッシェリヒア・コリ（E. coli）又はシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）を用いる生菌数アッセイによって解析した。
【０２０４】
図４６：ＨＲＧはＬＰＳに結合する。
２及び５μｇのＨＲＧを、ニトロセルロース膜に塗布し、引き続いて指定されているＬＰＳと共に、０．１５Ｍ ＮａＣｌ添加若しくは非添加の、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４又は１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．５中でインキュベートした。放射能をホスホリメージャーシステム（phosphorimager system）を用いて視覚化した。
【０２０５】
図４７：ＨＲＧは、マウスマクロファージからのＬＰＳ媒介性ＮＯ放出を増加させる。
ＲＡＷマクロファージを、ＬＬ−３７及びＨＲＧ（２及び１０μＭ）を含むか若しくは含まない１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳと共に、２４時間インキュベートした。上清を吸引し、そしてＮＯを、グリエス法を用いて測定した。ＨＲＧは、用量依存の形でＬＰＳ媒介性ＮＯ放出を有意に増加させた（ｎ＝６，ｐ＝０．００１）。
【０２０６】
図４８：ＴＬＲ４に対する抗体は、ＮＯ放出をブロックする。
ＲＡＷマクロファージを、ＨＲＧ（２μＭ）及びポリクローナル抗マウスＴＲＬ４（５μｇ／ｍｌ）を含むか若しくは含まない１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳと共に、２４時間インキュベートした。上清を吸引し、そしてＮＯを、グリエス法を用いて測定した。抗マウスＴＬＲ４は、ＬＰＳ及びＨＲＧ媒介性ＮＯ放出を有意にブロックしえた。（ｎ＝６，ｐ＝０．００１）。
【０２０７】
図４９：Ｈｒｇ-/-マウスでのＬＰＳによって誘発された敗血症における生存の増加。
ＬＰＳチャレンジ後のＨｒｇ-/-マウスの生存の増加。野生型（破線）及びＨｒｇ-/-（実線）マウスに、エッシェリヒア・コリ（E. coli）ＬＰＳをi.p.注入し、そして動物の生存を７日間にわたって追跡した。ＨＲＧ欠損マウス（ｎ＝８）は、野生型動物と比較して有意に生存の増加を示した（ｎ＝９，ｐ＝０．００２）。
【０２０８】
図５０：ＬＰＳチャレンジの１８時間後の目視による観察スコア。
野生型（ｗｔ）及びＨｒｇ-/-マウスの状態をＬＰＳチャレンジの１８時間後に目視で観察した（逆立った毛衣（ruffled fur）、猫背（hunched）。野生型マウスは、目視で有意に病的であり、野生型（ｗｔ）及びＨｒｇ-/-マウスの状態をＬＰＳチャレンジの１８時間後に目視で観察した（逆立った毛衣［黒色］、猫背［淡灰色］及び死直前［濃灰色］）。野生型マウスは、Ｈｒｇ-/-マウスと比較して目視で有意に病的であった（ｐ＝０．００１，ｎ＝１０）。
【０２０９】
図５１：ＬＰＳチャレンジ後、野生型動物と比較してＨｒｇ-/-マウスの肺では血管漏出が減少する。
野生型（ｗｔ）及びＨｒｇ-/-マウスの肺を、ＬＰＳをi.p.注入後、走査型電子顕微鏡検査法によって解析した。Ａ）は野生型 Ｂ）はＨｒｇ-/-、Ｃ）は、ＬＰＳ処理の２４時間後の野生型（ｗｔ）、Ｄ）は、ＬＰＳ処理の２４時間後のＨｒｇ-/-である。スケールバーは、５０μｍを表す。代表的な肺切片が示されている。
【０２１０】
図５２：ＧＨＨ２５は、マウスマクロファージにおいてＨＲＧ及びＬＰＳによって誘発された応答を抑制する。
ＲＡＷマクロファージを、ＨＲＧ（２μＭ）及びＧＨＨ２５（１０及び１００μＭ）を含むか、又は含まない１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳと共に、２４時間インキュベートした。上清を吸引し、そしてＮＯを、グリエス法を用いて測定した。ＧＨＨ２５は、ＬＰＳ及びＨＲＧ媒介性ＮＯ放出を、用量依存の形で有意に減少させた（ｎ＝６，ｐ＝０．００１）。
【０２１１】
図５３：ＧＨＨ２５は、ヒトマクロファージにおけるＨＲＧ及びＬＰＳによって誘発された応答を抑制する。
ヒトマクロファージを、ＨＲＧ（２μＭ）及びＧＨＨ２５（１０及び１００μＭ）を含むか、又は含まない１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳと共に、２４時間インキュベートした。上清を吸引し、そしてＴＮＦ−αを測定した。
【０２１２】
図５４：ＧＨＨ２５での処置後のＬＰＳによって誘発された敗血症における健康状態の改善と生存の増加。
ＧＨＨ２５での処置後の野生型マウスの生存の増加。野生型動物にエッシェリヒア・コリ（E. coli）ＬＰＳをi.p.注入し、そして３０分後に１ｍｇのＧＨＨ２５（破線）、又はバッファーのみ（実線）を注入した。動物の生存を７日間にわたって追跡した。ＧＨＨ２５で処置したマウス（ｎ＝１３）は、未処置の動物（ｎ＝１２，ｐ＝０．０３）と比較して有意に生存を増加させたことが示された。
【０２１３】
図５５：ＬＰＳチャレンジの１８時間後の目視での観察スコア。
野生型（ｗｔ）及びＨｒｇ-/-マウスの状態を、ＬＰＳチャレンジの１８時間後に目視で観察した（逆立った毛衣（ruffled fur）、猫背）。野生型マウスは、目視で有意に病的であり、野生型（ｗｔ）及びＨｒｇ-/-マウスの状態をＬＰＳチャレンジの１８時間後に目視で観察した（逆立った毛衣［黒色］、猫背［淡灰色］及び死直前［濃灰色］）。野生型マウスは、Ｈｒｇ-/-マウスと比較して目視で有意に病的であった（ｐ＝０．００４，ｎ＝１２）。
【０２１４】
図５６：アンチトロンビンIIIに由来するペプチドＦＦＦ２１は、凝固をブロックする。
ＦＦＦ２１は、正常ヒト血漿における凝固の内因系経路を弱める。これは活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を測定することによって決定した。凝固の外因系経路をモニタリングするプロトロンビン時間（ＰＴ）、及びトロンビン誘発フィブリンネットワーク形成を測定するトロンビン凝固時間（ＴＣＴ）から判断し、凝固系の他の部分は顕著には影響されなかった。
【発明を実施するための形態】
【０２１５】
実施例
実施例Ａ
序論
ヘパリンコファクターII
セルピンは、プロテアーゼを阻害することができる一連のタンパク質として最初に特定された類似の構造を有する一群のタンパク質である。頭字語であるセルピン（serpin）は、多くのセルピンがキモトリプシン様セリンプロテアーゼを阻害する（セリンプロテアーゼインヒビター：serine protease inhibitors）という理由で当初作られた。広範囲に研究されたセルピンスーパーファミリーの当初のメンバーは、ヒト血漿タンパク質であるアンチトロンビン及びアンチトリプシンであり、これらはそれぞれ、血液凝固及び炎症を制御する際に重要な役割を演じている。
【０２１６】
セルピンに関する構造研究によって、このファミリーの阻害メンバーは、ストレスから緩和へ（S to R）の転移と呼ばれている他とは異なるコンフォメーション変化を受けることが明らかとなった。セルピンのこのコンフォメーション可動性は、静止した鍵と鍵穴であるプロテアーゼインヒビターより勝る重要な利点を提供している。特に、阻害性セルピンの機能はヘパリンのような特異的なコファクターによって容易に制御することができる。こうした状況の典型的な例は、アンチトロンビンであり、該アンチトロンビンは、比較的不活性な状態で血漿中を循環する。長鎖ヘパリン内で高親和性ヘパリンペンタサッカライド配列に結合すると、アンチトロンビンは、コンフォメーション変化を受け、このメカニズムに重要なキーとなる残基が露出される。従って、アンチトロンビンのこのヘパリンペンタサッカライド結合形態は、トロンビン及び第Ｘａ因子のより有効なインヒビターである。更に、こうした双方の凝固プロテアーゼは、ヘパリンの結合部位（エキソサイト（exosites）と呼ばれている）を含んでいる。それ故、ヘパリンはまた、プロテアーゼとセルピンの双方の結合のためのテンプレートとして機能し、更に２つの相手間の相互作用を劇的に促進する。最初の相互作用の後、最終的にはセルピン複合体が形成され、そしてこのヘパリン部分が放出される。
【０２１７】
こうしたタンパク質中のヘパリン結合部位に相当するペプチドは、抗菌、抗炎症及び抗凝固特性を有している。
【０２１８】
組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）
組織因子経路インヒビター（すなわち、ＴＦＰＩ）は、クニッツ型プロテイナーゼインヒビター（Kunitz-type proteinase inhibitor）であり、該インヒビターは、第Ｘ因子（ＦＸ）依存性の形で組織因子−第ＶＩＩ因子（ＴＦ−ＶＩＩ）複合体を可逆的に阻害し、ＦＸとＦＩＸの双方の活性化の阻害をもたらす。ＴＦＰＩは、高度にマイナスに荷電されたアミノ末端、３つの縦列に連鎖するクニッツ型ドメイン、及び高度にプラスに荷電されたカルボキシ末端から成っている。血漿では、ＴＦＰＩは、全長及び可変Ｃ末端トランケート形態の双方に存在する［２８］。最初及び２番目のクニッツドメインは、それぞれ、ＴＦ−ＶＩＩ複合体及び第Ｘａ因子に結合し、そしてこれらを阻害することに関与している［２９］。３番目のクニッツドメインは、Ｃ末端のアミノ酸配列を含むそのカチオン性残基を介して、ヘパリンと相互作用しうる［３０］。このＣ末端領域はまた、血漿リポタンパク質、トロンボスポンジン−１、クリアランス受容体（［３１］）、リポポリサッカライド［３２］との相互作用に関与しており、そして細胞増殖［３３］並びに血液凝固［３４］、［３５］を阻害しうる。種々のＣ末端トランケート形態がインビボで存在するので、Ｃ末端のタンパク質分解の潜在的な役割が関与しており、そしてデータによれば、ＴＦＰＩは、トロンビン［３６］、プラスミン［３７］、及びマトリックスメタロプロテイナーゼ−８［３８］などの種々のプロテイナーゼによって切断されえ、その結果Ｃ末端断片をリリースしうるということが示されている。ＴＦＰＩ発現のアップレギュレーターには、エンドトキシン、ＩＬ−１、ＴＮＦ−α、血小板由来成長因子、ヘパリン、及び塩基性線維芽細胞増殖因子が含まれ、すべての生理学的メカニズムは、感染、炎症、及び増殖に関与している［３１］。
【０２１９】
この上記に報告したＴＦＰＩの多機能性、及び露出したカチオン性、かつヘパリン結合性のＣ末端の存在によって、ＴＦＰＩのＣ末端領域が直接的な抗微生物活性を発揮しうるか否かという問題が我々に提起される。我々は、Ｃ末端ＴＦＰＩペプチドが実際にグラム陰性及びグラム陽性菌及び真菌のいずれも直接殺すことができることをここに示す。更に、このペプチドはまた、抗凝固及び抗炎症作用を発揮することができるという証拠が提示されている。
【０２２０】
ヒスチジンリッチグリコプロテイン及びＧＨＨ２５
抗微生物血漿タンパク質であるヒスチジンリッチグリコプロテイン（ＨＲＧ）は、インビボにおける全身微生物感染に対して宿主を保護している。本明細書では、我々は、ＨＲＧは、宿主細胞中でＬＰＳに結合し、そしてＬＰＳ媒介性ＴＬＲ−４応答を増加させることから、パターン認識分子であることを示している。
【０２２１】
ＬＰＳは、マクロファージ、単球及び好中球上の受容体であるＣＤ１４と相互作用し、この相互作用は血漿タンパク質ＬＢＰ（ＬＰＳ結合タンパク質）によって増強される。このＬＰＳ／ＣＤ１４複合体は、トル様受容体（toll-like receptor）（ＴＬＲ）４の活性化をもたらし、該トル様受容体（ＴＬＲ）４は、次にＭｙＤ８８依存性又は非依存性経路を活性化する［３９］。このＬＰＳ応答はまた、ＬＢＰ非依存性でありうる［４０］。ＬＰＳ注入後、野生型及びＬＢＰ欠損マウスの間には、インビボにおけるＴＮＦ−α放出の差はなく、ＬＢＰ様能力を有するタンパク質が原因でありうることが示唆されている［４１］。次いでＴＬＲ４の活性化によって、単核食細胞の食細胞活性の増加、炎症応答を開始し、そしてサポートする放出されたサイトカイン及び一酸化窒素（ＮＯ）のカスケードがもたらされる。ＮＯは一酸化窒素シンターゼと呼ばれる一群の酵素によって産生され［４２］、微生物、寄生虫及び腫瘍に対して宿主を保護することなどの多くの生物学的プロセスに関与し、そして血圧を調節しているが、ＮＯの高レベルは、むしろ細胞傷害性でありえ、そして内在組織を破壊しうる。
【０２２２】
ＬＰＳによって誘発される応答は、宿主防御にとって不可欠であるが、高度の応答はむしろ敗血症をもたらしうる。サイトカイン及びＮＯは、熱、凝固活性、敗血症ショック、多臓器不全などの症状を有する敗血症ショックの発症、そして最悪の場合には宿主の死の主要な引き金となることが確認されている［４３］。このことは、ＬＰＳによって誘発される死に抵抗性のある誘導型ＮＯＳ（ｉＮＯＳ）変異マウスの存在という事実によって支持されている［４４］。種々の動物種のＬＰＳ毒性に対する感受性には高い変動性があり、例えば、かなり抵抗性があるマウス［４７］と比較してヒトは極めて感受性を有している［４５，４６］。敗血症は炎症誘発性メディエーターだけで制御されるという共通している誤解がある。敗血症の初期段階は、ＴＮＦ−α、ＮＯ、ブラディキニン、トロンビン及びヒスタミンなどの炎症誘発性メディエーターが支配しているが、一方、後期段階の間では、ＩＬ−６、活性プロテインＣ、アンチトロンビン及び顆粒球コロニー刺激因子などの抗炎症メディエーターが、最も広範囲に存在している［４８］。
【０２２３】
現在、敗血症の処置には、点滴での静脈内投与、広域スペクトル抗生物質、肺保護換気法、グルココルチコイド、インスリン療法及び組み換えヒト活性化プロテインＣ（recombinant human activator protein C）（ＡＰＣ）が含まれる。ＬＰＳを中和し、あるいはＬＰＳによって媒介される宿主の免疫細胞の活性化を阻止するために、例えば、サイトカイン活性を、抗体を用いてブロックすること、ＮＯ産生をブロックすること［４９］、及びＬＰＳの中和剤として抗微生物ペプチドを用いること［５０］によるなど多くの試みがなされている。
【０２２４】
この研究の目的は、ＬＰＳによって媒介される応答に対する、豊富な血漿タンパク質、ＨＲＧの作用を検討することであった。ＨＲＧは、肝臓で合成される６７ｋＤａの血漿タンパク質であり、１９７２年にはじめて記述された［５１，５２］。ＨＲＧはまた、血小板のα顆粒に起源するトロンビンが活性化すると放出されえ、そしてフィブリンクロットの表面を覆うことができる。フェチュイン及びキニノゲンと一緒に、ＨＲＧは、シスタチンスーパーファミリーに属する。このタンパク質の最も際立った特徴は、このタンパク質のヒスチジンリッチドメインが、保存性のあるＧＨＨＰＨ繰り返しを含んでいることである［５３］。ＨＲＧは、ヘパリン、プラスミノゲン、フィブリノゲン、トロンボスポンジン、ヘム、ＩｇＧ、ＦｃｇＲ及びＣ１ｑのような多様な群のリガンドとインビトロで相互作用することが示されている。インビボ研究では、ＨＲＧは抗凝固及び抗線溶調節物質（antifibrinolytic modifier）であり［５４］、腫瘍血管新生に対する抑制作用を有し［５５］、そして抗微生物タンパク質として自然免疫において重要な役割を果たしている［５６］ことが実証されている。
【０２２５】
本明細書では、我々は、ＬＰＳによって誘発されたＮＯ及びサイトカインをインビトロで高めることからＨＲＧが強力な炎症誘発性タンパク質であることを実証する。インビボ実験により、Ｈｒｇ-/-マウスがＬＰＳによって誘発された敗血症に対して著しく抵抗性があることが示された。我々のデータによれば、ＨＲＧは実験的内毒素血症においてＬＰＳ毒性をもたらす一因であることがはっきり実証された。しかしながら、このデータはまた、“ＧＨＨ２５”などのＨＲＧのペプチド断片の抗炎症作用を証明した。
【０２２６】
材料及び方法
ヒスチジンリッチグリコプロテイン。
合成ペプチドＧＨＨ２５（ＧＨＨＰＨＧＨＨＰＨＧＨＨＰＨＧＨＨＰＨＧＨＨＰＨ［配列番号１１］）は、Biopeptide（San Diego, CA, USA）に起源した。ウサギ抗マウスＴＲＬ４ポリクローナル抗体（Polyclonal rabbit anti mouse TRL4）を、GeneTex（Irvine, CA, USA）から購入した。サイトメトリックビーズアレイ、マウス炎症キットは、BD Biosciences（Stockholm, Sweden）に起源した。エッシェリヒア・コリ ＬＰＳ（０１１１：Ｂ４）は、Sigma(St Lois, MO）から購入した。
【０２２７】
ヒトＨＲＧの精製。血清ＨＲＧを以前に記載されている通りに精製した［５７］。簡単に述べれば、ヒト血清をニッケルニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）アガロースと共に、４℃で終夜ゆるやかに振とうし、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）で洗浄した。まず８０ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳで、非特異的に結合したタンパク質を溶離し、次いで５００ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳで精製されたＨＲＧを溶離して、溶離を行なった。このタンパク質を透析し、凍結乾燥し、そしてブラッドフォード法を用いて、濃度を決定した［５８］。
【０２２８】
ヘパリン及びＬＰＳの放射ヨウ素標識。ヘパリン（ブタの腸粘膜由来，Sigma-Aldrich）の放射ヨウ素標識が以前に述べられている通りに行なわれた［５９］。ＬＰＳのヨウ素化は、Ulevitchによって述べられている通りに行なわれた［６０］。１ｍｇのエッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）０１１１：Ｂ４ ＬＰＳをホウ酸塩バッファーにおいて、５０ｍＭ ｐ−ＯＨ ベンズイミデート（benzimidate）を加え（ｐＨ８）、４℃で終夜にわたってインキュベートし、次いでＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して透析した。次いでクロラミンＴ法を用いてＬＰＳを125Ｉで放射標識し、次に非標識125Ｉを透析によって除去した。
【０２２９】
ヘパリン及びＬＰＳ結合アッセイ。１００μｌ ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の１、２及び５μｇの合成ペプチドを、スロットブロット装置を用いて、ニトロセルロース膜（Hybond-C,Amersham Biosciences）上に塗布した。膜を、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の２％ウシ血清アルブミンを用いて、室温で１時間ブロッキングし、次いで放射標識したＬＰＳ（約４０μｇ・ｍＬ-1，０．１３×１０6ｃｐｍ・μｇ-1）又は放射標識したヘパリン（約１０μｇ・ｍＬ-1，０．４×１０6ｃｐｍ・μｇ-1）を加え、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中、室温で１時間インキュベートした。非標識ヘパリン（６ｍｇ／ｍｌ）を結合競合のために加えた。この膜をＰＢＳ、ｐＨ７．４中で３回洗浄した。Bas 2000放射イメージングシステム（radio-imaging system）（富士フィルム，東京，日本）が放射能を可視化するのに用いられた。
【０２３０】
細胞培養。マウスマクロファージセルライン，ＲＡＷ ２６４．７（Dr.H Bjoerkbackaから厚意により提供された）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（Dulbeccos Modified Eagle Medium）（DMEM）（Gibco）中で増殖させた。実験はすべて、血清のない条件下で行なわれた。
【０２３１】
ＲＡＷ マクロファージにおける一酸化窒素の誘導。コンフルエント細胞を回収し、そして９６ウェルプレートに移した（３．５×１０5／ウェル）。接着細胞をフェノールレッド不含ＤＭＥＭ（Gibco）で洗浄した後、エッシェリヒア・コリＬＰＳ（E. Coli LPS）（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＬＬ−３７（２若しくは１０μＭ）又はＨＲＧ（２若しくは１０μＭ）を、３７℃で３０分間プレインキュベートし、次いでこの細胞に移した。ＮＯ誘導の抑止のため、５μｇ／ｍｌの抗マウスＴＬＲ４抗体、１０若しくは１００μＭのＧＨＨ２５又は１００μｇ／ｍｌのヘパリンを使用した。この細胞を２４時間刺激し、そして一酸化窒素をグリエス（Griess）化学方法を用いて決定した［６１］。
【０２３２】
ヒトマクロファージに起源するＴＮＦ−α放出。ヒト単球由来のマクロファージ（ｈＭＤＭｓ）を、Lymphoprep（Axis-Shield PoC AS）密度勾配を用いて健常ドナーの血液から得られた末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣｓ）から得た。ＰＢＭＣｓを３×１０6細胞／ウェルの濃度で２４ウェルプレートに播種し、そして５％ＣＯ2の加湿雰囲気中で、１０％加熱不活性化した自家移植ヒト血漿（heat-inactivated autologous human plasma）、２ｍＭ
Ｌ−グルタミン、及び５０μｌ／ｍｌ 抗生物質−抗真菌薬を補充したＲＰＭＩ １６４０培地（Gibco）中で培養した。２４時間後、非接着細胞を除去し、そして隔日にフレッシュな培地と交換して、接着単球を１０日間にわたって分化させるとマクロファージになった。この細胞を無血清条件下でＨＲＧ（２μＭ）及びＧＨＨ２５（１００μＭ）を加えるか、又は加えずに、２４時間、１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激した。刺激の後、上清を吸引し、そしてＴＮＦ−αを、ＴＮＦ−α ヒトＥＬＩＳＡキット（Invitrogen）を用いて測定した。
【０２３３】
動物実験。初代ノックアウトマウス１２９／Ｂ６−ＨＲＧtm1wja1を、１４世代にわたってＣ５７ＢＬ／６マウス（Taconic）と交配して、均一な遺伝子バックグラウンドを得た。こうしたＨＲＧ−欠乏マウス株は、ＩＬＡＲ（研究用動物資源協会（Institute of Laboratory Animal Resources））規則に従ってＢ６−ＨＲＧtm1wja1と呼ばれた。野生型Ｃ５７ＢＬ／６コントロールマウス及びＣ５７ＢＬ／６Ｈｒｇ-/-マウス（８〜１２週齢、２７＋／−４ｇ）を、ルンド大学（Lund University）の動物施設で繁殖させた。Ｃ５７ＢＬ／６Ｈｒｇ-/-では、Ｈｒｇ遺伝子のエクソン１の翻訳開始点が欠如している［５４］。動物を光と温度の標準条件下で収納し、そして標準的な研究用のエサと水に自由にアクセスさせた。敗血症を誘発させるために、１８□ｇ／ｇのエッシェリヒア・コリ ０１１１：Ｂ４ ＬＰＳを、体重及び性別対応群に分割して、Ｃ５７ＢＬ／６又はＣ５７ＢＬ／６Ｈｒｇ-/-マウスに腹腔内注入した。生存及び状況を７日間にわたって追跡した。
【０２３４】
ＧＨＨ２５ペプチドで処理する場合、１ｍｇのペプチド（１０ｍＭ Ｔｒｉｓに希釈した，ｐＨ７．４）又はバッファーのみをＬＰＳチャレンジの３０分後に腹腔内注入し、次いで生存及び状況を追跡した。
【０２３５】
ＴＦＰＩ及びヘパリンコファクターII
ペプチド。
ＬＬ−３７（ＬＬＧＤＦＦＲＫＳＫＥＫＩＧＫＥＦＫＲＩＶＱＲＩＫＤＦＬＲＮＬＶＰＲＴＥＳ［配列番号１０１］）のほかは、ＴＦＰＩ及びＨＣIIに由来するペプチドが、Biopeptide Co., San Diego, USAによって合成され、ＬＬ−３７は、Innovagen AB, Lund, Swedenから得られた。こうしたペプチドの純度（＞９５％）は、マススペクトル分析（MALDI-ToF Voyager）によって確認された。
【０２３６】
微生物。細菌分離株、エッシェリヒア・コリATCC 25922、シュードモナス・エルギノーサ
ATCC 27853、スタフィロコッカス・アウレウス ATCC 29213、バチルス・サブチリス ATCC 6633 、カンジダ・アルビカンス ATCC 90028及びカンジダ・パラプシロシス ATCC 90018は、ルンド大学病院・細菌学部（Department of Bacteriology, Lund University Hospital）から得られた。
【０２３７】
生菌数解析。エッシェリヒア・コリ（E. coli）ATCC 25922細菌を、トッド・ヒューウイット（ＴＨ）培地（Todd-Hewitt (TH) medium）中で対数増殖期中期（mid-logarithmic phase）まで増殖させた。細菌を洗浄し、そして５ｍＭ グルコースを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中に希釈した。エッシェリヒア・コリ（E. coli）ATCC 25922（５０μｌ；２×１０6ｃｆｕ／ｍｌ）を、指定の濃度でペプチドと共に３７℃で２時間インキュベートした。ＴＦＰＩ−ペプチド及びＬＬ−３７での他の実験は、正常な、又は加熱不活性化した２０％クエン酸（citrate）−血漿（ＰＰ）と共に、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中で行なわれた。インキュベーション混合物の階段希釈液をＴＨ寒天上でプレーティングし、引き続いて３７℃で終夜インキュベーションし、そしてｃｆｕ決定をした。
【０２３８】
放射拡散アッセイ（Radial diffusion assay）。本質的に、先に述べた通り［６２，６３］、細菌を、１０ｍｌの１倍の（full strength）（３％ｗ／ｖ）トリプチケースソイブロス（ＴＳＢ）（Becton-Dickinson）中で対数増殖期中期まで増殖させた。次いで微生物を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４で１回洗浄した。続いて、４×１０6ｃｆｕを１５ｍｌの、アンダーレイ（underlay）アガロースゲル［０．０３％（ｗ／ｖ） ＴＳＢ、１％（ｗ／ｖ） 電気浸透度が低いタイプ（ＥＥＯ）のアガロース（Sigma-Aldrich）及び０．０２％（ｖ／ｖ）ツイーン２０（Sigma-Aldrich）から成る］に加えた。このアンダーレイを直径（φ）１４４ｍｍのペトリ皿に注いだ。アガロースの凝固後、４ｍｍの直径のウェルに穴をあけ、そして必要な濃度のペプチド溶液６μｌを各ウェルに加えた。プレートを３７℃で３時間インキュベートし、ペプチド拡散させた。次いでこのアンダーレイゲルを１５ｍｌの融解したオーバーレイ（overlay）（６％ ＴＳＢ及び１％低ＥＥＯアガロース（蒸留Ｈ2Ｏ中））で覆った。ペプチドの抗微生物活性を３７℃でのインキュベーションの１８〜２４時間後に各ウェル周辺の透明帯として可視化した。
【０２３９】
蛍光顕微鏡検査法。不透過性プローブＦＩＴＣ（Sigma-Aldrich, St. Louis, USA）を、細菌膜透過化をモニタリングするために使用した。スタフィロコッカス・アウレウス（S.
aureus） ATCC 29213細菌を、ＴＳＢ培地中で対数増殖期中期まで増殖させた。細菌を洗浄し、そしてバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，５ｍＭ グルコース）中で再懸濁すると、１×１０7CFU／mlの懸濁液が生じた。１００μｌの細菌懸濁液を、３０μＭのそれぞれのペプチドを加えて、３０℃で３０分間インキュベートした。次いで微生物を、３０℃で４５分間インキュベートすることによって、ポリ（Ｌ−リシン）−被覆スライドガラス上に固定化し、引き続いてバッファー中の２００μｌのＦＩＴＣ（６μｇ／ｍｌ）をスライド上に添加し、３０℃で３０分間最後のインキュベーションをした。スライドを洗浄し、そして細菌をインキュベーションによって固定した（最初に氷上で１５分間、次に４％パラホルムアルデヒド中、室温で４５分間）。次にこのスライドガラスをプロロングゴールド褪色防止剤入り封入剤（Prolong Gold antifade reagent mounting medium）（Invitrogen, Eugene, USA）を用いてスライド上にマウントした。浜松 Ｃ４７４２−９５冷却型ＣＣＤカメラ（Hamamatsu C4742-95 cooled CCD camera）（Hamamatsu, Bridgewater, USA）及びPlan Apochromat ×100 objective（１００倍対物レンズ）（Olympus, Orangeburg, USA）を備えたNikon Eclipse TE300（Nikon, Melville, USA）倒立型蛍光顕微鏡を用いて、細菌を可視化した。微分干渉顕微鏡（Nomarski）イメージングが微生物自体の可視化のために使用された。
【０２４０】
溶血アッセイ。ＥＤＴＡ血を８００ｇで１０分間遠心分離し、その後血漿及びバフィーコート（buffy coat）を除去した。赤血球を３回洗浄し、そしてＰＢＳ、ｐＨ７．４中で再懸濁して、５％懸濁液を得た。次いでこの細胞を転倒回転により、ペプチド（６０μＭ）の存在下、３７℃で６０分間インキュベートした。２％トリトン（Triton）Ｘ−１００（Sigma-Aldrich）がポジティブコントロールとして機能した。次いでこのサンプルを８００ｇで１０分間遠心分離し、そして上清を９６ウェルマイクロタイタープレートに移した。ヘモグロビン放出の吸光度をλ５４０ｎｍで測定し、そしてプロットし、トリトンＸ−１００によって誘発された溶血％として表現した。
【０２４１】
乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）アッセイ。ＨａＣａＴケラチノサイトを、牛脳下垂体抽出物及び組み換えＥＧＦ（ＢＰＥ−ｒＥＧＦ）（Invitrogen, Eugene, USA）を補充した無血清ケラチノサイト培地（ＳＦＭ）中、９６ウェルプレート（３０００細胞／ウェル）中で細胞がコンフルエンシー（confluency）に達するまで増殖させた。次いでこの培地を除去し、そして１００μｌの検討するペプチド（６０μＭ、（ＳＦＭ／ＢＰＥ−ｒＥＧＦ中に希釈するか、又は２０％ヒト血清を補充したケラチノサイト−ＳＦＭ中））を加えた。ＬＤＨベースＴＯＸ−７キット（Sigma-Aldrich, St. Louis, USA）を細胞からのＬＤＨ放出の定量化のために用いた。結果は、３連測定からの平均値に相当し、そして１％ トリトンＸ−１００から成るポジティブコントロール（１００％ＬＤＨ放出を生ぜしめる）と比較して分画ＬＤＨ放出として与えられた。
【０２４２】
スロットブロットアッセイ。ペプチドのＬＰＳ結合能力をスロットブロットアッセイによって検討した。ペプチド（２及び５μｇ）を、真空で、予めＰＢＳに浸したニトロセルロース膜（Hybond-C, GE Healthcare BioSciences, UK）に結合させた。次いで膜を２ｗｔ％ ＢＳＡ（ＰＢＳ中）、ｐＨ７．４によって、室温で１時間ブロッキングし、次に125Ｉ標識ＬＰＳ（４０μｇ／ｍＬ；０．１３×１０6ｃｐｍ／μｇ）、あるいは125Ｉ標識ヘパリン（Sigma）を加え、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、あるいは１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ中で、室温で１時間インキュベートした。ＬＰＳ結合後、膜を３回（毎回１０分）上記のバッファー中で洗浄し、そしてBas 2000放射イメージングシステム（Fuji，日本）を用いて放射能の有無を可視化した。
【０２４３】
リポソーム調製及び漏出アッセイ。検討するリポソームは、双性イオン性（ＤＯＰＣ／コレステロール ６０／４０ｍｏｌ／ｍｏｌ又はＤＯＰＣ（コレステロール無添加））、あるいはアニオン性（ＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ ７５／２５ｍｏｌ／ｍｏｌ）であった。ＤＯＰＧ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール，一ナトリウム塩）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、及びＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）はすべてAvanti Polar Lipids（Alabaster, USA）に起源し、＞９９％の純度であり、一方コレステロール（＞９９％純度）は、Sigma-Aldrich（St. Louis, USA）に起源した。こうしたリン脂質の長く、対称で、かつ不飽和のアシル鎖によって、いくつかの方法論的利点が達成された。特に、膜接着（membrane cohesion）が良好であり、このことは非常に安定な、単ラメラ（unilamellar）の、そしてほとんど欠点のないリポソーム（cryo-TEMから観察）、及び輪郭のはっきりした支持脂質二重膜（偏光解析及びＡＦＭによって観察）を調製しやすいようにし、漏出に関する詳細な値及び吸着密度を得ることが可能となった。この脂質混合物は、クロロホルムに溶解し、その後、溶媒を真空下で終夜蒸発によって除去した。次に、１０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ７．４を、０．１Ｍ カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）（Sigma, St. Louis, USA）と一緒に加えた。水和の後、この脂質混合物を液体窒素中で凍結させ、６０℃に加熱することから成る８回の凍結・融解のサイクルに付した。約φ１４０ｎｍの単ラメラリポソームが、LipoFast miniextruder（Avestin, Ottawa, Canada）に搭載されているポリカーボネートフィルター（ポアサイズ１００ｎｍ）を通して２２℃でマルチプル押し出し（multiple extrusions）によって生じた。非捕捉ＣＦを２回のその後のゲルろ過（Sephadex G-50, GE Healthcare, Uppsala, Sweden）によって、溶離剤としてＴｒｉｓバッファーを用い２２℃で除去した。リポソームからのＣＦ放出は、リポソーム分散（１０ｍＭ 脂質（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中））から５２０ｎｍで放出する蛍光をモニタリングすることによって決定した。絶対漏出の程度については、０．８ｍＭ トリトンＸ−１００（Sigma-Aldrich, St. Louis, USA）の添加によって各実験の最後にリポソームを破壊することによって得られた。SPEX-fluorolog 1650 0.22-m double spectrometer（SPEX Industries, Edison, USA）が、上記に述べられている条件下でリポソームの不存在下及び存在下でＴｒｉｓバッファー中、リポソーム漏出アッセイのために用いられた。測定は３７℃、３連で行なわれた。
【０２４４】
ＣＤスペクトル測定。溶液中のペプチドのＣＤスペクトルを、Jasco J-810 Spectropolarimeter（Jasco, U.K.）を用いて測定した。この測定は撹拌しながら、１０ｍｍ石英キュベット中、３７℃で行なわれ、そしてこのペプチドの濃度は１０μＭであった。１００μＭの脂質濃度でのリポソームのペプチドの二次構造に対する影響が、２００〜２５０ｎｍの範囲でモニタリングされた。検討される条件下で観察されたペプチドのコンフォメーション（conformation）はα−ヘリックスとランダムコイルのみであった。α−ヘリックスコンフォメーションのペプチドの断片Ｘαは、次の式から算出された。
Ｘα＝（Ａ−ＡC）／（Ａα−ＡC）
［上式で、Ａは、２２５ｎｍで記録されたＣＤシグナルであり、そしてＡα及びＡCは、それぞれ、１００％α−へリックス及び１００％ランダムコイルのコンフォメーションの参照ペプチドの２２５ｎｍでのＣＤシグナルである］。
【０２４５】
１００％α−へリックス及び１００％ランダムコイル参照は、それぞれ、０．１Ｍ ＮａＯＨ及び０．１Ｍ ＨＣｌ中の０．１３３ｍＭ（モノマー濃度）ポリ−Ｌ−リシンから得られた［６４、６５］。ペプチド構造に対するリポポリサッカライドの影響を決定する場合には、このペプチドの二次構造を、Ｔｒｉｓバッファー中並びにエッシェリヒア・コリ リポポリサッカライド（０．０２ｗｔ％）（Escherichia coli ０１１１：Ｂ４、高純度、１％未満タンパク質／ＲＮＡ、Sigma, UK）の存在下の双方で、１０μＭのペプチド濃度でモニタリングした。測定間の器械誤差を説明するために、バックグラウンド値（ペプチドシグナルが存在しない場合の２５０ｎｍで検出された）を差し引いた。バルク溶液に起源するシグナルもまた、補正された。
【０２４６】
インビトロでのマクロファージに対する種々の微生物産生物の作用並びにＨＣII及びＴＦＰＩの種々のペプチドによる抗炎症作用
３．５×１０5細胞を、１０％ＦＢＳ及び抗生物質を補充したフェノールレッド不含ＤＭＥＭ（Gibco）を含む９６ウェル組織培養プレート（Nunc, 167008）中に播種した。接着を可能にするためにインキュベーションの６時間後、細胞を、指定された用量でペプチドの添加、及び無添加の双方（図の凡例参照）で、１０ｎｇ／ｍＬのエッシェリヒア・コリ（E. coli）（０１１１：Ｂ４）ＬＰＳ（Sigma）、リポタイコ酸、ペプチオグリカン、又はザイモサンで刺激した。培養の上清中のＮＯレベルを刺激から２４時間後にグリエス反応を用いて決定した［６６］。手短に言えば、ニトライト（nitrite）、ＮＯ分解の安定な産生物を、５０μｌの培養上清を同じ量のグリエス試薬（Sigma, G4410）と混和し、そして１５分後に５５０ｎｍでの吸光度を読み取ることによって測定した。ＦＢＳ及び抗生物質を加えたフェノールレッド不含ＤＭＥＭがブランクとして使用された。標準曲線をｄｄＨ２０中の０〜８０μＭの亜硝酸ナトリウム溶液を用いて調製した。
【０２４７】
凝固アッセイ。
凝固時間はすべて、Amelung凝固計（coagulometer）を用いて測定された。活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）は、指定濃度で滅菌水中で希釈されたペプチドを、１００μＬのクエン酸添加ヒト血漿と共に１分間インキュベートし、引き続いて１００μＬのａＰＴＴ試薬（aPTT Automate, Diagnostica Stago）を３７℃で６０秒間にわたって添加することによって測定された。凝固は１００μＬの２５ｍＭ ＣａＣｌ2溶液を添加することによって開始された。プロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイでは、凝固はカルシウムを加えた１００μＬのThrombomax（ＰＴ試薬；Sigma-Aldrich）を添加することによっ
て開始された。トロンビン凝固時間（ＴＣＴ）を測定する場合は、凝固は１００μＬのAccuclotトロンビン時間試薬（Accuclot thrombin time reagent）（ＴＣＴ試薬；Sigma-Aldrich）を添加することによって開始された。
【０２４８】
結果及び結論
要約すれば、ＨＣII、ＡＴIIIなどのセルピン中の隠されたクリプティックな（cryptic）ヘパリン結合部位、並びにＨＲＧ及びＴＦＰＩを含む他のタンパク質に相応する上記に報告したペプチドは、抗菌、抗炎症及び抗凝固特性（図１〜１８、２９〜３３）を有している。特に重要なことは、ＨＣIIペプチドがＴＬＲ媒介性ＬＰＳ応答並びに凝固の内因系経路をブロックするという発見である。更に、ＴＦＰＩペプチドは、ユニークであり、かつ以前に開示されていない、凝固の内因系並びに外因系経路の双方に対する阻害活性を示した。従って、この結果により、このペプチドは、細菌感染、及びマクロファージ活性化を妨害することを包含する関連する炎症応答を減弱させるのみならず、重要なことは、凝固を妨害し、それ故、敗血症、ＣＯＰＤ及び、他の炎症及び凝固を含む、病原性段階を包含する多因子疾患のために顕著な治療的潜在能力が実証されたことである。
【０２４９】
参照
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peptides. Curr Opin Hematol, 2002. 9(1): p. 18-22。
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【０２５０】
実施例Ｂ−組織因子経路インヒビターのＣ末端ペプチドは、新規な宿主防御分子である
要約
組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）は、組織因子によって誘発された凝固を抑制するが、また、そのＣ末端を介して、細胞表面−相互作用、ヘパリン−相互作用、及びリポポリサッカライド−相互作用をモジュレートし、並びに成長阻害に関与しうる。ここで、我々は、ＴＦＰＩのＣ末端ペプチド配列は、グラム陰性菌であるエッシェリヒア・コリ及びシュードモナス・エルギノーサ、グラム陽性菌であるバチルス・サブチリス及びスタフィロコッカス・アウレウス、並びに真菌であるカンジダ・アルビカンス及びカンジダ・パラプシロシスに対して抗微生物作用があることを示す。ペプチド処理細菌の蛍光研究と、リポソームに対するペプチドの作用の分析をペアリングさせると、このペプチドは、“古典的な（classical）”ヒトの抗微生物ペプチドであるＬＬ−３７の場合に見られる作用と同様な膜破壊作用を発揮することが示された。
【０２５１】
Ｃ末端ペプチド（ＧＧＬ２７）（ＧＧＬＩＫＴＫＲＫＲＫＫＱＲＶＫＩＡＹＥＥＩＦＶＫＮＭ［配列番号４］）によって、シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）ではないが、エッシェリヒア・コリ（E. coli）に対する殺菌作用が、ヒト血漿中で高められ、そして加熱によって不活性化された血漿中でこの大部分が破壊され、この現象は、抗微生物作用のあるＣ３ａの生成及び補体活性化の古典的経路の活性化にリンクしていた。
更に、ＧＧＬ２７は、ＬＰＳショックのマウスモデルにおいてインビトロ及びインビボで抗エンドトキシン作用を示した。重要なことには、ＴＦＰＩは、正常な上皮の基底層で発現されるということが見出されたことであり、そして急性皮膚創傷並びに慢性下肢潰瘍の創縁において顕著に上方制御されていた。更に、ＴＦＰＩのＣ末端断片は、ヒト慢性下肢潰瘍中に存在する細菌と結合していた。こうした所見によって、感染症に対する皮膚の防御においてＴＦＰＩの新たな役割が示唆された。
【０２５２】
序論
微生物叢を制御するために、ヒト並びに実質的にすべての生命体は、種々の抗微生物ペプチド（１〜３）に基づく即効性宿主防御系を装備している。こうしたペプチドの大部分は、両親媒性構造によって特徴付けられ、そして線状のペプチド類を含んでなり、細菌結合に対してα−ヘリックス及び両親媒性コンフォメーションを採用している場合が多く、ペプチド類はシステイン架橋した逆平行β−シート、並びにシステインコンストレインドループ構造（cysteine-constrained loop structures）を形成している。加えて、抗微生物ペプチドは、これらがいくつかのアミノ酸の過剰出現によって特徴付けられていれば、こうした秩序構造を示さないペプチド中でも見出されうる（１，４〜６）。細菌膜との相互作用が抗微生物ペプチド機能の基本であるけれども、作用の正確な方式は複雑であり、膜を破壊するものと、膜を破壊しないものに分けられうる（１，３，７，８）。最近では、またデフェンシン及びカテリシジンなどの多くのカチオン性及び両親媒性抗微生物ペプチドは多機能的であり、また免疫調節的役割及び血管形成を媒介している（９〜１１）ということが次第に明らかとなってきており、従って最近のより広い定義の自然免疫系のこうしたメンバーの宿主防御ペプチドに動機を与えている。
【０２５３】
組織因子経路インヒビター（すなわち、ＴＦＰＩ）は、クニッツ型プロテイナーゼインヒビター（Kunitz-type proteinase inhibitor）であり、該インヒビターは、第Ｘ因子（ＦＸ）依存性の形で組織因子−第ＶＩＩ因子（ＴＦ−ＶＩＩ）複合体を可逆的に阻害し、ＦＸとＦＩＸの双方の活性化の阻害をもたらす。ＴＦＰＩは、高度にマイナスに荷電されたＮ末端、３つの縦列に連鎖するクニッツ型ドメイン、及び高度にプラスに荷電されたＣ末端から成っている。血漿では、ＴＦＰＩは、全長及び種々のＣ末端トランケート形態の双方に存在する［１２］。最初及び２番目のクニッツドメインは、それぞれ、ＴＦ−ＶＩＩ複合体及び第Ｘａ因子に結合し、そしてこれらを阻害することに関与している［１３］。３番目のクニッツドメインは、今度は、そのカチオン性Ｃ末端部を介してヘパリンと相互作用しうる［１４］。このＣ末端領域はまた、血漿リポタンパク質、トロンボスポンジン−１、クリアランス受容体（１５）、リポポリサッカライド［１６］との相互作用に関与しており、そして細胞増殖［１７］並びに血液凝固［１８，１９］を阻害しうる。種々のＣ末端トランケート形態がインビボで存在するので、Ｃ末端のタンパク質分解の潜在的な役割が関与しており、そしてデータによれば、ＴＦＰＩは、トロンビン［２０］、プラスミン［２１］、及びマトリックスメタロプロテイナーゼ−８［２２］などの種々のプロテイナーゼによって切断されえ、その結果Ｃ末端断片をリリースしうる。ＴＦＰＩ発現のアップレギュレーターには、エンドトキシン、ＩＬ−１、ＴＮＦ−α、血小板由来成長因子、ヘパリン、及び塩基性線維芽細胞増殖因子が含まれ、すべての分子は、感染、炎症、及び増殖に関与している［１５］。
【０２５４】
この上記に報告したＴＦＰＩの多機能性、及び露出したカチオン性、かつヘパリン結合性のＣ末端の存在によって、ＴＦＰＩのＣ末端領域が抗微生物活性を発揮しうるか否かという問題が我々に提起される。我々は、皮膚創傷中で発現され、そして慢性下肢潰瘍のフィブリン中で発見されたことが見出されたＴＦＰＩのＣ末端ペプチドが、実際に宿主の防御ペプチドとして機能しうることをここに示す。更に、グラム陰性菌のシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）ではないが、エッシェリヒア・コリ（E. coli）に対する殺菌作用が、膜侵襲複合体（ＭＡＣ）及び抗微生物作用のあるＣ３ａを形成することを含めて、ペプチドによって媒介される補体の活性化によって著しく強化されていた。
【０２５５】
材料及び方法
ペプチド−ＴＦＰＩに由来するペプチド（図１参照）及びコントロールペプチド：ＧＧＬ２７（Ｓ）（ＧＧＬＩＳＴＳＳＳＳＳＳＱＲＶＫＩＡＹＥＥＩＦＶＫＮＭ［配列番号１０２］）及びＤＳＥ２５（ＤＳＥＥＤＥＥＨＴＩＩＴＤＴＥＬＰＰＬＫＬＭＨＳＦ［配列番号１０３］）が、Biopeptide Co., San Diego, USAによって合成され、一方ＬＬ−３７（ＬＬＧＤＦＦＲＫＳＫＥＫＩＧＫＥＦＫＲＩＶＱＲＩＫＤＦＬＲＮＬＶＰＲＴＥＳ［配列番号１０１］）は、Innovagen AB, Lund, Swedenから得られた。こうしたペプチドの純度（＞９５％）は、マススペクトル分析（MALDI-ToF Voyager）によって確認された。
【０２５６】
微生物。細菌分離株、エッシェリヒア・コリ（E. coli）ATCC 25922、シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）ATCC 27853、スタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）ATCC 29213、バチルス・サブチリス（B. subtilis） ATCC 6633 、カンジダ・アルビカンス（C. albicans） ATCC 90028及びカンジダ・パラプシロシス（C. parapsilosis） ATCC 90018は、ルンド大学病院・細菌学部（Department of Bacteriology, Lund University Hospital）から得られた。他のエッシェリヒア・コリ（E. coli）及びシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）の臨床分離株は、皮膚感染症に罹患している患者に起源した。
【０２５７】
生物学的材料−フィブリン瘡蓋を、滅菌スパチュラを用いて慢性静脈下肢潰瘍（慢性創傷瘡蓋／表面）から回収し、そしてすぐに電子顕微鏡検査のために固定した。慢性静脈潰瘍（存続期間＞６ヶ月）に罹患している３人の患者からの組織切片を解析した。４ｍｍ生検試料を創傷の創縁及び腿のコントロールエリアから取った。急性創傷の場合には、４ｍｍの生検試料を１人の個人の腿から取り、そして次の創縁からの生検試料は、５及び８日目に取った。正常皮膚（ｎ＝３，腿）からの生検試料も、解析のために取った。研究プロジェクトは、ルンド大学病院の倫理委員会によって承認されている。同意書は患者から得られていた。
【０２５８】
放射拡散アッセイ（Radial diffusion assay）。本質的に、先に述べた通り［２３，２４］、細菌を、１０ｍｌの１倍の（full strength）（３％ｗ／ｖ）トリプチケースソイブロス（ＴＳＢ）（Becton-Dickinson）中で対数増殖期中期まで増殖させた。次いで微生物を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４で１回洗浄した。続いて、４×１０6ｃｆｕを１５ｍｌの、アンダーレイ（underlay）アガロースゲル［０．０３％（ｗ／ｖ） ＴＳＢ、１％（ｗ／ｖ） 電気浸透度が低いタイプの（ＥＥＯ）アガロース（Sigma-Aldrich）及び０．０２％（ｖ／ｖ）ツイーン２０（Sigma-Aldrich）から成る］に加えた。このアンダーレイを直径（φ）１４４ｍｍのペトリ皿に注いだ。アガロースの凝固後、４ｍｍの直径のウェルに穴をあけ、そして必要な濃度のペプチド溶液６μｌを各ウェルに加えた。プレートを３７℃で３時間インキュベートし、ペプチド拡散させた。次いでこのアンダーレイゲルを１５ｍｌの融解したオーバーレイ（overlay）（６％ ＴＳＢ及び１％ 低ＥＥＯアガロース（Low-EEO）（蒸留Ｈ2Ｏ中））で覆った。ペプチドの抗微生物活性を３７℃でのインキュベーションの１８〜２４時間後に各ウェル周辺の透明帯として可視化した。
【０２５９】
生菌数解析。エッシェリヒア・コリ（E. coli）菌株を、トッド・ヒューウイット（Todd-Hewitt）(TH)中で対数増殖期中期（mid-logarithmic phase）まで増殖させた。シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）菌株をＴＨ中で終夜増殖させた。菌を洗浄し、そして５ｍＭ グルコースを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中に希釈した。２×１０6ｃｆｕ／ｍｌの細菌を、指定の濃度で、Ｃ末端のＴＦＰＩに由来するペプチド ＧＧＬ２７、ＴＫＲ２２、又はＬＩＫ１７と共に、５０μｌ中、３７℃で２時間インキュベートした。追加の実験が、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４単独か、あるいは２０％正常又は加熱不活性化したクエン酸血漿を加えて行なわれた。インキュベーション混合物の階段希釈液をＴＨ寒天上でプレーティングし、引き続いて３７℃で終夜インキュベーションし、そしてｃｆｕ決定をした。
【０２６０】
フローサイトメトリー解析−５０μｌの細菌（１〜２×１０9ｃｆｕ）を、４５０μｌのヒト血漿単独か、あるい該血漿にＧＧＬ２７（３μＭ）を補充した該血漿と共にインキュベートした。サンプルを、３７℃で３０分間か、又は１時間インキュベートし、２つの等量にわけ、遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、そしてヒトＣ３ａのＣ末端エピトープ、ＬＧＥ２７（２５）に対するウサギポリクローナル抗体、あるいはＣ１ｑに対するウサギポリクローナル抗体と共に（双方とも１：１００で）、１００μｌのＰＢＳ中に再懸濁した。次にこの混合物を、室温で１時間インキュベートした。細菌をペレット化し、そしてＰＢＳで２回洗浄し、室温で３０分間、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（goat anti rabbit IgG FITC-labeled antibodies）（１：５００，Sigma）と共に、１００μｌのＰＢＳ中でインキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。別の実験では、細菌をクエン酸血漿中、３μＭのＴＡＭＲＡ標識ＧＧＬ２７ペプチドと一緒に、１時間インキュベートし、次いでペレット化し、そしてＰＢＳで２回洗浄した。フローサイトメトリー解析を、アルゴンレーザー（４８８ｎｍのアルゴンレーザー（１５ｍＷ））を備えたFACS-Caliburフローサイトメトリーシステム（Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ）を用いて行なった。この細菌集団を、前方散乱（ＦＳＣ）及び側方散乱（ＳＳＣ）を適切にセッティングして、ゲーティングすることによって選択した。
【０２６１】
蛍光顕微鏡検査法−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ；Sigma-Aldrich, St.
Louis, USA）を、細菌膜透過化をモニタリングするために使用した。エッシェリヒア・コリ（E. coli）ATCC 25922細菌を、ＴＳＢ培地中で対数増殖期中期まで増殖させた。細菌を洗浄し、そしてバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，５ｍＭ グルコース）中で再懸濁すると、１×１０7cfu／mlの懸濁液が生じた。１００μｌの細菌懸濁液を、３０μＭのそれぞれのペプチドを加えて、３０℃で３０分間インキュベートした。次いで微生物を、３０℃で４５分間インキュベートすることによって、ポリ（Ｌ−リシン）−被覆スライドガラス上に固定化し、引き続いてバッファー中の２００μｌのＦＩＴＣ（６μｇ／ｍｌ）をスライド上に添加し、３０℃で３０分間最後のインキュベーションをした。スライドを洗浄し、そして細菌をインキュベーションによって固定した（最初に氷上で１５分間、次に４％パラホルムアルデヒド中、室温で４５分間）。次にこのスライドガラスをプロロングゴールド褪色防止剤入り封入剤（Prolong Gold antifade reagent mounting medium）（Invitrogen, Eugene, USA）を用いてスライド上にマウントした。浜松 Ｃ４７４２−９５冷却型ＣＣＤカメラ（Hamamatsu C4742-95 cooled CCD camera）（Hamamatsu, Bridgewater, USA）及びPlan Apochromat ×100 objective（１００倍対物レンズ）（Olympus, Orangeburg, USA）を備えたNikon Eclipse TE300（Nikon, Melville, USA）倒立型蛍光顕微鏡を用いて、細菌を可視化した。微分干渉顕微鏡（Nomarski）イメージングが微生物自体の可視化のために使用された。
【０２６２】
組織化学−免疫染色のために、創傷生検試料を１０％ホルマリン中で固定し、再水和し、そしてパラフィン中に包埋した。５μｍ厚の切片をポリリシンによってコートしたスライドガラス上におき、キシレン中で脱パラフィンし、そしてアルコールで段階的に再水和した。次いでこのスライドを、Dako抗原賦活化溶液（Dako）を用いて９７℃で４０分間処理し、そしてＴＦＰＩに対するポリクローナル抗体（Sigma-Aldrich，１％ ＢＳＡ，５％ ヤギ血清，０．０５％ ツイーン２０を含むＴＢＳ中）の１：５０希釈中で、室温で２４時間インキュベートした。０．０５％ ツイーン２０を含むＴＢＳ中で３回、２０分洗浄した後、この切片を、一次抗体と同じバッファー中１：１０００希釈したアルカリホスファターゼコンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体（secondary goat anti-rabbit IgG）（Dako）でインキュベートし、そして更に２４時間インキュベートし、引き続いて３回、２０分洗浄した。切片をVulcan Fast Red chromogen（Biocare Medical, Concord, CA）と共に展開し、そしてハリスヘマトキシリン（Harris Hematoxylin）（EM Science, Gibbstown, NJ）を用いて対比染色した。マウスのインビボＬＰＳ−モデルに由来する肺を組織学的に評価するために、組織を上記のように包埋し、薄片にし、そしてヘマトキシリン及びエオシンでルーチン手順によって染色した（Histocenter, Gothenburg, Sweden）。
【０２６３】
電子顕微鏡検査法−透過型電子顕微鏡検査法及び細菌に対するペプチド作用の視覚化のために、シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）ATCC 27853（１〜２×１０6ｃｆｕ／サンプル）を、ペプチド ＧＧＬ２７（３０μＭ）と共に、３７℃で２時間インキュベートした。ＬＬ−３７（３０μＭ）をコントロールとして含めた。シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）サンプル懸濁液を炭素被覆銅グリッド上に２分間吸着させ、２滴の水で手短に洗浄し、そして２滴の０．７５％ギ酸ウラニルでネガティブ染色した。このグリッドを空気中、低圧でグロー放電によって親水化処理した。インビボ実験；慢性静脈潰瘍（ＣＷＳ）に罹患している患者からのフィブリン瘡蓋を、室温で１時間固定し（１．５％ ＰＦＡ，０．５％ ＧＡ（０．１Ｍ リン酸塩バッファー中），ｐＨ７．４）、引き続いて０．１Ｍ リン酸塩バッファー、ｐＨ７．４で洗浄した。次にこの固定し、そして洗浄したサンプルをエタノール中で脱水し、更にロウイクリル包埋（Lowicryl embedding）処理した（２６）。切片をLKB ultratomeで切断し、そして金のグリッド上にのせた。免疫染色するために、このグリッドを一枚のパラフィルムの上に広げた数滴の免疫試薬の上面にフロートした。遊離のアルデヒド基を５０ｍＭ グリシンでブロッキングし、次いでこのグリッドをインキュベーションバッファー（０．２％ ＢＳＡ−ｃ（ＰＢＳ中），ｐＨ７．６）中、５％（vol/vol）ヤギ血清と共に、１５分間インキュベートした。このブロッキング手順の後、Ｃ末端ＴＦＰＩのヤギポリクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ）（Abcam, UK）のみで、あるいはこれとＣ３ａのＣ末端部分に対するウサギポリクローナル抗体（ＬＧＥ２７抗体）（１μｇ／ｍｌ）（Innovagen AB）とを組み合わせて、４℃で終夜にわたってインキュベーションした（２５）。一次抗体なしのコントロールを含めた。このグリッドを多量（２００ｍｌ）のインキュベーションバッファー中で洗浄し、金コンジュゲート試薬を含む滴上にフローティングした。ＴＦＰＩ−ペプチドを検出するために、インキュベーションバッファー中の１μｇ／ｍｌ ＥＭ ウサギ抗ヤギＩｇＧ １０ｎｍ Ａｕ（1μg/ml EM rabbit anti-goat IgG 10nm Au）（ＢＢＩ）を加え、そしてインキュベーションを４℃で２時間行なった。ＴＦＰＩとＣ３ａの同時検出のために、１μｇ／ｍｌ ＥＭ ウサギ抗ヤギＩｇＧ ２０ｎｍ Ａｕ（1μg/ml EM rabbit anti-goat IgG 20nm Au）（ＢＢＩ）及び１μｇ／ｍｌ ＥＭ ヤギ抗ウサギＩｇＧ １０ｎｍ Ａｕ（1μg/ml EM goat anti-rabbit IgG 10nm Au）（ＢＢＩ）を使用した。過剰量のインキュベーションバッファーによって更に洗浄した後、切片を２％グルタルアルデヒド中で後固定した。最後に、切片を蒸留水で洗浄し、２％酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で後染色した。サンプルはすべて、８０ｋＶの加速電圧で作動するJeol JEM 1230電子顕微鏡で検討した。画像をGatan Multiscan 791ＣＣＤカメラで記録した。
【０２６４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロット法−ヒトクエン酸血漿（４５０μｌ）を、５０μｌ細菌（１〜２×１０9ｃｆｕ）のみで、あるいは３μＭのペプチドＧＧＬ２７を補充してインキュベートした。この混合物を３７℃で３０分間か、又は１時間インキュベートし、遠心分離し、そして上清及び細菌を回収した。この細菌ペレットをＰＢＳで洗浄し、そして結合タンパク質を０．１Ｍ グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．０で溶離した。溶離物のｐＨを１Ｍ Ｔｒｉｓで７．５に上昇させた。溶離タンパク質が、１容量部のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を４容量部のサンプルに添加することによって沈殿し、引き続いて、３０分間、氷上でインキュベーションし、そして１５０００ｇで遠心分離した（４℃、２０分間）。沈殿物及び上清をＳＤＳサンプルバッファー中に溶解し、そして還元条件下で１６．５％ トリス−トリシンゲル（Clear PAGETM, C.B.S Scientific）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。タンパク質及びペプチドをニトロセルロース膜（ハイボンド−Ｃ（Hybond-C））に移した。
【０２６５】
膜を３％（ｗ／ｖ）スキムミルクによってブロッキングし、洗浄し、そして、Ｃ３ａのＣ末端部分に対するウサギポリクローナル抗体（ＬＧＥ２７抗体）（１：１０００）、Ｃ１ｑに対するウサギポリクローナル抗体（１：１０００）（Dako）、ＴＦＰＩのＣ末端配列（ＶＫＩＡＹＥＥＩＦＶＫＮＭ［配列番号１０４］）（Abcam）を認識するヤギポリクローナル抗体、又はＣ５ｂ−９に対するウサギポリクローナル抗体（１：１０００）（Abcam, England）と共に、１時間インキュベートした。この膜を３回、１０分間洗浄し、そしてＨＲＰコンジュゲート二次抗体（１：２０００）（Dako）と共に、インキュベートし（１時間）、そして洗浄した（３×１０分）。タンパク質を増強された化学発光基質（LumiGLO(登録商標)）開発システムにより可視化した（Upstate cell signaling solutions）。
【０２６６】
インビトロにおけるマクロファージに対するＬＰＳの作用−３．５×１０5細胞を、１％ Anti-Anti（Invitrogen）を含む１０％ＦＢＳを補充したフェノールレッド不含ＤＭＥＭ（Gibco）を含む９６ウェル組織培養プレート（Nunc, 167008）中に播種した。接着を可能にするインキュベーションの２０時間後、細胞を洗浄し、そして種々の用量のペプチド ＧＧＬ２７、ＧＧＬ２７（Ｓ）、及びＤＳＥ２５の添加、及び無添加で、１０ｎｇ／ｍＬのエッシェリヒア・コリ（E. coli）（０１１１：Ｂ４）又はシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）のＬＰＳ（Sigma）で刺激した。培養上清中のＮＯレベルを刺激から２４時間後にグリエス反応を用いて決定した（２７）。手短に言えば、ニトライト（nitrite）、ＮＯ分解の安定な産生物を、５０μｌの培養上清を同じ量のグリエス試薬（Sigma, G4410）と混和し、そして１５分後に５５０ｎｍでの吸光度を読み取ることによって測定した。ＦＢＳ及び抗生物質を加えたフェノールレッド不含ＤＭＥＭがブランクとして使用された。標準曲線をｄｄＨ２０中の０〜８０μＭの亜硝酸ナトリウム試液を用いて調製した。
【０２６７】
動物感染モデル−動物を光と温度の標準条件下で収納し、そして標準的な研究用のエサと水に自由にアクセスさせた。シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）１５１５９細菌を対数増殖期まで増殖させ（ＯＤ620約０．５）、回収し、ＰＢＳ中で洗浄し、２×１０8ｃｆｕ／ｍｌまで同じバッファー中で希釈し、そして注入するまで氷上に保持した。この細菌の懸濁液１００μｌを雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスに腹腔内（i.p.）注入した。細菌注入の６０分後、０．５ｍｇのＧＧＬ２７又はバッファーのみをこのマウスに皮下（ｓ.ｃ.）注入した。対応するエッシェリヒア・コリ（E. coli）感染モデルでは、細菌を早期対数増殖期まで増殖させ（ＯＤ620約０．４）、回収し、ＰＢＳ中で洗浄し、１×１０8ｃｆｕ／ｍｌまで同じバッファー中で希釈し、そして注入するまで氷上に保持した。この細菌の懸濁液１００μｌを雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスにi.p.注入した。細菌注入の３０分後、０．２ｍｇのＧＧＬ２７ペプチド又はバッファーのみをｉ．ｐ．注入した。２つの独立した実験からのデータはプールされた。
【０２６８】
インビボにおけるＬＰＳモデル−雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８〜１０週齢、２２＋／−５ｇ）に、体重１ｋｇ当たり、１８ｍｇのエッシェリヒア・コリ（E. coli） ０１１１：Ｂ４ ＬＰＳ（Sigma）を腹腔内注入した。ＬＰＳ注入の３０分後に、０．５ｍｇのＧＧＬ２７、ＧＧＬ２７（Ｓ）、ＤＳＥ２５又はバッファーのみをマウスに腹腔内注入した。生存及び状態を７日間追跡した。血液回収及び組織化学のために、マウスをＬＰＳチャレンジの２０時間後に犠死させ、そして肺を除去し固定化した。こうした実験は、Malmoe/Lundの研究動物倫理委員会（the Laboratory Animal Ethics Committee）が承認していた。
【０２６９】
サイトカインアッセイ−サイトカイン、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−１、ＩＮＦ−γ、及びＴＮＦ−αを、ＬＰＳ（ペプチド処置有り又は無し）に曝したマウスからの血漿中で、サイトメトリックビーズアレイ（Cytometric bead array）；製造業者の指示に従ってマウス炎症キット（Becton Dickinson AB）を用いて測定した。
【０２７０】
溶血アッセイ−ＥＤＴＡ血を８００ｇで１０分間遠心分離し、その後血漿及びバフィーコート（buffy coat）を除去した。赤血球を３回洗浄し、そしてＰＢＳ、ｐＨ７．４中で再懸濁して、５％懸濁液を得た。次いでこの細胞を転倒回転により、ペプチド（６０μＭ）の存在下、３７℃で６０分間インキュベートした。２％トリトン（Triton）Ｘ−１００（Sigma-Aldrich）がポジティブコントロールとして機能した。次いでこのサンプルを８００ｇで１０分間遠心分離し、そして上清を９６ウェルマイクロタイタープレートに移した。ヘモグロビン放出の吸光度を５４０ｎｍで測定し、そしてトリトンＸ−１００によって誘発された溶血の％として表した。
【０２７１】
乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）アッセイ−ＨａＣａＴケラチノサイトを、牛脳下垂体抽出物及び組み換えＥＧＦ（ＢＰＥ−ｒＥＧＦ）（Invitrogen, Eugene, USA）を補充した無血清ケラチノサイト培地（ＳＦＭ）中、９６ウェルプレート（３０００細胞／ウェル）中で細胞がコンフルエンシーに達するまで増殖させた。次いでこの培地を除去し、そして１００μｌの検討するペプチド（６０μＭ、（ＳＦＭ／ＢＰＥ−ｒＥＧＦ中に希釈するか、又は２０％ヒト血清を補充したケラチノサイト−ＳＦＭ中））を加えた。ＬＤＨベースＴＯＸ−７キット（Sigma-Aldrich, St. Louis, USA）を細胞からのＬＤＨ放出の定量化のために用いた。結果は、３連測定からの平均値に相当し、そして１％ トリトンＸ−１００から成るポジティブコントロール（１００％ＬＤＨ放出を生ぜしめる）と比較して分画ＬＤＨ放出として与えられた。
【０２７２】
リポソーム調製及び漏出アッセイ−検討するリポソームは、アニオン性（ＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ ７５／２５ｍｏｌ／ｍｏｌ）であった。ＤＯＰＧ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール，一ナトリウム塩）及びＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）は双方ともAvanti Polar Lipids（Alabaster, USA）に起源し、＞９９％の純度であった。こうしたリン脂質の長く、対称で、かつ不飽和のアシル鎖のため、いくつかの方法論的利点が達成された。特に、膜接着（membrane cohesion）が良好であり、このことは非常に安定な、単ラメラの、そしてほとんど欠点のないリポソーム（ｃｒｙｏ−ＴＥＭから観察）を調製しやすいようにし、リポソーム漏出に関する詳細な検討が可能となった。この脂質混合物は、クロロホルムに溶解し、その後、溶媒を真空下で終夜蒸発によって除去した。次に、１０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ７．４を、０．１Ｍ カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）（Sigma, St. Louis, USA）と一緒に加えた。水和の後、この脂質混合物を液体窒素中で凍結させ、６０℃に加熱することから成る８回の凍結・融解のサイクルに付した。約φ１４０ｎｍの単ラメラリポソームが、LipoFast miniextruder（Avestin, Ottawa, Canada）に搭載されているポリカーボネートフィルター（ポアサイズ １００ｎｍ）を通して２２℃でマルチプル押し出し（multiple extrusions）によって生じた。非捕捉ＣＦを２回のその後のゲルろ過（Sephadex G-50, GE Healthcare, Uppsala, Sweden）によって、溶離剤としてＴｒｉｓバッファーを用い２２℃で除去した。リポソームからのＣＦ放出は、リポソーム分散（１０ｍＭ 脂質（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中））から５２０ｎｍで放出する蛍光をモニタリングすることによって決定した。絶対漏出の程度については、０．８ｍＭ トリトンＸ−１００（Sigma-Aldrich, St. Louis, USA）の添加によって各実験の最後にリポソームを破壊することによって得られた。SPEX-fluorolog 1650 0.22-m double spectrometer（SPEX Industries, Edison, USA）が、リポソーム漏出アッセイのために用いられた。測定は３７℃、３連で行なわれた。
【０２７３】
ＣＤスペクトル測定−ペプチドのＣＤスペクトルを、Jasco J-810分光偏光計（Spectropo
larimeter）（Jasco, U.K.）を用いて測定した。この測定は撹拌しながら、１０ｍｍ石英キュベット中、３７℃で行なわれ、そしてこのペプチドの濃度は１０μＭであった。１００μＭの脂質濃度でのリポソームのペプチドの二次構造に対する影響が、２００〜２５０ｎｍの範囲でモニタリングされた。α−ヘリックスコンフォメーションのペプチドの断片Ｘαは、次の式から算出された。
Ｘα＝（Ａ−ＡC）／（Ａα−ＡC）
［上式で、Ａは、２２５ｎｍで記録されたＣＤシグナルであり、そしてＡα及びＡCは、それぞれ、１００％α−へリックス及び１００％ランダムコイルのコンフォメーションの参照ペプチドの２２５ｎｍでのＣＤシグナルである］。
【０２７４】
１００％α−へリックス及び１００％ランダムコイル参照は、それぞれ、０．１Ｍ ＮａＯＨ及び０．１Ｍ ＨＣｌ中の０．１３３ｍＭ（モノマー濃度）ポリ−Ｌ−リシンから得られた［２８，２９］。ペプチド構造に対するリポポリサッカライドの影響を決定する場合には、このペプチドの二次構造を、Ｔｒｉｓバッファー中並びにエッシェリヒア・コリ リポポリサッカライド（０．０２ｗｔ％）（Escherichia coli ０１１１：Ｂ４、高純度、１％未満タンパク質／ＲＮＡ、Sigma, UK）の存在下で、１０μＭのペプチド濃度でモニタリングした。測定間の器械誤差を説明するために、バックグラウンド値（ペプチドシグナルが存在しない場合の２５０ｎｍで検出された）を差し引いた。バルク溶液に起源するシグナルもまた、補正された。
【０２７５】
ＴＦＰＩの系統樹解析−ＴＦＰＩアミノ酸配列がＮＣＢＩサイトから検索された。各配列はPsi-Blast（ＮＣＢＩ）を用いて解析し、オーソログ（ortholog）及びパラログ（paralog）配列を見出した。構造相同性＞７０％を示す配列が選択された。こうした配列はBlosum 69 protein weight matrix settingsを用いているClustalWを使用してアラインメントさせた。内部調整はClustalWインターフェースを利用して、構造アラインメントを考慮に入れてなされた。アラインメント内の各位置のコンシステンシーのレベルは、アラインメント評価ソフトウェアTcoffeeを用いることによって推定された。
【０２７６】
統計的解析−バー・ダイアグラム（ＲＤＡ，ＶＣＡ）が、少なくとも３つの独立した実験から平均値及び標準偏差として提示されている。
【０２７７】
結果
ＴＦＰＩのＣ末端ペプチドが抗微生物活性を有するかどうかを解明するために、我々は、以前にタンパク質分解作用（プラスミン及びトロンビン）によって作成されることが報告されているＴＦＰＩの定義されている領域、並びにＴＦＰＩのＣ末端ヘパリン結合エピトープ（配列については図３４Ａ参照）を含んでなるペプチド：ＬＩＫＴＫＲＫＲＫＫＱＲＶＫＩＡＹ［配列番号５］（ＬＩＫ１７）の作用を検討した。
【０２７８】
この結果によれば、このペプチドは、グラム陰性菌であるエッシェリヒア・コリ及びシュードモナス・エルギノーサ、グラム陽性菌であるバチルス・サブチリス及びスタフィロコッカス・アウレウス、並びに真菌であるカンジダ・アルビカンス及びカンジダ・パラプシロシスに対して放射拡散アッセイ（ＲＤＡ）において実際に抗微生物作用があったことが示された（図３４Ｂ）。このペプチドが“古典的な（classical）”ＡＭＰであるヒトカテリシジンＬＬ−３７の活性に匹敵する活性が示された（図３４Ｂ）ことは注目に値することである。対照的に、中央のＫ／Ｒ残基がＳによって置き換えられているコントロールペプチドＧＧＬ２７（Ｓ）、及びＴＦＰＩのＮ末端に由来するペプチドＤＳＥ２５（配列の実験手順参照）では、上記の微生物に対して抗微生物作用が生じなかった（図４３）。上記の抗菌作用結果は、更に、マトリックスを用いない生菌数アッセイ（matrix-free viable count assays）によって実証された。こうしたエッシェリヒア・コリ（E. coli）を用いる用量応答実験からの結果によって、特にＧＧＬ２７及びＬＩＫ１７は顕著な抗菌活性を示すことが確認された（図３４Ｃ）。
【０２７９】
ＦＡＣＳ解析によって、プラスミンによって作成されるＧＧＬ２７は、ヒト血漿中でエッシェリヒア・コリ（E. coli）及びシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）と貪欲に結合することが示された（図３５Ａ）。不透過性プローブＦＩＴＣを使用する研究によれば、ＬＩＫ１７（図３５Ｂ）及びＧＧＬ２７（図４４）は、ＬＬ−３７での処置後に見られるのと同様にエッシェリヒア・コリ（E. coli）の細菌膜を透過することが示された（３０，３１）（図３５Ｂ）。シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）を利用する電子顕微鏡検査法では、シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）の細胞外皮は、それらの細胞質の内容を欠いており、そして細胞内物質は細胞外で見出され、広範囲な膜損傷が実証された（図３５Ｃ）。同様な所見はＬＬ−３７でもやはり得られた。こうしたデータによれば、ＴＦＰＩに由来するペプチドは、細菌の膜に作用するが、しかしながら、それらは細菌にペプチド添加した後、細菌に対する二次的な代謝作用が細菌の死及び膜不安定化のトリガーになっているというような正確な機構的な事象を示してはいないことが示唆される。それ故、リポソームモデルは、ＬＩＫ１７及びＧＧＬ２７の膜透過性を検討するのに使用された。このペプチドはＣＦ放出を引き起こし（図３６Ａ）、従って、脂質膜に対する直接的作用が示された。速度論分析では、最大放出の約８０％が５〜１０分以内に起こることが示され、ＬＬ−３７で得られた結果に匹敵した（図３６Ｂ）。ＬＩＫ１７及びＧＧＬ２７が、リポソームへの結合に関連する顕著なコンフォメーション変化を示さず（図３６Ｃ）、エッシェリヒア・コリ（E. coli）ＬＰＳと共に、ただ比較的わずかな変化だけを示し（図３６Ｄ）、後者はペプチド及び／又はＬＰＳから生じ、リポソーム結合に対してヘリシティ中で顕著な増加を示すＬＬ−３７と対照的であることは注目に値する。細菌を殺すＡＭＰはまた、真核生物細胞に対して溶血及び膜透過活性を示しうる。しかしながら、この結果によって、ＴＦＰＩに由来するペプチドは、３〜６０μＭの用量で溶血活性がないことが示された（図３７Ａ）。このことは、＞６μＭの用量で容易に赤血球を透過性にするＬＬ−３７とは対照的である。同様に、このＴＦＰＩに由来するペプチドは、ＨａＣａＴ細胞を透過性にしなかったし、またこれらは検討濃度でいかなる顕著な毒性も示さなかった（図３７Ｂ）。
【０２８０】
多くの抗微生物ペプチドの活性は、生理学的塩の存在、並びに血漿又は血清ななどの“生体マトリクス（biomatrices）”の存在によって抑止される（３２，３３）ので、我々はまた、ペプチド活性に対する塩及びヒト血漿の影響を検討した。図３８Ａで実証されているように、３つのすべてのＴＦＰＩに由来するペプチド（ＧＧＬ２７，ＴＫＲ２２，及びＬＩＫ１７）の、特にエッシェリヒア・コリ（E. coli）に対する殺菌活性は、ヒト血漿の存在下で維持されるばかりでなく、顕著に強化された。ＴＦＰＩのＣ末端ペプチドによるエッシェリヒア・コリ（E. coli）の殺菌は、最近になって、古典的経路を介して媒介されており、そして膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の形成にリンクしている（３４）ことが示されたことはここにおいて注目されるべきである。その結果として、血漿を加熱して不活性化することによって、増強効果が抑止され、完全な補体系の存在は、この微生物を殺すことを促進することが示されている先の結果に適合している。これに加えて、ＴＦＰＩに由来するペプチドはまた、図３５及び３６に実証されているように、より高い濃度であっても（図３８Ａ）、直接ペプチドによって媒介される抗微生物作用に適合しており、加熱して不活性化した血漿中で殺菌を媒介していることは注目すべきことである。興味深いことには、エッシェリヒア・コリ（E. coli）での所見と対照的に、シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）の殺菌は、生理学的バッファーと比較して、ヒト血漿中では増強されなかった。更に、自然血漿の増強効果は、加熱して不活性化した血漿と比較して、顕著とはいえなかった（特にＧＧＬ２７及びＬＩＫ１７の場合）。上記の所見はエッシェリヒア・コリ（E. coli）及びシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）分離株のパネルを用いて一般化された（図３８Ｂ）。加えて、速度論研究によると、ペプチドによる細菌殺菌が５〜２０分以内に起こり、このことは多くの抗微生物ペプチドと互換性のある直接的な即効性を示していることが実証された（図４５）。
【０２８１】
ウェスタンブロット実験（図３９Ａ及びＢ）及びＦＡＣＳ解析（図３９Ｃ及びＤ）によって、ＧＧＬ２７は、Ｃ１ｑのエッシェリヒア・コリ（E.coli）への結合を増強することが示され、その結果、ＭＡＣの形成が増加した（図３９Ａ，Ｃ及びＤ）。これはまた、細菌への結合及び膜溶解によって媒介される、生理学的条件下での種々の細菌に対する抗微生物作用を発揮することが以前に示されているアナフィラトキシンであるＣ３ａの顕著な産生を誘発する（図３９Ｂ，Ｃ及びＤ）（２５）。これらをまとめると、こうした観察によって、ＧＧＬ２７の初期の細菌への結合（図３５Ａ）、引き続いて抗微生物性のＣ３ａの形成及び細菌への結合の増強を基にして（図３９Ｂ，Ｃ，及びＤ）、それ故、更にＧＧＬ２７によって誘発される全体の抗微生物作用が増大することになる（図３８Ｂ）細菌の殺菌の新規なメカニズムが提供される。こうした結果と対照的に、シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）をＧＧＬ２７に曝した後、Ｃ１ｑ／ＭＡＣにはいかなる顕著な修正も誘発されない（図３９Ａ，Ｃ及びＤ）。シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）に関連してＣ３ａを考慮すると、細菌結合ペプチド、並びにＣ３ａのＣ末端エピトープを含むより高分子量のペプチドのウェスタンブロットでは、わずかなＣ３ａバンドが同定された。ＦＡＣＳ解析では、こうしたＣ３ａを含んでいるフラグメントの産生の増加、及びこうしたＣ３ａを含んでいるフラグメントの細菌表面への結合が示された（図３９Ｃ及びＤ）。
【０２８２】
ＴＦＰＩは、普通は、血漿タンパク質と考えられるが、また内皮細胞、単球及びマクロファージによって発現される（１２）。免疫組織化学解析では、ＴＦＰＩは、正常ヒト皮膚、特に表皮基底層中で発現されることが示された（図４０Ａ）。更に、この分子は、急性創傷及び慢性下肢潰瘍の双方の傷縁で遍在的に発現されることが示された。慢性下肢潰瘍は、過度の慢性炎症状態、高レベルのプロテイナーゼ（例えば、プラスミン）及びシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）との頻繁な細菌コロニー形成によって特徴付けられる（３５）。従って、我々は、シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）によって感染された潰瘍などに起源するフィブリン瘡蓋を分析した。電子顕微鏡検査法及びＴＦＰＩのＣ末端部分に対する免疫金標識抗体によって実証されているように、こうしたペプチドエピトープは、細菌膜、並びにフィブリン線維に関連して見出された。二重染色法を用いて、Ｃ３ａは、こうしたＴＦＰＩ−ペプチドに特に関連していることが見出されたことは重要なことであった（図４０Ｂ）。従って、インビボのこうしたデータは、ＧＧＬ２７の微生物との結合に対する先の結果（図３９）、及びインビトロでの血漿中の抗微生物性のＣ３ａの産生の促進に対するそのかかわりに適合している。
【０２８３】
ヒトＴＦＰＩペプチドがマウス血漿中の細菌の殺菌を促進しないということは注目することである（図４１Ａ）。それにもかかわらず、マウス感染モデルにおける生存の延長が観察された（図４１Ｂ）。この観察の基礎をなしている可能性のあるメカニズムを説明するために、そしてＴＦＰＩの以前に報告されているＬＰＳ結合特性（１６）を考慮して、我々はＧＧＬ２７がインビトロ及びインビボで抗エンドトキシン作用を発揮しうるかどうかを検討した。その結果によれば、このペプチドは、マウス由来のマクロファージ（ＲＡＷ ２６４．７細胞）からのＬＰＳ媒介性ＭＯ放出を阻害し（図４１Ｃ）、そしてまた、ＬＰＳショックのマウスモデルにおける生存を顕著に増加させる（図４１Ｄ）ことが実際に示された。ＬＰＳ注入の２０時間後、サイトカインを分析すると、炎症誘発性のＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＭＣＰ−１が顕著に減少し、一方抗炎症性のＩＬ−１０は増加したことが示された（図４１Ｅ）。更に、ＧＧＬ２７によって処置された動物の肺において炎症及び血管漏出が著しく減少することが観察された（図４１Ｆ）。対照的に、２つのコントロールペプチド、ＴＦＰＩのＮ末端領域が起源のペプチドＤＳＥ２５、及びＳで置換されている“コア（core）”Ｋ／Ｒ残基を有しているペプチド ＧＧＬ２７（Ｓ）は、インビトロでＮＯ放出をブロックしないし、全サイトカイン放出、並びにインビボにおける生存を顕著に変化させるわけでもなかった（図４１Ｃ，Ｄ，Ｅ）。こうしたデータによって、エッシェリヒア・コリ（E. coli）及びシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）マウス感染モデルにおける改善の観察に適合する、ＧＧＬ２７の特異的な抗エンドトキシンの役割が実証された。更に、ＧＧＬ２７（Ｓ）の抗エンドトキシン活性の抑止はまた、この分子中の中央のカチオン性のＫ／Ｒ残基の重要性を強調している。総合すれば、この結果は、ＧＧＬ２７の他と異なる、宿主に関係する作用；宿主非依存性抗エンドトキシン作用そして宿主依存性及び補体ベース抗微生物機能、ＬＰＳ−相互作用及び補体−相互作用の異なる構造的必須要件の起こりうる論理的帰結を示している。この根拠の路線に沿って、図４２は、ＴＦＰＩのこの領域の進化を説明し、そしてカチオン性“コア（core）”の保存をハイライト表示しているが、また、このＴＦＰＩのＣ末端領域中のマウスとヒトの間の顕著な配列変化も強調している。
【０２８４】
考察
この研究のキーとなる所見は、皮膚内のＴＦＰＩの同定、創傷の間のそのアップレギュレーション、及び創傷中の存在と相俟って、直接的、そして補体媒介性殺菌作用、抗エンドトキシン作用の実証に基づく、ＴＦＰＩのＣ末端ペプチドのデュアル抗微生物活性の同定である。
【０２８５】
現在開示したＴＦＰＩのＣ末端ペプチドの直接的な抗菌作用では、補体Ｃ３（２５）、キニノゲン（３６，３７）、ヘパリン結合タンパク質（３８）、ヘパリン結合上皮成長因子及び他の成長因子（３９）、ヘパリン／ヘパラン硫酸相互作用蛋白質（heparin/heparan sulfate interacting protein）（４０）、β２−グリコプロテイン（４１）、ヒスチジンリッチグリコプロテイン（４２）、及びヒトトロンビン（４３）などのヘパリン結合タンパク質は、ホロタンパク質としてでも、それとも断片化した後であっても、インビトロで、いくつかの例ではインビボでも（３６，３７，４２）、抗微生物活性を発揮することができるということを示している観察に一致している。加えて、強化されたＭＡＣ形成と共に、ペプチド媒介性Ｃ３ａは、それによって宿主防御ペプチドが更なる補体由来ＡＭＰの産生によって殺微生物を選択的に増強することができるメカニズムを示す。凝固と補体系の間の重要なクロストーク（cross-talk）を示している最近の証拠（４４）によれば、更にＴＦＰＩ−ペプチドによるＣ３ａの産生の促進との生物学的な関連性がもたらされる。
【０２８６】
ＴＦＰＩのＣ末端領域を考慮すると、この領域に由来するペプチドは、低いヘリックス含量の他の線状のペプチドと似ている。例えば、成長因子に由来する抗微生物ペプチドはまた、規則的に組み入れられている疎水性残基（３９）などの“古典的（classical）”ヘリックスペプチドに典型的なそれらの低含量特徴を反映して、膜の存在下で低いヘリックス含量を示している。更に、キニノゲン由来の抗微生物ペプチドであるＨＫＨ２０（ＨＫＨＧＨＧＨＧＫＨＫＮＫＧＫＫＮＧＫＨ［配列番号１０５］）（４５）に関する研究によって、ＨＫＨ２０ペプチドは、バッファー中で大部分はランダムコイルコンフォメーションを呈し、そして脂質二重層で、静電気に支配されている相互作用を呈している（４５）ことが示された。
【０２８７】
ＴＦＰＩに由来するペプチドのように、ＨＫＨ２０（３６）及びヘパリン結合成長因子に由来するペプチドであるＧＫＲ２２（ＧＫＲＫＫＫＧＫＧＬＧＫＫＲＤＰＣＬＲＫＹＫ［配列番号１０６］）（３９）の双方とも、生理学的条件でそれらの抗菌活性を保持していることは注目に値することである。
【０２８８】
上記に関係して、最近の研究によれば、いくつかの低い両親媒性ペプチドは強力な静電相互作用、例えば、負の曲率の歪み（negative curvature strains）、膜の薄層化、又は脂質ドメインの形成をもたらすことによって大抵の場合は活性を示し、時々、その結果として、生物学的機能に影響する細菌膜の流動性変化になることが示されて（４６）いることは興味深い。
【０２８９】
先に言及したように、ＬＬ−３７（３１）、Ｃ３ａ（２５）、トロンビン−由来及びキニノゲン−由来のペプチド（３６，３７，４３）を含む、多くの抗微生物ペプチドがタンパク質分解の間に放出される。ＴＦＰＩを考慮すると、プラスミン及びトロンビンのような酵素は、創傷などの生理学的事象に関連する別個のＣ末端断片を放出する。それ故、トロンビンによるフィブリンクロット中に産生されるＴＦＰＩに由来するペプチド（２０）は、創傷治癒の間抗微生物活性に貢献することができる。その上、プラスミンによるその後のタンパク質分解（ＧＧＬ２７を産生）（２１）は、更にまた、放出される広範囲の宿主防御ペプチドを増加させることができる。上記に言及したごとく、微小血管の内皮細胞でその合成、及びそれに引き続く内皮、血漿、及び血小板での産出のほかに、ＴＦＰＩはまた、肝臓によって産生され、そして単球及びマクロファージ中に見出される（１２）ということは注目すべきである。ＴＦＰＩの産生はまた、毛細血管、巨核細胞、いくつかの細胞系、並びに新生細胞中で確認されている。ヒト皮膚の創傷の間のＴＦＰＩの著しいアップレグレーション、並びにフィブリン中、及び細菌でのその出現に結びついているこういった証拠によって、高い局所レベルの内因性のＴＦＰＩペプチドは、インビボで発生しうることが示唆されている。このペプチドがエッシェリヒア・コリ（E. coli）に対してヒト血漿中で特に活性であり、そしてそれほどではないにせよシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）に対しても活性であるという所見は、こうした創傷における極めてわずかのエッシェリヒア・コリ（E. coli）コロニー形成（３５，４７）と対照的に、慢性下肢潰瘍中のシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）の遍在する出現に照らして特に意味をもち、かつ興味深い。更に、細菌性のオンプチン（例えば、エッシェリヒア・コリ（E. coli）に起源するＯｍｐＴ）は、ＴＦＰＩに由来するＧＧＬ２７断片を放出することができるという実証に基づいて、最近になって、ＴＦＰＩは、オンプチンによって媒介されるタンパク質分解の不活性化に対する感受性を進化させ、いくつかの状態におけるエッシェリヒア・コリ（E. coli）感染に応答するプロコアグラントを増強する（４８）ということが提案されている。更に、我々のデータによって、別の宿主応答メカニズム；ＯｍｐＴによって媒介される宿主防御ペプチドＧＧＬ２７の産生；をエッシェリヒア・コリ（E. coli）感染に結びつけることによって、この仮説が実証されている。
【０２９０】
炎症と凝固とを同時に制御することは、ホメオスタシスを維持する際のキーとなる役割を演じており、そして組み換えＴＦＰＩを利用する試験によって、タンパク質がエッシェリヒア・コリ（E. coli）によって誘発された重篤な敗血症（４９）から防衛することが示されており、そして更にＴＦＰＩはまた、重篤な院外感染性肺炎に罹患している患者を含むフェーズＩＩＩの臨床試験の評価段階にあることは注目に値することである。この文脈で、インビトロ及びインビボでのＧＧＬ２７の抗エンドトキシン作用のここでの観察が、以前に観察されたエッシェリヒア・コリ（E. coli）敗血症時のＴＦＰＩの防衛作用（４９）の少なくとも一部ではあるが、説明できることを指摘することは興味深いところである。直接的及び間接的な、ＭＡＣ及びＣ３ａによって媒介される、ＴＦＰＩのＣ末端エピトープ、ＧＧＬ２７の抗微生物作用を示している最近の所見は、重篤な感染症と戦うペプチドベースの療法をデザインし、そして開発する際の将来の試みに対する意味合いを持つことができる。最後に、ＴＦＰＩ−ペプチドが、エクスビボでのマウス血漿中の殺菌を顕著には促進しなかったということ、並びに細菌性敗血症の間の全生存を増加させなかった（生存延長は観察されたけれども）という所見では、補体によって媒介される細菌クリアランスを含む側面のような、ヒトＣ末端ＴＦＰＩペプチドの生理学的な役割のある種の側面を評価することに関して言えば、マウスモデルは、不利であったかもしれないということが説明される。興味深いことには、一方では、ＴＦＰＩ−α形態（Ｃ末端カチオン性配列を有する）は、ヒトにおける支配的な形態であり、マウスでは、大抵の場合、ＴＦＰＩ−β（Ｃ末端配列を欠如している形態）を産生しているようであり（５０）、この観察は、上記に言及したヒトにおけるユニークなＣ末端及びＯｍｐＴを放出しうるペプチドの進化に適合している。
【０２９１】
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【０２９２】
実施例Ｃ−ＨＲＧ及びＡＴIIIに由来する例示的なペプチドの抗凝固及び抗炎症作用
ヒスチジンリッチグリコプロテイン（ＨＲＧ）
序論
ヒスチジンリッチグリコプロテイン及びＧＨＨ２５
抗微生物血漿タンパク質であるヒスチジンリッチグリコプロテイン（ＨＲＧ）は、インビボにおける全身微生物感染に対して宿主を保護している。本明細書では、我々は、ＨＲＧは、宿主細胞中でＬＰＳに結合し、そしてＬＰＳ媒介性ＴＬＲ−４応答を増加させることから、パターン認識分子であることを示している。
【０２９３】
ＬＰＳは、マクロファージ、単球及び好中球上の受容体であるＣＤ１４と相互作用し、この相互作用は血漿タンパク質ＬＢＰ（ＬＰＳ結合タンパク質）によって増強される。このＬＰＳ／ＣＤ１４複合体は、トル様受容体（ＴＬＲ）４の活性化をもたらし、該トル様受容体（ＴＬＲ）４は、次にＭｙＤ８８依存性又は非依存性経路を活性化する［１］。このＬＰＳ応答はまた、ＬＢＰ非依存性でありうる［２］。ＬＰＳ注入後、野生型及びＬＢＰ欠損マウスの間には、インビボにおけるＴＮＦ−α放出の差はなく、ＬＢＰ様能力を有するタンパク質が原因でありうることが示唆されている［３］。次いでＴＬＲ４の活性化によって、単核食細胞の食細胞活性の増加、炎症応答を開始し、そしてサポートする放出されたサイトカイン及び一酸化窒素（ＮＯ）のカスケードがもたらされる。ＮＯは一酸化窒素シンターゼと呼ばれる一群の酵素によって産生され［４］、微生物、寄生虫及び腫瘍に対して宿主を保護することなどの多くの生物学的プロセスに関与し、そして血圧を調節しているが、ＮＯの高レベルは、むしろ細胞傷害性でありえ、そして内在組織を破壊しうる。
【０２９４】
ＬＰＳによって誘発される応答は、宿主防御にとって不可欠であるが、高度の応答はむしろ敗血症をもたらしうる。サイトカイン及びＮＯは、熱、凝固活性、敗血症ショック、多臓器不全などの症状を有する敗血症ショックの発症、そして最悪の場合には宿主の死の主要な引き金となることが確認されている［５］。このことは、ＬＰＳによって誘発される死に抵抗性のある誘導型ＮＯＳ（ｉＮＯＳ）変異マウスの存在という事実によって支持されている［６］。種々の動物種のＬＰＳ毒性に対する感受性には高い変動性があり、例えば、かなり抵抗性があるマウス［９］と比較してヒトは極めて感受性を有している［７，８］。敗血症は炎症性誘発メディエーターだけで制御されるという共通している誤解がある。敗血症の初期段階は、ＴＮＦ−α、ＮＯ、ブラディキニン、トロンビン及びヒスタミンなどの炎症性誘発メディエーターが支配しているが、一方、後期段階の間では、ＩＬ−６、活性プロテインＣ、アンチトロンビン及び顆粒球コロニー刺激因子などの抗炎症メディエーターが、最も広範囲に存在している［１０］。
【０２９５】
現在、敗血症の処置には、点滴の静脈内投与、広域スペクトル抗生物質、肺保護換気法、グルココルチコイド、インスリン療法及び組み換えヒト活性化プロテインＣ（recombinant human activator protein C）（ＡＰＣ）が含まれる。ＬＰＳを中和し、あるいはＬＰＳによって媒介される宿主の免疫細胞の活性化を阻止するために、例えば、サイトカイン活性を、抗体を用いてブロックすること、ＮＯ産生をブロックすること［１１］、及びＬＰＳの中和剤として抗微生物ペプチドを用いること［１２］によるなど多くの試みがなされている。
【０２９６】
この研究の目的は、ＬＰＳによって媒介される応答に対する、豊富な血漿タンパク質、ＨＲＧの作用を検討することであった。ＨＲＧは、肝臓で合成される６７ｋＤａの血漿タンパク質であり、１９７２年にはじめて説明された［１３，１４］。ＨＲＧはまた、血小板のα顆粒に起源するトロンビン活性によって放出されえ、そしてフィブリンクロットの表面を覆うことができる。フェチュイン及びキニノゲンと一緒に、ＨＲＧは、シスタチンスーパーファミリーに属する。このタンパク質の最も際立った特徴は、このタンパク質のヒスチジンリッチドメインが、保存性のあるＧＨＨＰＨ繰り返しを含んでいることである［１５］。ＨＲＧは、ヘパリン、プラスミノゲン、フィブリノゲン、トロンボスポンジン、ヘム、ＩｇＧ、ＦｃｇＲ及びＣ１ｑのような多様な群のリガンドとインビトロで相互作用することが示されている。インビボ研究では、ＨＲＧは抗凝固及び抗線溶調節物質（modifier）であり［１６］、腫瘍血管新生に対する抑制作用を有し［１７］、そして抗微生物タンパク質として自然免疫において重要な役割を果たしている［１８］ことが実証されている。
【０２９７】
本明細書では、我々は、ＬＰＳによって誘発されたＮＯ及びサイトカインをインビトロで高めることからＨＲＧが強力な炎症誘発性タンパク質であることを実証する。インビボ実験により、Ｈｒｇ-/-マウスがＬＰＳによって誘発された敗血症に対して著しく抵抗性があることが示された。我々のデータによれば、ＨＲＧは実験的内毒素血症においてＬＰＳ毒性をもたらす一因であることがはっきり実証された。このデータはまた、ＧＨＨ２５の抗炎症作用を証明している。
【０２９８】
材料及び方法
合成ペプチドＧＨＨ２５（ＧＨＨＰＨＧＨＨＰＨＧＨＨＰＨＧＨＨＰＨＧＨＨＰＨ［配列番号１１］）は、Biopeptide（San Diego, CA, USA）に起源した。ウサギ抗マウスＴＲＬ４ポリクローナル（Polyclonal rabbit anti mouse TRL4）を、GeneTex（Irvine, CA, USA）から購入した。サイトメトリックビーズアレイ、マウス炎症キットは、BD Biosciences（Stockholm, Sweden）に起源した。エッシェリヒア・コリ ＬＰＳ（０１１１：Ｂ４）は、Sigma(St Lois, MO）から購入した。
【０２９９】
ヒトＨＲＧの精製。血清ＨＲＧを以前に記載されている通りに精製した［１９］。簡単に述べれば、ヒト血清をニッケルニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）アガロースと共に、４℃で終夜ゆっくり振とうし、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）で洗浄した。まず８０ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳで、非特異的に結合したタンパク質を溶離し、次いで５００ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳで精製されたＨＲＧを溶離して、溶離を行なった。このタンパク質を透析し、凍結乾燥し、そしてブラッドフォード法を用いて、濃度を決定した［２０］。
【０３００】
ヘパリン及びＬＰＳの放射ヨウ素標識。ヘパリン（ブタ腸粘膜由来，Sigma-Aldrich）の放射ヨウ素標識を以前に記載されている通りに行なった［２１］。ＬＰＳのヨウ素標識化は、Ulevitchが述べている通りに行なった［２２］。１ｍｇのエッシェリヒア・コリ ０１１１：Ｂ４ ＬＰＳを、ホウ酸バッファー中の５０ｍＭのｐ−ＯＨメチルベンズイミデート（benzimidate）中で（ｐＨ８）、４℃で終夜インキュベートし、次いでＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して透析した。次いでＬＰＳを、クロラミンＴ法を用いて125Ｉで放射標識し、次いで非標識125Ｉを透析によって除去した。
【０３０１】
ヘパリン及びＬＰＳ結合アッセイ。１００μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１、２及び５μｇの合成ペプチドをニトロセルロース膜（Hybond-C, Amersham Biosciences）の上にスロットブロット装置を用いて塗布した。膜をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、２％ウシ血清アルブミンを用いて室温で１時間ブロッキングし、次いで放射標識ＬＰＳ（約４０μｇ・ｍＬ-1，０．１３×１０6ｃｐｍ・μｇ−１）、又は放射標識ヘパリン（約１０μｇ・ｍＬ-1，０．４×１０6ｃｐｍ・μｇ-1）と共に、室温で１時間ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でインキュベートした。非標識ヘパリン（６ｍｇ／ｍｌ）を結合競合のために加えた。この膜をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。Bas2000放射イメージングシステム（radio-imaging system）（富士フィルム，東京，日本）が放射能を可視化するのに用いられた。
【０３０２】
細胞培養。マウスマクロファージセルライン，ＲＡＷ ２６４．７（Dr.H Bjoerkbackaから厚意により提供された）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（Dulbeccos Modified Eagle Medium）（DMEM）（Gibco）中で増殖させた。実験はすべて、血清のない条件下で行なわれた。
【０３０３】
ＲＡＷ マクロファージにおける一酸化窒素の誘導。コンフルエント細胞を回収し、そして９６ウェルプレートに移した（３．５×１０5／ウェル）。接着細胞をフェノールレッド不含ＤＭＥＭ（Gibco）で洗浄した後、エッシェリヒア・コリＬＰＳ（E. Coli LPS）（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＬＬ−３７（２若しくは１０μＭ）又はＨＲＧ（２若しくは１０μＭ）を、３７℃で３０分間プレインキュベートし、次いでこの細胞に移した。ＮＯ誘導の抑止のため、５μｇ／ｍｌの抗マウスＴＬＲ４抗体、１０若しくは１００μＭのＧＨＨ２５又は１００μｇ／ｍｌのヘパリンを使用した。この細胞を２４時間刺激し、そして一酸化窒素をグリエス（Griess）化学方法を用いて決定した［２３］。
【０３０４】
ヒトマクロファージに起源するＴＮＦ−α放出。ヒト単球由来のマクロファージ（ｈＭＤＭｓ）を、Lymphoprep（Axis-Shield PoC AS）密度勾配を用いて健常ドナーの血液から得られた末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣｓ）から得た。ＰＢＭＣｓを３×１０6細胞／ウェルの濃度で２４ウェルプレートに播種し、そして５％ＣＯ2の加湿雰囲気中で、１０％加熱不活性化した自家移植ヒト血漿（heat-inactivated autologous human plasma）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、及び５０μｌ／ｍｌ 抗生物質−抗真菌薬を補充したＲＰＭＩ １６４０培地（Gibco）中で培養した。２４時間後、非接着細胞を除去し、そして隔日にフレッシュな培地と交換して、接着単球を１０日間にわたって分化させるとマクロファージになった。この細胞を無血清条件下でＨＲＧ（２μＭ）及びＧＨＨ２５（１００μＭ）を加えるか、又は加えずに、２４時間、１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激した。刺激の後、上清を吸引し、そしてＴＮＦ−αを、ＴＮＦ−α ヒトＥＬＩＳＡキット（Invitrogen）を用いて測定した。
【０３０５】
動物実験。初代ノックアウトマウス１２９／Ｂ６−ＨＲＧtm1wja1を、１４世代にわたってＣ５７ＢＬ／６マウス（Taconic）と交配して、均一な遺伝子バックグラウンドを得た。こうしたＨＲＧ−欠損マウス株は、ＩＬＡＲ（研究用動物資源協会（Institute of Laboratory Animal Resources））規則に従ってＢ６−ＨＲＧtm1wja1と呼ばれた。野生型Ｃ５７ＢＬ／６コントロールマウス及びＣ５７ＢＬ／６Ｈｒｇ-/-マウス（８〜１２週齢、２７＋／−４ｇ）を、ルンド大学（Lund University）の動物施設で繁殖させた。Ｃ５７ＢＬ／６Ｈｒｇ-/-では、Ｈｒｇ遺伝子のエクソン１の翻訳開始点が欠如している［１６］。動物を光と温度の標準条件下で収納し、そして標準的な研究用のエサと水に自由にアクセスさせた。敗血症を誘発させるために、１８μｇ／ｇのエッシェリヒア・コリ０１１１：Ｂ４ ＬＰＳを、体重及び性別対応群に分割して、Ｃ５７ＢＬ／６又はＣ５７ＢＬ／６Ｈｒｇ-/-マウスに腹腔内注入した。生存及び状況を７日間にわたって追跡した。
【０３０６】
ＧＨＨ２５ペプチドで処理する場合、１ｍｇのペプチド（１０ｍＭ Ｔｒｉｓに希釈した，ｐＨ７．４）又はバッファーのみをＬＰＳチャレンジの３０分後に腹腔内注入し、次いで生存及び状況を追跡した。
【０３０７】
アンチトロンビンIII
セルピンは、プロテアーゼを阻害することができる一連のタンパク質として最初に特定された類似の構造を有する一群のタンパク質である。頭字語であるセルピン（serpin）は、多くのセルピンがキモトリプシン様セリンプロテアーゼを阻害する（セリンプロテアーゼインヒビター：serine protease inhibitors）という理由で当初作られた。広範囲に研究されたセルピンスーパーファミリーの当初のメンバーは、ヒト血漿タンパク質であるアンチトロンビン及びアンチトリプシンであり、これらはそれぞれ、血液凝固及び炎症を制御する際に重要な役割を演じている。
【０３０８】
セルピンに関する構造研究によって、このファミリーの阻害メンバーは、ストレスから緩和への(S to R)転移と呼ばれている他とは異なるコンフォメーション変化を受けることが明らかとなった。セルピンのこのコンフォメーション可動性は、静止した鍵と鍵穴であるプロテアーゼインヒビターより勝る重要な利点を提供している。特に、阻害性セルピンの機能はヘパリンのような特異的なコファクターによって容易に制御することができる。こうした状況の典型的な例は、アンチトロンビンであり、該アンチトロンビンは、比較的不活性な状態で血漿中を循環する。長鎖ヘパリン内で高親和性ヘパリンペンタサッカライド配列に結合すると、アンチトロンビンは、コンフォメーション変化を受け、このメカニズムに重要なキーとなる残基が露出される。従って、アンチトロンビンのこのヘパリンペンタサッカライド結合形態は、トロンビン及び第Ｘａ因子のより有効なインヒビターである。更に、こうした双方の凝固プロテアーゼは、ヘパリンの結合部位（エキソサイト（exosites）と呼ばれている）を含んでいる。それ故、ヘパリンはまた、プロテアーゼとセルピンの結合のための双方のテンプレートとして機能し、更に２つの相手間の相互作用を劇的に促進する。最初の相互作用の後、最終的にはセルピン複合体が形成され、そしてこのヘパリン部分が放出される。
【０３０９】
材料及び方法
（上記と同様）
【０３１０】
結果
アンチトロンビンIIIの１５３〜１７３番（アクセション番号Ｐ０１００８）としての、ＦＦＦ２１ペプチド（ＦＦＦＡＫＬＮＣＲＬＹＲＫＡＮＫＳＳＫＬＶ［配列番号１］）は、抗菌及び抗炎症特性を示す（図５６参照）。
【図面の簡単な説明】
【０３１１】
【図１】ＴＦＰＩのＣ末端ペプチドのＮＯブロッキング作用。  ＲＡＷ ２６４．７マクロファージを、１０ｎｇ／ｍｌのエッシェリヒア・コリ ＬＰＳ（E.coli LPS）で刺激し、そして１０μＭのペプチド ＧＧＬ２７、ＬＩＫ１７及びＴＫＲ２２を加えた。ＮＯをグリエス（Griess）試薬を用いて測定した。
【図２】ヘパリンコファクターIIのペプチドのＮＯブロッキング作用。  ＲＡＷマクロファージを、１０ｎｇ／ｍｌのエッシェリヒア・コリ ＬＰＳ（E.coli LPS）で刺激し、そしてペプチドＫＹＥ２８、ＮＬＦ２０、及びＫＹＥ２１を指定用量で加えた。ＬＬ−３７をポジティブコントロールとして提示した。ＮＯを、グリエス試薬を用いて測定した。
【図３】ヘパリンコファクターIIのペプチドの抗炎症作用。  ＫＹＥ２８、ＫＹＥ２１及びＮＬＦ２０は、種々の微生物生産物で刺激されたＲＡＷ２６４．７マクロファージのＮＯ産生をブロックする。細胞は、指定濃度のエッシェリヒア・コリ ＬＰＳ（E.coli LPS）、スタフィロコッカス・アウレウス（S.aureus）に起源するリポタイコ酸（ＬＴＡ）及びペプチドグリカン（ＰＧＮ）、並びにサッカロミセス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に起源するザイモサンＡに処された。ＮＯ産生を、１０μＭ ＧＫＹ２５を加えるか、又は加えずに、グリエス試薬を用いることによって決定した。
【図４】ＨＲＧは、ＬＰＳに結合する。  ２及び５μｇのＨＲＧをニトロセルロース膜上に塗布し、引き続いて、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、又は１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．５中のヨード処理したＬＰＳと、ＮａＣｌ添加（０．１５Ｍ）又は無添加で、インキュベーションした。放射能をphosphorimager systemを用いて可視化した。
【図５】ＨＲＧは、マウスマクロファージに起源するＬＰＳ媒介性ＮＯ放出を増加させる。  ＲＡＷマクロファージを、１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳと、ＬＬ−３７及びＨＲＧは添加（２及び１０μＭ）又は無添加で、２４時間インキュベートした。この上清を吸引し、そしてＮＯを、グリエス法を用いて測定した。ＨＲＧは、用量依存の形でＬＰＳ媒介性ＮＯ放出を有意に増加させた（ｎ＝６，ｐ＝０．００１）。
【図６】ＴＬＲ４に対する抗体はＮＯ放出をブロックする。  ＲＡＷマクロファージを、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳと、ＨＲＧ（２μＭ）は添加又は無添加、及び抗マウスＴＬＲ４ポリクローナル抗体（polyclonal anti mouse TRL4）（５μｇ／ｍｌ）は添加又は無添加で、２４時間インキュベートした。この上清を吸引し、そしてＮＯを、グリエス法を用いて測定した。抗マウスＴＬＲ４は、ＬＰＳ及びＨＲＧ媒介性ＮＯ放出を有意にブロックすることができた。（ｎ＝６，ｐ＝０．００１）。
【図７】Ｈｒｇ-/-マウスでのＬＰＳによって誘発された敗血症における生存の増加。  ＬＰＳチャレンジ後のＨｒｇ-/-マウスの生存の増加。野生型（破線）及びＨｒｇ-/-(実線）マウスに、エッシェリヒア・コリ（E. coli）ＬＰＳをi.p.注入し、そして動物生存を７日間にわたって追跡した。ＨＲＧ欠損マウス（ｎ＝８）は、野生型動物と比較して有意に生存を増加させることが示された（ｎ＝９，ｐ＝０．００２）。
【図８】ＬＰＳチャレンジの１８時間後の目視による観察スコア。  野生型（ｗｔ）及びＨｒｇ-/-マウスの状態をＬＰＳチャレンジの１８時間後に目視で観察した（逆立った毛衣（ruffled fur）、猫背及び死直前（hunched and pre-mortal））。野生型マウスは、目視で有意に病的であり、野生型（ｗｔ）及びＨｒｇ-/-マウスの状態をＬＰＳチャレンジの１８時間後に目視で観察した（逆立った毛衣［黒色］、猫背［淡灰色］及び死直前［濃灰色］）。野生型マウスは、Ｈｒｇ-/-マウスと比較して目視で有意に病的であった。（ｐ＝０．００１，ｎ＝１０）。
【図９】ＬＰＳチャレンジ後、野生型動物と比較してＨｒｇ-/-マウスの肺では血管漏出が減少する。  野生型（ｗｔ）及びＨｒｇ-/-マウスの肺を、ＬＰＳをi.p.注入後、走査型電子顕微鏡検査法によって解析した。Ａ）は野生型 Ｂ）はＨｒｇ-/-、Ｃ）は、ＬＰＳ処理の２４時間後の野生型（ｗｔ）、Ｄ）は、ＬＰＳ処理の２４時間後のＨｒｇ-/-である。スケールバーは、５０μｍを表す。代表的な肺切片が示されている。
【図１０】マウスマクロファージにおいて、ＧＨＨ２５は、ＨＲＧ及びＬＰＳによって誘発された応答を抑制する。  ＲＡＷマクロファージを、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳと、ＨＲＧ（２μＭ）及びＧＨＨ２５（１０及び１００μＭ）は添加又は無添加で、２４時間インキュベートした。この上清を吸引し、そしてＮＯを、グリエス法を用いて測定した。ＧＨＨ２５は、用量依存の形でＬＰＳ及びＨＲＧ媒介性ＮＯ放出を有意に減少させた。（ｎ＝６，ｐ＝０．００１）。
【図１１】ヒトマクロファージにおいて、ＧＨＨ２５は、ＨＲＧ及びＬＰＳによって誘発された応答を抑制する。  ヒトマクロファージを、１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳと、ＧＨＨ２５（１０及び１００μＭ）は添加又は無添加で、そしてＨＲＧ（２μＭ）は添加又は無添加で、２４時間インキュベートした。上清を吸引し、そしてＴＮＦ−αを測定した。
【図１２】ＧＨＨ２５での処置後のＬＰＳによって誘発された敗血症における健康状態の改善と生存の増加。  ＧＨＨ２５での処置後の野生型マウスの生存の増加。野生型動物にエッシェリヒア・コリ（E. coli）ＬＰＳをi.p.注入し、そして３０分後に１ｍｇのＧＨＨ２５（破線）、又はバッファーのみ（実線）を注入した。動物の生存を７日間にわたって追跡した。ＧＨＨ２５で処置したマウス（ｎ＝１３）は、未処置の動物と比較して有意に生存を増加させたことが示された（ｎ＝１２，ｐ＝０．０３）。
【図１３】ＬＰＳチャレンジの１８時間後の目視での観察スコア。  野生型（ｗｔ）及びＨｒｇ-/-マウスの状態を、ＬＰＳチャレンジの１８時間後に目視で観察した（逆立った毛衣（ruffled fur）、猫背）。野生型マウスは、目視で有意に病的であり、野生型（ｗｔ）及びＨｒｇ-/-マウスの状態をＬＰＳチャレンジの１８時間後に目視で観察した（逆立った毛衣［黒色］、猫背［淡灰色］及び死直前［濃灰色］）。野生型マウスは、Ｈｒｇ-/-マウスと比較して目視で有意に病的であった。（ｐ＝０．００４，ｎ＝１２）。
【図１４】ＴＦＰＩのＣ末端ペプチドは、凝固をブロックする。  （Ａ）ＴＦＰＩのＣ末端ペプチド；ＧＧＬ２７、ＬＩＫ１７、及びＴＫＲ２２は、正常ヒト血漿における凝固の外因系経路を弱める。これは活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を測定することによって決定した。ＧＧＬ２７及びＬＩＫ１７はまた、凝固の内因系経路をモニタリングするプロトロンビン時間（ＰＴ）に影響を与えた。トロンビン誘発フィブリンネットワーク形成を測定するトロンビン凝固時間（ＴＣＴ）は、ペプチド類によっては有意に影響されなかったが、（Ｂ）ＧＧＬ−２７では、用量依存の形で凝固を弱め、このことは正常ヒト血漿におけるａＰＴＴ、ＰＴ及びＴＣＴを測定することによってモニタリングされた。
【図１５】ヘパリンコファクターIIのペプチドは、凝固をブロックする。  ＫＹＥ２８及びＮＬＦ２０は、正常ヒト血漿における凝固の内因系経路を弱め、このことは活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を測定することによって決定された。ＫＹＥ２１は、ａＰＴＴのわずかなブロックを示したに過ぎなかった。凝固システムの他の部分では、凝固の外因系経路をモニタリングするプロトロンビン時間（ＰＴ）、及びトロンビン誘発フィブリンネットワーク形成を測定するトロンビン凝固時間（ＴＣＴ）によって判断して、顕著には影響が与えられなかった。
【図１６】ＴＦＰＩの構造を図解している略画。  酵素による切断部位が指定されている。
【図１７】ＴＦＰＩに由来するペプチドの抗微生物活性。  指定微生物に対する選択されたペプチド（１００μＭ（ＲＤＡ中））の抗微生物活性。抗微生物活性を決定するために、エッシェリヒア・コリ（E. coli） ATCC 25922、スタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus） ATCC 29213分離株（isolates）（４×１０6cfu）又はカンジダ・パラプシロシス（C. parapsilosis）ATCC 90018（１×１０5cfu）を０．１％ＴＳＢ アガロースゲル中に接種した。それぞれ、４ｍｍ直径のウェルに６μｌのペプチドをローディングした。３７℃で１８〜２４時間インキュベーションした後、クリアランスゾーンがそれぞれのペプチドの抑制効果に相当する（平均値が提示される、ｎ＝３）。
【図１８】ＴＦＰＩに由来するペプチドの抗菌活性。  生菌数アッセイ（viable count assays）において、エッシェリヒア・コリ（E. coli）、シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）、及びストレプトコッカス・アウレウス（S. aureus）に対するＴＦＰＩに由来するペプチド及びＬＬ−３７の作用。２×１０6ｃｆｕ／ｍｌの細菌を、正常又は加熱不活性化した２０％ヒト血漿を含んでいる、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４バッファー（Ｔｒｉｓ）中、あるいは０．１５ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中、ペプチドを指定濃度で含む５０μｌ中でインキュベートした（ｎ＝３、ＳＤは指定されている）。
【図１９】速度論分析。  ２０％血漿を含んでいる０．１５ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中のＴＦＰＩに由来するペプチド（６μＭ［左方パネル］及び３０μＭ［右方パネル］）による時間依存的殺菌をエッシェリヒア・コリ（E.coli）を用いる生菌数アッセイによって分析した。
【図２０】細菌膜に対する作用。  （Ａ）シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）及びエッシェリヒア・コリ（E. coli）に対するペプチドの透過性作用。（Ａ）細菌を指定のペプチドと共にインキュベートし、そして、透過性を不透過性プローブＦＩＴＣを用いて評価した。（Ｂ）電子顕微鏡分析。シュードモナス・エルギノーサ及びスタフィロコッカス・アウレウス細菌を、３０μＭのＧＫＹ２５及びＬＬ−３７で、３７℃で２時間インキュベートし、そして電子顕微鏡で解析した。スケールバーは１μｍであった。コントロール；バッファーコントロール。
【図２１】ＴＦＰＩペプチド ＬＩＫ１７の構造。  マイナスに荷電されたリポソーム（ＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ）の存在下でのＴＦＰＩに由来するＣ末端ペプチドのへリックス含量。ＬＩＫ１７構造は、リポソームの添加によってほとんど影響されなかった。
【図２２】トリスバッファー中及びＬＰＳの存在下でのＬＩＫ１７のＣＤスペクトル。  コントロールのために、バッファーとＬＰＳのみのＣＤスペクトルも提示された。
【図２３】リポソーム漏出（liposome leakage）に対する指定ペプチドの作用。  膜透過性作用は、ＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ（マイナスに荷電されている）リポソームに起源するカルボキシフルオレセインの蛍光放出を測定することによって記録した。この実験は、１０ｍＭトリスバッファー、ｐＨ７．４中で行なわれた。値は３連のサンプルの平均に相当する。
【図２４】真核生物細胞に対する活性。  指定ペプチドの溶血作用。細胞をこのペプチドの種々の濃度でインキュベートし、２％トリトンＸ−１００（Sigma-Aldrich）をポジティブコントロールとして機能させた。ヘモグロビン放出の吸光度をλ５４０ｎｍで測定し、そしてトリトンＸ−１００で誘発された溶血の％として表現した（ｙ軸のスケールに留意する）。ＬＬ−３７の作用を比較のために示す。
【図２５】ＨａＣａＴケラチノサイトを指定ＴＦＰＩ−ペプチド並びにＬＬ−３７に処した。細胞の透過性作用をＬＤＨベースＴＯＸ−７キットによって測定した。細胞からのＬＤＨ放出は、λ４９０ｎｍでモニタリングし、そして全ＬＤＨ放出％としてプロットした。
【図２６】ＭＴＴアッセイを、指定ペプチドの存在下（６０μＭ）で、ＨａＣａＴケラチノサイトの生存能力を測定するのに使用した。このアッセイでは、ＭＴＴは、代謝活性に関連する酵素によって、１つの色素、青色のホルマザンに変化する。色素の吸光度をλ５５０ｎｍで測定した。
【図２７】ヘパリンコファクターIIに由来するペプチドの抗微生物活性。  ＲＤＡにおける選択されたペプチド（１００μＭ）の指定の微生物に対する抗微生物活性。エッシェリヒア・コリ（E. coli）ATCC 25922、スタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus） ATCC 29213分離株（４×１０6cfu）又はカンジダ・パラプシロシス（C. parapsilosis）ATCC 90018（１×１０5cfu）を、０．１％ ＴＳＢアガロースゲル中に接種した。それぞれ、４ｍｍ直径のウェルに６μｌのペプチドをローディングした。３７℃で１８〜２４時間インキュベーションした後、クリアランスゾーンがそれぞれのペプチドの抑制効果に相当する（平均値が提示される、ｎ＝３）。
【図２８】（上方）生菌数アッセイにおけるヘパリンコファクターIIに由来するペプチド及びＬＬ−３７のエッシェリヒア・コリ（E. coli）に対する抗菌作用。２×１０6ｃｆｕ／ｍｌの細菌を、ペプチドを指定された濃度で、２０％ヒト血漿を含んでいる、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４バッファー（Ｔｒｉｓ）中、あるいは０．１５ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中、ペプチドを指定濃度で含む５０μｌ中でインキュベートした（ｎ＝３、ＳＤは指定されている）。（下方）２０％血漿を含んでいる０．１５ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中のヘパリンコファクターIIに由来するペプチド（６及び３０μＭで）による時間依存的殺菌をE.coliを用いる生菌数アッセイによって解析した。ＬＬ−３７（３０μＭ）が比較のために使用された。
【図２９】細菌膜に対する作用。  （Ａ）シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）及びエッシェリヒア・コリ（E. coli）に対するペプチドの透過性作用。（Ａ）細菌を指定のペプチドと共にインキュベートし、そして、透過性を、不透過性プローブＦＩＴＣを用いて評価した。（Ｂ）電子顕微鏡分析。シュードモナス・エルギノーサ及びスタフィロコッカス・アウレウス細菌を、３０μＭのＮＬＦ２０及びＬＬ−３７と共に３７℃で２時間インキュベートし、そして電子顕微鏡で解析した。スケールバーは１μｍであった。コントロール；バッファーコントロール。
【図３０】リポソームに対する構造及び作用。  （Ａ）マイナスに荷電されたリポソーム（ＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ）の存在下でのヘパリンコファクターIIに由来するＣ末端ペプチドのへリックス含量。（Ｂ）リポソーム漏出に対するＮＬＦ２０の作用。膜透過性作用は、ＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ（マイナスに荷電されている）リポソームに起源するカルボキシフルオレセインの蛍光放出を測定することによって記録した。（Ｃ）Ｔｒｉｓバッファー中及びＬＰＳの存在下でのＮＬＦ２０のＣＤスペクトル。コントロールのために、バッファーとＬＰＳのみの場合のＣＤスペクトルも提示された。この実験は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ７．４中で行なわれた。値は３連のサンプルの平均に相当する。
【図３１】シュードモナス・エルギノーサ敗血症の動物モデルにおけるＮＬＦ２０の作用。  トロンビンＨＣIIペプチドＮＬＦ２０は、生存を顕著に増加させた。マウスに、i.p.でシュードモナス・エルギノーサ細菌を注入し、引き続いて、１時間後、及びその後次の３日間にわたって２４時間間隔でＮＬＦ２０又はバッファーのみを皮下注入した。このペプチドでの処理は、顕著に生存を増加させた。
【図３２】真核生物細胞に対する活性。  （Ａ）指定ペプチドの溶血作用。細胞を種々の濃度のこのペプチドでインキュベートし、２％ トリトンＸ−１００（Sigma-Aldrich）をポジティブコントロールとして機能させた。ヘモグロビン放出の吸光度をλ５４０ｎｍで測定し、そしてトリトンＸ−１００で誘発された溶血の％として表現した（ｙ軸のスケールに留意する）。ＬＬ−３７の作用を比較のために示す。（Ｂ）ＨａＣａＴケラチノサイトを指定ＨＣII−ペプチド並びにＬＬ−３７に処した。細胞の透過性作用をＬＤＨベースＴＯＸ−７キットによって測定した。細胞からのＬＤＨ放出は、λ４９０ｎｍでモニタリングし、そして全ＬＤＨ放出の％としてプロットした。（Ｃ）ＭＴＴアッセイを、指定ペプチドの存在下（６０μＭで）で、ＨａＣａＴケラチノサイトの生存能力を測定するのに使用した。このアッセイでは、ＭＴＴは、代謝活性に関連する酵素によって、１つの色素、青色のホルマザンに変化する。色素の吸光度をλ５５０ｎｍで測定した。右パネルは、２０％血漿（溶血）又は２０％血清（ＬＤＨ及びＭＴＴ）の存在下での結果を示す。
【図３３】アンチトロンビンIIIに由来するペプチドＦＦＦ２１は凝固をブロックする。  ＦＦＦ２１は、正常ヒト血漿における凝固の内因系経路を弱め、このことは活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を測定することによって決定された。凝固システムの他の部分では、凝固の外因系経路をモニタリングするプロトロンビン時間（ＰＴ）、及びトロンビン誘発フィブリンネットワーク形成を測定するトロンビン凝固時間（ＴＣＴ）によって判断して、顕著には影響が与えられなかった。
【図３４】ＴＦＰＩに由来するペプチドの抗微生物活性。  （Ａ）ＴＦＰＩの構造を図解している略画。酵素切断部位が示されている。（Ｂ）抗微生物活性（指定の微生物に対する選択されたペプチドのＲＤＡを用いる）。抗微生物活性を決定するために、エッシェリヒア・コリ（E. coli）ATCC 25922、シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）ATCC 27853、スタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）ATCC 29213又はバチルス・サブチリス（B. subtilis）ATCC 6633分離株（４×１０6ｃｆｕ）又はカンジダ・アルビカンス（C. albicans）ATCC 90028及びカンジダ・パラプシロシス（C. parapsilosis）ATCC 90018（１×１０5ｃｆｕ）を、０．１％ ＴＳＢアガロースゲル中に接種した。各４ｍｍ直径のウェルに６μｌのペプチド（１００μＭ）をローディングした。３７℃で１８〜２４時間インキュベーションした後、クリアランスゾーンがそれぞれのペプチドの抑制効果に相当する（平均値が提示される、ｎ＝３）。（Ｃ）生菌数アッセイにおけるＴＦＰＩに由来するペプチド及びＬＬ−３７の、エッシェリヒア・コリ（E. coli）ATCC 25922に対する抗菌作用。細菌２×１０6ｃｆｕ／ｍｌを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４バッファー中で、指定濃度のペプチドと共に５０μｌ中でインキュベートし、ｃｆｕを決定した。
【図３５】細菌膜に対する作用。  （Ａ）細菌表面へのＴＥＰＩの結合。指定細菌（１〜２×１０9ｃｆｕ／ｍｌ）をヒト血漿５００μｌ中の３μＭのＴＡＭＲＡ標識ＧＧＬ２７ペプチドと共にインキュベートし、サンプルをＦＡＣＳによって解析した。（Ｂ）エッシェリヒア・コリ（E. coli）に対するペプチドの透過性作用。細菌を指定ペプチドと共にインキュベートし、そして透過性を、不透過性プローブＦＩＴＣを用いて評価した。（Ｃ）電子顕微鏡分析。シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）細菌を、３０μＭのＬＩＫ１７及びＬＬ−３７と共に、３７℃で２時間インキュベートし、そして逆染色法によって可視化した。スケールバーは１μｍであった。コントロール；バッファーコントロール。
【図３６】リポソームに対する構造及び作用。  （Ａ）リポソーム漏出に対する指定ペプチドの作用。膜透過性作用は、ＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ（マイナスに荷電されている）リポソームに起源するカルボキシフルオレセインの蛍光放出を測定することによって記録した。この実験は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー中で行なわれた。値は３連のサンプルの平均に相当する。（Ｂ）リポソームからのＣＦ放出の速度論。１μＭのペプチドが使用された。（Ｃ）マイナスに荷電されているリポソーム（ＤＯＰＥ／ＤＯＰＧ）の存在下でのＴＦＰＩに由来するＣ末端ＬＩＫ１６及びＧＧＬ２７ペプチドのヘリックス含量。ＬＩＫ１７及びＧＧＬ２７の構造はリポソーム添加によってほとんど影響を受けなかった。（Ｄ）Ｔｒｉｓバッファー中及びＬＰＳの存在下でのＬＩＫ１７及びＧＧＬ２７のＣＤスペクトル。コントロールのために、バッファーとＬＰＳのみの場合のＣＤスペクトルも提示された。
【図３７】真核生物細胞に対する活性。  （Ａ）指定ペプチドの溶血作用。細胞をこのペプチドの種々の濃度でインキュベートし、２％ トリトンＸ−１００（Sigma-Aldrich）をポジティブコントロールとして機能させた。ヘモグロビン放出の吸光度をλ５４０ｎｍで測定し、そしてトリトンＸ−１００で誘発された溶血の％として表現した（ｙ軸のスケールに留意する）。ＬＬ−３７の作用を比較のために示す。（Ｂ）上方パネル：ＨａＣａＴケラチノサイトを指定のＴＦＰＩ−ペプチド並びにＬＬ−３７に曝した。細胞の透過性作用をＬＤＨベースＴＯＸ−７キットによって測定した。細胞からのＬＤＨ放出は、λ４９０ｎｍでモニタリングし、そして全ＬＤＨ放出％としてプロットした。下方パネル：ＭＴＴアッセイを、指定のペプチドの存在下（６０μＭ）で、ＨａＣａＴケラチノサイトの生存を測定するのに使用した。このアッセイでは、ＭＴＴは、代謝活性に関連する酵素によって、１つの色素、青色のホルマザンに変化する。色素の吸光度をλ５５０ｎｍで測定した。
【図３８】ＴＦＰＩに由来するＣ末端ペプチドの活性。  （Ａ）ＴＦＰＩに由来するペプチド及びＬＬ−３７の、エッシェリヒア・コリ（E. coli）又はシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）に対する生菌数アッセイにおける抗菌作用。２×１０6ｃｆｕ／ｍｌの細菌を、２０％ヒトクエン酸血漿（ＣＰ）を含む、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４（バッファー）、又は０．１５ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中、又は加熱不活性化したヒトクエン酸血漿（ＨＣＰ）を加えたほかは同じバッファー中で、指定された濃度のペプチドと共に、５０μｌ中でインキュベートした（ｎ＝３，ＳＤは指定されている）。（Ｂ）指定の細菌の分離株を、バッファー、自然血漿（native plasma）（CP）、又は加熱不活性化した血漿（ＨＣＰ）中、３μＭでＧＧＬ２７及びＬＩＫ１７に２時間曝し、そしてｃｆｕ数を決定した。
【図３９】ＴＦＰＩのＣ末端ペプチドＧＧＬ２７は、Ｃ１ｑ、Ｃ３ａ及びＭＡＣのエッシェリヒア・コリ（E. coli）への結合を強化する。（Ａ）エッシェリヒア・コリ（E. coli）ATCC 25922及びシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）15159細菌を洗浄し、再懸濁し、そしてクエン酸血漿単独で加えるか、あるいはこれにＧＧＬ２７（３μＭ）を補充して、３７℃で３０分間、又は１時間インキュベートした。この細菌細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、そして結合タンパク質及び相当する上清を、還元性条件下でTris-Tricine ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、引き続いてＣ１ｑ又はＣ５ｂ−９を識別する抗体を用いて免疫ブロット法に処した。ＣＰ；クエン酸血漿、Ｓ；上清又は非結合細菌、Ｐ；細菌細胞に結合するペレット又は成分。（Ｂ）（Ａ）と同様であるが、Ｃ３ａに対する抗体を用いた（２５）。（Ｃ）（左方パネル）クエン酸血漿中（コントロール；黒色のカラム）及びＧＧＬ２７を補充した血漿中（灰色のカラム）、Ｃ１ｑ／Ｃ３ａ結合にポジティブな細菌の平均比率の比較。（右方カラム）Ｃ１ｑ及びＣ３ａの、エッシェリヒア・コリ（E. coli）及びシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）株に結合する度合いの比較であり、平均蛍光指数として表現されている（ＦＩ；Ｃ１ｑ／Ｃ３ａ結合の平均強度を乗じたＣ１ｑ／Ｃ３ａがポジティブな細菌の比率）。（＊；ｐ＜０．０５；＊＊；ｐ＜０．０１，＊＊＊；ｐ＜０．００１，ｔ−検定）。（Ｄ）クエン酸血漿中及びＧＧＬ２７を補充した血漿中のエッシェリヒア・コリ（E. coli）及びシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）へのＣ１ｑ／Ｃ３ａ結合のフローサイトメトリーヒストグラムの例。
【図４０】ヒト皮膚及び傷におけるＴＦＰＩの同定。  （Ａ）正常皮膚、急性創傷（ＡＷ）、及び慢性静脈下肢潰瘍（chronic venous leg ulcer）組織（慢性創傷；ＣＷ）におけるＴＦＰＩの免疫組織化学的同定。皮膚生検が、正常皮膚（正常皮膚；ｎ＝３）、急性創傷（ＡＷ−１及びＡＷ−２；それぞれ、創傷の５及び８日後）から、そして慢性静脈潰瘍に罹患している患者の創縁（ＣＷ；ｎ＝３）から取られた。典型的な切片が示されている。正常皮膚では、ＴＦＰＩが表皮の基底層に主として発見されている。ＡＷ及びＣＷでは、ＴＦＰＩは、表皮層のすべてから遍在的に見出だされる。スケールバーは１００μｍである。（Ｂ）ＴＦＰＩに由来するペプチドがヒト創傷に見出される。ＴＦＰＩのＣ末端ペプチド（C-terminal TFPI peptides）のシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）感染慢性創傷表面に起源するフィブリン瘡蓋に見出される細菌への結合の可視化。このペプチドはフィブリン（Ａ）、細菌（Ｂ，Ｃ）、及びマクロファージ内の細菌（Ｄ）に結合する。（Ｅ）及び（Ｆ）では、ＴＦＰＩ及びＣ３ａペプチドは、それぞれ、ＴＦＰＩ（２０ｎｍ）のＣ３ａ（１０ｎｍ）及びＣ末端部分（C-termini）に特異的な、異なるサイズの金標識抗体を用いる免疫金によって可視化した。５０の細菌プロフィールの評価によれば、ＴＦＰＩ分子の約７０％がＣ３ａに関連していることが示された。例示のための差込を参照されたい。
【図４１】ＧＧＬ２７のインビトロ及びインビボの作用。  （Ａ）２×１０6ｃｆｕ／ｍｌのエッシェリヒア・コリ（E. coli）を、２０％ヒトクエン酸血漿（ＣＰ）を含む、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４バッファー（バッファー）中、又は０．１５ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中、又はマウスクエン酸血漿を含むことのほかは同じバッファー（Ｂａｌｂ／ｃ若しくはＣ５７Ｂ／６）中、指定された濃度でＧＧＬ２７ペプチドと共に、５０μｌ中でインキュベートした（ｎ＝３，ＳＤは指定されている）。（Ｂ）このＧＧＬ２７ペプチドは、エッシェリヒア・コリ（E. coli）及びシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）感染マウスで生存を延長した。マウスにエッシェリヒア・コリ（E. coli）又はシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）細菌をｉ．ｐ．注入した。エッシェリヒア・コリ（E. coli）感染モデルでは、ＧＧＬ２７（２００μｇ）又はバッファーのみを、３０分後i.p.注入した（ｎ＝１０（各グループ）、Ｐ＜０．００１、カプラン・マイヤー生存時間分析ログ・ランク検定法（Kaplan-Meier Survival Analysis Log-Rank test））。シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）感染モデルでは、ＧＧＬ２７（５００μｇ）又はバッファーのみを、１時間後にs.c.注入した（ｎ＝８（各グループ）、Ｐ＜０．００１、カプラン・マイヤー生存時間分析ログ・ランク検定法（Kaplan-Meier Survival Analysis Log-Rank test））。（Ｃ）ＧＧＬ２７は、ＮＯ産生を抑制する。ＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージを、ＧＧＬ２７又は２つのコントロールペプチドＧＧＬ２７（Ｓ）及びＤＳＥ２５の存在下、指定濃度で、エッシェリヒア・コリ（E. coli）（左方パネル）又はシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）（右パネル）に起源するＬＰＳで刺激した。ＧＧＬ２７とこのコントロールペプチドの差は、統計的に有意であった（Ｐ＜０．０１）。（Ｄ）ＧＧＬ２７は、ＬＰＳによって誘発されたショックにおける生存を顕著に延長させた。マウスにエッシェリヒア・コリ（E. coli）ＬＰＳを注入し、引き続いてＧＧＬ２７（５００μｇ）を腹腔内投与した。バッファー及びペプチドＧＧＬ２７（Ｓ）及びＤＳＥ２５（５００μｇ）はコントロールとして機能した。生存を７日間にわたって追及した（ＧＧＬ２７；ｎ＝１６、バッファー；ｎ＝１５，ＧＧＬ２７（Ｓ）；ｎ＝８，ＤＳＥ２５；ｎ＝８）。ＧＧＬ２７とバッファー、又はコントロールペプチドとの間の差は、有意であった。Ｐ＜０．０１、カプラン・マイヤー生存時間分析ログ・ランク検定法（Kaplan-Meier Survival Analysis Log-Rank test）。＊は、ＧＧＬ２７（Ｓ）、ＤＳＥ２５、及びバッファーの線がオーバーレイしていることを示している。（Ｅ）ＧＧＬ２７は、炎症誘発性サイトカインを弱める。別の実験では、マウスをＬＰＳのi.p.注入の２０時間後に犠死させ、引き続いてＧＧＬ２７（５００μｇ）、バッファー又はコントロールペプチド ＧＧＬ２７（Ｓ）又はＤＳＥ２５を用いて上記と同様な処置をし、そして表示のサイトカインを血液中で分析した（コントロール；ｎ＝８；ＧＧＬ２７、ｎ＝１２；ＧＧＬ２７（Ｓ）、ｎ＝７；ＤＳＥ２５；ｎ＝８）。すべてのケースにおいて、ＧＧＬ２７処置動物とバッファーの間の差は、顕著であった。それぞれのサイトカインのＰ��は、ＩＬ−６；０．００２３、ＴＮＦ−α；０．００１８、ＩＦＮ−γ；０．０００２、ＭＣＰ−１；０．０００２、ＩＬ−１０；０．００２３であった。ＩＦＮ−γに関しては、コントロールとＧＧＬ２７（Ｓ）の間には有意な差があった。（Ｆ）ＬＰＳのi.p.注入、引き続いてＧＧＬ２７（５００μｇ）又はバッファーでの処置の２０時間後に、肺を解析した。組織化学的解析によれば、ＧＧＬ２７処置の肺では炎症変化が著しく弱められていることが示された（１つの代表的な肺切片が示されている）。
【図４２】ＴＦＰＩの進化（evolution）。  系統樹及び配列類似性では、ホモ・サピエンス（Homo sapiens）、スマトラオランウータン（Pongo abelii）及びスース・スクローファ（Sus scrofa）におけるＴＦＰＩが密接に関連していることが示されている。
【図４３】ペプチドＧＧＬ２７、及び中央のＫ／Ｒ残基がＳによって置き換えられているコントロールペプチドＧＧＬ２７（Ｓ）、及びＴＦＰＩのＮ末端に起源するペプチドＤＳＥ２５が、指示されている細菌及び真菌に対する抗微生物活性を有しているかどうかを分析した。これらのペプチドの阻害ゾーンが示されている。抗微生物活性を決定する場合には、細菌（４×１０6ｃｆｕ）又は真菌（１×１０5ｃｆｕ）が、０．１％ＴＳＢアガロースゲル中に接種された。各４ｍｍ直径ウェルに６μｌのペプチド（１００μＭ）をローディングした。クリアランスゾーンは、３７℃で１８〜２４時間インキュベーションした後の各ペプチドの阻止作用に相当する（平均値が呈示されている，ｎ＝３）。＊は、値がゼロであることを示している。
【図４４】細菌をＧＧＬ２７と共にインキュベートし、そして透過性を、不透過性プローブＦＩＴＣを用いて評価した。
【図４５】指定されているＴＦＰＩに由来するペプチド（３０μＭ）による殺菌の時間依存性を、２０％血漿を含む０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中、エッシェリヒア・コリ（E. coli）又はシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）を用いる生菌数アッセイによって解析した。
【図４６】ＨＲＧはＬＰＳに結合する。  ２及び５μｇのＨＲＧを、ニトロセルロース膜に塗布し、引き続いて指定されているＬＰＳと共に、０．１５Ｍ ＮａＣｌ添加若しくは非添加の、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４又は１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．５中でインキュベートした。放射能をホスホリメージャーシステム（phosphorimager system）を用いて視覚化した。
【図４７】ＨＲＧは、マウスマクロファージからのＬＰＳ媒介性ＮＯ放出を増加させる。  ＲＡＷマクロファージを、ＬＬ−３７及びＨＲＧ（２及び１０μＭ）を含むか若しくは含まない１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳと共に、２４時間インキュベートした。上清を吸引し、そしてＮＯを、グリエス法を用いて測定した。ＨＲＧは、用量依存の形でＬＰＳ媒介性ＮＯ放出を有意に増加させた（ｎ＝６，ｐ＝０．００１）。
【図４８】ＴＬＲ４に対する抗体は、ＮＯ放出をブロックする。  ＲＡＷマクロファージを、ＨＲＧ（２μＭ）及びポリクローナル抗マウスＴＲＬ４（５μｇ／ｍｌ）を含むか若しくは含まない１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳと共に、２４時間インキュベートした。上清を吸引し、そしてＮＯを、グリエス法を用いて測定した。抗マウスＴＬＲ４は、ＬＰＳ及びＨＲＧ媒介性ＮＯ放出を有意にブロックしえた。（ｎ＝６，ｐ＝０．００１）。
【図４９】Ｈｒｇ-/-マウスでのＬＰＳによって誘発された敗血症における生存の増加。  ＬＰＳチャレンジ後のＨｒｇ-/-マウスの生存の増加。野生型（破線）及びＨｒｇ-/-（実線）マウスに、エッシェリヒア・コリ（E. coli）ＬＰＳをi.p.注入し、そして動物の生存を７日間にわたって追跡した。ＨＲＧ欠損マウス（ｎ＝８）は、野生型動物と比較して有意に生存の増加を示した（ｎ＝９，ｐ＝０．００２）。
【図５０】ＬＰＳチャレンジの１８時間後の目視による観察スコア。  野生型（ｗｔ）及びＨｒｇ-/-マウスの状態をＬＰＳチャレンジの１８時間後に目視で観察した（逆立った毛衣（ruffled fur）、猫背（hunched）。野生型マウスは、目視で有意に病的であり、野生型（ｗｔ）及びＨｒｇ-/-マウスの状態をＬＰＳチャレンジの１８時間後に目視で観察した（逆立った毛衣［黒色］、猫背［淡灰色］及び死直前［濃灰色］）。野生型マウスは、Ｈｒｇ-/-マウスと比較して目視で有意に病的であった（ｐ＝０．００１，ｎ＝１０）。
【図５１】ＬＰＳチャレンジ後、野生型動物と比較してＨｒｇ-/-マウスの肺では血管漏出が減少する。  野生型（ｗｔ）及びＨｒｇ-/-マウスの肺を、ＬＰＳをi.p.注入後、走査型電子顕微鏡検査法によって解析した。Ａ）は野生型 Ｂ）はＨｒｇ-/-、Ｃ）は、ＬＰＳ処理の２４時間後の野生型（ｗｔ）、Ｄ）は、ＬＰＳ処理の２４時間後のＨｒｇ-/-である。スケールバーは、５０μｍを表す。代表的な肺切片が示されている。
【図５２】ＧＨＨ２５は、マウスマクロファージにおいてＨＲＧ及びＬＰＳによって誘発された応答を抑制する。  ＲＡＷマクロファージを、ＨＲＧ（２μＭ）及びＧＨＨ２５（１０及び１００μＭ）を含むか、又は含まない１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳと共に、２４時間インキュベートした。上清を吸引し、そしてＮＯを、グリエス法を用いて測定した。ＧＨＨ２５は、ＬＰＳ及びＨＲＧ媒介性ＮＯ放出を、用量依存の形で有意に減少させた（ｎ＝６，ｐ＝０．００１）。
【図５３】ＧＨＨ２５は、ヒトマクロファージにおけるＨＲＧ及びＬＰＳによって誘発された応答を抑制する。  ヒトマクロファージを、ＨＲＧ（２μＭ）及びＧＨＨ２５（１０及び１００μＭ）を含むか、又は含まない１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳと共に、２４時間インキュベートした。上清を吸引し、そしてＴＮＦ−αを測定した。
【図５４】ＧＨＨ２５での処置後のＬＰＳによって誘発された敗血症における健康状態の改善と生存の増加。  ＧＨＨ２５での処置後の野生型マウスの生存の増加。野生型動物にエッシェリヒア・コリ（E. coli）ＬＰＳをi.p.注入し、そして３０分後に１ｍｇのＧＨＨ２５（破線）、又はバッファーのみ（実線）を注入した。動物の生存を７日間にわたって追跡した。ＧＨＨ２５で処置したマウス（ｎ＝１３）は、未処置の動物（ｎ＝１２，ｐ＝０．０３）と比較して有意に生存を増加させたことが示された。
【図５５】ＬＰＳチャレンジの１８時間後の目視での観察スコア。  野生型（ｗｔ）及びＨｒｇ-/-マウスの状態を、ＬＰＳチャレンジの１８時間後に目視で観察した（逆立った毛衣（ruffled fur）、猫背）。野生型マウスは、目視で有意に病的であり、野生型（ｗｔ）及びＨｒｇ-/-マウスの状態をＬＰＳチャレンジの１８時間後に目視で観察した（逆立った毛衣［黒色］、猫背［淡灰色］及び死直前［濃灰色］）。野生型マウスは、Ｈｒｇ-/-マウスと比較して目視で有意に病的であった（ｐ＝０．００４，ｎ＝１２）。
【図５６】アンチトロンビンIIIに由来するペプチドＦＦＦ２１は、凝固をブロックする。  ＦＦＦ２１は、正常ヒト血漿における凝固の内因系経路を弱める。これは活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を測定することによって決定した。凝固の外因系経路をモニタリングするプロトロンビン時間（ＰＴ）、及びトロンビン誘発フィブリンネットワーク形成を測定するトロンビン凝固時間（ＴＣＴ）から判断し、凝固系の他の部分は顕著には影響されなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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