(57)【要約】本発明は、生物学的製剤の精製作業の開始時に細胞培養上清のｐＨを複数回変化させることによって、プロテアーゼを不活性化するための方法に関する。最初に３〜５のｐＨに、続いて７〜９のｐＨに設定される。
2013534143.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養から得られた液体中のプロテアーゼを不活性化するためのプロセスであって：
（ａ）該液体のｐＨを３〜５に調整する段階、および次に
（ｂ）該液体のｐＨを７〜９に調整する段階
を含むプロセス。
【請求項２】
細胞培養から得られた液体中のタンパク質の分解を減少させるためのプロセスであって、
（ａ）該液体のｐＨを３〜５に調整する段階、および次に
（ｂ）該液体のｐＨを７〜９に調整する段階
を含むプロセス。
【請求項３】
段階（ａ）でのｐＨが、３．５〜４．５の範囲であることを特徴とする、請求項１または２記載のプロセス。
【請求項４】
段階（ａ）でのｐＨが、５分〜３０分間維持されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項５】
段階（ａ）でのｐＨが、２０〜３０℃の温度で行われることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項６】
段階（ｂ）でのｐＨが、７．４〜８．５の範囲であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項７】
段階（ｂ）でのｐＨが、５分〜６０分間維持されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項８】
段階（ｂ）でのｐＨが、２０〜３０℃の温度で行われることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項９】
液体が、哺乳動物細胞培養物由来の液体であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項１０】
液体が、哺乳動物細胞培養物由来の無細胞液体であることを特徴とする、請求項９記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
技術分野
本発明は、生物学的製剤の製造の分野に属する。本発明は、特に無細胞の細胞培養上清中のタンパク質分解活性酵素を不活性化することによって生物学的製剤を調製するプロセスを改良することに関する。
【０００２】
背景
タンパク質、ポリヌクレオチド、多糖などの生体分子は、医薬として、診断用薬として、食品添加物、界面活性剤などとして、研究用試薬として、および多数の他の応用に、ますます商業的重要性を勝ち取りつつある。通常は、例えばタンパク質の場合、天然起源から分子を単離することではそのような生体分子のニーズにもう応えることができず、バイオテクノロジーの生産方法を使用する必要がある。
【０００３】
タンパク質のバイオテクノロジー調製は、典型的には適切な発現ベクターへのＤＮＡフラグメントのクローニングから始まる。適切な原核または真核発現細胞に発現ベクターをトランスフェクションし、続いてトランスフェクションされた細胞を選択した後に、後者を発酵槽中で培養し、所望のタンパク質を発現させる。次に、細胞または培養上清を回収し、その中に含有されるタンパク質を処理し、精製する。
【０００４】
回収された液体中に、例えば無細胞の培養上清中にプロテアーゼが存在することが知られている。モノクローナル抗体またはリコンビナントタンパク質などの生物学的製剤、および固定化プロテインＡなどのクロマトグラフィー材料は、両方とも、プロテアーゼによって非常に急速に分解する、または構造が損傷するおそれがある。これは、生成物の品質（均質性、機能性）を危うくすることにつながり、クロマトグラフィー材料では、結合能が減少し、結果として結合した生成物画分の汚染につながる。特に無血清培養および高生産性細胞では、生産される生物学的製剤は、高い相対濃度で存在し、したがって分子構造のタンパク質分解性損傷を特に受けやすく、低下した収率およびより低い生成物品質の両方につながる。
【０００５】
プロテアーゼによって起こるタンパク質の損傷は、中性ｐＨであっても起こるおそれがあるが、大規模なタンパク質分解は、特に、精製プロセスのために、例えば捕捉段階、例えば陽イオン交換クロマトグラフィーに望まれる結合条件を生み出す（コンディショニングする）ために、無細胞培養上清を酸性ｐＨレベルに調整しなければならない場合に観察されるおそれがある。
【０００６】
いくつかのプロテアーゼ、例えばペプシンなどの消化酵素が、ｐＨレベルの変化によって不可逆的に不活性化されることが知られている（Z. Bohak, Purification and Characterization of Chicken Pepsinogen and Chicken Pepsin, Journal of Biological Chemistry 244 (17) (1969) 4633-4648; B. Turk, V. Turk, Lysosomes as Suicide Bags in Cell Death: Myth or Reality?, Journal of Biological Chemistry 284 (33) (2009) 21783-21787）。プロテアーゼ阻害剤の添加も提案されている（A.J. Barrett, A. A. Kembhavi, M. A. Brown, H. Kirschke, C. G. Knight, M. Tamai and K. Hanada, L-trans-Epoxysuccinyl-leucylamido(4-guanidino)butane (E-64) and its analogues as inhibitors of cysteine proteinases including cathepsins B, H and L, Biochem. J. 201 (1982) 189-198）。しかしながら、これらは非常に高価で、有毒であり、生成物からの除去が困難である。したがって、これらは安全な医薬を経済的に生産するための選択肢ではない。
【０００７】
発明の簡潔な概要
本発明は、生物学的製剤の精製プロセスの開始時に、細胞培養上清のｐＨを何度も変化させることによってプロテアーゼを不活性化する方法に関する。本発明の利点は、生成物の品質および生成物の収率の改良、ならびにクロマトグラフィー材料に関するより長い寿命である。
【０００８】
驚くことに、回収された、哺乳動物細胞系（例えばＣＨＯ、「チャイニーズハムスター卵巣」細胞）の無細胞発酵上清が、酸性ｐＨに変化させることによって活性化することできるプロテアーゼであって、また、続いてｐＨを中性範囲に変化させることによって至適ｐＨでのその活性を不可逆的に不活性化することができるプロテアーゼを含有することが見出された。中性ｐＨレベルで活性なプロテアーゼもまた、酸性ｐＨレベルに変化させることによって中性条件下でその活性を不可逆的に不活性化することができる。
【０００９】
本発明は、特に、細胞培養物から得られた液体中のプロテアーゼを不活性化するためのプロセスであって：
（ａ）その液体のｐＨを３〜５に調整する段階、および次に
（ｂ）その液体のｐＨを７〜９に調整する段階
を含むプロセスに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ｐＨを２回変化させることによる、ＣＣＦ由来のプロテアーゼの活性化および不活性化を示す図である。
【図２】酸性ｐＨにおけるモデル基質であるインターフェロン（ＩＦＮ）の分解を示す図である。０．１mg/mlインターフェロンを、ｐＨ４において１０％(v/v)細胞培養上清（ＣＣＦ）と共に３７℃で０または１４時間、ｐＨ変化を行って、およびｐＨ変化を行わずにインキュベーションし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した（レーン２〜４）。ｐＨの変化は、２０℃にてｐＨ４およびｐＨ７で５分停止させて行った。ＩＦＮの分解は、ｐＨ変化を行った場合の方がｐＨ不活性化を行わない場合よりも有意に少ない（レーン３）。１４時間後にＩＦＮは完全に分解した（レーン４）。レーンの配置：１  −  マーカー；２  −  インキュベーション前のＩＦＮ（０．１mg/mL）；３  −  ＣＣＦ＋ＩＦＮ（ｐＨ４）、ｐＨ変化を行う、インキュベーション１４時間；４  −  ＣＣＦ＋ＩＦＮ（ｐＨ４）、ｐＨ変化を行わない、インキュベーション１４時間。
【図３】１０％(v/v)のＣＣＦと共にｐＨ４．０で３時間インキュベーションすることによるタンパク質ＩＦＮの分解のＲＰ−ＨＰＬＣによる分析を示す図である。中和によりプロテアーゼを不活性化し、続いてＩＦＮと共にｐＨ４．０でインキュベーションした後、３時間後に、ＩＦＮの７２％がＲＰ−ＨＰＬＣによってまだ検出することができ、一方で同時に不活性化を行わない場合、ＩＦＮの４３％だけがまだインタクトであった。したがって、タンパク質分解活性を野生型タンパク質の半分に減少させることができる。
【図４】酸性ｐＨおよび中性ｐＨにおける蛍光アッセイを示す図である。ＣＣＦ中のプロテアーゼは、ｐＨ３．５（●）およびｐＨ７（△）で活性である。ｐＨ３．５およびｐＨ７でＣＣＦ中に存在するプロテアーゼによって生じるタンパク質分解活性の測定値として、ペプチド基質を切断することによるフルオロフォアの放出を測定した。
【図５】ｐＨ変化を行う場合およびｐＨ変化を行わない場合における中性プロテアーゼのタンパク質分解活性を示す図である。中性プロテアーゼは、ｐＨ＜５への酸性化およびその後の中和によってほぼ完全に、そして不可逆的に不活性化することができる。それぞれの場合にｐＨ７で測定を行い、ペプチド基質を切断することによるフルオロフォアの放出を、タンパク質分解活性の測定値として測定した。
【図６】ｐＨ変化を行わない場合およびｐＨ変化を行う場合における酸性プロテアーゼのタンパク質分解活性を示す図である。図１と同じようにｐＨを変化させることによって、ＣＣＦ中のプロテアーゼの活性化／不活性化を行った。活性化したプロテアーゼはｐＨ＜５で活性であり、基質を切断する。ｐＨ≧７での短時間インキュベーションによって不活性化された活性化プロテアーゼは、ｐＨ３．７で３５％に減少した残留活性を示す。測定は、それぞれの場合にｐＨ３．７で実施し、ペプチド基質を切断することによるフルオロフォアの放出を、タンパク質分解活性の指標として測定した。
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、精製プロセスの開始時に細胞培養上清のｐＨを何度も変化させることによってプロテアーゼを不活性化するためのプロセスに関する。本発明の利点は、生成物の品質および収率の改良ならびにクロマトグラフィー材料の寿命の延長である。
【００１２】
驚くことに、回収された哺乳動物細胞系（例えばＣＨＯ、「チャイニーズハムスター卵巣」細胞）の無細胞発酵上清は、酸性ｐＨに変化させることによって活性化することができ、また、続いてｐＨを中性範囲に変化させることによって至適ｐＨでのその活性を不可逆的に不活性化することができるプロテアーゼを含有することが見出された。中性ｐＨ値で活性なプロテアーゼもまた、酸性ｐＨレベルに変化させることによって中性条件下でその活性を不可逆的に不活性化することができる。
【００１３】
別の局面では、本発明は、細胞培養物から得られた液体中のタンパク質分解を減少させるためのプロセスであって：
（ｃ）その液体のｐＨを３〜５に調整する段階、および次に
（ｄ）その液体のｐＨを７〜９に調整する段階
を含むプロセスに関する。
【００１４】
細胞培養上清の酸性化後に、存在するプロテアーゼの活性化が明らかに起こり、これは、本来リソソーム性のタンパク質分解酵素（カテプシン）が存在することを示している。これらのプロテアーゼは、エンドサイトーシス性タンパク質の分解に関与し、全ての組織中に不活性なプロ形態として一様に発現し、細胞内のエンドソーム中に位置する。これらの区画が成熟してリソソームを形成することに伴って、ｐＨが激しく低下し、それがリソソーム性プロテアーゼの自己触媒性活性化とトランスの活性化の両方につながる。細胞外腔へのカテプシンの分泌は、主に腫瘍組織の転移に関連して議論されており、いくつかの個別のカテプシンについては、細胞培養物中への分泌も記載されている。
【００１５】
中性ｐＨ値でのタンパク質分解活性は、一方で分泌されたプロテアーゼに、他方で、本来は膜内に位置するが、おそらく製造プロセス中に細胞膜から分離され、溶液中で活性であり続けるプロテアーゼによるものとすることができる。
【００１６】
典型的には、生物学的製剤プロセスにおいて、細胞は、生成物を含有する細胞培養上清から遠心分離または濾過によって分離される。次に、無細胞上清が無菌濾過（最大孔径０．２μM）され、再緩衝化のためにダイアフィルトレーションされた後、捕捉段階が続く。ｐＨを２回変化させることによる不活性化を、細胞から細胞培養上清を分離した直後の最初期に行い、それをその後、任意の他の加工段階に使用することができる。
【００１７】
ｐＨレベルを選択する場合、生成物の分子および技術装置が損傷してはならず、したがってｐＨレベル＜３（生成物タンパク質の化学修飾およびスチール製容器の腐食増加）ならびにｐＨ＞９（アスパラギンおよびグルタミンの脱アミド）は回避しなければならない。それぞれのｐＨ値での保持時間も生成物タンパク質の安定性に依存する。酸性化によるプロテアーゼの活性化に関する時間枠は、できるだけ短くなければならないが、有利には少なくとも５分（min）である。例えば、５から３０分の間、好ましくは５〜１５分の保持時間が有利である。酸性ｐＨレベルで活性化のための保持時間がより長いと、ターゲットタンパク質のタンパク質分解が増加するおそれがある。中性ｐＨでの酸性プロテアーゼの不活性化のためのその後の保持段階の時間枠は重要ではなく、ｐＨは、いくつかのプロセス段階にわたり維持することもでき、または再度変更することもできる。それは、全ての中性活性プロテアーゼがすでに不活性化されており、それ以上タンパク質分解活性を検出することができないからである。中和段階のための有利な保持時間は、例えば５〜６０分である。
【００１８】
それぞれのターゲットｐＨ値への調整は、１回添加によって、あるいは撹拌しながら酢酸もしくは塩酸などの酸または水酸化ナトリウム溶液もしくはトリスなどのアルカリ液／塩基を滴定することによって、溶液中で行うことができる。酸段階では、有利には３から５の間のｐＨ値、例えばｐＨ３．５〜４．５、好ましくは４が選択される。その後の中和による酸性プロテアーゼの不活性化のために、７〜９、好ましくはｐＨ７．４〜８．５のｐＨ値が有効であることが証明された。
【００１９】
本発明は、４℃〜３７℃、好ましくは１５℃〜３７℃、好ましくは２０〜３７℃の温度範囲で行うことができる。本発明を実施するために好ましい範囲は、２０℃〜３０℃である。
【００２０】
ｐＨを２回変えることによって酸性および中性プロテアーゼを不活性化するためのプロセスは、哺乳動物細胞（ＣＨＯおよびＮＳ０）の無細胞培養上清でうまく行われた。結果は、他の生産生物の培養上清にもあてはめることができ、生成物タンパク質の要件、特にそのｐＨ安定性の範囲内で様々な生物学的製剤の製造に使用することができる。
【００２１】
本発明は、純粋に物理化学的な方法および生化学的な方法を利用する。異なるｐＨユニットを介してｐＨを２回変化させることによって（図１）、酸性プロテアーゼ活性の最大７５％および中性プロテアーゼ活性の最大９０％を不可逆的に除去することができる。プロテアーゼ活性は、二つの検出方法、すなわち、ａ）ペプチド切断後の蛍光放出、およびｂ）ネイティブなタンパク質基質の分解による検出方法を使用して、検出することができる。
【００２２】
生成物および装置に有害なプロテアーゼは、迅速で簡単な物理化学的方法によって生物学的製剤医薬の製造中に不可逆的に不活性化することができる。結果として、細胞培養上清は、様々な方法で使用することができ、様々な精製技法によって得ることができる。
【００２３】
タンクへの酸およびアルカリ液の添加は、実施が非常に迅速かつ簡単であり、工業応用のために大規模化することもできる。プロテアーゼの不活性化後に、細胞培養上清を非常に多様な方法で精製プロセスに適合させることができる。従来の製造プロセスに比べて、停止時間またはｐＨ値は重大でない。
【００２４】
実施例
作業実施例１：回収後、捕捉段階前のｐＨ変化
ＣＨＯ細胞を最終体積８０Ｌの流加培養で１１日間成長させる。細胞培養上清（ＣＣＦ）を２０℃に維持し、貫流（throughflow）ディスク遠心分離機を使用して細胞から分離し、フィルターカスケードを通過させて無菌濾過する。次に、酢酸の添加によりＣＣＦのｐＨ値をｐＨ４に低下させる。ターゲットｐＨに到達した後、それを５〜１０分間維持してから、水酸化ナトリウム溶液の添加によってＣＣＦをｐＨ７．５に中和する。さらに処理する（捕捉段階）前に、捕捉段階に適切な結合条件を得るために、ＣＣＦに５０kD ＭＷＣＯメンブランを通過させて限外濾過／ダイアフィルトレーションする。
【００２５】
作業実施例２：ＣＣＦと細胞の分離直後、無菌濾過前のｐＨ変化
ＣＨＯ細胞を最終体積８０Ｌの流加培養で１１日間成長させる。細胞培養上清（ＣＣＦ）を貫流ディスク遠心分離機を使用して細胞から分離し、２０℃に維持する。次に、常に撹拌しながら酢酸を添加することによりＣＣＦのｐＨ値をｐＨ４に低下させる。ターゲットｐＨに到達した後、それを５〜１０分間維持してから、水酸化ナトリウム溶液の添加によってＣＣＦをｐＨ７．５に中和する。次に、処理されたＣＣＦにフィルターカスケードを通過させて無菌濾過する。さらに処理する（捕捉段階）前に、捕捉段階に適切な結合条件を得るために、ＣＣＦに５０kD ＭＷＣＯメンブランを通過させて限外濾過／ダイアフィルトレーションする。
【００２６】
作業実施例３：ｒＰｒｏｔＡ捕捉段階後、ウイルスの不活性化前のｐＨ変化
ＣＨＯ細胞を最終体積８０Ｌの流加培養で１１日間成長させる。細胞培養上清（ＣＣＦ）を貫流ディスク遠心分離機を使用して細胞から分離し、フィルターカスケードを通過させて無菌濾過し、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）を用いるｒプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーである捕捉段階に適切な結合条件を得るために、５０ｋD ＭＷＣＯメンブランを通過させて限外濾過／ダイアフィルトレーションする。MabSelectクロマトグラフィーカラムに、カラムマトリックス１mLあたり３２mgのｍＡｂをチャージし、酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）を用いた段階で抗体を溶離させる。撹拌しながら１Ｍトリスを添加することによって、生成物を含有する画分のｐＨをｐＨ７．５に調整し、そのｐＨを周囲温度で１０分間維持してから、ウイルスの酸性不活性化に適切な条件を選択する。
【００２７】
材料および方法
細胞培養上清
治療用タンパク質の分泌生産のために最適化されたマウス生産細胞系およびＣＨＯ生産細胞系を無血清培地中で数日間培養する。細胞培養上清（ＣＣＦ、無細胞の細胞培養液）を濾過または遠心分離によって細胞および不溶性成分から分離し、それぞれのｐＨに調整後、１０〜２０％(v/v)で活性アッセイのために使用する。
【００２８】
ｐＨ値の調整
細胞培養上清を酢酸の添加によって酸性化する。試料を直ちに混合し、選択されたｐＨで５〜１０分間インキュベーションする。沈降成分を遠心分離によってペレットにし、捨てる。水酸化ナトリウム溶液または１Ｍトリス塩基の添加によってｐＨを上昇させる。
【００２９】
プロテアーゼの種類を決定するための阻害実験
個別の種類のプロテアーゼを阻害するために、ＣＣＦを異なる市販阻害剤と共にインキュベーションし、次に、残留活性があれば活性アッセイで調べる。使用した阻害剤の濃度は、製造業者が推奨する濃度である。
【００３０】
活性アッセイ
蛍光アッセイ、フルオロフォアの放出による分析
タンパク質分解活性の動態測定および定量測定に使用される基質は、種々のペプチド−フルオロフォア結合体であり、その切断は、アミノメチルクマリン（ＡＭＣ）などの蛍光色素の放出またはＮ−メチルアミノベンゾイル−ジアミノプロピオン酸（Ｎｍａ）に対するジニトロフェニル（Ｄｎｐ）の消光作用の消失につながる。蛍光シグナルの増加は、Multilabel-Counter Victor2, 3（Perkin Elmer, Massachusetts, USA）を用いてλＥｘ＝３８０nm；λＥｍ＝４６０nm（ＡＭＣ）、λＥｘ＝３４０nm；λＥｍ＝４６０nmで測光的にモニターしてもよい（図３）。
【００３１】
動態分析および定量分析のための全てのアッセイを、０．２mMペプチド−ＡＭＣ、１０〜２０μMペプチド−ＭＣＡまたは５〜１０μM ＤｎＰ−ペプチド−Ｎｍａの基質飽和で、１０〜２０％(v/v)ＣＣＦの存在下、ｐＨ７（１００mMトリス／ＨＣｌ、２００mM ＮａＣｌ）およびｐＨ３．５（１００mM 酢酸Ｎａ、２００mM ＮａＣｌ）において実施する。
【００３２】
分解アッセイ、ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣによる分析
タンパク質分解活性の定性分析に使用される基質は、インターフェロンファミリー（ＩＦＮ）のネイティブなタンパク質である。ＩＦＮは、分子量が２２．５kDであり、溶液中でモノマーとして存在する。分解アッセイのために、０．１mg/ml ＩＦＮを１０％(v/v)ＣＣＦと共に３７℃、ｐＨ４で最大２４時間インキュベーションし、ＳＤＳ−ＰａｇｅおよびHeukeshovenによる銀染色によって検出する（Heukeshoven, J., Dernick, R., Improved silver staining procedure for fast staining in PhastSystem Development Unit. I. Staining of sodium dodecyl sulphate gels. Electrophoresis, 9, (1988) 28-32.）か、またはタンパク質の分解をタンパク質分解活性の測定値としてＲＰ−ＨＰＬＣによって決定する。
【００３３】
ＲＰ−ＨＰＬＣ分析は、Vydac 214 TP-C4カラムを使って水中に０．２％(v/v)ＴＦＡ（溶液Ａ）からアセトニトリル中に０．１５％(v/v)ＴＦＡ（溶液Ｂ）の勾配溶離によって、ＵＶ検出器（Waters 2487 Dual Absorbance Detector）を備えるWaters製ＨＰＬＣ装置（Waters 2695 alliance）で行う（表１）。
【００３４】
表１：ＲＰ−ＨＰＬＣ−Ｃ４カラムについての溶離勾配。勾配は水性溶媒から有機溶媒に移行する。
時間        溶液Ａ      溶液Ｂ
［min］    ［％］      ［％］
５．０      ６０        ４０
１５．０    ３０        ７０
１５．１    １０        ９０
１９．０    １０        ９０
１９．１    ６０        ４０
２１．０    ６０        ４０
【００３５】
結果
ＣＣＦ由来プロテアーゼによる基質切断は、酸性ｐＨ値ｐＨ＜５およびｐＨ７付近の中性範囲に位置する２個のピークを有する。それぞれのプロテアーゼの活性は、タンパク質の分解および蛍光発生ペプチド基質の切断後の蛍光放出によってモニターすることができる（図２および４）。図２に、１０％(v/v)ＣＣＦ存在下、ｐＨ４でのＩＦＮの分解を示す。わずか２、３時間後にＩＦＮは酸性条件下で分解し（レーン４）、図４に、ｐＨ３．５およびｐＨ７でインキュベーション後の２０％(v/v)ＣＣＦによるＤｎｐ−ペプチド−Ｎｍａ基質の切断の経時的な進行を示す。漸増する蛍光シグナルが、ペプチド基質切断の測定値である。活性を、酸性および中性ｐＨ値の両方で観察する。
【００３６】
この活性は、プロテアーゼの種類に特異的な阻害剤によって抑制することができるので、ＣＣＦ中にいくつかの種類のプロテアーゼが存在し、２群、すなわち低ｐＨレベルでのみ活性な酸性活性プロテアーゼおよび中性ｐＨレベルでのみ活性な中性活性プロテアーゼに分類できることを示している。酸性活性プロテアーゼは、中性ｐＨ値で活性を有さず、中性活性プロテアーゼは酸性ｐＨ値で活性を有さない。中性活性プロテアーゼは細胞分離時にすでに活性であるが、ＣＣＦ中の酸性活性プロテアーゼの活性化は、反応条件が酸性化されるまで起こらない。
【００３７】
中性プロテアーゼを不活性化するためのｐＨ二段階変化
未処理ＣＣＦ由来の中性プロテアーゼの活性は、ｐＨ７で蛍光アッセイにより測定することができる（図５、丸印）。ｐＨ７からｐＨ＜５に続いて中和という二段階変化にＣＣＦが供されるとき、ｐＨ７の蛍光アッセイでは実質的にさらなる活性を検出することができない（図５、三角印）。
【００３８】
ＣＣＦの短時間酸性化およびその後の中和は、中性活性プロテアーゼのタンパク質分解活性の不可逆的な全消失につながる。
【００３９】
酸性プロテアーゼを不活性化するためのｐＨ二段階変化
ＣＣＦの酸性化によって活性化されるプロテアーゼのタンパク質分解活性は、蛍光アッセイおよびタンパク質分解アッセイにおいてｐＨ３．５で検出することができる（図６、四角印）。しかしながら、酸性化後にＣＣＦを中和すると、この活性は維持されない。中和後に酸性プロテアーゼに至適なｐＨ３．５の反応条件を復元すると、蛍光アッセイで測定可能な酸性プロテアーゼの活性は、未処理ＣＣＦに比べて最大６５％減少する（図６、三角印）。
【００４０】
タンパク質の分解もまた、ｐＨの二重変化によって減少する。モデルタンパク質であるＩＦＮの分解は、中和段階後に有意に減少する（図３、灰色棒線）。
【００４１】
ｐＨを何度も変化させる結果として、ネイティブなタンパク質基質であるＩＦＮの分解を５０％減少させることが可能であった（図３、ＲＰ−ＨＰＬＣによる定量）。
【図２】
2013534143.tif 000003
【図１】
2013534143.tif 000004
【図３】
2013534143.tif 000005
【図４】
2013534143.tif 000006
【図５】
2013534143.tif 000007
【図６】
2013534143.tif 000008
【国際調査報告】
2013534143.tif 000009
2013534143.tif 000010
2013534143.tif 000011
2013534143.tif 000012
2013534143.tif 000013
2013534143.tif 000014