(57)【要約】本開示は、骨格筋および皮膚の成長、修復、および維持のために同化作用的に有利な状態を誘発するための、式Ｉによって定義される化合物またはその誘導体を含む、ブラシノステロイド化合物を使用する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブラシノステロイド化合物を含む、治療的有効量の組成物を被検体に投与するステップを含む、前記被検体における全身同化作用を増加させるための方法。
【請求項２】
前記ブラシノステロイド化合物は、式Ｉの化合物またはその誘導体であり、
【化１】
2013545809.tif 000017
式中、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、ＨおよびＯＨから成る群より独立して選択され、
Ｒ３は、Ｃ（Ｈ）ＯＨ、Ｃ（Ｈ）Ｆ、Ｃ＝Ｏ、およびＣ（Ｈ）ＯＲ９から成る群より選択され、
またはＲ２およびＲ３は、それらが結合される炭素原子とともに、３員エポキシド環を形成し、
Ｒ４は、ＣＨ２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ（Ｈ）ＯＨ、およびＮＨから成る群より選択され、
Ｒ５は、結合、Ｏ、ＮＨ、およびＣ＝Ｏから成る群より選択され、
Ｒ６は、Ｈおよび
【化２】
2013545809.tif 000018
から成る群より選択され、
Ｒ７は、ＣＨ２、Ｃ（Ｈ）ＣＨ３、Ｃ（Ｈ）ＣＨ２ＣＨ３、Ｃ＝ＣＨ２、およびＣ＝Ｃ（Ｈ）ＣＨ３から成る群より選択され、
Ｒ８は、ＨおよびＣＨ３から成る群より選択され、
Ｒ９は、Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎＣＨ３および
【化３】
2013545809.tif 000019
から成る群より選択され、
ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、および１８から成る群より選択される、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ブラシノステロイド化合物は、（２２Ｓ，２３Ｓ）−ホモブラシノリド（ＨＢ）、（２２Ｓ，２３Ｓ）−ホモカスタステロン、（２２Ｓ，２３Ｓ）−３α−フルオロ−ホモブラシノリド、（２２Ｓ，２３Ｓ）−３α−フルオロ−ホモカスタステロン、（２２Ｓ，２３Ｓ）−６−アザ−ホモブラシノリド、（２２Ｓ，２３Ｓ）−７−アザ−ホモブラシノリド、（２２Ｒ，２３Ｒ）−ホモブラシノリド、（２２Ｓ，２３Ｓ）−エピブラシノリド、および（２２Ｒ，２３Ｒ）−エピブラシノリドから成る群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記全身同化作用は、アンドロゲン副作用を最小限含む、または全く含まない、請求項１〜３のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記全身同化作用は、筋肉または皮膚の同化作用的に有利な状態である、請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
筋肉の前記同化作用的に有利な状態は、筋細胞内における、増加したタンパク質合成、増加したタンパク質蓄積、または減少したタンパク質分解によって測定される、請求項１〜５のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
筋肉の前記同化作用的に有利な状態は、増加した骨格筋量によって測定される、請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記増加した骨格筋量は、筋線維の増加した総数によって、または筋線維の増加した断面積によって測定される、請求項１〜７のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記筋繊維の増加した数は、増加したＩ型および／またはＩＩ型筋線維によって測定される、請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
筋肉の前記同化作用的に有利な状態は、増加した除脂肪体重、増加した体重増加、および／または減少した脂肪塊によって測定される、請求項１〜９のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
筋肉の前記同化作用的に有利な状態は、増加した身体能力、増加した体力、および／または増加した身体の健康によって測定される、請求項１〜１０のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記増加した体力は、増加した握力によって測定される、請求項１〜１１のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
筋肉の前記同化作用的に有利な状態は、アルファセリン／トレオニンタンパク質キナーゼ（ＡＫＴ）の増加したリン酸化によって測定される、請求項１〜１１のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
皮膚の前記同化作用的に有利な状態は、皮膚細胞内における、増加したタンパク質合成、増加したタンパク質蓄積、減少したタンパク質分解、または短縮した創傷治癒時間によって測定される、請求項１〜５のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記増加したタンパク質合成は、増加したコラーゲン産生によって測定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記増加したタンパク質蓄積または前記減少したタンパク質分解は、増加したコラーゲンによって測定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記増加したタンパク質合成は、増加したエラスチン産生によって測定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記増加したタンパク質蓄積または前記減少したタンパク質分解は、増加したエラスチンによって測定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記短縮した創傷治癒時間は、皮膚創傷の５０％が塞がれる時間によって測定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記短縮した創傷治癒時間は、元の創傷サイズの割合によって測定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記短縮した創傷治癒時間は、減少した炎症に起因する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記減少した炎症は、ＴＧＦ−βメッセンジャーＲＮＡの減少した発現、ＴＮＦ−αメッセンジャーＲＮＡの減少した発現、またはＩＣＡＭ−１メッセンジャーＲＮＡの減少した発現によって測定される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
皮膚の前記同化作用的に有利な状態は、増加した弾性、増加した平滑性、低減したしわ、および／または健康な輸血に起因する向上した色を有する皮膚によって実証される、請求項１〜５のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ブラシノステロイド化合物は、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１０００ｍｇ／ｋｇの投与量で前記被検体に少なくとも毎週投与される、請求項１〜２３のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ブラシノステロイド化合物は、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１０００ｍｇ／ｋｇの投与量で前記被検体に毎日投与される、請求項１〜２４のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ブラシノステロイド化合物は、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１０００ｍｇ／ｋｇの投与量で毎日２回投与される、請求項１〜２５のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ブラシノステロイド化合物は、数日から数週間または数日から数ヶ月の期間にわたって投与される、請求項１〜２６のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記化合物は、局所的に、非経口的に、または経腸的に投与される、請求項１〜２７のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記局所性投与は、化粧用途のための皮膚に対するものである、請求項１〜２８のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記被検体は、ほ乳類である、請求項１〜２９のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ほ乳類は、ヒトである、請求項１〜３０のうちのいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、概して、筋肉および皮膚の同化作用的に有利な状態を誘発するための化合物と、骨格筋および皮膚の成長、修復、および維持のためにそのような化合物を産生および使用する方法とに関する。より具体的には、化合物は、ブラシノステロイドを含む。
【背景技術】
【０００２】
ブラシノステロイドは、コレステロール由来の動物ステロイドホルモンおよび昆虫からのエクジステロイドと構造的に同様である、５α−コレスタンの植物特異的ポリヒドロキシ化誘導体である。ブラシノステロイドは、植物界の全体を通して、花粉、種、葉、および若い植物組織の中で低レベルにて見出される（Ｂａｊｇｕｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６２：１０２７−１０４６，  ２００３）。最初の生物学的に活性な植物ブラシノステロイドは、１９７９年にセイヨウアブラナの花粉から単離された。この群の５０以上の化合物の自然発生が、最初の発見後に報告されている（Ｆｕｊｉｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．  ５４：１３７−１６４，  ２００３）。ブラシノステロイドは、細胞伸長および細胞分裂において機能し、発芽および植物の光形態形成等の過程に関して特に研究されてきた。
【０００３】
動物ステロイドホルモンと同様に、ブラシノステロイドは、ブラシノステロイド応答の枠組みを設定する、他のホルモンとの相互作用を部分的に介して、成長に関与する特定の植物遺伝子の発現および複雑な生理学的反応を調節する。動物ステロイドホルモンが、核内受容体群の転写因子によって知覚される一方で、ブラシノステロイドは、保存ホスホチロシン残基ｐＴｙｒ２００における脱リン酸化による、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３）様キナーゼ、ブラシノステロイド集約型遺伝子座２（ＢＩＮ２）の不活性化を含む、細胞表面受容体キナーゼ媒介変換経路を通して信号伝達する。ＢＩＮ２の不活性化は、核内の転写因子ブラシナゾール耐性１（ＢＺＲ１）およびＢＲＩ１−ＥＭＳサプレッサー１（ＢＥＳ１）の蓄積を可能にする（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １１：１２５４−１２６，  ２００９）。
【０００４】
アルファセリン／トレオニンタンパク質キナーゼ（ＡＫＴ）は、成長因子受容体およびホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の下流で信号伝達する、セリン／トレオニンキナーゼである。したがって、成長因子受容体、栄養素、および筋肉収縮さえもＡＫＴ活性を増加させる。ＡＫＴは、ＡＫＴ／ｍＴＯＲおよびＡＫＴ／ＧＳＫ−３β信号伝達ネットワークを介して、グルコースの取り込み、グリコーゲン合成、およびタンパク質合成を刺激し、ＦｏｘＯ転写因子を不活性化することによって、骨格筋内のアポトーシスおよびタンパク質分解を阻害する。したがって、ＡＫＴは、多様な同化および異化刺激に応答する、筋肉信号伝達における重要な岐路に位置している。
【０００５】
動物におけるブラシノステロイドの作用についてはほとんど知られていない。天然ブラシノステロイドおよびその合成誘導体は、細胞培養の中で、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）およびアレナウイルス、麻疹、フニン、および水疱性口内炎ウイルス複製を阻害することが分かった。合成ブラシノステロイド類似体は、おそらくＨＳＶ−１感染への上皮および免疫細胞の応答の変調によって、局所的に投与された時に、マウスにおいて細胞毒性がなく、ヘルペス性間質性角膜炎の発生が低減した、ヒト結膜細胞株の中のＨＳＶ−１増殖およびウイルス拡散を防止した（Ｍｉｃｈｅｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．
Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １０８：１６４−１７０
，  ２００８）。天然ブラシノステロイドはまた、正常細胞の成長に影響を及ぼすことなく、いくつかのヒト癌細胞株の成長も阻害した（Ｍａｌｉｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６９：４１８−４２６，  ２００８）。農業で最も広く使用されているブラシノステロイドである、２４−エピブラシノリドは、有利な安全性プロファイルを有する。この化合物の半数致死量（ＬＤ５０）は、経口的または皮下に投与された時に、マウスでは１０００ｍｇ／ｋｇよりも高く、ラットでは２０００ｍｇ／ｋｇよりも高い。
【０００６】
２８−ホモブラシノリド（ＨＢ）または（２２Ｓ，２３Ｓ）−ホモブラシノリド（ＨＢ）（図１参照）は、種々のバイオアッセイシステムで植物の成長を誘発する際に、２４−エピブラシノリドとほとんど同じくらい活性である。ＨＢは、ハクサイの花粉およびスギの葯から最初に単離されたステロイド性ラクトンである。それは、植物中のその濃度が非常に低いため、化学合成を通して容易に入手可能である。ＨＢの植物成長促進作用は、核酸およびタンパク質の増加した合成と関連付けられる（Ｂａｊｇｕｚ，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３８：２０９−２１５，  ２０００；  Ｋａｒｔａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ５８：２６１−２６７，  ２００９）。加えて、ＨＢは、全タンパク質合成を活性化し、ポリペプチドのデノボ合成を誘発し、熱ショックを受けた植物において全タンパク質合成の熱耐性を増加させた（Ｋｕｌａｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄｓ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｌａｎｔ−ｃｅｌｌ  ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｕｎｄｅｒ  ｓｔｒｅｓｓ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．” Ｉｎ：Ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄｓより。Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＤＣ：  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ；  １４１−１５５，  ２００９）。
【０００７】
正式には同化アンドロゲンステロイド（ＡＡＳ）として、または口語的には単に「ステロイド」として知られている、同化ステロイドは、男性ホルモンであるテストステロンおよびジヒドロテストステロンの作用を模倣する薬剤である。それらは、細胞内のタンパク質合成を増加させ、特に筋肉の中で、細胞組織の蓄積（同化）をもたらす。要するに、同化は、筋肉量の増加および除脂肪体重の結果として生じる増加をもたらす、体内の細胞および組織の成長および分化をもたらす。しかしながら、同化ステロイドの長期使用または過剰用量と関連付けられる健康上のリスクがある。これらの作用は、コレステロールレベルの有害な変化（増加した低密度リポタンパク質および減少した高密度リポタンパク質）、にきび、高血圧、肝臓障害（主に経口ステロイドで）、および左心室の構造の危険な変化を含む。
【０００８】
したがって、当技術分野では、本明細書の上記で説明されるような健康上のリスクおよび身体へのマイナスの副作用を引き起こすことなく、身体に同化作用を及ぼす化合物の必要性がある。以下の開示は、そのようなブラシノステロイド化合物およびそれらを使用する方法の詳細を説明する。
【発明の概要】
【０００９】
本開示は、有害なアンドロゲン作用を伴わずに、健康な動物被検体における選択的同化作用ならびに向上した身体の健康および外見のためのブラシノステロイドの使用に関する、当技術分野での１つ以上の必要性に対処する。より具体的には、本開示は、ほ乳類、例えば、ヒト等の動物において、骨格筋および皮膚の成長、修復、および維持のために同化作用的に有利な状態を誘発するための、式Ｉによって定義される化合物またはその誘導体を含む、ブラシノステロイド化合物を使用する方法に関する。
【００１０】
本開示は、式Ｉの化合物またはその誘導体を含む、治療的有効量の組成物を被検体に投
与するステップを含む、被検体における全身同化作用を増加させるための方法を含む。
【化１】
2013545809.tif 000002
式中、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、ＨおよびＯＨから成る群より独立して選択され、
Ｒ３は、Ｃ（Ｈ）ＯＨ、Ｃ（Ｈ）Ｆ、Ｃ＝Ｏ、およびＣ（Ｈ）ＯＲ９から成る群より選択され、
またはＲ２およびＲ３は、それらが結合される炭素原子とともに、３員エポキシド環を形成し、
Ｒ４は、ＣＨ２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ（Ｈ）ＯＨ、およびＮＨから成る群より選択され、
Ｒ５は、結合、Ｏ、ＮＨ、およびＣ＝Ｏから成る群より選択され、
Ｒ６は、Ｈおよび
【化２】
2013545809.tif 000003
から成る群より選択され、
Ｒ７は、ＣＨ２、Ｃ（Ｈ）ＣＨ３、Ｃ（Ｈ）ＣＨ２ＣＨ３、Ｃ＝ＣＨ２、およびＣ＝Ｃ（Ｈ）ＣＨ３から成る群より選択され、
Ｒ８は、ＨおよびＣＨ３から成る群より選択され、
Ｒ９は、Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎＣＨ３および
【化３】
2013545809.tif 000004
から成る群より選択され、
ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、および１８から成る群より選択される。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本開示は、ブラシノステロイド化合物またはその誘導体を含む、治療的有効量の組成物を被検体に投与するステップを含む、被検体における全身同化作用を増加させるための方法を含む。特定の態様では、ブラシノステロイド化合物は、（２２Ｓ，２３Ｓ）−ホモブラシノリド（ＨＢ）、（２２Ｓ，２３Ｓ）−ホモカスタステロン、（２２Ｓ，２３Ｓ）−３α−フルオロ−ホモブラシノリド、（２２Ｓ，２３Ｓ）−３
α−フルオロ−ホモカスタステロン、（２２Ｓ，２３Ｓ）−６−アザ−ホモブラシノリド、（２２Ｓ，２３Ｓ）−７−アザ−ホモブラシノリド、（２２Ｒ，２３Ｒ）−ホモブラシノリド、（２２Ｓ，２３Ｓ）−エピブラシノリド、および（２２Ｒ，２３Ｒ）−エピブラシノリドから成る群より選択される。
【００１２】
いくつかの態様では、ブラシノステロイド化合物は、（２２Ｓ，２３Ｓ）−ホモブラシノリド（ＨＢ）、（２２Ｓ，２３Ｓ）−ホモカスタステロン、（２２Ｓ，２３Ｓ）−３α−フルオロ−ホモカスタステロン、（２２Ｓ，２３Ｓ）−７−アザ−ホモブラシノリドである。より具体的な態様では、ブラシノステロイド化合物は、（２２Ｓ，２３Ｓ）−ホモブラシノリド（ＨＢ）である。
【００１３】
いくつかの態様では、全身同化作用は、アンドロゲン副作用を最小限含む、または全く含まない。いくつかの態様では、全身同化作用のうちの少なくとも１つは、筋肉または皮膚の同化作用的に有利な状態である。
【００１４】
特定の態様では、筋肉の同化作用的に有利な状態は、筋細胞内における、増加したタンパク質合成、増加したタンパク質蓄積、または減少したタンパク質分解によって測定される。他の態様では、筋肉の同化作用的に有利な状態は、増加した骨格筋量によって測定される。さらなる態様では、増加した骨格筋量は、筋線維の増加した総数によって、および／または筋線維の増加した断面積によって測定される。さらに具体的な態様では、筋繊維の増加した数は、増加したＩ型および／またはＩＩ型筋線維によって測定される。ある態様では、筋肉の同化作用的に有利な状態は、増加した除脂肪体重、増加した体重増加、および／または減少した脂肪塊によって測定される。他の態様では、筋肉の同化作用的に有利な状態は、増加した身体能力、増加した体力、および／または増加した身体の健康によって測定される。別の態様では、増加した体力は、増加した握力によって測定される。特定の態様では、筋肉の同化作用的に有利な状態は、ＡＫＴの増加したリン酸化によって測定される。
【００１５】
他の特定の態様では、皮膚の同化作用的に有利な状態は、皮膚細胞内における、増加したタンパク質合成、増加したタンパク質蓄積、減少したタンパク質分解、または短縮した創傷治癒時間によって測定される（すなわち、創傷がより迅速に治癒する）。ある態様では、増加したタンパク質合成は、増加したコラーゲン産生によって測定される。他の態様では、増加したタンパク質蓄積または減少したタンパク質分解は、増加したコラーゲンによって測定される。一態様では、増加したタンパク質合成は、増加したエラスチン産生によって測定される。別の態様では、増加したタンパク質蓄積または減少したタンパク質分解は、増加したエラスチンによって測定される。いくつかの態様では、創傷治癒時間は、最大約２倍減少させられた。いくつかの態様では、短縮した創傷治癒時間は、皮膚創傷の５０％が塞がれる時間によって測定される。いくつかの態様では、短縮した創傷治癒時間は、元の創傷サイズの割合によって測定される。いくつかの態様では、短縮した創傷治癒時間は、減少した炎症に起因する。いくつかの態様では、減少した炎症は、ＴＧＦ−βメッセンジャーＲＮＡの減少した発現、減少したＴＮＦ−αメッセンジャーＲＮＡ、または減少したＩＣＡＭ−１メッセンジャーＲＮＡに起因する。別の態様では、皮膚の同化作用的に有利な状態は、増加した弾性、増加した平滑性、低減したしわ、および／または健康な輸血に起因する向上した色を有する皮膚によって実証される。
【００１６】
本開示のさらなる態様では、式Ｉの化合物、または特定のブラシノステロイド化合物は、約０．０１μＭから約１００μＭの濃度で細胞培養の中に投与される。いくつかの態様では、ブラシノステロイド化合物は、約０．１０μＭから約３０μＭの濃度で投与される。より具体的な態様では、ブラシノステロイド化合物は、約０．３０μＭから約２０μＭの濃度で投与される。さらなる態様では、化合物は、毎日投与される。
【００１７】
他の態様では、式１の化合物、または特定のブラシノステロイド化合物は、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１０００ｍｇ／ｋｇの投与量で被検体に少なくとも毎週投与される。いくつかの態様では、化合物は、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１０００ｍｇ／ｋｇの投与量で被検体に毎日投与される。さらなる態様では、化合物は、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１０００ｍｇ／ｋｇの投与量で毎日２回投与される。種々の態様では、化合物は、ある期間にわたって、すなわち、数週間または数ヶ月にわたって毎日投与される。いくつかの態様では、期間は、数日から数週間である。いくつかの態様では、期間は、数日から数ヶ月である。
【００１８】
本開示の他の態様では、ブラシノステロイド化合物は、局所的に、非経口的に、または経腸的に投与される。局所的に、非経口的に、または経腸的に投与する種々の手段は、当技術分野で周知であり、本明細書でさらに詳細に説明される。特定の態様では、ブラシノステロイド化合物は、化粧用途のための皮膚に局所的に投与される。より具体的な態様では、投与は、ほ乳類の被検体に対するものである。さらに具体的な態様では、被検体は、ヒト被検体である。
【００１９】
本開示は、本開示による、被検体における全身同化作用を増加させるためのブラシノステロイドの種々の使用を含む。いくつかの態様では、この同化作用は、最小限のアンドロゲン副作用を伴って、または全く伴わずに実行される。他の態様では、本開示は、最小限のアンドロゲン副作用を伴って、または全く伴わずに、被検体における全身同化作用を増加させるための薬剤の調製のためのブラシノステロイドの使用を含む。他の関連態様も、本開示で提供される。
【００２０】
先述の概要は、本開示の主題の全態様を定義することを目的としておらず、付加的な態様が以下の発明を実施するための形態等の他の節で説明される。本書は、統一開示として関係することを目的としており、たとえ特徴の組み合わせが本書の同じ文または段落または節で一緒に見出されなくても、本明細書で説明される特徴の全ての組み合わせが検討されることを理解されたい。本開示の主題の他の特徴および利点は、以下の発明を実施するための形態から明白となるであろう。しかしながら、本開示の精神および範囲内の種々の変更および修正が、この発明を実施するための形態から当業者に明白となるため、発明を実施するための形態および具体的実施例は、本開示の具体的実施形態を示す一方で、例証のみとして挙げられることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】当技術分野では２８−ホモブラシノリド（ＨＢ）として知られている、（２２Ｓ，２３Ｓ）−ホモブラシノリド（ＨＢ）の化学構造。
【図２】Ｌ６ラット筋管の中のタンパク質合成および分解へのＨＢの濃度および時間依存性作用。（Ａ）細胞が、［３Ｈ］−フェニルアラニンで４時間培養され、媒介物（０．１％エタノール）、増加する濃度のＨＢ、または陽性対照として６．５ｎＭのＩＧＦ−１で３通りに処置され、タンパク質合成が、総タンパク量によって正規化されたタンパク質への［３Ｈ］−フェニルアラニンの取り込みとして測定された。（Ｂ）タンパク質合成へのＨＢ処置の時間依存性作用を測定するために、細胞が３μＭ  ＨＢまたは６．５ｎＭ  ＩＧＦ−１で１〜２４時間処置された。（Ｃ）タンパク質分解へのＨＢの用量依存性作用が、［３Ｈ］−フェニルアラニンで一晩標識され、後に増加する濃度のＨＢまたは陽性対照として１０ｎＭのインスリンで４時間処置された細胞で観察され、次いで、タンパク質分解が、培地の中への酸可溶性［３Ｈ］−フェニルアラニンの放出として測定された。（Ｄ）タンパク質分解のＨＢ経時変化研究のために、完全に分化した筋管が、３μＭ  ＨＢで１〜４時間処置された。結果は、３通りで行われた判定の平均±ＳＥＭとして表される（一元配置ＡＮＯＶＡおよびダネット事後検定によって対照と比較した時に＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図３】ＨＢは、Ｌ６筋管の中のＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）リン酸化を増加させる。（Ａ）ＨＢの増加する用量または陽性対照として６．５ｎＭ  ＩＧＦ−１でシミュレートされたＡＫＴリン酸化の代表的な免疫ブロット。（Ｂ）３μＭ  ＨＢまたは陽性対照として６．５ｎＭ  ＩＧＦ−１への１５分間暴露に応答した、時間依存性ＡＫＴリン酸化の代表的な免疫ブロット。細胞が、ＨＢの指示された用量で処置され、次いで、リンおよび非リン特異的抗体を用いた免疫ブロット法によって細胞溶解物が分析された。
【図４】通常（Ａ−Ｂ）および高タンパク質食（Ｃ−Ｄ）を与えられたラットにおける体重増加および食物摂取へのＨＢの作用。動物は、２０（ＨＢ２０）または６０（ＨＢ６０）ｍｇ／ｋｇ体重のＨＢを毎日２４日間受容した。食物摂取（ＦＩ）が毎日記録され、累積食物摂取が３５０ｇ体重について正規化された。結果は平均±ＳＥＭとして表される（一元配置ＡＮＯＶＡおよびダネット事後検定によって媒介物で処置された動物と比較した時に＊Ｐ＜０．０５）。
【図５】ＨＢは、低いアンドロゲン活性を有する。（Ａ）増加する濃度のＨＢまたはメタンドロステノロン（陽性対照、ＩＣ５０＝２４ｎＭ）が、特異的アンドロゲン受容体結合リガンド［３Ｈ］−ミボレロンの存在下で４℃にて４時間培養され、インキュベーション緩衝液のＤＰＭが、リガンドの変位を定量化するように測定された。（Ｂ）無傷またはＯＲＸラットへのＨＢの経口または皮下投与は、動物における血漿中テストステロンに影響を及ぼさなかった。擬似手術を受けたまたはＯＲＸ動物が、経口的に２０または６０ｍｇ／ｋｇＨＢを１０日間毎日受容し、または皮下注射を介して０．４および４ｍｇ／ｋｇＨＢを１０日間毎日受容した。ＯＲＸ動物、および１０日間毎日の０．４ｍｇ／ｋｇプロピオン酸テストステロンの皮下注射である陽性対照と比較して、ＨＢで処置されたＯＲＸ動物では、血漿中テストステロンが検出されなかった（ＮＤ）。結果は平均±ＳＥＭとして表される（一元配置ＡＮＯＶＡおよびダネット事後検定によって媒介物で処置された動物と比較した時に＊Ｐ＜０．０５）。
【図６】ＨＢは、（１）訓練されていないＯＲＸラットの身体の健康を増進し（Ａ）、（２）混合線維腓腹筋の質量を増加させ（Ｂ）、（３）筋線維型分布および断面積の有利な変化を誘発する（Ｃ−Ｇ）。ＯＲＸラットが、経口的に媒介物あるいは２０または６０ｍｇ／ｋｇＨＢを１０日間毎日受容した。研究の終了時に、デジタルフォースゲージを使用して、去勢動物の後肢および前肢の握力が測定された。腓腹筋が切除されて重量を量られ、媒介物で処置された動物（Ｃ）、あるいは２０（Ｄ）または６０（Ｅ）ｍｇ／ｋｇＨＢを受容した動物の筋肉の中央部の連続横断低温切開片が、筋線維型分布（Ｆ）および断面積（Ｇ）を分析するように、ｍＡＴＰａｓｅ活性のために染色された。結果は平均±ＳＥＭとして表される（一元配置ＡＮＯＶＡおよびダネット事後検定によって媒介物で処置された動物と比較した時に＊Ｐ＜０．０５）。
【図７】この研究で使用されたホモブラシノリド（１）のおよびその類似体（２−９）の化学構造。化合物（２）および（４）は、ホモカスタステロンである（Ｂ環は６員環である）。
【図８】Ｌ６ラット筋管の中のタンパク質合成（Ａ）およびタンパク質分解（Ｂ）へのブラシノステロイド１および２の用量依存性作用。（Ａ）細胞が、［３Ｈ］−フェニルアラニンで４時間培養され、媒介物（０．１％エタノール）、陽性対照として６．５ｎＭのＩＧＦ−１、または試験化合物（０．３〜３０μＭ）で３通りに処置され、タンパク質合成が、総タンパク量によって正規化されたタンパク質への［３Ｈ］−フェニルアラニンの取り込みとして測定された。（Ｂ）タンパク質分解へのＨＢの用量依存性作用が、［３Ｈ］−フェニルアラニンで一晩標識され、後に媒介物（０．１％エタノール）、陽性対照として１０ｎＭのインスリン、またはブラシノステロイド類似体（０．３〜３０μＭ）で４時間処置された細胞で観察され、次いで、タンパク質分解が、培地の中への酸可溶性［３Ｈ］−フェニルアラニンの放出として測定された。結果は、３通りで行われた判定の平均±ＳＥＭとして表される（一元配置ＡＮＯＶＡおよびダネット事後検定によって対照と比較した時に＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図９】マウス線維芽細胞株ＮＩＨ−３Ｔ３に対するブラシノステロイド１−９のＭＴＴ検定によって測定されるような細胞生存曲線。細胞が、ブラシノステロイド（０．３〜３０μＭ）の種々の濃度で３７℃にて２４時間培養された。対照細胞の平均吸収度は、１００％細胞増殖を表し、処置された細胞の平均吸収度は、感度を判定する対照値に関係した。エラーバーは、繰り返しの実験によって判定されるような平均細胞増殖からの標準誤差（ｎ＝６）を表す。
【図１０】Ｌ６筋管の中のＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）リン酸化へのＨＢおよびその類似体の作用。１０μＭブラシノステロイド１−９で１時間または６．５ｎＭ  ＩＧＦ−１で１０分間（陽性対照）シミュレートされたＡＫＴリン酸化の代表的な免疫ブロット。リンおよび非リン特異的抗体を用いた免疫ブロット法によって、５０μｇの総可溶性タンパク量を含有するように正規化された細胞溶解物が分析された。
【図１１】生体内のＨＢの薬理ゲノム学的作用。（Ａ）ＲＮＡが、対照およびＨＢ処置動物（２４時間にわたって６０ｍｇ／ｋｇ）のプール（ｎ＝５）腓腹筋サンプルから抽出され、８４個の遺伝子の相対的遺伝子発現レベルを測定するように、ラットインスリン信号伝達経路ＰＣＲアレイを使用して分析された。中央の黒い線が１の倍変化（（２＾（−ΔＣｔ））を示す一方で、斜め線は、遺伝子発現閾値の４倍変化を示す。（Ｂ）Ｉｇｆ２遺伝子発現の結果および（Ｃ）筋肉成長および分化を変調する一式の筋原性転写因子が、対照およびＨＤ処置動物からの個々の筋肉サンプル（ｎ＝５）での従来のＲＴ−ＰＣＲによってさらに確認された。結果は、２通りで行われた判定の平均±ＳＥＭとして表される（スチューデントのｔ検定によって対照と比較した時に＊Ｐ＜０．０５）。
【図１２Ａ】本明細書で使用されるブラシノステロイドのうちのいくつかの合成は、以下のように記載される。（Ａ）Ｉ．（２２Ｓ，２３Ｓ，２４Ｓ）−２α，３α，２２，２３−テトラヒドロキシ−２４−エチル−５α−コレスタン−６−オンの合成。
【図１２Ｂ】本明細書で使用されるブラシノステロイドのうちのいくつかの合成は、以下のように記載される。（Ｂ）ＩＩ．．（２２Ｓ，２３Ｓ，２４Ｓ）−３α−フルオロ−２２，２３−ジヒドロキシ−２４−エチル−５α−コレスタン−６−オンの合成。
【図１２Ｃ】本明細書で使用されるブラシノステロイドのうちのいくつかの合成は、以下のように記載される。（Ｃ）ＩＩＩ．（２２Ｓ，２３Ｓ，２４Ｓ）−３α−フルオロ−２２，２３−ジヒドロキシ−７−オキソ−２４−エチル−５α−コレスタン−６−オンの合成。
【図１２Ｄ】本明細書で使用されるブラシノステロイドのうちのいくつかの合成は、以下のように記載される。（Ｄ）ＩＶ．（２２Ｓ，２３Ｓ，２４Ｓ）−２α，３α，２２，２３−テトラヒドロキシ−２４−エチル−Ｂ−ホモ−６−アザ−５α−コレスタン−６−オンの合成。
【図１２Ｅ】本明細書で使用されるブラシノステロイドのうちのいくつかの合成は、以下のように記載される。（Ｅ）Ｖ．（２２Ｓ，２３Ｓ，２４Ｓ）−２α，３α，２２，２３−テトラヒドロキシ−２４−エチル−Ｂ−ホモ−７−アザ−５α−コレスタン−６−オンの合成。
【図１３】マウス皮膚損傷モデルでの創傷治癒へのブラシノステロイド作用の経時変化。試験物質が、連続１０日間毎日１回、局所的に投与された。創傷閉塞（％）が、１、３、５、７、および９日に判定され、創傷半閉塞時間（ＣＴ５０）が得られた。ＨＢは、マウスモデルで創傷閉塞の割合を増加させ、創傷閉塞時間を短縮した。
【図１４】創傷と関連付けられる体重変化へのＨＢ処置の作用。皮膚および媒介物を除去するように、腰椎上に鋭い穴開け器が適用され、あるいは１０μｇ／マウスのＨＢまたは陽性対照ＣＧＳ−２１６８０が、局所的に１０日間毎日適用された。２因子反復測定ＡＮＯＶＡ、＊Ｐ＜０．０５（ｎ＝９）。
【図１５】マウス皮膚損傷モデルでの創傷治癒の経時変化。（Ａ）創傷サイズが、１０日間にわたって２日ごとに写真撮影および測定された。（Ｂ）１日に対する創傷閉塞（％）が２日ごとに判定され、ＣＴ５０が線形回帰によって計算された。２因子反復測定ＡＮＯＶＡ、＊Ｐ＜０．０５（ｎ＝９）。
【図１６】Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスの創傷内のサイトカインおよびケモカインｍＲＮＡ発現へのＨＢの作用。ＲＮＡが、創傷後１０日に収集された創傷組織から単離され、炎症性サイトカインＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、および付着ケモカインＩＣＡＭ−１のｍＲＮＡレベルがｑＰＣＲによって測定された。ハウスキーピング遺伝子（アクチン）の標的遺伝子発現は、１という値が割り当てられた。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、媒介物対照から有意に異なる、一元配置ＡＮＯＶＡおよびダネットポストホック検定。
【図１７】体外での擦過創傷閉塞へのブラシノステロイド処置の用量依存性作用。３Ｔ３スイス線維芽細胞単層が、滅菌ピペット先端で擦過され、媒介物（０．１％エタノール）、ＦＢＳ（１％、陽性対照）、あるいは（Ａ）ＨＢ、（Ｂ）（２２Ｓ，２３Ｓ）−３α−フルオロ−ホモカスタステロン（化合物４）、または（Ｃ）（２２Ｓ，２３Ｓ）−７−アザ−ホモブラシノリド（化合物６）の種々の濃度が、１用量につき一式の３つのウェルに追加され、１２時間培養された。データは、２つの実験±ＳＥの平均を表す。一元配置ＡＮＯＶＡおよびダネット事後検定を使用して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（ｎ＝３）。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本開示は、骨格筋および皮膚の成長、修復、および維持のために同化作用的に有利な状態を誘発するための、式Ｉで定義される化合物を含む、ブラシノステロイド化合物を使用する方法を提供する。
【００２３】
しかしながら、本開示の主題の実施形態が詳細に説明される前に、本開示は、その用途において、以下の説明で記載される、または図および実施例で例証される構成要素の構造および配列の詳細に限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される節の見出しは、組織的な目的によるものにすぎず、説明される主題を限定するものとして解釈されない。本願で引用される全ての参考文献は、参照することにより本明細書に明示的に組み込まれる。
【００２４】
本開示は、他の実施形態を包含し、種々の方法で実践または実行される。また、本明細書で使用される表現および用語は、説明の目的によるものであり、限定的と見なされるべきではないことを理解されたい。「含む」、「備える」、「有する」といった用語、およびそれらの変化例は、以降に記載される項目およびそれらの同等物、ならびに付加的な主題を包含するように意図されている。
【００２５】
定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。以下の参考文献は、本開示で使用される用語の多くの一般定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  （２ｄ  ｅｄ．  １９９４）；  ＴＨＥ  ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  （Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，  １９８８）；  ＴＨＥ  ＧＬＯＳＳＡＲＹ  ＯＦ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ，  ５ＴＨ  ＥＤ．，  Ｒ．  Ｒｉｅｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  （１９９１）；およびＨａｌｅ  ａｎｄ  Ｍａｒｈａｍ，  ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ
ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ  （１９９１）．
【００２６】
以下の略称が全体を通して使用される。
【表１】
2013545809.tif 000005
【００２７】
本明細書では、本明細書および添付の請求項で使用されるように、「１つの」および「その」といった単数形は、文脈が特に明確に決定しない限り、複数の参照を含むことに留意されたい。
【００２８】
範囲は、種々の態様では、「約」あるいは「およその」１つの特定の値から、および／または「約」あるいは「およその」別の特定の値までとして、本明細書で表される。
先行詞「約」の使用によって、値が近似として表される時に、ある量の変動が範囲に含まれることが理解されるであろう。
【００２９】
本明細書で使用されるように、以下の用語は、特に指定されない限り、それらに帰属する意味を有する。
【００３０】
「同化」という用語は、例えば、アミノ酸からの筋タンパク質または皮膚タンパク質の合成等の、複合分子がより単純な分子から合成される、代謝過程を表すと理解される。「同化状態」は、体内のどの場所でもタンパク質合成の刺激および／またはタンパク質の減少した分解のいずれか一方を通して、窒素が除脂肪体重で特異的に保持される、状態として定義される（Ｋｕｈｎ，  Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐｒｏｇ．  Ｈｏｒｍ．  Ｒｅｓ．  ５７：４１１−４３４，  ２００２）。同化過程は、臓器および組織を「蓄積する」傾向がある。これらの過程は、細胞の成長および分化、概して、複合分子の合成を伴う過程である、身体サイズの増加を生じる。同化過程および作用の実施例は、筋肉量、骨量、赤血球産生の増加、ならびに皮膚内のコラーゲンおよびエラスチンの合成の増加を含む。
【００３１】
加えて、「同化」という用語は、抗異化過程である作用機序を含む。「異化」という用語は、破壊的である代謝過程を表すと理解される。そのような破壊過程は、タンパク質の分解または「タンパク質分解」等の、より大きい分子のより小さい分子への分解を伴う。本開示の種々の態様では、ブラシノステロイドは、タンパク質分解に「抗異化作用」を及ぼす、すなわち、タンパク質分解を阻害する。
【００３２】
「全身同化作用」という用語は、被検体の全身への全体的なプラス作用を表すと理解される。そのような同化作用は、特に筋肉および皮膚の組織および組織内で、細胞組織の蓄積（同化）をもたらす、細胞内のタンパク質合成の増加、ならびに体力、耐久力、および除脂肪体重の増加等の一般作用によって示される。
【００３３】
「同化作用的に有利な状態」という用語は、タンパク質合成が増加させられ、および／またはタンパク質蓄積の増加とともにタンパク質分解が減少させられる、「蓄積」のプラスの状態を指す。いくつかの態様では、筋肉の同化作用的に有利な状態は、筋肉タンパク質合成が刺激され、筋タンパク質が蓄積し、体力および／またはサイズが増加し、より短い回復期間を経る筋肉をもたらすことを意味すると理解される。他の態様では、皮膚の同化作用的に有利な状態は、皮膚タンパク質合成が刺激され、皮膚タンパク質が蓄積し、より堅い、あるいは増加した弾性および／または若々しい外見（増加した平滑性、低減したしわ、および健康な輸血に起因する色）を有する皮膚をもたらすことを意味すると理解される。特定の態様では、皮膚の同化作用的に有利な状態は、皮膚がより若く見え、より少ないしわを有することを意味すると理解される。より具体的な態様では、皮膚の同化作用的に有利な状態は、創傷治癒時間が縮小されることを意味すると理解される。その結果として、皮膚がより速く治癒する。結果として、式Ｉの化合物および本明細書で説明されるブラシノステロイド化合物を用いた処置が「同化作用的に有利な状態」を誘発するため、化合物は、骨格筋および皮膚の成長、修復、および維持において有用である。
【００３４】
「最小限のアンドロゲン副作用を伴う、またはアンドロゲン副作用を全くない」という用語は、男性生殖器および典型的な男性の体毛パターンの発達、ならびに男性型はげ頭症、前立腺肥大、およびにきび等の望ましくない作用を含む、固有の男性特質に起因する因子等の男性ステロイドに起因し得る副次的作用がほとんどない、または全くないことを示すと理解される。
【００３５】
「有効量」および「治療的有効量」という用語はそれぞれ、本明細書で説明されるような被検体における筋肉および皮膚の全身同化作用または同化作用的に有利な状態を支援するために使用される、ブラシノステロイド化合物の量を指す。例えば、治療的有効量は、本開示のいくつかの態様では、被検体において、筋肉量を増加させる、除脂肪体重を増加させる、脂肪塊を減少させる、身体能力を増加させる、体力を増加させる、タンパク質産生を増加させる、タンパク質蓄積を増加させる、タンパク質分解を減少させる、またはそれらの組み合わせを行うために必要な量となる。
【００３６】
本明細書で使用されるような「対照」は、活性、陽性、陰性、または媒介物対照を指すことができる。当業者によって理解されるように、対照は、実験結果の関連性を確立するために使用され、試験されている状態の比較を提供する。
【００３７】
「ＡＫＴ」は、グルコース代謝、細胞増殖、アポトーシス、転写、および細胞移動等の複数の細胞過程で主要な役割を果たす、セリン／トレオニンタンパク質キナーゼである。ＡＫＴは、タンパク質合成および分解を調節することが知られている下流標的を変調する、ＩＧＦ−１信号伝達経路内の主要な仲介物である。骨格筋の中の構成的に活性なＡＫＴの活性化は、向上した代謝を伴う急速な筋肉肥大につながる（Ｉｚｕｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ．  Ｍｅｔａｂ．  ７：１５９−１７２，  ２００８）。ＡＫＴが、タ
ンパク質合成および分解を調節することが知られている細胞内標的を変調するため、ＡＫＴ活性化へのブラシノステロイド作用を判定するようにＡＫＴリン酸化が測定される。
【００３８】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、ペプチド結合を介して連結されたアミノ酸残基のポリマーを指すために、本明細書で交換可能に使用される。「タンパク質」という用語は、典型的には、大型ポリペプチドを指す。「ペプチド」という用語は、典型的には、短ポリペプチドを指す。
【００３９】
「化粧用途」という用語は、身体またはそのある部分、例えば、皮膚の外見を増進させる際の使用を意味すると理解される。化粧品は、スキンケアクリーム、ローション、パウダー、香水、リップスティック、マニキュア液、アイおよびフェイシャルメイク、ウェットティッシュ、パーマネントウェーブ、カラーコンタクトレンズ、ヘアカラー、ヘアスプレーおよびジェル、デオドラント、手の殺菌剤、ベビー用品、バスオイル、バブルバス、バスソルト、バター、および身体または身体部分の外見を向上させるように設計されている多くの他の種類の製品を含む。一態様では、本明細書で説明されるブラシノステロイド化合物は、皮膚の外見を向上させるように、スキンケアクリーム、ローション、または化粧品の中に処方される。
【００４０】
「ある期間にわたって」という用語は、少なくとも数日を意味すると理解される。いくつかの態様では、「期間」は、医師によって必要と判定されるような、数週間、数ヶ月間、または数年間の処置を含むことができる。
【００４１】
本明細書で使用されるように、「ブラシノステロイド」または「ＢＲ」という用語は、その類似体、変異体、および誘導体を含む、当技術分野で公知の全ての天然および合成ＢＲを含む、第６部類の植物ホルモンとして認識されているポリヒドロステロイドの類を表すと理解される。「類似体」、「変異体」、または「誘導体」は、ある場合においては程度が異なるが、自然発生分子と構造が実質的に同様であり、同一または同様の生物学的活性を有する、化合物である。ブラシノステロイドの構造、生物活性、および用途の論評が、Ｚｕｌｌｏら（Ｂｒａｚ．  Ｊ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １４：１４３−８１，  ２００２）によって提供され、その全体で参照することにより本明細書に組み込まれる。彼らの発見以来、７０個以上のＢＲ化合物が植物から単離されており（Ｂａｊｇｕｚ，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ４５：  ９５−１０７，  ２００７）、の全体で参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００４２】
本開示のいくつかの態様では、ブラシノステロイドは、式Ｉの化合物およびその誘導体を含む、組成物を含むと理解される。
【化４】
2013545809.tif 000006
式中、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、ＨおよびＯＨから成る群より独立して選択され、
Ｒ３は、Ｃ（Ｈ）ＯＨ、Ｃ（Ｈ）Ｆ、Ｃ＝Ｏ、およびＣ（Ｈ）ＯＲ９から成る群より選択され、
またはＲ２およびＲ３は、それらが結合される炭素原子とともに、３員エポキシド環を形成し、
Ｒ４は、ＣＨ２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ（Ｈ）ＯＨ、およびＮＨから成る群より選択され、
Ｒ５は、結合、Ｏ、ＮＨ、およびＣ＝Ｏから成る群より選択され、
Ｒ６は、Ｈおよび
【化５】
2013545809.tif 000007
から成る群より選択され、
Ｒ７は、ＣＨ２、Ｃ（Ｈ）ＣＨ３、Ｃ（Ｈ）ＣＨ２ＣＨ３、Ｃ＝ＣＨ２、およびＣ＝Ｃ（Ｈ）ＣＨ３から成る群より選択され、
Ｒ８は、ＨおよびＣＨ３から成る群より選択され、
Ｒ９は、Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎＣＨ３および
【化６】
2013545809.tif 000008
から成る群より選択され、
ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、および１８から成る群より選択される。
【００４３】
ブラシノステロイドの合成
種々の態様では、ＢＲは、カンペステロールから生合成される。生合成経路は、日本人研究者らによって解明され、後にシロイヌナズナ、トマト、およびエンドウマメにおけるＢＲ生合成突然変異体の分析を通して正しいことが示された。最も豊富で広く発生しているブラシノステロイドは、Ｃ２８ステロイドであり、それらの中でも、ブラシノリドが最も生物学的に活性である。ブラシノリドは、セイヨウアブラナからの花粉が茎伸長および細胞分割を推進でき、生物学的に活性な分子が単離されることが示された、１９７９年に、最初の単離されたブラシノステロイドであった。
【００４４】
植物は、全てステロイド生合成経路に由来する、ブラシノリドの生合成のための複数の経路を有する。カンペスタノールからカスタステロン（ＣＳ）への２つの経路である、Ｃ６酸化および後期Ｃ６酸化経路は、多くの植物で作動する。別の分岐経路である、初期Ｃ２２酸化経路は、シロイヌナズナのブラシノステロイド欠損突然変異体を使用して実証された。カンペステロールから６−デオキソチファステロールからのショートカット経路は、ブラシノステロイド生合成に関与するシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの機能分析によって実証された。したがって、少なくとも４つの経路が、ＣＳの生合成に関与し、ＣＳは、Ｂ環のラクトン化によってブラシノリド（ＢＬ）にさらに代謝される。付加的な説明が、Ｆｕｊｉｏｋａら（Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．  ５４：１３７−６４，  ２００３）によって提供され、その全体で参照することにより本明細書に
組み込まれる。
【００４５】
種々の態様では、以下のブラシノステロイドが使用される：［（２２Ｓ，２３Ｓ）−ホモブラシノリド（ＨＢ）または２８−ホモブラシノリドまたは「ＨＢ」としても知られている、（２２Ｓ，２３Ｓ，２４Ｓ）−２α，３α，２２，２３−テトラヒドロキシ−２４−エチル−β−ホモ−７−オキソ−５α−コレスタン−６−オン］、２２Ｓ，２３Ｓ，２４Ｒ）−２α，３α，２２，２３−テトラヒドロキシ−２４−メチルＢ−ホモ−７−オキサ−５α−コレスタン−６−オン、（２２Ｒ，２３Ｒ，２４Ｒ）−２α，３α，２２，２３−テトラヒドロキシ−２４−メチル−Ｂ−ホモ−７−オキサ−５α−コレスタン−６−オン、（２２Ｓ，２３Ｓ）−ホモカスタステロン、（２２Ｓ，２３Ｓ）−３α−フルオロ−ホモブラシノリド、（２２Ｓ，２３Ｓ）−３α−フルオロ−ホモカスタステロン、（２２Ｓ，２３Ｓ）−６−アザ−ホモブラシノリド、（２２Ｓ，２３Ｓ）−７−アザ−ホモブラシノリド、（２２Ｒ，２３Ｒ）−ホモブラシノリド、（２２Ｓ，２３Ｓ）−エピブラシノリド、オヨビ（２２Ｒ，２３Ｒ）−エピブラシノリド。
【００４６】
アエグレマルメロスコレア（ミカン科）から単離されたブラシノステロイドである、２４−エピブラシノリド（ＥＢＬ）が、種々の態様では、本開示の方法で使用するために含まれる。
【００４７】
ＨＢ（図１）が、Ｗａｔｅｒｓｔｏｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃａｒｍｅｌ，  ＩＮ）またはＳｃｉＴｅｃｈ（Ｐｒａｈａ，  Ｃｚｅｃｈ  Ｒｅｐｕｂｌｉｃ）から購入され、その構造が、ＥＳＩ−ＬＣＭＳおよびＮＭＲによって確認された。（２２Ｓ，２３Ｓ，２４Ｒ）−２α，３α，２２，２３−テトラヒドロキシ−２４−メチル−Ｂ−ホモ−７−オキサ−５α−コレスタン−６−オンおよび（２２Ｒ，２３Ｒ，２４Ｒ）−２α，３α，２２，２３−テトラヒドロキシ−２４−メチル−Ｂ−ホモ−７−オキサ−５α−コレスタン−６−オンが、ＳｃｉＴｅｃｈ（Ｐｒａｈａ，  Ｃｚｅｃｈ  Ｒｅｐｕｂｌｉｃ）から購入され、それらの構造が、ＥＳＩ−ＬＣＭＳおよびＮＭＲによって確認された。図１２は、本明細書で使用されるブラシノステロイドのうちのいくつかの合成を説明する。
【００４８】
いくつかの態様では、ブラシノステロイドが、細胞へのそれらの作用を調べるために投与される。態様では、ブラシノステロイドは、約０．０１μＭから約１００μＭの濃度で投与される。いくつかの態様では、ブラシノステロイドは、約０．１μＭから約５０μＭの濃度で投与される。種々の態様では、ブラシノステロイドは、約０．２μＭ、約０．３μＭ、約０．４μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．７μＭ、約０．８μＭ、約０．９μＭ、約１．０μＭ、約２．０μＭ、約３．０μＭ、約４．０μＭ、約５．０μＭ、約６．０μＭ、約７．０μＭ、約８．０μＭ、約９．０μＭ、約１０μＭ、約１１μＭ、約１２μＭ、約１３μＭ、約１４μＭ、約１５μＭ、約１６μＭ、約１７μＭ、約１８μＭ、約１９μＭ、約２０μＭ、約２１μＭ、約２２μＭ、約２３μＭ、約２４μＭ、約２５μＭ、約２６μＭ、約２７μＭ、約２８μＭ、約２９μＭ、約３０μＭ、約３５μＭ、約４０μＭ、または約４５μＭの濃度で投与される。
【００４９】
化学物質
種々の態様では、本開示で説明される、より多くの方法のうちの1つに関する種々の実験を実行するために、化学物質が購入された。Ｌ−［２，３，４，５，６−３Ｈ］−フェニルアラニンが、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）から入手された。Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴおよびＡＫＴ  ｍＡｂｓが、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｎｖｅｒｓ，  ＭＡ）から購入された。ｑＰＣＲに使用された試薬および酵素が、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  （Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）から入手された。全ての他の化学物質および細胞培地は、特に指定されない限り、Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）およびＳｉｇｍａ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）から入手された。
【００５０】
細胞培養
いくつかの態様では、細胞培養実験が実行された。ラットＬ６骨格筋細胞株ＣＲＬ−１４５８がＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ）から入手された。筋芽細胞が、３７℃および５％ＣＯ２にて、１０％ＦＢＳおよび０．１％ペニシリン・ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）の中で定期的に維持された。細胞が、タンパク質合成、分解、および細胞生存研究のために２４ウェルプレートの中へ、ならびにウェスタンブロット分析のために６ウェルプレートの中へ培養された（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ  Ｏｎｅ，  Ｍｏｎｒｏｅ，  ＮＣ）。いったん細胞が９０％集合に達すると、血清濃度を２％まで下げることによって分化が誘発され、培地が２日ごとに交換された。培養の７〜９日後に、筋芽細胞は多核筋管に融合していた（Ｍａｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，
Ｎａｔｕｒｅ  ２５１：６１８−６２０，  １９７４）。ＮＩＨ  ３Ｔ３マウス胚線維芽細胞株（ＡＴＣＣ  ＃ＣＣＬ−９２）が、３７℃および５％ＣＯ２にてＤＭＥＭおよび１０％ＦＢＳの中で維持され、３〜４日ごとに継代培養された。
【００５１】
他の態様では、皮膚細胞へのブラシノステロイドの作用を調べるように、細胞培養実験が実行される。ヒトケラチン生成細胞の培養は、皮膚の細胞生物学の研究のための便利で有用なモデルである。しかしながら、種々の態様では、当技術分野で皮膚タンパク質の研究に使用される任意の細胞が、本開示で使用される。
【００５２】
いくつかの態様では、コラーゲンおよびエラスチンへのブラシノステロイドの作用が研究される。コラーゲンおよびエラスチンは、人体内で作製されて使用される、構造タンパク質である。コラーゲンは、主に腱、靱帯、ならびに皮膚、血管、および肺の結合組織で見出される。エラスチンは、主に動脈壁、肺、腸、および皮膚で見出される。これらのタンパク質は、結合組織内で連携して機能する。コラーゲンは、結合組織および臓器が機能することができるように、それらに剛性を与え、エラスチンは、それらを伸張させ、元の状態に戻らせる。コラーゲンは、エラスチンが破壊点まで伸張することを可能にしない。皮膚では、コラーゲンおよびエラスチンは、表皮の直下の層であり、真皮の主要構成要素である。コラーゲンおよびエラスチンは、皮膚の支持構造を提供する。ブラシノステロイドは、いくつかの態様では、そのような皮膚タンパク質に同化作用を及ぼす、すなわち、コラーゲンおよびエラスチンの産生を増加させ、コラーゲンおよびエラスチンの蓄積を増加させ、コラーゲンおよびエラスチンの分解を減少させる。
【００５３】
細胞生存試験および用量範囲判定
種々の態様では、細胞生存が測定され、化合物および試薬の用量の作用が細胞株で試験される。いくつかの態様では、細胞生存が、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）分析によって３通りに測定され（Ｍｏｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５：５５−６３，  １９８３）、マイクロプレートリーダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）を使用して、５５０ｎｍにて分光光度法で定量化された。媒介物（０．１％エタノール）と比較して細胞生存の変化を示さなかった試薬の濃度が、さらなる研究のために選択された。
【００５４】
タンパク質合成の測定
種々の態様では、タンパク質合成が、特定のタンパク質へのブラシノステロイドの作用を判定するように測定された。タンパク質合成を測定するための全ての既知の方法が、本開示の方法に含まれる。ブラシノステロイド用量反応研究では、完全に分化した筋管が、無血清ＤＭＥＭで洗浄され、媒介物（０．１％エタノール）、増加する濃度のＨＢ、または
陽性対照として６．５ｎＭのインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）で３通りに処置された。化合物が、０．５μＣｉ／ｍＬ［３Ｈ］−フェニルアラニンを含有する無血清培地に追加され、４時間培養された。ＨＢ経時変化研究のために、完全に分化した筋管が、同じ培養条件を使用して、３μＭ  ＨＢで１〜２４時間処置された。氷上に細胞を置き、培地を破棄し、組み込まれていない放射標識を除去するように冷たいＰＢＳで細胞を広く洗浄することによって、培養が停止された。タンパク質が、５％トリクロロ酢酸で沈殿させられ、０．５Ｎ  ＮａＯＨ中で溶解させられた（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ．  Ｓｃｉ．  ２４：１２３−１２９，  ２００２）。タンパク質結合フェニルアラニンの比放射能が、液体シンチレーションカウンタＬＳ  ６５００（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，  Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，  ＣＡ）を使用して定量化され、ＢＣＡタンパク質分析（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）によって判定された総タンパク量のｍｇに正規化された。
【００５５】
タンパク質分解の測定
種々の態様では、タンパク質分解が、特定のタンパク質へのブラシノステロイドの作用を判定するように測定される。タンパク質分解を測定するための全ての既知の方法が、本開示の方法に含まれる。タンパク質分解へのブラシノステロイドの作用が、わずかな修正を伴って、Ｆａｗｃｅｔｔら（Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ３８５：３５７−３６３，  ２００１）によって説明されるように、完全に分化した筋管で調査された。完全に分化した筋管が、１．５μＣｉ／ｍＬ［３Ｈ］−フェニルアラニンを用いた細胞タンパク質の標識化を可能にするように１６時間培養された。細胞が、組み込まれていない放射標識を除去するようにＰＢＳで２回洗浄され、媒介物（０．１％エタノール）、増加する濃度のブラシノステロイド、または無血清培地中の１０ｎＭのインスリンで４時間処置された。氷上に細胞を置くことによって、培養が停止され、培地中のタンパク質が、５％トリクロロ酢酸で沈殿させられた。無タンパク質フェニルアラニン比放射能が、液体シンチレーションカウンタＬＳ  ６５００（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，
Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，  ＣＡ）を使用して定量化され、ＢＣＡタンパク質分析（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）によって判定された総細胞タンパク量のｍｇに正規化された。
【００５６】
タンパク質濃度およびタンパク質検出
種々の態様では、タンパク質検出の方法およびタンパク質濃度を測定する方法が実行される。タンパク質を検出し、タンパク質濃度を測定するための全ての既知の方法が、本開示の方法に含まれる。
【００５７】
いくつかの態様では、ウェスタンブロット分析が実行された。完全に分化したＬ６筋管が、上記で説明されるように培養され、全細胞抽出物が、１０ｍＭフッ化ナトリウム、２ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）が補充された冷たいＲＩＰＡ緩衝液の中で沈殿させられ、４℃にて１２，０００ｇで２０分間遠心分離された。上清からの等量のタンパク質（５０μｇ）が、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離され、ニトロセルロース膜上にブロットされた。ウェスタンブロット検出が、製造業者の指示（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｄａｎｖｅｒｓ，  ＭＡ）に従って、モノクローナルｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）抗体を用いて実行された。洗浄された後、ブロットは、抗ウサギペルオキシダーゼ標識二次抗体用いて培養され、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）を使用して可視化された。揮散された後、同じブロットは、ローディング対照としての機能を果たすように、全ＡＫＴ抗体を用いて精査された。
【００５８】
アンドロゲン受容体結合
ラットアンドロゲン受容体結合分析が、参照することにより本明細書に組み込まれる、他の場所で説明されるように（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２７：１２３−１３１，  １９８７）、ＭＤＳ  Ｐｈａｒｍａ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｔａｉｗａｎ）によって行われた。媒介物（１％ＤＭＳＯ）、増加する濃度のＨＢ、またはメタンドロステノロンが、特異的結合リガンド［３Ｈ］−ミボレロンの存在下で４℃にて４時間培養され、培養緩衝液のＤＰＭが、リガンドの変位を定量化するように測定された。各処置が２〜３回繰り返され、結果が平均化された。
【００５９】
動物実験および遺伝子発現研究
６週齢オスウィスター系ラット（１８０〜２２０ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  ＭＡ）が、１２時間明暗サイクルとともに一定の室温で維持された室内で、個々のチャンバの中に収容された。動物は、食物および水に自由にアクセスできた。動物は、７日間新しい条件に適応させられ、動物の取扱は、物理的操作のストレスを低減するように、この時間の間に毎日実行された。動物は、投薬の１日前に体重によってグループに無作為化された。
【００６０】
プロトコル１：２３．９％タンパク質、１０．７％脂肪、５．１％繊維、および５８．７％炭水化物を含有する通常食を与えられ、４．６１ｋｃａｌ／ｇエネルギー値（＃５００１  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｃｈｏｗ食、Ｐｕｒｉｎａ，  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）をもたらした、ウィスター系ラットの３つのグループ（ｎ＝６）が、１ｍｌの媒介物（トウモロコシ油中の５％ＤＭＳＯ）、２０ｍｇ／ｋｇまたは６０ｍｇ／ｋｇ体重のＨＢを、２４日間毎日強制経口投与された。各動物の体重および消費された食物の総量（こぼれたものを計上した）が、実験の持続時間にわたって２日ごとに記録された。実験の終了時に、血液がＣＯ２吸入後の心臓穿刺によって収集され、動物の身体組成が、Ｌｕｎａｒ  Ｐｒｏｄｉｇｙ  Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｗａｕｋｅｓｈａ，  ＷＩ）を使用したＤＥＸＡ二重エネルギーＸ線吸収分析によって評価された。解剖時に、組織重量が記録された。組織サンプルが、液体窒素中でスナップ凍結することによって収集され、さらなる研究のために−８０℃で保管された。総ＲＮＡがＴｒｉｚｏｌを使用して単離され、その数量および純度が、ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  ＤＥ）を使用して判定された。プールＲＮＡサンプルが、ラットインスリン信号伝達ＰＣＲアレイ（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）に使用され、製造業者のプロトコルに従って分析された。ｃＤＮＡ合成および定量的ＰＣＲ分析が、本質的にＫｏｍａｒｎｙｔｓｋｙらによって説明されるように行われた（Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｏｂｅｓ．  （Ｌｏｎｄ）、２０１０  Ｓｅｐ  ７，  “Ｐｏｔａｔｏ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｆｏｏｄ
ｉｎｔａｋｅ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ｂｙ  ａ  ｔｒｙｐｓｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，”［印刷前Ｅｐｕｂ；  ＰＭＩＤ：  ２０８２０１７１  ［ＰｕｂＭｅｄ−出版者によって供給］］。
【００６１】
プロトコル２：３９．４％タンパク質、１０．０％脂肪、４．３％繊維、および３７．０％炭水化物を含有する高タンパク質食を与えられ、３．９３ｋｃａｌ／ｇエネルギー値（＃５７７９食、Ｔｅｓｔｄｉｅｔ／Ｐｕｒｉｎａ，  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，  ＩＮ）をもたらした、ウィスター系ラットの３つのグループ（ｎ＝８）が、１ｍｌの媒介物（トウモロコシ油中の５％ＤＭＳＯ）、２０または６０ｍｇ／ｋｇのＨＢを、２４日間毎日強制経口投与された。全ての手順および測定はプロトコル１に従った。
【００６２】
プロトコル３：４週齢の擬似手術を受けた（擬似、ｎ＝６）または精巣摘出された（ＯＲＸ、ｎ＝２４）ウィスター系ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  ＭＡ）が、擬似、ＯＲＸ（媒介物）、ＯＲＸ（経口的に２０ｍｇ／ｋｇ  Ｈ
Ｂ）、ＯＲＸ（経口的に６０ｍｇ／ｋｇ  ＨＢ）、およびＯＲＸ（皮下に分析のための陽性対照としての機能を果たす０．４ｍｇ／ｋｇプロピオン酸テストステロン）といった実験条件下で、１０日間のハーシュバーガー分析（外科的に去勢された思春期前後の成体モデル）を受けた。身体組成測定が行われなかったことを除いて、全ての手順および測定はプロトコル１に従った。Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄａｙｔｏｎ，  ＮＪ）によるデジタルフォースゲージ（Ｗａｇｎｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  モデルＦＤＶ５）を使用して、肢の握力が、対照動物および６０ｍｇ／ｋｇ  ＨＢを受容した動物について測定された。ラットは、足でスクリーンを握らされた後、足がスクリーンから解放されるまで迅速に引っ張られ、必要な解放力が記録された。各動物での３回の試験が３通りに行われ、スチューデントのｔ検定を使用して有意性が判定された（ｐ＜０．０５）。腓腹筋に加えて、アンドロゲン感受性組織（腹側前立腺、精嚢、球海綿体筋／肛門挙筋複合体、陰茎亀頭、およびカウパー腺）が解離され、重量を量られた。
【００６３】
プロトコル４：４週齢の擬似手術を受けた（擬似、ｎ＝６）または精巣摘出された（ＯＲＸ、ｎ＝２４）ウィスター系ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  ＭＡ）が、擬似、ＯＲＸ（媒介物）、ＯＲＸ（皮下に０．４ｍｇ／ｋｇ  ＨＢ）、ＯＲＸ（皮下に４ｍｇ／ｋｇ  ＨＢ）、およびＯＲＸ（皮下に分析のための陽性対照としての機能を果たす０．４ｍｇ／ｋｇプロピオン酸テストステロン）といった実験条件下で、１０日間のハーシュバーガー分析（外科的に去勢された思春期前後の成体モデル）を受けた。全ての手順および測定はプロトコル１に従った。
【００６４】
骨格筋
骨格筋は、体性神経系の制御下にある横紋筋組織の形態である。それは、３つの主要な筋肉型のうちの１つであり、その他は心筋および平滑筋である。その名前が示唆するように、ほとんどの骨格筋は、腱として知られているコラーゲン繊維の束によって骨に取り付けられている。
【００６５】
骨格筋は、筋線維として知られている個々の構成要素で構成されている。これらの線維は、発達性筋芽細胞（筋細胞を生じる一種の胚前駆細胞）の融合から形成される。筋原線維（筋線維）は、骨格筋の横紋のある外見に関与し、筋肉収縮に必要な基本機構を形成する基本機能単位である、サルコメアとして反復されるアクチンおよびミオシン筋原線維から成る、長い円筒形の多核細胞である。「筋肉」という用語は、結合組織によってともに保持される、筋線維の複数の束を指す。
【００６６】
筋線維
個々の筋線維は、発達中に、筋芽細胞として知られているいくつかの未分化未熟細胞の長い円筒形の多核細胞への融合から形成される。この状態への分化は主に、その後にサイズが増大し続ける細胞とともに、出生前に完了する。骨格筋は、筋線維の細胞質内の細胞骨格要素の配列により、顕微鏡下で視認した時に独特の横縞模様を示す。主要な細胞質タンパク質は、サルコメアと呼ばれる反復単位で配列される、ミオシンおよびアクチン（それぞれ、「厚い」および「薄い」フィラメントを形成する）である。ミオシンおよびアクチンの相互作用は、筋肉収縮に関与する。
【００６７】
存在するミオシンの種類（高速または低速）、および線維が受ける酸化的リン酸化の程度といった、筋線維を分類する２つの主要な方法がある。したがって、骨格筋は、Ｉ型およびＩＩ型といった２つの広いカテゴリに分けることができる。Ｉ型線維は、酸素結合タンパク質ミオグロビンの存在により、赤く見える。Ｉ型線維は、耐久力に適しており、ＡＴＰを生成するために酸化的代謝を使用するため、ゆっくり疲労する。ＩＩ型線維は、ミオグロビンの欠如および糖分解酵素への依存により、白く見える。ＩＩ型線維は、短い爆発的な速さおよび力に効率的であり、特定の亜型に応じて、酸化的代謝および嫌気的代謝
の両方を使用し、より早く疲労する。
【００６８】
個々の筋肉は、３つの種類の筋線維（Ｉ型、ＩＩａ型、およびＩＩｂ型）の混合物であるが、それらの割合は、その筋肉の動作に応じて異なる。弱い収縮が必要とされる場合、Ｉ型運動単位のみが活性化される。より強い収縮が必要とされる場合、Ｉ型線維を支援するように、ＩＩａ型線維が活性化または使用される。最大限の収縮は、常に最後に活性化されるＩＩｂ型線維の使用を促進する。これらの線維は、弾道的活動中に使用されるが、容易に疲れる。
【００６９】
筋肉組織学
組織学的分析用の筋肉サンプルが、ＯＲＸおよびＨＢ処置と関連付けられる線維型分布および断面積の差異の観察を可能にするように、プロトコル４（本明細書の上記で説明される）に従って処置された去勢動物の混合線維腓腹筋の中央部から採取された。連続横断低温切開片（１０μｍ）が、各筋肉から調製され、アルカリ性（ｐＨ＝９．５）前保温後に筋原線維アデノシン三リン酸（ｍＡＴＰａｓｅ）組織化学について分析された。線維断面積および酵素活性レベルが、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ）を使用してグレーレベル写真として保管された、筋肉断面のデジタル化画像から判定された。
【００７０】
血漿サンプルの分析
血液サンプルが、心臓穿刺によって一晩絶食した動物から採取され、ＥＤＴＡ被覆管の中に収集され、１，５００ｇで２０分間遠心分離され、分離された血漿が分析まで−８０℃で保管された。Ｌｉｆｅｓｃａｎグルコメータ（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，  ＮＪ）を使用して、グルコースが血液サンプル中で測定された。インスリンの血漿中濃度が、ラット／マウスインスリンＥＬＩＳＡキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，  ＭＡ）によって判定された。血漿トリグリセリドおよび総コレステロールが、酵素比色分析（Ｗａｋｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，  ＶＡ）によって測定された。血漿サンプル中の総テストステロンが、ＥＬＩＳＡ分析（ＤＲＧ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｍａｒｂｕｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）によって定量化された。
【００７１】
統計
Ｐｒｉｓｍ  ４．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，
ＣＡ）を使用して、統計分析が実行された。特に記述がない限り、データは、処置を因子として用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって分析された。ダネットの多重比較試験を使用して、個々の実験グループ間の差異のポストホック分析が行われた。体重増加が、時間および処置を独立変数として用いた２因子反復測定ＡＮＯＶＡによって分析された。有意性がｐ＜０．０５に設定された。値が平均±ＳＥＭとして報告された。５０％阻害濃度（ＩＣ５０）が、非線形回帰曲線分析によって計算された。
【００７２】
投与経路および投与量
本開示は、局所、腸内、または非経口投与に利用可能である、生物学的に活性な化合物、すなわち、ブラシノステロイド化合物（またはブラシノステロイド化合物単独）を含む、組成物を検討する。局所投与については、化合物は、種々の態様では、経真皮的に、経粘膜的に、経皮的に、点眼薬を介して、点耳薬を介して、または吸入によって送達される。特定の態様では、化合物は、化粧目的で皮膚に経皮的に塗布される。腸内／非経口投与については、化合物は、種々の態様では、経口的に、経直腸的に、舌下で、唇下で、頬側に、注射によって、または注入によって送達される。特定の態様では、化合物は、注射される時に、静脈内に、動脈内に、皮下に、皮内に、筋肉内に、心臓内に、心膜に、髄腔内に、腹腔内に、膀胱内に、硝子体内に、膣内に、硬膜外に、または鼻腔内に注射される。
【００７３】
いくつかの態様では、生物学的に活性な化合物は、経口投与のために錠剤化され、カプセル化され、または別様に処方される。いくつかの態様では、組成物は、医薬組成物、栄養補助組成物（例えば、栄養補助食品）として、あるいは米国食品医薬品局によって定義されるような食品および飲料添加物として提供される。上記の組成物の投与形態は、特に制限されない。例えば、液体溶液、懸濁液、乳液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤、粉末、坐薬、リポソーム、微小粒子、マイクロカプセル、滅菌等張水性緩衝溶液、および同等物が全て、好適な投与形態として検討される。
【００７４】
いくつかの態様では、組成物は、１つ以上の希釈剤、充填剤、塩、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、流動促進剤、湿潤剤、放出制御基質、着色剤、香味料、担体、賦形剤、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、市販のアジュバント、および／または当技術分野で公知の他の添加剤を含む。
【００７５】
種々の態様では、医薬媒介物、賦形剤、または媒体としての機能を果たす、薬学的に容認可能な（すなわち、当技術分野で公知であるように無菌で容認可能に非毒性の）液体、半固体、または固体希釈剤が使用される。具体的な態様では、希釈剤は、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ステアリン酸マグネシウム、リン酸カルシウム、鉱油、ココアバター、およびカカオ脂、ヒドロキシ安息香酸メチルおよびプロピル、タルク、アルギン酸塩、炭水化物、特に、マンニトール、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、蔗糖、ブドウ糖、ソルビトール、変性デキストラン、アラビアガム、およびデンプンを含むが、それらに限定されない。いくつかの態様では、そのような組成物は、化合物の物理的状態、安定性、生体内放出速度、および生体内クリアランス率に影響を及ぼす。
【００７６】
薬学的に容認可能な充填剤は、ある態様では、ラクトース、微結晶性セルロース、リン酸二カルシウム、リン酸三カルシウム、硫酸カルシウム、ブドウ糖、マンニトール、および／または蔗糖を含む。他の態様では、リン酸三カルシウム、炭酸マグネシウム、および塩化ナトリウムを含む塩が、医薬組成物で充填剤として使用される。
【００７７】
いくつかの態様では、結合剤が、組成物をともに保持して硬いタブレットを形成するために使用される。特定の態様では、結合剤は、アカシア、トラガカント、デンプン、およびゼラチン等の有機生成物からの材料を含む。他の好適な結合剤は、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）、およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を含む。
【００７８】
いくつかの態様では、化合物は、食品の中に投与される。化合物を含む食品はさらに、身体による化合物の吸収を増加させるように作用する、生体利用性増進剤を含む。生体利用性増進剤は、天然または合成化合物である。一態様では、化合物を含む食品はさらに、化合物の生体利用性を増進させるために、１つ以上の生体利用性増進剤を含む。
【００７９】
天然生体利用性増進剤は、ショウガ、キャラウェイ抽出物、コショウ抽出物、およびキトサンを含む。ショウガの中の活性化合物は、６−ジンゲロールおよび６−ショウガオールを含む。キャラウェイ油もまた、生体利用性増進剤として使用することができる（米国特許出願２００３／０２２８３８）。ピペリンは、生体利用性増進剤として作用する、コショウ（コショウまたはヒハツ）由来の化合物である（米国特許第５，７４４，１６１号参照）。ピペリンは、Ｂｉｏｐｅｒｉｎｅ（登録商標）（Ｓａｂｉｎｓａ  Ｃｏｒｐ．，
Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  Ｎ．Ｊ．）という商標の下で市販されている。いくつかの態様では、天然生体利用性増進剤は、食品の総重量に基づいて、約０．０２重量％から約０．６重量％の量で存在する。
【００８０】
好適な合成生体利用性増進剤の実施例は、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ（登録商標）、Ｌａｂｒａｆｉｌ（登録商標）およびＬａｂｒａｓｏｌ（登録商標）、Ｌａｕｒｏｇｌｙｃｏｌ（登録商標）、Ｐｌｅｕｒｏｌ  Ｏｌｅｉｑｕｅ（登録商標）（Ｇａｔｔｅｆｏｓｓｅ  Ｃｏｒｐ．，  Ｐａｒａｍｕｓ，  Ｎ．Ｊ．）、ならびにＣａｐｍｕｌ（登録商標）（Ａｂｉｔｅｃ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，  Ｏｈｉｏ）を含むが、それらに限定されない。
【００８１】
化合物の量および投与レジメンは、投与の目的に関連する種々の因子、例えば、被検体の年齢、性別、体重、ホルモンレベル、または被検体の他の栄養必要量に基づく。
【００８２】
いくつかの態様では、化合物は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から約１０ｇ／ｋｇ体重の投与量、すなわち量で、被検体に投与される。いくつかの態様では、化合物は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重の量で被検体に投与される。いくつかの態様では、化合物は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０２ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０３ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０４ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０６ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０７ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０８ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０９ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．２ｍｇ／ｋｇ体重、約０．３ｍｇ／ｋｇ体重、約０．４ｍｇ／ｋｇ体重、約０．５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．６ｍｇ／ｋｇ体重、約０．７ｍｇ／ｋｇ体重、約０．８ｍｇ／ｋｇ体重、約０．９ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ体重、約２ｍｇ／ｋｇ体重、約３ｍｇ／ｋｇ体重、約４ｍｇ／ｋｇ体重、約５ｍｇ／ｋｇ体重、約６ｍｇ／ｋｇ体重、約７ｍｇ／ｋｇ体重、約８ｍｇ／ｋｇ体重、約９ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約２０ｍｇ／ｋｇ体重、約３０ｍｇ／ｋｇ体重、約４０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約６０ｍｇ／ｋｇ体重、約７０ｍｇ／ｋｇ体重、約８０ｍｇ／ｋｇ体重、約９０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１５０ｍｇ／ｋｇ体重、約２００ｍｇ／ｋｇ体重、約２５０ｍｇ／ｋｇ体重、約３００ｍｇ／ｋｇ体重、約３５０ｍｇ／ｋｇ体重、約４００ｍｇ／ｋｇ体重、約４５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５００ｍｇ／ｋｇ体重、約５５０ｍｇ／ｋｇ体重、約６００ｍｇ／ｋｇ体重、約６５０ｍｇ／ｋｇ体重、約７００ｍｇ／ｋｇ体重、約７５０ｍｇ／ｋｇ体重、約８００ｍｇ／ｋｇ体重、約８５０ｍｇ／ｋｇ体重、約９００ｍｇ／ｋｇ体重、約９５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｇ／ｋｇ、約２．５ｇ／ｋｇ体重、約５ｇ／ｋｇ体重、約７．５ｇ／ｋｇ体重、または１０ｇ／ｋｇ体重の量で被検体に投与される。
【００８３】
いくつかの態様では、化合物は、１日につき約１μｇ／ｋｇ体重から１日につき約１０ｇ／ｋｇ体重の投与量で動物被検体に投与される。特定の態様では、化合物は、１日につき約１ｍｇ／ｋｇ体重から１日につき約１ｇ／ｋｇ体重の投与量で動物被検体に投与される。より具体的な態様では、化合物は、１日につき約１０ｍｇ／ｋｇ体重から１日につき約１００ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で動物被検体に投与される。
【００８４】
特定の態様では、レジメンは、化合物の複数用量を含む。一態様では、上記で立案されるような化合物レジメンは、１日につき１回投与される。いくつかの態様では、化合物は、数日、数週間、数ヶ月、または数年の期間にわたって毎日投与される。種々の態様では、化合物は、任意の時に個体に投与される。いくつかの態様では、化合物は、同時に、あるいは食事の摂取の前または後に投与される。
【００８５】
本明細書で説明される化合物は、ブラシノステロイド化合物を必要としている被検体にそれを提供するために、人間医学および獣医学の分野で有用であることが理解されるであろう。いくつかの態様では、処置される被検体または個体は、ほ乳類である。特定の態様では、ほ乳類は、ヒトである。獣医学的目的で、被検体は、ほ乳類および非ほ乳類を含む。ある態様では、ほ乳類は、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、およびヤギ等の家畜である。種々の態様では、ほ乳類は、イヌおよびネコ等のペットを含む。他の態様では、被検体は、
ほ乳類および非ほ乳類となり得る、珍しいおよび／または動物園の動物を含む。他の態様では、被検体は、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、およびハムスター等の実験動物を含む。ある態様では、非ほ乳類は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、およびガチョウ等の家禽を含む。
【００８６】
一態様では、化合物は、ヒトに投与するために処方され、したがって、果物ベースの風味等のヒトの興味を引く風味を含有する。菓子のような質および風味で処方される化合物もまた、不快な味および質感により、薬剤または栄養補助食品を服用することにしばしば抵抗がある子供にとって魅力的である。
【００８７】
別の態様では、化合物は、ヒト以外の動物に投与するために処方される。錠剤およびカプセル等の従来の固体投与形態での動物への化合物の投与は、動物がしばしばそれらを吐き出すという点で問題となり得て、動物が投薬手順に抵抗することを習得するため、連続投与はしばしば困難である。この目的で処方された時に、化合物は、種々の態様では、より典型的にはヒト以外の動物の興味を引く風味、例えば、魚および肉の風味を含有する。
【００８８】
本明細書で引用される各出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それが本開示と矛盾しない程度に、その全体で参照することにより組み込まれる。
【００８９】
本明細書で説明される実施例および実施形態は、例証目的によるものにすぎず、それを踏まえた種々の修正または変更が当業者に提案され、本願の精神および範囲ならびに添付の請求項の範囲内に含まれることを理解されたい。本明細書で引用される全ての出版物、特許、および特許出願は、あらゆる目的で、それらの全体で参照することにより本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００９０】
本開示の付加的な態様および詳細が、限定的よりもむしろ例証的となることを目的としている、以下の実施例から明白となるであろう。
【００９１】
実施例１：タンパク質合成へのＨＢの作用
ＨＢがタンパク質合成を誘発するかどうかを判定するために、細胞がいくつかの濃度のＨＢ（０．３〜２０μＭ）で４時間処置され、筋管への放射性標識［３Ｈ］−フェニルアラニンの取り込みが評価された。より低い濃度（１μＭ）で、ＨＢが、対照レベルを上回ってタンパク質合成を１２．４±２．３％増加させた（ｐ＜０．０５）。反応は、それぞれ、３４．９±３．１％および３６．９±２．９％の増加を伴って、１０から２０μＭのＨＢの間で飽和に近づいた（図２Ａ）。６．５ｎＭでのＩＧＦ−１が、この分析で陽性対照としての機能を果たした。ＩＧＦ−１（陽性対照）は、タンパク質合成を４２．５±４．５％増加させた。高濃度のＨＢは、あまり効果的ではなかった。ＨＢは、ＭＴＴ分析および細胞学的観察によって確立されるように、最大２５μＭまで、完全に分化したＬ６ラット骨格筋管への毒性を示さなかった。
【００９２】
タンパク質合成へのＨＢの速度作用を調査するために、筋管を処置するために５０％有効用量として選択された３μＭ  ＨＢを用いて、１〜２４時間研究が実行された。ＨＢに応答したタンパク質合成の時間依存性増加が観察された（図２Ｂ）。ＨＢ刺激タンパク質合成は、３時間でピークに達し、処置の４時間後に減少し始めた。タンパク質合成へのＩＧＦ−１の同様の速度作用が観察されたが、ＩＧＦ−１の作用は、より規模が大きかった。
【００９３】
この研究は、ＨＢが筋管内のタンパク質合成を用量および時間依存的に刺激したことを示す。
【００９４】
実施例２：タンパク質分解への２８ＨＢの作用  
ＨＢがタンパク質分解に影響を及ぼすかどうかを評価するために、［３Ｈ］−フェニルアラニンで標識されたタンパク質の分解が、培地の中への酸可溶性放射能の放出について観察された。０．３〜２０μＭの濃度でのＨＢは、タンパク質分解を用量依存的に阻害し、ＨＢの作用は、３から１０μＭの間の濃度で停滞期に達した（図２Ｃ）。
【００９５】
より低い濃度で、１μＭ  ＨＢが、対照レベルを上回ってタンパク質分解を８．２±０．６％減少させた（ｐ＜０．０５）。より高い濃度で、１０μＭ  ＨＢが、対照レベルを上回ってタンパク質分解を９．５±０．９％減少させた（ｐ＜０．０５）。１０ｎＭでのインスリンが、この分析で陽性対照としての機能を果たし、タンパク質分解を１３．０±１．６％低減した。ＨＢに応答したタンパク質分解の速度を調査するために、３μＭ  ＨＢを用いて、１〜４時間研究が行われた。タンパク質分解の抑制は、時間依存的に発生し、ＨＢおよびインスリンの両方について３時間で停滞期に達した（図２Ｄ）。
【００９６】
ＩＧＦ−１は、インスリンと同様に、タンパク質合成への同化作用および骨格筋内のタンパク質分解への抗異化作用の両方を及ぼす（Ｈａｒｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １１２：８７−９６，  １９８７）。タンパク質合成は、インスリン注入よりもＩＧＦ−１注入に感受性が高く、インスリン受容体によって仲介されない（Ｄｏｕｇｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ８８：６１４−６２２，  １９９１）。それとは反対に、インスリンは、タンパク質分解を阻害することによって、タンパク質の代謝回転に影響を及ぼす（Ｒｏｏｙａｃｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｎｕｔｒ．  １７：４５７−４８５，  １９９７）。
【００９７】
この研究は、ＨＢがＬ６ラット骨格筋細胞内のタンパク質分解を阻害したことを示す。
【００９８】
実施例３：ＨＢがＡＫＴのリン酸化を刺激する
ＩＧＦ−１は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ＧＳＫ−３βおよびＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ依存性機序を通して筋管内のタンパク質分解を阻害することが、以前に示されている（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３７：２２０７−２２１６，  ２００５）。ＡＫＴは、タンパク質合成および分解を調節することが知られている下流標的を変調する、ＩＧＦ−１信号伝達経路内の主要な仲介物であることが実証されている（Ｈａｊｄｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４７：１００６−１０１３，  １９９８）。プラスの正味タンパク質平衡を誘発するように、それを通してＨＢが信号伝達する変換経路を特徴付けるために、Ｌ６筋管内のＡＫＴのリン酸化レベルが調査された。
【００９９】
［３Ｈ］−フェニルアラニン取り込み分析で得られた結果と一致して、ＨＢが、用量および時間依存的にＡＫＴのリン酸化を刺激した（図３）。増加する濃度のＨＢが、処置の１時間後に３μＭ  ＨＢを用いて最大３倍までＡＫＴのＳｅｒ４７３リン酸化を刺激した（図３Ａ）。ＡＫＴ刺激がＨＢの追加後３０分で検出され、リン酸化が最大１時間まで維持された一方で、総ＡＫＴタンパク質レベルは不変であった（図３Ｂ）。ＡＫＴリン酸化へのＨＢの作用は、ＩＧＦ−１について説明されるものほど堅調ではないが（Ｒｏｍｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３：１００９−１０１３，  ２００１）、これらのデータは、Ｌ６筋管内の同化信号伝達のＨＢ刺激におけるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路の役割を支持する。
【０１００】
したがって、この研究は、部分的にＡＫＴリン酸化を誘発することによって、ＨＢがＬ６ラット骨格筋細胞内のタンパク質分解を阻害したことを示す。ＡＫＴ活性化を生じた有効ＨＢ濃度は、タンパク質合成を変調するために必要とされる濃度と同程度であり、ＨＢ
がタンパク質合成の刺激およびタンパク質分解の抑制を伴うことを意味する。
【０１０１】
実施例４：同化作用身体組成へのＨＢの同化作用
動物の身体組成への植物ブラシノステロイドの潜在的な同化作用を評価するために、２０および６０ｍｇ／ｋｇ体重のＨＢ（それぞれ、ＨＢ２０およびＨＢ６０）が、通常食を２４日間与えられた健康なラットに経口で毎日投与された。
【０１０２】
処置の終了時に、ＨＢ２０またはＨＢ６０で処置されたラットの最初の体重に対する全体重増加は、媒介物で処置された対照と比較して、それぞれ１８．３％および２６．８％増加した（図４Ａ）。毎日の食物摂取量合計のわずかであるが統計的に有意な増加（対照については２０．８±０．４ｇ、ＨＢ２０については２２．２±０．８ｇ、ＨＢ６０群については２３．６±０．５ｇ）が、ＨＢ投与と関連付けられたが、体重で調整された時に、食物摂取量は全てのグループの間で異ならなかった（図４Ｂ）。したがって、ＨＢ処置群内の体重増加の増加は、動物の食性の変化に起因し得ない。ＤＥＸＡ分析によって判定された身体組成は、除脂肪体重がＨＢ２０（７．０％）およびＨＢ６０動物（１４．２％）で有意に多かったことを示した。脂肪塊は、それらの対照物と対比して、ＨＢ２０（−３．９％）およびＨＢ６０群（−４．９％）でわずかに少なかった。したがって、ＨＢ処置ラットでのより大きい体重増加は、主に増加した除脂肪体重によるものであった（表１）。
表１．ＨＢで処置されたラットの身体組成および血液生化学
【表２】
2013545809.tif 000009
ラットは、通常（２３．９％タンパク質含量）食または高タンパク質（３９．４％タンパク質含量）食のいずれか一方を与えられ、２０または６０ｍｇ／ｋｇ体重ＨＢを、２４日間毎日強制経口投与された。身体組成がＤＥＸＡによって測定された。結果は平均±ＳＥＭとして表される（一元配置ＡＮＯＶＡおよびダネット事後検定によって適切な対照と比較した時に＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【０１０３】
ＨＢの投与は、それぞれ、ＨＢ２０およびＨＢ６０動物で腓腹筋量を１５．６％および
１９．０％増加させた。全身骨塩量（ＢＭＣ）は、ＨＢ処置動物でわずかに多かったが、差異は有意性に到達しなかった。ＨＢの補給は基礎血漿コレステロールまたはトリグリセリドに影響を及ぼさなかった。ＨＢのより多くの用量は、対照（５．０±０．３ｍＭ）と対比した、わずかに低い血漿グルコースレベル（４．５±０．３ｍＭ）と関連付けられたが、差異は統計的有意性に到達しなかった。インスリンレベルがわずかに上昇させられた（表１）。
【０１０４】
実施例５：高タンパク質食を与えられたラットにおけるＨＢの同化作用
食事タンパク質の短期増加は、おそらく、時間とともに徐々に正常に戻る食事摂取量の最初の減少により、ラットにおいて除脂肪体重に有利に働き、体脂肪を低減できることが示されている（Ｊｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｕｔｒ．  １３１：９１−９８，  ２００１）。高タンパク質食が、除脂肪体重および筋肉量へのＨＢ関連作用をさらに増進させることができるかどうかを調査するために、高タンパク質食（３９．４％タンパク質）を与えられたラットが、経口で２０および６０ｍｇ／ｋｇ体重ＨＢを２４時間毎日投与された。
【０１０５】
高タンパク質食を与えられた対照動物は、通常食を食べた対照動物よりも少ない食物を摂取し、体重増加が少なかった（表１）。体重および食物摂取へのＨＢの促進作用が、通常および高タンパク質食の両方の背景で明白であった。高タンパク質食はおそらく、体重増加への低用量のＨＢ（２０ｍｇ／ｋｇ）の促進作用を増進した（図４Ｃ）。食物摂取量のＨＢ関連増加は、これらの動物で観察されなかった（図４Ｄ）。高タンパク質食に起因し得る、身体組成または血液生化学の付加的な差異がなかった（表１）。
【０１０６】
健康なラットへのＨＢの２４日間経口投与は、媒介物で処置された対照と比較して、体重増加、除脂肪体重、および腓腹筋量を選択的に増加させた（図４および表１）。ＨＢ処置動物の高タンパク質食の補給は、低用量のＨＢの作用を増進した（表１）。予想通りに（Ｊｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．、上記、２００１）、高タンパク質食を与えられた対照動物（図４ＣおよびＤ）は、通常食を与えられた対照動物（図４ＡおよびＢ）と比較して、増加した体重増加、食物摂取量、および他の身体組成パラメータを示した。それらの血漿トリグリセリドも減少させられた（表１）。ＨＢを用いた処置は、高用量のＨＢを受容するコホート内でわずかに低かった空腹時グルコースを除いて、通常食または高タンパク質食のいずれか一方を与えられた動物において血液生化学を改変しない。
【０１０７】
実施例６：ＨＢがアンドロゲン受容体を結合しない
ＨＢがアンドロゲンと同様の同化作用を生じたため、ＨＢがアンドロゲン受容体を活性化する可能性を除外するように研究が実行された。ＨＢを、同化剤として治療的に使用されるアンドロゲン類似体である、メタンドロステノロンと比較するために、ラット核アンドロゲン受容体からの標識［３Ｈ］−ミボレロンの変位を測定する結合分析が使用された（Ｆｅｌｄｋｏｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ９４：４８１−４８７，  ２００５）。
【０１０８】
メタンドロステノロンは、２４ｎＭのＩＣ５０でアンドロゲン受容体への特異的結合、および内因性リガンドであるテストステロンと同様の結合曲線を生じた。しかしながら、ＨＢは、０．０１μＭから最大１０μＭの濃度からでは有意な結合を示さなかった（図５Ａ）。この研究は、血漿中テストステロンレベルがＨＢ処置に応答して異ならなかったため、身体組成および骨へのＨＢの生体内作用が内因性テストステロン作用に起因し得ないことを示した（図５Ｂ）。
【０１０９】
実施例７：ＯＲＸラットにおけるＨＢの選択的作用
同化作用がある全てのステロイドは、テストステロンの誘導体であり、男性生殖器系の
成長および機能を刺激するため、アンドロゲン性であるとともに同化作用がある。個々の薬剤は、同化／アンドロゲン活性の平衡が異なるが、現在入手可能な薬剤のうちのいずれも純粋には同化作用がない（Ｋｕｈｎ，  Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐｒｏｇ．  Ｈｏｒｍ．  Ｒｅｓ．  ５７：４１１−４３４，  ２００２）。したがって、アンドロゲン欠乏後にアンドロゲン依存性組織を回復させる、注入されたプロピオン酸テストステロン（陽性対照）と対比したＨＢの能力が、外科的に去勢された思春期前後のラットモデルで調査された（Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｓｏｃ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ．
Ｍｅｄ．  ８３：１７５−１８０，  １９５３）。
【０１１０】
適切な用量範囲での経口および皮下処置が、精巣摘出術（ＯＲＸ）後２週間で開始され、１０日間継続された。予想通り、アンドロゲン欠乏が、前立腺、精嚢、球海綿体筋／肛門挙筋複合体、陰茎亀頭、およびカウパー腺のサイズの有意な縮小を引き起こし、これらの臓器はそれぞれ、擬似手術を受けた動物で観察されたものの８．６％、６．５％、２３．９％、５４．６％、および４０．５％まで縮小した。０．４ｍｇ／ｋｇでのプロピオン酸テストステロンの注射が、アンドロゲン感受性臓器の重量を３倍から８倍に増加させたが、テストステロン注射は、擬似対照と比較して、腹側立腺、精嚢、および球海綿体筋／肛門挙筋複合体を元のサイズに回復させることができなかった。１０日間の処置後、２０および６０ｍｇ／ｋｇでのＨＢの経口投与は、ＯＲＸと関連付けられるアンドロゲン感受性組織の減量を防止できなかったが、陰茎亀頭のわずかであるが有意な用量依存性増加が、ＨＢ処置と関連付けられた（対照動物について４５．７±１．５ｍｇと対比して、Ｈ２０について５５．３±１．７ｍｇおよびＨ６０について５９．６±１．６ｍｇ）。対照的に、ＨＢは球海綿体筋／肛門挙筋複合体の重量（同化活性の骨格筋バイオマーカー）を増加させたが、変化は統計的に有意ではなかった。ＨＢが、ハーシュバーガー分析での陽性対照（０．４ｍｇ／ｋｇでのプロピオン酸テストステロン）に対して１倍および１０倍用量で皮下注射された時に、アンドロゲン感受性組織重量は、有意な増加が４ｍｇ／ｋｇＨＢで観察された陰茎亀頭および球海綿体筋／肛門挙筋複合体を除いて、ＯＲＸ対照の重量と異ならなかった（表２）。
表２．ＨＢで処置された擬似およびＯＲＸラットからのアンドロゲン感受性組織の重量
【表３】
2013545809.tif 000010
ラットは、通常食（２３．９％タンパク質含量）を与えられ、２０または６０ｍｇ／ｋｇ体重ＨＢを１０日間毎日強制経口投与された、または０．４および４ｍｇ／ｋｇ体重ＨＢを皮下注射された。結果は平均±ＳＥＭとして表される（一元配置ＡＮＯＶＡおよびダネット事後検定によってＯＲＸと比較した時に＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）１。プロピオン酸テストステロン（ＴＰ）が、０．４ｍｇ／ｋｇで皮下注射として投与され、陽性対照としての機能を果たした。
【０１１１】
擬似動物では、２０または６０ｍｇ／ｋｇＨＢの経口投与が血漿中テストステロンレベルを改変しなかった。予想通り、精巣摘出術により、事実上検出不可能なレベルのテストステロンを有する、ＯＲＸ動物へのＨＢの経口または皮下投与後に、血漿中テストステロンが検出されなかった一方で、プロピオン酸テストステロンの０．４ｍｇ／ｋｇ注射は、ＯＲＸラットにおける血漿中テストステロンレベルを元のレベルの２０．５％まで部分的に回復させた（図５Ｂ）。
【０１１２】
ＨＢは、ハーシュバーガー分析で試験された時に非常に低いアンドロゲン活性を示した（表２）。ＨＢは、アンドロゲンと同様の同化作用を動物で生じたが、同化作用は、薬学的異なると考えられた。ＨＢ投与（経口または皮下）は、同化ステロイドの強力なアンドロゲン作用とは際立って対照的に、最小限のアンドロゲン副作用しか生じなかった。ＨＢがアンドロゲン受容体への低い結合を有し、または有意な結合を持たず、血漿中テストステロンレベルを変調しなかった（図５Ａ）という付加的な観察は、ＨＢが、アンドロゲン依存性機序を通して、その同化作用を及ぼし得ることを示す。たとえＨＢおよびアンドロゲンの両方が同じステロイド骨格を含有しても、Ｃ６／Ｃ７におけるラクトン機能、Ｃ２およびＣ３における２つのヒドロキシル基、ならびにＣ２４におけるメチル置換基を含む、２つの部類の化合物を区別する、主要な構造差がある。理論に縛られることを希望することなく、これらの化学的差異は、ＨＢが核内アンドロゲン受容体を活性化することを制限し、薬理反応の差異を説明してもよい。
【０１１３】
実施例８：ＯＲＸラットにおける身体能力および筋線維分布
ＨＢがどのようにして身体能力および筋肉の構造変化に影響を及ぼしたかを判定するために、動物は、前および後肢の握力について、ならびに筋肉量および機能の基礎的改変によって検出することができる筋肉の構造変化について試験された。
【０１１４】
下肢の握力の変化が、１日につき６０ｍｇ／ｋｇＨＢの経口投与を１０日間受容したＯＲＸ動物において、有意に大きかった（対照の−０．０１４３±０．０３９２ｋｇと対比して０．０８５１±０．０１９７ｋｇ）。前肢の握力の変化も、ＨＢ処置動物でより大きかった（図６Ａ）が、有意性に達しなかった（対照の０．１６３１±０．０４０５ｋｇと対比して０．２７１１±０．０６６０ｋｇ）。
【０１１５】
予想通り、アンドロゲン欠乏が、擬似手術を受けた動物で観察されたものの８５．８％までの腓腹筋量の有意な減少を引き起こした（図６Ｂ）。ＯＲＸラットへのＨＢの経口投与は、それぞれ、ＨＢ２０およびＨＢ６０動物で腓腹筋量を１３．８％および１０．３％増加させ、したがって、筋肉を元のサイズにほぼ回復させた。同時に、陽性対照の１倍および１０倍の用量でのＨＢの皮下投与は、それぞれ、腓腹筋量を２．８％および９．１％増加させた。
【０１１６】
構造変化を判定するために、筋肉量および機能の基礎的改変、線維分布の変化（図６Ｃ）、および断面積（図６Ｄ）が分析された。去勢マウスにおけるＨＢ処置は、腓腹筋線維萎縮を防止し、去勢対照のレベルを上回って、Ｉ型およびＩＩａ型線維の平均線維面積を増加させた（Ｐ＜０．００１）。対照動物と比較して、線維型分布は、ＨＢ処置動物（１０日間にわたって１日につき２０または６０ｍｇ／ｋｇ）で有意な影響を受けた。ＩＩａ
型およびＩＩｂ型線維の総数が、ＨＢ用量から独立して約６０％増加した一方で、Ｉ型線維の数の有意な増加は、高用量のＨＢのみで観察された。
【０１１７】
ＨＢは、訓練されていないＯＲＸラットの向上した身体の健康を示した（図６）。しかしながら、訓練されていないラットの前および後肢の身体の健康へのＨＢの差動作用は（図６）、豊富なアンドロゲン受容体がオスでは典型的には低い、後肢領域で、より強い薬理反応が観察されたことを示すと考えられる。去勢動物へのＨＢの１０日間経口投与は、増加した身体能力および耐久力のために重要である、筋原線維の総数ならびに酸化的Ｉ型およびＩＩａ型筋線維の断面積の大幅な増加につながった。したがって、ＨＢの経口投与は、最小限のアンドロゲン副作用を伴って、または全く伴わずに、強い同化反応をトリガした。
【０１１８】
実施例９：タンパク質合成への官能基の位置または立体化学の作用
同化活性へのＨＢ官能基の官能基位置または立体化学間の構造・活性関係を調査するために、一連のＨＢ類似体［（２２Ｓ，２３Ｓ）−ホモカスタステロン、（２２Ｓ，２３Ｓ）−３α−フルオロ−ホモブラシノリド、（２２Ｓ，２３Ｓ）−３α−フルオロ−ホモカスタステロン、（２２Ｓ，２３Ｓ）−６−アザ−ホモブラシノリド、および（２２Ｓ，２３Ｓ）−７−アザ−ホモブラシノリド（表３の化合物ＩＤ２−６）］が合成され、Ｌ６ラット骨格筋細胞内のタンパク質合成を刺激する、またはタンパク質分解を阻害する能力（実施例１０参照）について、他の合成および自然発生ブラシノステロイド［（２２Ｒ，２３Ｒ）−ホモブラシノリド、（２２Ｓ，２３Ｓ）−エピブラシノリド、および（２２Ｒ，２３Ｒ）−エピブラシノリド（表３の化合物ＩＤ７−９）］と比較された。
【０１１９】
（２２Ｓ，２３Ｓ）−ホモカスタステロン（表３の化合物ＩＤ２）が、ブラシノステロイドの同化活性へのＣ−６ラクトンの影響を評価するように合成された。Ｃ−２における機能的ヒドロキシ官能基が欠けており、Ｃ−３においてフッ素化される化合物を合成することによって［（２２Ｓ，２３Ｓ）−３α−フルオロ−ホモブラシノリドおよび（２２Ｓ，２３Ｓ）−３α−フルオロ−ホモカスタステロン（表３の化合物ＩＤ３および４）］、筋細胞内のタンパク質蓄積を推進するブラシノステロイドの能力における（２α，３α）−隣接ジオール部分の要求が試験された。（２２Ｓ，２３Ｓ）−６−アザ−ホモブラシノリドおよび（２２Ｓ，２３Ｓ）−７−アザ−ホモブラシノリド（表３の化合物ＩＤ５および６）が、ブラシノステロイド分子のＢ環に−アザおよび７−アザ置換基を含有するように合成され、生物活性のための６−ケト基の要求の評価を可能にした。
【０１２０】
（２２Ｒ，２３Ｒ）−隣接ジオール部分の立体化学が異なる（表３の化合物ＩＤ７）、または５α−エルゴスタン構造の側鎖内のＣ−２４にメチル基を持つ（表３の化合物ＩＤ８および９）、他の自然発生ブラシノステロイドへのＨＢの同化活性も比較された。ＨＢおよびその類似体の構造が図７に示される。
表３．Ｌ６ラット骨格筋細胞内のタンパク質蓄積へのＨＢ（１）およびその類似体（２−９）の作用
【表４】
2013545809.tif 000011
【表５】
2013545809.tif 000012
化合物は１０μＭで試験され、結果は３通りで行われた判定の平均±ＳＥＭとして表される（一元配置ＡＮＯＶＡおよびダネット事後検定によって対照と比較した時に＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）
【０１２１】
ＨＢおよびその類似体の生物活性が、生体外でＬ６ラット骨格筋細胞内のタンパク質合成の増加を測定することによって評価された。細胞が、［３Ｈ］−フェニルアラニンで４時間培養され、媒介物（０．１％エタノール）または試験化合物（１０μＭ）で３通りに処置され、タンパク質合成が、総タンパク量によって正規化されたタンパク質への［３Ｈ］−フェニルアラニンの取り込みとして測定された（表３）。これらの条件下で、ＨＢおよび（２２Ｓ，２３Ｓ）−ホモカスタステロンの両方が、それぞれ、タンパク質合成を３７．２±５．９％（ｐ＜０．００１）および４１．０±２．７％（ｐ＜０．００１）増加させた。このタンパク質合成は、この分析で陽性対照としての機能を果たした、６．５ｎＭでのＩＧＦ−１の生物活性（４２．５±４．５％、ｐ＜０．００１）と有利に比較して増加した。Ａ環内のＣ−３における２α−ヒドロキシル基およびフッ素化の除去（表３の化合物ＩＤ３−４）は、陽性対照と比較して、生物活性の約５０％減少につながった（それぞれ、２４．６±５．３％、ｐ＜０．０１および２２．５±２．７％、ｐ＜０．０１）。しかしながら、依然としてタンパク質合成の増加があった。７−オキサラクトン基のＢ環内のアミンとの置換（表３の化合物ＩＤ６）が、生物学的活性を半分に低減した一方で、６−カルボニル基のアミンとの同様の置換（表３の化合物ＩＤ５）は、タンパク質合成の活性の完全損失をもたらした。側鎖内の修飾（表３の化合物ＩＤ７−９）が、活性を無効にした。
【０１２２】
タンパク質合成への最も活性なブラシノステロイドの用量依存性作用を調査するために、表３からの０．３〜３０μＭの化合物１−２を用いて研究が実行された。両方の反応が、それぞれ、３６．９±２．９％および４０．７±４．９％（ｐ＜０．０１）のタンパク質合成または発現の最大増加とともに、１０から２０μＭの間で飽和に近づいた（図８Ａ）。
【０１２３】
ＨＢに関係する一連のブラシノステロイド類似体（表３の化合物ＩＤ２−６）が合成され（図７）、これらの化合物の構造・活性関係が、Ｌ６ラット骨格筋細胞においてタンパク質合成および分解分析を実行することによって探索された。結果は、（２２Ｓ，２３Ｓ）−ホモカスタステロンが、ＨＢと同様に、筋細胞内でタンパク質蓄積を有意に増加させ
ることができると示した（図８）。これらの化合物間の唯一の差異が、ＨＢのＢ環内の付加的な７−オキサラクトン基であるため、これらの結果は、７−オキサラクトン部分がブラシノステロイドの同化部分に必要ではないことを示す。それとは反対に、ラクトンから植物中の６−ケトンに移行すると、ブラシノリド活性がブラシノリドとカスタステロンとの間で５０％減少することが観察された（Ｔａｋａｔｓｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｐｅｒｋｉｎ．  Ｔｒａｎｓ．  １：４３９−４４７，  １９８４）。この部分の６−アザ−７−オキサラクトン（化合物ＩＤ５、表３）または６−オキソ−７−アザ（化合物ＩＤ６、表３）基のいずれか一方への変換が、タンパク質合成を刺激する能力を劇的に低減した（表３）。これらの結果は、６−アザ−７−オキソ−ホモブラシノリドが不活性であった（Ａｎａｓｔａｓｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇａｚｚｅｔａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ｉｔａｌｉａｎａ  １１４：１５９−１６１，  １９８４）一方で、７−アザ−ホモブラシノリドで劇的に低減された植物ブラシノリド活性を示した（Ｔａｋａｔｓｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ．  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ３５：２１１−２１６，  １９８７）、以前の研究と同様である。
【０１２４】
ブラシノステロイドの同化活性へのＡ環置換基の作用は、あまり劇的ではなかった。α−フルオロ基による２つの２α，３α−隣接ヒドロキシル基の置換は、生物活性を減少させたが、無効にはしなかった。
【０１２５】
また、データは、Ｃ−２４における側鎖（メチル対エチル）が、ほ乳類系における生物活性のために非常に重要であることを示した。エピブラシノリド（表３の化合物ＩＤ８および９）は、ホモブラシノリド（表３の化合物１および７）と比較して、骨格筋細胞内で非常時低い同化活性を保有することが分かった。
【０１２６】
実施例１０：タンパク質分解への官能基の位置および立体化学の作用
（表３に示されるような）ＨＢおよびその類似体の生物活性もまた、生体外でＬ６ラット骨格筋細胞内のタンパク質分解の減少を測定することによって評価された。細胞が、［３Ｈ］−フェニルアラニンで一晩標識され、後に媒介物（０．１％エタノール）または試験化合物（１０μＭ）で３通りに４時間処置され、タンパク質分解が、総タンパク量によって正規化された培地への酸可溶性［３Ｈ］−フェニルアラニンの放出として評価された（表３）。ＨＢ、（２２Ｓ，２３Ｓ）−ホモカスタステロン、（２２Ｓ，２３Ｓ）−３α−フルオロ−ホモブラシノリド、（２２Ｓ，２３Ｓ）−３α−フルオロ−ホモカスタステロン、（２２Ｓ，２３Ｓ）−６−アザ−ホモブラシノリド、および（２２Ｒ，２３Ｒ）−ホモブラシノリドが、生体外でタンパク質分解を低減したが、それらの活性の効力は、それらの構造によって異なった。化合物ＩＤ１−３は、この分析で陽性対照としての機能を果たした１０ｎＭインスリン処置と有利に比較して、２０％以上のタンパク質分解の最も強い防止を示した（２０．２±１．６％、ｐ＜０．０５）。分解の防止は、（化合物１および７を化合物８および９と比較して）側鎖内のＣ−２４位置におけるエチル基の存在に依存し、（化合物１および７を比較して）（２２Ｒ，２３Ｒ）−隣接ジオール部分の立体化学に部分的に依存した。興味深いことに、７−オキサラクトン基の（２２Ｓ，２３Ｓ）−７−アザ−ホモブラシノリドのＢ環内のアミンとの置換が、タンパク質分解へのその作用を完全に無効にした一方で、６−カルボニル基の（２２Ｓ，２３Ｓ）−６−アザ−ホモブラシノリド内のアミンとの同様の置換は、その生物学的活性に軽微な作用しか及ぼさなかった。
【０１２７】
この分析での最も活性な化合物の中でも、０．３〜２０μＭの濃度でのＨＢが、タンパク質分解を用量依存的に阻害し、ＨＢ活性は３から１０μＭの間で停滞期に達した（図８Ｂ）。より低い濃度で、１μＭ  ＨＢが、対照レベルを上回ってタンパク質分解を８．２±０．６％減少させた（ｐ＜０．０５）。０．３〜３０μＭの濃度での化合物２が、タンパク質分解を用量依存的に阻害し、化合物２の活性は１０μＭで停滞期に達した。より低
い濃度で、１μＭでの化合物２が、対照レベルを上回ってタンパク質分解を８．７±１．７％抑制した（ｐ＜０．０５）。
【０１２８】
これらの研究は、６−ケト基および２２α，２３α−ヒドロキシルが、ラット骨格筋細胞内のブラシノステロイドの同化活性のために重要であるという証拠を提供する。そのような情報は、高い同化選択性を保有する新規の治療用分子の設計に有用である。加えて、分析された分子の中でも、（２２Ｓ，２３Ｓ）−ホモブラシノリドおよび（２２Ｓ，２３Ｓ）−ホモカスタステロンは、最大の同化活性を保有することが確認された。
【０１２９】
実施例１１：Ｌ６筋細胞および３Ｔ３線維芽細胞内の細胞毒性
全てのブラシノステロイドおよびそれらの類似体は、ＭＴＴ分析および細胞学的観察によって確立されるように、最大３０μＭの濃度まで、生体外で細胞に投与された時に完全に分化したＬ６ラット骨格筋管への毒性を示さなかった。したがって、全ての化合物が、３Ｔ３／ＮＩＨマウス線維芽細胞培養を使用して、基礎細胞毒性について標準試験で試験された。（２２Ｓ，２３Ｓ）−６−アザ−ホモブラシノリドが、１２．５μＭの半最大阻害濃度（ＩＣ５０）で用量依存的に細胞増殖を阻害した、唯一のブラシノステロイド類似体であった。Ａ環内のＣ−３におけるフッ素化（（２２Ｓ，２３Ｓ）−３α−フルオロ−ホモブラシノリドおよび（２２Ｓ，２３Ｓ）−３α−フルオロ−ホモカスタステロン）は、元のブラシノステロイド（（２２Ｓ，２３Ｓ）−ホモブラシノリドおよび（２２Ｓ，２３Ｓ）−ホモカスタステロン）と比較して、増加した細胞毒性につながった（図９）。
【０１３０】
実施例１２：ＡＫＴリン酸化
ＡＫＴは、タンパク質合成および分解を調節することが知られている細胞内標的を変調するため、ＡＫＴリン酸化へのブラシノステロイドの作用を判定するように実験が実行された。［３Ｈ］−フェニルアラニン取り込み分析で得られた結果と一致して、生物活性ブラシノステロイドが、ラット骨格筋細胞培養の中でＡＫＴのリン酸化を刺激した（図８）。
【０１３１】
ＨＢおよび（２２Ｓ，２３Ｓ）−ホモカスタステロン処置は、１時間後にＡＫＴの有意な活性をもたらし、１０分以内にＡＫＴをリン酸化する、ＩＧＦ−１によって生じた反応よりもはるかに遅い反応であった。同様の遅延したＡＫＴ反応が、エクジステロイドについて以前に報告されている（Ｇｏｒｅｌｉｃｋ−Ｆｅｌｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．
Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．  ５６：３５３２−３５３７，  ２００８）。
【０１３２】
実施例１３：生体内のＨＢの薬理ゲノム学的作用
本明細書の上記で立案されるように、ＨＢ処置（通常食を２４日間与えられた健康なラットに毎日６０ｍｇ／ｋｇ体重）は、訓練されていないラットにおける除脂肪体重の１４．２％増加および向上した身体の健康と関連付けられた。どのようにしてＨＢがこのような作用を引き起こしていたかを判定するために、ＨＢの経口投与（２４日間の６０ｍｇ／ｋｇ）後の遺伝子発現の変化を調べることによって、ＨＢの薬理ゲノム学的性質が、健康なラットにおいて研究された。
【０１３３】
凍結骨格筋（媒介物（Ｃｔｒ）およびＨＢ処置動物の腓腹筋生検）から得られたプールＲＮＡサンプルが、ＨＢへのｍＲＮＡ反応を測定するために、ラットインスリン信号伝達ＰＣＲアレイで使用された。インスリン信号伝達、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）およびマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路、炭水化物代謝、および細胞周期調節に関与する８４個の遺伝子のうち、遺伝子の２つの小集団が、Ｃｔｒ群よりもＨＢ処置群で多く発現された。しかしながら、差異の規模は異なった（図１１Ａ）。
【０１３４】
上方調節された遺伝子の第１の小集団は、アルファ−１Ｄアドレナリン受容体（ＡＤＲＡ１Ｄ）（６．５倍）、インスリン様成長因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ１）（２．５倍）、およびステロール調節要素結合タンパク質１（ＳＲＥＢＰ−１）（２．５倍）といった、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ信号伝達経路を通して上方調節された一式の標的遺伝子を含んだ。第２の小集団は、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ２（ＦＢＰ２）（４．５倍）およびＩＧＦ−２（１．４倍）といった、筋細胞成長および炭水化物代謝を調節する、上方調節された遺伝子を含有した。
【０１３５】
アルファ−１Ｄアドレナリン受容体は、Ｇタンパク質への結合を伴い、その後にホスホリパーゼＣβおよびタンパク質キナーゼＣの活性化が続く、カテコールアミンの内因性機能を仲介する（Ｓｔｒｏｓｂｅｒｇ，  Ｏｂｅｓ．  Ｒｅｓ．  ３  Ｓｕｐｐｌ  ４：５０１Ｓ−５０５Ｓ，  １９９５）。ＩＧＦ−２およびＩＧＦＢＰ１のメッセンジャーＲＮＡレベルもまた、ＨＢが投与されたラットの骨格筋内で上方調節された。骨格筋分化中のインスリン様成長因子２（ＩＧＦ−２）発現は、転写レベルで調節され（Ｋｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ７：２９１−３０２，  １９９３）、局所的に産生されたＩＧＦ−２によるインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）受容体を通した信号伝達は、正常な筋肉成長および再生に重要である経路を定義する。
【０１３６】
これらの結果は、ＣｔｒおよびＨＢ処置動物からの個々の筋肉サンプルでＲＴ−ＰＣＲを使用することによって、ＩＧＦ−２遺伝子発現についてさらに検証された（図１１Ｂ）。真核翻訳開始因子２Ｂ１（ＥＩＦ２Ｂ１）の発現の変化は見られなかった。
【０１３７】
たとえＡＫＴの誘発性活性化が、衛星細胞の活性化を伴わずに、骨格筋量および力を増加させるのに十分であっても（Ｂｌａａｕｗ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２３：３８９６−３９０５，  ２００９）、筋肉成長および分化を変調する、種々の筋原性転写因子の発現へのＨＢ処置の作用も評価された。ＨＢ処置は、筋肉分化１（ＭＹＯＤ１）（２．１倍）、筋原性因子５（ＭＹＦ５）（１．３倍）、筋原性因子６（ＭＹＦ６）（１．３倍）、およびミオゲニン（筋原性因子４またはＭＹＯＧとしても知られている）（１．７倍）の上方調節を誘発した（図１１Ｃ）。ＭＹＯＤ１は、ＨＢ処置後の２倍以上の上方調節と関連付けられた唯一の転写因子であった（図１１Ｃ）。ＭＹＯＤ１は、筋肉特異的遺伝子を活性化することによって細胞分化を誘発し、細胞増殖から分化への切替において重要である（Ｓｏｌｏｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １９１：３４９−３６０，  ２００６）。
【０１３８】
結果は、ＨＢが筋細胞成長および炭水化物代謝に関与する２組の遺伝子を強く刺激したことを示す。上方調節される遺伝子の中でも、ＡＤＲＡ１Ｄは、最も顕著な６．５倍誘発を示した（図１１Ａ）。α１アドレナリン受容体は、Ｇタンパク質への結合を伴い、その後にホスホリパーゼＣβおよびタンパク質キナーゼＣの活性化が続く、カテコールアミンの内因性機能を仲介する。
【０１３９】
理論に縛られることを希望することなく、ＡＤＲＡ１Ｄは、筋肉生存および分化を調節してもよい（Ｓａｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２５：２５３−２６２，  ２０１０）。ＩＧＦ−２およびＩＧＦＢＰ１のメッセンジャーＲＮＡレベルまた、ＨＢが投与されたラットの骨格筋内で上方調節された。骨格筋分化中のＩＧＦ−２発現は、転写レベルで調節され（Ｋｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ７：２９１−３０２，  １９９３）、局所的に産生されたＩＧＦ−２によるインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）受容体を通した信号伝達は、正常な筋肉成長および再生に重要である経路を定義する。
【０１４０】
実施例１４：ブラシノステロイド処置が創傷閉塞時間を短縮した
動物の皮膚への植物ブラシノステロイドの潜在的な同化作用を評価するために、生体外擦過創傷閉塞実験が実行された。
【０１４１】
３Ｔ３スイスアルビノマウス線維芽細胞がＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ）から入手された。細胞株が、３〜４日ごとに継代培養され、３７℃および５％ＣＯ２にて１０％ＦＢＳおよび０．１％ペニシリン・ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭの中で維持された。細胞は、細胞増殖および擦過創傷閉塞分析のために２４ウェル皿の中で、ならびに細胞生存および酸化窒素産生研究のために９６ウェル皿の中で副次培養された。
【０１４２】
３Ｔ３線維芽細胞が、３×１０５細胞／ｍｌの濃度で２４ウェル皿の中へ播種され、ほぼ密集した細胞単層まで培養された。実験の日に、線形創傷が、滅菌１００μｌプラスチックピペット先端を用いて単層に生成され、滅菌ＰＢＳで細胞を１回洗浄することによって、細胞残骸が除去された。媒介物（０．１％エタノール）、陽性対照（０．５％ＦＢＳ）、あるいは種々の濃度の化合物の分画、副分画、または純粋化合物を含有する、新鮮ＤＭＥＭ培地が、１用量につき一式の３つのウェルに追加され、５％ＣＯ２で３７℃にて１２時間培養された。次いで、細胞が、ＰＢＳ中の２０μｌの１０％メチレンブルーを用いて５分間可視化された。各ウェルからの擦過領域の３つの代表的な画像が、擦過創傷閉塞を推定するように０および１２時間で写真撮影された。画像は、ＩｍａｇｅＪプログラム（ＮＩＨ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ）を使用して分析され、創傷閉塞率が、媒介物対照に対して計算され、対照と比べた創傷閉塞率として報告された（表４）。
【０１４３】
ＨＢおよびその類似体を用いた処置は、生体外で創傷閉塞を向上させた。表４を参照されたい。
表４．３Ｔ３細胞での擦過創傷閉塞へのＨＢ（１）およびその類似体（２−９）の作用
【表６】
2013545809.tif 000013
【表７】
2013545809.tif 000014
化合物は１０μＭで試験され、結果は３通りで行われた判定の平均±ＳＥＭとして表される（一元配置ＡＮＯＶＡおよびダネット事後検定によって対照と比較した時に＊Ｐ＜０．０５）
【０１４４】
１２匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊオスマウス（２０±４ｇ；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  ＭＡ）が、１２時間明暗サイクルとともに一定の室温で維持された室内で、個々のチャンバの中に収容された。動物は、食物および水に自由にアクセスできた。動物は、７日間新しい条件に適応させられた。動物は、物理的操作のストレスを低減するように毎日取り扱われた。動物は、投薬の１日前に体重によってグループに無作為化された。
【０１４５】
揮発性麻酔（効果を生じるために５％イソフルラン）下で、各動物の肩および背部が剃毛された。皮筋および付着組織を含む皮膚を除去するように、それらの腰椎上に鋭い穴開け器（内径６ｍｍ）が適用された。試験物質が、皮膚損傷の直後に連続１０日間毎日１回、局所的に（ＴＯＰ）投与された。使用された物質は、（１）ホモブラシノリド（１０μｇ／マウス）、（２）陽性対照（ＣＧＳ−２１６８０、特異的アデノシンＡ２Ａ亜型受容体作用薬、１０μｇ／マウス）、または（３）媒介物（１．５％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ））であった。
【０１４６】
創傷治癒の速度を調査するために、創傷サイズが、処置後１、３、５、７、および９日に測定された。創傷は、透明なプラスチックシート上に透写され、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）よりオンライン上にある、ＩｍａｇｅＪプロブラム（ｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を使用することによって測定された。ＩｍａｇｅＪは、ＮＩＨで開発された、一般公開されているＪａｖａベースの画像処理プログラムである。処置を受けた創傷の面積を、対照処置を受けた創傷の面積と比較することによって、創傷閉塞までの時間が推定された。創傷の閉塞率（％）が計算され、創傷半閉塞時間（皮膚創傷の５０％が塞がれる時間、ＣＴ５０）が、Ｇｒａｐｈ−Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＵＳＡ）を使用した線形回帰によって分析された。実験の終了時に（創傷の誘発後１０日）、ＣＯ２ガス吸入によって動物が安楽死させられた。血液が、心臓穿刺によって収集された。創傷組織および筋肉が、免疫組織化学分析および創傷治癒因子分析のために収集された。ＨＢは、創傷閉塞のマウスモデルにおいて、生体内の創傷閉塞の割合を増加させた（図１３）。したがって、ＢＲ処置は、創傷治癒に必要な時間を縮め、すなわち、短縮し、したがって、創傷の処置において皮膚に有益な作用を及ぼした。
【０１４７】
実施例１５：ブラシノステロイドが皮膚細胞内のエラスチン産生を増加させた
動物の皮膚への植物ブラシノステロイドの潜在的な同化作用を評価するために、ヒト皮
膚線維芽細胞内のエラスチン遺伝子発現が、ホモカスタステロンを用いた処置に応答して測定された。
【０１４８】
ヒト新生児皮膚線維芽細胞（ＨＮＤＦ）が、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳの中で維持され、５％ＣＯ２を伴う加湿３７℃インキュベータの中で保持された。細胞が、２４ウェルプレートの中に１つのウェルにつき１×１０４個の細胞の密度で置かれ、２４時間、または１００％密集度に達するまで培養された。後に、培地が除去され、着脱細胞または細胞残骸を除去するように、細胞が５００μＬ  ＰＢＳで２回洗浄された。次いで、ＨＮＤＦが、以下の通りに１６時間処置された：ＤＭＥＭのみ、レチノイン酸５μＭ、レチノイン酸１０μＭ、ホモカスタステロン５μＭ、およびホモカスタステロン１０μＭ。
【０１４９】
製造業者の指示に従ってＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＲＮＡがＨＮＤＦから抽出された。ＮａｎｏＤｒｏｐ  ｓｙｓｔｅｍ（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  ＤＥ）を使用して、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光測定によって、ＲＮＡが分光光度法で定量化された。ＲＮＡの質が、ゲル電気泳動での分離によって評価された。微量のＤＮＡ汚染を除去するために、次いで、ＲＮＡが、製造業者のガイドラインに従ってＤｎａｓｅ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処置された。製造業者のプロトコルに従ってＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が、各サンプルに３．０μｇのＲＮＡを使用して合成された。
【０１５０】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）増幅が、１２．５μｌ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲマスタ混合（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、５μｌの１：２５希釈ｃＤＮＡ、０．５μｌの６μＭ遺伝子特異的プライマー（ＩＤＴ，  Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，  ＩＡ）、および７μｌＰＣＲ−等級純水を含有する、２５μｌの全容量内で、ＡＢＩ  ７３００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ上で３通りに実行された。プライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，  ＩＡ，  ＵＳＡ）によって、以下の通りに合成された：β−アクチン、順方向プライマー５’−ＡＣＧ  ＴＴＧ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＡＧＧ  ＣＴＧ  ＴＧＣ  ＴＡＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、逆方向プライマー５’−ＣＴＣ  ＧＧＴ  ＧＡＧ  ＧＡＴ  ＣＴＴ  ＣＡＴ  ＧＡＧ
ＧＴＡ  ＧＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、エラスチン、逆方向プライマー５’−ＡＡＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＣＡＡ  ＡＧＴ  ＴＣＧ  ＧＴ  −３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、および逆方向プライマー５’−ＡＣＴ  ＡＡＧ  ＣＣＴ  ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＣＣＡ  ＴＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）。ｑＰＣＲ増幅が、５０℃で２分間の１サイクル、９５℃で１０分間の１サイクル、その後に続いて９５℃で１５秒および６０℃で１分の４０サイクルを使用して、７３００  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａ＆Ｂ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で行われた。解離曲線が、９５℃で１５秒、６０℃で１分、および９５℃で１５秒の１サイクルで完成された。ＲＴなし（ＮＲＴ）およびテンプレート対照なし（ＮＴＣ）は、品質管理ステップとして各実験に含まれなかった。標的ｍＲＮＡ発現が、ΔΔＣｔ方法を使用して分析され、β−アクチンハウスキーピング遺伝子の発現に対して正規化された。ＤＭＥＭのみで処置された細胞（陰性対照）が、この研究で較正サンプルとしての機能を果たし、１．０という値が、較正サンプルの標的遺伝子発現に割り当てられた。全てのサンプルは３通りに実行された。０．００１というｐ値が有意であると見なされた。
表５．ホモカスタステロンがヒト皮膚線維芽細胞内のエラスチン遺伝子発現を増加させる
【表８】
2013545809.tif 000015
＊＊ｐ＜０．００１、一元配置ＡＮＯＶＡ、ボンフェローニ多重比較検定、ｎ＝３
【０１５１】
ホモカスタステロンは、ＨＮＤＦ内のエラスチンのｍＲＮＡレベルを有意に増加させた。実際、エラスチンｍＲＮＡレベルを増加させるホモカスタステロンの作用は、レチノイン酸（陽性対照）の作用に匹敵し、処置されていない細胞よりも最大３．２３±０．４倍高かった（表５）。したがって、ホモカスタステロンは、皮膚内のエラスチン産生にプラスの作用を及ぼす。この実験は、ＢＲが、ホモカスタステロンのように、皮膚の処置における実用性を実証し、局所的な老化防止スキンケア製品として有用であることを示す。
【０１５２】
実施例１６：皮膚へのＨＢの同化作用
動物の皮膚への植物ブラシノステロイドの潜在的な同化作用を評価するために、２０および６０ｍｇ／ｋｇ体重のＨＢ（それぞれ、ＨＢ２０およびＨＢ６０）が、通常食を２４日間与えられた健康なラットに毎日経口投与された。
【０１５３】
コラーゲンおよびエラスチン産生が、それらの対照物と対比して、ＨＢで処置された動物の皮膚内で測定される。コラーゲンおよびエラスチンのタンパク質分解が、例えば、コラーゲンまたはエラスチンＥＬＩＳＡによって、それらの対照物と対比して、ＨＢで処置された動物の皮膚内で測定される。ＨＢで処置された動物の皮膚に存在するコラーゲンおよびエラスチンタンパク質の量が、それらの対照物と対比して測定される。
【０１５４】
ＨＢを用いた処置は、皮膚内のコラーゲンおよびエラスチン産生を増加させ、皮膚内のコラーゲンおよびエラスチンのタンパク質分解を減少させ、および／または皮膚内のコラーゲンおよびエラスチンの量を増加させる。
【０１５５】
実施例１７：創傷治癒の動物モデル
創傷治癒への植物ブラシノステロイドの作用を評価するために、動物モデルが、本明細書の以下で説明されるように種々の態様で使用された。
【０１５６】
Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＭＥ）から入手された２７匹の６週齢オスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスが、１２時間明暗サイクルとともに一定の室温で維持された室内で、個々のチャンバの中に収容された。マウスは、食物および水に自由にアクセスできた。マウスは、７日間新しい条件に適応させられ、マウスの取扱は、理的操作のストレスを低減するように、この時間の間に毎日行われた。マウスは、投薬の１日前に体重によってグループ（ｎ＝９）に無作為化された。揮発性麻酔（効果を生じるために５％イソフルラン）下で、各動物の肩および背部が剃毛された。皮筋および付着組織を含む皮膚を除去するように、それらの腰椎上に鋭い穴開け器（内径６ｍｍ）が適用された。試験物質（対照媒介物１．５％カルボキシメチルセルロース、あるいは１０μｇ／マウスのＨＢまたは陽性対照としてアデノシン受容体作用薬ＣＧＳ−２１６８０（Ｖａｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ７７：  １１１７−１１２４，  ２００９））が、皮膚損傷の直後に、次いで、１０日間毎日、局所的に投
与された。
【０１５７】
創傷治癒の速度を調査するために、創傷サイズが、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を用いて、２日ごとに写真撮影および測定された。処置創傷の面積を対照創傷の面積と比較することによって、創傷閉塞までの時間が推定された。創傷の閉塞率（％）が計算され、皮膚創傷の５０％が閉塞された時間（ＣＴ５０）が、線形回帰によって分析された。実験の終了時に、ＣＯ２ガス吸入によって動物が安楽死させられた。創傷組織サンプルが、液体窒素中でスナップ凍結することによって収集され、創傷治癒因子分析のために−８０℃で保管され、またはＭａｙｅｒのヘマトキシリンおよびエオシンを使用した定期的な組織切片および染色法のために４％パラホルムアルデヒドで固定された。
【０１５８】
実施例１８：創傷治癒の動物モデルにおける体重および食物摂取量へのブラシノステロイド処置の作用
体重および食物摂取量への創傷の作用を評価するために、実施例１７で説明されるプロトコルに従って、動物が創傷され、ＨＢ、ＣＧＳ−２１６８０（陽性対照）、または媒介物（陰性対照）で１０日間処置された。基本的に、皮膚を除去するように、腰椎上に鋭い穴開け器が適用され、次いで、処置（１０μｇ／マウスのＨＢ、ＣＧＳ−２１６８０、または媒介物）が、１０日間局所的に投与された。体重および食物摂取量が、創傷後の１０日間、１日おきに動物で測定された。
【０１５９】
データが平均±ＳＥＭとして報告された。多重比較ダネット検定によって完成した一元配置ＡＮＯＶＡを使用したＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４．０（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を用いて、統計分析が行われた。創傷閉塞関連の体重変化が、時間および処置を独立変数として用いた２因子反復測定ＡＮＯＶＡによって分析された。０．０５未満のＰ値が有意と見なされた。
【０１６０】
創傷後の１０日間の期間に、体重に対する有意な全体的作用はなかったが、全てのマウスが創傷後の２日に減量し、体重増加が４日に再開した（図１４）。マウスは、２日までに１．５ｇの体重を減らし、処置間に有意差はなかったが、ＨＢが創傷と関連付けられる減量を低減する傾向があった。また、創傷後４８時間続いた食物摂取の過渡的な低減もあり、処置間に有意差は見られなかった。
【０１６１】
実施例１９：ＨＢ処置が創傷治癒を向上させる
皮膚創傷治癒への植物ブラシノステロイドの作用を評価するために、ＨＢ（１０μｇ／マウス／日）、陽性対照（ＣＧＳ−２１６８０）（１０μｇ／マウス／日）、または陰性対照（媒介物単独）が、実施例１７で詳述されるように、創傷後の１０日間毎日、局所的に投与された。創傷サイズが、１０日間、２日ごとに写真撮影および測定された。１日に対する創傷閉塞（％）が２日ごとに判定され、ＣＴ５０が線形回帰によって計算された。２因子反復測定ＡＮＯＶＡが行われた。０．０５未満のＰ値（ｎ＝９）が有意と見なされた。
【０１６２】
皮膚創傷治癒は、媒介物単独で処置された対照と比較して、ＨＢを受容した動物で有意に向上させられた（図１５Ａ）。ブラシノステロイド作用は、創傷治癒の初期段階（創傷後最大６日）に発生すると考えられた（図１５Ｂ）。ＣＴ５０は、媒介物対照（７．２±０．２日）と比較して、ＨＢ（５．４±０．３日）および陽性対照ＣＧＳ−２１６８０（６．２±０．４日）の両方によって有意に低減された。ＨＢ処置と関連付けられる最も強い作用が、炎症および組織修復段階が重複する、４日に観察された。理論に縛られることを希望することなく、細胞増殖の刺激または創傷領域の中への移動によって、ＨＢが創傷治癒を促進すること可能性がある。
【０１６３】
データが元の創傷サイズの割合に関して表された時に、対照マウスに対して創傷閉塞の速度の２倍の増加があった。ＨＢ処置と関連付けられる別の興味深い形態学的観察は、４日に顕著になり、６〜８日にゆっくり治まって創傷後１０日に完全に消滅した、創傷縁の増加した体積であった。この作用は、陰性および陽性対照の両方では欠けていた。
【０１６４】
実施例２０：ＨＢが創傷治癒における炎症性マーカーを低減する
皮膚創傷治癒は、初期炎症反応によって特徴付けられる。創傷治癒における炎症へのブラシノステロイドの作用を評価するために、創傷およびＨＢ、陽性対照（ＣＧＳ−２１６８０）、または陰性対照（媒介物）を用いた処置後１０日に、炎症性サイトカインＴＮＦ−αおよびＴＧＦ−βならびに付着ケモカインＩＣＡＭ−１のｍＲＮＡレベルが、対照および処置マウスの創傷組織で測定された。
【０１６５】
リアルタイム定量的ＰＣＲ
総ＲＮＡが、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を使用して線維芽細胞から抽出された。ＲＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐリーダ（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  ＤＥ）を使用して、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光測定によって、ＲＮＡが分光光度法で定量化された。ＲＮＡの質が、ゲル電気泳動によって評価された。次いで、微量のＤＮＡ汚染を除去するように、ＲＮＡがＤｎａｓｅ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）で処置され、製造業者のプロトコルに従ってＳｔｒａｔａｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，  ＣＡ）を使用して、ｃＤＮＡが、２．５μｇのＲＮＡで合成された。Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ２．０ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を使用して選択された、β−アクチン、順方向プライマー５’−ＧＧＧ  ＡＡＡ  ＴＣＧ  ＴＧＣ  ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＴＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、および逆方向プライマー５’−ＧＣＧ  ＧＣＡ  ＧＴＧ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＴＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）といった、遺伝子特異的プライマー（ＩＤＴ，  Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，  ＩＡ）を使用して、定量的ＰＣＲが、本質的に前述のように２通りに行われた（Ｋｏｍａｒｎｙｔｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｏｂｅｓ．  ３５：  ２３６−４３，  ２０１１）。ハウスキーピング遺伝子β−アクチンの標的遺伝子発現は、１という値が割り当てられた。サンプルは、増幅特異性を確認するように融解曲線分析を受けた。内因性対照遺伝子に対する標的遺伝子β−アクチンの相対的変化が、２ΔΔＣＴ方法を使用して判定された（Ｗｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２７０：  ４１−９，  １９９９）。
【０１６６】
ＨＢ処置は、ＴＧＦ−β  ｍＲＮＡの下方調節、ＩＣＡＭ−１  ｍＲＮＡの有意な抑制、およびＴＮＦ−α  ｍＲＮＡのほぼ完全な下方調整への弱い作用と関連付けられた（図１６）。アデノシン受容体作用薬ＣＧＳ−２１６８０（陽性対照）で処置された動物からの創傷組織は、ＴＮＦ−α  ｍＲＮＡの顕著な抑制を示したが、ＴＧＦ−βまたはＩＣＡＭ−１  ｍＲＮＡレベルのいずれか一方への作用を示さなかった。
【０１６７】
実施例２１：細胞生存および増殖へのブラシノステロイドの作用
細胞増殖へのブラシノステロイドの作用をさらに解明し、ブラシノステロイドの生物学的活性のための構造・活性要件を判定するために、ＨＢ（図１）およびその天然または合成類自体（図７、表６、およびＥｓｐｏｓｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ５４：  ４０５７−６６，  ２０１１）の細胞傷害および細胞増殖作用が、３Ｔ３マウス線維芽細胞培養で分析された。
【０１６８】
細胞培養
ＮＩＨ  ３Ｔ３マウス胚線維芽細胞株ＣＣＬ−９２（「３Ｔ３線維芽細胞」）が、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ）から入手された。細胞は、３７℃および５％ＣＯ２にて、１０％ＦＢＳおよび０．１％ペニシリン・ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）の中で定期的に維持され、３〜４日ごとに継代培養された。細胞は、増殖および細胞生存分析のために９６ウェルプレート、ならびに擦過創傷閉塞研究のために２４プレートの中に副次培養された（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ  Ｏｎｅ，  Ｍｏｎｒｏｅ，  ＮＣ）。
【０１６９】
細胞生存および増殖分析
３Ｔ３線維芽細胞が、１×１０４細胞／ｍｌの濃度で、９６ウェル平底皿の中へ播種された。細胞生存が、本質的にＭｏｓｍａｎｎ（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ
６５，  ５５−６３，  １９８３）によって説明されるように、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）分析によって３通りに（４時間にわたって０．３〜３０μＭの試験物質）測定され、マイクロプレートリーダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）を使用して、５５０  ｎｍで分光光度法で定量化された。媒介物（０．１％エタノール）と比較して細胞生存の変化を示さなかった試薬の濃度が、さらなる研究のために選択された。細胞増殖研究のために、細胞が０．１〜１０μＭの試験物質で３通りに２４時間処置され、Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）からのＢｒｄＵ（５−ブロモ−２’−デオキシウリジン）キットを使用して分析された。
【０１７０】
ＨＢ［（２２Ｓ，２３Ｓ，２４Ｓ）−２α，３α，２２，２３−テトラヒドロキシ−２４−エチル−β−ホモ−７−オキソ−５α−コレスタン−６−オン］がＷａｔｅｒｓｔｏｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃａｒｍｅｌ，  ＩＮ）から購入され、その構造がＥＳＩ−ＬＣＭＳおよびＮＭＲによって確認された。ホモカスタステロン（２２Ｓ，２３Ｓ，２４Ｓ）−２α，３α，２２，２３−テトラヒドロキシ−２４−エチル−５α−コレスタン−６−オン（２）、（２２Ｓ，２３Ｓ，２４Ｓ）−３α−フルオロ−２２，２３−ジヒドロキシ−２４−エチル−Ｂ−ホモ−７−オキサ−５α−コレスタン−６−オン（３）、（２２Ｓ，２３Ｓ，２４Ｓ）−３α−フルオロ−２２，２３−ジヒドロキシ−２４−エチル−５α−コレスタン−６−オン（４）、（２２Ｓ，２３Ｓ，２４Ｓ）−２α，３α−２２，２３−テトラヒドロキシ−２４−エチル−Ｂ−ホモ−６−アザ−５α−コレスタン−７−オン（５）、（２２Ｓ，２３Ｓ，２４Ｓ）−２α，３α−２２，２３−テトラヒドロキシ−２４−エチル−Ｂ−ホモ−７−アザ−５α−コレスタン−６−オン（６）、（２２Ｒ，２３Ｒ，２４Ｓ）−２α，３α−２２，２３−テトラヒドロキシ−２４−エチル−Ｂ−ホモ−７−オキサ−５α−コレスタン−６−オン（７）、（２２Ｓ，２３Ｓ，２４Ｒ）−２α，３α−２２，２３−テトラヒドロキシ−２４−メチルＢ−ホモ−７−オキサ−５α−コレスタン−６−オン（８）、および（２２Ｒ，２３Ｒ，２４Ｒ）−２α，３α−２２，２３−テトラヒドロキシ−２４−メチルＢ−ホモ−７−オキサ−５α−コレスタン−６−オン（９）を含む、ブラシノステロイド類似体２〜９（図７）が、以前に合成または購入され（Ｅｓｐｏｓｉｔｏ、上記参照）、図７に示されている。全ての他の化学物質および細胞培地は、特に指定がない限りＳｉｇｍａ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）から入手された。
【０１７１】
表６の化合物５、（２２Ｓ，２３Ｓ）−６−アザ−ホモブラシノリドは、１２．５ｍＭのＩＣ５０とともに最高細胞毒性を示した。
【０１７２】
分子のＡ環内にフッ素化置換基を伴う２つの他の合成ブラシノステロイドは、試験された最高濃度である、３０ｍＭで弱い毒性を示した。細胞増殖および細胞移動の刺激を誘発する化合物の能力の間には明白な相関がなかった（表６）。
【０１７３】
実施例２２：擦過創傷閉塞へのブラシノステロイドの作用
擦過創傷閉塞へのブラシノステロイド処置の作用をさらに調べるために、創傷およびブラシノステロイドを用いた処置後に、３Ｔ３線維芽細胞が調べられた。
【０１７４】
生体外の擦過創傷閉塞
３Ｔ３スイス線維芽細胞が、３×１０５細胞／ｍｌの濃度で２４ウェル組織培養の中へ播種され、ほぼ密集した細胞単層まで培養された。次いで、線形創傷が、滅菌１００μｌプラスチックピペット先端を用いて単層に生成された。ＰＢＳで洗浄することによって、細胞残骸が除去された。媒介物（０．１％エタノール）、ＦＢＳ（１％、陽性対照）、または種々の濃度のブラシノステロイドを伴うＤＭＥＭ培地が、１用量につき一式の３つのウェルに追加され、５％ＣＯ２で３７℃にて１２時間培養された。細胞は、１０％メチレンブルーの中で５分間可視化された。各条件下の擦過領域の各ウェルからの３つの代表的な画像が、処置後０および１２時間で相対的細胞移動を推定するように写真撮影された。データは、各用量時点での擦過閉塞の割合を対照に対して計算することによって、米国国立衛生研究所（ｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）からオンラインで入手可能なＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して分析された。
【０１７５】
３Ｔ３線維芽細胞の顕微鏡観察は、１２時間の培養後に、５μＭにて３０±４．２％の最大有効性で、ＨＢが擦過創傷域の中への細胞移動を促進することを実証した。ＨＢを用いたそのような処置は、陽性対照として使用される１％ＦＢＳ（４１．５±６．５％）、ならびに以前に報告されたＰＤＧＦ処置の参照活性（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １２２：  ５２３−５３２，  ２００９）に有利に匹敵する。いくつかのＨＢ類似体は、この分析では、構造的修飾に特に関連することなく、同様のまたは減少した擦過創傷閉塞活性を示した（表６）。細胞傷害性化合物５（（２２Ｓ，２３Ｓ）−６−アザ−ホモブラシノリド）は、予想通り、線維芽細胞への作用を示さなかった。用量依存性移動活性が、０．１〜１０μＭの濃度で創傷閉塞を有意に加速した全ての活性化合物について評価された。化合物４（（２２Ｓ，２３Ｓ）−３α−フルオロ−ホモカスタステロン）は、ＨＢと同様に、高い活性を保有することが判明した一方で、化合物６（（２２Ｓ，２３Ｓ）−７−アザ−ホモブラシノリド）は、おそらく、この処置のより高い用量と関連付けられる弱い細胞毒性により、３μＭで最も高い活性を示した（図１７Ａ−Ｃ）。
表６．３Ｔ３マウス線維芽細胞内の細胞生存、増殖、および擦過創傷閉塞へのＨＢ（１）およびその類似体（２−９）の作用
【表９】
2013545809.tif 000016
結果は３通りで行われた判定の平均±ＳＥＭとして表される（一元配置ＡＮＯＶＡおよびダネット事後検定によって対照と比較した時に＊Ｐ＜０．０５）。ＦＢＳおよび血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）が参照処置として示されている。Ｎｔ＝試験されていない。
【０１７６】
ＨＢが、最大３０μＭの濃度で試験された時に、生体外で細胞毒性を示さなかった一方で、分子のＢ環内に６−アザ基またはＡ環内にフッ素化置換基を含有する、いくつかのブラシノステロイド類似体は、試験された最高濃度で弱い毒性を示した（表６）。５μＭで細胞増殖を誘発する能力について、この研究で試験された４つ全てのブラシノステロイドは、分子のＡまたはＢ環のいずれか一方の構造変化との相関がない、適度な生物学的活性を示した（表６）。Ｒ，Ｒ−およびＳ，Ｓ−２４−エピブラシノリドの両方は、細胞増殖を促進したが、移動を促進しなかった一方で、ＨＢ処置が両方のパラメータの有意な増加をもたらしたため、細胞増殖を誘発する化合物の能力と、細胞移動を刺激するその能力との間にも相関がなかった。しかしながら、細胞移動を促進する化合物の能力（図１７）と、細胞生存、細胞周期進行、および移動に関与する信号変換経路内の主要な酵素である、Ａｋｔのリン酸化を誘発するその能力（Ｅｓｐｏｓｉｔｏ、上記参照）との間に、直接相関があった。
【０１７７】
本開示は、本開示の実践のための特定の様態を備えることが分かっている、または提案されている、特定の実施形態に関して説明されている。本開示の種々の修正および変動は、本開示の範囲および精神から逸脱することなく、当業者に明白となるであろう。本開示は、具体的実施形態に関連して説明されているが、請求されるような本開示の主題は、そのような具体的実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、当業者に明白となる、本開示を実行するための説明された様態の種々の修正は、以下の請求項の範囲内であることを目的としている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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