(57)【要約】  【課題】  ポリヌクレオチド上の損傷の存在および程度を評価するための方法およびシステムが提供される。  【解決手段】  本方法は、前記損傷部位で標識を組み込む工程と、前記損傷の存在および程度を決定するために前記標識をイメージングする工程とを含む。本システムは、単一分子上で損傷評価を実施できる機器を含む。  【選択図】      図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
方法であって、
ポリヌクレオチド上の第１部位を、ポリメラーゼ伸長を支持できる第１部分に転換させる工程と、
前記第１部位またはその近位で第１標識を組み込めるように前記第１部分で伸長を実行する工程と、
前記第１標識を含む前記ポリヌクレオチドの１つの部分を直鎖化する工程と、
前記第１標識をイメージングする工程と
を有する方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記直鎖化する工程は、前記第１標識を含む前記ポリヌクレオチドの１つの部分をナノチャネル内に限定することによって実行されるものである方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、前記第１部位は、前記ポリヌクレオチド内の一本鎖切断、前記ポリヌクレオチド内の二本鎖切断、シクロブタン−ピリミジン二量体、６−４光分解生成物、チミン二量体、酸化ピリミジン、脱塩基部位、上記のいずれかの原子価異性体、上記のいずれかのデュワー（Ｄｅｗａｒ）原子価異性体、またはそれらのいずれかの組み合わせを有するものである方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法において、前記転換させる工程は、アピリミジン部位、アプリン部位、伸長不可能な一本鎖切断、またはそれらのいずれかの組み合わせを生じさせるものである方法。
【請求項５】
請求項１記載の方法において、前記転換させる工程は、前記第１部位を、アプリン部位を加水分解し、アピリミジン部位を加水分解し、またはその両方を実施する酵素と接触させる工程を有するものである方法。
【請求項６】
請求項５記載の方法において、前記転換させる工程は、前記第１部位を、Ｎ−グリコシラーゼ、アルカリ処理、またはその両方と接触させる工程を有するものである方法。
【請求項７】
請求項６記載の方法において、前記Ｎ−グリコシラーゼは、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、紫外線ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、ホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ、またはそれらのいずれかの組み合わせを有するものである方法。
【請求項８】
請求項３記載の方法において、前記第１部位は脱塩基部位を有し、前記脱塩基部位は、前記脱塩基部位を一本鎖切断に転換するようにアルカリ溶液と接触させられるものである方法。
【請求項９】
請求項３記載の方法において、前記第１部位は一本鎖切断を有し、前記一本鎖切断は、前記一本鎖切断を二本鎖切断に転換するようにアルカリ溶液と接触させられるものである方法。
【請求項１０】
請求項４記載の方法において、この方法は、さらに、
前記アピリミジン部位、前記アプリン部位、前記伸長不可能な一本鎖切断、またはその両方をアプリン／アプリミジンリアーゼ、ホスホジエステラーゼ、またはそれらのいずれかの組み合わせと接触させる工程を有するものである方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の方法において、前記リアーゼはエンドヌクレアーゼＩＶを有するものである方法。
【請求項１２】
請求項１記載の方法において、前記伸長は、前記ポリヌクレオチドを、ポリメラーゼおよび前記第１標識を有するヌクレオチドと接触させる工程によって実行されるものである方法。
【請求項１３】
請求項１記載の方法において、前記第１部分は、ポリメラーゼ伸長を支持できる３’−ＯＨ構造を有するものである方法。
【請求項１４】
請求項１記載の方法において、この方法は、さらに、
前記ポリヌクレオチドの少なくとも１つの構造的特徴を特徴付ける工程を有するものである方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法において、前記特徴付ける工程は、前記ポリヌクレオチド上の少なくとも１つの標識の位置を特定する工程を有するものである方法。
【請求項１６】
請求項１５記載の方法において、この方法は、さらに、
前記ポリヌクレオチド上の２若しくはそれ以上の標識の相対位置を決定する工程を有するものである方法。
【請求項１７】
請求項１４記載の方法において、この方法は、さらに、
前記ポリヌクレオチドの長さにおける標識の数を計算する工程を有するものである方法。
【請求項１８】
請求項１記載の方法において、この方法は、さらに、
前記ポリヌクレオチドを含有するサンプル中に存在する標識の数を決定する工程を有するものである方法。
【請求項１９】
請求項１記載の方法において、前記第１標識は、蛍光体を有するものである方法。
【請求項２０】
請求項１記載の方法において、この方法は、さらに、
前記第１部位またはその近くで第２標識を組み込む工程を有するものである方法。
【請求項２１】
請求項２０記載の方法において、前記第１および第２標識は、構造において相互に相違するものである方法。
【請求項２２】
請求項２１記載の方法において、前記第１および第２標識は、異なる波長の照明で蛍光を発光するものである方法。
【請求項２３】
請求項１記載の方法において、前記転換または実行する工程の少なくとも１つは、前記ポリヌクレオチドが多孔性マトリックス内に存在する間に行われるものである方法。
【請求項２４】
請求項２３記載の方法において、前記マトリックスは、アガロースゲルを有するものである方法。
【請求項２５】
請求項２３記載の方法において、この方法は、さらに、
前記ポリヌクレオチドを遊離させられるように前記マトリックスを少なくとも部分的に分解する工程を有するものである方法。
【請求項２６】
請求項２３記載の方法において、この方法は、さらに、
前記ポリヌクレオチドの少なくとも１つの部分を前記マトリックスに付着させる工程を有するものである方法。
【請求項２７】
請求項２６記載の方法において、前記付着させる工程はビオチン−アビジン反応、受容体−リガンド反応、抗体−抗原反応、またはそれらのいずれかの組み合わせによって実行されるものである方法。
【請求項２８】
請求項１記載の方法において、前記イメージングする工程は、前記ポリヌクレオチドを１若しくはそれ以上の波長の照明で照明する工程を有するものである方法。
【請求項２９】
請求項１記載の方法において、この方法は、さらに、
前記第１標識の存在または位置を前記ポリヌクレオチドの構造的特徴に関連付ける工程を有するものである方法。
【請求項３０】
請求項２９記載の方法において、この方法は、さらに、
２若しくはそれ以上の標識の存在または位置を前記ポリヌクレオチドの構造的特徴に関連付ける工程を有するものである方法。
【請求項３１】
分析システムであって、
１ｎｍ〜約２５０ｎｍの範囲内の特徴的寸法を有する１若しくはそれ以上のナノチャネルを有する流体チップを受け入れるように構成されたサンプルステージと、
前記流体チップ内に配置されたサンプルを照明するように構成された照明光源と、
前記流体チップ内に配置された照明されたサンプルの画像を収集するように構成された画像収集装置と
を有するシステム。
【請求項３２】
請求項３１記載のシステムにおいて、このシステムは、さらに、
前記流体チップ内に配置されたサンプルから反射された照明の第１ビームを検出できる検出器を有するものであるシステム。
【請求項３３】
請求項３１記載のシステムにおいて、このシステムは、さらに、
前記流体チップ内に配置されたサンプルから反射された照明の第１および第２ビームの位置を検出できる検出器を有するものであるシステム。
【請求項３４】
請求項３２記載のシステムにおいて、このシステムは、さらに、
前記流体チップ内に配置された前記サンプルから反射された照明の第１ビームの位置に応答して前記ステージを平行移動させるように構成されたコントローラを有するものであるシステム。
【請求項３５】
請求項３３記載のシステムにおいて、このシステムは、さらに、
前記流体チップ内に配置された前記サンプルから反射された照明の第１ビームの位置に応答して前記ステージを平行移動させるように構成されたコントローラを有するものであるシステム。
【請求項３６】
請求項３５記載のシステムにおいて、前記コントローラは、前記流体チップ内に配置された前記サンプルから反射された照明の第１または第２ビームのうちの少なくとも１つの第１および第２位置の間の間隔を入力として受信するものであるシステム。
【請求項３７】
請求項３１記載のシステムにおいて、このシステムは、さらに、
前記流体チップ内に配置された前記サンプルに提供された照明の波長を変化させるように前記照明の経路内に配置できる少なくとも１つのフィルタを有するものであるシステム。
【請求項３８】
請求項３１記載のシステムにおいて、前記システムは、２若しくはそれ以上の照明光源を有するものであるシステム。
【請求項３９】
請求項３８記載のシステムにおいて、少なくとも２つの照明光源は、異なる波長の照明を提供するように構成されるものであるシステム。
【請求項４０】
請求項３１記載のシステムにおいて、このシステムは、さらに、前記照明光源と前記サンプルとの間の照明経路内に配置されたビームエクスパンダを有するものであるシステム。
【請求項４１】
請求項４０記載のシステムにおいて、前記ビームエクスパンダは、ケプラー式（Ｋｅｐｌｅｒｉａｎ）ビームエクスパンダ、ガリレイ式（Ｇａｌｉｌｅａｎ）ビームエクスパンダ、またはその両方を有するものであるシステム。
【請求項４２】
請求項３１記載のシステムにおいて、このシステムは、さらに、前記サンプルに適用された、または前記サンプルから反射された照明をフィルタリングするように構成されたフィルタホイールを有するものであるシステム。
【請求項４３】
請求項３１記載のシステムにおいて、前記システムは、流体サンプルを前記流体チップのナノチャネル内に誘導するように構成された電場源を有するものであるシステム。
【請求項４４】
請求項３１記載のシステムにおいて、このシステムは、さらに、流体チップ上に配置された１若しくはそれ以上の表示に一致して前記システムを構成するように構成されたリーダを有するものであるシステム。
【請求項４５】
方法であって、
ポリメラーゼ伸長を支持できる第１部分を生じさせるようにポリヌクレオチド内の第１一本鎖切断をアルカリホスファターゼと接触させる工程と、
前記ポリオリゴヌクレオチド内に標識を組み込めるように前記部分をポリメラーゼおよび標識ヌクレオチドと接触させる工程と、
ナノチャネル内に前記第１標識を限定することによって前記ポリヌクレオチドの少なくとも１つの部分を直鎖化する工程と、
前記第１標識をイメージングする工程と
を有する方法。
【請求項４６】
請求項４５記載の方法において、前記アルカリホスファターゼは、エビアルカリホスファターゼを有するものである方法。
【請求項４７】
請求項４５記載の方法において、この方法は、さらに、前記標識ヌクレオチドの存在または位置を前記ポリヌクレオチドの構造的特徴に関連付ける工程を有するものである方法。
【請求項４８】
請求項４７記載の方法において、この方法は、さらに、２若しくはそれ以上の標識の存在または位置を前記ポリヌクレオチドの構造的特徴に関連付ける工程を有するものである方法。
【請求項４９】
方法であって、
伸長不可能な一本鎖切断をポリメラーゼ伸長可能な部位に転換させられるようにポリヌクレオチド内の一本鎖切断に３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを適用する工程と、
前記ポリヌクレオチド内に標識を組み込めるようにＤＮＡポリメラーゼおよび標識デオキシヌクレオチドを適用する工程と
を有する方法。
【請求項５０】
請求項４９記載の方法において、前記標識は、蛍光体、放射性部分、またはそれらのいずれかの組み合わせを有するものである方法。
【請求項５１】
請求項４９記載の方法において、前記ポリメラーゼは、本質的に遊離デオキシヌクレオチドの非存在下で適用されるものである方法。
【請求項５２】
方法であって、
脱塩基部位を有するポリヌクレオチドを多孔性マトリックス物質内に配置する工程と、
前記脱塩基部位を前記ポリヌクレオチド内の一本鎖切断に転換させられるように、前記ポリヌクレオチド内の一本鎖切断を前記ポリヌクレオチド内の二本鎖切断に転換させられるように、またはその両方のために、前記ポリヌクレオチドをアルカリ性物質と接触させる工程と、
前記ポリヌクレオチド内の一本鎖切断、前記ポリヌクレオチド内の二本鎖切断、またはその両方を、ポリメラーゼ伸長を支持できる部分に転換させる工程と、
１若しくはそれ以上の標識を前記ポリヌクレオチド内に組み込めるように前記部分をポリメラーゼおよび標識ヌクレオチドと接触させる工程と
を有する方法。
【請求項５３】
請求項５２記載の方法において、前記ポリヌクレオチドは、細胞内に配置されるものである方法。
【請求項５４】
請求項５２記載の方法において、この方法は、さらに、前記ポリヌクレオチドを遊離させられるように前記細胞を溶解させる工程、前記ポリヌクレオチドを増幅する工程、前記ポリヌクレオチドを消化する工程、またはそれらのいずれかの組み合わせを有するものである方法。
【請求項５５】
請求項５２記載の方法において、前記ポリヌクレオチド内の一本鎖切断を転換させる工程は、前記一本鎖切断を、３’ホスホジエステラーゼ活性を有するエンドヌクレアーゼと接触させる工程を有するものである方法。
【請求項５６】
請求項５２記載の方法において、この方法は、さらに、前記ポリヌクレオチドを遊離させられるように前記マトリックスを少なくとも部分的に分解する工程を有するものである方法。
【請求項５７】
請求項５２記載の方法において、この方法は、さらに、１若しくはそれ以上の標識をイメージングする工程と、前記イメージングされた標識を前記ポリヌクレオチドの構造的特徴に関連付ける工程とを有するものである方法。
【請求項５８】
方法であって、
ポリヌクレオチドを多孔性マトリックス物質内に配置する工程と、
ポリヌクレオチド上の第１部位を、ポリメラーゼ伸長を支持できる第１部分に転換させる工程と、
前記第１部位またはその近位で第１標識を組み込めるように前記第１部分で伸長を実行する工程と、
ナノチャネル内に前記第１標識を限定することによって前記ポリヌクレオチドの少なくとも１つの部分を直鎖化する工程と、
前記第１標識をイメージングする工程と
を有する方法。
【請求項５９】
請求項５８記載の方法において、前記ポリヌクレオチドは、細胞内に配置されるものである方法。
【請求項６０】
請求項５９記載の方法において、前記細胞は、前記多孔性マトリックス物質内に配置されるものである方法。
【請求項６１】
請求項６０記載の方法において、前記細胞は、前記ポリヌクレオチドを遊離させられるように溶解されるものである方法。
【請求項６２】
請求項５８記載の方法において、この方法は、さらに、（ａ）前記ポリヌクレオチドを遊離させられるように前記細胞を溶解する工程、（ｂ）前記ポリヌクレオチドを増幅させる工程、（ｃ）前記ポリヌクレオチドを消化する工程、またはそれらのいずれかの組み合わせを有するものである方法。
【請求項６３】
請求項５８記載の方法において、この方法は、さらに、前記ポリヌクレオチドを遊離させられるように前記マトリックスを少なくとも部分的に分解する工程を有するものである方法。
【請求項６４】
請求項５８記載の方法において、前記転換させる工程は、前記第１部位をＮ−グリコシラーゼと接触させることにより実行されるものである方法。
【請求項６５】
請求項６４記載の方法において、前記伸長は、前記ポリヌクレオチドをポリメラーゼおよび前記第１標識を含むヌクレオチドと接触させることによって実行されるものである方法。
【請求項６６】
請求項５８記載の方法において、この方法は、さらに、前記第１標識の存在または位置を前記ポリヌクレオチドの構造的特徴に関連付ける工程を有するものである方法。
【請求項６７】
請求項６６記載の方法において、この方法は、さらに、２若しくはそれ以上の標識の存在または位置を前記ポリヌクレオチドの構造的特徴に関連付ける工程を有するものである方法。
【請求項６８】
キットであって、
ある量のＮ−グリコシラーゼと、
ある量のアプリン／アプリミジンリアーゼ、３’−ホスホジエステラーゼ、またはその両方と、
ある量のポリメラーゼと、
ある量の標識ヌクレオチドと
を有するキット。
【請求項６９】
請求項６８記載のキットにおいて、前記キットは、前記キットの試薬の１若しくはそれ以上の分注を実行できる器具と係合するように構成されたパッケージ内に配置されるものであるキット。
【請求項７０】
請求項６８記載のキットにおいて、前記アプリン／アプリミジンリアーゼは、エンドヌクレアーゼＩＶを有するものであるキット。
【請求項７１】
キットであって、
ある量のアルカリ性物質と、
ある量のアプリン／アプリミジンリアーゼ、３’−ホスホジエステラーゼ、またはその両方と、
ある量のポリメラーゼと、
ある量の標識ヌクレオチドと
を有するキット。
【請求項７２】
システムであって、
キットであって、（ａ）ある量のポリメラーゼと、（ｂ）ある量の標識ヌクレオチドと、（ｃ）ある量の１若しくはそれ以上のアプリン／アプリミジンリアーゼ、３’−ホスホジエステラーゼ、またはエンドヌクレアーゼＩＶとを含み、
前記キットは、サンプルイメージャと係合するように構成され、
１若しくはそれ以上のナノチャネルを含む流体チップと係合するように構成されるサンプルステージを有するサンプルイメージャと、
前記流体チップのナノチャネル内に配置されたサンプルとの光通信が可能な照明光源と、
前記ナノチャネル内に配置された、照明されたサンプルの画像を収集できる画像収集装置と
を有するシステム。
【請求項７３】
方法であって、
少なくとも１つの標識を含むポリヌクレオチドの領域を直鎖化する工程を有し、
前記標識はポリメラーゼ伸長によって前記ポリヌクレオチド内に組み込まれるものであり、
前記ポリメラーゼ伸長は脱塩基部位、一本鎖切断、またはその両方から転換された部分で実行されるものである方法。
【請求項７４】
請求項７３記載の方法において、この方法は、さらに、前記少なくとも１つの標識をイメージングする工程を有するものである方法。
【請求項７５】
請求項７３記載の方法において、前記脱塩基部位は、アプリン部位、アピリミジン部位、またはその両方を有するものである方法。
【請求項７６】
請求項７３記載の方法において、前記直鎖化する工程は、ナノチャネル内に少なくとも１つの標識を含有するポリヌクレオチドの領域を限定することによって実行されるものである方法。
【請求項７７】
請求項７３記載の方法において、この方法は、さらに、前記標識の存在または位置を前記ポリヌクレオチドの構造的特徴に関連付ける工程を有するものである方法。
【請求項７８】
請求項７７記載の方法において、この方法は、さらに、２若しくはそれ以上の標識の存在または位置を前記ポリヌクレオチドの構造的特徴に関連付ける工程を有するものである方法。
【請求項７９】
方法であって、
ポリヌクレオチド上の損傷部位またはその近くで標識を組み込む工程と、
前記標識を含む前記ポリヌクレオチドの領域を直鎖化する工程と、
前記標識をイメージングする工程と
を有する方法。
【請求項８０】
請求項７９記載の方法において、この方法は、さらに、前記ポリヌクレオチド上の２若しくはそれ以上の標識の存在、間隔、またはその両方を決定する工程を有するものである方法。
【請求項８１】
請求項７９記載の方法において、前記組み込む工程は、前記損傷部位を、ポリメラーゼ伸長を支持できる部分に転換させる工程を有するものである方法。
【請求項８２】
請求項８１記載の方法において、前記転換させる工程は、さらに、前記損傷部位を中間体に転換させる工程を有し、前記中間体はポリメラーゼ伸長を支持できる部分への１若しくはそれ以上の工程によって転換されるものである方法。
【請求項８３】
請求項８１記載の方法において、この方法は、さらに、前記標識の存在または位置を前記ポリヌクレオチドの構造的特徴に関連付ける工程を有するものである方法。
【請求項８４】
請求項８３記載の方法において、この方法は、さらに、２若しくはそれ以上の標識の存在または位置を前記ポリヌクレオチドの構造的特徴に関連付ける工程を有するものである方法。
【請求項８５】
システムであって、
流体チップを受け入れるように構成された基部と、
前記流体チップ内に配置されたポリヌクレオチドサンプルを照明するように構成された照明器と、
前記流体チップ内に配置された前記ポリヌクレオチドサンプルから画像を収集するように構成された画像収集装置と
を有するシステム。
【請求項８６】
請求項８５記載のシステムにおいて、このシステムは、さらに、前記照明器を前記流体チップ内に配置されたサンプルと光通信するように配置する光学媒体を有するものであるシステム。
【請求項８７】
請求項８６記載のシステムにおいて、前記光学媒体は、ファイバ、レンズ、ミラー、またはそれらのいずれかの組み合わせを有するものであるシステム。
【請求項８８】
請求項８５記載のシステムにおいて、このシステムは、さらに、前記照明器によって前記ポリヌクレオチドサンプルに供給される照明の波長を変化させることができる１若しくはそれ以上のフィルタを有するものであるシステム。
【請求項８９】
請求項８５記載のシステムにおいて、このシステムは、さらに、前記流体チップ内に配置された前記ポリヌクレオチドサンプルと通信できる勾配源を有するものであるシステム。
【請求項９０】
請求項８９記載のシステムにおいて、前記勾配源は、圧力源、電位源、電流源、磁場源、またはそれらのいずれかの組み合わせを有するものであるシステム。
【請求項９１】
請求項８５記載のシステムにおいて、前記照明器は、レーザを有するものであるシステム。
【請求項９２】
請求項８５記載のシステムにおいて、前記システムは、２若しくはそれ以上の波長の照明を前記ポリヌクレオチドサンプルに適用するように構成されているものであるシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利
本研究は、米国立衛生研究所助成金番号第２Ｒ４４Ｈ００４１９９−０３−ＮＩＨ／ＮＨＧＲＩ号、米国立標準技術研究所助成金番号第７０ＮＡＮＢ７Ｈ７Ｏ２７Ｎ  ＮＩＳＴ−ＡＴＰ  ２００７号、および米国立衛生研究所助成金番号第１Ｒ４３ＨＧ００４８１７−０１  ＮＩＨ／ＤＨＨＳ号による支援を受けた。よって米国政府は、本開示に所定の権利を有するものである。
【０００２】
（関連出願）
本出願は、２０１０年１０月２７日付で出願された米国特許出願第６１／４０７，３０２号、「Ｎａｎｏａｎａｌｙｚｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、２０１０年１０月２０日付で出願された米国特許出願第６１／３９４，９１５号、「ＤＮＡ  Ｄａｍａｇｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｎａｎｏｃｈａｎｎｅｌ  Ａｒｒａｙ」、２０１０年１０月２７日付で出願された米国特許出願第６１／４０７，１８２号、「Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＤＮＡ  Ｎａｎｏｃｈａｎｎｅｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｔｕｄｉｅｓ」、および２０１０年１２月１日付で出願された米国特許出願第６１／４１８，５１６号、「ＤＮＡ  Ｄａｍａｇｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｎａｎｏｃｈａｎｎｅｌ  Ａｒｒａｙ」に対する優先権を主張するものである。これらの出願は、ありとあらゆる目的のためにこの参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本開示は、核酸分析の分野、ナノ流体工学の分野、および光学機器の分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
生体のゲノムは、常に内因性および環境誘発性ＤＮＡ変化の危険に曝されている。特定ゲノム部位でのＤＮＡ傷害は、ヌクレオチド配列における変化を引き起こすことがある。ＤＮＡ分子は、（ａ）ＤＮＡ複製中に発生するミスマッチ、（ｂ）ＤＮＡ分子の不安定性の結果として生じる、例えばウラシルの取り込み、塩基の脱アミノ反応、脱プリン反応および脱ピリミジン反応などの損傷、（ｃ）環境要因に起因する損傷を含む様々な方法で損傷する可能性がある。例えば、電離放射線は修飾塩基や鎖切断を生成し、紫外線はシクロブタンピリミジン二量体や他の光分解生成物を生成する。典型的なＤＮＡ損傷のシナリオは図１に図示した。
【０００５】
ＤＮＡ損傷の結果は、ＤＮＡ断片化（二本鎖ＤＮＡ切断）、一本鎖ＤＮＡ切断、および修飾塩基を生じさせる。現在は、ＤＮＡ増幅を必要とせずにこれらのイベントを検出するために利用できる高スループットおよび高感度の方法は限られており、そのＤＮＡ増幅はそれらの修飾を隠蔽する可能性がある。したがって当分野においては、ポリヌクレオチド損傷を検出するための方法およびシステムに対する必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上述の課題を解決するために、本開示は最初に、方法であって、ポリヌクレオチド上の第１部位をポリメラーゼ伸長を支持できる第１部分へ転換させる工程と、前記第１部位またはその近位で第１標識を組み込めるように前記第１部分で伸長を実行する工程と、前記第１標識を含む前記ポリヌクレオチドの１つの部分を直鎖化する工程と、前記第１標識をイメージングする工程とを含む方法を提供する。
【０００７】
本開示は、分析システムであって、適切には１ｎｍ〜約２５０ｎｍの範囲内の特徴的寸法を有する１若しくはそれ以上のナノチャネルを含む流体チップを受け入れるために構成されたサンプルステージと、前記流体チップ内に配置されたサンプルを照明するために構成された照明光源と、前記流体チップ内に配置された照明されたサンプルの画像を収集するために構成された画像収集装置とを含むシステムをさらに提供する。
【０００８】
さらに方法であって、ポリメラーゼ伸長を支持できる第１部分を生じさせるようにポリヌクレオチド内の第１一本鎖切断をアルカリホスファターゼと接触させる工程と、標識を前記ポリオリゴヌクレオチド内に組み込めるように前記部分をポリメラーゼおよび標識ヌクレオチドと接触させる工程と、ナノチャネル内に前記第１標識を限定することによって前記ポリヌクレオチドの少なくとも１つの部分を直鎖化する工程と、前記第１標識をイメージングする工程とを含む方法もまた提供される。
【０００９】
追加して方法であって、前記伸長不可能な一本鎖切断をポリメラーゼ伸長可能な部位に転換させられるようにポリヌクレオチド内の一本鎖切断へ３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを適用する工程と、標識を前記ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｏｔｉｄｅ）内に組み込めるようにＤＮＡポリメラーゼおよび標識デオキシヌクレオチドを適用する工程とを含む方法が提供される。
【００１０】
本開示は、方法であって、脱塩基部位を有するポリヌクレオチドを多孔性マトリックス物質内に配置する工程と、前記脱塩基部位を前記ポリヌクレオチド内の一本鎖切断へ転換されるように、前記ポリヌクレオチド内の一本鎖切断を前記ポリヌクレオチド内の二本鎖切断に転換されるように、またはその両方のために前記ポリヌクレオチドをアルカリ性物質と接触させる工程と、前記ポリヌクレオチド内の一本鎖切断、前記ポリヌクレオチド内の二本鎖切断、またはその両方をポリメラーゼ伸長を支持できる部分に転換させる工程と、１若しくはそれ以上の標識を前記ポリヌクレオチド内に組み込めるように前記部分をポリメラーゼおよび標識ヌクレオチドと接触させる工程とを含む方法もまた提供する。
【００１１】
さらに追加の方法であって、ポリヌクレオチドを多孔性マトリックス物質内に配置する工程と、ポリヌクレオチド上の第１部位をポリメラーゼ伸長を支持できる第１部分へ転換させる工程と、前記第１部位またはその近位で第１標識を組み込めるように前記第１部分で伸長を実行する工程と、ナノチャネル内に前記第１標識を限定することによって前記ポリヌクレオチドの少なくとも１つの部分を直鎖化する工程と、前記第１標識をイメージングする工程とを含む方法もまた開示される。
【００１２】
さらに開示されるのは、キットであって、ある量のＮ−グリコシラーゼ（Ｎ−ｇｌｙｓｏｓｙｌａｓｅ）と、ある量のアプリン／アプリミジンリアーゼ（ｌｙｓａｓｅ）、３’−ホスホジエステラーゼ、またはその両方と、ある量のポリメラーゼと、ある量の標識ヌクレオチドとを含むキットである。
【００１３】
キットは、さらにある量のアルカリ性物質と、ある量のアプリン／アプリミジンリアーゼ（ｌｙｓａｓｅ）、３’−ホスホジエステラーゼ、またはその両方と、ある量のポリメラーゼと、ある量の標識ヌクレオチドとを含むことができる。
【００１４】
さらにシステムが提供される。これらのシステムは、適切にもキットであって、（ａ）ある量のポリメラーゼと、（ｂ）ある量の標識ヌクレオチドと、（ｃ）ある量の１若しくはそれ以上のアプリン／アプリミジンリアーゼ（ｌｙｓａｓｅ）、３’−ホスホジエステラーゼ、またはエンドヌクレアーゼＩＶとを含み、前記キットは、サンプルイメージャと係合するために適応し、前記サンプルイメージャは、１若しくはそれ以上のナノチャネルを含む流体チップと係合するために適応するサンプルステージと、前記流体チップのナノチャネル内に配置されたサンプルとの光通信が可能な照明光源と、前記ナノチャネル内に配置された照明されたサンプルの画像を収集できる画像収集装置とを含むキットを含んでいる。
【００１５】
本明細書で提供される他の方法は、少なくとも１つの標識を含むポリヌクレオチドの１つの領域を直鎖化する工程であって、前記標識はポリメラーゼ伸長によって前記ポリヌクレオチド内に組み込まれており、前記ポリメラーゼ伸長は脱塩基部位、一本鎖切断、またはその両方から転換された部分上で実施される工程を含んでいる。
【００１６】
本明細書で開示される追加の方法は、ポリヌクレオチド上の１つの損傷部位またはその近位で１つの標識を組み込む工程と、前記標識を含む前記ポリヌクレオチドの１つの領域を直鎖化する工程と、前記標識をイメージングする工程とを含んでいる。
【００１７】
本開示はさらに、システムであって、流体チップを受け入れるために構成された基部と、前記流体チップ内に配置されたポリヌクレオチドサンプルを照明するために構成された照明器と、前記流体チップ内に配置された前記ポリヌクレオチドサンプルから画像を収集するために構成された画像収集装置とを含むシステムもまた提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
概要ならびに下記の詳細な説明は、添付の図面と結び付けて読むことにより詳細に理解される。本発明を具体的に例示するために、図面には本発明の典型的な実施形態が図示されている。しかし本発明は本明細書に開示した特定の方法、組成物、および機器には限定されない。さらに、図面は必ずしも一定の縮尺では描出されていない。
【図１】図１は、ＤＮＡ損傷の結果として生じる可能性がある典型的なＤＮＡ傷害であって、一本鎖切断（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋｓ：ＳＳＢｓ）、二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋｓ：ＤＳＢｓ）、および修飾塩基を含む傷害を示す図である。    表１は、セシウム１３７（１３７Ｃｓ）から生成されるγ線の形にある電離放射線へのＤＮＡの曝露の結果として生じるＤＮＡ傷害のタイプおよび量の例を示す表である。
【図２】図２は、本開示による例示的方法であって、Ｎ−グリコシラーゼを使用して紫外線（Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ：ＵＶ）損傷塩基およびさらに酸化的損傷塩基を認識し、その後に前記ＤＮＡ損傷部位を蛍光標識する方法を示す図である。
【図３】図３は、３種のＤＮＡ精製プロトコールから精製されたヒトゲノムＤＮＡの典型的なサイズ分布を示す図である：Ｓ１：Ｂｕｃｃａｌ  Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅ  Ｇｅｎｅキット（Ｑｉａｇｅｎ社）；Ｓ２：Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅ  Ｇｅｎｅキット（Ｑｉａｇｅｎ社）；Ｓ３：Ｅａｓｙ  ＤＮＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）。相対サイズ分布は、パルス・フィールド・ゲル電気泳動法（ｐｕｌｓｅｄ  ｆｉｅｌｄ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＰＦＧＥ、図の左側のパネル）を用いてアッセイされ、その間にナノチャネルアレイ内を貫流させてイメージングした同一ＤＮＡサンプルについてのサイズヒストグラムが生成され（図の中央パネル）、１００Ｋｂｐ（塩基対）未満のＤＮＡ質量に対する比率として長さが１００Ｋｂｐより長いＤＮＡ質量の定量は右側のパネルに提供されている。
【図４】図４（上方パネル）は、ＵＶ損傷を受け、その後にベント（エキソ−）ポリメラーゼおよび蛍光ヌクレオチドと併せてＤＮＡ修復酵素であるエンドヌクレアーゼｌＶおよびＴ４エンドヌクレアーゼＶに曝露させられたフォスミドＤＮＡについてのサイズヒストグラムであり、下方のパネルはＵＶＣ（紫外線Ｃ波）曝露の関数としてのフォスミドＤＮＡの典型的な一本鎖切断密度を図示しているが、ＵＶＣ曝露は０〜５，０００Ｊ／ｍ２の範囲に及んだ。
【図５】図５は、ＵＶ損傷に曝露させられ、その後にベント（エキソ−）ポリメラーゼおよび蛍光ヌクレオチドと併せてＤＮＡ修復酵素であるエンドヌクレアーゼＩＶおよびＵＶ損傷エンドヌクレアーゼ（ＵＶ  ｄａｍａｇｅ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ：ＵＶＤＥ）と接触させられたフォスミドＤＮＡについての典型的なサイズヒストグラムである。
【図６】図６は、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）損傷を受け、その後にベント（エキソ−）ポリメラーゼおよび蛍光標識ヌクレオチドとともにＤＮＡ修復酵素であるエンドヌクレアーゼＩＶおよびエンドヌクレアーゼＩＩＩに曝露させられたフォスミドＤＮＡについての典型的なサイズヒストグラムであり、フォスミドＤＮＡのＨ２Ｏ２処理は、０〜２．５μＭの範囲に及んだ。
【図７】図７は、多孔性マトリックス内に細胞を配置する工程を含む代替のＤＮＡ損傷評価アッセイを示す図である。
【図８】図８は、０μＭ対５００μＭの過酸化水素に曝露させ、図７に図示した代替のセルベースのＤＮＡ損傷アッセイを使用して処理された３例ずつのヒト細胞サンプルからのデータを示す図である。図８Ａは、ヒトＢ細胞の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）処理後のヒトゲノムＤＮＡのサイズヒストグラムである。細胞をアガロース中に包埋して溶解させ、その後にアルカリ処理し、次にベント（エキソ−）ポリメラーゼおよび蛍光ヌクレオチドと併せてＤＮＡ修復酵素であるエンドヌクレアーゼＩＶに曝露させ、その次に細胞プラグのβ−アガラーゼ消化にかけた。図８Ｂは、平均分子長および平均標識密度（標識／１００ｋｂ）を示す図である。
【図９】図９は、ナノチャネルアレイ内の蛍光標識ＤＮＡの単一分子イメージング（Ａ）およびその後のデータ分析（Ｂ）を示す図であり、用量依存的に増加した標識密度およびＵＶＣ照射により処理したヒトゲノムＤＮＡについての低下した分子サイズを図示している。ナノチャネルアレイ内で分析したＵＶＣ処理サンプルをさらに図示したように分子サイズ比較のためにＰＦＧＥゲル（Ｃ）上でもまたランした。
【図１０】図１０は、ＤＮＡの酸化的損傷を検出するためのプロセシング経路を示す図である。
【図１１】図１１は、本開示によって処理されたＤＮＡからのデータの典型的マッピングを示す図である。
【図１２】図１２は、既存照明システムと本開示において使用した照明システムとの比較を示す図である。
【図１３】図１３は、ここに開示したシステムにおいて使用したオートフォーカスシステムの略図である。
【図１４】図１４は、本開示によるシステムの外観図および内部図である。
【図１５】図１５は、本開示によるシステムの内部図である。
【図１６】図１６は、本開示によるシステムの内部図である。
【図１７】図１７は、本開示による具体的なイメージングワークフローである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、本開示の一部を形成する添付の図面および実施例と結び付けて以下の詳細な説明を参照することでより容易に理解することができる。本発明は、本明細書に記載および／または図示した特定の器具、方法、用途、条件若しくはパラメータには限定されないと、および本明細書で使用する用語は一例としてのみ特定の実施形態を記載するためであり、本発明を限定することは意図されていないと理解されたい。さらに、添付の請求項を含む本明細書において使用するように、単数形の「１つの」や「その」は複数形を含み、特定の数値に関する言及は、状況が明らかに他のことを指示しない限り少なくとも該特定値を含んでいる。本明細書で使用する用語「複数」は、１つより多い数を意味する。ある範囲の数値が表示される場合、また別の実施形態は前記１つの特定値からおよび／または他の特定値までを含んでいる。同様に、数値が近似値として表示される場合は、先行詞「約」の使用によって、前記特定値は他の実施形態を形成すると理解できる。全ての範囲は包括的で組み合わせることができる。
【００２０】
明確にするために別個の実施形態の状況において本明細書に記載されている本発明の所定の特徴は、さらに単一実施形態において組み合わせて提供できると理解されたい。反対に、単一実施形態の状況において略して記載されている本発明の様々な特徴は、別個に、または任意の小結合においても提供することができる。さらに、範囲で規定された数値についての言及は、その範囲内のありとあらゆる数値を含んでいる。本出願に引用したありとあらゆる文献は、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２１】
第１態様では、本開示は、方法を提供する。これらの方法は、例えば、ポリヌクレオチド上に存在する可能性がある損傷の存在、タイプ、および程度を評価するために使用できる。
【００２２】
これらの方法は、適切にはポリヌクレオチド上の第１部位をポリメラーゼ伸長を支持できる第１部分へ転換させる工程と、前記第１部位またはその近位で第１標識を組み込めるように前記第１部分で伸長を実行する工程と、前記第１標識を含む前記ポリヌクレオチドの１つの部分を直鎖化する工程と、前記第１標識をイメージングする工程とを含んでいる。
【００２３】
直鎖化する工程は、多数の方法で実行することができる。１つの実施形態では、前記直鎖化する工程は、ナノチャネル内に前記第１標識を含む前記ポリヌクレオチドの１つの部分を限定することによって実行される。適切なナノチャネルは、現在は許可されていてこの参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第１０／４８４，２９３号に記載されている。ポリオリゴヌクレオチドを直鎖化するために使用されるナノチャネルは、適切には約２５０ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、約１５０ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、または約５０ｎｍ未満さえの溝幅を有する。ナノチャネルは、約２００ｎｍ未満、約１５０ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、または２ｎｍ未満さえの溝深さを有していてよい。ナノチャネルは、適切には１ｎｍ〜約２５０ｎｍの範囲内にある特徴的な寸法（深さ、幅、長さ）を有する。米国特許出願第１０／４８４，２９３号は、そのようなナノチャネルおよびナノチャネルアレイを製造する様々な方法について記載している。
【００２４】
これらのナノチャネルは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第１１／５３６，１７８号に記載されたように、全体または一部のいずれかが取り囲まれてよく、およびさらに一様または様々な深さを有していてよい。ナノチャネルは、さらに米国特許出願第１１／５３６，１７８号に記載されたように、ナノチャネル内に輸送されるポリヌクレオチドの通過を調節できるように柱、支柱、または他の障害物を含むことができる。ナノチャネルは、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの部分を含有するために十分な長さであってよく、前記ポリヌクレオチドの前記標識部分は適切には伸長させられる前記領域内にある。
【００２５】
ポリヌクレオチドの第１部位は適切には損傷部位であり、前記ポリヌクレオチド内の一本鎖切断、または前記ポリヌクレオチド内の二本鎖切断さえであってよい。ここに開示した方法のために適切な第１部位には、さらにシクロブタン−ピリミジン二量体、光分解生成物（例、６−４光分解生成物）、チミン二量体、酸化ピリミジン、脱塩期部位（例、アプリン部位、アピリミジン部位）もまた含まれる。上記の原子価異性体および上記のデュワー（Ｄｅｗａｒ）原子価異性体は、さらにこれらの部位のいずれかの組み合わせと同様に適切である。
【００２６】
第１部位の転換は、適切にはアプリミジン部位、アプリン部位、一本鎖切断（適切には伸長不可能）、またはこれらの一部の組み合わせを生じさせる。前記転換させる工程は、前記第１部位を、アプリン部位を加水分解する、アピリミジン部位を加水分解する、またはその両方を加水分解する酵素と接触させる工程によって実行できる。前記接触させる工程は、前記第１部位をＮ−グリコシラーゼ、アルカリ性物質、またはその両方とさえ接触させる工程によって実施できる。
【００２７】
エンドヌクレアーゼＩＩＩ、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、紫外線ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、ホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼなどを含む様々な化合物をＮ−グリコシラーゼとして使用できる。転換を実行するためには、化合物の組み合わせを使用できる。
【００２８】
１つの実施形態では、第１部位は脱塩基部位であってよく、該脱塩基部位はアルカリ性物質と接触させられる。様々なアルカリ性物質（例、塩基溶液）を使用できる。アルカリ性物質は、次に適切には前記脱塩基部位を一本鎖切断へ転換させる。ここに開示した方法のこの態様は図７に図示したが、この図はアルカリ処理の適用によって脱塩基部位の一本鎖切断（「ＳＳＢ」）への転換を図示している。アルカリ処理は、さらに一本鎖切断を二本鎖切断へ転換させるためにも使用でき、その転換は二本鎖切断への転換を実行できるように前記一本鎖切断を前記アルカリ溶液と接触させる工程によって実行される。
【００２９】
ユーザは、さらに脱塩基（アピリミジン／アプリン）部位、若しくは一本鎖切断（適切には伸長不可能）、またはその両方をアプリン／アピリミジンリアーゼ（ｌｙｓａｓｅ）、ホスホジエステラーゼ、またはそれらの任意の組み合わせと接触させることができる。エンドヌクレアーゼＩＶは、この目的にとって特に適切なリアーゼ（ｌｙｓａｓｅ）であると考えられるが、ＡＰエンドヌクレアーゼクラスＩ、エンドデオキシリボヌクレアーゼ（アプリン若しくはアピリミジン）、デオキシリボヌクレアーゼ（アプリン若しくはアピリミジン）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エンドヌクレアーゼＩＩＩ、ファージ−Ｔ４  ＵＶエンドヌクレアーゼ、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）ＵＶエンドヌクレアーゼ、ＡＰ部位−ＤＮＡ  ５’−ホスホモノエステル−リアーゼ、およびＸ線エンドヌクレアーゼＩＩＩを含む（しかしこれらに限定されるものではない）他のいわゆるＡＰリアーゼ（ｌｙｓａｓｅ）もまた使用できる。
【００３０】
上述したように、ポリヌクレオチドの特徴は、前記特徴の標識組み込み可能な部位への転換によって標識することができる。そのような実施形態では、これは塩基を標識組み込み可能な化学構造へ転換させるためにＮ−グリコシラーゼを使用することによって実施できる。この転換は、Ｎ−グリコシラーゼをポリヌクレオチドとともにインキュベートする工程によって実行できる。これは順に、損傷ＤＮＡ塩基の脱塩基（すなわち、アプリン／アピリミジン）部位への転換を生じさせる。この転換は、ヌクレオチドの糖と塩基との間のＮ−グリコシル結合の切断によって発生することができる。脱塩基エンドヌクレアーゼは、次に前記脱塩基部位をポリメラーゼ伸長可能な部位へ転換させるために適用できる。その後のＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光デオキシヌクレオチドの適用は、次にＤＮＡ損傷部位での蛍光標識の組み込みを生じさせる。
【００３１】
ユーザは、酸化プリン損傷を標識できる。これは、酸化プリンを脱塩基部位へ転換されるようにホルムアミドピリミジン［ｆａｐｙ］−ＤＮＡグリコシラーゼ（ｆｏｒｍａｍｉｄｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ［ｆａｐｙ］−ＤＮＡ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ：ＦＰＧ）の適用によって実施できる。ユーザは、次に前記脱塩基部位をポリメラーゼ伸長可能な部位へ転換させるために脱塩基（つまり、アプリン／アピリミジン）エンドヌクレアーゼまたは他の脱塩基エンドヌクレアーゼを適用できる。ユーザは、次にＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光ヌクレオチド（またはデオキシヌクレオチド）を適用することができ、これは順に最初のＤＮＡ酸化的損傷の部位を蛍光標識する。
【００３２】
酸化ピリミジン損傷もまた標識することができる。これは、酸化ピリミジンを脱塩基部位へ転換されるように、適切にはエンドヌクレアーゼＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、またはその両方の適用によって実施される。ユーザは、次に前記脱塩基部位をポリメラーゼ伸長可能な部位へ転換されるように脱塩基（つまり、アプリン／アピリミジン）エンドヌクレアーゼを適用できる。前記部位は、次に蛍光デオキシヌクレオチドとともにＤＮＡポリメラーゼの適用によって標識できる。
【００３３】
一本鎖切断および脱塩基部位もまた標識できる。これは、伸長不可能な一本鎖切断および脱塩基部位をポリメラーゼ伸長可能な部位へ脱塩基エンドヌクレアーゼを使用することによって実施される。ユーザは、次に前記ポリメラーゼ伸長可能な部位を標識するためにＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光（さもなければ標識された）デオキシヌクレオチドを適用することができる。
【００３４】
ポリヌクレオチドの伸長は、適切には前記ポリヌクレオチドをポリメラーゼおよび前記第１標識を含むヌクレオチド（デオキシヌクレオチドを含む）と接触させる工程によって実施される。標識は、蛍光体、放射性粒子などであってよい。この標識する工程は、蛍光プローブを前記オリゴヌクレオチドの１つの区分または特徴に結合させる工程によって実施できる。前記プローブは、前記オリゴヌクレオチドの１つの部分に相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）である部分を含むことができ、ユーザは、前記オリゴヌクレオチドの前記相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）部分を露出させるように行動することができる。標識は、前記ヌクレオチドへ必ずしも直接的に付着させられる必要はないが、それは前記ヌクレオチド自体が、次に前記標識、または何らかの他の、前記蛍光体に結合している相補的部分に結合する部分を含む可能性があるためである。
【００３５】
第１部分は、適切にはポリメラーゼ伸長を支持できる部分、例えば３’−ＯＨ構造である。この方法で、ユーザは、前記第１部分の部位またはその近くで（および伸長によって、該部位が順に前記ポリヌクレオチド損傷若しくは傷害の場所に対応する前記第１部位またはその近くで）前記標識を組み込めるように前記ポリメラーゼおよび標識ヌクレオチドを適用することができる。標識は、損傷部位、または前記損傷部位から１、５、１０、１５、２０、５０、または１００塩基内でさえあってよい。
【００３６】
ユーザは次に、本明細書に記載したように、標識を含むポリヌクレオチドの１つの部分を直鎖化して前記標識をイメージングまたはさもなければ可視化することができる。これは本明細書の他の場所に記載したように、ナノチャネル内の前記ポリヌクレオチドを直鎖化する工程によって実施できる。前記直鎖化する工程は、前記ポリヌクレオチドの１つの部分（例、末端）を基質に付着させ、次に前記ポリヌクレオチドの１つの部分を勾配力（例、電気勾配）の適用によって、または液滴の前進する空気／流体正面の作用によって前記ポリヌクレオチドを伸長させられるようにその中に前記ポリヌクレオチドが懸濁している流体を蒸発させる工程によってさえ伸長させることにより実施することができる。
【００３７】
標識されて伸長させられたポリヌクレオチドは、適切には例えばナノチャネル内で直鎖化形でイメージングされる。このイメージングする工程は、ユーザに前記ポリヌクレオチド上に配置された任意の標識の位置特定を可能にさせる。イメージングする工程は、さらに特定標識が前記ポリオリゴヌクレオチド上に存在するかしないかをユーザが決定することを可能にさせる。例えば、ユーザは、５６０ｎｍの波長で前記ポリオリゴヌクレオチドに蛍光を発光するプローブを導入できるが、このとき前記プローブは特定塩基配列に対して相補的である。前記プローブが前記イメージング工程で検出されない場合、ユーザは次に前記プローブについての特定捕捉配列が前記ポリオリゴヌクレオチド上に存在しなかったと理解する。
【００３８】
ユーザは、例えばポリヌクレオチド上の少なくとも１つの標識の前記位置を特定する、前記ポリヌクレオチド上の２若しくはそれ以上の標識の相対位置を決定する、ある長さの前記ポリヌクレオチド内の標識の数を計算する、または前記ポリヌクレオチドを含有するサンプル中に存在する標識の数を決定するなど、適切にも前記ポリヌクレオチドの少なくとも１つの構造的特徴を特徴付けることができる。
【００３９】
ユーザはさらに、第１標識の存在若しくは位置を前記ポリヌクレオチドの構造的特徴に関連付ける、または２若しくはそれ以上の標識の存在若しくは位置を前記ポリヌクレオチドの構造的特徴に関連付けることさえできる。１つの例として、ユーザは、ここに開示した方法にしたがってポリヌクレオチドを処理することができる。標識の存在の検出は、ユーザに、試験下のポリヌクレオチドが何らかの損傷を含有することを指示する。前記ポリヌクレオチドのより大きな状況内での標識の位置特定は、ユーザに、前記損傷が前記ポリヌクレオチド内の特定位置で発生していることを指示することになる。例えば、ユーザは、標識が特定遺伝子に対応する前記ポリヌクレオチドの１つの領域内に存在すると決定することができ、これは順に対象が特定遺伝子を表示する能力が損傷若しくは変化している可能性があることを示唆する。
【００４０】
ユーザはさらに、複数の標識の存在が複数の位置での損傷を示唆していると決定できる。ユーザは、相違する標識（例えば、その分子が順に相互から構造に関して、またはそれらの励起および／または発光波長に関してさえ異なる第１および第２蛍光体）を使用できる。この方法で、ユーザは、異なる位置へ異なる標識を（例えば、ポリメラーゼ／ヌクレオチドの一連の連続適用によって）適用し、その後にこれらの標識の存在について前記ポリヌクレオチドをアッセイすることができる。この方法で、ユーザは、ポリヌクレオチド上の複数の部位に損傷があることを決定できる。
【００４１】
ユーザは、一組の観察されたデータ値を得るために前記ポリヌクレオチドを含む各標識特徴を分析できるように前記ナノチャネル内のイメージングされたポリオリゴヌクレオチドに基づいてデータセットを構築できる。この情報は、前記ポリオリゴヌクレオチド上の標識の存在、標識間の間隔、標識の配列などに関する情報を含むことができる。ユーザは、次にこの観察されたデータ値セットに基づいて前記ポリヌクレオチドを特徴付けることができる。１つの例として、ユーザは、「正常」個体において離れている所定間隔である標識間の間隔が前記個体がそれらの２つの標識についての位置間のそれらの遺伝子内の突然変異を有することを示唆することを決定できる。ユーザは、特定標識の存在（前記標識の非存在とは対照的に）が突然変異の存在を示すこともまた決定できる。
【００４２】
様々な標識を使用すると、様々な種類の損傷の存在を示すことができる。例えば、図２に示したように、ユーザは、ＵＶおよび酸化誘発性損傷の存在についてポリヌクレオチドを試験することができる。ユーザは、ＵＶ損傷部位のプロセシング中に第１標識および酸化的損傷部位のプロセシング中に第２標識（前記第１標識とは励起および／または発光特徴が異なる）を組み込むことができる。両方の標識の存在についてアッセイすることによって、ユーザは、前記ポリヌクレオチド上のＵＶおよび酸化的損傷部位の存在および位置を決定することができる。
【００４３】
一部の実施形態では、方法の少なくとも一部（例、第１部位の転換、伸長を支持するために使用される部分の作成）は、前記ポリヌクレオチドが多孔性マトリックス、例えばアガロース若しくはポリアクリルアミド内に存在する間に実施される。例えば、前記ポリヌクレオチドは、多孔性マトリックス内に自然に配置される細胞内に存在する可能性がある。細胞は溶解させることができ、依然として前記マトリックス内に存在する前記ポリヌクレオチドは、ここに開示した方法にしたがって処理することができる。または、前記ポリヌクレオチドは細胞から（例、溶解させることによって）回収し、次に前記多孔性マトリックス内に配置することができる。前記多孔性マトリックス内の前記ポリヌクレオチドをプロセシングすることによって、ユーザは増幅および他の方法に関連する流体操作工程を回避することができ、その流体操作工程は分析下の前記ポリヌクレオチドを損傷させる可能性がある剪断力を導入することがある。ユーザは、ここに開示した方法の一部としてポリヌクレオチドを（制限酵素を使用して）消化することができる。
【００４４】
ユーザがマトリックスを使用する実施形態では、ユーザは前記ポリヌクレオチドの少なくとも一部を前記マトリックスへ付着させることができるが、これは要件ではない。これは、ビオチン−アビジン対合によって、受容体−リガンド反応によって、抗体−抗原反応などによって実行できる。
【００４５】
標識をイメージングする工程は、前記標識を照明する工程によって実施できる。蛍光体標識の場合には、ユーザは、蛍光体の励起波長を有する照明により前記標識を照明し、その後に前記標識から反射された照明を画像収集装置、例えばＣＣＤ（ｃｈａｒｇｅ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｄｅｖｉｃｅ）またはＣＭＯＳ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｍｅｔａｌ−ｏｘｉｄｅ  ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）機器を用いて収集する工程によって前記標識をイメージングすることができる。
【００４６】
本開示は、システムをさらに提供する。これらのシステムは、適切には１ｎｍ〜約２５０ｎｍの範囲内の特徴的寸法を有する１若しくはそれ以上のナノチャネルを含む流体チップを受け入れるために構成されたサンプルステージと、前記流体チップ内に配置されたサンプルを照明するために構成された照明光源と、前記流体チップ内に配置された照明されたサンプルの画像を収集するために構成された画像収集装置とを含んでいる。
【００４７】
一部の実施形態では、本システムは、流体チップ内に配置されたサンプルから反射された照明の第１ビームを検出できる検出器を含んでいる。そのような検出器は、ＣＣＤカメラ、焦点面アレイ、ＣＭＯＳ機器、フォトダイオード、フォトダイオードアレイ、位置感知機器、ＥＭＣＣＤｓ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｙｉｎｇ  Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、ＣＣＤｓ、ＰＭＴｓ（ｐｈｏｔｏ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ  ｔｕｂｅｓ）、アバランシェフォトダイオードなどであってよい。１つの典型的な配列は図１３に示されており、この図は照明が照明光源からサンプルに送達され、前記サンプルから反射され、画像収集装置によって収集される典型的なオートフォーカスシステムを図示している。サンプルの位置は、順に前記画像収集装置上の反射された照明の位置に応答して調整することができる。典型的なシステムは、２０１０年５月１８日付で出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３５２５３号、「Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｓｐａｔｉａｌ  Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｒｅｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ」に記載されており、前記出願はこの参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本システムは、流体チップ内に配置されたサンプルから反射された照明の第１および第２ビームの位置を検出できる検出器を含むことができる。そのような実施形態では、本システムは照明の２若しくはそれ以上のビームを前記サンプルに適用する。
【００４８】
ステージ若しくは流体チップの位置は、前記流体チップ内に配置されたサンプルから反射された照明の第１ビームの位置に応答して前記ステージを平行移動させるために構成されているコントローラによって調節することができる。上述したように、前記チップは前記サンプルから前記画像収集装置に反射された照明の位置に応答して平行移動させることができる。コントローラは、前記流体チップ内に配置されたサンプルから反射された照明の第１および第２ビームのうちの少なくとも１つの第１および第２位置間の間隔を入力として使用できる。
【００４９】
本開示によるシステムは、１若しくはそれ以上の光学フィルタを含むことができる。そのようなフィルタは、適所にあるフィルタを変化させることのできるフィルタホイールまたは他の器具中に存在してよい。これらのフィルタは、適切には前記フィルタを前記流体チップ内に配置されたサンプルに提供される照明の波長を変化させるため、または前記サンプルから反射された照明をフィルタリングするために使用できるように、照明光源とサンプルとの間の照明経路内に配置される。
【００５０】
システムは、１、２若しくはそれ以上さえの照明光源を含むことができる。前記照明光源は、レーザ、ＬＥＤｓ（ｌｉｇｈｔ  ｅｍｉｔｔｉｎｇ  ｄｉｏｄｅｓ）、白熱電球、紫外光源などであってよい。システムは、様々な波長の照明を提供するために構成されている２つ（若しくはそれ以上）の照明光源を含むことができる。そのような様々な照明光源を使用することによって、または照明フィルタを使用することによって、ユーザは、サンプルに複数の波長の照明を提供することができ、これは順に様々な励起波長を有する標識を励起する能力を提供する。
【００５１】
システムは、照明光源とサンプルとの間の照明経路内に配置されたビームエクスパンダもまた含むことができる。ケプラー式（Ｋｅｐｌｅｒｉａｎ）ビームエクスパンダ、ガリレイ式（Ｇａｌｉｌｅａｎ）ビームエクスパンダなどは、この目的に全てが適合する。適切な光学部品は、例えばＴｈｏｒｌａｂｓ社（ｗｗｗ．ｔｈｏｒｌａｂｓ．ｃｏｍ）およびＮｅｗｐｏｒｔ社（ｗｗｗ．ｎｅｗｐｏｒｔ．ｃｏｍ）から購入することができる。ビームエクスパンダは、視野全体にわたって励起光線を拡散させるように作用する。ビームの拡大は、視野内の蛍光体の一様な励起を可能にする均一な照明を提供する。
【００５２】
本システムは、流体チップのナノチャネル内へ、またはナノチャネル内で流体サンプルを動かすために構成されている電場源または他の（例、圧力）場源を含むことができる。そのような場は、静的場または変動場であってよい。本システムは、前記場をユーザの要請で、または流体チップが前記システム内に配置されると前記システムが前記場を印加するように自動的に適用するように構成できる。
【００５３】
流体チップは、その上に配置された１若しくはそれ以上の表示を含むことができる。そのような表示は、バーコード、イメージ、英数文字列などであってよい。前記チップは、さらにそれ自体がチップの形状である表示もまた含むことができ、例えば、チップの指標は、曲線、ペグ、スロット、または前記チップ内若しくはチップ上に形成された他の突起であってよい。本システムは、リーダ、または流体チップ上に配置された１若しくはそれ以上の表示に一致して本システムを構成するために適合する他の器具を含むことができる。例えば、チップは、前記チップがＵＶ損傷の存在について評価されなければならないサンプルまたはＵＶ損傷を評価するために既に処理されているサンプルを含有することを示す特定の指標または表示を含むことができる。本システムは、順に、例えば以前のプロセシング中に前記ポリヌクレオチドサンプル内に組み込まれた蛍光体標識の励起波長に対応する波長の照明を提供できるように、前記チップ上の表示に応答して自己設定することができる。
【００５４】
ここに開示したシステムは、様々な要素を含むことができる。以下ではこれらの要素の典型的実施形態についての説明を提供する。
【００５５】
複数の照明光源
本システムは、様々な波長の複数の照明（例、レーザ）光源を含むことができる。各光源は、順に様々なスペクトル特徴を備える蛍光色素を蛍光的に励起することができる。レーザは、ダイオード励起の固体レーザおよびダイオードレーザを含む、同一または異なるタイプのレーザであってよい。典型的な波長は、ＵＶから赤外線の範囲にわたる。非レーザ光源、例えばランプおよびＬＥＤｓもまた蛍光イメージングのための励起光源として使用できる。複数の波長を使用すると、蛍光を発光する、またはさもなければ相違する波長で相互から視認できる標識またはタグを照明することができる。例えば、３００ｎｍまたは５００ｎｍでの放射線の適用はユーザにそれらの波長の内の１つで蛍光を発光するプローブ（もしあれば）の位置を特定することを可能にする。この方法で、ユーザは、特定プローブ（例、アデノシド塩基に付着したプローブ）が前記サンプル上または特定の位置にさえ存在するかしないかを迅速に決定するためにサンプルへ様々な波長を適用することができる。様々なプローブを様々な塩基に付着させることによって、ユーザは次に、サンプルを照明して前記ユーザがサンプル内に組み込もうとした特定塩基の位置（若しくは不在）を適切に決定することができる。
【００５６】
図９は、ナノチャネルアレイ内の蛍光標識ＤＮＡの単一分子イメージング（Ａ）およびその後のデータ分析（Ｂ）を図示している。これらは、ＵＶＣ照射により照射されたヒトゲノムＤＮＡについての用量依存的に増加した標識密度および減少した分子サイズを明示している。ナノチャネルアレイ内で分析したＵＶＣ処理サンプルをさらに分子サイズ比較のためにＰＦＧＥゲル（Ｃ）上でもまたランしたが、図示したように、該図は用量依存性サイジングデータを図示している。
【００５７】
ビーム成形および高倍率
ナノチャネルアレイの広範囲の照明を達成するために、本システムは、レーザビームの直径を拡大して視野をより均一に照明するためにビーム拡大光学機器をさらに含むことができる。ケプラー式およびガリレイ式ビームエクスパンダのどちらも使用できる。典型的な拡大率は、１×〜３０×の範囲に及ぶ。必要に応じて、高レーザ強度を必要とする用途のためには、ビーム走査光学機器を組み込むことができる。ビーム走査は、走査ミラー、マイクロミラーまたは当業者には公知の他のビーム偏向システムによって実施できる。
【００５８】
広範囲落射照明
ここに開示したシステムの一部の実施形態のまた別の特徴は、蛍光単一分子を連続してイメージングするための広範囲落射照明の使用である。多数の単一分子イメージング用途では、イメージングのために内部全反射（ｔｏｔａｌ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ：ＴＩＲＦ）スキームが使用される。そのようなスキームでは、入射励起光線は前記サンプル領域内に前記光線のほんの一部分だけが浸透することを許容する角度で前記イメージング平面に衝突する。
【００５９】
ＴＩＲＦアプローチの結果は、前記イメージング平面に遠位（１００ｎｍより遠く離れている）である物質（典型的には液体であるが、全ての場合ではない）が励起されないので、このためバックグラウンドシグナルの一因とならないことである。
【００６０】
ＴＩＲＦシステムは、複雑で正確に整列させることが困難である。これとは対照的に、落射照明システムは、励起光の入射角に左右されないため、その結果としてより容易に調整でき、より安定性である。ここに開示したシステムは、ナノチャネルアレイの固有の性質のためにこのアプローチを利用する。ナノチャネルアレイは、分子および試薬を１００ｎｍ若しくはそれ以下の深さに限定するので、ＴＩＲＦ照明の必要が排除される。オートフォーカスシステムと併用すると、本システムは、複雑またはかさの高い振動減衰装置を必要とせずに高速単一分子検出を確実に実行できる安定性光学システムを有している。これは、単一分子検出を実施する場合に落射照明を使用する重要な利点であり、ナノチャネルアレイ技術によって可能になる。落射照明システムはユーザがサンプルを照射して同一側から検出することを可能にするが、これは前記検出器に進入する励起光の量を減少させるために役立つ。
【００６１】
典型的な照明スキームは、図１２に図示されている。図の上方パネルに図示したように、ＴＩＲＦシステムでは、エバネッセント場内の物体だけが励起される。これは順に、励起されるようになるエバネッセント場からはるかに遠い他の物体からのバックグラウンドシグナルを減少させる。
【００６２】
しかしここに開示したシステムは、標準広範囲照射を利用できる。蛍光物体（例、ポリヌクレオチドに付着させた蛍光標識）はチップまたはステージの表面近くに拘束されるために、分析下の特定分子の近傍にある他のサンプル物質からの極めてわずかなバックグラウンドシグナルしか生じない。図の下方パネルに図示したように（この図は、ポリヌクレオチドサンプルを含有するナノチャネルアレイの正面図である）、ナノチャネルはチップまたはステージの表面近くにサンプルポリオリゴヌクレオチドを拘束するように作動する。このチャネルは、それらが単一ポリヌクレオチドを収容するような寸法にできる。
【００６３】
オートフォーカスシステム
オートフォーカスシステムは、イメージングレンズとサンプル表面との間隔を監視するための多位置センサと結合された別個の赤外線レーザを使用できる。本システムは、本システムの全ての他の部品から自律的にランし、一次フォーカシング（つまり、正確な焦点位置を見つける）を実施して、いったん見いだした焦点位置を追跡することができる。本システムは、１００Ｈｚの周波数では１０ｎｍの精度で補正できるが、１００ｎｍ、または１０００若しくは５０００ｎｍさえの精度が適切であるので、そのような精度は要件ではない。１００Ｈｚ未満（例えば、５０Ｈｚ、２０Ｈｚ、１０Ｈｚ、または５若しくは１Ｈｚさえ）の周波数が適切である。そのような精度調整は、主イメージングレンズの動作を正確にコントロールする圧電駆動部を使用して達成される。本オートフォーカスシステムは、ナノチャネルアレイとともに作動するように適応させることができる。前記アレイの特定形状は、オートフォーカスユニットによって対応されなければならない光学的応答を生じさせる。１００ｎｍ未満の特徴は珍しくない。各視野の明確な焦点は、１、１０、２０、５０、または１００フレーム／秒の捕捉率でイメージングしながら対物レンズの上方で前記アレイを動的に移動させることによって維持することができる。本オートフォーカスシステムは、サンプルの信頼できる堅固なイメージングおよび画像分析を可能にする。典型的なシステムは、２０１０年５月１８日付で出願され、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３５２５３号、「Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｓｐａｔｉａｌ  Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｒｅｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ」に規定されている。
【００６４】
適切なオートフォーカスシステムの略図は、図１３に図示されている。その図に図示したように、サンプルは平行光線（例、レーザ）によって照明され、これは次にサンプルから反射し、放射線検出器（例、ＣＣＤまたはＣＭＯＳ器具）によって収集される。本システムは、次に前記検出器上の反射されたビームの位置を光学焦点に対応するビームの位置と比較することができ、次に反射されたビームが光学焦点に対応する検出器上の位置上に存在するように合わせて前記サンプルステージを移動させることができる。
【００６５】
多色蛍光検出
本システムは、様々な波長の蛍光シグナルを検出するために設計されている。多位置高速フィルタホイールは、多重化を可能にする複数（例、１０）の蛍光色の識別を可能にする。有機蛍光体、量子ドット、デンドリマー、蛍光ビーズ、および金属ドットを含む多数の様々な蛍光部分を使用できる。本システムは、単一蛍光体レベルでの感度を送達できる。最適構造は、蛍光部分の性質およびアッセイの要件に左右されることになる。これはユーザが、一部の実施形態では、サンプル中に存在する単一標識（例、塩基に結合した蛍光体）の存在を検出することを可能にする。
【００６６】
高感度カメラ
本システムは、個別蛍光分子の画像を記録するためのカメラもまた含むことができる。蛍光染色および染料の全発光スペクトルをカバーする高量子効率を備える電子増倍ＣＣＤカメラが特に適切であると考えられる。だが他のタイプのカメラおよび検出器具もまた性能および効率の弱点に適応させることができる。カメラは、さらに熱の衝撃を最小限に抑えて電子雑音を最小限に抑えるために室温より低い温度に冷却されてもよい。カメラを冷却するためには、約−２０℃〜約−１００℃の温度を使用できる。蛍光感度に関する要求が少ない用途のためには、電子増倍能力を備えない検出器が適切である。これらには、従来型ＣＣＤｓ、ＣＭＯＳ検出器、光電子増倍管、およびフォトダイオードが含まれる。本システムは、光子計数能力を含むことができ、その能力は所定の単一分子分析用途のために有用である。そのような適切な器具の供給業者には、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃａｓｃａｄｅ社、浜松ホトニクス（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）ＩｍａｇＥＭ社、Ａｎｄｏｒ  ｉＸｏｎ社、およびＮｅｏ  ＳＣＭＯＳ社が含まれる。
【００６７】
ステージ
本システムは、適切には１つの視野から次の視野へ移動する場合に１００ｎｍ未満の精度が可能なＸＹステージを含むが、数十ｎｍ、数百ｎｍ、または数千ｎｍさえの範囲内の精度が適切である。本ステージは、ナノチャネル・アレイ・チップに適応させることができる。データ収集中、本ステージ（一部の実施形態では）は、その間にナノチャネルアレイが部分的または全体的にイメージングされるラスタ走査ルーチンを実行する。ナノチャネルのアレイ全体を扱えるように複数の画像を収集できる。これらの画像は、次にアレイ全体の複合図を生成するためにとじ合わされる。ステージの精度は、画像のとじ合わせを可能にする。とじ合わされた画像は、単一視野、つまりＤＮＡの１ＭＢフラグメントより大きな生体分子の検出を可能にする。典型的な画像は図１１に図示されており、この図はポリヌクレオチドの様々な領域上の様々な標識の存在の視覚表示を示している。様々なポリヌクレオチドセグメントは、例えば前記ポリヌクレオチドの消化生成物であってよい。各セグメントは次に、様々なタイプの損傷に対応する標識の存在または非存在について処理されたセグメントを調査することによって様々なタイプの損傷の存在または非存在について評価することができる。ユーザは、次に様々なセグメントをポリヌクレオチド全体の凝集マップに組み立てることができ、このマップは、前記ポリヌクレオチドが経験している可能性のある様々なタイプの損傷の位置を含んでいる。
【００６８】
図１１は、ここに開示したシステムおよび方法の用途を図示している典型的なスクリーンショットである。この図では、左上隅の２つのファイル・フォルダ・アイコン１１０１は、ユーザが様々なファイル（例、参照ファイルまたはサンプル・データ・ファイル）を選択してアップロードすることを可能にする。「Ｍａｐ」ボタン１１０４の隣の中央の３つの積層ウインドウ１１０３は、特定配列モチーフに結合する酵素、例えば切断酵素、制限エンドヌクレアーゼ、ホーミング酵素、メチルトランスフェラーゼ、または特定配列モチーフ自体さえ、例えばＣＴＣＣＡＧＣ若しくは他の配列を表している。
【００６９】
これらのボタンのすぐ下にある垂直のグレーのストライプを備える水平バー１１０５は、この領域のＧＣ含有量を反映して、ＧＣ含有量が高いほど濃く、よりＡＴリッチであるほど明るい理論的グレースケールバーコードを備える標的ゲノム領域（左上隅にあるアップロードされたファイル）の略図である。トグル領域１１０６（２本の太い垂直バーによって規定された）は、前記領域に沿ってスライドさせることができ、前記トグル内に囲い込まれた領域は下のウインドウに図示されている。ユーザは、分析対象のポリヌクレオチドに沿ってボタン１１１３をより前進または後進させるためにコントロールボタン１１１３もまた使用できる。ユーザは、大きなウインドウ１１１６に示して拡大されている領域を設定するために当該の特定塩基位置を入力することができる。
【００７０】
３本の水平線（１１０７、１１０８、および１１０９）はドット（有色ドットを含む）または他のアイコンを含むことができ、それらのドットまたはアイコンは、予測標識／切断部位が、上記のウインドウ内でこれらの個別酵素／配列モチーフから１つを選択しなければならない場合は、前記領域全体に分布していることを示している。これらの線１１０７、１１０８、および１１０９の下方には３つのボタン１１１０、１１１１、および１１１２があり、これら各々を使用すると、ユーザがサンプル上の標識密度を評価できるように、サンプル上の標識の数を表示することができる。例えば、ユーザがボタン１１１０をクリックしなければならない場合は、このウインドウはそのボタンに対応する標識が存在する場所を示している強調表示されたゲノム領域を表示することになる。そのような標識は、切断酵素Ｎｂ．ＮｂｖｃＩからの標識の結果を表示できる。また別のボタン（例、ボタン１１１１）をクリックすることによって、ユーザは、酵素ＢｓｐＱＩに由来する標識を可視化することができる。
【００７１】
積層セグメント１１１４は、標識サンプルの画像から生成された実際デジタル化データを表示している。本システムは、サンプルの様々なセグメントのシグネチャパターンをアライメントさせることができ、相互のアライメントと全体的または部分的にオーバーラップする。参照バー１１１５は、次にこの複合マッピング情報を示すことができる。または、これらの視覚的「ナノコンティング」は、ゲノム領域の真の構造的情報を反映するコンセンサス隣接位置シグネチャパターンを形成することができよう。これはさらに、アップロードする、または第１例と比較するための参照配列ファイルが存在しない点で、デノボ（ｄｅ  ｎｏｖｏ）シーケンシングの場合にはシーケンシングのための参照マップもまた提供することができる。
【００７２】
ユーザフレンドリーのコントロールソフトウエアとのタッチ・スクリーン・インターフェース
本システムは、グラフィカル・ユーザ・インタフェースを含むことができる。そのようなインターフェースは、ユーザのニーズに依存して、ＩＳＯ  １３４８５およびＦＤＡ  １２  ＣＦＲ  １１ガイドラインに準拠してよい。このインターフェースは、別個のユーザレベルでのログインを支持できる。グラフィック・ユーザ・インタフェースを使用すると、ユーザ相互作用を最小限に抑え、ラン・レシピ・セットアップを単純化することができる。抵抗膜方式タッチスクリーンを使用すると、ユーザの入力をラン・レシピ・セットアップ・パラメータに翻訳することができる。ランレシピおよび操作はユーザ定義可能であり、類似のランからの結果との容易な比較を可能にするために、特定の実験または用途に合わせて調整することができる。ランの結果はオンボードで分析できる、または別個のコンピュータワークステーション上でのアーカイブ分析若しくは詳細分析のためにデータをエクスポートできる。
【００７３】
ランタイムでの高スループット画像獲得のための特注マイクロコントローラ
スレーブとして機能する別個のマイクロコントローラは、高速画像取得のために必要なイベントを管理および同期化するために使用できる。コントローラは、レーザをカメラ露光と同期化するように作動することができ、画像取得直後にフィルタホイールおよびＸＹステージが応答することを保証する。マイクロコントローラは、ユーザによって実行可能なコマンドの配列に入力されたラン・レシピ・パラメータを解明する。これらのコマンドは、サンプル電圧負荷条件、レーザ配列順序、ならびにレーザパルス時間分、走査反復回数などを提供する。
【００７４】
特注コントロールソフトウエアを用いるオンボードコンピュータ
ソフトウエアアプリケーションはオンボードコンピュータ上でランすることができ、このアプリケーションは、マイクロコントローラスレーブにとってのマスタとして作動する。この特注ソフトウエアアプリケーションは、ユーザのランレシピ入力にデータ分析パラメータを加えたものを翻訳し、直接サブアッセンブリ部品が相互作用するためのパイプを提供する。このソフトウエアアプリケーションは、ユーザのニーズに依存して、ＩＳＯ  １３４８５およびＦＤＡ  ２１  ＣＦＲ  １１に適切に準拠してよい。
【００７５】
電極束と蒸発コントロール
一部の例では、ナノチャネル・サンプル・リザーバの蒸発は、ラン結果に強い影響を与えることがある。電極束を使用すると、サンプルリザーバの蒸発を軽減およびコントロールすることができる。
【００７６】
サンプルは、ナノチャネルへの分子装填を実行するためにランバッファとともにリザーバ内に装填することができる。電場を使用すると、サンプルが正または負の電位を有するので、サンプルを装填することができる。電場サンプル装填は、ユーザによってランレシピの一部として入力され、マイクロコントローラによってコントロールされる。電場装填パラメータは、装填されるサンプルの正味電荷によって指令され、正または負のいずれかに帯電していてよい。これらは、一部の場合には、０．１ＶＤＣ増分で最適化されるが、より微細な解像度を使用することができる。最適化は、サンプル正味電荷、サンプル長および分子構成の関数であり、ユーザは所望の各分子種に対して特定の電場装填パラメータを設定することができる。本システムは、本システム内の特定流体含有量を維持または達成できるように必要とされる場合は、追加のバッファまたは他の溶液を加えるように構成することができる。１つの実施形態では、電極は、流体チップをネスト化する、またはさもなければ前記流体チップと係合するテフロン（登録商標）ブロックによって支持される。このネスト化作用は、電極とチップレザーバとの間の密封を提供し、これは周囲の環境との相互作用を最小限に抑えるために役立つ。この方法で、環境への蒸発損失が最小限に抑えられる。電場は、サンプル入力および出力ウエル内に浸漬した電極によって印加できる。電圧は、適切には０．１秒〜数分間の範囲に及ぶ可能性がある一定時間にわたって０．１〜１００Ｖの範囲内で印加される。電圧を印加するためには標準オペアンプ（ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  ａｍｐｓ：Ｏｐ−Ａｍｐｓ）が使用され、マイクロコントローラによってコントロールされる。
【００７７】
非係留分子の単一分子イメージングのための広範囲照明
現行の単一分子イメージングアプローチは、単一分子感度を達成するためにＴＩＲＦに依存する。この構成では、励起光はある角度（ＴＩＲＦ角）で入射してイメージング平面の表面近くでエバネッセント電磁場を生じさせる。このエバネッセント場は、典型的には前記イメージング表面の１００ｎｍ上方に広がる。この場に曝露させられた蛍光部分は蛍光励起されるので、適切な蛍光検出器を使用して検出できる放射光を生成する。このエバネッセント場の範囲外の蛍光物体は、励起されないので、そこでバックグラウンド蛍光シグナルの一因とはならない。
【００７８】
しかしＴＩＲＦには、幾つかの不利点がある。第一に、光学機器はアラインメントに対して感受性である。入射光は正確な角度でサンプルに衝突しなければならず、さもなければエバネッセント場が生成されない。第二に、その中で物体を検出できる限定量は、熱拡散を介してイメージング表面から離れて前記物体が移動するのを防止するために前記表面に係留されることを必要とすることが多い。このことは、追加の化学的または物理的係留機構を必要とする。
【００７９】
ここに開示したシステムは、単一分子検出のために標準広視野イメージングの使用を許容するためにナノチャネルアレイとともに作動する。ナノチャネルアレイは、蛍光（または他の標識）部分をイメージング平面の近くに拘束するために使用される。このため、他の部分からのバックグラウンド蛍光が生じる可能性はほとんどない。これはＴＩＲＦイメージングの必要を取り除き、順により単純でより安定性の光学系を可能にする。さらに、分子はイメージング平面から拡散することが制限されるために、前記蛍光部分は前記表面に係留される必要がない。
【００８０】
ここに開示したシステムのまた別の特徴は、サンプルが本システム上でイメージングされるように、ナノチャネル器具およびアレイとともに作動できるオートフォーカスシステムの組み込みである。オートフォーカスシステムは、主励起レーザと共線の追加のレーザを使用する。これはこのサブシステムと主イメージング成分との統合を可能にする。さらに、本オートフォーカスシステムは、ここに開示したシステム上でイメージングされるナノチャネルアレイと連動するように特別に配列することができる。他のオートフォーカスシステムは一般に特色のないガラス基板と連動するように設計されていて、前記システム内の他の成分とは直接には一体化されない、または例えばナノチャネルアレイの表面のようなナノ構造表面に適応することができない。
【００８１】
高速自動作動
ここに開示したシステムは、単一分子感度を備える高速イメージングに適応することができる。フィルタホイール、カメラ、ＸＹステージおよびレーザは、１０、２０、３０、またはそれ以上のフレーム／秒でのイメージングを許容するように適切に選択および構成される。適切なステージは、例えば、Ａｅｒｏｔｅｃｈ社、Ｐｈｙｓｉｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅ社、およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ社から入手できる。適切なフィルタホイールは、例えば、Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ社、Ｆｉｎｇｅｒ  Ｌａｋｅｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ社、およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ社から入手できる。適切なレーザは、例えば、Ｃｏｂｏｌｔ  ＡＢ社、Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｌａｓｅｒ社、および他の光学装置の供給会社から購入できる。各個別機器の速度は、イメージングルーチン中の様々な作動を順序付けるマイクロコントローラによって協調させることができる。１つの実施形態では、１枚の画像を獲得するために、ＸＹステージはそのポイントで励起レーザが発射される関心視野へ移動し、カメラは画像獲得のためにセットされる。ナノチャネルアレイ全体がイメージングされるまで、このラスタタイプのシーケンスが繰り返される。
【００８２】
イメージング速度は、次に電極束によって可能になる自動装填シーケンスと結合される。関心サンプルにとって適切な電圧（例えば、−３０Ｖ〜＋３０Ｖ）を使用して、サンプルはイメージングの準備においてアレイ内に装填される。この装填シーケンスは、次に各画像走査後に繰り返すことができ、次々に高速データ収集を可能にする。１つの実施例として、二本鎖ＤＮＡを使用した場合は、イメージングされるＤＮＡの１分当たり１Ｇｂｐまでを表すデータ獲得速度を達成できる。イベントの自動化および自律的順序付けは、最小限のユーザ介入および最小限の保守しか必要としない取扱が容易なプラットフォームを提供する。本システムは、さらにナノチャネルアレイの自動装填およびサンプルの自動分注にも適応する。これはロボットシステムとの統合を許容し、さらに分析のスループットおよび全般的速度をさらに改善する。
【００８３】
適応させられた様々なサンプル
本システムは、広範囲のサンプルタイプに適応させることができるという意味においてオープンプラットフォームとしても設計される。適切なサンプルには、生物学的サンプル、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、バイオポリマー、およびそのような種を含む他の複合体が含まれる。他の高分子、例えばポリマー、デンドリマー、オリゴマーなどもまた分析できる。サンプル分析が特定の環境条件、例えば加熱または冷却を必要とする可能性がある場合は、そのような要件もまた前記サンプルタイプおよび特定要件に適応させることができるが、それは加熱器、冷却器、および流体／気体源もまたここに開示したシステム内に組み込めるからである。
【００８４】
典型的なシステムは、図１４に図示されている。図１４（上方パネル）は、本システムの外観図を示しており、その外観図は（様々なシステムモジュールおよびユニットを取り囲む）キャビネットおよび本システムへのユーザ入力を提供し、さらに本システムによって集められるデータを表示するために使用できるタッチ・スクリーン・コントローラを含んでいる。
【００８５】
図１４の下方パネルは、典型的システムの内部図を示している。図１４に示されたように、本システムはサンプルステージを含むことができ、そのステージはナノチャネル支持チップまたは他の基板と係合する。本ステージは、サンプルから反射された照明に応答して可動性であってよい。本システムはバーコードリーダを含むことができ、そのリーダは流体チップ上に存在するバーコードまたは他の表示からの情報を読み取ることができ、その情報を使用すると本システムの１若しくはそれ以上の態様、例えば照明波長を構成することができる。本システムはさらに電場プローブアームを含むことができ、そのプローブアームを使用すると流体チップ内に配置されたサンプルを感知する、または前記サンプルへ電場を印加する（または前記サンプルを前記チップ内に引き込む）ことさえできる。サンプルへ照明を適用するためには１若しくはそれ以上のレーザを使用することができ、フィルタホールを使用すると適用または反射された照明をフィルタリングすることができる。カメラは、サンプルから反射または発光された照明を収集するために機能する。カードケージは、様々なプロセシングおよびコントロールユニットを含有する。
【００８６】
バーコードは、粘着ラベルによってチップに適用されてよい、または一部の場合には、流体チップ上に直接的に記載される。本システムがバーコードを読み取ると、例えば（ａ）前記チップが既に使用されているかどうかと、（ｂ）前記チップが特定アッセイを支持するために設計されているかどうかとを決定できる。
【００８７】
図１５は、典型的システムの成分の詳細図である。図の右上隅には、２つのレーザ（５２３ｎｍおよび４７３ｎｍ）が示されている。これらの波長は必須ではなく、ユーザは所望のレーザまたは他の照明器を使用できる。レーザからの照明はミラーおよびダイクロイックミラーの間を通過させられ、ビームエクスパンダを通過することができる。例示的な１４×ビームエクスパンダが示されているが、当然ながら他のビームエクスパンダを使用できる。ペリスコープミラーは、照明ビームをサンプルへ、またはサンプルから方向付けるために使用され、そのサンプルは対物レンズの上方に配置される。管状レンズを使用すると、この図の右下に示したＥＭＣＣＤカメラに向けて照明を届けることができる。
【００８８】
フィルタホイールおよびペリスコープミラーを使用すると、カメラに所定の波長だけを提供することができるので、そこでカメラは、イメージングする、可視化する、または様々な標識間を識別することさえが可能になる。フィルタホイールは、本システムの光学縦列内の１若しくはそれ以上のフィルタの迅速なポジショニングを可能にできるように電動化できる。１つの限定的な実施例として、フィルタホイールは、光学エンコーダを備えるステッパモータによって駆動される多位置ロータリホイールを含むことができる。典型的なフィルタは、蛍光照明の帯域、低域または高域フィルタリングのいずれかを提供する誘電体被覆ガラスを含むことになる。典型的な中心波長は、可視スペクトル（４００〜７００ｎｍ）内にあるが、この範囲に限定されるものではない。帯域フィルタの場合には、典型的帯域幅は３０〜６０ｎｍであるが、他の範囲であってもよい。
【００８９】
図１６は、図１５に示したシステムのまた別の図を提供する。図の右側には、５３２ｎｍレーザヘッドが示されている。このレーザヘッドは、（この図では）ＥＭＣＣＤカメラの背部にある。このカメラは、フィルタホイールと光通信している。
【００９０】
図１６の図では、対物レンズはこの図の左側に示されており、前記対物レンズはステージの上方にポジショニングされている。ステージは、適切には、サンプルをイメージングのために焦点内に配置できるようにｚ方向に可動性である。本明細書の他の場所で記載したように、ステージの移動はコントローラによって適切に調節され、そのコントローラはオートフォーカスシステムに基づいて前記ステージを作動させる。
【００９１】
図１６の左側に示したように、サンプルからオートフォーカスセンサへ反射される照明を方向付けるためにポジショニングされたオートフォーカス・ダイクロイック・ミラーが存在してよい。オートフォーカス成分において使用される照明は、オートフォーカスモジュール内に存在する赤外線（Ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ：ＩＲ）レーザユニットによって図示されるように、ＩＲ領域内にあってよい。ＩＲ照射は、他の波長を使用する照明もまた使用できるので、要件ではない。オートフォーカスプリズムは、照明をセンサ若しくは検出器へ、またはセンサ若しくは検出器から方向付けることができる。
【００９２】
オートフォーカスセンサ若しくは検出器上に反射された照明の位置に基づいて、本システムは、サンプルを最適焦点に配置するためにステージ（およびサンプル）を上下に移動させることができる。例えば２０１０年５月１８日付で出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３５２５３号、「Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｓｐａｔｉａｌ  Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｒｅｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ」（この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されたように、オートフォーカスシステムは、最適焦点でサンプルから反射された照明に対応する検出器上の参照スポットを記録することができ、次にその参照スポットで反射された照明を維持できるようにステージの位置を調整する。
【００９３】
例えば、ユーザおよびシステムは、サンプルが最適焦点にある場合に、ＩＲレーザから生成されて前記サンプルから反射されたＩＲのビームが位置ｘ１、ｙ１でオートフォーカス検出器に衝突することを決定できる。プロセッシング中にビームが位置ｘ２、ｙ２で前記検出器に衝突すると、本システムは、前記検出器上のビーム衝突位置をｘ１、ｙ１へ復帰させられるようにステージを上方または下方へ平行移動させることができる（または前記ステージを傾けることさえできる）。
【００９４】
図１６に示した図は、さらに照明されたサンプルからフィルタホイールおよびＥＭＣＣＤ器具へ照明を方向付けるために使用されるミラーおよび典型的管状レンズ（図の下方に示されている）もまた図示している。ペリスコープミラーの配置を使用すると、管状レンズからフィルタホイール領域およびＥＭＣＣＤカメラへ照明を方向付けることができる。
【００９５】
図１７は、本開示による作動の典型的順序を図示している。この図に示したように、ユーザはナノチャネルアレイ（例えば、カートリッジまたはチップの形状にある）をアナライザシステムに取り付けることによって開始できる。サンプルは、次にナノチャネル内へ（適切には流体形で）装填できる。電極束は、次に係合してサンプルをアレイ内に装填することができる。ポリヌクレオチドは帯電できる、または１若しくはそれ以上の荷電基を含むことができるので、電場の印加はサンプルをチャネル内に装填するように機能できる。本システムのイメージング成分は、本明細書に記載したオートフォーカス法、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３５２５３号に記載された方法、または当業者には公知の他の適切なオートフォーカス法を使用して、サンプル上に適切に焦点合わせされる。
【００９６】
照明光源（例、レーザ）は、次に１若しくはそれ以上の標識からの蛍光を生成するために使用され、前記蛍光は次に画像収集装置によって収集される。ステージ、照明光源、またはその両方は、次に前記ステージの様々な部分および様々なサンプルが照明されるように移動することができ、および本システムは次のサンプルからの情報を収集する。本システムは、所定のサンプルのいずれかまたは全視野をイメージングできる。
【００９７】
本開示は、他の方法であって、ポリメラーゼ伸長を支持できる第１部分を生じさせるようにポリヌクレオチド内の第１一本鎖切断をアルカリホスファターゼと接触させる工程と、標識を前記ポリオリゴヌクレオチド内に組み込めるように前記部分をポリメラーゼおよび標識ヌクレオチドと接触させる工程と、ナノチャネル内に前記第１標識を限定することによって前記ポリヌクレオチドの少なくとも１つの部分を直鎖化する工程と、前記第１標識をイメージングする工程とを含む方法を提供する。
【００９８】
様々なアルカリホスファターゼを使用できる。エビアルカリホスファターゼは、ここに開示した方法にとって特に適合すると考えられる。適切な直鎖化およびイメージング法は、本明細書の他の場所に記載されている。ユーザは、本開示において記載したように、さらに標識ヌクレオチド（または複数の標識ヌクレオチド）の存在または位置を前記ポリヌクレオチドの構造的特徴に関連付けることができる。
【００９９】
ここに開示した追加の方法には、前記伸長不可能な一本鎖切断をポリメラーゼ伸長可能な部位に転換されるようにポリヌクレオチド内の一本鎖切断へ３’から５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを適用する工程と、標識を前記ポリヌクレオチド内に組み込めるようにＤＮＡポリメラーゼおよび標識デオキシヌクレオチドを適用する工程とが含まれる。適切な標識は、本明細書の他の場所に記載されており、蛍光体（例、フルオレセイン、ＹＯＹＯ、テキサスレッドなど）が含まれる。この技術を使用すると、非ＯＨ−３’修飾を標識することができる。様々な蛍光体は、Ｆｉｓｈｅｒ社やＳｉｇｍａ社の化学薬品供給業者、ならびにＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社（ｗｗｗ．ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｏｂｅｓ．ｃｏｍ）から入手できる。ここに開示した方法のポリメラーゼは、適切には本質的に遊離ヌクレオチドまたは遊離デオキシヌクレオチドさえの非存在下で適用される。
【０１００】
本開示は、さらに追加の方法であって、脱塩基部位を有するポリヌクレオチドを多孔性マトリックス物質内に配置する工程と、前記脱塩基部位を前記ポリヌクレオチド内の一本鎖切断へ転換されるように、前記ポリヌクレオチド内の一本鎖切断を前記ポリヌクレオチド内の二本鎖切断に転換されるように、またはその両方のために前記ポリヌクレオチドをアルカリ性物質と接触させる工程と、前記ポリヌクレオチド内の一本鎖切断、前記ポリヌクレオチド内の二本鎖切断、またはその両方をポリメラーゼ伸長を支持できる部分に転換させる工程と、１若しくはそれ以上の標識を前記ポリヌクレオチド内に組み込めるように前記部分をポリメラーゼおよび標識ヌクレオチドと接触させる工程とをさらに含む方法を提供する。ユーザは、次に本明細書の他の場所に記載されたように、１若しくはそれ以上の標識をイメージングする、またはさもなければ位置特定若しくは検出することができる。
【０１０１】
その情報を用いると、ユーザは、１若しくはそれ以上の標識の存在または位置を本明細書の他の場所に記載したように、前記ポリヌクレオチドの構造的特徴にさらに関連付けることができる。ユーザは、さらにここに開示した方法またはシステムのいずれかにおいて、前記ポリヌクレオチドの構造的情報を損傷状態または疾患状態にさえさらに関連付けることができる。
【０１０２】
ポリヌクレオチドは、一部の実施形態では、細胞内に配置されてよい。細胞は、ポリヌクレオチドを遊離させられるように順に溶解させることができる。ユーザは、ポリヌクレオチドを増幅する、ポリヌクレオチドを消化する、または上記のいずれかを実施できる。細胞、ポリヌクレオチド、またはその両方は、多孔性マトリックス物質内に配置されてよい。ポリヌクレオチド内の一本鎖切断を転換させる工程は、前記一本鎖切断を３’ホスホジエステラーゼ活性を有するエンドヌクレアーゼと接触させる工程によって実施できる。
【０１０３】
ユーザは、ポリヌクレオチドを遊離させられるようにマトリックス物質を少なくとも部分的に分解することができる。ポリヌクレオチドは、それが多孔性マトリックス内に存在する間にプロセシングされてよい、またはポリヌクレオチドはマトリックスの外部でプロセッシングされてよい。本明細書の他の場所で記載したように、多孔性マトリックスの使用は、順にポリヌクレオチドを損傷させる可能性がある剪断力を発生させる流体取扱工程を減少させる、または排除することさえできる。同様に本明細書の他の場所で記載したように、ユーザは、１若しくはそれ以上の標識をイメージングして前記イメージングされた標識をポリヌクレオチドの構造的特徴に関連付けることができる。「イメージングする工程」は、分析下の前記ポリヌクレオチドの画像または他の描出がモニタまたはユーザが視認するための他の機器上に表示されることを必要としないと理解されたい。その代りに、用語「イメージングする工程」は、標識から反射または発光された照明を収集する工程を意味すると理解すべきである。その収集された照明についての詳細なプロセッシングは、ポリヌクレオチド上の適所でユーザが前記標識を視認することを可能にするビデオまたは他の画像の構築を含むことができる。
【０１０４】
本明細書で提供される他の方法は、ポリヌクレオチドを多孔性マトリックス物質内に配置する工程と、ポリヌクレオチド上の第１部位をポリメラーゼ伸長を支持できる第１部分へ転換させる工程と、前記第１部位またはその近位で第１標識を組み込めるように前記第１部分で伸長を実行する工程と、ナノチャネル内に前記第１標識を限定することにより前記ポリヌクレオチドの少なくとも１つの部分を直鎖化する工程と、前記第１標識をイメージングする工程とを含む方法が含まれる。本明細書の他の場所に記載したように、ユーザは、前記イメージングされた標識を前記ポリヌクレオチドの構造的特徴に、または前記ポリヌクレオチドのドナーの損傷若しくは疾患状態にさえ関連付けることができる。ポリヌクレオチドは、細胞内に配置されてよく、前記細胞は溶解させ、さらに前記多孔性マトリックス内に配置することができる。ユーザは、さらに（ａ）前記ポリヌクレオチドを遊離させられるように前記細胞を溶解し、（ｂ）前記ポリヌクレオチドの一部または全部を増幅させ、（ｃ）前記ポリヌクレオチドを消化することができる、または上記の一部の組み合わせさえ実施できる。ユーザは、さらにポリヌクレオチドを遊離させられるように前記マトリックスを少なくとも部分的に分解することもできる。これは熱、光線、化学薬品曝露、マイクロ波、またはマトリックス物質を分解させる際に有用な他の方法によって実施することができる。
【０１０５】
第１部位を転換させる工程は、前記第１部位をＮ−グリコシラーゼと接触させる工程によって実施できる。適切なＮ−グリコシラーゼは、本明細書の他の場所に記載されている。伸長は、本明細書の他の場所に記載したように、ポリヌクレオチドを第１標識を含むポリメラーゼおよびヌクレオチドと接触させる工程によって実施できる。ユーザは、上記で説明したように、さらに１若しくはそれ以上の標識の存在または位置を前記ポリヌクレオチドの構造的特徴に関連付けることができる。
【０１０６】
本開示によるキットには、適切にはある量のＮ−グリコシラーゼ（Ｎ−ｇｌｙｓｏｓｙｌａｓｅ）と、ある量のアプリン／アプリミジンリアーゼ（ｌｙｓａｓｅ）、３’−ホスホジエステラーゼ、またはその両方と、ある量のポリメラーゼと、ある量の標識ヌクレオチドとが含まれる。
【０１０７】
適切な物質は、本明細書の他の場所に記載されている。本キットの試薬は、本キットの試薬の１若しくはそれ以上の分注を実行できる器具と係合するために適応したパッケージ内に配置できる。１つの実施例として、本キットは上記の薬剤のパウチを含むことができ、本キットは次に本システムのレシーバ内に挿入可能であり、前記レシーバは、適切な試薬をサンプルに適用できるように適切なパウチへ圧力を印加するために構成される。本キットは、入口および出口ポートを含むことができるが、これらのポートは本キット内または外への物質の通過のために使用できる。
【０１０８】
本開示による他のキットには、ある量のアルカリ性物質と、ある量のアプリン／アプリミジンリアーゼ（ｌｙｓａｓｅ）、３’−ホスホジエステラーゼ、またはその両方と、ある量のポリメラーゼと、ある量の標識ヌクレオチドとが含まれる。これらのキットは、本明細書の他の場所に記載した方法を実施するために使用でき、その方法は、損傷ポリヌクレオチド上でのポリメラーゼ伸長可能な部位の形成を含んでいる。
【０１０９】
本明細書ではまた別のシステムも提供される。これらのシステムは、適切にはキットであって、（ａ）ある量のポリメラーゼと、（ｂ）ある量の標識ヌクレオチドと、（ｃ）ある量の１若しくはそれ以上のアプリン／アプリミジンリアーゼ（ｌｙｓａｓｅ）、３’−ホスホジエステラーゼ、またはエンドヌクレアーゼＩＶとを含み、前記キットは、サンプルイメージャと係合するために適応し、前記サンプルイメージャは、１若しくはそれ以上のナノチャネルを含む流体チップと係合するために適応するサンプルステージと、前記流体チップのナノチャネル内に配置されたサンプルとの光通信が可能な照明光源と、前記ナノチャネル内に配置された照明されたサンプルの画像を収集できる画像収集装置とを含むキットを含んでいる。
【０１１０】
本明細書で開示された追加の方法は、少なくとも１つの標識を含むポリヌクレオチドの１つの領域を直鎖化する工程であって、前記標識はポリメラーゼ伸長によって前記ポリヌクレオチド内に組み込まれており、前記ポリメラーゼ伸長は脱塩基部位、一本鎖切断、またはその両方から転換された部分上で実施される工程もまた含んでいる。
【０１１１】
組み込みおよび転換アプローチは、本明細書の他の場所に記載されている。本方法は、前記少なくとも１つの標識をイメージングする工程をさらに含むことができる。直鎖化する工程は、本開示に提示した他の方法によって実施することができ、前記方法はナノチャネル内に少なくとも１つの標識を含有するポリヌクレオチドの領域を限定する工程を含んでいる。ユーザは、次に１若しくはそれ以上の標識の存在または位置を前記ポリヌクレオチドの構造的特徴に関連付けることができる。ユーザはさらに、前記標識の存在若しくは位置または前記ポリヌクレオチドの構造的特徴さえを前記ポリヌクレオチドの疾患若しくは損傷状態に関連付けることができる。
【０１１２】
本開示は、さらに方法であって、ポリヌクレオチド上の損傷部位またはその近くで標識を組み込む工程と、前記標識を含む前記ポリヌクレオチドの１つの領域を直鎖化する工程と、前記標識をイメージングする工程とを含む方法もまた提供する。ユーザは、前記ポリヌクレオチド上の２若しくはそれ以上の標識の存在、間隔またはその両方を決定することができる。ユーザは、次に１若しくはそれ以上の標識の存在または位置を前記ポリヌクレオチドの構造的特徴に関連付けることができる。ユーザはさらに、前記標識の存在若しくは位置または前記ポリヌクレオチドの構造的特徴さえを前記ポリヌクレオチドの疾患若しくは損傷状態に関連付けることができる。
【０１１３】
標識の組み込みは、適切には損傷部位をポリメラーゼ伸長を支持できる部分へ転換させる工程によって実施される。この転換は、損傷部位を中間体へ転換させる工程を含むことができる。前記中間体は、順に適切には１若しくはそれ以上の工程によってポリメラーゼ伸長を支持できる部分へ転換される。
【０１１４】
本開示によってまた別のシステムがさらにまた提供される。これらのシステムは、適切には流体チップを受け入れるために構成された基部と、前記流体チップ内に配置されたポリヌクレオチドサンプルを照明するために構成された照明器と、前記流体チップ内に配置された前記ポリヌクレオチドから画像を収集するために構成された画像収集装置とを含むシステムもまた含んでいる。
【０１１５】
これらのシステム（および本明細書に開示した他のシステム）は、前記照明器を流体チップ内に配置されたサンプルと光通信するように配置する光学媒体を含むことができる。光学媒体は、ファイバ、レンズ、ミラーなどであってよい。本システムは、さらに前記ポリヌクレオチドサンプルへ照明器によって供給される照明の波長を変化させることができる１若しくはそれ以上のフィルタもまた含むことができる。
【０１１６】
システムは、流体チップ内に配置されたポリヌクレオチドサンプルと通信できる勾配源をさらに含むことができる。勾配源は、圧力源、電位源、電流源、磁場源、またはそれらのいずれかの組み合わせを含むことができる。照明器は、レーザ、ＬＥＤまたは当業者には公知の他の照明源であってよい。本システムは、本明細書の他の場所に記載したように、前記ポリヌクレオチドサンプルへ２若しくはそれ以上の波長の照明を適用するために構成できる。
【０１１７】
本開示はそこで、ＤＮＡ損傷を評価する方法を提供する。これらの方法には、さらに下流シーケンシングアッセイにおける成功または不成功に基づいて検出されたＤＮＡ損傷をゲノムＤＮＡの質へ関連付ける工程が含まれる。この評価は、分析下の損傷したＤＮＡの標識プロファイル（つまり、標識の位置および標識のタイプ）をコントロールＤＮＡの標識プロファイルと比較する工程によって実施できる。例えば、ユーザは、サンプルＤＮＡが損傷した位置を含有するかどうかを決定するために、ＤＮＡサンプル（つまり、損傷している可能性がある）の標識プロファイルをコントロール（損傷していない）ＤＮＡサンプルのプロファイルと比較することができる。
【０１１８】
ユーザは、さらにシーケンシングまたは他のアッセイのためにゲノムおよびｃＤＮＡライブラリの質（ＤＮＡ損傷の程度を含む）をさらに評価することができる。それには、ライブラリ挿入サイズ、フラグメントのサイズ分布、フラグメントのサイズ一様性、ならびにライブラリＤＮＡ損傷、例えば二本鎖切断、一本鎖切断、脱塩基部位、塩基傷害、ＤＮＡ付加化合物、フラグメント末端の質の評価（アダプタライゲーション、ベクタライゲーションなどについて）の測定が含まれる。ユーザは、ライブラリＤＮＡフラグメントのバックボーン標識、および／またはこれらのフラグメントに沿ったＤＮＡ損傷特定部位標識化を測定することから引き出されるデータを関連付ける工程によって、ライブラリまたは個別クローンの質を評価できる。
【０１１９】
ここに開示したシステムは、ユーザが、パラレルフォーマットで単一分子ベースおよび分子１つずつベースで小さな生物学的サンプル（例、ＤＮＡ）を同定および分析することを可能にする。本システムは、高分子の高分解能分析を提供し、これは順に生命科学研究、臨床研究、診断学およびオーダーメイド医療の分野における極めて多数（および新規）の用途の遂行を可能にする。
【０１２０】
典型的な複雑なゲノムは、多倍体（ｍｕｌｔｉｐｌｏｉｄ）染色体ＤＮＡから成る。各個別染色体は長さが数十万から数億塩基対（Ｋｂｐ）の範囲に及ぶことがある。これらの分子は、細胞から抽出された場合に溶液中に球状ランダムコイルを形成する半柔軟性バイオポリマーであると概念化することができる。
【０１２１】
ここに開示した、ナノチャネルを使用する方法は、自然状態のゲノムＤＮＡフラグメント（および他のポリマー分子）を系統的な直鎖状フォーマットに解明する、分類する、伸長する、および／または限定することができる。この工学技術はサンプルＤＮＡの小フラグメントへのフロントエンド増幅または剪断を必要としないので、このため臨床的に貴重なゲノム構造的情報、例えばコピー数多型（ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ：ＣＮＶｓ）、平衡傷害、または他のそのようなゲノム再配列および特徴を保存する。この工学技術の単一分子分析能力のために、極微量のサンプルしか必要とされず、このことは他のゲノム分析プラットフォームからの脱却を意味する。
【実施例１】
【０１２２】
以下はここに開示した方法およびシステムの実施例である。これらの実施例は具体例に過ぎず、本開示の範囲を限定するものと読み取るべきではない。
【０１２３】
ナノチャネルアレイ内でのＤＮＡサイズ分布の検出
１つのモデルシステムでは、ＤＮＡサンプルは様々なＤＮＡサンプル調製キットを用いて調製され、Ｇｅｎｔｒａ  ＰｕｒｅＧｅｎｅ（商標）キットを使用する口腔スワブＤＮＡＢ、Ｇｅｎｔｒａ  ＰｕｒｅＧｅｎｅ（商標）キットを使用する培養細胞ＤＮＡ、Ｅａｓｙ  ＤＮＡ（商標）キットを使用する培養細胞ＤＮＡを含んでいる。
【０１２４】
図３に示した３つのサンプルは、パルス・フィールド・ゲル上の様々なサイズ分布を示している。いずれかの単一の理論に拘束されなくても、サイズ分布におけるこの相違は、二本鎖切断（ＤＳＢｓ）の形態にある精製誘発性損傷に起因する。精製誘発性ＤＳＢｓは、本明細書の他の場所に記載したように、ナノチャネルアレイ内でイメージングされたＤＮＡのサイズ分布を分析することによって評価できる。ＤＳＢｓは、低ＤＮＡ長に向かう質量中心の移動、所定長より長いＤＮＡ分子のパーセンテージの減少、または所定長の範囲間のＤＮＡ分子のパーセンテージの減少にさえ基づいて定量できる（図３）。
【０１２５】
ナノチャネルアレイ内でのＵＶ損傷に起因するＤＮＡ二本鎖切断の検出。
【０１２６】
ＤＮＡへのＵＶ線は最も大量の突然変異性および細胞毒性ＤＮＡ傷害、例えばシクロブタン−ピリミジン二量体（ｃｙｃｌｏｂｕｔａｎｅ−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ｄｉｍｅｒｓ：ＣＰＤｓ）および６〜４個の光分解生成物（６−４  ｐｈｏｔｏｐｒｏｄｕｃｔｓ：６−４ＰＰｓ）およびそれらのデュワー（Ｄｅｗａｒ）原子価異性体の内の２つだけを含むのではなく、そのような曝露はさらに二本鎖および一本鎖ＤＮＡ切断もまた生成させることがある。ＵＶ線によって誘発される二本鎖ＤＮＡ切断のために、損傷したＤＮＡ分子の長さ分布はより短い長さへ移動し、順に二本鎖切断の量はＤＮＡ長測定から推測することができる。
【０１２７】
ナノチャネルアレイ内でのＵＶ損傷に起因する一本鎖切断の検出：
ＵＶ線によって誘発された一本鎖ＤＮＡ切断は、上述したようにナノチャネルアレイ内で測定できる。１つの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼの作用によってこれらの切断部位で蛍光色素ヌクレオチドを組み込むことができるが、このポリメラーゼは標識ヌクレオチドを前記切断部位で組み込むように作用する。標識ＤＮＡ分子は、次にナノチャネルアレイ内で（例えば、直鎖形に）伸長させられ、蛍光顕微鏡を使用して個別にイメージングすることができる。ＤＮＡバックボーンに沿ったこれらの蛍光標識の位置を決定することによって、一本鎖切断の分布および密度を正確に確定することができる。
【０１２８】
ナノチャネルアレイ内でのＴ４エンドヌクレアーゼＶおよびベントポリメラーゼを用いたＵＶ誘発性シクロブタン−ピリミジン二量体の検出。
【０１２９】
ＵＶ線は最も大量の突然変異性および細胞毒性ＤＮＡ傷害：ＣＰＤｓおよび６−４ＰＰｓならびにそれらのデュワー原子価異性体の内の２つを誘発する。しかしＴ４エンドヌクレアーゼＶは、塩基除去修復酵素経路の一部として機能し、ピリミジン二量体を取り除く。この酵素は、次に前記二量体の５’ピリミジンのグリコシル結合および３’ホスホジエステル結合を切断し、これは順にＤＮＡ内のＳＳＢを生じさせる。結果として生じる切断部位は、ＤＮＡ分子の３’末端での遊離ＯＨ基を含有し、ベント（またはその他の）ポリメラーゼを使用すると、次に切断部位で蛍光ヌクレオチドを組み込むことができる。標識ＤＮＡ分子は、次にナノチャネル内で伸長させられ、次に多色蛍光顕微鏡を使用してイメージングされる。
【０１３０】
ＤＮＡバックボーンに沿った１若しくはそれ以上の蛍光標識の位置を決定することによって、ＵＶ誘導性シクロブタン−ピリミジン二量体の分布および密度を正確に確定することができる（図４）。追加して、フランクＤＳＢｓおよびＳＳＢｓへ転換されるクラスタ化ＵＶ損傷に起因するＤＳＢｓは、分子長のサイズ分布を生成することによって測定できる（図４）。類似のサイズ分布評価は、ＵＶＣ損傷を受けたがＵＶＤＥとともにインキュベートされたＤＮＡについて実施された（図５）。この分布は、分子サイズに関する損傷への用量反応を示している。
【０１３１】
蛍光イメージングはヌクレオチドを検出できる唯一の方法ではないと理解されたい。ヌクレオチドは、さらに放射性物質、例えばアイソトープを用いて標識でき、前記放射性物質は、前記ヌクレオチドが前記ポリヌクレオチドサンプル内に組み込まれた後に順に検出して位置特定することができる。蛍光イメージングは、特に適切であると考えられる。
【０１３２】
エンドヌクレアーゼＩＶおよびベントポリメラーゼによって認識および標識され、ナノチャネルアレイ内で検出される損傷した塩基：
エンドヌクレアーゼＩＶは、ＤＮＡ内の様々な酸化的損傷に作用することができる。この酵素は、ＤＮＡ中で無傷ＡＰを加水分解するアプリン／アプリミジン（ＡＰ）エンドヌクレアーゼであると特徴付けられている。ＡＰ部位は傷害に対して５’側である第１ホスホジエステル結合で切断され、３’末端ではヒドロキシル基および５’末端ではデオキシリボース５’−ホスフェートを残す。この酵素はさらに３’−ジエステラーゼ（ｄｉｅｓｔｅｒｅａｓｅ）活性を有し、ＤＮＡの３’末端からホスホグリコアルデヒド、無傷デオキシリボース５−ホスフェートおよびホスフェートを遊離させることができる。
【０１３３】
ホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ（ＦＰＧ）およびベントポリメラーゼによって認識および標識され、ナノチャネルアレイ内で検出される損傷した塩基。
【０１３４】
ホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼは、ＤＮＡ修復酵素の塩基除去修復酵素（ｂａｓｅ−ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｒｅｐａｉｒ：ＢＥＲ）経路のメンバーである。ＦＰＧは、Ｎ−グリコシラーゼおよびＡＰ−リアーゼ両方として機能する。ＦＰＧは、二本鎖ＤＮＡから損傷した塩基を認識して切断し、Ｎ−グリコシル結合を加水分解してアプリン／アプリミジン（ＡＰ）部位を作り出す。この酵素は、ＡＰ部位の３’および５’ホスホジエステル結合を切断し、ＤＮＡ内に間隙を作り出して３’および５’−ホスフェート末端を残す。ＦＰＧは、８−オキソグアニン、８−オキソアデニン、ホルムアミドピリミジン（ＦａｐｙＡ、ＦａｐｙＧ、メチル−ｆａｐｙ−グアニン、アフラトキシンＢ１−ｆａｐｙ−グアニン）、５−ヒドロキシ−シトシン、５−ヒドロキシ−ウラシルおよび開環Ｎ−７グアニン付加化合物（７−メチルグアニン）を含む変異原性潜在力を備える多数の修飾塩基を同定して取り除く。
【０１３５】
エンドヌクレアーゼＩＩＩおよびベントポリメラーゼによって認識および標識され、ナノチャネルアレイ内で検出される損傷した塩基。
【０１３６】
エンドヌクレアーゼＩＩＩは、ＡＰ部位を作り出す以下のピリミジン傷害：ウレア、５，６ジヒドロキシチミン、チミングリコール、５−ヒドロキシ−５メチルヒダントイン（ｍｅｔｈｙｌｈｙｄａｎｔｏｎ）、ウラシルグリコール、６−ヒドロキシ−５，６−ジヒドロチミンおよびメチルタルトロニルウレア（ｍｅｔｈｙｌｔａｒｔｒｏｎｙｌｕｒｅａ）を除去できるＮ−グリコシラーゼである。エンドヌクレアーゼＩＶ、ベント（エキソ−）ポリメラーゼおよび蛍光ヌクレオチドと結合されたエンドヌクレアーゼＩＩＩは、酸化ピリミジン損傷の部位ならびにＳＳＢｓから成る部位およびＤＮＡバックボーンに沿ったアプリン／アプリミジン（ＡＰ）部位を標識できる。ＤＮＡバックボーンに沿った蛍光標識を決定することによって、酸化ピリミジンの分布および密度を極めて正確に確定することができる（図６ｂ）。さらに、ＳＳＢｓへ転換されるクラスタ化酸化ピリミジン損傷に起因するフランクＤＳＢｓおよびＤＳＢｓは、分子長のサイズ分布によって測定できる（図６ａ）。
【０１３７】
脱塩基部位の形態にある、次にエンドヌクレアーゼＩＶおよびベントポリメラーゼによって認識および標識され、ナノチャネルアレイ内で検出される損傷した塩基に対する感度を強化するためのＤＮＡ包埋ゲルプラグのアルカリ処理の使用。
【０１３８】
また別のセルベースＤＮＡ損傷アッセイ（図７）では、アルカリ溶液を使用すると酵素活性を組み込むことなく損傷誘発性脱塩基部位をＳＳＢｓへ転換させることができる。しかしアルカリ転換脱塩基部位に由来するＳＳＢｓ（ならびにフランクＳＳＢｓの大部分）は、必ずしもポリメラーゼによって伸長可能ではない。本明細書の他の場所に規定したように、エンドヌクレアーゼＩＶは３’−ホスホジエステラーゼ活性を有し、その活性は順に３’ブロック基を備える伸長不可能なＳＳＢｓから有意な比率のポリメラーゼ伸長可能な切断部位への転換を許容し、前記切断部位はポリメラーゼ伸長中に蛍光ヌクレオチドを用いて蛍光標識することができる。
【０１３９】
アルカリ処理は、さらにＤＮＡバックボーンの局所的アルカリ誘導性変性によって密集したＳＳＢｓをＤＳＢｓへ転換させる作用も有し、これは損傷誘導性二本鎖切断（ＤＳＢｓ）を検出するためにより高感度のアッセイをもたらす。精製ＤＮＡを産生するためにアガロース中に細胞を包埋する工程は、ＤＮＡの直接的操作、例えば断片化を導くことがあるピペッティングに関連する剪断力を排除し、真の損傷誘導性断片化の改善された検出を許容する。さらに、多孔性ゲルマトリックスは、アルカリ処理後に続く酵素反応のために必要である適切なバッファ条件を容易にするためにバッファ交換を可能にする。図８では、セルベース酸化的アッセイは、酸化的損傷剤として過酸化水素を用いて示されている。処理対未処理細胞の生ＤＮＡサイズヒストグラム（図８Ａ）は、未処理コントロールと比較して過酸化水素処理細胞から精製されたＤＮＡについてより小さなフラグメントサイズへの明確な変化を証明している。過酸化水素処理後のＤＮＡの平均サイズおよび標識組み込み密度（図８Ｂ）は、各々ＤＳＢｓおよびＳＳＢｓの形態における明白な酸化的損傷を証明している。
【０１４０】
図１０は、酸化的損傷を評価するための典型的な分析経路を図示している。酸化的損傷では、酸化的ストレスの最も重大な結果は、突然変異およびゲノム不安定性を引き起こすことがあるＤＮＡ修飾であると考えられる。ＤＮＡ内で形成される酸化生成物には、鎖切断、無塩基糖若しくはＡＰ（アプリン／アプリミジン（ａｐｕｒｉｎｉｃｉａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃ））部位、および酸化塩基が含まれる。図に示したように、標識（例、蛍光標識）は酸化的損傷部位で組み込むことができ、前記標識は後でイメージングできる。
【０１４１】
図示したように、１つの酸化的損傷標識化学では、エンドヌクレアーゼＩＩＩは、酸化ピリミジンをアピリミジン（ＡＰ）部位および伸長不可能なＳＳＢｓに転換できるＮ−グリコシラーゼである。エンドヌクレアーゼＩＶは、順にＡＰ部位および伸長不可能なＳＳＢｓを、ポリメラーゼ伸長が可能な３’−ＯＨを含有する一本鎖切断に転換するために使用できる。蛍光標識ヌクレオチドは、次に塩基損傷の部位でＤＮＡポリメラーゼによって組み込まれ、標識密度および分子長分布によってＤＮＡ損傷を測定するためにナノチャネルアレイ内でイメージングされる。
【０１４２】
追加の物質
また別の開示は、以下の特許出願文献の中に見いだされ、それらの各々はこの参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２００７年７月１９日付で出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１６４０８号、「Ｎａｎｏｎｏｚｚｌｅ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ａｒｒａｙｓ：Ｔｈｅｉｒ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｆｏｒ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」、２００８年３月２８日付で出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５８６７１号、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｏｆ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｎａｎｏｃｈａｎｎｅｌ  Ａｒｒａｙｓ」、２００９年６月５日付で出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４６４２７号、「Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、２００９年６月３０日付で出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４９２４４号、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｆｏｒ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」、２００９年１１月１９日付で出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６４９９６号、「Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」、２０１０年５月１８日付で出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３５２５３号、「Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｓｐａｔｉａｌ  Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｒｅｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ」、２０１０年９月２７日付で出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５０３６２号、「Ｎａｎｏｃｈａｎｎｅｌ  Ａｒｒａｙｓ  Ａｎｄ  Ｎｅａｒ−Ｆｉｅｌｄ  Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｆｏｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、２０１０年１０月２１日付で出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５３５１３号、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｆｏｒ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」。
【０１４３】
ここに開示したアッセイは、ナノチャネルアレイ内のＤＮＡ分子の分子集団のサイズ分布およびヌクレオチド修飾を直接的にイメージングすることができる。本アッセイは、蛍光体または他の標識を用いる長鎖ゲノムＤＮＡ分子上の特異的ヌクレオチド修飾（一本鎖切断または化学的修飾）の酵素標識化によって開始できる。標識ＤＮＡ分子は、次に（例えば、ナノチャネルアレイ内で）直鎖化され、高分解能蛍光顕微鏡を用いてイメージングされる。ＤＮＡバックボーン上の蛍光標識の位置を特定することによって、ゲノムの構造的情報および個別ＤＮＡ分子上の修飾ヌクレオチドの分布を高精度で推定できる。超小型化ナノアレイ機器は、柔軟性および効率的標識化学と一緒になって単一分子レベルでの全ゲノムの直接的イメージング分析を可能にする。
【０１４４】
所定のＤＮＡ損傷は、ＤＮＡポリメラーゼ進行をブロックし、順にＰＣＲ効率に影響を及ぼす可能性がある。特異的ＤＮＡ傷害は、さらに結果として突然変異を生じさせる組み込みミスを伴うポリメラーゼ組み込みの忠実度にも影響を及ぼす。例えば、８−オキソ−７，８−ジヒドロ−２０−デオキシグアノシン（８−ｏｘｏｄＧ）の存在下では、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼはｄＣＭＰ（ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ：デオキシシチジン一リン酸）および少ない程度のｄＡＭＰ（ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ：デオキシアデノシン一リン酸）を挿入した。また別の場合には、単一８−オキソ−７，８−ジヒドロ−２−デオキシアデノシン、脱塩基部位、またはｃｉｓ−ｓｙｎチミジン二量体が増幅効率を劇的に減少させた。
【０１４５】
多くのシーケンシング技術は、ゲノムＤＮＡからのシーケンシングライブラリの構築を必要とし、その質およびゲノム表示は最終シーケンシング結果を決定する。シーケンシングライブラリの質は、ゲノムＤＮＡの質およびライブラリ構築プロセスによって決定される。ここに開示した方法は、必ずしもＰＣＲを必要とせず、上述したように、ユーザがライブラリの質を評価することを可能にする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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