(57)【要約】本発明は、動物の乳腺細胞において特異的な発現を可能にするプロモーターの転写制御下に置かれたヒトPLTPをコードするポリヌクレオチドを含む１又はそれより多いコピー数の導入遺伝子をゲノム中に含むトランスジェニック動物の乳からヒト組換えPLTP製剤を得ることに関する。得られた組換えヒトPLTP製剤は、敗血症ショックの予防又は治療に用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳腺細胞における特異的な発現を可能にするプロモーターの転写制御下に置かれたヒト血漿リン脂質転送タンパク質(PLTP)をコードするポリヌクレオチドを含む１又はそれより多いコピー数の導入遺伝子をゲノム中に含み、活性型ヒトPLTPを乳に分泌することを特徴とするトランスジェニック動物。
【請求項２】
ウサギであることを特徴とする請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のトランスジェニック動物の乳。
【請求項４】
活性型ヒトPLTPの産生のための原材料としての請求項３に記載の乳の使用。
【請求項５】
乳を清澄化すること、及び乳清を回収することを含むことを特徴とする請求項３に記載の乳から組換えヒトPLTP製剤を製造する方法。
【請求項６】
乳清からPLTPを抽出することを更に含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
乳清からのPLTPの抽出が、ヘパリン上でのアフィニティクロマトグラフィにより行われる請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１つに記載の方法により得ることができる組換えヒトPLTP製剤。
【請求項９】
敗血症ショックの予防又は治療に用いるための請求項８に記載の組換えヒトPLTP製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、トランスジェニック動物の乳からの組換えヒト血漿リン脂質転送タンパク質(plasma phospholipid transfer protein)(PLTP)の製造、及びその使用である。
【背景技術】
【０００２】
血漿リン脂質転送タンパク質(PLTP)は、元を正せば、循環中のリポタンパク質同士のリン脂質を交換する能力、及びアテローム発生誘発性又は抗アテローム生成性のリポタンパク質の構造及び組成を改変する能力に関して同定されていた。それは、コレステリルエステル転送タンパク質(CETP)、リポ多糖結合タンパク質(LBP)及び殺菌性透過性増強タンパク質(BPI)も含む脂質転送/リポ多糖結合タンパク質(LT/LBP)遺伝子ファミリーに属する。
【０００３】
内皮細胞から単離されたヒトPLTPのcDNAは、1750bpの長さを有し、17アミノ酸のシグナル配列の後に476アミノ酸の成熟タンパク質をコードする1518bpのオープンリーディングフレームを含む。成熟PLTPの配列は、非常に多くの潜在的O-グリコシル化部位に加えて、６つの潜在的N-グリコシル化部位をアミノ酸47、77、100、126、228及び381に含む(DAYら, J Biol Chem, 269, 9388-91, 1994)。PLTPが複雑なN-グリカン構造を効率的に生み出すこと及びN-グリコシル化がタンパク質の分泌において必須の役割を果たし、その生物学的活性に加担することが示されている(HUUSKONEN及びEHNHOLM, Curr Opin Lipidol, 11, 285-9, 2000; QUら, Protein J, 25, 167-73, 2006)。
【０００４】
PLTPは血漿中で２つの異なるタイプのリポタンパク質粒子と結合した(associees)２つの形態(１つは活性であり、もう１つは不活性である(OKAら, J Lipid Res, 41, 1651-7, 2000))で存在することが示されている。活性形態は、HDL(高密度リポタンパク質)のそれに近い160kDaの平均分子量を有する粒子と結合し、不活性形態は、HDL及びLDL(低密度リポタンパク質)のそれの中間である520kDaの平均分子量を有する粒子と結合している。KARKKAINENら(J Biol Chem, 277, 15413-8, 2002)は、これら２つの形態の血漿からの分離について記載しており、活性形態がアポリポタンパク質Eと結合し、不活性形態がアポリポタンパク質A-Iと結合していると報告している。その他の著者らは、反対に、血漿中で、活性形態がアポリポタンパク質A-Iと主に結合し、不活性形態がアポリポタンパク質Eと結合していると報告している(CHEUNG及びALBERS, J Lipid Res, 47, 1315-21, 2006)。
【０００５】
リン脂質転送活性に加えて、PLTPはまた、その他の両親媒性の分子、特に細菌のリポ多糖(LPS)の血清リポタンパク質への転送を可能にする。インビトロでの実験は、細胞培養物の上清中で発現された組換えPLTPが、LPSをグラム陰性細菌の壁からHDL粒子に転送し、細胞膜の受容体、特にCD14及びTLR4への結合を妨げることによりこれらLPSの生物学的効果を中和することを示している(HAILMANら, J Biol Chem, 271, 12172-8, 1996) (VESYら, Infect Immun, 68, 2410-7, 2000)。
【０００６】
このPLTPの特性は、細菌のLPSが非常に強力な炎症促進効果を有するので、最も格別な興味対象である。細胞の受容体とのそれらの相互作用は、炎症促進性サイトカインの産生を誘導し、非常に強力な炎症応答(その最も深刻な現れとしてはエンドトキシンショック又は敗血症ショック)の刺激は、死の原因となり得る。インビトロで観察されたLPS転送及び中和特性に基づいて、PLTPを敗血症ショックの治療に用い得ることが示唆されている(特許US 5932536)。
【０００７】
LPSにより誘導される効果の中和においてPLTPが果たす役割は、PLTP遺伝子ノックアウト(よって、このタンパク質を発現しない)マウス(PLTP-KOマウス)においてインビボで間接的に確認されている。これら動物において、１回のLPS注入後、LPSと循環中のリポタンパク質との結合が遅延し、炎症性サイトカイン(IFN-γ、IL-6、TNF-α)の産生が増大し、生存期間が野生型マウスよりも短かったことが観察されている(GAUTIERら, J Biol Chem, 283, 18702-10, 2008)。
【０００８】
しかしながら、PLTPの生物学的特性及びその治療への使用の可能性は、この背景において用い得るPLTP製剤が入手可能でないので、インビボPLTP投与実験により現在までに確認できていない。
【０００９】
当初、PLTPはヒト血漿から精製された(DAYら, J Biol Chem, 269, 9388-91, 1994; TOLLEFSONら, J Lipid Res, 29, 1593-602, 1988; LAGROSTら, J Lipid Res, 35, 825-35, 1994)。しかしながら、血漿は、PLTPが比較的少なく(全血漿タンパク質１グラム当たり50マイクログラムオーダーのPLTP)、また複合的な媒体でもあり、この媒体からのPLTP精製は、実行が面倒で非常に低い(１％オーダーの)精製収率をもたらす一連のクロマトグラフィ工程を必要とする。更に、血漿PLTPの活性は、血漿リポタンパク質との結合によって変化し得、一般的には、精製後、性質及び活性は不確かなままである幾つかの区別可能なバンドの形態にあるようである。
【００１０】
様々なタイプのトランスフェクトされた真核細胞において種々の哺乳動物種からの組換えPLTPを産生しようとする幾つかの試みが実施されている。ヒト又はマウスPLTPの産生にBHK細胞(ALBERSら, Biochim Biophys Acta, 1258, 27-34, 1995)；ブタPLTPの産生にCOS-1細胞(PUSSINENら, J. Lipid Res., 38, 1473-81, 1997)；バキュロウイルスに感染した昆虫Sf-9細胞(HUUSKONENら, Biochim Biophys Acta, 1391, 181-92, 1998)；HeLa細胞(HUUSKONENら, J. Lipid Res., 39, 2021-30, 1998)が用いられた。これら発現系は、複数のバンドの形態でしばしば現れる種々の分子量のタンパク質の産生をもたらした。血漿PLTPに可能な限り近い組換えPLTPを産生するために、様々なリポタンパク質及びアポリポタンパク質の分泌の研究に既に汎用されている肝細胞HepG2を用いることが提案されている。実際に、大部分の血漿PLTPは肝臓で産生され、これらの細胞は、天然PLTPの特徴の再現に最適な細胞環境を提供できると推測された(GUOら, J Nutr, 129, 1984-91, 1999)。実際、この発現系の使用は、天然タンパク質のそれに類似する特徴を有する組換えPLTPを得ることを可能にした。次いで、この組換えPLTPの精製は、それが160kDaのリポタンパク質の粒子においてHepG2細胞により産生されるアポリポタンパク質E、特にOKAら及びKARKKAINENら(2000, 2002, 前記で引用)により以前に記載された血漿PLTPの活性形態によく似ていることが示された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、この発現系は、以前に記載されたものと同様に、それを治療目的で用いるのはもちろんのこと、インビボでその活性を試験することを可能にする程度に十分な量のPLTPの産生さえ可能にするものではない。
したがって、組換えPLTPのソース(これは、活性形態にあり、かつその有効な使用を構想するに十分な量のこのタンパク質の産生を可能にする)を利用可能にすることが望ましい。
【００１２】
トランスフォームされた細胞の培養物による治療上重要なタンパク質の生産の代替法は、トランスジェニック動物による、特にその乳におけるそれらの生産である(HOUDEBINE, "Production of pharmaceutical proteins by transgenic animals. Comparative Immunology", Microbiology & Infectious Diseases, 32: 107-121, 2009)。このアプローチは、理論的には多くの利点(特により高い収率、細胞培養物中での生産よりも低い生産コスト、及び工業レベルでの生産へのより簡単でより柔軟なスケールアップ)を有する。しかしながら、トランスジェニックマウスの乳において天然のヒトタンパク質のそれに類似する生物学的特性を有する組換えタンパク質プラスミノーゲンインヒビター(tPA)を生産する可能性は何年も前(GORDONら, Bio Technol, 5, 1183-7, 1987)に証明されたが、トランスジェニック動物の乳において首尾よく産生することが可能なタンパク質の数は依然として比較的限られたままである。実際、発現される興味あるタンパク質の性質に特に依存する多くの要因が成功又は失敗を決定し得る。
【００１３】
これらの要因には、特に、乳腺において、天然のヒトタンパク質のそれに類似する翻訳後修飾を示すタンパク質を産生する宿主の能力である。この要因は、乳において、非常に多くかつ多様性ある翻訳後修飾(シグナルペプチド及びプロペプチドの切断、O-グリコシル化及びN-グリコシル化)を有し、肝臓において天然に産生されるPLTPのようなタンパク質を組換え形態で産生することを構想する場合に特に重要である。実際、乳腺の細胞は、肝細胞のそれとは異なる翻訳後修飾の能力を有する。
【００１４】
例えば、トランスジェニック動物の乳における産生が最も研究されているタンパク質の一部である凝固因子の場合、ヒトプロテインＣを乳腺において発現するトランスジェニックマウスは、プロペプチドの切断及びγ-カルボキシル化を正しく行うことができなかったことが観察されている(DROHANら, Transgenic Res., 355-64, 1994)。類似の観察がトランスジェニックブタにおいて、プロテインＣ及び第IX因子についてなされている(LEEら, J. Biochem., 118, 81-7, 1995; VAN COTTら, Genet Anal., 15, 155-60, 1999)。
【００１５】
もう一つの重要な要因は、乳が構成する環境である。それは、タンパク質及び脂質が非常に豊富な多成分複合媒体である。それは、それ自体、水相である乳清中のカゼインミセルのコロイド溶液である液体中の脂肪球のエマルジョンの形態にある。
【００１６】
乳清は、ラクトース、ミネラル塩、並びにビタミン及び水溶性タンパク質をとりわけ含む。カゼインミセルは、多様な程度リン酸化されており、かつリン酸基を介してカルシウムと結合している様々なタイプのカゼイン(α、β、γ)からなる超分子構造である。脂質の大半は、リン脂質及び中性脂肪と結合した様々なタンパク質から主になる複合体アセンブリである(MATHER, J. Dairy Sci., 83, 203-47, 2000)リポタンパク質の膜「乳脂肪球皮膜(milk fat globule membrane)(MFGM)」で覆われた球状小滴の形態で乳中に分散している(DANTHINEら, Lait, 80, 209-22, 2000)。
【００１７】
PLTPの高い親油性並びにそのコレステロール、リン脂質及びジアシルグリセリド結合能を考慮すれば、それが乳において組換え形態で産生されるならば、脂肪球皮膜と好ましく結合することが推測され得る。更に、PLTP活性が、結合しているリポタンパク質構造のタイプに依存することが知られているという限りにおいて、PLTPと乳脂肪球皮膜との相互作用の効果は、予測するのが難しいようである。
【００１８】
更に、トランスジェニック動物の乳において産生される興味ある組換えタンパク質の精製は、従来、(例えば酸性pHにおける沈殿後の遠心分離によって)カゼインミセルを、及び(例えば遠心分離によって)脂肪球を除去することを意図する乳を清澄化する工程をもって開始する。次いで、興味あるタンパク質を乳清から精製する。このアプローチは、一般的に、親水性タンパク質の場合に効果的である。しかしながら、タンパク質がカゼインミセルにより又は脂肪球により捕捉されるならば、その精製は、その生物学的活性に有害であるリスクを有する、より一層激烈な方法の使用を必要とし得る。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
それにも拘らず、今回、本発明者らは、驚くべきことに、その乳腺でヒトPLTPをコードする配列を発現するトランスジェニックウサギが、その乳において活性型組換えPLTPを産生すること、及び更に、このPLTPが乳清から抽出できることを見出した。
【発明の詳細な説明】
【００２０】
結果として、本発明の主題は、活性型ヒトPLTPをその乳において発現するトランスジェニック動物である。好ましくは、動物はウサギである。
【００２１】
本発明によるトランスジェニック動物は、そのゲノム中に、該動物の乳腺の細胞においてその特異的な発現を可能にするプロモーターの転写制御下に置かれたヒトPLTPをコードするポリヌクレオチドを含む１又はそれより多いコピー数の導入遺伝子を含む。
【００２２】
表現「導入遺伝子」は、宿主生物のゲノム中に安定的に挿入された核酸構築物であって、その後代へと世代を超えて遺伝するものを意味するものと解される。本件において、導入遺伝子は、トランスジェニック宿主動物の乳において、興味あるタンパク質(PLTP)の発現を可能にする。
【００２３】
PLTPを発現させるために用いられるプロモーターは、宿主生物の乳腺において発現される遺伝子の内生プロモーター、又は外来プロモーターであってもよい。乳腺細胞における特異的な発現を可能にするプロモーターは、それ自体公知である。それらは、例えば、カゼイン遺伝子又は乳清タンパク質のプロモーターであってもよい。具体的には、α-、β-又はκ-カゼインプロモーター、β-ラクトグロビンプロモーター、α-ラクトアルブミンプロモーター、WAP (乳清酸性タンパク質)プロモーター、又はラクトフェリンプロモーターを挙げることができる。好ましいプロモーターは、特許EP 0527063に記載されるWAPプロモーターである。用いる宿主動物の乳腺における発現のために、最適化されたDNA配列を有利に用いることが可能である。このような配列は、潜在的なスプライシング部位、A/T高含有配列(これはmRNAを不安定化する)、ポリアデニル化部位並びに潜在的にパラサイト(potentiellement parasites)であるTATAボックス及びCpGアイランドを除去するために、及び宿主動物の乳腺細胞のし好性を乳タンパク質の産生に反映する目的でコドンを最適化するために、当業者に周知の技術によりインシリコで得てもよい。
【００２４】
有利には、導入遺伝子は、組換えタンパク質の転写及び／又は翻訳を最適化することを意図するその他の因子を更に含む。このような因子は、それ自体、当業者に公知である(例えばHOUDEBINE, "Design of expression cassettes for the generation of transgenic animals (including insulators)", Rat Genomics: Methods in Molecular Biology, Vol 597: 55-69, 2009を参照)。
【００２５】
それらは、特に：
- 組み込まれた導入遺伝子のコピー数に部分的に依存し、かつ動物のゲノム中の導入遺伝子の組込み部位への依存性がより低いタンパク質発現レベルを確約する、プロモーターの5'に置かれた強力なインスレーターであってもよい。例えば、ニワトリβ-グロビン遺伝子の5'HS4領域 (TABOIT-DAMERONら, Transgenic. Res., 8: 223-235, 1999; RIVAL-GERVIERら, Transgenic. Res., 12: 723-730, 2003)を挙げることができる。
- １又はそれより多い転写又は翻訳エンハンサーを含んでいてもよい１又はそれより多いエキソン/イントロン対であってもよい。例としては、SV40ウイルスゲノムの後期及び前期遺伝子のイントロン、β-グロビン遺伝子の第２のイントロン、EF1 α遺伝子のイントロン、α-s1カゼイン遺伝子のイントロン、WAP遺伝子のイントロン、ヒト及びウシ成長ホルモン遺伝子のイントロンを挙げることができる。「エンハンサー」配列は、特に、HTLVウイルス若しくはMMTVウイルス(マウス乳腺腫瘍ウイルス)のLTR配列中に存在するもの、イムノグロビン遺伝子の「エンハンサー」配列、α s-1カゼイン遺伝子の「エンハンサー」配列、β-グロビンの「エンハンサー」配列から選択することができる。また、「エンハンサー」配列は、RIVAL-GERVIERら(Mol. Reprod. Develop., 63: 161-167, 2002)により又は出願EP 1217071において記載されるように、WAP遺伝子上流(最大140kbp)の遠位領域又はWAP遺伝子下流(少なくとも10kbp)の遠位領域であってもよい。
- 転写の効果的な終了を確約する強力なターミネーターであってもよい。例としては、SV40ウイルス前期又は後期遺伝子ターミネーター、β-グロビン遺伝子、WAP遺伝子、ヒト又はウシ成長ホルモン遺伝子のそれらを挙げることができる。
【００２６】
トランスジェニック生成(transgenese)は、それ自体公知の慣用の方法により行うことができる。有利には、遺伝子構築物は、マイクロインジェクションによって、受精胚の前核の１つに導入され、次いで受精胚は代理母となるメスに再移植される。また、トランスジェニック動物の産生は、核移植クローニング後の代理母となるメスへの胚移植により；又は導入遺伝子の存在下で精子をインキュベートし、次いで卵母細胞に導入するICSI(卵細胞質内精子注入法)、により；或いは、ラット及びマウスで特に用いられる、インビトロで遺伝子改変された細胞からの胚のキメラ化により可能である。
【００２７】
また、本発明の主題は、本発明によるトランスジェニック動物により産生された乳、及び組換えヒトPLTPの製造における原料としてのこの乳の使用でもある。
また、本発明の主題は、乳を清澄化すること、及び乳清を回収することを含むことを特徴とする、本発明によるトランスジェニック動物の乳から組換えヒトPLTP製剤を製造する方法でもある。
【００２８】
乳は、それ自体当業者に公知の慣用の方法により清澄化することができる。特に、任意にキレート剤の存在下において、酸性pH(4.6未満又はそれに等しい)におけるカゼインを沈殿した後、一方では脂肪球及び他方ではカゼイン沈殿物を除去するために遠心分離することが挙げられる。また、乳は、超遠心分離又はタンジェンシャル濾過により清澄化してもよい。
このようにして回収された乳清は、組換えPLTP製剤を構成し、任意に濃縮した後、いくつかの用途にそのまま用いてもよい。
【００２９】
しかしながら、この乳清からPLTPを抽出する更なる工程(PLTPが豊富な製剤を得ることが可能になる)を行うことが概ね好ましい。
有利には、乳清からのPLTP抽出は、適切な固体支持体に付着したヘパリン上でのアフィニティクロマトグラフィにより行う。
ヘパリン上でのアフィニティクロマトグラフィは、適切な固体支持体に付着したヘパリンのカラム上に乳清をロードすることによる、漸増イオン強度における溶出を行うことによる、及びリン脂質転送活性を含むフラクションを回収することによる慣用の様式で行われる。
一般的に、クロマトグラフィは、概ね約7.4のpHである生理的pHにおいて、0〜1mMの漸増濃度のNaClの存在下に行われる。リン脂質転送活性を含むフラクションは、250〜450mM、好ましくは300〜400mMのNaCl濃度範囲で溶出される。
【００３０】
また、本発明の主題は、本発明に従う方法により得ることができる組換えヒトPLTP製剤である。
この製剤は、ヒトPLTPについて提唱される全ての用途、特に敗血症ショックの予防又は治療に用いてもよい。
有利には、この製剤は、非経口経路により、好ましくは注入により投与することができる組成物の形態に製剤化される。
【００３１】
本発明は、トランスジェニックウサギの乳から組換えヒトPLTPの製造及び敗血症ショックの治療におけるその効果を説明する非限定的な実施例に言及する、続く更なる記載の助けによって、より深く理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ウサギWTの乳(乳A及び乳B)及びPLTPTgWAPの乳(乳04、乳06及び乳13)におけるリン脂質転送活性の比較。Ｘ軸：時間(分);Ｙ軸： リン脂質転送活性(蛍光ユニット)。
【図２】50mMの増大を伴う不連続NaCl勾配を用いて、ヘパリンセファロースHR26/16カラムで清澄化された乳のタンパク質の溶出についてのFPLCプロフィール。Ｘ軸：溶出体積；Ｙ軸：280nmにおける吸光度。
【図３】ヘパリンセファロースカラムで溶出したフラクション#167、#175及び#178の変性条件下でのポリアクリルアミド勾配ゲル電気泳動。
【図４】100mMの増大を伴う不連続NaCl勾配を用いて、ヘパリンセファロースHR26/16カラムで清澄化された乳のタンパク質の溶出についてのFPLCプロフィール。Ｘ軸：溶出体積(ミリリットル)；Ｙ軸：280nmにおける吸光度。
【図５】ヘパリンセファロースカラムで溶出した、高いリン脂質転送比活性を有するフラクション#68の変性条件下でのポリアクリルアミド勾配ゲル電気泳動。「unbound」：非結合フラクション；「bound」：結合フラクション。
【図６】(より短時間でクマシーブルー染色した図５と同様の)電気泳動の２回目のラン。「bound」：結合フラクション。
【図７】精製PLTPフラクション(黒色バー)又は同一体積のPBSバッファー(白色バー)のいずれかを注入したPLTP-KOマウスからの血漿中のリン脂質転送活性。Ｘ軸：種々のサンプリング時間；Ｙ軸：リン脂質転送活性(蛍光ユニット)。
【図８】組換えPLTP(黒色バー)又はPBSバッファー(白色バー)を受容した動物における、LPS注入後のサイトカインの血漿濃度。
【図９】24時間の期間にわたって測定し、血漿pg/ml×時間として表したサイトカイン濃度の曲線下面積。
【図１０】15mg/kgのLPSを受容し、精製PLTPフラクション(黒色バー)又は同一体積のPBSバッファー(白色バー)のいずれかを注入されたPLTP-KOマウスの血漿のリン脂質転送活性。
【図１１】単回用量のLPS(15mg/kg、腹腔内)を受容したPLTP-KOマウスの死亡率を示すKaplan-Meier曲線。矢印：LPS後15分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間及び７時間の時点における数回のバッファー(PBS)又は組換えPLTP(PLTP)の静脈内注入(尾静脈)。
【図１２】単回用量のLPS(25mg/kg、腹腔内)を受容したPLTP-KOマウスの死亡率を示すKaplan-Meier曲線。矢印：単回用量のLPS、次いでLPS後１時間、５時間、10時間、24時間、32時間、48時間、56時間、72時間及び80時間の時点における数回の活性型組換えPLTP又は不活化された組換えPLTP静脈内注入(尾静脈)。
【図１３】活性型組換えPLTP、不活化された組換えPLTP(２時間、65℃)、野生型マウス血漿(WT)、PLTP-KOマウス血漿及びPBSバッファーのリン脂質転送活性の比較。Ｘ軸：時間(分)；Ｙ軸：リン脂質転送活性(蛍光ユニット)。
【実施例】
【００３３】
実施例１：ヒトPLTPをコードする配列を含むトランスジェニック生成ベクターの構築
中間ベクターへのPLTP cDNAのクローニング
5'の位置においてコンセンサスコザック配列及びユニークMluI制限部位により、並びに3'の位置において２つの終止コドン及びNheI制限部位に接したヒトPLTP前駆体(UniProtKB/Swiss-Prot P55058)をコードする、戻し翻訳(retrotraduit)した合成cDNA配列を合成し、プラスミドpBluescriptに由来する、アンピシリン耐性遺伝子及び細菌性Col E1複製起点を含む中間ベクターにクローニングした。
【００３４】
トランスジェニック生成ベクター
クローニングに用いたトランスジェニック生成ベクターは、アンピシリン耐性遺伝子及び細菌性Col E1複製起点を有するプラスミドpPolyIIIに由来する。このトランスジェニック生成ベクターは：6.3kbpのウサギWAP(乳清酸性タンパク質) (Genbank X52564)プロモーター(RIVAL-GERVIERら, Transgenic Res., 6: 723-730, 2003)上流のニワトリβ-グロビン遺伝子5'HS4インスレーター配列(Genbank U78775) (RECILLAS-TARGAら, Proc. Natl. Acad. Sci., 10: 6883-6888, 2002)の二量体；転写エンハンサーを含むウサギβ-グロビン遺伝子(Genbank V00882)の第２のイントロン；R領域およびHTLV-1 U5領域の始め(ATTALら, FEBS Lett., 392, 220-224, 1996)と融合したSV40の前初期遺伝子の5'UTR配列を含む第２の転写エンハンサー(SUR 1.2.3)；マウスIgG重鎖のmu領域(Genbank J00440)に由来する第３の転写エンハンサー(Igμ2) (GILLIESら, Cell 33, 717-728, 1983)及びヒト成長因子ホルモン(Genbank M13438)の転写ターミネーターを含む発現カセットを含む。このカセットは、第２及び第３の転写エンハンサーの間に位置するMluIサイト及びNheIサイトを含む。それは、プラスミドpPolyIIIの配列の切除を可能にするNotIサイトにより両側を挟まれている。
【００３５】
中間ベクターからMluI/NheI消化により回収されたPLTPをコードするDNAインサートを発現カセットのMluI及びNheIサイトの間に挿入した。
得られたトランスジェニック生成ベクターは、その5'〜3'方向に、i)ニワトリβ-グロビン遺伝子の5'HS4インスレーター配列の二量体、ii) 6.3kbpのウサギWAP(乳清酸性タンパク質)プロモーター、iii)第１の転写エンハンサーを含むイントロン、iv)第２の転写エンハンサー、v)ヒトPLTP cDNA、vi)第３の転写エンハンサー、及びvii)転写ターミネーターを含むインサートを含む。
上記のように、組換えベクターを含むコロニーは、それらのアンピシリン耐性に基づいて選択され、次いで制限フラグメントの分析及びその後のシーケンシングによりインサートの存在を確認する。
【００３６】
実施例２：乳腺においてヒトPLTPを発現するトランスジェニックウサギの作製
トランスジェニックウサギを慣用のマイクロインジェクション技術により得た(BRINSTERら, Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 4438-4442, 1985)。
トランスジェニック生成のためのインサートの調製
組換えPLTPをコードする配列を含むトランスジェニック生成ベクターを制限酵素NotIにより消化し、導入遺伝子を含むインサートをアガロースゲル上で単離し、次いでElutipD (Schleicher-Schuell, Ecquevilly, France)上で製造業者の説明書に従って精製し、エタノールで沈殿させ、次いで10mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA, pH 7.4を含むバッファー中に採取した。
【００３７】
ドナー及びレシピエントのウサギの準備
卵胞の発達を刺激するために、ブタFSH (濾胞刺激ホルモン)を用いて、16〜30週齢の胚ドナーのニュージーランドウサギを３日間皮下経路により処置した。３日目に、ウサギはhCGホルモン(ヒト絨毛性ホルモン(human Choroidic Hormone))の静脈内注入を受け、次いでメスを交配させる。
レシピエントのウサギは、18〜20週齢である。精管切除されたオスと交配させる前にメスを昼間の長い周期(16時間の光)で１週間保持するか、又はホルモン処置(FSH/LH過排卵)のいずれかにより同期化された偽妊娠を誘発する。
【００３８】
収集した胚のマイクロインジェクション及び移植
４日目に、交配の18〜19時間後、DNAのマイクロインジェクションを行うために、ドナーのウサギから胚を収集する。回収後直ちに(交配の15〜25時間後)DNAのマイクロインジェクションを行う。１細胞期の胚をノマルスキーレンズ及びマイクロマニピュレータを備えた倒立型顕微鏡のもとで培地の小滴中に置いた。ピペットを用いて、個々の胚を適切な場所に配置し、固定した。10mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA, pH 7.4を含むバッファー中に導入遺伝子を1ng/μlから6ng/μlまで変動し得る濃度に希釈し、好ましくは、注入用ピペットの助けにより胚の雄性前核中にマイクロインジェクションする。
【００３９】
マイクロインジェクションに続き、胚を培地中で１〜５時間(35〜40℃、空気中３〜５％のCO2)インビトロで維持する。次いで、マイクロインジェクションされた胚の質を実体顕微鏡のもとで素早く評価する。次いで、同期化されたレシピエントのウサギの卵管(それぞれの卵管中に10個の胚)のルーメン中への全身麻酔下で、外科的手順(卵管を開腹により一時的に摘出する)を用いて、インタクトな単細胞の胚を再移植する。分娩は、胚移植の29〜31日後に自然に起こり得る。必要であれば、それは、31日目にオキシトシンを注入することにより誘発する。生まれた若いウサギの数は、再移植された胚の数と比較して、５〜20％のオーダーである。
【００４０】
実施例３：トランスジェニックウサギの選抜及び特徴決定
胚発生の過程中、マイクロインジェクションされた組換えDNAは、ゲノム中にランダムに組み込まれる。新生ウサギ(10日)は、耳の生検により導入遺伝子の存在について試験する。ゲノムDNAを抽出し、組換えインサートに特異的なプライマーを用いてPCR (ポリメラーゼ連鎖反応)分析を行う。
導入遺伝子が検出されたウサギを「Founders F0」という。
founder F0系を、i)ゲノム中に組み込まれた導入遺伝子のコピー数の分析、及びii)組込み部位の数の決定により更に特徴決定した。
各々のfounder F0系のゲノム中に組み込まれた導入遺伝子のコピー数は、定量PCRにより及びサザンブロッティングにより決定した。この数は、系統に依存して、１コピー/細胞〜100コピー/細胞程度で変動する。
また、組込み部位の数も、サザンブロッティングにより決定した。この数は、系に依存して、１〜３部位/ゲノムで変動する。
【００４１】
実施例４：トランスジェニックウサギの乳におけるヒト組換えPLTPの発現の評価
実施例３のF0トランスジェニックウサギの乳中のリン脂質転送活性を評価した。
そのために、乳サンプルにおけるPLTPによるリン脂質転送活性を、Roar Biomedical Inc. (New York, NY, USA)からの市販キットを用いて、製造業者の推奨に従って測定した。蛍光リン脂質、この場合ホスファチジルコリンは、リポソームタイプの供与体基質と結合しているとき、自己消光状態で存在する。PLTPのリン脂質転送活性は、蛍光リン脂質が、インキュベーション用培地に存在する、例えばVLDL(「超低比重リポタンパク質」)タイプの受容体リポタンパク質に転移するときに、漸増蛍光強度により測定する(Masson D.ら. Mol Human Reprod 2003; 9: 457)。
【００４２】
図１は、非トランスジェニックウサギ又はWTウサギの乳(乳A及び乳B)、及びPLTPについてのトランスジェニックウサギのいくつかの系、すなわちPLTPTgWAPウサギの乳(乳04、乳06及び乳13)におけるリン脂質転送活性の比較を表す。WTウサギの乳において顕著なリン脂質転送活性が検出されないとき、PLTPTgWAPウサギの乳は、合成リポソームと血漿VLDLリポタンパク質との間の時間依存的な蛍光リン脂質交換能を示す。最も高いリン脂質転送活性を示す乳13は、タンパク質の精製に用いた。
【００４３】
実施例５：トランスジェニックウサギの乳からの活性型ヒトPLTP製剤の製造
1 - 酸性pH及び室温におけるカゼインの沈殿
１容量の乳を、２容量の0.5mM EDTA, pH 8.0及び７容量のミリＱ水と混合する。EDTAは、カルシウムイオンをキレート化すること、及びPLTPの部分を保持することができるカゼインミセルを破壊することを可能にする。
(pHiが4.6である)カゼインを完全に沈殿させるために、氷酢酸を撹拌しながら滴下により加えることにより、pHを４まで徐々に下げる。
【００４４】
2 - 低速遠心分離及びpHの中和による乳清の清澄化
酸性pHにおけるカゼインの沈殿後、10分間2000g及び 4℃における混合物の遠心分離。
脂質上清とタンパク質ペレットとの間に位置する中間清澄化フラクションの回収。
pH 7.4を得るのに十分な量の固体Trisを用いる中性化。
このようにして回収したフラクションのグラスファイバーフィルター(Millipore AP2004700)上での濾過。それは、カラム上への注入前の慣用の濾過である。それは、大きいサイズの凝集体及び／又は粒子を除去すること、及びこのことにより、これら大きいサイズの凝集体及び／又は粒子による妨害を回避することによってカラムを保護することが可能となる。
【００４５】
3 - ヘパリンセファロースカラム上でのアフィニティクロマトグラフィによるPLTPの抽出／精製
20mM Trisバッファー, pH 7.4で予め平衡化されたHeparin Sepharose 6 Fast Flowカラム(240x16mm ID)上への室温における清澄化及び濾過されたタンパク質フラクションの注入。
注入速度：蠕動ポンプを用いて１ml/分。
20mM Trisバッファー, pH 7.4を用いる一晩のカラムのリンス。
Akta FPLCシステムへのロードされたカラムの接続。
20mM Trisバッファー, pH 7.4の20mM Tris/1M NaClバッファー, pH 7.4への (50又は100mM NaClの増大を伴う)不連続勾配のプログラミング。
150mmol PBS/l NaClバッファー, pH 7.4に対するフラクションの透析。
各々のフラクションにおけるリン脂質転送活性を(実施例４と同一のプロトコルに従って)測定し、BCAタンパク質アッセイ(市販のビシンコニン酸アッセイキット, Interchim, Montlucon, Franceを用いるアッセイ)についての値と比較する。
【００４６】
結果
50mMの増大を伴う不連続NaCl勾配を用いて行った抽出の結果を図２及び３に説明する。
図２に示されるように、スキムミルクフラクションのタンパク質は、ヘパリンカラムから、不連続NaCl勾配に従ういくつかの連続ピーク中に溶出する。いくつかの不連続ピーク(フラクション#167、#175及び#178)は、最も高い(250mMを超える)NaCl濃度において溶出する。
リン脂質転送活性の測定結果を以下の表Iにまとめる。
【００４７】
【表１】
2013524786.tif 000002
【００４８】
リン脂質転送比活性(表Iの「比活性(SA)」の欄)は、それが開始時の乳よりも50倍以上高いフラクション#167、#175及び#178において最も高い(表Iの右側の最後の欄)。
図３は、これらのフラクションが、それぞれ30及び60kDaの見かけ分子量を有する２つの優勢なタンパク質からなることを示す。30kDaのバンドは、WT及びPLTPTgWAPの乳において多量に見られるカゼインに相当する。60kDaのバンドは、PLTPについて従来から報告されているMWの領域(50及び70kDaの間)にある。
【００４９】
100mMの増大を伴う不連続NaCl勾配を用いて行った抽出の結果を、図４〜６及び以下の表IIにより説明する。
最も高いリン脂質転送比活性を示すフラクション(フラクション#68)は、300mM NaClの段階で溶出する(図４)。
このフラクションは、開始時の乳よりも44倍高い比活性を有する(以下の表IIの右側の最後の欄)。
【００５０】
【表２】
2013524786.tif 000003
【００５１】
変性条件下における電気泳動分析は、PLTPに相当する60kDaにおける主要なバンド、及びカゼインに相当する30kDaにおけるよりはっきりとしたバンドを再び示す(図５)。より低い強度でバンドを染色する２回目の電気泳動は、最も活性なフラクション#68について60kDaのシングルバンドを示す(図６)。これらの結果は、ヒトPLTPが、最も高いリン脂質転送比活性を示すフラクションの主要な構成要素であることを示す。
【００５２】
実施例６：PLTPノックアウトマウスにおけるエンドトキシンショックの予防のためのトランスジェニックウサギの乳から得られたヒトPLTPの使用
以前のデータ(GAUTIERら, J Biol Chem, 283, 18702-10, 2008)は、マウス(ホモ接合型PLTP-KOマウス)の内因性PLTP遺伝子の無力化が、LPSを中和及び解毒化する能力を野生型WTマウスと比較して減少させることを示している。致死量のLPSの注入後の死は、WTマウスよりもPLTP-KOマウスにおいて早く起こる。
【００５３】
外因性組換えPLTP供給が、動物におけるLPSの解毒化及びエンドトキシンショック耐性を増大できるかどうか判定するために、PLTP-KOマウスは、腹腔内経路による時間０における致死量(15mg/kg)又は亜致死量(5mg/kg)のLPS注入、その後のPBSバッファー又は上記の実施例５に記載されるようにしてトランスジェニックウサギの乳から調製した組換えPLTP(100マイクロリットルの活性フラクション#68)の連続的な静脈内注入により受容した。次いで、循環中のサイトカイン(IL-6、IL-10、MCP-1、IFNγ、TNFα)濃度及びリン脂質転送PLTP活性のアッセイのために、GAUTIERら(2008, 上記で引用)により記載されたプロトコルに従って、後眼窩穿刺により血漿を回収した。最後に、最初のLPS注入後４日間にわたって致死率を記録した。
【００５４】
図７は、組換えPLTP又はPBSバッファーの注入後のマウスにおける血漿リン脂質転送活性を示す。この血漿リン脂質転送活性は、PBSバッファーを受容したマウスと比較して、組換えPLTP注入の30分後に顕著に高い。活性の増大は、最初のPLTP注入の90分後に消失するが、４時間の時点において起こる第３の注入の60分後に顕著なままである。同様に、t=9hの時点(すなわち、t=8hの時点における最後の外因性PLTP注入の60分後)において、血漿リン脂質転送活性は、PBSバッファーを受容した動物と比較して、組換えPLTPを受容した動物において顕著に高い。t=24時間の時点において、t=8hの時点で最後の組換えPLTP注入を受けた動物は、PBSバッファーを受容した動物と比較して、血漿リン脂質転送活性の増大をもはや示さない。
これらの結果は、PLTP-KOマウスにおける外因性PLTPの注入が、60分オーダーの持続性を有する血漿リン脂質転送活性の顕著でかつ一過性の上昇をもたらすことを示す。
【００５５】
サイトカインIL-6、IL-10、MCP-1、IFNγ及びTNFαの産生に対する組換えPLTPの効果を研究するために、亜致死量(5mg/kg)のLPS腹腔内注入を一回受けている動物は、次いで、PBSバッファー又は組換えPLTPの数回(LPS投与の10分、2h、4h、6h及び8h後)の静脈内注入(尾静脈)を受けた。イソフルランで麻酔した動物における後眼窩血液サンプルを、T0、T30min、T1h30min、T5h、T9h及びT24hの時点で回収し、サイトカインをアッセイした。
【００５６】
結果を図８及び９により説明する。
5mg/kgのLPS単回用量の注入後、循環中のサイトカイン濃度は、研究した24時間の間に、最初の増加段階後に減少段階を有し、t=24 hにおいて、t=0の時点においてPLTP-KOマウスで測定されたバックグラウンド値をもたらす２段階の変動を辿る(図８)。組換えPLTPを受容したマウスにおいて、PBSを受容したマウスと比較して、循環中のIL-6、IL-10及びIFNγ濃度の顕著な減少が様々な時点で観察された。サイトカインIL-6、IL-10、MCP-1、IFNγ及びTNFは、著しくより低いIL-6及びIFNγ産生を伴う２段階曲線を示す。研究した24時間の間、曲線下面積(AUC)の算出は、PBSを受容したマウスよりもむしろ静脈内経路により組換えPLTPを受容したマウスにおいて、著しく低い値のIL-6(p=0.058)及びIFNγ(p=0.036)を示す(図９)。
【００５７】
死に対する外因性PLTPの効果を研究するために、15mg/kgの単回致死量のLPSの腹腔内注入に続いて、LPS注入後t=15分、t=1h、t=2h、t=3h、t=4h、t=5h、t=7hの時点における一連の外因性PLTP静脈内注入を行った。LPS注入後T0、T1h30min及びT6hの時点において、麻酔した動物の後眼窩血液サンプルを回収し、血漿リン脂質転送活性を測定した。動物の生存期間を並行して書き留めた。
【００５８】
結果を図10及び11に説明する。
図10に示されるように、血漿リン脂質転送活性は、PBSバッファーを受容したマウスと比較して、組換えPLTPを受容したマウスにおいて、２回目の注入の30分後に著しく高い。(５倍オーダーの)活性増大は、t=6hの時点、すなわち組換えPLTPの４回目の注入後１時間において観察される。またも、これらの結果は、PLTP-KOマウスにおける外因性PLTPの累積的注入が、少なくとも60分の持続性を有する血漿リン脂質転送活性の顕著でかつ一過性の上昇をもたらすことを示す。Kaplan-Meier曲線(図11)は、PBSバッファーを受容した動物と比較した、外因性の組換えPLTPを受容した動物の生存の延長を示す。生存の平均期間は、PBSを受容したマウス(n=8)について33.6±5.4h (mean±sem)であり、PLTPを受容したマウス(n=7)について77.1±6.2h (mean±sem)である(カイ二乗検定によりPBSに対してp<0.05)。
これらの結果は、一回のLPS腹腔内注入によりエンドトキシンショックに服した動物における外因性PLTP供給の有益な効果を立証する。LPS注入に続く最初の数時間の間の連続的なPLTP注入は、炎症性サイトカインの産生を著しく減少させ、生存を延長する。
【００５９】
実施例７：PLTPノックアウトマウスのエンドトキシンショック予防におけるトランスジェニックウサギの乳から得られた活性型又は不活化されたヒトPLTPの使用
実施例６において観察された死に対する外因性PLTPの効果を確認するために、単回致死量(25mg/kg体重)のLPS腹腔内注入に続いて、LPS注入後t=1h、5h、10h、24h、32h、48h、56h、72h及び80hの時点において、実施例５に記載されるようにしてトランスジェニックウサギの乳から調製した組換えPLTP(200マイクロリットル、2.2gタンパク質/l)の一連の静脈内注入を行った。
【００６０】
図12に表したように、時間の関数としての生存率を追跡した。活性型組換えPLTPの効果を、実施例５に従って精製した組換えPLTP製剤を２時間65℃で加熱することにより不活化されたPLTPのそれと比較した。Kaplan-Meier曲線をカイ二乗検定により比較した。４日後、LPS及びその後不活化されたPLTPを注入された全てのマウスが死んだ。活性型組換えPLTPの注入は、動物の生存を非常に顕著に増大させる(不活性化されたPLTPに対してp<0.05)ことを可能にする。60％を超えるマウスが持続的に(７日を越えて)死を免れた。したがって、外因性の活性型組換えPLTPの静脈内注入は、加熱により不活化された同一のPLTPとは対照的に、致死量のLPS注入を受けたPLTP-KOマウスの生存を増大する。
【００６１】
実施例４と同様、市販キット(Roar Biomedical Inc.)の助けを用いる蛍光によって、不活化されたPLTPのリン脂質転送活性を測定し、PBSバッファー、活性型組換えPLTP、野生型(WT)マウス血漿及びPLTP-KOマウス血漿のものと比較した。図13に示す結果は、WTマウス血漿及び活性型組換えPLTPだけがリン脂質転送活性を検出することを可能にし、不活化された組換えPLTPは、PBSバッファー及びPLTP-KOマウス血漿と同様に、顕著な活性をもたらさないことを示す。
【００６２】
これらの結果は、一回のLPS腹腔内注入によりエンドトキシンショックに服した動物における外因性PLTP供給の有益な効果を確認する。LPS注入に続く最初の数時間の間のPLTPの連続注入は、生存を著しく延長する。
【図９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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