(57)【要約】ＬＲＲＫ２に対する試験化合物の影響を細胞系システムにおいて評価するための方法であって、下記の工程：ａ）ＬＲＲＫ２を含む前記細胞系システムを前記試験化合物に暴露することの、前記ＬＲＲＫ２のＳｅｒ９１０および／またはＳｅｒ９３５のリン酸化状態に対する影響を評価する工程；ならびに／あるいはｂ）ＬＲＲＫ２を含む前記細胞系システムを前記試験化合物に暴露することの、１４−３−３ポリペプチドへの前記ＬＲＲＫ２の結合に対する影響を評価する工程を含む方法。前記方法は、ＬＲＲＫ２を含む前記細胞系システムを前記試験化合物に暴露することの、ＬＲＲＫ２の細胞内位置に対する影響を評価する工程を含むか、または、当該工程をさらに含むことができる。前記方法は、インビボシステムを含み、細胞系システムにおいて想定されるＬＲＲＫ２阻害剤の影響を評価することにおいて有効であると考えられる。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＲＲＫ２に対する試験化合物の影響を細胞系システムにおいて評価するための方法であって、下記の工程：
ａ）ＬＲＲＫ２を含む前記細胞系システムを前記試験化合物に暴露することの、前記ＬＲＲＫ２のＳｅｒ９１０および／またはＳｅｒ９３５のリン酸化状態に対する影響を評価する工程；ならびに／あるいは
ｂ）ＬＲＲＫ２を含む前記細胞系システムを前記試験化合物に暴露することの、１４−３−３ポリペプチドへの前記ＬＲＲＫ２の結合に対する影響を評価する工程
を含む方法。
【請求項２】
ＬＲＲＫ２を含む前記細胞系システムを前記試験化合物に暴露することの、ＬＲＲＫ２の細胞内位置に対する影響を評価する工程を含むか、または、当該工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
化合物を、ＬＲＲＫ２に対する阻害効果を細胞系システムにおいて有すると見なされるとして選択する工程をさらに含み、ただし、前記ＬＲＲＫ２のＳｅｒ９１０および／またはＳｅｒ９３５のリン酸化が前記暴露の後で低下するならば、かつ／あるいは、１４−３−３ポリペプチドへの前記ＬＲＲＫ２の結合が前記暴露の後で低下するならば、かつ／あるいは、細胞質プールにおけるＬＲＲＫ２の蓄積が前記暴露の後で低下するならば、試験化合物がそのように選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
Ｓｅｒ９１０のリン酸化が、Ｓｅｒ９１０がリン酸化されるＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体、または、Ｓｅｒ９１０がリン酸化されないＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体を使用して評価される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
Ｓｅｒ９３５のリン酸化が、Ｓｅｒ９３５がリン酸化されるＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体、または、Ｓｅｒ９３５がリン酸化されないＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体を使用して評価される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
１４−３−３ポリペプチドへの前記ＬＲＲＫ２の結合が、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を使用して評価される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞系システムがインビトロ細胞システムである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞系システムがエクスビボ細胞システムである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞系システムがインビボシステムである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＬＲＲＫ２を含む前記細胞系システムが試験動物において前記試験化合物にさらされている、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＬＲＲＫ２のＳｅｒ９１０および／またはＳｅｒ９３５のリン酸化状態を評価すること、ならびに／あるいは、１４−３−３ポリペプチドへの前記ＬＲＲＫ２の結合を評価すること、ならびに／あるいは、細胞質プールにおけるＬＲＲＫ２の蓄積を評価することが、前記試験動物から得られる細胞に対して行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記試験動物から得られる前記細胞が、前記試験動物から血液において得られる細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞系システムが破砕細胞システムである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞系システムがリンパ芽球様細胞系システムである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
Ｓｅｒ９１０がリン酸化されるＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体、または、Ｓｅｒ９３５がリン酸化されるＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体、または、Ｓｅｒ９１０がリン酸化されないＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体、または、Ｓｅｒ９３５がリン酸化されないＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体。
【請求項１６】
１）Ｓｅｒ９１０がリン酸化されるＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体、または、Ｓｅｒ９１０がリン酸化されないＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体；
２）Ｓｅｒ９３５がリン酸化されるＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体、または、Ｓｅｒ９３５がリン酸化されないＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体；
３）１４−３−３ポリペプチド、または、１４−３−３ポリペプチドに対して特異的に結合する抗体；および
４）蛍光標識されたＬＲＲＫ２ポリペプチド、または、蛍光標識されたＬＲＲＫ２をコードするポリヌクレオチド
のうちの２つ以上を含む部分品のキット。
【請求項１７】
１）Ｓｅｒ９１０がリン酸化されるＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体、または、Ｓｅｒ９１０がリン酸化されないＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体；
２）Ｓｅｒ９３５がリン酸化されるＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体、または、Ｓｅｒ９３５がリン酸化されないＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体；
３）１４−３−３ポリペプチド、または、１４−３−３ポリペプチドに対して特異的に結合する抗体；および／あるいは
４）蛍光標識されたＬＲＲＫ２ポリペプチド、または、蛍光標識されたＬＲＲＫ２をコードするポリヌクレオチド
の使用であって、ＬＲＲＫ２に対する試験化合物の影響を細胞系システムにおいて評価するための方法における使用。
【請求項１８】
ＬＲＲＫ２ポリペプチドまたはＬＲＲＫ２ポリヌクレオチド、あるいは、ＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体と、１４−３−３ポリペプチドまたは１４−３−３ポリヌクレオチド、あるいは、１４−３−３ポリペプチドに対して特異的に結合する抗体とを含む精製された調製物または部分品のキット。
【請求項１９】
ＬＲＲＫ２変異体（例えば、パーキンソン病の患者において見出されるＬＲＲＫ２変異体）を特徴づける方法であって、下記の工程：
ａ）前記ＬＲＲＫ２変異体のＳｅｒ９１０および／またはＳｅｒ９３５のリン酸化状態を評価する工程；ならびに／あるいは
ｂ）前記ＬＲＲＫ２変異体の１４−３−３ポリペプチドへの結合能を評価する工程
を含む方法。
【請求項２０】
細胞系システムにおいて発現されるとき、前記ＬＲＲＫ２変異体の細胞内位置を評価する工程を含むか、または、当該工程をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＬＲＲＫ２阻害剤を評価するためのアッセイに関連する。
【背景技術】
【０００２】
ロイシンリッチリピートプロテインキナーゼ−２（ＬＲＲＫ２）をコードする遺伝子内における常染色体優性ミスセンス変異は、ヒトをパーキンソン病にかかりやすくさせる［非特許文献１、２］。ＬＲＲＫ２変異を有する患者は一般に、臨床上の出現および症状が特発性パーキンソン病と区別できないパーキンソン病をおよそ６０歳〜７０歳の年齢で発症する［非特許文献３］。ＬＲＲＫ２における変異が家族性パーキンソン病の４％を占め、散発性パーキンソン病患者の１％において認められる［非特許文献３］。
【０００３】
ＬＲＲＫ２は大きい酵素（２５２７残基）であり、ロイシンリッチリピート（１０１０位〜１２８７位の残基）、ＧＴＰａｓｅドメイン（１３３５位〜１５０４位の残基）、ＣＯＲドメイン（１５１７位〜１８４３位の残基）、セリン／トレオニンプロテインキナーゼドメイン（１８７５位〜２１３２位の残基）およびＷＤ４０反復（２２３１位〜２２７６位の残基）からなる［非特許文献４］。４０を超えるミスセンス変異が報告されている［非特許文献５］。ＬＲＲＫ２のある一群の変異体形態の活性ならびに局在化が、各種多様なアプローチを使用して発現され、また、アッセイされる様々な形態の組換えＬＲＲＫ２を使用して以前の研究では分析されている［非特許文献４、３２］。最も頻繁な変異が、キナーゼドメインのサブドメインのＶＩＩ−ＤＦＧモチーフの中に位置する高度に保存されたＧｌｙ２０１９のＳｅｒ残基へのアミノ酸置換からなり［非特許文献５］、この場合、この置換はＬＲＲＫ２のプロテインキナーゼ活性をおよそ２倍高めている［非特許文献６］。この発見は、ＬＲＲＫ２の阻害剤がパーキンソン病の処置のために有用であるかもしれないことを示唆する。様々な変異体、例えば、ＬＲＲＫ２［Ｒ１４４１Ｃ］およびＬＲＲＫ２［Ｙ１６９９Ｃ］などが、誤って折り畳まれたタンパク質の凝集物からなることが示唆された離散的な細胞質ゾルプールに蓄積することもまた報告された［非特許文献６］。
【０００４】
ＬＲＲＫ２の固有的なプロテインキナーゼ触媒活性が、ペプチド基質（例えば、ＬＲＲＫｔｉｄｅ［非特許文献７］またはＮｉｃｔｉｄｅ［非特許文献８］など）を用いるアッセイでインビトロにおいて容易に測定される（国際公開ＷＯ２００８／１２２７８９および国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ２００９／００２０４７もまた参照のこと）。このことは、阻害剤を特定するためのスクリーニングに着手することを可能にしている。近年の研究では、Ｈ−１１５２と呼ばれる、広範囲に展開されるＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤もまた、ＬＲＲＫ２を類似する効力（１５０ｎＭのＩＣ５０）で阻害したことが示されている［非特許文献８］。多標的チロシンキナーゼ阻害剤のスニチニブ（これはＳｕｔｅｎｔとして上市され、ＳＵ１１２４８としてもまた知られている）は、腎細胞ガンおよび他のガンを処置するために使用されるものであるが、近年、ＬＲＲＫ２を阻害すること（２０ｎＭのＩＣ５０）が明らかにされている［非特許文献８〜１０］。本発明者らはまた、Ｈ−１１５２およびスニチニブがＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］変異体を野生型ＬＲＲＫ２よりも２倍〜４倍強く阻害することを見出している［非特許文献８］。ＬＲＲＫ２キナーゼドメインの分子モデルリングに基づいて、本発明者らは、通常の場合には活性であったが、Ｈ−１１５２に対する感受性が３２分の１であり、かつ、スニチニブに対する感受性が１２分の１であった薬物抵抗性のＬＲＲＫ２［Ａｌａ２０１６Ｔｈｒ］変異体を設計している［非特許文献８］。
【０００５】
ＬＲＲＫ２阻害剤の開発における障害は、これらの化合物の相対的有効性をインビボにおいてどのように評価するかである。これは、ＬＲＲＫ２がどのように調節されるかについて、また、その基質が何であるかについてほとんど知られていないからである。本発明者らは、ＬＲＲＫ２阻害剤を細胞系システムにおいて評価するために使用することができる方法を提供する。本発明者らは、ＬＲＲＫ２キナーゼ活性により、ロイシンリッチリピートドメインに隣接する２つのＮ端側残基（Ｓｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５）のリン酸化が調節され、そして、この場合、これらの残基が、ホスホ−アダプターである１４−３−３タンパク質への結合を媒介することを明らかにする［非特許文献１１］。このことと一致して、Ｈ−１１５２およびスニチニブはＳｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５の脱リン酸化を誘導し、それにより、薬物抵抗性のＬＲＲＫ２［Ａｌａ２０１６Ｔｈｒ］変異体との１４−３−３相互作用ではなく、野生型ＬＲＲＫ２およびＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］との１４−３−３相互作用を破壊した。本発明者らは、１４−３−３結合の破壊により、ＬＲＲＫ２が、ＬＲＲＫ２［Ｒ１４４１Ｃ］変異体およびＬＲＲＫ２［Ｙ１６９９Ｃ］変異体について以前に報告された細胞質プールと外見上は類似する細胞質プール内に蓄積することが誘導されるという証拠を提供する。Ｓｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５のリン酸化または１４−３−３の結合、あるいは、ＬＲＲＫ２の細胞内位置を、ＬＲＲＫ２阻害剤の効力をモニターするために使用することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｚｉｍｐｒｉｃｈ，  Ａ．，  Ｂｉｓｋｕｐ，  Ｓ．，  Ｌｅｉｔｎｅｒ，  Ｐ．，  Ｌｉｃｈｔｎｅｒ，  Ｐ．，  Ｆａｒｒｅｒ，  Ｍ．，  Ｌｉｎｃｏｌｎ，  Ｓ．，  Ｋａｃｈｅｒｇｕｓ，  Ｊ．，  Ｈｕｌｉｈａｎ，  Ｍ．，  Ｕｉｔｔｉ，  Ｒ．  Ｊ．，  Ｃａｌｎｅ，  Ｄ．  Ｂ．，  Ｓｔｏｅｓｓｌ，  Ａ．  Ｊ．，  Ｐｆｅｉｆｆｅｒ，  Ｒ．  Ｆ．，  Ｐａｔｅｎｇｅ，  Ｎ．，  Ｃａｒｂａｊａｌ，  Ｉ．  Ｃ．，  Ｖｉｅｒｅｇｇｅ，  Ｐ．，  Ａｓｍｕｓ，  Ｆ．，  Ｍｕｌｌｅｒ−Ｍｙｈｓｏｋ，  Ｂ．，  Ｄｉｃｋｓｏｎ，  Ｄ．  Ｗ．，  Ｍｅｉｔｉｎｇｅｒ，  Ｔ．，  Ｓｔｒｏｍ，  Ｔ．  Ｍ．，  Ｗｓｚｏｌｅｋ，  Ｚ．  Ｋ．  ａｎｄ  Ｇａｓｓｅｒ，  Ｔ．  （２００４）  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＬＲＲＫ２  ｃａｕｓｅ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ−ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ  ｗｉｔｈ  ｐｌｅｏｍｏｒｐｈｉｃ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．  Ｎｅｕｒｏｎ．  ４４，  ６０１−６０７
【非特許文献２】Ｐａｉｓａｎ−Ｒｕｉｚ，  Ｃ．，  Ｊａｉｎ，  Ｓ．，  Ｅｖａｎｓ，  Ｅ．  Ｗ．，  Ｇｉｌｋｓ，  Ｗ．  Ｐ．，  Ｓｉｍｏｎ，  Ｊ．，  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇ，  Ｍ．，  Ｌｏｐｅｚ  ｄｅ  Ｍｕｎａｉｎ，  Ａ．，  Ａｐａｒｉｃｉｏ，  Ｓ．，  Ｇｉｌ，  Ａ．  Ｍ．，  Ｋｈａｎ，  Ｎ．，  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｊ．，  Ｍａｒｔｉｎｅｚ，  Ｊ．  Ｒ．，  Ｎｉｃｈｏｌｌ，  Ｄ．，  Ｃａｒｒｅｒａ，  Ｉ．  Ｍ．，  Ｐｅｎａ，  Ａ．  Ｓ．，  ｄｅ  Ｓｉｌｖａ，  Ｒ．，  Ｌｅｅｓ，  Ａ．，  Ｍａｒｔｉ−Ｍａｓｓｏ，  Ｊ．  Ｆ．，  Ｐｅｒｅｚ−Ｔｕｒ，  Ｊ．，  Ｗｏｏｄ，  Ｎ．  Ｗ．  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，  Ａ．  Ｂ．  （２００４）  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｔｈａｔ  ｃａｕｓｅ  ＰＡＲＫ８−ｌｉｎｋｅｄ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｎｅｕｒｏｎ．  ４４，  ５９５−６００
【非特許文献３】Ｈｅａｌｙ，  Ｄ．  Ｇ．，  Ｆａｌｃｈｉ，  Ｍ．，  Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ，  Ｓ．  Ｓ．，  Ｂｏｎｉｆａｔｉ，  Ｖ．，  Ｄｕｒｒ，  Ａ．，  Ｂｒｅｓｓｍａｎ，  Ｓ．，  Ｂｒｉｃｅ，  Ａ．，  Ａａｓｌｙ，  Ｊ．，  Ｚａｂｅｔｉａｎ，  Ｃ．  Ｐ．，  Ｇｏｌｄｗｕｒｍ，  Ｓ．，  Ｆｅｒｒｅｉｒａ，  Ｊ．  Ｊ．，  Ｔｏｌｏｓａ，  Ｅ．，  Ｋａｙ，  Ｄ．  Ｍ．，  Ｋｌｅｉｎ，  Ｃ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｄ．  Ｒ．，  Ｍａｒｒａｓ，  Ｃ．，  Ｌａｎｇ，  Ａ．  Ｅ．，  Ｗｓｚｏｌｅｋ，  Ｚ．  Ｋ．，  Ｂｅｒｃｉａｎｏ，  Ｊ．，  Ｓｃｈａｐｉｒａ，  Ａ．  Ｈ．，  Ｌｙｎｃｈ，  Ｔ．，  Ｂｈａｔｉａ，  Ｋ．  Ｐ．，  Ｇａｓｓｅｒ，  Ｔ．，  Ｌｅｅｓ，  Ａ．  Ｊ．  ａｎｄ  Ｗｏｏｄ，  Ｎ．  Ｗ．  （２００８）  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ，  ｇｅｎｏｔｙｐｅ，  ａｎｄ  ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｅｎｅｔｒａｎｃｅ  ｏｆ  ＬＲＲＫ２−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ａ  ｃａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｔｕｄｙ．  Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．  ７，  ５８３−５９０
【非特許文献４】Ｍａｔａ，  Ｉ．  Ｆ．，  Ｗｅｄｅｍｅｙｅｒ，  Ｗ．  Ｊ．，  Ｆａｒｒｅｒ，  Ｍ．  Ｊ．，  Ｔａｙｌｏｒ，  Ｊ．  Ｐ．  ａｎｄ  Ｇａｌｌｏ，  Ｋ．  Ａ．  （２００６）  ＬＲＲＫ２  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２９，  ２８６−２９３
【非特許文献５】Ｂｉｓｋｕｐ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｗｅｓｔ，  Ａ．  Ｂ．  （２００８）  Ｚｅｒｏｉｎｇ  ｉｎ  ｏｎ  ＬＲＲＫ２−ｌｉｎｋｅｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ
【非特許文献６】Ｇｒｅｇｇｉｏ，  Ｅ．  ａｎｄ  Ｃｏｏｋｓｏｎ，  Ｍ．  Ｒ．  （２００９）  Ｌｅｕｃｉｎｅ  Ｒｉｃｈ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｋｉｎａｓｅ  ２  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：  Ｔｈｒｅｅ  Ｑｕｅｓｔｉｏｎｓ．  ＡＳＮ  Ｎｅｕｒｏ．  Ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献７】Ｊａｌｅｅｌ，  Ｍ．，  Ｎｉｃｈｏｌｓ，  Ｒ．  Ｊ．，  Ｄｅａｋ，  Ｍ．，  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  Ｄ．  Ｇ．，  Ｇｉｌｌａｒｄｏｎ，  Ｆ．，  Ｋｎｅｂｅｌ，  Ａ．  ａｎｄ  Ａｌｅｓｓｉ，  Ｄ．  Ｒ．  （２００７）  ＬＲＲＫ２  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｓ  ｍｏｅｓｉｎ  ａｔ  ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ−５５８：  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｏｗ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｍｕｔａｎｔｓ  ａｆｆｅｃｔ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  ４０５，  ３０７−３１７
【非特許文献８】Ｎｉｃｈｏｌｓ，  Ｒ．  Ｊ．，  Ｄｚａｍｋｏ，  Ｎ．，  Ｈｕｔｔｉ，  Ｊ．  Ｅ．，  Ｃａｎｔｌｅｙ，  Ｌ．  Ｃ，  Ｄｅａｋ，  Ｍ．，  Ｍｏｒａｎ，  Ｊ．，  Ｂａｍｂｏｒｏｕｇｈ，  Ｐ．，  Ｒｅｉｔｈ，  Ａ．  Ｄ．  ａｎｄ  Ａｌｅｓｓｉ，  Ｄ．  Ｒ．  （２００９）  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ＬＲＲＫ２，  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  ４２４，  ４７−６０
【非特許文献９】Ｃｏｖｙ，  Ｊ．  Ｐ．  ａｎｄ  Ｇｉａｓｓｏｎ，  Ｂ．  Ｉ．  （２００９）  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｔｈｅ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ  ｋｉｎａｓｅ  ２．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３７８，  ４７３−  ４７７
【非特許文献１０】Ａｎａｎｄ，  Ｖ．  Ｓ．，  Ｒｅｉｃｈｌｉｎｇ，  Ｌ．  Ｊ．，  Ｌｉｐｉｎｓｋｉ，  Ｋ．，  Ｓｔｏｃｈａｊ，  Ｗ．，  Ｄｕａｎ，  Ｗ．，  Ｋｅｌｌｅｈｅｒ，  Ｋ．，  Ｐｕｎｇａｌｉｙａ，  Ｐ．，  Ｂｒｏｗｎ，  Ｅ．  Ｌ，  Ｒｅｉｎｈａｒｔ，  Ｐ．  Ｈ．，  Ｓｏｍｂｅｒｇ，  Ｒ．，  Ｈｉｒｓｔ，  Ｗ．  Ｄ．，  Ｒｉｄｄｌｅ，  Ｓ．  Ｍ．  ａｎｄ  Ｓｔｅｖｅｎ，  Ｐ．  Ｂ．  （２００９）  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ  ｋｉｎａｓｅ  ２  ：  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｎｏｖｅｌ  ａｓｓａｙｓ．  Ｆｅｂｓ  Ｊ．  ２７６，  ４６６−４７８
【非特許文献１１】Ｍａｃｋｉｎｔｏｓｈ，  Ｃ．  （２００４）  Ｄｙｎａｍｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  １４−３−３  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  ３８１  ，  ３２９−３４２
【非特許文献１２】Ｒｅｅｄ，  Ｓ．  Ｅ．，  Ｓｔａｌｅｙ，  Ｅ．  Ｍ．，  Ｍａｙｇｉｎｎｅｓ，  Ｊ．  Ｐ．，  Ｐｉｎｔｅｌ，  Ｄ．  Ｊ．  ａｎｄ  Ｔｕｌｌｉｓ，  Ｇ．  Ｅ．  （２００６）  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｌｉｎｅａｒ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ  ｉｓ  ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｍｅａｎｓ  ｏｆ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  １３８，  ８５−９８
【非特許文献１３】Ｍｏｏｒｈｅａｄ，  Ｇ．，  Ｄｏｕｇｌａｓ，  Ｐ．，  Ｃｏｔｅｌｌｅ，  Ｖ．，  Ｈａｒｔｈｉｌｌ，  Ｊ．，  Ｍｏｒｒｉｃｅ，  Ｎ．，  Ｍｅｅｋ，  Ｓ．，  Ｄｅｉｔｉｎｇ，  Ｕ．，  Ｓｔｉｔｔ，  Ｍ．，  Ｓｃａｒａｂｅｌ，  Ｍ．，  Ａｉｔｋｅｎ，  Ａ．  ａｎｄ  ＭａｃＫｉｎｔｏｓｈ，  Ｃ．  （１９９９）  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  １４−３−３  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １８，  １−１２
【非特許文献１４】Ｗａｎｇ，  Ｌ，  Ｘｉｅ，  Ｃ，  Ｇｒｅｇｇｉｏ，  Ｅ．，  Ｐａｒｉｓｉａｄｏｕ，  Ｌ，  Ｓｈｉｍ，  Ｈ．，  Ｓｕｎ，  Ｌ，  Ｃｈａｎｄｒａｎ，  Ｊ．，  Ｌｉｎ，  Ｘ．，  Ｌａｉ，  Ｃ，  Ｙａｎｇ，  Ｗ．  Ｊ．，  Ｍｏｏｒｅ，  Ｄ．  Ｊ．，  Ｄａｗｓｏｎ，  Ｔ．  Ｍ．，  Ｄａｗｓｏｎ，  Ｖ．  Ｌ．，  Ｃｈｉｏｓｉｓ，  Ｇ．，  Ｃｏｏｋｓｏｎ，  Ｍ．  Ｒ．  ａｎｄ  Ｃａｉ，  Ｈ．  （２００８）  Ｔｈｅ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ９０  ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ  ｋｉｎａｓｅ  ２．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２８，  ３３８４−３３９１
【非特許文献１５】Ｙａｆｆｅ，  Ｍ．  Ｂ．，  Ｒｉｔｔｉｎｇｅｒ，  Ｋ．，  Ｖｏｌｉｎｉａ，  Ｓ．，  Ｃａｒｏｎ，  Ｐ．  Ｒ．，  Ａｉｔｋｅｎ，  Ａ．，  Ｌｅｆｆｅｒｓ，  Ｈ．，  Ｇａｍｂｌｉｎ，  Ｓ．  Ｊ．，  Ｓｍｅｒｄｏｎ，  Ｓ．  Ｊ．  ａｎｄ  Ｃａｎｔｌｅｙ，  Ｌ．  Ｃ．  （１９９７）  Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  １４−３−３：ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．  Ｃｅｌｌ．  ９１，  ９６１−９７１
【非特許文献１６】Ｇｒｅｇｇｉｏ，  Ｅ．，  Ｔａｙｍａｎｓ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｚｈｅｎ，  Ｅ．  Ｙ．，  Ｒｙｄｅｒ，  Ｊ．，  Ｖａｎｃｒａｅｎｅｎｂｒｏｅｃｋ，  Ｒ．，  Ｂｅｉｌｉｎａ，  Ａ．，  Ｓｕｎ，  Ｐ．，  Ｄｅｎｇ，  Ｊ．，  Ｊａｆｆｅ，  Ｈ．，  Ｂａｅｋｅｌａｎｄｔ，  Ｖ．，  Ｍｅｒｃｈａｎｔ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ｃｏｏｋｓｏｎ，  Ｍ．  Ｒ．  （２００９）  Ｔｈｅ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ＬＲＲＫ２  ａｕｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｓ  ｉｔｓ  ＧＴＰａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ  ａｔ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｉｔｅｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３８９，  ４４９−４５４
【非特許文献１７】Ｋａｍｉｋａｗａｊｉ，  Ｓ．，  Ｉｔｏ，  Ｇ．  ａｎｄ  Ｉｗａｔｓｕｂｏ，  Ｔ．  （２００９）  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｕｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ＬＲＲＫ２．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ４８，  １０９６３−１０９７５
【非特許文献１８】Ｇｌｏｅｃｋｎｅｒ，  Ｃ．  Ｊ．，  Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，  Ａ．，  Ｂｏｌｄｔ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ｕｅｆｆｉｎｇ，  Ｍ．  （２００９）  Ｔｈｅ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ＬＲＲＫ２  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ＭＡＰＫＫＫ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｓ  ＭＫＫ３／６  ａｎｄ  ＭＫＫ４／７，  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  １０９，  ９５９−９６８
【非特許文献１９】Ｚａｎｉｖａｎ，  Ｓ．，  Ｇｎａｄ，  Ｆ．，  Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ，  Ｓ．  Ａ．，  Ｇｅｉｇｅｒ，  Ｔ．，  Ｍａｃｅｋ，  Ｂ．，  Ｃｏｘ，  Ｊ．，  Ｆａｓｓｌｅｒ，  Ｒ．  ａｎｄ  Ｍａｎｎ，  Ｍ．  （２００８）  Ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．  Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ７，  ５３１４−５３２６
【非特許文献２０】Ｈａｕｓｓｅｒ，  Ａ．，  Ｌｉｎｋ，  Ｇ．，  Ｈｏｅｎｅ，  Ｍ．，  Ｒｕｓｓｏ，  Ｃ，  Ｓｅｌｃｈｏｗ，  Ｏ．  ａｎｄ  Ｐｆｉｚｅｎｍａｉｅｒ，  Ｋ．  （２００６）  Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  １４−３−３  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ４−ｋｉｎａｓｅ  ＩＩＩ  ｂｅｔａ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｆｒｏｍ  ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｓ  ｌｉｐｉｄ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  １１９，  ３６１３−３６２１
【非特許文献２１】Ｈｕｔｃｈｉｎｓ，  Ｊ．  Ｒ．，  Ｄｉｋｏｖｓｋａｙａ，  Ｄ．  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋｅ，  Ｐ．  Ｒ．  （２００２）  Ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  Ｓ２８７  ｉｎ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  Ｃｄｃ２５Ｃ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−２Ａ  ｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｂｙ  １４−３−３  ｂｉｎｄｉｎｇ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ５２８，  ２６７−２７１
【非特許文献２２】Ｓａｔｏ，  Ｓ．，  Ｃｈｉｂａ，  Ｔ．，  Ｓａｋａｔａ，  Ｅ．，  Ｋａｔｏ，  Ｋ．，  Ｍｉｚｕｎｏ，  Ｙ．，  Ｈａｔｔｏｒｉ，  Ｎ．  ａｎｄ  Ｔａｎａｋａ，  Ｋ．  （２００６）  １４−３−３ｅｔａ  ｉｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｐａｒｋｉｎ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｌｉｇａｓｅ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２５，  ２１１−２２１
【非特許文献２３】Ｏｓｔｒｅｒｏｖａ，  Ｎ．，  Ｐｅｔｒｕｃｅｌｌｉ，  Ｌ．，  Ｆａｒｒｅｒ，  Ｍ．，  Ｍｅｈｔａ，  Ｎ．，  Ｃｈｏｉ，  Ｐ．，  Ｈａｒｄｙ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｗｏｌｏｚｉｎ，  Ｂ．  （１９９９）  ａｌｐｈａ−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｓｈａｒｅｓ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｗｉｔｈ  １４−３−３  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  １９，  ５７８２−５７９１
【非特許文献２４】Ｕｂｌ，  Ａ．，  Ｂｅｒｇ，  Ｄ．，  Ｈｏｌｚｍａｎｎ，  Ｃ，  Ｋｒｕｇｅｒ，  Ｒ．，  Ｂｅｒｇｅｒ，  Ｋ．，  Ａｒｚｂｅｒｇｅｒ，  Ｔ．，  Ｂｏｒｎｅｍａｎｎ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｒｉｅｓｓ，  Ｏ．  （２００２）  １４−３−３  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ａ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ−ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  １４−３−３  ｅｔａ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  １０８，  ３３−３９
【非特許文献２５】Ｙａｃｏｕｂｉａｎ，  Ｔ．  Ａ．，  Ｓｌｏｎｅ，  Ｓ．  Ｒ．，  Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ，  Ａ．  Ｊ．，  Ｈａｍａｍｉｃｈｉ，  Ｓ．，  Ｓｃｈｉｅｌｔｚ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｃａｌｄｗｅｌｌ，  Ｇ．  Ａ．  ａｎｄ  Ｓｔａｎｄａｅｒｔ，  Ｄ．  Ｇ．  （２０１０）  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  １４−３−３  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ．  １  ，  ｅ２
【非特許文献２６】Ｃｈｅｎ，  Ｈ．  Ｋ．，  Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｆｕｎｅｚ，  Ｐ．，  Ａｃｅｖｅｄｏ，  Ｓ．  Ｆ．，  Ｌａｍ，  Ｙ．  Ｃ，  Ｋａｙｔｏｒ，  Ｍ．  Ｄ．，  Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，  Ｍ．  Ｈ．，  Ａｉｔｋｅｎ，  Ａ．，  Ｓｋｏｕｌａｋｉｓ，  Ｅ．  Ｍ．，  Ｏｒｒ，  Ｈ．  Ｔ．，  Ｂｏｔａｓ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｚｏｇｈｂｉ，  Ｈ．  Ｙ．  （２００３）  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｋｔ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ａｔａｘｉｎ−１  ｗｉｔｈ  １４−３−３  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ  ｔｙｐｅ  １．  Ｃｅｌｌ．  １１３，  ４５７−４６８
【非特許文献２７】Ｂｅｒｇ，  Ｄ．，  Ｈｏｌｚｍａｎｎ，  Ｃ．  ａｎｄ  Ｒｉｅｓｓ，  Ｏ．  （２００３）  １４−３−３  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ４，  ７５２−７６２
【非特許文献２８】Ｃｏｘ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｍａｎｎ，  Ｍ．  （２００８）  ＭａｘＱｕａｎｔ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｈｉｇｈ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒａｔｅｓ，  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ  ｐ．ｐ．ｂ．−ｒａｎｇｅ  ｍａｓｓ  ａｃｃｕｒａｃｉｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２６，  １３６７−１３７２
【非特許文献２９】Ｇｏｏｄｍａｎ，  Ｋ．  Ｂ．，  Ｃｕｉ，  Ｈ．，  Ｄｏｗｄｅｌｌ，  Ｓ．  Ｅ．，  Ｇａｉｔａｎｏｐｏｕｌｏｓ，  Ｄ．  Ｅ．，  Ｉｖｙ，  Ｒ．  Ｌ，  Ｓｅｈｏｎ，  Ｃ．  Ａ．，  Ｓｔａｖｅｎｇｅｒ，  Ｒ．  Ａ．，  Ｗａｎｇ，  Ｇ．  Ｚ．，  Ｖｉｅｔ，  Ａ．  Ｑ．，  Ｘｕ，  Ｗ．，  Ｙｅ，  Ｇ．，  Ｓｅｍｕｓ，  Ｓ．  Ｆ．，  Ｅｖａｎｓ，  Ｃ，  Ｆｒｉｅｓ，  Ｈ．  Ｅ．，  Ｊｏｌｉｖｅｔｔｅ，  Ｌ．  Ｊ．，  Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ，  Ｒ．  Ｂ．，  Ｄｕｌ，  Ｅ．，  Ｋｈａｎｄｅｋａｒ，  Ｓ．  Ｓ．，  Ｙｉ，  Ｔ．，  Ｊｕｎｇ，  Ｄ．  Ｋ．，  Ｗｒｉｇｈｔ，  Ｌ．  Ｌ，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｇ．  Ｋ．，  Ｂｅｈｍ，  Ｄ．  Ｊ．，  Ｂｅｎｔｌｅｙ，  Ｒ．，  Ｄｏｅ，  Ｃ．  Ｐ．，  Ｈｕ，  Ｅ．  ａｎｄ  Ｌｅｅ，  Ｄ．  （２００７）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｏｎｅ  ｉｎｄａｚｏｌｅ  ａｍｉｄｅｓ  ａｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｒｈｏ−ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．  ５０，  ６−９
【非特許文献３０】Ｄｕｂｏｉｓ，  Ｆ．，  Ｖａｎｄｅｒｍｏｅｒｅ，  Ｆ．，  Ｇｅｒｎｅｚ，  Ａ．，  Ｍｕｒｐｈｙ，  Ｊ．，  Ｔｏｔｈ，  Ｒ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｓ．，  Ｇｅｒａｇｈｔｙ，  Ｋ．  Ｍ．，  Ｍｏｒｒｉｃｅ，  Ｎ．  Ａ．  ａｎｄ  Ｍａｃｋｉｎｔｏｓｈ，  Ｃ．  （２００９）  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  １４−３−３−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｎｅｗ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｏｆ  ＰＩ  ３−ｋｉｎａｓｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ
【非特許文献３１】Ｍ  Ｍｏｏｒｅ，  Ｂ．  Ｗ．  ａｎｄ  Ｐｅｒｅｚ，  Ｖ．  Ｊ．  （１９６７）  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｒｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｐｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  （Ｆ．Ｄ  Ｃａｒｌｓｏｎ，  ｅｄ）． Ｗｏｏｄ  Ｈｏｌｅ，  ＭＡ；  Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ，  Ｉｎｃ，  ３４３−３５９
【非特許文献３２】Ａｎａｎｄ，  Ｖ．  Ｓ．  ａｎｄ  Ｂｒａｉｔｈｗａｉｔｅ，  Ｓ．  Ｐ．  （２００９）  ＬＲＲＫ２  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．  ＦＥＢＳ  Ｊ．  ２７６，  ６４２８−６４３５
【非特許文献３３】Ａｌｅｇｒｅ−Ａｂａｒｒａｔｅｇｕｉ，  Ｊ．，  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，  Ｈ．，  Ｌｕｆｉｎｏ，  Ｍ．  Ｍ．，  Ｍｕｔｉｈａｃ，  Ｒ．，  Ｖｅｎｄａ，  Ｌ．  Ｌ．，  Ａｎｓｏｒｇｅ，  Ｏ．  ａｎｄ  Ｗａｄｅ−Ｍａｒｔｉｎｓ，  Ｒ．  （２００９）  ＬＲＲＫ２  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｌｏｃａｌｉｚｅｓ  ｔｏ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｍｉｃｒｏｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｏｄｅｌ．  Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．  １８，  ４０２２−４０３４
【非特許文献３４】Ｂａｉｎ，  Ｊ．，  Ｐｌａｔｅｒ，  Ｌ，  Ｅｌｌｉｏｔｔ，  Ｍ．，  Ｓｈｐｉｒｏ，  Ｎ．，  Ｈａｓｔｉｅ，  Ｃ．  Ｊ．，  ＭｃＬａｕｃｈｌａｎ，  Ｈ．，  Ｋｌｅｖｅｒｎｉｃ，  Ｉ．，  Ａｒｔｈｕｒ，  Ｊ．  Ｓ．，  Ａｌｅｓｓｉ，  Ｄ．  Ｒ．  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，  Ｐ．  （２００７）  Ｔｈｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：  ａ  ｆｕｒｔｈｅｒ  ｕｐｄａｔｅ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  ４０８，  ２９７−３１５
【非特許文献３５】Ｇｒｅｇｇｉｏ，  Ｅ．，  Ｊａｉｎ，  Ｓ．，  Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ，  Ａ．，  Ｂａｎｄｏｐａｄｈｙａｙ，  Ｒ．，  Ｌｅｗｉｓ，  Ｐ．，  Ｋａｇａｎｏｖｉｃｈ，  Ａ．，  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇ，  Ｍ．  Ｐ．，  Ｂｅｉｌｉｎａ，  Ａ．，  Ｂｌａｃｋｉｎｔｏｎ，  Ｊ．，  Ｔｈｏｍａｓ，  Ｋ．  Ｊ．，  Ａｈｍａｄ，  Ｒ．，  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｄ．  Ｗ．，  Ｋｅｓａｖａｐａｎｙ，  Ｓ．，  Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，  Ａ．，  Ｌｅｅｓ，  Ａ．，  Ｈａｒｖｅｙ，  Ｒ．  Ｊ．，  Ｈａｒｖｅｙ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ｃｏｏｋｓｏｎ，  Ｍ．  Ｒ．  （２００６）  Ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｏｘｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｍｕｔａｎｔ  ＬＲＲＫ２／ｄａｒｄａｒｉｎ．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓ．  ２３，  ３２９−３４１
【非特許文献３６】Ｓｍｉｔｈ，  Ｗ．  Ｗ．，  Ｐｅｉ，  Ｚ．，  Ｊｉａｎｇ，  Ｈ．，  Ｍｏｏｒｅ，  Ｄ．  Ｊ．，  Ｌｉａｎｇ，  Ｙ．，  Ｗｅｓｔ，  Ａ．  Ｂ．，  Ｄａｗｓｏｎ，  Ｖ．  Ｌ，  Ｄａｗｓｏｎ，  Ｔ．  Ｍ．  ａｎｄ  Ｒｏｓｓ，  Ｃ．  Ａ．  （２００５）  Ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ  ｋｉｎａｓｅ  ２  （ＬＲＲＫ２）  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐａｒｋｉｎ，  ａｎｄ  ｍｕｔａｎｔ  ＬＲＲＫ２  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １０２，  １８６７６−１８６８１
【非特許文献３７】Ｔｏｎｇ，  Ｙ．，  Ｐｉｓａｎｉ，  Ａ．，  Ｍａｒｔｅｌｌａ，  Ｇ．，  Ｋａｒｏｕａｎｉ，  Ｍ．，  Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，  Ｈ．，  Ｐｏｔｈｏｓ，  Ｅ．  Ｎ．  ａｎｄ  Ｓｈｅｎ，  Ｊ．  （２００９）  Ｒ１４４１Ｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＬＲＲＫ２  ｉｍｐａｉｒｓ  ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １０６，  １４６２２−１４６２７
【非特許文献３８】Ｌｅｓａｇｅ，  Ｓ．，  Ｊａｎｉｎ，  Ｓ．，  Ｌｏｈｍａｎｎ，  Ｅ．，  Ｌｅｕｔｅｎｅｇｇｅｒ，  Ａ．  Ｌ．，  Ｌｅｃｌｅｒｅ，  Ｌ．，  Ｖｉａｌｌｅｔ，  Ｆ．，  Ｐｏｌｌａｋ，  Ｐ．，  Ｄｕｒｉｆ，  Ｆ．，  Ｔｈｏｂｏｉｓ，  Ｓ．，  Ｌａｙｅｔ，  Ｖ．，  Ｖｉｄａｉｌｈｅｔ，  Ｍ．，  Ａｇｉｄ，  Ｙ．，  Ｄｕｒｒ，  Ａ．，  Ｂｒｉｃｅ，  Ａ．，  Ｂｏｎｎｅｔ，  Ａ．  Ｍ．，  Ｂｏｒｇ，  Ｍ．，  Ｂｒｏｕｓｓｏｌｌｅ，  Ｅ．，  Ｄａｍｉｅｒ，  Ｐ．，  Ｄｅｓｔｅｅ，  Ａ．，  Ｍａｒｔｉｎｅｚ，  Ｍ．，  Ｐｅｎｅｔ，  Ｃ，  Ｒａｓｃｏ，  Ｏ．，  Ｔｉｓｏｎ，  Ｆ．，  Ｔｒａｎｃｈａｎ，  Ｃ．  ａｎｄ  Ｖｅｒｉｎ，  Ｍ．  （２００７）  ＬＲＲＫ２  ｅｘｏｎ  ４１  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｐｏｒａｄｉｃ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  Ｅｕｒｏｐｅａｎｓ．  Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ．  ６４，  ４２５−４３０
【非特許文献３９】Ｐａｉｓａｎ−Ｒｕｉｚ，  Ｃ，  Ｎａｔｈ，  Ｐ．，  Ｗａｓｈｅｃｋａ，  Ｎ．，  Ｇｉｂｂｓ，  Ｊ．  Ｒ．  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，  Ａ．  Ｂ．  （２００８）  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＬＲＲＫ２  ｉｎ  ｐｕｂｌｉｃｌｙ  ａｖａｉｌａｂｌｅ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｃａｓｅｓ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｎｏｒｍａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ．  Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ．  ２９，  ４８５−４９０
【非特許文献４０】Ｎｉｃｈｏｌｓ，  Ｒ．  Ｊ．，  Ｄｚａｍｋｏ，  Ｎ．，  Ｈｕｔｔｉ，  Ｊ．  Ｅ．，  Ｃａｎｔｌｅｙ，  Ｌ．  Ｃ，  Ｄｅａｋ，  Ｍ．，  Ｍｏｒａｎ，  Ｊ．，  Ｂａｍｂｏｒｏｕｇｈ，  Ｐ．，  Ｒｅｉｔｈ，  Ａ．  Ｄ．  ａｎｄ  Ａｌｅｓｓｉ，  Ｄ．  Ｒ．  （２００９）  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ＬＲＲＫ２，  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  ４２４，  ４７−６０
【非特許文献４１】Ｒａｙｎａｕｄ，  Ｆ．  Ｉ．，  Ｅｃｃｌｅｓ，  Ｓ．  Ａ．，  Ｐａｔｅｌ，  Ｓ．，  Ａｌｉｘ，  Ｓ．，  Ｂｏｘ，  Ｇ．，  Ｃｈｕｃｋｏｗｒｅｅ，  Ｉ．，  Ｆｏｌｋｅｓ，  Ａ．，  Ｇｏｗａｎ，  Ｓ．，  Ｄｅ  Ｈａｖｅｎ  Ｂｒａｎｄｏｎ，  Ａ．，  Ｄｉ  Ｓｔｅｆａｎｏ，  Ｆ．，  Ｈａｙｅｓ，  Ａ．，  Ｈｅｎｌｅｙ，  Ａ．  Ｔ．，  Ｌｅｎｓｕｎ，  Ｌ，  Ｐｅｒｇｌ−Ｗｉｌｓｏｎ，  Ｇ．，  Ｒｏｂｓｏｎ，  Ａ．，  Ｓａｇｈｉｒ，  Ｎ．，  Ｚｈｙｖｏｌｏｕｐ，  Ａ．，  ＭｃＤｏｎａｌｄ，  Ｅ．，  Ｓｈｅｌｄｒａｋｅ，  Ｐ．，  Ｓｈｕｔｔｌｅｗｏｒｔｈ，  Ｓ．，  Ｖａｌｅｎｔｉ，  Ｍ．，  Ｗａｎ，  Ｎ．  Ｃ，  Ｃｌａｒｋｅ，  Ｐ．  Ａ．  ａｎｄ  Ｗｏｒｋｍａｎ，  Ｐ．  （２００９）  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｉｄｅ  ３−ｋｉｎａｓｅｓ：  ｆｒｏｍ  ＰＩ−１０３  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＰＩ−５４０，  ＰＩ−６２０  ｔｏ  ｔｈｅ  ｏｒａｌ  ａｇｅｎｔ  ＧＤＣ−０９４１．  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．  ８，  １７２５−  １７３８
【非特許文献４２】Ｆａｎ，  Ｑ．  Ｗ．，  Ｋｎｉｇｈｔ，  Ｚ．  Ａ．，  Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，  Ｄ．  Ｄ．，  Ｙｕ，  Ｗ．，  Ｍｏｓｔｏｖ，  Ｋ．  Ｅ．，  Ｓｔｏｋｏｅ，  Ｄ．，  Ｓｈｏｋａｔ，  Ｋ．  Ｍ．  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ，  Ｗ．  Ａ．  （２００６）  Ａ  ｄｕａｌ  ＰＩ３  ｋｉｎａｓｅ／ｍＴＯＲ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｅｍｅｒｇｅｎｔ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｉｎ  ｇｌｉｏｍａ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．  ９，  ３４１−３４９
【非特許文献４３】Ｆｅｌｄｍａｎ，  Ｒ．  Ｉ．，  Ｗｕ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｐｏｌｏｋｏｆｆ，  Ｍ．  Ａ．，  Ｋｏｃｈａｎｎｙ，  Ｍ．  Ｊ．，  Ｄｉｎｔｅｒ，  Ｈ．，  Ｚｈｕ，  Ｄ．，  Ｂｉｒｏｃ，  Ｓ．  Ｌ．，  Ａｌｉｃｋｅ，  Ｂ．，  Ｂｒｙａｎｔ，  Ｊ．，  Ｙｕａｎ，  Ｓ．，  Ｂｕｃｋｍａｎ，  Ｂ．  Ｏ．，  Ｌｅｎｔｚ，  Ｄ．，  Ｆｅｒｒｅｒ，  Ｍ．，  Ｗｈｉｔｌｏｗ，  Ｍ．，  Ａｄｌｅｒ，  Ｍ．，  Ｆｉｎｓｔｅｒ，  Ｓ．，  Ｃｈａｎｇ，  Ｚ．  ａｎｄ  Ａｒｎａｉｚ，  Ｄ．  Ｏ．  （２００５）  Ｎｏｖｅｌ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ３−ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ−１．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２８０，  １９８６７−１９８７４
【非特許文献４４】Ｌｏｇｉｅ，  Ｌ，  Ｒｕｉｚ−Ａｌｃａｒａｚ，  Ａ．  Ｊ．，  Ｋｅａｎｅ，  Ｍ．，  Ｗｏｏｄｓ，  Ｙ．  Ｌ，  Ｂａｉｎ，  Ｊ．，  Ｍａｒｑｕｅｚ，  Ｒ．，  Ａｌｅｓｓｉ，  Ｄ．  Ｒ．  ａｎｄ  Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，  Ｃ．  （２００７）  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｂ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｌｉｖｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ．  ５６，  ２２１８−２２２７
【非特許文献４５】Ｇａｒｃｉａ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｍｏｒａｎ，  Ｊ．，  Ｃｌａｒｋｅ，  Ｒ．  Ｇ．，  Ｇｒａｙ，  Ａ．，  Ｃｏｓｕｌｉｃｈ，  Ｓ．  Ｃ，  Ｃｈｒｅｓｔａ，  Ｃ．  Ｍ．  ａｎｄ  Ａｌｅｓｓｉ，  Ｄ．  Ｒ．  （２００９）  Ｋｕ−００６３７９４  ｉｓ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ  （ｍＴＯＲ）．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  ４２１，  ２９−４２
【非特許文献４６】Ｒｉｎｇ，  Ｄ．  Ｂ．，  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｋ．  Ｗ．，  Ｈｅｎｒｉｋｓｅｎ，  Ｅ．  Ｊ．，  Ｎｕｓｓ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｇｏｆｆ，  Ｄ．，  Ｋｉｎｎｉｃｋ，  Ｔ．  Ｒ．，  Ｍａ，  Ｓ．  Ｔ．，  Ｒｅｅｄｅｒ，  Ｊ．  Ｗ．，  Ｓａｍｕｅｌｓ，  Ｉ．，  Ｓｌａｂｉａｋ，  Ｔ．，  Ｗａｇｍａｎ，  Ａ．  Ｓ．，  Ｈａｍｍｏｎｄ，  Ｍ．  Ｅ．  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ，  Ｓ．  Ｄ．  （２００３）  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ａｎｄ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ．  ５２，  ５８８−５９５
【非特許文献４７】Ｗｉｌｈｅｌｍ，  Ｓ．  Ｍ．，  Ｃａｒｔｅｒ，  Ｃ，  Ｔａｎｇ，  Ｌ，  Ｗｉｌｋｉｅ，  Ｄ．，  ＭｃＮａｂｏｌａ，  Ａ．，  Ｒｏｎｇ，  Ｈ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｃ，  Ｚｈａｎｇ，  Ｘ．，  Ｖｉｎｃｅｎｔ，  Ｐ．，  ＭｃＨｕｇｈ，  Ｍ．，  Ｃａｏ，  Ｙ．，  Ｓｈｕｊａｔｈ，  Ｊ．，  Ｇａｗｌａｋ，  Ｓ．，  Ｅｖｅｌｅｉｇｈ，  Ｄ．，  Ｒｏｗｌｅｙ，  Ｂ．，  Ｌｉｕ，  Ｌ．，  Ａｄｎａｎｅ，  Ｌ，  Ｌｙｎｃｈ，  Ｍ．，  Ａｕｃｌａｉｒ，  Ｄ．，  Ｔａｙｌｏｒ，  Ｉ．，  Ｇｅｄｒｉｃｈ，  Ｒ．，  Ｖｏｚｎｅｓｅｎｓｋｙ，  Ａ．，  Ｒｉｅｄｌ，  Ｂ．，  Ｐｏｓｔ，  Ｌ．  Ｅ．，  Ｂｏｌｌａｇ，  Ｇ．  ａｎｄ  Ｔｒａｉｌ，  Ｐ．  Ａ．  （２００４）  ＢＡＹ  ４３−９００６  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ｂｒｏａｄ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｏｒａｌ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｔｈｅ  ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６４，  ７０９９−７  ０９
【非特許文献４８】Ｂａｒｒｅｔｔ，  Ｓ．  Ｄ．，  Ｂｒｉｄｇｅｓ，  Ａ．  Ｊ．，  Ｄｕｄｌｅｙ，  Ｄ．  Ｔ．，  Ｓａｌｔｉｅｌ，  Ａ．  Ｒ．，  Ｆｅｒｇｕｓ，  Ｊ．  Ｈ．，  Ｆｌａｍｍｅ，  Ｃ．  Ｍ．，  Ｄｅｌａｎｅｙ，  Ａ．  Ｍ．，  Ｋａｕｆｍａｎ，  Ｍ．，  ＬｅＰａｇｅ，  Ｓ．，  Ｌｅｏｐｏｌｄ，  Ｗ．  Ｒ．，  Ｐｒｚｙｂｒａｎｏｗｓｋｉ，  Ｓ．  Ａ．，  Ｓｅｂｏｌｔ−Ｌｅｏｐｏｌｄ，  Ｊ．，  Ｖａｎ  Ｂｅｃｅｌａｅｒｅ，  Ｋ．，  Ｄｏｈｅｒｔｙ，  Ａ．  Ｍ．，  Ｋｅｎｎｅｄｙ，  Ｒ．  Ｍ．，  Ｍａｒｓｔｏｎ，  Ｄ．，  Ｈｏｗａｒｄ，  Ｗ．  Ａ．，  Ｊｒ．，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｙ．，  Ｗａｒｍｕｓ，  Ｊ．  Ｓ．  ａｎｄ  Ｔｅｃｌｅ，  Ｈ．  （２００８）  Ｔｈｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｅｎｚｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅ  ＭＥＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ＣＩ−１０４０  ａｎｄ  ＰＤ  ０３２５９０１．  Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．  １８，  ６５０１−６５０４
【非特許文献４９】Ｓａｐｋｏｔａ，  Ｇ．  Ｐ．，  Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，  Ｌ．，  Ｎｅｗｅｌｌ，  Ｆ．  Ｓ．，  Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，  Ｃ，  Ｂａｉｎ，  Ｊ．，  Ｆｒｏｄｉｎ，  Ｍ．，  Ｇｒａｕｅｒｔ，  Ｍ．，  Ｈｏｆｆｍａｎｎ，  Ｍ．，  Ｓｃｈｎａｐｐ，  Ｇ．，  Ｓｔｅｅｇｍａｉｅｒ，  Ｍ．，  Ｃｏｈｅｎ，  Ｐ．  ａｎｄ  Ａｌｅｓｓｉ，  Ｄ．  Ｒ．  （２００７）  ＢＩ−Ｄ１８７０  ｉｓ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐ９０  ＲＳＫ  （ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｓ６  ｋｉｎａｓｅ）  ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  ４０１，  ２９−３８
【非特許文献５０】Ｐａｒｇｅｌｌｉｓ，  Ｃ，  Ｔｏｎｇ，  Ｌ，  Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ，  Ｌ，  Ｃｉｒｉｌｌｏ，  Ｐ．  Ｆ．，  Ｇｉｌｍｏｒｅ，  Ｔ．，  Ｇｒａｈａｍ，  Ａ．  Ｇ．，  Ｇｒｏｂ，  Ｐ．  Ｍ．，  Ｈｉｃｋｅｙ，  Ｅ．  Ｒ．，  Ｍｏｓｓ，  Ｎ．，  Ｐａｖ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｒｅｇａｎ，  Ｊ．  （２００２）  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ３８  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ｂｙ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ．  Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．  ９，  ２６８−  ２７２
【非特許文献５１】Ｃｕｅｎｄａ，  Ａ．，  Ｒｏｕｓｅ，  Ｊ．，  Ｄｏｚａ，  Ｙ．  Ｎ．，  Ｍｅｉｅｒ，  Ｒ．，  Ｃｏｈｅｎ，  Ｐ．，  Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，  Ｔ．  Ｆ．，  Ｙｏｕｎｇ，  Ｐ．  Ｒ．  ａｎｄ  Ｌｅｅ，  Ｊ．  Ｃ．  （１９９５）  ＳＢ  ２０３５８０  ｉｓ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａ  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ｗｈｉｃｈ  ｉｓ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｔｒｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３６４，  ２２９−２３３
【非特許文献５２】Ｇａｉｌｌａｒｄ，  Ｐ．，  Ｊｅａｎｃｌａｕｄｅ−Ｅｔｔｅｒ，  Ｉ．，  Ａｒｄｉｓｓｏｎｅ，  Ｖ．，  Ａｒｋｉｎｓｔａｌｌ，  Ｓ．，  Ｃａｍｂｅｔ，  Ｙ．，  Ｃａｍｐｓ，  Ｍ．，  Ｃｈａｂｅｒｔ，  Ｃ，  Ｃｈｕｒｃｈ，  Ｄ．，  Ｃｉｒｉｌｌｏ，  Ｒ．，  Ｇｒｅｔｅｎｅｒ，  Ｄ．，  Ｈａｌａｚｙ，  Ｓ．，  Ｎｉｃｈｏｌｓ，  Ａ．，  Ｓｚｙｎｄｒａｌｅｗｉｅｚ，  Ｃ，  Ｖｉｔｔｅ，  Ｐ．  Ａ．  ａｎｄ  Ｇｏｔｔｅｌａｎｄ，  Ｊ．  Ｐ．  （２００５）  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｐｏｔｅｎｔ，  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ，  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｃｔｉｖｅ  （ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｋｉｎａｓｅ．  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．  ４８，  ４５９６−４６０７
【非特許文献５３】Ｂｅｎｎｅｔｔ，  Ｂ．  Ｌ，  Ｓａｓａｋｉ，  Ｄ．  Ｔ．，  Ｍｕｒｒａｙ，  Ｂ．  Ｗ．，  Ｏ’Ｌｅａｒｙ，  Ｅ．  Ｃ，  Ｓａｋａｔａ，  Ｓ．  Ｔ．，  Ｘｕ，  Ｗ．，  Ｌｅｉｓｔｅｎ，  Ｊ．  Ｃ，  Ｍｏｔｉｗａｌａ，  Ａ．，  Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｓ．，  Ｓａｔｏｈ，  Ｙ．，  Ｂｈａｇｗａｔ，  Ｓ．  Ｓ．，  Ｍａｎｎｉｎｇ，  Ａ．  Ｍ．  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｄ．  Ｗ．  （２００１）  ＳＰ６００１２５，  ａｎ  ａｎｔｈｒａｐｙｒａｚｏｌｏｎｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｊｕｎ  Ｎｔｅｒｍｉｎａｌ  ｋｉｎａｓｅ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ９８，  １３６８１−１３６８６
【非特許文献５４】Ｂｕｒｋｅ，  Ｊ．  Ｒ．，  Ｐａｔｔｏｌｉ，  Ｍ．  Ａ．，  Ｇｒｅｇｏｒ，  Ｋ．  Ｒ．，  Ｂｒａｓｓｉｌ，  Ｐ．  Ｊ．，  ＭａｃＭａｓｔｅｒ，  Ｊ．  Ｆ．，  Ｍｃｌｎｔｙｒｅ，  Ｋ．  Ｗ．，  Ｙａｎｇ，  Ｘ．，  ｌｏｔｚｏｖａ，  Ｖ．  Ｓ．，  Ｃｌａｒｋｅ，  Ｗ．，  Ｓｔｒｎａｄ，  Ｊ．，  Ｑｉｕ，  Ｙ．  ａｎｄ  Ｚｕｓｉ，  Ｆ．  Ｃ．  （２００３）  ＢＭＳ−３４５５４１  ｉｓ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｉ  ｋａｐｐａ  Ｂ  ｋｉｎａｓｅ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄｓ  ａｔ  ａｎ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  ｂｌｏｃｋｓ  ＮＦ−ｋａｐｐａ  Ｂ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７８，  １４５０−１４５６
【非特許文献５５】Ｃａｓｔｒｏ，  Ａ．  Ｃ，  Ｄａｎｇ，  Ｌ．  Ｃ，  Ｓｏｕｃｙ，  Ｆ．，  Ｇｒｅｎｉｅｒ，  Ｌ，  Ｍａｚｄｉｙａｓｎｉ，  Ｈ．，  Ｈｏｔｔｅｌｅｔ，  Ｍ．，  Ｐａｒｅｎｔ，  Ｌ，  Ｐｉｅｎ，  Ｃ，  Ｐａｌｏｍｂｅｌｌａ，  Ｖ．  ａｎｄ  Ａｄａｍｓ，  Ｊ．  （２００３）  Ｎｏｖｅｌ  ＩＫＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：  ｂｅｔａ−ｃａｒｂｏｌｉｎｅｓ．  Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．  １３，  ２４１９−２４２２
【非特許文献５６】Ｈｕ，  Ｙ．，  Ｇｒｅｅｎ，  Ｎ．，  Ｇａｖｒｉｎ，  Ｌ．  Ｋ．，  Ｊａｎｚ，  Ｋ．，  Ｋａｉｌａ，  Ｎ．，  Ｌｉ，  Ｈ．  Ｑ．，  Ｔｈｏｍａｓｏｎ，  Ｊ．  Ｒ．，  Ｃｕｏｚｚｏ，  Ｊ．  Ｗ．，  Ｈａｌｌ，  Ｊ．  Ｐ．，  Ｈｓｕ，  Ｓ．，  Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ−Ｎｕｔｔｅｒ，  Ｃ，  Ｔｅｌｌｉｅｚ，  Ｊ．  Ｂ．，  Ｌｉｎ，  Ｌ．  Ｌ．  ａｎｄ  Ｔａｍ，  Ｓ．  （２００６）  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｐｌ２  ｋｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ＴＮＦａｌｐｈａ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ−３−ｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．  Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．  １６，  ６０６７−６０７２
【非特許文献５７】Ｄｅｇｔｅｒｅｖ，  Ａ．，  Ｈｉｔｏｍｉ，  Ｊ．，  Ｇｅｒｍｓｃｈｅｉｄ，  Ｍ．，  Ｃｈ’ｅｎ，  Ｉ．  Ｌ．，  Ｋｏｒｋｉｎａ，  Ｏ．，  Ｔｅｎｇ，  Ｘ．，  Ａｂｂｏｔｔ，  Ｄ．，  Ｃｕｎｙ，  Ｇ．  Ｄ．，  Ｙｕａｎ，  Ｃ，  Ｗａｇｎｅｒ，  Ｇ．，  Ｈｅｄｒｉｃｋ，  Ｓ．  Ｍ．，  Ｇｅｒｂｅｒ，  Ｓ．  Ａ．，  Ｌｕｇｏｖｓｋｏｙ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｙｕａｎ，  Ｊ．  （２００８）  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＩＰ１  ｋｉｎａｓｅ  ａｓ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｎｅｃｒｏｓｔａｔｉｎｓ．Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．  ４，  ３１３−３２１
【非特許文献５８】Ｌｅｅｍｈｕｉｓ，  Ｊ．，  Ｂｏｕｔｉｌｌｉｅｒ，  Ｓ．，  Ｓｃｈｍｉｄｔ，  Ｇ．  ａｎｄ  Ｍｅｙｅｒ，  Ｄ．  Ｋ．  （２００２）  Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｈ８９  ａｃｔｓ  ｏｎ  ｃｅｌｌ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  Ｒｈｏ  ｋｉｎａｓｅ．  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．  ３００，  １０００−１００７
【非特許文献５９】Ｍｕｉｄ，  Ｒ．  Ｅ．，  Ｄａｌｅ，  Ｍ．  Ｍ．，  Ｄａｖｉｓ，  Ｐ．  Ｄ．，  Ｅｌｌｉｏｔｔ，  Ｌ．  Ｈ．，  Ｈｉｌｌ，  Ｃ．  Ｈ．，  Ｋｕｍａｒ，  Ｈ．，  Ｌａｗｔｏｎ，  Ｇ．，  Ｔｗｏｍｅｙ，  Ｂ．  Ｍ．，  Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ，  Ｊ．，  Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，  Ｓ．  Ｅ．  ａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，  Ｒｏ  ３１−８４２５，  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｏｌｕｂｌｅ，  ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  ａｎｄ  ｐｏｓｔ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｔｉｍｕｌｉ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ２９３，  １６９−１７２
【非特許文献６０】Ｇｓｃｈｗｅｎｄｔ，  Ｍ．，  Ｍｕｌｌｅｒ，  Ｈ．  Ｊ．，  Ｋｉｅｌｂａｓｓａ，  Ｋ．，  Ｚａｎｇ，  Ｒ．，  Ｋｉｔｔｓｔｅｉｎ，  Ｗ．，  Ｒｉｎｃｋｅ，  Ｇ．  ａｎｄ  Ｍａｒｋｓ，  Ｆ．  （１９９４）  Ｒｏｔｔｌｅｒｉｎ，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  １９９，  ９３−９８
【非特許文献６１】Ｔｏｋｕｍｉｔｓｕ，  Ｈ．，  Ｉｎｕｚｕｋａ，  Ｈ．，  Ｉｓｈｉｋａｗａ，  Ｙ．  ａｎｄ  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｒ．  （２００３）  Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｂｅｔａ  Ｃａ２＋／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｄｉｃｔａｔｅｓ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，  ＳＴＯ−６０９．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７８，  １０９０８−１０９１３
【非特許文献６２】Ｚｈｏｕ，  Ｇ．，  Ｍｙｅｒｓ，  Ｒ．，  Ｌｉ，  Ｙ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｙ．，  Ｓｈｅｎ，  Ｘ．，  Ｆｅｎｙｋ−Ｍｅｌｏｄｙ，  Ｊ．，  Ｗｕ，  Ｍ．，  Ｖｅｎｔｒｅ，  Ｊ．，  Ｄｏｅｂｂｅｒ，  Ｔ．，  Ｆｕｊｉｉ，  Ｎ．，  Ｍｕｓｉ，  Ｎ．，  Ｈｉｒｓｈｍａｎ，  Ｍ．  Ｆ．，  Ｇｏｏｄｙｅａｒ，  Ｌ．  Ｊ．  ａｎｄ  Ｍｏｌｌｅｒ，  Ｄ．  Ｅ．  （２００１）  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ  ａｃｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０８，  １１６７−１１７４
【非特許文献６３】Ｍｅｙｄａｎ，  Ｎ．，  Ｇｒｕｎｂｅｒｇｅｒ，  Ｔ．，  Ｄａｄｉ，  Ｈ．，  Ｓｈａｈａｒ，  Ｍ．，  Ａｒｐａｉａ，  Ｅ．，  Ｌａｐｉｄｏｔ，  Ｚ．，  Ｌｅｅｄｅｒ，  Ｊ．  Ｓ．，  Ｆｒｅｅｄｍａｎ，  Ｍ．，  Ｃｏｈｅｎ，  Ａ．，  Ｇａｚｉｔ，  Ａ．，  Ｌｅｖｉｔｚｋｉ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｒｏｉｆｍａｎ，  Ｃ．  Ｍ．  （１９９６）  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ  ｂｙ  ａ  Ｊａｋ−２  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ３７９，  ６４５−６４８
【非特許文献６４】Ｈａｎｋｅ，  Ｊ．  Ｈ．，  Ｇａｒｄｎｅｒ，  Ｊ．  Ｐ．，  Ｄｏｗ，  Ｒ．  Ｌ，  Ｃｈａｎｇｅｌｉａｎ，  Ｐ．  Ｓ．，  Ｂｒｉｓｓｅｔｔｅ，  Ｗ．  Ｈ．，  Ｗｅｒｉｎｇｅｒ，  Ｅ．  Ｊ．，  Ｐｏｌｌｏｋ，  Ｂ．  Ａ．  ａｎｄ  Ｃｏｎｎｅｌｌｙ，  Ｐ．  Ａ．  （１９９６）  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ，  ｐｏｔｅｎｔ，  ａｎｄ  Ｓｒｃ  ｆａｍｉｌｙ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｌｃｋ−  ａｎｄ  ＦｙｎＴｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７１，  ６９５−７０１
【非特許文献６５】Ｎａｇａｏ，  Ｍ．，  Ｋａｚｉｒｏ，  Ｙ．  ａｎｄ  Ｉｔｏｈ，  Ｈ．  （１９９９）  Ｔｈｅ  Ｓｒｃ  ｆａｍｉｌｙ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｒｈｏ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｋｉｎａｓｅ  ｂｙ  Ｇａｌｐｈａ１２．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  １８，  ４４２５−４４３４
【非特許文献６６】Ｓｏｎｇ，  Ｙ．，  Ｋｅｓｕｍａ，  Ｄ．，  Ｗａｎｇ，  Ｊ．，  Ｄｅｎｇ，  Ｙ．，  Ｄｕａｎ，  Ｊ．，  Ｗａｎｇ，  Ｊ．  Ｈ．  ａｎｄ  Ｑｉ，  Ｒ．  Ｚ．  （２００４）  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｈａｒｍｉｎｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３１７，  １２８−１３２
【非特許文献６７】Ｍｅｉｊｅｒ，  Ｌ，  Ｂｏｒｇｎｅ，  Ａ．，  Ｍｕｌｎｅｒ，  Ｏ．，  Ｃｈｏｎｇ，  Ｊ．  Ｐ．，  Ｂｌｏｗ，  Ｊ．  Ｊ．，  Ｉｎａｇａｋｉ，  Ｎ．，  Ｉｎａｇａｋｉ，  Ｍ．，  Ｄｅｌｃｒｏｓ，  Ｊ．  Ｇ．  ａｎｄ  Ｍｏｕｌｉｎｏｕｘ，  Ｊ．  Ｐ．  （１９９７）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｒｏｓｃｏｖｉｔｉｎｅ，  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｃｄｃ２，  ｃｄｋ２  ａｎｄ  ｃｄｋ５．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２４３，  ５２７−５３６
【非特許文献６８】Ｂｌａｋｅ，  Ｒ．  Ａ．，  Ｂｒｏｏｍｅ，  Ｍ．  Ａ．，  Ｌｉｕ，  Ｘ．，  Ｗｕ，  Ｊ．，  Ｇｉｓｈｉｚｋｙ，  Ｍ．，  Ｓｕｎ，  Ｌ  ａｎｄ  Ｃｏｕｒｔｎｅｉｄｇｅ，  Ｓ．  Ａ．  （２０００）  ＳＵ６６５６，  ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｒｃ  ｆａｍｉｌｙ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，  ｕｓｅｄ  ｔｏ  ｐｒｏｂｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０，  ９０１８−９０２７
【非特許文献６９】Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ，  Ｅ．  Ａ．，  Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．，  Ｍｏｏｒｅ，  Ｊ．，  Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，  Ｒ．  Ｋ．，  Ａｊｏｓｅ−  Ａｄｅｏｇｕｎ，  Ａ．  Ｏ．，  Ｎａｋａｙａｍａ，  Ｔ．，  Ｇｒａｈａｍ，  Ｊ．  Ａ．，  Ｄｅｍｕｒ，  Ｃ，  Ｈｅｒｃｅｎｄ，  Ｔ．，  Ｄｉｕ−Ｈｅｒｃｅｎｄ，  Ａ．，  Ｓｕ，  Ｍ．，Ｇｏｌｅｃ，  Ｊ．  Ｍ．  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｋ．  Ｍ．  （２００４）  ＶＸ−６８０，  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｕｒｏｒａ  ｋｉｎａｓｅｓ，  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．  １０，  ２６２−２６７
【非特許文献７０】Ｈｏｌｄｅｒ，  Ｓ．，  Ｚｅｍｓｋｏｖａ，  Ｍ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｃ，  Ｔａｂｒｉｚｉｚａｄ，  Ｍ．，  Ｂｒｅｍｅｒ，  Ｒ．，  Ｎｅｉｄｉｇｈ，  Ｊ．  Ｗ．  ａｎｄ  Ｌｉｌｌｙ，  Ｍ．  Ｂ．  （２００７）  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＰＩＭ１  ｋｉｎａｓｅ．  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．  ６，  １６３−１７２
【非特許文献７１】Ｈａｒｄｃａｓｔｌｅ，  Ｉ．  Ｒ．，  Ｃｏｃｋｃｒｏｆｔ，  Ｘ．，  Ｃｕｒｔｉｎ，  Ｎ．  Ｊ．，  Ｅｌ−Ｍｕｒｒ，  Ｍ．  Ｄ．，  Ｌｅａｈｙ，  Ｊ．  Ｊ．，  Ｓｔｏｃｋｌｅｙ，  Ｍ．，  Ｇｏｌｄｉｎｇ，  Ｂ．  Ｔ．，  Ｒｉｇｏｒｅａｕ，  Ｌ．，  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  Ｃ，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｇ．  Ｃ．  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｒ．  Ｊ．  （２００５）  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔ  ｃｈｒｏｍｅｎ−４−ｏｎｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＤＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  （ＤＮＡ−ＰＫ）  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  ａｐｐｒｏａｃｈ．  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．  ４８，  ７８２９−７８４６
【非特許文献７２】Ｓｔｅｅｇｍａｉｅｒ，  Ｍ．，  Ｈｏｆｆｍａｎｎ，  Ｍ．，  Ｂａｕｍ，  Ａ．，  Ｌｅｎａｒｔ，  Ｐ．，  Ｐｅｔｒｏｎｃｚｋｉ，  Ｍ．，  Ｋｒｓｓａｋ，  Ｍ．，  Ｇｕｒｔｌｅｒ，  Ｕ．，  Ｇａｒｉｎ−Ｃｈｅｓａ，  Ｐ．，  Ｌｉｅｂ，  Ｓ．，  Ｑｕａｎｔ，  Ｊ．，  Ｇｒａｕｅｒｔ，  Ｍ．，  Ａｄｏｌｆ，  Ｇ．  Ｒ．，  Ｋｒａｕｔ，  Ｎ．，  Ｐｅｔｅｒｓ，  Ｊ．  Ｍ．  ａｎｄ  Ｒｅｔｔｉｇ，  Ｗ．  Ｊ．  （２００７）  Ｂｌ  ２５３６，  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  １，  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．  １７，  ３１６−３２２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の態様は、ＬＲＲＫ２に対する試験化合物の影響を細胞系システムにおいて評価するための方法であって、下記の工程：
ａ）ＬＲＲＫ２を含む前記細胞系システムを前記試験化合物に暴露することの、前記ＬＲＲＫ２のＳｅｒ９１０および／またはＳｅｒ９３５のリン酸化状態に対する影響を評価する工程；ならびに／あるいは
ｂ）ＬＲＲＫ２を含む前記細胞系システムを前記試験化合物に暴露することの、１４−３−３ポリペプチドへの前記ＬＲＲＫ２の結合に対する影響を評価する工程
を含む方法を提供する。
【０００８】
ある実施形態において、本発明の方法は、ＬＲＲＫ２を含む前記細胞系システムを前記試験化合物に暴露することの、ＬＲＲＫ２の細胞内位置に対する影響を評価する工程を含むか、または、当該工程をさらに含むことができる。
【０００９】
本発明の方法は、さらに、化合物を、ＬＲＲＫ２に対する阻害効果を細胞系システムにおいて有すると見なされるとして選択する工程をさらに含むことができ、ただし、前記ＬＲＲＫ２のＳｅｒ９１０および／またはＳｅｒ９３５のリン酸化が前記暴露の後で低下するならば、かつ／あるいは、１４−３−３ポリペプチドへの前記ＬＲＲＫ２の結合が前記暴露の後で低下するならば、かつ／あるいは、細胞質プールにおけるＬＲＲＫ２の蓄積が前記暴露の後で低下するならば、試験化合物がそのように選択される。
【００１０】
試験化合物は典型的には、例えば、インビトロアッセイを使用して、例えば、ＬＲＲＫｉｔｉｄｅまたはＮｉｃｔｉｄｅをＬＲＲＫ２基質ポリペプチドとして使用するアッセイを使用して、ＬＲＲＫ２の潜在的阻害剤として既に選択されている化合物である場合がある。化合物をＬＲＲＫ２の潜在的阻害剤として選択するために好適なアッセイの例が、例えば、国際公開ＷＯ２００８／１２２７８９および国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ２００９／００２０４７に記載される。
【００１１】
典型的には、Ｓｅｒ９１０のリン酸化が、Ｓｅｒ９１０がリン酸化されるＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体、または、Ｓｅｒ９１０がリン酸化されないＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体を使用して評価される。
【００１２】
典型的には、Ｓｅｒ９３５のリン酸化が、Ｓｅｒ９３５がリン酸化されるＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体、または、Ｓｅｒ９３５がリン酸化されないＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体を使用して評価される。
【００１３】
Ｓｅｒ９１０がリン酸化されるＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体によって、Ｓｅｒ９１０がリン酸化されるＬＲＲＫ２には結合するが、Ｓｅｒ９１０がリン酸化されないＬＲＲＫ２には結合しない抗体、または、他のリン酸化されたセリン残基には結合しない抗体が意味される。同様に、Ｓｅｒ９３５がリン酸化されるＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体は、Ｓｅｒ９３５がリン酸化されないＬＲＲＫ２、または、他のリン酸化されたセリン残基には結合しない。リン酸化されたセリン残基に対して広く結合する抗体は、Ｓｅｒ９１０がリン酸化されるＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体、または、Ｓｅｒ９３５がリン酸化されるＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体ではない。
【００１４】
同様に考慮すべき事項が、Ｓｅｒ９１０がリン酸化されないＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体、または、Ｓｅｒ９３５がリン酸化されないＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体に関連して適用される。Ｓｅｒ９１０がリン酸化されないＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体は、Ｓｅｒ９１０がリン酸化されるＬＲＲＫ２には結合しない。Ｓｅｒ９３５がリン酸化されないＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体は、Ｓｅｒ９３５がリン酸化されるＬＲＲＫ２には結合しない。
【００１５】
そのような抗体を作製および使用する方法は当業者には明らかであるであろう。そのような抗体の実例、ならびに、そのような抗体を作製および使用する方法の実例が実施例に記載される。抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。
【００１６】
一例として、ＥＬＩＳＡ型アッセイが、当業者には広く知られているであろうように、特に有用であり得る。
【００１７】
１４−３−３ポリペプチドへのＬＲＲＫ２の結合を、タンパク質：タンパク質の相互作用を評価するための好適な技術であれば、どのような技術によってでも評価することができる。典型的には、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）技術を、下記でさらに議論されるように、使用することができる。有用であり得る他の技術では、免疫沈殿技術を使用することができる。例えば、免疫沈殿を、当業者には明らかであるであろうように、ＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体を用いて行うことができ、または、１４−３−３ポリペプチドに対して特異的に結合する抗体を用いて行うことができる。１４−３−３ポリペプチドに対して特異的に結合する抗体は当業者には広く知られているであろうし、また、市販されている。代替では、免疫沈殿を、これもまた当業者には明らかであるであろうように、組換えＬＲＲＫ２に存在するタグに対して特異的に結合する抗体を用いて、または、組換え１４−３−３ポリペプチドに存在するタグに対して特異的に結合する抗体を用いて行うことができる。
【００１８】
一例として、１４−３−３コプルダウンまたは（リン酸化状態に依存しない）抗ＬＲＲＫ２抗体のどちらかとカップリングするホスホ／デホスホＬＲＲＫの検出を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＡｌｐｈａ−Ｅｌｉｓａ技術（これは、ハイスループット・スクリーニング・システムを達成することにおいて有用であると思われる）を使用して行うことができると考えられる。Ｌｕｍｉｎｅｘビーズまたはプレート型エレクトロケミルミネセンス（ＭＳＤ；メソスケール発見）検出を使用する多重アッセイもまた使用することができるであろう。
【００１９】
タンパク質：タンパク質およびホスホタンパク質検出の両方に対して適用可能であるＡｌｐｈａスクリーニング技術（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）（ＭＡＰＫ経路、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路およびＡＫＴ経路について開発され、販売されるＳｕｒｅファイヤーキット）の詳細が、例えば、
http://las.perkinelmer.co. uk/Catalog/CategoryPage.htm?CategoryID=AlphaTech&M=BIO
において見出され得る。
【００２０】
ホスホタンパク質の検出ならびにタンパク質：タンパク質および総タンパク質の定量化に対して適用可能であるＬｕｍｉｎｅｘ技術の詳細が、例えば、
http://www.luminexcorp.com/applications/cellular_signaling.html
において見出され得る。
【００２１】
そのような技術の使用の一例が、Ｋｈａｎ  ＩＨ、Ｚｈａｏ  Ｊ．、Ｇｈｏｓｈ、Ｐ．Ｚｉｍａｎ、Ｍ．、Ｓｗｅｅｎｅｙ  Ｃ、Ｋｕｎｇ  ＨＪおよびＬｕｃｉｗ  ＰＡ（２０１０）、Ａｓｓａｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８、２７〜３６に関連して記載される。
【００２２】
ＭＳＤ技術において、プレート表面での捕獲および抗体検出の原理は、どのようなＥＬＩＳＡとも同じであり、しかし、検出様式では、ルテニウムによりタグ標識されたプローブによるエレクトロケミルミネセンスが使用され、そしてまた、この技術は、アレー形式によるウエルでの多重化を可能にする。
http://www.mesoscale.com/CatalogSystemWeb/WebRoot/literature/brochures/pdf/techBrochure.pdf
【００２３】
定量的な、細胞培養でのアミノ酸による安定同位体標識化（ＳＩＬＡＣ）に基づく質量分光法を、ＬＲＲＫ２（または１４−３−３ポリペプチド）の免疫沈殿物と会合するタンパク質を特定および定量するために使用することができる。当業者には広く知られているであろうように、他の免疫沈殿物方法を使用することができる。例えば、ジゴキシゲニン標識された１４−３−３ポリペプチドを使用することができる。そのような方法のいくつかの実例が実施例に記載される。上記で記されるように、タンパク質：タンパク質の相互作用を細胞または細胞抽出物において評価するための他の技術もまた使用することができる。例えば、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）に基づくシステムを、組換えＬＲＲＫ２と、組換え１４−３−３ポリペプチドとの相互作用が評価されているならば、例えば、ＬＲＲＫ２および１４−３−３ポリペプチドの両方がともに蛍光ポリペプチドによりタグ標識されるならば、使用することができる。
【００２４】
したがって、ＬＲＲＫ２と、１４−３−３タンパク質との間における分子相互作用（および、試験化合物の影響）を、ＦＲＥＴに基づく方法を使用して、例えば、顕微鏡（例えば、多光子顕微鏡など）でのＦＬＩＭ−ＦＲＥＴなどを使用して調べることができるであろう。一例として、Ｃｈｅｒｒｙタグ標識された野生型１４−３−３イソ型を発現させるための構築物、または、（コントロールとしてであるが）、ホスホ標的と結合しない、Ｃｈｅｒｒｙタグ標識された１４−３−３イソ型の不活性変異体（例えば、１４−３−３ゼータ［Ｅ１８０Ｋ］など）を発現させるための構築物を、野生型ＧＦＰ−ＬＲＲＫ２を安定的に発現する細胞株に、または、（コントロールとしてであるが）、ＧＦＰ−ＬＲＲＫ２［Ｓ９１０Ａ／Ｓ９３５Ａ］を安定的に発現する細胞株にトランスフェクションすることができる。ＧＦＰ蛍光団と、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光団とが、ＬＲＲＫ２の１４−３−３への結合によって一緒になり、その結果として、それらの蛍光寿命（これが検出され得る）が影響を受けるであろうとき、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）が生じ得る。ＦＬＩＭ（蛍光寿命画像化顕微鏡法）を使用して、本発明者らは、強いタンパク質−タンパク質相互作用（したがって、ＦＲＥＴ）の部位と、相互作用が弱い部位、または、相互作用がない部位とが（カラーコード化によって）認識され得る細胞の空間分布を作製することができる（例えば、Ｌｉｅｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｃｏｍｐａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ＦＬＩＭ−ＦＲＥＴ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００９  Ｎｏｖ  １６；  １８７（４）：４８１−９６．を参照のこと）。ＦＬＩＭ−ＦＲＥＴは、ＧＦＰ−ＬＲＲＫ２［Ｓ９１０Ａ／Ｓ９３５Ａ］と、ｍＣｈｅｒｒｙ−１４−３−３との間、または、野生型ＧＦＰ−ＬＲＲＫ２と、不活性１４−３−３ポリペプチドとの間では観測されないはずである。
【００２５】
一般に使用されるＦＲＥＴ対には、ＣＦＰ（ドナー）およびＹＦＰ（アクセプター）、同様にまた、ＧＦＰ（ドナー）およびＣｈｅｒｒｙ（アクセプター）が含まれる。ドナー蛍光団およびアクセプター蛍光団がともに、同じ励起光波長により励起される場合、例えば、ＧＦＰ−ＹＦＰのＦＲＥＴ対の場合には、強化アクセプター蛍光（ＥＡＦ）と呼ばれる特別な種類のＦＲＥＴを検出することができる。ＦＲＥＴ技術に関するさらなる参考文献の例には、下記が含まれる：
Ｗａｌｌｒａｂｅ  ＆  Ｐｅｒｉａｓａｍｙ  （２００５）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  １６，  Ｉｓｓｕｅ  １，  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００５，  Ｐａｇｅｓ  １９−２７；  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ＦＲＥＴ  ａｎｄ  ＦＬＩＭ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；  Ａｉ  ｅｔ  ａｌ  （２００８）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５，  ４０１−４０３  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＦＲＥＴ  ｐａｉｒｓ  ｆｏｒ  ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｄｕａｌ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ；  Ｓｈａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：  １５６７−１５７２  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  ｒｅｄ，  ｏｒａｎｇｅ  ａｎｄ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．  ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ．
【００２６】
ＬＲＲＫ２を含む細胞系システムを試験化合物に暴露することの、当該ＬＲＲＫ２のＳｅｒ９１０および／またはＳｅｒ９３５のリン酸化状態に対する影響を評価すること、ならびに／あるいは、ＬＲＲＫ２を含む細胞系システムを試験化合物に暴露することの、当該ＬＲＲＫ２の１４−３−３ポリペプチドへの結合に対する影響を評価することを、ＬＲＲＫ２の細胞内局在化を評価することによって行うことができ、（または、ＬＲＲＫ２の細胞内局在化を評価することによってさらに評価することができる）。Ｓｅｒ９１０および／またはＳｅｒ９３５のリン酸化を低下させること、ならびに／あるいは、ＬＲＲＫ２の１４−３−３ポリペプチドへの結合を低下させることは、（細胞質全体に拡散的に位置するのとは対照的に）、細胞質プールに存在するＬＲＲＫ２ポリペプチドの量を増大させると考えられる。ＬＲＲＫ２の細胞内位置を、当業者には広く知られている技術を使用して、例えば、免疫組織化学または蛍光顕微鏡観察を使用して、例えば、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）タグを有する組換えＬＲＲＫ２ポリペプチドを使用する免疫組織化学または蛍光顕微鏡観察を使用して評価することができる。そのような技術の実例が実施例に示される。
【００２７】
１つの実施形態において、本発明の方法は、ＬＲＲＫ２を含む細胞系システムを試験化合物に暴露することの、ＬＲＲＫ２の細胞内位置に対する影響を評価する工程を含むことができ、または、当該工程をさらに含むことができる。
【００２８】
細胞系システムはインビトロ細胞システムである場合がある。例えば、アッセイを細胞株に対して行うことができる。好適な細胞株の例には、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞またはＨＥＫ−２９３細胞が含まれると考えられる。他の好適な細胞には、例えば、野生型ＬＲＲＫ２を発現するヒト対象に由来するか、あるいは、ＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］（または、パーキンソン症候群に関連する他のＬＲＲＫ２変異体）についてホモ接合性であるヒト対象に由来するＥＢＶ形質転換されたリンパ芽球様細胞が含まれる。ニューロン細胞株もまた使用することができる。好適な細胞株はまた、組換えＬＲＲＫ２および／または組換え１４−３−３ポリペプチドを発現する細胞株である場合がある。そのような発現のための好適な細胞には、実施例に記載されるように、Ｔ−Ｒｅｘ細胞が含まれると考えられる。これらの細胞、例えば、Ｔ−Ｒｅｘ細胞は、当業者には広く知られているであろうように、組換えＬＲＲＫ２または組換え１４−３−３ポリペプチドを誘導可能な様式で発現することができる。例えば、細胞を、例えば、実施例に記載されるように、ドキシサイクリンを培養培地に含むことによって、所望される組換えポリペプチドを発現させるために誘導することができる。
【００２９】
１４−３−３ポリペプチドは典型的には、ヒトのベータイソ型、イータイソ型、シータイソ型、ゼータイソ型、ガンマイソ型またはイプシロンイソ型であり得るか、あるいは、ヒトのベータイソ型、イータイソ型、シータイソ型、ゼータイソ型、ガンマイソ型またはイプシロンイソ型を含み得る。１４−３−３ポリペプチドはヒトのシグマイソ型でないことだけが好ましい。１４−３−３ポリペプチド配列の例が下記に示される。当業者は他の１４−３−３ポリペプチド配列をデータベースから容易に特定することができる。例えば、ＮＣＢＩデータベースのＨｏｍｏｌｏｇｅｎｅ機能を使用することができる。
ヒト 14-3-3 ベータ
MTMDKSELVQKAKLAEQAERYDDMAAAMKAVTEQGHELSNEERNLLSVAYKNVVGARRSS WRVISSIEQKTERNEKKQQMGKEYREKIEAELQDICNDVLELLDKYLIPNATQPESKVFY LKMKGDYFRYLSEVASGDNKQTTVSNSQQAYQEAFEISKKEMQPTHPIRLGLALNFSVFY YEILNSPEKACSLAKTAFDEAIAELDTLNEESYKDSTLIMQLLRDNLTLWTSENQGDEGD
AGEGEN
マウス 14-3-3 ベータ
MTMDKSELVQKAKLAEQAERYDDMAAAMKAVTEQGHELSNEERNLLSVAYKNVVGARRSS WRVISSIEQKTERNEKKQQMGKEYREKIEAELQDICNDVLELLDKYLILNATQAESKVFY LKMKGDYFRYLSEVASGENKQTTVSNSQQAYQEAFEISKKEMQPTHPIRLGLALNFSVFY YEILNSPEKACSLAKTAFDEAIAELDTLNEESYKDSTLIMQLLRDNLTLWTSENQGDEGD
AGEGEN
ヒト 14-3-3 イプシロン
MDDREDLVYQAKLAEQAERYDEMVESMKKVAGMDVELTVEERNLLSVAYKNVIGARRASW RIISSIEQKEENKGGEDKLKMIREYRQMVETELKLICCDILDVLDKHLIPAANTGESKVF YYKMKGDYHRYLAEFATGNDRKEAAENSLVAYKAASDIAMTELPPTHPIRLGLALNFSVF YYEILNSPDRACRLAKAAFDDAIAELDTLSEESYKDSTLIMQLLRDNLTLWTSDMQGDGE EQNKEALQDVEDENQ
マウス 14-3-3 イプシロン
MDDREDLVYQAKLAEQAERYDEMVESMKKVAGMDVELTVEERNLLSVAYKNVIGARRASW RIISSIEQKEENKGGEDKLKMIREYRQMVETELKLICCDILDVQDKHLIPAANTGESKVF YYKMKGDYHRYLAEFATGNDRKEAAENSLVAYKAASDIAMTELPPTHPIRLGLALNFSVF YYEILNSPDRACRLAKAAFDDAIAELDTLSEESYKDSTLIMQLLRDNLTLWTSDMQGDGE EQNKEALQDVEDENQ
ヒト 14-3-3 イータ
MGDREQLLQRARLAEQAERYDDMASAMKAVTELNEPLSNEDRNLLSVAYKNVVGARRSSW RVISSIEQKTMADGNEKKLEKVKAYREKIEKELETVCNDVLSLLDKFLIKNCNDFQYESK VFYLKMKGDYYRYLAEVASGEKKNSVVEASEAAYKEAFEISKEQMQPTHPIRLGLALNFS VFYYEIQNAPEQACLLAKQAFDDAIAELDTLNEDSYKDSTLIMQLLRDNLTLWTSDQQDE
EAGEGN
マウス 14-3-3 イータ
MGDREQLLQRARLAEQAERYDDMASAMKAVTELNEPLSNEDRNLLSVAYKNVVGARRSSW RVISSIEQKTMADGNEKKLEKVKAYREKIEKELETVCNDVLALLDKFLIKNCNDFQYESK VFYLKMKGDYYRYLAEVASGEKKNSVVEASEAAYKEAFEISKEHMQPTHPIRLGLALNFS VFYYEIQNAPEQACLLAKQAFDDAIAELDTLNEDSYKDSTLIMQLLRDNLTLWTSDQQDE
EAGEGN
ヒト 14-3-3 ガンマ
MVDREQLVQKARLAEQAERYDDMAAAMKNVTELNEPLSNEERNLLSVAYKNVVGARRSSW RVISSIEQKTSADGNEKKIEMVRAYREKIEKELEAVCQDVLSLLDNYLIKNCSETQYESK VFYLKMKGDYYRYLAEVATGEKRATVVESSEKAYSEAHEISKEHMQPTHPIRLGLALNYS VFYYEIQNAPEQACHLAKTAFDDAIAELDTLNEDSYKDSTLIMQLLRDNLTLWTSDQQDD
DGGEGNN
マウス 14-3-3 ガンマ
MVDREQLVQKARLAEQAERYDDMAAAMKNVTELNEPLSNEERNLLSVAYKNVVGARRSSW RVISSIEQKTSADGNEKKIEMVRAYREKIEKELEAVCQDVLSLLDNYLIKNCSETQYESK VFYLKMKGDYYRYLAEVATGEKRATVVESSEKAYSEAHEISKEHMQPTHPIRLGLALNYS VFYYEIQNAPEQACHLAKTAFDDAIAELDTLNEDSYKDSTLIMQLLRDNLTLWTSDQQDD
DGGEGNN
ヒト 14-3-3 シータ
MEKTELIQKAKLAEQAERYDDMATCMKAVTEQGAELSNEERNLLSVAYKNVVGGRRSAWR VISSIEQKTDTSDKKLQLIKDYREKVESELRSICTTVLELLDKYLIANATNPESKVFYLK MKGDYFRYLAEVACGDDRKQTIDNSQGAYQEAFDISKKEMQPTHPIRLGLALNFSVFYYE ILNNPELACTLAKTAFDEAIAELDTLNEDSYKDSTLIMQLLRDNLTLWTSDSAGEECDAA
EGAEN
マウス 14-3-3 シータ
MEKTELIQKAKLAEQAERYDDMATCMKAVTEQGAELSNEERNLLSVAYKNVVGGRRSAWR VISSIEQKTDTSDKKLQLIKDYREKVESELRSICTTVLELLDKYLIANATNPESKVFYLK MKGDYFRYLAEVACGDDRKQTIENSQGAYQEAFDISKKEMQPTHPIRLGLALNFSVFYYE ILNNPELACTLAKTAFDEAIAELDTLNEDSYKDSTLIMQLLRDNLTLWTSDSAGEECDAA
EGAEN
ヒト 14-3-3 ゼータ
MDKNELVQKAKLAEQAERYDDMAACMKSVTEQGAELSNEERNLLSVAYKNVVGARRSSWR VVSSIEQKTEGAEKKQQMAREYREKIETELRDICNDVLSLLEKFLIPNASQAESKVFYLK MKGDYYRYLAEVAAGDDKKGIVDQSQQAYQEAFEISKKEMQPTHPIRLGLALNFSVFYYE ILNSPEKACSLAKTAFDEAIAELDTLSEESYKDSTLIMQLLRDNLTLWTSDTQGDEAEAG
EGGEN
マウス 14-3-3 ゼータ
MDKNELVQKAKLAEQAERYDDMAACMKSVTEQGAELSNEERNLLSVAYKNVVGARRSSWR VVSSIEQKTEGAEKKQQMAREYREKIETELRDICNDVLSLLEKFLIPNASQPESKVFYLK MKGDYYRYLAEVAAGDDKKGIVDQSQQAYQEAFEISKKEMQPTHPIRLGLALNFSVFYYE ILNSPEKACSLAKTAFDEAIAELDTLSEESYKDSTLIMQLLRDNLTLWTSDTQGDEAEAG
EGGEN
ヒト 14-3-3 シグマ
MERASLIQKAKLAEQAERYEDMAAFMKGAVEKGEELSCEERNLLSVAYKNVVGGQRAAWR VLSSIEQKSNEEGSEEKGPEVREYREKVETELQGVCDTVLGLLDSHLIKEAGDAESRVFY LKMKGDYYRYLAEVATGDDKKRIIDSARSAYQEAMDISKKEMPPTNPIRLGLALNFSVFH YEIANSPEEAISLAKTTFDEAMADLHTLSEDSYKDSTLIMQLLRDNLTLWTADNAGEEGG
EAPQEPQS
マウス 14-3-3 シグマ
MERASLIQKAKLAEQAERYEDMAAFMKSAVEKGEELSCEERNLLSVAYKNVVGGQRAAWR VLSSIEQKSNEEGSEEKGPEVKEYREKVETELRGVCDTVLGLLDSHLIKGAGDAESRVFY LKMKGDYYRYLAEVATGDDKKRIIDSARSAYQEAMDISKKEMPPTNPIRLGLALNFSVFH YEIANSPEEAISLAKTTFDEAMADLHTLSEDSYKDSTLIMQLLRDNLTLWTADSAGEEGG
EAPEEPQS
【００３０】
１４−３−３ポリペプチドは、当業者には広く知られているであろうように、タグ配列を含むことができる。例えば、ＦＲＥＴシステムにおいて有用であるタグを使用することができる。例えば、蛍光タンパク質タグ（例えば、Ｃｈｅｒｒｙタグ）を使用することができる。１４−３−３ポリペプチドは、１４−３−３ポリペプチドがリン酸化ポリペプチドに結合する場合には一般に当てはまると考えられるように、ＬＲＲＫ２ポリペプチドに結合するとき、ダイマー（典型的にはホモダイマー）の形態であってもよいと考えられる。典型的には、１４−３−３ポリペプチドは全長型１４−３−３ポリペプチドである。
【００３１】
組換えＬＲＲＫ２は、例えば、実施例に記載されるように、例えば、蛍光ポリペプチド成分（例えば、ＧＳＴ成分または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）成分）またはＦＬＡＧ成分によりタグ標識されるＬＲＲＫ２である場合がある。ＬＲＲＫ２ポリペプチドは野生型ＬＲＲＫ２である場合があり、または、ＬＲＲＫ２変異体、例えば、ＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］である場合がある。典型的には、ＬＲＲＫ２は薬物抵抗性のＡ２０１６Ｔ変異を有しない。典型的には、ＬＲＲＫ２はキナーゼ不活性変異体ではない。典型的には、ＬＲＲＫ２はセリン残基を９１０位および９３５位（これは全長の野生型ＬＲＲＫ２の番号表記である）に有する。典型的には、これらのセリン残基の周りの配列もまた、野生型ＬＲＲＫ２から変化していない。具体的には、図３Ｇにおいて特定される残基が典型的には保持されている（すなわち、−３位および−４位における塩基性残基、−２位におけるＳｅｒ残基、−１位におけるＡｓｎ、ならびに、＋１位における大きい疎水性残基）。典型的には、ＬＲＲＫ２は全長型ＬＲＲＫ２である。
【００３２】
ＬＲＲＫ２が薬物抵抗性のＡ２０１６Ｔ変異を有するコントロール細胞が有用である場合がある。ＬＲＲＫ２が変異（例えば、アラニンへの変異）を９１０位および９３５位（これは全長の野生型ＬＲＲＫ２の番号表記である）の一方または両方に有するコントロール細胞が有用である場合がある。ＬＲＲＫ２がキナーゼ不活性変異体であるコントロール細胞もまた有用である場合がある。
【００３３】
ＦＬＡＧまたはＧＳＴによりタグ標識されたＬＲＲＫ２を安定的に発現する細胞株が特に有用である場合がある。ＦＲＥＴを行うために適合性のある蛍光性タグによりタグ標識されるＬＲＲＫ２および１４−３−３ポリペプチドを発現する細胞株が有用である場合がある。ＦＲＥＴのドナー−アクセプター対の例が当業者には広く知られているであろうし、また、いくつかの実例が上記で示される。例えば、ＬＲＲＫ２をＧＦＰ成分によりタグ標識することができ、一方、１４−３−３ポリペプチドをＣｈｅｒｒｙ成分によりタグ標識することができる。
【００３４】
ニューロン細胞株または血液細胞株もまた特に有用である場合がある。ＬＲＲＫ２を内因的に発現するどのような細胞株もまた有用である場合がある。
【００３５】
ＬＲＲＫ２は典型的にはヒトＬＲＲＫ２であり、しかし、代替では、別の哺乳動物ＬＲＲＫ２である場合がある（例えば、実験室動物のＬＲＲＫ２、あるいは、ＬＲＲＫ２の潜在的阻害剤を評価することにおいて有用であると考えられる組織アッセイシステムまたは器官アッセイシステムのＬＲＲＫ２）。したがって、ＬＲＲＫ２は実験室用齧歯類のＬＲＲＫ２（例えば、マウス、ウサギまたはラット）である場合があり、または、実験室用霊長類のＬＲＲＫ２（例えば、サルＬＲＲＫ２）である場合がある。本発明のアッセイは、例えば、実験室動物（例えば、マウスまたはサル）の脳組織におけるＬＲＲＫ２に対する試験化合物の影響を評価することにおいて有用であるかもしれない。
【００３６】
ＬＲＲＫ２ポリペプチドは、野生型ヒトＬＲＲＫ２の天然に存在する変異を有するヒトＬＲＲＫ２、または、その融合体が可能である。ヒトＬＲＲＫ２の天然に存在する変異は、パーキンソン病（ＰＤ）に関連する変異であり得る。上記で記されるように、この変異は、野生型ヒトＬＲＲＫ２の番号表記を使用する場合、Ｇ２０１９Ｓであり得る。この変異は、Ｊａｌｅｅｌ  ｅｔ  ａｌ  （２００７）  ｓｕｐｒａ  ｏｒ  ｉｎ  ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１２１１，  ｓｕｐｒａにおいてさらに議論されるように、ＬＲＲＫ２のプロテインキナーゼ活性を高めると考えられる。
【００３７】
変異は、野生型ヒトＬＲＲＫ２の番号表記を使用する場合、代替では、Ｒ１４４１Ｃ、Ｒ１４４１Ｇ、Ｙ１６９９Ｃ、Ｒ１９１４Ｈ、Ｉ２０１２Ｔ、Ｉ２０２０ＴまたはＧ２３８５Ｒであり得る。Ｒ１４４１Ｃ、Ｒ１４４１Ｇ、Ｙ１６９９ＣまたはＴ２３６１Ｉの変異を有するＬＲＲＫ２は、野生型ＬＲＲＫ２と類似するプロテインキナーゼ活性を有すると考えられる。Ｒ１９１４ＨまたはＩ２０１２Ｔの変異を有するＬＲＲＫ２は、ほぼ不活性であると考えられる。Ｒ１４４１ＣまたはＹ１６９９Ｃの変異を有するＬＲＲＫ２は、野生型ＬＲＲＫ２よりも大きい程度に、（細胞質全体に拡散的に存在するよりはむしろ）細胞質プールに蓄積すると考えられる。Ｉ２０１２Ｔの変異を有するＬＲＲＫ２は、野生型ＬＲＲＫ２と、Ｒ１９１４ＨまたはＩ２０１２Ｔの変異を有するＬＲＲＫ２との中間的な活性を有すると考えられる。Ｇ２３８５Ｒの変異を有するＬＲＲＫ２もまた、ほぼ不活性であると考えられる。さらなる変異体の活性が国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１２１１（上掲）の図１７に示される。
【００３８】
化合物を、２つ以上のＬＲＲＫ２ポリペプチドに対して、例えば、２つ以上の変異体ＬＲＲＫ２ポリペプチドに対して試験することが有用である場合がある。これは、設計および試験するためのさらなる化合物について決定することを助けるかもしれない。
【００３９】
本質的ではないが、ＬＲＲＫ２ポリペプチドが、Ｔｈｒ５５８またはＴｈｒ５２６の残基に対する全長型ヒトモエシンのリン酸化に関して、あるいは、そのような残基を含むペプチド基質（例えば、ＲＬＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱまたはＲＬＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱＧＮＴＫＱＲまたはＲＬＧＷＷＲＦＹＴＬＲＲＡＲＱＧＮＴＫＱＲ）のリン酸化に関して、全長型ヒトＬＲＲＫ２の酵素活性の少なくとも３０％を有することが特に好ましい。ＬＲＲＫ２ポリペプチドが、Ｔｈｒ５５８またはＴｈｒ５２６の残基に対する全長型ヒトモエシンのリン酸化に関して、あるいは、上記で議論されるような、そのような残基を含むペプチド基質のリン酸化、または、ＲＬＧＷＷＲＦＹＴＬＲＲＡＲＱＧＮＴＫＱＲのリン酸化に関して、全長型ヒトＬＲＲＫ２の酵素活性の少なくとも５０％を有するならば、好ましくは少なくとも７０％を有するならば、より好ましくは少なくとも９０％を有するならば、より好ましい。
【００４０】
ＮＣＢＩデータベースにおける哺乳動物ＬＲＲＫ２配列についてのアクセション番号には、下記が含まれる：
AAV63975.1 human
XP_001168494.1 Pan troglodytes, (chimpanzee)
XP_615760.3 Bos Taurus (domestic cow)
XP_543734.2 Canis familiaris (dog)
NP_080006.2 Mus musculus (mouse)
XP_235581.4 Rattus norvegicus ( rat)
【００４１】
哺乳動物ＬＲＲＫ２ポリペプチド配列および非哺乳動物ＬＲＲＫ２ポリペプチド配列の数多くのさらなる例が、当業者には広く知られているであろうように、ＮＣＢＩ  Ｍｅｄｌｉｎｅ（商標）サービスからアクセス可能な配列データベースにおいてアクセスすることができる。
【００４２】
ポリペプチドの「変化体」によって、本発明者らは、挿入、欠失および置換（保存的または非保存的のどちらであろうとも）を包含する。具体的には、本発明者らは、そのような変化が、適する場合には、プロテインキナーゼ活性、または、リン酸化され得ること、または、ＬＲＲＫ２と、１４−３−３ポリペプチドとの間での相互作用を実質的に変化させない、当該ポリペプチドの変化体を包含する。当業者は、例えば、各ポリペプチドの様々な例の配列（例えば、異なる種に由来する配列）を比較することに基づいて、適切な変化体を容易に設計し、試験することができるであろう。当業者は、挿入または欠失がどこにおいて行われ得るか、あるいは、どの残基が、適する場合には変化されないままであり得るか、または、保存的置換によって置換され得るか、または、非保存的置換によって置換され得るかを容易に決定することができるであろう。変化体ポリペプチドは、例えば、実施例に記載されるように、容易に試験することができる。
【００４３】
「保存的置換」によって、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；および、Ｐｈｅ、Ｔｙｒなどの組合せが意図される。
【００４４】
ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会の三文字または一文字のアミノ酸コードが、上記で定義される記号Ｚａａを除いて、本明細書中では使用される。具体的には、Ｘａａは任意のアミノ酸を表す。少なくとも、本明細書中で定義されるコンセンサス配列に対応するアミノ酸はＬ−アミノ酸であることが好ましい。
【００４５】
ポリペプチド変化体が、少なくとも６５％の同一性を関連性があるヒトポリペプチドのアミノ酸配列に関して有するアミノ酸配列（より好ましくは少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％または７４％の同一性、一層より好ましくは少なくとも７５％の同一性、さらに一層より好ましくは少なくとも８０％の同一性、さらに好ましくは少なくとも８５％の同一性、一層さらに好ましくは少なくとも９０％の同一性、最も好ましくは少なくとも９５％または９７％の同一性を関連性があるヒトポリペプチドのアミノ酸配列に関して有するアミノ酸配列）を有するならば、特に好ましい。
【００４６】
プロテインキナーゼ変化体が、少なくとも６５％の同一性をヒトポリペプチドの触媒作用ドメインのアミノ酸配列に関して有するアミノ酸配列（より好ましくは少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％または７４％の同一性、一層より好ましくは少なくとも７５％の同一性、さらに一層より好ましくは少なくとも８０％の同一性、さらに好ましくは少なくとも８３％または８５％の同一性、一層さらに好ましくは少なくとも９０％の同一性、最も好ましくは少なくとも９５％または９７％の同一性を関連性があるヒトアミノ酸配列に関して有するアミノ酸配列）を有するならば、一層さらに好ましい。
【００４７】
プロテインキナーゼ関連ポリペプチドの触媒作用ドメインが、例えば、下記で記載されるような配列比較を使用して、当業者によって容易に特定され得ることが理解されるであろう。プロテインキナーゼは、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  （１９９６）  Ｃｅｌｌ，  ８５，  １４９−１５８  ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｒａｄｚｉｏ−Ａｎｄｚｅｌｍ  （１９９４）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２，  ３４５−３５５において総説されるように、保存された触媒作用コアを示す。このコアは、逆平行β−シートを主として含む小さいＮ端側突出部と、ほとんどがα−らせんである大きいＣ端側突出部とに折り重なる。
【００４８】
２つのポリペプチドの間におけるパーセント配列同一性を、好適なコンピュータープログラム（例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ大学Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ＧｒｏｕｐのＧＡＰプログラム）を使用して求めることができ、パーセント同一性は、配列が最適にアラインメントされているポリペプチドに関して計算されることが理解されるであろう。
【００４９】
アラインメントは代替では、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）を使用して行うことができる。使用されるパラメーターは下記の通りであり得る：
高速ペアワイズ・アライメント・パラメーター：Ｋチュープル（ワード）サイズ；１、ウインドウサイズ；５、ギャップペナルティー；３、トップ・ダイアゴナルの数；５、スコア化方法：ｘパーセント。
多重アラインメントパラメーター：ギャップ・オープン・ペナルティー；１０、ギャップ・エクステンション・ペナルティー；０．０５。
スコア化行列：ＢＬＯＳＵＭ。
【００５０】
アラインメントは代替では、プログラムＴ−ＣｏｆｆｅｅまたはプログラムＥＭＢＯＳＳを使用して行うことができる。
【００５１】
例えば、全長型ヒトＬＲＲＫ２のＳｅｒ９１０に対応する（等価である）残基を、ポリペプチドの配列を、配列間の一致を最大とするような方法で全長型ヒトＬＲＲＫ２の配列に関してアラインメントすることによって特定することができる。アライメントは、目視検査によって、および／または、ポリペプチドのパーセント同一性が計算されることを同様にまた可能にするであろう好適なコンピュータープログラム（例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ大学Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ＧｒｏｕｐのＧＡＰプログラム）の使用によって行うことができる。Ａｌｉｇｎプログラム（Ｐｅａｒｓｏｎ  （１９９４）  ｉｎ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  ＩＩ  （Ｇｒｉｆｆｉｎ，  ＡＭ  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  ＨＧ  ｅｄｓ）  ｐｐ  ３６５−３８９，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｌｉｆｔｏｎ）。したがって、この様式で特定される残基もまた、「対応する残基」である。
【００５２】
（例えば）ＬＲＲＫ２の短縮型形態の場合、または、アミノ酸の単純な置換が生じている形態では、「対応する残基」を特定することは容易であることが理解されるであろう。
【００５３】
スクリーニングにおいて使用されるポリペプチドは、天然に存在する対立遺伝子変化体（スプライス変化体を含む）を含めて、哺乳動物（好ましくはヒト）由来である（あるいは、農業において有用な種、または、飼育動物もしくは伴侶動物として有用な種、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシである）ことが好ましい。スクリーニングにおいて使用されるポリペプチドは、当業者には知られているように、あるいは、上記で述べられるように、または、実施例に記載されるように、ＧＳＴ部分を含むことができ、あるいは、ビオチン化することができ、または、他の場合には、例えば、６Ｈｉｓ、ＨＡ、ｍｙｃもしくは他のエピトープタグによりタグ標識することができる。これは、ポリペプチドの精製および／または検出において有用である場合がある。
【００５４】
化合物の影響を、残基Ｓｅｒ９１０または残基Ｓｅｒ９３５のリン酸化、あるいは、１４−３−３ポリペプチドの結合、あるいは、ＬＲＲＫ２の細胞内局在化を当該化合物の種々の濃度の存在下で、例えば、当該化合物の非存在下および存在下で、例えば、約１００μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．１μＭ、０．０１μＭおよび／または０．００１μＭの濃度で比較することによって求めることができる。
【００５５】
試験化合物の影響を、ＬＲＲＫ２の阻害剤であると考えられる化合物（例えば、Ｈ−１１５２および／またはスニチニブ）の影響と比較することが有用である場合がある。
【００５６】
細胞系システムはエクスビボ細胞システムである場合がある。細胞は組織または器官のサンプルの形態である場合がある。サンプルは、血液、腎臓、脳または脾臓（あるいは、ＬＲＲＫ２が非常に発現する他の組織）のサンプルである場合がある。
【００５７】
細胞系システムはインビボシステムである場合がある。例えば、ＬＲＲＫ２を含む細胞系システムは試験動物において試験化合物に暴露されているかもしれない。試験動物を試験化合物に暴露する好適な方法は当業者には広く知られているであろう。典型的には、化合物は、注射による投与のために、または、経口投与のために配合することができ、しかし、当業者には明らかであるであろうように、他の投与経路を使用することができる。分析のためのサンプルを、侵襲的な技術、最小限に侵襲的な技術または非侵襲的な技術によって試験動物から得ることができる。例えば、血液サンプル（これは最小限に侵襲的である）を分析することができる；または、脳組織のサンプル（これは侵襲的である）、これは動物の屠殺を必要とする場合がある。
【００５８】
ＬＲＲＫ２のＳｅｒ９１０および／またはＳｅｒ９３５のリン酸化状態を評価すること、ならびに／あるいは、ＬＲＲＫ２の１４−３−３ポリペプチドへの結合を評価すること、ならびに／あるいは、ＬＲＲＫ２の細胞内位置を評価することを、試験動物から得られる細胞に対して行うことができる。例えば、試験動物から得られる細胞は、試験動物から血液において得られる細胞である場合がある。
【００５９】
細胞系システムはリンパ芽球様細胞系システムである場合がある。リンパ芽球様細胞は試験動物からの血液サンプルに存在し得る。マクロファージ細胞株（例えば、ＲＡＷ細胞株）システムが有用であるかもしれない。ヒト志願者からの血液から得られるマクロファージを使用するシステムもまた有用であるかもしれない。
【００６０】
本方法は、ＬＲＲＫ２のプロテインキナーゼ活性（あるいは、Ｓｅｒ９１０および／またはＳｅｒ９３５のリン酸化、あるいは、ＬＲＲＫ２と、１４−３−３ポリペプチドとの間での相互作用、あるいは、細胞質プールにおけるＬＲＲＫ２の蓄積）を細胞系システムにおいて調節する化合物、例えば、阻害する化合物を特定することにおいて有用であると考えられる。ＬＲＲＫ２のプロテインキナーゼ活性（あるいは、Ｓｅｒ９１０および／またはＳｅｒ９３５のリン酸化、あるいは、ＬＲＲＫ２と、１４−３−３ポリペプチドとの間での相互作用、あるいは、細胞質プールにおけるＬＲＲＫ２の蓄積）を細胞系システムにおいて調節する化合物、例えば、阻害する化合物は、パーキンソン病（例えば、特発性パーキンソン病または遅発型パーキンソン病）またはパーキンソン症候群の処置において有用であるかもしれない。
【００６１】
ＬＲＲＫ２のプロテインキナーゼ活性（あるいは、Ｓｅｒ９１０および／またはＳｅｒ９３５のリン酸化、あるいは、ＬＲＲＫ２と、１４−３−３ポリペプチドとの間での相互作用、あるいは、細胞質プールにおけるＬＲＲＫ２の蓄積）を細胞系システムにおいて調節する化合物、例えば、阻害する化合物はまた、他の神経変性状態において有用であるかもしれない。
【００６２】
上記化合物は、ＬＲＲＫ２ポリペプチドと、基質ポリペプチドとの間での接触領域またはその近くに結合する化合物であり得るか、あるいは、別の領域に結合し、かつ、例えば、複合体の安定化（または不安定化）を生じさせる立体配座変化もしくはアロステリック変化を誘導する化合物、または、その形成の促進（または阻害）を生じさせる化合物であり得る。上記化合物は、ＬＲＲＫ２ポリペプチドのプロテインキナーゼ活性をアロステリック効果によって増大させるようにＬＲＲＫ２ポリペプチドまたは基質ポリペプチドに結合することができる。このアロステリック効果は、ＬＲＲＫ２ポリペプチドの活性の自然界での調節に関与するアロステリック効果であるかもしれない。
【００６３】
本方法において特定される化合物はそれ自体が薬物として有用であるかもしれないか、または、本方法において特定される化合物は、より効力のある化合物を設計および合成するためのリード化合物を表すかもしれない。
【００６４】
上記化合物は、化合物を特定する上記方法のそれぞれについて、薬物様化合物、または、薬物様化合物を開発するためのリード化合物であるかもしれない。前記方法は、当業者には広く知られているように、医薬用化合物または薬物の開発におけるスクリーニングアッセイとして有用であるかもしれないことが理解されるであろう。
【００６５】
用語「薬物様化合物」は当業者には広く知られており、また、この化合物を、例えば、医薬品における有効成分として薬剤における使用のために好適にし得る特性を有する化合物の意味を包含する場合がある。したがって、例えば、薬物様化合物は、有機化学の技術によって合成され得る分子、それほど好ましくはないが、分子生物学または生化学の技術によって合成され得る分子である場合があり、好ましくは、小分子（これは５０００ダルトン未満であり得る）である。薬物様化合物はさらに、特定のタンパク質（１つまたは複数）との選択的相互作用の特徴を示してもよく、また、生物学的利用能および／または細胞膜浸透能を有してもよく、しかし、これらの特徴は必須でないことが理解されるであろう。
【００６６】
用語「リード化合物」は同様に当業者には広く知られており、また、この化合物は、自身は（例えば、その意図された標的に対する効力が弱いだけであるために、または、その作用において選択性がないために、または、不安定であるために、または、合成が困難であるために、または、生物学的利用能が不良であるために）薬物としての使用について好適ではないが、より望ましい特性を有し得る他の化合物を設計するための出発点を提供し得るという意味を包含する場合がある。
【００６７】
プロテインキナーゼの活性をインビボにおいて調節し得る化合物を特定することが望ましいであろうことが理解されるであろう。したがって、本方法において使用される試薬および条件は、例えば、ＬＲＲＫ２ポリペプチドと、基質ポリペプチドとの間における相互作用が、ヒトＬＲＲＫ２と、内因性のヒト基質ポリペプチドとの間における場合と実質的に同じであるように選ばれ得ることが理解されるであろう。典型的には、本発明の方法は、ヒト組換えポリペプチドを場合により発現するヒト細胞系システムにおいて行うことができる。上記化合物はＬＲＲＫ２ポリペプチドに結合してもよい、または、基質ポリペプチドに結合してもよいことが理解されるであろう。
【００６８】
本発明のスクリーニング方法、または、ＬＲＲＫ２ポリペプチドのプロテインキナーゼ活性を調節する化合物の能力が測定され得る他のアッセイにおいて試験される化合物は、分子モデリング技術を使用して、例えば、コンピューター技術を使用して、選択および／または設計（改変を含む）が行われている化合物である場合がある（しかし、そのような化合物である必要はない）。選択または設計された化合物は、（既に合成されていないならば）合成し、そして、ＬＲＲＫ２ポリペプチドに対するその影響について、例えば、プロテインキナーゼ活性に対するその影響について試験することができる。化合物は本発明のスクリーニング方法で試験することができる。
【００６９】
試験される化合物は、プロテインキナーゼの活性を調節することができる可能性があると既に考えられる化合物である場合があり、または、プロテインキナーゼの活性を調節する可能性が高いことに基づいて選択されていない化合物である場合がある。したがって、試験される化合物は、一般的な、選択されていない化合物バンクの少なくとも一部を形成する化合物である場合があり、または、代替では、事前に選択された化合物バンクの少なくとも一部を形成する化合物、例えば、プロテインキナーゼの活性を調節する可能性が高いと考えられることに基づいて事前に選択される化合物のバンクを形成する化合物である場合がある。
【００７０】
ハイスループット操作が可能であるスクリーニングアッセイが特に好ましいであろうことが理解されるであろう。
【００７１】
当業者には明らかであるであろうように、上記化合物が他のプロテインキナーゼに対してどのような影響を有するかを評価することが望ましい場合がある。例えば、他のプロテインキナーゼの基質、例えば、ＲｏｃｋＩＩの基質のリン酸化に対する化合物の影響を、ＬＲＲＫ２阻害剤と、ＲＯＣＫ阻害剤とを区別するために評価することが望ましい場合がある。例えば、例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１２１１（上掲）の図２０および図２２に示されるように、または、それらの説明文において議論されるように、ＬＲＲＫ２およびＲｏｃｋ−ＩＩの基質選択性が異なる。一例として、ＬＲＲＫ２はＭＹＰＴをリン酸化せず、一方、ＲｏｃｋＩＩはＭＹＰＴをリン酸化する。
【００７２】
本明細書中に記載されるスクリーニング方法を使用して特定される化合物をさらに試験することが適切であるかもしれないＰＤモデル、バイオマーカーおよび評価技術に関する情報が、例えば、下記のリンク（これらは当業者に入手可能な情報を表している）において見出され得る。
http://www.ninds.nih.gov/about_ninds/plans/nihparkinsons_agenda.htm#Models
http://www.sciencedaily.com/releases/2006/07/060729134653.htm (mouse model with mitochondrial disturbance)
http://www.sciencedaily.com/releases/2004/10/041005074846.htm (embryonic stem cell model)
http://en.wikipedia.org/wiki/Parkinson's_disease
【００７３】
ＰＤ動物モデルには、６−ヒドロキシドーパミン処理の齧歯類およびＭＰＴＰ処理の霊長類が含まれる。両者は、ドーパミン作動性脳細胞（およびいくつかの他のタイプ）の毒性破壊に基づいており、これらには通常、若い、他の場合には健康な動物が用いられる。これらのモデルはパーキンソン病のいくつかの重要な特徴を再現するので、それらは、出現した新しい治療法を試験するために有用であると考えられる。
【００７４】
化合物はまた、当業者には広く知られているように、他の試験（例えば、毒性学試験または代謝試験）に供される場合がある。
【００７５】
本発明のスクリーニング方法は、選択された化合物の合成、精製および／または配合を行う工程を含むことができる。化合物は、医薬使用のために、例えば、動物またはヒトでのインビボ試験における使用のために配合される場合がある。
【００７６】
本発明のさらなる態様は、Ｓｅｒ９１０がリン酸化されるＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体、または、Ｓｅｒ９３５がリン酸化されるＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体、または、Ｓｅｒ９１０がリン酸化されないＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体、または、Ｓｅｒ９３５がリン酸化されないＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体を提供することである。
【００７７】
本発明のさらなる態様は、１）Ｓｅｒ９１０がリン酸化されるＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体、または、Ｓｅｒ９１０がリン酸化されないＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体；２）Ｓｅｒ９３５がリン酸化されるＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体、または、Ｓｅｒ９３５がリン酸化されないＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体；３）（例えばジゴキシゲニンで、例えば標識された）１４−３−３ポリペプチド、または、１４−３−３ポリペプチドに対して特異的に結合する抗体；および４）蛍光標識されたＬＲＲＫ２ポリペプチド、または、蛍光標識されたＬＲＲＫ２をコードするポリヌクレオチドのうちの２つ以上を含む部分品のキットを提供する。
【００７８】
本発明のさらなる態様は、１）Ｓｅｒ９１０がリン酸化されるＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体；２）Ｓｅｒ９３５がリン酸化されるＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体；３）１４−３−３ポリペプチド、または、１４−３−３ポリペプチドに対して特異的に結合する抗体；および／あるいは４）蛍光標識されたＬＲＲＫ２ポリペプチド、または、蛍光標識されたＬＲＲＫ２をコードするポリヌクレオチドの使用であって、ＬＲＲＫ２に対する試験化合物の影響を細胞系システムにおいて評価するための方法における使用を提供する。
【００７９】
本発明のさらなる態様は、ＬＲＲＫ２ポリペプチドまたはＬＲＲＫ２ポリヌクレオチド（すなわち、ＬＲＲＫ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）、あるいは、ＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体と、１４−３−３ポリペプチドまたは１４−３−３ポリヌクレオチド（すなわち、１４−３−３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）、あるいは、１４−３−３ポリペプチドに対して特異的に結合する抗体とを含む精製された調製物または部分品のキットを提供する。調製物またはキットは、例えば、組換えによるＬＲＲＫ２ポリヌクレオチドまたはＬＲＲＫ２ポリペプチドと、組換えによる１４−３−３ポリペプチドまたは１４−３−３ポリヌクレオチドとを含むことができる。ＬＲＲＫ２および１４−３−３は、上記で議論されるように、ＦＲＥＴシステムにおける使用に好適である蛍光性タグを含むことができる。調製物またはキットは、免疫沈殿されたＬＲＲＫ２ポリペプチドおよび１４−３−３ポリペプチドを含むことができる。調製物またはキットは、ＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体と、１４−３−３ポリペプチド（これは、例えば、標識することができ、例えば、ジゴキシゲニンにより標識することができる）、または、１４−３−３ポリペプチドに対して特異的に結合する抗体とを含むことができる。
【００８０】
調製物またはキットは本発明のアッセイにおいて有用であり得る。
【００８１】
用語「抗体」によって、合成抗体、ならびに、抗原結合部位を保持する、完全な抗体のフラグメントおよび変化体（例えば、上記で議論されるようなもの）が含まれる。抗体はモノクローナル抗体であってもよく、しかし、同様に、ポリクローナル抗体調製物、その一部（１つまたは複数）（例えば、ＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメント）、あるいは、合成抗体またはその一部であってもよい。Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂの抗体フラグメントはすべて、大腸菌において発現させ、大腸菌から分泌させることができ、したがって、このことは多量の前記フラグメントの容易な製造を可能にする。「ＳｃＦｖ分子」によって、ＶＨおよびＶＬのパートナードメインが柔軟なオリゴペプチドを介して連結される分子が意味される。ＩｇＧクラスの抗体が好ましい。
【００８２】
選択された抗原に対する好適なモノクローナル抗体を、上記で示されるように改変される公知技術によって、例えば、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”（Ｈ．Ｚｏｌａ）（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８８）および“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”（ＪＧＲ  Ｈｕｒｒｅｌｌ）（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８２）に開示される技術によって調製することができる。二重特異性抗体を、細胞融合によって、一価フラグメントの再結合によって、または、完全な抗体の化学的な架橋によって調製することができる。二重特異性抗体を調製するための方法が、Ｃｏｒｖａｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  （１９８７）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ２４，  １２７−１３２  ａｎｄ  １３３−１３７  ａｎｄ  １３８−１４３に開示される。
【００８３】
それらの特異的な結合部位を保持する様々な抗体フラグメントの合成に関わる技術の一般的な総説が、Ｗｉｎｔｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  （１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４９，  ２９３−２９９に見出されるはずである。
【００８４】
「精製された（される）」によって、調製物が、調製物が他の成分の存在下で形成されている場合、他の成分（例えば、組換え細胞の他の成分）から少なくとも部分的に分離されていることが意味される。使用され得る精製方法の実例が実施例に記載される。
【００８５】
調製物は実質的に純粋である場合がある。「実質的に純粋」によって、本発明者らは、前記ポリペプチドが他のタンパク質を実質的に有しないことを意味する。したがって、本発明者らは、重量比でタンパク質含有量の少なくとも２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％または３０％を前記ポリペプチドとして含むどのような組成物をも包含する。タンパク質含有量の好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％が前記ポリペプチドである。
【００８６】
したがって、本発明はまた、前記ポリペプチドと、混入物とを含む組成物であって、混入物が、重量比で組成物の９６％未満、９５％未満、９４％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満または７０％未満、好ましくは組成物の５０％未満、より好ましくは組成物の３０％未満、さらにより好ましくは組成物の１０％未満、最も好ましくは重量比で組成物の５％未満を含む組成物を包含する。
【００８７】
本発明はまた、エクスビボにおいて他の成分と組み合わされるとき、実質的に純粋な前記ポリペプチドを包含し、ただし、この場合、前記他の成分は、前記ポリペプチドが見出される細胞に見出される成分のすべてではない。
【００８８】
本発明のさらなる態様は、ＬＲＲＫ２変異体（例えば、パーキンソン病の患者において見出されるＬＲＲＫ２変異体）を特徴づける方法であって、下記の工程：ａ）前記ＬＲＲＫ２変異体のＳｅｒ９１０および／またはＳｅｒ９３５のリン酸化状態を評価する工程；ならびに／あるいはｂ）前記ＬＲＲＫ２変異体の１４−３−３ポリペプチドへの結合能を評価する工程を含む方法を含む。本発明はさらに、細胞系システムにおいて発現されるとき、前記ＬＲＲＫ２変異体の細胞内位置を評価する工程を含むか、または、当該工程をさらに含むことができる。評価工程は、上記で記載される抗体、試薬および細胞系システムを使用して行うことができる。
【００８９】
本明細書中で参照されるすべての文書が本明細書により参照によって組み込まれる。疑念を回避するために、Ｊａｌｅｅｌ  ｅｔ  ａｌ  （２００７）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ４０５（２），  ３０７−３１７，  ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１２１１  ａｎｄ  ＰＣＴ／ＧＢ２００９／００２０４７が参照により組み込まれる。
【００９０】
本明細書における明らかに以前に刊行された文書の列挙または議論は、当該文書が最新技術の一部であること、または、共通する一般的な知識であることを認めるものとして必ずしも解釈されるべきではない。
【００９１】
次に、本発明が、下記の限定されない図および実施例を参照することによってより詳しく説明される。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】定量的質量分析法により、１４−３−３が主要なＬＲＲＫ２相互作用因子として特定される。ＧＦＰ、野生型全長ＧＦＰ−ＬＲＲＫ２または全長ＧＦＰ−ＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］変異体を安定的に発現する２９３−ＨＥＫ細胞を、Ｒ６Ｋ４  ＳＩＬＡＣ培地（ＧＦＰ−ＬＲＲＫ２またはＧＦＰ−ＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］）または通常のＲ０Ｋ０  ＳＩＬＡＣ培地（ＧＦＰ）のどちらかで多数回の継代培養のために培養した。細胞を溶解し、ＧＦＰおよびＧＦＰ−ＬＲＲＫ２からの溶解物（ＡおよびＣ）の等量またはＧＦＰおよびＧＦＰ−ＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］からの溶解物（ＢおよびＤ）の等量を混合した。免疫沈殿を、抗ＧＦＰ抗体を用いて開始し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、その後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルをコロイダルブルーにより染色した（ＡおよびＢ）。ＬＲＲＫ２バンドの移動が矢じりにより示され、ＧＦＰバンドが矢により示される。マーカーの分子量がゲルの左側および右側に示される。各ゲルからのレーン全体を切り出し、トリプシンにより消化し、質量分析法のために処理した。各サンプルをＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析法によって分析し、ＭａｘＱｕａｎｔ（バージョン１３．１３．１０）を使用して定量化した［非特許文献２８］。結果のまとめが表形式で示される。ペプチドの数、および、定量化された、示されているタンパク質に対応する配列範囲の割合が、ＧＦＰ対野生型ＬＲＲＫ２（Ｃ）およびＧＦＰ対ＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］（Ｄ）の各比較のために標識ペプチド対非標識ペプチドについての濃縮率と一緒に示される。事後誤差確率ＰＥＰが示され、これは、ＭａｘＱｕａｎｔ定量化の正確性を見積もるものであり、この場合、ゼロに近いほど、特異的相互作用の確率が大きくなる［非特許文献２８］。
【図２】１４−３−３とのＬＲＲＫ２相互作用の特徴づけ。Ａ．）５ｍｇのＳｗｉｓｓ３Ｔ３溶解物をコントロールＩｇＧまたは抗ＬＲＲＫ２（Ｓ３４８Ｃ）抗体による免疫沈殿に供した。免疫沈殿物を４〜１２％のＮｏｖｅｘ  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離し、ＬＲＲＫ２に対する抗体（Ｓ３７４Ｃ）、Ｈｓｐ９０に対する抗体および汎１４−３−３に対する抗体により免疫ブロットした。Ｂ．）５ｍｇのＳｗｉｓｓ３Ｔ３溶解物を抗汎１４−３−３抗体による免疫沈殿に供し、免疫沈殿物を４〜１２％のＮｏｖｅｘ  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離し、汎１４−３−３およびＬＲＲＫ２に対する抗体（Ｓ３７４Ｃ）により免疫ブロットした。Ｃ．）ＧＳＴまたはＧＳＴタグ標識された１４−３−３イソ型をコードするｐＥＢＧプラスミドによりトランスフェクションされ、かつ、１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンを培養培地に含むことによってＬＲＲＫ２を発現するように誘導されるＴ−Ｒｅｘ  ＨＥＫ２９３  ＦＬＡＧ−ＬＲＲＫ２細胞の溶解物。トランスフェクション後３６時間で、細胞を溶解し、グルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅでアフィニティー精製したタンパク質を抗ＧＳＴ抗体または抗ＦＬＡＧ抗体により免疫ブロットした。Ｄ．）ＬＲＲＫ２の示されたドメインをコードするフラグメントをＨＥＫ−２９３細胞において一過性に発現させ、抗ＦＬＡＧ抗体により免疫沈殿させた。免疫沈殿物を４〜１２％のＮｏｖｅｘ  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離し、抗ＦＬＡＧ抗体によるか、または、ファーウエスタンアッセイにおけるジゴキシゲニン標識された１４−３−３を伴う１４−３−３オーバーレイによるかのどちらかによりプローブした。共免疫沈殿させた１４−３−３を抗汎１４−３−３抗体により検出した。Ｅ．）内因性ＬＲＲＫ２を抗ＬＲＲＫ２（Ｓ３４８Ｃ）によりＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞から免疫沈殿させ、続いて、示された抗体による免疫ブロット分析または１４−３−３オーバーレイアッセイに先立ってＥＤＴＡの非存在下または存在下においてλ−ホスファターゼで処理した。Ｆ．）ＨＥＫ−２９３細胞における一過性トランスフェクションの後で得られる免疫沈殿されたＦＬＡＧ−ＬＲＲＫ２を用いて開始された実験であったことを除いて、Ｅの場合と同様。
【図３】ＬＲＲＫ２リン酸化部位、１４−３−３結合部位の特定、ならびに、抗ｐＳ９１０および抗ｐＳ９３５の特徴づけ。Ａ．）内因性ＬＲＲＫ２をＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞から抗ＬＲＲＫ２  １００−５００（Ｓ３４８Ｃ）により免疫沈殿させ、ＦＬＡＧ−ＬＲＲＫ２を安定な誘導可能なＴ−Ｒｅｘ  ＨＥＫ２９３細胞から抗ＦＬＡＧアガロースにより免疫沈殿させ、４〜１２％のＮｏｖｅｘ  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離し、コロイダルブルーにより染色した。ゲルはいくつかの実験を表す。ＬＲＲＫ２のトリプシンペプチドをＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計でのＬＣ−ＭＳＭＳに供した。Ｂ．）ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析法によって特定されるホスホペプチドが表形式で示される。実測質量（ｍ／ｚ）および予測質量（Ｍ）が、特定されるリン酸化部位およびペプチド配列と一緒に示される。評価された実験の数（Ｎ）が欄の上部に示され、また、リン酸化ペプチドが特定された（合計での）回数が示される。Ｃ．）ＬＲＲＫ２のドメイン構造が一定の縮尺で示され、ドメイン境界を示すアミノ酸残基が示される。特定されたリン酸化部位の位置が示される。Ｄ．）ＡおよびＢにおいて特定される示されたリン酸化部位をＡｌａに変異させ、ＨＥＫ−２９３細胞において一過性に発現させた。ＬＲＲＫ２をＦＬＡＧアガロースにより免疫沈殿させ、等量の各タンパク質をＦＬＡＧ（全体）によりプローブし、また、１４−３−３と直接に結合することができるかをオーバーレイアッセイで評価した。１４−３−３およびＨｓｐ９０の共免疫沈殿（Ｃｏ−ＩＰ）を、免疫沈殿物を汎１４−３−３抗体およびＨｓｐ９０抗体により免疫ブロットすることによって評価した。キナーゼ活性を３０μＭのＮｉｃｔｉｄｅに対してアッセイし、比活性を、Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＬＩＣＯＲを使用する定量的免疫ブロットにより免疫沈殿物におけるタンパク質レベルについてリン酸の取り込みを補正することによって求めた。比活性が、分あたりカウント数／ＬＩＣＯＲ吸光度単位（ｃｐｍ／ＬＩＣＯＲ  ＡＵ）として示される。データは平均±ＳＥＭであり、二連で行われたものであり、少なくとも４回の別個の実験を表す。Ｅ．）ＬＲＲＫ２の示された形態を一過性トランスフェクションによって２９３細胞において発現させた。トランスフェクション後３６時間で、これらをＦｌａｇ抗体により免疫沈殿させ、Ｓ９１０に対するリン特異的抗体（Ｓ３５７Ｃ）およびＳ９３５に対するリン特異的抗体（Ｓ８１４Ｃ）により免疫ブロットした。１４−３−３への免疫沈殿物の直接の結合をオーバーレイアッセイによって評価し、１４−３−３およびＨｓｐ９０の共免疫沈殿をそれぞれの抗体による免疫ブロッティングによって評価した。Ｆ．）ＬＲＲＫ２を野生型オスＣ５７ＢＬ／６マウスの組織から免疫沈殿させ、Ｅにおける場合と同様にＳｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５のリン酸化について免疫ブロットし、１４−３−３の結合をオーバーレイアッセイによって評価した。Ｇ．）ヒト由来ＬＲＲＫ２（ＮＰ＿９４０９８０）、ハツカネズミ由来ＬＲＲＫ２（ＮＰ＿０８０００６）、ドブネズミ由来ＬＲＲＫ２（ＸＰ＿２３５５８１）、ウシ由来ＬＲＲＫ２（ＸＰ＿６１５７６０）、イヌ由来ＬＲＲＫ２（ＸＰ＿５４���７３４）およびニワトリ由来ＬＲＲＫ２（ＸＰ＿４２７０７７）の多重配列アライメント。リン酸化された残基（セリン９１０およびセリン９３５）の位置が示される。同一残基が示される。Ｈ．）ヒトＬＲＲＫ２のＳｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５のリン酸化部位の周りの残基の配列比較。Ｉ．）ヒト由来ＬＲＲＫ２（ＮＰ＿９４０９８０）、チンパンジー由来ＬＲＲＫ２（ＸＰ＿００１１６８４９４）、ハツカネズミ由来ＬＲＲＫ２（ＮＰ＿０８０００６）、ドブネズミ由来ＬＲＲＫ２（ＸＰ＿２３５５８１）、ウシ由来ＬＲＲＫ２（ＸＰ＿６１５７６０）、イヌ由来ＬＲＲＫ２（ＸＰ＿５４３７３４）およびニワトリ由来ＬＲＲＫ２（ＸＰ＿４２７０７７）の多重配列アライメント。リン酸化された残基（セリン９１０およびセリン９３５）の位置が示される。同一残基が示される。
【図４】Ｈ−１１５２処置およびスニチニブ処置はＳ９１０およびＳ９３５の脱リン酸化および１４−３−３相互作用の破壊をもたらす。Ａ．）内因性ＬＲＲＫ２をＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞から抗ＬＲＲＫ２  １００−５００（Ｓ３４８Ｃ）により免疫沈殿させ、ＤＭＳＯビヒクルコントロールまたは示された濃度のＨ−１１５２により９０分間処理した。免疫沈殿物を４〜１２％のＮｏｖｅｘゲルで分離し、１４−３−３オーバーレイ・ファーウエスタン分析に供し、抗ｐＳ９１０（Ｓ３５７Ｃ）抗体、抗ｐＳ９３５（Ｓ８１４Ｃ）抗体および抗ＬＲＲＫ２（Ｓ３７４Ｃ）抗体により免疫ブロットした。免疫ブロットを、Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＬＩＣＯＲによって定量化した。ＬＲＲＫ２リン酸化の量がリン特異的抗体／総ＬＩＣＯＲ吸光度単位の比（ｐＳ９１０／ＬＲＲＫ２［ＡＵ］）として示される。Ｂ．）内因性ＬＲＲＫ２の免疫沈殿物を、細胞が、細胞溶解の前に、示された時間にわたって３０μＭでのＨ−１１５２により処理されたことを除いて、Ａにおける場合のように分析した。Ｃ．）およびＤ．）それぞれ、Ｈ１１５２ではなく、スニチニブが用いられたことを除いて、Ａ．およびＢ．における場合と同様。データは平均±ＳＥＭであり、二連で行われたものであり、少なくとも２回の別個の実験を表す。
【図５】ＬＲＲＫ２キナーゼ活性がＳｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５のリン酸化ならびに１４−３−３の結合を制御するという証拠。ＡおよびＢ）示された形態のＦｌａｇ−ＬＲＲＫ２を一過性に発現するＨＥＫ−２９３細胞を、ＤＭＳＯビヒクルコントロールあるいは示された濃度のＨ１１５２またはスニチニブにより９０分間処理した。細胞を、０．５％ＮＰ４０および１５０ｍＭが補充された溶解緩衝液において溶解し、抗ＦＬＡＧ免疫沈殿に供した。免疫沈殿物を４〜１２％のＮｏｖｅｘ  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離し、ＦＬＡＧ（総ＬＲＲＫ２）、抗ｐＳ９１０、抗ｐＳ９３５による免疫ブロット、ならびに、１４−３−３オーバーレイアッセイに供した。類似する結果が２回の別個の実験において得られた。
【図６】Ｓｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５のリン酸化がＬＲＲＫ２の自己リン酸化によって媒介されないという証拠。内因性ＬＲＲＫ２を、ＤＭＳＯにより、あるいは、Ｓｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５の脱リン酸化を誘導するために３０μＭのＨ１１５２または１０μＭのスニチニブにより２時間処理されたＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞から免疫沈殿させた。免疫沈殿物を、０．５ＭのＮａＣｌを含有する溶解緩衝液により洗浄して、阻害剤を除き、その後、マグネシウム−ＡＴＰが存在する、または存在しない、２０μＭのＮｉｃｔｉｄｅを含有するキナーゼ緩衝液において３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、免疫沈殿物を８０００ｒｐｍで０．５分間遠心分離し、上清をＬＲＲＫ２キナーゼ活性の測定のためにＰ８１紙にスポットした。サンプル緩衝液をペレット化ビーズに加え、ＬＲＲＫ２のＳ９１０およびＳ９３５のリン酸化を免疫ブロット分析後に定量化した。メンブランはまた、ＬＲＲＫ２の自己リン酸化を評価するためにオートラジオグラフィーに供された。Ｈ−１１５２がＬＲＲＫ２キナーゼアッセイに対して有した副次的影響は大きくない。
【図７】ＬＲＲＫ２がどのようにしてＳ０ｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５のリン酸化を制御し、これにより、１４−３−３の結合を引き起こすかの提案されるモデル。本発明者らのデータは、ＬＲＲＫ２キナーゼ活性が、Ｓｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５に作用するプロテインキナーゼの活性を刺激するか、または、Ｓｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５に作用するプロテインホスファターゼの活性を阻害することを示唆する。このことは、ＬＲＲＫ２が１４−３−３のイソ型と相互作用することを可能にし、また、ＬＲＲＫ２の拡散的な細胞質局在化を安定化させる。したがって、ＬＲＲＫ２阻害剤による細胞の処理により、Ｓｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５の脱リン酸化ならびに１４−３−３イソ型の解離が引き起こされる。本発明者らの知見は、Ｓｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５のＬＲＲＫ２リン酸化ならびに１４−３−３の結合が、開発途中にあるＬＲＲＫ２阻害剤の効力を評価するためのバイオマーカーとして用いられ得るであろうことを示している。
【図８】１４−３−３の結合はＬＲＲＫ２の細胞質局在化に影響を与える。Ａ．）示された形態のＬＲＲＫ２を有する安定な誘導可能なＴ−ＲＥｘ細胞株を、ＧＦＰ−ＬＲＲＫ２の発現を誘導するために０．１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンにより２４時間誘導した。各変異体の誘導された細胞から得られる細胞溶解物の等量を、融合タンパク質を検出するための抗ＧＦＰ抗体、または、負荷コントロールとしての抗ＧＡＰＤＨによる免疫ブロット分析に供した。Ｂ．）示された形態のＧＦＰ−ＬＲＲＫ２の培養物を表す蛍光顕微鏡写真が示される。１４−３−３非結合性変異体において認められるＧＦＰ−ＬＲＲＫ２の細胞質プールが白矢じりにより示される。
【図９】４１個のパーキンソン病に伴うＬＲＲＫ２変異体の活性および１４−３−３結合。挿入図は、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）、Ｒａｓ複合体ＧＴＰａｓｅドメイン（ＲＯＣ）、Ｒｏｃのカルボキシ末端（ＣＯＲ）、ならびに、キナーゼ触媒作用ドメイン（キナーゼ）および最小ＷＤ４０反復ドメイン（ＷＤ４０）の注釈が施されるＬＲＲＫ２のドメイン構造を例示する。ＰＤ関連変異の位置が示される。これらのドメインのアミノ酸境界が示される。ＦＬＡＧタグ標識された全長型ＬＲＲＫ２の示された変化体をＨＥＫ２９３細胞において一過性に発現させ、免疫沈殿分析に供した。免疫沈殿物のキナーゼ活性をＬＲＲＫｔｉｄｅに対して評価し、比活性を、ＬＩＣＯＲ技術を使用するＬＲＲＫ２の定量的抗ＦＬＡＧ免疫ブロット分析によって求め、ｃｐｍ／ＬＩＣＯＲとして定義した。野生型ＬＲＲＫ２の活性を１に設定した。変異体の活性は野生型に相対する。アッセイを３回の実験について二連で行った。棒はｓ．ｅ．ｍ．である。ＦＬＡＧ−ＬＲＲＫ２免疫沈殿物はまた、抗ＦＬＡＧ抗体、抗ｐＳｅｒ９１０抗体および抗ｐＳｅｒ９３５抗体による免疫ブロット分析に供された。ＬＲＲＫ２変化体への１４−３−３結合を、１４−３−３ファーウエスタン分析、および、１４−３−３を共沈殿させるための１４−３−３免疫ブロッティングによって評価した。
【図１０】ＬＲＲＫ２［Ｒ１４４１Ｃ］ノックインマウスにおけるＳｅｒ９１０／Ｓｅｒ９３５のリン酸化および１４−３−３結合の破壊。脳、腎臓および脾臓の組織を３匹のホモ接合性ＬＲＲＫ２［Ｒ１４４１Ｃ］ノックインマウスおよび３匹の野生型同腹子コントロールから素早く切除し、液体窒素でスナップ凍結した。ＬＲＲＫ２を、脳、腎臓または脾臓の全組織溶解物から免疫沈殿させた。免疫沈殿物をＳｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５におけるＬＲＲＫ２のリン酸化について、また、総ＬＲＲＫ２について免疫ブロットした。１４−３−３結合と相互作用し得るかを、１４−３−３ファーウエスタン分析によって評価した。脾臓からの十分なサンプルが、Ｓｅｒ９１０のリン酸化を測定するために入手できなかったことには留意すること。
【図１１】４１個のＰＤ関連ＬＲＲＫ２変異体の位置決定。示された変異体を有する安定な誘導可能なＴ−ＲＥｘ細胞株の並行培養物を、ＧＦＰ−ＬＲＲＫ２の発現を誘導するために１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンにより２４時間誘導した。Ａ．）各変異体の誘導された細胞から得られる細胞溶解物の等量を、融合タンパク質を検出するための抗ＧＦＰ抗体、または、負荷コントロールとしての抗ＥＲＫ１による免疫ブロット分析に供した。Ｂ．）それぞれのＰＤ関連変異体の培養物を表す蛍光顕微鏡写真（パネル１〜４３）が示される。ＧＦＰ−ＬＲＲＫ２の細胞質プールが白矢じりにより示される。位置決定分析を２つの独立して作製された安定な細胞株に対して二連で行った。顕微鏡写真のそれぞれのより大きいパネルが図１２に示される。
【図１２】４１個のＰＤ関連ＬＲＲＫ２変異体の影響のまとめ。  野生型に対するキナーゼ活性、この場合、−は、活性が検出できないことを示し、＋は、変化がほぼないことに等しく、それぞれの倍数増大がさらなる＋によって表される。ホスホセリン９１０およびホスホセリン９３５のリン酸化ならびに直接の１４−３−３結合の影響、この場合、変化がないことが、＋＋によって表され、＋は、Ｓｅｒ９１０／Ｓｅｒ９３５のリン酸化または１４−３−３の結合における低下を示し、−は、Ｓｅｒ９１０／Ｓｅｒ９３５のリン酸化または１４−３−３の結合が検出できないことを示す。局在化が、拡散的な細胞質染色については拡散的として示される。凝集物は、細胞質プールの出現を意味する。本発明者らはＬＲＲＫ２変異体を６つのグループに分けている。グループ１の変異体は、キナーゼ活性における２倍を超える増大、しかし、正常な１４−３−３結合および拡散的局在化を示す（緑色陰影−＊）。グループ２の変異体は、正常なキナーゼ活性、しかし、低下したＳｅｒ９１０／Ｓｅｒ９３５のリン酸化ならびに１４−３−３の結合を示し、細胞質プール内に蓄積する（桃色陰影−＊＊）。グループ３の変異体は、正常なキナーゼ活性、しかし、低下したＳｅｒ９１０／Ｓｅｒ９３５のリン酸化ならびに１４−３−３の結合を示し、拡散的な細胞質局在化を示す（青色陰影−＊＊＊）。グループ４の変異体は、正常なキナーゼ活性、Ｓｅｒ９１０／Ｓｅｒ９３５のリン酸化ならびに１４−３−３の結合を示したが、細胞質プール内に蓄積する（黄色陰影−＊＊＊＊）。グループ５の変異体は、キナーゼ活性、Ｓｅｒ９１０／Ｓｅｒ９３５のリン酸化または１４−３−３の結合を何ら示さず、拡散的に局在化する（赤色陰影−＊＊＊＊＊）。グループ６の変異体は、野生型ＬＲＲＫ２と類似する性質を示す（陰影なし）。
【図１３】４１個のＰＤ関連ＬＲＲＫ２変異体の位置決定。顕微鏡写真のそれぞれのより大きいパネルが、明瞭さを改善するために示されることを除いて、図１１に示されるのと同じ局在化データ。
【図１４】１４−３−３結合の破壊は細胞質凝集物内におけるＬＲＲＫ２の蓄積を誘導する。Ａ．）示された形態のＬＲＲＫ２を有する安定な誘導可能なＴ−ＲＥｘ細胞株を、ＧＦＰ−ＬＲＲＫ２の発現を誘導するために０．１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンにより２４時間誘導した。示された細胞株を、固定処理の前に、示された用量のＨ−１１５２の非存在下または存在下で９０分間処理した。ＧＦＰ−ＬＲＲＫ２局在化の代表的な蛍光顕微鏡写真が示される。ＧＦＰ−ＬＲＲＫ２の細胞質凝集物が白矢じりにより示される。Ｂ．）示された形態のＧＦＰ−ＬＲＲＫ２の培養物を表す蛍光顕微鏡写真が示される。ＧＦＰ−ＬＲＲＫ２の細胞質凝集物が白矢じりにより示される。位置決定分析を二連で行った。類似する結果が２つの独立した実験において認められた。
【図１５】内因性ＬＲＲＫ２を、ＤＭＳＯビヒクルコントロールまたは示された濃度の強力なＲＯＣＫ阻害剤ＧＳＫ４２９２８６Ａにより９０分間処理されたＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞から抗ＬＲＲＫ２  １００−５００（Ｓ３４８Ｃ）により免疫沈殿させた。免疫沈殿物を、示された抗体による免疫ブロット分析、ならびに、１４−３−３オーバーレイ・ファーウエスタン分析に供した。免疫ブロット分析を、Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＬＩＣＯＲ分析によって定量化した。ＬＲＲＫ２リン酸化の量がリン特異的抗体／総ＬＩＣＯＲ吸光度単位の比（ｐＳ９１０／ＬＲＲＫ２［ＡＵ］）として示される。
【図１６】ＧＦＰ−ＬＲＲＫ２を安定的に発現するＨＥＫ−２９３を、ＤＭＳＯ、または、ＤＭＳＯに溶解される下記の阻害剤により、示された濃度で９０分間処理した。スニチニブ（ＬＲＲＫ２阻害剤［非特許文献４０］）、ＧＤＣ−０９４１（ＰＩ３Ｋ阻害剤［非特許文献４１］）、ＰＩ−１０３（ｍＴＯＲ／ＰＩ３Ｋの二重阻害剤［非特許文献４２］）、ＢＸ−７９５（ＭＡＲＫ／ＰＤＫ１の二重阻害剤［非特許文献４３］）、ＡＫＴｉ１／２（ＰＫＢ阻害剤［非特許文献４４］）、ＫＵ００６３７９４（ｍＴＯＲ阻害剤［非特許文献４５］）、ＣＨＩＲ−９９０２１（ＧＳＫ３阻害剤［非特許文献４６］）、ＢＡＹ４３９００６（Ｒａｆ阻害剤［非特許文献４７］）、ＰＤ−０３２５９０１（ＭＥＫ１阻害剤［非特許文献４８］）、ＢＩＤ−１８７０（ＲＳＫ阻害剤［非特許文献４９］）、ＢＩＲＢ−０７９６（ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤［非特許文献５０］）、ＳＢ２０３５８０（ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤［非特許文献５１］）、ＡＳ６０１２４５（ＪＮＫ阻害剤［非特許文献５２］）、ＳＰ６００１２５（ＪＮＫ阻害剤［非特許文献５３］）、ＢＭＳ３４５５４１（ＩＫＫ阻害剤［非特許文献５４］）、ＰＳ−１１４５（ＩＫＫ阻害剤［非特許文献５５］）、ＴＰＬ２阻害剤３１（Ｃｏｔ／ＴＰＬ２阻害剤［非特許文献５６］）、ネクロスタチン（ＲＩＰＫ阻害剤［非特許文献５７］）、Ｈ−８９（ＰＫＡ／ＲＯＣＫの二重阻害剤［非特許文献５８］）、ＲＯ−３１−８２２０（ＰＫＣ阻害剤［非特許文献５９］）、ロットレリン（ＰＫＣ阻害剤［非特許文献６０］）、ＳＴＯ−６０９（ＣａＭＫＫ阻害剤［非特許文献６１］）、化合物Ｃ（ＡＭＰＫ阻害剤［非特許文献６２］）、ＡＧ４９０（ＪＡＫ阻害剤［非特許文献６３］）、ＰＰ１（Ｓｒｃ阻害剤［非特許文献６４］）、ＰＰ２（Ｓｒｃ阻害剤［非特許文献６５］）、ＧＳＫ４２９２８６Ａ（ＲＯＣＫ阻害剤［非特許文献４０］）、ハルミン（ＣＤＫ／ＤＹＲＫの二重阻害剤［非特許文献６６］）、ロスコビチン（ＣＤＫ阻害剤［非特許文献６７］）、ＳＵ−６６６８（Ｓｒｃ／Ａｕｒｏｒａキナーゼの二重阻害剤［非特許文献６８］）、ＶＸ−６８０（Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤［非特許文献６９］）、ケルセタゲチン（ＰＩＭＫ阻害剤［非特許文献７０］）、４０１ＫｕＤＯＳ（ＤＮＡＰＫ阻害剤［非特許文献７１］）、ＢＩ−２５３６（ＰＬＫ１阻害剤［非特許文献７２］）。溶解後、３０μｇの溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、Ｓｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５におけるＬＲＲＫ２リン酸化について免疫ブロットした。総ＬＲＲＫ２をＧＦＰ免疫ブロットによって評価した。示される免疫ブロットは２回の独立した実験を表す。
【実施例１】
【００９３】
キナーゼ活性の阻害はＳｅｒ９１０／Ｓｅｒ９３５におけるＬＲＲＫ２の脱リン酸化および１４−３−３結合の破壊を引き起こす。ＬＲＲＫ２阻害剤を評価するための細胞系アッセイの開発。
ロイシンリッチリピートプロテインキナーゼ−２（ＬＲＲＫ２）は著しい数のパーキンソン病患者において変異している。Ｇｌｙ２０１９をＳｅｒに変化させるありふれた変異はキナーゼ触媒活性を高めるので、小分子のＬＲＲＫ２阻害剤は、パーキンソン病を処置することにおいて有用であるかもしれない。しかしながら、ロバストな細胞系アッセイを開発するために利用され得るであろうＬＲＲＫ２の生理学的基質または下流エフェクターが何ら特定されていないので、阻害剤の有効性は評価が困難である。今回、本発明者らは、内因性ＬＲＲＫ２が内因性１４−３−３イソ型と相互作用することを明らかにする。この相互作用が、ロイシンリッチリピートドメインの前方に位置する保存されたＳｅｒ９１０残基およびＳｅｒ９３５残基のリン酸化によって媒介される。驚くべきことに、ＬＲＲＫ２の２つの構造的に無関係な阻害剤（Ｈ−１１５２またはスニチニブ）によるＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞の処理は、Ｓｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５における内因性ＬＲＲＫ２の脱リン酸を誘導し、それにより、１４−３−３との相互作用を破壊した。本発明者らは、Ｈ−１１５２およびスニチニブが、ＬＲＲＫ２キナーゼ活性を阻害することによってＳｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５の脱リン酸化を誘導することを示唆する；これらの化合物は、薬物抵抗性ＬＲＲＫ２［Ａ２０１６Ｔ］変異体の有意な脱リン酸化を誘導することができなかった。そのうえ、ＬＲＲＫ２の１４−３−３非結合性変異体が、細胞質全体に拡散的に局在化するよりはむしろ、離散的な細胞質プールの中に蓄積するという知見と一致して、Ｈ−１１５２は、ＬＲＲＫ２が細胞質プール内に蓄積することを生じさせる。これらのデータは、Ｓｅｒ９１０、Ｓｅｒ９３５の脱リン酸化、または、１４−３−３結合の破壊、および／あるいは、ＬＲＲＫ２の細胞質局在化をモニターすることが、ＬＲＲＫ２キナーゼ阻害剤の相対的効力をインビボで評価するためのマーカーとして使用され得ることを示している。これらの知見はＬＲＲＫ２キナーゼ阻害剤の開発を助けるであろう。これらの知見はまた、Ｓｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５のリン酸化がどのようにＬＲＲＫ２によって制御されるかを理解し、かつ、パーキンソン病の発症に対する何らかの関係を確立するためのさらなる研究を刺激するであろう。
【００９４】
材料および方法
試薬および一般的方法。組織培養試薬をＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得た。グルタチオンＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４ＢをＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得た。［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰをＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒから得た。Ｐ８１ホスホセルロース紙をＷｈａｔｍａｎから得た。Ｐｅｐｃｅｕｔｉｃａｌｓにより、Ｎｉｃｔｉｄｅが合成された。Ｆｌｐ−ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘシステムをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た。安定な細胞株は、ヒグロマイシンによる選抜によって製造者の説明書に従って作製されたものであり、以前に記載されている［非特許文献８］。制限酵素消化、ＤＮＡ連結および他の組換えＤＮＡ手順を、標準的プロトコルを使用して行った。すべての変異誘発を、Ｑｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して行った。トランスフェクションのために使用されるＤＮＡ構築物を、ＱｉａｇｅｎまたはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのプラスミドＭａｘｉキットを製造者のプロトコルに従って使用して大腸菌ＤＨ５αから精製した。すべてのＤＮＡ構築物がＤＮＡ配列決定によって確認された（ＤＮＡ配列決定が、ＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴターミネーター化学（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ自動ＤＮＡシーケンサーで使用して、Ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｕｎｄｅｅ（スコットランド、英国）によって行われた）。Ｈ１１５２をＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入し、スニチニブをＬＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。
【００９５】
緩衝液。溶解緩衝液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％（ｗ／ｖ）１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１０ｍＭ  β−グリセロリン酸ナトリウム、５０ｍＭ  ＮａＦ、５ｍＭピロリン酸ナトリウム、０．２７Ｍスクロース、１ｍＭベンズアミジンおよび２ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含有し、かつ、示されるように１５０ｍＭのＮａＣｌとともに、１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００または０．５％（ｖ／ｖ）のＮＰ−４０のどちらかが補充された。緩衝液Ａは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡおよび０．１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール、ならびに、０．２７Ｍスクロースを含有した。λホスファターゼ反応を、１ｍＭ  ＭＮＣｌ２および２ｍＭ  ＤＴＴが補充される緩衝液Ａにおいて行った。
【００９６】
細胞培養、処理および細胞溶解。ＨＥＫ−２９３細胞およびＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミンおよび１×抗真菌剤／抗生物質溶液が補充されるダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。Ｔ−ＲＥｘ細胞株を、１０％ＦＢＳおよび２ｍＭグルタミン、１×抗真菌剤／抗生物質［ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ］、ならびに、１５μｇ／ｍｌのブラストシジンおよび１００μｇ／ｍｌのヒグロマイシンが補充されるＤＭＥＭで培養した。培養物を、１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンを示された時間または２４時間培養培地に含むことによって、示されたタンパク質を発現させるために誘導した。
【００９７】
細胞トランスフェクションをポリエチレンイミン法［非特許文献１２］によって行った。阻害剤が利用される場合、阻害剤をＤＭＳＯに溶解し、コントロールとして使用されるＤＭＳＯの同等体積とともに、示された濃度で使用した。培養培地におけるＤＭＳＯの最終濃度は０．１％（ｖ／ｖ）を決して超えなかった。阻害剤を、溶解前に、示された時間にわたって培養培地に加えた。１５ｃｍディッシュあたり、ＨＥＫ２９３細胞は、示された界面活性剤が補充される溶解緩衝液の１．０ｍｌにより溶解され、３Ｔ３細胞は、示された界面活性剤が補充される溶解緩衝液の０．６ｍｌにより溶解され、１６，０００×ｇでの４℃での１０分間の遠心分離によって清澄化された。誘導および阻害剤処理の後、Ｔ−ＲＥｘ−ＧＦＰ発現細胞を、ＰＢＳによる洗浄の後、ＳＤＳ溶解緩衝液により室温で溶解した。ＳＤＳ溶解物を煮沸し、超音波処理して粘度を下げた。直ちに使用されないとき、すべての溶解物上清が液体窒素でスナップ凍結され、使用まで−８０℃で貯蔵された。タンパク質濃度を、ＢＳＡを標準物とするＢｒａｄｆｏｒｄ法を使用して求めた。
【００９８】
抗体。抗ＬＲＲＫ２  １００−５００（Ｓ３４８ＣおよびＳ４０６Ｃ）および抗ＬＲＲＫ２  ２９４８−２５１４（Ｓ３７４Ｃ）は、以前に記載されたものであった［非特許文献８］。ＬＲＲＫ２のホスホセリン９１０に対する抗体（Ｓ３５７Ｃ）を、ＫＬＨコンジュゲート化ホスホペプチドＶＫＫＫＳＮｐＳＩＳＶＧＥＦＹ（式中、ｐＳがホスホセリンである）をヒツジに注射することによって作製し、ホスホペプチドおよびデホスホペプチドに対する正の選抜および負の選抜によってそれぞれアフィニティー精製した。ＬＲＲＫ２のホスホセリン９３５に対する抗体（Ｓ８１４Ｃ）を、ＫＬＨコンジュゲート化ホスホペプチドＮＬＱＲＨＳＮｐＳＬＧＰＩＦＤＨ（式中、ｐＳがホスホセリンである）をヒツジに注射することによって作製し、ホスホペプチドおよびデホスホペプチドに対する正の選抜および負の選抜によってそれぞれアフィニティー精製した。ヒツジのポリクローナル抗体Ｓ６６２ＢをＭＢＰ−ＭＹＰＴニワトリアミノ酸（７１４〜１００４）に対して惹起させた。ＭＹＰＴホスホトレオニン８５０に対するウサギのポリクローナル抗体をＵｐｓｔａｔｅ（＃３６−００３）から得た。抗ＧＦＰ抗体（Ｓ２６８Ｂ）を組換えＧＦＰタンパク質に対して惹起させ、抗原に対してアフィニティー精製した。抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体およびアフィニティーマトリックスをＳｉｇｍａ（Ａ２２２０）から得た。Ｎａｎｏｔｒａｐ  ＧＦＰバインダーアフィニティーマトリックスをＣｈｒｏｍｏＴｅｋから得た。１４−３−３を認識するウサギポリクローナル抗体（Ｋ−１９、ＳＣ−６２９）、および、コントロールのウサギＩｇＧ（ＳＣ−２０２７）抗体をＳａｎｔａＣｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから得た。ＨＳＰ９０抗体をＣｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（＃４８７７）から得た。抗ＭＡＲＫ３をＵｐｓｔａｔｅ（＃０５−６８０）から得た。
【００９９】
免疫学的手順。細胞溶解物（１０μｇ〜３０μｇ）をＳＤＳポリアクリルアミドゲルまたはＮｏｖｅｘ  ４〜１２％グラジエントゲルでの電気泳動によって分離し、ニトロセルロースメンブランに電気ブロットした。メンブランを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ緩衝液）における５％スキムミルク（ｗ／ｖ）によりブロッキング処理した。ホスホ抗体については、一次抗体を、１０μｇ／ｍｌの脱リン酸化ペプチドを含むＴＢＳＴにおける５％スキムミルクで希釈されて１μｇ／ｍｌの濃度で使用した。すべての他の抗体は、ＴＢＳＴにおける５％（ｗ／ｖ）ミルクにおいて１μｇ／ｍｌで使用された。免疫複合体の検出を、蛍光団コンジュゲート化二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、その後、Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＬＩＣＯＲを使用する可視化、または、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）および増強ケミルミネセンス試薬による可視化のどちらかを使用して行った。免疫沈殿のために、抗体を１μｇ抗体／μｌビーズの比率でプロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに非共有結合によりカップリングしたか、または、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースを利用した。細胞溶解物をカップリング抗体と１時間インキュベーションした。免疫複合体を、０．３ＭのＮａＣｌが補充される溶解緩衝液により２回洗浄し、そして、緩衝液Ａにより２回洗浄した。沈殿物をキナーゼの供給源として使用したか、または、免疫ブロットによって直ちに分析した。オーバーレイ・ファーウエスタン分析で使用されるジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識された１４−３−３を、［非特許文献１３］に記載されるように調製した。ＬＲＲＫ２との１４−３−３相互作用を直接に評価するために、免疫沈殿物をニトロセルロースメンブランに電気ブロットし、５％スキムミルクにより３０分間ブロッキング処理した。ＴＢＳＴによる洗浄の後、メンブランを、４℃で一晩、ＴＢＳＴにおける５％ＢＳＡで１μｇ／ｍｌに希釈されるＤＩＧ標識された１４−３−３とインキュベーションした。ＤＩＧ  １４−３−３を、ＨＲＰ標識された抗ＤＩＧ  Ｆａｂフラグメント（Ｒｏｃｈｅ）により検出した。
【０１００】
ＳＩＬＡＣ培地。ＳＩＬＡＣ  ＤＭＥＭ培地（ＮａＨＣＯ３、Ｌ−グルタミン、アルギニン、リシンおよびメチオニンを含まない高グルコース、Ｂｉｏｓｅｒａ  ＃Ａ０３４７）を、１０％の透析ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を用いて調製し、これに、メチオニン、グルタミン、ＮａＨＣＯ３、標識された、または標識されないアルギニンおよびリシンを補充した。ＧＦＰタグ標識されたタンパク質を有する細胞を、下記の同位体標識化とともに１：１０の比率での３回の継代培養のために、ＳＩＬＡＣ  ＤＭＥＭにおいて培養した。ＧＦＰ対野生型ＬＲＲＫ２については、Ｌ−アルギニン（８４μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＬ−リシン（１４６μｇ／ｍｌ  リシン；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をＧＦＰ“ｌｉｇｈｔ”培地に加え、一方、Ｌ−アルギニン（１３Ｃ）およびＬ−リシン（１３Ｃ）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を同じ濃度でＧＦＰ−ＬＲＲＫ２野生型“ｈｅａｖｙ”培地に加えた。ＧＦＰ対ＬＲＲＫ２  Ｇ２０１９Ｓの実験については、Ｌ−アルギニンおよびＬ−リシンをＧＦＰ“ｌｉｇｈｔ”培地に加え、Ｌ−アルギニン（１３Ｃ／１５Ｎ）およびＬ−リシン（１３Ｃ／１５Ｎ）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）をＧＦＰ−ＬＲＲＫ２  Ｇ２０１９Ｓ“ｈｅａｖｙ”培地に加えた。アミノ酸濃度は通常のＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のための処方に基づく。調製されると、ＳＩＬＡＣ培地をよく混合し、０．２２μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過した。代謝標識された細胞を、ドキシサイクリンを培養培地に含むことによって２４時間、ＧＦＰまたはＧＦＰ−ＬＲＲＫ２融合タンパク質を発現させるために誘導した。
【０１０１】
ＳＩＬＡＣ質量分析。代謝標識され、かつ、ＧＦＰまたはＬＲＲＫ２野生型またはＧ２０１９Ｓのどれかを発現させるために誘導される細胞を、１０ｃｍディッシュあたり０．５ｍｌで、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が補充される溶解緩衝液において溶解した。それぞれの条件について個々に、９ｍｇの細胞溶解物を、４℃で１時間、２０μｌのベッド体積のＧＦＰバインダーアガロースビーズによる個々の免疫沈殿に供した。ビーズを、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および３００ｍＭのＮａＣｌが補充される溶解緩衝液の５ｍｌにより１回洗浄し、その後、この溶解緩衝液の１０ｍｌにより洗浄した。その後、ビーズを５ｍｌの貯蔵緩衝液により１回洗浄し、その後、１０ｍｌの貯蔵緩衝液により１回洗浄した。ビーズと会合したタンパク質を、７０℃で１０分間、１×ＬＤＳサンプル緩衝液により溶出し、その後、０．２２μｍのスピン−Ｘカラムに通した。コントロールＧＦＰの溶出液を、等量での野生型ＬＲＲＫ２またはＬＲＲＫ２  Ｇ２０１９Ｓのどちらかの溶出液と一緒にし、上記のように還元し、アルキル化した。サンプルをゲルの半分のみについて１２％のＮｏｖｅｘゲルで分離した。ゲルをコロイダルブルーにより一晩染色して、３時間脱染色した。レーン全体を以前の記載［非特許文献３０］のように、合計で９つのバンドで切り出し、トリプシンにより消化した。
【０１０２】
ペプチドの質量分析法による分析。消化物を、溶媒Ａ（２％アセトニトリル／０．１％ギ酸／９８％水）および溶媒Ｂ（９０％アセトニトリル／１０％水／０．０９％ギ酸）を用いて、Ｐｒｏｘｅｏｎ  Ｅａｓｙ−ＬＣナノフローＬＣシステム（Ｐｒｏｘｅｏｎ、デンマーク）に装着されるＰｅｐＭａｐ  Ｃ１８ナノカラム（７５μｍ×１５ｃｍ、Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に接続されるＢｉｏｓｐｈｅｒｅ  Ｃ１８トラップカラム（０．１ｍｍ（内径）×２ｍｍ、Ｎａｎｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、オランダ）で分離した。１０μｌのサンプル（合計で２μｇのタンパク質）を溶媒Ａにおいてトラップカラムに７μｌ／分の一定流速により負荷し、同じ流速で３分間洗浄した。トラップでの濃縮の後、ペプチドを、３００ｎｌ／分の一定流速による９０分間にわたる５％〜５０％の溶媒Ｂの直線グラジェントにより溶出した。ＨＰＬＣシステムは、５ｃｍのＰｉｃｏｔｉｐ  ＦＳ３６０−２０−１０エミッターが装着されるナノエレクトロスプレーイオン源（Ｐｒｏｘｅｏｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を介してリニア・イオン・トラップ−オービトラップ・ハイブリッド質量分析計（ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ）に接続された。スプレー電圧が１．２ｋＶに設定され、加熱キャピラーの温度が２００℃に設定された。プロフィルモードでのフルスキャンＭＳサーベイスペクトル（ｍ／ｚ  ３５０〜１８００）を、５００，０００個のイオンの蓄積の後、６０，０００の分解能によりＯｒｂｉｔｒａｐにおいて取得した。Ｏｒｂｉｔｒａｐにおけるプレビュースキャンからの５つ最も強いペプチドイオンを、１０，０００個のイオンの蓄積の後、ＬＴＱにおいて衝突誘導解離（正規化衝突エネルギー、３５％；活性化Ｑ、０．２５０；および活性化時間、３０ｍｓ）によってフラグメント化した。最大フィリング時間がフルスキャンについては１，０００ｍｓであり、ＭＳ／ＭＳスキャンについては１５０ｍｓであった。前駆体イオンの電荷状態スクリーニングが可能となり、すべての帰属されない電荷状態、ならびに、一価の化学種が棄却された。ロック質量オプションが、質量の正確性を改善するためにサーベイスキャンについて可能となった。データを、Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウエアを使用して取得した。
【０１０３】
質量分析法データのＭａｘＱｕａｎｔ分析。それぞれの実験について得られる生の質量分析データファイルを、ＭａｘＱｕａｎｔ（バージョン１．０．１３．１３）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｘｑｕａｎｔ．ｏｒｇ）およびＭａｓｃｏｔ検索エンジン（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、バージョン２．２．２）ソフトウエアを使用して１つの定量化されたデータセットにまとめた。酵素特異性をトリプシンの酵素特異性に設定した（これは、プロリン残基のＮ端側での切断、および、アスパラギン酸残基と、プロリン残基との間における切断について考慮する）。ソフトウエア内で使用される他のパラメーター：変更可能な修飾−メチオニンの酸化；データベース−標的・おとりのヒトＭａｘＱｕａｎｔ（ｉｐｉ．ＨＵＭＡＮ．ｖ３．５２．ｄｅｃｏｙ）（これは１４８，３８０個のデータベース入力を含有する）；標識−Ｒ６Ｋ４［ＧＦＰ対野生型ＬＲＲＫ２について］またはＲ１０Ｋ８［ＧＦＰ対ＬＲＲＫ２  Ｇ２０１９Ｓについて］；ＭＳ／ＭＳ許容誤差−０．５Ｄａ；（ｅ）１００Ｄａあたりの最高ＭＳ／ＭＳピーク−５；最大見逃し切断−２；標識アミノ酸の最大値：３；誤発見率（ＦＤＲ）：１％。
【０１０４】
ＬＲＲＫ２免疫沈殿キナーゼアッセイ。ペプチドキナーゼアッセイを、３０μＭのＮｉｃｔｉｄｅペプチド基質の存在下、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．１ｍＭ  ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（約５００〜１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）において、免疫沈殿ＬＲＲＫ２をキナーゼの供給源として用いて５０μｌの総体積で組み立てた。反応を、反応混合物の３０μｌをＰ８１ホスホセルロース紙に加え、５０ｍＭリン酸に浸すことによって停止させた。徹底した洗浄の後、反応生成物をチェレンコフ計数によって定量化した。残る反応液の半分を、Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＬＩＣＯＲシステムを使用する免疫ブロット分析に供した。比活性がｃｐｍ／ＬＩＣＯＲに依存しない密度値として表される。
【０１０５】
５００μｇのトランスフェクション細胞溶解物を、５μｌのベッド体積の抗ＦＬＡＧアガロースによる免疫沈殿に１時間供した。ビーズを、３００ｍＭ  ＮａＣｌが補充される溶解緩衝液により２回、その後、緩衝液Ａにより２回洗浄した。ペプチドキナーゼアッセイを、２００μＭの長い変化体のＬＲＲＫｔｉｄｅペプチド基質（ＲＬＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱＧＮＴＫＱＲ）［非特許文献９、１０］またはＮｉｃｔｉｄｅペプチド基質（ＲＬＧＷＷＲＦＹＴＬＲＲＡＲＱＧＮＴＫＱＲ）［非特許文献１０］の存在下、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．１ｍＭ  ［λ−３２Ｐ］ＡＴＰ（約３００〜５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）において、免疫沈殿ＬＲＲＫ２を用いて５０μｌの総体積で組み立てた。反応を、反応混合物の３０μｌをＰ８１ホスホセルロース紙に加え、５０ｍＭリン酸に浸すことによって停止させた。徹底した洗浄の後、反応生成物をチェレンコフ計数によって定量化した。残る反応液の半分を、Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＬＩＣＯＲシステムを使用する免疫ブロット分析に供した。比活性がｃｐｍ／ＬＩＣＯＲに依存しない密度値として表される。
【０１０６】
質量分析法によるリン酸化部位の特定。内因性ＬＲＲＫ２および組換えＬＲＲＫ２を、抗ＬＲＲＫ２（１００−５００）アガロースまたは抗ＦＬＡＧアガロースを使用して、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３溶解物、または、ＦＬＡＧ−ＬＲＲＫ２を発現させるために誘導されるＴ−Ｒｅｘ細胞の細胞溶解物の５０ｍｇからそれぞれ免疫沈殿させた。免疫沈殿物を、２×ＬＤＳサンプル緩衝液または２００μｇ／ｍｌ  ＦＬＡＧペプチドを使用してアフィニティーマトリックスから溶出させ、１０ｍＭジチオスレイトールによる還元および５０ｍＭヨードアセトアミドによるアルキル化の前に０．２μｍのＳｐｉｎ−Ｘカラム（Ｃｏｒｎｉｎｇ）でろ過した。サンプルを７０℃で１０分間加熱し、コロイダルブルー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による染色に先立って４〜１２％のＮｏｖｅｘゲルで分離した。ＬＲＲＫ２に対応するバンドを切り出し、以前の記載［非特許文献３０］のようにトリプシンにより消化した。サンプルを、上位５つのイオンが、親イオンからのリン酸の中性喪失（ｚ＝２、３および４について、中性喪失質量＝４９、３２．３３および２４．５）の多段階活性化を使用するリニア・イオン・トラップでフラグメント化されたことを除いて、上記のように、ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ）で分析した。Ｍａｓｃｏｔ包括的ファイルを、ｒａｗ２ｍｓｍ（Ｍ．Ｍａｎｎからの譲渡）を使用して生ファイルから作製し、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｄｅｘ（ＩＰＩ）マウスデータベースを内因性ＬＲＲＫ２について使用するか、または、ＩＰＩヒトデータベースを組換えＬＲＲＫ２について使用するローカルＭａｓｃｏｔサーバー（ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）に対して検索した。
【０１０７】
蛍光顕微鏡観察。ＨＥＫ−２９３  Ｆｌｐ−ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、ＬＲＲＫ２のＧＦＰタグ標識された野生型および変異体形態を有する安定な細胞を、標準的プロトコルを使用して作製した。細胞を４ウエルのガラス製底部のＣＣ２被覆チャンバースライド（Ｎｕｎｃ）に置床した。置床後１日目に、細胞を０．１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンにより誘導し、２４時間後、細胞を、リン酸塩緩衝化生理的食塩水で緩衝化される４％パラホルムアルデヒド（ＵＳＢから購入、＃１９９４３）において固定処理した。細胞をＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に載せ、αＰｌａｎ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔの１００倍対物レンズを使用するＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ７００共焦点顕微鏡でそれぞれの変異体について同じ設定のもとで画像化した。
【０１０８】
結果
ＬＲＲＫ２の１４−３−３との会合。本発明者らは、ＨＥＫ−２９３細胞に由来する安定的に発現された全長型ＧＦＰ−ＬＲＲＫ２（図１Ａおよび図１Ｂ）、同様にまた、ＧＦＰ−ＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］変異体（図１Ｃおよび図１Ｄ）の免疫沈殿物と会合するタンパク質を特定するために、定量的な、細胞培養でのアミノ酸による安定同位体標識化（ＳＩＬＡＣ）に基づく質量分析を用いた。最上位のヒット（これは、ＧＦＰ単独と比較して、ＧＦＰ−ＬＲＲＫ２またはＧＦＰ−ＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］に関して１０倍〜３０倍より大きいレベルで濃縮されたものである）は、野生型ＬＲＲＫ２については１４−３−３のべータイソ型、イータイソ型、シータイソ型、ゼータイソ型およびイプシロンイソ型を含み（図１Ｂ）、ＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］についてはべータイソ型、シータイソ型、ゼータイソ型、ガンマイソ型およびイプシロンイソ型を含んでいた（図１Ｄ）。観測された２つの他の大きな相互作用は、それらのキナーゼ特異的な標的化ＣＤＣ３７サブユニットとシャペロン会合する熱ショックタンパク質−９０（Ｈｓｐ９０）の２つのイソ型を含んでいた（５倍〜１５倍濃縮された）。Ｈｓｐ９０およびＣＤＣ３７は、野生型ＬＲＲＫ２と、同様にまた、ＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］変異型との両方と会合した。Ｈｓｐ９０およびＣＤＣ３７は、ＬＲＲＫ２と相互作用することが以前に報告されている［非特許文献１４］。ＬＲＲＫ２の他の有意な相互作用因子が本発明者らの相互作用因子スクリーニングでは何ら認められなかった。
【０１０９】
本発明者らは、Ｈｓｐ９０と同様に、内因性１４−３−３がＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞から内因性ＬＲＲＫ２と一緒に共免疫沈殿したことを見出した（図２Ａ）。本発明者らはまた、内因性ＬＲＲＫ２が、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞から、内因性１４−３−３イソ型を認識する抗体と一緒に共免疫沈殿したことを認めた（図２Ｂ）。ヒト１４−３−３の７つすべてのイソ型の発現のためにコードするプラスミドを、全長型ＦＬＡＧ−ＬＲＲＫ２を安定的に発現する以前に作製されたＨＥＫ−２９３細胞［非特許文献８］にトランスフェクションした。アフィニティー精製の後、変則的なシグマイソ型は別として、１４−３−３の他のすべての形態がＦＬＡＧ−ＬＲＲＫ２と相互作用した（図１Ｃ）。本発明者らはまた、全長型ＬＲＲＫ２が２９３細胞における内因性１４−３−３と会合したが、並行実験では、試験されたＬＲＲＫ２の様々な単離されたドメインは１４−３−３と結合することができなかったことを認めた（図１Ｄ）。この観察結果が、１４−３−３オーバーレイ−ファーウエスタン結合アッセイを用いて確認され、このアッセイでは、単離されたドメインではなく、全長型ＬＲＲＫ２がジゴキシゲニン標識の１４−３−３に結合した（図１Ｄ−下段パネル）。
【０１１０】
１４−３−３のイソ型はほとんどが、それらの結合パートナー上における特定のリン酸化された残基と相互作用する［非特許文献１１、１５］。１４−３−３のＬＲＲＫ２との会合がリン酸化に依存したどうかを確認するために、本発明者らは内因性ＬＲＲＫ２（図２Ｅ）または過剰発現させたＦＬＡＧ−ＬＲＲＫ２（図２Ｆ）をラムダホスファターゼの存在下または非存在下でインキュベーションした。ラムダホスファターゼによる内因性ＬＲＲＫ２または過剰発現ＬＲＲＫ２の処理は、オーバーレイアッセイを使用して評価される１４−３−３の相互作用を著しく低下させた。ＥＤＴＡがアッセイに含まれる場合（ＥＤＴＡがアッセイに含まれることにより、ラムダホスファターゼが阻害される）、ラムダホスファターゼがＬＲＲＫ２への１４−３−３結合を抑制することが妨げられた（図２Ｅおよび図２Ｆ）。ラムダホスファターゼ処理の後におけるＬＲＲＫ２への１４−３−３の残存結合は恐らくは、ＬＲＲＫ２の不完全な脱リン酸化に起因するものと思われる。
【０１１１】
内因性ＬＲＲＫ２における主要なリン酸化部位のマッピング。どのリン酸化された残基が１４−３−３への結合を媒介するかを明らかにするために、本発明者らは、マウスＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞から免疫沈殿された内因性ＬＲＲＫ２の詳細なホスホペプチドｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析法分析を行った（図３Ａ）。これにより、３つの明瞭なリン酸化部位、すなわち、Ｓｅｒ８６０、Ｓｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５が明らかにされた（図３Ｂ）。これらの残基は、ロイシンリッチリピートの直前であるＬＲＲＫ２のＮ端側の非触媒作用領域に位置する（図３Ｃ）。本発明者らはまた、ＨＥＫ−２９３細胞において発現される過剰発現させた全長型ヒトＦＬＡＧ−ＬＲＲＫ２のリン酸化を分析し、これにより、Ｓｅｒ８６０、Ｓｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５がリン酸化の主要な部位であることが確認された（図３Ａおよび図３Ｂ）。加えて、本発明者らは、過剰発現させたヒトＦＬＡＧ−ＬＲＲＫ２の調製物における３つの他のリン酸化部位、すなわち、Ｓｅｒ９５５、Ｓｅｒ９７３およびＳｅｒ９７６を見出した（図３Ｂおよび図３Ｃ）。Ｓｅｒ９５５、Ｓｅｒ９７３およびＳｅｒ９７６を含むホスホペプチドもまた、内因性ＬＲＲＫ２の本発明者らの分析では検出されたが、これらのペプチドは存在量がより少なかったために、本発明者らはその正確なリン酸化部位を定めることができなかった（データは示されず）。
【０１１２】
Ｓｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５のリン酸化は１４−３−３結合を媒介するが、キナーゼ活性を制御しない。本発明者らは、Ｓｅｒ８６０、Ｓｅｒ９５５、Ｓｅｒ９７３、Ｓｅｒ９７６、または、Ｓｅｒ９７３＋９７６の両方のリン酸化部位のＡｌａへの変異は、全長型ＦＬＡＧ−ＬＲＲＫ２への１４−３−３の結合に影響を及ぼさなかったことを認めた（図３Ｄ）。しかしながら、驚くべきことに、Ｓｅｒ９１０および／またはＳｅｒ９３５のＡｌａへの変異は相互作用を失わせた。このことは、これらの残基のリン酸化が１４−３−３イソ型へのＬＲＲＫ２の結合を媒介することを示している（図３Ｄ）。特定されたリン酸化部位の変異は、Ｎｉｃｔｉｄｅ基質ペプチドに対して測定されるとき、ＬＲＲＫ２のプロテインキナーゼ活性に影響を及ぼさなかった（図３Ｄ）。
【０１１３】
次に、本発明者らは、Ｓｅｒ９１０またはＳｅｒ９３５がリン酸化されるＬＲＲＫ２を認識するリン特異的抗体を作製した。これらの抗体は特異的であった。これは、Ｓｅｒ９１０のＡｌａへの変異はホスホ−Ｓｅｒ９１０抗体によるＬＲＲＫ２の認識を失わせ、同様に、Ｓｅｒ９３５の変異はホスホ−Ｓｅｒ９３５抗体による認識を失わせたからである（図３Ｅ）。本発明者らは、Ｓｅｒ９１０のＡｌａへの変異が、ＬＩＣＯＲによって定量化されたとき、Ｓｅｒ９３５のリン酸化をおよそ半減させ、また、逆も同様に、Ｓｅｒ９３５の変異がＳｅｒ９１０のリン酸化をおよそ半減させたことを一貫して認めた（図３Ｅ）。これらの抗体を利用して、本発明者らは、マウスの脳、腎臓および脾臓から免疫沈殿される内因性ＬＲＲＫ２がＳｅｒ９１０ならびにＳｅｒ９３５においてリン酸化されたこと、また、この内因性ＬＲＲＫ２もまた、１４−３−３と結合したことを明らかにする（図３Ｆ）。
【０１１４】
配列アライメントにより、Ｓｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５の部位、同様にまた、それらを取り囲む残基が、哺乳動物種では高度に保存されていることが示される（図３Ｇ）。Ｓｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５を含むこの領域は、線虫またはキイロショウジョウバエのＬＲＫ−１には存在せず、また、実際、哺乳動物のＬＲＲＫ１には存在しない。Ｓｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５の周りの残基を比較することにより、いくつかの驚くべき類似性が示される（図３Ｈ、すなわち、−３位および−４位における塩基性残基、−２位におけるＳｅｒ残基、−１位におけるＡｓｎ、および、＋１位における大きい疎水性残基）。
【０１１５】
ＬＲＲＫ２阻害剤はＳｅｒ９１０／Ｓｅｒ９３５の脱リン酸化を誘導し、１４−３−３結合を破壊した。Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞をＬＲＲＫ２阻害剤のＨ−１１５２（図４Ａ）またはスニチニブ（図４Ｃ）の増大する量とインキュベーションすることにより、Ｓｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５における内因性ＬＲＲＫ２の用量依存的な脱リン酸化が生じ、これには、１４−３−３結合が同時に減少することが付随した。１０μＭ〜３０μＭのＨ−１１５２または３μＭ〜１０μＭのスニチニブはＳｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５のほとんど完全な脱リン酸化を誘導し、その結果、１４−３−３結合の喪失を生じさせた。内因性ＬＲＲＫ２−Ｓｅｒ９１０／Ｓｅｒ９３５リン酸化および１４−３−３結合に対するＨ−１１５２の阻害効果（図４Ｂ）およびスニチニブの阻害効果（図４Ｄ）が３０分以内に認められ、少なくとも２時間にわたって持続した。
【０１１６】
ＬＲＲＫ２キナーゼ活性はＳｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５のリン酸化ならびに１４−３−３結合を制御するという証拠。ＬＲＲＫ２のリン酸化および１４−３−３の結合に対するＨ１１５２およびスニチニブの影響がＬＲＲＫ２プロテインキナーゼ活性の阻害から生じたことを明らかにするために、本発明者らは、ＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］変異体またはＨ１１５２／スニチニブ抵抗性ＬＲＲＫ２［Ａ２０１６Ｔ＋Ｇ２０１９Ｓ］変異体を過剰発現するＨＥＫ−２９３をＬＲＲＫ２阻害剤により処理した。内因性ＬＲＲＫ２に関して認められるように、本発明者らは、Ｈ−１１５２およびスニチニブが、Ｓｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５におけるパーキンソン病ＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］変異体の用量依存的な脱リン酸化、ならびに、１４−３−３への結合を破壊することを誘導したことを見出した（図５Ａ−上段パネル）。しかしながら、非常に重要なことに、Ｈ−１１５２またはスニチニブのどちらも、Ｓｅｒ９１０またはＳｅｒ９３５のリン酸化、あるいは、薬物抵抗性ＬＲＲＫ２［Ａ２０１６Ｔ＋Ｇ２０１９Ｓ］変異体への１４−３−３結合を有意に阻害しなかった（図５Ａ−下段パネル）。このことは、Ｈ１１５２およびスニチニブがＳｅｒ９１０ならびにＳｅｒ９３５の脱リン酸化を誘導し得ること、したがって、１４−３−３結合を破壊し得ることが、これらの化合物がＬＲＲＫ２プロテインキナーゼ活性を阻害し得ることに依存していることを強く示唆する。
【０１１７】
Ｈ−１１５２およびスニチニブが変異体ＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］を野生型ＬＲＲＫ２よりも２倍〜４倍強く阻害することを明らかにする薬理学的データ［非特許文献８］と一致して、本発明者らは、Ｈ１１５２およびスニチニブが、脱リン酸化を誘導することにおいて、また、１４−３−３のＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］への結合を損なうことにおいて、野生型ＬＲＲＫ２よりも強力であったことを見出した（図５Ａおよび図５Ｂ−上段パネルを比較せよ）。野生型ＦＬＡＧ−ＬＲＲＫ２の脱リン酸化を２９３細胞において誘導することにおけるＨ−１１５２およびスニチニブの効力は、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞において内因性ＬＲＲＫ２について認められるこれらの薬物の影響と類似していた（図４および図５Ｂを比較せよ）。
【０１１８】
ＬＲＲＫ２がＳｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５を自己リン酸化しないという証拠。ＬＲＲＫ２は、セリン残基よりもトレオニン残基をリン酸化する著しい優先傾向を有しており［非特許文献８］、このことは、Ｓｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５のリン酸化が自己リン酸化によって媒介されないかもしれないことを示唆する。このことと一致して、ＬＲＲＫ２自己リン酸化部位を調べる他の研究では、多数のホスホトレオニン自己リン酸化部位がマッピングされているが、ＬＲＲＫ２がＳｅｒ９１０またはＳｅｒ９３５においてリン酸化することは報告されていない［非特許文献１６〜１８］。内因性ＬＲＲＫ２がＳｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５において自身をリン酸化し得るかどうかをさらに調べるために、本発明者らは、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞を、非薬物下で、または、Ｓｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５の脱リン酸化を誘導するために３０μＭのＨ−１１５２でのどちらかで処理した（図６）。内因性ＬＲＲＫ２を免疫沈殿させ、洗浄して薬物を除き、免疫沈殿物をマグネシウム−ＡＴＰの非存在下または存在下でインキュベーションした。３０分後、ＬＲＲＫ２キナーゼ活性、ならびに、Ｓｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５のリン酸化を定量化した。これらの研究では、Ｈ−１１５２処理された細胞から単離されるＬＲＲＫ２は脱リン酸化され、そして、薬物が除かれていたことを示す処理されていない細胞から単離されるＬＲＲＫ２と同じ活性を有したことが明らかにされた（図６）。重要なことではあるが、本発明者らは、Ｈ１１５２処理された細胞から得られるＬＲＲＫ２をマグネシウム−ＡＴＰとインキュベーションした後におけるＳｅｒ９１０またはＳｅｒ９３５のリン酸化における増大を何ら認めなかった。薬物非処理の細胞から単離されるＬＲＲＫ２の、Ｓｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５でのリン酸化の量もまた、自己リン酸化反応では増大しなかった。
【０１１９】
Ｓｅｒ９１０／Ｓｅｒ９３５のリン酸化に対する多数のシグナル伝達阻害剤の影響。Ｓｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５の脱リン酸化の特異性へのさらなる洞察を得るために、ＧＦＰ−ＬＲＲＫ２を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞を、ＰＩ３−キナーゼ、ｍＴＯＲ、ＥＲＫ、ｐ３８、ＪＮＫを含む細胞における主要なシグナル伝達経路、および、生来的な免疫シグナル伝達経路を抑制する阻害剤を含めて、３３個のキナーゼ阻害剤の一群により処理した（図１６）。すべての阻害剤を、文献で日常的に用いられる濃度の上限、および、シグナル伝達経路を抑制することが知られている本発明者らの単位で利用した。予想されるように、１０μＭのスニチニブはＳｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５の著しい脱リン酸化を誘導し、一方で、試験された阻害剤のうちの３２個はＳｅｒ９１０／Ｓｅｒ９３５の脱リン酸化に有意な影響を及ぼさなかった。Ｓｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５のある程度の脱リン酸化が、１５μＭの濃度で使用され、多くのプロテインキナーゼをＪＮＫよりも強く阻害することが知られている比較的非特異的なＪＮＫ阻害剤ＳＰ６００１２５［非特許文献３４］に関して認められた。より強力なＪＮＫ阻害剤ＡＳ６０１２４５はこれらの部位の脱リン酸化を誘導しなかったことには留意しなければならない。さらなる研究が、Ｓｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５のリン酸化を直接に媒介するプロテインキナーゼを明確化するために必要であろう。
【０１２０】
１４−３−３結合の破壊はＬＲＲＫ２の細胞局在化を変化させる。１４−３−３タンパク質の一般的な役割は、１４−３−３タンパク質が結合するタンパク質の細胞内局在化に影響を与えることである。したがって、本発明者らは、１４−３−３結合がＬＲＲＫ２の細胞局在化に影響を及ぼし得るかどうかを調べた。低レベル、かつ、できる限り均一な発現を保証するために、本発明者らは、全長型ＧＦＰ−ＬＲＲＫ２の野生型形態および１４−３−３非結合性Ｓｅｒ９１０／Ｓｅｒ９３５変異体形態を安定的に発現するＦｌｐ−ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ  ２９３細胞を作製した。免疫ブロット分析により、野生型ＧＦＰ−ＬＲＲＫ２形態および変異体ＧＦＰ−ＬＲＲＫ２形態が類似するレベルで発現されたことが明らかにされた（図８Ａ）。次に、本発明者らは、共焦点顕微鏡観察を使用して細胞内局在化を調べ、以前の報告［非特許文献１８］と一致して、野生型ＬＲＲＫ２が細胞質ゾル全体に一様に分布し、核から排除されたことを見出した（図８Ｂ）。対照的に、ＬＲＲＫ２［Ｓ９１０Ａ］、ＬＲＲＫ２［Ｓ９３５Ａ］およびＬＲＲＫ２［Ｓ９１０Ａ＋Ｓ９３５Ａ］の１４−３−３非結合性変異体が細胞質ゾルプール内に蓄積した（図８Ｂ）。
【０１２１】
４１個のＬＲＲＫ２疾患関連変異体の１４−３−３結合の特徴づけ。次に、本発明者らは、ＬＲＲＫ２の４１個のパーキンソン病形態型のＳｅｒ９１０／Ｓｅｒ９３５リン酸化および１４−３−３結合特性を調べることに決めた。分析されたＬＲＲＫ２における種々の変異の場所が図９の挿入図に示される。本発明者らは、Ｎ端のＦｌａｇエピトープタグを有するＬＲＲＫ２の全長の野生型形態および変異体形態を２９３細胞において発現させた。ＬＲＲＫ２を免疫沈殿させ、タンパク質のレベルを定量的ＬＩＣＯＲ−免疫ブロッティング分析によって求めた。類似するレベルのＬＲＲＫ２形態物を免疫ブロット分析に供した。免疫ブロット分析では、変異体のほとんどが、野生型酵素と類似する程度にＳｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５においてリン酸化され、１４−３−３と相互作用したことが明らかにされた（図９、下段パネル）。しかしながら、Ｓｅｒ９１０／Ｓｅｒ９３５のリン酸化、したがって、１４−３−３結合が、４つの変異体（Ｒ１４４１Ｇ、Ｙ１６９９Ｃ、Ｅ１８７４ｓｔｏｐおよびＩ２０２０Ｔ）において失われた（図９、下段パネル）。Ｓｅｒ９１０／Ｓｅｒ９３５のリン酸化および１４−３−３結合が、６つの他の変異体（Ｍ７１２Ｖ、Ｒ１４４１Ｈ、Ｒ１４４１Ｃ、Ａ１４４２Ｐ、Ｌ１７９５ＦおよびＧ２３８５Ｒ）において有意に低下した（図９、下段パネル）。
【０１２２】
本発明者らはまた、ＬＲＲＫｔｉｄｅペプチド基質を用いてＬＲＲＫ２の４１個の変異体形態の相対的なプロテインキナーゼの比活性を比較した［非特許文献９］（図５）。以前の研究［非特許文献７〜９］と一致して、ＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］変異体は野生型ＬＲＲＫ２よりも約３倍大きい比活性を有した。２つの他の変異体、すなわち、ＬＲＲＫ２［Ｒ１７２８Ｈ］およびＬＲＲＫ２［Ｔ２０３１Ｓ］もまた、野生型ＬＲＲＫ２よりも２倍および４倍増大した活性をそれぞれ示した。キナーゼドメインを有さず、したがって、不活性であるＲ１８７４ｓｔｏｐ変異は別として、試験されたすべての他の変異体が野生型ＬＲＲＫ２と類似する活性を有した。
【０１２３】
１４−３−３の内因性ＬＲＲＫ２との会合がＬＲＲＫ２［Ｒ１４４１Ｃ］ノックインマウスでは損なわれる。ＬＲＲＫ２［Ｒ１４４１Ｃ］のパーキンソン病変異が１４−３−３結合を破壊するというさらなる証拠を得るために、本発明者らは、以前に報告された同腹子野生型マウスおよびホモ接合性ＬＲＲＫ２［Ｒ１４４１Ｃ］ノックインマウスに由来する内因性ＬＲＲＫ２と会合する１４−３−３のレベルを比較した［非特許文献１９］。ＬＲＲＫ２を、それぞれの遺伝子型の３匹の別個のマウスから得られる脾臓、腎臓および脳から免疫沈殿させた。免疫ブロッティングおよび１４−３−３オーバーレイ分析により、ＬＲＲＫ２発現のレベルが野生型マウスおよびノックインマウスにおいて類似しており、しかしながら、Ｓｅｒ９１０／Ｓｅｒ９３５のリン酸化および会合した１４−３−３のレベルが、野生型と比較されるＬＲＲＫ２［Ｒ１４４１Ｃ］ノックインマウスに由来する組織において著しく低下したことが明らかにされた（図１０）。変異の最大の影響が腎臓において認められた。
【０１２４】
ＬＲＲＫ２の４１個の変異体形態の細胞局在化。全長型ＧＦＰ−ＬＲＲＫ２の野生型形態および変異体形態の低レベル、かつ、できる限り均一な発現を保証するために、本発明者らは、ＧＦＰ−ＬＲＲＫ２の野生型形態および変異体形態を安定的に発現するＦｌｐ−ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ  ２９３細胞を作製した。免疫ブロット分析により、様々なＧＦＰ−ＬＲＲＫ２形態が比較的類似するレベルで発現されたことが明らかにされた（図１１Ａ）。調べられた野生型、キナーゼデッド変異体および多くの他のＬＲＲＫ２変異体の局在化が細胞質ゾル全体に一様に分布し、かつ、核から排除され、細胞質プール内における蓄積が認められなかった（図１１Ｂ、または、より大きい画像を見るための図１３を参照のこと）。驚くべきことに、低下したＳｅｒ９１０／Ｓｅｒ９３５のリン酸化および１４−３−３への結合を示したほとんどの変異体が細胞質ゾルプール内に蓄積した（Ｒ１４４１Ｃ、Ｒ１１４１Ｇ、Ｒ１４４１Ｈ、Ａ１４４２Ｐ、Ｙ１６９９Ｃ、Ｌ１７９５Ｆ、Ｉ２０２０Ｔ）。短縮されたＥ１８７４ｓｔｏｐ変異体（これは拡散的な細胞質局在化を示した）を除いて、２つの他の変異体（Ｍ７１２ＶおよびＧ２３８５Ｒ）だけが、低下したＳｅｒ９１０／Ｓｅｒ９３５のリン酸化および１４−３−３結合を示し（図９）、しかし、細胞質プールに蓄積しなかった（図１１Ｂまたは図１３）。１つだけの変異体（Ｒ１０６７Ｑ）が、１４−３−３と相互作用し、かつ、細胞質プール内に蓄積することが見出された（図１１Ｂまたは図１３）。
【０１２５】
１４−３−３結合の破壊はＬＲＲＫ２の細胞局在化を変化させる。細胞質全体に拡散的に局在化するよりはむしろ、１４−３−３と相互作用しないＬＲＲＫ２の変異体は、本実施例において示されるように、細胞質凝集物の中に蓄積する。このことは、本発明者らに、Ｈ−１１５２処理が、離散的な細胞質プールへのＧＦＰ−ＬＲＲＫ２またはＧＦＰ−ＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］の細胞質での再局在化を誘導するかどうかを調べることを促した（図１４）。本発明者らは、ＧＦＰ−ＬＲＲＫ２またはＧＦＰ−ＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］の薬物感受性形態または薬物抵抗性（Ａ２０１６Ｔ変異体）形態を低レベルで発現する安定な誘導可能なＴ−ＲＥｘ細胞株を用いた。非処理の細胞では、ＧＦＰ−ＬＲＲＫ２およびＧＦＰ−ＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］が細胞質全体に拡散的に局在化し、核には認められなかった（図１４Ａ）。しかしながら、Ｈ−１１５２処理はＬＲＲＫ２の細胞質プール内における著しい蓄積を誘導した（図１４Ａ）。Ｈ−１１５２のこの影響がＬＲＲＫ２キナーゼ活性の阻害を介して媒介されることに合致して、細胞質プールにおける蓄積が、薬物抵抗性のＬＲＲＫ２［Ａ２０１６Ｔ］またはＬＲＲＫ２［Ａ２０１６Ｔ＋Ｇ２０１９Ｓ］を発現する細胞をＨ−１１５２により処理したときには何ら認められなかった（図４Ａ）。さらなるコントロールとして、本発明者らは、１４−３−３と結合せず、細胞質プール内に蓄積することが以前に示されたＧＦＰ−ＬＲＲＫ２［Ｒ１４４１Ｃ］およびＧＦＰ−ＬＲＲＫ２［Ｙ１６９９Ｃ］の局在化を調べた［本実施例；３３］。本発明者らは、これらの変異体が、Ｈ−１１５２による処理の後でＧＦＰ−ＬＲＲＫ２およびＧＦＰ−ＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］について認められる細胞質プール様構造体と類似する細胞質プール様構造体の中に蓄積したことを確認した（図１４Ａおよび図１４Ｂを比較せよ）。
【０１２６】
考察
本論文における重要な知見が、ＬＲＲＫ２のキナーゼ活性により、Ｓｅｒ９１０／Ｓｅｒ９３５のリン酸化、したがって、１４−３−３結合、同様にまた、ＬＲＲＫ２の細胞質局在化が間接的に制御されることである。本発明者らが調べている細胞株（Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３（図４）およびＨＥＫ−２９３（図５））では、Ｓｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５におけるＬＲＲＫ２のリン酸化、したがって、１４−３−３への結合が、構造的に異なったＬＲＲＫ２阻害剤のＨ−１１５２およびスニチニブによる処理によって取り消された。本発明者らはまた、Ｈ−１１５２が、１４−３−３と結合しないＬＲＲＫ２変異体について認められる離散的な細胞質プールと類似する離散的な細胞質プールの中に蓄積するようにＬＲＲＫ２を誘導することを見出している（図１４Ｂ）。本発明者らは、ＬＲＲＫ２阻害剤が、薬物抵抗性ＬＲＲＫ２［Ａ２０１６Ｔ］変異体の脱リン酸化または再局在化を誘導することにおいて効果的ではないので（図５）、脱リン酸化および細胞質での再局在化がＬＲＲＫ２キナーゼ活性の阻害から生じると結論する。Ｈ−１１５２およびスニチニブが、ＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］のＳｅｒ９１０／Ｓｅｒ９３５の脱リン酸化を誘導することにおいて野生型ＬＲＲＫ２よりも強力である（図５）という知見はまた、これらの薬物がＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］を野生型ＬＲＲＫ２よりも２倍〜４倍強く阻害すること［非特許文献８］と一致している。
【０１２７】
本発明者らは、１４−３−３のイソ型が内因性ＬＲＲＫ２と相互作用し、これがＳｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５のリン酸化によって媒介されることを明らかにする。１４−３−３タンパク質が、多くの細胞内タンパク質（これらは、異なった細胞プロセスに対する広範囲に及ぶ影響を発揮する）と動的に相互作用する。それらは、標的タンパク質上における特定のリン酸化された残基に結合することによって働く。ＬＲＲＫ２が１４−３−３のイソ型と相互作用するという知見は、一次配列の分析によって予測され得ないと考えられる。これは、９１０および９３５のリン酸化部位の周りの残基は、１４−３−３相互作用の一般的モードのための最適なモード１およびモード２のコンセンサス結合モチーフにこだわらないからである［非特許文献１１、１５］。しかしながら、１４−３−３と相互作用する多くのタンパク質は、異なった予測できない変則的な結合モチーフを介して相互作用する。これは恐らくは、他の構造的特徴が相互作用に寄与すると考えられるからである［非特許文献１１］。
【０１２８】
本発明者らが調べているすべての細胞株（Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３（図４）およびＨＥＫ−２９３（図５））では、Ｓｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５におけるＬＲＲＫ２のリン酸化、したがって、１４−３−３への結合が、細胞を構造的に異なったＬＲＲＫ２阻害剤のＨ−１１５２およびスニチニブにより処理することによって取り消された。本発明者らは、Ｈ−１１５２ならびにスニチニブが、薬物抵抗性ＬＲＲＫ２［Ｔ２０１６Ａ］変異体の脱リン酸化を誘導することにおいて効果的ではないので（図５）、脱リン酸化がＬＲＲＫ２キナーゼ活性の阻害から生じると結論する。さらに、Ｈ−１１５２およびスニチニブは、ＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］の脱リン酸化を誘導することにおいて野生型ＬＲＲＫ２よりも強力であり（図５）、このことは、これらの薬物がＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］を野生型ＬＲＲＫ２よりも２倍〜４倍強く阻害することと一致している。
【０１２９】
重要な疑問が、ＬＲＲＫ２がＳｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５のリン酸化を制御する機構に関する。１つの可能性が、Ｓｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５が直接のＬＲＲＫ２自己リン酸化部位を構成することである。しかしながら、本発明者らのデータは、Ｈ−１１５２またはスニチニブにより処理された細胞から単離される脱リン酸化されたＬＲＲＫ２はマグネシウム−ＡＴＰとのインキュベーションの後でＳｅｒ９１０／Ｓｅｒ９３５において自身をリン酸化することができないことを示唆する（図６）。このことは、最適なペプチド基質におけるリン酸化Ｔｈｒ残基をＳｅｒ残基に置換することにより、ＬＲＲＫ２によるリン酸化が失われたという本発明者らの知見［非特許文献８］によって明らかにされるように、ＬＲＲＫ２が、セリン残基よりもトレオニン残基をリン酸化する著しい優先傾向を有することを一致している。さらには、ＬＲＲＫ２自己リン酸化部位をマッピングすることを目指した数多くの研究では、Ｓｅｒ９１０またはＳｅｒ９３５が特定されていない［非特許文献１６〜１８］。メラノーマ腫瘍の包括的ホスホプロテオミック研究では、Ｓｅｒ９３５におけるＬＲＲＫ２のリン酸化が、２２５０のタンパク質に関して分類される５６００のリン酸化部位の１つとして特定されたが、これはさらには調べられなかった［非特許文献１９］。
【０１３０】
ただ１つだけのプロテインキナーゼがこれらの残基の両方をリン酸化するかもしれないことを示唆する、Ｓｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５の周りの配列における有意な類似性が存在する（図３Ｇ）。本発明者らの知見が意味することは、Ｓｅｒ９１０／Ｓｅｒ９３５キナーゼがＬＲＲＫ２によって刺激されるかもしれないこと、および／または、これらの残基に作用するプロテインホスファターゼ（１つまたは複数）がＬＲＲＫ２によって阻害されることである。今後の研究では、Ｓｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５に作用するキナーゼ（１つまたは複数）および／またはプロテインホスファターゼ（１つまたは複数）を特定すること、ならびに、それらがＬＲＲＫ２によって制御されるかどうかを明らかにすることが重要であろう。
【０１３１】
本発明者らのデータは、Ｓｅｒ９１０またはＳｅｒ９３５のどちらかの変異により、相互作用１４−３−３相互作用が失われるので、Ｓｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５の両方のリン酸化が、結合するとしてＬＲＲＫ２との１４−３−３の安定な相互作用のために必要であることを示唆する。１４−３−３分子は、リン酸化された残基と相互作用する能力をそれぞれのモノマーが有するダイマーを形成する［非特許文献１５］。したがって、１４−３−３ダイマーは、２つのリン酸化された残基と相互作用する能力を有する。１４−３−３の１つのダイマーが、リン酸化されたＳｅｒ９１０およびリン酸化されたＳｅｒ９３５の両方と相互作用することが可能である。本発明者らはまた、Ｓｅｒ９１０またはＳｅｒ９３５のどちらかをＡｌａ残基に変異させることにより、他方の残基の有意な脱リン酸化が誘導されたことを認めた（図３Ｅ）。１４−３−３が結合することにより、ＬＲＲＫ２が、プロテインホスファターゼによって脱リン酸化されることから保護されるならば、このことは説明され得ると思われる。したがって、１４−３−３の結合をＳｅｒ９１０またはＳｅｒ９３５のどちらかの変異によって失わせることにより、他方の部位の脱リン酸化が促進されると思われる。他の標的（例えば、ホスファチジルイノシトール４−キナーゼＩＩＩベータ［非特許文献２０］またはＣｄｃ２５Ｃ［非特許文献２１］など）への１４−３−３結合は、リン酸化された残基をプロテインホスファターゼから立体的に遮蔽することによってであると恐らくは考えられるが、これらの酵素を脱リン酸化から保護することが示されている。
【０１３２】
１４−３−３タンパク質は最初、脳において非常に発現される酸性タンパク質として４２年以上前に特定された［非特許文献３１］。それ以降、様々な１４−３−３タンパク質が、パーキンソン病を含めて、数多くの神経学的障害の調節に関係しているとされている［非特許文献２６、２７］。例えば、１４−３−３イータは、パーキン、すなわち、常染色体劣性若年性パーキンソニズムにおいて変異するタンパク質に結合し、そのＥ３リガーゼ活性を負に調節する［非特許文献２２］。様々な１４−３−３タンパク質がアルファ−シヌクレインと相互作用し［非特許文献２３］、パーキンソン病患者の脳におけるレビー小体に見出されている［非特許文献２４］。加えて、１４−３−３シータ、１４−３−３イプシロンおよび１４−３−３ガンマは近年、神経毒性の細胞系モデルにおいてアルファ−シヌクレインの過剰発現の毒性影響を抑制することが示された［非特許文献２５］。本発明者らのデータは、ＬＲＲＫ２への１４−３−３結合が、パーキンソン病と関連があるかもしれないことを示唆する。これは、驚くべきことに、調べられた４１個の変異のうちの１０個がＳｅｒ９１０／Ｓｅｒ９３５の低下したリン酸化および１４−３−３イソ型への低下した結合を示したからである（図１２）。
【０１３３】
本発明者らのデータは、Ｓｅｒ９１０および／またはＳｅｒ９３５の変異により、ＬＲＲＫ２の触媒活性は影響を受けないので（図３Ｄ）、１４−３−３相互作用はＬＲＲＫ２プロテインキナーゼ活性を制御していないことを示唆する。そのうえ、Ｈ−１１５２またはスニチニブによる細胞の処理では、Ｓｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５の脱リン酸化、同様にまた、１４−３−３結合を破壊することが誘導され、しかし、内因性ＬＲＲＫ２キナーゼ活性は影響を受けなかった（図６）。ＬＲＲＫ２への１４−３−３結合は基質または他の調節因子とのその相互作用に影響を与えるかもしれないか、あるいは、ＬＲＲＫ２の安定性または細胞局在化に影響するかもしれない。本発明者らの実験は、Ｓｅｒ９１０／Ｓｅｒ９３５の変異による１４−３−３結合の破壊が、ＬＲＲＫ２が細胞質プール内に蓄積することを生じさせたので、１４−３−３結合がＬＲＲＫ２の細胞質局在化に影響することを示している。以前の研究では、ＬＲＲＫ２［Ｒ１４４１Ｃ］およびＬＲＲＫ２［Ｙ１６９９Ｃ］を含めて、様々なＬＲＲＫ２変異体が、細胞において発現されたとき、細胞質プール内に蓄積することが明らかにされており［非特許文献３３、３５、３６］、このことは、本発明者らが本研究において確認することができた知見である（図１１Ｂまたは図１３）。これらの細胞質プールは、誤って折り畳まれた不安定なＬＲＲＫ２タンパク質の凝集物を含むことが示唆された［非特許文献３５］。このことが当てはまるならば、１４−３−３は、ＬＲＲＫ２を安定化することにおいて役割を果たしていることが示唆されるかもしれない。重要なことに、本発明者らは、細胞質プール内に蓄積した８個の変異体のうちの７個が、分析された野生型ＬＲＲＫ２およびほとんどの他のＬＲＲＫ２変異体が１４−３−３と結合し、かつ、細胞質ゾルプール内に蓄積しなかった条件のもとで、低下したＳｅｒ９１０／Ｓｅｒ９３５のリン酸化および１４−３−３への結合を示した（図１１Ｂ）。本発明者らはまた、Ｓｅｒ９１０／Ｓｅｒ９３５のリン酸化および１４−３−３結合が、損なわれたドーパミン作動性神経伝達を示すホモ接合性のＲ１４４１Ｃノックインマウスに由来する３つのマウス組織において著しく低下することを明らかにすることによってこれらの知見の妥当性を確認している［非特許文献３７］。
【０１３４】
図１２において、本発明者らは、本発明者らが分析している４１個のＬＲＲＫ２変異を、本研究で分析される変異がプロテインキナーゼ活性、Ｓｅｒ９１０／Ｓｅｒ９３５のリン酸化および１４−３−３結合、ならびに、細胞局在化に対して有する影響に基づいて６つのグループに分けている。分析された４１個の変異のうちの３つだけが、ＬＲＲＫ２プロテインキナーゼを２倍〜４倍著しく高めた。驚くべきことに、ＬＲＲＫ２［Ｔ２０３１Ｓ］変異はＬＲＲＫ２［Ｇ２０１９Ｓ］変異体よりも活性であり、野生型ＬＲＲＫ２よりもほぼ４倍大きい活性を示した。ＬＲＲＫ２［Ｔ２０３１Ｓ］変異は、ＰＤの家族歴を有するただ１人のスペイン人患者において報告されているだけである［非特許文献３８］。興味深いことに、Ｔｈｒ２０３１が、ＬＲＲＫ２キナーゼドメインのＴループの中に、すなわち、多くのキナーゼがリン酸化によって活性化される領域の中に位置する。近年の研究では、昆虫細胞において発現されるＬＲＲＫ２の触媒活性フラグメントが、Ｔｈｒ２０３１を含めて、いくつかの残基において自己リン酸化されることが示唆されている［非特許文献１６］。だが、本発明者らは、この部位のリン酸化を内因性ＬＲＲＫ２または過剰発現ＬＲＲＫ２においてこれまで一度も認めることができないでいる。本発明者らは、Ｔｈｒ２０３１をＡｌａに変化させて、リン酸化を防止することにより、Ｔ２０３１Ｓ変異と類似する、活性における増大（ＲＪＮ、データは示されず）がもたらされたこと、および、Ｇｌｕに変異させて、リン酸化を模倣することにより、ＬＲＲＫ２が不活性化されること（ＮＤ、データは示されず）を見出している。さらなる研究が、Ｔｈｒ２０３１の役割、および、Ｓｅｒへのその変異および／またはリン酸化または他の共有結合修飾がどのようにＬＲＲＫ２の触媒活性に影響を与えるかを理解するために必要である。ＬＲＲＫ２［Ｒ１７２８Ｈ］変異はキナーゼ活性における２倍の増大を示し、ＰＤの家族歴を有するただ１人の患者において特定された［非特許文献３９］。Ａｒｇ１７２８残基がＣＯＲドメインにおけるキナーゼドメインの外側に位置する（図９）。
【０１３５】
図７において、本発明者らは、Ｓｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５のリン酸化がＬＲＲＫ２活性に依存し、かつ、１４−３−３イソ型への結合を媒介するモデルを示す。Ｓｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５におけるＬＲＲＫ２のリン酸化、または、１４−３−３結合は、開発途中にあるＬＲＲＫ２阻害剤の相対的効力を評価するために、細胞に基づく読み出しとして展開することができる。このアッセイは、ＬＲＲＫ２阻害剤により処置される動物またはヒトの細胞株または組織において展開することができる。ＬＲＲＫ２阻害剤が臨床試験で投与されるヒト患者については、血液におけるＳｅｒ９１０およびＳｅｒ９３５でのＬＲＲＫ２のリン酸化状態をＬＲＲＫ２阻害剤の効力のバイオマーカーとして用いることができるであろう（これは、ＬＲＲＫ２が血液細胞において強く発現されるからである）。本発明者らは、これが、ＬＲＲＫ２プロテインキナーゼ阻害剤の効力を、内因性ＬＲＲＫ２標的のリン酸化を測定することに基づいて評価するために使用することができる最初の簡便な細胞系システムであると信じている。
【図１Ａ−Ｄ】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図２Ｃ−Ｄ】
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【図２Ｅ−Ｆ】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ−Ｅ】
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【図３Ｆ−Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図４Ｃ−Ｄ】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ−Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１（Ｐａｒｔ１）】
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【図１１（Ｐａｒｔ２）】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１４Ａ−Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年12月21日(2011.12.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＲＲＫ２に対する試験化合物の影響を細胞系システムにおいて評価するための方法であって、下記の工程：
ａ）ＬＲＲＫ２を含む前記細胞系システムを前記試験化合物に暴露することの、前記ＬＲＲＫ２のＳｅｒ９１０および／またはＳｅｒ９３５のリン酸化状態に対する影響を評価する工程；ならびに／あるいは
ｂ）ＬＲＲＫ２を含む前記細胞系システムを前記試験化合物に暴露することの、１４−３−３ポリペプチドへの前記ＬＲＲＫ２の結合に対する影響を評価し、化合物を、ＬＲＲＫ２に対する阻害効果を細胞系システムにおいて有すると見なされるとして選択する工程（ただし、１４−３−３ポリペプチドへの前記ＬＲＲＫ２の結合が前記暴露の後で低下するならば、試験化合物がそのように選択される）；ならびに／あるいは
ｃ）ＬＲＲＫ２を含む前記細胞系システムを前記試験化合物にさらすことの、ＬＲＲＫ２の細胞内位置に対する影響を評価し、化合物を、ＬＲＲＫ２に対する阻害効果を細胞系システムにおいて有すると見なされるとして選択する工程（ただし、細胞質プールにおけるＬＲＲＫ２の蓄積が前記暴露の後で増加するならば、試験化合物がそのように選択される）
を含む方法。
【請求項２】
化合物を、ＬＲＲＫ２に対する阻害効果を細胞系システムにおいて有すると見なされるとして選択する工程をさらに含み、ただし、前記ＬＲＲＫ２のＳｅｒ９１０および／またはＳｅｒ９３５のリン酸化が前記暴露の後で低下するならば、試験化合物がそのように選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｓｅｒ９１０のリン酸化が、Ｓｅｒ９１０がリン酸化されるＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体、または、Ｓｅｒ９１０がリン酸化されないＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体を使用して評価される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
Ｓｅｒ９３５のリン酸化が、Ｓｅｒ９３５がリン酸化されるＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体、または、Ｓｅｒ９３５がリン酸化されないＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体を使用して評価される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
１４−３−３ポリペプチドへの前記ＬＲＲＫ２の結合が、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を使用して評価される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞系システムがインビトロ細胞システムである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞系システムがエクスビボ細胞システムである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞系システムがインビボシステムである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＬＲＲＫ２を含む前記細胞系システムが試験動物において前記試験化合物にさらされている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＬＲＲＫ２のＳｅｒ９１０および／またはＳｅｒ９３５のリン酸化状態を評価すること、ならびに／あるいは、１４−３−３ポリペプチドへの前記ＬＲＲＫ２の結合を評価すること、ならびに／あるいは、細胞質プールにおけるＬＲＲＫ２の蓄積を評価することが、前記試験動物から得られる細胞に対して行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記試験動物から得られる前記細胞が、前記試験動物から血液において得られる細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞系システムが破砕細胞システムである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞系システムがリンパ芽球様細胞系システムである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
Ｓｅｒ９１０がリン酸化されるＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体、または、Ｓｅｒ９３５がリン酸化されるＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体。
【請求項１５】
１）Ｓｅｒ９１０がリン酸化されるＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体、または、Ｓｅｒ９１０がリン酸化されないＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体；
２）Ｓｅｒ９３５がリン酸化されるＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体、または、Ｓｅｒ９３５がリン酸化されないＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体；および
３）１４−３−３ポリペプチド、または、１４−３−３ポリペプチドに対して特異的に結合する抗体
のうちの２つ以上を含み、選択的に
４）蛍光標識されたＬＲＲＫ２ポリペプチド、または、蛍光標識されたＬＲＲＫ２をコードするポリヌクレオチド
をさらに含む部分品のキット。
【請求項１６】
１）Ｓｅｒ９１０がリン酸化されるＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体、または、Ｓｅｒ９１０がリン酸化されないＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体；および／あるいは
２）Ｓｅｒ９３５がリン酸化されるＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体、または、Ｓｅｒ９３５がリン酸化されないＬＲＲＫ２に対して特異的に結合する抗体
の使用であって、ＬＲＲＫ２に対する試験化合物の影響を細胞系システムにおいて評価するための方法における使用。
【請求項１７】
ＬＲＲＫ２変異体（例えば、パーキンソン病の患者において見出されるＬＲＲＫ２変異体）を特徴づける方法であって、下記の工程：
ａ）前記ＬＲＲＫ２変異体のＳｅｒ９１０および／またはＳｅｒ９３５のリン酸化状態を評価する工程；ならびに、選択的に；
ｂ）前記ＬＲＲＫ２変異体の１４−３−３ポリペプチドへの結合能を評価する工程
を含む方法。
【請求項１８】
細胞系システムにおいて発現されるとき、前記ＬＲＲＫ２変異体の細胞内位置を評価する工程を含む、請求項１７に記載の方法。
【国際調査報告】
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