(57)【要約】  本願は、光合成細菌を光合成が起きる条件及びアルコール存在下で培養する段階を含む、光合成バクテリアを利用した水素生産方法に関する。本願の方法は、既存の方法に比べて水素生産性が顕著に増進され、アンモニウムイオンによる阻害に敏感でなく、特に廃有機物に多量に含まれたアンモニウムイオンの存在程度に関係なく常に一定水準の水素生産が可能であり、活用度、経済性に優れる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光合成細菌を光合成が起きる条件及びアルコール存在下で培養する段階を含むことを特徴とする、光合成バクテリアを利用した水素生産方法。
【請求項２】
前記光合成細菌は、ロドバクター属バクテリアであることを特徴とする、請求項１に記載の光合成バクテリアを利用した水素生産方法。
【請求項３】
前記光合成細菌は、ロドバクタースフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドバクターカプスラタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ロドバクターアピグメンタム（Ｒ．ａｐｉｇｍｅｎｔｕｍ）、ロドバクターアゾトフォルマンス（Ｒ．ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）、ロドバクターブラスティカス（Ｒ．ｂｌａｓｔｉｃｕｓ）、ロドバクターグルコニカム（Ｒ．ｇｌｕｃｏｎｉｃｕｍ）、ロドバクターリトラリス（Ｒ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、ロドバクターマシリエンシス（Ｒ．ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）及びロドバクターベルドカンピ（Ｒ．ｖｅｌｄｋａｍｐｉｉ）で構成される群から選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の光合成バクテリアを利用した水素生産方法。
【請求項４】
前記アルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール及びブタノールで構成される群から選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の光合成バクテリアを利用した水素生産方法。
【請求項５】
前記アルコールは、窒素固定酵素を活性化させることを特徴とする、請求項１に記載の光合成バクテリアを利用した水素生産方法。
【請求項６】
前記方法は、アンモニアの存在下で行われることを特徴とする、請求項１に記載の光合成バクテリアを利用した水素生産方法。
【請求項７】
前記方法による水素生成は、培地内に添加されたアルコールが消費されないことを特徴とする、請求項１に記載の光合成バクテリアを利用した水素生産方法。
【請求項８】
前記アルコールは、培地に約０．０５体積％〜２体積％で含まれることを特徴とする、請求項１に記載の光合成バクテリアを利用した水素生産方法。
【請求項９】
前記アルコールは、前記光合成細菌の接種と同時に及び／または、培養初期に添加されることを特徴とする、請求項１に記載の光合成バクテリアを利用した水素生産方法。
【請求項１０】
前記光合成は、約２０℃〜３７℃、嫌気または微好気、及び約３〜３００Ｗ／ｍ２の光条件で行われることを特徴とする、請求項１に記載の光合成バクテリアを利用した水素生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光合成細菌を利用した水素生産方法であって、具体的にはエタノールを含む培地で光合成細菌を培養することを含む、光合成細菌を利用した水素生産方法または水素生産効率増進方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代産業の構造においては、化学工業の原料物質とエネルギー源の多くを化石燃料に依存するしかない。化石燃料の量は、限られており、このような化石燃料の利用は経済的問題と共に種々の環境問題を引き起こしている。このような状況下で化石燃料を代替することができるエネルギーに関する研究が盛んに行われており、太陽光を利用するエネルギー生産技術は人類が依存すべき究極の新再生エネルギー技術の中の一つに該当する。光エネルギー利用技術は、種々の方法によって可能であるが、その中でも光合成は３５億年の進化過程を経て現在のような高い光エネルギー利用効率を保有する。
【０００３】
光合成菌株の代謝活動で放出される水素は、クリーンエネルギーとして未来の究極的な代替エネルギー源といわれている。現在の化石燃料や原子力等に比べて、水素は燃焼時に極少量の公害物質だけを排出する。さらに、水素は、ガスや液体として保存でき、その使用の幅が非常に広くなる大きな潜在力を持っている。
【０００４】
光合成菌株の水素生成は、主に窒素固定酵素によるプロトン（ｐｒｏｔｏｎ、Ｈ＋）固定の結果であり、この時消費するエネルギーは全面的に光合成の明反応に依存する。窒素固定酵素は、ＮｉｆＨ（ｄｉｎｉｔｒｏｇｅｎａｓｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）及びＮｉｆＤ−ＮｉｆＫ（ｄｉｎｉｔｒｏｇｅｎａｓｅ）で構成される酵素複合体であり、その反応のためＡＴＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を消費する（Ｐｅｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｚｉｌａｇｙｉ  ２００６．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１０：１０１−１０８）。このような水素生成機構は、まだ詳しく究明されておらず、酵素の複雑性と酸素敏感度のために水素生成と関連した研究の進展は遅い状況である。従って、現在まで光合成細菌を利用した水素生成増進の技術開発は、このような窒素固定酵素と水素生成酵素の改良や活性調節よりは、明反応を最適化させる方法によって進められてきた。即ち、培養菌体が可能な限り多くの光を受けられるようにする培養器の最適化をとおして、より一層多くのエネルギーが水素生成に用いられるようにしてきた。
【０００５】
しかしながら、このようなアプローチは、光機構固有の光エネルギー利用能力を越えられないという限界を持っている。従って、より多くのエネルギーが水素生成と関連した代謝に用いられるようにすることで、同時に水素生成酵素の活性化及び安定化等を導ける方法の究明が求められている。
【０００６】
光合成細菌は、紅色非硫黄細菌（ｐｕｒｐｌｅ  ｎｏｎ−ｓｕｌｆｕｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、紅色硫黄細菌（ｐｕｒｐｌｅ  ｓｕｌｆｕｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、緑色非硫黄細菌（ｇｒｅｅｎ  ｎｏｎ−ｓｕｌｆｕｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、及び緑色硫黄細菌（ｇｒｅｅｎ  ｓｕｌｆｕｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）に分けられ、これらは藻類（ａｌｇａｅ）や植物の光合成とは異なって、その過程中に酸素を発生させないことを特徴とする。
【０００７】
この中で、紅色非硫黄細菌であるロドバクター属微生物は、種々の代謝条件、即ち、好気的条件、嫌気暗条件、嫌気光条件いずれにおいて成長することができる。また、ロドバクター属微生物は、太陽エネルギーを清浄な化学エネルギーの水素に転換させる能力によって微生物を利用した代替エネルギー技術開発の主な対象に用いられてきた。去る５０年の研究を通して、ロドバクター属微生物は、その遺伝子操作が大腸菌と同程度に容易に確立されており、水素生成窒素固定酵素及び水素生成関連構成要素の遺伝子も比較的明確に知られている。例えば、ロドバクタースフェロイデスＫＣＴＣ１２０８５（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．２００２．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６０：１４７−１５３）は自然界より分離された光合成菌株として、水素生成能と塩に対する高抵抗性を持っており、分子遺伝学的アプローチが容易であり、水素生成がより増進される変異株の製造が可能であるという長所を持っている。
【０００８】
しかし、ロドバクター属微生物による水素生産は、アンモニウムイオンが存在する場合、顕著に減少し、概して低い効率を示す等の技術的問題を持っているため、まだ商用化の段階に達しておらず、これに対する解決策が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本願は、前述した従来の諸問題点を解決するために案出されたもので、水素生産に係る酵素の活性及び安定化を通して、光合成細菌を利用した水素生産方法及び水素生産効率を増大させる方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願は、光合成細菌を光合成が起きる条件及びアルコール存在下で培養する段階を含む、光合成バクテリアを利用した水素生産方法を提供する。
【００１１】
本願はまた、前記光合成細菌は、ロドバクター属バクテリアの光合成バクテリアを利用した水素生産方法を提供する。
【００１２】
本願はまた、前記光合成細菌は、ロドバクタースフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドバクターカプスラタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ロドバクターアピグメンタム（Ｒ．ａｐｉｇｍｅｎｔｕｍ）、ロドバクターアゾトフォルマンス（Ｒ．ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）、ロドバクターブラスティカス（Ｒ．ｂｌａｓｔｉｃｕｓ）、ロドバクターグルコニカム（Ｒ．ｇｌｕｃｏｎｉｃｕｍ）、ロドバクターリトラリス（Ｒ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、ロドバクターマシリエンシス（Ｒ．ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）及びロドバクターベルドカンピ（Ｒ．ｖｅｌｄｋａｍｐｉｉ）で構成される群から選択される一つ以上である、光合成バクテリアを利用した水素生産方法を提供する。
【００１３】
本願はまた、前記アルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール及びブタノールで構成される群から選択される一つ以上である、光合成バクテリアを利用した水素生産方法を提供する。
【００１４】
本願はまた、前記アルコールは、窒素固定酵素を活性化させるものである、光合成バクテリアを利用した水素生産方法を提供する。
【００１５】
本願はまた、前記方法は、アンモニアの存在下で行われるものである、光合成バクテリアを利用した水素生産方法を提供する。
【００１６】
本願はまた、前記方法による水素生成は、培地内に添加されたアルコールが消費されないことを特徴とする、光合成バクテリアを利用した水素生産方法を提供する。
【００１７】
本願はまた、前記アルコールは培地に約０．０５体積％〜２体積％で含まれる、光合成バクテリアを利用した水素生産方法を提供する。
【００１８】
本願はまた、前記アルコールは、前記光合成細菌の接種と同時に及び／または、培養初期に添加されるものである、光合成バクテリアを利用した水素生産方法を提供する。
【００１９】
本願は、光合成細菌を光合成が起きる条件のアルコール存在下で培養する段階を含む光合成バクテリアの水素生産効率増進方法を提供する。
【発明の効果】
【００２０】
本願の水素生産方法は、既存の水素生産方法と比較して２倍（４モル  Ｈ２／モル  基質）以上に水素生産効率が増進され、またアンモニウムイオンの存在する条件でも既存の方法と比較して１０倍（５〜６モル  Ｈ２／モル  基質）以上の増進効果を示した。このような本願の方法は、特に廃有機物に多量に含まれたアンモニウムイオンの存在程度に関係なく常に一定水準の水素生産が可能であって、経済性、活用度及び実用性に優れる。
【００２１】
また、本願の水素生産方法は、水素エネルギーの生産技術であると同時にＣＯ２発生低減技術であり、環境にやさしい廃棄物の処理と共に用いられる場合にも非常に有用である。
【００２２】
さらにロドバクター属の光合成微生物を用いる場合、このような微生物は、現在、藻類及び魚類の飼料として利用されており、有用な二次代謝産物を同時に生産できるため、水素生産後に残るバイオマスと代謝産物を確保する二次的な工程と連係してその経済的価値を極大化させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】光合成条件のロドバクタースフェロイデス野生型菌株（ＷＴ）の累積水素生産量及び成長曲線を示す。アンモニウムイオンが存在するシストロム最少培地を利用して試験を行い、エタノール（ＥｔＯＨ）は最終濃度が各０．１％及び０．５％になるべく添加し、対照群としてエタノールを添加しなかった培地を用いた。
【図２】光合成条件で培養されたロドバクタースフェロイデス野生型菌株（ＷＴ）の窒素固定酵素活性を示す。培地にエタノール（ＥｔＯＨ）を０．２％添加した場合とエタノールを添加しなかった対照群に対し試験を行った。その活性は、細胞によって生成されたエチレンの量を時間及び細胞の量で分けて示した。
【図３】光合成条件のロドバクタースフェロイデス菌株の累積水素生産量を示す。ロドバクタースフェロイデス野生型菌株（ＷＴ）及び窒素固定酵素欠損菌株（ＮｉｆＤＫ  ｍｕｔａｎｔ）を同時に試験した。エタノール（ＥｔＯＨ）は、最終濃度が０．５％になるように添加し、エタノールを添加しなかった対照群と同時に試験した。時間は、最初に水素が発生した時点から水素量の測定時点までの差で示した。
【図４】光合成条件でロドバクタースフェロイデス野生型菌株（ＷＴ）の累積水素生産量及び成長曲線を示す。各々０ｍＭと２ｍＭのアンモニウム濃度にて、エタノール（ＥｔＯＨ）を培地内に０．２％で添加した場合とエタノールを添加しなかった対照群に対し試験を行った。
【図５】光合成条件のロドバクタースフェロイデス野生型菌株（ＷＴ）の累積水素生産量及び成長曲線を示す。エタノール（０．５％）を添加する時点を細胞の成長が１０ＫＵ、１００ＫＵ、及び３００ＫＵに達した時として互いに異ならせて、エタノールを添加しなかった対照群と共に試験を行った。
【図６】光合成条件のロドバクタースフェロイデス野生型菌株（ＷＴ）の累積水素生産量を示す。アンモニウムイオンが存在するシストロム最少培地を利用して試験し、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールは、各々最終濃度が０．２％、０．５％、０．５％、０．２％になるように添加して試験を行った。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本願では、光合成細菌に種々の物質を添加して、水素生成能に及ぼす影響を試験して、アルコールが光合成細菌の水素生成能を画期的に増加させることを発見して本発明を完成した。
【００２５】
従って、本願は、一様態で本願は光合成細菌を光合成が起きる条件及びアルコール存在下で培養する段階を含む光合成バクテリアを利用した水素生産方法に関するものである。
【００２６】
さらに、本願は、他の様態で光合成細菌を光合成が起きる条件及びアルコール存在下で培養する段階を含む光合成バクテリアの水素生産効率増進方法に関するものである。
【００２７】
本願で、前記光合成細菌は、紅色非硫黄細菌（ｐｕｒｐｌｅ  ｎｏｎ−ｓｕｌｆｕｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、紅色硫黄細菌（ｐｕｒｐｌｅ  ｓｕｌｆｕｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、緑色非硫黄細菌（ｇｒｅｅｎ  ｎｏｎ−ｓｕｌｆｕｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、または、緑色硫黄細菌（ｇｒｅｅｎ  ｓｕｌｆｕｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）である。一実現例で本願の光合成細菌は、紅色非硫黄細菌であるロドバクター属微生物である。一実現例で前記ロドバクタースフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドバクターカプスラタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ロドバクターアピグメンタム（Ｒ．ａｐｉｇｍｅｎｔｕｍ）、ロドバクターアゾトフォルマンス（Ｒ．ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）、ロドバクターブラスティカス（Ｒ．ｂｌａｓｔｉｃｕｓ）、ロドバクターグルコニカム（Ｒ．ｇｌｕｃｏｎｉｃｕｍ）、ロドバクターリトラリス（Ｒ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、ロドバクターマシリエンシス（Ｒ．ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）及びロドバクターベルドカンピ（Ｒ．ｖｅｌｄｋａｍｐｉｉ）で構成される群から選択される。他の実現例で前記ロドバクタースフェロイデスは、ロドバクタースフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）またはロドバクターカプスラタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）である。さらに他の実現例ではロドバクタースフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）である。
【００２８】
本願で光合成が起きる条件とは、光合成細菌の明反応を導くための条件であり、適切な量の光、温度、空気を必要とし、当業者は光合成細菌の具体的な種類によって最適の条件を決められる。例えば、光合成は、約２０〜３７℃、嫌気または微好気及び約３〜３００Ｗ／ｍ２の光条件で行われる。微好気条件とは、酸素濃度約５％以下の条件である。一実現例では、光合成は１０Ｗ／ｍ２の光、嫌気、３０℃の条件で１２０時間行われる。
【００２９】
ロドバクタースフェロイデスは、窒素固定酵素の作用を介して水素ガスを生産し、従ってこの酵素活性度の大きさによって水素生成量が決定される。しかし、発生した水素を用いる酵素であるニッケル−鉄含有水素酵素（ｕｐｔａｋｅ−Ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，Ａｐｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．２０００．Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７３：３３３−３３８）の作用により水素生成量が減少しうる。従って、ロドバクタースフェロイデスの水素生成効率は、二つの酵素の相対的な活性程度によって決定されるといえる。本願の方法に用いられるアルコールは、特に制限はないが、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、またはブタノールを含む。一実現例で、前記アルコールは、エタノール、プロパノール、またはブタノールである。他の実現例で、前記アルコールは、ブタノール、またはエタノールである。
【００３０】
本願のアルコールは、細胞の成長を妨げない範囲まで添加され、培地に対し約０．０５体積％〜２体積％で含まれる。ある実現例でアルコールは約０．１％〜１％の濃度で用いられる。
【００３１】
本願はまた、前記アルコールは、これに制限されるものではないが、前記光合成細菌の接種と同時に、または培養初期に添加されうる。培養初期とは、細胞接種後細胞の濃度が約１〜１５０ＫＵ範囲の場合をいう。
【００３２】
一様態で、本願の方法は、アルコールによる窒素固定酵素の活性化によるものである。
【００３３】
本願に用いられたアルコールの量は、追加生成された水素ガスの量に比べて非常に僅かな量で、添加されたアルコールが光合成細菌、例えば、ロドバクタースフェロイデス内で代謝され、そのエネルギーを利用することで、水素生成能力が増進されたものではなく、細胞内アルコールによる窒素固定酵素の活性化によるものである。
【００３４】
従って、他の様態で、本願の方法による水素生成は、培地内に添加されたアルコールが消費されない。アルコールが消費されない場合、連続的な水素生産工程で反応器内にエタノールを追加的に入れなくても、増進された水素生産性を維持することが可能で、水素生産効率を増大させることができる。
【００３５】
窒素固定酵素の活性度を測定した結果、エタノールの添加時に窒素固定酵素の活性は、対照群に比べて約４倍増加し（図２）、窒素固定酵素を発現できない変異株の場合、このような効果が観察されなかったが（図３）、これはアルコールによる窒素固定酵素の活性増進及びこれに伴う水素生成能の増進と見られる。
【００３６】
従って、本理論で限定するものではないが、本願のアルコール使用による光合成細菌の水素生成能増進は、窒素固定酵素の活性によるものである。
【００３７】
他の様態で、本願の方法は、アンモニウムイオンの存在下でも水素を効率よく生産できることに関する。
【００３８】
アンモニウムイオンによる窒素固定酵素活性の阻害は、ロドバクター属を利用した水素生成において克服しなければならない課題の中の一つであるが、本発明の方法による水素生成は、アンモニウムイオンの存在による阻害効果に敏感ではない。窒素固定酵素の発現及びその活性は、培地内にアンモニウムイオンが存在する場合、種々の調節因子の作用によって非常に顕著に減少することになる（Ｍａｓｅｐｏｈｌ  ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：２４３−２４８）。これは、窒素固定反応が非常に多くのＡＴＰを消費する反応であるためである。このような調節は、大きく三段階に分けられるが、最も上位段階の調節は、窒素固定酵素を発現させる遺伝子であるｎｉｆＨＤＫの転写活性因子であるＮｉｆＡに対する調節である。ＮｔｒＣは、アンモニウムがない条件においてＮｔｒＢによってリン酸化され、リン酸化されたＮｔｒＣがｎｉｆＡ遺伝子の転写水準を高めることになり、ＰＩＩ蛋白質であるＧｌｎＢは、この過程でＮｔｒＢと結合してこの作用を助ける。ＮｉｆＡの活性調節が二番目の段階であり、この段階はＰＩＩ蛋白質であるＧｌｎＢとＧｌｎＫなどが関連して、このようなＮｉｆＡに対する活性調節によって窒素固定酵素の転写程度が決定されることになる。最後の段階の調節は、既に翻訳された窒素固定酵素の活性に対する調節であり、アンモニウムイオンの濃度によりＤｒａＴ及びＤｒａＧ蛋白質が関与して窒素固定酵素の最終活性を決めることになる。
【００３９】
具体的に、光合成細菌、例えば、ロドバクタースフェロイデスの水素発生は、窒素固定酵素（ｎｉｔｒｏｇｅｎａｓｅ）の活性によるもので、培地内の窒素源が充分でない場合、窒素固定酵素は、アンモニウム（ＮＨ４＋）イオンを合成する役割を果たすと同時に水素ガスを発生させる（Ｗａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．１９７５．Ｎａｔｕｒｅ  ２５８：６３０−６３１）。しかし、窒素固定酵素の活性は、アンモニウムイオンによって抑制されるため、水素生成もアンモニウムイオンの存在によって阻害を受けることになる。
【００４０】
これは、特に廃有機物を利用した水素生成時において、アンモニウムイオンの濃度を調節するに当たり追加費用が必要とされる問題点であるが、本願の方法を用いる場合、アンモニアの存在中でも水素生産が可能になり、このような問題が解決された。本理論で限定するものではないが、アンモニウムイオンの存在を認知して、窒素固定酵素の活性を調節する因子であるＰＩＩ蛋白質の作用抑制による現象であると考えられる。
【００４１】
本願は、光合成細菌が光合成成長条件で水素を発生する特性を利用して、培地内にアルコールを添加して窒素固定酵素の活性増進を導いて、これに伴う水素生成能を向上させるものであって、このような特徴を含む限り、光合成細菌を利用した公知の水素生産工程を本願の方法に導入して用いることができる。光合成バクテリアを用いた一般的水素生産方法は、公知になっており、例えば、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．２００２．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６０：１４７−１５３、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｙｄｒｏｇｅｎ  Ｅｎｅｒｇｙ  ３１：１２１−１２７、韓国特許第０６８０６２４号に記載のものが挙げられ、具体的な光合成培養条件、アルコールの量は用いる光合成菌株の種類によって適切に決められる。
【００４２】
以下、実施例に基づいて本発明をより一層詳細に説明するが、下記実施例は、本発明を例示するためのものであって、本発明の内容を限定するものではない。
【００４３】
実施例１：エタノール存在下で光合成細菌を利用した水素生産
水素生産をため、ロドバクタースフェロイデス２．４．１（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−８０８、Ｃｏｈｅｎ−Ｂａｚｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．１９５６．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ４９：２５−６８）、またはロドバクタースフェロイデスＫＣＴＣ１２０８５を対象菌株として用い、この菌株等の成長のために、シストロム最少培地［２０ｍＭリン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、３．８ｍＭ硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）、３４ｍＭコハク酸（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、０．５９ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸（Ｌ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ）、０．３０ｍＭ  Ｌ−アスパラギン酸（Ｌ−ａｓｐａｒｔａｔｅ）、８．５ｍＭ塩化ナトリウム、１．０５ｍＭニトリロ三酢酸（ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、１．２ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２６Ｈ２Ｏ）、０．２３ｍＭ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２７Ｈ２Ｏ）、２５Ｍ硫酸鉄（ＩＩ）（ＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏ）、０．１６Ｍモリブデン酸アンモニウム（（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４４Ｈ２Ｏ）、４．７Ｍ  ＥＤＴＡ、３８Ｍ硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４７Ｈ２Ｏ）、９．１Ｍ硫酸マンガン（ＭｎＳＯ４Ｈ２Ｏ）、１．６Ｍ硫酸銅（ＣｕＳＯ４５Ｈ２Ｏ）、０．８５Ｍ硝酸コバルト（ＩＩ）（Ｃｏ（ＮＯ３）Ｈ２Ｏ）、１．８Ｍホウ酸（Ｈ３ＢＯ３）、８．１Ｍニコチン酸、１．５Ｍチアミン塩酸、４１ｎＭビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）（Ｓｉｓｔｒｏｍ、Ｗ．Ｒ、１９６２．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８：６０７−６１６）を基本培地として用いた。場合によっては、窒素固定酵素の活性を最適化するために、モリブデン酸アンモニウムを同量のモリブデン酸ナトリウムに代替して用い、硫酸アンモニウムを排除してその代わりＬ−グルタミン酸を７ｍＭの濃度に増やして用い、コハク酸を３０ｍＭのマレイン酸（ｍａｌａｔｅ）に代替して用いた。アンモニウムイオンの効果を確認するためには、培地に２ｍＭの塩化アンモニウムを添加した。
【００４４】
ロドバクタースフェロイデス菌株１０８ＣＦＵ／ｍｌをシストロム最少培地１０ｍｌに接種した後、これを１０Ｗ／ｍ２の光条件で３０℃、嫌気条件、１２０時間、菌株を培養して、水素生成能力を試験した。水素の生成量を測定するために、細胞は空気が漏れないように考案されたビン（ｓｅｒｕｍ  ｖｉａｌ）に入れて、光が与えられる培養器で成長させた。瓶内部の酸素除去のためにアルゴン（ａｒｇｏｎ）で置換した後、成長を始めさせた。時間が経過したら空気層（ｇａｓ  ｐｈａｓｅ）の一部を空気が漏れないように考案された注射器（ガスタイトシリンジ：ｇａｓ−ｔｉｇｈｔ  ｓｙｒｉｎｇｅ）を介して取り出して、ガスクロマトグラフィー（Ｇａｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＧＣ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ）で分析した。
【００４５】
図１は、光合成条件のロドバクタースフェロイデス２．４．１野生型菌株（ＷＴ）の累積水素生産量及び成長曲線を示す。アンモニウムイオンが存在するシストロム最少培地を利用して試験を行い、エタノール（ＥｔＯＨ）は、最終濃度が各０．１％及び０．５％になるべく添加し、エタノールを添加しなかった対照群と同時に試験した。各実験条件で菌株の成長には大きな差が見られなかった。シストロム最少培地を用いる場合、成長がほぼ完了した時点から水素が発生するが、エタノールを添加しなかった対照群では、０．５２モル  Ｈ２／モル  コハク酸の水素生成効率を示した。これに対して、エタノールが各０．１％及び０．５％になるべく添加された実験群は、各５．０４モル  Ｈ２／モル  コハク酸及び５．７２モル  Ｈ２／モル  コハク酸の水素を発生して、１０倍以上の水素生産性増進効果が示された。
【００４６】
実施例２：エタノール添加時の窒素固定酵素活性測定
窒素固定酵素の活性は、アセチレン（Ｃ２Ｈ２）を基質として、エチレン（Ｃ２Ｈ４）が生成される速度を利用して測定した。窒素固定酵素は、基質として、窒素ガス（Ｎ２）以外にもプロトン（Ｈ＋）及びアセチレンを還元して各々水素ガス（Ｈ２）及びエチレンを生成する能力を持つ。従って、アセチレンの還元程度を介して窒素固定酵素の活性を測定することができる（Ｋｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９２．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３７：４９６−５００）。ロドバクタースフェロイデス菌株を１０Ｗ／ｍ２の光が与えられる光合成条件で成長させて窒素固定酵素の活性度を試験した。１０ｍｌの細胞（１０８ＣＦＵ／ｍｌ）をバイアル瓶（６５ｍｌ）に入れて、光が与えられる培養器で成長させ、１５０から２００の間のＫｌｅｔｔ  Ｕｎｉｔ（ＫＵ）まで育った細胞を実験に用いた。実験中の追加的な蛋白質合成を防ぐために、蛋白質合成阻害剤であるクロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）を５０μｇ／ｍｌの濃度で添加した後、内部のガスをアルゴンで置換した。アセチレンは、全体空気層の１０％となるようにガスタイトシリンジを利用して注入した。暗条件で１０分間培養した後、１０Ｗ／ｍ２の光を与えて反応を始めさせた。エチレンの量は、時間が経過したら空気層の一部をガスタイトシリンジを介して取り出してガスクロマトグラフィーで分析した。
【００４７】
図２は、光合成条件で培養されたロドバクタースフェロイデス菌株の窒素固定酵素活性を示す。エタノールを培地内に０．２％で添加した場合と、エタノールを添加しなかった対照群に対して試験を行った。その結果、エタノールの添加時に窒素固定酵素の活性は、１８．２ｎｍｏｌｅＫＵ−１ｈ−１と示され、対照群の活性である４．７ｎｍｏｌｅＫＵ−１ｈ−１に比べて約４倍が増加する現象が見られた。
【００４８】
従って、エタノール添加によるロドバクタースフェロイデスの水素生成能の増進は、窒素固定酵素活性の増加によって行われたことが確認された。
【００４９】
実施例３：窒素固定酵素欠損変異株製造及びエタノールの水素生成増進効果試験
ロドバクタースフェロイデス２．４．１の染色体ＤＮＡを公知の方法のとおり分離して、これを鋳型としてＮ−末端にＮｉｆＤ制限酵素部位を含む約０．６ｋｂの断片と、Ｃ−末端にＮｉｆＫに制限酵素部位を含む約０．７ｋｂの断片と、を重合酵素連鎖反応を利用して合成した（ＮｉｆＤ−Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＣＣＧ  ＡＧＡ  ＣＣＡ  ＡＣＡ  ＴＧＡ  ＡＧＣ  −３’、ＮｉｆＤ−Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＣＧ  ＣＧＡ  ＴＡＴ  ＧＧＴ  ＧＧＣ  −３’、ＮｉｆＫ−Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＴＡＣ  ＣＧＣ  ＡＴＧ  ＴＡＴ  ＧＣＧ−３’、ＮｉｆＫ−Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＧＡ  ＡＣＧ  ＡＧＡ  ＴＧＴ  ＣＧＧ−３’）。さらに、前記断片をＴ−ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＳｔｕＩ部位に２．０ｋｂの転写／翻訳終結（ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）及びスペクチノマイシン（ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）抵抗性遺伝子、Ｓｍｒ／Ｓｐｒ）（Ｐｒｅｎｔｋｉ，Ｐ．，  ａｎｄ  Ｋｒｉｓｃｈ，Ｈ．Ｍ．（１９８４）Ｇｅｎｅ（Ａｍｓｔ．）２９，３０３−３１３）をリガーゼで連結した後、得られたＤＮＡ断片を自殺ベクター（ｓｕｉｃｉｄｅ  ｖｅｃｔｏｒ）ｐＬＯ１（Ｌｅｎｚ  Ｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９４．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：４３８５−４３９３）にクローニングした。クローニングされた構造物は、ｐＬＯ１ベクター上に存在するカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）抵抗性遺伝子を利用して、カナマイシン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシンを各々２５、５０、５０μｇ／ｍｌの濃度で用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で選別してｐＤＣＳ１００を収得した。前記組み換えベクターを大腸菌Ｓ１７−１に形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）した後、ロドバクタースフェロイデスに下記方法で接合を介して入れた。ベクターを含む大腸菌細胞を対象宿主細胞と混ぜた後、平板培地に乗せて６時間から１２時間程度接合が起きるようにした後、該当抗生剤（Ｓｍ、Ｓｐ）が添加されたシストロム（Ｓｉｓｔｒｏｍ）限定平板培地に塗抹して形質転換された宿主細胞を得た。
【００５０】
大腸菌Ｓ１７−１は、アミノ酸中プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）を合成できない栄養要求変異株（ａｕｘｏｔｒｏｐｈ）であり、プロリンが欠乏した限定平板培地で育たなく、形質転換されなかった宿主細胞は、抗生剤カナマイシンを２５μｇ／ｍｌの濃度で添加した培地で育たないため、抗生剤抵抗性を持つ形質転換された宿主細胞を確保することができる。
【００５１】
それと共に、ｐＬＯ１ベクターは自殺ベクターであり、ロドバクタースフェロイデス内で複製されないため、相同組み換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を介して、ロドバクタースフェロイデス２．４．１の染色体上に単一交差（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）が導かれた。
【００５２】
また、ｐＬＯ１ベクターは、レバンスクラーゼ（Ｌｅｖａｎｓｕｃｒａｓｅ）をコードグするｓａｃＢ遺伝子を含有しており、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）が存在する培地でスクロースのポリマーを形成して細胞を殺すことになる。
【００５３】
従って、ストレプトマイシンとスペクチノマイシンを各５０μｇ／ｍｌの濃度で用いてスクロースを１５％の濃度で平板培地に添加して、ストレプトマイシンとスペクチノマイシンに対しては抵抗性を示すと同時にカナマイシンに対しては敏感性を示す二重交差（ｄｏｕｂｌｅ  ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）コロニーを選別した。このコロニーは、窒素固定酵素の単量体中ＮｉｆＤ及びＮｉｆＫを発現できないように構成された変異株として窒素固定酵素の活性を示すことができない。
【００５４】
ロドバクタースフェロイデス野生型菌株及び前記窒素固定酵素欠損菌株（ＮｉｆＤＫ  ｍｕｔａｎｔ）を１０Ｗ／ｍ２の光が与えられる実施例１の光合成条件で成長させて、水素ガスの生成程度を試験した。アンモニウムイオンが存在するシストロム最少培地を利用して試験し、細胞の成長及び水素生成誘導、そして生成された水素ガスの分析は実施例１の方法と同様に行われた。
【００５５】
図３は、光合成条件のロドバクタースフェロイデス菌株の累積水素生産量を示す。実験条件で二つの菌株の成長において大きな差は見られなかった。野生型菌株では図１の結果と同様にエタノールによる水素生成増進効果が観察された反面、窒素固定酵素欠損菌株ではエタノール添加有無と関係なく水素の生成が観察されなかった（図３）。従って、エタノール添加に伴う水素生成増加現象は、窒素固定酵素の活性によるものであることが確認された。
【００５６】
実施例４：アンモニウムイオンの存在有無に伴うエタノールの水素生成増進効果試験
本発明の内容に基づいて、エタノールを利用して水素を生産する場合にも窒素固定酵素のアンモニウムイオンによる活性阻害現象が起きるか否かを確認した。
【００５７】
実施例１に記載されたようにロドバクタースフェロイデス野生型菌株を１０Ｗ／ｍ２の光が与えられる光合成条件で成長させて、水素ガスの生成程度を試験した。アンモニウムイオンの効果を確認するために、最適な水素生成のためにアンモニウムが除去された変形培地（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．２００２．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６０：１４７−１５３）と、この培地に２ｍＭの塩化アンモニウムを添加した二つの条件で行った。
【００５８】
生成された水素ガスの分析は、実施例１の方法と同様に行われた。菌体の成長速度は、エタノールの添加可否と関係なく、０ｍＭアンモニウムイオン条件が２ｍＭアンモニウムイオン条件より全般的に遅れたが、成長を終えた時の細胞数は、全ての条件においてほぼ同じであった（図４）。
【００５９】
前記組成が変形された培地を利用して細胞を成長させると、細胞成長初期から水素ガスが発生する。水素ガスの測定結果、０．２％のエタノール添加条件では、０ｍＭのアンモニウム存在時と比較した時、２ｍＭのアンモニウム存在時にも８０％以上の水素生成能が残存した（図４）。これは、エタノールが添加されなかった対照群では、アンモニウム存在時の水素生成能が１０％以下となり大きく減少するのに対して、画期的に向上したアンモニウムイオンに対する抵抗性を示す（図４）。エタノールが添加された場合には、アンモニウムイオンが存在しても窒素固定酵素の活性は８０％以上を維持した。
【００６０】
実施例５：多様な紅色非硫黄細菌（ｐｕｒｐｌｅ  ｎｏｎ−ｓｕｌｆｕｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）を対象にしたエタノールの水素生成増進効果試験
紅色非硫黄細菌（ｐｕｒｐｌｅ  ｎｏｎ−ｓｕｌｆｕｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）として、ロドバクタースフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）以外にも水素生産のために代表的に用いられる菌株であるロドバクターカプスラタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）及びロドスピリルムラブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ）を対象にして、エタノール添加による水素生成増進可否を確認した。
【００６１】
ロドバクターカプスラタスの亜種としては、ＳＢ１００３を、ロドスピリルムラブラムの亜種としては、ＵＲ１を用い、これはこれらの菌株が各種内で最も広く研究された亜種であるためである。ロドバクターカプスラタススの成長のために、アンモニウムイオンが除去され変形されたシストロム最少培地を、ロドスピリルムラブラムの成長のためにはＭＧ最少培地（Ｌｅｈｍａｎ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ．１９９１．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：５７０５−５７１１）を用いた。
【００６２】
各菌株１０８ｃｆｕ／ｍｌを上述した各培地に接種した後、１０Ｗ／ｍ２の光が与えられる光合成条件３０℃、嫌気条件で１２０時間培養しながら、成長させて水素ガスの生成程度を試験した。エタノールは、０．２％の最終濃度になるように処理し、細胞の成長及び水素生成誘導、そして生成された水素ガスの分析は、実施例１の方法と同様に行われた。
【００６３】
その結果、ロドバクターカプスラタスの水素生成量が、約１．５倍増進されたが、実験条件でロドスピリルムラブラムの水素生成増進効果は起きなかった。
【００６４】
紅色非硫黄細菌の光合成培養時エタノールの添加に伴う水素生成増進可否
【表１】
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（増進倍数：アルコール添加時水素生成量／米添加時水素生成量）
【００６５】
実施例６：水素生成増進のためのエタノール添加最適濃度及び時期
水素生成増進のためのエタノール添加の最適濃度及び添加時点を確認した。ロドバクタースフェロイデス菌株にエタノールの濃度を０．０１％〜２％の体積当たり体積濃度（体積／体積％）で互いに異なるように添加して、光合成条件で成長させて累積水素生成量を測定した。
【００６６】
１％のエタノール添加条件とは異なり、２％のエタノールが培地に添加されると、細胞成長が阻害され、この条件では水素生成量の増加程度が顕著に減少した。また、０．０５％未満の濃度でエタノールを添加した場合には、水素生成に対する誘導現象が殆ど見られなかった。従って、水素生成増進のために、エタノールの濃度を０．０５％から２％の範囲以内で添加して用いることができるが、より好ましくはエタノールを０．１％から１％の濃度範囲内で添加して用いた方法が適切な方法といえる。
【００６７】
図５は、エタノールの添加時点に伴う細胞の成長曲線及び累積水素生成量を示す。１０ＫＵになるように細胞を接種して細胞の成長を始めた場合、約２４時間以後に細胞の数は３００ＫＵ近所に達し、これ以上増えない。しかし、水素生成が確認される時点は、接種後３０時間以後であり、細胞の数が増えない範囲にてエタノール誘導による水素生成が起きることになる。前記理由から、エタノールの培地内での添加時点を互いに異なるようにして、その効果を調べた。
【００６８】
その結果、細胞の接種と同時（１０ＫＵ）、または細胞成長初期（１００ＫＵ）時点にエタノールが添加された場合に、細胞成長後期（３００ＫＵ）時点にエタノールが添加された場合に比べて水素生成誘発効果がより大きく現れた（図５）。これは、水素が活発に発生する時点が接種してから３０時間以後であっても、細胞成長序盤からエタノールが存在する場合に、その誘発効果が大きく現れる結果となり、細胞が活発に育つ間にエタノール作用に伴う水素生成活性誘導が、相当成り立つことが分かる。
【００６９】
実施例７：水素生成培地内コハク酸及びエタノールの濃度変化分析
培地内主要炭素源であるコハク酸とエタノールの濃度、及び窒素固定酵素の活性に影響を及ぼすアンモニウムイオンの効果を調べた。水素生成条件は、実施例１と同様である。培地内のコハク酸の濃度は、ＨＰＬＣを利用して分析した。これのために、Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈ有機酸カラム（ｃｏｌｕｍｎ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、ろ過された３０μｌの培地を注入して分析した。その分析条件は、移動相として０．０１Ｍ硫酸（Ｈ２ＳＯ４）を用いて、オーブン温度は６０℃、移動相の移動速度を０．６ｍｌ／ｍｉｎにした。培地内エタノールの濃度は、アルコール酸化酵素（ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を利用したＥｎｚｙｃｈｒｏｍ  ｅｔｈａｎｏｌ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｂｉｏａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）を用いて分析した。エタノールが培地に添加されても、コハク酸が炭素源として消費される速度は、エタノールを添加しなかった対照群とさほど差を示すことなく、細胞が成長する間持続的に消費されることが分かった（表２）。これとは異なり、エタノールは、培地内に初期に添加した濃度である５μｌ／ｍｌ（０．５％）がそのまま残存する現象が見られた（表３）。従って、添加したエタノールは、コハク酸のように炭素源として用いられるのではなく、培地内にそのまま残存して窒素固定酵素の活性に影響を与えることが明らかになった。
【００７０】
ロドバクタースフェロイデスの光合成培養時の培地内コハク酸の濃度変化
【表２】
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【００７１】
ロドバクタースフェロイデスの光合成培養時の培地内エタノールの濃度変化
【表３】
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【００７２】
実施例８：多様なアルコール（ａｌｃｏｈｏｌ）を利用した水素生成増進効果試験
エタノール以外のアルコール類に対する水素生成増進効果の可否を調べた。エタノール以外にもメタノール［ｍｅｔｈａｎｏｌ、ＣＨ３ＯＨ］、プロパノール［ｐｒｏｐａｎｏｌ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ］、イソプロパノール［ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ、（ＣＨ３）２ＣＨＯＨ］、ブタノール［ｂｕｔａｎｏｌ、ＣＨ３（ＣＨ２）２ＣＨ２ＯＨ］、イソアミルアルコール［ｉｓｏａｍｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ、（ＣＨ３）２ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＯＨ］を利用して試験した。実施例１と同様な条件でロドバクタースフェロイデス野生型菌株に各アルコールを０．１％、０．２％、０．５％、１．０％の濃度で添加した後、１０Ｗ／ｍ２の光が与えられる光合成条件で成長させて、水素ガスの生成程度を試験した。メタノールを各濃度別に培地に添加した場合、１．０％においてだけ細胞成長の阻害が見られたが、残りの条件では細胞の成長に大きな影響を及ぼすことはなかった。メタノールを０．１％、０．２％、０．５％の濃度で処理した場合、水素ガス生成量が増加することが見られ、０．２％添加された場合、その効果が最も大きく現れた（図６）。プロパノールを各濃度別に培地に添加した場合、０．１％、０．２％、０．５％、１．０％の全ての条件で、水素ガス生成量が増加することが観察され、０．５％添加された場合、その効果が最も大きく現れた（図６）。イソプロパノールで処理した場合にも対照群に比べて約３５％程度の水素生成量を増進させることが明らかになったが、その効果は、エタノール、プロパノール、ブタノールに比べて僅かであった。ブタノールを各濃度別に培地に添加した場合、１．０％を添加した条件を除いて０．１％、０．２％、０．５％の条件で水素ガス生成量が増加することが観察され、０．２％が添加された場合、その効果が最も大きく現れた（図６）。イソアミルアルコールで処理した場合には、細胞成長を顕著に抑制し、却って水素生成効率を低減させた。従って、ロドバクタースフェロイデスを利用した水素生成時、エタノール以外にもメタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノールを添加して、水素生成効率増加を誘導することができ、より好ましくはエタノールの代わりにプロパノール、またはブタノールが用いられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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