(57)【要約】  細胞療法適用のための細胞を培養する方法であって、抗原提示細胞、フィーダ細胞、またはその両方の存在下において、培地量対表面積の比は、増殖表面が気体透過性材料を含まない場合は１ｍｌ／ｃｍ２以下であり、増殖表面が気体透過性材料を含む場合は２ｍｌ／ｃｍ２以下であって、所望の細胞を増殖させる工程を含む方法。所望の細胞は、生産サイクルの始めには表面密度が０．５×１０６細胞／ｃｍ２未満であり、所望の細胞の表面密度と、前記抗原提示細胞、フィーダ細胞、またはその両方の表面密度との和は、少なくとも約１．２５×１０５細胞／ｃｍ２である。
2013512694.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を生産する方法において、
抗原提示細胞、フィーダ細胞、またはその両方の存在下において所望の細胞を増殖させる工程であって、表面積に対する培地量の比は、増殖表面が気体透過性材料を含まない場合には１ｍｌ／ｃｍ２以下であり、増殖表面が気体透過性材料を含む場合には２ｍｌ／ｃｍ２以下である、前記工程を含み、
前記所望の細胞の表面密度は、生産サイクルの始めには０．５×１０６細胞／ｃｍ２未満であり、前記所望の細胞の表面密度と、前記抗原提示細胞、フィーダ細胞、またはその両方の表面密度との和は、約１．２５×１０５細胞／ｃｍ２以上である、細胞を生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、細胞を培養する方法に関し、より具体的には細胞療法のための細胞を培養することに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養は、細胞療法のコストおよび複雑さの大きな要因である。現在の方法では、細胞を培養する処理は時間がかかり高価である。多くの細胞を生産するために、インビトロの培養工程は、典型的に、段階的に進行するように行なわれる。最初の段階では所望の細胞は、細胞培養装置中に配置される細胞組成物内において、比較的小さな集団として存在する。この段階では、細胞組成物は、所望の細胞源（末梢血単核細胞など）、所望の細胞の増殖を刺激するフィーダ細胞、および／または抗原提示を典型的に含む。細胞の存在する培地をおおむね無撹拌状態とすることの可能な培養装置および培養方法は、細胞が比較的無撹拌のままであるので好まれる。このような装置には、標準組織培養プレート、フラスコおよびバッグが含まれる。培養は段階的に進行され、この段階は一般に、細胞組成物がグルコースなどの増殖基質の培地を枯渇させることができるようにすること、使用済み培地を除去すること、使用済み培地を新鮮培地に交換すること、および、所望の細胞を所望量得られるまでこの処理を繰り返すことからなる。所望の細胞集団が増加するとともに追加の増殖表面が必要になるにつれて、新たな生産段階を開始するために、他の装置に細胞組成物をしばしば移動させる。しかしながら、従来の方法では、増殖表面上の細胞集団が増加するにつれて、所望の細胞集団の増殖速度は遅くなる。最終的に、所望の細胞の相当に大きい集団を生産するには非常に時間がかかり複雑であるという結果となる。
【０００３】
エプスタインバーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）に対し抗原特異性を有するＴリンパ球（ＥＢＶ−ＣＴＬ）を生じさせるための最新式生産方法は、生産の複雑さを示す例である。ＥＢＶ−ＣＴＬの最適な増殖のための従来の方法は、標準２４ウェル組織培養プレートを使用する。各ウェルは、細胞が常駐するその表面積が２ｃｍ２であって、気体移動の必要性のため、１ｍｌ／ｃｍ２に制限された培地量を有している。培養工程は、照射済みの抗原提示細胞系の存在下にＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を含む細胞組成物を入れることにより始まるが、リンパ芽球様細胞系（ＬＣＬ）であってもよく、表面密度（つまり増殖表面の、細胞／ｃｍ２）比は約４０：１で、約１×１０６ＰＢＭＣ／ｃｍ２および約２．５×１０４照射抗原提示細胞／ｃｍ２である。これによって細胞組成物内のＥＢＶ−ＣＴＬの集団の量が大きくなる。９日後、ＥＢＶ−ＣＴＬは、最小表面密度約２．５×１０５ＥＢＶ−ＣＴＬ／ｃｍ２、新たな表面密度比４：１で、照射抗原提示ＬＣＬの存在下に選択的に再増殖する。酸素が細胞に達することができるように、培地量は、増殖表面の面積に関する比で最大１ｍｌ／ｃｍ２までに制限されるが、これによってグルコースなどの増殖溶質が制限される。その結果、達成することができる最大表面密度は約２×ｌ０６ＥＢＶ−ＣＴＬ／ｃｍ２になる。このように、週当たりの最大細胞増殖は約８倍（つまり２×ｌ０６ＥＢＶ−ＣＴＬ／ｃｍ２を２．５×１０５ＥＢＶ−ＣＴＬ／ｃｍ２で除す）以下である。ＥＢＶ−ＣＴＬを継続的に増殖させるために、抗原再刺激を有する追加の２４ウェルプレートにＥＢＶ−ＣＴＬを毎週移動させ、２４ウェルプレートの各ウェル内の培地および増殖因子を週に２度交換する必要がある。ＥＢＶ−ＣＴＬ表面密度がウェル当たりの可能な最大量に接近するにつれて、従来の方法はＥＢＶ−ＣＴＬ集団増殖の速度が遅くなる結果をもたらすので、細胞注入、ならびに無菌性アッセイ、同定アッセイ、および効力アッセイなどの品質管理手段に十分な量のＥＢＶ−ＣＴＬを得るために、これらの操作をしばしば４週間から８週間にもなる長い生産期間にわたり繰り返さなければならない。
【０００４】
ＥＢＶ−ＣＴＬの培養は、細胞療法に固有の複雑な細胞生産工程の一例に過ぎない。生産時間を削減し、同時に生産コストおよび複雑さを低減することができる、細胞療法のための細胞を培養する、より実用的な手段が必要とされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
生産の全体を通して集団増殖速度を増加させる新規な方法を生み出し、そうすることによって細胞を生産する複雑さおよび所要時間を削減する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
生産工程の全体を通して従来とは異なる条件を定期的に再確立させる段階的な生産工程を使用することによって、現在可能であるより短期間かつ経済的な方式で、細胞療法のための細胞生産を生じさせることができることが見出された。従来とは異なる条件は、所望の細胞の表面密度（つまり細胞／ｃｍ２）の低減、抗原提示細胞および／またはフィーダ細胞に対する所望の細胞の新規の比、および／または培地量対表面積の比が増大した気体透過性材料を含む増殖表面の使用を含む。
【０００７】
本発明の実施形態は細胞療法適用のための細胞を培養する改良された方法に関する。それらの実施形態は、生産工程の全体を通して、所望の細胞集団が従来の方法と比較してより高い増殖速度を維持することを可能にするさまざまな新しい方法を使用することによって、所望の細胞を所望の数を生じさせるために必要な、時間、コストおよび複雑さを低減する方法を含む。
【０００８】
本発明の一態様は、培養工程を段階的に行うこと、および、所望の細胞集団の増殖速度が現在可能な速度を超えることを可能にする、１つ以上の段階の始めにおける条件を確立することに依存する。培養の少なくとも１つの段階および好ましくはほぼすべての段階が、表面密度が従来と異なって低く、所望の細胞当たりの抗原提示細胞（および／またはフィーダ細胞）の比が従来と異なっていて、気体透過性でない増殖表面または気体透過性である増殖表面のいずれかに静置されている所望の細胞を含む開始条件を確立する。本発明のこの態様の新規の実施形態を使用することによって、所望の細胞集団は、従来の方法によって可能であるよりも短い期間でさらに倍加させることができ、それによって生産の期間を削減することができる。
【０００９】
本発明の別の態様は、培養工程を段階的に行うこと、および所望の細胞集団の増殖速度が現在可能な速度を超えるように、１つ以上の段階の始めにおける条件を確立することに依存する。培養の少なくとも１つの段階、および好ましくはほぼすべての段階が、培地量対増殖表面積の比が従来と異なって高く、気体透過性材料を含む増殖表面上に静置されている所望の細胞を含む条件を確立する。本発明のこの態様の新規の実施形態を使用することによって、所望の細胞集団は、従来の方法によって可能であるよりも短い期間でさらに倍加することができ、それによって生産の期間を削減することができる。
【００１０】
本発明の別の態様は、培養工程を段階的に行うこと、および所望の細胞集団の増殖速度が現在可能な速度を超えるように、各段階の条件を確立することに依存する。培養の少なくとも１つの段階、および好ましくはほぼすべての段階が、培地量対増殖表面積の比が従来と異なって高く、所望の細胞当たりの抗原提示細胞（および／またはフィーダ細胞）の比が従来と異なり、表面密度（つまり、細胞／ｃｍ２）が従来と異なって低く、気体透過性材料を含む増殖表面上に静置されている所望の細胞を含む開始条件を確立する。本発明のこの態様の新規の実施形態の使用によって、所望の細胞集団を、従来の方法によるよりも短い期間でさらに倍加することができ、それによって生産期間を削減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】Ａ：実施例１における抗原特異的Ｔ細胞の集団が、最初の７日間にわたり、開始刺激の後に少なくとも７回の細胞倍加を受けることを示す図、Ｂ：実施例１についての四量体解析によって測定された、時間の経過につれて細胞組成物内のＴ細胞集団が増殖する大きさを実証するデータを示す図、Ｃ：実施例１において、２３日の期間にわたり抗原特異的Ｔ細胞の集団増殖速度が減少することを示す図。
【図２】実施例１において、抗原特異的Ｔ細胞に関する予測される増殖倍と観察された増殖倍との間の相違を例示する表。
【図３】Ａ：実施例２の刺激後の抗原特異的Ｔ細胞の存在を示す図、Ｂ：実施例２において、抗原特異的Ｔ細胞対抗原提示細胞の比を４：１に維持しながら、表面密度が１×ｌ０６／ｃｍ２から３．１×１０４／ｃｍ２まで減少するときの抗原特異的Ｔ細胞の集団増殖を示す図、Ｃ：実施例２において、抗原提示細胞の一定数の存在下で、表面密度が１×１０６／ｃｍ２から３．１×１０４／ｃｍ２まで減少するときの抗原特異的Ｔ細胞の集団増殖を示す図。
【図４】図３に記載される研究を継続する際に得られた結果の例を示す図であって、所望の細胞が他の細胞の支援を必要とするとき、フィーダ細胞および／または抗原提示細胞の適切な供給がある限り、所望の細胞の表面密度が従来と異なって低い状態で集団増殖を開始できることをさらに実証する図。
【図５】３種の異なる細胞表面密度（ＣＴＬ／ｃｍ２）で培養を開始することによって、所望の細胞の集団増殖の大きさを、繰り返す能力を実証するヒストグラム。
【図６】データを得るために使用した気体透過性試験装置の横断面図。
【図７】Ａ：本発明に従って生産された抗原特異的Ｔ細胞の増殖曲線を示す図であって、実施例５で行なったような従来の方法と比較する図、Ｂ：実施例５において、フローサイトメトリーの前方散乱対側方散乱によって測定したとき、細胞生存率は、本発明に従って生産された抗原特異的Ｔ細胞における方が従来の方法と比較して有意に高かったことを示す図、Ｃ：実施例５において、Ａｎｎｅｘｉｎ−ＰＩ７ＡＡＤによって測定したとき、細胞生存率は、本発明に従って生産された抗原特異的Ｔ細胞における方が従来の方法と比較して有意に高かったことを示す図、Ｄ：実施例５において、本発明の新規の方法において生産された細胞の優位な増殖が、各日のＣＦＳＥ標識細胞のフローサイトメトリー解析によって測定されたとき、従来の方法を使用して培養された細胞のような、細胞特異的増殖速度を示しておりこれにより、細胞増殖速度の増加が細胞死の減少に起因したことを確かなものにしたことを示す図。
【図８】Ａ：培地を交換する必要のない従来の方法において可能であった範囲を超えて、ＥＶＢ−ＣＴＬがどのように増殖することができたかを示す図、Ｂ：ＥＢＥＲを定量ＰＣＲによって評価したとき、実施例６の培養条件が最終細胞産物をどのように改変しなかったか示す図、Ｃ：Ｂ細胞マーカであるＣＤ２０を定量ＰＣＲによって評価したとき、実施例６の培養条件が最終細胞産物をどのように改変しなかったかを示す図。
【図９】所望の細胞および抗原提示細胞の表面密度の累積が非常に低い（ここでは、ＡＬ−ＣＴＬ細胞およびＬＣＬ細胞が混合されて表面密度３０，０００細胞／ｃｍ２の細胞組成物となっている）ことによって、ＡＬ−ＣＴＬ集団が増殖を開始できなかったことを実験的に実証したことの例を示す図。
【図１０】Ａ：細胞を培養する新規の２つの方法が、２３日の期間にわたって、従来の方法より多くの細胞をどのように生産するかを示す実施例８のデータを提示する図、Ｂ：実施例８における試験装置の中で培養された細胞の写真、Ｃ：実施例８において、２つの新規の培養方法および従来の方法のすべてが、同じ表現型を有する細胞を生産することを示す図、Ｄ：実施例８で、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、ＢＺＬＦ１由来の、ＥＢＶペプチドエピトープおよびＥＢＶのＥＢＮＡ１で刺激され、ＨＬＡ−Ａ２−ＬＭＰ２ペプチド五量体染色法で染色されたＴ細胞がペプチド特異的Ｔ細胞と同様の発生頻度を示した代表的な培養を示す図、Ｅ：５１Ｃｒ放出アッセイによって評価したとき、細胞は細胞溶解活性および細胞特異性を維持し、自己ＥＢＶ−ＬＣＬを死滅させたが、ＨＬＡ不適合ＥＢＶ−ＬＣＬの死滅は低かったことを実施例８の新規の方法および従来の方法のために示す図。
【図１１】本発明の一態様を使用した所望の細胞型の集団増殖と、従来のシナリオ下における増殖表面上の所望の細胞の集団増殖とを比較したグラフ。
【図１２】気体透過性材料を含む増殖表面、および、１または２ｍｌ／ｃｍ２を超える、従来と異なって高い培地量対増殖表面積の比を利用することにより得ることができる利点の一例を示す図。
【図１３】完了時の細胞表面密度が従来の表面密度より極めて大きい、本発明の一実施形態下における所望の細胞型集団増殖と従来のシナリオ下における増殖表面上の所望の細胞集団増殖の新規の方法を比較したグラフ。
【図１４】従来の方法を超える別のさらなる利点を提供する細胞生産の別の新規な方法を示す図。
【図１５】新規な方法の能力を実証するべく図１４に示した各生産方法の比較を示すとともに、十分に効率を獲得するために、さまざまな段階で生産手順を調節することがなぜ有用であるかを示す図。
【図１６】生産が進むにつれて効率を獲得するために、新規な方法では生産手順をどのように調節することができるのかの一例を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、添付図面に関する以下の詳細な説明を考慮することで、本発明のさまざまな実施形態をより深く理解できる。
定義
抗原提示細胞（ＡＰＣ：ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）：特定の抗原に応答するように所望の細胞を惹起するために作用する細胞。
【００１３】
ＣＴＬ：細胞傷害性Ｔ細胞
所望の細胞：生産処理において量を増やすことを目標とする特異的な型の細胞。一般に、所望の細胞は浮遊細胞であり、例は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、初代Ｔリンパ球およびさまざまな抗原特異的細胞、および他の多くのもの（それらはすべて、機能、インビボの残留性または安全性を改良するように遺伝子改変することができる）を含む。臨床的使用に必要な細胞は、フィーダ細胞および／または抗原提示細胞で増殖することができ、この抗原提示細胞は、ＰＢＭＣ、ＰＨＡ  ｂｌａｓｔ、ＯＫＴ３  Ｔ、Ｂ  ｂｌａｓｔ、ＬＣＬおよびＫ５６２（天然であるか、または発現するように遺伝子改変されていて、抗原および／またはエピトープ、ならびに４１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ、および他の多くのものなどの共刺激分子）を含むことができ、これらはペプチドまたは関連する他の抗原でパルスする場合もあれば、しない場合もある。
【００１４】
ＥＢＶ（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）：エプスタインバーウイルス
ＥＢＶ−ＣＴＬ：ＥＢＶ感染細胞またはＥＢＶ由来のペプチドを発現したり提示したりする細胞を、Ｔ細胞表面受容体により特異的に認識したＴ細胞。
【００１５】
ＥＢＶ−ＬＣＬ：エプスタインバーウイルスで形質転換されたＢリンパ芽球様細胞系。
フィーダ細胞：所望の細胞の量を増加させるように作用する細胞。状況によっては抗原提示細胞もフィーダ細胞として作用することができる。
【００１６】
増殖表面：細胞がその上に静置される、培養装置内の領域。
ＰＢＭＣ（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌ）：末梢血由来の末梢血単核細胞で、いくつかの所望の細胞の源となり、フィーダ細胞として作用することができる。
【００１７】
応答細胞（Ｒ）：刺激細胞に反応する細胞。
静置細胞培養：日常の操作のために培養装置の設定場所が移動される場合、および／または細胞に新鮮培地などが定期的に供給される場合以外は、撹拌されたり混合されたりしない培地中で細胞を培養する方法。一般に、静置培養中の培地は、通常、静止状態にある。本発明は静置細胞培養方法に関する。
【００１８】
刺激：抗原提示および／またはフィーダ細胞が所望の細胞上で有する作用。
刺激細胞（Ｓ）：応答細胞に影響を及ぼすであろう細胞。
表面密度：細胞が静置される装置内の表面の、単位面積当たりの細胞量。
【００１９】
養子Ｔ細胞療法のための所望の細胞集団の生産を単純化する新規の方法を見つけようとしたとき、細胞療法適用のための細胞のより効率的な培養に門戸を開いていた一連の実験が行なわれた。本発明の多数の例示的な実施例およびさまざまな態様は、従来の方法と比較して、生産時間および複雑さを低減する能力をどのように達成することができるかを示すべく記載される。
【００２０】
実施例１：従来の方法の限界の実証
この実施例のデータは、ウェル当たり２ｍｌ（つまり培地の高さが１．０ｃｍで、培地量対表面積の比が１ｍｌ／ｃｍ２）の培地量を使用する標準２４ウェル組織培養プレート（つまり１ウェル当たりの表面積が２ｃｍ２）におけるＥＢＶ−ＣＴＬ生産のための、従来の培養方法の限界を実証する。
【００２１】
培養段階１、０日目：培地量対増殖表面積の比１ｍｌ／ｃｍ２、および、４０：１の比（ＰＢＭＣ：ＬＣＬ）の抗原提示γ線照射（４０Ｇｙ）自己ＥＢＶ−ＬＣＬで、正常なドナー由来のＰＢＭＣ（約１×１０６細胞／ｍｌ）細胞組成物を培養し、４５％のクリック培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，ＣＡ）、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ、および１０％のＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０中の細胞組成物表面密度を約１×１０６細胞／ｃｍ２に確立することによって、ＥＢＶ−ＣＴＬの集団増殖を開始した。
【００２２】
培養段階２、９日目から１６日目：９日目に、段階１で生み出された細胞組成物からＥＢＶ−ＣＴＬを回収し、表面密度０．５×１０６ＥＢＶ−ＣＴＬ／ｃｍ２で新鮮培地に再懸濁し、ＣＴＬ：ＬＣＬが４：１の比（表面密度０．５×１０６ＣＴＬ／ｃｍ２：１．２５×１０５ＬＣＬ／ｃｍ２）の照射自己ＥＢＶ−ＬＣＬで再刺激した。１３日目に、２４ウェルプレートの各ウェル中の培地量２ｍｌのうち１ｍｌを除去し、組換えヒトＩＬ−２（ｌＬ−２）（５０Ｕ／ｍｌ）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ；Ｃｈｉｒｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）を含む新鮮培地１ｍｌと交換した。
【００２３】
培養段階３、１７日目から２３日目：段階２の条件は、ＩＬ−２の添加を週に２度繰り返し、２３日目に培養を終結した。培養は終結したが、段階２および３の培養を模倣した追加の培養段階を続けることができる。
【００２４】
細胞毒性試験における標的細胞として使用するための細胞系および腫瘍細胞：アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）からＢＪＡＢ（Ｂ細胞リンパ腫）およびＫ５６２（慢性赤血球白血病）を得た。細胞はすべて、１０％の熱失活したウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、２５ＩＵ／ｍＬのペニシリン、および２５ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン（すべてＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＯ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で培養を維持した。細胞は３７℃で５％の二酸
化炭素を含んでいる加湿雰囲気に維持した。
【００２５】
免疫表現型検査：
細胞表面：Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）のフィコエリトリン（ＰＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ｐｅｒｉｏｄｉｎクロロフィル蛋白質（ＰｅｒＣＰ）、および、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２５、ＣＤ４４モノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）で細胞を染色した。ＰＥ結合四量体（Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）およびＡＰＣ結合五量体（Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ  Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）は、ＥＢＶ−ＣＴＬ前駆体発生頻度を定量化するために使用された。細胞表面および五量体染色のためのそれぞれ１０，０００および１００，０００のライブイベントをＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメータで得て、データをＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  （Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析した。
【００２６】
細胞分裂を測定するためのＣＦＳＥ標識：２×１０７の倍加速度を評価するために、ＰＢＭＣまたはＥＢＶ特異的ＣＴＬ（ＥＢＶ−ＣＴＬ）を２度洗浄し、０．１％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含んでいる８５０μｌの１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。染色に先立って、一定分量のカルボキシフルオレセインジアセテート、サクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）（ジメチルスルホキシド中１０ｍＭ）（Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ細胞増殖キット（Ｃ３４５５４）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を解凍し、１×ＰＢＳで１：１０００に希釈し、その希釈物１５０μｌを細胞懸濁液（標識濃度は１μＭだった）に加えた。ＣＦＳＥで室温に１０分間、細胞をインキュベートした。次に、１ｍｌのＦＢＳを細胞懸濁液に加え、続いて３７℃で１０分間、インキュベートした。その後、細胞を１×ＰＢＳで２度洗浄し、計数し、かつ、記載の抗原で刺激した。
【００２７】
ＡｎｎｅｘｉｎＶ−７−ＡＡＤ染色：培養におけるアポトーシス細胞および壊死細胞の百分率を測定するために、製造者（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標）＃５５９７６３，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の指示通りにＡｎｎｅｘｉｎ−７−ＡＡＤ染色を実施した。簡潔に説明すると、２４ウェルプレートまたはＧＲｅｘから冷ＰＢＳでＥＢＶ−ＣＴＬを洗浄し、１×１０６細胞／ｍｌの濃度で１×結合バッファーに再懸濁し、暗所に室温（２５℃）で１５分間Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＰＥおよび７−ＡＡＤで染色した。インキュベーションに続いて、フローサイトメトリーによって細胞を直ちに分析した。
【００２８】
クロム放出試験：標準４時間の５１Ｃｒ放出アッセイにおいてＥＢＶ−ＣＴＬの細胞障害活性を評価した。所望の細胞として、自己ならびに、ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ不適合ＥＢＶ形質転換リンパ芽球様細胞系（ＥＢＶ−ＬＣＬ）を使用して、ＭＨＣ拘束およびＭＨＣ非拘束による死滅を測定し、Ｋ５６２細胞系を使用して、ナチュラルキラー活性を測定した。培地だけで、または１％のトリトンＸ−１００でインキュベートした、クロム標識した所望の細胞を使用して、自然および最大５１Ｃｒ放出をそれぞれ測定した。三種のウェルの特異的な溶菌の平均百分率は以下のように算出された：［（テスト総数−自然発生総数）／（最大総数−自然発生総数）］×１００。
【００２９】
酵素免疫スポット（エリスポット）アッセイ：エリスポットアッセイを使用して、抗原刺激に応答してＩＦＮγを分泌したＴ細胞の発生頻度および機能を定量化した。２４ウェルプレート、またはＧ−Ｒｅｘの中で増殖したＣＴＬ系統を、照射ＬＣＬ（４０Ｇｙ）またはＬＭＰ１、ＬＭＰ２、ＢＺＬＦ１およびＥＢＮＡ１  ｐｅｐｍｉｘ（１μｇ／ｍｌに希釈）（ＪＰＴ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、またはＥＢＶペプチドＨＬＡ−Ａ２  ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ＝ＧＬＣ、ＨＬＡ−Ａ２  
ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ＝ＣＬＧ、ＨＬＡ−Ａ２−ＦＬＹＡＬＡＬＬＬ＝ＦＬＹおよびＨＬＡ−Ａ２９  ＩＬＬＡＲＬＦＬＹ＝ＩＬＬ（Ｇｅｎｅｍｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ，Ｔｅｘａｓ）で刺激し、２μＭの最終濃度に希釈し、ネガティブコントロールとしてＣＴＬを単独で機能させた。ＣＴＬはエリスポット培地［５％のヒト血清（Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ）（Ｖａｌｌｅｙ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）および２ｍＭのＬ−グルタミン（ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）］中に１×１０６／ｍｌで再懸濁した。
【００３０】
９６ウェル濾過プレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ，＃ＭＡＨＡ８４５１０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）は、１０μｇ／ｍＬの抗ＩＦＮ−γ抗体（Ｃａｔｃｈｅｒ−ｍＡＢ９１−ＤＩＫ，Ｍａｂｔｅｃｈ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）で４℃で一晩被覆し、次いで、洗浄し、３７℃で１時間、エリスポット培地でブロックした。応答細胞および刺激細胞を２０時間プレート上でインキュベートし、次いで、プレートを洗浄し、ビオチン結合抗ＩＦＮ−γモノクローナル第二抗体（Ｄｅｔｅｃｔｏｒ−ｍＡＢ（７−Ｂ６−１−Ｂｉｏｔｉｎ）、Ｍａｂｔｅｃｈ）を用いてインキュベートし、続いてアビジンすなわち、ビオチン化された西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣキット（標準），＃ＰＫ６１００，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）でインキュベートし、次いで、ＡＥＣ基質（Ｓｉｇｍａ，８１．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で発色させた。培養条件をそれぞれ３回繰り返した。評価のためにプレートをＺｅｌｌｎｅｔ  Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ．に送った。スポット形成単位（ＳＦＣ）および投入した細胞数をプロットした。
【００３１】
統計解析：インビトロのデータは平均±１ＳＤとして提示される。ステューデントｔ検定を使って試料間の違いの統計的有意差を測定し、Ｐ＜０．０５の場合に有意差があると判定した。
【００３２】
これらの培養条件下では、図１のＡに示すように、開始刺激の後、最初の７日間にわたって抗原特異的Ｔ細胞の集団は少なくとも７回細胞倍加を受ける。したがって、Ｔ細胞が一週間で１２８倍増殖すると予想する（抗原特異的Ｔ細胞の発生頻度に、細胞組成物の細胞総数を乗じて評価）。第１、第２および第３刺激の後の四量体陽性細胞の発生頻度を図１のＢに示す。０日目には、２種のＥＢＶ四量体、ＲＡＫおよびＱＡＫに対する反応性Ｔ細胞の発生頻度はそれぞれ０．０２％および０．０１％であった。０日目に１回だけ刺激した後、９日目までに、細胞組成物中の四量体陽性Ｔ細胞の発生頻度は０．０２％および０．０１％から２．７％および１．２５％までそれぞれ増加していた。このように、ＲＡＫおよびＱＡＫによって測定したとき、細胞組成物内に存在している抗原特異的四量体陽性Ｔ細胞の百分率は、１３５倍および１２５倍増を達成した。さらに培養段階１の０日目に１回だけ刺激した後、９日目までに、細胞組成物中の細胞の表面密度においても１．１倍の増加（データは示していない）（約１．１×１０６細胞／ｃｍ２が存在した）を観察した。ＰＢＭＣ組成物内の大多数の細胞が刺激抗原に特異的ではないので、総細胞数における全体的な増加はほとんど観察されないが、図１のＣに示すように、組成物内の抗原特異的細胞集団の増殖倍は、培養の第１段階の間に、約２８０であった。ＣＳＦＥで測定すると、培養の第２段階および第３段階の間、細胞倍加の数は同じであったが、不運にも、培養の第２段階または第３段階の間、抗原特異的Ｔ細胞増殖はこの速度を持続せず、段階２では５．７、および段階３では４．３に過ぎなかった。図２は、抗原特異的Ｔ細胞（ｎ＝３）の、予測される増殖と観察した増殖との間の相違を例示する表を示す。
【００３３】
所望の細胞の集団増殖の速度はその後の培養段階において減少するので、所望の細胞を生産するのに要する時間は、典型的に、ほぼ最初の生産の週の後に遅くなることを、実施
例１は実証する。
【００３４】
実施例２：所望の細胞集団を増加させるための所要時間の削減は、培養の任意の所与の１段階または複数の段階の始めに、所望の細胞集団の細胞表面密度を低減することにより達成することができる。
【００３５】
第２のＴ細胞刺激に続く所望の細胞集団増殖速度が、第１の刺激と比較して低下したのは、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）をもたらす細胞培養条件に限定したためと仮定した。たとえば、図３のＡを参照すると、第１刺激では、ＰＢＭＣのうちのＥＢＶ抗原特異的Ｔ細胞構成成分は多くとも集団の２％であるため、抗原特異的応答Ｔ細胞の播種密度はｃｍ２当たり２×ｌ０４未満である。残りのＰＢＭＣは、非増殖フィーダ細胞（図３のＡにおいてＣＦＳＥ陽性細胞と見なされる）として作用し、抗原特異的ＣＴＬの増殖を可能にする最適な細胞間接触を持続させる。対照的に、９日目の第２刺激において、大多数のＴ細胞は抗原特異的であり、組成物の総細胞密度はほぼ同じであるが、増殖細胞密度は５０〜１００倍高い。その結果、再刺激で、大多数の細胞が増殖し、これにより急速に培地の栄養素および酸素供給を消費し消耗させる可能性がある。
【００３６】
培養条件を限定することが最適以下のＴ細胞増殖速度の原因だったかどうかを判断するために、より低い細胞密度で蒔いた活性化Ｔ細胞の増殖を測定した。方法は前述の実施例１のとおりである。
【００３７】
図３のＢに示すように、各ウェルが２ｃｍ２の増殖表面積を有する標準２４ウェルプレートのウェルに、応答細胞対刺激細胞の比（Ｒ：Ｓ）を４：１に維持しつつ１×１０６／ｃｍ２から３．１×１０４／ｃｍ２の範囲で縮小していく表面密度を生み出す倍加希釈で、活性化ＥＢＶ特異的Ｔ細胞を播種した。ｃｍ２当たり１．２５×ｌ０５の開始ＣＴＬ表面密度において、最大のＣＴＬ増殖（４．７±１．１倍）が達成されたが、図３のＢに示すように、さらなる希釈は増殖速度を減少させた。この限定的な希釈効果はおそらく細胞間接触が無いためであると推測されるので、一定数のフィーダ細胞（１．２５×１０５／ｃｍ２の表面密度で蒔かれたＥＢＶ−ＬＣＬ）とともに、１×１０６から３．１×ｌ０４までの表面密度のＥＢＶ−ＣＴＬの倍加希釈を培養し、７日の期間にわたる細胞増殖を評価した。図３のＣに提示するように、１×１０６／ｃｍ２の表面密度のＥＢＶ−ＣＴＬでのわずか２．９±０．８倍の増殖から、３．１×１０４／ｃｍ２の表面密度のＥＢＶ−ＣＴＬでの３４．７±１１倍の増殖に至るまで、ＣＴＬ増殖における劇的な増加を観察した。重要なことは、この培養条件の変更は、細胞の機能または抗原特異性を変化させなかった（データは示していない）ことである。そのため、活性化された抗原特異的Ｔ細胞の集団は従来の培養方法によるよりも、より高い増殖が可能である。注目すべきは、達成された最大の表面密度は刺激（１．７から２．５×１０６／ｃｍ２）後、開始表面密度に関係なく同じだったことである。
【００３８】
このように、従来の培養条件は限定的であり、所望の細胞集団に従来の方法の表面密度の限界を超えさせるために、培地量対増殖表面積の比を従来の１ｍｌ／ｃｍ２を超えて増加させる必要があることを示している。さらに、任意の培養段階の始めに、所望の細胞集団の表面密度を従来の方法未満に低減することによって、約３４倍まで抗原特異的ＣＴＬの増殖を改良することができる。このことは細胞療法に相当な派生効果を有している。この細胞療法では、生産の始めの細胞量がかなり限定されていることがしばしばある。たとえば、限定量の所望の細胞を、増大した表面積上に、より低下された表面密度で分配することによって、従来の表面密度と比較して集団増殖速度が劇的に増加するので、より短い期間でより多くの所望の細胞集団が得られる。
【００３９】
実施例３：所望の細胞および／または抗原提示細胞を含む細胞集団の最小表面密度によ
って、非常に低い表面密度で播種される所望の細胞集団の増殖を可能にすることができる。
【００４０】
図３に記載される研究を継続する際に得た結果の実施例を図４に示し、さらに、所望の細胞が他の細胞の支援を必要とするとき、フィーダ細胞および／または抗原提示細胞の適切な供給がある限り、所望の細胞の表面密度が従来と異なって低い状態で集団増殖を開始することができることを実証した。これらの実験において、Ｒ：Ｓ比が８対１で約１．０×ｌ０６所望の細胞／ｃｍ２とＲ：Ｓ比が１対３２で単に約３９００所望の細胞／ｃｍ２との間のＲ：Ｓ比および表面密度で、実験を中止した時点で開始表面密度の５０倍を超えるまで、総細胞組成物がどのように所望の細胞を大幅に増殖させることができるかについて実証を続ける。
【００４１】
実施例４：生産工程が段階的に繰り返すことを可能にする能力は、所望の細胞が従来とは異なって低い表面密度で段階を開始することによって、集団増殖、段階の終了、および条件の繰り返しを可能にし、反復可能な結果を生ずることを実証した。
【００４２】
図５に示すように、所望の細胞の３種の表面密度（ＣＴＵ／ｃｍ２）で、実施例３に記載される評価を続けた。各特異的播種密度は一貫して同じ倍率まで増加させることができた。このことの有する意味について、所望の細胞集団のための生産時間を劇的に低減する能力に関連して、さらに詳細に記載する。
【００４３】
実施例５：気体透過性材料を含む増殖表面上で所望の細胞を培養する一方、同時に、増殖表面積に対する培地量を増加させることは、従来の方法と比較して、所与の培養段階で所望の細胞が倍加できる回数を増加させ、達成可能な表面密度を増加させる。
【００４４】
細胞系および腫瘍細胞、免疫表現型検査、ＣＦＳＥ標識、ＡｎｎｅｘｉｎＶ−７−ＡＡＤ染色、クロム放出アッセイ、酵素免疫スポット（エリスポット）アッセイ、Ｔリンパ球のレトロウイルス生産および形質導入、および統計解析は、実施例１に記載されるとおりである。
【００４５】
試験装置（以下、一般的に「Ｇ−Ｒｅｘ」と称す）は、図６で示すように構築した。各Ｇ−Ｒｅｘ１０の底部２０は、気体透過性シリコーン膜を含み、厚さ約０．１２７ｍｍ（０．００５インチ）から０．１７７８ｍｍ（０．００７インチ）である。Ｗｉｌｓｏｎに対する出願継続中の米国特許出願第１０／９６１，８１４号明細書は、代替気体透過性材料の使用に関する多くの情報源の中でも特に、本発明の実施形態の多くにとって有益である気体透過性培養装置の形状、特徴、および他の有用な特性について当業者に知らせるために使用することができる。この実施例３において、Ｇ−Ｒｅｘ（「Ｇ−Ｒｅｘ４０」と称する）は１０ｃｍ２の増殖表面積を有しており、その上に細胞組成物（アイテム３０として示した）を静置したが、細胞組成物の特性は、記載の通り、実験の全体を通して多様だった。培地空間（アイテム４０として示した）は、特に明記しない限り、３０ｍＬだったが、培地量対増殖表面積の比３ｍｌ／ｃｍ２を生み出した。
【００４６】
活性化ＥＢＶ特異的ＣＴＬおよび照射自己ＥＢＶ−ＬＣＬは、ＣＴＬ：ＬＣＬ比を従来の４：１にしてＧ−Ｒｅｘ４０装置の中で培養された。Ｇ−Ｒｅｘ４０の中に５×１０５細胞／ｃｍ２の表面密度でＥＢＶ−ＣＴＬを播種し、ＥＢＶ−ＣＴＬ集団増殖速度を、増殖表面積に対する培地量１ｍｌ／ｃｍ２で標準２４ウェルプレートの中に同じ表面密度で播種したＥＢＶ−ＣＴＬと比較した。図７のＡ（ｐ＝０．００５）に示したように、３日後、Ｇ−Ｒｅｘ４０の中のＥＢＶ−ＣＴＬは、培地交換無しで、５×１０５／ｃｍ２から７．９×１０６／ｃｍ２（範囲５．７〜８．１×１０６／ｃｍ２の中央値）まで増加した。対照的に、従来の２４ウェルプレートで３日間培養されたＥＢＶ−ＣＴＬは、３日目ま
でに、５×１０５／ｃｍ２の表面密度から１．８×１０６／ｃｍ２（範囲１．７から２．５×１０６／ｃｍ２の中央値）までしか増加しなかった。Ｇ−Ｒｅｘ４０の中に培地を補充することによって表面密度をさらに増加させることができるのに対して、２４ウェルプレートの中に培地またはＩＬ２を補充することによって細胞表面密度を増加させることはできなかった。たとえば、７日目に、培地およびＩＬ２を補充すると、その後、ＥＢＶ−ＣＴＬ表面密度は、Ｇ−Ｒｅｘ４０の中で、９．５×１０６細胞／ｃｍ２（範囲８．５×１０６から１１．０×１０６／ｃｍ２）までさらに増加した（データは示していない）。
【００４７】
Ｇ−Ｒｅｘ装置における優位な細胞増殖の背後にある機構を理解するために、培養の５日目に、ＯＫＴ３に刺激された末梢血Ｔ細胞の生存能をフローサイトメトリーの前方散乱対側方散乱を用いて評価した。培養物に残留照射ＥＢＶ−ＬＣＬが存在し、これが解析の妨げとなって、このアッセイでは、ＥＢＶ−ＣＴＬを評価することができなかった。図７のＢに示すように、細胞生存率は、Ｇ−Ｒｅｘ４０培養における方が有意に高かった（Ｇ−Ｒｅｘ４０の中の生存率８９．２％対２４ウェルプレートの中の生存率４９．９％）。次いで、７日間の各日、生存細胞とアポトーシス性／壊死性細胞とを識別するためにＡｎｎｅｘｉｎ−ＰＩ  ７ＡＡＤを使用して培養物を分析し、図７のＣに示すように、２４ウェルプレートの中で増殖するＴ細胞において、Ｇ−Ｒｅｘの中のものと比較して、一貫してより低い生存率を観察した。増殖細胞の生存が累積的に改良されたことが、２４ウェルプレートと比較したＧ−Ｒｅｘ装置の中の細胞数の増加に寄与したことを、これらのデータは示す。
【００４８】
さらなる寄与が存在するかどうかをＧ−Ｒｅｘ対２４ウェルプレートの中の増加細胞分裂数から判断するために、０日目にＴ細胞をＣＦＳＥで標識し、培地量４０ｍｌのＧ−Ｒｅｘ４０装置と、各ウェルの培地量が２ｍｌの２４ウェルプレートとに分けた。各日のフローサイトメトリー解析によって、１日目から３日目までに細胞分裂数における相違がないことを実証した。しかしながら、３日目以降、図７のＤに示すようにＧ−Ｒｅｘ４０の中で培養された所望の細胞の集団は、２ｍｌウェルの縮小速度を超える速度で増加し続けたが、このことは、培養条件が限定的になっていたことを示している。このように、従来の方法と比較して、Ｇ−Ｒｅｘ４０試験装置の中の所望の細胞の大きな集団は、細胞死の減少と増殖の維持との組合せからもたらされた。
【００４９】
実施例６：従来と異なって高い培地量対増殖表面積の比の使用、および、気体透過性材料を含む増殖表面の使用によって、生産の間に培養物に供給する必要性を低減することができる一方、同時に従来と異なって高い所望の細胞の表面密度を得ることができる。
【００５０】
これは、ＥＢＶ：ＬＣＬの開始および増殖のためのＧ−Ｒｅｘ試験装置の使用によって、実証された。本実施例では、Ｇ−Ｒｅｘ２０００は図８に記載されるような装置を指すが、例外は、底部が１００ｃｍ２の増殖表面積を含み、２０００ｍｌの培地容量が使用可能であることである。Ｇ−Ｒｅｘ２０００の中でＥＢＶ−ＬＣＬを培養し、細胞表現型を変化させることなく増殖した。培地量対表面積の比１０ｍｌ／ｃｍ２を生み出すために、１０００ｍｌのＲＰＭＩ完全培地とともに、表面密度１×ｌ０５細胞／ｃｍ２でＧ−Ｒｅｘ２０００の中にＥＢＶ−ＬＣＬを播種した。比較のために、培地量対表面積の比約０．１８ｍｌ／ｃｍ２を生み出すために、ＲＰＭＩ完全培地３０ｍｌとともに表面密度５×ｌ０５細胞／ｃｍ２でＴ１７５フラスコの中にＥＢＶ−ＬＣＬを蒔いた。図８のＡに提示したように、Ｇ−Ｒｅｘ２０００の中で培養されたＥＢＶ−ＬＣＬは、いかなる操作または培地の交換も必要とせずにＴ１７５フラスコの中で培養されたものより大きく増殖した。図８のＢおよび図８のＣに提示するように、ＥＢＥＲおよびＢ細胞マーカのＣＤ２０を定量ＰＣＲによって評価したとき、この培養条件では細胞の最終産物は改変されなかった。
【００５１】
実施例７：培養の始めに十分なフィーダ細胞および／または抗原細胞が存在しないと、
所望の細胞は増殖しない場合がある。しかしながら、細胞組成物は、増殖させるために、フィーダ細胞および／または抗原細胞として作用する追加の細胞型を含むように変更することができる。
【００５２】
図９は、所望の細胞および抗原提示細胞の表面密度の累積が非常に低い（ここでは、ＡＬ−ＣＴＬ細胞およびＬＣＬ細胞が混合されて表面密度３０，０００細胞／ｃｍ２の細胞組成物となっている）ことによって、ＡＬ−ＣＴＬ集団が増殖を開始することができなかったことを、実験的に実証した例を示す。しかしながら、フィーダ細胞として作用する別の細胞型を含むように組成物を変更することによって、これと同じ細胞組成物が増殖するようにすることもできる。ここでは、表面密度が約０．５×１０６細胞／ｃｍ２である３種の様々な照射済みＫ５６２細胞のフィーダ層を評価した。そして、全ての場合において、ＡＬ−ＣＴＬの集団は、ヒストグラムの最初のカラムに示された開始細胞組成物から増殖し、１４日間にわたり、表面密度わずか１５，０００細胞／ｃｍ２から表面密度４．０×１０６細胞／ｃｍ２まで変化した。さらに、第３の細胞型の添加とは対照的に、ＬＣＬ集団の増加が同様の好ましい結果を達成したことを実証した。細胞組成物が適切な数のフィーダ細胞および／または抗原特異的細胞を含むとき、増殖を開始するために所望の細胞の非常に低い集団を使用することができることを実証するために、ＬＣＬまたはＫ５６２に使用される高い表面密度を任意に選んだ。フィーダ細胞が供給不足であったり、高価であったり、または用意するのが煩わしいときは、フィーダ細胞の表面密度を０．５×１０６細胞／ｃｍ２未満に低減することを推奨する。一般に、および実証してきたように、抗原提示細胞および／またはフィーダ細胞が細胞組成物中にあるとき、抗原提示細胞および／またはフィーダ細胞および所望の細胞の付加的な表面密度は、所望の細胞の集団増殖を開始する細胞組成物中に十分な表面密度を生み出すために、好ましくは少なくとも約０．１２５×１０６細胞／ｃｍ２であるべきである。さらに、標準表面密度の限界を超えて連続する増殖を達成するために、気体透過性材料を含む増殖表面を、培地量対表面積の比４ｍｌ／ｃｍ２とともにこの実施例に使用した。
【００５３】
実施例８：所望の細胞の表面密度を低減し、刺激細胞に対する応答細胞の比を変更し、増殖表面積に対する培地の比を増大し、かつ気体透過性材料を含む増殖表面上に対して表面密度の低い培養物で細胞を定期的に分配することによって、他の方法と比較して、より多くの所望の細胞がより短い期間で生産できるようになり、生産工程が単純化する。
【００５４】
所望の細胞の生産を単純化し短期化する能力についてさらに判断するために、ＥＢＶ−ＣＴＬの開始および増殖のためのＧ−Ｒｅｘ試験装置を使用した。本実施例では、Ｇ−Ｒｅｘ５００は図６に記載されるような装置を指すが、例外は、底部が１００ｃｍ２の増殖表面積を含み、５００ｍｌの培地容量が使用可能であることである。
【００５５】
ＥＢＶ−ＣＴＬ生産の開始段階として、表面密度１×１０６／ｃｍ２（合計＝Ｇ−Ｒｅｘ４０の増殖表面積１０ｃｍ２に分配された１０７個のＰＢＭＣ）で、Ｇ−Ｒｅｘ４０中に、ＰＢＭＣを播種し、ＰＢＭＣ：ＥＢＶ−ＬＣＬが４０：１の比を使用したＥＢＶ−ＬＣＬでＰＢＭＣを刺激した。ＣＴＬ生産にとって、この４０：１の比は最初の刺激により応答Ｔ細胞の抗原特異性を維持するには好ましい。培養の開始段階の後、９日目に第２段階を開始し、１×１０７応答Ｔ細胞をＧ−Ｒｅｘ４０からＧ−Ｒｅｘ５００試験装置に移動した。培養の段階２を開始するために、２００ｍｌのＣＴＬ培地をＧ−Ｒｅｘ５００の中に置くことにより、段階２の始めでの培地量対表面積の比は２ｍｌ／ｃｍ２となり、培地高さは増殖表面領域より２．０ｃｍ高くなった。段階２の始めの所望の細胞の表面密度は１×１０５ＣＴＬ／ｃｍ２であって、抗原提示細胞の表面密度は５×１０５ＬＣＬ／ｃｍ２であり、そのため、抗原提示細胞に対する所望の細胞の比は、従来とは異なる１：５となった。この段階で、２細胞の表面密度およびＲ：Ｓ比は、すべての検査されたドナーにおいて継続的なＥＢＶ−ＣＴＬ増殖を引き起こした。４日後（１３日目）、ＩＬ−２（
５０Ｕ／ｍｌ−最終濃度）を培養物に直接加え、同様に新鮮培地２００ｍｌを加え、これにより培地量対表面積の比が４ｍｌ／ｃｍ２となった。ＣＴＬの表面密度中央値として、ｃｍ２当たり６．５×１０６を得た（２．４×１０６から３．５×１０７の範囲）。
【００５６】
気体透過性材料を含む増殖表面の使用により、従来の手順と比較して、培地量対表面積の比の増大（つまり１ｍｌ／ｃｍ２より大きい）、細胞表面密度の減少（つまり０．５×１０６／ｃｍ２未満）および、刺激細胞に対する応答細胞の比（４：１未満）の変更が可能となり、生産時間が短縮される。図１０のＡは、実施例８のこのＧ−Ｒｅｘ手法と、実施例１の従来の方法の使用および実施例５に記載されるＧ−Ｒｅｘ手法との比較を示す。示すように、いずれかのＧ−Ｒｅｘ方法において約１０日で生ずることができるのと同数の所望の細胞を生ずるために、従来の方法は２３日を必要とする。２３日後、実施例８のＧ−Ｒｅｘ手法によって、実施例５のＧ−Ｒｅｘ方法よりも、所望の細胞を２３．７多く生産することができ、実施例１の従来の方法よりも所望の細胞を６８．４倍多く生産することができた。さらに、細胞表面密度が７×１０６／ｃｍ２を超えたときに培養物を分割したところ、この所望の細胞は、追加の抗原提示細胞刺激を必要とせずに、２７〜３０日まで分裂し続けた。
【００５７】
光学顕微鏡を使用してＧ−Ｒｅｘの中のＣＴＬを明確に見ることはできないが、ＣＴＬのクラスターを目視または倒立顕微鏡によって見えるようにすることができる。培養の９、１６および２３日目の細胞の外観を図１０のＢに示す。図１０のＣに示すように、Ｇ−Ｒｅｘの培養は、増殖細胞の表現型を変化させず、細胞組成物の９０％以上はＣＤ３＋細胞であり（Ｇ−Ｒｅｘ対２４ウェルで９６．７±１．７対９２．８±５．６）、それらの大部分はＣＤ８＋（６２．２％±３８．３対７５％±２１．７）であった。活性化マーカＣＤ２５およびＣＤ２７、ならびに記憶マーカＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、およびＣＤ６２Ｌの評価は、各培養条件下で増殖したＥＢＶ−ＣＴＬ間で本質的な違いがなかったことを実証した。エリスポット（ＥＬｉｓｐｏｔ）および五量体解析により測定したところ、抗原特異性も、培養条件によって影響されなかった。図１０のＤは、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、ＢＺＬＦ１およびＥＢＮＡ１由来のＥＢＶペプチドエピトープで刺激され、ＨＬＡ−Ａ２−ＬＭＰ２ペプチド五量体染色で染色されたＴ細胞が、ペプチド特異的Ｔ細胞と同様の発生頻度を示した代表的な培養を示す。さらに、図１０のＥに示すように５１Ｃｒ放出アッセイによって評価したところ、増殖された細胞は、その細胞溶解活性および細胞溶解特異性を維持しており、自己ＥＢＶ−ＬＣＬを死滅させた（Ｇ−Ｒｅｘ対２４ウェルプレートについて、２０：１の比で６２％±１２対５７％±８  Ｅ：Ｔ）。ＨＬＡ不適合ＥＢＶ−ＬＣＬの死滅は減少した（２０：１の比で、１５％±５対１２％±７）。
【００５８】
細胞療法のための改良された細胞生産のためのさまざまな新規方法の考察：生産サイクルの始めでの所望の細胞集団の表面密度の低減、応答細胞と刺激細胞との間の表面密度比の低減、気体透過性材料を含む増殖表面、および／または培地量対増殖表面積の比の増加を含むさまざまな条件について、細胞療法の研究および臨床適用のための細胞の生産を促進し、単純化するために、どのように使用することができるかを当業者に実証するために、実施例１〜８を提示してきた。実施例１〜８は、抗原特異的Ｔ細胞の生産に関連していたが、これらの新規の培養条件は、臨床的適合性を有する（または概念マウスモデルの前臨床証拠に必要とされる）多くの重要な浮遊細胞型に適用することができ、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、初代Ｔリンパ球、多種多様な抗原特異的細胞、および他の多くのもの（それらはすべて、機能、インビボの残留性または安全性を改良するために、遺伝子改変することもできる）が含まれる。細胞は、フィーダ細胞および／または抗原提示細胞を用いて増殖させることができるが、このフィーダ細胞および／または抗原提示細胞は、ＰＢＭＣ、ＰＨＡ  ｂｌａｓｔ、ＯＫＴ３  Ｔ、Ｂ  ｂｌａｓｔ、ＬＣＬ、およびＫ５６２、（天然、または発現するために遺伝子改変されていて、抗原および／またはエピトープ、ならびに、４１ＢＢＬ、ＯＸ
４０Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ、および他の多くのものなどの共刺激分子）を含むことができ、これらはペプチドまたは関連する他の抗原でパルスする場合もあれば、しない場合もある。
【００５９】
従来と異なった低い開始表面密度：本発明の一態様は、従来の方法と比較して、所望の細胞の低い表面密度を使用することによって生産時間を削減することができることの発見である。この方式では、所望の細胞は、従来の方法において可能であるより、最小細胞表面密度と最大細胞表面密度との間に大きな数値差を有することができる。所望の細胞集団の増殖速度は縮小し始めたが、所望の細胞の量が、生産を終了するにはまだ十分ではないときに、気体透過性材料を含む追加の増殖表面上に再び低い開始表面密度で所望の細胞を再分配するのが好ましい。
【００６０】
より低い表面密度に依存する新規の細胞生産方法が、任意の所与の培養段階の始めに、どのように適用することができるのかを説明するために、ここで一例が記載される。図１１は、本発明の一態様を使用した所望の細胞型の集団増殖と比較した、従来のシナリオの下での増殖表面上の所望の細胞集団増殖に関するグラフ表示を示す。この新規の方法では、生産段階の始めでの所望の細胞の表面密度は、従来の表面密度より少ない。この新規の方法の利点に焦点を合わせるために、本説明では、所望の細胞集団を最初に得る工程については記載していない。当業者がこの新規の方法の、時間に関する利点をより容易に判断することができるように、培養の「日」は「０」で開始する。この例において、従来の方法の各生産サイクルは、従来の表面密度０．５×１０６所望の細胞／ｃｍ２で始まるが、一方この例の各生産サイクルは、はるかに低く従来と異なる表面密度０．１２５×１０６所望の細胞／ｃｍ２で始まる。このように、この例で培養を開始するためには、従来の方法が要求するより４倍多くの表面積（つまり５００，０００／１２５，０００）が必要である。この例では、従来の方法の所望の細胞は、１４日で最大の表面密度２×１０６細胞／ｃｍ２に達する。このように、増殖面積１ｃｍ２によって２×１０６細胞／ｃｍ２がもたらされ、次いで、従来の開始密度０．５×１０６細胞／ｃｍ２（つまり、４ｃｍ２×０．５×１０６細胞＝２×ｌ０６細胞）を使用して生産を続けることができるように、増殖面積の４ｃｍ２上に２×１０６細胞／ｃｍ２を再分配する。このサイクルは、最大細胞表面密度に再び達するまでさらに１４日間繰り返され、それぞれ２．０×１０６細胞を生じ増殖表面積４ｃｍ２で合計８．０×１０６細胞となる。次いで、これらが増殖面積１６ｃｍ２の上に分配され、４２日間にわたって合計で３２×１０６細胞を生ずるように増殖サイクルが繰り返される。
【００６１】
図１１で表された新規の方法では、生産の始めに１ｃｍ２の上に５００，０００の所望の細胞を堆積させる従来の方法を使用する代わりに、従来と異なって低い開始表面密度の１２５，０００所望の細胞／ｃｍ２を０日目に生み出すために、増殖面積４ｃｍ２の上に均等に５００，０００の細胞を分配する。例では、新規の方法は、従来の方法を用いたときのように、７日目にまさに減少するところであるその増殖速度を有している。新規の方法における細胞は表面密度が１×１０６細胞／ｃｍ２である。このように、増殖速度がまさに減少するところである時点で、この培養段階によって、４×１０６細胞を生産し、次いで、開始表面密度０．１２５×１０６細胞／ｃｍ２（つまり３２ｃｍ２×０．１２５×１０６細胞＝４×１０６細胞）を使用して段階２における生産を続けることができるように増殖面積３２ｃｍ２の上にそれを再分配する。生産サイクル、または生産段階は、１４日目までさらに７日間繰り返すが、１４日目には所望の細胞１．０×１０６を含む各増殖表面積３２ｃｍ２で最大細胞表面密度に再び達し、わずか１４日で、合計で３２×１０６細胞を産出する。従来の方法におけるように、各生産サイクルの終わりに、終了表面密度を開始表面密度で除した倍数を、新規の方法がどのようにして生ずるかに注意されたい。しかしながら、細胞が増殖生産に入る前に開始細胞表面密度を減少させ、かつ、各生産段階を完了することによって、時間は著しく削減される。この例は、所望の細胞の表面密度
を減少する（この場合０．１２５×１０６細胞／ｃｍ２）ことによって、従来の細胞表面密度と比較して、従来の方法のときの時間のわずか３３％（１４日対４２日）で、同量の所望の細胞がどのようにして生まれるかについて記載している。
【００６２】
０．１２５×１０６細胞／ｃｍ２の開始表面密度を使用して、利点を定量化したが、当業者は、本発明のこの例が、従来の細胞表面密度を下回る任意の減少により生産所要時間が削減し得ることを実証することに気付くべきである。さらに、当業者は、本明細書に提示された本方法および他の新規の方法に記載される細胞増殖速度、および細胞増殖の減少が起きる時点は、説明の目的のみのためにあり、実際の速度は、培地組成物、細胞型、などのさまざまな条件に基づいた各適用において多様であることを認識すべきである。さらに、本発明のこの態様の利点は、生産時間の削減であり、任意の特定用途において従来の細胞表面密度より表面密度を減少することに起因するが、この例示的な例に使用される特定の従来の表面密度は、適用ごとに様々である場合があることを、当業者は所与の適用のために認識すべきである。
【００６３】
このように、低減された細胞表面密度を使用することによって、細胞組成物内に存在する所望の細胞の所与の一定量を生産する期間を最小限にする要望があるときの、本発明の方法の一態様がここに記載される。所望の細胞は、以下のような、従来と異なって低い細胞表面密度で増殖表面上に堆積すべきである。
ａ．所望の細胞が、抗原提示細胞および／またはフィーダ細胞の存在化にあり、増殖表面が気体透過性を備えない場合は１ｍｌ／ｃｍ２まで、および、増殖表面が気体透過性を備える場合は２ｍｌ／ｃｍ２までの培地量対表面積の比であり、
ｂ．好ましい表面密度条件は、生産サイクルの始めに標的細胞の表面密度が、０．５×１０６細胞／ｃｍ２未満であるのが好ましく、かつ、図４に記載されるように、さらに減少することがなお好ましく、
ｃ．所望の細胞の表面密度に抗原提示細胞および／またはフィーダ細胞の表面密度を加えた表面密度が、少なくとも約１．２５×１０５細胞／ｃｍ２であるのが好ましい。
【００６４】
１．２５×１０５細胞／ｃｍ２未満の抗原提示細胞および／またはフィーダ細胞の表面密度をさらに低減しようと試みる場合、所望の細胞集団増殖が限定的にならないことを、上記の例に基づいて、検証することが賢明である。抗原提示細胞および／またはフィーダ細胞の適切な供給によって増大させるとき、従来と異なった低密度で所望の細胞集団の増殖を達成することができることを実証する目的に基づいて１．２５×１０５細胞／ｃｍ２を選択した。
【００６５】
気体透過性材料を含む増殖表面、および、培地量対増殖表面積のより高い比の使用によって生産を単純化し短期化することができる。本発明の別の態様では、気体透過性材料を含む増殖表面、および、従来の比を超える培地量対増殖表面積の比の使用、および、徐々に増殖表面積の量を増加させる生産サイクルの繰り返しが、生産所要時間を削減するであろうことを見出した。
【００６６】
これらの条件は、どのように生産所要時間を削減することができるかを例示するための例をここで提示する。気体透過性材料を含む増殖表面、および、１／ｃｍ２または２ｍｌ／ｃｍ２を超える従来と異なって高い培地量対増殖表面積の比の利用によって得ることができる利点の例を示すために、図１２は考察を増大する。続く考察はこのような方法の使用によって、生産時間の削減、使用する増殖表面積量の低減、ならびに／または労働および汚染リスクの低減を含み、どのようにしていくつかの選択肢が使用可能になるかを当業者に実証することを意図している。図１２および関連する考察は単に例に過ぎず、本発明の範囲を限定しないことを当業者は認識できるであろう。
【００６７】
この例示的な例における所望の細胞集団を含む細胞組成物は、「Ｘ」時間当たり約１ｍｌ消費すると仮定する。図１２は、「従来の方法」および「新規の方法」に分類される２つの生産工程を示す。増殖の始めに、各工程は、表面密度０．５×１０６／ｃｍ２で所望の細胞から始まる。しかしながら、新規の方法における増殖表面は、気体透過性材料、および従来の方法の１ｍｌ／ｃｍ２と対照的に２ｍｌ／ｃｍ２の培地量対表面積の比を含む。時間「Ｘ」において、従来の方法の所望の細胞集団は、２×１０６／ｃｍ２の表面密度プラトーに達し栄養素を枯渇させるが、一方、新規の方法の追加の培地量は増殖の継続を可能にし、所望の細胞表面密度は３×１０６／ｃｍ２となる。新規の方法が継続する場合、表面密度は４×ｌ０６／ｃｍ２に達する。このように、多くの有益な選択肢が生じる。新規の方法は、従来の方法より多くの細胞を生産して時間「Ｘ」より前に終結することができ、従来の方法より約１．５倍多くの細胞を生産して時間「Ｘ」に終結することができ、または、従来の方法の２倍多く所望の細胞を生産して、時間は２倍かかるが供給用の装置を扱う必要が全く無く、培地が栄養素を枯渇させるまで継続することができる。従来の方法が同数の細胞を集めるためには細胞を回収しなければならず、工程を再開するには、労働、および、起こり得る汚染リスクが加わる。細胞療法適用は典型的に、一定数の細胞を用いないと始めることができないので、従来の方法では生産の始めに簡単に表面積を増加させるという選択肢は認められない。
【００６８】
２回以上の生産サイクルがどのようにより有益になりえるかを示すために、図１３は図１２の例を継続する。図１３は、新規の方法の表面密度が従来の方法の表面密度を超える、本発明の新規方法の下での所望の細胞型の集団増殖と比較した、従来の方法の下での増殖表面上の所望の細胞集団増殖のグラフ表示を示す。この例に焦点を合わせるために、この説明では、所望の細胞集団を得る工程については記載していない。本発明のこの態様の時間に関連する利点を、当業者がより容易に判断することができるように、培養の「日」は０で開始する。この例において、「０日目」に従来の所望の細胞の表面密度０．５×１０５細胞／ｃｍ２を使用して両方の培養を開始する。この例示的な例において、従来の方法の増殖表面も、気体透過性材料を含む。しかしながら、従来の方法における増殖表面比に対する培地量は、新規の方法における４ｍｌ／ｃｍ２と対照的に１ｍｌ／ｃｍ２である。図１３で示すように、従来の方法における所望の細胞集団は約４日で、表面密度約ｌ．５×１０６細胞／ｃｍ２のとき、増殖速度が低下し始め、１４日で最大表面密度２×１０６細胞／ｃｍ２に達する。その時点で、所望の細胞集団を、新鮮培地１．０ｍｌ／ｃｍ２の中に、表面密度０．５×１０６／ｃｍ２で、増殖面積の４ｃｍ２に分配し、生産サイクルは再び始まり、さらに１４日で、表面密度２×１０６細胞／ｃｍ２に達し、２８日に８×１０６の所望の細胞を生じる。比較すると、新規の方法における所望の細胞集団は、ほぼ１０日から１１日で表面密度約３×１０６細胞／ｃｍ２のとき増殖速度が低下し始め、２８日で最大表面密度４×１０６細胞／ｃｍ２に達することができた。しかしながら、生産を促進するために、所望の細胞集団がまだ高増殖率にあるときにサイクルが終了する。このように、約１０〜１１日に、新鮮培地４．０ｍｌ／ｃｍ２の中に増殖表面積６ｃｍ２に対して表面密度０．５×１０６／ｃｍ２で３×１０６細胞を再分配し、生産サイクルは再び始まり、所望の細胞集団はほぼさらなる１０〜１１日で表面密度３×１０６細胞／ｃｍ２に達し、およそ２１日で１８×１０６の所望の細胞を生んだ。このように、新規の方法は、従来の方法と比較して、約７５％の時間で、２倍を超える数の所望の細胞を生産した。
【００６９】
気体透過性材料を含む増殖表面上に１０×１０６細胞／ｃｍ２を超える細胞表面密度を得ることができたが、高い表面密度を使用する本発明の態様は、この例に記載される密度に限定するものではないことを実証した。
【００７０】
このように、低減された細胞表面密度を使用することによって、細胞組成物内に存在する所与の量の所望の細胞を生産するための所要時間を最小限にする要望があるときの、本
発明の方法の別の例がここに記載される。
ａ．抗原提示細胞および／またはフィーダ細胞の存在下において、培地量対表面積の比が少なくとも２ｍｌ／ｃｍ２で、気体透過性材料を含む増殖表面領域に所望の細胞を播種すること、および、
ｂ．生産サイクルの始めに、標的細胞の表面密度が約０．５×１０６細胞／ｃｍ２の従来の密度内であるような、好ましい表面密度条件を確立すること、および、
ｃ．所望の細胞集団が従来の表面密度約２×１０６細胞／ｃｍ２を超えて増殖することができるようにすること、および、
ｄ．さらに多くの所望の細胞が求められる場合、気体透過性材料を含む追加の増殖表面に所望の細胞を再分配すること、および、所望の細胞を十分得られるまでステップａ〜ｄを繰り返すこと。
【００７１】
これらの新規の方法を使用するとき、以下の培養を開始する特性を組み合わせることによってさらなる有益性を達成することができる。すなわち、従来と異なって低い表面積を使用すること、所望の細胞および／またはフィーダ細胞の新規の表面密度比を使用すること、気体透過性材料を含む増殖表面領域を利用すること、従来と異なって高い培地量対増殖表面積の比を利用すること、およびサイクルで生産を行なうことである。この条件は、所望の結果を達成するために、低減生産時間、表面積利用、供給頻度などの間のバランスを取るなど、任意の生産サイクルで多様になることがあり得る。
【００７２】
図１４は、従来の方法に関連したまたさらなる利点が得られる、別の新規の方法を示す。本明細書に記載した、他の例示的な実施形態のように、本明細書の記載は、本発明の範囲を限定しないが、改良された生産効率の利点を達成する方法について記載されるように作用することを、当業者は認識しえるだろう。
【００７３】
この例において、所望の細胞は、従来の条件において毎週倍加している。当業者がこの実施形態の時間に関する利点をより容易に判断することができるように、培養の「日」は「０」で開始する。さらに、この例を単純化するために、フィーダ細胞および／または抗原提示細胞の表面密度比に関する前述のことは繰り返さない。例示の目的で、従来の条件において７日間の倍加時間で５００，０００の所望の細胞の開始集団が「０日目」の生産を表していると仮定する。従来の方法は、表面密度０．５×１０６細胞／ｃｍ２でおよび培地量対表面積の比１ｍｌ／ｃｍ２で始める。示すように、所望の細胞集団が表面密度２×ｌ０６細胞／ｃｍ２に達すると、細胞を表面密度０．５×１０６細胞／ｃｍ２で追加の表面領域上に分配し、生産サイクルを新たに始める。本例の新規の方法を、表面密度０．０６×１０６細胞／ｃｍ２、気体透過性材料を含む増殖表面領域、および培地量対表面積の比６ｍｌ／ｃｍ２で始める。示すように、集団が増殖プラトーの始まりに近づいているとき、細胞をさらなる増殖表面領域に再分配する。この場合、細胞表面密度が、培地量対表面積の比の１．５倍（つまり約１．５×ｌ０６細胞／ｍｌ）に接近すると従来の方法においてプラトーが開始されることに注意して、集団がプラトーに達していることを測定する。このように、約９日目に、表面密度約４．５×１０６細胞ｓ／ｃｍ２で細胞を増殖表面積３６ｃｍ２上に分配し、生産サイクルを新たに始める。
【００７４】
図１５は、図１４で表された各生産方法の比較を作表し、かつ、新規の方法の能力、および、十分に効率を獲得するためにさまざまな段階で生産手順を調節することはなぜ賢明かを実証するべく段階に拡大する。新規の方法は従来の方法を圧倒し、生産サイクルのわずか第２段階を完了しただけで、必要表面積がわずか６１％でわずか約半分の時間でほぼ１．３７倍多くの細胞を生ずることに注意されたい。一方、生産サイクルの第３段階が、どのように、細胞における量の増加を生み出し、かつ表面積に相当する増加を生み出すかに注意されたい。このように、任意の所与の工程ごとに、最適水準の効率を達成するために、工程の各サイクルの全体を通して、最初の細胞表面密度および／または最終の細胞表
面密度をどのように調節するかを予想するために、生産サイクルはモデル化されるべきである。
【００７５】
１つの例として、図１６は、生産が進むにつれて効率を獲得するため、新規の方法においてどのように可変量を変更することができるのかの例を示す。たとえば、サイクル３の開始表面密度の０．０６から０．７０細胞／ｃｍ２までの増加、および、最終表面密度の４．５から７．５細胞／ｃｍ２までの変化を行なうことができる。最終表面密度の増加は、開始の６ｍｌ／ｃｍ２を超えて大きな数まで、培地量対表面積の比の増加の問題である。表面積に対する培地量が大きければ大きいほど、サイクルはそれだけ長く急増殖相にとどまる（つまりプラトーより前の集団増殖）。ここでは、５日の延長を許し、急増殖相を完了させて、培地量対表面積の比を約８ｍｌ／ｃｍ２に上げた。そうすることにより、この例において、合理的な表面積を用いて３４日で３兆を超える細胞を生産できる。たとえば、装置を構築して気体透過性材料を含む増殖表面約６２５ｃｍ２でテストした。これは従来の方法より明らかに優位な細胞生産の手法である。
【００７６】
このように、低減された細胞表面密度を使用することによって細胞組成物内に存在する所与の量の所望の細胞を生産するための所要時間を最小限にする要望があるときの、本発明の方法の好ましい別の実施形態がここに記載される。
ａ．抗原提示細胞および／またはフィーダ細胞の存在下において、少なくとも２ｍｌ／ｃｍ２の培地量対表面積の比で、気体透過性材料を含む増殖表面領域に所望の細胞を播種すること、および
ｂ．生産サイクルの始めに、標的細胞の表面密度が従来の密度未満であり、好ましくは約０．５×１０６所望の細胞／ｃｍ２〜約３９００所望の細胞／ｃｍ２の間であり、かつ所望の細胞と抗原提示細胞および／またはフィーダ細胞との合計が少なくとも約１．２５×ｌ０５細胞／ｃｍ２であるような、好ましい表面密度条件を確立すること、および
ｃ．所望の細胞集団が従来の表面密度約２×１０６細胞／ｃｍ２を超えて増殖することを可能にすること、および
ｄ．さらに多くの所望の細胞が求められる場合、気体透過性材料を含む追加の増殖表面に所望の細胞を再分配すること、および、十分な所望の細胞が得られるまでステップａ〜ｄを繰り返すこと。
【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１】
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【図３】
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【図７】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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