(57)【要約】  創傷、熱傷創傷、植皮片、褥瘡及び糖尿病性足部潰瘍の予防及び治療用の局所製剤の調製のための新規な相乗作用的医薬組成物が開示される。相乗作用的組成物は、１又は２以上の殺菌薬及び静菌薬と併用してマイトジェニックタンパク質を含む。本発明におけるマイトジェニックタンパク質は、組換えヒト上皮増殖因子（Bharat Biotech International Limited社のｒｈ−ＥＧＦ）及び／又はｒｈ−ＰＤＧＦ−ＢＢのような任意の他の成長因子であり、前記殺菌薬及び静菌薬は、広域抗生物質スルファジアジン銀（ＳＳＤ）及びクロルヘキシジングルコン酸塩（glucomate）（ＣＨＧ）である。相乗作用的組成物に加えて、前記局所製剤は、基剤成分、担体、保存剤、乳化剤、皮膚軟化剤及び無痛化剤並びに１又は２以上の他の構成物も含む。前記新規な組成物は、より広範な抗菌薬適用範囲、ｒｈ−ＥＧＦによるＳＳＤの銀効果の逆転、熱傷創傷における銀耐性微生物に対する有効性、及びより優れた及びより迅速な創傷治癒等の相乗効果をもたらす。前記新規な組成物は、クリーム剤、ゲル剤又は液剤の形態で局所製剤を調製するために用いることができる。前記新規な製剤は、保存期間がより長く、貯蔵温度２〜８℃で２年を超えて安定性がある。
2013527229.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイトジェニックタンパク質、１又は２以上の殺菌薬及び１又は２以上の静菌薬を含み、１又は２以上の他の成分をも含む、創傷、熱傷創傷、植皮片、褥瘡及び糖尿病性足部潰瘍の予防及び治療用の局所製剤の調製のための新規な相乗作用的医薬組成物。
【請求項２】
マイトジェニックタンパク質が、組換えヒト上皮増殖因子（ｒｈ−ＥＧＦ）、ＡＡ及び／又はＢＢの血小板由来成長因子（ｒｈ−ＰＤＧＦ−ＡＡ及び／又はＢＢ）又は任意の他の成長因子からなる群から選択される１又は２以上の成長因子である、請求項１に記載の局所製剤の調製のための新規な相乗作用的医薬組成物。
【請求項３】
殺菌薬及び静菌薬が、バシトラシン、スルファジアジン銀（ＳＳＤ）、ニトロフラゾン、クロルヘキシジングルコン酸塩（ＣＨＧ）、ポリミキシンＢ硫酸塩、ネオマイシン、ポビドンヨード、マフェニド、ニトロフラゾン及びゲンタマイシンからなる群から選択される、請求項１に記載の局所製剤の調製のための新規な相乗作用的医薬組成物。
【請求項４】
マイトジェニックタンパク質が、組換えヒト上皮増殖因子（ｒｈ−ＥＧＦ）である、請求項１又は２に記載の局所製剤の調製のための新規な相乗作用的医薬組成物。
【請求項５】
マイトジェニックタンパク質の濃度が、１μｇ／ｇ〜１５μｇ／ｇ ｗｔ／ｗｔである、請求項１又は２に記載の局所製剤の調製のための新規な相乗作用的医薬組成物。
【請求項６】
殺菌薬の濃度が、０．０００１％〜１０％である、請求項１又は３に記載の局所製剤の調製のための新規な相乗作用的医薬組成物。
【請求項７】
殺菌薬の濃度が、０．０００１％〜５％である、請求項１又は３に記載の局所製剤の調製のための新規な相乗作用的医薬組成物。
【請求項８】
殺菌薬が、広域抗生物質スルファジアジン銀（ＳＳＤ）である、請求項１又は３に記載の局所製剤の調製のための新規な相乗作用的医薬組成物。
【請求項９】
静菌薬が、広域抗生物質クロルヘキシジングルコン酸塩（ＣＨＧ）である、請求項１又は３に記載の局所製剤の調製のための新規な相乗作用的医薬組成物。
【請求項１０】
局所製剤における１又は２以上の他の成分が、
ジポリヒドロキシステアリン酸ＰＥＧ−３０、イソヘキサデカン、安息香酸Ｃ−１２−１５アルキル、二酸化チタン、ポリヒドロキシステアリン酸、ステアリン酸アルミニウム、アルミナ、硫酸マグネシウム、ステアリン酸、ソルビトール、メチルパラベンナトリウム、プロピルパラベンナトリウム、水酸化ナトリウム、ＥＤＴＡ二ナトリウム、アクリロイルジメチルタウリン酸アンモニウム／ＶＰコポリマー、ジパルミトイルヒドロキシプロリン、Bois II（商標）、セチルアルコール、安息香酸Ｃ１２−１５アルキル、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド、トコフェリル酢酸、ポリアクリルアミド、Ｃ１３−１４イソパラフィン、エトキシジグリコール、フェノキシエタノール、メチルパラベン、ブチルパラベン、エチルパラベン及びプロピルパラベン、トリエタノールアミン、軽質流動パラフィン、pemulen TR-1、カルボポールultrez、マンニトール、及び精製水からなる群から選択される、請求項１に記載の局所製剤の調製のための新規な相乗作用的医薬組成物。
【請求項１１】
局所製剤が、クリーム剤及び／又はゲル剤及び／又は液剤の形態である、請求項１に記載の局所製剤の調製のための新規な相乗作用的医薬組成物。
【請求項１２】
グラム陽性菌、グラム陰性菌、銀耐性細菌、嫌気性菌、酵母及び真菌に対して有効であり、より優れた及びより迅速な創傷治癒をもたらし、貯蔵温度２〜８℃で２年を超えて安定である、請求項１に記載の創傷、熱傷創傷、植皮片、褥瘡及び糖尿病性足部潰瘍の予防及び治療のための新規な相乗作用的医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、局所適用のための新規な相乗作用的医薬組成物に関する。より具体的には、本発明は、創傷、熱傷創傷、植皮片、褥瘡、糖尿病性足部潰瘍及び他の皮膚疾患の予防及び治療における使用のための局所製剤の調製のための新規な相乗作用的医薬組成物に関する。本発明の新規な製剤は、１又は２以上の相乗作用的に活性な成分及び１又は２以上の不活性成分を含む。相乗作用的に活性な成分は、１又は２以上の殺菌薬及び静菌薬と相乗作用的に組み合わせてマイトジェニック（mitogenic）タンパク質（成長因子）を含む。より具体的には、相乗作用的に活性な成分は、組換えヒト上皮増殖因子（ｒｈ−ＥＧＦ，Recombinant Human Epidermal Growth Factor）（Bharat Biotech International Limited社のREGEN-D（商標））及び／又は血小板由来成長因子（ｒｈ−ＰＤＧＦ−ＢＢ，Platelet Derived Growth Factor）、スルファジアジン銀（ＳＳＤ，silver sulfadiazine）及びクロルヘキシジングルコン酸塩（ＣＨＧ，chlorhexidine gluconate）を含み、１又は２以上の不活性成分は、担体、保存剤、乳化剤、皮膚軟化剤及び無痛化剤並びに１又は２以上の他の構成物を含むことができる。本発明の新規な組成物は、クリーム剤若しくはゲル剤の形態又は液剤の形態で創傷、熱傷創傷、植皮片、褥瘡、糖尿病性足部潰瘍及び他の皮膚疾患への適用のための局所製剤を調製するために用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
熱傷は、熱、寒さ、電気、化学薬品、摩擦又は放射線によって引き起こされる、皮膚が経験する任意の極端な状態である。熱傷は、組織液及び電解質平衡異常、熱傷部位の治癒の減速、代謝障害、筋肉異化及び生命維持を司る器官の様々な他の合併症を一般に伴い、細菌及び／又は微生物による感染などの第２の合併症をさらに有し得る。これらの合併症は、それぞれ生命を救うことにおいて包括的な熱傷管理を提供するために異なる薬剤／薬物を必要とする。
【０００３】
熱傷に関連する傷害及び死亡は、東南アジア、特に、インドなどの開発途上国における大きな問題である。ＷＨＯの報告のように、東南アジア地域は、世界負担の１０％にのぼり、インドだけで、熱傷に関連する死亡が年間３５，０００件を占める。ＵＳＡなどの先進国であっても、推定２１０万人の米国人が、毎年熱傷の医学的処置を求めている。熱傷患者における主な死亡原因の１つは、重症の全身感染である。これらの感染の第１の侵入経路は、未処置の熱傷表面の様々な細菌及び病原体への曝露である。皮膚バリアの破損、大量の皮膚細菌量、正常細菌叢が日和見病原体に変化する可能性及び免疫系の深刻な低下などの因子は、熱傷犠牲者において、通常、生命を脅かす敗血症に寄与する（Kucan JO. Robson MC, Heggers JP. et al. Comparison of silver sulfadiazine, povidoneiodine and physiologic saline in the treatment of chronic pressure ulcers. J Am Geriatr Soc. 1981:29:232-235）。熱傷表面の適切な創傷管理及び創傷の傷口が塞がることによる早期の再上皮化は、熱傷患者の治療及び予後において重要なステップである。
【０００４】
感染制御は、二次感染の予防において、また、妥当な熱傷創傷治癒過程を維持することにおいて、非常に重要な方法である。局所抗微生物（antimicrobial）薬の使用が、熱傷創傷における細菌バランスの確立に必須であるが、これは、皮膚増殖及びコラーゲン沈着の過程が大きな役割を果たしている熱傷創傷の治癒の遅れに関連している（McCauley RL, Li YY, Chopra V, Herndon DN, Robson MC. Cytoprotection of human dermal fibroblasts against silver sulfadiazine using recombinant growth factors. J Surg Res. 1994 Apr;56(4):378-84）。いくつかの研究では、組換えヒト上皮増殖因子（ｒｈ−ＥＧＦ）又は血小板由来成長因子（ｒｈ−ＰＤＧＦ−ＢＢ）などの成長促進因子の生成の遅延又は不足により、これらの受容体を用いる創傷治癒過程の遅延が起こり、これがII度及びIII度の熱傷で著しいことが示された。
【０００５】
組換えヒト上皮増殖因子ｒｈ−ＥＧＦは、標的細胞上で受容体キナーゼに結合することにより細胞増殖、移動及び分化を調節する成長因子のファミリーに属する（Vijay Viswanathan, MD, PhD; Sharad Pendsey, MD, MDDG; N. Sekar, MS, MNAMS, MCh, FICS; G.S.R. Murthy, PhD. A Phase III Study to Evaluate the Safety and Efficacy of Recombinant Human Epidermal Growth Factor (REGEN-DTM 150) in healing Diabetic Foot ulcers. Wounds 2006; 18(7): 186-196）。ｒｈ−ＥＧＦは、強力なマイトジェンとして、また、平滑筋細胞を含めて多くの細胞タイプについての分化因子として作用することが示されている（Lev-Ran A, Hwang DL: Epidermal growth factor and platelet-derived growth factor in blood in diabetes mellitus. Acta Endocrinol (copenh) 1990; 123(3) (September): 326-330）。動物における実験研究では、ｒｈ−ＥＧＦを局所適用することによって、中間層創傷（partial thickness wound）及びII度熱傷の表皮再生の速度を加速することが実証されている（Brown G L, Nannoy L B, Gritten J, Cramer A B, Yancey JM, Curtsinger LJ 3rd et al. Enhancement of wound healing by topical treatment with Epidermal growth factor. N Eng J Med 1989; 321(2) (July (13)): 76-9）。ｒｈ−ＥＧＦは、分子量６．２ｋＤａの５３個のアミノ酸からなるタンパク質であり、組換え遺伝子技術によって得られる。合成ｒｈ−ＥＧＦポリヌクレオチド配列をコードする新規なベクターを作製し、これを大腸菌（E.coli）において過剰発現させ、精製して、９８％を超える純粋なタンパク質が得られた（K. Sharma, P.V. Cherish Babu, P. Sasidhar, V.K.Srinivas, V. Krishna Mohan, Ella Krishna. Recombinant human epidermal growth factor inclusion body solubilization and refolding at large scale using expanded-bed adsorption chromatography from Escherichia coli, Protein Expression and Purification, 2008, 60, 7-14）。
【０００６】
創傷治癒の過程において、細胞増殖のシグナルは、ＥＧＦ受容体を介してｒｈ−ＥＧＦペプチドによって送られる。ＥＧＦ受容体は、ｒｈ−ＥＧＦ結合に関与する細胞質ドメイン及び細胞外ドメインと共に、チロシンキナーゼ膜貫通ドメインを有する。これにより、ＥＧＦ受容体を二量体形成させ、受容体を自己リン酸化させ、他のタンパク質をチロシンリン酸化させる。これは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰキナーゼ）経路を活性化し、最終的にＣ−Ｆｓなどの転写因子のリン酸化を起こして、増殖に寄与するＡＰ−１及びＥＬＫ−１を作り出す。ｒｈ−ＥＧＦに応答したＪＡＫキナーゼによるＳＴＡＴ−１及びＳＴＡＴ−３転写因子の活性化は、増殖性シグナル伝達に寄与する。さらに、ホスファチジルイノシトールシグナル伝達及びｒｈ−ＥＧＦ活性プロテインキナーゼＣによって誘導されるカルシウム放出は、ＥＧＦシグナル伝達の他の構成成分である。上記過程は、細胞を創傷に誘引し、これらの増殖を刺激し、肉芽組織の形成速度を上げ、コラーゲン産生を増加させる（Greenhalgh, DG. The Role of Growth Factors in Wound Healing. Journal of Trauma-Injury Infection & Critical Care 1996; 41(1): 159-7、Buckley A, Davidson JM, Kamerath CD, Woodward SC. Epidermal growth factor increases granulation tissue formation dose dependently. J. Surg Res. 1987; 43(4) 322-328）。
【０００７】
ｒｈ−ＥＧＦのような成長因子は、熱傷創傷を治癒する上で役立つが、熱傷創傷管理中に引き起こされる感染症を予防することが重要である。クローン化され、大腸菌において過剰発現された組換えヒト上皮増殖因子ｒｈ−ＥＧＦ（REGEN-D、Bharat Biotech International Limited社）は、治癒の期間をかなり短縮することにより、熱傷創傷の治癒を高めることが示される。しかし、熱傷創傷に伴うリスクは、微生物による感染の侵入である。これが、抗微生物薬が熱傷創傷管理において重要な役割を果たすところである。
【０００８】
従来技術において、様々な局所抗菌薬／抗微生物薬は、バシトラシン、ポリミキシンＢ硫酸塩、ネオマイシン、ポビドンヨード、マフェニド酢酸塩クリーム剤、ニトロフラゾン、ゲンタマイシンなどのような創傷ケアに使用可能である。
【０００９】
バシトラシンは、グラム陽性球菌及び桿菌に対して有効であるポリペプチド抗生物質である。バシトラシンは、ケラチノサイト増殖に影響を与えないが、創傷の再上皮化を強化することもできる。バシトラシンが細菌原形質膜の特性に作用し、分子合成に作用しないため、耐性株の発生率は増加しそうにない（Eaglstein WH, Mertz PM, Alvarez OM. Effect of topically applied agents on healing wounds. Clin Dermatol. 1984;2: 11 2-1 15）。
【００１０】
ポリミキシンＢ硫酸塩は、グラム陰性生物に対して有効である単純な塩基性ペプチド抗生物質である。ポリミキシンＢ硫酸塩は、ケラチノサイト増殖をより大幅に減少させる（Brown MRW, Wood SM. Relation between cation and lipid content of cell walls of Pseudomonas aen~ginosa,P roteus~'trlgaris. and KlebsieNa aerogenes and their sensitivity to polymyxin B and other antibacterial agents. JPharm Pharmacol. 1972;24:215-228）。
【００１１】
ネオマイシンは、広域抗生物質であり、グラム陰性生物に対して特に有効である。しかし、過敏症反応、特に、発疹のような副作用が、ネオマイシンでより頻発する（Cooper ML, Boyce ST, Hansbrough JF, et al. Cytotoxicity to cultured human keratinocytes of topical antimicrobial agents. J Surg Res. 1990;48:190-195）。
【００１２】
ポビドンヨードは、グラム陽性及びグラム陰性菌に対して有効な殺菌薬（bactericidal）である。臨床濃度でのポビドンヨードは、インビトロでヒト線維芽細胞及びケラチノサイトへの毒性があることを示している。ポビジンヨード（Povidine-iodine）はまた、創傷滲出物により不活性化することが報告されている。この局所薬剤は、創傷による焼痂を軟化させるのではなく硬化させる恐れがあり、したがって、創傷デブリドマンの困難及び不快感を高める（Kucan JO. Robson MC, Heggers JP. et al. Comparison of silver sulfadiazine, povidoneiodine and physiologic saline in the treatment of chronic pressure ulcers. J Am Geriatr Soc. 1981:29:232-235）。
【００１３】
マフェニド酢酸塩は、メチル化された局所スルホンアミド化合物である。この薬物は、ほとんどのグラム陰性及びグラム陽性病原体に対して広範囲の抗菌活性を有する。しかし、マフェニドの使用は、再上皮化に対して阻害性がある場合がある。マフェニドは、多形核白血球（ＰＭＮ）及びリンパ球活性を抑制する（Lindberg RB, Moncrief JA, Mason AD Jr. Control of experimental and clinical burn wound sepsis by topical application of sulfamylon compounds. Ann NY Acad Sci. 1968; 150:950-960）。
【００１４】
ニトロフラゾン化合物は、黄色ブドウ球菌（S.aureus）、エンテロバクター（Enterobactor）及び大腸菌に対して有効な広域抗菌薬であるが、緑膿菌（P.aeruginosa）に対してあまり有効ではなく、有意な殺真菌活性を有さない。ニトロフラゾンは、培地中のケラチノサイトの増殖及び遊走に悪影響を有することが示されている（Taddonio TE, Thomson PD, Smith DJ Jr, Prasad JK. A survey of wound monitoring and topical antimicrobial therapy practices in the treatment of burn injury. J Bum Care Rehabil. 1990;11:423-427）。ニトロフラゾンは、米国で熱傷センターにおいてあまり頻繁に用いられない。
【００１５】
ゲンタマイシンは、グラム陰性微生物に対して非常に有効である。ゲンタマイシンに対する耐性は、現れることがあり、この耐性によって、この薬剤の使用が確実に制限される。ゲンタマイシンは、ＰＭＮの活性を阻害することが示されている。皮膚過敏症がゲンタマイシンと共に報告されている（Hansbrough JF, Zapata-Sirvent RL, Cooper ML. Effects of topical antimicrobial agents on the human neutrophil resp~ratoryb urst. Arch Sulg. 1991;126:603-608）。
【００１６】
スルファジアジン銀（ＳＳＤ）は、１％水溶性クリーム剤として調製される硝酸銀及びスルファジアジンナトリウムの局所スルホンアミド化合物である。スルファジアジン銀は、広範囲のフローラ、特に、大腸菌、エンテロバクター、クレブシエラ（Klebsiella）種、緑膿菌のようなグラム陰性菌並びに黄色ブドウ球菌及びカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）のようなグラム陽性菌に対して有効である。
【００１７】
熱傷創傷に利用可能な様々な局所抗微生物薬、すなわち、上記で指定されたこれらの中のいくつかのうち、スルホンアミド誘導体は、グラム陽性及びグラム陰性細菌感染症に感染した異なる程度の熱傷創傷を治療するため並びに酵母に対して有効であるために、近年、受けるに値する評判を享受している。スルホンアミドのうち、ほとんどの熱傷患者における予防及び治療のために選択される薬物は、スルファジアジン銀（ＳＳＤ）であった。ＳＳＤは、熱傷創傷用に用いられる局所クリーム剤に一般に組み入れられる有効な広域抗微生物薬である。実際に、過去５０年間から、ＳＳＤは、微生物に感染した、異なる程度の熱傷創傷の治療のために従来から用いられてきた。
【００１８】
過去の研究では、ＳＳＤが他の抗微生物薬に対して耐性である細菌を阻害すること及びこの化合物が他の多くの抗微生物薬よりも優れていることが示されている。これは、微生物の細胞膜及び細胞壁に作用して、その殺菌効果をもたらす。銀は、細菌に選択的に毒性がある濃度でこの製剤からゆっくりと放出される。銀はまた、細菌細胞のＤＮＡを損傷する。他のスルホンアミドのようなスルファジアジンは、パラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）と競合することによりジヒドロ葉酸の細菌合成を阻害する。スルファジアジンは、ヒトの細胞に対して作用しない。
【００１９】
他の抗微生物薬、すなわち、クロルヘキシジングルコン酸塩（ＣＨＧ）は、現在の診療において広範に支持されている、強力で比較的非毒性の防腐薬である（LOWBURYE,. J. L., LILLEYH, . A. & BULL,J . P. 1960 Disinfection of the skin of operation sites. British Medical Journal 2, 1039-1044）。ＣＨＧは、重要な防腐薬、消毒薬、抗菌デンタルリンス、及び保存剤である。クロルヘキシジングルコン酸塩は、広範な抗微生物スペクトルを有し、グラム陽性菌、グラム陰性菌、ウイルス及び真菌に対して有効である。ＣＨＧは、細菌細胞壁及び細胞質の構成成分に結合し、浸透圧平衡を変化させ、また、細胞質構成成分を沈殿させる。低濃度で、クロルヘキシジンは、静菌性であり；より高濃度で、殺菌性である。クロルヘキシジングルコン酸塩は、角質層に結合するビスビグアニドであり、殺菌活性及び殺真菌活性を持続させる。クロルヘキシジングルコン酸塩は、全血などの有機材料の存在下でその有効性を失わない。ＣＨＧは、広範な細菌から吸収性材料の漏出を引き起こすよう微生物の細胞壁上に吸着され、タンパク質の構造に影響を与え、例えば、膜結合型ＡＴＰａｓｅを阻害し（HAROLD,F . M., BAARDAJ, . R., BARON,C . & ABRAMS,A . 1969 Dio 9 and chlorhexidine; Inhibition of membrane-bound ATPase and of cation transport in Streptococcus faecalis. Biochemica et Biophysica Acta 183, 129-136）、タンパク質の立体配置を変更し、細胞によるポリミキシンの取り込みを促進する。
【００２０】
ＳＳＤは過去５０年間熱傷創傷のための標準治療であるが、いくつかの研究では、この化合物が、成長促進因子の生成の遅延又は不足により、これらの受容体を用いる創傷治癒過程を遅延させ、これがII度及びIII度熱傷では著しいことが示された。また、銀の熱傷創傷からの吸収により、真皮再生を障害し、真皮組織の機械的強度を低下させる銀毒性をもたらす。ヒト皮膚線維芽細胞に関するいくつかのインビトロでの研究では、ＳＳＤ及びマフェニド酢酸塩の濃度の増加に伴う進行性細胞傷害活性を示している。同様の研究において、ＥＧＦ、塩基性線維芽細胞増殖因子、又は血小板由来成長因子へのヒト皮膚線維芽細胞の前曝露により、ＳＳＤの影響に対してヒト皮膚線維芽細胞の細胞保護作用をもたらす（Ae-Ri Cho Lee, Hyunju Leem, Jaegwan Lee, Kyung Chan Park. Reversal of silver sulfadiazine- impaired wound healing by epidermal growth factor. Biomaterials 2005;26:4670-4676）。
【００２１】
銀に対する細菌耐性の症例も報告されている。Casonらは、早くも１９６６年には熱傷創傷におけるグラム陰性桿菌においてこれを報告した（Cason JS, Jackson DM, Lowbury EJ, Ricketts CR. Antiseptic and aseptic prophylaxis for burns: use of silver nitrate and of isolators. Br Med J 1966; 2(525): 1288-94）。１９７０年代の終わりに、ＳＳＤに耐性のグラム陰性分離株（エンテロバクター・クロアカ（Enterobacter cloacae）、プロビデンシア・スチュアーティイ（Providencia stuartii）、及び緑膿菌）による熱傷創傷感染又はコロニー形成の大流行の報告が数件ある。銀への曝露が、耐性微生物を選択することができ、銀が広範に用いられる場合、これが本質的に銀−耐性細菌の優勢において重要な役割を果たし得ることが明らかである。
【００２２】
Liらは、インビトロにおける濃度を増加させるために曝露を繰り返すことによって高濃度の銀（１０２４ｐｐｍを超える）に対して細菌耐性の発生を報告した（Li XZ, Nikaido H, Williams KE. Silver-resistant mutants of Escherichia coli display active efflux of Ag+ and are deficient in porins. J Bacteriol 1997; 179(19): 6127-32）。
【００２３】
熱傷創傷の治療のためのＳＳＤの使用に関連する欠点により、ｒｈ−ＥＧＦと共にＳＳＤを含む、Bharat Biotech International Limited社（ＢＢＩＬ）による製剤が開発された。この組合せは、長期間のｒｈ−ＥＧＦの放出及び最適な創傷治癒効果のために必要な銀の送達の制限に役立つ。このＳＳＤ及びｒｈ−ＥＧＦの組合せの最も重要な機能は、ｒｈ−ＥＧＦのＳＳＤに対する細胞保護効果であり、また、ＥＧＦを同時に補充することによる障害された熱傷創傷治癒過程の可逆性において役立つ。これらの結果は、この組合せによって、熱傷患者における創傷治癒過程を促進することによりそこで銀の細胞毒性効果を逆転させる（reversal）上で役立つことが確立された。しかし、透過性バリアによる臨床サンプルにおいて報告されたＳＳＤに対する細菌耐性及び銀−耐性生物の発生についての可能性に関する懸念が持ち上がっている。
【００２４】
ＢＢＩＬのｒｈ−ＥＧＦ及びＳＳＤの組合せを用いた血流中のＥＧＦの透過性について研究がなされ、結果として、陰性であることが見出され、これにより、ＢＢＩＬで生成されたｒｈ−ＥＧＦは、血流中に入らないことが明らかに示された。熱傷患者におけるＳＳＤのＢＢＩＬのｒｈ−ＥＧＦとの組合せ試験は、真皮及び皮下組織の熱傷の瘢痕形成の促進に対するｒｈ−ＥＧＦの適用の有効性を示し、その結果、正常な皮膚と同一の外見、弾性及び色を有する皮膚をもたらし、大きな達成としては、肥厚性瘢痕がなかったことであった。これらの証拠は、おそらく、そのマイトジェニック効果により、ｒｈ−ＥＧＦの瘢痕形成に対する効果を示す。
【００２５】
ｒｈ−ＥＧＦ及びＳＳＤの組合せが、ＳＳＤの影響を逆転することにより創傷治癒の遅延の問題を解決するが、この製剤の最も重大な欠点は、スルホンアミド耐性が、ＳＳＤの不透過性によりしばしば認められることである。感染症を管理するためにイオン銀を用いることの医学的な利点にもかかわらず、細菌耐性の発生についての可能性に関する懸念が持ち上がっており、抗生物質に対する交差耐性との関連が暗示されている。銀−耐性生物は、臨床及び環境サンプルにおいて報告されている。ＳＳＤのＥＧＦとの組合せは、銀による細胞毒性効果を防止し得るにすぎず、障害された創傷治癒過程を回復する上で役立つ。しかし、この組合せは、透過性バリアによるＳＳＤに対する微生物耐性に対して有効となり得ない。この組合せは、銀に耐性の微生物に対する感染の予防に十分でなく、これは、創傷治癒過程を延長する恐れがある二次感染の原因、また、熱傷創傷への深刻な脅威をもたらす。
【００２６】
従来技術において、多数の抗微生物薬が試験され用いられている。その中でも最もよく知られる薬剤の１つは、スルファジアジン銀（ＳＳＤ）であり、これは、単独で又はクロルヘキシジングルコン酸塩（ＣＨＧ）のような他の抗微生物薬と併用して又はBharat Biotech International Limited社によって用いられる通りｒｈ−ＥＧＦとのＳＳＤの組合せとして用いられている。
【００２７】
しかし、従来技術の製剤には、より広域スペクトルの適用範囲、耐性の発生、金属イオン毒性、細胞毒性などのリスクがない、より速い創傷治癒をもたらすことが可能であるものはなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２８】
【非特許文献１】Kucan JO. Robson MC, Heggers JP. et al. Comparison of silver sulfadiazine, povidoneiodine and physiologic saline in the treatment of chronic pressure ulcers. J Am Geriatr Soc. 1981:29:232-235
【非特許文献２】McCauley RL, Li YY, Chopra V, Herndon DN, Robson MC. Cytoprotection of human dermal fibroblasts against silver sulfadiazine using recombinant growth factors. J Surg Res. 1994 Apr;56(4):378-84
【非特許文献３】Vijay Viswanathan, MD, PhD; Sharad Pendsey, MD, MDDG; N. Sekar, MS, MNAMS, MCh, FICS; G.S.R. Murthy, PhD. A Phase III Study to Evaluate the Safety and Efficacy of Recombinant Human Epidermal Growth Factor (REGEN-DTM 150) in healing Diabetic Foot ulcers. Wounds 2006; 18(7): 186-196
【非特許文献４】Lev-Ran A, Hwang DL: Epidermal growth factor and platelet-derived growth factor in blood in diabetes mellitus. Acta Endocrinol (copenh) 1990; 123(3) (September): 326-330
【非特許文献５】Brown G L, Nannoy L B, Gritten J, Cramer A B, Yancey JM, Curtsinger LJ 3rd et al. Enhancement of wound healing by topical treatment with Epidermal growth factor. N Eng J Med 1989; 321(2) (July (13)): 76-9
【非特許文献６】K. Sharma, P.V. Cherish Babu, P. Sasidhar, V.K.Srinivas, V. Krishna Mohan, Ella Krishna. Recombinant human epidermal growth factor inclusion body solubilization and refolding at large scale using expanded-bed adsorption chromatography from Escherichia coli, Protein Expression and Purification, 2008, 60, 7-14
【非特許文献７】Greenhalgh, DG. The Role of Growth Factors in Wound Healing. Journal of Trauma-Injury Infection & Critical Care 1996; 41(1): 159-7
【非特許文献８】Buckley A, Davidson JM, Kamerath CD, Woodward SC. Epidermal growth factor increases granulation tissue formation dose dependently. J. Surg Res. 1987; 43(4) 322-328
【非特許文献９】Eaglstein WH, Mertz PM, Alvarez OM. Effect of topically applied agents on healing wounds. Clin Dermatol. 1984;2: 11 2-1 15
【非特許文献１０】Brown MRW, Wood SM. Relation between cation and lipid content of cell walls of Pseudomonas aen~ginosa,P roteus~'trlgaris. and KlebsieNa aerogenes and their sensitivity to polymyxin B and other antibacterial agents. JPharm Pharmacol. 1972;24:215-228
【非特許文献１１】Cooper ML, Boyce ST, Hansbrough JF, et al. Cytotoxicity to cultured human keratinocytes of topical antimicrobial agents. J Surg Res. 1990;48:190-195
【非特許文献１２】Lindberg RB, Moncrief JA, Mason AD Jr. Control of experimental and clinical burn wound sepsis by topical application of sulfamylon compounds. Ann NY Acad Sci. 1968; 150:950-960
【非特許文献１３】Taddonio TE, Thomson PD, Smith DJ Jr, Prasad JK. A survey of wound monitoring and topical antimicrobial therapy practices in the treatment of burn injury. J Bum Care Rehabil. 1990;11:423-427
【非特許文献１４】Hansbrough JF, Zapata-Sirvent RL, Cooper ML. Effects of topical antimicrobial agents on the human neutrophil resp~ratoryb urst. Arch Sulg. 1991;126:603-608
【非特許文献１５】LOWBURYE,. J. L., LILLEYH, . A. & BULL,J . P. 1960 Disinfection of the skin of operation sites. British Medical Journal 2, 1039-1044
【非特許文献１６】HAROLD,F . M., BAARDAJ, . R., BARON,C . & ABRAMS,A . 1969 Dio 9 and chlorhexidine; Inhibition of membrane-bound ATPase and of cation transport in Streptococcus faecalis. Biochemica et Biophysica Acta 183, 129-136
【非特許文献１７】Ae-Ri Cho Lee, Hyunju Leem, Jaegwan Lee, Kyung Chan Park. Reversal of silver sulfadiazine- impaired wound healing by epidermal growth factor. Biomaterials 2005;26:4670-4676
【非特許文献１８】Cason JS, Jackson DM, Lowbury EJ, Ricketts CR. Antiseptic and aseptic prophylaxis for burns: use of silver nitrate and of isolators. Br Med J 1966; 2(525): 1288-94
【非特許文献１９】Li XZ, Nikaido H, Williams KE. Silver-resistant mutants of Escherichia coli display active efflux of Ag+ and are deficient in porins. J Bacteriol 1997; 179(19): 6127-32
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
本発明の目的
本発明の第一の目的は、創傷、熱傷創傷、植皮片、褥瘡、糖尿病性足部潰瘍及び他の皮膚疾患の予防及び治療用に用いられる局所製剤の調製のための広域医薬組成物を提供することである。
【００３０】
本発明の他の目的は、抗微生物薬／抗菌薬及びマイトジェニックタンパク質をより広範な抗菌／抗微生物スペクトルと共に含む新規な局所医薬製剤を提供し、これはＳＳＤ耐性微生物に対して有効であり、副作用がない又は無視できる。
【００３１】
本発明の他の目的は、成長因子のいずれか１つを含む、創傷治癒特性がより優れた及びより迅速である新規な局所医薬製剤を提供することである。
【００３２】
本発明のさらなる目的は、より長期の安定性及び有効期間を有する、クリーム剤、ゲル剤又は液剤の形態で新規な広域局所医薬製剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００３３】
創傷、熱傷創傷、植皮片、褥瘡、糖尿病性足部潰瘍及び他の皮膚疾患の予防及び治療用の局所製剤を調製するための新規な相乗作用的広域医薬組成物が開示され、この製剤は、クリーム剤、ゲル剤又は液剤の形態となり得る。
【００３４】
本発明の新規な相乗作用的組成物は、少なくとも３つの相乗作用的に活性な成分及び１若しくは２以上の不活性成分を含む。相乗作用的に活性な成分は、１又は２以上の広域殺菌薬、１又は２以上の広域静菌薬及びマイトジェニック成長因子を含む。
【００３５】
不活性成分は、基剤、製剤への透過性及び安定性を提供するために用いられ、担体、保存剤、乳化剤、皮膚軟化剤及び無痛化剤並びに１又は２以上の他の構成物を含む。
【００３６】
本発明の好ましい一実施形態において、マイトジェニックタンパク質は、Bharat Biotech International Limited社により開発された組換えヒト上皮増殖因子（ｒｈ−ＥＧＦ）（REGEN-D（商標））又は血小板由来成長因子（ｒｈ−ＰＤＧＦ−ＢＢ）である。
【００３７】
殺菌薬及び静菌薬は、バシトラシン、スルファジアジン銀（ＳＳＤ）、ニトロフラゾン、クロルヘキシジングルコン酸塩（ＣＨＧ）、ポリミキシンＢ硫酸塩、ネオマイシン、ポビドンヨード、マフェニド、ニトロフラゾン及びゲンタマイシンからなる群から選択される。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態において、広域殺菌薬は、スルファジアジン銀（ＳＳＤ）であり、広域静菌薬は、クロルヘキシジングルコン酸塩（ＣＨＧ）である。
【００３９】
製剤の相乗的に不活性な成分は、ジポリヒドロキシステアリン酸ＰＥＧ−３０、イソヘキサデカン、安息香酸Ｃ−１２−１５アルキル、二酸化チタン、ポリヒドロキシステアリン酸、ステアリン酸アルミニウム、アルミナ、硫酸マグネシウム、ステアリン酸、ソルビトール、メチルパラベンナトリウム、プロピルパラベンナトリウム、水酸化ナトリウム、ＥＤＴＡ二ナトリウム、アクリロイルジメチルタウリン酸アンモニウム／ＶＰコポリマー、ジパルミトイルヒドロキシプロリン、Bois II（商標）、セチルアルコール、安息香酸Ｃ１２−１５アルキル、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド（caprylic/capric triclyceride）、トコフェリル酢酸、ポリアクリルアミド、Ｃ１３−１４イソパラフィン、エトキシジグリコール、フェノキシエタノール、メチルパラベン、ブチルパラベン、エチルパラベン及びプロピルパラベン、トリエタノールアミン、軽質流動パラフィン、pemulen TR-1、カルボポールultrez、マンニトール、及び精製水からなる群から選択される。
【００４０】
本発明の新規な相乗作用的組成物は、より広範な抗微生物及び／又は抗菌スペクトル、ＳＳＤ耐性微生物に対する有効性、より優れた及びより迅速な創傷治癒、ＳＳＤ細胞毒性の逆転、抗菌／抗微生物活性が持続される製剤のより長期の安定性及び有効期間のような相乗効果を有する。
【００４１】
様々な試験及び検定結果では、この組成物が、異なる程度の熱傷創傷に最も適しており、この新規な相乗作用的組成物が、創傷、植皮片、褥瘡及び糖尿病性足部潰瘍のような他の適応症のために使用できることが示されている。
【００４２】
これらの研究から得られた結果によって、新規な製剤が、異なる程度の熱傷において、また、いかなる感染もなしに熱傷をすばやく治癒するために非常に有効であったことが明らかに示された。安定性試験を、これらの新規な製剤について行い、この新規な製剤のリアルタイム及び加速時間の安定性試験ではどちらも、組合せがいかなる感染もなしに熱傷創傷をすばやく治癒することにおいて安定しており、より効果的であることが示されている。
【００４３】
ｒｈ−ＥＧＦ、スルファジアジン銀（ＳＳＤ）及びクロルヘキシジングルコン酸塩（ＣＨＧ）を含む製剤の新規な相乗作用的組成物は、銀に対して耐性の微生物の影響を防止し、熱傷創傷における銀の透過性において役立つ。さらに製剤中の低濃度のＣＨＧは、熱傷創傷において銀の透過性に役立ち、それによって、耐性微生物に対する銀の有効性を強化する。
【００４４】
ＢＢＩＬのｒｈ−ＥＧＦ、ＳＳＤ及びＣＨＧのこの相乗作用的な組合せを選択する根拠は、スルホンアミド耐性がしばしば透過性バリアによるものであり、クロルヘキシジンがこのバリアに影響を与えることができるということが周知であり、第２に、この組合せが、ＳＳＤのものと同様の熱傷治療において予防特性を有し、耐性が、前者のいずれか一方に現れず、創傷治癒過程が、ｒｈ−ＥＧＦ＋ＳＳＤ単独よりも製剤の３つの薬剤でより迅速であることであった。
【００４５】
この新規な相乗作用的組成物は、ｒｈ−ＥＧＦによる銀の効果の逆転に役立ち、銀に耐性の広範囲の微生物に対しても有効であり、この耐性は、低濃度でＣＨＧを加えることにより銀の透過性を高めることによって防止される。組成物の相乗作用の結果は、ＣＨＧとＳＳＤとの間の相乗的相互作用により得られる。製剤のＣＨＧは、ＳＳＤの抗菌作用の有効性を高める。さらに、極めて高濃度のＳＳＤに耐性の微生物は、ＳＳＤが本発明の製剤においてＣＨＧと併用して用いられるとき、殺滅することもできる。いくつかの種のシュードモナス（Pseudomonas）及びブドウ球菌（Staphylococcus）株のスルホンアミドへの耐性は、上記パラグラフにおいて説明した通りバリア機序によるものである。しかし、ＣＨＧ及びＳＳＤの組合せに関して、ＣＨＧが窒素塩基、ヌクレオチド又はヌクレオシドの流出を可能にするために十分に膜を変化させず、この変化が、スルファディジン（sulphadizine）分子の移行を可能にするのに十分であり、それによって、熱傷創傷において微生物を完全に減少させることが可能になると結論付けられる。
【００４６】
したがって、本発明の新規な製剤中のＢＢＩＬのｒｈ−ＥＧＦと共にＣＨＧ及びＳＳＤの相乗効果は、局所予防作用による並びに治療のための熱傷創傷における感染の最も有効な制御を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】製剤中で異なる濃度のｒｈ−ＥＧＦを用いた動物数に対する創傷治癒の百分率を示すグラフである。
【図２】製剤中の異なる濃度のｒｈ−ＰＤＧＦ−ＢＢを用いた動物数に対する創傷治癒の百分率を示すグラフである。
【図３】異なる製剤組成物を用いた熱傷患者の創傷治癒の百分率を示すグラフである。
【図４】ＥＬＩＳＡ法による新規な製剤中のｒｈ−ＥＧＦ含有量の推定を示すグラフである。
【図５】黄色ブドウ球菌における新規な製剤の比較動態のグラフである。
【図６】本発明の製剤の加速安定性試験のグラフである。
【図７】本発明の製剤のリアルタイム安定性試験のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本発明の詳細な実施形態は、本明細書において開示されるが、開示された実施形態が、本発明の模範的なものにすぎず、様々な形態で具現することができるということが理解されるべきである。したがって、本明細書に開示される具体的な構造上及び機能上の詳細は、制限されるものとして解釈されるものではなく、実質的には適切に詳細ないかなる構造においても本発明を様々に使用するために、当業者を教示するための代表的な原理として解釈されるものにすぎない。さらに、本明細書において用いられる用語及び語句は、制限されるものではないが、むしろ、本発明の理解可能な説明を提供するものとする。
【００４９】
本発明は、創傷、熱傷創傷、植皮片、褥瘡、糖尿病性足部潰瘍及び他の皮膚疾患の予防及び治療用の、クリーム剤又はゲル剤又は液剤の形態である局所製剤の調製のための新規な相乗作用的広域医薬組成物に関する。
【００５０】
本発明の新規な相乗作用的組成物は、少なくとも３つの相乗作用的に活性な成分及び１又は２以上の不活性成分を含む。相乗作用的に活性な成分は、１又は２以上の広域殺菌薬、１又は２以上の広域静菌薬及びマイトジェニック成長因子を含む。
【００５１】
不活性成分は、基剤、製剤への透過性及び安定性を提供するために用いられ、担体、保存剤、乳化剤、皮膚軟化剤及び無痛化剤並びに１又は２以上の他の構成物を含む。
【００５２】
本発明の好ましい一実施形態において、マイトジェニックタンパク質は、Bharat Biotech International Limited社によって開発された組換えヒト上皮増殖因子（ｒｈ−ＥＧＦ）（REGEN-D（商標））又は血小板由来成長因子（ｒｈ−ＰＤＧＦ−ＢＢ）のような成長因子である。
【００５３】
殺菌薬及び静菌薬は、バシトラシン、スルファジアジン銀（ＳＳＤ）、ニトロフラゾン、クロルヘキシジングルコン酸塩（ＣＨＧ）、ポリミキシンＢ硫酸塩、ネオマイシン、ポビドンヨード、マフェニド、ニトロフラゾン及びゲンタマイシンからなる群から選択される。
【００５４】
本発明の好ましい実施形態において、選択される広域殺菌薬は、スルファジアジン銀（ＳＳＤ）であり、広域静菌薬は、クロルヘキシジングルコン酸塩（ＣＨＧ）である。
【００５５】
製剤の相乗的に不活性な成分は、ジポリヒドロキシステアリン酸ＰＥＧ−３０、イソヘキサデカン、安息香酸Ｃ−１２−１５アルキル、二酸化チタン、ポリヒドロキシステアリン酸、ステアリン酸アルミニウム、アルミナ、硫酸マグネシウム、ステアリン酸、ソルビトール、メチルパラベンナトリウム、プロピルパラベンナトリウム、水酸化ナトリウム、ＥＤＴＡ二ナトリウム、アクリロイルジメチルタウリン酸アンモニウム／ＶＰコポリマー、ジパルミトイルヒドロキシプロリン、Bois II（商標）、セチルアルコール、安息香酸Ｃ１２−１５アルキル、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド、トコフェリル酢酸、ポリアクリルアミド、Ｃ１３−１４イソパラフィン、エトキシジグリコール、フェノキシエタノール、メチルパラベン、ブチルパラベン、エチルパラベン及びプロピルパラベン、トリエタノールアミン、軽質流動パラフィン、pemulen TR-1、カルボポールultrez、マンニトール、及び精製水からなる群から選択される。
【００５６】
本発明の好ましい一実施形態において、新規な相乗作用的組成物は、より広範な微生物及び／又は細菌の適用範囲、銀耐性微生物に対する有効性、より優れた及びより迅速な創傷治癒、ＳＳＤ細胞毒性の逆転、ＳＳＤの銀の影響の逆転、及び抗菌／抗微生物活性が持続される製剤のより長期の有効期間のような相乗効果をもたらす所望の比において、マイトジェニックタンパク質（ｒｈ−ＥＧＦ）、殺菌薬（ＳＳＤ）及び静菌薬（ＣＨＧ）を含む。
【００５７】
組換えヒト上皮増殖因子（ｒｈ−ＥＧＦ）（Bharat Biotech International Limited社のREGEN D）は、創傷、植皮片、熱傷創傷、褥瘡及び糖尿病性足部潰瘍のような適応症の治療及び管理のために用いられている周知の成長因子である。ｒｈ−ＥＧＦは、成長因子のファミリーに属し、細胞増殖、移動及び分化を調節することが知られる。ｒｈ−ＥＧＦは、マイトジェンとして、また、多くの細胞タイプのための分化因子として作用することが示されている。ｒｈ−ＥＧＦが創傷の治癒に役立つが、熱傷創傷管理中に感染を予防することが重要である。
【００５８】
ＳＳＤは、熱傷のための標準治療である。しかし、いくつかの研究では、この化合物が、成長促進因子の生成の遅延又は不足により、これらの受容体を用いる創傷治癒過程の遅延をもたらし、これがII度及びIII度熱傷では重大であることが示された。
【００５９】
銀耐性微生物の影響を防止するため及び耐性微生物に対する銀の透過性に役立てるために、本発明の新規な製剤は、開発されており、ＳＳＤ及びｒｈ−ＥＧＦの組合せに、追加の薬剤ＣＨＧが加えられる。組合せが、さらに低濃度のＣＨＧであるという理由から、熱傷創傷における銀の耐性微生物への透過性に役立ち、それによって、耐性微生物に対する銀の有効性を助ける。
【００６０】
クロルヘキシジングルコン酸塩は、角質層に結合するビスビグアニドであり、この領域を拭き取ったときでさえ、６時間にわたって殺菌活性及び殺真菌活性を持続させることが示される。クロルヘキシジングルコン酸塩は、全血などの有機材料の存在下でその有効性を失わず、これは、重要な防腐薬、消毒薬、抗菌デンタルリンス及び保存剤である。これは、グラム陽性菌、グラム陰性菌、ウイルス及び真菌に対して抗微生物スペクトルを有する。ＣＨＧは、細菌の細胞壁及び細胞質構成物に結合し、浸透圧平衡の変更、また、細胞質構成物の沈殿をもたらす。
【００６１】
新規な相乗作用的組成物を用いて確立された結果によって、ｒｈ−ＥＧＦを加えて銀の細胞毒性を予防することにより銀の影響を逆転させることが示されている。ＣＨＧを加えることによって、耐性微生物への銀の透過性を高めることによりこの新規な組合せが広範囲の微生物に対して有効になった。
【００６２】
この新規な相乗作用的製剤はまた、インビトロでの分析におけるこれらの組合せにおいて微生物の減少に対する効果を示し、この相乗作用的な組合せは、広範囲の抗生物質耐性微生物に対して有効であった。これらの結果から、異なる程度の熱傷創傷の治療のための並びに創傷、植皮片、褥瘡及び糖尿病性足部潰瘍などの他の適応症のための局所医薬製剤として用いられるこの新規な相乗作用的組成物は安定性が高く、有効期間が２年を超えることが立証された。
【００６３】
本発明において、製剤中の各成分は、利用可能な標準的な方法を用いてその濃度に対して測定された。ｒｈ−ＥＧＦの効力は、５μｇ、１０μｇ、及び１５μｇから開始し、最適な濃度でＳＳＤ及びＣＨＧを維持する異なる濃度のｒｈ−ＥＧＦを用いた動物試験［実施例１］及び熱傷患者における試験［実施例３］を行うことにより決定される。
【００６４】
ｒｈ−ＰＤＧＦ−ＢＢの効力は、１μｇ、３μｇ、及び５μｇから開始し、最適な濃度でＳＳＤ及びＣＨＧを維持する異なる濃度のｒｈ−ＰＤＧＦ−ＢＢを用いた動物試験［実施例２］を行うことにより決定された。
【００６５】
ｒｈ−ＥＧＦ濃度は、ＥＬＩＳＡ法の妥当性が検証されることにより推定された［実施例４］。
【００６６】
新規な製剤中のＳＳＤの推定について、アッセイは、米国薬局方において利用可能なアッセイ法に基づいて行われた。これらの推定の結果では、クリーム剤に加えるＳＳＤの厳密な量が推定できることを示した［実施例５］。
【００６７】
新規な製剤中のＣＨＧの推定について、アッセイは、英国薬局方において利用可能なアッセイ法に基づいて行われた［実施例５］。
【００６８】
ｒｈ−ＥＧＦ、ＳＳＤ及びＣＨＧを含有するこの新規な相乗作用的製剤はまた、インビトロでの分析におけるこれらの組合せにおいて微生物の減少に対する効果を示し、初めてこの相乗作用的な組合せが、広範囲の抗生物質耐性微生物に対して有効である場合、動力学的効果を示した［実施例６］。
【００６９】
本発明において、加速及びリアルタイム安定性試験は、ＳＳＤ、ＣＨＧ及びｒｈ−ＥＧＦを含む新規な製剤についてなされ、これらの結果では、３つの成分がすべての製剤の添加される組成物の中で減少又は低下なしに安定しており、この新規な製剤が２年を超えて安定していることが明らかに示された。
［実施例］
【実施例１】
【００７０】
動物モデルにおいて効力を試験するための異なる濃度のｒｈ−ＥＧＦの選択：
新規な相乗作用的製剤について、ＳＳＤ、ＣＨＧ及び第３の薬剤、すなわち、ＢＢＩＬのｒｈ−ＥＧＦの添加の組合せを、５μｇ、１０μｇ及び１５μｇから変えて、これら３つの薬剤の最善の組合せを選択した。安定性試験を、これらの新規な製剤に関して行った。安定した製剤を、これらの新規な製剤の効力を点検するための設計された動物モデルにおいて適用した。
【００７１】
製剤の８つの組合せを、新規な製剤の効力のための動物モデルにおいて試験した。
１．１％スルファジアジン銀クリーム剤
２．１％スルファジアジン銀＋ｒｈ−ＥＧＦ１０μｇ／ｇクリーム剤
３．１％スルファジアジン銀＋０．０２％クロルヘキシジングルコン酸塩＋ｒｈ−ＥＧＦ５μｇ／ｇクリーム剤
４．１％スルファジアジン銀＋０．０２％クロルヘキシジングルコン酸塩＋ｒｈ−ＥＧＦ１０μｇ／ｇクリーム剤
５．１％スルファジアジン銀＋０．０２％クロルヘキシジングルコン酸塩＋ｒｈ−ＥＧＦ１５μｇ／ｇクリーム剤
６．１％スルファジアジン銀＋０．０２％クロルヘキシジングルコン酸塩＋ｒｈ−ＥＧＦ５μｇ／ｇゲル剤
７．１％スルファジアジン銀＋０．０２％クロルヘキシジングルコン酸塩＋ｒｈ−ＥＧＦ１０μｇ／ｇゲル剤
８．１％スルファジアジン銀＋０．０２％クロルヘキシジングルコン酸塩＋ｒｈ−ＥＧＦ１５μｇ／ｇゲル剤
【００７２】
合計９６匹のラット［雄４８匹及び雌４８匹］を、ｒｈ−ＥＧＦの新規な相乗作用的製剤の効力を試験するために選択した。全動物母集団を、主な２群、すなわち、試験群をグループＩ及び対照群をグループIIに分けた。各群を、８つのサブグループに細分化し、この８つの群を、５μｇ／ｇ、１０μｇ／ｇ及び１５μｇ／ｇのクリーム剤及びゲル剤から開始する様々な濃度のｒｈ−ＥＧＦとの上記の前記組合せの異なる８つの製剤を用いて適用した。
【００７３】
【表１】
2013527229.tif 000003
【００７４】
動物モデルにおける熱傷創傷生成：
試験及び対照群動物を、熱傷創傷の生成のために用いた。特別に作製された黄銅棒をラットにおける熱傷創傷の生成のために用いた。黄銅棒を、７５±２℃で１５±１分間加熱水浴において維持した。動物を、実験開始の前日２×２×２ｃｍサイズの面積で剪毛した。黄銅棒を、水浴から取り出し、１５〜２０秒の短い時間ラットの皮膚に置き、直ちに取り除いた。棒直径を、棒が触れるとき、動物の皮膚が約１ｃｍの創傷を作り出すように選択した。各動物について、別々の無菌棒を、存在する場合、動物における任意の感染又は一方の動物からの他方の動物への感染の任意の移動を防止するために用いる。ラットにおける熱傷創傷生成の３０分後に、上記の前記５つの新規なクリーム系製剤を適用した。試験製剤及び対照の両方を、創傷が治癒するまで又は６週の終わりまで無菌の綿棒で１日２回熱傷部位に均等に塗布した。適用前に、いかなる場合でも基本的な熱傷創傷管理を、動物において行った。
【００７５】
本試験の第１の目的は、グループIIに比べてグループＩの場合において４０％を超えて有意に短縮した治癒期間である。上皮化の第２のエンドポイントを、新規な製剤群において、対照群と比較して観察した。クリーム製剤とゲル製剤との間の効果にあまり差はない。クリーム製剤は、ゲル製剤と比較してより効果的であり、他の２つの通常の製剤と比較したとき、これらのクリーム製剤及びゲル製剤は共に優れている。著しい瘢痕肥大又はいかなる色素沈着変化は、３〜８までの新規な製剤サブグループにおいて観察されなかった。熱傷創傷治癒の期間は、すべての新規な製剤群の動物において同様ではなかったが、治癒期間の百分率は、対照群の動物と比較して５０％を超えた。
【００７６】
【表２】
2013527229.tif 000004
【００７７】
これらの新規な製剤で試験した動物９６匹のうち、熱傷創傷治癒の期間は、すべての新規な製剤群の動物において同様ではなかったが、これらの結果は、これらの製剤が、これらの対照群よりも速く治療期間を促進することを明らかに示している。
【００７８】
【表３】
2013527229.tif 000005
【００７９】
治癒時間の上記百分率に基づいて、１％ＳＳＤ＋０．０２％ＣＨＧ＋１０μｇ／ｇ ｒｈ−ＥＧＦクリーム剤の組成物を含む局所製剤が、熱傷患者のために用いられるための最良の製剤であったと結論付けられた。製剤は、それぞれ加速時間の場合に＋２５℃±２℃の温度で及びリアルタイムの場合に５℃±３℃の温度で前記組成物を用いて加速時間及びリアルタイム安定性試験を実施し、これらの結果から、組合せが、＋２℃から８℃の貯蔵温度で２年を超えて安定性が高いことが確立された。
【００８０】
図１を参照すると、これは、製剤中の有効成分の異なる組成物、すなわち、ｒｈ−ＥＧＦ、ＳＳＤ及びＣＨＧを用いた動物における創傷治癒の百分率を示す。クリーム製剤の結果では、１％ＳＳＤのみが製剤中で用いられたとき、創傷治癒百分率は、約６０％にすぎなかったことを示した。創傷治癒は、１％ＳＳＤ及びｒｈ−ＥＧＦ１０μｇ／ｇの組合せで約７８％に改善した。創傷治癒百分率は、１％ＳＳＤ、０．０２％ＣＨＧ及びｒｈ−ＥＧＦ５μｇ／ｇの組合せで約９５％であった。一方、創傷治癒百分率は、１％ＳＳＤ、０．０２％ＣＨＧ及びｒｈ−ＥＧＦ１０μｇ／ｇを含む製剤でほぼ１００％であった。クリーム製剤及びゲル製剤を同様の組成物と比較したとき、結果では、クリーム製剤が、ゲル製剤よりも治癒率はわずかに高いことを示した。
【実施例２】
【００８１】
動物モデルにおいて効力を試験するための異なる濃度のｒｈ−ＰＤＧＦ−ＢＢの選択：
新規な相乗作用的製剤の場合、ＳＳＤ、ＣＨＧ及び第３の薬剤、すなわち、ｒｈ−ＰＤＧＦ−ＢＢの添加の組合せを、１μｇ／ｇ、３μｇ／ｇ及び５μｇ／ｇから変化させて、これらの３つの薬剤の最良の組合せを選択した。これらの製剤を、上記で説明した通り熱傷創傷生成をすることにより、これらの新規な製剤の効力を点検するために、設計された動物モデルにおいて適用した。
【００８２】
製剤の５つの組合せを、新規な製剤の効力のための動物モデルにおいて試験した。
１．１％スルファジアジン銀クリーム剤
２．１％スルファジアジン銀＋ｒｈ−ＰＤＧＦ−ＢＢ５μｇ／ｇクリーム剤
３．１％スルファジアジン銀＋０．０２％クロルヘキシジングルコン酸塩＋ｒｈ−ＰＤＧＦ−ＢＢ１μｇ／ｇクリーム剤
４．１％スルファジアジン銀＋０．０２％クロルヘキシジングルコン酸塩＋ｒｈ−ＰＤＧＦ−ＢＢ３μｇ／ｇクリーム剤
５．１％スルファジアジン銀＋０．０２％クロルヘキシジングルコン酸塩＋ｒｈ−ＰＤＧＦ−ＢＢ５μｇ／ｇクリーム剤
【００８３】
合計６０匹のラット［雄３０匹及び雌３０匹］を、ｒｈ−ＰＤＧＦ−ＢＢの新規な相乗作用的製剤の効力を試験するために選択した。全動物母集団を、主な２群、すなわち、試験群をグループＩ及び対照群をグループIIに分けた。各群を、５つのサブグループに細分化し、この５つの群を、１μｇ／ｇ、３μｇ／ｇ及び５μｇ／ｇクリーム剤から開始する様々な濃度のｒｈ−ＰＤＧＦ−ＢＢとの上記の前記組合せの異なる５つの製剤を用いて適用した。
【００８４】
【表４】
2013527229.tif 000006
【００８５】
本試験の第１の目的は、グループIIに比べてグループＩの場合において３０％を超えて有意に短縮した治癒期間である。熱傷創傷治癒の期間は、すべての新規な製剤群の動物において類似しなかったが、治癒時間の百分率は、対照群の動物と比較して３０％を超えた。
【００８６】
【表５】
2013527229.tif 000007
【００８７】
図２を参照すると、これは、製剤中の有効成分の異なる組成物、すなわち、ｒｈ−ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＳＳＤ及びＣＨＧを用いた動物における創傷治癒の百分率を示す。５μｇ／ｇのｒｈ−ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＳＳＤ及びＣＨＧを含むクリーム製剤の結果は、他の群と比べたとき、より良い創傷治癒百分率を示した。
【実施例３】
【００８８】
熱傷患者における新規な製剤の安全性及び効力：
ＥＧＦ、ＦＧＦ、及びＴＧＦのようないくつかの成長因子は、治癒過程を調整し、細胞増殖、分化及び臓器成長の調節に関与する調節タンパク質として同定されている。様々なヒトの研究は、ｒｈ−ＥＧＦ軟膏剤の局所適用による熱傷創傷治癒の促進を評価するために実施されている。製剤の５つの組合せを、新規な製剤の効力について熱傷患者において試験した。
１．１％スルファジアジン銀（対照）
２．１％スルファジアジン銀＋ｒｈ−ＥＧＦ１０μｇ／ｇ（グループＩ）
３．１％スルファジアジン銀＋０．０２％クロルヘキシジングルコン酸塩＋ｒｈ−ＥＧＦ５μｇ／ｇ（グループII）
４．１％スルファジアジン銀＋０．０２％クロルヘキシジングルコン酸塩＋ｒｈ−ＥＧＦ１０μｇ／ｇ（グループIII）
５．１％スルファジアジン銀＋０．０２％クロルヘキシジングルコン酸塩＋ｒｈ−ＥＧＦ１５μｇ／ｇ（グループIV）
【００８９】
本試験において、新規な相乗作用的製剤の比較試験を行って、熱傷患者の表層（Ｉ度−皮膚の外層のみに影響を与える）及び中間層（II度−皮膚の外層及び基底層に影響を与える）におけるこれらの製剤対対照群の安全性及び効力を評価した。男性及び女性を含めた合計５０名の患者を、２つの群に、すなわち、グループＩ〜グループIV（新規な組合せ）に患者４０名及び対照群に患者１０名を登録した。熱傷患者において、試験群における創傷が完全に閉鎖した対象の割合を対照群と評価し比較するために、以下のパラメータを示す。
（ａ）（創傷治癒の測定による）治癒率。
（ｂ）創傷が完全に閉鎖するために必要な時間（日数）。
【００９０】
減菌された透明なシートを、創傷に置いて、その周囲を、油性マジックペンを用いて透写した。その透写を上部シートの上で行い；創傷と接触した下部シートを使用後に処分した。透明性を、長さ１ｍｍ２角でカウントするメートル単位のグラフ用紙の上に置いた。試験薬、すなわち、被験薬及び対照薬をクリーム基剤中に入れた。被験薬及び対照薬の両方を、創傷が治癒するまで又は６週の終わりまで無菌の綿棒で１日２回熱傷部位に均等に塗布した。適用前に、脱落組織のデブリドマン又は膿除去のような基本的な熱傷創傷管理ケアを、いかなる場合でも行った。定量的変数を平均値（±ＳＤ）として示し、対照と治療群間の他の特徴を異なる方法で分析した。
【００９１】
合計５０名の患者を、対照群及び試験群に登録した。試験コホートは、表６中にある。第１の目的、すなわち、治癒期間は、対照群に比べてグループIII（ＳＳＤ＋ＣＨＧ＋ｒｈ−ＥＧＦ１０μｇ／ｇ）において５０パーセントを超えて有意に短縮した。対照群及び試験群（ＳＳＤ＋ＣＨＧ＋ｒｈ−ＥＧＦ１０μｇ／ｇ）において患者のうちいずれかの患者における熱傷の表面積は、全身の表面積の２０％以下であった。試験群における平均治癒時間は、５日であったのに対して、対照群は１２日であった。
【００９２】
第２の目的、すなわち、上皮化の質は、完全治癒後に行われた創傷生検により観察し、対照群に比べてグループIII（ＳＳＤ＋ＣＨＧ＋ｒｈ−ＥＧＦ１０μｇ／ｇ群）においてより良好な上皮化を示した。付属器再生及びコラーゲン成熟はまた、対照部位に比べて良好であった。グループIII（ＳＳＤ＋ＣＨＧ＋ｒｈ−ＥＧＦ１０μｇ／ｇ）における創傷表面の刺激性の一症例があり、これは、いかなる薬剤も用いずに２４時間で分離した。著しい瘢痕肥大又は色素沈着変化は、この群で示されなかった。
【００９３】
【表６】
2013527229.tif 000008
【００９４】
【表７】
2013527229.tif 000009
【００９５】
【表８】
2013527229.tif 000010
【００９６】
上記の結果から、新規な相乗作用的製剤（ＳＳＤ＋ＣＨＧ＋ｒｈ−ＥＧＦ１０μｇ／ｇ）が、表層及び中間層熱傷における上皮化を加速し、熱傷患者においてより迅速な熱傷創傷の閉鎖、病院滞在の短縮及びより良好な予後をもたらすことが明らかである。膨大なエビデンスによって、外来性成長因子が組織修復に必要であることが示唆されている。これらは、内因性成長因子及びこれらの遺伝子発現のための誘導物質としても、創傷治癒を加速することにおける組織修復細胞のための刺激薬としても作用し得る。熱傷事故が流行に近いほど増加するシナリオにおいて、臨床的な治癒を増大させる、ｒｈ−ＥＧＦなどの成長因子に影響を及ぼす洗練された治療は、将来重要な役割を果たすことが予想される。
【００９７】
図３は、熱傷患者における創傷治癒の百分率を示す表８において示した結果のグラフである（ヒトのデータ）。図３のグラフは、最も良好な創傷治癒結果が、互いの抗微生物特性及び創傷治癒特性を強化する成分の相乗的な相互作用によりＳＳＤ＋ＣＨＧ＋ｒｈ−ＥＧＦを含む製剤で得られたことを確認する。
【００９８】
この新規な相乗作用的製剤の組合せの主な利点は、熱傷創傷時の細菌の侵入により引き起こされる感染を防止するものであり、同時に、ｒｈ−ＥＧＦは、細菌感染症を侵入させずに熱傷を治癒し、熱傷をすばやく治癒させることが可能である。感染を予防する他に、最も重要な利点は、成長因子ｒｈ−ＥＧＦの存在下で最適なレベルに組織を再生するために細胞を曝露させることにより、ＳＳＤの効果により創傷治癒の障害を逆転することである。製剤のこの新規な相乗作用的組成物は、感染の減少においてより有意であり、それによって、すばやい創傷治癒率及び熱傷によって引き起こされる創傷の治癒を可能にする。組合せが、クロルヘキシジングルコン酸塩がさらに低濃度であるという理由から、熱傷創傷における銀の耐性微生物への透過性に役立ち、それによって、耐性微生物に対する銀の有効性を助ける。
【実施例４】
【００９９】
新規な製剤中のｒｈ−ＥＧＦの推定
ｒｈ−ＥＧＦを、固相サンドイッチ酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ，Enzyme Linked-Immuno-Sorbent Assay）を用いて推定した。ヒトｒｈ−ＥＧＦに特異的なポリクローナル抗体を、マイクロタイター細片のウェル上でコーティングした。ｒｈ−ＥＧＦの標準、対照を含めたサンプルを、これらのウェルにピペットで移した。主な原理は、第１のインキュベーション中であり、ｒｈ−ＥＧＦ抗原は、ある部位で固定化された（捕捉）抗体に結合する。洗浄後、ｒｈ−ＥＧＦに特異的なビオチン化モノクローナル抗体を加えた。第２のインキュベーション中、この抗体は、第１のインキュベーション中に捕捉された固定化ｒｈ−ＥＧＦに結合する。過剰の第２の抗体の除去後、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（酵素）を加える。これは、ビオチン化抗体に結合する。第３のインキュベーション及びすべての非結合の酵素を除去するための洗浄後、基質溶液を加え、これを結合酵素によって作用させて色を呈する。この着色された生成物の強度は、元の検体に存在するｒｈ−ＥＧＦの濃度と直接比例する。本方法を用いて、ｒｈ−ＥＧＦの含有量を上記の新規な製剤において推定した。これらの結果は、ｒｈ−ＥＧＦの添加した含有量が、本明細書と同様であり、タンパク質が活性であることを明らかに示す。
【０１００】
図４は、上記パラグラフ中で実施例３において説明されたＥＬＩＳＡ法による新規な製剤中のｒｈ−ＥＧＦ含有量の推定を示すグラフである。
【実施例５】
【０１０１】
新規な製剤中のスルファジアジン銀の推定及び新規な製剤中のクロルヘキシジングルコン酸塩の推定。
ＳＳＤアッセイを、USP 27 Page No: 1740-1741に指定される方法によって行った。これらの推定の結果は、クリーム剤に加えられたＳＳＤの厳密な量が推定できることを示した。
【０１０２】
ＣＨＧアッセイをまた、BP 2005、BP volume III、Formulation preparations: Specific Monographs Lidocaine and Chlorhexidine gelに指定される手順によって行った。これらの推定の結果は、クリーム剤に加えられたＣＨＧの厳密な量が推定できることを示した。
【実施例６】
【０１０３】
新規な製剤との相乗作用動態
ＳＳＤ及びＣＨＧとのＢＢＩＬのｒｈ−ＥＧＦの相乗作用を、試験生物の成長培地に対するこの新規な組成物の効果を分析することによりインビトロで試験した。黄色ブドウ球菌の終夜培地を、０．１〜０．２のＯＤ６００値で用いた。完全な実験手順を、３７℃の温度条件を維持することにより行った。３つの構成物、すなわち、ＢＢＩＬのｒｈ−ＥＧＦ、ＳＳＤ及びＣＨＧを有する新規な相乗作用的組成物を、ＢＢＩＬのｒｈ−ＥＧＦ及びＳＳＤの組合せと比較した。接種時間を０時間と見なし、組合せを培地に添加後、読み取りを規則的な時間間隔で行った。グラフを、新規な相乗作用的製剤の動態の測定のために培地光学密度対時間でプロットした。結果から、３つの構成物、すなわち、ＢＢＩＬのｒｈ−ＥＧＦ、ＳＳＤ及びＣＨＧを有する新規な組成物が、ＢＢＩＬのｒｈ−ＥＧＦ及びＳＳＤの組合せと比較して、微生物数の減少においてより感受性が高かったと結論付ける。この結果は、熱傷創傷のために用いることができるＢＢＩＬのｒｈ−ＥＧＦ、ＳＳＤ及びＣＨＧのこの新規な相乗作用的な組合せの利点を明らかに示している。
【０１０４】
図５を参照すると、対照（１％ＳＳＤ）、ＢＢＩＬのｒｈ−ＥＧＦ＋ＳＳＤの組合せ及びＢＢＩＬのｒｈ−ＥＧＦ＋ＳＳＤ＋ＣＨＧの組合せの製剤を用いて、実施例６において説明される通りの黄色ブドウ球菌に対する新規な製剤の比較動態のグラフである。
【実施例７】
【０１０５】
スルファジアジン銀、クロルヘキシジングルコン酸塩及びｒｈ−ＥＧＦの組合せを用いた新規な製剤の安定性試験
ＳＳＤ、クロロヘキシジン（chlorohexidine）グルコン酸塩及びｒｈ−ＥＧＦクリーム剤を含有する新規な製剤の安定性を、リアルタイム及び加速された安定性条件のために推定した。リアルタイム試験を貯蔵温度＋２℃〜＋８℃で２４カ月間行い、加速試験を、貯蔵温度＋２５℃±２℃及び６０％ＲＨ±５％で６カ月間行った。この安定性試験の根拠は、貯蔵温度２〜８℃で２４カ月間ＳＳＤ、クロロヘキシジングルコン酸塩及びｒｈ−ＥＧＦクリーム剤を含有する新規な製剤の有効期間を確立することである。
【０１０６】
これらの結果から、熱傷創傷における使用のための医薬組成物として調製した新規な製剤が、貯蔵温度２〜８℃で２年を超えて安定性があることが結論付けられる。
【０１０７】
図６は、ＳＳＤ＋ＣＨＧ＋ｒｈ−ＥＧＦを含む本発明の新規な組成物の製剤による加速安定性試験を示すグラフである。加速安定性試験は、本発明の新規な組成物を含む製剤が、６カ月終了後さらに９５％ｒｈ−ＥＧＦ活性を有したことを示した。これらの結果により、新規な製剤が、実施例７において上記で説明した通りの加速試験の条件下で９５％又はそれ以上のｒｈ−ＥＧＦ活性で安定性があったことを確立した。
【０１０８】
図７を参照すると、製剤中でＳＳＤ＋ＣＨＧ＋ｒｈ−ＥＧＦの新規な組成物を用いて行われたリアルタイム安定性試験のグラフである。試験結果は、新規な製剤が、実施例７において上記で説明した通りの貯蔵条件下で２４カ月後に９５％又はそれ以上のｒｈ−ＥＧＦ活性を有することを示した。したがって、新規な製剤は、より安定性があり、有効期間がより長い。
【実施例８】
【０１０９】
本発明の新規な組成物を用いた局所適用のための異なる製剤の調製
異なる局所クリーム製剤は、創傷、熱傷創傷、植皮片、褥瘡、糖尿病性足部潰瘍における適用のための、上記の本明細書において前述のパラグラフ中に記載のものなど、ｒｈ−ＥＧＦ、ＳＳＤ及びＣＨＧを含む本発明の新規な組成物を用いて調製することができる。新規な組成物は、局所製剤を調製するために用いることができ、他の成分は、所要量によって基剤、担体、保存剤、乳化剤、皮膚軟化剤、無痛化剤及び皮膚軟化剤などとして加えてもよい。以下は、本発明の新規な組成物と併用して様々な成分で調製することができるクリーム製剤のいくつかの例である。
【０１１０】
以下の表に示したクリーム製剤が、当業者がよりよく理解するため及び例示的な目的のためのものにすぎず、本発明の異なる実施形態を示すにすぎないことを理解するべきである。特許請求の範囲は、他のいくつかのクリーム製剤が、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく本発明の新規な組成物の組合せにおいて調製することもできるため、これらのクリーム製剤のみに限定するべきではない。
【０１１１】
【表９】
2013527229.tif 000011
【０１１２】
【表１０】
2013527229.tif 000012
【０１１３】
【表１１】
2013527229.tif 000013
【０１１４】
【表１２】
2013527229.tif 000014
【０１１５】
（参考文献）
1.Kucan JO. Robson MC, Heggers JP. et al. Comparison of silver sulfadiazine, povidoneiodine and physiologic saline in the treatment of chronic pressure ulcers. J Am Geriatr Soc. 1981:29:232-235.
2.McCauley RL, Li YY, Chopra V, Herndon DN, Robson MC. Cytoprotection of human dermal fibroblasts against silver sulfadiazine using recombinant growth factors. J Surg Res. 1994 Apr;56(4):378-84.
3.Vijay Viswanathan, MD, PhD; Sharad Pendsey, MD, MDDG; N. Sekar, MS, MNAMS, MCh, FICS; G.S.R. Murthy, PhD. A Phase III Study to Evaluate the Safety and Efficacy of Recombinant Human Epidermal Growth Factor (REGEN-DTM 150) in healing Diabetic Foot ulcers. Wounds 2006; 18(7): 186-196.
4.Lev-Ran A, Hwang DL: Epidermal growth factor and platelet-derived growth factor in blood in diabetes mellitus. Acta Endocrinol (copenh) 1990; 123(3) (September): 326-330.
5.Brown G L, Nannoy L B, Gritten J, Cramer A B, Yancey JM, Curtsinger LJ 3rd et al. Enhancement of wound healing by topical treatment with Epidermal growth factor. N Eng J Med 1989; 321(2) (July (13)): 76-9.
6.K. Sharma, P.V. Cherish Babu, P. Sasidhar, V.K. Srinivas, V. Krishna Mohan, Ella Krishna. Recombinant human epidermal growth factor inclusion body solubilization and refolding at large scale using expanded-bed adsorption chromatography from Escherichia coli, Protein Expression and Purification, 2008, 60, 7-14.
7.Greenhalgh, DG. The Role of Growth Factors in Wound Healing. Journal of Trauma-Injury Infection & Critical Care 1996; 41(1): 159-7.
8.Buckley A, Davidson JM, Kamerath CD, Woodward SC. Epidermal growth factor increases granulation tissue formation dose dependently. J. Surg Res. 1987; 43(4) 322-328.
9.Eaglstein WH, Mertz PM, Alvarez OM. Effect of topically applied agents on healing wounds. Clin Dermatol. 1984;2: 11 2-1 15.
10.Brown MRW, Wood SM. Relation between cation and lipid content of cell walls of Pseudomonas aen〜ginosa, P roteus〜'trlgaris. and KlebsieNa aerogenes and their sensitivity to polymyxin B and other antibacterial agents. JPharm Pharmacol. 1972;24:215-228.
11.Cooper ML, Boyce ST, Hansbrough JF, et al. Cytotoxicity to cultured human keratinocytes of topical antimicrobial agents. J Surg Res. 1990;48:190-195,
12.Monafo WW, West MA. Current treatment recommendations for topical bum therapy. Drugs. 1990;40:364-373.
13.Lineaweaver W, McMorris S, Soucy D, Howard R. Cellular and bacterial toxicities of topical antimicrobials. Plast Reconstr Sulg. 1985:75:394-j96.
14.Cooper ML. Laxer JA, Hansbrough JF. The cytotoxic effects of commonly used topical antimicrobial agents on human fibroblasts and keratinocytes. J Trauma. 1991;31:775-784.
15.McCauley RL, Linares HA, Pelligrini V, et al. In vitro toxicity of topical antimicrobial agents to human fibroblasts. J SUT Res. 1989; 46:267-274.
16.Lindberg RB, Moncrief JA, Mason AD Jr. Control of experimental and clinical burn wound sepsis by topical application of sulfamylon compounds. Ann NY Acad Sci. 1968; 150:950-960.
17.Taddonio TE, Thomson PD, Smith DJ Jr, Prasad JK. A survey of wound monitoring and topical antimicrobial therapy practices in the treatment of burn injury. J Bum Care Rehabil. 1990;11:423-427.
18.LOWBURYE,. J. L., LILLEYH, . A. & BULL,J . P. 1960 Disinfection of the skin of operation sites. British Medical Journal 2, 1039-1044.
19.HAROLD,F . M., BAARDAJ, . R., BARON,C . & ABRAMS,A . 1969 Dio 9 and chlorhexidine; Inhibition of membrane-bound ATPase and of cation transport in Streptococcus faecalis. Biochemica et Biophysica Acta 183, 129-136.
20.Hansbrough JF, Zapata-Sirvent RL, Cooper ML. Effects of topical antimicrobial agents on the human neutrophil resp〜ratoryb urst. Arch Sulg. 1991;126:603-608.
21.Cason JS, Jackson DM, Lowbury EJ, Ricketts CR. Antiseptic and aseptic prophylaxis for burns: use of silver nitrate and of isolators. Br Med J 1966; 2(525): 1288-94.
22.Gayle WE, Mayhall CG, Lamb VA, Apollo E, Haynes BW. Resistant Enterobacter cloacae in a burn center: the ineffectiveness of silver sulfadiazine. J Trauma 1978; 18(5): 317-23.
23.Wenzel RP, Hunting KJ, Osterman CA, Sande MA. Providencia stuartii, a hospital pathogen: potential factors for its emergence and transmission. Am J Epidemiol 1976; 104(2): 170-80.
24.Klasen HJ. A historical review of the use of silver in the treatment of burns. II. Renewed interest for silver. Burns 2000; 26(2): 131-8.
25.Bridges K, Lowbury EJ. Drug resistance in relation to use of silver sulphadiazine cream in a burns unit. J Clin Pathol 1977; 30(2): 160-4.
26.Silver S. Bacterial silver resistance: molecular biology and uses and misuses of silver compounds. FEMS Microbiol Rev 2003; 27(2-3): 341-53. 
27.Li XZ, Nikaido H, Williams KE. Silver-resistant mutants of Escherichia coli display active efflux of Ag+ and are deficient in porins. J Bacteriol 1997; 179(19): 6127-32.
28.Fuller FW, Parrish M, Nance FC. A review of the dosimetry of 1% silver sulfadiazine cream in burn wound treatment. J Burn Care Rehabil 1994;15(3):213-23
29.Ae-Ri Cho Lee, Hyunju Leem, Jaegwan Lee, Kyung Chan Park. Reversal of silver sulfadiazine- impaired wound healing by epidermal growth factor. Biomaterials 2005;26:4670-4676
30.HUGO,W . B. & LONGWORTHA,. R. 1964 Some aspects of the mode of action of chlorhexidine. Journal of Pharmacy and Pharmacology 16,655-662.
31.Annear DI, Mee BJ, Bailey M. Instability and linkage of silver resistance, lactose fermentation, and colony structure in Enterobacter cloacae from burn wounds. J Clin Pathol.1976;29(5):441-443.
32.Carr HS, Rosenkranz HS. R factor in Enterobacter cloacae resistant to silver sulfadiazine. Chemotherapy. 1975;21(1):41-44.
33.Belly RT, Kydd GC. Silver resistance in microorganisms. Develop Industrial Microbiol. 1982;23:567-577.
34.Choudhury P, Kumar R. Multidrug- and metal-resistant strains of Klebsiella pneumoniae isolated from Penaeus monodon of the coastal waters of deltaic Sundarban. Can J Microbiol. 1998;44(2):186-189.
35.Robb EC, Fitz DG, Nathan P. Delivery of topical antimicrobial agents silver sulfadiazine, gentamicin and nystain to infected burn wounds in rats from preloaded synthetic dressings. Trans Am Soc Artif Inter Organs 1980;26:533-6.
36.Robb EC, Nathan P. Control of experimental burn wound infection: comparative delivery of antimicrobial agent (silver sulfadiazine) either from a cream base or from a solid synthetic dressing. J Trauma 1981;21:889-93.
【０１１６】
前述の実施形態の詳細な説明は、本発明の具体的な実施形態を例示する添付図面、実施例及び表を意味する。異なる製剤及び組成物を有する他の実施形態は、本発明の範囲から逸脱しない。「本発明」などという用語は、本明細書に記載の本出願人の発明の多くの代替の態様又は実施形態のいくつかの具体例に関して用いられ、その使用もその非存在も、本出願人の発明の範囲又は特許請求の範囲を制限することを意図するものではない。本明細書は、読者の便宜のためにセクションに分かれているにすぎない。見出しは、本発明の範囲を制限するものと解釈すべきではない。定義は、本発明の説明の一部として意図されている。本発明の様々な詳細が、本発明の範囲から逸脱することなく変わり得るということが理解される。さらに、前述の「参照文献」及び説明は、例示の目的のためにすぎず、制限の目的のためではない。
【図１】
2013527229.tif 000015
【図２】
2013527229.tif 000016
【図３】
2013527229.tif 000017
【図４】
2013527229.tif 000018
【図５】
2013527229.tif 000019
【図６】
2013527229.tif 000020
【図７】
2013527229.tif 000021
【国際調査報告】
2013527229.tif 000022
2013527229.tif 000023
2013527229.tif 000024