(57)【要約】  リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスを処理して比較的低粘度の高固形分シロップを製造してもよく、それはエネルギー含量が高く、発酵製造工程中で燃焼させてもよい。高固形分シロップは、ブロスまたは枯渇ブロスの液体／固体分離を通じて得られ、懸濁固形分の低い薄い蒸留廃液を生成して、低粘度を保ちながら蒸発させて高固形分にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスの液体／固体分離からの液体画分の蒸発生成物であるか、または生成物枯渇リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスである、少なくとも約４０質量％の固形分を含んでなり約１００センチポアズ未満の粘度を有するシロップ。
【請求項２】
リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスが、酸、アルコール、アルカン、アルケン、芳香族、アルデヒド、ケトン、バイオポリマー、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ビタミン、抗生物質、および医薬品からなる群から選択される標的生成物を含んでなる、請求項１に記載のシロップ。
【請求項３】
標的化合物が、エタノール、ブタノール、および１，３−プロパンジオールからなる群から選択される、請求項２に記載のシロップ。
【請求項４】
リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスが、スイッチグラス、古紙、製紙業汚泥、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ苞葉、トウモロコシ茎葉、草、小麦、麦藁、干し草、大麦藁、稲藁、サトウキビバガス、穀類の加工から得られる構成成分、樹木、枝、根、葉、木片、おがくず、灌木および低木、野菜、果物、および花卉からなる群から選択されるバイオマスから生成される、請求項１に記載のシロップ。
【請求項５】
固形分が少なくとも約４５％である、請求項１に記載のシロップ。
【請求項６】
固形分が少なくとも約５０％である、請求項１に記載のシロップ。
【請求項７】
ａ）標的生成物を含んでなるリグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスを提供するステップと；
ｂ）蒸留によって、（ａ）のリグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスから前記標的生成物を除去し、全蒸留廃液を生成するステップと；
ｃ）（ｂ）の全蒸留廃液から液体および固体画分を分離して、約０．１質量％未満の懸濁固形分を含んでなる薄い蒸留廃液を生成するステップと；
ｄ）（ｃ）の薄い蒸留廃液を蒸発させて、少なくとも約４０質量％の固形分を含んでなり約１００センチポアズ未満の粘度を有するシロップを製造するステップと
を含んでなる、標的生成物を製造する方法。
【請求項８】
標的生成物が、エタノール、ブタノール、および１，３−プロパンジオールからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
シロップがさらなる乾燥なしに燃焼される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
薄い蒸留廃液の蒸発からの水が再循環される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）のリグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロス、または（ｂ）の枯渇ブロスまたは全蒸留廃液が、約６以下のｐＨを有する、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）のリグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロス、または（ｂ）の枯渇ブロスまたは全蒸留廃液が、約７０℃〜約１５０℃の温度で約３０秒間〜約２１０分間加熱処理され、時間と温度が逆相関する、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスが、スイッチグラス、古紙、製紙業汚泥、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ苞葉、トウモロコシ茎葉、草、小麦、麦藁、干し草、大麦藁、稲藁、サトウキビバガス、穀物加工から得られる構成成分、樹木、枝、根、葉、木片、おがくず、灌木および低木、野菜、果物、および花卉からなる群から選択されるバイオマスから生成される、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
シロップの固形分が少なくとも約４５％である、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
シロップの固形分が少なくとも約５０％である、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、２０１０年４月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／３２８７９９号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、発酵プロセス技術分野に関する。具体的には、リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスの処理において、１００センチポアズ（ｃｅｎｔｅｒｐｏｉｓｅ）未満の粘度を有して、少なくとも約４０％の固形分を含有するシロップを製造し得ることが発見された。
【背景技術】
【０００３】
農業残渣、木材、林業廃棄物、製紙業汚泥、および都市および工業固形廃棄物などのセルロースおよびリグノセルロース系原材料および廃棄物は、燃料として使用されるアルコールおよびその他の化学薬品などの価値ある製品を製造するための、潜在的に大量の再生可能な原材料を提供する。セルロース、ヘミセルロース、およびリグニンを含んでなる炭水化物ポリマーから構成される、セルロースおよびリグノセルロース系原材料および廃棄物は、概して多様な化学的、機械的、および酵素的手段によって処理して、加水分解生成物中のヘキソースおよびペントース糖類を主として放出させ、次に生体触媒を使用してそれを発酵させて有用な製品を製造し得る。
【０００４】
加水分解生成物は、加水分解バイオマス中に存在する代謝可能な糖類に加えて、生成物単離および後処理過程まで残った未消化リグニンおよびその他のバイオマス成分を含む。主生成物の他に、生体触媒およびその他の発酵ブロス構成成分と混合されたこれらの加水分解生成物構成成分を処理しなくてはならない。特に製造量が非常に大きい燃料アルコール類の製造においては、正味水使用量が重要であり、燃料アルコールを製造するための化石エネルギーの使用量についても同様である。正味水使用量を最小化するために、生成物を取り出した発酵ブロスをプロセスの初期段階に再循環してもよく、または固形分をこのブロスから分離し液体ストリームをプロセスの初期段階に再循環してもよい（逆戻し流（ｂａｃｋ−ｓｅｔ）と称される）。また再循環に先だって、液体ストリームを様々な方法によって精製してもよい。リグニンを高比率で含有する固体ストリームは、動物飼料としては栄養価が低いが、製造工程全体で燃焼させてエネルギーを提供する、燃料として使用してもよい。
【０００５】
リグノセルロース系バイオマスでなく、穀物を発酵性糖原料として使用するエタノール製造用トウモロコシ穀粒ドライ製粉工程の全蒸留廃液中の液体および固体画分を分離するために、典型的には遠心分離が使用される。典型的に使用される高速水平デカンタ型遠心分離機は、懸濁固形分を除去するのには効率的でない。国際公開第２００８０７６７１６号パンフレットは、遠心分離機からの遠心分離液中の固形分凝集を改善して、引き続く固体／液体分離を助ける、アニオン性ポリマー凝集剤の使用を開示する。この方法を使用して、懸濁固形分が皆無かそれに近い薄い蒸留廃液を得てもよい。US20080153149は、真菌バイオリアクター内における遠心分離と、それに続く得られた液体画分（薄い蒸留廃液）の処理を開示する。この方法は、高価値真菌バイオマスを製造するための基材として薄い蒸留廃液を使用し、再利用可能なプロセス水もまた得られる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特に大量の液体を処理して、再利用可能な液体ストリームと使用可能な固体ストリームを製造しなくてはならない場合に、リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物を含む発酵ブロスからの製造副流を処理するための効率的かつ低コストの方法に対する必要性がなおもある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスからの加工シロップ副生物と、シロップを製造する方法とを提供する。
【０００８】
したがって本発明は、少なくとも約４０質量％の固形分を含んでなる約１００センチポアズ未満の粘度を有するシロップを提供し、前記シロップはリグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスの液体／固体分離からの液体画分の蒸発生成物である。
【０００９】
別の実施形態では、本発明は、
ａ）リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスを提供するステップと；
ｂ）場合により、（ａ）のリグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスから生成流を取り出して、枯渇ブロスを生成するステップと；
ｃ）（ａ）のブロスまたは（ｂ）の枯渇ブロスから液体および固体画分を分離して、約０．１質量％未満の懸濁固形分を含んでなる薄い蒸留廃液を生成するステップと；
ｄ）（ｃ）の薄い蒸留廃液を蒸発させて、少なくとも約４０質量％の固形分と約１００センチポアズ未満の粘度を有するシロップを生成するステップと
を含んでなる、シロップを製造する方法を提供する。
【００１０】
代案の実施形態では、本発明は、
ａ）エタノール生成物を含んでなるリグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスを提供するステップと；
ｂ）蒸留によって（ａ）のリグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスからエタノールを取り出して、全蒸留廃液を生成するステップと；
ｃ）（ｂ）の全蒸留廃液から液体および固体画分を分離して、約０．１質量％未満の懸濁固形分を含んでなる薄い蒸留廃液を生成するステップと；
ｄ）（ｃ）の薄い蒸留廃液を蒸発させて、少なくとも約４０質量％の固形分を含んでなる約１００センチポアズ未満の粘度を有するシロップを生成するステップと
を含んでなる、エタノールを製造する方法を提供する。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、
ａ）ブタノール生成物を含んでなるリグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスを提供するステップと；
ｂ）（ａ）のリグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスからブタノールを抽出して、枯渇ブロスを生成するステップと；
ｃ）（ｂ）の枯渇ブロスから液体および固体を分離して、懸濁固形分が約０．１質量％未満の薄い蒸留廃液を生成するステップと；
ｄ）（ｃ）の薄い蒸留廃液を蒸発させて、少なくとも約４０質量％の固形分を含んでなる約１００センチポアズ未満の粘度を有するシロップを生成するステップと
を含んでなる、ブタノールを製造する方法を提供する。
【００１２】
配列の簡単な説明
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で述べられる規則に従う。
【００１３】
表１  糖化で使用されるグリコシルヒドロラーゼのコード領域およびタンパク質の配列番号
2013524838.tif 000002
【００１４】
寄託株に関する情報
出願人らは、「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」の条項に従って、以下の生物学的寄託を行った。
【００１５】
2013524838.tif 000003
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物が発酵培地に含まれる場合、培地中の生体触媒による生成物の製造から得られる発酵ブロスは、生成物、細胞、リグニン、およびその他のバイオマス構成成分の混合物を含む複合スラリーである。副流を処理して有用な材料にすることは、ブタノールおよびエタノールなど、発酵ブロス中に比較的少量生じる生成物の製造において特に重要である。本明細書で開示されるステップを通じて、液体および固体ストリームは、固形分が少なくとも約４０％であるシロップの製造を含めて、効率的に処理される。シロップは固形分が十分高く、燃焼時にエネルギーを提供し、それは製造工程に適用し得る。シロップからのエネルギー、ならびに再循環される精製水は、製造工程全体に効率を提供し、それによって商業化を達成してもよい。
【００１７】
特許請求の範囲および明細書の説明では、以下の定義と略語を使用する。
【００１８】
本明細書の用法では、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、「ｈａｓ」、「ｈａｖｉｎｇ」、「ｃｏｎｔａｉｎｓ」または「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」またはあらゆるその他のバリエーションは、非排他的包含をカバーすることが意図される。例えば、構成要件の一覧を構成する組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、必ずしもこれらの構成要件のみに限定されず、明示的に列挙されない、またはこのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に固有でない、その他の構成要件を含んでもよい。さらに特に断りのない限り、「ｏｒ」は排他的ｏｒでなく、包括的ｏｒを指す。例えば条件ＡまたはＢは、以下のいずれかによって満たされる。Ａが真で（または存在し）Ｂが偽であり（または存在せず）、Ａが偽で（または存在せず）Ｂが真であり（または存在する）、ＡおよびＢの双方が真である（または存在する）。
【００１９】
本発明の構成要件または構成要素に先立つ不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、構成要件または構成要素の事例（すなわち発生）数に関して非制限的であることが意図される。したがって「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは少なくとも１つを含むものと解釈すべきであり、構成要件または構成要素の単数形は、数が単数であることを明らかに意味する場合を除いて、複数もまた含む。
【００２０】
「発明」または「本発明」という用語は、本明細書の用法では非限定的用語であり、特定の発明のいずれかの単一の実施形態を指すことは意図されず、本明細書および特許請求の範囲に記載される全ての可能な実施形態を網羅する。
【００２１】
本明細書の用法では、用いられる本発明の成分または反応物質の量を修飾する「約」という用語は、例えば実際に濃縮物または調製溶液を製造するために使用される典型的な測定および液体取り扱い手順を通じて；これらの手順における不注意による誤りを通じて；組成物を製造しまたは方法を実施するのに用いられる成分の、製造または原料または純度の違いを通じて、生じ得る数量の変動を指す。「約」という用語はまた、特定の初期混合物に起因する組成物の異なる平衡条件が原因で、異なっている量を網羅する。「約」という用語によって修飾されるか否かを問わず、特許請求の範囲は、量の同等物を含む。一実施形態では、「約」という用語は、報告される数値の１０％以内、好適には報告される数値の５％以内を意味する。
【００２２】
「発酵性糖」という用語は、発酵過程で微生物が炭素源として使用し得る、オリゴ糖類および単糖類を指す。
【００２３】
「リグノセルロース系」という用語は、リグニンおよびセルロースの双方を含んでなる組成物を指す。リグノセルロース系材料はまた、ヘミセルロースを含んでなってもよい。
【００２４】
「セルロース系」という用語は、セルロースと、ヘミセルロースをはじめとする追加的構成成分とを含んでなる組成物を指す。
【００２５】
「糖化」という用語は、多糖類からの発酵性糖の生成を指す。
【００２６】
「前処理バイオマス」という用語は、糖化に先だって前処理されたバイオマスを意味する。前処理は、物理的、熱的または化学的手段、およびそれらの組み合わせの形態をとってもよい。
【００２７】
「ブタノール」という用語という用語は、イソブタノール、１−ブタノール、２−ブタノール、またはそれらの組み合わせを指す。
【００２８】
「リグノセルロース系バイオマス」という用語は、あらゆるリグノセルロース系材料を指し、セルロース、ヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖類および／または単糖類を含んでなる材料を含む。バイオマスはまた、タンパク質および／または脂質などの追加的構成成分を含んでなってもよい。バイオマスは単一起源に由来してもよく、またはバイオマスは１つ以上の起源に由来する混合物を含んでなり得る。例えばバイオマスは、トウモロコシ穂軸およびトウモロコシ茎葉、または草および葉の混合物を含んでなることもあり得る。リグノセルロース系バイオマスとしては、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、工業固形廃棄物、製紙業汚泥、庭ごみ、木材および林業廃棄物が挙げられるが、これに限定されるものではない。バイオマスの例としては、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ苞葉やトウモロコシ茎葉などの農作物残渣、草、小麦藁、大麦藁、干し草、稲藁、スイッチグラス、古紙、サトウキビバガス、ソルガム植物材料、ダイズ植物材料、穀類の製粉から得られる構成成分、樹木、枝、根、葉、木片、おがくず、灌木および低木、野菜、果物、および花卉が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００２９】
「リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物」という用語はリグノセルロース系バイオマスの糖化から得られる生成物を指す。バイオマスはまた、糖化に先だって前処理または予備加工されてもよい。
【００３０】
「リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロス」という用語は、リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物を含んでなる培地中における、生体触媒の増殖と産生から得られる生成物を含有するブロスである。このブロスは生体触媒によって消費されないリグノセルロース系バイオマス加水分解生成物の構成成分、ならびに生体触媒それ自体、および生体触媒によって生じる生成物を含む。
【００３１】
「スラリー」という用語は、不溶性物質と液体の混合物を指す。スラリーはまた、高レベルの溶解固形分を含有してもよい。スラリーの例として、糖化ブロス、発酵ブロス、および蒸留廃液が挙げられる。
【００３２】
「全蒸留廃液」という用語は、蒸留缶出液を指す。全蒸留廃液は、高沸点物質および蒸留供給ストリームのあらゆる固形分を含有する。全蒸留廃液は、枯渇ブロスの一種である。
【００３３】
「薄い蒸留廃液」という用語は、全蒸留廃液、発酵ブロス、または生成物枯渇発酵ブロスの固体／液体分離から得られる液体画分を指す。
【００３４】
「生成物枯渇ブロス」または「枯渇ブロス」という用語は、本明細書では、生成流除去後のリグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスを指す。
【００３５】
「シロップ」という用語は、概して蒸発による薄い蒸留廃液からの水除去によって生成する、濃縮生成物を意味する。
【００３６】
「濾過ケーク抵抗」または「ケーク比抵抗」という用語は、スラリー濾過性を定量化する高さ特定値を指す。本値は、スラリー濃度、粘度、圧力、および濾過面積から独立している。本値はＲｕｔｈの式を使用して計算され、濾過装置の規模の変更に使用し得る。
【００３７】
Ｒｕｔｈの式：ｄｔ／ｄＶ＝（μαavＣ／Δｐ）Ｖ＋μＲm／Δｐ
式中、ｔは濾過時間（ｓ）であり、Ｖはフィルター単位面積当たり濾液量（ｍ3／ｍ2）であり、Δｐは濾過加圧力（Ｐａ）であり、μは液体粘度（ｋｇ／ｍｓ）であり、μαavはケーク平均比抵抗ｍ／ｋｇ）であり、Ｒmは濾材抵抗（ｍ-1）であり、Ｃは濾液単位容積当たりの形成されたケーク質量（ｋｇ／ｍ3）である。Ｙｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（Ｋｏｒｅａｎ  Ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．，１８（５），７４１，（２００１））を参照されたい。
【００３８】
「Ｘｙｎ３」は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）のＧＨ１０ファミリーキシラナーゼである。Ｘｙｎ３（配列番号１；コード配列番号５）は、キシロビオシダーゼの存在下で前処理バイオマスまたは単離ヘミセルロースに作用した際に、これらの酵素の組み合わせがキシロースモノマー産生を増大させるその能力によってエンドキシラナーゼ活性を有することが間接的に示された。
【００３９】
「Ｆｖ３Ａ」は、フザリウム・ベルチシリオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ）のＧＨ３ファミリー酵素である。Ｆｖ３Ａ（配列番号２；コード配列番号６）は、ｐ−ニトフェニル−β−キシロピラノシド、キシロビオース、混合直鎖キシロオリゴマー、およびヘミセルロースからの分枝アラビノキシランオリゴマーを基質としたアッセイによって、β−キシロシダーゼ活性を有することが示された。
【００４０】
「Ｆｖ４３Ｄ」は、フザリウム・ベルチシリオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ）のＧＨ４３ファミリー酵素である。Ｆｖ４３Ｄ（配列番号３；コード配列番号７）は、ｐ−ニトフェニル−β−キシロピラノシド、キシロビオース、または混合直鎖キシロオリゴマーを基質としたアッセイによって、β−キシロシダーゼ活性を有することが示された。
【００４１】
「Ｆｖ５１Ａ」は、フザリウム・ベルチシリオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ）のＧＨ５１ファミリー酵素である。Ｆｖ５１Ａ（配列番号４；コード配列番号８）は、ｐ−ニトフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシドを用いたアッセイによって、エンドキシラナーゼの作用によってヘミセルロースから放出されたオリゴマーの組からのアラビノースの放出によって、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有することが示された。
【００４２】
「標的生成物」という用語は、発酵中に微生物生成宿主細胞によって産生されるあらゆる生成物を指す。標的生成物は、宿主細胞中の遺伝子改変酵素経路の結果であってもよく、または内在経路によって生成されてもよい。典型的な標的生成物としては、酸、アルコール類、アルカン、アルケン、芳香族、アルデヒド、ケトン、バイオポリマー、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ビタミン、抗生物質、および医薬品が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００４３】
低粘度高固形分シロップ
本発明は、特に高固形分シロップを製造するための、リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスからの副流の処理に関する。副流は、典型的にはリグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスからの生成物を除去した後に処理される。生成物が除去されたブロスは枯渇ブロスである。リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスまたは枯渇ブロスは固体および液体画分に分離され、液体画分は薄い蒸留廃液である。この薄い蒸留廃液は懸濁固形分が非常に低い。薄い蒸留廃液の低い懸濁固形分濃度のために、それは引き続く蒸発中に低粘度を保つ。粘度は蒸発全体を通じて約１００センチポアズ未満を保つので、少なくとも約４０％以上の固形分のシロップに蒸発させることができる。蒸発によって、少なくとも約４０％，４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％固形分のシロップが生じる。約３５％以下の固形分のシロップが、それらを燃焼させるのに使用される以上のエネルギーを提供しないのに対し、少なくとも約４０％固形分のシロップは燃焼してエネルギーを提供し得る。
【００４４】
典型的なトウモロコシ穀粒乾燥粉砕エタノール製造工程（リグノセルロース系バイオマスでなく、穀物が発酵性糖類源として使用される工程）では、薄い蒸留廃液は懸濁固形分濃度がはるかにより高く、蒸発中に粘稠になって、固形分４０％未満のシロップにしか蒸発させることができない。乾燥粉砕工程からの薄い蒸留廃液中の総懸濁固形分は、典型的には約２％〜３％である。本方法では、リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物ブロスまたは枯渇ブロスからの薄い蒸留廃液は、１，０００ｐｐｍまたは０．１％未満の懸濁固形分を有する。
【００４５】
薄い蒸留廃液を蒸発させて固形分４０％以上のシロップにできることによって、蒸発器内でより多量の水もまた回収できるようになり、次にそれを製造工程全体に再循環できる。本方法を使用して、リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵プロセスから、少なくとも約６０％の水を再循環してもよい。再循環水は、リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵プロセス中の水の少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％であってもよい。得られる生成物容積当たりの要処理ブロス容積が比較的高く、高い製造量が貫流水の使用を許さないことから、水の再循環は、エタノールまたはブタノール製造のためのリグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵において特に重要である。シロップ中のより高い％固形分は追加的乾燥工程を排除し、より低い資本および操業コストがもたらされる。
【００４６】
リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロス
バイオマス加水分解生成物
リグノセルロース系バイオマスは、加水分解生成物中で発酵性糖類を製造するために当業者に知られているあらゆる方法によって処理してもよい。典型的には、バイオマスは物理的、熱的および／または化学的処理を使用して前処理され、酵素的に糖化される。物理的および化学的処理としては、粉砕、製粉、切断、アンモニアまたはＮａＯＨなどによる塩基処理、および酸処理が挙げられるが、これに限定されるものではない。参照によって本明細書に援用する、同一譲受人の同時係属中の米国特許出願公開第２００７００３１９１８Ａ１号明細書で開示されるように、特に有用なのは、アンモニアを含んでなる水溶液にバイオマスを接触させてバイオマス−水性アンモニア混合物を形成する低アンモニア前処理であり、アンモニア濃度は、バイオマス−水性アンモニア混合物のアルカリ性ｐＨを保つのに十分であるがバイオマス乾燥質量に対して約１２質量％未満であり、バイオマスの乾燥質量はバイオマス−水性アンモニア混合物質量に対して少なくとも約１５質量％固形分である。バイオマスはまた、典型的には前処理に先だって粒度が低減される。
【００４７】
酵素的糖化は、典型的にはセルロースおよびヘミセルロースを分解して、グルコース、キシロース、およびアラビノースをはじめとする糖類を含有する加水分解生成物生成するために酵素共同体を利用する。糖化酵素については、Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，６６：５０６−５７７，２００２）でレビュ−される。
【００４８】
少なくとも１つの酵素が使用され、典型的には１つまたは複数のグリコシダーゼを含む糖化酵素共同体が使用される。グリコシダーゼは、二糖類、オリゴ糖類、および多糖類のエーテル結合を加水分解し、一般酵素群「ヒドロラーゼ」（ＥＣ３．）の酵素分類ＥＣ３．２．１．ｘ（それぞれＥｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  １９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ  ｗｉｔｈ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １（１９９３），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２（１９９４），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３（１９９５，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ４（１９９７），およびＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ５［ｉｎ  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２３：１−５，１９９４；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３２：１−６，１９９５；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３７：１−５，１９９６；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５０：１−６，１９９７；およびＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６４：６１０−６５０  １９９９］）に含まれる。本方法で有用なグリコシダーゼは、それらが加水分解するバイオマス構成成分によって分類し得る。本方法のために有用なグリコシダーゼとしては、セルロース−加水分解グリコシダーゼ（例えばセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グリコシダーゼ）、ヘミセルロース−加水分解グリコシダーゼ（例えばキシラナーゼ、エンドキシラナーゼ、エキソキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、アラビノ−キシラナーゼ、マンナーゼ、ガラクターゼ、ペクチナーゼ、グルクロニダーゼ）、およびデンプン−加水分解グリコシダーゼ（例えば、アミラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、イソアミラーゼ）が挙げられる。これに加えて、糖化酵素共同体に、ペプチダーゼ（ＥＣ３．４．ｘ．ｙ）、リパーゼ（ＥＣ３．１．１．ｘおよび３．１．４．ｘ）、リグニナーゼ（ＥＣ１．１１．１．ｘ）、およびフェルロイルエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．７３）などのその他の活性を添加して、バイオマスのその他の構成要素からの多糖類放出を助けることが有用かもしれない。多糖類加水分解酵素を産生する微生物は、異なる基材特異性を有するいくつかの酵素または１群の酵素によって触媒されるセルロース分解などの活性を示すことが多いことが当該技術分野で良く知られている。したがって微生物からの「セルラーゼ」は１群の酵素を含んでなってもよく、それらの全てがセルロース分解活性に寄与してもよい。セルラーゼなどの商業的または非商業的酵素製剤は、酵素を得るために使用される精製スキーム次第で多数の酵素を含んでなってもよい。
【００４９】
Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰセルラーゼ、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ、Ａｃｃｅｌｅｒａｓｅ（登録商標）１５００、およびＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＤＵＥＴ（Ｄａｎｉｓｃｏ  Ｕ．Ｓ．Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）などの糖化酵素を商業的に得ることができる。これに加えて糖化酵素は未精製であってもよく、細胞抽出物またはホールセル調製品の一種として提供されてもよい。酵素は、複数の糖化酵素を発現するように遺伝子操作された組換え微生物を使用して製造することもできる。
【００５０】
本発明で特に価値があるのは、ＧＨ３、ＧＨ３９、ＧＨ４３、ＧＨ５５、ＧＨ１０、およびＧＨ１１ファミリーなどのグリコシドヒドロラーゼのクラスである。ＧＨは、２つ以上の炭水化物間の、または炭水化物と非炭水化物部分間のグリコシド結合を加水分解する１群の酵素である。ＧＨファミリーは配列類似性に基づいて分類されており、炭水化物活性酵素（ＣＡＺｙ）データベース（Ｃａｎｔａｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３７（データベース発行）：Ｄ２３３−２３８）で利用できる。これらの酵素はいくつかの基質に作用でき、糖化プロセスにおいて効果的である。グリコシドヒドロラーゼファミリー３（「ＧＨ３」）酵素は、いくつかの既知の活性を有する：β−グルコシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．２１）；β−キシロシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．３７）；Ｎ−アセチルβ−グルコサミニダーゼ（ＥＣ：３．２．１．５２）；グルカンβ−１，３−グルコシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．５８）；セロデキストリナーゼ（ＥＣ：３．２．１．７４）；エキソ−１，３−１，４−グルカナーゼ（ＥＣ：３．２．１）；およびβ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２３）。グリコシドヒドロラーゼファミリー３９（「ＧＨ３９」）酵素は、α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＥＣ：３．２．１．７６）またはβ−キシロシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．３７）活性を有する。グリコシドヒドロラーゼファミリー４３（「ＧＨ４３」）酵素は以下の活性を有する：Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５５）；β−キシロシダーゼ（ＥＣ３．２．１．３７）；エンドアラビナナーゼ（ＥＣ３．２．１．９９）；およびガラクタン１，３−β−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．１４５）。グリコシドヒドロラーゼファミリー５１（「ＧＨ５１」）酵素は、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５５）またはエンドグルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）活性を有する。グリコシドヒドロラーゼファミリー１０（「ＧＨ１０」）については、Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８：２４０３−２４１２およびＬｏ  Ｌｅｇｇｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５０９：３０３−３０８）でより詳しく述べられ、グリコシドヒドロラーゼファミリー１１（「ＧＨ１１」）についてはＨａｋｏｕｖａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：９６１７−２４でより詳しく述べられる。
【００５１】
酵素共同体中で特に有用なのは、グリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）Ｘｙｎ３、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ５１Ａ、およびＦｖ４３Ｄである。Ｘｙｎ３（配列番号：１）はトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）のＧＨ１０ファミリーキシラナーゼであり、Ｆｖ３Ａ（配列番号：２）はフザリウム・ベルチシリオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ）のＧＨ３ファミリー酵素であり、Ｆｖ４３Ｄ（配列番号：３）はフザリウム・ベルチシリオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ）からのＧＨ４３ファミリー酵素であり、Ｆｖ５１Ａ（配列番号：４）はフザリウム・ベルチシリオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ）のＧＨ５１ファミリー酵素である。
【００５２】
これらの酵素は、それらの天然の宿主生物から単離することも、または産生のために遺伝子操作された宿主生物中で発現させることもできる。例えば当業者に知られている標準法を使用して、標的発現宿主細胞中で活性なプロモーター、上述のＧＨをコードする配列、および終結シグナルを含有するキメラ遺伝子がプラスミドベクターから発現され、または標的発現宿主細胞のゲノムに組み込まれる。使用されるコード配列は発現のために使用される特定宿主についてコドン最適化されてもよい。典型的に使用される発現宿主細胞としては、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、およびストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）などの細菌；サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、クリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、およびファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）などの酵母；およびアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ブジェルカンデラ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、カワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、コリナスカス（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）、ケトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）（Ｃｈａｅｒｔｏｍｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィロバシジウム（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ジベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）、ネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロミセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロカエテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、シワタケ（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、ヒラタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）、スエヒロタケ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、スポロトリカム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスクス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、ホウロクタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）などの糸状菌が挙げられる。
【００５３】
どのようにして共同体中で使用される酵素の有効量を判定し、最適酵素活性のために条件を調節するかは当業者なら認識するであろう。当業者はまた、共同体中で必要とされる酵素活性クラスをどのように最適化して選択条件下で所定の前処理生成物の最適糖化を得るかを認識するであろう。糖化の一例はUS20070031918に記載される。
【００５４】
発酵に先だって、糖化混合物を例えば蒸発により濃縮して発酵性糖の濃度を増大させてもよい。
【００５５】
糖化に続いて、糖化生成物中の液体が、例えばバッチ法または連続法でリグニンなどの固形物から分離されていてもよい。発酵に先だって、液体または全糖化生成物が滅菌されていてもよい。発酵中に使用される生体触媒と、糖化中に使用されるｐＨ次第で、ｐＨを発酵に適したものに調節してもよい。
【００５６】
発酵性糖類を含有するリグノセルロース系バイオマス加水分解生成物は、典型的には培地の部分として発酵培地に含まれ、生体触媒増殖と生成物産生のための炭素源の全部または一部を提供する。リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵培地中の加水分解生成物は、少なくとも全容積の約２５％であり、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上であってもよい。発酵培地の４０％または８０％として使用される加水分解生成物の例は、参照によって本明細書に援用するUS20070031918の実施例９に提供される。加水分解生成物中の発酵性糖類濃度に応じて、培地に追加的糖類を添加してもよい。例えば約８０ｇ／Ｌのグルコースと約５０ｇ／Ｌのキシロースを含有する加水分解生成物が発酵培地に４０％含まれる場合、追加的なグルコースとキシロースを添加して、所望の最終糖類濃度にしてもよい。当業者には良く知られているように、加水分解生成物に加えて、発酵培地は、生成物産生のために使用される特定生体触媒による増殖および産生に必要とされる、その他の栄養素、塩、および要素を含有してもよい。補足物質としては、例えば酵母抽出物、特定のアミノ酸、リン酸、窒素源、塩、および微量元素が挙げられる。酵素触媒反応に必要なプラスミドまたは補助因子を維持するための抗生物質など、特定生体触媒によって作られる特定生成物産生に必要とされる構成要素もまた含まれてもよい。本明細書で使用される発酵培地中において、加水分解生成物は全容積の９０％である。
【００５７】
加水分解生成物を調製し、それを発酵培地に添加して、次に発酵を実施する代わりに、同時糖化発酵（ＳＳＦ）工程を使用して、リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスを生成してもよい。この工程では、バイオマスが産生生体触媒によって代謝されるにつれて糖類がそれから生成する。
【００５８】
生体触媒発酵および標的生成物
リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵培地中の発酵性糖類は適切な生体触媒によって代謝されて、標的生成物が生じる。発酵工程中に糖類を生体触媒に接触させて、生体触媒によって作られる標的生成物が生じる条件下で、生体触媒を増殖させる。使用される特定の生体触媒に有用な条件次第で、温度および／またはヘッドスペースガスを発酵のために調節してもよい。発酵は好気性であっても嫌気性であってもよい。これらの条件、および温度とｐＨをはじめとするその他の条件が、使用される特定の生体触媒について調節される。
【００５９】
典型的には、生体触媒は標的生成物を生成するように改変されるが、生体触媒は天然で標的生成物を産生してもよい。生体触媒を使用して発酵により製造してもよい標的生成物としては、例えば酸、アルコール類、アルカン、アルケン、芳香族、アルデヒド、ケトン、バイオポリマー、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ビタミン、抗生物質、および医薬品が挙げられる。アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、エチレングリコール、プロパンジオール、ブタンジオール、グリセロール、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、および１，３−プロパンジオールが挙げられるが、これに限定されるものではない。酸としては、酢酸、乳酸、プロピオン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、酪酸、グルコン酸、イタコン酸、クエン酸、コハク酸、およびレブリン酸が挙げられるが、これに限定されるものではない。アミノ酸としては、グルタミン酸、アスパラギン酸、メチオニン、リジン、グリシン、アルギニン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンが挙げられる。追加的標的生成物としては、メタン、エチレン、アセトン、および工業酵素が挙げられる。特に適切な生成物は、エタノールと、イソブタノール、２−ブタノール、および１−ブタノールをはじめとするブタノールである。
【００６０】
糖類の標的生成物への発酵は、一段階または多段階発酵中で、１つまたは複数の適切な生体触媒によって実施されてもよい。生体触媒は、細菌、糸状菌、および酵母から選択される微生物であってもよい。生体触媒は野性型微生物または組換え微生物であってよく、例えば、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）が挙げられる。別の実施形態では、生体触媒は、組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、およびピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）からなる群から選択されてもよい。
【００６１】
標的生成物を製造するために、発酵で使用される多数の生体触媒については記載されており、その他のものが、発見され、突然変異を通じて生成され、または組換え手段を通じて遺伝子改変されてもよい。リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物培地中の発酵性糖類を使用するあらゆる生体触媒を使用して、それが生成することが知られている標的生成物を作成してもよく、それによって本方法を使用した処理のためのリグノセルロース系バイオマス加水分解生成物ブロスが生成される。リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵培地中の製造で特に有用なのは、ブタノールおよびエタノールなど、燃料として使用してもよいアルコール生成物である。
【００６２】
溶剤産生クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）による炭水化物のアセトン、ブタノール、エタノールへの発酵（ＡＢＥ発酵）は、良く知られている（Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ（１９８６）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５０：４８４−５２４）。クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）変異株を使用して、高レベルのブタノールを製造し、アセトンおよびエタノールもまた製造する発酵工程が、米国特許第５１９２６７３号明細書に記載される。高レベルのブタノールを製造し、アセトンおよびエタノールもまた製造するためのクロストリジウム・ベイジェリンキイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）変異株の使用が、米国特許第６３５８７１７号明細書に記載される。遺伝子改変酵母によるブタノールの製造は、例えばUS20070092957 A1で開示される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の遺伝子改変株はまた、エタノール製造のための生体触媒としても使用されている（Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：６２６３−６２７２）。エタノールは、リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵培地中で、遺伝子改変ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）によって製造されている（US20070031918 A1）。エタノール産生が改善されたザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）遺伝子改変株が、US2003/0162271 A1号明細書および米US2009/0246846 A1号明細書に記載される。
【００６３】
米国特許第７５０４２５０号明細書では、１，３−プロパンジオールを産生する組換え微生物が開示される。
【００６４】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）組換え株（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９：３９９−４０７）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）天然株（US20050250192）、およびリゾプス・オリゼー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）（Ｔａｙ  ａｎｄ  Ｙａｎｇ（２００２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８０：１−１２）によって、発酵中に乳酸が製造されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）組換え株が、１，３プロパンジオール（米国特許第６０１３４９４号明細書、米国特許第６５１４７３３号明細書）、およびアジピン酸（Ｎｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１８：２０１−２１１）を製造する発酵中の生体触媒として使用されている。組換えクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）（Ｃｈｅｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：１−３３）、および新たに同定された酵母株（Ｆｒｅｅｒ（２００２）Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：２７１−２７５）を使用して、発酵によって酢酸が作られている。組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）とその他の細菌によるコハク酸製造が米国特許第６１５９７３８号明細書で、変異組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）によるコハク酸製造がＬｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．７：１１６−１２７）で開示されている。変異トルロプシス・グラブラタ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｇｌａｂｒａｔａ）酵母（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．５５：６８０−６８５）、および突然変異大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｙｏｋｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：２１６４−２１６７）によって、ピルビン酸が製造されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）組換え株が、パラ−ヒドロキシケイ皮酸（US20030170834）およびキナ酸（US20060003429）を製造するための生体触媒として使用されている。
【００６５】
プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニッチ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ）の突然変異体がプロピオン酸を生成する発酵で使用されており（Ｓｕｗａｎｎａｋｈａｍ  ａｎｄ  Ｙａｎｇ（２００５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９１：３２５−３３７）、クロストリジウム・チロブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）によって酪酸が作られている（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｙａｎｇ（２００３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８２：９３−１０２）。クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種１７ｃｒ１株により、発酵によってスレオニンからプロピオネートおよびプロパノールが作られている（Ｊａｎｓｓｅｎ（２００４）Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８２：４８２−４８６）。酵母様アウレオバシジウム・プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）を使用して（Ａｎａｎｔａｓｓｉａｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９１：４９４−５０１）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｓ  ｎｉｇｅｒ）変異体によって（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．３９：１１３６−４３）、グルコン酸が作られている。５−ケト−Ｄ−グルコン酸がグルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）の突然変異体によって作られ（Ｅｌｆａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．６６：６６８−６７４）、イタコン酸がアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）突然変異体によって産生され（Ｒｅｄｄｙ  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｈ（２００２）Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．８５：６９−７１）、クエン酸がアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）変異株によって産生され（Ｉｋｒａｍ−Ｕｌ−Ｈａｑ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．９６：６４５−６４８）、キシリトールがカンジダ・ギリエルモンジィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）ＦＴＩ２００３７によって産生された（Ｍｕｓｓａｔｔｏ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｏ（２００３）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９５：３３１−３３７）。大量の３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸もまた含有する、４−ヒドロキシ吉草酸含有バイオポリエステルが、組換えシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）およびラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）によって産生される（Ｇｏｒｅｎｆｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２：４５−５７）。Ｌ−２，３−ブタンジオールが、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）によって作られた（Ｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｌｅｔｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：５３３−５３７）。
【００６６】
コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、およびセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）の栄養要求性株およびアミノ酸アナログ耐性株を使用して、発酵によるアミノ酸製造が達成された。例えば、ヒスチジンアナログ耐性株を使用したヒスチジンの製造が、日本特許出願公開第５６００８５９６号公報報に記載され、組換え株の使用が欧州特許第１３６３５９号明細書に記載される。トリプトファンアナログ耐性株を使用したトリプトファンの製造が、日本特許出願公開第４７００４５０５号公報および日本特許出願公開第５１０１９０３７号公報に記載される。イソロイシンアナログ耐性株を使用したイソロイシンの製造が、日本特許出願公開第４７０３８９９５号公報、日本特許出願公開第５１００６２３７号公報、および日本特許出願公開第５４０３２０７０号公報に記載される。フェニルアラニンアナログ耐性株を使用したフェニルアラニンの製造が、日本特許出願公開第５６０１００３５号公報に記載される。成長のためにフェニルアラニンを必要とするチロシン耐性株（Ａｇｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ  ５０（１）Ｒ７９−Ｒ８７（１９７６）、または組換え株（欧州特許第２６３５１５号明細書、欧州特許第３３２２３４号明細書）を使用したチロシンの製造、およびＬ−アルギニンアナログ耐性株を使用したアルギニンの製造（Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７２）３６：１６７５−１６８４、日本特許出願公開第５４０３７２３５号公報および日本特許出願公開第５７１５０３８１号公報）について記述されている。フェニルアラニンはまた、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ３１８８２、３１８８３、および３１８８４株中における発酵によっても製造された。組換えコリネ型細菌中におけるグルタミン酸の生成が、米国特許第６９６２８０５号明細書に記載される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異株によるスレオニンの製造が、Ｏｋａｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｉｋｅｄａ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｅｎｇ．８９：８７−７９に記載される。メチオニンがコリネバクテリウム・リリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｌｉｕｍ）変異株によって産生された（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ，（２００５）Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．９６：２８７−２９４）。
【００６７】
有用なペプチド、酵素、およびその他のタンパク質も生体触媒によって作られている（例えば米国特許第６８６１２３７号明細書、米国特許第６７７７２０７号明細書、米国特許第６２２８６３０号明細書）。
【００６８】
リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロス中で良好に増殖して、高い産生量を有するためには、生体触媒は、バイオマス加水分解生成物中に存在する酢酸などの阻害物質に対して、より高い耐性を有するように選択され、または遺伝子改変されてもよい。例えば、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）がリグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロス中で遭遇するようなストレス条件下における、キシロース利用およびエタノール産生の改善が、参照によって本明細書に援用する、同一譲受人の同時係属中の米国特許出願公開第２０１１００１４６７０号明細書で開示される。同明細書では、キシロース、酢酸、酢酸アンモニウム、およびエタノールを含有する培地中における、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の継続的成長と、ＺＷ７０５などのザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株の改善された単離が開示される。
【００６９】
リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスからの高固形分シロップの調製
生体触媒によって産生される生成物を含有する生成流を除去した後に、リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスから副流が処理される。例えばブタノールが生成物である場合、ガスストリッピングなどによって発酵ブロスを抽出することで、または参照によって本明細書に援用する同一譲受人の同時係属中の国際公開第２００９／１４９２７０号パンフレットで開示されるように、水非混和性有機抽出剤を使用して水相からブタノール含有有機相を分離することで、ブタノールを発酵ブロスから除去してもよい。生成物を除去して得られたブロスが枯渇ブロスである。エタノールが生成物である場合、ブロスは典型的にはビールカラムを使用して蒸留され、エタノール生成流と枯渇ブロスである全蒸留廃液とが生じる。蒸留は、大気圧または減圧をはじめとする、当業者に知られているあらゆる条件を使用してもよい。代案としては、生成物は分離後に固体または液体画分から除去されてもよい。
【００７０】
ブロスまたは全蒸留廃液などの枯渇ブロスは、固体および液体ストリームに分離され、液体ストリームは薄い蒸留廃液と称されて、約０．１％未満の懸濁固形分を有する。約０．１％未満の懸濁固形分を有する薄い蒸留廃液を生じる、あらゆる分離工程を使用してもよい。ベルトフィルター、ベルトプレス、スクリュープレス、ドラムフィルター、ディスクフィルター、ヌッチェフィルター、フィルタープレスまたは濾過遠心分離機などの様々な濾過装置を使用してもよい。真空、圧力、または遠心力の適用などによって、濾過を助けてもよい。これに加えて、遠心分離と、遠心分離後に残る懸濁固形分を除去する続く小型フィルタープレスなどの分離工程の組み合わせを使用して、低い懸濁固形分濃度を得てもよい。
【００７１】
最初に分離された液体の一部を再分離してもよい。例えば濾過する場合、濾過の始めに、最初の濾液の一部をフィルター供給タンクに再循環させて戻し、薄い蒸留廃液の質を改善してもよい。濾液の最初の５％〜１０％は、約０．１％の懸濁固形分を有してもよい。しかし残る９０％〜９５％の濾液は、典型的には懸濁固形分がはるかにより低く、したがって薄い蒸留廃液の平均は、最初の濾液の再循環なしでさえ、実質的に懸濁固形分が０．１％未満である。
【００７２】
濾過効率を改善するために、参照によって本明細書に援用する、同一譲受人の同時係属中の米国仮特許出願第６１／３２８８０４号明細書で開示されるような加熱処理を使用してもよい。リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロス、または全蒸留廃液などの枯渇ブロスは、ブロスまたは全蒸留廃液などの枯渇ブロスの濾過ケーク抵抗が少なくとも約２０％低下する条件下で加熱処理してもよい。ブロスまたは全蒸留廃液などの枯渇ブロスは、約７０℃〜約１５０℃の温度で、約３０秒間〜２１０分間処理される。範囲内のより低い温度でより長時間が使用され、範囲内のより高い温度でより短時間が使用される。例えば、米国仮特許出願第６１／３２８８０４号明細書の実施例２および４において、７０℃で６０分間の加熱は、濾過ケーク抵抗を２４％低下させるのに十分であり；１１０℃で３０秒間の加熱は、濾過ケーク抵抗を２１％低下させるのに十分であり；１４５℃で３０秒間の処理は、濾過ケーク抵抗を４５％低下させた。特に有用なのは、約３０秒間〜３０分間などのより短時間で効果がある、約９５℃〜約１５０℃の温度である。典型的には９５℃〜１００℃で実施される常圧蒸留からの全蒸留廃液を、その温度に約１５〜３０分間保ってもよい。この場合、先の工程段階が原因で、全蒸留廃液またはその他の枯渇ブロスまたはブロスの温度が所望の温度以上であれば、さらなる加熱は必要ないかもしれず；全蒸留廃液またはその他の枯渇ブロス、またはブロスを断熱容器内に必要な時間入れておくことで、温度が所望時間にわたり維持される。短時間の処理では、約３０秒間〜２分間にわたる約１１０℃〜約１５０℃の温度が特に有用である。加熱処理は、所望の時間にわたり温度を維持できる、あらゆるシステム内で実施してもよい。例えば、加熱は保温ジャケット付き容器内または熱交換器内にあってもよく、引き続いて容器内またはパイプループ内で保持される。
【００７３】
米国仮特許出願第６１／３２８８０４号明細書で開示されるように、所定温度で濾過ケーク抵抗を少なくとも約２０％低下させる所要時間はまた、処理されるブロス、枯渇ブロス、または全蒸留廃液のｐＨに応じて変動し得る。濾過ケーク抵抗のより大きな低下はより低いｐＨで得られ、ｐＨ６以下が特に有用である。発酵で使用される生体触媒次第で、リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスのｐＨは、既にｐＨ６以下である場合もある。代案としては、加熱処理に先だってまたはその最中に、ブロス、枯渇ブロス、または全蒸留廃液のｐＨを約６、５、４、または３に調節してもよい。ｐＨ調節用酸の均一な分散のために、枯渇ブロスまたは全蒸留廃液のｐＨ調節中に混合または撹拌することが、有用かもしれない。これに加えて、均一な温度制御のために加熱処理中に混合を使用してもよい。連続的または非連続的であってもよい混合は、典型的にはインペラを使用するものなどの撹拌器システムによって実施される。
【００７４】
加熱処理リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスまたは枯渇ブロスの液体／固体分離に続いて固形分画分またはウェットケークを燃焼させて、製造工程にエネルギーを供給してもよい。ウェットケークは、燃焼に先だって風乾などにより乾燥させて水分を低下させてもよい。
【００７５】
生成流は、加熱処理リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスの液体／固体濾過に続いて去してもよい。例えば、エタノール生成流を生じる蒸留など、液体ストリームを抽出または蒸留して、生成流と残留液体を生成してもよい。
【００７６】
液体／固体分離に続いて、液体画分の一部を逆戻し流として直接再循環させてもよい。前処理、糖化、または生体触媒種培養生成など、淡水が必要とされる工程のあらゆる時点で、逆戻し流として液体を添加することもあり得る。液体画分の残りまたは全部を蒸発によってさらに精製し、再循環し得る水と、シロップとを生成する。液体画分、または薄い蒸留廃液の低い懸濁固形分濃度のために、それは引き続く蒸発工程中に低粘度を保つ。蒸発全体を通じて粘度は約１００センチポアズ未満のままであり、蒸発させて、懸濁および溶解固形分の組み合わせである全固形分が少なくとも約４０％のシロップが生成できる。本明細書の実施例３で実証されるように、粘度は、％全固形分、ｐＨ、および温度に関連する。例えば、ｐＨ５．７および６０℃では約６７％固形分への蒸発によって１００センチポアズ未満の粘度が保たれるのに対し；ｐＨ４．７では６９．５％固形分のシロップは４０℃で粘度１００センチポアズ未満を保つ。蒸発は、加圧、大気圧、または減圧下であってもよい。
【００７７】
得られた少なくとも約４０％固形分のシロップを燃焼させてエネルギーを提供することができ、追加的乾燥工程は必要ない。典型的にはトウモロコシ穀粒乾燥粉砕エタノールプロセス中で生成されるシロップは約３５％以下の固形分を有し、乾燥、次に燃焼で使用されるのよりも大きなエネルギーを提供しない。
【００７８】
蒸発は、流下薄膜、上昇薄膜、強制循環、プレートまたは機械的および熱蒸気再加圧システムなどのあらゆる蒸発システム内であってもよい。蒸発は、連続的またはバッチ式であってもよく、多重効用蒸発器を使用してもよい。蒸発水は、リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵工程全体で再循環させてもよい。
【実施例】
【００７９】
本発明を以下の実施例でさらに定義する。これらの実施例は本発明の好ましい実施態様を示しながら、例証としてのみ提供されるものと理解すべきである。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特徴を見極め得て、その範囲と精神を逸脱することなく本発明に様々な変更と修正を加えて、それを様々な用途と条件に適応させ得る。
【００８０】
使用される略語の意味は、次のとおりである。「ｓ」は秒であり、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」または「ｈｒ」は時間を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍ」はメートルであり、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「ｃｍ」はセンチメートルを意味し、「μｍ」はマイクロメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｋｇ」はキログラムであり、「ｒｐｍ」は毎分回転数を意味し、「Ｃ」は摂氏であり、「ｐｐｍ」は百万分の一を意味し、「ｃＰ」はセンチポアズである。
【００８１】
一般方法：
糖化酵素
Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）１５００（Ａ１５００）およびＭｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼは、Ｄａｎｉｓｃｏ  Ｕ．Ｓ．Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）から得た。
【００８２】
セルラーゼおよびヘミセルラーゼ産生株
２２９株：変異誘発と高セルラーゼ産生についての選択とを通じて、ＲＬ−Ｐ３７から誘導されたトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）株（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ  ａｎｄ  Ｍｏｎｔｅｎｅｃｏｕｒｔ，１９８４，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４６−５３）をＰＥＧ媒介形質転換（Ｐｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅ  ６１（２）：１５５−６４）を使用して、β−グルコシダーゼ発現カセット（ｃｂｈ１プロモーター、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）β−グルコシダーゼ遺伝子、ｃｂｈ１ターミネーター、およびａｍｄＳマーカー）β−グルコシダーゼ遺伝子、ｃｂｈ１ターミネーター、およびａｍｄＳマーカー）、エンドキシラナーゼ発現カセット（ｃｂｈ１プロモーター、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｘｙｎ３、およびｃｂｈ１ターミネーター）を用いて同時形質転換した。多数の形質転換体を単離して、β−グルコシダーゼおよびエンドキシラナーゼ産生について調べた。Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）＃２２９株と称される１形質転換体を本明細書に記載される特定の研究で使用した。
【００８３】
Ｈ３Ａ株：エレクトロポレーションを使用して、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）２２９株をβ−キシロシダーゼＦｖ３Ａ発現カセット（ｃｂｈ１プロモーター、Ｆｖ３Ａ遺伝子、ｃｂｈ１ターミネーター、およびａｌｓＲマーカー）、β−キシロシダーゼＦｖ４３Ｄ発現カセット（ｅｇｌ１プロモーター、Ｆｖ４３Ｄ遺伝子、天然Ｆｖ４３Ｄターミネーター）、およびＦｖ５１Ａα−アラビノフラノシダーゼ発現カセット（ｅｇｌ１プロモーター、Ｆｖ５１Ａ遺伝子、Ｆｖ５１Ａ天然ターミネーター）を用いて同時形質転換した。クロリムロンエチルを含有するフォーゲル寒天プレート上で、形質転換体を選択した。多数の形質転換体を単離して、β−キシロシダーゼ、およびＬ−α−アラビノフラノシダーゼ産生について調べた。Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）β−グルコシダーゼ１、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｘｙｎ３、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ５１Ａ、およびＦｖ４３Ｄを組換え的に発現するＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）統合発現Ｈ３Ａ株を単離した。
【００８４】
Ｈ３Ａ株の発酵中に生成する細胞外タンパク質を遠心分離によって細胞集団から分離し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  １０ｋＤ分子カットオフ質量膜を通過させる膜限外濾過により濃縮して、ｐＨ４．８に調節した。ＷｅｉｃｈｓｅｌｂａｕｍおよびＧｏｒｎａｌｌによって修正された修正ビウレット法を使用して、ウシ血清アルブミンを較正物質として使用して総タンパク質量を測定した（Ｗｅｉｃｈｓｅｌｂａｕｍ，１９６０，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ．１６：４０；Ｇｏｒｎａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９４９  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  １７７：７５２）。このＨ３Ａ細胞外タンパク質調製品は、本明細書でＨ３Ａタンパク質と称され、セルラーゼおよびヘミセルラーゼの組み合わせ調製品として使用されて、ＳＳＦ中に複合糖質の加水分解をもたらした。
【００８５】
生体触媒および種菌の調製
発酵で使用されるザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）株の起源
これらの実施例のようにして処理されるリグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスは、代案の生体触媒を使用して作成されてもよい。これらの実施例では例示的な株が使用され、下で説明される。代案として、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−７８５８として寄託されたＺＷ６５８株を使用して、処理するリグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスを生成してもよい。
【００８６】
ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ７０５株は、本明細書に簡潔に述べるように、参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１１−００１４６７０号明細書で詳述される方法によってＺＷ８０１−４株から作り出された。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ８０１−４株の培養は、次のようにしてストレス条件下で成長させた。ＺＷ８０１−４は、参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，７４１，１１９号明細書に記載される、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の組換えキシロース利用株である。全て米国特許第７，７４１，１１９号明細書に記載されるように、ＺＷ８０１−４株はＺＷ８００株に由来し、それはＺＷ６５８株に由来する。ＺＷ６５８は、逐次遺伝子転位事象と、それに続くキシロース含有選択培地上での適応によって、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼ、およびトランスケトラーゼをコードする４つのキシロース利用遺伝子を含有する２つのオペロンＰｇａｐｘｙｌＡＢおよびＰｇａｐｔａｌｔｋｔを、ＺＷ１（ＡＴＣＣ＃３１８２１）のゲノムに組み込むことにより構築される。ＺＷ６５８は、ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−７８５８として寄託された。ＺＷ６５８中では、宿主媒介二重交叉相同的組換えと、選択可能なマーカーとしてスペクチノマイシン耐性とを使用して、グルコース−果糖酸化還元酵素をコードする遺伝子を挿入的に不活性化して、ＺＷ８００を作り出した。Ｃｒｅリコンビナーゼを使用した部位特異的組換えによって、ｌｏｘＰ部位によって境界が規定されるスペクチノマイシン耐性マーカーを除去し、ＺＷ８０１−４を作り出した。
【００８７】
撹拌し、ｐＨおよび温度制御した２５０ｍｌ発酵槽（Ｓｉｘｆｏｒｓ；Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）内でＺＷ８０１−４の連続培養を実施した。発酵のための基礎培地は、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、１５ｍＭリン酸アンモニウム、１ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム、１０ｍＭソルビトール、５０ｇ／Ｌキシロース、および５０ｇ／Ｌグルコースであった。高濃度の酢酸およびアンモニアの存在下における成長への適応は、９７日間にわたり、比希釈率によって測定される確立された増殖率を保ちながら、上記連続培養培地に添加する酢酸アンモニウム濃度を徐々に増大させることで達成された。酢酸アンモニウムは、１６０ｍＭの濃度に増大された。アンモニウムイオン濃度のさらなる増大は、１３９日間の連続培養の終わりまでにリン酸アンモニウムを最終総アンモニウムイオン濃度２１０ｍＭに添加することで達成された。ＺＷ７０５株は平板培養して単一コロニーにし、１つの選択されたコロニーを増幅させることで適応集団から単離した。
【００８８】
参照によって本明細書に援用する、同一譲受人の同時係属中の米国仮特許出願第６１／４２４０７７号明細書で開示されるように、トウモロコシ穂軸加水分解生成物培地中での成長へのさらなる適応によって、ＺＷ７０５株からＡＲ３  ７−３１株が作られた。培養濁度が規定の狭い範囲内に保たれるように、培養中への培地の流入量を制御することで培養中の細胞濃度が一定に保たれる、連続流動培養装置である、タービドスタット（米国特許第６，６８６，１９４号明細書；Ｈｅｕｒｉｓｋｏ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）内で、ＺＷ７０５を培養した。連続培養装置内の増殖培養には、休止培地（培地Ａ）およびチャレンジ培地（培地Ｂ）の２種の培地が利用できた。培養をグロースチャンバー内の休止培地上で濁度設定点に成長させ、次にその細胞密度を保つように設定された希釈率で希釈した。１０分毎に１回、規定の容積で培地を添加することによって希釈を実施した。タービドスタットが培地チャレンジモードに入ると、先の培地添加後に設定点に復元する速度に基づいて、チャレンジ培地または休止培地の添加を選択した。グロースチャンバー内の培地の定常状態濃度は、培地Ａと培地Ｂの混合であり、２つの培地の比率は、設定希釈率で設定細胞密度が維持できる、各培地からの抜き取り速度に依存する。グロースチャンバー内の集団を代表する細胞サンプルをタービドスタットの流出物から１週間間隔で（トラップチャンバー内に）回収した。細胞サンプルをＭＲＭ３Ｇ６培地内で一度培養し、グリセロール貯蔵液として−８０℃で保存する。
【００８９】
培養が、流入培地中に存在するグルコースの全部とキシロースのおよそ半分を使用して、設定希釈率における設定点細胞密度を満たすことを要する、任意の濁度設定点まで、ＺＷ７０５を培養した。５０％ＨＹＡｃ／ＹＥおよび５０％ＭＲＭ３Ｇ６．５Ｘ４．５ＮＨ4Ａｃ１２．３である休止培地、およびＨＹＡｃ／ＹＥであるチャレンジ培地を使用して。３週間後に単離された株を、休止培地としてＨＹＡｃ／ＹＥおよびチャレンジ培地としてＨＹＡｃ／ＹＥ＋９質量％エタノールを使用した、別の一連のタービドスタット適応で使用した。ＡＲ３  ７−３１株が２週間後に単離され、加水分解生成物培地中におけるキシロースおよびグルコース利用が改善され、ならびにエタノール産生も改善された株として特徴付けられた。配列分析により、ＡＲ３７−３１は、膜輸送タンパク質の特徴を有する、フザリン酸耐性タンパク質をコードするとアノテートされるタンパク質をコードする、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムＯＲＦ中に突然変異を有することが分かった。
【００９０】
培地
ＭＲＭ３は、１リットル当たり以下を含有する：酵母抽出物（１０ｇ）、ＫＨ2ＰＯ4（２ｇ）、およびＭｇＳＯ4０．７Ｈ2Ｏ（１ｇ）
ＭＲＭ３Ｇ６は、６０ｇ／Ｌグルコースを含有するＭＲＭ３である。
ＭＲＭ３Ｇ６．５Ｘ４．５ＮＨ4Ａｃ１２．３は、６５ｇ／Ｌグルコース、４５ｇ／Ｌキシロース、１２．３ｇ／Ｌ酢酸アンモニウムを含有するＭＲＭ３である。
ＨＹＡｃ／ＹＥは、遠心分離によってそれから固形分が除去された穂軸加水分解生成物を含有し、濾過滅菌されて、６８ｇ／Ｌグルコース、４６ｇ／Ｌキシロース、および５ｇ／Ｌ酢酸を含有し、６．２ｇ／Ｌ酢酸アンモニウム、および０．５％酵母抽出物が添加されて、ｐＨ５．８に調節された。
【００９１】
ケーク比抵抗
ケーク比抵抗は、ケーク高さ単位当たりの濾過ケークの抵抗性変化を定量化する。それはスラリー濃度、粘度、圧力、および濾過面積から独立している。値は、上述のようにＲｕｔｈの式から得られる［Ｙｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｏｒｅａｎ  Ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．、１８（５），７４１，（２００１）を参照されたい］。
【００９２】
粘度測定の詳細
完全な温度制御ができるＰａａｒＰｈｙｓｉｃａＭＣＲ３００レオメータによって、粘度を測定した。トウモロコシバイオマスサンプルに適用された測定原理は、円錐−円錐または二重ギャップタイプの測定ヘッドを使用した回転原理である。測定は、異なる温度（２０℃、４０℃、６０℃）において、１〜３００  １／ｓの勾配の剪断速度で実施した。報告された粘度は、無限剪断粘度である。
【００９３】
蒸発
５Ｌジャケット付き丸底フラスコと連絡した、Ｓｙｌｔｈｅｒｍ熱伝導流体で充填された再循環加熱槽を含んでなる、実験室規模の蒸発機構を使用した。塔頂留出物冷却のために、二重凝縮器付き短経路蒸留ヘッドを使用した。蒸発では、約１〜２ｋｇの薄い蒸留廃液を使用した。塔頂水および残留シロップ（ｂｏｔｔｏｍｓ  ｓｙｒｕｐ）サンプルを一定時間毎に収集した。
【００９４】
濾過−４６０ｍｍ  Ｎｅｔｚｓｃｈ  ＦｉｌｔｅｒＰｒｅｓｓ
以下の市販されるプレパイロット規模のプレスを使用した：
Ｎｅｔｚｓｃｈ  ４７０／ＳＰメンブランフィルタープレスMix Pack Membrane、1.0 Pre Squeeze容量(ANDRITZ AG,Stattegger Strasse18,A-8045 Graz,Austria)。適切な数の供給用バルブ付きＭａｎｕａｌＰｉｐｉｎｇ、コアブロー、ケークブロー、メンブランブローバック、および濾液ブロックが含まれている。
【００９５】
液体／固形分の分離には、４７０ｍｍプレスを使用する。この装置は、２つの操作スキッドからなる；１つ目は２つの撹拌供給タンクとプレスに供給するための空気ポンプを有し、２つ目のカートはプレスそれ自体である。
・  フィルター面積：６８００ｃｍ２
・  チャンバー数：２
・  最大濾過圧力＝７バール（７００キロパスカル）
・  最大操作温度８５℃
・  開閉装置：水圧ラム
・  材料供給：圧縮空気駆動式ダイヤフラムポンプ
・  寸法：１３００×１５００×６００ｍｍ
・  質量：およそ２５０ｋｇ
【００９６】
プレスは加圧下で流体を処理する。スラリーを最大で１００ｐｓｉ（６８９．５キロパスカル）でプレスに供給する。フィルタープレートスタックを６，０００ｐｓｉ（４１．４メガパスカル）で圧搾する水圧ラムがある。また機械的圧搾のために、最高で２２５ｐｓｉ（１５５１．３キロパスカル）の絞り圧力をプレスに提供する、別個の空気シリンダーもある。
【００９７】
実施例１
リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスの製造
トウモロコシ穂軸の前処理
発酵バッチＦＲＦ６
Ｊａｙｇｏ水平パドル反応装置（およそ１７０Ｌ）を使用して、サイズが全て＜１／２インチ（１．２７ｃｍ）である、４バッチの穂軸片を前処理した。穂軸を反応装置に装填し、容器を真空にして０．１バール（１０キロパスカル）絶対圧にして、次に水酸化アンモニウム溶液を導入してバイオマス乾燥質量に対して、約４（２バッチ）、６（１バッチ）または８（１バッチ）質量％のＮＨ3とした。蒸気を添加して、温度を約１４５℃にした。この温度を２０分間保った。前処理の終わりに、反応装置を制御された方式で圧抜きして大気圧にし、次に引き続いて真空にして、容器内圧力を約０．１バール（１０キロパスカル）絶対圧に戻した。反応装置を出た前処理穂軸片は、約５５質量％乾燥バイオマスであった。穂軸片を１．０ｍｍスクリーン付き微粉砕機（モデル番号１ＳＨ，シリアル番号１００１９；Ｐｕｌｖｅｒｉｚｉｎｇ  Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｋｒｏｐｕｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｓｕｍｍｉｔ，ＮＪ）内でサイズを１ｍｍ未満に低下させた。
【００９８】
発酵バッチＦＲＦ７〜１０
穂軸バッチの前処理のために、容器本体および側面本体周囲に蒸気を通過させるジャケットを有する、水平Ｌｉｔｔｌｅｆｏｒｄ  Ｄａｙ  １３０Ｌ反応装置容器（Ｌｉｔｔｌｅｆｏｒｄ  Ｄａｙ，Ｉｎｃ．，Ｆｌｏｒｅｎｃｅ，ＫＹ）を使用した。各バッチ毎に、容器に穂軸を装填した（サイズ１ｍｍ未満）。１．０ｍｍスクリーン付き微粉砕機（モデル番号１ＳＨ，シリアル番号１００１９；Ｐｕｌｖｅｒｉｚｉｎｇ  Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｋｒｏｐｕｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；  Ｓｕｍｍｉｔ，ＮＪ）で処理して、穂軸片のサイズを低下させた。異なる前処理バッチで使用した穂軸の％水分を表２に示す。
【００９９】
容器を真空にして０．１気圧にし、容器上部近くへ２８．９質量％水酸化アンモニウム溶液および水を導入して、バイオマス乾燥質量に対して６質量％のＮＨ3とした。容器の上部近くに蒸気を導入して、容器内部温度を１４５℃に上昇させた。この温度を２０分間保った。前処理の終わりに、ベントコンデンサを通じて反応装置を圧抜きし、大気圧にした。引き続いて１５分間真空（およそ１気圧未満）にして、温度を６０℃未満に低下させた。各前処理バッチがその中で使用された発酵バッチと並べて、各前処理バッチの最終％固形分を表２に示す。
【０１００】
表２  穂軸、前処理および発酵バッチ
2013524838.tif 000004
【０１０１】
ＦＲＦ６〜１０の糖化実施
２００ＬのＳａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｂｉｏｓｔａｔ  Ｄ２００内で７２時間にわたり糖化を実施したが、＃９だけは２４時間糖化した。固体装填率は、２０％〜２５％であった。前処理穂軸バイオマスのｐＨをＨ2ＳＯ4で５．３に調節した。添加した酵素は、Ａ１５００、Ｘｙｎ３、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ５１Ａ、およびＦｖ４３Ｄの組合せであり、それを＃６〜９では２１．３ｍｇタンパク質／ｇグルカン＋キシランで添加したが、実験＃６ではＭｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼでＸｙｎ３を置換し、実験＃１０ではＨ３Ａ抽出物（一般方法に記載される）を１４ｍｇ／ｇグルカン＋キシランで使用した。糖化は４７℃で実施した。
【０１０２】
種培養調製
復活培養物として、２ｍＬの凍結ＺＷ７０５保存株（一般方法に記載される株）をＭＲＭ３Ｇ６（１０ｇ／ＬのＢＢＬ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、６０ｇ／Ｌのグルコース）中で、振盪せずに３３℃で８時間培養した。１ＬのＭＲＭ３Ｇ１０培地（ＭＲＭ３Ｇ６と同一であるが１００ｇ／Ｌグルコースを添加）を含有する振盪フラスコに、２０ｍＬの復活培養物を接種して、３３℃で振盪しながら１３〜１６時間培養した。ＯＤ600が１．５〜３．１になるまで増殖させた。十分な振盪フラスコ培養物を使用して、０．１（ＦＲＦ７〜１０）または０．３５（ＦＲＦ６）の初期ＯＤ600で、１０Ｌの種発酵槽に接種した。
【０１０３】
ＭａｘＳＭＧ２０またはＭａｘＳＧＭ１５（２０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4、５ｇ／ＬのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１０ｍＭのソルビトール、および２００ｇ／Ｌのグルコース中の種発酵。種発酵を３３℃およびｐＨ５．８（ＦＲＦ６および７）または５．５（ＦＲＦ８〜１０）で実施した。８５ｇ／Ｌ未満へのグルコースの低下が初めて観察された後に、種培養物を収穫した。グルコースはＹＳＩ  ２７００  ＳＥＬＥＣＴ（商標）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＹＳＩ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＯＨ）を使用して測定された。
【０１０４】
発酵
１８０Ｌのバイオマス加水分解生成物と２０ＬのＺＷ７０５種培養を含有する２００Ｌ  Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＢｉｏｓｔａｔＤ２００内で、表２に列挙する発酵バッチを実施した。ｐＨをＮａＯＨで５．８に調節した。発酵は３０℃〜３３℃で８０時間（ＦＲＦ６、７）、９０時間（ＦＲＦ８、１０）または１２０時間（ＦＲＦ９）保った。
【０１０５】
実施例２
リグノセルロース系トウモロコシ穂軸バイオマス加水分解生成物発酵ブロスからの薄い蒸留廃液の組成
実施例１に記載の通り、前処理、糖化、および発酵を使用して発酵ブロスバッチを生成した。連続蒸留塔を使用して、表３に示すように、異なる発酵バッチ供給物を異なる条件下で蒸留した。９８％硫酸の添加によって、バッチ１０（１０−１、１０−２）の発酵ブロスサンプルを表３に示すより低いｐＨに調節した。カラム内の蒸留滞留時間は約８分間であった。
【０１０６】
エタノールストリームを蒸留塔から収集した。一般方法に記載の通り、フィルタープレスを使用して蒸留塔からの全蒸留廃液を６０℃で濾過した。表３に示すように、いくつかのバッチは加熱処理した。
【０１０７】
濾過からの薄い蒸留廃液サンプルを全固形分（溶解および懸濁固形分を含む）と懸濁固形分について分析した。サンプルを真空内または８０℃の対流オーブン内で乾燥するまで２４〜７２時間加熱して、全固形分を測定した。各乾燥サンプル質量は、サンプルの原質量の百分率として表された。ＡＳＴＭ  Ｄ５９０７−０９に従って、懸濁固形分を測定した。表３に示すように、薄い蒸留廃液サンプルは、様々なバッチにおいて５〜７％の全固形分と約１００〜７５０ｐｐｍの懸濁固形分を有することが示された。
【０１０８】
表３  異なる発酵ブロス供給バッチの調製詳細および結果
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【０１０９】
実施例３
異なる％固形分への蒸発に続くシロップ粘度に対する薄い蒸留廃液のｐＨおよび温度の影響
一般方法に記載の通り、実験室規模の蒸発機構を使用して、薄い蒸留廃液から水を蒸発させた。実施例１および２に記載されるように調製した発酵ブロスバッチ７〜１０からの薄い蒸留廃液サンプルを、表４に示すように異なる圧力条件下で蒸発させた。５０％ＮａＯＨまたは９８％硫酸どちらかの添加によって、薄い蒸留廃液のサンプルをｐＨ調節し、表４のサンプルｐＨ値を得た。塔頂水および残留シロップ（ｂｏｔｔｏｍ  ｓｙｒｕｐ）サンプルを異なる％全固形分で収集した。薄い蒸留廃液サンプルの初期％全固形分は、実施例２と同様に５％〜７％であった。シロップサンプルの粘度は１〜３００  １／ｓの勾配の剪断速度で異なる温度（２０℃、４０℃、および６０℃）において測定した。無限剪断粘度数を表４に報告する。測定されたシロップサンプルは、表４に示す温度および濃度でニュートン流体であった。真空オーブンまたは８０℃の対流オーブン内で２４〜４８時間乾燥させて、各サンプルの％全固形分を測定した。
【０１１０】
約７０％固形分のサンプルを含めた全サンプルの粘度は、６０℃で１００センチポアズ未満のままであった。より低いｐＨでは、約７０％固形分までのサンプルは４０℃で１００センチポアズ未満の粘度を有した。
【０１１１】
表４  異なる％固形分に蒸発させた薄い蒸留廃液からのシロップサンプル粘度
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ｎｄ*＝測定せず
【０１１２】
実施例４
薄い蒸留廃液の異なる％固形分への蒸発に続くトウモロコシ茎葉加水分解生成物発酵ブロスからのシロップの粘度
サンプルＤＦ１０６２では、セカンドパストウモロコシ茎葉を３／８インチ（０．９５ｃｍ）に粉砕した。前処理は、１４０℃において１４％ＮＨ3および６５％固形分で６０分間実施した。糖化は４７℃でｐＨ５．３において、７．８ｍｇ／ｇグルカン＋キシラン酵素共同体によって９６時間実施した。糖化酵素は、一般方法に記載されるＨ３Ａ株調製品に類似した、ＲＬ−Ｐ３７に由来するトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）株中で発現されるセルラーゼとヘミセルラーゼの混合物（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ  ａｎｄ  Ｍｏｎｔｅｎｅｃｏｕｒｔ（１９８４）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４６−５３）であり、Ｈ３Ａ株調製品もまた使用し得る。サンプルＤＦ１０６５では、セカンドパス細断茎葉を５／６４インチ（０．２ｃｍ）に粉砕した。前処理は、１４０℃において、８％ＮＨ3および５５％固形分で２０分間実施した。糖化は４７℃でｐＨ５．３において、７．８ｍｇ／ｇグルカン＋キシランの同一酵素共同体によって９６時間実施した。
【０１１３】
発酵では、１０ｍＭソルビトールを加水分解生成物に添加して、発酵前にｐＨを５．８に調節した。ＤＦ１０６２およびＤＦ１０６５は、１０容積％（最終容積）の即時収穫可能ＺＷ７０５種培養と共に、ｐＨ５．８および３３℃で、２３．５時間後に３０℃に移行させて発酵させた。種培養は、ｈａｌｆＹＥＭａｘＳＭＧ１５培地（１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4、５ｇ／ＬのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１０ｍＭのソルビトール、１５０ｇ／Ｌのグルコース）中において、３３℃およびｐＨ５．５で培養して、約１２５ｇ／Ｌのグルコースを消費させた。実験室蒸留ユニット内において、異なる発酵バッチを１気圧で３時間蒸留した。実験室規模濾過ユニットを使用して、蒸留塔からの全蒸留廃液を濾過した。実験室規模の蒸発機構を使用して、１気圧で薄い蒸留廃液から水を蒸発させた。塔頂水および残留シロップ（ｂｏｔｔｏｍ  ｓｙｒｕｐ）サンプルを異なる％全固形分で収集した。シロップサンプルの粘度は、１〜３００  １／ｓの勾配の剪断速度で異なる温度（２０℃、４０℃、および６０℃）において測定した。報告された粘度は、表５中の１００  １／ｓ剪断速度である。懸濁固形分は、実施例２と同様にして測定した。％全固形分は、メトラー装置を使用して測定した。サンプルを１０５℃で３０秒間加熱した。１０５℃で２４０秒間後に、平均質量損失が１ｍｇを越えなかった場合に、全固形分を報告した。薄い蒸留廃液サンプルについて測定された総懸濁固形分は（検出限界であり）低かった。双方の薄い蒸留廃液サンプルは、ｐＨ５．７を有した。
【０１１４】
表５  異なる％固形分に蒸発させた薄い蒸留廃液からのシロップサンプル粘度
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【０１１５】
実施例５
薄い蒸留廃液の異なる％固形分への蒸発に続く、スイッチグラス加水分解生成物発酵ブロスからのシロップの粘度
サンプルＤＦ１１０２およびＤＦ１１１９サンプルでは、スイッチグラスを＜１ｍｍに粉砕した。１２％ＮＨ3を用いて、１５５℃で６０分間前処理を実施した。糖化は４７℃でｐＨ５．３において、１４ｍｇ／ｇグルカン＋キシラン酵素共同体によって９４時間実施した。糖化酵素は、一般方法に記載されるＨ３Ａ株調製品に類似した、ＲＬ−Ｐ３７に由来するトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）株中で発現されるセルラーゼとヘミセルラーゼの混合物（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ  ａｎｄ  Ｍｏｎｔｅｎｅｃｏｕｒｔ（１９８４）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４６−５３）であり、Ｈ３Ａ株調製品もまた使用し得る。発酵では、１０ｍＭソルビトールを加水分解生成物に添加して、発酵前にｐＨを５．８に調節した。ＤＦ１１０２は、１０容積％（最終容積）の即時収穫可能ＡＲ３７−３１株種培養と共に、ｐＨ５．８および３３℃で、２１時間後に３０℃に移行させて発酵させた。
【０１１６】
種培養は、ｈａｌｆＹＥＭａｘＳＭＧ１５培地（１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、５ｇ／ＬのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１０ｍＭのソルビトール、１５０ｇ／Ｌのグルコース）中において、３３℃およびｐＨ５．５で培養して、約１２５ｇ／Ｌのグルコースを消費させた。異なる発酵バッチを実験室蒸留ユニット内において、１気圧で３時間蒸留した。実験室規模濾過ユニットを使用して、蒸留塔からの全蒸留廃液を濾過した。実験室規模の蒸発機構を使用して、１気圧で薄い蒸留廃液から水を蒸発させた。塔頂水および残留シロップ（ｂｏｔｔｏｍ  ｓｙｒｕｐ）サンプルを異なる％全固形分で収集した。シロップサンプルの粘度は、１〜３００  １／ｓの勾配の剪断速度で異なる温度（２０℃、４０℃、および６０℃）において測定した。報告される粘度は表６の１００  １／ｓ剪断速度である。薄い蒸留廃液について測定される総懸濁固形分は０．２６％であった。％懸濁固形分および％全固形分は実施例４と同様にして測定される。薄い蒸留廃液サンプルはｐＨ５．７を有した。
【０１１７】
表６  異なる％固形分に蒸発させた薄い蒸留廃液からのシロップサンプルの粘度
2013524838.tif 000009
【配列表】
2013524838000001.app
【国際調査報告】
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