(57)【要約】本発明は、腫瘍細胞のアポトーシスを促進する方法であって、有効量の接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤の投与により、腫瘍増殖を阻害するか、または腫瘍の転移を阻害するか、または腫瘍アポトーシスを促進するか、またはそれらの任意の組み合わせをもたらすことができる方法を提供する。阻害剤は、低分子有機化合物である。したがって、接着斑キナーゼ阻害剤は、悪性のがんなどの腫瘍の処置に使用することができる。たとえば、有効量のＦＡＫ阻害剤ＰＮＤ−１１８６の投与は、乳がんおよび卵巣がんのマウスモデルで腫瘍細胞を阻害することが明らかになっている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の腫瘍細胞のアポトーシスを促進するか、または患者における転移を阻害するか、またはその両方を行う方法であって、有効量の接着斑キナーゼの阻害剤を、それを必要としている該患者に投与することを含み、該阻害剤は、下記式の化合物
【化４】
2013501808.tif 000013
またはその任意の薬学的に許容される塩である、方法。
【請求項２】
アポトーシスの促進により、腫瘍に罹患した前記患者の腫瘍増殖を阻害するか、腫瘍の転移を阻害するか、または腫瘍アポトーシスを促進するか、またはそれらの任意の組み合わせをもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記腫瘍は悪性のがんである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記腫瘍は乳がんまたは卵巣がんを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記阻害剤は薬学的に許容される賦形剤を含む処方物として前記患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記阻害剤は前記患者に経口投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記阻害剤は前記患者に非経口投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記患者に有益な作用を与えるのに十分な持続期間および頻度で一定期間にわたり、該患者に前記阻害剤を複数回投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記患者に有効量の第２の薬物を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
患者の腫瘍細胞のアポトーシスを促進するか、または転移を阻害するか、またはその両方を行う薬物を調製するための、接着斑キナーゼ阻害剤に属する阻害剤の使用であって、該阻害剤は、下記式の化合物
【化５】
2013501808.tif 000014
またはその任意の薬学的に許容される塩である、使用。
【請求項１１】
アポトーシスの促進により、腫瘍増殖を阻害するか、または腫瘍の転移を阻害するか、または腫瘍アポトーシスを促進するか、またはそれらの任意の組み合わせを行う、請求項１０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２００９年８月１２日に出願された米国仮特許出願６１／２３３，３５１号への優先権を主張し、この米国仮特許出願は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
政府支援の陳述
本発明は、国立衛生研究所によるＮＩＨ助成金ＣＡ１０７２６３およびＣＡ１０２３１０、ならびに米軍研究所助成金ＯＣ０８００５１の下、政府支援によりなされた。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
アポトーシスは、細胞が内部の生化学的シグナルに応答してプログラム死を起こす細胞現象である。典型的には、アポトーシスは発生および分化に関与して生体に有利に働く。場合によっては、腫瘍はアポトーシスが起こらないため増殖すると考えられる。腫瘍の増殖および転移は、腫瘍を持つ生体にとって負のプロセスである。腫瘍の転移は、がん関連死の主要な原因である。
【０００４】
腫瘍細胞は、足場非依存的様式で増殖することができる。これには、インテグリン細胞表面受容体により制御される通常の増殖抑制を回避する生存シグナルが、一部介在している。
【０００５】
接着斑キナーゼ（ＦＡＫ：ｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｋｉｎａｓｅ）は、ＦＡＫの活性が細胞の生存、遊走および浸潤の制御に関与するインテグリン媒介性マトリックス結合部位にリクルートされる細胞質チロシンキナーゼである。接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）は、インテグリンに結合し、増殖、生存および遊走など様々な細胞プロセスを調節する。
【０００６】
ＦＡＫは、腫瘍細胞内でシグナル伝達キナーゼおよび細胞接着に関連する足場の両方として機能してｐ１３０Ｃａｓおよびパキシリンなど様々な細胞骨格関連タンパク質の位置的な動員およびリン酸化を調整する。Ｓｃｈｌａｅｐｆｅｒ  ＤＤ，Ｈａｕｃｋ  ＣＲ，Ｓｉｅｇ  ＤＪ．，Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｋｉｎａｓｅ，Ｐｒｏｇ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９９９，７１：４３５−７８；Ｚｏｕｑ  ＮＫ，Ｋｅｅｂｌｅ  ＪＡ，Ｌｉｎｄｓａｙ  Ｊ，Ｖａｌｅｎｔｉｊｎ  ＡＪ，Ｚｈａｎｇ  Ｌ，Ｍｉｌｌｓ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＫ  ｅｎｇａｇｅｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｔｏ  ｍａｉｎｔａｉｎ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ａｎｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ｐａｘｉｌｌｉｎ  ａｎｄ  ｐ１３０Ｃａｓ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  ２００９，１２２：３５７−６７を参照されたい。Ｙ３９７でのＦＡＫ自己リン酸化の増大は、ＦＡＫの活性化のマーカーである。インテグリンを介してＹ３９７でのＦＡＫリン酸化により、ＳｒｃファミリーチロシンキナーゼのＦＡＫへの結合が促進され得、ＦＡＫ介在性のｃ−Ｓｒｃ活性化を引き起こすことができる。Ｗｕ  Ｌ，Ｂｅｒｎａｒｄ−Ｔｒｉｆｉｌｏ  ＪＡ，Ｌｉｍ  Ｙ，Ｌｉｍ  ＳＴ，Ｍｉｔｒａ  ＳＫ，Ｕｒｙｕ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ＦＡＫ−Ｓｒｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｅｖｅｎｔｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ａｌｐｈａ５ｂｅｔａ１  ａｎｄ  ａｌｐｈａ４ｂｅｔａ１  ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００８，２７：１４３９-４８を参照されたい。ＦＡＫおよびｃ−Ｓｒｃは共にｐ１３０Ｃａｓなどの共通の下流標的をリン酸化し得るため、ＦＡＫおよび／またはｃ−Ｓｒｃの阻害作用が下流標的のリン酸化現象に異なる結果を与えるかどうかは、特定されていない。Ｄｅｆｉｌｉｐｐｉ  Ｐ，Ｄｉ  Ｓｔｅｆａｎｏ  Ｐ，Ｃａｂｏｄｉ  Ｓ．ｐ１３０Ｃａｓ：ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００６，１６：２５７−６３を参照されたい。マウスの４Ｔ１乳癌細胞では、ＦＡＫが浸潤および転移の細胞表現型を促進することが明らかになっている。Ｍｉｔｒａ  ＳＫ，Ｌｉｍ  ＳＴ，Ｃｈｉ  Ａ，Ｓｃｈｌａｅｐｆｅｒ  ＤＤ，Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｒｏｋｉｎａｓｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００６，２５：４４２９−４０を参照されたい。浸潤性ヒトがんではＦＡＫの発現が増加し（Ｍｉｔｒａ  ＳＫ，Ｓｃｈｌａｅｐｆｅｒ  ＤＤ．，Ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ＦＡＫ−Ｓｒｃ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃ��ｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００６，１８：５１６−２３）、ＦＡＫのシグナル伝達は、方向性を持った細胞運動を促進する（Ｍｉｔｒａ  ＳＫ，Ｈａｎｓｏｎ  ＤＡ，Ｓｃｈｌａｅｐｆｅｒ  ＤＤ．，Ｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｋｉｎａｓｅ：ｉｎ  ｃｏｍｍａｎｄ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００５，６：５６−６８；Ｔｏｍａｒ  Ａ，Ｓｃｈｌａｅｐｆｅｒ  ＤＤ．，Ｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｋｉｎａｓｅ：ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ＧＡＰｓ  ａｎｄ  ＧＥＦｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００９，２１：６７６−８３）。
【０００７】
ＦＡＫに対するＡＴＰ競合低分子阻害剤が、Ｎｏｖａｒｔｉｓ（ＴＡＥ−２２６）およびＰｆｉｚｅｒ（ＰＦ−５７３，２２８、ＰＦ−５６２，２７１）により開発されてきた。加えて、主要なＦＡＫのチロシン−３９７自己リン酸化、およびＦＡＫに結合するＳｒｃファミリーキナーゼへのアクセスを阻止する化合物（Ｙ１５など）も同定されてきた。たとえば、Ｓｈｉ  Ｑ，Ｈｊｅｌｍｅｌａｎｄ  ＡＢ，Ｋｅｉｒ  ＳＴ，Ｓｏｎｇ  Ｌ，Ｗｉｃｋｍａｎ  Ｓ，Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｌｏｗ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｋｉｎａｓｅ，ＴＡＥ２２６，ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｇｌｉｏｍａ  ｇｒｏｗｔｈ，Ｍｏｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｇ  ２００７，４６：４８８−９６；Ｓｌａｃｋ−Ｄａｖｉｓ  ＪＫ，Ｍａｒｔｉｎ  ＫＨ，Ｔｉｌｇｈｍａｎ  ＲＷ，Ｉｗａｎｉｃｋｉ  Ｍ，Ｕｎｇ  ＥＪ，Ａｕｔｒｙ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００７，２８２：１４８４５−５２；Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＷＧ，Ｕｎｇ  Ｅ，Ｗｈａｌｅｎ  Ｐ，Ｃｏｏｐｅｒ  Ｂ，Ｈｕｌｆｏｒｄ  Ｃ，Ａｕｔｒｙ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＰＦ−５６２，２７１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８，６８：１９３５−４４；ａｎｄ  Ｇｏｌｕｂｏｖｓｋａｙａ  ＶＭ，Ｎｙｂｅｒｇ  Ｃ，Ｚｈｅｎｇ  Ｍ，Ｋｗｅｈ  Ｆ，Ｍａｇｉｓ  Ａ，Ｏｓｔｒｏｖ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，１，２，４，５−ｂｅｎｚｅｎｅｔｅｔｒａａｍｉｎｅ  ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｙ３９７  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｄｅｃｒｅａｓｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２００８，５１：７４０５−１６を参照されたい。
【０００８】
ＰＮＤ−１１８６などのＦＡＫの様々な阻害剤は、２００８年３月１０日に出願され、特許文献１として公開されたＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００３２０５号に開示されており、その全体を本明細書に緩用する。ＰＮＤ−１１８６の調製については、その公開された特許出願に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００８／１１５３６９号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、患者における細胞のアポトーシスを促進する、または転移を阻害する、またはインビボで、例えば患者においてその両方を行う方法であって、有効量の接着斑キナーゼの低分子阻害剤を、それを必要とする患者に投与する方法を対象とする。たとえば、阻害剤は、下記式の化合物またはその任意の薬学的に許容される塩であってもよい。
【００１１】
【化１】
2013501808.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ポリＧｌｕ：Ｔｙｒ（４：１）のリン酸化を測定する、ＧＳＴ−ＦＡＫ４１１−６８６およびＨｉｓタグ付きＦＡＫ４１１−６８６（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）のＫ−ＬＩＳＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）活性プロファイルを示す。バキュロウイルス発現、グルタチオンアガロース結合およびサイズ分画クロマトグラフィー後、ＧＳＴ−ＦＡＫ４１１−６８６の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー染色により可視化したところ、９０％超であった（図示）。三重測定により平均値±ＳＤを算出した。
【図２Ａ】図２Ａは、表記のタンパク質について免疫ブロッティングした一連のＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンドを示し、これはＦＡＫ、ｃ−Ｓｒｃおよびｐ１３０Ｃａｓのチロシンリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏｎ）に対するＰＮＤ−１１８６の作用を示す。Ｙ３９７でのＦＡＫの自己リン酸化の増加は、ＦＡＫの活性化のマーカーである。４Ｔ１細胞は７０％コンフルエントで、１０μｇ／ｍＬのフィブロネクチンでコートした組織培養プレートに播種した。細胞をビヒクル（ＤＭＳＯ）またはＰＮＤ−１１８６で１時間処理した。細胞ライセート内のＦＡＫ、ｐ１３０Ｃａｓ、Ｓｒｃまたはアクチンの総レベルを示す。同時に、ＦＡＫまたはＳｒｃ活性（ｐＹ３９７のＦＡＫまたはｐＹ４１６のＳｒｃ）、およびｐ１３０Ｃａｓのチロシン（ｔｙｐｒｏｓｉｎｅ）リン酸化（ｐＹ２４９のｐ１３０Ｃａｓ）の変化について、ホスホ特異的免疫ブロッティングを行った。
【図２Ｂ】図２Ｂは、表記のタンパク質について免疫ブロッティングした一連のＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンドを示し、これはＦＡＫ、ｃ−Ｓｒｃおよびｐ１３０Ｃａｓのチロシンリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏｎ）に対するＰＮＤ−１１８６の作用を示す。Ｙ３９７でのＦＡＫの自己リン酸化の増加は、ＦＡＫの活性化のマーカーである。４Ｔ１細胞は７０％コンフルエントで、１０μｇ／ｍＬのフィブロネクチンでコートした組織培養プレートに播種した。細胞をビヒクル（ＤＭＳＯ）またはダサチニブ（ＬＣ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）で１時間処理した。細胞ライセート内のＦＡＫ、ｐ１３０Ｃａｓ、Ｓｒｃまたはアクチンの総レベルを示す。同時に、ＦＡＫまたはＳｒｃ活性（ｐＹ３９７のＦＡＫまたはｐＹ４１６のＳｒｃ）、およびｐ１３０Ｃａｓのチロシン（ｔｙｐｒｏｓｉｎｅ）リン酸化（ｐＹ２４９のｐ１３０Ｃａｓ）の変化について、ホスホ特異的免疫ブロッティングを行った。
【図２Ｃ】図２Ｃは、１時間の処理（ＰＮＤ−１１８６、１μＭ）、続いてＰＢＳによる洗浄後の４Ｔ１細胞におけるＦＡＫのｐＹ３９７のリン酸化の経時変化を示す。ＰＢＳによる洗浄後、表記の時間にタンパク質ライセートを作製した。
【図３Ａ】図３Ａは、ビヒクル（ＤＭＳＯ）または１μＭのＰＮＤ−１１８６の存在下、０時間、１１時間および２２時間（スケールバーは２５０μＭ）に創傷アッセイから得た一連のコマ撮り顕微鏡画像を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、３回の実験のうち代表的な１実験のコマ撮り画像を定量化したものを示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、１μＭのＰＮＤ−１１８６の存在下で４時間後の、フィブロネクチンコートＭｉｌｌｉＣｅｌｌトランスウェルの細胞の運動性を、ＤＭＳＯ対照に対する比率で示す（±ＳＤ）。
【図４Ａ】図４Ａは、７２時間にわたるビヒクルおよび表記の濃度のＰＮＤ−１１８６の存在下での培養プレート上の４Ｔ１細胞の接着増殖および懸濁（非接着）増殖を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ヨウ化プロピジウム染色を用いた、細胞の接着増殖および懸濁増殖の細胞周期解析を示し、相対的なＤＮＡ量を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、カスパーゼ３切断を示す接着細胞または懸濁細胞由来のライセートを示している、染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンドを示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、表記の濃度のＰＮＤ−１１８６の存在下、フローサイトメトリーを用いて決定した接着細胞と懸濁細胞のアネキシンＶ陽性細胞のグラフを示す。
【図５Ａ】図５Ａは、表記の濃度のＰＮＤ−１１８６の存在下での４Ｔ１細胞スフェロイド懸濁物の顕微鏡写真を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、７２時間（ｎ＝４０）でのスフェロイドの大きさに関するグラフを示す（±ＳＤ）。
【図５Ｃ】図５Ｃは、表記のタンパク質に対する表記の濃度のＰＮＤ−１１８６の活性を示す、免疫ブロッティングしたＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンドを示す。
【図６Ａ】図６Ａは、表記の濃度のＰＮＤ−１１８６の存在下での軟寒天上の４Ｔ１細胞コロニーの顕微鏡写真である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、表記の濃度のＰＮＤ−１１８６の存在下でのコロニー数の関係を示すグラフである。
【図６Ｃ】図６Ｃは、表記の濃度のＰＮＤ−１１８６の存在下でのコロニーの大きさの関係を示すグラフである。
【図６Ｄ】図６Ｄは、表記の濃度のＰＮＤ−１１８６の存在下での軟寒天上の４Ｔ１細胞コロニーの顕微鏡写真である。
【図６Ｅ】図６Ｅは、表記の濃度のＰＮＤ−１１８６の存在下での細胞アポトーシス比率の関係を示すグラフである。
【図７Ａ】図７Ａは、１００ｍｇ／ｋｇのＰＮＤ−１１８６の存在下と、対照の存在下とでの、マウスに皮下移植してから８日後のｍＣｈｅｒｒｙ４Ｔ１腫瘍の顕微鏡写真を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、表記の量のＰＮＤ−１１８６の存在下での、マウスに皮下移植してから８日後の腫瘍の腫瘍重量を示すグラフを示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、表記の量のＰＮＤ−１１８６に対する蛍光ＴＵＮＥＬ染色の平均強度を定量化したものを示す。
【図７Ｄ】図７Ｄは、表記の量のＰＮＤ−１１８６の存在下、ＴＵＮＥＬ染色した腫瘍の代表的な顕微鏡写真画像を示す。
【図７Ｅ】図７Ｅは、１００ｍｇ／ｋｇのＰＮＤ−１１８６に曝露された移植腫瘍由来の細胞内で切断型カスパーゼ−３を示す、蛍光染色した顕微鏡写真を対照と比較して示す。
【図８Ａ】図８Ａは、表記の濃度のＰＮＤ−１１８６の存在下で培養した卵巣癌腫瘍ＩＤ８細胞由来の細胞数を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、表記の濃度のＰＮＤ−１１８６の存在下で培養した卵巣癌腫瘍ＩＤ８細胞由来の生存細胞数を示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、ＩＤ８細胞を腹腔内注射した４６日後のＣ５７ＢＩ６マウスの写真を示す。試験マウスには、０．５ｍｇ／ｍＬのＰＮＤ−１１８６（５％スクロース溶液中）と対照とを経口的に自由に与えた。
【図８Ｄ】図８Ｄは、ＩＤ８を注射したマウスと対照との腹膜腔から採取した腹水関連細胞のグラフを示す。
【図８Ｅ】図８Ｅは、０．５ｍｇ／ｍＬのＰＮＤ−１１８６と対照とで処置したマウスを用いて抗ＦＡＫ、続いてホスホ特異的抗ＦＡＫで免疫ブロッティングしたＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンドを示す。
【図８Ｆ】図８Ｆは、マウス由来の腹水細胞における総ＦＡＫに対するＦＡＫリン酸化の割合を示すグラフを示す。
【図８Ｇ】図８Ｇは、０．５ｍｇ／ｍＬのＰＮＤ−１１８６と対照とに曝露後の、ＩＤ８を注射したマウス由来の腹膜組織の明視野顕微鏡写真画像および蛍光顕微鏡写真画像を示す。
【図８Ｈ】図８Ｈは、上記のようにＩＤ８を注射したマウス由来の腹膜関連腫瘍を定量化したもの示すグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書および添付の特許請求の範囲に使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、複数の意味を含む。
【００１４】
本明細書で使用する場合、「個体」または「患者」（処置の被験体と同様）は、哺乳動物および非哺乳動物を共に意味する。哺乳動物として、たとえば、ヒト；非ヒト霊長類、たとえば類人猿およびサル；ならびに非霊長類、たとえばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジおよびヤギが挙げられる。非哺乳動物としては、たとえば、魚類および鳥類が挙げられる。
【００１５】
「有効量」という表現は、障害に罹患している個体の治療の説明に使用する場合、障害に関与するＦＡＫが活性である個体の組織内のＦＡＫを阻害するか、または他の方法でＦＡＫに作用し、そうした阻害または他の作用が有利な治療効果を発揮するのに十分な程度に起こる、本発明の化合物の量をいう。
【００１６】
本明細書の意味の範囲内における「処置する」または「処置」とは、障害または疾患に関連する症状の軽減、あるいは、これらの症状のさらなる進行または悪化の阻害、あるいは、疾患もしくは障害の防止または予防、あるいは、疾患または障害の治癒をいう。
【００１７】
本明細書で使用する場合、本発明の化合物の「有効量」または「治療有効量」とは、障害もしくは状態に関連する症状の全部または一部を軽減する、あるいは、これらの症状のさらなる進行もしくは悪化を阻止または遅延させる、あるいは、障害もしくは状態を防止または予防する化合物の量をいう。特に、「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するのに必要な投与量および期間における有効な量をいう。治療有効量はまた、発明の化合物の任意の毒性または有害な作用を、治療上有益な作用が上回る量である。
【００１８】
本明細書で使用される用語としての「アポトーシス」は、内因性または外因性シグナルから内部の生化学的機構が働き、最終的に細胞の死を引き起こす細胞または細胞群のプログラム死をいう。アポトーシス「を促進する」とは、外因性シグナル、ＦＡＫキナーゼ阻害剤分子による作用の結果、本来ならば存在し続けることが可能な細胞、たとえば、腫瘍でアポトーシスが起こることをいう（すなわち、「腫瘍アポトーシスを促進する」とは、その作用が、正常な細胞と比較して腫瘍の細胞に対してある程度選択的である、こうしたプロセスをいう）。
【００１９】
「腫瘍増殖を阻害する」とは、腫瘍の大きさまたは塊の増加に対する作用をいい、この場合、有効量のＦＡＫ阻害剤の非存在下で予想されるものと比較して、その増加が小さくなる。
【００２０】
「腫瘍の転移を阻害する」とは、腫瘍細胞の集団における細胞の転移もしくは悪性形質転換の発生または速度を低下させ、遊走癌細胞により正常な細胞で癌状態が誘導されるのを阻害する作用をいう。
【００２１】
当該技術分野において周知のように「塩」は、イオン形態のカルボン酸、スルホン酸またはアミンなどが対イオンと組み合わされた有機化合物を含む。たとえば、アニオン形態の酸は、金属カチオン、たとえばナトリウム、カリウムおよび同種のものなどのカチオン；ＮＨ４＋などのアンモニウム塩、もしくはテトラメチルアンモニウムなどのテトラアルキルアンモニウム塩など様々なアミンのカチオン、またはトリメチルスルホニウムなどの他のカチオンおよび同種のものと塩を形成することができる。「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」塩は、ヒトでの摂取が認められており、クロリド塩またはナトリウム塩など一般に無毒であるイオンから形成される塩である。「両性イオン」は、分子内に形成され得、かつ一方はアニオンを形成し、他方はカチオンを形成し、相互にバランスをとる働きをする少なくとも２つのイオン性基を持つ分子内塩である。たとえば、グリシンなどのアミノ酸は、両性イオン形態で存在することができる。「両性イオン」は、本明細書の意味の範囲内にある塩である。本発明の化合物は、塩の形態をとってもよい。「塩」という用語は、本発明の化合物である遊離酸または遊離塩基の付加塩を包含する。塩は、「薬学的に許容される塩」であってもよい。「薬学的に許容される塩」という用語は、薬学的用途に有用性を与える範囲内の毒性プロファイルを有する塩をいう。ただし、薬学的に許容されない塩は、高い結晶化度などの特性を有する場合があり、こうした特性は、本発明の実施に有用性があり、たとえば本発明の化合物の合成、精製または処方のプロセスに有用性がある。
【００２２】
好適な薬学的に許容される酸付加塩は、無機酸から調製しても、または有機酸から調製してもよい。無機酸の例として、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭酸、硫酸およびリン酸が挙げられる。適切な有機酸は、脂肪族、脂環式、芳香族、アラリファティック（ａｒａｌｉｐｈａｔｉｃ）、複素環式のカルボン酸およびスルホン酸クラスの有機酸から選択してもよく、その例として、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、４−ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン酸（パモ酸）、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、スルファニル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、ステアリン酸、アルギン酸、β−ヒドロキシ酪酸、サリチル酸、粘液酸およびガラクツロン酸が挙げられる。薬学的に許容されない酸付加塩の例として、たとえば、ペルクロラートおよびテトラフルオロボレートが挙げられる。
【００２３】
本発明は、患者において細胞のアポトーシスを促進するかまたは転移を阻害するか、あるいはインビボでその両方を行うＰＮＤ−１１８６などのＦＡＫの低分子阻害剤の使用を対象とする。その低分子ＦＡＫ阻害剤は、腫瘍細胞アポトーシスを誘導または促進することにより、インビボでＦＡＫのＴｙｒ−３９７リン酸化を阻止することができ、腫瘍の大きさの縮小、および腫瘍の転移の防止などの抗腫瘍効果を示し得る。
【００２４】
本発明は、患者において細胞のアポトーシスを促進するかまたは転移を阻害するか、あるいは患者などでその両方を行う方法であって、有効量の接着斑キナーゼの阻害剤を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法を対象とする。たとえば、本阻害剤は、下記式の化合物
【００２５】
【化２】
2013501808.tif 000003
またはその任意の薬学的に許容される塩であってもよい。様々な薬学的に許容される塩については以下で考察する。他の関連するＦＡＫ阻害剤は、参照によって本明細書に援用する、２００８年３月１０日に出願され、国際公開第２００８／１１５３６９号として公開されたＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００３２０５号に開示されている。
【００２６】
種々の実施形態では、細胞のアポトーシスを促進すると、腫瘍に罹患した患者の腫瘍増殖を阻害するか、腫瘍の転移を阻害するか、または腫瘍アポトーシスを促進するか、あるいはそれらの任意の組み合わせをもたらし得る。たとえば、腫瘍は、悪性のがんであってもよい。たとえば、腫瘍は、乳がんまたは卵巣がんを含んでいてもよい。
【００２７】
種々の実施形態では、薬学的に許容される賦形剤を含む処方物として上記阻害剤を上記患者に投与してもよい。様々な薬学的に許容される賦形剤については以下で考察する。
【００２８】
種々の実施形態では、上記阻害剤を上記患者に経口投与してもよい。他の実施形態では、上記阻害剤を上記患者に非経口投与してもよい。経口投与または非経口投与に適した上記阻害剤を含む様々な処方物については、以下で考察する。
【００２９】
上記アポトーシスを促進するＦＡＫ阻害剤の投与には、様々な投薬レジメンを使用してもよい。たとえば、上記患者に有益な作用を与えるのに十分な持続期間および頻度で一定期間にわたり、上記患者に上記阻害剤の複数回投与を行ってもよい。種々の実施形態では、上記患者が処置される条件に応じて、有効量の第２の薬物を上記患者に投与してもよい。
【００３０】
種々の実施形態では、本発明は、細胞のアポトーシスを促進する薬物の調製のための、接着斑キナーゼ阻害剤に属する阻害剤の使用であって、該阻害剤は、下記式の化合物
【００３１】
【化３】
2013501808.tif 000004
またはその任意の薬学的に許容される塩を含む、使用を提供する。種々の実施形態では、細胞のアポトーシスを促進すると、腫瘍増殖を阻害するか、または腫瘍の転移を阻害するか、または腫瘍アポトーシスを促進するか、あるいはそれらの任意の組み合わせをもたらし得る。種々の実施形態では、悪性または非悪性の腫瘍を含む悪い状態を処置するため、本薬物を使用してもよい。
【００３２】
本明細書の発明者らにより、ＰＮＤ−１１８６はＦＡＫのＴｙｒ−３９７リン酸化をインビボで阻止し、同所性のヒト乳癌のマウス腫瘍モデル、およびマウスの乳癌のマウス腫瘍モデルで抗腫瘍効果を示すことが明らかになっている。ＰＮＤ−１１８６を投与（１００ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）したところ、腫瘍におけるＦＡＫのＴｙｒ−３９７リン酸化の阻害（６０％超）が１２時間持続した（１２時間で、血漿中に平均１５．１μＭ、腫瘍中に平均１０．４μｇ／ｇ）。ＰＮＤ−１１８６を１５０ｍｇ／ｋｇ、１日２回ｐ．ｏ．投与すると、同所性および同系乳癌腫瘍増殖、および腫瘍細胞の肺への自然転移を顕著に阻害した。驚いたことに、０．５ｍｇ／ｍｌのＰＮＤ−１１８６を含む飲料水を自由に与えたマウス（血漿中に平均１．０μＭおよび腫瘍中に平均０．５２μｇ／ｇ）は、腫瘍増殖、および腫瘍性のＦＡＫ−ｐ１３０Ｃａｓのリン酸化の著しい低下を示した。ＰＮＤ−１１８６は培養細胞に対して細胞毒性を示さなかったが、ＰＮＤ−１１８６を自由に与えられた動物由来の腫瘍では、腫瘍芯で壊死領域を示し、ＴＵＮＥＬ染色が増加し、白血球の浸潤が低下していた。ＰＮＤ−１１８６処置により、腫瘍関連の巨脾腫が抑制され、腫瘍壊死因子−α誘発性のインターロイキン−６サイトカイン発現を抑制することから、ＦＡＫの阻害は腫瘍に影響を与え得ることが示唆された。したがってＰＮＤ−１１８６は、腫瘍細胞のアポトーシスの促進または誘導などにより、腫瘍細胞と支質細胞の両方への作用を介して腫瘍増殖および転移または進行を抑制するのに臨床的に有用であり得る。参照によってその全体を本明細書に援用するＣ．Ｗａｌｓｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＰＮＤ−１１８６  ＦＡＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｄｅｃｒｅａｓｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｂｒｅａｓｔ  ｔｏ  ｌｕｎｇ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｐｒｅ−ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌｓ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ  （２０１０），９：１０，７７８−７９０；Ｉ．Ｔａｎｊｏｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＤ−１１８６  ＦＡＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ  （２０１０），９：１０，７６４−７７７を参照されたい。
【００３３】
ＰＮＤ−１１８６は、ＦＡＫのＴｙｒ−３９７に対する抗ホスホ特異的免疫ブロッティングにより測定したところ、マウスおよびヒト乳癌細胞におけるＩＣ５０が約１００ｎＭであることが明らかになっている。ＦＡＫの阻害は、培養腫瘍細胞においてｃ−Ｓｒｃ、ｐ１３０Ｃａｓまたはパキシリンのチロシンリン酸化を変化させない。細胞の増殖および運動性の阻害には、驚くほどの高濃度（ＩＣ５０を５倍超上回る）が必要であった。それにもかかわらず、軟寒天を用いて、または非接着条件下で細胞をコロニーとして増殖させた場合、１００ｎＭのＰＮＤ−１１８６は、細胞増殖、ＦＡＫ−Ｃａｓリン酸化を阻害し、細胞死を誘導した。これに合わせて、マウスの飲料水に０．５ｍｇ／ｍｌという低レベルのＰＮＤ−１１８６を加えると、腫瘍量が減少し、カスパーゼ３切断が増加し、腫瘍のＴＵＮＥＬ染色が増加した。したがってＦＡＫの活性は、三次元環境における腫瘍細胞の生存の促進に予想外に決定的な役割を果たしており、その種の環境でＦＡＫを阻害すると、腫瘍細胞の死をもたらし得る。
【００３４】
インビトロキナーゼアッセイで組換えＦＡＫキナーゼドメインをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として用いると（図１参照）、ＰＮＤ−１１８６は、１．５ｎＭのＩＣ５０でＦＡＫの活性を阻害した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＫｉｎａｓｅＰｒｏｆｉｌｅｒサービスを用いて、ＰＮＤ−１１８６の選択性を評価した。組換えタンパク質キナーゼを用いたこのスクリーニングでは、０．１μＭのＰＮＤ−１１８６は、ＦＡＫだけでなく、Ｆｌｔ３（ＦＭＳ−ｌｉｋｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３：ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３）キナーゼの阻害にも特異性を示した。より高いＰＮＤ−１１８６レベル（１μＭ）では、ＦＡＫおよびＦｌｔ３の活性は無視できる程度であり、ＡＣＫ１（ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｄｃ４２−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  １：活性化Ｃｄｃ４２関連チロシンキナーゼ１）、Ａｕｒｏｒａ−Ａ、ＣＤＫ２（ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ  ２：サイクリン依存性キナーゼ２）／サイクリンＡ、インスリン受容体（ＩＲ）、Ｌｃｋ（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ：リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ）およびＴｒｋＡ（ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ  Ａ：トロポミオシン関連キナーゼＡ）など他のキナーゼも５０％超阻害した。Ｆｌｔ３の発現は、造血系の細胞で認められ、本明細書で使用した４Ｔ１細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞またはＩＤ８細胞では検出できる程度に発現しない。下記表１を参照されたい。
【００３５】
表１：ＰＮＤ−１１８６のキナーゼプロファイル解析
【００３６】
【表１】
2013501808.tif 000005
マウスの４Ｔ１乳癌細胞では、ＦＡＫは、浸潤および転移の細胞表現型を促進する。４Ｔ１細胞に加えるＰＮＤ−１１８６の濃度を上げると（０．１μＭから１．０μＭまで）、ＦＡＫのＴｙｒ−３９７リン酸化（ｐＹ３９７）を阻害し、その結果、１時間以内で総ＦＡＫタンパク質のレベルが上昇した（図２Ａ参照）。ＰＮＤ−１１８６をヒトＭＤ−ＭＢＡ−２３１乳癌細胞およびマウスＩＤ８卵巣癌細胞に加えても、同様の結果が得られた。ＰＮＤ−１１８６の、ＦＡＫのｐＹ３９７阻害に対する細胞のＩＣ５０は、デンシトメトリー解析により約０．１μＭと測定され、ＦＡＫのｐＹ３９７リン酸化の最大減少率は、約８０％であった（図２Ａ参照）。
【００３７】
ＰＮＤ−１１８６によるＦＡＫの阻害は、洗い出し実験により、ＦＡＫのｐＹ３９７リン酸化が６０分以内に十分に回復することが示されたように、可逆的であった（図２Ｃ）。驚いたことに、ＰＮＤ−１１８６を１μＭまで加えても、接着４Ｔ１細胞におけるＳｒｃのＴｙｒ−４１６リン酸化（ｐＹ４１６）またはｐ１３０ＣａｓのＴｙｒ−２４９リン酸化（ｐＹ２４９）に対するホスホ特異的抗体の反応性により測定した場合、ｃ−Ｓｒｃ活性に影響を与えなかった（図２Ａ）。対照的に、ダサチニブ（ＢＭＳ−３５４８２５）を４Ｔ１細胞に加えた場合（Ａｂｅｌｓｏｎマウス白血病ウイルスオンコジーンホモログ１、ＡｂｌおよびＳｒｃファミリーキナーゼを共に阻害）、ＳｒｃのｐＹ４１６およびｐ１３０ＣａｓのｐＹ２４９が共に用量依存的に減少した（図２Ｂ）。とりわけ、ダサチニブは、ＦＡＫのｐＹ３９７レベルに影響を与えず（図２Ｂ）、ＭＤ−ＭＢＡ−２３１細胞、またはＰＰ１として一般に知られる４−アミノ−５−（４−メチルフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］−ピリミジンなど別のＳｒｃ阻害剤を用いても、同様の結果が得られた。以上を総合すると、これらの結果は、ＰＮＤ−１１８６は、ＦＡＫリン酸化を可逆的に強力に阻害すること、さらに、ＳｒｃのｐＹ４１６リン酸化およびｐ１３０ＣａｓのｐＹ２４９リン酸化は、接着４Ｔ１細胞においては、Ｓｒｃの活性に依存するが、ＦＡＫの活性には依存しないことを示す。
【００３８】
ＰＮＤ−１１８６はまた、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、対照）または１μＭのＰＮＤ−１１８６（図３Ａ）の存在下で２２時間行った時間経過創傷治癒アッセイにより示されたように、４Ｔ１細胞の遊走も阻害する。ＰＮＤ−１１８６は、４Ｔ１細胞の移動を防ぎ、これは、隆起形成が見られないこと、および４Ｔ１エッジ細胞の集団の単層から分離が稀にしか起こらないことと関連していた。１μＭのＰＮＤ−１１８６を用いた場合、２２時間にわたり４Ｔ１細胞の剥離または死の証拠が観察されず、目を引くのは、１．０μＭのＰＮＤ−１１８６の存在下で細胞分裂を行っている細胞が可視化されたことであった。２２時間かけていくつかの創傷領域の定量化を行なったところ、ＤＭＳＯ処理４Ｔ１細胞は、８９％の創傷閉鎖を示すのに対して、ＰＮＤ−１１８６処理細胞の閉鎖は、４０％にすぎないことが明らかになった（図３Ｂ）。
【００３９】
創傷アッセイの結果を検証するため、フィブロネクチンでコートした膜、および走化性刺激物として加えた血清を用いて、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌチャンバー運動アッセイを行った（図３Ｃ）。Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ運動アッセイにＰＮＤ−１１８６を加えると、用量依存的様式で４Ｔ１細胞の移動が妨げられ、０．４μＭのＰＮＤ−１１８６を４時間添加した際に約５０〜６０％の最大阻害率となった。重要な点として、ＰＮＤ−１１８６は、マイクロモル以下のレベルでダサチニブを添加した場合と同様に、４Ｔ１細胞のフィブロネクチンへの接着には影響を与えなかった。これらの結果は、４Ｔ１細胞の運動性を促進する際のＦＡＫ活性の重要性を裏付ける。
【００４０】
４Ｔ１細胞の細胞増殖に対する作用を決定するため、ＰＮＤ−１１８６の濃度を上げたもの（０．１μＭから１．０μＭまで）を、接着または懸濁（非接着）４Ｔ１細胞に加え、２４時間、４８時間および７２時間後に総細胞数を計数した（図４Ａ）。接着細胞では、２４時間および４８時間で差は観察されなかった。しかしながら、７２時間では、１．０μＭのＰＮＤ−１１８６で処理した細胞の数が減少し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色と組み合わせたフローサイトメトリー解析により、ＤＭＳＯ対照と比較して、細胞周期のＳおよびＧ２／Ｍ期で若干の蓄積が明らかになった（図４Ｂ）。懸濁４Ｔ１細胞では、ＰＮＤ−１１８６の全濃度で、４８時間での細胞数が低減され、この差は、ＤＭＳＯと比較して７２時間での０．１μＭ  ＰＮＤ−１１８６で有意であった（ｐ＜０．００１）（図４Ａ）。興味深いことに、懸濁物中１．０μＭのＰＮＤ−１１８６で処理した細胞のＰＩ染色解析からは、細胞周期の差は明らかではなかった（図４Ｂ）。しかしながら、他の細胞型のアポトーシスのマーカーである、ＰＩ染色により検出される２倍体未満（１Ｎ）の細胞の蓄積があった。これらの結果は、細胞周期の進行に対するＰＮＤ−１１８６の作用は限定的であり、総細胞数に対する作用は、細胞死と関連し得ることを示す。
【００４１】
ＰＮＤ−１１８６が懸濁４Ｔ１細胞アポトーシスを誘発しているかどうかを決定するため、ＰＮＤ−１１８６で２４時間処理した接着および懸濁４Ｔ１細胞のライセートを、免疫ブロッティングにより解析した（図４Ｃ）。ＰＮＤ−１１８６は０．１μＭで接着および懸濁細胞におけるＦＡＫのｐＹ３９７リン酸化を阻害するのに十分であった。目を引くのは、ＰＮＤ−１１８６処理懸濁細胞では切断型カスパーゼ３の検出が増加する（０．４μＭで最大）けれども、ＰＮＤ−１１８６処理接着細胞では検出できないことであった（図４Ｃ）。カスパーゼ３切断はカスパーゼ３活性化と関連しており、それは、細胞アポトーシスのイニシエーターである。ＰＮＤ−１１８６を添加したときの懸濁物中の４Ｔ１細胞アポトーシスに関する独立した検証として、細胞を２４時間処理し、フローサイトメトリーによりアネキシンＶ結合について解析した（図４Ｄ）。接着条件では、検出されたアネキシンＶ陽性細胞は低レベルにすぎず、これは、ＰＮＤ−１１８６を最大１．０μＭ添加しても上昇しなかった。対照的に、懸濁４Ｔ１対照細胞は、アネキシンＶ染色の増加を示し、これは、０．１μＭから０．４μＭまでのＰＮＤ−１１８６を添加したときにアネキシンＶ陽性染色が５０〜６０％までさらに増加した（図４Ｄ）。以上を総合すると、懸濁条件下、低レベルのＰＮＤ−１１８６を添加したときの４Ｔ１細胞アポトーシスの誘発から、足場非依存的条件下での細胞の生存にとって、ＦＡＫの活性が不可欠であり得ることが示唆される。
【００４２】
ＰＮＤ−１１８６は懸濁細胞条件下で４Ｔ１細胞アポトーシスを選択的に促進するため、４Ｔ１細胞を３Ｄスフェロイドとして培養し、ＰＮＤ−１１８６の濃度を上げたもの（０．１μＭから１．０μＭまで）を７２時間にわたり加えておき、スフェロイドの大きさに対する作用を測定した（図５ＡおよびＢ）。０．１μＭのＰＮＤ−１１８６では、スフェロイドの平均の大きさが約３倍縮小し、０．２μＭのＰＮＤ−１１８６では最大作用が観察された。これまで、マイクロモル以下のレベルで生物学的反応の最大阻害を示した、本出願人に公知のＦＡＫ阻害剤は他にない。
【００４３】
４Ｔ１細胞のスフェロイドにおけるＰＮＤ−１１８６によるＦＡＫ阻害の特異性を決定するため、免疫ブロッティングを行った（図５Ｃ）。３Ｄスフェロイド条件下では、接着４Ｔ１条件と比較してＦＡＫのｐＹ３９７リン酸化の総レベルが低下した。接着条件と３Ｄスフェロイド条件とでｐ１３０ＣａｓのｐＹ２４９リン酸化またはｐ１３０ＣａｓのｐＹ４１０リン酸化に差は確認されなかった（図５Ｃ、レーン１および２）。しかしながら、４Ｔ１のスフェロイドでは０．１μＭのＰＮＤ−１１８６が、ＦＡＫのｐＹ３９７、ｐ１３０ＣａｓのｐＹ２４９およびｐ１３０ＣａｓのｐＹ４１０のリン酸化を強力に阻害した（図５Ｃ、レーン３）。ＰＮＤ−１１８６の添加を増加させると、総ＦＡＫレベルは上昇し、ｐ１３０Ｃａｓの発現に変化はなく、ＦＡＫの阻害およびｐ１３０Ｃａｓのチロシンリン酸化は持続した（図５Ｃ）。接着４Ｔ１細胞、スフェロイド４Ｔ１細胞、またはＰＮＤ−１１８６処理スフェロイド４Ｔ１細胞内のＳｒｃのｐＹ４１６発現レベル、あるいはＳｒｃの発現レベルに変化はなかった（図５Ｃ）。重要なのは、４Ｔ１のスフェロイドにおけるＰＮＤ−１１８６によるｐ１３０Ｃａｓのリン酸化の阻害が、二次元（２Ｄ）単層としての４Ｔ１細胞に対するＰＮＤ−１１８６の作用の欠如と異なることである。ｐ１３０Ｃａｓなどの標的のＦＡＫリン酸化は、３Ｄ条件で４Ｔ１細胞の生存を促進することができる。
【００４４】
４Ｔ１細胞を軟寒天中でコロニーとして増殖させ、ＰＮＤ−１１８６添加の作用を評価した（図６）。１０日間までに、ＰＮＤ−１１８６の添加により、４Ｔ１軟寒天コロニーの総数および大きさが共に用量依存的に阻害された（図６Ａ〜Ｃ）。軟寒天中で４Ｔ１細胞を確立してから４日後にＰＮＤ−１１８６を加えたときも、同様の結果が得られた（図７）。０．２μＭのＰＮＤ−１１８６では、４Ｔ１軟寒天コロニーの大きさが７７％抑制され（図６Ｃ）、これは、膜のブレビングおよび細胞収縮により測定した場合、４Ｔ１細胞アポトーシスの増加（５０％超）に対応した（図６ＤおよびＥ）。以上を総合すると、本発明者らの結果は、ＰＮＤ−１１８６は、一般的な細胞傷害性薬物としては作用しないが、３Ｄ環境で細胞の生存を選択的かつ強力に妨害するという仮説を裏付ける。
【００４５】
ＰＮＤ−１１８６投与に対する４Ｔ１腫瘍増殖の感受性を決定するため、ｍＣｈｅｒｒｙで蛍光標識した４Ｔ１細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下で増殖させた（図７）。８日間かけて一次腫瘍を確立してから、ビヒクルまたは３０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇのＰＮＤ−１１８６で１２時間ごとに（１日２回、ｂ．ｉ．ｄ．）５日間投与し、その後、ｍＣｈｅｒｒｙ  ４Ｔ１腫瘍をｉｎ  ｓｉｔｕで可視化し、続いて抽出し、秤量した（図７ＡおよびＢ）。ビヒクル処置４Ｔ１腫瘍は、鮮やかな蛍光を発し、全体的に多葉性で周囲の組織に浸潤していたのに対して、１００ｍｇ／ｋｇのＰＮＤ−１１８６で処置したマウスの腫瘍は、暗い非蛍光中心を含み、全体的に丸みを帯び、皮下組織に緩やかに接着していた（図７Ａ）。１００ｍｇ／ｋｇのＰＮＤ−１１８６で処置すると、最終的な４Ｔ１腫瘍重量が有意に１／２に減少する（ｎ＝８、ｐ＜０．０５）一方、３０ｍｇ／ｋｇのＰＮＤ−１１８６では、最終的な腫瘍重量はわずかに減少したものの、対照と比較して有意差はなかった（ｎ＝８、ｐ＞０．０５）。１００ｍｇ／ｋｇのＰＮＤ−１１８６の腫瘍の中心におけるｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の消失が細胞アポトーシスの増加と関連していたかを決定するため、中央切片（ｍｅｄｉａｌ  ｓｅｃｔｉｏｎ）をＴＵＮＥＬ染色（図７ＣおよびＤ）、および抗切断型カスパーゼ３染色（図７Ｅ）により解析した。３０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇのＰＮＤ−１１８６の投与は、ビヒクル処置対照と比較して腫瘍のＴＵＮＥＬ染色を著しく増加させた（図７Ｄ）。ＰＮＤ−１１８６処置マウスの腫瘍では、切断型カスパーゼ−３染色の増加も認められたことから（図７Ｅ）、これらの結果は、本発明者らのインビトロ解析と一致しており、ＰＮＤ−１１８６が３Ｄ条件で４Ｔ１細胞のアポトーシスを促進し、インビボでの腫瘍増殖の阻害をもたらすことを示す。
【００４６】
卵巣癌腫瘍細胞の進行過程で、細胞は一次腫瘍から分離し、腹膜腔内で多細胞スフェロイドとして増殖することができる。ＰＮＤ−１１８６は３Ｄ環境で４Ｔ１乳癌アポトーシスを選択的に促進するため、マウスＩＤ８卵巣癌の細胞増殖に対するＰＮＤ−１１８６の作用をインビトロおよびインビボで評価した（図８）。スフェロイドとして懸濁させた細胞培養物では、０．１μＭ、０．４μＭおよび１．０μＭのＰＮＤ−１１８６は、７２時間でＩＤ８細胞数を有意に抑制し（図８Ａ）、１５日後には生細胞が劇的に減少した（図８Ｂ）。低レベルのＰＮＤ−１１８６がインビボでＩＤ８の増殖に影響を与えられるかどうかを決定するため、ｄｓＲｅｄで蛍光標識したＩＤ８細胞をＣ５７Ｂｌ６マウスに腹腔内注射し、１１日後、マウスに、飲料水の代わりに５％スクロース（対照）、または５％スクロースに加えた０．５ｍｇ／ｍｌのＰＮＤ−１１８６を自由に与えた。ＰＮＤ−１１８６投与による有害作用および体重の減少は、認められなかった。３０日間の処置後、飲料水中のＰＮＤ−１１８６で処置したマウスは、対照マウスが腹部の腫脹を示したのに対して、腹部の腫脹を示さなかった（図８Ｃ）。これは、５％スクロース対照と比較して、腹水関連細胞数が少ないこと（図８Ｄ）、および０．５ｍｇ／ｍｌのＰＮＤ−１１８６投与によりＦＡＫのｐＹ３９７が２倍超阻害されることと対応していた（図８ＥおよびＦ）。腹水関連のＩＤ８スフェロイド増殖を阻害するだけでなく、ＰＮＤ−１１８６処置マウスは、インビボでのｄｓＲｅｄ蛍光イメージングにより検出した腹膜腔内の腫瘍小結節が著しく少なかった（図８ＧおよびＨ）。これらの結果は、低レベルのＰＮＤ−１１８６投与がインビトロおよびインビボで卵巣癌細胞の増殖を阻害することを示す。三次元環境で細胞のアポトーシスを促進するＰＮＤ−１１８６の選択的作用から、足場非依存的生存シグナル生成におけるＦＡＫ活性の新しい役割が示される。
【００４７】
ＰＮＤ−１１８６の経口投与は、動物の罹患率、死亡または体重減少をもたらすことなく、２種類（４Ｔ１およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１）の同所性乳癌マウス腫瘍モデルで著しい抗腫瘍作用および抗転移作用を発揮した。ＰＮＤ−１１８６は、同系４Ｔ１腫瘍のマウスの腫瘍関連炎症細胞の浸潤および巨脾腫を著しく抑制したことから、ＰＮＤ−１１８６が腫瘍関連炎症を低減し得ることが示唆される。
【００４８】
静脈内（ｉ．ｖ．）投与、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与および経口（ｐ．ｏ．）投与後のＢａｌｂ／ｃマウスにおいて、ＰＮＤ−１１８６の薬物動態（ＰＫ：ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）を測定した（以下の表２）。ＰＮＤ−１１８６は、ｉ．ｖ．注射後、多指数関数的消失を示し、その消失半減期（ｔ１／２）は１．７２時間であった。ｉ．ｐ．およびｐ．ｏ．投与後、ＰＮＤ−１１８６は速やかに吸収され）、消失半減期（ｔ１／２）は２．１５〜２．６５時間、バイオアベイラビリティー（％Ｆ）は１４．８〜４２．２％であった。ＰＮＤ−１１８６のバイオアベイラビリティーは経口投与に比べ腹腔内投与で高く、  ＰＮＤ−１１８６の血漿中濃度、最高濃度（Ｃｍａｘ）およびゼロ時から無限大時間（０〜ｉｎｆ）までの血漿中濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）は、用量の関数として直線的に増加した。
【００４９】
表２：静脈内（ｉ．ｖ．）投与後、腹腔内投与（ｉ．ｐ．）投与後、経口（ｐ．ｏ．）投与後および自由投与後のマウスにおけるＰＮＤ−１１８６の薬物動態（ＰＫ）パラメーター。
【００５０】
【表２】
2013501808.tif 000006
上記のＰＫパラメーターは、ｉ．ｐ．投与またはｐ．ｏ．投与後に観察された最高血漿中濃度（Ｃｍａｘ）および最高濃度到達時間（Ｔｍａｘ）、ゼロ時から無限大時間までの血漿中濃度−時間曲線下面積ＡＵＣ（０〜ｉｎｆ）、分布容積（Ｖｄ）、全身クリアランス（Ｃｌ）、対数線形消失半減期（ｔ１／２）、ならびにバイオアベイラビリティー（％Ｆ）を含む。ＰＫ解析は、ｉ．ｐ．およびｐ．ｏ．についてはＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  ４．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡのモデル２００、およびｉ．ｖ．についてはそのモデル２０１を用いてノンコンパートメント解析により行った）。
【００５１】
ＰＮＤ−１１８６が充実性腫瘍のＦＡＫおよびｐ１３０Ｃａｓに影響を与えたかどうかを決定するため、皮下４Ｔ１乳癌腫瘍を確立し、ビヒクル（５０％ＰＥＧ４００のＰＢＳ溶液）またはＰＮＤ−１１８６の単回ｉ．ｐ．注射を施した。１００ｍｇ／ｋｇのＰＮＤ−１１８６では、最高血漿レベル（１１７μＭ）に３０分以内に到達し、腫瘍における最高ＰＮＤ−１１８６（１６．１μｇ／ｇ）には１時間以内に達し、１２時間まで持続した（１２時間での血漿レベルは１．１μＭ）。１００ｍｇ／ｋｇのＰＮＤ−１１８６では、腫瘍のＦＡＫのＴｙｒ−３９７リン酸化（ｐＹ３９７  ＦＡＫ）の阻害（６０％超）が１２時間持続し、ｐ１３０ＣａｓのＴｙｒ−４１０リン酸化（ｐＹ４１０Ｃａｓ）は３時間までに顕著に低下した。ｐ１３０ＣａｓのｐＴｙｒ−２４９に対するホスホ特異的抗体を使用したときも、同様の結果が得られた。３０ｍｇ／ｋｇのＰＮＤ−１１８６では、最高血漿レベル（３５μＭ）に１５以内に到達し、腫瘍における最高ＰＮＤ−１１８６（０．７５μｇ／ｇ）には１時間以内に達した。これは、ＦＡＫのｐＹ３９７リン酸化を３〜６時間阻害するのに十分であり、その後腫瘍のＰＮＤ−１１８６レベルは、１２時間で０．０４μｇ／ｇまで低下し（血漿レベルは０．１μＭ）、この時点で腫瘍のＦＡＫのｐＹ３９７リン酸化は顕著には阻害されなかった。これらの結果は、ＰＮＤ−１１８６がインビボで腫瘍のＦＡＫおよびｐ１３０Ｃａｓのチロシンリン酸化を用量依存的に阻害し、かつ１μＭ以上の血漿レベルであれば、腫瘍関連のＦＡＫ阻害を促進するのに十分であることを示す。
【００５２】
ＰＮＤ−１１８６水溶液の経口バイオアベイラビリティーは、腹腔内投与するときよりも低い（上記の表２）。ＰＮＤ−１１８６を１５０ｍｇ／ｋｇ経口投与すると、最高血漿レベルは４時間までに約１４μＭとなり、３μＭを上回るＰＮＤ−１１８６の血漿レベルが１２時間持続した。これを１日２回（ｂ．ｉ．ｄ．）経口（ｐ．ｏ）投与し、同所性移植したｍＣｈｅｒｒｙ蛍光４Ｔ１腫瘍細胞を用いて、抗腫瘍効果を試験した。７日目までには、１５０ｍｇ／ｋｇのＰＮＤ−１１８６は、ビヒクル対照と比較して腫瘍容積を著しく減少させた。１６日間までには、１５０ｍｇ／ｋｇのＰＮＤ−１１８６は、ビヒクル対照と比較して最終腫瘍容積を３倍減少させ、最終腫瘍重量は、全体重に影響を与えることなく３．１倍減少した一次乳房脂肪パッド４Ｔ１腫瘍の解析から、抗ＣＤ３１染色により検出される血管数が多いことが明らかになった。肺癌異種移植片のこれまでの研究により、ＰＦ−５６２，２７１の投与後に腫瘍の微小血管密度が低下することは示されたが、ＰＮＤ−１１８６処置４Ｔ１同所性腫瘍において、抗ＣＤ３１染色で測定されるような血管に大きな差は観察されていなかった。ＰＮＤ−１１８６処置４Ｔ１腫瘍の大きさが小さくなることを説明し得る分子機構を決定するため、デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）により中央切片を解析した。ＰＮＤ−１１８６を投与したマウスは、乳房脂肪パッド腫瘍におけるＴＵＮＥＬ染色がビヒクル処置対照と比較して２．８倍の増加を示した。したがって、腫瘍細胞アポトーシスの増加は、ＰＮＤ−１１８６による腫瘍増殖の阻害に関わるメカニズムであり得る。
【００５３】
４Ｔ１の腫瘍切片を、マクロファージおよび他の造血細胞に存在する共通のマーカー、ＣＤ４５染色について解析した。無処置およびビヒクル処置マウスでは、４Ｔ１一次腫瘍内に多数のＣＤ４５陽性細胞が存在した。１５０ｍｇ／ｋｇのＰＮＤ−１１８６で処置したマウスは、ＣＤ４５腫瘍関連の染色が２．８倍の減少を示し、このことにより、ＰＮＤ−１１８６処置で４Ｔ１腫瘍への免疫細胞の浸潤が減少することが裏付けられた。
【００５４】
これが局所的であるか、または全身性反応であるかどうかを決定するため、ビヒクルもしくはＰＮＤ−１１８６で処置した正常Ｂａｌｂ／ｃマウスまたは腫瘍を担持するマウスを用いて、脾臓の大きさを解析した。ビヒクル処置マウスの脾臓の重量は、ＰＮＤ−１１８６処置マウスの２倍超であった。目を引くのは、ＰＮＤ−１１８６処置マウスの脾臓は、健康であり、無処置で腫瘍を担持しないマウスと見分けが付かなかった。巨脾腫は、一部は炎症性サイトカイン産生の増加が原因であるため、４Ｔ１培養細胞を腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα：ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α）の添加により刺激し、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ：ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）によりインターロイキン−６（ＩＬ−６）サイトカインの産生を測定した。ＴＮＦαは、４Ｔ１のＩＬ−６産生の増加を４倍超誘発し、ＰＮＤ−１１８６の添加（０．２５μＭから１．０μＭまで）は、ＩＬ−６の放出を用量依存的に阻害した。ＰＮＤ−１１８６による処置の抗炎症作用は、４Ｔ１の腫瘍進行を抑える働きをすることができる。
【００５５】
４Ｔ１腫瘍は、後期の乳がんの進行モデルとして使用される。たとえば、Ｈｅｐｐｎｅｒ  ＧＨ，Ｍｉｌｌｅｒ  ＦＲ，Ｓｈｅｋｈａｒ  ＰＭ．，Ｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０００，２：３３１−４を参照されたい。乳房脂肪パッドに移植された４Ｔ１細胞は、血液循環に侵入し、７〜１０日以内に肺転移を形成する。ＰＮＤ−１１８６は、４Ｔ１の腫瘍増殖および関連する炎症をどちらも阻害するため、同所性乳房脂肪パッドの注射、および１５日間のＰＮＤ−１１８６（１５０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．、ｂ．ｉ．ｄ．）による処置後に、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光４Ｔ１細胞の転移分布を測定した。背側および腹側肺画像のｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を直接可視化したものを定量化し、肺転移数をカウントして分布をわずか、中程度または大きいに分類した。ビヒクル対照マウスの場合、過半数（７／１２）が、肺転移負荷が中程度および大きかったのに対し、ＰＮＤ−１１８６マウスでは、過半数（７／１２）が、肺転移がわずかであり、転移負荷が大きいマウスは認められなかった。これらの知見は、肺切片のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色により確認され、そこでは、対照は検出可能な４Ｔ１肺転移を示したが、ＰＮＤ−１１８６処置マウスは検出可能な４Ｔ１肺転移を示さなかった。したがって、低分子ＦＡＫ阻害剤ＰＮＤ−１１８６は、自然乳がん転移のプロセスを妨害することができる。
【００５６】
腫瘍増殖に対する作用を決定するため、ｍＣｈｅｒｒｙ−４Ｔ１同所性腫瘍の移植から４８時間後、マウスへのＰＮＤ−１１８６の自由な経口投与を開始した。１３日目には、ノギス測定により測定した腫瘍の大きさが著しく異なっており、２２日目には、ＰＮＤ−１１８６投与は、毒性または体重減少をともなわずに、最終腫瘍量を１．８倍超抑制した。一次４Ｔ１腫瘍の免疫ブロッティング解析では、ＰＮＤ−１１８６の自由投与は、ＦＡＫのｐＹ３９７リン酸化およびｐ１３０ＣａｓのｐＹ４１０リン酸化を共に阻害するのに十分であった。自由なＰＮＤ−１１８６はさらに、腫瘍内のｐＹ１１８パキシリンリン酸化も阻害したが、ｐＹ４１６  Ｓｒｃのリン酸化も、ｐＹ４０２  Ｐｙｋ２、ｐＳ４７３  ＡｋｔおよびｐＴ３０８  Ａｋｔのリン酸化も阻害しなかった。脾臓の比較から、ＰＮＤ−１１８６により自由に処置したマウスは、大きさが正常であるのに対し、対照マウスには脾肥大があることが明らかになった。５％スクロースを摂取した対照マウスは、中程度ないし大きな肺転移負荷を示した（９／１１）のに対して、自由なＰＮＤ−１１８６マウスの大部分は、肺転移負荷が、わずかないし中程度であった（１３／１５）。このため、低レベルのＰＮＤ−１１８６投与は、インビボで４Ｔ１腫瘍の進行を遅延させるのに有効である。
【００５７】
４Ｔ１の知見をヒト乳癌に拡大するため、Ｋ−ＲａｓおよびＢ−Ｒａｆに活性化変異を含むＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ＮＯＤ／重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ：ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）マウスの乳房脂肪パッドに移植した。１２日後、腫瘍が触知可能になったとき、０．５ｍｇ／ｍｌのＰＮＤ−１１８６または対照の５％スクロースを飲料水として自由に与えた。実験の２７日間（ＰＮＤ−１１８６投与から１５日間）に、対照の腫瘍は、ノギス測定により測定して著しく大きくなり、ＰＮＤ−１１８６の自由投与では７０日目に、最終腫瘍重量が５倍超減少した。低レベルのＰＮＤ−１１８６処置は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍内のＦＡＫのｐＹ３９７リン酸化を著しく低下させるのに十分であった。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の自然転移に対する作用を決定するため、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの肺を切除し、Ｈ＆Ｅ染色し、微小転移を数えた。対照マウスは、検出可能な転移を呈したが、ＰＮＤ−１１８６の自由処置では、転移肺病変の数が３．５倍超減少した。
【００５８】
ＰＮＤ−１１８６処置が、腫瘍細胞の転移に影響するいくつかの因子に影響を与え得る一次腫瘍の大きさを減少させるため、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を尾静脈注射して、実験的転移アッセイを行った。マウスに１５０ｍｇ／ｋｇのＰＮＤ−１１８６または水（ビヒクル）をｐ．ｏ．で前投与し、１時間または６時間後、蛍光イメージングにより肺毛細管内の腫瘍細胞の蓄積または逗留を定量した。１時間および６時間のどちらも、ＰＮＤ−１１８６は、肺内の腫瘍細胞の蓄積を著しく阻害した。実験的転移アッセイにおけるＰＮＤ−１１８６の血漿レベルは、１μＭを超えると考えられるので、細胞を懸濁させＰＮＤ−１１８６とインキュベートすることにより、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１のアポトーシスをインビトロで解析した。アネキシンＶ結合により測定し、フローサイトメトリーにより定量化したところ、１０μＭまでの濃度のＰＮＤ−１１８６は、６時間以内にＭＤＡ−ＭＢ−２３１のアポトーシスの増加を促進しなかった。したがって、ＰＮＤ−１１８６の経口投与は、インビボでＦＡＫのチロシンリン酸化を低下させ、その結果、２種類の同所性乳癌モデルで強い抗腫瘍活性および抗転移活性がもたらされる。
【００５９】
本発明の方法のための薬学的組成物およびその投与
本発明の実施形態のもう１つの態様は、低分子ＦＡＫ阻害剤を単独または別の薬物と組み合わせてヒトまたはヒト以外の患者に投与するための、本発明の化合物の組成物を提供する。本発明の化合物を含む組成物は、たとえば、参照によって本明細書に援用するＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ  Ｅｄ．，１９９５、またはその新版に記載されているような従来の技術により調製することができる。本組成物は、たとえばカプセル、錠剤、エアロゾル、溶液、懸濁物または局所外用薬など従来の形態であってもよい。
【００６０】
典型的な組成物は、本発明の化合物と、キャリアでも、または希釈剤でもよい薬学的に許容される賦形剤とを含む。たとえば、活性化合物は通常、キャリアと混合するか、またはキャリアで希釈するか、またはアンプル、カプセル、サッシェ、紙または他の容器の形態であってもよいキャリア内に封入する。活性化合物をキャリアと混合する場合、またはキャリアが希釈剤としての役割を果たす場合、キャリアは、活性化合物のビヒクル、賦形剤または媒体として機能する固体材料でも、半固体材料でも、または液体材料でもよい。活性化合物は、顆粒状の固体キャリアに吸着させ、たとえばサッシェに入れてもよい。好適なキャリアの一部の例として、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ポリヒドロキシエトキシル化ヒマシ油、ピーナッツ油、オリーブ油、ゼラチン、ラクトース、白土、スクロース、デキストリン、炭酸マグネシウム、糖、シクロデキストリン、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸、もしくはセルロースの低級アルキルエーテル、ケイ酸、脂肪酸、脂肪酸アミン、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペンタエリトリトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン、ヒドロキシメチルセルロース、ならびにポリビニルピロリドンがある。同様に、キャリアまたは希釈剤としては、単独もしくはワックスと混合したモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの当該技術分野において公知の任意の持続放出材料を挙げることもできる。
【００６１】
本処方物は、活性化合物と有害な反応を起こさない助剤と混合してもよい。こうした添加剤として、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝剤および／または着色物質  保存剤、甘味剤もしくは香味剤を挙げることができる。本組成物はさらに、必要に応じて滅菌してもよい。
【００６２】
投与経路は、経口、鼻、肺、頬、皮下、皮内、経皮、または非経口、たとえば、直腸、デポー、皮下、静脈内、尿道内、筋肉内、鼻腔内、点眼剤または軟膏など、適切または所望の作用部位に本発明の活性化合物を効率的に輸送するのであれば、どのような経路であってもよいが、経口経路が好ましい。
【００６３】
経口投与に固体キャリアを使用する場合、調製物は、錠剤化しても、粉末もしくはペレット形態で硬質ゼラチンカプセルに充填してもよいし、あるいは、トローチまたはロゼンジ形態であってもよい。液体キャリアを使用する場合、調製物は、シロップ、エマルジョン、軟質ゼラチンカプセル、または水性もしくは非水性液体懸濁物または溶液など無菌の注射用液体の形態であってもよい。
【００６４】
注射用剤形としては一般に、好適な分散剤または湿潤剤、および懸濁化剤を用いて調製することができる水性懸濁物または油性懸濁物が挙げられる  注射用形態は、溶媒または希釈剤で調製される溶液相でも、または懸濁物の形態でもよい。許容可能な溶媒またはビヒクルとして、滅菌水、リンゲル液または等張食塩水溶液が挙げられる。あるいは、無菌の油を溶媒または懸濁化剤として利用してもよい。好ましくは、油または脂肪酸は、天然油または合成油、脂肪酸、モノ−、ジ−またはトリ−グリセリドなど不揮発性である。
【００６５】
注射の場合、処方物はまた、上記のような適切な溶液で再構成するのに好適な粉末であってもよい。それらの例として、凍結乾燥粉末、ロータリー乾燥粉末もしくは噴霧乾燥粉末、非晶質粉末、顆粒、沈殿物または微粒子が挙げられるが、これに限定されるものではない。注射の場合、処方物は必要に応じて、安定剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、バイオアベイラビリティーモディファイヤー、およびこれらの組み合わせを含んでもよい。本化合物は、ボーラス注射または持続注入など注射による非経口投与用に処方してもよい。注射用単位剤形は、アンプル中または複数用量容器中に存在してもよい。
【００６６】
本発明の処方物は、当該技術分野において周知の手順を用いることにより、患者への投与後に活性成分を迅速放出、持続放出または遅延放出するように設計してもよい。したがって、処方物はまた、制御放出または徐放できるように処方してもよい。
【００６７】
本発明が意図している組成物は、たとえば、ミセルもしくはリポソーム、またはいくつかの別の封入形態を含んでもよく、あるいは、長期の貯蔵および／または送達効果を提供するため、徐放性放出形態で投与してもよい。したがって、処方物をペレットまたはシリンダーに圧縮し、筋肉内または皮下にデポー注射剤として埋め込んでもよい。こうした埋没物は、シリコーンおよび生分解性ポリマー、たとえば、ポリラクチド−ポリグリコリドなど既知の不活性材料を利用してもよい。他の生分解性ポリマーの例として、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。
【００６８】
鼻腔投与の場合、調製物は、エアロゾルに使用するため、液体キャリア、好ましくは水性キャリアに溶解または懸濁させた本発明の化合物を含み得る。キャリアは、可溶化剤、たとえば、プロピレングリコール、界面活性剤、レシチン（ホスファチジルコリン）またはシクロデキストリンなどの吸収促進剤、またはパラベンなどの防腐剤など、添加剤を含んでもよい。
【００６９】
非経口用途の場合、特に好適なのは、注射用溶液または懸濁物、好ましくは活性化合物をポリヒドロキシ化ヒマシ油に溶解させた水溶液である。
【００７０】
タルクおよび／または炭水化物キャリアもしくはバインダー、または同種のものを含む錠剤、糖剤またはカプセル剤は、経口用途に特に好適である。錠剤、糖剤またはカプセル剤に好ましいキャリアとして、ラクトース、コーンスターチ、および／またはポテトスターチが挙げられる。甘味ビヒクルを利用してもよい場合、シロップ剤またはエリキシル剤を使用してもよい。
【００７１】
従来の錠剤化技術により調製できる典型的な錠剤として、下記がある：
【００７２】
【表３】
2013501808.tif 000007
＊フィルムコーティング用の可塑剤として使用されるアシル化モノグリセリド。
【００７３】
本発明の化合物は、広い投薬量範囲にわたり有効である。たとえば、成人ヒトの処置の場合、１日約０．０５〜約５０００ｍｇ、好ましくは約１〜約２０００ｍｇ、一層好ましくは約２〜約２０００ｍｇの投与量を使用してもよい。典型的な投与量は、１日約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇである。患者のレジメンを選択する際、頻繁には、比較的多い投与量から始め、患者の状態がコントロールされたとき、投与量を減らす必要がある場合がある。正確な投与量は、化合物の活性、投与モード、所望の治療法、投与される形態、処置対象の被験体および処置対象の被験体の体重、ならびに担当の医師または獣医師の優先度および経験によって異なる。
【００７４】
一般に、本発明の化合物は、単位投与量につき約０．０５ｍｇ〜約１０００ｍｇの活性成分と薬学的に許容されるキャリアを含む単位剤形に小分けにする。
【００７５】
通常、経口投与、鼻投与、肺投与または経皮投与に好適な剤形は、約１２５μｇ〜約１２５０ｍｇ、好ましくは約２５０μｇ〜約５００ｍｇ、一層好ましくは約２．５ｍｇ〜約２５０ｍｇの化合物を薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤と混合したものを含む。
【００７６】
剤形は、毎日投与しても、または１日２回もしくは３回など１日２回以上投与してもよい。あるいは、処方する医師により望ましいことが分かった場合、剤形は、１日おきまたは週１回など毎日より少ない頻度で投与してもよい。
【実施例】
【００７７】
化合物（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）：２００８年３月１０日に出願され国際公開第２００８／１１５３６９号として公開されたＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００３２０５号に記載されているように、ＰＮＤ−１１８６を合成し、ＨＣｌ塩として使用した。インビボアッセイのため、ＰＮＤ−１１８６を水に溶解させた（溶解度＝２２ｍｇ／ｍｌ）。
【００７８】
バキュロウイルスＦＡＫ触媒ドメインおよびインビトロキナーゼアッセイ：プライマー５’−ｃｇａｔｃｇａａｔｔｃｔｃｇａｃｃａｇｇｇａｔｔａｔｇａｇａｔｔｃａ−３’  ５’−ｔａｇｃｔｇｔｃｇａｃｔｔａｃｔｇｃａｃｃｔｔｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃａｇｇ−３’を用いてポリメラーゼ連鎖反応により、ＦＡＫ触媒ドメイン領域（４１１−６８６）を作製し、ＧＳＴとの融合体としてｐＧＥＸ４Ｔにクローニングし、ｐＡｃＧ２Ｔバキュロウイルス発現ベクター（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｂａｃｕｌｏｇｏｌｄ）に導入した。プラークアッセイによりウイルスクローンを特定し、増幅した。タンパク質発現のため、ＳＦ９細胞に２〜５ｐｆｕ／細胞の感染多重度で形質導入し、２７℃で４８時間培養した。グルタチオンアガロースアフィニティークロマトグラフィーを用いて、ＧＳＴ−ＦＡＫ（４１１−６８６）を精製し、続いてｈｉｌｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘクロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してサイズ分画を行った。タンパク質を濃縮し、５０ｍＭのトリス  ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのオルトバナジン酸Ｎａ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭのＥＧＴＡ、０．１％β−メルカプトエタノール、および２０％グリセロール中で凍結保存した。純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより９０％超と推定された。Ｋ−ＬＩＳＡスクリーニングキット（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、およびマイクロタイタープレートに固定した基質としてポリ（Ｇｌｕ：Ｔｙｒ）（４：１）コポリマー（Ｐ０２７５、Ｓｉｇｍａ）を用いて、ＧＳＴ−ＦＡＫインビトロキナーゼ活性を測定し、Ｈｉｓタグ付きＦＡＫ４１１−６８６（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と比較した。５０μＭのＡＴＰおよび１０ｍＭのＭｎＣｌ２、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２５ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％ＢＳＡおよび０．１ｍＭのオルトバナジン酸Ｎａを含む緩衝液中に試験化合物を様々な濃度で用いて、ＩＣ５０値を室温で５分間測定した。１／２対数濃度で段階希釈（１μＭから開始）した化合物を３回ずつ試験した。西洋わさびペルオキシダーゼ−結合体化抗ｐＴｙｒ抗体（ＰＹ２０，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用い、分光光度法による（ｓｐｅｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｉｃ）色の定量化により、基質のリン酸化を測定した。Ｈｉｌｌ−Ｓｌｏｐｅモデルを用いてＩＣ５０値を決定した。ＫｉｎａｓｅＰｒｏｆｉｌｅｒサービス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を利用して、キナーゼ選択性プロファイリングを行った。
【００７９】
試薬および細胞：β−アクチン（ＡＣ−１７）に対する抗体は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製であった。Ｓｒｃ（Ｓｒｃ−２）およびＡｋｔに対する抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製であった。ＦＡＫ（４．４７）に対する抗体は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製であった。ｐＹ２４９  ｐ１３０Ｃａｓ、ｐＹ４１０  ｐ１３０Ｃａｓ、ｐＹ４１６  Ｓｒｃに対する部位およびホスホ特異的抗体および抗切断型カスパーゼ−３は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製であった。抗ｐＹ３９７  ＦＡＫおよびＴＯＰＲＯ−３は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製であった。抗ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）はＣｈｅｍｉｃｏｎ社製、ウシ血漿フィブロネクチンはＳｉｇｍａ社製、ダサチニブおよびＰＰ１はそれぞれＬＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製およびＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製であった。４Ｔ１マウス乳癌細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得た。ＩＤ８マウス卵巣癌細胞は、Ｋａｔｈｅｒｉｎｅ  Ｒｏｂｙから提供された（Ｒｏｂｙ  ＫＦ，Ｔａｙｌｏｒ  ＣＣ，Ｓｗｅｅｔｗｏｏｄ  ＪＰ，Ｃｈｅｎｇ  Ｙ，Ｐａｃｅ  ＪＬ，Ｔａｗｆｉｋ  Ｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｅｖｅｎｔｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２０００；２１：５８５−９１）。細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ：ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、１ｍＭの非必須アミノ酸、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したダルベッコ変法イーグル培地で培養した。インビトロ試験では、ＰＮＤ−１１８６をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させ、使用時まで−８０℃で保存した。最終の実験ＤＭＳＯ濃度は、０．１％〜０．２％であった。赤色蛍光ｍＣｈｅｒｒｙまたはｄｓＲｅｄタンパク質（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のコード配列をレンチウイルス発現ベクター（ｐＣＤＨ−ＭＳＣ１，Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｃｉｅｎｃｅｓ）にサブクローニングし、Ｍｉｔｒａ  ＳＫ，Ｌｉｍ  ＳＴ，Ｃｈｉ  Ａ，Ｓｃｈｌａｅｐｆｅｒ  ＤＤ．Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｒｏｋｉｎａｓｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００６；２５：４４２９−４０に記載されているように、組換えレンチウイルスを作製した。形質導入した４Ｔ１またはＩＤ８細胞を、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳＡｒｉａ，Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で富化し、安定な細胞集団を得た。高転移性のｍＣｈｅｒｒｙ  ４Ｔ１細胞の選択は、肺転移細胞の単離および増殖により行った。ｍＣｈｅｒｒｙ−４Ｔ１細胞を採取し、８〜１０週齢雌Ｂａｌｂ／ｃマウスのＴ４乳房（ｍ��ｍｍａｒｙ）脂肪パッドに注射した。４週間後、肺を除去し、エラスターゼおよびコラゲナーゼ処理により単一の細胞に分離し、次いで６０μＭの６−チオグアニン（Ｓｉｇｍａ）とともに２週間培養し、４Ｔ１細胞を選択した。ｍＣｈｅｒｒｙ−４Ｔ１細胞（４Ｔ１−Ｌ）の集団を蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）により採取し、シプロフロキサシン（１０μｇ／ｍｌ）で処理し、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によりマイコプラズマ陰性であることを確認し、乳房脂肪パッド注射から１０日以内に自然肺転移コロニーの確立を再確認した。
【００８０】
足場依存性スフェロイドおよび軟寒天細胞増殖アッセイ：接着（組織培養処理）条件下、および非接着（ポリ−ＨＥＭＡコート）条件下、増殖培地を用いて６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に、３５ｍｍウェル当たり細胞（２×１０５）を培養した。２４時間から１６８時間の間に、全細胞を集めて、限定的なトリプシン−ＥＤＴＡ処理により単細胞懸濁物を調製し、トリパンブルー染色および計算により生細胞を計数した（ＶｉＣｅｌｌ  ＸＲ、Ｂｅｃｋｍａｎ）。スフェロイドの面積測定のため、７２時間後、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ５１顕微鏡を用いて細胞の位相差画像を取得した。Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェア（バージョン１．４３）を用いて、面積を計算した。軟寒天アッセイでは、２％寒天（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を含む０．２ｍｌの増殖培地の１：４ミックスで４８ウェルプレートをコートした（下層）。０．３％寒天を含む０．２ｍｌの増殖培地の混合物（上層）中に、１ウェル当たり５×１０４個の細胞を（３連で）培養した。寒天の凝固後、ＤＭＳＯまたはＰＮＤ−１１８６を含む０．２ｍｌの増殖培地を加えた（０．６ｍｌについての最終濃度）。別の実験では、４日後にＰＮＤ−１１８６を加えた。１０日後、コロニーの位相差画像を取得し、９視野（１ウェル当たり３視野）をカウントして計数し、Ｉｍａｇｅ  Ｊを用いて総面積を測定した。すべての解析では、実験ポイントを３連で行い、実験は、少なくとも２回繰り返した。
【００８１】
免疫ブロッティング：１％トリトンＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳを含む溶解緩衝液を用いて、細胞のタンパク質抽出物を作製し、４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）により分離し、Ｍｉｔｒａ  ＳＫ，Ｌｉｍ  ＳＴ，Ｃｈｉ  Ａ，Ｓｃｈｌａｅｐｆｅｒ  ＤＤ．Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｒｏｋｉｎａｓｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００６；２５：４４２９−４０に記載されている（ｄｅｓｃｒｉｂｅｄｉｎ）ように逐次的な免疫ブロッティングを行った。Ｉｍａｇｅ  Ｊ（バージョン１．４２ｑ）を用いた、ブロットのデンシトメトリー解析により、相対的な発現レベルおよびホスホ特異的抗体反応性を測定した。ｐＹ３９７  ＦＡＫタンパク質と総ＦＡＫとの比率を算出することにより、ＦＡＫおよびｐ１３０Ｃａｓのチロシンリン酸化の阻害を定量化した。ｐＹ４１０  ｐ１３０Ｃａｓおよび総ｐ１３０Ｃａｓのブロットデータを用いてｐ１３０Ｃａｓについても、同様の解析を行った。
【００８２】
免疫組織化学：アポトーシスの検出のため、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、切片（７μｍ）を解析した。ＣＤ４５染色のため、切片（７μｍ）を４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｈｙｄｅ）で固定し、ＰＢＳでリンスし、５％ＢＳＡ、１％ヤギ血清および０．１％トリトンＸを含むＰＢＳ溶液でブロッキングした。５％ＢＳＡおよびＰＢＳ中で１μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ結合体化抗ＣＤ４５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２時間インキュベートした。同じ濃度のＦＩＴＣ結合体化ＩｇＧ２ｂアイソタイプ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を陰性対照として使用した。１：２５，０００希釈のＨｅｏｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とのインキュベーションにより、細胞核を可視化した。画像は、単色電荷結合カメラ（ＯＲＣＡ  ＥＲ；Ｈａｍａｍａｔｓｕ）、倒立顕微鏡（ＩＸ５１；Ｏｌｙｍｐｕｓ）およびＳｌｉｄｅｂｏｏｋソフトウェア（ｖ５．０、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ）を用いて４０×（ＵＰＬＦＬ対物レンズ、１．３ＮＡ；Ｏｌｙｍｐｕｓ）で逐次的に撮像した。画像は、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ３（Ａｄｏｂｅ）を用いて擬似カラー表示し、重ねてマージした。蛍光の定量は、Ｉｍａｇｅ  Ｊ（ｖ１．４３）を用いて行った。
【００８３】
細胞遊走アッセイ：以前に記載されているように、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ（１２ｍｍの直径、８μｍの細孔を有する；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）チャンバーを用いて、血清刺激による走化を行った４９。膜の両側をフィブロネクチン（１０μｇ／ｍｌ）でコーティングし、１０％ＦＢＳを底部チャンバーに加えて走化を刺激した。データポイントは、少なくとも２つの独立した実験における３つの遊走チャンバーからの細胞数（９視野）を表す。掻傷閉鎖運動アッセイでは、フィブロネクチンコート（１０μｇ／ｍｌ）ガラス底１２ウェルプレート（ＭａｔＴｅｋ）に細胞を播種し、１６時間血清飢餓状態にした（０．５％ＦＢＳ）。細胞をピペット先端で傷つけ、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞に、ＦＡＫ阻害剤（１μＭ）を含むかあるいは含まない１０％ＦＢＳ培地を補充した。自動ステージ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ８１）上で１０×対物レンズを用いて、湿度およびＣＯ２を調節しながら３７℃で２２時間まで１０分間隔で画像を取得することにより、一連のコマ撮り画像を得た。Ｉｍａｇｅ  Ｊを用いて経時的に核位置を追跡して、移動した細胞の軌跡および距離を測定した。
【００８４】
細胞増殖およびアポトーシスアッセイ：細胞増殖の解析のため、表記の時間にわたり、接着細胞または懸濁細胞をＰＮＤ−１１８６で処理し、限定トリプシン処理により単一細胞懸濁物として集め、７０％エタノールで固定し、遠心分離により集めて、ＰＢＳで洗浄した。細胞ペレットを、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（１０μｇ／ｍｌ）、ＤＮＡｓｅを含まないＲＮＡｓｅ（１００μｇ／ｍｌ、Ｑｉａｇｅｎ）を含む３００μｌのＰＢＳに懸濁し、次いで撹拌しながら１時間３７℃でインキュベートした。フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によりサンプルを解析し、ＭｏｄＦｉｔ  ＬＴ３．２ソフトウェア（Ｖｅｒｉｔｙ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｈｏｕｓｅ）により細胞周期の解析を行った。記載されているように２９、ＰＩ染色により、細胞アポトーシスの指標としての低二倍体ＤＮＡ量を検出した。細胞アポトーシス解析では、接着細胞または懸濁細胞をＰＮＤ−１１８６で処理し、上述のように集めて、フィコエリトリン（ＰＥ：ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）結合体化アネキシンＶ結合および７−アミノ−アクチノマイシン（７−ＡＡＤ：７−ａｍｉｎｏ−ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）反応性（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に対して染色し、１時間以内にフローサイトメトリーにより解析した。細胞の自家蛍光（陰性）スタウロスポリン処理（陽性）対照に基づき、四分円ゲート（ｑｕａｄｒａｎｔ  ｇａｔｅ）を設定した。アポトーシスを、アネキシンＶ陽性細胞の割合として計算した。軟寒天アッセイでは、少なくとも２００個の細胞の目視検査によりアポトーシスを定量化し、膜のブレッビングまたは細胞収縮が出現した場合に、アポトーシスと定義した。さらに、免疫ブロッティングによる、タンパク質ライセート中での切断型カスパーゼ−３抗体反応性の出現によってもアポトーシスを検出した。
【００８５】
ＩＬ−６  ＥＬＩＳＡ：２百万個の４Ｔ１細胞を培養し、１０％ＦＢＳ中で４時間伸張させ、その後、ＤＭＳＯ（対照）または表記の濃度のＰＮＤ−１１８６を加えた。１時間後、組換え腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα  ｅＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）（１０ｎｇ／ｍｌ）を加え、２４時間後、抗マウスＩＬ−６ＥＬＩＳＡキット（ｅＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）を用いて、順化培地中のＩＬ−６レベルを測定した。
【００８６】
腫瘍におけるアポトーシスの検出：新鮮な腫瘍を最適切削温度（ＯＣＴ：Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｃｕｔｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）化合物（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｋ）内で急速凍結し、クライオミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  ３０５０Ｓ）を用いて薄切り（７μＭ）にし、スライドガラスにマウントした。切片を３％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％トリトンを含むＰＢＳで３分間透過処理し、８％ヤギ血清を含むＰＢＳを用いて６０分間ＲＴでブロッキングした。活性化カスパーゼ−３検出では、切片を、切断型カスパーゼ３抗体（２％ヤギ血清を含むＰＢＳで１：２００に希釈）と１８時間４℃でインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、フルオレセインイソチオシアネート結合体化抗ウサギおよびＴＯＰＲＯ−３（青）とインキュベートしてＤＮＡ検出を行った。切片の画像を、３０μｍのピンホール設定、１．４ＮＡ、６０×オイル対物レンズを用いて、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｃ１共焦点顕微鏡で取得し、ＥＺ−Ｃ１  ３．５０ソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ）を用いて解析した。腫瘍アポトーシスはまた、製造者（Ｒｏｃｈｅ）の指示どおりテトラメチルローダミン（ＴＭＲ：ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）キットを用いて、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）染色によっても測定した。ＩＮＦＩＮＩＴＹ１−３Ｃ：デジタルカラーカメラおよび４×対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ  Ｍ２−Ｂｉｏ  Ｓｔｅｒｅｏ  顕微鏡を用いて、全腫瘍切片の明視野画像および蛍光画像を取得した。
【００８７】
マウス腫瘍の研究：６〜８週齡雌Ｃ５７Ｂｌ６マウスおよびＢＡＬＢ／ｃマウスをＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から入手し、国際実験動物管理公認協会（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）のガイドラインに従い、病原体フリーの条件で飼育した。インビボ研究はすべて、承認された施設の実験動物管理および使用プロトコルの下で実施した。限定トリプシン処理により、増殖させた腫瘍細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄し、注射の前にＶｉＣｅｌｌ  ＸＲ（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いてカウントした。トリパンブルー排除法により測定した細胞生存率は、９５％超であった。皮下腫瘍増殖では、１×１０６個のｍＣｈｅｒｒｙ標識４Ｔ１細胞を含む１００μｌのＰＢＳを、Ｂａｌｂ／ｃマウスの後側腹部に注射した。８日後、同容積の腫瘍（ノギスで測定し、（長さ×幅の２乗）／２で決定）を持つマウスを群分け（各群ｎ＝８）し、ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）を含むＰＢＳ（１：１）に可溶化したＰＮＤ−１１８６を、１２時間ごとに３０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇで頸部領域に皮下注射した（１００μｌ）。対照動物にはＰＥＧ４００：ＰＢＳ注射を施し、１３日目にＯｌｙｍｐｕｓ  ＯＶ１００  Ｉｎｔｒａｖｉｔａｌ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてｉｎ  ｓｉｔｕで腫瘍の画像を取得し、腫瘍を切除および秤量し、半分をＯＣＴで凍結させ、ＦＡＫリン酸化解析のためもう半分をタンパク質溶解緩衝液に可溶化した。ＩＤ８卵巣癌腫瘍増殖では、１×１０７個のＩＤ８細胞を含むＰＢＳ０．８ｍＬを、Ｃ５７Ｂｌ６マウスに腹腔内注射した。１１日後、５％スクロースを含む水に溶解した０．５ｍｇ／ｍＬのＰＮＤ−１１８６を飲用として与え、対照マウスには５％スクロースを与えた（各群ｎ＝８）。投与は、自由に３０日間継続し、その後マウスを安楽死させ、腹水を集め、遠心分離により（２０００ｒｐｍ、５分間）細胞を得、細胞容積をピペットにより測定してから、免疫ブロッティング解析のためタンパク質溶解緩衝液に可溶化した。
【００８８】
ＰＮＤ−１１８６の薬物動態（ＰＫ）評価：静脈内（ｉ．ｖ．）注射では、マウスに、ビヒクル、または、１０％ＤＭＳＯ、１０％Ｔｗｅｅｎ８０および８０％水中の２ｍｇ／ｋｇのＰＮＤ−１１８６を投与した。腹腔内（ｉ．ｐ．）注射では、マウスに、５０％ＰＥＧ４００を含むＰＢＳ中の３０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇのＰＮＤ−１１８６を投与した。経口（ｐ．ｏ．）投与では、マウスに、１５０ｍｇ／ｋｇのＰＮＤ−１１８６水溶液を投与した。ｐ．ｏ．投与の場合、０．５時間、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間および４８時間、ｉ．ｐ．投与およびｉ．ｖ．投与の場合、０．０８３時間、０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間および４８時間での終末心臓穿刺により、血液サンプルを集めた。各時点につき３匹のマウスを使用した。自由投与では、各群で５匹のマウスを使用して７日後に血液サンプルを集めた。各サンプルを、０．５ＭのＥＤＴＡ０．０５ｍｌを含むチューブに集め、室温、９００×ｇで１５分間遠心分離し、血漿を集めた。ＰＮＤ−１１８６量は、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ：ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）および質量分析解析により決定した（補足方法を参照されたい）。
【００８９】
ＰＮＤ−１１８６の薬力学的（ＰＤ：Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ）評価：４Ｔ１細胞をＢａｌｂ／ｃマウスの側腹部に注射し、腫瘍（３００〜４００ｍｍ３）として１０日間増殖させた。ビヒクル（５０％ＰＥＧ４００を含むＰＢＳ）、３０ｍｇ／ｋｇのＰＮＤ−１１８６または１００ｍｇ／ｋｇのＰＮＤ−１１８６をｉ．ｐ．注射し、マウスを１時間、３時間、６時間および１２時間で屠殺した。各群につき５匹のマウスを使用した。腫瘍を切除し、１％トリトン−Ｘ１００、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＧＴＡ、１０ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、１０μｇ／ｍｌのアプロチニンを含む溶解緩衝液でＰｒｏ２００組織ホモジナイザー（Ｐｒｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ホモジナイズした。ライセートのタンパク質濃度は、マイクロビシンコニン酸キット（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて決定した。均等のタンパク質ライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離、免疫ブロッティングにより解析した。
【００９０】
アポトーシスアッセイ：懸濁細胞をＰＮＤ−１１８６で処理し、集めて、フルオレセイン結合体化アネキシンＶ結合に対して染色し（３０分）、１時間以内にフローサイトメトリーにより解析した。細胞の自家蛍光（陰性）スタウロスポリン処理（陽性）対照に基づき、四分円ゲートを設定した。アポトーシスを、アネキシンＶ陽性細胞の割合として計算した。
【００９１】
同所性乳がんモデル：１００万個の４Ｔ１細胞またはＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を含む１０μｌのＰＢＳを、Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジを用いて８〜１０週齡マウスのＴ４乳房脂肪パッドに注射した。腫瘍が触知可能になったとき（４Ｔ１では２４〜４８時間後、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１では１２日後）、ＰＮＤ−１１８６処置（経口強制または自由）を開始した。腫瘍を３〜４日ごとにデジタルノギスで測定し、式：Ｖ＝（ａ×ｂ２）／２（ａ＝長さ、ｍｍ；ｂ＝幅、ｍｍ）を用いて腫瘍容積（ｍｍ３）を算出した。体重は、週１回測定して毒性を評価した。肺、脾臓および一次腫瘍を外科的に切除し、秤量した。免疫ブロッティングのため、タンパク質溶解緩衝液中で腫瘍切片をホモジナイズするか、または最適切削温度（ＯＣＴ）化合物（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｋ）に埋め込み、液体窒素で凍結させ、クライオスタット（Ｌｅｉｃａ  ３０５０Ｓ）を用いて薄切り（７μＭ）にし、スライドガラスにマウントした。
【００９２】
４Ｔ１腫瘍の転移解析では、肺をＰＢＳでリンスし、ＯＶ１００  Ｓｍａｌｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて、背側および腹側の蛍光画像を取得した。すべての画像で共通のｍＣｈｅｒｒｙ蛍光閾値を設定し、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを用いて各肺に存在するマイクロ腫瘍の平均積分画素密度を決定して、肺転移負荷を算出した。転移性腫瘍負荷（転移病変の数または平均画素体積）を決定し、各群（わずか、中程度および大きい）を分布数に基づき分類した。画像取得後、肺をブアン溶液（Ｓｉｇｍａ）で固定し、パラフィン包埋し、薄切りにして組織学的評価のためヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。Ｓｌｉｄｅｂｏｏｋ（ｖ５．０）ソフトウェアを用いて、微分干渉コントラストＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ８１倒立顕微鏡およびＯｌｙｍｐｕｓ  ＤＰ７１デジタルカラーカメラにより、画像を取得した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍の転移研究では、２５ゲージ（ｇｕａｇｅ）針を用いて、ＯＣＴを含む滅菌水の１：１溶液の気管内注射により、肺を膨張させた。肺を切除し、ＯＣＴに包埋し、液体窒素で凍結させた。Ｈ＆Ｅ切片における肺病変を数えて１葉ごとの肺転移の平均数を決定した（スクロースではｎ＝１１葉、ＰＮＤ−１１８６ではｎ＝１３葉）。
【００９３】
実験的転移アッセイ：ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質を安定発現している５０万個（１００μｌのＰＢＳ中）のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をｉ．ｖ．（尾静脈経由）注射する１４時間前および２時間前に、１２週齡ヌードマウスに１５０ｍｇ／ｋｇのＰＮＤ−１１８６または水（ビヒクル）をｐ．ｏ．投与した。実験的転移負荷を決定するため、細胞注射の１時間後および６時間後に肺を除去し、ＰＢＳでリンスし、ＯＶ１００イメージングを用いて背側と腹側の蛍光画像を取得した。すべての画像で共通のｍＣｈｅｒｒｙ蛍光閾値を設定し、Ｉｍａｇｅ  Ｊを用いて、蛍光を発する肺の総面積を算出した。
【００９４】
統計的方法：群間の有意差は、１元ＡＮＯＶＡとＴｕｋｅｙの事後検定を用いて決定した。データ対間の差は、対応のない両側スチューデントのｔ検定または両側マンホイットニー検定を用いて決定した。転移発生間の差は、両側フィッシャーの正確確率検定を用いて決定した。統計解析はすべて、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（バージョン５．０ｂ、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）を用いて行った。ｐ値が＜０．０５である場合、有意と見なした。
【００９５】
参考文献
【００９６】
【数１】
2013501808.tif 000008
【００９７】
【数２】
2013501808.tif 000009
【００９８】
【数３】
2013501808.tif 000010
【００９９】
【数４】
2013501808.tif 000011
【０１００】
【数５】
2013501808.tif 000012
本発明について、当業者が製造し、使用できるよう十分に詳細に説明および例示を行ってきたが、特許請求の範囲の精神および範囲を逸脱しない範囲で様々な代替、修正および改善が当業者には明らかになるであろう。
【０１０１】
本明細書に言及した特許および刊行物についてはすべて、参照によって援用するために１つ１つの特許を具体的に個々に示してしてあるのと同じ程度に参照によってその全体を本明細書に援用する。
【０１０２】
使用してきた用語および表現は、説明の用語として使用しており、限定の用語として使用しているものではない。こうした用語の使用および表現は、図示および説明された特徴の任意の等価物またはその一部を除外することを意図するものではない。一方、特許請求されている本発明の範囲内で、様々な修正が可能であることが認められる。したがって、好ましい実施形態および任意の特徴により本発明を具体的に開示してきたが、当業者は、本明細書に開示された概念の修正および変形を行ってもよく、こうした修正および変形は、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲内と見なされることを理解すべきである。
【図３Ｂ】
2013501808.tif 000015
【図３Ｃ】
2013501808.tif 000016
【図４Ａ】
2013501808.tif 000017
【図４Ｂ】
2013501808.tif 000018
【図４Ｄ】
2013501808.tif 000019
【図５Ｂ】
2013501808.tif 000020
【図６Ｂ】
2013501808.tif 000021
【図６Ｃ】
2013501808.tif 000022
【図６Ｅ】
2013501808.tif 000023
【図７Ｂ】
2013501808.tif 000024
【図７Ｃ】
2013501808.tif 000025
【図８Ａ】
2013501808.tif 000026
【図８Ｂ】
2013501808.tif 000027
【図８Ｄ】
2013501808.tif 000028
【図８Ｆ】
2013501808.tif 000029
【図８Ｈ】
2013501808.tif 000030
【図１】
2013501808.tif 000031
【図２Ａ】
2013501808.tif 000032
【図２Ｂ】
2013501808.tif 000033
【図２Ｃ】
2013501808.tif 000034
【図３Ａ】
2013501808.tif 000035
【図４Ｃ】
2013501808.tif 000036
【図５Ａ】
2013501808.tif 000037
【図５Ｃ】
2013501808.tif 000038
【図６Ａ】
2013501808.tif 000039
【図６Ｄ】
2013501808.tif 000040
【図７Ａ】
2013501808.tif 000041
【図７Ｄ】
2013501808.tif 000042
【図７Ｅ】
2013501808.tif 000043
【図８Ｃ】
2013501808.tif 000044
【図８Ｅ】
2013501808.tif 000045
【図８Ｇ】
2013501808.tif 000046
【手続補正書】
【提出日】平成24年4月11日(2012.4.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2013501808000001.app
【国際調査報告】
2013501808.tif 000047