(57)【要約】  アミノ酸配列ＳＮＫを含む、Αβ由来の新規な拘束ペプチドエピトープ、関連する抗体組成物および使用方法。アミノ酸配列ＳＮＫを含む立体構造エピトープを含み且つオリゴマーΑβの溶媒に露出された抗体アクセス可能なナックル領域に対応する、環状ペプチドと特異的に結合する単離された抗体を記載する。アミノ酸配列ＳＮＫを含み且つオリゴマーΑβの溶媒に露出された抗体アクセス可能なナックル領域に対応する、拘束された環状立体配置を有するエピトープを含む抗原ペプチドも記載する。アルツハイマー病を処置、予防および診断する方法も記載する。
2013524774.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａβ由来の環状ペプチドと特異的に結合する単離された抗体であって、前記環状ペプチドが、オリゴマーＡβの溶媒に露出された抗体アクセス可能なナックル領域に対応する少なくともＳＮＫのアミノ酸配列を有する立体構造エピトープを含む、単離された抗体。
【請求項２】
Ａβ由来の環状ペプチドと特異的に結合する単離された抗体であって、前記環状ペプチドが、オリゴマーＡβの溶媒に露出された抗体アクセス可能なナックル領域に対応する配列番号：１に対応するアミノ酸配列を有する立体構造エピトープを含む、単離された抗体。
【請求項３】
非オリゴマー形態のＡβに対するよりも、オリゴマー形態のＡβに対してより大きな親和性でもって特異的に結合する、請求項１または２に記載の単離された抗体。
【請求項４】
モノクローナル抗体である、請求項１〜３のいずれかに記載の単離された抗体。
【請求項５】
ヒト化抗体である、請求項１〜４のいずれかに記載の単離された抗体。
【請求項６】
拘束された環状立体配置を有するエピトープを含む抗原ペプチドであって、前記エピトープが、オリゴマーＡβの溶媒に露出された抗体アクセス可能なナックル領域に対応する少なくともＳＮＫのアミノ酸配列を有する、抗原ペプチド。
【請求項７】
拘束された環状立体配置を有するエピトープを含む抗原ペプチドであって、前記エピトープが、オリゴマーＡβの溶媒に露出された抗体アクセス可能なナックル領域に対応する配列番号：１に対応するアミノ酸配列を有する、抗原ペプチド。
【請求項８】
オリゴマーＡβの溶媒に露出された抗体アクセス可能なナックル領域が、オリゴマーＡβ（１−４０）またはオリゴマーＡβ（１−４２）の残基２５〜２９に対応する、請求項８または９に記載の抗原ペプチド。
【請求項９】
検出可能な標識とコンジュゲートされた、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離された抗体を含む、免疫複合体。
【請求項１０】
治療上の有効量の請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離された抗体および医薬上許容されるアジュバントを含む、組成物。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか一項に記載の抗原ペプチドおよび医薬上許容されるアジュバントを含む、抗オリゴマーワクチン組成物。
【請求項１２】
アルツハイマー病の処置を必要とする患者においてアルツハイマー病を処置または予防する方法であって、医薬上有効量の請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離された抗体または請求項９に記載の免疫複合体を投与することを含む、方法。
【請求項１３】
アルツハイマー病の処置を必要とする患者においてアルツハイマー病を処置または予防する方法であって、請求項１２に記載のワクチンを投与することを含む、方法。
【請求項１４】
アルツハイマー病に罹患している疑いのある患者においてアルツハイマー病を診断する方法であって、
ａ）患者から生体試料を単離する工程；
ｂ）前記試料中での抗原／抗体複合体の形成を可能にする十分な時間および条件下で、前記生体試料を請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離された抗体と接触させる工程；および
ｃ）前記試料中の抗原／抗体複合体の存在を検出する工程を含み、ここで、前記複合体の存在が患者におけるアルツハイマー病の診断を示す、方法。
【請求項１５】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離された抗体；および
シグナルを生成する化合物と連結された抗原を含むコンジュゲート、
を含む、キット。
【請求項１６】
１つ以上の検出試薬を含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離された抗体；
シグナルを生成する化合物と連結された抗原を含むコンジュゲート；および
アルツハイマー病を診断するにあたっての使用説明書、
を含む、コマーシャルパッケージ。
【請求項１８】
アルツハイマー病の処置または予防のための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体または請求項９に記載の免疫複合体の使用。
【請求項１９】
アルツハイマー病の処置または予防のための、請求項１３に記載のワクチンの使用。
【請求項２０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離された抗体をコードする、核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は２０１０年３月３日に出願された米国仮出願第６１／３１０，１６７号の優先権の利益を主張し、前記仮出願は出典明示により完全に本明細書の一部とされる。
【０００２】
（分野）
本発明は、Ａベータオリゴマーの新規の立体構造エピトープ、関連の抗体組成物および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
アルツハイマー病（ＡＤ）は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のタンパク分解産物であるＡベータ（１−４０）、Αβ（１−４２）およびΑβ（１−４３）ペプチド（アミロイドβまたはΑβとも称される）で主として構成される細胞外プラークの脳での蓄積に付随した一般的な認知症傾向（記憶障害および認知障害）の神経変性疾患である。加えて、異常にリン酸化されたタウタンパク質（ニューロン微小管関連タンパク質）で主として構成される神経原線維変化が、死に瀕したニューロンの細胞内に蓄積する。Αβ（１−４２）はＡＤ患者のアミロイドプラークにおいて主要な分子種である。
【０００４】
家族性型のＡＤは、ＡＰＰ遺伝子における、又はそのタンパク産物がＡＰＰのΑβへのプロセシングに関係するプレセニリン１もしくは２遺伝子における突然変異に起因し得る。アポリポタンパク質Ｅ対立遺伝子バリアントも、孤発性および家族性のＡＤの両方の発症年齢に影響を及ぼす。最近では、ペプチドがオリゴマー化したΑβの特定の分子種が、ＡＤおよび該疾患のマウスモデルで観察される神経毒性の主要な構成要素を媒介することが明らかにされた（Walsh et al. 2002）。Αβオリゴマーの毒性は、ニューロンのインスリン受容体の機能不全によって（Zhao et al. 2008）、及び正常なシナプス機能に対する干渉、特に海馬での、グルタミン酸受容体の異所性活性化による干渉によって現れ得る（De Felice et al. 2007; Nimmrich et al. 2008）。Ａβオリゴマーと正常な細胞性アイソフォームのプリオンタンパク質ＰｒＰＣとの間のナノモーラーの親和性結合相互作用が報告された（Lauren et al. 2009）。さらに、ＰｒＰＣと様々な毒性シグナル伝達経路との間の相互作用（Solforosi et al. 2004; Lefebvre-Roque et al. 2007）、例えばグルタミン酸受容体サブユニットとの相互作用（Khosravani et al. 2008）が、Ａβオリゴマーの毒性に関する統一メカニズムをもたらし得る。
【０００５】
Αβの免疫認識が、ヒト変異体アミロイド前駆体タンパク質を発現するトランスジェニックマウスの病理学および挙動の両方の改善をもたらし得ることは広く認められている。しかしながら、「非選択的な」Αβ免疫療法によりヒトを治療するにあたっては内在する危険性がある。例えば、自己免疫髄膜脳炎が、非選択的Αβ免疫原を含有するアルツハイマーワクチンを受けた患者の約１０％で発症した（Gelinas et al. 2004; Robinson et al. 2004; Broytman and Malter 2004; Mathews and Nixon 2003）。結果として生じる髄膜脳炎はΑβに対する細胞性免疫の活性化によるもののようであったが、細胞性免疫反応とは無縁の、受動注入されたΑβモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が脳の微小出血と関係していることも示された（Goni and Sigurdsson 2005）。Αβによる非選択的免疫の別の危険性は、脳のニューロンおよび循環性単球（circulating monocyte）の表面に露出する親タンパク質ＡＰＰの免疫認識である（Jung et al. 1996; Jung et al. 1990）。そのような細胞表面膜分子の認識は、溶解の引き金となり得るか、又は栄養学的活性を含み得るＡＰＰタンパク質の細胞外ドメインの機能に対する干渉の引き金となり得る（Morimoto et al. 1998; Mileusnic et al. 2005; Mileusnic et al. 2000）。
【０００６】
Αβペプチドの「非特異的な」認識に関する別の問題は、Αβペプチドが単に毒性のΑβ分子種、Αβオリゴマーの前駆体であるということである。Αβオリゴマーは、培養中の細胞系およびニューロンを殺すこと（Lambert et al. 2007; Lacor et al. 2007; Ronicke et al. 2008）、及びスライス培養および生きた動物における、長期増強（ＬＴＰ）と称される記憶に役立つ重要なシナプス活性を妨害することが示された（Balducci et al. 2010; Shankar et al. 2008; Selkoe 2008; Klyubin et al. 2005; Walsh et al. 2002; Wang et al. 2002）。マウスでの記憶障害の発症と相関する特異的Αβオリゴマーが特定され、それを精製し、正常な若いラットに注入した場合、マウスで見られる拒否行動の欠陥（negative behavioral defects）が再現される（Lesne et al. 2006）。同様の研究により、ＰｒＰＣが、Αβオリゴマーに対する受容体として働き得ること、及びその毒性作用をシナプスＬＴＰ妨害（disruption）において変換し得ることが実証された（Lauren et al. 2009）。
【０００７】
過去にＡβペプチドに対するΑβワクチンおよびモノクローナル抗体が産生されたが、これまでのところ、望ましい治療効果を与え、また動物および／またはヒトで重篤な副作用を引き起こさないことが証明されたものはない。この疾患の進行を阻止または遅延させるが、人体に否定的な影響および潜在的に致死的な影響をもたらさない、生物製剤の開発に関する治療的必要性がある。この必要性は、一般集団の増加する寿命に鑑みて特に明白であり、この寿命の増加に伴って、アルツハイマー病と診断される年間患者数は増加している。疾患特異エピトープ（ＤＳＥ）である免疫学的エピトープを同定し、毒性のΑβオリゴマー分子種を特異的に標的とする免疫療法を開発することが望ましいであろう。また、毒性のΑβオリゴマー分子種を標的とし、且つ細胞表面のＡＰＰの自己免疫認識を避ける免疫療法の開発も望ましい。そのようなＤＳＥエピトープは、標的タンパク質の毒性を特異的に中和する免疫療法および予防ワクチンの標的となり得る。また、ＡＤを発症する危険性がある集団の指標を与える診断ツール、ＡＤと他の認知症症候群を区別する鑑別診断のための診断ツール、およびＡＤ治療に対するバイオマーカーをモニタする診断ツールを開発することも望ましい。
【０００８】
従って、毒性のΑβオリゴマー分子種に固有の疾患特異エピトープを提供することが望ましい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Walsh, D.M., et al., Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature, 2002. 416(6880): p. 535-9.
【非特許文献２】Gelinas, D.S., et al., Immunotherapy for Alzheimer’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. 101 Suppl 2: p. 14657-62.
【非特許文献３】Robinson, S.R., et al., Lessons from the AN 1792 Alzheimer vaccine: lest we forget. Neurobiol Aging, 2004. 25(5): p. 609-15.
【非特許文献４】Broytman, O. and J.S. Malter, Anti-Abeta: The good, the bad, and the unforeseen. J Neurosci Res, 2004. 75(3): p. 301 -6.
【非特許文献５】Mathews, P.M. and R.A. Nixon, Setback for an Alzheimer’s disease vaccine: lessons learned. Neurology, 2003. 61 (1): p. 7-8.
【非特許文献６】Goni, F. and E.M. Sigurdsson, New directions towards safer and effective vaccines for Alzheimer’s disease. Curr Opin Mol Ther, 2005. 7(1): p. 17-23.
【非特許文献７】Jung, S.S., J. Nalbantoglu, and N.R. Cashman, Alzheimer’s beta-amyloid precursor protein is expressed on the surface of immediately ex vivo brain cells: a flow cytometric study. J Neurosci Res, 1996. 46(3): p. 336-48.
【非特許文献８】Jung, S.S., S. Gauthier, and N.R. Cashman, Beta-amyloid precursor protein is detectable on monocytes and is increased in Alzheimer’s disease. Neurobiol Aging, 1999. 20(3): p. 249-57.
【非特許文献９】Morimoto, T., et al., Involvement of amyloid precursor protein in functional synapse formation in cultured hippocampal neurons. J Neurosci Res, 1998. 51 (2): p. 185-95.
【非特許文献１０】Mileusnic, R., C.L. Lancashire, and S.P. Rose, Amyloid precursor protein: from synaptic plasticity to Alzheimer’s disease. Ann N Y Acad Sci, 2005. 1048: p. 149-65.
【非特許文献１１】Mileusnic, R., et al., APP is required during an early phase of memory formation. Eur J Neurosci, 2000. 12(12): p. 4487-95.
【非特許文献１２】Lambert, M.P., et al., Monoclonal antibodies that target pathological assemblies of Abeta. J Neurochem, 2007. 100(1): p. 23-35.
【非特許文献１３】Lacor, P.N., et al., Abeta oligomer-induced aberrations in synapse composition, shape, and density provide a molecular basis for loss of connectivity in Alzheimer’s disease. J Neurosci, 2007. 27(4): p. 796-807.
【非特許文献１４】Ronicke, R., et al., Abeta mediated diminution of MTT reduction-an artefact of single cell culture? PLoS One, 2008. 3(9): p. e3236.
【非特許文献１５】Balducci, C, et al., Synthetic amyloid-beta oligomers impair long-term memory independently of cellular prion protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010, 107(5): p. 2295-300.
【非特許文献１６】Shankar, G.M., et al., Amyloid-beta protein dimers isolated directly from Alzheimer’s brains impair synaptic plasticity and memory. Nat Med, 2008. 14(8): p. 837-42.
【非特許文献１７】Selkoe, D.J., Soluble oligomers of the amyloid beta-protein impair synaptic plasticity and behavior. Behav Brain Res, 2008. 192(1): p. 106- 3.
【非特許文献１８】Klyubin, I., et al., Amyloid beta protein immunotherapy neutralizes Abeta oligomers that disrupt synaptic plasticity in vivo. Nat Med, 2005. 1 1 (5): p. 556-61.
【非特許文献１９】Wang, H.W., et al., Soluble oligomers of beta amyloid (1 -42) inhibit long-term potentiation but not long-term depression in rat dentate gyrus. Brain Res, 2002. 924(2): p. 133-40.
【非特許文献２０】Lesne, S., et al., A specific amyloid-beta protein assembly in the brain impairs memory. Nature, 2006. 440(7082): p. 352-7.
【非特許文献２１】Lauren, J., et al., Cellular prion protein mediates impairment of synaptic plasticity by amyloidbeta oligomers. Nature, 2009. 457(7233): p. 1 128-32.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
（概要）
本開示の目的は、アルツハイマー病の診断、処置および予防のための、従前のエピトープ、抗体、組成物および方法の少なくとも１つの不利な点を取り除く又は緩和することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
第一の態様において、本開示は、一部分において、選択的抗体結合に有益な特徴を有するＡβ中の新規な構造エピトープに関する驚くべき発見に基づく。
【００１２】
１つの実施形態において、オリゴマーＡβの溶媒に露出された抗体アクセス可能な「ナックル領域（knuckle region）」に対応する少なくともＳＮＫのアミノ酸配列を有するＡβ由来の環状ペプチドが提供される。
【００１３】
他の実施形態において、拘束された環状立体配置（constrained cyclic configuration）を有するエピトープを含む抗原ペプチドであって、前記エピトープがオリゴマーＡβの溶媒に露出された抗体アクセス可能なナックル領域に対応する少なくともＳＮＫのアミノ酸配列を有する、抗原ペプチドが提供される。
【００１４】
他の実施形態において、拘束された環状立体配置を有するエピトープを含む抗原ペプチドであって、前記エピトープがオリゴマーＡβの溶媒に露出された抗体アクセス可能なナックル領域に対応する配列番号１に対応するアミノ酸配列を有する、抗原ペプチドが提供される。
【００１５】
１つの態様において、該抗原ペプチドのエピトープは、オリゴマーＡβ（１−４０）またはオリゴマーＡβ（１−４２）の残基２５〜２９に対応する。
【００１６】
他の実施形態において、Αβ由来の環状ペプチドに特異的に結合する単離された抗体であって、前記環状ペプチドがオリゴマーＡβの溶媒に露出された抗体アクセス可能なナックル領域に対応する少なくともＳＮＫのアミノ酸配列を有する立体構造エピトープを含む、単離された抗体が提供される。
【００１７】
他の実施形態において、Αβ由来の環状ペプチドに特異的に結合する単離された抗体であって、前記環状ペプチドがオリゴマーＡβの溶媒に露出された抗体アクセス可能なナックル領域に対応する配列番号１に対応するアミノ酸配列を有する立体構造エピトープを含む、単離された抗体が提供される。
【００１８】
１つの態様において、単離された抗体は、非オリゴマー形態のＡβに対するよりも、オリゴマー形態のＡβに対してより大きな親和性でもって特異的に結合する。
【００１９】
別の態様において、単離された抗体はモノクローナルである。
【００２０】
他の態様において、単離された抗体はヒト化されたものである。
【００２１】
他の実施形態において、検出可能な標識でコンジュゲートされた、Αβ由来の環状ペプチドであってオリゴマーＡβの溶媒に露出された抗体アクセス可能なナックル領域に対応する少なくともＳＮＫのアミノ酸配列を有する立体構造エピトープを含む環状ペプチドと特異的に結合する単離された抗体を含む免疫複合体が提供される。
【００２２】
他の態様において、該単離された抗体をコードする核酸が提供される。
【００２３】
他の実施形態において、治療上有効量のＡβ由来の環状ペプチドと特異的に結合する単離された抗体および医薬上許容されるアジュバントを含む組成物であって、前記環状ペプチドがオリゴマーＡβの溶媒に露出された抗体アクセス可能なナックル領域に対応する少なくともＳＮＫのアミノ酸配列を有する立体構造エピトープを含む、組成物が提供される。
【００２４】
他の実施形態において、拘束された環状立体配置を有するエピトープを含む抗原ペプチドおよび医薬上許容されるアジュバントを含む抗オリゴマーワクチン組成物であって、前記エピトープがオリゴマーＡβの溶媒に露出された抗体アクセス可能なナックル領域に対応する少なくともＳＮＫのアミノ酸配列を有する、ワクチン組成物が提供される。
【００２５】
他の態様において、アルツハイマー病の処置を必要とする患者において該疾患を処置または予防する方法であって、医薬上有効量の単離された抗体または免疫複合体を投与することを含む、方法が提供される。
【００２６】
他の態様において、アルツハイマー病の処置を必要とする患者において該疾患を処置または予防する方法であって、ワクチンを投与することを含む、方法が提供される。
【００２７】
他の態様において、アルツハイマー病に罹患している疑いのある患者においてアルツハイマー病を診断する方法であって、ａ）前記患者から生体試料を単離する工程；ｂ）前記生体試料中で抗原／抗体複合体の形成を可能にする十分な時間および条件下で、前記生体試料を単離された抗体と接触させる工程；およびｃ）前記試料中の抗原／抗体複合体の存在を検出する工程を含み、ここで、前記複合体の存在が患者におけるアルツハイマー病の診断を示す、診断方法が提供される。
【００２８】
他の実施形態において、単離された抗体、及びシグナル生成化合物と連結された抗原を含むコンジュゲートを含むキットが提供される。
【００２９】
さらなる態様において、上記キットは１つ以上の検出試薬を含む。
【００３０】
他の実施形態において、単離された抗体；シグナル生成化合物と連結された抗原を含むコンジュゲート；およびアルツハイマー病を診断する際の使用説明書を含む、製品が提供される。
【００３１】
他の態様において、アルツハイマー病の処置または予防のための抗体または免疫複合体の使用が提供される。
【００３２】
他の態様において、アルツハイマー病の処置または予防のためのワクチンの使用が提供される。
【００３３】
他の実施形態において、Ａβ由来の環状ペプチドに結合できる単離された抗体であって、前記環状ペプチドがオリゴマーＡβの溶媒に露出されたナックル領域に対応するアミノ酸配列ＳＮＫを有する、単離された抗体が提供される。１つの態様において、そのような抗体は、非オリゴマー形態のＡβに対するよりも、オリゴマー形態のＡβに対してより大きな親和性でもって結合する。
【００３４】
他の実施形態において、アルツハイマー病に罹患しているか又は罹患している疑いのある患者の処置方法であって、ＳＮＫ配列を含むアミノ酸組成物を有するＡβ由来の環状ペプチドに結合できる抗体の治療上の有効量を前記患者に投与することを含む処置方法が提供される。１つの態様において、非オリゴマー形態のＡβに対するよりも、オリゴマー形態のＡβに対してより大きな親和性でもって結合する。
【００３５】
他の実施形態において、被検体におけるＡＤの発症または進行を予防する方法であって、オリゴマーＡβのナックル領域に対応するアミノ酸配列ＳＮＫを有する拘束された環状立体配置を有するエピトープを含む抗原ペプチドの治療上の有効量を前記被検体に投与することを含む、予防方法が提供される。投与の際に、該抗原ペプチドはオリゴマーＡβに対する免疫応答を惹起する。産生される抗体は、オリゴマーＡβに特異的に結合できる。特定の実施形態において、該抗体は、非オリゴマー形態のＡβよりも、オリゴマー形態のＡβに対してより大きな親和性でもって結合する。
【００３６】
本開示の他の態様および形態は、添付の図面とあわせて下記の具体的な実施形態を参酌することで当業者には明らかとなろう。
【００３７】
本開示の実施形態を、ここに、添付の図面を参酌しつつ単なる例示として記載する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】モノマーＡβの動力学的特性を示す動的光散乱の結果を視覚的に示す図。
【図２】オリゴマーΑβの動力学的特性を示す動的光散乱の結果を視覚的に示す図。
【図３】オリゴマーΑβの動力学的特性を示す動的光散乱の結果を視覚的に示す図。
【図４】ＳＮＫエピトープを含むジスルフィド−環化ペプチドの３次元モデル。
【図５】ＳＮＫを含む立体構造ペプチドに結合する抗ＳＮＫモノクローナル抗体のスクリーニングに関する代表的な分析サイクルのＢｉａｃｏｒｅ（商標）の結果を視覚的に示す図。
【図６】ＳＮＫエピトープを含むＢＳＡコンジュゲート鎖状または環状ペプチドの、鎖状（３Ｆ５、３Ｇ２）、環状（５Ｅ３、５Ｄ８）および中間特異的（intermediate-specific）（４Ｄ１１、４Ｄ１２）モノクローナル抗体の結合、及び前記抗体の合成Ａβ１−４２オリゴマーに対する反応性を示す、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラムのオーバーレイの結果を視覚的に示す図。
【図７】ＳＮＫエピトープを含む鎖状または環状ペプチドのＢＳＡコンジュゲートの鎖状（３Ｆ５、３Ｇ２）、環状（５Ｅ３、５Ｄ８）および中間特異的（４Ｄ１１、４Ｄ１２）モノクローナル抗体に対する結合、及び前記抗体の合成Ａβ１−４２オリゴマーに対する反応性を示す、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラムのオーバーレイの結果を視覚的に示す図。
【図８】合成Ａβ１−４２オリゴマーの種々の濃度の環状モノクローナル抗体５Ｅ３に対する結合を示す、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）分析の結果を視覚的に示す図。
【図９】細胞表面に位置するＡＰＰに対する標識化６Ｅ１０抗体および陰性対照を結合する細胞の比較を示す、フローサイトメトリートレース。
【図１０】細胞表面に位置するＡＰＰに対する標識化５Ｅ３抗体および陰性対照を結合する細胞の比較を示す、フローサイトメトリートレース。
【図１１】種々の濃度の５Ｅ３抗体の存在下および非存在下でのモック対照、可溶性モノマーおよびオリゴマーＡβ１−４０と共にインキュベートした細胞の細胞生存の程度を示す、神経毒性分析の結果を視覚的に示す図。
【図１２】ＴＢＳ中に均質化し、トリス−トリシンゲル中で分画し、ｐａｎ−Ａβ６Ｅ１０抗体を用いて免疫ブロットした脳組織を示す、免疫ブロットの結果。
【図１３】ＴＢＳ中に均質化し、トリス−トリシンゲル中で分画し、ｐａｎ−Ａβ５Ｅ３抗体を用いて免疫ブロットした脳組織を示す、免疫ブロットの結果。
【図１４】抗体５Ｅ３存在下（「５Ｅ３」）または非存在下（「Ｃ」）でのＡβポリマー化を試験する静的光散乱実験の結果を示す図。
【図１５】抗体５Ｅ３の重鎖および軽鎖の５’および３’端の読み取り（read）のヌクレオチド配列を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
（詳しい説明）
概して、本開示は、Αβに由来する新規拘束ペプチドエピトープ（constrained peptide epitope）（以下で「新規エピトープ」または「新規立体構造エピトープ」とも称される）、及び関連する抗体組成物を提供する。新規立体構造エピトープと結合できる抗体は、アルツハイマー病の処置における診断法および治療薬として有効である。Αβに由来する新規拘束ペプチドエピトープは、ＡＤおよび関連する認知症の予防のためのワクチンに有用である。新規立体構造エピトープと結合できる抗体は、アルツハイマー関連の認知症の診断、治療および予防にも有用である。
【００４０】
本明細書において直接定義されない用語はいずれも、本発明が属する分野において理解されるように、それらの用語に一般に付随する意味を有するものと理解されるべきである。
【００４１】
本明細書で用いられる用語「単離された抗体」は、本明細書において、本質的に純粋で、別の抗原特性を有する他の抗体および抗体断片などの無関係の細胞外物質を含まない、新規立体構造エピトープに結合できる抗体を意味する。しかしながら、新規立体構造エピトープに特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原との交差反応を有してもよい。当業者であれば、実験条件はいずれかの所定の抗体が特異的な結合を最大にするために最適化されなければならないことは容易に理解するであろう。用語“抗体”は本発明に関する新規立体構造エピトープと特異的に反応するその抗体断片を含むことを意図する。抗体は従来技術を用いて断片化することができ、該断片は上記と同じように有用性についてスクリーニングされる。例えば、断片は抗体をペプシンで処理することによって作製できる。結果として生じる断片をさらに処理し、ジスルフィド結合を還元してもよい。
【００４２】
本明細書で用いられる用語「被検体」は動物、例えばトリまたは哺乳動物を意味する。具体的な動物には、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタまたは霊長類が挙げられる。被検体は、さらにヒトであってもよく、あるいは患者と呼ばれるヒトであってもよい。被検体は、さらにトランスジェニック動物であってもよい。被検体は、さらに齧歯動物、例えばマウスまたはラットであってもよい。
【００４３】
本明細書で用いられる用語「エピトープ」は、特異抗体または特異抗体の形態を含むものにより認識され得る分子内の領域を意味する。
【００４４】
本明細書で用いられる用語「立体構造エピトープ」は、アミノ酸配列が特定の三次元構造を有するエピトープを意味する。立体構造特異エピトープと特異的に結合する抗体は、その立体構造特異エピトープのアミノ酸の空間配置を認識する。
【００４５】
本明細書で用いられる用語「Ａβ」は別には「アミロイドベータ」、「アミロイドβ」または「Ａβ」とも称されることがある。アミロイドベータは、アルツハイマー病患者の脳内のアミロイドプラークの主成分であると思われる３９−４３アミノ酸から成るペプチドである。本願明細書のいずれかで記載されるように、Αβオリゴマー化はアルツハイマー病の神経毒性の鍵となる部分であることが示されている。
【００４６】
本明細書で用いられる用語「より大きな親和性」は、本明細書において、抗体結合の程度を意味し、ここに、ある抗体Ｘが、標的Ｚに対するよりも標的Ｙに対してより強く且つより小さい解離定数でもって結合し、この文脈において、抗体Ｘは、標的Ｚに対するよりも、標的Ｙに対してより大きな親和性を有する。同様に、用語「より小さな親和性」は、本明細書において、抗体結合の程度を意味し、ここに、ある抗体Ｘが、標的Ｚに対するよりも標的Ｙに対してより小さい強さで且つより大きい解離定数でもって結合し、この文脈において、抗体Ｘは、標的Ｚに対するよりも、標的Ｙに対してより小さな親和性を有する。
【００４７】
本明細書で用いられる用語「Αβモノマー」は、本明細書において、単離された鎖状形態（linear form）のＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチド、好ましくは他のＡβペプチドと本質的に非共有結合相互作用に関係しないＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの形態を意味する。
【００４８】
本明細書で用いられる用語「Αβオリゴマー」は、本明細書において、前駆体Ａβモノマーが約５０未満のモノマーから成る規則的な三次元構造に非共有結合で凝集されている単離された形態のＡβペプチドを意味する。
【００４９】
本明細書で用いられる用語「Ａβフィブリル」は、本明細書において、非共有結合で会合した個々のＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの会合体を含む分子構造であって、電子顕微鏡下で繊維構造を示す分子構造を意味する。繊維構造は典型的には「クロスベータ」構造であり；多量体のサイズに理論上の上限はなく、フィブリルは数千個のモノマーを含み得る。
【００５０】
本明細書で用いられる用語「抗原」は、本明細書において、宿主の免疫系を刺激し、液性および／または細胞性抗原特異的応答を生じさせ得る１つ以上のエピトープを含む、タンパク質、ポリペプチド、またはその断片などの分子を意味する。この用語は、用語「免疫原」と交換可能に用いられる。抗イディオタイプ抗体またはその断片、および抗原もしくは抗原決定基を模倣し得る合成ペプチド模倣体などの抗体も、本明細書で用いられる抗原の定義のもとで把握される。同様に、生体内での、例えばＤＮＡ免疫適用での抗原決定基を示すオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、本明細書において、抗原の定義に含まれる。
【００５１】
本発明のペプチドを記載するのに用いられる命名は、アミノ基を各アミノ酸残基の左に、カルボキシ基を右に表す慣行に従う。本発明の選択された特定の実施形態を示す配列において、アミノ末端およびカルボキシ末端の基は、特に示さないが、それらが生理的なｐＨ値でとる形態であることは、特段の定めがない限り、理解されるであろう。
【００５２】
本明細書において、説明を目的として、多くの詳細が、実施形態の完全な理解を提供するために記載される。しかしながら、これらの具体的な詳細は必須でないことは、当業者には明らかであろう。
【００５３】
原子レベルのΑβオリゴマーの構造は、溶液および固体状態のパラダイムにおける結晶学およびＮＭＲの限界のために確実には原子レベルで解かれていない。生化学、生物物理学的および免疫化学的データは、Αβモノマーがブロードβヘアピン立体ジッパー構造（broad β hairpin steric zipper structure）にパッキングされるフィブリル／オリゴマーモデルを示唆する（Luhrs et al. 2005; Sawaya et al. 2007; Rauk 2009）。天然のモノマーΑβペプチドは、凝集の際に、フォールディングおよびヘアピン立体ジッパーの形成を伴う立体構造変化を受けて、オリゴマーＡβ構造が結果的に生じる。Αβ（１−４２）はβシート凝集に対する傾向がより大きい。オリゴマーΑβの詳細な構造は未知であるが、Αβオリゴマー構造は、分子動力学シミュレーション、原子間力顕微鏡およびアミド水素交換測定の組合せを用いて特徴づけられた。Αβ（１−４２）およびΑβ（１−４０）オリゴマーの構造は上記方法を用いて分析された。Αβオリゴマーのβストランドの配向が、残基Ｄ２３とＫ２８の間に分子間塩架橋を含むことは当業者には公知である。この立体配置では、Ｋ２８残基は実質的に内部に配向してＤ２３とＫ２８との間の塩架橋を形成し、ヘアピンターンを安定化させる（Lurs et al. 2005）および Rauk 2008）。
【００５４】
当分野で公知の提案されたＡβオリゴマー構造に関する検討が、免疫応答を特異的に指令する領域およびＡβオリゴマー特異抗体を開発し得る領域を特定するために行われた。Ａβオリゴマーモデルの洞察は、結合に利用可能な溶媒に露出された潜在的に抗体アクセス可能な残基を有する３つの領域、即ちＡβペプチドのｍＡｂ  ６Ｅ１０により認識されるＡβオリゴマーのＮ末端（配列番号２として特定されたＦＲＨＤＳＧ）（残基４−９）；ｍＡｂ  ４Ｇ８により認識されるＡβオリゴマーペプチドのＮ末端の第３の混合極性−疎水性（mixed polar-hydrophobic）ドメイン（配列番号３として特定されたＬＶＦＦＡＥＤＶ）（残基１７−２４）；および残基２５−２９から成るＡβオリゴマーペプチドの拘束ターンドメイン（ＧＳＮＫＧ）を明らかにした。残基２６−２８のＳＮＫを含む拘束ターンドメインエピトープの発見は、立体構造上拘束されており、鎖状ＡβまたはＡＰＰには存在しないもののようである。この立体構造上拘束されたエピトープに対する抗体は、鎖状ＡβまたはＡＰＰには結合しないことが期待され、Ａβオリゴマー特異抗体であり得る。
【００５５】
残基２５−２９（ＣＧＳＮＫＧＣ）を含むジスルフィド結合した環状ペプチドの分子動力学モデリングの画像取得が行われ；非天然システインがジスルフィド結合のために加えられた。このモデリングは、文献Lurs et al. (2005)およびRauk (2008)で予測された内側に配向されたリジン２８側鎖に反して、図４で示されるようにリジン２８の側鎖が外側に配向されることを明らかにする。このリジン２８残基の外向きの配向という驚くべき発見は、リジン側鎖が溶媒に露出されて、大きく且つε−アミノ基を介して帯電されていることによる、残基２５−２９（ＣＧＳＮＫＧＣ）を含むこの環状ペプチドの高い免疫原性と一致する。少なくともＳＮＫ残基を含む立体構造上の環状エピトープ（cycle epitope）に対する抗体は、Αβオリゴマーの毒性を効果的に中和することが以下の実施例で示された（図１１を参照のこと）。このリジン２８残基の外向きの配向という驚くべき発見は、抗体アクセス可能な様式では類似してリジン側鎖が溶媒に対して配向を示す信頼できるΑβオリゴマーとも一致する。セリン２６、アスパラギン２７およびリジン２８残基のＳＮＫは、Αβオリゴマーのナックル領域に位置し、すべて荷電を有するか極性であり、小さい非極性アミノ酸より大きな免疫原性を有する。Αβオリゴマーのナックル領域に位置するＳＮＫ残基の環状立体構造は、溶媒に露出されており、抗体が結合するのに利用できる新規な立体構造エピトープを形成する。下記の実施例では、結合に関してこのΑβオリゴマーの立体構造上拘束されたＳＮＫエピトープの有効性に関する発見を確認する。Αβオリゴマー表面のこの新規な構造的に拘束されたエピトープの発見は、選択的な抗体結合に有利な特性を有する。
【００５６】
新規立体構造エピトープは、ＳＮＫエピトープ配列のいずれかの端に位置する天然のグリシンをさらに含んでいてよい。新規立体構造エピトープは、ＳＮＫエピトープ配列の両端に天然のグリシン残基をさらに含んでいてよい。１つの態様において、天然のグリシン残基はこの新規立体構造エピトープの免疫原性に限定的な貢献もしくは全く貢献しない。しかしながら、グリシン残基は、ペプチドの環化に内在する幾分かの立体的な力の均衡（tension）を軽減し得る。アミノ酸構造式において、各残基は一般に、以下の表１に従い、アミノ酸の慣用名に対応して１文字または３文字表記により示すことができる。
【００５７】
表１：天然のペプチドに一般的に見出される２０個の標準的なＬアミノ酸の命名および略語。
【表１】
2013524774.tif 000003
【００５８】
エピトープは、溶媒に露出され且つＡβオリゴマー表面で構造的に拘束された強い極性／荷電残基から成る。エピトープは、環状の拘束された立体配置において少なくとも残基２６−２８のＳＮＫから成る。他の態様において、エピトープは環状の拘束された立体配置において残基２５−２８のＧＳＮＫから成る。さらなる態様において、エピトープは環状の拘束された立体配置において残基２６−２９のＳＮＫＧから成る。他の態様において、エピトープは環状の拘束された立体配置において残基２５−２９のＧＳＮＫＧ（配列番号１）から成る。
【００５９】
１つの態様において、新規立体構造特異エピトープの構造は、アミノ酸残基の比較的堅い（rigid）立体配置に依存する。
【００６０】
公知の抗体６Ｅ１０および４Ｇ８それぞれを結合し、Ａβオリゴマーの溶媒に露出した表面および親タンパク質ＡＰＰの発現を支持する細胞（ニューロンと単球の両方）の表面に現れる、配列番号２および配列番号３として特定された公知のエピトープとは対照的に、拘束された環状立体配置を有する新規立体構造エピトープは、ＡＰＰの分子表面には存在せず、かくしてＡＰＰの自己免疫認識を制限する。ニューロンおよび単球の細胞表面に位置するＡＰＰのＧＳＮＫＧモチーフは十分に構造化されていない。拘束された環状立体配置を有する新規立体構造エピトープに結合する立体構造特異抗体は、以下の実施例で示されるさように、細胞表面のＡＰＰ上の構造化されていないＧＳＮＫＧモチーフを限定的に認識するか又は認識しない。この新規立体構造エピトープを認識する抗体は、モノマーＡβに対して殆ど若しくは全く認識を示さない。他の態様において、新規立体構造エピトープを認識する抗体は、エピトープの立体的な込み具合（crowding）および／または好ましくない態様のために、フィブリルＡβに対して殆ど若しくは全く認識を示さない。
【００６１】
新規立体構造エピトープに対する抗体は、本開示の他の態様において提供される。分析は、拘束された環状立体配置を有する新規立体構造エピトープに結合する抗体がＡβオリゴマーのアミノ酸２５−２９の領域におけるサブユニット間の非鎖状エピトープ構造を認識することを示す。この新規立体構造エピトープに対する抗体の特異性は、前記抗体がＡβオリゴマー形態を特異的に標的化することを可能にし、それにより、神経や免疫機能に影響を及ぼすことが知られていモノマーＡβやＡＰＰを標的とすることを避けることができ、並びにモノマーＡβがオリゴマーＡβよりも大量に存在するため、抗体の結合に対する有用性は増大する。
【００６２】
新規立体構造エピトープに結合できる抗体は、アルツハイマー病の処置における診断薬と治療薬の両方に有用であり、ＡＤ予防のためのワクチンが本発明の他の態様において提供される。
【００６３】
本明細書中で記載されるようにＡβ由来の新規立体構造エピトープを含む環状ペプチドに特異的に結合する抗体は、前記新規立体構造エピトープを含むジスルフィド環状ペプチドから合成された抗体を含む。
【００６４】
治療としての使用に関し、Ａβ由来の環状ペプチドであって、オリゴマーＡβのナックル領域に対応する少なくともＳＮＫのアミノ酸配列を有する立体構造エピトープを含む環状ペプチドと特異的に結合する抗体は、標準的な広く確立された抗体産生方法を用いて作製することができる。治療組成物は、Ａβ由来の環状ペプチドであって、オリゴマーＡβのナックル領域に対応する少なくともＳＮＫのアミノ酸配列を有するエピトープを含む環状ペプチドと特異的に結合する抗体と、医薬上許容されるアジュバントを組合せて含む。そのような治療用組成物は、アルツハイマー病を処置または予防することを必要とする患者に投与することがきでる。１つの態様において、そのような治療用組成物は、アルツハイマー病の発症を遅延させ得る。
【００６５】
表現「医薬上許容される」は、医薬および獣医学分野での使用に許容されること、即ち許容されない毒性または他の不適当さがないことを意味する。医薬上許容されるアジュバントの例は、ペプチド・ベースの薬に慣用されるもの、例えば希釈剤、賦形剤などがある。参照は、一般的な医薬製剤に対するガイダンスに関しては、"Remington's: The Science and Practice of Pharmacy", 21st Ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005を参照することができる。アジュバントの選択は、組成物の意図された投与モードに依存する。本発明の１つの実施形態において、組成物は、点滴または皮下、筋注もしくは静脈注による投与用に製剤化され、したがって、滅菌および発熱性物質フリーの形態の水溶液として利用され、および所望により緩衝または等張されてよい。このように、組成物は、蒸留水、またはより望ましくは食塩水、リン酸緩衝塩水または５％デキストロース溶液中にて投与することができる。錠剤、カプセル剤または懸濁剤による経口投与のための組成物は、糖、例えばラクトース、グルコースおよびスクロース；澱粉、例えばコーンスターチおよびジャガイモ澱粉；セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；粉末トラガカント；モルト；ゼラチン；タルク；ステアリン酸；ステアリン酸マグネシウム；硫酸カルシウム；植物油、例えば落花生油、綿実油、胡麻油、オリーブ油およびトウモロコシ油；ポリオール、例えばプロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；寒天；アルギン酸；水；等張食塩水およびリン酸緩衝液を用いて調製される。湿潤剤、潤滑油、例えばラウリル硫酸ナトリウム、スタビライザ、打錠剤（tableting agent）、抗酸化剤、防腐剤、着色剤および風味量が存在してもよい。クリーム、ローションおよび軟膏は、適当なベース、例えばトリグリセリド・ベースを用いて、局所適用のために調剤され得る。そのようなクリーム、ローションおよび軟膏は界面活性剤を含有してもよい。エアゾール製剤、例えば経鼻送達用のエアロゾール製剤もまた調製されてよく、それらには適切なプロペラント・アジュバントが使用されてよい。投与される方法に拘らず、他のアジュバントも組成物に添加されてよく、例えば抗菌性物質が長期の貯蔵期間を越えて微生物成長を予防するために組成物に添加されてよい。治療用組成物は、概して製造および貯蔵の条件下で無菌かつ安定でなければならない。
【００６６】
ワクチンとしての使用に関して、オリゴマーＡβのナックル領域に対応する少なくともＳＮＫのアミノ酸配列を有する立体構造上拘束されたエピトープを含む抗原ペプチドは、医薬上許容されるアジュバントと組合せて投与された場合に、オリゴマーＡβを特異的に標的化する抗体を産生する。これらの抗体は、オリゴマーΑβのナックル領域に対応する少なくともＳＮＫのアミノ酸配列を有するエピトーに特異的に結合する。ワクチンは、オリゴマーＡβのナックル領域に対応する少なくともＳＮＫのアミノ酸配列を有する立体構造上拘束されたエピトープを含む抗原ペプチドを医薬上許容されるアジュバントと組合せて含む。ワクチンは、オリゴマーΑβの中和を通じて脳アミロイドの発生を妨げ、ＡＤの発現を妨げるよう作用する。オリゴマーΑβが阻止される場合、それらの関連する毒性は阻止される。そのような毒性は、例えばシナプス機能不全および神経細胞死を含み得る。他の態様において、上記のワクチン投与に際して産生される抗体は、モノマーＡβの毒性のオリゴマーＡβ形態への凝集を遅延させるので、オリゴマーΑβの増幅を遅延させる。更なる態様において、上記のワクチンの投与に際して産生される抗体は、モノマーＡβの毒性のオリゴマーＡβ形態への凝集を阻止するので、オリゴマーＡβの増幅を阻止する。
【００６７】
医薬上許容されるアジュバントの例としては、水酸化アルミニウム、ミョウバン、アルハイドロゲル（Alhydrogel（登録商標）：アルミニウム三水和物）または他のアルミニウム含有塩類、ビロゾーム、ＣｐＧモチーフを含む核酸、スクアレン、油、ＭＦ５９、ＱＳ２１、さまざまなサポニン、ウイルス様粒子、モノホスホリル−リピッドＡ／トレハロース・ジコリノミラート、ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、コポリマー、例えばポリオキシプロピレンおよびポリオキシエチレンなどを含む。
【００６８】
ワクチンは、進行性アルツハイマー病のリスクのある患者集団、例えば高齢集団、公知のＡＤ促進性の変異を保有する「リスク」個人の既知集団に投与することができる。
【００６９】
１つの実施形態において、ワクチンによる処置に関し、被検体は、１日１回、１週１回、１月１回、１年１回、１０年１回まで様々であってよいスケジュールで免疫される。典型的なレジメンは、６週間隔でブースター注射される免疫を含む。他のレジメンは、１、２および１２ヵ月後にブースター注射する免疫から成る。あるいは、ブースター注射は被検体の免疫反応および生理条件に応じて変更し得る。免疫に関して、抗オリゴマーワクチンは、処置あたり約０．０００１マイクログラム〜１０グラム、約０．０１マイクログラム〜約１グラム、約１マイクログラム〜約１ｍｇおよび約１００〜２５０マイクログラムの範囲の投与量で投与し得る。１つの実施形態において、処置を施すタイミングは以下の１つ以上である：０ヵ月、２ヵ月、６ヵ月、９ヵ月および／または１２ヵ月。１つのレジメンにおいて、投薬は第１免疫化後、２、６、９および１２ヵ月である。他のレジメンにおいて、投薬は第１免疫化に続き２および４週で、その後は毎月である。他のレジメンにおいて、投薬は先の免疫に対する被検体の生理条件および／または被検体への反応に応じて変化する。投与経路は、限定するものではないが、随意に筋肉内および腹膜内注射を含む。１つの実施形態において、組成物は三角筋に注射される。
【００７０】
診断または処置応答バイオマーカーとして使用するために、適切な生体試料を患者から単離する；前記試料を、オリゴマーＡβのナックル領域に対応する少なくともＳＮＫのアミノ酸配列を有するエピトープを含むＡβ由来の環状ペプチドに特異的に結合する抗体と、抗原／抗体複合体の形成を可能にするのに適した条件下である時間の間接触させる；および前記複合体の存在を検出する。複合体が検出される場合、ＡＤの診断の兆候がその患者にある。この目的のための適切な生体試料は、組織、細胞およびバイオ液体、例えば脳脊髄液（ＣＳＦ）と血液を含む。
【００７１】
使用する場合、新規立体構造エピトープに結合する抗体はＡＤにおいて大きな診断価値がある。本発明の抗体またはワクチン組成物による処置の候補となる被検体の特定を支援するために、本発明はさらに、試験管内または生体内診断法によるエピトープの検出を提供する。
【００７２】
いずれかの所定の試料中のオリゴマーΑβの存在を検出するために、本発明は、オリゴマーΑβを含む疑いのある試料を、モノマーＡβおよびＡＰＰと比較してオリゴマーＡβに独特に存在する新規立体構造エピトープに選択的に結合する抗体または結合断片を用いて処理し、抗原：抗体複合体が形成されたかどうかを決定し、ここで、その形成が、試料中にオリゴマーＡβが存在することの指標である、検出方法を提供する。抗原：抗体複合体の存在が患者におけるＡＤの診断をさらに示す。
【００７３】
試験管内で適用される場合、検出方法は、被検体、通常ＡＤを有する疑いのある被検体由来の体液または組織または器官試料の生体試料の分析を伴う。組織または器官試料、例えば固体もしくは半固体組織または器官から得られる試料は、消化、抽出または他の方法で液体の状態にしてもよい。生体試料または試料群は、被検体から適当な時期に、例えば被検体がＡＤもしくは関連する認知症を有すると診断される前またはそれらを有することが疑われる前、該疾患または障害の症状の処置または緩和のための治療レジメンの間、被検体の死後（その原因または疑わし原因に関わりなく）に採取するこができる。あるいは、生体試料は、提供された体液または組織を含み、例えば濃縮血液の供給組織または機関の場合には血液、血漿または血小板を含んでもよい。
【００７４】
該抗体が検出可能な抗原：抗体複合体を形成した場合、試料中のオリゴマーＡβの存在が確認される。そのような複合体の形成は、様々なプロトコル、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、免疫組織化学および類似のプロトコルを用いて決定することができる。試料中の複合体、それによる新規立体構造エピトープの存在を明らかにするために、抗体は望ましくは、視覚的にまたは機器の補助のいずれかにより検出可能な試薬にコンジュゲートまたはカップリングすることにより標識した抗体として提供される。当該試薬または標識は、直接または間接的に検出可能なシグナルを生成することができる。例えば、標識は放射線不透明体または放射性同位元素、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ；蛍光（発蛍光団）または化学発光（発色団）化合物、例えばフルオレセインイソチオシアネート、ローダミンまたはルシフェリン；酵素、例えばアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはホースラディシュペルオキシダーゼ；イメージング剤；あるいは金属イオンであってよい。あるいは、新規立体構造エピトープは、エピトープ抗体に結合する標識化二次試薬、例えばエピトープ抗体に結合する標識化抗体を用いて明らかにすることができ、間接的にエピトープの存在が明らかになる。抗原：抗体複合体の存在は、２つの試薬が溶液中にあることを要求しない間接的な方法により検出されてもよい。例えば、複合体はフローサイトメトリーを用いて間接的に検出可能であり、ここで、抗体は未処理の細胞（intact cell）表面上に存在するエピトープに結合して抗体：抗原複合体を形成する。抗原：抗体複合体は、抗体ベースでない方法、例えばサイズ、電荷および運動度に基づいてタンパク質を篩い分ける方法、例えば電気泳動、クロマトグラフィ、質量分析および類似の方法により特定することもできる。
【００７５】
関連した実施形態において、本発明の標識化抗体またはその結合断片の標識化形態は、生体内で、抗体が結合するオリゴマーΑβの存在を画像化するのに用いることができる。この目的で、本発明は、生体内イメージングに有用な試薬、例えばテクネチウム、ガドリニウムなどの同位元素と連結された形式の抗体または断片を提供する。
【００７６】
他の態様において、製造品（コマーシャルパッケージとも称する）は、包装材料および医薬品組成物を含んで提供される。組成物は、薬学的に許容されるアジュバントおよびΑβ由来の環状ペプチドに特異的に結合する高次構造感受性の抗体の治療上の有効量を含み、前記環状ペプチドはオリゴマーΑβのナックル領域に対応する少なくともＳＮＫのアミノ酸配列を有するエピトープを含む。包装材料は、その組成物がアルツハイマー病を処置するために有用であることを示すラベルが付されてもよい。包装材料は、医薬品を包装するのに一般に用いられるいずれかの適切な材料であってよく、例えば、ガラス、プラスチック、ホイルおよびボール紙を含む。
【００７７】
他の態様において、製造品は、包装材料および医薬品組成物を含んで提供される。組成物は、本明細書中で提供されるように、オリゴマーΑβのナックル領域に対応する少なくともＳＮＫのアミノ酸配列を有する立体構造上拘束されたエピトープを含むペプチドを、医薬上許容されるアジュバントと組合せて含む。組成物は、生理的に又は薬学的に許容される賦形剤を含んでもよく、包装材料は組成物の活性成分（例えばペプチド）を示すラベルを含んでいてもよい。ラベルは、組成物の意図された使用、例えば処置試薬もしくは予防試薬としてか、または、オリゴマーΑβに特異的な抗血清もしくは抗体を産生することを目的として被検体での免疫応答を惹起させる組成物としての意図された使用を更に含んでいてもよく、本明細書中で記載されるようにキットで使用される。
【００７８】
さらなる実施形態において、オリゴマーＡβの特定のための高次構造感受性の抗体を産生もしくはスクリーニングするための化合物または組成物の使用説明書と共に、本明細書で提供されるペプチドを含む組成物を含むキットが提供される。キットは、オリゴマーΑβ特異抗体または抗血清の産生および／または同定に有用であり得るし、説明書は、例えば、服用濃度、服用間隔、好ましい投与方法、免疫学的スクリーニングもしくは試験方法またはそれに類する情報を含んでもよい。
【００７９】
他の実施形態において、その使用説明書と共に、本明細書で提供される１つ以上のペプチドを含む組成物を含む、医薬調製用のキットが提供される。説明書は、医薬が投与された被検体における治療上もしくは予防上の免疫応答を惹起するのに有用な医薬を調製するための一連の工程を含んでいてもよい。キットは、ＡＤの１つ以上の症状または関連する認知症の治療、予防または改善のための処置における医薬の使用説明書、例えば服用濃度、服用間隔、好ましくは投与方法などをさらに含んでいてもよい。
【００８０】
他の実施形態において、ＡＤまたは関する認知症を診断するためのキットが提供される。キットは、その使用説明書と共に、本明細書に記載の立体構造感受性の抗体および選択的抗体または抗血清を１つ以上含む。抗体は、さらに検出試薬にカップリングされていてよい。検出試薬の例としては、二次抗体、例えば抗マウス抗体、抗ウサギ抗体またはその類似のものを含む。そのような二次抗体は、適切な基質が提供された場合に検出可能な比色反応または化学発光反応を与える酵素にカップリングされてよい。キットは、検出反応を実行するための試薬、例えばプロテイナーゼＫなどの酵素、ブロッキングバッファ、ホモジナイズ・バッファ、抽出バッファ、希釈剤バッファまたは類似のものをさらに含んでいてよい。
【００８１】
他の実施形態において、生体試料中のオリゴマーＡβの存在を検出するためのキットが提供される。キットは、その使用説明書と共に、オリゴマーＡβに特異的に結合する高次構造感受性の抗体または抗血清を１つ以上含む。抗体は、さらに検出可能な試薬とカップリングされていてよい。検出試薬の例としては、二次抗体、例えば抗マウス抗体、抗ウサギ抗体またはその類似のものを含む。そのような二次抗体は、適切な基質が提供された場合に検出可能な比色反応または化学発光反応を与える酵素とカップリングされてよい。キットは、検出反応を実行するための試薬、例えばプロテイナーゼＫなどの酵素、ブロッキングバッファ、ホモジナイズ・バッファ、抽出バッファ、希釈剤バッファまたは類似のものをさらに含んでいてよい。
【００８２】
従来の方法は、高次構造感光性の抗体、例えばポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体を調製するために用いることができる。ポリクローナル抗体を産生するために、哺乳動物（例えばマウス、ハムスターまたはウサギ）を、該哺乳動物における抗体応答を惹起させる免疫原形態の新規立体構造エピトープを用いて免疫することができる。例えば、新規立体構造エピトープ配列を含むジスルフィド架橋した環状ペプチドを、このペプチドのＮ末端およびＣ末端のシステイン間のジスルフィド結合を用いてループ構造に拘束することができる。このジスルフィド架橋した環状ペプチドは、従来技術を用いて合成することができ、そして哺乳類に導入することができる。
【００８３】
ペプチドに免疫原性を与えるための技術は、当該分野で周知であり、例えば担体へのコンジュゲーションを含む。ペプチドは、アジュバントの存在下で投与してもよい。免疫の進行は、血漿または血清中の抗体力価の検出によりモニタすることができる。標準的なＥＬＩＳＡまたは他の免疫アッセイ手順を抗原としての免疫原と共に用いて、、抗体レベルを評価することができる。免疫に続いて、抗血清を得ることができ、そして所望により該血清からポリクローナル抗体を単離することができる。
【００８４】
モノクローナル抗体を産生するために、抗体産生細胞（Ｂリンパ球）を免疫した動物から採取し、標準的な体細胞融合手順により不死のミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる。このような技術は当該分野において周知であり（例えば、ハイブリドーマ技術は最初はKohlerおよびMilstein により開発された(Nature 256, 495-497(1975)）、同様に他の技術、例えばＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al., Immunol. Today 4, 72 (1983)）、ヒトモノクローナル抗体を産生するＥＢＶハイブリドーマ技術(Cole et al., Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy (1985) Allen R. Bliss, Inc., pages 77-96)、および立体構造抗体ライブラリーのスクリーニング(Huse et al., Science 246, 1275 (1989))も開発された。ハイブリドーマ細胞は、選択した新規高次構造エピトープと特異的な反応性のある抗体の産生のために免疫化学的にスクリーニングし、モノクローナル抗体を単離することができる。
【００８５】
典型的な抗体は、２つの免疫グロブリン（Ｉｇ）“重鎖”および２つのＩｇ“軽鎖”から成り、一般にＹ字型の高次構造をとるものと考えられている。抗体のクラスまたはアイソタイプを特定する種々異なる形態の重鎖が存在する。５種類の哺乳動物の免疫グロブリン重鎖が存在し：γ、δ、α、μおよびε、これらは、免疫グロブリンのクラスをそれぞれ規定する：ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ。哺乳動物では２種類の軽鎖がある：カッパ（κ）鎖およびラムダ（λ）鎖。
【００８６】
各重鎖は以下の２つの領域を有する：同じクラスの免疫グロブリンでは全て同じであるが、クラス間では相違する定常領域（重鎖γ、αおよびδは、３つタンデム免疫グロブリンドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）から成る定常領域を有するが、付加される柔軟性に関するヒンジ領域も有する；重鎖μおよびεは、４つのドメインから成る定常領域を有する）；および異なるＢ細胞間では相違するが、同じＢ細胞もしくはＢ細胞クローンで産生される免疫グロブリンでは全て同じである可変領域（ＶＨ）。いずれの重鎖の可変領域も、単一の免疫グロブリンドメインから成る。これらのドメインは約１１０アミノ酸長である。
【００８７】
各軽鎖は２つのタンデム免疫グロブリンドメインから成る：１つの定常領域（ＣＬ）；および抗原を結合するのに重要な１つの可変領域（ＶＬ）。
【００８８】
幾つかの抗体部分は特有の機能を有する。例えば、「Ｙ字」の腕は、２つの抗原（概して同一のもの）を結合することができ、かくして、特定の異物を認識することができる部位を有する。この抗体の領域は、「Ｆａｂ」（fragment, angigen binding）領域と称される。それは、抗体の各重鎖および軽鎖由来の１つの定常領域と１つの改変領域から成る。「パラトープ」は重鎖および軽鎖由来の可変領域側の抗体単量体のアミノ末端で形成される。可変領域は、ＦＶ領域とも称され、抗原に結合するにあったて最も重要な領域である。より詳細には、βストランドの可変ループ、軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）上にそれぞれ３つのループが抗原に対する結合に役割を果たす。これらのループは、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）と称される。
【００８９】
相補性決定領域（ＣＤＲｓ）は、これらのタンパク質が抗原の形状を補完する抗体内の領域である。したがって、ＣＤＲｓはタンパク質の親和性および特定の抗原に対する特異性を決定する。ＣＤＲｓは、この分子の最も可変的な部分であり、これらの分子の多様性に寄与し、抗体が膨大なレパートリーの抗原を認識することを可能にする。
【００９０】
抗原レセプターの可変領域のアミノ酸配列には、３つのＣＤＲｓ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）が非連続的に配置されている。抗原レセプターは典型的には２つの可変領域（２つの異なるポリペプチド鎖、重鎖および軽鎖上の）から成るため、集合的に抗原と接触することとなり得る各抗原レセプターには６つのＣＤＲｓがある。単一の抗体分子は、２つの抗原レセプターを有し、従って、抗体分子は１２のＣＤＲｓを含む。
【００９１】
一般的な「Ｙ」字型の抗体のベースは、免疫細胞活性を調整する役割を有する。この領域は、Ｆｃ（Fragment, crystallizable）領域と称され、抗体のクラスに依存する２または３の定常領域に寄与する２つの重鎖から成る。このＦｃ領域は、特定のクラスのＦｃ受容体、および他の免疫分子、例えば補体タンパク質に結合することにより、抗体が所定の抗原に対して適当な免疫応答を生成することを保証する。これを行うことにより、抗体は、異なる生理学的効果、例えばオプソニン化される粒子の認識、細胞の溶解、または肥満細胞、好塩基球もしくは好酸球の脱顆粒を媒介する。
【００９２】
アミノ酸配列において指定されるＣＤＲｓに関する方法はたくさんある。「カバット（Kabat）」定義は、配列の変動性に基づいて、最も一般的に用いられる。「コチア（Chothia）」定義は構造ループ領域の位置に基づく。「ＡｂＭ」定義は、オックスフォード・モレキュラーＡｂＭ抗体モデリング・ソフトウェアにより用いられる２つの定義の折衷法である。「接触（contact）」定義は、利用可能な複合体結晶構造の分析に基づく。
【００９３】
当業者であれば、公知のパターンおよび配列アライメント方法を用いて、ＣＤＲｓを含むいずれかの所定の配列中のＣＤＲｓを容易に特定できるであろう。他の態様において、当業者に既知のモデリングまたは他の方法もまたＣＤＲの特定に用いることができる。当該分野には抗体の配列中のＣＤＲｓを特定する際に当業者を支援するための、周知のガイドライン、例えば以下のウェブサイト（http://www.bioinf.org.uk/abs/）に提示されたものがある。
【００９４】
５Ｅ３抗体の重鎖および軽鎖が配列決定された。この重鎖配列および軽鎖配列は、図１５で特定された配列に相当する。当業者であれば、抗原結合の決定要素である上記配列部分を他の抗体フレームワークに移し変え、例えば「キメラ」もしくは「ヒト化」抗体を生成することができることは理解できるであろう。
【００９５】
当業者は、図１５で示される５’配列および３’配列の読み取り（read）をアライメントし、コンセンサス配列を容易に作り出すことができ（例えば、利用可能なソフトウェア・パッケージ、例えばＧＣＧまたはシーケンサー（Sequencher）を用いて）、そして、不一致を解消するために要求される配列トレースを試験することができる。残りの不一致はどのようなものでも再度の配列決定により解決し得る。不一致、例えばヌクレオチド配列の中程のストップコドンは、明らかなヌクレオチドの読み間違い（misread）として当業者には知られている。アミノ酸およびヌクレオチドを配列決定する場合に、配列決定方法が１以上の塩基を不正確にコールした場合、その配列決定エラーまたはミスコールが生じることなり、不正確な読み取りとなることは当該分野で周知である。分子生物学の変動のため、研究室ベースのＤＮＡ配列決定方法は完全に正確というわけではなく、それらは機械で稀に塩基をミスコールすることがよく知られている。そのようなミスコールは、その配列の読み取りを他の読み取りまたはリファレンスに対してアライメントした場合に明らかになる。
【００９６】
「キメラ」抗体も本発明の範囲にあると考えれる。キメラ抗体は、２つの異なる抗体由来の配列を含み得る。それらは、２つの異なる種由来の抗体の配列を含んでいてもよい。キメラ抗体分子は、例えば、マウス、ラットまたは他の種由来の抗体の抗原結合ドメインをヒトの定常ペプチド領域と共に含み得る。従来法を用いて、本発明の新規立体構造エピトープを認識する免疫グロブリン可変領域を含むキメラ抗体を作製することができる（例えば、Morrison et al., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 81 ,6851 (1985)；Takeda et al., Nature 314, 452(1985)，Cabilly et al., 米国特許第4,816,567号；Boss et al., 米国特許第4,816,397号；Tanaguchi et al., 欧州特許公開公報EP171496；欧州特許公開公報0173494，英国特許第GB 2177096B号を参照のこと）。
【００９７】
「ヒト化抗体」は、非ヒト種由来の抗体配列を含み、そのタンパク質配列は、ヒトで天然に産生される抗体バリアントに対する類似性を増大させるように改変されている。幾つかの場合に、これらヒト化抗体は、キメラ抗体の特定のサブセットと考えることができる。しかしながら、「ヒト化」は単純なキメラの生成とは通常、別のものと理解される。そうは言っても、ヒト化プロセスは、マウス−ヒトキメラの生成を最初の工程を含み得る（例えば、マウスＦａｂをヒトＦｃに再接合（splice）してもよい）。その後、そのキメラを、分子のＦａｂ部分におけるアミノ酸配列の選択的な改変によって、さらにヒト化してもよい。このプロセスは、抗体が最初に創り出された特性を維持するために、通常「選択的」である。例えば、ＣＤＲ部分を除いて、ヒトのＦａｂ配列と異なるＦａｂ配列部分は、適当な個々のアミノ酸を交換することによって変異させることができる。これは、突然変異誘導を用いるＤＮＡレベルで達成される。キメラ中間体を生成することなく、ヒト化抗体を生産することは可能である。ヒト化抗体の「直接的」な生成は、適切なＣＤＲコーディング・セグメント（望ましい結合特性に関与する）をヒト抗体「スキャホールド」中に挿入することによって達成することができる。上記のように、これは適当なベクターを用いる組換えＤＮＡ法および哺乳動物細胞での発現を通じて達成される。すなわち、抗体が所望の特性を示す（例えば）マウスで産生された後に、その抗体をコードするＤＮＡを単離し、ベクター中にクローニングし、配列決定してもよい。抗体ＣＤＲに対応するＤＮＡ配列を、その後に決定してもよい。所望のＣＤＲの正確な配列が分かれば、これらの配列をヒト抗体バリアント用のＤＮＡを含有するコンストラクトに適当に挿入するストラテジーを考案することができる。このストラテジーは、ＣＤＲ配列の読み取りに基づく直鎖ＤＮＡ断片の合成を使用してもよい。多様性ライブラリ（Diversity libraries）は、合成多様性含有（diversity-containing）オリゴヌクレオチド・プライマーを使用して生成することができる。結果として生じるクローンのプールを、既知の方法を用いて更にスクリーニングし、最適化されたヒト化抗体クローンを特定してもよい。
【００９８】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載の本発明に関する新規立体構造エピトークと特異的な反応性を有するモノクローナル抗体またはキメラ抗体は、ヒト定常領域のキメラを産生することにより更にヒト化することができ、その可変領域の一部、特に抗原結合ドメインの保存されたフレームワーク領域はヒト起源であり、超可変領域のみが非ヒト起源である。そのような免疫グロブリン分子は当分野で公知の技術により作製することができる（例えば、Teng et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.., 80, 7308-7312 (1983); Kozbor et al., Immunology Today, 4, 7279 (1983); Olsson et al., Meth. Enzymol., 92, 3-16 (1982) 及びＰＣＴ公開公報ＷＯ９２／０６１９３または欧州特許公報ＥＰ０２３９４００）。ヒト化抗体は、商業的に生産することもできる（Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Great. Britain）。
【００９９】
１つの態様において、５Ｅ３の重鎖および／または軽鎖配列を含むキメラ抗体またはヒト化抗体、その一部または複数の部分が提供される。その部分は、抗原結合に関する決定基であり得る。幾つかの実施形態において、決定基は、５Ｅ３のＣＤＲ配列を含み得る。当該抗体は、５Ｅ３と同じエピトープと結合する。それらは、５Ｅ３により結合されるエピトープと少なくとも部分的に重複するエピトープに結合してもよい。
【０１００】
幾つかの実施形態において、キメラ抗体またはヒト化抗体は、５Ｅ３のＣＤＲ配列と実質的に同一のＣＤＲ配列を含んでいてもよい。幾つかの実施形態において、抗体は、５Ｅ３の配列と比較して、保存的配列変化があってもよい。
【０１０１】
一般のアミノ酸の間での「保存的アミノ酸置換」は、以下の群の各々の中でのアミノ酸間の置換により例証される：（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン、（３）セリンおよびトレオニン、（４）アスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩、（５）グルタミンおよびアスパラギン、（６）リジン、アルギニンおよびヒスチジン。
【０１０２】
当分野で周知のＢＬＯＳＵＭ６２表は、タンパク質配列セグメントの約２，０００のローカルマルチプルアライメントに由来するアミノ酸置換マトリックスであり、関連タンパク質の５００超のグループの非常に保全された領域を表す（Henikoff and Henikoff, Proc. Nat’IAcad. Sci. USA 89:10915 (1992)）。したがって、ＢＬＯＳＵＭ６２置換頻度は、本発明のアミノ酸配列に導入され得る保存的アミノ酸置換を定義するのに用いることができる。単に化学的性質（上記のように）だけに基づくアミノ酸置換を設計することは可能であるが、用語「保存的アミノ酸置換」は好ましくは−１超のＢＬＯＳＵＭ６２値によって表される置換を意味する。例えば、アミノ酸置換が０、１、２または３のＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴づけられる場合、アミノ酸置換は保存的である。このシステムによれば、好ましい保存的アミノ酸置換は少なくとも１（例えば１、２または３）のＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴づけられるが、より好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも２（例えば２または３）のＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴づけられる。
【０１０３】
幾つかの実施形態において、抗体は、５Ｅ３のＣＤＲ配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％または少なくとも９０％同一のＣＤＲ配列を含み得る。それらは、５Ｅ３のＣＤＲ配列と少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または９９％超同一であってもよい。
【０１０４】
抗体の製作に用いられる標準な組換えＤＮＡ技術および分子クローン技術は、当該分野で周知であり、より完全には、Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989（以下「Sambrook」と称する）に記載されている。
【０１０５】
用語「組換え」は、２つの別の分離された配列セグメントの人工的な組合せ、例えば化学合成による、又は遺伝子工学技術による核酸の単離されたセグメント操作による組合せを意味する。
【０１０６】
本発明の幾つかの実施形態の組成物または化合物の投与量は、投与経路（経口、静脈、吸入またはその他のもの）及び前記組成物または化合物を投与する形態（溶液、徐放又はその他のもの）に応じて変化し得る。適当な投与量の決定は、当業者の能力の範囲にある。
【０１０７】
「医薬上許容される担体」は、いずれか及びすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびに生理的に適合するその他のものを含む。医薬上許容される担体の例は、１つ以上の水、食塩、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、及びそれらの組合せを含む。多くの場合、等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物に含むことが好ましい。医薬上許容される担体は、抗体または抗体部分の棚寿命または有効性を増強する、微量の補助剤、例えば湿潤剤または乳化剤、防腐剤または緩衝剤をさらに含んでいてもよい。
【０１０８】
本発明の医薬組成物は、「有効量」、「治療上の有効量」または「予防上の有効量」の本発明の抗体または抗体部分を含んでいてもよい。「治療上の有効量」は、所望の治療結果を達成するために必要な投与量および期間での有効な量を意味する。抗体または抗体部分の治療上の有効量は、当業者により決定され得るものであり、個人の疾患の状態、年齢、性別及び体重などの要素、並びに個人における望ましい応答を誘発する抗体または抗体部分の能力に応じて変化し得る。治療上の有効量は、抗体または抗体部分の毒作用または有害効果のいずれかより治療上の有益な効果が勝る量でもある。「予防上の有効量」は、所望の予防上の結果を達成するのに必要な投与量および期間での有効な量を意味する。典型的には、予防上の用量は疾患前もしくは初期に用いられるため、予防上の有効量は治療上の有効量より少ないであろう。有効量は、量あたりの量の基準（例えば、被検体のキログラムあたりのマイクログラムもしくはミリグラム）で算出され得るか、又は容積あたりの量の基準（例えば、濃度、ミリリットルあたりのマイクログラムもしくはミリグラム）で算出され得る。容積あたりの量の単位を用いる場合、抗体は、約０．１μｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌの量で、又はそれらの間のいずれかの量、例えば、０．１、０．５、１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、５０００、１００００、２００００μｇ／ｍｌ、若しくはそれらの間のいずれかの量；約１μｇ／ｍｌ〜約２０００μｇ／ｍｌ、又はそれらの間のいずれかの量、例えば、１．０、２．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０、３５．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、８０．０、９０．０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００μｇ／ｍｌ、若しくはそれらの間の量；あるいは約ｌ０μｇ／ｍｌ〜約１０００μｇ／ｍｌ又はそれらの間のいずれかの量、例えば１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０、３５．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、８０．０、９０．０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、５００、７５０、１０００μｇ／ｍｌ、又はそれらの間の量；あるいは約３０μｇ／ｍｌ〜約１０００μｇ／ｍｌ、又はそれらの間のいずれかの量、例えば、３０．０、３５．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、８０．０、９０．０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、５００、７５０、１０００μｇ／ｍｌの量で存在してもよい。
【０１０９】
量および／または濃度は、量/量の基準（例えば被検体のキログラムあたりのマイクログラムまたはミリグラム）で算出されてよく、又は量／容積の基準（例えば、濃度、ミリリットルあたりのマイクログラムまたはミリグラム）で算出されてもよい。量／容積の単位を用いる場合、抗体またはペプチドは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、若しくはそれらの間のいずれかの量、例えば０．１、０．５、１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、５０００、１００００、２００００μｇ／ｍｌ、もしくはそれらの間のいずれかの量、又は約１μｇ／ｍｌ〜約２０００μｇ／ｍｌ、もしくはそれらの間のいずれかの量、例えば１．０、２．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０、３５．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、８０．０、９０．０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００μｇ／ｍｌ、もしくはそれらの間のいずれかの量、又は約１０μｇ／ｍｌ〜約１０００μｇ／ｍｌ、若しくはそれらの間のいずれかの量、例えば、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０、３５．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、８０．０、９０．０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、５００、７５０、１０００μｇ／ｍｌ、若しくはそれらの間のいずれかの量、又は約３０μｇ／ｍｌ〜約１０００μｇ／ｍｌ、若しくはそれらの間のいずれかの量、例えば、３０．０、３５．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、８０．０、９０．０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、５００、７５０、１０００μｇ／ｍｌの量で存在してもよい。
【０１１０】
本発明の抗体は、例えば、非経口投与に適した医薬組成物中に組み込まれていてもよい。好ましくは、抗体は、有効量の抗体を含有する注射可能な溶液として調製され得る。注射可能な溶液は、フリント（flint）またはアンバー（amber）バイアル、アンプルまたは充填済みのシリンジ中の、液体または凍結乾燥剤形のいずれかで構成されてよい。いずれかの適切な緩衝剤を、医薬組成物の調製に用いてもよい。緩衝剤の例としては、限定するものではないが、琥珀酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムを含む。凍結防止剤および増量剤は、凍結乾燥剤形に含めてもよい。安定剤を、液剤および凍結乾燥剤形に用いてもよい。
【０１１１】
本発明の様々な実施形態に係る組成物は、治療組成物を含め、有効量の抗体またはペプチドを含む投薬として投与することができる。投与量は、約０．１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ（被検体の重量に基づく）、例えば０．１、０．５、１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、５０００、１００００、２００００μｇ／ｋｇ、若しくはそれらの間の量、例えば、１．０、２．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０、３５．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、８０．０、９０．０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００μｇ／ｋｇ、若しくはその間の量、又は約１０μｇ／ｋｇ〜約１０００μｇ／ｋｇ、若しくはそれらの間の量、例えば、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０、３５．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、８０．０、９０．０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、５００、７５０、１０００μｇ／ｋｇ、若しくはそれらの間の量、又は約３０μｇ／ｋｇ〜約１０００μｇ／ｋｇ、若しくはそれらの間の量、例えば３０．０、３５．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、８０．０、９０．０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、５００、７５０、１０００μｇ／ｋｇを含んでいてよい。
【０１１２】
当業者であれば、被検体の体重、医薬組成物の濃度、個々の成分又はそれらの組合せ、或いは医薬組成物の容積、個々の成分又はそれらの組合せを考慮して、単位（unit）を所望の適用に適した形式に、必要に応じて容易に相互変換することもできる。
【０１１３】
本発明の医薬品組成物は様々な剤形であってよい。それらは、例えば、液体、半固体および固体投与形、例えば液剤（例えば注射可能な溶液および注入溶液）、分散剤または懸濁剤、錠剤、ピル、粉剤、リポソームおよび坐剤を含む。好ましい形は、投与および治療適用の計画された方法に依存する。典型的な好ましい組成物は、注射可能な溶液または注入溶液、例えば他の抗体を用いたヒトの受動免疫に使用されるものと類似の組成物の剤形である。好ましい投与方法は非経口である（例えば、静脈内、皮下、腹膜内、筋肉内）。好ましい実施形態において、抗体は静脈内注入または注射により投与される。他の好ましい実施形態において、抗体は筋肉内または皮下注射により投与される。
【０１１４】
本発明の抗体は、当該分野で公知の種々の方法により投与することができるが、多くの治療適用に関して、好ましい投与経路／方法は、皮下注射、静脈内注射もしくは注入である。当業者に明らかであるが、投与経路および／または方法は、所望の結果に応じて変更してもよい。特定の実施形態において、活性化合物は、化合物を迅速な放出から保護する担体を用いて、例えばインプラント、経皮性パッチおよびカプセル化送達系を含む徐放製剤を調製してもよい。生分解性の生体適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を用いることができる。そのような製剤の調製に関する方法の多くは、特許されているか、又は一般に当業者には公知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照のこと。
【０１１５】
特定の実施形態において、本発明の抗体は、例えば、不活性希釈剤または吸収可能な可食用担体と共に経口投与することができる。化合物（及び、必要に応じて他の成分）は、ハードまたはソフト・シェルゼラチンカプセルに封入されてもよく、錠剤に圧縮されてもよく、又は直接被検体の食事に取り入れられてもよい。経口治療的投与に関し、化合物は賦形剤と共に組込まれて、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁剤、シロップ、ウエハーなどの剤形で用いられてもよい。非経口投与以外で本発明の化合物を投与するために、その不活化を予防する材料を用いて、当該化合物をコーティングすること、又は合成物を同時投与することが必要であり得る。
【０１１６】
補助活性化合物を、医薬組成物に組込んでもよい。特定の実施形態において、本発明の抗体は、ＡＤまたは関連する認知症を処置するのに有用な１以上の付加的な治療剤を用いて、同時に製剤化および／または同時投与される。例えば、本発明の抗体の１つまたはその抗体部分を、他の標的に結合する付加的な１以上の抗体を用いて同時に製剤化および／または同時投与してもよい。
【０１１７】
特定の実施形態において、本発明の抗体またはその断片は、当分野で公知の半減期延長媒体（half-life extending vehicle）と連結されてもよい。そのような媒体は、限定するものではないが、Ｆｃ領域、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデキストランを含む。そのような媒体は、例えば米国特許出願第０９／４２８０８２号および公開されたＰＣＴ出願 ＷＯ９９／２５０４４に記載されており、それらはいずれの目的に関しても参照により本明細書の一部とされる。
【０１１８】
本発明の１つの実施形態において、拘束された環状立体配置を有するエピトープを含む抗原ペプチドであって、前記エピトープが少なくともＳＮＫのアミノ酸配列を含み、オリゴマーＡβの溶媒に露出された抗体アクセス可能なナック領域に対応する抗原ペプチドが提供される。
【０１１９】
本発明の他の実施形態において、拘束された環状立体配置を有するエピトープを含む抗原ペプチドであって、前記エピトープが配列番号１に対応するアミノ酸配列を有し、オリゴマーＡβの溶媒に露出された抗体アクセス可能なナックル領域に対応する抗原ペプチドが提供される。
【０１２０】
本発明の他の実施形態において、Ａβ由来の環状ペプチドに結合可能な抗体であって、前記環状ペプチドが少なくともＳＮＫのアミノ酸配列を有する立体構造エピトープを含み、オリゴマーＡβの溶媒に露出された抗体アクセス可能なナック領域に対応する抗体が提供される。
【０１２１】
本発明のさらなる実施形態において、Ａβ由来の環状ペプチドに結合できる抗体であって、前記環状ペプチドが配列番号１に対応するアミノ酸配列を有する立体構造エピトープを含み、オリゴマーＡβの溶媒に露出された抗体アクセス可能なナックル領域に対応する抗体が提供される。
【０１２２】
特定の実施形態において、そのような抗体は、非オリゴマー形態のＡβよりも、オリゴマー形態のＡβにより大きな親和性でもって結合できる。
【０１２３】
他の実施形態において、アルツハイマー病を有するか又は有する疑いのある被検体を処置する方法であって、前記被検体に、Ａβ由来の環状ペプチドと結合できる抗体の治療上の有効量を投与することを含み、ここで、前記環状ペプチドは、オリゴマーＡβの溶媒に露出された抗体アクセス可能なナックル領域に対応する少なくともＳＮＫのアミノ酸配列を有する、方法が提供される。特定の実施形態において、該抗体は、非オリゴマー形態のＡβよりも、オリゴマー形態のＡβにより大きな親和性でもって結合できる。
【０１２４】
他の実施形態において、被検体におけるＡＤの進展または進行を予防する方法であって、前記被験体に、Ａβ由来の環状ペプチドに特異的に結合するペプチドと結合できる抗体の治療上の有効量を投与することを含み、ここで、前記環状ペプチドは、オリゴマーＡβの溶媒に露出された抗体アクセス可能なナックル領域に対応する少なくともＳＮＫのアミノ酸配列を有する立体構造エピトープを含む、方法が提供される。特定の実施形態において、該抗体は、非オリゴマー形態のＡβよりも、オリゴマー形態のＡβにより大きな親和性でもって結合できる。
【０１２５】
本発明の更なる態様は、本発明の好ましい実施形態の以下の記述を考慮することによって、より明らかとなるであろう。当業者は、本発明の他の実施形態が可能であり、本発明の細部は多くの点で、本発明の思想を逸脱することなく改変できることを理解し得る。このように、図面、詳細な説明および実施例は、実際は例示とみなされるべきものであり、限定と考えるべきてはない。
【０１２６】
実施例
実施例１：Ａβ精製および凝集およびオリゴマーの特徴づけ
形質転換、発現および精製
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞および大腸菌ＤＨ５α細胞を、Ａβ１−４０をコードする構築物で形質転換した。１Ｌ培養からの大腸菌細胞を、２５ｍＬのリシスバッファ（５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣＩ ｐＨ８．０＋１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））中に再懸濁して、均質化した懸濁液を得た（プロテアーゼ阻害剤は添加しなかった）。その懸濁液を、４０ｍｌの遠心分離管（ＪＡ−２０）に移し、氷上に置き、強度６（即ち、小型の超音波処理チップでの最大の設定）および５０ＨＺ断続（intermittence）で３分間の超音波処理を行い、次いで４℃の１８０００ｇで１０分間の遠心工程を行った。この超音波処理プロセスは３回繰り返した。可溶性画分を毎回回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（ＴＣＡ沈殿はこの場合必要ではなかった）。最後に、ペレットを、８Ｍの尿素、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣＩ ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡを含有する１２．５ｍＬの緩衝液中で再懸濁し、次いで１回の追加的な超音波処理処置工程および遠心分離工程（１８０００ｒｐｍ、１０分間）を行った。その後、この溶液を１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０＋１ｍＭのＥＤＴＡを用いて４倍希釈した（３７．５ｍＬの添加）。次いで、このタンパク質溶液を、精製用の実際の緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０＋１ｍＭのＥＤＴＡ）を用いて最終的に平衡化したＤＥＡＥセルロース（WhatmanのＤ５２；これは最初に０．５ＮのＮａＯＨを用いて１５分間、次いで水での洗浄および０．５ＭのＨＣＩ、続いて複数回の水での洗浄、最後に濃縮緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０＋１ｍＭのＥＤＴＡ）により再生した）と共にインキュベートした。ペプチドは、穏やかな振盪条件下（即ち、磁気攪拌プレート上に置かれ内部に磁石を含む、ファルコンチューブにて）２０分間、バッチにて樹脂に結合させた。結合しなかったペプチドを通過画分（flow through）中に回収し、後の１２００ｒｐｍで１分間の遠心分離によりビーズを沈殿させた。これらのビーズをピペットで取り出した。
【０１２７】
複数回洗浄を行い、それぞれ５分間のインキュベート、そして短時間の遠心分離工程（１２００ｒｐｍｄで１分間）により画分を取り出した：それぞれ０、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、５００ｍＭのＮａＣＩを含む２５ｍＭのＴｒｉｓＨＣＩ ｐＨ８．０＋１ｍＭのＥＤＴＡを用いた。溶出した画分を氷上で保ち、ペプチドのモノマー状態を維持した。
【０１２８】
このアプローチにより、２５０μＬの濃縮画分をＴＣＡ沈殿後にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＴＣＡ沈殿のために、試料を氷上で少なくとも３０分間２０％のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）中でインキュベートし、次いで１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行った。上清を破棄し、ペレットを７５０μＬの氷冷アセトンで洗浄し、次いで１４，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行った。アセトンを除去し、残留物は蒸発させた。ペレットをプロテイン・ローディング・ダイを用いて再溶解し、８〜１０μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【０１２９】
Ａβ凝集プロトコルおよびＡβのオリゴマー化
Ａβのモノマー化を達成するために、精製したＡβをｍｉｌｉＱ水に対して透析し、凍結乾燥した。凍結乾燥後に、ＡβをＴＣＡまたはギ酸のいずれかに再生させ、次いで蒸発させて、ガラス管上に単量体の分子層を形成させた。モノマーＡβをＰＢＳ（５ｍＭ）、ｐＨ約６．８中に再懸濁し、モノマー形態のＡβを維持した。
【０１３０】
Ａβのオリゴマー化を達成するために、モノマーＡβを出発物質として用い、２００μＭで超音波処理しながら１２時間３３℃でインキュベートした。この手順は、Ａβ繊維よりもＡβオリゴマーの形成を導く。
【０１３１】
オリゴマーの特徴づけ
懸濁液中の粒子のサイズ分布プロフィールを測定するために用いられ得る周知の技術である動的光散乱（ＤＬＳ）によって、オリゴマーのサイズを特徴づけた。光源はレーザーで単色かつコヒーレントであり、散乱強度における時間依存的な揺らぎを観察する。これらの揺らぎは、溶液中でブラウン運動を受ける小分子の結果であり、従って、溶液中での散乱体間の距離が時間と共に常に変化する。光が小粒子に当ると、光は全ての方向に散乱し、これはレイリー散乱として知られている。次いで、散乱した光は、周囲の粒子により構造的または破壊的な干渉のいずれかを受ける、そして、この強度の揺らぎには、散乱体の時間スケールの動きに関する情報が含まれる。ＤＬＳは、溶液中のＡベータ試料のサイズ分布を測定するために用い、Ａベータがモノマー形態かオリゴマー形態かを確認した。
【０１３２】
図１は、ＤＬＳを用いて分析したＡβ試料はモノマーＡβであったことを示す。商業的に入手可能なＡβ（１−４０）（５０μＭ）を５ｍＭのＰＢＳ中、１０℃でインキュベートした。１ｎｍ未満の疎水半径（Ｒｈ）が算出された。これらの結果は、当業者にモノマーＡβの典型的ものと知られているモノマーＡβの約１ｎｍ未満の期待されたＲｈと一致する。
【０１３３】
図２は、ＤＬＳを用いて分析したＡβ試料はオリゴマーＡβであったことを示す。商業的に入手可能なＡβ（１−４０）（８０μＭ）を１５０ｍＭのＰＢＳ中、１０℃でインキュベートした。この結果は、みかけの単分散集団を示す。２００ｎｍの疎水半径（Ｒｈ）が算出された。この結果は、当業者にオリゴマーＡβの典型的ものと知られているオリゴマーＡβの約１００ｎｍ〜２００ｎｍの間の期待されたＲｈと一致する。
【０１３４】
図３は、ＤＬＳを用いて分析したＡβ試料はオリゴマーＡβであったことを示す。商業的に入手可能なＡβ（１−４０）（５０μＭ）を１５０ｍＭのＰＢＳ中、１０℃でインキュベートした。この結果は、みかけの単分散集団を示す。１９０ｎｍの疎水半径（Ｒｈ）が算出された。この結果は、当業者にオリゴマーＡβの典型的なＲｈと一致する。
【０１３５】
実施例２：立体構造上拘束されたエピトープを含む環状ペプチドの生成
新規立体構造エピトープを含む環状ペプチドは、ペプチドのＮ末端とＣ末端に位置するシステイン残基間のジスルフィド結合を用いて拘束されたループ構造体に構築した。２つの非天然システインをＧＳＮＫＧ配列、１つをそのＣ末端に１つをそのＮ末端に加えた。この２個のシステインを、調節された条件下で酸化して、ジスルフィド架橋を形成させた。
【０１３６】
環状ペプチドの構造は、新規立体構造エピトープを含むＡβオリゴマーのナックル領域の「ナックル」構造および配向を模倣するように構成した。
【０１３７】
図４は、新規立体構造ＳＮＫエピトープを含むジスルフィド環化ペプチドの３次元モデルを示す。
【０１３８】
当業者は、拘束されたエピトープを形成する他の方法が当該分野で公知であることを理解するであろう。例えば、ペプチドを、そのペプチドの２つの残基間での結合の形成により環化し、閉じたループを提供することができる。環状ペプチドは、ホモデチック（homodetic）（全ての結合がペプチド結合である）またはヘテロデチック（heterodetic）（ペプチド結合と、他のタイプの結合、例えばエステル結合、エーテル結合、アミド結合またはジスルフィド結合との両方がある）と形成され得る。ペプチドは、化学的方法または酵素的方法を用いて環化されてよい。米国特許公開第２００９／０２１５１７２号は、ペプチドの配列に依存しない様式で、アミド結合を介したペプチドのヘッド−テイルの環化を触媒する組換えタンパク質を記載する。目的のペプチドを囲むプレペプチド中の認識配列は、環化に影響する。Bourne et al（Methods in Molecular Biology, 2005 298:151-166）は、セーフティー・キャッチ・リンカー（safety catch linker）および保存手順の使用を介した環状ペプチドアレイ調製についてのコンビナトリアル方法を記載する。米国特許公開第２００４／００１４１００号は、環状ペプチドの生体内産生のための方法を開示する。米国特許公開第２０１０／０２４０８６５号、米国特許公開第２０１０／０１３７５５９号および米国特許第７，５６９，５４１号は、ペプチド環化のための様々な方法を記載し、例えば、ペプチドのＮ末端、Ｃ末端または内部のチオールもしくはメルカプタン含有残基の酸化を介して、該ペプチドを環化することができる。チオール含有残基の例は、システイン、ホモシステイン、ペニシラミンを含む。幾つかの実施形態において、第１のチオール含有残基はシステインである；幾つかの実施形態において、第１と第２のチオール含有残基はシステインである。ペプチド内の２個のチオール含有残基は酸化されて、ジスルフィド結合によって連結された二量体アミノ酸システインを形成し得る。種々の酸化試薬を用いて、そのようなチオールジスルフィド転換を達成することができ、例えば酸素（空気）、ジメチルスルホキシド、酸化型グルタチオン、フェリシアン化カリウム、タリウム（ＩＩＩ）トリフルオロアセテート、または当業者には既知であって当業者に既知のそのような方法で用いられ得る他の酸化試薬がある。そのような方法の例は、ＰＣＴ国際公開ＷＯ０１／９２４６６およびAndreu et al., 1994. Methods in Molecular Biology 35:91-169に記載されている。
【０１３９】
実施例３：Ａβオリゴマー特異モノクローナル抗体の誘導およびスクリーニング
Ａβオリゴマー特異立体構造エピトープ（配列番号１）に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、実施例２で記載されるようにこのペプチドのＮ末端およびＣ末端のシステイン間のジスルフィド連結を用いてループ構造内で拘束されたエピトープに対する抗体を産生することにより創り出した。
【０１４０】
ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、ＰｒＰおよびＳＯＤ１−ミスフォールディング・特異エピトープ（Paramithiotis et al. 2003; Rakhit et al. 2007）に用いられたマルチプルアンチゲンペプチド（ＭＡＰ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に連結された、本明細書中でＧＳＮＫＧ−ＣＬＥと称する新規な拘束されたループエピトープ（ＣＬＥ）で免疫した。マウス血清は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に連結したＧＳＮＫＧ−ＣＬＥに対してスクリーニングをして、脾臓融合およびハイブリドーマ・スクリーニングを、それらのマウスにて、構造をとらない可溶性ＡβではなくＧＳＮＫＧ−ＣＬＥとの特異的かつ強力な相互作用に関して実施した。陽性の選択したＩｇＧを分泌するクローンを大規模生産し、次いで環状および鎖状ＧＳＮＫＧ−ＢＳＡ、合成ＡβオリゴマーおよびＡＤ脳由来のＡβオリゴマーを用いた免疫学的方法による特徴づけを行った。
【０１４１】
環状ＧＳＮＫＧペプチドに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を創り出し、ペプチドＥＬＩＳＡにより結合について予めスクリーニングした。ＧＳＮＫＧ環状ペプチドに対して創り出された幾つかの抗体は、優先的に環状ペプチドを認識し、幾つかは鎖状ペプチド、幾つかは環状および鎖状の両方を認識した。鎖状と環状ペプチドの両方を認識する抗体の能力は、例えば、生体内でシステイン架橋の還元により部分的に又は完全に鎖状になった環状ペプチドの免疫認識に関係し得る。中間のＧＳＮＫＧペプチドに対して創り出された抗体が、環状と鎖状ペプチドの両方を認識する抗体を表す。ＥＬＩＳＡの結果に基づいて、２つの環状特異抗体（５Ｄ８、５Ｅ３）、２つの鎖状特異ＩｇＧ（３Ｆ５、３Ｇ２）および２つの中間特異ＩｇＧ（４Ｄ１１、４Ｄ１２）クローンを、更なる分析のために選び出した。実時間で且つ標識する必要の無い生体分子間相互作用をモニタするための表面プラズモン共鳴の光学現象を利用した技術であるＢｉａｃｏｒｅ（商標）プラットフォームを更なる分析のために用いた。
【０１４２】
図５は、例示的なＢｉａｃｏｒｅ（商標）の結果を示す。モノクローナル抗体を、ラビット抗マウスＦｃ特異（ＲＡＭＦｃ）抗体を用いて組織培養上清から捕捉し、ＣＭ５センサーチップ上に共有結合で固定化した。次いで、ＢＳＡコンジュゲートＧＳＮＫＧペプチド（鎖状および環状）およびオリゴマーΑβ（１−４２）の結合は、捕捉したｍＡｂに対してこれらのアナライトを流すことによって調べた。結合応答（Binding response）は、捕捉されたｍＡｂではなく固定化されたＲＡＭｆｃを含むフローセルを参照とし、さらに、１ｍｇ／ｍｌのカルボキシメチル・デキストランを含むＨｅｐｅｓ緩衝塩溶液（ＨＢＳ）から成るサンプル希釈液をブランクとした。加えて、観察された応答を、捕捉したｍＡｂの量に対して規格化し、別のｍＡｂとの正確な対比を可能にした。
【０１４３】
図６および図７は、結果として生じるＢｉａｃｏｒｅ（商標）のセンサーグラムを表し、ＥＬＩＳＡで選択された鎖状優先（linear-preferential）のクローン（３Ｆ５、３Ｇ２）はＢｉａｃｏｒｅチップ上の鎖状および環状ＢＳＡコンジュゲートペプチドを結合しなかったことを示し；ＥＬＩＳＡで選択された中間のクローン（４Ｄ１１、４Ｄ１２）はＢｉａｃｏｒｅチップ上の鎖状および環状ペプチドの両方と結合したことを示し；ならびに、ＥＬＩＳＡで選択した環状クローン（５Ｄ８、５Ｅ３）はＢｉａｃｏｒｅチップ上の環状ＢＳＡコンジュゲートペプチドと主に結合したことを示す。環状クローン５Ｅ３および５Ｄ８は、Ａβ（１−４２）オリゴマーおよび環状ペプチドに最も強く結合することを実際に示し、また、一方で中間クローンと比較して鎖状ペプチドの結合はほとんど示さなかった。これらの結果は、実施例２の環状ペプチドを用いて産生した抗体のスクリーニングで、環状特異抗体のサブセットがＡβオリゴマーエピトープの選択的な抗体認識をもたらしたことを示す。
【０１４４】
図８は、ｍＡｂ  ５Ｅ３である環状優先クローンが、Ａβ（１−４２）オリゴマーに対して濃度依存的な様式で結合することを示す。この観察は、滴定可能なＡβオリゴマー中のアクセス可能で立体構造上拘束されたエピトープが、信頼できる免疫学的抗原抗体相互作用と一致することを実証する。このように、Ｂｉａｃｏｒｅ分析は、環状ＧＳＮＫＧペプチドおよび全長オリゴマーΑβ（１−４２）が共通する分子的特徴、高次構造的に圧迫されたエピトープを共有することを実証し、立体構造感受性が高いｍＡｂ  ５Ｅ３により特異的に認識されることを実証する。
【０１４５】
Αβ（１−４２）オリゴマー特異ｍＡｂは、ＡＤの細胞および動物モデルでの治療用途について、およびΑβオリゴマーにより損なわれたシナプス機能に関する神経生理学的アッセイで中和活性についてさらに試験してもよい。
【０１４６】
実施例４：フローサイトメトリー分析
フローサイトメトリー分析は、細胞表面でのＡＰＰを結合する抗体の程度を測定するために行った。
【０１４７】
健康な生体Ｂｌａｃｋ／６マウスを二酸化炭素チャンバー内で安楽死させた。脳を直ぐに取り出し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に沈め、続いてＰＢＳ＋１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中に沈めた。単一細胞懸濁液を、剥離鋏および１００μｍおよび７０μｍシーブを通じた連続継代で脳を細分することによって生成した。細胞を３０分間室温でブロッキング工程としてＰＢＳ＋１％ＦＢＳ中でインキュベートした。次いで、細胞を１０μｇ／ｍＬまたは１μｇ／ｍＬの６Ｅ１０および５Ｅ３のいずれかをそれぞれ加えたＰＢＳ＋１％ＦＢＳ中でインキュベートした（又はしなかった）。室温で１時間後に、細胞を２回洗浄（４００×ｇで５分）し、１％ＦＢＳおよびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）またはフルオレセイン（ＦＩＴＣ）のいずれかとコンジュゲートした抗マウス抗体を含むＰＢＳ中に１：１０００希釈で共に再懸濁した。非染色対照に加えて、幾つかの細胞を、非特異的相互作用の対照のために二次抗体単独と共にインキュベートした。二次抗体を３０分間室温で試料と共にインキュベートし、その後、細胞を洗浄し、直ぐに分析するか、又は４％パラフォルムアルデヒド中、４℃で一晩固定した。BD LSRII Flow Cytometerを用いてデータを収集し、FlowJoをデータ分析のために用いた。
【０１４８】
図９および図１０は、フローサイトメトリー分析の結果を示す。図９は、フローサイトメトリートレースであり、細胞表面に位置するＡＰＰに対する、細胞が結合する標識化６Ｅ１０ ｐａｎ−Ａβ抗体と二次抗体陰性対照との比較を示す。図１０は、細胞表面に位置するＡＰＰに対する、細胞が結合する標識化５Ｅ３抗体と二次抗体陰性対照との比較を示す。図９で示される６Ｅ１０抗体は、細胞表面に位置するＡＰＰに対する、細胞が結合するＦＩＴＣ標識化６Ｅ１０の有意な割合を示す。対照的に、図１０で示される５Ｅ３抗体は、対照と比較して、ＦＩＴＣ標識化５Ｅ３の非常に僅かな結合を示す。これらの結果は、ＦＩＴＣ標識化５Ｅ３が、ＦＩＴＣ標識化６Ｅ１０と比較して、細胞表面のＡＰＰに対する有意に低い結合性を示すことを明確に表す。これらの分析の結果は、構造的に拘束されたオリゴマーに特異的な新規立体構造エピトープがニューロンの細胞表面に存在しないことを示し、これは天然のＡＰＰにはＧＳＮＫＧモチーフの鎖状で構造化されていない性質と一致する。この細胞表面の構造的に拘束された新規な立体構造エピトープの欠如は、アルツハイマー病の治療に用いられる環状エピトープ（cyclic epitope）に対する免疫応答が天然のＡＰＰを標的としないことを示す。これらの結果は、オリゴマーΑβの環状ＧＳＮＫＧエピトープと特異的に結合する抗体が、既知の６Ｅ１０抗体と比較して、好ましい安全性プロフィールを有することを実証する。
【０１４９】
実施例５：ニューロン分析
神経毒性分析を行い、種々の濃度の５Ｅ３抗体の存在下および非存在下でのモック（培地のみ）対照、可溶性（鎖状）Ａβ１−４０およびオリゴマーＡβ１−４０と共にインキュベートした細胞についての細胞生存の程度を測定した。モック対照は、培地のみ（抗体なし）で処理した。
【０１５０】
１０，０００個のラットの初期ニューロン／ウェルを含む９６ウェルを、ｐｏｌｙ−Ｌ−リジン（ScienCell #0403；２マイクログラム／ｃｍ２、１時間、３７℃、ＰＢＳで３回洗浄）下、各ウェルにつき０．２ｍｌの神経培地（ScienCell #1521）を用いて成長させた。培地を７日毎に交換した。可溶性Ａβ（１−４０）およびオリゴマーΑβ（１−４０）を、神経培地中に種々の濃度（図１１を参照のこと）の５Ｅ３抗体の存在下または非存在下で回転装置にて室温で４時間インキュベートした。この混合液０．２ｍｌを、培地の除去後のニューロンに加えた。２４時間の期間後に、細胞の生存をRoche Cell Proliferation kit II（#11465015001 ）を用いて製造業者のプロトコルに従って測定した。光学濃度はプレートリーダーを用いて測定した。
【０１５１】
図１１は、ニューロン毒性アッセイの結果を示す。Ａβは、鎖状Ａβモノマー立体配置およびオリゴマーＡβ立体配置の両方でニューロンに対して有毒である。立体構造上拘束されたＡβエピトープに指向された抗体５Ｅ３は、Ａβのオリゴマー型に対して保護的であることが示された。抗体５Ｅ３が鎖状Ａβに関して保護的であることは示されなかった。これらの結果は、抗体５Ｅ３結合の立体構造特異性を実証する。
【０１５２】
実施例６：免疫ブロット分析
６Ｅ１０抗体および５Ｅ３抗体のＡＰＰ、モノマーΑβおよびオリゴマーΑβに対する相対的な結合を決定するために、免疫ブロット分析を行った。
【０１５３】
均質化
脳組織試料の重量を測定し、次いで、脳組織の終濃度が２０％となるように新鮮な氷冷の大量ＴＢＳ（５ｍＭのエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、５ｍｍのＥＤＴＡおよびプロテアーゼ阻害剤カクテルを補充した）中に沈めた。その組織を、以下のように、機械式ホモジナイザーを用いてこの緩衝液中で均質化した：組織をホモジナイザーに、３０秒３回の均質化を行い、各均質化の間に３０秒間氷上においた。次いでＴＢＳ均質化した試料を、超遠心分離（７０，０００×ｇ、９０分）にかけた。上澄みを集め、−８０℃で保存した。
【０１５４】
ＴＢＳ均質液のタンパク質濃度を、ＢＣＡプロテインアッセイを用いて測定した。場合によっては、等量のタンパク質を、トリス−トリシン・サンプルバッファー（Invitrogen）中でボイルした後にトリス−トリシン４−２０％ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、０．２μｍのポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレンに転写した。転写後に、メンブレンをＰＢＳ中に沈め、エピトープの熱回復（heat recovery）のためにそれぞれ３分間のボイルを２回行った。メンブレンを、一次抗体として６Ｅ１０またはオリゴマー特異抗体５Ｅ３を用いて免疫ブロットにかけた。双方とも、１μｇ／ｍｌの濃度で用いた。
【０１５５】
図１２は、ＴＢＳ中で均質化し、トリス−トリシンゲルにて分画してｐａｎ−Ａβ  ６Ｅ１０抗体で免疫ブロットした脳組織を示す免疫ブロットの結果を表す。ＡＰＰとの反応およびモノマー形態のＡβとの反応は明らかであり、同様に、Ａβオリゴマーのバンドに対する軽度の反応性は明らかである。
【０１５６】
図１３は、抗体５Ｅ３についての免疫ブロットの結果を示す。抗体５Ｅ３は、約４５−５５ｋＤａで、明らかにＳＤＳに安定なオリゴマー種を特異的に認識した。これは、オリゴマー種におけるΑβモノマーの強固な非共有結合相互作用を示す。モノマー形態のＡβとの相互作用は観察されなかったが、ＡＰＰとの幾らかの限られた反応性がこの免疫ブロットでは明白であり、これはブロットメンブレン上での変性ならびに部分的な天然および非天然の再生と関連すると推定される。ｐａｎ−Ａβ抗体６Ｅ１０は、オリゴマー種に関する限定された認識もしくは認識しないことを示した。実施例３（実証的なＢｉａｃｏｒｅ（商標）常套手段に基づく、及び５Ｅ３とＡβ４２間の化学量論を１と仮定した）で述べたＢｉａｃｏｒｅ（商標）データは免疫ブロットと一致しており、これは、５Ｅ３と結合するＡβ（１−４２）種が１０量体から１３量体の間であることを示し、モノマーあたりの分子量を４．０〜４．３ｋＤａとした場合、Ｂｉａｃｏｒｅデータはオリゴマー種が〜５０ｋＤａであることを示し、これは、５Ｅ３抗体により検出されたメインバンドの分子量と整合する。
【０１５７】
実施例７：Ａβオリゴマー形成阻害の分析
Αβ阻害分析を行い、Αβオリゴマーの増幅(propagation)における遅延を誘発する５Ｅ３抗体の能力を測定した。
【０１５８】
静的光散乱（ＳＬＳ）は、ポリマーまたはタンパク質のような巨大分子の平均分子量（Ｍｗ）を得るために散乱光の強度を測定する物理化学の技術である。多くの角度での散乱強度の測定は、二乗平均平方根半径（回転半径（Ｒｇ）とも称される）の算出を可能にする。様々な濃度で多くの試料の散乱強度を測定することによって、第２ビリアル係数Ａ２が算出できる。静的光散乱実験のために、高い強度の単色光、通常レーザーを、巨大分子を含む溶液に照射する。所定の波長（λ）で１または多くの角度（θ）の散乱強度を測定するために、１または多くの検出器を用いる。
【０１５９】
重量平均分子量を校正せずに光散乱強度から直接的に評価するために、レーザー強度、検出器の量子収率、及び全体の散乱容積、ならびに検出器の立体角が既知である必要がある。これは非実用的であるため、すべての商業機器は、トルエンのような強く、既知の散乱体を用いて補正する。これは、トルエンおよび他の幾つかの溶媒のレイリー比が絶対光散乱装置を用いて測定されているからである。
【０１６０】
図１４は、毒性のオリゴマーＡβ形態へのモノマーＡβの凝集を遅延させる５Ｅ３抗体の能力を示す。Αβオリゴマー形成は、５Ｅ３の非存在下（図１４中の「Ｃ」）、又は５Ｅ３存在下（図１４中の「５Ｅ３」）で試験した。商業的に供給されたΑβ（１−４０）（２３μΜ）を、３９℃で反応容量１５０μＬにて抗体５Ｅ３（２．０ｍｃＭ）と共にインキュベートした。矢印で示されるＳＬＳ強度のシフトは、５Ｅ３抗体の散乱強度の寄与に相当する。図１４は、抗体５Ｅ３を用いたインキュベーションが結果的にＡβオリゴマー形成における有意な遅延をもたらしたことを示す。
【０１６１】
この重合に対する抑制効果は、抗体５Ｅ３、それに関連するヒト化抗体およびキメラ抗体、並びに新規な立体構造エピトープ自体、例えばワクチン組成物の治療上の役割を支持する。
【０１６２】
実施例８：生体試料中のＡβオリゴマーの検出
精製した５Ｅ３抗体は生体試料、例えば脳を含む組織由来の均質液中のＡβオリゴマーを検出するために用いることができると考えられる。この検出は、様々な検出プラットフォーム、例えばＢｉａｃｏｒｅ（商標）プラットフォームを用いて実施することができ、診断および／または予防上の価値を有し得る。
【０１６３】
実施例９：５Ｅ３および関連抗体ならびにワクチンによる処置
５Ｅ３抗体による処置は、毒性のＡβオリゴマーを特異的におよび／または選択的に排除するために提供することができ、ならびにＡβオリゴマーの毒性に関連した疾患、例えばアルツハイマー病の発症または進行を処置および／または予防するのに有用であり得る。５Ｅ３と同じエピトープに対するヒト抗体またはヒト化抗体は、アルツハイマー病の処置および／または予防に有用であり得る。他の態様において、５Ｅ３により認識されるエピトープと一部重複するエピトープは、アルツハイマー病を処置および／または予防するのに有用であり得る。
【０１６４】
同様に、本明細書に記載の新規な立体構造エピトープは、Ａβオリゴマーに対する特異的な免疫応答を惹起するのに有用であり、それは、例えばアルツハイマー病での処置または予防に有用であり得る。
【０１６５】
上記の実施形態は、例示のみを目的とする。添付の特許請求の範囲によってのみ規定される範囲を逸脱することなく、当業者であれば、特定の実施形態に対して改変、修飾および変更を施すことができる。
【０１６６】
【表２】
2013524774.tif 000004
【表３】
2013524774.tif 000005
【図１】
2013524774.tif 000006
【図２】
2013524774.tif 000007
【図３】
2013524774.tif 000008
【図４】
2013524774.tif 000009
【図５】
2013524774.tif 000010
【図６】
2013524774.tif 000011
【図７】
2013524774.tif 000012
【図８】
2013524774.tif 000013
【図９】
2013524774.tif 000014
【図１０】
2013524774.tif 000015
【図１１】
2013524774.tif 000016
【図１２】
2013524774.tif 000017
【図１３】
2013524774.tif 000018
【図１４】
2013524774.tif 000019
【図１５】
2013524774.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成25年1月10日(2013.1.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
残基２５−２９（ＣＧＳＮＫＧＣ：配列番号８）を含むジスルフィド結合した環状ペプチドの分子動力学モデリングの画像取得が行われ；非天然システインがジスルフィド結合のために加えられた。このモデリングは、文献Lurs et al. (2005)およびRauk (2008)で予測された内側に配向されたリジン２８側鎖に反して、図４で示されるようにリジン２８の側鎖が外側に配向されることを明らかにする。このリジン２８残基の外向きの配向という驚くべき発見は、リジン側鎖が溶媒に露出されて、大きく且つε−アミノ基を介して帯電されていることによる、残基２５−２９（ＣＧＳＮＫＧＣ）を含むこの環状ペプチドの高い免疫原性と一致する。少なくともＳＮＫ残基を含む立体構造上の環状エピトープ（cycle epitope）に対する抗体は、Αβオリゴマーの毒性を効果的に中和することが以下の実施例で示された（図１１を参照のこと）。このリジン２８残基の外向きの配向という驚くべき発見は、抗体アクセス可能な様式では類似してリジン側鎖が溶媒に対して配向を示す信頼できるΑβオリゴマーとも一致する。セリン２６、アスパラギン２７およびリジン２８残基のＳＮＫは、Αβオリゴマーのナックル領域に位置し、すべて荷電を有するか極性であり、小さい非極性アミノ酸より大きな免疫原性を有する。Αβオリゴマーのナックル領域に位置するＳＮＫ残基の環状立体構造は、溶媒に露出されており、抗体が結合するのに利用できる新規な立体構造エピトープを形成する。下記の実施例では、結合に関してこのΑβオリゴマーの立体構造上拘束されたＳＮＫエピトープの有効性に関する発見を確認する。Αβオリゴマー表面のこの新規な構造的に拘束されたエピトープの発見は、選択的な抗体結合に有利な特性を有する。
【手続補正書】
【提出日】平成25年1月10日(2013.1.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2013524774000001.app
【国際調査報告】
2013524774.tif 000021
2013524774.tif 000022
2013524774.tif 000023
2013524774.tif 000024