(57)【要約】  オンコスタチンＭの生物学的機能を中和することができる抗体及び組成物は、変形性関節症及び特発性肺線維症等の、オンコスタチンＭに関連する疾患及び障害を治療するのに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＯＳＭタンパク質に特異的に結合し、ヒトＯＳＭタンパク質とｇｐ１３０タンパク質との間の相互作用を調節する単離された抗体であって、配列番号２０及び２１のアミノ酸配列から選択される重鎖相補性決定領域３（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む、抗体。
【請求項２】
配列番号４８のアミノ酸配列を有する重鎖フレームワーク１配列、Ｈ−ＣＤＲ１配列、フレームワーク２配列、Ｈ−ＣＤＲ２配列、及びフレームワーク３配列を更に含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記重鎖残基Ｓ３１が、配列番号１１のアミノ酸配列を有する前記ＯＳＭタンパク質とＱ２０位で接触し、重鎖残基Ｔ３０及びＹ５２が、配列番号１１のアミノ酸配列を有する前記ＯＳＭタンパク質とＧ１２０位で接触する、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
ヒト可変軽鎖フレームワークの残基が、ヒトＶカッパ生殖系列遺伝子に由来する、請求項２に記載の抗体。
【請求項５】
前記Ｖカッパ生殖系列遺伝子が、ＩＧＫＶ４生殖系列遺伝子配列である、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
配列番号８を含む軽鎖可変領域を更に含み、ＸiがＹ、Ｓ、又はＡであり、Ｘ2が、Ｋ、Ｅ、又はＮであり、Ｘ3が、Ｙ、Ｗ、又はＦであり、Ｘ4がＷである、請求項２に記載の抗体。
【請求項７】
前記Ｌ−ＣＤＲ３配列が、配列番号２９のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
前記Ｌ−ＣＤＲ３配列が、配列番号２７、２８、４５、及び４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
前記Ｌ−ＣＤＲ１配列が、配列番号２３〜２５及び３０〜４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の抗体。
【請求項１０】
前記Ｌ−ＣＤＲ２配列が、配列番号２６及び４２〜４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
ヒトＯＳＭに特異的に結合し、ヒトＯＳＭタンパク質とヒトｇ１３０タンパク質との間の相互作用を調節する単離された抗体であって、配列番号４９〜５３からなる群から選択される軽鎖可変領域アミノ酸配列並びに／又は配列番号５４及び５５からなる群から選択される重鎖可変領域アミノ酸配列を含む、単離された抗体。
【請求項１２】
前記抗体が、配列番号５１の軽鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号５５の重鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の単離された抗体。
【請求項１３】
前記抗体が、配列番号５３の軽鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号５４の重鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の単離された抗体。
【請求項１４】
抗体パラトープが、配列番号１１のアミノ酸配列を有するヒトＯＳＭのエピトープ残基とＱ１６位、Ｑ２０位、及びＧ１２０位で接触する、請求項１１に記載の単離された抗体。
【請求項１５】
ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、及びＩｇＭからなる群から選択されるヒト重鎖定常領域を更に含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項１６】
前記定常領域が、ヒトＩｇＧアイソタイプを含む、請求項１５に記載の単離された抗体。
【請求項１７】
前記アイソタイプがＩｇＧ１である、請求項１６に記載の単離された抗体。
【請求項１８】
前記定常領域が、前記抗体に非溶解性を付与するように変異したものである、請求項１７に記載の単離された抗体。
【請求項１９】
前記定常領域が、野生型ＩｇＧ１定常ドメイン配列を有する抗体と比較して、新生児受容体（ＦｃＲｎ）に対する前記抗体の親和性を強化するように変異したものである、請求項１６に記載の単離された抗体。
【請求項２０】
前記定常領域が、４２８位及び４３４位で変異し、付番は、ＫａｂａｔのＥＵ付番に従う、請求項１９に記載の単離された抗体。
【請求項２１】
前記変異が、Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓであり、付番は、ＫａｂａｔのＥＵ付番に従う、請求項２０に記載の単離された抗体。
【請求項２２】
請求項１〜２１に記載の抗体のうちのいずれか一項に記載の抗原結合断片。
【請求項２３】
前記断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｄ、Ｆ（ａｂ）2、及びＳｃＦｖからなる群から選択される、請求項２２に記載の抗原結合断片。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の単離された抗体又は前記抗体の抗原結合断片、及び薬学的に許容される賦形剤又は担体を含む、薬学的組成物。
【請求項２５】
ヒトＯＳＭタンパク質とヒトｇｐ１３０タンパク質との間の相互作用の調節に応答する疾患又は障害に罹患するヒト患者を治療する方法であって、前記患者に治療有効量の請求項２４に記載の組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項２６】
前記疾患又は障害が、変形性関節症、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、神経障害性関節症、反応性関節炎、及び回旋腱板裂傷関節症からなる群から選択される関節症である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
マクロファージ及び単球による炎症性サイトカイン及びケモカインの放出を特徴とする疾患又は障害に罹患するヒト患者を治療する方法であって、前記患者に治療有効量の請求項２４に記載の組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項２８】
前記疾患又は障害が、関節リウマチ、若年型関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、乾癬、慢性斑点疾患（plaque disease）、紅斑性狼瘡、炎症性肺疾患、特発性肺線維症、敗血症、子癇前症、ＣＯＰＤ、喘息、及び多発性硬化症からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記患者が、粥状動脈硬化、糖尿性腎障害、肺線維症、特発性肺線維症、全身性硬化症、及び肝硬変からなる群から選択される線維性疾患に罹患する、請求項２５に記載のヒト患者を治療する方法。
【請求項３０】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の治療用抗体又はその抗原結合断片の重鎖及び／又は軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３１】
請求項３０に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、安定に形質転換された又はトランスフェクトされた組み換え宿主細胞。
【請求項３２】
配列番号５３の軽鎖可変アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、及び配列番号５４の重鎖可変アミノ酸配列をコードする第２のポリヌクレオチドを含むベクターを含む、請求項３１に記載の安定して形質転換された又はトランスフェクトされた組み換え宿主細胞。
【請求項３３】
配列番号５１の軽鎖可変アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、及び配列番号５５の重鎖可変アミノ酸配列をコードする第２のポリヌクレオチドを含むベクターを含む、請求項３１に記載の安定に形質転換された又はトランスフェクトされた組み換え宿主細胞。
【請求項３４】
前記細胞が、哺乳動物のものである、請求項３２又は３３のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項３５】
前記細胞が、ＣＨＯである、請求項３４に記載の宿主細胞。
【請求項３６】
抗体を製造するためのプロセスであって、請求項３４に記載の宿主細胞を培養する工程と、前記細胞から前記抗体を回収する工程と、を含む、プロセス。
【請求項３７】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその断片の減菌調製物、及びそれを必要とする対象に前記抗体を投与するための説明書を含む、キット。
【請求項３８】
ヒトＯＳＭタンパク質に特異的に結合する単離された抗体であって、
ａ．配列番号２３〜２５及び３０〜４１からなる群から選択される軽鎖相補性決定領域１（Ｌ−ＣＤＲ１）アミノ酸配列と、
ｂ．配列番号２６、４２〜４４からなる群から選択される軽鎖相補性決定領域２（Ｌ−ＣＤＲ２）アミノ酸配列と、
ｃ．配列番号１０、２７〜２９、４５、４７からなる群から選択される軽鎖相補性決定領域３（Ｌ−ＣＤＲ３）アミノ酸配列と、
を含む、単離された抗体。
【請求項３９】
ＯＳＭに特異的に結合する単離された抗体であって、
ａ．配列番号１４及び１５からなる群から選択される重鎖相補性決定領域１（Ｈ−ＣＤＲ１）アミノ酸配列と、
ｂ．配列番号１６〜１８からなる群から選択される重鎖相補性決定領域２（Ｈ−ＣＤＲ２）アミノ酸配列と、
ｃ．配列番号１９〜２２からなる群から選択される重鎖相補性決定領域３（Ｈ−ＣＤＲ３）アミノ酸配列と、
を含む、単離された抗体。
【請求項４０】
請求項３８に記載の軽鎖Ｌ−ＣＤＲ１、２、及び３並びに請求項３９に記載の重鎖Ｈ−ＣＤＲ１、２、及び３を含む、単離された抗体。
【請求項４１】
ＯＳＭに特異的に結合する単離された抗体であって、
配列番号１４のアミノ酸配列を有するＨ−ＣＤＲ１と、
配列番号１７のアミノ酸配列を有するＨ−ＣＤＲ２と、
配列番号２１のアミノ酸配列を有するＨ−ＣＤＲ３と、
配列番号３８のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ１と、
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ２と、
配列番号４６のアミノ酸配列を有するＬ−ＣＤＲ３と、を含む単離された抗体。
【請求項４２】
本明細書に記載されたいずれかの発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト細胞上の膜受容体に結合するオンコスタチンＭによって生成される生物学的活性を中和することができるヒト抗体及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）は、単球、マクロファージ、好中球、及び活性化Ｔリンパ球によって分泌されるサイトカインのＩＬ−６ファミリーの２８ｋＤａ多機能メンバーである（Ｔａｎａｋａ  ＆  Ｍｉｙａｊｉｍａ，Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １４９：３９〜５３，２００３）。分泌ＯＳＭのカルボキシ末端付近のタンパク質分解開裂は、２つのＮ−結合グリコシル化部位を有する２０９のアミノ酸長である完全な活性形態のＯＳＭを生じる。ＯＳＭは、共通の受容体サブユニットであるｇｐ１３０タンパク質を共有する、（ＩＬ−６、ＩＬ−１１、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、カルジオトロフィン−１、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、及びカルジオトロフィン様サイトカイン（ＣＬＣ））を含むサイトカインのＩＬ−６ファミリーに属する。ヒトにおいて、ＯＳＭは、ｇｐ１３０及びＬＩＦＲαサブユニット、又はｇｐ１３０及びＯＳＭＲβサブユニットからなる受容体ヘテロダイマーを通してシグナル伝達する。ＩＬ−６ファミリーの他のサイトカインとは対照的に、ＯＳＭは、直接かつ任意の更なる膜結合共受容体の不在下でｇｐ１３０に結合する（Ｇｅａｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：１４３４〜１４３７，１９９２）。ＯＳＭがｇｐ１３０に結合した後、ＯＳＭＲβ又はＬＩＦＲαは、高親和性シグナル伝達複合体を形成するように動員される（Ｍｏｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：３２６３５〜３２６４３，１９９６）。いずれかの受容体の活性化は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を介したシグナル伝達をもたらす（Ａｕｇｕｓｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：１５７６０〜１５７６４，１９９７）。
【０００３】
ＯＳＭは、本質的に、免疫系起源の細胞によって生成され、そのシグナル伝達受容体の広域な分布のため、細胞成長の調節、神経発達、及び細胞外マトリックス組成物の調節を含む、様々な生物学的活性に関連している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
その名前が示唆するように、オンコスタチンＭは、発癌性過程に関連する。しかしながら、ＯＳＭは、肺線維症等の有害な状態をもたらす炎症性及び肥大性経路の初期事象にも関与する。よって、シグナル遮断抗体がｇｐ１３０発現細胞に対して臨床的に有応な細胞毒性、細胞増殖抑制、又は免疫調節作用を及ぼし得る受容体シグナル伝達（ｇｐ１３０シグナル伝達）事象を遮断することができるヒトＯＳＭに特異的なヒト抗体を提供する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ＯＳＭ及びＯＳＭ結合受容体の、宿主対象の細胞、組織、又は臓器に対する相互作用に関連する１つ以上の生物活性に関連する活性を遮断することができるＯＳＭ結合モノクローナル抗体を提供する。宿主細胞において発現するための核酸によってコードされ得る例示的なＯＳＭ結合モノクローナル抗体のアミノ酸配列が提供される。本発明のＯＳＭモノクローナル抗体のうちの１つ以上は、本発明の抗体によって結合されるとき、シグナル伝達複合体であるｇｐ１３０及びＬＩＦＲα又はｇｐ１３０及びＯＳＭＲβの受容体構成要素との相互作用を防止し、それによって、リガンドライゲーション誘導シグナル伝達及び下流生物学的活性を防止するＯＳＭの表面上のエピトープを画定する。
【０００６】
本発明の一態様は、配列番号１３〜１８に単独で記載されるアミノ酸配列を含む、若しくは配列番号１〜３に記載されるＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３の特定の位置での抗原結合ドメイン、配列番号２７〜２９及び４７によって表されるＣＤＲ３を含む、又は配列番号２３〜２６に単独で記載されるアミノ酸配列を含む、若しくは配列番号５〜８及びそれらの変異体に記載される特定の位置で抗原結合ドメイン、及び配列番号１９〜２２によって表されるＣＤＲ３を含む、モノクローナル抗体の抗原結合能力を有するヒトＯＳＭタンパク質と反応する単離された抗体である。特定の実施形態では、ヒトＯＳＭ結合抗体は、配列番号４９〜５５から選択される可変ドメインを含む。
【０００７】
本発明の別の実施形態では、完全長ＩｇＧ構造として使用されるモノクローナル抗体結合ドメインは、ヒトＩｇＧ定常ドメイン又はその特定の変異体に由来する定常ドメインを有し、ＯＳＭの、ＯＳＭ受容体構成要素を提示する細胞への結合を防止するために、薬学的調製物において治療用分子として使用される。別の実施形態では、結合ドメインは、ＯＳＭの、ＯＳＭ受容体構成要素を提示する細胞への結合を防止することができる治療用分子として使用するための抗体断片として構成される。本発明の一態様では、これらに限定されないが、１３〜２８及び３０〜４６及び配列番号２９及び４７によって提供される変異体等の、本発明のＯＳＭ結合ドメインのうちの１つ以上を含む、薬学的に許容される製剤、送達系、又はオンコスタチンＭ関連状態を治療するキット若しくは方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ｐＩＸコートタンパク質上に提示されるＦａｂライブラリを構築するために使用される生殖系列遺伝子配列を示し、ＨＶドメインのそれぞれは、配列番号１〜３（１＝ＩＧＨＶ１−６９、２＝ＩＧＨＶ３−２３、及び３＝ＩＧＨＶ５−５１）による多型ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３、続いて、可変長の多型Ｈ−ＣＤＲ３領域、及びＪ領域（ＦＲ４、配列番号４）からなり、ＬＶドメインのそれぞれは、配列番号５〜８（５＝ＩＧＫＶ１−３９（Ｏ１２）、６＝ＩＧＫＶ３−１１（Ｌ６）、７−ＩＧＫＶ３−２０（Ａ２７）、及び８＝ＩＧＫＶ４−１（Ｂ３））による多型ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３、続いて、Ｊ領域（ＦＲ４、配列番号１０）が続く配列番号９によるＣＤＲ３からなる、配列。
【図２Ａ】ＢｒｄＵ取り込みによって測定され、ビヒクルのみの存在下で対照に正規化されたＡ３７５−Ｓ２細胞の増殖抑制における、ＣＨＯ細胞由来組み換えヒト及びカニクイザルのオンコスタチンＭの用量応答グラフ。
【図２Ｂ】Ｌ１８０（配列番号５３）及びＨ１７（配列番号５４）可変ドメインからなる抗体Ｍ７１が、ＯＳＭが２ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する場合に、Ａ３７５−Ｓ２増殖のＯＳＭ抑制を緩和する能力を示すグラフ。
【図３】増加したプロテオグリカン合成の尺度である、35ＳＯ4取り込みを、抗体の不在下で観察されたレベルより上に増加させる、２０μｇ／ｍＬでのＭ６４、Ｍ７１、Ｍ５５、及びＭ６９の作用を示す棒グラフであり、非特異的アイソタイプ抗体は、ＯＳＭを分泌することができるアルギン酸塩ビーズ及びヒトマクロファージにおいて、ヒト軟骨細胞の共培養物の対照であった、棒グラフ。
【図４Ａ】この場合のＥＣ５０は、約１ｎｇ／ｍＬであることが分かった、ＮＨＬＦ細胞におけるヒトＯＳＭ刺激されたｐＳＴＡＴ３の用量応答を示すグラフ。
【図４Ｂ】２ｎｇ／ｍＬのＯＳＭの存在下で抗体Ｍ７１がｐＳＴＡＴ３シグナルを中和する能力を示すグラフ。
【図５Ａ】ＯＳＭで誘発された後、及び示される濃度のＭ７１抗体で前処理された、又は前処理されなかった個々のマウスの血清中で検出されたＩＰ−１０（Ａ）及びＭＣＰ−１（Ｂ）の量を示す散布図。
【図５Ｂ】ＯＳＭで誘発された後、及び示される濃度のＭ７１抗体で前処理された、又は前処理されなかった個々のマウスの血清中で検出されたＩＰ−１０（Ａ）及びＭＣＰ−１（Ｂ）の量を示す散布図。
【図６Ａ】３ｍｇ／ＫｇのＭ７１又はＭ７１のＦｃ変異体の静脈内（Ａ）又は皮下（Ｂ）投与後のカニクイザルにおける経時的な血清濃度を示すグラフ。
【図６Ｂ】３ｍｇ／ＫｇのＭ７１又はＭ７１のＦｃ変異体の静脈内（Ａ）又は皮下（Ｂ）投与後のカニクイザルにおける経時的な血清濃度を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書に引用する、特許及び特許出願を含むがそれらに限定されない刊行物はすべて、それらがあたかも本明細書に完全に記載されているのとまったく同様に本願に援用するものである。
【００１０】
略語
ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン；ＣＤＲ＝相補性決定領域；Ｃｙｎｏ＝カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）；ＤＮ＝糖尿性腎障害；ＥＣＤ＝細胞外ドメイン；ＦＲ＝フレームワーク；Ｈ＝重鎖；ＩＰＦ＝間質性肺関節炎；Ｌ＝軽鎖；Ｉｇ＝免疫グロブリン；Ｍａｂ＝モノクローナル抗体；ＯＳＭ＝オンコスタチンＭ；ＯＡ＝変形性関節症；ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水；ＲＡ＝関節リウマチ；ＶＬ＝可変軽鎖；ＶＨ＝可変重鎖。
【００１１】
定義
本明細書で使用されるとき、「抗体」は、抗体全体、及びその任意の抗原結合断片又は短鎖を含む。したがって、抗体は、本発明の抗体の中に組み込むことのできる、重鎖若しくは軽鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）若しくはそのリガンド結合部、重鎖若しくは軽鎖可変領域、重鎖若しくは軽鎖定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域若しくはその任意の部分、又は結合タンパク質の少なくとも一部分などが挙げられるが、これらに限定されない免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含む、任意のタンパク質又はペプチド含有分子を含む。用語「抗体」は、抗体、その消化断片、特定部分及び変異体を更に含むことを意図し、これには抗体模倣薬が挙げられ、又は抗体の構造及び／若しくは機能を模倣する抗体の部分若しくはその特定断片若しくは一部を含み、単鎖並びに単一ドメイン抗体及びその断片が挙げられる。機能的断片は、予め選択された標的に対する抗原結合断片を含む。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例は、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ、ドメインからなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域にてジスルフィド架橋により結合された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ、ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単腕（single arm）のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４〜５４６）；並びに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。更に、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは別個の遺伝子によりコードされているが、これらのドメインは組み換え方法を使用して合成リンカーにより連結することができ、合成リンカーは、ＶＬ及びＶＨ領域を対にして、一価分子を形成する単一タンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる、例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６、及びＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９〜５８８３を参照のこと）として作製することを可能にする。そのような単鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることを意図する。これらの抗体断片は、当業者に既知の従来の技術を使用して得られ、これらの断片はインタクト抗体と同一の方法で、有用性に関してスクリーニングされる。逆に、ｓｃＦｖコンストラクトのライブラリを使用して抗原結合能力に関してスクリーニングした後、従来の技術を使用して、ヒト生殖系列遺伝子配列をコードする他のＤＮＡにスプライスしてもよい。そのようなライブラリの１つの例は、「ＨｕＣＡＬ：ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリ」（Ｋｎａｐｐｉｋ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（２０００）２９６（１）：５７〜８６）である。
【００１２】
用語「ＣＤＲ」は、抗原結合に関与する、又はその原因である、抗体の相補性決定領域又は高頻度可変領域アミノ酸残基を指す。抗体のヒトＩｇＧサブタイプの高頻度可変領域、即ちＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）に記載されているように、軽鎖可変部ドメイン内の残基２４〜３４（Ｌ−ＣＤＲ１）、５０〜５６（Ｌ−ＣＤＲ２）、及び８９〜９７（Ｌ−ＣＤＲ３）と、重鎖可変部ドメイン内の３１〜３５（Ｈ−ＣＤＲ１）、５０〜６５（Ｈ−ＣＤＲ２）、及び９５〜１０２（Ｈ−ＣＤＲ３）とからのアミノ酸残基、並びに／又は高頻度可変ループ（即ち、（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７（１９８７））により記載されているように、軽鎖可変部ドメイン内の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、及び９１〜９６（Ｌ３）と、重鎖可変部ドメイン内の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）又は現在のＨ２  Ｃｈｏｔｈｉａ画定の５２〜５７、及び９６〜１０１（Ｈ３））からのそれらの残基を含む。Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋは、構造的に保存されたＨＶを「正準構造」と呼ぶ。フレームワーク又はＦＲ１−４残基は、高頻度可変領域以外の及び高頻度可変領域を囲む、それらの可変ドメイン残基である。Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋの付番システムは、小文字表記、例えば３０ａ、３０ｂ、３０ｃ等で表される特定の残基の拡張を示すことにより、ループ内の残基の数の相違を考慮する。最近では、共通の付番システムであるｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＩＭＧＴ）（ＬａＦｒａｎｃ，ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：Ｄ５９３〜Ｄ５９７）が開発され、広く採用されている。
【００１３】
本明細書において、ＣＤＲは、アミノ酸配列と、連番による軽鎖又は重鎖内の位置との両方の観点において意味される。免疫グロブリン可変ドメインの構造内のＣＤＲの「位置」が、種間で保存され、ループと呼ばれる構造に存在するとき、構造上の特徴により可変ドメイン配列を整合する付番システムを使用することにより、ＣＤＲ及びフレームワーク残基は、容易に同定される。この情報は、１つの種の免疫グロブリンから、典型的にヒト抗体からのアクセプターフレームワークの中へのＣＤＲ残基のグラフト化及び置換に使用される。
【００１４】
用語「成熟」は、ポリペプチドの特性を変更する目的のために、抗体の可変領域における指向された変化に適用される。当該技術分野において既知であり、本明細書に記載されるように、Ｖ領域配列における多くの位置は、抗原の認識に影響を及ぼすことができる。本来、抗体は、変異したものである体細胞の進行性過程により高親和性及び特異性を獲得する。この過程は、親和性、又は可溶性若しくは耐酸化性等の生物物理学的パラメータを強化する一方で、それらが種を反映するように（この場合ヒト抗体）、各抗体鎖の配列一体性を維持しながら、並行選択及び標的変異を可能にするようにインビトロで模倣され得る。指向された変化又は「変異」を行う過程は、典型的に、コード配列のレベルで実施され、強化された特性の選択についてのサブライブラリを作成することにより達成され得る。
【００１５】
本明細書で使用される「ＯＳＭ」は、ＯＳＭポリペプチドをコードするコード配列を含む、オンコスタチンＭポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。ヒトＯＳＭは、ヒトｏｓｍ遺伝子（遺伝子５００８）の生成物である。
【００１６】
「エピトープ」という用語は、抗体に対する特異的結合が可能なタンパク質決定因子を意味する。エピトープは、通常、アミノ酸又は糖側鎖等の、化学的に活性な表面分子の分類からなり、通常、特異的な三次元構造特性並びに特異的な電荷特性を有する。構造的及び非構造的エピトープは、後者ではなく前者に対する結合が、変性溶媒の存在下で損失するという点で区別される。
【００１７】
本明細書で使用されるとき、ＫDは、解離定数、詳細には既定の抗原についての抗体の解離定数ＫDを意味し、特異的標的に対する抗体の親和性の尺度である。高親和性抗体は、既定の抗原について、有するＫDが１０-8Ｍ以下、より好ましくは１０-9Ｍ以下、更に好ましくは１０-10Ｍ以下である。ＫDの逆数は、ＫA、会合定数である。本明細書で使用されるとき、用語「ｋdis」又は「ｋ2」又は「ｋd」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指すよう意図されている。「ＫD」は、解離速度（ｋ2）（「オフ速度（ｋoff」）とも呼ばれる）と結合速度（ｋ1）（又は「オン速度（ｋon）」）との比である。よってＫDは、ｋ2／ｋ1又はｋoff／ｋonに等しく、モル濃度（Ｍ）として表現される。ここで、ＫDが小さくなるほど、結合は強くなる。よって、ＫDが１０-6Ｍ（又は１マイクロＭ）とは、１０-9Ｍ（又は１ｎＭ）に比べ、弱い結合を表わす。
【００１８】
本明細書で使用されるところの「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一分子組成物の抗体分子の調製を意味する。モノクローナル抗体組成物は、特定エピトープの単一の結合特異性及び親和性を示す。この用語はまた、「組み換え抗体」及び「組み換えモノクローナル抗体」も含み、（ａ）動物、又は抗体分泌動物細胞と融合パートナーとの融合により調製されたハイブリドーマから単離された抗体、（ｂ）抗体を発現するよう形質転換された宿主細胞、例えばトランスフェクトーマから単離された抗体、（ｃ）組み換えの、ヒト又は他の種のコンビナトリアル抗体ライブラリから単離された抗体、並びに（ｄ）免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライスすることを含む任意の他の手段により調製、発現、作製又は単離された抗体、などの全ての抗体は、組み換え手段により調製、発現、作製又は単離される。本明細書で使用されるとき、「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に有さない抗体を指すことが意図される。しかしながら、ヒトＯＳＭのエピトープ、アイソフォーム、又は変異体に特異的に結合する、単離された抗体は、他の関連した抗原、例えば他の種（例えば、ＯＳＭ種ホモログ）由来の抗原に対して交差反応性を有する場合がある。更に、単離抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まない場合もある。本発明の一実施形態では、異なる特異性を有する「単離された」モノクローナル抗体の組み合わせを、明確に規定された組成物中で混ぜ合わせる。
【００１９】
本明細書で使用されるとき、「特異的な結合」、「免疫特異的な結合」及び「免疫特異的に結合する」は、所定の抗原に結合する抗体を指す。通常、抗体の結合における解離定数（ＫD）は１０-7Ｍ以下であり、抗体が特定の抗原に結合する際のＫDは、特定の抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン、又は他の任意の特定のポリペプチド）に結合する際のＫDと比較して１／２以下である。「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」という表現は、本明細書において、「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と同義的に使用される。本明細書で使用されるとき、「高度に特異的な」結合は、特定の標的エピトープに対する抗体の相対的なＫDが、他のリガンドに対する抗体の結合に関するＫDの少なくとも１０倍小さいことを意味する。
【００２０】
本明細書で使用されるとき、「タイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＧ）を指す。幾つかの抗体クラスは、同様に重鎖定常領域によりコードされるサブクラス又は「アイソタイプ」（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）を更に包含する。抗体は、抗体の生物学的機能を更に強化する定常領域ドメイン内の特定の残基でタンパク質に結合されるオリゴ糖によって更に修飾され得る。例えば、ヒト抗体アイソタイプにおいて、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、及びわずかながらＩｇＧ２は、マウスＩｇＧ２ａ抗体と同様、エフェクター機能を提示する。
【００２１】
「エフェクター」機能又は「エフェクターポジティブ（effector positive）」は、抗体が抗原特異的結合ドメインから区別されるドメインを含み、ドメインは、受容体、又は補体などの他の血液成分と相互作用して、例えばマクロファージの動員、及び抗体の抗原結合ドメインに結合された細胞の破壊をもたらす事象を引き起こすことができる。抗体は、エフェクター分子の結合により仲介される数種のエフェクター機能を有する。例えば、抗体に対する補体のＣ１成分の結合は、補体系を活性化させる。補体の活性化は、オプソニン作用と、細胞の病原体の溶解に重要である。補体の活性化は、炎症性応答を刺激し、また自己免疫過敏症にも関与し得る。更に、抗体は、Ｆｃ領域を介して細胞に結合し、抗体Ｆｃ領域上のＦｃ受容体部位が細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する。ＩｇＧ（γ受容体）、ＩｇＥ（η受容体）、ＩｇＡ（α受容体）及びＩｇＭ（μ受容体）を含む、抗体の異なるクラスに特異的な多数のＦｃ受容体が存在する。細胞表面上のＦｃ受容体に対する抗体の結合は、多数の重要で多様な生物学的応答を誘発し、生物学的応答には、抗体被覆粒子の貪食及び破壊、免疫複合体の排除、キラー細胞による抗体被覆標的細胞の溶解（抗体依存性細胞介在性細胞傷害、又はＡＤＣＣと称される）、炎症性メディエーターの放出、胎盤通過、並びに免疫グロブリン産生の制御が含まれる。
【００２２】
用語「ポリペプチド」は、ポリペプチドを形成するためにペプチド結合によって結合されたアミノ酸残基を含む分子を意味する。アミノ酸が５０個未満の低分子ポリペプチドは、「ペプチド」と呼ばれることもある。ポリペプチドは「タンパク質」と呼ばれることもある。
【００２３】
概論
本発明は、ＯＳＭタンパク質及び開裂生成物を結合し、それらの生物学的活性を中和することができる単離されたＭａｂを提供する。特に、本発明のＯＳＭ結合ｍＡｂは、ｇｐ１３０に対するＯＳＭ結合を遮断する、又はＯＳＭ結合ｇｐ１３０によるＬＩＦＲａ又はＯＳＭＲｂの動員を防止することができる。いずれの場合においても、本発明のＯＳＭ  ｍＡｂは、ＯＳＭ誘導ｇｐ１３０受容体シグナル伝達を遮断することができる。
【００２４】
ＳＴＡＴ３のリン酸化反応は、様々な病理学的状況において、線維芽細胞によるコラーゲンの過剰産生をもたらすことが報告されてきた（Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３（３９）：５４１６〜２５，２００６、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ８１（１）：１０２〜１３，２００１）。これらの特性は、ＲＡ、ＯＡ、並びに特発性肺線維症（ＩＰＦ）及び糖尿性腎障害（ＤＮ）等の線維性適応症に対するこれらの抗体の治療的価値の可能性を示す。
【００２５】
ヒトＯＳＭ遺伝子生成物であるＯＳＭ（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿０６５３９１）は、長さが２５アミノ酸のシグナルペプチド及び残基２３４と２３５との間にタンパク質分解性開裂部位を有する、長さが２５２アミノ酸のプレプロポリペプチド（配列番号１１）である。これは、残基３１から１５２と、及び７４から１９２との間に２つの内部ジスルフィドを形成する５つのシステイン残基を有する分泌タンパク質である（Ｋａｌｌｅｓｔａｄ  ＪＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９１  Ｍａｙ  １５；２６６（１４）：８９４０〜５）。残基１００及び２１７に２つの潜在的なＮ−結合グリコシル化部位が存在し、真核生物細胞内で生成されるとき、タンパク質はグリコシル化される。ヒトＯＳＭは、残基１０５に遊離スルフヒドリルを有する。
【００２６】
カニクイザルＯＳＭタンパク質の配列は、公的なドメインで入手することができなかったが、注釈ゲノム配列（ＮＷ＿００１０９５１６９）に由来する１８６７ｂｐ  ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ番号：ＸＭ＿００１１１０１４８）について自動計算により生成された記録が存在した。カニクイザルＯＳＭ配列を得るために、ＲＮＡがカニクイザルＰＢＭＣから単離され、次に、遺伝子がＲＴ−ＰＣＲによってこのｃＤＮＡから増幅され、配列決定された。クローン化された配列の推定翻訳（配列番号１２）は、本出願人による同時係属中の出願（米国第１２／６４８４３０号）に開示されるように、推定カニクイザル（Ｒｈｅｓｕｓ）配列と９９．６％同一であり、ヒトＯＳＭタンパク質配列と９２％同一であり、マウスＯＳＭタンパク質配列と４１％同一であることが分かった。
【００２７】
したがって、本発明は、ＯＳＭ結合ｇｐ１３０シグナル伝達に起因する下流生物学的活性を阻害することができるヒト由来ＯＳＭ結合Ｍａｂの同定を対象とし、Ｍａｂは、
ＯＳＭの存在下で細胞の増殖を回復させる、組織外植片における関節内（関節部）マトリックスのＯＳＭ誘発軟骨細胞分解を阻害する、
ヒト肺線維芽細胞におけるＯＳＭ依存ＳＴＡＴ３リン酸化反応を効率的に中和する、及びＯＳＭ誘発サイトカイン放出を防止する能力を示す。
【００２８】
１．本発明の抗体の組成物
本発明のＯＳＭ中和抗体は、インビトロ、原位置、及び／又はインビボで少なくとも１つのＯＳＭ活性又はＯＳＭ受容体結合を阻害する、遮断する、又はそれに干渉し、ＯＳＭ活性又はリガンド結合を促進、刺激、誘発、又は作動させず、そしてまた抗体結合がＯＳＭ受容体のＯＳＭ誘導ライゲーションの下流作用、特に、宿主細胞のシグナル伝達等の、ＯＳＭとのｇｐ１３０相互作用も模倣しない抗体である。好適なＯＳＭ中和抗体、特定部分、又は変異体は、任意に、これらに限定されないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はタンパク質合成、タンパク質放出、細胞活性化、増殖又は分化、抗体分泌、ＯＳＭ受容体シグナル伝達、ＯＳＭ開裂、ＯＳＭ結合、ＯＳＭ又はｇｐ１３０の誘発、合成、又は分泌等の、少なくとも１つのＯＳＭ活性又は機能に影響を及ぼすこともできる。
【００２９】
本発明は、ＯＳＭ結合又はＯＳＭによるＬＩＦＲ動員後、ｇｐ１３０シグナル伝達を阻害することができる抗ヒトＯＳＭモノクローナル抗体の発見に基づく。ｐＩＸコートタンパク質に結合されるフィラメント状のファージ粒子上に提示されるＦａｂライブラリの形態の抗体結合ドメイン（ＷＯ第２９０８５４６２Ａ１号を参照し、また以下に更に記載される）は、ＯＳＭを結合する能力に対して選択された。ｇｐ１３０を使用した競合アッセイは、ＯＳＭに結合されるとき、ＯＳＭがｇｐ１３０に結合するのを防止した、これらのＦａｂを区別するために使用された。別の方法としては、Ｆａｂは、ＯＳＭに結合されるとき、ｇｐ１３０結合に対するＬＩＦＲ動員を防止することができた。細胞に基づく（Ａ３７５、ヒトメラノーマ細胞）アッセイは、ＯＳＭ発現宿主細胞のｇｐ１３０媒介ｐＳＴＡＴ３活性化を阻害することができる幾つかの候補抗体を同定するために使用された。
【００３０】
本明細書に記載されるＯＳＭ結合抗体は、ヒトＯＳＭタンパク質の活性形態上に少なくとも２つの特異な領域を認識し、ＯＳＭ上に抗体又は類似する機能遮断能力を有する他の化合物の標的に適した複数の部位を更に発見したことを示す。よって、アミノ酸配列として本明細書に提供される抗体結合ドメインの発現及び精製は、ＯＳＭ中和活性を示す新規分子の選択手段を提供することができるツールを更に提供する。
【００３１】
一実施形態において、抗ヒトＯＳＭ抗体は、配列番号４９〜５５に示すようなアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）又は重鎖可変（ＶＨ）領域を含む結合領域を有し、抗体又はその結合部分は、ＯＳＭに免疫特異的に結合する。本発明の別の実施形態では、配列番号５４又は５５及びその抗原結合部分を含む重鎖を含み、ＯＳＭタンパク質に結合し、加えて、
１．１００ｐＭ未満のＫDでヒトＯＳＭに結合する、
２．５００ｐＭ未満のＫDでカニクイザルＯＳＭに結合する、
３．２ｎｇ／ｍＬのヒトＯＳＭの存在下で、ＯＳＭの不在下の９０％のレベルまでＡ３７５−Ｓ２細胞の増殖を回復させることができる、
４．２ｎｇ／ｍＬのカニクイザルＯＳＭの存在下で、ＯＳＭの不在下の９０％のレベルまでＡ３７５−Ｓ２細胞の増殖を回復させることができる、
５．組織外植片における関節内（関節部）マトリックスのＯＳＭ誘発軟骨細胞分解を阻害する、
６．正常なヒト肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）におけるＯＳＭ依存ＳＴＡＴ３リン酸化反応を効率的に中和する、又は
７．マウスにおいてＯＳＭで全身誘発された後のサイトカイン放出を遮断する等の、本発明の抗体の特異的な機能特性を有する。
【００３２】
本発明の別の態様では、本明細書に記載される上記に言及される生物学的活性の幾つか又は全てを示す抗体、特に、Ｍ５５及びＭ７１結合ドメインと命名されるＭａｂの構造上の特徴は、ＯＳＭに結合する等の、本発明の抗体の少なくとも１つの機能特性を保持する構造的に関連するヒト抗ＯＳＭ抗体を生成するために使用される。より具体的には、Ｍ５５及びＭ７１の１つ以上のＣＤＲ領域（配列番号１及び８の特定の残基等）は、更なる組み換えにより遺伝子操作を受けた、本発明のヒト抗ＯＳＭ抗体を生成するために、配列番号１３〜２８、３０〜４６等の、既知のヒトフレームワーク領域及びＣＤＲと組み換えにより組み合わされ得る。
【００３３】
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＲ１、２、及び／又は３を含み、ＩＧＶＨ１〜６９（配列番号１）又はＩＧＶＨ５−５１（配列番号３）の配列を有し、配列番号１３〜２２からなる群から選択されるＣＤＲからの１つ以上の残基は、配列番号１又は３のＣＤＲ位置に存在し、一方、抗体がＯＳＭに結合する能力（例えば、保存的置換）をなおも保持する。したがって、別の実施形態では、遺伝子操作を受けた抗体は、配列番号１３〜２２に列挙されるＣＤＲ又は配列番号２９若しくは４７によって与えられるＬ−ＣＤＲ３の変異体と、例えば９０％、９５％、９８％、又は９９．５％同一である１つ以上のＣＤＲから構成され得る。
【００３４】
単純なＯＳＭへの結合に加え、上述のもの等の、遺伝子操作を受けた抗体は、結合がインビボでＧＰ１３０陽性細胞増殖の抑制をもたらす、ＯＳＭタンパク質又はその開裂生成物のＧＰ１３０陽性細胞への結合を阻害する能力等の、本発明の抗体の他の機能特性の保持について選択され得る。
【００３５】
本発明のヒトモノクローナル抗体は、例えば標準的なＥＬＩＳＡにより、ＯＳＭに対する結合について試験することができる。
【００３６】
２．ＯＳＭ中和抗体の生成
本明細書において、配列番号１、３、８のライブラリフレームワークを含む指定される重鎖及び軽鎖配列を含み、かつ配列番号１３〜２８、３０〜４６のＣＤＲを有する、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ９、Ｍ１０、Ｍ４２、Ｍ４５、Ｍ５３、Ｍ５４、Ｍ５５、Ｍ６２、Ｍ６３、Ｍ６５、Ｍ６６、Ｍ６７、Ｍ６８、Ｍ６９、Ｍ７１、及びＭ８３により例示される、所望の生物活性スペクトルを示すＯＳＭ中和抗体は、様々な技法により生成され得る。
【００３７】
別の実施形態では、配列番号１１の残基５１〜２２７のわずか５〜全て、又はその核酸コード配列を含む、本発明の抗体により結合されたエピトープは、ＯＳＭの産生に関連する疾患又は疾患の症状を治療し、防止し、又は寛解させる目的において、宿主内で本発明の抗体を直接生成するために、対象を免疫化するために使用され得る。
【００３８】
一実施形態及び本明細書で例示されるように、ヒト抗体は、ファージライブラリから選択され、この場合のファージは、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含み、ライブラリは、例えば、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、又は対合している又はしていない抗体可変領域を示す幾つかの他の構造等のヒト抗体結合ドメインを発現する（Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ｌｏ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４：３０９〜３１４（１９９６）：Ｓｈｅｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．ＰＩＴＡＳ（ＵＳＡ）９５：６１５７〜６１６２（１９９８））、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））。本発明のヒトモノクローナル抗体は、ファージディスプレイ法を用いて、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリをスクリーニングして調製することもできる。ヒト抗体単離のためのそのようなファージディスプレイ法は、当技術分野にて確立されている。例えば、Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号及び同第５，５７１，６９８号、Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第５，４２７，９０８号及び同第５，５８０，７１７号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第５，９６９，１０８号及び同第６，１７２，１９７号、並びにＧｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第５，８８５，７９３号、同第６，５２１，４０４号、同第６，５４４，７３１号、同第６，５５５，３１３号、同第６，５８２，９１５号及び同第６，５９３，０８１号を参照されたい。
【００３９】
ファージクローンは、生物選抜として知られる多工程手順により選択され、それを通して同定される。生物選抜は、ファージ提示タンパク質リガンド変異体（ファージ提示ライブラリ）を標的とインキュベートし、洗浄法により未結合ファージを取り除き、特定的に結合ファージを溶出することにより実行される。溶出されたファージは、標的に最良の結合を提示する抗体断片を持つこれらのファージクローンを好む特定の配列のプールを富化する結合及び任意の増幅の更なるサイクルが行われる前に、任意に増幅される。数回後に、個々のファージクローンが特徴付けされ、クローンにより提示されたペプチドの配列が、ファージビリオンの対応するＤＮＡを配列決定することにより決定される。
【００４０】
ＦａｂファージｐＩＸライブラリ
ファージ提示技術の特定の実施形態では、Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３９７：３８５〜３９６，２０１０、第ＷＯ２９０８５４６２Ａ１号、及びＵＳ第１２／５４６８５０号に記載され、本明細書に更に詳述される、ｐＩＸファージコートタンパク質上に提示される合成Ｆａｂライブラリは、ヒト生殖系列遺伝子由来のヒトＩｇＧ配列のレパートリーから結合剤を選択するために使用される。ライブラリは、配列が天然源から単離されたヒト抗体に存在することが観察された頻度に基づき選択された既知のＩＧＶ及びＩＧＪ生殖系列配列によりコードされた４つのＶＬ及び３つのＶＨドメイン上に構築された。選択されたＶＨ（ＩＭＧＴ命名法）は、ＩＧＨＶ１〜６９（配列番号１）、ＩＧＨＶ３〜２３（配列番号２）、又はＩＧＨＶ５〜５１（配列番号３）である。ＶＨ設計における多様性は、ＣＤＲ３領域に可変長の配列を有する重鎖を生成し、一定の長さを保持するＨ−ＣＤＲ１及びＨ−ＣＤＲ２において多様性位置を制限する。フレームワーク４（Ｈ−ＦＲ４）は、ライブラリの全メンバーの中で一定に保たれた（配列番号４）。
【配列表１】
【００４１】
2013544076.tif 000002
この場合、１６９ライブラリにおいて、Ｘ1は、Ａ又はＧであり、Ｘ2は、Ｇ又はＷであり、Ｘ3は、Ｉ又はＳであってもよく、Ｘ4は、Ｐ又はＡであってもよく、Ｘ5は、Ｉ又はＹであってもよく、Ｘ6は、Ｆ又はＮであってもよい。
【配列表２】
【００４２】
2013544076.tif 000003
この場合、３２３ライブラリにおいて、Ｘ1は、Ｓ、Ｄ、Ｎ、又はＴであってもよく、Ｘ2は、Ａ、Ｇ、又はＷであってもよく、Ｘ3は、Ｓ又はＨであってもよく、Ｘ4は、Ｖ、Ａ、Ｎ、又はＧであってもよく、Ｘ5は、Ｓ、Ｎ、Ｋ、又はＷであってもよく、Ｘ6は、Ｙ、Ｓ、Ｇ、又はＱであってもよく、Ｘ7は、Ｓ又はＤであってもよく、Ｘ8は、Ｓ又はＧであってもよい。
【配列表３】
【００４３】
2013544076.tif 000004
この場合、５５１ライブラリにおいて、Ｘ1は、Ｓ、Ｎ、又はＴであってもよく、Ｘ2は、Ｓ又はＧであってもよく、Ｘ3は、Ｉ又はＲであってもよく、Ｘ4は、Ｄ又はＹであってもよく、Ｘ5は、Ｇ又はＳであってもよく、Ｘ6は、Ｄ又はＹであってもよい。
【００４４】
ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号４）を有するＦＲ４又はＪＨ領域（１１残基）は、上記の配列に連結されて、完全な重鎖可変領域を形成する。
【００４５】
多様化を標的としたＨ−ＣＤＲ１及びＨ−ＣＤＲ２位置は、１）生殖系列遺伝子の多様性、及び２）既知の構造の抗体−抗原複合体における抗原との接触に見られる頻度、により決定された（Ａｌｍａｇｒｏ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１７：１３２〜１４３，２００４）。選択された位置でのアミノ酸の多様性は、１）生殖系列における使用、２）ヒトの再配置されたＶ遺伝子で最も頻繁に観察されるアミノ酸、３）単一塩基体細胞変異に起因すると推定されるアミノ酸、及び４）抗原認識の一因となるアミノ酸の生化学的及び生物物理学的特性、により決定された。
【００４６】
ライブラリは、最終長が７〜１４残基である以下の（式Ｉ）に示されるように、ヒト抗体のレパートリー（Ｓｈｉら、２０１０、上記）を模倣するＶＨ（Ｈ３）のＣＤＲ３に多様性を組み込む。５０００を超えるヒト可変領域のＣＤＲ３の中で、アミノ酸グリシン（Ｇ）及びアラニン（Ａ）は、全位置において頻繁に使用される。加えて、アスパラギン酸（Ｄ）は位置９５で頻繁に用いられ、チロシン（Ｙ）はＪセグメントの正準領域に先行する位置で頻繁にコード化される。アミノ酸フェニルアラニン（Ｆ）、アスパラギン酸（Ｄ）、及びチロシン（Ｙ）は、これらの位置のＩｇＧに使用される位置９９〜１０１で優先される。多くの場合、これらの位置は、Ｈ−ＣＤＲ３に対して構造上の支持としての機能を果たし、抗原及び／ＩｇＧの表面に、あまりアクセス可能ではないため、位置９９のアミノ酸フェニルアラニン＋ロイシン（５０／５０比）、位置１００のアスパラギン酸、及び位置１０１のチロシンは、固定される。よって、式Ｉの配列は、配列番号１、２、又は３と配列番号４との間に挿入され、完全なＶＨを作製する。
−（Ｄ）−（Ｎ）ｎ（Ｎ＋Ｏ）ｍ（Ｆ）ＤＹ−    （Ｉ）
式中、
（Ｄ）＝Ａｓｐ（Ｄ）及びＧｌｙ（Ｇ）豊富位置。
（Ｎ）ｎ＝Ａｌａ（Ａ）及びＧｌｙ（Ｇ）豊富位置、ｎ＝３−７。
（Ｏ）ｍ＝Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、及びＹ（Ｔｙｒ）豊富、ｍ＝１−４。
（Ｆ）＝Ｐｈｅ（Ｆ）優先位置。
【００４７】
ライブラリの様々な変形は、同様にヒト生殖系列レパートリーに由来する固定された又は多様化された軽鎖と対合する工程を包含する。本発明において、４つの軽鎖ライブラリＶＬカッハ゜遺伝子（Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３１：１０１７〜１０２８及びその後、Ｓｃｈａｅｂｌｅ  ＆  Ｚａｃｈａｕ，１９９３  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒ  ３７４：１００１〜１０２２）は、Ａ２７（ＩＧＫＶ３−２０*０１）、Ｂ３（ＩＧＫＶ４−１*０１）、Ｌ６（ＩＧＫＶ３−１１*０１）、及びＯ１２（ＩＧＫＶ１−３９*０１）であり、この場合、カッコ内の遺伝子名は、推定された対応するＩＭＧＴ遺伝子である。Ｆａｂは、ジシストロニックベクターの発現を介してｐＩＸ上に提示され、ＶＨ−ＣＨ１ドメインは、コートタンパク質配列に融合し、ＶＬ−ＣＬカッパ又はＶＬ−ＣＬラムダは、ＶＨ−ＣＨ１と自己会合する遊離ポリペプチドとして発現する。ＣＤＲ領域には下線を施す。
【００４８】
Ｖカッパ（Ｖｋ）生殖系列遺伝子に基づく軽鎖可変ライブラリ
【配列表４】
【００４９】
2013544076.tif 000005
【００５０】
各可変領域スカフォールドの特定位置での多様性を下の表１に要約し、この場合、アミノ酸一文字コードが使用され、図１に示されるように、選択的に特定位置で存在する。
【００５１】
【表１】
2013544076.tif 000006
【００５２】
ライブラリの全てのＶＬ  ＣＤＲ３は、７つの残基を有し、最初の２つの残基は、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）であり、Ｋａｂａｔ残基９５に対応する残基は、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）である。Ｌ−ＣＤＲ３において、配列は、ＱＱＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＰＸ5Ｔ（配列番号９）に対応し、この場合、多型は、下の表の通りであり、残基位置は、Ｋａｂａｔに従う。
【００５３】
【表２】
2013544076.tif 000007
【００５４】
様々な配列は、遺伝子間で長さが変動し、高頻度可変ループ又はＣＤＲ内の特定の残基位置での多様性は、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  Ｂ，Ｌｅｓｋ  ＡＭ，Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ，１９９７（Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２７３：９２７〜９４８）に画定される残基付番を使用して、以下のように説明され得る。このシステムにおいて、高頻度可変ループの長さの変化は、所与の残基において、ａ、ｂ、ｃ等のサブ位置の表記によって提供される。
【００５５】
ＪＫ４、ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１０）等のフレームワーク４（ＦＲ４）セグメントは、完全なヒト軽鎖可変領域を形成するために使用された。
【００５６】
０．２〜２０ｎＭの様々なタンパク質標的に対するＦａｂ親和性は、初期の選択で示された。
【００５７】
再組み換えＶＬ又はＶＨ多様性からなる結合パラメータを改善するための、組み込まれた成熟過程のための方法、又は別の方法としては、指向された若しくは限定されたＶＬ改変は、参考刊行物に記載される、本明細書に教示される、及び当該技術分野に公知であるものと組み合わされたライブラリ用に設計され、使用されるベクター及びプライマーを使用して達成される。
【００５８】
ＯＳＭ結合免疫グロブリンドメインの代替え供給源
本明細書に開示されるヒトＭａｂの特徴を備えたＯＳＭ結合抗体が作製されるか、又は結合断片が、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション法（ハイブリドーマ法）を含む、多くの方法により形成された免疫グロブリンドメインから供給され得る。ハイブリドーマ法では、マウス又はハムスター若しくはマカクザル等の他の適切な宿主動物を上記のように免疫して、免疫に用いられるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生する又は産生し得るリンパ球を誘発する。代替的に、リンパ球はインビトロで免疫化されてもよい。次いで、リンパ球をポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を使用して骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９〜１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
【００５９】
ＯＳＭ中和抗体はまた、任意に、本明細書に記載される、及び／又は当該技術分野において既知であるように、ヒト抗体のレパートリーを生成することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ヒト以外の霊長類など）の免疫化により生じる場合もある。ヒト抗ＯＳＭ抗体を生成する細胞を、このような動物から単離し、本明細書に記載の方法のような、好適な方法を用いて不死化してもよい。或いは、抗体をコードする配列は、クローニングし、好適なベクターに導入し、また本明細書に教示する方法及び当該技術分野において既知である方法により抗体の発現及び単離のために宿主細胞をトランスフェクトするために用いることができる。
【００６０】
それらの生殖系構造にヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を有するトランスジェニックマウスの使用により、正常ヒト免疫系が許容性を示すヒト自己抗原を含む種々の標的に対する高親和性完全ヒトモノクローナル抗体が単離される（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎらの米国特許第５５６９８２５号、米国特許第６３００１２９号、及び１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６〜９、Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３〜２１、Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．＆  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，１９９８，Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３〜９５、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｄ．，１９９５，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５〜９３、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらの米国特許第６７１３６１０号、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：１３２３〜１３２６、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５〜８５１、Ｍｅｎｄｅｚ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６〜１５６、Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１〜２３、Ｙａｎｇ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：１２３６〜１２４３、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ａｎｄ  Ｔａｕｓｓｉｇ，Ｍ  Ｊ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：４５５〜４５８，１９９７、Ｔｏｍｉｚｕｋａらの国際公開特許第０２０４３４７８号）。このようなマウスの内因性免疫グロブリン遺伝子座を分断又は欠失させ、内因性遺伝子によりコードされた、抗体を産生する動物の能力を除去することができる。加えて、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．）及びＭｅｄａｒｅｘ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）などの会社は、上述したような技術を使用して、選択された抗原に対して指向されるヒト抗体を提供するよう従事し得る。
【００６１】
パンニング戦略における標的リガンド及び免疫原性抗原として使用するためのポリペプチドの調製は、組み換えタンパク質産生等の任意の好適な技法を使用して実施され得る。精製タンパク質、又は全細胞若しくは細胞若しくは組織抽出物を含むタンパク質混合物の形態の標的リガンド若しくはその断片、又は免疫化の場合、抗原は、動物の身体内で、前記抗原又はその一部をコードする核酸から新規に形成されてもよい。
【００６２】
本発明の単離された核酸は、当技術分野にて周知のように、（ａ）組み換え方法、（ｂ）合成技術、（ｃ）精製技術、又はそれらの組み合わせを使用して形成することができる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、容易に単離され、当該技術分野において既知である方法（例えば、ヒト抗体領域の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによる）を用いて配列決定される。ハイブリドーマを作製する場合、かかる細胞は、かかるＤＮＡ源として機能し得る。或いは、例えばファージ又はリボソームディスプレイライブラリ等のコード配列及び翻訳産物が連結しているディスプレイ技術を用いると、結合剤及び核酸の選択が簡略化される。ファージ選択後、ファージに由来する領域をコードする抗体を単離し、ヒト抗体又は任意の他の所望の抗原結合断片を含む抗体全体を作製するために用い、哺乳動物の細胞、昆虫細胞、酵母、及び細菌を含む任意の所望の宿主内で発現させることができる。
【００６３】
ヒト抗体
本発明は更に、ヒトＯＳＭに結合するヒト免疫グロブリン（又は抗体）を提供する。これらの抗体はまた、遺伝子操作を受けた又は適応されたとして特徴付けされ得る。免疫グロブリンは、実質的にヒト生殖系列免疫グロブリンからの可変領域（複数可）を有し、抗原認識に関与することが知られる残基において指向された変形、例えば、ＫａｂａｔのＣＤＲ又は構造的に画定されるような高頻度可変ループを含む。存在する場合、定常領域（１つ以上）も、実質的にヒト免疫グロブリンからである。ヒト抗体は、少なくとも約１０-6Ｍ（１マイクロＭ）、約１０-7Ｍ（１００ｎＭ）、１０-9Ｍ（１ｎＭ）以下のＯＳＭに対するＫDを示す。親和性の変化に影響を及ぼす、例えば、ＯＳＭに対するヒト抗体の親和性を改善する、又はそのＫDを減少させるために、ＣＤＲ残基又は他の残基のいずれかの置換が行われ得る。
【００６４】
ＯＳＭに結合するヒト抗体を産生するための供給源は、好ましくは、フィラメント状ファージ粒子上に提示されるヒト由来Ｆａｂのレパートリーを使用する、ヒトＯＳＭに結合し、カニクイザルＯＳＭと交差反応することができると同定された配列番号１３〜５５として記載される可変領域、フレームワーク、及び／又はＣＤＲとして本明細書に提供される配列である。
【００６５】
ヒト可変ドメインフレームワークが、ＣＤＲの起源である親可変フレームワークと同一又は同様の立体構造（conformation）をとる場合、ＣＤＲのいずれかをヒト可変ドメインフレームワークに置換することにより、その正確な空間配向が維持される可能性が最も高い。最終Ｍａｂに対合される重鎖及び軽鎖の可変フレームワーク領域は、同一又は異なるヒト抗体配列に由来し得る。ヒト抗体配列は、天然に存在するヒト抗体の配列であってもよく、又はヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来してもよく、又は数種のヒト抗体及び／若しくは生殖系列配列のコンセンサス配列であってもよい。
【００６６】
好適なヒト抗体配列は、マウス可変領域のアミノ酸配列と、既知のヒト抗体の配列とのコンピュータ比較により同定される。比較は重鎖と軽鎖とで別々に行われるが、原理はそれぞれに関して類似している。
【００６７】
経験的方法に関しては、所望の活性、結合親和性又は特異性をスクリーニングし得る変異体配列のライブラリを形成することが特に簡便であることが見出されている。そのような変異体のライブラリを形成するための１つのフォーマットは、ファージディスプレイベクターである。別の方法としては、変異体は、可変ドメイン内に標的残基をコードする核酸配列を無作為化又は多型化するための代替え又は既知の方法を使用して生成され得る。
【００６８】
更なる置換が必要であるか否かを決定する他の方法と、置換されるアミノ酸残基の選択とは、コンピュータモデリングを用いて達成することができる。免疫グロブリン分子の３次元画像を生成するコンピュータハードウェア及びソフトウェアは広く入手可能である。一般に、分子モデルは、免疫グロブリン鎖又はそのドメインに関する解明された構造から出発して生成される。モデリングされる鎖のアミノ酸配列の、解明された３次元構造の鎖又はドメインとの類似性が比較され、最大の配列類似性を示す鎖又はドメインが分子モデル構成の出発点として選択される。解明された出発構造は、モデリングされている免疫グロブリン鎖又はドメイン内の実際のアミノ酸と、出発構造内のアミノ酸との間の差異を許容するよう変更される。次いで、変更された構造は、複合体免疫グロブリンに組み立てられる。最終的に、モデルは、エネルギー最小化し、また全部の原子が互いから適切な距離内に存在し、結合の長さと角度とが化学的に許容し得る限界内にあることを検証することにより精密化される。
【００６９】
コードの縮重により、多様な核酸配列が各免疫グロブリンアミノ酸配列をコードするであろう。所望の核酸配列は、デノボ（de nova）固相ＤＮＡ合成、又は所望のポリヌクレオチドの早期に調製された変異体のＰＣＲ変異誘発により生成され得る。本願に記載される抗体をコードする全ての核酸は、本発明に明白に含まれる。
【００７０】
本明細書に記載されるように生成されたヒト抗体の可変セグメントは、典型的には、ヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部に結合される。抗体は、軽鎖及び重鎖定常領域の両方を含む。重鎖定常領域は、通常、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、更にＣＨ４ドメインを含むことがある。
【００７１】
ヒト抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＥを含む抗体の任意のクラス、並びにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む任意のサブクラス（アイソタイプ）からの任意のタイプの定常ドメインを含んでもよい。ヒト化抗体が細胞傷害活性を示すことが所望される場合、定常ドメインは通常、補体結合性定常ドメインであり、クラスは一般にＩｇＧ1である。かかる細胞毒性が望ましくないとき、定常ドメインは、ＩｇＧ2クラスであってもよい。ヒト化抗体は、２つ以上のクラス又はアイソタイプからの配列を含んでもよい。
【００７２】
場合により定常領域に結合されたヒト化軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸は、発現ベクター内に挿入される。軽鎖及び重鎖は、同じ又は異なる発現ベクターにクローニングされ得る。免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確実にする発現ベクター（１つ以上）内の制御配列に操作可能に結合される。そのような対照配列は、シグナル配列、プロモーター、エンハンサー、及び転写終結配列を含む（Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，１００２９（１９８９）、ＷＯ第９０／０７８６１号、Ｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１１４９（１９９２）を参照、これらは、全ての目的において、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。
【００７３】
３．抗ＯＳＭ抗体の使用方法
以下により詳細に記載されるように、本発明は、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ９、Ｍ１０、Ｍ４２、Ｍ４５、Ｍ５３、Ｍ５４、Ｍ５５、Ｍ６２、Ｍ６３、Ｍ６５、Ｍ６６、Ｍ６７、Ｍ６８、Ｍ６９、Ｍ７１、及びＭ８３の可変ドメインを有する単離されたモノクローナル抗体がＯＳＭ上の重複エピトープに結合し、インビトロ及び／又はインビボＯＳＭ阻害活性を提示することを示す。有意に、選択されたＭＡｂの反応性は、ｇｐ１３０とのＯＳＭ相互作用を用量依存的に遮断する、ｇｐ１３０の存在下でＯＳＭシグナル伝達を減少させる、Ａ３７５細胞のＯＳＭ刺激された増殖を減少させる、マクロファージ刺激された軟骨細胞コラーゲン産生を防止する、又はインビボでＯＳＭによるサイトカイン放出を減少させる能力を含む。
【００７４】
本発明に記載したようなモノクローナル抗体の特性を考慮すると、抗体又はその抗原結合断片は、ヒト及び動物におけるＯＳＭ関連の状態を治療又は予防するための治療剤及び予防剤の両方として好適である。
【００７５】
一般に、使用は、本発明の治療有効量若しくは予防有効量の１つ以上のモノクローナル抗体又は抗原結合断片、又は同様の結合及び生物学的活性スペクトルを有するように選択された抗体若しくは分子を、感染しやすい対象又はＯＳＭ活性が免疫学的障害若しくは腫瘍成長及び転移等の病理学的後遺症を有することが知られる状態を示す者に投与する工程を含む。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片を含む、抗体の任意の活性型を投与することができる。
【００７６】
好ましくは、用いられる抗体は、ＭＡｂに対する免疫反応が、許容できないほど短い循環半減期を生じさせない、又は被験体においてＭＡｂに対する免疫反応を誘導するように、レシピエント種と適合する。投与されるＭＡｂは、細胞溶解又は細胞毒性メカニズムを使用して標的細胞集団を枯渇させるために、対象のＦｃ受容体への結合及びＡＤＣＣメカニズムの活性化等の幾つかの二次機能を示すか、又はそれらは、標的細胞集団を保存するために、これらの二次エフェクターを制限することにより、又はその欠失により遺伝子操作を受けてもよい。
【００７７】
個体の治療は、治療的に有効な量の本発明の抗体を投与することを含み得る。抗体は、以下に記載のようなキットで提供されてもよい。抗体は、例えば等量の混合物として投与されてもよく、又は個別に連続して提供されても、又は一度に投与されてもよい。レシピエント患者内でＯＳＭに結合可能な抗体若しくはその断片、又はＯＳＭに対して保護できる抗体を患者に提供する際、投与される薬剤の用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全身の医学的状態、既往歴などの因子に応じて変動するであろう。
【００７８】
同様の手法で、本発明のモノクローナル抗体の他の治療的使用は、本モノクローナル抗体のうちの１つに対して上昇された抗イディオタイプ抗体を使用する、患者の能動免疫化である。エピトープの構造を模倣した抗イディオタイプによる免疫化は、能動的な抗ＯＳＭ応答を誘発し得る（Ｌｉｎｔｈｉｃｕｍ，Ｄ．Ｓ．ａｎｄ  Ｆａｒｉｄ，Ｎ．Ｒ．，Ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｅｓ，Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｍｉｃｒｙ（１９８８），ｐｐ  １〜５  ａｎｄ  ２８５〜３００）。
【００７９】
同様に、能動免疫は、ワクチンの成分として、１つ以上の抗原性及び／又は免疫原性エピトープを投与することにより誘導され得る。ワクチン接種は、予防的に又は治療的に、レシピエントがこの生物学的機能領域に対して保護抗体を生成できるのに十分な量を経口又は非経口的に投与することにより実施し得る。宿主は、純粋なペプチド断片、又は改変されたペプチドの抗原性／免疫原性ペプチドで能動免疫され得る。元来のタンパク質配列に対応していない１つ以上のアミノ酸を、元来のペプチド又は切頭型のペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に添加してもよい。かかる追加のアミノ酸は、ペプチドを別のペプチド、大きな担体タンパク質、又は支持体に結合させるのに有用である。これらの目的に有用なアミノ酸としては、チロシン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、及びこれらの誘導体が挙げられる。別のタンパク質改変技術は、例えば、ＮＨ２−アセチル化又はＣＯＯＨ−末端アミド化を用いて、別のタンパク質又はペプチド分子又は支持体に、ペプチドを結合又は融合させる更なる手段を提供することもできる。
【００８０】
望ましくないＯＳＭ生物活性に対する保護が可能な抗体は、ＯＳＭ関連の症状又は病理の軽減、回復又は寛解を達成するのに十分な量でレシピエント対象に提供されることが意図される。十分な又は「治療的に有効な量」とは、薬剤の、用量、投与経路などが、そのような応答に影響を与えるのに十分な場合、症候の軽減に「有効」である量をさす。抗体投与に対する反応は、被験体の罹患組織、器官、又は細胞を分析することにより、又は画像化技術により、又は組織サンプルのエクスビボ分析により、測定され得る。剤の存在が、レシピエント患者の生理に検出可能な変化をもたらす場合、その剤は生理学的に重要である。
【００８１】
治療適用
本発明のＯＳＭ中和抗体、その抗原結合断片、又は特定の変異体を使用して、細胞、組織、臓器又は動物（哺乳動物及びヒトを含む）内で測定し又は効果をもたらして、ＯＳＭ又ＯＳＭを発現する細胞により媒介、影響又は調節される状態の発生を診断し、監視し、調節し、治療し、軽減し、予防を補助する、又は状態の症状を軽減することができる。よって、本発明は、当該技術分野において既知のように、又は本明細書に記載されているように、本発明の少なくとも１つのＯＳＭ抗体を用いて、細胞、組織、臓器、動物、又は患者における少なくとも１つのＯＳＭ関連疾患を調節又は治療するための方法を提供する。
【００８２】
ＯＳＭは、炎症に関与する様々な疾患状態において上方制御することが知られており、骨形成、軟骨分解、コレステロールの取り込み、痛み、及び炎症を含む様々な生物学的役割にかかわってきた。特別な適応症については以下に論述する。
【００８３】
適応症
本発明の発明者は、ＯＳＭが軟骨破壊を媒介することを示し、ＯＳＭが組織外植片からの関節内マトリックスにおいて、軟骨細胞分解をもたらすことを示した。ＯＳＭは、Ｔ．Ｃａｗｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９８，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，４１（１０）１７６０〜１７７１）に示されるように軟骨からのコラーゲン放出を促進することができるＴＮＦα等のサイトカイン放出も促進し、現在、Ｍ７１結合ドメインとして例示される抗体が全身性サイトカイン放出を遮断することができる。本発明の抗体であるＭ５５、Ｍ６４、Ｍ６９、及びＭ７１は、マクロファージ−軟骨細胞共培養系においてプロテオグリカン合成をＯＳＭ特異的抗体の不在下で見られるレベルより上に増加させる能力を示した。
【００８４】
本発明者は、本発明の中和抗ＯＳＭ抗体を投与することにより、インビボでＩＬ−６、ＩＰ−１０、及びＫＣ等のＯＳＭ誘導サイトカイン及びケモカイン放出を阻害することを更に示した。ＩＰ−１０、すなわちインターフェロンγ誘発タンパク質１０ｋＤａ又は低誘発性サイトカインＢ１０は、ヒトにおいて、ＣＸＣＬ１０遺伝子（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０））によりコードされるタンパク質である。ＣＸＣＬ１０は、単球／マクロファージ、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び樹状細胞における化学誘引、並びに内皮細胞へのＴ細胞付着促進等の幾つかの役割に起因する。現在ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（ＣＸＣＬ１）として知られるＫＣは、以前はＧＲＯ１癌遺伝子、ＧＲＯα、好中球活性化タンパク質３（ＮＡＰ−３）、及びメラノーマ成長刺激活性α（ＭＳＧＡ−α）とも呼ばれたＣＸＣケモカインファミリーに属する低分子サイトカインである。ヒトにおいて、このタンパク質は、ＣＸＣＬ１遺伝子によりコードされる。ＣＸＣＬ１は、マクロファージ、好中球、及び上皮細胞によって発現し、好中球化学誘引物質活性を有する。
【００８５】
したがって、本発明によると、変形性関節症、炎症性関節症、又は炎症性障害等の関節性プロテオグリカン分解性疾患の治療又は予防用の薬剤の製造において、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ９、Ｍ１０、Ｍ４２、Ｍ４５、Ｍ５３、Ｍ５４、Ｍ５５、Ｍ６２、Ｍ６３、Ｍ６５、Ｍ６６、Ｍ６７、Ｍ６８、Ｍ６９、Ｍ７１、及びＭ８３の群から選択される抗体又は抗体断片の使用が提供される。ＯＳＭの拮抗薬の具体的な使用は、薬剤の製造において、軟骨からのコラーゲン放出を防止する又は減少させることである。本発明は、ｇｐ１３０へのＯＳＭ結合を遮断する有効量のそのような抗体をそのような障害に罹患する患者に投与する工程を含む、炎症性関節症若しくは炎症性障害の治療又は予防のための方法を更に提供する。
【００８６】
本発明の抗体は、ＯＳＭが、直接又は間接的に、炎症性サイトカインの放出等を通して組織又は臓器、特に皮膚、肺、及び関節部に病変形成をもたらす炎症性過程の治療用の調製物に使用され得る。そのような病態は、変形性関節症、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、神経障害性関節症、反応性関節炎、回旋腱板裂傷関節症、リウマチ熱、ライター症候群、全身性進行性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、天疱瘡、類天疱瘡、壊死性血管炎、重症筋無力症、多発性硬化症、紅斑性狼瘡、多発性筋炎、類肉腫症、肉芽腫症、血管炎、悪性貧血、ＣＮＳ炎症性障害、抗原−抗体複合体媒介疾患、自己免疫溶血性貧血、橋本甲状腺炎、グレーブス病、レイノー病、糸球体腎炎、皮膚筋炎、慢性活動性肝炎、セリアック病、ＡＩＤＳの自己免疫合併症、萎縮性胃炎、及びアジソン病、内毒血症、若しくは敗血性ショック（敗血症）、又は敗血症の症状の１つ以上、並びに他の種類の急性及び慢性炎症を含む。本発明の方法からより具体的に利益を得ることができるこれらの患者は、大腸菌、インフルエンザ菌Ｂ、ナイセリア髄膜炎、ブドウ球菌、又は肺炎球菌の感染に罹患する者である。敗血症のリクスのある患者は、火傷、創傷、腎不全又は肝不全、外傷、火傷、易感染性（ＨＩＶ）、造血性新生物、多発性骨髄腫、キャッスルマン病、又は心臓粘液腫に罹患する者を含む。
【００８７】
ＯＳＭに関連し、本発明の抗体を用いた治療又は予防療法に適している他の状態は、肺線維症、糖尿性腎障害、特発性肺線維症、全身性硬化症、及び肝硬変等の線維性疾患を含む。本発明の抗体の使用の別の適応症は、後根神経節の神経に関与する侵害受容性痛の治療又は防止においてである。
【００８８】
投与及び用量
本発明は、ＯＳＭ中和抗体の安定な製剤を提供するものであって、好ましくは、水性リン酸緩衝生理食塩水又は混合塩水だけでなく、保存加工された溶液及び製剤、並びに、薬学的用途又は家畜への使用に適した多目的の保存加工された製剤であり、薬学上許容できる製剤には少なくとも１つのＯＳＭ中和抗体が含まれている。好適な媒体及びその製剤（他のヒトタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンを含む）は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．ｅｄ．，Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ  ２００６，Ｐａｒｔ  ５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｐ  ６９１〜１０９２、具体的にはｐｐ．９５８〜９８９に記載されている。
【００８９】
本明細書に記載される安定した若しくは保存加工された製剤又は溶液におけるＯＳＭ中和抗体は、当該技術分野に周知の移植片、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプにおいて製剤又は当業者が認識する他の手段を使用して、静脈内（Ｉ．Ｖ．）、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）、皮下（Ｓ．Ｃ．）、経皮、肺動脈、経粘膜を含む様々な送達方法を介して本発明により患者に投与され得る。
【００９０】
例えば、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、液嚢内、胸郭内、子宮内、膀胱内、病巣内、ボーラス、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮手段等の身体部分又は腔に対して部位特異的投与を行ってもよい。
【００９１】
一般的に、抗体の全身投与量を投与する場合、約１ｎｇ／ｋｇ〜１００ｎｇ／ｋｇ、１００ｎｇ／ｋｇ〜５００ｎｇ／ｋｇ、５００ｎｇ／ｋｇ〜１μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜５００μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ（レシピエントの体重）の範囲の投与量の抗体をレシピエントに提供することが望ましいが、より少ない又はより多い投与量を投与してもよい。もちろん、本発明の拮抗薬の好適な投与量は、治療される疾患又は障害、投与経路、及び治療される個人の年齢及び体重、並びに拮抗薬の性質等の要因によって変動する。特定の任意の投与量に拘束されることなく、例えば、非経口的投与において、０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇの日用量の本発明の抗体（又は他の巨大分子）（通常、上記の薬学的組成物の一部として存在する）が、典型的な成人を治療するのに好適であってもよいと考えられている。
【００９２】
治療は、単回投与スケジュール、又は好ましくは、治療の一次過程が、１〜１０回別個に投与され、次いで反応を維持又は強化するのに必要な時間間隔他の投与量を投与し（例えば第２の投与量を１〜４ヶ月間投与）、必要に応じて数ヶ月後次の投与（１又は複数）を行う、複数回投与スケジュールで行われ得る。好適な治療スケジュールの例としては、（ｉ）０、１ヶ月及び６ヶ月、（ｉｉ）０、７日、及び１ヶ月、（ｉｉｉ）０及び１ヶ月、（ｉｖ）０及び６ヶ月、又は疾患症状を低減する、又は疾患の重篤度を低下させると予測される所望の反応を誘発するのに十分な他のスケジュールが挙げられる。
【００９３】
本発明の抗体は、単独で、又はステロイド（プレドニゾンなど）、シクロホスファミド、シクロスポリンＡ、若しくはプリン類似体（例えば、メトトレキサート、６−チオグアニン等）等の免疫抑制薬、又は抗リンパ球抗原抗体、抗白血球抗原抗体、ＴＮＦ拮抗薬（例えば、抗ＴＮＦ抗体）、若しくはＴＮＦ阻害剤（例えば、可溶性ＴＮＦ受容体）等の抗体、又はＮＳＡＩＤ若しくは他のサイトカイン阻害剤等の薬剤と組み合わされて使用され得る。
【００９４】
【表３−１】
2013544076.tif 000008
【００９５】
【表３−２】
2013544076.tif 000009
【００９６】
【表３−３】
2013544076.tif 000010
【００９７】
ここで、以下の具体的及び非限定的な実施例を参照して、本発明を説明する。
【実施例】
【００９８】
実施例１：試薬及びアッセイ
ＯＳＭ結合抗体を選択し、特徴付けるために、ヒト及びカニクイザルＯＳＭの構築物が哺乳動物の細胞発現のために生成された。ヒトＯＳＭ（ＮＭ＿０２０５３０によってコードされたＮＰ＿０６５３９１）は、２２７のアミノ酸（配列番号１１）の完全長の分泌タンパク質に加工される２５２のアミノ酸前駆体であり、これは、より完全な活性成熟形態のアミノ酸１〜１８４に更に加工されるプロタンパク質である。ヒトＯＳＭ  ｃＤＮＡは、ＯｒｉＧｅｎｅ（カタログ番号ＳＣ１２１４２１）から注文し、ＯｒｉＧｅｎｅクローンからヒトＯＳＭのＯＲＦをＰＣＲにより増幅し、タンパク質精製のためのヘキサＨｉｓタグ、及び部位指向タンパク質ビオチン化のためのＡｖｉＴａｇ（配列番号５６）と共にシグナルペプチド（マウスＩｇＧ１）を導入した。後者は、受容体と相互作用するＯＳＭの周辺に存在するリジン残基の無作為な化学ビオチン化を避けるために選択された。
【００９９】
カニクイザルＯＳＭは、ｃＤＮＡを得るためにＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、カニクイザルＰＢＭＣのＲＮＡからクローン化され、次に、米国特許出願第１２／６４８４３０号に記載されるように、ヒトＯＳＭ配列から設計したＵＴＲプライマーを使用してＰＣＲ増幅された。発現した完全長タンパク質を配列番号１２に示し、切断された、活性形態は５１〜２２７の１８４の残基により表される。
【０１００】
ヒト及びカニクイザルＯＳＭの前駆体及び成熟形態は、ＨＥＫ  ２９３で発現し、標準的な方法論を使用して精製された。タンパク質の機能的活動は、対照として大腸菌由来の市販のヒトＯＳＭ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２９５−ＯＭ）を使用して、Ａ３７５−Ｓ２細胞増殖及びｐＳＴＡＴ３シグナル伝達アッセイにおいて試験された。
【０１０１】
Ｍａｂｓ
対照抗体が使用された場合、ＣＮＴＯ６２３４と命名されるヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗体が使用された。
【０１０２】
化学ビオチン化
サイトカイン上のアミン残基を標的とするＮＨＳ−エステルケミストリー（ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ，＃２１４３５）を使用して、組み換えヒトＯＳＭをビオチン化した。ビオチンカップリング反応は、１モルの抗原当り１モルのビオチンの標的標識効率について最適化された。後者は、結合及び機能活性の損失を最小にし、一方で、タンパク質集団のほぼ完全な標識を確実にする。反応の完了時に、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）に含まれるＺｅｂａ  Ｄｅｓａｌｔ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓを使用して、遊離ビオチン試薬及び残りの脱離基からタンパク質を精製した。約８０％の出発原料を回収した。ビオチンの取り込みのレベルを測定するために、１モルのヒトＯＳＭ当り約１モルのビオチンを示す、ＨＡＢＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，＃２８００５）を使用した。ビオチン化タンパク質におけるストレプトアビジンカップリング及びｇｐ１３０−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号６７１−ＧＰ）結合の両方を検証するために、Ｏｃｔｅｔ機器（ＦｏｒｔｅＢＩＯ）を使用した。Ｏｃｔｅｔ測定値は、ビオチン化ヒトＯＳＭが未標識の出発原料と基本的に同一のプロファイルで、ｇｐ１３０に結合したことを示した。
【０１０３】
インビトロ標的ビオチン化
１５残基ＡｖｉＴａｇ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）（配列番号５６）は、内因性ＢｉｒＡ基質ＢＣＣＰと類似するビオチンアクセプター動態を有する（Ｂｅｃｋｅｔｔ  ｅｔ．ａｌ．１９９９，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）。関心のタンパク質に連結される際、１つのアクセプターリジン残基を有するＡｖｉＴａｇは、１つの位置でのみビオチン化される。組み換えカニクイザルＯＳＭは、Ａｖｉｄｉｔｙから商業的に入手可能なビオチン−タンパク質リガーゼ及び試薬を使用して、インビトロで部位特異的にビオチン化された。一価のストレプトアビジン親和性樹脂を使用して、ビオチン化カニクイザルＯＳＭを精製した。得られたタンパク質の質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣ−ＨＰＬＣによって評価された。ビオチンの取り込みのレベルを測定するために、１モルのカニクイザルＯＳＭ当り約１モルのビオチンを示す、ＨＡＢＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，＃２８００５）が使用された。ビオチン化タンパク質におけるストレプトアビジンカップリング及びｇｐ１３０−Ｆｃキメラ結合の両方を検証するために、Ｏｃｔｅｔ機器（ＦｏｒｔｅＢＩＯ）を使用した。Ｏｃｔｅｔ測定値は、ビオチン化カニクイザルＯＳＭが未標識の出発原料と基本的に同一のプロファイルで、ｇｐ１３０に結合したことを示した。
【０１０４】
固相免疫アッセイ
最初のファージ−Ｆａｂパンニングには、ＴＢＳ中の２μｇ／ｍＬのビオチン化ヒトＯＳＭ又はカニクイザルＯＳＭでコーティングされたＮＥＵＴＲＡＶＩＤＩＮ（商標）ＥＬＩＳＡプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用した。４℃で一晩インキュベートし、遮断、そして洗浄した後、パンニングの各回からのポリクローナルファージプールの１：１００希釈物を添加した。ｐＶＩＩＩに特異的なＨＲＰ抱合モノクローナル、Ｍ１３ファージ主要コートタンパク質（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号２７−９４２１−０１）、次に、化学発光基質ＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１５８２９５０００１）の添加、そしてＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ機器で読み取り、結合ファージを検出した。
【０１０５】
個々のクローンの最初のスクリーニングは、大腸菌の上清からの分泌された可溶性Ｆａｂ−Ｈｉｓタンパク質を使用して実施された。可溶性Ｆａｂ−Ｈｉｓタンパク質を含有する細菌由来の上清は、ＥＬＩＳＡ形式で結合を行うために使用された。Ｂｌａｃｋ  ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ、カタログ番号４３７１１１）を１μｇ／ｍＬのヒツジ抗ヒトＦｄ（ＣＨ１）抗体（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ、カタログ番号ＰＣ０７５）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄し、遮断した後、５０μＬの未希釈の細菌由来の上清（Ｆａｂ−Ｈｉｓタンパク質を含有する）を添加し、穏やかに振盪しながら室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、２０ｎＭのビオチン化ヒト又はカニクイザルＯＳＭを、捕捉したＦａｂに添加した。室温で１時間後、ＳＡ−ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号４３−４３２３）を添加し、上述のように化学発光検出を行った。２０ｎＭの濃度のヒトＯＳＭを用いた一次結合ＥＬＩＳＡスクリーニングが、ナノモルの親和性範囲の親和性でクローンの検出を可能にすることが計算された。
【０１０６】
エピトープビニング
エピトープビニングは、ヒトＩｇＧ１変換ｍＡｂ及び市販の抗体であるＭＡＢ２９（ＯＳＭＲβ／ＬＩＦＲα動員遮断剤（Ｒ遮断剤）として知られる）を使用して実施された結合特徴に基づきＭＡｂを分類するために実施された競合アッセイである。
【０１０７】
３８４ウェル多重アレイプレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）、Ｌ２５ＸＡ−４）の各ウェルに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４（Ｓｉｇｍａ，Ｐ３８１３）中の２．５μｇ／ｍＬの抗ヒトＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ，７０９−００５−１４９）を添加した。プレートを４℃で一晩インキュベートし、次に室温で１時間、５０μＬのＭＳＤ遮断剤Ａで遮断した。３８４多重アレイプレートを３回洗浄し（ＰＢＳ  ｐＨ７．４、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０（Ｓｃｙｔｅｋ、ＰＢＴ０１０））、各ウェルに１．０μｇ／ｍＬの試験ｍＡｂの溶液を添加し、次に室温で１時間、滴定プレート振盪器上でレベル６で振盪させた。プレートを前回同様、３回洗浄した。
【０１０８】
並行して、５μｇ／ｍＬの競合ｍＡｂの溶液及び１μｇ／ｍＬのビオチン化ＯＳＭ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、２９５−ＯＭ−０１０／ＣＦ）を、ＭＳＤアッセイ緩衝液（１：３の遮断緩衝液とＰＢＳ  ｐＨ７．４、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０）中で別の９６ウェルプレート（ＣＯＳＴＡＲ、３３５７）で混合し、室温で１時間、滴定プレート振盪器上でレベル３で振盪させた。競合抗体及びビオチン化ＯＳＭのプレ複合体を３８４多重アレイプレートの各ウェルに添加し、室温で１時間振盪させた（滴定プレート振盪器上でレベル６）。プレートを３回洗浄し、各ウェルにストレプトアビジンスルホＴＡＧ（ＭＳＤ、Ｒ３２Ａｄ−Ｓ）を添加し、室温で３０分間振盪させた（滴定プレート振盪器上でレベル６）。プレートを３回洗浄し、各ウェルに、蒸留水（ＭＳＤ、Ｒ９２ＴＣ−１）で１：４に希釈した読み取り緩衝液Ｔを添加した。プレートをＭＳＤ  Ｓ６０００機器上で読み取った。
【０１０９】
自己競合からのシグナル（最大シグナルにおいて２〜４倍減少）と共に、競合ｍＡｂが不在（最大シグナル）のビオチン化ＯＳＭの存在下で試験ｍＡｂにおいて獲得されたシグナルに基づきデータを解釈した。エピトープ競合は、競合ｍＡｂの存在下の値が自己競合からの値の３つの標準偏差内であったときに割り当てられた。
【０１１０】
Ａ３７５細胞
Ａ３７５細胞（ＡＴＣＣ；ＣＲＬ−１６１９）は、悪性メラノーマに由来するヒト上皮細胞である。Ａ３７５−Ｓ２細胞（ＡＴＣＣ；ＣＲＬ−１８７２、ＩＬ−１に敏感なＣＲＬ−１６１９の亜系統）は、Ｔ−１７５培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号４３１０８０）中の１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で補われた完全成長培地（ＤＭＥＭ／ＧｌｕｔａＭａｘ−Ｉ，Ｇｉｂｃｏ）中で培養され、約８０％のコンフルエントになったとき、１：２０の継代培養比で、３日〜４日毎に継代培養された。
【０１１１】
Ａ３７５−Ｓ２細胞増殖（ＢｒｄＵ取り込み）アッセイ
ヒト又はカニクイザルＯＳＭによるＡ３７５−Ｓ２細胞増殖の減少を、化学発光ＥＬＩＳＡを使用して、ＢｒｄＵ取り込みにより測定した。オンコスタチンＭは、Ａ３７５−Ｓ２ヒトメラノーマ細胞系において増殖を減少させた（Ｚａｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ８３：９７３９〜９７４３）。この細胞系は、抗体発見の全段階で抗オンコスタチンＭ抗体を評価するために使用された。Ａ３７５−Ｓ２細胞を、Ｔ−１５０組織培養フラスコ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ  ３５−５００１）中で、９５％  Ｏ２−５％  ＣＯ２、３７℃のＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  １１９９５）＋１０％  ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  １６１４０）＋１％  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ  １５１４０）に維持し、１週間に２回１：１０に分けた。
【０１１２】
増殖アッセイを実施するために、細胞をトリプシン処理（０．２５％、Ｇｉｂｃｏ  ２５２００）して、Ｔ１５０フラスコから取り出し、次に、黒色のＴＣコーティングされたプレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ  ３５３９４８）の内部４８ウェルで、２００μＬのＤＭＥＭ／ＦＢＳ／Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ中で、２０００細胞／ウェルの密度で平板培養した。３７℃／９５％  Ｏ２−５％  ＣＯ２で一晩インキュベートした後、培地を取り出し、１８０μＬの新しい培地と交換した。最終濃度の１０Ｘで試験溶液の全てを含有する別のプレートを調製した。適切な実験状態を生成するために、このプレートから２０μＬを細胞プレートの対応するウェルに移した。各実験状態は、３つ組で試験された。中和を評価した任意の実験において、抗体及びオンコスタチンＭは、細胞に添加される少なくとも１時間の間、一緒にインキュベートされた。次に、プレートを３７℃／９５％  Ｏ２−５％  ＣＯ２で更に７２時間インキュベートした。この時点で、化学発光ＢｒｄＵ細胞増殖ＥＬＩＳＡ（Ｒｏｃｈｅ  １１６６９９１５００１）を実施した。ＢｒｄＵ標識試薬を４時間培養物に添加した。次に、培地を取り出し、１００μＬの固定溶液を各ウェルに添加した。室温で３０分後、溶液を取り出し、１００μＬ／ウェルの抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ溶液を添加した。室温で２時間後、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄し、１００μＬのＳｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｐｉｃｏ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ３７０６９）を各ウェルに添加した。次に、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｖｉｃｔｏｒ３機器を使用して、発光を読み取った。
【０１１３】
最初の実験は、増殖の抑制における実験室内で生成したＣＨＯ細胞由来組み換えヒト及びカニクイザルのオンコスタチンＭの用量応答を決定するために行われた。１〜５希釈で１００ｎｇ／ｍＬの開始濃度から０．０２４４ｎｇ／ｍＬの最終濃度までＯｓｍを試験した。増殖の％阻害は、ビヒクル対照で処理された細胞と比較して計算された。そのような実験の結果を図２Ａに示す。ヒト又はカニクイザルのオンコスタチンＭの濃度が増加すると、対応してＢｒｄＵ取り込みが減少した。抗増殖活性及びＥＣ５０の作用の両方の程度に基づいたヒト及びカニクイザルのオンコスタチンＭの抗増殖活性は、区別不能である。
【０１１４】
これらの実験に基づき、抗オンコスタチンＭ抗体を評価し、比較するために、２ｎｇ／ｍＬの濃度のオンコスタチンが使用され、それは、この濃度が増殖を約８０％阻害し、抗体の用量応答を決定するための大きなウィンドウを提供するからである。抗体の完全な用量範囲は、２ｎｇ／ｍＬのヒト又はカニクイザルのオンコスタチンＭの存在下で評価された。加えて、アイソタイプ対照は、使用された抗オンコスタチンＭ抗体の最高濃度の実験に含まれた。アッセイウィンドウは、未処理対照ウェル（最大増殖）と２ｎｇ／ｍＬのオンコスタチンＭだけ（最小増殖）でインキュベートされたウェルとの間の相違により画定され、抗体の任意の濃度での％中和は、このウィンドウ内で画定された。
【０１１５】
Ａ３７５−Ｓ２  Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＳＴＡＴ３アッセイを使用したｐＳＴＡＴ３シグナル伝達
ＯＳＭは、細胞表面受容体ｇｐ１３０に結合し、ＯＳＭＲβにより受容体ヘテロ二量体化を誘発して、シグナル伝達分子ＳＴＡＴ３の活性化（リン酸化反応）を含む細胞内シグナル伝達カスケードを開始させることにより、Ａ３７５−Ｓ２細胞の成長を阻害する（Ｋｏｒｔｙｌｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：３７４２〜３７５３，１９９９）。ＳＴＡＴ３シグナル伝達の乱れは、Ａ３７５−Ｓ２細胞のＯＳＭ成長阻害を破壊し、ＳＴＡＴ３活性化がＯＳＭシグナル伝達において主要な工程であることを示す（Ｈｅｉｎｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７４：１〜２０，２００３）。Ａ３７５−Ｓ２細胞におけるＳＴＡＴ３リン酸化反応は、ＯＳＭ濃度依存であることが示され、刺激された細胞でそれを測定するための市販のキットが入手可能である。Ａ３７５−Ｓ２細胞におけるＯＳＭ誘発ＳＴＡＴ３リン酸化反応の中和は、Ｍａｂ候補の一次スクリーニングアッセイとして選択された。
【０１１６】
ＯＳＭ誘発ＳＴＡＴ３リン酸化反応の抗体中和において、Ａ３７５−Ｓ２細胞は、完全成長培地で２００μＬ中２５，０００細胞／ウェルで９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５９６）に播種され、２４時間インキュベートされる。１０μｇ／ｍＬから開始して１：５に連続希釈された実験用ｍＡｂと共に３時間室温で予めインキュベートされた５ｎｇ／ｍＬのヒトＯＳＭ（組み換えの哺乳動物の細胞由来、ＯＳＭＮ１−１）を含有する溶液で細胞を処理する。対照は、未処理細胞、刺激された細胞（５ｎｇ／ｍＬのＯＳＭのみ）、及びｈＩｇＧ１アイソタイプ対照ｍＡｂを含む。全ての処理は、特に記載のない限り、３つ組で実施される。
【０１１７】
ｐＳＴＡＴ３内容物の分析は、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＳＴＡＴ３  Ｗｈｏｌｅ−Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｋｉｔ（ＭＳＤ、カタログ番号Ｋ１５０ＤＩＤ−１、ロット番号Ｋ００１０５７０）、次に製造者のプロトコルを使用して行われる。簡潔に、細胞を２００μＬ／ウェル容積で１０分間処理し、処理溶液を取り出し、５０μＬの細胞ＭＳＤ溶解緩衝液を多重チャネルピペットを介して添加する。プレートを軌道振盪器（３００ＲＰＭ）上に５分間設置する。その後、３０μＬの各溶解物をＭＳＤ  ｐｈｏｓｐｈｏ−ＳＴＡＴ３の９６ウェルプレートに移す。プレートを密封し、室温で１時間、軌道振盪器（３００ＲＰＭ）上に設置し、１５０μＬのＭＳＤ洗浄緩衝液で３回洗浄し、２５μＬの二次検出抗体抱合体（抗ｐＳＴＡＴ３−Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋）を各ウェルに添加し、再度密封し、室温で１時間、軌道振盪器（３００ＲＰＭ）上でインキュベートする。プレートを前と同様に洗浄し、１５０μＬのＭＳＤ読み取り緩衝液（トリプロピルアミン溶液）を各ウェルに添加した。プレートをＭＳＤ  ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００機器上で読み取る。
【０１１８】
インライン成熟された親及び対照ｍＡｂの完全なＥＣ５０用量応答曲線を得、正規化した％  ｐＳＴＡＴ３シグナルとしてプロットした。
【０１１９】
表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）による親和性測定
前述のヒト又はカニクイザルＯＳＭ構築物を用い、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００光バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により結合親和性を測定した。アミンカップリングケミストリーの製造者の指示を用いて、抗マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号３１５−００５−０４６）及び抗ヒト（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９−００５−０９８）の抗ＩｇＧ  Ｆｃ抗体混合物をカルボキシメチル化デキストラン表面のＣＭ−５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１０００−１４）にカップリングすることにより、バイオセンサー表面を調製した。抗ＯＳＭ抗体の約１９，０００ＲＵ（反応単位）を、４つのフローセルそれぞれに固定化した。ランニング緩衝液（ＤＰＢＳ＋０．００５％  Ｐ２０＋３ｍＭ  ＥＤＴＡ）の中で２５℃で速度実験を実施した。１００ｎＭ〜０．４１２ｎＭの範囲の連続希釈ヒト及びカニクイザルＯＳＭ  ＥＣＤをランニング緩衝液中で調製した。約２００ＲＵのｍＡｂをセンサーチップのフローセル２〜４の上に捕捉した。フローセル１は、参照表面として用いた。ｍＡｂの捕捉に続いて、抗原を５０μＬ／分で３分間注入（結合相）し、次いで緩衝液フロー（解離相）を１０分間注入した。１００ｍＭのＨ３ＰＯ４（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号７９６１）の５０μＬ／分での１８秒注入の２つのパルスによってチップ表面を再生した。
【０１２０】
ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ、バージョン３．２）を使用して、収集したデータを加工した。先ず、アナライト注入の参照サブトラクション曲線から、バッファ注入によって生成された曲線を引くことにより、データからの２倍の参照サブストラクションが行われた。データの速度分析を、１：１の結合モデルと全体的適合を用いて実施した。各ｍＡｂの結果を、Ｋａ（オン速度）、Ｋｄ（オフ速度）、及びＫD（親和性定数）の形で報告した。
【０１２１】
実施例２：ＯＳＭ結合ＦＡＢの選択
新規Ｆａｂ−ｐＩＸライブラリは、Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ３９７：３８５〜３９６，２０１０、ＷＯ第０９０８５４６２Ａ１号、Ｕ．Ｓ．第１２／５４６８５０号に記載され、本明細書の上記において、ＩＭＧＴ命名法において、ＩＧＨＶ１−６９（配列番号１）、ＩＧＨＶ３−２３（配列番号２）、又はＩＧＨＶ５−５１（配列番号３）で使用される重鎖ヒト生殖系列フレームワークに言及する１６９、３２３、及び５５１と呼ばれる。３つの重鎖ライブラリフレームワークは、４つの軽鎖ライブラリＶＬカッハ゜フレームワーク：Ａ２７（ＩＧＫＶ３−２０*０１（配列番号５））、Ｂ３（ＩＧＫＶ４−１*０１（配列番号６））、Ｌ６（ＩＧＫＶ３−１１*０１（配列番号７））、及びＯ１２（ＩＧＫＶ１−３９*０１（配列番号８））と組み合わされる。ライブラリにおいて、Ｆａｂｓ  Ｖ領域は、重鎖に配列番号４及び軽鎖に配列番号１０を含むＪ領域（ＦＲ４）の追加により完成する。重鎖ＣＤＲ３は、７〜１４残基の可変長のものである。各ライブラリの完全なＶ領域の例は、図１に示され、付番され、ＣＤＲ領域はＫａｂａｔに従い示される。
【０１２２】
初期の一式の抗ＯＳＭファージ提示ヒットは、市販のグリコシル化ヒトＯＳＭを使用して同定された。Ｆａｂ−ｐＩＸファージ提示ライブラリは、常磁性ストレプトアビジン（ＳＡ）ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１２．０５Ｄ）上に捕捉したビオチン化ヒトＯＳＭ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２９５−ＯＭ）、次に公開されたファージ選択のプロトコル（Ｍａｒｋｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｄｂｕｒｙ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．２４８：１６１〜１７６，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００４）を使用してパンニングされた。簡潔に、ビオチン化ヒトＯＳＭが１００ｎＭの最終濃度に未抱合ビーズ上に前吸着されたファージライブラリに添加され、穏やかに回転させながら１時間インキュベートされた。遮断されたＳＡビーズを添加し、結合ファージによりビオチン化ＯＳＭを捕捉するために１５分間インキュベートした。磁気的に捕捉したファージ／抗原／ビーズ複合体を１ｍＬのＴＢＳＴで５回、１ｍＬのＴＢＳで１回洗浄した。最後のＴＢＳ洗浄の除去後、１ｍＬの指数的に成長するＴＧ１細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２００１２３）を添加し、振盪させずに３０分間、３７℃でインキュベートした。感染細菌をＬＢ／寒天（１％グルコース／１００μｇ／ｍＬカルベニシリン）プレート（Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｌ５８０４）上に撒き、３７℃で一晩インキュベートした。菌叢をこすり落とし、グリセロールストック［１５％グリセロール／カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）／２ｘＹＴ］を調製し、−８０℃で保管した。２回目のパンニング用のファージを調製するために、２５ｍＬの２ｘＹＴ／カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）を２５μＬの細菌由来のグリセロールストックと共に播種し、ほぼ０．５のＯＤ６００まで、３７℃で成長させた。ヘルパーファージＶＣＳＭ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２００２５１）を約１０：１の感染の多重度で培養物に添加し、振盪させずに３０分間、３７℃でインキュベートを行った。細菌を沈降させ、ペレットを誘導培地（２ｘＹＴ／Ｃａｒｂ／Ｋａｎ／ＩＰＴＧ）に再懸濁し、一晩３０℃で成長させた。ファージを２％  ＰＥＧ／０．２５Ｍ  ＮａＣｌ（最終濃度）で沈殿させ、２ｍＬのＰＢＳに再懸濁した。初回のファージを４℃で保管し、２回目のパンニングを行うために使用した。パンニングパラメータは、１回目が１００ｎＭの抗原、室温で１時間インキュベート、ＴＢＳＴで洗浄５ｘ、次にＴＢＳで洗浄１ｘ；２回目が１０ｎＭの抗原、室温で１時間インキュベート、ＴＢＳＴで洗浄１０ｘ／ＴＢＳで洗浄１ｘ；そして３回目が１ｎＭの抗原、１６時間（一晩）４℃でインキュベート、ＴＢＳＴで洗浄１０ｘ／ＴＢＳで洗浄１ｘであった。
【０１２３】
Ｆａｂが抗ヒトＦｄ（ＣＨ１）抗体で捕捉され、ビオチン化ヒトＯＳＭが２０ｎＭで添加され、結合ＯＳＭがＳＡ−ＨＲＰにより検出された成功例がＥＬＩＳＡにより監視された。
【０１２４】
カニクイザルＯＳＭと交差反応することが示された、提示Ｆａｂとしての３０（３０）の固有の重鎖−軽鎖対合がＥＬＩＳＡにより同定された。重鎖は、１６９（ＩＧＨＶ１−６９由来）及び５５１（ＩＧＨＶ５−５１由来）ライブラリからの配列を表し、４つ全てのライブラリ生殖系列起源（Ａ２７、Ｂ３、Ｌ６、及びＯ１２）を表す軽鎖可変領域と組み合わされた。
【０１２５】
実施例３：ＯＳＭ結合ＭＡＢの特徴付け
４つの螺旋体束構造のＯＳＭは、比較的非構造的なループによって結合されるＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤと呼ばれる４つのα螺旋状セグメントを特徴とする。ＯＳＭは、配列番号１のアミノ酸及び残基Ｑ１６、Ｑ２０、Ｇ１２０、Ｎ１２３、Ｎ１２４による接触を含むように決定された螺旋体Ａ及びＣ（部位ＩＩ）に位置する表面を介してｇｐ１３０と相互作用する（Ｄｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ８（８）：８６３〜８７４，２０００、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２３：１６１〜１７２，２００９）。ＯＳＭＲβ及びＬＩＦＲα（部位ＩＩＩ）とのＯＳＭ相互作用に関与する表面は、螺旋体Ｄに位置する残基によって主に画定されると考えられている（Ｄｅｌｌｅｒら、同章）。
【０１２６】
ｇｐ１３０へのＯＳＭ結合の防止（部位ＩＩ又はＢ遮断剤）又はＬＩＦＲａ若しくはＯＳＭＲｂ（部位ＩＩＩ又はＲ遮断剤）のＯＳＭ結合ｇｐ１３０動員の防止のいずれかを通してＯＳＭ誘導ｇｐ１３０シグナル伝達を防止することができるＯＳＭに対して高親和性結合剤を選択することが目的である。
【０１２７】
最初に選択されたＯＳＭ結合Ｆａｂの３０のうち２９が、完全長ヒトＩｇＧ１  Ｍａｂに変換するためにベクターにクローン化された。特徴付けアッセイは、
（１）エピトープ群又は「ビン」を同定するための競合結合、（２）表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）による親和性測定、及び（３）ｐＳＴＡＴ３シグナル伝達を遮断する能力、であった。全てのスクリーニング及びアッセイは、実施例１に記載するように、哺乳動物の細胞生成（グリコシル化）されたヒト及びカニクイザルタンパク質を使用して行われた。
【０１２８】
結果
ｐＳＴＡＴ３及びＥＬＩＳＡ結合アッセイの対照ＭＡＢ２９５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に対するそのランク付けに基づき選択されたｍＡｂのサブセットの親和性測定のデータを表３に示す。
【０１２９】
【表４】
2013544076.tif 000011
【０１３０】
ビニングアッセイの結果は、Ｍ５、Ｍ６、及びＭ９が相互に競合したが、ＭＡＢ２９５と競合しなかったことを示した。Ｍ１０は、ＭＡＢ２９５と競合しなかった。これらの４つのｍＡｂは、ｇｐ１３０シグナル伝達の機能的中和剤であることもｐＳＴＡＴ３アッセイによって示された。したがって、Ｍ１０はＲ遮断剤であり、Ｍ５、Ｍ６、及びＭ９は、ｇｐ１３０へのＯＳＭ結合を遮断する（Ｂ遮断剤）であるということになる。
【０１３１】
治療誘導のための標的親和性は、親和性（ＫD）が約１ｎＭであると測定されたＯＳＭ−ｇｐ１３０相互作用と明確に競合する必要性によって決定された。したがって、ＯＳＭにおいて１００ｐＭ以下のＫDの標的親和性が所望された。
【０１３２】
治療候補の１００ｐＭ親和性の必要条件に合致した誘導体を生成するために、ＯＳＭ−ｇｐ１３０相互作用遮断剤であると分かったＭ５、Ｍ６、及びＭ９の中和ＭＡｂ＋Ｍ１０がインライン成熟のために選択された。ｍＡｂがヒトＯＳＭ（５００ｐＭ未満のＫD）の５倍以内の親和性でカニクイザルＯＳＭに結合することが更に望ましい特性であった。
【０１３３】
これら４つのＭａｂの結合ドメインの組成物は、表４に示されるように指定される４つの固有の重鎖及び軽鎖対を表すことが分かった。
【０１３４】
【表５】
2013544076.tif 000012
【０１３５】
完全な可変領域配列は、本明細書で上述されるファージライブラリを生成するために使用された生殖系列配列を含み、したがって、固定された残基は、未変異の親生殖系列残基と合致する。そのようなものとして、各Ｖ領域は、配列番号１〜３又は５〜８と呼ばれるスカフォールド内の指定されたＣＤＲ１及びＣＤＲ２、次にＣＤＲ３（表３及び４）、そして軽鎖可変領域（ＬＣについては表５、そしてＨＣについては表６）において、次に重鎖については配列番号４、及び軽鎖については配列番号１０としてＪ領域からなる。
【０１３６】
【表６】
2013544076.tif 000013
【０１３７】
ＨＣ可変領域Ｈ２は、配列番号１に由来するＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３を含み、この場合、Ｘ1＝Ａであり、Ｘ2＝Ｇであり、Ｘ3＝Ｉであり、Ｘ4＝Ｐであり、Ｘ５＝Ｉであり、Ｘ6＝Ｆであり、Ｈ−ＣＤＲ２に更なる変異を有する。ライブラリ５５１（Ｈ１４、Ｈ１７、及びＨ１３５）からのＨＣは、配列番号３に由来するＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３を含み、この場合、Ｘ1＝Ｓであり、Ｘ2＝Ｓ又はＧであり、Ｘ3＝Ｉであり、Ｘ4＝Ｙであり、Ｘ5＝Ｇであり、Ｘ6＝Ｙ又はＤである。４つのＨＣのそれぞれは、固有のＣＤＲ３（配列番号１９〜２２）からなる。
【０１３８】
【表７】
2013544076.tif 000014
【０１３９】
選択されたＦａｂのＬＣ可変領域は全て、Ｂ３ライブラリに由来し、本明細書及び参照刊行物に記載されるように、ライブラリ多様化の開始配列として使用されたＩＧＫＶ４−１（Ｂ３）としてＩＭＧＴデータベースに表される精選された生殖系列配列を含む。４つの軽鎖のうちの３つは、ＣＤＲ１が異なり、Ｈ−ＣＤＲ２が同一であった。４つの選択されたＬＣ可変ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３のコンセンサス配列は、配列番号８に由来し、この場合、Ｘ1は、Ｙ、Ｓ、又はＡであり、Ｘ2は、Ｋ、Ｅ、又はＮであり、Ｘ3は、Ｙ、Ｗ、又はＦであり、Ｘ4は、常にＷである。
【０１４０】
２つの固有のＣＤＲ３配列が同定された。Ｌ−ＣＤＲ３は、式Ｑ−Ｑ−（Ｓ，Ｙ）−（Ｆ，Ｙ）−Ｓ−（Ｆ，Ｔ）−ＰＬＴにより表されるコンセンサス配列（配列番号２９）によって表され得る。
【０１４１】
実施例４．親和性再選択
実施例３に記載されるＯＳＭＭ５、ＯＳＭＭ６、ＯＳＭＭ９、及びＯＳＭＭ１０の４つのＶ領域対合は、親和性を改善するために、軽鎖再選択のために選択された。効率的かつ能率的な様式で一次選択から多数の抗体を親和性成熟させるために、Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３９７：３８５〜３９６，２０１０及びＷＯ第０９０８５４６２Ａ１号並びにＵ．Ｓ．第１２／５４６８５０号に記載される「インライン」成熟過程が使用された。簡潔に、選択の初回に得た抗原特異的クローンのＶH領域は、対応するＶLスカフォールドのライブラリ（この場合、Ｂ３ベースのＶ領域（配列番号８））と組み合わされた。
【０１４２】
３つの新しいライブラリが作製され、１つは多様ＶL鎖の供給源として一次選択に使用されたＶLライブラリを使用し、２つの更なるライブラリは、既知の構造の最近の抗原−抗体複合体の分析に基づき設計された（Ｒａｇｈｕａｎｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ，２０１０）。残基は、特異性決定残基使用（ＳＤＲＵ）とも呼ばれる標的タンパク質の結合に最も関与している可能性があるこれらの残基に基づく多様化について選択された。Ｖカッパ軽鎖において、これは、標的がタンパク質、ペプチド、又は低分子ハプテンであるか否かにより僅かに異なる、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋによって画定される高頻度可変ループを中心とする３つの接触領域であることが決定された。表５は、親和性成熟に使用されたＶLライブラリを示し、この場合、Ｂ３は、発見段階中に使用された同じライブラリであり、ライブラリ２の「ＳＤＲＭ集中」は、ＳＤＲＵ残基及び多様性の集中に基づいており、ＮＮＫは、無作為化ライブラリである。表において、「Ｘ」は、ＮＮＫミックスにより生成された任意のアミノ酸＋１つの終止コドンを意味する。
【０１４３】
表７にライブラリー１、２及び３の多様性がまとめてある。最終ライブラリの分析中、当初の設計の一部でなく、したがって、合成法の結果として導入された幾つかのアミノ酸を同定した。ジヌクレオチドを使用して合成されたライブラリ２に関し、こうしたアミノ酸は、Ｓ（位置３０ｃ）、Ｔ（位置３０ｄ）、ＥＫ（位置３０ｆ）、ＩＷ（位置３２）、ＴＶ（位置５０）、Ｉ（位置９２）、Ｄ（位置９３）、及びＦ（位置９６）であった。
【０１４４】
【表８】
2013544076.tif 000015
【０１４５】
Ｆａｂ−Ｈｉｓタンパク質は、３回目のパンニング生産物、及び対応する親Ｆａｂより高い結合シグナルを有する個々のヒットを同定するために採用されたモノクローナルＦａｂ−Ｈｉｓ  ＥＬＩＳＡから調製された。２ｎＭ及び０．２ｎＭの２つの濃度のビオチン化ヒト抗原がこれらのランク付けＥＬＩＳＡに使用された。各親クローンの結合シグナルは、１００％として設定された。元来の重鎖及び軽鎖Ｖ領域を含む親Ｆａｂと比較した場合、最大９倍（９００％）改善された結合を示すＭ６及びＭ９の親和性成熟から２２のヒットがあった。重鎖及び軽鎖のこれらの新しい対合の幾つかを更なる評価のために選択した。
【０１４６】
ＭＡＢ２９５対照並びに親ｍＡｂのＭ６及びＭ９と比較したヒト及びカニクイザルＯＳＭのインライン成熟ｍＡｂの親和性（ＫD）を表８にまとめ、これらのｍＡｂのＣＤＲ組成物を表９に示す。幾つかの場合において、ＬＣＶは、Ｈ１４及びＨ１７の両方と対合された。その生物物理学的特性及び機能特性に基づき指定された候補治療誘導であった特定のｍＡｂは灰色で強調される。
【０１４７】
【表９】
2013544076.tif 000016
【０１４８】
【表１０】
2013544076.tif 000017
【０１４９】
選択された候補のＬＣ−ＣＤＲ３多様性Ｑ−Ｑ−（Ｓ，Ｙ）−（Ｆ，Ｙ）−Ｓ−（Ｆ，Ｔ）−ＰＬＴ（配列番号２９）を減らし、再選択された高親和性ＬＣ−ＣＤＲ３のコンセンサス配列は、ＱＱＹ−（Ｆ，Ｙ）−ＳＴＰ−（Ｌ，Ｉ）−Ｔ（配列番号４７）として表される。
【０１５０】
再選択されたｍＡｂにおいて、Ｈ１４及びＨ１７のＶＨは、配列番号４８により与えられ、配列番号１４（ＣＤＲ１）及び配列番号１７（ＣＤＲ２）を含む共通のＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３を共有する。
【０１５１】
ヒト及びカニクイザルＡ３７５−Ｓ２細胞増殖を減少させる能力
インライン成熟抗体を評価するために、１〜５希釈で５μｇ／ｍＬ又は１μｇ／ｍＬから開始して、それぞれ、０．００１６又は０．０００３２μｇ／ｍＬに至るまで用量応答が実施された。Ｍ７１による中和を図２Ｂに示す。抗体の濃度が増加すると、ヒト及びカニクイザルオンコスタチンＭの両方の抗増殖作用が中和される。用量応答曲線は、ヒト（開記号）及びカニクイザル（閉記号）オンコスタチンＭを用いた３つの別個の実験からのデータを使用して計算された。表１０は、ヒト及びカニクイザルオンコスタチンＭに対するＭ５５、Ｍ６４、Ｍ６９、及びＭ７１のＩＣ50（９５％信頼区間）をまとめる。
【０１５２】
【表１１】
2013544076.tif 000018
【０１５３】
ヒトｇｐ１３０競合
競合実験は、実施例１に記載されるＢｉａｃｏｒｅ  ３０００光学バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、インライン成熟＋上記の表からの選択された新しい結合剤用に選択された抗ＯＳＭ  ｍＡｂとヒトｇｐ１３０との間で行われた。
【０１５４】
バイオセンサー表面は、製造者の指示に従い、各試験ｍＡｂをカルボキシメチル化デキストラン表面のＣＭ−５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１０００−１４）にカップリングすることにより調製された。各試験ｍＡｂの約４，０００〜１５，０００ＲＵ（反応単位）は、機器の４つのフローセルの１つに固定された。競合実験は、ランニング緩衝液（ＤＰＢＳ＋０．００５％  Ｐ２０＋３ｍＭ  ＥＤＴＡ）の中で２５℃で実施された。ヒトＯＳＭ（実験室内、ＯＳＭＮ１−１）をランニング緩衝液中で３０ｎＭに希釈し、固定されたｍＡｂを含むフローセルのそれぞれの上に３μＬ／分で３分間注入した。ヒトＯＳＭ捕捉後、３００ｎＭで競合ｍＡｂ又はヒトｇｐ１３０−Ｆｃのいずれかを３分間注入し（会合段階）、次に３分間緩衝層を流した（解離段階）。１００ｍＭのＨ3ＰＯ4（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号７９６１）の５０μＬ／分での１２秒の２つのパルスによってチップ表面を再生した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア、バージョン３．２（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて、回収したデータを加工した。最初に、ヒトＯＳＭの注入時にセンサーグラムを整合した。次に、ヒトＯＳＭの結合レベル（ＲＵ）、競合ｍＡｂ、又はｇｐ１３０−Ｆｃを記録した。競合ｍＡｂ又はｇｐ１３０−ＦｃがＯＳＭ表面上に注入されたときの結合（ＲＵ）の上昇は、固定された試験ｍＡｂとの競合がないことを示し、逆もまた同様である。フローセル（Ｆｃ１など）固定されたｍＡｂは、表１０の水平のサンプル列に沿って表示される。
【０１５５】
Ｍ２は、ＯＳＭに結合するｇｐ１３０と競合しないことが知られている市販の抗体ＭＡＢ２９５と競合することが以前示された。競合結合アッセイを示す結果は、Ｍ５４、Ｍ５５、Ｍ６４、Ｍ６９、及びＭ７１がＯＳＭ抗原においてヒトｇｐ１３０−Ｆｃと競合することを示した（表１１）。
【０１５６】
【表１２】
2013544076.tif 000019
【０１５７】
Ａ３７５細胞においてｐＳＴＡＴ３を遮断する能力
Ｍ６及びＭ９の５ｎｇ／ｍＬのｈＯＳＭの存在下又は不在下で、Ａ３７５細胞及びこれらのＭａｂのインライン成熟変異体において実施された、計算されたｐＳＴＡＴ３阻害のＥＣ５０値を表１２に示す。
【０１５８】
【表１３】
2013544076.tif 000020
【０１５９】
実施例５．生物活性
マクロファージ−軟骨細胞共培養アッセイ
マクロファージ−軟骨細胞共培養系において、Ｍ７１を評価した。分化マクロファージは、オンコスタチンＭを生成することが知られている（Ｈａｓｅｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ３８：６１２〜６１７，１９９９）。ＯＳＭは、軟骨マトリックスの大部分を作り上げる高度に硫酸化されたプロテオグリカンアグリカン（ＧＡＧ）の合成を減少させることができる。
【０１６０】
抗ヒトオンコスタチンＭ抗体は、組み換えＨＥＫ生成Ｈｉｓ−Ａｖｉタグ付けされたヒト及びカニクイザルのオンコスタチンＭを使用して発見され、これらの抗体の活性は、これらの分子並びにＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（２９５−ＯＭ）の細菌由来の組み換えヒトオンコスタチンＭを使用して評価された。ｈｉｓ−ａｖｉタグ（ＨＥＫ生成Ｏｓｍ）又はグリコシル化（細菌由来の組み換えＯｓｍ）の欠損のいずれかのため、これらのいずれも天然の内因性ヒトオンコスタチンＭと同一ではない。マクロファージは、オンコスタチンＭを分泌することが知られており（Ｇｒｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ３２：１８８９〜９７，１９９１）、オンコスタチンＭは、ヒト軟骨細胞においてプロテオグリカン合成を減少させる（Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．ＯＡ  ａｎｄ  Ｃａｒｔ．１２：８１０−１０，２００４）。よって、マクロファージ−軟骨細胞共培養系は、抗ヒトオンコスタチンＭ抗体が内因性又は天然のヒトオンコスタチンＭを中和する能力を決定するために使用された。簡潔に、４０，０００の正常なヒト関節軟骨細胞を含有する単一のアルギン酸塩ビーズを分化ヒトマクロファージの存在下で７２時間培養した。これらの実験は、用量範囲の抗オンコスタチンＭ抗体の存在下で行われた。実験の終わりに、放射能35ＳＯ4の取り込みによりプロテオグリカン合成を測定した。
【０１６１】
ＣＤ１４＋末梢血単球をＡｌｌＣｅｌｌから得た。０．５ｍＬのマクロファージ培地（１０％の熱失活されたＦＢＳ、１％のＮＥＡＡ、及び１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐを含むＲＰＭＩ＋グルタミン）中で、２．５×１０５細胞／ウェルの４８ウェルプレート上で単球を培養した。細胞を１００ｎｇ／ｍＬのマクロファージ−コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）で処理した。４８時間後、培地を交換して、非付着細胞を取り除いた。６日目に、Ｍ−ＣＳＦ含有マクロファージ培地を、Ｍ−ＣＳＦを含まないマクロファージ培地と交換した。８日目に、マクロファージ培地を軟骨細胞培地（１０％のウシ胎児血清を含む５０％のＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２／５０％  ＤＭＥＭ）と交換し、単一のアルギン酸塩ビーズ軟骨細胞培養物（Ａｒｔｉｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ＃ＣＤＤ−Ｈ−２２００）を各ウェルに添加した。Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ  Ｍ  ＤｕｏＳｅｔ（ＤＹ２９５）を使用してオンコスタチンＭレベルの分析用に条件付きマクロファージ培地のアリコートを確保し、−８０℃で保管した。
【０１６２】
アルギン酸塩ビーズ−マクロファージ共培養物を、２０μｇ／ｍＬの抗ヒトオンコスタチンＭ抗体（Ｍ６４、Ｍ７１、Ｍ５５、Ｍ６９）の存在下、又は用量範囲（５μｇ／ｍＬ〜０．０００７６μｇ／ｍＬ；１〜３希釈）の抗体（Ｍ７１及びＭ５５）の存在下のいずれかで、維持した。加えて、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＣＮＴＯ６２３４）が、試験された抗オンコスタチンＭ抗体の最高濃度でプレートに含まれた。他の対照は、軟骨細胞のみ（共培養ではない）及び２ｎｇ／ｍＬのヒトオンコスタチンＭの存在下の軟骨細胞であった。加えて、マクロファージのみを含有するウェルは、オンコスタチンＭの産生を測定するために維持された。７２時間の共培養後、更に２０時間の間、１０μＣｉ／ｍＬの放射能３５ＳＯ４（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＮＥＸ０４１Ｈ００２ＭＣ）を各ウェルに添加した。
【０１６３】
35ＳＯ4の取り込みは、ＣＰＣ沈殿法（ＭＰ  ＢＩｏｍｅｄｉｃａｌｓ（＃１９０１７７））を使用して測定された。35ＳＯ4と共に２０時間インキュベートした後、標識された培地を取り出し、各ビーズをＣａ及びＭｇを含むＤＰＢＳで２回洗浄した。２回目の洗浄後、２００μＬのクエン酸緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、５５ｍＭのクエン酸Ｎａ、ｐｈ  ６．８）を各ビーズに添加した。ビーズが溶解されるまで、プレートを３７℃で１０〜１５分間インキュベートした。各ウェルからの１００μＬのアリコートを１％のＣＰＣで予備湿潤したＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ  ９６ウェルフィルタプレートに移し、次に１０μＬの１０％のＣＰＣを５分間各ウェルに添加した。次に、フィルタが乾くまで、プレートに真空を適用した。次に、各ウェルを２００μＬの１％のＣＰＣで２回洗浄し、フィルタが乾くまで、毎回プレートに真空を適用した。次に、プラスチックの底をプレートから取り外し、シーラ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＃６００５１８５）と交換した。シンチレーション流体（５０μＬ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＃６０１３６２１）を各ウェルに添加し、プレートシーラをプレートの上に適用した。次に、プレートをＴｏｐ  Ｃｏｕｎｔ読み取り器上で数えた。
【０１６４】
２０μｇ／ｍＬで、Ｍ６４、Ｍ７１、Ｍ５５、及びＭ６９は、プロテオグリカン合成を抗体の不在下で観察されたレベルより上に増加させ、一方、アイソタイプ対照は効果がなかった（図３）。別の実験において、Ｍ７１は、プロテオグリカン合成を軟骨細胞のみにより示されたレベル（１００％中和として定義される）に用量を依存的に増加させ、ＥＣ５０は３０ｎｇ／ｍＬであり、アイソタイプ対照は効果がなかった。これらのデータは、マクロファージ由来Ｏｓｍが共培養された軟骨細胞においてプロテオグリカン合成を減少させ、抗ヒトオンコスタチンＭ抗体が天然のオンコスタチンＭを中和したことを示す。
【０１６５】
ヒト肺線維芽細胞Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＳＴＡＴ３アッセイ
ＯＳＭは、正常なヒト肺線維芽細胞において増殖及びコラーゲン産生を誘発する（Ｓｃａｆｆｉｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １３６：７９３〜８０１，２００２）。線維芽細胞によるコラーゲンの過剰産生は、多くの病理学的状態の主な特徴である（Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３（３９）：５４１６〜２５，２００６、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ８１（１）：１０２〜１３，２００１）。オンコスタチンＭ受容体シグナル伝達は、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路を活性化し、ＳＴＡＴ３のリン酸化反応は、シグナル伝達経路における初期事象である（Ａｕｇｕｓｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｔｙｐｅ  ＩＩ  Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ  Ｍ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：１５７６０〜１５７６４）。オンコスタチンＭがｐＳＴＡＴ３を生成する能力は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｈｕｍａｎ／ｍｏｕｓｅ  ｐＳＴＡＴ３  Ｄｕｏｓｅｔ（ＤＹＣ４６０７−５）を用いて、正常なヒト肺維芽細胞（ＮＨＬＦ）において決定された。次に、このアッセイは、Ｍ５５及びＭ７１がオンコスタチンＭシグナル伝達を中和する能力を決定するために使用された。
【０１６６】
これらの実験は、Ｌｏｎｚａ所有ＦＧＭ−２（ＣＣ−３１３２）培地中で成長させたＬｏｎｚａ（ＣＣ−２５１２）からのＮＨＬＦを使用して行われた。簡潔に、細胞をＦＧＭ−２中で、２５，０００細胞／ウェルで平板培養し、２４時間培養した。次に、細胞をオンコスタチンＭ抗体又は抗体＋オンコスタチンＭで１０分間処理した。この１０分間のインキュベーション中の温度依存作用を避けるために、処置を調製するために使用された溶液の全ては、予め加温され、３７℃に維持された。１０分間の処理後、培地を吸引して取り除き、完全溶解緩衝液と交換した。溶解緩衝液（ｐＨ＝７．２）は、１％のＮＰ−４０、１％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、及び０．０１Ｍのリン酸ナトリウムからなり、４℃で保管された。使用する時に、完全溶解緩衝液は、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ，１１８３６１５３００１）１錠、及び１１０μＬのＨＡＬＴホスファターゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ７８４２０）を１１ｍＬの溶解緩衝液に添加することによって調製された。１０分間の溶解工程後、得られた溶解物は、ｐＳＴＡＴ３検出ができる状態である。
【０１６７】
オンコスタチンＭ用量応答を決定するために、ＮＨＬＦ細胞を用量範囲のＯＳＭ（１〜４希釈で１００ｎｇ／ｍＬ〜０．０２４ｎｇ／ｍＬ、３つ組ウェル）で処理した。各ウェルのＯｓｍの濃度が処理に必要な最終濃度より１０Ｘ高い予め加温したＰＢＳ＋１％のＢＳＡ中で希釈プレートを調製し、培地のみのウェルが、未処理対照として含まれた。培地を培養プレートから完全に取り除き、１８０μＬの予め加温されたＦＧＭ−２と交換した。タイマーを１０分間開始させ、次に２０μＬを希釈プレートの各ウェルから培養プレートの対応するウェルに移した。１０分後、細胞プレート中の処置溶液を吸引により完全に取り除き、１００μＬの完全溶解緩衝液と交換した。インキュベーション時間の差を最小にするために、溶解緩衝液を処理と同じ順序でウェルに添加した。次に、アッセイプレートを１０分間振盪器に設置した。振盪後、溶解物は、後の試験のために−８０℃で凍結されるか、又は抗ｐＳＴＡＴ３でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに直接移されるかのいずれかであった。ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｈｕｍａｎ／ｍｏｕｓｅ  ｐＳＴＡＴ３  Ｄｕｏｓｅｔ）は、１）９０μＬの溶解物又は標準物のみが各ウェルに添加された、及び２）ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｐｉｃｏ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ３７０６９）がＨＲＰ基質として使用されたことを除き、製造者の指示に従い行われた。ＥＬＩＳＡプレートは、Ｖｉｃｔｏｒ３プレート読み取り器上で発光について読み取られた。
【０１６８】
Ｍ５５及びＭ７１がＮＨＬＦのＯＳＭシグナル伝達を中和する能力を評価するために、細胞を２ｎｇ／ｍＬのヒトＯｓｍの存在下、用量範囲の抗ＯＳＭ抗体（３つ組ウェル、１〜１０希釈で５００ｎｇ／ｍＬ〜０．００５ｎｇ／ｍＬ、又は１〜２希釈で５０ｎｇ／ｍＬ〜１．５６３ｎｇ／ｍＬ）で処理した。アイソタイプ対照（最高濃度の抗ＯＳＭ抗体）用に含まれたウェル、並びに未処理対照及びＯＳＭのみで処理された細胞の両方に抗体を含まない希釈プレートが、最終濃度の２０Ｘで抗体用量応答処置用にＰＢＳ中で調製された。ヒトオンコスタチンＭは、ＦＧＭ−２中で４０ｎｇ／ｍＬ（最終濃度の２０Ｘ）で別に調製された。２０Ｘの抗体及びＯＳＭ溶液は、１０Ｘの処置溶液を生成するために希釈プレート中で等容量で混合され、プレートを３７℃で１時間インキュベートし、ＯＳＭを抗体に結合させた。１時間後、培地を培養プレートから取り除き、１８０μＬの予め加温されたＦＧＭ−２と交換した。タイマーを１０分間開始させ、２０μＬを希釈プレートの各ウェルから培養プレートの対応するウェルに移した。１０分後、細胞プレート中の溶液を吸引により完全に取り除き、１００μＬの完全溶解緩衝液と交換した。インキュベーション時間の差を最小にするために、溶解緩衝液を処理と同じ順序でウェルに添加した。次に、アッセイプレートを１０分間振盪器に設置した。振盪後、溶解物は、後の試験のために−８０℃で凍結されるか、又は抗ｐＳＴＡＴ３でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに直接移されるかのいずれかであった。ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｈｕｍａｎ／ｍｏｕｓｅ  ｐＳＴＡＴ３  Ｄｕｏｓｅｔ）は、１）９０μＬの溶解物又は標準物のみが各ウェルに添加された、及び２）ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｐｉｃｏ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ３７０６９）がＨＲＰ基質として使用されたことを除き、製造者の指示に従い行われた。ＥＬＩＳＡプレートは、Ｖｉｃｔｏｒ３プレート読み取り器上で発光について読み取られた。
【０１６９】
ヒトオンコスタチンＭは、約１ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０でＮＨＬＦ細胞においてｐＳＴＡＴ３を増加させた。オンコスタチンＭ用量応答の例を図４Ａに提供する。この例において、ＥＣ５０は０．９０ｎｇ／ｍＬであり、９５％信頼区間は０．７０〜１．１７ｎｇ／ｍＬであった。抗オンコスタチンＭ抗体の中和能力は、２ｎｇ／ｍＬのオンコスタチンＭの存在下で決定され、データの全ては、抗体が存在しない２ｎｇ／ｍＬのＯＳＭの存在下の発光に正規化された。図４Ｂは、Ｍ７１によるＯＳＭ誘発ＳＴＡＴ３リン酸化反応の用量依存中和を示す。Ｍ７１の濃度が増加すると、ＳＴＡＴ３リン酸化反応の程度が減少する。用量応答曲線は、６つの別個の実験からのデータから計算され、計算されたＭ７１のＩＣ５０は８．９ｎｇ／ｍＬであり、９５％信頼区間は６．９〜１１．６ｎｇ／ｍＬであった。
【０１７０】
実施例６：インビボでの活性
Ｍ７１は、ヒトオンコスタチンＭの全身性投与後のインビボでサイトカインの産生を遮断するその能力について評価された。ヒトオンコスタチンＭの腹腔内注入は、おそらくマウス白血病阻害因子受容体を通して、及びそれと相互作用して特定の血清サイトカインのレベルを増加させる。
【０１７１】
ヒトオンコスタチンＭのマウスへの全身（ｉ．ｐ．）投与は、抗オンコスタチンＭモノクローナル抗体がインビボ設定で中和する能力を評価するためのモデルとして開発された。マウスは、２００μＬのＰＢＳ中の１０μｇのヒトオンコスタチンＭ又はＰＢＳビヒクル対照でｉ．ｐ．注入された。１時間後、マウスをＣＯ２で麻酔し、末端心穿刺により血液を採取した。個々の血液サンプルを氷上で２０分間凝固させ、次に３５００ｒｐｍで１０〜１５分間回転させた。血清サンプルは、製造者の指示により、ＭｉｌｌｉｐｌｅｘマウスＭＡＰサイトカイン／ケモカインマルチプレックス（３２）パネルを用いて分析されるまで凍結させた。サンプルの分析は、ビヒクル対照と比較して、ヒトオンコスタチンＭがパネルの他のサイトカインに対して作用することなくマウスＫＣ、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、及びエオタキシンの血清レベルを顕著に増加させたことを示した。これらのデータは、ヒトオンコスタチンＭの注入が、おそらく抗オンコスタチンＭ抗体がインビボで中和する能力を試験するために使用され得るマウス白血病阻害因子受容体との相互作用を通してサイトカイン放出を誘発することを示す（Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：２４３１〜３７，１９９７、Ｌｉｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １８：３３５７〜３３６７，１９８８）。
【０１７２】
Ｍ７１及びＭ５５は、マウス全身投与モデルで評価された。簡潔に、マウスは、Ｍ７１又はＭ５５（２０、２．０、又は０．２ｍｇ／ｋｇのヒトＩｇＧ１抗ヒトＯｓｍ）、ＣＮＴＯ６２３４（ｈｕＩｇＧ１アイソタイプ対照、２０ｍｇ／ｋｇ）、又は１０μＬ／ｇの容量のＰＢＳで皮下的に投与された。２４時間後、次いで各マウスは、０．１％のマウス血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ  Ａ３５５９）を含むＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｄ８３５７）中の１０μｇの実験室内で生成されたＣＨＯ細胞由来組み換えヒトオンコスタチンＭ、又はＰＢＳ−ＭＳＡビヒクル対照のみ（総容量２００μＬ）のいずれかでｉ．ｐ．注入された。１時間後、マウスをＣＯ２で麻酔し、末端心穿刺により血液を採取した。個々の血液サンプルを氷上で２０分間凝固させ、次に３５００ｒｐｍで１０〜１５分間回転させた。血清サンプルは、ＭｉｌｌｉｐｌｅｘマウスＭＡＰサイトカイン／ケモカインマルチプレックス（３２）パネルを用いて分析されるまで凍結させた。血清サンプルを製造者の指示により分析した。
【０１７３】
ヒトオンコスタチンＭは、キットにより検出された５つサイトカイン（エオタキシン、ＩＬ−６、ＩＰ−１０、ＫＣ、及びＭＣＰ−１）の血清レベルにおいて大幅な（対合されないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定）増加を誘発した。２０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照ＣＮＴＯ６２３４での前投与は、オンコスタチンＭ誘発サイトカイン放出に対して作用がなかった。しかしながら、Ｍ７１による前投与は、２．０及び２０ｍｇ／ｋｇでＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、及びエオタキシン並びに２０ｍｇ／ｋｇでＫＣの、血清レベルを大幅に減少させた。０．２ｍｇ／ｋｇのＭ７１でサイトカインのいずれに対しても作用はなかった。Ｍ７１及びアイソタイプ対照のＩＰ−１０及びＭＣＰ−１に対する作用を、それぞれ、図５Ａ及びＢに示す。２０及び２．０ｍｇ／ｋｇの両方での中和はＩＰ−１０でのみ見られたが、強い中和はＭ５５であまり観察されなかった。ＩＬ−６、エオタキシン、及びＭＣＰ−１の血清レベルは、２０ｍｇ／ｋｇのＭ５５で減少したが、ＫＣレベルでの減少は、Ｍ５５のいずれの用量でも見られなかった。これらのデータは、抗オンコスタチンＭ抗体がマウス全身投与モデルにおいて外因性ヒトオンコスタチンＭの生物学的作用を中和する能力を示した。
【０１７４】
ＩＰ−１０（インターフェロンγ誘発タンパク質１０ｋＤａ又は低誘発性サイトカインＢ１０）は、ヒトにおいて、ＣＸＣＬ１０遺伝子（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０））によりコードされるタンパク質である。ＣＸＣＬ１０は、単球／マクロファージ、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び樹状細胞における化学誘引、並びに内皮細胞へのＴ細胞付着促進等の、幾つかの役割に起因する。現在ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（ＣＸＣＬ１）として知られるＫＣは、以前はＧＲＯ１癌遺伝子、ＧＲＯα、好中球活性化タンパク質３（ＮＡＰ−３）、及びメラノーマ成長刺激活性α（ＭＳＧＡ−α）とも呼ばれたＣＸＣケモカインファミリーに属する低分子サイトカインである。ヒトにおいて、このタンパク質は、ＣＸＣＬ１遺伝子によりコードされる。ＣＸＣＬ１は、マクロファージ、好中球、及び上皮細胞によって発現し、好中球化学誘引物質活性を有する。
【０１７５】
実施例７．共結晶学
Ｖ領域Ｈ１７（配列番号５１）及びＬ１８０（配列番号５５）を含むＦａｂ断片は、ヒトＯＳＭ（配列番号１０）残基２６〜２１２と共に結晶化された。
【０１７６】
ＯＳＭは、ｇｐ１３０サイトカインファミリーの他のメンバーとその４つの螺旋体束３次元構造を共有する。４つの螺旋体束構造は、比較的非構造的なループによって結合されるＡ（残基１０〜３７）、Ｂ（残基６７〜９０）、Ｃ（残基１０５〜１３１）、及びＤ（残基１５９〜１８５）と呼ばれる４つのα螺旋体セグメントを特徴とする。ＯＳＭは、螺旋体Ａ及びＣに位置するアミノ酸残基（Ｑ１６、Ｑ２０、Ｇ１２０、Ｎ１２３、Ｎ１２４）を含むエピトープ指向部位ＩＩを介してｇｐ１３０と相互作用する（Ｄｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ８（８）：８６３〜８７４，２０００、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２３：１６１〜１７２，２００９）。ＯＳＭＲβ及びＬＩＦＲαとのＯＳＭ相互作用に関与するエピトープである部位ＩＩＩは、大部分は螺旋体Ｄに位置する残基によって画定されると考えられている（Ｄｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ８（８）：８６３〜８７４，２０００）。
【０１７７】
結晶化
複合体の結晶化は、０．２μＬのタンパク質複合体（１０．９５ｍｇ／ｍＬ）及び０．２μＬのリザーバ溶液の等容量を分配するＯｒｙｘ４タンパク質結晶化ロボット（Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、２０℃でシッティングドロップ（sitting-drop）蒸気拡散法により実施された。多重結晶化スクリーニングが実施された。大半の液滴は透明なままであり、複合体の高可溶性を示す。結晶は、０．１ＭのＭＥＳ（ｐＨ  ６．５）、２．４Ｍの硫酸アンモニウム、及び０．１Ｍのトリス（ｐＨ  ８．５）、３．５Ｍのギ酸ナトリムから得た。
【０１７８】
結晶構造溶液の結果
Ｈ１４／Ｌ１８０  Ｆａｂと接触するＯＳＭ残基は、結合エピトープを構成する。ＯＳＭと接触する抗体残基は、結合パラトープを構成する。２つの可変ドメインの６つ全てのＣＤＲは、ＯＳＭ結合に関与する。接触する残基は表１３に記載され、図５に示される。重鎖可変領域Ｈ１のＣＤＲと共に、長いＣＤＲ−Ｌ１は、底部に小さい隆起を有する谷のような結合部位を形成する（図４Ｃ、左側のパネル）。結合時、谷の両側は、２つの螺旋体の間に底部隆起結合を有する螺旋体Ａ及びＣに沿ってＯＳＭの４つの螺旋体束を抱持する（図４Ｃ、右側のパネル）。抗体及び抗原結合接触面は、溶媒アクセス可能表面の２，５１４Å２を埋設する（Ａｂにおいては１２２５Å２及びＡｇについては１２９８Å２）。接触面に多くの荷電残基が存在するが、荷電−荷電対合は存在せず、ｖｄｗ及びＨ結合が抗体及び抗原相互作用に最も重要な役割を果たすことを示唆する。
【０１７９】
【表１４】
2013544076.tif 000021
*距離カットオフ値は、Ｈ結合（太字で強調される）においては３．３Å、そしてｖｄｗ接触においては３．９Åである。
【０１８０】
よって、Ｈ１７／Ｌ１８０  Ｆａｂは、ｇｐ１３０、Ｑ２０及びＧ１２０によって、並びにＡ及びＣ螺旋体に沿って接触することが以前に示された残基でＯＳＭに接触する。
【０１８１】
実施例８：薬物動態
ＯＳＭは、細胞上の細胞表面提示標的とは反対に、炎症性過程に関連する可溶性標的である。本明細書で発見された結合領域を含み、Ｆｃドメインを更に有する完全なＩｇＧの性質は、よって、改変ＦｃＲ結合を付与する変異体でＦｃを操作する方法を使用して、その使用に関連する目的及び治療仕様に合わせることができる。
【０１８２】
本発明の組成物において、循環における活性の維持及び持続性は、治療用モノクローナルＩｇＧの有益な仕様である。したがって、Ｆｃドメインは、新生児受容体（ＦｃＲｎ）に対して強化された親和性を有する。
【０１８３】
Ｎ４３４Ｓ（ＵＳ第７３７１８２６号、ＷＯ第２００６／０５３３０１号）と組み合わせて、前述される変異Ｍ４２８Ｌ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ、米国特許第７６７０６００号）を使用して、標準的な組み換え技法を用いて変異した野生型の抗体を構築した。これらの２つのＭａｂであるＭ７１及びＭ７１  Ｌ／Ｓは、標準的な活性アッセイにおいて比較され、ヒト以外の霊長類の循環における持続性について比較された。
【０１８４】
アッセイ
Ｍ７１及びＭ７１  Ｌ／Ｓは、Ａ３７５−Ｓ２増殖アッセイにおいて、並べて比較された。用量応答は、１〜５希釈で１μｇ／ｍＬの開始濃度から０．０００３２μｇ／ｍＬまで評価された。１μｇ／ｍＬの濃度で、これらの抗体のアイソタイプ対照であるＣＮＴＯ３９３０及びＣＮＴＯ８８５２は、それぞれ、２ｎｇ／ｍＬのヒトオンコスタチンＭが増殖を阻害する能力に対して効果がなかった。Ｍ７１及びＭ７１  Ｌ／Ｓの両方は、１μｇ／ｍＬでオンコスタチンＭの作用を完全に中和し、ＩＣ５０において測定可能な相違はなかった。
【０１８５】
マウス全身投与モデルにおいて、Ｍ７１及びＭ７１  Ｌ／Ｓを比較した。簡潔に、マウスは、Ｍ７１及びＭ７１  Ｌ／Ｓ（２０、１０、又は５．０ｍｇ／ｋｇ）、ＣＮＴＯ３９３０（ｈｕＩｇＧ１アイソタイプ対照、２０ｍｇ／ｋｇ）、ＣＮＴＯ８８５２（Ｆｃ変異型のアイソタイプ対照、２０ｍｇ／ｋｇ）、又は１０μＬ／ｇの容量のＰＢＳで皮下的に投与された。２４時間後、各マウスは、０．１％のマウス血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ  Ａ３５５９）を含むＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｄ８３５７）中の１０μｇの室内で生成されたＣＨＯ細胞由来組み換えヒトオンコスタチンＭ、又はＰＢＳ−ＭＳＡビヒクル対照のみ（総容量２００μＬ）のいずれかでｉ．ｐ．注入された。１時間後、マウスをＣＯ２で麻酔し、末端心穿刺により血液を採取した。個々の血液サンプルを氷上で２０分間凝固させ、次に３５００ｒｐｍで１０〜１５分間回転させた。ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、エオタキシン、ＫＣ、及びＩＰ−１０に特異的なビーズからなる特注のＭｉｌｌｉｐｏｒｅマウスマルチプレックスを使用して分析するまで血清サンプルを凍結した。いずれのアイソタイプ対照は、ヒトオンコスタチンＭによって誘発されたサイトカイン放出に対していずれの作用もなかった。しかしながら、Ｍ７１及びＭ７１  Ｌ／Ｓの両方は、オンコスタチンＭ誘発サイトカイン放出を中和し、潜在能又は有効性において明らかな相違はなかった。
【０１８６】
薬物動態分析
非末端カニクイザル薬物動態研究において、Ｍ７１及びＭ７１  Ｌ／Ｓの血清半減期を比較した。研究は、総数１２匹のカニクイザルを含み、各抗体について皮下（ｓ．ｃ．、ｎ＝３）及び静脈内（ｉ．ｖ．、ｎ＝３）投与を評価した。３ｍｇ／ｋｇの抗体が投与され、研究は６０日にわたって行われた。血液サンプルは、１（ＩＶ群のみ）時間及び６時間、並びに１、２、４、６、８、１２、１６、３０、３７、４５、及び６０日目に採取された。サンプルからの血清は、試験まで−８０℃で凍結された。血清の抗体レベルは、カニクイザル血清において、ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙプラットホーム用に最適化されたＥＬＩＳＡを使用して決定された。ビオチン化捕捉抗体は、Ｍ７１（マウス抗Ｍ７１）に対して生じた抗イディオタイプ抗体であった。検出抗体はルテニウム標識された抗ヒトＩｇＧであり、読み出しはＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ化学発光であった。
【０１８７】
研究の結果を図６Ａ及びＢに示す。図６Ａは、Ｍ７１の血清半減期が１５．２１＋／−３．０日であり、Ｍ７１  Ｌ／Ｓの半減期が２９．４＋／−２．３日であるｉ．ｖ．投与からのプロットを示す。同様の結果がｓ．ｃ．投与（図６Ｂ）から得られ、Ｍ７１においては１５．４＋／−４日の血清半減期であり、Ｍ７１  Ｌ／Ｓにおいては３２．０＋／−５．９日であった。
【０１８８】
結果は、Ｍ７１  Ｌ／Ｓ  ｔ  １／２がＭ７１と比較して、約２倍増加したことを示した。
【図１】
2013544076.tif 000022
【図２Ａ】
2013544076.tif 000023
【図２Ｂ】
2013544076.tif 000024
【図３】
2013544076.tif 000025
【図４Ａ】
2013544076.tif 000026
【図４Ｂ】
2013544076.tif 000027
【図５Ａ】
2013544076.tif 000028
【図５Ｂ】
2013544076.tif 000029
【図６Ａ】
2013544076.tif 000030
【図６Ｂ】
2013544076.tif 000031
【配列表】
2013544076000001.app
【国際調査報告】
2013544076.tif 000032
2013544076.tif 000033
2013544076.tif 000034
2013544076.tif 000035