(57)【要約】  【課題】本発明は、成体心臓幹細胞の非老化性プールの単離ならびに使用方法を提供することを課題とする。  【解決手段】本発明は、成体心臓幹細胞の非老化性プールの単離ならびに使用方法を記載する。特に、優れた再生能力を有する成体心臓幹細胞の小集団が開示される。このような細胞は、不死ＤＮＡを有することが判明した。非老化性幹細胞を含む組成物も記載される。さらに、本発明は、単離非老化性成体心臓幹細胞を用いて、加齢心筋または損傷心筋を修復するための方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離ヒト成体心臓幹細胞および製薬上許容可能な担体を含む薬学的組成物であって、前記単離心臓幹細胞がｃ−ｋｉｔ陽性であり、不死ＤＮＡを有する組成物。
【請求項２】
前記心臓幹細胞がＩＧＦ−１受容体陽性である請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記心臓幹細胞が５ｋｂｐ長より長いテロメアを有する請求項１記載の組成物。
【請求項４】
前記心臓幹細胞が７ｋｂｐ長より長いテロメアを有する請求項３記載の組成物。
【請求項５】
前記心臓幹細胞がｐ１６ＩＮＫ４ａ陰性である請求項１記載の組成物。
【請求項６】
前記心臓幹細胞がヒト心筋組織から単離される請求項１記載の組成物。
【請求項７】
前記心臓幹細胞が、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）ラベリング後の培養中の細胞の少なくとも１回の継代後にＢＲｄＵ陰性である請求項１記載の組成物。
【請求項８】
前記心臓幹細胞が少なくとも９０％の純度である請求項１記載の組成物。
【請求項９】
前記心臓幹細胞が少なくとも９５％の純度である請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
前記心臓幹細胞が約１００％の純度である請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１記載の組成物を被験者に投与することによるそれを必要とする前記被験者における損傷心筋の修復方法であって、前記損傷心筋の構造的および機能的完全性が前記組成物の投与後に少なくとも部分的に回復される方法。
【請求項１２】
前記単離成体心臓幹細胞が自系である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物が心筋内にまたは冠動脈内に投与される請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記損傷心筋が心筋梗塞である請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
前記心臓幹細胞が、前記被験者への投与前に１つ以上のサイトカインに曝露される請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
前記１つ以上のサイトカインがインスリン様増殖因子Ｉおよび／または肝細胞増殖因子である請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
不死ＤＮＡを有する成体心臓幹細胞の単離方法であって、以下の：
（ａ）成体心臓幹細胞をＤＮＡ標識に曝露すること（この場合、前記心臓幹細胞はｃ−ｋｉｔ陽性であり、心筋組織から単離される）；
（ｂ）少なくとも１回の集団倍加のために前記標識化心臓幹細胞を培養すること；そして
（ｃ）ＤＮＡ標識に関して陰性である心臓幹細胞を選択すること（ここで、前記選択幹細胞は不死ＤＮＡを有する心臓幹細胞である）
を包含する方法。
【請求項１８】
前記ＤＮＡ標識がＢｒｄＵ、クロロでオキシウリジン（ＣｌｄＵ）またはヨードデオキシウリジン（ＩｄＵ）である請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記成体心臓幹細胞が、ＤＮＡ標識への曝露前に、１つ以上の非老化性マーカーから選択される請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
前記１つ以上の非老化性マーカーが、長いテロメア、高テロメラーゼ活性、ＩＧＦ−１受容体発現およびｐ１６ＩＮＫ４ａ発現に関して陰性からなる群から選択される請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記成体心臓幹細胞がヒトである請求項１７記載の方法。
【請求項２２】
前記ＤＮＡ標識に関して陰性である心臓幹細胞を単離することをさらに包含する請求項１７記載の方法。
【請求項２３】
製薬上許容可能な担体ならびに請求項１７記載の方法により単離される成体心臓幹細胞を含む薬学的組成物。
【請求項２４】
ｃ−ｋｉｔ陽性、ＩＧＦ−１受容体陽性、ｐ１６ＩＮＫ４ａ陰性であり、不死ＤＮＡを有する成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団。
【請求項２５】
前記成体心臓幹細胞がヒトである請求項２４記載の細胞集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許出願第１２／９３８，１５９号（２０１０年１１月２日出願）（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
電子形式で提出されるテキストファイルの説明
本明細書に添えて電子形式で提出されるテキストファイルの記載内容は、参照により本明細書中で援用される：配列表のコンピューター読取り可能フォーマット（ファイル名：AUTL_003_03WO_SeqList_ST25.txt、記録された日付：２０１１年１１月１日、ファイルサイズ  ５キロバイト）。
【０００３】
本発明は、一般的に、心臓学の分野に、さらに特定的には、特定の部類の成体心臓幹細胞の単離方法に関する。本発明は、これらの単離幹細胞を含有する組成物、ならびに心臓血管性疾患の処置、加齢関連心筋症の修復、および心不全の防止のためのこれらの組成物の使用方法も包含する。
【０００４】
政府支援の説明
本出願は、一部は、米国国立衛生研究所からの補助金：補助金番号：ＨＬ−３８１３２、ＡＧ−１５７５６、ＨＬ−６５５７７、ＨＬ−６６９２３、ＨＬ−６５５７３、ＨＬ−０７５４８０、ＡＧ−１７０４２、ＨＬ−０８１７３７、ＡＧ−０２６１０７およびＡＧ−０２３０７１により、政府に支援された。政府は、本発明における一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００５】
心不全は、高齢者における死亡の主因である。しかしながら、これが原発性加齢性心筋症の結果であるか、慢性冠動脈疾患の結果であるかは不明である。ヒトに置いて、年齢に伴う冠動脈循環の必然的な病変を、心筋老化および心不全の内因性メカニズムと分離することは難しい。老化性心臓は、典型的には、心臓疾患に適合する機能的余力および限定能力の低減を示す（Maggioni et al. (1993) N. Engl. J. Med. 329: 1442-1448）。重要な問題は、平均寿命が不可避の遺伝子時計を反映しているか（Sanderson and Scherbov (2005) Nature 435: 811-813）、あるいは心不全が器官および生物体のプログラムされた死を妨げて、ヒトの寿命に負の影響を及ぼすかである。
【０００６】
心臓血管性疾患は、心不全の潜在的一因であり、工業化世界全体を通して主要な健康危険因子である。最も一般的な心臓血管性疾患であるアテローム硬化症は、心臓発作、卒中および四肢の壊疽の主因であり、それにより米国における死亡の主因である。アテローム硬化症は、多数の細胞型および分子因子を伴う複合疾患である（詳細な再検討に関しては、Ross (1993) Nature 362: 801-809を参照）。
【０００７】
虚血は、不適切な還流のための器官の組織における酸素供給の欠如により特性化される症状である。このような不適切な還流は、多数の自然原因、例えばアテローム硬化性または再狭窄性病変、貧血または卒中等を有する。多数の医学的介入、例えばバイパス手術中の血流の遮断も、虚血をもたらす。時として罹患心臓血管性組織により引き起こされるもののほかに、虚血は、時としては、虚血性心疾患の場合のように心臓血管性組織に影響を及ぼし得る。しかしながら、虚血は、酸素供給の欠如を蒙っている任意の器官で起こり得る。
【０００８】
心臓における虚血の最も一般的な原因は、心筋梗塞（ＭＩ）である。心臓発作として一般に既知のＭＩは、最もよく知られた型の心臓血管性疾患である。１９９８年の概算は、米国で７３０万人がＭＩに罹患していることを示しており、１００万人以上が当該年にＭＩを経験している（American Heart Association, 2000）。これらの個体のうち、男性の２５％および女性の３８％が、その最初にＭＩが確認された年内に死亡している（American Heart Association, 2000）。ＭＩは、典型的には冠動脈の狭窄により引き起こされる心臓の領域への血流の突然のおよび持続的欠如により引き起こされる。適切な血液供給がないと、組織は虚血になり、筋細胞および血管構造の死に至る。壊死組織のこの領域は、梗塞部位として言及され、最終的には瘢痕組織になる。生存は、梗塞部位のサイズによって決まり、回復の確率は梗塞部位の増大に伴って減少する。例えばヒトにおいて、左心室の４６％以上の梗塞は、非可逆的心原性ショックおよび死を誘発する。
【０００９】
ＭＩに関するほとんどの研究が、梗塞サイズの低減に集中してきた。心筋細胞または骨格筋原細胞を移植することにより壊死組織を再生する試みは少数であった（Leor et al. (1996) Circulation 94:(Supplement II) II-332-II-336 ; Murray et al. (1996) Clin. Invest. 98:2512-2523; Taylor et al. (1998) Nature Med. 4, 929-933; Tomita et al. (1999) Circulation 100(suppl II), II-247-II-256; Menasche et al. (2000) Circulation 100(suppl II), II-247-II-256）。細胞は移植後に生存し得るが、それらは、機能的および構造的の両面で健全である健常心筋および冠動脈血管を再構築できない。
【００１０】
正常成体における細胞はすべて、身体の種々の区域に存在する前駆体細胞として生じる。これらの細胞は、順に、先祖と呼ばれる非常に未熟な細胞に由来し、これらは、半固体培地、例えばメチルセルロースまたは寒天、あるいは液体培地中での１〜３週間培養で細胞の連続コロニーに発達することにより検定される。始原細胞それ自体は、幹細胞と呼ばれる始原細胞の一クラスに由来する。幹細胞は、分裂時に、自己複製および始原細胞への分化の両方のための能力を有する。したがって、分裂中の幹細胞は、付加的な原始幹細胞およびそれより多少分化した始原細胞の両方を生じる。血球の発達における幹細胞の周知の役割のほかに、幹細胞は、他の組織、例えば肝臓、脳および心臓を含めて（これらに限定されない）中に見出される細胞も生じる。
【００１１】
幹細胞は、無限に分裂し、特定の型の細胞に特殊化する能力を有する。卵が受精し、分裂し始めた後に存在する全能性幹細胞は、全部の可能性を有し、あらゆる型の細胞になることができる。一旦、細胞が胞胚段階に到達すると、細胞の可能性は減少するが細胞は依然として身体内のあらゆる細胞に発達し得るが、しかしながら、それらは胚の発生のために必要とされる支持組織に発達できない。細胞は、依然として多数の型の細胞に発達し得る場合、多能性とみなされる。発生中、これらの細胞はさらに特殊化されるようになり、特殊機能を有する細胞を生じるに任せる。多能性と考えられるこれらの細胞は、ヒト成体において見出され、成体幹細胞と呼ばれる。幹細胞が骨髄中にあると特定されること、そして血流全体を通して循環する少量の末梢血幹細胞が存在することは周知である（National Institutes of Health, 2000）。
【００１２】
今までのところ、少数の血液学的障害を除いて（Bagby et al. (2004) Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program 318-336）、幹細胞不全は、自己複製器官、例えばヒト心臓では起きない。大型心筋梗塞後に実際に死亡するかまたは末期虚血性および非虚血性心筋症のために心臓移植を受ける患者の心臓中に、機能的適格心臓幹細胞のプールが存在する（Urbanek et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 10440-10445; Urbanek et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 8692-8697）。同様に、長いテロメアを有する循環心臓幹細胞は、冠動脈疾患および心不全の危険因子の非存在下で老齢性代償不全ヒト心臓において同定されている（Chimenti et al. (2003) Circ. Res. 93: 604-613）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、一部は、優れた再生能力を示し、培養中で数回継代後でさえ細胞老化を示さない成体心筋中に存在する成体心臓幹細胞の小集団の発見に基づいている。これらの細胞は、相対的に多量のテロメラーゼ活性を保持し、長いテロメアを有し、そしてＰ１６ＩＮＫ４ａ陰性である。いくつかの実施形態では、これらの細胞は、ＩＧＦ−１受容体を発現する。本発明は、成体心臓幹細胞のこの非老化性小集団を単離するための方法を、ならびに種々の心臓症状を処置するために非老化性心臓幹細胞のこのプールを用いる方法を提供する。
【００１４】
本発明は、心筋組織、例えばヒト心筋組織から非老化性成体心臓幹細胞を単離する方法を包含する。一実施形態では、被験体から心臓幹細胞を抽出すること；上記幹細胞を拡張し、培養すること；拡張幹細胞におけるテロメア長、テロメラーゼ活性および／またはＩＧＦ−１受容体発現を確定すること；そしてＩＧＦ−１受容体に関して陽性であるかおよび／または特定テロメア長およびテロメラーゼ活性のレベルを有する幹細胞を選択することを包含する。一実施形態では、単離非老化性幹細胞は、１つ以上の幹細胞マーカー、例えばｃ−ｋｉｔおよびＭＤＲ１を発現する。
【００１５】
本発明の別の態様では、非老化性心臓幹細胞は、不死ＤＮＡを保有する幹細胞に関してさらに選択され得る。細胞複製後に老いたＤＮＡ鋳型鎖（例えば不死ＤＮＡ）を保持する心臓幹細胞は、新しいＤＮＡ鋳型のみを有する心臓幹細胞より大きい成長能力（すなわち、より多数の非老化性細胞を生じる）および修復可能性を有する。一実施形態では、不死ＤＮＡを有するこのような心臓幹細胞は、細胞培養中での少なくとも１回の継代後にＤＮＡ標識を保持しない心臓幹細胞のクローンを選択することにより同定される。ＤＮＡ標識に関して陰性である心臓幹細胞（すなわち、不死ＤＮＡを有する心臓幹細胞）は、不死ＤＮＡを有する成体心臓幹細胞の純粋集団を得るために単離され得る。したがって、本発明は、不死ＤＮＡを有する成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団およびその薬学的組成物も包含する。ある実施形態では、このような心臓幹細胞は、ｃ−ｋｉｔ陽性、ＩＧＦ−１受容体陽性およびｐ１６ＩＮＫ４ａ陰性である。
【００１６】
本発明は、単離非老化性成体心臓幹細胞の薬学的組成物も提供する。一実施形態では、薬学的組成物は、単離ヒト心臓幹細胞および製薬上許容可能な担体を含み、この場合、上記単離ヒト心臓幹細胞はｃ−ｋｉｔ陽性、ＩＧＦ−１受容体陽性であり、そして５ｋｂｐ長より長いテロメアを有する。別の実施形態では、ヒト心臓幹細胞はｐ１６ＩＮＫ４ａ陰性である。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、不死ＤＮＡを有する単離ヒト心臓幹細胞およびその他の幹細胞（例えば、その他の心臓幹細胞、例えば新しいＤＮＡ鋳型鎖を有するもの）の混合物を含む。このような組成物では、当該組成物は、不死ＤＮＡを含む単離心臓幹細胞を少なくとも８％以上含む。ある実施形態では、組成物は、不死ＤＮＡを含む単離心臓幹細胞を少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％含む（すなわち、組成物中の心臓幹細胞は、不死ＤＮＡを有する心臓幹細胞に関して少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の純度である）。
【００１７】
本発明は、被験者における損傷心筋および／または加齢関連心筋症の修復方法であって、損傷および／または加齢心筋の領域に単離非老化性生体心臓幹細胞を投与することを包含する方法も包含するが、この場合、上記心臓幹細胞は、それらの投与後に心筋および／または心筋細胞を生じて、それにより損傷心筋および／または加齢関連心筋症を修復する。ある実施形態では、単離非老化性心臓幹細胞は、不死ＤＮＡを含有する。このような実施形態では、非老化性心臓幹細胞は、損傷心筋の構造的および機能的完全性を老化性心臓幹細胞（例えば、本明細書中に記載されるような非老化のマーカーを有さない）より大きい回復を示す。単離非老化性成体心臓幹細胞は、投与前に活性化され得る。一実施形態では、単離非老化性成体心臓幹細胞は、１つ以上のサイトカイン、例えば肝細胞増殖因子またはインスリン様増殖因子−１にそれらを曝露することにより活性化される。別の実施形態では、活性化幹細胞は、自系であるか、あるいはそれらが再投与される同一被験体から単離される。いくつかの実施形態では、当該方法はさらに、走化性勾配を形成するために１つ以上のサイトカインの心筋内投与を包含するが、この場合、上記走化性勾配は、加齢または損傷心筋の領域への投与非老化性成体心臓幹細胞の動員を助長する。
【００１８】
本発明は、被験体における心不全を防止または処置する方法であって、被験体の心臓に単離非老化性生体心臓幹細胞（不死ＤＮＡを含有する心臓幹細胞を含む）を投与すること、そしてアンギオテンシンＩＩ受容体アンタゴニストを投与することを包含する方法も包含する。いくつかの実施形態では、当該方法はさらに、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬の投与を包含する。単離非老化性心臓幹細胞は、投与前に１つ以上のサイトカインに曝露することにより活性化され得る。他の実施形態では、当該方法はさらに、走化性勾配を形成して、加齢または損傷心筋の領域への委嘱活性化幹細胞の移動を促進するために、１つ以上のサイトカイン、例えば肝細胞増殖因子またはインスリン様増殖因子−１の心筋内投与を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】（Ａ）２９ヶ月での左心室（ＬＶ）の心尖における１４のｃ−ｋｉｔ陽性ＣＰＣ（緑色）のクラスター；１４のＣＰＣのうちの１２がＧＡＴＡ−４（黄色；筋細胞の始原細胞）を表す。１２のＧＡＴＡ−４陽性ＣＰＣのうちの２つ（差込み図）は、心臓−ミオシン重鎖（ＭＨＣ、赤色；筋細胞の始原細胞）を表す。２つのＣＰＣは、ｃ−ｋｉｔ（緑色、矢印；Ｌｉｎｎｅｇ−ＣＰＣ）のみを表す。２つの小さな発達中の筋細胞が存在する（矢頭）。核、ＰＩ（青色）。（Ｂ）２０ヶ月での左心房における１５個のＣＰＣのクラスター；１３個はＧＡＴＡ−４陽性であり、２個はｃ−ｋｉｔのみを表す（矢印）。発達中の筋細胞が存在する（矢頭）。
【図２】ＣＰＣ／心筋１ｍｍ３（上パネル）、ｐ１６ＩＮＫ４ａ陽性ＣＰＣの割合（中央パネル）および機能的適格ＣＰＣ／心筋１ｍｍ３（下パネル）。ｐ１６ＩＮＫ４ａ−ＣＰＣの値は、アポトーシスＣＰＣを含む（図４参照）。
【図３】２０ヶ月での左心室（ＬＶ）におけるｃ−ｋｉｔ陽性ＣＰＣ（緑色）のクラスター；いくつかのＣＰＣは、老化関連タンパク質ｐ１６ＩＮＫ４ａ（白色；矢頭）を表す。筋細胞、ＭＨＣ（赤色）。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ、青色）。
【図４】アポトーシスＣＰＣのパーセンテージ（上パネル）および数／心筋１ｍｍ３（下パネル）。＊ｐ＜０．０５対４ヶ月（４ｍ）。＊＊ｐ＜０．０５対１２ヶ月（１２ｍ）；†ｐ＜０．０５対２０ヶ月（２０ｍ）。
【図５】筋細胞の始原細胞（ｃ−ｋｉｔ陽性ＭＥＦ２Ｃ陽性ＣＰＣ／心筋１ｍｍ３）および前駆体（ｃ−ｋｉｔ陽性ＭＥＦ２Ｃ陽性ＭＨＣ陽性ＣＰＣ／心筋１ｍｍ３）。＊ｐ＜０．０５対４ヶ月（４ｍ）。＊＊ｐ＜０．０５対１２ヶ月（１２ｍ）；†ｐ＜０．０５対２０ヶ月（２０ｍ）。
【図６】ＢｒｄＵラベリングの７日後の老いた心臓：７個のＣＰＣ（ｃ−ｋｉｔ、緑色）のうちの３個がＢｒｄＵ明性（黄色；矢印）である心房陥凹。ＢｒｄＵ明性ＣＰＣは、Ｌｉｎｎｅｇ（ＧＡＴＡ−４陰性）である。ＢｒｄＵ明性筋細胞も存在する（星印）。
【図７】（Ａ）追跡１２週間後の老いた心臓：１１個のＣＰＣ（ｃ−ｋｉｔ、緑色）のうちの１個がＢｒｄＵ明性（深紅色；矢印）およびＢｒｄＵ暗性（矢頭）である心房陥凹。（Ｂ）ＢｒｄＵ明性ＣＰＣは、Ｌｉｎｎｅｇ（ＧＡＴＡ−４陰性）である。（Ｃ）１個のＢｒｄＵ暗性筋細胞も認められる（α−筋節アクチン、α−ＳＡ、星印）。いくつかの非筋細胞核も、ＢｒｄＵにより標識される。（Ｄ）７日および１２週間でのＢｒｄＵ明性およびＢｒｄＵ暗性−ＣＰＣ。
【図８】（ＡおよびＢ）７日でのＢｒｄＵ（黄色）明性−（矢印）およびＢｒｄＵ暗性−（矢頭）筋細胞（α−ＳＡ、赤色）。いくつかの非筋細胞核も、ＢｒｄＵにより標識される。ラミニン、白色。（ＣおよびＤ）１２週間でのＢｒｄＵ（黄色）明性−（矢印）、中間−（中白矢頭）およびＢｒｄＵ暗性−（矢頭）筋細胞（α−ＳＡ、赤色）。ラミニン、白色。
【図９】７日および１２週間でのＢｒｄＵ明性−、中間−および暗性−筋細胞。＊ｐ＜０．０５対７日（７ｄ）。＊＊ｐ＜０．０５対新しい心臓。
【図１０】若い（上パネル）および老いた（下パネル）心臓から単離された分裂中の筋細胞（α−ＳＡ、赤色）における中期および後期染色体。ホスホ−Ｈ３（緑色）が存在する。
【図１１】ホスホ−Ｈ３（ＣおよびＤ：緑色）に関して陽性である中期染色体（ＡおよびＢ：青色、ＰＩ；矢印）が、若い（ＡおよびＣ）および老いた（ＢおよびＤ）心臓のＬＶ心筋における小分裂中心筋細胞で明白である。
【図１２】組織切片（左パネル）および単離筋細胞（右パネル）における筋細胞有糸分裂指数。＊ｐ＜０．０５対若い心臓。
【図１３】若い（Ａ）および老いた（Ｂ）心臓からの新規単離ＣＰＣのサイトスピン調製物中のテロメア（Ｑ−ＦＩＳＨ、深紅色）。Ｌｉｎｎｅｇ−ＣＰＣ（ｃ−ｋｉｔ、緑色；矢印）、筋細胞の始原細胞（Ｎｋｘ２．５、白色；矢頭）および筋細胞前駆体（α−ＳＡ、赤色；星印）が存在する。（Ｃ）長い（Ｌ５１７８Ｙ−Ｒ、４８ｋｂｐ）および短い（Ｌ５１７８Ｙ−Ｓ、７ｋｂｐ）テロメアを有するリンパ腫細胞を、比較および参照点のために用いた。
【図１４】若い（Ａ）および老いた（Ｂ）ＬＶ心筋は、長い（Ａ）および短い（Ｂ）テロメアを有する小サイクリング（Ｋｉ６７、黄色；矢印）筋細胞を含有する。
【図１５】若い（上パネル）および老いた（下パネル）心臓におけるＬｉｎｎｅｇ−ＣＰＣ、筋細胞の始原細胞、筋細胞前駆体および増幅中の筋細胞でのテロメア長の分布。各細胞クラスにおいて、平均テロメア長が、≦１２ｋｂｐおよび≧１８ｋｂｐのテロメアを有する細胞のパーセンテージと一緒に列挙されている。各細胞部類に関して、サイクリング細胞（緑色中黒バー）および老化性ｐ１６ＩＮＫ４ａ陽性細胞（赤色中黒バー）の割合が示されている。
【図１６】若い（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ）および老いた（Ｃ、Ｆ）心臓からの新規単離ＣＰＣは、膜上にＩＧＦ−１Ｒ（Ａ、深紅色）、ｃ−Ｍｅｔ（Ｂ、黄色）およびＡＴ１受容体（Ｃ、白色）、ならびに細胞質中にＩＧＦ−１（Ｄ、深紅色）、ＨＧＦ（Ｅ、黄色）およびＡｎｇＩＩ（Ｆ、白色）を表す。
【図１７】年齢の一関数としてのＣＰＣ中のレニン、ＡｏｇｅｎおよびＡＴ１受容体ｍＲＮＡ。β−アクチンを、標準化のために用いた。ＲＴ−ＰＣＲ生成物は、予測分子量および配列を有した。ｍＲＮＡにおける遺伝子発現変動比を、３ヶ月での若いＣＰＣにおける値に関連して示す。
【図１８】若い（３ヶ月）および老いた（２７ヶ月）ＣＰＣにおけるＡｏｇｅｎおよびＡＴ１受容体のタンパク質レベル。肺（Ｌ）および腎臓（Ｋ）組織溶解物を、陽性対照として用いた。
【図１９】年齢の一関数としてのＣＰＣ中のＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦ−１、ｃ−ＭｅｔおよびＨＧＦｍＲＮＡ。β−アクチンを、標準化のために用いた。ＲＴ−ＰＣＲ生成物は、予測分子量および配列を有した。ｍＲＮＡにおける遺伝子発現変動比を、３ヶ月での若いＣＰＣにおける値に関連して示す。
【図２０】２４時間の非刺激およびリガンド刺激ＣＰＣにおけるＩＧＦ−１、ＨＧＦおよびＡｎｇ  ＩＩの生成。ＣＰＣタンパク質およびβ−アクチン発現の総量により、値を標準化した。＊ｐ＜０．０５対３ヶ月（３ｍ）；＊＊ｐ＜０．０５対非刺激ＣＰＣ。
【図２１Ａ−Ｂ】若いおよび老いたＣＰＣの増殖（Ａ）およびアポトーシス（Ｂ）。非刺激ＣＰＣにおける値に関して、変化パーセントをコンピューター処理した。＊ｐ＜０．０５対３ヶ月（３ｍ）。
【図２１Ｃ−Ｅ】基線（左パネル）での、ならびにＡｎｇ  ＩＩ刺激後（右パネル）の若い（Ｃ）および老いた（Ｄ）ＣＰＣにおける８−ＯＨ−ｄＧ（深紅色）の局在化。（Ｅ）８−ＯＨ−ｄＧに関して陽性のＣＰＣ。＊ｐ＜０．０５対３ｍ；†ｐ＜０．０５対ＳＦＭ。
【図２２】ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−１Ｒ、ＨＧＦ、ｃ−Ｍｅｔ、Ａｎｇ  ＩＩおよびＡＴ１受容体に関して陽性のＣＰＣ。＊ｐ＜０．０５対４ｍおよび１２ｍ；＊＊ｐ＜０．０５対２０ｍ。
【図２３】若い（３ｍ）および老いた（２７ｍ）心臓からのＣＰＣの集団倍加時間およびＢｒｄＵ標識化。
【図２４】ＴＲＡＰ検定により測定された若い（３ｍ）および老いた（２７ｍ）ＣＰＣにおけるテロメラーゼ活性。テロメラーゼ活性は、５０ｂｐで開始して、６ｂｐ周期性を示す。ＨｅＬａ細胞を陽性対照として用い、ＲＮアーゼで処置した試料を陰性対照として用いた。ＴＳＲ８を用いて、当該帯域の位置を確証した。３つのタンパク質濃度を用いて、検定の特異性を実証した。３６ｂｐでの帯域は、ＰＣＲ効率に関する内部対照である。
【図２５】（Ａ）図示のように、ＣＰＣのクラスターは、心房中に貯蔵される。この解剖学的区域に、ＥＧＦＰ−レトロウイルスを注入して、サイクリングＣＰＣを感染させた。感染２日後、漸増濃度のＨＧＦを単独で、またはＩＧＦ−１と一緒に、心房からＬＶ正中領域に心筋内送達して、走化性勾配を生じて、ＣＰＣ−ＥＣＣの移動を促進した。（Ｂ）いくつかがＥＧＦＰ−レトロウイルス（緑色；矢印）に感染した数個のＣＰＣ（ｃ−ｋｉｔ、白色）を含有する心房心筋の切片。筋細胞（ＭＨＣ、赤色）。
【図２６】レトロウイルスの感染の２日後、増殖因子を投与し、そして二光子顕微鏡により、酸素添加タイロード溶液中で、ＥＧＦＰ陽性細胞の移動をex vivoで検査した。これらの画像は、４月齢のフィッシャー３４４ラットにおける増殖因子の投与後１０時間での細胞移動に対応する。これら５つのパネル（Ａ〜Ｅ）（パネルＣは２枚示されている）は、各々２０分間隔で検査した同一視野を示す。緑色蛍光は、in vivoでのＥＧＦＰ標識化細胞を反映する。種々の色の矢頭は、８０分間の期間に亘る大型中空矢印の方向に動く細胞を指し示す。白色円形は、視野中に出現し、次いで消失した細胞を示す。パネルＥにおける白色小正方形は、パネルＤにおいて現われ始めた２つの細胞を示す。
【図２７】図２６からのパネルＥを、ここで再び示す（Ａ）。正方形は、二光子顕微鏡により生きた組織で、ならびに共焦点顕微鏡による同一ＬＶ領域の固定および染色後に検出されるＥＧＦＰ陽性細胞を限定する（パネルＢ）。両方のパネルにおける緑色蛍光は、同一細胞を同定する（ＡおよびＢ）。ＥＧＦＰ陽性細胞は、ｃ−ｋｉｔ（Ｃ、緑色）、ＭＤＲ１（Ｄ、黄色）、ＧＡＴＡ−４（Ｃ、白色）およびｃ−Ｍｅｔ（Ｅ、赤色）を表す。例えば、３個のＥＧＦＰ陽性細胞はＫｉ６７陽性であり（Ｄ、深紅色；星印）、ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ１およびｃ−Ｍｅｔを発現し（矢頭）、１個のＥＧＦＰ陽性細胞は４つのタンパク質すべてを表す（矢印）。筋細胞（ＭＨＣ、赤色）。核（ＰＩ、青色）。
【図２８】これらの画像は、２７月齢のフィッシャー３４４ラットにおける増殖因子の投与後１０時間での細胞移動に対応する。これら５つのパネル（Ａ〜Ｅ）（パネルＣは２枚示されている）は、各々１５分間隔で検査した同一視野を示す。緑色蛍光は、in vivoでのＥＧＦＰ標識化細胞を反映する。種々の色の矢頭は、６０分間の期間に亘る大型中空矢印の方向に動く細胞を指し示す。赤色円形は、視野中に存在し、次いで消失した細胞を示す。黄色卵形は、観察期間全体を通して視野内で動いた細胞を取り囲んでいる。
【図２９】図２８からのパネルＥを、ここで高倍率で再び示す；新規パネルＡ。正方形および長方形は、二光子顕微鏡により生きた組織で、ならびに共焦点顕微鏡による同一ＬＶ領域の固定および染色後に検出されるＥＧＦＰ陽性細胞を限定する（パネルＢ）。両方のパネルにおける緑色蛍光は、同一細胞を同定する（ＡおよびＢ）。ＥＧＦＰ陽性細胞は、ｃ−ｋｉｔ（Ｃ、緑色）、Ｓｃａ−１（Ｄ、黄色）、ＧＡＴＡ−４（Ｃ、白色）およびｃ−Ｍｅｔ（Ｅ、赤色）を表す。例えば、７個のＥＧＦＰ陽性細胞はｃ−ｋｉｔ、Ｓｃａ−１およびｃ−Ｍｅｔを表し（矢頭）、３個のＥＧＦＰ陽性細胞は４つのタンパク質すべてを表す（矢印）。筋細胞（ＭＨＣ、赤色）。核（ＰＩ、青色）。
【図３０】２７ヶ月目のラット心臓。色付き矢頭は、黄色中空矢印の方向に動くＥＧＦＰ陽性細胞を指し示す。ローダミン標識化デキストラン（赤色）により、冠動脈血管系を可視化している。
【図３１】これらの画像は、４月齢のフィッシャー３４４ラットにおいて得た。ローダミン標識化デキストランを含有する酸素添加タイロード溶液で冠動脈循環を還流し、増殖因子を観察時点で投与した。最初の画像を１５分以内に得たが、これは、心臓の心外膜表面における顕微鏡の調整に必要とされる時間である。これら５つのパネル（Ａ〜Ｅ）（パネルＣは２枚示されている）は、各々２０分間隔で検査した同一視野を示す。赤色蛍光は冠動脈血管系の分布に対応し、緑色蛍光はin vivoでのＥＧＦＰ標識化細胞を反映する。種々の色の矢頭は、８０分間の期間に亘る大型中空矢印の方向に動くＥＧＦＰ陽性細胞を指し示す。全パネルにおいて、ＥＧＦＰ移動細胞は冠動脈の外側に存在したが、これは、冠動脈循環が心筋内のＥＧＦＰ陽性細胞（色付き矢頭）の移動に関係がなかったことを示唆している。
【図３２】移動中のＥＧＦＰ陽性細胞は、間質フィブロネクチン（黄色）により限定されるトンネル内に突き止められた。大型矢印は、ＥＧＦＰ陽性細胞の移動の方向を指し示す。
【図３３】増殖因子投与後の若い（４ｍ）および老いた（２７ｍ）心臓におけるいいＧＦＰ陽性細胞の移動の速度（上パネル）および細胞数（中央パネル）、ならびにサイクリング細胞（下パネル）。＊ｐ＜０．０５対４ｍ。
【図３４】移動ＣＰＣ（Ａ、ｃ−ｋｉｔ、緑色）および非移動ＣＰＣ（Ｂ）におけるテロメア長（ＡおよびＢ：深紅色）。（Ｃ）移動ＣＰＣは、ｐ１６ＩＮＫ４ａ陰性である。非移動ＣＰＣは、大部分はｐ１６ＩＮＫ４ａ陽性である（Ｄ、黄色）。
【図３５】図において、ＣＰＣのクラスターは、心房および心尖に貯蔵されている。これらの解剖学的区域に、ＥＧＦＰ−レトロウイルスを注入して、サイクリングＣＰＣおよびＥＣＣを感染させた。感染２日後、漸増濃度のＨＧＦをＩＧＦ−１と一緒に、心房および心尖からＬＶ正中領域に心筋内送達した。目的は、貯蔵ＣＰＣと損傷心筋の間に走化性勾配を生じて、組織損傷の区域への機能的適格原始細胞の転位置を促すことであった。対照動物には、ビヒクルを注入した。４５日後に、処置および非処置動物を検査した。
【図３６】増殖因子で処置した２８〜２９ヶ月心臓における新規形成ＥＧＦＰ陽性心筋細胞（左パネル：ＥＧＦＰ、緑色；右パネル：ＭＨＣ、赤色；矢印）。
【図３７】１６〜１７ｍでの処置心臓における新規形成ＥＧＦＰ陽性心筋細胞（左パネル：ＥＧＦＰ、緑色；右パネル：ＭＨＣ、赤色；矢印）。
【図３８】２１〜２２ｍでの処置心臓における新規形成ＥＧＦＰ陽性毛細管（左パネル、上パネル：ＥＧＦＰ、緑色；中央パネル：ｖＷＦ、白色；下パネル：併合）ならびに２８〜２９ｍでの処置心臓における小動脈（右パネル、上パネル：ＥＧＦＰ、緑色；中央パネル：α−ＳＭＡ、赤色；下パネル：併合）。
【図３９】心筋再生の区域。ＥＧＦＰ、緑色（Ａ）；ＭＨＣ、赤色（Ｂ）；ＢｒｄＵ、白色（Ｃ）ならびにＡ、ＢおよびＣの併合（Ｄ）。
【図４０】それぞれ１６〜１７ｍ、２１〜２２ｍおよび２８〜２９ｍでの処置心臓における新規形成ＥＧＦＰ陽性心筋細胞、毛細管および小動脈。＊ｐ＜０．０５対１６〜１７および２１〜２２ヶ月。
【図４１】ＢｒｄＵ陽性筋細胞（上パネル）および冠状小動脈（中央パネル）および毛細管（下パネル）。＊ｐ＜０．０５対１６〜１７ヶ月。＊＊ｐ＜０．０５対２１〜２２ヶ月；†ｐ＜０．０５対非処置動物。
【図４２】Ｐ１６ＩＮＫ４ａ陽性筋細胞。＊ｐ＜０．０５対２８〜２９ヶ月での非処置心臓。
【図４３】１６〜１７、２１〜２２および２８〜２９ヶ月の非処置（橙色バー）および処置（青色バー）ラットにおける基線（１５、２０および２７ヶ月；白色バー）での、ならびに４５日後のＬＶ解剖学。＊ｐ＜０．０５対基線、および†ｐ＜０．０５対４５日後の非処置動物。
【図４４】１６〜１７、２１〜２２および２８〜２９ヶ月の非処置（橙色バー）および処置（青色バー）ラットにおける基線（１５、２０および２７ヶ月；白色バー）での、ならびに４５日後のＬＶ血行力学。＊ｐ＜０．０５対基線、および†ｐ＜０．０５対４５日後の非処置動物。
【図４５】１６〜１７ヶ月の非処置心臓の、ならびに２８〜２９ヶ月の処置心臓の解剖学および血行力学。小三角形は、個々の値を示す。
【図４６】処置の非存在下および存在下での２７ヶ月のラットにおける基線での、ならびに４５日後の心エコー検査パラメーター。＊ｐ＜０．０５対２７ヶ月での同一心臓。
【図４７】増殖因子処置の非存在下（Ａ）および存在下（Ｂ）での２７ヶ月の、ならびに４５日後のラットのＭモード心エコー検査。処置に伴う心臓動作の改善が明らかである。
【図４８】２７ヶ月の非処置および増殖因子処置動物における死亡率。
【図４９】心筋試料から単離された単一ｈＣＰＣ由来のクローン。単一ｈＣＰＣから、多細胞クローンを９日で発育させた；ｈＣＰＣクローンは、ｃ−ｋｉｔに関して陽性である（緑色）。
【図５０】クローン原性ｈＣＰＣは主に筋細胞（α−ＳＡ、赤色）に分化するが、しかし平滑筋細胞（ＳＭＣ；α−ＳＭＡ、緑色）および内皮細胞（ＥＣ；ｖＷＦ、黄色）にも分化する。
【図５１】ｈＣＰＣの注入の２１日後の梗塞マウス（左パネル）における、ならびにｈＣＰＣの注入の１４日後の梗塞ラット（右パネル）におけるヒト心筋（矢頭）。新しい筋細胞は、α−ＳＡに関して陽性である（赤色）。心筋のヒト起源は、核（緑色）中のＡｌｕに関するヒトＤＮＡ配列の検出により確証された；ＢｒｄＵは、新規形成筋細胞を標識するために投与された（右上パネル、白色）。
【図５２Ａ−Ｂ】（Ａ）ｈＣＰＣにおけるテロメラーゼ活性。この検定では、Ｐ３〜Ｐ４、Ｐ５〜Ｐ６およびＰ８〜Ｐ９でのｈＣＰＣを分析した。これらの継代は、９〜１２、１５〜１８および２５〜２８集団倍加に対応する。テロメラーゼ活性の生成物は、５０ｂｐで出発し、６−ｂｐ周期性を示す。２つのタンパク質濃度を用いた。ＲＮアーゼおよびＣＨＡＰＳ緩衝液で処置した試料を陰性対照として用い、ＨｅＬａ細胞を陽性対照として用いた。３６ｂｐでの帯域は、ＰＣＲ効率に関する内部対照に対応する。テロメラーゼ活性は、Ｐ３〜Ｐ４からＰ８〜Ｐ９まで、ほぼ５０％減少した。（Ｂ）心臓ＰＣにおけるテロメア長。これらの画像は、Ｐ３〜Ｐ４、Ｐ５〜Ｐ６およびＰ８〜Ｐ９でのｈＣＰＣにおいて得られた。深紅色ドットは、個々のテロメアを表す。短い（７ｋｂｐ、Ｌ５１７８Ｙ−Ｓ）および長い（４８ｋｂｐ、Ｌ５１７８Ｙ−Ｒ）既知のテロメア長を有するリンパ腫細胞を、比較および参照点のために用いた。
【図５２Ｃ】（Ｃ）異なる継代出のｈＣＰＣにおけるテロメア長の分布。平均テロメア長を、テロメア短縮の程度および５ｋｂｐ以上の長さのテロメアを有する細胞の割合と一緒に示す。
【図５３Ａ−Ｇ】実時間ＲＴ−ＰＣＲ（Ａ〜Ｃ、Ｈ、Ｋ、Ｌ）および免疫細胞化学（Ｄ〜Ｇ、Ｉ、Ｊ、Ｍ、Ｎ）によるｈＣＰＣにおける局所ＲＡＳ（Ａ〜Ｊ）およびＩＧＦ−１−ＩＧＦ−１Ｒ系（Ｋ〜Ｎ）の構成成分の検出。
【図５３Ｈ−Ｎ】同上。
【図５４】上パネルは、高齢患者から収集したＩＧＦ−１Ｒ（示されていない）に関して陽性であるｈＣＰＣにおけるテロメラーゼ（深紅色）およびＢｒｄＵ（緑色）の局在化を示す。下パネルは、ＢｒｄＵ標識化が、若い（Ｙ）および高齢（Ｏ）患者の両方において、ＩＧＦ−１Ｒを発現するｈＣＰＣではより高い、ということを示す。
【図５５】高齢患者から単離されたＩＧＦ−１Ｒ陽性（Ａ）およびＩＧＦ−１Ｒ陰性（Ｂ）ｈＣＰＣにおけるＡＴ１受容体（ＡＴ１Ｒ；赤色、矢印）の局在化。緑色：ｃ−ｋｉｔ。Ｃ：若い（Ｙ）および高齢（Ｏ）患者から得られたＩＧＦ−１Ｒ陽性およびＩＧＦ−１Ｒ陰性ｈＣＰＣにおけるＡＴ１受容体の分布。
【図５６Ａ−Ｄ】ヒト心臓幹細胞（ｈＣＳＣ）を単離し、ＢｒｄＵの非存在下でin vitroで拡張して、次に、ほぼ１００％「祖父母ｈＣＳＣ」がＢｒｄＵ陽性（９９．５±１．０％）になるまで、〜５−６集団倍加のためにＢｒｄＵに曝露した。次いで、これらの細胞は分裂して、これもまたＢｒｄＵ陽性である「親ｈＣＳＣ」のプールを生じた（Ａ）。ＢｒｄＵ標識化親ＣＳＣを限定希釈でプレート化して（Ｂ）、染色分体分離のパターンに従ってクローンを生じた（Ｃ、Ｄ）。
【図５６Ｅ】４つの代表的クローン（Ｅ）のうちの３つにおいて、ＢｒｄＵによりすべてのｈＣＳＣを標識したが、一方、四番目のクローンでは、ｈＣＳＣは、１個の細胞を除いて、すべてＢｒｄＵ陰性であった。
【図５７】ＨＣＳＣ増殖。Ａ：クローン効率。Ｂ：老いた（緑色）および新しい（赤色）ＤＮＡを有するｈＣＳＣ；平均±ＳＤ。
【図５８】ｈＣＳＣのｐ１６ＩＮＫ４ａおよびＱドット標識化。Ａ：隣接パネルにおいてより高倍率で示される１個のＢｒｄＵ陽性細胞（白色、矢頭）がｐ１６陰性であるクローン。老化性ｐ１６陽性ｈＣＳＣ（深紅色、矢印）に関する対照を示す。Ｂ：１個のＢｒｄＵ陽性細胞（白色、矢頭）が隣接パネルにおいてより高倍率で示されるクローン。この細胞は、多数のＱドット（赤色蛍光）を保持した。多数回の分裂を経た他のクローン細胞にでは、最小量のＱドットが存在する。
【図５９】ｈＣＳＣ分裂。Ａ：ｈＣＳＣにおける細胞周期の長さ。Ｂ：３つのｃ−ｋｉｔ陽性ｈＣＳＣの各々からなるクローンの例。各々の場合、１個の細胞はＣＩｄＵおよびＩｄＵに関して陰性である（矢頭）。ＣおよびＤ：２組の染色体においてＢｒｄＵの均一（Ｃ；白色、矢印）および非均一（Ｄ；白色、矢印）局在化を示す分裂後期のｈＣＳＣ；パネルＤでは、１組の染色体のみがＢｒｄＵ陽性である。
【図６０Ａ−Ｄ】ｈＣＳＣクローン。Ａ〜Ｄ：プレート化後９日目に、新しいＤＮＡを有する単一ＢｒｄＵ標識化ｈＣＳＣは、すべてがＢｒｄＵ（Ｂ、白色）により標識される〜３５０のｃ−ｋｉｔ陽性細胞のクローン（Ａ、緑色）を形成した。これに対比して、老いたＤＮＡを有する単一ＢｒｄＵ標識化ｈＣＳＣは、１個の細胞だけがＢｒｄＵ陽性である（Ｄ：差込図、白色）〜７００のｃ−ｋｉｔ陽性細胞（Ｃ）を生じた。
【図６０Ｅ−Ｉ】集団倍加時間（ＰＤＴ）（Ｅ）およびクローンサイズ（Ｆ）。老いた（緑色）および新しい（赤色）ＤＮＡを有するｈＣＳＣ。Ｇ：細胞分化。Ｈ：老いたＤＮＡ（緑色）を有するｈＣＳＣからの１２のクローン中で、１個のｐ１６陽性クローン細胞のみが検出された。老化性細胞は、新しいＤＮＡ（赤色）を有するｈＣＳＣからの１２のクローン中でより高頻度で存在した。Ｉ：アポトーシスは稀であった。
【図６１】単一ＢｒｄＵ標識化「親」ｈＣＳＣ（緑色）は、１個の細胞のみがＢｒｄＵ陽性である〜１０，０００のｃ−ｋｉｔ陽性細胞のクローンを生じた。「親」ＢｒｄＵ標識化ＤＮＡは、第二分裂後に失われた。長方形中に、ＢｒｄＵ（白色、矢頭）を保有する細胞を高倍率で示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書中で用いる場合、「自系」は、同一個体に由来するかまたはそれから転移されるものを指す（すなわち、自系供血；自系骨髄移植片）。
【００２１】
本明細書中で用いる場合、「同種異系」は、遺伝子的に異なるが、しかし同一種に属するかまたはそれから得られるものを指す（例えば、同種異系組織移植片）。
【００２２】
本明細書中で用いる場合、「幹細胞」は「始原細胞」と互換的に用いられ、有糸分裂によりそれ自体を再生する能力を有し、クローン原性であり、そして種々の特殊化細胞型に分化し得る細胞を指す。本明細書中で用いられる幹細胞は、体細胞性幹細胞、例えば骨髄または心臓幹細胞である。
【００２３】
本明細書中で用いる場合、「成体」幹細胞は、胚起源でなく、胚または胎児組織に由来しない幹細胞を指す。
【００２４】
本発明で用いられる幹細胞は、系列陰性であるよう選択されるのが有益である。「系列陰性」という用語は、細胞が特定細胞系列に特徴的な抗原を発現しないことを意味するとして当業者に既知である。そして、系列陰性幹細胞はｃ−ｋｉｔ陽性であるよう選択される、というのが有益である。「ｃ−ｋｉｔ」という用語は、幹細胞の表面に存在することが知られている、そして幹細胞を他の周囲細胞から同定し、分離する方法に語句普通に利用される受容体であるとして、当業者に既知である。
【００２５】
本明細書中で用いる場合、「非老化性幹細胞」は、複製的老化を示すことなく、多数回繰り返して分裂する能力を保有する幹細胞を指す。非老化性幹細胞は、長いテロメアを有するか、および／または若い動物から新たに単離されたｃ−ｋｉｔ陽性心臓細胞におけるテロメラーゼ活性の少なくとも６０％であるテロメラーゼ活性のレベルを有する。「長いテロメア」は、若年動物から単離される心臓幹細胞からの平均テロメア長とほぼ同じかまたはそれより長い長さを有するテロメアを指す。例として、齧歯類における長いテロメアは、約１８ｋｂｐ以上の長さを有するテロメアである。ヒトでは、長いテロメアは、約５ｋｂｐ以上の長さを有するテロメアである。本明細書中で用いる場合、「ヒト非老化性幹細胞」は、約５ｋｂｐ以上の長さのテロメア長を有し、ならびに若い（２０〜４０歳）個体から新たに単離されたｃ−ｋｉｔ陽性心臓細胞におけるテロメラーゼ活性の少なくとも６０％であるテロメラーゼ活性レベルを有する幹細胞を指す。非老化性幹細胞は、ｐ１６ＩＮＫ４ａのような老化のマーカーに関して陰性である。したがって、非老化性心臓幹細胞はｐ１６ＩＮＫ４ａ陰性である。いくつかの実施形態では、非老化性心臓幹細胞は、ＩＧＦ−１受容体を発現する（すなわち、非老化性心臓幹細胞は、ＩＧＦ−１Ｒ陽性である）。
【００２６】
本明細書中で用いる場合、「損傷心筋」は、虚血状態に曝露されてきた心筋細胞を指す。これらの虚血状態は、心筋梗塞、あるいはその他の心臓血管性疾患または関連愁訴により引き起こされ得る。酸素の欠乏は、周囲区域における細胞の死を引き起こし、梗塞を後に残して、これが結局は瘢痕となる。
【００２７】
本明細書中で用いる場合、「加齢性心筋症」は、生物体が年を取ると生じる内在的メカニズムの結果としての心筋の劣化を指す。
【００２８】
本明細書中で用いる場合、「サイトカイン」という用語は「増殖因子」と互換的に用いられ、細胞表面の受容体を結合し、シグナル伝達カスケードを開始し、したがって細胞過程に影響を及ぼすペプチドまたはタンパク質を指す。「サイトカイン」および「増殖因子」という用語は、ネイティブサイトカインまたは増殖因子の機能的変異体を包含する。サイトカインまたは増殖因子の機能的変異体は、その対応する受容体を活性化する能力を保有する。変異体としては、アミノ酸置換、挿入、欠失、代替的スプライス変異体、またはネイティブタンパク質の断片が挙げられる。ポリペプチドに関する「変異体」という用語は、参照配列に関連して１つ以上のアミノ酸により変更されるアミノ酸配列を指す。変異体は「保存的」変化を有し得るが、この場合、置換アミノ酸は、同様の構造的または化学的特性、例えばロイシンのイソロイシンによる置き換えを有する。代替的には、変異体は、「非保存的」変化、例えばグリシンのトリプトファンによる置き換えを有する。類似の小変異は、アミノ酸欠失または挿入あるいはその両方も含み得る。生物学的活性を除去することなくどのアミノ酸残基が置換され、挿入され、または欠失され得るかを確定するに際しての指針は、当該技術分野で周知のコンピュータープログラム、例えばＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアを用いて見出され得る。
【００２９】
本発明の薬学的組成物は、治療薬として、すなわち治療用途に用いられ得る。本明細書中で用いる場合、「処置」および「治療」という用語は、治癒効果、緩和効果および予防効果を包含する。ある実施形態では、治療的有効用量の幹細胞および／またはサイトカインが、心臓に適用され、送達され、または投与されるか、あるいは心臓中に移植される。有効用量または量は、有益なまたは所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。上記用量は、１回以上の投与で投与され得る。
【００３０】
本明細書中で用いる場合、「患者」または「被験体」は任意の脊椎動物を包含し、例としてはヒト、哺乳類、爬虫類、両生類および魚類が挙げられ得るが、これらに限定されない。しかしながら、患者または被験体は、哺乳類、例えばヒト、あるいは家畜化哺乳類のような哺乳類、例えばイヌ、ネコ、ウマ等、あるいは生産哺乳類、例えばウシ、ヒツジ、ブタ等であるのが有益である。好ましい一実施形態では、患者または被験体はヒトである。
【００３１】
本発明は、特定小集団の成体心臓幹細胞を単離する方法を提供する。これらの「非老化性」成体心臓幹細胞は、正常テロメラーゼ活性および長いテロメアを保有することにより細胞老化を回避し、これにより、幹細胞は分裂し続け、短縮化テロメアを有する子孫を生じることなく分化することができる。したがって、非老化性成体心臓幹細胞から生成される成育可能な筋細胞、内皮細胞および平滑筋細胞は、先在する心筋に機能的に統合して、加齢性心筋症または損傷心筋を修復し、それにより器官機能を保ち得る。非老化性心臓幹細胞は、本明細書中に記載される非老化性マーカーを欠く心臓幹細胞と比較して、増殖および再生能力増強を示す（例えば、長いテロメア、高テロメラーゼ活性、ｐ１６ＩＮＫ４ａ陰性およびＩＧＦ−１Ｒ発現）。
【００３２】
本発明の一実施形態では、非老化性成体心臓幹細胞を単離する方法は、被験体から心臓幹細胞を抽出すること；幹細胞を拡張し、培養すること；培養幹細胞の少なくとも１つの非老化性特質を確定すること（ここで、上記特質は、テロメア長、テロメラーゼ活性、ｐ１６ＩＮＫ４ａ発現およびＩＧＦ−１受容体発現からなる群から選択される）；そして長いテロメアを有する幹細胞、対照と比較して少なくとも６０％のテロメラーゼ活性を有する幹細胞、ｐ１６ＩＮＫ４ａ陰性である幹細胞、ＩＧＦ−１受容体を発現する幹細胞、またはその組合せを選択すること（ここで、上記選択幹細胞は非老化性成体心臓幹細胞である）を包含する。いくつかの実施形態では、単離非老化性成体心臓幹細胞は、ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ−１またはその組合せを発現する。別の実施形態では、被験体から心臓幹細胞を抽出するステップは、被験体から心筋組織検体を獲得すること、そして組織検体から幹細胞を単離することを包含する。好ましい実施形態では、被験体はヒトである。
【００３３】
成体幹細胞の単離方法は、当該技術分野で既知である。幹細胞は、被験体または患者から得られる組織検体、例えば心筋または骨髄から単離され得る。例として、組織検体は、切り刻まれ、適切な培地中に入れられる。組織検体から増殖する幹細胞は、初代培養後、約１〜２週間で観察され得る。初代培養後約４週間で、拡張幹細胞が遠心分離により収集され得る。米国特許出願公開第２００６／０２３９９８３号（２００６年２月１６日出願）（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）は、成体幹細胞を培養し、拡張するために適した培地を記載する。しかしながら、当業者は、必要な構成成分を決定し、一般に用いられる細胞培地を本発明の単離幹細胞を培養するのに用いられるよう変更することができる。
【００３４】
本発明の幹細胞は系列陰性（ＬｉｎＮＥＧ）である、ということが好ましい。ＬｉｎＮＥＧ幹細胞は、種々の手段により、例えば幹細胞集団を系列マーカーに対する抗体と接触させ、その後、磁気ビーズおよびバイオマグネットと共役される抗免疫グロブリン抗体を用いることにより抗体結合細胞を単離することによって系列陽性細胞を除去すること（これらに限定されない）により単離され得る。代替的には、抗体結合系列陽性幹細胞は、抗免疫グロブリン抗体と共役されるビーズを含有するカラム上に保持され得る。例えば、心臓系列のマーカー（例えば、血管細胞または心筋細胞委任のマーカー）を発現する細胞は、系列陰性心臓幹細胞を単離するために心臓幹細胞集団から除去され得る。血管系列のマーカーとしては、ＧＡＴＡ６（ＳＭＣ転写因子）、Ｅｔｓ１（ＥＣ転写因子）、Ｔｉｅ−２（アンギオポエチン受容体）、ＶＥ−カドヘリン（細胞接着分子）、ＣＤ６２Ｅ／Ｅ−セレクチン（細胞接着分子）、アルファ−ＳＭ−アクチン（α−ＳＭＡ、収縮タンパク質）、ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）、ｖＷＦ（因子ＶＩＩＩの担体）、バンデイレラ・シンプリシフォリア（Bandeiraera simplicifolia）およびハリエニシダ（Ulex europaeus）レクチン（ＥＣ表面糖タンパク質結合分子）が挙げられるが、これらに限定されない。筋細胞鶏痘のマーカーとしては、ＧＡＴＡ４（心臓転写因子）、Ｎｋｘ２．５およびＭＥＦ２Ｃ（筋細胞転写因子）、ならびにアルファ−筋節アクチン（α−ＳＡ、収縮タンパク質）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
本発明の好ましい一実施形態では、ＬｉｎＮＥＧ幹細胞は、幹細胞因子に関する受容体であり、多薬剤耐性−１（ＭＤＲ１）であり、染料、毒性物質および薬剤を細胞から押出得るＰ−糖タンパク質である１つ以上の幹細胞表面マーカー、例えばｃ−ｋｉｔを発現する。これらの表面マーカーのいずれか１つを発現するＬｉｎＮＥＧ幹細胞の一集団を単離するための陽性選択方法は、当業者に周知である。考え得る方法の例としては、種々の型の細胞分類、例えば蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）および磁気的細胞分類、ならびにアフィニティークロマトグラフィーの変法が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい一実施形態では、ＬｉｎＮＥＧ幹細胞はｃ−ｋｉｔ陽性である。
【００３６】
幹細胞マーカーを発現する単離ＬｉｎＮＥＧ幹細胞は、細胞培養プレートの単一ウェル中で個別にプレート化され、そして個々の幹細胞からクローンを得るために拡張され得る。一実施形態では、テロメア長は、単一幹細胞由来のクローンで測定される。テロメア長の決定方法は、当該技術分野で周知である。テロメア長は、定量的蛍光in situハイブリダイゼーション（Ｑ−ＦＩＳＨ）、サザンブロットまたは定量的ＰＣＲのような方法を用いることにより査定され得る。少なくとも５ｋｂｐ、少なくとも７ｋｂｐ、少なくとも８ｋｂｐ、少なくとも９ｋｂｐ、少なくとも１０ｋｂｐ、少なくとも１２ｋｂｐ、少なくとも１３ｋｂｐ、少なくとも１４ｋｂｐ、少なくとも１５ｋｂｐ、少なくとも１６ｋｂｐ、少なくとも１７ｋｂｐまたは少なくとも１８ｋｂｐ長が、細胞培養における使用のために、またはさらなる拡張のために選択され得る。好ましい一実施形態では、少なくとも５ｋｂｐ長、さらに好ましくは少なくとも７ｋｂｐ長であるテロメアを有するヒト心臓幹細胞が、さらなる使用のために選択される。
【００３７】
別の実施形態では、テロメラーゼ活性は、拡張幹細胞クローンで測定される。テロメラーゼ活性の測定方法としては、電気泳動的およびＥＬＩＳＡベースのテロメア反復増幅プロトコール（ＴＲＡＰ）検定、ならびに実時間ＰＣＲ法が挙げられる。単離幹細胞におけるテロメラーゼ活性は、対照細胞におけるテロメラーゼ活性と比較され得る。対照細胞は、若い動物から新たに単離されたｃ−ｋｉｔ陽性心臓細胞であり得る。ヒト非老化性心臓幹細胞の場合、対照細胞は、若い（２０〜４０歳）個体から新たに単離されたｃ−ｋｉｔ陽性心臓細胞であり得る。対照細胞と比較して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％のテロメラーゼ活性を発現する幹細胞が、使用およびさらなる拡張のために選択され得る。
【００３８】
さらに別の実施形態では、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）受容体発現が、拡張幹細胞クローンで査定される。ＩＧＦ−１受容体は表面タンパク質であり、当業者に既知の慣例的方法により検出され、表面マーカーの発現を測定し得る。このような方法としては、ＦＡＣＳ、磁気細胞分類およびアフィニティークロマトグラフィーの変法が挙げられるが、これらに限定されない。代替的には、ＩＧＦ−１受容体発現は、免疫細胞化学またはウエスタンブロッティング技法により測定され得る。好ましい一実施形態では、ＩＧＦ−１受容体発現に関して陽性である幹細胞クローンが、さらなる使用のために選択される。
【００３９】
さらに別の実施形態では、拡張幹細胞クローンは、ｐ１６ＩＮＫ４ａ発現に関して測定され得る。好ましい一実施形態では、ｐ１６ＩＮＫ４ａ発現に関して陰性である幹細胞は、さらなる使用のために選択される。
【００４０】
ある実施形態では、拡張心臓幹細胞は、不死ＤＮＡを含有するクローンに関して選択され得る。本明細書中で用いる場合、「不死ＤＮＡ」は、細胞複製後に保持される老いた鋳型鎖（新規合成ＤＮＡ鎖と対比した場合）を指す。小集団の心臓幹細胞は非無作為染色分体分離により分裂して、老いた鋳型鎖（すなわち、不死ＤＮＡ）を保持する娘細胞およびより新しい鋳型鎖（すなわち新しいＤＮＡ）を受け継ぐ娘細胞を生じる。両方のクラスの心臓幹細胞（すなわち、不死ＤＮＡを保有する者と新ＤＮＡを保有するもの）は、損傷心臓組織の構造および機能を有効に修復し得るが、不死ＤＮＡを含有する心臓幹細胞は、新ＤＮＡを含有する心臓幹細胞と比較して、優れた増殖および再生能力を示す、ということを本発明人等は発見した。実施例８Ｆを参照。不死ＤＮＡを含有する心臓幹細胞クローンは、培養中のＤＮＡ標識化親心臓幹細胞の少なくとも１回の継代または集団倍加後、ＤＮＡ標識に関して陰性であるクローンを選択することにより同定され得る。例えば、心臓幹細胞はブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）で標識され、次いでクローンは、少なくとも１回の集団倍加が起きるまで、ＤＮＡ標識の非存在下で培養中で標識化親細胞を増殖させることにより、個々のＢｒｄＵ標識化細胞からその後生成される。その結果生じたＢｒｄＵ陰性クローンは、老いた鋳型または不死ＤＮＡを保持する心臓幹細胞を表す。不死ＤＮＡを含有する心臓幹細胞は、他の方法、例えば実施例８に記載されているように、ＦＲＥＴ戦略を用い、その後ＦＡＣｓ分析する方法によっても同定され得る。他の標識を用いる新規合成ＤＮＡ鋳型および老いたＤＮＡ鋳型を含有する細胞間のその他の識別方法は、当業者に既知であり、不死ＤＮＡを含有する心臓幹細胞を同定するために用いられ得る。
【００４１】
したがって、本発明は、不死ＤＮＡを有する成体心臓幹細胞を単離するための方法を包含する。一実施形態では、当該方法は、成体心臓幹細胞をＤＮＡ標識に曝露すること；少なくとも１回の集団倍加のために上記標識化心臓幹細胞を培養すること；そしてＤＮＡ標識に関して陰性である心臓幹細胞を選択すること（ここで、上記選択幹細胞は不死ＤＮＡを有する心臓幹細胞である）を包含する。好ましくは、成体心臓幹細胞はｃ−ｋｉｔ陽性であり、心筋組織（例えば、ヒト心筋組織）から単離される。ＤＮＡ標識は、標識化ヌクレオシドのような細胞を複製するに際して新規合成ＤＮＡ中に組入れられる任意の標識であり得る。単離方法に用いるための適切なＤＮＡ標識としては、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、クロロでオキシウリジン（ＣｌｄＵ）、ヨードデオキシウリジン（ＩｄＵ）等が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、成体心臓幹細胞は、ＤＮＡ標識への曝露前に、本明細書中に記載される１つ以上の非老化性マーカーに関して予備選択され得る。例えば、心筋組織から単離される幹細胞（例えば、ｃ−ｋｉｔ陽性心臓幹細胞）は、テロメア長、テロメラーゼ活性、ＩＧＦ−１受容体発現および／またはｐ１６ＩＮＫ４ａ発現に関して検査され得る。長いテロメア（例えば、ヒト心臓幹細胞に関しては５ｋｂｐより長い）、高テロメラーゼ活性、ＩＧＦ−１受容体陽性および／またはｐ１６ＩＮＫ４ａ発現陰性を有する心臓幹細胞が、不死ＤＮＡを有する心臓幹細胞の単離方法に用いるために選択され、単離され得る。言い換えれば、いくつかの実施形態では、不死ＤＮＡを有する心臓幹細胞に関するさらなる選択のためにＤＮＡ標識に曝露されるべき心臓幹細胞の出発プールは、本明細書中に記載される非老化性マーカーのうちの１つ以上を有する心臓幹細胞であり得る。
【００４２】
ある実施形態では、ＤＮＡ標識の非存在に関して選択される心臓幹細胞は、不死ＤＮＡを有する心臓幹細胞の実質的に純粋な集団を得るために単離され得る。したがって、本発明は、ｃ−ｋｉｔ陽性であり、不死ＤＮＡを有する成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団も包含する。本明細書中で用いる場合、「実質的に純粋な」は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％純粋であることを意味する。実質的に純粋な集団中の心臓幹細胞は、ＩＧＦ−１受容体陽性およびｐ１６ＩＮＫ４ａ陰性でもあり得る。ある実施形態では、成体心臓幹細胞はヒトである。本発明は、製薬上許容可能な担体、ならびに不死ＤＮＡを有する成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団を含む薬学的組成物も提供する。前に考察されたように、成体心臓幹細胞のこの集団は、老いたＤＮＡ鋳型を保持しない（すなわち、不死ＤＮＡを有さない）心臓幹細胞と比較して、優れた再生能力を有する。
【００４３】
本発明は、損傷心筋の区域に単離非老化性幹細胞を投与することによるそれを必要とする被験者における損傷心筋または加齢性心筋症の修復および／または再生方法であって、投与幹細胞が、筋細胞、内皮細胞または平滑筋細胞のうちの１つ以上に分化する方法も提供する。ある実施形態では、損傷心筋は心筋梗塞である。分化細胞は、増殖され、種々の心臓構造、例えば冠動脈、小動脈、毛細管および心筋を形成するが、これらはすべて、心臓における適正な機能に不可欠な構造である。内皮細胞および平滑筋細胞を含めた細胞の移植は移植細胞を損傷領域内で生存させるが、しかしながらそれらは完全機能性を心臓が取り戻すことができるために必要な構造を形成しない、ということが文献中に示されている。機能的および構造的完全性の両方を回復する能力は、本発明のさらに別の態様である。好ましい一実施形態では、非老化性幹細胞は、成体心臓幹細胞である。別の実施形態では、非老化性成体心臓幹細胞は、本明細書中に記載される心臓または血管系症状のうちの１つに関して治療的処置を必要とする被験体から採取された心臓組織から単離され、上記非検体に移植し戻される（すなわち、心臓幹細胞は自系である）。
【００４４】
一実施形態では、当該方法は、不死ＤＮＡを含有する単離非老化性心臓幹細胞を投与することを包含する。上記のように、心臓幹細胞のこの小集団は、心臓幹細胞の他の集団（例えば、新しいＤＮＡを含有する心臓幹細胞または本明細書中に記載されるような非老化性マーカーを保有しない心臓幹細胞）と比較して、優れた再生特性を示す。例えば、いくつかの実施形態では、損傷心筋の構造的修復は、不死ＤＮＡを含有しない心臓幹細胞を用いて観察される修復に比して、不死ＤＮＡを含有する心臓幹細胞の投与後に増強される。構造的修復の測定値としては、壁厚増大、形成される筋細胞の数、細胞複製の程度、ならびに再生される小動脈および毛細管の数が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、損傷心筋の機能的修復は、不死ＤＮＡを含有しない心臓幹細胞を用いて観察される修復に比して、不死ＤＮＡを含有する心臓幹細胞の投与後に増強される。機能的修復の測定値としては、血行力学的測定値、例えば収縮期血圧、陽性および陰性ｄＰ／ｄｔ、ならびにコンピューター処理拡張期応力の増大における減衰が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
したがって、本発明は、治療的有効用量または量の幹細胞を心臓に投与することを包含する。有効用量は、有益なまたは所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。上記用量は、１回以上の投与で投与され得る。同時係属中の米国特許出願公開第２００６／０２３９９８３号（２００６年２月１６日出願）（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）における実施例で例証されているように、２×１０４〜１×１０５個の幹細胞が、心筋梗塞のマウスモデルにおいて心筋修復および再生を実行するために十分であった。マウスおよびヒトの心臓間には明白なサイズ差が認められるが、この範囲の幹細胞は同様にヒトにおいても十分であると考えられる。心臓幹細胞の有効用量は、約２×１０４〜約２×１０７、さらに好ましくは約１×１０５〜約６×１０６、最も好ましくは約２×１０６であり得る。しかしながら、何が有効用量とみなされるかの精確な決定は、各患者に個別の因子、例えばそのサイズ、年齢、心筋損傷の区域、ならびに損傷発生時以来の時間量を基礎にし得る。当業者、具体的には医者または心臓学者は、過度の実験を伴わずに有効用量を構成する幹細胞の数を決定し得る。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態では、単離非老化性幹細胞は、被験体への投与前に活性化される。幹細胞の活性化は、１つ以上のサイトカイン、例えば肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）またはその変異体に単離幹細胞を曝露することにより成し遂げられ得る。
【００４７】
ＨＧＦは、ｃ−Ｍｅｔ受容体の活性化を介して幹細胞移動およびホーミングに正の影響を及ぼす（Kollet et al. (2003) J. Clin. Invest. 112: 160-169; Linke et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 8966-8971; Rosu-Myles et al. (2005) J. Cell. Sci. 118: 4343-4352; Urbanek et al. (2005) Circ. Res. 97: 663-673）。同様に、ＩＧＦ−１およびその対応する受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）は、心臓幹細胞分裂を誘導し、テロメラーゼ活性を上方調節し、複製老化を妨げ、心臓中の機能的適格心臓幹細胞のプールを保存する（Kajstura et al. (2001) Diabetes 50: 1414-1424; Torella et al. (2004) Circ. Res. 94: 514-524; Davis et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 8155-8160）。好ましい一実施形態では、単離非老化性幹細胞は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）および／またはインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）と接触される。一実施形態では、ＨＧＦは、約０．１〜約４００ｎｇ／ｍｌの量で存在する。別の実施形態では、ＨＧＦは、約２５、約５０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約３７５または約４００ｎｇ／ｍｌの量で存在する。別の実施形態では、ＩＧＦ−１は、約０．１〜約５００ｎｇ／ｍｌの量で存在する。さらに別の実施形態では、ＩＧＦ−１は、約２５、約５０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約４００、約４２５、約４５０、約４７５または約５００ｎｇ／ｍｌの量で存在する。
【００４８】
単離非老化性幹細胞の活性化のために適しているサイトカインのいくつかの他の限定例としては、アクチビンＡ、骨形成タンパク質  ２、骨形成タンパク質  ４、骨形成タンパク質  ６、カルジオトロフィン−１、繊維芽細胞増殖因子  １、繊維芽細胞増殖因子  ４、Ｆｌｔ３  リガンド、神経膠細胞由来神経栄養因子、ヘパリン、インスリン様増殖因子−ＩＩ、インスリン様増殖因子結合タンパク質−３、インスリン様増殖因子結合タンパク質−５、インターロイキン−３、インターロイキン−６、インターロイキン−８、白血病抑制因子、ミッドカイン、血小板由来増殖因子  ＡＡ、血小板由来増即因子  ＢＢ、プロゲステロン、プトレシン、幹細胞因子、間質細胞由来因子−１、トロンボポエチン、形質転換増殖因子−α、形質転換増殖因子−β１、形質転換増殖因子−β２、形質転換増殖因子−β３、血管内皮細胞増殖因子、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３ａおよびＷｎｔ５ａが挙げられる（Kanemura et al. (2005) Cell Transplant. 14:673-682; Kaplan et al. (2005) Nature 438:750-751; Xu et al. (2005) Methods Mol. Med. 121:189-202; Quinn et al. (2005) Methods Mol. Med. 121:125-148; Almeida et al. (2005) J Biol Chem. 280:41342-41351; Barnabe-Heider et al. (2005) Neuron 48:253-265; Madlambayan et al. (2005) Exp Hematol 33:1229-1239; Kamanga-Sollo et al. (2005) Exp Cell Res 311:167-176; Heese et al. (2005) Neuro-oncol. 7:476-484; He et al. (2005) Am J Physiol. 289:H968-H972; Beattie et al. (2005) Stem Cells 23:489-495; Sekiya et al. (2005) Cell Tissue Res 320:269-276; Weidt (2004) Stem Cells 22:890-896; Encabo et al (2004) Stem Cells 22:725-740; およびBuytaeri-Hoefen et al. (2004) Stem Cells 22:669-674に記載されている。これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される）。
【００４９】
上記サイトカインの機能的変異体も、本発明に用いられ得る。機能的サイトカイン変異体は、それらの対応する受容体を結合し、活性化する能力を保持する。変異体としては、アミノ酸置換、挿入、欠失、代替的スプライス変異体、またはネイティブタンパク質の断片が挙げられる。例えば、ＮＫ１およびＮＫ２は、ＨＧＦの天然スプライス変異体であって、これらはｃ−ＭＥＴ受容体と結合し得る。これらの型の天然スプライス変異体は、機能を保持するサイトカインタンパク質の工学処理された変異体と同様に、本発明により意図される。
【００５０】
いくつかの実施形態では、それを必要とする被験体への非老化性幹細胞の投与は、心臓への１つ以上のサイトカインの投与を伴う。サイトカインは、幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、間質細胞由来因子−１、スチール因子、血管内皮細胞増殖因子、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージ刺激因子、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、インターロイキン−３、あるいは幹細胞を刺激および／または動員しうる任意のサイトカインからなる群から選択され得る。好ましい一実施形態では、サイトカインは、ＨＧＦ、ＩＧＦ−１、ＨＧＦまたはＩＧＦ−１の機能的変異体、あるいはその組合せから選択される。サイトカインは、非老化性幹細胞と同時的に送達され得る。代替的には、サイトカインの投与は、指定期間による非老化性幹細胞の投与に専攻するかまたはその後に続く。当該期間は、約１５分、約３０分、約１時間、約３時間、約６時間、約１２時間、約２４時間、約３６時間、約１週間、約２週間、約１ヶ月または約６ヶ月であり得る。
【００５１】
サイトカインは、１回以上の投与により心臓に送達され得る。一実施形態では、サイトカインは、単一回投与により送達される。別の実施形態では、多数回投与の同一投与量のサイトカインが心臓に送達される。本発明の好ましい一実施形態は、走化性勾配が形成されるよう、心臓への多数回用量投与のサイトカインの投与を包含する。心臓の心房および／または心尖から左心室の中央領域に延びる走化性勾配は、漸増サイトカイン濃度の多数回用量投与により確立され得る。代替的には、走化性勾配は、非老化性幹細胞の移植の部位から左心室の中央領域または梗塞心筋の境界領域に形成され得る。
【００５２】
一実施形態では、少なくとも２つのサイトカインが走化性勾配の形成に用いられる。別の実施形態では、第一サイトカインの濃度は一定のままであるが、一方、第二サイトカインの濃度は可変的で、それにより走化性勾配を形成する。好ましい一実施形態では、走化性勾配は、ＩＧＦ−１およびＨＧＦの多数回投与により形成されるが、この場合、ＩＧＦ−１の濃度は一定のままであり、そしてＨＧＦの濃度は可変的である。いくつかの実施形態では、ＨＧＦの可変濃度は、約０．１〜約４００ｎｇ／ｍｌの範囲であり得る。他の実施形態では、ＩＧＦ−１の濃度は、約０．１〜約５００ｎｇ／ｍｌであり得る。
【００５３】
単離非老化性幹細胞およびサイトカインは、注入により心臓に投与され得る。注入は、好ましくは、心筋内である。当業者が承知しているように、心臓は作動している筋肉であるので、これは、幹細胞および／またはサイトカインのための好ましい送達方法である。この経路による注入は、心臓の収縮運動のために注入物質が失われないということを保証する。他の実施形態では、心臓幹細胞は冠動脈内投与される。
【００５４】
本発明のさらなる一態様では、幹細胞および／またはサイトカインは、経心内膜的に、または経心外膜的注入により投与される。この好ましい実施形態は、サイトカインが心筋内注入される実施形態により必要とされる保護的周囲膜にサイトカインを浸透させる。本発明の別の好ましい実施形態は、経心内膜注入物を送達するためのカテーテルベースのアプローチを包含する。カテーテルの使用は、胸腔の開口が必要とされるより侵襲的な送達方法を排除する。当業者が理解するように、回収の最適時間は、より侵襲性の小さい手順に任される。カテーテルアプローチは、ＮＯＧＡカテーテルまたは同様の系のような技法の使用を伴う。ＮＯＧＡカテーテル系は、当該区域の電気機械的マッピング、ならびに標的化注入物を送達するか、または治療薬で標的化区域を浸すために用いられ得る格納式針を提供することにより、誘導投与を促す。本発明の実施形態のいずれかが、このような系の使用により投与されて、注入物を送達し、または治療薬を提供する。画像処理の取込みによる標的化処置を提供する能力も提供する代替的系、ならびに本発明とともに用いられ得るカテーテル送達系を、当業者は理解するであろう。ＮＯＧＡおよび類似の系の使用に関する情報は、例えばSherman (2003) Basic Appl. Myol. 13: 11-14; Patel et al. (2005) The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery 130:1631-38；およびPerrin et al. (2003) Circulation 107: 2294-2302（これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される）に見出され得る。別の実施形態では、単離非老化性心臓幹細胞は、冠動脈内投与経路により投与される。本発明とともに利用され得る送達または移植のその他の有用な方法、例えばDawn et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 3766-3771（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載された方法を、当業者は理解する。
【００５５】
本発明の方法は、心臓血管性疾患、例えばアテローム硬化症、虚血、高血圧、再狭窄、狭心症、リウマチ性心疾患、先天性心臓血管性欠損症、加齢性心筋症および動脈炎症、ならびに動脈、小動脈および毛細管のその他の疾患（これらに限定されない）の処置のために有用である。具体的には、本発明の方法は、上記疾患のうちの１つに起因するか、または年齢に伴う心筋細胞の一般的衰えに起因する損傷心筋の修復および／または再生を提供する。
【００５６】
本発明は、被験体における心不全を防止するかまたは処置する方法であって、単離非老化性成体心臓幹細胞を上記非検体の心臓に投与すること、ならびにアンギオテンシンＩＩ受容体アンタゴニストを投与することからなる方法も包含する。一実施形態では、非老化性成体心臓幹細胞は不死ＤＮＡを含有する。別の実施形態では、非老化性成体心臓幹細胞は、本明細書中に記載されるような１つ以上のサイトカインへの曝露により、投与前に活性化される。さらに別の実施形態では、１つ以上のサイトカインは、心臓に投与されて走化性勾配を形成し、上記の投与非老化性成体心臓幹細胞を心筋損傷の区域に移動させる。別の実施形態では、上記の１つ以上のサイトカインは、ＨＧＦ、ＩＧＦ−１またはその変異体である。
【００５７】
レニン−アンギオテンシン系（ＲＡＳ）は、身体における血圧および細胞外容積の調節を促進するホルモン系である。腎還流が低下すると、腎臓中の細胞は酵素レニンを放出する。レニンは、肝臓により分泌される不活性前駆体ペプチドであるアンギオテンシノーゲンをアンギオテンシンＩに切断する。アンギオテンシンＩは、その後、主に肺で見出されるアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）によりアンギオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）に変換される。ＡｎｇＩＩは、ＡＴ１受容体の活性化を介して、多数の作用、例えば血管狭窄ならびにアルドステロンおよびバソプレッシンの分泌を生じる。ＡｎｇＩＩは、心臓における酸化的損傷の年齢依存的蓄積に関連づけられており（Fiordaliso et al. (2001) Diabetes 50: 2363-2375; Kajstura et al. (2001) Diabetes 50: 1414-1424）、そして老化を誘導し、内皮始原細胞の数および機能を減少することが報告されている（Kobayashi et al. (2006) Hypertens. Res. 29: 449-455）。さらに、ＡｎｇＩＩは、筋細胞におけるアポトーシスを誘発し（Leri et al. (1998) J. Clin. Invest. 101: 1326-1342）、心不全の進行に関与し得る（McMurray et al. (2003) Lancet 362: 767-771）。実際、ＡＴ１受容体の抑制は、慢性心不全を有する患者の臨床結果を改善し、ヒトの寿命を延ばすことが示されている（McMurray et al. (2003) Lancet 362: 767-771）。
【００５８】
本発明は、被験体の心臓に非老化性成体心臓幹細胞の投与と組合せてＡｎｇＩＩ受容体アンタゴニストを投与することにより、被験体における心不全を防止するか、および／または慢性心不全を処置する方法を提供する。好ましくは、ＡｎｇＩＩ受容体アンタゴニストは、ＡＴ受容体のアンタゴニストである。本発明により包含されるＡｎｇＩＩ受容体アンタゴニストのいくつかの非限定例としては、バルサルタン、テルミサルタン、ロサルタン、イルベラルタン、オルメサルタン、カンデサルタンおよびエプロサルタンが挙げられる。
【００５９】
さらに、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の阻害薬は、ＡｎｇＩＩ受容体アンタゴニストに加えて、またはその代わりに、投与され得る。上記のように、ＡＣＥは、アンギオテンシンＩをアンギオテンシンＩＩに変換する。この酵素の抑制は、ＡｎｇＩＩのレベル低減をもたらし、したがって、心臓幹細胞に及ぼすＡｎｇＩＩの有害作用を減少する。本発明の方法に用いられ得るＡＣＥ阻害薬としては、ベナゼプリル、エナラプリル、リシノプリル、カプトプリル、フォシノプリル、ラミプリル、ペリンドプリル、キナプリル、モエキシプリルおよびトランドラプリルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
ＡｎｇＩＩ受容体アンタゴニストまたはＡＣＥ阻害薬は、非老化性成体心臓幹細胞の投与後に、多数回用量投与で被験体に投与され得る。当該アンタゴニストまたは阻害薬は、設定時間の間、慣例的スケジュールで摂取され得る。例えば、阻害薬は、非老化性成体心臓幹細胞の投与後、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約６ヵ月、約１２ヶ月または約２４ヶ月の間、１日１回摂取され得る。他の用量投与スケジュールが用いられることもある。当業者、特に医者または心臓学者は、ＡＣＥ阻害薬またはＡｎｇＩＩ受容体アンタゴニストの投与のための適切な用量およびスケジュールを決定し得る。
【００６１】
好ましくは、非老化性心臓幹細胞、ならびにアンギオテンシンＩＩ受容体アンタゴニストおよび／またはＡＣＥ阻害薬の投与後、心不全の１つ以上の症候が低減されるかまたは軽減される。心不全の症候としては、疲労、衰弱、速いまたは不規則な心拍、呼吸困難、持続性の咳または喘鳴、脚または足の浮腫、ならびに腹部の腫脹が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
本発明は、例えば、心臓血管性疾患、心不全またはその他の心臓症状を処置するための本発明の方法に用いるための、非老化性成体幹細胞および／または少なくとも１つのサイトカインを含む薬学的組成物のような組成物の製造方法も包含する。一実施形態では、薬学的組成物は、単離非老化性非と心臓幹細胞および製薬上許容可能な担体を含むが、この場合、上記の単離ヒト心臓幹細胞は、ｃ−ｋｉｔ陽性、ＩＧＦ−１受容体陽性であり、５ｋｂｐ長より長いテロメアを有する。別の実施形態では、心臓幹細胞は７ｋｂｐ長より長いテロメアを有する。さらに別の実施形態では、心臓幹細胞は９ｋｂｐ長より長いテロメアを有する。いくつかの実施形態では、非老化性心臓幹細胞はｐ１６ＩＮＫ４ａ陰性である。
【００６３】
ある実施形態では、薬学的組成物は、不死ＤＮＡを含有する非老化性成体心臓幹細胞を含む。一実施形態では、薬学的組成物は、不死ＤＮＡを含有する非老化性成体心臓幹細胞に加えて、他の成体心臓幹細胞または他の幹細胞型（例えば、造血性幹細胞）を含み得る。好ましくは、このような薬学的組成物は、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の非老化性成体心臓幹細胞（不死ＤＮＡを含有する）を含む。他の実施形態では、薬学的組成物は、純粋な（すなわち１００％の）非老化性成体心臓幹細胞（不死ＤＮＡを含有）を含む。このような薬学的組成物は、いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるような不死ＤＮＡを有する成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団を製薬上許容可能な担体とともに懸濁するかまたは混合することにより調製され得る。
【００６４】
好ましい一態様では、当該方法および／または組成物（例えば薬学的組成物）は、有効量の非老化性成体心臓幹細胞あるいは２つ以上のサイトカインを、心臓および／または血管性症状を処置するのに有用である適切な薬剤と組合せて含む。
【００６５】
付加的な好ましい態様では、本発明の薬学的組成物は、注入により送達される。これらの投与（送達）経路としては、皮下または非経口、例えば静脈内、動脈内（例えば冠動脈内）、筋肉内、腹腔内、心筋内、経心内膜、経心外膜、鼻内投与、ならびにくも膜下腔内、および輸注技法が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、薬学的組成物は、好ましくは、注入に適した形態である。
【００６６】
本発明の治療薬を非経口的に投与する場合、それは一般的に、単位投与量注入可能形態（溶液、懸濁液、乳濁液）で処方される。本発明に適した薬学的処方物としては、滅菌水溶液または分散液、ならびに滅菌注入可能溶液または分散液中に再構成するための滅菌粉末が挙げられる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、その適切な混合物および植物油を含有する溶媒または分散媒質であり得る。
【００６７】
適正な流動性は、例えばレシチンのようなコーティングの使用により、分散駅の場合には必要な粒子サイズの保持により、ならびに界面活性剤の使用により保持され得る。非水性ビヒクル、例えば綿実油、ゴマ油、オリーブ油、ダイズ油、トウモロコシ油、ヒマワリ油または落花生油、ならびにエステル、例えばイソプロピルミリステートも、複合組成物のための溶媒系として用いられ得る。
【００６８】
さらに、組成物の安定性、滅菌性および等張性を増強する種々の添加物、例えば抗菌防腐剤、酸化防止剤、キレート化剤および緩衝剤が付加され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等により保証され得る。多くの場合、等張剤、例えば糖、塩化ナトリウム等を含むのが望ましい。注入可能製剤形態の吸収延長は、吸収を遅延する作用物質、例えば一ステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によりもたらされ得る。しかしながら、本発明によれば、用いられる任意のビヒクル、希釈剤または添加物は、化合物と相溶性でなければならない。
【００６９】
滅菌注入可能溶液は、必要量の適切な溶媒中の本発明を実行するのに利用される化合物を、所望により種々の量の他の成分とともに組入れることにより調製され得る。
【００７０】
例えば治療的用量の非老化性心臓幹細胞を含む本発明の薬学的組成物は、任意の相溶性担体、例えば種々のビヒクル、アジュバント、添加物および希釈剤を含有する注入可能処方物中で、被験体に投与され得る；あるいは本発明に利用可能な化合物は、緩徐放出皮下移植片または標的化送達系、例えばモノクローナル抗体、イオン泳動的、ポリマーマトリックス、リポソームおよび微小球の形態で、被験体に非経口的に投与され得る。
【００７１】
本発明で利用される薬学的組成物は、被験体に経口投与され得る。錠剤、懸濁液、溶液、乳濁液、カプセル、粉末、シロップ等の中で化合物を投与するといったような慣用的方法が、利用可能である。化合物を傾向的にまたは静脈内に送達し、そして生物学的活性を保持する既知の技法が選択される。
【００７２】
一実施形態では、本発明の組成物は最初に投与され、その後、さらなる投与により保持され得る。例えば、本発明の組成物は、一型の組成物中で投与され、その後、異なるかまたは同一の型の組成物中で投与され得る。例えば、本発明の組成物は、静脈内注入により投与されて、血中レベルを適切なレベルにし得る。その時、被験体のレベルは経口剤形により保持され得るが、しかし被験体の症状によって、他の投与形態が用いられ得る。
【００７３】
投与されるべき薬学的組成物の量は、処置されている被験体に関して変わる。一実施形態では、２×１０４〜１×１０５の成体心臓幹細胞および５０〜５００μｇ／ｋｇ／日のサイトカインまたは上記サイトカインの変異体が、被験体に投与される。しかしながら、有効用量を考慮されるべきものの精確な決定は、各被験体に個別の因子、例えばそれらのサイズ、年齢、損傷心筋の区域、および損傷後経過時間を基礎にし得る。したがって、本発明の方法で投与されるべき組成物中の化合物、ならびに任意の添加物、ビヒクルおよび／または担体の投与および量を、当業者は容易に決定し得る。典型的には、任意の添加物（活性幹細胞（単数または複数）および／またはサイトカイン（単数または複数）に加えて）は、リン酸塩緩衝化生理食塩水中に０．００１〜５０重量％溶液の量で存在し、そして活性成分は、マイクログラム〜ミリグラムのオーダーで、例えば約０．０００１〜約５重量％、好ましくは約０．０００１〜約１重量％、最も好ましくは約０．０００１〜約０．０５重量％、あるいは約０．００１〜約２０重量％、好ましくは約０．０１〜約１０重量％、最も好ましくは約０．０５〜約５重量％で存在する。もちろん、動物またはヒトに投与されるべき任意の組成物に関しては、そして任意の特定の投与方法に関しては、したがって、適切な動物モデル、例えば齧歯類、例えばマウスにおける致死用量（ＬＤ）およびＬＤ50を確定することにより、毒性を；そして組成物（単数または複数）の投与量、その中の構成成分の濃度、ならびに適切な応答を示す組成物（単数または複数）の投与時機を確定することが好ましい。このような確定は、当業者の知識、この開示内容および本明細書中で引用される文書により、過度の実験を必要としない。そして、過度の実験なしに、逐次投与のための時機が確認され得る。
【００７４】
本発明の治療薬を含む組成物の例としては、開口部、例えば口、鼻、肛門、膣、経口、胃内、粘膜（例えば経舌、歯槽、歯肉、嗅覚または呼吸粘膜）投与等のための液体調製物、例えば懸濁液、シロップまたはエリキシル；ならびに非経口、皮下、皮膚内、筋肉内または静脈内投与（例えば注入可能投与）のための調製物、例えば滅菌懸濁液または乳濁液が挙げられる。このような組成物は、適切な担体、希釈剤または賦形剤、例えば滅菌水、生理学的食塩水、グルコース等と混合して存在し得る。組成物はさらにまた、凍結乾燥され得る。組成物は、投与経路、所望の調製物によって、補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、ゲル化または粘度増強添加物、防腐剤、風味剤、着色剤等を含有し得る。標準テキスト、例えば「REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17th edition, 1985」（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）は、過度の実験を伴わずに、適切な調製物を調製するために参考にされ得る。
【００７５】
本発明の薬学的組成物は、選択ｐＨに緩衝され得る液体調製物、例えば等張水溶液、懸濁液、乳濁液または粘性組成物として好都合に提供される。消化管吸収が好ましい場合、本発明の組成物は、ピル、錠剤、カプセル、カプレット等の「固体」形態、例えば緩徐放出されるか、または液体充填物、例えばゼラチン被覆液体を有し、それによりゼラチンが胃中で溶解されて、腸に送達される「固体」調製物であり得る。鼻または呼吸器（粘膜）投与が所望される場合、組成物は、圧搾噴霧ディスペンサー、ポンプディスペンサーまたはエアロゾルディスペンサーにより分配される形態であり得る。エアロゾルは、通常は、炭化水素によって圧力を掛けられている。ポンプディスペンサーは、好ましくは、計量用量または特定粒子サイズを有する用量を分配し得る。
【００７６】
本発明の組成物は、特に経口投与される場合、より魅力的にさせるために、製薬上許容可能な風味剤および／または着色剤を含有し得る。粘性組成物は、ゲル、ローション、軟膏、クリームなどの形態（例えば、経皮投与のため）であり得るし、典型的には、粘度が約２５００〜６５００ｃｐｓであるよう十分量の増粘剤を含有するが、しかし、１０，０００ｃｐｓまでというさらに粘性の組成物が用いられることもある。粘性組成物は、好ましくは２５００〜５０００ｃｐｓの粘度を有するが、それは、その範囲より粘度が高くなると投与が難しくなるためである。しかしながら、その範囲より高いと、組成物は固体またはゼラチン形態に近づき、そうなると、経口摂取用の嚥下ピルとして容易に投与され得る。
【００７７】
明らかに、適切な担体およびその他の添加物の選択は、正しい投与経路ならびに特定剤形の性質、例えば液体剤形（例えば、組成物が、溶液、懸濁液、ゲルまたは別の液体形態の何れで処方されるか）、または固体剤形（例えば、組成物が、ピル、錠剤、カプセル、カプレット、徐放形態または液体充填形態の何れに処方されるか）によって決まる。
【００７８】
溶液、懸濁液およびゲルは、普通は、活性化合物のほかに多量の水（好ましくは精製水）を含有する。少量の他の成分、例えばｐＨ調節剤（例えば塩基、例えばＮａＯＨ）、乳化剤または分散剤、緩衝剤、防腐剤、湿潤剤、ゼリー化剤（例えばメチルセルロース）、着色剤および／または風味剤も存在し得る。組成物は等張性であり、すなわちそれらは血液および涙液と同一浸透圧を有し得る。
【００７９】
本発明の組成物の所望の等張性は、塩化ナトリウム、あるいはその他の製薬上許容可能な作用物質、例えばデキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコール、あるいはその他の無機または有機溶質を用いて成し遂げられ得る。塩化ナトリウムは、ナトリウムイオンを含有する緩衝液のために特に選択される。
【００８０】
組成物の粘度は、製薬上許容可能な増粘剤を用いて選定レベルに保持され得る。入手が容易で且つ経済的であり、そして作業が容易であるため、メチルセルロースが選択される。他の適切な増粘剤としては、例えばキサンタンゴム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマー等が挙げられる。増粘剤の好ましい濃度は、選択される作用物質によって決まる。重要な点は、選定濃度を達成する量を用いることである。粘性組成物は、普通は、このような増粘剤の付加により溶液から調製される。
【００８１】
製薬上許容可能な防腐剤は、組成物の保存寿命を増大するために用いられ得る。ベンジルアルコールが適しているが、しかし種々の防腐剤、例えばパラベン、チメロサール、クロロブタノールまたは塩化ベンズアルコニウムも用いられ得る。防腐剤の適切な濃度は、総重量を基礎にして０．０２％〜２％であるが、しかし選択される作用物質によってかなりの程度の変動があり得る。
【００８２】
組成物は活性化合物に関して化学的に不活性であるよう選択されるべきである、と当業者は理解する。これは、化学的および薬学的原則として当業者に問題を提示しないし、あるいは標準テキストを参照することにより、または簡単な実験（過度の実験を含まない）により、本開示内容および本明細書中で引用される文書から、問題は容易に回避され得る。
【００８３】
本発明の組成物は、一般的に許容される手法に従って成分を混合することにより調製される。例えば、選定構成成分は、ブレンダーまたは他の標準装置中で簡単に混合されて、濃化混合物を生成し、これは次に、水または増粘剤、そしておそらくはｐＨを制御するための緩衝剤または張性を制御するための付加的溶質の付加により、最終濃度および粘度に調整され得る。一般的に、ｐＨは約３〜７．５であり得る。組成物は、特定被験体の年齢、性別、体重および症状、そして投与のために用いられる組成物形態（例えば固体対液体）を考慮しながら、医学および獣医学の当業者に周知の投与量および技法で投与され得る。ヒトまたは他の哺乳類のための投与量は、本開示内容、本明細書中で引用される文書、ならびに当該技術分野での知識から、当業者により過度の実験を伴わずに決定され得る。
【００８４】
初期投与およびさらなる用量投与のための、または逐次的投与のための適切なレジメンも可変的であり、初期投与と、その後の投与を包含し得る；しかしそれでも、本開示内容、本明細書中で引用される文書、ならびに当該技術分野での知識から、当業者により確定され得る。
【００８５】
本発明の薬学的組成物は、心不全および心臓血管性疾患、例えばアテローム硬化症、虚血、高血圧、再狭窄、狭心症、リウマチ性心疾患、先天性心臓血管性欠損症および動脈炎症、ならびに動脈、小動脈および毛細管のその他の疾患、あるいは関連愁訴（これらに限定されない）を処置するために用いられる。したがって本発明は、これらの症状、または心臓の衰弱を伴う他の症状のうちの任意の１つ以上の処置または防止のために、本明細書中で考察されるような非老化性成体幹細胞を、単独で、または本明細書中で考察されるような１つ以上のサイトカインまたは前記サイトカインの変異体と組合せて投与することを包含する。そして有益な投与経路は、これらの症状を処置するために最もよく適合するもの、例えば注入によるもの、例えば皮下または非経口的、例えば静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、心筋内、経心内膜、経心外膜、鼻内投与、ならびにくも膜下腔内投与、そして輸注技法を包含するが、これらに限定されない。
【００８６】
以下の実施例により本発明をさらに例証するが、それらは本発明を限定するものではない。本出願全体を通して引用される参考文献、特許および公開特許出願の記載内容、ならびに図面は、全ての目的のために参照により本明細書中で援用される。
【実施例】
【００８７】
実施例１−心臓幹細胞の機能的プールは老化心臓中に保存される
Ａ．  老いた心臓における心臓幹細胞の特性化
心臓始原細胞（ＣＰＣ）としても既知である心臓幹細胞（ＣＳＣ）は、幹細胞抗原  ｃ−ｋｉｔ、ＭＤＲ−１およびＳｃａ−１を、単独でまたは組合せて発現する系列陰性（ＬｉｎＮＥＧ）細胞である（Beltrami et al. (2003) Cell 114: 763-776）。ＬｉｎＮＥＧ−ＣＰＣは、心臓ニッチ中の早期委任細胞で一団を形成され（Urbanek et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 9226-9231）、これは主に心房および心尖に位置するが、しかしそれらは左心室（ＬＶ）の基部−中央部領域にも存在する（図１Ａおよび１Ｂ参照）。心筋老化が老いた筋細胞の蓄積に伴うＣＰＣ機能における変化により状態調節されるか否かを明示するために、４、１２、２０および２８月齢のラットにおける加齢関連タンパク質ｐ１６ＩＮＫ４ａの発現と一緒にＣＰＣの数を、われわれは測定した。これらの月齢は、それぞれ若年成体、十分に成熟した成体、老齢および老化動物に対応する。
【００８８】
この分析は、４、１２、２０および２８月齢のラットにおけるＬＶの心房、基部−中央部領域および心尖におけるｃ−ｋｉｔ陽性ＣＰＣに制限された。ｃ−ｋｉｔに対する抗体（R&D Systems）を用いることにより、ＣＰＣを同定した。免疫細胞化学により、細胞表現型を限定した。心臓、骨格筋、神経および造血細胞系列のマーカーに関してＣＰＣを試験して、ＬｉｎＮＥＧ−ＣＰＣを検出した（Beltrami et al. (2003) Cell 114: 763-776; Linke et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 8966-8971; Urbanek et al. (2005) Cir. Res. 97: 663-673）。筋細胞の始原細胞および前駆体を知るために、転写因子、ならびに筋細胞に特異的な細胞質タンパク質と一緒にｃ−ｋｉｔの存在を確定した。用いられる抗体の完全一覧を、以下の表１に示す。
【表１】
2013542957.tif 000002
2013542957.tif 000003
直接的標識化：一次抗体は蛍光色素と共役した。間接的標識化：種特異的二次抗体は蛍光色素と共役した。Ｆ：フルオレセインイソチオシアネート、Ｔ：テトラメチルローダミンイソチオシアネート、Ｃｙ５：シアニン５、ＱＤ６５５：６５５ｎｍでの発光を有する量子ドット、ＱＤ６０５：６０５ｎｍでの発光を有する量子ドット。
【００８９】
ＬＶおよび心房心筋の単位面積当たりのＣＰＣまたは２つの他の細胞部類の数  Ｎ（ｃｐｃ）Ａを、共焦点顕微鏡で計数することにより、ＣＰＣ、筋細胞の始原細胞および筋細胞の前駆体の外形計測測定値を得た。さらに、シュワルツ・サルティコフ法を利用して、心筋の単位容積当たりのＣＰＣの数  Ｎ（ｃｐｃ）Ｖ、ならびにＣＰＣの平均直径  Ｄ（ｃｐｃ）を得た（Anversa and Olivetti (2002) in Handbook of Physiology, E. Page, H.A. Fozzard  and R.J. Solaro, eds., New York: Oxford Univ. Press, Sect. 2, Vol. 1:75-144; Rota et al. (2006) Circ. Res. 99: 42-52; Urbanek et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 9226-9231）。筋細胞の始原細胞および前駆体の測定のために、同一アプローチを続けて用いた。さらに、複製老化および非可逆的増殖停止に達したＣＰＣの数（Janzen et al. (2006) Nature 443: 421-426; Molofsky et al. (2006) Nature 443: 448-452; Krishnamurthy et al. (2006) Nature 443: 453-457）を、老化関連タンパク質ｐ１６ＩＮＫ４ａの発現により評価した。さらにまた、アポトーシスを受けているＣＰＣの割合（Linke et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 8966-8971; Rota et al. (2006) Cir. Res. 99: 42-52; Kajstura et al. (2001) Diabetes 50: 1414-1424）を、ヘパリン１により評価して、老化を伴う心臓の種々の解剖学的区域において、機能的適格ＣＰＣの数を確立した（Urbanek et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 8692-8697; Rota et al. (2006) Cir. Res. 99: 42-52）。
【００９０】
４ヶ月から２８ヶ月まで、心臓におけるＣＰＣの数は〜２．９倍増大した（図２）。しかしながら、in vivoでの細胞周期からの幹細胞の恒久的撤退を促すｐ１６ＩＮＫ４ａ（Janzen et al. (2006) Nature 443: 421-426; Molofsky et al. (2006) Nature 443: 448-452; Krishnamurthy et al. (2006) Nature 443: 453-457）は、有意の割合のＣＰＣで検出された（図３参照）。ｐ１６ＩＮＫ４ａ陽性ＣＰＣのパーセンテージは、４ヶ月の〜６％から２８ヶ月の〜８１％に増大した（図２）。同様に、アポトーシスは年齢に伴って劇的に増大し、ｐ１６ＩＮＫ４ａ陽性ＣＰＣに制限された（図４）。これらの変わりやすい要素のため、機能的ＣＰＣの数は２０ヶ月までは本質的に一定のままであったが、しかし２８ヶ月で急に減少した（図２）。したがって、年齢に伴うＣＰＣ区画の拡張は、老いた、非複製性の死にかけているｐ１６ＩＮＫ４ａ陽性の蓄積により特性化される。これらのデータは、老化性アポトーシス性ｐ１６ＩＮＫ４ａ陽性筋細胞の数の同様の増大で一致する（Kajstura et al. (1996) Am. J. Physiol. 271: H1215-H1228; Kajstura et al. (2000) Am J. Pathol. 156: 813-819）。
【００９１】
筋細胞の始原細胞−前駆体は、筋細胞に特異的な転写因子および細胞質タンパク質と一緒にｃ−ｋｉｔを発現する分化中のＣＰＣに対応し、これは、ＣＰＣと形成中の筋細胞との間の線形関係を示している。筋細胞転写因子転写因子  ＭＥＦ２Ｃに陽性であるＣＰＣ、すなわち筋細胞の始原細胞、あるいはＭＥＦ２Ｃと筋節タンパク質心臓ミオシン重鎖（ＭＨＣ）の両方に陽性であるＣＰＣ、すなわち筋細胞の前駆体は、年齢に伴って増大したが、これは、筋細胞の生成が老いた心臓において増強された、ということを示している（図５）。
【００９２】
パルスチェイスＢｒｄＵ標識化検定を実施して（Urbanek et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 9226-9231）、ＣＰＣの増殖行動ならびにＣＰＣ分化により形成される筋細胞の始原細胞の程度を査定した。目的は、老化心臓が、分化始原細胞を促すよう活性化され得る機能的適格ＣＰＣのプールを含有するか否かという疑問に答えることであった。したがって、４および２７ヶ月目のラットに、ＢｒｄＵを７日間曝露して、ＢｒｄＵ陽性ＣＰＣおよび筋細胞を７日目および１２週間追跡後に測定した。具体的には、４および２７ヶ月目のラットを、各々２つの群に分けた。第１の場合には、４および２７ヶ月目のラットを飲料水中のＢｒｄＵに７日間曝露して、その後、屠殺し、試験した。第２の場合には、４および２７ヶ月目のラットを、飲料水中のＢｒｄＵに７日間曝露して、１２週間の追跡期間後、それぞれ７および３０ヶ月目に試験した。明性および暗性ＢｒｄＵ標識化ＣＰＣを蛍光強度により識別して、長期標識保持ＣＰＣを採点して、常在性幹細胞の機能的同一性を提供した（Tumbar et al. (2004) Science 303: 359-363）。蛍光レベル＞４，０００および＜２，０００単位（ピクセル掛ける平均強度）は、それぞれ明性および暗性細胞の典型であるとみなされた（Urbanek et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 9226-9231）。７日および１２週目の明性および暗性ＢｒｄＵ標識化筋細胞も確定した。さらに、筋細胞有糸分裂指数（Urbanek et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 8692-8697; Urbanek et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 9226-9231）も、ＬＶ心筋における増幅中の筋細胞の実際の集団の定量的概算値を有するために、若いおよび老いた心臓におけるホスホ−Ｈ３の発現により測定した（Urbanek et al. (2005a) Cir. Res. 97:663-673; Anversa et al. (2006) Circulation 113: 1451-1463）。
【００９３】
７日目に検出されたＢｒｄＵ−明性ＣＰＣの数（図６）は、若いおよびおいた動物における１２週間の追跡後、それぞれ８６％および９３％低減した。７日目に、５３２および２，０１２個のＢｒｄＵ−明性ＣＰＣが、それぞれ若いおよび老いた心臓において見出された。１２週間後の対応する値は７３および１４０で、これは、心筋における遅いサイクリング幹細胞プールを構成した（図７）。７日から１２週まで、ＢｒｄＵ−暗性ＣＰＣは、若い心臓では１０倍、老いた心臓では３２倍増大した。ＢｒｄＵ−明性ＣＰＣおよびＢｒｄＵ−暗性ＣＰＣの総数は、若い動物では１２週間で変化しなかったが、しかし老いた動物では有意に増大した。したがって、ＣＰＣの増殖動態は、若い心臓では原始細胞のプールを保存するが、しかし老いた心筋ではこの区画を拡張する。
【００９４】
同様に、ＢｒｄＵ陽性筋細胞を、７日目（図８ＡおよびＢ）ならびに１２週目（図８ＣおよびＤ）に測定した。１２週目のＢｒｄＵ−明性筋細胞は限定回数の分裂を経た細胞であったが、一方、ＢｒｄＵ−暗性筋細胞はＣＰＣの始原細胞とみなされ、これは曝露時にＢｒｄＵ陽性になり、多数の適格化細胞を生じた。中間レベルのＢｒｄＵ（２，０００より多いが４，０００単位未満のピクセル×平均強度）を有する細胞は増幅中の筋細胞を表すと考えられ、これは、曝露時点でＢｒｄＵを取り込んで、分裂および分化し続けた。
【００９５】
散乱したＢｒｄＵ陽性筋細胞が、若いおよび老いた動物において標識化の７日後に観察された。１２週間の追跡後、ＢｒｄＵ−明性筋細胞と一緒にＢｒｄＵ−暗性筋細胞のクラスターが、両群で、しかし主に老いた動物において観察された。ＢｒｄＵ陽性筋細胞のパーセンテージは、老いた心臓では若い心臓の５．３倍であった（図９）。両方の場合に、７日目に検出されたＢｒｄＵ−明性筋細胞の数は、１２週間後に顕著に減少した。逆に、ＢｒｄＵ−暗性筋細胞は増大した。in situおよび単離細胞において測定される筋細胞有糸分裂指数により、老いた心臓における高レベルの筋細胞形成を確証した。有糸分裂の種々の時期における筋細胞（図１０および１１）を同定し、有糸分裂指数を算定した。有志分裂指数は、若い心臓と比較して、老いた心臓のほうが高かった（図１２）。したがって、老化心臓は、その活性化が強力な筋細胞再生をもたらす機能的適格ＣＰＣのプールを含有する。
【００９６】
Ｂ．短縮化テロメアを有する心臓幹細胞は老化筋細胞を生じる
老いた心臓における筋細胞再生増大は、生活年齢に伴うｐ１６ＩＮＫ４ａ陽性筋細胞の蓄積および心臓老化表現型の獲得と矛盾している（(Kajstura et al. (2000) Am. J. Pathol. 156: 813-819）。さらに、ｐ１６ＩＮＫ４ａ陽性筋細胞のアポトーシスは、老いた心筋においては若い心筋より６倍高く（Kajstura et al. (1996) Am. J. Physiol. 271: H1215-H1228）、筋細胞の始原細胞−前駆体および筋細胞有糸分裂指数は、年齢に伴って増大する。これらの明らかに矛盾する結果は、加齢に伴うＣＰＣ区画における欠陥を指し示す。老いた心臓において、相対的に短いテロメアを有するＣＰＣの活性化および分化は、急速に老化に達する筋細胞の始原細胞を生成し得る。この仮説を試験するために、３および２７ヶ月目の心臓から収集したｃ−ｋｉｔ陽性細胞のサイトスピンで、テロメア長を測定した。３および２７月齢のラットからの心臓から単離した拡張（継代Ｐ７〜Ｐ８）ｃ−ｋｉｔ陽性ＣＰＣを、ＣＨＡＰＳ緩衝液中で均質化して、４℃で遠心分離した。非処置およびＲＮアーゼ処置細胞抽出物を、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ末端標識化テロメラーゼ基質（ＴＳオリゴヌクレオチド：５’−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡ−ＧＣＡＧＡＧＴＴ−３’、配列番号１）、Ｔａｑポリメラーゼおよびアンカー逆方向プライマー（５’−ＧＣＧＣＧＣ−［ＣＴＡＡＣＣ］３ＣＴＡＡＣＣ−５’、配列番号２）とともに４５分間インキュベートした。試料を２８回の増幅周期に曝露した（Leri et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 8626-8631; Torella et al. (2004) Circ. Res. 94: 514-524; Urbanek et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 8692-8697）。ＰＣＲ産物を、１２％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。テロメラーゼ誘導性反応は、６ｂｐ周期性を有する梯子を生じた。当該帯域の光学密度（ＯＤ）を、ＰＣＲ効率に関して正規化した。定量的蛍光in situハイブリダイゼーション（Ｑ−ＦＩＳＨ）および共焦点顕微鏡により、３および２７ヶ月目の心臓からの新たに単離されたｃ−ｋｉｔ陽性細胞のサイトスピンで、テロメア長を評価した（Chimenti et al. (2003) Cir. Res. 93: 604-613; Leri et al. (2003) EMBO J. 22: 131-139; Urbanek et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 8692-8697）。代表的顕微鏡写真を、図１３ＡおよびＢに示す。同様に、若いおよび老いた心臓の組織切片中の小さい発達中の筋細胞において、テロメア長を評価した（図１４ＡおよびＢ）。フルオレセインイソチオシアネート−ペプチド核酸（ＦＩＴＣ−ＰＮＡ）プローブを用いた。短い（Ｌ５１７８Ｙ−Ｓ、７ｋｂｐ）および長い（Ｌ５１７８Ｙ−Ｒ、４８ｋｂｐ）テロメアを有するリンパ腫細胞（図１３Ｃ）で測定される蛍光シグナルを、参照点として用いた（Leri et al. (2003) EMBO J. 22: 131-139; Chimenti et al. (2003) Cir. Res. 93: 604-613; Urbanek et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 8692-8697）。
【００９７】
老いた心臓において、ＣＰＣ、筋細胞の始原細胞−前駆体および発達中の筋細胞におけるテロメア長の分布は、短い方のテロメア方向に左にシフトした（図１５）。ＣＰＣ、筋細胞の始原細胞−前駆体および発達中の筋細胞中の平均テロメア長は、若い細胞よりも老いた細胞では、それぞれ３０％、３５％および５１％短かった。老いたＣＰＣのほぼ５０％、そして若いＣＰＣの〜１５％が、１２ｋｂｐより短いテロメアを有し、ｐ１６ＩＮＫ４ａ陽性であった。しかしながら、老いたＣＰＣの〜２０％は１８ｋｂｐより長いテロメアを有したが、これは、老化心筋とは逆の関連増殖を指し示している。したがって、年齢に伴うＣＰＣにおけるテロメア縮小は、器官老化を状態調節する老化表現型を急速に獲得する筋細胞の始原細胞の生成をもたらす。
【００９８】
実施例２．  増殖因子受容体系の平衡は加齢心臓の幹細胞においてシフトされる
Ａ．  加齢心臓からの幹細胞におけるＩＧＦ−１／ＩＧＦ−１Ｒ、ＨＧＦ／ｃ−ＭＥＴおよびＡｎｇ  ＩＩ／ＡＴ１  Ｒの発現
ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−１Ｒ系は、テロメラーゼの酸化ストレスおよびリン酸化の減弱によりテロメア長を保存する。さらに、この系は、Ａｋｔ−ＰＩ３キナーゼ経路を介してＣＰＣ増殖および生存を促進する（Torella et al. (2004) Circ. Res. 94: 514-524; Gude et al. (2006) Circ. Res. 99: 381-388）。しかしながら、ＩＧＦ／１−ＩＧＦ−１Ｒは、ＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔ受容体系により主に調整されるＣＰＣ移動およびホーミングにおける役割を有さない（Linke et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 8966-8971; Urbanek et al. (2005) Circ. Res. 97: 663-673）。原始細胞に及ぼすＩＧＦ−１の影響は、心臓に限定されない。ＩＧＦ−１は、骨格筋における衛星細胞の増殖および分化を誘導し（Musaro et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 1206-1210）、心不全を伴う骨格筋萎縮を防止する（Schulze et al. (2005) Circ. Res. 97: 418-426）。ＣＰＣに関するアンギオテンシンＩＩ（Ａｎｇ  ＩＩ）の結果は不明であるが、しかしこの増殖因子は、老化を誘導し、内皮始原細胞の数および機能を減少し（Kobayashi et al. (2006) Hypertens. Res. 29: 449-455）、アポトーシスを誘発し（Leri et al. (1998) J. Clin. Invest. 101: 1326-1342）、そして心不全の進行に関与する（McMurray et al. (2003) Lancet 362: 767-771）。したがって、ＣＰＣが局所的レニン−アンギオテンシン系（ＲＡＳ）を保有するか否か、そして加齢がＲＡＳ、ならびにＣＰＣにおけるＩＧＦ−１、ＩＧＦ−１Ｒ、ＨＧＦおよびｃ−Ｍｅｔの発現に影響を及ぼすか否かを、われわれは確定した。
【００９９】
ＣＰＣにおけるこれらの増殖因子および対応する受容体の発現を、実施例１に記載した方法と同様の方法により査定した。ＣＰＣは、ＩＧＦ−１Ｒ、ｃ−ＭｅｔおよびＡＴ１−受容体を、ＩＧＦ−１、ＨＧＦおよびＡｎｇ  ＩＩと一緒に発現する（図１６Ａ〜Ｆ）。新たに単離されたＣＰＣにおける、そして組織切片におけるＡｎｇ  ＩＩ、ＩＧＦ−１およびＨＧＦの検出は、増殖因子が細胞内に形成されるか、または循環から隔離されるかを識別できない。したがって、これらの増殖因子およびそれらの対応する受容体に関する転写物を、実時間ＲＴ−ＰＣＲによりＣＰＣ中で検出した。以前に詳細に記載されたように（Ojaimi et al. (2005) Am J. Physiol. 289: H1399-H1407）、トリゾール（TRI REAGENT, Sigma）を用いて市販のＲＮＡ単離キットで、３、１２、１６および２４ヶ月目の心臓から得たｃ−ｋｉｔ陽性ＣＰＣから、総ＲＮＡを単離した。第一鎖緩衝液、各々０．４ｍＭのｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰを、２００ＵのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Invitrogen）、１０ＵのＲＮアーゼ阻害薬（ＲＮａｓｉｎ  Ｐｌｕｓ、Promega）および５００ｎｇのランダムヘキサマー（Promega）と一緒に含有する２０μｌの反応液中の５００ｎｇの総ＲＮＡから、ｃＤＮＡを得た。この混合物を、４２℃で２時間インキュベートした。その後、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｖ２．０解析ソフトウェア（Applied Biosystems）を用いて設計されたプライマー（表２参照）で、実時間ＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＰＣＲ系（Roche Diagnostics）を、重複で実行される実時間ＲＴ−ＰＣＲのために用いた。各場合に、５ｎｇのｃＤＮＡを用いたが、但し、レニンは１５ｎｇ必要であった。ｃＤＮＡをＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎマスターミックス（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｆａｓｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、 Roche）と併合した。サイクリング条件は以下の通りであった：９５℃で１０分間、その後、４５回の増幅（９５℃で１０秒の変性、５秒間アニーリング、そして７２℃で２０秒の伸長）。各プライマー組のために用いられるアニーリング温度を、以下の表２に列挙する。ハウスキーピング遺伝子β−アクチンにより決定される入力に対して、定量値を正規化した。
【表２】
2013542957.tif 000004
【０１００】
ＣＰＣ加齢は、アンギオテンシン（Ａｏｇｅｎ）およびＡＴ１受容体の一貫した下方調節を生じたが、一方、レニンｍＲＮＡは１２および１６ヶ月で増大して、２４ヶ月で基線に戻った（図１７）。ｍＲＮＡにおける変化は年齢に伴って生じたが、しかしＡｏｇｅｎおよびＡＴ１受容体のタンパク質レベル（標準ウエスタンブロッティング技法により査定）は変化せず（図１８）、これは、ＲＡＳ機能が老いたＣＰＣにおいて無傷のままであったことを示唆している。
【０１０１】
加齢に伴うＩＧＦ−１Ｒ  ｍＲＮＡの有意の減少により、ＣＰＣ  ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−１Ｒ系を特性化したが、一方、ＩＧＦ−１発現は可変的で、２４ヶ月目にのみ低減される傾向があった。ｃ−Ｍｅｔ転写物は、加齢ＣＰＣにおいて少し影響を及ぼされたが、しかしＨＧＦ  ｍＲＮＡは２４ヶ月目に減衰された（図１９）。
【０１０２】
さらに原始細胞に及ぼす年齢の作用を特性化するために、ＩＧＦ−１、ＨＧＦおよびＡｎｇ  ＩＩを合成し、分布津する３および２７ヶ月でのＣＰＣの能力を測定した。３および２７ヶ月目（Ｐ５〜Ｐ６）の心臓からの拡張ｃ−ｋｉｔ陽性ＣＰＣをＳＦＭ中で培養し、ＩＧＦ−１（１５０ｎｇ／ｍＬ）、ＨＧＦ（２００ｎｇ／ｍＬ）およびＡｎｇ  ＩＩ（１０〜１１Ｍ）に２４時間曝露した。増殖因子を含有する培地を除去し、細胞を２回洗浄して、新鮮なＳＦＭを付加した。ＳＦＭは、ＩＧＦ−１Ｒ（Abcam）およびｃ−Ｍｅｔ（R&D Systems）に対する抗体、またはＡＴ１受容体アンタゴニスト  テルミサルタン（１０−７Ｍ；Sigma）およびＡＴ２受容体遮断薬ＰＤ１２３３１９（１０−７Ｍ、Sigma）を含有した。遮断薬は、リガンド結合を回避するために用いられた。ＩＧＦ−１、ＨＧＦおよびＡｎｇ  ＩＩに関して、３および９時間後に、培地を収集した。ＥＬＩＳＡにより増殖因子量を確定し（ＩＧＦ−１、R&D Systems；ＨＧＦ、B-Bridge International；Ａｎｇ  ＩＩ、Peninsula Laboratories）、ウエスタンブロッティングにより測定されるＣＰＣタンパク質およびβ−アクチン（Sigma）発現の総量により正規化した。
【０１０３】
ＩＧＦ−１に関する基線値は、若いＣＰＣおよび老いたＣＰＣにおいて同様であったが、しかしＨＧＦは老いた細胞のほうが低い傾向にあった。しかしながら、Ａｎｇ  ＩＩレベルは、若いＣＰＣのほうが老いたＣＰＣにおけるよりも３倍高かった（図２０）。リガンドで刺激後、ＩＧＦ−１の生成は、２７ヶ月目より３ヶ月目の細胞で８倍高かったが、一方、ＨＧＦの合成は若いＣＰＣでは４倍、老いたＣＰＣでは３．５倍増大した。ＣＰＣのＡｎｇ  ＩＩ刺激は、どちらの細胞集団においてもオクタペプチドの分泌の割合を増大しなかった。したがって、加齢は、ＣＰＣ増殖、生存および移動に関与する調節系に負の作用を及ぼし、細胞における局所的ＲＡＳの結果を強力にする。これらの表現型特性は、ＣＰＣ老化および心筋加齢において重要な役割を有し得る。
【０１０４】
Ｂ．  若いおよび老いた心臓から単離された心臓幹細胞に及ぼすＩＧＦ−１、ＨＧＦおよびＡｎｇ  ＩＩの作用
ＣＰＣにおけるＩＧＦ−１／ＩＧＦ−１Ｒ、ＨＧＦ／ｃ−ＭｅｔおよびＲＡＳの発現の変化の機能的結果を確定するために、Ｐ７〜Ｐ８での３および２７ヶ月目の心臓からのｃ−ｋｉｔ陽性ＣＰＣをＳＦＭ中で培養し、ＩＧＦ−１（１５０ｎｇ／ｍＬ）、ＨＧＦ（２００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＧＦ−１およびＨＧＦ一緒（ＩＧＦ−１−ＨＧＦ）またはＡｎｇ  ＩＩ（１０−９Ｍ）で２４時間刺激した。ＢｒｄＵを、８時間間隔で培地に付加した。細胞を固定し、ＢｒｄＵ取込みを以前に記載されたように測定した（Beltrami et al. (2003) Cell 114: 763-776; Linke et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 8966-8971; Urbanek et al. (2005) Circ. Res. 97: 663-673）。同様に、Ａｎｇ  ＩＩ（１０−９Ｍ）単独で、またはＩＧＦ−１（１５０ｎｇ／ｍＬ）、ＨＧＦ（２００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＧＦ−１−ＨＧＦの存在下で、ＣＰＣを２４時間刺激した。細胞を固定し、ＴｄＴ検定（Kajstura et al. (1996) Am. J. Physiol. 271: H1215-H1228; Rota et al. (2006) Circ. Res. 99: 42-52）によりアポトーシスを確定した。ＣＰＣにおける酸化ストレスの程度に及ぼす２４時間のＡｎｇ  ＩＩ（１０−９Ｍ）の作用を、８−ＯＨ−ｄＧの存在により測定した（Rota et al.(2006) Circ. Res. 99: 42-52）。８−ＯＨ−ｄＧシグナルの強度をImageProソフトウェアで測定し(Kajstura et al. (2001) Diabetes 50: 1414-1424; Torella et al. (2004) Circ. Res. 94: 514-524)、ＰＩ蛍光に関して正規化した。
【０１０５】
ＣＰＣ増殖を誘導するＩＧＦ−１、ＨＧＦおよびＩＧＦ−１−ＨＧＦの能力は、老いたＣＰＣでは減衰されたが、しかしなくなりはしなかった。Ａｎｇ  ＩＩは、若いＣＰＣおよび老いたＣＰＣに及ぼす増殖促進作用を有した（図２１Ａ）。Ａｎｇ  ＩＩは若いＣＰＣおよび老いたＣＰＣにおけるアポトーシスを刺激し、そしてＩＧＦ−１はＡｎｇ  ＩＩ媒介性ＣＰＣ死の程度を減少させた。逆に、ＨＧＦ単独は、アポトーシスを減少させなかったか、あるいはＣＰＣ生存に及ぼすＩＧＦ−１の作用を増強しなかった（図２１Ｂ）。ＣＰＣアポトーシスにおけるＩＧＦ−１の抑制的役割は老いた細胞より若い細胞のほうが高かったが、しかしアポトーシスの４０％低減が老いたＣＰＣで測定された。
【０１０６】
Ａｎｇ  ＩＩは、ヒドロキシルラジカルの生成をもたらし、これは順次、若いＣＰＣＯおよび老いたＣＰＣ２で変わり得る現象であるデオキシグアノシン（ｄＧ）酸化を促進する。ヒドロキシルラジカルの存在下で、８−ＯＨ−ｄＧ損傷の形成は、非テロメアＤＮＡよりもテロメアＤＮＡのほうが５倍高かった（Kawanishi and Oikawa (2004) Ann. NY Acad. Sci. 1019: 278-284）。酸化ストレスは、テロメア短縮、増殖停止およびアポトーシスを誘導する。８−ＯＨ−ｄＧは、若いＣＰＣより老いたＣＰＣにおいてより大きい割合で検出され（図２１Ｃ〜Ｅ）、そしてさらにＡｎｇ  ＩＩは老いたＣＰＣにおいて８−ＯＨ−ｄＧ陽性細胞の集団を増大し、年齢に伴うＡｎｇ  ＩＩ媒介性ＤＮＡ損傷に関する機序を提供する。したがって、老いた心臓は、機能的ＣＰＣのプールを含有するが、しかしながら、酸化ストレスおよびＤＮＡ完全性に及ぼすその影響により感受性である。
【０１０７】
これらの結果に基づいて、これらの増殖因子受容体系が年齢の一関数としてすべてのＣＰＣにおいて均一に影響を及ぼされるか、あるいは加齢が始原細胞の小群を無傷のままにしておく多数のＣＰＣを漸増的に包含するか否かを、われわれは確立した。ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−１Ｒ、ＨＧＦおよびｃ−Ｍｅｔに関して陽性であるＣＰＣの割合は、３ヶ月から２８ヶ月まで減少し、Ａｎｇ  ＩＩおよびＡＴ１受容体を発現するＣＰＣのパーセンテージは増大した（図２２）。ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−１ＲおよびＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔを発現するＣＰＣはｐ１６ＩＮＫ４ａに関して一貫して陰性であったが、一方、ｐ１６ＩＮＫ４ａはＡｎｇ  ＩＩおよびＡＴ１受容体に関して陽性であるＣＰＣ中で検出された（示されていない）。
【０１０８】
老いた心臓中の小比率のＣＰＣが若い心筋の場合と同様に増殖能力を保有するか否かを試験するために、３および２７ヶ月目のＣＰＣを連続継代して、２０集団倍加に達した。誘導増殖期は２７ヶ月目のＣＰＣにおいてより長かったが、しかし指数増殖期は両群の細胞で類似していた（図２３）。同様に、Ｐ７〜Ｐ８で５日間のＢｒｄＵ標識化は、両年齢での匹敵するレベルのＢｒｄＵ陽性ＣＰＣを生じた。重要なことは、Ｐ７〜Ｐ８でのテロメラーゼ活性が老いたＣＰＣにおいて３３％だけ減少されたことであった（図２４）。したがって、心筋加齢は、機能的適格ＣＰＣのプールを枯渇しない。
【０１０９】
実施例３−若いおよび加齢心臓におけるＨＧＦによる常在心臓幹細胞の動員
Ａ．  動員心臓幹細胞は長いテロメアを有し、ｐ１６ＩＮＫ４Ａ陰性である。
加齢心臓における非老化性ＣＰＣの区画の存在は、これらの細胞が活性化され、そして心房および心尖におけるそれらの貯蔵部位からＬＶ基部−中央部領域に場所を移すよう誘導され得るという可能性を高めた。ＥＧＦＰをコードするレトロウイルスベクターを房室間溝に注入して、４および２７ヶ月目の動物における複製中の細胞を標識した（図２５）。両方の場合に、〜９−１２％ｃ−ｋｉｔ陽性ＣＰＣを注入部位でＥＧＦＰに感染させた。この値は、この領域におけるＫｉ６７陽性ＣＰＣの割合と一致した（データは示されていない）。感染２日後、心臓を切り出して、房室間溝近くのＣＰＣ蓄積部位からＬＶ中央領域まで、３つの漸増濃度のＨＧＦを投与した（図２５）。以前に実行したように、この走化性勾配を導入して、心臓機能のほとんどを保持する心臓の部分へのＣＰＣの転位置を助けた（Linke et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 8966-8971; Urbanek et al. (2005) Circ. Res. 97: 663-673）。さらにまた、心筋損傷は、この解剖学的区域に主に位置する（Kajstura et al. (1996) Am. J. Physiol. 271: H1215-H1228）。各心臓を二光子顕微鏡（Bio-Rad Ｒａｄｉａｎｃｅ  ２１００ＭＰ）の台に乗せて、大動脈を逆行的に通して連続的に還流し、ローダミン標識化デキストランの非存在下または存在下で、酸素添加タイロードで３７℃で還流した。デキストランは７０，０００の分子量を有し、そしてこのサイズのため、デキストランは内皮細胞バリアを横断せず、冠動脈血管系に留まったままである（Dawn et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 3766-3771 ; Urbanek et al. (2005) Circ. Res. 97: 663-673）。ＥＧＦＰおよびローダミンは、モード同期チタンサファイアフェムト秒レーザー（Tsunami, Spectra-Physics）で、それぞれ９６０および８４０ｎｍで励起される。５１５および６００ｎｍの発光波長で、対応する画像を得た。このアプローチにより、ＥＧＦＰ陽性細胞の転位置ならびに冠動脈血管系に関するそれらの局在化を、経時的に確定した（Urbanek et al. (2005) Circ. Res. 97: 663-673）。ＨＧＦ注入後６時間までに、画像を収集した（図２６〜２９）。その後、心臓を固定し、共焦点顕微鏡により分析した。
【０１１０】
完了時に、二光子顕微鏡により検査される心筋の区域を処理し、移動いいＧＦＰ陽性細胞の同一性に関して分析した。転位置ＥＧＦＰは、ｃ−ｋｉｔまたは他の幹細胞抗原ＭＤＲ１およびＳｃａ−１を、ｃ−Ｍｅｔと一緒に発現した。さらに、ＧＡＴＡ−４を移動ＥＧＦＰ陽性ｃ−ｋｉｔ陽性細胞のいくつかにおいて検出し、筋細胞系列へのそれらの委任を実証した。Ｋｉ６７は、これらの細胞の小集団中に存在した（図２７および２９）。
【０１１１】
ＥＧＦＰ陽性細胞の転位置が冠動脈循環、心筋間質またはその両方を介して起こるか否かを確定するために、冠動脈血管系をローダミン標識化デキストランで還流し、ＨＧＦを観察時点で注入した（Urbanek et al. (2005) Circ. Res. 97: 663-673）。５〜６時間の期間に亘って、移動中のＥＧＦＰ陽性細胞で冠動脈の管腔内に見出されたものはなかった（図３０および３１）が、これは、ＣＰＣが間質を介して移動したことを示唆している。実際、間質フィブロネクチンにより限定されるトンネル内で、ＥＧＦＰ陽性細胞を検出した（図３２）。
【０１１２】
ＨＧＦは、房室間溝からＬＶ中央領域に向けてＣＰＣを動因子、転位置した。しかしながら、２つの加齢作用が観察された：移動速度と移動中のＣＰＣの数は、おいた心臓よりも若い心臓のほうが有意に高かった（図３３）。ＣＰＣに及ぼすＩＧＦ−１の増殖促進作用のため（Linke et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 8966-8971; Urbanek et al. (2005) Circ. Res. 97: 663-673）、ＩＧＦ−１を、単独で、またはＨＧＦと組合せて注入して（図２５）、ＥＧＦＰ陽性細胞の数および移動速度を、サイクリングＥＧＦＰ陽性細胞の割合と一緒に確定した。若いおよび老いた心臓において、ＩＧＦ−１単独は、ＣＰＣの移動を刺激できなかった（図３３）。同様に、ＩＧＦ−１は、ＨＧＦの移動能力を増大しなかった。しかしながら、ＩＧＦ−１は、若い心臓と老いた心臓の両方で、分裂中のＣＰＣの数の有意の増大を生じた（図３３）。
【０１１３】
移動中のＣＰＣおよびそれらの早期委任始原細胞は、長いテロメアを有し、ｐ１６ＩＮＫ４ａ陰性であった。これは、ビヒクルを注入された対照心臓の中央領域に存在する非転位置ＣＰＣの特性と異なる。これらの細胞は、短いテロメアを有し、しばしばｐ１６ＩＮＫ４ａを発現した（図３４）。これらの結果は、機能的適格ＣＰＣは心房ニッチ中に貯蔵されるが、一方、加齢作用はＬＶ心筋の中央領域でより顕著であった、ということを示唆する。したがって、加齢は、ＣＰＣの増殖および移動特性を減衰するが、しかし無くしはしない。
【０１１４】
Ｂ．  動員された心臓幹細胞は新しい筋細胞を生じて、加齢性心筋損傷を修復する
これらの観察に基づいて、心臓に及ぼす加齢の負の作用が常在ＣＰＣの活性化により逆転され得るか否かを試験した。ＨＧＦおよびＩＧＦ−１を、１５、２０および２７月齢のラットに心筋内注入した。器官損傷は〜１５ヶ月で明らかになり、２０ヶ月で増大するが、しかし心室機能は保存されるため、これらの月齢を選択した（Kajstura et al. (1996) Am. J. Physiol. 271: H1215-1228）。２７ヶ月目に、広範な組織損傷は顕在性心不全と一緒に存在する（Wei (1992) Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 289: F1144-F1152; Kajstura et al. (1996) Am. J. Physiol. 271: H1215-1228）。ＣＰＣは主に心房および心尖に分布されるため、これらの区域からＬＶ中央領域に向かう２つの走化性勾配が作られて、ＣＰＣ転位置、増殖および分化を増強する（図３５）。４５日後に、動物を屠殺した。増殖因子投与の２日前に、房室間溝および心尖にＥＧＦＰ−レトロウイルスを注入して、サイクリングＣＰＣを標識した。時々に過ぎないが、ＥＧＦＰ陽性細胞はＣＰＣではなかった。しかしながら、これらのＥＧＦＰ陽性非ＣＰＣは、ＨＧＦ、ＩＧＦ−１またはその両方により動員されなかった。したがって、感染部位から離れたＬＶ中央領域におけるＥＧＦＰ陽性細胞の存在は、ＣＰＣ移動を示すものであった。
【０１１５】
すべての処置ラットにおいて、ＬＶの中央領域で、冠動脈抵抗小動脈および毛細管構造と一緒に、ＥＧＦＰ陽性分化筋細胞を同定した（図３６〜３８）。逆に、ＥＧＦＰ陽性筋細胞および血管は、非処置動物においては検出されなかった。新規形成筋細胞が、小クラスターで、または心筋全体に散在して見出された。しばしば、再生された発達中の筋細胞の群が、心筋損傷の病巣に取って替わった（図３９）。定量的に、心筋１ｍｍ２当たりのＥＧＦＰ陽性筋細胞の数は、１６〜１７および２１〜２２ヶ月目の動物よりも２８〜２９ヶ月目の動物の方が有意に多かった。同様の応答は、冠動脈血管に関して観察された（図４０）。
【０１１６】
〜９−１２％のＣＰＣがＥＧＦＰ−レトロウイルスに感染したため、ＥＧＦＰ標識化構造は、一部は、組織再生の程度のみを反映した。したがって、増殖因子またはビヒクルの送達後にＢｒｄＵを投与し、実験全体を通して継続した。このアプローチを用いて、累積筋細胞および血管形成を、加齢単独で、ならびに増殖因子療法と一緒に確定した。処置の非存在下では、筋細胞および血管増殖は年齢に伴って増大し、これは、組織損傷に部分的に反応する老いた心臓の能力を指し示している。増殖因子による処置は、心筋細胞形成を、１６〜１７、２１〜２２および２８〜２９ヶ月目で、それぞれ５５％、６６％および８８％増大した（図４１）。血管再生も起きたが、しかし筋細胞と同程度ではなかった。２８〜２９ヶ月での処置心臓における新規筋細胞は、ｐ１６ＩＮＫ４ａ陽性細胞の数を２０％減少した（図４２）が、この変化は、ＢｒｄＵ標識化筋細胞における増大に反映された。したがって、老化性心筋では、機能的適合ＣＰＣは筋細胞および血管系列をうまく獲得して、老いた心臓の構造に影響を及ぼし得る。
【０１１７】
Ｃ．  常在心臓幹細胞の活性化は心臓に及ぼす加齢の機能的作用を減衰し、寿命を延ばす
屠殺前に、非注入ラット、ビヒクルを注入されたラット（非処置）、または増殖因子を注入されたラット（処置）において、血行力学的パラメーターを得た。動物を抱水クロラール（３００ｍｇ／ｋｇ  ｂ．ｗ．、腹腔内）で麻酔し、Ａ／Ｄ変換器（ｉＷｏｒｘ  ２１４）およびコンピューター系に接続されたマイクロチップ圧力変換器（ＳＰＲ−６１２、Millar Instruments）を用いて、右頚動脈にカニューレ挿入した。非開胸調製物におけるＬＶ拡張末期圧（ＬＶＥＤＰ）、収縮期圧（ＬＶＳＰ）、最大圧（ＬＶＤＰ）、ならびに＋および−ｄＰ／ｄｔの評価のために、カテーテルを左心室（ＬＶ）心臓腔中に進行させた（Kajstura et al. (1996) Am. J. Physiol. 271: H1215-1228; Leri et al. (1998) J. Clin. Invest. 101: 1326-1342; Beltrami et al. (2003) Cell 114:763-776; Urbanek et al. (2005) Circ. Res. 97: 663-673）。ＬＶ心臓腔の半径と組合せた壁厚測定値（下記参照）およびＬＶＥＤＰを用いて、拡張期壁応力をコンピューター計算した。
【０１１８】
血行力学的測定値の収集後、リン酸塩緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ７．４）およびヘパリン（１００ＩＵ／ｍｌ）を充填したポリエチレンカテーテルを腹部大動脈にカニューレ挿入した。矢継ぎ早に、大動脈カテーテルを通した塩化カドミウム（１００ｍＭ）の注入により心臓を拡張期に停止させ、リン酸塩緩衝液による還流を〜３分間実行した。胸郭を開き、右心房を切開して血液および環流液のドレナージを可能にした。次いで、１０％リン酸塩緩衝化ホルマリンでの還流により、心臓を固定した。還流圧を平均心房圧に調整した。手順全体を通して、in vivo測定拡張末期圧と等価の高さに設定された加圧レザバーからの固定液で、ＬＶ心臓腔を充填した（Kajstura et al. (1996) Am. J. Physiol. 271: H1215-1228; Leri et al. (1998) J. Clin. Invest. 101: 1326-1342; Beltrami et al. (2003) Cell 114:763-776; Urbanek et al. (2005) Circ. Res. 97: 663-673）。固定後、心臓を解剖して、右心室および心室間中隔を含めたＬＶの重量を記録した。心臓の基部から心尖への主縦軸を確定し、ＬＶを、この軸と垂直に５つの環を連続切片として切断した。心室の中央領域での最小および最大腔直径ならびに壁厚を得て、縦軸と一緒に、ＬＶ心臓腔容積をコンピューター計算するために利用した（Dawn et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 3766-3771; Linke et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 8966-8971）。
【０１１９】
ＣＰＣ活性化により媒介される心筋再生は、心室解剖学に及ぼす加齢作用を減衰した；ＬＶ心臓腔直径および容積は低減され、壁厚対心臓腔半径比およびＬＶ質量対心臓腔容積比は全年齢で増大した（図４３）。腔寸法におけるこれらの変化は、２８〜２９ヵ月での老化性不全心臓の心室機能の改善を伴った。処置の非存在下では、２７ヶ月での心不全は、２８〜２９ヶ月でさらに悪化した。逆に、処置後、ＬＶ拡張末期圧（ＬＶＥＤＰ）、収縮期圧（ＬＶＳＰ）、最大圧（ＬＶＤＰ）、＋ｄＰ／ｄｔおよび−ｄＰ／ｄｔ、ならびに２７ヶ月で見出された算定拡張期壁応力における変化は、２８〜２９ヶ月ではもはや明白でなかった（図４４）。増殖因子投与は、加齢性筋疾患を逆転した。２８〜２９ヶ月での処置心臓の解剖学および機能は、１６〜１７ヶ月目の１年若い非処置心臓の解剖学および機能と同様になった（図４５）。
【０１２０】
ラットにおける侵襲性血行力学は屠殺時に収集され得るだけで、多重決定を除外する。上記結果を強化するために、２７ヶ月目、処置の１日前、次いで４５日後、屠殺前、２８〜２９ヶ月目にラットで、心エコーを記録した。ビヒクルを注入されたラットの一群を、同様に試験した。ラットをケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ  ｂ．ｗ．、腹腔内）で麻酔して、１３−ＭＨｚ線形変換器を装備したＡｃｕｓｏｎ  Ｓｅｑｕｏｉａ  ２５６ｃを利用して、心エコーパラメーターを収集した（Dawn et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 3766-3771; Linke et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 8966-8971）。前胸郭を剃毛し、ラットを左外側臥位に置いた。直腸温度プローブを配置して、試験全体を通して加熱パッドで体温を３７．０℃〜３７．５℃に注意深く保持した。傍胸骨長軸、傍胸骨短軸、および心尖四腔断面像を用いて、２Ｄ、Ｍモードを得た。収縮期および拡張期解剖学的パラメーターを、乳頭筋レベルでＭモードトレースにより得た。面積長さ法により、駆出率（ＥＦ）を算定した（Dawn et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 3766-3771; Linke et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 8966-8971）。
【０１２１】
治療は拡張末期および収縮末期ＬＶ直径を減少させたが、一方、駆出率は６７±７％から７９±７％に、１２ポイント増大した。非処置ラットでは、心臓機能は時間に伴って悪化した（図４６）。処置に伴う心臓性能の改善は、心エコーを早期と後期で比較した場合、明らかであった（図４７ＡおよびＢ）。
【０１２２】
最終的な問題は、ＣＰＣ活性化および分化により媒介される心臓機能における改善が、このモデルにおいて寿命を延長したか否かであった。この目的のために、２７ヶ月目のラットの一群で、死亡率試験を実行した。同時に、３２匹の非処置ラットおよび４８匹の処置ラットを同一条件下で保持し、死亡を経時的にモニタリングした。３１ヶ月までに、非処置ラットはすべて死亡した。しかしながら、処置ラットの２８％が３１ヶ月では生きており、最後の動物が死亡したのは３３ヶ月目であった（図４８）。増殖因子処置は、２７ヶ月で４４％、５７日から８２日に、平均余命を増大した。したがって、心不全からの回復は、ラットにおける最大寿命を延長する。
【０１２３】
実施例４  −  非老化性心臓幹細胞の単離および加齢性心筋症の修復におけるそれらの使用
心臓手術を受けたことのある同意患者から、心筋検体を得た。試料を細かく切断し、肝細胞増殖因子およびインスリン様増殖因子−１を２００ｎｇ／ｍｌの濃度で補足した培地を含有する非被覆ペトリ皿の表面に植えつけた。細胞培養中で〜２週間後、当該組織から増殖した細胞を、免疫ビーズでｃ−ｋｉｔに関して分類し、培養する。以前に記載されたように、ＦＡＣＳおよび免疫細胞化学により、細胞表現型を限定する（Beltrami et al. (2003) Cell 114: 763-776; Orlic et al. (2001) Nature 410: 701-705; Urbanek et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 8692-8697）。個々のヒトｃ−ｋｉｔ陽性細胞を、０．２５〜０．５細胞／ウェルの密度で、Terasakiプレートの単一ウェル中に植えつける（Beltrami et al. (2003) Cell 114: 763-776; Linke et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 8966-8971）。１個より多い細胞を含有するウェルを除外する。個々のｃ−ｋｉｔ陽性細胞とともに植え付けられたウェルの各々から生成されたクローンを、実施例１に上記したように、テロメア長および／またはテロメラーゼ活性に関して試験する。少なくとも５ｋｂｐ長のテロメアまたは対照幹細胞のテロメラーゼ活性の少なくとも６０％のテロメラーゼ活性を有するクローンを選択し（ヒト非老化性心臓幹細胞）、細胞培養中で拡張させ得る。テロメラーゼ活性の比較のための対照細胞は、若い（２０〜４０歳）個体から新たに単離されたｃ−ｋｉｔ陽性心臓細胞であり得る。好ましくは、非老化性心臓幹細胞は、投与前に、１つ以上の増殖因子（例えば、肝細胞増殖因子および／またはインスリン様増殖因子−１）への曝露により活性化される。
【０１２４】
加齢性心筋症または他の原因のための心筋損傷、例えば心筋梗塞を蒙っている患者は、上記のように単離される非老化性心臓幹細胞の少なくとも１回の注入を受け得る。ｃ−ｋｉｔ陽性細胞は、〜２００，０００ｃ−ｋｉｔ陽性細胞が各クローンから得られるＰ２で収集され得る。患者は、単離非老化性心臓幹細胞の少なくとも１回の心筋内注入を受ける。増殖因子、例えば肝細胞増殖因子およびインスリン様増殖因子−１の注入は、単離幹細胞の心筋内注入と同時的に投与され得る。代替的には、増殖因子は、幹細胞の注入後に投与され得る。注入非老化性幹細胞は、心筋損傷の区域に動員され、成育可能な筋細胞、内皮細胞および塀核金細胞に分化して、損傷組織を修復し、および／または再生する。新規生成心筋は機能性であり、心臓機能の保存に寄与し、臓器不全を防止する。
【０１２５】
実施例５  −  移植非老化性心臓幹細胞の動員は梗塞心臓におけるアンギオテンシンＩＩ遮断を補足する
心筋梗塞（ＭＩ）の主な悪化因子のうちの２つは、筋肉質量の損失および腔拡張であって、これらはともに、負の左心室（ＬＶ）リモデリングの、ならびに心臓性能の低下の一因となる。ＭＩのこれらの因子を改善するために、心筋梗塞の誘導後に、実施例４に記載したように単離された非老化性心臓幹細胞（ＣＳＣ）をマウスに心筋内移植する。非老化性ＣＳＣは、投与前に、１つ以上のサイトカイン、例えば肝細胞増殖因子および／またはインスリン様増殖因子−１に曝露することにより、活性化され得る。ＡＴ１受容体アンタゴニスト、例えばロサルタンは、約２０ｍｇ／体重１ｋｇ／日の用量でマウスに投与されて、細胞肥大を減じ、それにより心臓腔容積の拡大を減じる。ＭＩをマウスで生じさせて、動物を４つの群に細分する：１．  擬似手術（ＳＯ）；２．  ＭＩのみ；３．  ＭＩ＋ＡＴ１受容体遮断薬；４．  ＭＩ＋ＡＴ１受容体遮断薬＋非老化性ＣＳＣ。ＭＩの１ヵ月後に、動物を屠殺し、ＬＶ機能、梗塞寸法および心臓リモデリングを評価する。非老化性ＣＳＣで処置されたマウスにおいて、心筋再生も測定する。非老化性ＣＳＣの移植およびＡＴ１受容体遮断薬を受けている群は、ＡＴ１受容体遮断薬単独を受けた動物、ならびに処置されなかった動物と比較して、心臓腔直径に関して損傷心臓のより好ましい結果を有すると予期される。例えば、心臓腔直径および心臓腔容積は、非処置およびＡＴ１受容体遮断薬処置動物と比較して、低減される。ＬＶ質量対心臓腔容積比は、ＭＩおよびＭＩ＋ＡＴ１受容体遮断薬群よりもＭＩ＋ＡＴ１受容体遮断薬＋非老化性ＣＳＣ群の方が高い。さらに、ＭＩ＋ＡＴ１受容体遮断薬＋非老化性ＣＳＣ群における組織修復は増大されて、新規の心筋、小動脈および毛細管を示し、これらは、ＭＩサイズを低減するよう作用する。心エコー的には、収縮機能は、ＡＴ１受容体遮断薬および非老化性ＣＳＣで処置されたマウスの壁の梗塞領域において再現する。血行力学的には、ＭＩ＋ＡＴ１受容体遮断薬＋非老化性ＣＳＣ群は、低ＬＶＥＤＰおよび高＋および−ｄＰ／ｄｔを有する。要するに、心室リモデリングに及ぼすＡＴ１受容体遮断薬の正の影響は、梗塞区域への移植非老化ＣＳＣの転位置により媒介される心臓修復の過程により増強される。動員ＣＳＣは、梗塞サイズおよび心室拡張を低減し、それにより梗塞心臓の収縮行動をさらに改善する。
【０１２６】
実施例６  −  再生能力を有するヒト心臓幹細胞は加齢性および不全性の心臓から単離され得る
この実施例の目的は、テロメア長が、ヒト心臓幹細胞としても既知であるヒト心臓始原細胞（ｈＣＰＣ）の増殖行動の重要な変数である、ということを実証することである。短いテロメアを有する始原細胞は、心臓の恒常性および修復における役割をほとんどまたは全く有さず、したがって、ヒト心不全の管理のための治療的価値を最小限有し得るかまたは全く有さないことがある。短いテロメアを有するｈＣＰＣは、臨床的に実行されるべき細胞のプールから排除されて、非代償性心臓のための細胞療法の効力を増強し得る。有意の増殖予力を有するｈＣＰＣ小集団の使用は、投与されるべき細胞の数を劇的に減少させて、正の臨床終点を達成する。さらに、このアプローチは、機能的適格ｈＣＰＣのプールに不利益となる年齢、性別、ならびに心臓疾患の型および持続期間の結果を回避するのに役立ち得る。
【０１２７】
Ａ．  ヒト心筋組織から単離される心臓幹細胞はin vitroで拡張され、損傷心筋を修復するために用いられ得る
心臓手術および体外循環を受けている患者から得られる心筋の小試料から、ヒト心臓始原細胞（ｈＣＰＣ）を単離した。廃棄試料、例えば心房付属物を、この目的のために利用した。心筋からのｈＣＰＣ単離後、系列マーカーに関して陰性であり、ｃ−ｋｉｔに関して陽性である個々のｈＣＰＣを、Terasaki培養プレートの単一ウェル中でプレート化して、Bearzi et al. (2007) Proc Natl Acad Sci USA., Vol. 104:14068-14073に記載されたようにin vitroでクローン拡張した（図４９）。これらのクローン原性ｈＣＰＣは主に筋細胞に分化したが、しかし平滑筋および内皮細胞も生じた（図５０）。in vitro拡張ｈＣＰＣが分化し、機能的適格性に達し、損傷心筋を修復し得たことを実証するために、免疫不全マウスおよび免疫抑制ラットに梗塞を生じさせて、冠動脈結紮直後に梗塞と隣接する収縮心筋中にｈＣＰＣを注入した。図５１に示したように、ｈＣＰＣはヒト筋細胞および冠動脈血管を伴って損傷心筋を再生し、虚血性損傷の大きさを低減し、梗塞心臓の性能を改善した。
【０１２８】
Ｂ．  クローン拡張化ヒト心臓幹細胞におけるテロメア長およびテロメラーゼ活性
幹細胞の増殖は、テロメラーゼ活性およびテロメア長により調節される（Morrison et al. (1996) Immunity, Vol. 5:207-216; Allsopp et al. (2003) Blood, Vol. 102:517-520; Lansdorp (2005) Ann N Y Acad Sci., Vol. 1044:220-227; Armstrong et al. (2005) Stem Cells, Vol. 23:516-529; and von Zglinicki (2000) Ann N Y Acad Sci., Vol. 908:99-110）。各分裂中、半保存的ＤＮＡ複製は、複製フォークのラギング鎖の合成を完了するための慣用的ＤＮＡポリメラーゼの無能力からなる内因性の障害物を有する（Nugent and Lundblad V (1998) Genes Dev., Vol. 12:1073-1085）。末端複製問題は、ＤＮＡの進行性短縮を引き起こす。真核生物細胞では、染色体はテロメアと呼ばれる保護キャップにより護られ、テロメラーゼはテロメアの長さを無傷に保持し得る酵素である（Greider (1990) Bioessays, Vol. 12:363-369）。テロメラーゼは、鋳型としてそれ自体のＲＮＡを利用することにより３’染色体末端を延長する逆転写酵素である（Blackburn (1992) Ann Rev Biochem, Vol. 61:113-129）。テロメラーゼ活性は染色体末端の進行性侵食を完全に防止して、増殖停止を延期することはできない。この点で、複製的老化は、臨界長を越えるテロメアの短縮により誘発されるＧ１増殖停止に対応する（Kim et al. (2002) Oncogene, Vol. 21:503-511; Campisi (2005) Cell, Vol. 120:513-522）。したがって、テロメア−テロメラーゼ系は、有糸分裂時計およびｈＣＰＣの能力を制御して、心筋をde novoで形成する。心筋形成における欠陥（Leri et al. (2003) EMBO J, Vol. 22:131-139）はテロメラーゼ欠損マウスにおいて認められるが、しかしこれらの齧歯類ＣＰＣが心臓修復を促すのに有効でないか否かは不明である。テロメラーゼ活性およびテロメア長における変化は、始原細胞の滞留および移動を阻み（Flores et al. (2005) Science, Vol. 309:1253-1256; Flores et al. (2006) Curr Opin Cell Biol, Vol. 18:254-260; Siegl-Cachedenier et al. (2007) J Cell Biol, Vol. 179:277-290）、そして誘導される筋細胞の始原細胞は、分裂し、機能的適格収縮細胞を形成するための限定能力を有し得る。
【０１２９】
ｈＣＰＣにおけるテロメア長は、対照、急性梗塞心臓で、ならびに末期虚血性心筋症のために心臓移植を受けている患者から外植される心臓で、測定されている（Chimenti et al. (2003) Circ Res, Vol. 93:604-613）。さらに、テロメア長は、心不全の存在下または非存在下で、加齢性ヒト心臓からの筋細胞で得られている（Urbanek et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 102:8692-8697）。これらのデータから、重度のテロメア短縮は、不全心臓のｈＣＰＣにおいて明らかである。したがって、テロメア長は、損傷心臓に関する最長期再配置能力を保有するｈＣＰＣプールを同定するために用いられ得る。テロメアの長さは、細胞の再生能力の良好な予測子である（Weng et al. (1998) Immunity, Vol. 9:151-157; Yang et al. (2001) Mech Ageing Dev, Vol. 122:1685-1694; and Honda et al. (2001) Clin Immunol, Vol. 99:211-221）。移植骨髄細胞の増殖行動は、それらのテロメア長により予測され得る。実際、骨髄移植後の造血再生は、再配置細胞が短いテロメアを有する場合、低効率的である（Lincz et al. (2004) Bone Marrow Transplant, Vol. 34:439-445）。サイクリングｈＣＰＣはテロメラーゼタンパク質を発現し、テロメラーゼ活性を示す（Chimenti et al. (2003) Circ Res, Vol. 93:604-613; Urbanek et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 102:8692-8697; and Urbanek et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 100:10440-10445）。
【０１３０】
老化性フィッシャー３４４ラット（実施例３）およびＦＶＢマウス（Torella et al. (2004) Circ Res, Vol. 94:514-524）の不全心臓で得られたわれわれの観察と一致して、テロメア−テロメラーゼ軸は、老いたヒトのｈＣＰＣにおいて減損されると予期される。ｈＣＰＣの増殖能力を査定し、ｈＣＰＣ機能に及ぼす培養条件および集団倍加の作用を確立するために、ｈＣＰＣにおけるテロメラーゼ活性およびテロメア長を測定した。この分析を実施して、ｈＣＰＣが培養中で迅速に細胞老化に達するか否か、あるいは非可逆的増殖停止が獲得される前に細胞が臨床的関連数に拡張され得るか否かを明確にした。この目的のために、ｈＣＰＣの核をＰ３〜Ｐ４、Ｐ５〜Ｐ６およびＰ８〜Ｐ９で得たが、これらは、それぞれ、９〜１２、１５〜１８および２５〜２８集団倍加（ＰＤ）に対応する。核を、フルオレセイン−イソチオシアネートと共役されたペプチド−核酸テロメアプローブで染色した；既知の短い（Ｌ５１７８Ｙ−Ｓ細胞、７ｋｂｐ）および長い（Ｌ５１７８Ｙ−Ｒ細胞、４８ｋｂｐ）テロメアを有するリンパ腫細胞を、比較および参照点のために用いた（Bearzi et al. (2007) Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 104:14068-14073; Urbanek et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 102:8692-8697; Chimenti et al. (2003) Circ Res, Vol. 93:604-613; and Leri et al. (2003) EMBO J, Vol. 22:131-139）。Ｐ３〜Ｐ４からＰ５〜Ｐ６までに、平均テロメア長は９．３から８．２ｋｂｐに１２％減少し、そしてＰ３〜Ｐ４からＰ８〜Ｐ９までに、平均テロメア長は９．３から６．９ｋｂｐに２６％減少した（図５２ＢおよびＣ）。重要なことは、ヒト細胞におけるテロメア長は約９．０ｋｂｐであるという点である（Notaro et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 94:13782-13785）。Ｐ３からＰ９までに、〜１８ＰＤが認められ、平均テロメア短縮はＰＤ当たり１３０ｂｐであった。これは、２．４ｋｂｐという総損失を説明する。テロメア減少のこの比率は、ヒト骨髄造血幹細胞において一般に見出されるものに匹敵する（Van Ziffle et al. (2003) Stem Cells, Vol. 21:654-660）。
【０１３１】
ヒト造血幹細胞およびほとんどのｈＣＰＣの細胞老化ならびに非可逆的増殖停止に関連した臨界テロメア長は、２．０から１．５ｋｂｐまで変化がある（Van Ziffle et al. (2003) Stem Cells, Vol. 21:654-660）。したがって、臨界テロメア短縮を有するｈＣＰＣの割合は、Ｐ３〜Ｐ４での１％からＰ５〜Ｐ６での２％およびＰ８〜Ｐ９での５％に増大した。しかしながら、Ｐ８〜Ｐ９での〜２５−２８ＰＤ後、６９％のｈＣＰＣが≧５．０ｋｂｐのテロメア長を有した。Ｐ８〜Ｐ９での細胞は、複製性老化および非可逆的増殖停止の発生の前に２３回の付加的ＰＤ（５−２＝３ｋｂｐ/０．１３ｋｋｐ＝２３ＰＤｓ）を受け得る、と予測され得る。したがって、複製性老化が達成される前に、〜５０回のＰＤが１×１０１５ｈＣＰＣの形成を生じ得る。
【０１３２】
Ｐ３〜Ｐ４、Ｐ５〜Ｐ６およびＰ８〜Ｐ９での異なる継代で得られたｈＣＰＣにおけるＴＲＡＰ検定により、テロメラーゼ活性を測定した（図５２Ａ）。テロメラーゼ活性の生成物は５０ｂｐで出発し、６−ｂｐ周期性を示す。ＲＮアーゼで処置された試料を陰性対照として用い、ＨｅＬａ細胞を陽性対照として用いた。２つのタンパク質濃度を用いて、反応の特異性を実証した。３６ｂｐでの帯域は、ＰＣＲ効率に関する内部対照に対応する。テロメラーゼ活性はＰ３〜Ｐ４からＰ８〜Ｐ９までに〜５０％減少したが、しかしテロメラーゼ活性はこれらの後期継代で依然として存在し、このことはｈＣＰＣの有意の増殖後退を指し示している。したがって、長いテロメアを有するｈＣＰＣはin vitroで広範に増殖され、それらの拡張能力の大きな損失前にin vivoで移植され得る。
【０１３３】
実施例７  −  増殖因子受容体系の発現はヒト心臓幹細胞再生能力と相関する
ヒト心臓始原細胞（ｈＣＰＣ）は、始原細胞行動に及ぼす異なる作用を有し得る２つの増殖因子受容体系を保有する：レニン−アンギオテンシン系（ＲＡＳ）とインスリン様増殖因子−１／インスリン様増殖因子−１受容体（ＩＧＦ−１−ＩＧＦ−１Ｒ）系である。ＲＡＳおよびＩＧＦ−１−ＩＧＦ−１Ｒ増殖因子系の構成成分の各々の転写物を、実時間ＲＴ−ＰＣＲにより拡張ｈＣＰＣ（Ｐ５〜Ｐ６）で検出した（図５３、パネルＡ〜Ｃ、Ｈ、Ｋ、Ｌ）。各場合に、５ｎｇのｃＤＮＡを用いたが、但し、レニンは１５ｎｇ必要であった。ｃＤＮＡをＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎマスターミックス（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｆａｓｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、Roche）と併合した。サイクリング条件は以下の通りであった：９５℃で１０分間、その後、４５回の増幅（９５℃で１０秒の変性、５秒間アニーリング、そして７２℃で２０秒の伸長）。ゲノム汚染の影響を回避するために、各遺伝子に関する順方向および逆方向プライマーを異なるエキソン中に配置した。逆転写酵素ナシで生成されたｃＤＮＡを含有する反応、ならびにプライマー単独との反応も含まれた。４つの連続希釈点の標準曲線を用いて、ＰＣＲ効率を評価した。ハウスキーピング遺伝子β−アクチンにより決定される入力に対して、定量値を正規化した。ゲル電気泳動により、ＲＴ−ＰＣＲ生成物の予測分子量を確証した。さらに、図５３（パネルＤ〜Ｇ、Ｉ、Ｊ、Ｍ、Ｎ）に示したように、ＲＡＳおよびＩＧＦ−１−ＩＧＦ−１Ｒ系の構成成分の細胞分布を、以前に記載されたように免疫染色および共焦点顕微鏡により評価した（Bearzi et al. (2007) Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 104:14068-14073; Gonzalez et al. (2008) Circ Res, Vol. 102:597-606）。同様の観察は、齧歯類（実施例２参照；Urbanek et al. (2005) Circ Res, Vol. 97:663-673）およびイヌ（Linke et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 102:8966-8971）ＣＰＣでなされており、始原細胞機能の調整における細胞ＲＡＳおよびＩＧＦ−１−ＩＧＦ−１Ｒの関連性を強
化する。
【０１３４】
Ａ．  ＩＧＦ−１−ＩＧＦ−１Ｒ増殖因子系
ＩＧＦ−１は強力な増殖促進ならびに心臓および骨格筋始原細胞に及ぼす抗アポトーシス作用を発揮する、ということを一連の試験が示しているため、局所的ＩＧＦ−１−ＩＧＦ−１Ｒ系は、ｈＣＰＣの増殖および生存を保護するのに重要な役割を果たす。トランスジェニックマウスにおいて、骨格筋に対して標的にされる局所的に作用性ＩＧＦ−１は、筋肉増殖および分化を増強し、加齢性筋萎縮を防止し、損傷後の再生を強力にする（Musaro et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 101:1206-1210; Schulze et al. (2005) Circ Res, Vol. 97:418-426）。同様に、ＩＧＦ−１の心臓限定発現は、心室筋細胞の形成を増大し、細胞機械的行動を改善し、筋細胞死を減じ、加齢性筋疾患の発症を遅らせる（Torella et al. (2004) Circ Res, Vol. 94:514-524; Reiss et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 93:8630-8635; Redaelli et al. (1998) Circ Res, Vol. 82:594-603）。ＩＧＦ−１は、トランスジェニックマウスにおいて、ＣＰＣの分裂を誘導し、テロメラーゼ活性を上方調節し、複製性老化を妨げ、そして機能的適格ＣＰＣのプールを保持する（Linke et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 102:8966-8971; Torella et al. (2004) Circ Res, Vol. 94:514-524; Urbanek et al. (2005) Circ Res, Vol. 97:663-673）。骨格筋損傷後、ＩＧＦ−１は筋肉再生の一助となる衛星細胞の活性化、動員および分化を促す（Musaro et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 101:1206-1210）。心不全は、骨格筋質量の損失を伴う異化状態をもたらし（Levine et al. (1990) N Engl J Med, Vol. 323:236-241; Anker et al. (1997) Circulation, Vol. 96:526-534）、そしてＩＧＦ−１はこの過程に反対に作用する（Schulze et al. (2005) Circ Res, Vol. 97:418-426）。同様に、ＩＧＦ−１の心臓過剰発現は、心筋梗塞（Li et al. (1997) J Clin Invest, Vol. 100:1991-1999; Nagoshi et al. (2005) J Clin Invest, Vol. 115:2128-2138）、冠動脈狭窄（Li et al. (1999) Circ Res, Vol. 84:1007-1019）、拡張心筋症（Welsh et al. (2002) Circ Res, Vol. 90:641-648）、および糖尿病（Kajstura et al. (2001) Diabetes, Vol. 50:1414-1424; Norby et al. (2004) J Endrocrinol, Vol. 180:175-182）の作用を減衰させる。ＩＧＦ−１は細胞死を減じ、細胞再生を増強するが、これは、損傷の程度を減衰させ、構造的および機能的回復の程度を決定する。
【０１３５】
下等生物、例えば線虫およびショウジョウバエにおける短い寿命は、成体期における体細胞組織の再生能力の損失と関連している（Maier et al. (2004) Genes Dev, Vol. 18:306-319）。瀕死の細胞は取り替えられ得ず、これは器官機能における急速な且つ進行性の低下を生じる。逆に、常在始原細胞の活性化および委任による細胞代謝回転は、哺乳類では依然として活性であり、そして経時的に蓄積する老いた損傷細胞は、新しい、より若い、より良好に機能する細胞に取って替わられ得る。ＩＧＦ−１は、ＣＰＣを含めた感受性細胞における細胞代謝回転および再生を協力にする（実施例２参照；Linke et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 102:8966-8971; Torella et al. (2004) Circ Res, Vol. 94:514-524; Urbanek et al. (2005) Circ Res, Vol. 97:663-673）。ＩＧＦ−１活性化およびＣＰＣの増殖により媒介される心筋再生は、哺乳類における心不全およびその合併症の開始を遅らせる（実施例３参照；Linke et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 102:8966-8971; Torella et al. (2004) Circ Res, Vol. 94:514-524; 2, 49, 50）。実際、高齢固体におけるＩＧＦ−１レベルの回復は、健康利益を有する（Carter et al. (2002) Trends Genet, Vol. 18:295-301）。
【０１３６】
ｈＣＰＣに及ぼすＩＧＦ−１−ＩＧＦ−１Ｒ増殖因子系の考え得る一作用は、酸化ストレスおよび細胞加齢をもたらすフリーラジカルの減衰である。この可能性を試験するために、無血清培地単独で、またはＩＧＦ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）を伴って培養された新たに単離されたマウスＣＰＣにおける、二光子顕微鏡によるスーパーオキシド陰イオンの生成を測定した（ＲｅｄｏｘＳｅｎｓｏ  Ｒｅｄ  ＣＣ−１）。ミトコンドリアをＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎおよび二光子顕微鏡により同時に確認し、スーパーオキシド陰イオンのミトコンドリア局在化を確証した。ＩＧＦ−１は、スーパーオキシド陰イオンの生成を劇的に減少させた。ミトコンドリアスーパーオキシド陰イオンは、無血清培地中のマウスＣＰＣと比較して、ＩＧＦ−１に曝露されたマウスＣＰＣにおいて約６４％低減された。
【０１３７】
ＩＧＦ−１の非存在下および存在下での新たに単離されたマウスＣＰＣにおけるヒドロキシルラジカルの基線生成および過酸化水素（１００μＭ）誘導性生成も測定した。ＩＧＦ−１は、ヒドロキシルラジカルの基線生成および過酸化水素誘導性生成の両方を有意に低減した。これらの実験の結果は、ＩＧＦ−１−ＩＧＦ−１Ｒ系が細胞老化の防止において重要な役割を果たす、ということを示唆している。
【０１３８】
総体的に、これらの知見は、ＩＧＦ−１Ｒの発現がｈＣＰＣの増殖能力の保存のために重要である、ということを示唆する。重要なのは、ＩＧＦ−１Ｒの存在が、老化細胞のプールからのｈＣＰＣを分類し、in vitroおよびin vivoでのそれらのそれぞれの増殖および分化能力を評価するために用いられ得る、ということである。この見解を支持して、若いおよび老いた患者の両方からのＩＧＦ−１Ｒ発現に関して陽性または陰性であるｈＣＰＣを単離し、in vitroでそれらの増殖および分化能力を測定した。
【０１３９】
各ｈＣＰＣ調製物から、Ｐ１でのｃ−ｋｉｔ陽性ｈＣＰＣを、ＦＡＣＳＡｒｉａ細胞選別機（Becton Dickinson）を用いてＩＧＦ−１Ｒの発現によって分類した。その後、実施例１Ｂに記載したようにＱ−ＦＩＳＨによりテロメア長を確定して、これらのｈＣＰＣ小集団におけるＩＧＦ−１Ｒエピトープとテロメア長との間の直接的関係を確立した。いくつかのパラメーター、例えばサイクリング細胞のパーセンテージ、集団倍加時間（ＰＤＴ）、細胞周期の時機、連続分裂に伴う老化性細胞の蓄積およびテロメア短縮、ならびに複製に伴うテロメラーゼ活性の変化を分析して、in vitroで分裂、分化するｈＣＰＣクラスの能力を確定した。サイクリングおよび非サイクリング細胞の割合を測定するために、ＩＧＦ−１Ｒ陽性ｈＣＰＣおよびＩＧＦ−１Ｒ陰性ｈＣＰＣを低密度（１００細胞／ｃｍ２）でプレート化し、ＢｒｄＵ（１μｇ／ｍｌ）を、１日３回１週間、培地に付加した。細胞を固定誌、前に記載されたように免疫細胞化学によりＢｒｄＵ取込みを確定した（実施例１；Urbanek et al. (2005) Circ Res, Vol. 97:663-673）。長い標識化期間にかんがみて、ＢｒｄＵ陽性および陰性細胞は、それぞれサイクリングおよび非サイクリングｈＣＰＣとみなされた。
【０１４０】
図５４に示したように、ＩＧＦ−１Ｒに関して強陽性のｈＣＰＣは、この受容体に関して陰性であるｈＣＰＣより、ＢｒｄＵ取込みにより測定下場合に有意に高い分裂速度を有すると思われる。分析した場合、若い心臓および老いた不全心臓から得られたＩＧＦ−１Ｒ陽性ｈＣＰＣの増殖行動に実際的差異は認められなかった。老化性ｈＣＰＣの区画は非不全心臓におけるよりも不全心臓の方が大きかった（Urbanek et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 102:8692-8697）が、しかし若いｃ−ｋｉｔ陽性ＩＧＦ−１Ｒ陽性ｈＣＰＣの集団を代償不全心臓から単離し、顕著な増殖後退を保有することが判明した。
【０１４１】
分裂するＩＧＦ−１Ｒ陽性ｈＣＰＣの無傷能力を、ＩＧＦ−１Ｒ陰性ｈＣＰＣの低レベルの増殖と対比したが、これは、典型的には、アンギオテンシン１（ＡＴ１）受容体の発現の上方調節により成し遂げられた（図５５）。これらのデータは、ＲＡＳがｈＣＰＣ老化および死において一役を果たし得る、ということを示唆する。ＲＡＳは、齧歯類ＣＰＣの老化に関与しており（実施例２参照）、この場合、生活年齢は、おいた細胞におけるＡｎｇ  ＩＩの生成と一緒に、ＲＡＳの種々の構成成分の発現増強により特性化されて、ＣＰＣ増殖停止およびアポトーシスにおけるこのオクタペプチドの役割を支持する証拠を提供する。Ａｎｇ  ＩＩは、心臓における酸化的損傷の年齢依存的蓄積の有意の一助であり得る（Kajstura et al. (2001) Diabetes, Vol. 50:1414-1424）。Ａｎｇ  ＩＩの抑制は、心不全を確かに阻止し、ヒトにおける寿命を延長する（O’Meara et al. (2007) Circulation, Vol. 115:3111-3120）。Ａｎｇ  ＩＩは活性酸素種（ＲＯＳ）を生成し、持続性酸化ストレスは細胞ＤＮＡ修復過程の限度を越えることがある。フリーラジカルにより誘導されるＤＮＡ損傷の最も顕著な形態は、Ａｎｇ  ＩＩに曝露されたＣＰＣにおいて（実施例２）、または慢性的不全心臓で（Chimenti et al. (2003) Circ Res, Vol. 93:604-613）実証された８−ＯＨ−ｄＧである。酸化ヌクレオチド  ８−ＯＨ−ｄＧは、Ａｎｇ  ＩＩを用いて有意に、そして若いＣＰＣよりも老いたＣＰＣにおいてより多く、増大する；８−ＯＨ−ｄＧは、テロメアのＧＧＧトリプレットで蓄積して、テロメア短縮および無キャップを生じる傾向があり（Kawanishi and Oikawa (2004) Ann NY Acad Sci, Vol. 1019:278-284）、テロメア完全性の損失は、細胞老化および死の主な決定因子である。逆に、ＩＧＦ−１は、ＲＯＳの生成を阻止し（Kajstura et al. (2001) Diabetes, Vol. 50:1414-1424）、加齢心筋における酸化ストレスを減少させ（Torella et al. (2004) Circ Res, Vol. 94:514-524）、そして相同組換えにより酸化的ＤＮＡ損傷を修復する（Yang et al. (2005) Am J Physiol, Vol. 289:F1144-F1152）。
【０１４２】
Ｂ．  ＩＧＦ−１Ｒ陽性ヒト心臓幹細胞による損傷心筋の修復
これらの試験の目的は、免疫不全ラットにおける梗塞直後に、in vivoでＩＧＦ−１Ｒ陽性の長いテロメアのｈＣＰＣ小集団の治療効力を確定することである（条件１）。同様に、梗塞直後のin vivoでのＩＧＦ−１Ｒ陰性短テロメアｈＣＰＣ小集団の治療効力も試験する（条件２）。これらの実験の結果は、ＩＧＦ−１Ｒ発現とｈＣＰＣの再生能力との間の相関を確立する。
【０１４３】
心臓手術を受けている患者からのヒト心筋組織試料から、ヒトＣＰＣを単離する。上記パートＡに記載したようにＩＧＦ−１Ｒの発現により、ｃ−ｋｉｔ陽性ｈＣＰＣをさらに特性化する。ｈＣＰＣの小集団を、in vitroでのそれらの増殖特質に基づいて選択する。例えば、ＩＧＦ−１Ｒに関して陽性で、最適増殖速度を示すｈＣＰＣを、条件１における梗塞動物への投与のために選択する。ＩＧＦ−１Ｒに関して陰性で、低増殖速度を示すｈＣＰＣを、条件２における梗塞動物への投与のために選択する。投与前に、以前記載されたようにレンチウイルス感染によりＥＧＦＰでｈＣＰＣの選択小集団を標識する（Bearzi et al. (2007) Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 104:14068-14073）。
【０１４４】
麻酔メス免疫不全ラットにおいて、心筋梗塞を誘導する。冠動脈閉塞直後に、各々〜１５，０００ＥＧＦＰ標識化ｈＣＰＣの２回の注入を、境界域の反対部位に実行する。動物をＢｒｄＵに曝露し、梗塞および細胞移植の１ヵ月後に屠殺する。
【０１４５】
週２回、心エコーにより動物を追跡する。線形変換器（１５−６Ｌ）を装置したＰｈｉｌｉｐｓ  Ｓｏｎｏｓ  ５５００を用いて、軽く麻酔されたラット（ケタミン）で心エコーを実施する。前胸郭を剃毛し、乳頭筋のレベルで傍胸骨短軸から二次元（２Ｄ）画像およびＭモードトレースを記録する。Ｍモードトレースから、拡張期および収縮期の解剖学的パラメーター、ならびに後壁の短縮率を確定する。２Ｄ短軸における左心室（ＬＶ）横断画像から駆出率（ＥＦ）を得る：ＥＦ＝［（ＬＶＤＡ−ＬＶＳＡ）／ＬＶＤＡ］＊１００（ここで、ＬＶＤＡおよびＬＶＳＡは拡張期および収縮期のＬＶ面積に対応する）。
【０１４６】
心筋梗塞および細胞移植の１ヵ月後、血行力学的および形態学的に動物を試験する。麻酔（抱水クロラール、３００ｍｇ／ｋｇ  ｂ．ｗ．、腹腔内）下で、Ａ／Ｄ変換器（ｉＷｏｒｘ  ２１４）およびコンピューター系に接続されたマイクロチップ圧力変換器（ＳＰＲ−６１２、Millar Instruments）を用いて、右頚動脈にカニューレ挿入した。左心室圧ならびに＋および−ｄＰ／ｄｔの評価のために、カテーテルを左心室（ＬＶ）中に進行させる。血行力学的データの収集後、形態学的に試験されるべき動物において、ＣｄＣｌ２の静脈内注入により心臓を拡張期に停止させ、ホルマリンでの冠動脈血管系の還流により、心筋を固定する。ＬＶ心臓腔を、in vivo測定拡張末期圧と等価圧に保持する。この手順は、解剖学的データの獲得のために重要である。
【０１４７】
残存する筋細胞数ならびに心室間中隔を含めて左心室から失われた筋細胞数の外形計測分析により、梗塞寸法を得る。新規生成筋細胞の数およびそれらの容積分布を測定する。さらに、生存筋細胞における肥大性応答を確定する。新規形成小動脈および毛細管の査定のために、同様の分析を実行する。予備の心筋の血管新生も確定する。
【０１４８】
共焦点顕微鏡、ならびに核、細胞質および膜タンパク質の標識化により、筋細胞、内皮細胞および平滑筋細胞を同定する（Bearzi et al. (2007) Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 104:14068-14073）。Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲン抗体により、コラーゲンを検出する。筋細胞の数およびサイズに関する心筋再構成の程度ならびに再生組織内の血管形成の程度を、定量的に確定する（Linke et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 102:8966-8971; Bearzi et al. (2007) Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 104:14068-14073; Urbanek et al. (2005) Circ Res, Vol. 97:663-673）。損傷心室内の新筋細胞の生理学的組込みの形態学的同等物を、コネキシン４３およびＮ−カドヘリンの発現により実証する。細胞融合が心筋再生の一因であるという可能性も評価する。したがって、臨床的に用いられるべき心臓幹細胞の最も適切な小集団の選択のためのin vitroプロトコールの妥当性を確立する。
【０１４９】
Ｃ．  ヒト心臓幹細胞老化におけるｐ５３の役割
今までのところ、細胞老化の最も信頼できるマーカーは、テロメア−テロメラーゼ系である（Kim et al. (2002) Oncogene, Vol. 21:503-511; Campisi J (2005) Cell, Vol. 120:513-522; and Yang et al. (2001) Mech Ageing Dev, Vol. 122:1685-1694）。テロメラーゼ活性は、正常成体心臓において存在し、心筋肥大（Urbanek et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 100:10440-10445）、急性および慢性虚血性心筋症（Urbanek et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 102:8692-8697）、ならびに早発性心筋加齢（Chimenti et al. (2003) Circ Res, Vol. 93:604-613）において増大される。しかしながら、このリボ核タンパク質は、テロメア侵食を防止しない；重度のテロメア短縮が、不全ヒト心臓の筋細胞およびｈＣＰＣで検出されている（Urbanek et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 102:8692-8697; Chimenti et al. (2003) Circ Res, Vol. 93:604-613; and Urbanek et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 100:10440-10445）。これらの観察は、造血幹細胞（ＨＳＣ）で得られる結果と一致する。ＨＳＣは、低〜中レベルのテロメラーゼを発現するが、しかしテロメアは年齢に伴ってかなり短縮する（Notaro et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 94:13782-13785）。検出可能なテロメラーゼ活性の存在下でのテロメア短縮を説明するために、２つの可能性が提唱されている：すなわち、テロメラーゼ機能のサプレッサーが細胞周期中に働くこと、あるいはテロメアクロマチンの再構築とテロメラーゼによるテロメアの伸長との間に競合が生じることである（Notaro et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 94:13782-13785）。ＨＳＣと同様に、ｈＣＰＣにおけるテロメア短縮は、集団倍加当たり〜１３０ｂｐの割合で起きる（図５２）。慢性心臓代償障害および加齢は、ｈＣＰＣにおけるテロメラーゼ活性とテロメアの長さとの間の不均衡をもたらして、臨界テロメア短縮、増殖停止および細胞老化を引き起こす（Urbanek et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 102:8692-8697；Chimenti et al. (2003) Circ Res, Vol. 93:604-613）。これらの特質を有するｈＣＰＣの存在は、心室機能に及ぼす顕著な結果を有する。
【０１５０】
無傷長のテロメアは、染色体の末端を見えないようにするループ構造を形成する（Griffith et al. (1999) Cell, Vol. 97:503-514）。テロメアが短縮されると、Ｔ−およびＤ−ループはつぶれ、ＤＮＡ損傷の部位として細胞に感知される（Griffith et al. (1999) Cell, Vol. 97:503-514；Greider CW (1999) Cell, Vol. 97:419-422；およびYang et al. (2005) Mol Cell Biol, Vol. 25:1070-1080）。二本鎖ＴＴＡＧＧＧ反復は短くなり過ぎてテロメア結合タンパク質を結合できず、Ｔ−ループを形成し、そして一本鎖化３’オーバーハングはＤ−ループを形成できない（Griffith et al. (1999) Cell, Vol. 97:503-514; Greider CW (1999) Cell, Vol. 97:419-422）。短いテロメアのレベルでの多重チェックポイントタンパク質の蓄積は、主要プレイヤーが転写因子ｐ５３であるＤＮＡ損傷応答を、機能不全テロメアが誘発する、ということを示す（Stansel et al. (2002) J Biol Chem, Vol. 277:11625-11628）。毛細管拡張性運動失調突然変異化（ＡＴＭ）プロテインキナーゼは、セリン１５でのｐ５３のリン酸化のために必要とされる（Celli and de Lange (2005) Nat Cell Biol, Vol. 7:712-718）。この事象は、ｐ５３の翻訳後修飾のカスケードを活性化し、これがｐ５３標的遺伝子の転写とその後のアポトーシスプログラムの活性化または細胞老化の開始を引き起こす。セリン１５でのｐ５３リン酸化は、可能な場合は、ＤＮＡ修復を促すためのｐ２１Ｃｉｐ１の発現増強を伴う（Campisi J (2005) Cell, Vol. 120:513-522）。したがって、ｐ５３は、特定タンパク質、例えばｐ２１Ｃｉｐ１、ＢａｘおよびＢａｄの上方調節により、増殖停止、アポトーシスおよび老化を調整する（Selivanova and Wiman (2005) Adv Canc Res, Vol. 66:143-180; Levine AJ (1997) Cell, Vol. 88:323-331）。ＢａｘおよびＢａｄはアポトーシスに関与するが、一方、高レベルのｐ２１Ｃｉｐ１は非可逆的増殖停止および細胞老化を誘発する。ｐ１６ＩＮＫ４ａは稀に、ＤＮＡ二本鎖切断と共存する（Herbig et al. (2004) Mol Cell, Vol. 14: 501-513）；ｐ１６ＩＮＫ４ａは、ｐ５３およびｐ２１Ｃｉｐ１の誘導を追跡する遅延応答を示す（Jacobs and de Lange (2005) Cell Cycle, Vol. 4:1364-1368）。
【０１５１】
心筋細胞において、ｐ５３は筋細胞ＲＡＳの構成成分のための転写因子として作用し（Pierzchalski et al. (1997) Exp Cell Res, Vol. 234:57-65；Leri et al. (1998) Circulation, Vol. 97:194-203；Leri et al. (1998) J Clin Invest, Vol. 101:1326-1342；Leri et al. (1999) Am J Pathol, Vol. 154:567-580；Leri et al. (1999) Circ Res, Vol. 84:752-762；Leri et al. (2000) Am J Pathol, Vol. 157:843-857；およびFiordaliso et al. (2001) Diabetes, Vol. 50:2363-2375）、そしてｐ５３の類似の機能は、ｈＣＰＣで有効であると仮定される。ＡｏｇｅｎおよびＡＴ１受容体のプロモーターは、ｐ５３に関するコンセンサス結合部位を含有する。Ａｏｇｅｎ基質の利用可能性はＡｎｇ  ＩＩの生合成における制限段階を表すため、ｐ５３によるＡｏｇｅｎの調節は特に関係がある。さらに、ｈＣＰＣにおけるＡｎｇ  ＩＩの生合成および放出の増大は、ＡＴ１受容体の長期刺激を生じて、ｈＣＰＣアポトーシスまたは老化を持続する陽性フィードバックループを作り出す。ＡＴ１受容体活性化に伴うＡｎｇ  ＩＩの継続的分泌は、順次、ＰＫＣおよびｐ３８−ＭＡＰＫによるセリン３９０でのｐ５３のＣ末端のリン酸化を誘発する（Fiordaliso et al. (2001) Diabetes, Vol. 50:2363-2375）。この翻訳後修飾は、ｐ５３依存性（Ｂａｘ、Ｂａｄ、ｐ２１Ｃｉｐ１）およびｐ５３調節化（Ａｏｇｅｎ、ＡＴ１受容体）遺伝子の転写と一緒に、ｐ５３機能を上方調節する。ｐ５３の抑制が、Ａｎｇ  ＩＩの合成、ｐ５３およびｐ３８  ＭＡＰキナーゼリン酸化ならびに細胞死を防止する、ということは重要である。同様に、ＡＴ１受容体遮断薬  ロサルタンは、Ａｎｇ  ＩＩにより誘導されるｐ５３およびｐ３８  ＭＡＰキナーゼのリン酸化を防止する（Fiordaliso et al. (2001) Diabetes, Vol. 50:2363-2375）。さらに、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼの抑制は、Ａｎｇ  ＩＩ媒介性筋細胞死によるロサルタンの結果を、より遠位レベルで、模倣する（Fiordaliso et al. (2001) Diabetes, Vol. 50:2363-2375）。
【０１５２】
ＩＧＦ−１−ＩＧＦ−１Ｒ系におけるｐ５３の有力な機能は、転写の抑制による（Werner et al. (1996) Biochemistry, Vol. 93:8318-8323；Prisco et al. (1997) Mol Cell Biol, Vol.17:1084-1092；およびGirnita et al. (2000) Cancer Res, Vol. 60:5278-5283）、または受容体と、ＩＧＦ−１Ｒのユビキチン化および分解をもたらすＭｄｍ２との間の複合体の形成による（Girnita et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 100: 8247-8252）、ＩＧＦ−１Ｒ発現の下方調節からなる。さらにまた、ＩＧＦ−１刺激は、ｐ５３のアミノ末端のリン酸化をもたらし、そしてリン酸化ｐ５３はＭｄｍ２を上方調節し（Leri et al. (1999) Am J Pathol, Vol. 154:567-580; Leri et al. (1999) Circ Res, Vol. 84:752-762）、これが順次、ＩＧＦ−１Ｒを分解し得る（Girnita et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 100: 8247-8252）。ｐ５３活性増大が、上皮組織器官におけるＩＧＦ−１産生と関連づけられてきた、ということは重要である（Gatza et al. (2008) Dev Biol, Vol. 313:130-141）。さらに、ｐ５３−標的遺伝子  ＰＴＥＮは、ＰＩＰ３においてホスファターゼとして作用し、Ａｋｔリン酸化（Levine et al. (2006) Genes Dev, Vol. 20:267-275）およびＩＧＦ−１細胞応答を阻止する。
【０１５３】
ＩＧＦ−１は、Ｍｄｍ２の上方調節およびＭｄｍ２−ｐ５３不活性タンパク質複合体の形成を介してｐ５３を抑制し、最終的にＡｎｇ  ＩＩの合成およびｐ５３機能を減少させる（Leri et al. (1999) Am J Pathol, Vol. 154:567-580; Leri et al. (1999) Circ Res, Vol. 84:752-762）。ＩＧＦ−１の主な下流エフェクターはＡｋｔであって、これは、ｐ５３のＮ末端をリン酸化して、ｍｄｍ２遺伝子の選択的転写を生じる（Ashcroft et al. (2000) Mol Cell Biol, Vol. 20:3224-3233; Haupt Y (2004) Cell Cycle, Vol. 3:884-885）。ｐ５３αらせんペプチドの残基１６〜２８は、Ｍｄｍ２の疎水性ポケットと結合して（Chen et al. (2005) Mol Cancer Ther, Vol. 4:1019-1025）、タンパク質−タンパク質複合体を形成する。Ｍｄｍ２は、核小体区画に転写因子を隔離することにより、ｐ５３機能を抑圧し、その半減期を減少させて、そのＤＮＡ結合活性を抑制する（Stommel and Wahl (2005) Cell Cycle, Vol. 4:411-417; Vousden and Prives (2005) Cell, Vol. 120:7-10）。Ｍｄｍ２−ｐ５３不活性複合体の生成の結果として、ｈＣＰＣに及ぼすＩＧＦ−１の抗アポトーシスおよび抗加齢作用は、局所的ＲＡＳの下方調節により媒介され得る。総体的に、これらの知見は、ｈＣＰＣの老化は、一方ではＲＡＳと、他方でＩＧＦ−１との間の不均衡によって決まり得る、ということを示唆する。
【０１５４】
別の重要な態様は、テロメラーゼとｐ５３との間の関係に関する。ｐ５３はテロメラーゼの触媒サブユニット（ＴＥＲＴ）のプロモーターと直接結合し得ないが、しかしｐ５３は２つの機序によりＴＥＲＴ発現を抑圧する。ｐ５３はＳｐ１と複合体を形成するが、これはＴＥＲＴプロモーターの活性化のためにはもはや利用可能でない（Kusumoto et al. (1999) Clin Cancer Res, Vol. 5: 2140−2147；Kanaya et al. (2000) Clin Cancer Res, Vol. 6:1239−1247；Xu et al. (2000) Oncogene, Vol. 19: 5123−5133；およびShats et al. (2004) J Biol Chem, Vol. 279: 50976−50985）。さらに、ｐ５３は、リン酸化ポケットタンパク質Ｒｂの蓄積に好都合であるｐ２１Ｃｉｐ１の誘導によりＴＥＲＴ転写を抑制する（Helmbold et al. (2006) Oncogene, Vol. 25:5257-5262）。活性化Ｒｂは、ＴＥＲＴのプロモーターにおける抑圧的Ｅ２Ｆ−Ｒｂタンパク質複合体のアセンブリーによりＴＥＲＴを安定的に抑える（Shats et al. (2004) J Biol Chem, Vol. 279: 50976−50985; Won et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 101:11328−11333）。したがって、局所的ＲＡＳはテロメラーゼを下方調節するが、一方、ＩＧＦ−１はｐ５３機能の調整によりテロメラーゼを上方調節する。ＩＧＦ−１がＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路を介してｈＣＰＣにおけるテロメラーゼをリン酸化し得る、ということは重要である。マウステロメラーゼにおけるＡｋｔリン酸化に関するコンセンサス部位  ＲＶＲＬＲＥＬＳＱＥ（アミノ酸５８５〜５９４；配列番号２３）を同定したが（Torella et al. (2004) Circ Res, Vol. 94:514-524）、同様の配列はヒトＴＥＲＴに存在し（Kang et al. (1999) J Biol Chem, Vol. 274:13085-13090）、これは、ＩＧＦ−１がテロメラーゼを上方調節し、それによりｈＣＰＣ増殖および生存を上方調節して、細胞加齢を遅延する、ということを示唆している。
【０１５５】
これらの観察に基づいて、ｈＣＰＣの増殖および生存は、ｐ５３機能により、局所的ＲＡＳおよびＩＧＦ−１−ＩＧＦ−１Ｒ経路の活性を制御して、ｈＣＰＣ老化および死を状態調節するテロメア−テロメラーゼ系により調節される、という仮説を試験する。
【０１５６】
酵素的解離およびウサギｃ−ｋｉｔ抗体（Santa Cruz Biotechnology）を用いた分類により明白な心不全を有する患者から得られる心筋組織試料から、ヒトＣＰＣを単離する。５〜１０％ＦＢＳおよびインスリン−セレン−トランスフェリン混合物を補足したＦ１２培地中で、分類細胞を拡張させる（Ｐ５〜Ｐ６）。各ｈＣＰＣ調製物から、ＩＧＦ−１ＲおよびＡＴ１受容体の発現によって、細胞をさらに分類する。ｈＣＰＣのペレットを液体窒素中で急速凍結させて、分子解析のために−８０℃で保存する。
【０１５７】
単離ｈＣＰＣ中に存在する異なる増殖因子受容体系を解析するために、Ｐ５〜Ｐ６での分別ｈＣＰＣを無血清培地（ＳＦＭ）中で培養して、ＩＧＦ−１およびＡｎｇ  ＩＩ分泌を測定する。さらに、培養をＩＧＦ−１（ヒト組換えＩＧＦ−１  １５０ｎｇ／ｍｌ）またはＡｎｇ  ＩＩ（１０−１１ｍｏｌ／Ｌ）で２４時間の期間中刺激して、陽性フィードバックループが増殖因子生成に関与するか否かを検出する。増殖因子を含有する培地を除去し、細胞を２回洗浄する。新鮮なＳＦＭを付加する。ＳＦＭは、ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体（Abcam）またはＡＴ１受容体アンアゴニスト  ロサルタン（１０−７Ｍ）およびＡＴ２受容体遮断薬ＰＤ１２３３１９（１０−７ｍｏｌ／Ｌ、Sigma）を含有する。遮断薬は、リガンド結合を回避するために用いられる。ＩＧＦ−１およびＡｎｇ  ＩＩ測定のために、３、９、１５および２４時間後に培地を収集する。ＥＬＩＳＡ（）により増殖因子量を確定し、そしてウエスタンブロッティングにより測定されるｈＣＰＣタンパク質およびβ−アクチン発現の総量により正規化する。さらに、アンギオテンシノーゲン（Ａｏｇｅｎ）、レニン、カテプシン、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）、ＡＣＥ２、チマーゼ、ＡＴ１受容体、ＡＴ２受容体、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−１Ｒを、実時間ＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロッティングおよび免疫細胞化学により確定する。細胞老化はＩＧＦ−１−ＩＧＦ−１Ｒ系の下方調節ならびにＲＡＳ系の上方調節と相関する、と予期される。
【０１５８】
実験の次のシリーズは、単離ｈＣＰＣにおけるテロメア−テロメラーゼ系の発現および活性を検査する。テロメラーゼの触媒性サブユニットおよびテロメア関連タンパク質の発現を査定するために、低張および高張緩衝液中での分別ｈＣＰＣのインキュベーションにより、核抽出物を得た。タンパク質を、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）抗体と免疫沈降させて、ウエスタンブロッティングにより検出する（テロメラーゼ酵素サブユニットの検出のため）か、または８〜１０％ＳＤＳ／ＰＡＧＥ上に載せて、ニトロセルロース上に移して、ＴＲＦ−１およびＴＲＦ−２に対する特定の抗体に曝露する（テロメア関連タンパク質の検出）。テロメラーゼは、１２０〜１２５ｋＤａ帯域に対応する。ＨｅＬａ細胞を、陽性対照として用いる（Leri et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 98:8626−8631）。
【０１５９】
ＴＲＡＰ検定により、テロメラーゼ活性を査定する。分別ｈＣＰＣをＣＨＡＰＳ緩衝液中で均質化して、４℃で遠心分離する。１〜５μｇの非処置およびＲＮアーゼ処置ｈＣＰＣ抽出物を、［γ３２Ｐ］ＡＴＰ−末端標識化テロメラーゼ基質（ＴＳオリゴヌクレオチド：５’−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ−３’、配列番号１）、Ｔａｑポリメラーゼおよびアンカー逆方向プライマー（３’−ＧＣＧＣＧＣ［ＣＴＴＡＣＣ］３ＣＴＡＡＣＣ−５’、配列番号１９）とともに３０分間インキュベートする。試料を２７回の増幅周期に曝露する。ＩＧＦ−１Ｒ陽性およびＡＴ１受容体陽性ｈＣＰＣにおいて、２つのアプローチによりテロメア長を測定する。第一のアプローチは、テロメア制限断片（ＴＲＦ）解析からなる。このアプローチでは、ｈＣＰＣを、制限酵素ＲｓａＩおよびＨｉｎｆＩとともに一晩インキュベートする。消化ＤＮＡ断片を、０．５×ＴＢＥ緩衝液を有する１％アガロースゲル中で移動させる。５×デンハート溶液、５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム緩衝液、０．１％ＳＤＳおよび２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４中で、５５℃で５時間、ゲルを予備ハイブリダイズする。配列（ＴＴＡＧＧＧ）ｎを含有する１．６ｋｂの３２Ｐ−標識化プローブを付加し、ハイブリダイズする。ゲルを洗浄し、フィルムに曝露する。既知のテロメア長を有する細胞株を、比較のために利用する。サザンブロットハイブリダイゼーションは、種々のサイズのテロメア断片のスメアを生じて、全細胞集団における平均テロメア長の概算を提供する（Kang et al. (1999) J Biol Chem, Vol. 274:13085-13090）。第二のアプローチは、Ｑ−ＦＩＳＨ技法を伴い、実施例１に記載されている。
【０１６０】
２つの異なる検定により、テロメラーゼリン酸化を査定する。第一の検定であるＡｋｔプロテインキナーゼ検定は、テロメラーゼをリン酸化する上流キナーゼ（Ａｋｔ）の活性を査定する。この検定は、ＰｅｐＴａｇ非放射性プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）検定系１１(Promega, Madison, Wisconsin)のプロトコールに従って実施される。Ａｋｔキナーゼ基質に関しては、フルオレセイン共役Ｈ２Ｂヒストン（３０ＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳ３９、配列番号２０）およびｈＴＥＲＴ（８１７ＡＶＲＩＲＧＫＳＹＶ８２６、配列番号２１）オリゴペプチドを用いる(Peptron)。低張および高張緩衝液中での分別ｈＣＰＣのインキュベーションにより、核抽出物を得る。５μｇのフルオレセインオリゴペプチドを、２０μｌのプロテインキナーゼ反応混合物（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１ｍＭジチオトレイトール、０．２ｍＭ  ＥＧＴＡ、２０μＭ  ＡＴＰ、１μｇホスファチジルセリン、プロテインキナーゼ活性剤）中の１０μｌの溶解物とともに、３０℃で３０分間インキュベートする。９５℃で１０分間加熱することにより、反応を停止する。リン酸化ペプチドを、１００Ｖで１５分間、０．８％アガロースゲル上で分離する。リン酸化負荷電基質は、陽極に移動する。第二の検定は、リン酸化ヒトＴＥＲＴの存在を検出する。ＨＮＴＧ緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；０．１％トリトンＸ−１００；および１０％グリセロール）を用いてｈＣＰＣ溶解物を調製し、次いで、抗ＴＥＲＴ（Ｈ−２３１、Santa Cruz）とともに一晩インキュベートする。免疫沈降タンパク質を氷冷ＨＮＴＧ緩衝液で洗浄し、抗−ホスホ−（Ｓｅｒ）−Ａｋｔ−基質（Cell Signaling）を用いてイムノブロッティングに付す。この抗体は、位置−３および−５でＡｒｇが前置されるホスホ−Ｓｅｒを含有するＡｋｔコンセンサス部位を含有するタンパク質（ＲＸＲＸＸＳ、配列番号２２）を認識する。高い増殖能力を示すｈＣＰＣは、不十分な増殖特質を有するｈＣＰＣと比較して、長い、テロメア、高いテロメラーゼ活性およびより多くのリン酸化テロメラーゼを有すると予期される。さらに、ＩＧＦ−１Ｒ発現は、高増殖能力およびより長いテロメアと相関すると予期されるが、一方、ＡＴ１受容体発現は、低増殖能力およびより短いテロメアと相関すると予期される。
【０１６１】
実験の次のシリーズは、ｈＣＰＣの細胞老化におけるｐ５３の役割を査定する。１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でタンパク質溶解物（３０〜５０μｇ）を分離し、分離タンパク質をニトロセルロースに移し、そしてニトロセルロースを、ＴＢＳＴ中に１〜２μｇ／ｍｌの濃度で、ホスホ−Ｓｅｒ３９０−ｐ５３抗体およびホスホ−Ｓｅｒ１５−ｐ５３抗体、ＡＴＭプロテインキナーゼ抗体、ホスホ−ｐ３８ＭＡＰキナーゼ抗体およびホスホ（Ｓｅｒ４７３）−Ａｋｔ抗体に曝露することによる分別ｈＣＰＣの調製において、ｐ５３およびそれぞれのキナーゼリン酸化を検査する。リン酸化Ｒｂの発現も測定する。ｐ５３−標的遺伝子、Ｂａｘ、Ｍｄｍ２、ＰＴＥＮおよびｐ２１Ｃｉｐ１の発現を、ウエスタンブロッティングにより確定する。ｐ５３とＭｄｍ２、ならびにｐ５３とＳｐ１との間の複合体の形成を、免疫沈降およびウエスタンブロッティングにより検出する。具体的には、３つの別個の免疫沈降検定を実施する：タンパク質抽出物を、３μｇのマウスモノクローナル抗ｐ５３（Ｐａｂ２４０、Santa Cruz）および２５０μｌのＨＮＴＧ緩衝液とともに４℃で一晩インキュベートする。その後、５０μｌのプロテインＡ−アガロースを付加する。洗浄後、試料を、１４，０００ｒｐｍで２分間、遠心分離する。免疫沈降タンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ニトロセルロースフィルター上に移して、ウサギポリクローナル抗Ｍｄｍ２（Ｃ−１８およびＫ−２０、Santa Cruz）または抗Ｓｐ１（Abeam）に１μｇ／ｍｌの濃度で曝露する。この免疫沈降から得られる上清を、抗ｐ５３（Ｐａｂ２４０、Santa Cruz）で再び免疫沈降して、次に、ウサギポリクローナル抗ｐ５３（ＦＬ−３９３、Santa Cruz）に曝露して、非結合ｐ５３の量を得る。
【０１６２】
分別ｈＣＰＣにおけるｐ５３の活性を評価するために、ｐ５３の転写活性を２つのアプローチにより評価する。第一のアプローチは、電気泳動移動度シフト検定を用いる。Ａｏｇｅｎ、ＡＴ１受容体、Ｂａｘ、ｐ２１Ｃｉｐ１およびＩＧＦ−１受容体のプロモーター領域におけるｐ５３に関するコンセンサス結合部位を利用して、検定に用いるためのオリゴヌクレオチドを設計する。［γ３２ＡＴＰ］標識化オリゴヌクレオチドを帯域シフト検定に用いるが、これは、Ａｎｇ  ＩＩ、ＩＧＦ−１、ロサルタン、ＰＤ１２３３１９またはＩＧＦ−１遮断抗体の存在下および非存在下で培養される分別ｈＣＰＣで実施される。低張および高張緩衝液に細胞を曝露することにより、核抽出物を得て、過剰量の非標識化自己オリゴヌクレオチドおよびｐ５３抗体とともにインキュベートする。第二アプローチは、クロマチン免疫沈降を包含する。Ａｏｇｅｎ、ＡＴ１受容体、Ｂａｘ、ｐ２１Ｃｉｐ１およびＩＧＦ−１受容体特異的遺伝子のプロモーター上のｐ５３の位置をマッピングするために、音波処理によりホルムアルデヒド架橋ＤＮＡを断片化し、ｐ５３抗体で分解する。免疫沈降クロマチンを回収し、架橋を消失する。当該遺伝子のプロモーター領域を、ＰＣＲにより認識する。ｈＣＰＣの老化は、ｐ５３機能の上方調節と相関すると予期される。
【０１６３】
実施例８  −  不死ＤＮＡを有するヒト心臓幹細胞は優れた再生能力を有する
幹細胞自己複製についての一般的理解は、３５年前に提唱された古い理論の復活により、近年、混乱を生じている（Cairns (1975) Nature, Vol. 255:197-200）。古いＤＮＡを受け継ぐ娘細胞が幹細胞特徴を保持するよう、連続分裂において、幹細胞は、元の鋳型ＤＮＡ鎖（「最も古い」）を同時分離し得るが、一方、新ＤＮＡを獲得する娘細胞は一過性増幅プールに進入する、ということが示唆されている。不死ＤＮＡ鎖の非無作為分離は、非修復性複製の誤りに起因する突然変異の蓄積を阻止し、細胞分裂中のテロメア短縮を部分的に防止する（Cairns (1975); Potten et al. (2002) N. Cell. Sci., Vol. 115: 2381-2388; Falconer et al. (2010) Nat. Protoc., Vol. 5: 1362-1377）。造血およびその他の幹細胞にこの概念が適用可能であるか試されてきているし（Kiel et al. (2007) Nature, Vol. 449:238-242）、幹細胞分裂のこの機序に対する反論が主張されている（Lansdorp (2007) Cell, Vol. 129: 1244-1247）。
【０１６４】
不死鎖仮説が正しい場合、母幹細胞の数は寿命の多少早期に各器官で遺伝子的に決定されなければならず、この細胞クラスはその後、拡張され得ない。逆に、この部類の「真の」幹細胞は、ヒトの寿命の進行に伴って一般に存在する環境因子、酸化ストレスおよび疾病過程の結果として劇的に減少し得る。しかしながら、老いたＤＮＡを保有する心臓幹細胞（ＣＳＣ）は、損傷心臓を再集団形成し得る最も強力な幹細胞プールを代表する。ヒト心筋が不死ＤＮＡ鎖仮説に従って分裂するＣＳＣを含有するという実証は、ヒト心臓が、組織恒常性および修復が常在ＣＳＣの区画により調節される自己複製器官である、という認識を支持する強力な証拠を提供する。
【０１６５】
Ａ．  ヒトＣＳＣは非対称的および対称的染色分体分離により分裂する
ヒトＣＳＣ（ｈＣＳＣ）の分裂中に非無作為ＤＮＡ鋳型分離から無作為ＤＮＡ鋳型分離を識別するために必要とされるアプローチは、複雑である；ヒトにおけるin vivo試験は実施できず、原始または委任状態の幹細胞はin vivoでの任意の系において明確に確認され得ない（Kiel et al. (2007); Lansdorp (2007)）。先祖「祖父母」ＤＮＡは、外因性送達チミジン類似体により標的化され得ず、老いたおよび新規合成標識化「親」ＤＮＡの共存は第二世代で失われ（Potten et al. (2002); Falconer et al. (2010); Karpowicz et al. (2005) J. Cell. Biol., Vol. 170: 721-732; Shinin et al. (2006) Nat. Cell. Biol., Vol. 8: 677-687; Conboy et al. (2007) PLoS. Biol., Vol. 5: e102; Rando (2007) Cell, Vol. 129: 1239-1243）、不死ＤＮＡを保有するｈＣＳＣのin vivo運命を追跡できなくする。
【０１６６】
染色分体の非無作為および／または無作為分離によるｈＣＳＣの分裂は、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）タグ化ｈＣＳＣのクローン検定によって実証されるに過ぎない。このプロトコールは、幹細胞レベル、すなわちクローン形成能レベルで、老いたＤＮＡを有するＢｒｄＵ陽性親ｈＣＳＣの分裂により形成されるクローン細胞がＢｒｄＵ標識化細胞（親ＤＮＡの新規合成鎖）のみを示し、一方、クローン中の他のｈＣＳＣはすべてＢｒｄＵ陰性であり、完全ＤＮＡ鋳型を保有する母細胞の子孫であることを強調する。これに対比して、染色分体の無作為分離に伴うｈＣＳＣの分裂により形成されるクローンは、すべてＢｒｄＵ陽性であるがしかしＢｒｄＵの希釈がクローン拡張に伴って起きる細胞で構成されると予期される。
【０１６７】
以前に詳述されたように（Bearzi et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 104: 14068-14073）、１６のヒト心筋試料から系列陰性ｃ−ｋｉｔ陽性ｈＣＳＣを収集した。その後、これらのｈＣＳＣの細胞周期の長さ（ｎ＝６）を、標識化有糸分裂法により確定し（Baserga, Ed. The Biology of Cell Reproduction, Harvard University Press, Cambridge Mass/Longdon England, 1985）、２６±３時間であることが判明した（図５９Ａ）。このパラメーターに基づいて、ほぼ１００％「祖父母ｈＣＳＣ」がＢｒｄＵ陽性になるまで（９９．５±１．０％）、〜５−６集団倍加の期間の間、系列陰性ｃ−ｋｉｔ陽性ｈＣＳＣをＢｒｄＵに曝露した。次いで、これらの細胞は分裂して、ＢｒｄＵに関しても陽性である「親ｈＣＳＣ」を生成した（図５６Ａ）。次にＢｒｄＵタグ化ｈＣＳＣを、１細胞／ｃｍ２の限界希釈でプレート化するか、または０．２５〜０．５細胞／ウェルの密度でTerasakiプレートの個々のウェル中に投入した（図５６Ｂ）。１個より多い細胞を含有するウェルは除外した。平均１３，０００のｈＣＳＣを患者当たりで植え付けた；総体的に、１，２８１クローンを得て、０．６％のクローン効率に達した（図５７ＡおよびＢ）。クローン効率は、年齢および心臓疾患の継続期間とは無関係であった。
【０１６８】
１，２８１クローンのうち、７７が単一ｈＣＳＣのＢｒｄＵ標識化により特性化され（図５６ＣおよびＥ）、１，２０４が全クローン細胞のＢｒｄＵ標識化により特性化された（図５６ＤおよびＥ）が、これは、始祖ｈＣＳＣの６％が分裂して元のＤＮＡ鋳型を保有し、一方、９４％が複製して、新規合成ＤＮＡのみを保有したことを示している。したがって、ｈＣＳＣは、染色分体の非無作為および無作為分離により自己複製する２つの細胞クラスからなると思われるが、後者が優勢である。１６例の患者において、老いたＤＮＡを保有するｈＣＳＣのパーセンテージは年齢と反比例的に関連したが、一方、冠動脈疾患、大動脈狭窄およびそれらの継続期間は、老いたおよび新しいＤＮＡを有するｈＣＳＣの相対的割合に影響を及ぼさなかった。
【０１６９】
Ｂ．  細胞老化および拡張性増殖はｈＣＳＣ分裂のパターンに影響を及ぼさない
ｈＣＳＣ分裂の非無作為染色分体分離モデルを立証するかまたは反証するために論じられるべき重要な一変数は、クローンの６％でＢｒｄＵを保有した単一細胞の特性化を包含する。以下の３つの可能性が考えられた（Lansdorp (2007)）：ａ）個々のＢｒｄＵ陽性細胞はクローンの形成における早期に増殖停止および複製的老化に達し、標識の漸増的希釈に伴いクローン細胞を生成できない；ｂ）非老化ＢｒｄＵ標識化姉妹細胞は、ＢｒｄＵの漸増的希釈に伴うクローンの生成に関与し、これは免疫標識により検出不可能になった；そしてｃ）分裂中のＢｒｄＵ陽性ｈＣＳＣは、複製中のＢｒｄＵ陰性細胞と一緒に、ＢｒｄＵ陰性およびＢｒｄＵ陽性ｈＣＳＣで構成される「混合」クローンを生成し得た。
【０１７０】
各々１つだけのＢｒｄＵ陽性細胞を含有する４０のクローンを、ｐ１６ＩＮＫ４ａに関して標識した；老化関連タンパク質ｐ１６ＩＮＫ４ａの存在は、恒久的に細胞周期への幹細胞の再入を防止する（Janzen et al. (2006) Nature, Vol. 443: 421-426; Molofsky et al. (2006) Nature, Vol. 443: 448-452; Krishnamurthy et al. (2006) Nature, Vol. 443: 453-457）。これらのクローンでは、ＢｒｄＵ陽性およびＢｒｄＵ陰性クローン細胞はともにｐ１６ＩＮＫ４ａを発現しなかったが（図５８Ａ）、但し、標識化新ＤＮＡを受け継いだ細胞は非可逆的増殖停止に達した。老いたＤＮＡを保有した各クローン中の個々の細胞、ならびに新ＤＮＡを含有した他の細胞はともに、細胞周期撤退を受けなかった。
【０１７１】
クローン細胞が実際に、細胞複製を伴うチミジン類似体の極端なレベルの希釈の生成物というよりむしろ、老いたＤＮＡを有するｈＣＳＣの何回かの分裂の生成物であったということを支持する証拠を集めるために、ＢｒｄＵ標識化親ｈＣＳＣ（図５６Ａ参照）を量子ドット（Ｑドット）で負荷し、プレート化した。このプロトコールを実行して、ＢｒｄＵを失い、不死ＤＮＡ鎖を保有した細胞が、細胞質に置けるＱドット標識化を顕著に低減する数回の分裂を受けたか否かを決定した；各々１つのＢｒｄＵ陽性細胞を含有する１４のクローンを分析した。クローンＢｒｄＵ陰性ｈＣＳＣにおけるＱドット蛍光の強度は、分裂の数に比例して減少したが、一方、１４のＢｒｄＵ陽性ｈＣＳＣは大量のＱドットを保有した（図５８Ｂ）。さらに、ＢｒｄＵを保有するおよび保有しない細胞の組合せからなるクローンの例は、検査した全クローンにおいて認められなかった。したがって、ｈＣＳＣ分裂の非無作為染色分体分離モデルは、著しくＢｒｄＵ標識された細胞の老化表現型の獲得、老いたＤＮＡを保有する細胞の複製の欠如、あるいは分裂中のＢｒｄＵ陽性およびＢｒｄＵ陰性ｈＣＳＣのクローン拡張への同時的関与を包含しない。
【０１７２】
不死ＤＮＡ鎖仮説、ならびに複製の間、老いたおよび新ＤＮＡを別様に分離するｈＣＳＣの２つのプールをヒト心臓が保有する、という認識の重要な一態様は、これらの別個のＤＮＡ分配機序の直接的形態学的証拠の獲得を必要とした。この目的のために、ｃ−ｋｉｔ陽性ｈＣＳＣをＢｒｄＵに〜３６時間曝露して、それらにハロゲン化ヌクレオチドを取り込ませた。次いで、ＢｒｄＵを除去し、〜３０時間の追跡期間を導入して、ＢｒｄＵの非存在下でｈＣＳＣに１回の細胞周期を経過させた。この期間の終了時に、細胞を固定し、有糸分裂後期画像におけるＢｒｄＵの分布を検査した。ほとんどの場合に、両組の後期染色体はＢｒｄＵに標識されたが、これは、無作為染色分体分離を実証している。しかしながら、限定数の有糸分裂細胞において、１組の後期染色体においてのみＢｒｄＵが検出され、これは、細胞分裂中の非無作為染色分体分離と一致した（図５９ＣおよびＤ）。
【０１７３】
ｈＣＳＣの一小集団が染色分体の非無作為分離により分裂するということをさらに実証するために、クロロデオキシウリジン（ＣｌｄＵ）標識化親ｈＣＳＣをクローン分析のためにプレート化した。その後、ヨードデオキシウリジン（ＩｄＵ）を〜２６時間の細胞周期の期間中に負荷して、ＣｌｄＵ標識化親ｈＣＳＣ由来の２つの細胞の第一世代における新規合成ＤＮＡ鎖を同定した。次に、ＩｄＵを培養から除去し、第二細胞世代におけるＤＮＡ鎖の分析を、〜２６時間の追跡期間後に実施した。このアプローチにより、３細胞のクローンが見出されたが、この場合、１つの細胞はＣｌｄＵおよびＩｄＵに関して陽性であり、１つの細胞はＩｄＵのみに陽性で、そして１つの細胞はＣｌｄＵおよびＩｄＵの両方に関して陰性であった（図５９Ｂ）。後者細胞は老いたＤＮＡを保有したが、一方、他の２つの細胞は新ＤＮＡを含有した。
【０１７４】
Ｃ．  不死ＤＮＡを保有するｈＣＳＣはより大きい増殖余力を有する
老いたＤＮＡを保有する幹細胞の増殖余力が理論的に新規合成ＤＮＡのみを受け継いでいる幹細胞の余力より優れている、という仮定に基づいて、これら２つのクラスのｈＣＳＣに由来するクローン子孫のサイズおよび年齢を確定した。この定量的分析を７例の患者で実行し、染色分体の非無作為分離により生成される１０５クローン、ならびに無作為分離により形成される１３５クローンを包含した。最初の７日の間、最大３００細胞／クローンからなる発達中のクローンを分析した。老いたＤＮＡを有するｈＣＳＣにより生成されるクローン中に存在する細胞の数は、新ＤＮＡを有するｈＣＳＣにより生成されるクローンで見出されるものより１．６倍多かった（図６０Ａ〜ＤおよびＦ）。非無作為染色分体分離により分裂するｈＣＳＣで観察された細胞生成速度増強は、この細胞プールの２３％短い集団倍加時間と一致した（図６０Ｅ）。重要なことは、クローンのサイズの差が時間に伴って増大した、ということである。１２日目に、老いたＤＮＡを有するｈＣＳＣは、新ＤＮＡを保有するｈＣＳＣで得られるものより２．２倍大きいクローンを形成した。不死ＤＮＡを保有するｈＣＳＣにより発達したクローンは多数回の分裂を経たが、３つのｐ１６ＩＮＫ４ａ陽性細胞のみが、１０５クローンで検出された。逆に、ｐ１６ＩＮＫ４ａ標識化は、無作為染色分体分離を伴うｈＣＳＣの複製により生成されるクローン細胞の２％を占めた（図６０Ｈ）。単一ＢｒｄＵ標識化「親」ｈＣＳＣは〜１０，０００個のｃ−ｋｉｔ陽性細胞のクローンを生じたが、この場合、１つの細胞のみがＢｒｄＵ陽性であった（図６１）。
【０１７５】
Ｑ−ＦＩＳＨにより測定されるテロメア長は、老いたおよび新ＤＮＡを保有するｈＣＳＣ由来の細胞において、それぞれ７〜１０ｋｂｐから２．０〜９ｋｂｐまで変化した、ということは重要である。両ｈＣＳＣクラスにおいて、テロメア長は心臓の年齢と反比例の関係を有した。さらに、すべての細胞がｐ１６ＩＮＫ４ａを発現した３０個以下の細胞からなる小コロニー／クローンは、新ＤＮＡを有するｈＣＳＣの分裂に限定された；４０のこのような例が、１２０４の生成クローンにおいて認められた。老いたＤＮＡを有するｈＣＳＣの複製から得られた１０５例において、老化クローンは見出されなかった。老いたＤＮＡを有するｈＣＳＣにより生成されるクローンは、有意に大きく、すべてｐ１６ＩＮＫ４ａ陰性で、ＩＧＦ−１受容体を発現するクローン細胞で構成された。逆に、新ＤＮＡを有するｈＣＳＣにより形成されるクローンのうちのいくつかは非常に小さく、時折、クローン細胞は均一にｐ１６ＩＮＫ４ａ陽性で、ＩＧＦ−１受容体を欠いた。したがって、不死ＤＮＡを保有するｈＣＳＣは、高度の増殖余力を有する強力な始原細胞のプールを構成する。
【０１７６】
Ｄ．  ｈＣＳＣの線状および指数増殖
上で考察した知見は、いくつかの挑戦的問題を提起した。不死ＤＮＡを保有するｈＣＳＣにより予期されるべき線状増殖、ならびに新規合成ＤＮＡを有するｈＣＳＣが経験する指数増殖は、これらの細胞部類により形成されるクローンのサイズと一致しなかった。実際、反対の結果が得られた。当該過程の早期に、より少数のクローン細胞が老いたＤＮＡを有するｈＣＳＣにより生成されるはずであり、その後、新規合成ＤＮＡのみを含有する娘細胞は増殖停止に入らなかったが、しかし指数的に増殖する子孫を作った。クローン検定のためのｈＣＳＣのプレート化後７および１２日目に収集されたデータに基づいて、両方の型のクローンが等しいサイズになったと基をコンピューター計算して、４日であることが判明した。したがって、不死ＤＮＡを保有するｈＣＳＣの増殖パターンの変化は、４日の期間に亘って起こるはずであった。老いたＤＮＡを有するｈＣＳＣの線状拡張が、植えつけの〜２６−３０時間後に、ＣｌｄＵ標識化「親」細胞の最初の分裂中に保存される、ということをわれわれの以前の実験は示唆したが、これは、細胞分裂におけるシフト、すなわち線状増殖から指数増殖への臨界間隔として２および３日を指し示している。
【０１７７】
老いたおよび新ＤＮＡを有するｈＣＳＣを起源とするクローンにおける細胞増殖の機序を特性化するために、各幹細胞により発達する細胞の数を時間の一関数として確定した。植え付けの４日後、両細胞クラスは指数増殖を示したが、しかし細胞複製速度は、不死ＤＮＡを保有するｈＣＳＣ由来のクローンにおいてより高かった。データを対数スケールでプロットした場合、その線は、４日目に交差する指数的および線状セグメントを有した。
【０１７８】
クローンを作り、プレート化後２、３および６日目のクローン細胞の特性を確定して、それらの運命：細胞周期停止、線状増殖および指数増殖を確立した。ＣｌｄＵ標識化「親」ｈＣＳＣを、Terasakiプレートの単一ウェル中に植えつけた。２４時間後、各植える中に２つの細胞が認められた時に、ＩｄＵを２４時間付加した。次いで、クローンを６日まで拡張させた。染色分体の無作為分離により分裂するｈＣＳＣにより作られるクローン細胞は、２、３および６日目に同一パターンを示した；クローン内の全細胞がＣｌｄＵおよびＩｄＵに関して陽性であった。さらに、これらの細胞は、細胞周期阻害薬ｐ５３に関して陰性で、細胞周期タンパク質Ｋｉ６７およびＭＣＭ５に関して陽性であったが、これは、指数増殖を実証している。造血系と同様にして、ｐ５３を細胞静止のマーカーとして用いた（Liu et al. (2009) Cell. Stem. Cell, Vol. 4: 37-48; van Os et al. (2009) Cell. Stem. Cell, Vol. 4:7-8）。Ｋｉ６７とＭＣＭ５の組合せを用いたが、それは、これらのタンパク質が細胞周期の種々の期を一緒に担当するためであった（Scholzen and Gerdes (2000) J. Cell. Physiol., Vol. 182: 311-322; Bell and Dutta (2000) Annu. Rev. Biochem., Vol. 71: 333-374）。
【０１７９】
染色分体の非無作為分離により分裂するｈＣＳＣから得られるクローンにおいて、複雑なパターンの細胞行動が見出された。２日目に、クローンは、３つの細胞で構成された：＠不死ＤＮＡを保有する細胞はＣｌｄＵおよびｐ５３に関して陰性であったが、しかしＩｄＵを含有し、Ｋｉ６７−ＭＣＭ５を発現した；他の２つの細胞は、ｐ５３に関して陽性で、ＣｌｄＵまたはＩｄＵにより標識された。３日目に、クローンは４つの細胞で構成された：老いたＤＮＡを有する細胞は、ＣｌｄＵ、ＩｄＵおよびｐ５３に関して陰性であったが、しかしＫｉ６７−ＭＣＭ５を発現した；２つの細胞は、ｐ５３に陽性で、ＣｌｄＵまたはＩｄＵにより標識された；そして１つの細胞は、ＣｌｄＵおよびｐ５３に関して陰性であったが、しかしＩｄＵおよびＫｉ６７−ＭＣＭ５に関して陽性であった。この細胞は、静止状態に入らず、指数的に増殖し始めたＩｄＵ陽性「母」幹細胞の分裂により生成される娘細胞を反映した。実際、６日目に、クローンは１４の細胞で構成された：指数的拡張集団を表す８つの細胞は、希釈ＩｄＵ標識化を示し、ｐ５３に関して陰性で、Ｋｉ６７−ＭＣＭ５に関して陽性であった；２つの細胞はｐ５３を発現し、ＣｌｄＵまたはＩｄＵ陽性であった；３つの細胞は、ＣｌｄＵ、ＩｄＵおよびＫｉ６７−ＭＣＭ５に関して陰性であったが、しかしｐ５３を発現した；そして最後に、不死ＤＮＡを保有する１つの細胞はＫｉ６７−ＭＣＭ５陽性で、ＣｌｄＵ、ＩｄＵおよびｐ５３に関して陰性であった。したがって、これらのクローンは、不死ＤＮＡを保有するｈＣＳＣの線状増殖、ならびに新規合成ＤＮＡを保有する１つのｈＣＳＣの指数増殖の結果であったが、これらは第３分裂後、増殖抑制を免れた。
【０１８０】
大型クローンは、１２日目に、類似の行動を保持した。Ｋｉ６７は、大多数のクローン子孫の生成に関与する新ＤＮＡを有するサイクリング細胞を同定した。Ｋｉ６７−ＭＣＭ５陰性細胞は、ｐ５３を発現し、増殖停止に入る老いたＤＮＡを有するｈＣＳＣの線状増殖由来のクローン細胞を構成した。ｐ５３がＫｉ６７−ＭＣＭ５に関して陰性であるすべての静止細胞において検出され、新規合成ＤＮＡを含有する細胞における増殖停止の機序としてのこの腫瘍サプレッサーを指し示しているということは重要である。ｐ５３陽性ｈＣＳＣは、非相同末端結合媒介性ＤＮＡ修復のマーカーである５３ＢＰ１およびＲａｄ５１を発現した（Huertas (2010) Nat. Struct. Mol. Biol., Vol. 17:11-16）が、これは、新規ＤＮＡを保有する非分裂中娘細胞が、誤りがちなＤＮＡ修復応答を活性化することによりＤＮＡ損傷と反応した、ということを示唆している（Mohrin et al. (2010) Cell. Stem. Cell., Vol. 7: 174-185）。５３ＢＰ１およびＲａｄ５１は、新ＤＮＡを有するｈＣＳＣ由来のクローンにおいて指数的に増殖する細胞中で検出されなかった。総体的に、これらの観察は、幹細胞自己複製の不死鎖仮説がヒト心臓の始原細胞の一クラスにおいて有効である、ということを示唆している。
【０１８１】
Ｅ．  非対称的染色分体分離により分裂するｈＣＳＣにより生成される子孫
幹細胞分裂中の染色分体の非無作為分離が、古いＤＮＡを有する娘幹細胞ならびに新ＤＮＡを有する娘「委任」細胞の形成を必然的に生じる（Cairns (1975); Potten et al. (2002); Falconer et al. (2010); Karpowicz  et al. (2005); Rando (2007)）という認識は、議論の余地がある。このパターンの細胞増殖は、対称的細胞分裂、ならびに幹細胞がそれらのプールを迅速に拡張し、あるいは２つの娘幹細胞または２つの娘分化細胞の生成により大型子孫を作るという可能性を除外する（Morrison and Kimble (2006) Nature, Vol. 441:1068-1074）。したがって、老いたＤＮＡを含有する単一ｈＣＳＣにより形成されるクローンが実際に１つだけの真の幹細胞（老いたＤＮＡ）および委任細胞（新ＤＮＡ）のクラスターにより構成されるか否かを確定した。これらの細胞小集団におけるＢｒｄＵ標識化の非存在または存在を確立するために、クローン細胞の小アリコートを検査した；非無作為ＤＮＡ鋳型分離由来のクローンは、ＢｒｄＵ陽性細胞を全く含有しないかまたは多くても１つ含有し、そして無作為ＤＮＡ鋳型分離により形成されるクローンはすべてＢｒｄＵ陽性細胞で構成された。
【０１８２】
次に、ＦＡＣＳにより両クラスのクローン原性細胞を分析し、転写因子ならびに筋細胞、ＥＣおよびＳＭＣに特異的な細胞質タンパク質を、１％未満で発現することが判明した。これらの結果は、非無作為であっても無作為であってもＤＮＡ鋳型分離により分裂したｈＣＳＣ由来の新ＤＮＡを含有するクローン原性細胞の系列委任を除外する傾向がある。非無作為染色分体分離により分裂したｈＣＳＣにより形成されるクローン細胞の免疫標識により、同様のデータを収集した；全クローン細胞が、Ｎｋｘ２．５およびＧＡＴＡ４に関しておおむね陰性であった。これらのデータは、ｈＣＳＣの分裂中の染色分体の非対称分離が委任子孫を生成せず、非対称幹細胞分裂と同等とみなされず、しかしむしろ対称幹細胞分裂と同等であり得る、ということを示唆している。
【０１８３】
この見解をさらに支持するために、クローン細胞をサブクローニングして、細胞分裂中の非対称染色分体分離の役割の付加的特性化を獲得した。さらにまた、ビルド標識化親ｈＣＳＣ由来のクローンを、ビルドに関するクローン細胞の小アリコートを染色することにより同定した。ハロゲン化ヌクレオチドに関する陽性細胞の非存在は、非無作為ＤＮＡ鋳型分離からのクローン細胞の生成、ならびにサブクローン分析のための適切な試料を示すと考えられる。したがって、ＢｒｄＵ陰性クローン細胞を、限界希釈で沈着させて、細胞付着後、ＢｒｄＵを〜２６時間（細胞周囲の長さ）の期間中付加して、すべてのサイクリング細胞を標識した；次いで、ＢｒｄＵを除去した。単一ＢｒｄＵ陽性細胞を有するサブクローンを１つだけ得たが、一方、他のサブクローンはすべて、非分化ＢｒｄＵ標識化細胞で構成された。したがって、非無作為染色分体分離は、一方はおいたＤＮＡを有し、他方は新ＤＮＡを有する２つの娘幹細胞の形成に伴う対称幹細胞分裂を反映した。
【０１８４】
ＤＮＡ分離の有糸分裂非対称は、紡錘体機構の構成成分により状態調節され得る（Neumueller and Knoblich (2009) Genes. Dev., Vol. 23: 2675-2699）。分裂中の細胞は、老いた動原体または中心小体（これらは「母」細胞により受け継がれ得る）を、不死ＤＮＡ鎖と一緒に認識し得る（Shinin et al. (2006) Nat. Cell. Biol., Vol. 8: 677-687）。有糸分裂紡錘体は、動的微小管および有糸分裂モーターを用いて、染色体の「探索および捕捉」、ならびにそれらのアラインメントおよび分離を引き起こす動きを駆動する（Brunet and Vernos (2001) EMBO. Rep., Vol. 2: 669-673）。ｈＣＳＣにおける染色分体の偏向的分離の分子的基礎を理解するために、左右ダイニンモータータンパク質（ＬＲＤ）を試験した（Armakolas and Klar (2007) Science, Vol. 315:100-101）。ＬＲＤ遺伝子の突然変異は胚性左右身体軸非対称をもたらし、この現象は、細胞分裂の様式の変更により媒介される（Sapienza (2007) Science, Vol. 315: 46-47）。したがって、ＢｒｄＵ標識化ｈＣＳＣを、ＬＲＤおよびＥＧＦＰに関するｓｉＲＮＡを含有するプラスミドでトランスフェクト氏、ＥＧＦＰに関してＦＡＣＳ分類して、限界希釈でプレート化した。対照ｈＣＳＣにスクランブルｓｉＲＮＡで形質導入し、正常レベルのＬＲＤを発現させた。対照ｈＣＳＣにより生成されるクローンのほぼ５％が、単一ＢｒｄＵ明細胞を示したが、これは、始祖細胞の非対称染色分体分離により分離する予測数のｈＣＳＣを反映している。これに対比して、始祖ｈＣＳＣにおけるＬＲＤの下方調節は、対称染色分体分離により専ら形成されるクローンを生じるが、これは、ＬＲＤが染色分体の非対称分離に関与する因子の１つであり得る、ということを示唆している。
【０１８５】
Ｆ．  梗塞後の心筋再生
老いたおよび新しいＤＮＡを有するｈＣＳＣの臨床的移入を実証するために、考察されたアプローチは、今までのところ用いられ得なかった。梗塞心臓にin vivoで送達されるべき、両クラスの、有意数の生きているｈＣＳＣの同定および収集を可能にするプロトコールを開発しなければならなかった。この新規の戦略は、複製中のｈＣＳＣのＤＮＡ中に組み込まれるＢｒｄＵとＤＮＡ染料の蛍光強度との間の相互作用を利用する（Crissman et al. (1994) Methods. Cell. Biol., Vol. 41: 341-349; Rampal et al. (1997) J. Chromatogr. A., Vol. 781: 357-365）。単量体シアニン核酸染色  ＴＯ−ＰＲＯ−３は二本鎖ＤＮＡ中に介在し、ＢｒｄＵ−アデノシン対に隣接して位置する場合、蛍光のＴＯ−ＰＲＯ−３固有レベルが劇的に増大される（Rampal et al. (1997); Beisker et al. (1999) Cytometry, Vol. 37: 221-229）。これは、非介在染料、すなわちヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いる場合は起きないが、それは、その蛍光効率が隣接ヌクレオチドと無関係であるためである（Crissman et al. (1994)）。ＤＮＡがＰＩおよびＴＯ−ＰＲＯ−３の両方によって標識される場合、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が起こる（Beisker et al. (1999); Chan and Holmes (2004) Methods Mol. Biol., Vol. 263: 281-292; Van Wageningen et al. (2006) Cytometry A., Vol. 69: 291-298）。これは、老いたおよび新しいＤＮＡを有する生きているｈＣＳＣのＦＡＣＳ分類、すなわち、ＢｒｄＵ陰性細胞（老いたＤＮＡ）からのＢｒｄＵ陽性細胞（新しいＤＮＡ）の分離のための基礎を形成した。
【０１８６】
ＦＲＥＴに及ぼすＢｒｄＵ取込みの影響を確定するために、ｈＣＳＣをＢｒｄＵに〜５−６集団倍加の間曝露して、ほぼ１００％のＢｒｄＵ標識化を達成した。次いで、ＢｒｄＵ陽性ｈＣＳＣを、ＰＩおよびＴＯ−ＰＲＯ−３の両方で標識した。ＢｒｄＵの存在は、ＰＩスペクトルの振幅の減少を、ならびにＴＯ−ＰＲＯ−３シグナルの増大をもたらした。母ＤＮＡを有するｈＣＳＣを分裂させて、新規合成ＢｒｄＵ標識化ＤＮＡを娘細胞の１つに移させる３６時間の追跡期間後、ＢｒｄＵ陽性およびＢｒｄＵ陰性ｈＣＳＣをＦＡＣＳ分類して、５日間別々に培養し、それらの集団倍加時間（ＰＤＴ）を確定した；老いたＤＮＡを有するｈＣＳＣは、前に示したように、高増殖率と一致するより短いＰＤＴを有した。
【０１８７】
「母」ＤＮＡを有するｈＣＳＣにより生成される子孫のin vitroでの増強された増殖能力がin vivoで保存される場合、この細胞クラスは、損傷心臓におけるより強力なレベルの心臓修復を誘導すると予期され得る。したがって、老いたおよび新しいＤＮＡを有するｈＣＳＣの子孫により促進される心筋再生の程度を、免疫抑圧ラットにおける梗塞後に確定した（Bearzi et al. (2007); Bearzi et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 106: 15885-15890）。これらのin vivo試験において、２つの部類のｈＣＳＣを、上記のＦＡＣＳ−ＦＲＥＴプロトコールにより調製し、それらのその後の追跡のためにＥＧＦＰレンチウイルスに感染させた。冠動脈閉塞および細胞送達の１０日後に、老いたおよび新しいＤＮＡを有するｈＣＳＣの子孫の治療効力に、有意差が認められた。前者の細胞型は、優等度の組織再構成を生じた；梗塞は、この部類のｈＣＳＣの増殖および分化によりほぼ完全に取り替えられた（修復応答は従来観察されていなかった）（Bearzi et al. (2007); Beltrami et al. (2003) Cell, Vol. 114: 763-776; Urbanek et al. (2005) Circ. Res., Vol. 97: 663-673; Padin-Iruegas et al. (2009) Circulation, Vol. 876-887  7, 39-42）。壁肥厚、精製された筋細胞の数、および細胞複製の程度は、「母」ＤＮＡを有するｈＣＳＣの子孫に関しては全て高かったが、但し、筋細胞のサイズは、両群の梗塞動物の場合と同様であった。新規形成筋細胞はコネキシン４３およびＮ−カドヘリンを発現し、筋細胞膜した領域における筋節横紋を示した。再生された小動脈および毛細管の数も、この細胞型に関しては多かった。ヒト起源の再生構造物を、ＡｌｕプローブによるヒトＤＮＡ配列の検出、ならびにスペクトル分析により記録される免疫標識シグナルの特異性により確証した。両ｈＣＳＣ子孫が梗塞心臓の血行力学的性能を改善したが、、しかし不死ＤＮＡを保有するｈＣＳＣ由来の細胞は付加的陽性作用を示した、ということは重要である。収縮期血圧の回復、ならびに陽性および陰性ｄＰ／ｄｔ、そして拡張期ストレスのコンピューター算定値の増大における減衰は、新ＤＮＡを有するｈＣＳＣにより生成される細胞を用いて得られるものより有意に大きかった。
【０１８８】
Ｇ．  考察
この実施例に記載された結果は、ヒト心臓が、分裂中に、老いた鋳型ＤＮＡ鎖を保持する心臓幹細胞の小プールを保有し、そして増殖抑制、ならびに新規合成ＤＮＡを保有する娘細胞における誤りがちなＤＮＡ修復応答の活性化後、それぞれ老いたおよび新規のＤＮＡを保持する２つの娘細胞を生成する、という直接的証拠を提供する。前者は線状増殖を経るが、一方、後者は指数増殖を経験し、心筋において染色分体の選択的分配の非存在下で複製するｈＣＳＣの大型区画の原因であり得る。しかしながら、両ｈＣＳＣクラスは、in vitroおよびin vivoで、非分化、自己複製性およびクローン原性である幹細胞特質を保有する。これらの観察は、John Cairnsにより提唱された幹細胞増殖のモデル、ならびに娘細胞の運命に関するその密接な関係（Cairns (1975)）を、一部のみ支持する。不死鎖仮説によれば、老いたＤＮＡ鋳型を保有する細胞は幹細胞として機能し、器官の幹細胞プールを保存するが、一方、新規合成ＤＮＡ鎖を含有する細胞は系列特異化を受ける。したがって、染色分体の非対称分離は非対称幹細胞分裂と等価とみなされているが、しかしこれは事実ではない。さらに、われわれの従来の知見は、ｈＣＳＣはin vitroおよびin vivoで対称的および非対称的に分裂して、同一のまたは相違する運命を有する娘細胞を生じる、ということを示す（Bearzi et al. (2007); Bearzi et al. (2009)）。ｈＣＳＣ分裂のこれらのパターンは、エンドサイトーシスタンパク質であるｎｕｍｂおよびα−アダプチンの局在化（Zhong (2003) Neuron, Vol. 37: 11-14）ならびにノッチ受容体の機能（Boni et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 105: 15529-15534）に基づいて確定されている。
【０１８９】
幹細胞自己複製のCairnモデルの欠点のいくつかを強調する最新の観察は、各心臓幹細胞ニッチが老いたＤＮＡを保有する優勢な細胞、ならびに新ＤＮＡを含有するＣＳＣのクラスターで構成される。各ニッチ構造内に見出される明るくＢｒｄＵ標識されるＣＳＣ（Urbanek et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 103: 9226-9231）は、その後分裂しなかったＢｒｄＵ標識化祖父母ＣＳＣにほぼ対応する。この認識は、上記のようなマウス心臓のＢｒｄＵ明性ＣＳＣにおけるｐ５３、５３ＢＰ１およびＲａｄ５１の発現の欠如と一致する。無作為染色分体分離により形成されるＣＳＣのみがニッチ区域を出て、機能的適格心筋細胞および血管構造物に分化する。幹細胞増殖のこのパターンは、ニッチ内の祖父母ＣＳＣのプールサイズを保護する。チミジン類似体により明るく標識されるＣＳＣの存在が、低指令細胞の運命を制御する不死ＤＮＡを保有する真の幹細胞を含有する心臓ニッチの認識を可能にする、ということは重要である。
【０１９０】
不死ＤＮＡ鎖を保有するヒトＣＳＣは長いテロメアを有し、非老化性細胞の大きなプールを生じる。この高自己複製能力は、新規合成ＤＮＡのみを保有するｈＣＳＣの増殖を有意に越えて、前者クラスの幹細胞を、損傷後の心筋再生のためのより望ましい始原細胞にする。実際、老いたＤＮＡを有するｈＣＳＣにより生成される子孫は、新ＤＮＡを有するｈＣＳＣにより得られる細胞によって誘導されるものより構造的および機能的に優れている梗塞心筋の回復をもたらした。新規形成心筋細胞および冠動脈血管による壁の全梗塞領域の取替えは、心臓および非心臓始原細胞に関して、以前には観察されなかった。「母」ＤＮＡを保有するｈＣＳＣから開発されたクローン原性細胞により媒介される心室血行力学および解剖学における印象的な回復は、虚血性および非虚血性心不全に関するこの幹細胞部類の臨床的関連性を強調する。
【０１９１】
前記の詳細な説明は理解し易くするために示されただけで、修正は当業者には明らかであるので、本発明は上記の記載内容に限定されると解釈されるべきでない。本明細書中で提供される情報のいずれもが従来技術であるかまたは目下主張される発明に関連するということ、あるいは具体的にまたは無条件に参照される出版物のいずれもが従来技術であるということではない。
【０１９２】
別記しない限り、本明細書中で用いられる技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する当該技術分野の当業者に一般に理解されるものと同一の意味を有する。
【０１９３】
本発明をその具体的実施形態と結びつけて記載してきたが、さらなる修正が可能であると理解されるし、概して、本発明の原理に従って、そして本発明が関連する当該技術分野内で既知のまたは慣例的な実行の範囲内であるような、本明細書中で前記したような本質的特徴に当てはまり得るような、添付の特許請求の範囲に従うような本発明の開示内容からの逸脱を含めて、本発明のあらゆる変形、用途または適用を網羅するよう意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ−Ｂ】
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【図２１Ｃ−Ｅ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２Ａ−Ｂ】
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【図５２Ｃ】
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【図５３Ａ−Ｇ】
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【図５３Ｈ−Ｎ】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６Ａ−Ｄ】
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【図５６Ｅ】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０Ａ−Ｄ】
2013542957.tif 000068
【図６０Ｅ−Ｉ】
2013542957.tif 000069
【図６１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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