(57)【要約】  本発明は、三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）の治療における使用のための、パクリタキセル、又はその薬学的に許容される塩；及び式Ｉの化合物（本明細書に記載のもの）又はその薬学的に許容される塩によって表される少なくとも１つのサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤を含む薬学的組合せに関する。本発明は、細胞傷害性抗腫瘍剤パクリタキセル、及び少なくとも１つのサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤を含む薬学的組合せの治療有効量の、それを必要とする患者への投与による、乳癌、特に、三重陰性乳癌の治療のための方法に関し；ここで、投与時の該組合せは相乗効果を示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
パクリタキセル又はその薬学的に許容される塩の治療有効量、及び式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量を含む、三重陰性乳癌の治療における使用のための薬学的組合せ；
【化１】
2013542979.tif 000021
（式中、Ａｒは、非置換であるか、或いは：塩素、臭素、フッ素、もしくはヨウ素から選択されるハロゲン；ニトロ、シアノ、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、トリフルオロメチル、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、カルボキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシカルボニル、ＣＯＮＨ２、又はＮＲ１Ｒ２から選択される１個、２個、又は３個の同一の又は異なる置換基によって置換されているフェニルであり；ここで、Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、水素又はＣ１−Ｃ４−アルキルから選択される）。
【請求項２】
前記ＣＤＫ阻害剤が式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩であり；ここで、前記フェニル基が：塩素、臭素、フッ素、もしくはヨウ素から選択されるハロゲン；Ｃ１−Ｃ４−アルキル、又はトリフルオロメチルから選択される１個、２個、又は３個の同一の又は異なる置換基によって置換されている、請求項１に記載の使用のための薬学的組合せ。
【請求項３】
前記ＣＤＫ阻害剤が式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩であり；ここで、前記フェニル基が、塩素、臭素、フッ素、又はヨウ素から選択される１個、２個、又は３個のハロゲンによって置換されている、請求項１又は２に記載の使用のための薬学的組合せ。
【請求項４】
前記ＣＤＫ阻害剤が式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩であり；ここで、前記フェニル基が塩素によって置換されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための薬学的組合せ。
【請求項５】
式Ｉの化合物によって表されるＣＤＫ阻害剤 が、（＋）−トランス−２−（２−クロロ−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩（化合物Ａ）である、請求項４に記載の使用のための薬学的組合せ。
【請求項６】
前記ＣＤＫ阻害剤が式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩であり；ここで、前記フェニル基が、クロロ及びトリフルオロメチル基で二置換されている、請求項１又は２に記載の使用のための薬学的組合せ。
【請求項７】
前記式Ｉの化合物によって表されるＣＤＫ阻害剤が、（＋）−トランス−２−（２−クロロ−４−トリフルオロメチルフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩（化合物Ｂ）である、請求項６に記載の使用のための薬学的組合せ。
【請求項８】
パクリタキセル、又はその薬学的に許容される塩の治療有効量；及び式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩によって表されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量；が、それを必要とする対象に連続的に投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用のための薬学的組合せ。
【請求項９】
パクリタキセル、又はその薬学的に許容される塩の治療有効量；が、式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩によって表されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量の前に投与される、請求項８に記載の使用のための薬学的組合せ。
【請求項１０】
治療的相乗効果を示す、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のための薬学的組合せ。
【請求項１１】
対象における三重陰性乳癌を治療する方法であって、前記対象に、パクリタキセル又はその薬学的に許容される塩の治療有効量、及び請求項１に記載の式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項１２】
前記ＣＤＫ阻害剤が式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩であり；ここで、前記フェニル基が：塩素、臭素、フッ素、もしくはヨウ素から選択されるハロゲン；Ｃ１−Ｃ４−アルキル、又はトリフルオロメチルから選択される１個、２個、又は３個の同一の又は異なる置換基によって置換されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＣＤＫ阻害剤が式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩であり；ここで、前記フェニル基が、塩素、臭素、フッ素、又はヨウ素から選択される１個、２個、又は３個のハロゲンによって置換されている、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＣＤＫ阻害剤が式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩であり；ここで、前記フェニル基が塩素によって置換されている、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記式Ｉの化合物によって表されるＣＤＫ阻害剤が、（＋）−トランス−２−（２−クロロ−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩（化合物Ａ）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＣＤＫ阻害剤が式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩であり；ここで、前記フェニル基が、クロロ及びトリフルオロメチル基で二置換されている、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記式Ｉの化合物によって表されるＣＤＫ阻害剤 が、（＋）−トランス−２−（２−クロロ−４−トリフルオロメチルフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩（化合物Ｂ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
パクリタキセル、又はその薬学的に許容される塩の治療有効量；及び式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩によって表されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量；が、それを必要とする対象に連続的に投与される、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
パクリタキセル、又はその薬学的に許容される塩の治療有効量；が、式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩によって表されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量の前に投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
パクリタキセル及び前記ＣＤＫ阻害剤が治療的相乗効果を示す、請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
三重陰性乳癌の治療における使用のための薬剤の製造のための請求項１に記載の薬学的組合せの使用。
【請求項２２】
請求項１に記載の薬学的組合せに含まれるＣＤＫ阻害剤が、（＋）−トランス−２−（２−クロロ−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩（化合物Ａ）である、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
請求項１に記載の薬学的組合せに含まれるＣＤＫ阻害剤が、（＋）−トランス−２−（２−クロロ−４−トリフルオロメチルフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩（化合物Ｂ）である、請求項２２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）の治療における使用のための、パクリタキセル、又はその薬学的に許容される塩；及び式Ｉの化合物（本明細書に記載のもの）又はその薬学的に許容される塩によって表される少なくとも１つのサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤を含む薬学的組合せに関する。本発明はまた、対象における三重陰性乳癌を治療する方法であって、対象に、パクリタキセル、又はその薬学的に許容される塩の治療有効量；及び式Ｉの化合物（本明細書に記載のもの）又はその薬学的に許容される塩によって表される少なくとも１つのサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤の治療有効量を含む薬学的組合せを投与することを含む方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、異常な細胞が制御なしに分裂する疾患を説明するために用いられる一般用語である。癌細胞は、隣接する組織に浸潤することができ、かつ血流及びリンパ系を通して身体の他の部分に広がることができる。膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、頭頸部癌、子宮内膜癌、腎臓（腎細胞）癌、白血病、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膵癌、前立腺癌、甲状腺癌、皮膚癌、非ホジキンリンパ腫、及び黒色腫などの、様々なタイプの癌がある。現在、化学療法、放射線、外科手術、ホルモン療法、免疫療法、及び遺伝子療法を含む、かつて無いほど多くの治療が癌に利用できる。化学療法は、最も日常的に用いられる癌治療である。
【０００３】
最も広く用いられる化学療法剤（抗腫瘍剤）としては、パクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、カルボプラチン、シスプラチン、トポテカン、及びゲムシタビンが挙げられる。これらの抗腫瘍剤は、様々な癌の治療に用いられ、成功している。しかしながら、やがて、一部の癌患者は、そのような標準的な抗腫瘍剤の使用を伴う単剤療法に対する耐性を発症することが見出されている。薬物に対する耐性（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）又は耐性（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）は、治療の成功に対する重大な障害である。そのような耐性は、多くの場合、内因性（すなわち、治療の開始時に存在する）又は獲得性（すなわち、化学療法の経過中に発生する）のいずれかであると考えられる。漸増濃度のドキソルビシンに対するヒト非小細胞肺癌細胞（ＮＣＩ−Ｈ４６０）の曝露を伴う研究により、ドキソルビシンに対して耐性があり、かつエトポシド、パクリタキセル、ビンブラスチン、及びエピルビシンに対して交差耐性がある新しい細胞株（ＮＣＩ−Ｈ４６０／Ｒ）の出現が報告された（Ｊ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，２００６，１８，１，６６−７３）。ゲムシタビンは、膵癌の治療のために最も臨床活性が高い薬物であると考えられたが、それは、薬物に対する腫瘍細胞の既存の又は獲得された化学耐性のために、膵癌患者の状態を顕著には改善しなかった（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００３，２２，２１，３２４３−５１）。
【０００４】
癌治療において認められる又はよく見られる別の問題は、抗腫瘍剤の多くと関連する強い毒性である。耐性の発生、並びに従来の抗腫瘍剤、例えば、ゲムシタビン及びパクリタキセルと関連する強い毒性にもかかわらず、これらの薬剤は、それらが腫瘤を縮小する能力を有するために、今なお癌治療で重要であり続けている。応答率を改善し、かつ従来の抗腫瘍剤と関連する毒性を防ぐために、新しい治療手法が評価されているところである。
【０００５】
１つのそのような手法は、異なる抗癌剤の組合せを含むプロトコルに関するものである。最適な組合せ化学療法プロトコルは、治療効力の増大、宿主毒性の減少、及び薬物耐性の最小化又は遅延をもたらすことができる。異なる毒性を有する薬物を組み合わせた場合、各々の薬物をその最適用量で使用することができ、耐えられない副作用を最小限に抑えるのに役立つ。抗腫瘍剤のうちのいくつかは、単剤療法として使用されたときよりも他の抗癌剤と組み合わせて使用されたときに相乗的に有効であることが見出されている。
【０００６】
シクロホスファミドと５−フルオロウラシルは、卵巣明細胞腺癌細胞で相乗的に作用する（Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．，２００１，１６２，１，３９−４８）。組合せ化学療法は、単剤療法、放射線療法、又は外科的処置で治療するのが難しい進行期の癌を治療するために有利に使用することもでき、例えば、パクリタキセルとゲムシタビンの組合せが、転移性非小細胞肺癌の治療について報告されている（Ｃａｎｃｅｒ，２００６，１０７，５，１０５０−１０５４）。ゲムシタビンとカルボプラチンの組合せ化学療法は、非小細胞肺癌を有する高齢患者を治療するために比較的安全かつ有効であった（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．，２００８，４０，１１６−１２０）。ゲムシタビンとカルボプラチンの組合せは、許容される毒性で、進行ＴＣＣ（移行細胞癌）において活性がある（ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ，２００７，７，９８）。ゲムシタビンとカルボプラチンによる治療は、白金感受性の再発性卵巣癌を有する患者の無増悪生存率を有意に改善する（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ，２００５，１５（Ｓｕｐｐｌ．１），３６−４１）。
【０００７】
最近、薬物応答率を改善するために、及び抗腫瘍剤に対する耐性に対処するために、癌の治療のための、１以上の標準的な抗腫瘍剤、例えば、パクリタキセル、シスプラチンなどと、分子標的抗癌剤との組合せが試されている。分子標的薬、例えば、メシル酸イマチニブ、フラボピリドールなどは、その活性が癌細胞とより特異的に関連しているタンパク質、例えば、キナーゼを調節する。長期にわたる研究により、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）ファミリーのメンバーが、様々な細胞プロセスにおいて重要な役割を果たすことが証明されている。１１種のＣＤＫファミリーメンバーが現在までに知られている。これらの中で、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、及びＣＤＫ６は、細胞周期において重要な役割を果たすことが知られている（Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９５，６６，１８１−２１２）。ＣＤＫは、サイクリン、例えば、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型（Ｄ１、Ｄ２、及びＤ３）、並びにＥ型サイクリンとの非共有結合的複合体を形成することによって活性化される。このファミリーの各々のアイソザイムは、細胞周期の特定の側面（細胞シグナル伝達、転写など）に関与し、ＣＤＫアイソザイムのうちのいくつかは、特定の種類の組織に特異的である。これらのキナーゼの異常発現及び過剰発現は、多くの病態で証明されている。潜在的に有用なＣＤＫ阻害特性を有するいくつかの化合物が開発され、文献に報告されている。
【０００８】
フラボピリドールは、臨床試験にまで至ったサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の最初の強力な阻害剤である。フラボピリドールは、種々の癌細胞株において従来の細胞傷害性抗腫瘍剤の細胞傷害性応答を相乗的に促進することが見出された。例えば、肺癌細胞についてのドセタキセルとフラボピリドールの組合せ処理は、Ｒａｄｉｏｔｈｅｒ．Ｏｎｃｏｌ．，２００４，７１，２，２１３−２１に報告されており、胃癌の治療については、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．，２００３，２，６，５４９−５５に報告されている。ＰＣＴ公開ＷＯ２００８１３９２７１号は、非小細胞肺癌及び膵癌の治療のための、ＣＤＫ阻害剤の（＋）−トランス−２−（２−クロロフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩と、細胞傷害性腫瘍剤、例えば、ドキソルビシン、ドセタキセル、パクリタキセル、及びゲムシタビンとの組合せを開示している。
【０００９】
癌の治療について様々な治療選択肢が利用可能であるが、この疾患は、今なお最も致命的な疾患の１つであり続けている。全ての種類の癌が致命的であるが、乳癌は、今なお致命的な癌の一種であり続けている。実際、女性において、乳癌は最も一般的な癌であり、癌による死亡の５番目に多い原因である。異なる形態の乳癌は、顕著に異なる生物学的特徴及び臨床的挙動を有することがある。したがって、患者の乳癌の分類は、治療レジメンを決定するための重要な要素となっている。乳癌患者は、３つの主なグループに分類される：
（ｉ）いくつかのエストロゲン受容体（ＥＲ）標的療法の選択肢±化学療法によって管理されるホルモン受容体陽性腫瘍を有する者；
（ｉｉ）さらに、トラスツズマブ、又は場合によっては、ラパチニブによるＨＥＲ２指向性療法を受けるＨＥＲ２＋腫瘍を有する者；及び
（ｉｉｉ）化学療法が利用可能な唯一の全身治療モダリティである、ホルモン受容体［ＥＲ及びプロゲステロン受容体（ＰＲ）］陰性及びＨＥＲ２）乳癌を有する者。
【００１０】
現在、トラスツズマブが、乳癌患者のための標的療法として開発されている。研究により、乳癌の発現プロファイルが体系的変化を示し、かつ５つの主要なグループへの乳癌の分類を可能にすることが示されており、それらのうちの２つはＥＲ＋（内腔Ａ及びＢ）グループ、３つはＥＲ−グループ［正常乳房様、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２としても知られる）、及び「基底様」］である。基底様グループは、ホルモン受容体及びＨＥＲ２の発現を欠く腫瘍が多く、従来のネオアジュバント及びアジュバント化学療法レジメンに応答するにもかかわらず、より侵襲性の臨床的挙動、独特の転移パターン、及び不良な予後を有することが示されている。上記のことを基に、三重陰性乳癌に対する関心が、（ｉ）このグループの乳癌患者に合った療法の欠如、及び（ｉｉ）基底様癌のプロファイルとの重複に端を発していることは明らかである（Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２００８，５２，１０８−１１８）。
【００１１】
三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）、すなわち、エストロゲン受容体（ＥＲ）陰性及びプロゲステロン受容体（ＰＲ）陰性であり、かつヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）を過剰発現しない腫瘍は乳癌の約１５％を占め、２００８年には、全世界で約１７０，０００症例が報告された。三重陰性乳癌は、他の分子サブグループに関する腫瘍よりも顕著に侵襲性（転移性）である。ＴＮＢＣは、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、及びＨＥＲ２受容体を発現せず、そのため、それらは、ホルモン療法及びＨＥＲ２標的療法を含む、現在利用可能な標的治療に耐性がある。基底様癌又は三重陰性癌を有する患者は、非基底様／非三重陰性患者のものと比較したとき、最初の転移事象後の生存期間が有意により短い。ＢＲＣＡ１生殖系列突然変異キャリアに生じる腫瘍の大部分は、基底様癌で記載されているものと同様の形態的特徴を有し、それらは、三重陰性かつ基底様の表現型を示す。
【００１２】
ＴＮＢＣは、最も厄介な乳癌グループのうちの１つを構成する。そのような癌を有する患者に、現在利用可能な唯一の全身療法は、化学療法である。しかしながら、そのような腫瘍を有する患者の生存率は今なお悪く、それゆえ、その管理は、より侵襲的な介入を必要とし得る。結果として、ＴＮＢＣのための標的療法の開発はかなり重要である。最近の治験により、ポリ（ＡＤＰ−リボシル）化ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤のＢＳＩ−２０１（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓによって開発されたイニパリブとして現在知られている）が、ＴＮＢＣにおいて非常に有効であることが示された（Ｍａｔｕｒｉｔａｓ，２００９，６３，２６９−２７４）。また、ＴＮＢＣは、ＰＡＲＰレベルの上昇を特徴とする。これらの特徴は、ＰＡＲＰ阻害によって、ＴＮＢＣにおける化学療法誘発性ＤＮＡ損傷の効果を強化することができる可能性があることを示唆している（Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１０，７，５，２，７−１０；Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，７，７，４４１−４４３）。
【００１３】
三重陰性乳癌は、化学療法に応答すると報告されているものの、そのような腫瘍を有する患者の生存率は今なお悪く、それゆえ、その管理は、より侵襲的な代替的介入を必要とし得る。したがって、三重陰性乳癌のための生物学的情報に基づく全身療法及び標的療法の開発は最も重要であり、この不均質な腫瘍集団の複雑さを理解すること、及び組合せ療法を用いることによって達成可能であると分かる可能性がある（Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２００８，５２，１０８−１１８）。
【００１４】
上記の議論を考慮し、かつ三重陰性乳癌を治療するための治療選択肢が非常に限られていることを考慮して、ＴＮＢＣを治療するためのさらなる治療選択肢及び治療方法が依然として必要である。
【発明の概要】
【００１５】
一態様では、本発明は、三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）の治療における使用のための、パクリタキセル、又はその薬学的に許容される塩の治療有効量；及び式Ｉの化合物（本明細書に記載のもの）又はその薬学的に許容される塩によって表されるサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤の治療有効量を含む薬学的組合せに関する。
【００１６】
一態様では、本発明は、対象における三重陰性乳癌を治療する方法であって、対象にパクリタキセル、又はその薬学的に許容される塩の治療有効量を；式Ｉの化合物（本明細書に記載のもの）又はその薬学的に許容される塩によって表されるサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤の治療有効量と組み合わせて投与することを含む方法に関する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、対象における三重陰性乳癌を治療する方法であって、対象にパクリタキセル、又はその薬学的に許容される塩の治療有効量を投与し；その後、対象に式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩によって表されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量を投与することを含む方法に関する。
【００１８】
さらなる態様では、本発明は、三重陰性乳癌の治療のための、パクリタキセル又はその薬学的に許容される塩の治療有効量、及び式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩によって表されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量を含む薬学的組合せの使用に関する。
【００１９】
また別の態様では、本発明は、三重陰性乳癌を治療するための薬剤の製造のための、パクリタキセル又はその薬学的に許容される塩、及び式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩によって表されるＣＤＫ阻害剤；を含む薬学的組合せの使用に関する。
【００２０】
本発明の他の態様及びさらなる適用性の範囲は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、及びＭＣＦ−７）におけるコロニー形成に対する化合物Ａの効果
【図２】ＭＣＦ−７乳癌細胞株におけるＭＣＴＳ形成に対する化合物Ａの効果
【図３Ａ】ＭＣＦ−７（Ｈｅｒ２−、ＢＲＣＡ＋／−アレル欠失）細胞株における細胞周期進行及びアポトーシスに対する化合物Ａの時間依存的効果
【図３Ｂ】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株における細胞周期進行及びアポトーシスに対する化合物Ａの時間依存的効果
【図４】化合物Ａで処理したＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株における抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−２の発現
【図５Ａ】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株（細胞周期の様々な段階）に対する化合物Ａの効果
【図５Ｂ】ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞株に対する化合物Ａの効果
【図５Ｃ】ＴＮＢＣ  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞株に対するＢＳＩ−２０１の効果
【図６Ａ】様々な乳癌細胞株におけるサイクリンＤ１レベル
【図６Ｂ】ＭＣＦ−７細胞周期タンパク質及びＣＤＫ４キナーゼ活性に対する化合物Ａの効果
【図７】ＰＡＲポリマーによって測定される乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８）におけるＰＡＲＰ酵素活性に対する化合物Ａの効果
【図８】２つのＴＮＢＣ細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８）におけるＰＡＲＰ及び細胞周期タンパク質に対する化合物Ａ（２４時間）の効果
【図９】Ｕ２５１  ＨＲＥ及びＵ２５１  ｐＧＬ３細胞株におけるＨＩＦ−１α阻害に対する化合物Ａの効果
【図１０】ＶＥＧＦ受容体遺伝子ベースのアッセイを用いたＶＥＧＦ阻害に対する化合物Ａの効果
【図１１Ａ】ＢＴ−５４９乳癌細胞株の遊走に対する化合物Ａの効果
【図１１Ｂ】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞株の遊走に対する化合物Ａの効果
【図１１Ｃ】ＭＣＦ−７乳癌細胞株の遊走に対する化合物Ａの効果
【図１２】内皮細胞管形成アッセイで観察される内皮管形成に対する化合物Ａの効果
【図１３】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株における２４時間のパクリタキセルと、それに続く７２時間の完全培地（ＣＭ）−グループＩＡ／化合物Ａ（ＩＣ50）−グループＩＶＡ／スニチニブ（ＩＣ50）−グループＶＡの組合せの効果
【図１４】ＢＴ−５４９細胞株における２４時間のパクリタキセルと、それに続く７２時間の完全培地（ＣＭ）−グループＩＢ／化合物Ａ（ＩＣ50）−グループＩＶＢ／スニチニブ（ＩＣ50）−グループＶＢの組合せの効果
【図１５】ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞株における２４時間のパクリタキセルと、それに続く７２時間の完全培地（ＣＭ）−グループＩＣ／化合物Ａ（ＩＣ50）−グループＩＶＣ／スニチニブ（ＩＣ50）−グループＶＣの組合せの効果
【発明を実施するための形態】
【００２２】
パクリタキセル、又はその薬学的に許容される塩、及び式Ｉの化合物（本明細書に記載のもの）又はその薬学的に許容される塩から選択されるＣＤＫ阻害剤を含む、本発明の薬学的組合せが；三重陰性乳癌の治療で使用されたときに、相乗効果を示すことが現在見出されている。
【００２３】
特に、本発明は、対象における三重陰性乳癌を治療又は管理する方法であって、対象にパクリタキセルの治療有効量を、式Ｉの化合物から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と組み合わせて投与することを含む方法を提供する。
【００２４】
本発明の薬学的組合せ中に含まれるＣＤＫ阻害剤は、本明細書に記載の式Ｉの化合物から選択される。以下の式Ｉによって表されるＣＤＫ阻害剤は、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ特許公開ＷＯ２００４００４６３２号（米国特許第７，２７２，１９３号に対応する）及びＰＣＴ特許公開ＷＯ２００７１４８１５８号に開示されている。式Ｉの化合物は、様々な癌細胞の増殖を阻害するＣＤＫ阻害剤である。本発明の薬学的組合せ中に含まれる式Ｉの化合物は、様々な固形悪性腫瘍及び血液悪性腫瘍に対して効果がある。本発明の発明者らは、式Ｉの化合物をパクリタキセルと組み合わせると、アポトーシス、すなわち、プログラム細胞死が増加することを観察した。
【００２５】
本発明で使用されるＣＤＫ阻害剤は、以下の式Ｉによって表される化合物から選択される。
【化１】
2013542979.tif 000002
【００２６】
（式中、Ａｒは、非置換であるか、或いは：クロロ、ブロモ、フルオロ、もしくはヨードから選択されるハロゲン；ニトロ、シアノ、Ｃ1−Ｃ4−アルキル、トリフルオロメチル、ヒドロキシ、Ｃ1−Ｃ4−アルコキシ、カルボキシ、Ｃ1−Ｃ4−アルコキシカルボニル、ＣＯＮＨ2、又はＮＲ1Ｒ2から選択される１個、２個、又は３個の同一の又は異なる置換基によって置換されているフェニル基であり；
ここで、Ｒ1及びＲ2は、各々独立に、水素又はＣ1−Ｃ4−アルキルから選択される。）
【００２７】
式（Ｉ）の化合物は、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開ＷＯ２００４００４６３２号及びＰＣＴ公開ＷＯ２００７１４８１５８号に開示されている方法に従って調製することができる。
【００２８】
式（Ｉ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩の一般的な調製プロセスは、以下の工程を含む：
【００２９】
（ａ）式ＶＩＡ
【化２】
2013542979.tif 000003
の中間体化合物の分割されたエナンチオマー的に純粋な（−）−トランスエナンチオマーを、ルイス酸触媒の存在下、無水酢酸で処理して、式ＶＩＩＡ
【化３】
2013542979.tif 000004
の分割されたアセチル化化合物を得ること、
【００３０】
（ｂ）式ＶＩＩＡの分割されたアセチル化化合物を、塩基及び溶媒の存在下、式ＡｒＣＯＯＨの酸又は式ＡｒＣＯＣｌの酸塩化物又は式（ＡｒＣＯ）2Ｏの酸無水物又は式ＡｒＣＯＯＣＨ3のエステル（式中、Ａｒは、式（Ｉ）の化合物に関連して上で定義されている通りである）と反応させて、式ＶＩＩＩＡ；
【化４】
2013542979.tif 000005
の分割された化合物を得ること、
【００３１】
（ｃ）式ＶＩＩＩＡの分割された化合物を、好適な溶媒中、塩基で処理して、式ＩＸＡ；
【化５】
2013542979.tif 000006
（式中、Ａｒは、上で定義されている通りである）の対応する分割されたβ−ジケトン化合物を得ること；
【００３２】
（ｄ）式ＩＸＡの分割されたβ−ジケトン化合物を塩酸などの酸で処理して、式ＸＡ
【化６】
2013542979.tif 000007
の対応する環化化合物を得ること
【００３３】
（ｅ）式ＸＡの化合物を１２０〜１８０℃の範囲の温度で脱アルキル化剤とともに加熱することによって、それを脱アルキル化に供して、式（Ｉ）の化合物の（＋）−トランスエナンチオマーを得ること、及び任意に、対象化合物をその薬学的に許容される塩に変換すること。
【００３４】
上記の工程（ａ）で利用されるルイス酸触媒は：ＢＦ3、Ｅｔ2Ｏ、塩化亜鉛、塩化アルミニウム、及び塩化チタンから選択することができる。
【００３５】
プロセス工程（ｂ）で利用される塩基は、トリエチルアミン、ピリジン、及びＤＣＣ−ＤＭＡＰ組合せ（Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドと４−ジメチルアミノピリジンの組合せ）から選択することができる。
【００３６】
式ＶＩＩＩＡの化合物から式ＩＸＡの対応するβ−ジケトン化合物への転位がベーカー・ベンカタラマン転位として知られることが当業者には明らかであろう（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９３３，１３８１およびＣｕｒｒ．Ｓｃｉ．，１９３３，４，２１４）。
【００３７】
プロセス工程（ｃ）で使用される塩基は：リチウムヘキサメチルジシラジド、ナトリウムヘキサメチルジシラジド、カリウムヘキサメチルジシラジド、水素化ナトリウム、及び水素化カリウムから選択することができる。好ましい塩基は、リチウムヘキサメチルジシラジドである。
【００３８】
式ＩＸＡの化合物の脱アルキル化のためにプロセス工程（ｅ）で使用される脱アルキル化剤は：ピリジン塩酸塩、三臭化ホウ素、三フッ化ホウ素エーテラート、及び三塩化アルミニウムから選択することができる。好ましい脱アルキル化剤は、ピリジン塩酸塩である。
【００３９】
式ＶＩＡの出発化合物の調製は、１−メチル−４−ピペリドンを１，３，５−トリメトキシベンゼンの氷酢酸溶液と反応させて、１−メチル−４−（２，４，６−トリメトキシフェニル）−１，２，３，６−テトラヒドロピリジンを生じさせ、これを、三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート、水素化ホウ素ナトリウム、及びテトラヒドロフランと反応させて、１−メチル−４−（２，４，６−トリメトキシフェニル）ピペリジン−３−オールを生じさせることを含む。１−メチル−４−（２，４，６−トリメトキシフェニル）ピペリジン−３−オールから式ＶＩＡの化合物への変換は、トリエチルアミン、ピリジン、炭酸カリウム、又は炭酸ナトリウムなどの酸素求核剤の存在下でのｐ−トルエンスルホニルクロリド、メタンスルホニルクロリド、トリフルオロメタンスルホン酸無水物、又は五塩化リンなどの適当な試薬による処理と、それに続く、イソプロパノール、エタノール、又はプロパノールなどのアルコール溶媒中、酢酸ナトリウム又は酢酸カリウムなどの酸素求核剤の存在下での環縮小によって、化合物１−メチル−４−（２，４，６−トリメトキシフェニル）ピペリジン−３−オールのピペリジン環上に存在するヒドロキシル基を、トシル、メシル、トリフレート、又はハライドなどの脱離基に変換することを含む。
【００４０】
一実施形態では、ＣＤＫ阻害剤は、フェニル基が：塩素、臭素、フッ素、又はヨウ素から選択されるハロゲン；Ｃ1−Ｃ4−アルキル、及びトリフルオロメチルから選択される１個、２個、又は３個の同一の又は異なる置換基によって置換されている、式Ｉの化合物である。
【００４１】
別の実施形態では、ＣＤＫ阻害剤は、フェニル基が、塩素、臭素、フッ素、又はヨウ素から選択される１個、２個、又は３個のハロゲンによって置換されている、式Ｉの化合物である。
【００４２】
別の実施形態では、ＣＤＫ阻害剤は、フェニル基が塩素によって置換されている、式Ｉの化合物である。
【００４３】
さらなる実施形態では、式Ｉの化合物によって表されるＣＤＫ阻害剤は、（＋）−トランス−２−（２−クロロ−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン又はその薬学的に許容される塩である。
【００４４】
またさらなる実施形態では、式Ｉの化合物によって表されるＣＤＫ阻害剤は、（＋）−トランス−２−（２−クロロ−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩（本明細書において化合物Ａと表される）である。
【００４５】
別の実施形態では、ＣＤＫ阻害剤は、フェニル基が、クロロ及びトリフルオロメチル基で二置換されている、式Ｉの化合物である。
【００４６】
さらなる実施形態では、式Ｉの化合物によって表されるＣＤＫ阻害剤は、（＋）−トランス−２−（２−クロロ−４−トリフルオロメチルフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン；又はその薬学的に許容される塩である。
【００４７】
またさらなる実施形態では、式Ｉの化合物によって表されるＣＤＫ阻害剤は、（＋）−トランス−２−（２−クロロ−４−トリフルオロメチルフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩（本明細書において化合物Ｂと表される）である。
【００４８】
一実施形態では、式Ｉの化合物によって表されるＣＤＫ阻害剤は、抗血管新生剤である。
【００４９】
一実施形態では、式Ｉの化合物によって表されるＣＤＫ阻害剤は、ＨＩＦ−１α阻害剤である。一実施形態では、式Ｉの化合物によって表されるＣＤＫ阻害剤は、ＶＥＧ−Ｆ阻害剤である。一実施形態では、式Ｉの化合物によって表されるＣＤＫ阻害剤は、ＰＡＲＰ酵素阻害剤である。
【００５０】
薬学的に許容される塩の形態であり得る、式Ｉの化合物の製造、並びに上記の化合物を含有する経口及び／又は非経口薬学的組成物の製造は、ＰＣＴ公開ＷＯ２００４００４６３２号（米国特許第７，２７２，１９３号に対応する）及びＰＣＴ公開ＷＯ２００７１４８１５８号に開示されている。これらのＰＣＴ公開は、式Ｉによって表されるＣＤＫ阻害剤が多くの癌細胞の増殖を阻害することを開示している。本明細書において上で示されているように、式ＩのＣＤＫ阻害剤は、その塩の形態で使用することができる。式Ｉの化合物の好ましい塩としては、塩酸塩、メタンスルホン酸塩、及びトリフルオロ酢酸塩が挙げられる。
【００５１】
式Ｉの化合物は、少なくとも２つのキラル中心を含み、したがって、２つの異なる光学異性体（すなわち、（＋）又は（−）エナンチオマー）の形態で存在する。全てのそのようなエナンチオマー、及びラセミ混合物を含むその混合物が本発明の範囲内に含まれる。式Ｉの化合物のエナンチオマーは、ＰＣＴ公開ＷＯ２００４００４６３２号、ＷＯ２００８００７１６９号、及びＷＯ２００７１４８１５８号に開示されている方法によって、上記のように得ることができるか、又は式Ｉの化合物のエナンチオマーは、キラルＨＰＬＣ及び酵素的分割などの、当技術分野で周知の技術によって得ることもできる。用語「エナンチオマー的に純粋な」は、９５％を超えるエナンチオマー過剰（ｅｅ）で存在する化合物を記述するものである。別の実施形態では、エナンチオマー過剰は９７％を超える。また別の実施形態では、エナンチオマー過剰は９９％を超える。用語「エナンチオマー過剰」は、あるエナンチオマーの量と生成物混合物中に存在する別のエナンチオマーの量の差を記述するものである。
【００５２】
或いは、式Ｉの化合物のエナンチオマーは、光学活性のある出発材料を用いることによって合成することができる。したがって、式Ｉの化合物の定義は、全てのあり得る立体異性体及びそれらの混合物を含む。式Ｉの化合物の定義は、規定の活性を有するラセミ体及び単離された光学異性体を含む。
【００５３】
パクリタキセルは、本発明の薬学的組合せ中に含まれる細胞傷害性抗腫瘍剤であるが、これは、タイヘイヨウイチイの木であるタクスス・ブレビフォリア（Ｔａｘｕｓ  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）から単離された天然のジテルペン産物である（Ｒｏｗｉｎｓｋｙ  ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，８２，１２４７−１２５９（１９９０））。パクリタキセルの単離及びその構造は、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９３，２３２５（１９７１）に開示されている。それは、チューブリン二量体からの微小管の集合を促進し、脱重合を妨げることによって微小管を安定化する抗微小管剤である。パクリタキセルは、肺癌、卵巣癌、乳癌、頭頸部癌、及び進行型のカポジ肉腫を有する患者を治療するのに用いられる。パクリタキセルは、卵巣癌の治療において（Ｍｅｒｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．；Ｙａｌｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，６４：５８３，１９９１）及び乳癌の治療に対して（Ｈｏｌｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ；Ｊ．Ｎａｔ．ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，８３；１７９７，１９９１）臨床使用が承認されているが、それは、他の癌を治療する際にも有用であり、例えば、それは、頭頸部癌（Ｆｏｒａｓｔｉｒｅ  ｅｔ．ａｌ．，Ｓｅｍ．Ｏｎｃｏｌ．，２０：５６，１９９０）及び肺癌（Ｍ．Ｇｈａｅｍｍａｇｈａｍｉ  ｅｔ  ａｌ；Ｃｈｅｓｔ；１１３；８６−９１（１９９８））の治療のための有力な候補であると考えられている。パクリタキセルは、米国特許第５，６７０，５３７号に開示されており、この文献は、感受性のある癌の治療におけるパクリタキセルの使用又は投与に関するその教示について、参照により本明細書に組み込まれる。パクリタキセルは、注射溶液のＴａｘｏｌ（登録商標）として市販されている。パクリタキセルがアルブミンに結合している製剤は、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）（Ａｂｒａｘｉｓ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）という商標で販売されている。
【００５４】
別途示されない限り、上記又は下記に使用される一般用語は、好ましくは、本開示との関連において以下の意味を有する：
【００５５】
本明細書で使用される場合、用語「組合せ」又は「薬学的組合せ」は、抗癌剤、すなわち、パクリタキセルとＣＤＫ阻害剤（式Ｉの化合物）の組合せ投与を意味し；抗癌剤は、独立して同時に、又はとりわけ、組合せ相手が相乗効果を示すことを可能にする時間間隔内で別々に、投与することができる。
【００５６】
本明細書で使用される場合、用語「相乗的な」は、本発明の方法及び組合せを用いて達成される効果が、パクリタキセル又はその薬学的に許容される塩、及びＣＤＫ阻害剤である式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩を別々に用いて得られる効果の和よりも大きいことを意味する。有利には、そのような相乗作用は、同じ用量でより大きい効力を提供し、かつ／又は多剤耐性の構築を防止するかもしくは遅延させる。
【００５７】
三重陰性乳癌の治療との関連における「治療有効量」は、本発明の組合せを受容する対象において以下の効果のうちの１つ又は複数をもたらすことができる量を指す：（ｉ）減速及び完全な成長停止を含む、腫瘍成長のある程度の阻害；（ｉｉ）癌細胞の数の低下；（ｉｉｉ）腫瘍サイズの縮小；（ｉｖ）末梢器官への腫瘍細胞浸潤の阻害（すなわち、低下、減速、もしくは完全な停止）；（ｖ）転移の阻害（すなわち、低下、減速、もしくは完全な停止）；（ｖｉ）腫瘍の退縮もしくは拒絶をもたらし得るが、必ずしもその必要はない、抗腫瘍免疫応答の増強；並びに／又は（ｖｉｉ）三重陰性乳癌と関連する１以上の症状のある程度の軽減。
【００５８】
本明細書で使用される場合、用語「管理する」、「管理すること」、及び「管理」は、対象又は患者が、ＴＮＢＣの進行又は悪化を予防するために該患者又は対象に投与されたときに、本発明の薬学的組合せから得る有益な効果を指す。
【００５９】
本明細書で使用される場合、用語「三重陰性乳癌（複数可）」又は「ＴＮＢＣ」は、様々な組織病理学的表現型の癌腫を包含する。例えば、あるＴＮＢＣは、腫瘍細胞が、乳房の正常な基底／筋上皮細胞に通常見られる遺伝子、例えば、高分子量基底サイトケラチン（ＣＫ、ＣＫ５／６、ＣＫ１４、ＣＫ１７）、ビメンチン、ｐ−カドヘリン、ｃｃＢクリスタリン、ファシン、並びにカベオリン１及び２を発現する「基底様」（「ＢＬ」）に分類される。しかしながら、ある他のＴＮＢＣは、異なる組織病理学的表現型を有し、その例としては、乳房の非特殊型の高悪性度浸潤性腺管癌、化生性癌、髄様癌、及び唾液腺様腫瘍が挙げられる。本発明の薬学的組合せが提供される治療のためのＴＮＢＣは、非応答性又は不応性ＴＮＢＣであってもよい。
【００６０】
本明細書で使用される用語「非応答性／不応性」は、三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）を有する対象または患者のうち、ＴＮＢＣの治療のために現在利用可能な癌療法（例えば、化学療法、放射線療法、外科手術、ホルモン療法、及び／又は、生物療法／免疫療法）を受けているけれども、その療法が患者の治療に臨床的に十分ではなく、さらなる効果的な療法を必要とする（例えば、治療に感受性のない）者を表すために用いられる。この語句は、療法に応答するが、副作用に苦しむ、再発する、耐性を発症するなどの、対象又は患者を記述することもできる。様々な実施形態では、「非応答性／不応性」は、癌細胞の少なくとも相当な部分が死滅しないか、又はその細胞分裂が停止しないことを意味する。癌細胞が「非応答性／不応性」であるかどうかの決定は、当技術分野で認められている「不応性」の意味をそのような文脈で用いて、癌細胞に対する治療の有効性を検定するための当技術分野で公知の任意の方法によって、インビボ又はインビトロのいずれかで行なうことができる。癌細胞の数が、顕著には低下していないか、又は増加している場合、癌は、「非応答性／不応性」である。
【００６１】
本明細書で使用される場合、用語「治療周期」は、パクリタキセル又はその薬学的に許容される塩、及び式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩のＣＤＫ阻害剤の投与の連続シークエンスが実行される期間を指す。
【００６２】
用語「アポトーシス」は、細胞内の一連の分子工程がその死をもたらす細胞死の一種を指す。これは、不要な又は異常な細胞を取り除く身体の正常なやり方である。アポトーシスの過程は、癌細胞で遮断されている場合がある。プログラム細胞死とも呼ばれる（癌用語辞典、  米国国立癌研究所）。
【００６３】
本明細書で使用される場合、用語「アポトーシスを増加させる」は、プログラム細胞死の割合の増加、すなわち、抗腫瘍剤のみ又はＣＤＫ阻害剤のみのいずれかへの曝露（接触）と比べて、より多くの細胞が死の過程に誘導されることと定義される。
【００６４】
本明細書で使用される用語「対象」は、治療、観察、又は実験の対象となっている、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを指す。
【００６５】
一実施形態では、本発明は、対象における三重陰性乳癌の治療方法であって、対象に、パクリタキセル又はその薬学的に許容される塩の治療有効量、及び式Ｉの化合物（本明細書に記載のもの）又はその薬学的に許容される塩から選択されるサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤を投与することを含む方法に関する。
【００６６】
したがって、本発明の方法では、三重陰性乳癌は、それを必要とする対象に、パクリタキセル又はその薬学的に許容される塩の治療有効量を、式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量と組み合わせて投与することによって治療され、その場合、相乗効果が得られる。
【００６７】
一実施形態では、本発明は、対象における三重陰性乳癌を治療する方法であって、対象に、パクリタキセル又はその薬学的に許容される塩の治療有効量、及び式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量を投与することを含む方法に関し、ここで、パクリタキセル及び該ＣＤＫ阻害剤は、連続的に投与される。
【００６８】
一実施形態では、本発明は、対象における三重陰性乳癌を治療する方法であって、対象に、パクリタキセル又はその薬学的に許容される塩の治療有効量、及び式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量を投与することを含む方法に関し、ここで、パクリタキセルは、該ＣＤＫ阻害剤の投与の前に投与される。
【００６９】
一実施形態では、本発明の三重陰性乳癌を治療する方法は、パクリタキセル及びＣＤＫ阻害剤を本明細書に記載の用量範囲で投与することを含む。
【００７０】
一実施形態では、本発明は、対象における三重陰性乳癌を治療する方法であって、対象に、パクリタキセル又はその薬学的に許容される塩の治療有効量、及び化合物Ａ又は化合物Ｂから選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量を投与することを含む方法に関する。
【００７１】
一実施形態では、本発明は、対象における三重陰性乳癌を治療する方法であって、対象に、パクリタキセル又はその薬学的に許容される塩の治療有効量、及び化合物Ａ又は化合物Ｂから選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量を投与することを含む方法に関し、ここで、パクリタキセル及び該化合物Ａ又は化合物Ｂは、連続的に投与される。
【００７２】
一実施形態では、本発明は、対象における三重陰性乳癌を治療する方法であって、対象にパクリタキセル又はその薬学的に許容される塩の治療有効量、及び化合物Ａ又は化合物Ｂから選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量を投与することを含む方法に関し、ここで、パクリタキセルは、化合物Ａ又は化合物Ｂの投与の前に投与される。
【００７３】
一実施形態では、本発明は、三重陰性乳癌の治療における使用のための薬学的組合せに関し、ここで、該薬学的組合せは、パクリタキセル又はその薬学的に許容される塩の治療有効量、及び式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量を含む。
【００７４】
一実施形態では、本発明は、三重陰性乳癌の治療における使用のための薬学的組合せに関し、ここで、該薬学的組合せは、パクリタキセル又はその薬学的に許容される塩の治療有効量、及び式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量を含み、ここで、パクリタキセル及び該ＣＤＫ阻害剤は、連続的に投与される。
【００７５】
一実施形態では、本発明は、三重陰性乳癌の治療における使用のための薬学的組合せに関し、ここで、該薬学的組合せは、パクリタキセル又はその薬学的に許容される塩の治療有効量、及び式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量を含み、ここで、パクリタキセルは、ＣＤＫ阻害剤の投与の前に投与される。
【００７６】
一実施形態では、本発明は、三重陰性乳癌の治療における使用のため薬剤の製造のための薬学的組合せの使用に関し、ここで、該薬学的組合せは、パクリタキセル又はその薬学的に許容される塩の治療有効量、及び式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩によって表されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量を含む。
【００７７】
一実施形態では、三重陰性乳癌の治療における使用のために提供される薬学的組合せ中に含まれるＣＤＫ阻害剤は、化合物Ａ又は化合物Ｂから選択される。
【００７８】
一実施形態では、薬学的組合せに含まれるＣＤＫ阻害剤は、化合物Ａである。
【００７９】
一実施形態では、薬学的組合せに含まれるＣＤＫ阻害剤は、化合物Ｂである。
【００８０】
一実施形態では、本発明の薬学的組合せ中に含まれる抗癌剤は、それらの異なる物理的及び化学的特徴のために、異なる投与経路を必要とし得る。例えば、式ＩのＣＤＫ阻害剤を、その良好な血液レベルを生成させ、かつ維持するために、経口又は非経口のいずれかで投与し得る一方で、抗腫瘍剤を、静脈内、皮下、又は筋肉内経路で非経口的に投与し得る。
【００８１】
経口使用のために、式ＩのＣＤＫ阻害剤を、例えば、錠剤もしくはカプセル、粉末、分散性顆粒、又はカシェーの形態で、或いは水性溶液又は懸濁液として投与し得る。経口使用のための錠剤の場合、一般に使用される担体には、ラクトース、トウモロコシデンプン、炭酸マグネシウム、タルク、及び糖が含まれ、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤が一般に添加される。カプセル形態での経口投与のために、有用な担体には、ラクトース、トウモロコシデンプン、炭酸マグネシウム、タルク、及び糖が含まれる。
【００８２】
筋肉内、腹腔内、皮下、及び静脈内使用のために、活性成分（パクリタキセル又はＣＤＫ阻害剤）の滅菌溶液が通常利用され、これらの溶液のｐＨは、好適に調整及び緩衝化されるべきである。
【００８３】
一実施形態では、使用される活性成分の滅菌溶液は、生理食塩水又は蒸留水中で調製される。
【００８４】
活性成分、すなわち、組合せ中に含まれる抗癌剤の実際の投薬量は、患者の要件及び治療されている状態の重症度によって様々に異なり得る。通常、治療は、化合物の最適用量に満たないより少ない用量で開始される。その後、各成分の用量を、その状況下での最適効果に達するまで少量ずつ増加させる。しかしながら、薬学的組合せ中の各成分の量は、通常、単独で投与された場合に治療効果をもたらす量に満たない。便宜のため、全日用量を、必要に応じて分割し、１日の間に少しずつ投与することができる。一実施形態では、パクリタキセルが、各々１０ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲の相乗的有効用量で投与され、かつＣＤＫ阻害剤が、５ｍｇ／ｍ2／日〜１０００ｍｇ／ｍ2／日の範囲の相乗的有効用量、特に、９ｍｇ／ｍ2／日〜約２５９ｍｇ／ｍ2／日の範囲の用量で投与されるように、パクリタキセル又はその薬学的に許容される塩、及び式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩から選択されるＣＤＫ阻害剤は、注射可能な形態で連続的に投与される。
【００８５】
一実施形態では、三重陰性乳癌の治療における使用のために提供される薬学的組合せは、それを必要とする対象に、以下の工程を含む、６〜８回の治療周期、特に、６回の治療周期；２回連続の治療周期の間、投与される。：
【００８６】
ｉ）治療周期の１日目のパクリタキセルと化合物Ａの薬学的組合せ単回用量投与；
ｉｉ）２日目から、連続４日間の１日１用量の化合物Ａの投与；
ｉｉｉ）薬物（抗癌剤）を投与しない２日間のインターバル；
ｉｖ）連続５日間の化合物Ａの任意投与、次いで、薬物（抗癌剤）投与をしない２日間のインターバル；
ｖ）任意に、工程ｉｖ）を反復すること；及び
ｖｉ）工程ｉ）の開始から３週間のインターバルの後、工程ｉ）〜ｖ）を第二の治療周期として繰り返すこと
【００８７】
一実施形態では、薬学的組合せは、それを必要とする対象に、外科手術前もしくは外科手術後に、又は外科手術前に一部及び外科手術後に一部、２回〜６回の治療周期の間、投与される。
【００８８】
本発明によって提供される組合せは、特定のアッセイ系で、及びいくつかの異なるインビトロでの投与スケジュールで評価されている。実験の詳細は、本明細書で以下に提供されている通りである。本明細書で提示されるデータは、式Ｉの化合物から選択されるＣＤＫ阻害剤と組み合わせたときに、パクリタキセルが相乗効果を示すことを明確に示している。三重陰性乳癌の治療において組み合わせて使用したときの抗癌剤が、細胞をＣＤＫ阻害剤のみ、式Ｉの化合物のみ、又はパクリタキセルのみで処理したときよりも、増殖性細胞におけるアポトーシス又は細胞傷害性を増大させることが明確に示されている。
【００８９】
薬理学的アッセイで使用される、代表的な化合物の化合物Ａは、（＋）−トランス−２−（２−クロロ−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩を指し、これは、参照により本明細書に組み込まれる、公開されたＰＣＴ公開ＷＯ２００４００４６３２号に開示されている化合物のうちの１つであった。
【００９０】
これから、パクリタキセル及びＣＤＫ阻害剤を含む本発明の組合せの相乗効果を、その好ましい実施形態に関して、より詳細に説明する。これらは単なる例として提供されており、本発明を限定することを意図するものではないことに留意すべきである。
【００９１】
以下の略語又は用語を本明細書で使用する：
ＡＴＣＣ：アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション，ＵＳＡ
ＡＴＰ：アデノシン三リン酸
ＣＨＣｌ3：クロロホルム
ＣＤＣｌ3：重水素化クロロホルム
ＣＯ2：二酸化炭素
ＣｏＡ：補酵素Ａ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）
ＤＣＣ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＢＴＡ：ジベンゾイル酒石酸
ＤＭＡＰ：４−ジメチルアミノピリジン
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸
ＤＴＴ：ジチオスレイトール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＥｔＯＡｃ：酢酸エチル
ＦＢＳ：胎仔ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）血清（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ）
ＦＣＳ：胎仔ウシ（ｃａｌｆ）血清（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ）
ｇ：グラム
ｈ：時間
ＨＣｌ：塩酸
ＩＰＡ：イソプロピルアルコール
ＫＢｒ：臭化カリウム
Ｋｇ：キログラム
Ｌ：リットル
ＭｇＳＯ4：硫酸マグネシウム
ＭｅＯＨ：メタノール
Ｍｉｎ：分
ｍＬ：ミリリットル
μＬ：マイクロリットル
μＭ：マイクロモル
ｍｍｏｌ：ミリモル
ｍｏｌ：モル
Ｎａ2ＣＯ3：炭酸ナトリウム
Ｎａ2ＳＯ4：硫酸ナトリウム
ＮａＢＨ4：水素化ホウ素ナトリウム
ＮａＯＨ：水酸化ナトリウム
ＮＣＩ：米国国立癌研究所
℃：セ氏度
ＰＡＲＰ：ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）
ＰＩ：ヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）
ＲＰＭＩ：米国ロズウェルパーク記念研究所
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
【００９２】
細胞株（供給源：ＡＴＣＣ，ＵＳＡ）：
ＴＮＢＣ：三重陰性乳癌
ＭＣＦ−７：（ＨＥＲ低、ＥＲ＋、ＰＲ＋、ＢＲＣＡ＋／−アレル欠失）乳癌細胞株
Ｔ４７−Ｄ：（ＨＥＲ低、ＥＲ＋、ＰＲ＋）乳癌細胞株
ＺＲ−７５−１：（ＨＥＲ低、ＥＲ＋、ＰＲ＋）乳癌細胞株
ＭＤＡ−ＭＢ−４６８：（ＨＥＲ−、ＥＲ−、ＰＲ−）三重陰性乳癌細胞株
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１：（ＨＥＲ−、ＥＲ−、ＰＲ−）三重陰性乳癌細胞株
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５−Ｓ：（ＨＥＲ−、ＥＲ−、ＰＲ−）三重陰性乳癌細胞株
ＭＤＡ−ＭＢ−３６１：（ＨＥＲ−、ＥＲ−、ＰＲ−）三重陰性乳癌細胞株
ＨＢＬ−１００：（ＨＥＲ−、ＥＲ−、ＰＲ−）三重陰性乳癌細胞株
ＢＴ−５４９：（ＨＥＲ−、ＥＲ−、ＰＲ−）三重陰性乳癌細胞株
ＨＵＶＥＣ：ヒト臍帯静脈内皮細胞
【００９３】
細胞株（供給源：ＮＣＩ，ＵＳＡ）：
Ｕ２５１  ＨＲＥ：遺伝子改変膠芽腫細胞
Ｕ２５１  ｐＧＬ３：遺伝子改変膠芽腫細胞
抗体（供給源：Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）：
サイクリンＤ１（細胞周期タンパク質）
Ｂｃｌ−２（抗アポトーシスタンパク質）
ＣＤＫ４（サイクリン依存性キナーゼ−４）
Ｒｂ（レチノブラストーマ）
ｐＲｂ  Ｓｅｒ７８０（ホスホ−レチノブラストーマ）
ＰＡＲ（ＰＡＲＰ酵素の基質）
ＰＡＲＰ（ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ）
β−アクチン（ハウスキーピングタンパク質、ウェスタンブロット解析のローディング対照として使用される）
細胞株のインキュベーション条件：３７℃及び５％ＣＯ2
【００９４】
本発明を、以下の非限定的な実施例によってさらに説明するが、この実施例は、本発明をさらに例示するものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、また、それらは、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきでもない。
【実施例】
【００９５】
実施例１：
（＋）−トランス−２−（２−クロロフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩（化合物Ａ）の調製
水素化ナトリウム（５０％、０．５４ｇ、１１．２５ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で、撹拌しながら、０℃の（−）−トランス−１−［２−ヒドロキシ−３−（２−ヒドロキシメチル−１−メチルピロリジン−３−イル）−４，６−ジメトキシフェニル）−エタノン（０．７ｇ、２．２ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（１５ｍＬ）溶液に少しずつ添加した。１０分後、メチル２−クロロベンゾエート（１．１５ｇ、６．７５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２５℃で２時間撹拌した。メタノールを２０℃未満で注意深く添加した。反応混合物をクラッシュアイス（３００ｇ）上に注ぎ、１：１のＨＣｌ（ｐＨ２）で酸性化し、ＥｔＯＡｃ（２×１００ｍＬ）を用いて抽出した。水性層を飽和Ｎａ2ＣＯ3（ｐＨ１０）を用いて塩基性化し、ＣＨＣｌ3（３×２００ｍＬ）を用いて抽出した。有機層を乾燥させ（無水Ｎａ2ＳＯ4）、濃縮した。残渣に濃ＨＣｌ（２５ｍＬ）を添加し、室温で２時間撹拌した。反応混合物をクラッシュアイス（３００ｇ）上に注ぎ、飽和水性Ｎａ2ＣＯ3溶液を用いて塩基性にした。混合物をＣＨＣｌ3（３×２００ｍＬ）を用いて抽出した。有機抽出物を水で洗浄し、乾燥させ（無水Ｎａ2ＳＯ4）、濃縮すると、化合物の（＋）−トランス−２−（２−クロロ−フェニル）−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−５，７−ジメトキシ−クロメン−４−オンが得られた。［収率：０．６７ｇ（６４％）；ｍｐ：９１〜９３℃；［α］D25＝＋５．８°（ｃ＝０．７、メタノール）］
【００９６】
溶融ピリジン塩酸塩（４．１ｇ、３５．６ｍｍｏｌ）を（＋）−トランス−２−（２−クロロ−フェニル）−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−５，７−ジメトキシ−クロメン−４−オン（０．４ｇ、０．９ｍｍｏｌ）に添加し、１８０℃で１．５時間加熱した。反応混合物を２５℃に冷却し、ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）で希釈し、Ｎａ2ＣＯ3を用いてｐＨ１０に塩基性化した。混合物を濾過し、有機層を濃縮した。残渣を水（５ｍＬ）に懸濁させ、３０分間撹拌し、濾過し、乾燥させると、化合物の（＋）−トランス−２−（２−クロロ−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オンが得られた。［収率：０．２５ｇ（７０％）］
【００９７】
（＋）−トランス−２−（２−クロロ−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン（０．２ｇ、０．４８ｍｍｏｌ）をＩＰＡ（５ｍＬ）に懸濁させ、３．５％ＨＣｌ（２５ｍＬ）を添加した。懸濁液を加熱して、透明な溶液を得た。この溶液を冷却し、固体を濾過すると、化合物の（＋）−トランス−２−（２−クロロフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩、すなわち、化合物Ａが得られた。
収率：０．２１ｇ（９７％）；ｍｐ：１８８〜１９２℃；［α］D25＝＋２１．３°（ｃ＝０．２、メタノール）；
【００９８】
実施例２：
（＋）−トランス−２−（２−クロロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシ−メチル−１−メチルピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩（化合物Ｂ）の調製
トランス−１−［２−ヒドロキシ−３−（２−ヒドロキシメチル−１−メチルピロリジン−３−イル）−４，６−ジメトキシフェニル）−エタノンの化合物（１．１６ｇ、３．２ｍｍｏｌ）、２−クロロ−４−トリフルオロメチル安息香酸（０．８８ｇ、４ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（１．３５ｇ、６．５ｍｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（０．４ｇ、３．２７ｍｍｏｌ）の混合物をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解させ、室温で１２時間撹拌した。反応混合物を０℃に冷却し、沈殿したジシクロヘキシル尿素を濾過し、有機層を濃縮し、残渣を、クロロホルム中の１％メタノール及び０．０１％アンモニアを溶離剤として用いるカラムクロマトグラフィーにより精製すると、化合物の（＋）−トランス−２−クロロ−４−トリフルオロメチル安息香酸２−（２−アセトキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−６−アセチル−３，５−ジメトキシフェニルエステルが得られた［収率：１．４４ｇ（７８．８％）］。
【００９９】
窒素雰囲気下、０℃で維持されたｎ−ＢｕＬｉ（１５％ヘキサン溶液、２．２ｍＬ、５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液に、ヘキサメチルジシラザン（１．０８ｍＬ、５．１ｍｍｏｌ）を滴加し、１５分間撹拌した。これに、（＋）−トランス−２−クロロ−４−トリフルオロメチル安息香酸２−（２−アセトキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−６−アセチル−３，５−ジメトキシフェニルエステル（１．４４ｇ、２．５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液を滴加し、温度を０℃に維持した。添加後、反応液を室温にまで温めさせておき、２．５時間撹拌した。反応混合物を希ＨＣｌで酸性化し、１０％重炭酸ナトリウムでｐＨ８〜９に塩基性化した。水性層をクロロホルム（３×２５ｍＬ）で抽出した。有機層を水（２５ｍＬ）、ブライン（２５ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させた。有機層を減圧下で濃縮し、真空下で乾燥させると、酢酸３−｛３−［３−（２−クロロ−４−トリフルロメチル（−フェニル）−３−オキソ−プロピオニル］−２−ヒドロキシ−４，６−ジメトキシ−フェニル｝−１−メチル−ピロリジン−２−イルメチルエステルが油（１．３ｇ、９０．２％）として得られた。このエステルを濃ＨＣｌ（１０ｍＬ）に溶解させ、３時間撹拌して、環化をもたらした。３時間後に、反応混合物を固体ＮａＨＣＯ3でｐＨ８〜９に塩基性化した。水性層をクロロホルム（２５×３ｍＬ）で抽出し、水（２５ｍＬ）及びブライン（２５ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮し、真空上で乾燥させた。残渣を、クロロホルム中の３％メタノールと０．１％アンモニアとを溶離剤として用いるカラムクロマトグラフィーで精製すると、化合物の（＋）−トランス−２−（２−クロロ−４−トリフルオロメチルフェニル）−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチルピロリジン−３−イル）−５，７−ジメトキシ−クロメン−４−オンが黄色の固体として得られた。［収率：０．５６ｇ（４８．２％）］
【０１００】
（＋）−トランス−２−（２−クロロ−４−トリフルオロメチルフェニル）−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチルピロリジン−３−イル）−５，７−ジメトキシ−クロメン−４−オン（０．２５ｇ、０．５ｍｍｏｌ）、ピリジン塩酸塩（０．２５ｇ、２．１６ｍｍｏｌ）、及び触媒量のキノリンの混合物を１８０℃で２．５時間加熱した。反応混合物をメタノール（２５ｍＬ）で希釈し、固体Ｎａ2ＣＯ3でｐＨ１０に塩基性化した。反応混合物を濾過し、メタノールで洗浄した。有機層を濃縮し、残渣を、０．１％アンモニアとクロロホルム中の４．５％メタノールとを溶離剤として用いるカラムクロマトグラフィーで精製すると、化合物の（＋）−トランス−２−（２−クロロ−４−トリフルオロメチルフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシ−メチル−１−メチルピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オンが黄色の固体として得られた。［収率：０．１５ｇ（６３．７％）］
【０１０１】
（＋）−トランス−２−（２−クロロ−４−トリフルオロメチルフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシ−メチル−１−メチルピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン（０．１ｇ、０．２ｍｍｏｌ）をメタノール（２ｍＬ）に懸濁させ、エーテルＨＣｌで処理し、有機溶媒を蒸発させると、化合物の（＋）−トランス−２−（２−クロロ−４−トリフルオロメチル−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩が得られた。［収率：０．１ｇ（９２．８％）］
【０１０２】
薬理学的アッセイ：
実施例３：
ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いた細胞傷害性アッセイ
ヨウ化プロピジウム蛍光アッセイ（ＰＩ）は、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ，１９９５，６，５２２−３２に記載の手順に従って実施した。
【０１０３】
ヒト腫瘍細胞株のインビトロ成長を特徴付けるため、及び化合物の細胞傷害活性を試験するために、アッセイを開発した。損傷した細胞膜にのみ透過するヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を色素として用いた。インターカレーション複合体は、ＰＩと二本鎖ＤＮＡとによって形成され、これにより、蛍光の増幅がもたらされる。細胞を−２０℃で２４時間凍結させた後、ＰＩは全ＤＮＡにアクセスすることができ、全細胞集団のカウントが可能になった。バックグラウンド測定値は、培地及びヨウ化プロピジウムを含む無細胞ウェルから得られた。
【０１０４】
ヒト乳癌細胞株（すなわち、ＭＣＦ−７、Ｔ４７−Ｄ、ＺＲ−７５−１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５−Ｓ、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＨＢＬ−１００、ＢＴ−５４９）を、１０％ＦＣＳを含む１８０μＬのＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地、Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ）又はＲＰＭＩ  １４６０中、１５００〜３０００細胞／ウェルの密度で、９６ウェルプレートに播種し、約１６時間インキュベートして、細胞を接着させておいた。その後、細胞を様々な濃度の化合物Ａ（０．１〜３μＭ）で処理した。上記の手順を、様々な濃度の化合物Ａ、パクリタキセル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）、及びスニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標）、ＬＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）について、３つのＴＮＢＣ細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、及びＢＴ−５４９）で繰り返した、すなわち、化合物Ａの濃度範囲を０．１〜３μＭとし、パクリタキセルの濃度範囲を０．１〜１０μＭとし、一方、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））については、濃度範囲を４８時間の全期間の間１〜１００μＭとした。プレートを、３７℃±１℃の加湿５％ＣＯ2インキュベーター内でインキュベートした。対照ウェルをビヒクル（ＤＭＳＯ）で処理した。インキュベーション期間の最後に、これらのプレートを、ＰＩ細胞傷害性アッセイプロトコルを用いてアッセイした。パーセント細胞傷害性を様々な薬物濃度で計算し、プロットされたグラフから、ＩＣ50値を決定した。本研究の結果を表１Ａ及び１Ｂに示す。
【表１Ａ】
2013542979.tif 000008
【０１０５】
表１Ａは、化合物処理の４８時間後に行なわれた細胞傷害性アッセイによって決定された、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＢＴ−５４９、及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８における化合物Ａ、パクリタキセル、及びスニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））のＩＣ50値（単位μＭ）を示している。
【表１Ｂ】
2013542979.tif 000009
【０１０６】
表１Ｂは、化合物Ａが、遺伝子マーカーに関係なく、０．３〜１．０μＭの範囲のＩＣ50で、全ての乳癌細胞株に対して有効に抗増殖性であることが分かったことを示している。
【０１０７】
実施例４：
クローン形成アッセイ又はコロニー形成アッセイ
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、及びＭＣＦ−７細胞株を、６ウェルプレート中、１５００細胞／ウェルの密度で、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ  １４６０中に播種した。２４時間のインキュベーションの後、細胞を（実施例３の手順により決定される）ＩＣ10、ＩＣ30、及びＩＣ50濃度の化合物Ａで４８時間処理した。このＩＣ10、ＩＣ30、及びＩＣ50値を表２に示す。培地を処理の最後に除去し、新鮮な培地（薬物なし）中で１４日間インキュベートした。１４日後、培地を吸引し、コロニーを、２：１の比率のメタノールと酢酸の混合物で固定し、水ですすぎ、固定手順を繰り返した。プレートを乾燥させ、コロニーを０．１％クリスタルバイオレットで５分間染色した。最後に、ウェルを水ですすぎ、乾燥させた。
【表２】
2013542979.tif 000010
【０１０８】
結果は図１に示されており、これは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、及びＭＣＦ−７細胞株（播種密度：１５００細胞／プレート）におけるＩＣ10、ＩＣ30、及びＩＣ50用量の化合物Ａによる応答の視覚的増強を示している。
【０１０９】
化合物Ａは、用量依存的な様式でコロニー形成能を阻害することが分かった。
【０１１０】
実施例５：
多細胞腫瘍スフェロイド（３Ｄ）形成に対する化合物Ａの効果
このアッセイは、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００７，１４０，１４１−１５１に開示されている方法に従って実施した。
【０１１１】
多細胞腫瘍スフェロイド（ＭＣＴＳ）モデルは、最もよく記載されている３Ｄインビトロ腫瘍モデル系のうちの１つであり、これは、腫瘍組織の特徴の多くを表現し、再現性のある実験を可能にし、優れたインビトロスクリーニング系を提供する。ＭＣＴＳをハンギングドロップ法を用いて増殖させた。簡潔に述べると、細胞単層をトリプシン−ＥＤＴＡを用いて剥離した。細胞数を調整し、１，０００細胞／滴を含む２０μＬのハンギングドロップ滴を細菌等級ペトリ皿の中で生成させた。これらのハンギングドロップを、５％ＣＯ2の加湿雰囲気で、３７℃で２４時間インキュベートした。このように生成されたＭＣＴＳを、様々な濃度（０．３μＭ〜３０μＭ）の化合物Ａの存在下又は非存在下で７２時間、培養した。
【０１１２】
結果を図２に示す。
【０１１３】
ＭＣＦ−７細胞懸濁液を、ＭＣＴＳの増殖のために、様々な濃度の化合物Ａ（０．３μＭ〜３０μＭ）と共インキュベートしたとき、３μＭ濃度以降の化合物Ａで、スフェロイド形成が停止した。１μＭで形成されたＭＣＴＳのサイズも対照と比べてより小さかった。ＭＣＴＳは、患者腫瘍の病態生理学的環境をシミュレートすることが十分によく特徴付けられているので、この観察は臨床的観点から重要である。腫瘍の低酸素状態の形成をもたらすスフェロイド中での酸素勾配のために、それは、腫瘍組織に広がる微小環境を模倣する。スフェロイド形成に対する化合物Ａの効果は、化合物Ａが低酸素状況下で有効であり得ることを示している。
【０１１４】
実施例６：
ＭＣＦ−７（Ｈｅｒ低、ＥＲ＋、ＰＲ＋、ＢＲＣＡ＋／−アレル欠失）及びＴＮＢＣ細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１における細胞周期進行及びアポトーシスに対する化合物Ａの時間依存的効果
細胞周期進行及びアポトーシスに対する化合物Ａの時間依存的効果を２つの乳癌細胞株で評価した。非同期ヒト乳癌細胞株のＭＣＦ−７（Ｈｅｒ低、ＥＲ＋、ＰＲ＋、ＢＲＣＡ＋／−アレル欠失）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ  １４６０中、フラスコ当たり０．５×１０6細胞の密度で、２５ｍｍ3組織培養フラスコに播種した。２４時間後、細胞を４．５μＭの化合物Ａで０、２４、４８、及び７２時間処理した。剥離された細胞と接着している細胞の両方を、表３に挙げられている様々な時点で回収した（トリプシン処理した）。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄した後、細胞を氷冷７０％エタノール中で固定し、さらなる解析まで−２０℃で保存した。
【０１１５】
解析の前に、細胞をＰＢＳで２回洗浄して、固定液を除去し、５０μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム及び５０μｇ／ｍＬのＲＮアーゼＡを含むＰＢＳに再懸濁させた。室温（２０〜３５℃）で２０分間のインキュベーションの後、フローサイトメトリーを用いて細胞を解析した。Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ，ＵＳＡ）をこれらの研究に用いた。４８８ｎｍに設定されたアルゴンイオンレーザーを励起源として用いた。赤色蛍光のレベルで規定したとき、２ｎ〜４ｎのＤＮＡ含量を有する細胞は、細胞周期のＧ１、Ｓ、及びＧ２／Ｍ期にあると表した。２ｎ未満のＤＮＡ含量を示す細胞は、サブ−Ｇ１（アポトーシス集団）細胞と表した。各細胞周期コンパートメント内の細胞の数は、存在する細胞の総数のパーセンテージとして表した。結果を表３に示し、図３Ａ（ＭＣＦ−７細胞株）及び図３Ｂ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株）にグラフで示す。
【表３】
2013542979.tif 000011
【０１１６】
上の表に示した結果から、化合物Ａが、ＭＣＦ−７（Ｈｅｒ低、ＥＲ＋、ＰＲ＋、ＢＲＣＡ＋／−アレル欠失）及びＴＮＢＣ細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１でアポトーシスを誘導したことが明らかである。最大のアポトーシスは４８時間及び７２時間で見られた。
【０１１７】
実施例７：
ウェスタンブロット解析を用いたＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における化合物Ａの効果：
若干の修正を加えて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２００７，６，９１８−９２５に開示されている手順に従って、ウェスタンブロットアッセイを実施した。
【０１１８】
ＭＣＦ−７細胞及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、２５ｍｍ3組織培養フラスコ中の１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ  １４６０培地中に播種し、２４時間インキュベートした。これらの細胞を、１．５及び４．５μＭの化合物Ａで処理した。様々な時点で、すなわち、６、２４、及び３０時間で、細胞を回収するか又はトリプシン処理し、溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）を用いて溶解させた。タンパク質含量を推定した。溶解物をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、次いで、ウェスタンブロッティングに適用した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２００７，６，９１８−９２５）。Ｂｃｌ−２及びアクチンに対する特異的抗体を用いて、ウェスタンブロッティングを行なった。結果を図４に示す。
【０１１９】
図４から、化合物Ａが、両方の細胞株において用量依存的な様式で、抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−２を下方調節することを理解することができる。ＭＣＦ−７細胞では、Ｂｃｌ−２が、２４時間以降、顕著に下方調節される一方、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１では、顕著な下方調節は、３０時間で観察された。
【０１２０】
実施例８：
細胞周期進行及びアポトーシスに対する化合物Ａの効果：
細胞周期進行及びアポトーシスに対する化合物Ａ及びＰＡＲＰ阻害剤ＢＳＩ−２０１（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓにより開発されたイニパリブ。ＢＳＩ−２０１は自前で調製する）の効果の比較を、２つのＴＮＢＣ細胞株で評価した。同期していないヒトＴＮＢＣ細胞株のＭＤＡ−ＭＢ−２３１とＭＤＡ−ＭＢ−４６８を、２５ｍｍ3組織培養フラスコ中、フラスコ当たり０．５×１０6細胞の密度で、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ  １４６０中に播種した。２４時間後、細胞を、１．５及び３．０μＭの化合物Ａ又は５０μＭのＰＡＲＰ阻害剤ＢＳＩ−２０１のいずれかで７２時間処理した。インキュベーション後、細胞を回収し（トリプシン処理し）、実施例６に示したように処理した。結果を表４Ａ及び４Ｂに示し；図５Ａ、５Ｂ、及び５Ｃにグラフで示す。
【表４Ａ】
2013542979.tif 000012
【表４Ｂ】
2013542979.tif 000013
【０１２１】
ＴＮＢＣ細胞株のＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８は、化合物Ａで処理したとき、用量依存的なアポトーシスの増加を示した。ＢＳＩ−２０１（５０μＭ）は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１におけるアポトーシスの誘導を示さなかった。しかしながら、最小限のアポトーシス（１２．６７％）が、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８で観察された。
【０１２２】
実施例９：
ＭＣＦ−７細胞周期タンパク質及びＣＤＫ４キナーゼ活性に対する化合物Ａの効果
ステップ１：サイクリン−Ｄ１発現の基礎レベル
サイクリン−Ｄ１発現の基礎レベルを、様々な乳癌細胞株、すなわち、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＢＴ−５４９、及びＨＢＬ−１００にわたって、ウェスタンブロット解析を用いて調べた（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２００７，６，９１８−９２５）。これらの細胞を、２５ｍｍ3組織培養フラスコ中の１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ  １４６０培地中に播種し、２４時間インキュベートした。これらの細胞を回収し（トリプシン処理し）、溶解緩衝液を用いて溶解させた。タンパク質含量を推定した。溶解物をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、次いで、ウェスタンブロッティングに適用した。サイクリンＤ１抗体を用いて、ウェスタンブロッティングを行なった。アクチンはローディング対照として使用される。結果を図６Ａに示す。高サイクリンＤ１レベルは、三重陰性乳癌細胞株を含む乳癌細胞株の大部分で観察された。
【０１２３】
ステップ２：ＭＣＦ−７細胞周期タンパク質及びＣＤＫ４キナーゼ活性に対する化合物Ａの効果
ＭＣＦ−７細胞を、２５ｍｍ3組織培養フラスコ中の１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ  １４６０培地中に播種し、２４時間インキュベートした。これらの細胞を１．５μＭの化合物Ａで処理した。様々な時点、すなわち、３時間、６時間、９時間、１２時間、及び２４時間で、細胞を回収し（トリプシン処理し）、溶解緩衝液を用いて溶解させた。タンパク質含量をブラッドフォード法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９７６，７２，２４８−２５４）で推定した。溶解物をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、次いで、ウェスタンブロッティングに適用した。様々な細胞周期タンパク質、すなわち、サイクリンＤ１、ＣＤＫ４、Ｒｂ、及びｐＲｂＳｅｒ７８０に対する特異的抗体を用いて、ウェスタンブロッティングを行なった。
【０１２４】
免疫沈降アッセイのために、ＭＣＦ−７細胞を血清飢餓によって同期させた。これらの細胞を、様々な時点、すなわち、３時間、６時間、９時間、及び１２時間で、１．５μＭの化合物Ａで処理した。細胞を回収し（トリプシン処理し）、溶解緩衝液を用いて溶解させ、タンパク質含量を推定した。ＣＤＫ４に対する特異的抗体を用いる免疫沈降によって、ＣＤＫ４−Ｄ１（サイクリンＤ１及びＣＤＫ４）を溶解物から精製した。免疫複合体をプロテインＡセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）を用いてさらに精製した。免疫複合体を用いて、基質としてのｐＲｂと32Ｐ標識ＡＴＰ（ＢＲＩＴ，Ｉｎｄｉａ）とを用いて、ＣＤＫ４活性を決定した。混合した反応液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで、転写及びオートラジオグラフィーに適用した。結果を図６Ｂに示す。
【０１２５】
化合物Ａは、ＭＣＦ−７（Ｈｅｒ低、ＥＲ＋、ＰＲ＋、ＢＲＣＡ＋／−、アレル欠失あり）において、時間依存的な様式でサイクリンＤ１及びｐＲｂを下方調節する。サイクリンＤ１及びｐＲｂ発現は、６時間以降、顕著には１２時間での減少を示す。２４時間を除き、Ｒｂ全体の顕著な変化は見られない。細胞ベースのアッセイにおけるＣＤＫ４キナーゼ活性の減少は早くも３時間から見られた。
【０１２６】
実施例１０：
ＰＡＲポリマーで測定されるＰＡＲＰ酵素活性に対する化合物Ａの効果
ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）は、ポリ（ＡＤＰ−リボシル化）（ＰＡＲ）触媒能を保有する酵素のファミリーの原理メンバーである。ＰＡＲＰ酵素活性を調べるために、ＰＡＲポリマー形成を測定した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を、２５ｍｍ3組織培養フラスコ中の１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ  １４６０培地中に播種し、２４時間インキュベートした。これらの細胞を１．５μＭ及び５μＭの化合物Ａで２４時間処理した。細胞を回収し（トリプシン処理し）、溶解緩衝液を用いて溶解させた。ＰＡＲに対する特異的抗体を用いてウェスタンブロッティング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２００７，６，９１８−９２５）を行なった。結果を図７に示す。
【０１２７】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株におけるＰＡＲポリマー形成の阻害によって観察されるように、化合物Ａは、ＰＡＲＰ酵素活性を阻害する。しかしながら、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８では、ＰＡＲポリマーの形成が阻害されないことが観察された。
【０１２８】
実施例１１：
ＴＮＢＣ細胞株におけるＰＡＲＰ及び細胞周期タンパク質に対する化合物Ａ（２４時間）の効果
ＰＡＲＰ活性と細胞周期タンパク質サイクリンＤ１、全Ｒｂ、及びｐＲｂ  ７８０との相関を、２つのＴＮＢＣ細胞株、すなわち、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１で調べた。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を、２５ｍｍ3組織培養フラスコ中の１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ  １４６０培地中に播種し、２４時間インキュベートした。これらの細胞を１．５μＭ及び５μＭの化合物Ａで２４時間処理した。細胞を回収し（トリプシン処理し）、溶解緩衝液を用いて溶解させた。ＰＡＲ、ＰＡＲＰ、サイクリンＤ１、ＣＤＫ４、及びｐＲｂ  Ｓｅｒ  ７８０に対する特異的抗体を用いて、ウェスタンブロッティングを実施した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｓ，２００７，６，９１８−９２５）。結果を図８に示す。
【０１２９】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１では、ＰＡＲポリマー形成の阻害によって見られるように、化合物Ａは、ＰＡＲＰ酵素活性を阻害する。これは、ｐＲｂ、サイクリンＤ１、及びＣＤＫ４の用量依存的な減少を伴う。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８では、ＰＡＲポリマー形成の変化は見られなかったものの、アポトーシスの指標であるＰＡＲＰ切断は顕著であった。
【０１３０】
ＴＮＢＣ細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を化合物Ａで処理し、２４時間インキュベートしたとき、この細胞株でＰＡＲＰ活性の阻害が観察された。しかしながら、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８は、ＰＡＲＰ酵素阻害を示さず、その代わりに、ＰＡＲＰの切断を示した。これらは両方とも、アポトーシスを経ている細胞のマーカーである。したがって、化合物Ａがこれらの細胞株の両方において顕著なアポトーシスを誘導することが明らかである。
【０１３１】
実施例１２：
ＨＩＦ−１α阻害に対する化合物Ａの効果
ＨＩＦ−１α受容体遺伝子ベースのアッセイにおける試験系：
１）Ｕ２５１  ＨＲＥ：ルシフェラーゼレポーター遺伝子が３コピーの同族ＨＲＥの制御下にある組換えベクターを安定に発現する遺伝子改変細胞Ｕ２５１  ＨＲＥ。
２）Ｕ２５１  ｐＧＬ３：対照細胞株は、非特異的及び／又はＨＩＦ−１非依存的様式でルシフェラーゼ発現を阻害する化合物を除外するのに役立つ構成的活性型ＳＶ４０プロモーター及びエンハンサーの制御下にホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む。これらの細胞は、酸素正常条件で高い基礎レベルのルシフェラーゼを発現し、低酸素条件で若干より低いレベルのルシフェラーゼを発現した。
【０１３２】
Ｕ２５１  ＨＲＥ細胞を、１８０μＬの容量中、１００００〜１５０００細胞／ウェルで、９６ウェルの白色平底プレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ2、及び周囲Ｏ2で２４時間インキュベートした。化合物Ａを、様々な濃度、すなわち、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１．０、３．０、及び１０μＭで試験し、プレートを、３７℃、５％ＣＯ2、１％Ｏ2、及び９４％Ｎ2のモジュール式低酸素チャンバー（Ｂｉｌｌｕｐｓ  Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ，ＭＩＣ  １０１，ＵＳＡ）内で２０時間インキュベートした。２０時間のインキュベーション後、プレートを取り出し、室温、５％ＣＯ2、及び周囲Ｏ2で１．５時間インキュベートした。４０μＬのＢｒｉｇｈｔ  Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を添加し、３分後、発光モードでＰｏｌａｒ  Ｓｔａｒ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＵＳＡ）を用いて、発光を測定した。適当な対照細胞（Ｕ２５１  ｐＧＬ３）を、それらを３７℃、５％ＣＯ2、及び周囲Ｏ2で処理したことを除き、同様に処理した。化合物毒性をＭＴＳアッセイを用いて検定した。
【０１３３】
結果を図９にグラフで示す。
【０１３４】
化合物Ａによる処理は、低酸素下（＜１％Ｏ2）のＵ２５１  ＨＲＥ細胞株において用量依存的な様式でＨＩＦ−１αの発現を効果的に遮断した。これらの化合物は、正常酸素下の対照細胞株Ｕ２５１  ｐＧＬ３におけるルシフェラーゼ発現を阻害しなかった。これは、化合物ＡがＨＩＦ−１αを特異的に阻害することを示している。
【０１３５】
実施例１３：
ＶＥＧＦ阻害に対する化合物Ａの効果：
細胞株Ｍ−９は、ＶＥＧＦ−Ｌｕｃコンストラクト（ｐＧＬ２−ｂａｓｉｃ中のＶＥＧＦプロモーター）と、ＶＥＧＦプロモーターレポーター遺伝子を形成するジェネティシン（Ｇ４１８）耐性遺伝子を含むプラスミドとで安定にコトランスフェクトされているＭＤＡ−ＭＢ−２３１である。ルシフェラーゼ活性によって測定される、クローン細胞におけるレポーター遺伝子の発現は、安定である。
【０１３６】
ＶＥＧＦ受容体遺伝子ベースのアッセイを用いて、ＶＥＧＦ阻害に対する化合物Ａの効果を評価した。
【０１３７】
ＶＥＧＦアッセイの試薬：
溶解アッセイ緩衝液（１×）
トリス−リン酸塩（ｐＨ７．８）−１２５ｍＭ、ＤＴＴ−１０ｍＭ、ＥＤＴＡ−１０ｍＭ、グリセロール−５０％、及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００−５％。
ルシフェラーゼアッセイ試薬（ＬＡＲ）
ルシフェラーゼアッセイ緩衝液−８ｍＬ、５３０μＭ  ＡＴＰ−５３０μＬ、２７０μＭ  ＣｏＡ−１ｍＬ、及び１７０μＭルシフェリン−１ｍＬ。
ルシフェラーゼアッセイ緩衝液（ＬＡＢ）（１×）
トリシン（ｐＨ７．８）−２０ｍＭ、マグネシアアルバ−１．０７ｍＭ、ＭｇＳＯ４−２．６７ｍＭ、ＥＤＴＡ−０．１ｍＭ、及びＤＴＴ−３３．３ｍＭ。
ＬＡＢ中で作製されるＡＴＰストック＝５．８５ｍｇ／ｍＬ
ＬＡＢ中で作製されるＣｏＡストック＝２．１ｍｇ／ｍＬ
ＬＡＢ中で作製されるルシフェリンストック＝１．５ｍｇ／ｍＬ
【０１３８】
ＶＥＧＦアッセイ用のプロトコル：
１．Ｍ−９細胞を継代培養し、３７℃及び５％ＣＯ2の加湿インキュベーター内で、１０％ＦＢＳ、及び４μＬ／ｍｌ  Ｇ４１８（ストック１００ｍｇ／ｍＬ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で維持した。
２．細胞を、組織培養等級の９６ウェル白色プレート及び透明プレートに、１８０μＬ容量中、３×１０4細胞／ウェルの密度で播種し、３７℃の加湿ＣＯ2インキュベーター（５％ＣＯ2）内で１６〜２０時間接着させておいた。インキュベーション条件が異なるので、合計２組のプレートを作製した。
３．最終所望濃度がそれぞれのウェルで達成されるように、化合物Ａ、Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標）、及びＢＳＩ−２０１を培地に連続希釈した。（ウェル中のＤＭＳＯ濃度は０．５％を超えない）。
４．インキュベーション条件：１組のプレートを、周囲大気条件下、５％ＣＯ2でインキュベートし、以後、正常酸素／有酸素プレートと表す。一方、もう１組のプレートを、酸素濃度が１％未満、窒素が９４％、ＣＯ2が５％である無酸素条件とし、以後、低酸素プレートと表す。インキュベーションの温度を３７℃とし、湿度を７５％超とする。
５．低酸素条件及び正常酸素条件下での２０〜２４時間のインキュベーションの後、プレートをインキュベーターから取り出し、全てのウェルの培地を白色プレートから除去する。細胞を１００〜１５０μＬ／ウェルのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で速やかに洗浄する。細胞を４０〜５０μＬの溶解緩衝液で２０分間溶解させる。
６．全てのウェルに、１００μＬのルシフェラーゼアッセイ試薬（ＬＡＲ）を添加し、ＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）（Ｐａｃｋａｒｄ，ＵＳＡ）で、発光について直ちにプレートを読み取る。阻害率及び阻害濃度（ＩＣ50）又は有効濃度（ＥＣ50）を対照（未処理）値と比較して計算する。
【０１３９】
低酸素下でのＶＥＧＦ阻害のＩＣ50値（μＭ）：
化合物Ａ：０．３１μＭ
Ｓｕｔｅｎｔ：１５μＭ
ＢＳＩ−２０１：＞１００μＭ
【０１４０】
結果を図１０にグラフで示す。
【０１４１】
化合物Ａによる処理は、ＶＥＧＦの発現を用量依存的な様式で効果的に遮断した。
【０１４２】
実施例１４：
創傷治癒アッセイにおける化合物Ａの効果
創傷治癒アッセイは、単純で、費用がかからず、インビトロでの有向性の細胞遊走を調べるための最も初期に開発された方法の１つである。この方法は、インビボでの創傷治癒時の細胞遊走を模倣する。
【０１４３】
プロトコル：
１．ＭＣＦ−７細胞を、２５ｍｍ3組織培養フラスコ中の１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ  １４６０培地中に播種し、２４時間インキュベートした。
２．細胞をトリプシン処理し、滅菌６ウェルプレートに１ウェル当たり（０．５〜２．０）×１０6の密度で播種した。
３．プレートを、周囲酸素レベル下、３７℃の加湿ＣＯ2インキュベーター（５％ＣＯ2）内で、約１６時間インキュベートした。細胞は、ウェルの全面にコンフルエントな均一の単層を形成することが観察された。コンフルエントな単層のための必要とされる細胞数は、具体的な細胞型とディッシュの大きさの両方によって決まる。
４．一直線の細胞単層をピペットの先端で均等に擦って、「引っ掻き傷」を生成させた。化合物の添加前に、引っ掻き傷の１枚目の画像を取得した。
５．化合物Ａを１μＭ及び３μＭの濃度で添加した。
６．その後、さらなるインキュベーションのために、プレートをインキュベーター内で保持した。インキュベーションの時間枠は、使用した具体的な細胞型について実験的に決定した。
７．インキュベーション後、デュッシュを位相差顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）下に置き、基準点を一致させ、１枚目の画像の撮影領域を位置合わせし、２枚目の画像を取得した。各画像について、引っ掻き傷の一方の側ともう一方の側の距離を測定した。
【０１４４】
ＢＴ−５４９及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株についても、同様のプロトコルに従った。
【０１４５】
結果を図１１Ａ、１１Ｂ、及び１１Ｃに示す。
【０１４６】
化合物Ａは、三重陰性乳癌細胞株を含む全ての乳癌細胞株で強力な抗遊走効果を示した。対照細胞は、２４時間のインキュベーションの後、完全な治癒を示した。化合物Ａで処理した細胞は、両側からの非常に少ない遊走を示し、したがって、強力な抗遊走効果が示された。
【０１４７】
実施例１５：
内皮管形成アッセイにおける化合物Ａの血管新生
管形成アッセイは、血管新生の阻害及び誘導を研究するための、単純であるが、強力なモデルである。このアッセイは、細胞外マトリックス（ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）Ｍａｔｒｉｘ，ＵＳＡ）中に明白な血管様の管を形成する内皮細胞の能力に依存しており、このマトリックス中で、この血管様の管を顕微鏡観察により後から可視化することができる。それにより、ネイティブな生理的環境によく似ている３次元マトリックス中での血管新生性の管の解析が可能となる。
【０１４８】
プロトコル
内皮細胞管形成アッセイ
コンフルエントなＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）を、所望のコンフルエンスになるまで上述の内皮培地を用いて培養した。ＨＵＶＥＣについては、６０〜８０％コンフルエンスが推奨される。
【０１４９】
細胞単層をトリプシン処理し、細胞を５〜１０％血清を含む培養培地に再懸濁させることによって、内皮細胞懸濁液を調製した。（２４ウェルプレートの１ウェルにつき）細胞懸濁液１８０μＬ当たり（０．５〜１）×１０6個の細胞を、４℃で解凍しておいた培地（ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｍａｔｒｉｘ）に添加した。その後、この懸濁液をプレートに添加し、インキュベーションのために保持した。細胞を２〜３時間接着させておき、その後、化合物Ａ（１μＭ）、ロテノン（１μＭ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）、及びトポテカン（３μＭ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）（２０μＬの１０×ストック）をそれぞれのウェルに添加した。ＤＭＳＯを対照として用いた。２４〜４８時間のインキュベーションの後、細胞を、管形成及び血管新生について位相差顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）下で観察した。
【０１５０】
結果を図１２に示す。
【０１５１】
化合物Ａは、３ＤゲルＨＵＶＥＣ管形成アッセイにおいて、内皮細胞管形成、したがって、血管新生を効果的に阻害した。１μＭの化合物Ａは、ロテノン（標準的なＶＥＧＦ阻害剤）に匹敵し、トポテカン（臨床試験における既知のＨＩＦ−１阻害剤）よりも優れていた。
【０１５２】
実施例１６：
インビトロ細胞傷害性アッセイ：
方法
ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）アッセイを用いた三重陰性乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対する化合物Ａとパクリタキセルの組合せの効果
アッセイプロトコル：
ヨウ化プロピジウム蛍光アッセイ（ＰＩ）をＡｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ，１９９５，６，５２２−３２に言及されている手順に従って実施した。
【０１５３】
ヒト腫瘍細胞株のインビトロ成長を特徴付けるため、及び試験化合物の細胞傷害活性を試験するために、アッセイを開発した。損傷した細胞膜にのみ透過するヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を色素として用いた。インターカレーション複合体はＰＩと二本鎖ＤＮＡとによって形成され、これにより、蛍光の増幅がもたらされる。細胞を−２０℃で２４時間凍結させた後、ＰＩは全ＤＮＡにアクセスすることができ、全細胞集団のカウントが可能になった。バックグラウンド測定値は、培地及びヨウ化プロピジウムを含む無細胞ウェルから得られた。
【０１５４】
ヒト三重陰性乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を、９６ウェルプレートに、１８０μＬのＲＰＭＩ−１６４０培地中、１５００〜３０００細胞／ウェルの密度で播種し、３７±１℃の加湿５％ＣＯ2インキュベーター内で約１６時間インキュベートして、細胞を接着させた。その後、表５に示す薬物処理のスケジュールに従って細胞を処理した。このスケジュールは、６つの処理グループからなる。全ての処理グループにおいて、２０μＬの１０×化合物（最初にＤＭＳＯに溶解させ、その後、細胞培地に希釈したもの、最終ＤＭＳＯ濃度は０．５％を超えない）をウェル中で用い、プレートを、３７±１℃の加湿５％ＣＯ2インキュベーター内でインキュベートした。培地をウェルから除去し、ＰＢＳで洗浄した。１ウェル当たり１００μＬのＰＩワーキング溶液（７μｇ／ｍＬ）を添加し、プレートを−８０℃で約１６時間保存した。プレートを解凍し、ＰＯＬＡＲｓｔａｒ  ｏｐｔｉｍａプレートリーダー（ＵＳＡ）を用いて、励起５３６ｎｍ及び放出５９０ｎｍで蛍光を測定した。
【０１５５】
（１ｍｇ／ｍＬのＰＩストック溶液は、１ｍｇのＰＩを１ｍＬの蒸留水に溶解させることによって調製した。ＰＩワーキング溶液は、１４０μＬのストック溶液をＰＢＳに添加して、容量を２２０ｍＬにすることによって調製した（７μｇ／ｍＬ））。
【０１５６】
スケジュール：それは、６つの処理グループからなる。
【０１５７】
１）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、パクリタキセル（０．０３、０．１、０．３、１．０、及び３．０μＭ濃度のＩＣμＭ）で処理し、２４時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、完全培地（ＣＭ）を添加し、７２時間インキュベートした（グループＩＡ）。
２）細胞を完全培地で処理し、２４時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、化合物Ａ（ＩＣ50＝１μＭ）を添加し、７２時間インキュベートした（グループＩＩＡ）。
３）細胞を完全培地で処理し、２４時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標）、ＩＣ50＝７．８μＭ）を添加し、７２時間インキュベートした（グループＩＩＩＡ）。
４）細胞を、様々な濃度のパクリタキセル（０．０３、０．１、０．３、１．０、及び３．０μＭ）で処理し、２４時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、化合物Ａ（ＩＣ50＝１μＭ）を添加し、７２時間インキュベートした（グループＩＶＡ）。
５）細胞を、パクリタキセル（０．０３、０．１、０．３、１．０、及び３．０μＭ）で処理し、２４時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標）、ＩＣ50＝７．８μＭ）を添加し、７２時間インキュベートした（グループＶＡ）。
６）細胞をＤＭＳＯビヒクルで処理し、２４時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、完全培地（ＣＭ：培地＋１０％ＦＣＳ）を添加し、７２時間インキュベートした（グループＶＩＡ）。
【０１５８】
薬物処理のスケジュールを表５に示す。
【表５】
2013542979.tif 000014
【０１５９】
インキュベーション期間の最後に、ＰＩ細胞傷害性アッセイプロトコルを用いてプレートを検定した。結果を表６、表７、及び図１３に示す。
【表６】
2013542979.tif 000015
【０１６０】
ＴＮＢＣ  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株における相乗効果を、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２００６，５８，６２１−６８１に記載されている、Ｃｈｏｕ及びＴａｌａｌａｙによるＣｏｍｐｕＳｙｎソフトウェアを用いて評価した。組合せ指数（ＣＩ）を用いて、組合せが、相加的であるか、相乗的であるか、又は拮抗的であるかを評価する。ＣＩ＜１は相乗的であり、ＣＩ＝１は相加的であり、ＣＩ＞１は拮抗的である。組合せグループを評価したときの組合せ指数を表７に示す。
【表７】
2013542979.tif 000016
【０１６１】
ＴＮＢＣ細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１における組合せ指数の値から明らかであるように、パクリタキセルと化合物Ａの組合せは、パクリタキセルとＳｕｔｅｎｔ（登録商標）よりも比較的相乗的であった。
【０１６２】
細胞傷害性の決定：
実施例３の表１Ａで明らかにされている、化合物処理の４８時間後に行なわれた細胞傷害性アッセイで決定されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＢＴ−５４９、及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８における化合物Ａ、パクリタキセル、及びスニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））のＩＣ50値（単位μＭ）を実施例１６で用いた。化合物処理の終了後、すなわち、４８時間後に、プレートをＰＩアッセイのために処理し、ＤＭＳＯ（ビヒクル）対照と比較して細胞傷害性パーセントを計算した。
【０１６３】
組合せ実験で用いたスケジュールの結果は、パクリタキセルと組み合わせて使用したときに、化合物Ａが相乗的であることを示した。
【０１６４】
実施例１７：
インビトロ細胞傷害性アッセイ：
方法
ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いた三重陰性乳癌細胞株ＢＴ−５４９に対する化合物Ａとパクリタキセルの組合せの効果
アッセイプロトコル：
ヨウ化プロピジウム蛍光アッセイ（ＰＩ）をＡｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ，１９９５，６，５２２−３２に言及されている手順に従って実施した。
【０１６５】
ヒト腫瘍細胞株のインビトロ成長を特徴付けるため、及び化合物の細胞傷害活性を試験するために、アッセイを開発した。損傷した細胞膜にのみ透過するヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を色素として用いた。インターカレーション複合体はＰＩと二本鎖ＤＮＡとによって形成され、これにより、蛍光の増幅がもたらされる。細胞を−２０℃で２４時間凍結させた後、ＰＩは全ＤＮＡにアクセスすることができ、全細胞集団のカウントが可能になった。バックグラウンド測定値は、培地及びヨウ化プロピジウムを含む無細胞ウェルから得られた。
【０１６６】
ヒト三重陰性乳癌細胞株ＢＴ−５４９を、９６ウェルプレートに、１８０μＬのＲＰＭＩ−１６４０培地中、１５００〜３０００細胞／ウェルの密度で播種し、３７±１℃の加湿５％ＣＯ2インキュベーター内で約１６時間インキュベートして、細胞を接着させた。その後、表８のスケジュールに従って細胞を処理した。各スケジュールは、６つの処理グループからなる。全ての処理グループにおいて、２０μＬの１０×化合物（最初にＤＭＳＯに溶解させ、その後、細胞培地に希釈したもの、最終ＤＭＳＯ濃度は０．５％を超えない）をウェル中で用い、プレートを、３７±１℃の加湿５％ＣＯ2インキュベーター内でインキュベートした。培地をウェルから除去し、ＰＢＳで洗浄した。１ウェル当たり１００μＬのＰＩワーキング溶液（７μｇ／ｍＬ）を添加し、プレートを−８０℃で約１６時間保存した。プレートを解凍し、ＰＯＬＡＲｓｔａｒ  ｏｐｔｉｍａプレートリーダー（ＵＳＡ）を用いて、励起５３６ｎｍ及び放出５９０ｎｍで蛍光を測定した。
【０１６７】
（１ｍｇ／ｍＬのＰＩストック溶液は、１ｍｇのＰＩを１ｍＬの蒸留水に溶解させることによって調製した。ＰＩワーキング溶液は、１４０μＬのストック溶液をＰＢＳに添加して、容量を２２０ｍＬにすることによって調製した（７μｇ／ｍＬ））。
【０１６８】
スケジュール：それは、６つの処理グループからなる。
【０１６９】
１）ＢＴ−５４９細胞をパクリタキセル（０．０３、０．１、０．３、１．０、及び３．０μＭ濃度）で処理し、２４時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、完全培地を添加し、７２時間インキュベートした（グループＩＢ）。
２）細胞を完全培地で処理し、２４時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、化合物Ａ（ＩＣ50＝１μＭ）を添加し、７２時間インキュベートした（グループＩＩＢ）。
３）細胞を完全培地で処理し、２４時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標）、ＩＣ50＝７．８μＭ）を添加し、７２時間インキュベートした（グループＩＩＩＢ）。
４）細胞を、パクリタキセル（０．０３、０．１、０．３、１．０、及び３．０μＭ）で処理し、２４時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、化合物Ａ（ＩＣ50＝１μＭ）を添加し、７２時間インキュベートした（グループＩＶＢ）。
５）細胞を、パクリタキセル（０．０３、０．１、０．３、１．０、及び３．０μＭ）で処理し、２４時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標）、ＩＣ50＝７．８μＭ）を添加し、７２時間インキュベートした（グループＶＢ）。
６）細胞をＤＭＳＯビヒクルで処理し、２４時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、完全培地（ＣＭ：培地＋１０％ＦＣＳ）を添加し、７２時間インキュベートした（グループＶＩＢ）。
【０１７０】
薬物処理のスケジュールを表８に示す。
【表８】
2013542979.tif 000017
【０１７１】
組合せグループを評価したときの組合せ指数を表９に示す。結果を図１４に示す。
【表９】
2013542979.tif 000018
【０１７２】
ＴＮＢＣ細胞株ＢＴ−５４９における組合せ指数によって示されるように、パクリタキセルと化合物Ａの組合せは、パクリタキセルとＳｕｔｅｎｔ（登録商標）よりも比較的相乗的であった。
【０１７３】
実施例１８：
インビトロ細胞傷害性アッセイ：
方法
ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いた三重陰性乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８に対する化合物Ａとパクリタキセルの組合せの効果
アッセイプロトコル：
ヨウ化プロピジウム蛍光アッセイ（ＰＩ）をＡｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ，１９９５，６，５２２−３２に言及されている手順に従って実施した。
【０１７４】
ヒト腫瘍細胞株のインビトロ成長を特徴付けるため、及び化合物の細胞傷害活性を試験するために、アッセイを開発した。損傷した細胞膜にのみ透過するヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を色素として用いた。インターカレーション複合体はＰＩと二本鎖ＤＮＡとによって形成され、これにより、蛍光の増幅がもたらされる。細胞を−２０℃で２４時間凍結させた後、ＰＩは全ＤＮＡにアクセスすることができ、全細胞集団のカウントが可能になった。バックグラウンド測定値は、培地及びヨウ化プロピジウムを含む無細胞ウェルから得られた。
【０１７５】
ヒト三重陰性乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８を、９６ウェルプレートに、１８０μＬのＲＰＭＩ−１６４０培地中、１５００〜３０００細胞／ウェルの密度で播種し、３７±１℃の加湿５％ＣＯ2インキュベーター内で約１６時間インキュベートして、細胞を接着させた。その後、表１０のスケジュールに従って細胞を処理した。各スケジュールは、６つの処理グループからなる。全ての処理グループにおいて、２０μＬの１０×化合物（最初にＤＭＳＯに溶解させ、その後、細胞培地に希釈したもの、最終ＤＭＳＯ濃度は０．５％を超えない）をウェル中で用い、プレートを、３７±１℃の加湿５％ＣＯ2インキュベーター内でインキュベートした。培地をウェルから除去し、ＰＢＳで洗浄した。１ウェル当たり１００μＬのＰＩワーキング溶液（７μｇ／ｍＬ）を添加し、プレートを−８０℃で約１６時間保存した。プレートを解凍し、ＰＯＬＡＲｓｔａｒ  ｏｐｔｉｍａプレートリーダー（ＵＳＡ）を用いて、励起５３６ｎｍ及び放出５９０ｎｍで蛍光を測定した。
【０１７６】
（１ｍｇ／ｍＬのＰＩストック溶液は、１ｍｇのＰＩを１ｍＬの蒸留水に溶解させることによって調製した。ＰＩワーキング溶液は、１４０μＬのストック溶液をＰＢＳに添加して、容量を２２０ｍＬにすることによって調製した（７μｇ／ｍＬ））。
【０１７７】
スケジュール：それは、６つの処理グループからなる。
【０１７８】
１）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を、パクリタキセル（０．０３、０．１、０．３、１．０、及び３．０μＭ濃度）で処理し、２４時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、完全培地を添加し、７２時間インキュベートした（グループＩＣ）。
２）細胞を完全培地で処理し、２４時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、化合物Ａ（ＩＣ50＝１μＭ）を添加し、７２時間インキュベートした（グループＩＩＣ）。
３）細胞を完全培地で処理し、２４時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標）、ＩＣ50＝７．８μＭ）を添加し、７２時間インキュベートした（グループＩＩＩＣ）。
４）細胞を、パクリタキセル（０．０３、０．１、０．３、１．０、及び３．０μＭ）で処理し、２４時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、化合物Ａ（ＩＣ50＝１μＭ）を添加し、７２時間インキュベートした（グループＩＶＣ）。
５）細胞を、パクリタキセル（０．０３、０．１、０．３、１．０、及び３．０μＭ）で処理し、２４時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標）、ＩＣ50＝７．８μＭ）を添加し、７２時間インキュベートした（グループＶＣ）。
６）細胞をＤＭＳＯビヒクルで処理し、２４時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、完全培地（ＣＭ：培地＋１０％ＦＣＳ）を添加し、７２時間インキュベートした（グループＶＩＣ）。
【０１７９】
薬物処置のスケジュールを表１０に示す。
【表１０】
2013542979.tif 000019
【０１８０】
組合せグループを評価したときの組合せ指数を表１１に示す。結果を図１４に示す。
【表１１】
2013542979.tif 000020
【０１８１】
ＴＮＢＣ細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８における組合せ指数によって示されるように、パクリタキセルと化合物Ａの組合せは、パクリタキセルとＳｕｔｅｎｔ（登録商標）よりも比較的相乗的であった。
【０１８２】
本発明は記載されている。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、文脈上そうでないことが明白に示されない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、複数の指示対象を含むことに留意すべきである。したがって、例えば、「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」を含む組成物に対する言及は、２以上の化合物の混合物を含む。文脈上そうでないことが明白に示されない限り、用語「又は（ｏｒ）」は、一般に、「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」を含むその意味において利用されることにも留意すべきである。
【０１８３】
本明細書中の刊行物及び特許出願は全て、本発明が関連する分野の当業者のレベルを示すものである。
【０１８４】
本発明は、様々な特定の及び好ましい実施形態及び技術に関して記載されている。しかしながら、本発明の精神及び範囲内にとどまりつつ、多くの変形及び修正が行なわれ得ることが理解されるべきである。                                                           
【図１】
2013542979.tif 000022
【図２】
2013542979.tif 000023
【図３Ａ】
2013542979.tif 000024
【図３Ｂ】
2013542979.tif 000025
【図４】
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【図５Ａ】
2013542979.tif 000027
【図５Ｂ】
2013542979.tif 000028
【図５Ｃ】
2013542979.tif 000029
【図６Ａ】
2013542979.tif 000030
【図６Ｂ】
2013542979.tif 000031
【図７】
2013542979.tif 000032
【図８】
2013542979.tif 000033
【図９】
2013542979.tif 000034
【図１０】
2013542979.tif 000035
【図１１Ａ】
2013542979.tif 000036
【図１１Ｂ】
2013542979.tif 000037
【図１１Ｃ】
2013542979.tif 000038
【図１２】
2013542979.tif 000039
【図１３】
2013542979.tif 000040
【図１４】
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【図１５】
2013542979.tif 000042
【手続補正書】
【提出日】平成25年7月18日(2013.7.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パクリタキセル又はその薬学的に許容される塩の治療有効量、及び式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩から選択されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量を含む、三重陰性乳癌の治療における使用のための薬学的組合せ；
【化１】
2013542979.tif 000043
（式中、Ａｒは、非置換であるか、或いは：塩素、臭素、フッ素、もしくはヨウ素から選択されるハロゲン；ニトロ、シアノ、Ｃ1−Ｃ4−アルキル、トリフルオロメチル、ヒドロキシル、Ｃ1−Ｃ4−アルコキシ、カルボキシ、Ｃ1−Ｃ4−アルコキシカルボニル、ＣＯＮＨ2、又はＮＲ1Ｒ2から選択される１個、２個、又は３個の同一の又は異なる置換基によって置換されているフェニルであり；ここで、Ｒ1及びＲ2は、各々独立に、水素又はＣ1−Ｃ4−アルキルから選択される）。
【請求項２】
前記ＣＤＫ阻害剤が式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩であり；ここで、前記フェニル基が：塩素、臭素、フッ素、もしくはヨウ素から選択されるハロゲン；Ｃ1−Ｃ4−アルキル、又はトリフルオロメチルから選択される１個、２個、又は３個の同一の又は異なる置換基によって置換されている、請求項１に記載の薬学的組合せ。
【請求項３】
前記ＣＤＫ阻害剤が式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩であり；ここで、前記フェニル基が、塩素、臭素、フッ素、又はヨウ素から選択される１個、２個、又は３個のハロゲンによって置換されている、請求項１又は２に記載の薬学的組合せ。
【請求項４】
前記ＣＤＫ阻害剤が式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩であり；ここで、前記フェニル基が塩素によって置換されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の薬学的組合せ。
【請求項５】
式Ｉの化合物によって表されるＣＤＫ阻害剤 が、（＋）−トランス−２−（２−クロロ−フェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩（化合物Ａ）である、請求項４に記載の薬学的組合せ。
【請求項６】
前記ＣＤＫ阻害剤が式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩であり；ここで、前記フェニル基が、クロロ及びトリフルオロメチル基で二置換されている、請求項１又は２に記載の薬学的組合せ。
【請求項７】
前記式Ｉの化合物によって表されるＣＤＫ阻害剤が、（＋）−トランス−２−（２−クロロ−４−トリフルオロメチルフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシメチル−１−メチル−ピロリジン−３−イル）−クロメン−４−オン塩酸塩（化合物Ｂ）である、請求項６に記載の薬学的組合せ。
【請求項８】
パクリタキセル、又はその薬学的に許容される塩の治療有効量；及び式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩によって表されるＣＤＫ阻害剤の治療有効量；が、それを必要とする対象に連続的に投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の薬学的組合せ。
【請求項９】
パクリタキセル、又はその薬学的に許容される塩；が、式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩によって表されるＣＤＫ阻害剤の前に投与される、請求項８に記載の薬学的組合せ。
【請求項１０】
治療的相乗効果を示す、請求項１〜９のいずれか一項に記載の薬学的組合せ。
【請求項１１】
三重陰性乳癌の治療における使用のための薬剤の製造のための請求項１〜７のいずれか一項に記載の薬学的組合せの使用。
【請求項１２】
前記組合せが治療的相乗効果を示す、請求項１１に記載の使用。                                                          
【国際調査報告】
2013542979.tif 000044
2013542979.tif 000045
2013542979.tif 000046
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