(57)【要約】本発明は、A3GがRNAと結合する能力を調節する任意の作用物質をスクリーニングするためのアッセイ法を提供する。本発明は、ハイスループットスクリーニング方法により同定された作用物質と、HIV感染を阻害しかつウイルスの薬物耐性の出現を減少させる手段として該同定された作用物質を用いる処置の方法とを提供する。2013534808.tif 000006
2013534808.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
A3G：核酸分子相互作用を妨害する作用物質を同定する方法であって、A3G：核酸分子複合体形成のために効果的である条件下で、A3G：核酸分子複合体におけるA3Gを、試験作用物質と接触させる段階、および、該試験作用物質がA3G：核酸分子相互作用を妨害するか否かを検出する段階を含み、A3G：核酸分子相互作用の妨害の検出によって、A3G：RNA核酸分子を妨害する作用物質が同定される、方法。
【請求項２】
前記核酸分子が、ssDNA、RNA、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
A3G：RNA相互作用を妨害する前記試験作用物質が、レンチウイルス感染性の阻害剤の一部として、ssDNA dCからdUへのそのデアミナーゼ活性を活性化する、請求項2記載の方法。
【請求項４】
A3G：RNA相互作用を妨害する前記試験作用物質が、レンチウイルス感染性の阻害剤の一部として、レンチウイルス複製複合体におけるssDNAへの結合を可能にする、請求項2記載の方法。
【請求項５】
ハイスループット方法である、請求項1記載の方法。
【請求項６】
前記ハイスループット方法がフェルスタークエンチ共鳴エネルギー移動（FqRET）である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
請求項1記載の方法により同定される、作用物質。
【請求項８】
細胞を、請求項1記載の方法により同定された作用物質の抗ウイルス有効量と接触させる段階を含む、ウイルスの感染性を阻害するための方法。
【請求項９】
前記ウイルスが、HIV1、HIV2、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、XMRV、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
前記ウイルスが細胞の細胞質中のRNA中間体と関連している、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
前記ウイルスが細胞の細胞質中のDNA複製と関連している、請求項8記載の方法。
【請求項１２】
前記ウイルスが、line、sineおよびaluのカテゴリーの内因性レトロウイルスエレメントを含む、請求項8記載の方法。
【請求項１３】
前記ウイルスが泡沫状ウイルスである、請求項8記載の方法。
【請求項１４】
前記作用物質がA3GとRNAとの相互作用を阻害し、それにより、該A3Gが抗ウイルス活性を示すことが可能になる、請求項8記載の方法。
【請求項１５】
前記作用物質が、アルタンセリン、クロニジン、およびそれらの類似体からなる群より選択され、かつ、関連する化学的スキャフォールド（化学型）を有する、請求項8記載の方法。
【請求項１６】
A3G：RNA複合体を、請求項1記載の方法により同定された作用物質の阻害有効量と接触させる段階を含む、細胞中においてA3G：RNA相互作用を阻害するための方法。
【請求項１７】
前記作用物質が、アルタンセリン、クロニジン、およびそれらの類似体からなる群より選択され、かつ、関連する化学的スキャフォールド（化学型）を有する、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
患者においてHIV感染またはAIDSを処置または予防するための方法であって、そのような処置または予防を必要とする患者に、請求項1記載の方法により同定された作用物質の治療有効量を投与する段階を含む方法。
【請求項１９】
前記作用物質が、アルタンセリン、クロニジン、およびそれらの類似体からなる群より選択され、かつ、関連する化学的スキャフォールド（化学型）を有する、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
A3GのRNA不活性化を解除し、それにより、細胞中のA3Gを活性化する段階を含む、ウイルス耐性を攻撃する方法。
【請求項２１】
その抗ウイルス活性を発揮するために、A3Gがキャプシド化されない、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞がウイルスに感染しておらず、かつA3G tの活性化がウイルス複製を先制的に阻害する、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
A3GのRNA不活性化を解除することが、細胞を、請求項１記載の方法により同定された作用物質の抗ウイルス有効量と接触させることにより達成される、請求項20記載の方法。
【請求項２４】
A3GのRNA不活性化を解除することが、細胞を、アルタンセリン、クロニジン、およびそれらの類似体からなる群より選択されかつ関連する化学的スキャフォールド（化学型）を有する作用物質の抗ウイルス有効量と接触させることにより達成される、請求項20記載の方法。
【請求項２５】
細胞中においてA3G：RNA複合体を妨害する段階を含む、該細胞のウイルス感染の前に該細胞中においてA3Gの活性型のリザーバーを作製する方法。
【請求項２６】
細胞中においてA3G：RNA複合体を妨害する段階を含む、該細胞中においてウイルスの薬物耐性の出現を減少させる方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
ヒトAPOBEC3GまたはhA3Gは、一本鎖核酸の状況においてシチジンのウリジンへのまたはデオキシシチジンのデオキシウリジンへの加水分解的脱アミノ化を触媒するシチジンデアミナーゼのファミリーのメンバーである（Jarmuz, et al., 2002, Genomics. 79: 285-96（非特許文献1）；Wedekind, et al., 2003, Trends Genet. 19: 207-16（非特許文献2））。hA3Gは、抗レンチウイルス宿主因子として機能する（Sheehy, et al., 2002, Nature. 418: 646-650（非特許文献3））。とはいえ、hA3G抗ウイルス活性の機構に関するデアミナーゼ依存性およびデアミナーゼ非依存性の仮説は、当分野において携わる研究グループを二分してきた。当分野の大部分は、A3Gが、その抗ウイルス活性を発揮するために、出芽ビリオンを伴いキャプシド化されなければならないと考える。本明細書において提示するデータは、これがそうである必要がないことを示し、RNA依存性の高分子量凝集体からA3Gを動員することができる小分子の抗ウイルス性のおよび治療的な潜在能力を実証する。これらの結果は予測不可能であった。なぜなら、それらはA3GのRNA依存性の不活性化が、インビトロおよび生細胞の両方において可逆的であり、A3G宿主抗ウイルス活性を活性化することを示すからである。
【０００２】
帰属するいくつかのグループが、C末端触媒中心内のアミノ酸残基を、抗ウイルスssDNAデアミナーゼ活性のために不可欠であるとして選択するのに対し、hA3GのN末端半分中の偽触媒中心内およびその周囲の残基が、RNA結合、Gag依存性およびGag非依存性の相互作用を介したビリオンとのコアセンブリーのために必要とされ、逆転写を遮断するhA3Gの能力を媒介する（Iwatani, et al., 2006, J Virol. 80: 5992-6002（非特許文献4）；Navarro, et al., 2005, Virology. 333: 374-86（非特許文献5）；Hakata, et al., 2006, J Biol Chem. 281:36624-31（非特許文献6）；Hache, et al., 2005, J Biol Chem. 280: 10920-4（非特許文献7））。免疫蛍光研究では、プロセシング体（P体）（Wichroski, et al., 2006, PLoS Pathog. 2: e41（非特許文献8））およびストレス顆粒（Stopak, et al., 2006, J Biol Chem. 282: 3539-46（非特許文献9）；Kozaket al., 2006, J Biol Chem. 281: 29105-19（非特許文献10））として以前に特徴付けられた断続細胞質分布においてhA3Gが実証された。P体またはストレス顆粒に特徴的なタンパク質は、hA3Gと共免疫沈降するが、リボヌクレアーゼ消化後にはそのようにならない（Wichroski, et al., 2006, PLoS Pathog. 2: e41（非特許文献8）；Kozaket al., 2006, J Biol Chem. 281: 29105-19（非特許文献10）；Chiu, et al., 2006, Proc Natl Acad Sci USA. 103: 15588-93（非特許文献11））。インビトロのhA3Gは、RNAまたはssDNAに非特異的に結合し（Kozaket al., 2006, J Biol Chem. 281: 29105-19（非特許文献10）；Chelico, et al., 2006, Nat Struct Mol Biol. 13: 392-9（非特許文献12）；Opi, et al., 2006, J Virol. 80: 4673-82（非特許文献13））、従って、細胞RNAは、hA3Gをこれらの細胞質画分と非特異的に会合させうる。
【０００３】
サイズ排除クロマトグラフィーおよびショ糖密度沈降分析では、ヒト細胞から単離されたhA3Gが、5-15mDaの高分子量（HMM）複合体として構築されたことが示された（Chiu, et al., 2006, Proc Natl Acad Sci U S A. 103: 15588-93（非特許文献11）；Chiu, et al., 2005, Nature.435: 108-14（非特許文献14）；Kreisberg, et al., 2006, J Exp Med.203: 865-70（非特許文献15）；Gallois-Montbrun, et al., 2007, J Virol 81, 2165-78（非特許文献16））。HMM複合体は、リボヌクレアーゼを用いた消化によりインビトロで低分子量複合体（LMM）に解離された。興味深いことに、HMM複合体は、インビトロで試験された場合、デアミナーゼ活性を欠いたが、リボヌクレアーゼ処理により活性化された（Chelico, et al., 2006, Nat Struct Mol Biol. 13: 392-9（非特許文献12）；Opi, et al., 2006, J Virol. 80: 4673-82（非特許文献13）；Chiu, et al., 2005, Nature. 435: 108-14（非特許文献14）；Wedekind, et al., 2006, J Biol Chem. 281: 38122-6（非特許文献17））。
【０００４】
HIVワクチン臨床治験での最近の失敗は、HIV/AIDS治療のための新規薬物を同定することを目的とする努力を一新する必要性を強調している（Altman et al., 2008 Nature 452: 503（非特許文献18））。当分野において新規のHIV/AIDS治療が必要とされる。本発明は、この必要性、ならびにHIV感染の処置に関する他の必要性を満足させる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Jarmuz, et al., 2002, Genomics. 79: 285-96
【非特許文献２】Wedekind, et al., 2003, Trends Genet. 19: 207-16
【非特許文献３】Sheehy, et al., 2002, Nature. 418: 646-650
【非特許文献４】Iwatani, et al., 2006, J Virol. 80: 5992-6002
【非特許文献５】Navarro, et al., 2005, Virology. 333: 374-86
【非特許文献６】Hakata, et al., 2006, J Biol Chem. 281:36624-31
【非特許文献７】Hache, et al., 2005, J Biol Chem. 280: 10920-4
【非特許文献８】Wichroski, et al., 2006, PLoS Pathog. 2: e41
【非特許文献９】Stopak, et al., 2006, J Biol Chem. 282: 3539-46
【非特許文献１０】Kozaket al., 2006, J Biol Chem. 281: 29105-19
【非特許文献１１】Chiu, et al., 2006, Proc Natl Acad Sci USA. 103: 15588-93
【非特許文献１２】Chelico, et al., 2006, Nat Struct Mol Biol. 13: 392-9
【非特許文献１３】Opi, et al., 2006, J Virol. 80: 4673-82
【非特許文献１４】Chiu, et al., 2005, Nature.435: 108-14
【非特許文献１５】Kreisberg, et al., 2006, J Exp Med.203: 865-70
【非特許文献１６】Gallois-Montbrun, et al., 2007, J Virol 81, 2165-78
【非特許文献１７】Wedekind, et al., 2006, J Biol Chem. 281: 38122-6
【非特許文献１８】Altman et al., 2008 Nature 452: 503
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、A3G：核酸分子相互作用を妨害する作用物質を同定する方法を含む。一態様において、本方法は、A3G：核酸分子複合体形成のために効果的である条件下で、試験作用物質を、A3G：核酸分子複合体におけるA3Gと接触させる段階、および、該試験作用物質がA3G：核酸分子相互作用を妨害するか否かを検出する段階を含み、A3G：核酸分子の相互作用の妨害の検出によって、A3G：RNA核酸分子を妨害する作用物質が同定される。
【０００７】
一態様において、核酸分子は、ssDNA、RNA、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
【０００８】
別の態様において、A3G：RNA相互作用を妨害する試験作用物質は、レンチウイルス感染性の阻害剤の一部として、ssDNA dCからdUへのそのデアミナーゼ活性を活性化する。
【０００９】
別の態様において、A3G：RNA相互作用を妨害する試験作用物質は、レンチウイルス感染性の阻害剤の一部として、レンチウイルス複製複合体におけるssDNAへの結合を可能にする。
【００１０】
一態様において、A3G：核酸分子相互作用を妨害する作用物質を同定する方法は、ハイスループット方法である。一態様において、ハイスループット方法は、フェルスタークエンチ共鳴エネルギー移動（FqRET）である。
【００１１】
本発明はまた、A3G：核酸分子相互作用を妨害する作用物質を同定する方法により同定された作用物質を含む。
【００１２】
本発明はまた、ウイルスの感染性を阻害するための方法を含む。一態様において、本方法は、細胞を、本発明の方法により同定された作用物質の抗ウイルス有効量と接触させる段階を含む。
【００１３】
一態様において、ウイルスは、HIV1、HIV2、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、XMRV、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
【００１４】
別の態様において、ウイルスは、細胞の細胞質中のRNA中間体に関連している。
【００１５】
さらに別の態様において、ウイルスは、細胞の細胞質中でのDNA複製に関連している。
【００１６】
別の態様において、ウイルスは、line、sineおよびaluのカテゴリーの内因性レトロウイルスエレメントを含む。
【００１７】
別の態様において、ウイルスは泡沫状ウイルスである。
【００１８】
一態様において、作用物質はA3GとRNAとの相互作用を阻害し、それにより、A3Gが抗ウイルス活性を示すことを可能にする。
【００１９】
一態様において、作用物質は、アルタンセリン、クロニジン、およびそれらの類似体からなる群より選択され、かつ、関連する化学的スキャフォールド（化学型）を有する。
【００２０】
本発明はまた、細胞中においてA3G：RNA相互作用を阻害するための方法を含む。一態様において、本方法は、A3G：RNA複合体を、本発明の方法により同定された作用物質の阻害有効量と接触させる段階を含む。
【００２１】
本発明は、患者においてHIV感染またはAIDSを処置または予防するための方法を含む。一態様において、本方法は、そのような処置または予防を必要とする患者に、本発明の方法に従って同定された作用物質の治療有効量を投与する段階を含む。
【００２２】
本発明はまた、ウイルス耐性を攻撃する方法を含む。一態様において、本方法は、A3GのRNA不活性化を解除し、それにより、細胞中のA3Gを活性化させる段階を含む。一態様において、その抗ウイルス活性を発揮するために、A3Gはキャプシド化されない。別の態様において、細胞はウイルスに感染しておらず、かつA3G tの活性化は、ウイルス複製を先制的に阻害する。
【００２３】
さらに別の態様において、A3GのRNA不活性化を解除することは、細胞を、本発明の方法に従って同定された作用物質の抗ウイルス有効量と接触させることにより、達成される。別の態様において、A3GのRNA不活性化を解除することは、細胞を、アルタンセリン、クロニジン、およびそれらの類似体からなる群より選択されかつ関連する化学的スキャフォールド（化学型）を有する作用物質の抗ウイルス有効量と接触させることにより達成される。
【００２４】
本発明はまた、細胞のウイルス感染の前に該細胞中においてA3Gの活性型のリザーバーを作製する方法を含む。一態様において、本方法は、細胞中においてA3G：RNA複合体を妨害する段階を含む。
【００２５】
本発明はまた、細胞中においてウイルスの薬物耐性の出現を減少させる方法を含む。一態様において、本方法は、細胞中においてA3G：RNA複合体を妨害する段階を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
本発明を説明する目的のために、図面において本発明の特定の態様が示される。しかし、本発明は、図面中に示される態様の正確な配置および手段に限定されない。
【図１】RNAがssDNAをA3Gから外すことを実証するイメージである。
【図２】ハイスループットスクリーニング（HTS）アッセイ条件の最適化を図示するイメージである。
【図３Ａ】FqRET HTSアッセイ法において使用される複合体のアセンブリーの概略図を示すイメージである。
【図３Ｂ】精製されたHMMおよびLMM（タンパク質精製の間のRNアーゼ A消化有りおよびRNアーゼ A消化無し）のクマシーブルー染色ゲルを示すイメージである。
【図４】図4Aおよび図4Bを含む図4は、Alexa647-A3GおよびQXL670-RNAにより形成されるタンパク質-RNA複合体を図示する一連のイメージである。図4Aは、Alexa647 A3Gを、示した温度で、QXL670/32P標識RNAを用いて1時間にわたりインキュベートしたことを図示する。反応は、2.5倍または5倍のいずれかのモル過剰量のRNAを含んだ。複合体アセンブリーをEMSAにより評価し、放射標識RNAを、Typhoon 9410 Phosphorimagerを使用して検出した。図4Bは、37℃反応のEMSAが647nm光に曝露され、670nmで蛍光についてスキャンされ、A3G-RNA複合体におけるクエンチングが明らかになったことを図示する。
【図５】RNアーゼ消化によって、クエンチングがA3G-RNA複合体を必要とすることが実証されることを図示するイメージである。
【図６】ライブラリースクリーニングからの結果を図示するイメージである。
【図７Ａ】さらなる研究のためにライブラリースクリーニングから選択された4つの化合物を図示するイメージである。
【図７Ｂ】さらなる研究のためにライブラリースクリーニングから選択された4つの化合物を図示するイメージである。
【図７Ｃ】さらなる研究のためにライブラリースクリーニングから選択された4つの化合物を図示するイメージである。
【図８】「ヒット」が、HMMおよびLMMの電気泳動移動度により測定される通り、A3G RNA結合を減少させることを図示するイメージである。
【図９】「ヒット」のいずれもA3Gデアミナーゼ活性を阻害しなかったことを図示するイメージである（クロニジンおよびアルタンセリンにより例示される）。
【図１０】試験化合物がウイルス粒子中へのA3G侵入を阻害しなかったことを図示するイメージである。
【図１１】感染性レポーター細胞株（TMZ-bl）において過剰発現されたA3Gが、MDa、RNアーゼ感受性HMMとして凝集したことを図示するイメージである。
【図１２】試験化合物を用いたインビトロでのHMMの処理後の、A3Gデアミナーゼ活性の再活性化を図示するイメージである。
【図１３】細胞性A3Gの活性化がウイルス感染性を減少させることを実証するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明は、ポリヌクレオチド分子に結合したAPOBEC3G（A3G）を標的化するための組成物および方法を提供する。本発明は、少なくとも部分的に、A3GがRNAに結合された複合体を妨害する能力に基づく。A3G：RNA複合体を妨害することは、HMMとしてのA3Gに結合し、凝集するRNAの能力に拮抗することにより、宿主防御因子A3Gを活性化する役割を果たす。したがって、本発明は、ポリヌクレオチド分子へのA3G結合を選択的に標的化し、抗ウイルス治療として宿主防御を活性化することを含む。好ましくは、ポリヌクレオチド分子はRNAである。本発明の以下の説明は、A3G：RNA複合体の形成を妨害または防止することに関して、本発明を記載する。しかし、本発明は、A3G：RNA複合体に限定されるべきではない。むしろ、本発明は、任意のA3G：ポリヌクレオチド複合体を妨害または防止することを含む。
【００２８】
本発明は、A3G-RNA結合を妨害する作用物質を同定するためのスクリーニングアッセイ法、および該アッセイ法により同定された該作用物質を提供する。例えば、作用物質は、アルタンセリン、クロニジン、およびそれらの類似体を含むが、これらに限定されない。しかし、本発明は、これらの化合物だけに限定されるべきではなく、本発明のスクリーニング方法に従って同定することができる任意の化合物およびそれらの類似体を含むべきである。
【００２９】
一態様において、本発明は、A3G-RNA複合体を妨害することにより、既存のA3Gを活性化するための方法を提供する。換言すれば、本発明は、A3G-RNA複合体を妨害するその能力に基づく、抗ウイルス活性を有する化合物についてスクリーニングする方法を含む。
【００３０】
別の態様において、本発明は、A3G-RNA複合体の形成を防止することにより、生細胞中の既存のA3Gを活性化するための方法を提供する。換言すれば、本発明は、A3G-RNA複合体の形成を防止するその能力に基づく、抗ウイルス活性を有する化合物についてスクリーニングする方法を含む。
【００３１】
A3GとRNAの間の相互作用を阻害するまたは低下させることは、A3Gが活性型で存在することを可能にし、例えば、HIV複製を阻害するA3Gのデアミナーゼ依存性および非依存性の抗ウイルス活性をオンするように切り換える(switch on)。一例において、ウイルスを産生している細胞が、A3GおよびRNAを阻害する作用物質を用いて処理される場合、細胞により産生されているウイルスが不活性化され、このように、感染の今後のラウンドを行うことはできない（または低下した能力を示す）。この様式において、ウイルスの感染性は、本発明のスクリーニング方法により同定された化合物により阻害される。
【００３２】
一態様において、本発明は、HMMとしてのA3GのRNA不活性化を軽減するための組成物および方法を提供する。一部の例において、A3GのRNA不活性化は可逆的であり、一旦A3Gが活性化されると、A3Gは、侵入するウイルスに対して抗ウイルス活性を発揮することができる。一部の例において、本発明の組成物は、非特異的な様式でA3G：RNA複合体を標的化し、ウイルス複製および組込みを阻害することができる。従って、一部の例において、本発明の組成物は、治療的有効性のために、A3Gキャプシド化にのみ依存しない。このように、本発明は、ウイルス耐性を攻撃するための新規の機会を与える。
【００３３】
一態様において、本発明は、ウイルス感染、複製、および細胞染色体DNA中への組み込みを阻害するための先制措置として、細胞中の細胞性A3Gを活性化する方法を提供する。すなわち、一態様において、本発明は、ウイルス感染の前にA3Gの活性型のリザーバーを作製するための方法を提供する。
【００３４】
本明細書において開示する方法は、作用物質を、A3GとRNAの間の相互作用を阻害するその能力について迅速にスクリーニングすることを可能にし、その作用物質は、ウイルス感染を処置する一方で、それを用いない場合には他の種類の抗ウイルス治療から別に生じうる細胞毒性のリスクを低下させることを含むが、これらに限定されない治療的な利益を提供する。好ましくは、ウイルス感染はHIVである。
【００３５】
定義
本明細書において使用する場合、以下の用語の各々は、このセクションにおいてそれに関連する意味を有する。
【００３６】
本明細書において「1つの（a）」および「1つの（an）」という冠詞は、冠詞の文法的な目的語の1つまたは複数（例えば、少なくとも1つ）を指すために使用する。例として、「エレメント」は、1つのエレメントまたは複数のエレメントを意味する。
【００３７】
「結合」という用語は、生理学的条件下での、例えば、共有結合的、静電的、疎水性、イオン性、および/または水素結合の相互作用による少なくとも2つの分子間での直接的な会合を指す。
【００３８】
本明細書において使用する場合、「断片」という用語は、核酸に適用される場合、より大きな核酸の部分配列を指す。核酸の「断片」は、少なくとも約20ヌクレオチド長；例えば、少なくとも約50ヌクレオチドから約100ヌクレオチド；好ましくは、少なくとも約100から約500ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも約500から約1000ヌクレオチド、さらにより好ましくは、少なくとも約1000ヌクレオチドから約1500ヌクレオチド；特に、好ましくは、少なくとも約1500ヌクレオチドから約2500ヌクレオチド；最も好ましくは、少なくとも約2500ヌクレオチドでありうる。
【００３９】
「コードする」は、ヌクレオチドの定義された配列（即ち、rRNA、tRNA、およびmRNA）またはアミノ酸の定義された配列のいずれかを有する、生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび巨大分子の合成のための鋳型としての役割を果たす、ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列、例えば遺伝子、cDNA、またはmRNAなどの固有の特性およびそれに起因する生物学的特性を指す。このように、遺伝子は、その遺伝子に対応するmRNAの転写および翻訳が細胞または他の生物システムにおいてタンパク質を産生する場合、そのタンパク質をコードする。コード鎖、つまり、mRNA配列と同一であり、通常は配列リストにおいて提供されるヌクレオチド配列と、遺伝子またはcDNAの転写のための鋳型として使用される非コード配列との両方が、その遺伝子またはcDNAのタンパク質または他の産物をコードするとして言及することができる。
【００４０】
「発現ベクター」は、発現されるヌクレオチド配列に機能的に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用エレメントを含み；発現のための他のエレメントは、宿主細胞によりまたはインビトロ発現システムにおいて供給することができる。発現ベクターは、当技術分野において公知の全てのもの、例えば、組換えポリヌクレオチドを取り込むコスミド、プラスミド（例えば、ネイキッドのものまたはリポソーム中に含まれるもの）およびウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルス）などを含む。
【００４１】
本明細書において使用する場合、「遺伝子」という用語は、単独でまたは他のエレメントとの組み合わせで、細胞において発現することが可能であるエレメントまたはエレメントの組み合わせを指す。一般的に、遺伝子は以下を含む（5'から3'末端）：（1）原核細胞、ウイルス、または真核細胞（トランスジェニック哺乳動物を含む）などの任意の細胞において機能することが可能である5'非翻訳リーダー配列を含む、プロモーター領域；（2）所望のタンパク質をコードする、構造遺伝子またはポリヌクレオチド配列；および（3）典型的には、転写の終結およびRNA配列の3'領域のポリアデニル化をもたらす、3'非翻訳領域。これらのエレメントの各々が、隣接エレメントへの連続付着により機能的に連結される。上記のエレメントを含む遺伝子を、標準的な組換えDNA方法により、任意の発現ベクター中に挿入する。
【００４２】
本明細書において使用する場合、「遺伝子産物」は、遺伝子の転写、逆転写、重合、翻訳、翻訳後、および/または発現の過程において産生される任意の産物を含む。遺伝子産物は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド断片、またはポリヌクレオチド分子を含むが、これらに限定されない。
【００４３】
「相同」は、本明細書において使用する場合、2つのポリマー分子の間の、例えば、2つの核酸分子、例えば、2つのDNA分子または2つのRNA分子の間の、または、2つのポリペプチド分子の間のサブユニット配列の類似性を指す。
【００４４】
2つの分子の両方におけるサブユニット位置が、同じ単量体サブユニットにより占められる場合、例えば、2つのDNA分子の各々における位置が、アデニンにより占められる場合、それらは、その位置で相同である。2つの配列の間の相同性は、マッチする位置または相同な位置の数の一次関数である。例えば、2つの化合物配列における位置の半分（例えば、ポリマーの10サブユニット長における5つの位置）が相同である場合、2つの配列は50％相同であり、位置の90％、例えば、10個の内9個がマッチするまたは相同である場合、2つの配列は90％相同性を有する。例として、DNA配列の5'ATTGCC3'および5'TATGGC3'は50％相同性を有する。
【００４５】
本明細書において使用する場合、「相同性」は「同一性」と同義的に使用される。
【００４６】
「単離された核酸分子」という用語は、核酸の天然の供給源に存在する他の核酸分子から分離された核酸分子を含む。例えば、ゲノムDNAに関して、「単離された」という用語は、ゲノムDNAが天然に関連する染色体から分離された核酸分子を含む。好ましくは、「単離された」核酸には、その核酸が由来する生物のゲノムDNAにおいて、その核酸に天然で隣接する配列（即ち、その核酸の5'および3'末端に位置づけられる配列）がない。さらに、「単離された」核酸分子には、組換え技術により産生された場合での他の細胞物質または培養培地が実質的になく、あるいは、化学的に合成された場合での化学的前駆体または他の化学物質が実質的にない。
【００４７】
「レンチウイルス」という用語は、本明細書において使用する場合、ウイルスのこの属の種々のメンバーのいずれかでありうる。レンチウイルスは、例えば、哺乳動物、例えばヒツジ、ヤギ、ウマ、ウシ、または、ヒトを含む霊長類などに感染するものでありうる。典型的なそのようなウイルスは、例えば、Viznaウイルス（ヒツジに感染する）；サル免疫不全ウイルス（SIV）、ウシ免疫不全ウイルス（BIV）、キメラサル/ヒト免疫不全ウイルス（SHIV）、ネコ免疫不全ウイルス（FIV）、およびヒト免疫不全ウイルス（HIV）を含む。「HIV」は、本明細書において使用する場合、HIV-1およびHIV-2の両方を指す。本明細書における考察の多くは、HIVまたはHIV-1に関するが、他の適したレンチウイルスも含まれることを理解すべきである。
【００４８】
「哺乳動物」という用語は、本明細書において使用する場合、任意の非ヒト哺乳動物を指す。そのような哺乳動物は、例えば、齧歯類、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、およびブタである。好ましい非ヒト哺乳動物は、ラットおよびマウス、より好ましくはマウスを含む、齧歯類の科より選択される。好ましい哺乳動物はヒトである。
【００４９】
「核酸分子」は、一般的に、DNA分子（例えば、cDNAまたはゲノムDNA）およびRNA分子（例えば、mRNA）ならびにヌクレオチド類似体を使用して生成されたDNAまたはRNAの類似体を含むことを意図する。核酸分子は一本鎖または二本鎖でありうるが、好ましくは、二本鎖DNAである。
【００５０】
「機能的に連結される」という用語は、調節配列と異種核酸配列の間の機能的な連結を指し、後者の発現をもたらす。例えば、第1の核酸配列は、第1の核酸配列が第2の核酸配列と機能的な関係において配置される場合、第2の核酸配列と機能的に連結される。例えば、プロモーターは、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響する場合、コード配列に機能的に連結される。一般的に、機能的に連結されたDNA配列は、近接しており、必要な場合、同じリーディングフレームにおいて2つのタンパク質コード領域を結合する。
【００５１】
本明細書において使用する場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は互換的に使用され、ペプチド結合により共有結合的に連結されたアミノ酸残基からなる化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも2つのアミノ酸を含まなければならず、配置されるタンパク質のまたはペプチドの配列を含みうるアミノ酸の最大数に限界はない。ポリペプチドは、ペプチド結合により互いに結合された2つまたはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書において使用する場合、この用語は、一般的には当技術分野において、例えばペプチド、オリゴペプチド、およびオリゴマーとしても言及される短い鎖、および一般的には当技術分野において、タンパク質として言及され、その内に多くの型がある長い鎖の両方を指す。「ポリペプチド」は、例えば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ポリペプチドの変異体、改変ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質を含む。ポリペプチドは、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの組み合わせを含む。
【００５２】
本明細書において使用する場合、「ポリヌクレオチド」は、cDNA、RNA、DNA/RNAハイブリッド、lineエレメント、sineエレメント、およびaluエレメント、内因性レトロウイルスエレメント、レトロウイルス、アンチセンスRNA、リボザイム、siRNA、ゲノムDNA、合成形態、および混合ポリマー、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含み、化学的または生化学的に修飾されて、非天然ヌクレオチド塩基もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基、合成ヌクレオチド塩基、または半合成ヌクレオチド塩基を含みうる。また、本発明の範囲内に含まれるのは、1つまたは複数のヌクレオチドの欠失、挿入、置換、または他のポリヌクレオチド配列への融合を含むがこれらに限定されない野生型または合成遺伝子の変化であるが、ただし、遺伝子の一次配列におけるそのような変化が、受動免疫を誘発する発現ペプチドの能力を変化させないことを条件とする。
【００５３】
「薬学的に許容される」は、ヒトにおける適用または獣医学的適用のいずれかのために、生理学的に許容できることを意味する。また、「薬学的に許容される」は、生物学的ではなく、かつそうでなければ望ましくないことはない、物質を意味し、即ち、物質を、対象に、任意の望ましくない生物学的な効果を起こすことなくかつ有害な様式で相互作用することなく、それが含まれる薬学的組成物の他の構成要素のいずれかとともに投与してもよい。本質的に、薬学的に許容される物質は、レシピエントに非毒性である。当業者に周知でありうる通り、担体を必然的に選択し、活性成分の任意の分解を最小限にし、対象における任意の有害な副作用を最小限にしうる。薬学的に許容される担体および薬学的組成物の他の構成要素の考察については、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Company, 1990を参照のこと。
【００５４】
本明細書において使用する場合、「薬学的組成物」は、ヒトにおける使用および獣医学的使用のための製剤を含む。
【００５５】
本明細書において使用する場合、「予防する」、「予防すること」、「予防」、「予防的処置」という用語などは、障害または症状を有さないが、それを発生するリスクのあるまたは感受性のある対象において障害または症状を発生する可能性を減少させることを指す。
【００５６】
「組換え核酸」は、組換えDNA技術により別の核酸に隣接して配置されている任意の核酸である。「組換えられた核酸」はまた、実験室の遺伝子技術（例えば、形質転換および組込み、トランスポゾンホッピング、またはウイルス挿入など）により第2の核酸の隣に配置されている任意の核酸を含む。一般的に、組換えられた核酸は、天然では、第2の核酸に隣接して位置づけられない。
【００５７】
「組換えタンパク質」という用語は、組換えDNA技術により産生される本発明のタンパク質を指し、一般的には、発現タンパク質をコードするDNAを適した発現ベクター中に挿入し、次に、該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換して、異種タンパク質を産生する。さらに、組換えタンパク質をコードする組換え遺伝子に関する、「〜に由来する」という語句は、天然タンパク質のアミノ酸配列または天然のタンパク質の置換および欠失を含む変異により生成されたそれと類似のアミノ酸配列を有するそれらのタンパク質を、「組換えタンパク質」の意味の範囲内で含むことを意味する。
【００５８】
「試験作用物質」またはそうでなければ「試験化合物」は、本明細書において使用する場合、本明細書に記載するアッセイ法の1つまたは複数においてスクリーニングされる作用物質または化合物を指す。試験作用物質は、有機小分子、公知の薬剤、ポリペプチド；炭水化物、例えばオリゴサッカライドおよびポリサッカライドなど；ポリヌクレオチド；脂質またはリン脂質；脂肪酸；ステロイド；またはアミノ酸類似体を含むがこれらに限定されない種々の一般的な型の化合物を含む。試験作用物質は、天然産物ライブラリーおよびコンビナトリアルライブラリーなどのライブラリーから得ることができる。また、自動アッセイの方法が公知であり、短期間での数千の化合物のスクリーニングが可能である。
【００５９】
本明細書において使用する場合、「処置する」、「処置すること」、「処置」という用語などは、障害および/またはそれに関連する症候を低下または寛解させることを指す。除外されることはないが、障害または症状を処置することは、障害、症状またはそれに関連する症候が完全に排除されることを必要としないことが理解されるであろう。
【００６０】
「変異体」は、この用語が本明細書において使用される通り、配列において、参照核酸配列またはペプチド配列とそれぞれ異なるが、参照分子の本質的な特性を保持する核酸配列またはペプチド配列である。核酸変異体の配列における変化は、参照核酸によりコードされるペプチドのアミノ酸配列を変えないことがあるか、または、アミノ酸置換、付加、欠失、融合、および切断をもたらしうる。ペプチド変異体の配列における変化は、典型的には、限定的または保存的であり、参照ペプチドおよび変異体の配列は、全体的に密接に類似し、多くの領域において、同一である。変異体および参照ペプチドは、アミノ酸配列において、任意の組み合わせにおける1つまたは複数の置換、付加、欠失により異なりうる。核酸またはペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体など、天然に存在しうるか、または、天然に存在することが公知ではない変異体でありうる。核酸およびペプチドの非天然変異体は、変異誘発技術によりまたは直接合成により作製されうる。
【００６１】
「ウイルス感染性」は、この用語が本明細書において使用される通り、細胞の感染、細胞におけるウイルスの複製、および細胞からの子孫ビリオンの産生のいずれかを意味する。
【００６２】
「ビリオン」は、完全なウイルス粒子；核酸、および一部のウイルスの場合において脂質エンベロープをさらに含むキャプシドである。
【００６３】
説明
本発明は、RNAへのA3G結合を選択的に標的化し、宿主防御を活性化することを、キャプシド化が抗ウイルス作用のA3G抗ウイルス機構のために必要とされない効果的な抗ウイルス治療として使用できるという発見に基づく。一態様において、本発明は、A3G-RNA複合体を解離する作用物質を用いてA3Gを活性化することにより、宿主防御機構に対するHIV耐性を克服する方法を提供する。
【００６４】
したがって、本発明は、A3G：RNA複合体を妨害するスクリーニング方法、および、RNAとのA3G複合体に偏りかつ基づくように設計されているスクリーニング方法により同定された作用物質を含む。同定された作用物質は抗ウイルス化合物と考えられる。なぜなら、それらは、A3GからRNAを解離し、それにより、A3Gの抗ウイルス特性を「オンするように切り換える」からである。結果的に、宿主防御因子は、ウイルス複製複合体と相互作用するように位置づけられ、それにより、ウイルス感染性を遮断する。
【００６５】
本明細書に記載するアッセイ法は、独特であり、HIV/AIDS創薬産業を実際的にする科学技術である。なぜなら、それらは、2つの発見に基づくからである。1つは、A3GへのRNA結合およびA3Gの不活性化が可逆的であることである。2つは、A3GへのRNA結合が、A3GへのRNA結合がA3G宿主抗ウイルス活性を何故阻害するのかについての基礎として、A3Gへの一本鎖DNA基質（例えば、HIV複製の間での逆転写の間に形成されるssDNAなど）結合を外すおよび阻害することである。
【００６６】
スクリーニングの方法
本発明は、インビボまたはインビトロで形成されたRNA-タンパク質複合体の形成を調節または制御する化合物についてのスクリーニングの方法に関する。好ましくは、RNA-タンパク質複合体はRNA-A3Gである。一態様において、スクリーニング方法は、A3G：RNA複合体を試験化合物と、A3G：RNA複合体形成のために効果的である条件下で接触させる段階、および、試験作用物質がA3G：RNAを妨害するか否かを検出する段階を含み、A3G：RNA相互作用の妨害の検出によって、A3G：RNA相互作用を妨害する作用物質が同定される。
【００６７】
他の方法、ならびに本明細書において開示する方法の変形物は、本発明の説明から明らかであろう。例えば、試験化合物は固定または増加してもよい。複数の化合物またはタンパク質は1回で試験してもよい。「調節」、「調節する」、および「調節すること」は、RNA-タンパク質複合体の増強した形成、RNA-タンパク質複合体の形成における減少、RNA-タンパク質複合体の型または種類における変化、あるいはRNA-タンパク質複合体の形成の完全な阻害を指しうる。使用してもよい適した化合物は、タンパク質、核酸、小分子、ホルモン、抗体、ペプチド、抗原、サイトカイン、成長因子、化学療法剤を含む薬理学的作用物質、発癌物質、または他の細胞（即ち、細胞間接触）を含むが、これらに限定されない。スクリーニングアッセイ法を使用して、RNAまたはタンパク質上の結合部位をマップすることもできる。例えば、RNAタグをコードするタグ配列を変異させ（欠失、置換、付加）、次に、変異の結果を判定するためのスクリーニングアッセイ法において使用することができる。
【００６８】
本発明は、試験作用物質、試験化合物、またはタンパク質を、RNA-タンパク質複合体を調節または制御するそれらの能力についてスクリーニングするための方法に関する。インビトロまたはインビボで形成されるRNA-タンパク質複合体を精製するための、および、もしあれば、試験作用物質、試験化合物またはタンパク質の存在下および非存在下で精製されたRNA-タンパク質複合体の間の差を観察するための本発明の方法を実施することにより、差は、試験作用物質、試験化合物、またはタンパク質がRNA-タンパク質複合体を調節することを示す。
【００６９】
本発明の一局面は、レンチウイルスの感染性を阻害する作用物質を同定する（例えば、所望の活性を誘発する1つまたは複数について推定作用物質をスクリーニングする）ための方法である。典型的なそのようなレンチウイルスは、例えば、SW、SHIV、および/またはHIVを含む。本方法は、大規模な量の組換えA3Gの成功した産生を使用する。これは、A3GとRNAの間の相互作用に干渉することができる作用物質を検出するアッセイ法を可能にする。A3G：RNA複合体に干渉する作用物質は、レンチウイルスの感染性を阻害することが期待されうる。さらに、そのような作用物質は、細胞タンパク質の機能に干渉しないことが期待されうるが、このように、もしあれば、A3G：RNA複合体の妨害の結果としての副作用がほとんど誘発されないことが期待されうる。
【００７０】
本方法は、（a）推定阻害物質を、RNAおよびA3Gを含む混合物と、A3G：RNA複合体形成のために効果的である条件下で接触させる段階；および（b）該物質の存在によりA3G：RNA複合体形成のレベルが減少するか否かを検出する段階を含む。一部の例において、該物質はA3Gに結合し、それにより、A3G：RNA複合体形成を阻害する。別の例において、該物質はRNAに結合し、それにより、A3G：RNA複合体形成を阻害する。種々の従来の手順のいずれかを使用して、そのようなアッセイ法を行うことができる。
【００７１】
別の態様において、本方法は、（a）推定阻害物質を、A3G：RNA複合体を含む混合物と、A3G：RNA複合体を維持するために効果的である条件下で接触させる段階；および（b）該物質の存在によりA3G：RNA複合体が妨害されるか否かを検出する段階を含む。一部の例において、該物質はA3Gに結合し、それにより、A3G：RNA複合体を妨害する。別の例において、該物質はRNAに結合し、それにより、A3G：RNA複合体形成を妨害する。種々の従来の手順のいずれかを使用して、そのようなアッセイ法を行うことができる。
【００７２】
本発明は、A3Gと核酸分子の間の相互作用を阻害する化合物を同定するための方法を包含する。一態様において、核酸分子はRNAである。別の態様において、核酸分子はssDNAである。しかし、本発明は、核酸分子の任意の特定の型に限定すべきではない。むしろ、当業者は、本開示を用いた場合、任意のA3G：核酸分子複合体を標的化することが本発明において包含されることを理解するであろう。非限定的な例として、本開示はA3G：RNA複合体を指す。したがって、一態様において、本発明は、A3GとRNAの間の結合を決定するためのアッセイ法を提供する。本方法は、組換えA3GとRNAを、候補化合物の存在下において接触させる段階を含む。候補化合物の非存在下におけるA3G：RNA複合体の量と比較した、候補化合物の存在下におけるA3G：RNA複合体の阻害またはA3G：RNA複合体の低下した量を検出することは、候補化合物がA3G：RNA相互作用の阻害剤であるという指標である。
【００７３】
本明細書において提示する開示に基づき、本発明のスクリーニング方法は、マイクロタイタープレートにおけるハイスループット化合物ライブラリースクリーニングのための頑強なフェルスタークエンチ共鳴エネルギー移動（FqRET）アッセイ法に適用可能である。アッセイ法は、インビトロでのA3GとRNAの間の複合体形成に関するレポーティングを可能にする色素タンパク質または発色団の選択的な配置に基づく。例えば、適切に位置づけられたFRETドナーおよびFRETクエンチャーは、四成分複合体がA3GとRNAの間に形成される場合、「暗い」シグナルをもたらす。しかし、本スクリーニング方法は、本明細書において開示するアッセイ法だけに限定されないはずである。むしろ、本発明の組換えタンパク質およびRNAを、他のハイスループットスクリーニングアッセイ法を含む任意のアッセイ法において使用することができ、それは、RNAとタンパク質の間の結合を制御する作用物質をスクリーニングするために適用可能である。このように、本発明は、タンパク質-RNA相互作用に干渉する作用物質を検出するために有用である任意のアッセイ法における本発明の組換えタンパク質およびRNAの使用を包含する。
【００７４】
当業者はまた、本明細書において提供する開示の観点において、当技術分野において公知の標準的な結合アッセイ法、または将来開発されるものを使用して、有用な化合物を同定するための試験化合物の存在下または非存在下において、本発明のA3GとRNAの結合を評価することができることを理解するであろう。このように、本発明は、この方法を使用して同定された任意の化合物を含む。
【００７５】
本スクリーニング方法は、組換えA3GおよびRNAを含む混合物を試験化合物と接触させる段階、および、A3G：RNA複合体の存在を検出する段階を含み、試験化合物または対照の非存在下における量と比較した、A3G：RNA複合体のレベルにおける減少が、試験化合物がA3GとRNAの間の結合を阻害することができることを示す。特定の態様において、対照は、異なる濃度（例えば、より低い濃度）の試験化合物を用いて、または試験作用物質などの非存在下において、実施される同じアッセイ法である。
【００７６】
任意の特定の理論により拘束されることを望まないが、A3G：RNA複合体が複合体形成の最大レベルを含むと考えられる。なぜなら、A3GおよびRNAの存在が、公知の対照阻害剤の非存在下において互いに結合する傾向を有するからである。試験化合物の活性を、試験化合物がA3G：RNA複合体形成のレベルを減少させることができるか否かを判定することにより測定することができる。
【００７７】
試験化合物が、A3G：RNA複合体の形成に干渉する能力を判定することは、例えば、A3Gタンパク質またはRNAをタグ、ラジオアイソトープ、または酵素標識と結合させることにより達成することができ、A3G：RNA複合体を、複合体における標識された構成要素を検出することにより測定することができる。例えば、複合体の構成要素（例えば、A3GまたはRNA）を、32P、125I、35S、14C、または3Hを用いて、直接的または間接的に標識することができ、ラジオアイソトープを放射線放出の直接カウントによりまたはシンチレーションカウントにより検出する。あるいは、複合体の構成要素を、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼを用いて酵素的に標識することができ、次に、適切な基質の産物への変換の決定により、酵素標識を検出する。
【００７８】
試験化合物がA3G：RNA複合体に干渉する能力を判定することはまた、科学技術、例えばリアルタイムの生体分子相互作用分析（BIA）（Sjolander et al., 1991, Anal. Chem. 63: 2338-2345およびSzabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 699-705に記載される）などを使用して達成することができる。BIAは、相互作用物のいずれも標識することなく、リアルタイムで生体特異的な相互作用を研究するための科学技術である（例えば、BIAcore, BIAcore International AB, Uppsala, Sweden）。表面プラズモン共鳴（SPR）の光学現象における変化は、生体分子の間のリアルタイム反応の指標として使用することができる。
【００７９】
本発明の方法の複数の態様において、A3GまたはRNAのいずれかを固定化し、一方または両方の分子の非複合体形態から複合体形態の分離を促し、かつ、アッセイ法の自動化に適応させることが望ましいことがある。A3G：RNA複合体に対する試験化合物の効果は、反応物を含むのに適した任意の容器を使用して達成することができる。そのような容器の例は、マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管を含む。一態様において、融合タンパク質を提供することができ、それは、タンパク質の1つまたは両方がマトリクスに結合することが可能なドメインを加える。例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ/標的融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemical, St. Louis, Mo.）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着することができ、次に、試験化合物の存在下において、それを、A3G：RNA複合体の他の対応する構成要素と組み合わせる。混合物を、複合体形成に貢献する条件下で（例えば、塩およびpHに関する生理学的条件で）インキュベートする。インキュベーションに続き、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄し、任意の非結合物質を除去し、マトリクスをビーズのケース中に固定化し、複合体の形成を直接的または間接的のいずれかで、例えば、上に記載する通りに判定する。
【００８０】
試験化合物は、以下を含む、当技術分野において公知のコンビナトリアルライブラリー方法における多数のアプローチのいずれかを使用して得ることができる：生物学的ライブラリー；空間的にアドレス指定可能である平行した固相ライブラリーまたは液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー方法；「1ビーズ1化合物」ライブラリー方法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー方法。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定され、他の4つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の小分子ライブラリーに適用可能である（Lam et al., 1997, Anticancer Drug Des.12: 45）。
【００８１】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当技術分野において、例えば、以下において見出すことができる：DeWitt et al., 1993, Proc. Natl. Acad. USA 90: 6909；Erb et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422；Zuckermann et al., 1994, J. Med. Chem. 37: 2678；Cho et al., 1993, Science 261: 1303；Carrell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed.Engl. 33: 2059；Carell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061；およびGallop et al., 1994, J. Med. Chem. 37: 1233。
【００８２】
化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Houghten, 1992, Biotechniques 13: 412-421）、またはビーズ（Lam, 1991, Nature 354: 82-84）、チップ（Fodor, 1993, Nature 364: 555-556）、細菌（Ladner、米国特許第5,223,409号）、胞子（Ladner、米国特許第5,223,409号）、プラスミド（Cull et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869）上で、あるいは、ファージ上（Scott and Smith, 1990, Science 249: 386-390；Devlin, 1990, Science 249: 404-406；Cwirla et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-6382；Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222: 301-310；およびLadner、上記）で提示されてもよい。
【００８３】
「ハイスループット」様式が好ましい状況において、有用な特性を伴う新規の化学的実体を、特定の望ましい特性または活性を伴う化学的化合物（「リード化合物」と呼ぶ）を同定し、リード化合物の変異体を作製し、それらの変異体化合物の特性および活性を評価することにより生成することが典型的である。現在の傾向は、創薬の全ての局面について時間スケールを短縮することである。
【００８４】
一態様において、ハイスループットスクリーニング方法は、所望の活性を潜在的に有する多数の化合物（候補化合物）を含むライブラリーを提供する段階を含む。次に、そのような「コンビナトリアル化学ライブラリー」を、本明細書に記載する通りの1つまたは複数のアッセイ法においてスクリーニングし、所望の特徴的な活性を表示するそれらのライブラリーメンバー（特定の化学種またはサブクラス）を同定する。このようにして同定された化合物は、従来の「リード化合物」としての役割を果たすことができる、あるいは、それ自体を、潜在的なまたは実際の治療薬として使用することができる。
【００８５】
処置の方法
一態様において、本発明は、ウイルス感染と関連する疾患、障害、または症状を処置する方法を提供する。好ましくは、ウイルス感染はHIVである。本方法は、対象、例えば哺乳動物、好ましくはヒトに、A3GとRNAの間の相互作用を阻害する薬学的組成物の治療有効量を投与する段階を含む。
【００８６】
本発明は、本明細書において他で考察するスクリーニング方法を使用して同定された化合物を含む。そのような化合物は、HIV感染、またはそうでなければA3G：RNA複合体の解離不能に関連する障害を処置するための治療薬として使用することができる。
【００８７】
A3GとRNAの間の相互作用を阻害するための化合物についての能力は、ウイルス感染、例えば、HIV感染を防ぐかまたはそうでなければ予防するための治療薬を提供することができる。
【００８８】
このように、本発明は薬学的組成物を含む。有用である薬学的に許容される担体は、グリセロール、水、生理食塩水、エタノール、および、リン酸塩および有機酸の塩などの他の薬学的に許容される塩溶液を含むが、これらに限定されない。これらおよび他の薬学的に許容される担体の例は、Remington's Pharmaceutical Sciences（1991, Mack Publication Co., New Jersey）に記載されており、その開示は、その全体において本明細書において示されるかのように、参照により組み入れられる。
【００８９】
薬学的組成物は、滅菌の注射可能な水性または油性の懸濁液または溶液の形態で、調製、パッケージ化、または販売してもよい。この懸濁液または溶液は、公知の技術に従って製剤化してもよく、活性成分に加えて、本明細書に記載する追加の成分、例えば分散剤、湿潤剤、または懸濁剤などを含んでもよい。そのような滅菌の注射可能な製剤は、腹膜で許容される非毒性の希釈剤または溶媒、例えば水または1,3-ブタンジオールなどを使用して調製してもよい。他の許容される希釈剤および溶媒は、リンゲル溶液、等張塩化ナトリウム溶液、および合成のモノグリセリドまたはジグリセリドなどの固定油を含むが、これらに限定されない。
【００９０】
本発明の方法において有用である薬学的組成物を、経口投与経路、直腸投与経路、膣投与経路、腹膜投与経路、局所投与経路、肺投与経路、鼻腔内投与経路、口腔投与経路、眼投与経路、または別の投与経路に適した製剤中で、投与、調製、パッケージ化、および/または販売してもよい。他の企図される製剤は、投影されたナノ粒子、リポソーム調製物、活性成分を含む再シール形成赤血球、および免疫学的に基づく製剤を含む。
【００９１】
本発明の組成物は、経口、直腸、膣、腹膜、局所、肺、鼻腔内、口腔、または眼の投与経路がこれらに限定されない多数の経路を介して投与されうる。投与の経路は、当業者に容易に明らかであろうが、処置されている疾患の型および重症度、処置されている動物またはヒトの患者の型および年齢などを含む任意の数の因子に依存するであろう。
【００９２】
本明細書において使用する場合、薬学的組成物の「腹膜投与」は、対象の組織の物理的な破れにより特徴付けられる投与および組織における破れを通しての薬学的組成物の投与の任意の経路を含む。腹膜投与は、このように、組成物の注射による、外科的切開を通じた組成物の適用による、組織貫通非外科的創傷を通しての組成物の適用によるなどの薬学的組成物の投与を含むが、これらに限定されない。特に、腹膜投与は、皮下注射、腹腔内注射、筋肉内注射、胸骨内注射、および腎臓透析注入技術を含むが、これらに限定されないことが企図される。
【００９３】
薬学的組成物は、対象への投与に適した形態で活性成分単独からなりうる。または、薬学的組成物は、活性成分および1つまたは複数の薬学的に許容される担体、1つまたは複数の追加の成分、あるいはこれらの特定の組み合わせを含みうる。活性成分は、生理学的に許容されるエステルまたは塩の形態で、例えば生理学的に許容される陽イオンまたは陰イオンとの組み合わせなどで薬学的組成物中に存在しうるが、当技術分野において周知の通りである。
【００９４】
本明細書に記載する薬学的組成物の製剤は、公知のまたは薬理学の当技術分野において今後開発される任意の方法により調製されうる。一般的に、そのような調製方法は、活性成分を、担体あるいは1つまたは複数の他のアクセサリー成分と会合させる段階、および、次に、必要であるかまたは望ましい場合、所望の単一または複数用量単位に産物を成形またはパッケージ化する段階を含む。
【００９５】
本明細書において提供される薬学的組成物の説明は、主に、ヒトへの倫理的投与に適した薬学的組成物に指向しているが、そのような組成物が、一般的に、全ての種類の動物への投与に適していることが当業者により理解されうる。組成物を種々の動物への投与に適するようにするための、ヒトへの投与に適した薬学的組成物の改変が十分に理解されており、当業者の獣医薬理学者は、単に普通の、もしあれば実験法を用いて、そのような改変を設計および実施することができる。本発明の薬学的組成物の投与が企図される対象は、ヒトおよび他の霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコおよびイヌなどの商業的に関連する哺乳動物を含む哺乳動物を含むが、これらに限定されない。
【００９６】
本発明の薬学的組成物の放出制御製剤または徐放性製剤を、従来の技術を使用して作製してもよい。
【００９７】
腹膜投与に適した薬学的組成物の製剤は、滅菌水または滅菌等張生理食塩水などの薬学的に許容される担体と組み合わせた活性成分を含む。そのような製剤は、ボーラス投与のためまたは継続投与に適した形態で、調製、パッケージ化、または販売してもよい。注射可能な製剤は、アンプル中などの単位剤形中でまたは保存剤を含む複数用量容器中で、調製、パッケージ化、または販売してもよい。腹膜投与のための製剤は、懸濁液、溶液、油性または水性のビヒクル中のエマルション、ペースト、および、埋め込み型の徐放性製剤または生分解性製剤を含むが、これらに限定されない。そのような製剤は、懸濁剤、安定剤、または分散剤を含むがこれらに限定されない、1つまたは複数の追加の成分をさらに含みうる。腹膜投与のための製剤の一態様において、活性成分は、再構成組成物の腹膜投与の前の適したビヒクル（例えば、滅菌した発熱物質なしの水）を用いた再構成のための乾燥（即ち、粉末または顆粒）形態で提供される。
【００９８】
薬学的組成物は、滅菌の注射可能な水性または油性の懸濁液または溶液の形態で、調製、パッケージ化、または販売してもよい。この懸濁液または溶液は、公知の技術に従って製剤化してもよく、活性成分に加えて、本明細書に記載する追加の成分、例えば分散剤、湿潤剤、または懸濁剤などを含んでもよい。そのような滅菌の注射可能な製剤は、腹膜で許容される非毒性の希釈剤または溶媒、例えば水または1,3-ブタンジオールなどを使用して調製してもよい。他の許容される希釈剤および溶媒は、リンゲル溶液、等張塩化ナトリウム溶液、および、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドなどの固定油を含むが、これらに限定されない。有用である他の非経口投与可能な製剤は、微結晶形態中に、リポソーム調製物中に、または生分解性ポリマー系の成分として、活性成分を含むものを含む。徐放または埋め込みのための組成物は、薬学的に許容されるポリマー物質または疎水性物質、例えばエマルション、イオン交換樹脂、難溶性ポリマー、または難溶性塩などを含みうる。
【００９９】
局所投与に適した製剤は、液体調製物または半液体調製物、例えばリニメント、ローション、水中油型または油中水型のエマルション、例えばクリーム、軟膏、またはペーストなど、および溶液または懸濁液などを含むが、これらに限定されない。局所的に投与可能な製剤は、例えば、約1％から約10％（w/w）までの活性成分を含みうるが、活性成分の濃度は、溶媒中の活性成分の溶解限度と同じ高さでありうる。局所投与のための製剤は、本明細書に記載する追加の成分の1つまたは複数をさらに含みうる。
【０１００】
典型的には、動物に、好ましくはヒトに投与してもよい本発明の化合物の投与量は、処置されている動物の型および疾患状態の型、動物の年齢、および投与の経路を含むがこれらに限定されない任意の数の因子に依存して、変動しうる。
【０１０１】
本化合物は、動物に、1日数回の頻度で投与することができる。あるいは、それは、例えば1日1回、1週間に1回、2週間毎に1回、1ヶ月に1回、またはさらにより低い頻度で、例えば数ヶ月毎に1回またはさらに1年もしくはそれ未満で1回などのより低い頻度で投与してもよい。用量についての頻度は、当業者に容易に明らかであり、処置されている疾患の型および重症度、動物の型および年齢などではあるがこれらに限定されない任意の数の因子に依存すると考えられる。好ましくは、本化合物は、注射後少なくとも1日にわたる持続効果を提供するボーラス注射として投与されるが、この投与が必要である訳ではない。ボーラス注射は腹腔内に提供することができる。
【実施例】
【０１０２】
ここで、本発明を、以下の実施例を参照して記載する。これらの実施例は、例証だけの目的のために提供される。本発明は、これらの実施例に限定されないが、むしろ、本明細書において提供される教示の結果として明らかである全ての変形物を包含する。
【０１０３】
活性化CD4+細胞（HIV複製を支持する）における大多数のhA3GはHMM形態で回収されるのに対し、非感染静止CD4+細胞（HIV感染に耐性である）におけるものはLMMである（Chiu, et al., 2005, Nature. 435: 108-14；Kreisberg, et al., 2006, J Exp Med. 203: 865-70；Chiu, et al., 2006, J Biol Chem. 281: 8309-12；Cullen, 2006, J Virol. 80: 1067-76）。HIVは、実験的に混合されたTリンパ球細胞集団におけるHMM複合体中にhA3Gの大半がある細胞に優先的に感染した（Kreisberg, et al., 2006, J Exp Med. 203: 865-70）。HMM中のhA3Gの回収の増加もまた、単球からマクロファージへの成熟の間に、つまり、HIV感染に対する許容性の増加に関連するが、全細胞hA3Gの存在量の低下にも関連する分化プロセスの間に観察された（Stopak, et al., 2006, J Biol Chem. 282: 3539-46；Chiu, et al., 2005, Nature. 435: 108-14；Peng et al., 2006, J Exp Med. 203: 41-6）。樹状細胞（DC）の成熟は、hA3G mRNAおよびタンパク質の発現の増加に関連した。しかし、PBMCとは対照的に、成熟DCは、R5栄養性HIVに対して許容性が低くなった。成熟DC（ポリ（I：C）/TNF-αを用いてインビトロで分化させた）における全細胞hA3Gのパーセンテージの増加が、未成熟DCと比較して、LMM複合体においてあった（Stopak, et al., 2006, J Biol Chem. 282: 3539-46）。成熟DCは、従って、HMMを形成する手段を欠いたか、または、細胞RNAとのhA3G相互作用を積極的に阻害した。A3Gの抗ウイルス活性は、ウイルス複製機構の進行を物理的に遮断する、ならびに、新生プロウイルスDNAに結合し、かつdCからdUへの移行（脱アミノ化）を介した複数の変異を触媒するその能力から生じる。これらの活性は、活性化T細胞がそれらの静止状態に戻る場合、存在しない（Santoni de Sio et al., 2009 PLoS One 4: e6571）。なぜなら、A3Gが、高分子量（HMM）凝集体中に隔離されたままであるからである。HMM複合体は、細胞RNAへのA3Gの非特異的結合を介して一緒に繋留される複数（4〜＞20）の不活性化A3Gサブユニットで構成されうる（Chiu et al., 2005 Nature 435: 108-114；Gallois-Montbrun et al., 2007 J Virol, 81: 2165-2178；Kozak et al., 2006 J Biol Chem 281: 29105-29119；Stopak et al., 2007 J Biol Chem 282: 3539-3546；Chelico et al., 2006 Nat Struct Mol Biol 13: 392-399；Sheehy et al., 2002 Nature 418, 646-650；Wichroski et al., 2006 PLoS Pathog 2: e41）。従って、実験は、hA3G-RNA複合体を標的化し、HMMをLMMにインビボで変換するように設計した。これは、潜伏ウイルスについての新規の治療的介入として与えられる。
【０１０４】
本明細書において提示する実施例は、HIV発明を処置するために有用である作用物質についてアッセイする方法を実証する。本明細書において提示する実施例は、hA3Gを解離し、それをRNAから解放する戦略としてhA3G：RNA複合体を標的化することに関し、hA3Gの抗ウイルス活性がHIVの活動性または潜伏感染に対して防御することを可能にする。
【０１０５】
実施例1：既存のhA3Gの活性化
以下の実験は、APOBEC3G（A3G）のアクチベーターがウイルス耐性の出現を減少させることができるという考えに基づく。A3Gは、それがHIV複製を阻害することを可能にする酵素的および非酵素的な特性の両方を有する（Holmes, et al., 2007, Trends Biochem Sci, 32: 118-128）。この宿主-防御因子の有効性は、細胞RNAの全ての形態に非特異的に結合し、それにより、オリゴマー化し、高分子量（HMM）凝集体を形成するその能力のため、活性化T細胞において損なわれる（Chiu, et al., 2005, Nature, 435: 108-114；Gallois-Montbrun, et al., 2007, J Virol, 81: 2165-2178；Kozak, et al., 2006, J Biol Chem, 281:29105-29119；Kreisberg, et al., 2006, J Exp Med, 203: 865-870；Stopak, et al., 2007, J Biol Chem, 282: 3539-3546）。RNA依存性凝集の大きさは、それが、HIVの感染および炎症に続き、T細胞中のA3G分子の実質的に全てを取込み、不活性化するほどである。宿主防御について追加的に危険にさらすことは、T細胞が静止状態に入る際、A3Gが直ちに再活性化にならないことであり（Santoni de Sio, et al., 2009, PLoS One, 4: e6571）、ウイルス耐性の出現が、HMMにおよびウイルスリザーバー内でのA3G抗ウイルス活性の非存在に部分的に起因しうることを示唆している。しかし、細胞中に存在するA3Gが侵入するウイルスと相互作用し、それらの複製を阻害し、それにより、細胞を非許容性にすることができるか否か、または、A3Gが、抗ウイルス活性を発揮するために、ウイルス粒子を伴う細胞に入らなければいけないか否か（Chiu, et al., 2008, Annu Rev Immunol, 26: 317-353）の論争がある。これに関連して、ビリオンとのA3Gキャプシド化についての宿主細胞RNAまたはウイルスRNAとのA3G相互作用の重要性をめぐる議論がある（Strebel, et al., 2008, Retrovirology, 5:55）。本発明の高リスクな局面は、A3G：RNA結合の完全な阻害が、キャプシド化が、A3Gが抗ウイルス性であることができる唯一の手段である場合、その抗ウイルス活性を阻害しうることである。しかし、文献はまた、複製するウイルスDNA上でのA3Gキャプシド化およびdCからdUへのそのデアミナーゼ活性が、A3GがHMMとしてRNAに結合していないことを必要としたことを示す（Chiu, et al,. 2006, Trends Immunol, 27: 291-297; Khan, et al., 2009, Retrovirology, 6:99；Opi, et al., 2006, J Virol, 80: 4673-4682; Soros, et al., 2007, PLoS Pathog, 3:e15）。このように、A3Gアクチベーターは、HMM凝集体を形成するA3Gの傾向を低下させ、主要な戦略的な利点を与えうることが提示されている。なぜなら、それらは、ウイルス組込みの前およびVif依存性A3G分解前の、ウイルスライフサイクルの初期段階の間に、宿主-防御（先制攻撃）を可能にしうるからであり、A3Gキャプシド化が重要な考慮となったからである。
【０１０６】
したがって、実験は、組換えA3GおよびRNAを含むインビトロで構築されたHMM複合体に基づくA3Gアクチベーター（ヒット）についてのハイスループットスクリーニング（HTS）のためのアッセイ法を確立するように設計された。また、実験は、ヒットがアンタゴニストとして特徴付けられうるが、A3GへのRNA結合を完全には排除しなかったか否かを評価するように設計された。
【０１０７】
本明細書において他に開示する通り、（i）RNアーゼの包含に依存したLMM二量体またはHMM四量体としての物質の＞90％を伴う＞7mg/mlの量でのhA3Gの発現が達成されており、（ii）LMMおよびHMM hA3Gの両方が、外因性RNAにインビトロで結合することが示されており、（iii）ゲルシフト分析によって、24merおよび41merプローブとのhA3G核酸複合体の効率的な構築が示されており、（iv）hA3GのN末端内の個々の残基がRNAへの結合のために必要であるが、全長hA3Gだけが実際にRNAに結合し、（v）インビトロのデアミナーゼ活性および感染性のアッセイ法の機能的エンドポイント、および（vi）qFRETドナー-アクセプター対とスクリーニングのための適切な多様性セット化合物ライブラリーとの商業的な供給源の考慮。
【０１０８】
以下の実験を、HMM複合体におけるhA3G-RNAを妨害することにより細胞中に存在する既存のhA3Gを活性化するように設計した。hA3G-RNA複合体を妨害することによって、デアミナーゼ依存性および非依存性機構の両方について抗ウイルス活性が促進されると考えられる。潜伏ウイルスからのHIV VifはhA3G分解を促進し続けうるが、hA3G活性化は、細胞が抗ウイルス活性を用いて「反撃する」ことを可能にする。
【０１０９】
HTSアッセイ法が、RNAへのA3G結合に拮抗し、それにより、HMMとしてのA3GのRNA依存性凝集を減少させる化合物についてスクリーニングするように開発された。アッセイ法は、（1）A3GとRNAとの相互作用を低下させた化合物についてポジティブシグナルを産生し、（2）アッセイバックグラウンドと理論的な最大シグナルの間の良好なダイナミックレンジを有し、かつ（3）384ウェルマイクロタイタープレートフォーマット中のHTSについて適応された。クエンチFRET（FqRET）アッセイ法が、A3G：RNA複合体形成に基づいて確立されており、それは、647nm光により放射された場合に化合物Alexa647（A3Gに結合されている）から放射される蛍光を吸収およびクエンチングする化合物QXL670（RNAに結合されている）の能力を利用する。ヒットは、クエンチングを逆転し、670nMで赤色蛍光を誘導するそれらの能力を介して同定された。
【０１１０】
実施例2：アッセイ構成要素およびそれらの相互作用の検証
非特異的RNAのどの長さおよび配列がA3G：RNA複合体の最も効率的な形成をもたらしうるかを判定するための実験を実施した。A3Gを、バキュロウイルスシステムを使用して発現させ、ニッケル親和性クロマトグラフィーにより精製した。GC含量およびAU含量の異なるRNAを化学的に合成するか、または、10〜99ヌクレオチド（nt）の変動する長さで、インビトロで転写した。A3G：RNA複合体を、これらのRNAを用いて、広範なA3G濃度にわたりインビトロで構築した。小さいおよび大きい複合体の収量を、天然ゲル上の電気泳動移動度シフトアッセイ法（EMSA）により決定した。これらの研究は、GCリッチRNAがA3Gに結合しないが、AUリッチRNAはA3Gに、しかし、低親和性で結合することを示した。4番目のヌクレオチド毎にGまたはCを含むAUリッチRNA配列が、研究に最適であるとして同定された。なぜなら、それは、A3Gについて最も高い結合親和性を有したからである（Kd＝30nM）（A3GへのこのRNA結合の例を、図8に示す）。A3G HMM凝集体のサイズが、RNAの長さの増加に伴い増加し、＜20ntのRNAは効率的に結合しなかった。99ntのRNAをHTSアッセイ法のために選択した。以下のデータについて使用されたRNAは、以下の配列を有した。
2013534808.tif 000003
【０１１１】
DNA基質へのA3G結合に対するA3GへのRNA結合の効果を判定するために次の実験を実施した。A3G：DNA複合体を、標準的なデアミナーゼアッセイ条件下で、放射性DNAを用いてインビトロで構築し、EMSAにより、先立つ競合を伴わずまたは伴って、非標識99nt RNAの増加濃度から分析した（図1、左パネル）。EMSAゲルは、A3Gを伴わない放射標識DNAの速い移動バンドを示したが（左下）、それは、DNAとインキュベートされたA3Gとの遅い複合体にシフトする（第2レーン、赤色矢印により示す）。非標識RNAの増加量を、各々の構築反応に、RNA：DNAの0.5〜100倍モル過剰量加えた場合、A3G：DNA複合体は、電気泳動移動度がより大きいより小さな複合体に解離し、最終的には、DNAはA3Gから全て遊離した。データは、RNAが、A3G結合についてDNAと競合することを実証し、それにより、A3G：RNA凝集体が宿主防御において何故効果的ではないのかについて1つの説明を示唆した。
【０１１２】
EMSAのために使用され、デアミナーゼ活性のためのssDNA基質としての役割を果たすssDNAは、以下の配列を伴う41ntのssDNAである。
2013534808.tif 000004
【０１１３】
RNA結合が、DNAにおけるA3Gデアミナーゼ活性を阻害しうると考えられた。上に記載するものと同じ実験条件を使用して、DNA基質を、DNAを伴うA3Gとの、RNA競合を伴わないまたは伴うインビトロのインキュベーションの後に精製した。A3Gによる脱アミノ化に起因するCからUの変化を伴うDNA基質のパーセントを、dATPの代わりの鎖終結ヌクレオチドddATPの包含を介したdUについてのプライマー伸長シークエンシングにより決定した（図1、右パネル）。反応産物を変性ゲル電気泳動により分解した。放射標識プライマー（P）が伸長して、非改変DNA上で長い産物（C）、および、A3GがCからUの改変を触媒したDNA上で短い産物（U）（プライマー伸長へのddATP誘導性停止に起因する）が産生された。RNA競合を伴わない反応条件は、U移行を伴うDNAの71％をもたらした。競合RNAは、デアミナーゼ活性の顕著な阻害を誘導した。EMSAおよびデアミナーゼデータを比較することにより、活性DNAデアミナーゼ複合体のRNA依存性溶解が、デアミナーゼ活性の最大喪失に対応することが明らかであった。この知見は新規であり、RNAが、DNA基質をA3Gから外すことによりA3Gデアミナーゼ活性を阻害することを示した。データはまた、A3Gの関連する生物学的特性がインビトロでモデル化することができることを示した。
【０１１４】
実施例3：クエンチフェルスター共鳴エネルギー移動（qFRET）を用いるhA3G-RNA複合体の妨害についてのポジティブ選択スクリーニング
以下の実験を、A3Gに結合したRNAがssDNAにおけるデアミナーゼ活性を不活性化し、RNAの除去が抗ウイルス活性を再活性化するとの理論的根拠に基づいて設計した。A3GへのRNA結合を妨害する化合物についてのポジティブ選択は、qFRETに基づく。結合したFRET対（FRETドナーおよびアクセプター）を、最適な重複スペクトルについて評価し、アクセプターはドナーの蛍光をクエンチングするが、それ自体は、蛍光を発せず、かつ天然hA3G構造を変えない。FRETクエンチャーQXL（商標）520は上の基準を満たす（AnaSpec, CA）。精製されたEGFP-hA3G（FRETドナーとして、509nmでの放射）を、QXL520含有RNAオリゴヌクレオチドとインビトロで反応させることができる。QXL520を、RNA内の異なる位置に、合成の間に配置し、hA3G-RNA複合体におけるFRET対の近接を最適化する。RNAプローブによるhA3Gクエンチングが可逆的であることを評価するために、EGFP蛍光およびインビトロのデアミナーゼ活性を、RNアーゼ消化に続く、適切なタンパク質折り畳みおよび機能のエンドポイントとして使用する。QXL520を欠くRNAと形成したhA3G-RNA複合体は、クエンチングしないはずである（ネガティブ対照）。
【０１１５】
任意の特定の理論により拘束されることを望まないが、hA3G-RNA複合体を妨害する化合物についてのポジティブな読み出しを用いるスクリーニングは、「ヒット」についてのネガティブシグナルを用いたスクリーニングよりも優れていると考えられる。FRET中の適切なクエンチャーを、それらが、蛍光分子の放射スペクトルと比べて、吸収極大を実証する波長、ならびに、それらを、実験のバッファー条件に適合し、コンジュゲーションを受け入れられるようにする化学的特徴に基づいて選ぶ。EGFPの波長（509nm）で放射されたエネルギー量子を吸収することができる化合物が、短距離内
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および適切な双極子（配向）で位置づけられる場合に、レーザー励起後にEGFPから放射された蛍光はクエンチングされる（暗くなる）（Cullen, 2006, J Virol. 80: 1067-76；Peng et al., 2006, J Exp Med. 203: 41-6）。
【０１１６】
hA3Gのナノモル量を、N末端またはC末端のEGFPを伴う可溶性蛍光タンパク質（Bennett et al., 2008 JBC 283(12): 7320-7）として、クエンチャーQXL520を用いて5'に、3'に、または内部にコンジュゲートされたRNAの増加量を用いて滴定し、RNA結合および蛍光のクエンチングを達成する。種々の長さおよび配列のRNAを、商業的に合成するかまたはhA3Gとの構築のためにインビトロで転写することができる。hA3G-RNA複合体形成に起因するクエンチング活性を、標準的なデアミナーゼ反応バッファー条件において時間分解蛍光測定法によりモニターする。ゲルシフト分析を使用して、hA3G-RNA結合効率をモニターすることができる。
【０１１７】
蛍光の最良のクエンチングを可能にするqFRETドナー-アクセプター対を同定することが重要である。RNA＋アルブミンは、最大にクエンチングされた（暗）対照としての役割を果たし、EGFP-hA3Gは、単独でまたは非標識RNAとともに、最大にクエンチングされていない（蛍光）対照としての役割を果たす。反応物のRNアーゼ消化は、EGFP-hA3Gを遊離させ、クエンチングが標識RNAの結合に起因したことを実証することができる。EGFP-QXL520ドナー-アクセプター対を、qFRETについてのスペクトルの重なりおよびエネルギー収支において一致させるが、ドナー/アクセプターの他の組み合わせは、商業的に利用可能であり、かつ、探索されて最大クエンチングを達成することができる。例えば、hA3Gを、クエンチャーQXL570と（異なる末端および異なるR基で）化学的に結合することができ、Cy3を、合成の間にRNA中に組み込ませ、蛍光ドナーを産生することができる。
【０１１８】
HTSのためのアッセイ法の最適化
FqRET HTSアッセイ法を確立するために、A3Gを、Alexa Fluor647と化学的に結合させ、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。99ntのRNAを、アミノアリルUTPを用いてインビトロで転写させ、クエンチャーQXL670との化学的結合のための部位を導入した。RNAをQXL670とインキュベートし、QXL670-RNAをゲル電気泳動により精製した。Alexa647-A3G：QXL670-RNA複合体形成を、EMSAにより確認した。これらの複合体は、1：5のA3G：RNAのインプットで670nMの蛍光の＞50％クエンチングを実証した。アッセイ法はHTSのために理想的である。なぜなら、それにはロボット工程がほとんど含まれないからである（均質アッセイ法）。Alexa647-A3G：QXL670-RNA複合体のRNアーゼ消化によるクエンチングの完全な逆転によって示される通り、クエンチングは、A3GへのRNA結合に依存的であった（図2、上パネル）。ライブラリー化合物をDMSO中に溶解させる場合の、FqRETアッセイ法の重要な特徴は、蛍光シグナルが5％までのDMSOにより影響を受けないことである（図2、下パネル）。バックグラウンドからヒットシグナルを識別するアッセイ法の能力を評価するためのHTS分野における基準は、Z因子である。Zは1-[(3 sq ＋ 3 su)/(平均q-平均u)]として計算され、式中、s＝標準偏差、q＝Alexa647-A3G：QXL647-RNA複合体からのクエンチングシグナル、およびu＝Alexa647-A3G単独からの非クエンチングシグナルである。許容されるz因子は0.5でありうる。384ウェルプレート中でのアッセイ法についてのZ因子は、0.7であると計算され、従って、突出していた。クエンチングされたA3G：RNA複合体を大量に手作業で構築し、それらを384ウェルプレートへロボットで分散させるまで、-80℃で保存した。複合体は、凍結融解に安定である。薬物様小分子のライブラリーからの広範な濃度の個々の化学物質を、各ウェルに加えて、4時間後、各ウェルからの蛍光を、ベースラインおよびAlexa647-A3G単独としての（最大蛍光としての）未処置（クエンチング）反応と比べて、ロボットプレートリーディングにより定量化した。Alexa647-A3G、QXL670-RNA、およびAlexa647-A3G：QXL670-RNA複合体を、1日でルーチン的に産生し、15,000の化合物をスクリーニングすることができる。
【０１１９】
qFRETシステムを、ハイスループットスクリーニングのためのマイクロタイターディッシュフォーマットに最適化することができる。本明細書において他に記載する条件を、384ウェルプレートフォーマットまでスケール変更することができ、蛍光クエンチングを、Perkin Elmerプレートリーダーを用いて測定し、スクリーニングのための読み出しを較正することができる。任意の特定の理論により拘束されることを望まないが、化学物質ライブラリーをスクリーニングすることは、ハイスループットを必要とし、最大数の化合物を最短時間でサンプリングすることができると考えられる。クエンチングのための最適条件近くのhA3G RNA結合条件を、384ダークウェル マイクロタイターディッシュの容積にスケールダウンし、Perkin Elmerプレートリーダーを使用して分析した。
【０１２０】
qFRETシステムを使用して、小分子の限られた多様性セットを使用して、hA3G-RNA複合体を妨害する化合物をスクリーニングすることができる。試験することができる非限定的なライブラリーは、Life Chemistry、Maybridge、MyriaScreen、Sigma-Aldrich Screenから得ることができ、それらは、一緒で、合計約＞150,000の化合物を含み；他のHIV標的についてのスクリーニングにおいて「ヒット」を得るためにうまく使用されてきた補完的な、しかし、広いファルマコフォアの5つおよび代表のリピンスキーの法則に全てが従う。hA3G-RNA相互作用を低下させ、デアミナーゼ活性を遮断しないヒットを、感染性を減少させるが、細胞毒性が無いまたは細胞毒性が低い化合物についてさらに評価する。
【０１２１】
Life Chemistry、Maybridge、MyriaScreen、およびSigma-Aldrichライブラリーは、ファルマコフォアを広くサンプリングする薬物様化合物の適切な多様性セットとして頻繁に引き合いに出される。化合物は、構築反応の間に加えられる0.005〜5マイクロモルの範囲にわたり試験される。現在の能力は、30個の384ウェルプレート/日のセットアップおよび評価を可能にする。ポジティブ対照およびネガティブ対照を用いるウェルについてカウントし、約20,000の化合物を1週間に評価することができると考えられる。「ヒット」は、任意の濃度でEGFPシグナルの≧50％増強を伴う任意の化合物としてスコアされる。ヒットを、用量応答分析を使用して、ssDNAデアミナーゼ活性とウイルスキャプシド化とに対する潜在的な副作用について評価する。商業的に利用可能な細胞毒性アッセイ法（Promega）を、各ヒットを用いて実施することができる。
【０１２２】
実施例4  クエンチFRET（FqRET）アッセイ法の設計の評価
実験を、A3G RNA結合を妨害し、それにより、A3G酵素および抗ウイルス活性を活性化する化合物についてのハイスループットスクリーニング（HTS）アッセイ法の開発において、組換えAPOBEC3GおよびRNAからなる蛍光クエンチングされたタンパク質-RNA複合体を構築するように設計した（図3A）。このアッセイ法は、ポジティブシグナルに基づき、大きな化合物ライブラリーからの化学物質の選択を可能にする。なぜなら、「ヒット」は、RNAに結合し、それにより、蛍光クエンチングを軽減するA3Gの能力を損なうかまたは無能にするからである。A3GアクチベーターについてのFqRETアッセイ法の開発は、A3G宿主防御の候補アクチベーターを同定したが、HIV/AIDS治療においてクラス最高（first-in-class）となる潜在能力を有する。アプローチは、3つの設計の考慮に基づいて最適化されてきた。（1）ライブラリー中にある小分子化合物のいくつかは、ヒットとして誤解釈されうる緑色の自己蛍光を有する。偽ポジティブシグナルを、赤色蛍光ドナー/アクセプター対を選択することにより、アッセイ法において低下させることができる。（2）A3G単独は、バキュロウイルス感染Sf9昆虫細胞を使用して容易に発現され、構造研究のために複数のミリグラム量で可溶性タンパク質として精製することができる。この組換えA3Gは、647nmで光を吸収し、670nmで蛍光を発する赤色蛍光ドナー（Alexa647）に化学的に結合されてきた（図3A）。結果的に、適切な蛍光アクセプター（クエンチャー）QXL670がRNAに結合されてきた。（3）FqRETは、ドナーとクエンチャーの近接近を必要とする距離依存的な物理化学的現象である。この時にA3G-RNA複合体についてのNMRまたは結晶構造がない場合には、RNAと相互作用するA3G内のアミノ酸残基は未知である。しかし、A3GのN末端中の非触媒ドメインは、RNA結合のために重要であることが公知であり（Opi, et al., 2006, J Virol 80: 4673-4682；Navarro, et al., 2005, Virology 333: 374-386）、小角X線散乱により決定されるA3G-RNA複合体の分子エンベロープは、RNAがA3Gの全長に沿って密接に関連することを示唆する（Wedekind, et al., 2006, J Biol Chem 281: 38122-38126）。理論的には、クエンチングは、A3Gの全表面に沿ったRNA相互作用に起因しうる。クエンチングの効率を最大限にするために、化学的結合条件を、Alexa647およびQXL670を（それぞれ）A3GおよびRNA上の複数の部位に結合できるように、確立した。具体的には、Alexa647は、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステルとして購入し、かつ、精製されたA3Gと、pH＝7.2、Alexa647への結合のために、A3Gの全ての曝露された一次アミノ基および二次アミノ基を活性化する条件において、反応させた。QXL670はまた、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステルとして購入し、かつ、アミノアリルUTPとUTPの1：1.5モル比を使用してRNAをインビトロで転写した。RNA配列が30％のUを含むとする場合には、アミノアリルUTPの取り込みによって、アミノ基が、QXL670への結合のために、各RNA分子の長さに沿って利用可能であることが確実となる。
【０１２３】
A3GおよびRNAの化学的結合を最適化する
15〜20mgのA3Gを、2リットルのバキュロウイルス感染Sf9昆虫細胞培養物から精製することができる。図3Bは、精製されたHMMおよびLMMのクマシーブルー染色ゲルを示す（タンパク質精製の間のRNアーゼ A消化有りおよび無し）。A3GへのAlexa647の結合は、反応バッファー条件および温度、結合反応の持続時間、ならびにAlexa647とA3Gのモル比について最適化されてきた。Alexa647-A3Gを、インプットA3Gの85％超の回収率を伴うサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。A3Gへのその高効率結合について以前に記載された99ヌクレオチドの非特異的RNAのインビトロ転写（Bennett, et al., 2008, J Biol Chem 283: 33329-33336）を、Ambion, Inc.のmMessage mMachine kitを用いて行った。10μgのアミノアリル標識RNAを、各転写反応において合成した。QXL670結合を転写反応において行い、QXL670-RNAをポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）により精製した。PAGEからのQXL670-RNAの回収率は≧70％であった。結合反応条件を、タンパク質、RNA、またはAlexa647/QXL670インプットの広い範囲にわたって変動させ、異なる量の蛍光およびクエンチングを伴うA3GまたはRNAを産生しうる。この柔軟性は強みである。なぜなら、それによってアッセイ法のシグナルおよび検出限界の最適化が可能になるからである。
【０１２４】
A3G-RNA複合体形成のためのアッセイ条件を確立する
化学的に結合させたA3GがRNAに結合するその能力を保持していたと判定されている。電気泳動ゲル移動度シフトアッセイ法（EMSA）は、A3G-RNA複合体形成の効率の視覚的および定量的な測定値を提供する。EMSAを最初に使用して、最適なバッファー条件、A3GとRNAのモル比、ならびに、複合体構築反応の温度および持続時間を測定した。Levin et al.（Opi, et al., 2006, J Virol 80: 4673-4682）により報告された反応条件は、A3Gに対して2〜5倍モル過剰量のRNAを使用して、37℃で1時間にわたり行った場合、効率的であることが決定された。
【０１２５】
これらの実験のために、RNAを、アミノアリルUTPおよびα-32P ATPを用いて転写し、QXL670結合およびゲルシフト複合体のＸ線造影を可能にした。各複合体構築反応は、0.01nmolのA3G（0.5μg）および示したモル過剰量のRNAを含んだ。より大きなA3G-RNA複合体への32P標識RNAの電気泳動移動度シフトは、化学的に結合させたA3GおよびRNAが、相互作用するそれらの能力を保持することを実証した（図4A）。
【０１２６】
中間サイズの複合体が、より低い温度での反応物から明らかであったが、最大サイズの複合体の回収は37℃で最も効率的であった。37℃の反応物からの一定分量ならびにQXL670-RNAを伴わない反応からのAlexa647-A3Gを第2のゲル上で実行し、647nmでの励起に続く670nmでの蛍光についてスキャンした。Alexa647-A3GはQXL670-RNAとは反応しないことが観察されたが、蛍光高速移動バンドにより測定した通りである（図4B、A3G単独）。QXL670-RNAとともに構築されると、ALexa647-A3Gの蛍光がクエンチングされ、A3G-RNA複合体が、図4A中の32Pに基づいて移動すると予測される位置での大きく低下した蛍光を伴った。他のEMSA実験（示さず）において、RNA-タンパク質複合体構築は、A3GがQXL670と結合し、RNAがAlexa647と結合した場合、等しく効率的であった。しかし、Alexa647-A3GおよびQXL670-RNAを、さらなる実験を行うための例示的な分子として選んだ。
【０１２７】
クエンチングがA3G-RNA複合体の形成によるものであったということの証明
EMSAデータは、A3G-RNA複合体が構築されていたこと、および、巨大分子と結合され、複合体中に存在する化学物質がFqRETのための必要な物理化学的特性を有することの強い証拠を提供した。しかし、EMSAはハイスループットではなく、例示的なハイスループットスクリーニングは、マイクロタイタープレートの状況におけるFqRETシステムの使用を含む。この目的のために、A3G-RNA複合体を、30μl反応中で、ドナーとクエンチャーの1：5モル比を使用して構築した。クエンチングが、43μlキュベットを備えたFluorMax-4蛍光光度計を使用して、これらの反応中で55％と高いことが決定された（図5）。完全なクエンチングは、ドナーならびにクエンチャーの長いA3GおよびRNAの一般化された配置を前提とすると、予想されなかった。重要なことに、アッセイ法についてのz因子は突出していた（0.7）。RNアーゼ消化は、A3G-RNA複合体からRNAを除去し、A3G酵素的ssDNA結合活性を再活性化することが公知である（Wedekind, et al., 2006, J Biol Chem 281: 38122-38126；Soros, et al., 2007, PLoS Pathog 3:e15）。クエンチングされた複合体のRNアーゼ消化が蛍光を増強することが観察されたが（図5）、A3G-RNA複合体形成がFqRETに欠かせないことを実証している。
【０１２８】
実施例4：ハイスループットスクリーニング（HTS）
以下の実験を、細胞RNAをA3Gから解離させ、それにより、HIV感染性に対する宿主防御を活性化するそれらの能力に基づく治療薬開発のために抗ウイルス化合物を同定するように設計した。アッセイ法を、A3GからのRNAの解離時にポジティブシグナルを提供しうる、インビトロで構築されたA3G-RNA複合体に基づいて開発した。アッセイ法は、A3G-RNA複合体の形成により誘導されるクエンチFRETの生物物理学的技術に基づく。アッセイ法を、1536ウェルマイクロタイタープレート中でのハイスループットスクリーニング（HTS）のために必要なフォーマットに適応させてきた。HTSアッセイ法を使用して、薬物様小分子のライブラリーをスクリーニングし、A3Gと直接的に相互作用し、HIV感染を阻害するそれらの能力について「ヒット」を評価する。関連する化合物を、それらの合成化学の潜在能力および予測される構造活性関係（SAR）について評価することができる。続いて、予備前臨床試験をマウスにおいて行い、T細胞取込みおよび薬物投与経路、投薬、組織代謝、薬物代謝、代謝物排泄、および毒性（まとめてADMETとして公知である）を判定することができる。
【０１２９】
A3Gを標的化し、その抗HIV活性を活性化する化合物は、クラス最高の薬物に対する前駆体でありうる。HIV-1感染性サイクルの異なる段階で発現される個々のHIVタンパク質を標的化する従来の治療薬とは異なり、A3G活性化は、ウイルス感染の初期および後期段階で宿主防御を促進する。A3Gを活性化することによって、侵入するHIVに対する防御の厳密な第一選択を伴う細胞を提供すると考えられ、それが複製する際にHIVゲノムを妨害する。また、活性化A3Gは、ビリオンと構築することによりVif依存性分解を回避することができると考えられており、キャプシド化にならず、Vifにより分解されるA3G-RNA複合体とは異なる（Soros, et al., 2007, PLoS Pathog 3:e15）。これは、A3Gを物理的な近接中に配置し、ウイルスが複製の次のサイクルを開始する瞬間に、感染するHIVを打ち倒す。従って、A3Gを活性化することの追加の特質は、Vifがこれらの細胞において発現されるにもかかわらず、リザーバーからの感染性ウイルスの産生を減少させることである。これらの2つの機構は、まとめて、A3G mRNAの上昇発現と長期非進行者のPBMCにおける低下したウイルス負荷の間の相関を説明しうる（Jin, et al., 2005, J Virol 79:11513-11516）。任意の特定の理論により拘束されることを望まないが、本発明のA3Gアクチベーターを、Vifアンタゴニスト（伝統的なアプローチからの化合物）およびHAARTの部分と組み合わせて使用し、ウイルス耐性を減少および/または排除することができる。
【０１３０】
本発明のHTSアッセイ法は、ナノモル範囲で抗ウイルス活性を有し、高い親和性でA3Gに結合し、低い毒性を有する化合物を同定するために有用であり、薬化学を介したリード化合物へのその開発は、容易に達成されると予測される。
【０１３１】
薬物様小分子の20,000個の化合物のChemBridge Diversity Setライブラリーの予備スクリーニングを、HTSについて大学の施設で行うことができる。このライブラリー中の化合物は≧95％純粋であることが保証されている。スクリーニングを、濃度1μMで、各化合物について行うことができる。ヒットは、DMSO溶媒処理単独と比べた蛍光または化合物単独に起因しうる自己蛍光における≧20％増加を産生する化合物としてスコアされる。なぜなら、これが、真のポジティブについての現実的な閾値であると考えられるからである。真のヒットは、しかし、用量応答を実証するのに対し（ここで、減少する化合物濃度は、比例的により少ない蛍光をもたらす）、偽のヒット（大部分が、高い化学物質濃度の非特異的な効果に起因する）は、希釈時にポジティブシグナルを産生するのを停止する。最初のヒットは、ライブラリーから「選抜」され、再スクリーニングのための希釈系列として再構築される。ヒットが20,000個の化合物のライブラリーから予測される。なぜなら、それは、公知のファルマコア全体からの化学構造を広く表しており、工業的標準は、≧0.5のz因子を伴うアッセイ法が、そのようなライブラリーからの0.1％のヒット率を有するからである。
【０１３２】
本発明のHTSアッセイ法はまた、200,000個の化合物のChemBridge Diversity Setライブラリーをスクリーニングするために使用することができる。追加のスクリーニングの重要性は、より大きなライブラリーが化学構造のより広い多様性を含むだけでなく、しかし、重要であるのはまた、関連する化学構造の複数の変種（類似体）を含むことである。ライブラリーにおけるより大きな複雑度は、その構造がA3Gに対してより高い親和性で（アロステリック的にまたは直接的に）結合し、より低い濃度でA3GからRNAを解離させうるヒットを産生することが予想される。このカテゴリーにおける化合物は、バックグラウンド対照と比べて増加した蛍光として、ヒットの低濃度で明らかである。A3Gに結合するが、RNAに結合するA3Gの能力には影響しないヒットは、HTSアッセイ法により検出されない。より大きなライブラリースクリーニングからのヒットは、最終的にリード化合物として開発されうるより代表的な化学構造でありうる。
【０１３３】
ヒットは、コンピューター支援創薬（CADD）ソフトウェアを使用して、それらの構造的関係（クラスター分析）について評価される。ヒットは少数の構造クラス（クラスター）に分類することができ、ライブラリーが、ヒットを産生しなかったこれらのクラス内に類似体を含むことが予想される。この情報の全てが、SARを評価し、本来のライブラリー中になかったが、一般的に利用可能である、試験すべき他の類似体を追求および同定するための最善の化合物を決定することができる所望の商業的ベンダーによりコンピューターで分析されることができる。
【０１３４】
関心対象の化合物は、商業的ベンダーによりマイクロタイターディッシュフォーマット中に構築され、本明細書の他に記載した通り、Rochester大学のHTS施設を使用してFqRETアッセイ法において再試験される。結果によって洗練されたコンピューターSAR分析が可能になり、それを通じて、＜25の化合物を機能的エンドポイント分析のために選択することができる。選択はまた、その可用性ならびに公知の合成および薬化学経路が容易に達成可能である化合物について偏らせることができる。化合物を取得し、それらの構造および純度を商業的ベンダーで質量分析により検証し、希釈系列において再試験し、未処理対照と比べて、蛍光における50％および95％増加を誘導する各化合物の濃度を測定することができる。
【０１３５】
HIVの複製を阻害するヒットは、A3Gトランスフェクト293T細胞において産生された偽型Vif+ウイルスに基づくアッセイ法およびルシフェラーゼベースTZM-bl細胞感染性のレポーターアッセイ法を使用して最初に決定される（Platt, et al., 1998, J Virol 72: 2855-2864）。ウイルス感染性を≧20％だけ減少させる化合物を、広範囲の用量にわたり評価し、それらのIC50およびIC95を測定する。ナノモルからマイクロモル以下までの濃度範囲内でのIC50を実証する化合物を選択し、商業的ベンダーに送り、ヒトPBMC中での生HIVに対するそれらの抗ウイルス有効性について評価する。これらの研究では、20日間の拡大感染研究におけるp24 Gag免疫学的アッセイ法に基づく感染性を定量化する。化合物処理を伴わない感染細胞（ネガティブ対照）、およびAZTを用いて処理した感染細胞（ポジティブ薬物対照）を、平行分析として実行し、各ヒットの抗ウイルス活性の大きさを評価する。各化合物の用量依存性を決定することができる。類似の様式で、各化合物の有効性を、R5およびX4 HIV株の両方（Cicala, et al., 2006, Proc Natl Acad Sci U S A 103: 3746-3751）、HIVの異なるクレード、ならびに公知の薬物耐性表現型を伴うHIVの株に対して評価する。株が耐性または感受性であることが公知である関連薬物は、平行アッセイ法においてそれぞれネガティブ感染性対照およびポジティブ感染性対照として評価される。薬物耐性株の抑制は、新規治療薬としてのA3Gアクチベーターの潜在能力を強調する。商業的ベンダーはまた、精製されたCD4+T細胞、静止記憶T細胞などの関連細胞型においておよびPHA/IL2刺激PBMCにおいて、ヒットの抗ウイルス活性を評価することができる。≦6ヒットを、関連細胞型におけるそれらの用量依存的な抗ウイルス活性に基づき、さらなる機能的エンドポイント分析のために同定することができると予想される。これらの化合物は、3つの機能的エンドポイントについて評価することができる。
【０１３６】
（i）A3Gから非特異的細胞RNAを解離させることは、ウイルス粒子中に取り込まれたA3Gの量を増加させると考えられる。これは、化合物で処理した感染細胞から精製されたウイルス粒子が、DMSO単独を用いて処理した感染細胞から単離された粒子と比較した場合、A3Gウエスタンブロットシグナルにおける増加として明らかである。これらのデータは、以前に記載された通り、ウイルス粒子インプットについての標準化対照としてp24ウエスタンブロットシグナルを使用して、PhosphorImagerスキャニングデンシトメトリーにより定量化することができる（Bennett, et al., 2008, J Biol Chem 283: 33329-33336）。
【０１３７】
（ii）A3Gの活性化は、ウイルス複製を減少させ、プロウイルスゲノムの超変異を誘導すると考えられる。化合物を用いて処理されたまたはされていない偽ウイルス感染細胞から抽出したDNAを、リアルタイムPCRにより定量化し、HIV特異的アンプリマーを使用して、ヒットがプロウイルスDNA発現を減少させる程度を判定することができる。ウイルスDNA配列は、大学のゲノムセンターのシークエンシングサービスを通じて、A3G最近傍シグニチャーを用いてdGからdAへの超変異を評価することができる（Yu, et al., 2004, Nat Struct Mol Biol 11: 435-442；Hache, et al., 2005, J Biol Chem 280: 10920-10924）。
【０１３８】
（iii）A3Gに直接的に結合する化合物を同定するために、RNAを含めずに調製した組換えA3Gを、そのC末端ポリヒスチジンタグを介して、ニッケル親和性結合のために設計されたBiaCoreチップに固定化させ、BiaCore X機器で分析することができる。A3Gを含むチップの表面上の偏向した入射光を反射させて、シグナルとして検出することができる。反射光の角度は、A3Gが化合物に結合し、立体構造を変化させる場合に変化し、反射光角（表面プラズモン共鳴、SPR）における変化を、化合物を加えないA3Gから反射した光と比べて測定する。SPRは、70,000 RUまでの広い線形範囲および100 RUの感度を有する（ここで、1 RU＝1pgの結合化合物/mm2）。関連するヒットは、濃度の広い範囲にわたりA3G結合について評価することができる。結果として得られるRUから、各化合物についての会合（Ka）および解離（Kd）定数を、BiaCore Xで利用可能なソフトウェアパッケージを使用して計算することができる。SPRは本質的に質量検出器であり、測定値における誤差は、巨大分子のサイズが増加するにつれて増加する。A3G-RNA複合体を解離する化合物の能力は、従って、等温熱量測定またはITCを使用して行うことができ、それは、BiaCore定量化の確認を可能にするだけでなく、しかし、また、A3G-RNA相互作用における変化に関連する熱力学的パラメータの決定を比類なく可能にする。生物物理学的パラメータは、薬化学のための高度SARおよび定量的計量を可能にする。
【０１３９】
多くのヒットが、機能的エンドポイント分析、ナノモル濃度範囲における高レベルの有効性、およびA3G-RNA標的との相互作用に基づいて、リード化合物の開発のための有意な潜在能力を有するものとして同定されると考えられる。この段階での重要な基盤は、化合物の毒性を確立することである。ヒットを、Yale大学のHTSセンターでの「生物的プロファイリング/カウンタースクリーニング」サービスを使用して、ヒト臍帯静脈内皮細胞における細胞毒性についての用量の適切な範囲（感染性研究に基づく）にわたり最初に試験する。これらの研究は、化合物が、細胞生存、形態、細胞周期の進行に影響するかまたはストレス応答を誘導するかを明らかにすることができる。
【０１４０】
毒性が低い化合物は、商業的ラボサービスの設備およびサービスを使用して、広い範囲の用量にわたりマウスに投与することができる。研究は、統計的有意性を達成するために必要とされる動物の数について設計することができる。動物の投与および毒物学は、偽処置動物としての年齢を一致させた雄および雌の各5匹ならびに試験する化合物の各用量についての5匹の雄および雌動物を用いて開始することができる。体重増加、行動および代謝評価を行うことができる。処置は、毎日の食物摂取量および毎週の全身または臓器重量における個々の変化が、未処置の動物について期待される観察正常範囲の+/-15％内にある場合、低い全身組織毒性を有すると考えることができる。各化合物のT細胞取込みを決定することができる。ADMETは、当業者により作成された実験設計に基づいて計画することができる。適切な商業的ベンダーは、減少した毒性を伴う化合物を産生し、取込みおよび分布を改善する薬化学についてアドバイスすることができる。
【０１４１】
実施例5：HTSによるA3G：RNA複合体におけるヒットの選択
理想的には、頑強なHTSは低いバックグラウンドを有し、自己蛍光化合物に起因する偽ポジティブを判別することができるはずである。スクリーニングされた化合物の総数当たりの同定された化合物の数は、良好なアッセイ法について、0.1％〜0.5％である「ヒット率」である。2,000化合物スペクトルライブラリーおよび446化合物National Clinical Collectionライブラリーを用いる96ウェルフォーマット中でのHTSアッセイ法が開発されている。これらのライブラリーは、薬物様化合物の小さな多様性セットと一緒に、多様な特許期限切れの薬物から成った。各ライブラリー化合物を最初に20uMでスクリーニングした。分析のグラフィック表示（図6）は、8つの化合物だけが、クエンチングされたベースラインと非クエンチングAlexa647-A3Gについて予想される最大蛍光の間の「ヒットゾーン」内で蛍光を誘導することを示した。これは0.32％のヒット率に対応した。自己蛍光的であり、予想される最大蛍光を上回り放射したライブラリー中の化合物は、追求しなかった。4つの化合物をさらなる研究のために選択した（図7）。なぜなら、それらは1uM〜20uMの間の蛍光を誘導する用量依存的な能力を示したからである。
【０１４２】
実施例6：RNA結合アンタゴニストについてのヒットの検証
図7に図示する4つの化合物を、濃度の範囲にわたり各化学物質を用いて放射性標識RNA上に構築されたA3G：RNA複合体を処理することにより、A3G：RNA複合体を脱凝集するそれらの能力について評価し、次に、EMSAによるHMMのサイズ減少について評価した。遅い電気泳動移動度HMMのサイズに影響しなかったDMSO（または、本来のスクリーニングにおけるヒットではなかった化合物）（図8）。全ての4つのヒットが、変動する程度で、より速く移動する低分子量（LMM）複合体へのA3G：RNA凝集体の用量依存的な分解を実証したが、クロニジン（CAS 74103-07-4）により例示される通りであった。アルタンセリン（CAS 76330-71-1）は、A3G複合体の部分からRNAを完全に解離させる能力を有する唯一のヒットであったが、最も高いアルタンセリン濃度でのLMM複合体に加えて、遊離RNAの出現により証明される通りであった。ヒットのいずれもRNA分解を誘導しなかった。化合物は、RNAの添加の前にA3Gと予めインキュベートした場合、それらの最大の効果を有し、それらがA3Gに結合し、RNA依存性凝集体を形成するA3Gの能力を阻害していることを示唆する。精製されたA3Gは、本明細書の他に記載する通り、変動濃度のヒットの各々を用いて処理し、続いてDNAデアミナーゼ活性についてアッセイした。顕著には、ヒットのいずれもA3Gデアミナーゼ活性を阻害しなかった（クロニジンおよびアルタンセリンにより例示される、図9）。ヒットは、商業的に利用可能なCell Death Assay（Cell TiterGlo, Promega）を使用してアッセイした場合、50uMまで細胞に毒性はなかった。データはA3G：RNA複合体形成のアンタゴニストを実証し、重要なことに、ヒットはHMMを部分的に脱凝集し、しかし、A3G：DNAデアミナーゼ活性を阻害しなかった。
【０１４３】
実施例7：ヒットの抗ウイルス活性
各ヒットの抗ウイルス活性を、化合物がビリオンを用いたA3Gパッケージングを阻害しうるか否かの関心に取り組むために、A3Gの安定発現を伴うまたは伴わないHEK 293T細胞において産生された偽型ウイルスに各々基づく2つの異なる単一ラウンド感染性アッセイ法を使用して評価した。ウイルス粒子を、env無しであり、機能的Vifを発現したまたは発現しないプロウイルスHIV DNAを用いてトランスフェクトし、VSV env遺伝子を用いてコトランスフェクトすることにより、安定的なA3G発現を有するHEK 293T細胞中で産生させた。トランスフェクションから5時間後、20μMのいずれかの化学物質を、または、対照としてDMSOを加えた。偽型ウイルスを、各条件からトランスフェクションから24時間後に収集した。p24 ELISAによるウイルス調製物の標準化時、等価のナノグラム量の各ウイルスでのウエスタンブロット分析を実施し、A3Gのウイルス粒子取り込みを評価した（図10）。データは、ウイルス粒子中に取り込まれたA3Gの量が、化学物質の添加により影響されず、しかし、期待通り、Vif発現は、ウイルス粒子中のA3Gの回収を低下させる際にドミナントな効果を有することを実証した。より多くのA3G（Vif-）を伴うウイルス粒子は、文献により予測される通り、感染性が低かった。
【０１４４】
化合物が生細胞においてHMMから抗ウイルス活性を活性化できるか否かを直接的に試験するための実験を実施した。このために、HMMとしてのA3Gを発現する細胞株を作製した。TZM-blレポーター細胞を、A3G cDNAを用いてトランスフェクトし、A3Gの安定発現を伴う細胞株を選択した（TZM-bl-A3G）。HMM A3Gを確認するために、細胞抽出物を、TZM-bl-A3G細胞から調製し、サイズ排除クロマトグラフィーにより分画した。抗A3G抗体を用いる画分のウエスタンブロットは、A3GがMDa、RNアーゼ感受性HMMとして凝集することを示した（図11）。単離されたHMMは、RNアーゼ消化により10倍活性化されうるインビトロのデアミナーゼ活性の低レベル（4％ dCからdU）を有した（図12、上パネル）。20μMのクロニジンおよびアルタンセリンを用いたHMMの処理は、未処理HMMと比較して、A3Gデアミナーゼ活性をそれぞれ6および8倍活性化した（図12、下パネル）。データは、選択されたヒットが、細胞中で構築されたA3G：RNA複合体を標的化することを実証した。
【０１４５】
細胞中の化合物の抗ウイルス活性を評価するために、機能的Vif遺伝子を伴うまたは伴わない偽型ウイルスを、A3Gを発現しないHEK 293T細胞中で産生した。ウイルス粒子を産生細胞の培地から収集し、p24含量および等しい数のウイルス粒子に基づいて標準化し、野生型TZM-blまたはTZM-bl-A3G細胞を感染させるために使用した。文献から予測される通り（Chelico, et al,.2006, Nat Struct Mol Biol, 13: 392-399）、HMMは、DMSO単独を用いて処理された両方の細胞株においてウイルス+/- Vifの感染性により示される通り、抗ウイルス活性を有さなかった（図13）。しかし、HIV複製および、結果的にTat発現は、A3GアクチベーターによるHMMの分解が宿主防御を刺激することができる場合、阻害されると予測される。A3Gアクチベーターの作用の提示された機構と一致して、アルタンセリン、および、より少ない程度で、クロニジンは、TZM-bl-A3G細胞において抗ウイルス活性を誘導したが、TZM-bl細胞においてしなかった（図13）。アルタンセリンは、20uMの単一用量で、ウイルス感染性の＞40％を阻害した。これらの化合物の抗ウイルス活性は、機能的Vif遺伝子の存在により影響されなかったが、予測可能な結果である。なぜなら、Vifは後期のウイルスライフサイクルにおいてだけ発現されていたからである。
【０１４６】
アルタンセリンは、公知の5-HT2A受容体（セロトニン2A受容体）アンタゴニストであり、中枢神経系における5-HT2A受容体発現のPET画像のためのヒトにおける使用について認可されており、十分に許容される。クロニジンは、脳においてα2受容体と相互作用し、高血圧を処置するために使用される。両方の化合物についてのFDA認可は、HIV/AIDS臨床治験のための再目的化を合理化しうる。しかし、これらの化合物の化学的フレームワークは、薬化学構造活性関係（SAR）研究ならびに最適化された標的選択性および低いナノモル抗ウイルス有効性を伴う化学型の同定のための無比の機会を与える。
【０１４７】
実施例8：薬物耐性を制限する薬物および送達システム
HIVの薬物耐性株の出現は、ウイルス複製の間での逆転写酵素の高い変異頻度に、およびウイルスリザーバーにおける免疫共有原子価を下回るレベルで進行しているウイルス遺伝子組換えに部分的に起因する。A3Gの抗ウイルス活性は、ウイルス複製機構の進行を物理的に遮断し、かつ、新生プロウイルスDNAに結合し、dCからdUへの移行（脱アミノ化）を介した複数の変異を触媒するその能力から生じる。これらの活性は、活性化T細胞がそれらの静止状態に戻る場合、存在しない（Santoni de Sio et al., 2009 PLoS One 4: e6571）。なぜなら、A3Gが、高分子量（HMM）凝集体中に隔離されたままであるからである。HMM複合体は、細胞RNAへのA3Gの非特異的結合を介して一緒に繋留される複数（4〜＞20）の不活性化A3Gサブユニットで構成されうる（Chiu, et al., 2005, Nature, 435:108-114；Gallois-Montbrun, et al., 2007, J Virol, 81: 2165-2178；Kozak, et al., 2006, J Biol Chem, 281: 29105-29119；Stopak, et al., 2007, J Biol Chem, 282: 3539-3546；Chelico, et al,.2006, Nat Struct Mol Biol, 13: 392-399；Sheehy, et al., 2002, Nature, 418: 646-650；Wichroski, et al., 2006,.PLoS Pathog 2:e41）。
【０１４８】
本発明は、RNAへのA3G結合を選択的に標的化し、宿主防御を活性化するためのHMM形成を抗ウイルス治療として使用することができる発見に基づく。N末端中の特定のアミノ酸、A3Gの偽触媒ドメインが、RNA依存性A3G凝縮に関与したことが観察されている（Sheehy, et al., 2002, Nature, 418: 646-650；Huthoff, et al., 2009, PLoS Pathog, 5:e1000330；Iwatani, et al., 2006, J Virol, 80: 5992-6002；Navarro, et al., 2005, Virology, 333: 374-386；Bennett, et al., 2008, J Biol Chem, 283: 33329-33336；Shandilya, et al., 2010, Structure, 18: 28-38；Wedekind, et al., 2006, J Biol Chem, 281: 38122-38126）。対照的に、DNAが結合し、dCは、A3GのC末端の触媒ドメインを介して脱アミノ化された（Sheehy, et al., 2002, Nature, 418: 646-650；Iwatani, et al., 2006, J Virol, 80:5992-6002；Navarro, et al., 2005, Virology, 333: 374-386；Shandilya, et al., 2010, Structure, 18: 28-38）。単離におけるA3GのC末端半分は、DNA結合および脱アミノ化のために十分であったのに対し、A3GへのRNA結合およびデアミナーゼ活性の阻害は全長A3Gを必要とした（Bennett, et al., 2008, J Biol Chem, 283: 33329-33336）。
【０１４９】
本明細書において提示する開示は、A3GへのRNA結合が、酵素を誘導してそのDNA基質を解放することにより、デアミナーゼ活性を阻害したことを実証する。A3GのN末端へのRNA結合は、C末端でのDNA結合を嫌ったタンパク質の立体構造変化を誘導すると考えられる（Navarro, et al., 2005, Virology, 333: 374-386）。または、RNAは、C末端でのDNA結合について直接的に競合すると考えられる。
【０１５０】
本発明に先立って、伝統的な考え方は、A3Gが抗ウイルス性となるようにキャプシド化されなければならないこと、および、Vifを阻害することがA3G宿主防御を可能にする唯一の方法であったことを保持する。例えば、最近のRNAiノックダウン実験は、非許容細胞におけるA3G発現の減少が、細胞をHIV感染に許容性にするために十分ではなかったことを示すことにより、A3G抗ウイルス活性の重要性に挑戦してきた（Santoni de Sio et al., 2009 PLoS One 4: e6571, Kamata et al., 2009 PLoS Pathog 5: e1000342）。これらの知見は、A3G発現レベルがウイルス負荷と相関しないことを示唆した、正常およびHIV感染患者でのより初期の研究を支持した（Cho et al., 2006 J Virol 80: 2069-2072）。これらの研究からの合理的な結論は、A3GがHIV感染に対する唯一の細胞防御機構ではないことである。宿主防御におけるA3Gの有意な役割を支持する議論は、Vifを同時発現させた場合にA3Gの細胞レベルを維持した、HTSを介した化合物の発見であった（Nathans et al., 2008 Nat Biotechnol 26: 1187-1192）。これらの化合物は、A3Gをウイルス粒子とともに構築することを可能にし、HIV感染性を減少させた。研究は、長期非進行性患者（LTNP）が、非感染対照よりまたはHIV/AIDSを伴う患者よりも高いA3Gの発現レベルを有したというより初期の報告を支持した（Jin et al., 2005 J Virol 79: 11513-11516；Vazquez-Perez et al., 2009 Retrovirology 6: 23, Ulenga et al., 2008 J Infect Dis 198: 486-492）。興味深い推論は、LTNPから単離されたウイルスゲノムがVif遺伝子中に高い割合の変異を含むことであった（Janini et al., 2001 J Virol 75: 7973-7986）。この分野における論争は、現在の研究試薬が、許容細胞におけるA3Gの活性化がそれらを非許容性にするか否かの疑問に取り組むことができないとの事実から生じる。この点において、A3G：RNA複合体を標的化する本発明の化合物が既に同定されており、この疑問に取り組む際に戦略的に重要であることが示されている。例えば、本発明は、本発明が、A3G-RNA複合体を解離する化合物を用いてA3Gを活性化することにより、宿主防御機構に対するHIV耐性を克服する方法を提供する点で、ウイルス耐性の重要な問題に対する非従来型の解決法を提供する。
【０１５１】
本明細書において提示する結果は、RNA-タンパク質相互作用の理解のための、およびA3G-RNA複合体などのRNA-タンパク質相互作用を妨害することができることにより新規の抗ウイルス特性を示す作用物質の同定のためのアッセイ法を実証する。（i）A3G DNAデアミナーゼ活性が、RNAへのA3G結合およびHMM形成と拮抗する化合物により刺激されたこと、および（ii）ウイルス複製が、HMMとしてのA3Gを発現する許容細胞を、A3G活性化化合物を用いて処理した際に阻害されたことが実証されてきた。これは、文献から予測できなかったであろう高レベルの成功である。なぜなら、伝統的な考え方は、A3Gをキャプシド化して抗ウイルス性にしなければならないことであり、かつVifの阻害することがA3G宿主防御を可能にする唯一の方法であることであるからである。
【０１５２】
HMMとしてのA3GのRNA不活性化が可逆的であるか否か、および、一旦A3Gが活性化されるとそれが侵入するウイルスに対して抗ウイルス活性を発揮するか否かを試験するための実験の次のセットを設計した。任意の特定の理論により拘束されることを望まないが、A3Gアクチベーターは、A3GへのRNAの非特異的結合に拮抗し、ウイルス複製および組込みを阻害し、従って、治療的有効性のために、排他的にA3Gキャプシド化に依存しないと考えられる。
【０１５３】
したがって、本発明の局面は、A3GへのRNA結合がインビトロでおよび生細胞中で可逆的であるという知見の予測不可能な特徴に基づく。この知見は、当技術分野が、A3Gが、抗ウイルス効果を有するために粒子中にある必要があったことが理解されるという事実に特に基づいて、予測不可能である。反対に、本発明は、A3Gが、侵入するウイルスを先制的に攻撃することができ、抗ウイルス性であるためにウイルス中になくてもよいとの発見に基づく。このように、A3Gが重要な抗ウイルス剤であることを証明し、初めて、より多くのA3GがHIVに対するより良好な防御であるか否かの論争に取り組んでいる。
【０１５４】
1つまたは複数の新規抗ウイルス化合物が、ナノモルの有効性および低い毒性を示すと考えられ、その作用の機構が新規標的を介しているとして検証される。A3Gの活性化は、宿主に「反撃する」追加の手段で力を与えることにより、ウイルス感染性、およびウイルス耐性の出現を減少させると考えられる。本発明は、ウイルス複製の侵入後阻害を通じて、HIVから細胞を防御する能力を与える。
【０１５５】
アルタンセリンおよびクロニジンの同定に基づいて化学的スキャフォールドおよびR基の構造活性関係（SAR）分析を行う
80個の化合物が同定されており、それらは、クロニジンおよびアルタンセリンのコアスキャフォールドの両バリエーションであり、様々なR基を有し、これらの化合物は、構造活性関係（SAR）研究のために合成される。化合物を、本明細書において他で考察するFqRET HTSを介して再スクリーニングし、標的と反応性である化学物質を選択する。
【０１５６】
ヒットを、広範な用量にわたり評価し、4つの機能的エンドポイントに基づいて、治療的価値が最も高い化合物を同定する：（i）単一ラウンドのウイルス感染性法において測定した最も低いIC50およびIC95、（ii）ウイルス粒子を伴うA3Gの最も高い回収率、（iii）EMSAに基づくA3G：RNA複合体を解離する能力、（iv）インビトロのデアミナーゼ活性に対して効果低いかまたは効果が無いこと。
【０１５７】
化合物を、非特異的RNA対HIV RNAまたは7SL RNAへのA3G結合についての二次FqRETアッセイ法において再評価し、A3Gキャプシド化を顕著に増強する化合物を同定する。
【０１５８】
これらの研究に基づき、適切な化合物を、これらの化合物の設計および修飾の試験を含む追加のSAR分析のために選択し、（i）それらのIC50/IC95を低下させ、かつ（ii）それらの毒性を減少または排除することができる。
【０１５９】
薬物-標的の相互作用を検証する構造研究に適したA3GおよびRNAの量は、容易に産生することができる。表面プラズモン共鳴（BiaCore）および等温カロリメトリー（ITC）のためのRochester大学の構造生物学コア装置およびサービスを使用して、以下を決定することができる：（i）A3Gに対する化合物の親和性、（ii）A3G結合についての化合物のオンおよびオフ速度動態、および（iii）広範な化合物濃度にわたるA3GへのRNAおよびDNA結合の定量化。
【０１６０】
ヒットを、処理したまたは未処理の感染細胞においてプロウイルスDNAおよび複製中間体を定量するためのqPCRを使用して、ウイルス複製を遮断するそれらの能力について評価する。変異頻度は、未処理対照と比べた、化合物処理した感染物のPCR増幅させたプロウイルスゲノムにおいて定量化し（+/-A3G発現）、抗ウイルス機構の部分としてのA3Gデアミナーゼ活性の活性化に起因する変異頻度を評価する。
【０１６１】
より大きな化合物ライブラリーを用いるFqRETアッセイ法によりHTSを行う
新規でかつ革新的な標的に基づく治療薬の開発では、標的と反応性である化学型および標的の活性を改変するそれらの能力の包括的な理解が必要とされる。例えば、抗ウイルス活性および本発明の新規標的と反応性を有する特許期限切れの化合物からの、化合物の同定は、有意な進歩であり、望ましい特徴を伴う他の化合物が存在する可能性が高いことを示す。この潜在能力は、より大きな化学的多様性を伴うライブラリーのHTSによってのみ実現することができる。
【０１６２】
FqRETアッセイ法を使用して、例えば、ChemBridgeから商業的に入手可能な薬物様小分子のdiversity setライブラリーをスクリーニングする。ヒット同定、ヒット検証、およびSAR分析を、本明細書において他で考察する通りに実施する。検証したヒットを、本明細書において他で考察する通りに、化学クラスター分析およびSAR分析に供する。
【０１６３】
生ウイルス感染性試験
単回ラウンドの感染性アッセイ法は、化合物の抗ウイルス活性の良好な最初の評価を提供し、ウイルス粒子産生の間での各化合物の抗ウイルス有効性を評価するための、VSVエンベロープ偽型HIVに基づく従来のアッセイ法を使用することができる。単一ラウンド感染性アッセイ法を使用することができ、それは、HEK 293T細胞（胎児腎臓細胞株）中で産生された偽型ウイルスおよびルシフェラーゼレポーター発現HeLa細胞（子宮頚癌細胞）の感染性に基づく。これは、HIV感染性を評価するために学術研究機関および産業において広く使用されている効果的な最初の試験であり、最近の研究では、VSV envタンパク質がウイルス-宿主細胞の相互作用の動態を変化させうることが示されている（Yu, et al., 2009, PLoS Pathog, 5:e1000633）。臨床治験における成功の最も大きな可能性を確実にするために、生HIVウイルスおよびヒト白血球（PBMC）を用いた試験を介してGCE化合物の有効性を判定することが重要であると考えられる。
【０１６４】
化合物を、例えば、薬化学からもたらされるものを、広範な薬物用量（50uM〜0.5nM）にわたり、21日間の拡大感染において、0.01〜1.0moiまで変動する初期ウイルスインプットで生HIV-1NL4-3を用いて感染させたヒトPBMCを使用して試験する。IC50およびIC95を、ウイルス感染性の測定値としての細胞溶解物からのHTS逆転写酵素活性を使用して測定する。GCE化合物の相対的な抗ウイルス有効性は、感染しているが未処理である細胞について、および抗ウイルスポジティブ対照としての従来のRT阻害剤を用いて処理した感染細胞について見いだされるものと比較した、HIVバースト相および拡大感染を減少させるそれらの能力を比較することにより、評価される。
【０１６５】
化合物を、異なる地理的領域（クレード）に由来するウイルスを使用して、21日間の拡大感染におけるウイルスに対するそれらの抗ウイルス効果について評価する。化合物を、3つの異なる多剤耐性菌でそれらの抗ウイルス効果について評価する。拡大感染の複数ラウンドを、関連するGCE化合物の無効低用量を用いて行うことができ、結果として得られるウイルスを、広範なGCE化合物の用量にわたり薬物耐性株の出現について試験することができる。
【０１６６】
動物毒性試験
FDA認可への前条件として、新たな抗HIV/AIDS治療薬を、2つの異なる種において、投与の経路、投薬、代謝、排泄、および毒性（ADMET）について評価しなければならない。それらのDNA変異活性のため、A3Gアクチベーターを、「ディープ」シークエンシング技術を使用して、偽対照と比較して、処置動物のゲノムにおける単一ヌクレオチド多型（SNPS）の発生における変化を定量化することにより、遺伝毒性について評価することができる。ADMETを、商業的なラボサービスを使用してマウスにおいて行う。動物全体評価ならびに代謝および血液化学エンドポイントは、（i）最大許容単一用量、（ii）単一または複数投薬計画に続く血漿中薬物濃度、（iii）化合物の半減期、ならびに（iv）代謝および排泄を決定する。
【０１６７】
実験の次のセットは、非ヒト霊長類種およびSIVを使用して、前臨床ADMETおよび有効性を評価することである。ヒトでのI/IIa相臨床治験の前の有効性試験が可能である。なぜなら、細胞RNA依存性凝集およびA3Gの不活性化が全ての哺乳動物において発生するからである。
【０１６８】
本明細書において引用する各々のおよびすべての特許、特許出願、および刊行物の開示が、本明細書により、その全体の参照により、本明細書において組み入れられる。
【０１６９】
本発明は、特定の態様を参照して開示されているが、本発明の他の態様および変形物が、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、当業者により考案されうることが明らかである。添付の特許請求の範囲は、全てのそのような態様および等価の変形物を含むと解釈されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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