(57)【要約】  本発明は、活性成分としてペプチドを含む、高含量のタンパク質、脂質、炭水化物、アミノ酸、無機塩及び他のイオンを特徴とするロパルルス・ジュンセウスサソリの毒から得られる新規のペプチドに関する。本発明は、がん患者の生活の質を改善する該ペプチドの特性、例えばその抗発がん性、鎮痛性及び抗炎症性により薬物として用いられる配合物にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サソリ毒から得られ、５４４．４２Ｄａの分子量及び配列番号１のアミノ酸配列を有することを特徴とする、ＲｊＬＢ−０１と呼ばれるペプチド。
【請求項２】
サソリ毒から得られ、１９６４．０Ｄａの分子量及び配列番号２のアミノ酸配列を有することを特徴とする、ＲｊＬＢ−０３と呼ばれるペプチド。
【請求項３】
サソリ毒から得られ、４７４８．１４Ｄａの分子量及び配列番号３のアミノ酸配列を有することを特徴とする、ＲｊＬＢ−０４と呼ばれるペプチド。
【請求項４】
サソリ毒から得られ、９０８．０Ｄａの分子量及び配列番号４のアミノ酸配列を有することを特徴とする、ＲｊＬＢ−０５と呼ばれるペプチド。
【請求項５】
サソリ毒から得られ、７０７．０３Ｄａの分子量及び配列番号５のアミノ酸配列を有することを特徴とする、ＲｊＬＢ−０７と呼ばれるペプチド。
【請求項６】
サソリ毒から得られ、７１２．４２Ｄａの分子量及び配列番号６のアミノ酸配列を有することを特徴とする、ＲｊＬＢ−０８と呼ばれるペプチド。
【請求項７】
サソリ毒から得られ、１２０３．４４Ｄａの分子量及び配列番号７のアミノ酸配列を有することを特徴とする、ＲｊＬＢ−０９と命名されたペプチド。
【請求項８】
サソリ毒から得られ、５９３０．４５Ｄａの分子量及び配列番号８のアミノ酸配列を有することを特徴とする、ＲｊＬＢ−０１４と呼ばれるペプチド。
【請求項９】
ロパルルス・ジュンセウスのサソリ毒から得られ、賦形剤である蒸留水と混合された、腫瘍細胞に対する高い細胞毒性活性を有する活性成分としてペプチドを有することを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１０】
ホメオパシー処理している、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の少なくとも１つのペプチドを含有し、該ペプチドは抗腫瘍活性を有し、該選択されたペプチドが前記アミノ酸配列のいずれかを有する、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
１０ｍＬ〜２０ｍＬの蒸留水で希釈された、ロパルルス・ジュンセウスのサソリ毒に含まれるペプチドの混合物を、以下の濃度：１．５％〜２．０％の範囲のＲＪＬ−０１、８％〜９％の範囲のＲＪＬＢ−０３、０．５％〜０．８％の範囲のＲＪＬＢ−０７、０．５％〜１．０％の範囲のＲＪＬＢ−０８、０．３％〜０．６０％の範囲のＲＪＬＢ−０９、０．４％〜０．８％の範囲のＲＪＬＢ−１４で有することを特徴とする、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ホメオパシー処理している、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
経口経路、局所経路、非経口経路、直腸経路、膣内経路及びエアロゾル経路により投与される配合物に使用される、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は基本的に、医薬産業に、特にはロパルルス・ジュンセウス（Rhopalurus junceus）サソリ（キョクトウサソリ科、ロパルルス属（Rhopalurusgenus）、ロパルルス・ジュンセウス（R. junceus）種、一般名「赤」サソリ）（その毒にはペプチド、タンパク質、アミノ酸及び遊離アミンの混合物が含まれる）から得られるペプチドの同定に関連するものである。
【背景技術】
【０００２】
サソリは陸上の節足動物であり、また有毒動物として地球上に初めて現れた最古の群である。分類学による分類が節足動物門クモ綱サソリ目であるサソリの種類はおよそ１５００種を超える。自然の生育環境において、サソリの毒はｐＨ７．１２の乳白色の乳状液体であり、粘液、脂質、炭水化物、アミノ酸、無機塩、低分子量の有機分子、及び主成分である分子量が３ｋＤａ〜９０ｋＤａの範囲の多様なタンパク質を含む。近年、広範な薬理活性を示すペプチドの含量が高く、そのため生物医学研究に非常に有効なツールであることから、サソリ毒に対する研究が加速している（非特許文献１、非特許文献２）。この点において、近年では、抗炎症成分（非特許文献３）、鎮痛薬（非特許文献４）、がんの治療（非特許文献５、非特許文献６）及び神経変性疾患の治療（非特許文献３）のようなこれらの毒素及びそれらの誘導体の活性についてかなり多くの特許文献及び非特許文献が見られるようになってきている。構成にサソリ及び／又はサソリの毒が含まれる発明は、がん療法を目的とする広範な配合物を含む。１９９３年の特許文献１及び特許文献２の著者らは、いずれもサソリと、他の植物及び動物の材料とを混合することにより、がんの治療及び予防を可能にするワインを得たことに言及している。サソリは、原発性肝臓がんを治療する錠剤（特許文献３（２０００年）及び特許文献４（２００１年））及び患者において腫瘍細胞の成長を阻害し、がんを治癒することができるカプセル（特許文献５（２００３年））の形態の配合物の成分の１つである。他の特許はがん治療のための様々な配合物を記載している（特許文献６（２０００年）、特許文献７（２００１年）、特許文献８（２００３年））。
【０００３】
特定の腫瘍細胞型に作用する、サソリ毒から得られる毒素の限定的な使用に関する特許も存在する。サソリ毒の毒素に関する初期研究は、ペプチドがレイウラス・キンクエストリアツス（Leiurus quinquestriatus：オブトサソリ）ヘブライサソリから得られたことに言及していた。クロロトキシンと命名された４ＫＤａのペプチドであるこの毒素は、神経膠腫（神経膠由来の原発性脳腫瘍）において発現するクロライドチャネルに結合する能力がある（非特許文献７）。この大発見に基づき、１９９９年に特許文献９においてUllrich et al.は神経膠腫を治療する診断方法を説明している。神経膠腫における或る特定の細胞受容体に対するクロロトキシンの特異的作用に基づく他の研究によって、この毒素は、腫瘍細胞が中枢神経系（ＣＮＳ）細胞と共通の胚起源を有する他の種の腫瘍に対する特異性の高いマーカーであることが示されてきた（非特許文献８）。加えて、近年の研究によって、クロロトキシンが「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」で神経膠腫の成長を阻害するだけでなく、この種の腫瘍の脳領域への浸潤及び拡散を予防する能力もあり、該脳領域は、この種のがんの高い浸潤速度に関与する酵素であるメタロプロテイナーゼとのクロロトキシンの特異的かつ選択的な相互作用のために損傷を受けなかったことが示されている（非特許文献９）。２００４年には、動物に移植した腫瘍に対するブータス・マルテンシー・カーシュ：キョクトウサソリ）サソリ由来の単離毒素の抗腫瘍活性に関する別の特許（特許文献１０）が公開された。
【０００４】
幾つかの場合において、記載の特許に基づき、がんを治療する又は治癒する能力がある多様な配合物が挙げられている。とはいっても、これらの場合では、この品質がそれらの製造に関わるサソリ及び毒素の一部のタイプに特有のものであることは証明されていない。その一方で、レイウルス・キンクエストリアツスサソリから得られる記載の毒素はクロロトキシン及びブータス・マルテンシー・カーシュの場合と同様に、それ自体は抗腫瘍活性を示さず、全毒中の毒素の混合物としてではなく単離毒素として或る特定のタイプの腫瘍を治療することができるにすぎない。
【０００５】
キューバでは、抗腫瘍活性が研究において実験的に証明されているロパルルス・ジュンセウスのサソリ毒希釈溶液が存在する。この研究では、溶液を自然発生腫瘍を有する家畜に投与し、腫瘍の低減及び除去（obliteration）並びに良好な生存を観察した（特許文献１１）。本発明は、本発明によって特許請求される治療法及び生活の質の改善のための任意の医薬配合物についての知識がないという意味で顕著な特徴を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】中国特許公開第１０７３４８０号
【特許文献２】中国特許公開第１０７６８５８号
【特許文献３】中国特許公開第１２６５９０１号
【特許文献４】中国特許公開第１２７９０８８号
【特許文献５】中国特許公開第１３９１９４１号
【特許文献６】中国特許公開第１２５２３２１号
【特許文献７】中国特許公開第１３１６２４９号
【特許文献８】中国特許公開第１３９９９７９号
【特許文献９】米国特許第５９０５０２７号
【特許文献１０】欧州特許出願公開第２００２０７７４２５１号
【特許文献１１】キューバ特許第２２４１３号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Martin-Eauclaire M-F, Segoard M, Ramos C, Cestele S, Bougis PE, andSvenson B, Production of active insect-specific scorpion neurotoxin in yeast.Eur.J. Biochem. 1994; 223; 637-45
【非特許文献２】Bednarek MA, Bugianesi RM, Leonard RJ, Felix JP. Chemical synthesisand structure-function studies of margatoxin, a potent inhibitor of voltagedependent potassium channel in human T lymphocytes. Biochem Biophys Res Commun.1994 Jan 28; 198(2):619-25
【非特許文献３】Rajendra W, Armugan A and Jeyaseeian K. Toxins in anti-nociception andanti-inflammation. Toxicon 2004 July; 44(1):1-17
【非特許文献４】Guan RJ, Wang CG, Wang M and Wang DC. A depressant insect toxin witha novel analgesic effect from scorpion Buthus martensii Karsch. Biochem.Biophys. File 2001; 1549(1):9-18
【非特許文献５】Liu YF, Ma RL, Wang SL, Duan ZY, Zhang JH, Wu LJ and Wu CF.Expression of an antitumor-analgesic peptide from the venom of Chinese scorpionButhus martensi Karsch in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 2003;27(2):253-8
【非特許文献６】Wang WX, Ji YH. Scorpion venom induces glioma cell apoptosis in vivoand inhibits glioma tumor growth in vitro. J Neurooncol. 2005 May; 73(1):1-7
【非特許文献７】De Bin JA, Maggio JE, Strichartz GR. Purification andcharacterization of chlrotoxin,a chloride channel ligand from venom of the scorpion. Am J Physiol 1993;264:361-369
【非特許文献８】Lyons SA, O'Neal J, Sontheimer H: Chlorotoxin, a scorpion derivedpeptide, specifically binds to gliomas and tumors of neuroectodermal origin.GLIA 2002; 39:162-73
【非特許文献９】Deshane J, Garner CC and Sontheimer H: Chlorotoxin inhibits gliomacell invasion via matrix metalloproteinase-2. J Biol Chem 2003; 278:4135-44
【発明の概要】
【０００８】
ロパルルス・ジュンセウスのサソリ毒及び／又はその誘導体の組成及び薬理学的特性から、ロパルルス・ジュンセウスのサソリ毒及び／又はその誘導体は非常に価値のある天然薬物とされ、その抗炎症効果、鎮痛効果及び抗発がん効果によって、市販されている他の類似の製品とは実質的に区別される。ロパルルス・ジュンセウスのサソリ毒及び／又はその誘導体は、腫瘍細胞に働く（fight）高有効成分（ペプチド）と鎮痛活性及び抗炎症活性を与える他の成分とが組み合わされた完全に天然の薬物である。加えて、ロパルルス・ジュンセウスのサソリ毒及び／又はその誘導体は、腫瘍細胞のアポトーシスの誘導による、並びにその鎮痛特性及び抗炎症特性による有益な効果を有する。これらの特徴によって、ロパルルス・ジュンセウスのサソリ毒及び／又はその誘導体はがん疾患及びそれに関連する炎症状態を患う患者の生活の質を改善するのに非常に価値のあるものとなる。本発明から得られる天然物の組成物が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗発がん活性を有する低分子量タンパク質の群を含み、低分子量のタンパク質の群の作用によってｉｎ  ｖｉｖｏでの潜在的な抗腫瘍活性が確認されることが見出されている。
【０００９】
本発明の目的の一つは、毒において見られる抗腫瘍活性を有する活性成分であるペプチドの組成を決定し、該ペプチドを説明することである。サソリ毒の定性的組成、化学スクリーニング、物理化学特性及び薬理活性に関する概要をそれぞれ、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＩＩ、表ＩＶ、表Ｖ、表ＶＩ及び表ＶＩＩに示す。
【００１０】
表Ｉ．本発明の配合物に用いられるロパルルス・ジュンセウスの全毒の化学スクリーニング
【表１】
2013542196.tif 000002
【００１１】
表ＩＩ．ロパルルス・ジュンセウスの全毒における金属イオンの決定
【表２】
2013542196.tif 000003
＊下限未満のレベルの重金属
【００１２】
表ＩＩＩ．本発明の配合物に用いられるロパルルス・ジュンセウスのサソリ毒の物理化学
【表３】
2013542196.tif 000004
【００１３】
表ＩＶ．低圧液体クロマトグラフィを用いる分子排除及びポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により得られた、サソリ毒におけるタンパク質の相対分子量（ＲＭＷ）の表
【表４】
2013542196.tif 000005
【００１４】
表Ｖ．ロパルルス・ジュンセウスの全毒から同定された、腫瘍細胞に対して毒性活性を有する活性成分
【表５】
2013542196.tif 000006
【００１５】
表ＶＩ．毒性研究の概要
【表６】
2013542196.tif 000007
備考：Ｎ.Ｅ．：効果なし
【００１６】
表ＶＩＩ．薬理研究の概要
【表７】
2013542196.tif 000008
【００１７】
以下の手順を本発明における混合物の組成を決定するために実施した。
改良を加えたローリー法による全タンパク質の測定
化学スクリーニング
１２  ＨＲ  １０＆３０  Ｓｕｐｅｒｏｓｅカラムを用いた低圧液体クロマトグラフィ分離による分子量の群でのペプチドの分離
ポリアクリルアミドゲルタンパク質電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
逆相Ｃ１８カラムを用いた高分解能液体クロマトグラフィによる全毒及びペプチドの分離
２２０ｎｍ及び２８０ｎｍ波長のＵＶスペクトルの測定
正常細胞及び腫瘍細胞における細胞生存
質量分析による各対象のペプチドの分析。
【００１８】
マウスで行った急性及び亜慢性の毒性アッセイの結果によると、本発明の生成物は非毒性である。
【００１９】
本発明の生成物の例として以下に詳しく記載される研究は、何ら本出願の範囲を限定するものではない。
【００２０】
実施例として与えられる実験を行うために、数匹のサソリを選択し、それらの毒を電気刺激により抽出し、適切に蒸留水で希釈した。次いでこれを１００００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により清澄化し、粘液及び細胞残渣等の成分を取り除いた。毒タンパク質含量の決定をローリー法によって行い、５ｍｇ／ｍＬ〜１５ｍｇ／ｍＬ濃度であることが示された。
【００２１】
腹腔内（ＩＰ）投与経路
アッセイ物質及び陽性対照を初めに投与した。３０分後、１０μＬ〜１５μＬのクロトン油溶液を動物の右耳の内側表面及び外側表面のそれぞれに投与し、左耳を対照として使用した。３時間後、動物を種の通常の基準に従って（ＦＥＬＡＳＡに準拠して）屠殺し、両耳を切断し、８ｍｍ径の円形サンプルを、パンチを用いて採取し、分析規模に秤量した。
【００２２】
局所投与経路
初めに、２５μＬ〜３０μＬのクロトン油溶液を動物の右耳の内側表面及び外側表面のそれぞれに投与し、左耳を対照として使用した。次いで、アッセイ物質を速やかに与えた。３時間後、動物を種の通常の基準に従って（ＦＥＬＡＳＡに準拠して）屠殺し、両耳を切断し、８ｍｍ径の円形サンプルを、パンチを用いて採取し、分析規模に秤量した。
【００２３】
経口投与経路
２５μＬ〜３０μＬのクロトン油溶液を動物の右耳の内側表面及び外側表面のそれぞれに投与し、左耳を対照として使用した。次いで、アッセイ物質を経口投与により速やかに投与した。３時間後、動物を種の通常の基準に従って（ＦＥＬＡＳＡに準拠して）屠殺し、両耳を切断し、８ｍｍ径の円形サンプルを、パンチを用いて採取し、分析規模に秤量した。
【００２４】
クロトン油の局所投与によって、抗炎症剤を評価するのに適切な皮膚炎症モデルが与えられる。クロトン油の活性成分は、皮膚への適用が、血管透過性及び血管破裂の増大、白血球浸潤、プロテインＣの活性化、並びにアラキドン酸及びその代謝産物の放出の増大を含む組織学的変化及び生化学的変化をもたらす強力な炎症促進剤であるホルボール−１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）である。ＰＭＡは強力な好中球活性化因子としても知られており、耳において広範な強い血液潅流（irrigation）が起こる。
【００２５】
ＩＰ投与経路
体重１ｋｇ当たり１ｍｇ〜５ｍｇの用量のＩＰ投与が、マウスの耳においてクロトン油により誘導される膨脹を阻害し（表ＶＩＩＩ）、３ｍｇ／ｋｇ用量が、より高い炎症阻害効果を有していたことから（９７％対６０．８６％）、実験動物における１５ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンのＩＰ投与よりも効果的であった。５ｍｇ／ｋｇ用量は陽性対照（デキサメタゾン）とは統計学的に異ならなかった（ｐ＞０．０５）。
【００２６】
表ＶＩＩＩ．マウスの耳の浮腫モデルにおけるロパルルス・ジュンセウス毒の腹腔内投与の効果
【表８】
2013542196.tif 000009
値は平均±ＳＤである。少なくとも１つの共通の文字を有する群は統計的に異ならない（ｐ＞０．０５）。
【００２７】
経口投与経路
５ｍｇ、１０ｍｇ及び２０ｍｇのロパルルス・ジュンセウス毒の投与により、陰性対照群と比較して有意な耳の浮腫の重量減少が起こるが（表ＩＸ）、ロパルルス・ジュンセウス毒により誘導される膨脹阻害は、ホスホリパーゼＡ２（アラキドン酸経路に関与する酵素）を阻害する良好なステロイド系抗炎症薬であるデキサメタゾンにより誘導される膨脹阻害とは統計的に同等ではない。
【００２８】
表ＩＸ．マウスの耳の浮腫モデルにおけるロパルルス・ジュンセウス毒の経口投与の効果
群
【表９】
2013542196.tif 000010
値は平均±ＳＤである。少なくとも１つの共通の文字を有する群は統計的に異ならない（ｐ＞０．０５）。
【００２９】
局所投与経路
ロパルルス・ジュンセウス毒の局所投与により、表Ｘに示されるように対照群と比較して耳の浮腫の減少が起こった。
【００３０】
表Ｘ．マウスの耳の浮腫モデルにおけるロパルルス・ジュンセウス毒の局所投与の効果
群
【表１０】
2013542196.tif 000011
値は平均±ＳＤである。少なくとも１つの共通の文字を有する群は統計的に異ならない（ｐ＞０．０５）。
【００３１】
表ＸＩは実施した研究の結果を示す。ロパルルス・ジュンセウス毒の経口投与により、陰性対照群と比較して僅かな肉芽腫組織の阻害が起こり、このことは炎症の増殖段階におけるロパルルス・ジュンセウス毒の活性を示唆する。研究した２つの生成物の用量は同程度の効果を有していた。
【００３２】
表ＸＩ．ラットにおける綿球誘発性の肉芽腫に対するロパルルス・ジュンセウス毒の効果
群
【表１１】
2013542196.tif 000012
値は平均±ＳＤである。少なくとも１つの共通の文字を有する群は統計的に異ならない（ｐ＞０．０５）。
【００３３】
表ＸＩＩは、様々な実験群での肉芽腫の重量及びカルミン含量の値を示す。毒素は、対照群と比較して、その３ｍｇ／ｋｇ及び５ｍｇ／ｋｇ用量でそれぞれ１．３２倍及び２．０５倍、肉芽腫の重量を低減した（ｐ＜０．０５）。
【００３４】
血管形成は腫瘍の成長及び転移に重要なプロセスであり、そのためこの複雑なプロセスを阻害することができる生成物を有することが腫瘍疾患を治療する代替方法である。
【００３５】
カルミン含量は空気嚢の肉芽腫における新たな血管の形成の指標である。毒素の投与により、肉芽腫組織における新たな血管の形成が３ｍｇ／ｋｇ及び５ｍｇ／ｋｇの（ＩＰ）用量でそれぞれ３９．２２％及び６９．２４％低減し、全ての実験群間で統計的に有意な差を伴っていた（ｐ＜０．００１）。
【００３６】
表ＸＩＩ．ラット（ｎ＝１０）のアジュバント誘発性の炎症血管形成における肉芽腫重量及びカルミン含量に対する腹腔内投与されたロパルルス・ジュンセウス毒の効果
群
【表１２】
2013542196.tif 000013
少なくとも１つの共通の文字を有する群は統計的に異ならない（ｐ＞０．０５）。
【００３７】
Ａ：４９０ｎｍでの吸光度
表ＸＩＩＩは、マウスの３％酢酸誘発性の捻転モデルに腹腔内接種したロパルルス・ジュンセウス毒の鎮痛効果の結果を示す。
【００３８】
【表１３−１】
2013542196.tif 000014
【００３９】
様々な用量の毒で処理した群は全て、陰性対照群と比較してはるかに低い（ｐ＜０．０５）腹部収縮を示した。２．５ｍｇ／ｋｇ及び７．５ｍｇ／ｋｇ用量の毒は、既知の鎮痛薬であるアスピリンを与えた群と同程度の効果を有していた。その一方で、５．０ｍｇ／ｋｇ用量のロパルルス・ジュンセウス毒は、１００ｍｇ／ｋｇのアスピリンの投与により得られた阻害（４９．２８％）より高い阻害を示した（８７．７４％）。
【００４０】
表ＸＩＩＩ．酢酸誘発性の腹部捻転モデルにおけるロパルルス・ジュンセウス毒の腹腔内投与の効果
【表１３−２】
2013542196.tif 000015
ＮＣ：陰性対照；Ｎｏ：数
ＡＳＡ：アスピリン
少なくとも１つの共通の文字を有する群は統計的に異ならない（ｐ＞０．０５）。
【００４１】
経口経路投与
表ＸＩＶで明らかなように、様々な用量の毒を与えた群は全て、陰性対照群と比較して腹部収縮の数の顕著な低下を示した（ｐ＜０．０５）。用いた毒用量と陽性対照群（アスピリン）との比較により、顕著な鎮痛効果が示された。１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ及び２０ｍｇ／ｋｇ用量のロパルルス・ジュンセウス毒はアスピリンと同様の形式で腹部収縮を阻害した。５０ｍｇ／ｋｇ用量は陽性対照との統計的に有意な差はもたらさなかったが、実験動物において腹部捻転の５４．７８％の阻害を達成した。
【００４２】
表ＸＩＶ．ロパルルス・ジュンセウス毒の経口投与後の酢酸誘発性の腹部捻転の阻害
【表１４】
2013542196.tif 000016
ＮＣ：陰性対照
ＡＳＡ：アスピリン
【００４３】
マウスにおける熱的鎮痛モデル
Drug Discoverに記載の方法を使用した。
【００４４】
国立実験動物育種センター（ＣＥＮＰＡＬＡＢ）から平均体重２０ｇ〜２５ｇのＯＦ１雄性マウスを使用した。（１６頁）
【００４５】
動物を、アッセイ物質を投与する前とアッセイ物質を投与した後の両方で５５℃の一定温度のホットプレート（UGO-Basile）上に置いた。後肢の舐め又は跳躍の形での侵害受容応答の潜時を測定した。２０秒以内に侵害受容応答を示した動物のみをアッセイに選んだ。実験（Selection）は４０秒で終了した。
【００４６】
生理食塩溶液を陰性対照に投与し、４％コデインを陽性対照に投与し、様々な用量のロパルルス・ジュンセウス毒を試験群に投与した後、それぞれの動物における応答潜時を２時間後及び３時間後に測定した。
【００４７】
この研究の間、マウスにおける熱刺激に対する侵害受容反応性を、オピオイド鎮痛及び或る種の重大な痛覚過敏性の脊柱反応を検出する急性疼痛感受性試験であるホットプレートアッセイを用いて測定した。物質は、動物の正常な反応時間がその投与によって２倍になる場合に重大な鎮痛特性を有するとみなされる。
【００４８】
ロパルルス・ジュンセウス毒の鎮痛効果を図１及び表ＸＶに示す。結果により、３つの用量の生成物のＩＰ投与がホットプレートの熱刺激を有意に低減したことが示される。図１は３つの用量のロパルルス・ジュンセウス毒がマウスでのホットプレートアッセイにおいて侵害受容応答の潜時を大幅に延ばすことを示す。
【００４９】
様々な実験群における疼痛阻害を表ＸＶに示す。熱誘発性の痛覚の強い阻害が観察され、最大の阻害が投与の２時間後に起こる。３時間後でも強力な効果があり、２．５ｍｇ／ｋｇ及び７．５ｍｇ／ｋｇ用量は陽性対照と同程度の効果を有するが、７．５ｍｇ／ｋｇ用量はコデインよりも大きくより長期的な効果を有する。
【００５０】
表ＸＶ．ホットプレートモデルにおけるロパルルス・ジュンセウス毒の投与の効果
【表１５】
2013542196.tif 000017
少なくとも１つの共通の文字を有する群は統計的に異ならない（ｐ＞０．０５）。
【００５１】
ホットプレート試験の結果により、より大きくかつより複雑なニューロン統合が舐め及び跳躍応答に必要となることから、ロパルルス・ジュンセウス毒が骨髄よりも中枢神経系に対して高い抗侵害受容効果を有することが示される。
【００５２】
表ＸＶＩ．フェナントロリン／Ｃｕ２＋誘発性のＤＮＡ損傷のモデルにおけるロパルルス・ジュンセウスサソリ毒の酸化促進能
【表１６】
2013542196.tif 000018
異なる文字は対照と比較した統計的な差を意味する（ｐ＜０．０５）。
【００５３】
表ＸＶＩＩ．フェナントロリン／Ｃｕ２＋誘発性のＤＮＡ損傷のモデルにおけるロパルルス・ジュンセウスサソリ毒の酸化促進能。
【表１７】
2013542196.tif 000019
異なる文字は対照と比較した統計的な差を意味する（ｐ＜０．０５）。
【００５４】
表ＸＶＩＩＩ．ロパルルス・ジュンセウスサソリ毒のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生物学的活性を評価する研究に使用する細胞
【表１８】
2013542196.tif 000020
Ｓｉｎｇｌｅ−ｌａｙｅｒ：単層
Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ：懸濁液
ＮＤ：未測定  ＣＣ５０：細胞毒性濃度の中央値
【００５５】
単層で成長させた細胞培養液（癌）は、正常細胞及び懸濁液中で成長させた腫瘍細胞と比較した有意な細胞成長阻害（ｐ＜０．０５）と、正常細胞及び懸濁液中で成長させた腫瘍細胞より高い感受性とを示した。
【００５６】
ヒトの正常なＭＲＣ−５細胞株と、ヒト腫瘍細胞とのＣＣ５０の比較により、ロパルルス・ジュンセウスサソリ毒が、正常細胞と比較して腫瘍細胞において差次的かつ有意な細胞毒性を有することが示された（ｐ＜０．０５）（表ＸＶＩＩＩ）。
【００５７】
毒の曝露により、ヒト及びマウスの腫瘍細胞株において単層成長条件下で有意な成長阻害が引き起こされた（ｐ＜０．０５）。Ｕ９３７腫瘍細胞株及びＳ−１８０腫瘍細胞株（両方とも懸濁液中で成長させた）は毒の投与に対してより低い感受性を示し、その効果は成長を僅かに低下させるだけであった（表ＸＶＩＩＩ）。
【００５８】
正常細胞、リンパ球及び腹膜マクロファージは腫瘍細胞よりも低い感受性を示した。用いられる濃度の全範囲にわたって有意な毒性効果は観察されなかった（ｐ＞０．０５）（表ＸＶＩＩＩ）。
【００５９】
５０日後の肺転移の発生率の評価により、サソリ毒の投与が自然肺転移の発現を有意に低減したことが示された（０．８ｍｇ／ｋｇ、３．２ｍｇ／ｋｇ）（表ＸＩＸ）。
【００６０】
表ＸＩＸ．Ｆ３１１マウス乳腺腫瘍を移植したＢａｌｂ／ｃマウスにおける肺転移の発現の発生率。＊対照に対する統計的に有意な差（ｐ＜０．０５）
【表１９】
2013542196.tif 000021
【００６１】
経口投与経路
Ｂａｌｂ／ｃマウスに移植された乳腺腺癌モデルに対するサソリ毒の効果を評価した。治療群に対して４つの用量（６ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ及び５０ｍｇ／ｋｇ）を使用した。対照には食塩溶液を与え、全ての投与は３５日間、経口経路で行った。腫瘍成長は３５日間モニタリングした。
【００６２】
サソリ毒を投与した実験群は、対照群と比較して有意な腫瘍の成長阻害を示した（ｐ＜０．０５）（図４）。実験群は、腫瘍の進行遅延に関して３５日間の評価の間、用量応答比を示した。
【００６３】
表ＸＸ．１０６個のＳ−１８０マウス細胞を腹腔内移植し、経口で与えるロパルルス・ジュンセウスサソリ毒で処理した実験群の平均生存時間
【表２０】
2013542196.tif 000022
【００６４】
表ＸＸＩ．１０６個のＳ−１８０マウス細胞を腹腔内移植し、経口で与えるロパルルス・ジュンセウスサソリ毒で処理した実験群間の生存時間
【表２１】
2013542196.tif 000023
【００６５】
１２．５ｍｇ／ｋｇ用量ではより長期の平均生存時間が得られ（２４日間）、それに２５ｍｇ／ｋｇ用量（２２．５日間）及び６ｍｇ／ｋｇ用量（２０．５日間）が続き、対照の平均生存時間は２０日間であった（表ＸＸＩ）。同様に、１２．５ｍｇ／ｋｇ用量は、対照群の１００％のマウスが死滅した時間で最大の生存率（パーセント）を示し（表ＸＸＩ）、６ｍｇ／ｋｇ用量及び２５ｍｇ／ｋｇ用量はそれぞれ、２６％及び２２％を示した。これらの結果にもかかわらず、３つの実験群（６ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇ及び２５ｍｇ／ｋｇ）間での生存時間及び生存率（パーセント）の増大は統計的に有意なものではなかった。５０ｍｇ／ｋｇ用量は全ての場合において対照と同様の値を示した。
【００６６】
分子排除クロマトグラフィにより得られた画分の抗増殖活性に対するアッセイ
細胞成長に対するタンパク質画分の効果を実施例６と同様の方法で決定した。本研究は２つの腫瘍細胞株：ＨｅＬａ（ヒト頸癌）及びＡ５４９（ヒト肺癌）と、正常なＭＲＣ−５細胞株（ヒト肺線維芽細胞）とを使用した。画分はウェル内において９μｇ／ｍＬ〜６００μｇ／ｍＬの最終濃度とした。
【００６７】
細胞株における画分の細胞毒性評価により、ＬＢ−０３画分及びＬＢ−０４画分では腫瘍細胞の成長阻害が示され、正常細胞においてはほとんど毒性が示されなかった。表ＸＸＩＩは精製画分のそれぞれに対するＣＣ５０を示す。
【００６８】
表ＸＸＩＩ．腫瘍細胞株及び正常細胞株における分子排除クロマトグラフィにより得られた画分の相対分子量及び平均細胞毒性濃度
【表２２】
2013542196.tif 000024
＊相対分子量はｌｏｇ  ＰＭ対ＶｏＶｅの検量線から決定した。
ＭＷ：パターンタンパク質の分子量
Ｖｏ：カラムの死容積
Ｖｅ：それぞれのタンパク質ピークに対する溶出容量
【００６９】
ＦＰＬＣ分子排除クロマトグラフィにより得られた画分を、それらのタンパク質組成を確認するために４％から２０％への勾配を用いるポリアクリルアミドゲル電気泳動で泳動させ、それを図７に表す。
【００７０】
ＬＢ−０３画分及びＬＢ−０４画分は低分子量タンパク質組成を有し、更には腫瘍細胞（Ｈｅｌａ及びＡ５４９）に対するより高い細胞毒性と、正常細胞（ＭＲＣ−５）に対する低い毒性とを示す画分であった。
【００７１】
これらの画分はＣ１８逆相分析曲線を用いる高分解能液体クロマトグラフィにより再精製した。２つの溶液を移動相として使用した：溶液Ａ（０．１２％  トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液）及び溶液Ｂ（０．１０％  ＴＦＡのアセトニトリル溶液）。画分成分の溶出を、７０分間、溶液Ｂの０％から７０％への段階勾配を用いて０．５ｍｌ／分の流量で行い、画分の検出波長は２２０ｎｍとした。腫瘍細胞（Ｈｅｌａ）及び正常細胞（ＣＨＯ）において得られた純粋なペプチドを実施例６に記載されるような方法で評価し、それらの分子量及びタンパク質配列を、高分解能の液体クロマトグラフィ装置に組み込まれた質量分析により決定した。
【００７２】
腫瘍細胞に対する高い細胞毒性活性と、正常細胞に対する低い毒性とを有する８つのペプチド（ＲｊＬＢ−０１、ＲｊＬＢ−０３、ＲｊＬＢ−０４、ＲｊＬＢ−０５、ＲｊＬＢ−０７、ＲｊＬＢ−０８、ＲｊＬＢ−０９及びＲｊＬＢ−１４）が得られた。これらの結果により、全毒で観察されたものが裏付けられ、腫瘍細胞に対する毒成分の選択的毒性が確認される。
【００７３】
活性成分の精製に基づき、毒におけるそれらの存在率を決定した（表ＸＸＩＩＩ）。
【００７４】
表ＸＸＩＩＩ．毒組成物における活性成分の割合及び腫瘍細胞に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生物学的活性の範囲
【表２３】
2013542196.tif 000025
（２４頁）
【００７５】
ＲｊＬＢ−０１ペプチド、ＲｊＬＢ−０３ペプチド及びＲｊＬＢ−０４ペプチドで得られた分子量はそれぞれ、９０８Ｄａ、１９６４Ｄａ及び４７４８．１４Ｄａであった。得られた配列をサソリ毒ペプチドデータベースと比較したが、これまでに記載されたペプチドとの相同性は見られず、このことは結果の新規性の更なる証拠である。
【００７６】
本発明による別の結果は以下のようにして得られた配合物である：５０匹〜１００匹のロパルルス・ジュンセウス種のサソリを採取し、それらの毒を電気刺激により抽出し、１０ｍＬ〜２０ｍＬの蒸留水で希釈した。次いで、それを１５分間の１００００ｒｐｍの遠心分離により清澄化して、粘液及び細胞残渣等の成分を取り除いた。同時に、それらのタンパク質を、ローリー法を用いて測定し、結果は５ｍｇ／ｍＬ〜１５ｍｇ／ｍＬの濃度であった。それからサソリ毒を唯一の賦形剤として蒸留水を用いて適切に希釈し、濃度範囲が０．０５ｍｇ／ｍＬ〜０．１ｍｇ／ｍＬである配合物を得た。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】平均寿命が２〜３時間内で変動する中枢性鎮痛薬であるコデイン（陽性対照）の挙動を、本発明者らの結果に併せて示す図である。
【図２】Ａ５４９腫瘍細胞株及びＨｅｌａ腫瘍細胞株から抽出されたＤＮＡの１．５％アガロースゲル電気泳動を示す図である。毒は１つのウェル当たり０．５ｍｇ／ｍＬの最終濃度で与えられた。それぞれの細胞株のＤＮＡを２４時間後及び４８時間後に抽出した。  トラックＭ：ラムダＤＮＡ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ分子量マーカー。  トラック１〜３：Ａ５４９細胞株、１：毒を含まないＤＮＡ対照、２：２４時間後に抽出したＤＮＡ、３：４８時間後に抽出したＤＮＡ。  トラック４〜６：Ｈｅｌａ細胞株、４：毒を含まないＤＮＡ対照、５：２４時間後に抽出したＤＮＡ、６：４８時間後に抽出したＤＮＡ。
【図３】実験群における腫瘍成長の動態を示す図である。腫瘍成長は３５日間モニタリングした。腫瘍成長の阻害は与えられた毒の用量に依拠していた。対照との統計的な有意性は、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１であった。
【図４】実験群における腫瘍成長の動態を示す図である。腫瘍成長は３５日間モニタリングした。腫瘍成長の阻害は与えられた毒の用量に依拠していた。対照との統計的な有意性は、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１であった。
【図５】実験による肺転移の発生に対するサソリ毒の経口投与の効果ｔを示す図である。統計的に有意な差：＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図６】１２  ＨＲ１０／３０  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ分子排除カラムを用いた低圧液体クロマトグラフィにおけるロパルルス・ジュンセウスサソリ毒のクロマトグラフィプロファイルを示す図である。
【図７】還元条件下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す図である。精製により得られる画分を、低圧液体クロマトグラフィを用いて適用した。トラック１：分子量マーカー、トラック２：全毒、トラック３：ＬＢ−０１画分、トラック４：ＬＢ−０２画分、トラック５：ＬＢ−０３画分、トラック６：ＬＢ−０４画分。
【図８】評価した画分の再精製により得られた純粋なペプチドに関する濃度応答曲線を示す図である。評価をＨｅｌａ（ヒト頸癌）腫瘍細胞で行った。用いる濃度は６．２５μｇ／ｍＬ〜４００μｇ／ｍＬであった。
【図９】評価した画分の再精製により得られた純粋なペプチドに関する濃度応答曲線を示す図である。評価をＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）非腫瘍細胞で行った。用いる濃度は６．２５μｇ／ｍＬ〜８００μｇ／ｍＬであった。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００７８】
実施例１  マウスにおけるクロトン油誘発性の耳の浮腫の急性炎症モデル
国立実験動物育種センター（ＣＥＮＰＡＬＡＢ）から平均体重１８ｇ〜２２ｇのＯＦ−１雄性マウスを使用した。ＣＹＴＥＤ（Ｉｂｅｒｏ−Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ  ｆｏｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、ペルー、１９９６年１１月）により記載された方法を使用した。０．５％  アセトンクロトン油溶液を使用した。デキサメタゾンを０．５％  ＣＭＣに溶解した。
【００７９】
実施例２  ラットにおける綿球移植モデル
国立実験動物育種センター（ＣＥＮＰＡＬＡＢ）から体重１８０ｇのスプラーグドーリーラットを使用した。
【００８０】
ＣＹＴＥＤ（Ｉｂｅｒｏ−Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ  ｆｏｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、ペルー、１９９６年１１月）による綿球移植方法を行った。
【００８１】
炎症は損傷に対する組織応答である。これには、酵素の関与及び活性化、メディエータ放出、流体溢出、細胞移動、並びに組織の破壊及び修復が含まれる（Vane, 1995）。抗炎症効果は化学物質群によりもたらされ、それらの薬理活性と化学構造との間には僅かに相関関係があることが知られている（Sertie, 1990）。これにより、炎症プロセスの複雑性と合わせて考えると、薬理アッセイを実施するのに様々な実験モデルを使用することが要求される。ラットにおける綿球肉芽腫（正：granuloma）モデルは、慢性炎症状態に対する効果を研究するのに頻繁に用いられるアッセイである（Elieter, 1999）。綿球移植後において３つの炎症段階が明らかになっている。最後の段階は３〜６日目に起こる細胞増殖段階である。この段階は、デキサメタゾン等の抗炎症性ステロイド及び非ステロイド性抗炎症薬により阻害することができる（Sw, 1972）。
【００８２】
動物は綿栓の移植の７日後に、確立された安楽死方法によって屠殺し、綿球を取り出し研究を行った。綿球の最終重量と初期重量との差を発生した肉芽腫組織とみなした。
【００８３】
実施例３  炎症性血管形成モデル
ＣＥＮＰＡＬＡＢから体重１８０ｇ〜２４０ｇのスプラーグドーリー雄性ラットを使用した。
【００８４】
炎症性血管形成は、血管形成カスケードにおいて進行する一連の異なるが基本的には類似する分子機構を伴う複雑なプロセスである。肉芽腫形成が誘導された６日後には、肉芽腫は対照群において明確に規定され、触診可能であった。これは２００１年にPrimellesによって報告された結果と一致している。毒を投与した動物の場合、肉芽腫は触診で小さくなっており、それらの巨視的観察により、あまり明確ではない境界が示され、肉芽腫は表皮にそれほど付着していなかった。
【００８５】
実施例４．鎮痛活性
マウスにおける酢酸誘発性の捻転のモデル
ＣＹＴＥＤに記載の方法は以下のとおりであった。
【００８６】
国立実験動物育種センター（ＣＥＮＰＡＬＡＢ）から平均体重２０ｇ〜２５ｇのＯＦ１雄性マウスを使用した。
【００８７】
腹腔内経路投与
１ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ及び７．５ｍｇ／ｋｇ用量のロパルルス・ジュンセウス毒の腹腔内接種を行った。３０分後、実験動物に０．１ｍＬの３パーセント酢酸溶液を腹腔内投与し、捻転の数／動物を初めに捻転が観察されてから１０分間、記録した。
【００８８】
経口経路投与
１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ及び５０ｍｇ／ｋｇ用量のロパルルス・ジュンセウス毒を経口投与した。１時間後、実験動物に０．１ｍＬの３パーセント酢酸溶液を腹腔内投与し、捻転の数／動物を初めに捻転が観察されてから１０分間、記録した。
【００８９】
実施例５  抗酸化活性の評価
ロパルルス・ジュンセウス毒によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗酸化活性を、銅フェナントロリン系及びブレオマイシン鉄系の酸化プロセスにおけるＤＮＡ保護効果により評価した。毒はＤＮＡを過酸化プロセスから保護することから、抗酸化活性を示した。
【００９０】
銅フェナントロリン系及びブレオマイシン鉄系は、上記の配合物におけるロパルルス・ジュンセウス誘導体がＤＮＡに対する酸化促進効果を有しないことを示した。様々なロパルルス・ジュンセウス誘導体濃度で得られる吸光度値は陽性対照で得られる吸光度値よりも低い。表ＸＶＩ及び表ＸＶＩＩはかかる評価の結果を示す。
【００９１】
実施例６．腫瘍細胞及び正常細胞のパネルにおけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞毒性
細胞成長に対する毒の効果を、ミトコンドリア脱水素酵素によるこの（イエロー）テトラゾリウム塩の代謝還元により起こる細胞増殖を測定するＭＴＴアッセイにおいて確認した。生じる化合物（ブルーホルマザン）を溶解し、分光光度法によって定量することができる。
【００９２】
９つの腫瘍細胞株を本研究に用いた：ＨｅＬａ（ヒト頸癌）、ＨＥｐ−２（ヒト咽頭類表皮癌）、ＮＣＩ−Ｈ２９２（ヒト肺粘膜表皮癌）、Ａ５４９（ヒト肺癌）、Ｕ９３７（ヒト組織球性リンパ腫）、Ｌ９２９（マウス線維肉腫）、Ｓ−１８０（マウス肉腫）、及びＦ３１１（マウス乳腺癌）。同様に、３つの正常細胞株を用いた：ＭＲＣ−５（ヒト肺線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザルの正常な腎細胞）、及びＭＤＣＫ（イヌの正常な腎細胞）。腹膜マクロファージ（Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹膜から抽出）及びリンパ球（Ｂａｌｃ／ｃマウスの脾臓から抽出）も評価した。細胞を、細胞培養物の特質に応じて、培養フラスコ内の最小必須培地（ＭＥＭ）又はＲＰＭＩ−１６４０培地中で成長させ、２ｍＭ  グルタミン、非必須アミノ酸、１０％  ウシ胎仔血清（ＢＦＳ）、及び１００ＩＵ／ｍＬ−１００μｇ／ｍＬ  ペニシリン−ストレプトマイシンを添加した。それぞれの培地を、単層が形成されるまで３７℃及び５パーセントＣＯ２で高湿度雰囲気下においてインキュベートした。それぞれの細胞株を、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を用いて剥離し、ノイバウエルチャンバーでカウントした後、２×１０５個の細胞／ｍＬ濃度で調製した。
【００９３】
本アッセイを９６ウェルの平底のポリスチレン細胞培養皿（Coming Inc.、ｃｏｓｔａｒ（商標））において行った。５０μＬの細胞株をそれぞれ、各ウェルに注ぎ入れ、５パーセントＣＯ２及び３７℃雰囲気下で２４時間インキュベートした。かかる期間の後、先に溶解させた毒を含む培地を５０μＬ添加した。最終毒濃度は、ウェルにおいて０．１ｍｇ／ｍＬ、０．２５Ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．７５ｍｇ／ｍＬ及び１ｍｇ／ｍＬであった。最終細胞株濃度は全て１０４個の細胞／ウェルであった。ウシ胎仔血清（ＢＦＳ）は培地中において１０％で使用した。
【００９４】
培養皿を５パーセントＣＯ２及び３７℃雰囲気下で３日間再度インキュベートした。かかる期間の後、１０μＬのＭＴＴ滅菌溶液（５ｍｇ／ｍＬのテトラゾリウム塩の滅菌ＰＢＳ溶液）を各ウェルに添加し、同じ条件下で４時間インキュベートした。最後に、培地を捨て、２００μＬ／ウェルのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液を添加し、高湿度雰囲気下において３７℃で３０分間インキュベートした。光学密度（ＯＤ）を、リファレンスとして６３０ｎｍを用い、Dynex TechnologiesのＥＬＩＳＡ  ＭＲＸ  Ｒｅｖｅｌａｔｉｏｎマイクロディッシュリーダーにおいて５６０ｎｍで読み取った。それぞれの画分の濃縮を３回行い、本アッセイを４回実施した。
【００９５】
濃度応答曲線分析のために、細胞増殖率（パーセント）を、様々な毒濃度に対して式（１−ＯＤ（サンプル）／ＯＤ（対照））×１００からグラフにより得た。平均細胞毒性濃度は、非処理の対照と比較して生存細胞の数（ＭＴＴ吸光度）の５０パーセントの低減をもたらす毒濃度であるＣＣ５０で表し、評価した細胞のそれぞれについて表ＸＶに表す。
【００９６】
実施例７．アポトーシス研究
アポトーシスを求める研究をＤＮＡ断片化により行った。Ｈｅｌａ細胞株及びＡ５４９細胞株を使用した。結果を図２に示す。アポトーシスの特徴的なＤＮＡ断片化は毒で処理したＨｅｌａ細胞の対応トラックにおいて観察され、対照ウェル及びＡ５４９細胞株では単一の無傷の染色体ＤＮＡバンドが観察された。これらの結果により、サソリ毒はアポトーシス及び壊死の両機構により細胞死を誘導することができることが示される。
【００９７】
実施例８．固形腫瘍における抗腫瘍活性。Ｆ３１１乳腺腺癌の実験モデル。腹腔内投与経路
Ｂａｌｃ／ｃマウスに移植された乳腺腺癌モデルに対するサソリ毒の効果を評価した。３つの用量（０．２ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ及び３．２ｍｇ／ｋｇ）を処理群に用いた。対照に食塩溶液を腹腔内投与した。腫瘍成長を３５日間モニタリングした。腫瘍を移植して５０日後、動物を屠殺し、それらの肺を取り出し、肺転移について検査した。
【００９８】
サソリ毒で処理した実験群は、対照群と比較して有意な腫瘍成長阻害を示した（ｐ＜０．０５）（図３）。実験群は、腫瘍の進行遅延に関しての３５日間の評価の間、用量応答比を示した。処理群における腫瘍成長の有意な低減により、ロパルルス・ジュンセウスサソリ毒が、少なくとも評価期間の間、腫瘍成長に影響を及ぼすことから抗腫瘍効果を有することが示される。
【００９９】
実施例９  Ｆ３１１乳腺腺癌の実験モデル。経口投与経路
Ｂａｌｂ／ｃマウスに注入した乳腺腺癌モデルにおけるサソリ毒の効果を評価した。４つの用量（６ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ及び５０ｍｇ／ｋｇ）を処理群に用い、対照群に食塩溶液を経口投与した。腫瘍成長を３５日間モニタリングした。
【０１００】
サソリ毒（１２．５ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ及び５０ｍｇ／ｋｇ）で処理した実験群は、対照群と比較して有意な腫瘍成長阻害を示した（ｐ＜０．０５）（図４）。処理群で見られた腫瘍進行の有意な低減により、ロパルルス・ジュンセウスサソリ毒が少なくとも評価期間の間、腫瘍成長に影響を及ぼすことから、ロパルルス・ジュンセウスサソリ毒の抗腫瘍効果が実証される。
【０１０１】
実施例１０  抗転移活性  転移性肺腫瘍の実験モデル.
転移性肺腫瘍に関し、サソリ毒の効果が、Ｂａｌｂ／ｃマウスに移植された乳腺ガンのモデルで評価された。４タイプの投与（６ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ及び５０ｍｇ／ｋｇ）が、処置中行われた。コントロールには、食塩溶液が投与された。処置は、肺にガンを静脈投与で移植後２４時間で始めた。処置は、２１日間、朝に、毎日行われた。全ての実験グループで、最後の投与後２４時間で、頚椎脱臼で実験動物が屠殺され、肺臓器が転移出現の分析のために抽出された。ガンの発現は、１００％であった。６ｍｇ／ｋｇ投与の実験群が、転移の出現に関し、コントロール群に比べ最も高いレベルを示した。２５ｍｇ／ｋｇ投与の実験群は、コントロール群に比べ、転移の出現の減少を示した。しかし、差異は、有意差ではなかった。１２．５ｍｇ／ｋｇ と ５０ｍｇ／ｋｇ投与群は、転移の出現に関し、統計的に有意差をもって減少を示した。
【０１０２】
実施例１１  活性成分としての毒タンパク質の精製及び同定
全タンパク質内容物を分離するために、全毒を０．１Ｍ  酢酸アンモニア（ＮＨ４Ａｃ）に溶解し、１００００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を寸法が１０×３００ｍｍの１２  ＨＲ  １０／３０  Ｓｕｐｅｒｏｓｅろ過ゲルカラムを備えるＡＫＴＡ  ＦＰＬＣ（Amersham Pharmacia Biotech）低圧液体クロマトグラフィ機器に投入した。カラムを、０．１Ｍ  ＮＨ４Ａｃ及び同じ溶媒に混合した材料を用いて０．５ｍＬ／分の流量で平衡化した。吸光度を２８０ｎｍの光学密度（ＯＤ）で７２分間、モニタリングした。７５  ＨＲ  １０/２０  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ分子排除カラムを、リボヌクレアーゼＡ（１３．７Ｋｄａ）、キモトリプシノーゲン（２５Ｋｄａ）、オボアルブミン（４３Ｋｄａ）、アルブミン（６７Ｋｄａ）及びブルーデキストラン２０００を含むパターンタンパク質キットを用いて較正した。パターン曲線を作成し、クロマトグラフィの間に得られる様々なタンパク質画分の相対分子量を決定した。クロマトグラフィ操作の結果を図６に表す。
【０１０３】
実施例１２  ヒトがん患者に与えられる配合物に関する臨床研究（天然物）
本研究の目的はがん患者における生活の質を評価することであった。本研究に含まれる被験体は組織学的に確認された任意の病期のがんを患う男女の患者であった。患者のインフォームドコンセントと、カルテの概要とが記載された書類は、治療するがん専門医により作成された。書類には、臨床期間（evolution）の間に病院において医師によって行われた患者の臨床状態の評価が含まれていた。追跡調査の間隔（periodicity）は２ヶ月以上とした。追跡調査を１年間行った。配合物は４０ｍＬ容のフラスコ内において０．０５ｍｇ／ｍＬ〜０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で調製した。フラスコの内容物を賦形剤として用いられる蒸留水で希釈し、１リットルにした。生成物を経口経路で毎日投与し、推奨用量は患者の状態及び組織学的診断に依拠するものとした。
【０１０４】
総計１００人の患者が本研究に含まれ、評価するがんの主な場所は乳房、前立腺、結腸、肺、脳及び膵臓であった。生成物の投与によっては、治療の何れの時点であっても全く有害反応が引き起こされず、このことは前臨床研究での観察結果に一致していた。全ての症例で、全ての肺がん患者において呼吸困難及び咳嗽がほとんど又は全くないというような主な臨床レベルでの変化の改善により明らかなように、生活の質が改善された。多くの患者は、一部の症例において病変の安定化、及びその他の症例においては病変の消失という形でより良好なＸ線検査結果を示した。加えて、血液学的レベルでの変化が安定化し、疼痛及び膨脹が低減した。１年間、本発明の配合物で処理した患者の５０％超が研究状態の幾つかで推定された生存時間よりも長期にわたる生存時間を有していた。
【０１０５】
実施例１３  ヒトがん患者における配合物の臨床研究（同毒療法産物）
本研究の目的はがん患者における生活の質の評価であった。研究個体として含めるのに、任意の病期のがんであると組織学的に確認された男女の患者を用いた。患者の同意書（consent act）と、一次医療がん専門医により作成されたカルテの概要とを含む書類を用意した。
【０１０６】
患者の臨床的挙動の評価を書類に含め、評価は臨床的進行を通して追跡調査し、患者が元いた病院の専門医によって行われた。追跡調査の間隔は少なくとも２ヶ月とした。追跡調査は１年間行った。配合物は４０ｍＬの容量のボトル内において０．０５ｍｇ／ｍＬ〜０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で調製した。フラスコの内容物を１リットルになるまで賦形剤として用いられる蒸留水で希釈した。生成物を経口経路で毎日投与し、推奨用量は患者の病期及び組織学的診断に依拠するものとした。
【０１０７】
総計１００人の患者が本研究に含まれ、がんの主な場所は乳房、前立腺、結腸、肺、脳及び膵臓であった。生成物の投与によっては、何れの症例であっても、治療の間は有害反応が引き起こされず、このことは前臨床研究で観察されたものに一致していた。全ての症例で、肺がん患者の全症例において呼吸困難及び咳嗽の低減又は消失のような主な臨床レベルでの変化の改善を含む生活の質の向上が観察された。多くの患者において、一部の症例において病変が安定化し、その他の症例においては病変が消失したことから、Ｘ線検査結果の改善が確認された。これに加えて、血液学的レベルでの変化の安定化が達成され、疼痛及び炎症が低減した。１年間、本発明の対象である配合物で処理した患者の５０％超で、研究状態の幾つかで推定された生存期間を上回った。
【０１０８】
実施例１４．Ｖｉｄａｔｏｘ  （商標）  ３０ＣＨ臨床研究
ＶＩＤＡＴＯＸ  （商標）  ３０ＣＨは、LABIOFAMのホメオパシー研究所で開発されたホメオパシー生物療法薬である。その活性成分は３０００倍希釈のロパルルス・ジュンセウスサソリ毒である。ＶＩＤＡＴＯＸ  （商標）  ３０ＣＨは３３％アルコール媒体中で点滴剤の形態となる。
【０１０９】
特別ながん治療を受けている男女の患者１７４人で行われた本研究により、様々な身体部位（肺、前立腺、乳房、結腸、膵臓、ｔリンパ球、脳、直腸等）におけるがんの治療に対するＶＩＤＡＴＯＸ  （商標）  ３０ＣＨの補助効果が実証された。その結果により、生成物を投与した患者の９６％が１２ヶ月を越えて生存し、患者の９０％が医師によって確認された臨床症状の改善を報告し、６３人の患者のうち、中期状態まで進行した６２％の患者の疼痛（主症状として）が緩和処置する必要がなく、２７％の患者では疼痛の報告なく、いずれにおいても治療に対する有害反応の報告はなかったことが示される。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図２】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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