(57)【要約】有利に自己組織化して粒子になる双性イオン性ブロックコポリマーおよび双性イオン性抱合体、双性イオン性コポリマーおよび双性イオン性抱合体から組織化する粒子、自己組織化した粒子を含む医薬組成物、およびこの粒子を使用して治療用および診断用薬剤を送達する方法。【選択図】    図２Ａおよび図２Ｂ
2013510229.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ポリ（カルボキシベタイン）、ポリ（スルフォベタイン）またはポリ（フォスフォベタイン）を含む双性イオン性ポリマーブロックと；
（ｂ）疎水性ブロックと
を含むブロックコポリマー。
【請求項２】
前記双性イオン性ポリマーブロックは複数の繰り返し単位を含み、各繰り返し単位は以下の式を有する請求項１に記載のコポリマー：
【化１】
2013510229.tif 000013
ここで、
Ｒ1は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、Ｃ1−Ｃ6アルキル、およびＣ6−Ｃ12アリール基からなる群より選択され；
Ｒ2およびＲ3は、独立にアルキルおよびアリールからなる群より選択されるか、またはそれらが結合する窒素と共にカチオン中心を形成しており；
Ｌ1は、カチオン中心［Ｎ+（Ｒ5）（Ｒ6）］をポリマー主鎖［−（ＣＨ2−ＣＲ4）n−］に共有結合しているリンカーであり；
Ｌ2は、アニオン中心［Ａ（＝Ｏ）−Ｏ-］をカチオン中心に共有結合しているリンカーであり；
ＡはＣ、Ｓ、ＳＯ、Ｐ、またはＰＯであり；
Ｍ+は（Ａ＝Ｏ）Ｏ-アニオン中心に会合している対イオンであり；
Ｘ-はカチオン中心に会合している対イオンであり；
ｎは１から約１０，０００までの整数である。
【請求項３】
Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は独立にＣ1−Ｃ3アルキルからなる群より選択される請求項２に記載のコポリマー。
【請求項４】
Ｌ1はｎが１−２０である−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ＣＨ2）n−および−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）n−からなる群より選択される請求項２に記載のコポリマー。
【請求項５】
Ｌ2は−（ＣＨ2）n−であり、ここでｎは１から２０までの整数である請求項２に記載のコポリマー。
【請求項６】
ｎは１０から約１，０００までの整数である請求項２に記載のコポリマー。
【請求項７】
Ｍ+は金属イオン、アンモニウムイオンまたは有機イオンである請求項２に記載のコポリマー。
【請求項８】
Ｘ-は、ハロゲン化物、カルボキシラート、アルキルスルフォナート、サリチラート、ラクタート、ビス（トリフルオロメチルスルフォニル）アミドアニオン、ニトラート、パークロラート、テトラフルオロボラート、ヘキサフルオロフォスファート、トリフルオロメチルスルフォナートからなる群より選択される請求項２に記載のコポリマー。
【請求項９】
Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3はメチルであり、Ｌ1は−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ＣＨ2）2−であり、Ｌ2は−（ＣＨ2）−であり、ＡはＣまたはＳＯである請求項２に記載のコポリマー。
【請求項１０】
前記疎水性ブロックは生体適合性ポリマーを含む請求項１に記載のコポリマー。
【請求項１１】
前記疎水性ブロックはホモポリマーまたはコポリマーを含む請求項１に記載のコポリマー。
【請求項１２】
前記疎水性ブロックは、乳酸−グリコール酸コポリマー、ポリカプロラクトン、ポリグリコリド、ポリ乳酸、ポリ−３−ヒドロキシブチラート、ポリジオキサノン、ポリトリメチレンカーボナート、ポリ（グリコリド−コ−カプロラクトン）、ポリ（グリコリド−コ−トリメチレンカーボナート）、およびポリ（ジオキサノン−コ−トリメチレンカーボナート−コ−グリコリド）から選択されるポリマーを含む請求項１に記載のコポリマー。
【請求項１３】
前記疎水性ブロックは数平均分子量が約１，０００から約２００，０００までである請求項１に記載のコポリマー。
【請求項１４】
（ａ）混合電荷コポリマーを含む混合電荷コポリマーブロックと；
（ｂ）疎水性ブロックと
を含むブロックコポリマー。
【請求項１５】
前記混合電荷コポリマーは複数の繰り返し単位を含み、各繰り返し単位は以下の式を有する請求項１４に記載のコポリマー：
【化２】
2013510229.tif 000014
ここで、
Ｒ4およびＲ5は、独立に水素、フッ素、トリフルオロメチル、Ｃ1−Ｃ6アルキル、およびＣ6−Ｃ12アリール基から選択され；
Ｒ6、Ｒ7、およびＲ8は、独立にアルキルおよびアリールから選択されるか、またはそれらが結合する窒素と共にカチオン中心を形成しており；
Ａ（＝Ｏ）−ＯＭ）はアニオン中心であり、ここでＡはＣ、Ｓ、ＳＯ、Ｐ、またはＰＯであり、Ｍは金属または有機対イオンであり；
Ｌ3は、カチオン中心［Ｎ+（Ｒ6）（Ｒ7）（Ｒ8）］をポリマー主鎖に共有結合しているリンカーであり；
Ｌ4は、アニオン中心［Ａ（＝Ｏ）−ＯＭ］をポリマー主鎖に共有結合しているリンカーであり；
Ｘ-はカチオン中心に会合している対イオンであり；
ｎは１から約１０，０００までの整数であり；
ｐは１から約１０，０００までの整数である。
【請求項１６】
Ｒ1−Ｒ8は独立にＣ1−Ｃ3アルキルからなる群より選択される請求項１４に記載のコポリマー。
【請求項１７】
Ｌ3は−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ＣＨ2）n−および−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）n−からなる群より選択され、ここでｎは１−２０である請求項１４に記載のコポリマー。
【請求項１８】
Ｌ4は−（ＣＨ2）n−であり、ここでｎは１から２０までの整数である請求項１４に記載のコポリマー。
【請求項１９】
ｎは１０から約１，０００までの整数である請求項１４に記載のコポリマー。
【請求項２０】
ｐは１０から約１，０００までの整数である請求項１４に記載のコポリマー。
【請求項２１】
Ｍ+は金属イオン、アンモニウムイオンまたは有機イオンである請求項１４に記載のコポリマー。
【請求項２２】
Ｘ-は、ハロゲン化物、カルボキシラート、アルキルスルフォナート、サリチラート、ラクタート、ビス（トリフルオロメチルスルフォニル）アミドアニオン、ニトラート、パークロラート、テトラフルオロボラート、ヘキサフルオロフォスファート、トリフルオロメチルスルフォナートからなる群より選択される請求項１４に記載のコポリマー。
【請求項２３】
Ｒ1−Ｒ8はメチルであり、Ｌ3は−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ＣＨ2）2−であり、Ｌ4は−（ＣＨ2）−であり、ＡはＣまたはＳＯである請求項１４に記載のコポリマー。
【請求項２４】
前記疎水性ブロックは生体適合性ポリマーを含む請求項１４に記載のコポリマー。
【請求項２５】
前記疎水性ブロックはホモポリマーまたはコポリマーを含む請求項１４４に記載のコポリマー。
【請求項２６】
前記疎水性ブロックは、乳酸−グリコール酸コポリマー、ポリカプロラクトン、ポリグリコリド、ポリ乳酸、ポリ−３−ヒドロキシブチラート、ポリジオキサノン、ポリトリメチレンカーボナート、ポリ（グリコリド−コ−カプロラクトン）、ポリ（グリコリド−コ−トリメチレンカーボナート）、およびポリ（ジオキサノン−コ−トリメチレンカーボナート−コ−グリコリド）から選択されるポリマーを含む請求項１４に記載のコポリマー。
【請求項２７】
前記疎水性ブロックは数平均分子量が約１，０００から約２００，０００までである請求項１４に記載のコポリマー。
【請求項２８】
ポリ（カルボキシベタイン）、ポリ（スルフォベタイン）、またはポリ（フォスフォベタイン）に共有結合した脂質を含む双性イオン性抱合体。
【請求項２９】
ポリ（カルボキシベタイン）、ポリ（スルフォベタイン）、またはポリ（フォスフォベタイン）は複数の繰り返し単位を含み、各繰り返し単位は以下の式を有する請求項２８に記載の抱合体：
【化３】
2013510229.tif 000015
ここで
Ｒ1は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、Ｃ1−Ｃ6アルキル、およびＣ6−Ｃ12アリール基からなる群より選択され；
Ｒ2およびＲ3は、独立にアルキルおよびアリールからなる群より選択されるか、またはそれらが結合する窒素と共にカチオン中心を形成しており；
Ｌ1は、カチオン中心［Ｎ+（Ｒ5）（Ｒ6）］をポリマー主鎖［−（ＣＨ2−ＣＲ4）n−］に共有結合しているリンカーであり；
Ｌ2は、アニオン中心［Ａ（＝Ｏ）−Ｏ-］をカチオン中心に共有結合しているリンカーであり；
ＡはＣ、Ｓ、ＳＯ、Ｐ、またはＰＯであり；
Ｍ+は（Ａ＝Ｏ）Ｏ-アニオン中心に会合している対イオンであり；
Ｘ-はカチオン中心に会合している対イオンであり；
ｎは１から約１０，０００までの整数である。
【請求項３０】
前記脂質はジアシルフォスファチジルエタノールアミンまたはジアシルフォスファチジルグリセロールである請求項２８に記載の抱合体。
【請求項３１】
前記脂質は、ジオレオイルフォスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−フォスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルフォスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−フォスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルフォスフォエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−フォスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチル−フォスフォエタノールアミン、１６−Ｏ−ジメチル−フォスフォエタノールアミン、１８−１−ｔｒａｎｓ−フォスフォエタノールアミン、１−ステアロイル−２−オレオイル−フォスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、および１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミン（ｔｒａｎｓＤＯＰＥ）からなる群より選択される請求項２８に記載の抱合体。
【請求項３２】
前記脂質はジステアロイル−フォスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）である請求項２８に記載の抱合体。
【請求項３３】
混合電荷コポリマーに共有結合した脂質を含む混合電荷コポリマー抱合体。
【請求項３４】
前記混合電荷コポリマーは複数の繰り返し単位を含み、各繰り返し単位は以下の式を有する請求項３３に記載の抱合体：
【化４】
2013510229.tif 000016
ここで
Ｒ4およびＲ5は、独立に水素、フッ素、トリフルオロメチル、Ｃ1−Ｃ6アルキル、およびＣ6−Ｃ12アリール基から選択され；
Ｒ6、Ｒ7、およびＲ8は、独立にアルキルおよびアリールから選択されるか、またはそれらが結合する窒素と共にカチオン中心を形成しており；
Ａ（＝Ｏ）−ＯＭ）はアニオン中心であり、ここでＡはＣ、Ｓ、ＳＯ、Ｐ、またはＰＯであり、Ｍは金属または有機対イオンであり；
Ｌ3は、カチオン中心［Ｎ+（Ｒ6）（Ｒ7）（Ｒ8）］をポリマー主鎖に共有結合しているリンカーであり；
Ｌ4は、アニオン中心［Ａ（＝Ｏ）−ＯＭ］をポリマー主鎖に共有結合しているリンカーであり；
Ｘ-はカチオン中心に会合している対イオンであり；
ｎは１から約１０，０００までの整数であり；
ｐは１から約１０，０００までの整数である。
【請求項３５】
前記脂質はジアシルフォスファチジルエタノールアミンまたはジアシルフォスファチジルグリセロールである請求項３３に記載の抱合体。
【請求項３６】
前記脂質は、ジオレオイルフォスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−フォスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルフォスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−フォスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルフォスフォエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−フォスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチル−フォスフォエタノールアミン、１６−Ｏ−ジメチル−フォスフォエタノールアミン、１８−１−ｔｒａｎｓ−フォスフォエタノールアミン、１−ステアロイル−２−オレオイル−フォスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、および１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミン（ｔｒａｎｓＤＯＰＥ）からなる群より選択される請求項３３に記載の抱合体。
【請求項３７】
疎水性部分はジステアロイル−フォスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）である請求項３３に記載の抱合体。
【請求項３８】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の複数のブロックコポリマーを含むコアシェルポリマー粒子。
【請求項３９】
治療用および／または診断用薬剤をさらに含む請求項３８に記載の粒子。
【請求項４０】
標的薬剤をさらに含む請求項３８または３９に記載の粒子。
【請求項４１】
請求項２８〜３７のいずれか１項に記載の複数の抱合体を含むミセル。
【請求項４２】
治療用および／または診断用薬剤をさらに含む請求項４１に記載のミセル。
【請求項４３】
標的薬剤をさらに含む請求項４１または４２に記載のミセル。
【請求項４４】
請求項２８〜３７のいずれか１項に記載の複数の抱合体を含むリポソーム。
【請求項４５】
治療用および／または診断用薬剤をさらに含む請求項４４に記載のリポソーム。
【請求項４６】
標的薬剤をさらに含む請求項４４または４５に記載のリポソーム。
【請求項４７】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の複数のブロックコポリマーを含むポリマーソーム。
【請求項４８】
治療用および／または診断用薬剤をさらに含む請求項４７に記載のポリマーソーム。
【請求項４９】
標的薬剤をさらに含む請求項４７または４８に記載の粒子。
【請求項５０】
請求項３８〜４０のいずれか１項に記載のコアシェルポリマー粒子と薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤とを含む組成物。
【請求項５１】
請求項４１〜４３のいずれか１項に記載のミセルと薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤とを含む組成物。
【請求項５２】
請求項４４〜４６のいずれか１項に記載のリポソームと薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤とを含む組成物。
【請求項５３】
請求項４７〜４９のいずれか１項に記載のポリマーソームと薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤とを含む組成物。
【請求項５４】
請求項５０〜５３のいずれか１項に記載の組成物をそれを必要とする対象者に投与することを含む、治療用または診断用薬剤を送達する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は2009年11月6日に提出した米国仮出願第61/259,085の利益を主張する。各出願は参照によりその全体がここに明確に組み込まれる。
【０００２】
政府使用許諾権の記載事項
本発明は、政府の支援により、the Office of Naval Research、the National Science Foundation、およびthe National Cancer Instituteからそれぞれ与えられたN000140910137、DMR 0705907、およびU54 CA 119335-04Sの下で行われた。政府は本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
発明の背景
ナノ粒子（ＮＰ）の安定性および標的効率は薬物送達および画像診断へのその用途にとって最も重量な２つの点である。コーティング材料は、これら２つの点に対処するために、ＮＰを安定にするだけでなく多機能性にするのに必要とされる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、非特異タンパク質吸着に対するその耐性（すなわちノンファウリング（nonfouling）性）のおかげで、安定化目的のためにＮＰを修飾するのに最も一般的に使用される材料である。しかしながら、ＰＥＧは酸化損傷および生体媒質中での機能の低下に敏感であり、その長期適用を制限する。複合培地でのその安定性の他にも、ＮＰ自体の安定性はしばしば見逃されるもう１つの重要な点である。ＮＰはあらゆる必要な製造プロセスたとえば遠心分離または凍結乾燥を通じて無傷のままであることを必要とする。ＰＥＧでコーティングされたそれを含むＮＰの安定性を維持するために、たとえば低速限外ろ過および凍結乾燥前の凍結保護物質の添加などのいくつかの手段を使用しなければならない。標的化薬物送達のために、生物学的認識要素（たとえば、標的リガンド）を多くの場合ＮＰ表面上に固定する必要がある。長いＰＥＧ鎖（たとえば、２−５ｋＤａ）の端部で潜在的に利用可能なのは１つの官能基のみであり、これに生体分子を抱合させる。加えて、未反応官能基は、特に複合培地たとえば血漿および血清中で、非特異的結合を引き起こしうる。現在の全てのＮＰコーティング材料では、優れた安定性と多機能性との間で妥協しなければならないであろう。
【０００４】
ＮＰコーティング材料の開発の進歩にも拘わらず、ＮＰの超安定性および多機能性の両方に適応できる単一の材料またはコーティングのプラットフォームについての必要性が存在する。
【０００５】
発明の概要
１つの態様において、本発明はブロックコポリマーであって：
（ａ）ポリ（カルボキシベタイン）、ポリ（スルフォベタイン）またはポリ（フォスフォベタイン）を含む双性イオン性ポリマーブロックと；
（ｂ）疎水性ブロックと
を含むブロックコポリマーを提供する。
【０００６】
１つの実施形態において、双性イオン性ポリマーブロックは複数の繰り返し単位を含み、各繰り返し単位は以下の式を有し：
【化１】
2013510229.tif 000003
【０００７】
ここで、
Ｒ1は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、Ｃ1−Ｃ6アルキル、およびＣ6−Ｃ12アリール基からなる群より選択され；
Ｒ2およびＲ3は、独立にアルキルおよびアリールからなる群より選択されるか、またはそれらが結合する窒素と共にカチオン中心を形成しており；
Ｌ1は、カチオン中心［Ｎ+（Ｒ5）（Ｒ6）］をポリマー主鎖［−（ＣＨ2−ＣＲ4）n−］に共有結合しているリンカーであり；
Ｌ2は、アニオン中心［Ａ（＝Ｏ）−Ｏ-］をカチオン中心に共有結合しているリンカーであり；
ＡはＣ、Ｓ、ＳＯ、Ｐ、またはＰＯであり；
Ｍ+は（Ａ＝Ｏ）Ｏ-アニオン中心に会合している対イオンであり；
Ｘ-はカチオン中心に会合している対イオンであり；
ｎは１から約１０，０００までの整数である。
【０００８】
もう１つの態様では、本発明はブロックコポリマーであって：
（ａ）混合電荷コポリマーを含む混合電荷コポリマーブロックと；
（ｂ）疎水性ブロックと
を含むブロックコポリマーを提供する。
【０００９】
１つの実施形態では、混合電荷コポリマーは複数の繰り返し単位を含み、各繰り返し単位は以下の式を有し：
【化２】
2013510229.tif 000004
【００１０】
ここで、
Ｒ4およびＲ5は、独立に水素、フッ素、トリフルオロメチル、Ｃ1−Ｃ6アルキル、およびＣ6−Ｃ12アリール基から選択され；
Ｒ6、Ｒ7、およびＲ8は、独立にアルキルおよびアリールから選択されるか、またはそれらが結合する窒素と共にカチオン中心を形成しており；
Ａ（＝Ｏ）−ＯＭ）はアニオン中心であり、ここでＡはＣ、Ｓ、ＳＯ、Ｐ、またはＰＯであり、Ｍは金属または有機対イオンであり；
Ｌ3は、カチオン中心［Ｎ+（Ｒ6）（Ｒ7）（Ｒ8）］をポリマー主鎖に共有結合しているリンカーであり；
Ｌ4は、アニオン中心［Ａ（＝Ｏ）−ＯＭ］をポリマー主鎖に共有結合しているリンカーであり；
Ｘ-はカチオン中心に会合している対イオンであり；
ｎは１から約１０，０００までの整数であり；
ｐは１から約１０，０００までの整数である。
【００１１】
上述のポリマーに関して、１つの実施形態では、疎水性ブロックは生体適合性ポリマーを含む。１つの実施形態では、疎水性ブロックはホモポリマーまたはコポリマーを含む。１つの実施形態では、疎水性ブロックは乳酸−グリコール酸コポリマー（poly(lactic-co-glycolic acid)）、ポリカプロラクトン、ポリグリコリド、ポリ乳酸、ポリ−３−ヒドロキシブチラート、ポリジオキサノン、ポリトリメチレンカーボナート、ポリ（グリコリド−コ−カプロラクトン）、ポリ（グリコリド−コ−トリメチレンカーボナート）、およびポリ（ジオキサノン−コ−トリメチレンカーボナート−コ−グリコリド）からなる群より選択されるポリマーを含む。１つの実施形態では、疎水性ブロックは約１，０００から約２００，０００までの数平均分子量を有する。
【００１２】
１つの態様では、本発明は、双性イオン性ポリマー抱合体であって、ポリ（カルボキシベタイン）、ポリ（スルフォベタイン）、またはポリ（フォスフォベタイン）に共有結合した脂質を含む抱合体を提供する。
【００１３】
１つの実施形態では、ポリ（カルボキシベタイン）、ポリ（スルフォベタイン）、またはポリ（フォスフォベタイン）は複数の繰り返し単位を含み、各繰り返し単位は以下の式を有し：
【化３】
2013510229.tif 000005
【００１４】
ここで
Ｒ1は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、Ｃ1−Ｃ6アルキル、およびＣ6−Ｃ12アリール基からなる群より選択され；
Ｒ2およびＲ3は、独立にアルキルおよびアリールからなる群より選択されるか、またはそれらが結合する窒素と共にカチオン中心を形成しており；
Ｌ1は、カチオン中心［Ｎ+（Ｒ5）（Ｒ6）］をポリマー主鎖［−（ＣＨ2−ＣＲ4）n−］に共有結合しているリンカーであり；
Ｌ2は、アニオン中心［Ａ（＝Ｏ）−Ｏ-］をカチオン中心に共有結合しているリンカーであり；
ＡはＣ、Ｓ、ＳＯ、Ｐ、またはＰＯであり；
Ｍ+は（Ａ＝Ｏ）Ｏ-アニオン中心に会合している対イオンであり；
Ｘ-はカチオン中心に会合している対イオンであり；
ｎは１から約１０，０００までの整数である。
【００１５】
１つの態様では、本発明は混合電荷コポリマー抱合体であって、混合電荷ポリマーに共有結合している脂質を含む混合電荷ポリマー抱合体を提供する。
【００１６】
１つの実施形態では、混合電荷複合体コポリマーは複数の繰り返し単位を含み、各繰り返し単位は以下の式を有し：
【化４】
2013510229.tif 000006
【００１７】
ここで
Ｒ4およびＲ5は、独立に水素、フッ素、トリフルオロメチル、Ｃ1−Ｃ6アルキル、およびＣ6−Ｃ12アリール基から選択され；
Ｒ6、Ｒ7、およびＲ8は、独立にアルキルおよびアリールから選択されるか、またはそれらが結合する窒素と共にカチオン中心を形成しており；
Ａ（＝Ｏ）−ＯＭ）はアニオン中心であり、ここでＡはＣ、Ｓ、ＳＯ、Ｐ、またはＰＯであり、Ｍは金属または有機対イオンであり；
Ｌ3は、カチオン中心［Ｎ+（Ｒ6）（Ｒ7）（Ｒ8）］をポリマー主鎖に共有結合しているリンカーであり；
Ｌ4は、アニオン中心［Ａ（＝Ｏ）−ＯＭ］をポリマー主鎖に共有結合しているリンカーであり；
Ｘ-はカチオン中心に会合している対イオンであり；
ｎは１から約１０，０００までの整数であり；
ｐは１から約１０，０００までの整数である。
【００１８】
上述の抱合体に関して、１つの実施形態では、脂質はジアシルフォスファチジルエタノールアミンまたはジアシルフォスファチジルグリセロールでる。１つの実施形態では、脂質は、ジオレオイルフォスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルフォスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−フォスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルフォスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−フォスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルフォスフォエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−フォスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチル−フォスフォエタノールアミン、１６−Ｏ−ジメチル−フォスフォエタノールアミン、１８−１−ｔｒａｎｓ−フォスフォエタノールアミン、１−ステアロイル−２−オレオイル−フォスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、および１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミン（ｔｒａｎｓＤＯＰＥ）からなる群より選択される。１つの実施形態では、脂質はジステアロイル−フォスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）である。
【００１９】
他の態様では、本発明は粒子を提供する。
【００２０】
１つの実施形態では、本発明はコアシェルポリマー粒子であって、複数の本発明のブロックコポリマーを含む粒子を提供する。
【００２１】
１つの実施形態では、本発明はミセルであって、複数の本発明の抱合体を含む複数のリポソームの抱合体を含むミセルを提供する。
【００２２】
１つの実施形態では、本発明はリポソームであって、複数の本発明の抱合体を含むリポソームを提供する。
【００２３】
１つの実施形態では、本発明はポリマーソームであって、複数の本発明のブロックコポリマーを含むポリマーソームを提供する。
【００２４】
粒子は１種以上の標的薬剤と、１種以上の治療用薬剤および／または１種以上の診断用薬剤とをさらに含むことができる。
【００２５】
他の態様では、本発明は、本発明の１つ以上の粒子と、薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤とを含む組成物を提供する。
【００２６】
さらなる態様では、本発明は、治療用および／または診断用薬剤を送達する方法であって、本発明の組成物をそれを必要とする対象者に投与することを含む方法を提供する。
【００２７】
本発明の前述の態様および付随する利点の多くは、添付の図面と組み合わせて以下の詳細な説明を参照することによって容易に理解されるであろうし、同時にそれはより十分に理解されることとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、本発明の代表的な双性イオン性ポリマー抱合体、ＰＬＧＡ−ＰＣＢコポリマーの調製；ＰＬＧＡ−ＰＣＢ／Ｄｔｘｌ ＮＰの形成；および標的リガンドまたは診断色素によるＮＰのポスト機能付与の概略図である。
【図２Ａ】図２Ａ−図２Ｆは、代表的な双性イオン性ポリマー抱合体ナノ粒子の特徴を示している。凍結乾燥および超音波処理なしのピペットによる水中での簡単な再懸濁前（図２Ａ）および再懸濁後（図２Ｂ）のＰＬＧＡ−ＰＣＢ ＮＰについての走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像。棒目盛は１μｍである。
【図２Ｂ】図２Ａ−図２Ｆは、代表的な双性イオン性ポリマー抱合体ナノ粒子の特徴を示している。凍結乾燥および超音波処理なしのピペットによる水中での簡単な再懸濁前（図２Ａ）および再懸濁後（図２Ｂ）のＰＬＧＡ−ＰＣＢ ＮＰについての走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像。棒目盛は１μｍである。
【図２Ｃ】図２Ｃは１０重量％ＢＳＡのＰＢＳ溶液中および１００％ＦＢＳ中での３７℃での５日間にわたるＰＬＧＡ−ＰＣＢ ＮＰの安定性を示している。ＮＰの大きさ（平均±ＳＤ、ｎ＝３）を時間の関数としてプロットしている。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＰＬＧＡ−ＰＣＢ ＮＰについての高速遠心分離に対するＮＰの安定性を、３回の連続遠心分離サイクルで試験したものである。遠心分離の各工程（１６１１０ｇ、１５分）ののち、上澄み液を除去するかまたは保持し、ＮＰペレットをピペットにより超音波処理なしで再懸濁した。
【図２Ｅ】図２Ｅは、ＰＬＧＡ−ＰＣＢ／Ｄｔｘｌ ＮＰ（１重量％の薬物負荷）についての高速遠心分離に対するＮＰの安定性を、３回の連続遠心分離サイクルで試験したものである。遠心分離の各工程（１６１１０ｇ、１５分）ののち、上澄み液を除去するかまたは保持し、ＮＰペレットをピペットにより超音波処理なしで再懸濁した。
【図２Ｆ】図２Ｆは、凍結保護物質の添加なしに凍結乾燥させたのちの、ＰＬＧＡ、ＮＰ、ＰＬＧＡ−ＰＣＢ ＮＰ、および１重量％の薬物負荷をしたＰＬＧＡ−ＰＣＢ／Ｄｔｘｌ ＮＰの安定性を示している。ＮＰの大きさ（平均±ＳＤ、ｎ＝３）をプロットしており、多分散指数（ＰＤＩ、平均±ＳＤ、ｎ＝３）を各大きさの点と共に示している。
【図３Ａ】図３Ａは、ＮＨ2−フルオレセインと抱合したＰＬＧＡ−ＰＣＢ ＮＰについての研究の結果を示している。フルオレセイン処理をしていない裸のＮＰ、フルオレセイン（−ＥＤＣ、＋ＮＨＳ）で処理したＮＰ、およびフルオレセイン（＋ＥＤＣ、＋ＮＨＳ）で処理したＮＰをそれぞれ黒色、青色、および緑色の曲線で示している。フルオレセインと共有結合したＮＰ（緑色の線）は、ＮＰ（−ＥＤＣ＋ＮＨＳ＋フルオレセイン）からの平均蛍光強度の大きな増加を示す。ガラクトースで機能付与されたＰＬＧＡ−ＰＣＢ／ＮＢＤ ＮＰのＨｅｐＧ２細胞への結合。
【図３Ｂ】図３Ｂは、細胞を２時間にわたり、ＮＨ2−ガラクトース（＋ＥＤＣ、＋ＮＨＳ）で処理したＰＬＧＡ−ＰＣＢ／ＮＢＤ ＮＰと共にインキュベートしたものである。蛍光画像および位相差画像を２０時間で撮り、それを図に示したように合わせた。
【図３Ｃ】図３Ｃは、細胞を２時間にわたり、ＮＨ2−ガラクトース（−ＥＤＣ、＋ＮＨＳ）で処理したＰＬＧＡ−ＰＣＢ／ＮＢＤ ＮＰと共にインキュベートしたものである。蛍光画像および位相差画像を２０時間で撮り、それを図に示したように合わせた。
【図４】図４は、本発明の代表的な双性イオン性ブロックコポリマー、ＤＳＰＣ−ＰＣＢの調製の概略図である。
【図５Ａ】図５Ａ−図５Ｄは、本発明の代表的な粒子（ベシクルおよびミセル）［ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＣＢ ５Ｋ（図５Ａ）；ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＣＢ ２Ｋ（図５Ｂ））および関連するＰＥＧ粒子［ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ ５Ｋ（図５Ｃ）；ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ ２Ｋ（図５Ｄ）］についてのモル組成の関数としてのサイズ排除クロマトグラフィー結果を比較している。
【図５Ｂ】図５Ａ−図５Ｄは、本発明の代表的な粒子（ベシクルおよびミセル）［ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＣＢ ５Ｋ（図５Ａ）；ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＣＢ ２Ｋ（図５Ｂ））および関連するＰＥＧ粒子［ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ ５Ｋ（図５Ｃ）；ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ ２Ｋ（図５Ｄ）］についてのモル組成の関数としてのサイズ排除クロマトグラフィー結果を比較している。
【図５Ｃ】図５Ａ−図５Ｄは、本発明の代表的な粒子（ベシクルおよびミセル）［ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＣＢ ５Ｋ（図５Ａ）；ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＣＢ ２Ｋ（図５Ｂ））および関連するＰＥＧ粒子［ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ ５Ｋ（図５Ｃ）；ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ ２Ｋ（図５Ｄ）］についてのモル組成の関数としてのサイズ排除クロマトグラフィー結果を比較している。
【図５Ｄ】図５Ａ−図５Ｄは、本発明の代表的な粒子（ベシクルおよびミセル）［ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＣＢ ５Ｋ（図５Ａ）；ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＣＢ ２Ｋ（図５Ｂ））および関連するＰＥＧ粒子［ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ ５Ｋ（図５Ｃ）；ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ ２Ｋ（図５Ｄ）］についてのモル組成の関数としてのサイズ排除クロマトグラフィー結果を比較している。
【図６】図６は、本発明の代表的な粒子（リポソーム）（ＤＳＰＣ／ＤＰＳＥ−ＰＣＢ ５Ｋ）および関連する粒子についてのＰＢＳ中での３７℃でのリポソーム安定性を深くしている。
【図７】図７は、本発明の代表的なナノ粒子、ＰＬＧＡ−ＰＣＢ ＮＰからのドセタキセル放出プロファイルをＰＬＧＡ ＮＰと比較している。両方のＮＰの薬物負荷は１重量％であった。
【図８Ａ】図８Ａおよび図８Ｂは１０重量％ＢＳＡのＰＢＳ溶液（図８Ａ）中、および３７℃の１００％ＦＢＳ溶液（図８Ｂ）中でのＮＰ安定性（ナノ粒子の大きさ）を比較している。ＮＰの大きさ（平均±ＳＤ、ｎ＝３）を時間の関数としてプロットした。
【図８Ｂ】図８Ａおよび図８ＢはＰＢＳ中の１０重量％ＢＳＡ溶液（図８Ａ）中、および３７℃の１００％ＦＢＳ溶液（図８Ｂ）中でのＮＰ安定性（ナノ粒子の大きさ）を比較している。ＮＰの大きさ（平均±ＳＤ、ｎ＝３）を時間の関数としてプロットした。
【図９】図９は、ＨｅｐＧ２細胞での、本発明の代表的なナノ粒子、ＰＬＧＡ−ＰＣＢ ＮＰの細胞生存度（細胞毒性）をＰＬＧＡ ＮＰと比較している。ＮＰを細胞と共に示した濃度で２４時間にわたってインキュベートし、直ぐに細胞生存度について３回分析した。
【００２９】
発明の詳細な説明
本発明は、有利に自己組織化して粒子になるブロックコポリマーおよび抱合体を提供する。本発明は、ブロックコポリマーおよび抱合体から組織化された粒子、前記自己組織化粒子を含む医薬組成物、ならびに治療用および診断用薬剤を前記粒子を使用して送達する方法をさらに含む。前記ブロックコポリマーおよび抱合体ならびに関連する粒子の製造方法も提供する。
【００３０】
ブロックコポリマー
１つの態様では、本発明はブロックコポリマーを提供する。１つの実施形態では、ブロックコポリマーは双性イオン性ブロックコポリマーである。もう１つの実施形態では、ブロックコポリマーは混合電荷ブロックコポリマーである。
【００３１】
双性イオン性ブロックコポリマー
１つの実施形態では、本発明は双性イオン性ブロックコポリマーを提供する。ここで使用する限りにおいて、用語「双性イオン性ブロックコポリマー」は、双性イオン性ポリマーブロックを有するブロックコポリマーを指す。
【００３２】
１つの実施形態では、ブロックコポリマーは双性イオン性ブロックコポリマーであって：
（ａ）ポリ（カルボキシベタイン）、ポリ（スルフォベタイン）またはポリ（フォスフォベタイン）を含む双性イオン性ブロックと；
（ｂ）疎水性ブロックと
を含む双性イオン性ブロックコポリマーを提供する。
【００３３】
１つの実施形態において、双性イオン性ポリマーブロックは複数の繰り返し単位を含み、各繰り返し単位は以下の式（Ｉ）を有し：
【化５】
2013510229.tif 000007
【００３４】
ここで、
Ｒ1は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、Ｃ1−Ｃ6アルキル、およびＣ6−Ｃ12アリール基からなる群より選択され；
Ｒ2およびＲ3は、独立にアルキルおよびアリールからなる群より選択されるか、またはそれらが結合する窒素と共にカチオン中心を形成しており；
Ｌ1は、カチオン中心［Ｎ+（Ｒ5）（Ｒ6）］をポリマー主鎖［−（ＣＨ2−ＣＲ4）n−］に共有結合しているリンカーであり；
Ｌ2は、アニオン中心［Ａ（＝Ｏ）−Ｏ-］をカチオン中心に共有結合しているリンカーであり；
ＡはＣ、Ｓ、ＳＯ、Ｐ、またはＰＯであり；
Ｍ+は（Ａ＝Ｏ）Ｏ-アニオン中心に会合している対イオンであり；
Ｘ-はカチオン中心に会合している対イオンであり；
ｎは１から約１０，０００までの整数であり；
＊は繰り返し単位が次のそれに共有結合をしている場所を示している。
【００３５】
混合電荷ブロックコポリマー
１つの実施形態では、本発明は混合電荷ブロックコポリマーを提供する。１つの実施形態では、ブロックコポリマーは混合電荷ブロックコポリマーであって：
（ａ）ポリ（カルボキシベタイン）、ポリ（スルフォベタイン）、またはポリ（フォスフォベタイン）を含む混合電荷コポリマーブロックと；
（ｂ）疎水性ブロックと
を含む混合電荷ブロックコポリマーを提供する。
【００３６】
ここで使用する限りにおいて、用語「混合電荷ブロックコポリマー」は混合電荷ポリマーブロックを有するブロックコポリマーを指す。
【００３７】
ここで使用する限りにおいて、用語「混合電荷コポリマー」は、ポリマー主鎖と、正に帯電した複数の繰り返し単位と、負に帯電した複数の繰り返し単位とを有するコポリマーを指す。本発明の実施では、これらのコポリマーはイオン対コモノマーの重合によって調製できる。
【００３８】
混合電荷コポリマーは、正に帯電した複数の繰り返し単位と負に帯電した複数の繰り返し単位とを含む。１つの実施形態では、混合電荷コポリマーは実質的に電子的中性である。ここで使用する限りにおいて、用語「実質的に電気的中性な」は有利な非ファウリング性をコポリマーに付与するコポリマーを指す。１つの実施形態では、実質的に電気的中性なコポリマーは正味の電荷が実質的にゼロであるコポリマー（すなわち、正に帯電した繰り返し単位と負に帯電した繰り返し単位との数がほぼ同じであるコポリマー）である。１つの実施形態では、正に帯電した繰り返し単位の数の負に帯電した繰り返し単位の数に対する比は約１：１．１から約１：０．５までである。１つの実施形態では、正に帯電した繰り返し単位の数の負に帯電した繰り返し単位の数に対する比は約１：１．１から約１：０．７までである。１つの実施形態では、正に帯電した繰り返し単位の数の負に帯電した繰り返し単位の数に対する比は約１：１．１から約１：０．９までである。
【００３９】
イオン対コモノマー。１つの実施形態では、コモノマーは好適な重合性イオン対コモノマーの共重合によって調製される。
【００４０】
本発明において有用な代表的なイオン対コモノマーは式（ＩＩ）および（III）を有する。
【化６】
2013510229.tif 000008
【００４１】
この実施形態では、混合電荷コポリマーは式（ＩＶ）の繰り返し単位を有する：
【化７】
2013510229.tif 000009
【００４２】
ここで、
Ｒ4およびＲ5は、独立に水素、フッ素、トリフルオロメチル、Ｃ1−Ｃ6アルキル、およびＣ6−Ｃ12アリール基から選択され；
Ｒ6、Ｒ7、およびＲ8は、独立にアルキルおよびアリールから選択されるか、またはそれらが結合する窒素と共にカチオン中心を形成しており；
Ａ（＝Ｏ）−ＯＭ）はアニオン中心であり、ここでＡはＣ、Ｓ、ＳＯ、Ｐ、またはＰＯであり、Ｍは金属または有機対イオンであり；
Ｌ3は、カチオン中心［Ｎ+（Ｒ6）（Ｒ7）（Ｒ8）］をポリマー主鎖に共有結合しているリンカーであり；
Ｌ4は、アニオン中心［Ａ（＝Ｏ）−ＯＭ］をポリマー主鎖に共有結合しているリンカーであり；
Ｘ-はカチオン中心に会合している対イオンであり；
ｎは１から約１０，０００までの整数であり；
ｐは１から約１０，０００までの整数であり；
＊は繰り返し単位が次のそれに共有結合している場所を示している。
【００４３】
１つの実施形態では、Ｒ7およびＲ8はＣ1−Ｃ3アルキルである。
【００４４】
Ｒ6、Ｒ7、およびＲ8は、独立にアルキルおよびアリールから選択されるか、またはそれらが結合する窒素と共にカチオン中心を形成している。１つの実施形態では、Ｒ6、Ｒ7、およびＲ8はＣ1−Ｃ3アルキルである。
【００４５】
ある実施形態では、Ｌ3は−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ＣＨ2）n−および−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）n−からなる群より選択され、ここでｎは１から２０までの整数である。ある実施形態では、Ｌ3は−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ＣＨ2）n−であり、ここでｎは１−６である。
【００４６】
ある実施形態では、Ｌ4はＣ1−Ｃ20アルキレン鎖である。代表的なＬ4基としてはｎが１−２０（たとえば、１、３、または５）である−（ＣＨ2）n−が挙げられる。
【００４７】
ある実施形態では、ＡはＣまたはＳＯである。
【００４８】
ある実施形態では、ｎは５から約５，０００までの整数である。
【００４９】
１つの実施形態では、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、およびＲ8はメチルであり、Ｌ3は−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ＣＨ2）2−であり、Ｌ4は−ＣＨ2−であり、Ａ1はＣまたはＳＯであり、ｎは５から約５，０００までの整数である。
【００５０】
上述の式では、ポリマー主鎖としては、ビニル主鎖（すなわち、−Ｃ（Ｒ’）（Ｒ’’）−Ｃ（Ｒ’’’）（Ｒ’’’’）−，ここでＲ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、およびＲ’’’’は独立に水素、アルキル、およびアリールから選択される）が挙げられ、これはビニルモノマー（たとえば、アクリラート、メタクリラート、アクリルアミド、メタクリルアミド、スチレン）から得られる。
【００５１】
上述の式では、Ｎ+はカチオン中心である。ある実施形態では、カチオン中心は第４級アンモニウム（たとえば、Ｌ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＬ2に結合しているＮ）である。アンモニウムに加えて、他の有用なカチオン中心（たとえば、Ｎと一緒になったＲ2およびＲ3）としてはイミダゾリウム、トリアザオリウム、ピリジニウム、モルフォリニウム、オキサゾリジニウム、ピラジニウム、ピリダジニウム、ピリミジニウム、ピペラジニウム、およびピロリジニウムが挙げられる。
【００５２】
Ｒ1−Ｒ8は独立に水素、アルキル、およびアリール基から選択される。代表的なアルキル基としては、Ｃ1−Ｃ10の直鎖および分枝のアルキル基が挙げられる。ある実施形態では、アルキル基は、たとえばアリール基（たとえば、−ＣＨ2Ｃ6Ｈ5、ベンジル）を含む複数種の置換基のうちの１つでさらに置換されている。１つの実施形態では、Ｒ2およびＲ3、ならびにＲ6、Ｒ7、およびＲ8はメチルである。１つの実施形態では、Ｒ1−Ｒ8はメチルである。代表的なアリール基としてはたとえばフェニルなどのＣ6−Ｃ12アリール基が挙げられる。上述の式のある実施形態について、Ｒ2およびＲ3、および／またはＲ6、Ｒ7、およびＲ8はＮ+と共にカチオン中心を形成する。
【００５３】
Ｌ1はカチオン中心をポリマー主鎖に共有結合しているリンカーである。ある実施形態では、Ｌ1は、Ｌ1の残基をポリマー主鎖（またはモノマーのための重合性部分）に結合させる官能基（たとえば、エステルまたはアミド）を含む。この官能基に加え、Ｌ1はＣ1−Ｃ20のアルキレン鎖を含むことができる。代表的なＬ1基としては、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ＣＨ2）n−および−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）n−が挙げられ、ここでｎは１−２０である（たとえば、ｎ＝２）。
【００５４】
Ｌ2はカチオン中心をアニオン中心に共有結合しているリンカーである。Ｌ2はＣ1−Ｃ20のアルキレン鎖でありうる。代表的なＬ2基としては、−（ＣＨ2）n−が挙げられ、ここでｎは１−２０（たとえば、１、３、または５）である。
【００５５】
Ｌ3はカチオン中心をポリマー主鎖に共有結合しているリンカーである。ある実施形態では、Ｌ3は、Ｌ3の残基をポリマー主鎖（またはモノマーのための重合性部分）に結合させる官能基（たとえば、エステルまたはアミド）を含む。この官能基に加え、Ｌ3はＣ1−Ｃ20のアルキレン鎖を含むことができる。代表的なＬ3基としては、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ＣＨ2）n−および−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ2）n−が挙げられ、ここでｎは１−２０である（たとえば、ｎ＝２）。
【００５６】
Ｌ4はアニオン中心をポリマー主鎖に共有結合しているリンカーである。Ｌ4はＣ1−Ｃ20のアルキレン鎖でありうる。代表的なＬ4基としては、−（ＣＨ2）n−が挙げられ、ここでｎは１−２０（たとえば、１、３、または５）である。
【００５７】
代表的なアルキル基としてはＣ1−Ｃ30の直鎖および分子のアルキル基が挙げられる。ある実施形態では、たとえばアリール基（たとえば、−ＣＨ2Ｃ6Ｈ5、ベンジル）などの複数種の置換基のうちの１つでさらに置換されている。
【００５８】
代表的なアリール基としては、たとえば置換されたフェニル基を含むフェニルなどのＣ6−Ｃ12アリール基（たとえば、安息香酸）が挙げられる。
【００５９】
Ｘ-はカチオン中心と会合している対イオンである。対イオンはカチオンポリマーの合成の結果から得られる対イオンまたはモノマー（たとえば、Ｃｌ-、Ｂｒ-、Ｉ-）でありうる。カチオン中心の合成から最初に製造される対イオンは、他の好適な対イオンで交換することもできる。代表的な疎水性対イオンとしては、カルボキシラート、たとえば安息香酸および脂肪酸アニオン（たとえば、ＣＨ3（ＣＨ2）nＣＯ2-、ここでｎ＝１−１９）；アルキルスルフォナート（たとえば、ＣＨ3（ＣＨ2）nＳＯ3-、ここでｎ＝１−１９）；サリチラート；ラクタート；ビス（トリフルオロメチルスルフォニル）アミドアニオン（Ｎ-（ＳＯ2ＣＦ3）2）；およびこれらの誘導体が挙げられる。また、他の対イオンを塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、硫酸イオン；硝酸イオン；過塩素酸イオン（ＣｌＯ4）;テトラフルオロボラート（ＢＦ4）；ヘキサフルオロフォスファート（ＰＦ6）；トリフルオロメチルスルフォナート（ＳＯ3ＣＦ3）；およびこれらの誘導体から選択できる。他の好適な対イオンとしては、サリチル酸（２−ヒドロキシ安息香酸）、ベンゾアート、およびラクタートが挙げられる。
【００６０】
本発明において有用な双性イオン性ポリマーおよび混合電荷コポリマーに関して、重合度（ＤＰまたはｎ）、数平均分子量（Ｍn）、および多分散指数としても知られている重量平均分子量と数平均分子量との比（Ｍw／Ｍn）は、多様でありうる。１つの実施形態では、ポリマーは重合度（ｎ）が１から約１０，０００までである。１つの実施形態では、ｎは約１０から約５，０００までである。もう１つの実施形態では、ｎは約１００から約３，５００までである。１つの実施形態では、ポリマーは数平均分子量（Ｍn）が約２００から約２，０００，０００Ｄａまでである。１つの実施形態では、Ｍnは約２，０００から約１００，０００Ｄａまでである。もう１つの実施形態では、Ｍnは約２０，０００から約８０，０００Ｄａまでである。１つの実施形態では、ポリマーは、重量平均分子量と数平均分子量との比（Ｍw／Ｍn）が約１．０から約２．０までである。１つの実施形態では、Ｍw／Ｍnは約１．１から約１．５までである。もう１つの実施形態では、Ｍw／Ｍnは約１．２から約２．０までである。
【００６１】
ブロックコポリマーにおいて、疎水性ブロックはコポリマーのうちコアシェル粒子のコアを形成する部分である。好適な疎水性ブロックは生体適合性ポリマーであるポリマーブロックを含む。疎水性ブロックはホモポリマーまたはコポリマーから構成されうる。双性イオン性ブロックまたは混合電荷コポリマーブロックは粒子のシェルを形成する。
【００６２】
代表的な生分解性疎水性ブロックとしてはペプチド、ポリエステル、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリエステルアミド、およびポリオキサエステル、ならびにそれらの誘導体およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００６３】
代表的な疎水性ブロックは乳酸−グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリグリコリド（ＰＧ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ−３−ヒドロキシブチラート、ポリジオキサノン、ポリトリメチレンカーボナート、ポリ（グリコリド−コ−カプロラクトン）（Monocryl（登録商標））、ポリ（グリコリド−コ−トリメチレンカーボナート）（Maxon（登録商標））、およびポリ（ジオキサノン−コ−トリメチレンカーボナート−コ−グリコリド）（BioSyn（登録商標））から選択されるポリマーを含む。
【００６４】
ある実施形態では、疎水性ブロックは数平均分子量が約１，０００から約２００，０００Ｄａまでである。
【００６５】
ブロックコポリマーは、疎水性ブロックをベースにしたラジカル開始剤（ラジカル開始末端基を含むように機能付与された疎水性ポリマー）を調製し、次に好適なカルボキシベタインモノマーを重合することによって調製できる。あるいは、ブロックコポリマーは好適に機能付与された疎水性ポリマー（たとえば、末端アミノ基）を好適に機能付与された双性イオン性ポリマー（たとえば、末端カルボキシ基またはその反応性誘導体）またはその疎水性誘導体（たとえば、カチオン性エステル誘導体）に共有結合させることによって調製できる。
【００６６】
抱合体
もう１つの態様では、本発明は抱合体を提供する。１つの実施形態では、抱合体は双性イオン性ポリマー抱合体である。もう１つの実施形態では、抱合体は混合電荷コポリマー抱合体である。上で説明したブロックコポリマーと同様に、この抱合体は、抱合体の自己組織上に粒子のコアを構成する疎水性部分を含む。粒子のシェルは双性イオン性ポリマー部分または混合電荷コポリマー部分から構成される。
【００６７】
双性イオン性抱合体
１つの実施形態では、本発明は、ポリ（カルボキシベタイン）、ポリ（スルフォベタイン）またはポリ（フォスフォベタイン）に共有結合した脂質を含む双性イオン性ポリマー抱合体を提供する。もう１つの実施形態では、本発明は、ポリ（カルボキシベタイン）、ポリ（スルフォベタイン）またはポリ（フォスフォベタイン）に共有結合した脂質を含む混合電荷コポリマー抱合体を提供する。
【００６８】
抱合体における使用に好適な脂質は種々の合成のベシクル形成脂質または自然発生のベシクル形成脂質から選択することができる。これらの脂質としてはリン脂質、スフィンゴ脂質、およびステロールが挙げられる。脂質は化学基たとえばアミン基、水酸基、アルデヒド基、またはカルボン酸基を、双性イオン性ポリマーまたは混合電荷コポリマー鎖の共有結合に好適なその極性頭部基に含む。
【００６９】
１つの実施形態は、２つの炭化水素基、たとえばフォスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、フォスファチジルグリセロール（ＰＧ）、フォスファチジン酸（ＰＡ）、またはホスファチジルイノシトール（ＰＩ）を含み、ここで各炭化水素鎖は３−２４個の炭素原子を長さに含み、様々な不飽和度を有する。
【００７０】
好適な脂質としては、ジアシルフォスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、ケファリン、およびセレブロシドから得られるそれが挙げられる。ジアシル化合物の場合、アシル基は脂肪酸基である（たとえばＣ8−Ｃ40）。
【００７１】
ある実施形態では、脂質はジアシルフォスファチジルエタノールアミンまたはジアシルフォスファチジルグリセロールである。
【００７２】
代表的な脂質としては、ジオレオイルフォスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−フォスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルフォスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−フォスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルフォスフォエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−フォスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチル−フォスフォエタノールアミン、１６−Ｏ−ジメチル−フォスフォエタノールアミン、１８−１−ｔｒａｎｓ−フォスフォエタノールアミン、１−ステアロイル−２−オレオイル−フォスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、および１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン（ｔｒａｎｓＤＯＰＥ）が挙げられる。
【００７３】
１つの実施形態では、疎水性部分はジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）である。
【００７４】
双性イオン性ポリマー抱合体の場合、この抱合体の双性イオン性ポリマー部分は、双性イオン性ポリマーブロックについて上で説明したそれ（すなわち、式（Ｉ））と同じである。
【００７５】
混合電荷コポリマー抱合体の場合、この抱合体の混合電荷コポリマー部分は、混合電荷コポリマーブロックについて上で説明したそれ（すなわち、式（ＩＶ））と同じである。
【００７６】
抱合体は、好適に機能付与された疎水性部分（たとえば、末端アミノ）を好適に機能付与された双性ポリマーまたは混合電荷コポリマー（たとえば、カルボキシ末端基またはその反応性誘導体）またはその疎水性誘導体（たとえば、カチオン性エステル誘導体）に共有結合させることによって調製できる。
【００７７】
本発明の代表的な双性イオン性抱合体、治療薬を含む対応する粒子、およびこの粒子のリポソーム製剤の調製および特性を、例１において説明する。
【００７８】
粒子
本発明のもう１つの態様では、双性イオン性ブロックコポリマーおよび双性イオン性抱合体から形成される粒子が提供される。前記コポリマーおよび抱合体の性質のおかげで、粒子は水性の環境において自己組織化によって形成できる。水性の環境（たとえば、生理環境）では、粒子は、コポリマーの疎水性部分を構成する疎水性コアと、コポリマーの高電荷双性イオン性部分を構成する親水性シェルとを有する。もう１つの実施形態では、粒子は前記抱合体から構成されるミセルの形態を有する。
【００７９】
ある実施形態では、粒子はベシクル構造を有しうる。１つの実施形態では、粒子は、前記抱合体および他のベシクル形成脂質から作られるリポソームの形態を有する。これらのベシクル形成脂質は種々の合成または自然発生のベシクル形成脂質から選択することができる。これらの脂質としてはリン脂質、スフィンゴ脂質、およびステロールが挙げられる。もう１つの実施形態では、粒子は前記コポリマーから作られるポリマーソームの形態を有する。カーゴ、たとえば治療用および／または診断用薬剤の送達の場合、コアシェルナノ粒子およびミセルは疎水性カーゴを封入するのに適しており、リポソームおよびポリマーソームは、疎水性カーゴも封入できるが、親水性カーゴを優先する。
【００８０】
もう１つの実施形態では、本発明は、本発明の複数の双性イオン性抱合体を含む粒子を提供する。ある実施形態では、この粒子は１種以上のベシクル形成脂質をさらに含む。
【００８１】
１つの実施形態では、粒子はコアシェルナノ粒子である。
【００８２】
１つの実施形態では、粒子はポリマーソームである。
【００８３】
１つの実施形態では、粒子はミセルである。
【００８４】
１つの実施形態では、粒子はリポソームである。
【００８５】
コア−シェルナノ粒子およびミセルは疎水性粒子をコーティングするのに有用である。疎水性粒子としては金属粒子（たとえば、金、銀、酸化鉄、量子ドット）およびポリマー粒子が挙げられる。
【００８６】
ある実施形態では、粒子は平均流体力学的径が約５から約５０００ｎｍまでである。ある実施形態では、粒子は平均流体力学的径が約５から約５００ｎｍまでである。他の実施形態では、粒子は平均流体力学的径が約５から約２００ｎｍまでである。腎糸球体の孔（約５ｎｍ）よりも大きな径を有する堅牢なＮＰは腎臓ろ過を有効に減らすことができ、それにより血液循環時間を増やすことができる。腫瘍血管系は正常組織（４０−８０ｎｍまたはさらには１μｍ）よりも大きな孔隙径を有し、そのため、血管透過性および滞留性亢進（ＥＰＲ）効果と呼ばれる、好適な大きさのＮＰの腫瘍への受動性漏出を可能にする。
【００８７】
治療用薬剤。ある実施形態では、本発明の粒子は１種以上の治療用薬剤をさらに含む。本発明に従って使用されうる例示的な治療用薬剤としては小分子、有機金属化合物、核酸、タンパク質（たとえば、多量体タンパク質、タンパク質複合体、ペプチド）、脂質、炭水化物、ホルモン、金属、放射性元素および化合物、薬物、ワクチン、免疫薬、および／またはこれらの組み合わせが挙げられる。
【００８８】
いくつかの実施形態では、治療用薬剤は薬剤活性を有する小分子および／または有機金属化合物である。いくつかの実施形態では、治療薬剤は臨床的に使用する薬物である。いくつかの実施形態では、薬物は、抗ガン剤、抗生剤、抗ウイルス剤、抗ＨＩＶ剤、抗寄生虫剤、抗原虫剤、麻酔剤、抗凝固薬、酵素の阻害剤、ステロイド剤、ステロイド系または非ステロイド系抗炎症剤、抗ヒスタミン剤、免疫抑制剤、抗悪性腫瘍薬、抗原、ワクチン、抗体、鬱血除去薬、鎮静剤、オピオイド、鎮痛剤、解熱剤、産児調節剤、ホルモン、プロスタグランジン、黄体ホルモン剤、抗緑内障剤、眼病用剤、抗コリン作動薬、麻酔剤、抗鬱剤、抗精神病薬、神経毒、催眠薬、精神安定剤、痙攣薬、筋弛緩剤、抗パーキンソン剤、鎮痙剤、筋収縮剤、チャネル遮断剤、縮瞳薬、分泌抑制剤、抗血栓剤、抗凝血剤、抗コリン剤、β−アドレナリン遮断薬、利尿剤、心血管活性剤、血管作用薬、血管拡張剤、抗過敏症剤、血管形成剤、細胞−細胞外マトリックス相互作用のモジュレータ（たとえば、細胞増殖阻害剤および抗接着分子）、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質合成の阻害剤である。
【００８９】
ある実施形態では、小分子薬は任意の薬物でありうる。いくつかの実施形態では、薬物は、ヒトまたは動物における使用に安全かつ有効であると政府関連機関または規制機関によって既に判断されているものである。たとえば、ヒトでの使用が認可された薬物は、アメリカ食品医薬局によって、参照によりここに組み込まれる21 C.F.R. §§ 330.5, 331〜361、および440〜460に列挙されている；獣医学用途のための薬物は、アメリカ食品医薬局によって、参照によりここに組み込まれている21 C.F.R §§ 500〜589に列挙されている。列挙された全ての薬剤は本願発明に従う使用に合格であると考えられている。
【００９０】
本発明における使用に好適な種類および具体的な薬剤のより完全な一覧表は、Pharmaceutical Drugs: Syntheses, Patents, Applications by Axel Kleemann and Jurgen Engel, Thieme Medical Publishing, 1999およびthe Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs and Biologicals, Ed. by Budavari et al, CRC Press, 1996にあり、これらは両方とも参照によりここに組み込まれている。
【００９１】
本発明のある実施形態では、治療用薬剤は核酸（たとえば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、その誘導体）である。いくつかの実施形態では、核酸剤は機能性ＲＮＡである。一般に、「機能性ＲＮＡ」は、タンパク質をコードするものではなく、代わりにその構成要素が細胞内で１つ以上の別々の機能または活性を特徴的に有するＲＮＡ分子の種類に属する。異なる配列を有する機能性ＲＮＡ分子の相対的な活性は異なりうるものであり、該ＲＮＡが存在している特定の細胞のタイプに少なくとも部分的に依存しうることが認められるであろう。したがって、用語「機能性ＲＮＡ」はここではある種類のＲＮＡ分子を指すのに使用し、この種類の全ての構成要素があらゆる特定の条件のセットのもとで実際にこの種類の活性特徴を示すことを意味することを意図していない。いくつかの実施形態では、機能性ＲＮＡとしては、ＲＮＡｉ誘起実体（たとえば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、およびマイクロＲＮＡ）、リボザイム、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、三重らせん形成に有用なＲＮＡが挙げられる。
【００９２】
いくつかの実施形態では、核酸剤はベクターである。ここで使用する限りにおいて、用語「ベクター」は、核酸分子であって、それが結合していた他の核酸を運搬することができる核酸分子（典型的には、必ずしもそうではないが、ＤＮＡ分子）を指す。ベクターは、ホスト細胞においてそれらが結合する核酸の染色体外での複製および／または発現を達成することができる。いくつかの実施形態では、ベクターはホスト細胞のゲノムへの組込みを達成することができる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、ベクターはタンパク質および／またはＲＮＡの発現を管理するのに使用される。いくつかの実施形態では、発現させようとするタンパク質および／またはＲＮＡは細胞によっては通常発現されない。いくつかの実施形態では、発現さようとするタンパク質および／またはＲＮＡは細胞によって通常発現されるが、ベクターが該細胞へ送達されていない場合に発現されるそれよりも低いレベルである。いくつかの実施形態では、ベクターが、ここで説明した機能性ＲＮＡ、たとえばＲＮＡｉ誘起実体、リボザイムのいずれかの発現を管理する。
【００９４】
いくつかの実施形態では、治療用薬剤はタンパク質またはペプチドでありうる。用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は交互に使用することができる。ある実施形態では、ペプチドは、大きさが、約５から約５０００まで、５から約１０００まで、約５から約７５０まで、約５から約５００まで、約５から約２５０まで、約５から約１００まで、約５から約７５まで、約５から約５０まで、約５から約４０まで、約５から約３０まで、約５から約２５まで、約５から約２０まで、約５から約１５まで、または約５から約１０までのアミノ酸に及ぶ。
【００９５】
ポリペプチドはＬ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、またはその両方を含有する場合があり、当技術で知られている種々の修飾アミノ酸または類似物のいずれかを含有する場合がある。有用な修飾としては、たとえば末端アセチル化、アミド化が挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ここで説明したような、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、合成アミノ酸、およびこれらの組み合わせを含みうる。
【００９６】
いくつかの実施形態では、治療用薬剤はホルモン、エリスロポエチン、インスリン、サイトカイン、ワクチン接種のための抗原、成長因子でありうる。いくつかの実施形態では、治療用薬剤は抗体および／またはその特徴部分でありうる。いくつかの実施形態では、抗体としては、限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ（すなわち「ヒト化」）抗体、または一本鎖（組替体）抗体を挙げることができる。いくつかの実施形態では、抗体は低減されたエフェクター機能および／または二重特異性分子を有しうる。いくつかの実施形態では、抗体としてはＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーによって作られるフラグメント（たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ二重特異性抗体、およびＦｄフラグメント）を挙げることができる。
【００９７】
いくつかの実施形態では、治療用薬剤は炭水化物である。ある実施形態では、炭水化物はタンパク質と会合している炭水化物（たとえば、糖タンパク質、プロテオグリカン）である。炭水化物は天然でもよいしまたは合成でもよい。また、炭水化物は誘導体化された天然炭水化物でもよい。ある実施形態では、炭水化物は単糖類または複合糖類でありうる。ある実施形態では、炭水化物は単糖類であり、限定はされないが、グルコース、フルクトース、ガラクトース、およびリボースが挙げられる。ある実施形態では、炭水化物は二糖類であり、限定はされないが、ラクトース、スクロース、マルトース、トレハロース、およびセロビオースが挙げられる。ある実施形態では、炭水化物は多糖類であり、限定はされないが、セルロース、微結晶性セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、メチルセルロース（ＭＣ）、デキストロース、デキストラン、グリコーゲン、キサンタンガム、ジェランガム、でんぷん、およびプルランが挙げられる。ある実施形態では、炭化水素は糖アルコールであり、限定はされないが、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、およびラクチトールが挙げられる。
【００９８】
いくつかの実施形態では、治療用薬剤は脂質である。ある実施形態では、脂質はタンパク質に会合している脂質（たとえば、リポタンパク質）である。本発明に従って使用されうる例示的な脂質としては、限定されないが、油、脂肪酸、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、必須脂肪酸、シス脂肪酸、トランス脂肪酸、グリセリド、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、ホルモン、ステロイド（たとえば、コレステロール、胆汁酸）、ビタミン（たとえば、ビタミンＥ）、リン脂質、スフィンゴ脂質、リポタンパク質が挙げられる。
【００９９】
いくつかの実施形態では、脂質は１種以上の脂肪酸基またはその塩を含みうる。いくつかの実施形態では、脂肪酸基は可消化性であり、長鎖（たとえば、Ｃ8−Ｃ50）であり、置換されているまたは置換されていない炭化水素を含みうる。いくつかの実施形態では、脂肪酸基は、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキド酸、ベヘン酸、またはリグノセリン酸のうちの１種以上でありうる。いくつかの実施形態では、脂肪酸基はパルミトレイン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、アルファ−リノール酸、ガンマ−リノール酸、アラキドン酸、ガドレイン酸、アラキドン酸、エイコサペンタン酸、ドコサヘキサエン酸、またはエルカ酸のうちの１種以上でありうる。
【０１００】
診断用薬剤。ある実施形態では、本発明の粒子は１種以上の診断用薬剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、診断用薬剤としては、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、コンピュータ断層撮影（ＣＡＴ）、単一光子放射型コンピュータ断層撮影、Ｘ線、蛍光透視検査、および磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）で使用される市販の撮像造影剤（imaging agent）；鎮吐薬；ならびにコントラスト造影剤（contrast agent）が挙げられる。ＭＲＩでのコントラスト造影剤としての使用に好適な材料の例はガドリニウムキレートと、鉄、マグネシウム、マンガン、銅、およびクロムとを含む。ＣＡＴおよびＸ線撮像に有用な材料の例としてはヨウ素系の材料が挙げられる。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、診断用および／または治療用薬剤は放射性核種でありうる。使用する放射性核種の中で、ガンマ放射体、ポジトロン放射体、およびＸ線放射体が診断および／または治療の目的に好適であるが、ベータ放射体およびアルファ放射体も治療のために使用することができる。本発明での使用に好適な放射性核種としては、限定されないが、123Ｉ、125Ｉ、130Ｉ、131Ｉ、133Ｉ、135Ｉ、47Ｓｃ、72Ａｓ、72Ｓｅ、90Ｙ、88Ｙ、97Ｒｕ、100Ｐｄ、101ｍＲｈ、119Ｓｂ、128Ｂａ、197Ｈｇ、211Ａｔ、212Ｂｉ、212Ｐｂ、109Ｐｄ、111Ｉｎ、67Ｇａ、68Ｇａ、67Ｃｕ、75Ｂｒ、77Ｂｒ、99ｍＴｃ、14Ｃ、13Ｎ、15Ｏ、32Ｐ、33Ｐ、および18Ｆが挙げられる。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、診断用薬剤は蛍光性、発光性または磁性部分でありうる。蛍光性および発光性部分としては種々の様々な有機または無機の小分子が挙げられ、これら「色素」、「ラベル」または「インジケーター」と一般に呼ばれる。例としてはフルオレセイン、ローダミン、アクリジン色素、Alexa色素、シアニン色素が挙げられる。蛍光性および発光性部分としては種々の天然発生タンパク質およびその誘導体、たとえば遺伝子改変変異体が挙げられうる。たとえば、蛍光タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度ＧＦＰ、赤色、青色、黄色、シアン、およびサファイア蛍光タンパク質、サンゴ礁蛍光タンパク質が挙げられる。発光タンパク質としては、ルシフェラーゼ、エクオリンおよびこれらの誘導体が挙げられる。多くの蛍光および発光色素およびタンパク質が当技術において知られている（たとえば、米国特許出願公開第2004/0067503号； Valeur, B., "Molecular Fluorescence: Principles and Applications," John Wiley and Sons, 2002；Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, Molecular Probes, 9th edition, 2002；およびThe Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Invitrogen, 10th edition（the Invitrogenのウェブサイトから閲覧可能である）を参照のこと）。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、診断用薬剤は所定の診断方法で検出できるナノ粒子、たとえば量子ドット、酸化鉄、金ナノ粒子、ナノロッドもしくはナノシェル、カーボンナノチューブ、ナノシート、シリカで保護したナノ粒子またはこれらのナノ材料の組み合わせでありうる。
【０１０４】
ある実施形態では、本発明の粒子は、１種以上の治療用薬剤および／または１種以上の診断用薬剤をさらに含む。
【０１０５】
標的薬剤。ある実施形態では、粒子（カーゴを有しているまたは有していない）は１種以上の標的薬剤をさらに含む。
【０１０６】
治療および診断目的に有用な粒子は、本発明のポリマーを用いて有利に処理できる。ある実施形態では、表面は、複数のポリマーのうち前記表面に接着した部分に供給結合している複数の標的結合パートナーを含む。この実施形態では、標的結合パートナーは標的分子に対する親和性を有する。これらの実施形態では、表面を診断分析で使用できる。
【０１０７】
表面に対する標的分子の結合親和性は、表面に固定された標的結合パートナーから得られる。標的結合パートナーと標的分子とは、各々結合対要素と呼ばれ、結合対を形成する。各結合対要素は他方の要素に特異的に結合する分子である。１つの実施形態では、標的結合パートナーは標的分子に対する親和性を有し、約１０-8未満のＫdを有する。
【０１０８】
結合対要素は任意の好適な分子でありうるものであり、限定されないが、タンパク質、ペプチド、タンパク質、多糖類または少糖類、糖たんぱく質、脂質およびリポタンパク、ならびに核酸と、明確な生理活性を有する合成有機または無機分子、たとえば抗生剤、抗炎症剤、もしくは細胞接着メディエーターとが挙げられる。
【０１０９】
本発明の表面に固定できるタンパク質の例としては、リガンド結合タンパク質、レクチン、ホルモン、受容体、および酵素が挙げられる。代表的なタンパク質としては抗体（モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、一本鎖または他の組替形態）、それらのタンパク質／ペプチド抗原、タンパク質−ペプチドホルモン、ストレプトアビジン、アビジン、Ａタンパク質、Ｇタンパク質、成長因子およびそれらのそれぞれの受容体、ＤＮＡ結合タンパク質、細胞膜受容体、エンドソーム膜受容体、核膜受容体、ニューロン受容体、視覚受容体、ならびに筋細胞受容体が挙げられる。本発明の表面に固定できる代表的なオリゴヌクレオチドとしては、ＤＮＡ（ゲノムまたはｃＤＮＡ）、ＲＮＡ、アンチセンス、リボザイム、およびＲＮアーゼＰのための外部誘導配列が挙げられ、その大きさは、短いオリゴヌクレオチドプライマーから遺伝子全体までに及びうる。
【０１１０】
標的化合物に特異的に結合する他の標的結合パートナーとしては、受容体、たとえば炎症性メディエーターＰ−セレクチンおよびＥ−セレクチンのためのリガンド上の炭水化物に結合する糖タンパク質上の多糖類または少糖類、ならびに相補配列に結合する核酸配列、たとえばリボザイム、アンチセンス、ＲＮアーゼＰのための外部誘導配列、およびアプタマーが挙げられる。
【０１１１】
１つの実施形態では、標的結合パートナーは抗体であり、標的分子は抗体に対する抗原である。この実施形態では、本発明の表面は抗原に特異的に結合し、非特異タンパク質の吸着を防止する。１つの実施形態では、標的結合パートナーは細胞接着を促進できるタンパク質であり、標的分子は細胞である。この実施形態では、発明の表面は細胞に特異的に結合し、非特異タンパク質の吸着および非特異細胞の接着を防ぐ。
【０１１２】
標的結合パートナーを固定するためのカルボキシベタインポリマー表面の使用は、参照によりその全体がここに明確に組み込まれているWO 2008/083390に記載されている。
【０１１３】
医薬組成物
他の態様では、本発明は双性イオン性ブロックコポリマーおよび双性イオン性抱合体を含む組成物を提供する。ある実施形態では、組成物は対象者への投与に好適な医薬組成物である。これらの組成物は薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤を含む。
【０１１４】
治療用／診断用薬剤の送達方法
もう１つの態様では、本発明は前記粒子を使用する方法を提供する。
【０１１５】
１つの実施形態では、本発明は治療用および／または診断用薬剤を治療または診断を必要とする対象者に送達する方法を提供する。この方法では、本発明の双性イオン性ブロックコポリマーおよび双性イオン性抱合体のうちの１種以上の粒子を含む組成物を対象者に投与する。
【０１１６】
以下に、代表的な双性イオン性ブロックコポリマーおよび双性イオン性抱合体、それらの粒子、ならびにその特性を説明する。
【０１１７】
１つの実施形態では、本発明は双性イオン性材料、ポリ（カルボキシベタイン）（ＰＣＢ）を提供し、これは、各ＣＢ側鎖がアミン含有生体分子との抱合のための１つのカルボキシラートアニオン基を有するのと同時に、各アカルボキシラートアニオン基が双性イオン性基としての１つのカチオン性四級アミン基と対を成して、複合培地からであっても非特異タンパク質吸着を有効に防ぐという点で独特である。生体分子との抱合は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＥＤＣ／ＮＨＳ）化学よって容易に達成できる。抱合のあと、未反応のＮＨＳエステル基を加水分解してカルボキシラートアニオンにし、これがカチオン性四級アミンと対を作り、非ファウリング性の双性イオン性構造体を形成する。しかしながら、機能性付与可能なＣＯＯＨ末端ＰＥＧの場合、未反応官能基（たとえば、カルボン酸（carboxylate acid））はいくつかのファウリング問題を、特に複合培地においてもたらしうる。したがって、ＰＣＢは大量の官能基ととても低いファウリングバックグラウンドとを全て１つの材料に有し、２つの全く異なる性質：非ファウリング性および機能付与を妥協しない。抗体をＰＣＢ被覆センサーチップに固定した場合、機能付与後の表面はとても低いファウリング性（たとえば、未希釈の血漿および血清からでさえも、＜０．３ｎｇ／ｃｍ2の吸着タンパク質）を維持したままであり、血液中の生物マーカーが高い感度で検出できる。ＣＢのＮＰ表面上への導入は薬物送達キャリアの安定性および多機能能力の両方を高める。
【０１１８】
１つの態様では、本発明は乳酸−グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）ベースの薬物送達システムを提供する。ＰＬＧＡは、ＦＤＡに認可されており、その疎水性および水性媒体中での加水分解が遅いという性質のおかげにより薬物を封入することと薬物放出を制御することとのために使用されてきた。１つの実施形態では、本発明は双性イオン性ブロックコポリマー（たとえば、ＰＬＧＡ−ＰＣＢブロックコポリマー）を提供し、これは自己組織化して薬物送達用のＰＣＢシェルを有するＰＬＧＡ−コアＮＰとなる。
【０１１９】
ＰＬＧＡ−ＰＣＢ ＮＰは、双性イオン性ＣＢの強い水和およびＰＬＧＡ−コアとＰＣＢ−シェルと間の明確な親水性／疎水性の違いのおかげによる安定効果を示す。２つのブロック間のこの違いは大きいため、ＰＬＧＡおよびＰＣＢホモポリマーを共に溶解できる共通の溶媒も混合溶媒もない。したがって、ＰＬＧＡ−ＰＣＢブロックコポリマーの合成は、この溶媒問題のせいで非常に挑戦的である。この問題を解決するために、新たなカルボキシベタインｔｅｒｔ−ブチル（ＣＢ−ｔＢｕ）エステルモノマーを調製した（図１を参照のこと）。双性イオン性のＣＢとは異なり、ＣＢ−ｔＢｕは有機溶媒中での安定性を有するカチオン性エステルモノマーであり、そのためＰＬＧＡとＰＣＢ−ｔＢｕポリマーとの共有結合を共通溶媒、たとえばアセトニトリル中で可能にする。双性イオン性ＣＢ構造体は、ＰＬＧＡとの共有結合後、ｔＢｕエステル基の酸性環境、たとえばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中で加水分解することによって再生できる。この合成経路は、双性イオン性ＣＢ分子の有機合成における適応性を潜在的に広げ、極性の双性イオン性ＣＢと広範な疎水性分子との間の反応を可能にする。
【０１２０】
ＰＬＧＡ−ＰＣＢブロックコポリマーは、ＣＢのＰＬＧＡ（適切な末端基を有する）開始ラジカル重合によってまたはＰＬＧＡとＰＣＢとの抱合（たとえば、ＣＯＯＨ末端ＰＬＧＡがＮＨ2末端ＰＣＢに結合する）によって調製されうる。後者の経路は、ＮＨ2−ＰＣＢ生成物が広範なＣＯＯＨ末端分子、たとえば市販のＰＬＧＡ、強力な化学療法薬、ならびに安定化および多機能性目的のためのタンパク質または酵素に抱合されうるので好ましい。しかしながら、ＮＨ2−ＰＣＢのＣＯＯＨ−ＰＬＧＡブロックへの直接抱合は、２つのブロックの極性におけるそれらの劇的な差のせいで難しい。双性イオン性ＰＣＢは水またはメタノールのみに溶解させることができるが、ＰＬＧＡはいずれの溶媒にも溶解させることができない。また、ＰＬＧＡは少量の水により加水分解することが知られている。これらの「溶媒」の問題を解決するために、本発明はＣＢ−ｔＢｕエステルモノマー（図１）を提供し、これは安定であり、無水有機溶媒たとえばアセトニトリルおよびＤＭＦにおける溶解性を有する。ＣＢ−ｔＢｕエステルモノマーは、ＴＦＡ-ＮＨ3+を生じさせる開始剤（２−アミノエチル２−ブロモイソブチラート）（図１、工程１）によって開始される、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）法によって重合される。ＴＦＡ塩の除去後、有機溶媒中での優れた溶解性を有するＰＣＢ−ｔＢｕ−ＮＨ2が得られ（図１、工程２）、これは、ＰＬＧＡ−ＰＣＢ−ｔＢｕブロックコポリマーを形成する無水アセトニトリル中でのＰＬＧＡ−ＮＨＳとの抱合を可能にする（図１、工程３）。ｔＢｕエステルの特異性はＴＦＡによるエステル基の容易な除去にあり、これは、双性イオン性ＣＢ構造体を生じさせ、ＰＬＧＡはこのような酸性環境では無傷のままである（図１、工程４）。１時間のＴＦＡ処理は、そのメチルアクリラート部分におけるエステル結合を切ることなしにＰＣＢ−ｔＢｕをＰＣＢに完全に変換するのに十分であり、６時間までのＴＦＡインキュベーションはＰＬＧＡのエステル主鎖を破壊しないであろう。ＰＬＧＡおよびポリ乳酸（ＰＬＡ）の酸分解に対する耐性が知られている。そのため、ＰＣＢ−ｔＢｕは、疎水性部分が加水分解を受けるとしても、一方のＰＣＢブロックと他方の疎水性ブロックとを含有するあらゆる両親媒性ブロックポリマー（たとえば、ＰＬＡ−ＰＣＢまたはＰＬＧＡ−ＰＣＢ）の一般的な合成方法において使用できる。
【０１２１】
ＰＬＧＡ−ＰＣＢ ＮＰを調製するために、ブロックコポリマーを水混和性有機溶媒に溶解させる溶媒置換法（すなわちナノ晶析法）を使用した。ＰＣＢブロックは溶解可能であるがＰＬＧＡブロックはそうでない水を添加すると、「ＰＬＧＡコア−ＰＣＢシェル」構造のＮＰが形成される。有機溶媒は撹拌中に蒸発して水溶液が残り、その中でＮＯが硬化する。疎水性薬物を有機溶媒中でコポリマーに混合する際、それらは上で説明したプロセスの間にＮＰの疎水性コアの中に封入されるようになる（図１、工程５）。有機溶媒は、ＰＬＧＡおよびＰＣＢブロック間の極性の明確な違いのおかげで、ＮＰ形成において重要な役割を果たしうる。単一の溶媒、たとえば２,２,２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）は、この溶媒中でのＰＬＧＡの溶解性のおかげでＰＬＧＡ−ＰＣＢを大量に溶解させることができるが、粒度分布が不均一な大きな粒子をもたらす（５１５．８±５０．０ｎｍ、ＰＤＩ＝０．５２７±０．０５６）。これは、ＴＦＥ中でのＰＣＢブロックの微視的な不溶状態の結果得られる。したがって、「ＰＣＢコア−ＰＬＧＡシェル」の逆ミセルの形成は、小さく均質なＮＰに有利でない。ＴＦＥ中でのＰＣＢブロックの溶解性を高めるために、ＴＦＥ／ＭｅＯＨ共溶媒を代わりに使用し、それにより、単分散の粒度分布，たとえばＮＰサイズ＝１４８．８±１．１ｎｍ；ＰＤＩ＝０．０４０±０．０１１（図２Ａ），を有するＮＰを再現性のある方法で作製した。なお、ＴＦＥは、撹拌の際のＴＦＥの容易な蒸発のおかげで、ＤＭＳＯよりも好ましい。典型的な調製の場合、ＰＬＧＡ−ＰＣＢコポリマーは自己組織化して非常に低いＰＤＩを有するＮＰになった。収率は１００％に近く、晶析物も微小サイズの粒子もこの組織化過程によっては生じなかった。したがって、ろ過を使用して大きな粒子を除去する必要はなかった。溶媒置換中に界面活性剤は必要ない。これは、双性イオン性ＰＣＢシェルはＮＰを水性媒体中で安定化させるからである。ＰＥＧ化されたＮＰシステムと比較すると、ＰＣＢはＮＰの分散性に対するより優れた安定化効果を有する。これはＰＣＢがＰＥＧよりも遥かに親水性であり、そのため、自己組織化の過程中に予想されるＰＬＧＡによる鎖の包埋が少ないからである。コポリマーブロック間の明確な極性の違いが、小さく均質なＮＰへのこのような有効な組織化に関与する。上で得られたＰＬＧＡ−ＰＣＢ ＮＰのゼータ電位を測定すると−４３．５±１．０ｍＶであり、同じ大きさ（ＮＰの大きさ＝１４５．７±３．９ｎｍ；ＰＤＩ＝０．１１３±０．０３３）のＰＬＧＡ ＮＰはゼータ電位が−６８．１±１．８ｍＶであった。
【０１２２】
ドセタキセルを上述の方法によってＰＬＧＡ−ＰＣＢ ＮＰに封入し、薬物放出プロファイルを集めた。調製物中の初期薬物投入量が５重量％である場合、得られるＰＬＧＡ−ＰＣＢ／Ｄｔｘｌ ＮＰは、薬物負荷が約１重量％（０．９３３±０．０２１重量％）であり、大きさが１３８．５±０．６ｎｍであり、ＰＤＩが０．１２５±０．０１７であり、ゼータ電位が−３４．８±１．３ｍＶであった。ＰＣＢで修飾したおよび修飾していないＰＬＧＡ ＮＰは、９６時間にわたる類似した持続的な薬物放出プロファイルを有し、封入した薬物の５０％を最初の８時間で放出する。薬物放出の動態は、ＰＬＧＡブロックの長さを変化させることによってさらに調節できる；薬物放出速度はＰＬＧＡの分子量を増やすことによって延ばすことができる。
【０１２３】
生物学的な関連培地たとえば血清中でのＮＰの安定性は、生体内での使用のための薬物送達媒体としてのそれらの実行可能性を決定する。未希釈の血漿および血清からの表面に結合する非特異タンパク質を有効に低減させることがわかっているＰＣＢは疎水性ＰＬＧＡ ＮＰを複合培地中で安定化させることができる。ＰＬＧＡ−ＰＣＢ ＮＰを、ＰＢＳ中の１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液または１００％ＦＢＳ溶液に３７℃で入れ、ＮＯの大きさを時間の関数として測定した。１３時間の試験中ＰＣＢ修飾ＮＰの大きさの増加は観察されなかったが、修飾していないＰＬＧＡ ＮＰはこれらの培地中へのそれらの浸漬直後に激しく凝集した。ＰＬＧＡ−ＰＣＢ ＮＰの長期研究から、これらの粒子はそれらの元々の大きさを１０重量％ＢＳＡおよび１００％ＥＢＳ培地の両方で５日間の期間にわたって維持することがわかる（図２Ｃ）。これは、ＰＬＧＡ−ＰＣＢ ＮＰが生体内での薬物送達のために使用できることを意味する。
【０１２４】
後調製または後処理によるＮＰの安定性は、実験室で作り出したＮＰからそれらの臨床用途までにおいても重要である。ＰＣＢは静電的に誘起された水和によって水に結合するので、それは水素結合材料たとえばＰＥＧよりも強い水和を有する。双性イオン性ＰＣＢポリマーはＮＰを処理の種々の工程の過酷な条件から保護することが予想される。高速遠心分離はＮＰペレットを生成するために精製目的で広く使用されているが、ＰＥＧ化ＮＰなどのＰＬＧＡベースのＮＰはペレット形成中に凝集しやすい。薬物が負荷されているまたは負荷されていないＰＣＢ修飾ＰＬＧＡ ＮＰは繰り返される高速遠心分離からペレットの簡単なピペット再懸濁によって容易に回収されたので、それにより超音波処理の必要はなくなった。しかしながら、未修飾のＰＬＧＡ ＮＰのペレットは、形成すると、超音波処理なしでは再懸濁できない。ＰＣＢ修飾ＮＰの場合特に、上澄み液を（標準的なＮＰ精製手順でのように）各遠心分離工程で除去した際、図２Ｄおよび図２Ｅから計算されたＰＬＧＡ−ＰＣＢ ＮＰおよびＰＬＧＡ−ＰＣＢ／Ｄｘｌ ＮＰについて６−９％および１−８％の大きさの増加が、ＰＤＩのわずかな増加を伴ってそれぞれ確認された。各サイクル後に得られるより小さなＰＤＩはその残留するＮＰの単分散に影響を与える。なお、ＮＰ凝集に起因しない各サイクル後のわずかな大きさの増加が存在する。より小さなＮＰは、各遠心分離工程でペレットを形成しにくく、そのため、上澄み液の除去は回収される部分の粒度分布をより大きな値に移動させるであろう。この安全性の問題を二重に確認するために、遠心分離工程の合間で上澄み液を除去しなかった並列実験を行った。繰り返される遠心分離によりＮＰは同様の大きさおよびＰＤＩを維持したことが分かり、これはＰＬＧＡ ＮＰ（薬物が封入されているまたはされていない）をペレット化によるあらゆる凝集から安定させるＰＣＢの能力を示している。これは、疎水性ＰＬＧＡコアを機械的に誘起される凝集から安定させる、ＮＰのＰＣＢシェルによって作り出される強い水和層のおかげによる。
【０１２５】
凍結乾燥は、水性の保管媒体中でのポリマーの分解および薬物の漏れを防ぐための、ＮＰの保管に必要な手順である。凍結保護添加剤なしに凍結乾燥に耐えることができる他のポリマーベースＮＰはない。ＰＥＧ化ＮＰであっても、１０％スクロースなどの添加剤が必要である。なぜなら、ＰＥＧは凍結乾燥によって結晶化され、ＮＰ凝集を防ぐその機能を失うからである。ＰＣＢ修飾ＰＬＧＡ ＮＰは何ら添加剤なしにその安定性を凍結乾燥後に保持する（図２Ｆ）。薬物負荷されているまたはされていない乾燥ＰＣＢ修飾ＮＰのピペットを用いる（超音波処理を必要としない）簡単な再懸濁は同様の平均径および低いＰＤＩでＮＰを回収する。また、これらのＮＰは乾燥後にＳＥＭによって視覚化した（図２Ｂ）。この挙動は、強いＰＣＢの水和および特徴的なＰＬＧＡ／ＰＣＢブロックによって得られうる。ＰＥＧとは異なり、ＰＣＢはある量の水分子と強く結合して凍結乾燥中の結晶化を防ぐ。加えて、二つのブロック間の明瞭な極性の差のおかげによるコポリマーの有効な組織化はほとんど欠陥を含まない保護性ＰＣＢシェルを与え、これは非常に脱水された環境であっても疎水性コアを遠ざけておく。複合生物学的培地および苛酷な調製後処理に耐えることができるそれら能力のおかげで、双性イオン性ＰＣＢ修飾ＮＰは産業的および臨床的の両方の安定性の問題に独自に対処する。
【０１２６】
ＮＰの機能付与は、生体分子をたとえば色素および標的リガンドに様々な目的で付着させるのに必要とされる。興味のある分子をＰＣＢシェル上に固定させることについての実行可能性を調べるために、フルオレセインを蛍光性ＮＰを作り出すためのモデルリガンドとして使用した。ＰＣＢのカルボキシル基を（＋）ＥＤＣおよびＮＨＳの存在下でＮＨＳエステルに変換し、その後フルオレセイン分子中のアミン基と抱合させた。ＮＰ表面上での抱合化学を確認するために、ネガティブコントロールとして、ＮＨＳエステルの生成なしに、（−）ＥＤＣは存在しないが＋ＮＨＳを存在させてＮＰを調製した。このネガティブコントロールでは、ＮＰへの色素のあらゆる結合は物理的相互作用によるものであるはずである。フルオレセインインキュベーションのあと、ＮＨＳエステルを表面に有するＮＰは、色素へのそれらの共有結合のおかげでコントロールよりも著しく高い蛍光を有した（図３Ａ）。また、標的薬物送達媒体としてのＰＬＧＡ−ＰＣＢ ＮＰの可能性を評価した。緑色蛍光染料（ＮＢＤ）を「可視」モデル薬物として使用し、ＮＰに封入した。得られたＰＬＧＡ−ＰＣＢ／ＮＢＤ ＮＰを、アミン修飾ガラクトースリガンドに、＋ＥＤＣおよび＋ＮＨＳかまたは−ＥＤＣおよび＋ＮＨＳでさらに抱合させ、その後ＨｅｐＧ２細胞と共にインキュベートして細胞結合能力を試験した。ガラクトースは、生体内の肝癌細胞株（たとえばＨｅｐＧ２）および生体内の肝細胞中のアシアロ糖タンパク質受容体を標的するのに広く使用される。固定されたガラクトースリガンド（＋ＥＤＣ、＋ＮＨＳ）を有するＰＬＧＡ−ＰＣＢ／ＮＢＤ ＮＰは容易にこの細胞に結合し、それにより図３Ｂに示すように強い蛍光を生み出す。固定されたリガンド（−ＥＤＣ、＋ＮＨＳ）を持たないＰＬＧＡ−ＰＣＢ／ＮＢＤ ＮＰは標的性がなく非ファウリング性のＮＰをもたらし、そのため低い細胞結合能力を有する（図３Ｃ）。これらのフルオレセインおよびガラクトース／ＮＢＤ結果から、ＰＣＢ修飾ＮＰは、撮像および／または標的の目的でアミン末端分子を用いて容易に機能付与できることが分かる。
【０１２７】
ＣＢの構造は、溶質が生命体の浸透圧調節に非常に重要であるグリシンベタインのそれに類似している。ヒトによって吸収されるグリシンベタインの概算は１日当たり０．１から２．５ｇまでである。したがって、バイオミメティックＰＣＢでのＰＬＧＡの修飾は、ＦＤＡによって認可されたＰＬＧＡに何ら毒性をもたらすはずがない。実際、細胞毒性分析から、ＰＬＧＡ−ＰＣＢ ＮＰが、１０ｍｇ／ｍｌまでの濃度のＮＰでの２４時間のインキュベーション後のＨｅｐＧ２細胞の生存度に関して、ＰＬＧＡ ＮＰに類似していたことが分かった。この濃度は、成人の場合、体重１ｋｇあたり５００ｍｇ超に対応し、これは生体内薬物送達に必要とされるものよりも遥かに高い投薬量である。
【０１２８】
本発明の代表的なナノ粒子薬物送達システムの調製および特性は例２に示す。図７は、本発明の代表的なナノ粒子、ＰＬＧＡ−ＰＣＢ ＮＰからのドセタキセル放出プロファイルをＰＬＧＡ ＮＰと比較する。両ＮＰについての薬物負荷は１重量％である。ＰＣＢ修飾は薬物放出挙動を未修飾ＰＬＧＡからあまり変化させなかった。図８Ａおよび８Ｂは、ＰＢＳ中の１０重量％ＢＳＡ溶液（図８Ａ）および３７℃の１００％ＦＢＳ溶液（図８Ｂ）中でのＮＰ安定性（ナノ粒子の大きさ）を比較している。ＮＰの大きさ（平均±ＳＤ、ｎ＝３）を時間の関数としてプロットした。図９は、ＨｅｐＧ２細胞での、本発明の代表的なナノ粒子、ＰＬＧＡ−ＰＣＢ ＮＰの細胞生存度（細胞毒性）をＰＬＧＡ ＮＰと比較している。ＮＰを細胞と共に示した濃度で２４時間にわたってインキュベートし、直ぐに細胞生存度について３回分析した。ＰＬＧＡ ＮＰと類似して、ＰＬＧＡ−ＰＣＢ ＮＰは１０ｍｇ／ｍｌまでの濃度で細胞毒を示さなかった。
【０１２９】
ＰＣＢ修飾ＮＰは、ＰＥＧ化ＮＰよりも、その容易な加工性、異常な安定性、および妥協されない多機能性の点で優れている。ＰＣＢの豊富なカルボキシレートアニオン基は、標的リガンド、治療用薬物、および診断用ラベルの付着を従来のＮＨＳ／ＥＤＣ化学によって全て１つの材料で可能にし、ＰＣＢを「セラノスティックス」のための万能プラットフォームにする。
【０１３０】
以下の例は、例示を目的として提供するものであり、本発明を限定するものではない。
【０１３１】
例１
代表的な双性イオン性抱合体：ＤＳＰＥ−ＰＣＢの調製および特性
この例では、本発明の代表的な双性イオン性抱合体，ＤＳＰＥ−ＰＣＢ，と関連するリポソームの調製および特性を説明する。この抱合体の調製は図４に示している。
【０１３２】
ＤＳＰＥ−ＰＣＢ抱合体
原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）のためのＮＨＳエステル開始剤（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド２−ブロモプロパノアート）。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２．２６ｇ、１９．６ｍｍｏｌ）および２−ブロモプロピオン酸（１．４５ｍｌ、１６．４ｍｍｏｌ）を丸底フラスコ内の５００ｍｌの無水ジクロロメタン中に磁気撹拌子を用いて溶解させた。フラスコを０℃まで冷却し、Ｎ,Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド（３．３５ｇ、１６．３４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２５ｍｌ）を滴下した。室温で終夜撹拌したのち、反応混合物を濾過し溶媒を減圧化で除去して、黄色固体を得た。この生成物をフラッシュクロマトグラフィーによってさらに精製した。２．４ｇの白色固体（９．６３ ｍｍｏｌ、収率＝５９％）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（クロロフォルム）δ（ｐｐｍ）：１．９７および２．００（ｄ、３Ｈ、−ＣＯＯＣＨ（ＣＨ3）Ｂｒ)、２．８９（ｓ、４Ｈ、−ＣＯＣＨ2ＣＨ2ＣＯ−）、４．６４（ｑｕａｒ、Ｊ＝６Ｈｚ、１Ｈ、−ＣＯＯＣＨ（ＣＨ3）Ｂｒ）。
【０１３３】
２−ｔｅｒｔ−ブトキシ−Ｎ−（２−（メタクリロイルオキシ）エチル）−Ｎ,Ｎ−ジメチル−２−オキソエタンアミニウム（ＣＢ−ｔＢｕ）。５ｇの２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリラートおよび８．６８ｇのｔｅｒｔ−ブチルブロモアセタートを２０ｍｌのアセトニトリル中で２４時間にわたって５０℃でＮ2保護下で反応させた。２５０ｍｌのエチルエーテルを反応混合物に添加し、生じた白色の結晶を単離して乾燥させた。得られたＣＢ−ｔＢｕモノマーを直ちに−２０℃のデシケータ内に保管した（収率９６％）。1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ（ｐｐｍ）：１．４４（ｓ、９Ｈ、−ＯＣ（ＣＨ3）3）、１．８７（ｓ、３Ｈ、ＣＨ2＝Ｃ（ＣＨ3）ＣＯＯ−）、３．３１（ｓ、６Ｈ、−ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）2ＣＨ2ＣＯＯ−）、３．９８（ｔ、Ｊ＝３Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ2＝Ｃ（ＣＨ3）ＣＯＯＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）2ＣＨ2−)、４．２８（ｓ、２Ｈ、−ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）2ＣＨ2ＣＯＯ−）、４．６０（ｔ、Ｊ＝３Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ2＝Ｃ（ＣＨ3）ＣＯＯＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）2ＣＨ2−）、５．７３および６．１０（ｓ、２Ｈ、ＣＨ2＝Ｃ（ＣＨ3）ＣＯＯ−）。
【０１３４】
ＮＨＳ−ＰＣＢ−ｔＢｕ。ＣＢ−ｔＢｕのＡＴＲＰを無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中でＣｕ（Ｉ）Ｂｒ／ＨＭＴＥＴＡ触媒を使用して行った。典型的な重合では、ＤＭＦおよび液体ＨＭＴＥＴＡリガンドから窒素によるバブリングによって別々に酸素を追い出した。１ｇのＣＢ−ｔＢｕモノマー（３．６７ｍｍｏｌ）および１２５ｍｇのＮＨＳ開始剤（０．５ｍｍｏｌ）をシュレンク管に添加した。第２のシュレンク管に７１．７ｍｇのＣｕ（Ｉ）Ｂｒ（０．５ｍｍｏｌ）を添加した。両方の管を窒素および真空の間での３回の循環によって脱酸素した。８および２ｍＬの脱酸素したＤＭＦをモノマー／開始剤の管とＣｕ（Ｉ）Ｂｒの管とにそれぞれ添加した。１３６μＬ（０．５０ｍｍｏｌ）の脱酸素したＨＭＴＥＴＡをＣｕ（Ｉ）Ｂｒ含有溶液に添加し、窒素保護下で３０分間にわたって撹拌した。次に、触媒溶液（Ｃｕ（Ｉ）／ＨＭＴＥＴＡ）をモノマー／開始剤溶液に全て添加して反応を開始させた。反応を終夜室温で行った。重合後、反応はエチルエーテル中で完全に晶析させた。次に、晶析物を減圧下で乾燥させて、極小量のＤＭＦ（３−５ｍＬ）中に再溶解させた。この溶液を完全に溶解するまでボルテックスで撹拌し、アセトン中で晶析させて可溶な触媒および微量のモノマーを除去した。これを合計で３回繰り返して、触媒を完全に除去した。残ったエステルポリマーを終夜減圧下で乾燥させ、ＮＭＲで分析した。（７５４ｍｇ、収率＝７４．５％）。
【０１３５】
ＮＨＳ−ＰＣＢおよび分子量測定。ｔＢｕ基の加水分解によってＮＨＳ−ＰＣＢが得られた。５００ｍｇのＮＨＳ−ＰＣＢ−ｔＢｕを５ｍｌのトリフルオロ酢酸中に溶解させたこれを２時間にわたってそのままにしておいた。次に、溶液をエチルエーテル中で晶析させ、終夜減圧下で乾燥させた。分子量（たとえば、約４，９０９Ｄａ）を1Ｈ ＮＭＲ （Ｄ2Ｏ）δ（ｐｐｍ）：２．８２（ｓ、開始剤からの４Ｈ、−ＣＯＣＨ2ＣＨ2ＣＯ−）、３．２７（ｂ、ＣＢＭＡ−１からの６Ｈ、−ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）2ＣＨ2ＣＯＯ-）、４．２および４．５（ｍ、６Ｈ、−ＣＯＯＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）2ＣＨ2ＣＯＯ-）から決定した。なお、遊離ＮＨＳは1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ（ｐｐｍ）：２．６７（ｓ、開始剤からの４Ｈ、−ＣＯＣＨ2ＣＨ2ＣＯ−）を有するであろう。また、水相ＧＰＣはＰＤＩ＝１．０３でのＭＷ＝５４１０Ｄａを示す。これらのＭＷデータは、ＤＳＰＥ−ＰＣＢにおけるＰＣＢブロックについてのＭＷを特徴付けるのに使用した。
【０１３６】
ＤＳＰＥ−ＰＣＢ。１,２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミン（ＤＳＰＥ、Genzyme Pharmaceuticals）を手に入れた状態で使用した。1Ｈ ＮＭＲ （トリフルオロ酢酸−ｄ）δ（ｐｐｍ）：０．９０７（６Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、−ＣＨ3）、１．３４４（５６Ｈ、ｂｒ ｓ、ＣＨ3−（ＣＨ2）14−）、１．７５２（４Ｈ、ｍ、ＣＨ3−（ＣＨ2）14−ＣＨ2−，）、２．５５１（４Ｈ、ｍ、ＣＨ3−（ＣＨ2）15−ＣＨ2−）、３．６６４（２Ｈ、ｓ、−ＣＨ2−ＮＨ3+）、４．４３８および４．６０６（６Ｈ、ｍ、−ＣＨ2−ＣＨ（Ｃ17Ｈ35ＣＯＯ）−ＣＨ2−ＰＯ4−ＣＨ2−）、５．５８１（１Ｈ、ｍ、ｓｎ２−ＣＨ）。
【０１３７】
典型的な反応の場合、１２０ｍｇのＮＨＳ−ＰＣＢ−ｔＢｕ（ＰＣＢについてのＭＷは５Ｋである）および１２０ｍｇのＤＳＰＥを、３０ｍｌクロロホルム／４．３ｍｌのＤＭＦの混合溶媒中で、１２９μｌのトリエチルアミンの存在下で数日間撹拌した。次に、反応混合物を蒸発乾固させてエチルエーテル中で晶析させた。晶析物をアセトニトリルでまず抽出し、ろ過した。ろ液を蒸発乾固させ、ＴＦＡによって４時間にわたり処理し、エチルエーテル中で晶析させ、真空乾燥させた。乾燥させた生成物を２００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ＝８）中で２０ｍＭのヒドロキシルアミンで中和させ、ＰＢＳ中続けて水中で繰り返し限外ろ過（３０ＫのＭＷカットオフ）を行った。純粋なＤＳＰＥ−ＰＣＢ抱合体がこのプロセスで残り、これを凍結乾燥させた（収率＝５８％）。
【０１３８】
ＤＳＰＥ−ＰＣＢ抱合体の生成を確認し、モル比（ＤＳＰＥ／ＣＢ）を1Ｈ ＮＭＲ（トリフルオロ酢酸−ｄ）δ（ｐｐｍ）：２．５６７（ｍ、ＤＳＰＥからのＣＨ3−（ＣＨ2）15−ＣＨ2−の４Ｈ）、４．６３７（ｂｒ ｍ、ＤＳＰＥからの−ＣＨ2−ＣＨ（Ｃ17Ｈ35ＣＯＯ）−ＣＨ2−ＰＯ4−ＣＨ2−の６Ｈ、およびＰＣＢからの−ＣＯＯＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）2ＣＨ2ＣＯＯ-の６Ｈ）、５．５９０（ｓ、ＤＳＰＥからのｓｎ2−ＣＨの１Ｈ）によって測定すると１／２０であった。この１／２０（ＤＳＰＥ／ＣＢ）のモル比は概して５０００ＤａのＰＣＢが１つのＤＳＰＥ分子に抱合しており、抱合していないＰＣＢのＮＭＲおよびＧＰＣ法による分子量と一致していることを意味する。
【０１３９】
ＤＳＰＥ−ＰＣＢリポソーム
典型的な製剤では、脂質成分（たとえば、ＤＳＰＣおよびＤＳＰＥ−ＰＣＢまたは市販のＤＳＰＥ−ＰＥＧなど）を２,２,２−トリフルオロエタノール中で所望のモル比で混合した。蒸発乾固によって脂質の薄膜が形成された。脂質膜の水和は、６０℃でのＰＢＳの添加、続けての３回の凍結融解サイクルによって達成された。得られたリポソームをポリカーボネート膜（８０ｎｍ）を備えた６０℃のAvanti（登録商標） Mini-Extruderを通して２０回押し出した。粒度およびその多分散指数（ＰＤＩ）をＰＢＳ中で測定し、ゼータ電位を水中で測定した。種々の製剤についての典型的なリポソームの大きさおよびゼータ電位を図５Ａ−図５Ｄに示す。概して、これらのリポソームは約１００ｎｍであり、低いＰＤＩ数を有した。これらのリポソームを、Waters 2414屈折率検出器および特注のサイズ排除カラム（Sephacryl（登録商標） S-500 HR chromatography medium（GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA）を充填したTricorn（登録商標） 10/600カラム)を備えたWaters Alliance 2695 Separations Moduleによって、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析した。移動相は、流量が１ｍｌ／分であり２５℃のＰＢＳ溶液であった。なお、試験したＤＳＰＥ−ＰＣＢおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧの両方ともが水溶液中で単独でミセルを形成するであろう。図５Ａおよび図５Ｂ（ＤＳＰＥ−ＰＣＢ）を図５Ｃおよび図５Ｄ（ＤＥＰＥ−ＰＥＧ）と比較すると、同じ分子量の範囲内では、ＤＳＰＥ−ＰＣＢはミセル化を引き起こすことなしにより多く合体してリポソームになることができたことがわかる。リポソームをＰＢＳ中で３７℃でインキュベートし、凝集からのそれらの安定性を試験した。図６から、ＤＳＰＥ−ＰＣＢおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ抱合体修飾リポソームのみが、長期凝集からリポソームを保護することができ、一方でこれらの抱合体を持たない製剤は数時間のうちに凝集し始めたことがわかった。
【０１４０】
表１．様々な製剤についての大きさおよびゼータ電位に関する属性。５Ｋまたは２Ｋは、ＰＣＢまたはＰＥＧポリマーについてのＭＷを表している。データは、３回測定し、平均値±標準偏差として示している。
【表１】
2013510229.tif 000010
【０１４１】
ＤＳＰＥ−ＰＣＢリポソームについての生体内循環試験。表２に挙げた全てのリポソームを、１ｍｏｌ％の１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミン−Ｎ−（リサミンローダミンＢスルフォニル）（Avanti）を添加することによって、リポソーム形成プロセス中に蛍光ラベルした。全てのこれらリポソーム製剤は１５０ｎｍ未満であり、ほぼ単分散である。これらの製剤をそれらの循環プロファイルについてラットで評価した。Sprague Dawley（１５０ｇ）ラットを無作為にグループ分けし（グループの大きさは３である）、３−５％のイソフルランで麻酔した。２．３μｍｏｌのリン脂質を含有する２００μｌの各リポソーム製剤を尾静脈を通して注射した。５分、４時間、８時間、２４時間、および４８時間に、ラットを３−５％のイソフルランで一時的に麻酔をし、５０−１００μｌの血液を左または右のいずれかの伏在静脈から抜き取った。４８時間後、ＣＯ2吸引によりラットを安楽死させた。集めた血液を秤量し、水／アセトニトリル混合物に混合させる。短時間の遠心分離後、上澄みを５５７ｎｍで励起させた際の５８３．６ｎｍの蛍光放射について測定する。これらの血液試料中のリポソームの投与量を定量化するために、較正曲線を作った。時間に対する投与量は、１−コンパートメント薬物動態学的モデルによって固定し、循環半減期および曲線下面積（ＡＵＣ）データを計算して表３に示した。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ対象物よりも著しく長いＤＳＰＥ−ＰＣＢリポソームの循環が観察された。ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＣＢ ５Ｋ （９／１）自体は９−１０時間の半減期を有し、これは３−４時間であるＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ ５Ｋ （９／１）よりもはるかに長い。
【０１４２】
表２．様々な製剤についての大きさおよびゼータ電位に関する属性。５Ｋまたは２Ｋは、ＰＣＢまたはＰＥＧポリマーについてのＭＷを表している。データは３回測定し、平均値±標準偏差として示している。
【表２】
2013510229.tif 000011
【０１４３】
表３．様々な製剤についての生体内循環プロファイル。５Ｋまたは２Ｋは、ＰＣＢまたはＰＥＧポリマーについてのＭＷを表している。データは３回測定し、平均値±標準偏差として示している。％ＩＤは注射した投与量の％を表している。
【表３】
2013510229.tif 000012
【０１４４】
例２
代表的なナノ粒子薬物送達システム：両親媒性ＰＬＧＡ双性イオン性ブロックコポリマーの調製および特性
この例では、本発明の代表的なナノ粒子薬物送達システムの調製および特徴を説明する。
【０１４５】
材料。臭化２−ブロモイソブチリル、ｔ−Ｂｏｃ−アミノエチルアルコール、２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリラート、ｔｅｒｔ−ブチルブロモアセタート、Ｃｕ（Ｉ）Ｂｒ、１,１,４,７,１０,１０−ヘキサメチルトリエチレンテトラアミン（ＨＭＴＥＴＡ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、２,２,２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）、および４−アミノフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＮＨ2−ガラクトース）をSigma-Aldrich（St. Louis, MO）から購入した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）をAcros Organics USA（Morris Plains, NJ）から購入した。５０：５０のモノマー比の（Ｄ,Ｌ−乳酸−グリコール酸）コポリマー（ＰＬＧＡ）をDurect Corporation（Pelham, AL）から購入した。ドセタキセル（Ｄｔｘｌ）をLC Laboratories（Woburn, MA）から購入した。５−（アミノメチル）フルオレセイン塩酸塩、および２２−（Ｎ−（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾール−４−イル）アミノ）−２３,２４−ビスノル−５−コレン−３β−オール（ＮＢＤ）をInvitrogen（Carlsbad, CA）から購入した。
【０１４６】
ナノ粒子調製
２−アミノエチル２−ブロモイソブチラート。ＮＨ2官能基を有するＡＴＲＰ開始剤を以下のようにして合成した。簡単に述べると、３．５７ｇの臭化２−ブロモイソブチリルを、氷浴において、８ｍｌの塩化メチレン中の２．５ｇのｔ−Ｂｏｃ−アミノエチルアルコールおよび１．７３ｇのトリエチルアミンの溶液に添加した。４時間の反応後、塩を濾過して取り除き、ろ液を飽和炭酸水素ナトリウム溶液を用いて抽出した。塩化メチレン相を硫酸マグネシウムで乾燥させて、蒸発乾固した。得られたｔ−Ｂｏｃ−アミノエチル２−ブロモイソブチラートを１５ｍｌのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で２時間にわたって処理し、エチルエーテルを添加して再結晶した（収率９５％）。1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ（ｐｐｍ）：１．９３（ｓ、６Ｈ、−Ｃ（ＣＨ3）2Ｂｒ）、３．１６（ｓ、２Ｈ、ＴＦＡ-・ＮＨ3+ＣＨ2ＣＨ2ＯＣＯ）、４．３１（ｔ、Ｊ＝５Ｈｚ、２Ｈ、ＴＦＡ-・ＮＨ3+ＣＨ2ＣＨ2ＯＣＯ）、８．２２（ｓ、３Ｈ、ＴＦＡ−・ＮＨ3+ＣＨ2ＣＨ2ＯＣＯ）。
【０１４７】
２−ｔｅｒｔ−ブトキシ−Ｎ−（２−（メタクリロイルオキシ）エチル）−Ｎ,Ｎ−ジメチル−２−オキソエタンアミニウム（ＣＢ−ｔＢｕモノマー）。５ｇの２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリラートおよび８．６８ｇのｔｅｒｔ−ブチルブロモアセタートを２０ｍｌのアセトニトリル中で２４時間にわたり５０℃でＮ2保護下で反応させた。２５０ｍｌのエチルエーテルを反応混合物に添加し、生じた白色結晶を単離して乾燥させた。得られたＣＢ−ｔＢｕモノマーを直ちに−２０℃のデシケータ内に保管した（収率９６％）。1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ（ｐｐｍ）：１．４４（ｓ、９Ｈ、−ＯＣ（ＣＨ3）3）、１．８７（ｓ、３Ｈ、ＣＨ2＝Ｃ（ＣＨ3）ＣＯＯ−）、３．３１（ｓ、６Ｈ、−ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）2ＣＨ2ＣＯＯ−）、３．９８（ｔ、Ｊ＝３Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ2＝Ｃ（ＣＨ3）ＣＯＯＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）2ＣＨ2−）、４．２８（ｓ、２Ｈ、−ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）2ＣＨ2ＣＯＯ−）、４．６０（ｔ、Ｊ＝３Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ2＝Ｃ（ＣＨ3）ＣＯＯＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）2ＣＨ2−）、５．７３および６．１０（ｓ、２Ｈ、ＣＨ2＝Ｃ（ＣＨ3）ＣＯＯ−）。
【０１４８】
ＰＣＢ−ｔＢｕポリマーの合成。ＣＢ−ｔＢｕモノマーのＡＴＲＰを以下のようにして行った：７４ｍｇのＣｕ（Ｉ）Ｂｒおよび１４８．６ｍｇのＨＭＴＥＴＡをシュレンク管の中に入れ、３回の減圧−窒素サイクルに供した。次に、７ｍｌの脱気したＤＭＦを添加して溶液Ａを作った。同様に、１．８ｇのＣＢ−ｔＢｕモノマーおよび８０ｍｇの２−アミノエチル２−ブロモイソブチラートを、酸素を完全に排除したもう１つのシュレンク管に入れ、続けて８ｍｌの脱気したＤＭＦを添加し、溶液Ｂを作った。Ｎ2保護下で溶液Ｂを溶液にＡに移すことによって重合を開始させた。６０℃での２４時間にわたる反応後、ポリマーをまずエチルエーテル中で晶析させ、次に少量のエタノール中に溶解させ、アセトン中で繰り返し晶析させ、残留するモノマー、開始剤および触媒を除去した。得られたＰＣＢ−ｔＢｕを更なる使用の前に減圧下で乾燥させた。
【０１４９】
ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＣＢ−ｔＢｕ抱合体。抱合プロセスは、ＮＨＳ／ＥＤＣ化学によるものであった。簡単に述べると、３．２ｇのＣＯＯＨ末端ＰＬＧＡ（０．２０ｄｌ／ｇ）、８６．４ｍｇのＮＨＳおよび１４７．２ｍｇのＥＤＣを６ｍｌの塩化メチレン中で４時間にわたり室温で反応させた。次に、５ｍｌのエチルエーテルを添加して、白色晶析物を得た。得られたＰＬＧＡ−ＮＨＳを冷たいエチルエーテル／メタノール混合物（２／１、ｖ／ｖ）で洗浄してＮＨＳおよびＥＤＣ残留物を除去し、その後、使用の前に減圧乾燥した。ＴＦＡ-・ＮＨ3+末端ｐＣＢＭＡ−ｔＢｕを過剰なトリエチルアミンで処理してＴＦＡ保護を除去した。ＮＨ2末端ｐＣＢＭＡ−ｔＢｕを濾過によって精製し、エチルエーテル中に晶析させ、減圧乾燥した。８７８ｍｇのＮＨ2末端ＰＣＢ−ｔＢｕおよび１．６８ｇのＰＬＧＡ−ＮＨＳを７ｍｌのアセトニトリル中の５０μｌのトリエチルアミンの存在下で６０℃で２０時間にわたって抱合させた。得られたＰＬＧＡ−ＰＣＢ−ｔＢｕを冷たいエタノール中に晶析させた。ＰＣＢＭＡ−ｔＢｕ混入物を洗浄サイクルを繰り返すことによって除去した。ＰＬＧＡ−ＰＣＢＭＡ−ｔＢｕ抱合体の生成を確認し、重量比 （ＰＬＧＡ／ＰＣＢ）を1Ｈ ＮＭＲ（アセトニトリルｄ3）δ （ｐｐｍ）：１．５５(ｍ、ＰＬＧＡの３Ｈ、−ＣＯＣＨ（ＣＨ3）Ｏ−、およびＰＣＢ−ｔＢｕの９Ｈ、−ＯＣ（ＣＨ3）3）、３．６５（ｂｒ、ＰＣＢ−ｔＢｕの６Ｈ、−ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）2ＣＨ2ＣＯＯＣ（ＣＨ3）3）、４．８５（ｍ、ＰＬＧＡの２Ｈ、−ＣＯＣＨ2Ｏ−）、５．２２（ｍ、ＰＬＧＡの１Ｈ、−ＣＯＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−）によって測定したところ６／１ （モル比１２．４／１） であった。ポリマーは使用前に減圧下で乾燥させた。
【０１５０】
ｔＢｕエステル基の加水分解。対照実験において、６時間までＴＦＡで処理したＰＬＧＡは、著しい分子量の変化を示さず、１時間のＴＦＡ処理後のＰＣＢ−ｔＢｕは1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）において１．４４ｐｐｍの信号を示さなかった。これは、ｔＢｕエステル基が完全に除去されることを示している。メタクリラートでのエステル結合がＴＦＡ処理によって破壊されなかったことを確かめるために、ＣＢ−ｔＢｕモノマーをＴＦＡ中で１時間にわたり加水分解させ、加水分解生成物が1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ（ｐｐｍ）：１．８９（ｓ、３Ｈ、ＣＨ2＝Ｃ（ＣＨ3）ＣＯＯ−）、３．３１（ｓ、６Ｈ、−ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）2ＣＨ2ＣＯＯ−）、３．９８（ｔ、Ｊ＝３Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ2＝Ｃ（ＣＨ3）ＣＯＯＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）2ＣＨ2−）、４．４８（ｓ、２Ｈ、−ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）2ＣＨ2ＣＯＯ-）、４．５４（ｓ、２Ｈ、ＣＨ2＝Ｃ（ＣＨ3）ＣＯＯＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）2ＣＨ2−）、５．７５および６．０６（ｓ、２Ｈ、ＣＨ2＝Ｃ（ＣＨ3）ＣＯＯ−）によりＣＢ双性イオン性モノマーと同定された。ＰＬＧＡ−ｃｏ−ＰＣＢを得るために、ＰＬＧＡ−ｃｏ−ＰＣＢ−ｔＢｕをＴＦＡで１時間にわたって処理して、ｔＢｕエステル基を除去した。得られたＰＬＧＡ−ｃｏ−ＰＣＢをエチルエーテル中に晶析させ、少量のＴＦＥ中に再溶解させ、エチルエーテル中で繰り返して晶析させた。減圧乾燥後、コポリマーはＮＰの製剤の準備が整っている。重量比（ＰＬＧＡ／ＰＣＢ）を1Ｈ ＮＭＲ（トリフルオロ酢酸−ｄ）δ（ｐｐｍ）：５．５０（ｍ、ＰＬＧＡの１Ｈ、−ＣＯＣＨ（ＣＨ3）Ｏ−）、５．１０（ｍ、ＰＬＧＡの２Ｈ、−ＣＯＣＨ2Ｏ−）、１．７７（ｄ、３Ｈ、ＰＬＧＡの−ＣＯＣＨ（ＣＨ3）Ｏ−）、３．６４（ｂｒ、ＰＣＢの６Ｈ、−ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）2ＣＨ2ＣＯＯ−）によって測定すると１０／１であった。
【０１５１】
ＰＣＢホモポリマー（ＰＣＢ−ｔＢｕポリマーの加水分解によって得られる）の分子量および分布を、Waters Ultrahydrogel 1000カラムおよびWaters 2414屈折率検出器を備えたWaters Alliance 2695 Separations Moduleによって測定した。移動相は、０．７ｍｌ／分の流量で３５℃の１００ｍＭＮａＣｌ水溶液であった。Polymer Laboratoriesからのポリ（エチレンオキシド）を標準として使用した。ゲル透過クロマトグラフィーは、１．１２の多分散性での、１３６４０の分子量（Ｍｎ）を示す。
【０１５２】
ＰＬＧＡ−ＰＣＢ ＮＰの製剤。溶媒置換（ナノ晶析）法を使用して、ＮＰを製剤した。ＰＬＧＡ−ＰＣＢコポリマーをＴＦＥ／ＭｅＯＨ １／１ ｖ／ｖ共溶媒中に０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させた。水（水：有機溶媒の体積比、４：１）を１０００ｒｐｍで撹拌しながらコポリマー溶液に滴下して移した。２時間後、溶媒をＰＢＳに交換し、得られたＰＬＧＡ−ＰＣＢ ＮＰをAmicon Ultra-4 centrifugal filter（Millipore, Billerica（MA, US））によって１００，０００ Ｄａ ＭＷでカットオフして所望の濃度まで濃縮した。ＰＬＧＡ ＮＰは、J. Cheng, B. A. Teply, I. Sherifi, J. Sung, G. Luther, F. X. Gu, E. Levy-Nissenbaum, A. F. Radovic-Moreno, R. Langer, O. C. Farokhzad, Biomaterials 2007, 28, 869に記載されているように調製した。ドセタキセルを、有機溶媒中でポリマーと混合することによりＮＰに負荷させ、上述の手段に従ってＰＬＧＡ−ＰＣＢ／Ｄｔｘｌ ＮＰを製剤した。ＮＰの平均径、多分散指数（ＰＤＩ）およびゼータ電位は、Zetasier Nano-ZS（Malvern Instruments Ltd（Malvern, WR, UK））によって３回測定した。０から１．００までに及ぶＰＤＩを使用して、ＮＰの粒径分布を特徴付けた。ＮＰはＰＤＩ＜０．１０の場合に単分散であるとみなす。
【０１５３】
薬物負荷および放出の動態。ドセタキセルを有するポリマー（ＰＬＧＡまたはＰＬＧＡ−ＰＣＢのいずれか）のナノ晶析後、薬物負荷されたＮＰおよび遊離薬物を含有する調製溶液が、１００，０００ Ｄａ ＭＷでカットオフを有するMicrocon centrifugal filter （Millipore（Billerica, MA））を通過した。調製溶液に加えてろ液中の薬物含有量（遊離薬物を含む）を比較して、薬物負荷量（薬物／ポリマー、ｗ／ｗ）を測定した。薬物放出の研究中、Ｄｔｘｌ負荷ＮＰ溶液をSlide-A-Lyzer MINI dialysis microtubes （３５００Ｄａ ＭＷ カットオフ、Pierce（Rockford, IL））の中に１つのチューブあたり１００μｌ（０．３３ｍｇ／ｍｌ）で入れた。これらのチューブを１ＬのＰＢＳに対して３７℃で穏やかに撹拌しながら透析した。２４時間ごとにＰＢＳを新たに供給した。様々な時点で、３つのマイクロチューブを取り出して、ＮＰによって保持されている薬物含有量を測定した。全ての水溶液試料を同じ体積のアセトニトリルと終夜混合して、ＨＰＬＣを行う前に薬物を完全に放出した。ドセタキセル含有量は、逆相Ｃ１８カラム（Econosil、２５０×４．６ｍｍ、５μｍ, Alltech, （Deerfield, IL, USA））およびＵＶ検出器（２２７ｎｍの波長）を備えたWaters Alliance 2695 Separations Moduleによって３回定量した。移動相は水およびアセトニトリル（ｖ／ｖ ５０／５０）であり、室温での流量が０．５ｍｌ／分であった。遊離Ｄｏｃについての滞留時間は１３．７５分であった。
【０１５４】
色素分子および標的リガンドによるＰＬＧＡ−ＰＣＢ ＮＰ機能付与。目的の分子はＰＬＧＡ−ＰＣＢ ＮＰ上にＥＤＣ／ＮＨＳ化学によって固定できる。色素分子を抱合するために、ＮＰを４００ｍＭのＥＤＣおよび２００ｍＭのＮＨＳと共に水中で２０分間にわたってインキュベートし、純粋で洗浄して未反応ＨＤＣおよびＮＨＳを除去した。１００μｌの水中の０．５ｍｇのＮＨＳ活性化ＮＰを、ｐＨ＝９の１０ｍＭのホウ酸ナトリウム緩衝液中で１０ｍｇ／ｍｌの濃度にある２５μｌの５−（アミノメチル）フルオレセイン塩酸塩（Invitrogen（Carlsbad, CA, US））に暗所で２．５時間にわたって反応させた。得られた色素−ＮＰ抱合体をｐＨ９の緩衝液および水で洗浄し、水中で再懸濁させ、FACScan flow cytometer（Becton Dickinson（San Jose, CA））で０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で分析した。標的リガンドの固定化のために、２２−（Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１,３−ジアゾール−４−イル）アミノ）−２３,２４−ビスノル−５−コレン−３β−オール（ＮＢＤ）を、初期薬物負荷量が０．２５重量％であるＰＬＧＡ−ＰＣＢ ＮＰに処方した。得られたＰＬＧＡ−ＰＣＢ／ＮＢＤ ＮＰを、４００ｍＭのＥＤＣおよび２００ｍＭのＮＨＳによって水中で２０分間にわたって活性化させた。１００μｌの水中の０．５ｍｇのＮＨＳ−活性化ＮＰを、ｐＨ＝９の１０ｍＭのホウ酸ナトリウム緩衝液中で１０ｍｇ／ｍｌの濃度にある１０μｌのＮＨ2−ガラクトースに１時間にわたって反応させた。得られたガラクトース−ＮＰ抱合体をｐＨ９の緩衝液およびＰＢＳで洗浄し、細胞のインキュベーションの前にＰＢＳ中で再懸濁させた。ＨｅｐＧ２細胞を、２４−ウェルプレートにおいて、可欠アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよび１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を供給したフルＭＥＭ培地（Hyclone（Logan, UT））中で５％のＣＯ2下３７℃で育て、５０％コンフルーエンスを達成した。次に、細胞を予め温めていたＰＢＳで洗浄し、ＦＢＳの供給なしに１つの穴あたり４００μｌのＮＰ含有ＭＥＭ培地を用いてインキュベートした（ＰＬＧＡ−ＰＣＢ／ＮＢＤ−ガラクトースＮＰ濃度：１．２５ｍｇ／ｍｌ）。２時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１つの穴あたり４００μｌのＦＢＳ含有培地を供給した。３７℃での２０時間のインキュベートののち、細胞をNikon TE2000U顕微鏡を使用して映像化した。対照実験では、ＥＤＣは存在しなかったが、他のすべての条件および手順は全く同じであった。
【０１５５】
ＰＬＧＡ−ＰＣＢ ＮＰについての細胞毒性試験。ＮＰの細胞毒性をVybrant（登録商標） MTT Cell Proliferation Assay Kit（Molecular Probes（Eugene, OR）)を使用して評価した。簡単に述べると、ＨｅｐＧ２細胞を、９６−ウェルプレートにおいて、可欠アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよび１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を供給したフルＭＥＭ培地中で５％のＣＯ2下３７℃で育て、８０−９０％コンフルーエンスを達成した。各穴に対して、細胞をＰＢＳで洗浄し、種々の濃度のＰＬＧＡ−ＰＣＢ ＮＰまたはＰＬＧＡ ＮＰのいずれかを含有する２００μｌのフル培地＋５０μｌの１２ｍＭのＭＴＴ保存溶液でさらに４時間インキュベートした。次に、ＭＴＴ含有培地を１５０μｌのＤＭＳＯと交換して、生じた結晶を３７℃で１０分間にわたって溶解させた。５７０ｎｍでの吸収（Ａｂｓ）をSpectraMax M5 microplate reader（Molecular Devices（Sunnyvale, CA））を使用し、純ＤＭＳＯをブランクの測定値として用いて測定した。 ＮＰインキュベーションをしない細胞をコントロールとして用い、ＮＰ処理による細胞の生存度を３回見積もった：細胞の生存度（％）＝Ａｂｓ試料／Ａｂｓコントロール×１００。
【０１５６】
例示的な実施形態を示して説明してきたが、本発明の精神および範囲から逸れることなしに種々の変更が可能であることは明らかであろう。
【０１５７】
排他的な権利または特権が請求されるところの本発明の実施形態は以下のように定義される。
【図１】
2013510229.tif 000017
【図２Ａ】
2013510229.tif 000018
【図２Ｂ】
2013510229.tif 000019
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2013510229.tif 000021
【図２Ｅ】
2013510229.tif 000022
【図２Ｆ】
2013510229.tif 000023
【図３Ａ】
2013510229.tif 000024
【図３Ｂ】
2013510229.tif 000025
【図３Ｃ】
2013510229.tif 000026
【図４】
2013510229.tif 000027
【図５Ａ】
2013510229.tif 000028
【図５Ｂ】
2013510229.tif 000029
【図５Ｃ】
2013510229.tif 000030
【図５Ｄ】
2013510229.tif 000031
【図６】
2013510229.tif 000032
【図７】
2013510229.tif 000033
【図８Ａ】
2013510229.tif 000034
【図８Ｂ】
2013510229.tif 000035
【図９】
2013510229.tif 000036
【国際調査報告】
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2013510229.tif 000038
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