(57)【要約】増加した血清半減期を有する糖改変体Ｆｃ融合タンパク質が本発明において提供される。１つ以上の非内因性グリコシル化部位を導入することによってＦｃ融合タンパク質の血清半減期を増加させるための方法もまた提供される。本発明は、免疫グロブリンＦｃドメインおよび少なくとも１つの異種ポリペプチドドメインを含む融合タンパク質の血清半減期を延長するための方法を提供する。ある特定の実施形態において、それらの方法は、最初のＦｃ融合タンパク質の異種部分をコードする核酸を、１つ以上のさらなるＮ結合型グリコシル化部位をコードするように改変することによって、最初のＦｃ融合タンパク質と比べて延長された血清半減期を有する改変されたＦｃ融合タンパク質をコードする改変された核酸を調製する工程を包含する。
2013512674.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変されたＦｃ融合タンパク質をコードする改変された核酸を調製するための方法であって、該改変されたＦｃ融合タンパク質は、最初のＦｃ融合タンパク質と比べて延長された血清半減期を有し、該改変されたＦｃ融合タンパク質および該最初のＦｃ融合タンパク質の各々は、Ｆｃ部分および異種部分を含み、該方法は、該最初のＦｃ融合タンパク質の該異種部分をコードする核酸を、１つ以上のさらなるＮ結合型グリコシル化部位をコードするように改変する工程を包含し、ここで、（ａ）該改変された核酸は、適当な細胞培養物において発現されるとき、薬物動態学的サルアッセイにおいて測定される該最初のＦｃ融合タンパク質の血清半減期よりも少なくとも１０％長い血清半減期を有する改変されたＦｃ融合タンパク質をコードし、かつ（ｂ）該改変されたＦｃ融合タンパク質は、改変されていないＦｃ融合タンパク質と比べて、実質的に同じかまたは高いインビボ生物学的活性を有する、方法。
【請求項２】
前記１つ以上のさらなるＮ結合型グリコシル化部位が、前記異種部分の１つ以上のアミノ酸配列に導入され、該アミノ酸配列が、表面に露出している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つ以上のさらなるＮ結合型グリコシル化部位が、前記異種部分の１つ以上のアミノ酸配列に導入され、該アミノ酸配列が、表面に露出しており、かつβシートまたはαヘリックスに組み込まれていない、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記異種部分が、リガンド結合ドメインを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記リガンド結合ドメインが、膜貫通レセプターの細胞外ドメインに由来する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記１つ以上のさらなるＮ結合型グリコシル化部位が、前記異種部分内の位置に導入され、ここで、任意のさらなる糖成分が前記リガンド結合ドメインを実質的に干渉しない、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記１つ以上のさらなるＮ結合型グリコシル化部位が、前記リガンド結合ドメインのアミノ酸配列が改変されない位置に導入される、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記１つ以上のさらなるＮ結合型グリコシル化部位は、該さらなるＮ結合型グリコシル化部位に付着される任意の糖成分がリガンド結合境界面を実質的に干渉しないと予測される位置に導入される、請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記改変されたＦｃ融合タンパク質が、前記最初のＦｃ融合タンパク質の最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）の１／２以下のＩＣ５０でリガンドに結合する、請求項４〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記最初のＦｃ融合タンパク質が、少なくとも１つのグリコシル化部位が導入されるように、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加または欠失によって改変される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記最初のＦｃ融合タンパク質が、少なくとも１つのグリコシル化部位が導入されるように、少なくとも１つのアミノ酸残基の置換によって改変される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記最初のＦｃ融合タンパク質の前記異種部分が、少なくとも２つの構造的に異なるαヘリックスドメインおよび／またはβシートドメインを含み、該ドメインは、表面に露出している非構造ポリペプチド領域によって接続されている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
さらなるＮ結合型グリコシル化部位が、前記非構造ペプチド領域内に位置する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記最初のＦｃ融合タンパク質の前記異種部分が、各９０アミノ酸あたり１つより少ないＮ結合型グリコシル化部位を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記最初のＦｃ融合タンパク質の前記異種部分が、各１２５アミノ酸あたり１つより少ないＮ結合型グリコシル化部位を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記改変されたＦｃ融合タンパク質の前記異種部分が、各９０アミノ酸あたり少なくとも１つのＮ結合型グリコシル化部位を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記改変されたＦｃ融合タンパク質の前記異種部分が、各６５アミノ酸あたり少なくとも１つのＮ結合型グリコシル化部位を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記改変されたＦｃ融合タンパク質の前記異種部分の各アミノ酸であって、Ｎ結合型グリコシル化が付着している、各アミノ酸は、Ｎ結合型グリコシル化によって改変された他の任意のアミノ酸と少なくとも２０アミノ酸離れている、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記最初のＦｃ融合タンパク質が、前記Ｆｃ部分と前記異種部分との間にポリペプチドリンカーをさらに含み、該ポリペプチドリンカーがＮ結合型グリコシル化部位を含まない、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記改変されたＦｃ融合タンパク質が、前記リンカー内に位置するＮ結合型グリコシル化部位を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記異種部分がＴＮＦＲ２レセプターの細胞外ドメインを含み、該細胞外ドメインがリガンド結合ドメインを含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＴＮＦＲ２レセプターの前記細胞外ドメインが、配列番号２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
改変されたＦｃ融合タンパク質を調製するための方法であって、該改変されたＦｃ融合タンパク質は、最初のＦｃ融合タンパク質と比べて延長された血清半減期を有し、該方法は：
（ａ）請求項１から２２のいずれかに記載の方法に従って調製される改変された核酸を、哺乳動物または哺乳動物様のグリコシル化を提供する細胞培養物において発現させる工程；および
（ｂ）該細胞培養物から該改変されたＦｃ融合タンパク質を収集する工程
を包含する、方法。
【請求項２４】
前記改変されたＦｃ融合タンパク質を精製する工程をさらに包含する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記改変されたＦｃ融合タンパク質を精製する工程が、該改変されたＦｃ融合タンパク質をプロテインＡに曝露する工程、および該プロテインＡに結合した該改変されたＦｃ融合タンパク質を収集する工程を包含する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
患者に投与するために、前記改変されたＦｃ融合タンパク質を処方する工程をさらに包含する、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記改変された核酸が、哺乳動物細胞株によって発現される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記哺乳動物細胞株が、ＣＨＯ細胞株、ＮＳＯ細胞株、ＣＯＳ細胞株およびＨＥＫ２３６細胞株からなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記改変された核酸が、シアル酸を含むＮ結合型糖成分を産生する細胞株において発現される、請求項２３、２７または２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記改変された核酸が、哺乳動物または哺乳動物様のグリコシル化を提供するように操作された非哺乳動物細胞によって発現される、請求項２３または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞株が、真菌細胞、昆虫細胞または植物細胞に由来する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１〜２２のいずれかに記載の方法に従って調製される改変された核酸を含む、細胞株。
【請求項３３】
請求項２３〜３２のいずれか１項に記載の方法に従って調製される改変されたＦｃ融合タンパク質。
【請求項３４】
免疫グロブリンＦｃドメインおよび少なくとも１つの異種ポリペプチドドメインを含む融合タンパク質であって、ここで、該融合タンパク質は、少なくとも１つの非内因性Ｎ結合型グリコシル化部位が導入されるように、該免疫グロブリンＦｃドメインの外側で改変されており、ここで、該導入された１つ以上のグリコシル化部位におけるグリコシル化によって、薬物動態学的サルアッセイにおいて測定される該改変された融合タンパク質の血清半減期が、導入されたグリコシル化部位を欠く融合タンパク質の血清半減期と比べて少なくとも１０％増加する、融合タンパク質。
【請求項３５】
前記異種ポリペプチドドメインが、レセプターの細胞外ドメインの少なくとも一部分を含み、該一部分が、リガンド結合ドメインを含む、請求項３４に記載の融合タンパク質。
【請求項３６】
前記グリコシル化部位が、リガンド結合ポケットの外側の前記細胞外ドメインに導入される、請求項３５に記載の融合タンパク質。
【請求項３７】
前記導入された１つ以上のグリコシル化部位におけるグリコシル化が、前記レセプターのリガンド結合活性に３倍を超えて影響しない、請求項３５または３６に記載の融合タンパク質。
【請求項３８】
前記融合タンパク質が、少なくとも１つのグリコシル化部位が導入されるように、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加または欠失によって改変されている、請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項３９】
前記融合タンパク質が、少なくとも１つのグリコシル化部位が導入されるように、少なくとも１つのアミノ酸残基の置換によって改変されている、請求項３４〜３８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項４０】
前記異種ポリペプチドドメインの分子量が、少なくとも２５ｋＤａである、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項４１】
前記導入された１つ以上のグリコシル化部位におけるグリコシル化によって、前記融合タンパク質の血清半減期が、導入されたグリコシル化部位を欠く融合タンパク質の血清半減期と比べて少なくとも２０％増加する、請求項３４〜４０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項４２】
改変されていない異種ポリペプチドドメインが、各９０アミノ酸あたり１つより少ないＮ結合型グリコシル化部位を含む、請求項３４〜４１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項４３】
改変されていない異種ポリペプチドドメインが、各１２５アミノ酸あたり１つより少ないＮ結合型グリコシル化部位を含む、請求項３４〜４１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項４４】
前記改変された異種ポリペプチドが、各９０アミノ酸あたり少なくとも１つのＮ結合型グリコシル化部位を含む、請求項３４〜４１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項４５】
前記改変された異種ポリペプチドが、各６５アミノ酸あたり少なくとも１つのＮ結合型グリコシル化部位を含む、請求項３４〜４１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項４６】
Ｎ結合型グリコシル化によって改変された各アミノ酸が、Ｎ結合型グリコシル化によって改変された他の任意のアミノ酸と少なくとも２０アミノ酸離れている、請求項３４〜４５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項４７】
前記融合タンパク質が、前記Ｆｃドメインと前記異種ポリペプチドドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含む、請求項３４〜４６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項４８】
前記導入されたグリコシル化部位の少なくとも１つが、前記リンカー内に配置されている、請求項４７に記載の融合タンパク質。
【請求項４９】
前記Ｆｃ融合タンパク質の前記異種部分が、少なくとも２つの構造的に異なるαヘリックスドメインおよび／またはβシートドメインを含み、該ドメインは、表面に露出した非構造ポリペプチド領域によって接続されている、請求項３４〜４８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５０】
導入されるグリコシル化部位が、前記非構造ペプチド領域内に位置する、請求項４９に記載の融合タンパク質。
【請求項５１】
前記レセプターが、神経成長因子／腫瘍壊死因子レセプターファミリーのメンバーである、請求項３５〜５０に記載の融合タンパク質。
【請求項５２】
前記レセプターが、ＴＮＦＲ２レセプターである、請求項５１に記載の融合タンパク質。
【請求項５３】
前記ＴＮＦＲ２レセプターの細胞外ドメインが、配列番号２のＱ２６、Ｄ２５、Ａ２８、Ｅ１３３またはＧ２３１から選択される１つ以上のアミノ酸残基においてアミノ酸置換を含む、請求項５２に記載の融合タンパク質。
【請求項５４】
前記ＴＮＦＲ２レセプターの細胞外ドメインが、配列番号２のアミノ酸２６におけるＱからＮへの置換、および配列番号２のアミノ酸２８におけるＡからＳへの置換を含む、請求項５３に記載の融合タンパク質。
【請求項５５】
前記ＴＮＦＲ２レセプターの細胞外ドメインが、配列番号２のアミノ酸２５におけるＤからＮへの置換、および配列番号２のアミノ酸１３３におけるＥからＮへの置換を含む、請求項５３に記載の融合タンパク質。
【請求項５６】
前記ＴＮＦＲ２レセプターの細胞外ドメインが、配列番号２のアミノ酸２５におけるＤからＮへの置換、および配列番号２のアミノ酸２３１におけるＧからＮへの置換を含む、請求項５３に記載の融合タンパク質。
【請求項５７】
前記ＴＮＦＲ２レセプターの細胞外ドメインが、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、請求項５３〜５６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５８】
前記ＴＮＦＲ２レセプターの細胞外ドメインが、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項５７に記載の融合タンパク質。
【請求項５９】
前記ＴＮＦＲ２レセプターの細胞外ドメインが、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一である、請求項５８に記載の融合タンパク質。
【請求項６０】
前記融合タンパク質が：
ａ）配列番号５のアミノ酸１３〜２５７を含むポリペプチド；
ｂ）配列番号６のアミノ酸１３〜２５７を含むポリペプチド；
ｃ）配列番号７のアミノ酸１３〜２５７を含むポリペプチド；および
ｄ）配列番号８のアミノ酸１３〜２５７を含むポリペプチド
から選択される異種ドメインを含む、請求項５３に記載の融合タンパク質。
【請求項６１】
前記融合タンパク質が、リンカーおよびＦｃ部分を含み、該リンカーおよびＦｃ部分が、配列番号１８のアミノ酸配列を有する、請求項６０に記載の融合タンパク質。
【請求項６２】
請求項３４〜６１のいずれか１項に記載の融合タンパク質および薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的調製物であって、該調製物は、哺乳動物への投与に適するように、発熱性材料を実質的に含まない、薬学的調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００９年１２月２日に出願された米国仮出願番号第６１／２６６，０９５号、および２０１０年４月２３日に出願された同第６１／３２７，５８２号の利益を主張する。上記米国仮出願の全教示は、参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
天然状態または組換え的に生成されたときの治療用のタンパク質またはペプチドは、多くの場合、短い安定期間または短い血清半減期を示す不安定な分子である。さらに、これらの分子は、処方されるとき、特に、診断および治療の目的のために水溶液として処方されるとき、極度に不安定であることが多い。タンパク質性の治療用分子のインビボまたはインビトロにおける安定性を拡大するかまたは促進する実用的な溶液はほとんど無い。多くの治療薬、特に、ペプチド薬は、インビボでの不十分な血清半減期に悩まされている。これにより、治療効果に必要な血清レベルを維持するために、高頻度および／もしくはより高用量でのそのような治療薬の投与、または徐放製剤の使用を余儀なくされる。薬物の高頻度の全身投与は、かなりの負の副作用を伴う。例えば、高頻度の、例えば、毎日の、全身注射は、被験体にとってかなりの苦痛の種であり、投与関連感染症の高リスクの原因となり、特に、その治療薬が静脈内投与されるべきであるとき、入院または高頻度の来院を必要とし得る。そのうえ、長期間の処置における毎日の静脈内注射は、血管穿刺が繰り返されることによって引き起こされるかなりの組織瘢痕および血管病理ももたらし得る。同様の問題が、治療薬の高頻度の全身投与のすべてについて、例えば、糖尿病患者に対するインスリンの投与、または多発性硬化症に罹患している患者におけるインターフェロン薬物の投与について、知られている。これらの因子のすべてが、患者の服薬率を低下させ、医療制度に対するコストを増加させる。
【０００３】
医薬品の血清半減期を改変するために可能性のある１つの解決方法は、半減期を増加させ得る薬剤分子に共有結合的に付着することである。以前に、ポリペプチドに対するポリエチレングリコールまたは「ＰＥＧ」などのポリマーの付着によって、それらの血清半減期が増加し得ることが示された。しかしながら、ポリマーの付着によって、薬物活性が低下し得る。不完全または不均一な付着によって、異なる特性を有する化合物の混合集団がもたらされる。さらに、そのような改変に起因する半減期の変化は、予測不可能である。例えば、種々のポリエチレングリコールと、ＩＬ−８、Ｇ−ＣＳＦおよびＩＬ−１ｒａとの結合体化によって、様々な活性および半減期を有する分子が生成された（非特許文献１）。ＩＬ−８とＰＥＧ２０との結合体化は、その半減期を変化させなかったが、ＩＬ−１ｒａとＰＥＧ２０との結合体化は、半減期を７倍近く増加させた。さらに、ＩＬ−８／ＰＥＧ２０結合体は、天然タンパク質よりも１０〜２０倍有効性が低い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ＧａｅｒｔｎｅｒおよびＯｆｆｏｒｄ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．（１９９６），７：３８−４４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、生物学的に活性な分子の生物学的機能を著しく減少させずにその分子の血清半減期を増加することができる方法が、大いに望ましいだろう。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
要旨
一つには、本開示は、免疫グロブリンＦｃドメインおよび少なくとも１つの異種ポリペプチドドメインを含む融合タンパク質の血清半減期を延長するための方法を提供する。ある特定の実施形態において、それらの方法は、最初のＦｃ融合タンパク質の異種部分をコードする核酸を、１つ以上のさらなるＮ結合型グリコシル化部位をコードするように改変することによって、最初のＦｃ融合タンパク質と比べて延長された血清半減期を有する改変されたＦｃ融合タンパク質をコードする改変された核酸を調製する工程を包含する。いくつかの実施形態において、本発明の改変された核酸は、適当な細胞培養物において発現されるとき、最初のＦｃ融合タンパク質の血清半減期よりも少なくとも１０％長い血清半減期を有する改変されたＦｃ融合タンパク質をコードし得る。いくつかの実施形態において、本発明の改変されたＦｃ融合タンパク質は、改変されていないＦｃ融合タンパク質と比べて、実質的に同じまたは高いインビボ生物学的活性を有する。ある特定の実施形態において、さらなる（すなわち、導入される）グリコシル化部位の１つ以上におけるグリコシル化は、そのさらなるグリコシル化部位を欠く融合ポリペプチドの血清半減期と比べて、改変されたＦｃ融合タンパク質の半減期（例えば、インビトロ、インビボにおける血清半減期）を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２２５％もしくは２５０％またはそれ以上増加させる。ある特定の実施形態において、改変されたＦｃ融合タンパク質、およびさらなるグリコシル化部位を欠く融合ポリペプチドの血清半減期は、比較するために、同じ動物モデルまたは動物種において測定される。例示的な実施形態において、血清半減期は、本明細書中に記載されるような薬物動態学的ラットアッセイまたは薬物動態学的サルアッセイにおいて測定される。
【０００７】
いくつかの実施形態において、本開示は、ａ）少なくとも１つのさらなるＮ結合型グリコシル化部位を導入するように改変された核酸を、哺乳動物または哺乳動物様のグリコシル化を提供する細胞培養物において発現させること、およびｂ）その細胞培養物から改変されたＦｃ融合タンパク質を収集することによって、最初のＦｃ融合タンパク質と比べて延長された半減期を有する改変されたＦｃ融合タンパク質を調製するための方法を提供する。Ｆｃ融合タンパク質は、細胞培養物からタンパク質を得るのに適した任意の手法を用いて、粗画分、部分的に精製された画分または高度に精製された画分として収集され得る。ある特定の態様において、改変された核酸は、シアル酸を含むＮ結合型糖成分を産生する細胞株において発現される。ある特定の態様において、改変された核酸は、哺乳動物細胞株によって発現され、その細胞株としては、ＣＨＯ細胞株、ＮＳＯ細胞株、ＣＯＳ細胞株またはＨＥＫ２３６細胞株が挙げられるがこれらに限定されない。他の態様において、改変された核酸は、哺乳動物または哺乳動物様のグリコシル化を提供するように操作された非哺乳動物細胞によって発現され、その細胞としては、遺伝的に操作された真菌細胞、昆虫細胞または植物細胞が挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の態様において、精製は、改変されたＦｃ融合タンパク質をプロテインＡに曝露し、そのプロテインＡに結合した改変されたＦｃ融合タンパク質を収集する工程を含み得る。好ましい実施形態において、本開示の方法によって生成されるＦｃ融合タンパク質は、患者に投与するために処方される。
【０００８】
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書中に記載される方法のいずれかに従って調製される改変された核酸を含む細胞株を提供する。本発明の細胞株は、哺乳動物細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞株、ＮＳＯ細胞株、ＣＯＳ細胞株またはＨＥＫ２３６細胞株）、または哺乳動物もしくは哺乳動物様のグリコシル化を提供するように遺伝的に改変された非哺乳動物細胞株（例えば、真菌細胞、昆虫細胞または植物細胞）を含み得る。
【０００９】
ある特定の実施形態において、本開示は、増加された安定性および／または血清半減期を特徴とする糖改変体Ｆｃ融合タンパク質、ならびに増加された半減期を有する融合タンパク質を生成するための方法を提供する。本発明のＦｃ融合タンパク質としては、免疫グロブリンＦｃドメインおよび少なくとも１つの異種ポリペプチドドメインを含むポリペプチドが挙げられるがこれに限定されない。そのＦｃ融合タンパク質は、少なくとも１つの非内因性Ｎ結合型グリコシル化部位を導入するように免疫グロブリンＦｃドメインの外側で改変され、それにより、導入されるグリコシル化部位を欠く融合タンパク質の半減期（例えば、インビトロ、インビボまたは血清半減期）と比べて、改変された融合タンパク質の血清半減期が増加する。ある特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、その融合物の血清半減期を、導入されるグリコシル化部位を欠く融合タンパク質の血清半減期（ｓｅｒｕｍ  ｈａｌｆ−ｌｉｖｅ）と比べて少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２２５％もしくは２５０％またはそれ以上増加させる、少なくとも１つの非内因性の、すなわち導入される、Ｎ結合型グリコシル化部位を含む。ある特定の実施形態において、改変されたＦｃ融合タンパク質、およびさらなるグリコシル化部位を欠く融合ポリペプチドの血清半減期は、比較のために同じ動物モデルまたは動物種において測定される。例示的な実施形態において、血清半減期は、本明細書中に記載されるような薬物動態学的ラットアッセイまたは薬物動態学的サルアッセイにおいて測定される。
【００１０】
本発明のＦｃ融合タンパク質は、１つのＮ結合型グリコシル化部位を導入するために、１つ以上のアミノ酸残基の付加、欠失または置換によって改変され得る。ある特定の実施形態において、最初のＦｃ融合タンパク質の異種部分は、各５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５  １００、１０５  １１０、１１５、１２０、１３０、１４０または１５０アミノ酸あたり少なくとも１つのＮ結合型グリコシル化部位を含む。ある特定の実施形態において、最初のＦｃ融合タンパク質の異種部分は、各６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０または１２５アミノ酸あたり１個より少ないＮ結合型グリコシル化部位を含む。ある特定の実施形態において、Ｎ結合型グリコシル化に付着された、改変されたＦｃ融合タンパク質の異種部分の各アミノ酸は、Ｎ結合型グリコシル化によって改変された他の任意のアミノ酸と少なくとも１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００アミノ酸離れている。ある特定の実施形態において、さらなるＮ結合型グリコシル化部位は、改変されたＦｃ融合タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端とＣ末端の両方の１０、２０、３０、４０または５０アミノ酸以内に存在しない。
【００１１】
好ましい実施形態において、本発明のＦｃ融合タンパク質は、表面に露出したアミノ酸配列（すなわち、可溶性ループドメイン）によって接続されており、かつαヘリックスまたはβシートに組み込まれない、少なくとも２つの構造的に異なるドメインを含む。好ましい実施形態において、さらなるＮ結合型グリコシル化部位は、表面に露出しているアミノ酸配列内に位置する。好ましい実施形態において、さらなるＮ結合型グリコシル化部位は、二次構造エレメント、例えば、αヘリックスまたはβシートを有するタンパク質の領域に組み込まれない。本発明において有用な異種部分には、タンパク質の機能的ドメイン（例えば、酵素ドメインもしくは触媒ドメインまたはリガンド結合ドメイン）が含まれ得る。いくつかの実施形態において、本開示のＦｃ融合タンパク質は、リンカードメインをさらに含む。いくつかの実施形態において、導入されるグリコシル化部位のうちの少なくとも１つは、リンカードメイン内に配置される。本発明の融合ポリペプチドの異種ドメインは、好ましくは、高分子量であり、少なくとも２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５または１１０ｋＤａである。
【００１２】
特定の実施形態において、異種部分は、細胞レセプター（例えば、膜貫通レセプター）の細胞外（すなわち、可溶性）ドメイン、ならびにその任意の改変体（変異体、フラグメントおよびペプチド模倣型を含む）を含む。好ましい実施形態において、異種部分（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｏｔｉｏｎ）には、膜貫通レセプターのリガンド結合ドメインが含まれる。本開示の方法は、付着される任意のさらなる糖成分が、リガンド結合ドメインを実質的に干渉しないような（例えば、導入されるグリコシル化部位を欠くＦｃ融合タンパク質のリガンド結合性と比べて２、３、５、１０または１５倍未満の結合活性の減少）その異種の位置において１つ以上のＮ結合型グリコシル化部位を導入するために使用され得る。ゆえに、いくつかの態様において、導入されるＮ結合型グリコシル化部位の１つ以上は、リガンド結合ドメインのアミノ酸配列が改変されないような位置、および／またはリガンド境界面を実質的に干渉しないと予測される位置に導入される。ある特定の実施形態において、Ｆｃ融合タンパク質は、最初のＦｃ融合タンパク質のＩＣ５０（すなわち、最大半量阻害濃度）よりも２、３、５または１０倍以下だけ低いＩＣ５０を有する。
【００１３】
ある特定の実施形態において、Ｆｃ融合タンパク質は、神経成長因子／腫瘍壊死因子レセプターファミリーのメンバーから選択される異種部分を含む。特定の実施形態において、細胞外レセプタードメインは、腫瘍壊死因子２型レセプター（すなわち、ＴＮＦＲ２）の一部分を含む。好ましい実施形態において、本開示は、１マイクロモル濃度未満または１００、１０もしくは１ナノモル濃度未満のＫＤでＴＮＦ−αに結合するＴＮＦＲ２融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、本発明のＴＮＦＲ２融合タンパク質は、ヒトＴＮＦＲ２前駆体タンパク質（すなわち、配列番号１）のＤ４７、Ｑ４８、Ａ５０、Ｅ１５５またはＧ２５３位に配置される１つ以上の改変されたアミノ酸を有するＴＮＦＲ２細胞外ドメインを含む。これらの残基は、ＴＮＦＲ２（すなわち、配列番号２）のプロセシングされた細胞外のドメインのそれぞれＤ２５、Ｑ２６、Ａ２８、Ｅ１３３およびＧ２３１位に対応する。好ましい改変には、ＴＮＦＲ２ポリペプチドに１つ以上のＮ結合型グリコシル化部位を導入する、アミノ酸の付加、置換および／または欠失が含まれ、例えば、配列番号２のアミノ酸配列に対するアミノ酸置換Ｑ２６Ｎ、Ａ２８Ｓ、Ｄ２５Ｎ、Ｅ１３３Ｎ、Ｄ２５Ｎ、Ｇ２３１Ｎが挙げられる。いくつかの実施形態において、１つ以上のＮ結合型グリコシル化部位を導入するために、１つより多い改変（例えば、付加、欠失および／または置換）がＴＮＦＲ２融合タンパク質に対して行われ、その改変としては、例えば、配列番号２のアミノ酸配列に対する、Ｑ２６Ｎ／Ａ２８Ｓ；Ｄ２５Ｎ／Ｅ１３３Ｎ；Ｄ２５Ｎ／Ｇ２３１Ｎ；Ｑ２６Ｎ／Ａ２８Ｓ／Ｅ１３３Ｎ；Ｑ２６Ｎ／Ａ２８Ｓ／Ｇ２３１Ｎ；またはＥ１３３Ｎ／Ｇ２３１Ｎ置換を含むＴＮＦＲ２改変体が挙げられる。本発明のＴＮＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質は、本明細書中に開示されるもののいずれかであり得る（例えば、配列番号１、２、５、６、７もしくは８から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、または配列番号１、２、５、６、７もしくは８から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む、融合タンパク質）。ＴＮＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質は、ＴＮＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質および薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的調製物として処方され得、ここで、その薬学的調製物は、哺乳動物への投与に適するように、発熱性材料を実質的に含まない。本組成物は、サイズ排除クロマトグラフィーによって評価されるとき、他のポリペプチド構成要素に対して少なくとも９５％純粋であり得、必要に応じて本組成物は、少なくとも９８％純粋である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
本特許または本出願ファイルは、カラーで仕上げられた少なくとも１つの図面を含む。カラーの図面を含む本特許または本特許出願公報の写しは、請求され、必要な手数料の支払いがなされたときに、当局によって提供され得る。
【図１】図１は、ＴＮＦＲ２−ｈ（１）Ｆｃポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５）を示している。リンカーなしで免疫グロブリンＦｃドメインに融合されたヒトＴＮＦＲ２の細胞外ドメインを有する可溶性ＴＮＦＲ２融合タンパク質（ｈ（１）Ｆｃ改変体と命名される）が示されている。免疫グロブリンＦｃ領域に一重下線が引かれており、天然に存在するＮ結合型グリコシル化部位に二重下線が引かれている。
【図２】図２は、Ｑ４８Ｎ／Ａ５０Ｓ改変体ＴＮＦＲ２−ｈ（１）Ｆｃポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号６）を示している。リンカーなしでｈ（１）Ｆｃ免疫グロブリンＦｃドメインに融合されたヒトＴＮＦＲ２の細胞外ドメインを有する可溶性ＴＮＦＲ２融合タンパク質が示されている。天然に存在するＴＮＦＲ２−Ｆｃ細胞外ドメインが、Ｎ結合型グリコシル化部位を導入するために４８および５０位で改変された。免疫グロブリンＦｃ領域に一重下線が引かれており、置換されたアミノ酸に二重下線が引かれている。
【図３】図３は、改変体（Ｄ４７Ｎ／Ｅ１５５Ｎ）ＴＮＦＲ２−ｈ（１）Ｆｃポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号７）を示している。リンカーなしでｈ（１）Ｆｃ免疫グロブリンＦｃドメインに融合されたヒトＴＮＦＲ２の細胞外ドメインを有する可溶性ＴＮＦＲ２融合タンパク質が示されている。天然に存在するＴＮＦＲ２−Ｆｃ細胞外ドメインが、Ｎ結合型グリコシル化部位を導入するために４７および１５５位で改変された。免疫グロブリンＦｃ領域に一重下線が引かれており、置換されたアミノ酸に二重下線が引かれている。
【図４】図４は、改変体（Ｄ４７Ｎ／Ｇ２５３Ｎ）ＴＮＦＲ２−ｈ（１）Ｆｃポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号８）を示している。リンカーなしでｈ（１）Ｆｃ免疫グロブリンＦｃドメインに融合されたヒトＴＮＦＲ２の細胞外ドメインを有する可溶性ＴＮＦＲ２融合タンパク質が示されている。天然に存在するＴＮＦＲ２−Ｆｃ細胞外ドメインが、Ｎ結合型グリコシル化部位を導入するために４７および２５３位で改変された。免疫グロブリンＦｃ領域に一重下線が引かれており、置換されたアミノ酸に二重下線が引かれている。
【図５】図５は、天然のリーダー配列を有する、ＴＮＦＲ２−ｈ（１）Ｆｃポリペプチド（すなわち、配列番号５）をコードする核酸配列（配列番号９）を示している。
【図６】図６は、ＴＮＦとＴＮＦＲ２レセプターの細胞外ドメインとの結合境界面を示しているリボン図である。ＴＮＦは、左側の緑色のリボン構造であり、ＴＮＦＲ２レセプターは、右側の青色のリボン構造である。Ｎ結合型グリコシル化部位を導入するために操作された部位は、円で示されている。単一変異は、青色の円によって表示されており、二重変異は、緑色の円によって表示されている。リガンド結合活性を有意に減少させた変異は、ＴＮＦ結合部位の近位に配置されており、赤色の円として示されている。
【図７】図７は、強調されている非内因性グリコシル化部位を導入するための、例示的なアミノ酸改変を有するＴＮＦＲ２の細胞外ドメインの配列を示している。強調された各領域について、非内因性グリコシル化部位を導入し得る改変の特定の例が示されている。シグナルペプチドが、一重下線で示されており、内因性グリコシル化部位が、二重下線で示されている。
【図８】図８は、ＴＮＦＲ２構造内のベータ鎖の予測される位置（矢印）を示している。ナンバリングは、天然のＴＮＦＲ２前駆体配列（配列番号１）に基づく。ＴＮＦＲ１（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＥＸＴ）、サイトカイン応答変更因子Ｅ（ＣｒｍＥ；ＰＤＢ  ＩＤ：２ＵＷＩ）およびＣＤ１３４（ＯＸ４０；ＰＤＢ  ＩＤ：２ＨＥＹ）との配列比較および構造相同性によって、二次構造を推測した。
【図９】図９は、天然のリーダー配列を有する改変体ＴＮＦＲ２−ｈ（２）Ｆｃポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１６）を示している。４アミノ酸リンカーを介して例示的なヒトＦｃドメイン（配列番号１４）に融合された天然のヒトＴＮＦＲ２の細胞外ドメインを有する可溶性ＴＮＦＲ２融合タンパク質が示されている。Ｆｃドメインが、一重下線で示されており、リーダー配列およびリンカー配列に二重下線が引かれている。
【図１０】図１０は、ＴＮＦＲ２−ｈ（２）Ｆｃポリペプチド（すなわち、配列番号１６）をコードするヌクレオチド配列（配列番号１７）を示している。Ｆｃドメインをコードする配列が、一重下線で示されており、リーダーおよびリンカーをコードする配列に二重下線が引かれている。
【図１１】図１１は、ラットコラーゲン誘発関節炎モデルにおける炎症のマーカーとしての、足の体積に対する糖改変体Ｑ４８Ｎ／Ａ５０Ｓ  ＴＮＦＲ２−ｈ（１）Ｆｃの作用を示している。０および７日目にコラーゲンを投与し、被験物質での処置を６日目に開始した。示されているデータは、平均値±ＳＥＭである。ＴＮＦＲ２−ｈ（１）Ｆｃと同様に、Ｑ４８Ｎ／Ａ５０Ｓ  ＴＮＦＲ２−ｈ（１）Ｆｃでの処置は、この研究の後半のビヒクル処置ラットにおいて観察された足の腫脹を防止した。
【図１２】図１２は、ラットコラーゲン誘発関節炎モデルにおける骨質に対する糖改変体Ｑ４８Ｎ／Ａ５０Ｓ  ＴＮＦＲ２−ｈ（１）Ｆｃの作用を示している。２１日目の研究完了後のマイクロコンピュータ断層撮影（マイクロＣＴ）によって、エキソビボにおいて足根骨の像を得た。ＴＮＦＲ２−ｈ（１）Ｆｃと同様に、Ｑ４８Ｎ／Ａ５０Ｓ  ＴＮＦＲ２−ｈ（１）Ｆｃでの処置は、ビヒクル処置ラットにおいて観察された骨侵食を防止した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
詳細な説明
１．概要
ある特定の態様において、本開示は、適切な標的タンパク質の適切な位置に少なくとも１つの非内因性Ｎ結合型グリコシル化部位を導入することによって、Ｆｃ融合タンパク質の血清半減期が延長され得るという驚くべき発見に関する。したがって、本開示は、そのポリペプチド上のＮ結合型グリコシル化部位の数を増加させることによって、特定の治療用ポリペプチドであるＦｃ融合タンパク質の血清半減期を増加させるための方法を提供する。本明細書中で証明されるように、本開示の方法は、リガンド結合ドメインを含むレセプターの細胞外ドメインの一部分を含むＦｃ融合タンパク質の血清半減期を増加させるために使用された。特定の例において、本開示は、それぞれの融合タンパク質の改変されていない形態と比べて増加された半減期を特徴とする改変されたＴＮＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質を提供する。本開示を任意の特定の作用機序に限定しないが、Ｆｃ融合タンパク質の非Ｆｃ部分（「異種部分」）は、その患者の体内滞留時間中に様々な細胞内および細胞外の環境に曝露されると提唱される。これらの種々の条件によって、その異種部分の一部分が、プロテアーゼに対する基質、またはタンパク質の改変もしくは分解のプロセスを開始する他の酵素もしくは分子に対する基質として脆弱になる可能性がある。したがって、本開示は、Ｆｃ融合タンパク質の血清半減期が、異種部分を分解するように作用する物質に有意に影響され、その異種部分をそのような物質から保護する傾向がある改変が、より長い血清半減期をもたらし得るという新規の提案を提供する。本明細書中に記載されるように、１つ以上のＮ結合型グリコシル化部位の付加によって、異種ドメインの脆弱な部分を望まれない分解または変更から保護するため、および場合によっては、そのような分子の望ましい構造上のコンフォメーションを安定化するための、単一工程の生体適合性の系を提供する。
【００１６】
最初のＦｃ融合タンパク質の異種ドメイン内のどの位置がさらなるＮ結合型グリコシル化部位に最も適用できるかを演繹的に予測することは困難であり得、何の制約または指針もないときは、任意の１つの異種ドメインが、理論上は、１つ以上のさらなるＮ結合型部位のほぼ無限の組み合わせで改変され得る。種々の最初のＦｃ融合タンパク質を用いた研究を通して、本出願人は、改変された分子の生物学的活性（特に、インビボ生物学的活性）を保ちつつ、最初のＦｃ融合タンパク質と比べて延長された血清半減期を示す改変されたＦｃ融合タンパク質に到達するために、妥当な部位数での最初のＦｃ融合タンパク質の改変を可能にする様々な指針を見出した。本開示全体の範囲を限定することを望むものではないが、本出願人は、以下の原理の１つ以上を用いることにより、半減期が延長された活性なＦｃ融合タンパク質を生成する実行可能なアプローチが提供されることを見出した：（１）タンパク質構造解析によって決定されるか経験的方法によって決定されるかに関係なく、Ｎ結合型グリコシル化部位は、Ｆｃ融合タンパク質の異種部分の表面に露出した位置、特に、規定のタンパク質構造エレメント（例えば、アルファヘリックスまたはベータシート）内に含まれない位置に配置されることが有利であり得る；（２）Ｎ結合型グリコシル化部位は、改変または分解に供された場合にタンパク質の構造または機能の実質的な混乱を引き起こし得るＦｃ融合タンパク質の異種部分内の位置に配置されることが有利であり得る（例えば、多くのタンパク質は、切断された場合にタンパク質全体およびその活性の混乱をほとんどまたはまったく引き起こさない非構造領域をＮ末端に有し、したがって、そのような位置に配置されるＮ結合型グリコシル化部位は、血清半減期に対して比較的小さい作用しか有さない可能性があるが、対照的に、構造エレメント間に配置される表面露出領域は、高露出と、望ましくない分解に供された場合のそのタンパク質に対する重大な結果との組み合わせを示すので、構造エレメント間の表面露出アミノ酸は、Ｎ結合型グリコシル化部位の導入にとって望ましい位置に相当する）；（３）Ｎ結合型グリコシル化部位は、最初のＦｃ融合タンパク質の重要な機能的部位（例えば、リガンド結合表面または触媒部位）を干渉しない位置に配置され得、これは、その機能的部位自体の外部の位置を選択すること、および／または任意の新しいＮ結合型糖成分がその機能的部位に突き出ないであろう位置を選択することによって達成され得る；（４）Ｎ結合型グリコシル化部位の付加によって達成される作用の程度は、すでに最初のＦｃ融合タンパク質に存在するＮ結合型糖の密度と反比例し得るので、そのアプローチは、比較的低レベルのグリコシル化（例えば、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２５アミノ酸またはそれ以上の異種部分あたり１個未満のＮ結合型部位）を有する異種部分を有する最初のＦｃ融合タンパク質を用いるとき、最も有効であり得る；（５）重度にグリコシル化された異種部分と軽度にグリコシル化された異種部分の両方において、達成される作用の程度は、Ｎ結合型グリコシル化部位間の間隔に比例し得る（これは、１つ以上のさらなるＮ結合型グリコシル化部位が、比較的規則正しい間隔、かつ既存のＮ結合型グリコシル化部位または他のさらなるＮ結合型グリコシル化部位から離れた（例えば、Ｎ結合型グリコシル化部位のＮ残基間が１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０アミノ酸を超える）間隔で配置されることが有利であり得ることを意味し、重度にグリコシル化されたタンパク質でさえ、糖が密集する場合、十分に間隔が空けられたＮ結合型部位の付加によって、血清半減期の有意な増加が促進され得る）。上記原理の１つ以上を用いることにより、最初のＦｃ融合タンパク質と比べて延長された血清半減期を示す単一の改変されたＦｃ融合タンパク質を設計することが可能であり得るが、単一の最初のＦｃ融合タンパク質に基づいて複数の改変されたＦｃ融合タンパク質を生成すること、これらの変更された形態を試験すること、次いで、増加された半減期と保持された生物学的活性との最善の組み合わせを示す改変された形態の組み合わせを試験することが有益であることが多い。
【００１７】
ある特定の態様において、本開示は、そのポリペプチド上のＮ結合型グリコシル化部位の数を増加させることによって、特定の治療用ポリペプチドであるＦｃ融合タンパク質の血清半減期を増加させるための方法に関する。本明細書中で証明されるように、本開示の方法は、リガンド結合ドメインを含むレセプターの細胞外ドメインの一部分を含むＦｃ融合タンパク質の血清半減期を増加させるために使用された。特定の例において、本開示は、それぞれの融合タンパク質の改変されていない形態と比べて増加された半減期を特徴とする改変されたＴＮＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質を提供する。その機序に関係なく、さらなるグリコシル化部位の導入が、高分子量の生物製剤、特に、Ｆｃ融合タンパク質の半減期を延ばす有効な方法であることは、本明細書中に提示されるデータから明らかである。
【００１８】
特定の実施形態において、本開示は、増加された血清半減期を特徴とする改変されたＴＮＦＲ２−Ｆｃ糖改変体融合タンパク質を提供する。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、正常な炎症応答および免疫応答に関わる、天然に存在するサイトカインである。腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）および腫瘍壊死因子−β（ＴＮＦβ）は、相同的な多機能性サイトカインである。これらのポリペプチドの構造的および機能的な特徴が非常に類似していることにより、それらは、腫瘍壊死因子または「ＴＮＦ」と集合的に記述される。一般にＴＮＦに帰されている活性としては：他のサイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１０を含む）の放出、ケモカインの誘導、接着分子の増加、血管の成長、組織破壊酵素の放出、およびＴ細胞の活性化が挙げられる。例えば、Ｆｅｌｄｍａｎｎら、１９９７，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６４：２８３−３５０，Ｎａｗｒｏｔｈら、１９８６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６３：１３６３−１３７５；Ｍｏｓｅｒら、１９８９，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ，８３：４４４−４５５；Ｓｈｉｎｇｕら、１９９３，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９４：１４５−１４９；ＭａｃＮａｕｌら、１９９２，Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｕｐｐｌ．，１：１９８−１９９；およびＡｈｍａｄｚａｄｅｈら、１９９０，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．８：３８７−３９１を参照のこと。これらの活性のすべてが、炎症応答を増強するように働き得る。
【００１９】
ＴＮＦは、組織の損傷をもたらす炎症促進性作用（例えば、血管内皮細胞に対して凝血促進活性を誘導すること（Ｐｏｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：１６８０（１９８６））、好中球およびリンパ球の接着を増加させること（Ｐｏｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：３３１９（１９８７））ならびにマクロファージ、好中球および血管内皮細胞からの血小板活性化因子の放出を刺激すること（Ｃａｍｕｓｓｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３９０（１９８７）））を引き起こす。ＴＮＦはまた、感染症（Ｃｅｒａｍｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ９：２８（１９８８））、免疫障害、腫瘍性の病態（Ｏｌｉｆｆら、Ｃｅｌｌ  ５０：５５５（１９８７））、自己免疫性の病態および移植片対宿主病態（Ｐｉｇｕｅｔら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１２８０（１９８７））にも関連する。うっ血性心不全、炎症性腸疾患（クローン病を含む）、関節炎および喘息が、そのようなＴＮＦ関連障害の中に入る。
【００２０】
特に、ＴＮＦは、発熱、倦怠感、食欲不振および悪液質を含む、グラム陰性敗血症およびエンドトキシンショックにおいて中心的役割を果たす（Ｍｉｃｈｉｅら、Ｂｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．７６：６７０−６７１（１９８９）；Ｄｅｂｅｔｓら、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｖｉｅｎｎａ  Ｓｈｏｃｋ  Ｆｏｒｕｍ，ｐ．４６３−４６６（１９８９）；Ｓｉｍｐｓｏｎら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｃｌｉｎ．５：２７−４７（１９８９）；Ｗａａｇｅら、Ｌａｎｃｅｔ  １：３５５−３５７（１９８７）；Ｈａｍｍｅｒｌｅら、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｖｉｅｎｎａ  Ｓｈｏｃｋ  Ｆｏｒｕｍ  ｐ．７１５−７１８（１９８９）；Ｄｅｂｅｔｓら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１７：４８９−４９７（１９８９）；Ｃａｌａｎｄｒａら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６１：９８２−９８７（１９９０）；Ｒｅｖｈａｕｇら、Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．１２３：１６２−１７０（１９８８））。
【００２１】
ＴＮＦは、ＴＮＦ応答性細胞上の特異的な細胞表面レセプターとの相互作用を介して、その生物学的作用を開始する。細胞表面腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）には、ｐ７５（または２型）およびｐ５５（または１型）と命名された異なる２つの形態がある（Ｓｍｉｔｈら、１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：１０１９−１０２３；Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒら、１９９０，Ｃｅｌｌ  ６１：３５１−３５９）。ＴＮＦＲ  １型およびＴＮＦＲ  ２型の各々は、ＴＮＦαとＴＮＦβの両方に結合する。ＴＮＦの生物学的活性は、いずれかの細胞表面ＴＮＦＲへの結合に依存する。１型レセプター（ＴＮＦ−Ｒ５５、ＴＮＦ−ＲＩまたはＴＮＦＲ−βとも呼ばれる）は、ＴＮＦ−αの細胞傷害性、抗ウイルス性および増殖性の活性をもたらすシグナルを伝達すると示されている５５ｋｄの糖タンパク質である。ｐ７５レセプター（ＴＮＦ−Ｒ７５、ＴＮＦＲ２またはＴＮＦＲ−αとも呼ばれる）は、細胞傷害性および増殖性のシグナル、ならびにＧＭ−ＣＳＦの分泌をもたらすシグナルを伝達すると示されている７５ｋＤａの糖タンパク質である。
【００２２】
ＴＮＦアンタゴニスト（例えば、可溶性ＴＮＦＲおよび抗ＴＮＦ抗体）は、ＴＮＦ活性を阻止して、ＴＮＦに応答したＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、接着分子および組織破壊の減少を引き起こすと証明されている（Ｆｅｌｄｍａｎｎら、１９９７）。ハムスター抗マウスＴＮＦ抗体を利用したＴＮＦ拮抗作用の影響が、ＤＢＡ／１マウスにおけるＩＩ型コラーゲン関節炎のモデルにおいて試験された（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：９７８４−９７８８）。疾患の発症後に開始された処置によって、足蹠の腫脹、臨床スコア、および関節破壊の組織病理学が改善された。他の研究も、抗体（Ｔｈｏｒｂｅｃｋｅら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：７３７５−７３７９）またはＴＮＦＲ構築物（Ｈｕｓｂｙら、１９８８，Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．１：３６３−７１；Ｔｅｔｔａら、１９９０，Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．４９：６６５−６６７；Ｗｏｏｌｅｙら、１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：６６０２−６６０７；Ｐｉｇｕｅｔら、１９９２，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７７：５１０−５１４）のいずれかを用いて同様の結果を得ている。
【００２３】
３つの特異的なＴＮＦアンタゴニストが、現在、ＦＤＡによって承認されている：エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））およびアダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））。これらの薬物の１つ以上が、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎および炎症性腸疾患（クローン病または潰瘍性大腸炎）の処置について承認されている。
【００２４】
ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に連結された可溶性ヒトＴＮＦＲ（ｐ７５）の組換えバージョン（ｓＴＮＦＲ（ｐ７５）：Ｆｃ，Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標），Ｉｍｍｕｎｅｘ）の臨床試験から、その投与によって、ＲＡ疾患の活動性の有意かつ迅速な減少がもたらされたことが示された（Ｍｏｒｅｌａｎｄら、１９９７，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３７：１４１−１４７）。さらに、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）に対する小児科の臨床試験からの安全性データは、この薬物が、一般に、若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）を有する患者によって十分許容されることを示唆している（Ｇａｒｒｉｓｏｎら、１９９８，Ａｍ．Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｎｏｖ．９，１９９８，ａｂｓｔｒａｃｔ  ５８４）。
【００２５】
上で述べたように、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に連結されたヒト７５キロダルトン（ｐ７５）ＴＮＦＲの細胞外リガンド結合部分からなる二量体の融合タンパク質である。Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）のＦｃ構成要素は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびヒンジ領域を含むが、ＩｇＧ１のＣＨ１ドメインを含まない。Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）哺乳動物細胞発現系において産生される。それは、９３４アミノ酸からなり、およそ１５０キロダルトンの見かけの分子量を有する（Ｓｍｉｔｈら、１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：１０１９−１０２３；Ｍｏｈｌｅｒら、１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：１５４８−１５６１；米国特許第５，３９５，７６０号（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）；米国特許第５，６０５，６９０号（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）。
【００２６】
Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）は、現在、１つ以上の疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）に対して不十分な反応を有する患者における中等度から重度の活動性関節リウマチの徴候および症状の減少について示唆されている。Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）は、メトトレキサート単独に十分に反応しない患者において、メトトレキサートと併用して使用され得る。Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）は、１つ以上のＤＭＡＲＤに対して不十分な反応を有する患者における中等度から重度の活動性多関節型若年性関節リウマチの徴候および症状の減少についても示唆されている（１９９９年５月２８日）。Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）は、皮下注射として、１週間に２回、２５ｍｇでＲＡ患者に投与される。
【００２７】
現在、ＥＮＢＲＥＬ調製物を用いた処置は、１週間に２回皮下に投与されるが、これは、高価であり、患者にとって不快かつ不便である。したがって、本開示は、導入されるグリコシル化部位を欠く可溶性ＴＮＦレセプターの血清半減期と比べて改変されたポリペプチドの血清半減期を増加させる少なくとも１つの非内因性Ｎ結合型グリコシル化部位を導入するように改変されたＴＮＦ結合レセプター（例えば、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））の可溶性（例えば、細胞外）部分を含むＴＮＦアンタゴニストを提供する。
【００２８】
本明細書において使用される用語は、概して、当該分野における、本発明の文脈内における、および各用語が使用される特定の文脈における、それらの通常の意味を有する。ある特定の用語が、本発明の組成物および方法、ならびにそれらをどのように作製し使用するかを説明する際に、当業者にさらなる指針を提供するために下記または本明細書の他の箇所で論じられる。用語の任意の使用の範囲または意味は、その用語が使用される特定の文脈から明らかになるだろう。
【００２９】
「約」および「およそ」は、測定の性質または精度を考慮に入れると、通常、測定された量について許容され得る誤差の程度を意味するものとする。代表的には、例示的な誤差の程度は、所与の値または所与の値の範囲の２０パーセント（％）以内、好ましくは、１０％以内、より好ましくは、５％以内である。
【００３０】
あるいは、および生体系において特に、用語「約」および「およそ」は、１桁以内の値、好ましくは、所与の値の５倍以内の値、より好ましくは、２倍以内の値を意味し得る。
【００３１】
本発明の方法は、配列を互いに比較する工程（野生型配列と１つ以上の変異体（配列改変体）との比較を含む）を包含し得る。そのような比較は、代表的には、例えば、当該分野で周知の配列アラインメントプログラムおよび／またはアルゴリズム（いくつかの例を挙げれば、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＭＥＧＡＬＩＧＮ）を用いた、ポリマー配列のアラインメントを含む。当業者は、そのようなアラインメントでは、変異が残基の挿入または欠失を含む場合、配列アラインメントは、挿入されたまたは欠失された残基を含まないポリマー配列内に「ギャップ」（代表的には、ダッシュまたは「Ａ」によって表される）を導入し得ることを容易に認識し得る。
【００３２】
そのすべての文法的な形および綴りバリエーションにおける「相同」とは、「共通の進化的起源」を有する２つのタンパク質（同じ生物種内の上科由来のタンパク質ならびに異なる生物種由来の相同タンパク質を含む）間の関係性のことを指す。そのようなタンパク質（およびそれらをコードする核酸）は、同一性パーセントに関するものであるか、または特定の残基もしくはモチーフおよび保存された位置の存在によるものであるかに関係なく、それらの配列類似性によって反映される配列相同性を有する。
【００３３】
そのすべての文法上の形態における用語「配列類似性」とは、共通の進化的起源を共有するかもしれないし共有しないかもしれない、核酸配列間またはアミノ酸配列間の同一性または対応の程度のことを指す。
【００３４】
しかしながら、通常の使用法および本願において、用語「相同」は、「高度に」などの副詞で修飾されるとき、配列類似性のことを指し得、共通の進化的起源に関係することもあるし、関係しないこともある。
【００３５】
用語「薬物動態学的特性」とは、生理活性物質（例えば、小分子、ポリペプチド薬など）の吸収、分布、代謝および排出のことを指す。
【００３６】
２．糖改変体Ｆｃ融合タンパク質
異種ポリペプチドに連結された免疫グロブリン分子由来のＦｃドメインを有する糖改変体融合タンパク質が、本明細書中に提供される。その糖改変体融合タンパク質は、融合タンパク質のＦｃドメインの外側に少なくとも１つの非内因性Ｎ結合型グリコシル化部位を含む。そのＦｃドメインは、直接、またはポリペプチドリンカーを介して間接的に、異種ポリペプチドに連結され得る。非内因性グリコシル化部位は、異種ポリペプチド、リンカーまたはその両方に導入され得る。
【００３７】
「非内因性」、「導入される」または「新規の」グリコシル化部位とは、そのポリペプチドの改変されていないバージョンに存在しないグリコシル化部位のことを指す。したがって、本明細書中に記載される糖改変体融合タンパク質は、融合タンパク質の改変されていないバージョンに存在するグリコシル化部位の数と比べて、少なくとも１つのさらなるＮ結合型グリコシル化部位を有する。例えば、融合タンパク質の改変されていないバージョンが、Ｆｃドメインの外側に２つのグリコシル化部位を有し、１つのＮ結合型グリコシル化部位が、異種ポリペプチドに導入される場合、その糖改変体融合タンパク質は、２つの天然のグリコシル化部位および１つの導入されたグリコシル化部位を含む３つのＮ結合型グリコシル化部位を有することになる。天然に存在する改変体または人工の改変体もまた、グリコシル化部位の数を増加させる本発明の方法に従って改変され得るので、グリコシル化部位の数を増加させるための融合タンパク質の改変は、特定の「野生型」アミノ酸配列に限定されないことが理解されるべきである。
【００３８】
いくつかのタンパク質が多数の糖側鎖を担持し得ることは、周知である。Ｏ結合型グリコシル化部位間の距離は、わずか１つおきのアミノ酸であり得る（例えば、Ｋｏｌｓｅｔ  ＆  Ｔｖｅｉｔ（２００８）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ６５：１０７３−１０８５およびＫｉａｎｉら（２００２）Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）：１９−３２を参照のこと）。Ｎ結合型グリコシル化部位については、部位間の距離は、わずか３、４、５または６アミノ酸であり得る（例えば、Ｌｕｎｄｉｎら（２００７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８１：５６０１−５６０４（２００７）；Ａｐｗｅｉｌｅｒら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １４７３：４−８（これらの各々の全内容が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。したがって、ある特定の実施形態において、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは１００またはそれ以上のＮ結合型グリコシル化部位が、本明細書中に記載される融合タンパク質に付加され得る。ある特定の実施形態において、本開示の糖改変体融合タンパク質は、各１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０または２００アミノ酸あたり少なくとも１つのグリコシル化されたアミノ酸を含む。ある特定の実施形態において、Ｎ結合型グリコシル化された各アミノ酸は、他の任意のＮ結合型、Ｏ結合型、またはＮ結合型およびＯ結合型のグリコシル化されたアミノ酸と少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは１００またはそれ以上のアミノ酸だけ離れている。
【００３９】
本明細書中で使用されるとき、「グリコシル化部位」は、糖付着コンセンサス配列（すなわち、糖、（単糖、オリゴ糖または多糖のいずれか）をアミノ酸配列に付着するためのコンセンサス配列として作用する、ある範囲のアミノ酸）のことを意味し得るか、または糖成分が共有結合的に連結される実際のアミノ酸残基のことを意味し得る。その糖成分は、単糖（単糖分子）、オリゴ糖または多糖であり得る。
【００４０】
Ｎ結合型グリコシル化部位は、糖成分を付加するように、タンパク質のアミノ酸配列を改変することによって、または融合タンパク質におけるアミノ酸残基を化学的に改変することによって、融合タンパク質に導入され得る。好ましい実施形態において、本明細書中に記載される融合タンパク質は、コンセンサス配列ＮＸＴ／Ｓ（アスパラギン−Ｘ−セリン／トレオニン）（ここで、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）を有する少なくとも１つのＮ結合型グリコシル化部位を導入するように（例えば、指定のアミノ酸の挿入、欠失または置換によって）改変される。タンパク質上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、ポリペプチドへのグリコシドの化学的または酵素的な結合によるものである。例えば、用いられる結合の様式に依存して、糖成分は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン；（ｂ）遊離カルボキシル基；（ｃ）遊離スルフヒドリル基（例えば、システインのもの）；（ｄ）遊離ヒドロキシル基（例えば、セリン、トレオニンまたはヒドロキシプロリンのもの）；（ｅ）芳香族残基（例えば、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンのもの）；または（ｆ）グルタミンのアミド基に付着され得る。例えば、ＷＯ８７／０５３３０およびＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ（１９８１）ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。例示的な実施形態において、Ｎ結合型グリカンを生成するために、糖成分は、アルギニン残基に結合される。
【００４１】
例示的な実施形態において、糖成分は、宿主細胞において融合タンパク質を発現させることによって細胞機構を用いて、導入されたグリコシル化部位に付加される。一般に、融合タンパク質は、適切なグリコシル化を提供する哺乳動物細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞株）または他の哺乳動物発現細胞株において発現され得る。
【００４２】
ある特定の実施形態において、糖成分は、哺乳動物様のグリコシル化をもたらすように操作された非哺乳動物宿主細胞（例えば、酵母、細菌または昆虫細胞）を用いて、導入されたグリコシル化部位に付加され得る。ヒトにおける糖タンパク質のプロセシングを模倣する一連の酵素反応を行う遺伝的に改変されたグリコシル化経路を有する細胞株が開発されている。これらの操作された細胞において発現される組換えタンパク質は、実質的に同一でないにせよ、ヒトの対応物に類似の糖タンパク質（例えば、哺乳動物様のグリコシル化）をもたらす。
【００４３】
発現されるペプチドのグリコシル化プロファイルを変更するように宿主細胞を遺伝的に改変するための手法は、周知である。例えば、Ａｌｔｍａｎｎら（１９９９，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．１６：１０９−１２３）、Ａｉｌｏｒら（２０００，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １０（８）：８３７−８４７）、Ｊａｒｖｉｓら（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｍａｒｃｈ，１９９９，ａｂｓｔｒａｃｔ）、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｊａｒｖｉｓ（２００１，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １１（１）：１−９）およびＰａｌａｃｐａｃら（１９９９，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９６：４６９７）、Ｊａｒｖｉｓら（１９９８．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：５２８−５３３）、Ｇｅｍｇｒｏｓｓ（米国特許公開番号２００２０１３７１３４）（これらのすべてが、昆虫細胞または植物細胞をグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子でトランスフェクトすることによって、昆虫細胞発現系または植物細胞発現系を「ヒト化する（ｈｕｍｍａｎｉｚｅ）」手法を開示している）を参照のこと。
【００４４】
原核生物系において発現されるペプチドのグリコシル化プロファイルを遺伝的に変更する手法も存在する。インビボにおいてオリゴ糖を産生する、細菌Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＡｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ由来の様々なグリコシルトランスフェラーゼで大腸菌が操作されている（Ｂｅｔｔｌｅｒら、１９９９，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１６：２０５−２１２）。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのβ１，３Ｎアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ａｃｅｔｙｌ  ｇｌｕｃｏａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）ｌｇｔａ遺伝子を過剰発現するように遺伝的に操作された大腸菌は、外来性ラクトースを効率的にグリコシル化する（Ｐｒｉｅｍら、２００２，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２：２３５−２４０）。
【００４５】
真菌細胞は、外来性グリコシルトランスフェラーゼを産生するようにも遺伝的に改変されている（Ｙｏｓｈｉｄａら、１９９９，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，９（１）：５３−５８；Ｋａｌｓｎｅｒら、１９９５，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１２：３６０−３７０；Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋ  ａｎｄ  Ｅｒｎｓｔ，１９９４，Ｇｅｎｅ  １４５（２）：２９９−３０３；Ｃｈｉｂａら、１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３０８：４０５−４０９）。
【００４６】
ある特定の実施形態において、本開示のＦｃ融合タンパク質を発現する宿主細胞は、１つ以上の外来性グリコシルトランスフェラーゼ酵素および／または１つ以上の外来性グリコシダーゼ酵素を発現する真核細胞または原核細胞であり得、ここで、その宿主細胞内での組換え糖ペプチドの発現によって、「ヒト」グリカン構造を有する組換え糖ペプチドが産生される。
【００４７】
いくつかの実施形態において、上記細胞において有用な異種グリコシルトランスフェラーゼ酵素は、例えば、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら（２００２，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｇｅｎｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎ．Ｙ．）において入手可能なグリコシルトランスフェラーゼファミリーのリストに含められた任意の公知のグリコシルトランスフェラーゼ酵素からなる群より選択され得る。
【００４８】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、宿主細胞内での組換え糖ペプチドの発現によって、「ヒト」グリカン構造を有する組換え糖ペプチドが産生されるように、１つ以上の内因性グリコシルトランスフェラーゼ酵素および／または１つ以上の内因性グリコシダーゼ酵素が不活性化された、真核細胞または原核細胞であり得る。
【００４９】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、異種のグリコシルトランスフェラーゼ酵素および／またはグリコシダーゼ酵素を発現し得、同時に、１つ以上の内因性のグリコシルトランスフェラーゼ酵素および／またはグリコシダーゼ酵素が不活性化されている。内因性のグリコシルトランスフェラーゼ酵素および／またはグリコシダーゼ酵素は、当業者に公知の任意の手法を用いて不活性化され得、その手法としては、アンチセンス法、および宿主細胞のゲノムに核酸を挿入することを含む手法が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５０】
例示的な実施形態において、本明細書中に記載される糖改変体融合タンパク質は、その融合タンパク質の改変されていない形態と比べて高い安定性および／または増加された血清半減期を有する。例示的な実施形態において、糖改変体融合タンパク質の血清半減期は、その融合タンパク質の改変されていない形態と比べて、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％もしくは３００％またはそれ以上増加される。ある特定の実施形態において、改変されたＦｃ融合タンパク質およびさらなるグリコシル化部位を欠く融合ポリペプチドの血清半減期は、比較のために、同じ動物モデルまたは動物種において測定される。例示的な実施形態において、血清半減期は、本明細書中に記載されるような薬物動態学的ラットアッセイまたは薬物動態学的サルアッセイにおいて測定される（例えば、実施例４および５を参照のこと）。
【００５１】
例示的な実施形態において、１つ以上の非内因性グリコシル化部位の導入は、融合タンパク質の異種ポリペプチド部分の１つ以上の生物学的活性に有意に影響しない。例えば、融合タンパク質の異種ポリペプチド部分の１つ以上の生物学的活性は、１０倍、５倍、３倍、２．５倍、２倍、１．５倍、１倍、０．５倍未満またはそれより少なく、影響され得る。異種ポリペプチド部分の生物学的活性の例は、本明細書中にさらに記載されるが、例えば、タンパク質間相互作用、リガンド結合、生理学的活性などが挙げられる。
【００５２】
例示的な実施形態において、１つ以上の非内因性グリコシル化部位が、Ｆｃ融合タンパク質の異種部分に導入される。Ｆｃ融合タンパク質の異種部分は、触媒ドメインまたはリガンド結合ドメインを含み得る。本明細書中で使用されるとき、「リガンド結合ドメイン」とは、別の分子、例えば、リガンドと相互作用するタンパク質上の領域のことを指す。例えば、リガンド結合ドメインとは、抗体によって結合されるタンパク質上の領域、抗原に結合する抗体上の領域、リガンドに結合するレセプター上の領域、レセプターに結合するリガンド上の領域、第２のポリペプチドに結合する第１のポリペプチド上の領域、小分子に結合するポリペプチド上の領域などのことを指し得る。例示的な実施形態において、リガンド結合ドメインは、リガンドに結合する膜貫通レセプタータンパク質の細胞外ドメイン内の領域である。本明細書中で使用されるとき、「触媒ドメイン」とは、機能活性を有する領域のことを指す。触媒ドメインの例としては、例えば、キナーゼドメイン、ホスファターゼドメイン、プロテアーゼドメインが挙げられる。
【００５３】
例示的な実施形態において、１つ以上の非内因性グリコシル化部位は、可撓性または非構造である、表面に露出した領域（例えば、αヘリックスおよび／またはβシートを接続するループ領域）に導入される。通常、タンパク質は、二次構造および三次構造を有するポリペプチド鎖である。ポリペプチドの二次構造は、αヘリックスおよびβシートと呼ばれる２つの一般的な構造ドメインへのポリペプチド鎖のフォールディングを含む。タンパク質の三次構造は、様々な長さおよび不規則な形状のループ領域によって接続される、αヘリックスおよびβシートである二次構造の組み合わせからなる。一般に、二次構造エレメントの組み合わせによって、安定な疎水性コアが形成され、ループ領域は、タンパク質の表面に提示される。ループ領域は、溶媒に曝露されるので、それらは、一般に、内部の構造的に安定な二次構造ドメイン（例えば、αヘリックスおよびβシートドメイン）よりも、様々な反応性分子およびタンパク質酵素（例えば、プロテアーゼ）による求核攻撃／ペプチド結合切断を受けやすい。
【００５４】
ある特定の実施形態において、融合タンパク質の異種ポリペプチド部分における１つ以上の天然に存在するグリコシル化部位（例えば、改変されていない形態のタンパク質におけるグリコシル化部位）を除去することが望ましい場合がある。例えば、Ｎ結合型グリコシル化部位の間隔を変更するために、天然に存在するグリコシル化部位を除去し、次いで、所望の位置に２つの非内因性グリコシル化部位を導入することが望ましい場合がある。さらに、融合タンパク質に存在する天然に存在するＯ結合型グリコシル化部位の１つ以上を除去することが望ましい場合がある。
【００５５】
Ｎ結合型およびＯ結合型のグリコシル化部位は、コンセンサスアミノ酸配列を削除することによって、またはアミノ酸残基から糖成分を化学的もしくは酵素的に切断することによって、除去され得る。例えば、Ｎ結合型グリコシル化部位は、Ｎ結合型グリコシル化認識部位（すなわち、ＮＸＴ／Ｓ）の１番目もしくは３番目のアミノ酸の位置の一方もしくは両方におけるアミノ酸の置換もしくは欠失、および／またはそのトリペプチド配列の２番目の位置のアミノ酸の欠失によって除去され得る。Ｏ結合型グリコシル化部位は、１つ以上のセリンもしくはトレオニン残基の付加、欠失もしくは置換、および／または下記に示されるようなＯ結合型コンセンサス配列の破壊によって除去され得る。あるいは、ポリペプチド上に存在する１つ以上の天然に存在する炭水化物部分の除去が、化学的および／または酵素的に達成され得る。化学的な脱グリコシル化は、例えば、グリコシル化されたポリペプチドをトリフルオロメタンスルホン酸化合物または等価な化合物に曝露することを含み得る。この処理は、アミノ酸配列がインタクトなままで、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんどまたはすべての糖の切断をもたらす。化学的な脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら（１９８７）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２およびＥｄｇｅら（１９８１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１によってさらに説明されている。グリコシル化されたポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０によって説明されているような様々なエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用によって達成され得る。
【００５６】
ある特定の実施形態において、１つ以上の非内因性Ｎ結合型グリコシル化部位に加えて１つ以上のＯ結合型グリコシル化部位を導入することが望ましい場合がある。Ｏ結合型グリコシル化部位は、Ｏ結合型グリコシル化コンセンサス配列をポリペプチドに導入することによって、タンパク質に付加され得る。例示的なＯ結合型コンセンサス配列としては、例えば、ＣＸＸＧＧＴ／Ｓ−Ｃ、ＮＳＴＥ／ＤＡ、ＮＩＴＱＳ、ＱＳｌＱＳ、０／Ｅ−ＦＩ１ＲＺＫ−Ｖ、Ｃ−Ｅ／Ｄ−ＳＮおよびＧＧＳＣ−Ｋ／Ｒが挙げられる。あるいは、Ｏ結合型糖成分は、ポリペプチド内のアミノ酸を化学的に改変することによって導入され得る。例えば、ＷＯ８７／０５３３０およびＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ（１９８１）ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００５７】
ある特定の実施形態において、本明細書中に記載される糖改変体ポリペプチドは、さらなるドメイン（例えば、リーダー配列、リンカーおよび／または精製／同定タグ）を含み得る。
【００５８】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、シグナル配列、例えば、ミツバチメリチンリーダー（ＨＢＭＬ）：ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号１０）；組織プラスミノゲンアクチベーター（ＴＰＡ）リーダー：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号１１）；または（ｉｉｉ）天然のリーダー配列を含み得る。
【００５９】
本開示の融合タンパク質は、必要に応じてリンカードメインを含み得る。ある特定の実施形態において、融合タンパク質は、Ｆｃドメインと異種ポリペプチドドメインとの間に位置する比較的非構造のリンカーを含む。この非構造リンカーは、１、２、３、４もしくは５アミノ酸の人工配列、または二次構造を比較的含まない５〜１０、１５、２０、３０、５０もしくはそれ以上の長さのアミノ酸であり得る。リンカーは、グリシン残基およびプロリン残基に富んでいることがあり、例えば、トレオニン／セリンおよびグリシンの単一配列またはトレオニン／セリンおよびグリシンの反復配列（例えば、ＴＧ３（配列番号１２）またはＳＧ３（配列番号１３）のシングレットまたは反復）を含み得る。ある特定の実施形態において、導入されるグリコシル化部位の１つ以上が、リンカードメイン内に配置され得る。
【００６０】
本開示の融合タンパク質は、その融合タンパク質の単離および／または検出を容易にするドメインを含み得る。そのようなドメインの周知の例としては、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）またはヒト血清アルブミンが挙げられるがこれらに限定されない。融合ドメインは、所望の特性を付与するように選択され得る。例えば、いくつかの融合ドメインが、アフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離にとって特に有用である。親和性精製のために、アフィニティークロマトグラフィーにとって適切なマトリックス（例えば、グルタチオン、アミラーゼおよびニッケルまたはコバルトに結合体化された樹脂）が使用される。そのようなマトリックスの多くは、「キット」の形態で入手可能である（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＧＳＴ精製システム、および（ＨＩＳ６）融合パートナーを用いたとき有用であるＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）システム（Ｑｉａｇｅｎ））。別の例として、融合ドメインは、ポリペプチドの検出を容易にするように選択され得る。そのような検出ドメインの例としては、様々な蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）、ならびに特異的な抗体が入手可能な通常短いペプチド配列である「エピトープタグ」が挙げられる。特異的なモノクローナル抗体が容易に入手可能な周知のエピトープタグとしては、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）およびｃ−ｍｙｃタグが挙げられる。場合によっては、融合ドメインは、適切なプロテアーゼが融合タンパク質を部分的に消化することによってそこから組換えタンパク質が遊離されるのを可能にするプロテアーゼ切断部位（例えば、Ｘａ因子またはトロンビンに対するもの）を有する。次いで、遊離されたタンパク質は、その後のクロマトグラフィー分離によって、融合ドメインから単離され得る。
【００６１】
融合タンパク質の種々のエレメントが、所望の機能性と一致する任意の様式で配列され得ることが理解される。例えば、Ｆｃドメインが、異種ポリペプチドドメインに対してＣ末端に配置され得るか、あるいは、異種ポリペプチドドメインが、Ｆｃドメインに対してＣ末端に配置され得る。そのＦｃドメインおよび異種ドメインは、融合タンパク質において隣接している必要はなく、さらなるドメインまたはアミノ酸配列が、いずれかのドメインに対してＣ末端もしくはＮ末端に、またはそれらのドメイン間に含められ得る。
【００６２】
ある特定の実施形態において、糖改変体融合タンパク質は：ＰＥＧ化されたアミノ酸、ファルネシル化されたアミノ酸、アセチル化されたアミノ酸、ビオチン化されたアミノ酸、脂質部分に結合体化されたアミノ酸、および有機誘導体化剤に結合体化されたアミノ酸から選択される１つ以上のさらなる改変されたアミノ酸残基を含み得る。そのような翻訳後修飾の結果として、本明細書中に記載される融合タンパク質は、非アミノ酸エレメント（例えば、ポリエチレングリコール、脂質およびホスフェート）を含み得る。種々の細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、Ｗ１３８、ＮＩＨ−３Ｔ３またはＨＥＫ２９３）は、そのような翻訳後の活性に対する特定の細胞機構および特徴的な機構を有し、本発明のポリペプチドの正確な改変およびプロセシングを確実にするように選択され得る。
【００６３】
本開示の融合タンパク質は、通常、少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００もしくは１１０ｋＤａまたはそれ以上のサイズである高分子量である。
【００６４】
例示的な実施形態において、本開示は、Ｆｃドメインの外側に少なくとも１つの非内因性Ｎ結合型グリコシル化部位を有するＴＮＦＲ２−Ｆｃ糖改変体融合タンパク質を提供する。ある特定の実施形態において、本発明の糖改変体融合タンパク質は、配列番号１８、２１、２２、２３または２４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含み得る。ある特定の場合において、糖改変体融合タンパク質は、配列番号１８、２１、２２、２３または２４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有する。
【００６５】
ある特定の実施形態において、本明細書中に記載される糖改変体Ｆｃ融合タンパク質は、ＡｃｔＲＩＩｂレセプターの細胞外ドメインおよび／または抗体の可変領域を含まない。
【００６６】
Ｆｃドメイン
本明細書中に記載される糖改変体融合タンパク質は、異種ポリペプチドに融合された免疫グロブリン重鎖Ｆｃドメインを含む。免疫グロブリンのＦｃ部分との融合は、広範囲のタンパク質に対して望ましい薬物動態学的特性を付与すると知られている。本明細書中で使用される用語「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」とは、天然配列Ｆｃ領域および改変体Ｆｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域のことを指す。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は、様々であり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基またはＰｒｏ２３０から免疫グロブリンのカルボキシル末端に及ぶと規定される。Ｆｃ領域のＣ末端のリジン（ＥＵナンバリングシステムによれば残基４４７）は、例えば、抗体の重鎖をコードする核酸を組換え的に操作するとき、除去され得る。別段示されない限り、本明細書において免疫グロブリン重鎖内の残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）（本明細書中で参考として明確に援用される）におけるようなＥＵインデックスのナンバリングである。「ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックス」とは、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基のナンバリングのことを指す。
【００６７】
「天然配列Ｆｃ領域」は、天然に見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトＦｃ領域には、天然配列ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域（非ＡおよびＡアロタイプ）；天然配列ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域；天然配列ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域；および天然配列ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域、ならびにそれらの天然に存在する改変体が含まれる。
【００６８】
「改変体Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸の改変、好ましくは、１つ以上のアミノ酸置換のせいで、天然配列Ｆｃ領域のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、改変体Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換（例えば、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域における、約１〜約１０個のアミノ酸の置換、好ましくは、約１〜約５個のアミノ酸の置換）を有する。本明細書中の改変体Ｆｃ領域は、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の相同性、最も好ましくは、それらと少なくとも約９０％の相同性、より好ましくは、それらと少なくとも約９５％の相同性を有し得る。
【００６９】
好ましい実施形態において、本明細書中に記載されるＦｃ融合タンパク質は、免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅ）ＦｃドメインのＣ末端部分のＮ末端に融合された異種部分を有する。好ましくは、パパイン切断部位のすぐ上流のヒンジ領域から開始する配列（例えば、重鎖定常領域の１番目の残基を１１４または他の免疫グロブリンの類似部位と考えて）が融合に使用される。１つの実施形態において、異種ドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ３重鎖の、ヒンジ領域およびＣＨ２およびＣＨ３、またはＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに融合される。いくつかの実施形態において、融合が行われる正確な部位は重大ではなく、最適な部位が日常的な実験によって決定され得る。
【００７０】
ヒトＦｃドメインについては、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３免疫グロブリン配列を使用することが好ましい。ＩｇＧ１を使用する主な利点は、ＩｇＧ１融合タンパク質が、固定化されたプロテインＡ上で効率的に精製され得る点である。対照的に、ＩｇＧ３融合タンパク質の精製には、それほど著しく多用途でない基材であるプロテインＧが必要である。しかしながら、免疫グロブリンの他の構造的および機能的な特性が、特定の構築に対するＩｇ融合パートナーを選択する際に考慮されるべきである。例えば、ＩｇＧ３ヒンジは、より長く、かつより可撓性であるので、ＩｇＧ１に融合されたときに正しく折り畳まれないかまたは機能しない可能性があるより大きな異種部分を受け入れることができる。別の考慮すべき点は、結合価であり得る；ＩｇＧイムノアドヘシンは、二価のホモ二量体であるのに対し、ＩｇＡおよびＩｇＭのようなＩｇサブタイプはそれぞれ、基本的なＩｇホモ二量体単位の二量体または五量体の構造を生じ得る。
【００７１】
インビボで適用するために設計されたＦｃ融合タンパク質については、薬物動態学的特性およびＦｃ領域によって特定されるエフェクター機能が、同様に重要である。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４のすべてが、２１日というインビボ半減期を有するが、補体系を活性化する際のそれらの相対的な力価は異なる。ＩｇＧ４は、補体を活性化せず、ＩｇＧ２は、補体活性化がＩｇＧ１よりも有意に弱い。さらに、ＩｇＧ１とは異なり、ＩｇＧ２は、単核細胞上または好中球上のＦｃレセプターに結合しない。ＩｇＧ３は、補体活性化にとって最適であるが、そのインビボ半減期は、他のＩｇＧアイソタイプのおよそ３分の１である。
【００７２】
ヒト治療薬として使用するために設計されるＦｃ融合タンパク質に対する別の重要な考慮すべき点は、特定のアイソタイプのアロタイプ改変体の数である。一般に、血清学的に定義されるアロタイプがより少ないＩｇＧアイソタイプが好ましい。例えば、ＩｇＧ１は、４つの血清学的に定義されるアロタイプ部位しか有さず、そのうちの２つ（ＧＩｍおよび２）は、Ｆｃ領域内に配置されており；これらの部位のうちの１つであるＧｌｍｌは、免疫原性でない。対照的に、ＩｇＧ３には、血清学的に定義されるアロタイプが１２個存在し、そのすべてが、Ｆｃ領域に存在し；これらの部位のうちの３つ（Ｇ３ｍ５、１１および２１）だけが、免疫原性でない１つのアロタイプを有する。したがって、ＩｇＧ３融合タンパク質の潜在的な免疫原性は、ＩｇＧ１融合タンパク質のそれよりも高い。
【００７３】
ある特定の実施形態において、Ｆｃ融合タンパク質において使用されるＦｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較して１つ以上の変更を含み得る。それにもかかわらず、これらのＦｃドメインは、それらの野生型対応物と比較して、治療的有用性に必要な実質的に同じ特徴を保持し得る。例えばＷＯ９９／５１６４２に記載されているような、例えば、変更された（すなわち、改善されたまたは減少された）ＣＩｑ結合および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらし得るある特定の変更がＦｃ領域内において行われ得ると考えられる。Ｆｃ領域改変体の他の例に関係する、Ｄｕｎｃａｎ  ＆  Ｗｉｎｔｅｒ  Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８−４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；およびＷＯ９４／２９３５１も参照のこと。ＷＯ００／４２０７２（Ｐｒｅｓｔａ）およびＷＯ２００４／０５６３１２（Ｌｏｗｍａｎ）には、ＦｃＲに対する結合性が改善されたまたは減少された抗体改変体が記載されている。これらの特許公報の内容は、本明細書中で明確に参考として援用される。Ｓｈｉｅｌｄｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）もまた参照のこと。増加された半減期、および母体のＩｇＧを胎児に移行させるのに関与する新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））に対する改善された結合性を有する抗体は、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する１つ以上の置換をその抗体中に有するＦｃ領域（ｒｅｇ  ｏｎ）を含む。変更されたＦｃ領域アミノ酸配列および増加されたまたは減少されたＣＩｑ結合能を有するポリペプチド改変体は、米国特許第６，１９４，５５１号および国際公開ＷＯ９９／５１６４２に記載されている。Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）もまた参照のこと。これらの内容は、本明細書中で明確に参考として援用される。
【００７４】
例示的なＦｃドメインを下に示す。
【００７５】
【化１】
2013512674.tif 000003
都合のよいリンカー（ＴＧ３）とＦｃドメインとが組み合わされた例を下に示す。
【００７６】
【化２】
2013512674.tif 000004
必要に応じて、Ｆｃドメインは、残基（例えば、Ａｓｐ−２６５、リジン３２２およびＡｓｎ−４３４）に１つ以上の変異を有する。ある特定の場合において、これらの変異の１つ以上（例えば、Ａｓｐ−２６５変異）を有する変異体Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比べて、Ｆｃγレセプターに結合する能力が低下している。他の場合では、これらの変異の１つ以上（例えば、Ａｓｎ−４３４変異）を有する変異体Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比べて、ＭＨＣクラスＩ関連Ｆｃレセプター（ＦｃＲＮ）に結合する能力が増加している。
【００７７】
異種ポリペプチド
本明細書中に記載される糖改変体融合タンパク質は、Ｆｃドメインに直接または間接的に融合された異種ポリペプチド部分も含む。その異種ポリペプチド部分は、任意のポリペプチドであり得る。例示的な実施形態において、異種ポリペプチド部分は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００ｋＤａまたはそれ以上の分子量を有する。
【００７８】
異種ポリペプチド部分は、治療用タンパク質またはそのフラグメント（例えば、成長因子、酵素、血清酵素、内分泌因子（例えば、ＧＬＰ１）、骨形成タンパク質および可溶性レセプターフラグメント）であり得る。例示的な異種ポリペプチドとしては、成長因子（例えば、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（例えば、ＴＧＦ−アルファ、ＴＧＦ−ベータ、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ；例えば、ＶＥＧＦ−２））、インターフェロン（例えば、ＩＮＦ−アルファ、ＩＮＦ−ベータ）およびインスリンが挙げられる。他の例示的な異種ポリペプチドとしては、アルファ−ガラクトシダーゼ（例えば、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（商標））などの酵素が挙げられる。他の例示的な異種ポリペプチドとしては、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、ミオスタチンおよび腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）が挙げられる。他の例示的な異種ポリペプチドとしては、膜貫通レセプターの細胞外ドメイン（細胞レセプターの任意の天然に存在する細胞外ドメイン、ならびにその任意の改変体（変異体、フラグメントおよびペプチド模倣型を含む）を含む）が挙げられる。
【００７９】
例示的な実施形態において、異種ポリペプチド部分は、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのレセプター由来のレセプターの細胞外ドメインである。可溶性レセプターポリペプチドの例としては、例えば、本開示の配列番号２、５、６、７または８が挙げられる。好ましい実施形態において、少なくとも１つの非内因性Ｎ結合型グリコシル化部位を有する糖改変体融合タンパク質に含められる細胞外レセプタードメインは、天然に存在するレセプターのリガンドに結合する能力を有する。ある特定の実施形態において、非内因性Ｎ結合型グリコシル化部位が、細胞外レセプタードメインのリガンド結合ポケットの外側に導入される。好ましくは、導入されるグリコシル化部位のグリコシル化は、レセプタータンパク質と可溶性リガンドとの結合に有意に影響しない。例示的な実施形態において、導入されるグリコシル化部位（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｄ）のグリコシル化は、細胞外レセプタードメインとそのリガンドとの結合を、１０倍、５倍、３倍、２．５倍、２倍、１．５倍、１倍、０．５倍またはそれ未満より大きく減少させない。好ましくは、少なくとも１つの非内因性Ｎ結合型グリコシル化部位を含む可溶性レセプタードメインは、１μＭ未満または１００、１０もしくは１ｎＭ未満の解離定数で特定のリガンドに結合し得る。
【００８０】
１つの実施形態において、本明細書中に記載される糖改変体融合タンパク質は、神経成長因子（ＮＧＦ）／腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプターファミリー由来のレセプターの細胞外ドメインを含む異種ポリペプチド部分を含む。例えば、Ｍ．Ｌｏｔｚら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，６０：１−７（１９９０）を参照のこと。そのＮＧＦ／ＴＮＦレセプターファミリーには、例えば、神経成長因子レセプター（ＮＧＦＲ）、ＴＮＦＲ１（またはＴＮＦＲ５５）、ＴＮＦＲ２（またはＴＮＦＲ７５）、ＴＮＦレセプター関連タンパク質（ＴＮＦＲｒｐ）、ＣＤ４０、Ｈｏｄｇｋｉｎ抗原ＣＤ３０、Ｔ細胞抗原ＣＤ２７、Ｆａｓ／ＡＰＯ−１、ＯＸ−４０および４−１ＢＢ／ＩＬＡが含まれる。例示的な実施形態において、本明細書中に記載される融合タンパク質は、少なくとも１つの非内因性Ｎ結合型グリコシル化部位を有するＴＮＦＲ２の細胞外ドメインを含む。
【００８１】
本明細書中で使用されるとき、用語「ＴＮＦＲ２」とは、任意の種由来の腫瘍壊死因子レセプター２型（ＴＮＦＲ２）タンパク質のファミリー、および突然変異誘発または他の改変によるそのようなＴＮＦＲ２タンパク質に由来する改変体のことを指す。ＴＮＦＲ２ファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチ領域を含むリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達活性を有すると予測される細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。
【００８２】
用語「ＴＮＦＲ２ポリペプチド」には、ＴＮＦＲ２ファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチド、ならびに有用な活性を有するその任意の改変体（変異体、フラグメント、融合物およびペプチド模倣型を含む）を含むポリペプチドが含まれる。例えば、ＴＮＦＲ２ポリペプチドには、ＴＮＦＲ２ポリペプチドの配列と少なくとも約８０％同一、好ましくは、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはそれ以上同一の配列を有する任意の公知のＴＮＦＲ２の配列に由来するポリペプチドが含まれる。例えば、本発明のＴＮＦＲ２ポリペプチドは、ＴＮＦαまたはＴＮＦβに結合し得、ＴＮＦＲ２タンパク質および／またはＴＮＦαもしくはＴＮＦβの機能を阻害し得る。ＴＮＦＲ２ポリペプチドの例としては、ヒトＴＮＦＲ２前駆体ポリペプチド（配列番号１）および可溶性ヒトＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、配列番号２、５、６、７または８）が挙げられる。
【００８３】
ヒトＴＮＦＲ２前駆体タンパク質配列は、以下のとおりである：
【００８４】
【化３】
2013512674.tif 000005
シグナルペプチドに一重下線が引かれている；細胞外ドメインは太字であり、潜在的なＮ結合型グリコシル化部位には二重下線が引かれている。
【００８５】
プロセシングされたヒトＴＮＦＲ２可溶性（細胞外）ポリペプチド配列は、以下のとおりである：
【００８６】
【化４】
2013512674.tif 000006
天然に存在するＮ結合型グリコシル化部位に下線が引かれている。本明細書中で報告されるように、アミノ末端のロイシンは、削除され得、アミノ末端にはプロリン残基が残っている。
【００８７】
ヒトＴＲＦＲ２前駆体タンパク質をコードする核酸配列は、以下のとおりである（ＧｅｎｂａｎｋエントリーＮＭ＿００１０６６．２）：
【００８８】
【化５】
2013512674.tif 000007
【００８９】
【化６】
2013512674.tif 000008
ヒトＴＮＦＲ２可溶性（細胞外）ポリペプチドをコードする核酸配列は、以下のとおりである：
【００９０】
【化７】
2013512674.tif 000009
本開示は、１つ以上のＮ結合型グリコシル化部位（ＮＸＳ／Ｔ）の付加によって、改変されていないＴＮＦＲ２−Ｆｃタンパク質と比べてＴＮＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質の血清半減期が増加されることを証明する。Ｎ結合型グリコシル化部位は、既存のＳもしくはＴに対して、正しい位置にＮを導入することによって、または既存のＮに対して、正しい位置にＳもしくはＴを導入することによって、最小労力で導入され得る。ＴＮＦＲ２における非内因性ＮＸＳ／Ｔ配列の導入に特に適した部位としては、例えば、配列番号２について、アミノ酸２５〜２７（ＤＱＴ）、２６〜２８（ＱＩＡ）、１３３〜１３５（ＥＴＳ）および２３１〜２３３（ＧＳＴ）が挙げられる。例えば、Ｎ結合型グリコシル化部位を導入し得る望ましい変更は：Ｄ２５Ｎ、Ｑ２６Ｎ、Ａ２８Ｓ、Ｅ１３３ＮおよびＧ２３１Ｎである。場合によっては、いくつかのアミノ酸が、非内因性のＮＸＳ／Ｔ配列を導入するように改変され得る。例えば、Ｑ２６Ｎ／Ａ２８Ｓの二重置換は、配列番号２の残基２６〜２８において、新規のＮ結合型グリコシル化部位を導入するために必要なＮ残基とＳ残基の両方を提供する。さらに、ＴＮＦＲ２−Ｆｃポリペプチド上の１つより多い領域が、複数のＮ結合型グリコシル化部位を導入するように改変され得る。例えば、Ｄ２５Ｎ／Ｅ１３３Ｎの二重置換は、配列番号２の残基２５〜２７および１３３〜１３５において２つのＮ結合型グリコシル化部位を導入し、Ｄ２５Ｎ／Ｇ２３１Ｎの二重置換は、配列番号２の残基２５〜２７および２３１〜２３３において２つのＮ結合型グリコシル化部位を導入する。他の例示的なＴＮＦＲ２改変体としては、例えば、Ｅ１３３Ｎ／Ｇ２３１Ｎ、Ｑ２６Ｎ／Ａ２８Ｓ／Ｅ１３３ＮおよびＱ２６Ｎ／Ａ２８Ｓ／Ｇ２３１Ｎが挙げられる。グリコシル化されると予測される任意のＳが、グリコシル化によってもたらされる保護に起因して、免疫原性部位を作り出すことなくＴに変更され得る。同様に、グリコシル化されると予測される任意のＴが、Ｓに変更され得る。
【００９１】
３．糖改変体融合タンパク質をコードする核酸
ある特定の態様において、本発明は、本発明の糖改変体融合タンパク質（本明細書中に開示されるフラグメントおよび機能的改変体を含む）のいずれかをコードする単離された核酸および／または組換え核酸を提供する。その主題の核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。そのような核酸は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であり得る。これらの核酸は、例えば、本発明の糖改変体融合タンパク質を作製するための方法において、または直接的な治療薬として（例えば、遺伝子治療アプローチにおいて）、使用され得る。
【００９２】
例示的な実施形態において、本発明の核酸は、ＴＮＦＲ２−Ｆｃ糖改変体融合タンパク質をコードする。例えば、配列番号３は、天然に存在するヒトＴＮＦＲ２前駆体ポリペプチドをコードし、配列番号４は、ＴＮＦＲ２のプロセシングされた細胞外ドメインをコードする。
【００９３】
ある特定の実施形態において、本発明の糖改変体融合タンパク質をコードする主題の核酸は、配列番号３、４、９または１７の改変体である核酸を含むとさらに理解される。改変体ヌクレオチド配列は、１つ以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失によって異なる配列（例えば、対立遺伝子改変体）を含む。例示的な実施形態において、その改変体核酸は、コードされたタンパク質内に１つ以上の非内因性Ｎ結合型グリコシル化部位を導入する核酸配列改変を含む。
【００９４】
ある特定の実施形態において、本発明は、配列番号３、４、９または１７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であり、かつコードされたタンパク質内に非内因性Ｎ結合型グリコシル化部位を導入する１つ以上の配列改変を含む、単離された核酸配列または組換え核酸配列を提供する。当業者は、コードされたタンパク質内に１つ以上の非内因性Ｎ結合型グリコシル化部位を導入する、配列番号３、４、９または１７に相補的な核酸配列および配列番号３、４、９または１７の改変体もまた本発明の範囲内であることを認識するだろう。さらなる実施形態において、本発明の核酸配列は、単離され得、組換えであり得、および／もしくは異種ヌクレオチド配列と融合され得るか、またはＤＮＡライブラリー中のものであり得る。
【００９５】
他の実施形態において、本発明の核酸はまた、配列番号３、４、９もしくは１７において指定されるヌクレオチド配列、配列番号３、４、９もしくは１７の相補配列、またはそれらのフラグメントに高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。そのようなヌクレオチド配列は、１つ以上の非内因性Ｎ結合型グリコシル化部位を有する糖改変体タンパク質融合物をコードする。当業者は、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件が変動し得ることを容易に理解するだろう。当業者は、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件が変動し得ることを容易に理解するだろう。例えば、約４５℃の６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）におけるハイブリダイゼーションに続く、５０℃の２．０×ＳＳＣでの洗浄が行われ得る。例えば、洗浄工程における塩濃度は、５０℃の約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから５０℃の約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーより選択され得る。さらに、洗浄工程における温度は、室温である約２２℃での低ストリンジェンシー条件から約６５℃の高ストリンジェンシー条件に上昇され得る。温度と塩の両方が、変動し得るか、または温度もしくは塩濃度が一定に保持され得る一方で、他方の変数が変更される。１つの実施形態において、本発明は、室温の６×ＳＳＣに続く室温の２×ＳＳＣでの洗浄の低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。
【００９６】
遺伝暗号の縮重に起因して配列番号３、４または９に示されるような核酸と異なり、かつコードされるタンパク質に１つ以上の非内因性Ｎ結合型グリコシル化部位を導入する、単離された核酸改変体もまた、本発明の範囲内である。例えば、いくつかのアミノ酸が、１つより多いトリプレットによって指定される。同じアミノ酸を特定するコドン、すなわちシノニム（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣは、ヒスチジンに対するシノニムである）は、そのタンパク質のアミノ酸配列に影響しない「サイレント」変異をもたらし得る。しかしながら、その主題のタンパク質のアミノ酸配列を変更させるＤＮＡ配列多型が哺乳動物細胞間に存在し得ると予想される。当業者は、特定のタンパク質をコードする核酸の１つ以上のヌクレオチド（ヌクレオチドの約３〜５％まで）におけるこれらのバリエーションが、天然の対立遺伝子バリエーションに起因して所与の種の個体間に存在し得ることを認識するだろう。任意のおよびすべてのそのようなヌクレオチドバリエーションおよびその結果得られるアミノ酸多型が、本発明の範囲内である。
【００９７】
ある特定の実施形態において、本発明の組換え核酸は、発現構築物内の１つ以上の制御ヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。制御ヌクレオチド配列は、一般に、発現のために使用される宿主細胞にとって適切なものであり得る。数多くのタイプの適切な発現ベクターおよび適当な制御配列が、様々な宿主細胞について当該分野で公知である。代表的には、前記１つ以上の制御ヌクレオチド配列としては、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および翻訳終結配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列が挙げられ得るがこれらに限定されない。当該分野で公知であるような構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターが、本発明によって企図される。それらのプロモーターは、天然に存在するプロモーター、または２つ以上のプロモーターのエレメントを組み合わせたハイブリッドプロモーターであり得る。発現構築物は、エピソーム（例えば、プラスミド）上において細胞内に存在し得るか、または発現構築物は、染色体に挿入され得る。好ましい実施形態において、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択可能なマーカー遺伝子は、当該分野で周知であり、使用される宿主細胞によって異なる。
【００９８】
ある特定の実施形態において、主題の核酸は、本発明の糖改変体融合タンパク質をコードし、かつ少なくとも１つの制御配列に作動可能に連結された、ヌクレオチド配列を含む発現ベクターとして提供される。制御配列は、当該分野において認められたものであり、本発明のポリペプチドの発現を指示するように選択される。したがって、制御配列という用語には、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節エレメントが含まれる。例示的な制御配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。例えば、作動可能に連結されたときＤＮＡ配列の発現を調節する多種多様な発現調節配列のいずれかが、糖改変体融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を発現させるためにこれらのベクターにおいて使用され得る。そのような有用な発現調節配列としては、例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルスの最初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣまたはＴＲＣ系、発現がＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによって指示されるＴ７プロモーター、ファージラムダの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質に対する調節領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素に対するプロモーター、酸ホスファターゼ（例えば、Ｐｈｏ５）のプロモーター、酵母アルファ接合因子のプロモーター、バキュロウイルス系の多角体プロモーター、および原核細胞もしくは真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を調節すると知られている他の配列、ならびにそれらの様々な組み合わせが挙げられる。発現ベクターのデザインは、形質転換される宿主細胞の選択および／または発現が望まれるタンパク質のタイプのような因子に依存し得ることが理解されるべきである。さらに、ベクターのコピー数、そのコピー数およびそのベクターによってコードされる他の任意のタンパク質（例えば、抗生物質マーカー）の発現を調節する能力もまた考慮されるべきである。
【００９９】
本発明の組換え核酸は、クローニングされた遺伝子またはその一部分を、原核細胞、真核細胞（酵母、鳥類、昆虫または哺乳動物）またはその両方における発現に適したベクターにライゲートすることによって作製され得る。本発明の組換え糖改変体融合タンパク質を生成するための発現ビヒクルには、プラスミドおよび他のベクターが含まれる。例えば、適当なベクターには、以下のタイプのプラスミドが含まれる：大腸菌などの原核細胞における発現用の、ｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミドおよびｐＵＣ由来プラスミド。
【０１００】
いくつかの哺乳動物発現ベクターは、細菌内でのベクターの増殖を促す原核生物の配列と、真核細胞内で発現される１つ以上の真核生物の転写単位の両方を含む。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇ由来ベクターが、真核細胞のトランスフェクションに適した哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターのうちのいくつかは、原核細胞と真核細胞の両方における複製および薬物耐性選択を容易にするために、ｐＢＲ３２２などの細菌のプラスミド由来の配列で改変される。あるいは、ウイルスの誘導体（例えば、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）またはエプスタイン・バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５））が、真核細胞内でのタンパク質の一過性の発現のために使用され得る。他のウイルス（レトロウイルスを含む）の発現系の例は、下記の遺伝子治療送達系の説明において見出され得る。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換において使用される様々な方法が、当該分野で周知である。原核細胞と真核細胞の両方に適した他の適した発現系、ならびに一般的な組換え手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）を参照のこと。場合によっては、バキュロウイルス発現系を使用することによって組換え糖改変体融合タンパク質を発現することが望ましい場合がある。そのようなバキュロウイルス発現系の例としては、ｐＶＬ由来ベクター（例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（例えば、ｐＡｃＵＷ１）およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクター（例えば、β−ｇａｌ含有ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ）が挙げられる。
【０１０１】
好ましい実施形態において、Ｐｃｍｖ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）およびｐＣＩ−ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）などのベクターが、ＣＨＯ細胞において本発明の主題の糖改変体融合タンパク質を産生するために設計され得る。明らかであるように、その主題の遺伝子構築物は、精製にむけて、培養において増殖する細胞内でその主題の糖改変体融合タンパク質の発現を引き起こすために、例えば、タンパク質（融合タンパク質または改変体タンパク質を含む）を産生するために、使用され得る。
【０１０２】
本開示はまた、本発明の主題の糖改変体タンパク質融合物の１つ以上に対するコード配列を含む組換え遺伝子でトランスフェクトされた宿主細胞に関係する。その宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、本発明の糖改変体融合タンパク質は、大腸菌などの細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用する）、酵母または哺乳動物細胞において発現され得る。他の適当な宿主細胞は、当業者に公知である。好ましくは、その宿主細胞は、発現されるタンパク質に対して哺乳動物のグリコシル化パターンをもたらし得る哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯまたはＢＨＫ細胞株）であり得る。
【０１０３】
したがって、本発明はさらに、本発明の主題の糖改変体融合タンパク質を生成する方法に関係する。例えば、Ｆｃ融合タンパク質をコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞が、Ｆｃ融合タンパク質の発現が生じるのを可能にする適切な条件下で培養され得る。そのＦｃ融合タンパク質は、分泌され得、そして細胞とＦｃ融合タンパク質を含む培地との混合物から単離され得る。あるいは、そのＦｃ融合タンパク質は、細胞質に保持され得るか、または膜画分中、および収集されて溶解されてタンパク質が単離される細胞中に保持され得る。細胞培養物は、宿主細胞、培地および他の副産物を含む。細胞培養に適した培地は、当該分野で周知である。主題のＦｃ融合タンパク質は、タンパク質を精製するための当該分野で公知の手法（イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、Ｆｃ融合タンパク質の特定のエピトープに特異的な抗体を用いる免疫親和性精製、およびＦｃ融合タンパク質に融合されたドメインに結合する物質を用いる親和性精製（例えば、プロテインＡカラムが、Ｆｃ融合タンパク質を精製するために使用され得る）を含む）を用いて、細胞培養液、宿主細胞またはその両方から単離され得る。好ましい実施形態において、Ｆｃ融合タンパク質は、その精製を容易にするさらなるドメインを含む。好ましい実施形態において、精製は、例えば、以下のうちの３つ以上を任意の順序で含む一連のカラムクロマトグラフィー工程によって達成され得る：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィー。その精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換によって完了され得る。本発明の糖改変体融合タンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーによって測定されるとき＞９８％の純度に、およびＳＤＳ  ＰＡＧＥによって測定されるとき＞９５％に精製され得る。
【０１０４】
別の実施形態において、本発明の組換え糖改変体Ｆｃ融合タンパク質の所望の部分のＮ末端におけるポリ−（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位配列などの精製リーダー配列をコードする融合遺伝子のおかげで、Ｎｉ２＋金属樹脂を用いるアフィニティークロマトグラフィーによる、発現された融合タンパク質の精製が可能になり得る。次いで、その精製リーダー配列が、その後、エンテロキナーゼでの処理によって除去されることにより、本発明の精製された糖改変体融合タンパク質が提供され得る（例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉら（１９８７）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ４１１：１７７；およびＪａｎｋｎｅｃｈｔら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：８９７２を参照のこと）。
【０１０５】
融合遺伝子を作製するための手法は、周知である。本質的には、種々のポリペプチド配列をコードする様々なＤＮＡフラグメントの連結が、従来の手法（平滑末端化されたまたは粘着末端化された末端をライゲーションに使用すること、適切な末端をもたらす制限酵素消化、必要に応じて付着末端を埋めること、望ましくない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的ライゲーション）に従って行われる。別の実施形態において、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成装置を含む従来の手法によって合成され得る。あるいは、後にアニールしてキメラ遺伝子配列を生成し得る２つの連続した遺伝子フラグメント間に相補的なオーバーハングを生じるアンカープライマーを用いて、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅が行われ得る（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２を参照のこと）。
【０１０６】
４．血清半減期を増加させる方法
特定の実施形態において、本発明は、Ｆｃドメインの外側に１つ以上の非内因性Ｎ結合型グリコシル化部位を導入するように融合タンパク質を改変することによって、Ｆｃ融合タンパク質の安定性および／または半減期（例えば、インビトロ、インビボまたは血清半減期）を増加させるための方法に関する。例えば、そのような方法は、１つ以上の非内因性Ｎ結合型グリコシル化部位を導入するようにＦｃ融合タンパク質の配列を改変する工程、および糖改変体Ｆｃ融合タンパク質を産生する適当な細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはヒト細胞）において前記改変されたポリペプチドをコードする核酸を発現させる工程を包含し得る。そのような方法は：ａ）改変されたポリペプチドの発現に適した条件下で細胞を培養する工程（ここで、前記細胞は、改変されたポリペプチド発現構築物で形質転換されている）；およびｂ）そのように発現された改変されたタンパク質を収集する工程を包含し得る。精製は、例えば、以下のうちの１、２もしくは３つまたはそれ以上を任意の順序で含む一連の精製工程によって達成され得る：プロテインＡクロマトグラフィー（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ）、陰イオン交換クロマトグラフィー（ｃｈｒｏｍｏｔｏｇｒａｐｈｙ）（例えば、Ｑセファロース）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（例えば、フェニルセファロース）、サイズ排除クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィー。本開示のそのようなポリペプチドは、さらに液体または固体（例えば、凍結乾燥された形態）として処方され得る。本明細書中に記載される任意の糖改変体融合タンパク質が、前記方法を用いて生成され得る。
【０１０７】
好ましい実施形態において、導入されたグリコシル化部位の１つ以上におけるグリコシル化によって、改変された融合タンパク質の半減期（例えば、インビトロ、インビボ、血清半減期）が、導入されるグリコシル化部位を欠く融合タンパク質の血清半減期と比べて少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２２５％もしくは２５０％またはそれ以上増加する。ある特定の実施形態において、本開示の方法は、本開示の融合タンパク質の各１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００アミノ酸あたり少なくとも１つのグリコシル化されたアミノ酸を導入するために使用され得る。ある特定の実施形態において、本開示の方法は、Ｎ結合型グリコシル化、Ｏ結合型グリコシル化またはその両方によって改変された各アミノ酸間の間隙が少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００アミノ酸またはそれ以上を維持するようにグリコシル化部位を導入するために使用され得る。
【０１０８】
ある特定の実施形態において、本開示は、少なくとも１つの異種ポリペプチドドメインおよび免疫グロブリンＦｃドメインを含む融合タンパク質の半減期を延長するための方法を提供する。例えば、そのような方法は、ａ）１つ以上の非内因性Ｎ結合型グリコシル化部位を導入するように免疫グロブリンＦｃドメインの外側でＦｃ融合タンパク質を改変する工程、およびｂ）導入されたグリコシル化部位のうちの１つがグリコシル化されるようにＦｃ融合タンパク質を発現させる工程を包含し得る。本明細書中に開示される方法は、例えば、リガンド結合ドメインを含むレセプターの細胞外ドメインの一部分（例えば、可溶性部分）を含むＦｃ融合タンパク質の半減期を延長するために使用され得る。ある特定の実施形態において、その方法は、Ｆｃ融合タンパク質のリガンド結合ドメインの外側にグリコシル化部位を導入するために使用される。好ましい実施形態において、グリコシル化部位を導入するための方法は、可溶性リガンドに対する融合タンパク質のレセプター部分の結合に有意に影響せず、例えば、リガンドの結合は、導入されるグリコシル化部位を欠くＦｃ融合タンパク質に対するリガンドの結合と比べて２、３、５、１０または１５倍未満だけ影響される。いくつかの実施形態において、本開示の方法は、リンカードメインを含む融合タンパク質に１つ以上のグリコシル化部位を導入するために使用される。ある特定の実施形態において、本開示の方法は、リンカードメイン内に少なくとも１つのグリコシル化部位を導入するために使用され得る。一般に、本明細書中に開示される方法は、高分子量、例えば、少なくとも２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５または１１０ｋＤａである高分子のタンパク質である、異種ドメインを有する融合タンパク質の半減期を増加させるために使用される。
【０１０９】
５．スクリーニングアッセイ
ある特定の態様において、本発明は、少なくとも１つの生物学的活性を維持し、かつ高い安定性および／または増加された血清半減期を有する、糖改変体Ｆｃ融合タンパク質を同定するためのスクリーニングアッセイを提供する。糖改変体融合タンパク質は、生物学的活性を調節する能力を査定するため、それらの安定性を査定するため、および／またはインビボもしくはインビトロにおいてそれらの血清半減期を査定するために試験され得る。糖改変体融合タンパク質は、例えば、動物モデルにおいて試験され得る。
【０１１０】
本発明の糖改変体融合タンパク質の生物学的活性についてスクリーニングするアプローチは数多く存在し、例えば、糖改変体レセプター−Ｆｃ融合タンパク質をアッセイするときは、改変されたレセプターがリガンドに結合する能力が測定され得るか、またはその糖改変体融合タンパク質がリガンド−レセプターシグナル伝達を乱す能力もまたアッセイされ得る。ある特定の実施形態において、改変されていないタンパク質の少なくとも１つの生物学的活性を保持する糖改変体（例えば、選択された細胞株に対する、リガンドまたはレセプターが媒介する作用を混乱させるレセプター改変体）を同定する糖改変体融合タンパク質のハイスループットスクリーニングが行われ得る。
【０１１１】
様々なアッセイ形式が十分であるが、それにもかかわらず、本開示に照らして、本明細書中にはっきりと記載されないものも、当業者によって理解されるだろう。本明細書中に記載されるように、本発明の糖改変体融合タンパク質は、前記融合タンパク質をコードする核酸の対応するフラグメントから組換え的に生成されたポリペプチドをスクリーニングすることによって得ることができる。さらに、フラグメントは、従来のＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ化学などの当該分野で公知の手法を用いて化学的に合成され得る。
【０１１２】
本発明の機能的に活性な糖改変体融合タンパク質は、前記融合タンパク質をコードする、対応する変異誘発された核酸から組換え的に生成された改変された融合タンパク質のライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。それらの糖改変体は、改変されていない融合タンパク質の生物学的活性、例えば、糖改変体レセプター融合物が様々な細胞レセプタータンパク質（例えば、ＴＮＦＲ２レセプタータンパク質）のアンタゴニスト（インヒビター）として作用する能力、および／またはリガンド−レセプター結合によって媒介される細胞内のシグナル伝達を少なくとも保持するものを同定するために、生成され、試験され得る。
【０１１３】
機能的な糖改変体は、安定性および／または血清半減期を増加させるように本発明の融合タンパク質のアミノ酸配列を改変することによって作製され得る。そのような改変された糖改変体タンパク質は、生物学的活性（例えば、リガンド結合性）を保持するように選択されるとき、改変されていない融合タンパク質の機能的等価物と考えられる。改変された糖改変体融合タンパク質はまた、例えば、１つ以上のＮ結合型グリコシル化部位を導入するアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、および／または他の配列改変（例えば、保存的置換）によって作製され得る。例えば、イソロイシンまたはバリンによるロイシン、グルタミン酸によるアスパラギン酸、セリンによるトレオニンの個別の置換、または構造的に関係があるアミノ酸によるアミノ酸の類似の置換（例えば、保存的変異）が、その結果生じる分子の生物学的活性に対して大きな作用を有さないであろうと予想されることは妥当である。保存的置換は、側鎖に関するアミノ酸のファミリー内で行われる置換である。本発明の融合タンパク質のアミノ酸配列の変化が機能的ホモログをもたらすか否かは、改変体融合タンパク質が、改変されていない融合タンパク質と類似の様式で生物学的活性を示す能力を査定することによって容易に判定され得る。例えば、改変体レセプターＦｃ融合タンパク質（例えば、ＴＮＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質）は、特異的なリガンド（例えば、ＴＮＦαまたはＴＮＦβ）に結合する能力、レセプターポリペプチドへのリガンドの結合を妨害する能力、またはレセプターへのリガンドの結合によって引き起こされるシグナル伝達を干渉する能力についてスクリーニングされ得る。
【０１１４】
糖改変体融合タンパク質のコンビナトリアルライブラリーは、各々が潜在的なポリペプチド配列の少なくとも一部分を含む融合タンパク質のライブラリーをコードする遺伝子の縮重ライブラリーを経由して作製され得る。例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物が、潜在的なポリペプチドヌクレオチド配列の縮重セットが個別のポリペプチドとして、あるいは、より大きな融合タンパク質のセットとして（例えば、ファージディスプレイの場合）発現可能であるように、遺伝子配列に酵素的にライゲートされ得る。
【０１１５】
潜在的な糖改変体のライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から生成し得る方法が多く存在する。縮重遺伝子配列の化学的合成が、自動ＤＮＡ合成装置において行われ得、次いで、その合成遺伝子が、発現用の適切なベクターにライゲートされ得る。縮重オリゴヌクレオチドの合成法は、当該分野で周知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，ＳＡ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８１）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐｒｏｃ．３ｒｄ  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｓｙｍｐｏｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｅｄ．ＡＧ  Ｗａｌｔｏｎ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ｐｐ  ２７３−２８９；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅら（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと）。そのような手法は、他のタンパク質の指向性進化において使用されている（例えば、Ｓｃｏｔｔら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９２）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９：２４２９−２４３３；Ｄｅｖｌｉｎら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７：６３７８−６３８２；ならびに米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，１９８，３４６号および同第５，０９６，８１５号を参照のこと）。
【０１１６】
点変異および切断によって作製されるコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および、もっと詳しく言うなら、ある特定の特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための、広範囲の手法が当該分野で公知である。そのような手法は、一般に、本発明の糖改変体融合タンパク質のコンビナトリアル突然変異誘発によって作製された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適用可能であり得る。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広く使用されている手法は、代表的には、複製可能な発現ベクターに遺伝子ライブラリーをクローニングすること、得られたベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、および所望の活性の検出が遺伝子（その産物が検出される）をコードするベクターの比較的簡便な単離を容易にする条件下でそのコンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。
【０１１７】
好ましいアッセイには、レセプター−リガンド結合アッセイおよびリガンド媒介性細胞シグナル伝達アッセイが含まれる。本発明の糖改変体レセプター−Ｆｃ融合タンパク質とリガンドとの複合体の形成は、様々な手法によって検出され得る。例えば、複合体の形成の調節は、イムノアッセイまたはクロマトグラフィー検出によって、例えば、検出可能に標識されたタンパク質（例えば、放射性標識された（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈ）、蛍光標識された（例えば、ＦＩＴＣ）、または酵素的に標識された、レセプターポリペプチドまたはリガンド）を用いて定量され得る。
【０１１８】
ある特定の実施形態において、本発明は、糖改変体レセプター−Ｆｃ融合タンパク質とその結合リガンドとの相互作用の程度を直接または間接的に測定する際の、蛍光偏光アッセイおよび蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）アッセイの使用を企図する。さらに、他の検出様式（例えば、光導波路（ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２６４３２および米国特許第５，６７７，１９６号）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、表面電荷センサーおよび表面力センサーに基づく検出様式）が、本発明の多くの実施形態と適合可能である。
【０１１９】
さらに、本発明は、糖改変体Ｆｃ融合タンパク質とその結合パートナーとの相互作用を乱すかまたは増強する物質を同定するための「２ハイブリッドアッセイ」としても知られる相互作用捕捉アッセイの使用を企図する。例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら（１９９３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０−９２４；およびＩｗａｂｕｃｈｉら（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６）を参照のこと。あるいは、そのようなタンパク質間相互作用は、光架橋、放射性標識されたリガンドの結合、およびアフィニティークロマトグラフィー（Ｊａｋｏｂｙ  ＷＢら、１９７４，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ４６：１）を含むインビトロでの生化学的方法を用いてタンパク質レベルで同定され得る。ある特定の場合において、糖改変体融合タンパク質は、機序に基づいたアッセイ（例えば、リガンドまたはレセプターポリペプチドに結合する糖改変体融合タンパク質を検出するアッセイ）においてスクリーニングされ得る。これは、固相または流体相の結合事象を含み得る。あるいは、リガンドまたはレセプターポリペプチドをコードする遺伝子が、レポーター系（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質）とともに細胞にトランスフェクトされ得、必要に応じてハイスループットスクリーニングによって糖改変体ライブラリーに対してスクリーニングされ得るか、または糖改変体ライブラリーの個別のメンバーを用いてスクリーニングされ得る。機序に基づいた他の結合アッセイ、例えば、自由エネルギーの変化を検出する結合アッセイが使用され得る。結合アッセイは、ウェル、ビーズもしくはチップに固定された標的、または固定化された抗体によって捕捉される標的、またはキャピラリー電気泳動によって分離される標的を用いて、行われ得る。その結合したタンパク質は、通常、比色定量または蛍光または表面プラズモン共鳴を用いて、検出され得る。
【０１２０】
６．例示的な治療上の使用
様々な実施形態において、本発明の糖改変体融合タンパク質で処置される患者または本発明の糖改変体融合タンパク質での処置の候補患者は、哺乳動物（例えば、げっ歯類および霊長類）、特に、ヒト患者であり得る。ある特定の実施形態において、本開示は、増加された半減期を特徴とする改変された可溶性レセプター−Ｆｃ融合物を提供する。レセプター−Ｆｃ融合物は、本明細書中で要約される様々な障害および状態を処置する際の使用について先に記載された。
【０１２１】
本明細書中で使用されるとき、障害または状態を「防止する」治療薬とは、統計的サンプルにおいて、処置されるサンプルにおけるその障害または状態の発生を未処置のコントロールサンプルと比べて減少させるか、あるいは未処置のコントロールサンプルと比べてその障害もしくは状態の発生を遅延させるかまたはその１つ以上の症状の重症度を低下させる、治療薬のことを指す。本明細書中で使用される用語「処置する」は、指名された状態の予防、またはその状態がいったん確立されたらその回復もしくは排除を含む。どちらにしても、防止または処置は、医師または他の医療提供者によって提供される診断、およびその治療薬の投与の意図される結果において、識別され得る。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、本開示は、増加された血清半減期を有するＴＮＦＲ２レセプターの細胞外ドメインを含む糖改変体融合タンパク質を提供する。そのようなＴＮＦＲ２−Ｆｃ糖改変体融合物は、ＴＮＦαが介在する様々な障害または状態（例えば、急性および慢性の免疫性および自己免疫性の病態（例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、若年性慢性関節炎、甲状腺炎（ｔｈｙｒｏｉｄｏｓｉｓ）、移植片対宿主病、強皮症、真性糖尿病、グレーヴズ病）、脊椎関節症、感染症に関連する障害（例えば、敗血症症候群、悪液質、急性または慢性の細菌感染に起因する循環虚脱およびショック、急性および慢性の寄生虫病ならびに／または細菌、ウイルスもしくは真菌の感染症）、慢性の炎症性の病態（例えば、強皮症、サルコイドーシス、慢性炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎およびクローン病の病態）、血管の炎症性の病態（例えば、播種性血管内凝固、アテローム性動脈硬化症および川崎病の病態）および神経変性疾患（例えば、多発性硬化症、急性横断性脊髄炎、錐体外路系疾患、ハンチントン舞踏病および老人性舞踏病；パーキンソン病、進行性核上性麻痺（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅｏ  ｐａｌｓｙ）、脊髄性運動失調症、フリードライヒ運動失調症、メンセル（Ｍｅｎｃｅｌ）病、デジェリーヌ・トーマス病、シャイ・ドレーガー（Ｓｈｉ−Ｄｒａｇｅｒ）病、マシャド・ジョセフ病、レフサム病、無βリポタンパク質血症（ａｂｅｔａｌｉｐｏｐｒｏｔｅｍｉａ）、毛細血管拡張、ミトコンドリア多系統障害、筋萎縮性側索硬化症、乳児性脊髄性筋萎縮症、若年性脊髄性筋萎縮症、アルツハイマー病、ダウン症候群、びまん性レヴィー小体病、ウェルニッケ・コルサコフ症候群、クロイツフェルト・ヤコブ病、亜急性硬化性全脳炎、ハラーフォルデン・シュパッツ（Ｈａｌｌｅｒｒｏｒｄｅｎ−Ｓｐａｔｚ）病、ならびに拳闘家痴呆）が挙げられる）を防止するためまたは処置するために使用され得る。
【０１２３】
７．薬学的組成物
ある特定の実施形態において、本明細書中に記載される糖改変体融合タンパク質は、薬学的に許容され得るキャリアとともに処方される。例えば、本開示の融合タンパク質は、単独で、または薬学的製剤（治療用組成物）の構成要素として、投与され得る。主題の化合物は、ヒトまたは獣医学において使用するために好都合な任意の方法で投与用に処方され得る。適切な投薬レジメンが、主治医によって決定され得、その治療用タンパク質の改変されていないバージョンに対する標準的な投薬レジメンによって形成され得る。
【０１２４】
ある特定の実施形態において、本発明の治療方法は、本組成物を全身的に、または埋没物もしくはデバイスとして局所的に、投与する工程を包含する。投与されるとき、本発明において使用するための治療用組成物は、当然のことながら、発熱物質を含まない生理的に許容され得る形態である。上に記載されたような組成物に必要に応じて含められ得る、本明細書中に記載される融合タンパク質以外の治療上有用な薬剤は、本発明の方法において、その主題の融合タンパク質と同時にまたは連続的に投与され得る。
【０１２５】
代表的には、本明細書中に記載される融合タンパク質は、非経口的に（ｐａｒｅｎｔａｌｌｙ）投与され得る。非経口投与に適した薬学的組成物は、１つ以上の薬学的に許容され得る滅菌された等張性の水性もしくは非水性の溶液、分散液、懸濁液もしくはエマルジョン、または滅菌された注射可能な溶液もしくは分散液に使用直前に再構成され得る滅菌された散剤とともに、１つ以上の本開示の融合タンパク質を含み得、その薬学的組成物は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、意図されるレシピエントの血液とその製剤を等張性にする溶質、または懸濁剤もしくは増粘剤を含み得る。本発明の薬学的組成物において使用され得る適当な水性および非水性のキャリアの例としては、水、エタノール、ポリオール類（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適当な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。例えば、レシチンなどのコーティング材料を使用することによって、分散液の場合は、必要な粒径を維持することによって、および界面活性物質を使用することによって、適切な流動性が維持され得る。
【０１２６】
さらに、本組成物は、標的組織部位（例えば、骨、筋肉、循環器系など）への送達用の形態として、被包され得るか、または注射され得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、１つ以上の治療用化合物（例えば、糖改変体融合タンパク質）を標的組織部位（例えば、骨、筋肉、循環器系）に送達することができる、発生中の組織に構造を提供することができる、および体内に最適に再吸収されることができる、マトリックスを含み得る。例えば、そのマトリックスは、本開示の融合タンパク質の緩効性を提供し得る。そのようなマトリックスは、他の埋め込まれる医学的適用のために現在使用されている材料から形成され得る。
【０１２７】
マトリックス材の選択は、生体適合性、生分解性、力学的特性、美容上の外観および境界面特性に基づく。主題の組成物の特定の適用法が、適切な製剤を規定し得る。本組成物に対する潜在的なマトリックスは、生分解性かつ化学的に定義された硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ無水物であり得る。他の潜在的な材料は、生分解性かつ生物学的に十分定義されているもの（例えば、骨または皮膚コラーゲン）である。さらなるマトリックスは、純粋なタンパク質または細胞外マトリックス構成要素を含む。他の潜在的なマトリックスは、生分解性でない化学的に定義されたもの（例えば、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミネートまたは他のセラミックス）である。マトリックスは、上で述べられたタイプの材料（例えば、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイトまたはコラーゲンおよびリン酸三カルシウム）のいずれかの組み合わせを含み得る。バイオセラミックスは、組成（例えば、カルシウム−アルミネート−ホスフェート）、ならびにポアサイズ、粒径、粒子の形状および生分解性を変化させる処理において変化され得る。
【０１２８】
ある特定の実施形態において、融合タンパク質は、経口投与のために、例えば、カプセル、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ（風味がつけられた基剤、通常、スクロースおよびアカシアまたはトラガントを用いる）、散剤、顆粒剤の形態で、または水性もしくは非水性の液体中の溶液もしくは懸濁液として、または水中油型もしくは油中水型の液体エマルジョンとして、またはエリキシル剤もしくはシロップ剤として、またはトローチ剤（不活性な基剤（例えば、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシア）を用いる）として、および／または口腔洗浄薬などとして、処方され得、それらの各々は、活性成分として所定量の薬剤を含む。ある薬剤は、ボーラス、舐剤またはペーストとしても投与され得る。
【０１２９】
経口投与用の固体剤形（例えば、カプセル、錠剤、丸剤、糖衣錠および散剤顆粒剤）において、本発明の１つ以上の融合タンパク質は、１つ以上の薬学的に許容され得るキャリア（例えば、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム）、および／または以下のうちのいずれかと混合され得る：（１）充填剤または増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよび／またはケイ酸）；（２）結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアカシア）；（３）吸湿剤（例えば、グリセロール）；（４）崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカのデンプン、アルギン酸、ある特定のシリケート、および炭酸ナトリウム）；（５）溶解遅延剤（例えば、パラフィン）；（６）吸収促進物質（例えば、四級アンモニウム化合物）；（７）湿潤剤（例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール）；（８）吸収剤（例えば、カオリンおよびベントナイト粘土）（９）潤滑剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよびそれらの混合物）；および（１０）着色剤。カプセル、錠剤および丸剤の場合、薬学的組成物は、緩衝剤も含み得る。類似のタイプの固体組成物は、ラクトースまたは乳糖のような賦形剤、ならびに高分子量ポリエチレングリコールを用いて、軟および硬充填ゼラチンカプセルにおいて充填剤としても使用され得る。
【０１３０】
経口投与用の液体剤形には、薬学的に許容され得るエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ剤およびエリキシル剤が含まれる。その液体剤形は、活性成分に加えて、当該分野において通常使用される不活性な希釈剤（例えば、水または他の溶媒）、可溶化剤および乳化剤（例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル）、ならびにそれらの混合物を含み得る。経口用組成物は、不活性な希釈剤のほかにも、佐剤（例えば、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、香味剤、着色剤、芳香剤および保存剤）も含み得る。
【０１３１】
懸濁液は、融合タンパク質に加えて、懸濁剤（例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガント、ならびにそれらの混合物）を含み得る。
【０１３２】
本発明の組成物は、佐剤（例えば、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤）も含み得る。様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含めることによって、微生物の作用の防止が確実にされ得る。等張剤（例えば、糖、塩化ナトリウムなど）を組成物に含めることも望ましい場合がある。さらに、注射可能な薬学的形態の長時間の吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる物質を含めることによってもたらされ得る。
【実施例】
【０１３３】
例示
本発明は、本明細書中で広く説明されてきたが、以下の実施例を参照することによってより容易に理解され得、その実施例は、ある特定の実施形態および本発明の実施形態を説明する目的のためだけに含められるものであって、本発明を限定することを目的としていない。
【０１３４】
実施例１：糖改変体ＴＮＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質の発現
本出願人は、様々なＴＮＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（各々がさらなるＮ結合型グリコシル化部位を含む）を発現するためのベクターを構築した。コントロールＴＮＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（すなわち、基礎的な、すなわち「最初の」改変されていない形態のＴＮＦＲ２−Ｆｃ）は、介在リンカーなしでヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインに融合されたヒトＴＮＦＲ２の細胞外ドメインを有する。その最初のＴＮＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質の配列を図１に示し（配列番号５）、コード核酸（リーダー配列を含む）を図５に示す（配列番号８）。図１に示される融合タンパク質は、ＴＮＦＲ２−ｈ（１）Ｆｃとさらに完全に命名される。ＴＮＦＲ２−ｈ（２）Ｆｃと命名された改変体は、図９（配列番号１６）に示されるように代替リンカー／境界配列を有し、図１０に示されるヌクレオチド配列（配列番号１７）によってコードされる。タンパク質構築物を、哺乳動物細胞において発現させるためにｐＡＩＤ４ベクター（Ｐｅａｒｓａｌｌら、ＰＮＡＳ  １０５（２００８）：７０８２−７０８７）内にクローニングした。
【０１３５】
最初の実験にむけて、ＴＮＦＲ２−Ｆｃの糖改変体をＨＥＫ２９３細胞において一過性に発現させた。簡潔には、５００ｍｌスピナーにおいて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２５０ｍｌの体積のＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地中で６×１０５細胞／ｍｌに調整し、一晩生育した。翌日、これらの細胞を、０．５μｇ／ｍｌの最終ＤＮＡ濃度のＤＮＡ：ＰＥＩ（１：１）複合体で処理した。４時間後、２５０ｍｌの培地を加え、細胞を７日間生育した。その細胞を遠沈することによって培養上清を収集し、濃縮した。
【０１３６】
改変体を、様々な手法（例えば、プロテインＡカラム（Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標），ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）が挙げられる）を用いて精製し、低ｐＨ（３．０）グリシン緩衝液で溶出した後、サイズ排除クロマトグラフィーに供した。リン酸緩衝食塩水またはＴｒｉｓ緩衝食塩水に対してタンパク質を透析した。
【０１３７】
図５に提供されるタンパク質配列は、「ＬＰＡ・・・」のＮ末端の配列を示しているが、各タンパク質のかなりの部分が、そのＮ末端のロイシンが除去されることにより、「ＰＡＱ・・・」というＮ末端の配列がもたらされることを示した。したがって、本明細書中に開示されるいずれのＴＮＦＲ２−Ｆｃ分子も、１つまたは２つのアミノ酸がＮ末端から除去されていることがある。
【０１３８】
使用するにあたり、３つの異なるリーダー配列が考えられた：
【０１３９】
【化８】
2013512674.tif 000010
さらなる精製は、例えば、以下のうちの３つ以上を任意の順序で含む一連のカラムクロマトグラフィー工程によって達成され得る：Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィー。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換によって完了され得る。
【０１４０】
実施例２：糖改変体ＴＮＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質の設計
さらなるＮ結合型グリコシル化部位を導入するための位置を、ＴＮＦＲ２の細胞外ドメインとそのリガンドであるＴＮＦ（結晶座標は公的に入手可能）との共結晶構造の検討、および本明細書中に記載される原理の適用によって、選択した。半減期を延長しつつ、そのタンパク質のＴＮＦアンタゴニスト活性を保存すると予測される位置におけるような変更を選択し、その変更を図７に示す。アミノ酸のナンバリングが、図７に示されるような天然のプロセシングされていないＴＮＦＲ２アミノ酸配列に基づくことに注意されたい。以下の位置のうちの１つにさらなるＮ結合型糖成分を有するように、変更されたＴＮＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質を設計した：４７、４８、６２、１１４、１５５、２０２、２０３、２２２および２５３。天然のＴＮＦＲ２−Ｆｃは、１７１位および１９３位にＮ結合型糖成分を有すること（これは、最初のＴＮＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質の異種（ｈｅｔｅｒｏｌｇｏｕｓ）ドメインが、１：１１７．５というＮ結合型糖成分とアミノ酸との比を有することを意味する）に注意されたい。さらなる糖成分の予測される位置を、ＴＮＦＲ２−ＴＮＦ共結晶構造上にマッピングし、これらを図６に示す。図８は、関連するタンパク質との配列比較および構造上の相同性によって推測される、ＴＮＦＲ２細胞外ドメインにおけるベータ鎖二次構造の予測される位置を示している。新しいＮ結合型部位の各々は、構造エレメントに対して内側に位置された。例えば、４７位および４８位に導入される部位は、第１のベータシート構造エレメントに対して内側である。単一のさらなるＮ結合型グリコシル化部位を有するタンパク質を作製し、試験した後、組み合わせ変異体を作製し、試験した。
【０１４１】
実施例３：ＴＮＦＲ２−Ｆｃ糖改変体タンパク質の試験
改変された分子の機能性、およびその分子の薬物動態学的特性に対する改変の影響を査定する一連のアッセイにおいて、ＴＮＦＲ２−ｈ（１）Ｆｃの糖改変体を試験した。
【０１４２】
無細胞生化学的アッセイにおいてリガンド結合性を査定するために、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００バイオセンサー装置を使用した。簡潔には、ＴＮＦＲ２−ｈ（１）Ｆｃ改変体をフローセルに充填し、次いで、ＴＮＦに曝露した。動態パラメータ（ｋａおよびｋｄ）を評価することによって、解離定数（ＫＤ）を算出した。
【０１４３】
リガンド阻害を査定するために、本質的にはＫｈａｂａｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．４６（１９９５）：１０７−１１０に記載されているようなＴＮＦシグナル伝達についての細胞ベースアッセイを使用した。簡潔には、ＷＥＨＩ細胞（ＡＴＣＣ）を、ＴＮＦ−アルファ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．）およびアクチノマイシンＤの存在下において培養した。ＴＮＦ−アルファは、これらの細胞においてアポトーシスを引き起こし、溶解速度をＡ４９０ｎｍにおいて検出した。ＴＮＦ−アルファアンタゴニストが存在することにより、ＩＣ５０の検出を可能にするシグナルが減少する。
【０１４４】
上記の分子の薬物動態学的特性を査定するために、標準的な手法を用いてＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて研究を行った。簡潔には、順化期間後に、ＴＮＦＲ２−ｈ（１）Ｆｃ分子を動物に投与し、最初の投与の６、１０、２４、３２、４８、７２、９６、１４４、２１６および３１２時間後に尾に切り目を入れることによって出血させた。ＴＮＦＲ２−Ｆｃ分子の存在を、ヒトＦｃ部分に対するＥＬＩＳＡによって検出した。
【０１４５】
そのデータを、天然のＴＮＦＲ２−ｈ（１）Ｆｃ分子から得られたデータに対して正規化することにより、実験ごとのばらつきを最小にした。正規された値を下に示す。望ましい質を示すタンパク質を灰色かつ下線で示している。
【０１４６】
【表１】
2013512674.tif 000011
＊Ｄ４７Ｎタンパク質は、インビボでの試験を可能にするのに十分な量で発現されなかった。
＊＊Ｎ結合型糖を６２位または１１４位に配置する変異によって、リガンド結合の完全な破壊が引き起こされたことから、他の特性を評価しなかった。
【０１４７】
上に提示されたデータは、野生型分子のリガンド結合および拮抗作用と類似のリガンド結合および拮抗作用を保持しつつ、単一のさらなるＮ結合型部位を含む改変体のほぼ半数（９つ中４つ）が、実質的に改善された血清半減期を示したことを示唆している。血清半減期に対する異種間物差し法の影響のため、ラットにおける２０〜３０％の血清半減期の変化は、ヒト患者に対して投薬レジメンの意味ある改善を提供するはずである。興味深いことに、組み合わせ変異は、一般に、血清半減期またはタンパク質活性を減少させるとみられたことから、この分子では、グリコシル化密度のさらなる増加が、もはや有益でなかったことが示唆される。
【０１４８】
これらのデータは、本明細書中に提供される教示を用いることにより、延長された血清半減期を有するＦｃ融合分子を効率的に作製することができることを証明している。
【０１４９】
実施例４：薬物動態学的ラットアッセイ
糖改変体分子の薬物動態学的特性は、標準的な手法を用いてＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて測定され得る。簡潔には、順化期間後、糖改変体分子を８匹の動物の皮下に（ＳＣ）投与し、最初の投与の６、１０、２４、３２、４８、７２、９６、１４４、２１６および３１２時間後に尾に切り目を入れることによって出血させる。糖改変体分子の存在は、標的タンパク質に適した任意の方法を用いて検出され得る。例えば、糖改変体Ｆｃ融合タンパク質は、ヒトＦｃ部分に対するＥＬＩＳＡを用いて検出され得る。各個別の動物について、血清排出半減期（Ｔ１／２）を算出する。平均Ｔ１／２および標準偏差を糖改変体分子について算出する。同じ用量で投与される適切なコントロール分子（例えば、導入されるＮ結合型グリコシル化部位を含まないＦｃ融合タンパク質）に対する平均Ｔ１／２および標準偏差がまだ決定されていない場合、それらを決定するために同様の研究が行われ得る。スチューデントのｔ検定などの適切な統計的検定を用いて、平均Ｔ１／２を解析する。糖改変体分子の平均Ｔ１／２は、適切なコントロール分子の平均Ｔ１／２と比較され得る。
【０１５０】
前述の方法に従って、ラットにおいてＴＮＦＲ２−ｈ（１）Ｆｃ、Ｑ４８Ｎ／Ａ５０Ｓ  ＴＮＦＲ２−ｈ（１）ＦｃおよびＱ４８Ｎ／Ａ５０Ｓ  ＴＮＦＲ２−ｈ（２）Ｆｃの薬物動態学的特性を比較する研究を行った。この研究では、５ｍｇ／ｋｇという単回用量の皮下投与の２８日後までタンパク質濃度が測定された（構築物１つあたりｎ＝３匹のラット）。
【０１５１】
【表２】
2013512674.tif 000012
ＴＮＦＲ２−ｈ（１）Ｆｃと比較したところ、糖改変体Ｑ４８Ｎ／Ａ５０Ｓ  ＴＮＦＲ２−ｈ（１）ＦｃおよびＱ４８Ｎ／Ａ５０Ｓ  ＴＮＦＲ２−ｈ（２）Ｆｃの血清半減期は、それぞれ５０％および８０％長いことが見出された。著しいことに、Ｑ４８Ｎ／Ａ５０Ｓ  ＴＮＦＲ２−ｈ（２）Ｆｃに対する最高血清濃度（Ｃｍａｘ）は、Ｑ４８Ｎ／Ａ５０Ｓ  ＴＮＦＲ２−ｈ（１）Ｆｃよりもほぼ５倍高かった（２０．８μｇ／ｍｌ対４．４μｇ／ｍｌ，ｐ＜０．０５）。これらの結果は、ＴＮＦＲ２−Ｆｃ糖改変体のリンカー／境界領域の改変（配列番号１６と配列番号５とを比較のこと）によって、改善された薬物動態学的特性を有する改変体（この実施例におけるＱ４８Ｎ／Ａ５０Ｓ  ＴＮＦＲ２−ｈ（２）Ｆｃ）がもたらされ得ることを証明している。したがって、配列番号１８として提供されるリンカー−ｈＦｃ配列は、特に、本明細書中に開示される任意の糖改変体との組み合わせにおいて有用であり得る。
【０１５２】
実施例５：薬物動態学的サルアッセイ
糖改変体分子の薬物動態学的特性は、標準的な手法を用いてカニクイザルモデルにおいて行われ得る。簡潔には、４匹の雄および４匹の雌のカニクイザルを選択する。それらの動物は、この手順の当初は実験的にナイーブであり、およそ２〜６歳であり、少なくとも２．５ｋｇの体重である。標準的な食餌を動物に与え、処置全体にわたってそれらの動物を標準的な手順に従って収容する。皮下（ＳＣ）投与または静脈内（ＩＶ）投与によって糖改変体分子を動物に投薬する。２２日間にわたって、以下の投与後の時点において大腿静脈穿刺によって血液サンプルを収集する：５分後、１５分後、３０分後、１時間後、２時間後、４時間後、８時間後、１２時間後、２４時間後、３４時間後、４８時間後、５８時間後、７２時間後、１２０時間後、１６８時間後、２４０時間後、３３６時間後、４０８時間後および５０４時間後。投薬前の血液サンプルも収集する。血液を収集した後、そのサンプルを氷上に保管し、遠心分離によって血清を単離する。血清サンプル中の糖改変体分子の存在は、標的タンパク質に適した任意の方法を用いて検出され得る。例えば、糖改変体Ｆｃ融合タンパク質は、ヒトＦｃ部分に対するＥＬＩＳＡを用いて検出され得る。各個別の動物について、血清排出半減期（Ｔ１／２）を算出する。平均Ｔ１／２および標準偏差を糖改変体分子について算出する。同じ用量で投与される適切なコントロール分子（例えば、導入されるＮ結合型グリコシル化部位を含まないＦｃ融合タンパク質）に対する平均Ｔ１／２および標準偏差がまだ決定されていない場合、それらを決定するために同様の研究が行われ得る。スチューデントのｔ検定などの適切な統計的検定を用いて、平均Ｔ１／２を解析する。糖改変体分子の平均Ｔ１／２は、適切なコントロール分子の平均Ｔ１／２と比較され得る。
【０１５３】
実施例６：ラットコラーゲン誘発関節炎モデルにおけるＱ４８Ｎ／Ａ５０Ｓ  ＴＮＦＲ２−ｈ（１）Ｆｃの作用
糖改変体Ｑ４８Ｎ／Ａ５０Ｓ  ＴＮＦＲ２−ｈ（１）Ｆｃを、ラットにおけるコラーゲン誘発関節炎に対する有効性について評価した。ウシコラーゲンＩＩ型（Ｅｌａｓｔｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，カタログ番号ＣＮ２７６）を０．０１Ｍ酢酸およびフロイント不完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ，カタログ番号２６３９１０）に１ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解し、研究の０および７日目に、雌Ｌｅｗｉｓラット（１５０〜２００ｇ）の尾の底部に皮内注射（２ｍｇ／ｋｇ）によって投与した。６日目から開始して、３ｍｇ／ｋｇのＱ４８Ｎ／Ａ５０Ｓ  ＴＮＦＲ２−ｈ（１）Ｆｃ、３ｍｇ／ｋｇのＴＮＦＲ２−ｈ（１）Ｆｃ、またはビヒクルでラットを１週間に３回皮下処置した。足の体積は、ベースラインおよび研究の全体にわたる複数の時点においてプレチスモメトリーによって測定したのに対し、骨質は、研究の終わりに（エキソビボで）マイクロコンピュータ断層撮影（マイクロ−ＣＴ）によって査定した。
【０１５４】
足の腫脹をコラーゲン誘発炎症に対するマーカーとして使用した。予想通り、ビヒクルで処置されたラットにおける足の体積は、研究の途中で増加し、終わりまで上昇したままだった。この足の腫脹は、ポジティブコントロールであるＴＮＦＲ２−ｈ（１）Ｆｃで処置されたラットと同程度に、糖改変体Ｑ４８Ｎ／Ａ５０Ｓ  ＴＮＦＲ２−ｈ（１）Ｆｃで処置されたラットにおいて効果的に阻害された（図１１）。さらに、マイクロ−ＣＴによって査定された骨質は、ビヒクルで処置されたコントロールと比べて、これらの両方の処置群において同様に改善されたことから（図１２）、抗炎症性の有効性のさらなる証拠がもたらされた。これらのデータは、糖改変体Ｑ４８Ｎ／Ａ５０Ｓ  ＴＮＦＲ２−ｈ（１）Ｆｃが、その置換されていない対応物であるＴＮＦＲ２−ｈ（１）Ｆｃの抗炎症性の有効性と等価な抗炎症性の有効性をインビボにおいて有することを証明している。
【０１５５】
まとめると、前述の結果は、ＴＮＦＲ２−ｈ（１）Ｆｃのある特定の糖改変体、例えば、Ｑ４８Ｎ／Ａ５０Ｓ  ＴＮＦＲ２−ｈ（１）Ｆｃが、ＴＮＦＲ２−ｈ（１）Ｆｃ自体と比べて、増加された血清半減期および低下しない抗炎症性の有効性を有することを示唆している。
【０１５６】
参考としての援用
本明細書中で言及されるすべての刊行物および特許は、各個別の刊行物または特許が参考として援用されると明確かつ個別に示されたかのように、それらの全体が参考として援用される。
【０１５７】
主題の特定の実施形態を論じてきたが、上記の明細書は、例示的なものであって、限定的なものではない。この明細書および下記の請求項を検討すると、多くのバリエーションが当業者に明らかになるだろう。本発明の完全な範囲は、等価物の完全な範囲に加えて請求項、およびそのようなバリエーションに加えて本明細書を参照することにより決定されるべきである。
【図１】
2013512674.tif 000013
【図２】
2013512674.tif 000014
【図３】
2013512674.tif 000015
【図４】
2013512674.tif 000016
【図５】
2013512674.tif 000017
【図６】
2013512674.tif 000018
【図７】
2013512674.tif 000019
【図８】
2013512674.tif 000020
【図９】
2013512674.tif 000021
【図１０】
2013512674.tif 000022
【図１１】
2013512674.tif 000023
【図１２】
2013512674.tif 000024
【配列表】
2013512674000001.app
【国際調査報告】
2013512674.tif 000025
2013512674.tif 000026
2013512674.tif 000027