(57)【要約】  ヒトＣＤ１３３と特異的に結合するモノクローナル抗体、及びこれらの一本鎖可変断片は、本明細書で開示される。また、ヒトＣＤ１３３と特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、本明細書で開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイブリドーマクローン７として同定される、ハイブリドーマ。
【請求項２】
ハイブリドーマクローン７により産生される、モノクローナル抗体。
【請求項３】
ハイブリドーマクローン７により産生されるモノクローナル抗体の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）。
【請求項４】
配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、又は配列番号５８のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のｓｃＦｖ。
【請求項５】
前記ｓｃＦｖが、配列番号５８のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のｓｃＦｖ。
【請求項６】
配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、又は配列番号５８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
単離されたポリヌクレオチドが、配列番号５８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列含む、請求項６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
単離されたポリヌクレオチドが、配列番号５７の核酸配列を含む、請求項７に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項２に記載のモノクローナル抗体を含む組成物。
【請求項１０】
請求項３〜５のいずれか一項に記載のｓｃＦｖを含む組成物。
【請求項１１】
請求項２に記載のモノクローナル抗体；又は
請求項３〜５のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ；
を含む標的部分；及び
細胞溶解毒素の治療的に活性な部分を含む毒素部分
を含む、融合ポリペプチド。
【請求項１２】
毒素部分が脱免疫化される、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１１に記載の第一の融合ポリペプチド；及び
請求項１１に記載の第二の融合ポリペプチド；又は
癌幹細胞により異なるように発現される第二のマーカーと特異的に結合する、モノクローナル抗体若しくはこれらのｓｃＦｖを含む融合ポリペプチド
を含む、第二の融合ポリペプチド
を含む、組成物。
【請求項１４】
癌幹細胞により異なるように発現される少なくとも一つのマーカーが、ＣＤ１３３を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
癌幹細胞により異なるように発現される少なくとも一つのマーカーが、ＥＧＦＲを含む、請求項１３又は１４に記載の組成物。
【請求項１６】
斯かる治療を必要とする対象に、治療的に有効量の以下：
請求項２に記載のモノクローナル抗体；
請求項３〜５のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ；
請求項１１又は１２に記載の融合ポリペプチド；又は
請求項９、１０、又は１３〜１５のいずれか一項に記載の組成物
を投与すること
を含む、方法。
【請求項１７】
モノクローナル抗体と結合したナノ粒子を更に含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１８】
ｓｃＦｖと結合したナノ粒子を更に含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項２に記載のモノクローナル抗体、又は
請求項３〜５のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ
と結合する検出可能なマーカーを含む、組成物。
【請求項２０】
請求項１９に記載の組成物と、ＣＤ１３３を発現する少なくとも一つの細胞とを接触させること；及び
ＣＤ１３３を発現する少なくとも一つの細胞と特異的に結合する組成物の少なくとも一部を含む複合体を検出すること
を含む、方法。
【請求項２１】
前記接触させることが、ＣＤ１３３を発現する癌幹細胞を含む組成物を対象に投与することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＣＤ１３３を発現する少なくとも一つの細胞と特異的に結合する組成物の少なくとも一部を含む複合体を検出することが、対象が新生物状態を有するか、あるいはリスクを有することを示す、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１０年５月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／３４８，３４８号、及び２０１０年１０月５日に出願された米国仮特許出願第６１／３９０，０１１号に対する優先権を主張し、これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【背景技術】
【０００２】
背景
癌細胞は、正常細胞と同様に分化する。腫瘍細胞集団は、あまり分化していない、自己複製する腫瘍イニシエーティング幹細胞の比較的小さいコホート、及びより分化した腫瘍細胞の比較的大きいコホートを含む。より分化した細胞は、化学療法により影響を受けやすく、あまり分化していない癌幹細胞のごく一部は、より薬物耐性を有し、従って、薬物耐性再発に起因する。ＣＤ１３３は、癌幹細胞についての確立されたマーカーである。
【０００３】
ヒトＣＤ１３３は、造血幹細胞、神経幹細胞のマーカーとして、結腸癌及び神経膠芽腫を含む多くの癌における腫瘍イニシエーティング細胞集団の富化のために用いられる細胞表面糖タンパク質である（Kemper et al.; Weigmann et al, 1997; Yin et al., 1997）。抗ＣＤ１３３抗体は、これらの幹細胞集団の同定、単離、及び標的化に有用な重要なツールである。多くのＣＤ１３３抗体は、市販されているが、これらは、いくつかの制限を有する。第一に、最も広く用いられている抗ＣＤ１３３モノクローナル抗体は、はっきりと定義されていない糖化エピトープであると最初に考えられたものを認識するが（Bidlingmaier et al., 2008）、恐らくエピトープマスキングのために、分化の間、喪失する非糖化エピトープであることが近年報告されている（Kemper et al.）。いずれにしても、これらの抗体は、特定の翻訳後修飾されたＣＤ１３３エピトープを発現する細胞を検出せず、それ故、全てのＣＤ１３３発現を決定するために用いることができない。第二に、未修飾のＣＤ１３３エピトープを標的とする市販の抗ＣＤ１３３抗体は、しばしばポリクローナルである。第三に、市販されている抗体の多くは、限定された生物学的アッセイにおける使用にのみ適している。これらの欠点を克服するために、ＣＤ１３３の非糖化エピトープを特異的に認識し、複数の生物学的アッセイに有用である新規の抗ＣＤ１３３モノクローナル抗体を作製する必要性は、存在する。
【０００４】
上皮性悪性腫瘍は、形質転換された上皮細胞の侵襲性悪性腫瘍である。最も致命度の高い癌のいくつかは、膵臓、頭頸部、前立腺、乳、結腸、及び他の臓器の薬物耐性癌を含む上皮性悪性腫瘍である。例えば、膵臓癌において、１０〜１５％の患者のみが、その侵襲性の増殖並びにリンパ節及び肝臓への転移の急速な速度のために、診断において切除可能であると発見される。全てのステージを考慮する場合、１〜４％の５年生存率を有する者の平均生存期間は、３〜６ヶ月であり、米国だけで、３２，０００人超の患者が毎年死亡している。American Cancer Societyによれば、著しく高い生存率を有する乳癌でもなお、２００７年において、４０，０００人の予測される死亡者数とともに、１７８，０００件の推定される新規症例を有する。頭頸部癌の場合、米国において、２００６年に報告された症例の４０，０００件のうち、約１１，０００人がそれらの疾患で死亡している。主な原因は薬物耐性疾患の転移性再発であり、それ故代替の薬物が早急に必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
発明の概要
一つの態様では、本発明は、ヒトＣＤ１３３と特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。態様によっては、該モノクローナル抗体は、本明細書に記載されるハイブリドーマクローン７により産生される。
【０００６】
別の態様では、本発明は、ハイブリドーマクローン７として本明細書において同定されるハイブリドーマを提供する。
【０００７】
別の態様では、本発明は、ハイブリドーマクローン７により産生されるモノクローナル抗体の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を提供する。態様によっては、ｓｃＦｖは、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、又は配列番号５５のアミノ酸配列を含む。一つの特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号５３のアミノ酸配列を含む。
【０００８】
別の態様では、本発明は、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、又は配列番号５５のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。態様によっては、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号５３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。一つの特定の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号５６の核酸配列を含む。
【０００９】
別の態様では、本発明は、融合ポリペプチドを提供する。一般的に、融合ポリペプチドは、標的部分及び毒素部分を含む。標的部分は、癌幹細胞により異なるように発現されるマーカーと特異的に結合する本明細書に記載されるモノクローナル抗体又はそのｓｃＦｖを含み得る。態様によっては、毒素部分は、細胞溶解毒素の脱免疫化された治療的に活性な部分を含み得る。
【００１０】
別の態様では、本発明は、今述べたように複数の融合ポリペプチドを含む組成物を提供する。態様によっては、組成物は、第一の融合ポリペプチド及び第二の融合ポリペプチドを含み、ここで第一の融合ポリペプチドは、癌幹細胞により異なるように発現される第一のマーカーと特異的に結合し、第二の融合ポリペプチドは、癌幹細胞により異なるように発現される第二のマーカーと特異的に結合する。一つの実施形態では、一つの融合ポリペプチドは、ＣＤ１３３と特異的に結合してもよく、別の融合ポリペプチドは、ＥＧＦＲと特異的に結合してもよい。
【００１１】
別の態様では、本発明は、モノクローナル抗体又はそのｓｃＦｖがナノ粒子と結合し得る組成物を提供する。特定の実施形態では、ナノ粒子は、生分解性でもよい。特定の実施形態では、ナノ粒子は、細胞溶解毒素を含んでもよい。
【００１２】
別の態様では、本明細書に記載されるモノクローナル抗体又はそのｓｃＦｖを含む治療的有効量の組成物を、斯かる治療を必要とする対象に投与することを含む、治療方法を提供する。態様によっては、モノクローナル抗体又はそのｓｃＦｖは、治療的部分と融合してもよく、治療的化合物を含むナノ粒子と結合してもよい。
【００１３】
別の態様では、本発明は、検出可能なマーカーと結合した本明細書に記載されるモノクローナル抗体又はそのｓｃＦｖを含む組成物を提供する。
【００１４】
更に別の態様では、本発明は、癌幹細胞マーカーを発現する細胞を検出する方法を提供する。一般的に、該方法は、ＣＤ１３３を発現する少なくとも一つの細胞と、検出可能なマーカー及び結合した本明細書に記載されるモノクローナル抗体又はそのｓｃＦｖを含む組成物とを接触させる、細胞と特異的に結合する組成物の部分を検出することを含む。態様によっては、組成物は対象に投与されてもよい。
【００１５】
本発明の上記の概要は、それぞれ開示される各々の実施形態や本発明の全ての実施を記載することを意図しない。以下の記載は、実例する実施形態をより具体的に、例証する。本願中いくつかの箇所において、例の一覧を介してガイダンスが提供され、その例は様々な組み合わせで用いられ得る。それぞれの例において、引用されたリストは代表的なグループとしてのみ役割を果たし、排他的なリストとして解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１：ワクチン接種に用いられたＣＤ１３３抗原。ＣＤ１３３タンパク質のトポロジー地図（パネルＡ）及びアミノ酸配列（パネルＢ、配列番号ｌ）。パネルＢで下線を引かれている配列番号ｌのアミノ酸残基１８０〜３８０及び６１２〜７６５からなる組み換えキメラＣＤ１３３抗原（配列番号２）は、生成された。この組み換えキメラＣＤ１３３抗原（配列番号２）は、細菌的に発現され、精製され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより４５ｋＤａの分子量を有することが示された（パネルＣ）。
【００１７】
【図２】図２：新規に生成されたＣＤ１３３ハイブリドーマの分析。ハイブリドーマクローンの上清は、ウエスタンブロット（パネルＡ）及び免疫蛍光（パネルＢ）アッセイにおいて一次抗体として試験された。免疫付与前の血清（−ｖｅ）又は免疫後の抗血清（ａ．ｓ．）は、対照として用いられた。ウエスタンブロットについては、タンパク質濃度について標準化されたＣａｃｏ−２溶解物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にロードされ、溶解され、ニトロセルロース膜上にブロットされ、ストリップに切断された。各ストリップは、同定されたハイブリドーマから上清を用いてプローブされた。レーン１における膜は、市販の抗体（ａｂ１９８９８，Ａｂｅａｍ）を用いてプローブされ、更なる陽性対照として役割を果たした。免疫蛍光については、Ｃａｃｏ−２細胞は、固定され、ハイブリドーマ上清で免疫染色された。市販の抗体（２９３Ｃ３，Ｍｉｌｉｔｅｎｙｉ）は、更なる陽性対照として用いられた。パネル中のスケールバーは、２００マイクロメーターを表す。ハイブリドーマクローン７の上清は、一次性神経膠芽腫及び腎組織の免疫組織化学的分析に用いられた（パネルＣ）。
【００１８】
【図３】図３：ハイブリドーマクローン７により産生された抗体の特異性。（Ａ）フローサイトメトリー。細胞は、ハイブリドーマクローン７又は２９３Ｃ３（Ｍｉｌｉｔｅｎｙｉ）のいずれかからの一次抗体とインキュベートされ、続いて標識された二次抗体とインキュベーションされ、その後フローサイトメトリーにより分析された。新規に開発された抗ＣＤ１３３ハイブリドーマクローン７からの抗体（中空の黒色ヒストグラム）は、ＣＤ１３３過剰発現細胞であるＣａｃｏ−２（ｉｉｉ）、ＧＢＭ６（ｉｖ）、及びＣＤ１３３で形質導入されたＵ８７細胞（ｉｉ）を特異的に染色するが、ＣＤ１３３陰性Ｕ８７細胞（ｉ）は染色しなかった。ハイブリドーマクローン７により産生されたモノクローナル抗体を用いた免疫染色は、クローン２９３Ｃ３（中空の灰色ヒストグラム）と比較される。アイソタイプ対照は、塗りつぶされた灰色ヒストグラムにより表される。（Ｂ）ツニカマイシンに仲介される糖化阻害。Ｃａｃｏ−２細胞は、３日間、増加する用量のツニカマイシン（２．５、５、１０、２０μｇ／ｍｌ）で処理された。ＤＭＳＯ処理された細胞、又は未処理の細胞は、対照として役割を果たした。細胞は溶解され、その後ハイブリドーマクローン７により産生されたモノクローナル抗体又はＧＡＰＤＨ抗体を用いたウェスタンブロッティングにより分析された。
【００１９】
【図４】図４：ＣＤ１３３ｓｃＦＶは、ＣＤ１３３マーカーを認識する。ＣＤ１３３ｓｃＦｖは、ＦＩＴＣで標識された。オリゴヌクレオチドは、ＣＤ１３３の既知のＧｅｎＢａｎｋ配列から調製され、その後ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）−ＤＮＡ複合体を用いてＨＥＫ２９３−ＴＬＲ２細胞にトランスフェクトされた。細胞は、抗ＣＤ１３３ｓｃＦｖ−ＦＩＴＣ複合体とインキュベートされ、洗浄され、その後フローサイトメトリーにより分析された。データは、％陽性細胞が蛍光強度に対してプロットされることによる、標準的なヒストグラム形式で表される。ＣＤ１３３でトランスフェクトされた細胞のみが、ＦＩＴＣ標識されたＣＤ１３３ｓｃＦｖと反応した。対照は、空ベクターと反応されるトランスフェクトされた細胞、アイソタイプ対照と反応されるトランスフェクトされた細胞、又はＣＤ１３３−ＦＩＴＣと反応されないトランスフェクトされていない細胞を含む。
【００２０】
【図５】図５：脱免疫化されたＣＤ１３３ＫＤＥＬ遺伝子は、末端ＫＤＥＬ配列を用いて、下流のＰＥ３８とスプライスされた抗ＣＤ１３３ｓｃＦＶからなる。
【００２１】
【図６】図６：生存率が培養された細胞において毎日測定される、トリパンブルー生存率アッセイ。ＵＭＳＣＣ−１１Ｂ頭頸部癌細胞は、ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬ（ＣＤ１３３ＫＤＥＬ）又は対照の抗Ｂ細胞標的毒素ＣＤ２２ＫＤＥＬのいずれかで処理された。
【００２２】
【図７】図７：ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬ融合タンパク質は、腫瘍幹細胞の特徴である腫瘍イニシエーションを防ぐ。分類された細胞がヌードマウスの脇腹に注射される腫瘍イニシエーションアッセイ。グラフは、成長する腫瘍についての腫瘍成長の速度を示す。Ｐ値は分類された群及び分類されていない（対照）群間の有意性を示す。
【００２３】
【図８】図８：時間に亘る、培養されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に関するｄＣＤ１３３ＫＤＥＬの効果を測定するトリパンブルー生存率アッセイ。ＮＴＲ−未処理。
【００２４】
【図９】図９：全身性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍を有するマウスにおける、腫瘍進行に関するｄＣＤ１３３ＫＤＥＬの効果。全身性腫瘍は、脾臓内注射による２百万個の細胞を与えることにより、ヌードマウスにおいて誘導された。マウスの処置は、ｄＣＤｌ３３ＫＤＥＬでの腫瘍接種の６日後に開始された。一回の処置は、１日おきに（ＭＷＦ）与えられる２０μｇの薬物の注射からなり、マウスは、６回の処置を受けた。動物は、毎週撮影された。生物発光強度は、光子／秒／ｓｒ／ｃｍ2の関数として測定された。対照は未処置であった。
【００２５】
【図１０】図１０：ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬ、ｄＥＧＦ４ＫＤＥＬ、又は双方の混合物で処置されたマウスにおける腫瘍進行の生物発光分析。
【００２６】
【図１１】図１１：3Ｈ−チミジン摂取アッセイは、変異導入された形態（２２１９ＡＲＬＫＤＥＬ  ７ｍｕｔ、バッチ１、バッチ２、バッチ３）、及び変異導入されていない形態（２２１９ＡＲＬＫＤＥＬ（親））をＤａｕｄｉ細胞と比較した場合、活性損失が無いことを示す。細胞死滅は、３バッチの変異導入された薬物、及び１バッチの変異導入されていない薬物について、４８時間後、同じであった。
【００２７】
【図１２】図１２：正常なマウスの群は、変異導入した、又はしていない薬物で毎週免疫付与された。動物は、血液採取され、血清は、ＥＬＩＳＡを用いて、抗毒素抗体について毎週試験された。値は平均され、その後スチューデントのＴ試験により分析された。曲線は、有意に異なった（ｐ＜０．０５）。
【００２８】
【図１３】図１３：一定量の２２１９ＫＤＥＬの死滅を中和するための、図１２におけるマウスからの血清サンプルの能力。血清は、４匹の２２１９ＫＤＥＬ７ｍｕｔ−免疫付与マウス、及び２匹の変異導入されていない２２１９ＤＥＬで免役付与されたマウスから採取され、その後、０．２ｎＭ  ２２１９ＫＤＥＬとインキュベートされた。２２１９ＫＤＥＬ  ｍｕｔ７マウスからの血清は、２２１９ＤＥＬによる細胞死滅を妨害しなかった。
【００２９】
【図１４】図１４：全身性Ｂ細胞疾患を有するマウスは、変異導入された２２ｌ９ＫＤＥＬ  ７ｍｕｔで処置された。これらの８０％は、無病で生存した。対照は全て死亡した。
【００３０】
【図１５】図１５：免疫応答性Ｂ６マウス（ｎ＝５／群）は、ＥＧＦＡＴＦＫＤＥＬ  ７ｍｕｔ及び脱免疫していないＥＧＦＡＴＦＫＤＥＬで毎週免疫付与された。血清は、毎週採取され、抗毒素（ＰＥ）レベルは、感度の高いＥＬＩＳＡアッセイで測定された。応答は、著しく阻害された。
【００３１】
【図１６】図１６：ＭｉａＰａＣａ−２膵臓癌細胞に関するｄＣＤ１３３ＫＤＥＬの効果。ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬは、3Ｈ−ロイシン取り込みタンパク質合成アッセイを用いて、細胞株に関して試験された。ＣＤ３ＣＤ３ＫＤＥＬは陰性対照として含まれた。ｄＥＧＦ４ＫＤＥＬは、この細胞株上での高いＥＧＦＲ発現により、陽性対照として含まれた。データは、培地単独でインキュベートされた対照細胞と比較した3Ｈ−ロイシン取り込みの百分率として表される。
【００３２】
【図１７】図１７：ＮＡ頭頸部癌細胞に関するｄＣＤ１３３ＫＤＥＬの効果。ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬは、3Ｈ−ロイシン取り込みタンパク質合成アッセイを用いて、ＮＡ細胞株に関して試験された。ＣＤ３ＣＤ３ＫＤＥＬは陰性対照として含まれた。ｄＥｐＣＡＭ２３は、この細胞株上での高いＥｐＣＡＭ発現により、陽性対照として含まれた。データは、培地単独でインキュベートされた対照細胞と比較した3Ｈ−ロイシン取り込みの百分率として表される。
【００３３】
【図１８】図１８：抗マウスＩｇＧがＣＤ１３３抗体−結合ナノ粒子と結合するが（レーン３）、結合していないナノ粒子（レーン２）とは結合しないことを示すウエスタンブロット。
【００３４】
【図１９】図１９：ＣＤ１３３抗体と結合した（ｃ）又は結合していない（ｂ）、６−クマリンでロードされたＰＬＧＡ粒子のフローサイトメトリーデータ。
【００３５】
【図２０】図２０：ＣＤ１３３−免疫粒子を用いたＣａｃｏ−２細胞の蛍光免疫染色。
【００３６】
【図２１】図２１：Ｃａｃｏ−２細胞溶解物のＣＤ１３３結合ナノ粒子（ＣＤ１３３−ＮＰ）及び非結合ナノ粒子（ＮＰ）含量。Ｃａｃｏ−２細胞は、ＣＤ１３３結合ナノ粒子の優れた摂取を示した。
【００３７】
【図２２】図２２：ヒト頭頸部側腹部腫瘍を有するヌードマウスにおける、インビボ腫瘍進行に関するｄＣＤ１３３ＫＤＥＬの効果。Ａ）腫瘍の容量は、キャリパーで測定された。Ｂ）時間に亘る、処置された（ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬ処置）及び未処置（ＰＢＳ処置）のマウスの生物発光画像。
【００３８】
【図２３】図２３：ヒト頭頸部側腹部腫瘍を有するヌードマウスにおける、インビボ腫瘍進行に関するｄＣＤ１３３ＫＤＥＬの効果。時間に亘る、処置された（ＣＤ１３３ＫＤＥＬ）、未処置の（未処置）、及び対照の（ＣＤ１９ＫＤＥＬ）マウスの生物発光画像。
【００３９】
【図２４】図２４：ｓｃＦｖＣＤ１３３−ＫＤＥＬで処置された、ヒト神経膠芽腫異種移植を有するｎｕ／ｎｕマウスにおける、腫瘍進行を示す写真。Ａ）ヒト神経膠芽腫細胞の腹腔内注射の７日後の腫瘍シグナル前処置；Ｂ）ｓｃＦｖＣＤ１３３−ＫＤＥＬでの処置の１４日後の腫瘍シグナル。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
例証的な実施形態の詳細な説明
本発明は、癌幹細胞により異なるように発現される特定のマーカーと特異的に結合する、モノクローナル抗体及びそれらの断片の発見を活用する組成物及び方法を提供する。本明細書に記載される組成物及び方法は、モノクローナル抗体（及びそれらの断片）が癌幹細胞の集団を標的とするので、癌の特定の形態の検出及び治療のための更なる選択肢を提供し得る。これは、癌の特定の形態の早期検出を可能にし、及び／又は腫瘍細胞の小さいが増殖性のサブ集団を標的化することにより有効的な治療を提供し得る。
【００４１】
以下の開示を通して、以下の用語は示された意味を有する：
「異なるように発現される」とは、別の細胞種類によるマーカーの発現と比較して、癌幹細胞により異なる程度に発現されるマーカーの特徴を意味する。場合によっては、異なる発現は、マーカーが、別の細胞種類よりも、癌幹細胞により著しい程度でまで発現されるものでもよい。特定の場合では、マーカーは、癌幹細胞により発現され得るが、癌幹細胞以外の細胞種類において検出可能なレベルで発現されない。
【００４２】
「部分」及びそのバリエーションとは、特定の特性、例えば特定の生物学的又は化学的機能（例えば、標的特異性又は細胞溶解活性）を示す化合物の部分を意味する。
【００４３】
「ポリペプチド」とは、ペプチド結合により連結されたアミノ酸のポリマーを意味する。従って、例えば、ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、及び酵素なる用語は、ポリペプチドの定義内に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば糖化、アセチル化、リン酸化等を含む。ポリペプチドなる用語は、任意の特定の最小長または最大長のアミノ酸のポリマーを含まない。ポリペプチドは、天然源から直接単離されてもよく、又は組み換え、酵素、又は化学的技術を用いて調製され得る。
【００４４】
「特異的」及びそのバリエーションとは、特定の対象に対して、任意の程度で、異なる又は一般的（即ち非特異的）でない親和性を有することを意味する。
【００４５】
「治療的」及びそのバリエーションとは、治療、又は１若しくはそれ以上の現存する症候若しくは症状に関連する臨床兆候を改善する部分を意味する。「改善する」とは、程度、重症度、頻度、及び／又は特定の症状の症候若しくは臨床兆候特徴の可能性の任意の減少を意味する。「兆候」又は「臨床兆候」とは、患者以外のものにより発見され得る特定の状態に関する客観的な身体的発見を意味する。「症候」とは、任意の主観的な、疾患又は患者の状態の証拠を意味する。
【００４６】
用語「及び／又は」は、を意味する。１若しくは全ての列挙された要素、又は任意の２若しくはそれ以上の列挙された要素の組み合わせを意味する。
【００４７】
用語「含む」及びそのバリエーションとは、これらの用語が該記載及び請求項に見られる場合、限定的な意味を有さない。
【００４８】
他に特に定めのない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び「少なくとも一つ」は、互換的に用いられ、１又は１超を意味する。
【００４９】
本明細書においてもまた、端点による数値範囲の列挙は、その範囲内に含まれる全ての数字を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５等を含む）。
【００５０】
現在入手可能なＣＤ１３３抗体の意義深い不都合点は、それぞれの抗体が特定の種類のイムノアッセイについてのみ好適である点であり、幅広い技術について、複数の抗体の使用が要求される。ここで、我々は、ウェスタンブロッティング、免疫蛍光、免疫組織化学、及びフローサイトメトリー用途においてＣＤ１３３抗原を認識する新規抗ＣＤ１３３モノクローナル抗体を報告する。我々の研究において、ハイブリドーマの予備スクリーニングは、ＥＬＩＳＡにより達成され、ハイブリドーマクローン７が、ＥＬＩＳＡ用途に潜在的に用いられ得ることを示した。加えて、我々は、ハイブリドーマクローン７抗体の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をクローン化している。
【００５１】
第二に、現在のＣＤ１３３抗体の関連する制限は、最も一般的に用いられる抗ＣＤ１３３抗体、例えばＡＣ１３３及び２９３Ｃ３が、糖化されたＣＤ１３３エピトープであると報告されていることを認識することである（Bidlingmaier et al., 2008で論じられる）。あるいは、他方では、これらが糖化されたエピトープよりもむしろ、タンパク質折り畳み変化のために、糖化の結果として隠されるエピトープであることが提案されている。恐らく、驚くことではないが、増加した腫瘍イニシエーション及び自己複製能力を有する細胞について濃縮するための、これらの糖化依存性ＣＤ１３３抗体を用いて分類された細胞の能力に関する大議論が存在している。多くの報告は、排他的な腫瘍イニシエーション潜在力を有するＣＤ１３３+細胞を記述しているが、多くの矛盾する研究は、ＣＤ１３３-細胞がまた、異種移植アッセイにおいて腫瘍をイニシエ−トすることを記述している（Bidlingmaier et al., 2008）。場合によっては、いわゆる「ＣＤ１３３-細胞」は、ＡＣ１３３／２９３Ｃ３エピトープを喪失しているＣＤ１３３+細胞である。実際、結腸腫瘍イニシエーティング細胞の分化は、ＣＤ１３３ｍＲＮＡの安定的なレベルにも関わらず、ＡＣ１３３エピトープ、腫瘍形成能、及びクローン形成能の喪失により達成され得る。
【００５２】
糖化依存性（例えば、ＡＣ１３３、２９３Ｃ３）及び糖化独立性（例えばハイブリドーマクローン７）ＣＤ１３３抗体の組み合わされた使用は、ＣＤ１３３発現における変化からＣＤ１３３糖化における変化を識別するための極めて強力なツールとなり得る。これは、表面マーカー、例えばＣＤ１３３に基づいて分類された細胞を用いて、癌幹細胞仮説を試験するための取り組みにおいて、利用し得る特徴であり得る。糖化及び非糖化エピトープについてのハイブリドーマクローン７の例証された反応性は、分化状態に関わらずＣＤ１３３+癌細胞に対する標的治療に有用であることを示す。
【００５３】
ＣＤ１３３タンパク質のアミノ酸残基１８０〜３８０及び６１２〜７６５からなる組み換えキメラ抗原は、ＣＤ１３３の報告されている構造（Shmelkov et al., 2005）に基づいて設計された（図１Ａ、図１Ｂ）。Ｈｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓ抗原分析プロット、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性親水性指標（hydropathy）特性、及びＥｍｉｎｉ表面確率分析は、疎水性の、非特異的な、弱い免疫原性領域を同定及び避けるために、用いられた。組み換え抗原は、大腸菌で発現され、精製され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された。（図１Ｃ）。精製されたタンパク質は、４５ｋＤａの分子量を有し、それは予測された分子量と一致した。
【００５４】
精製された抗原は、標準的なハイブリドーマ技術を用いて、モノクローナル抗ＣＤ１３３抗体の産生のために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに注入された。得られたハイブリドーマクローンからの細胞培養上清は、ＥＬＩＳＡにより、組み換えＣＤ１３３に対する抗体の産生のためにスクリーニングされた。２ラウンドのスクリーニング後、抗ＣＤ１３３抗体を分泌する１１個の陽性の安定的なハイブリドーマクローンは、得られた。
【００５５】
我々は、ＣＤ１３３+Ｃａｃｏ−２細胞を用いたウエスタンブロット、及び免疫蛍光アッセイにより、スクリーニングされたハイブリドーマを確認し、それは、ハイブリドーマクローン７及びハイブリドーマクローン１７のみの上清とともに、ＣＤ１３３の予測された分子量に対応する明確なバンドを示した（図２Ａ）。免疫蛍光アッセイでは、しかしながら、ハイブリドーマクローン７、ハイブリドーマクローン１５、及びハイブリドーマクローン１６からの上清は、しっかりとＣａｃｏ−２細胞膜を染色した一方で、ハイブリドーマクローン９、及びハイブリドーマクローン１３からの上清は、弱い染色を提供した（図２Ｂ）。
【００５６】
ハイブリドーマクローン７は、双方のアッセイにおいてＣＤ１３３エピトープの認識に有効的であるので、我々は、更なる特徴付け、及び他の用途におけるその使用を試験するために、それを選択した。ヒト神経膠腫、及び腎臓組織部分の免疫組織化学的分析において、ハイブリドーマクローン７は、膜特異的染色をもたらした（図２Ｃ）。染色は、腎臓部分において、鮮明且つ均一であり、神経膠腫組織においてより不均一であった。
【００５７】
我々は、次に、ＣＤ１３３に対するハイブリドーマクローン７の特異性を決定した。ＣＤ１３３low/-Ｕ８７細胞は、ヒトＣＤ１３３ｃＤＮＡをコードする発現プラスミドを用いてトランスフェクトされ、ハイブリドーマクローン７又は市販のＣＤ１３３抗体（２９３Ｃ３）のいずれかを用いて染色され、フローサイトメトリーにより分析された。適切なアイソタイプ抗体及び疑似的にトランスフェクとされたＵ８７細胞は、対照として用いられた。ハイブリドーマクローン７及び２９３Ｃ３抗体は、トランスフェクとされていないＵ８７細胞を著しく染色しなかった（図３Ａ（ｉ）及び図３Ａ（ｉｉ））。対照的に、双方の抗体は、ＣＤ１３３でトランスフェクトされた細胞を標識し、ＣＤ１３３についてハイブリドーマクローン７の特異性を示した。次に、ハイブリドーマクローン７は、ＣＤ１３３様２９３Ｃ３抗体を内生的に発現するＣａｃｏ−２及びＧＢＭ６細胞を免疫染色し得た（図３Ａ（ｉｉｉ）及び図３Ａ（ｉｖ））。
【００５８】
次に、我々は、ハイブリドーマクローン７が糖化エピトープを認識するかどうかを決定した。Ｃａｃｏ−２細胞は、ウエスタンブロット分析の前に、十分に立証されているタンパク質糖化阻害剤であるツニカマイシン（Tkacz and Lampen, 1975; Lehle and Tanner, 1976）で処理された。ツニカマイシン処理されたサンプルでは、糖化されたＣＤ１３３タンパク質に対応する１３０ｋＤａのバンド、及び非糖化タンパク質に由来すると考えられる９５ｋＤａのバンドが見られる。対照的に、対照サンプルにおいて、糖化ＣＤ１３３バンドのみが見られた。１３０ｋＤａのバンドは、高用量のツニカマイシン、及び続いて延長した処理されたサンプルにおいてさえ存在し、これらの細胞におけるＣＤ１３３糖化の不完全な阻害を示す。高用量のツニカマイシンは、ＧＡＰＤＨバンドの減少からの証拠のように、明らかな細胞毒性をもたらす。これらの結果は、ハイブリドーマクローン７が非糖化エピトープと特異的に結合することを強く示す。
【００５９】
次に、ハイブリドーマクローン７は、ハイブリドーマクローン７により産生されるＣＤ１３３特異的モノクローナル抗体のｓｃＦｖをクローン化するために用いられた。最初に、マウスｓｃＦｖライブラリーは、ハイブリドーマクローン７由来のＲＮＡを用いて構築された。全ＲＮＡ精製及び第一鎖ｃＤＮＡ合成の後、ｓｃＦｖをコードする遺伝子レパートリーは、増幅された（実施例１０）。ＶＨ及びＶＬ遺伝子プールは、合成されたｃＤＮＡから分離して増幅された。ｓｃＦｖ遺伝子は、オーバーラップＰＣＲを用いてＶＨ及びＶＬ断片を融合することにより、ランダムに組み立てられた。ｓｃＦｖｃＤＮＡ及びベクターは、単一の、まれに切断する制限エンドヌクレアーゼであるＳｆｉＩにより消化された。ライゲーション後、組み換え構築物は、エレクトロコンピテント大腸菌ＸＬＩ−ＢＬＵＥに形質転換された。一晩インキュベーション後、増幅された組み換えファージミドは、宿主細菌から抽出された。ライブラリー構築は、一回の形質転換のみにより達成され、１．０ｘ１０7の理論的サイズを有した。
【００６０】
標準的なパンニングは３ラウンド行なわれ、その後、３０個のランダムに選択されたコロニーは、ファージＥＬＩＳＡを用いて、ＣＤ１３３に対するそれらの反応性についてアッセイされた。９つの陽性クローンは、同定され、それぞれは、ｓｃＦｖ：配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、及び配列番号５５を産生する。ＤＮＡ配列決定は、９個のＣＤ１３３−特異的クローンのうちの５個が同一であることを示し、それらが、全て、単一のハイブリドーマクローン７に由来することを強く示す。
【００６１】
組み換えクローン１１（配列番号５３をコードする）は、発現のために大腸菌Ｔｏｐ  １０Ｆ’への形質転換のために選択された。そのプロセスにおいて、組み換えクローン１１は、クローンによりコードされるｓｃＦｖポリペプチドが、Ｎ末端のアミノ酸及びＣ末端のアミノ酸の欠失を有するように、５’末端及び３’末端の双方において切断された。クローン化されたコーディング配列は配列番号５７に反映され、コードされたｓｃＦｖポリペプチドは配列番号５８に反映される。配列番号５３と比較して、配列番号５８は、Ｎ末端において６個のアミノ酸、及びＣ末端において１６個のアミノ酸が切断される。配列番号５８はまた、Ｎ末端において、クローニングプロセスの人為的な結果であるメチオニンを有する。
【００６２】
ｓｃＦｖ（配列番号５８）の可溶性発現は、大腸菌分泌機構を用いて達成され、低温（３０℃）において誘導される。発現されたｓｃＦｖ（配列番号５８）は、培養培地及び大腸菌のペリプラズム空間に主に発見される。
【００６３】
可溶性ｓｃＦｖＥＬＩＳＡは、ＣＤ１３３に対する結合特異性を確かめるために行なわれた。培養培地及びペリプラズム空間の双方に存在する組み換えクローン１１ｓｃＦｖ（配列番号５８）は、ヒトＣＤ１３３に特異的であった。
【００６４】
従って、一つの態様では、本発明は、本明細書の記載に従って、ハイブリドーマクローン７により産生されたモノクローナル抗体のｓｃＦｖを提供する。本明細書に用いられるように、ハイブリドーマクローン７により産生されたモノクローナル抗体のｓｃＦｖは、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５８のいずれか一つを含むポリペプチド、又は配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５８のいずれか一つを含む参照ポリペプチドと構造的に類似するポリペプチドを含み得る。
【００６５】
一つの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号５３のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ｓｃＦｖは、参照ポリペプチドと構造的に類似するポリペプチドであり、参照ポリペプチドは配列番号５３のアミノ酸配列を含む。
【００６６】
別の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ｓｃＦｖは、参照ポリペプチドと構造的に類似するポリペプチドであり、参照ポリペプチドは配列番号５８のアミノ酸配列を含む。
【００６７】
ポリペプチドのアミノ酸配列が参照ポリペプチドと比較して一定程度の同一性を有する場合、本明細書で用いられるように、ポリペプチドは、参照ポリペプチドに対して「構造的に類似する」。二つのポリペプチドの構造的類似性は、それらの配列の長さに亘り、同一のアミノ酸の数を最適化するために、二つのポリペプチド（例えば、候補ポリペプチドと、例えば、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、又は配列番号５８のポリペプチド）の残基をアライメントすることにより、長いポリペプチドの全長にわたり決定され得る；いずれか又は双方の配列中のギャップは、同一のアミノ酸の数を最適化するために、アライメントを作成することを許容されるが、各配列中のアミノ酸は、それらの適切な順番においてそれでもなお維持されるべきである。候補ポリペプチドは、参照ポリペプチドと比較されるポリペプチドである。候補ポリペプチドは、例えば、動物から単離され得、組み換え技術を用いて生産され、又は化学的若しくは酵素的に合成され得る。
【００６８】
アミノ酸配列の対での比較分析は、ＧＣＧパッケージ（version 10.2, Madison WI）のＢＥＳＴＦＩＴアルゴリズムを用いて実行され得る。或いは、ポリペプチドは、Tatiana et al.（FEMS Microbiol Lett, 174, 247- 250 (1999)）により記載されるように、National Center for Biotechnology Information (NCBI)ウェブサイト上で利用可能であるＢＬＡＳＴ２サーチアルゴリズムのＢｌａｓｔｐプログラムを用いて比較されてもよい。全てのＢＬＡＳＴ２サーチパラメーターについて、マトリックス（matrix）＝BLOSUM62；オープンギャップペナルティー（open gap penalty）＝１１、エクステンションギャップペナルティー（extension gap penalty）＝１、ギャップｘ＿ドロップオフ（gap x_dropoff）＝５０、予測（expect）＝１０、語長（wordsize）＝３、及びフィルターオン（filter on）を含む初期値が用いられてもよい。
【００６９】
二つのアミノ酸配列の比較では、構造的類似性は、％「同一性」により言及されてもよく、又は％「相同性」により言及されてもよい。「同一性」は、長いポリペプチドの全長における同一のアミノ酸の存在を意味する。「相同性」は、長いポリペプチドの全長における同一のアミノ酸の存在ではないが、保存的置換の存在を意味する。アミノ酸についての保存的置換は、アミノ酸が属する分類の他のメンバーから選択されてもよい。例えば、特定のサイズ又は特性（例えば電荷、疎水性、及び親水性）を有するアミノ酸の群に属するアミノ酸が、特に、生物学的活性に直接関連しないタンパク質の領域においてタンパク質の活性を改変することなく別のアミノ酸に置換され得ることは、タンパク質生化学の分野においてよく知られている。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが挙げられる。正に帯電した（塩基性の）アミノ酸としては、アルギニン、リジン及びヒスチジンが挙げられる。負に帯電した（酸性の）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸が挙げられる。保存的置換としては、例えば、正電荷を維持するためにＡｒｇの代わりにＬｙｓ（逆もまた同様）；負電荷を維持するためにＡｓｐの代わりにＧｌｕ（逆もまた同様）；遊離の−ＯＨを維持するためにＴｈｒの代わりにＳｅｒ；及び遊離の−ＮＨ２を維持するためにＡｓｎの代わりにＧｌｎが挙げられる。同様に、ポリペプチドの機能的活性を取り除く１又はそれ以上の連続的な又は非連続的なアミノ酸の欠損又は付加を含む、ポリペプチドの生物学的に活性なアナログはまた、考慮される。
【００７０】
本発明のポリペプチドは、参照アミノ酸配列に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列相同性を有するポリペプチドを含み得る。
【００７１】
本発明のポリペプチドは、参照アミノ酸配列に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含み得る。
【００７２】
アミノ酸相同性又はアミノ酸同一性を評価する場合、参照アミノ酸配列は、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、又は配列番号５８のいずれか一つであり得る。従って、態様によっては、参照アミノ酸配列は、配列番号４７のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、参照アミノ酸配列は、配列番号４８のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、参照アミノ酸配列は、配列番号４９のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、参照アミノ酸配列は、配列番号５０のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、参照アミノ酸配列は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、参照アミノ酸配列は、配列番号５２のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、参照アミノ酸配列は、配列番号５３のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、参照アミノ酸配列は、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、参照アミノ酸配列は、配列番号５５のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、参照アミノ酸配列は、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。
【００７３】
一つの特定の実施形態では、参照アミノ酸配列は、配列番号５３を含む。別の特定の実施形態では、参照アミノ酸配列は、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。
【００７４】
例えば、上述のように、配列番号５８は、配列番号５３のいくらか切断されたバージョンを表すｓｃＦｖポリペプチドである。配列番号５８は２４３個のアミノ酸を有し、そのうちの２４２個は、２６３個のアミノ酸を有する配列番号５３の対応するアミノ酸と同一である。従って、配列番号５８は、配列番号５３と比較して９２％の配列同一性を有する。配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５４、又は配列番号５５のアミノ酸配列の同様の切断は、好適な機能性ポリペプチドを同様に提供する。
【００７５】
本発明のポリペプチドはまた、付加配列、例えばカラム上での補足又は抗体の使用により精製を容易にする、付加されたＣ末端又はＮ末端のアミノ酸のためのコーディング配列の付加を提供するために、設計され得る。斯かるタグとしては、例えば、ニッケルカラム上でポリペプチドの精製を可能にするヒスチジンリッチタグが挙げられる。斯かる遺伝子改変技術、及び好適な付加配列は、分子生物学の技術分野においてよく知られている。
【００７６】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載されるような、ハイブリドーマクローン７により産生されるモノクローナル抗体のｓｃＦｖをコードする単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。典型的な単離されたポリヌクレオチドとしては、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、若しくは配列番号５８のいずれか一つのアミノ酸配列、又は配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、若しくは配列番号５８のいずれか一つを含む参照ポリペプチドと構造的に類似するのポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドが挙げられる。典型的なポリヌクレオチドとしてはまた、斯かるポリヌクレオチド配列の相補鎖が挙げられる。また、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５８のいずれか一つのアミノ酸配列、又は配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、若しくは配列番号５８のいずれか一つを含む参照ポリペプチドと構造的に同様のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと標準的なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び斯かるポリヌクレオチド配列の相補鎖は本発明に含まれる。
【００７７】
また、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、若しくは配列番号５８のいずれか一つのアミノ酸配列をコードする参照ヌクレオチド配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドは本発明に含まれる。
【００７８】
態様によっては、参照ヌクレオチド配列は、配列番号５３のアミノ酸配列をコードし得る。一つの実施形態では、参照ヌクレオチド配列は、配列番号５６のヌクレオチド配列を含み得る。
【００７９】
他の実施形態では、参照ヌクレオチド配列は、配列番号５８のアミノ酸配列をコードし得る。一つの実施形態では、参照ヌクレオチド配列は、配列番号５７のヌクレオチド配列を含み得る。
【００８０】
本明細書で用いられるように、「配列同一性」とは、二つのポリヌクレオチド配列間の同一性を意味する。配列同一性は、一般的に、それらの配列の長さに亘り、同一のヌクレオチドの数を最適化するために、二つのポリヌクレオチドの残基をアライメントすることにより、決定され；いずれか又は双方の配列中のギャップは、共有するヌクレオチドの数を最適化するために、アライメントの作成において許容されるが、各配列中のヌクレオチドは、それらの適切な順番においてそれでもなお維持されなければならない。候補配列は、既知の配列と比較される配列である。例えば、二つのポリヌクレオチド配列は、Tatiana et al., FEMS Microbiol Lett., 1999;i 74: 247-250により記載され、ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/において、ワールドワイドウェブ上で利用可能である、ＢＬＡＳＴ２サーチアルゴリズムのＢｌａｓｔｎプログラムを用いて比較され得る。全てのＢＬＡＳＴ２サーチパラメーターについて、マッチについての報酬（reward for match）＝１、ミスマッチについてのペナルティ（penalty for mismatch）＝−２、オープンギャップペナルティー（open gap penalty）＝５、エクステンションギャップペナルティー（extension gap penalty）＝２、ギャップｘ＿ドロップオフ（gap x_dropoff）＝５０、予測（expect）＝１０、語長（wordsize）＝１１、及びフィルターオン（filter on）を含む、初期値が用いられてもよい。
【００８１】
ポリヌクレオチド断片はまた、本発明に含まれる。ポリヌクレオチド断片は、本明細書に記載されるように、単離されたポリヌクレオチドの部分でもよい。斯かる部分は、数百ヌクレオチド長、例えば約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、又は約８００ヌクレオチド長でもよい。或いは、斯かる部分は、約１０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド長でもよい。
【００８２】
本発明のモノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、又はポリヌクレオチドは、対象からのサンプルがＣＤ１３３を発現する細胞を有するかどうかを決定するために用いられ得る。ヒトＣＤ１３３は、造血幹細胞、神経幹細胞のマーカーとして、結腸癌及び神経膠芽腫を含む多くの癌において腫瘍イニシエーション細胞集団の富化のために、用いられる細胞表面糖タンパク質である。従って、ＣＤ１３３発現細胞の同定、局在、及び／又は定量は、サンプルが得られる対象が、ＣＤ１３３を発現する細胞により少なくとも一部において特徴付けられる症状を有する、又は発症のリスクを有するかどうかに関する情報を医師に提供してもよい。態様によっては、対象から得られる生体サンプル中でＣＤ１３３を発現する細胞を同定することは、対象が結腸癌及び／又は神経膠芽腫を有する、又は発症に関するリスクを有すことを示し得る。
【００８３】
一般的に、本発明のモノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、又はポリヌクレオチドは、対象から得られる生体サンプルの少なくとも一部と接触し得る。モノクローナル抗体又はｓｃＦｖの場合、生体サンプルとしては、ＣＤ１３３を発現する細胞、ＣＤ１３３を発現する細胞の断片、及び／又は生体サンプルにおいて細胞から少なくとも部分的に単離されるＣＤ１３３が挙げられる。ポリヌクレオチドの場合、生体サンプルとしては、例えば溶解された細胞、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及び／又はｃＤＮＡ（又は例えばＰＣＲによるｍＲＮＡ増幅の他の生成物）が挙げられる。
【００８４】
モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、又はポリヌクレオチドが、サンプル中の細胞によるＣＤ１３３発現を示す方法において、生体サンプルの成分と特異的に結合するかどうかを検出し得る。例えば、モノクローナル抗体又はｓｃＦｖとＣＤ１３３の少なくとも一部との特異的な結合は、検出されてもよい。同様に、（必要であれば変性した）本発明のポリヌクレオチドと、（また、必要であれば変性した）サンプルからの少なくとも一部のポリヌクレオチドとの特異的な結合（例えば、ハイブリダイゼーション）は、ＣＤ１３３発現を示す。
【００８５】
癌幹細胞コンパートメントは、１超の幹細胞集団を含み、ＣＤ１３３ＫＤＥＬは、ＣＤ１３３を発現するこれらの集団の少なくとも一つに対して非常に効果的である。我々は、我々が試験した様々な上皮性悪性腫瘍において、約５％ＣＤ１３３細胞／９５％ＣＤ１３３細胞を検出した。例えば、表１は、いくつかの株を示す。抗ＣＤ１３３ｓｃＦＶは、ＦＩＴＣで標識され、その後、標準的なフローサイトメトリーが行なわれた。ＣＤ１３３発現のレベル（４〜７．１％）は、報告されている値と一致した。ＣａＣｏ−２結腸直腸上皮性悪性腫瘍は、高いレベルでＣＤ１３３＋細胞を発現することが知られている細胞株であり、従って、我々は、陽性対照としてそれを含めた。抗ＣＤ４５−ＦＩＴＣ及び抗ＣＤ１９ＦＩＴＣは、造血細胞を優先的認識する陰性対照である。
【００８６】
【表１】
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【００８７】
従って、モノクローナル抗体及び／又はｓｃＦｖは、対象において癌幹細胞の存在を検出するために設計される診断方法に用いられてもよく、それは対象が新生物症状、例えば上皮性悪性腫瘍を有する、又はリスクを有することを示し得る。斯かる診断方法は、対象から適切な生体サンプルを得て、インビトロでモノクローナル抗体及び／又はｓｃＦｖと生体サンプルの一部とを接触させ、モノクローナル抗体及び／又はｓｃＦｖと、生体サンプル中の細胞との特異的な結合を検出することを含む。他の場合では、診断方法は、適切な検出可能なマーカーと結合したモノクローナル抗体及び／又はｓｃＦｖを含む組成物を対象に投与し、その後、インビボで組成物の少なくとも一部と対象の細胞との特異的な結合を検出することを含む。
【００８８】
治療的使用
抗ＣＤ１３３抗体は、診断ツールとして元々開発されているにも関わらず、研究は、リガンド、例えば本明細書に記載の抗ＣＤ１３３抗体により結合する場合、ＣＤ１３３が迅速に内在化することを示す。迅速に内在化するマーカーを有する細胞は、ターゲットトキシンのための大変優れた標的であるので、我々は、ｓｃＦｖ融合分子（我々の抗ＣＤ１３３ｓｃＦｖとともに同一の分子上でクローン化した毒素を含む）を組み立てることにより、ＣＤ１３３ターゲットトキシン：ターゲットトキシンｄＣＤ１３３ＫＤＥＬを合成した。
【００８９】
化学療法を受けた上皮性悪性腫瘍患者において、癌の再発の一つの原因は、癌幹細胞である。癌幹細胞は、正常細胞と同様に分化することが、現在認識されている。従って、あまり分化していない、自己複製する、腫瘍イニシエーティング幹細胞の小さいコホートが存在する。より分化した癌幹細胞の大きいコホートもまた、存在する。あいにく、それは、化学療法により影響を受けやすいより分化した細胞、及び一部のより薬物耐性を有するあまり分化していない癌幹細胞である。さらに、これらのあまり分化していない癌幹細胞は、これらの数を自己複製し、腫瘍をイニシエートする能力を有し、従って転移性疾患に寄与する。これは、癌幹細胞が、確立された幹細胞マーカー、例えばＣＤ１３３又はＣＤ４４を用いて分類される様々な上皮性悪性腫瘍において、現在確立されている。分類された細胞は、マウスに異種移植され、腫瘍イニシエート及び自己複製するその速度は、腫瘍イニシエーションアッセイにおいて著しく増大した。幹細胞は、幹細胞ではない腫瘍細胞よりも、化学療法に対してより耐性を有し得るので、これらの癌幹細胞を選択的に破壊する薬物は、再発及び転移の予防のために極めて高い価値を有する。ターゲットトキシンは、タンパク質合成の強力な触媒阻害剤であり、多くの報告は、これらが、従来の化学療法薬と全く異なる機構により薬物耐性細胞を死滅させることを示す。従って、我々は、癌幹細胞を取り除くＴＴを設計するために遺伝子工学を用いた。
【００９０】
ＣＤ１３３は、様々な癌についての幹細胞マーカーである。癌イニシエーティング細胞におけるＣＤ１３３の発現は、脳、前立腺、及び結腸癌、並びにより最近では乳癌においてよく記載されている。プロミニン−１としても知られるＣＤ１３３は、５つの膜貫通ドメイン及び膜突出として局在する２つの大きな糖化された細胞外ループを有する細胞表面糖タンパク質である。癌幹細胞におけるＣＤ１３３の機能は確立されていないが、一つの選択的にスプライスされた形態は、コレステロールと結合し、従って、ヘッジホッグシグナル伝達に関与し得、それは初期の細胞分化及び上皮間葉相互作用に要求される。
【００９１】
ＣＤ１３３に関するいくつかの研究は、市販の抗ＣＤ１３３モノクローナル抗体が糖化されたＣＤ１３３を認識し、従って望ましくなく、これらが翻訳後修飾されたＣＤ１３３エピトープを発現する細胞を検出せず、全てのＣＤ１３３発現を測定するために正確でないので批判されてきた。解決策として、ハイブリドーマクローン７により産生される本明細書で同定されるモノクローナル抗体及び本明細書に記載されるそれらからのｓｃＦｖは、開発された。
【００９２】
分子／細胞に基づくターゲットトキシン（ＴＴ）は、癌標的細胞の強力な死滅剤である。これらは、タンパク質合成の酵素的阻害剤である。これらが伸長因子２のＡＤＰ−リボシル化を触媒する酵素であるので、これらは、一つの化学反応を完了する細胞質を通して移動し、その後、次を開始する。化学療法剤は、この機構を共有せず、一つの分子に基づき、有効性は低い。重要なことには、患者の腫瘍は、しばしば化学療法に耐性を有し、多くの場合、それは特に造血系に対して強い毒性を示すので、化学療法の投与は一つの選択肢ではない。触媒性毒素は、異なる抗癌機構を有するので、ターゲットトキシンは、これらが膵臓癌においてさえ、化学療法と相乗効果を与えるので、従来の療法に対する抗い難い選択肢を表す。ターゲットトキシンと化学療法剤の相乗効果に関する多くの公開されている報告は存在する。それ故、我々は、抗ＣＤ１３３ｓｃＦＶ及び下流の緑膿菌外毒素からなる抗ＣＤ１３３ターゲットトキシンを組み立てた。小胞体保持配列であるＫＤＥＬは、それが細胞質区画への毒素の侵入を促進し、死滅能力を増大することが知られているので、Ｃ末端に付加された。我々は、該分子をｄＣＤ１３３ＫＤＥＬと呼んだ。
【００９３】
従って、我々は、腫瘍幹細胞を死滅させ得る初めてのその種類である抗幹細胞生物学的製剤ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬを作り出した。ＣＤ１３３＋幹細胞は、少数（４〜７％）の腫瘍細胞集団のみを表すにもかかわらず、我々は、培養において、大半の細胞が、ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬを用いた処理で、時間に亘って死滅したという事実に驚かされた。我々は、ＣＤ１３３細胞外ドメインの非グリコシル化骨格を認識する新規の抗ＣＤ１３３モノクローナルを作り出した。ｓｃＦｖ−ＴＴ融合は、驚くべきことに、インビトロで高い抗上皮性悪性腫瘍活性、及びインビボで全身的に注入される場合、高い抗腫瘍効果を有する。これは、確立された幹細胞マーカーであるＣＤ１３３を認識するその種類の最初の薬剤である。
【００９４】
それにもかかわらず、ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬとＥＧＦ４ＫＤＥＬを組み合わせることは、ＣＤ１３３ＫＤＥＬ又はＥＧＦ４ＫＤＥＬのいずれか単独の個別の投与と比較して、インビボでの全身性上皮性悪性腫瘍死滅を著しく増大した（ＥＧＦ４ＫＤＥＬは、ＥＧＦＲを標的とする二重特異性ＴＴである）。我々の組み合わされたインビトロ及びインビボでの発見の解釈は、一超の幹細胞画分が存在することである。
【００９５】
一つの候補は、ＣＤ４４＋癌幹細胞の集団であり、それは結腸癌におけるＣＤ１３３＋幹細胞と独立していると考えられる。ＣＤ４４は、しかしながら、ヒアルロン酸についての受容体であり、正常細胞において偏在的に発現される。従って、ＣＤ４４に基づく治療薬は、本明細書に記載されるＣＤ１３３に基づく治療薬と対照的に、非標的臓器と実質的に交差反応性を示し得る。別の候補は、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）である。更に別は、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）であり、それはまた、上皮性悪性腫瘍上で広く発現され、癌幹細胞上で発現される。抗体マイクロアレイ分析は、最終的に、更なる標的を同定し得る。
【００９６】
従って、別の態様では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、又はポリヌクレオチドの治療的使用を含む。一つの実施形態では、ｓｃＦｖは、繰り返される治療が、抗毒素抗体の産生の減少した結果とともに与えられるように、効率的に脱免疫化される切断された緑膿菌外毒素と融合されたｓｃＦｖを含むターゲットトキシン（ＴＴ）をクローン化するために用いられた。フローサイトメトリーにより測定されたＣＤ１３３＋癌幹細胞の一部のみの存在にもかかわらず、ｓｃＦｖ−ＴＴ融合物（ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬ）は、乳癌及び頭頸部癌細胞株を用いて、インビトロで培養された上皮性悪性腫瘍細胞の拡大を減少させるのに非常に有効的であった。インビボで試験された場合、薬剤は動物の高いパーセンテージにおいて、完全寛解を誘導するのに有効的である。ＣＤ１３３単独は、優れた効果を有するが、ｓｃＦｖ−ＴＴ融合物はより優れた効果を有する。
【００９７】
ｓｃＦｖ−ＴＴ融合物は、ＣＤ１３３＋癌幹細胞を認識し、取り除くための新しいツールとして示される。本明細書で用いられるように、「取り除く」及びそのバリエーションとは、細胞の適切な対照集団に関する任意の程度まで「取り除かれる」集団において、生細胞の増殖を減少させることを意味する。従って、場合によっては、特定の細胞を「取り除くこと」は、「取り除かれる」細胞の実際の集団の増加を含むが、増加は、適切な対照集団において観察される対応する集団増加よりも低い。従って、態様によっては、細胞を「取り除くこと」は、適切な対照集団と比較して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％取り除かれた細胞の集団を減少させることを含み得る。他の実施形態では、細胞を「取り除くこと」は、集団における細胞の数を実際の減少を意味してもよい。これらの実施形態では、細胞を「取り除くこと」は、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％取り除かれた細胞の実際の数を実際に減少させることを含み得る。
【００９８】
例えば、ｓｃＦｖ−ＴＴ融合物を用いた細胞培養液からＣＤ１３３＋幹細胞を取り除き得、その後、どの幹細胞集団が残るかを研究し得る。残った細胞集団は、例えば、２色及び３色の蛍光色素を用いて検出されてもよい。斯かる戦略は、それに優れた上皮性悪性腫瘍マーカーを発現する第二の癌幹細胞集団を同定することを可能にする。例えば、我々は、ＥＧＦＲ／ＥｐＣＡＭ発現細胞が、ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬを用いてＣＤ１３３＋細胞を取り除いた後に残るという証拠を有する。
【００９９】
別の例としては、斯かる治療を必要とする対象にインビボで抗癌療法を提供するために、ＣＤ１３３＋幹細胞を取り除き得る。抗ＣＤ１３３ｓｃＦｖを含むｓｃＦｖ−ＴＴ融合物は、ＣＤ１３３＋癌幹細胞へのターゲットトキシンの標的化された送達を提供し得る。ＣＤ１３３＋癌幹細胞は、多数の様々な上皮性悪性腫瘍、神経膠芽腫、星状細胞腫、及び非上皮性悪性腫瘍において同定されている。従って、抗ＣＤ１３３＋ｓｃＦｖを含むｓｃＦｖ−ＴＴ融合物は、様々な臓器の一つ又は複数の腫瘍を治療し得る一つの治療の選択を提供し得る。典型的な腫瘍としては、脳腫瘍（例えば、神経膠芽腫、星状細胞腫等）、筋腫瘍（例えば、非上皮性悪性腫瘍）、及び／又は様々な上皮性悪性腫瘍、例えば乳癌、膵臓癌、頭頸部癌、前立腺癌、結腸癌、表２に列挙される上皮性悪性腫瘍のいずれか、又は上皮性悪性腫瘍の任意の組み合わせが挙げられる。
【０１００】
【表２】
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【０１０１】
関連する上皮性悪性腫瘍からの上皮性悪性腫瘍細胞株としては、例えば、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ｌｕｃ及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８／ｌｕｃ（乳癌）、ＭｉａＰａＣａ−２／ｌｕｃ及びＳＷ１９９０／ｌｕｃ（膵臓癌）、ＰＣ−３／ｌｕｃ（前立腺癌）、ＵＭＳＣＣ−１１Ｂ／ｌｕｃ及びＮＡ／ｌｕｃ（頭頸部癌）、並びにＨＴ−２９／ｌｕｃ（結腸癌）が挙げられる。幹細胞は、様々な上皮性悪性腫瘍における全ての細胞集団の４〜１１％を示す。
【０１０２】
一度、分類及び腫瘍イニシエーションアッセイを通して幹細胞集団が同定されると、それは、非常に選択的なリガンド標的毒素の中で、他のターゲットトキシンがこれらの癌幹細胞の死滅に有用であるかどうか決定され得る。例えば、それは、ＣＤ１３３ＫＤＥＬとヌードマウスモデルにおいて他の癌幹細胞を認識するターゲットトキシンを組み合わせ得る。原則としては、我々は、ＥＧＦ４ＫＤＥＬと組み合わされたＣＤ１３３＋癌幹細胞を認識するｄＣＤ１３３ＫＤＥＬがインビボで優れた抗上皮性悪性腫瘍効果を有しているので、この手法は価値を有することを既に示している。また、癌幹細胞は、より分化した癌細胞よりも、しばしば化学療法剤に対して薬物耐性を有するので、それは、様々な癌幹細胞に対する１又はそれ以上の化学療法剤との組み合わせにおけるｓｃＦｖ−ＴＴ融合物を投与することに関する併用療法を試験し得る。
【０１０３】
二次的な癌幹細胞集団の同定に対する応答として、それは、他の癌幹細胞集団に対するターゲットトキシンを産生するためのｄＣＤ１３３ＫＤＥＬの構築とともに確立された一般的なｓｃＦｖ−ＴＴモデルを使用し得る。例えば、インビボでのデータは、上述のｄＣＤ１３３ＫＤＥＬ、及びＣＤ１３３＋癌幹細胞が除かれた後に残る癌幹細胞のコホートにより発現されるＥＧＦＲ（ｄＥＧＦ４ＫＤＥＬ）を標的とする対応するｓｃＦｖ−ＴＴ融合物を用いた併用療法は、ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬ単独よりも優れた抗上皮性悪性腫瘍効果を示すことを提案する。
【０１０４】
従って、ｓｃＦｖ−ＴＴ融合物は、標的細胞集団により発現されるマーカーと特異的に結合する任意の好適な標的化ｓｃＦｖを含み得る。幹細胞集団のための好適なマーカーとしては、例えばＣＤ１３３、ＣＤ４４、ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）、ＥＧＦＲ（上皮細胞増殖因子受容体、例えば、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、又はＨＥＲ４）、ｕＰＡＲ（ウロキナーゼ受容体）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、メソテリン、及びＭＵＣ１（ｍｕｃｉｎ  １）が挙げられる。
【０１０５】
また、融合物のターゲットトキシン（ＴＴ）部分は、任意の好適な治療的部分を含み得る。好適な治療的部分は、直接的又は間接的な細胞毒性を与える化合物、例えば小分子、放射線剤、及び／又は毒性ポリペプチドを含み得る。毒性ポリペプチドとしては、例えば、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素Ａ、緑膿菌外毒素（ＰＥ）、ブリオジン（ｂｒｙｏｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、α−サルシン、アスペルギリン、レストリクトシン、アンジオジェニン、サポリン、アブリン、原核生物のリボヌクレアーゼ、真核生物のリボヌクレアーゼ、リシン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）、プロアポトーシスポリペプチド、リボソーム阻害タンパク質、又は先述の任意の生物学的に活性な断片が挙げられる。プロアポトーシスポリペプチドとしては、例えば、Ｂａｘ、Ｆａｓ、Ｂａｄ、Ｂａｋ、Ｂｉｍ、Ｂｉｋ、Ｂｏｋ、Ｈｒｋ、ＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬ、又はＴＮＦ−αが挙げられる。
【０１０６】
好適な治療部分はまた、例えば、１又はそれ以上の治療材料（例えば、細胞毒性化合物）を含む、生物分解性ナノ粒子を含み得る。実施例２１は、ＣＤ１３３モノクローナル抗体が機能性分子（６−クマリン）を有するナノ粒子と結合し得、その機能が、ナノ粒子がモノクローナル抗体と結合した後も保持し得ることを例証する。更に、図２１は、ＣＤ１３３の場合、標的部分が、抗体−ナノ粒子の標的指向性の細胞内摂取を引き起こし得ることを例証し、標的とされた診断及び／又は標的とされた治療用途のための抗体−ナノ粒子の有用性が示される。例えば、ナノ粒子は、生物分解性であり、抗体と結合するように設計され、且つ治療的化合物を含むように設計される。抗体−ナノ粒子組成物は、全身的に対象に投与されてもよく、さらに抗体のリガンドを発現する細胞に標的特異的な送達を提供する。一度標的細胞により摂取されると、ナノ粒子は分解し得、標的細胞の内部で治療的化合物を放出する。これは、治療的化合物の全身曝露を最小限にし、それ故治療的化合物と非標的細胞間の接触を限定し得る。もちろん、ナノ粒子は、任意の他の治療的部分と同様に、それは意図された標的細胞集団に適当である、モノクローナル抗体又はそのｓｃＦｖのいずれかと結合してもよい。
【０１０７】
脱免疫化毒素
これらの酵素的性質が、ターゲットトキシンを最も有効的な単一細胞死滅剤にするにも関わらず、ターゲットトキシンを患者に投与することが、ターゲットトキシンの有効性を限定する抗毒素抗体をもたらし得るように、これらは免疫原性である。これは、患者の免疫系が完全である場合、固体腫瘍研究の場合において、特に問題である。一つの上皮性悪性腫瘍研究では、抗毒素応答が全ての治療された患者において生じた。この問題に対処するために、我々は、免疫原性アミノ酸が部位特異的変異導入を用いて変異導入された毒素を用いて、我々の抗腫瘍幹細胞薬剤を合成した。
【０１０８】
我々は、Onda et al., "An Immunotoxin with Greatly Reduced Immunogencity by Identification and Removal of B Cell Epitopes," PNAS 2008 Aug. 12; 105(32): 11311-11316. Epub 2008 Aug. 4のエピトープマッピング戦略を用いて、切断された緑膿菌外毒素とスプライスされたヒトサイトカインＥＧＦ及びＩＬ−４からなる二重特異性リガンド指向性毒素（ＢＬＴ）である、ＥＧＦ４ＫＤＥＬについて毒素を脱免疫化した。末端小胞体保持配列であるＫＤＥＬは、薬効を増大させるためにＣ末端に配置された。我々のｄＥＧＦ４ＫＤＥＬは、乳癌、肺癌、前立腺癌、膵臓癌、及び結腸直腸癌に対する強力な薬剤である。従って、我々は、薬物の効果を無効にする抗毒素免疫応答を生じること無く繰り返して与えることのできる薬物を有する。この同一の毒素カセットは、ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬを合成するために用いられた（図５）。
【０１０９】
我々は、ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬの存在下で、上皮性悪性腫瘍細胞を連続して培養した。最初は、我々は、活性を測定するために、放射標識されたチミジン摂取アッセイ、又はロイシン取り込みタンパク質合成アッセイを用いたが、これは、１日における活性のみしか測定できなかった。従って、我々は、薬物の存在下で癌細胞の連続培養を可能にするアッセイを考案した。我々は、数日間、薬物の存在下でｄＣＤ１３３ＫＤＥＬを培養し、我々は毎日培地を交換し、トリパンブルー染色排除により生細胞を計測した。驚くべきことに、図６は、ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬが、生体染色排除により測定されたＵＭＳＣＣ−１１Ｂ頭頸部癌細胞増殖の阻害に非常に効果的であった。ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬは、０．３ｎＭの濃度において細胞を死滅させた。
【０１１０】
図７は、ＣＤ１３３＋頭頸部癌細胞ＵＭＳＣＣ−１１Ｂ細胞が磁気ビーズに付着された我々のＣＤ１３３ｓｃＦｖを用いて分類され、その後ＭＡＧＳ磁気ビーズキット（STEMCELL Technologies, Inc., Vancouver, British Columbia, Canada）を用いて精製された腫瘍イニシエーションアッセイを示す。
【０１１１】
推定上の幹細胞は、ヌードマウスの脇腹に注射される。これらが濃縮された幹細胞である場合、その後、これらは、非幹細胞よりも、腫瘍取り込みの高いレベルを有する加速された速度で増殖する。図７は、分類された細胞が、腫瘍イニシエーションの高い発生率を有し（７５％）、これらの腫瘍が、分類されていない腫瘍細胞で得られるものよりも著しく高い平均腫瘍増殖を有することを示す（ｐ＜０．０４）。これは、ＣＤ１３３ｓｃＦｖが実際に腫瘍幹細胞を認識する証拠を提供する。興味深いことには、細胞のサンプルが注射の前にｄＣＤ１３３ＫＤＥＬで処理された場合、これらの細胞は、低い増殖速度を有し、４つの腫瘍増殖のうちわずか１つであった。これは我々のＣＤ１３３ｓｃＦｖが実際に癌幹細胞を濃縮することを実証する。
【０１１２】
他の上皮性悪性腫瘍は、ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬ処理により影響を受ける。ＣＤ１３３＋癌幹細胞は、乳癌において同定されており、我々のフローサイトメトリー研究は、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１において癌幹細胞の存在を指し示す。それ故、図６の通りに、我々は、ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬの存在下でＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を培養し、生存率はトリパンブルーを用いて毎日測定された。図８は、ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬが著しく乳癌細胞を阻害したが、対照ＣＤ３ＣＤ３ＫＤＥＬが阻害しなかったことを示す。ＣＤ３ＣＤ３ＫＤＥＬは、ＣＤ３イプシロンＴ細胞受容体を認識する。従って、死滅は特異的であった。
【０１１３】
更なる癌幹細胞マーカーは、ＣＤ１３３に関連して記述される同一の戦略が、癌幹細胞の他のコホートに特異的であるターゲットトキシン薬剤を生成するために用いられ得るように、同定され得る。我々は、更に関連する癌幹細胞マーカーとして、ＥＧＦＲ及びＥｐＣＡＭを既に同定した。更に癌幹細胞マーカーは、標準的な定められた技術を用いて同定されてもよい。好適な技術は、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｒｒａｙ  ５００（Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA）を用いる分析を含む。斯かる抗体アレイは、サンプル間の相対的なタンパク質存在量の測定を提供する。
【０１１４】
従って、特定の実施形態では、ｓｃＦｖ−ＴＴ融合物は、脱免疫化されたターゲットトキシン部分を含み得る。本明細書に用いられる「脱免疫化された」及びそのバリエーションとは、（ａ）毒素が投与されるものに対するそれによる抗毒素免疫反応を減少させ、且つ（ｂ）治療的及び／又は予防的に有効な量の毒素活性を保持する、１又はそれ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を意味する。
【０１１５】
本明細書に記載される脱免疫化戦略を用いて、我々は、二重特異性リガンド指向性毒素として知られている３つの異なるｓｃＦｖ−ＴＴ融合物：白血病治療についての脱免疫化２２１９ＫＤＥＬ  ７ｍｕｔ、上皮性悪性腫瘍治療についての脱免疫化ＥＧＦ４ＫＤＥＬ  ７ｍｕｔ、及び神経膠腫治療についての脱免疫化ＥＧＦＡＴＦＫＤＥＬに対する著しい抗毒素抗体減少、及び／又は著しいインビボ抗癌応答を観察した。例えば、抗毒素免疫応答が、脱免疫化２２１９ＫＤＥＬ（２２１９ＫＤＥＬ  ７ｍｕｔ、ｄ２２１９ＫＤＥＬ、又は２２１９ＡＲＬＫＤＥＬ  ７ｍｕｔとしても本明細書で称される（例えば図１１））を用いて減少する程度を決定するために、緑膿菌外毒素（ＰＥ）に基づく薬剤を受けたヒト患者からの血清は、マウスとしてＰＥの同一の有望な免疫原性領域を認識するので、免疫不全のマウスは、ヒト免疫原性のモデルとして用いられた。
【０１１６】
脱免疫化２２１９ＫＤＥＬ  ７ｍｕｔ融合ポリペプチドは、アセンブリーＰＣＲを用いて合成された融合遺伝子から発現された。その最終配置では、２２１９ＡＲＬＫＤＥＬ融合遺伝子（５’末端〜３’末端）は、ＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位、次に抗ＣＤ２２ｓｃＦｖ遺伝子からなる。この抗ＣＤ２２ｓｃＦｖ遺伝子は、ＶHドメインに先行するＶLドメインで配置され、ＡＲＬリンカー（ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ，配列番号６９）をコードする断片により結合された。次に、Ｇ4Ｓリンカー（ＧＧＧＧＳ）に続いて（同一のＶL／ＶH方向及び同一ＡＲＬリンカーにおいて）抗ＣＤ１９ｓｃＦｖはクローン化され、その後、下流に７個のアミノ酸であるＥＡＳＧＧＰＥリンカーが続いた。リンカーは、ＥＲ保持配列であるＫＤＥＬで置き換えられたそのＣ末端のＲＥＤＬＫを有するＰＥ３８（３６０ａａ）が続き、最終的に３’末端においてＮｏｔＩ制限酵素認識部位が続く。結果物である２６５０ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ断片遺伝子は、イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導可能なＴ７プロモーターの制御下で、ｐＥＴ２１ｄ細菌発現ベクターにスプライスされた。ＤＮＡ配列解析（Biomedical Genomics Center, University of Minnesota）は、遺伝子が配列中で正確であるか、フレームでクローン化されているかを確かめるために用いられた。減少した免疫原性を有する変異導入された２２１９ＡＲＬＫＤＥＬ分子（２２１９ＡＲＬＫＤＥＬ  ７ｍｕｔ）を作製するために、ＰＥ38ＫＤＥＬ上の７つの主なエピトープに分布する８個のアミノ酸は、QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene. La Jolla CA, USA）を用いて変異導入され、ＤＮＡ配列決定により確認された。以下の免疫原性の、親水性のアミノ酸：Ｒ４９０Ａ、Ｒ５１３Ａ、Ｒ４６７Ａ、Ｅ５４８Ｓ、Ｋ５９０Ｓ、Ｒ４３２Ｇ、Ｑ３３２Ｓ、Ｒ３１３Ａは、改変され、ＤＮＡ配列決定により確認された。
【０１１７】
脱免疫化ＥＧＦＡＴＦＫＤＥＬ融合ポリペプチドは、ＤＮＡシャッフリング及びＤＮＡクローニング技術を用いて合成された融合遺伝子から発現された。その最終配置では、ＥＧＦＡＴＦＫＤＥＬ融合遺伝子（５’末端〜３’末端）は、ＮｃｏＩ制限酵素認識部位、ＡＴＧ開始コドン、ヒトＥＧＦについての遺伝子、ヒト筋アルドラーゼ（ＨＭＡ）の２０アミノ酸セグメントにより連結されるｕＰＡからの下流の１３５−アミノ末端断片（ＡＴＦ）、７アミノ酸であるＥＡＳＧＧＰＥリンカー、Ｃ末端においてＲＥＤＬＫを置き換えるＫＤＥＬを有する緑膿菌外毒素（ＰＥ）分子の最初の３６２個のアミノ酸、及び構築物の３’末端においてＮｏｔＩＩ制限酵素認識部位からなった。ＨＭＡセグメントは、フレキシブルな非免疫原性リンカーとして分子に組み込まれた。ＡＴＦ遺伝子断片の使用は、我々の実験室によって先に記載された。結果物である１７４８ｂｐのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩＩ断片遺伝子は、イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシドで誘導可能なＴ７プロモーターの制御下で、ｐＥＴ２８ｃ細菌発現ベクターにスプライスされた。ＤＮＡ配列解析（Biomedical Genomics Center, University of Minnesota）は、遺伝子が配列中で正確であるか、フレームでクローン化されているかを確認するために用いられた。減少した免疫原性を有するＥＧＦＡＴＦＫＤＥＬ分子を作製するために、ＰＥ３８上の７つの主なエピトープに代表される８個のアミノ酸は、QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene. La Jolla CA, USA）を用いて変異導入された。以下のアミノ酸：Ｒ４９０Ａ、Ｒ５１３Ａ、Ｒ４６７Ａ、Ｅ５４８Ｓ、Ｋ５９０Ｓ、Ｒ４３２Ｇ、Ｑ３３２Ｓ、Ｒ３１３Ａは改変され、ＤＮＡ配列決定により確認された。
【０１１８】
図１１は、変異が、変異導入されていない親薬剤と比較して薬物活性に影響を与えないことを示す。図１２では、免疫不全のＢＡＬＢ／ｃマウスを用いた免疫付与研究は、親の２２１９ＡＲＬＫＤＥＬ分子と比較して、２２１９ＡＲＬＫＤＥＬ  ７ｍｕｔの免疫原性を比較するために行なわれた。マウス（ｎ＝６／群）は、免疫付与され、全９週の間、毎週血液採取された（１０回の注射）。各動物からの血清サンプルは、抗ＰＥ３８（ＫＤＥＬ）ＩｇＧを検出するためにＥＬＩＳＡを用いて分析された。図１２は、臨床量（１０μｇ／ｋｇの薬物）での９回（６９日）又は１０回（７６日）回の注射後、脱免疫化変異体（２２１９ＡＲＬＫＤＥＬ  ８ｍｕｔ）に対して産生された抗毒素ＩｇＧのレベルは、変異導入されたいない親（２２１９ＡＲＬＫＤＥＬ）に対して産生された抗毒素ＩｇＧの２０％〜２５％であった。従って、脱免疫化薬剤の複数回の注射を与えられたマウスは、薬物の等量の親形態で注射されたものよりも著しく低い抗毒素レベルを生じた（ｐ＜０．０５）。従って、それは、ヒト免疫原性のモデルとして検証されたネズミモデルにおいて、薬物の脱免疫化形態の複数回の注射を与え、限定的な抗毒素免疫応答を生じ得る。図１３は、脱免疫化していない薬剤で免疫付与されたマウスからの血清が、インビトロで、２２１９ＫＤＥＬ死滅を中和したことを示す。脱免疫化薬剤で免疫付与されたマウスからの血清は、インビトロで２２１９ＫＤＥＬ死滅を中和しなかった。従って、２２１９ＫＤＥＬ  ７ｍｕｔでの複数回投与は、脱免疫化されたいない親形態での複数回投与よりも、低い抗毒素抗体の中和を引き起こす。最終的に、図１４は、変異導入された薬剤が、腫瘍が静脈内に注射される、システムＲａｊｉ−ｌｕｃ／ｓｃｉｄマウスモデルを用いた全身性Ｂ細胞悪性腫瘍に対して強力な抗癌効果を誘発したことを示す。生存者は、Vallera et al., "Bioengineering a unique deimmunized bispecific targeted toxin that simultaneously recognizes human CD22 and CD 19 receptors in a mouse model of B-cell metastases," Mol Cancer Ther. 2010 Jun;9(6): 1872-83. Epub 2010 Jun 8 に記載されるように、発症していないとして検証された。
【０１１９】
真上で議論されるデータは、エピトープマッピングにより毒素免疫原性に関連する７つの主なサブ群に位置する８個のアミノ酸置換を有することにより、脱免疫化ＰＥ毒素を用いて生成された。変異は、エピトープ１中のＱ３３２Ｓ、エピトープ２ａ中のＲ４６７Ａ、エピトープ３中のＲ３１３Ａ、エピトープ４ａ中のＲ４３２Ｇ、エピトープ５中のＲ４９０Ａ、エピトープ６ａ中のＲ５１３Ａ及びＥ５４８Ｓ、並びにエピトープ７中のＫ５９０Ｓであった。ＰＥ３８の組織分布的なエピトープマップは、毒素の様々な決定因子に対して６０個のモノクローナル抗体のパネルを用いた相互競争アッセイを用いて作られた。我々の最近の薬剤を用いて、免疫付与の１２又は１４週間後、免疫応答の８０％の減少が存在した（図１５）。
【０１２０】
同一の手法は、ＣＤ１３３ＫＤＥＬ（ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬ）の脱免疫化形態を生成するために用いられてもよく、それは、インビボにおいて有効性が示されている。
【０１２１】
脱免疫化された変異体の活性は、本明細書に記載のトリパンブルー生存率アッセイを用いてスクリーニングされてもよい。脱免疫化ｓｃＦｖ−ＴＴ構築物の細胞溶解活性は、脱免疫化されていない親形態と比較され得る。これらのアッセイから作成された細胞溶解曲線は、高い再現性を有した。活性の統計学的に有意な損失は、ｄ２２１９ＫＤＥＬ、ｄＥＧＦ４ＫＤＥＬ、及びｄＥＧＦＡＴＦＫＤＥＬの脱免疫化型で観察されなかった。従って、本明細書に記載される脱免疫化手法は、一般的に適用可能であるようにみえる。
【０１２２】
脱免疫化は、二つの異なるＭＨＣハプロタイプを有する二つの異なるマウス株において、血清抗体レベルの降下を引き起こす。異なるＭＨＣ分子が、ＭＨＣグルーブ中のペプチド断片のこれらの提示において異なるので、これは関連し、一つのハプロタイプは別のものとは異なるペプチドを提供し得る。従って、Ｂ細胞認識領域の変異導入に伴う潜在的な問題は、様々なＭＨＣ多形が、抗原を異なるように認識し得ることである。脱免疫化は、ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）及びＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）株の双方において、著しい抗毒素減少をもたらす。それ故、これは、全ての７つの領域を変異導入する強さが、これらの可能性のあるＭＨＣの差異を克服するのに十分であったことを示す。更に、ＰＥで高度に免役付与されたＢＡＬＢ／ｃマウスからの抗ＰＥ抗体は、ヒトにおいての同様のエピトープと反応し、同一のＢ細胞エピトープが異なるＴ細胞支持を用いて認識されたことを示す。
【０１２３】
ターゲットトキシンを用いた幹細胞標的化
癌幹細胞を取り除くための一つの戦略は、標的特異的枯渇を含む。我々のインビボモデルは、生物発光画像化により、リアルタイムでインビボにおける全身性上皮性悪性腫瘍に対するターゲットトキシンの効果を測定することを可能にする。我々の研究のために選択される全ての上皮性悪性腫瘍は、ルシフェラーゼ遺伝子でトランスフェクトされ、ヌードマウス中で非常によく増殖した。図９では、我々は、我々の確立されたヌードマウスにおける全身性腫瘍増殖のＭＢＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルを用いた。４百万個の細胞は、０日目にヌードマウスの脾臓に外科的に注射された。ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬを用いた処置は、６日目に開始された。ＭＷＦの毎週の投与は、５週間与えられた（２０μｇ／注射）。研究は、ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬのインビボ注射が、３５日の期間に亘り、６０％のマウスにおいて、抗腫瘍効果をもたらしたことを示す。抗Ｔ細胞薬物（ＣＤ３ＣＤ３ＫＤＥＬ）が与えられた対照マウスは、効果を示さなかった（示されない）。ともに、これらのデータは、ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬが、腫瘍幹細胞を認識し、死滅させるという証拠を提供する。更に、ＣＤ１３３＋癌幹細胞が腫瘍細胞集団の低いパーセンテージを生じるという事実にも関わらず、ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬの一般的な抗腫瘍効果は、顕著である。
【０１２４】
従って、癌幹細胞は、ｓｃＦｖ−ＴＴ治療のための特に効果的な標的であり、それは、ターゲットトキシンの送達のためのこれらの他のサブ集団に特異的な他のマーカーに対するｓｃＦｖを用いた、癌幹細胞の他のサブ集団まで拡張し得る。図１０は、ＣＤ１３３＋癌幹細胞を破壊するためのｄＣＤ１３３ＫＤＥＬ、及び第二の幹細胞集団である、ＥＧＦＲを発現する癌幹細胞を取り除くためのｄＥＧＦ４ＫＤＥＬの組み合わせを用いた、上皮性悪性腫瘍の治療の結果を示す。実験設計の一部として、図９に示される群は、準最適量のｄＣＤ１３３ＫＤＥＬ、準最適量のＥＧＦ４ＫＤＥＬ、又は双方の準最適量の組み合わせで処置された。双方の薬剤が個別に試験される場合、画像化データは、僅かな効果のみを下記で示した。双方の薬剤が正確に同一の用量及びスケジュールで組み合わされた場合、５匹の動物のうちの４匹は、ＣＤ１３３＋癌幹細胞に加えて別の幹細胞集団の存在を支持する組み合わされた処置と共に優れた効果を示す長期間疾患を示さない生存者と共に完全な応答を示した。
【０１２５】
癌幹細胞を取り除くための第二の戦略は、確立された化学療法剤と組み合わされたｓｃＦｖ−ＴＴ融合物を用いた処置を含む。多数の研究は、ターゲットトキシンが化学療法と組み合わされた場合、非常に効果的であることを示す。斯かる併用療法は、任意の好適な化学療法剤を用いて実行され得る。好適な化学療法剤としては、例えば、アルキル化剤、例えばシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、又はイホスファミド；抗代謝剤、例えばアザチオプリン又はメルカプトプリン；植物性アルカロイド又はテルペノイド、例えばビンカ・アルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン等）、ホドフィロトキシン（例えば、エトポシド又はテニポシド）、又はタキサン（例えば、パクリタキセル）；トポイソメラーゼ阻害剤、例えば１型トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、イリノテカン又はトポテカン）又は２型トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、又はテニポシド）；又は抗新生物薬、例えばダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、又はブレオマイシンが挙げられる。
【０１２６】
製剤
本発明のモノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、ポリヌクレオチド、ｍＡｂ−融合物、又はｓｃＦｖ−融合物は、医薬的に許容される担体を更に含み得る組成物で提供されてもよい。「医薬的に許容される」とは、組成物の他の成分に適合し、これらの受容者に有害でない、希釈剤、担体、賦形剤、塩等を意味する。典型的に、組成物は、組成物が本明細書に記載されるように用いられる場合、医薬的に許容される担体を含む。本発明の組成物は、抗原に対する免疫応答を刺激するのに好適な経路を含む、選択された投与の経路に適合する様々な形態における医薬的調製において製剤化されてもよい。従って、本発明の組成物は、例えば経口；皮内、経皮、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内等を含む非経口；及び局所、例えば鼻腔内、肺内、乳房内、膣内、子宮内、皮内、経皮、及び直腸等を含む既知の経路を介して投与され得る。組成物が、例えば動物の身体を介して、粘膜免疫、例えば分泌ＩｇＡ抗体の産生を刺激するために、粘膜表面、（例えばスプレイ又はエアロゾルを介した）例えば鼻又は呼吸粘膜への投与により、投与し得ることは予測される。
【０１２７】
本発明の典型的な実施形態は、以下を含む：
１．ハイブリドーマクローン７として本明細書で同定されるハイブリドーマ。
２．ハイブリドーマクローン７により産生されるモノクローナル抗体。
３．ハイブリドーマクローン７により産生されるモノクローナル抗体の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）。
４．配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、又は配列番号５８のアミノ酸配列を含む、実施形態３に記載ののｓｃＦｖ。
５．ｓｃＦｖが配列番号５８のアミノ酸配列を含む、実施形態４に記載のｓｃＦｖ。
【０１２８】
６．配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、又は配列番号５８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
７．単離されたポリヌクレオチドが、配列番号５８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、実施形態６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
８．単離されたポリヌクレオチドが、配列番号５７の核酸配列を含む、実施形態７に記載の単離されたポリヌクレオチド。
９．実施形態１又は実施形態２に記載のモノクローナル抗体を含む、組成物。
１０．実施形態３〜５のいずれか一つに記載のｓｃＦｖを含む、組成物。
【０１２９】
１１．実施形態２に記載のモノクローナル抗体；又は
実施形態３〜５のいずれか一つに記載のｓｃＦｖ；
を含む標的部分；及び
細胞溶解毒素の治療的有効部分を含む毒素部分；
を含む融合ポリペプチド。
１２．毒素部分が脱免疫化される、実施形態１１に記載のポリペプチド
１３．実施形態１１に記載の第一の融合ポリペプチド；及び
実施形態１１に記載の第二の融合ポリペプチド；又は
癌幹細胞により異なるように発現される第二のマーカーと特異的に結合するモノクローナル抗体若しくはそのｓｃＦｖを含む融合ポリペプチド
を含む、第二の融合ポリペプチドを含む、組成物。
１４．癌幹細胞により異なるように発現される少なくとも一つのマーカーが、ＣＤ１３３を含む、実施形態１３に記載の組成物。
１５．癌幹細胞により異なるように発現される少なくとも一つのマーカーが、ＥＧＦＲを含む、実施形態１３又は実施形態１４に記載の組成物。
【０１３０】
１６．斯かる治療を必要とする対象に、治療的有効量の以下：
実施形態２に記載のモノクローナル抗体；
実施形態３〜５に記載のいずれか一つのｓｃＦｖ；
実施形態１１又は実施形態１２に記載の融合ポリペプチド；又は
実施形態９、１０、又は１３〜１５のいずれか一つに記載の組成物
を投与することを含む、方法。
１７．モノクローナル抗体と結合したナノ粒子を更に含む、実施形態９に記載の組成物。
１８．ｓｃＦｖと結合したナノ粒子を更に含む、実施形態１０に記載の組成物。
１９．実施形態２に記載のモノクローナル抗体、又は
実施形態３〜５に記載のいずれか一つのｓｃＦｖ、
と結合する検出可能なマーカーを含む、組成物。
２０．実施形態１９に記載の組成物とＣＤ１３３を発現する少なくとも一つの細胞とを接触させ；
ＣＤ１３３を発現する少なくとも一つの細胞と特異的に結合した組成物の少なくとも一部を含む複合体を検出すること；
を含む、方法。
【０１３１】
２１．前記接触させることが、ＣＤ１３３を発現する癌幹細胞を含む対象に組成物を投与することを含む、実施形態２０に記載の方法。
【０１３２】
２２．ＣＤ１３３を発現する少なくとも一つの細胞と特異的に結合した組成物の少なくとも一部を含む複合体を検出することが、
対象が新生物症状を有する、又はリスクを有することを示す、実施形態２０に記載の方法。
【０１３３】
分離したステップを含む、本明細書で開示される任意の方法については、ステップは、任意の適切な順番で行なわれてもよい。必要に応じて、２又はそれ以上のステップの任意の組み合わせは、同時に行なわれてもよい。
【０１３４】
本発明は、以下の実施例により例証される。特定の実施例、材料、量、及び手順は、
本明細書で説明されるような本発明の範囲及び趣旨に従って、広く解釈されることは、理解される。
【実施例】
【０１３５】
実施例
実施例１−細胞培養
Ｃａｃｏ−２細胞は、２０％ＦＢＳ、１％非必須アミノ酸（Sigma- Aldrich Corp., St. Louis, MO）、１％ピルビン酸ナトリウム（Sigma- Aldrich Corp., St. Louis, MO）、及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含む最小必須培地（ＭＥＭ）中で培養された。ＧＢＭ６細胞は、外科的に単離された神経膠腫標本に由来し；これらの細胞は、Ｂ２７、Ｎ２、及び２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ及びＦＧＦが添加された血清フリーＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で培養された。Ｕ８７細胞は、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含むダルベッコのＭＥＭ中で培養された。全ての試薬は、他に記載の無い限りInvitrogen（Carlsbad, CA）から購入された。
【０１３６】
実施例２−ＣＤ１３３抗原設計及び産生
ヒトＣＤ１３３（ＮＣＢＩ参照配列  ＮＭ＿００６０１７．１）は、８６５個のアミノ酸残基のタンパク質をコードする。これらのうちの約３５５個は、高い免疫原性を有することが理論的に予測された。この選択されたアミノ酸ブロックに対応する１０６５ｂｐのオリゴヌクレオチドは、微生物発現を改良するために、コドン最適化を組み込んだ後、合成された。オリゴヌクレオチド配列は、ＰＣＲ増幅され、Ｎ末端にＨｉｓ−タグを有するＰＥＴ３０ａベクターにクローン化され、配列は確認され、その後ＢＬ−２１（ＤＥ３）大腸菌株に形質転換された。タンパク質発現のために、０．５リットルの形質転換された微生物は、ＬＢ培地中で増殖され、０．４ｍＭ  ＩＰＴＧにより２時間誘導された。細胞は、遠心分離によりペレットにされ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶解バッファに再懸濁され、氷槽上で超音波処理により破壊された。上清及びペレット中のタンパク質発現は、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中でこれらを分離すること、その後クーマシーブルーにより染色することにより分析された。組み換えタンパク質は、ニッケル−ＮＴＡビーズを用いることにより、ペレットから精製された。
【０１３７】
実施例３−免疫付与及びモノクローナル抗体産生
研究に用いられる全ての動物プロトコールは、University of MinnesotaのIACUCにより認可された。Ｂａｌｂ／ｃマウスは、組み換えＣＤ１３３ペプチド断片を用いて注射された。動物は、ＣＤ１３３に対する十分な血清力価が、ＥＬＩＳＡにより分析されるように得られるまで、抗原で３〜４回、定期的にブーストされた。免疫付与された動物は、麻酔され、これらの脾臓は取り除かれた。得られた脾細胞は、ＰＥＧを用いてミエローマ細胞と融合され、ＨＡＴ培地で培養された。培養上清は、ＥＬＩＳＡを用いてＣＤ１３３に対する抗体の産生についてスクリーニングされた。
【０１３８】
実施例４−ウエスタンブロットによるハイブリドーマ上清のスクリーニング
Ｃａｃｏ−２細胞は、ＲＩＰＡバッファ（Thermo Scientific, Waltham, MA）に溶解され、残屑を取り除くために、１０，０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離された。細胞溶解物のタンパク質濃度は、標準としてウシ血清アルブミンを用い、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Thermo Scientific, Waltham, MA）を用いて測定された。細胞溶解物は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA）により分離され、基準ブロッター（Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA）を用いて、ニトロセルロース膜（Whatman Inc., Piscataway, NJ）に転写された。膜は、ＴＢＳＴ中で１時間、５％脱脂粉乳でブロックされ、その後、４℃で一晩、ハイブリドーマ上清又は対照（陰性対照：前免疫血清；陽性対照：Abcom製抗ＣＤ１３３抗体ａｂ１９８９８、及び免疫後抗血清）とインキュベートされた。膜は、その後ＴＢＳＴで３回洗浄され、その後、室温で１時間、５％脱脂粉乳／ＴＢＳＴ中で、ＨＲＰと結合した抗マウスＩｇＧ（CalBiochem, San Diego, CA）とインキュベートされた。膜はその後ＴＢＳＴで３回洗浄され、SuperSignal West Pico化学発光基質（Thermo Scientific, Waltham, MA）を用いて視覚化された。
【０１３９】
実施例５−免疫蛍光
Ｃａｃｏ−２細胞は、１６ウェルチャンバースライドにプレートされた。培養の４時間後、細胞は、４％パラホルムアルデヒドで固定され、ＤＰＢＳで洗浄され、その後、２００ｍＭグリシン中で１０分間インキュベートされた。細胞は、その後、ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ及び０．２％ゼラチンの溶液で１０分間ブロックされた。続いて、４℃で一晩、ハイブリドーマ上清又は関連する対照（陰性対照：前免疫血清；陽性対照：Miltenyi Biotec（Auburn, CA）製抗ＣＤ１３３抗体ＡＣ１４１、及び免疫後抗血清）とインキュベーションされた。細胞は、ＰＢＳで５回洗浄され、その後、１時間室温で、抗マウスＩｇＧと結合したＡｌｅｘａ５９４とインキュベートされた。細胞は、ＰＢＳで更に洗浄され、その後、蛍光顕微鏡下で視覚化された。画像は、ProgRes C3（登録商標）ソフトウェアを用いて取得され、その後、Adobe Photoshop（登録商標）を用いて処理された。
【０１４０】
実施例６−ＣＤ１３３ｃＤＮＡトランスフェクション
ＣＤ１３３−ＩＲＥＳ  ＧＦＰ又はＣＭＶ  ＧＦＰ構築物は、製造者の指示に従って、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤトランスフェクション試薬を用いて、Ｕ８７細胞にトランスフェクトされた。手短に言えば、細胞は、１０ｃｍディッシュにプレートされた。１２時間後、１０μｇのｐＤＮＡは、血清フリー増殖ＤＭＥＭに希釈され、４０μｌのトランスフェクション試薬と混合された。１５分間のインキュベーション後、トランスフェクション混合物は、細胞に添加された。４８時間後、細胞は、フローサイトメトリーのために、非酵素的細胞解離バッファ（Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）を用いて回収された。
【０１４１】
実施例７−ＦＡＣＳ染色
初代のヒト神経膠芽腫ＧＢＭ６細胞、Ｕ８７、又はＣａｃｏ−２細胞は、３回洗浄され、１００μｌのＰＢＳに懸濁された。細胞は、ＣＤ１３３／２（２９３Ｃ３）（Miltenyi Biotec, Auburn, CA）又は１００μｌのハイブリドーマクローン７上清のいずれかで染色され、４℃で３０分間インキュベートされ、３回洗浄され、その後１００μｌのＰＢＳに懸濁された。細胞は、更に４℃で３０分間、１０μｌの抗マウスｈｙｌｉｔｅ６４７（１：４０希釈；American Qualex, San Clemente, CA）とインキュベートされ、３回洗浄され、フローサイトメトリーにより分析された。
【０１４２】
実施例８−免疫組織化学
ヒト腎臓又は神経膠芽腫組織の５μｍパラフィン切片は、帯電したスライドに乗せられた。切片は、標準的な方法を用いて脱パラフィン化及び再水和され、水道水の流水でリンスされ、５分間ＰＢＳ槽中に置かれた。スライドは、３０分間、ＥＤＴＡバッファ（ｐＨ８．０）の入った染色ディッシュ有する余熱蒸気槽中でその後インキュベートされ、その後２０分間冷却された。スライドは、最低５分間、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄され、その後、以下のインキュベーションステップ：血清フリーバックグラウンドSniper（Biocare Medical, Concord, CA）、４℃で一晩のハイブリドーマ上清の１：２００希釈における一次抗体、Leica Bond post primary、Leica Bond polymer、及びDAB chromagen developerを用いたブロッキング、に供された。切片は、よくリンスされ、ヘマトキシリンで対比染色され、脱水され、カバースリップで密閉され、画像化された。
【０１４３】
実施例９−ツニカマイシン処理及び分析
Ｃａｃｏ−２細胞は、６−ウェルプレートに播種され、３日間、２．５μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌのツニカマイシン又はビヒクル（０．１％ＤＭＳＯを含む培地）で処理された。サンプルは、一連のウェルから培地を取り除くこと、及びＲＩＰＡバッファに細胞を溶解することにより、毎日回収された。溶解物は、細胞残屑を取り除くために遠心分離され、その後一次抗体として、ハイブリドーマクローン７又は抗ＧＡＰＤＨ（Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）を用いて、ウェスタンブロッティングにより分析された。
【０１４４】
実施例１０−ｓｃＦｖのクローニング及び発現
概要
ヒト  プロミニン−１−特異的マウスＭＡｂのｓｃＦｖ遺伝子クローンは、作り出された。最初に、マウスｓｃＦｖライブラリーは、ハイブリドーマ細胞株由来のＲＮＡを用いて構築された。手短に言えば、全てのＲＮＡ精製及び第一鎖のｃＤＮＡ合成後、独自の２ステップＰＣＲプロトコールは、ｓｃＦｖをコードする遺伝子レパートリーを増幅するために用いられた。ＶＨ及びＶＬ遺伝子プールは、別々に合成されたｃＤＮＡから増幅された。ｓｃＦｖ遺伝子は、オーバーラップＰＣＲを用いてＶＨ及びＶＬ断片をランダムに融合することにより、組み立てられた。ｓｃＦｖ  ｃＤＮＡ及びｐＣＤｉｓｐｌａｙ−４ベクターは、一つの、稀に切断する制限酵素ＳｆｉＩにより消化された。ライゲーション後、組み換え構築物は、エレクトロ−コンピテント大腸菌ＸＬＩ−ＢＬＵＥに形質転換された。３７℃で一晩培養後、増幅された組み換えファージミドは、細菌から抽出され、−２０℃で保存された。ライブラリー構築は、一回の形質転換のみにより達成され、１．０ｘ１０7の理論的サイズを有した。
【０１４５】
その後、標準的なパンニングプロセスが行なわれた。再増幅されたライブラリーは、３７℃で１〜２時間、９６−ウェルプレートに、予めコートされたヒト  プロミニン−１とインキュベートされた。複数回の洗浄後、結合ファージ抗体は、低ｐＨバッファで溶出された。回収された組み換えファージは、パンニングの次のラウンドのために、大腸菌中で増幅された。３ラウンドのパンニング後、３０個ののランダムに選択されたクローンは、ファージＥＬＩＳＡにより、プロミニン−１に対するこれらの反応性について、調べられ、９個の陽性クローンが同定された。ＤＮＡ配列決定の結果は、これらの５つが同一であることを示し、これらが、全て、単一のハイブリドーマクローン：抗プロミニン−１  ＭＡｂを分泌するハイブリドーマ細胞株に由来することを示す。
【０１４６】
これらの一つであるＮｏ．１１クローンは、発現のために、大腸菌Ｔｏｐ１０Ｆ’に形質転換された。ｓｃＦｖの可溶性発現は、大腸菌分泌機構を用いることにより達成され、低温（３０℃）で誘導された。発現されたｓｃＦｖは、培養培地及び大腸菌のペリプラズム空間に主に発見される。
【０１４７】
可溶性ｓｃＦｖ  ＥＬＩＳＡは、標的タンパク質との結合特異性を確かめるために行なわれた。培養培地及び大腸菌のペリプラズム空間の双方において発現された組み換えＮｏ．１１  ｓｃＦｖは、結合シグナルが、陽性対照である親の無傷の二価抗体よりも低いにも関わらず、ヒト  プロミニン−１タンパク質について特異的であった。
【０１４８】
結論としては、我々は、選択されたハイブリドーマクローンからｓｃＦｖ遺伝子／ｃＤＮＡを首尾よくクローンすることができた。
【０１４９】
材料及び試薬
抗原：６*ＨＩＳ融合タンパク質として、大腸菌において発現されるヒト  プロミニン−１。
ハイブリドーマ細胞株：抗ヒトＣ−プロミニン−１ネズミモノクローナル抗体（Ｎｏ．７）。
ＥＩＡ／ＲＩＡ  ストリップウェル  ９６−ウェルプレート：Corning（New York, NY）。
酵素：
ＲＴ：Superscript II 逆転写酵素、Invitrogen（Carlsbad, CA)
ＥｘＴａｑ：Takara Co.（Shiga, Japan）
Ｔ４リガーゼ：Invitrogen（Carlsbad, CA）
制限酵素：ＳｆｉＩ、Roche（Basel, Switzerland）
大腸菌ＸＬＩ−ＢＩｕｅ宿主株：Stratagene（La Jolla, CA）製。ＸＬＩ−Ｂｌｕｅは、アンバー終止コドンが認識されず、マウスＳｃＦｖ抗体がファージコートタンパク質ＩＩＩと融合され、ファージビリオンの表面上に提示される、抑制株である。
【０１５０】
大腸菌Ｔｏｐ１０Ｆ’宿主株：Invitrogen（Carlsbad, CA）製。Ｔｏｐ１０Ｆ’は、アンバー終止コドンが認識され、可溶性ｓｃＦｖ抗体が産生される、非抑制株である。
【０１５１】
ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ：Stratagene（La Jolla, CA）製。
【０１５２】
ＬＢ培地：１リットルあたり：１０ｇBacto-Tryptone、５ｇ酵母抽出物、５ｇＮａＣｌ。
【０１５３】
ＬＢ−Ａプレート：１ＬのＬＢ培地に１５ｇのアガーを添加し、オートクレーブし、冷却後、アンピシリン（ＡＭＰ）を１００μｇ／ｍＬまで添加した。
【０１５４】
ＳＢ培地：１リットルあたり：１０ｇ  ＭＯＰＳ、３０ｇトリプトン、２０ｇ酵母抽出物。溶解するまで撹拌され、ｐＨ７．０に滴定される。１２１℃で２０分間、オートクレーブされる。
【０１５５】
トップアガー：５０ｍＬのＬＢ培地に０．３５ｇのバクトアガーを添加。オートクレーブ。
【０１５６】
ＰＢＳ：１リットルあたり：８ｇ  ＮａＣｌ、０．２ｇ  ＫＣｌ、１．７ｇ  Ｎａ2ＨＰＯ4、０．１６３ｇ  ＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．４まで、ＨＣ１。
コーティングバッファ：０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ3（ｐＨ８．６）。
ＴＢＳバッファ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ。
【０１５７】
基質：Pierce（Rockford, IL）製のＴＭＢ及びＨ2Ｏ2。
ブロッキングバッファ１：ＴＢＳ（ｐＨ７．４）、１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ、０．０２％ＮａＮ3。フィルター滅菌され、４℃で保存される。
ブロッキングバッファ２：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、５ｍｇ／ｍＬ脱脂粉乳、０．０２％ＮａＮ3、４℃で保存。
【０１５８】
ＨＯＵＲＰ−結合抗Ｍ１３抗体：GE healthcare（Fairfield, CT）製。
ＨＯＵＲＰ−結合抗ＨＡタグ抗体：GenScript Co.（Piscataway, NJ）製。
ＨＯＵＲＰ−結合ヤギ抗マウス二次抗体：Golden Bridge Int., Inc.（Mukilteo, WA）製。
【０１５９】
酸性溶出バッファ：０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）。
【０１６０】
ファージ沈殿剤（ＰＥＧ／ＮａＣｌ）：２０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール−６０００、２．５Ｍ  ＮａＣｌ。オートクレーブ、室温で保存。
【０１６１】
全ＲＮＡ抽出キット：QIAGEN Co.（Valencia, CA）。
【０１６２】
プラスミド精製キット：QIAGEN Co.（Valencia, CA）。
【０１６３】
ベクター：ｐＣＤｉｓｐｌａｙ−４ベクター。
【０１６４】
アガロースゲルＤＮＡ断片回収キット：Takara Co.（Shiga, Japan）。
【０１６５】
ニトロセルロース膜：Bio-Rad Laboratories, Inc.（Hercules, CA）。
【０１６６】
【表３】
2013534813.tif 000004
【０１６７】
【表４】
2013534813.tif 000005
【０１６８】
【表５】
2013534813.tif 000006
【０１６９】
【表６】
2013534813.tif 000007
【０１７０】
【表７】
2013534813.tif 000008
【０１７１】
実験手順
抗原−抗体反応のバリデーション
ハイブリドーマ細胞は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で培養された。細胞が、コンフルエントであった場合、これらは、更に２〜３日培養された。上清は、ＥＬＩＳＡのために回収された。組み換えＣ−プロミニン−１タンパク質は、９６−ウェルプレート中に１：１０００希釈でコートされ、４℃で一晩インキュベートされた。コーィングバッファは、棄てられ、タンパク質は、１回洗浄され、３００μｌ／ウェルのミルクバッファが添加され、４℃で一晩インキュベートされた。
【０１７２】
ＥＬＩＳＡ。ハイブリドーマ上清は、１：１、１：１０、１：１００、１：５００に５％ミルクバッファで希釈され、５０μｌ／ウェルが添加され、３７℃で１時間インキュベートされた。ウェルは、４回洗浄され、５０μｌ／ウェルのヤギ抗マウス二次抗体−ＨＯＵＲＰ結合体は、１：２０００の希釈で添加され、３７℃で１時間インキュベートされた。４回洗浄され、５０μｌ／ウェルの基質で添加された。
【０１７３】
ＸＬＩ−ＢＬＵＥエレクトロコンピテント細胞及びＶＣＳＭ１３ヘルパーファージの調製
エレクトロコンピテント大腸菌−ＸＬＩ−Ｂｌｕｅの調製
１５ｍＬの予め暖められたＳＢは、アガープレート上に新しくストリークされたグリセロールストックから単一の大腸菌コロニーで、５０−ｍＬフラスコに植菌された。テトラサイクリンは、３０μｇ／ｍＬまで添加され、細胞は、２５０ｒｐｍ、３７℃で一晩培養された。２．５ｍＬの培養液は、５００ｍＬのＳＢ、１０ｍＬの２０％グルコース、及び５ｍＬの１Ｍ  ＭｇＣｌ2を含む６つの２−Ｌの各フラスコに希釈された。抗生物質は添加されなかった。フラスコは２．５時間後、６００ｎｍの光学密度（ＯＤ）が約０．７になるまで、２５０ｒｐｍ、３７℃で振盪された。６つのフラスコは、培養され、１２個の５００−ｍＬ遠心ボトルは、１５分間氷上で冷却された。全ては氷上維持され、可能な限り迅速に行なわれた。
【０１７４】
フラスコ培養液は、６個の予め冷却された５００−ｍＬ遠心ボトルに注がれ、４℃で２０分間、３，０００ｇで回転された。上清は、注ぎ出され、それぞれのペレットは、２５−ｍＬの予め冷却されたプラスチックピペットを用いて、２５ｍＬの予め冷却された１０％グリセロールに再懸濁された。２つの再懸濁されたペレットは、一つの予め冷却された５００−ｍＬ遠心ボトルに合わされ、予め冷却された１０％グリセロールは、約５００ｍＬまで添加された。他のペレットは、同時に合わされ、これまでと同様に回転された。各ペレットは、５００ｍＬの予め冷却された１０％グリセロールに再懸濁され、これまでのように回転された。上清は、注ぎ出され、各ペレットは、完全に均一になるまで、２５ｍＬの予め冷却された１０％グリセロールに再懸濁された。懸濁液は、予め冷却された５０−ｍＬチューブに移され、４℃で１５分間、２，５００ｇで回転された。その間、約５０個の１．５ｍＬマイクロ遠心チューブは、ドライアイス／エタノール槽中のラックにセットされた。
【０１７５】
各チューブからの上清は、ペレットが滑り落ち始めるまで、注意深く注ぎ出された。上清は、廃てられた。２５−ｍＬの予め冷却されたプラスチックピペットを用いて、各ペレットは、残っている容量に再懸濁され、３つの懸濁液は合わされた。末端が切断された１−ｍＬピペットチップは、用いられた。ドライアイス／エタノール槽中に置かれたマイクロ遠心チューブに迅速に一定分量、３００−μｌの容量を等分するために用いられた。チューブは、蓋をされ、−８０℃で保存された。
【０１７６】
ヘルパーファージ−ＶＣＳＭｌ３の調製
ＯＤ６００  ０．４における２００μｇ／ｍＬのＸＬＩ−Ｂｌｕｅは、３０分、３７℃の水槽中で、１０μｌの１００倍段階希釈のＶＣＳＭ１３ヘルパーファージで感染された。３ｍＬの溶解されたＨ−トップアガー（４２℃）は、添加され、温かいＬＢプレート上に注がれた。プレートは、セットされ、３７℃で一晩インキュベートされた。小さいプラークは、０．４のＯＤ６００において、５ｍＬの新鮮なＳＢに摘み取られ、３７℃で振盪され約２時間培養された。培養液は、２リットルフラスコ中５００ｍＬ  ＳＢに添加され、３７℃で１時間振盪して培養された。カナマイシンは、５０μｇ／ｍＬの最終濃度で添加され、フラスコは、３７℃で一晩振盪され、培養された。
【０１７７】
一晩の培養液は、１５分間１０，８００ｇで回転され、１００ｍＬのＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％ポリエチレングリコール６０００、２．５Ｍ  ＮａＣｌ）は、４００ｍＬ上清に添加され、１時間氷上に放置された。培養液は、３０分間１０，８００ｇで回転され、ＰＥＧ／ＮａＣｌは、注ぎ出された。ペレットは、８ｍＬ  ＰＢＳに再懸濁され、いくらか残っている細菌残屑を取り除くために、１０分間１１，６００ｇで回転された。上清は、新しい５０−ｍＬボトルに移され、４℃で保存された。
【０１７８】
マウスｓｃＦｖライブラリーの構築
マウスｓｃＦｖ増幅のためのプライマーは、合成された。全ＲＮＡは抽出され、ｃＤＮＡに逆転写された。抗ヒト  プロミニン−１ハイブリドーマ細胞全ＲＮＡの抽出及び精製は、QIAGEN RNeasy Micro Handbookに従って行なわれた。
【０１７９】
以下の成分は、ヌクレアーゼフリーマイクロ遠心チューブに添加された：
オリゴ（ｄＴ）20（５００μｇ／ｍＬ）        １μｌ
全ＲＮＡ                                  １０μｌ
１μｌ  ｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ）      １μｌ    
１２μｌ
【０１８０】
混合物は、５分間、６５℃に加熱され、その後素早く氷上で冷却された。チューブの内容物は、短いスピンにより、回収された。以下は、その後チューブに添加された：
５第一鎖バッファ                      ４μｌ
０．１Ｍ  ＤＴＴ                      ２μｌ
ＲＮａｓｅＯＵＴ（阻害剤）            １μｌ
Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ    １μｌ    
２０μｌ
【０１８１】
内容物は、混合され、４℃で５０分間インキュベートされた。反応は、７０℃で１５分間加熱することにより、不活性化された。
【０１８２】
ＰＣＲは、マウスｓｃＦｖをコードする遺伝子レパートリーを増幅するために、実行された。軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）断片の可変領域をコードするＤＮＡ配列は、独立して増幅され、オーバーラップ伸長ＰＣＲにより融合され、稀に切断するＳｆｉＩの二つの非対称部位を用いることにより、直接的にクローンされた。用いられるプライマー配列は、材料及び試薬の欄に示される。ｓｃＦｖ（ＶＬ−リンカー−ＶＨ）は、一つのＬａｃＺプロモーターの制御下で、単一の転写物として、転写される。抗体遺伝子とバクテリオファージ遺伝子ＩＩＩ間のアンバー終止コドンは、大腸菌の非抑制株において、可溶性ｓｃＦｖ断片の産生を可能にする。
【０１８３】
ＰＣＲ反応及び条件
ＶＬ及びＶＨの増幅のための第一ラウンドのＰＣＲ
Ｔａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）        ０．２５μＬ
１０Ｘ  ＰＣＲバッファ（Ｍｇ2+フリー）          ５．０μＬ
ＭｇＣｌ2（２５ｍＭ）                           ４．０μＬ
ｄＮＴＰｓ（各２．５ｍＭ）                      ４．０μＬ
ｃＤＮＡ                                        ２．０μＬ
プライマーｌ（ＶＨ又はＶＬの５’、１０μＭ）    １．０μＬ
プライマー２（ＶＨ又はＶＬの３’、１０μＭ）    １．０μＬ    
５０．０μＬまでＨ2Ｏを添加                   ５０．０μＬ
【０１８４】
第一ラウンドのＰＣＲ条件：
９４℃で５分間
３０サイクルの
９４℃で３０秒間
５６℃で３０秒間
７２℃で１分間
続いて７２℃で１０分間
【０１８５】
第一ラウンドのＰＣＲ産物の単離
ＰＣＲ産物は、１％アガロースゲル上で泳動され、正確なサイズのバンドは、切り出された（マウス抗体のＶＨ及びＶＬのサイズは、約４００ｂｐである）。ＤＮＡは、レジン結合キット（Takara Co., Shiga, Japan）により、精製された。
【０１８６】
ＰＣＲの第二ラウンド（オーバーラップ伸長）
ＰＣＲの第二ラウンドでは、適切な第一ラウンド生成物は、ｓｃＦｖ生成物を生成するために、等量のモル比で混合された。
【０１８７】
Ｔａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）        ０．２５μＬ
１０Ｘ  ＰＣＲバッファ（Ｍｇ2+フリー）          ５．０μＬ
ＭｇＣｌ2（２５ｍＭ）                           ４．０μＬ
ｄＮＴＰｓ（各２．５ｍＭ）                      ４．０μＬ
Ｆｄ（５０ｎｇ）                                ２．０μＬ
軽鎖（５０ｎｇ）                                ２．０μＬ
ＲＳＣ−Ｆ（１０μＭ）                          １．０μＬ
ＲＳＣ−Ｂ（１０μＭ）                          １．０μＬ    
５０．０μＬまでＨ2Ｏを添加                   ５０．０μＬ
【０１８８】
以下の条件下で、ｓｃＦｖのためのＰＣＲを行なった：
９４℃で５分間
２０サイクルの
９４℃で３０秒間
５６℃で３０秒間
７２℃で２分間
続いて７２℃で１０分間
【０１８９】
第二ラウンドのＰＣＲ産物の単離
ＰＣＲ産物は、１％アガロースゲル上で泳動され、正確なサイズのバンドは、切り出された（マウス抗体のｓｃＦｖのサイズは、約８００ｂｐである）。ＤＮＡは、レジン結合キット（Takara Co., Shiga, Japan）により、精製された。
【０１９０】
ｓｃＦｖ  ＰＣＲ産物及びｐＣＤｉｓｐＩａｙ−４ベクターの制限酵素消化
ＰＣＲ産物の消化反応は、以下を含む：
１０μｇの精製されたｓｃＦｖ産物
１６０ユニットのＳｆｉＩ（１μｇのＤＮＡあたり１６ユニット）
２０μｌの１０バッファＭ
２００μＬまで水を添加
【０１９１】
ｐＣＤｉｓｐｌａｙ−４ベクターの消化反応は、以下を含むべきである：
２０μｇのｐＣＤｉｓｐｌａｙ−４ベクター
１２０ユニットのＳｆｉＩ（１μｇのＤＮＡあたり６ユニット）
２０μｌの１０バッファＭ
２００μＬまで水を添加
【０１９２】
双方の消化物は、５０℃で５時間インキュベートされた。消化されたｓｃＦｖ及びベクターは、１％アガロースゲル（二重に切断されたベクターの正確なサイズは、約３４００ｂｐであり、ここで、線形化したベクターＤＮＡは、５０００ｂｐである）上で精製された。
【０１９３】
消化されたｓｃＦｖと消化されたベクターＤＮＡのライゲーション
以下のライゲーション混合物は、１６℃で一晩インキュベートされた：
ｐＣＤｉｓｐｌａｙ−４ベクター  ２μｇ
ｓｃＦｖ  ３μｇ
５バッファ  ４０μｌ
Ｔ４リガーゼ  １５μｌ
２００μＬまで水を添加
【０１９４】
ライゲーション産物のコンピテント大腸菌ＸＬＩ−ＢＬＵＥ細胞への形質転換
ライゲーション産物は、１μＬのグリコーゲン、１μＬの酵母ｔＲＮＡ、及び２０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム、及び４００μＬのエタノールを添加することにより沈殿され、混合物は−２０℃で一晩保存された。
【０１９５】
ライゲーション産物混合物は、４℃で１５分間、マイクロ遠心機で、最大速度で回転された。上清は除かれ、棄てられた。ペレットは、１ｍＬの７０％エタノールで２回リンスされ、ペーパータオルの上に逆さにされて、水気を切った。ペレットは、穏やかにボルテックスすることにより、３０μｌの水に溶解された。
【０１９６】
３００μＬのエレクトロコンピテント大腸菌は、氷上で溶かされた。コンピテント細胞は、ライゲートされたライブラリーサンプルに添加され、１回、上下にピペットすることにより混合され、キュベットに移された。キュベットは、１分間氷上に置かれ、その後、２．５ＫＶでエレクトロポレートされた。キュベットは、すぐに１ｍＬの予め温められたＳＢで、その後２ｍＬで２回フラッシュされた。キュベットをフラッシュするために用いられる５μｌのＳＢは、５０−ｍＬフラスコに合わされた。フラスコは、３７℃で１時間、２５０ｒｐｍで振盪された。
【０１９７】
１０ｍＬの予め温められたＳＢ、及び３μＬの１００ｍｇ／ｍＬ  ａｍｐRは、フラスコに添加された。１５−ｍＬの培養液は、３７℃で１時間、２５０ｒｐｍで振盪された。形質転換された細菌の力価を調べるために、２μｌの培養液は２００μＬのＳＢ培地に希釈され、１００μＬ及び１０μｌのこの１：１００希釈は、ＬＢ＋ａｍｐRプレート上にプレートされた。プレートは、３７℃で一晩インキュベートされた。
【０１９８】
８０ｍＬの予め温められたＳＢ、５ｍＬの２０％グルコース、及び９７μＬのａｍｐRは、培養液に添加された。１００−ｍＬ培養液は、３７℃で１晩、２５０ｒｐｍで振盪された。
【０１９９】
細菌細胞は、一晩の培養液の遠心分離により回収され、ファージミドは、ＱＩＡＧＥＮキットを用いることにより、精製された。ファージミドは、−２０℃で保存された。
【０２００】
ヒト  プロミニン−１に対するライブラリーパンニング
ライブラリー再増幅（ｒｅａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）
１０μｇのマウスｓｃＦｖライブラリーファージミドは、３００μＬのエレクトロコンピテントＸＬＩ−ＢＬＵＥ細胞に電気的に形質転換された。キュベットは、すぐに１ｍＬの予め温められたＳＢで、その後２ｍＬで２回フラッシュされ、その５ｍＬは、５０−ｍＬフラスコに合わされた。フラスコは、３７℃で１時間、２５０ｒｐｍで振盪された。
【０２０１】
１０ｍＬの予め温められたＳＢ、３μｌのａｍｐR及び３０μｌのｔｅｔRは添加された。１５ｍＬの培養液は、３７℃で１時間、２５０ｒｐｍで振盪された。４．５μＬのａｍｐRは添加され、フラスコは、３７℃で更に１時間、２５０ｒｐｍで振盪された。
【０２０２】
４ｍＬのＶＣＳＭ１３ヘルパーファージは添加され、培養液は、５００−ｍＬフラスコに移された。１８０ｍＬの予め温められたＳＢ培地、９２．５μＬのａｍｐR及び３７０μＬのｔｅｔRは添加された。２００−ｍＬの培養液は、３７℃で１．５時間、３００ｒｐｍで振盪された。
【０２０３】
２００μＬの５０ｍｇ／ｍＬ  ＫａｎRは添加され、振盪は、３７℃、２５０ｒｐｍで、４〜５時間続けられた。培養液は、４℃で１５分間、３，０００ｇで回転された。５０ｍＬ  ５*ＰＥＧ／ＮａＣｌは添加され、培養液は、３０分間、氷上で保存された。それは、４℃で１５分間、１５，０００ｇで回転された。上清は、棄てられた。ボトルは、ペーパータオル上に逆さにすることにより水気を切られ、残った液体は、遠心ボトルの上部からペーパータオルで拭き取られた。
【０２０４】
ファージペレットは遠心ボトルの側面にそって、上下にピペットすることにより、２ｍＬのＴＢＳ中１％ＢＳＡに再懸濁された。懸濁液は、１．５ｍＬチューブに移され、それはボルテックスされ、４℃で５分間、マイクロ遠心機で、最大速度で回転された。上清は、４℃で保存された。
【０２０５】
ヒト  プロミニン−１に対するライブラリーパンニング
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルは、５０μｌの０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ3、ｐＨ８．６中２μｇのヒト  プロミニン−１でコートされ、４℃で一晩インキュベートされた。コーティング溶液は、ウェルから振ってあけられ、ウェルは、３００μｌのＴＢＳ中１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）を添加することによりブロックされた。プレートは密閉され、４℃で一晩インキュベートされた。
【０２０６】
ブロッキングバッファは、ウェルから振ってあけられ、５０μＬの新鮮な、調製されたファージライブラリーは、各ウェル（４ウェル）に添加された。プレートは密閉され、３７℃で２時間インキュベートされた。
【０２０７】
ファージ溶液は、ウェルから振ってあけられ、ウェルは、ＥＬＩＳＡプレート洗浄装置により５回洗浄された（第二ラウンドにおいて１０回洗浄され、第三ラウンドにおいて１５回洗浄された）。
【０２０８】
最終洗浄溶液を振ってあけられた後、５０μＬの０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．２は、添加され、プレートは、３７℃で１０分間インキュベートされた。溶液は１０回激しく上下にピペットされ、溶出液は、６μｌの中和溶液（１Ｍ  Ｔｒｉｓ）を含むマイクロ遠心チューブに移された。溶出液は、２−ｍＬ  ＸＬＩ−ＢＬＵＥ細胞に移され、３７℃で３０分間インキュベートされた。
【０２０９】
６ｍＬの予め温められたＳＢ培地及び１．６μＬの１００ｍｇ／ｍＬ  ａｍｐR、及び１２μｌの５ｍｇ／ｍＬ  ｔｅｔRは、細胞に添加された。８−ｍＬの培養液は、３７℃で１時間、２５０ｒｐｍで振盪された。２．４μＬのａｍｐRは添加され、培養液は、３７℃で更に１時間、２５０ｒｐｍで振盪された。
【０２１０】
２ｍＬのＶＣＳＭ１３ヘルパーファージは、８−ｍＬの培養液に添加され、培養液はフラスコに移された。９０ｍＬのＳＢ培地、及び４６μｌのａｍｐR、及び１８４μｌのｔｅｔRは添加された。１００−ｍＬの培養液は、３７℃で１．５時間、２５０ｒｐｍで振盪された。
【０２１１】
１００μｌの５０ｍｇ／ｍＬ  ｋａｎRは添加され、振盪は、３７℃で一晩、２５０ｒｐｍで続けられた。
【０２１２】
培養液は、４℃で１５分間、３，０００ｇで回転され、２５ｍＬ  ５*ＰＥＧ／ＮａＣｌは添加され、培養液は、３０分間氷上で保存された。
【０２１３】
培養液は、４℃で１５分間、１５，０００ｇで回転された。上清は棄てられた。ボトルは、ペーパータオル上に逆さにすることにより水気は切られ、残った液体は、遠心ボトルの上部からペーパータオルで拭き取られた。
【０２１４】
ファージペレットは、２ｍＬのＴＢＳ中１％ＢＳＡで、遠心ボトルの側面にそって、上下にピペットすることにより再懸濁された。懸濁液は、１．５ｍＬチューブに移され、ボルテックスされ、マイクロ遠心機で、４℃で５分間、最大速度で回転された。上清は、パンニングの次のラウンドのために、４℃で保存された。
【０２１５】
パンニングの第三ラウンドは行なわれた。
【０２１６】
ファージＥＬＩＳＡ
３０個のコロニーは、ライブラリーパンニング第三溶出滴定プレートから、ランダム選択され、１００μｇ／ｍＬ  ａｍｐRを含む２ｍＬ  ＬＢ培地に植菌された。２−ｍＬチューブは、３７℃で５〜８時間、２５０ｒｐｍで振盪された。
【０２１７】
４０μｌのヘルパーファージＶＣＳＭ１３は、各培養液に添加され、３７℃で更に２時間振盪された。
【０２１８】
２μｌのｋａｎRは、各培養液に添加され、培養液は、３０℃で一晩、２５０ｒｐｍで振盪された。
【０２１９】
培養液は、１５分間、１２，０００ｒｐｍで遠心分離され、上清は回収された。ファージを含む上清は、等量の５％ミルクで希釈され、室温で１０分間インキュベートされた。
【０２２０】
１００μｌの希釈されたファージは、各ウェルに添加され、３７℃で２時間インキュベートされた。
【０２２１】
プレートは、５回洗浄された。
【０２２２】
１ウェルあたり、５０μｌの希釈された二次抗体結合物は、１：３，０００（５％ミルクに希釈されたＨＯＵＲＰ−結合抗Ｍ１３抗体）で添加され、３７℃で１時間インキュベートされた。
【０２２３】
プレートは、５回洗浄された。５０μｌ／ウェルＴＭＢ基質は、検出のために添加され、室温で３０分間インキュベートされた。
【０２２４】
ＤＮＡ配列決定及びバイオインフォマティックス分析
９つのクローンは、ファージＥＬＩＳＡにより、ヒト  プロミニン−１と特異的に反応することが分かっており、これらは、Ｎｏ．４、５、６、７、８、１０、１１、２２、２３である。プラスミドは抽出され、配列決定のためのプライマーは：Ｐ１：５’−ＡＡＧＡＣＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＣＡＧ−３’（配列番号４５）、及びＰ２：５’−ＧＣＣＣＣＣＴＴＡＴＴＡＧＣＧＴＴＴＧＣＣＡＴＣ−３’（配列番号４６）である。
【０２２５】
リターン配列は、専門家用ソフトウェア（DNA Star）を用いて翻訳され、タンパク質配列は、アライメントされた。
【０２２６】
ｓｃＦｖ原核生物発現
配列決定結果に従って、Ｎｏ．１１クローンは、発現のために、大腸菌  宿主であるＴｏｐ１０Ｆ’に形質転換された。単一のコロニーが選択され、１００μｇ／ｍＬ  ＡｍｐRを含むＬＢ培地中で、３７℃で一晩培養された。ＩＰＴＧは、ｌｍＭの最終濃度まで添加され、３０℃で一晩誘導された。
【０２２７】
一晩の培養液は、回収され、５分、１０，０００ｒｐｍで回転された。上清及びペレットは、発現検出のために回収された。タンパク質は、２  ＳＤＳサンプルバッファと１００℃で１０分間煮沸することにより、変性された。タンパク質サンプルは、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、ニトロセルロース膜（Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA）に転写された。膜は、ミルクブロッキングバッファを用いて、室温で１時間ブロッキングされ、室温で１．５時間、１：２００希釈におけるＨＯＵＲＰ−結合抗ＨＡタグ抗体とインキュベートされ、洗浄バッファ中で４回洗浄され、タンパク質は、製造者（Pierce, Rockford, IL）により奨められる化学発光アッセイにより検出された。
【０２２８】
可溶性ｓｃＦｖ  ＥＬＩＳＡ
単一のコロニーは、ＬＢ−Ａｍｐプレート中のＮｏ．１１ＤＮＡで形質転換されたＴｏｐ１０Ｆ’大腸菌から選択され、１００μｇ／ｍＬ  Ａｍｐを含む２５ｍＬ  ＬＢ培地に植菌するために用いられた。培養液は、３７℃で一晩、２５０ｒｐｍで振盪された。
【０２２９】
２５ｍＬの一晩の培養液は、Ａｍｐを含む５００ｍＬ  ＬＢに希釈され、ＯＤ６００が０．５〜０．７に達するまで、３７℃で約２時間、２５０ｒｐｍで振盪された。ＩＰＴＧは、最終濃度１ｍＭまで添加された。培養液は、３０℃で一晩振盪された。
【０２３０】
培養液は、４℃で２０分間、５，０００ｇで遠心分離された。上清は、ＥＬＩＳＡのために保存された。
【０２３１】
細胞ペレットは、プロテアーゼ阻害剤（１ｍＭ  ＰＭＳＦ）を含む５０ｍＬの氷冷されたＰＢＳで完全に懸濁され、短いバースト（short bursts）において、氷上で超音波処理された。出力設定は、７分間、４０％出力サイクル５（ＨＤ２２００Ｗ／ＭＳ  ７３）であった。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００は、最終濃度１％で細胞溶解液に添加され、融合タンパク質の可溶化を助けるために、室温で穏やかに３０分間混合された。
【０２３２】
混合物は、４℃で３０分間、１５，０００ｒｐｍ（Ｈｅｒａｅｕｓ  ＃３３３４ローター）で遠心され、上清は、ＥＬＩＳＡのために回収された。
【０２３３】
２つの上清（一方は一晩の培養液上清からであり、他方は、一晩の培養ペレットからである）は、等量の５％ミルクを含む可溶性マウスｓｃＦｖで希釈され、室温で１０分間インキュベートされた。
【０２３４】
１００μｌの希釈されたｓｃＦｖは、（ヒト  プロミニン−１でコートされた）各ウェルに添加され、３７℃で１時間インキュベートされた。
【０２３５】
プレートは、５回洗浄された。
【０２３６】
１ウェルあたり、５０μｌの希釈された二次抗体結合物は、１：２，０００（５％ミルクに希釈されたＨＯＵＲＰ−結合抗ＨＡ）で添加され、３７℃で１時間インキュベートされた。
【０２３７】
プレートは、５回洗浄された。
【０２３８】
５０μｌ／ウェルＴＭＢ基質は、検出のために添加され、室温で３０分間インキュベートされた。
【０２３９】
抗原−抗体反応のバリデーション
陰性及びブランク対照下で、ＭＡｂを含む上清は、１：１、１：１０、１：１００、１：５００希釈において、ヒト  プロミニン−１と特異的に反応し得、抗ヒトＣ−プロミニン−１ネズミモノクローナル抗体（Ｎｏ．７）は、その抗原と、高い特異性及び親和性で結合し、その可変領域のクローニング及び発現は、実現可能であることを示す。
【０２４０】
ｓｃＦｖフォーマットを用いたミニマウス抗体ライブラリーの構築
ミニマウスｓｃＦｖライブラリーは、２ステップで構築された。ＶＬ及びＶＨの可変領域遺伝子プールは、最大限の多様性を維持するために、これらの対応するバックワード及びフォーワードプライマーを用いて増幅された。ＶＨについて１９の組み合わせ（１９ｘ１）、及びＶＬについて５１の組み合わせ（１７ｘ３）のうち、４つのＶＨ及び７つのＶＬの組み合わせは、増幅された陽性バンド（約４００ｂｐ）を有した。精製後、ＶＨ及びＶＬ遺伝子は、ｓｃＦｖ遺伝子を伸長させるために、オーバーラップ伸長（約８００ｂｐ）により、互いに組み合わせられた。オーバーラップｓｃＦＶ  ＰＣＲ産物及びｐＣＤｉｓｐｌａｙ−４ベクターは、ＳｆｉＩを用いて消化された。ライゲーション後、ライゲーション産物は、ＸＬＩ−ＢＬＵＥに形質転換され、得られた組み換えファージミドは、−２０℃で保存された。単一のエレクトロポレーションにより、１．０ｘ１０7のメンバーを含むファージ抗体ライブラリーは、構築された。
【０２４１】
ヒト  プロミニン−１に対するバイオパンニング
マウスｓｃＦｖライブラリーは、ヒト  プロミニン−１に対して、パンニングされた。表８に見られるように、パンニングの３回のラウンド後、特異的ｓｃＦｖクローンの濃縮は、効率的であり、第一から第三ラウンドまでのパンニングから、相対的な収率の３９４倍（６．３ｘ１０-5／１．６ｘ１０-7）の増加を達成する。
【０２４２】
【表８】
2013534813.tif 000009
【０２４３】
ファージＥＬＩＳＡ
３ラウンドのパンニング後、３０個のランダムに選択されたファージクローンは、スクリーニングされ、９個は、ファージＥＬＩＳＡにより、ヒト  プロミニン−１タンパク質と特異的に反応することが分かった（表９）。結合特性を有するＡ４５０の値は、プロミニン−１に対する陽性対照であると考えられた。
【０２４４】
【表９】
2013534813.tif 000010
【０２４５】
配列決定の結果
９個の陽性クローンは、首尾よく配列決定され、これらの推定されるアミノ酸配列は、下記に列挙される（表１０）。DNA Starソフトウェアを用いたこれらの配列解析は、Ｎｏ．５、８、１１、２２、２３の重鎖及び軽鎖可変領域が同一であることを明らかにした。また、全ての配列は、互いに大変近く、これらが、単一のハイブリドーマクローンである、抗プロミニン−１ＭＡｂを分泌するハイブリドーマ細胞株由来であることを示す。そのバリエーションは、ＰＣＲ又は配列決定による。
【０２４６】
【表１０】
2013534813.tif 000011
【０２４７】
Ｎｏ．１１は、発現のために、大腸菌Ｔｏｐ１０Ｆ’に形質転換された。そのＤＮＡ配列は、下記に列挙される。
【０２４８】
【表１１】
2013534813.tif 000012
【０２４９】
可溶性形態で発現されたｓｃＦｖの検出
大腸菌Ｔｏｐ１０Ｆ’に形質転換することにより、可溶性組み換えＮｏ．１１ｓｃＦｖ抗体は産生される。Ｔｏｐ１０Ｆ’は非抑制株であるので、アンバー終止コドンは翻訳され、可溶性ｓｃＦｖ抗体は、産生される。ｓｃＦｖの可溶性発現は、大腸菌分泌機構及びを用いることにより達成され、低温（３０℃）で誘導された。
【０２５０】
発現されたｓｃＦｖは、培養培地及び大腸菌のペリプラズム空間に主に発見された。培養上清及びペレット中の発現された可溶性ｓｃＦｖはウエスタンブロットで検出された。ｓｃＦｖは、３４ｋＤａのサイズでＨＡ−融合タンパク質として発現されたので、検出抗体は、ＨＯＵＲＰ−結合抗ＨＡタグ抗体であった。
【０２５１】
可溶性ｓｃＦｖに基づくＥＬＩＳＡ
可溶性ｓｃＦｖＥＬＩＳＡは、標的タンパク質との結合特異的性を確かめるために行なわれた。ここで、発現されたｓｃＦｖは、ヒト  プロミニン−１で予めコートされたプレートにより捕捉され、ＨＡタグと融合した可溶性ｓｃＦｖの結合は、抗ＨＡ  Ａｂ−ＨＯＵＲＰ結合体で検出された。表１２に示されるように、結合シグナルは、陽性対照である親の無傷の二価抗体よりも低いにも関わらず、培養培地及びペリプラズム空間の双方において発現されるＮｏ．１１  ｓｃＦｖは、ヒト  プロミニン−１タンパク質に特異的であることが確認された。上清及びペレットは、試験サンプルであり、ＰＣは陽性対照を意味し、ハイブリドーマにより分泌された抗体（１：２０００で希釈）が用いられ、ＢＬＫはブランクを意味する。
【０２５２】
【表１２】
2013534813.tif 000013
【０２５３】
ファージディスプレイ技術を用いることにより、我々は、首尾よく、ヒト  プロミニン−１に対するネズミＭＡｂのＶＬ及びＶＨ遺伝子をクローン化及び選択し、大腸菌宿主においてそのｓｃＦｖ断片を発現させた。
【０２５４】
ヒト  プロミニン−１特異的ＭＡｂ［クローン７］に由来する新しく構築されたマウスｓｃＦｖライブラリーによる、ヒト  プロミニン−１に対するパンニングの３回のラウンド後、９個のクローン、即ちＮｏ．４、５、６、７、８、１０、１１、２２、２３は、陽性ファージＥＬＩＳＡシグナルを有して検出された。ＤＮＡ配列決定は、これらの内の全ての重鎖及び軽鎖可変領域が同様であったことを明らかにした。特に、Ｎｏ．５、８、１１、２２及び２３は同一であり、これらは全て、抗プロミニン−１ＭＡｂを分泌する単一のハイブリドーマ細胞株に由来することを示す。
【０２５５】
Ｎｏ．１１クローンは、Ｔｏｐ１０Ｆ’大腸菌宿主において、可溶性ｓｃＦｖタンパク質を発現するために用いられた。３０℃で一晩誘導後、発現されたｓｃＦｖは、培養培地及び大腸菌のペリプラズム空間中で主に発見された。
【０２５６】
最終的に、可溶性ｓｃＦｖに基づくＥＬＩＳＡは、標的タンパク質に対するＮｏ．１１  ｓｃＦｖ抗体の特異的な結合を確認し、このｓｃＦｖ遺伝子がその対応物（ｂｏｄｙ）である、ヒト  プロミニン−１−特異的ＭＡｂに由来することを示す。
【０２５７】
このＮｏ．１１クローンのＤＮＡ配列は、元のハイブリドーマのＶＨ及びＶＬ断片の実際のｃＤＮＡ配列である。他のｓｃＦｖクローンの配列中の小さな改変は、ＰＣＲ及びＤＮＡ配列決定に由来し得る。
【０２５８】
従来、ＭＡｂは、免疫付与されたマウスからのＢ細胞と同種からのミエローマ細胞とを融合させることにより産生される。この不死化ハイブリドーマ細胞株の中でも、Ｂ細胞は、そのエピトープに対するＭＡｂを分泌し、ミエローマ細胞株は、これらを不死化させ、それは、これらが無限に増殖及び分裂し得ることを意味する。ＭＡｂをコードするｓｃＦｖ遺伝子がハイブリドーマ全ＲＮＡからクローン化される場合、おそらく、我々は抗原特的に再構成された免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子を意味するが、ミエローマは、Ｂ細胞起源であり、抗体の分泌のために必要な全ての細胞性機構を有し、多くは遺伝子を転写し、これらのタンパク質を分泌さえする。従って、ハイブリドーマの２つのパートナー細胞がコードする抗体ＶＨ及びＶＬ遺伝子は、互いにミスマッチであり、ｓｃＦｖクローニングの失敗をもたらす可能性が存在する。
【０２５９】
いくつかの様々な分析に基づいて、５又はそれ以上のファミリーに組織される１００超のマウス重鎖生殖細胞系配列、及び同様の数のｋ軽鎖生殖細胞系配列が存在することが推測されている。従って、１対のプライマーを用いて、抗原特異的抗体ＶＨ及びＶＬ遺伝子を増幅することは難しい。変性したプライマーが用いられ得るにもかかわらず、この手法は、必然的に、再構成された遺伝子の部分の５’及び３’を改変し、組み換えｓｃＦｖの低タンパク質発現、又は更には非発現を導く。
【０２６０】
上述のこれらの問題を回避するために、ファージディスプレイ技術は、ヒト  プロミニン−１特異的ＭＡｂ  ｓｃＦｖ構築物をクローン化するため、及び原核生物発現を行なうために、用いられる。２セットのマウス特異的ＶＨ及びＶＬプライマーは設計され、全てのプライマーの組み合わせを用いて行なわれるＰＣＲは、全ての再構成された可変領域の増幅を理論的に可能にする。増幅されたＶＨ、ＶＬプールは、その後、クローニングのために用いられる最終的なｓｃＦｖ遺伝子を提供するために、オーバーラップＰＣＲを介して、連結される。従って、双方の末端において真正な残基を含むＶＨ、ＶＬ遺伝子レパートリーが増幅され、ＳｃＦｖ遺伝子プールは、ＶＨ及びＶＬの最大の組み合わせを与え、それは、プロミニン−１−特異的ＭＡｂのｓｃＦｖクローンを確実に含む。
【０２６１】
プロミニン−１に対するパンニングの３回のラウンド後、９個のクローンは、陽性ファージＥＬＩＳＡシグナルを有して検出された。ＤＮＡ配列決定は、これらの内の５個が同一であることを明らかにし、これらが全て、抗プロミニン−１  ＭＡｂを分泌する単一のハイブリドーマ細胞株由来であったこと、及びこのクローニング戦略は功を奏することを示した。
【０２６２】
リンカーの長さは、ｓｃＦｖ分子の会合状態に影響を与えるように見える。長いリンカー（約２０個のアミノ酸）は、単量体分子を好むように見える一方で、短いリンカー（例えば、５個のアミノ酸）は二量体を好むように見え、一つのｓｃＦｖ分子のＶＨは、他方のＶＬと対を成し、また逆も同様である。この研究では、１８−アミノ酸長のリンカー（ＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＧＳＳＲＳＳ；配列番号７４）がＶＨ及びＶＬ断片を接続するために用いられる。
【０２６３】
実施例１１
Ｕｌｔ−Ｌｕｃ又はＣＭＶ−ＣＤ１３３ｐＤＮＡ構築物は、製造者（Polyplus Transfection）の指示に従って、ＪｅｔＰＥＩトランスフェクション試薬を用いて、ＨＥＫ２９３−ＴＬＲ２細胞にトランスフェクトされた。手短に言えば、７．５ｘ１０5細胞／ウェルは、６−ウェルプレートに播種された。１２時間後、２．５μｇの各ｐＤＮＡは、５μｌの５％デキストロースに希釈され、また５μｌの５％デキストロース中で、０．３５μｌのＪｅｔＰＥＩと混合された。１５分間のインキュベーション後、トランスフェクション混合物は、細胞に添加された。４８時間後、細胞は、フローサイトメトリーのために非酵素的細胞解離バッファ（Sigma- Aldrich Corp., St. Louis, MO）を用いて回収された。
【０２６４】
ＣＤ１３３ｓｃＦｖは、２４：１のＦＩＴＣ：ｓｃＦｖ比において、ＦＩＴＣ（Invitrogen, Carlsbad, CA）で標識され、任意の遊離の未結合のＦＩＴＣを取り除くために透析された。オリゴヌクレオチドは、ＣＤ１３３の既知のＧｅｎｅＢａｎｋ配列から調製され、その後ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）−ＤＮＡ複合体を用いてＨＥＫ２９３−ＴＬＲ２細胞にトランスフェクトされた。細胞は、抗ＣＤ１３３ｓｃＦｖ−ＦＩＴＣ複合体とインキュベートされ、洗浄され、その後、BD FACScanto IIフローサイトメーターで試験された。データは、％陽性細胞が蛍光強度に対してプロットされる、標準的なヒストグラム形式で表される。ＣＤ１３３でトランスフェクトされた細胞のみが、ＦＩＴＣ標識されたＣＤ１３３ｓｃＦｖと反応した。対照は、空ベクターと反応したトランスフェクトされた細胞、アイソタイプ対照と反応したトランスフェクトされた細胞、又はＣＤ１３３−ＦＩＴＣと反応しないトランスフェクトされていない細胞を含む。結果は、図４に示される。
【０２６５】
実施例１２−ｄＣＤ１３３ＤＥＬの構築
一本鎖ＣＤ１３３ＫＤＥＬをコードするハイブリッド遺伝子の合成及び組み立ては、ＤＮＡ−シャッフリング及びＤＮＡクローニング技術を用いて達成された。完全に組み立てられた融合遺伝子（５’末端〜３’末端）は、ＮｃｏＩ制限酵素認識部位、ＡＴＧ開始コドン、２４３個のアミノ酸のヒトｄＣＤ１３３についての遺伝子、重鎖及び軽鎖ｓＦｖ間のグリシン  セリン（Ｇ４Ｓ）３リンカー、７個のアミノ酸のＥＡＳＧＧＰＥリンカー、Ｃ末端においてＲＥＤＬＫを置き換えるＫＤＥＬを含む緑膿菌外毒素（ＰＥ）分子の最初の３６２個のアミノ酸、及び構築物の３’末端におけるＮｏｔＩ制限酵素認識部位からなる。結果物である１８４６ｂｐのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ断片遺伝子は、イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシドで誘導可能なＴ７プロモーターの制御下で、ｐＥＴ２８ｃ細菌発現ベクターにスプライスされた。ＤＮＡ配列解析（Biomedical Genomics Center, University of Minnesota）は、遺伝子が、配列中で正確であり、フレームでクローン化されることを確かめるために用いられた。減少した免疫原性を有する脱免疫化ＣＤ１３３ＫＤＥＬ（ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬ）を作製するために、ＰＥ３８上の７つの主なエピトープを表す８個のアミノ酸は、QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene, La Jolla, CA）を用いて変異導入された。以下のアミノ酸：Ｒ４９０Ａ、Ｒ５１３Ａ、Ｒ４６７Ａ、Ｅ５４８Ｓ、Ｋ５９０Ｓ、Ｒ４３２Ｇ、Ｑ３３２Ｓ、Ｒ３１３Ａは、改変され、ＤＮＡ配列決定により確認された。
【０２６６】
実施例１３−ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬ融合タンパク質は、インビトロで扁平上皮性悪性腫瘍細胞を死滅させる。
頭頸部癌細胞株ＵＭＳＣＣ−１１Ｂは、２４ウェル組織培養プレート中で培養された。手短に言えば、１ウェルあたり１０，０００細胞がプレートされた。融合タンパク質を含む培地は、毎日交換された。ウェルは、トリプシン／生理食塩水溶液を用いて１日おきに回収され、トリパンブルー生体染色色素で染色され、血球計測器で顕微鏡的に計測された。未処理のウェルは、典型的に８日でコンフルエントになった。０．５ｎＭ  ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬを含むウェルでは、細胞増殖は、未処理のウェル中の細胞と比較して阻害された。同様の濃度の対照抗Ｂ細胞標的毒性ＣＤ２２ＫＤＥＬを含むウェルでは、増殖は阻害されなかった。結果は、図６に示される。
【０２６７】
実施例１４
腫瘍イニシエーション研究のために、ＵＭＳＣＣ−１１Ｂ扁平上皮性悪性腫瘍細胞は、１匹のマウスあたり、３００，０００細胞の濃度で、ヌードマウスの右脇腹に注射された。腫瘍サイズはデジタルキャリパーを用いて、各週２回測定され、腫瘍体積は計算された。３つの実験的細胞群は試験された。（８０％超の純度で、幹細胞技術ＦＩＴＣ選択磁気ビーズキットを用いて）ＣＤ１３３発現について濃縮されたＵＭＳＣＣ−１１Ｂ細胞を与えられた動物は、増殖の高い発生率（７５％）を示し、濃縮された癌幹細胞集団と一致する及び早い速度で増殖した。分類されていない細胞（対照）は、３８％の腫瘍発生率を有し、著しく遅く増殖した（ｐ＜０．０４）。第三の群のマウスは、６日間、ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬと培養された細胞が与えられた。これらのマウスは、４つのうち１つのみで低いレベルの腫瘍取り込みを有し、この腫瘍は遅い速度で増殖した。データは、ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬが、腫瘍イニシエーションを阻害することを示す。結果は、図７に示される。
【０２６８】
実施例１５
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、２４ウェル組織培養プレート中で培養された。手短に言えば、１ウェルあたり１０，０００個の細胞がプレートされた。融合タンパク質を含む培地は、毎日交換された。ウェルは、トリプシン／生理食塩水溶液を用いて１日おきに回収され、トリパンブルー生体染色色素で染色され、血球計測器で顕微鏡的に計測された。１ｎＭ又は１０ｎＭのｄＣＤ１３３ＫＤＥＬを含むウェルでは、細胞増殖は、未処理のウェル中の細胞と比較して、阻害された。同様の濃度の対照抗Ｔ細胞標的毒性ＣＤ３ＣＤ３ＫＤＥＬを含むウェルでは、増殖は遅かったが、完全に阻害されなかった。ＮＴＲ−未処理。結果は、図８に示される。
【０２６９】
実施例１６
ＣＤ２２+ＣＤ１９+Ｄａｕｄｉ細胞に関するリガンドを標的とするＣＤ２２ＣＤ１９と結合された脱免疫化毒性の効果を測定するために、増加する濃度の脱免疫化毒性で作られた２２１９ＫＤＥＬ  ７ｍｕｔは、脱免疫化されたいない毒性で作られた非変異導入２２１９ＫＤＥＬと、増殖アッセイにおいて比較された。データは、％対照応答として、図１１に表される。
【０２７０】
抗毒素抗体を検出するために、免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、脱免疫化された薬物又は脱免疫化されていない薬物のいずれかを用いて免疫付与された。マウスは、数週間、毎週免疫付与された。個々のマウスからの血清は、μｇ／ｍｌ抗毒素ＩｇＧを測定する改変されたＥＬＩＳＡにおいて分析された。データは、平均μｇ  ＩｇＧ／ｍｌとして、表される。二つの群は、有意に異なり（ｐ＜０．０５）、脱免疫化された薬物は、何回かの免疫付与後、抗毒素の約８０％の減少を示した。結果は、図１２に示される。
【０２７１】
中和する抗体が存在するかどうか測定するために、免疫付与されたマウスからの血清は、２２１９ＫＤＥＬの一定の阻害濃縮を中和するこれらの能力について試験された。データは％対照応答として表される。ＳＡＬ＝血清抗毒素レベル。脱免疫化さていない薬物を用いて免疫付与されたマウスからの血清は中和したが、脱免疫化された薬物を用いて免疫付与されたマウスからの血清は、中和しなかった。結果は、図１３に示される。
【０２７２】
脱免疫化された２２１９ＫＤＥＬ  ７ｍｕｔが有効的であるかどうか測定するために、Ｒａｊｉ−ｌｕｃ細胞の致死注射を与えられたＳＣＩＤマウスは、３回の薬物、又は３日目に開始される対照ＣＤ３ＣＤ３ＫＤＥＬで処置された。プールされたデータ（実験１及び２）は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットとして表される。薬物は、極めて有効的であり、癌の発症を防ぐことができた。結果は、図１４に示される。
【０２７３】
実施例１７
マウスモデル
我々のマウスモデルは、以下の特徴を含む。１）乳癌及び膵臓癌モデルにおける細胞は、全身的に与えられてもよく、癌は、肝臓を含むいくつかの主要な臓器に転移する。２）我々は、薬物を用いて、全身的に、腹腔内的に処置する。３）我々は、リアルアタイムに腫瘍の進行を追うことができる。我々は、生物発光イメージングにより、時間に亘る薬物処置の効果を追い、各時点でマウスを屠殺することなく内部で起きていることを可視化できるように、我々は、ホタルルシフェラーゼ及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子を用いた我々の上皮性悪性腫瘍株の全てを遺伝子的に操作することにより、これを達成した。全てのの腫瘍株は、安定的なトランスフェクタント、及び腫瘍原性又は抗原発現に変化がないことのために選択される。組織学的研究は、生物発光データを確かめるために行なわれた。オリジナルのトランスフェクションに用いられる遺伝子は、二つのレポーターである、ルシフェラーゼ及びＧＦＰをコードし、それは更なる情報を付加する。例えば、最近の研究では、我々は、腫瘍進行を観察するためにルシフェラーゼレポーターを、及び同じ動物において、腫瘍により標的化された特異的な臓器の位置を突き止めるために、ＧＦＰレポーターを用いた。我々がリアルタイムにインビボにおいて転移を可視化し、転移の進行の性質について学ぶことができることは、有利である。乳癌及び頭頸部癌については、細胞は、脾臓に外科的に埋め込まれる。膵臓癌細胞は、同所的に与えられる。細胞は、我々のモデルにおいて致命的であり、腫瘍は、最も一般的に、肝臓に転移する。４）長期の生存は、組織学研究により、腫瘍がないと検証される。組織学所見は、我々の生物発光イメージング結果と常に相関する。これらのモデルの値は、いくつかの最近の出版物において証明されている。
【０２７４】
全身性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍を有するマウスにおける腫瘍進行に関するｄＣＤ１３３ＫＤＥＬの効果
全身性腫瘍は、脾臓内注射を介して腫瘍細胞を注入することにより、ヌードマウスにおいて誘導された。脾臓内注射については小切開が行なわれ、鉗子は、脾臓を固定化するために用いられた。二百万個の細胞の半分は、逆流を避けるために、２７ゲージニードルを用いて、脾臓はゆっくりと注入された。マウスの腹腔内処置は、ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬを用いた腫瘍接種の６日後に、開始された。一回の処置は、１日おきに（ＭＷＦ）与えられる２０μｇの薬物の注射からなり、マウスは、６つのコースの処置が与えられた。動物は、毎週画像化された。生物発光強度は、光子／秒／ｓｒ／ｃｍ2の関数として測定された。対照は、処置されなかった。マウスは、リアルタイムで画像化され、画像はXenogen Ivis画像化システム（Xenogen Corporation, Hopkington, MA）を用いて捕捉され、IGOR Pro 4.09aソフトウェア（WaveMetrics, Inc., Portland, OR）で分析された。画像化の前に、マウスはイソフルランガスを用いて麻酔された。全てのマウスは、画像化の１０分前に、ルシフェラーゼのための基質として、１００μｌの３０ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−ルシフェリン水溶液（Gold Biotechnology, St. Louis MO）を受けた。全ての画像は、全ての画像は、５分の露光時間で表され、全ての関心領域（ＲＯＩ）は、光子／秒／ｓｒ／ｃｍ2の単位で表された。結果は図９に示される。
【０２７５】
併用治療
全身性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍は、脾臓内注射を介して細胞を与えることにより、ヌードマウスにおいて誘導された。マウスの処置は、準最適的用量のｄＣＤ１３３ＫＤＥＬ、準最適的用量のｄＥＧＦ４ＫＤＥＬ、又は準最適的用量の双方の混合物を用いて、腫瘍接種の６日後に開始された。一回の処置は、１日おきに（ＭＷＦ）与えられる４μｇのｄＣＤ１３３ＫＤＥＬ、又は３μｇのＥＧＦ４ＫＤＥＬの注射からなり、マウスは、４回の処置を受けた。最後の群は、組み合わされた双方の薬物を用いて処置された。動物は、毎週画像化された。生物発光強度は、光子／秒／ｓｒ／ｃｍ2の関数として測定された。対照は、処置されなかった。結果は、図１０に示される。
【０２７６】
実施例１８−ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬは、インビトロにおいてヒト膵臓腺上皮性悪性腫瘍ＭｉａＰａＣａ−２を阻害する。
タンパク質合成阻害は、抗癌活性の測定として用いられる。タンパク質合成を測定するために、我々は、3Ｈ−ロイシン取り込みを測定する標準的なアッセイを用いた。細胞（１０4／ウェル）は、９６ウェル平底プレートにプレートされ、３７℃、５％ＣＯ2において一晩インキュベートされた。種々の濃度のｄＣＤ１３３ＫＤＥＬは、３重に、ウェルに添加された。インキュベーションは、７２時間続けられ、［メチル−3Ｈ］−ロイシン（GE Healthcare, UK）は、インキュベーションの最後の２４時間に、添加された（１ウェルあたり、１μＣｉ）。プレートは、細胞を分離するために凍結され、その後ガラス繊維フィルター上に回収され、洗浄され、乾燥され、標準的なシンチレーション法を用いて計測された。結果は、図１６に示される。
【０２７７】
実施例１９−ＵＭＳＣＣ−１１Ｂ細胞におけるＣＤ１３３発現
ＵＭＳＣＣ−１１Ｂ細胞及び頭頸部癌細胞におけるＣＤ１３３発現。ＣＤ１３３発現は、フローサイトメトリーを用いて、ＵＭＳＣＣ−１１Ｂ細胞株において測定された。細胞は、暗所、氷上において、３０分間、抗ＣＤ１３３ｓｃＦＶ−ＦＩＴＣと反応させた。細胞はその後、生理食塩水を用いて３回洗浄され、フローサイトメーター（FACScanto(TM) II, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ）を用いて試験された。ブランク（未処理の細胞）は、非陽性細胞活性のゲートを確立するために用いられた。ＣＤ１３３は、頭頸部癌細胞株であるNA、及びＵＭＳＣＣ−１１Ｂの双方において、それぞれ５．９％、及び６％、発現した（表１３）。Ｃａｃｏ−２結腸直腸上皮性悪性腫瘍は、それがＣＤ１３３を過剰発現することが知られているので、陽性対照細胞株としてインキュベートされた。対照は、抗ＥｐＣａｍ−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ４５−ＦＩＴＣ、及び抗ＣＤ１９−ＦＩＴＣと反応した細胞を含む。ＣＤ４５及びＣＤ１９の発現は、主に、正常で有害な造血細胞に限られる。
【０２７８】
【表１３】
2013534813.tif 000014
【０２７９】
実施例２０−ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬは、インビトロにおいてヒト頭頸部癌細胞株ＮＡを阻害する
ＮＡ細胞（１０4／ウェル）は、９６ウェル平底プレートにプレートされ、３７℃、５％ＣＯ2において一晩インキュベートされた。種々の濃度のｄＣＤ１３３ＫＤＥＬは、３重にウェルに添加された。インキュベーションは、７２時間続けられ、［メチル−3Ｈ］−ロイシン（GE Healthcare, UK）は、インキュベーションの最後の２４時間に、添加された（１ウェルあたり、１μＣｉ）。プレートは、細胞を分離するために凍結され、その後回収された。データは、培地単独でインキュベートされた対照細胞と比較した、3Ｈ−ロイシン取り込みのパーセンテージとして表された。ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬは、タンパク質合成活性を阻害した。対照抗Ｔ細胞用量は、ＮＡ細胞と反応せず、活性を阻害しなかった。ｄＥｐＣＡＭ２３ＫＤＥＬは、この細胞株におけるＥｐＣＡＭ高発現のために、陽性対照として含まれた。結果は、図１７に示される。
【０２８０】
実施例２１−ＣＤ１３３−免疫粒子
細胞培養
Ｃａｃｏ−２細胞は、ＡＴＣＣから得られ、３７℃／５％ＣＯ2の加湿されたインキュベーターで、２０％ＦＢＳ（Invitrogen, Carlsbad, CA）、１％非必須アミノ酸（Sigma- Aldrich Corp., St. Louis, MO）、１％ピルビン酸ナトリウム（Sigma- Aldrich Corp., St. Louis, MO）、及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Sigma- Aldrich Corp., St. Louis, MO）を含む最小必須培地（ＭＥＭ）中で培養された。
【０２８１】
６−クマリンでロードされた、マレイミド機能化ＰＬＧＡナノ粒子の調製
ＰＬＧＡ（３０ｍｇ）及び６−クマリン（２５０μｇ）は、１ｍｌのクロロホルムに溶解された。水中油型エマルジョンは、氷槽上で５分間、プローブ超音波処理（１８〜２４Ｗ、Sonicator XL, Misonix, Inc., Faraiingdale, NY）することにより、８ｍｌの２．５％ｗ／ｖ水性ＰＶＡ溶液中にポリマー溶液を乳化させることにより形成された。２ブロック共重合体ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＭＡＬ（８ｍｇ）は、クロロホルム（２００μｌ）に溶解され、撹拌されながら、上記のエマルジョンに液滴滴下された。エマルジョンは、室温条件で１８時間撹拌後、２時間真空にされ、残存するクロロホルムを取り除いた。ナノ粒子は、超遠心分離（３５，０００ｒｐｍ、４℃で３５分間、Optima LE-80K, Beckman Coulter, Inc., Brea, CA）により回収され、脱イオン水で３回洗浄された。ナノ粒子懸濁液は、その後、凍結乾燥され（FreeZone 4.5, Labconco Corp., Kansas City, MO）、乾燥粉末を得た。
【０２８２】
ＣＤ１３３抗体と６−クマリンでロードされたマレイミド機能化されたポリ（乳酸−共−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ナノ粒子との結合
ＣＤ１３３抗体のイミノチオレーション：２０μｇのＣＤ１３３抗体（AC 141, Miltenyi Biotec, Auburn, CA）は、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含むリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ８）を用いて最終濃度１ｍｌに希釈された。これに、リン酸ナトリウム／塩化ナトリウムバッファ中で新しく調製された４μｌの１ｍＭ  ２−イミノチオランの溶液は添加され、ローター中で４℃で２時間インキュベートされた。イミノチオレートされた抗体溶液は、製造者のプロトコールに従って、Ｚｅｂａ脱塩カラム（Pierce, Rockford, IL）を用いて、Ｈｅｐｅｓバッファ混合物（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）で脱塩及びバッファ交換された。脱塩された抗体溶液は、４℃で３０分間、４０００ｒｐｍで遠心分離により、ウルトラ−４遠心分離フィルターユニット（AMICON, Millipore Corp., Billerica, MA）を用いて、更に濃縮された。
【０２８３】
抗体とマレイミド機能化ＰＬＧＡナノ粒子との結合：
先のステップで得られた濃縮された抗体溶液（約２００μｌ）は、１５ｍｇのマレイミド機能化ＰＬＧＡナノ粒子に添加され、蛍光６−クマリン色素でロードされ、７５０μｌのＨｅｐｅｓバッファ混合物に分散され、ローター中で約４．５時間、室温でインキュベートされた。粒子は、遠心分離（ベンチトップ遠心で１４０００ｒｐｍ、３０分間、又は超遠心で３００００ｒｐｍ、３０分間のいずれか）によりペレットにされ、オートクレーブされた脱イオン水で２回洗浄された。ナノ粒子懸濁液は、その後、凍結乾燥され（FreeZone 4.5, Labconco Corp., Kansas City, MO）、乾燥粉末を得た。
【０２８４】
ＣＤ１３３−ナノ粒子のウエスタンブロット
１ｍｇのＰＬＧＡ粒子（未結合（plain）、又はＣＤ１３３抗体と結合）は、２−メルカプトエタノールが添加された２５μｌの２ｘゲルローディングバッファ（Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA）に分散され、回転振盪器中で、室温で３０分間インキュベートされた。チューブは、８２℃に加熱された水槽に５分間置かれ、その後遠心分離され、ナノ粒子をペレットにした。約２０μｌの上清は、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分離され、基準ブロッター（Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA）を用いて、ニトロセルロース膜（Whatman Inc., Piscataway, NJ）に転写された。膜は、ＴＢＳＴ中５％脱脂粉乳で、４℃で一晩ブロックされ、その後、室温で１．５時間、５％脱脂粉乳／ＴＢＳＴ中で、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP, EMD Chemicals, Gibbstown, NJ）と結合した抗マウスＩｇＧとインキュベートされた。膜はその後ＴＢＳＴで３回洗浄され、SUPERSIGNAL WEST PICO化学発光基質（Pierce, Rockford, IL）を用いて視覚化された。結果は、図１８に示される。
【０２８５】
ＣＤ１３３−免疫粒子を用いたＣａｃｏ−２細胞の免疫染色
Ｃａｃｏ−２細胞は、１６−ウェル  チャンバスライドにプレートされた。培養の４日後、細胞は４％パラホルムアルデヒドで固定化され、ＤＰＢＳ中で洗浄され、その後２００ｍＭグリシンで１０分間インキュベートされた。細胞は、その後、ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ及び０．２％ゼラチンの溶液で１０分間ブロックされた。これは、続いて、ブロッキング溶液中で調製された６−クマリンでロードされたＣＤ１３３抗体結合ＰＬＧＡ粒子の懸濁液、又は関連する対照（陰性対照：６−クマリンでロードされた未結合のＰＬＧＡ粒子、及び二次抗体対照；陽性対照：抗ＣＤ１３３抗体ＡＣ１４１，Miltenyi Biotec, Auburn, CA）と、４℃で２時間インキュベーションされた。細胞は、ＰＢＳで３回洗浄され、室温で１時間、ＡＬＥＸＡ５９４結合抗マウスＩｇＧ（Invitrogen, Carlsbad, CA）で染色された。細胞は、更にＰＢＳで洗浄され、蛍光顕微鏡下で視覚化された。画像は、ProgRes C3（登録商標）ソフトウェア（Jenoptik AG, Jena, Germany）を用いて取得され、Photoshop（Adobe Systems, Inc., San Jose, CA）を用いて加工された。結果は、図２０に示される。
【０２８６】
フローサイトメトリー
６−クマリンでロードされたＰＬＧＡ粒子（未結合（plain）又はＣＤ１３３抗体と結合）はＰＢＳ中に最終濃度１ｍｇ／ｍｌまで分散され、ＡＬＥＸＡ６４７結合抗マウスＩｇＧ（Invitrogen, Carlsbad, CA）とローター中で、室温で２時間インキュベートされた。粒子は、５分、１２０００ｒｐｍでの遠心分離によりペレットにされ、ＰＢＳで一回洗浄され、その後フローサイトメトリーにより分析された。結果は、図１９に示される。
【０２８７】
Ｃａｃｏ−２細胞におけるＣＤ１３３抗体結合ＰＬＧＡ粒子の摂取
Ｃａｃｏ−２細胞は、２４−ウェルプレートに播種され、５％ＣＯ2インキュベーター中で培養された。コンフルエントの場合、細胞は、以下の一連のステップに供される：まず、完全増殖培地は、減少した血清培地（２％ＦＣＳを含む）で置き換えられ、４５分間インキュベートされた。これは、続いて、４℃で１時間、減少した血清培地中に分散された、ＣＤ１３３抗体結合ＰＬＧＡ粒子、又はＰＬＧＡ粒子（４０μｇ／ウェル）のいずれかとインキュベーションされた。次に、ナノ粒子処理は取り除かれ、ＰＢＳで１回洗浄され、その後細胞は、完全増殖培地を供給され、３７℃で１時間インキュベートされた。細胞は、その後、ＰＢＳで洗浄され、８ｍＭリン酸カリウムバッファ中１％ｗ／ｖ  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いて溶解された。細胞溶解物の一部は、凍結乾燥され、メタノールで抽出された。メタノール抽出物中の６−クマリン濃度は、ＨＰＬＣ分析により決定された。
【０２８８】
細胞溶解物中のナノ粒子濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Pierce, Rockford, IL）を用いて測定される全細胞タンパク質に対して、標準化された。結果は、図２１に示される。
【０２８９】
実施例２２
マウスは、ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬを用いた全身的な処置に非常に耐性を有した。マウスは、２０μｇ、５０μｇ、又は１００μｇのｄＣＤ１３３ＫＤＥＬのいずれかの腹腔内注射、１日休んで、第二の腹腔内注射を与えられた。生存率は、表１４に示される。生存した全ての動物は、薬物が優れた許容性を有し、インビボにおいて最小の毒性を有することを示す、最小限の体重損失を有して生存した。
【０２９０】
【表１４】
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【０２９１】
実施例２３
ヒト頭頸部側腹部腫瘍を有するヌードマウスにおけるインビボ腫瘍進行に関するｄＣＤ１３３ＫＤＥＬの効果。側腹部腫瘍進行は、頭頸部癌を研究するために、インビボモデルにおいて認められ、従って、マウス（ｎ＝５／群）は、３百万個のＵＭＳＣＣ−１１Ｂ細胞の側腹部注射を受けた。マウスの腫瘍内処置は、ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬを用いた腫瘍接種の６日後に開始された。１回の処置は、１日おきに（ＭＷＦ）与えられる２０μｇの薬物の注射からなり、マウスは、８回の注射が与えられた。Ａでは、腫瘍体積は、時間に亘りキャリパーを用いて測定された。矢印は、処置（Ｔｘ）の開始と終了を示す。Ｂでは、動物は、毎週画像化された。生物発光強度は、光子／秒／ｓｒ／ｃｍ2の関数として測定された。対照は、ＰＢＳで処理された。マウスは、リアルタイムで画像化され、画像はXenogen Ivis画像化システム（Xenogen Corporation, Hopkington, MA）を用いて捕捉され、IGOR Pro 4.09aソフトウェア（WaveMetrics, Inc., Portland, OR）で分析された。画像化の前に、マウスはイソフルランガスを用いて麻酔された。全てのマウスは、画像化の１０分前に、ルシフェラーゼのための基質として、１００μｌの３０ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−ルシフェリン水溶液（Gold Biotechnology, St. Louis MO）を受けた。全ての画像は、５分の露光時間で表され、全ての関心領域（ＲＯＩ）は、光子／秒／ｓｒ／ｃｍ2の単位で表された。双方の群からの代表的な動物は示される。ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬで処置されたＭ４−Ｍ６は、完全に応答し、５０日後、腫瘍が無くなった一方で、対照は応答しなかった。結果は、図２２に示される（ＮＤ−データなし）。
【０２９２】
実施例２４
ヒト頭頸部側腹部腫瘍を有するヌードマウスにおけるインビボ腫瘍進行に関するｄＣＤ１３３ＫＤＥＬの効果。この実施例は、腫瘍が、ヌードにおいて多くの細胞（６百万）超の腫瘍内注射により誘導され、マウスの処置が、ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬを用いた腫瘍接種の１０日後に開始される点をを除いて、実施例２３とほぼ同様に行なわれた。ヌードマウス（ｎ＝５／群）は、ＵＭＳＣＣ−１１Ｂ細胞の側腹部注射が与えられた。マウスの腫瘍内処置は、ｄＣＤ１３３ＫＤＥＬを用いた腫瘍接種の６日後に開始された。１回の処置は、１日おきに（ＭＷＦ）与えられる２０μｇの薬物の注射からなり、マウスは、８回の注射が与えられた。対照は、陰性対照である抗Ｂ細胞ＣＤ１９ＫＤＥＬで処理された、又は全く処置されなかった。生物発光強度は、光子／秒／ｓｒ／ｃｍ2の関数として測定された。対照は、ＰＢＳで処置された。マウスは、リアルタイムで画像化され、画像はXenogen Ivis画像化システムを用いて捕捉された。全ての関心領域（ＲＯＩ）は、光子／秒／ｓｒ／ｃｍ2の単位で表された。６０％の動物（５匹中３匹）は、検出可能な腫瘍増殖を有することなくｄＣＤ１３３ＫＤＥＬ処理に対して完全に応答し、一方で対照はいずれも応答しなかった。結果は、図２３に示される（ＮＤ−データなし）。
【０２９３】
実施例２５
細胞培養
患者９（Ｐ９−Ｆ）細胞株は、ＧＢＭと診断されたヒト患者から近年確立され、２μｇ／ｍｌピューロマイシン選択下でルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するように作られる。細胞は、１％非必須アミノ酸（Sigma- Aldrich Corp., St. Louis, MO）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Sigma- Aldrich Corp., St. Louis, MO）、Ｂ２７、Ｎ２、ブラストサイジン（Invivogen, Carlsbad, CA）、並びに２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ及びＦＧＦが懸濁された血清フリーＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で懸濁されたニューロスフェアとして維持された。細胞は、５％ＣＯ2を含む、加湿された３７℃大気中でインキュベートされた。腹腔内注射の前に、Ｐ９−Ｆニューロスフェアは、遠心分離され、非酵素的細胞解離バッファ（Sigma- Aldrich Corp., St. Louis, MO）中で解離され、単個細胞懸濁液を形成した。細胞数及び生存率は、Countess自動化細胞カウンター（Invitrogen, Carlsbad, CA）上で、トリパンブルー排除を介して決定された。
【０２９４】
Ｐ９−Ｆ頭蓋内（ＩＣ）注射
無胸腺症のｎｕ／ｎｕマウスは、５４ｍｇ／ｍｌケタミン及び９．２ｍｇ／ｍｌキシラジンの混合物の腹腔内注射で麻酔され、Ｋｏｐｆ定位固定ヘッドフレームに置かれた。頭皮は、ベタジンで拭かれ、正中切開は外科用メスで行なわれた。穿頭孔は、ブレグマに置かれた矢状方向の正中線から、横に２．５ｍｍ、前に０．５ｍｍに置かれた。Hamiltonシリンジ（２６ゲージ）は、尾状核被殻の正中線に対して頭蓋骨表面から３．３ｍｍの深さまでＰ９−Ｆ細胞を送達するために用いられた。腫瘍増殖は、生物発光画像化により評価された。
【０２９５】
ｓｃＦｖＣＤ１３３−ＫＤＥＬ腹腔内（ＩＰ）注射
Ｐ９−Ｆ細胞のＩＣ注射の１週間後、マウス（ｎ＝６）は、１０μｇ  ｓｃＦｖＣＤ１３３−ＫＤＥＬをＩＰに注射された。ｓｃＦｖＣＤ１３３−ＫＤＥＬの注射の２０分前に、１つの群（ｎ＝７）は、浸透性の血液脳関門（ＢＢＢ）破壊（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）を容易にするために、２ｍｇ／ｋｇ  ２５％マンニトールがＩＰに与えられた。投与計画は、２０μｇ  ｓｃＦｖＣＤ１３３−ＫＤＥＬを用いて、５日間の連続処理、２日間の休止、続いて５日間の連続処理からなる。
【０２９６】
マウスは、Ｄ−ルシフェリンを腹腔内に注射され、イソフルランで麻酔された。１５分後、マウスは、Xenogen IVIS Imaging Systemに置かれ、５分間画像化された。結果は、図２４に示される。赤色丸印は、光子束を定量する関心領域（ＲＯＩ）を表す。
【０２９７】
本明細書で引用される全ての特許、特許出願、及び刊行物、並びに電子的に入手可能な材料（例えばＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑにおけるヌクレオチド配列寄託、例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢにおけるアミノ酸配列寄託、並びにＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑにおいて注釈付きのコーディング領域からの翻訳を含む）の完全な開示は、これらの全体において参照により援用される。本願の開示と、参照により本明細書に援用される任意の文献（単数又は複数）の間で幾らかの矛盾が存在する場合、本願の開示が優先される。先述の詳細な説明及び実施例は、理解の明確性のためにのみ与えられる。不必要な限定は、これらから理解されない。本発明は、当業者に明らかであるバリエーションについて、示され、開示される厳密な記載に限定されず、請求項により定義される本発明内に含まれる。
【０２９８】
他に特に記載の無い限り、本明細書及び請求項に用いられる成分量及び分子量等の量を表すの全ての数字は、全ての場合において、用語「約」により修飾されているとして理解される。従って、他に特に記載の無い限り、それとは逆に、本明細書及び特許請求の範囲に説明される数値パラメーターは、本発明により得られる所望の特性に依存して変わり得る近似値である。少なくとも、特許請求の範囲と同等の学説を限定するための試みとしてではなく、各数値パラメーターは、少なくとも、報告される有効数字の数を考慮して、通常の丸めの技術（ordinary rounding technique）を適用することにより、構築されるべきである。
【０２９９】
本発明の広い範囲を説明する数値範囲及びパラメーターは、近似値であるにもか関わらず、特定の実施例に説明される数値は、できる限り正確に報告される。全ての数値は、しかしながら、これらのそれぞれの試験測定に見出される標準偏差に必ず起因する範囲を本質的に含む。
【０３００】
全ての見出しは、読者の利便性のためのものであり、特に記載の無い限り、見出しに続く文章の意味を限定するために用いられるべきではない。
【０３０１】
配列表フリーテキスト
【表１５】
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【０３０２】
【表１６】
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【０３０３】
【表１７】
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【０３０４】
【表１８】
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【０３０５】
【表１９】
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【０３０６】
【表２０】
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【０３０７】
【表２１】
2013534813.tif 000022
【０３０８】
【表２２】
2013534813.tif 000023
【０３０９】
【表２３】
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【０３１０】
参考文献
【表２４】
2013534813.tif 000025
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2013534813.tif 000029
【図５】
2013534813.tif 000030
【図６】
2013534813.tif 000031
【図７】
2013534813.tif 000032
【図８】
2013534813.tif 000033
【図９】
2013534813.tif 000034
【図１０】
2013534813.tif 000035
【図１１】
2013534813.tif 000036
【図１２】
2013534813.tif 000037
【図１３】
2013534813.tif 000038
【図１４】
2013534813.tif 000039
【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
2013534813.tif 000047
【図２３】
2013534813.tif 000048
【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年2月5日(2013.2.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ１３３と特異的に結合する、モノクローナル抗体。
【請求項２】
請求項１に記載のモノクローナル抗体の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）。
【請求項３】
配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、又は配列番号５８のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のｓｃＦｖ。
【請求項４】
前記ｓｃＦｖが、配列番号５８のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のｓｃＦｖ。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれか一項に記載のｓｃＦｖを含む、組成物。
【請求項６】
請求項１に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項７】
請求項１に記載のモノクローナル抗体；又は
請求項２〜４のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ
を含む標的部分；及び
細胞溶解毒素の治療的に活性な部分を含む毒素部分
を含む融合ポリペプチド。
【国際調査報告】
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