(57)【要約】  ＣＬＥＣ−２に結合しその機能を調節するリガンドが提供される。本明細書に記載される核酸ＣＬＥＣ−２リガンドは、ＣＬＥＣ−２媒介血小板凝集を抑制することができ、血栓形成、腫瘍転移、リンパ脈管新生、ＨＩＶ播種、炎症応答、サイトカイン産生および食作用などのＣＬＥＣ−２媒介過程の調節における使用も提供し得る。インビトロでもインビボおよびエクスビボでもＣＬＥＣ−２リガンドの活性を逆転させることができるモジュレーター分子も本明細書では開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＬＥＣ−２に結合する核酸リガンドであって、少なくとも１つのステム構造および少なくとも１つのループ構造を形成する核酸配列を含む核酸リガンド、または薬学的に許容されるこの塩。
【請求項２】
５’から３’方向に、
５−１０塩基対長である第１のステム、
配列５’−ＧＮＣ−３’を含む第１のトリヌクレオチドループ、
４塩基対長である第２のステムであり、第２のステムの塩基にゆらぎ対を含む、前記第２のステム、および
ヌクレオチド配列５’−ＹＵＹＮＮＲＹＵ−３’を含む第２のループ
を含む、請求項１に記載のリガンド。
【請求項３】
核酸配列が、配列番号７または配列番号８または配列番号９に対して少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項１に記載のリガンド。
【請求項４】
核酸配列が配列番号２４に対して少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項１に記載のリガンド。
【請求項５】
約０．１ｎＭから１０ｎＭまでの範囲に及ぶ解離定数でＣＬＥＣ−２に結合する、請求項１から４のいずれか一項に記載のリガンド。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載のリガンドまたは薬学的に許容されるこの塩を含む医薬組成物。
【請求項７】
ＣＬＥＣ−２リガンドに特異的に結合するモジュレーターであって、
前記モジュレーターが第２の核酸配列を含み、
前記ＣＬＥＣ−２リガンドが第１の核酸配列を含む、
モジュレーター。
【請求項８】
ＣＬＥＣ−２媒介障害を処置するための方法であって、治療的有効量の請求項１から６のいずれか一項に記載のリガンドまたは薬学的に許容されるこの塩を、治療を必要とする宿主に投与することを含む方法。
【請求項９】
ＣＬＥＣ−２媒介障害が血小板媒介障害である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
血小板媒介障害が、血管障害、心血管障害、末梢血管障害、脳血管障害、血小板媒介炎症性障害、糖尿病関連障害、癌およびＨＩＶ感染症からなる群から選択される、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
血管障害が、急性冠動脈症候群、血栓症、血栓塞栓症、血小板減少症、末梢血管疾患および一過性脳虚血発作からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
脳血管障害が、一過性脳虚血発作、虚血性発作および塞栓症からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
血小板媒介炎症性障害が、関節炎、関節炎リューマチ、乾癬性関節炎、反応性関節炎、炎症性腸疾患、強直性脊椎炎および強皮症からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
癌が、肺癌、乳癌、前立腺癌、精巣癌、膵癌、脳癌、骨癌および肝癌からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
糖尿病関連障害が、糖尿病性網膜症、糖尿病性脈管障害、アテローム動脈硬化症、虚血性発作、末梢血管疾患、急性腎損傷および慢性腎不全からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
ＣＬＥＣ−２リガンドがＣＬＥＣ−２依存性血小板凝集体形成を活性化するのか阻害するのかを決定するための方法であって、
（ａ）ＣＬＥＣ−２リガンドを血液試料と混合して、処理された血液試料を調製するステップ、
（ｂ）処理された血液試料を、固体支持体に固定化されている促進性分子と接触させるステップ、
（ｃ）接触後、血小板凝集体形成を測定するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）において検出された血小板凝集体形成の程度を、ＣＬＥＣ−２リガンドのない対照血液試料を用いて前記促進性分子を接触させる場合に得られる血小板凝集の程度と比較するステップ
を含む方法。
【請求項１７】
促進性分子がＣＬＥＣ−２の活性化剤である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
促進性分子が可溶性Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型コラーゲンであり、ロドサイチンを血液試料に添加することをさらに含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｂ）に先立って、処理された血液試料をモジュレーター分子と混合することをさらに含み、前記モジュレーター分子は調節リガンド分子に結合することができる、請求項１６、１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＣＬＥＣ−２リガンドおよび医薬賦形剤を含むキット。
【請求項２１】
ＣＬＥＣ−２リガンドに特異的に結合するモジュレーターをさらに含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
ＣＬＥＣ−２リガンドに特異的に結合するモジュレーターを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１０年１０月１４日提出の米国特許仮出願第６１／３９３１９１号の優先権の利益を主張し、この特許文献は参照によりその全体を本明細書に組み込んでいる。
【０００２】
本発明は、一般には、タンパク質ＣＬＥＣ−２に結合しその活性を調節する核酸リガンドを含む薬理学的システムに関する。これらの核酸リガンドは、核酸リガンドの活性を阻害してその薬理学的効果を中和し、それによりＣＬＥＣ−２機能を回復するモジュレーターを使用することで、能動的に可逆的でもある。本発明は、核酸リガンドおよび／またはモジュレーターを含む組成物ならびにＣＬＥＣ−２媒介障害を処置するのにこれら作用剤および組成物を使用する方法にさらに関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｃ型レクチン様受容体２（ＣＬＥＣ−２）は、バイオインフォマティクスアプローチを使用して最近同定され、血小板受容体として認識された（Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ，Ｃ．Ａ．、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」、２００９年；９：９０−９５頁）。ＣＬＥＣ−２は、細胞外Ｃ型レクチン様ドメインおよび単一ｈｅｍＩＴＡＭ（免疫受容活性化チロシンモチーフ）ＹＸＸＬモチーフを含有する短い細胞質ドメインを有する２型膜貫通タンパク質である。細胞質ＹＸＸＬモチーフにおけるチロシン７のリン酸化は、Ｓｒｃキナーゼが活性化されるとリガンド結合により誘発され、今度は、ＰＬＣγ２を含む一連の下流シグナル伝達タンパク質をリン酸化する。ＣＬＥＣ−２と相互作用をしこの生理シグナル伝達機能を媒介することができる２種類の既知の天然に存在するタンパク質、内在性タンパク質ポドプラニンとヘビ毒タンパク質ロドサイチンがあり、この両方が凝集と分泌の両方の強力な刺激作用を含む血小板活性化を誘発する。Ｉｎｏｕｅ−ＳｕｚｕｋｉらはＫａｔｏと共同で、ポドプラニン誘導血小板凝集のプロファイルがロドサイチン誘導血小板凝集のプロファイルと極めて類似していることを報告し、ＣＬＥＣ−２をポドプラニンの受容体として同定した（Ｉｎｏｕｅ−Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．Ｏ．ら、Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２０１１年、９（ｓｕｐｐｌ  １）：４４−５５頁）。彼らは、ロドサイチン誘導血小板凝集が、ＣＲＰにより誘導される血小板凝集と比べてＴｘＡ２生成とアクチン重合に高度に依存性であることも明らかにした（Ｉｎｏｕｅ，Ｋ．ら  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９９年；２５６：１１４−１２０頁）。ロドサイチンもポドプラニンもマイクロモル親和性でＣＬＥＣ−２と直接相互作用する（Ｋａｔｏ，Ｙ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ、２００８年；９９：５４−６１頁；Ｏｚａｋｉ，Ｙら、Ｊ．Ｔｈｒｏｍ．Ｈｅｍｏｓｔ、２００８年；７：１９１−１９４頁）。ＣＬＥＣ−２は、ポドプラニンを介して腫瘍細胞に結合することが明らかにされており、マウス研究からの結果はＣＬＥＣ−２シグナル伝達が腫瘍転移を促進し得ることを示している（Ｗａｔｓｏｎ，Ａ．Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００９年；４８：１０９８８−１０９９６頁）。
【０００４】
ＣＬＥＣ−２は、血栓形成を伝播する際に、インビボで正常止血および血栓症にも関与していた（Ｓｐａｌｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．、Ｊ．Ｔｈｒｏｍ．Ｈｅｍｏｓｔ、２００９年；７：１１９２−１１９９頁；Ｗａｔｓｏｎ，Ａ．Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００９年；４８：１０９８８−１０９９６頁）。血管壁損傷による内皮下細胞外マトリックスタンパク質の曝露は、血小板活性化および凝集を誘発する。最近、抗ＣＬＥＣ−２抗体処置により循環する血小板由来のタンパク質が数日間減少することがマウスにおいて明らかにされた。ＣＬＥＣ−２欠損マウスにより、エクスビボおよびインビボで重度の血小板凝集体形成異常が明らかにされた（Ｍａｙ，Ｆ．ら、Ｂｌｏｏｄ、２００９年；１１４：３４６４−３４７２頁）。エクスビボおよびインビボでの流動条件下の血栓形成は、マウスがＣＬＥＣ−２を欠損している場合には重篤な障害になる。ＣＬＥＣ−２欠損マウスは、αＩＩｂβ３を阻害する作用剤またはＧＰ１ｂαを阻害する作用剤で処置されたマウスと比べると出血時間の中程度の増加を示す（Ｍａｙ，Ｆ．ら、Ｂｌｏｏｄ、２００９年；１１４：３４６４−３４７２頁；Ｋｕｎｉｃｋｉ，Ｔ．、Ｂｌｏｏｄ、２００９年；１１４：３３６４−３３６５頁）。
【０００５】
ＣＬＥＣ−２は、血小板へのヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）の付着を媒介することも見出されている。血小板上のＣＬＥＣ−２受容体がＨＩＶ−１に結合すると、ＨＩＶ−１は血小板による破壊を回避することも前記血小板を使用してウイルス伝播を促進することもできるようになることがある（Ｃｈａｉｐａｎ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００６年；８０（１８）：８９５１−８９６０頁）。ＣＬＥＣ−２受容体シグナル伝達は、骨髄樹状細胞において炎症応答を調節することにも関与していた（Ｍｏｕｒａｏ−Ｓａ，Ｄ．ら、２０１１年  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．４１：３０４０−３０５３頁）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ，Ｃ．Ａ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２００９年；９：９０−９５頁
【非特許文献２】Ｉｎｏｕｅ−Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．Ｏ．ら、Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２０１１年、９（ｓｕｐｐｌ  １）：４４−５５頁
【非特許文献３】Ｉｎｏｕｅ，Ｋ．ら  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９９年；２５６：１１４−１２０頁
【非特許文献４】Ｋａｔｏ，Ｙ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ、２００８年；９９：５４−６１頁
【非特許文献５】Ｏｚａｋｉ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｔｈｒｏｍ．Ｈｅｍｏｓｔ、２００８年；７：１９１−１９４頁
【非特許文献６】Ｗａｔｓｏｎ，Ａ．Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００９年；４８：１０９８８−１０９９６頁
【非特許文献７】Ｓｐａｌｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．、Ｊ．Ｔｈｒｏｍ．Ｈｅｍｏｓｔ、２００９年；７：１１９２−１１９９頁
【非特許文献８】Ｍａｙ，Ｆ．ら、Ｂｌｏｏｄ、２００９年；１１４：３４６４−３４７２頁
【非特許文献９】Ｋｕｎｉｃｋｉ，Ｔ．、Ｂｌｏｏｄ、２００９年；１１４：３３６４−３３６５頁
【非特許文献１０】Ｃｈａｉｐａｎ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００６年；８０（１８）：８９５１−８９６０頁
【非特許文献１１】Ｍｏｕｒａｏ−Ｓａ，Ｄ．ら、２０１１年  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．４１：３０４０−３０５３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、ＣＬＥＣ−２媒介障害を処置するための治療薬および方法に対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（要旨）
本明細書では、ＣＬＥＣ−２を特異的に阻害する核酸リガンド、これらのリガンドを同定するおよび／または特徴付けるための方法、ならびにこれらのリガンドの使用のための処置が記載されている。
【０００９】
一態様では、単離された核酸配列を含むＣＬＥＣ−２リガンドまたは薬学的に許容されるこの塩が提供される。一実施形態では、少なくとも１つのヌクレオチドはリボヌクレオチドである。別の実施形態では、少なくとも１つのヌクレオチドは２’−フルオロ−２’デオキシピリミジンヌクレオチドである。さらに別の実施形態では、ＣＬＥＣ−２リガンドの単離された核酸配列は、リボヌクレオチドと２’−フルオロ−２’デオキシピリミジンヌクレオチドの混合物を含む。
【００１０】
一実施形態では、ＣＬＥＣ−２リガンドは、少なくとも１つのステムおよび少なくとも１つのループを含む二次構造を含む。
【００１１】
一実施形態では、ＣＬＥＣ−２リガンドは、５’から３’方向に、５−１０塩基対（ｂｐ）長である第１のステム、配列５’−ＧＮＣ−３’を含む第１のトリヌクレオチドループ、４ｂｐ長である第２のステムであり、第２のステムの塩基にゆらぎ対を含む前記第２のステム、およびヌクレオチド配列５’−ＹＵＹＮＮＲＹＵ−３’を含む第２のループを含む。
【００１２】
一実施形態では、ＣＬＥＣ−２核酸リガンドは約２０から約１００ヌクレオチド（ｎｔ）長である。別の実施形態では、このリガンドは約３０から約９０、約３０から約４０または約３０から約３５ｎｔ長である。別の実施形態では、ＣＬＥＣ−２核酸リガンドは、約３０ｎｔ、３１ｎｔ、３２ｎｔ、３３ｎｔ、３４ｎｔまたは３５ｎｔ長である。
【００１３】
一実施形態では、ＣＬＥＣ−２リガンドは、配列番号４−９３からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％同一である核酸配列または薬学的に許容されるこの塩を含む。
【００１４】
一実施形態では、リガンドはタンパク質ＣＬＥＣ−２またはこの断片に結合する。別の実施形態では、リガンドはＣＬＥＣ−２の可溶性ドメインに結合する。さらに別の実施形態では、リガンドはＣＬＥＣ−２細胞外ドメインに結合する。さらに別の実施形態では、リガンドはＣＬＥＣ−２  Ｇｌｎ５８−Ｐｒｏ２３０ドメインに結合する。一実施形態では、リガンドはＣＬＥＣ−２タンパク質（配列番号１）に特異的に結合する。別の実施形態では、リガンドはＣＬＥＣ−２の細胞外ドメイン（配列番号２）に特異的に結合する。
【００１５】
一実施形態では、リガンドは、その１つまたは複数が改変されているヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ヌクレオチド改変は安定化に寄与する改変である。さらに別の実施形態では、改変はインビトロおよび／またはインビボでリガンドの安定性を増加する。さらに別の実施形態では、改変はインビボでリガンドの生物学的利用能を増加する。
【００１６】
一実施形態では、リガンドはこの３’末端に逆位チミンを含む。
【００１７】
一実施形態では、リガンドは、ＣＬＥＣ−２に対して約２０ナノモル（ｎＭ）またはそれ未満の解離定数（「Ｋｄ」）を有する。
【００１８】
一実施形態では、リガンドは、０より大きいが約１００マイクロモル（μＭ）未満、約１μＭ未満、約５００ナノモル（ｎＭ）未満、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約５００ピコモル（ｐＭ）未満、約３００ｐＭ未満、約２５０ｐＭ未満または約２００ｐＭ未満であるＣＬＥＣ−２に対する解離定数を有する。一実施形態では、リガンドは約０．１から１０ｎＭまたは約０．５から約５ｎＭの範囲に及ぶＣＬＥＣ−２に対する解離定数を有する。
【００１９】
一実施形態では、ＣＬＥＣ−２リガンドは、ＣＬＥＣ−２のバリアントに結合してこの機能を減少または阻害し、ＣＬＥＣ−２バリアントはＣＬＥＣ−２アミノ酸配列（配列番号１または配列番号２）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。
【００２０】
一実施形態では、ＣＬＥＣ−２リガンドがＣＬＥＣ−２に結合することにより、ＣＬＥＣ−２の活性立体構造が安定化する。別の実施形態では、ＣＬＥＣ−２リガンドがＣＬＥＣ−２に結合することにより、ＣＬＥＣ−２の不活性立体構造が安定化する。
【００２１】
一実施形態では、リガンドの１つまたは複数のヌクレオチドは改変された糖および／または改変された塩基を含む。別の実施形態では、改変は２’−安定化に寄与する改変である。さらに別の実施形態では、２’−安定化に寄与する改変は、ヌクレオチド糖環上の２’−フルオロ改変である。
【００２２】
一実施形態では、ＣＬＥＣ−２に対する核酸リガンドは可逆的であり、ＣＬＥＣ−２に結合しているＣＬＥＣ−２リガンドは解離されることができる。別の実施形態では、ＣＬＥＣ−２に結合しているＣＬＥＣ−２リガンドは、ＣＬＥＣ−２リガンドモジュレーターの存在下でＣＬＥＣ−２から解離される。
【００２３】
一態様では、ＣＬＥＣ−２リガンドに結合するモジュレーターであって、ＣＬＥＣ−２リガンドの活性を部分的にまたは完全に逆転させるモジュレーターが提供される。
【００２４】
一実施形態では、モジュレーターは単離された核酸配列を含む。別の実施形態では、モジュレーターは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、ポリペプチド配列またはこれらの任意の組合せを含む。一実施形態では、モジュレーターは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル−２’デオキシヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチル−２’デオキシヌクレオチドの混合物を含む核酸モジュレーターである。別の実施形態では、核酸モジュレーターは、少なくとも１つの改変されたデオキシリボヌクレオチドおよび／または少なくとも１つの改変されたリボヌクレオチドを含む。
【００２５】
一実施形態では、モジュレーターは、ＣＬＥＣ−２核酸リガンドの少なくとも一部に相補的であるオリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態では、モジュレーターは、ＣＬＥＣ−２核酸リガンドの少なくとも一部に相補的であるオリゴヌクレオチドからなる。別の実施形態では、モジュレーターは、ＣＬＥＣ−２リガンドにおけるループの少なくとも一部に相補的であるオリゴヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態では、モジュレーターは、ＣＬＥＣ−２リガンドにおけるステムの少なくとも一部に相補的であるオリゴヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態では、モジュレーターは、ＣＬＥＣ−２リガンドにおけるステムの少なくとも一部におよびＣＬＥＣ−２リガンドにおけるループの少なくとも一部に相補的であるオリゴヌクレオチド配列を含む。
【００２６】
一実施形態では、モジュレーターは、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４および配列番号６５からなる群から選択される配列に対して８０％、８５％、９０％、９１％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を超えて同一である配列を含む。別の実施形態では、モジュレーターは、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４および配列番号６５からなる群から選択される配列を含む。
【００２７】
一実施形態では、ＣＬＥＣ−２核酸リガンドのモジュレーターは、リボザイム、ＤＮＡザイム、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルフォリノ核酸（ＭＮＡ）およびロックド核酸（ＬＮＡ）からなる群から選択される。
【００２８】
一実施形態では、ＣＬＥＣ−２核酸リガンドのモジュレーターは、ＣＬＥＣ−２核酸リガンドの少なくとも一部に相補的である核酸を含む。別の実施形態では、モジュレーターは、リボザイム、ＤＮＡザイム、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルフォリノ核酸（ＭＮＡ）およびロックド核酸（ＬＮＡ）からなる群から選択され、このモジュレーターはＣＬＥＣ−２核酸リガンドの少なくとも一部に特異的に結合または相互作用する。
【００２９】
一実施形態では、モジュレーターは、核酸結合タンパク質またはペプチド、小分子、オリゴ糖、核酸結合脂質、ポリマー、ナノ粒子およびマイクロスフェアからなる群から選択され、このモジュレーターはＣＬＥＣ−２核酸リガンドの少なくとも一部に結合または相互作用する。
【００３０】
一実施形態では、モジュレーターは、配列が約１０ｎｔから約３０ｎｔ、約１０ｎｔから約２５ｎｔ、約１０ｎｔから約２０ｎｔ、約１０ｎｔから約１５ｎｔまたは約１５ｎｔから約２０ｎｔ長である、単離された核酸配列を含む。別の実施形態では、モジュレーターは、配列が約１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔまたは２０ｎｔ長である、単離された核酸配列を含む。
【００３１】
一実施形態では、ＣＬＥＣ−２核酸リガンドおよび／または核酸モジュレーター配列のヌクレオチドのうちの１つまたは複数が改変される。別の実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチドは、２’ヒドロキシル位に改変を含む。別の実施形態では、ＣＬＥＣ−２リガンドに存在する改変は２’−フルオロからなる群から選択される。別の実施形態では、ＣＬＥＣ−２リガンドの１つまたは複数のヌクレオチドは、２’−フルオロ−２’デオキシシチジンまたは２’−フルオロ−２’デオキシウリジンである。さらに別の実施形態では、モジュレーターの１つまたは複数のヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルシトシン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルグアノシンまたは２’−Ｏ−メチルチミジンである。さらに別の実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチドは、２’フルオロシチジン、２’フルオロウリジン、２’フルオロアデノシンまたは２’−フルオログアノシンである。
【００３２】
一実施形態では、ＣＬＥＣ−２核酸モジュレーターの１つまたは複数のヌクレオチドの改変は、５−フルオロウラシル、５−フルオロシトシン、５−ブロモウラシル、５−ブロモシトシン、５−クロロウラシル、５−クロロシトシン、５−ヨードウラシル、５−ヨードシトシン、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルチオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、６−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、５−メトキシシトシン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシルオキシ酢酸（ｖ）、ブトキソシン（ｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチルチオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシルオキシ酢酸（ｖ）、５−メチルチオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎカルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）および２，６−ジアミノプリンからなる群から選択される改変を含む。
【００３３】
一実施形態では、モジュレーターは、少なくとも１つの改変された糖部分を含む。
【００３４】
一実施形態では、モジュレーターがＣＬＥＣ−２リガンドに結合すると、ＣＬＥＣ−２リガンド内の自殺位が曝露され、それによってＣＬＥＣ−２リガンドの二次構造が破壊され、ヌクレアーゼによる核酸ＣＬＥＣ−２リガンドの破壊が増強される。
【００３５】
一実施形態では、ＣＬＥＣ−２リガンド−ＣＬＥＣ−２複合体にモジュレーターが結合すると、ＣＬＥＣ−２リガンドのＣＬＥＣ−２への結合が減少または排除される。
【００３６】
別の態様では、ＣＬＥＣ−２リガンドの活性をモジュレートする方法が提供される。
【００３７】
一実施形態では、核酸リガンドはＣＬＥＣ−２に特異的に結合し、ＣＬＥＣ−２媒介障害を抑制する。一実施形態では、リガンドは、血小板凝集を媒介するＣＬＥＣ−２の能力を抑制する。一実施形態では、リガンドは、血小板活性化および分泌を媒介するＣＬＥＣ−２の能力を抑制する。一実施形態では、リガンドは、血栓形成を伝播するＣＬＥＣ−２の能力を抑制する。一実施形態では、リガンドは、内在性タンパク質ポドプラニンと相互作用するＣＬＥＣ−２の能力を抑制する。一実施形態では、リガンドは、腫瘍細胞と相互作用するＣＬＥＣ−２の能力を抑制する。一実施形態では、リガンドは、ポドプラニンを介して腫瘍細胞に結合し血小板を腫瘍部位に引き付けるＣＬＥＣ−２の能力を抑制する。一実施形態では、リガンドは、ＣＬＥＣ−２の能力を腫瘍細胞と相互作用することから抑制し、それによって転移を抑制する。一実施形態では、リガンドは、ＣＬＥＣ−２の能力を腫瘍細胞と相互作用することから抑制し、それによって増殖因子を放出する腫瘍細胞の能力を減少させる。一実施形態では、リガンドは、ＣＬＥＣ−２の能力をヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と相互作用することから抑制する。一実施形態では、リガンドは、ＣＬＥＣ−２の能力をＨＩＶ播種を促進することから抑制する。一実施形態では、リガンドは、ＣＬＥＣ−２シグナル伝達媒介炎症応答、サイトカイン産生、血小板−単球相互作用および血小板粘着の能力を抑制する。
【００３８】
一実施形態では、核酸ＣＬＥＣ−２リガンドを投与されている宿主にＣＬＥＣ−２リガンドのモジュレーターを投与することによりＣＬＥＣ−２核酸リガンドの活性をモジュレートする方法が提供される。一実施形態では、モジュレーターはオリゴヌクレオチドモジュレーターまたはこの誘導体であることが可能であり、ある種の実施形態では、核酸ＣＬＥＣ−２リガンドの一部に相補的である。
【００３９】
追加の態様では、ＣＬＥＣ−２リガンドを使用してＣＬＥＣ−２機能を調節する方法が提供される。
【００４０】
一実施形態では、ＣＬＥＣ−２機能を調節するための方法は、宿主に治療的有効量のＣＬＥＣ−２リガンドを投与することを含む。別の実施形態では、この方法は、すでにＣＬＥＣ−２リガンドを投与されている宿主にＣＬＥＣ−２リガンドモジュレーターを投与することをさらに含む。
【００４１】
別の態様では、ＣＬＥＣ−２媒介疾患または障害を処置するまたは寛解させる方法が提供される。
【００４２】
一実施形態では、この方法は、ＣＬＥＣ−２に結合するＣＬＥＣ−２リガンドの治療的有効量をそれを必要とする宿主に投与することを含む。一実施形態では、宿主は血小板媒介障害に罹っていると診断されている。
【００４３】
一実施形態では、血小板媒介疾患または障害は、心血管障害、脳血管障害、末梢血管障害、急性冠動脈症候群、糖尿病関連障害および癌からなる群から選択される。
【００４４】
一実施形態では、脳血管障害は、血栓症、血栓塞栓症または一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）である。別の実施形態では、急性冠動脈症候群は、冠動脈血栓症、不安定狭心症または心筋梗塞に起因する。さらに別の実施形態では、糖尿病関連障害は、糖尿病性網膜症、糖尿病性脈管障害、アテローム動脈硬化症、虚血性発作、末梢血管疾患、急性腎損傷または慢性腎不全である。一実施形態では、癌は、肺癌、乳癌、前立腺癌、精巣癌、膵癌、脳癌、骨癌および肝癌から選択される。
【００４５】
一実施形態では、ＣＬＥＣ−２リガンドは、非経口投与、静脈内注射、内皮送達、関節内送達、滑液嚢内送達、くも膜下腔内、動脈内送達、心臓内送達、筋肉内送達、皮下送達、眼窩内送達、嚢内送達、脊髄内送達、胸骨内送達、局所送達、経皮パッチ送達、直腸送達、頬側送達、膣または尿道坐剤を介した送達、腹膜送達、経皮送達、点鼻薬を介した送達、手術移植を介した送達、内部手術用ペンキ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｐａｉｎｔ）を介した送達、注入ポンプを介した送達またはカテーテルを介した送達により投与される。
【００４６】
別の態様では、血小板機能を調節するＣＬＥＣ−２リガンドを投与することによりそれを必要とする患者を処置するための方法が提供される。
【００４７】
一実施形態では、治療的有効量のＣＬＥＣ−２が投与される。
【００４８】
一実施形態では、治療的有効量は血小板粘着および／もしくは凝集および／もしくは分泌を減少または抑制する。
【００４９】
一態様では、ＣＬＥＣ−２に結合する核酸リガンドの治療的有効量を含む医薬組成物が提供される。
【００５０】
一態様では、ＣＬＥＣ−２に結合する核酸ＣＬＥＣ−２リガンドの活性を逆転させるモジュレーターの治療的有効量を含む医薬組成物が提供される。
【００５１】
一実施形態では、医薬組成物は、ＣＬＥＣ−２リガンドおよび薬学的に許容される賦形剤を含む。別の実施形態では、医薬組成物は、静脈内注射に適した液体である。さらに別の実施形態では、医薬組成物は、皮下注射に適した液体またはディスパーションである。
【００５２】
一態様では、ＣＬＥＣ−２核酸リガンドおよび／またはＣＬＥＣ−２核酸リガンドの活性を調節するモジュレーターの治療的有効量を含むキットが提供される。
【００５３】
一実施形態では、キットはＣＬＥＣ−２リガンドを含む。別の実施形態では、キットはＣＬＥＣ−２リガンドのモジュレーターを含む。さらに別の実施形態では、キットは、ＣＬＥＣ−２リガンドとＣＬＥＣ−２リガンドのモジュレーターの両方を含む。
【００５４】
本明細書に記載される核酸リガンドの方法、医薬組成物および使用も、抗血小板または抗血栓療法を必要とする障害または処置計画において使用するためのモジュレート可能な治療法として提供される。ある種の実施形態では、処置は、経皮的介入を含む外科的介入である。この方法は、ＣＬＥＣ−２に対する核酸リガンドをそれを必要とする、閉塞性血栓疾患または冠動脈、大脳もしくは末梢血管系の障害に罹っているまたは罹るリスクがある宿主に投与することを含むことが可能である。さらに、核酸リガンドまたはこのモジュレーターが薬学的に許容される担体と組み合わされている医薬組成物が提供される。モジュレーターを含有する組成物は、核酸リガンドを与えられている宿主に投与して、リガンドの活性のモジュレーションを可能にし、したがって、出血の危険のある宿主の凝固状態を調節するように設計することが可能である。
【００５５】
一態様では、ＣＬＥＣ−２リガンドがＣＬＥＣ−２機能を活性化するのか阻害するのかを決定するための方法が提供される。一実施形態では、ＣＬＥＣ−２機能はＣＬＥＣ−２依存性またはＣＬＥＣ−２媒介血小板凝集である。別の実施形態では、ＣＬＥＣ−２リガンドがＣＬＥＣ−２依存性血小板凝集を活性化するかどうかを決定するための方法が提供される。さらに別の実施形態では、この方法はインビトロで実施される。
【００５６】
一実施形態では、この方法は、
（ａ）ＣＬＥＣ−２リガンドを血液試料と混合して、処理された血液試料を調製するステップ、
（ｂ）処理された血液試料を促進性分子と接触させるステップ、
（ｃ）接触後、血小板凝集体形成を測定するステップ、および
（ｄ）ステップ（ｃ）において検出された血小板凝集体形成の程度を、ＣＬＥＣ−２に結合して促進性分子とのこの相互作用を阻害するのに使用されるＣＬＥＣ−２リガンドのない対照血液試料を用いて得られる血小板凝集体形成の程度と比較するステップ
を含む。
【００５７】
一実施形態では、促進性分子は固体支持体に固定化されている。
【００５８】
一実施形態では、促進性分子はＣＬＥＣ−２活性化物質である。別の実施形態では、促進性分子はロドサイチンである。さらに別の実施形態では、促進性分子はポドプラニンである。
【００５９】
一実施形態では、ＣＬＥＣ−２活性化物質と組み合わせて使用される場合、促進性分子は可溶性コラーゲンである。別の実施形態では、可溶性コラーゲンはＩ、ＩＩまたはＩＩＩ型コラーゲンである。さらに別の実施形態では、この方法は、ＣＬＥＣ−２活性化物質を血液試料に添加することをさらに含む。さらに別の実施形態では、ＣＬＥＣ−２活性化物質はロドサイチンである。
【００６０】
一実施形態では、血液試料は全血である。別の実施形態では、血液試料は多血小板血漿（ＰＲＰ）である。さらに別の実施形態では、血液試料は洗浄血小板である。
【００６１】
一実施形態では、ＣＬＥＣ−２リガンドは核酸ＣＬＥＣ−２リガンドである。別の実施形態では、核酸ＣＬＥＣ−２リガンドは、配列番号８または配列番号９または配列番号８もしくは配列番号９由来の配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】ＳＥＬＥＸ核酸リガンド選択過程の図である。
【図２】Ｓｅｌ２選択の１から１０ラウンドのための条件を示す図である。
【図３】ＣＬＥＣ−２リガンド選択の結合の濃縮を示す図である。
【図４】選択されたＣＬＥＣ−２核酸リガンドの結合曲線を示す図である。
【図５Ａ】Ｓ２−２０  Ｔ１０の予想される二次構造を図示する図である。
【図５Ｂ】ＲＢ  ５８７の予想される二次構造を図示する図である。
【図６】縮重選択（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）のための特定の条件を示す図である。
【図７Ａ】Ｓ２−２０縮重選択配列保存を図示する図である。
【図７Ｂ】Ｓ２−２０縮重選択配列保存を図示する図である。
【図８】ＣＬＥＣ−２リガンドとモジュレーター間の相補性領域を示す図である。
【図９Ａ】ＣＬＥＣ−２リガンドのロドサイチン誘導ＷＰ血小板凝集のグラフである。
【図９Ｂ】ＣＬＥＣ−２リガンドのロドサイチン誘導ＷＰ血小板凝集のグラフである。
【図１０Ａ】ＣＬＥＣ−２リガンドの存在下でのまたはＣＬＥＣ−２リガンドとＣＬＥＣ−２リガンドモジュレーターの存在下でのロドサイチン誘導血小板凝集のグラフである。
【図１０Ｂ】ＣＬＥＣ−２リガンドの存在下でのまたはＣＬＥＣ−２リガンドとＣＬＥＣ−２リガンドモジュレーターの存在下でのロドサイチン誘導血小板凝集のグラフである。
【図１０Ｃ】ＣＬＥＣ−２リガンドの存在下でのまたはＣＬＥＣ−２リガンドとＣＬＥＣ−２リガンドモジュレーターの存在下でのロドサイチン誘導血小板凝集のグラフである。
【図１１Ａ】ロドサイチン誘導ヒトＰ−セレクチン発現のグラフである。
【図１１Ｂ】ロドサイチン誘導ヒトＰ−セレクチン発現のグラフである。
【図１２Ａ】インビトロフローベースの血小板粘着アッセイの結果を示す図である。
【図１２Ｂ】インビトロフローベースの血小板粘着アッセイの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
核酸リガンドは、「アプタマー」とも呼ばれるが、目的の標的分子への結合を可能にする特定の三次元形状をとる天然に存在しない一本鎖核酸である。ペプチドおよびタンパク質に結合するリガンドでは、モノクローナル抗体がこの標的タンパク質に結合するとタンパク質の機能が阻害されることがあるのと同じように、リガンドがこの標的タンパク質に会合するとタンパク質の機能を阻害することがある。核酸リガンドの独特の特長は、ワトソン−クリック型塩基対合によりリガンドにハイブリダイズする相補的オリゴヌクレオチドの形態で、それ自体に対する活性制御剤を生成する能力である。これらの活性制御剤は、リガンドの活性構造を根本的に変化させ、それによってこの薬理活性を中和する。本発明は、ＣＬＥＣ−２の生体機能および相互作用を媒介するＣＬＥＣ−２に対する核酸リガンドを含む化合物、組成物および方法を提供する。さらに、ＣＬＥＣ−２核酸リガンドの活性を調節することができるモジュレーターが提供される。
【００６４】
定義
本明細書で使用される場合、他の方法で指示されてなければ、以下の定義が適用するものとする。
【００６５】
重さ、時間、用量、等の量などの測定可能な値に言及する場合に本明細書で使用される用語「約」は、特定された量から±２０％または±１０％、±５％、±１％もしくは±０．１％の変動を包含することが意図されており、したがって、変動は開示された方法を実施するのに適切である。
【００６６】
「核酸リガンド」は、本明細書では「リガンド」または「アプタマー」と呼ばれることもあるが、三次構造を形成することができ、標的分子と相互作用する核酸である。「ＣＬＥＣ−２核酸リガンド」または「ＣＬＥＣ−２リガンド」または「抗ＣＬＥＣ−２リガンド」または「核酸ＣＬＥＣ−２リガンド」とは、ＣＬＥＣ−２またはこの断片に特異的に結合するリガンドまたはアプタマーのことである。ＣＬＥＣ−２断片は、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはこの断片などの可溶性断片であってもよい。代わりに、ＣＬＥＣ−２リガンドは、細胞の表面で発現されるまたは血小板と会合しているのが見出されるＣＬＥＣ−２分子に結合する。ＣＬＥＣ−２タンパク質は、細胞上で内因的に発現されるまたは組換え手段により発現されることもある。この用語は、生理的環境において対象の標的分子と複合体を形成することができる特定の結合領域を有するオリゴヌクレオチドのことである。標的分子へのリガンドの結合の親和性は、リガンドと標的分子間の相互作用の解離定数（Ｋｄ）の点から定義される。典型的には、その標的に対するリガンドのＫｄは約０．１ｎＭから約１００ｎＭの間である。結合の特異性は、環境におけるリガンドおよび他の物質または無関係な分子一般に関する解離定数と比べた場合の標的に対するリガンドの比較解離定数の点から定義される。典型的には、標的に関するリガンドのＫｄは、環境における無関係物質または付随的物質に関するＫｄの１０分の１、５０分の１、１００分の１または２００分の１になる。
【００６７】
本明細書で使用される場合、相同領域という文脈においては、「実質的に相同な」配列は、特定の分子内でワトソン−クリック塩基対合により同じ二次構造を形成する配列である。ある種の実施形態では、特定のリガンドに対する少なくとも８０％、８５％または約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％配列同一性などのそれよりも多い配列同一性を共有するならば、配列は「実質的に相同」である。明確にするために、そのような「実質的に相同な」配列は、特定の配列に対して「少なくとも８０％、８５％、９０％もしくは９５％配列同一性を有する」配列と、または配列は特定のリガンド配列に対して約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であり得ると言ってもよい。５０またはそれ未満のヌクレオチドなどの特定された長さの核酸リガンドという状況では、相同配列は、ワトソン−クリック結合に、特定領域内の配列同一性とは無関係に、同じ二次構造を形成させる任意の領域において見出すことができる。
【００６８】
本出願と一緒に提出される配列表は、一次配列のみを提供する（特定の改変なしのヌクレオチドの配列を提供する）。本特許明細書においておよび提出される配列表において提供される配列それぞれが、本明細書に記載される改変のいかなる組合せでも有し得ることは理解されている。表１−４に記載される改変を有する配列は、それぞれが特定の「クローン名」または「名称」と関連しており、これらの名称はその具体的に定義された改変を有する核酸配列の定義された説明を与える。
【００６９】
「リガンドモジュレーターペア」は、標的分子に対する特定のリガンドと、リガンドとその標的の相互作用がモジュレートされるようにリガンドの二次および／または三次構造を変化させるリガンドモジュレーターを含むことが意図されている。モジュレーターはリガンドの一部に相補的なオリゴヌクレオチドであることが可能である。モジュレーターは、インビトロ、エクスビボまたはインビボでの生理条件下でリガンドの立体構造を変化させてリガンドの標的結合能を１０％から１００％、２０％から１００％、２５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％または１０％から１００％までの範囲の任意の割合で減少させることができる。
【００７０】
「モジュレーター」、「解毒剤（ａｎｔｉｄｏｔｅ）」、「レギュレーター」または「制御剤」とは、本明細書に記載されるリガンドまたはアプタマーに結合してそのリガンドとこの標的分子間の相互作用を目的の形態で変更する（たとえば、リガンドの構造を改変することにより）ことができる任意の薬学的に許容される作用剤のことである。
【００７１】
本明細書で使用される「モジュレートする（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」は、活性における減弱、増加または何か他の測定可能な変化を意味する。
【００７２】
「宿主」とは哺乳動物のことであり、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む。宿主の例には、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ブタ、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ウシおよびヒトが含まれるがこれらに限定されない。
【００７３】
本明細書で使用される「薬学的に許容される」は、連邦もしくは州政府の規制当局により承認されている、または米国薬局方もしくはヒトに使用するために一般的に承認されている他の薬局方に収載されていることを意味する。
【００７４】
薬学的有効量は、疾患状態の発生を予防する、抑制するまたは疾患状態を処置する（症状をある程度軽減する）のに必要な用量である。薬学的有効量は、疾患の種類、使用される組成物、投与経路、処置される哺乳動物の種類、検討中の特定の哺乳動物の身体特性、併用薬物および医者が認識する他の要因に依拠する。一般に、活性成分の０．１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の量が、核酸リガンドとモジュレーターの効力に応じて投与される。
【００７５】
「安定化された核酸分子」とは、安定化されていない核酸分子と比べてインビボで（たとえば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼにより）容易に分解されにくい核酸分子のことである。安定化は、長さおよび／または二次構造および／またはオリゴヌクレオチド骨格の糖またはリン酸部分内における化学的置換の包含の機能でありえる。安定化は、たとえば、分子を安定化することができる二次構造を制御することにより得ることが可能である。たとえば、核酸分子の３’末端が上流領域に相補的である場合、その部分は折り畳まれて分子を安定化する「ステムループ」構造を形成することができる。
【００７６】
用語「結合親和性」および「結合活性」は、標的に結合するまたは結合しないリガンド分子の傾向を指すことが意図されている。前記相互作用のエネルギー機構は「結合活性」および「結合親和性」において重要である。なぜならば、エネルギー機構が、相互作用する相手の必要な濃度、これらの相手が会合することができる速度ならびに溶液中の結合しているおよび遊離の分子の相対濃度を規定するからである。エネルギー機構は、とりわけ、解離定数Ｋｄの決定を通じて特徴付け得る。
【００７７】
本明細書で使用される「処置」または「処置する」は、（ａ）疾患から保護する、すなわち、臨床症状を発生させない、（ｂ）疾患を抑制する、すなわち、臨床症状の発生を停止、寛解、減少または抑制する、および／または（ｃ）疾患を軽減する、すなわち、臨床症状の後退を引き起こす、を含む哺乳動物における疾患の任意の処置を意味する。人間医学においては、最終的な誘導事象（単数または複数）が未知で、潜在性であることがあり、または患者は前記事象（単数または複数）の発生のずっと後まで確認されないために、「予防する」と「抑制する」を区別するのは必ずしも可能ではないことは当業者であれば理解する。したがって、本明細書で使用される場合、用語「予防」は、本明細書で定義される「予防する」と「抑制する」の両方を包含する「処置」の要素であることが意図されている。本明細書で使用される用語「保護」は、「予防」を含むことが意図されている。
【００７８】
用語「有効量」は、処置される障害または疾患状態を処置するのに十分な投与量を意味する。これは、患者、疾患および行われる処置に応じて変化することになる。
【００７９】
本明細書で使用されるＣＬＥＣ−２核酸リガンド「バリアント」は、ＣＬＥＣ−２核酸リガンドと基本的に同じ機能を果たすバリアントを包含し、実質的に同じ構造を含む。
【００８０】
ＣＬＥＣ−２
ＣＬＥＣ−２は、肝細胞ならびに単球、樹状細胞、ＮＫ細胞および顆粒球を含むいくつかの造血細胞の表面で発現される膜貫通型タンパク質である。造血細胞および肝臓類洞内脾細胞のうち、ＣＬＥＣ−２タンパク質は血小板および巨核球細胞において特異的に発現される（Ｃｈａｉｐａｎら、２００６年；Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、８０：８９５１−８９６０頁）。ＣＬＥＣ−２は、ＳｒｃおよびＳｙｋキナーゼを通じて血小板活性化を媒介することが明らかにされている。
【００８１】
最初、ＣＬＥＣ−２に対する外来性リガンドのみが同定されていた。これらのリガンドには、ヘビ毒であるロドサイチン（アグレチン（ａｇｇｒｅｔｉｎ））およびＨＩＶ−１が含まれており、この両方が血小板を活性化しそれによって血小板凝集を活性化することが明らかにされている。ＣＬＥＣ−２欠損は、出血時間の増加および閉塞性動脈血栓形成からの保護を伴う（Ｍａｙら、２００９年、Ｂｌｏｏｄ、１１４：３４６４−３４７２頁）。Ｍａｙらは、マウスの抗ＣＬＥＣ−２抗体処置により、循環する血小板においてＣＬＥＣ−２が数日間、完全におよび高度に特異的に消失し、これに伴って血小板凝集に重篤な欠陥が生じることも明らかにした。
【００８２】
内在性ＣＬＥＣ−２リガンドは、最近、Ｏｚａｋｉら（２０１０年；Ｊ．Ｔｈｒｏｍ  Ｈａｅｍｏｓ．、７：１９１−１９４頁）により同定されたが、ポドプラニンである。ポドプラニンは、腫瘍誘導血小板凝集および腫瘍転移に関与しているシアロ糖タンパク質である。ポドプラニンはリンパ内皮においておよび腎臓ポドサイトにおいて高度に発現される。ポドプラニンの発現は血管内皮では検出されない。ポドプラニンとＣＬＥＣ−２の相互作用は、発生中の血液とリンパ管の分離にとって重要である。研究によれば、ポドプラニン欠損マウスもＣＬＥＣ−２欠損マウスも出血表現型および不定型の血管接続を示すことが明らかにされた（Ｓｃｈａｃｈｔ，Ｖ．ら、２００３年、ＥＭＢＯ、Ｊ．２２：３５４６−３５５６頁；Ｓｕｚｕｋｉ−Ｉｎｏｕｅ  Ｋ．ら、２０１０年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５：２４４９４−２４５０７頁）。研究によれば、ＣＬＥＣ−２は、受容体が腫瘍細胞伝播を著しく促進することで知られているプロセスである腫瘍細胞誘導血小板活性化を媒介するために、血行性腫瘍転移に関与し得ることが示唆されている（Ｈｏｎｎら、１９９２年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ、１１：３２５−３５１頁；Ｎｉｅｓｗａｎｄｔら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、１９９９年、５９：１２９５−１３００頁）。
【００８３】
完全長ＣＬＥＣ−２タンパク質のアミノ酸配列（ジェンバンク受託番号ＡＡＦ３６７７７）は以下に提示されている。
ＣＬＥＣ−２（配列番号１）
【００８４】
【化１】
2013545443.tif 000002
【００８５】
ＣＬＥＣ−２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、およそアミノ酸５８−２２９を包含しており、以下に提示されている。
ＣＬＥＣ−２（Ｇｌｎ５８−Ｐｒｏ２２９）（配列番号２）
【００８６】
【化２】
2013545443.tif 000003
【００８７】
Ｎ−末端Ｈｉｓ１０タグ（配列番号３）に融合したＣＬＥＣ−２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、本明細書に記載される核酸リガンドを選択するために使用されたが、アミノ酸５８−２２９を包含しており、以下に提示されている。
【００８８】
【化３】
2013545443.tif 000004
【００８９】
ＣＬＥＣ−２核酸リガンドの開発
ＣＬＥＣ−２タンパク質に特異的に結合する核酸リガンドは、ＳＥＬＥＸ法を使用して同定された。ＳＥＬＥＸにより最初に得られたリガンドは、次に、ＣＬＥＣ−２リガンドの特性を理解するために完全に特徴付けられた。そのような特徴付けには、配列決定、保存された配列、二次構造予測およびトランケーションを決定するための配列整列化ならびにＣＬＥＣ−２に特異的に結合し阻害するという目的の機能にもっとも重要であるリガンド領域を同定するための変異解析が含まれた。
【００９０】
ＳＥＬＥＸとは、指数関数的濃縮（ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）によるリガンドの組織的進化（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ）のことである。この方法は、標的分子へ高度に特異的な結合をする核酸分子のインビトロ進化を可能にする。ＳＥＬＥＸ法は、たとえば、米国特許第５４７５０９６号および米国特許第５２７０１６３号に記載されている（ＷＯ  ９１／１９８１３も参照）。
【００９１】
そのもっとも基本的な形態では、ＳＥＬＥＸプロセスは、以下の一連のステップにより定義し得る。
１）異なる配列の核酸の候補混合物が調製される。候補混合物には一般に、固定された配列の領域（すなわち、候補混合物のメンバーのそれぞれが同じ位置に同じ配列を含有する）およびランダム化された配列の領域が含まれる。固定された配列領域は、（ａ）以下に記載される増幅ステップを支援する、（ｂ）標的に結合することが分かっている配列を模倣する、または（ｃ）候補混合物において所与の構造配列の核酸の濃度を増強するように選択される。ランダム化された配列は、全体的にランダム化することも（すなわち、任意の位置に塩基を見出す確率は４つに１つである）または部分的にのみランダム化することも（たとえば、任意の位置に塩基を見出す確率は、０から１００％の間の任意のレベルで選択することができる）可能である。
２）候補混合物は、標的と候補混合物のメンバー間の結合に都合の良い条件下で選択された標的と接触させる。このような状況下で、標的と候補混合物の核酸間の相互作用は、標的と標的に対してもっとも強力な親和性を有する核酸間で核酸−標的複合体を形成すると見なすことが可能である。
３）標的に対してもっとも高度な親和性を有する核酸は、標的に対する親和性の少ない核酸から区分される。もっとも高度な親和性核酸に一致する配列は候補混合物にはごくわずかな数しか（おそらく、１分子の核酸のみ）存在しないので、区分化中、候補混合物中における相当量の核酸（およそ５から５０％）が保持されるように、区分化基準を設定するのが一般的に望ましい。
４）次に、区分化中に標的に対して比較的高度な親和性を有するとして選択された核酸は増幅されて、新しい候補混合物を作り、標的に対して比較的高度な親和性を有する核酸に濃縮される。
５）上記の区分化と増幅ステップを繰り返すことにより、新たに形成された候補混合物が含有する弱く結合する配列は徐々に少なくなり、標的に対する核酸の親和性の平均度合は一般的に増加することになる。ＳＥＬＥＸプロセスは、標的分子ともっとも高度な親和性相互作用を可能にする特定の二次および三次構造に折り畳まれる最初の候補混合物由来の核酸配列を表す１つまたは少数の独特の核酸を含有する候補混合物を生じる。
【００９２】
ＣＬＥＣ−２に特異的な核酸リガンドは、たとえば、米国特許第７０８７７３５号に記載されるＳＥＬＥＸ法を使用して、分子の細胞外ドメインを表す短いペプチドに対してＳＥＬＥＸを実施することにより生成することができる。代わりに、たとえば、米国特許第６７３０４８２号に記載されるＳＥＬＥＸ法を使用して、無傷の血小板、タンパク質について濃縮された血小板膜画分で、精製されたＣＬＥＣ−２で、またはＣＬＥＣ−２受容体を特異的に過剰発現している細胞系統でＳＥＬＥＸを実施することにより、ＣＬＥＣ−２に特異的な核酸リガンドを単離することが可能である。
【００９３】
さらに、ＳＥＬＥＸプロセスは、米国特許第５７８０２２８号に記載されるスキームなどの、競合親和性溶出スキームを使用して特異的ＣＬＥＣ−２核酸リガンドを単離することに向けることが可能である。
【００９４】
ある種の実施形態では、ＣＬＥＣ−２核酸リガンドは、生理条件下でＣＬＥＣ−２受容体に結合する。生理条件は典型的には、溶液の塩およびｐＨのレベルに関係している。インビトロでは、生理条件は典型的には、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを約７．４のｐＨで含むバッファーにおいて再現される。ある種の実施形態では、天然の、典型的には活性化されていない血小板が上記の通りに使用されて、核酸リガンドの集団をスクリーニングし濃縮された集団を与え、この中には血小板上に見出されるタンパク質に向けられるリガンドが含有される。次に、濃縮された集団は、目的のＣＬＥＣ−２受容体を過剰発現している安定な細胞系統またはタンパク質で一過性にトランスフェクトされている細胞系統に対して使用される。リガンド競合実験を通じてまたは細胞内シグナル伝達経路へのその効果を同定することにより、これらの細胞から単離された受容体にまたはホール細胞に修正されたＳＥＬＥＸ手法を使用することにより、二次スクリーニングは実現することが可能である。
【００９５】
多血小板血漿もしくは洗浄血小板調製物において実施される光線透過率凝集測定、または全血において実施されるインピーダンス凝集測定、または多血小板血漿もしくは全血もしくは洗浄血小板において、ロドサイチンにより血小板を活性化し続いて抗ＣＤ６２Ｐ（Ｐ−セレクチン）、抗ＰＡＣ１（活性化されたＧＰＩＩｂＩＩＩａ）もしくは抗フィブリノーゲンを含む血小板活性化および凝集のマーカーで染色して実施されるＦＡＣＳなどの血小板機能アッセイにおいて血小板凝集の抑制についてリガンドをスクリーニングすることも可能である。ＣＬＥＣ−２に対する所与の核酸リガンドの特異性は、所与の受容体の既知のアゴニストにより誘発される細胞内シグナル伝達事象を遮断するリガンドの能力によりさらに区別することが可能である。ＣＬＥＣ−２に対する所与の核酸リガンドの特異性は、凝集がＣＬＥＣ−２以外の受容体を活性化するアゴニストにより誘発される場合の血小板凝集に対する効果の非存在によりさらに区別することも可能である。
【００９６】
本明細書に記載されるリガンドは単離された核酸配列を含み、この配列はＤＮＡでもＲＮＡでも可能であり、改変されたリボ核酸またはデオキシリボ核酸を使用して合成することが可能である。本明細書に記載されるある種の実施形態では、核酸の配列はＲＮＡ配列として書かれる。同様に、核酸リガンドが最初はＤＮＡ分子として同定される本明細書に記載されるある種の実施形態では、核酸の配列はＤＮＡ配列として書かれる。ＤＮＡ配列としてテキスト形式で提示されるヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列内のチミン（Ｔ）がウリジン（Ｕ）で置き換えられてヌクレオチドの対応するＲＮＡ配列が得られる対応するＲＮＡ配列の記述を本質的に与えることは理解されている。同様に、ＲＮＡ配列としてテキスト形式で提示されるヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列内のウリジン（Ｕ）がチミン（Ｔ）で置き換えられて対応するＤＮＡ配列が得られる対応するＤＮＡ配列の記述を本質的に与えることは理解されている。
【００９７】
標的に関するリガンドの結合親和性は、Ｋｄの点から定義することができる。この解離定数の値は、実施例１に記載される放射性リガンド結合法によりなどの、周知の方法により直接決定することが可能である。
【００９８】
一部の実施形態では、ＣＬＥＣ−２へのリガントの結合のＫｄは、約１ｎＭから約１００ｎＭまで、約１０ｎＭから約５０ｎＭまでまたは約０．１ｎＭから約２０ｎＭまでの範囲に及ぶことができる。他の実施形態では、ＣＬＥＣ−２へのリガントの結合のＫｄは、環境内の無関係なタンパク質または他の付随する物質へのリガントの結合のＫｄの少なくとも２分の１、３分の１、４分の１、５分の１または１０分の１である。無関係なタンパク質は、別の血小板活性化または粘着受容体などのＣＬＥＣ−２に存在するモチーフに関係するモチーフを有するタンパク質であることもある。
【００９９】
以下でより詳細に考察されるように、ＳＥＬＥＸ法により得られ同定されるリガンドの結合活性は、多種多様の技術手法を使用してさらに改変または増強することが可能である。
【０１００】
一部の実施形態では、リガンドはＣＬＥＣ−２の細胞外ドメインと相互作用する。リガンドは、内在性リガンドのＣＬＥＣ−２受容体への結合を妨害することができる。ある種の実施形態では、リガンドはＣＬＥＣ−２受容体を介する細胞内シグナル伝達を阻害することができる。リガンドは、ポドプラニンなどの内在性リガンドと相互作用するこの受容体の能力が減少するように、二量体立体構造などの受容体の立体構造を安定化することも破壊することもできる。ある種の実施形態では、リガンドは、血小板凝集および／もしくは活性化ならびに／または血小板粘着ならびに／または血小板分泌に影響を与えることができる。
【０１０１】
本明細書に記載される核酸リガンドは、能動的な可逆的作用剤として機能することができる。これらは、患者への投与後、第２の作用剤の投与により直接制御することが可能な作用剤または薬学的な活性分子である。下にもっと詳細に記載されるように、第２の作用剤は、本明細書ではモジュレーターと呼ばれるが、リガンドの薬理活性を遮断または微調整することができる。その結果、リガンドの薬理活性は、たとえば、薬物クリアランス以外の手段により逆転させることができる。
【０１０２】
本明細書に開示されるＣＬＥＣ−２リガンドは、好ましくは、ＣＬＥＣ−２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（アミノ酸残基Ｇｌｎ５８−Ｐｒｏ２３０；配列番号２）に特異的に結合する核酸リガンドである。ＣＬＥＣ−２リガンドは、下におよび実施例１にもっと詳細に記載されるＳＥＬＥＸ法を使用して選択され、次に、安定性、ＣＬＥＣ−２に対する親和性および／またはＣＬＥＣ−２活性を調節する能力を増加させるよう改変された。
【０１０３】
本明細書に記載される方法に従って単離されたリガンドは、本明細書の実施例２に提示される、下の表１−２に提示されている。
【０１０４】
本明細書に記載されるように、ＣＬＥＣ−２に結合するアプタマーは実施例１−２に記載される通りに単離され塩基配列決定され、２０の独特な配列が同定された。１つのクローン、Ｓ２−２０は、ＣＬＥＣ−２依存性血小板凝集の高親和性阻害因子として同定された。このクローンは、さらに実施例３−５に記載されるＳＥＬＥＸ選択された配列の切断型および／または変異されたバージョンを生成することにより特徴付けられた。クローンＳ２−２０（配列番号８または配列番号９）の二次構造解析は、ｍｆｏｌｄサーバー（ｍｆｏｌｄ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｒｐｉ．ｅｄｕ）で利用可能なソフトウェアを使用して、ＣＬＥＣ−２リガンド（アプタマー）が約６ｂｐ長の第１のステムを有する共通構造を予想したが、データによれば、この第一ステムの長さは５から１０ｂｐの範囲に及び、ＣＬＥＣ−２に対する高親和性を維持することができることが明らかにされている。したがって、アプタマーの第１のステムは、約３ｂｐから約１５ｂｐまで、または約４ｂｐから約１２ｂｐまで、または約５ｂｐから約１０ｂｐまでの範囲に及び得る。第１のステムは、約３ｂｐ、４ｂｐ、５ｂｐ、６ｂｐ、７ｂｐ、８ｂｐ、９ｂｐ、１０ｂｐ、１１ｂｐ、１２ｂｐ、１３ｂｐ、１４ｂｐまたは１５ｂｐの長さを有し得ることが想定されている。ＣＬＥＣ−２リガンド構造は、配列５’−ＧＡＣ−３’を有する第１のループを有するとも予想されたが、変異解析により第１のループ構造の第二位における変異の許容性が明らかにされた。したがって、ＣＬＥＣ−２リガンドの第１のループは５’−ＧＮＣ−３’共通配列を含み、ＮはＡ、Ｔ、Ｃ、ＧまたはＵであることが可能であることが想定されている。第一ループの３’側に第２のステムがあり、ステムの塩基にゆらぎ塩基対のある約４ｂｐの長さを有するが、この長さは約３ｂｐから７ｂｐまでまたは４ｂｐから約６ｂｐまで変わり得る。第２のステムの３’側に、配列５’−ＣＵＣＡＵＡＵＵ−３’の第２のループ構造がある。変異解析により、好ましいループ２共通配列は５’−ＹＵＹＮＮＲＹＵ−３’であり得、Ｙはピリミジン、ＲはプリンおよびＮはＡ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵであることが明らかにされた。Ｓ２−２０に由来する切断型ＣＬＥＣ−２リガンドのうち、Ｓ２−２０  Ｔ１０（配列番号２２）およびＲＢ５８７（配列番号２４）がそのようなリガンドの例である。
【０１０５】
共通構造を決定すれば、リガンド構造および機能を増強または減少させ得る１つまたは複数のヌクレオチドを同定するためのリガンドの操作が促進される。共通構造を決定すれば、特定のステムおよびループ構造へのヌクレオチド付加、欠失および置換をさらに効率よく同定し試験することが可能になる。
【０１０６】
共通二次構造が分かれば、リガンド構造および機能にとって有害になり得る改変を回避することも可能になる。たとえば、ステムまたはループ領域内の２’−フルオロなどのある種の改変は共通二次構造内に保存されていることもある。これらの場合、リガンドのステムまたはループから２’−フルオロを取り去ると活性が失われることがある。
【０１０７】
一実施形態では、リガンドはＳＥＬＥＸ法を使用して選択される核酸分子であり、切断型およびこれに実質的に相同な配列を含む。本明細書で使用されるように、相同領域という状況では、「実質的に相同な」配列は、特定の分子内でワトソン−クリック塩基対合により同じ二次構造を形成する配列である。別の実施形態では、ＳＥＬＥＸ法を使用して選択されるリガンドは、配列番号５−５９にまたは配列番号９−１４、１６−２２、２４、３３、３７、３８、４２、４４−４８および５５−５７からなる群から選択される配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるまたは同一である核酸配列を含む核酸配列からなる群から選択される。さらに別の実施形態では、リガンドは、生理条件下、インビトロで測定された場合、約１０ｎＭ未満または約５ｎＭ未満の解離定数を有するリガンドである。
【０１０８】
本明細書に記載されるＣＬＥＣ−２リガンドは、配列番号７、配列番号８または配列番号９内の１つまたは複数のヌクレオチド位に欠失を有することによりＳ２−２０配列とは異なる配列を含む核酸分子でもよい。ＣＬＥＣ−２リガンドは、配列番号７、配列番号８または配列番号９内に１つまたは複数の欠失の任意の組合せ導入することにより作製してもよい。
【０１０９】
本明細書で言及されるＣＬＥＣ−２リガンドは、配列番号７、配列番号８または配列番号９の５’および／または３’末端から１つまたは複数のヌクレオチドを切断する（欠失する）ことにより生成される配列を含んでいてもよい。たとえば、ＣＬＥＣ−２リガンドは、配列番号７、配列番号８または配列番号９の最初（５’）の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６ヌクレオチドを欠失することにより生成される配列であってもよい。別の実施形態では、配列番号７、配列番号８または配列番号９から最後（３’）の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６ヌクレオチドが欠失される。さらに別の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９もしくは８０位のヌクレオチドまたはこれらの任意の組合せが配列番号７、配列番号８または配列番号９の配列から欠失される。別の実施形態では、欠失配列の組合せは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドからなる。
【０１１０】
好ましい実施形態では、ＣＬＥＣ−２リガンドは、配列番号２４に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である配列を含む。この実施形態では、ＣＬＥＣ−２リガンドは、約２０ｂｐから４０ｂｐ、２５ｂｐから３０ｂまたは約２７ｂｐから３３ｂｐまでの範囲に及ぶ長さを有する。このＣＬＥＣ−２リガンドは、第１のステム、５’−ＧＮＣ−３’（ＮはＧ、Ａ、Ｔ、ＣまたはＵ）を含む第１のループ、第２のステムおよび５’−ＣＵＣＡＵＡＵＵ−３’または５’−ＹＵＹＮＮＲＹＵ−３’（Ｙはピリミジン、Ｒはプリン、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵ）を含む第２のループを含む二次構造を有する。核酸リガンド配列番号２４という状況では、特定の領域内の配列同一性とは無関係に、ワトソン−クリック結合に同じ二次構造を形成させるいかなる領域においても相同配列を見出すことができる。
【０１１１】
本明細書に記載されるＣＬＥＣ−２リガンドは、インビトロでおよび／またはインビボでＣＬＥＣ−２分子の活性を阻害するように機能する。言い換えると、ＣＬＥＣ−２活性を測定するように設計された特定のアッセイにおいては、ＣＬＥＣ−２リガンドを添加するとＣＬＥＣ−２活性を減少させ得る。たとえば、ＣＬＥＣ−２リガンドはＣＬＥＣ−２機能を阻害する。ＣＬＥＣ−２リガンドは、インビトロでおよび／またはインビボでＣＬＥＣ−２依存性血小板機能を阻害することにより機能し得る。
【０１１２】
ＣＬＥＣ−２核酸リガンドのモジュレーター
一部の実施形態では、ＣＬＥＣ−２に対する核酸リガンドは可逆的である。一態様では、ＣＬＥＣ−２リガンドのモジュレーターを前記核酸リガンドを投与された宿主に投与することによりＣＬＥＣ−２に対するリガンドの活性をモジュレートするための方法が提供される。
【０１１３】
モジュレーターは、核酸リガンドに結合し、そのリガンドとこの標的分子間の相互作用を（たとえば、核酸リガンドの構造を改変することにより）目的の方法で改変することができる、または核酸リガンドを分解する、代謝する、切断するもしくは他の方法で化学的に変化させてその生物学的効果を改変するいかなる薬学的に許容される作用剤でも含むことが可能である。
【０１１４】
本明細書に記載されるＣＬＥＣ−２リガンドの核酸モジュレーターは標準相補的ワトソン−クリック塩基対合則に基づいて設計される（実施例６参照）。変化する長さのモジュレーターオリゴヌクレオチドは、ＣＬＥＣ−２機能を阻害することが明らかにされているＣＬＥＣ−２リガンドに相補的な配列を有するように合成される。次に、合成されたモジュレーターオリゴヌクレオチドのそれぞれは、たとえば、ゲル移動度シフトアッセイにより、ＣＬＥＣ−２リガンドの結合するその能力について試験される。次に、ＣＬＥＣ−２リガンドに結合するモジュレーターがＣＬＥＣ−２リガンドの活性を逆転させることもできるかどうかを試験することが重要である。下でおよび実施例のセクションでさらに詳細に記載されるように、所与のモジュレーターの逆転活性は、ＣＬＥＣ−２リガンドの抗血小板活性を評価するアッセイを使用して試験することが可能である。ＣＬＥＣ−２媒介血小板凝集を阻害するＣＬＥＣ−２リガンドを同定するために実施されるアッセイは、ＣＬＥＣ−２リガンドに結合することが明らかにされているモジュレーターの存在下でも実施される。モジュレーターは、ＣＬＥＣ−２リガンドの添加の前に、同時にまたは後でアッセイ混合物に添加してもよい。モジュレーターの逆転活性は、たとえば、洗浄血小板凝集研究、全血、多血小板血漿におけるまたは洗浄血小板調製物におけるロドサイチンまたはポドプラニン誘導血小板凝集アッセイ、ＣＬＥＣ−２リガンドの存在下でＰ−セレクチン発現を評価するためのロドサイチンまたはポドプラニンを用いて実施されるフローサイトメトリーアッセイおよびインビトロフローベースの血小板粘着アッセイを使用して実証することが可能である。
【０１１５】
好ましい実施形態では、ＣＬＥＣ−２核酸リガンドのモジュレーターは、ＣＬＥＣ−２核酸リガンド配列に少なくとも部分的に相補的である核酸配列である。図８に示されるように（および表４参照）、ＣＬＥＣ−２リガンドＲＢ５８７のモジュレーターは、ＲＢ５８７の異なる領域にハイブリダイズするように設計された。ＲＢ５８１は、ＲＢ５８７の一次配列の３’１６塩基に相補的であるが、血小板凝集アッセイにおけるＣＬＥＣ−２リガンド阻害活性の中和により決定される場合およびゲル移動度シフトアッセイにより決定される場合、ＣＬＥＣ−２へのＲＢ５８７の結合を減少させるのに効果的であった。したがって、一部の実施形態では、ＣＬＥＣ−２リガンドの同じ領域に相補的であるまたはハイブリダイズすることができるモジュレーターが本明細書で提供される。したがって、本明細書に記載されるモジュレーターは、ループ２、ステム２およびステム１またはこれらの部分を包含するＣＬＥＣ−２核酸リガンドの領域にハイブリダイズすることができる。１つの特定の例として、本明細書に記載されるモジュレーターは、ＣＬＥＣ−２リガンドＲＢ５８７（配列番号２４）のおよそ１４−３１または１４−２６または１６−３１または１８−３１または２１−３１または１６−２６または１６−２９位の塩基に対応する領域にハイブリダイズすることができる。さらに、モジュレーターとＣＬＥＣ−２リガンドとの特定の相互作用により、ＣＬＥＣ−２ポリペプチドへのＣＬＥＣ−２リガンドの結合は減少する。さらに、モジュレーターは、ＣＬＥＣ−２リガンドによるＣＬＥＣ−２標的タンパク質機能の阻害を抑制または逆転させ得る。
【０１１６】
好ましい実施形態では、ＣＬＥＣ−２核酸リガンドのモジュレーターは、ＣＬＥＣ−２核酸リガンド配列に少なくとも部分的に相補的である核酸配列である。図８に示されるように（および表４参照）、ＣＬＥＣ−２リガンドＲＢ５８７のモジュレーターは、ＲＢ５８７の異なる領域にハイブリダイズするように設計された。ＲＢ５８２は、ＲＢ５８７の一次配列の内部１６塩基に相補的であるが、血小板凝集アッセイにおけるＣＬＥＣ−２リガンド阻害活性の中和により決定される場合およびゲル移動度シフトアッセイにより決定される場合、ＣＬＥＣ−２へのＲＢ５８７の結合を減少させるのに効果的であった。したがって、一部の実施形態では、ＣＬＥＣ−２リガンドの同じ領域に相補的であるまたはハイブリダイズすることができるモジュレーターが本明細書で提供される。したがって、本明細書に記載されるモジュレーターは、ループ２、ステム２およびステム１の一部またはこれらの部分を包含するＣＬＥＣ−２核酸リガンドの領域にハイブリダイズすることができる。１つの特定の例として、本明細書に記載されるモジュレーターは、ＣＬＥＣ−２リガンドＲＢ５８７（配列番号２４）のおよそ１４−３１または１４−２９または１４−２７または１６−２９または１６−２７または１９−２９または２１−３１または２１−２９位の塩基に対応する領域にハイブリダイズすることができる。さらに、モジュレーターとＣＬＥＣ−２リガンドとの特定の相互作用により、ＣＬＥＣ−２ポリペプチドへのＣＬＥＣ−２リガンドの結合は減少する。さらに、モジュレーターは、ＣＬＥＣ−２リガンドによるＣＬＥＣ−２標的タンパク質機能の阻害を抑制または逆転させ得る。
【０１１７】
好ましい実施形態では、ＣＬＥＣ−２核酸リガンドのモジュレーターは、ＣＬＥＣ−２核酸リガンド配列に少なくとも部分的に相補的である核酸配列である。図８に示されるように（および表４参照）、ＣＬＥＣ−２リガンドＲＢ５８７のモジュレーターは、ＲＢ５８７の異なる領域にハイブリダイズするように設計された。ＲＢ５８３は、ＲＢ５８７の一次配列の内部１５塩基に相補的であるが、血小板凝集アッセイにおけるＣＬＥＣ−２リガンド阻害活性の中和により決定される場合およびゲル移動度シフトアッセイにより決定される場合、ＣＬＥＣ−２へのＲＢ５８７の結合を減少させるのに効果的であった。したがって、一部の実施形態では、ＣＬＥＣ−２リガンドの同じ領域に相補的であるまたはハイブリダイズすることができるモジュレーターが本明細書で提供される。したがって、本明細書に記載されるモジュレーターは、ループ１、ステム２およびループ２またはこれらの部分を包含するＣＬＥＣ−２核酸リガンドの領域にハイブリダイズすることができる。１つの特定の例として、本明細書に記載されるモジュレーターは、ＣＬＥＣ−２リガンドＲＢ５８７（配列番号２４）のおよそ７−２１または９−２１または９−１７または７−１９または７−１７または７−１４位の塩基に対応する領域にハイブリダイズすることができる。さらに、モジュレーターとＣＬＥＣ−２リガンドとの特定の相互作用により、ＣＬＥＣ−２ポリペプチドへのＣＬＥＣ−２リガンドの結合は減少する。さらに、モジュレーターは、ＣＬＥＣ−２リガンドによるＣＬＥＣ−２標的タンパク質機能の阻害を抑制または逆転させ得る。
【０１１８】
好ましい実施形態では、ＣＬＥＣ−２核酸リガンドのモジュレーターは、ＣＬＥＣ−２核酸リガンド配列に少なくとも部分的に相補的である核酸配列である。図８に示されるように（および表４参照）、ＣＬＥＣ−２リガンドＲＢ５８７のモジュレーターは、ＲＢ５８７の異なる領域にハイブリダイズするように設計された。ＲＢ５８４は、ＲＢ５８７の一次配列の内部１６塩基に相補的であるが、血小板凝集アッセイにおけるＣＬＥＣ−２リガンド阻害活性の中和により決定される場合およびゲル移動度シフトアッセイにより決定される場合、ＣＬＥＣ−２へのＲＢ５８７の結合を減少させるのに効果的であった。したがって、一部の実施形態では、ＣＬＥＣ−２リガンドの同じ領域に相補的であるまたはハイブリダイズすることができるモジュレーターが本明細書で提供される。したがって、本明細書に記載されるモジュレーターは、ステム１の一部、ループ１、ステム２およびループ２の一部またはこれらの部分を包含するＣＬＥＣ−２核酸リガンドの領域にハイブリダイズすることができる。１つの特定の例として、本明細書に記載されるモジュレーターは、ＣＬＥＣ−２リガンドＲＢ５８７（配列番号２４）のおよそ１−２１または１−１９または１−１４または４−１４または４−１９または４−２１または６−２１または６−１４位の塩基に対応する領域にハイブリダイズすることができる。さらに、モジュレーターとＣＬＥＣ−２リガンドとの特定の相互作用により、ＣＬＥＣ−２ポリペプチドへのＣＬＥＣ−２リガンドの結合は減少する。さらに、モジュレーターは、ＣＬＥＣ−２リガンドによるＣＬＥＣ−２標的タンパク質機能の阻害を抑制または逆転させ得る。
【０１１９】
好ましい実施形態では、ＣＬＥＣ−２核酸リガンドのモジュレーターは、ＣＬＥＣ−２核酸リガンド配列に少なくとも部分的に相補的である核酸配列である。図８に示されるように（および表４参照）、ＣＬＥＣ−２リガンドＲＢ５８７のモジュレーターは、ＲＢ５８７の異なる領域にハイブリダイズするように設計された。ＲＢ５８５は、ＲＢ５８７の一次配列の５’１８塩基に相補的であるが、血小板凝集アッセイにおけるＣＬＥＣ−２リガンド阻害活性の中和により決定される場合およびゲル移動度シフトアッセイにより決定される場合、ＣＬＥＣ−２へのＲＢ５８７の結合を減少させるのに効果的であった。したがって、一部の実施形態では、ＣＬＥＣ−２リガンドの同じ領域に相補的であるまたはハイブリダイズすることができるモジュレーターが本明細書で提供される。したがって、本明細書に記載されるモジュレーターは、ステム１、ループ１、ステム２およびループ２の一部またはこれらの部分を包含するＣＬＥＣ−２核酸リガンドの領域にハイブリダイズすることができる。１つの特定の例として、本明細書に記載されるモジュレーターは、ＣＬＥＣ−２リガンドＲＢ５８７（配列番号２４）のおよそ１−２１または１−１８または１−１６または１−１４または４−２１または４−１８または４−１４または６−１４または６−１８または６−２１位の塩基に対応する領域にハイブリダイズすることができる。さらに、モジュレーターとＣＬＥＣ−２リガンドとの特定の相互作用により、ＣＬＥＣ−２ポリペプチドへのＣＬＥＣ−２リガンドの結合は減少する。さらに、モジュレーターは、ＣＬＥＣ−２リガンドによるＣＬＥＣ−２標的タンパク質機能の阻害を抑制または逆転させ得る。
【０１２０】
好ましい実施形態では、ＣＬＥＣ−２核酸リガンドのモジュレーターは、ＣＬＥＣ−２核酸リガンド配列に少なくとも部分的に相補的である核酸配列である。図８に示されるように（および表４参照）、ＣＬＥＣ−２リガンドＲＢ５８７のモジュレーターは、ＲＢ５８７の異なる領域にハイブリダイズするように設計された。ＲＢ５８６は、ＲＢ５８７の一次配列の５’１３塩基に相補的であるが、血小板凝集アッセイにおけるＣＬＥＣ−２リガンド阻害活性の中和により決定される場合およびゲル移動度シフトアッセイにより決定される場合、ＣＬＥＣ−２へのＲＢ５８７の結合を減少させるのに効果的であった。したがって、一部の実施形態では、ＣＬＥＣ−２リガンドの同じ領域に相補的であるまたはハイブリダイズすることができるモジュレーターが本明細書で提供される。したがって、本明細書に記載されるモジュレーターは、ステム１、ループ１およびステム２またはこれらの部分を包含するＣＬＥＣ−２核酸リガンドの領域にハイブリダイズすることができる。１つの特定の例として、本明細書に記載されるモジュレーターは、ＣＬＥＣ−２リガンドＲＢ５８７（配列番号２４）のおよそ１−１３または１−１０または６−１３位の塩基に対応する領域にハイブリダイズすることができる。さらに、モジュレーターとＣＬＥＣ−２リガンドとの特定の相互作用により、ＣＬＥＣ−２ポリペプチドへのＣＬＥＣ−２リガンドの結合は減少する。さらに、モジュレーターは、ＣＬＥＣ−２リガンドによるＣＬＥＣ−２標的タンパク質機能の阻害を抑制または逆転させ得る。
【０１２１】
モジュレーターの別の例には、核酸リガンド配列の少なくとも一部に相補的であるオリゴヌクレオチドまたはこれの類似体（リボザイムまたはＤＮＡザイムを含む）が含まれる。他の例には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルフォリノ核酸（ＭＮＡ）もしくはロックド核酸（ＬＮＡ）；核酸結合タンパク質もしくはペプチド；オリゴ糖；小分子；または核酸結合ポリマー、脂質、ナノ粒子もしくはマイクロスフィアベースのモジュレーターが含まれる。
【０１２２】
モジュレーターは、特定の核酸リガンドに高度な特異性および目的の程度の親和性で結合するように設計することが可能である。モジュレーターは、結合すると、リガンドの構造がより活性なまたはより活性ではない形態に改変されるように設計することも可能である。たとえば、標的になった核酸リガンドに結合すると、そのリガンドの二次構造および／または三次構造が変更され、それにより前記リガンドはもはやその標的分子に結合できなくなるまたはその標的分子により低い親和性で結合するように、モジュレーターを設計することが可能である。代わりに、モジュレーターは、結合すると、リガンドの三次元構造が、その標的分子に対するリガンドの親和性が増強されるように変更されるように設計することが可能である。すなわち、モジュレーターは、結合すると、構造モチーフがリガンドの親和性が増加されるように改変されるように設計することが可能である。別の実施形態では、リガンド／モジュレーター対は、対象の標的に結合することができない核酸リガンド分子にモジュレーターが結合すると、リガンド内に構造モチーフが生成され、それによってリガンドはその標的分子に結合することができるようになるように設計される。
【０１２３】
モジュレーターは、特定の核酸リガンドまたは核酸リガンドのセットに、複合体を形成するのに十分な親和性で非特異的に結合するように設計することも可能である。そのようなモジュレーターは一般に、電荷−電荷相互作用を介して核酸と会合することができる。そのようなモジュレーターは、１よりも多い核酸リガンドに同時に結合することもできる。モジュレーターは、１つまたは複数の核酸リガンドに結合すると、核酸リガンドの構造がその活性型から著しく変化することはなく、むしろモジュレーターは、核酸リガンドとその標的分子との会合を遮蔽するまたは立体的に妨げるように設計することが可能である。
【０１２４】
ヌクレオチドモジュレーターは、リガンド分子への効果的な結合を可能にするいかなる長さでも可能である。たとえば、オリゴヌクレオチドモジュレーターは、約１０ヌクレオチド（ｎｔ）から約３０ｎｔ、約１０ｎｔから約２０ｎｔまたは約１５ｎｔからの長さの範囲に及ぶことができる。ヌクレオチドモジュレーターは、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔ、２４ｎｔ、２５ｎｔ、２６ｎｔ、２７ｎｔ、２８ｎｔ、２９ｎｔまたは３０ｎｔ長でもよい。当業者であれば、３０ｎｔよりも大きな長さを有するヌクレオチドモジュレーターを想定することも可能である。
【０１２５】
本明細書に記載される核酸リガンドは、活性な三次構造を有し、これは適切で安定した二次構造の形成により影響を受けることが可能である。したがって、相補的オリゴヌクレオチドモジュレーターと核酸リガンド間の二重鎖の形成の機構は２本の短い線状オリゴリボヌクレオチド間の二重鎖の形成に類似しているが、そのような相互作用を設計するための規則とそのような産物の形成の速度論の両方は分子内リガンド構造に影響を受けることが可能である。
【０１２６】
核酸リガンドとオリゴヌクレオチドモジュレーター間での最初の塩基対形成の核形成速度は、最終的な安定した二重鎖の形成において重要な役割を果たしており、このステップの速度は、オリゴヌクレオチドモジュレーターを、核酸リガンドに存在する一本鎖ループおよび／または一本鎖３’もしくは５’テールに標的することにより大いに増強される。分子間二重鎖の最適な形成が起こるためには、自由エネルギーは、標的にされた核酸リガンド内の既存の分子内二重鎖の形成に関して分子間二重鎖の形成にとって理想的に有利である。
【０１２７】
本明細書に記載されるモジュレーターは一般には、標的にされた核酸リガンド配列の少なくとも一部に相補的である配列を含むオリゴヌクレオチドである。たとえば、モジュレーターオリゴヌクレオチドは、標的にされたリガンドの約６ｎｔ（ヌクレオチド）から２５ｎｔ、８ｎｔから２０ｎｔまたは１０ｎｔから１５ｎｔに相補的な配列を含むことができる。モジュレーターオリゴヌクレオチドの長さは、標的にされたリガンドと求める効果を考慮し、本明細書に記載され当業者には公知の技法を使用して容易に最適化することが可能である。オリゴヌクレオチドは、ＤもしくはＬ立体化学またはこれらの混合物を有するヌクレオチドを用いて作製することが可能である。天然に存在するヌクレオシドはＤ立体配置である。
【０１２８】
オリゴヌクレオチドモジュレーターは、核酸リガンドの少なくとも一部に相補的な配列を含むが、絶対的相補性は必要ではない。「核酸リガンドの少なくとも一部に相補的な」配列とは、本明細書では、核酸リガンドとハイブリダイズすることができるのに十分な相補性を有する配列のことである。ハイブリダイズする能力は、核酸の相補性の程度と長さの両方に依存することができる。一般に、ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが大きくなるにしたがって、このオリゴヌクレオチドが含有しそれでも安定な二重鎖（または場合によっては三重鎖）を形成することができる標的リガンドとの塩基ミスマッチの数は多くなる。当業者であれば、ハイブリダイズされた複合体の融点を決定する標準法を使用することによりミスマッチの許容できる程度を確かめることができる。オリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはこれらのキメラ混合物または誘導体または改変されたバージョンであることが可能である。
【０１２９】
モジュレーターは、核酸骨格にも個々の核酸の構造にも改変を含むことが可能である。ある種の実施形態では、モジュレーターは、リガンド中の少なくとも１つのループ領域に相補的な核酸である。他の実施形態では、モジュレーターは、リガンド中の少なくとも１つのステム領域に相補的な核酸である。さらに他の実施形態では、モジュレーターは、少なくとも１つのループ領域および１つの連続するステム領域に相補的な核酸である。一部の実施形態では、モジュレーターは、リガンドの一部に生理条件でハイブリダイズする配列を少なくとも有するオリゴヌクレオチドである。モジュレーターの目的の機能に応じて、モジュレーターは、核酸リガンドの二次および／または三次構造を破壊または安定化するように設計することが可能である。
【０１３０】
一部の実施形態では、モジュレーターは、リガンド上の「自殺位」に結合しそれによってリガンドの配列を破壊するように設計される。自殺位は、酵素的切断を受けやすいリガンドの一本鎖部分である。一つの例示的な実施形態では、自殺位は、モジュレーターがリガンドに結合すると一本鎖で不安定になり、血液または肝臓エンドヌクレアーゼなどの循環中の酵素によるリガンドの切断を増強することができる。ある種の実施形態では、モジュレーターはリガンドに結合し、その後前記リガンドはもはやその標的とは相互作用できなくなる。
【０１３１】
一部の実施形態では、モジュレーター配列は少なくとも１つの改変されたヌクレオチドを含む。たとえば、２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロ改変であり、これは２’−Ｏ−メチルシトシン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、２’フルオロシチジンまたは２’フルオロウリジンを含むことができる。
【０１３２】
様々な戦略を使用して、オリゴヌクレオチドモジュレーターによる結合のための核酸リガンド内の最適部位を決定することが可能である。相補的オリゴヌクレオチドが核酸リガンドの周辺で「歩行される（ｗａｌｋｅｄ）」経験的戦略を使用することができる。このアプローチに従えば、リガンド上の約５ヌクレオチド（たとえば、リガンドの１−１５、６−２０、１１−２５、等に相補的なオリゴヌクレオチド）により捩じれる約１５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド（たとえば、２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロオリゴヌクレオチド）を使用することが可能である。経験的戦略は、ハイブリダイゼーションの効率性に対する核酸リガンドの三次構造の影響を予測するのは困難になることがあるために、特に効果的になることが可能である。
【０１３３】
実施例６および８に記載されるアッセイなどのアッセイを使用し、核酸リガンドの完全な結合を達成するのに必要なモル過剰なオリゴヌクレオチドを特に重視して、特定の核酸リガンドにハイブリダイズする異なるオリゴヌクレオチドの能力を評価することができる。その標的分子からの核酸リガンドの解離速度または前記分子とのリガンドの会合速度を増加する異なるオリゴヌクレオチドモジュレーターの能力は、たとえば、ＢＩＡＣＯＲＥアッセイを使用する標準速度論研究を行うことにより決定することも可能である。オリゴヌクレオチドモジュレーターは、リガンドとその標的分子間の相互作用を目的の形態で改変するのに５−５０倍のモル過剰なオリゴヌクレオチドまたはそれ未満が必要であるように、選択することが可能である。
【０１３４】
代わりに、標的にされた核酸リガンドは、オリゴヌクレオチドモジュレーターとの会合を促進するために、一本鎖テール（３’または５’）を含むように改変することが可能である。適切なテールは、１から２０ヌクレオチド、１から１０ヌクレオチド、１から５ヌクレオチドまたは３から５ヌクレオチドを含むことができる。テールは改変もし得る（たとえば、２’−Ｏ−メチルおよび２’−フルオロ改変であり、これは２’−Ｏ−メチルシトシン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、２’フルオロシチジンまたは２’フルオロウリジンを含むことができる）。テールド（ｔａｉｌｅｄ）リガンドは、結合およびバイオアッセイ（たとえば、以下の実施例に記載されている）において試験し、一本鎖テールの付加が核酸リガンドの活性な構造を破壊しないことを検証することが可能である。テール配列と、たとえば、１、２、３、４または５塩基対を形成することができる一連のオリゴヌクレオチド（たとえば、２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド）を設計して、テールドリガンド単独と会合するその能力、ならびにその標的分子からのリガンドの解離速度または前記分子とのリガンドの会合速度を増加するその能力について試験することが可能である。スクランブルされた配列制御を用いて、この効果は二重鎖形成に起因するものであり非特異的効果ではないことを検証することができる。
【０１３５】
別の実施形態では、モジュレーターはリボザイムまたはＤＮＡザイムである。酵素的核酸は、先ず標的ＲＮＡまたはＤＮＡに結合することにより作用する。そのような結合は、標的ＲＮＡを切断するように作用する分子の酵素的部分に密に近接して保持されている酵素的核酸の標的結合部分を通じて起こる。したがって、酵素的核酸は先ず、相補的塩基対合を通じて標的ＲＮＡまたはＤＮＡを認識し次に結合し、正確な部位に結合すると、酵素的に作用して標的ＲＮＡを切断し、それによってＲＮＡリガンドの不活化を可能にする。それぞれが異なる種類の特異性を示すリボザイムが少なくとも５種類存在する。たとえば、グループＩイントロンはサイズが約３００から＞１０００ヌクレオチドであり、切断部位のすぐ５’の標的配列にＵを必要とし、切断部位の５’側の４−６ヌクレオチドに結合する。別の種類はリボヌクレアーゼＰ  ＲＮＡ（Ｍ１  ＲＮＡ）であり、これはサイズが約２９０から４００ヌクレオチドである。第３の種類はハンマーヘッド型リボザイムであり、これはサイズが約３０から４０ヌクレオチドである。ハンマーヘッド型リボザイムは、切断部位のすぐ５’の標的配列にＵＨ（ＨはＧではない）を必要とし、切断部位の両側で可変数のヌクレオチドに結合する。第４の種類はヘアピンリボザイムであり、サイズが約５０ヌクレオチドである。ヘアピンリボザイムは、切断部位のすぐ３’の標的配列にＧＵＣを必要とし、切断部位の５’側の４ヌクレオチドおよび切断部位の３’側のほうの可変数に結合する。第５のグループはデルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムであり、これはサイズが約６０ヌクレオチドである。ＤＮＡザイムは一本鎖であり、ＲＮＡもＤＮＡも切断する。ＤＮＡザイムの一般モデルが提唱されており、「１０−２３」モデルとして知られている。「１０−２３」モデルに従うＤＮＡザイムは、それぞれ７から９デオキシリボヌクレオチドの２つの基質認識ドメインが隣接する、１５デオキシリボヌクレオチドの触媒ドメインを有する。
【０１３６】
別の実施形態では、モジュレーターそれ自体は核酸リガンドである。この実施形態では、目的の治療標的に結合する第１のリガンドが生成される。第２のステップでは、第１のリガンドに結合する第２のリガンドが本明細書に記載されるＳＥＬＥＸプロセスまたは別のプロセスを使用して生成され、治療リガンドと標的間の相互作用をモジュレートする。一実施形態では、第２のリガンドは第１のリガンドの効果を非活性化する。
【０１３７】
別の例示的な実施形態では、モジュレーターはＰＮＡ、ＭＮＡ、ＬＮＡまたはＰＣＯベースのモジュレーターである。オリゴヌクレオチドモジュレーターの核酸塩基は、核酸塩基間連鎖、たとえば、ペプチジル連鎖（ペプチド核酸（ＰＮＡ）の場合：Ｎｉｅｌｓｅｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４、１４９７頁および米国特許第５５３９０８２号）およびモルフォリノ連鎖（Ｑｉｎら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１０、１１頁（２０００）；Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．７、１８７頁（１９９７）；Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．７、６３頁（１９９７）；Ｔａｙｌｏｒら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７１、１７４４５頁（１９９６）；Ｐａｒｔｒｉｄｇｅら  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．６、１６９頁（１９９６））を介して、または他の任意の天然または改変された連鎖により連結することが可能である。オリゴ核酸塩基はロックド核酸（ＬＮＡ）でも可能である（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｄｙｎ  １７、１７５頁（１９９９）；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ  １３、４４頁（２０００）；Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １１、２２８頁（２０００））。
【０１３８】
ＰＮＡは、オリゴヌクレオチドに類似しているが組成は異なる化合物である。ＰＮＡでは、オリゴヌクレオチドのデオキシリボース骨格はペプチド骨格で置き換えられている。ペプチド骨格のそれぞれのサブユニットは天然に存在するまたは天然に存在しない核酸塩基に付着している。ＰＮＡは、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン単位からなるアキラルポリアミド骨格を有することが多い。プリンまたはピリミジン塩基は、メチレンカルボニルリンカー（１−３）を介してそれぞれの単位に連結されて、相補的核酸を標的にする。ＰＮＡは、ワトソン−クリック塩基対合則に従って平行または逆平行方向に相補的ＲＮＡまたはＤＮＡに結合する。ＰＮＡオリゴマーの無電荷の性質は、天然のホモ二重鎖と比べて、ハイブリッドＰＮＡ／ＤＮＡ（ＲＮＡ）二重鎖の安定性を増強する。
【０１３９】
モルフォリノ核酸は、それぞれが６員モルフォリン環に連結されている４種の遺伝子塩基（アデニン、シトシン、グアニンおよびチミン）のうちの１つを含有するモルフォリノサブユニットから構築されるので、そう称される。これらの４種のサブユニット種のサブユニットは、非イオン性ホスホロジアミデートサブユニット間連鎖により特定の順に結合されて、モルフォリノオリゴを与える。
【０１４０】
ＬＮＡは、これがモジュレーターの第一候補になるいくつかの特長を有するＤＮＡ類似物の１種である。ＬＮＡモノマーは、ＲＮＡモノマーに構造的に類似する二環式化合物である。ＬＮＡはＤＮＡとＲＮＡの化学特性の大半を共有し、水溶性であり、ゲル電気泳動により分離することができ、エタノール沈殿する、等である（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、５４、３６０７−３６３０頁（１９９８））。しかし、ＬＮＡモノマーをＤＮＡまたはＲＮＡ内に導入すると、相補的ＤＮＡまたはＲＮＡとの二重鎖の高温安定性を生じるが、同時にワトソン−クリック塩基対合則に従う。
【０１４１】
プソイド環状オリゴ核酸塩基（ＰＣＯ）もモジュレーターとして使用することが可能である（米国特許第６３８３７５２号参照）。ＰＣＯは３’−３’または５’−５’末端を通じて結合された２つのオリゴヌクレオチドセグメントを含有する。ＰＣＯのセグメント（「機能的セグメント」）の１つは、ある機能性（たとえば、標的ＲＮＡへの相補性）を有する。別のセグメント（「保護セグメント」）は、機能的セグメントの（このセグメントが機能的セグメントに結合している末端に応じて）３’−または５’−末端に相補的である。機能的と保護的セグメントセグメント間の相補性に結果として、ＰＣＯは、標的核酸（たとえば、ＲＮＡ）の非存在下で分子内プソイド環状構造を形成する。ＰＣＯは、３’−３’または５’−５’連鎖の存在および分子内プソイド環状構造の形成のせいで従来のオリゴヌクレオチドよりも安定である。マウスにおける薬物動態、組織分布および安定性研究により、ＰＣＯは、ＰＳ−オリゴヌクレオチド一般よりも高いインビボ安定性ならびにＰＳ−オリゴヌクレオチド一般に類似する薬物動態および組織分布プロファイル、しかし選択された組織からの急速な排出を有することが示唆される。フルオロフォアおよびクエンチャー分子が本開示のＰＣＯに適切に連結されると、前記分子は直線的配置の時は蛍光を発するが、環状構造の時は蛍光は消光される。この特長を使用してＰＣＯを潜在的モジュレーターとしてスクリーニングすることが可能である。
【０１４２】
別の例示的な実施形態では、モジュレーターはペプチドベースのモジュレーターである。核酸リガンドのペプチドベースのモジュレーターは、オリゴヌクレオチドまたはその類似物に対する代替分子クラスのモジュレーターである。このクラスのモジュレーターは、標的核酸リガンドの十分に活性なオリゴヌクレオチドモジュレーターが、標的とオリゴヌクレオチドモジュレーター間の核形成を促進するのに十分な一本鎖領域に欠けるせいで単離することができない場合は、特に有用である。さらに、ペプチドモジュレーターは、オリゴヌクレオチドモジュレーターとは異なる生物学的利用能および薬物動態を与える。一つの例示的な実施形態では、モジュレーターはプロタミンである（Ｏｎｅｙら、２００９年、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１５：１２２４−１２２８頁）。プロタミンは水に可溶性で、熱により凝固することはなく、アルギニン、アラニンおよびセリンを含む（大部分がプロリンおよびバリンも含有し、多くがグリシンおよびイソロイシンを含有する）。モジュレーターには、プロタミンバリアント（たとえば、Ｗａｋｅｆｉｅｌｄら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．６３：２８０頁（１９９６）参照）および米国特許出願公開第２００４／０１２１４４３号に記載される改変型を含む改変型のプロタミンも含まれる。他のモジュレーターには、米国特許第６６２４１４１号および米国特許出願公開第２００５／０１０１５３２号に記載される断片などのプロタミン断片が含まれる。モジュレーターには、一般に、ヘパリン、他のグリコサミノグリカンまたはプロテオグリカンの活性をモジュレートするペプチドも含まれる（たとえば、米国特許第５９１９７６１号参照）。一つの例示的な実施形態では、モジュレーターは、ポリ−Ｌ−リジンおよびポリ−Ｌ−オルニチンなどの、電荷−電荷相互作用を安定化させる陽イオン性ＮＨ基を含有するペプチドである。
【０１４３】
標的核酸リガンドに結合しそれによってこの活性をモジュレートすることができるペプチドを単離するためのいくつかの戦略が利用可能である。たとえば、ビーズに固定化されたコードされたペプチドコンビナトリアルライブラリーが記載されており、ウイルスＲＮＡ配列に結合し、ウイルスＲＮＡと前記ＲＮＡに特異的に結合するウイルス調節タンパク質間の相互作用を破壊することができるペプチドを含有することが実証されている（Ｈｗａｎｇら  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９９年、９６：１２９９７頁）。そのようなライブラリーを使用して、標識を標的核酸リガンドに付加し、ライブラリーの一部のメンバーと核酸間の結合が好まれる条件下で、標識された標的とビーズに固定化されたペプチドライブラリーを一緒にインキュベートすることにより、核酸リガンドのモジュレーターを単離することが可能である。所与のビーズ上の特定のペプチドへの核酸リガンドの結合により、ビーズは核酸リガンド上の標識により「色付け」され、したがって、ビーズの簡単な単離により標的に結合することができるペプチドを同定することが可能になる。そのようなスクリーニング法により単離されるペプチドと標的核酸リガンド間の直接的相互作用は、核酸リガンドのモジュレーターを同定するために記載されている任意の数の結合アッセイを使用して確認し定量化することが可能である。標的核酸リガンドの活性をモジュレートする前記ペプチドの能力は、適切なバイオアッセイにより確かめることが可能である。
【０１４４】
一部の実施形態では、モジュレーターはタンパク質である。たとえば、ある種の実施形態では、核酸リガンドはビオチン分子に連結される。その例では、ストレプトアビジンまたはアビジンが投与されて、リガンドに結合し、この効果を逆転させる（Ｓａｖｉら  Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、６：１６９７−１７０６頁参照）。アビジンは、鳥類、爬虫類および両生類の輸卵管において産生され、その卵の白い部分に沈着している四量体タンパク質である。ストレプトアビジンは、細菌ストレプトマイセス・アビジニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉ）から精製される四量体タンパク質である。四量体タンパク質は、それぞれが高度な親和性と特異性でビオチン（ビタミンＢ７、ビタミンＨ）に結合することができる４つの同一サブユニット（ホモ四量体）を含有する。ＣＬＥＣ−２核酸リガンドのタンパク質モジュレーターは、ＣＬＥＣ−２核酸リガンドが結合するＣＬＥＣ−２ドメインの可溶性部分であってもよい。たとえば、ＣＬＥＣ−２ポリペプチドのＥＣＤまたはこの断片は、細胞結合のまたは天然のＣＬＥＣ−２への結合をめぐってＣＬＥＣ−２核酸リガンドと競合し、ＣＬＥＣ−２核酸リガンドの天然のＣＬＥＣ−２分子への結合を逆転させ得る。
【０１４５】
追加の実施形態では、モジュレーターはオリゴ糖ベースのモジュレーターである。オリゴ糖は核酸と相互作用することができる。たとえば、抗生物質アミノグリコシドは、ストレプトマイセス種の産物であり、様々なリボザイム、リボソームのＲＮＡ成分ならびにＨＩＶ−１のＴＡＲおよびＲＲＥ配列などのＲＮＡ分子の多様なアレイと特異的に相互作用する。したがって、オリゴ糖は核酸に結合することができ、これを使用して核酸リガンドの活性をモジュレートすることが可能である。
【０１４６】
別の実施形態では、モジュレーターは小分子ベースのモジュレーターである。リガンドと標的の間に介入するまたは他の方法でリガンドと標的間の結合を破壊するもしくは改変する小分子も、治療調節物質として使用することが可能である。そのような小分子は、小分子ありおよびなしでのリガンドと標的間の結合変化を測定するアッセイにおいて候補をスクリーニングすることにより、または小分子ありおよびなしでの標的に対するリガンドの生物学的効果の差異を測定するインビボまたはインビトロアッセイを使用することにより同定することが可能である。目的の効果を示す小分子が同定されると、コンビナトリアルアプローチなどの技法を使用して目的の調節効果のために化学構造を最適化することが可能である。
【０１４７】
追加の例示的な実施形態では、モジュレーターは核酸結合ポリマー、脂質、ナノ粒子またはマイクロスフィアである。追加の非限定的例では、モジュレーターは、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＥＤＯＰＣ）；ジラウロイルエチルホスファチジルコリン（ＥＤＬＰＣ）；ＥＤＬＰＣ／ＥＤＯＰＣ；ピリジニウム界面活性剤；ジオレオイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＯＰＥ）；（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（ドデシルオキシ）−１−プロパンアミニウムブロマイド（ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ）プラス中性コリピッド（ｃｏ−ｌｉｐｉｄ）ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）（ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ／ＤＯＰＥ）；（±）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［２−（スペルミン  カルボキシアミド）エチル］−２，３−ビス（ジオエイルオキシ（ｄｉｏｅｙｌｏｘｙ）−１−プロパンアミニウムペタ塩酸塩（ＤＯＳＰＡ）；ジラウロイルエチルホスファチジルコリン（ＥＤＬＰＣ）；エチルジミリストイルホスファチジルコリン（ＥＤＭＰＣ）；（±）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−２，３−ビス（ｚ−オクタデク−９−エン−オイルオキシ）−１−プロパンアミニウム塩化物（ＤＯＴＡＰ）；（±）−Ｎ−２−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（テトラデシルオキシ）−１−プロパンアミニウムブロマイド（ＤＭＲＩＥ）；（±）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−２，３−ビス（ｚ−オクタデク−９−エニルオキシ）−１−プロパンアミニウム塩化物（ＤＯＴＭＡ）；５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシル−アミド（ＤＯＧＳ）；ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５−カルボキシスペルミルアミド（ＤＰＰＥＳ）；１，３ジオレオイルオキシ−２−（６−カルボキシスペルミル）−プロピルーアミド（ＤＯＳＰＥＲ）；テトラメチルテトラパルミトイルスペルミン（ＴＭＴＰＳ）；（テトラメチルテトラオレイルスペルミン（ＴＭＴＯＳ）；テトラメチルテトララウリルスペルミン（ＴＭＴＬＳ）；テトラメチルテトラミリスチルスペルミン（ＴＭＴＭＳ）；テトラメチルジオレイルスペルミン（ＴＭＤＯＳ）；ジフィタノイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＰｈＰＥ）；および（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（ドデシルオキシ）−１−プロパンアミニウムブロマイド（ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ）からなる群から選択することが可能である。
【０１４８】
アルコール）；アクリルまたはメタクリルポリマー；Ｎｅｗｋｏｍｅデンドリマー；ポリフェニレン；ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド（ＤＡＢ）；セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）；アルブミン；酸処理ゼラチン；ポリリジン；ポリオルニチン；ポリアルギニン；ＤＥＡＥ−セルロース；ＤＥＡＥ−デキストラン；およびポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリル酸）；およびポリプロピルアミン（ＰＯＰＡＭ）。
【０１４９】
一実施形態では、モジュレーターはキトサンおよびキトサン誘導体から選択される。キトサン誘導体には、水溶性キトサンナノ粒子が含まれる（たとえば、米国特許第６４７５９９５号；米国特許出願公開第２００６／００１３８８５号；Ｌｉｍｐｅａｎｃｈｏｂら、（２００６）「Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ  Ｂ−Ｃｈｉｔｏｓａｎ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ」；Ｎａｒｅｕｓａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １４（２）：２７−３４頁）。キトサンポリマー（基本的に、反復グルコサミンモノマーで構成された極めて大きなポリアミンポリマー）のポリカチオン性を考慮すると、キトサンを使用して、宿主への注入に続いて、リガンドを凝集および／またはインビボで多価電解質複合体中に被包し得る。これは、キトサン上に見出される一次アミンとリガンドのリン酸ジエステル骨格の相互作用に一部基づいている。
【０１５０】
他の実施形態では、モジュレーターは、１，５−ジメチル−１，５−ジアザウンデカメチレンポリメソブロマイド；ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンブロックコポリマー；ポリ−Ｌ−リジン；ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）；β−シクロデキストリン含有ポリカチオン（ＣＤＰ）；β−シクロデキストリン含有ポリカチオン（イミダゾール含有バリアント）（ＣＤＰ−Ｉｍ）；ポリホスホロアミド酸ポリマー（８ｋＤａ、３０ｋＤａ）（ＰＰＡ−ＤＰＡ  ８ｋ、ＰＰＡ−ＤＰＡ  ３０ｋ）；ポリブレン；スペルミン；ＰＥＧ−ブロック−ＰＬＬ−デンドリマー；ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）；マンノース−ＰＥＩ；トランスフェリン−ＰＥＩ；線状ＰＥＩ（ｌＰＥＩ）；ゼラチン；メタクリル酸／メタクリルアミド；ポリ（ベータアミノエステル）；多価電解質複合体（ＰＥＣ）；ポリ（ビニルアミン）（ＰＶＡ）；コラーゲン；ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）；ポリアリルアミン；ポリビニルピリジン；アミノアセタール化ポリ（ビニルからなる群から選択される。
【０１５１】
ある種の実施形態では、キトサンポリマー上の一級アミンを実質的に改変して、水溶性および電荷状態を変更することができる。キトサン誘導体には、トリメチルキトサンクロライド（ＴＭＣ）が含まれ、これは異なる程度の四級化で合成することが可能である；ポリ両性電解質ポリマーであるモノ−カルボキシメチル化キトサン（ＭＣＣ）；グルタルアルデヒド架橋誘導体（ＣＳＧＡ）；チオラート化キトサン（Ｌｅｅら（２００７）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２４：１５７−６７頁）；グリコールキトサン（ＧＣ）、エチレングリコールにコンジュゲートされたキトサン誘導体（Ｌｅｅら（２００７）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ．）；［Ｎ−（２−カルボキシベンジル）キトサン（ＣＢＣＳ）（Ｌｉｎら（２００７）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｒｅｓ．３４２（１）：８７−９５頁）；ベータ−シクロデキストリン−キトサンポリマー（Ｖｅｎｔｅｒら（２００６）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ．３１３（１−２）：３６−４２頁）；Ｏ−カルボキシメチルキトサン；Ｎ，Ｏ−カルボキシメチルキトサン；またはキサンテート基をその骨格上に導入することにより化学的に改変されたキトサンが含まれる。
【０１５２】
一実施形態では、空のキトサンナノ粒子が生成され、モジュレーターとして使用される。１０，０００Ｄａから＞１，０００，０００Ｄａの分子量範囲のキトサンまたはキトサン誘導体を使用し得る。ある種の実施形態では、キトサンは５００，０００Ｄａまたはそれより少ない。ある種の実施形態では、キトサンは１００，０００Ｄａまたはそれより少ない。一部の実施形態では、前記化合物は１０，０００から１００，０００Ｄａ、１０，０００から９０，０００、１０，０００から８０，０００、２０，０００から７０，０００、３０，０００から７０，０００、約３０，０００、約４０，０００、約５０，０００または約６０，０００Ｄａである。
【０１５３】
一部の実施形態では、異なる程度の脱アセチル化された一級アミンを含有するキトサンポリマーが使用される。これらの実施形態では、異なる程度の脱アセチル化によりポリマーの電荷状態が変更され、それによってポリマーの結合特性が変更される。宿主においてキトサンナノ粒子がリガンドと接触すると、リガンドはナノ粒子表面に結合し捕捉されるまたはナノ粒子に進入してイオン性相互作用により被包され得る。
【０１５４】
別の実施形態では、モジュレーターはポリリン酸ポリマーマイクロスフィアである。ある種の実施形態では、モジュレーターは、米国特許第６５４８３０２号に記載される、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−エチル−亜リン酸塩）またはＰ（ＬＡＥＧ−ＥＯＰ）、等などのそのようなマイクロスフィアの誘導体である。そのようなポリマーは、ポリマー骨格の一部として種々の官能基を含有するように作製することが可能である。一例では、ポリマーは、接触すると１つまたは複数の核酸を複合体化または被包することができるように、生理的ｐＨで陽電荷を有する第四級アミンを含有し得る。ある種の実施形態では、ポリマーは陽電荷を含有しない。
【０１５５】
ある種の実施形態では、モジュレーターは陽イオン分子である。ある種の実施形態では、リガンドは、グアニン四重鎖（Ｇ−四重鎖またはＧ−四本鎖）構造を形成する。これらの構造は陽イオン分子により結合される。ある種の実施形態では、前記分子は金属キレート分子である。一部の実施形態では、モジュレーターはポルフィリンである。一部の実施形態では、前記化合物はＴＭＰｙＰ４である。Ｊｏａｃｈｉｍｉら  ＪＡＣＳ  ２００７年、１２９、３０３６−３０３７頁およびＴｏｒｏら  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００８年、Ａｕｇ１、３７９（１）８−１５頁を参照されたい。
【０１５６】
モジュレーターは、一般に、結合アッセイ、分子モデリングまたは生物学的機能の改変を測定するインビボもしくはインビトロアッセイを通じて同定することが可能である。一実施形態では、核酸へのモジュレーターの結合は、ゲルシフトアッセイにより決定される。別の実施形態では、核酸リガンドへのモジュレーターの結合はＢＩＡＣＯＲＥアッセイにより決定される。
【０１５７】
標準結合アッセイを使用して、モジュレーターを同定し選択することが可能である。非限定的例は、ゲルシフトアッセイおよびＢＩＡＣＯＲＥアッセイである。すなわち、試験モジュレーターは、試験条件または典型的な生理条件下で標的にされる核酸リガンドと接触させ、試験モジュレーターが実際にリガンドに結合するのかどうかに関して判定することが可能である。次に、核酸リガンドに結合することが分かっている試験モジュレーターは適切なバイオアッセイ（リガンドとその標的分子に応じて異なり、たとえば、凝固試験）において解析され、試験モジュレーターがその標的分子上のリガンドにより引き起こされる生物学的効果に影響を与えることができるかどうかを判定することが可能である。
【０１５８】
ゲルシフトアッセイは、結合能を評価するのに使用される周知の技法である。たとえば、ＣＬＥＣ−２に対する核酸リガンドは先ずＣＬＥＣ−２タンパク質もしくはこの断片またはＣＬＥＣ−２タンパク質もしくは断片を含有する混合物と一緒にインキュベートされ、次に電気泳動によりゲル上で分離される。リガンドがタンパク質に結合すると、この複合体はサイズが大きくなり、したがってその移動は、ＣＬＥＣ−２タンパク質の非存在下でゲルの対照レーンに適用することができる遊離リガンドの移動と比べて遅れることになる。リガンドは、たとえば、放射性または非放射性成分により標識され、ゲル内のリガンドＣＬＥＣ−２複合体の検出が可能になる。ゲルシフトアッセイを使用してＣＬＥＣ−２結合活性を有するリガンドについてスクリーニングする場合、複合体は次にゲルから抽出され、単離されたリガンドは解析されて目的のＣＬＥＣ−２結合活性を有するリガンドを同定することができる。
【０１５９】
ゲルシフトアッセイを使用して、ＣＬＥＣ−２に対する核酸リガンドへの結合についてモジュレーターをスクリーニングすることも可能である。なぜならば、核酸リガントとのモジュレーターの会合により遊離リガンドの移動と比べて核酸リガンドの移動度は遅れるからである（たとえば、Ｒｕｓｃｏｎｉら、２００２年、Ｎａｔｕｒｅ、４１９：９０−９４頁参照）。
【０１６０】
さらに、モジュレーターをそのようなアッセイフォーマットに添加して、ＣＬＥＣ−２核酸リガンドとＣＬＥＣ−２の会合を遮断するその能力についてスクリーニングすることが可能である。たとえば、ＣＬＥＣ−２−リガンド混合物を、増加する量の潜在的モジュレーターの存在下でインキュベートすることができる。目的の活性のあるモジュレーターは、ゲルシフトアッセイにより検出した場合、ＣＬＥＣ−２−リガンド複合体の形成を特異的に減少させることになる。
【０１６１】
ＢＩＡＣＯＲＥ技術は、ポリペプチド−核酸相互作用を含む巨大分子相互作用を同定し解析するための信頼できる貴重なツールとして当業者には公知である。したがって、この技術を使用すれば、ＣＬＥＣ−２タンパク質またはこの断片に特異的に結合する核酸アプタマーまたはリガンドについてスクリーニングまたは同定することができる。ＢＩＡＣＯＲＥ技術は、表面に粘着する相互作用体が解析の特異性を決定するように、センサーチップ表面上で結合事象を測定する。言い換えると、ＣＬＥＣ−２タンパク質または断片を、たとえば、ヒスチジンタグを介してセンサーチップ表面に粘着させることができる。次に、結合したＣＬＥＣ−２タンパク質は、潜在的リガンド分子を含有する溶液に曝露される。核酸リガンドがＣＬＥＣ−２タンパク質に結合すれば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）シグナルが直ちに変化する。前記シグナルは、表面に結合する分子の質量に正比例する。
【０１６２】
ゲルシフトアッセイについて記載されているように、ＢＩＡＣＯＲＥを使用すればＣＬＥＣ−２リガンドのモジュレーターを同定または解析することができる。さらに、チップ結合ＣＬＥＣ−２タンパク質を曝露させる反応混合物は、増加する量のモジュレーターと一緒に既知のＣＬＥＣ−２リガンドの両方を含有することができ、その効果は、ＣＬＥＣ−２とそのリガンド間の結果としての相互作用の標準ＢＩＡＣＯＲＥ解析により判定することができる。
【０１６３】
オリゴヌクレオチドもしくはこの類似物、ペプチド、ポリペプチド、オリゴ糖または小分子が、標的とのその相互作用が改変されるような形態でリガンドに結合することができるかどうかを判定することが可能なアッセイが他にいくつか存在する。たとえば、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）、滴定熱量測定、シンチレーション近接アッセイ、分析用超遠心を使用する沈降平衡アッセイ（たとえば、ｗｗｗ．ｃｏｒｅｓ．ｕｔａｈ．ｅｄｕ／ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ参照）、蛍光偏光アッセイ、蛍光異方性アッセイ、蛍光強度アッセイ、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）アッセイ、ニトロセルロース繊維結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＯＮＡ（たとえば、米国特許第５７８９１６３号参照）、ＲＩＡまたは平衡透析アッセイを使用して、核酸リガンドに結合する作用剤の能力を評価することが可能である。作用剤と核酸リガンド間の相互作用が直接決定される直接アッセイを実施することが可能である、またはリガンドをその標的から置き換える作用剤の能力を評価する競合もしくは置換アッセイを実施することが可能である（たとえば、Ｇｒｅｅｎ、Ｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｊａｎｊｉｃ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３０（５）、２００１年、１０９４頁および米国特許第６３０６５９８号参照）。候補モジュレーション作用剤が同定されると、その標的に対する核酸リガンドの活性をモジュレートするその能力はバイオアッセイにおいて確認することができる。代わりに、リガンドとこの標的との相互作用をモジュレートすることができる作用剤が同定される場合、そのような結合アッセイを使用して、作用剤がリガンドと直接相互作用していることを検証することができ、相互作用の親和性を測定することが可能である。
【０１６４】
別の実施形態では、質量分析を、核酸リガンドに結合するモジュレーター、モジュレーターと核酸リガンド間の相互作用の部位（複数可）およびリガンドに対する作用剤の相対的結合親和性の同定のために使用することが可能である（たとえば、米国特許第６３２９１４６号参照）。そのような質量分析法は、選択された標的リガンドに結合しこのリガンドのモジュレーターとして使用することができる個々の化合物を求めて化学混合物またはライブラリー、特にコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするためにも使用することが可能である。さらに、質量分析法を使用すれば、たとえば、化合物のコンビナトリアルライブラリーに対して複数の標的核酸リガンドを同時にスクリーニングすることができる。さらに、質量分析法を使用すれば、複数の分子種、特に「小」分子間の相互作用および標的リガンド上の分子相互作用部位を同定することができる。
【０１６５】
別の実施形態では、核酸リガンドと、処置される障害に特異的である標的と間の相互作用を改変する際のモジュレーターの有効性を評価するインビボまたはインビトロアッセイは、核酸リガンドに結合するモジュレーターの同定のために使用することが可能である。周知であり使用することが可能な生物学的特性についての標準アッセイが豊富に存在する。生物学的アッセイの例は、本出願に引用され特定の適用のためにある種の核酸リガンドを記載している特許に提供されている。
【０１６６】
一実施形態では、モジュレーターは、１０（１０．０）マイクロモル（μＭ）未満、１（１．０）マイクロモル（μＭ）、好ましくは０．１μＭ未満、さらに好ましくは０．０１μＭ未満のモジュレーター濃度で溶液中の核酸リガンドに実質的に結合する能力を有する。「実質的に」は、標的の生物学的活性の少なくとも５０パーセントの減少が標的の存在下でのモジュレーションにより観察されることを意味し、５０％の減少で本明細書ではＩＣ５０値と呼ばれる。
【０１６７】
リガンドとモジュレーターの最適化
リガンドが治療薬として使用するのに適切であるために、リガンドは好ましくは合成が廉価であり、宿主における使用が安全であり、インビボで安定している。野生型ＲＮＡおよびＤＮＡオリゴヌクレオチドは、典型的には、ヌクレアーゼによる分解に対するその感受性のせいでインビボでは安定していない。ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性は、２’位での修飾基の取り込みにより大幅に増加させることが可能である。
【０１６８】
２’−フルオロまたはアミノ基はオリゴヌクレオチドプールに取り込まれ、その後にリガンドがそこから選択される。本開示では、２’−フルオロピリミジンがインビトロ転写反応において使用されて、リガンド選択のための最初のオリゴヌクレオチドプールが生成される（実施例１参照）。
【０１６９】
リガンド（たとえば、ＳＥＬＥＸにより）およびモジュレーター（たとえば、配列相補性に基づく設計）の最初の同定後、リガンドとモジュレーターは改変または操作されて、種々の手段によりその目的の構造、機能および／または安定性が改善されることが可能である。これらの手段には、特定の糖残基を置換する、リガンドにおける特定の領域および／または構造の組成およびサイズを変化させる、ならびにモジュレーターによりさらに効果的に調節され得るリガンドを設計することが含まれるが、これらに限定されない。
【０１７０】
核酸リガンドの設計および最適化は、リガンドの二次構造ならびに二次構造とモジュレーター制御間の関係への認識を含む。核酸を改変する従来の方法とは違って、ＣＬＥＣ−２タンパク質に対するリガンドの設計は、潜在的モジュレーターの設計に対するリガンドの変化の影響を検討することを含み得る。たとえば、リガンドがトランケーションにより改変される場合、対応するモジュレーターは切断型リガンドを制御するように設計されるほうがよい。
【０１７１】
ＳＥＬＥＸプロセスを通じて同定されたリガンドの二次構造は、当業者には公知の種々の方法により予想することが可能である。たとえば、それぞれの配列は、Ｍｆｏｌｄなどのソフトウェアプログラムを使用して解析し得る（ｍｆｏｌｄ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｒｐｉ．ｅｄｕ；Ｚｕｋｅｒ、２００３年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：３４０６−３４１５頁およびＭａｔｈｅｗｓら、１９９９年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８８：９１１−９４０頁も参照）。その後、種々の選択された配列の比較配列解析を使用して、保存された共通二次構造エレメントに基づいて配列を整列化し、ＣＬＥＣ−２リガンドの予想される二次共通構造を得ることができる。
【０１７２】
本明細書に開示されるＣＬＥＣ−２核酸リガンドは、変化する全体のリガンド長ならびにステムおよびループ構造の長さにより改変することが可能である。たとえば、リガンドの５’および／または３’末端の一部がＳＥＬＥＸプロセスにおいて選択されるリガンドから欠失されているリガンドトランケーションを生成し得る。リガンドにより許容されるトランケーションの程度を決定するために、使用される１つの方法は、リガンドの５’または３’末端領域に相補的なオリゴヌクレオチド（たとえば、ＤＮＡオリゴヌクレオチド）を熱アニールし、次にアニールされたオリゴヌクレオチドのあるリガンドの結合とこれのないリガンドの結合を比較することであり得る。アニールされたオリゴヌクレオチドのあるリガンドとこれのないリガンド間で著しい結合差異が観察されない場合、これは、リガンドのアニールされた部分がリガンドの標的タンパク質への結合にとって必要ではないことを示唆している。この方法は、種々の長さのリガンドの５’または３’末端にアニールするオリゴヌクレオチドを使用して実施され、完全に機能的なリガンドを与える５’および３’境界を決定することができる。
【０１７３】
別の実施形態では、設計はリガンドのサイズを減らすことを含む。別の実施形態では、モジュレーターのサイズはリガンドのサイズとの関係で変えられる。さらに別の実施形態では、グアニンひもは４グアニン未満、または３グアニン未満、または２グアニン未満またはグアニンなしに減らされる。しかし、これらの変化の連合効果は、適切な活性を与えるがモジュレーターにより簡単に中和されるリガンドを作製するという難問に応えなければならない。
【０１７４】
モジュレーターのターゲティングでは、改良されたリガンドは、オリゴヌクレオチドモジュレーターとの会合を促進するために一本鎖テール（３’または５’）を含むように改変することも可能である。適切なテールは、１ｎｔから２０ｎｔ、好ましくは１ｎｔから１０ｎｔ、１ｎｔから５ｎｔまたは３ｎｔから５ｎｔを含むことができ、テール内のそれぞれの位のヌクレオチドはＡ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵでもよい。そのようなテールは、下にさらに詳細に記載されている改変されたヌクレオチドを含み得ることは容易に理解される。
【０１７５】
テール付のリガンドは、結合およびバイオアッセイ（たとえば、下に記載されている）において試験し、一本鎖テールを付加してもリガンドの活性な構造が破壊されないことを検証することが可能である。たとえば、テール配列と１、３または５塩基対を形成することができる一連のオリゴヌクレオチド（たとえば、２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド）を設計して、テール付きのリガンドとのみ会合するその能力ならびにその標的分子からのリガンドの解離速度またはその標的分子とのリガンドの会合速度を増加するその能力について試験することが可能である。スクランブルされた配列制御を用いて、その効果が二重鎖形成に起因し非特異的効果ではないことを検証することが可能である。
【０１７６】
ＣＬＥＣ−２リガンドは、対になったモジュレーターによるさらに効果的な調節を可能にする自殺位を有するようにも設計し得る。モジュレーターがリガンドに結合すると、自殺位は一本鎖で不安定になり、それによって血液または肝臓エンドヌクレアーゼなどの血液中に天然に存在する酵素によるリガンドの切断を促進する。これは、循環からの活性なリガンドの効果的でほぼ即時の除去のための手段を提供する。
【０１７７】
化学修飾
核酸の治療的使用において遭遇する一つの問題は、そのリン酸ジエステル型のオリゴヌクレオチドは、全体効果が明らかになる前にエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼなどの細胞内および細胞外酵素により体液中で分解されることがあることである。核酸リガンドのある種の化学修飾は、核酸リガンドのインビボ安定性を増加するまたは核酸リガンドの送達を増強するもしくは媒介することができる。さらに、ある種の化学修飾は、核酸リガンド内の必要な構造エレメントの形成を安定化するもしくは促進するまたは標的分子との追加の分子相互作用を与えることにより、その標的に対する核酸リガンドの親和性を増加させることができる。
【０１７８】
リガンドの修飾は、追加の電荷、分極率、疎水性、水素結合、静電的相互作用および官能性を核酸リガンド塩基にまたは全体としてのリガンドに取り込む化学基を与える修飾を含むことができるがこれらに限定されない。修飾は、たとえば、分子の安定性および意図された標的に対する親和性などの特性を改善するために、塩基部分、糖部分またはリン酸骨格にあってもよい。そのような修飾には、２’−位糖修飾、５−位ピリミジン修飾、８−位プリン修飾、環外アミンでの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５−ヨードウラシルの置換、骨格修飾、ホスホロチオエートまたはアルキルリン酸修飾、メチル化、イソ塩基であるイソシチジンおよびイソグアニジンなどの異常な塩基対合組合せおよび同種のものが含まれるが、これらに限定されない。修飾は、キャッピングなどの３’および５’修飾も含むことができる。
【０１７９】
ＳＥＬＥＸ法は、改良されたインビボ安定性または改良された送達特徴などの改良された特徴をリガンドに与える修飾されたヌクレオチドを含有する高親和性核酸リガンドの同定を包含する。そのような修飾の例には、リボースおよび／またはリン酸および／または塩基位置での化学置換が含まれる。修飾されたヌクレオチドを含有するＳＥＬＥＸ同定された核酸リガンドは、米国特許第５６６０９８５号に記載されており、これにはピリミジンの５−および２’−位で化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドが記載されている。米国特許第５５８０７３７号には、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）および／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）を用いて修飾された１つまたは複数のヌクレオチドを含有する特定の核酸リガンドが記載されている。
【０１８０】
ＳＥＬＥＸ法は、米国特許第５６３７４５９号および米国特許第５６８３８６７号に記載されている、選択されたオリゴヌクレオチドを他の選択されたオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド機能的ユニットと組み合わせることを包含する。米国特許第５６３７４５９号には、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）および／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾された１つまたは複数のヌクレオチドを含有する高度に特異的な核酸リガンドが記載されている。ＳＥＬＥＸ法は、米国特許第６０１１０２０号に記載されている、選択された核酸リガンドを親油性または非免疫原性、高分子量化合物と診断または治療複合体に組み合わせることをさらに包含する。
【０１８１】
核酸リガンドがＳＥＬＥＸ法により導かれる場合、修飾は前または後ＳＥＬＥＸ修飾であることが可能である。前ＳＥＬＥＸ修飾は、その標的に対する特異性も改良されたインビボ安定性も備えたリガンドをもたらすことができる。２’−ヒドロキシル（２’−ＯＨ）核酸リガンドに加えられた後ＳＥＬＥＸ修飾は、核酸リガンドの結合能に有害な影響を与えることなくインビボ安定性を改良することができる。一実施形態では、リガンドの修飾には、分子の３’末端での３’−３’逆位リン酸ジエステル連鎖ならびにヌクレオチドの一部またはすべての２’フルオロ（２’−Ｆ）、２’アミノ（２’−ＮＨ２）、２’デオキシおよび／または２’Ｏメチル（２’−ＯＭｅ）修飾が含まれる。
【０１８２】
本明細書に記載されるリガンドは、ＣおよびＵ残基が２’−フルオロ置換されておりＡおよびＧ残基が２’−ＯＨの転写物のライブラリーを使用してＳＥＬＥＸにより最初に生成された。
【０１８３】
ある種の実施形態では、リガンドを構成している核酸は、修飾された糖および／または修飾された塩基を含む。ある種の実施形態では、修飾は２’−安定化修飾などの安定化修飾を含む。一実施形態では、２’−安定化修飾は、糖環上に２’−フルオロ修飾を含むことが可能である。
【０１８４】
一実施形態では、設計はリガンドもしくはモジュレーターまたはその両方の２’−ヒドロキシル含有量を減少させることを含む。別の実施形態では、設計はリガンドもしくはモジュレーターまたはその両方の２’−フルオロ含有量を減少させることを含む。別の実施形態では、設計はリガンドもしくはモジュレーターまたはその両方の２’−Ｏ−メチル含有量を増加させることを含む。
【０１８５】
医薬組成物では、リガンドは、可溶性または生物学的利用能を改良する塩の形態などの形態で提供することが可能である。適切な塩にはナトリウムおよびカリウムなどの無機陽イオンが含まれる。
【０１８６】
開示のオリゴヌクレオチドのいずれも、当技術分野で公知の標準法により、たとえば、自動ＤＮＡ合成機（たとえば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されているなどの）の使用により合成することが可能である。
【０１８７】
リガンドおよびモジュレーターは、当業者なら容易に理解し以下の通りに注記される略記法を使用して本明細書では記載される。「ｒＡ」は２’ＯＨ  Ａまたはアデノシン；「Ａ」は２’−デオキシＡまたは２’−デオキシアデノシン；「ｍＡ」は２’−Ｏ−メチルＡまたは２’−メトキシ−２’−デオキシアデニン；「ｒＧ」は２’−ＯＨ  Ｇまたはグアノシン；「Ｇ」は２’−デオキシＧまたは２’−デオキシグアノシン；「ｍＧ」は２’−Ｏ−メチルＧまたは２’−メトキシ−２’デオキシグアノシン；「ｆＣ」は２’−フルオロＣまたは２’−フルオロ−２’デオキシシチジン；「ｍＣ」は２’−Ｏ−メチルＣまたはメトキシ−２’−デオキシシチジン；「ｆＵ」は２’−フルオロＵまたは２’−フルオロ−ウリジン；「ｍＵ」は２’−Ｏ−メチルＵまたは２’−メトキシ−ウリジン；および「ｉＴ」は逆位２’ＨＴである。
【０１８８】
担体へのカップリング
本明細書に記載されるリガンドは生物学的利用能または安定性を改良する修飾も含むことができる。そのような修飾は、親水性または疎水性部分を含み得るがこれらに限定されない担体分子へのコンジュゲーションを含むことができる。
【０１８９】
ＣＬＥＣ−２媒介障害を処置するための方法
一実施形態では、ＣＬＥＣ−２媒介障害を処置するための方法であって、本明細書に記載されるリガンドまたは薬学的に許容されるこの塩の治療的有効量をそれを必要とする宿主に投与することを含む方法が提供される。
【０１９０】
ＣＬＥＣ−２は最初、血小板凝集の媒介物として同定された（概説については、Ｓｕｚｕｋｉ−Ｉｎｏｕｅら、２０１１年、Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、９（Ｓ１）：４４−５５頁参照）。その後、ＣＬＥＣ−２は、血栓形成および安定化に関与していることが明らかにされた。したがって、ＣＬＥＣ−２の機能または活性を抑制することができるＣＬＥＣ−２リガンドは多種多様な血小板媒介障害の治療的介入のために使用することが可能である。一実施形態では、ＣＬＥＣ−２媒介障害は血管障害を含む。別の実施形態では、血管障害は、急性冠動脈症候群、血栓症、血栓塞栓症、血小板減少症、末梢血管疾患および一過性脳虚血発作からなる群から選択される。本明細書に記載される組成物は、一過性脳虚血発作、虚血性発作および塞栓症を含むがこれらに限定されない脳血管障害の処置にも有用である。
【０１９１】
一実施形態では、ＣＬＥＣ−２媒介障害は糖尿病関連障害である。一実施形態では、糖尿病関連障害は、糖尿病性網膜症、糖尿病性脈管障害、アテローム動脈硬化症、虚血性発作、末梢血管疾患、急性腎損傷および慢性腎不全からなる群から選択される。
【０１９２】
一実施形態では、ＣＬＥＣ−２媒介障害は血小板媒介炎症障害を含む。別の実施形態では、血小板媒介炎症障害は、関節炎、関節炎リューマチ、乾癬性関節炎、反応性関節炎、炎症性腸疾患、強直性脊椎炎および強皮症からなる群から選択される。
【０１９３】
一実施形態では、ＣＬＥＣ−２媒介障害は癌である。血小板は癌転移および／または進行に関与していると長い間示唆されてきた（Ｎａｓｈら、２０２、Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ、３：４２５−４３０頁）。腫瘍細胞を取り囲む血小板凝集は、血液中で剪断応力およびＮＫ細胞から腫瘍細胞を保護し、それによって腫瘍細胞巣の形成を促進していることがある。さらに、内在性ＣＬＥＣ−２リガンドとしてのポドプラニンの発見以来、実験データによれば、ＣＬＥＣ−２／ポドプラニンは、抗転移薬の実行可能な標的であり得ることが示唆されてきた。たとえば、抗ポドプラニンブロッキング抗体は、ポドプラニンを発現している腫瘍細胞からなる転移性肺小結節の数を著しく抑制する（Ｋａｔｏら、２００８年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．、９９：５４−６１頁）。
【０１９４】
本明細書に記載されるＣＬＥＣ−２リガンドは、ＣＬＥＣ−２媒介血小板凝集を抑制することが明らかにされているが、腫瘍転移の処置および抑制に治療的使用を有する。一実施形態では、癌は、肺癌、乳癌、前立腺癌、精巣癌、膵癌、脳癌、骨癌および肝癌からなる群から選択される。しかし、本明細書に記載されるＣＬＥＣ−２リガンドは、転移してしまったまたは転移する可能性が高いと当業者により考えられているいかなる癌も処置または抑制するのに有用であり得ると理解されている。
【０１９５】
一実施形態では、ＣＬＥＣ−２リガンドは血小板活性化の開始を抑制する。他の実施形態では、ＣＬＥＣ−２リガンドは血小板活性化およびその結果起こる血小板炎症促進性応答を抑制する。他の実施形態では、ＣＬＥＣ−２リガンドは血小板粘着を抑制する。他の実施形態では、ＣＬＥＣ−２リガンドは血小板凝集を抑制する。さらに追加の実施形態では、ＣＬＥＣ−２リガンドは血栓生成を抑制する。
【０１９６】
ある種の実施形態では、血管事象、特に血栓または血栓塞栓症の形成を処置または予防する方法であって、本明細書に記載されるＣＬＥＣ−２核酸リガンドをそれを必要とする宿主に投与することを含む方法が提供される。
【０１９７】
一実施形態では、ＣＬＥＣ−２核酸リガンドは長期間提供される。この例では、ＣＬＥＣ−２リガンドモジュレーターは、緊急事態、たとえば、処置により、頭蓋内または胃腸出血を含む出血が生じる場合にのみ使用してもよい。別の実施形態では、ＣＬＥＣ−２核酸リガンド処置を受けた患者に救急手術が必要な場合にモジュレーターが投与される。別の実施形態では、ＣＬＥＣ−２核酸リガンドの濃度ならびにそれによって処置の持続時間および強度を制御するためにモジュレーターが投与される。別の実施形態では、ＣＬＥＣ−２核酸リガンドは、心肺バイパス処置中に血小板麻酔薬として与えられる。別の実施形態では、ＣＬＥＣ−２核酸リガンドは、経口抗血小板薬物にトランジションオフまたはオンの時期を与えるために投与され、モジュレーターは、経口抗血小板薬の治療レベルが確立されると、ＣＬＥＣ−２核酸リガンドを逆転させるために使用される。
【０１９８】
本明細書に記載される方法は、別の治療と組み合わせて使用してもよい。
【０１９９】
一実施形態では、宿主は、外科的介入を受ける準備をしているもしくは受けている、または宿主を閉塞性血栓症の危険にさらす外科的介入を受けたことがある。他の実施形態では、宿主は血液透析を可能にする血管移植片を受けており、これは血管と血小板間の相互作用のせいで閉塞するリスクがある。
【０２００】
一実施形態では、治療は、治療的有効量の抗癌薬または抗血栓薬を用いて宿主を処置することを含む。
【０２０１】
一実施形態では、治療は、ＨＩＶ抗ウイルス薬、免疫モジュレーターおよび抗感染症薬からなる群から選択される抗ＨＩＶ薬の治療的有効量を用いて宿主を処置することを含む。
【０２０２】
投与および医薬組成物
本明細書で教唆されるＣＬＥＣ−２核酸リガンドまたはＣＬＥＣ−２リガンドモジュレーターは、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含むことができるが、これらに限定されない医薬組成物に処方することが可能である。組成物の正確な性質は、任意の安定化修飾を含むリガンドおよび／またはモジュレーターの性質ならびに投与経路に少なくとも一部は依存することになる。モジュレーターを含有する組成物は、リガンドの活性のモジュレーションを可能にし、したがって投与されたＣＬＥＣ−２核酸リガンドの抗血小板活性を調節するように、ＣＬＥＣ−２核酸リガンドを与えられている宿主に投与するために設計することが可能である。
【０２０３】
医薬または薬理学組成物の設計および調製は、本開示に照らして当業者には公知である。典型的には、そのような組成物は、液体溶液または懸濁液としての注射液として；注射に先立つ液体中の溶液または懸濁液に適した固形形態；経口投与のための錠剤または他の固体として；徐放性カプセルとして；経口投与のための液体として；点眼液、クリーム、ローション、軟膏、吸入薬および同種のものを含むエリキシル、シロップ、坐薬、ゲルとしてまたは当技術分野で使用されている他の任意の形態で調製することが可能である。手術野における特定領域を扱う外科医、内科医または医療従事者による生理食塩水ベースの洗浄剤などの減菌製剤の使用も特に有用であり得る。組成物は、微小デバイス、微小粒子またはスポンジを介する送達のために処方することも可能である。組成物は、局所送達のためにステントなどの埋め込み型医療デバイス上に被膜することも可能である。
【０２０４】
ＣＬＥＣ−２核酸リガンドまたはＣＬＥＣ−２リガンドモジュレーターを含む薬剤的に有用な組成物は、少なくとも一部は薬学的に許容される担体の混合により処方することが可能である。そのような担体および処方の方法の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：「Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」、第２０版（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、２０００年）およびＡｎｓｅｌら、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」、６ｔｈ  Ｅｄ．（Ｍｅｄｉａ、Ｐａ．：Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、１９９５年）に見出せる。
【０２０５】
適切な医薬賦形剤には、安定化剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、バッファーおよびリン酸緩衝食塩水を含むがこれに限定されないｐＨ調整剤が含まれる。適切な添加剤には、生理的に生物学的適合性バッファー（たとえば、トロメタミン塩酸塩）、キレート剤の添加（たとえば、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡまたはＤＴＰＡ−ビスアミドなど）またはカルシウムキレート複合体（たとえば、カルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミド）、または場合によってカルシウムもしくはナトリウム塩（たとえば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウムまたは乳酸カルシウム）の添加が含まれる。医薬組成物は、液体の形態で使用するためにパッケージすることが可能であり、または凍結乾燥することが可能である。
【０２０６】
効果的投与に適切な薬学的に許容される組成物を形成するために、そのような組成物は有効量の核酸リガンドまたはモジュレーターを含有することになる。そのような組成物は、１つよりも多い化合物の混合物を含有することができる。組成物は、典型的には約０．１重量パーセント（ｗｔ％）から約５０ｗｔ％、約１ｗｔ％から約２５ｗｔ％または約５ｗｔ％から約２０ｗｔ％の活性作用剤（リガンドまたはモジュレーター）を含有する。
【０２０７】
皮下、筋肉内または静脈内注射および点滴液を含む、非経口投与のための医薬組成物が本明細書では提供される。非経口投与では、無菌懸濁液および溶液が望まれる。静脈内投与が望まれる場合、一般に適切な保存剤を含有する等張調製物が用いられる。医薬組成物は、無菌化されるならびに／または、保存剤、安定化剤、湿潤剤または乳化剤などのアジュバント、溶液促進剤、浸透圧を調節するための塩および／もしくはバッファーを含有してもよい。液体、特に注射可能な組成物は、たとえば、溶解する、分散する、等により調製することが可能である。活性化合物は、たとえば、水、緩衝水、生理食塩水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸、水性デキストロース、グリセロール、エタノールおよび同種のものなどの薬学的に純粋な溶剤に溶解する、またはと混合して、それによって注射可能な溶液または懸濁液を形成する。さらに、注射に先立って液体に溶解するのに適した固体形態を処方することが可能である。
【０２０８】
作用剤の水環境への溶解を補助するために、界面活性剤を湿潤剤として添加してもよい。界面活性剤は、ラウリル酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウムおよびジオクチルナトリウムスルホン酸などの陰イオン界面活性剤を含み得る。陽イオン界面活性剤を使用してもよく、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムを含むことができる。界面活性剤として製剤に含むことができる非イオン性界面活性剤には、ラウロマクロゴール４００、ポリオキシル４０ステアリン酸、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０および６０、グリセロールモノステアレート、ポリソルベート２０、４０、６０、６５および８０、ショ糖脂肪酸エステル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースならびにプルロニックＦ６８および／またはプルロニックＦ１２７などのプルロニック界面活性剤のいずれかが含まれるが、これらに限定されない（たとえば、Ｓｔｒａｐｐｅら  Ｅｕｒ．Ｊ．ｏｆ  Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．、２００５年、６１：１２６−１３３頁参照）。界面活性剤は、単独でまたは異なる比の混合物としてタンパク質または誘導体の製剤中に存在していてもよい。
【０２０９】
錠剤またはカプセルの形態での経口投与では、活性薬物成分は、エタノール、グリセロール、水および同種のものなどの経口非毒性薬学的に許容される不活性担体と組み合わせることが可能である。さらに、望まれるまたは必要な場合、適切な結合剤、潤滑剤、崩壊剤および着色剤も前記混合物に取り込むことが可能である。適切な結合剤には、制限なしで、デンプン、ゼラチン、グルコースまたはベータラクトースなどの天然糖、コーン甘味料、アカシア、トラガントまたはアルギン酸ナトリウムなどの天然および合成ガム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックスおよび同種のものが含まれる。これらの剤形で使用される潤滑剤には、制限なしで、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムおよび同種のものが含まれる。崩壊剤には、制限なしで、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムおよび同種のものが含まれる。
【０２１０】
経口投与で使用される液体形態では、活性薬物成分は、合成および天然ガム、たとえば、トラガント、アカシア、メチルセルロースおよび同種のものなどの適切な香りの懸濁化剤または分散剤と組み合わせることが可能である。用いることができる他の分散剤には、グリセリンおよび同種のものが含まれる。
【０２１１】
活性薬物成分を含有する局所調製物は、たとえば、アルコール、アロエベラゲル、アラントイン、グリセリン、ビタミンＡおよびＥオイル、鉱油、ＰＰＧ２ミリスチルエーテルプロピオン酸および同種のものなどの当技術分野で周知の種々の担体物質と混合させて、たとえば、アルコール溶液、局所クレンザー、クレンジングクリーム、スキンゲル、スキンローションおよびクリームまたはゲル製剤中のシャンプーを形成することができる。
【０２１２】
リガンドは、小単層小胞、大単層小胞および多層状小胞などのリポソーム送達システムの形態で投与することも可能である。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンなどの種々のリン脂質から形成することができる。直接（たとえば、単独で）またはリポソーム製剤で投与される活性作用剤は、たとえば、米国特許第６１４７２０４号に記載されている。
【０２１３】
リガンドは、標的設定可能な薬物担体として可溶性ポリマーと連結することも可能である。そのようなポリマーは、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリル−アミド−フェノール、ポリヒドロキシ−エチルアスパルトアミドフェノールまたはパルミトイル残基で置換されたポリエチル−エネオキシドポリリジンを含むことが可能である。さらに、リガンドは、薬物の徐放を達成するのに有用な生分解性ポリマーの一種、たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリオキサゾリン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレートおよびハイドロゲルの架橋されたまたは両親媒性ブロックコポリマーに連結することが可能である（好ましくは、共有結合を介して）。コレステロールおよび類似の分子を核酸リガンドに連結させて、生物学的利用能を増加し延長することができる。
【０２１４】
開示のモジュレーターを使用のために一緒に処方することができる親油性化合物および非免疫原性高分子量化合物は、当技術分野で現在知られているまたはその後開発された様々な技法のうちのいずれによっても調製することが可能である。典型的には、前記化合物は、リン脂質、たとえば、ジステアロイルホスファチジルコリンから調製され、中性脂質、たとえば、コレステロールなどの他の材料および正電荷を帯びた（たとえば、コレステロールのステリルアミンまたはアミノマンノースまたはアミノマンニトール誘導体）または負電荷を帯びた（たとえば、リン酸ジアセチル、ホスファチジルグリセロール）化合物などの表面改質剤も含み得る。多層状リポソームは、従来の技法により、すなわち、脂質を適切な溶剤に溶解し次に前記溶剤を蒸発させて器の内側に薄膜を残すことによりまたは噴霧乾燥により、適切な容器または器の内壁に脂質を沈着させることによって形成することができる。次に水相を旋回またはボルテックス運動とともに器に添加すると、多層状リポソーム小胞（ＭＬＶ）が形成される。次に、単層リポソーム小胞（ＵＶ）は、ＭＬＶの均質化、超音波処理または押し出し成型（フィルターを通して）により形成することができる。さらに、ＵＶは、洗剤除去法により形成することができる。本開示のある種の実施形態では、複合体は、リポソームの表面に会合したターゲティング核酸リガンド（複数可）および被包された治療薬または診断薬と一緒にリポソームを含む。前もって形成されたリポソームは改質して、核酸リガンドに会合させることが可能である。たとえば、陽イオン性リポソームは静電気相互作用を通じて核酸リガンドに会合する。代わりに、コレステロールなどの親油性化合物に粘着した核酸を前もって形成されたリポソームに付加することができ、それによりコレステロールはリポソーム膜に会合する。代わりに、核酸はリポソームの形成中にリポソームに会合させることができる。
【０２１５】
別の実施形態では、ステントまたは医療デバイスは、当業者に公知の方法に従って、ＣＬＥＣ−２リガンドまたはＣＬＥＣ−２リガンドモジュレーターを含む製剤で被膜し得る。
【０２１６】
治療キットも想定されている。キットは、上記方法を実行するのに必要になり得る試薬、活性作用剤および材料を含む。キットは、一般に、適切な容器手段で、ＣＬＥＣ−２リガンドおよび／またはＣＬＥＣ−２リガンドモジュレーターの薬学的に許容される製剤を含有することになる。キットがＣＬＥＣ−２リガンドとＣＬＥＣ−２モジュレーターの両方を含む場合、ＣＬＥＣ−２モジュレーターは、一部の実施形態では、キット内のＣＬＥＣ−２リガンドに結合するモジュレーターである。キットは、単一容器手段を有してもよくおよび／またはキットは化合物ごとに別個の容器手段を有してもよい。
【０２１７】
投与のための方法
本開示のＣＬＥＣ−２リガンドおよび／またはＣＬＥＣ−２リガンドモジュレーターの宿主への投与様式には、非経口（注射または時間をかけた少しずつの注入により）、静脈内、皮内、関節内、滑膜内、くも膜下腔内、動脈内、心臓内、筋肉内、皮下、眼窩内、嚢内、脊髄内、胸骨内、局所、経皮パッチ、直腸経由で、頬側、膣もしくは尿道坐剤、腹膜、経皮的、点鼻、手術移植、内部外科ペンキ、注入ポンプまたはカテーテルを経由してが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、作用剤および担体は、移植片、ボーラス、マイクロ粒子、マイクロスフィア、ナノ粒子またはナノスフィアなどの緩効性製剤で投与される。一実施形態では、ＣＬＥＣ−２核酸リガンドは、皮下注入（浸透ポンプによるなどの）を含む、皮下注射または沈着を経由して送達される。
【０２１８】
一実施形態では、ＣＬＥＣ−２核酸リガンドは皮下投与を経由して送達され、モジュレーターは皮下または静脈内投与により送達される。
【０２１９】
本開示のリガンドおよびモジュレーターを含む治療組成物は、単位用量の注射によるなどの静脈内に投与し得る。用語「単位用量」は治療組成物に言及して使用される場合、宿主に対する単位投与量として適切な物理的に別個の単位のことであり、それぞれの単位は、必要な希釈剤、すなわち、担体または媒体と合併して目的の治療効果を生じるように計算された予め定められた量の活性物質を含有する。
【０２２０】
さらに、非経口投与のための１つのアプローチは、一定レベルの投与量が維持されることを保証する、緩効性または徐放性システムの埋め込みを用いる。
【０２２１】
たとえば、罹患した関節の間質への局所投与も提供される。局所投与は、注射器または針などの注射デバイスを含有する他の製品からなどの、注射により達成される。注射器からの投与速度は、注射器の内容物を分配する目的の期間をかけて制御された圧力により制御することが可能である。別の例では、局所投与は、ポンプまたは他の類似のデバイスの使用により促進することができる注入により達成することが可能である。
【０２２２】
血管組織への局所投与のための代表的非限定的アプローチも提供され、（１）たとえば、取り除かれるまたはバイパスされる損傷を受けたまたは疾患に罹った血管組織セグメントの代わりに被膜されたまたは含浸された血管を埋め込むことにより、インビボでの送達のために核酸リガンドを含むゲルで血管組織を被膜するまたは含浸させる；（２）送達が望まれる血管へのカテーテルによる送達；（３）患者に埋め込まれることになる血管に組成物をポンプで送ることを含む。代わりに、化合物は、マイクロインジェクションにより、またはリポソーム被包により細胞に導入することが可能である。
【０２２３】
ステントなどの医療デバイスを前記リガンドを含有する医薬組成物で被膜することによる対象へのＣＬＥＣ−２リガンドの投与も提供される。リガンドの適切な放出および投与を可能にする被膜のための方法は当業者には公知である。
【０２２４】
本明細書に記載される組成物に対する最適投与計画は当業者により容易に確立することが可能であり、モジュレーター、患者および求められる効果によって変わることがある。有効量は、個体の状態、体重、性別、年齢および投与される核酸リガンドの量などの種々の要因に従って変わることがある。他の要因には投与様式が含まれる。
【０２２５】
薬学的有効量は、疾患の種類、使用される組成物、投与経路、処置される哺乳動物の種類、検討中の特定の哺乳動物の身体的特徴、併用薬物および当業者が認識することになる他の要因に依存する。一般に、組成物は、体重に対して調整される投与量、たとえば、約１μｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重までの範囲に及ぶ投与量で投与されることになる。さらに典型的には、投与量は約０．１ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ、さらに典型的には、約０．５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇまたは約１．０ｍｇ／ｋｇから約５．０ｍｇ／ｋｇまたは約１．０ｍｇ／ｋｇ、約２．０ｍｇ／ｋｇ、約３．０ｍｇ／ｋｇ、約４．０ｍｇ／ｋｇ、約５．０ｍｇ／ｋｇ、約６．０ｍｇ／ｋｇ、約７．０ｍｇ／ｋｇ、約８．０ｍｇ／ｋｇ、約９．０ｍｇ／ｋｇまたは約１０．０ｍｇ／ｋｇの範囲に及ぶことになる。典型的には、用量は最初は約０．００２μｇ／ｍｌから約２０００μｇ／ｍｌの薬物、さらに典型的には、約２．０μｇ／ｍｌから約４００μｇ／ｍｌ、さらに典型的には、約１０μｇ／ｍｌから２００μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌ薬物、約２０μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌ、約６０μｇ／ｍｌ、約８０μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約１２０μｇ／ｍｌ、約１４０μｇ／ｍｌ、約１６０μｇ／ｍｌ、約１８０μｇ／ｍｌまたは約２００μｇ／ｍｌの薬物の血漿濃度を提供する。
【０２２６】
既にリガンドを投与されている宿主にモジュレーターを投与する場合、モジュレーター対リガンドの比は、目的レベルのリガンドの抑制に基づいて調整することができる。モジュレーター用量は、リガンドの用量との相関関係に基づいて計算することが可能である。一実施形態では、モジュレーター対リガンドの重量対重量用量比は１：１である。別の実施形態では、モジュレーター対リガンドの比は、２：１または約２：１、３：１または約３：１、４：１または約４：１、５：１または約５：１、６：１または約６：１、７：１または約７：１、８：１または約８：１、９：１または約９：１、１０：１または約１０：１またはそれよりも多いなどの１：１よりも大きい。他の実施形態では、モジュレーター対リガンドの重量対重量用量比は、０．９：１もしくは約０．９：１、０．８：１もしくは約０．８：１、０．７：１もしくは約０．７：１、０．６：１もしくは約０．６：１、０．５：１もしくは約０．５：１、０．４５：１もしくは約０．４５：１、０．４：１もしくは約０．４：１、０．３５：１もしくは約０．３５：１、０．３：１もしくは約０．３：１、０．２５：１もしくは約０．２５：１、０．２：１もしくは約０．２：１、０．１５：１もしくは約０．１５：１、０．１：１もしくは約０．１：１などの約１：１未満または約０．００５：１もしくはそれ未満などの０．１：１未満である。一部の実施形態では、重量対重量用量比は、０．５：１から０．１：１までまたは０．５：１から０．２：１までまたは０．５：１から０．３：１までである。他の実施形態では、重量対重量用量比は、１：１から５：１までまたは１：１から１０：１までまたは１：１から２０：１までである。
【０２２７】
リガンドは単回日用量、隔日用量で静脈内に投与することが可能である、または日全投与量は数回に分けた用量で投与することが可能である。リガンドおよび／またはモジュレーター投与は、１日につき１回（ｑ．ｄ．）、１日につき２回（ｂ．ｉ．ｄ．）、１日につき３回（ｔ．ｉ．ｄ）または必要に応じてそれよりも多い回数提供してもよい。したがって、モジュレーターは、モジュレーターの投与により核酸リガンドの効果を変更するいかなる適切な手段でも提供される。核酸リガンドは、週２回、毎週、２週間ごとにまたは毎月皮下に投与することが可能である。一部の実施形態では、リガンドまたはモジュレーターは、１日につき１回よりも少ない回数で投与される。たとえば、リガンド投与は、１日おきに、３日おきに、４日おきに、毎週または毎月実施してもよい。
【０２２８】
一実施形態では、他の作用剤の同時投与または連続投与が望ましいことがある。活性作用剤が別々の投与製剤である１よりも多い活性作用剤を用いた併用処置では、活性作用剤は同時に投与することが可能である、またはそれぞれを別々の時間差を設けて投与することが可能である。
【０２２９】
組成物は、投与製剤と適合する形態でおよび治療的有効量で投与される。投与される量は、処置される宿主、活性成分を利用する宿主体系の能力および望まれる治療効果の程度に依存する。投与されるのに必要な活性成分の正確な量は、実施者の判断に依存し、それぞれの個体に特有である。しかし、全身適用に適した投与量範囲は本明細書に開示されており投与経路に依存する。投与に適した計画も可変であるが、初回投与とそれに続くその後の注射または他の投与による１時間またはそれよりも長い時間の間隔を開けての再投与により典型的に表される。代わりに、インビボ治療のために指定された範囲で血中濃度を維持するのに十分な連続静脈内注入が提供される。
【０２３０】
ある種の実施形態では、本開示の組成物は別の治療薬をさらに含み得る。第２の作用剤が使用される場合、第２の作用剤は別々の剤形としてまたは化合物もしくは組成物と一緒の単一剤形の一部として投与し得る。発明化合物のうちの１つまたは複数を単剤療法の適用において使用して、障害、疾患または症状を処置することができるが、前記化合物は、発明化合物または組成物（治療薬）の使用が同じならびに／または他の種類の障害、症状および疾患を処置するための１つまたは複数の他の治療薬の使用と組み合わされる併用療法においても使用し得る。併用療法は、２つまたはそれよりも多い治療薬の同時または連続した投与を含む。作用剤はいかなる順序で投与してもよい。代わりに、複数の治療薬を組み合わせて患者に投与することができる単一の組成物にすることができる。
【０２３１】
ＣＬＥＣ−２リガンドおよびＣＬＥＣ−２リガンドのモジュレーターを特徴付けるための方法
一態様では、本開示は、ＣＬＥＣ−２の活性化因子または阻害因子として機能し得るＣＬＥＣ−２リガンドを特徴付けるための方法を提供する。そのような方法は、ＣＬＥＣ−２媒介血小板凝集の点でＣＬＥＣ−２活性を評価する。一実施形態では、アッセイは、全血フローベースの血小板粘着アッセイを使用してインビトロまたはエクスビボで行われる。
【０２３２】
様々な研究により、ＣＬＥＣ−２はコラーゲン被膜表面への最初の血小板粘着には必要ではない場合があるが、ＣＬＥＣ−２は血小板凝集体の安定化および血栓成長には必要とされる場合があることが示唆されている。血栓症におけるＣＬＥＣ−２の役割は、たとえば、マウスにおいてＣＬＥＣ−２キメラを使用して研究されてきた。これらの研究によれば、ＣＬＥＣ−２は、インビトロでもインビボでも血栓安定化に関与していることが示唆されている（Ｓｕｚｕｋｉ−Ｉｎｏｕｅ，Ｋら、２０１０年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５、２４４９４−２４５０７頁）。インビトロでの血小板凝集体安定化におけるＣＬＥＣ−２受容体の役割も、全血潅流アッセイを使用して最近実証され、ＣＬＥＣ−２枯渇血小板はコラーゲン被膜表面に正常に粘着することはできるがその後の安定な血小板凝集体形成は中程度から高剪断速度下で強く損なわれた（Ｍａｙ，Ｆら、２００９年、Ｂｌｏｏｄ、１１４：３４６４−３４７２頁）。そのような研究を通じて、ＣＬＥＣ−２は、コラーゲンとは接触しない成長中の血栓に動員される血小板におけるＧＰＶＩの役割を「引き継ぐ」ことにより血栓成長に寄与し得ると仮定されてきた（Ｎｅｓｗａｎｄｔ，Ｂら、２０１１年、Ｊ．Ｔｈｒｏｍ．Ｈａｅｍｏｓｔ、９．ｓｕｐｐｌ  １：９２−１０４頁）。言い換えると、血小板のコラーゲン被膜表面への粘着および最初の血栓形成はＧＰＶＩに依存しているが、血小板のさらなる凝集、すなわち、血栓を形成するにはＣＬＥＣ−２が必要である。
【０２３３】
コラーゲン被膜表面への流動条件下での血小板の粘着は、インビトロおよびインビボ血栓成長および安定性の研究のために決まって使用されてきた。これらの流動実験は、たとえば、ＢｉｏＦｌｕｘ（商標）（Ｆｌｕｘｉｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）などの機器を使用して行われ、この機器はインビトロモデルにおいて生理的剪断フローを模倣する能力があり、ハイスループットウェルプレートフォーマットも提供する。
【０２３４】
全血を使用するインビトロフローベースの血小板粘着アッセイを使用して、ＣＬＥＣ−２媒介血小板凝集体形成の活性化因子または阻害因子を同定することができることがほどなく発見された。一実施形態では、全血の剪断フローに供される表面は、ＣＬＥＣ−２依存性血小板凝集体形成を効果的に刺激することが知られているロドサイチンで被膜される。実施例１０（図１２Ａ）に詳述されているように、ロドサイチン被膜表面の使用は、全血における流動条件下での血栓中の活性化された血小板の蓄積を支持している。次に、前記アッセイ法は、ＣＬＥＣ−２依存性血小板凝集体形成の推定阻害因子または活性化因子の存在下で実施される。たとえば、全血試料はＣＬＥＣ−２に結合することが知られている化合物（たとえば、本明細書に記載されるＣＬＥＣ−２リガンドのいずれか１つ）と一緒にインキュベートされる。次に、ＣＬＥＣ−２リガンドの存在下でおよび非存在下で血小板凝集体形成の比較を行うことが可能である。ＣＬＥＣ−２依存性血小板凝集体形成の阻害因子は、ＣＬＥＣ−２リガンドの非存在下での血小板凝集体形成のレベルと比べた場合、血小板凝集体形成のレベルを少なくとも５０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％減少させるＣＬＥＣ−２リガンドである。
【０２３５】
このアッセイを使用して、ＣＬＥＣ−２リガンドのモジュレーターも同定し得る。さらに、実施例１０に記載されているように、全血試料は、ＣＬＥＣ−２リガンドのモジュレーターの追加の存在下または非存在下、ＣＬＥＣ−２リガンドの存在下で、インキュベートしてもよい。ＣＬＥＣ−２リガンドの機能的モジュレーターである化合物は、ＣＬＥＣ−２リガンドの活性を逆転させることになる。たとえば、ＣＬＥＣ−２リガンドが血小板凝集体形成のレベルを減少させている場合、ＣＬＥＣ−２リガンドの機能的モジュレーターの添加により、ＣＬＥＣ−２リガンドのみの存在下で見られるレベルと比べて血小板凝集体形成が増加することになる。
【０２３６】
ＣＬＥＣ−２リガンドの機能を特徴付けるのに有用な第２のプロトコールでは、全血が可溶性Ｉ型コラーゲン（コラーゲンＩ）で被膜されている表面に曝露される、全血を使用するインビトロフローベースの血小板粘着アッセイが実施される。たとえば、実施例１０（図１２Ｂ）は、ウェルが可溶性ラット尾コラーゲンＩで被膜されている、ＢＩＯＦＬＵＸを使用して実施されたアッセイを示している。このプロトコールでは、全血試料は、可溶性コラーゲンＩ被膜表面を通るフローに先立って、ロドサイチンと一緒にインキュベートされる。試料中にロドサイチンが存在すると、ロドサイチンを欠く血液流に形成される血小板凝集体と比べてより大きな血小板凝集体が可溶性コラーゲンＩ被膜表面に形成される。ＣＬＥＣ−２媒介血小板凝集体形成を活性化または阻害するＣＬＥＣ−２リガンドの能力を試験するために、全血試料は、血流スッテプに先立ってＣＬＥＣ−２リガンドと一緒にインキュベートされる。ＣＬＥＣ−２リガンドとのインキュベーションは、ロドサイチンとのインキュベーションに先立ってまたはその後で行うことが可能である。代わりに、ＣＬＥＣ−２リガンドとロドサイチンは血液試料に同時に添加される。次に、上記のように、ＣＬＥＣ−２リガンドの存在下および非存在下での血小板凝集体形成についての比較を行うことが可能である。ＣＬＥＣ−２依存性血小板凝集体形成の阻害因子は、ＣＬＥＣ−２リガンドの非存在下での血小板凝集体形成のレベルと比べた場合、血小板凝集体形成のレベルを少なくとも５０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％減少させるＣＬＥＣ−２リガンドである。さらに、ＣＬＥＣ−２リガンドのモジュレーターは、上記のように、ＣＬＥＣ−２媒介血小板凝集体形成に対するＣＬＥＣ−２リガンドの効果を逆転させるその能力で特徴付けることが可能である。ＣＬＥＣ−２リガンドの機能的モジュレーターである化合物は、ＣＬＥＣ−２リガンドの活性を逆転させることになる。たとえば、ＣＬＥＣ−２リガンドが血小板凝集のレベルを減少させている場合、ＣＬＥＣ−２リガンドの機能的モジュレーターの添加により、ＣＬＥＣ−２リガンドのみの存在下で見られるレベルと比べて血小板凝集体形成が増加することになる。
【０２３７】
ＣＬＥＣ−２リガンドおよびＣＬＥＣ−２リガンドのモジュレーターの機能的活性を特徴付けるためのこれらのアッセイ法は、全血試料を用いた使用に限定されないことは理解される。血液試料は、ある種の実施形態では、１つまたは複数の天然血液成分を含み得る。血液試料は、ある種の実施形態では、１つまたは複数の人工血液成分を含み得る。代わりに、フローアッセイにおいて使用される血液試料は、全血または多血小板血漿または洗浄血小板を含む試料である。
【０２３８】
ＣＬＥＣ−２リガンドおよびモジュレーターの機能的活性は、様々な細胞系統、たとえば、内皮細胞、樹状細胞、白血球、単球、好中球、マクロファージ、リンパ系細胞、免疫細胞、すなわち、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｂ細胞を使用して試験することができる。様々な機能アッセイには、血小板−血小板相互作用、血小板−単球相互作用、血小板白血球相互作用、カルシウムシグナル伝達、細胞粘着アッセイ、分泌アッセイ、ＬＳＰ誘導炎症アッセイ、細胞遊走アッセイ、ＳｙｋおよびＳｒｋリン酸化アッセイ、リガンド結合についてのＥＬＩＳＡアッセイ、フローサイトメトリーベースの受容体占有アッセイまたは診断マーカーアッセイが含まれる。アプタマーリガンドを用いて試験することができる試薬およびＣＬＥＣ−２受容体モジュレーターの合成等価物は、架橋抗体、ＣＬＥＣ−２受容体の同種親和性相互作用研究、小分子阻害因子および活性化因子、ペプチド、タンパク質、モノクローナル抗体、リポタンパク質、脂質付加されたペプチド、等である。
【０２３９】
以下の実施例は本開示のある種の態様を例示するために提供される。これらの実施例は、本開示の範囲を限定すると決して考えられるべきではない。
【実施例】
【０２４０】
実施例１：ＣＬＥＣ−２に対する核酸リガンドの同定
ＳＥＬＥＸ法を使用して、図１に記載され例示されるＣＬＥＣ−２に結合するリガンドを得た。
【０２４１】
候補ＤＮＡライブラリーは、１ｎモルの鋳型ＤＮＡオリゴおよび１．５ｎモルの５’ＤＮＡプライマーオリゴを熱アニールしスナップ冷却することにより生成された。候補混合物を設計するためのＳｅｌ２  ＤＮＡ鋳型オリゴの配列は、５’−ＴＣＴＣＧＧＡＴＣＣ  ＴＣＡＧＣＧＡＧＴＣ  ＧＴＣＴＧ（Ｎ４０）ＣＣＧＣＡ  ＴＣＧＴＣＣＴＣＣＣ  ＴＡ−３’（配列番号４）（Ｎ４０は、等モル量のＡ、Ｔ、ＧおよびＣを用いて合成された４０近接ヌクレオチドを表す）であり、５’プライマーオリゴおよび３’プライマーオリゴは、それぞれ、
【０２４２】
【化４】
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および５’−ＴＣＴＣＧＧＡＴＣＣ  ＴＣＡＧＣＧＡＧＴＣ  ＧＴＣＴＧ−３’である。反応生成物はＥｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗで充填され、ＥＤＴＡを添加して停止されて最終濃度２ｍＭとし、ＰＣＩ［フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）］、次にクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出された。抽出物は脱塩され、濃縮され、組み込まれなかったヌクレオチドはＡｍｉｃｏｎ１０スピンカラムを用いて取り除かれた。ＤＮＡ鋳型は転写反応において利用されて、２’−フルオロピリミジン開始ライブラリーを生成した。インビトロ転写条件は、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、４％ＰＥＧ−８００、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭスペルミジン、０．００２％Ｔｒｉｔｏｎ、５ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ｒＧＴＰ、１ｍＭ  ｒＡＴＰ、３ｍＭ  ２’Ｆ−ＣＴＰ、３ｍＭ  ２’Ｆ−ＵＴＰ、８μｇ／ｍＬ無機ピロホスファターゼ、０．５μＭ  ＤＮＡライブラリーおよびＹ６３９Ｆ変異体Ｔ７ポリメラーゼであった。転写は３７℃で一晩インキュベートされ、デオキシリボヌクレアーゼ処理され、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で２度抽出され、Ａｍｉｃｏｎ１０スピンカラムを用いて濃縮され、１２％変性ＰＡＧＥゲル上でゲル精製された。ＲＮＡはゲルから溶出され、バッファー交換して、Ａｍｉｃｏｎ１０スピンカラムにおいてＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）洗浄剤を用いて濃縮された。
【０２４３】
ＣＬＥＣ−２選択は、約１０１４の異なる２’−フルオロピリミジンＲＮＡ配列の複合ライブラリーから開始した。複合ＲＮＡプールはビオチン−ＰＥＧ６−Ｈｉｓ６ペプチドに対してプレクリアー（ｐｒｅｃｌｅａｒ）され、磁気ストレプトアビジンビーズ上に固定化された。プレクリアーされたＲＮＡは、精製組換えＮ−ｔｅｒｍ  Ｈｉｓ１０タグ付きＣＬＥＣ−２タンパク質（配列番号３）に結合された。精製ヒスチジンタグ付きＣＬＥＣ−２タンパク質は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、カタログ番号１７１８−ＣＬ−０５０から入手され、残基Ｇｌｎ５８−Ｐｒｏ２２９を包含していた。
【０２４４】
ＣＬＥＣ−２リガンド選択は、結合バッファー「Ｆ」において実施された。結合バッファーＦは、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２および０．０１％ＢＳＡからなる。ラウンド３で開始し、０．００２４％酵母ｔＲＮＡは、ラウンド結合反応においてインキュベートされた。タンパク質−ＲＮＡ複合体は、２５ｍｍニトロセルロースディスク上で洗浄しながら分配された。結合ＲＮＡは、ＰＣＩ（２５：２４：１）中のインキュベーションと共にニトロセルロースディスクから抽出された。水が添加され、水相が抽出され、続いてクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出された。得られた結合ＲＮＡはエタノール沈殿された。沈殿したＲＮＡの４分の１は３’プライマーに熱アニールされ、ＡＭＶ  ＲＴを使用して逆転写された。全ＲＴ反応は、５’および３’プライマーを用いたＰＣＲならびに標準ＰＣＲ条件で使用されて、ＲＮＡ生成の次のラウンドのためのＤＮＡ鋳型を生成した。選択ラウンドごとの具体的条件は図２に示されている。
【０２４５】
ＣＬＥＣ−２に対するリガンドライブラリーの濃縮は、ＳＥＬＥＸおよび可溶性ＣＬＥＣ−２のそれぞれのラウンド由来の放射性標識されたリガンドＲＮＡプールを利用する直接結合研究においてモニターされた。結合研究は、トレースＰ３２末端標識されたＲＮＡを結合バッファーＦ中の段階希釈のＣＬＥＣ−２に添加して実施された。結合研究のための放射性標識されたＲＮＡを調製するために、１００ピコモルのＲＮＡは５０℃で１時間細菌性アルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化された。反応は、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出され、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出され、エタノール沈殿された。３ｐモルの脱リン酸化されたＲＮＡは、バッファーが供給されているＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび２０μＣｉのγ−Ｐ３２−ＡＴＰを用いて末端標識され、その後Ｂｉｏｒａｄ  ＭｉｃｒｏＢｉｏ  ＳｐｉｎＰ−３０スピンカラムを用いて洗浄された。末端標識されたＲＮＡは、最終濃度２０００ｃｐｍ／μＬまで希釈され、６５℃で５分間熱変性された。ＲＮＡおよびＣＬＥＣ−２希釈液は使用に先立って３７℃で平衡化された。ＲＮＡ（５μＬ）は、３７℃で、変化する濃度のＣＬＥＣ−２（１５μＬ）に添加され、５から１５分間一緒にインキュベートされた。次に、複合体化したＲＮＡ／ＣＬＥＣ−２タンパク質混合物は、Ｐｒｏｔｒａｎ  ＢＡ８５ニトロセルロース膜上に充填され、９６ウェル真空マニフォールドシステムにおいてＧｅｎｅｓｃｒｅｅｎ  Ｐｌｕｓ  Ｎｙｌｏｎ膜上に洗浄と共にかけられた。膜はホスフォイメージャースクリーンに曝露され、スキャンされ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｓｔｏｒｍ８４０ホスフォイメージャーを用いて定量化された。結合した割合は、ニトロセルロース上のカウント数を全カウント数で割って計算され、バックグランドについて調整された。ＣＬＥＣ−２選択の結合の濃縮は図３に示されている。
【０２４６】
実施例２：ＣＬＥＣ−２核酸リガンドの塩基配列決定および同定
実施例１に記載されるＳＥＬＥＸ実験のラウンド１０由来の抗ＣＬＥＣ−２濃縮されたリガンドライブラリーを表す最終ＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化され、精製キットを使用して洗浄され、線形化されたｐＵＣ１９ベクターに方向性にクローニングされた。細菌コロニーは単一クローンについて画線され、５ｍＬの一晩培養物は単一コロニーから播種された。プラスミドＤＮＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｐｕｒｅｌｉｎｋ  Ｑｕｉｃｋ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して単一コロニーから調製され、ベクタープライマーを利用して塩基配列決定された。全部で４２クローンが塩基配列決定され、２０が独特な配列を示した。これらの独自の配列それぞれが、ＣＬＥＣ−２親和性（実施例１における方法に従って）およびロドサイチン誘導ＣＬＥＣ−２依存性血小板凝集を阻害する能力（実施例８における方法に従って）に関して評価された。２０クローンについて得られたデータの解析後、リガンドＳ２−２０はＣＬＥＣ−２依存性凝集の高親和性阻害因子として同定され、下に詳述されるようにさらに完全に特徴付けられた。
【０２４７】
ＤＮＡランダム領域、対応するＲＮＡランダム領域、完全長ＤＮＡ、完全長ＲＮＡおよびアプタマーＳ２−２０のための改変を有する完全長ＲＮＡの配列は、表１に示されている。完全長とはＳＥＬＥＸプロセスから生じ、ＳＥＬＥＸプロセスにおいて使用されるリガンドライブラリーの両ランダム部分由来の配列ならびにランダム領域に隣接する固定された配列部分由来の配列を含む配列のことである。
【０２４８】
【表１】
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【０２４９】
ＣＬＥＣ−２に対する抗ＣＬＥＣ−２リガンドの親和性は、上の実施例１に記載されている放射性標識されたトレースリガンドＲＮＡおよび可溶性ＣＬＥＣ−２を使用する直接結合研究により決定された。ＣＬＥＣ−２に対する抗ＣＬＥＣ−２リガンド、Ｓ２−２０の親和性は高く、Ｋｄは約１．４ｎＭであった。
【０２５０】
実施例３：抗ＣＬＥＣ−２リガンド配列のトランケーションプロービング
潜在的二次構造についてのＳ２−２０のスクリーニングは、ｍｆｏｌｄサーバー（ｍｆｏｌｄ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｒｐｉ．ｅｄｕ）を利用して行われた。これらの方法の説明は、前記サーバーサイトはもちろん、Ｍ．Ｚｕｋｅｒ（２００３）「Ｍｆｏｌｄ  ｗｅｂ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（１３）、３４０６−１５頁およびＤ．Ｈ．Ｍａｔｈｅｗｓら（１９９９）「Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８８、９１１−９４０頁に見られる。抗ＣＬＥＣ−２リガンドＳ２−２０に対する一連の切断型化合物が生成され（表２）、ＣＬＥＣ−２に対するその親和性が決定された（表２）。ＲＢ５８７の例外はあるが、すべての切断型はインビトロでＤＮＡ鋳型から転写された。ＲＢ５８７は、ｉｄＴプレロードされたＣＰＧを用いてＭｅｒｍａｄｅ  １２  ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置で合成された。Ｓ２−２０完全長アプタマー、Ｓ２−２０  Ｔ１０トランケートおよびＲＢ５８７についての結合データは図４に示されている。
【０２５１】
【表２】
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【０２５２】
トランケートＳ２−２０  Ｔ１０およびＲＢ５８７の二次構造は図５に提示されている。５’および３’末端の予想される境界は、ステム１および機能的抗ＣＬＥＣ−２リガンドを形成するのに十分である。ステム１の３’部分が取り除かれると、Ｓ２−２０  Ｔ５の場合と同じように、ＣＬＥＣ−２への結合は消失する。Ｓ２−２０  Ｔ７およびＳ２−２０  Ｔ８についての結合データによれば、ステム１は５塩基対長であるがそれでも匹敵する結合親和性を保持することができる。ステム１を６塩基対から８−１０塩基対に延長しても、Ｓ２−２０  Ｔ６  ｅｘｔ８およびＳ２−２０  Ｔ６ｅｘｔ１０に関して実証されているように、高親和性でＣＬＥＣ−２に結合した。したがって、ステム１は５−１０塩基対長で匹敵する結合親和性を有することができる。
【０２５３】
ステム２は４塩基対ステムで、下側でのゆらぎ塩基対が好まれる。Ｓ２−２０  Ｔ１１は、ステム２の下側塩基対をＵ−ＧからＣ−Ｇに変化させる単一置換を有する。この置換は、Ｋｄの著しい（およそ３０倍）増加により示されるように、十分には許容されていない。
【０２５４】
実施例４：抗ＣＬＥＣ−２リガンド配列の変異プロービング
ループ領域内にヌクレオチド変異を含有するＳ２−２０トランケートの一連の変異体化合物が生成され、ＣＬＥＣ−２に対するその結合親和性が決定された（表３）。ＲＢ５８８の例外はあるが、すべての変異体トランケートはインビトロでＤＮＡ鋳型から転写された。ＲＢ５８８は、ｉｄＴプレロードされたＣＰＧを用いてＭｅｒｍａｄｅ  １２  ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置で合成された。
【０２５５】
【表３】
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2013545443.tif 000010
【０２５６】
切断型Ｓ２−２０配列の二次構造（図５）は、２つのループ構造が存在し、ループ１は５’−ＧＡＣ−３’でありループ２は５’−ＣＵＣＡＵＡＵＵ−３’であることを示している。変異解析を行うことにより、ループ構造のより厳密な定義を決定することができた。
【０２５７】
ループ１塩基１では、Ａ（ｍｕｔ２５）、Ｃ（ｍｕｔ７）またはＵ（ｍｕｔ３３）への置換は十分に許容されなかった。Ｍｕｔ７は基本的にＣＬＥＣ−２タンパク質への特異的結合はなく、化学的に合成されたバージョン（ＲＢ５８８）は、さらなる研究において負の対照として使用された。ループ１の第２の塩基は、Ｇ（ｍｕｔ３１）またはＵ（ｍｕｔ８）への置換を容易に受け入れ、この位置はプリンでもピリミジンでも許容できることが示唆される。二重変異体（ｍｕｔ１）結合データは、単一点変異体データと一致している。ループ１の第３の塩基はＣである方が好ましい。その他のピリミジンＵ（ｍｕｔ２６）へのＣの置換は十分に許容されず、Ｇ（ｍｕｔ６）への置換も許容されなかった。このデータを検討すると、ループ１は共通配列５’−ＧＮＣ−３’（「Ｎ」は４つの塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵ）のいずれかを表す）を有すると説明することができる。
【０２５８】
ループ２は８塩基ループであり、配列５’−ＣＵＣＡＵＡＵＵ−３を有する。変異体解析によれば、塩基１にはピリミジンが好ましいことが示唆される。Ｕ（ｍｕｔ１７）への置換は十分許容されたが、親和性のわずかな消失が観察された。Ｇ（ｍｕｔ９）への塩基１の置換は十分に許容されなかった。Ａ（ｍｕｔ１０）またはＣ（ｍｕｔ１８）への置換は十分に許容されなかったので、Ｕはループ２の第２の塩基で好ましい。ピリミジンはループ３の第３の塩基（ｍｕｔ１９）で好ましく、プリン（ｍｕｔ１１）への置換は十分に許容されなかった。ループ２の塩基４はプリン（ｍｕｔ２０）またはピリミジン（ｍｕｔ１２）置換を許容することができた。この位置はプリンでもピリミジンでも許容することができるが、塩基の欠失は許容されなかった（ｍｕｔ２８）。塩基５はＡ（ｍｕｔ１３）またはＣ（ｍｕｔ２１）への置換を許容することができ、匹敵する結合親和性であった。さらに、Ｇ（ｍｕｔ３２）への置換も許容された。この位置は置換を容易に許容することができるが、この位置の欠失は許容されない（ｍｕｔ３７）。ループ２の塩基６ではプリンが好ましい。プリン置換（ｍｕｔ２２）は許容されたが、ピリミジン置換（ｍｕｔ１４およびｍｕｔ２７）はどちらも許容されなかった。ピリミジンはループ２の塩基７で好ましい（ｍｕｔ２３）。塩基７でのＡ（ｍｕｔ１５）への置換ではＫｄが増加する。変異体１５（Ｋｄ約３０ｎＭ）の結合は生成されたその他の変異体構築物の多くよりも有意に優れているが、この位置のプリンはピリミジンほど望まれない。Ｕはループ２の塩基８で好まれる。Ｃ（ｍｕｔ２４）またはＡ（ｍｕｔ１６）へのこのＵの置換は十分に許容されなかった。
【０２５９】
このデータに基づいて、好まれるループ２共通配列は、以下の
５’−ＹＵＹＮＮＲＹＵ−３’
として書くことが可能であり、「Ｙ」はピリミジンを表し、「Ｒ」はプリンを表し、「Ｎ」は４つの塩基のいずれでも表す。
【０２６０】
実施例５：縮重ＳＥＬＥＸ
Ｓ２−２０  ＣＬＥＣ−２リガンド配列内の重要なヌクレオチドを同定するために、縮重ＳＥＬＥＸが実施された。縮重ＳＥＬＥＸのための開始鋳型オリゴは、縮重がＮ４０領域に故意に導入されているＳ２−２０配列であった。Ｓ２−２０縮重鋳型オリゴの合成は、Ｓ２−２０ランダム領域配列全体を通して６０％の最初の塩基および１３．３％の残りの３種の塩基のそれぞれであった。ＳＥＬＥＸの選択圧にＳ２−２０配列の縮重バージョンを導入することにより、どのヌクレオチド置換がＣＬＥＣ−２への結合にとり好まれるかを決定することが可能である。Ｓ２−２０縮重ＲＮＡ開始プールはＣＬＥＣ−２に対するナイーブＳｃｌ２プールに匹敵する結合を有していた。４ラウンドの選択後、縮重選択由来のラウンド４ＲＮＡプールの結合親和性は最初の選択由来のラウンド１０ＲＮＡに匹敵していた。縮重Ｓ２−２０選択のための特定の条件は図６に示されている。ラウンド３由来の４３のアプタマーおよびラウンド４由来の４６のアプタマーは、実施例２に記載される通りにクローニングされ塩基配列決定された。
【０２６１】
開始縮重プールは、開始配列の６０％を保存して設計された。個々の位置での置換度数率を分析することにより、どの塩基が置換を容易に許容するかを決定することが可能である。ランダム領域についてのラウンド３とラウンド４配列の両方の個々の位置でのそれぞれのヌクレオチドの頻度は図７に例示されている。前記配列のランダム領域における最初の２４ヌクレオチドは高度に保存されている。塩基位置２５−４０は、設計された６０％のベースラインと比べて含有される保存は有意に少ない。これらのデータは、トランケーションデータと一致しており、ＣＬＥＣ−２への結合に必要な最小必須領域が示されている。
【０２６２】
縮重選択解析により、ステム１がゆらぎ塩基対ならびにステム構造は無傷のままであると仮定していくつかの最小不対塩基を許容することができたことも明らかになっている。トランケーションデータと一致して、ステム２は縮重選択において高度に保存されており、ステムの底のＵ−Ｇ塩基対は１００％の頻度で好まれていた。
【０２６３】
ループ１では、ループ中の第１の塩基（Ｇ）は５’固定領域に由来しておりその結果その位置では変異は見られなかった。ループ１の塩基２（Ａ）では、実際にＡに対する好みが存在するように思われたが、他の置換が観察され、この位置でのＡの表示は、ＳＥＬＥＸがラウンド３からラウンド４に進むに従って減少しているように思われた。変異データと一致して、ループ１における第３の塩基のＣはラウンド３とラウンド４の両方由来の配列の１００％で保存されていた。ループ２では、縮重選択結果と実施例３における変異データを比較すると、類似する知見が見られた。
【０２６４】
全体としては、ＣＬＥＣ−２への結合に関与しているランダム領域の部分（ランダム領域の塩基１−２４）は最初のＳ２−２０配列に高度に収束していた。最小構造において必要ではないランダム領域の残りの塩基（塩基２５−４０）は、はるかに多岐にわたっていた。
【０２６５】
実施例６：抗ＣＬＥＣ−２リガンド配列に対する制御剤
リガンドは、相補的ワトソン−クリック塩基対合則に基づくリガンドでは、核酸モジュレーターまたは制御剤を設計するのに必要な情報をコードしている。所与の制御剤の有効性は、制御剤との核形成のためのリガンドの標的にされた領域の到達性、ならびにリガンドとの完全二重鎖形成に先立って変性を必要とすると考えられる制御剤内の限られた内部二次構造の非存在を含む、いくつかの要因に依存している。核酸モジュレーターとの会合のために好まれる領域であると考えられる抗ＣＬＥＣ−２リガンドの領域を定義するために、一連の制御剤（表４および図８参照）がＲＢ５８７について設計された。
【０２６６】
６つの制御剤（ＲＢ５８１−５８６）すべての有効性を試験するために、ゲルシフトアッセイが用いられた。このアッセイでは、ＲＢ５８７はγ−Ｐ３２−ＡＴＰで末端標識され、痕跡量で非標識ＲＢ５８７に加えられ、次にバッファーまたは様々なモル比の前記６つの制御剤のうちの１つと一緒にインキュベートされた。さらに具体的には、非標識ＲＢ５８７のモル濃度は１μＭと一定に保たれ、一定範囲の制御剤（８μＭから０．２５μＭ）が反応に加えられ、モル比範囲１：８から１：０．２５のＲＢ５８７対制御剤が得られた。反応は３７℃で１５分間インキュベートされ、１６％天然ポリアクリルアミド／０．５×ＴＢＥ／２ｍＭ  ＣａＣｌ２ゲル上に充填され。１０Ｗで３時間移動させた。次に、ゲルは取り外され、ラップに包まれ、遮光カセット内で１時間ホスフォイメージャースクリーンに曝露され、Ｓｔｏｒｍ８４０によりスキャンされた。生じたスキャンは、ＲＢ５８７の天然位置のみを示し、ＲＢ５８７プラス様々なモル量の制御剤は、リガンドと制御剤のハイブリダイゼーションのせいで上方に移動していた。ＲＢ５８７の天然のフォールディングを破壊するのに必要な制御剤の最小モル比の結果は表４に示されている。抗ＣＬＥＣ−２リガンド、ＲＢ５８７の二次構造は、制御剤の使用により効率的にモジュレートされることができる。
【０２６７】
【表４】
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【０２６８】
実施例７：抗ＣＬＥＣ−２リガンドの抗血小板活性を評価するための方法
洗浄血小板調製（ＷＰ）および凝集研究：
ヒト洗浄血小板は、基本的にＭｕｓｔａｒｄら（１９７２年；Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ  ２２、１９３−２０４頁）に記載されている通りに調製された。手短に言えば、ヒト血液は６分の１容量の酸／クエン酸塩／ブドウ糖（ＡＣＤ）バッファー（８５ｍＭクエン酸ナトリウム、６５ｍＭクエン酸および１１０ｍＭグルコース）に収集され、３７℃で３０分間水浴に置かれ、次に室温で１６分間、２５０×ｇで遠心分離された。多血小板血漿は取り除かれ、室温で１３分間、２２００×ｇで遠心分離され、次に、１０Ｕ／ｍＬヘパリンおよび５μＭ（最終濃度）プロスタグランジンＩ２（ＰＧＩ２）を含有するＨＥＰＥＳ緩衝タイロード溶液（１３６．５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、０．４３ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５．５ｍＭグルコース、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．３５％ウシ血清アルブミン）の４０ｍＬに再懸濁された。血小板懸濁液は３７℃水浴において１０分間インキュベートされ、５μＭ（最終濃度）ＰＧＩ２を添加され、混合液は１９００×ｇで８分間遠心分離された。生じたペレットは５μＭ（最終濃度）ＰＧＩ２を含有するＨＥＰＥＳ緩衝タイロード溶液の４０ｍＬに再懸濁され、次に３７℃水浴において１０分間インキュベートされ、１９００×ｇで８分間遠心分離された。ペレットは、０．１Ｕ／ｍＬジャガイモアピラーゼを含有するＨＥＰＥＳ緩衝タイロード溶液に３×１０８血小板／ｍＬの密度で再懸濁され、凝集測定研究での使用に先立って３７℃水浴において２時間インキュベートされた。
【０２６９】
ロドサイチン（アグレチン；Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌから購入）誘導ＷＰ血小板凝集は、３７℃でルミアグリゴメーター（Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ  Ｃｏｒｐ．Ｈａｖｅｒｔｏｗｎ、ＰＡ）において撹拌された（１２００ｒｐｍ）洗浄血小板の０．５ｍｌ懸濁液（４２５μｌ洗浄血小板、２５μｌフィブリノーゲン、２５μｌの阻害因子または対照および２５μｌのロドサイチン）を通る光の透過を測定することにより決定された。器具のベースラインは、０．５ｍｌのＨｅｐｅｓ緩衝タイロード溶液を使用して設定された。凝集測定に先立って、血小板懸濁液は１ｍｇ／ｍｌフィブリノーゲン最終濃度を補充された。血小板凝集は、指示された濃度のロドサイチン（７０−９０％間の凝集パーセントを生じる）の添加により開始され、光透過は少なくとも６分間連続して記録された。ロドサイチン誘導血小板凝集を遮断する能力についての抗ＣＬＥＣ−２リガンドまたは対照のスクリーニングでは、抗ＣＬＥＣ−２リガンドは目的の最終濃度を生じる希釈度で血小板懸濁液に添加され、ロドサイチンの添加前３分間インキュベートされ、応答はロドサイチン添加後４−６分間記録された。
【０２７０】
ロドサイチンの効力は、適切な誘発濃度を決定するために、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌバッファー中およそ３−６０ｎＭ範囲からの段階希釈を使用して用量反応曲線から得られた最大程度の凝集パーセントからドナーごとに決定された。ロドサイチン誘導血小板凝集を阻害する抗ＣＬＥＣ−２リガンドの能力は、広範囲の抗ＣＬＥＣ−２リガンド濃度を使用して、上記のＷＰ調製物において試験された。図９Ａおよび９Ｂは、ＣＬＥＣ−２リガンドＳ２−２０（トレース２およびトレース６；１μＭおよび０．５μＭ）；ＲＢ５８７（トレース１およびトレース５；１μＭおよび０．５μＭ）；ＲＢ５８８（トレース３およびトレース７；１μＭおよび０．５μＭ）；および対照（トレース４およびトレース８；２０ｎＭロドサイチン）のロドサイチン誘導ＷＰ血小板凝集のグラフを示している。ロドサイチン添加６分後の位置は、太い下向き矢印によりトレース上に印が付けられている。図９Ａおよび９Ｂで示されるように、Ｓ２−２０およびＲＢ５８７アプタマーは、およそ２０−３０ｎＭロドサイチンアゴニストの存在下でロドサイチン誘導ＷＰ凝集を阻害するのに十分に効果的であった。
【０２７１】
実施例８：ロドサイチン誘導血小板凝集アッセイにおける抗ＣＬＥＣ−２リガンドＳ２−２０完全長クローンおよびＲＢ５８７トランケートの抗血小板活性を評価するための方法
ヒト洗浄血小板は、基本的に上記の通りに調製された。ロドサイチンの効力は、実施例７に記載の通りに、適切な誘発濃度を決定するために、およそ３−６０ｎＭからのロドサイチンの段階希釈を使用して用量反応曲線から得られた最大程度の凝集パーセントからドナーごとに決定された。ロドサイチン誘導血小板凝集を阻害する抗ＣＬＥＣ−２リガンドの能力は、上記の通りにＷＰ調製物において試験された。Ｓ２−２０およびＲＢ５８７の用量反応解析からのデータは図１０Ａおよび１０Ｂに提示されている。図１０Ａは、ヒト洗浄血小板における変化する濃度のＣＬＥＣ−２核酸リガンドＳ２−２０クローンに対する対照のパーセントとして表されているロドサイチン誘導血小板凝集のグラフである。図１０Ｂは、ヒト洗浄血小板における変化する濃度のＣＬＥＣ−２核酸リガンドＲＢ５８７および不活性変異体ＲＢ５８８に対する対照のパーセントとして表されているロドサイチン誘導血小板凝集のグラフである。ロドサイチン添加後６分間の０．５μＭのＳ２−２０またはＲＢ５８７の存在下での凝集の基本的に完全な阻害が観察される。
【０２７２】
ＷＰにおけるＣＬＥＣ−２核酸リガンドの核酸モジュレーター試験のためのロドサイチン誘導血小板凝集アッセイ：
ヒト洗浄血小板は、上記の通りに調製された。広範囲の濃度のＣＬＥＣ−２核酸リガンド阻害因子が試験された場合、ＩＣ９５−１００値が得られる。ＩＣ９５−１００値は、所与の濃度の検証されるアゴニストにより誘発される凝集を約９５−１００％阻害するのに必要な阻害因子の濃度を表す。モジュレーターを抗血小板活性のその可逆性について試験する場合、血小板は２−４μＭ  ＣＬＥＣ−２アプタマー（ＩＣ９５−１００）またはバッファーＦと一緒に３分間インキュベートされ、続いてロドサイチンの添加前１０分間異なるモル濃度のモジュレーター（４：１、２：１、１：１のモジュレーター：アプタマー）が添加され、反応は６分間記録される。図１０Ｃは、ヒト洗浄血小板における単独でのまたはＣＬＥＣ−２リガンドモジュレーターＲＢ５８１、ＲＢ５８２、ＲＢ５８３、ＲＢ５８４、ＲＢ５８５およびＲＢ５８６と組み合わせた変化する濃度のＣＬＥＣ−２核酸リガンドＲＢ５８７に対する対照のパーセントとして表されているロドサイチン誘導血小板凝集のグラフを示す。
【０２７３】
実施例９：ロドサイチン（アグレチン）を用いたフローサイトメトリー（Ｐ−セレクチン：ＣＤ６２−Ｐ発現）を使用する血小板活性化機能解析
フローサイトメトリー研究：
ロドサイチン誘導ヒトＰ−セレクチン発現を阻害するＣＬＥＣ−２アプタマーの能力を評価するために、フローサイトメトリーがＰ−セレクチン特異的抗体を使用して実施された。血小板表面でのＰ−セレクチン発現は血小板活性化のマーカーである。ヒト洗浄血小板懸濁液（密度３×１０８細胞／ｍＬ）はタイロードバッファー中１／１０まで希釈され、３７℃に保たれた。バッファーＦ中のそれぞれの試験化合物（ＳＥＬ２プール、Ｓ２−２０、Ｓ２−２０  Ｔ４、Ｓ２−２０  Ｔ５、Ｓ２−２０  Ｔ６；ＲＢ５８７およびＲＢ５８８  ２０μＭストック）の５μＬが５ｍＬのアッセイ管に添加された。直ちに、５０μＬの希釈された血小板が添加され穏やかに混合された。管は室温で３分間インキュベートされた。２．５μＬのロドサイチン（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌバッファー、ｐＨ８．０中で３．３３１μＭストックが作製された）がそれぞれの管に添加され、混合されさらに５分間インキュベートされた。管は氷上に移され、１分間冷却された。２０μＬのＣＤ６２Ｐ−ＰＥ抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；カタログ番号５５０５６１）がそれぞれの管に添加され、氷上で２０分間インキュベートされた。それぞれの管の血小板懸濁液は、０．６ｍＬの氷冷ＰＢＳでさらに希釈され、ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒにおいて解析された。
【０２７４】
ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒを使用するＣＤ６２発現の検出：
２つの別個のドットプロット（１つはログＳＳＣ対ＦＳＣおよびログＦＳＣ対ＦＬ２−Ｈ）およびヒストグラムがフロー表示領域上で作成された。血小板はＳＳＣ対ＦＳＣのドットプロットを使用して同定された（機器は適切な表示に調整された）。血小板周辺の対象の領域１（Ｒ１）が作製された（これは細片が血小板として計数されるのを回避するためである）。領域１（Ｒ１）の血小板はドットプロットＦＳＣ対ＦＬ２−Ｈ上で観察された（対照を使用して調整されたＦＬ２）。血小板はヒストグラムプロットされたカウント対ＦＬ２−Ｈ上でも見られた。象限統計マーカーは、対照管を使用してＦＳＣ対ＦＬ２−Ｈドットブロット上にセットされ、統計的パラメータが定義された（対照；未染色血小板）。静止対照（プラス抗体）で開始する試料すべてが収集された。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して、対照の割合（％）としてプロットされる（１５０ｎＭロドサイチン活性化；下右象限は１００％活性化トータルとして処理された）。
【０２７５】
上記のＦＡＣＳ解析を使用して、ＷＰにおけるロドサイチン誘導Ｐ−セレクチン発現を阻害する、アプタマーＳ２−２０、ＲＢ５８７およびＳ２−２０の３つのトランケートの能力を試験した。得られたデータは図１１Ａおよび１１Ｂに例示されており、これらの図にはＰ−セレクチン−ＰＥ抗体を用いるフローサイトメトリーを使用してロドサイチン誘導ヒトＰ−セレクチン発現のグラフが与えられている。活性は、ヒト洗浄血小板における２μＭのＣＬＥＣ−２核酸リガンドＳ２−２０クローンおよびトランケート（図１１Ａ）またはヒト洗浄血小板における２μＭのＣＬＥＣ−２核酸リガンドＲＢ５８７および不活性変異体ＲＢ５８８（図１１Ｂ）に対する対照のパーセントとして表される。
【０２７６】
ＣＬＥＣ−２リガンドＳ２−２０、ＲＢ５８７、Ｓ２−２０−Ｔ４およびＳ２−２０−Ｔ６は、それぞれがヒトＷＰの表面上でのロドサイチン誘導ヒトＰ−セレクチン発現を著しく減少させることができたが、トランケートＳ２−２０−Ｔ５およびＲＢ５８８はＣＬＥＣ−２に結合せず、阻害活性を示すことはなく、ＣＬＥＣ−２に対するリガンド親和性とＣＬＥＣ−２活性の阻害間の相関関係を実証している。
【０２７７】
実施例１０：Ｂｉｏｆｌｕｘ（商標）２００（Ｆｌｕｘｉｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用するＣＬＥＣ−２アプタマー活性についての全血におけるインビトロフローベースの血小板粘着アッセイ
ＣＬＥＣ−２リガンドは、全血存在下でのインビトロフローベースの血小板粘着アッセイを使用して、ＣＬＥＣ−２媒介血小板凝集を阻害するその能力について特徴付けられた。
【０２７８】
潅流およびフロー実験のための全血調製：
血液は、１９Ｇ×３／４”針を使用して健康な志願者からＰＰＡＣＫ（０．３ｍＭ）抗凝固剤入りの６０ｍＬ注射器に吸引された。血液は直ちに、３７℃で１時間４μＭのカルセインＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｐ／Ｎ  Ｃ３１００  ＭＰ）で蛍光的に標識された（カルセインＡＭは、管を数回反転させて混合することにより極めてゆっくりと血液に添加された、血液は吸引から３．５時間内に使用された）。実験が線維性コラーゲンまたはロドサイチン被膜ウェルを用いて実施された場合、実験は２００μＬの標識された血液を入口ウェルに添加することにより開始され、潅流は、Ｂｉｏｆｌｕｘ（商標）ソフトウェアを使用して５ｄｙｎ／ｃｍ２全血フロー設定を３７℃で使用して直ちに開始された。実験がラット尾コラーゲン被膜表面を用いて実施された場合、全血は２分間１６５ｎＭのロドサイチンを用いて活性化され、次に実験は２００μＬの標識され活性化された血液を入口ウェルに添加することにより開始され、潅流は、Ｂｉｏｆｌｕｘ（商標）ソフトウェアを使用して５ｄｙｎ／ｃｍ２全血フロー設定を３７℃で使用して直ちに開始された。データ（血小板凝集体の蛍光画像）は、６−１０分の全持続時間６秒ごとにタイムラプス蛍光倒立顕微鏡（Ａｘｉｏｃａｍ  Ｃｈａｒｇｅｄ−Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ  ｃａｍｅｒａおよびＡｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアに接続されているＺｅｉｓｓ  ２００Ｍ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を使用して収集された。試験物（ＣＬＥＣ−２アプタマーＲＢ５８７および不活性リガンド対照ＲＢ５８８）を試験するために、２００μＬの標識された血液は、入口ウェルへの添加前に室温で３−５分間指示された濃度のアプタマー（またはバッファーＦ；１０μＬ容量で）と一緒にインキュベートされた。タグ付き画像ファイル（ｔｉｆｆ）フォーマットされた画像を使用して、Ｂｉｏｆｌｕｘ  Ｍｏｎｔａｇｅ（商標）ソフトウェアを使用して蛍光強度を計算し、次にデータ表はＭｉｃｒｏｓｏｆｔエクセルにエクスポートされ、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用してプロットされた（図１２Ａおよび１２Ｂ）。
【０２７９】
ロドサイチン被膜表面を用いた実験：
ロドサイチンは、ＣＬＥＣ−２依存性血小板凝集を効果的に刺激する（実施例７；図９および１０）。流動条件下でのＣＬＥＣ−２アプタマー活性を研究するためにロドサイチン被膜表面での血小板凝集体形成を解析した。フロー実験では、Ｂｉｏｆｌｕｘ４８ウェルプレート（Ｐ／Ｎ  ９００−００１７）が常用された。ロドサイチンを用いた被膜のために、プレートは５ｄｙｎ／ｃｍ２で５分間、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌバッファーを用いてプライムされ、次に５０μｇ／ｍｌの希釈されたロドサイチンは５ｄｙｎ／ｃｍ２で１０分間、出口ウェルから潅流された。線維性コラーゲン被膜プレートは対照として使用された。コラーゲン被膜のために、プレートは５ｄｙｎ／ｃｍ２で５分間、０．０２Ｍの酢酸を用いてプライムされ、次に０．０２Ｍの酢酸中の２５μｇ／ｍｌの希釈された線維性コラーゲン（Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ  Ｐ／Ｎ  ３８５）は５ｄｙｎ／ｃｍ２で１０分間、出口ウェルから潅流された。フローは停止され、プレートは室温で１時間インキュベートされた。被膜タンパク質は５ｄｙｎ／ｃｍ２で１０分間、ＰＢＳで洗浄された。プレートは、入口ウェル（１ｍｌ）を５％ｗ／ｖ  ＢＳＡ／ＰＢＳで完全に充填することにより遮断され、５ｄｙｎ／ｃｍ２で１５分間、チャネルに還流された。フローは停止され、プレートは室温でさらに１０分間インキュベートされた。過剰なＰＢＳ  ＢＳＡはすべてのウェルから取り除かれ、プレートは同日に使用するために室温に保たれるまたは２日間までの間、４℃でＰＢＳ  ＢＳＡ中に保存された。
【０２８０】
図１２Ａは、流動する全血に曝露されたロドサイチン被膜表面での血小板蓄積に対するＣＬＥＣ−２リガンドの効果のビデオスチール蛍光エンドポイント画像を示している（Ａ＝５０μｇ／ｍＬロドサイチン被膜；Ｂ＝２５μｇ／ｍＬ線維性コラーゲン被膜対照：５０μｇ／ｍＬロドサイチン被膜で被膜されたＦを通るＣ、Ｃ＝３μＭ  ＲＢ５８７；Ｄ＝３μＭ  ＲＢ５８８；Ｅ＝４μＭ  ＲＢ５８８；およびＦ＝４μＭ  ＲＢ５８７）。グラフＧは、Ｆｌｕｘｉｏｎ  Ｍｏｎｔａｇｅ（商標）ソフトウェアにより計算された粘着血小板表面被覆データの測定を示している。データは、ロドサイチン被膜表面上の不活性変異体ＲＢ５８８の最大応答パーセントとして表される。図１２Ａに示されるように、ロドサイチンは、全血における流動条件下での血小板凝集体中の活性化された血小板の蓄積を支持した。ＲＢ５８７はこの活性を特異的に遮断したが、不活性変異体対照のＲＢ５８８は遮断しなかった（図１２Ａ、パネルＣをＤと、ＦをＥと比較されたい）。
【０２８１】
可溶性ラット尾コラーゲンＩ被膜表面を用いた実験：
流動下の非活性化血小板と比べた、ラット尾コラーゲン被膜表面により大きな血小板凝集体を形成するロドサイチン（ＣＬＥＣ−２特異的アゴニスト）活性化された血小板の能力も解析した。次に、ＲＢ５８７を使用するこのプロセスにおけるＣＬＥＣ−２の考えられる機能を解析した。このアッセイでは、プレートは上記の通りに、１００μｇ／ｍＬの可溶性ラット尾コラーゲンＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号Ａ１０４８３−０１）で被膜された。プレートは５ｄｙｎ／ｃｍ２で５分間、０．０２Ｍ酢酸を用いてプライムされ、次に２５μｇ／ｍｌの希釈された線維性コラーゲン（Ｃｈｒｐｎｏ−ＬｏｇＰ／Ｎ３８５）または０．０２Ｍ酢酸中可溶性ラット尾コラーゲンの１００μｇ／ｍＬは５ｄｙｎ／ｃｍ２で１０分間、出口ウェルから潅流された。フローは停止され、プレートは室温で１時間インキュベートされた。被膜タンパク質は５ｄｙｎ／ｃｍ２で１０分間、ＰＢＳで洗浄された。プレートは、入口ウェル（１ｍｌ）を５％ｗ／ｖＢＳＡ／ＰＢＳで完全に充填することにより遮断され、５ｄｙｎ／ｃｍ２で１５分間、チャネルに還流された。フローは停止され、プレートは室温でさらに１０分間インキュベートされた。過剰なＰＢＳ  ＢＳＡはすべてのウェルから取り除かれ、プレートは同日に使用するために室温に保たれるまたは２日間までの間、４℃でＰＢＳ  ＢＳＡ中に保存された。
【０２８２】
図１２Ｂは、ロドサイチンアゴニスト処置の存在および非存在下で、流動する全血に曝露されたラット尾可溶性コラーゲン被膜表面での血小板蓄積に対するＣＬＥＣ−２リガンドの効果のビデオスチール蛍光エンドポイント画像を示している（Ａ＝２５μｇ／ｍＬ線維性コラーゲン被膜；Ｂ＝１００μｇ／ｍＬラット尾コラーゲン；Ｃ＝１００μｇ／ｍＬラット尾コラーゲンプラス１６５ｎＭロドサイチン処置；Ｄ＝１００μｇ／ｍＬラット尾コラーゲンプラスバッファーＦ；Ｅ＝１００μｇ／ｍＬラット尾コラーゲンプラス３μＭ  ＲＢ５８７プラス１６５ｎＭロドサイチン処置；Ｆ＝１００μｇ／ｍＬラット尾コラーゲンプラス３μＭ  ＲＢ５８８プラス１６５ｎＭロドサイチン処置）。グラフＧは、Ｆｌｕｘｉｏｎ  Ｍｏｎｔａｇｅ（商標）ソフトウェアにより計算された粘着血小板表面被覆データの測定を示している。データは、ロドサイチンの存在下、ラット尾コラーゲン被膜表面での不活性変異体ＲＢ５８８の最大応答パーセントとして表されている。図１２Ｂに示されるように、ロドサイチンアゴニストの存在は、未処置全血と比べて、ラット尾コラーゲン被膜表面に付着している血小板凝集体サイズを著しく増加させた。全血が、ＲＢ５８７と一緒にプレインキュベートされ、続いてロドサイチン活性化された場合、血小板凝集体サイズはロドサイチン非存在下、可溶性ラット尾コラーゲンを用いて見られるベースライン凝集体まで減少して戻っていた（図１２Ｂ−画像Ｂ、Ｄ、ＥおよびグラフＧ）。不活性変異体対照、ＲＢ５８８は、血小板凝集体サイズには効果はなかった（図１２ＢパネルＦ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
2013545443.tif 000028
【図１２Ａ】
2013545443.tif 000029
【図１２Ｂ】
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【配列表】
2013545443000001.app
【国際調査報告】
2013545443.tif 000031
2013545443.tif 000032
2013545443.tif 000033
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