(57)【要約】その断面に沿って部分的に変調周波数で位相変調される少なくとも１つの照明用ビームと、試料内への照明用ビームの強度変調された合焦のための顕微鏡対物レンズと、少なくとも１つの復調器を具備する検出用ビーム経路とを備えた、試料光を捕捉するための顕微鏡および方法であって、有利には、少なくとも１つの電気光学変調器（ＥＯＭ）が、照明用ビームの少なくとも一部、好ましくは半分を位相変調するために用いられ、あるいは照明用ビームの異なる区間または両半分が、ピエゾ素子の逆相の制御により、異なって、好ましくは逆相に変調され、あるいは複数の部分ビーム経路に分割するための音響光学変調器、および励起用ビームを部分的に位相変調するための光学素子が設けられ、かつ有利には、位相差を調整するための調整素子が設けられ、あるいは少なくとも１つの光学変調器、好ましくは音響光学変調器（ＡＯＭ）が、検出部での復調のために用いられ、あるいは復調のために検出器の運転モードの変更が行われ、あるいは例えば回転するマイクロレンズディスクにより生成された焦点分布またはマルチスポット生成の場合に、対物レンズの瞳面内での、半空間位相マスクの配置によるか、または部分ビームの各々が、その断面に沿って部分的に変調周波数で位相変調されることで個々に影響を及ぼされることによるか、または１本のビームが、その断面に沿って部分的に変調周波数で位相変調されることで影響を及ぼされ、該ビームがその後で分割されることにより、個々の焦点に強度変調が形成される。
2013524260.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
その断面に沿って部分的に変調周波数で位相変調される少なくとも１つの照明用ビームと、試料内への該照明用ビームの強度変調された合焦のための顕微鏡対物レンズと、少なくとも１つの復調器を具備する検出用ビーム経路とを備えた顕微鏡であって、
少なくとも１つの電気光学変調器（ＥＯＭ）が、該照明用ビームの少なくとも一部、好ましくは半分を位相変調するために用いられる、顕微鏡。
【請求項２】
前記照明用ビームの一部がＥＯＭを通るか、またはＥＯＭが、部分的にのみ前記照明用ビーム内にある、請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項３】
前記照明用ビームの異なる区間または両半分が、１つまたは複数のＥＯＭのパーツの逆極性の制御により、異なって、好ましくは逆相に変調される、請求項１または２に記載の顕微鏡。
【請求項４】
その断面に沿って部分的に変調周波数で位相変調される少なくとも１つの照明用ビームと、試料内への該照明用ビームの強度変調された合焦のための顕微鏡対物レンズと、少なくとも１つの復調器を具備する検出用ビーム経路とを備えた顕微鏡であって、
前記照明用ビームの異なる区間または両半分が、ピエゾ素子の逆相の制御により、異なって、好ましくは逆相に変調される、顕微鏡。
【請求項５】
その断面に沿って部分的に変調周波数で位相変調される少なくとも１つの照明用ビームと、試料内への該照明用ビームの強度変調された合焦のための顕微鏡対物レンズと、少なくとも１つの復調器を具備する検出用ビーム経路とを備えた、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の顕微鏡において、
複数の部分ビーム経路に分割するための音響光学変調器、および励起用ビームを部分的に位相変調するための光学素子が設けられ、かつ有利には、位相差を調整するための調整素子が設けられている、顕微鏡。
【請求項６】
その断面に沿って部分的に変調周波数で位相変調される少なくとも１つの照明用ビームと、試料内への該照明用ビームの強度変調された合焦のための顕微鏡対物レンズと、少なくとも１つの復調器を具備する検出用ビーム経路とを備えた、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の顕微鏡において、
少なくとも１つの光学変調器、好ましくは音響光学変調器（ＡＯＭ）が、検出部での復調のために用いられる、顕微鏡。
【請求項７】
少なくとも１つの音響光学変調器（ＡＯＭ）により、復調のためにビーム切替が行われる、請求項６に記載の顕微鏡。
【請求項８】
その断面に沿って部分的に変調周波数で位相変調される少なくとも１つの照明用ビームと、試料内への該照明用ビームの強度変調された合焦のための顕微鏡対物レンズと、少なくとも１つの復調器を具備する検出用ビーム経路とを備えた、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の顕微鏡において、
復調のために検出器の運転モードの変更が行われる、顕微鏡。
【請求項９】
その断面に沿って部分的に変調周波数で位相変調される少なくとも１つの照明用ビームと、試料内への該照明用ビームの強度変調された合焦のための顕微鏡対物レンズと、少なくとも１つの復調器を具備する検出用ビーム経路とを備えた、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の顕微鏡において、
例えば回転するマイクロレンズディスクにより生成された焦点分布またはマルチスポット生成の場合に、対物レンズの瞳面内での、半空間位相マスクの配置によるか、または分割されたもしくは別々の部分ビームが、その断面に沿って部分的に変調周波数で位相変調されることで個々に影響を及ぼされることによるか、または１本のビームが、その断面に沿って部分的に変調周波数で位相変調されることで影響を及ぼされ、該ビームがその後で部分ビームに分割されることにより、個々の焦点に強度変調が形成される、顕微鏡。
【請求項１０】
その断面において部分的に位相変調されている少なくとも１つの照明用ビームにより、合焦のための顕微鏡対物レンズを介して照明された試料の光を顕微鏡により捕捉するための方法であって、検出用ビーム経路内で復調が行われ、その際、好ましくは、該照明の位相変調が該試料内で強度変調に変換され、該強度変調が検出部で復調される方法であって、
少なくとも１つの電気光学変調器（ＥＯＭ）が、該照明用ビームの少なくとも一部、好ましくは半分を位相変調するために用いられる、方法。
【請求項１１】
前記照明用ビームの一部がＥＯＭを通るか、またはＥＯＭが、部分的にのみ前記照明用ビーム内にある、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記照明用ビームの異なる区間または両半分が、１つまたは複数のＥＯＭのパーツの逆極性の制御により、異なって、好ましくは逆相に変調される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
その断面において部分的に位相変調されている少なくとも１つの照明用ビームにより、合焦のための顕微鏡対物レンズを介して照明された試料の光を顕微鏡により捕捉するための方法であって、検出用ビーム経路内で復調が行われ、その際、好ましくは、該照明の位相変調が該試料内で強度変調に変換され、該強度変調が検出部で復調される方法であって、
前記照明用ビームの異なる区間または両半分が、ピエゾ素子の逆極性の制御により、異なって、好ましくは逆相に変調される、方法。
【請求項１４】
その断面において部分的に位相変調されている少なくとも１つの照明用ビームにより、合焦のための顕微鏡対物レンズを介して照明された試料の光を顕微鏡により捕捉するための方法であって、検出用ビーム経路内で復調が行われ、その際、好ましくは、該照明の位相変調が該試料内で強度変調に変換され、該強度変調が検出部で復調される、請求項１０乃至１３のいずれか１項に記載の方法において、
少なくとも１つの音響光学変調器が複数の部分ビーム経路への分割を行い、かつ励起用ビームを部分的に位相変調するための光学素子が設けられ、かつ有利には、調整素子が位相差の調整を実施する、方法。
【請求項１５】
その断面において部分的に位相変調されている少なくとも１つの照明用ビームにより、合焦のための顕微鏡対物レンズを介して照明された試料の光を顕微鏡により捕捉するための方法であって、検出用ビーム経路内で復調が行われ、その際、好ましくは、該照明の位相変調が該試料内で強度変調に変換され、該強度変調が検出部で復調される、請求項１０乃至１４のいずれか１項に記載の方法において、
少なくとも１つの光学変調器、好ましくは音響光学変調器（ＡＯＭ）が、検出部での復調のために用いられる、方法。
【請求項１６】
前記ＡＯＭにより、復調のためにビーム切替が行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
その断面において部分的に位相変調されている少なくとも１つの照明用ビームにより、合焦のための顕微鏡対物レンズを介して照明された試料の光を顕微鏡により捕捉するための方法であって、検出用ビーム経路内で復調が行われ、その際、好ましくは、該照明の位相変調が該試料内で強度変調に変換され、該強度変調が検出部で復調される、請求項１０乃至１６のいずれか１項に記載の方法において、
復調のために検出器の運転モードの変更が行われる、方法。
【請求項１８】
その断面において部分的に位相変調されている少なくとも１つの照明用ビームにより、合焦のための顕微鏡対物レンズを介して照明された試料の光を顕微鏡により捕捉するための方法であって、検出用ビーム経路内で復調が行われ、その際、好ましくは、該照明の位相変調が該試料内で強度変調に変換され、該強度変調が検出部で復調される、請求項１０乃至１７のいずれか１項に記載の方法において、
例えば回転するマイクロレンズディスクにより生成された焦点分布またはマルチスポット生成の場合に、対物レンズの瞳面内での、半空間位相マスクの配置によるか、または分割されたもしくは別々の部分ビームが、その断面に沿って部分的に変調周波数で位相変調されることで個々に影響を及ぼされることによるか、または１本のビームが、その断面に沿って部分的に変調周波数で位相変調されることで影響を及ぼされ、該ビームがその後で分割されることにより、個々の焦点に強度変調が形成される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に強散乱性で侵入深度の制限された媒体、とりわけ生物試料における光学検査のための顕微鏡法に関する。
【背景技術】
【０００２】
参考にした文献
［１］（非特許文献１）
［２］（非特許文献２）
［３］（非特許文献３）
［４］（非特許文献４）
［５］（非特許文献５）
［６］（非特許文献６）
参考にした特許は以下の文中で挙げる。
【０００３】
検出信号に試料散乱が影響を及ぼすという欠点を制限するために、既に様々な方法が知られている。
多光子顕微鏡法（特許文献１）
多光子励起のためにパルス状のレーザを使用する。使用されるレーザは非常に高価である。
【０００４】
適用には制限があり、例えば着色料の選択において、および高い試料負荷によって制限される。
例えば［１、２］で発表されているような焦点変調顕微鏡法（ＦＭＭ）
ＦＭＭでは、励起用レーザビームの（直径における）半分が位相変調される。この片側の位相変調が、顕微鏡対物レンズによる合焦の際に、焦点体積での強度変調をもたらす。この強度変調は、共焦点ピンホールの後、例えばロックイン検出により判定することができる。この方法の利点は、弾道上の、つまり散乱していない光子しか、この変調信号に寄与しないことである。例えば強散乱性の媒体内で多重散乱した光子は固定的な位相関係を喪失する。したがって散乱した光子はロックイン検波された信号に寄与せず、これにより（励起においても、検出においても）散乱光による背景が大きく減少し、かつそれにより共焦点レーザ顕微鏡の侵入深度が上昇する。
【０００５】
これまではレーザビームの半分を位相変調するために機械的手法が用いられてきた。［１］では、レーザビームが分割されたミラーに向けられ、このミラーの半分は、ピエゾ素子を介してもう半分に対して動かされる。
【０００６】
［２］では、ビームの半分だけが、ガルバノメータスキャナ上にあるガラス板を通って導かれる。このガラス板が回転することにより、ビームの半分の位相がもう半分に対して変調される。
【０００７】
すべての機械的手法の根本的な問題（アライメントなどを除く）は、使用される調整要素の機械的共振周波数により制限された低い変調速度である（［１］および［２］に関しては５〜２０ｋＨｚ）。ロックイン検出方法には、１ピクセル滞在時間ごとに変調周期の最低数（最低５〜１０）が必要なので、これにより画像撮影速度が大きく制限される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】欧州特許第５００７１７号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】チェンら（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．），Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ  １６，１８７６４（２００８）
【非特許文献２】ウォンら（Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．），Ａｐｐｌ．Ｏｐｔ．４８，３２３７（２００９）
【非特許文献３】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｏｋｏｇａｗａ．ｃｏｍ／ｓｃａｎｎｅｒ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｃｓｕＸ１ｅ＿１．ｈｔｍ
【非特許文献４】博士論文  アール  ランゲ（Ｒ．Ｌａｎｇｅ），ジーゲン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ  Ｓｉｅｇｅｎ）（２０００）
【非特許文献５】ロックインピクセルを備えたＴＯＦカメラ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｓａ−ｉｍａｇｉｎｇ．ｃｈ／
【非特許文献６】ゲート式インテンシファイア・カメラ：例えばｔａｕｔｅｃ  ｐｉｃｏ  ｓｔａｒ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｕｔｅｃ．ｃｏｍ／４７０９／４７３６．ｈｔｍｌ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、現況技術の欠点を回避することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この課題は、独立請求項に基づく方法および顕微鏡によって解決される。
好ましい変形形態が、従属請求項の対象である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】（ａ）〜（ｃ）は、平行斜線で示したレーザビームＬと共にＥＯＭの平面を上面図で示す。
【図２】（ａ），（ｂ）は、ＡＯＭ（Ａ）による、レーザビームＬの半分の高速の位相変調を示す。
【図３】（ａ），（ｂ）は、侵入深度／散乱光抑制を向上させるための顕微鏡構成を示す。
【図４】（ａ）〜（ｃ）は、信号検出の説明図である。
【図５】図３に示したのと類似のビーム経路を示す。
【図６】（ａ）は、中間像内の回転するマイクロレンズディスク（ＳＭＬ）と、顕微鏡対物レンズＯの瞳内の焦点変調器（ＦＭ）と、トリガ可能なイメージインテンシファイアを具備したカメラ（Ｋ）とを備えた広視野ＦＭＭ顕微鏡を示し、（ｂ）は、４つの部分画像による離散的復調に関する例を示し、（ｃ）は、変調周波数およびピクセル周波数の説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に、本発明の特に有利な態様を概略図に基づいて説明する。
１．電気光学変調器（ＥＯＭ）
本発明によればＥＯＭは、励起用ビームの少なくとも一部、好ましくは半分の特に高速で非機械的な位相変調のために用いられる。
【００１４】
有利には、励起用ビームの一部がＥＯＭを通ることができるか、またはＥＯＭが、部分的にのみ、励起用ビームが走っている一部で変調され得る。
特に有利には、ビームの異なる区間または両半分が、１つまたは複数のＥＯＭのパーツの逆極性の制御により、異なって（逆相に）変調される。
【００１５】
電気光学変調器は、複屈折性結晶におけるポッケルス効果を利用しており、このポッケルス効果では、電圧の印加によりレーザ光の偏光または位相が変化する。この変化は、結晶の種類およびサイズに応じて非常に高速に起こすことができる（最高で数１０ＭＨｚ）。
【００１６】
以下に、このことを有利にＦＭＭ顕微鏡法に利用できる実施形態を説明する。
−  相応のビーム拡大およびコリメートされたレーザビームにより半分照明されたＥＯＭ結晶（図１（ａ））
−  交流電界が電極によりビームの半分のみを介して限定されるＥＯＭ結晶（図１（ｂ）
）
−  逆方向の電界を有するＥＯＭ（散乱界を最小化するために、場合によってはシーケンシャルに配置される）（図１（ｃ））
−  ビームの前および後ろの偏光子と接続された古典的なＥＯＭ、この場合、ビームの半分だけが偏光子を通過し、したがって直接的にビームの半分の強度が変調され、これも同様に焦点内での強度変調をもたらす。
【００１７】
ＥＯＭに基づくすべての解決策の原理的で重要な利点は、数１０ＭＨｚという最大限の変調速度である。
図１は、電気光学変調器（ＥＯＭ）によるレーザビームの一部、特に半分の位相変調を示している。
【００１８】
図１（ａ）〜（ｃ）では、平行斜線で示したレーザビームＬと共にＥＯＭの平面を上面図で示している。
ＥＯＭは、［１、２］に倣い、照明用ビーム経路内にあり、有利には拡大（コリメート）されたビーム区間内にある。
【００１９】
ビーム拡大の大きさにより、ビーム断面を結晶サイズに適合させることができる。
図１（ａ）では、レーザビームＬの半分が結晶を照明することで、ＥＯＭによる変調空間を限定している。
【００２０】
この結晶は側面に、結晶を高周波制御するための電極を備えている。
図１（ｂ）では、ＥＯＭのうちビームの下半分が通っている半分だけを電極によって制御することで、変調空間をＥＯＭの電極により限定しており、つまり（電極の置き方により）結晶は完全に照明されるが、半分しか変調されない。
【００２１】
図１（ｃ）では、ビームの上半分および下半分の２つ部分が、上部と下部で逆相に極性を与えられた電極により異なって変調されている。
変調区間は、レーザビームに接して互いに重なり合ってもよいが、重なり合う必要はない。
【００２２】
図１（ｃ）の右側では、（左側での矢印方向における）側面図が概略的に示されており、この側面図では、制御される区間が有利には相互に横にずれている。
これは、散乱界を回避するために有利であり得る（ＥＯＭでは高い電圧が必要である）。
【００２３】
逆相に極性を与えられた実施形態は、例えば結晶を変性させるべきではないが、一方の側からもう一方の側へのクロストーク効果を回避すべき場合に有利であり得る。その上、逆相の制御により、ストローク間隔（逆方向の振幅の間隔）が、単相の制御に比べて倍増することが有利であり、これにより、所望の位相差（ストローク）の場合、結晶も短縮できるかもしれないことが有利である（全長の短縮）。
【００２４】
さらに、ＥＯＭの制御領域をずらして配置することにより、（半分を超えて）両方のビーム領域を重ねることができる。
逆相の制御が、チェン（Ｃｈｅｎ）［１］の有利なさらなる発展形態でもあることは興味深く、この場合、ビームの第２の半分のための第２のピエゾ駆動装置を設置することができるかもしれず、その際、両方のピエゾ駆動装置は逆相に稼働される。
【００２５】
その上、図１（ｃ）に示したように、影響を及ぼす部分をビームに沿ってずらすことも、チェン（Ｃｈｅｎ）［１］において有利なことに可能である。
２．ＦＭＭでの音響光学変調器（ＡＯＭ）の有利な使用
本発明によれば音響光学変調器が、複数の部分ビーム経路への分割、および励起用ビームを部分的に位相変調するための光学素子、および有利には、位相差を調整するための調整素子と協働して励起用ビームを変調するために使用される。
【００２６】
音響光学変調器は、レーザを高速に偏向するかまたは切り替えるために、結晶内の定在音波でのレーザビームの回折を利用する。この効果も、ビームの偏向を相応に利用すれば、以下のようにレーザビームの半分を高速で位相変調するために使用することができる。
−  ＡＯＭが、（例えば半分のガラス板による）それぞれ半分の固定的な位相ずれを有する部分ビーム経路の間で高速に切替を行う、図２（ａ）を参照。
−  ＡＯＭが、部分ビーム経路の間で高速に切替を行い、これらの部分ビーム経路を、半円がミラーおよびこれに相補的な半円がアパーチャとして実施された特殊なビーム結合器により再び結合する（図２（ｂ）を参照）。
【００２７】
位相シフトは、偏向ミラーの１つの上のピエゾ調整素子による光学的経路長の変更によって細かく調整することができ、こうして例えば様々な波長に適合させることができる。
ＡＯＭは、（結晶内での音の伝播速度に基づき）ＥＯＭほど高速には切り替わらないが、より安価である。
【００２８】
可能な切替速度は１〜１０ＭＨｚであるが、それでも機械的または電気機械的に達成可能なすべての素子より明らかに高い。
図２は、ＡＯＭ（Ａ）による、レーザビームＬの半分の高速の位相変調を示している。
【００２９】
図２（ａ）では、２つのビーム経路の間で切り替えることによるが、その際、上半分がガラス板を通って案内される。これらのビーム経路は、ビーム結合器（ＢＣ）で再び結合される。
【００３０】
図２（ｂ）では、部分的には図２（ａ）と同様であるが、ビーム結合器として、半分にミラーを備えたシャドウマスクを備えている（白＝ミラーを備えた部分、黒＝開口部）。
図２ではそれぞれ、顕微鏡の照明領域内のレーザビーム、例えばＡＯＭのような音響光学素子Ａ、および偏向ミラーｍ１、ｍ２、ｍ３、ビーム結合器ＢＣ、およびピエゾ調整器ＰＺＴ、ならびに半円形のガラス板Ｐが示されている。
【００３１】
Ａは音響光学偏向器であり、ビームを、そのまま進むビームＳｄと、ビーム迂回手段としてのミラーｍ１、ｍ２、ｍ３により偏向されたビームＳａとが走る２つの角度方向の間で、周波数ωで交互に切り替える。
【００３２】
図２（ａ）の板Ｐは半円のガラス板であり、これにより迂回した完全なビームＳａの半分が位相変調され、そのまま進むビームは位相変調されず、ビーム結合器ＢＣで両方のビームが再び重ねられ、ＢＣ内で片側半分が変調されたビームＳｍが得られる。
【００３３】
上側の偏向されたビームの絶対位相は、ピエゾ調整素子（ＰＺＴ）上のミラーによって調整することができる（遅い、ＤＣ）。高速の変調は、ＡＯＭによる、ビーム経路間の切替によって行われる。
【００３４】
図２（ｂ）のピエゾ素子ＰＺＴは、経路差を調整できるよう、図２（ｂ）で矢印により示唆するように、機械的な調整素子を備えたミラーであってもよい。
ＡＯＭは、両方のビーム間をωで切り替え、これによりビームの半分の位相変調をオンおよびオフし、これがその後、焦点内で本発明による強度変調を引き起こす。この強度変調は、周期的に上昇および下降し、ただし純粋な正弦関数である必要はなく、この強度変調は例えば矩形に推移することができ、復調の際にはこのことを考慮しなければならないであろう（比較的高次の高調波の部分）。ＡＯＭによる近似正弦関数の場合は、そのまま進むビームと迂回するビームの間との偏向角度が、ＡＯＭによりＭ１上で、少し変化されるであろう。
【００３５】
図２（ｂ）では、Ｓａ内に位相板を設けるのではなく、ＢＣ内に半円形の反射性部分が設けられ、かつ半円を開口し（半分のピンホール絞り）、つまり反射性部分には、ビーム経路の経路長の違いにより（調整素子ＰＺＴにより調整可能）位相シフトした状態で作用し、ＢＣの後ろではビームＳｍが位相のずれた両半分を有しており、これら両半分が焦点で重なり合う。
【００３６】
ここで説明した変調方法はそのまま、［１］および［２］で詳述されているようなＦＭＭ顕微鏡法のために、高速のロックインアンプと共に用いることができる。
しかしこの変調方法は、以下に図３に基づいて説明するような、高価なロックインアンプの使用を回避する検出方法にも適している。
【００３７】
この方法は、変調器を瞳内または共役面内に配置すれば、マルチスポット走査型顕微鏡にも用いることができる。
３．ＦＭＭ構成の検出部における有利な実施形態
本発明によれば、光学変調器が検出部での復調のために用いられるか、または検出器の運転モードが復調のために利用される。
【００３８】
図３は、侵入深度／散乱光抑制を向上させるための顕微鏡構成を示しており、この場合、試料Ｐの方向へのレーザＬの概略的なビーム経路内で、照明用ビーム経路と検出用ビーム経路を分離するためのダイクロイックスプリッタミラーＤが設けられている。
【００３９】
検出部は、ビームスプリッタＢＳにより、２つの部分ビーム経路に分割され、そこには検出器ｄ１、ｄ２が存在する。
さらに、光学変調器ｍ１、ｍ２、位相調整のための素子Ｐｈ、フィルタＦ、焦点変調器ＦＭ、および減算演算子Ｏ−が示されている。
【００４０】
蛍光励起のためのレーザＬは、焦点変調器（ＦＭ）により、例えば図１および図２に基づいて説明したように周波数ωで変調される。
ダイクロイックミラー（Ｄ）により反射された、ここでもωで変調されている、試料（Ｐ）の蛍光放射が、５０／５０ビームスプリッタ（ＢＳ）を介し、２つの検出器ｄ１およびｄ２によって位相敏感検出される。これに関し、例えばｄ１およびｄ２の前でそれぞれもう１つの変調器ｍが使用されるか（３ａのｍ１、ｍ２）、またはｄ１およびｄ２の検出器ゲインが変調される（３ｂ）。
【００４１】
平滑化された信号（フィルタＦ、例えば積分器）が、次いで、互いに減算される（演算子Ｏ−）。
変調器Ｍ１、Ｍ２は、有利にはＥＯＭのような光学変調器であってもよい。
【００４２】
ｍ１は直接変調され、ｍ２はＰｈによる位相シフトを受け、これにより互いに位相差（ΔΦ）を有する２つの部分信号が検出され、混合され、ローパスフィルタによりフィルタリングされ、つまり有利には、調整された相対位相、理想的には両方の検出成分間が９０度の相対位相で光学的復調が行われ、これにより健全な焦点を有する状態と、相殺的干渉により焦点が乱されているシフトされた状態とを互いに減算することができる（−演算子）。
【００４３】
こうして各ピクセル上で、焦点に基づく信号から焦点外の背景（散乱光）が取り除かれる。
図３（ｂ）では、光学信号が変調されるのではなく、検出器の「ゲイン」（例えばＰＭＴの加速電圧）が、それぞれＦＭにより制御され、ここでもＰｈを介して位相が調整され、信号がＦでフィルタリングされ、Ｏ−により減算される。
【００４４】
検出器ｄ１、ｄ２は、例えば周波数ω（および調整された位相シフト）でオンおよびオフされる。
図４は、信号検出を分かりやすく説明するのに役立つ。
【００４５】
上では最初に、位相（１）および１８０°位相をずらした、ビームの各半分による焦点領域内での蛍光励起が示されている（ゴングら（Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．），Ｏｐｔｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３４，３５０８（２００９）から）。
【００４６】
下では信号を図解している。
図４（ａ）は、３ピクセルにわたる強散乱性媒体において古典的な共焦点顕微鏡が受容した信号の図である。焦点からの信号は、励起用ビームの経路を通って試料により生成される背景よりかろうじて上にある。
【００４７】
図４（ｂ）は、例えば図２のように位相変調器を使用した場合の対応する信号である。上に示した状態１）と２）の間で高速に交互に切り替わっている。ただし励起用ビームは位相変調されており、この変調が焦点内で初めて強度変調に変換されるので、試料によるビーム経路を通っての強い背景寄与は、両方の状態１）および２）で実質的に同じである。
【００４８】
つまり、図３に基づき、両方の信号を正しい位相で電子的に減算することにより、背景寄与をすべて除去することができ、図４（ｃ）に示した利用信号が残る。
４．検出用ビーム経路内での光学変調
本発明によれば、ＡＯＭを用い、復調のためにビーム切替を利用する。
【００４９】
図５は、図３に示したのと類似のビーム経路を示している。
ただしここでは、検出器ｄ１とｄ２の間で周波数ωでの切替が行われ、有利にはＡＯＤ（Ａ）により、図２に示したように、ただしここでは検出部内で切替が行われる。
【００５０】
ここでもまた、既に図示および説明したように、焦点内の信号と焦点外の信号の減算およびローパスフィルタリングが行われる。
ビームスプリッタを使用しないことにより、それぞれ信号強度の半分が失われることがない。
【００５１】
Ｐｈにより位相差を調整することができる。
５．背景抑制を伴う広視野顕微鏡
本発明によれば、意外にも、例えば回転するマイクロレンズディスクにより生成された焦点分布または本願明細書に援用するＵＳ６．０２８．３０６に記載されているようなマルチスポット生成の場合に、ＦＭＭ方法に基づく半空間マスクの配置、特に上で記載した対物レンズの瞳面内での配置によるか、またはＦＭＭ方法に基づき部分ビームの各々が個々に影響を及ぼされることによるか、またはＤＥ１９９０４５９２Ｃ２、ＵＳ６２１９１７９に記載されているように１本のビームに共通の影響が及ぼされ、その後で分割されることにより、個々の焦点にＦＭＭ方法に基づく強度変調が形成される。
【００５２】
上述の、ポイントスキャニングシステム用に実施された変調方法および復調方法は、以下に述べるように、有利には、例えば広視野蛍光結像へも発展させることができる。
このために、図５に概略的に描いたような顕微鏡構造を使用することができる。
【００５３】
図６（ａ）は、中間像内の回転するマイクロレンズディスク（ＳＭＬ）と、顕微鏡対物レンズＯの瞳内の焦点変調器（ＦＭ）と、トリガ可能なイメージインテンシファイアを具備したカメラ（Ｋ）とを備えた広視野ＦＭＭ顕微鏡を示している。
【００５４】
図６（ｂ）は、４つの部分画像による離散的復調に関する例を示している（［４］から）。
図６（ｃ）は、変調周波数およびピクセル周波数を分かりやすく説明するための例として役立つ。
【００５５】
例えば横河電機株式会社の広視野スキャンモジュール［３］でのようなスピニング・マイクロレンズ・ディスクを、マイクロレンズの焦点が対物レンズにより試料内に結像されるように中間像面の付近に設置する。この焦点の各々で、上述のように、または［１］および［２］に記載されているように、焦点強度を変調させなければならない。これを達成するために、上で既に説明したように、変調器を照明用ビーム経路の瞳内に設けることができる。そこで行われる位相変調により、試料内ではすべての焦点に、これに対応する強度変調がもたらされる。
【００５６】
本方法の有利な散乱光抑制を利用するには、広視野において正しい位相でも検出されなければならない。これは、トリガ可能なイメージインテンシファイアを備えたカメラを介して行うことができる（例えば［６］）。イメージインテンシファイアは、非常に高速に切り替えることができ、従来のＣＣＤまたはＣＭＯＳカメラの比較的長い撮影時間の間にその背後で変調される高速「ゲート」として機能する。変調器ＦＭ、イメージインテンシファイア、および回転するマイクロレンズディスクＳＭＬが相応に同期する場合、例えば２つの画像をシーケンシャルに撮影することができ、その際、第１の画像は「健全な」焦点で（励起用ビームの両半分が同相で、図４）、および第２の画像は「破壊された」焦点で（励起用ビームの両半分が逆相で、図４）撮影される。
【００５７】
変調周期のこの例示的な２つの「サンプリングポイント」より多くサンプリングする場合、例えば１周期につき３枚または４枚のカメラ画像から、位相位置を広視野内でも復元することができる。複数の周期にわたって平均値を求めれば、信号品質をさらに改善することができる。
【００５８】
瞳内にあるＦＭの位置は、すべての部分ビームが、試料上の位置に応じて異なる角度で瞳内に存在することを意味し、瞳内ではそれぞれの点が瞳を満たしており、瞳の半分がＦＭにより変調されることで、それぞれのスポットが半分だけ位相変調され、試料内で重ねられる。
【００５９】
ＦＭはＥＯＭであってもよいが、［１、２］の現況技術でのような素子であってもよい。
図６（ｃ）では、スピニング・マイクロレンズ・ディスクのスキャン図式を限定的に示している。すべてのピクセル１が同時に露光され、次いで、すべてのピクセル２が同時に露光される（以下同様）。ディスクが１回転すると画像が完全に露光される。画像全体を正しい位相で復調できるように、ディスクの回転は位相結合されて行われなければならず、したがってすべてのピクセル１、２、３、４．．．は同じ位相位置を有する。つまり変調ωは、ディスクの回転周波数およびピクセル周波数の整数倍でもなければならない。インテンシファイアをトリガする周波数も、変調周波数の倍数でなければならない。
【００６０】
具体例：
典型的なスピニングディスク［３］は、１２５回転／秒以上で作動させることができ、その際、比率（マイクロレンズの全体数／同時に照明されるレンズの数）は例えば１２であり、したがって１回転につき１２枚の画像が走査され、つまり１５００Ｈｚの画像速度である。例えば同時に走査されるレンズが１０００個で、カメラピクセルが５００×５００の場合、マイクロレンズおよび画像ごとに２５０回のピクセル露光となり、したがってビーム半分用の変調器の変調周波数が１０ＭＨｚの場合、例えば位相位置を確定するための測定点を得るためにサンプリングおよび積分することができる、ピクセルごとの変調周期は、１０ＭＨｚ／（１５００Ｈｚ×２５０）で約２６となる。この場合、図６（ｂ）のような４つの位相点のためには、有利な全体的画像速度は３７５Ｈｚとなるであろう。
【００６１】
イメージインテンシファイアカメラの代わりに、例えば［４］および［５］のように、ロックインピクセル内臓のＣＭＯＳ／ＣＣＤカメラを使用してもよい。これらのカメラは一般的には、変調された照明と共に、飛行時間に基づく距離測定のために用いられるが、図５のような構成において復調のために用いることもできる。
【図１】
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【図２ａ）】
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【図２ｂ）】
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【図３ａ）】
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【図３ｂ）】
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【図５】
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【図４】
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【図６】
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【国際調査報告】
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