(57)【要約】ＣＥＡを発現する癌を検出、モニタリング、および／または治療するための改善された方法および組成物が提供される。【選択図】  図１
2013512454.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を発現する癌の再発を検出する方法であって、
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を発現する癌であると以前に診断され、治療された対象からの試料を得ることと、
完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、短型ＣＥＡタンパク質には免疫特異的に結合しない抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子を用いて、前記試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出し、それによって、前記試料中の短型ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することと、
を含み、
治療後に観察された濃度を超える、前記試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の濃度の検出は、前記ＣＥＡを発現する癌の再発を示す、上記方法。
【請求項２】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を発現する癌の再発を検出する方法であって、
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を発現する癌を患っている対象から、治療前に得られる第１の試料を得ることと、
完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、短型ＣＥＡタンパク質には免疫特異的に結合しない抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子を用いて、前記第１の試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の治療前の濃度を検出し、それによって、前記第１の試料中の短型ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することと、
前記対象から第２の試料を得て、前記抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子を用いて、前記第２の試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出し、それによって、前記第２の試料中の短型ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することと、
前記第２の試料を得たよりも後の時点で、前記対象から１つ以上のさらなる試料を得て、前記抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子を用いて、前記１つ以上のさらなる試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出し、それによって、前記１つ以上のさらなる試料中の短型ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することと、
を含み、
前記第２の試料で観察された完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を超える、前記１つ以上のさらなる試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の濃度の検出は、前記ＣＥＡを発現する癌の再発を示す、上記方法。
【請求項３】
抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）癌治療薬に対する感受性を判定する方法であって、
完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、短型ＣＥＡタンパク質には免疫特異的に結合しない抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子を用いて、対象からの試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出し、それによって、前記試料中の短型ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することと、
完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を、健常な対象からの試料中の完全長ＣＥＡタンパク質濃度を反映する標準範囲と比較することと、
を含み、
前記標準範囲を超える完全長ＣＥＡタンパク質の濃度の検出は、抗ＣＥＡ癌治療に対する感受性を示す、方法。
【請求項４】
抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）癌療法をモニタリングする方法であって、
完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、短型ＣＥＡタンパク質には免疫特異的に結合しない抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子を用いて、ＣＥＡを発現する癌の治療を受けている対象からの試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出し、それによって、前記試料中の短型ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することと、
前記完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を、治療前、または治療中の早期の時点で得られる前記同一の対象からの試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の濃度と比較することと、
を含み、
治療前または治療中の早期の時点で得られた濃度に対する、治療中の後期の時点で得られた試料中の完全長ＣＥＡ濃度の低下は、前記治療の有効性を示し、それによって、抗ＣＥＡ癌療法をモニタリングする、方法。
【請求項５】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を発現する癌を患っている対象を治療する方法であって、
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を発現する癌に対する治療前に、対象から試料を得ることと、
完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、短型ＣＥＡタンパク質には免疫特異的に結合しない抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子を用いて、前記試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出し、それによって、前記試料中の短型ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することと、
前記完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を、健常な対象からの試料中の完全長ＣＥＡタンパク質濃度を反映する標準範囲と比較する工程であって、
前記標準範囲を超える前記完全長ＣＥＡタンパク質の濃度の検出は、抗ＣＥＡ癌療法に対する感受性を示す、上記工程と、
前記対象が、抗ＣＥＡ癌療法に対して感受性があると判定される場合、抗ＣＥＡ癌治療薬を用いて前記対象を治療することと、
任意に、完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、短型ＣＥＡタンパク質には免疫特異的に結合しない抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子を用いて、前記対象からの治療後の試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を任意に検出し、それによって、前記治療後の試料中の短型ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することと、
任意に、前記治療後の試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を、治療前に得られた前記試料中の前記濃度と比較することと、
を含み、
前記治療前の試料と比較して前記治療後の試料中の完全長ＣＥＡタンパク質濃度の低下が、前記対象を治療する前記方法での前記抗ＣＥＡ癌治療薬の有効性を示す、上記方法。
【請求項６】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）タンパク質に免疫特異的に結合する癌治療薬に対する感受性を判定する方法であって、
ＣＥＡを発現する癌を患っている対象の治療に使用される癌治療薬を選択する工程であって、この癌治療薬は、ＣＥＡタンパク質の１つの型に免疫特異的に結合するが、ＣＥＡタンパク質の第２の型には免疫特異的に結合せず、ＣＥＡタンパク質の１つの型は、標的ＣＥＡタンパク質と称される、上記工程と、
前記癌治療薬が免疫特異的に結合するエピトープと同一または実質的に同一である前記標的ＣＥＡタンパク質上のエピトープに免疫特異的に結合する抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子を用いて、前記対象からの試料中の前記標的ＣＥＡタンパク質の濃度を検出し、それによって、前記試料中の非標的型のＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、前記標的ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することと、
前記標的ＣＥＡタンパク質の前記濃度を、健常な対象からの試料中の標的ＣＥＡタンパク質濃度を反映する標準範囲と比較することと、
を含み、
前記標準範囲を超える前記試料中の標的ＣＥＡタンパク質の濃度の検出は、前記癌治療薬に対する感受性を示す、上記方法。
【請求項７】
治療をモニタリングする方法であって、
ＣＥＡを発現する癌を患っている対象の治療に使用される癌治療薬を選択する工程であって、この癌治療薬は、ＣＥＡタンパク質の１つの型に免疫特異的に結合するが、ＣＥＡタンパク質の第２の型には免疫特異的に結合せず、ＣＥＡタンパク質の１つの型は、標的ＣＥＡタンパク質と称される、上記工程と、
前記癌治療薬が免疫特異的に結合するエピトープと同一または実質的に同一である前記標的ＣＥＡタンパク質上のエピトープに免疫特異的に結合する抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子を用いて、ＣＥＡを発現する癌の治療を受けている前記対象からの試料中の前記標的ＣＥＡタンパク質の濃度を検出し、それによって、前記試料中の他の非標的型のＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、前記標的ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することと、
前記標的ＣＥＡタンパク質の濃度を、前記癌治療薬による治療前または前記癌治療薬による治療中の早期の時点で得られた前記同一の対象からの早期試料中の標的ＣＥＡタンパク質の濃度と比較することと、
を含み、
前記癌治療薬による治療前または治療中の早期の時点で得られた濃度に対する、前記癌治療薬による治療中の後期の時点で得られた試料中の標的ＣＥＡ濃度の低下は、前記癌治療薬の有効性を示し、それによって、前記治療をモニタリングする、上記方法。
【請求項８】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を発現する癌を患っている対象を治療する方法であって、
ＣＥＡを発現する癌を患っている対象の治療に使用される癌治療薬を選択する工程であって、この癌治療薬は、ＣＥＡタンパク質の１つの型に免疫特異的に結合するが、ＣＥＡタンパク質の第２の型には免疫特異的に結合せず、ＣＥＡタンパク質の１つの型は、標的ＣＥＡタンパク質と称される、上記工程と、
前記治療薬が免疫特異的に結合するエピトープと同一または実質的に同一である前記標的ＣＥＡタンパク質上のエピトープに免疫特異的に結合する抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子を用いて、前記対象からの試料中の前記標的ＣＥＡタンパク質の濃度を検出し、それによって、前記試料中の他の非標的型のＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、前記標的ＣＥＡタンパク質の前記濃度を検出することと、
前記標的ＣＥＡタンパク質の前記濃度を、健常な対象からの試料中の標的ＣＥＡタンパク質濃度を反映する標準範囲と比較する工程であって、
前記標準範囲を超える前記標的ＣＥＡタンパク質の濃度の検出は、標的ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する癌治療薬に対する感受性を示す、上記工程と、
前記対象が前記癌治療薬に対して感受性があると判定される場合、標的ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する前記癌治療薬により前記対象を治療することと、
任意に、前記癌治療薬が免疫特異的に結合するエピトープと同一または実質的に同一である標的ＣＥＡ上のエピトープに免疫特異的に結合する抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子を用いて、前記癌治療薬による治療を受けている前記対象からの治療後の試料中の、標的ＣＥＡタンパク質の濃度を検出し、それによって、前記試料中の他の非標的型のＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、前記標的ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することと、
任意に、前記標的ＣＥＡタンパク質の濃度を、前記同一の対象からの、前記癌治療薬による治療前、または前記治療中の早期の時点で得られた試料中の標的ＣＥＡタンパク質の濃度と比較することと、
を含み、
前記治療前または前記治療中の早期の時点で得られた濃度に対する、前記癌治療薬による治療中の後期の時点で得られた試料中の標的ＣＥＡ濃度の低下は、前記対象の前記治療の有効性を示す、上記方法。
【請求項９】
対象からの試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の濃度および短型ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することと、
完全長ＣＥＡタンパク質濃度と短型ＣＥＡタンパク質濃度との比率を判定することと、を含む、方法。
【請求項１０】
前記比率を、健常な対象からの試料中の、完全長ＣＥＡタンパク質濃度と短型ＣＥＡタンパク質濃度との標準比率を反映する標準と比較することをさらに含み、
前記標準比率よりも高いまたは低い比率は、ＣＥＡを発現する癌の存在を示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
完全長ＣＥＡタンパク質の濃度の検出は、完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、短型ＣＥＡタンパク質には免疫特異的に結合しない抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子と、試料を接触させることを含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
完全長ＣＥＡタンパク質の濃度の検出は、完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、短型ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合しない抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子と、試料を接触させることを含み、短型ＣＥＡタンパク質の濃度の検出は、短型ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合しない抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子と、試料を接触させることを含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
抗ＣＥＡ癌治療薬によって前記対象を治療することをさらに含む、請求項１〜４または６〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記癌治療薬は、前記検出ステップに使用される前記抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子によって免疫特異的に結合されるものと同一または実質的に同一であるＣＥＡタンパク質上のエピトープに免疫特異的に結合する、請求項５、８、または１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記対象は、ヒトである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記癌治療薬は、タンパク質治療薬を含む、請求項３〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記タンパク質治療薬は、抗体または抗原結合フラグメントである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記タンパク質治療薬は、モノクローナル抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記モノクローナル抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記タンパク質治療薬は、配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質に免疫特異的に結合する、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記タンパク質治療薬は、配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質に免疫特異的に結合するが、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質には免疫特異的に結合しない、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記タンパク質治療薬は、抗体Ａ５Ｂ７の抗原結合ドメインを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記タンパク質治療薬は、二重特異性抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記二重特異性抗体は、ＣＥＡ結合部分およびＣＤ３結合部分を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記試料は、全血、血清、血漿、唾液、尿、糞便、精漿、汗、羊水、痰、母乳、胆液、組織ホモジネート、および腹水から選択される、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記試料は、腫瘍組織試料である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＣＥＡを発現する癌は、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、食道癌、胃食道癌、胃癌、肺癌、および乳癌から選択される、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記検出ステップは、
前記抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子と、前記試料を接触させることと、
免疫組織化学によって完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することと、
を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料は、前記抗体と接触させられ、前記抗体は、モノクローナル抗体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記モノクローナル抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記検出ステップは、
配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質に結合する前記抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子と、前記試料を接触させることと、
免疫組織化学によって完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することと、
を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記検出ステップは、
抗体Ａ５Ｂ７の抗原結合ドメインを含む抗体または抗原結合フラグメントと、前記試料を接触させることを含むが、但し、前記抗体が、Ａ５Ｂ７ではない、請求項１〜８または２８〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記検出ステップは、
Ａ５Ｂ７と同一または実質的に同一であるエピトープに結合する抗原結合ドメインを含む抗体または抗原結合フラグメントと、前記試料を接触させることを含むが、但し、前記抗体が、Ａ５Ｂ７ではない、請求項１〜８または２８〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記検出ステップは、
Ａ５Ｂ７と同一または実質的に同一のエピトープに結合する抗原結合ドメインを含む抗体または抗原結合フラグメントと、前記試料を接触させることを含むが、但し、前記抗体が、Ａ５Ｂ７または二重特異性抗体ではない、請求項１〜８または２８〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
生物学的試料中の短型癌胎児性抗原（ＣＥＡ）ＲＮＡの発現を検出する方法であって、
ＣＥＡヌクレオチド配列にハイブリダイズする核酸プローブまたは核酸プライマーのうちの１つまたは両方であって、（ｉ）短型ＣＥＡヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするが、完全長ＣＥＡヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズしないこと、または（ｉｉ）短型ＣＥＡの発現と完全長ＣＥＡの発現を区別する様式で、短型ＣＥＡヌクレオチド配列および完全長ＣＥＡヌクレオチド配列の両方に特異的にハイブリダイズすることによって、短型ＣＥＡの発現を特異的に特定する、核酸プローブまたは核酸プライマーを提供することと、
生物学的試料からＲＮＡを提供することと、
前記核酸プローブまたは核酸プライマーを用いて、前記生物学的試料中の短型ＣＥＡのＲＮＡの発現を検出することと、
を含む、上記方法。
【請求項３６】
生物学的試料中の短型癌胎児性抗原（ＣＥＡ）タンパク質の発現を検出する方法であって、
短型ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合しない抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子を提供することと、
生物学的試料を提供することと、
前記抗体を用いて前記生物学的試料中の短型ＣＥＡタンパク質の発現を検出することと、
を含む、上記方法。
【請求項３７】
前記生物学的試料は、腫瘍組織試料である、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記生物学的試料は、全血、血清、血漿、唾液、尿、糞便、精漿、汗、羊水、組織ホモジネート、痰、母乳、胆液、および腹水から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
抗体を提供することを含み、前記抗体は、モノクローナル抗体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記モノクローナル抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質に結合する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
完全長癌胎児性抗原（ＣＥＡ）タンパク質に対して免疫特異的な抗体を生成する方法であって、
短型ＣＥＡタンパク質に存在しない完全長ＣＥＡタンパク質の一部を提供することと、
前記抗体を生成するための抗原として、前記完全長ＣＥＡタンパク質の一部を使用することと、
を含む、方法。
【請求項４３】
前記抗体は、モノクローナル抗体である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む精製されたポリペプチド、または連続するアミノ酸残基：ＮＩＩＱＮＥＬＳＶＤ（配列番号１１）またはＮＩＩＱＮＫＬＳＶＤ（配列番号１２）を含む、そのフラグメント。
【請求項４５】
標的癌胎児性抗原（ＣＥＡ）タンパク質に免疫特異的に結合する癌治療薬に対して感受性がある可能性がある患者を特定する方法であって、
患者から試料を得ることと、
完全長ＣＥＡのＲＮＡ発現と短型ＣＥＡのＲＮＡ発現を区別するために、前記試料中の、標的ＣＥＡのＲＮＡの発現を検出することと、
を含み、
前記患者からの腫瘍試料が、前記標的ＣＥＡのＲＮＡを発現する場合、前記患者は、その標的ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する癌治療薬による治療に対して感受性があり得、前記患者からの腫瘍試料が、前記標的ＣＥＡのＲＮＡを発現しない場合、前記患者は、その標的ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する癌治療薬による治療に対して感受性を有さない可能性がある、上記方法。
【請求項４６】
標的ＣＥＡのＲＮＡ発現の検出は、プローブおよび／またはプライマーと前記試料を接触させて、完全長ＣＥＡのＲＮＡの発現を評価することを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
標的ＣＥＡのＲＮＡ発現の検出は、プローブおよび／またはプライマーと前記試料を接触させて、短型ＣＥＡのＲＮＡの発現を評価することを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
標的ＣＥＡのＲＮＡ発現の検出は、プローブおよび／またはプライマーと前記試料を接触させて、完全長ＣＥＡのＲＮＡおよび短型ＣＥＡのＲＮＡの両方の発現を評価することを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記患者から１つ以上のさらなる生物学的試料を採取することと、前記標的ＣＥＡタンパク質の発現について前記１つ以上の生物学的試料をアッセイすることと、をさらに含む、請求項４５〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
癌治療薬によって前記対象を治療することをさらに含む、請求項４５〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子は、配列番号２８〜４４および４６〜５１のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜８、１１〜３４、および３６〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記抗ＣＥＡ治療薬は、配列番号２８〜４４および４６〜５１のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３、５〜８、１３〜３４、および４５〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子は、配列番号４８のアミノ酸配列を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子は、配列番号４９のアミノ酸配列を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子は、配列番号４６のアミノ酸配列を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
前記抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
前記抗ＣＥＡ治療薬は、配列番号４８のアミノ酸配列を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
抗ＣＥＡ治療薬は、配列番号４９のアミノ酸配列を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
前記抗ＣＥＡ治療薬は、配列番号４６のアミノ酸配列を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項６０】
前記抗ＣＥＡ治療薬は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む、請求項６０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ＣＥＡを発現する癌を検出、モニタリング、および／または治療するための改善された方法および組成物が提供される。
【背景技術】
【０００２】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのＣＥＡ関連細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）ファミリーに属するグリコシル化ヒト腫瘍胎児抗原である。ＣＥＡは、細胞と細胞の接着を媒介し、腸の細菌定着を促進し、および感染性微生物を結合および捕捉することによって微生物感染から結腸を保護することが示唆されている。癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は、しばしば、ヒト癌腫および黒色腫において過剰発現されるよく特徴付けられた腫瘍関連抗原である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本開示は、ＣＥＡを発現する癌を検出、モニタリング、および／または治療するための改善した方法および組成物を提供する。
【０００４】
一態様において、本開示は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を発現する癌の再発を検出する方法を提供する。本方法は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を発現する癌であると以前に診断され、治療された対象から試料を得ることを含む。例えば、本方法は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を発現する癌であると以前に診断され、治療したヒト対象（例えば、ヒト患者）から試料を得ることを含む。本方法は、完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、短型ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合しない、抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子（例えば、診断試薬）を用いて、該試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出し、それによって、該試料中から短型ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出する診断ステップを含むことができる。治療後に以前に観察された範囲を超える、該試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の濃度の検出は、該ＣＥＡを発現する癌の再発を示している。
【０００５】
ある実施形態において、該診断試薬（例えば、抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子）は、完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、短型ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合しない。いくつかの実施形態において、該診断試薬はまた、他の関連したＣＥＡＣＡＭタンパク質ファミリーメンバー（ＣＥＡＣＡＭ１、３、４、６、７、および８等）に免疫特異的に結合しない。したがって、ある実施形態において、該診断試薬は、汎ＣＥＡファミリーメンバー抗体ではないが、完全長ＣＥＡタンパク質に対して特異的である。
【０００６】
ある実施形態において、該診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、Ａ５Ｂ７（Ａ５Ｂ７として知られるマウスモノクローナル抗体）ではない。ある実施形態において、該診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、ＭＥＤＩ−５６５ではない。ある実施形態において、該診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、ＩＭＭＵ−４またはアルシツモマブとして知られるマウスモノクローナル抗体ではない。ある実施形態において、該診断試薬は、抗ＣＤ３結合部分を含む二重特異性一本鎖抗体ではない。ある実施形態において、該診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、Ｈｅｆｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：４９−５７に特定される、ＣＥＡ．６６、Ｔ８４．６６、またはＴ８４．１２ではない。ある実施形態において、該診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、Ｄｕｒｂｉｎ（１９９４）ＰＮＡＳ  ９１：４３１３に特定される、ＰＲ１Ａ３ではない。ある実施形態において、該診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、Ｌｉｅｒｓｃｈ（２００５）ＪＣＯ  ２３：６７６３に特定される、ラベツズマブではない。ある実施形態において、該診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、製造供給元のカタログ番号＃４０１−８５を用いてＩｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．から供給されるＣａｎＡｇ  ＣＥＡ  ＥＩＡキット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄｉ．ｃｏｍ／ｗｏｒｌｄ＿ｈｏｍｅ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｍａｎｕａｌ＿ｋｉｔｓ／ｅｉａ＿ｋｉｔｓ／ｃａｎａｇ＿ｃｅａ．ｈｔｍｌ）で得られる抗体ではない。
【０００７】
ある実施形態において、本方法は、該試料中の、完全長および／または短型ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度を検出する診断ステップを含むことができる。該方法は、例えば、ＴａｑＭａｎアッセイにおいて、完全長および／または短型ＣＥＡのＲＮＡに対して特異的な定量的ＲＴ−ＰＣＲ、プライマー、および／またはプローブを採用し得、およびＳＡＧＥ、ＭＰＳＳ、アレイベースの方法、または直接シークエンシングを採用し得る。
【０００８】
ある実施形態において、試料を得ることは、血液試料、尿試料、糞便試料、または痰試料を得ることを含む。ある実施形態において、試料を得ることは、腫瘍生検標本または他の腫瘍組織試料を得ることを含む。ある実施形態において、試料は、全血、血清、血漿、唾液、尿、糞便、精漿、汗、羊水、痰、母乳、乳頭吸引液、または胸部、胆液、組織ホモジネート、胸水、および腹水からの細胞を含む他の流体のうちの１つ以上から選択される。
【０００９】
別の態様において、本開示は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を発現する癌の再発を検出する方法を提供する。本方法は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を発現する癌を患っている対象から、治療前に得られる第１の試料を得ることを含む。例えば、本方法は、治療の開始前にヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を発現する癌であると診断されたヒト対象（例えば、ヒト患者）から試料を得ることを含む。本方法は、完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、短型ＣＥＡタンパク質には免疫特異的に結合しない抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子（例えば、診断試薬）を用いて、該第１の試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の前治療濃度を検出し、それによって、該第１の試料中の短型ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出する診断ステップを含むことができる。本方法は、該対象から第２の試料を得ることと、該抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子を用いて（例えば、該診断試薬を用いて）、該第２の試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出し、それによって、該第２の試料中の短型ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することと、を含むことができる。例えば、第２の試料は、治療の開始後のある時間帯（または複数の時点）で回収できるため、治療の結果としてＣＥＡの低下が、測定できる。本方法は、該第２の試料を得るためのものより後の時点で、該対象から１つ以上のさらなる試料を得て、該抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子（例えば、該診断試薬）を用いて、該１つ以上のさらなる試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出し、それによって、該１つ以上のさらなる試料中の短型ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することと、を含むことができる。該第２の試料で観察された完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を超える、該１つ以上のさらなる試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の濃度の検出は、該ＣＥＡを発現する癌の再発を示す。例として、成功した治療後、ＣＥＡレベルは、低下する。その低下後、患者を、モニタリングすると、この低下後のＣＥＡレベルが増加しているのは、癌の再発を示しているかもしれない。ある実施形態において、前治療試料で観察された濃度とほぼ同一またはそれより高い濃度のＣＥＡレベルの増加は、ＣＥＡを発現する癌が再発していることを示す。
【００１０】
ある実施形態において、初期治療は、外科手術を含み、第１の試料は、ＣＥＡを発現する腫瘍のすべてまたは一部の外科的切除前に採取される。ある実施形態において、初期治療は、外科手術、化学療法、放射線療法、免疫療法、またはモノクローナル抗体療法、遺伝療法、腫瘍溶解性療法（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ）、もしくはウイルス療法等の生物学的療法のうちの１つ以上を含む。ある実施形態において、治療は、第１の試料が、任意の治療の開始前に採取されるが、第２および／またはさらなる試料が、治療のサイクル中（例えば、化学療法または放射線療法のサイクル中）に採取されるように、継続的に行われる。
【００１１】
ある実施形態において、診断試薬（例えば、抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子）は、完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、短型ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合しない。いくつかの実施形態において、診断試薬はまた、他の関連したＣＥＡＣＡＭタンパク質ファミリーメンバー（ＣＥＡＣＡＭ１、３、４、６、７、および８等）に免疫特異的に結合しない。したがって、ある実施形態において、診断試薬は、汎ＣＥＡファミリーメンバー抗体ではないが、完全長ＣＥＡタンパク質に対して特異的である。
【００１２】
ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、抗体は、Ａ５Ｂ７（Ａ５Ｂ７として知られるマウスモノクローナル抗体）ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、ＭＥＤＩ−５６５ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、ＩＭＭＵ−４またはアルシツモマブとして知られるマウスモノクローナル抗体ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗ＣＤ３結合部分を含む二重特異性一本鎖抗体ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、Ｈｅｆｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：４９−５７に特定される、ＣＥＡ．６６、Ｔ８４．６６、またはＴ８４．１２ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、Ｄｕｒｂｉｎ（１９９４）ＰＮＡＳ  ９１：４３１３に特定される、ＰＲ１Ａ３ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、Ｌｉｅｒｓｃｈ（２００５）ＪＣＯ  ２３：６７６３に特定される、ラベツズマブではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、製造供給元のカタログ番号＃４０１−８５を用いてＩｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．から供給される、ＣａｎＡｇ  ＣＥＡ  ＥＩＡキット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄｉ．ｃｏｍ／ｗｏｒｌｄ＿ｈｏｍｅ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｍａｎｕａｌ＿ｋｉｔｓ／ｅｉａ＿ｋｉｔｓ／ｃａｎａｇ＿ｃｅａ．ｈｔｍｌ）で得られる抗体ではない。
【００１３】
ある実施形態において、本方法は、該試料中の、完全長および／または短型ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度を検出する診断ステップを含むことができる。該方法は、例えば、ＴａｑＭａｎアッセイにおいて、完全長および／または短型ＣＥＡのＲＮＡに対して特異的な定量的ＲＴ−ＰＣＲ、プライマー、および／またはプローブを採用し得、ＳＡＧＥ、ＭＰＳＳ、アレイベースの方法、または直接シークエンシングを採用し得る。
【００１４】
ある実施形態において、試料を得ることは、血液試料、尿試料、糞便試料、または痰試料を得ることを含む。ある実施形態において、試料を得ることは、腫瘍生検標本または他の腫瘍組織試料を得ることを含む。ある実施形態において、試料は、全血、血清、血漿、唾液、尿、糞便、精漿、汗、羊水、痰、母乳、乳頭吸引液、または胸部、胆液、組織ホモジネート、胸水、および腹水からの細胞を含む他の流体のうちの１つ以上から選択される。
【００１５】
別の態様において、本開示は、抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）癌療法に対する感受性を判定する方法を提供する。本方法は、完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、短型ＣＥＡタンパク質には免疫特異的に結合しない抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子（例えば、診断試薬）を用いて、対象からの試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出し、それによって、該試料中の短型ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することを含む。本方法は、該完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を、健常な対象からの試料中の完全長ＣＥＡタンパク質濃度を反映する標準範囲と比較することを含むことができる。該標準範囲を超える完全長ＣＥＡタンパク質の濃度の検出は、抗ＣＥＡ癌療法に対する感受性を示す。
【００１６】
前述および以下のある実施形態において、健常な対象からの試料中の完全長ＣＥＡタンパク質濃度を反映する標準範囲は、非喫煙者の血清中の３ｕｇ／Ｌ（３ｎｇ／ｍＬ）以下および喫煙者の血清中の５μｇ／Ｌ（５ｎｇ／ｍＬ）以下である。ある実施形態において、標準範囲は、喫煙状態に関わらず、血清中の５μｇ／Ｌ（５ｎｇ／ｍＬ）以下である。
【００１７】
ある実施形態において、診断試薬（例えば、該抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子）は、完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、短型ＣＥＡタンパク質には免疫特異的に結合しない。いくつかの実施形態において、診断試薬はまた、他の関連したＣＥＡＣＡＭタンパク質ファミリーメンバー（ＣＥＡＣＡＭ１、３、４、６、７、および８等）に免疫特異的に結合しない。したがって、ある実施形態において、診断試薬は、汎ＣＥＡファミリーメンバー抗体ではないが、完全長ＣＥＡタンパク質に対して特異的である。
【００１８】
ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、抗体は、Ａ５Ｂ７（Ａ５Ｂ７として知られるマウスモノクローナル抗体）ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、ＭＥＤＩ−５６５ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、ＩＭＭＵ−４またはアルシツモマブとして知られるマウスモノクローナル抗体ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗ＣＤ３結合部分を含む二重特異性一本鎖抗体ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、Ｈｅｆｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：４９−５７に特定される、ＣＥＡ．６６、Ｔ８４．６６、またはＴ８４．１２ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、Ｄｕｒｂｉｎ（１９９４）ＰＮＡＳ  ９１：４３１３に特定される、ＰＲ１Ａ３ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、Ｌｉｅｒｓｃｈ（２００５）ＪＣＯ  ２３：６７６３に特定される、ラベツズマブではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、製造供給元のカタログ番号＃４０１−８５を用いてＩｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．から供給される、ＣａｎＡｇ  ＣＥＡ  ＥＩＡキット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄｉ．ｃｏｍ／ｗｏｒｌｄ＿ｈｏｍｅ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｍａｎｕａｌ＿ｋｉｔｓ／ｅｉａ＿ｋｉｔｓ／ｃａｎａｇ＿ｃｅａ．ｈｔｍｌ）で得られる抗体ではない。
【００１９】
ある実施形態において、本方法は、該試料中の、完全長および／または短型ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度を検出する診断ステップを含むことができる。該方法は、例えば、ＴａｑＭａｎアッセイにおいて、完全長および／または短型ＣＥＡのＲＮＡに対して特異的な定量的ＲＴ−ＰＣＲ、プライマー、および／またはプローブを採用し得、ＳＡＧＥ、ＭＰＳＳ、アレイベースの方法、または直接シークエンシングを採用し得る。
【００２０】
ある実施形態において、試料を得ることは、血液試料、尿試料、糞便試料、または痰試料を得ることを含む。ある実施形態において、試料を得ることは、腫瘍生検標本または他の腫瘍組織試料を得ることを含む。ある実施形態において、試料は、全血、血清、血漿、唾液、尿、糞便、精漿、汗、羊水、痰、母乳、乳頭吸引液、または胸部、胆液、組織ホモジネート、胸水、および腹水からの細胞を含む他の流体のうちの１つ以上から選択される。別の態様において、本開示は、抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）癌療法をモニタリングする方法を提供する。本方法は、完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、短型ＣＥＡタンパク質には免疫特異的に結合しない抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子（例えば、診断試薬）を用いて、ＣＥＡを発現する癌の治療を受けている対象からの試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出し、それによって、該試料中の短型ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することを含む。本方法は、該完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を、該同一の対象から、該治療前でまたは該治療中の早期の時点で得られた試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の濃度と比較することを含むことができる。治療前または該治療中の早期の時点で得られたものに対する、治療中の後期の時点または治療終了後に得られた試料中の完全長ＣＥＡ濃度の低下は、該治療の有効性を示し、それによって、該抗ＣＥＡ癌療法をモニタリングする。
【００２１】
ある実施形態において、初期治療は、外科手術を含み、第１の試料は、ＣＥＡを発現する腫瘍のすべてまたは一部の外科的切除前に採取される。ある実施形態において、初期治療は、外科手術、化学療法、放射線療法、免疫療法、またはモノクローナル抗体療法、遺伝療法、腫瘍溶解性療法（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ）、もしくはウイルス療法等の生物学的療法のうちの１つ以上を含む。ある実施形態において、治療は、第１の試料が、任意の治療の開始前に採取されるが、第２および／またはさらなる試料が、治療のサイクル中（例えば、化学療法または放射線療法のサイクル中）に採取されるように、継続的に行われる。
【００２２】
ある実施形態において、診断試薬（例えば、抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子）は、完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、短型ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合しない。いくつかの実施形態において、診断試薬はまた、他の関連したＣＥＡＣＡＭタンパク質ファミリーメンバー（ＣＥＡＣＡＭ１、３、４、６、７、および８等）に免疫特異的に結合しない。したがって、ある実施形態において、診断試薬は、汎ＣＥＡファミリーメンバー抗体ではないが、完全長ＣＥＡタンパク質に対して特異的である。
【００２３】
ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、抗体は、Ａ５Ｂ７（Ａ５Ｂ７として知られるマウスモノクローナル抗体）ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、ＭＥＤＩ−５６５ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、ＩＭＭＵ−４またはアルシツモマブとして知られるマウスモノクローナル抗体ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗ＣＤ３結合部分を含む二重特異性一本鎖抗体ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、Ｈｅｆｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：４９−５７に特定される、ＣＥＡ．６６、Ｔ８４．６６、またはＴ８４．１２ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、Ｄｕｒｂｉｎ（１９９４）ＰＮＡＳ  ９１：４３１３に特定される、ＰＲ１Ａ３ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、Ｌｉｅｒｓｃｈ（２００５）ＪＣＯ  ２３：６７６３に特定される、ラベツズマブではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、製造供給元のカタログ番号＃４０１−８５を用いてＩｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．から供給される、ＣａｎＡｇ  ＣＥＡ  ＥＩＡキット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄｉ．ｃｏｍ／ｗｏｒｌｄ＿ｈｏｍｅ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｍａｎｕａｌ＿ｋｉｔｓ／ｅｉａ＿ｋｉｔｓ／ｃａｎａｇ＿ｃｅａ．ｈｔｍｌ）で得られる抗体ではない。
【００２４】
ある実施形態において、本方法は、該試料中の完全長および／または短型ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度を検出する診断ステップを含むことができる。該方法は、例えば、ＴａｑＭａｎアッセイにおいて、完全長および／または短型ＣＥＡのＲＮＡに対して特異的な定量的ＲＴ−ＰＣＲ、プライマー、および／またはプローブを採用し得、ＳＡＧＥ、ＭＰＳＳ、アレイベースの方法、または直接シークエンシングを採用し得る。
【００２５】
ある実施形態において、試料を得ることは、血液試料、尿試料、糞便試料、または痰試料を得ることを含む。ある実施形態において、試料を得ることは、腫瘍生検標本または他の腫瘍組織試料を得ることを含む。ある実施形態において、試料は、全血、血清、血漿、唾液、尿、糞便、精漿、汗、羊水、痰、母乳、乳頭吸引液、または胸部、胆液、組織ホモジネート、胸水、および腹水からの細胞を含む他の流体のうちの１つ以上から選択される。別の態様において、本開示は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を発現する癌を患っている対象を治療する方法を提供する。本方法は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を発現する癌に対する治療前、例えば、治療の開始前に、対象から試料を得ることを含む。本方法は、完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、短型ＣＥＡタンパク質に特異的に結合しない抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子（例えば、診断試薬）を用いて、該試料（初期試料）中の完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出し、それによって、該試料中の短型ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することを含むことができる。本方法は、完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を、健常な対象からの試料中の完全長ＣＥＡタンパク質濃度を反映する標準範囲と比較することを含むことができ、このうち、該標準範囲を越える完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出した場合は、抗ＣＥＡ癌療法に対する強い感受性を示すものである。本方法は、初期診断試験に基づいて、抗ＣＥＡ癌療法に対して強い感受性があると判定される該対象を、抗ＣＥＡ癌治療薬を用いて治療することを含むことができる。本方法は、完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、短型ＣＥＡタンパク質には免疫特異的に結合しない抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子（例えば、診断試薬）を用いて、治療後の試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出し、それによって、該治療後の試料中の短型ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することを含むことができる。本方法は、該治療後の試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の該濃度を、治療前に得られた試料中の該濃度と比較することを含むことができる。該治療前の試料と比較して、該治療後の試料中の完全長ＣＥＡタンパク質濃度が低下している場合は、該対象を治療する該方法での該抗ＣＥＡ癌治療薬の有効性を示している。
【００２６】
ある実施形態において、治療は、１つ以上のさらなる治療法とともに抗ＣＥＡ癌治療薬を含む。例示的な治療法としては、外科手術、化学療法、放射線療法、免疫療法、モノクローナル抗体および遺伝子療法等の生物学的療法、薬草療法、鍼療法、または食餌療法が含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態において、治療は、第１の試料が、任意の治療の開始前に採取されるが、第２および／またはさらなる試料が、治療のサイクル中（例えば、化学療法または放射線療法のサイクル中）に採取されるように、継続的に行われる。
【００２７】
ある実施形態において、診断試薬（例えば、抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子）は、完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、短型ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合しない。いくつかの実施形態において、診断試薬はまた、他の関連したＣＥＡＣＡＭタンパク質ファミリーメンバー（ＣＥＡＣＡＭ１、３、４、６、７、および８等）に免疫特異的に結合しない。したがって、ある実施形態において、診断試薬は、汎ＣＥＡファミリーメンバー抗体ではないが、完全長ＣＥＡタンパク質に対して特異的である。
【００２８】
ある実施形態において、診断試薬および抗ＣＥＡ治療薬は、ＣＥＡと同一または実質的に同一のエピトープに結合する。
【００２９】
ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、抗体は、Ａ５Ｂ７（Ａ５Ｂ７として知られるマウスモノクローナル抗体）ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、ＭＥＤＩ−５６５ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、ＩＭＭＵ−４またはアルシツモマブとして知られるマウスモノクローナル抗体ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗ＣＤ３結合部分を含む二重特異性一本鎖抗体ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、Ｈｅｆｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：４９−５７に特定される、ＣＥＡ．６６、Ｔ８４．６６、またはＴ８４．１２ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、Ｄｕｒｂｉｎ（１９９４）ＰＮＡＳ  ９１：４３１３に特定される、ＰＲ１Ａ３ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、Ｌｉｅｒｓｃｈ（２００５）ＪＣＯ  ２３：６７６３に特定される、ラベツズマブではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、製造供給元のカタログ番号＃４０１−８５を用いてＩｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．から供給される、ＣａｎＡｇ  ＣＥＡ  ＥＩＡキット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄｉ．ｃｏｍ／ｗｏｒｌｄ＿ｈｏｍｅ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｍａｎｕａｌ＿ｋｉｔｓ／ｅｉａ＿ｋｉｔｓ／ｃａｎａｇ＿ｃｅａ．ｈｔｍｌ）で得られる抗体ではない。
【００３０】
ある実施形態において、本方法は、該試料中の、完全長および／または短型ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度を検出する診断ステップを含むことができる。該方法は、例えば、ＴａｑＭａｎアッセイにおいて、完全長および／または短型ＣＥＡのＲＮＡに対して特異的な定量的ＲＴ−ＰＣＲ、プライマー、および／またはプローブを採用し得、ＳＡＧＥ、ＭＰＳＳ、アレイベースの方法、または直接シークエンシングを採用し得る。
【００３１】
ある実施形態において、試料を得ることは、血液試料、尿試料、糞便試料、または痰試料を得ることを含む。ある実施形態において、試料を得ることは、腫瘍生検標本または他の腫瘍組織試料を得ることを含む。ある実施形態において、試料は、全血、血清、血漿、唾液、尿、糞便、精漿、汗、羊水、痰、母乳、乳頭吸引液、または胸部、胆液、組織ホモジネート、胸水、および腹水からの細胞を含む他の流体のうちの１つ以上から選択される。別の態様において、本開示は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）タンパク質に免疫特異的に結合する癌治療薬に対する感受性を判定する方法を提供する。本方法は、ＣＥＡを発現する癌を患っている対象の治療に使用される癌治療薬を選択することを含み、癌治療薬は、ＣＥＡタンパク質の１つの型に免疫特異的に結合するが、ＣＥＡタンパク質の第２の型には免疫特異的に結合せず、ＣＥＡタンパク質の１つの型は、標的ＣＥＡタンパク質と称される。本方法は、該癌治療薬が免疫特異的に結合するエピトープと同一または実質的に同一である該標的ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子（例えば、診断試薬）を用いて、該対象からの試料中の該標的ＣＥＡタンパク質の濃度を検出し、それによって、該試料中の他の非標的型のＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、標的ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することを含むことができる。本方法は、該標的ＣＥＡタンパク質の該濃度を、健常な対象からの試料中の標的ＣＥＡタンパク質濃度を反映する標準範囲と比較することを含むことができる。該標準範囲を超える該試料中の該標的ＣＥＡタンパク質の濃度を検出した場合は、該癌治療薬に対する強い感受性を示しているものである。
【００３２】
ある実施形態において、標的ＣＥＡタンパク質は、完全長ＣＥＡタンパク質である。ある実施形態において、標的ＣＥＡタンパク質は、短型ＣＥＡタンパク質である。いずれにしても、標的ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する診断試薬は、可溶性および細胞結合型の標的ＣＥＡタンパク質の両方に免疫特異的に結合することが想定され、これらはともに、成熟ＣＥＡタンパク質である。そのような診断試薬はまた、プロ型の標的ＣＥＡタンパク質にも結合することがおきるかもしれない。しかしながら、もし、診断的および治療的に関連のあるＣＥＡが、腫瘍上に発現し、体液に存在する成熟ＣＥＡタンパク質であるならば、関連のある試薬は、成熟標的ＣＥＡに免疫特異的に結合するものである。
【００３３】
ある実施形態において、癌治療薬および診断試薬は、同一のタンパク質である。ある実施形態において、癌治療薬および診断試薬は、少なくとも１つの抗原結合フラグメントを共有する。
【００３４】
ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、抗体は、Ａ５Ｂ７（Ａ５Ｂ７として知られるマウスモノクローナル抗体）ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、ＭＥＤＩ−５６５ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、ＩＭＭＵ−４またはアルシツモマブとして知られるマウスモノクローナル抗体ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗ＣＤ３結合部分を含む二重特異性一本鎖抗体ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、Ｈｅｆｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：４９−５７に特定される、ＣＥＡ．６６、Ｔ８４．６６、またはＴ８４．１２ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、Ｄｕｒｂｉｎ（１９９４）ＰＮＡＳ  ９１：４３１３に特定される、ＰＲ１Ａ３ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、Ｌｉｅｒｓｃｈ（２００５）ＪＣＯ  ２３：６７６３に特定される、ラベツズマブではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、製造供給元のカタログ番号＃４０１−８５を用いてＩｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．から供給される、、ＣａｎＡｇ  ＣＥＡ  ＥＩＡキット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄｉ．ｃｏｍ／ｗｏｒｌｄ＿ｈｏｍｅ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｍａｎｕａｌ＿ｋｉｔｓ／ｅｉａ＿ｋｉｔｓ／ｃａｎａｇ＿ｃｅａ．ｈｔｍｌ）で得られる抗体ではない。
【００３５】
ある実施形態において、本方法は、該試料中の完全長および／または短型ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度を検出する診断ステップを含むことができる。該方法は、例えば、ＴａｑＭａｎアッセイにおいて、完全長および／または短型ＣＥＡのＲＮＡに対して特異的な定量的ＲＴ−ＰＣＲ、プライマー、および／またはプローブを採用し得、ＳＡＧＥ、ＭＰＳＳ、アレイベースの方法、または直接シークエンシングを採用し得る。
【００３６】
ある実施形態において、試料を得ることは、血液試料、尿試料、糞便試料、または痰試料を得ることを含む。ある実施形態において、試料を得ることは、腫瘍生検標本または他の腫瘍組織試料を得ることを含む。ある実施形態において、試料は、全血、血清、血漿、唾液、尿、糞便、精漿、汗、羊水、痰、母乳、乳頭吸引液、または胸部、胆液、組織ホモジネート、胸水、および腹水からの細胞を含む他の流体のうちの１つ以上から選択される。
【００３７】
別の態様において、本開示は、治療をモニタリングする方法を提供する。本方法は、ＣＥＡを発現する癌を患っている対象の治療に使用される癌治療薬を選択することを含み、癌治療薬は、ＣＥＡタンパク質の１つの型に免疫特異的に結合するが、ＣＥＡタンパク質の第２の型には免疫特異的に結合せず、ＣＥＡタンパク質の１つの型は、標的ＣＥＡタンパク質と称される。本方法は、該癌治療薬が免疫特異的に結合するエピトープと同一または実質的に同一である該標的ＣＥＡタンパク質上のエピトープに免疫特異的に結合する抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子（例えば、診断試薬）を用いて、ＣＥＡを発現する癌の治療を受けている該対象からの試料中の該標的ＣＥＡタンパク質の濃度を検出し、それによって、該試料中の他の非標的型のＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、標的ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することを含むことができる。本方法は、該標的ＣＥＡタンパク質の濃度を、該同一の対象から、該癌治療薬による治療前または該癌治療薬による治療中の早期の時点で得られた早期試料中の標的ＣＥＡタンパク質の濃度と比較することを含むことができる。該癌治療薬による治療前または治療中の早期の時点で得られた濃度に対する、該癌治療薬による治療中の後の時点で得られた試料中の標的ＣＥＡ濃度の低下は、該癌治療薬の有効性を示し、それによって、該治療をモニタリングする。
【００３８】
ある実施形態において、標的ＣＥＡタンパク質は、完全長ＣＥＡタンパク質である。ある実施形態において、標的ＣＥＡタンパク質は、短型ＣＥＡタンパク質である。いずれにしても、標的ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する診断試薬は、可溶性および細胞結合型標的ＣＥＡタンパク質の療法に免疫特異的に結合することが想定される。そのような診断試薬はまた、プロ型の標的ＣＥＡタンパク質にも結合することができる。しかしながら、もし、診断的および治療的に関連のあるＣＥＡが、腫瘍上に発現し、体液に存在する成熟ＣＥＡタンパク質であるならば、関連のある試薬は、成熟標的ＣＥＡに免疫特異的に結合するものである。
【００３９】
ある実施形態において、癌治療薬および診断試薬は、同一のタンパク質である。ある実施形態において、癌治療薬および診断試薬は、少なくとも１つの抗原結合フラグメントを共有する。
【００４０】
ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、抗体は、Ａ５Ｂ７（Ａ５Ｂ７として知られるマウスモノクローナル抗体）ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、ＭＥＤＩ−５６５ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、ＩＭＭＵ−４またはアルシツモマブとして知られるマウスモノクローナル抗体ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗ＣＤ３結合部分を含む二重特異性一本鎖抗体ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、Ｈｅｆｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：４９−５７に特定される、ＣＥＡ．６６、Ｔ８４．６６、またはＴ８４．１２ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、Ｄｕｒｂｉｎ（１９９４）ＰＮＡＳ  ９１：４３１３に特定される、ＰＲ１Ａ３ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、Ｌｉｅｒｓｃｈ（２００５）ＪＣＯ  ２３：６７６３に特定される、ラベツズマブではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、製造供給元のカタログ番号＃４０１−８５を用いてＩｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．から供給される、ＣａｎＡｇ  ＣＥＡ  ＥＩＡキット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄｉ．ｃｏｍ／ｗｏｒｌｄ＿ｈｏｍｅ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｍａｎｕａｌ＿ｋｉｔｓ／ｅｉａ＿ｋｉｔｓ／ｃａｎａｇ＿ｃｅａ．ｈｔｍｌ）で得られる抗体ではない。
【００４１】
ある実施形態において、本方法は、該試料中の完全長および／または短型ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度を検出する診断ステップを含むことができる。該方法は、例えば、ＴａｑＭａｎアッセイにおいて、完全長および／または短型ＣＥＡのＲＮＡに対して特異的な定量的ＲＴ−ＰＣＲ、プライマー、および／またはプローブを採用し得、ＳＡＧＥ、ＭＰＳＳ、アレイベースの方法、または直接シークエンシングを採用し得る。
【００４２】
ある実施形態において、試料を得ることは、血液試料、尿試料、糞便試料、または痰試料を得ることを含む。ある実施形態において、試料を得ることは、腫瘍生検標本または他の腫瘍組織試料を得ることを含む。ある実施形態において、試料は、全血、血清、血漿、唾液、尿、糞便、精漿、汗、羊水、痰、母乳、乳頭吸引液、または胸部、胆液、組織ホモジネート、胸水、および腹水からの細胞を含む他の流体のうちの１つ以上から選択される。
【００４３】
別の態様において、本開示は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を発現する癌を患っている対象を治療する方法を提供する。本方法は、ＣＥＡを発現する癌を患っている対象の治療に使用される癌治療薬を選択することを含み、この場合、癌治療薬は、ＣＥＡタンパク質の１つの型に免疫特異的に結合するが、ＣＥＡタンパク質の第２の型には免疫特異的に結合せず、またＣＥＡタンパク質の１つの型は、標的ＣＥＡタンパク質と称される。本方法は、該癌治療薬が免疫特異的に結合するエピトープと同一または実質的に同一である該標的ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子（例えば、診断試薬）を用いて、該対象からの試料中の該標的ＣＥＡタンパク質の濃度を検出し、それによって、該試料中の他の非標的型のＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、該標的ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することを含むことができる。本方法は、該標的ＣＥＡタンパク質の該濃度を、健常な対象からの試料中の標的ＣＥＡタンパク質濃度を反映する標準範囲と比較することを含むことができる。該標準範囲を超える該標的ＣＥＡタンパク質の濃度を検出した場合は、標的ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する癌治療薬に対して強い感受性を示していることになる。本方法は、該対象が、該癌治療薬に対して強い感受性があると判定される場合、標的ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する癌治療薬によって該対象を治療することを含むことができる。本方法は、該癌治療薬が免疫特異的に結合するエピトープと同一または実質的に同一である標的ＣＥＡ上のエピトープに免疫特異的に結合する抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子を用いて、該癌治療薬による治療を受けている該対象からの治療後の試料中の、標的ＣＥＡタンパク質の濃度を検出し、それによって、該試料中の他の非標的型のＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、該標的ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することを含むことができる。本方法は、標的ＣＥＡタンパク質の濃度を、該同一の対象からの、該癌治療薬による治療前、または該治療中の早期の時点で得られた試料中の標的ＣＥＡタンパク質の濃度と比較することを含むことができ、該治療前または該治療中の早期の時点で得られた濃度に対する、該癌治療薬による治療中の後期の時点で得られた試料中の標的ＣＥＡ濃度の低下は、該対象の該治療の有効性を示す。
【００４４】
ある実施形態において、標的ＣＥＡタンパク質は、完全長ＣＥＡタンパク質である。ある実施形態において、標的ＣＥＡタンパク質は、短型ＣＥＡタンパク質である。いずれにしても、標的ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する診断試薬は、可溶性および細胞結合型標的ＣＥＡタンパク質の療法に免疫特異的に結合することが想定される。そのような診断試薬はまた、プロ型の標的ＣＥＡタンパク質にも結合することができる。しかしながら、もし、診断的および治療的に関連のあるＣＥＡが、腫瘍上に発現し、体液に存在する成熟ＣＥＡタンパク質であるならば、関連のある試薬は、成熟標的ＣＥＡに免疫特異的に結合するものである。
【００４５】
ある実施形態において、標的ＣＥＡは、短型ＣＥＡであり、診断試薬は、ＮＩＩＱＮＥＬＳＶＤ（配列番号１１）を含む短型ＣＥＡ多型に対して免疫特異的であるが、ＮＩＩＱＮＫＬＳＶＤ（配列番号１２）を含む短型ＣＥＡ多型に対して免疫特異的ではない。他の実施形態において、診断試薬は、ＮＩＩＱＮＫＬＳＶＤ（配列番号１２）を含む短型ＣＥＡ多型に対して免疫特異的であるが、ＮＩＩＱＮＥＬＳＶＤ（配列番号１１）を含む短型ＣＥＡ多型に対して免疫特異的ではない。他の実施形態において、診断試薬は、前述の短型ＣＥＡ多型の両方に対して免疫特異的である。
【００４６】
ある実施形態において、癌治療薬および診断試薬は、同一のタンパク質である。ある実施形態において、癌治療薬および診断試薬は、少なくとも１つの抗原結合フラグメントを共有する。
【００４７】
ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、抗体は、Ａ５Ｂ７（Ａ５Ｂ７として知られるマウスモノクローナル抗体）ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、ＭＥＤＩ−５６５ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、ＩＭＭＵ−４またはアルシツモマブとして知られるマウスモノクローナル抗体ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗ＣＤ３結合部分を含む二重特異性一本鎖抗体ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、Ｈｅｆｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：４９−５７に特定される、ＣＥＡ．６６、Ｔ８４．６６、またはＴ８４．１２ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、Ｄｕｒｂｉｎ（１９９４）ＰＮＡＳ  ９１：４３１３に特定される、ＰＲ１Ａ３ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、Ｌｉｅｒｓｃｈ（２００５）ＪＣＯ  ２３：６７６３に特定される、ラベツズマブではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、製造供給元のカタログ番号＃４０１−８５を用いてＩｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．から供給される、ＣａｎＡｇ  ＣＥＡ  ＥＩＡキット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄｉ．ｃｏｍ／ｗｏｒｌｄ＿ｈｏｍｅ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｍａｎｕａｌ＿ｋｉｔｓ／ｅｉａ＿ｋｉｔｓ／ｃａｎａｇ＿ｃｅａ．ｈｔｍｌ）で得られる抗体ではない。
【００４８】
ある実施形態において、本方法は、該試料中の完全長および／または短型ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度を検出する診断ステップを含むことができる。該方法は、例えば、ＴａｑＭａｎアッセイにおいて、完全長および／または短型ＣＥＡのＲＮＡに対して特異的な定量的ＲＴ−ＰＣＲ、プライマー、および／またはプローブを採用し得、ＳＡＧＥ、ＭＰＳＳ、アレイベースの方法、または直接シークエンシングを採用し得る。
【００４９】
ある実施形態において、試料を得ることは、血液試料、尿試料、糞便試料、または痰試料を得ることを含む。ある実施形態において、試料を得ることは、腫瘍生検標本または他の腫瘍組織試料を得ることを含む。ある実施形態において、試料は、全血、血清、血漿、唾液、尿、糞便、精漿、汗、羊水、痰、母乳、乳頭吸引液、または胸部、胆液、組織ホモジネート、胸水、および腹水からの細胞を含む他の流体のうちの１つ以上から選択される。
【００５０】
別の態様において、本開示は、対象からの試料中の、完全長ＣＥＡタンパク質またはＲＮＡの濃度および短型ＣＥＡタンパク質またはＲＮＡの濃度を検出する方法と、完全長ＣＥＡタンパク質またはＲＮＡの濃度と短型ＣＥＡタンパク質またはＲＮＡの濃度との比率を判定する方法と、を提供する。
【００５１】
ある実施形態において、本方法は、該比率を、健常な対象からの試料中の、完全長ＣＥＡタンパク質またはＲＮＡの濃度と短型ＣＥＡタンパク質またはＲＮＡの濃度との標準比率を反映する標準と比較することを含む。該標準比率とは著しく異なる比率は、ＣＥＡを発現する癌の存在を示す。
【００５２】
ある実施形態において、完全長ＣＥＡタンパク質の濃度の検出は、完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、短型ＣＥＡタンパク質には免疫特異的に結合しない抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子（例えば、診断試薬）と試料を接触させることを含む。
【００５３】
ある実施形態において、完全長ＣＥＡタンパク質の濃度の検出は、完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、短型ＣＥＡタンパク質には免疫特異的に結合しない抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子（例えば、第１の診断試薬）と試料を接触させることを含み、そして短型ＣＥＡタンパク質の濃度の検出は、短型ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、完全長ＣＥＡタンパク質には免疫特異的に結合しない抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子（例えば、第２の診断試薬）と試料を接触させることを含む。
【００５４】
ある実施形態において、完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する診断試薬は、他のＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーに免疫特異的に結合せず、そして／あるいは、短型ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する診断試薬は、他のＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーに免疫特異的に結合しない。
【００５５】
ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、抗体は、Ａ５Ｂ７（Ａ５Ｂ７として知られるマウスモノクローナル抗体）ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、ＭＥＤＩ−５６５ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、ＩＭＭＵ−４またはアルシツモマブとして知られるマウスモノクローナル抗体ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗ＣＤ３結合部分を含む二重特異性一本鎖抗体ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、Ｈｅｆｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：４９−５７に特定される、ＣＥＡ．６６、Ｔ８４．６６、またはＴ８４．１２ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、Ｄｕｒｂｉｎ（１９９４）ＰＮＡＳ  ９１：４３１３に特定される、ＰＲ１Ａ３ではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、Ｌｉｅｒｓｃｈ（２００５）ＪＣＯ  ２３：６７６３に特定される、ラベツズマブではない。ある実施形態において、診断試薬は、抗体であるが、但し、この抗体は、製造供給元のカタログ番号＃４０１−８５を用いてＩｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．から供給される、ＣａｎＡｇ  ＣＥＡ  ＥＩＡキット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄｉ．ｃｏｍ／ｗｏｒｌｄ＿ｈｏｍｅ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｍａｎｕａｌ＿ｋｉｔｓ／ｅｉａ＿ｋｉｔｓ／ｃａｎａｇ＿ｃｅａ．ｈｔｍｌ）で得られる抗体ではない。
【００５６】
ある実施形態において、本方法は、該試料中の完全長および／または短型ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度を検出する診断ステップを含むことができる。該方法は、例えば、ＴａｑＭａｎアッセイにおいて、完全長および／または短型ＣＥＡのＲＮＡに対して特異的な定量的ＲＴ−ＰＣＲ、プライマー、および／またはプローブを採用し得、ＳＡＧＥ、ＭＰＳＳ、アレイベースの方法、または直接シークエンシングを採用し得る。
【００５７】
ある実施形態において、試料を得ることは、血液試料、尿試料、糞便試料、または痰試料を得ることを含む。ある実施形態において、試料を得ることは、腫瘍生検標本または他の腫瘍組織試料を得ることを含む。ある実施形態において、試料は、全血、血清、血漿、唾液、尿、糞便、精漿、汗、羊水、痰、母乳、乳頭吸引液、または胸部、胆液、組織ホモジネート、胸水、および腹水からの細胞を含む他の流体のうちの１つ以上から選択される。
【００５８】
別の態様において、本開示は、生物学的試料中の短型癌胎児性抗原（ＣＥＡ）ＲＮＡの発現を検出する方法を提供する。本方法は、ＣＥＡヌクレオチド配列にハイブリダイズする核酸プローブまたは核酸プライマーのうちの１つまたは両方であって、このプローブおよび／またはプライマーは、（ｉ）短型ＣＥＡヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするが、完全長ＣＥＡヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズしないこと、または（ｉｉ）短型ＣＥＡの発現と完全長ＣＥＡの発現を区別する様式で、短型ＣＥＡヌクレオチド配列および完全長ＣＥＡヌクレオチド配列の両方に特異的にハイブリダイズすることによって、短型ＣＥＡの発現を特異的に特定する、核酸プローブまたは核酸プライマーを提供する。本方法は、生物学的試料からのＲＮＡを提供することを含むことができる。本方法は、該核酸プローブまたは核酸プライマーを用いて、該生物学的試料中の短型ＣＥＡのＲＮＡの発現を検出することを含む。
【００５９】
ある実施形態において、生物学的試料は、腫瘍組織試料である。
【００６０】
ある実施形態において、発現の検出は、定量的ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ分析を含む。ある実施形態において、発現の検出は、原位置ハイブリダイゼーション分析を含む。ある実施形態において、原位置ハイブリダイゼーション分析は、ＦＩＳＨ（蛍光原位置ハイブリダイゼーション）を含む。ある実施形態において、発現の検出は、ＲＮａｓｅ保護分析またはノーザンブロット分析を含む。ある実施形態において、発現の検出は、マイクロアレイ、ＳＡＧＥ、またはＭＰＳＳを用いた発現の検出を含む。
【００６１】
別の態様において、本開示は、生物学的試料中の短型癌胎児性抗原（ＣＥＡ）タンパク質の発現を検出する方法を提供する。本方法は、短型ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、完全長ＣＥＡタンパク質には免疫特異的に結合しない抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子（例えば、診断試薬）を提供することを含む。本方法は、生物学的試料を提供することを含むことができる。本方法は、該抗体を用いて、該生物学的試料中の短型ＣＥＡタンパク質の発現を検出することを含む。
【００６２】
ある実施形態において、試料を得ることは、血液試料、尿試料、糞便試料、または痰試料を得ることを含む。ある実施形態において、試料を得ることは、腫瘍生検標本または他の腫瘍組織試料を得ることを含む。ある実施形態において、試料は、全血、血清、血漿、唾液、尿、糞便、精漿、汗、羊水、痰、母乳、乳頭吸引液、または胸部、胆液、組織ホモジネート、胸水、および腹水からの細胞を含む他の流体のうちの１つ以上から選択される。ある実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体である。ある実施形態において、モノクローナル抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体である。ある実施形態において、抗体は、ポリクローナル抗体である。ある実施形態において、診断試薬は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質に結合する。
【００６３】
ある実施形態において、発現の検出は、免疫組織化学または免疫細胞化学分析を含む。ある実施形態において、発現の検出は、ＥＬＩＳＡ分析を含む。
【００６４】
別の態様において、本開示は、標的癌胎児性抗原（ＣＥＡ）タンパク質に免疫特異的に結合する癌治療薬に対して感受性がある可能性がある患者を特定する方法を提供する。ある実施形態において、本方法は、患者からの血液または腫瘍試料等を、例えば、腫瘍生検標本を得ることと、腫瘍試料中での標的ＣＥＡのＲＮＡの発現を検出することと、を含む。一例において、標的ＣＥＡのＲＮＡは、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）等の方法を用いて検出される。別例において、標的ＣＥＡのＲＮＡは、大規模並列サイン配列決定（Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＭＰＳＳ）を用いて検出される。別例において、標的ＣＥＡのＲＮＡは、オリゴヌクレオチドアレイまたはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイ等の長型および短型のＣＥＡを特異的に検出することができるマイクロアレイを用いて検出される。別例において、標的ＣＥＡのＲＮＡは、完全長ＣＥＡのＲＮＡ発現と短型ＣＥＡのＲＮＡ発現を区別するプローブおよび／またはプライマーを用いて検出される。別例において、ＣＥＡのＲＮＡは、ｃＤＮＡの形のいずれかで、または適したベクターに、ｃＤＮＡをクローン化した後、逆転写および配列決定され得る。
【００６５】
患者からの腫瘍試料が、該標的ＣＥＡのＲＮＡを発現する場合、この患者は、その標的ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する癌治療薬による治療に対して感受性がある可能性がある。しかしながら、患者からの腫瘍試料が、該標的ＣＥＡのＲＮＡを発現しない場合、この患者は、その標的ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する癌治療薬による治療に対して感受性がない。
【００６６】
ある実施形態において、標的ＣＥＡのＲＮＡ発現の検出は、プローブおよび／またはプライマーと該試料を接触させて、完全長ＣＥＡのＲＮＡの発現を評価することを含む。ある実施形態において、標的ＣＥＡのＲＮＡ発現の検出は、プローブおよび／またはプライマーと該試料を接触させて、短型ＣＥＡのＲＮＡの発現を評価することを含む。ある実施形態において、標的ＣＥＡのＲＮＡ発現の検出は、１つ以上のセットのプローブおよび／またはプライマーと該試料を接触させて、完全長ＣＥＡのＲＮＡおよび短型ＣＥＡのＲＮＡの両方の発現を評価することを含む。
【００６７】
ある実施形態において、本方法は、患者からの１つ以上のさらなる生物学的試料を得ることと、標的ＣＥＡタンパク質の発現について１つ以上の生物学的試料をアッセイすることと、をさらに含む。例えば、これらのさらなる１つ以上の生物学的試料は、完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する抗体と接触させ得る。
【００６８】
ある実施形態において、本方法は、癌治療薬によって該対象を治療することをさらに含む。
【００６９】
別の態様において、本開示は、完全長癌胎児性抗原（ＣＥＡ）タンパク質に対して免疫特異的な抗体を生成する方法を提供する。本方法は、短型ＣＥＡタンパク質に存在しない完全長ＣＥＡタンパク質の一部を提供することと、該抗体を生成するための抗原として、該完全長ＣＥＡタンパク質の一部を使用することと、を含む。
【００７０】
ある実施形態において、抗体は、完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、短型ＣＥＡタンパク質には免疫特異的に結合せず、また、他の関連したＣＥＡＣＡＭタンパク質ファミリーメンバー（ＣＥＡＣＡＭ１、３、４、６、７、および８等）には免疫特異的に結合しない。
【００７１】
ある実施形態において、該抗体は、モノクローナル抗体である。
【００７２】
ある実施形態において、該抗体は、ポリクローナル抗体である。
【００７３】
ある実施形態において、本方法は、該抗体から抗原結合フラグメントを生成することを含む。
【００７４】
ある実施形態において、本方法は、短型ＣＥＡタンパク質に存在しない完全長ＣＥＡタンパク質の一部で非ヒト動物を免疫化することを含む。
【００７５】
別の態様において、本開示は、短型ＣＥＡタンパク質に対して免疫特異的な抗体を生成する方法を提供する。ある実施形態において、本方法は、完全長ＣＥＡタンパク質に存在しない短型ＣＥＡタンパク質に存在する連続するアミノ酸残基の一部を含むフラグメントを提供することと、該抗体を生成するための抗体として、該フラグメントを使用することと、を含む。例示的なフラグメントは、短型ＣＥＡタンパク質に特有のスプライス部位を架橋する連続するアミノ酸残基を含む。
【００７６】
ある実施形態において、フラグメントは、連続するアミノ酸残基：ＮＩＩＱＮＥＬＳＶＤ（配列番号１１）を含む。ある実施形態において、フラグメントは、連続するアミノ酸残基：ＮＩＩＱＮＫＬＳＶＤ（配列番号１２）を含む。いずれにしても、フラグメントはまた、フラグメントの全サイズが、少なくとも１０個、１２個、１４個、１５個、１６個、１８個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、または１００個の連続するアミノ酸であるように、さらなるアミノ酸配列を含むこともできる。
【００７７】
ある実施形態において、フラグメントは、前述のフラグメントと実質的に同一のエピトープを含む。実質的に同一のエピトープを含むフラグメントは、少数（例えば、１、２、３個）の連続するアミノ酸置換を有する前述のフラグメントを含む。
【００７８】
ある実施形態において、抗体は、短型ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、完全長ＣＥＡタンパク質には免疫特異的に結合せず、また、他の関連したＣＥＡＣＡＭタンパク質ファミリーメンバー（ＣＥＡＣＡＭ１、３、４、６、７、および８等）には免疫特異的に結合しない。
【００７９】
ある実施形態において、抗体は、ＮＩＩＱＮＥＬＳＶＤ（配列番号１１）を含む短型ＣＥＡ多型に対して免疫特異的であるが、ＮＩＩＱＮＫＬＳＶＤ（配列番号１２）を含む短型ＣＥＡ多型に対して免疫特異的ではない。他の実施形態において、抗体は、ＮＩＩＱＮＫＬＳＶＤ（配列番号１２）を含む短型ＣＥＡ多型に対して免疫特異的であるが、ＮＩＩＱＮＥＬＳＶＤ（配列番号１１）を含む短型ＣＥＡ多型に対して免疫特異的ではない。他の実施形態において、抗体は、前述の両方の短型ＣＥＡ型に対して免疫特異的である。
【００８０】
ある実施形態において、該抗体は、モノクローナル抗体である。
【００８１】
ある実施形態において、本方法は、該抗体から抗原結合フラグメントを生成することを含む。
【００８２】
ある実施形態において、本方法は、完全長ＣＥＡタンパク質に存在しない短型ＣＥＡタンパク質の一部で非ヒト動物を免疫化することを含む。
【００８３】
別の態様において、本開示は、配列番号１（プロ配列の存在または不在下）で表されるアミノ酸配列を含む精製されたポリペプチド、または連続するアミノ酸残基：ＮＩＩＱＮＥＬＳＶＤ（配列番号１１）を含む、そのフラグメントを提供する。ある実施形態において、本開示は、配列番号１（Ｎ末端および／もしくはＣ末端プロ配列のすべてまたは一部の存在または不在下）で表されるアミノ酸配列を含む精製されたポリペプチド、または連続するアミノ酸残基：ＮＩＩＱＮＫＬＳＶＤ（配列番号１２）を含む、そのフラグメントを提供する。Ｎ末端プロ配列は、約３４個のアミノ酸残基シグナルペプチドであり、Ｃ末端プロ配列は、約１７個のアミノ酸ペプチドである。
【００８４】
ある実施形態において、精製されたポリペプチドは、配列番号１（成熟ＣＥＡが不在のプロ配列の存在または不在下）で表されるアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、精製されたポリペプチドは、連続するアミノ酸残基：ＮＩＩＱＮＥＬＳＶＤ（配列番号１１）を含む配列番号１のフラグメントを含む。ある実施形態において、精製されたポリペプチドは、連続するアミノ酸残基：ＮＩＩＱＮＫＬＳＶＤ（配列番号１２）を含む配列番号１のフラグメントを含む。ある実施形態において、該フラグメントは、約１０個の連続するアミノ酸残基である。ある実施形態において、該フラグメントは、約１２個、１４個、１５個、１６個、１８個、または２０個の連続するアミノ酸である。ある実施形態において、該フラグメントは、約２５個、３０個、３３個、３５個、４０個、４５個、４８個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、または１００個の連続するアミノ酸残基である。ある実施形態において、該フラグメントは、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、または少なくとも５０個の連続するアミノ酸残基である。ある実施形態において、該フラグメントは、２５０個未満、２００個未満、１７５個未満、１５０個未満、１２５個未満、１００個未満、９０個未満、８５個未満、８０個未満、７５個未満、７０個未満、６５個未満、６０個未満、５５個未満、または５０個未満の連続するアミノ酸残基である。ある実施形態において、該フラグメントは、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個、少なくとも２５０個、少なくとも３００個、少なくとも３５０個、または少なくとも４００個の連続するアミノ酸残基である。
【００８５】
ある実施形態において、精製されたポリペプチドは、アジュバントに結合させる。
【００８６】
ある実施形態において、精製されたポリペプチドは、免疫特異的抗体を生成するために使用される。
【００８７】
ある実施形態において、精製されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、免疫特異的抗体を生成するために使用される。
【００８８】
別の態様において、本開示は、本明細書に記載の特性のいずれかを有する診断方法を提供するが、そのなかで、該診断試薬が、患者に投与される。患者に投与した後、ＣＥＡ発現は、インビボ画像技術を用いて可視化することができる。代替として、試料は、患者から採取することができ、ＣＥＡ濃度は、エクスビボで評価することができる（例えば、濃度は、エクスビボでアッセイされるが、診断試薬とＣＥＡタンパク質との間の接触は、インビボで生じる）。本開示の本態様は、本明細書に詳細に記載の本開示の任意の１つ以上の態様および実施形態に適用され、そしてこれらのうちの任意の１つ以上と組み合わせることができる。
【００８９】
前述または後述の態様または実施形態のいずれかのある実施形態において、本方法は、抗ＣＥＡ癌治療薬を用いて、ヒト対象等の対象を治療することを含むことができる。ある実施形態において、そのような抗ＣＥＡ癌治療薬は、検出ステップに使用される診断試薬によって免疫特異的に結合されるものと同一または実質的に同一のエピトープに免疫特異的に結合する。ある実施形態において、抗ＣＥＡ癌治療薬は、抗ＣＥＡ部分および抗ＣＤ３部分を含む二重特異性抗体（二重特異性一本鎖抗体を含む）である。ある実施形態において、抗ＣＥＡ癌治療薬は、二重特異性抗体ＭＥＤＩ−５６５である。ある実施形態において、抗ＣＥＡ癌治療薬は、ＭＥＤＩ−５６５と同一である抗ＣＥＡ部分、またはＭＥＤＩ−５６５と同一もしくは実質的に同一のエピトープに結合する抗ＣＥＡ部分を有する二重特異性抗体である。ある実施形態において、抗ＣＥＡ癌治療薬は、ＭＥＤＩ−５６５と同一である抗ＣＥＡ部分、またはＭＥＤＩ−５６５と同一もしくは実質的に同一のエピトープに結合する抗ＣＥＡ部分を含むが、抗ＣＥＡ治療薬は、二重特異性抗体ではない。ある実施形態において、治療レジメンは、抗ＣＥＡ部分および抗ＣＤ３部分の両方を含む二重特異性抗体（二重特異性一本鎖抗体を含む）による治療を含む。
【００９０】
ある実施形態において、使用されるべき治療薬は、少なくとも、配列番号  ２８〜４４および４６〜５１のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むＣＥＡ結合部分を含む。ある実施形態において、使用されるべき治療薬は、配列番号  ２８〜４４および４７のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む二重特異性抗体である。ある実施形態において、使用されるべき治療薬は、配列番号  ３４、３６、４１、４２、４３、および４７のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む二重特異性抗体である。ある実施形態において、使用されるべき治療薬は、配列番号３７〜４０のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む二重特異性抗体である。ある実施形態において、使用されるべき治療薬は、配列番号４８で表されるアミノ酸配列を含む二重特異性抗体である。ある実施形態において、使用されるべき治療薬は、配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含む二重特異性抗体である。ある実施形態において、使用されるべき治療薬は、配列番号４８および４９で表されるアミノ酸配列を含む二重特異性抗体である。ある実施形態において、使用されるべき治療薬は、配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含む二重特異性抗体である。前述または上の実施形態のいずれかにおいて、配列番号４６は、Ｃ末端上に６つのヒスチジンをさらに含むことができる。
【００９１】
前述または後述の態様または実施形態のいずれかのある実施形態において、癌治療薬は、該検出ステップで使用される該抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子（例えば、診断試薬）によって免疫特異的に結合されるものと同一または実質的には同一であるＣＥＡタンパク質上のエピトープに免疫特異的に結合する。
【００９２】
前述または後述の態様または実施形態のいずれかのある実施形態において、本方法は、１つを超える診断ステップを含み、同一の診断試薬は、それぞれの診断ステップで使用される。ある実施形態において、本方法は、１つを超える診断ステップを含むが、同一の診断試薬は、すべてのステップで使用されず、診断試薬のそれぞれは、同一または実質的に同一のエピトープに結合する。
【００９３】
前述または後述の態様または実施形態のいずれかのある実施形態において、対象は、ヒトである。
【００９４】
前述または後述の態様または実施形態のいずれかのある実施形態において、診断および／または治療試薬は、ヒトＣＥＡに免疫特異的に結合する。
【００９５】
前述または後述の態様または実施形態のいずれかのある実施形態において、診断ステップ（複数可）は、エクスビボで（例えば、患者の体外で）行われる。
【００９６】
前述または後述の態様または実施形態のいずれかのある実施形態において、本方法は、１つ以上の治療ステップを含む。例示的な治療には、外科手術、化学療法、放射線療法、免疫療法、生物学的療法、薬草療法、鍼療法、または抗ＣＥＡ癌治療薬療法のうちの１つ以上が含まれる。適した治療レジメンには、適した医療専門家によって規定された用量および時間的経過に従って送達されるこれらおよび他の治療法のうちの任意の１つ以上が含まれる。
【００９７】
前述または後述の態様または実施形態のいずれかのある実施形態において、癌治療薬は、タンパク質治療薬を含む。ある実施形態において、タンパク質治療薬は、抗体または抗原結合フラグメントである。ある実施形態において、抗体または抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体由来である。ある実施形態において、モノクローナル抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体である。ある実施形態において、タンパク質治療薬は、配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質（成熟完全長ヒトＣＥＡ）に免疫特異的に結合する。ある実施形態において、タンパク質治療薬は、プロ配列の存在および／または不在下で、配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質に免疫特異的に結合するが、このタンパク質治療薬は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質には免疫特異的に結合しない。ある実施形態において、タンパク質治療薬は、（プロ配列の存在および／または不在下で）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質に免疫特異的に結合するが、このタンパク質治療薬は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質には免疫特異的に結合せず、他のＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーには免疫特異的に結合しない。ある実施形態において、タンパク質治療薬は、抗体Ａ５Ｂ７の抗原結合ドメインを含む。ある実施形態において、タンパク質治療薬は、二重特異性抗体である。ある実施形態において、二重特異性抗体は、ＭＥＤＩ−５６５である。
【００９８】
前述または後述の態様または実施形態のいずれかのある実施形態において、試料（例えば、診断試験が行われる生物学的試料）は、  全血、血清、血漿、唾液、尿、糞便、精漿、汗、羊水、痰、母乳、乳頭吸引液、または胸部、胆液、組織ホモジネート、胸水、および腹水からの細胞を含む他の流体のうちの１つ以上から選択される。ここで留意すべきは、そのような生物学的試料は、細胞および非細胞成分の両方を含有するかもしれないということである。ある実施形態において、試料は、腫瘍組織試料である。複数の試料が採取される実施形態では、本開示は、これらの試料のそれぞれが、同一の組織源（例えば、血清または糞便）に由来するかもしれないし、あるいは試料が、異なる組織源に由来するかもしれないことを考える。さらに、本開示は、診断ステップが、単一の供給源からの試料中のＣＥＡの発現または濃度を検出することを含むかもしれないし、あるいは１つを超える組織源からの試料中のＣＥＡ発現または濃度を検出することを含むかもしれないことを考える。
【００９９】
前述または後述の態様または実施形態のいずれかのある実施形態において、ＣＥＡを発現する癌は、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、食道癌、胃食道癌、胃癌、肺癌、および乳癌のうちの任意の１つ以上であり得る。ある実施形態において、ＣＥＡを発現する癌は、結腸癌である。ある実施形態において、癌のタイプ（例えば、膵臓または結腸）の分類とは、初発腫瘍の分類を指すが、転移が、他の組織に現れる場合があることが認識される。そのような場合には、癌は、例えば、癌が非結腸組織に転移する可能性があっても、ＣＥＡを発現する結腸癌として、なおも分類される。本明細書で論じるいずれの癌は、原発性または転移性（例えば、転移性結腸癌）であり得る。
【０１００】
前述または後述の態様または実施形態のいずれかのある実施形態において、検出ステップは、該抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子と試料を接触させることと、免疫組織化学または免疫細胞化学によって完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することと、を含む。前述または後述の態様または実施形態のいずれかのある実施形態において、検出ステップは、該抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子と試料を接触させることと、ＥＬＩＳＡによって完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することと、を含む。
【０１０１】
前述または後述の態様または実施形態のいずれかのある実施形態において、診断試薬は、モノクローナル抗体である。ある実施形態において、モノクローナル抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、ポリクローナル抗体である。
【０１０２】
前述または後述の態様または実施形態のいずれかのある実施形態において、検出ステップは、診断試薬（該抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子）と試料を接触させることであって、この抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子は、配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質に免疫特異的に結合する、接触させることと、免疫組織化学またはＥＬＩＳＡによって、完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することと、を含む。
【０１０３】
前述または後述の態様または実施形態のいずれかのある実施形態において、検出ステップは、抗体Ａ５Ｂ７の抗原結合ドメインを含む抗体または抗原結合フラグメントと試料を接触させることを含むが、但し、この抗体は、Ａ５Ｂ７ではない。
【０１０４】
前述または後述の態様または実施形態のいずれかのある実施形態において、検出ステップは、Ａ５Ｂ７と同一または実質的には同一のエピトープに結合する抗原結合ドメインを含む抗体または抗原結合フラグメントと該試料を接触させることを含むが、但し、この抗体は、Ａ５Ｂ７ではない。
【０１０５】
前述または後述の態様または実施形態のいずれかのある実施形態において、検出ステップは、Ａ５Ｂ７と同一または実質的には同一のエピトープに結合する抗原結合ドメインを含む抗体または抗原結合フラグメントと該試料を接触させることを含むが、但し、この抗体は、Ａ５Ｂ７またはＭＥＤＩ−５６５ではない。
【０１０６】
前述または後述の態様または実施形態のいずれかのある実施形態において、癌治療薬は、抗ＣＥＡ部分および抗ＣＤ３部分を含む二重特異性抗体（二重特異性一本鎖抗体を含む）を含む。前述または後述の態様または実施形態のいずれかのある実施形態において、癌治療薬は、ＭＥＤＩ−５６５を含む。前述または後述の態様または実施形態のいずれかのある実施形態において、診断試料は、抗ＣＥＡ部分および抗ＣＤ３部分を含む二重特異性抗体（二重特異性一本鎖抗体を含む）を含む。前述または後述の態様または実施形態のいずれかのある実施形態において、診断試薬は、ＭＥＤＩ−５６５である。前述または後述の態様または実施形態のいずれかのある実施形態において、癌治療薬および診断試薬はともに、抗ＣＥＡ部分および抗ＣＤ３部分を含む二重特異性抗体（二重特異性一本鎖抗体を含む）を含む。前述または後述の態様または実施形態のいずれかのある実施形態において、癌治療薬および診断試薬はともに、ＭＥＤＩ−５６５を含む。
【０１０７】
前述または後述の態様または実施形態のいずれかのある実施形態において、診断試薬は、Ａ５Ｂ７（Ａ５Ｂ７として知られるマウスモノクローナル抗体）、アルシツモマブ、ＣＥＡ．６６、Ｔ８４．６６、Ｔ８４．１２、ＰＲ１Ａ３、またはラベツズマブから選択される。
【０１０８】
前述または後述の態様または実施形態のいずれかのある実施形態において、癌治療薬は、ＭＥＤＩ−５６５、あるいはＭＥＤＩ−５６５と同一である、またはＭＥＤＩ−５６５と同一もしくは実質的には同一のエピトープに結合する抗ＣＥＡ部分を含む抗体を含む。前述または後述の態様または実施形態のいずれかのある実施形態において、診断試薬は、ＭＥＤＩ−５６５、あるいはＭＥＤＩ−５６５と同一である、またはＭＥＤＩ−５６５と同一もしくは実質的には同一のエピトープに結合する抗ＣＥＡ部分を含む抗体である。前述または後述の態様または実施形態のいずれかのある実施形態において、癌治療薬および診断試薬はともに、ＭＥＤＩ−５６５を含むか、あるいは、ＭＥＤＩ−５６５と同一である、またはＭＥＤＩ−５６５と同一もしくは実質的には同一のエピトープに結合する抗ＣＥＡ部分を含む。
【０１０９】
ある実施形態において、診断試薬（例えば、抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子）は、完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、短型ＣＥＡタンパク質には免疫特異的に結合しない。いくつかの実施形態において、診断試薬はまた、他の関連したＣＥＡＣＡＭタンパク質ファミリーメンバー（ＣＥＡＣＡＭ１、３、４、６、７、および８等）に免疫特異的に結合しない。したがって、ある実施形態において、診断試薬は、汎ＣＥＡファミリーメンバー抗体ではないが、完全長ＣＥＡタンパク質に対して特異的である。
【０１１０】
完全長（または短型）ＣＥＡに免疫特異的に結合する診断または治療試薬に対する特異性は、成熟ＣＥＡに対する免疫特異性（プロ配列の存在または不在に関係なく）を指すことを目的とする。しかしながら、成熟完全長ＣＥＡタンパク質に対して免疫特異的な抗体はまた、プロ配列の存在下で、完全長ＣＥＡに免疫特異的に結合することができることも容易に理解されよう。同様に、短型ＣＥＡタンパク質に対して免疫特異的な抗体はまた、プロ配列の存在（または不在）下で、短型ＣＥＡに免疫特異的に結合することができる。抗体が、成熟標的ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する（そして、非標的ＣＥＡタンパク質には免疫特異的に結合しない）限り、標的ＣＥＡタンパク質に対して免疫特異性があると見なされる。しかしながら、その成熟標的ＣＥＡに対応するプロタンパク質は、別の型または非標的型のＣＥＡであるとは見なされない。同様に、可溶性および膜に固定された成熟標的ＣＥＡの両方への結合は、非標的型のＣＥＡへの結合であるとは見なされない。
【０１１１】
前述または後述のいずれかのある実施形態において、ＣＥＡ濃度は、健常な対象からの試料中の完全長ＣＥＡタンパク質濃度を反映する標準範囲と比較される。ある実施形態において、標準範囲は、非喫煙者の血清中の３ｕｇ／Ｌ（３ｎｇ／ｍＬ）以下であり、喫煙者の血清中の５ｕｇ／Ｌ（５ｎｇ／ｍＬ）以下である。ある実施形態において、標準範囲は、喫煙状態に関わらず、血清中の５ｕｇ／Ｌ（５ｎｇ／ｍＬ）以下である。
【０１１２】
本開示は、前述の態様および実施形態のいずれかのすべての組み合わせ、ならびに、詳細の説明および実施例に記載される実施形態のいずれかとの組み合わせを企図する。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】図１Ａは、完全長ＣＥＡおよび短型ＣＥＡのエキソン構造の略図を提供する。ボックスは、エキソンを表し、エキソンは、番号付けされる。スプライス変異短型ＣＥＡは、完全長ＣＥＡと比較して、エキソン３および４、ならびにエキソン２の一部を欠損している。図１Ｂは、完全長および短型ＣＥＡのドメイン構造の表示を提供する。ＩｇＶ様は、免疫グロブリン変異様ドメインを指し、Ｉｇは、変異性免疫グロブリン様ドメインを指す。これらの略図の線は、原形質膜へのタンパク質のＧＰＩ連結を示す。それぞれのタンパク質のＮ末端は、それぞれの略図の左側から開始する。
【図２】完全長ＣＥＡおよび短型ＣＥＡ（ＣＥＡスプライス変異）におけるアミノ酸配列のアラインメントを提供する。図２では、ＣＥＡタンパク質が黒いボックス内に示されるＮ末端およびＣ末端プロ配列によって示される。これらのプロ配列は、通常、成熟ＣＥＡタンパク質に存在しない。短型ＣＥＡ（ＣＥＡスプライス変異）のアミノ酸配列は、配列番号１として提供される。Ｎ末端およびＣ末端プロ配列がない、成熟完全長ＣＥＡのアミノ酸配列が、配列番号２として提供される。実施例において抗体結合に重要と特定されるタンパク質の領域はまた、囲まれ、そして「エピトープ残基３２６−３４９」および「エピトープ残基３８８−４１０」として表示されることに留意されたい。図２では、これらの領域は、付番を用いて示され、これはＮ末端シグナル配列を含む。したがって、これらの領域はまた、「エピトープ残基２９２−３１５」および「エピトープ残基３５４−３７６」として成熟ＣＥＡタンパク質と関連する付番を用いて表示され得る。
【図３】完全長ＣＥＡのドメイン構造と短型ＣＥＡのドメイン構造との比較を提供する。図３において、Ｉｇは、免疫グロブリン様ドメインを指し、Ｖ−ｓｅｔは、Ｉｇ可変領域様Ｎ末端ドメインを指し、番号は、成熟タンパク質の順次的なＶ−ｓｅｔおよびＩｇドメインを表す。また、これらのＩｇドメインはＩｇＣドメインと称され、１から６まで順次的に付番されることを留意されたい。図３に提供される略図は、図１Ｂに提供される略図の代替的な図である。
【図４】短型ＣＥＡの発現に対するＣＨＯ細胞の単一細胞クローンのスクリーニングの結果を提供する。短型ＣＥＡの配列を保持するレンチウイルスに感染したＣＨＯ細胞が、短型ＣＥＡの細胞表面発現に対してスクリーニングされた。実験は、ＦＡＣＳベースのアプローチを用いて、ＩｇＧ  Ｂ９および抗ＣＥＡＣＡＭ５のモノクローナル抗体を用いて行われた。＜ＦＩＴＣ−Ａ＞は、結合抗体の関連蛍光強度を意味する。図の右側に沿った７２シリーズの番号は、細胞株クローン番号を指す。ＣＥＡの発現を欠損する親ＣＨＯ細胞は、ＣＨＯ  ｄｈｆｒ−と称する。完全長ヒトＣＥＡを発現するＣＨＯ細胞は、ＣＨＯｈｕＣＥＡと称する。
【図５】短型ＣＥＡを発現する、単一細胞ＣＨＯ細胞クローン７２−４および７２−１４に結合する様々な抗ＣＥＡ抗体の能力を示す。ＦＩＴＣ−Ａは、結合抗体の関連蛍光強度を意味する。２°のみとは、一次抗体の不在下で結合される二次抗体に共役される抗マウスＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８を指す。パネルＡは、ＣＥＡの発現を欠損する親ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞で観察されたＣＥＡ（完全長または短型）の発現の欠損を示す。パネルＢは、Ｂ９  ＩｇＧおよびＣＥＡＣＡＭ５抗体、ならびに汎抗体ＣＥＡＣＡＭ１、３、４、５、６およびＣＥＡＣＡＭ１、３、５、６が、完全長ＣＥＡを発現するＣＨＯ細胞に結合することを示す。パネルＣは、ＣＥＡＣＡＭ５抗体がまた、短型ＣＥＡを発現するＣＨＯ細胞クローン７２−４にも結合することを示す。しかしながら、Ｂ９  ＩｇＧ、ならびに汎抗体ＣＥＡＣＡＭ１、３、４、５、６およびＣＥＡＣＡＭ１、３、５、６は、クローン７２−４に著しく結合するとは思われない。パネルＤは、ＣＥＡＣＡＭ５抗体がまた、短型ＣＥＡを発現するＣＨＯ細胞クローン７２−１４にも結合することを示す。しかしながら、Ｂ９  ＩｇＧ、ならびに汎抗体ＣＥＡＣＡＭ１、３、４、５、６およびＣＥＡＣＡＭ１、３、５、６は、クローン７２−１４に著しく結合するとは思われない。
【図６】短型ＣＥＡを発現するＣＨＯ細胞のＭＥＤＩ−５６５によってＴ細胞媒介殺作用を検査する実験の結果を示す。完全長ＣＥＡを発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯｈｕＣＥＡ；丸）、ＣＥＡ発現を欠損する親ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ  ｄｈｆｒ−；四角）、および短型ＣＥＡを発現するＣＨＯ細胞のクローン７２−４および７２−１４（ＣＨＯ−ＣＥＡ  ＳＶ  ７２−４；三角、およびＣＨＯ−ＣＥＡ  ＳＶ  ７２−１４；逆三角）は、ＭＥＤＩ−５６５の存在下で、２人の個人（ドナー１および２）からのＣＤ３＋濃縮されたＴ細胞による殺作用に対する感受性について試験された。パネルＡは、ドナー１からの試料を用いた実験からの結果を示し、完全長ＣＥＡを発現する細胞が、ＭＥＤＩ−５６５の存在下でのみ、Ｔ細胞媒介殺作用に対して感受性があることを示す。パネルＢは、ドナー２からの試料を用いて得られた類似の結果を示す。
【図７】短型ＣＥＡを発現するＣＨＯ細胞クローンの存在下で、ＭＥＤＩ−５６５によるヒトＴ細胞の活性化を検査する実験の結果を示す。ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化は、増加した表面ＣＤ２５レベルによって査定される。ＣＤ２５−ＰＥ−ＭＦＩは、結合したＰＥ標識のマウス抗ヒトＣＤ２５抗体の蛍光強度を意味することを指す。ドナー１（パネルＡ）またはドナー２（パネルＢ）からのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、様々な用量のＭＥＤＩ−５６５、および（ｉ）完全長ＣＥＡを発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯｈｕＣＥＡ；丸）、（ｉｉ）ＣＥＡ発現を欠損する親ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ  ｄｈｆｒ−；四角）、（ｉｉｉ）短型ＣＥＡを発現するＣＨＯ細胞のクローン７２−４（ＣＨＯ−ＣＥＡ  ＳＶ  ７２−４；三角）、または（ｉｖ）短型ＣＥＡを発現するＣＨＯ細胞のクローン７２−１４（ＣＨＯ−ＣＥＡ  ＳＶ  ７２−１４；逆三角）のいずれかとともにインキュベートされた。パネルＡは、ドナー１からの試料を用いた実験の結果を示し、ＭＥＤＩ−５６５が、完全長ＣＥＡを発現するＣＨＯ細胞の存在下でのみ、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞が活性化することを示す。パネルＢは、ドナー２からの試料を用いて得られた類似の結果を示す。
【図８】ヒトＣＥＡの欠失変異体を検査する実験の結果を示す。欠失変異体は、表示されたＩｇＣ様ドメインを欠失させることによって、構築された（パネルＡ）。欠失変異体および野生型ＣＥＡの発現は、抗ＣＥＡポリクローナル抗体を用いてモニタリングされた（「ポリ」、パネルＢの上列）。形質移入体は、１０μｇ／ｍＬのＭＥＤＩ−５６５、続いて、抗−ペンタ−Ｈｉｓ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８（配列番号２７として開示される「ペンタ−Ｈｉｓ」）とともにインキュベートされ、フローサイトメトリーによって検出された（パネルＢの下列）。
【図９】ＣＥＡのＩｇＣ３ドメインとＩｇＣ５ドメインとの間のスワップ変異体を検査する実験の結果を示す。配列相同分析は、ＣＥＡのＩｇＣ３ドメインとＩｇＣ５ドメインとの間で異なる２１個の残基を示した（パネルＡ）。スワップ変異体を生成する３つのセグメントが、ＩｇＣ３ドメインおよびＩｇＣ５ドメインにおいて、Ａ、Ｂ、およびＣとして定義された（パネルＡ）。スワップ変異体は、Ｎドメイン、ＩｇＣ３またはＩｇＣ５ドメイン、およびＧＰＩ領域をコードするテンプレートとして、短縮型タンパク質ＩｇＣ３＿ＧＰＩまたはＩｇＣ５＿ＧＰＩを用いて、ＩｇＣ３とＩｇＣ５との間でセグメントＡ、Ｂ、またはＣを交換することによって構築された（パネルＢ）。スワップ変異体の発現は、抗ＣＥＡポリクローナル抗体を用いてモニタリングされた（「ポリ」、パネルＣの上列）。形質移入体は、１０μｇ／ｍＬのＭＥＤＩ−５６５、続いて、ペンタ−Ｈｉｓ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８（配列番号２７として開示される「ペンタ−Ｈｉｓ」）とともにインキュベートされ、フローサイトメトリーによって検出された（パネルＣの下列）。ＩｇＣ３のセグメントＡ（ＫＯ＿Ａ）またはＣ（ＫＯ＿Ｃ）とＩｇＣ５の対照物との置換は、ＭＥＤＩ−５６５の結合を破壊した。ＩｇＣ５へのＩｇＣ３のセグメントＡおよびＣの両方の接合は、ＭＥＤＩ−５６５への結合の増大をもたらした。
【図１０】ＭＥＤＩ−５６５の結合に関与したＣＥＡの必須残基を検査する実験の結果を示す。ＩｇＣ３のセグメントＡおよびＣにおいて、ＩｇＣ３とＩｇＣ５との間で異なる残基は、ＩｇＣ５：Ｆ２９２Ｔ２９４Ｎ２９９（ＫＯ＿ＦＴＮ）、Ｎ２９９Ｅ３０４（ＫＯ＿ＮＥ）、Ｅ３０４Ｌ３０９Ｉ３１５（ＫＯ＿ＥＬＩ）、Ｖ３５４、Ｇ３５５Ｐ３５６Ｅ３５８（ＫＯ＿ＶＧＰＥ）、Ｅ３６４Ｌ３６５Ｖ３６７Ｄ３６８Ｈ３６９（ＫＯ＿ＥＬＶＤＨ）、およびＩ３７４Ｎ３７６（ＫＯ＿ＩＮ）の対応する残基で置き換えられた（パネルＡ）。変異体ＫＯ＿ＦＴＮおよびＫＯ＿ＮＥは、ＭＥＤＩ−５６５に結合しないことを示した（パネルＡ）。ＣＥＡのＩｇＣ３ドメインのモデル構造は、ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬワークスペースを用いたテンプレートとして、マウスＣＥＡＣＡＭ１Ａ（３３．７％の配列相同性）の結晶構造を用いて、構築された（パネルＢ）。モデル構造は、セグメントＣにおける残基の２つのクラスター（Ｖ３５４Ｇ３５５Ｐ３５６Ｅ３５８およびＩ３７４Ｎ３７６）が、セグメントＡの必須残基Ｎ２９９に空間的に近接したことを示した。パネルＡの結果およびモデル構造に基づいて、ＩｇＣ５の対応する残基によるＩｇＣ３のＮ２９９の置き換え（ＫＯ＿Ｎ）、ＩｇＣ５の対照物によるＩｇＣ３のＶ３５４Ｇ３５５Ｐ３５６Ｅ３５８およびＩ３７４Ｎ３７６の置換（ＫＯ＿ＶＧＰＥ＋ＩＮ）、ならびにＩｇＣ５へのＩｇＣ３のＦ２９２Ｔ２９４Ｎ２９９、Ｖ３５４Ｇ３５５Ｐ３５６Ｅ３５８、およびＩ３７４Ｎ３７６の接合（ＫＩ＿ＦＴＮ＋ＶＧＰＥ＋ＩＮ）による、３つのさらなる変異体が構築された（パネルＣ）。残基Ｎ２９９のノックアウトは、ＭＥＤＩ−５６５結合を破壊した。ＩｇＣ５へのＦ２９２Ｔ２９４Ｎ２９９、Ｖ３５４Ｇ３５５Ｐ３５６Ｅ３５８、およびI３７４Ｎ３７６の接合は、ＭＥＤＩ５６５の結合の増大をもたらした。アミノ酸付番は、成熟ＣＥＡタンパク質に基づく。
【図１１】短型スプライス変異体にわたる完全長ＣＥＡに対するＭＥＤＩ−５６５の特異性を検査する実験の結果を示す。パネルＡは、フローサイトメトリーによって判定されるような、ＣＨＯ細胞中の完全長ＣＥＡおよびＣＥＡスプライス変異体タンパク質の発現を示す。ＭＥＤＩ−５６５（１０μｇ／ｍＬ）およびＣＥＡＣＡＭ５特異的ｍＡｂ（クローン２６／３／１３；１０μｇ／ｍＬ）が、それぞれ、完全長ＣＥＡの発現レベル、ならびにＣＨＯ細胞中の完全長ＣＥＡおよびＣＥＡスプライス変異体発現の同時発現を、フローサイトメトリーによって検出するために使用された。マウスＩｇＧ１、マウスＩｇＧ１対照抗体。＜ＦＩＴＣ−Ａ＞、ＦＩＴＣチャネルの蛍光。ＭＥＤＩ−５６５を媒介したヒトＴ細胞殺作用は、パネルＢに示される。ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化は、それぞれ、パネルＣおよびＤに示される。パネルＢでは、ＣＨＯ  ＤＨＦＲ−、ＣＨＯ  ＦＬ、ＣＨＯ  ＳＶ、およびＣＨＯ  ＦＬ＋ＳＶ細胞が、表示された濃度で、ＭＥＤＩ−５６５の存在下で、３人の個々のドナーからのＣＤ３＋Ｔ細胞による殺作用へのそれらの感受性について試験された。実験は、正副の二通りで行われた。列挙されたＥＣ５０値は、３人のドナーの間の平均値±標準誤差を示す。ｐ＝０．７９は、ＣＨＯ  ＦＬ  ＣＥＡとＣＨＯ  ＦＬ  ＋  ＳＶ  ＣＥＡ細胞との間のＥＣ５０値の細胞毒性を比較する。３人の健常なドナーのそれぞれから単離されたＣＤ８＋（パネルＣ）およびＣＤ４＋（パネルＤ）のＴ細胞の活性化（増加した表面ＣＤ２５レベル）は、パネルＢに示される細胞毒性アッセイを用いて同時に調査された。ｐ＝０．６０は、ＣＨＯ  ＦＬ  ＣＥＡとＣＨＯ  ＦＬ  ＋  ＳＶ  ＣＥＡとの間のＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化ＥＣ５０値を比較する；ｐ＝０．１５は、ＣＨＯ  ＦＬ  ＣＥＡとＣＨＯ  ＦＬ＋ＳＶ  ＣＥＡとの間のＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化ＥＣ５０値を比較する。ＭＦＩ  ＣＤ２５−ＡＰＣ＝結合型ＡＰＣ標識の抗ヒトＣＤ２５ｍＡｂの平均蛍光強度。実験は、再度繰り返され、同様の結果を得た。
【発明を実施するための形態】
【０１１４】
（ｉ）  序文
癌胎児性抗原（ＣＥＡ；ＣＥＡＣＡＭ５；ＣＤ６６ｅ）は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのＣＥＡ関連細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）ファミリーに属するグリコシル化ヒト腫瘍胎児抗原である。ＣＥＡＣＡＭ５は、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ７、およびＣＥＡＣＡＭ８と密接に関連する。ＣＥＡは、細胞と細胞の接着を媒介し、腸の細菌定着を促進し、感染性細菌を結合および捕捉することによって微生物感染から結腸を保護することが示唆されている。本明細書に使用されるように、ＣＥＡとは、ＣＥＡＣＡＭ５、特に、ヒトＣＥＡＣＡＭ５を指す。
【０１１５】
ＣＥＡは、偏光様式での上皮性起源（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ，１９９９）の正常組織中に低いレベルで発現され、そのような発現は、細胞の内腔部分でのみ観察される。対照的に、ＣＥＡの発現は、癌腫（結腸、膵臓、胃、食道、肺、胸部、子宮、卵巣、および子宮内膜を含む）および黒色腫のサブセット（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ，１９９９、Ｓａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９４）中で高い。癌細胞は、ＣＥＡの偏光（内腔）発現を欠失するだけでなく、ＣＥＡの高血中濃度をもたらす、ホスホリパーゼの作用によってそれらの表面からＣＥＡを能動的に切断する（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ，１９９９）。
【０１１６】
ＣＥＡの血中濃度は、胃腸癌を患っている患者における、有用な予後指標としての役割を果たし（Ｄｕｆｆｙ，２００１，Ｌｏｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００６、Ｒｏｔｈｅｒ，２００７）、上昇した濃度は、不良な予後を示し、低下した全生存と相関する。さらに、ＣＥＡを発現する癌を治療するために開発されている療法がある。診断ツールおよび推定治療薬の開発にもかかわらず、ＣＥＡについての多くが依然として不明である。
【０１１７】
本明細書に記載の実験前に、タンパク質が細胞表面に結合していることそしてタンパク質が血清および他の流体中に観察されるにもかかわらず、ある癌細胞に発現し、血清、および他の体液に流れるＣＥＡは、単一タンパク質であることが仮定された。換言すると、ＣＥＡ発現を検出した試薬が、細胞表面上に発現し、ある流体中に見出される単一タンパク質の発現を検出し、そして治療効果を提供するためにＣＥＡを標的とした化合物が、このタンパク質に結合すると仮定された。しかしながら、本明細書に詳述されるように、ＣＥＡは、一般に、ＣＥＡと称される約７０２アミノ酸タンパク質（成熟タンパク質には存在しない約３４アミノ酸Ｎ末端シグナルペプチドプロ配列および約１７アミノ酸Ｃ末端プロ配列の除去前）に対応する完全長型、ならびに本明細書で短型ＣＥＡと称されるスプライス変異体の少なくとも２つの型で存在すると思われる。２つの型のＣＥＡの存在は、細胞内のまたは流体中のＣＥＡの検出に基づく診断試験の特異性および関連性について質問を提起する。例えば、診断試験が、完全長および短型ＣＥＡの両方を認識することができる試薬に無意識のうちに依存する場合、試験が、生物学的関連性の一貫した結果を提供するかどうか明らかではない。このようなことを踏まえて、短型ＣＥＡの特定、およびヒトＣＥＡが、完全長および短型の両方（これらの両方は、細胞表面上または流体中に検出することができる）に存在するという正しい認識は、改善された診断試薬および治療試薬の作製および試験を可能にするという重要な情報を提供することになる。
【０１１８】
さらに、本明細書に詳述されるように、短型ＣＥＡの特定は、健常な患者からの試料において、ならびにＣＥＡを発現する癌および生物学的流体においての短型ＣＥＡの発現の分析を可能にする。さらになお、短型ＣＥＡの特定は、例えば、完全長ＣＥＡ対短型ＣＥＡの発現の一致／不一致、短型ＣＥＡ発現の予後値、短型ＣＥＡに対する完全長ＣＥＡの比率の予後値、ならびに完全長あるいは短型ＣＥＡのいずれかを標的化するが、両方を標的としない特定の診断試薬の生成、および／または最適化の分析を可能にする。さらに、２つの型のＣＥＡの存在の評価、ならびにこのような型の１つのみに特異的な診断試薬および治療試薬を生成する潜在的価値の評価は、適合した試薬の使用を可能にする。つまり、ヘルスケアプロバイダーは、診断目的のために、患者の治療計画の一部として、ＣＥＡを標的とする治療試薬によって認識されるものと同一または実質的に同一のＣＥＡのエピトープを認識する試薬を選択することができる。この適合型は、診断および治療試薬が、ＣＥＡ型に対して同一の特異性を有することを保証する。理論によって拘束されることなく、そのような適合は、治療効果と診断データとの間の相関を改善する可能性がある。
【０１１９】
ある態様および実施形態において、本開示の方法は、治療試薬（例えば、癌治療薬）として同一または実質的に同一のエピトープに結合する診断試薬を利用する。これに関連して、２つの試薬は、それらが互いに競合することができる場合、関連濃度で、そのエピトープに結合するために、実質的に同一のエピトープに結合する。例えば、重複するエピトープに結合する試薬は、実質的に同一のエピトープに結合する試薬と称する。そのような抗体は、競合的阻害剤であると言われる場合がある。
【０１２０】
（ｉｉ）  専門用語
さらなる詳しく本開示の説明を続ける前に、本開示が、特定の組成物またはプロセスステップに限定されないことを理解すべきである。そのようなものは変わり得るものであるからである。本明細書および添付の特許請求の範囲中に使用する場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかにそうではないと示していない限り、複数の指示対象を包含していることに留意しなければならない。
【０１２１】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に受け入れられた１文字コードにより言及され得る。
【０１２２】
抗体の、可変領域中のアミノ酸の付番、相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）は、別途指示されない限り、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ．（１９９１）に記述されるような、Ｋａｂａｔの定義に従う。この付番系を用いて、実際の直線状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの短縮、またはそれらへの挿入に対応する、少数のまたはさらなるアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後ろの単一のアミノ酸挿入物（Ｋａｂａｔによれば、残基５２）および重鎖ＦＲ残基８２の後ろに挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによれば、残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔ付番は、この抗体の配列の、「標準」Ｋａｂａｔ付番配列との相同性の領域でのアラインメントによって、所定の抗体について決定され得る。フレームワーク残基の最大アラインメントは、しばしば、Ｆｖ領域に使用されるべき、付番系の「スペーサー」残基の挿入を必要とする。加えて、任意の所定のＫａｂａｔ部位番号でのある特定の個々の残基の同一性は、種間または対立遺伝子の相違のため、抗体鎖間で変化してもよい。
【０１２３】
免疫グロブリンとしても知られている、本明細書に使用される「抗体および抗体群」は、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの異なるエピトープ結合フラグメントから形成された多特異的抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ′）２フラグメント、所望の生物学的活性を示す抗体フラグメント（例えば、抗原結合部分）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本開示の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、イントラボディー、ならびに上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを包含する。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性なフラグメント、すなわち、少なくとも１つの抗原結合部位を含有する分子を含む。免疫グロブリン分子は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、サブアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはアロタイプ（例えば、Ｇｍ、例えば、Ｇ１ｍ（ｆ、ｚ、ａ、もしくはｘ）、Ｇ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（ｇ、ｂ、もしくはｃ）、Ａｍ、Ｅｍ、およびＫｍ（１、２、もしくは３））からのものであり得る。抗体は、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス等、またはトリ（例えば、ニワトリ）等の他の動物を含むが、これらに限定されない、いずれの哺乳動物に由来してもよい。
【０１２４】
本明細書に使用される「免疫グロブリン様分子」という用語は、抗体模倣体または抗体様スカフォールドを指す。ある実施形態において、免疫グロブリン様分子は、一本鎖抗体、ダイアボディ、ミニボディ等の非免疫グロブリン抗原結合スカフォールドを含む任意のポリペプチドであり得る。免疫グロブリン様分子は、免疫グロブリン様フォールドを含むことができる。ある態様において、免疫グロブリン様分子は、変異アミノ酸配列を有することによって比較タンパク質から由来され得る。ある実施形態において、免疫グロブリン様分子は、抗体サブ構造、ミニボディ、アドネクチン、アンチカリン、アフィボディ、ノッティン（ｋｎｏｔｔｉｎ）、グルボディ（ｇｌｕｂｏｄｙ）、Ｃ型レクチン様ドメインタンパク質、テトラアクチン、クニツ（ｋｕｎｉｔｚ）ドメインタンパク質、チオレドキシン、シトクロムｂ５６２、亜鉛フィンガースカフォールド、ブドウ球菌ヌクレアーゼスカフォールド、フィブロネクチンもしくはフィブロネクチンダイマー、テネイシン、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、ＩＣＡＭ、タイチン、ＧＣＳＦ受容体、サイトカイン受容体、グリコシダーゼ阻害剤、抗生物質色素タンパク質、ミエリン膜接着分子Ｐ０、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２、クラスＩ  ＭＨＣ、Ｔ細胞抗原受容体、ＣＤ１、Ｃ２およびＶＣＡＭ−１のＩセットドメイン、ミオシン結合タンパク質ＣのＩセット免疫グロブリンドメイン、ミオシン結合タンパク質ＨのＩセット免疫グロブリンドメイン、テロキンのＩセット免疫グロブリンドメイン、ＮＣＡＭ、トゥイッチン、ニューログリアン、成長ホルモン受容体、エリスロポエチン受容体、プロラクチン受容体、インターフェロンガンマ受容体、β−ガラクトシダーゼ／グルクロニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、トランスグルタミナーゼ、Ｔ細胞抗原受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、組織因子ドメイン、シトクロムＦ、緑色蛍光タンパク質、ＧｒｏＥＬ、またはタウマチン由来であり得る。
【０１２５】
本明細書に使用される「完全長ＣＥＡ」という用語は、１０エキソンによってコードされる完全長ＣＥＡＣＡＭ５タンパク質またはそのようなタンパク質をコードするヌクレオチド配列を指す。完全長ＣＥＡタンパク質は、約７０２アミノ酸である（ＮおよびＣ末端プロ配列の除去前；Ｎ末端プロ配列は、約３４アミノ酸シグナル配列であり、Ｃ末端プロ配列は、約１７アミノ酸配列である）。プロ配列を含む完全長ＣＥＡタンパク質のアミノ酸配列は、図１に記述され、また、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿００４３５４．２でＧｅｎＢａｎｋに見出され得る。成熟完全長ＣＥＡタンパク質は、配列番号２に記述される。配列番号２に記述される配列は、特定の多型（太字および下線で示される）を参照することに留意されたい。他のＣＥＡ多型は、当技術分野で特定されている。しかしながら、表示された多型は、短型ＣＥＡに特有のスプライス部位で生じ、故に、本開示に潜在的関連性を有する。例えば、このスプライス部位での多型は、特定の抗体の結合特異性に影響を及ぼし得る可能性がある。ある実施形態において、完全長ＣＥＡとは、成熟完全長型のＣＥＡ（プロ配列のない）を指す。完全長（または短型）ＣＥＡに免疫特異的に結合する診断または治療試薬に対する特異性は、成熟ＣＥＡに対する免疫特異性（プロ配列の存在または不在に関係なく）を指すことが意図される。しかしながら、例えば、成熟完全長ＣＥＡタンパク質に対して免疫特異的な抗体はまた、プロ配列の存在下で、完全長ＣＥＡに免疫特異的に結合することができることも容易に理解されよう。試薬は、成熟標的ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する（そして、非標的ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合しない）限り、標的ＣＥＡタンパク質に対して免疫特異的であると見なされる。しかしながら、その成熟標的ＣＥＡに対応するプロタンパク質は、別の型または非標的型のＣＥＡであると見なされない。同様に、可溶性および膜に固定された成熟標的ＣＥＡは、非標的型のＣＥＡへの結合であると見なされない、あるいは、免疫特異性の欠如の証拠としても見なされない。さらに、ある試薬が、特定のＣＥＡ多型に対して免疫特異性があり得ると理解されるが、１つを超える多型の標的ＣＥＡに対する試薬の免疫特性が、非標的型のＣＥＡへの結合であると見なされない、あるいは、免疫特異性の欠如の証拠としても見なされない。
【０１２６】
本明細書に使用される「短型ＣＥＡ」という用語は、約４２０アミノ酸のＣＥＡＣＡＭ５のスプライス変異体またはそのようなタンパク質をコードするヌクレオチド配列を指す。短型ＣＥＡタンパク質は、エキソン３および４を欠失する完全長ＣＥＡのスプライス変異体である。つまり、短型ＣＥＡには、完全長ＣＥＡの残基１１６〜３９６（Ｎ末端プロ配列を含むように付番されるとき）のインフレーム短縮型が含まれる。プロ配列を含む短型ＣＥＡタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１と記述されている。配列番号１と記述される配列は、特定の多型（太字および下線で示される）を参照することに留意されたい。他のＣＥＡ多型は、当技術分野で特定されている。しかしながら、表示された多型は、短型ＣＥＡに特有のスプライス部位で生じ、故に、本開示に潜在的関連性を有する。ある実施形態において、短型ＣＥＡとは、成熟タンパク質中に存在しないプロ配列のない、成熟短型のＣＥＡを指す。短型ＣＥＡに免疫特異的に結合する診断または治療試薬に対する特異性は、成熟ＣＥＡに対する免疫特異性（プロ配列の存在または不在に関係なく）を指すことが意図される。しかしながら、例えば、成熟短型ＣＥＡタンパク質に対して免疫特異的な抗体はまた、プロ配列の存在下で、短型ＣＥＡに免疫特異的にも結合することができることは容易に理解されよう。試薬は、成熟標的ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する（そして、非標的ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合しない）限り、標的ＣＥＡタンパク質に対して免疫特異的であると見なされる。しかしながら、その成熟標的ＣＥＡに対応するプロタンパク質は、別の型または非標的型のＣＥＡであると見なされない。同様に、可溶性および膜に固定された成熟標的ＣＥＡは、非標的型のＣＥＡへの結合であると見なされない、あるいは、免疫特異性の欠如の証拠としても見なされない。さらに、ある試薬が、特定のＣＥＡ多型に対して免疫特異性があり得ると理解されるが、１つを超える多型の標的ＣＥＡに対する試薬の免疫特性が、非標的型のＣＥＡへの結合であると見なされない、あるいは、免疫特異性の欠如の証拠としても見なされない。
【０１２７】
本明細書に使用される「免疫特異的に結合する」という用語は、抗体等の特異的結合対の１つのメンバーが、診断的もしくは治療的関連濃度で、当技術分野における技術によって測定されるような、例えば、競合ＥＬＩＳＡによって、またはＢＩＡＣＯＲＥもしくはＫＩＮＥＸＡアッセイを用いたＫＤの測定によって、その特異的結合パートナー（複数可）以外の分子に有意に結合しない（すなわち、約２５％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％未満の交差反応）状態を指す。この用語はまた、例えば、本開示の抗体の抗原結合ドメインが、多くの抗原によって担持される特定のエピトープに対して特異的である場合に適用可能であり、そのような場合、抗原結合ドメインを担持する特異的抗体は、エピトープを担持する様々な抗原に特異的に結合することが可能である。ある実施形態において、ＣＥＡに免疫特異的に結合する抗体は、癌胎児性抗原関連の細胞接着タンパク質に結合しない。ある実施形態において、ＣＥＡに免疫特異的に結合する抗体は、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ７、およびＣＥＡＣＡＭ８に結合しない。ある実施形態において、ＣＥＡに免疫特異的に結合する抗体は、  ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ７、およびＣＥＡＣＡＭ８から選択されるタンパク質のうちの少なくとも１つにも結合しない。可溶性および膜結合型の標的ＣＥＡの両方に結合する診断または治療試薬の能力は、免疫特異性の欠如の証拠ではないことに留意されたい。実際には、免疫特異的試薬は、しばしば、可溶性および膜結合型の標的ＣＥＡの両方に免疫特異的に結合することが好ましい。さらに、成熟標的ＣＥＡおよびその成熟標的ＣＥＡに対応するプロタンパク質の両方に結合する診断または治療試薬の能力は、免疫特異性の欠如であると見られない。
【０１２８】
本明細書に使用される「Ａ５Ｂ７」という用語は、ＣＥＡに対して免疫特異的なマウスモノクローナル抗体を指し、例えば、ＷＯ第０７／０７１４２６号、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ（１９８８）３：３４−３７、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ（１９９４）６９：３０７−３１４、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（２００８）１４：２６３９−２６４６、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ（１９８６）５４：７５−８２、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（１９９２）５２：２３２９−２３３９に記載されている。
【０１２９】
本明細書に使用される「ＭＥＤＩ−５６５」という用語は、抗ＣＥＡ結合部分および抗ＣＤ３結合部分を含むＢｉＴＥクラスの二重特異性一本鎖抗体を指す。抗ＣＥＡ結合部分は、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７由来のヒト化ｓｃＦｖである。ＭＥＤＩ−５６５は、ＷＯ第０７／０７１４２６号、Ｌｕｔｔｅｒｂｕｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ３２：３４１−３５２、およびＯｓａｄａ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，１０２：１２４−３３に記載され、開示されている。抗体または抗体様分子のクラスに言及されるとき、「ＢｉＴＥ」という用語は、二重特異性Ｔ細胞結びつけ（ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｅｒ）を指す。そのような分子は、疾患状態と関連する抗原（例えば、癌性細胞上に発現した抗原）に対して免疫特異的である一部分およびそのような罹患した細胞をＴ細胞に連結する一部分を有する。ＷＯ第０７／０７１４２６号は、ＢｉＴＥ型分子のさらなる例示的な説明を提供する。
【０１３０】
（ｉｉｉ）  診断および予後に用いる方法  
本明細書に開示される抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子は、疾患および障害、特に、ＣＥＡ発現に関連する癌の診断および予後評価に有用である。疾患のそれぞれの段階で、抗体は、診断の正確さを向上し、治療判断を促進するために使用され得る。臓器またはリンパ節の大きさまたは構造の変化に依存する、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン等の腫瘍および癌のための標準的な診断方法とは異なって、標識抗体は、ＣＥＡ等の腫瘍抗原の発現または体液へのそのような抗原の脱落から、初期段階で異常細胞を検出することができる。癌が診断された時点で、正確な病期診断が、最も適切な療法を決定する際に、重要である。後で、外科手術後のフォローアップ中または他の治療中もしくはその後、血清および糞便等の体液中の腫瘍抗原のレベルの上昇は、従来の方法によって検出され得る前に、再発を示す場合がある。これらの方法は、特定の標的型のＣＥＡに免疫特異的に結合するが、他の型のＣＥＡには免疫特異的に結合しない抗体等の本明細書に記載の抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子のいずれかとともに使用することができる。
【０１３１】
ある態様において、本開示は、ＣＥＡを発現する癌の再発を検出する方法を提供する。ＣＥＡを発現する癌であると以前診断され、治療を受けたことがある患者は、完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することによって、癌の再発のための試験が行われ得る。本方法は、その患者の前の結果に見出される完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を比較することを、長期にわたって繰り返すことができる。これらの方法は、完全長ＣＥＡに免疫特異的に結合するが、短型ＣＥＡには免疫特異的に結合しない本明細書に記載の抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子（例えば、診断試薬）のいずれかとともに使用することができる。診断ステップが、複数回行われる際、検出ステップは、同一の診断試薬を用いて、または同一もしくは実質的に同一のエピトープに結合する診断試薬を用いて行うことができることが企図される。同様に、ＣＥＡ濃度が、単一型の生物学的試料（例えば、血清または糞便）中に検出することができる、あるいは、ＣＥＡ濃度が、１つを超える型の生物学的試料中で測定することができることが企図される。
【０１３２】
ある態様において、本開示は、抗ＣＥＡ癌療法に対する感受性を判定する方法を提供する。ＣＥＡを発現する癌であると以前診断されたことがある患者は、完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することによって、抗ＣＥＡ癌療法に対する感受性について試験を行うことができる。ある実施形態において、本方法は、完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を、健常な対象からの試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の標準濃度を反映する標準と比較することをさらに提供する。これらの方法は、特定の標的型のＣＥＡに免疫特異的に結合するが、他の型のＣＥＡには免疫特異的に結合しない抗体等の本明細書に記載の抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子（例えば、診断試薬）のいずれかとともに使用することができる。診断ステップが、複数回行われる際、検出ステップは、同一の診断試薬を用いて、または同一もしくは実質的に同一のエピトープに結合する診断試薬を用いて行うことができることが企図される。同様に、ＣＥＡ濃度が、単一型の生物学的試料（例えば、血清または糞便）中に検出することができる、あるいは、ＣＥＡ濃度が、１つを超える型の生物学的試料中で測定することができることが企図される。
【０１３３】
ある態様において、本開示は、抗ＣＥＡ癌療法をモニタリングする方法を提供する。ＣＥＡを発現する癌であると以前診断され、治療を受けたことがある患者は、完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することによって、モニタリングすることができる。ある実施形態において、本方法は、治療前あるいは治療の早期時点のいずれかで、同一の患者に対して判定された過去の濃度と、完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を比較することをさらに提供する。これらの方法は、特定の標的型のＣＥＡに免疫特異的に結合するが、他の型のＣＥＡには免疫特異的に結合しない抗体等の本明細書に記載の抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子のいずれかとともに使用することができる。診断ステップが、複数回行われる際、検出ステップは、同一の診断試薬を用いて、または同一もしくは実質的に同一のエピトープに結合する診断試薬を用いて行うことができることが企図される。同様に、ＣＥＡ濃度が、単一型の生物学的試料（例えば、血清または糞便）中に検出することができる、あるいは、ＣＥＡ濃度が、１つを超える型の生物学的試料中で測定することができることが企図される。
【０１３４】
ある態様において、本開示は、抗ＣＥＡ治療をモニタリングする方法、またはその患者に使用されるもしくは考えられている癌治療薬と同一もしくは実質的に同一のＣＥＡのエピトープに免疫特異的に結合する抗体を用いて、抗ＣＥＡ治療に対する感受性を判定する方法を提供する。ある実施形態において、抗ＣＥＡ治療薬は、標的型のＣＥＡに免疫特異的に結合するが、他の型のＣＥＡには免疫特異的に結合しない。
【０１３５】
ある態様において、本開示は、対象からの試料中の、完全長ＣＥＡタンパク質の濃度および短型ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することによって、完全長ＣＥＡタンパク質濃度と短型ＣＥＡタンパク質濃度との比率を判定するための方法を提供する。ある実施形態において、本方法は、この比率を、健常な対象からの試料中の完全長ＣＥＡタンパク質濃度と短型ＣＥＡタンパク質濃度との標準比率を反映する標準と比較することをさらに提供する。ある実施形態において、標準比率とは著しく異なる比率は、ＣＥＡを発現する癌の存在を示す。ある実施形態において、標準比率とは著しく異なる比率は、抗ＣＥＡ治療薬に対する感受性を示す。ある実施形態において、治療後の比率の変化は、療法の有効性を示す。ある実施形態において、抗ＣＥＡ治療薬は、標的型のＣＥＡに免疫特異的に結合するが、他の型のＣＥＡには免疫特異的に結合しない。ある実施形態において、完全長ＣＥＡタンパク質の濃度の検出は、完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、短型ＣＥＡタンパク質には免疫特異的に結合しない抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子と、試料を接触させることによって行われる。ある実施形態において、短型ＣＥＡタンパク質の濃度の検出は、短型ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、完全長ＣＥＡタンパク質には免疫特異的に結合しない抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子と、試料を接触させることによって行われる。
【０１３６】
ある態様において、本開示は、対象からの試料中の、完全長ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度および短型ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度を検出することによって、完全長ＣＥＡタンパク質濃度をコードするＲＮＡと短型ＣＥＡタンパク質濃度をコードするＲＮＡの比を判定するための方法を提供する。ある実施形態において、本方法は、この比率を、健常な対象からの試料中の、完全長ＣＥＡタンパク質濃度をコードするＲＮＡと短型ＣＥＡタンパク質濃度をコードするＲＮＡの標準比率を示す標準と比較することをさらに提供する。ある実施形態において、標準比率とは著しく異なる比率は、ＣＥＡを発現する癌の存在を示す。ある実施形態において、標準比率とは著しく異なる比率は、抗ＣＥＡ治療薬に対して感受性があることを示す。ある実施形態において、治療後の比率の変化は、療法の有効性を示す。ある実施形態において、抗ＣＥＡ治療薬は、標的型のＣＥＡに免疫特異的に結合するが、他の型のＣＥＡには免疫特異的に結合しない。ある実施形態において、完全長ＣＥＡタンパク質の濃度の検出は、完全長および短型ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡに対して特異的なプライマーおよびまたはプローブを用いて行われる。
【０１３７】
診断方法は、患者からの生物学的試料（例えば、血液試料、リンパ節生検、または組織）を用いてインビトロ（エクスビボ）で行うことができるか、あるいはインビボイメージングによって行うことができる。ある実施形態において、生物学的試料（「試料」としても称される）は、全血、血清、血漿、唾液、尿、糞便、精漿、汗、羊水、痰、母乳、胆液、組織ホモジネート、および腹水から選択される。ある実施形態において、生物学的試料は、腫瘍試料である。ある実施形態において、生物学的試料は、患者が患っている、または患っている疑いがある特定のＣＥＡを発現する癌に基づいて選択される。例えば、痰試料は、ある実施形態において、患者が肺癌を患っている場合、選択することができる。さらなる例として、糞便試料は、ある実施形態において、患者が結腸または直腸癌を患っている場合、選択することができる。しかしながら、他の実施形態において、全血、血清、または血漿試料は、癌の型に関わらず、検査される。
【０１３８】
特定の実施形態において、本出願は、本開示の抗体、または他の免疫特異的診断試薬が、診断造影剤に共役させる、抗体複合体を提供する。本出願の免疫特異的診断試薬を含む組成物は、例えば、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳを含むが、これに限定されない）、免疫細胞化学、免疫組織化学等によって、標的ＣＥＡを検出するために使用することができる。１つ以上の検出可能な標識は、診断試薬抗体、または一次診断試薬を検出するために使用される二次抗体に結合され得る。例示的な標識部分は、特に、放射線または磁気共鳴画像技術における、放射線不透過性色素、放射線造影剤、蛍光分子、スピン標識分子、酵素、または診断価値のある他の標識部分を含む。ある実施形態において、標的部分は、蛍光分子である。
【０１３９】
本開示に従って、放射性標識抗体は、インビトロ診断試験に使用することができる。抗体、その結合部分、プローブ、またはリガンドの比活性は、放射性標識の半減期、同位体純度、およびこの標識がこの生物学的薬剤にいかに組み込まれているかに依存する。免疫学的検定では、一般に、比活性が高いほど、感受性が良好である。例えば、診断で用いる標識として有用な放射性同位体は、ヨウ素（１３１Ｉもしくは１２５Ｉ）、インジウム（１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、リン（３２Ｐ）、炭素（１４Ｃ）、およびトリチウム（３Ｈ）、または上に列挙した治療同位体のうちの１つを含む。
【０１４０】
放射性標識抗体は、患者に投与することができ、抗体が反応する抗原を担持する癌細胞に局在化し、例えば、ガンマ検出器および放射トモグラフィーを用いた放射性核走査法等の既知の技術を用いてインビボで検出または「画像」される。例えば、Ｂｒａｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｍａｇｉｎｇ”，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），ｐｐ．６５−８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｏｌａｆｓｅｎ（２００８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  １４：１９１−１９７を参照し、これらは、参照することにより本明細書に組み込まれる。あるいは、放射標識が陽電子（例えば、１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏ、および１３Ｎ）を放射するときは、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙにあるＰｅｔ  ＶＩと称するもの等の、陽電子放射横断軸断層撮影スキャナーを用いることができる。陽電子走査技術におけるさらなる例示的な情報は、例えば、Ｇａｍｂｈｉｒ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２：６８３−６９３に見出され得る。
【０１４１】
フルオロフォアおよび発色団標識した生物学的薬剤は、当技術分野で公知の標準的部分から調製することができる。抗体および他のタンパク質が、最高約３１０ｎｍまでの波長を有する光を吸収するため、蛍光部分は、３１０ｎｍを超える、例えば、約４００ｎｍを超えるような波長で、実質的な吸収を有するように選択することができる。様々な適した蛍光体および発色団は、Ｓｔｒｙｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６２：５２６（１９６８）およびＢｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１：８４３−８６８（１９７２）によって記載され、これらは、参照することによって本明細書に組み込まれる。抗体は、米国特許第３，９４０，４７５号、第４，２８９，７４７号、および第４，３７６，１１０号（これらは、参照することによって本明細書に組み込まれる）に開示されるもののような従来の手順によって、蛍光性発色団基を用いて標識化することができる。
【０１４２】
診断および／または治療試薬に共役され、本方法および本明細書に記載の組成物に使用される、標識は、２８０ｎｍを上回る波長で、最高の吸収を示し、抗体に共有結合する際にそのスペクトル特性を保持する任意の化学部分、有機物、または無機物である。標識としては、発色団、フルオロフォア、蛍光タンパク質、リン光性色素、タンデム色素、粒子、ハプテン、酵素、および放射性同位体が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４３】
ある実施形態において、抗標的ＣＥＡ抗体（診断試薬および／または治療試薬）は、フルオロフォアに共役される。したがって、本開示の標識抗体に使用されるフルオロフォアとしては、ピレン（米国特許第５，１３２，４３２号に開示される対応する誘導体化合物のいずれかを含む）、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドールもしくはベンズインドール、オキサゾールもしくはベンズオキサゾール、チアゾールもしくはベンゾチアゾール、４−アミノ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）、シアニン（米国特許第６，９７７，３０５号および第６，９７４，８７３号に記載のあらゆる対応する化合物を含む）、カルボシアニン（米国特許第０９／５５７，２７５号、米国特許第４，９８１，９７７号、第５，２６８，４８６号、第５，５６９，５８７号、第５，５６９，７６６号、第５，４８６，６１６号、第５，６２７，０２７号、第５，８０８，０４４号、第５，８７７，３１０号、第６，００２，００３号、第６，００４，５３６号、第６，００８，３７３号、第６，０４３，０２５号、第６，１２７，１３４号、第６，１３０，０９４号、第６，１３３，４４５号、国際公開ＷＯ第０２／２６８９１号、ＷＯ第９７／４０１０４号、ＷＯ第９９／５１７０２号、ＷＯ第０１／２１６２４号、欧州特許ＥＰ第１  ０６５  ２５０  Ａ１号に記載の、あらゆる対応する化合物を含む）、カルボスチリル、ポルフィリン、サリチレート、アントラニレート、アズレン、ペリレン、ピリジン、キノリン、ボラポリアザインダセン（米国特許第  ４，７７４，３３９号、第５，１８７，２８８号、第５，２４８，７８２号、第５，２７４，１１３号、および第５，４３３，８９６号に記載のあらゆる対応する化合物を含む）、キサンテン（米国特許第６，１６２，９３１号、第６，１３０，１０１号、第６，２２９，０５５号、第６，３３９，３９２号、第５，４５１，３４３号、第５，２２７，４８７号、第５，４４２，０４５号、第５，７９８，２７６号、第５，８４６，７３７号、第４，９４５，１７１号、米国出願第０９／１２９，０１５号および第０９／９２２，３３３号に開示されるあらゆる対応する化合物を含む）、オキサジン（米国特許第４，７１４，７６３号に開示されるあらゆる対応する化合物を含む）もしくはベンゾオキサジン、カルバジン（米国特許第４，８１０，６３６号に開示されるあらゆる対応する化合物を含む）、フェナレノン、クマリン（米国特許第５，６９６，１５７号、第５，４５９，２７６号、第５，５０１，９８０号、および第５，８３０，９１２号に開示される対応する化合物を含む）、ベンゾフラン（米国特許第４，６０３，２０９号および４，８４９，３６２号に開示される対応する化合物を含む）、ベンズフェナレノン（米国特許第４，８１２，４０９号に開示されるあらゆる対応する化合物を含む）、ならびにそれらの誘導体がふくまれるが、これらに限定されない。本明細書に使用される、オキサジンには、レゾルフィン（第５，２４２，８０５号に開示されるあらゆる対応する化合物を含む）、アミノオキサジノン、ジアミノオキサジン、およびそれらのベンゾ置換類似体が含まれる。
【０１４４】
特定の実施形態において、本明細書に記載の診断または治療試薬に共役されるフルオロフォアには、キサンテン（ロードール、ローダミン、フルオレセイン、およびそれらの誘導体）、クマリン、シアニン、ピレン、オキサジン、およびボラポリアザインダセンが含まれる。他の実施形態において、そのようなフルオロフォアは、スルホン酸化キサンテン、フッ素化キサンテン、スルホン酸化クマリン、フッ素化クマリン、およびスルホン酸化シアニンである。また、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ、ＤｙＬｉｇｈｔ、Ｃｙ  Ｄｙｅｓ、ＢＯＤＩＰＹ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ＩＲＤｙｅｓ、ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、およびＲＯＸの商品名で販売され、一般に知られている色素も含まれる。
【０１４５】
抗標的ＣＥＡ診断および／または治療試薬に結合させるフルオロフォアの選択は、共役試薬の吸収および蛍光発光特性を判定するだろう。抗体および抗体結合リガンドに使用することができるフルオロフォア標識の物理的特性としては、スペクトル特性（吸収、発光、ストークスシフト）、蛍光強度、寿命、偏光および光退色速度、またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。これらの物理的特性のすべてが、１種のフルオロフォアを別のフルオロフォアと区別するために使用することができ、これによって多様な分析が可能になる。ある実施形態において、フルオロフォアは、４８０ｎｍを超える波長に吸収極大を有する。他の実施形態において、フルオロフォアは、４８８ｎｍまたは４８８ｎｍ付近〜５１４ｎｍ（アルゴンイオンレーザー励起源の出力による励起に特に適する）または５４６ｎｍ付近（水銀アークランプによる励起に特に適する）で吸収する。他の実施形態において、フルオロフォアは、組織または生物全体への適用においてＮＩＲ（近赤外領域）で発光することができる。蛍光標識の他の所望の特性には、例えば、標識化が、細胞または生物（例えば、生きている動物）において行われる場合、透過性および低毒性を含むことができる。
【０１４６】
ある実施形態において、酵素は、標識であり、抗標的ＣＥＡ診断および／または治療試薬に共役される。検出可能なシグナルの増幅を得ることができ、その結果、増加したアッセイ感度をもたらすため、酵素は、望ましい標識である。酵素自体は、検出可能な応答を生成しないが、適切な基質が酵素に接触した際に基質を分解する機能を果たすため、その変換された基質は、蛍光性、比色性、または発光性のシグナルを生成する。標識試薬上の１つの酵素が、検出可能なシグナルへと変換される複数の基質をもたらすことができるため、酵素は、検出可能なシグナルを増幅する。酵素基質は、好ましい測定可能な生成物、例えば、比色性、蛍光性、または化学発光性の生成物をもたらすように選択される。そのような基質は、当技術分野で広範に使用され、当業者によって周知である。
【０１４７】
一実施形態において、発色または蛍光発生基質および酵素の組み合わせは、西洋ワサビペルオキシダーゼ等のオキシドレダクターゼ、および３，３′−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）および３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）等の基質を使用し、これらは、特徴的な色（それぞれ、茶色および赤色）を呈する。検出可能な生成物を呈する他の発色オキシドレダクターゼ基質としては、２，２−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ｏ−ジアニシジン、５−アミノサリチル酸、４−クロロ−１−ナフトールが含まれるが、これらに限定されない。蛍光発生基質としては、ホモバニリン酸または４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル酢酸、Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄ試薬およびその変形（米国特許第４，３８４，０４２号）を含む還元体フェノキサジンおよび還元体ベンゾチアジン、ジヒドロフルオレセイン（米国特許第６，１６２，９３１号）を含む還元体ジヒドロキサンテン、ならびにジヒドロローダミン１２３を含むジヒドロローダミンが含まれるが、これらに限定されない。チラミド（米国特許第５，１９６，３０６号、第５，５８３，００１号、および第５，７３１，１５８号）であるペルオキシダーゼ基質は、酵素の作用の前に本質的に検出可能であるが、チラミドシグナル増幅法（ＴＳＡ）として記載されるプロセスにおいてペルオキシダーゼの作用により「適所に固定される」という点で、独特のクラスのペルオキシダーゼ基質を表す。これらの基質は、顕微鏡検査、フローサイトメトリー、光学式走査、および蛍光光度法による、その後の検出のために、細胞、組織、またはアレイである試料中の標的を標識するのに広く利用されている。
【０１４８】
別の実施形態において、発色（および、場合によっては、蛍光発生）基質および酵素の組み合わせは、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、６−クロロ−３−インドリルホスフェート、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリルホスフェート、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、もしくはｏ−ニトロフェニルホスフェート等の発色基質と組み合わせて、または４−メチルアンベリフェリルホスフェート、６，８−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリニリルホスフェート（ＤｉＦＭＵＰ、米国特許第５，８３０，９１２号）、フルオレセインジホスフェート、３−Ｏ−メチルフルオレセインホスフェート、レソルフィンホスフェート、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）ホスフェート（ＤＤＡＯホスフェート）もしくはＥＬＦ９７、ＥＬＦ３９、または関連するホスフェート（米国特許第５，３１６，９０６号および第５，４４３，９８６号）等の蛍光発生基質と組み合わせて、酸性ホスファターゼ、アルカリ性ホスファターゼ等のホスファターゼ酵素、またはかかるホスファターゼの組換え型バージョンを使用する。
【０１４９】
グリコシダーゼ、特に、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、およびβ−グルコシダーゼは、さらなる適した酵素である。適切な発色基質としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）および同様のインドリルガラクトシド、グルコシド、ならびにグルクロニド、ｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）およびｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、蛍光発生基質には、レソルフィンβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、フルオレセインジガラクトシド（ＦＤＧ）、フルオレセインジグルクロニド、およびそれらの構造変異体（米国特許第５，２０８，１４８号、第５，２４２，８０５号、第５，３６２，６２８号、第５，５７６，４２４号、および第５，７７３，２３６号）、４−メチルアンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、カルボキシアンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、およびフッ素化クマリンβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（米国特許第５，８３０，９１２号）が含まれる。
【０１５０】
さらなる酵素としては、ヒドロラーゼ（例えば、コリンエステラーゼおよびペプチダーゼ）、オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼおよびシトクロムオキシダーゼ）、ならびに適切な基質が公知であるレダクターゼが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５１】
化学発光を生成する酵素およびその適切な基質は、いくつかのアッセイにおいて好ましい。これらとしては、天然型および組換え型のルシフェラーゼおよびエクオリンが含まれるが、これらに限定されない。さらに、安定なジオキセタン、ルミノール、イソルミノール、およびアクリジニウムエステルを含有するもの等のホスファターゼ、グリコシダーゼ、およびオキシダーゼに対して化学発光を生成する基質が、有用である。
【０１５２】
別の実施形態において、ビオチン等のハプテンも、標識として利用される。ビオチンは、酵素系において検出可能なシグナルをさらに増幅する機能を果たすことができ、単離目的のためのアフィニティークロマトグラフィーで使用できるタグとして機能を果たすことができるので、有用である。検出目的では、アビジン−ＨＲＰ等の、ビオチンに親和性を有する酵素共役体が、使用される。その後、ペルオキシダーゼ基質を加えて検出可能なシグナルを生成することが付加される。
【０１５３】
また、ハプテンには、ホルモン、天然および合成薬物、汚染物質、アレルゲン、エフェクター分子、成長因子、ケモカイン、サイトカイン、リンフォカイン、アミノ酸、ペプチド、化学中間体、ヌクレオチド等が含まれる。
【０１５４】
ある実施形態において、蛍光タンパク質は、標識として抗体に共役することができる。蛍光タンパク質の例には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびフィコビリタンパク質、ならびにそれらの誘導体が含まれる。蛍光タンパク質、特に、フィコビリタンパク質は、タンデム色素標識した標識試薬を作製する際に特に有用である。これらのタンデム色素は、より大きなストークスシフトを得るために蛍光タンパク質およびフルオロフォアを含み、その発光スペクトルは、蛍光タンパク質の吸収スペクトルの波長からさらにシフトしている。これは、発光した蛍光が最大限に最適化されている試料（つまり、その発光がほとんどまたは少しも、蛍光タンパク質により再吸収されない試料）中の少量の標的を検出する際に特に有利である。このために作用して、その蛍光タンパク質およびフルオロフォアは、エネルギー転移対として機能し、その蛍光タンパク質は、フルオロフォアが吸収する波長で発光し、その後、その蛍光タンパク質のみを用いて得られ得るよりも蛍光タンパク質から遠く離れた波長で、フルオロフォアが発光する。特に有用な組み合わせは、米国特許第４，５２０，１１０号、第４，８５９，５８２号、第５，０５５，５５６号に開示されるフィコビリタンパク質、ならびに米国特許第５，７９８，２７６号に開示されるスルホローダミンフルオロフォア、または米国特許第６，９７７，３０５号および第６，９７４，８７３号に開示されるスルホン化シアニンフルオロフォア、または米国特許第６，１３０，１０１号に開示されるスルホン化キサンテン誘導体、ならびに米国特許第４，５４２，１０４号に開示されるこれらの組み合わせである。あるいは、フルオロフォアは、エネルギードナーとして機能し、蛍光タンパク質は、エネルギーアクセプターである。
【０１５５】
本出願は、そのような検出を必要とする対象における該癌細胞中のＣＥＡのｍＲＮＡまたはタンパク質の差次的発現を検出することを含む、癌を検出する方法を提供する。１つの例示的な実施形態において、癌を検出する方法は、ａ）患者から試料を単離することと、ｂ）本出願の免疫特異的診断試薬と該試料を接触させることと、ｃ）本出願の免疫特異的診断試薬と、該試料細胞の同じ型の非癌性細胞を接触させることと、ｄ）非癌性細胞と、該試料細胞中の発現を検出し、その差異を比較することと、を含む。
【０１５６】
ある実施形態において、本出願で用いる診断用の抗体複合体は、インビトロでの使用のために意図され、この抗体は、発色基質との接触の際、着色した生成物を生成する二次結合リガンドまたは酵素（酵素タグ）に連結される。好適な酵素の例には、ウレアーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、（西洋ワサビ）水素ペルオキシダーゼおよびグルコースオキシダーゼが挙げられる。ある実施形態において、二次結合リガンドは、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン化合物である。さらに、フルオロフォア、放射性部分等のいずれかが、同様に、インビトロ診断アッセイとの関連で使用することができることを容易に理解されよう。
【０１５７】
ある実施形態において、本出願の診断方法は、他の癌診断試験と組み合わせて使用することができる。
【０１５８】
本出願はまた、抗ＣＥＡ免疫特異性診断試薬を含む診断キットも提供する。そのような診断キットは、診断アッセイを行うための使用説明書とともに、既定量の試薬のパッケージ化された組み合わせをさらに含むことができる。免疫特異的診断試薬が、酵素で標識化される場合、キットは、酵素によって要求される基質および補酵素を含む。加えて、他の添加剤は、安定剤、緩衝液等を含むことができる。相対量の様々な試薬は、アッセイの感受性を実質的に最適化する試薬の溶液中の濃度を提供するために広範に変化させることができる。特に、試薬は、分解において、適切な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含む、通常、凍結乾燥された乾燥粉末として提供することができる。
【０１５９】
別の態様において、本開示は、ＣＥＡタンパク質成分を結合、精製し、定量化、そうでなければ、一般に検出するための免疫学的検定に関する。以下に詳述されるように、それらの最も単純かつ直接的な意味では、免疫学的検定は、結合アッセイである。ある実施形態において、免疫学的検定は、当技術分野で公知の様々な型の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫測定（ＲＩＡ）である。組織切片を用いる免疫組織化学的検出もまた、特に、有用である。しかしながら、検出が、そのような技法に限定されず、ウエスタンブロッティング、ドットアンドスロットブロッティング、フローサイトメトリー分析等もまた使用することが容易に理解されよう。
【０１６０】
様々な有用な免疫学的検定のステップは、例えば、Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ａｎｄ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２７（１９８７）等の科学文献に記載されており、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０１６１】
一般に、免疫結合法は、タンパク質またはペプチド（この場合、ＣＥＡ）を含有する疑いがある試料を得ること、および免疫複合体の形成を可能にするのに有効な条件下でＣＥＡとの免疫反応性のある第１の抗体と試料を接触させることを含む。
【０１６２】
免疫結合方法は、ＣＥＡタンパク質を精製するための方法を含み、患者の試料からのタンパク質の精製において、または組み換えにより発現したタンパク質を精製するために採用することができる。それらはまた、組織試料または他の生物学的試料中のＣＥＡの量を検出または定量化するための方法も含み、結合過程で形成された任意の免疫複合体の検出または定量化を必要とする。
【０１６３】
分析した生物学的試料は、ＣＥＡを含むと考えられる任意の試料、例えば、均質化した新生物組織試料であってよい。選択された生物学的試料を、免疫特異的診断試薬（一次免疫複合体の形成を可能にするのに有効な条件下で、十分な時間）と接触させることは、一般に、免疫特異的診断試薬を試料に添加すること、および存在する任意の標的ＣＥＡを用いて免疫複合体を形成する、すなわち、結合するために、免疫特異的診断試薬に対して十分な期間にわたる混合物のインキュベーションの問題である。この試料−抗体組成物を徹底的に洗浄して、いかなる非特異的に結合した種を除去し、一次免疫複合体内の特異的に結合される免疫特異的診断試薬のみを検出させる。
【０１６４】
一般的に、免疫複合体形成の検出は、当技術分野で公知であり、多数のアプローチの適用を通して達成され得る。これらの方法は、放射性、蛍光、生物学的、または酵素的タグの検出に基づいている。もちろん、当技術分野で公知であるように、二次抗体等の二次結合リガンドまたはビオチン／アビジンリガンド結合配置の使用を通してさらなる有利性を見出し得る。
【０１６５】
検出に使用される抗ＣＥＡ免疫特異的診断試薬は、それ自体、検出可能な標識に共役されることができ、単にこの標識を検出する。それによって、組成物中の一次免疫複合体の量が決定される。
【０１６６】
あるいは、一次免疫複合体内で結合することになる第１の免疫特異的診断試薬が、その抗体に対して結合親和性を有する第２の結合リガンドを用いて検出され得る。これらの場合、第２の結合リガンドは、検出可能な標識に連結され得る。第２の結合リガンドは、それ自体、抗体であることが多く、したがって、「二次」抗体と称される場合がある。一次免疫複合体を、二次免疫複合体の形成を可能にするのに効果的な条件下および十分な時間、標識された二次結合リガンドまたは抗体と接触させる。二次免疫複合体は、任意の非特異的に結合した標識二次抗体またはリガンドを除去するために広範囲に洗浄され、二次免疫複合体における残りの標識が検出される。
【０１６７】
特に、完全長および短型の両方の検出が望ましい実施形態（例えば、完全長と短型との比率を評価する場合）では、例えば、完全長ＣＥＡタンパク質および短型ＣＥＡタンパク質の濃度を検出するために異なる検出可能な標識を用いることによって、同一のアッセイにおいて、両方のタンパク質の濃度を測定することが企図される。しかしながら、２つの型のＣＥＡタンパク質が、別個に、例えば、同一の患者試料の２つのアリコートで、評価することができることも企図される。
【０１６８】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、結合アッセイの一種である。１つの型のＥＬＩＳＡでは、本出願の診断方法に使用される抗ＣＥＡ免疫特異的診断試薬は、ポリスチレンマイクロタイタープレート内のウェル等のタンパク質親和性を示す選択された表面上に固定化される。次いで、疑わしい新生物組織試料をウェルに添加する。結合および非特異的に結合した免疫複合体を除去するために除去した後、結合した標的ＣＥＡを検出することができる。検出は、一般的に、検出可能な標識に連結されている、標的ＣＥＡに対してのみ免疫特異的である必要のないもう１つの抗ＣＥＡ抗体の添加により達成される。この型のＥＬＩＳＡは、単純な「サンドイッチＥＬＩＳＡ」である。検出はまた、第２の抗ＣＥＡ抗体の添加、続いて、二次抗体に対する結合親和性を有する第３の抗体の添加によって達成されることができ、第３の抗体は、検出可能な標識に連結されている。
【０１６９】
別の型のＥＬＩＳＡでは、新生物組織試料は、ウェル表面上に固定化され、本出願において使用される抗ＣＥＡ免疫特異的診断試薬と接触させる。結合および非特異的に結合した免疫複合体を除去するために洗浄した後、結合した抗ＣＥＡ免疫特異的診断試薬が検出される。最初の抗ＣＥＡ免疫特異的診断試薬が、検出可能な標識に連結されている場合、免疫複合体は、直接検出され得る。あるいは、免疫複合体は、第１の抗ＣＥＡ免疫特異的診断試薬に対する結合親和性を有する二次抗体を用いて検出されることができ、二次抗体は、検出可能な標識に連結されている。
【０１７０】
採用した形式に関わらず、ＥＬＩＳＡは、ある共通の機能、例えば、コーティング、インキュベーション、または結合、非特異的に結合した種を除去するための洗浄、結合した免疫複合体の検出を有する。
【０１７１】
放射免疫測定（ＲＩＡ）は、抗体分子上の抗原結合部位に対する抗原の競合（親和性）に依存する分析技法である。標準曲線は、同一の既知濃度の標識抗原、および様々であるが、既知濃度の非標識抗原をそれぞれ含有する一連の試料から収集したデータから構築される。抗原は、放射性同位体トレーサーで標識される。その混合物を、免疫特異的診断試薬と接触させてインキュベートする。次いで、遊離抗原は、免疫特異的診断試薬から分離し、それと結合させる。次いで、ガンマまたはベータ放射線検出器等の適切な検出器を用いて、結合または遊離した標識抗原のいずれか、または両方の割合を決定する。この手順を、非標識抗原の様々な既知濃度を含有するいくつかの試料に対して反復し、結果を標準グラフとしてプロットする。結合トレーサー抗原率は、抗原濃度の関数としてプロットされる。典型的には、総抗原濃度は、増加するにつれ、抗体に結合したトレーサー抗原の相対量は、減少する。標準グラフを準備した後、分析を行っている試料中の抗原の濃度を決定するために標準グラフを使用する。
【０１７２】
分析において、抗原の濃度を決定すべき試料を、既知量のトレーサー抗原と混合する。トレーサー抗原は、試料中にあることが既知である同一の抗原であるが、適切な放射性同位体で標識されている抗原である。次いで、トレーサーを有する試料を、抗体と接触させてインキュベートする。次いで、試料中の残りの遊離抗原を、計測に適した検出器において計測することができる。抗体または免疫吸着剤と結合した抗原も、同様に計測され得る。次いで、標準曲線から元の試料中の抗原濃度を決定する。
【０１７３】
前述のものは、生物学的試料中の標的ＣＥＡの濃度を検出するために使用することができる特定の診断技法の単なる例示である。本開示の免疫特異的診断試薬は、標的ＣＥＡに免疫特異的に結合するが、非標的型のＣＥＡには免疫特異的に結合しない。
【０１７４】
（ｉｖ）役立つ治療方法
ある実施形態において、本開示の抗ＣＥＡ治療薬およびその組成物は、癌の予防および／または治療のために投与することができる。本開示は、ＣＥＡ媒介型疾患または障害を予防、治療、維持、改善、または阻害するための方法を包含し、これらの方法は、抗ＣＥＡ治療薬を投与することを含む。ある実施形態において、抗ＣＥＡ治療薬は、標的型のＣＥＡに免疫特異的に結合するが、他の型のＣＥＡには免疫特異的に結合しない。ある実施形態において、治療薬は、抗体である。ある実施形態において、抗ＣＥＡ抗体は、標的型のＣＥＡに免疫特異的に結合するが、他の型のＣＥＡには免疫特異的に結合しない。
【０１７５】
本明細書に使用される、上皮または他の腫瘍との関連で、本開示の薬学的組成物の「有効量」または「治療有効量」とは、一次、局所的、または転移性腫瘍組織を破壊、修正、制御、または除去するのに十分な治療薬剤の量を指す。治療有効量は、上皮腫瘍の広がりを遅延させるまたは最小化するのに十分な治療薬剤の量を指すことができる。治療有効量はまた、上皮腫瘍の治療または管理において、治療的有用性を提供する治療薬剤または薬学的薬剤の量を指すこともできる。さらに、本開示の治療薬剤または薬学的薬剤に関する治療有効量は、上皮腫瘍の治療または管理において、治療的有用性を提供する、治療薬剤または薬学的薬剤のみの量、または他の両方と組み合わせた量を意味する。本開示の抗体の量に関連して使用される、この用語は、全体の療法を改善し、望ましくない効果を軽減もしくは回避し、別の治療薬剤の治療有効性を増進する、または別の治療薬剤との相乗作用（本明細書に定義されるような）を与える、量を包含することができる。ある実施形態において、治療有効量の治療薬は、全体の療法を改善し、望ましくない効果を軽減もしくは回避するか、または、上皮腫瘍の治療での別の治療薬剤の治療有効性を増進するか、あるいは別の治療薬剤との相乗作用を与える。例えば、抗ＣＥＡ抗体は、単剤療法として患者に投与される場合、上皮腫瘍の直径の２０％の縮小を引き起こすことができる。対照的に、二次治療薬、例えば、以下に定義される抗癌剤は、１０％の腫瘍の縮小を引き起こすことができる。しかしながら、抗ＣＥＡ抗体および該二次治療薬の両方が、併用療法の形態で組み合わせて投与される場合、５０％の腫瘍の縮小が観察され得る。そのような効果は、本明細書に使用される相乗効果として理解される。本明細書に言及される場合、「療法」という用語は、上皮腫瘍の予防、治療、または改善に使用することができる任意の投与スキーム、方法、および／または薬剤を指す。「上皮腫瘍の予防、治療、または改善」という用語は、以下にさらに詳述される。「療法」という用語は、生物学的療法、支持療法、化学的療法、放射線療法、および／または上皮腫瘍、もしくは１つ以上のその症状の治療、予防、または改善に有用な他の療法を指すことができる。
【０１７６】
本明細書に使用される、患者への１つまたは複数の療法を投与するという状況で、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、および「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、上皮腫瘍の進行、重症度、および／または持続時間の軽減または改善を指す。該上皮腫瘍（複数可）は、異常な発現、例えば、ＣＥＡの過剰発現もしくは活性、および／または１つ以上の療法における薬剤投与（１つ以上の薬学的または治療薬剤の投与を含む）に起因する１つ以上のその症状の改善との関連があり得る。
【０１７７】
治療は、経口投与、局所性投与、注射によって、鼻腔内、直腸に、経皮的、眼球内挿入、カテーテル、ワイヤー、もしくはインプラント等の含浸もしくは被覆装置、または他の投与の経路の中でイオン泳動による治療薬剤の投与を含むことができる。
【０１７８】
文脈は、治療がまた、治療レジメンまたは療法とも交換可能に使用されることを示すことを留意されたい。つまり、治療という用語は、患者の治療レジメンのすべてまたは一部を指すことができる。ある実施形態において、そのような治療レジメンは、標的ＣＥＡに免疫特異的に結合する抗ＣＥＡ癌治療薬の投与を含む。そのような治療はまた、単独でまたは抗ＣＥＡ癌治療薬に加えて、１つ以上のさらなる治療法を含むこともできる。そのような１つ以上のさらなる治療法としては、外科手術、化学療法、放射線療法、鍼療法、栄養療法、薬草療法等が含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態において、治療には、標的ＣＥＡに免疫特異的に結合する抗ＣＥＡ癌治療薬の投与を含み、患者は、抗ＣＥＡ癌治療薬と同一または実質的に同一のエピトープに免疫特異的に結合する診断試薬を用いる診断に従う。ある実施形態において、診断試薬および抗ＣＥＡ癌治療薬は、同一の抗体であるか、または少なくとも１つの抗原結合ドメインを共有する。ある実施形態において、診断試薬は、ＭＥＤＩ−５６５および／またはその変異体ではないが、治療試薬は、ＭＥＤＩ−５６５および／またはその変異体である。
【０１７９】
注射による投与では、抗ＣＥＡ治療薬は、眼球内、眼周囲、筋肉内、動脈内、皮下、または静脈内に注射することができる。ポンピング機構は、事前選択された期間にわたって、抗ＣＥＡ治療薬を投与するために採用することができる。本開示のいくつかの実施形態では、薬物を局所に送達することが望ましく、したがって、注射は、眼周囲、眼球内、硝子体内、結膜下、眼球後方、強膜、または前眼房になされ得る。本開示のいくつかの実施形態では、全身送達が好ましい。ある実施形態において、投与は、所定の時間／期間にわたる静脈内投与である。
【０１８０】
全身投与では、抗ＣＥＡ治療薬は、経口用に配合され、投与することができる。治療薬剤の局所あるいは全身への送達のいずれかをもたらし得る投与では、本開示の組成物は、鼻腔内、経皮的、吸入によって、または経口投与のいくつかの形態によって、例えば、胃腸管から吸収不良である本開示の化合物を組み込むうがい薬またはトローチ剤を用いて、投与することができる。本開示の組成物の局所または局所的送達をもたらし得る投与では、イオン導入または局所性投与を使用することができる。
【０１８１】
抗ＣＥＡ療法が単独で投与され得る一方、ある実施形態において、投与は、薬学的に許容される担体を介してなされる。好適な薬学的担体は、当技術分野で公知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、リポソーム、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶液等が含まれる。そのような担体を含む組成物は、公知の従来の方法によって製剤化することができる。これらの薬学的組成物は、好適な用量で、対象に投与することができる。用量レジメンは、担当の医師および臨床的因子によって決定される。医療業界で周知であるとおり、いずれか一人の患者のための投薬量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与されるべき特定の化合物、性別、投与の時間および経路、全般的健康度、および併用して投与される予定の他の薬物を含む多くの因子による。非経口投与のための製剤としては、滅菌水性または非水性溶液、および懸濁液が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、およびオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルである。水性担体には、生理食塩水および緩衝媒体を含む、水、水性溶液、または懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンガーのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンガー液、または固定油が含まれる。静脈内ビヒクルには、流動体および栄養補給剤、電解質補給剤（リンガーのデキストロースに基づいたもののような）等が含まれる。例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガス等の保存剤および他の添加剤も、存在し得る。加えて、組成物は、ヒト起源のある実施形態において、例えば、血清アルブミンまたは免疫グロブリン等のタンパク質担体を含んでもよい。併用療法は、抗ＣＥＡ療法に加えて、薬学的組成物の使用目的によって、さらなる生物学的に活性な薬剤を含むことができることが想定される。そのような薬剤は、胃腸管系に作用する薬剤、細胞増殖抑制剤（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃａ）として作用する薬剤、高尿酸血症を予防する薬剤、免疫反応を阻害する薬剤（例えば、コルチコステロイド、ＦＫ５０６）、循環系に作用する薬剤、および／またはＴ細胞共刺激分子もしくはサイトカイン等の当技術分野で公知の薬剤であってよい。ある実施形態において、抗ＣＥＡ療法は、緩衝液、安定剤、および界面活性剤中に製剤化される。緩衝液は、リン酸、クエン酸、コハク酸、または酢酸緩衝液であってもよい。安定剤は、アミノ酸（複数可）および／または糖類であってもよい。界面活性剤は、洗浄剤、ＰＥＧ等であってもよい。ある実施形態において、抗ＣＥＡ療法は、クエン酸塩、リシン、トレハロース、およびＴｗｅｅｎ８０中に製剤化される。該薬学的組成物のための希釈剤としては、等張塩類溶液およびＴｗｅｅｎ８０が好ましい。
【０１８２】
本明細書に使用される「寛解（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）」という用語は、疾患、すなわち、上皮腫瘍の重症度における改善または緩和を指す。例えば、そのような寛解は、本開示の薬学的組成物の投与に起因する、安定な疾患の達成、またはさらにより好ましくは、上皮腫瘍の縮小、すなわち、微小、部分的応答または完全寛解であり得る。「安定な疾患」とは、臨床的および／もしくは組織学的診断方法によって、腫瘍進行／増殖が全くまたはほとんど観察されないまたは検出されない疾患状態を指す。例えば、指標病変の断面積の合計が５０％より多くの縮小である、腫瘍の縮小は、「部分的応答」と考えられ得る。「完全寛解」は、治療後に病変がこれ以上全く検出することができない状態を意味する。安定な疾患と部分的応答との間の腫瘍縮小を伴う応答は、微小応答と考えられ得る。例えば、指標病変の断面積の合計の２０％、２５％、または３０％縮小は、微小応答と称され得る。本明細書に使用される「寛解」はまた、上皮腫瘍の数の減少も包含する。それは、さらに、腫瘍進行の阻止／減速を意味する。さらに、治療しなかった患者と比較して、治療した腫瘍患者の全体的な生存の改善は、本明細書に使用される「寛解」として考えられ得る。これは、必要な変更を加えて、治療しなかった腫瘍患者と比較して、治療した腫瘍患者の進行のない生存または再発のない生存の改善にも当てはまる。加えて、「寛解」という用語は、上皮腫瘍の症状の強度の減少も指し、その結果得られる、例えば、治療した腫瘍患者の生活の質の改善も指すことができる。
【０１８３】
本明細書に使用される「上皮腫瘍の予防」という用語は、次のように理解される。ヒト患者からの原発上皮腫瘍の外科切除後、および／または原発上皮腫瘍の化学療法または放射線治療後に、腫瘍細胞のすべてが身体から排除されない場合もあり得る。しかしながら、これらの残存腫瘍細胞は、患者において再発性癌、すなわち、局所再発および／または転移を引き起こす可能性がある。転移は、よく見られる癌の合併症であるが、癌細胞が原発腫瘍から播種されて遠位のコロニーを形成する過程はあまり分かっていない。転移性癌は、ほぼ例外なく難治性で新しい治療方法の必要性が生じる。本開示の薬学的組成物を使用して、これらの播種された腫瘍細胞を死滅させて二次性腫瘍（一次療法後に身体に残存する腫瘍細胞から生じる）の形成を予防することができる。このようにして、薬学的組成物は、腫瘍患者において、局所再発および／または転移の形成を予防するために役立つ。
【０１８４】
抗腫瘍療法の成功は、それぞれの疾病について、例えば、コンピュータ断層撮影、Ｘ線、核磁気共鳴断層撮影（例えば、米国国立癌研究所の判定基準に基づく応答評価［Ｃｈｅｓｏｎ（１９９９），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．；１７（４）：１２４４］）、陽電子放射断層撮影走査、内視鏡検査、蛍光活性化細胞分類、骨髄の吸引、胸水または腹水、組織／組織学、および様々な上皮腫瘍特異的臨床化学パラメータ（例えば、血清中の可溶性ＣＥＡ濃度）により確立された標準的な方法でモニターすることができ、さらに、他の確立された標準的な方法を用いてよい。加えて、Ｔ細胞の活性化を判定するアッセイを用いてもよい；例えば、ＷＯ第９９／０５４４４０号を参照のこと。治療しなかった腫瘍患者と比較して、治療した腫瘍患者の全体的な生存、進行のない生存または再発のない生存の決定のために統計学を用いることができる。
【０１８５】
ある実施形態において、該上皮腫瘍は、胃腸腺癌、乳腺腺癌、または肺腺癌である。ある実施形態において、該胃腸腺癌は、結腸直腸腺癌、膵臓腺癌、食道腺癌、または胃腺癌である。
【０１８６】
他の実施形態において、本開示の該薬学的組成物は、腫瘍患者の血清／血漿中の高レベルの可溶性ＣＥＡ抗原を特徴とする、進行性腫瘍、後期腫瘍、腫瘍負荷量／腫瘍組織量が高い腫瘍患者、転移性腫瘍、またはＣＥＡ血清中濃度が１００ｎｇ／ｍＬより高い腫瘍患者（例えば、ＥＬＩＳＡにより測定）の治療のためのものである。
【０１８７】
本開示の使用または方法の別の実施形態において、上記に定義されるような該薬学的組成物は、追加薬物と組み合わせて、すなわち、併用療法の一部として、投与されるのに適している。
【０１８８】
ある実施形態において、抗ＣＥＡ抗体または治療薬学的組成物は、１つ以上の他の治療薬と組み合わせて投与される。ある実施形態において、抗ＣＥＡ抗体または治療薬学的組成物は、１つ以上の他の治療薬と同時に患者に投与される。ある実施形態において、そのような治療薬は、上皮腫瘍の治療に有用である。「同時に」という用語は、厳密に同一時点での薬学的組成物または治療薬剤の投与に限定されるものではなく、抗ＣＥＡ抗体または治療薬学的組成物が他の薬剤と共に作用して、それらがそれ以外の様態で投与された場合よりも増加した利益をもたらし得るように、ある配列および時間間隔内で、抗ＣＥＡ抗体または治療薬学的組成物が対象に投与されることを意味する。例えば、それぞれの治療薬剤は、同時に、または異なる時点においていずれかの順序で連続的に投与され得るが、それらは、同時に投与されない場合には、所望の治療効果が得られるように、時間的に十分に接近して投与されるべきである。それぞれの治療薬剤は、任意の適当な形態および任意の適当な経路で、別々に対象に投与することができる。他の実施形態において、抗ＣＥＡ抗体または治療薬学的組成物は、外科手術前に、同時に、またはその後に投与される。ある実施形態において、外科手術は、局所性上皮腫瘍を完全に切除し、サイズの大きい上皮腫瘍を縮小させる。外科手術はまた、予防手段として、または痛みを鎮めるために行うこともできる。本明細書に提供される投与の投薬量および頻度は、上で定義されるように、「治療効果のある」という用語によって包含される。投薬量および頻度は、さらに、一般的に、それぞれの患者に対して特異的な要因に従って異なり、これは、投与される特定の治療または予防薬剤、上皮腫瘍の重症度および型、投与経路、ならびに年齢、体重、反応、および患者の過去の病歴によって異なる。好適なレジメンは、そのような因子を考慮することによって、および例えば、文献に報告され、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（５９ｔｈ  ｅｄ．，２００５）で推奨されている投薬量に従うことにより、当業者によって選択することができる。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、抗ＣＥＡ抗体または治療薬学的組成物の投与による療法は、１つ以上の療法、例えば、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、および／または生物学的療法／免疫療法の投与と組み合わせる。治療薬剤には、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質（翻訳後修飾されたタンパク質、抗体等を含む）、または小分子（１０００ダルトン未満）、無機もしくは有機化合物、または核酸分子（２本鎖もしくは１本鎖ＤＮＡ、または２本鎖もしくは１本鎖ＲＮＡ、ならびに三重らせん核酸分子を含む）が含まれるが、これらに限定されない、タンパク質性分子が含まれるが、これらに限定されない。治療薬剤は、任意の既知生物（動物、植物、細菌、真菌、および原生生物、またはウイルスが含まれるが、これらに限定されない）に由来するか、または合成分子ライブラリーに由来してよい。
【０１９０】
特定の実施形態において、本開示の方法および使用は、キナーゼ、例えば、当技術分野に記載されるゲフィチニブ（イレッサ）、エルロチニブ（タルセバ）、抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、セツキシマブ、エルビタックス）、または抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体（例えば、トラスツズマブ、ハーセプチン）の阻害剤である１つ以上の治療薬剤の投与と組み合わせた、抗ＣＥＡ抗体または治療薬学的組成物の投与を包含し、例えば、Ｈａｒｄｉｅ  ａｎｄ  Ｈａｎｋｓ（１９９５）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ，Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを参照のこと。
【０１９１】
別の特定の実施形態において、本開示の方法および使用は、例えば、当技術分野に記載される、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ；アバスチン）、小分子化合物（例えば、バタラニブもしくはソラフェニブ）、またはＣＯＸ阻害剤である、１つ以上の治療薬剤の投与と組み合わせた、抗ＣＥＡ抗体または治療薬学的組成物の投与を包含する。
【０１９２】
別の特定の実施形態において、本開示の方法および使用は、例えば、当技術分野に記載される、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、カペシタビン、オキサリプラチン、イリノテカン、ゲムシタビン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、シスプラチン、カルボプラチン、タキサン類（例えば、ドセタキセル、パクリタキセル）である、１つ以上の治療薬剤の投与と組み合わせた、抗ＣＥＡ抗体または治療薬学的組成物の投与を包含する。
【０１９３】
ある実施形態において、さらなる治療薬剤と組み合わせた抗ＣＥＡ抗体または治療薬学的組成物を用いて、上皮腫瘍を患っている患者の併用療法は、相乗効果をもたらす。本明細書に使用される「相乗な」という用語は、任意の２つ以上の単一療法（例えば、１つ以上の治療薬剤）の相加効果よりも効果的な療法の組み合わせ（例えば、上に説明される、抗ＣＥＡ抗体または治療薬およびさらなる治療薬剤の組み合わせ）を指す。例えば、抗ＣＥＡ抗体または治療薬は、単剤療法として患者に投与される場合、上皮腫瘍の直径の２０％の縮小を引き起こすことができる。対照的に、二次治療薬、例えば、以下に定義される抗癌剤は、１０％の腫瘍の縮小を引き起こすことができる。しかしながら、抗ＣＥＡ抗体または治療薬および該二次治療薬の両方が、併用療法の形態で組み合わせて投与される場合、５０％の腫瘍の縮小が観察され得る。
【０１９４】
療法の組み合わせ（例えば、上に説明される、抗ＣＥＡ抗体または治療薬およびさらなる治療薬剤（複数可））の相乗効果により、低投薬量の１つ以上の療法（例えば、１つ以上の治療薬剤）および／または疾患、例えば、上皮腫瘍のある患者へ該療法の低頻度の投与が可能となる。低投薬量の療法（例えば、治療薬剤）を用いることができ、かつ／または該療法を低頻度で投与することができると、疾患、例えば、上皮腫瘍の予防または治療において該療法の効果を低下させることなく、該療法の対象への投与に関連する毒性が低減される。加えて、相乗効果は、上皮腫瘍（ＣＥＡの異常な発現（例えば、過剰発現）または活性を伴う可能性がある）の予防、制御、治療、および／または寛解において、療法（例えば、治療薬剤）の改善された有効性をもたらし得る。最後に、療法（例えば、治療薬剤）の組み合わせの相乗効果は、任意の単一療法の使用に関連する、有害なまたは望ましくない副作用を回避または減少させることができる。
【０１９５】
該併用療法において、活性薬剤は、任意に、抗ＣＥＡ抗体または治療薬と同一の薬学的組成物中に含まれ得るか、または別個の薬学的組成物中に含まれ得る。この後者の場合、該別個の薬学的組成物は、抗ＣＥＡ抗体または治療薬を含む該薬学的組成物の投与よりも前に、同時に、または後に、投与されるのに適している。さらなる薬物または薬学的組成物は、非タンパク質性化合物またはタンパク質性化合物であり得る。さらなる薬物が、タンパク質性化合物である場合、該タンパク質性化合物は、免疫エフェクター細胞の活性化シグナルを提供できることが有利である。
【０１９６】
ある実施形態において、該タンパク質化合物または非タンパク質化合物は、抗ＣＥＡ抗体または治療薬と同時に、または非同時に投与することができる。ある実施形態において、治療されるべき該対象は、ヒトである。
【０１９７】
癌療法およびそれらの用量、投与経路および推奨される使用は、当技術分野で既知であり、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（５６ｔｈ  ｅｄ．，２００２）等の文献に記載されている。
【０１９８】
ある実施形態において、治療レジメンは、抗ＣＥＡ部分および抗ＣＤ３部分の両方を含む二重特異性抗体（二重特異性一本鎖抗体を含む）による治療を含む。ある実施形態において、本開示の方法で使用されるべき治療薬は、ＭＥＤＩ−５６５である。ＭＥＤＩ−５６５を含むそのような二重特異性抗体により治療するための特定の方法は、ＰＣＴ公開ＷＯ第２００７／０７１４２６号に見出され、これは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。Ｌｕｔｔｅｒｂｕｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ３２：３４１−３５２、Ｏｓａｄａ  ｅｔ  ａｌ．２０１０，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，１０２：１２４−３３、およびＭｅｄｉｃａｌ  Ｎｅｗｓ  Ｔｏｄａｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄｉｃａｌｎｅｗｓｔｏｄａｙ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／１４５６９０．ｐｈｐ）も参照されたく、これらのそれぞれは、ＭＥＤＩ−５６５を説明し、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。ある実施形態において、使用されるべき治療薬には、少なくとも、ＭＥＤＩ−５６５と同一または実質的に同一のエピトープに結合するＣＥＡ結合部分が含まれる。
【０１９９】
ある実施形態において、使用されるべき治療薬は、少なくとも、配列番号２８〜４４および４６〜５１のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むＣＥＡ部分を含む。ある実施形態において、使用されるべき治療薬は、配列番号２８〜４４および４７のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む二重特異性抗体である。ある実施形態において、使用されるべき治療薬は、配列番号３４、３６、４１、４２、４３、および４７のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む二重特異性抗体である。ある実施形態において、使用されるべき治療薬は、配列番号３７〜４０のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む二重特異性抗体である。ある実施形態において、使用されるべき治療薬は、配列番号４８で表されるアミノ酸配列を含む二重特異性抗体である。ある実施形態において、使用されるべき治療薬は、配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含む二重特異性抗体である。ある実施形態において、使用されるべき治療薬は、配列番号４８および４９で表されるアミノ酸配列を含む二重特異性抗体である。ある実施形態において、使用されるべき治療薬は、配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含む二重特異性抗体である。
【０２００】
ある実施形態において、使用されるべき治療薬は、二重特異性一本鎖抗体等の二重特異性抗体である。第１および第２の結合ドメイン、例えば、二重特異性抗体または二重特異性一本鎖抗体内の配列の順序は、関連がある。結合ドメインの配列は、ＶＨＣＥＡ−ＶＬＣＥＡ−ＶＨＣＤ３−ＶＬＣＤ３、ＶＬＣＥＡ−ＶＨＣＥＡ−ＶＨＣＤ３−ＶＬＣＤ３、ＶＨＣＤ３−ＶＬＣＤ３−ＶＨＣＥＡ−ＶＬＣＥＡ、またはＶＨＣＤ３−ＶＬＣＤ３−ＶＬＣＥＡ−ＶＨＣＥＡであり得ることが想定される。いくつかの例において、ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１の結合ドメインは、ＶＨ−ＶＬ配向に配列される。例えば、本明細書に定義される二重特異性一本鎖抗体の結合ドメインは、ＶＨＣＥＡ−ＶＬＣＥＡ−ＶＨＣＤ３−ＶＬＣＤ３またはＶＬＣＥＡ−ＶＨＣＥＡ−ＶＨＣＤ３−ＶＬＣＤ３の順序に配列され得る。この文脈に使用される、「Ｎ末端に」または「Ｃ末端に」およびその文法的な変形は、分子の絶対的なＮまたはＣ末端での配置よりもむしろ、一次アミノ酸配列内の相対的位置を示す。したがって、非限定例として、「第２の結合ドメインにＣ末端に位置する」第１の結合ドメインは、単に、第１の結合ドメインが、二重特異性抗体内の第２の結合ドメインのカルボキシル側に位置し、さらなる配列、例えば、上で説明されるタグ、または放射性同位体等の別のタンパク質もしくは非タンパク質化合物が、二重特異性抗体の最終Ｃ末端で位置する可能性を除外しないことを意味する。
【０２０１】
ある実施形態において、治療薬は、結合ドメインが、ＶＨＣＥＡ−ＶＬＣＥＡ−ＶＨＣＤ３−ＶＬＣＤ３またはＶＬＣＥＡ−ＶＨＣＥＡ−ＶＨＣＤ３−ＶＬＣＤ３の順序で配列される、二重特異性抗体または二重特異性一本鎖抗体である。ある実施形態において、配列は、ＶＬＣＥＡ−ＶＨＣＥＡ−ＶＨＣＤ３−ＶＬＣＤ３である。ある実施形態において、治療薬は、配列番号４６に定義される、二重特異性一本鎖抗体構築物Ａ２４０  ＶＬ−Ｂ９  ＶＨｘ配列番号５０  ＶＨＶＬである。
【０２０２】
いくつかの例において、二重特異性抗体または二重特異性一本鎖抗体のヒトＣＥＡに免疫特異的に結合する結合ドメインは、少なくとも１つのＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ−Ｈ３、例えば、アミノ酸配列「ＦＹＦＤＹ」（配列番号２８）が、それぞれ、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のＫａｂａｔ位置１００、１００ａ、１００ｂ、１０１、および１０２に対応する、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３の一部を含む。いくつかの例において、ＣＤＨ−Ｈ３は、アミノ酸配列「ＤＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＦＹＦＤＹ」（配列番号２９）を有し、「Ｘ１」、「Ｘ２」、「Ｘ３」、または「Ｘ４」は、あらゆるアミノ酸残基を表し、アミノ酸残基「Ｄ」は、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のＫａｂａｔ位置９５に対応し、アミノ酸残基「ＦＹＦＤＹ」は、それぞれ、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３の、Ｋａｂａｔ位置１００、１００ａ、１００ｂ、１０１、および１０２に対応する。この点で、「Ｘ１」、「Ｘ２」、「Ｘ３」、および「Ｘ４」は、それぞれ、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３の、Ｋａｂａｔ位置９６（「Ｘ１」）、９７（「Ｘ２」）、９８（「Ｘ３」）、および９９（「Ｘ４」）に対応する。「Ｘ１」、「Ｘ２」、「Ｘ３」、または「Ｘ４」は、アミノ酸残基「Ｒ」（アルギニン）、「Ｇ」（グリシン）、「Ｌ」（ロイシン）、「Ｙ」（チロシン）、「Ａ」（アラニン）、「Ｄ」（アスパラギン酸）、「Ｓ」（セリン）、「Ｗ」（トリプトファン）、「Ｆ」（フェニルアラニン）、または「Ｔ」（トレオニン）を表すことが想定される。ある実施形態において、「Ｘ１」、「Ｘ２」、「Ｘ３」、および「Ｘ４」は、同一のアミノ酸、例えば、「Ｘ１」、「Ｘ２」、「Ｘ３」、および「Ｘ４」はすべて、「Ｆ」（フェニルアラニン）であることを表すことは、本開示の範囲から除外される。ある実施形態において、「Ｘ１」は、「Ｒ」（アルギニン）、「Ｆ」（フェニルアラニン）、「Ｍ」（メチオニン）、「Ｅ」（グルタミン酸）、または「Ｔ」（トレオニン）を表し、「Ｘ２」は、「Ｇ」（グリシン）、「Ｙ」（チロシン）、「Ａ」（アラニン）、「Ｄ」（アスパラギン酸）または、「Ｓ」（セリン）を表し、「Ｘ３」は、「Ｌ」（ロイシン）、「Ｆ」（フェニルアラニン）、「Ｍ」（メチオニン）、「Ｅ」（グルタミン酸）または、「Ｔ」（トレオニン）を表し、「Ｘ４」は、「Ｒ」（アルギニン）、「Ｙ」（チロシン）、「Ａ」（アラニン）、「Ｄ」（アスパラギン酸）または、「Ｓ」（セリン）を表す。
【０２０３】
いくつかの例において、ヒトＣＥＡに対して特異的な第２の結合ドメインは、モノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３の、少なくとも、アミノ酸配列「ＲＦＹＦＤＹ」（配列番号３０）、「ＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号３１）、「ＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号３２）、または「ＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号３３）を含む。いくつかの例において、第２の結合ドメインは、アミノ酸配列「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号３４）が、それぞれ、Ｋａｂａｔ位置９５（「Ｄ」、アスパラギン酸）、９６（「Ｒ」、アルギニン）、９７（「Ｇ」、グリシン）、９８（「Ｌ」、ロイシン）、９９（「Ｒ」、アルギニン）、１００（「Ｆ」、フェニルアラニン）、１００ａ（「Ｙ」、チロシン）、１００ｂ（「Ｆ」、フェニルアラニン）、１０１（「Ｄ」、アスパラギン酸）、および１０２（「Ｙ」、チロシン）に対応する、Ａ５Ｂ７の完全ＣＤＲ−Ｈ３を含む。Ｋａｂａｔによる付番系は、例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｔ．Ｔ．Ｗｕ，Ｈ．Ｍ．Ｐｅｒｒｙ，Ｋ．Ｓ．Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，ａｎｄ  Ｃ．Ｆｏｅｌｌｅｒ．１９９１．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅに記載されている。
【０２０４】
ある実施形態において、例えば、（上皮腫瘍細胞上の）ＣＥＡ標的抗原に対する親和性を改善する、および／または本明細書に定義される二重特異性一本鎖抗体の「微細特異性」を最適化するために、このＡ５Ｂ７由来の「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号３４）のＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列をさらに修飾することが望ましい場合がある。そのために、アミノ酸配列「ＤＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＦＹＦＤＹ」（配列番号２９）において、様々なアミノ酸残基は、向上した親和性および／または微細特異性を有する修飾されたＣＤＲ−Ｈ３を特定するために、位置「Ｘ１」、「Ｘ２」、「Ｘ３」、および／または「Ｘ４」（マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３の、それぞれ、Ｋａｂａｔ位置９６（「Ｘ１」）、９７（「Ｘ２」）、９８（「Ｘ３」）、および９９（「Ｘ４」）に対応する）で、試験することができる。例えば、「Ｘ１」、「Ｘ２」、「Ｘ３」、または「Ｘ４」は、アミノ酸残基「Ｒ」（アルギニン）、「Ｇ」（グリシン）、「Ｌ」（ロイシン）、「Ｙ」（チロシン）、「Ａ」（アラニン）、「Ｄ」（アスパラギン酸）、「Ｓ」（セリン）、「Ｗ」（トリプトファン）、「Ｆ」（フェニルアラニン）または、「Ｔ」（トレオニン）を表すことができる。本明細書では、１つ、２つ、３つ、またはすべて４つの表示された「Ｘ」位置は、ＣＤＲ−Ｈ３「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号３４）アミノ酸配列において、Ｋａｂａｔ位置９６〜９９で元の「ＲＧＬＲ」アミノ酸配列と比較して、交換することができる。ある実施形態において、「Ｘ１」、「Ｘ２」、「Ｘ３」、および「Ｘ４」は、同一のアミノ酸、例えば、「Ｘ１」、「Ｘ２」、「Ｘ３」、および「Ｘ４」はすべて、「Ｆ」（フェニルアラニン）であることを表すことは、除外される。Ａ５Ｂ７由来の「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」ＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列の上記の修飾は、当技術分野で既知の方法、例えば、無作為プライマーを用いて、ＰＣＲ法によって達成することができ、それは、ＣＥＡ結合ドメインのそのような修飾されたＣＤＲ−Ｈ３領域を有する二重特異性一本鎖抗体の生成を可能にする。これらの修飾された二重特異性一本鎖抗体の親和性または微細特異性は、当技術分野で記載の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、またはＦＡＣＳ分析によって、試験することができる。
【０２０５】
いくつかの実施形態において、二重特異性一本鎖抗体等の治療薬剤のヒトＣＥＡに対して特異的な結合ドメインは、アミノ酸配列「ＳＹＷＭＨ」（配列番号３６）を有するＣＤＲ−Ｈ１および／またはアミノ酸配列「ＦＩＲＮＫＡＮＧＧＴＴＥＹＭＳＶＫＧ」（配列番号３７）または「ＦＩＬＮＫＡＮＧＧＴＴＥＹＭＳＶＫＧ」（配列番号３８）を有するＣＤＲ−Ｈ２を含む。
【０２０６】
いくつかの実施形態において、二重特異性一本鎖抗体等の治療薬剤のヒトＣＥＡに対して特異的な結合ドメインは、アミノ酸配列「ＳＹＷＭＨ」（配列番号３６）を有するＣＤＲ−Ｈ１および／またはアミノ酸配列「ＦＩＲＮＫＡＮＧＧＴＴＥＹＭＳＶＫＧ」（配列番号３７）または「ＦＩＲＮＫＡＮＧＧＴＴＥＹＡＡＳＶＫＧ」（配列番号４７）を有するＣＤＲ−Ｈ２を含む。
【０２０７】
あるいは、本明細書に定義される二重特異性一本鎖抗体のヒトＣＥＡに対して特異的な該第２の結合ドメインは、アミノ酸配列「ＴＹＡＭＨ」（配列番号３９）を有するＣＤＲ−Ｈ１および／またはアミノ酸配列「ＬＩＳＮＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ」（配列番号４０）を有するＣＤＲ−Ｈ２を含む。
【０２０８】
ある実施形態において、二重特異性抗体または二重特異性一本鎖抗体等のヒトＣＥＡに対して特異的な結合ドメインのＶＨ領域のアミノ酸配列は、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のＫａｂａｔ位置９５〜１０２に対応する「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号３４）、アミノ酸配列「ＳＹＷＭＨ」（配列番号３６）を有するＣＤＲ−Ｈ１、およびアミノ酸配列「ＦＩＲＮＫＡＮＧＧＴＴＥＹＭＳＶＫＧ」（配列番号３７）を有するＣＤＲ−Ｈ２を含む。
【０２０９】
ある実施形態において、二重特異性形式または二重特異性一本鎖形式等において、ヒトＣＥＡに対して特異的な結合ドメインのＶＨ領域のアミノ酸配列は、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のＫａｂａｔ位置９５〜１０２に対応する「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号３４）、アミノ酸配列「ＳＹＷＭＨ」（配列番号３６）を有するＣＤＲ−Ｈ１、およびアミノ酸配列「ＦＩＬＮＫＡＮＧＧＴＴＥＹＡＡＳＶＫＧ」（配列番号４４）を有するＣＤＲ−Ｈ２を含む配列番号１４６である。
【０２１０】
ある実施形態において、二重特異性形式または二重特異性一本鎖形式等において、ヒトＣＥＡに対して特異的な結合ドメインのＶＨ領域のアミノ酸配列は、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のＫａｂａｔ位置９５〜１０２に対応する「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号３４）、アミノ酸配列「ＳＹＷＭＨ」（配列番号３６）を有するＣＤＲ−Ｈ１、およびアミノ酸配列「ＦＩＲＮＫＡＮＧＧＴＴＥＹＡＡＳＶＫＧ」（配列番号４７）を有するＣＤＲ−Ｈ２を含む。
【０２１１】
ある実施形態において、二重特異性一本鎖形式等において、ヒトＣＥＡに対して特異的な結合ドメインのＶＨ領域のアミノ酸配列は、マウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７のＣＤＲ−Ｈ３のＫａｂａｔ位置９５〜１０２に対応する「ＤＲＧＬＲＦＹＦＤＹ」（配列番号３４）、アミノ酸配列「ＴＹＡＭＨ」（配列番号３９）を有するＣＤＲ−Ｈ１、およびアミノ酸配列「ＬＩＳＮＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ」（配列番号４０）を有するＣＤＲ−Ｈ２を含む。
【０２１２】
ある実施形態において、ヒトＣＥＡに対して特異的な結合ドメインのＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号５９の配列を有するアミノ酸配列を含む。
【０２１３】
したがって、例えば、二重特異性一本鎖抗体のヒトＣＥＡに対して特異的な該結合ドメインは、上に定義される１つ、２つ、または３つのＣＤＲ−Ｈ領域を含むことができる。
【０２１４】
ある実施形態において、ヒトＣＥＡに対して特異的な結合ドメインのＶＬ領域のアミノ酸配列は、例えば、二重特異性形式または二重特異性一本鎖形式で、アミノ酸配列「ＴＬＲＲＧＩＮＶＧＡＹＳＩＹ」（配列番号４１）を有するＣＤＲ−Ｌ１、アミノ酸配列「ＹＫＳＤＳＤＫＱＱＧＳ」（配列番号４２）を有するＣＤＲ−Ｌ２、およびアミノ酸配列「ＭＩＷＨＳＧＡＳＡＶ」（配列番号４３）を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む。
【０２１５】
ある実施形態において、ヒトＣＥＡに対して特異的な結合ドメインのＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号４８の配列を有するアミノ酸配列を含む。
【０２１６】
上記のように、ＣＥＡに特異的に結合する第２の結合ドメインの可変領域の順序または配列は、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨであり得る。
【０２１７】
ある実施形態において、治療用二重特異性抗体または二重特異性一本鎖抗体等の治療薬剤のＣＥＡ結合部分のＶ領域は、
（ａ）配列番号４９に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ領域および配列番号４８に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ領域、
（ｂ）配列番号５１に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ領域および配列番号４８に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ領域、から選択される。
【０２１８】
ある実施形態において、治療薬は、
（ａ）配列番号２８〜５１のいずれかに示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２８〜５１のいずれかをコードするアミノ酸配列、
（ｃ）（ｂ）の相補的核酸配列に対するストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
（ｄ）（ｂ）の核酸配列への遺伝子コードの結果として、変性される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、および
（ｅ）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一のアミノ酸配列、から選択されるアミノ酸配列を含む二重特異性一本鎖抗体である。
【０２１９】
ある実施形態において、治療薬は、配列番号４６のアミノ酸配列を含む二重特異性一本鎖抗体である。
【０２２０】
（ｖ）薬学的製剤
抗体ベースの治療薬剤に特に有用な製剤はまた、米国特許出願公開第２００３０２０２９７２号、第２００４００９１４９０号、および第２００５０１５８３１６号にも記載されている。ある実施形態において、本出願の液体製剤は、実質的には、界面活性剤および／または無機塩がない。別の特定の実施形態において、液体製剤は、約５．０〜約７．０の範囲のｐＨを有する。なお別の特定の実施形態において、液体製剤は、約１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で、ヒスチジンを含む。さらに別の特定の実施形態において、液体製剤は、１ｍＭ〜１００ｍＭの範囲の濃度で、ヒスチジンを含む。液体製剤は、サッカリド、アミノ酸（例えば、アルギニン、リジン、およびメチオニン）、ならびにポリオール等の１つ以上の賦形剤をさらに含むことができることも企図される。液体製剤を調製し、分析するさらなる説明および方法は、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ第０３／１０６６４４号、ＷＯ第０４／０６６９５７号、およびＷＯ第０４／０９１６５８号に見出され得る。
【０２２１】
ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム等の湿潤剤、乳化剤、および潤滑剤、ならびに着色剤、放出剤、被覆剤、甘味料、香味剤および香料、保存料および酸化防止剤もまた、本出願の薬学的組成物中に存在することができる。
【０２２２】
ある実施形態において、対象抗体の製剤は、実質的に内毒素および／または関連する発熱物質がない、発熱物質非含有製剤である。内毒素は、微生物内に限定されていて、微生物が、破壊されるかまたは死んだ場合に放出される毒素が含まれる。また、発熱物質には、細菌および他の微生物の外膜由来の発熱誘発性熱安定性物質（糖タンパク質）が含まれる。これらの物質は共に、ヒトに投与された場合に、発熱、低血圧、およびショックを引き起こし得る。潜在的な有害な作用のため、低量の内毒素であっても、それを静脈内に投与される医薬品溶液から除去したほうが好都合である。Ｆｏｏｄ＆Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（「ＦＤＡ」）は、静脈内薬物投与の１回の１時間の期間中、５内毒素単位（ＥＵ）／用量／キログラム体重の上限を定めている（Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｆｏｒｕｍ  ２６（１）：２２３（２０００））。治療タンパク質が、数百または数千ミリグラム／キログラム体重の量で投与される場合、モノクローナル抗体を用いる場合であり得るように、微量の内毒素であってもそれを除去するのが好都合である。
【０２２３】
対象治療試薬の製剤には、経口、食事、局所、非経口（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下注射）、眼科用（例えば、局所もしくは眼球内）、吸入（例えば、気管支内、経鼻投与もしくは経口吸入、鼻内滴剤）、直腸、ならびに／または膣内投与に適したものが含まれる。他の好適な投与方法はまた、再充電可能なまたは生物分解可能なデバイスおよび制御放出ポリマーデバイスも含むことができる。特に、ステントは、本出願の薬剤と混合した制御放出ポリマーで被覆され得る。本開示の薬学的組成物はまた、他の薬剤を用いた組み合わせ療法の一部として（同一の製剤中あるいは別個の製剤中のいずれか）、投与することもできる。診断試薬用の製剤は、当技術分野の技術レベル内であり、インビトロ（エクスビボ）またはインビボ使用のために好適な賦形剤を含む。
【０２２４】
治療的に有効である製剤の量は、標準臨床技法によって決定することができる。加えて、インビトロアッセイを、任意に採用して、最適な投薬量範囲を特定するのに役立てることができる。製剤で採用される正確な用量も、投薬経路、および疾患または障害の重篤度に依存し、医師の判断、およびそれぞれの患者の状況に従って決定されなければならない。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系より得た用量応答曲線から外挿され得る。投与される組成物の投薬量は、標準用量応答試験と併せて必要以上の実験を行わずに、当業者が決定することができる。これらの決定を行う際に検討される関連状況は、治療される１つ以上の状態、投与される組成物の選択、個々の患者の年齢、体重、および応答、ならびに患者の症状の重症度を含む。例えば、患者の実際の体重を使用して、投与される製剤の用量がミリリットル（ｍＬ）で計算され得る。「理想」体重への下方調整は行われ得ない。そのような状況で、適切な用量は、以下の式：
用量（ｍＬ）＝［患者体重（ｋｇ）×用量レベル（ｍｇ／ｋｇ）／薬物濃度（ｍｇ／ｍＬ）］によって計算され得る。
【０２２５】
体液パラメーターの所望の減少を達成するために、そのような抗ＣＥＡ抗体は、様々な単位剤形で投与され得る。用量は、特定の抗体に従って異なる。例えば、異なる抗体は、異なる質量および／または親和性を有し得、そしてしたがって、異なる投薬量レベルを必要とし得る。Ｆａｂ′フラグメントとして調製される抗体または一本鎖抗体はまた、それらは天然免疫グロブリンよりかなり小さい質量であり、そしてしたがって、患者の血液中で同一のモルレベルに達するためにより低い投薬量を必要とするので、等価な天然免疫グロブリンとは異なる投薬量を必要とする。
【０２２６】
本開示の他の治療薬はまた、様々な単位剤形で投与され得、それらの投薬量はまた、投与される特定の治療薬の大きさ、有効性、およびインビボ半減期によって異なる。
【０２２７】
疾患の治療の目的には、本化合物（例えば、抗体）の適切な投薬量は、疾患の重症度および経過、患者の病歴および応答、抗体の毒性、ならびに医師の判断によって異なる。初期の候補投薬量が、患者に投与され得る。適切な投薬量および治療レジメンは、当業者に公知である従来の技術を用いて療法の経過をモニターすることにより確立することができる。
【０２２８】
本出願の製剤は、包装材料、ならびに投与様式に適切であるように、例えば、抗体および薬学的に許容される担体を含む薬学的薬剤を含む製品として流通され得る。包装材料は、製剤が癌の治療で用いることを示すラベルを含む。
【０２２９】
本開示の診断試薬についての有効な投薬量および投薬レジメンは、治療されるべき疾患または状態によって異なり、当業者によって決定することができる。
【０２３０】
（ｖｉ）製品およびキット
本開示は、本開示の液体製剤または凍結乾燥製剤で充填された１つ以上の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。特定の実施形態において、本開示の製剤は、異種タンパク質、異種ポリペプチド、異種ペプチド、大分子、小分子、マーカー配列、診断もしくは検出可能な薬剤、治療的部分、薬物部分、放射性金属イオン、二次抗体、および固体支持体が含まれるが、これらに限定されない、別の部分に組み換え技術によって融合されるまたは化学的に共役される抗ＣＥＡ診断または治療試薬を含む。特定の実施形態において、本開示の製剤は、無菌液体として単回用量バイアル中に製剤化される。本開示の製剤は、３ｃｃのＵＳＰ  Ｉ型ホウケイ酸褐色バイアル（Ｗｅｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ−部品番号６８００−０６７５）中に標的容積の１．２ｍＬで供給される。任意に、かかる容器（複数可）は、医薬品または生物学的製品の製造、使用、または販売を管理している行政機関によって規定された形態の注意書きを伴い、そのような注意書きは、ヒト診断および／または投与のための製造、使用、または販売に関する機関による承認を反映するものである。
【０２３１】
ある実施形態において、様々な目的、例えば、細胞からＣＥＡの精製または免疫沈降、標的ＣＥＡの検出用等を含む研究および診断のために有用である抗ＣＥＡ診断試薬を含むキットも提供される。ＣＥＡの単離および精製のために、キットは、ビーズ（例えば、セファロースビーズ）に結合された抗ＣＥＡ診断試薬を含有することができる。例えば、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット法において、インビトロで標的ＣＥＡの検出および定量のための抗体を含有するキットが、提供され得る。製品と同様に、キットは、容器と、容器上あるいは容器に付属したラベルまたは添付文書とを含む。容器は、本開示の少なくとも１つの抗ＣＥＡ診断試薬を含む組成物を保持する。例えば、希釈剤および緩衝液、対照診断試薬を含有するさらなる容器が、含まれ得る。ラベルまたは添付文書は、組成物の説明、ならびに意図したインビトロでまたは診断的使用のための指示を提供することができる。
【０２３２】
ある実施形態において、本開示は、抗ＣＥＡ治療試薬および好適な診断試薬の両方を含むキット（いわゆる、二重試薬キット）を提供する。そのようなキットは、前述の実施形態のいずれか、例えば、好適な緩衝液等を使用するための取扱説明書等を含むことができる。ある実施形態において、二重試薬キットは、一致するため、治療試薬および診断試薬が、同一または実質的に同一のエピトープに結合する。例えば、治療試薬および診断試薬は、標的ＣＥＡ（完全長または短型）に免疫特異的に結合し、診断および治療試薬は、同一または実質的に同一のエピトープに免疫特異的に結合する。ある実施形態において、診断試薬および治療試薬は、同一物である。ある実施形態において、２つの試薬は、少なくとも１つの抗原結合部分を共有する。
【０２３３】
（ｖｉｉ）ＲＮＡ検出方法
本出願は、生物学的試料中の完全長および／または短型癌胎児性抗原（ＣＥＡ）のＲＮＡの発現を検出する方法を提供する。（ｉ）完全長ＣＥＡヌクレオチドに存在する配列（例えば、短型からスプライスされた領域）、または短型ＣＥＡヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするが、完全長ＣＥＡヌクレオチド配列（例えば、完全長が不在の短型ＣＥＡヌクレオチドにおけるスプライス部位）には特異的にハイブリダイズしないこと、（ｉｉ）短型ＣＥＡの発現と完全長ＣＥＡの発現を区別する様式で、短型ＣＥＡヌクレオチド配列および完全長ＣＥＡヌクレオチド配列の両方に特異的にハイブリダイズすることによって、完全長および／または短型ＣＥＡの発現を特異的に特定するＣＥＡヌクレオチド配列にハイブリダイズする核酸プローブまたは核酸プライマーのうちの１つまたは両方が、提供される。生物学的試料からのＲＮＡが、さらに提供される。最終的に、生物学的試料中の短型ＣＥＡのＲＮＡの発現は、核酸プローブおよび／または核酸プライマーを用いることによって検出される。
【０２３４】
生物学的試料中の対象となる核酸の検出は、任意に、オリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイズベースのアッセイによって達成され得る（本開示によるプローブの非限定例が、前述された）。
【０２３５】
従来のハイブリダイゼーションアッセイには、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護、原位置ハイブリダイゼーション、プライマー伸長、サザンブロット（ＤＮＡ検出）、ドットまたはスロットブロット（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、およびノーザンブロット（ＲＮＡ検出）が含まれる。より最近になって、ＰＮＡが（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：７１−７５）記載されている。他の検出方法は、ディップスティック構成等のプローブを具備するキットを含む。
【０２３６】
生物学的試料中の対象となる標的（すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の検出を可能にするハイブリダイゼーションベースのアッセイは、例えば、１０、１５、２０、もしくは３０〜１００ヌクレオチド長、１０〜５０、または４０〜５０ヌクレオチド長であり得るオリゴヌクレオチドの使用に依拠する。
【０２３７】
ある実施形態において、本開示の単離されたポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）は、穏和ないしストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に記載された核酸配列のいずれかとハイブリダイズ可能である。
【０２３８】
生物学的試料中の対象となる核酸の検出はまた、任意に、ＮＡＴベースのアッセイによって達成され得、これには、例えば、ＰＣＲ（またはその変形、例えば、リアルタイムＰＣＲ等）等の核酸増幅技術を含む。
【０２３９】
異なる技法を用いたＲＮＡ発現を検出する例は、本出願の実施例のセクションに提供される。そのような例には、従来のＰＣＲ反応によってＲＮＡを増幅するためのプライマーの使用、ならびにＴａｑＭａｎと称されるアプローチに採用されるプローブおよびプライマーの組み合わせの使用が含まれる。ＲＮＡを検出する方法のさらなる例には、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ＳＡＧＥ、ＭＰＳＳ、アレイベースの方法、および直接配列決定が含まれる。
【０２４０】
本明細書に使用される「プライマー」は、標的配列にアニーリングを起こさせる（ハイブリダイズする）ことが可能であり、それによって、適切な条件下でＤＮＡ合成のための開始点として機能し得る二本鎖の領域を生成する、オリゴヌクレオチドを定義する。
【０２４１】
選択または標的核酸配列の増幅を、いくつかの適切な方法で実行することができる。一般に、Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ａｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌａｂ．８：１４を参照のこと。数多くの増幅技法が記載されており、それらは当業者の特定の要求を満たすことに容易に適応することができる。増幅技法の非限定例には、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写に基づく増幅、ｑ３レプリカーゼ系、およびＮＡＳＢＡが含まれる（Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，１１７３−１１７７、Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７−１２０２、Ｍａｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８：２５３−２６０、およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、上記参照）。
【０２４２】
「増幅対」（または「プライマー対」）という専門用語は、本明細書では、本開示のオリゴヌクレオチド（オリゴ）の一対を指し、いくつかの種類の増幅プロセスの１つ、例えば、ポリメラーゼ鎖反応等によって、選択された核酸配列を増幅する際に一緒に用いられるように選択される。他の種類の増幅プロセスには、以下にさらに詳細に説明されるように、リガーゼ鎖反応、鎖置換増幅、または核酸配列に基づいた増幅が含まれる。当技術分野で一般に公知のように、オリゴは、選択された条件下で相補的配列に結合するように設計される。
【０２４３】
特定の一実施形態において、患者からの核酸試料の増幅は、最も豊富に異なった形で発現した核酸の増幅に好都合の条件下で、増幅される。好ましい一実施形態において、ＲＴ−ＰＣＲは、最も豊富なｍＲＮＡの増幅に好都合の条件下で、患者からのｍＲＮＡ試料に対して実行される。別の好ましい実施形態において、異なった形で発現した核酸の増幅は、同時に実行される。そのような方法が、異なった形で発現した核酸配列の代わりに、異なった形で発現したタンパク質の検出に適することもあり得ることを当業者によって理解されよう。
【０２４４】
本開示のオリゴヌクレオチドプライマーは、特定のアッセイ形式、特定のニーズ、および採用した標的ゲノムに応じて、任意の適当な長さのものであってもよい。任意に、オリゴヌクレオチドプライマーは、少なくとも１２ヌクレオチド長、ある実施形態において、１５〜２４分子であり、選択された核酸増幅系に特に適するように、適合され得る。当技術分野で一般に公知のように、オリゴヌクレオチドプライマーは、その標的配列とのハイブリダイゼーションの融点を考慮に入れることで設計することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）。
【０２４５】
代替的な実施形態において、発現は、ｃＤＮＡの直接配列決定によって検出することができる。そのような直接配列決定は、ＲＮＡを検出し、定量化するためのさらなる方法を提供する。
【０２４６】
（ｖｉｉｉ）ＲＮＡの検出を用いた診断方法
別の態様において、本開示は、腫瘍が、完全長ＣＥＡのＲＮＡおよび／または短型ＣＥＡのＲＮＡのうちの１つまたは両方を発現するかどうかを評価するために腫瘍試料を評価することによって、標的癌胎児性抗原（ＣＥＡ）タンパク質に免疫特異的に結合する癌治療薬に対して感受性があり得る患者を特定する方法を提供する。ある実施形態において、本方法は、患者から腫瘍試料を得ることと、標的ＣＥＡのＲＮＡの腫瘍試料中の発現を検出することと、を伴う。例えば、この試料は、完全長ＣＥＡのＲＮＡ発現と短型ＣＥＡのＲＮＡ発現を区別するプローブおよび／またはプライマーと接触させることができる。ある実施形態において、プローブおよび／またはプライマー（または複数のプローブおよびプライマーの組み合わせ）との試料の接触は、完全長および短型ＣＥＡのＲＮＡの両方の特定を可能にする。他の実施形態において、プローブおよび／またはプライマーとの試料の接触は、完全長あるいは短型ＣＥＡのＲＮＡのいずれかを一意的に特定する。アッセイが行われる特定の方法に関わらず、腫瘍試料が、完全長ＣＥＡのＲＮＡおよび／または短型ＣＥＡのＲＮＡを発現するかどうかに関わらず情報を提供する。この情報は、患者が、特定の標的ＣＥＡタンパク質（長型あるいは短型のいずれか）に免疫特異的に結合する癌治療薬による治療に対して感受性があるかどうかを判定する際、有用であり得る。
【０２４７】
理論によって拘束されることなく、特定の標的型ＣＥＡのＲＮＡを発現しない、または低濃度のそのＲＮＡを発現する腫瘍が、そのＲＮＡによってコードされるＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する治療薬剤を投与することに基づいて治療レジメンに応答する可能性は低い。したがって、例えば、患者からの腫瘍試料が、完全長ＣＥＡのＲＮＡを発現しない、または低濃度のそのＲＮＡを発現する場合、この患者は、完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する治療薬による治療のふさわしい候補者ではない。同様に、患者からの腫瘍試料が、短型ＣＥＡのＲＮＡを発現しない、または低濃度のそのＲＮＡを発現する場合、この患者も、短型ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する治療薬による治療のふさわしい候補者ではない。
【０２４８】
しかしながら、患者からの腫瘍試料が、完全長および／または短型ＣＥＡのうちの１つまたは両方を発現する場合、この患者は、標的型のＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する治療薬による治療に対して感受性があり得る。したがって、腫瘍試料が、完全長ＣＥＡのＲＮＡを発現する場合、この患者は、完全長ＣＥＡに免疫特異的に結合する治療薬による治療に対して感受性があり得る。腫瘍試料が、短型ＣＥＡのＲＮＡを発現するが、完全長ＣＥＡのＲＮＡを発現しない場合、この患者は、短型ＣＥＡに免疫特異的に結合する治療薬による治療に対して感受性があり得る。したがって、ある実施形態において、患者から採取された腫瘍試料中のＲＮＡ発現の分析後、この患者は、抗ＣＥＡ治療薬等の適切な治療薬により治療することができる。さらに、腫瘍試料が、ＣＥＡのＲＮＡを発現しない場合、この患者の治療レジメンは、抗ＣＥＡ療法に対して不必要な曝露をすることなく、他のラインに沿って作成することができる。
【０２４９】
ある実施形態において、腫瘍試料が、特定の標的ＣＥＡのＲＮＡ発現の検査で陽性と出る場合、１つ以上のさらなる生物学的試料（例えば、血液、血清、痰、糞便、尿等）を患者から得て、特定の標的ＣＥＡのタンパク質発現を評価することができる。例えば、これらの１つ以上のさらなる生物学的試料を得て、完全長ＣＥＡまたは短型ＣＥＡに免疫特異的に結合する抗体と接触させて、腫瘍が、ＲＮＡ発現の検査で陽性と出た患者からの試料が、タンパク質発現の検査でも陽性と出るかどうかを評価することができる。ある実施形態において、１つ以上の生物学的試料中のタンパク質発現の試験の結果に応じて、この対象は、標的ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する癌治療薬により治療することができる（例えば、患者が、完全長ＣＥＡタンパク質および／または短型ＣＥＡタンパク質に対して陽性である場合、完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合し、患者が、短型ＣＥＡタンパク質のみに陽性である場合、短型ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する）。
【０２５０】
腫瘍試料等の試料中のＲＮＡを検出するための診断方法は、当技術分野で公知である。非限定例として、ＲＮＡ発現は、ＲＴ−ＰＣＲ分析、ＳＡＧＥ、ＭＰＳＳ、マイクロアレイ、直接配列決定、またはＴａｑＭａｎ定量分析を用いて検出することができる。１つ以上の生物学的試料中のタンパク質発現を評価するための方法は、本明細書の他の箇所で提供される通りである。さらに、患者が、例えば、完全長ＣＥＡに免疫特異的に結合する薬剤による治療に適していると特定される場合、例示的な癌治療薬が本明細書に提供される。
【０２５１】
（ｉｘ）タンパク質を産生する方法
本開示は、配列番号１（プロ配列の存在または不在下）で表されるアミノ酸配列を含む精製されたポリペプチド、または連続するアミノ酸残基：ＮＩＩＱＮＥＬＳＶＤ（配列番号１１）を含む、そのフラグメントを提供する。本開示は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む精製されたポリペプチド、または連続するアミノ酸残基：ＱＮＩＩＱＮＥＬＳＶＤＨ（配列番号１３）を含む、そのフラグメントを提供する。本開示は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む精製されたポリペプチド、または連続するアミノ酸残基：ＩＱＮＩＩＱＮＥＬＳＶＤＨＳ（配列番号１４）を含む、そのフラグメントを提供する。ある実施形態において、このフラグメントは、約１０個、１５個、２０個、２５個もしくは３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、もしくは４００個のアミノ酸を含む。
【０２５２】
本開示は、配列番号１（プロ配列の存在または不在下）で表されるアミノ酸配列を含む精製されたポリペプチド、または連続するアミノ酸残基：ＮＩＩＱＮＫＬＳＶＤ（配列番号１２）を含む、そのフラグメントを提供する。本開示は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む精製されたポリペプチド、または連続するアミノ酸残基：ＱＮＩＩＱＮＫＬＳＶＤＨ（配列番号１５）を含む、そのフラグメントを提供する。本開示は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む精製されたポリペプチド、または連続するアミノ酸残基：ＩＱＮＩＩＱＮＫＬＳＶＤＨＳ（配列番号１６）を含む、そのフラグメントを提供する。ある実施形態において、このフラグメントは、約１０個、１５個、２０個、２５個もしくは３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、もしくは４００個のアミノ酸を含む。
【０２５３】
標的ＣＥＡタンパク質またはフラグメントは、多くの方法のうちのいずれで産生することができる。例として、そのようなタンパク質およびフラグメントは、合成的に産生することができる。さらなる例として、そのようなタンパク質およびフラグメントは、組み換えによって産生することができる。
【０２５４】
標的ＣＥＡタンパク質の組み換え発現は、所望の標的ＣＥＡタンパク質のすべてまたは一部をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを構築することによって行うことができる。そのような標的ＣＥＡタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、得られると、エピトープ結合分子の産生のためのベクターは、当技術分野で公知の技法を用いて、組み換えＤＮＡ技術によって産生することができる。例えば、米国特許第６，３３１，４１５号を参照されたく、これは、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。このようにして、ヌクレオチド配列をコードする抗体を含有するポリヌクレオチドを発現することによってタンパク質を調製するための方法が本明細書に記載される。標的ＣＥＡタンパク質は、多くの異なる発現系において産生することができる。一実施形態において、標的ＣＥＡタンパク質が、産生され、哺乳動物細胞によって分泌される。別の実施形態において、標的ＣＥＡタンパク質が、産生され、ヒト細胞中に分泌される。特定の実施形態において、本開示の標的ＣＥＡタンパク質は、２９３Ｆ、ＣＨＯ、またはＮＳ０細胞株の細胞中に産生される。他の実施形態において、標的ＣＥＡタンパク質は、酵母または細菌性細胞中に産生される。別の実施形態において、標的ＣＥＡタンパク質は、例えば、ＳＦ９細胞中のバキュロウイルス媒介発現を用いて産生される。
【０２５５】
当業者に周知である方法を用いて、タンパク質コード配列ならびに適切な転写および翻訳調節シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、インビトロ組み換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組み換えが含まれる。このようにして、本開示は、プロモーターに操作可能に結合されるＣＥＡタンパク質分子をコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。
【０２５６】
一旦、発現ベクターが従来の技法によって宿主細胞に移送されると、トランスフェクトされた細胞は、従来の技法によって培養されて、ＣＥＡタンパク質を産生する。したがって、本開示は、異種プロモーターに操作可能に連結される標的ＣＥＡタンパク質をコードする宿主細胞を含む。
【０２５７】
多種多様の宿主発現ベクター系を利用して、米国特許第５，８０７，７１５号に記載されるＣＥＡタンパク質またはその一部を発現させることができる。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）等の哺乳動物細胞は、ヒトサイトメガロウイルス由来の主な中間型初期遺伝子プロモーターエレメント等のベクターと併せて、ＣＥＡタンパク質のための有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，４５：１０１（１９８６）およびＣｏｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：２（１９９０））。加えて、所望される具体的な様式で、挿入された配列の発現を調節する、または遺伝子産物を修飾および処理する宿主細胞株が選択されてもよい。タンパク質産物のかかる修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能に重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングならびに修飾のための、特徴的および特異的機構を有する。適切な細胞株または宿主系を選択して、本開示のタンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確保することができる。この目的のために、遺伝子産物の適切な一次転写、グリコシル化、およびリン酸化のプロセシングのための細胞機構を有する真核性宿主細胞が使用することが可能である。かかる哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２ＯおよびＴ４７Ｄ、ＮＳ０、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、およびＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５８】
細菌系において、いくつかの発現ベクターは、発現させられているタンパク質分子のために意図される使用に応じて、有利に選択されてもよい。例えば、ＣＥＡタンパク質を含む薬学的または診断的組成物の生成のために、大量のそのようなＣＥＡタンパク質が産生されるべきである場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を誘導するベクターが望ましい可能性がある。かかるベクターとしては、融合タンパク質が産生されるように、コード配列を個々にｌａｃＺコード領域とインフレームで該ベクターに連結され得るＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ，１２：１７９１（１９８３））ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ＆  Ｉｎｏｕｙｅ，１９８５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）、Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４：５５０３−５５０９（１９８９））等が含まれるが、これらに限定されない。また、ｐＧＥＸベクターを使用して、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させてもよい。概して、かかる融合タンパク質は、可溶性であり、グルタチオン−アガロース親和性マトリックスへの吸着および結合、続いて遊離グルタチオンの存在下での溶出によって、溶解した細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、トロンビンおよび／または因子Ｘａプロテアーゼ切断部位を発現させたポリペプチドに導入し、その結果、クローン化された標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出され得るように設計される。
【０２５９】
昆虫系においては、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が使用される。該ウイルスは、スポドプテラ・フルギペルダ細胞中で成長する。タンパク質コード配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）へと個々にクローン化され、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の調節下に配置されてもよい。
【０２６０】
哺乳動物宿主細胞では、複数のウイルスベースの発現系が利用されてもよい。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、対象となるコード配列は、アデノウイルス転写／翻訳調節複合体、例えば、後期プロモーターおよびトリパータイトリーダー配列に連結されてもよい。次いでこのキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボ組み換えによって、アデノウイルスゲノムに挿入されてもよい。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）への挿入は、感染宿主中で生存可能で、かつ抗体分子を発現することができる組み換えウイルスをもたらすであろう（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８１：３５５−３５９（１９８４）を参照されたい）。また、効果的な翻訳のために、具体的な開始シグナルが必要とされ得る。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が含まれる。さらに、挿入物全体の翻訳を確保するために、開始コドンは、所望のコード配列のリーディングフレームと同相であるべきである。これらの外因性翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方で、多種多様の起源由来であってもよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーター等の組み込みによって強化されてもよい（例えば、Ｂｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：５１−５４４（１９８７）を参照されたい）。
【０２６１】
（ｘ）抗体を作製する方法
本開示はまた、モノクローナル抗ＣＥＡ抗体も提供する。モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から得られ得る、すなわち、集団を含む個々の抗体が、少量で存在し得る潜在的な自然発生突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高特異的であり、単一の抗原部位に対して向けられる。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して向けられる異なる抗体を典型的に含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物と対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚染されていないハイブリドーマ培養によりしばしば合成される点で有利である。モノクローナル抗体はまた、ＣＨＯ細胞およびＮＳ０細胞等のトランスフェクト細胞中に産生されてもよい。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要としない。例えば、本開示に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９７５；２５６：４９５によって初めに記載されるハイブリドーマ法によって作製され得るか、または組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号および第６，３３１，４１５号を参照されたい）によって作製され得る。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９１；３５２：６２４−６２８およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９１；２２２：５８１−５９７に記載される技法を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。
【０２６２】
動物の免疫化のため（ＣＥＡを用いた場合）、抗体を産生する細胞の単離、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを生成するための不死化細胞（例えば、骨髄腫細胞）とのそのような細胞の融合、所望の抗原による分泌モノクローナル抗体の反応性のためのハイブリドーマ上清のスクリーニング（免疫原または免疫原を含有する分子の場合）、ハイブリドーマ上清または腹水中のそのような抗体の量の調製、ならびにそのようなモノクローナル抗体の精製および保存のための一般的方法は、多くの刊行物に見出され得る。これらには、Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８、Ｌｉｄｄｅｌｌ  ａｎｄ  Ｃｒｙｅｒ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，Ｗｅｓｔ  Ｓｕｓｓｅｘ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９９１、Ｍｏｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：３３７−３５１，１９９０、Ｗｕｒｚｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｉｎｆｌａｍｍ．８：３２８−３４０，１９９１、およびＭｏｌｌｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：３０７−３１２，１９８８が含まれる。
【０２６３】
特に企図される他の抗体は、オリゴクローナル抗体である。本明細書に使用される「オリゴクローナル抗体」という語句は、別々のモノクローナル抗体の予め決定された混合物を指す。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ第９５／２０４０１号、米国特許第５，７８９，２０８号および第６，３３５，１６３号を参照されたい。一実施形態において、１つ以上のエピトープに対する抗体の予め決定された混合物からなるオリゴクローナル抗体は、単一細胞中で生成される。他の実施形態において、オリゴクローナル抗体は、通常の軽鎖と対を成して複数の特異性を有する抗体を生成することができる複数の重鎖を含む（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ第０４／００９６１８号）。オリゴクローナル抗体は、単一の標的分子上の複数のエピトープを標的にすることが望ましい場合に、特に有用である。本明細書に開示されるアッセイおよびエピトープを考慮して、当業者は、意図された目的および所望の必要性に適用可能な抗体または抗体の混合物を生成するか、または選択することができる。
【０２６４】
あるいは、上記の方法がポリクローナル抗体を産生するために使用される場合、免疫化後、血流に分泌されるポリクローナル抗体は、既知の技法を用いて回収することができる。当然ながら、精製型のこれらの抗体は、例えば、プロテインＡ、抗免疫グロブリン、または抗原それ自体を用いた親和性クロマトグラフィー等の標準精製技法によって容易に調製することができる。どんな場合でも、免疫化の成功をモニターするために、血清中の抗原に対する抗体レベルは、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ等の標準技法を用いてモニターされる。
【０２６５】
さらに、抗ＣＥＡ抗体はまた、それらのゲノム中のＣＥＡマウスをコードする遺伝子を欠失するトランスジェニックマウス（ＣＥＡノックアウトマウス）のＣＥＡ免疫化によって産生することもできる。
【０２６６】
二重特異性抗体を作製するための方法は、当業者の範囲内である。伝統的に、二重特異性抗体の組み換え産生は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づき、ここで、２つの重鎖は、異なる特異性を持っている（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）は、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させることができる。ある実施形態において、融合は、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖との融合である。免疫グロブリン重鎖の融合、および必要に応じて、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを、別個の発現ベクターに挿入し、好適な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を生成するための例証される現在公知の方法のさらなる詳細に関しては、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）、ＷＯ第９６／２７０１１号、Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）、Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）、Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）、およびＴｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）を参照されたい。また、二重特性抗体には、架橋抗体またはヘテロ抱合抗体が含まれる。ヘテロ抱合抗体は、任意の便利な架橋方法を用いて作製することができる。好適な架橋薬剤は、当技術分野で公知であり、それらは複数の架橋技法と共に、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
【０２６７】
組み換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体フラグメントを作製し、単離する様々な技法もまた記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを使用して産生された。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合により２つの異なった抗体のＦａｂ′部分に連結することができる。抗体ホモダイマーは、ヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、次いで、再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた、抗体ホモダイマーの産生に対して使用することもできる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ダイマーの使用による二重特異性抗体フラグメントを作製するための戦略もまた、報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい。あるいは、抗体は、Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）に記載される「直線状抗体」であり得る。簡潔に言えば、これらの抗体は、一対の抗原結合領域を形成するタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。直線状抗体は、二重特異性または単一特異性であり得る。
【０２６８】
キメラ抗体を産生するために、２つの異なる種（例えば、ヒト定常領域およびマウス可変もしくは結合領域）に由来する部分は、従来の技法によって化学的に連結することができる、または遺伝子操作技法を用いて、単一の隣接タンパク質として調製することができる。キメラ抗体の軽鎖および重鎖部分の両方のタンパク質をコードするＤＮＡ分子は、隣接タンパク質として発現することができる。キメラ抗体を作製する方法は、米国特許第５，６７７，４２７号、米国特許第６，１２０，７６７号、および米国特許第６，３２９，５０８号に開示され、これらのそれぞれは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２６９】
ＣＥＡに対する完全ヒト抗体は、様々な技法によって産生することができる。一例が、トリオーマ方法論である。基本アプローチ、およびこのアプローチにおいて使用するための例示的な細胞融合パートナー、ＳＰＡＺ−４は、Ｏｅｓｔｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ２：３６１−３６７（１９８３）、Ｏｅｓｔｂｅｒｇの米国特許第４，６３４，６６４号、およびＥｎｇｌｅｍａｎらの米国特許第４，６３４，６６６号（これらのそれぞれは、参照することによりその全体が組み込まれる）によって記載されている。
【０２７０】
ＣＥＡに対するヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つのセグメントをコードするトランス遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック動物から産生することもできる。これらの特性を有する動物の産生および特性は、例えば、ＬｏｎｂｅｒｇらのＷＯ第９３／１２２２７号、米国特許第５，５４５，８０６号、およびＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらのＷＯ第９１／１０７４１号、米国特許第６，１５０，５８４号を参照することによって、詳細に記載され、これらは、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２７１】
また、様々な組み換え抗体ライブラリー技術を利用して、完全ヒト抗体を産生することもできる。例えば、１つのアプローチは、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）によって概説される一般的なプロトコルに従ってヒトＢ細胞からＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることである。抗体を結合するＣＥＡまたはそのフラグメントが、選択される。次いで、かかる抗体（または結合フラグメント）をコードする配列は、クローン化され、増幅される。Ｈｕｓｅによって記載されるプロトコルは、ファージディスプレイ技術と組み合わせて、さらに効率的に表示される。例えば、ＤｏｗｅｒらのＷＯ第９１／１７２７１号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらのＷＯ第９２／０１０４７号、米国特許第５，９６９，１０８号を参照されたい（参照することによってその全体が組み込まれる）。これらの方法では、メンバーが、それらの外面上に異なる抗体を提示するファージのライブラリーを産生する。抗体は、通常、ＦｖまたはＦａｂフラグメントとして提示される。所望の特異性を有するファージディスプレイ抗体が、ＣＥＡまたはそのフラグメントへの親和性濃縮によって選択される。さらなるアプローチが、本出願と共に使用することができる（米国特許出願第２００４００７２１６４号および第２００４０１７５７３６号、これらのそれぞれは、参照することによってその全体が組み込まれる）。
【０２７２】
真核細胞リボソームはまた、Ｃｏｉａ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １：２５４（１−２）：１９１−７（２００１）、Ｈａｎｅｓ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８（１２）：１２８７−９２（２０００）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５（２４）：１４１３０−５（１９９８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４（１０）：４９３７−４２（１９９７）（これらのそれぞれは、参照することによってその全体が組み込まれる）によって記載されるように、抗体のライブラリーを提示し、ＣＥＡ等の標的抗原に対してスクリーニングすることによって、結合ヒト抗体を単離する手段として使用することもできる。
【０２７３】
酵母系はまた、抗体等の哺乳動物細胞表面または分泌タンパク質をスクリーニングするのにも適している。抗体ライブラリーは、標的抗原に対するヒト抗体を得る目的のために、酵母細胞の表面上に提示され得る。このアプローチは、Ｙｅｕｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１８（２）：２１２−２０（２００２）、Ｂｏｅｄｅｒ，Ｅ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（６）：５５３−７（１９９７）によって記載されており、これらのそれぞれは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。あるいは、ヒト抗体ライブラリーを細胞内で発現させ、酵母２ハイブリッド系によってスクリーニングすることができる（ＷＯ第０２００７２９Ａ２号、これは参照することによりその全体が組み込まれる）。
【０２７４】
組み換えＤＮＡ技法を使用して、細菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞（例えば、ＮＳ０細胞）等の原核生物および真核生物発現系の両方を含む任意の発現系において、組み換え抗ＣＥＡ抗体、ならびにキメラもしくはヒト化抗ＣＥＡ抗体、または任意の他の抗ＣＥＡを遺伝子操作された抗体およびそのフラグメントもしくは共役体を産生することができる。
【０２７５】
一旦産生されると、本出願の全抗体、それらの二量体、個々の軽鎖および重鎖、または他の免疫グロブリン型は、硫酸アンモニウム沈殿、親和性カラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を含む、当技術分野の標準的な手法に従って精製することができる（概して、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，１９８２）を参照のこと）。ある実施形態において、例えば、少なくとも約９０〜９５％均一性、ある実施形態において、９８〜９９％またはそれ以上の均一性の実質的に純粋な免疫グロブリンが、薬学的目的のために使用することができる。所望により部分的に、または均一になるまで一旦精製されると、ポリペプチドは、（体外を含めて）治療で、あるいはアッセイ手法、免疫蛍光染色法等を開発し、実行する際に、使用することができる（概して、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｓ．Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ  ａｎｄ  Ｐｅｒｎｉｓ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９７９  ａｎｄ  １９８１を参照のこと）。
【０２７６】
例示的な実施形態
１．  癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を発現する癌の再発を検出する方法であって、
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を発現する癌であると以前に診断され、治療された患者から試料を取得することと、
完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、短型ＣＥＡタンパク質には免疫特異的に結合しない抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子を用いて、該試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出し、それによって、該試料中の短型ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することと、
を含み、
治療後に観察された濃度を超える、該試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の濃度の検出は、該ＣＥＡを発現する癌の再発を示す、方法。
【０２７７】
２．  癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を発現する癌の再発を検出する方法であって、
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を発現する癌を患っている対象から、治療前に得られる第１の試料を得ることと、
完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、短型ＣＥＡタンパク質には免疫特異的に結合しない抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子を用いて、該第１の試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の治療前の濃度を検出し、それによって、該第１の試料中の短型ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することと、
該対象から第２の試料を得て、該抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子を用いて、該第２の試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出し、それによって、該第２の試料中の短型ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することと、
該第２の試料を得るためのものより後の時点で、該対象から１つ以上のさらなる試料を得ていることと、該抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子（例えば、該診断試薬）を用いて、該１つ以上のさらなる試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出し、それによって、該１つ以上のさらなる試料中の短型ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することと、
を含み、
該第２の試料で観察された完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を超える、該１つ以上のさらなる試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の濃度の検出は、該ＣＥＡを発現する癌の再発を示す、方法。
【０２７８】
３．  抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）癌治療薬に対する感受性を判定する方法であって、
完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、短型ＣＥＡタンパク質には免疫特異的に結合しない抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子を用いて、試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出し、それによって、該試料中の該短型ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、該完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することと、
該完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を、健常な対象からの試料中の標準範囲を示す完全長ＣＥＡタンパク質濃度と比較することと、
を含み、
該標準範囲を超える完全長ＣＥＡタンパク質の濃度の検出は、抗ＣＥＡ癌治療に対する感受性を示す、方法。
【０２７９】
４．  抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）癌療法をモニタリングする方法であって、
完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、短型ＣＥＡタンパク質には免疫特異的に結合しない抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子を用いて、ＣＥＡを発現する癌の治療を受けている対象からの試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出し、それによって、該試料中の該短型ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、該完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することと、
該完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を、該治療前または該治療中の早期の時点で得られた該同一の対象からの試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の濃度と比較することと、
を含み、
治療前または該治療中の早期の時点で得られた濃度に対する、治療中の後半の時点で得られた試料中の完全長ＣＥＡ濃度の低下は、該治療の有効性を示し、それによって、該抗ＣＥＡ癌療法をモニタリングする、方法。
【０２８０】
５．  癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を発現する癌を患っている対象を治療する方法であって、
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を発現する癌に対する治療前に、対象から試料を得ることと、
完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、短型ＣＥＡタンパク質には免疫特異的に結合しない抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子を用いて、該試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出し、それによって、該試料中の前記短型ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、該完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することと、
該完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を、健常な対象からの試料中の完全長ＣＥＡタンパク質濃度を反映する標準範囲と比較することであって、
前記標準範囲を超える該完全長ＣＥＡタンパク質の濃度の検出は、抗ＣＥＡ癌治療に対する感受性を示す、比較することと、
該対象が、抗ＣＥＡ癌療法に対して感受性があると判定される場合、抗ＣＥＡ癌治療薬を用いて該対象を治療することと、
任意に、完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、短型ＣＥＡタンパク質には免疫特異的に結合しない抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子を用いて、該対象からの治療後の試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出し、それによって、該治療後の試料中の該短型ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、該完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することと、
該治療後の試料中の該完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を、治療前に得られた試料中の該濃度と比較することと、
を含み、
該治療前の試料と比較して、該治療後の試料中の完全長ＣＥＡタンパク質濃度の低下が、該対象を治療する該方法での該抗ＣＥＡ癌治療薬の有効性を示す、方法。
【０２８１】
６．  癌胎児性抗原（ＣＥＡ）タンパク質に免疫特異的に結合する癌治療薬に対する感受性を判定する方法であって、
ＣＥＡを発現する癌を患っている対象の治療に使用される癌治療薬を選択することであって、この癌治療薬は、ＣＥＡタンパク質の１つの型に免疫特異的に結合するが、ＣＥＡタンパク質の第２の型には免疫特異的に結合せず、ＣＥＡタンパク質の１つの型は、標的ＣＥＡタンパク質と称される、選択することと、
該癌治療薬が免疫特異的に結合するエピトープと同じまたは実質的に同じである前記標的ＣＥＡタンパク質上のエピトープに免疫特異的に結合する抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子を用いて、該対象からの試料中の該標的ＣＥＡタンパク質の濃度を検出し、それによって、該試料中の該非標的型のＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、該標的ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することと、
該標的ＣＥＡタンパク質の該濃度を、健常な対象からの試料中の標的ＣＥＡタンパク質濃度を反映する標準範囲と比較することと、
を含み、
該標準範囲を超える該試料中の該標的ＣＥＡタンパク質の濃度の検出は、前記癌治療薬に対する感受性を示す、方法。
【０２８２】
７．  治療をモニタリングする方法であって、
ＣＥＡを発現する癌を患っている対象の治療に使用される癌治療薬を選択することであって、この癌治療薬は、ＣＥＡタンパク質の１つの型に免疫特異的に結合するが、ＣＥＡタンパク質の第２の型には免疫特異的に結合せず、ＣＥＡタンパク質の１つの型は、標的ＣＥＡタンパク質と称される、選択することと、
該癌治療薬が免疫特異的に結合するエピトープと同一または実質的に同一である該標的ＣＥＡタンパク質上のエピトープに免疫特異的に結合する抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子を用いて、ＣＥＡを発現する癌の治療を受けている該対象からの試料中の該標的ＣＥＡタンパク質の濃度を検出し、それによって、該試料中の他の非標的型のＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、該標的ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することと、
該標的ＣＥＡタンパク質の濃度を、該癌治療薬による治療前または該癌治療薬による治療中の早期の時点で得られる該同一の対象からの早期試料中の標的ＣＥＡタンパク質の濃度と比較することと、
を含み、
該癌治療薬による治療前または治療中の早期の時点で得られた濃度に対する、該癌治療薬による治療中の後期の時点で得られた試料中の標的ＣＥＡ濃度の低下は、該癌治療薬の有効性を示し、それによって、該治療をモニタリングする、方法。
【０２８３】
８．  癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を発現する癌を患っている対象を治療する方法であって、
ＣＥＡを発現する癌を患っている対象の治療に使用される癌治療薬を選択することであって、この癌治療薬は、ＣＥＡタンパク質の１つの型に免疫特異的に結合するが、ＣＥＡタンパク質の第２の型には免疫特異的に結合せず、ＣＥＡタンパク質の１つの型は、標的ＣＥＡタンパク質と称される、選択することと、
該治療薬が免疫特異的に結合するエピトープと同一または実質的に同一である該標的ＣＥＡタンパク質上のエピトープに免疫特異的に結合する抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子を用いて、該対象からの試料中の該標的ＣＥＡタンパク質の濃度を検出し、それによって、該試料中の他の非標的型のＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、該標的ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することと、
該標的ＣＥＡタンパク質の該濃度を、健常な対象からの試料中の標的ＣＥＡタンパク質濃度を反映する標準範囲と比較することであって、
該標準範囲を超える該標的ＣＥＡタンパク質の濃度の検出は、標的ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する癌治療薬に対する感受性を示す、比較することと、
該対象が該癌治療薬に対して感受性があると判定される場合、標的ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する該癌治療薬により該対象を治療することと、
任意に、該癌治療薬が免疫特異的に結合するエピトープと同一または実質的に同一である標的ＣＥＡ上のエピトープに免疫特異的に結合する抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子を用いて、該癌治療薬による治療を受けている該対象からの治療後の試料中の標的ＣＥＡタンパク質の濃度を検出し、それによって、該試料中の他の非標的型のＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、該標的ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することと、
該標的ＣＥＡタンパク質の濃度を、該同一の対象からの、該癌治療薬による治療前、または前記治療中の早期の時点で得られた試料中の標的ＣＥＡタンパク質の濃度と比較することと、
を含み、
該治療前または該治療中の早期の時点で得られた濃度に対する、該癌治療薬による治療中の後期の時点で得られた試料中の標的ＣＥＡ濃度の低下は、該対象の該治療の有効性を示す、方法。
【０２８４】
９．  対象からの試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の濃度および短型ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することと、
完全長ＣＥＡタンパク質濃度と短型ＣＥＡタンパク質濃度との比率を判定することと、
を含む、方法。
【０２８５】
１０．  該比率を、健常な対象からの試料中の、完全長ＣＥＡタンパク質濃度と短型ＣＥＡタンパク質濃度との標準比率を反映する標準と比較することをさらに含み、
該標準比率よりも高いまたは低い比率は、ＣＥＡを発現する癌の存在を示す、実施形態９に記載の方法。
【０２８６】
１１．  完全長ＣＥＡタンパク質の濃度の検出は、完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、短型ＣＥＡタンパク質には免疫特異的に結合しない抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子と試料を接触させることを含む、実施形態９または１０に記載の方法。
【０２８７】
１２．  完全長ＣＥＡタンパク質の濃度の検出は、完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、短型ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合しない抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子と、試料を接触させることを含み、短型ＣＥＡタンパク質の濃度の検出は、短型ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合しない抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子と、試料を接触させることを含む、実施形態９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【０２８８】
１３．  抗ＣＥＡ癌治療薬によって該対象を治療することをさらに含む、実施形態１〜４または６〜７のいずれか１項に記載の方法。
【０２８９】
１４．  該癌治療薬は、該検出ステップに使用される該抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子によって免疫特異的に結合されるものと同一または実質的に同一であるＣＥＡタンパク質上のエピトープに免疫特異的に結合する、実施形態５、８、または１３のいずれか１項に記載の方法。
【０２９０】
１５．  該対象は、ヒトである、実施形態１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【０２９１】
１６．  該癌治療薬は、タンパク質治療薬を含む、実施形態３〜８のいずれか１項に記載の方法。
【０２９２】
１７．  該タンパク質治療薬は、抗体または抗原結合フラグメントである、実施形態１６に記載の方法。
【０２９３】
１８．  該タンパク質治療薬は、モノクローナル抗体である、実施形態１７に記載の方法。
【０２９４】
１９．  該モノクローナル抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体である、実施形態１８に記載の方法。
【０２９５】
２０．  該タンパク質治療薬は、配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質に免疫特異的に結合する、実施形態１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【０２９６】
２１．  該タンパク質治療薬は、配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質に免疫特異的に結合するが、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質には免疫特異的に結合しない、実施形態２０に記載の方法。
【０２９７】
２２．  該タンパク質治療薬は、抗体Ａ５Ｂ７の抗原結合ドメインを含む、実施形態１７に記載の方法。
【０２９８】
２３．  該タンパク質治療薬は、二重特異性抗体である、実施形態１７に記載の方法。
【０２９９】
２４．  該二重特異性抗体は、ＣＥＡ結合部分およびＣＤ３結合部分を含む、実施形態２３に記載の方法。
【０３００】
２５．  該試料は、全血、血清、血漿、唾液、尿、糞便、精漿、汗、羊水、痰、母乳、胆液、組織ホモジネート、および腹水から選択される、実施形態１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【０３０１】
２６．  該試料は、腫瘍組織試料である、実施形態１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【０３０２】
２７．  該ＣＥＡを発現する癌は、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、食道癌、胃食道癌、胃癌、肺癌、および乳癌から選択される、実施形態１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【０３０３】
２８．  該検出するステップは、
該抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子と、該試料を接触させることと、
免疫組織化学によって完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することと、
を含む、実施形態１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【０３０４】
２９．  該試料は、モノクローナル抗体である該抗体と接触させる、実施形態２８に記載の方法。
【０３０５】
３０．  該モノクローナル抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体である、実施形態２９に記載の方法。
【０３０６】
３１．  該検出ステップは、
配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質に結合する該抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子と、該試料を接触させることと、
免疫組織化学によって完全長ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することと、
を含む、実施形態１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【０３０７】
３２．  該検出ステップは、
抗体Ａ５Ｂ７の抗原結合ドメインを含む抗体または抗原結合フラグメントと該試料を接触させることを含むが、但し、該抗体は、Ａ５Ｂ７ではない、実施形態１〜８または２８〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【０３０８】
３３．  該検出ステップは、
Ａ５Ｂ７と同一または実質的に同一のエピトープに結合する抗原結合ドメインを含む抗体または抗原結合フラグメントと該試料を接触させることを含むが、但し、該抗体が、Ａ５Ｂ７ではない、実施形態１〜８または２８〜３１のいずれか１項に記載方法。
【０３０９】
３４．  該検出ステップは、
Ａ５Ｂ７と同一または実質的に同一のエピトープに結合する抗原結合ドメインを含む抗体または抗原結合フラグメントと該試料を接触させることを含むが、但し、該抗体が、Ａ５Ｂ７または二重特異性抗体ではない、実施形態１〜８または２８〜３１のいずれか１項に記載方法。
【０３１０】
３５．  生物学的試料中の短型癌胎児性抗原（ＣＥＡ）のＲＮＡの発現を検出する方法は、
ＣＥＡヌクレオチド配列にハイブリダイズする核酸プローブまたは核酸プライマーのうちの１つまたは両方であって、（ｉ）短型ＣＥＡヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするが、完全長ＣＥＡヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズしないこと、または（ｉｉ）短型ＣＥＡの発現と完全長ＣＥＡの発現を区別する様式で、短型ＣＥＡヌクレオチド配列および完全長ＣＥＡヌクレオチド配列の両方に特異的にハイブリダイズすることによって、短型ＣＥＡの発現を特異的に特定する、核酸プローブまたは核酸プライマーを提供することと、
生物学的試料からＲＮＡを提供することと、
該核酸プローブまたは核酸プライマーを用いて、該生物学的試料中の短型ＣＥＡのＲＮＡの発現を検出することと、
を含む、方法。
【０３１１】
３６．  生物学的試料中の短型癌胎児性抗原（ＣＥＡ）タンパク質の発現を検出する方法は、
短型ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合するが、完全長ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合しない抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子を提供することと、
生物学的試料を提供することと、
該抗体を用いて、該生物学的試料中の短型ＣＥＡタンパク質の発現を検出することと、
を含む、方法。
【０３１２】
３７．  該生物学的試料は、腫瘍組織試料である、実施形態３５または３６に記載の方法。
【０３１３】
３８．  該生物学的試料は、全血、血清、血漿、唾液、尿、糞便、精漿、汗、羊水、組織ホモジネート、痰、母乳、胆液、および腹水から選択される、実施形態３６に記載の方法。
【０３１４】
３９．  抗体を提供することを含み、該抗体は、モノクローナル抗体である、実施形態３６に記載の方法。
【０３１５】
４０．  該モノクローナル抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体である、実施形態３９に記載の方法。
【０３１６】
４１．  該抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質に結合する、実施形態３６に記載の方法。
【０３１７】
４２．  完全長癌胎児性抗原（ＣＥＡ）タンパク質に対して免疫特異的な抗体を生成する方法であって、
短型ＣＥＡタンパク質に存在しない完全長ＣＥＡタンパク質の一部を提供することと、
該抗体を生成するための抗原として、該完全長ＣＥＡタンパク質の一部を使用することと、
を含む、方法。
【０３１８】
４３．  該抗体は、モノクローナル抗体である、実施形態４２に記載の方法。
【０３１９】
４４．  配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む精製されたポリペプチド、または連続するアミノ酸残基：ＮＩＩＱＮＥＬＳＶＤ（配列番号１１）またはＮＩＩＱＮＫＬＳＶＤ（配列番号１２）を含む、そのフラグメント。
【０３２０】
４５．  標的癌胎児性抗原（ＣＥＡ）タンパク質に免疫特異的に結合する癌治療薬に対する感受性がある可能性がある患者を特定する方法であって、
患者から試料を得ることと、
完全長ＣＥＡのＲＮＡ発現と短型ＣＥＡのＲＮＡ発現を区別するために、該試料中の、標的ＣＥＡのＲＮＡの発現を検出することと、
を含み、
該患者からの腫瘍試料が、該標的ＣＥＡのＲＮＡを発現する場合、該患者は、その標的ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する癌治療薬による治療に対する感受性がある可能性があり、該患者からの腫瘍試料が、該標的ＣＥＡのＲＮＡを発現しない場合、該患者は、その標的ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する癌治療薬による治療に対する感受性がないであろう、方法。
【０３２１】
４６．  標的ＣＥＡのＲＮＡ発現の検出は、プローブおよび／またはプライマーと該試料を接触させて、完全長ＣＥＡのＲＮＡの発現を評価することを含む、実施形態４５に記載の方法。
【０３２２】
４７．  標的ＣＥＡのＲＮＡ発現の検出は、プローブおよび／またはプライマーと該試料を接触させて、短型ＣＥＡのＲＮＡの発現を評価することを含む、実施形態４５に記載の方法。
【０３２３】
４８．  標的ＣＥＡのＲＮＡ発現の検出は、プローブおよび／またはプライマーと該試料を接触させて、完全長ＣＥＡのＲＮＡおよび短型ＣＥＡのＲＮＡの両方の発現を評価することを含む、実施形態４５に記載の方法。
【０３２４】
４９．  該方法は、該患者から１つ以上のさらなる生物学的試料を採取することと、該標的ＣＥＡタンパク質の発現について該１つ以上の生物学的試料をアッセイすることと、をさらに含む、実施形態４５〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【０３２５】
５０．  該方法は、癌治療薬によって該対象を治療することをさらに含む、実施形態４５〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【０３２６】
５１．  該抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子は、配列番号２８〜４４および４６〜５１のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１〜８、１１〜３４、および３６〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【０３２７】
５２．  該抗ＣＥＡ治療薬は、配列番号２８〜４４および４６〜５１のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態３、５〜８、１３〜３４、および４５〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【０３２８】
５３．  該抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子は、配列番号４８のアミノ酸配列を含む、実施形態５１に記載の方法。
【０３２９】
５４．  該抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子は、配列番号４９のアミノ酸配列を含む、実施形態５１に記載の方法。
【０３３０】
５５．  該抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子は、配列番号４６のアミノ酸配列を含む、実施形態５１に記載の方法。
【０３３１】
５６．  該抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む、実施形態５１に記載の方法。
【０３３２】
５７．  該抗ＣＥＡ治療薬は、配列番号４８のアミノ酸配列を含む、実施形態５２に記載の方法。
【０３３３】
５８．  該抗ＣＥＡ治療薬は、配列番号４９のアミノ酸配列を含む、実施形態５２に記載の方法。
【０３３４】
５９．  該抗ＣＥＡ治療薬は、配列番号４６のアミノ酸配列を含む、実施形態５２に記載の方法。
【０３３５】
５９．  該抗ＣＥＡ治療薬は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む、実施形態６０に記載の方法。
【０３３６】
６０．  癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を発現する癌の再発を検出する方法であって、
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を発現する癌であると以前に診断され、治療された患者から試料を得ることと、
該試料中の、完全長ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度を検出することと、を含み、
治療後に観察された濃度を超える、該試料中の完全長ＣＥＡのＲＮＡの濃度の検出は、該ＣＥＡを発現する癌の再発を示す、方法。
【０３３７】
６１．  癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を発現する癌の再発を検出する方法であって、
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を発現する癌を患っている対象から、治療前に得られる第１の試料を得ることと、
該第１の試料中の、完全長ＣＥＡをコードするＲＮＡの治療前の濃度を検出することと、
該対象から第２の試料を得て、該第２の試料中の、完全長ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度を検出することと、
該第２の試料を得たものよりも後の時点で、該対象から１つ以上のさらなる試料を得て、該１つ以上のさらなる試料中の、完全長ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度を検出することと、
を含み、
該第２の試料中で観察された完全長ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度を超える該１つ以上のさらなる試料中の完全長ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度の検出は、該ＣＥＡを発現する癌の再発を示す、方法。
【０３３８】
６２．  抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）癌治療薬に対する感受性を判定する方法であって、  
対象からの試料中の完全長ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度を検出することと、
該完全長ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度を、健常な対象からの試料中の完全長ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度を反映する標準範囲と比較することと、
を含み、
該標準範囲を超える完全長ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度の検出は、抗ＣＥＡ癌療法に対する感受性を示す、方法。
【０３３９】
６３．  抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）癌療法をモニタリングする方法であって、
ＣＥＡ発現の治療を受けている対象からの試料中の完全長ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度を検出することと、
該完全長ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度を、該治療前または前記治療中の早期の時点で得られた該同一の対象からの試料中の完全長ＣＥＡタンパク質の濃度と比較することと、
を含み、
治療前または該治療中の早期の時点で得られた濃度に対する、治療中の後半の時点で得られた試料中の完全長ＣＥＡ濃度をコードするＲＮＡの低下は、該治療の有効性を示し、それによって、該抗ＣＥＡ癌療法をモニタリングする、方法。
【０３４０】
６４．  癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を発現する癌を患っている対象を治療する方法であって、
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を発現する癌に対する治療前に、対象から試料を得ることと、
該試料中の、完全長ＣＥＡをコードするＲＮＡの濃度を検出することと、
完全長ＣＥＡタンパク質をコードする該ＲＮＡの濃度を、健常な対象からの試料中の完全長ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度を反映する標準範囲と比較することであって、
該標準範囲を超える完全長ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度の検出は、抗ＣＥＡ癌療法に対する感受性を示す、比較することと、
該対象が、抗ＣＥＡ癌療法に対して感受性があると判定される場合、抗ＣＥＡ癌治療薬を用いて該対象を治療することと、
任意に、該対象からの治療後の試料中の完全長ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度を検出することと、
該治療後の試料中の完全長ＣＥＡタンパク質をコードする該ＲＮＡの濃度を、治療前に得られた試料中の該濃度と比較することと、
を含み、
該治療前の試料と比較して、該治療後の試料中の完全長ＣＥＡタンパク質濃度をコードするＲＮＡの低下が、該対象を治療する該方法での該抗ＣＥＡ癌治療薬の有効性を示す、方法。
【０３４１】
６５．  癌胎児性抗原（ＣＥＡ）タンパク質に免疫特異的に結合する癌治療薬に対する感受性を判定する方法であって、
ＣＥＡを発現する癌を患っている対象の治療に使用される癌治療薬を選択することであって、この癌治療薬は、ＣＥＡタンパク質の１つの型に免疫特異的に結合するが、ＣＥＡタンパク質の第２の型には免疫特異的に結合せず、ＣＥＡタンパク質の１つの型は、標的ＣＥＡタンパク質と称される、選択することと、
非標的型のＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度を検出することなく、該対象からの試料中の該標的ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度を検出することと、
該標的ＣＥＡタンパク質をコードする該ＲＮＡの該濃度を、健常な対象からの試料中の該標的ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度を反映する標準範囲を比較することと、
を含み、
該標準範囲を超える該試料中の該標的ＣＥＡタンパク質をコードする該ＲＮＡの濃度の検出は、該癌治療薬に対する感受性を示す、方法。
【０３４２】
６６．  治療をモニタリングする方法であって、
ＣＥＡを発現する癌を患っている対象の治療に使用される癌治療薬を選択することであって、この癌治療薬は、ＣＥＡタンパク質の１つの型に免疫特異的に結合するが、ＣＥＡタンパク質の第２の型には免疫特異的に結合せず、ＣＥＡタンパク質の１つの型は、標的ＣＥＡタンパク質と称される、選択することと、
ＣＥＡを発現する癌の治療を受けている該対象からの試料中の該標的ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度を、該試料中の非標的型のＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、検出することと、
該標的ＣＥＡタンパク質をコードする該ＲＮＡの濃度を、該癌治療薬による治療前または該癌治療薬による治療中の早期の時点で得られた該同一の対象からの早期の試料中の該標的ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度と比較することと、を含み、
該癌治療薬による治療前または治療中の早期の時点で得られた濃度に対する、該癌治療薬による治療中の後期の時点で得られた試料中の該標的ＣＥＡ濃度をコードするＲＮＡの低下は、該癌治療薬の有効性を示し、それによって、該治療をモニタリングする、方法。
【０３４３】
６７．  癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を発現する癌を患っている対象を治療する方法であって、
ＣＥＡを発現する癌を患っている対象の治療に使用される癌治療薬を選択することであって、この癌治療薬は、ＣＥＡタンパク質の１つの型に免疫特異的に結合するが、ＣＥＡタンパク質の第２の型には免疫特異的に結合せず、ＣＥＡタンパク質の１つの型は、標的ＣＥＡタンパク質と称される、選択することと、
プライマーおよび／またはプローブを用いて、該対象からの試料中の該標的ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度を検出し、該治療薬が免疫特異的に結合するエピトープと同一または実質的に同一である該標的ＣＥＡタンパク質上のエピトープをコードするＲＮＡを検出し、それによって、該試料中の非標的型のＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度を検出することなく、該ＲＮＡ標的ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度を検出することと、
該標的ＣＥＡタンパク質をコードする該ＲＮＡの濃度を、健常な対象からの試料中の標的ＣＥＡタンパク質濃度を反映する標準範囲と比較することであって、
該標準範囲を超える該標的ＣＥＡタンパク質の濃度の検出は、標的ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する癌治療薬に対する感受性を示す、比較することと、
該対象が該癌治療薬に対して感受性があると判定される場合、標的ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する該癌治療薬により該対象を治療することと、
任意に、該癌治療薬による治療を受けている該対象からの治療後の試料中の、標的ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度を検出し、それによって、該試料中の非標的型のＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度を検出することなく、該標的ＣＥＡタンパク質の濃度を検出することと、
該標的ＣＥＡタンパク質をコードする該ＲＮＡの濃度を、該癌治療薬による治療前または該治療中の早期の時点で得られた該同一の対象からの試料中の該標的ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度と比較することと、
を含み、
該癌治療薬による治療前または該治療中の早期の時点で得られた試料中の該標的ＣＥＡ濃度に対する、該癌治療薬による治療中の後期の時点で得られた試料中の該標的ＣＥＡ濃度をコードするＲＮＡの低下は、該対象の該治療の有効性を示す、方法。
【０３４４】
６８．  対象からの試料中の完全長ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度および短型ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度を検出することと、
完全長ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度と短型ＣＥＡタンパク質濃度をコードするＲＮＡの濃度との比率を判定することと、を含む、方法。
【０３４５】
６９．  該比率を、健常な対象からの試料中の、完全長ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度と短型ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度との標準比率を反映する標準と比較することをさらに含み、
該標準比率よりも高いまたは低い比率は、ＣＥＡを発現する癌の存在を示す、実施形態６８に記載の方法。
【０３４６】
11．  完全長ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度の検出は、完全長ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡにハイブリダイズするが、短型ＣＥＡタンパク質にはハイブリダイズしないプライマーおよびまたはプローブと、試料を接触させることを含む、実施形態６８または６９に記載の方法。
【０３４７】
７１．  完全長ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの濃度の検出は、完全長ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡにハイブリダイズするが、短型ＣＥＡタンパク質にはハイブリダイズしないプライマーおよびまたはプローブと、試料を接触させることと、短型ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡにハイブリダイズするが、完全長ＣＥＡタンパク質にはハイブリダイズしないプライマーおよびまたはプローブと、試料を接触させることと、を含む、実施形態６８〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【０３４８】
７２．  抗ＣＥＡ癌治療薬によって該対象を治療することをさらに含む、実施形態６０〜６３または６５〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【０３４９】
７３．  該癌治療薬は、該検出ステップに使用される該抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子によって免疫特異的に結合されるものと同一または実質的に同一であるＣＥＡタンパク質上のエピトープに免疫特異的に結合する、実施形態６４、６７、または７２のいずれか１項に記載の方法。
【０３５０】
７４．  該対象は、ヒトである、実施形態６０〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【０３５１】
７５．  該癌治療薬は、タンパク質治療薬を含む、実施形態６３〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【０３５２】
７６．  該タンパク質治療薬は、抗体または抗原結合フラグメントである、実施形態７５に記載の方法。
【０３５３】
７７．  該タンパク質治療薬は、モノクローナル抗体である、実施形態７６に記載の方法。
【０３５４】
７８．  該モノクローナル抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体である、実施形態７７に記載の方法。
【０３５５】
７９．  該タンパク質治療薬は、配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質に免疫特異的に結合する、実施形態７６〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【０３５６】
８０．  該タンパク質治療薬は、配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質に免疫特異的に結合するが、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質には免疫特異的に結合しない、実施形態７９に記載の方法。
【０３５７】
８１．  該タンパク質治療薬は、抗体Ａ５Ｂ７の抗原結合ドメインを含む、実施形態７６に記載の方法。
【０３５８】
８２．  該タンパク質治療薬は、二重特異性抗体である、実施形態７６に記載の方法。
【０３５９】
８３．  該二重特異性抗体は、ＣＥＡ結合部分およびＣＤ３結合部分を含む、実施形態８２に記載の方法。
【０３６０】
８４．  該試料は、全血、血清、血漿、唾液、尿、糞便、精漿、汗、羊水、痰、母乳、胆液、組織ホモジネート、および腹水から選択される、実施形態６０〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【０３６１】
８５．  該試料は、腫瘍組織試料である、実施形態６０〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【０３６２】
８６．  該ＣＥＡを発現する癌は、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、食道癌、胃食道癌、胃癌、肺癌、および乳癌から選択される、実施形態６０〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【０３６３】
８７．  該検出ステップは、実施形態３５または４５に記載の方法を含む、実施形態６０〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【０３６４】
８８．  該試料は、実施形態４６に記載のプローブ／およびまたはプライマーと接触させる、実施形態８７に記載の方法。
【０３６５】
８９．  該試料は、実施形態４７に記載のプローブ／およびまたはプライマーと、任意に、実施形態４６に記載のプローブおよび／またはプライマーと接触させる、実施形態８７に記載の方法。
【０３６６】
９０．  該検出ステップは、
配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＲＮＡにハイブリダイズするプライマーおよび／またはプローブと、該試料を接触させる、実施形態６０〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【０３６７】
９１．  該検出ステップは、
抗体Ａ５Ｂ７の抗原結合ドメインによって結合されるエピトープを含むタンパク質をコードするＲＮＡにハイブリダイズするプライマーおよび／またはプローブと、該試料を接触させることを含む、実施形態６０〜６７または８７〜９０のいずれか１項に記載の方法。
【０３６８】
９２．  該検出ステップは、
Ａ５Ｂ７によって結合される同一または実質的に同一のエピトープを含むタンパク質をコードするＲＮＡにハイブリダイズするプライマーおよび／またはプローブと、該試料を接触させることを含む、実施形態６０〜６７または８７〜９０のいずれか１項に記載の方法。
【０３６９】
９３．  該検出ステップは、
Ａ５Ｂ７によって結合される同一または実質的に同一のエピトープを含まないタンパク質をコードするＲＮＡにハイブリダイズするプライマーおよび／またはプローブと、該試料を接触させることを含む、実施形態６０〜６７または８７〜９０のいずれか１項に記載の方法。
【０３７０】
９４．  生物学的試料中の短型癌胎児性抗原（ＣＥＡ）タンパク質の発現を検出する方法は、
短型ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡにハイブリダイズするが、完全長ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡにはハイブリダイズしないプライマーおよびまたはプローブを提供することと、
生物学的試料を提供することと、
該プライマーおよびまたはプローブを用いて、該生物学的試料中の短型ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡの発現を検出することと、
を含む、方法。
【０３７１】
９５．  該生物学的試料は、腫瘍組織試料である、実施形態９４に記載の方法。
【０３７２】
９６．  該生物学的試料は、全血、血清、血漿、唾液、尿、糞便、精漿、汗、羊水、組織ホモジネート、痰、母乳、胆液、および腹水から選択される、実施形態９４に記載の方法。
【０３７３】
９７．  プライマーを提供することを含む、実施形態９４に記載の方法。
【０３７４】
９８．  プライマーおよびプローブを提供することを含む、実施形態９４に記載の方法。
【０３７５】
９９．  該プライマーおよび／またはプローブは、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＲＮＡに結合する、実施形態９４に記載の方法。
【０３７６】
１００．  該抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子は、配列番号２８〜４４および４６〜５１のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態６０〜６７、７０〜９３、および９４〜９９のいずれか１項に記載の方法。
【０３７７】
１０１．  抗ＣＥＡ治療薬は、配列番号２８〜４４および４６〜５１のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態６２、６４〜６７、および７２〜９３のいずれか１項に記載の方法。
【０３７８】
１０２．  該抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子は、配列番号４８のアミノ酸配列を含む、実施形態１００に記載の方法。
【０３７９】
１０３．  該抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子は、配列番号４９のアミノ酸配列を含む、実施形態１００に記載の方法。
【０３８０】
１０４．  該抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子は、配列番号４６のアミノ酸配列を含む、実施形態１００に記載の方法。
【０３８１】
１０５．  該抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む、実施形態１００に記載の方法。
【０３８２】
１０６．  該抗ＣＥＡ治療薬は、配列番号４８のアミノ酸配列を含む、実施形態１０１に記載の方法。
【０３８３】
１０７．  該抗ＣＥＡ治療薬は、配列番号４９のアミノ酸配列を含む、実施形態１０１に記載の方法。
【０３８４】
１０８．  該抗ＣＥＡ治療薬は、配列番号４６のアミノ酸配列を含む、実施形態１０１に記載の方法。
【０３８５】
１０９．  該抗ＣＥＡ治療薬は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む、実施形態１０１に記載の方法。
【０３８６】
１１０．  該標的は、完全長ＣＥＡタンパク質である、実施形態６、７、８、１３〜３４、４５〜４８、６５〜６７、および７２〜９３のいずれか１項に記載の方法。
【０３８７】
１１１．  該標的は、短型ＣＥＡタンパク質である、実施形態６、７、８、１３〜３４、４５〜４８、６５〜６７、および７２〜９３のいずれか１項に記載の方法。
【０３８８】
１１２．  実施形態６１〜１１１のいずれか１項に記載のＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡを検出することをさらに含む、実施形態１〜３４、３６〜４１、および５１〜６０のいずれか１項に記載のＣＥＡタンパク質を検出する方法。
【０３８９】
配列表
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例示
本開示をここで一般的に記載したが、本開示は、以下の実施例を参照することによりさらに容易に理解され、これらの実施例は、本開示のある態様および実施形態の説明のためにのみ含まれ、本開示を限定することを意図しない。例えば、本明細書に開示される特定の構築物および実験設計は、適切な機能を検証するための例示的なツールおよび方法を表す。したがって、開示された特定の構築物および実験計画のいずれかは、本開示に範囲内で置き換えることができることは、容易に明らかであろう。
【実施例】
【０３９０】
実施例１：短型ＣＥＡの特定
ＣＥＡ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＮＭ＿００２４８３；ＣＥＡＣＡＭ５；ＣＤ６６ｅ）の完全長転写物は、１０エキソンを含有し、それは、７０２アミノ酸（ａａ）（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿００４３５４．２；図１および２）のタンパク質前駆体に翻訳する。Ｎ末端３４アミノ酸シグナルペプチドおよびＣＥＡのＣ末端の１７アミノ酸ポリペプチドは、タンパク質成熟中に除去される（Ｂａｃｈｍａｎ，１９８７）。結腸癌組織からのより短いＣＥＡスプライス変異体（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＣＲ７４９３３７；短型ＣＥＡ）のｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ遺伝子配列データベースに特定された。この転写物は、エキソン２の代替的なスプライシングドナー部位を使用し、エキソン３および４をスキップし、したがって、転写物は、完全長ＣＥＡのアミノ酸１１６から３９６（Ｎ末端プロ配列を含む場合、計数される）のインフレーム短縮を伴い、４２０アミノ酸タンパク質をもたらす（図２）。この短縮は、Ｖ−ｓｅｔドメインの一部分および３つのＩｇＣ２様ドメインを欠損する（図３）。
【０３９１】
実施例２：完全長ＣＥＡおよび短型ＣＥＡの定量分析
ＴｉｓｓｕｅＳｃａｎ（商標）Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｔｉｓｓｕｅ定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）アレイを採用して、様々な病期および悪性度の正常および癌組織中完全長および短型ＣＥＡ転写物の発現を判定した。アレイは、ＴｉｓｓｕｅＳｃａｎ（商標）Ｃｏｌｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｑＰＣＲ  Ａｒｒａｙ  Ｉ、ＴｉｓｓｕｅＳｃａｎ（商標）Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｑＰＣＲ  Ａｒｒａｙ  Ｉ、ＴｉｓｓｕｅＳｃａｎ（商標）Ｇａｓｔｒｏｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｑＰＣＲ  Ａｒｒａｙ  Ｉ、ＴｉｓｓｕｅＳｃａｎ（商標）Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｑＰＣＲ  Ａｒｒａｙ  Ｉ、およびＴｉｓｓｕｅＳｃａｎ（商標）Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｑＰＣＲ  Ａｒｒａｙ  Ｉを含んだ。それぞれの組織ｃＤＮＡアレイのために、凍結乾燥したｃＤＮＡを、２．５μＬのリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）ｆｒｅｅ水中に再懸濁した。プレートは、密閉し、ボルテックスし、遠心分離して、完全ＤＮＡ試料の再懸濁を確保した。エキソン２および５のスプライス部位（短型ＣＥＡ用）ならびにエキソン３および４のスプライス部位（完全長ＣＥＡ用）を特異的に標的化したプライマーおよびプローブを分析に使用した（表１）。
【表１】
2013512454.tif 000049
【０３９２】
次いで、ＴａｑＭａｎアッセイのプールが、前増幅、続いて、特異的標的転写物の増幅のために製造業者によって供給されたプロトコルに従って作製された。具体的には、短型ＣＥＡ、完全長ＣＥＡ、またはリボソームサブユニット１８Ｓ  ｃＤＮＡに対して特異的な１０μＬの２０Ｘ  Ｃｕｓｔｏｍ  ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイミックスを、９９０μＬの水と混合して、アッセイの最終濃度を０．２Ｘにした。前増幅反応は、２．５μＬのプールしたアッセイミックスおよび５μＬのＴａｑＭａｎ  ＰｒｅＡｍｐ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを再懸濁したｃＤＮＡに添加することによって、供給された９６ウェルプレート中に調製された。前増幅反応は、表２中に示される条件下で、Ｔｅｔｒａｄ  Ｔｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒ上で実施された。前増幅後、試料は、ｐＨ８．０で、９０μＬのＤＮＡ再懸濁緩衝液を添加することによって、１００μＬまで希釈した。定量ＰＣＲは、標的遺伝子のそれぞれのために、前増幅したｃＤＮＡ試料およびＴａｑＭａｎアッセイ構成要素を用いて調製された（表３）。
【表２】
2013512454.tif 000050
【表３】
2013512454.tif 000051
【０３９３】
必要な反応構成要素を添加した後、それぞれのプレートは、ＭｉｃｒｏＡｍｐ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｆｉｌｍで密閉し、ボルテックスし、短時間遠心分離し、次いで、表４中に示されるサイクル条件を用いて、ＡＢＩ  ７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ中で、高速モードでｑＰＣＲのために処理した。
【表４】
2013512454.tif 000052
【０３９４】
ｑＰＣＲの完了後、ＳＤＳ２．２ソフトウェアを使用し、閾値サイクル（Ｃｔ）値を生成した。典型的な反応では、ＰＣＲ生成物は、指数関数的に生成される。生成物が検出可能になるまでにはいくつかのサイクルが必要であるため、蛍光対サイクル数のプロットは、Ｓ字状の外観を示す。後の方のサイクルでは、反応基質が枯渇し、ＰＣＲ生成物はもう２倍にはならず、曲線が平らになり始める。通常、ベースラインをわずかな標準偏差だけ超える、蛍光の量が指数関数的に増加し始める曲線上の点が、Ｃｔ値と称される。すべてのＣｔ値が出力された後に、相対定量の算出が行われた。遺伝子発現に対してそれより低ければ試料が陽性であると見なされ、それより高ければ試料が陰性であると見なされる、３０のＣｔカットオフ値が任意に選択された。
【０３９５】
陽性対照として、完全長（ＣＨＯ／ｈｕＣＥＡ）あるいは短型ＣＥＡ（ＣＨＯ／短型ＣＥＡクローン７２−４）のいずれかを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞からのｃＤＮＡが使用された。相補的ＤＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いたＲＮＡの単離、続いて、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ワンサイクルｃＤＮＡキットを用いるｃＤＮＡ合成によって、調製された。得られたｃＤＮＡは、ＲＮＡクリーンビーズによって洗浄し、２５μＬのＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水中に再懸濁した。完全長あるいは短型ＣＥＡのいずれも発現しないジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ−ＣＨＯ）の発現を欠損する親ＣＨＯ細胞からの陰性対照ｃＤＮＡは、同一の様式で調製された。陽性および陰性対照ｃＤＮＡ（５μＬ）は、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水中で５０倍に希釈され、上記のｑＰＣＲ増幅プロトコルにおいて、前増幅アレイｃＤＮＡとして使用された。陽性対照ｃＤＮＡは、それらの関連遺伝子特異的プライマーおよびプローブセットで、Ｃｔ値が３０を下回り、非関連セットで、Ｃｔ値が３０を上回ることを示した。予想通りに、３０を上回るＣｔ値が、完全長および短型ＣＥＡの両方のプライマーおよびプローブセットで陰性対照ｃＤＮＡに対して観察された。所定の試料中の完全長および短型ＣＥＡの相対発現レベルの算出のためのＣｔ値の正規化のために、リボソーム１８Ｓ  ＲＮＡ  ｃＤＮＡのＣｔ値が、使用された。
【０３９６】
この方法を用いて、ＴｉｓｓｕｅＳｃａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｑＰＣＲアレイを使用して、正常および癌性の結腸、膵臓、胃食道、肺、および乳房組織における完全長および短型ＣＥＡ転写物の発現を判定した（表５）。
【表５】
2013512454.tif 000053
【０３９７】
完全長ＣＥＡ転写物は、一般に、様々な悪性度および病期の、膵臓腺癌（５つのうち４つ）、結腸（４２のうち４１）、胃食道（４２のうち３８）、肺（４０のうち３９）、および乳房癌（４１のうち３８）において、検出された（Ｃｔ＜３０）。完全長ＣＥＡ転写物は、まれに、膵臓癌の神経内分泌（９つのうち１つ）、島細胞（４つのうち１つ）、および腺房細胞（１つのうち０）において検出された。正常な結腸、肺、および胃食道組織において、完全長ＣＥＡ転写物は、相対的に高い数字（Ｃｔ＜２５）で発現した。対照的に、正常な乳房組織において、完全長ＣＥＡ転写物は、低い数字（２５＜Ｃｔ＜３０）で発現した。完全長ＣＥＡ転写物の低い発現（Ｃｔ＜３０）は、ＴｉｓｓｕｅＳｃａｎ  Ａｒｒａｙからの正常な膵臓組織において見出された。
【０３９８】
短型ＣＥＡ転写物の発現（Ｃｔ＜３０）は、一般に、結腸（４２のうち４１）および胃食道癌の半分（４２のうち２１）において、見出された。発現はまた、様々な悪性度および病期の、肺癌（４０のうち１２）と乳房癌（４１のうち５つ）の比率にも見られた。短型ＣＥＡの発現は、まれに、膵臓腺癌（５つのうち１つ）に見出され、膵臓の神経内分泌癌（９つのうち０）、島細胞癌（４つのうち０）、または腺房細胞癌（１つのうち０）において見出されなかった。短型ＣＥＡ転写物の発現は、常に、完全長ＣＥＡ転写物の発現と一致した。これらの結果は、短型ＣＥＡスプライス転写物の発現は、異なる癌で異なるが、常に、完全長ＣＥＡ転写物と同時発現することを示す。
【０３９９】
実施例３：チャイニーズハムスター卵巣細胞における短型ＣＥＡのクローニングおよび発現
短型ＣＥＡの配列を含むｃＤＮＡクローンＤＫＦＺｐ７８１Ｍ２３９２Ｑのプラスミドは、Ｂ  Ｂｒｉｄｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌと合併したＩｍａＧｅｎｅｓ  ＧｍｂＨから購入した。プラスミドＤＮＡは、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニ調製キットを用いて、プラスミドＤＮＡ精製による細胞培養物から調製された。続いて、精製したＤＮＡは、ＰＣＲ反応においてテンプレートとして、使用し（表６および７）、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼキットおよび遺伝子特異的プライマー３７６および３７７を用いて、短型ＣＥＡを増幅した（表８）。
【表６】
2013512454.tif 000054
【表７】
2013512454.tif 000055
【表８】
2013512454.tif 000056
【０４００】
反応生成物は、１％  ＴＡＥ（トリスアセテートエチレンジアミン四酢酸）ゲル電気泳動後、１．２キロベースのＤＮＡバンドとして検出され、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを用いてゲルから精製した。生成物は、ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡクローニング（登録商標）によってｐＣＲ２．１ベクターにクローン化され、続いて、ＣＥＡ遺伝子特異的プライマー３７６および３７７を用いて、青色／白色選択および診断ＰＣＲによってスクリーニングされたＴＯＰ１０細菌に形質転換された。陽性コロニーからのＤＮＡは、Ｐｒｉｓｍ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒによって配列を決定し、正確な短型ＣＥＡ配列を確認した。照合された短型ＣＥＡは、Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（商標）を用いて、ＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ消化したウイルスにＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ消化したＣＥＡスプライス変異体を連結反応させることによって、ｐＣＤＨ１−ＨＣＳ１−ＥＦ１−Ｐｕｒｏベクターにサブクローン化された。そのようなサブクローニングは、遺伝子の構成的発現を誘導するサイトメガロウイルスプロモーターの短型ＣＥＡ下流に位置付けられた。短型ＣＥＡを担持するレンチウイルスベクターは、ＴＯＰ１０細菌に形質転換され、細菌コロニーは、レンチウイルスおよび短型ＣＥＡ配列に対して特異的なプライマーを用いて、ＰＣＲによってスクリーニングされた。正確な配向に短型ＣＥＡを含有する陽性コロニーを使用して、Ｒａｐｉｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、レンチウイルスＤＮＡを調製した。精製したレンチウイルスＤＮＡは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００トランスフェクション試薬によって、凝縮プラスミドと一緒に２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされて、感染性レンチウイルスを産生した。レンチウイルスを含有する細胞培養培地は、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞の感染のために使用された。続いて、細胞は、短型ＣＥＡを発現するレンチウイルス感染ＣＨＯ細胞の選択のために、７２時間あるいは２週間のいずれかで、完全成長培地中の５μｇ／ｍＬのピューロマイシンで処理された。ピューロマイシンによって選択された細胞のプールしたクローンは、限界希釈法によって単一細胞としてクローン化された。様々なレベルの短型ＣＥＡタンパク質を発現する単一細胞由来のクローンは、実施例４に定義されるように、抗体結合アッセイによって特定された。
【０４０１】
実施例４：抗体結合
ＩｇＧ  Ｂ９（ＩｇＧ  Ｂ９は、（ａ）マウスＡ５Ｂ７のヒト化ＣＤＲおよび（ｂ）マウスＩｇＧ１  Ｆｃドメインを有するキメラ抗体である）、抗ＣＥＡ抗体（抗ＣＥＡＣＡＭ  ５モノクローナル抗体、ＦＩＴＣ共役抗ヒトＣＤ６６ａ、ｃ、ｄ、ｅ、［ＣＥＡＣＡＭ１、３、５、６］、および抗ＣＥＡＣＡＭ１、３、４、５、６）の結合のために、抗体を、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］＋２％  ウシ胎仔血清［ＦＢＳ］）中に希釈された１０μｇ／ｍＬの濃度の細胞とともに、４℃で２０分間インキュベートした。結合ＩｇＧ  Ｂ９および非標識抗ＣＥＡモノクローナル抗体の検出のために、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中の１０μｇ／ｍＬのヤギ抗マウスＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８二次抗体とともに、暗室中で、４℃で１５分間インキュベートした。蛍光強度を判定する前に、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。Ｔ細胞への抗体の結合は、製造業者によって推奨された濃度で、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ２５に対して抗体を用いて、ＦＡＣＳ緩衝液中で行われた。結合アッセイのために、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、抗体および１０μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）とともに、暗室中で、４℃で２０分間インキュベートした。結合二次または直接共役抗体の蛍光強度は、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターを用いたフローサイトメトリーによって判定され、データは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析された。生存細胞は、補正マトリックスを構築するために、単一染色した対照細胞による蛍光補正後の抗体結合について検査された。Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｍｉｎｕｓ−ｏｎｅ対照が、陰性および陽性染色事象のゲートのために含まれた。
【０４０２】
短型ＣＥＡを発現するＣＨＯ細胞の生成は、実施例３に記載される。単一細胞クローンは、ＩｇＧ  Ｂ９またはＣＥＡＣＡＭ５特異的ＭＡｂの結合によって、短型ＣＥＡタンパク質の細胞表面発現についてスクリーニングされた（図４）。抗ＣＥＡＣＡＭ５  ＭＡｂが、様々なレベルで数多くのクローンに結合された。対照的に、ＩｇＧ  Ｂ９は、いかなるクローンにも実質的には結合しなかった。ＩｇＧ  Ｂ９によって認識されたエピトープを欠失し、また、２つの他の抗ＣＥＡモノクローナル抗体への結合を欠失する２つのクローン株、７２−４および７２−１４は、さらなる研究のために選択された（図５）。これらのクローンはまた、高レベルの抗ＣＥＡＣＡＭ５特異的モノクローナル抗体結合も示した（図４）。
【０４０３】
実施例５：細胞傷害性
ＣＨＯ／ｈｕＣＥＡ細胞のエフェクターＴ細胞媒介殺作用が、色素標識標的細胞の生存能力を測定するフローサイトメトリーベースのアッセイを用いて判定された。エフェクターＣＤ３＋Ｔ細胞は、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（登録商標）ヒトＴ細胞濃縮カクテルおよびＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ  Ｔ細胞密度培地によって、健常なドナーのヘパリン化された全血から単離された。簡潔に言えば、２０ｍＬのヒト全血を、１ｍＬのヒトＴ細胞濃縮カクテルに添加し、混合し、２５℃で２０分間インキュベートした。次いで、血液を、ＦＡＣＳ緩衝液を用いて１：１に希釈し、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ  Ｔ細胞密度培地で遠心分離した。濃縮ヒトＴ細胞は、血清／密度培地界面で除去され、ＦＡＣＳ緩衝液を用いて２回洗浄した。最終的に、ＣＤ３＋濃縮Ｔ細胞は、２．８×１０６細胞／ｍＬの密度で、１０％  ＦＢＳおよび４．５ｇ／Ｌのグルコースを含有するＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）−１６４０細胞培養培地中に再懸濁した。
【０４０４】
ＣＨＯ／ｈｕＣＥＡ細胞（完全長ＣＥＡタンパク質を発現する）またはＣＨＯ／短型ＣＥＡクローン７２−４および７２−１４（これらのそれぞれは、短型ＣＥＡタンパク質を発現する）は、標的細胞として使用された。細胞を、採取し、洗浄し、最終的に、１×１０６細胞／ｍＬの密度で、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。細胞を、１ｍＬあたり５μＬの３，３′−ジオクタデシルオキサカルボシアニン（ＤｉＯ）細胞標識溶液に迅速に添加し、３７℃で１分間インキュベートした。細胞を、洗浄し、２．８×１０５細胞／ｍＬの密度で、ＲＰＭＩ−１６４０細胞培養培地中に再懸濁した。
【０４０５】
連続希釈のＢｉＴＥ抗体（２０μＬ）を、１０対１のエフェクター対標的比で、９６ウェル非組織培養で処理されたプレート中に、９０μＬの標的およびエフェクター細胞のそれぞれに添加した。ＭＥＣ１４  ＢｉＴＥは、ＭＥＤＩ−５６５の対照ＢｉＴＥとして使用した。ＭＥＣ１４  ＢｉＴＥは、ＭＥＤＩ−５６５を構築するために使用された同一の抗ＣＤ３一本鎖抗体に連結したマウス抗Ｍｅｃｏｐｒｏｐ（除草剤）一本鎖抗体からなる。
【０４０６】
ＢｉＴＥ媒介細胞傷害性反応は、５％  ＣＯ２を有する雰囲気下で、７２時間、３７℃で行われた。
【０４０７】
細胞膜完全性として定義される細胞毒性は、ＰＩの細胞取り込みによってモニタリングされた。生存細胞は、ＰＩを除外する一方で、ＰＩは、非生存細胞中の核酸を染色する。非生存ヨウ化プロピジウム陽性、ＤｉＯ標識標的細胞の割合は、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターを用いたフローサイトメトリーによって判定され、データは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析された。
【０４０８】
ＭＥＤＩ−５６５は、ＣＨＯ／ｈｕＣＥＡ細胞（完全長ＣＥＡタンパク質を発現する細胞）の用量依存性殺作用を媒介した。対照的に、ＭＥＤＩ−５６５は、ＣＨＯ／短型ＣＥＡ細胞クローン７２−４および７２−１４（短型ＣＥＡタンパク質を発現する細胞）の殺作用を媒介しなかった（図６）。予想されたように、ＭＥＤＩ−５６５は、ＣＥＡの発現を欠失している親ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞の殺作用を媒介しなかった。
【０４０９】
ＭＥＤＩ−５６５は、ＣＨＯ／ｈｕＣＥＡ細胞によって共培養した後、用量依存性様式で、ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上の表面抗原ＣＤ２５の発現を誘発した（図７）。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞へのこの効果は、ＣＨＯ／短型ＣＥＡ細胞クローン７２−４および７２−１４の存在下で見られなかった。加えて、ＭＥＤＩ−５６５は、ＣＥＡの発現を欠失している親ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞で培養されたヒトＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化しなかった。これらの結果は、ＭＥＤＩ−５６５が短型ＣＥＡタンパク質のみを発現する細胞に結合する、またはこのＴ細胞殺作用を媒介することができないことと一致した。
【０４１０】
以下の結論は、実施例１〜５からもたらされ得る。完全長ＣＥＡ転写物は、結腸、膵臓、胃食道、肺、および乳房癌において、広範に発現した。短型ＣＥＡ転写物は、結腸癌において広範に、胃食道、肺、および乳房癌にわずかに、膵臓癌にまれに発現した。しかしながら、発現レベルおよび頻度は、異なるが、すべての組織試料中の短型ＣＥＡ転写物の発現は、完全長ＣＥＡ転写物の発現と一致した。
【０４１１】
短型ＣＥＡを伴うＣＥＡの発現を欠失している親ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞株の転写物により、短型ＣＥＡタンパク質を発現し、ＣＥＡＣＡＭ５に対して特異的なＭＡｂに結合した単一細胞クローンを得た。しかしながら、短型ＣＥＡタンパク質は、ＭＥＤＩ−５６５を有する同一のＣＥＡ結合部分を共有するＩｇＧ  Ｂ９、マウスモノクローナル抗体によって、または２つの別個のモノクローナル汎ＣＥＡ抗体（ＣＤ６６ａ、ｃ、ｄ、ｅ／ＣＥＡＣＡＭ１、３、５、６およびＣＥＡＣＡＭ１，３，４，５，６）によって結合されなかった。この結果は、短型ＣＥＡタンパク質が、完全長ＣＥＡタンパク質に存在し、ＩｇＧ  Ｂ９によって認識される特異的エピトープを保持しないことを示す。予想されるように、ＭＥＤＩ−５６５は、ＣＨＯ／短型ＣＥＡ細胞（短型ＣＥＡタンパク質のみを発現するＣＨＯ細胞）のＴ細胞媒介殺作用を媒介せず、Ｔ細胞は、これらの細胞毒性アッセイにおいて活性化されなかった。これは、ＣＨＯ／ｈｕＣＥＡ細胞のＭＥＤＩ−５６５媒介殺作用と対照的に、同時Ｔ細胞活性化を支持する。
【０４１２】
集合的に、本明細書に示される結果は、短型ＣＥＡの発現が、細胞表面上の完全長ＣＥＡへのＭＥＤＩ−５６５の結合に干渉しないことを示唆している。さらに、短型ＣＥＡの存在は、ＣＥＡを発現する癌細胞のＭＥＤＩ−５６５を媒介したＴ細胞殺作用を妨げない。
【０４１３】
実施例６：欠失変異体を介したエピトープマッピング
７０２アミノ酸（ａａ）でコードされる完全長ヒトＣＥＡ前駆タンパク質は、３４アミノ酸Ｎ末端シグナルペプチド（成熟タンパク質において除去される）、１つのＩｇＶ様Ｎドメイン、６つのＩｇＣ様ドメイン、および１７アミノ酸Ｃ末端ペプチド（成熟タンパク質において除去される）からなる。完全長ヒトＣＥＡの成熟タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２である。ＭＥＤＩ−５６５によって認識されるＣＥＡのドメインを特定するために、ＣＥＡ欠失変異体は、短縮型ＩｇＣ様ドメインによって、改変された。ＩｇＣ様ドメイン１−３（Ｄｅｌ１−３、配列番号３）の欠失、ＩｇＣ様ドメイン１（Ｄｅｌ１、配列番号４）の欠失、ＩｇＣ様ドメイン２（Ｄｅｌ２、配列番号５）の欠失、ＩｇＣ様ドメイン３（Ｄｅｌ３、配列番号６）の欠失、およびＩｇＣ様ドメイン４−５（Ｄｅｌ４−５、配列番号７）の欠失の、５つの欠失変異体が、図８に示されるように構築された。
【０４１４】
欠失変異体は、テンプレートとして、組織内の完全長ＣＥＡクローンを用いて、重複伸長ＰＣＲを介して、増幅され、組み立てられた。完全長および欠失変異体はともに、ヒトサイトメガロウイルス主要前初期（ｈＣＭＶｉｅ）エンハンサー、プロモーター、および５′非翻訳領域を有する哺乳動物発現ベクターにクローン化された。
【０４１５】
欠失変異体は、２９３フェクチンを用いてＨＥＫ２９３Ｆ細胞への一過性トランスフェクションによって、膜結合型ＧＰＩアンカータンパク質として発現された。形質移入体は、ＭＥＤＩ−５６５、続いて、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で標識された抗ペンタ−Ｈｉｓ抗体とともにインキュベートされ、次いで、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターを用いた結合のためにスクリーニングされた。すべての構築物のタンパク質発現は、抗ＣＥＡポリクローナル抗体でモニタリングされた。
【０４１６】
ドメイン欠失変異体を用いて、ＭＥＤＩ−５６５のエピトープを、ＣＥＡのＩｇＣ３ドメインにマッピングした。ＩｇＣ３またはＩｇＣ１−３ドメインの欠失は、ＣＥＡへのＭＥＤＩ−５６５の結合を妨害した（図８）。他の欠失変異体は、ＭＥＤＩ−５６５結合を保持した（例えば、ＭＥＤＩ−５６５結合は、ＩｇＣ１、２、または４−５ドメインが欠失した場合、妨害されなかった）。さらに、ＩｇＣ３ドメインをコードする短縮型ＣＥＡタンパク質（ＩｇＣ３＿ＧＰＩ）、フランキングＮドメインおよびＧＰＩ領域は、完全長ＣＥＡタンパク質に等しいＭＥＤＩ−５６５結合を保持した（図９）。
【０４１７】
実施例７：スワップ変異体を用いたエピトープマッピング
スワップ変異体は、ＣＥＡの第３のＩｇＣ様ドメイン（ＩｇＣ３）の短セグメントを第５のＩｇＣ様ドメイン（ＩｇＣ５）と交換して構築され、そのようなスワップ変異体が、ＭＥＤＩ−５６５結合に対して評価された。ＩｇＣ５は、ＭＥＤＩ−５６５結合には関与しないが、ＩｇＣ３との高度な相同性を共有するため、ＩｇＣ３のそれぞれのセグメントをノックアウトする際に使用するために選択された（図９）。２つの短縮型ＣＥＡタンパク質は、スワップ変異体、ＩｇＣ３＿ＧＰＩ（配列番号８）およびＩｇＣ５＿ＧＰＩ（配列番号９、図９）のテンプレートとして構築された。それぞれの構築物は、Ｎドメイン、ＩｇＣ３またはＩｇＣ５ドメイン、ＧＰＩ領域からなるが、これらの構築物は、他の５つのＩｇＣ様ドメインをコードしない（図９）。
【０４１８】
ＩｇＣ３およびＩｇＣ５ドメインは、約３０アミノ酸からなる３つのセグメントに分割され、それぞれのセグメントは、セグメントＡ、Ｂ、およびＣとして示された（図９）。「ノックアウト」変異体（ＫＯ）のために、ＩｇＣ３＿ＧＰＩは、ＩｇＣ３のセグメントを、ＫＯ＿Ａ、ＫＯ＿Ｂ、およびＫＯ＿Ｃを操作するＩｇＣ５の対応するセグメントで置き換えるテンプレートとして使用された（図９）。「ノックイン」変異体（ＫＩ）のために、ＩｇＣ５＿ＧＰＩは、ＩｇＣ３セグメントを、ＫＩ＿Ａ、ＫＩ＿Ｂ、ＫＩ＿Ｃ、およびＫＩ＿Ａ＋Ｃを構築する、ＩｇＣ５の対照物の代わりに接合した構造的テンプレートとして使用された（図９）。
【０４１９】
スワップ変異体は、重複伸長ＰＣＲを用いて組み立てられ、一過性哺乳動物発現のヒトサイトメガロウイルス主要前初期（ｈＣＭＶｉｅ）エンハンサー、プロモーター、および５′非翻訳領域をコードする哺乳動物発現ベクターにクローン化された。
【０４２０】
スワップ変異体は、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞への一過性トランスフェクションによって膜結合型ＧＰＩアンカータンパク質として発現された。形質移入体は、ＭＥＤＩ−５６５、続いて、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８で標識された抗ペンタ−Ｈｉｓモノクローナル抗体とともにインキュベートされ、次いで、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターを用いた結合のためにスクリーニングされた。すべての構築物のタンパク質発現は、抗ＣＥＡポリクローナル抗体でモニタリングされた。
【０４２１】
ＩｇＣ３ドメインの２つのセグメントは、ＭＥＤＩ−５６５結合にとって重要であることが見出された。ＩｇＣ３＿ＧＰＩのセグメントＡ（２９２−３１５）またはＣ（３５４−３７６）の対応するＩｇＣ５セグメントとの置換は、ＭＥＤＩ−５６５の結合を破壊した（セグメントの付番は、成熟完全長ＣＥＡタンパク質についてのものである）。常に、ＩｇＣ５＿ＧＰＩへのＩｇＣ３のセグメントＡおよびＣの両方の接合は、ＭＥＤＩ−５６５結合をもたらした。セグメントＢは、結合に対する影響を及ぼさなかった。したがって、スワップ変異体を用いた試験は、ＭＥＤＩ−５６５が、セグメントＡ（残基２９２〜３１５）および残基Ｃ（３５４〜３７６）からなるＣＥＡのＩｇＣ３ドメインにおいて、非直線状エピトープに結合することを示した。短型ＣＥＡの上記の分析からの明白であるように、このエピトープは、短型ＣＥＡタンパク質中に存在しない。
【０４２２】
実施例８：部位特異的突然変異誘発法および計算ホモロジーモデリングを介したエピトープマッピング
部位特異的突然変異誘発法および計算ホモロジーモデリングを実行して、ＭＥＤＩ−５６５結合にとって重要であるＣＥＡの残基を特定した。以下の残基が、セグメントＡおよびセグメントＣのＩｇＣ３エピトープ含有領域に限局されるため、およびこれらの残基が、ＩｇＣ３とＩｇＣ５との間で異なるため、それらは、対応するＩｇＣ５アミノ酸：Ｆ２９２Ｔ２９４Ｎ２９９、Ｎ２９９Ｅ３０４、Ｅ３０４Ｌ３０９Ｉ３１５、Ｖ３５４Ｇ３５５Ｐ３５６Ｅ３５８、Ｅ３６４Ｌ３６５Ｖ３６７Ｄ３６８Ｈ３６９、およびＩ３７４Ｎ３７６（成熟タンパク質の付番）をコードするクラスターとして突然変異した。
【０４２３】
ＣＥＡのＩｇＣ３ドメインのモデル構造は、ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬワークスペースを用いたテンプレートとして、マウスＣＥＡＣＡＭ１Ａ（３３．７％の配列相同性）の結晶構造を用いて構築された（図１０）。部位特異的突然変異誘発法およびモデル構造からの結果に基づいて、ＩｇＣ３のＮ２９９のＩｇＣ５の対応する残基との置き換え（ＫＯ＿Ｎ）、ＩｇＣ３のＶ３５４Ｇ３５５Ｐ３５６Ｅ３５８およびＩ３７４Ｎ３７６のＩｇＣ５の対照物との置換（ＫＯ＿ＶＧＰＥ＋ＩＮ）、およびＩｇＣ３のＦ２９２Ｔ２９４Ｎ２９９、Ｖ３５４Ｇ３５５Ｐ３５６Ｅ３５８、およびＩ３７４Ｎ３７６のＩｇＣ５への接合（ＫＩ＿ＦＴＮ＋ＶＧＰＥ＋ＩＮ）である、３つのさらなる変異体が構築された。
【０４２４】
すべての変異体は、テンプレートとして、短縮型ＣＥＡタンパク質のＩｇＣ３＿ＧＰＩまたはＩｇＣ５＿ＧＰＩを用いて、重複伸長ＰＣＲを用いて組み立てられた。様々な変異構築物は、一過性哺乳動物発現のヒトサイトメガロウイルス主要前初期（ｈＣＭＶｉｅ）エンハンサー、プロモーター、および５′非翻訳領域をコードする哺乳動物発現ベクターにクローン化された。
【０４２５】
変異体構築物は、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞への一過性トランスフェクションによってＧＰＩアンカータンパク質として発現された。形質移入体は、ＭＥＤＩ−５６５、続いて、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で標識された抗ペンタ−Ｈｉｓ  Ｍａｂとともにインキュベートされ、次いで、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターを用いて結合のためにスクリーニングされた。すべての構築物のタンパク質発現は、抗ＣＥＡポリクローナル抗体でモニタリングされた。
【０４２６】
ＩｇＣ３セグメントＡ中の残基Ｆ２９２Ｔ２９４Ｎ２９９が、ＩｇＣ５の対応する残基で置き換えられた時、ＭＥＤＩ−５６５の結合は、妨害された（図１０）（成熟タンパク質の付番）。特に、残基Ｎ２９９は、ＩｇＣ３中の単一アミノ酸のノックアウトが、ＭＥＤＩ−５６５結合を破壊するため、臨界ホットスポット残基として特定された。
【０４２７】
ＩｇＣ３のセグメントＣ中の残基Ｖ３５４、Ｇ３５５、Ｐ３５６、Ｅ３５８、Ｉ３７４、およびＮ３７６はまた、ＭＥＤＩ−５６５結合にも関与する。ＩｇＣ３のモデル構造は、セグメントＡの必須残基Ｎ２９９に空間的に近いセグメントＣ中の残基の２つのクラスター（Ｖ３５４Ｇ３５５Ｐ３５６Ｅ３５８およびＩ３７４Ｎ３７６）を示す（図１０）（成熟タンパク質の付番）。このモデルは、セグメントＣ中のこれらの残基が、ＭＥＤＩ−５６５結合に寄与し得ることを示唆した。実際に、これらの残基のノックアウトはともに、ＭＥＤＩ−５６５結合に大きな影響を及ぼした（が、完全に破壊しなかった）。最終的に、ＩｇＣ５にセグメントＣのアミノ酸Ｖ３５４Ｇ３５５Ｐ３５６Ｅ３５８およびＩ３７４Ｎ３７６を組み合わせた、セグメントＡのアミノ酸Ｆ２９２Ｔ２９４Ｎ２９９の接合は、ＭＥＤＩ−５６５結合をもたらし、この結合のレベルは、セグメントＡおよびＣの両方を一緒にしたノックイン変異体のレベルに匹敵した（６０アミノ酸残基をノックインした合計）（図１０）。
【０４２８】
以下の結論が、実施例６〜８からもたらされ得る。欠失およびスワップ変異体分析、部位特異的突然変異誘発法、および計算ホモロジーモデリングの組み合わせとともに、ＣＥＡの第３の免疫グロブリンＣ様ドメインにおいて、ＭＥＤＩ−５６５の非直線状、立体構造エピトープがマップされ、これらは、Ｎ２９９のホットスポット必須残基を有する、残基２９２〜３１５および３５４〜３７６の２つの領域からなる（成熟タンパク質の付番）。残基Ｆ２９２、Ｔ２９４、Ｖ３５４、Ｇ３５５、Ｐ３５６、Ｅ３５８、Ｉ３７４、およびＮ３７６はまた、ＭＥＤＩ−５６５の結合にとっても重要である（成熟タンパク質の付番）。このエピトープは、完全長ＣＥＡタンパク質に存在するが、短型ＣＥＡタンパク質（本明細書に記載のＣＥＡスプライス変異体）には存在しない。ＣＥＡの残基の付番は、成熟タンパク質について示されることを留意されたい（例えば、残基の計数は、Ｎ末端プロ配列を含まない）。しかしながら、これらの残基はまた、例えば、実施例８に示される残基付番に３４を加えることによって、プロタンパク質（例えば、残基の計数は、Ｎ末端プロ配列を含む）に関して特定することもできる。
【０４２９】
実施例９：ＣＥＡ多型の検討
他の起こり得るＣＥＡ変異体を特定するために、アミノ酸多型が、ＮＣＢＩ単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ＳＮＰ／）を用いて調査された。１０個の個々の非同義コード多型が、下表に示されるように、完全長ＣＥＡタンパク質において特定された。
【表９】
2013512454.tif 000057
【０４３０】
２つの非同義コードＳＮＰ（ｒｓ１０４０７５０３、ｒｓ７２４９２３０）が、ＭＥＤＩ−５６５結合エピトープ領域において、特定された。ｒｓ１０４０７５０３における、ＣからＡへの単一ヌクレオチドの変化は、成熟完全長ＣＥＡのアミノ酸位置３０６で、アラニン（ＡｌａまたはＡ）からアスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）へのアミノ酸変化をもたらした。ｒｓ７２４９２３０における、ＡからＧへの単一ヌクレオチドの変化は、成熟完全長ＣＥＡのアミノ酸位置３６４で、リシン（ＬｙｓまたはＫ）からグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）へのアミノ酸変化をもたらした。
【０４３１】
ＳＮＰデータベースによれば、集団の平均ヘテロ接合性は、ｒｓ１０４０７５０３およびｒｓ７２４９２３０に対して、それぞれ、０．１４１および０．１６８である。しかしながら、ｒｓ１０４０７５０３に対するマイナーアレルホモ接合体の比率は、ヨーロッパ人およびアジア人ともほぼ０であり、サハラ以南のアフリカ人集団では、０．０８である。ｒｓ７２４９２３０に対するマイナーアレルホモ接合体の比率は、異なる集団において、０から０．０３であった。両方のＳＮＰのホモ接合体の比率が、非常に低く、それらがＭＥＤＩ−５６５結合に関与する必須残基に影響を及ぼさないため、ＣＥＡへのＭＥＤＩ−５６５の結合において、これらのＳＮＰの影響がほとんどないと見込んでいる。
【０４３２】
実施例１０：抗ＣＥＡ癌療法に対する感受性の判定
ＣＥＡを発現する癌を患っている患者は、抗ＣＥＡ癌治療に対する感受性の試験を受ける資格がある。癌治療薬は、試験に対して選択される。癌治療薬は、完全長型のＣＥＡタンパク質（細胞表面および分泌された完全長ＣＥＡタンパク質）、標的ＣＥＡに免疫特異的に結合するが、短型のＣＥＡタンパク質（本実施例では、非標的ＣＥＡ）には免疫特異的に結合しない。試料、例えば、血液試料が、患者から採取され、標的ＣＥＡタンパク質に特異的なＥＬＩＳＡアッセイで分析されて、他の非標的型のＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、標的ＣＥＡタンパク質の濃度を判定する。標的ＣＥＡタンパク質の濃度を、健常な対象からの試料中の標的ＣＥＡタンパク質濃度を反映する標準範囲と比較する。標的ＣＥＡタンパク質濃度が、標準範囲を超える場合、この患者は、標的ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する癌治療薬に対して感受性がある。任意に、他のパラメーターもまた、評価されて、癌治療プロトコルが、患者に対して有益であるかどうかを判定する。
【０４３３】
あるいは、または加えて、試料、例えば、血液試料が、患者から採取され、完全長および／または短型ＣＥＡタンパク質をコードするＲＮＡを検出するための方法で分析される。標的ＣＥＡのＲＮＡの濃度を、健常な対象からの試料中の標的ＣＥＡのＲＮＡ濃度を反映する標準範囲と比較する。標的ＣＥＡのＲＮＡ濃度が、標準範囲を超える場合、この患者は、標的ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する癌治療薬に対して感受性がある。任意に、他のパラメーターもまた、評価されて、癌治療プロトコルが、患者に対して有益であるかどうかを判定する。
【０４３４】
癌を患っている対象は、本出願に記載される特異型のＣＥＡに対して標的にされたある種の療法に対して感受性があることが予想される。
【０４３５】
標的ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する癌治療薬に対して感受性があると判定された患者の診断用モニタリングは、治療後の様々な期間で（特定の治療後あるいは全レジメンの締結後のいずれか）、標的ＣＥＡ濃度および／またはＣＥＡのＲＮＡ濃度の検出に基づいた診断方法を用いるものである。例えば、診断用モニタリングは、標的ＣＥＡに免疫特異的に結合する抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子を用いるものである。ある実施形態において、診断用抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子は、癌治療薬として、標的ＣＥＡ上の同一または実質的に同一のエピトープに免疫特異的に結合する。
【０４３６】
特定型のＣＥＡを発現する癌に応じて、標的ＣＥＡ濃度は、他の流体の試料を採取することによってモニタリングすることができる。例えば、特に、結腸癌および直腸癌については、治療前、治療中、および／または治療後に、血液または糞便試料を採取し、使用して、ＣＥＡ濃度をモニタリングすることができる。さらなる例として、肺癌については、痰試料を、同様に使用することができる。
【０４３７】
実施例１１：完全長ＣＥＡに対する特異性
ＭＥＤＩ−５６５結合にとって重要な完全長ＣＥＡのアミノ酸は、大部分は、セグメントＣのアミノ酸Ｉ４０８およびＮ４１０を除いて、ＣＥＡスプライス変異体に存在しないことが見出される（図２、シグナル配列を含むタンパク質に対して示される、これらの残基は、成熟タンパク質に対してのみ計数される場合、Ｉ３７４およびＮ３７６に対応することを留意されたい）。実際には、ノックアウト（ＫＯ＿Ａ）およびノックイン（ＫＩ＿Ｃ）変異体は、エピトープマッピングに対して構築され、これは、セグメントＣ（アミノ酸Ｉ４０８およびＮ４１０を含有する）を有するが、Ａの欠失（残基Ｎ３３３を含有する）（完全長ＣＥＡタンパク質の付番）は、ＭＥＤＩ−５６５によって認識されなかった（図９）。この観察は、ＣＥＡスプライス変異体へのＭＥＤＩ−５６５の結合が、生じる可能性が低いことを示唆した。この仮説を試験するために、ＣＨＯ細胞は、完全長ＣＥＡ（ＣＨＯ  ＦＬ  ＣＥＡ）もしくはＣＥＡスプライス変異体（ＣＨＯ  ＳＶ  ＣＥＡ）、または順次に両方（ＣＨＯ  ＦＬ＋ＳＶ  ＣＥＡ）の発現を誘導するレンチウイルス構築物で感染され、ＣＥＡタンパク質発現は、ウエスタンブロット法によって検証された（データは示されず）。予想されたように、ＭＥＤＩ−５６５は、完全長ＣＥＡを発現する細胞に結合するが、ＣＥＡスプライス変異体を発現する細胞には結合しない（図１１Ａ）。Ｚｈｏｕらは、ＩｇＶ様ドメインおよびＩｇＣ５は、併置する細胞表面上で同種親和性ＣＥＡ相互作用を媒介し、両方のドメインは、ＣＥＡスプライス変異体内に存在することを示した。したがって、ＣＥＡスプライス変異体（短型）および完全長ＣＥＡタンパク質の同時発現が、同種親和性相互作用を通して、完全長型においてマスクされるＭＥＤＩ−５６５結合エピトープをもたらし、続いて、完全長ＣＥＡへのＭＥＤＩ−５６５結合を妨げる可能性があるという仮説を試験することを望んだ。同一の細胞上のＣＥＡスプライス変異体（短型）と完全長ＣＥＡの同時発現は、完全長ＣＥＡに対するＭＥＤＩ−５６５の結合親和性に有意に影響を及ぼさなかった（ＣＨＯ  ＦＬ  ＣＥＡ、ＫＤ＝５．０±０．１５ｎＭ、ＣＨＯ  ＦＬ＋ＳＶ  ＣＥＡ、ＫＤ＝５．６±３．０ｎＭ；ｐ＝０．８６）。同種親和性相互作用は、ＭＥＤＩ−５６５結合を阻止するようには見なされない。
【０４３８】
ＭＥＤＩ−５６５結合データと一致して、ＣＨＯ  ＳＶ  ＣＥＡは、健常なドナーからのＴ細胞の活性化を媒介せず、また、ＭＥＤＩ−５６５で培養された時、ＣＨＯ  ＳＶ  ＣＥＡ細胞を溶解するように誘発されるヒトＴ細胞を刺激しなかった（図１１）。対照的に、ＭＥＤＩ−５６５は、Ｔ細胞で活性化し、同様の活性レベル（ＥＣ５０値）で、ＣＨＯ  ＦＬ  ＣＥＡまたはＣＨＯ  ＦＬ＋ＳＶ  ＣＥＡ細胞の殺作用を誘発した；ＣＨＯ  ＦＬ  ＣＥＡ、ＥＣ５０＝７５±３５ｎｇ／ｍＬ；ＣＨＯ  ＦＬ＋ＳＶ  ＣＥＡ、ＥＣ５０＝５９±４３ｎｇ／ｍＬ；ｐ＝０．７９。ＭＥＤＩ−５６５は、ＣＥＡスプライス変異体に結合しないため、ＣＥＡスプライス変異体および完全長ＣＥＡの同時発現は、完全長ＣＥＡへのＭＥＤＩ−５６５結合に干渉せず、また、完全長ＣＥＡを発現する癌細胞のＭＥＤＩ−５６５を媒介したＴ細胞殺作用を阻害しないことが予想される。しかしながら、完全長ＣＥＡとＣＥＡスプライス変異体の区別は、ＭＥＤＩ−５６５療法を受けている患者における、血清ＣＥＡレベルの変化によってＣＥＡ陽性腫瘍細胞の状態をモニタリングする際に、重要であり得る。
【０４３９】
実施例１２：ＣＥＡを発現する癌の治療
ＣＥＡを発現する癌を患っている患者は、治療を受ける資格がある。任意に、患者は、実施例１０に示されるように、標的ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する癌治療薬に対して感受性があることを示している。試料、例えば、血液試料が、患者から採取され、標的ＣＥＡタンパク質、完全長ＣＥＡに対して特異的なＥＬＩＳＡアッセイを用いて分析されて、他の非標的型のＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、標的ＣＥＡタンパク質の濃度を判定する。あるいは、試料、例えば、血液試料が、患者から採取され、完全長および／または短型ＣＥＡをコードするＲＮＡの濃度を分析する。
【０４４０】
患者は、標的ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する癌治療薬、ＭＥＤＩ−５６５で治療される。任意に、ＣＥＡ発現に対して特異的ではない、外科手術、化学療法、および放射線療法等の治療法を含む、治療法の組み合わせが、治療において使用される。治療後の血液試料は、患者から採取され、他の非標的型のＣＥＡタンパク質の濃度を検出することなく、標的ＣＥＡタンパク質の濃度について試験される。標的ＣＥＡタンパク質の濃度は、同一の患者からの治療前の標的ＣＥＡタンパク質濃度と比較される。
【０４４１】
標的ＣＥＡタンパク質濃度の変化は、療法の有効性を示すことが期待される。
【０４４２】
標的ＣＥＡタンパク質に免疫特異的に結合する癌治療薬に対して感受性があると判定された患者の診断用モニタリングは、治療後の様々な期間で（特定の治療後あるいは全レジメンの締結後のいずれか）、標的ＣＥＡ濃度の検出に基づいた診断方法を用いるものである。例えば、診断用モニタリングは、標的ＣＥＡに免疫特異的に結合する抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子を用いるものである。ある実施形態において、診断用抗体、抗原結合フラグメント、または免疫グロブリン様分子は、癌治療薬として、標的ＣＥＡ上の同一または実質的に同一のエピトープに免疫特異的に結合する。
【０４４３】
特定型のＣＥＡを発現する癌に応じて、標的ＣＥＡ濃度は、他の流体の試料を採取することによってモニタリングすることができる。例えば、特に、結腸癌および直腸癌については、治療前、治療中、および／または治療後に、血液  糞便試料を採取し、使用して、ＣＥＡ濃度をモニタリングすることができる。さらなる例として、肺癌については、痰試料を、同様に使用することができる。
【０４４４】
参照文献
2013512454.tif 000058
【０４４５】
配列
配列番号１−短型ヒトＣＥＡ（プロ配列を含む）
2013512454.tif 000059
【０４４６】
太字および下線を引いた位置が、多型を示すため、その位置での残基は、ＥあるいはＫのいずれか（両方ではない）であり得ることに留意されたい。
【０４４７】
配列番号２−成熟完全長ＣＥＡ
2013512454.tif 000060
【０４４８】
太字および下線を引いた位置が、多型を示すため、その位置での残基は、ＥあるいはＫのいずれか（両方ではない）であり得ることに留意されたい。
【０４４９】
配列番号３−ＣＥＡ欠失変異体Ｄｅｌ１−３
2013512454.tif 000061
【０４５０】
配列番号４−ＣＥＡ欠失変異体Ｄｅｌ１
2013512454.tif 000062
【０４５１】
配列番号５−ＣＥＡ欠失変異体Ｄｅｌ２
2013512454.tif 000063
【０４５２】
配列番号６−ＣＥＡ欠失変異体Ｄｅｌ３
2013512454.tif 000064
【０４５３】
配列番号７−ＣＥＡ欠失変異体Ｄｅｌ４−５
2013512454.tif 000065
【０４５４】
配列番号８−ＣＥＡ短縮型変異体ＩｇＣ３＿ＧＰＩ
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【０４５５】
配列番号９−ＣＥＡ短縮型変異体ＩｇＣ５＿ＧＰＩ
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【０４５６】
配列番号１０−完全長ヒトＣＥＡ（プロ配列を含む）
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【０４５７】
太字および下線を引いた位置が、多型を示すため、その位置での残基は、ＥあるいはＫのいずれか（両方ではない）であり得ることに留意されたい。
【０４５８】
参照による引用
本明細書で言及されるすべての刊行物および特許は、あたかも個々の刊行物または特許出願書が具体的かつ個別に示され、参照することにより組み込まれているかのように、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０４５９】
対象開示の特定の実施形態が論じられているが、上の明細書は、例示的なものであり、限定されるものではない。本開示の多くの変形は、本明細書および以下の特許請求の範囲の概説の際、当業者には明らかであろう。本開示の全範囲は、特許請求の範囲をそれらの同等物の全範囲と共に、および本明細書をそのような変形と共に参照することにより決定されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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