(57)【要約】本発明は、折り畳まれたプレトロンビンを生産する方法であって、少なくとも１種のカオトロピック化合物および少なくとも１種の有機ジスルフィド化合物を含む可溶化バッファー中で、折り畳まれていないプレトロンビンまたはその誘導体を含む封入体が可溶化される方法に関する。本発明はさらに、トロンビンおよびα−トロンビンおよびその誘導体を生産する方法に関する。本発明はまた、本発明の方法により生産することができる折り畳まれたタンパク質を含む溶液に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
折り畳まれたプレトロンビンまたはその誘導体を生産する方法であって、折り畳まれていないプレトロンビンまたはその誘導体を含む封入体が、少なくとも１種のカオトロピック化合物および少なくとも１種の有機ジスルフィド化合物を含む可溶化バッファー中で可溶化され、続いて、可溶化されたプレトロンビンまたはその誘導体が少なくとも１種の還元剤、少なくとも１種の折り畳み補助剤、および二価の陽イオンを含む復元バッファー中で復元され、可溶化バッファーおよび復元バッファーは共に界面活性剤を含まない方法。
【請求項２】
ジスルフィド化合物がグルタチオンジスルフィドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
カオトロピック化合物がグアニジニウム塩、特に、グアニジニウム塩酸塩およびグアニジニウムチオシアン酸塩、ヨウ化物、バリウム塩、チオシアン酸塩、尿素および過塩素酸塩から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
封入体が原核細胞におけるプレトロンビンまたはその誘導体の組換え発現によって得られたものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
還元剤が有機モノスルフィドである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
折り畳み補助剤がアルギニンおよびグリセロールから選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
折り畳みがパルス復元法で行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
復元されたプレトロンビンまたは誘導体がクロマトグラフィーにより精製される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
精製が疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
トロンビンおよびα−トロンビンの少なくともいずれか一方、またはそれらの誘導体を生産する方法であって、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法に従って生産された復元プレトロンビンが、特にエカリンを用いた酵素的タンパク質分解によりトロンビンおよびα−トロンビンの少なくともいずれか一方、またはそれらの誘導体に変換される方法。
【請求項１１】
トロンビンおよびα−トロンビンの少なくともいずれか一方、またはそれらの誘導体がタンパク質分解後にクロマトグラフィーにより精製される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
精製が疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法により得られる、折り畳まれたプレトロンビン、折り畳まれたトロンビンおよび折り畳まれたα−トロンビンの少なくともいずれか一方、またはそれらの誘導体を含む溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、封入体から折り畳まれたプレトロンビンおよびトロンビンを生産する方法を提供する。本発明はまた、本発明の方法により生産される折り畳まれたタンパク質を含む溶液も提供する。
【背景技術】
【０００２】
血液凝固カスケードの中心的酵素はセリンプロテアーゼであり、チモーゲンとして知られるやや大きい不活性前駆体として肝臓で合成される。それらには、第ＩＩ因子とも呼ばれる、トロンビンの不活性前駆体であるプロトロンビンが含まれる。トロンビンは、血液凝固カスケードおよび線維素溶解において中心的役割を果たす。この血液凝固における中心的機能により、トロンビンはヒトの医療への使用にとって興味深いものとなっている。トロンビンは、例えばできるだけ速やかに創傷部を閉じるための薬剤として長らく用いられてきた（非特許文献１、２）。
【０００３】
また、トロンビンは他の多くのプロセスにも関与する。例えば、トロンビンはプロトロンビン活性化の停止および線維素溶解の開始を誘導する（非特許文献３）。さらに、トロンビンが胚発生、発癌、血圧調節、アルツハイマー病および創傷治癒プロセスに関与していることが様々な研究によって示されている（非特許文献４、５）。その高い多機能性のためにトロンビンは医学的使用およびバイオテクノロジー的使用に関して極めて興味深い活性化合物である。トロンビンは融合タンパク質の切断に、従って、精製およびアッセイタグの除去に用いられる（非特許文献６）。
【０００４】
そのキモトリプシン、トリプシンおよびエラスターゼなどの他のプロテアーゼとの相同性に基づいて、トロンビンはセリンプロテアーゼに分類されている。セリンプロテアーゼは同じ触媒機構を共通に持つ。セリンプロテアーゼの活性中心は、それらに典型的なセリン−ヒスチジン−アスパラギン酸の触媒三残基を特徴とする。トロンビンは、ジスルフィド結合によって互いに結合されたＡ鎖とＢ鎖の２鎖からなる。トロンビンの、短い方のＡ鎖は膵臓酵素のトリプシン、キモトリプシンおよびエラスターゼと共通の特徴を示さない。他方、これらのセリンプロテアーゼのＢ鎖は３つのさらなる分子内ジスルフィド結合を有し、ほとんど同じである（非特許文献７〜１０）。全てのセリンプロテアーゼと同様に、トロンビンも本質的に、６本のストランドを有する２つのβ折り畳み片からなり、それぞれが共に巻かれてバレル様構造を形成している。Ｖ形のＡ鎖は活性中心の反対側の、より大きなＢ鎖に沿ってくぼんだ溝状に延びている。
【０００５】
会合したチモーゲンプロトロンビン（７２ｋＤａ）は、Ｇｌａドメインと、２つのカールしたドメインとＡ鎖およびＢ鎖とからなる（非特許文献１１、１２）。これら２つのＡ鎖およびＢ鎖は、活性なタンパク質においてはジスルフィド結合を介して結合している。プロトロンビンはＡｒｇ２７１−Ｔｈｒ２７２の間とＡｒｇ３２０−Ｉｌｅ３２１の間でプロトロンビナーゼ複合体により切断される。それによりＮ末端は除去され、Ａ鎖とＢ鎖は互いに分離される。この活性化の順序によって、種々の中間生成物、メイゾトロンビンおよびプレトロンビン−２が形成される（非特許文献１３）。
【０００６】
活性化合物としての組換えトロンビン（ｒｈ−トロンビン）の使用は、現在市場にあるウシおよびヒト血漿から得られる製品の適当な代替である。一方、ｒｈ−トロンビンを用いれば、例えばＨＩＶおよびＢ型肝炎などの感染性疾患の伝達のリスクを最小限に抑えることができる。他方、これは内因性α−トロンビンと非常によく似た特徴を持つ活性化合物であるので、ヒトにおいて免疫応答がほとんど見込まれない。さらに、高細胞密度発酵法では一般に極めて高い生成物収量が達成できるので、組換え生産では従来の方法と比べて相当なコストの削減が期待される。
【０００７】
真核生物および原核細胞におけるα−トロンビンの組換え生産のための種々の方法は文献に記載されている。これらの方法のほとんどでは、α−トロンビンは不活性な前駆体分子プレトロンビン−２から得られ、最初のメタロプロテアーゼエカリンによるクロマトグラフィー精製工程の後に活性化される（非特許文献１４〜１６）。例えば、ザイモジェネティクス社（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）は真核生物ＣＨＯ細胞におけるｒｈ−トロンビンの生産方法を開発したが、この方法ではプレトロンビン−１が出発前駆体分子として用いられる。
【０００８】
哺乳類細胞における組換えタンパク質の生産は一般にコストも時間もかかり、生成物収量も多くない。既知の真核生物発酵法では、２５〜１４０ｍｇ／ｌ発酵培地の生成物収量が達成される。この場合、目的タンパク質であるプレトロンビン−２は培地に分泌される（非特許文献１４、１５）。
【０００９】
これらの重要なパラメーターを改善するためには、原核生物の生産が代替法となる。
非特許文献１６は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）におけるプレトロンビン−２の発現方法を、これに続く可溶化および折り畳みのための工程とともに開示している。折り畳まれた天然プレトロンビン−２の低い生成物収量が達成されたに過ぎない。真核生物発現系で達成される収量と比較して、非特許文献１６に記載された方法は不利であることが分かる。非特許文献１６に記載されている方法では、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００またはＢｒｉｊ（登録商標）−５８などの界面活性剤が用いられる。
【００１０】
特許文献１は、折り畳まれたトロンビンを生産する方法を開示している。この方法は、大腸菌での発現、封入体の取得および可溶化バッファー中でのその可溶化を含む。例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）、Ｂｒｉｊ（登録商標）またはＴｒｉｔｏｎ（登録商標）などの界面活性剤をさらに用いる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００２−３０６１６３号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．  “Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  Ｆｏｒｍ  １０−Ｋ  Ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｙｅａｒ  Ｅｎｄｅｄ  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ３１，  ２００３”  ２００３
【非特許文献２】Ｎａｋａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｎ．  Ｔｈｏｒａｃ．  Ｓｕｒｇ．  ２００５  ７９：  １７９３−１７９４
【非特許文献３】Ｅｓｍｏｎ  ＆  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  １９７４  ２４９（２４）：  ７７９１−７７９７
【非特許文献４】Ｇｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ．”  １９９６  ３１３（２）：  ３５３−３６８
【非特許文献５】Ｔｓｏｐａｎｏｇｌｏｕ  ＆  Ｍａｒａｇｏｕｄａｋｉｓ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  １９９９  ２７４（３４）：  ２３９６９−２３９７６
【非特許文献６】Ｊｅｎｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ２００３  ３１（１）：  １−１１
【非特許文献７】Ｂｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  １９９２  １（４）：  ４２６−４７１
【非特許文献８】Ｓｔｕｂｂｓ  ＆  Ｂｏｄｅ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．  １９９３  ６９（１）：  １−５８
【非特許文献９】Ｓｔｕｂｂｓ  ＆  Ｂｏｄｅ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．  １９９５  Ｊａｎ；  ２０（１）：２３−８
【非特許文献１０】Ｒｅｖｉｅｗ．  Ｅｒｒａｔｕｍ  ｉｎ：  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １９９５  Ｍａｒ；  ２０（３）：１３１
【非特許文献１１】Ｈｉｌｌｅｒ  ２００３，ビーレフェルト大学の理学博士号を取得するための学位論文
【非特許文献１２】Ｂｕｔｅｎａｓ  ＆  Ｍａｎｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｍｏｓｃｏｗ，  Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ，  ２００２，  ６７（１）：  ３−１２
【非特許文献１３】Ｒｏｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９８６  ２６１：  ４２２４−４２２８
【非特許文献１４】Ｒｕｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ．，  １０（２）：２１４−２５
【非特許文献１５】Ｙｏｎｅｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  （Ｔｏｋｙｏ），  １３５（５）：５７７−８２
【非特許文献１６】Ｓｏｅｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２００１，  １３０（２）：  ２６９−２７７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
発明の目的
本発明は、上記の欠点を克服する折り畳まれたプレトロンビンおよびトロンビンの生産方法を提供するという目的に基づく。
【００１４】
本発明は、特に、実施が容易で、高収量を達成するトロンビンおよびプレトロンビンの生産方法を開発するという目的に基づく。
本明細書において、本方法は、折り畳まれたプレトロンビンおよびトロンビンを高収量かつ高純度で生産することを可能としなければならない。本方法は好ましくは原核生物発現系を用いるべきである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の対象：
驚くことにこの目的は特許請求の範囲に記載される方法によって達成される。
本発明は、折り畳まれたプレトロンビンまたはその誘導体を生産する方法であって、折り畳まれていないプレトロンビンまたはその誘導体を含む封入体が、少なくとも１種のカオトロピック化合物および少なくとも１種の有機ジスルフィド化合物を含む可溶化バッファー中で可溶化される方法を提供する。
【００１６】
本発明の方法は、ヒトプレトロンビンの生産および精製に役立つ。好ましくはプレトロンビン−２が用いられる。このタンパク質は３０９個のアミノ酸を有し、分子量は３５，４８５．５Ｄａである。アミノ酸配列を図３に示す。ヒトプレトロンビンは切断されて、２９５個のアミノ酸を有し、分子量が３３，８１０．７Ｄａであるα−トロンビンとなり得る。この配列ならびにＡ鎖およびＢ鎖を図４に示す。
【００１７】
本発明によれば、プレトロンビンの誘導体も使用可能である。これらはそのプロセシングを受けた形態がトロンビン様活性、特にプロテアーゼ活性を有する誘導体である。プレトロンビンの誘導体は、それをタンパク質分解切断することにより活性なトロンビン誘導体を得ることができる、対応する前駆体ポリペプチドである。誘導体は特に、アミノ酸の突然変異、欠失または挿入により、またはそのポリペプチドの化学修飾により得ることができるものである。好ましくは、これらの誘導体は野生型タンパク質と８０％を超える、９０％を超えるまたは９５％を超える配列同一性を有する。これらの誘導体は、一ポリペプチド鎖につき少なくとも１つのシステインを有し、全て天然システインであることが好ましい。当業者ならば、本発明の方法が一般にプレトロンビンの誘導体を用いても実施可能であることが分かるであろう。ペプチド前駆体の折り畳みと切り離しの後に、トロンビンまたはα−トロンビンの対応する誘導体が得られる。従って、これらの方法に関して以下に述べられ、プレトロンビン、トロンビンおよびα−トロンビンについて言及される内容は、これらのポリペプチドの誘導体にも同様に当てはまる。従って、以下の概説では、「プレトロンビン」という用語は、「プレトロンビンまたはプレトロンビンの誘導体」と同等と考えることができる。このことはトロンビンとα−トロンビンにも同様に当てはまる。
【００１８】
本発明の方法では、封入体が可溶化される。封入体（ＩＢ: ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｉｅｓ）は、通常、欠陥のあるまたは不完全な折り畳みのタンパク質の集積体である。封入体は細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）などの細菌細胞内で、組換えタンパク質の過剰発現の事象として生じる。本発明に従って用いられる封入体は、好ましくは、折り畳まれたプレトロンビンを高純度で含む。このことは、封入体が少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０または少なくとも９０重量％のプレトロンビン（タンパク質総量に対する）を含有することを意味する。
【００１９】
可溶化バッファーは、ジスルフィド化合物を含む。ジスルフィド化合物は封入体のポリペプチドのシステインのチオール基（−ＳＨ）と混合ジスルフィドを形成し得る。ジスルフィドをこの溶液に加える。ジスルフィドは、封入体がジスルフィド結合を含む、また、含む可能性があるタンパク質を表さない。好ましくは、ジスルフィドは真のペプチドではない。好ましくは、ジスルフィドは低分子量化合物である。分子量は例えば２，０００ｇ／ｍｏｌ未満または１，０００ｇ／ｍｏｌ未満である。ジスルフィドは例えば５ｍＭ〜１Ｍ、特に１０ｍＭ〜０．５Ｍの濃度で用いられる。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態では、ジスルフィド化合物はジスルフィドグルタチオンである。グルタチオン（ＧＳＨ）は（γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニルグリシンとも）、グルタミン酸、システインおよびグリシンの３つのアミノ酸から形成されるプソイドトリペプチドである。ＧＳＨは原核生物および真核生物の双方の細胞質に存在し、ジスルフィド結合の形成に関与する。ＧＳＨは、ジスルフィド結合を含む二量体ＧＳＳＧと平衡状態にある。グルタチオンは、ジスルフィド交換反応において２つのポリペプチドまたは単一のポリペプチドからシステイン由来のＲ−ＳＨおよびＲ’−ＳＨと反応する。
Ｒ−ＳＨ  ＋  ＧＳＳＧ  →  Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｇ  ＋  ＧＳＨ
ＲＳＳＧは混合ジスルフィドと呼ばれる。ＲＳＳＧはポリペプチドのさらなるシステインと反応し、結果として、２つのシステイン間にジスルフィド結合が得られる。
Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｇ  ＋  ＨＳ−Ｒ’  →  Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ’  ＋  ＧＳＨ
グルタチオンは、サイトゾル内で酵素的に還元型（ＧＳＨ）で維持される。従って、サイトゾル内で「還元状態」であるとみなされる。この状態は可溶化バッファー中で確立され、その結果、それが含むジスルフィド化合物は上記の反応に従ってジスルフィド結合の形成を触媒する。ＧＳＳＧは、例えば１０ｍＭ〜０．５Ｍの濃度で用いられる。
【００２１】
可溶化バッファーは少なくとも１種のカオトロピック物質を含む。水中の規則的な水素結合を解く化学物質はカオトロピック剤と呼ばれる。水素結合が開裂されるので、カオトロピック剤は水構造に干渉し、無秩序状態を確保する（エントロピーの増大）。この理由は、溶媒和に必要なＨ２Ｏのケージ構造の形成が妨げられるためである。アミノ酸の場合、タンパク質折り畳みの駆動力は水中での疎水性アミノ酸の会合であることから、カオトロピック剤は疎水効果を低減し、タンパク質に対して変性作用を持つ。従って一般に、可溶化バッファー中で疎水効果を発揮し、従って、タンパク質に対して変性作用を持つ物質はいずれもカオトロピック物質として使用可能である。カオトロピック物質は一般に塩（えん）、または尿素などの低分子量化合物である。カオトロピック物質は、分子内にアルキル基などの疎水基を含まないことから、界面活性剤とは明確に区別される。一般に、カオトロピック作用はタンパク質、この場合にはプレトロンビンの溶解度の向上を伴う。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態では、カオトロピック化合物はグアニジニウム塩、特にグアニジニウム塩酸塩およびグアニジニウムチオシアン酸塩、ヨウ化物、バリウム塩、チオシアン酸塩、尿素および過塩素酸塩から選択される。
【００２３】
カオトロピック化合物は、従来の量で用いられる。例えば、４〜８Ｍグアニジニウム塩酸塩または４〜９Ｍ尿素が使用可能である。
本発明の好ましい実施形態では、可溶化バッファーはＴｒｉｓバッファーである。本発明の好ましい実施形態では、封入体内のタンパク質の−ＳＨ基と混合ジスルフィドを形成し得る試薬はＧＳＳＧであり、カオトロピック物質はグアニジニウム塩酸塩である。
【００２４】
可溶化バッファーは従来の添加剤、例えばＥＤＴＡまたは塩をさらに含んでもよい。可溶化バッファーのｐＨは例えば６〜１１の間、好ましくは７〜１０の間である。可溶化は好ましくは、例えば従来のホモジナイゼーション装置または超音波の手段によるなど、機械的に補助される。可溶化の後、残留する固体を分離することが好ましい。上清が可溶化プレトロンビンを含む。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態では、封入体は、原核細胞におけるプレトロンビンの組換え発現によって得られたものである。本発明の好ましい実施形態では、原核生物宿主細胞は細菌、好ましくは大腸菌である。本発明の好ましい実施形態では、細菌は、好ましくはｐＳＣＩＬ００８由来のプラスミドで形質転換された、大腸菌ＪＭ１０８（ＤＳＭＺ  ５５８５；３．３．２００６）である。
【００２６】
好ましくは、可溶化後に、過剰なジスルフィド化合物が除去される。この試薬の除去は好ましくは、バッファー交換のための方法を用いて、すなわち、透析、クロマトグラフィーまたはタンジェンシャルフロー・フィルトレーションによって行われる。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態では、可溶化プレトロンビンは、少なくとも１種の還元剤、少なくとも１種の折り畳み補助剤および二価の陽イオンを含有する復元バッファー中で復元される。本発明の好ましい実施形態では、可溶化物は、数回に分けて、連続的に数日かけて折り畳みバッチに添加される。好ましくは、可溶化物は、可溶化物に対して急速希釈を行うことによる「パルス復元」にて添加する。これに関しては、例えば、２４時間間隔で６パルスを行うことができる。パルス回数は、可溶化バッチの添加後に、折り畳まれていないタンパク質の濃度が高すぎないように設定する（そうでなければ凝集塊が得られるため）。例えば、１回のパルス当たり約０．１ｇ／ｌのタンパク質が新たに折り畳みバッチに移行する（可溶化物の添加後の折り畳みバッチ中のタンパク質濃度に基づく）。このようにして、折り畳みバッチ中で０．６ｇ／ｌのタンパク質終濃度を達成することができる。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態では、還元剤は有機モノスルフィドである。ここでは、グルタチオン（ＧＳＨ）の使用が好ましい。ＧＳＨ／ＧＳＳＧ混合物も使用可能である。
本発明の好ましい実施形態では、折り畳み補助剤はアルギニンおよびグリセロールから選択される。タンパク質の折り畳みを促進する化合物は一般に、「折り畳み補助剤」として使用可能である。このような化合物は当業者に公知である。このような化合物は種々の方式で折り畳みを補助することができる。アルギニンは不適切な折り畳みの中間体を脱安定化し、これによりこれらは少なくとも部分的に折り畳みが再び解かれ（熱力学的閉塞状態から）、従って、再び適切に折り畳まれ得ると仮定される。他方、グリセロールは通常、タンパク質を安定化する。折り畳み補助剤を用いない方法に比べて、本発明の方法において折り畳まれたプレトロンビンの絶対収量を５％超、特に１０％超または２０％超（折り畳みに用いたプレトロンビンの総量に基づく）高める化合物が折り畳み補助剤として特に好適である。
【００２９】
復元バッファーは二価の陽イオンを含む。カルシウム塩、特に塩化カルシウムの使用が好ましい。復元バッファーは好ましくはＴｒｉｓバッファーである。
復元は好ましくは、６〜１２の間、特に７〜１１の間のｐＨで行われる。
【００３０】
好ましい実施形態では、折り畳まれたプレトロンビンまたはその誘導体を生産する方法は、以下の工程：折り畳まれていないプレトロンビンまたはその誘導体を含む封入体を、少なくとも１種のカオトロピック化合物および少なくとも１種の有機ジスルフィド化合物を含む可溶化バッファー中で可溶化させる工程と、続いて、可溶化されたプレトロンビンまたはその誘導体を、少なくとも１種の還元剤、少なくとも１種の折り畳み補助剤、および二価の陽イオンを含む復元バッファー中で復元させる工程（なお、この可溶化バッファーおよび復元バッファーは共に界面活性剤を含まない）とを含む。
【００３１】
従って、本発明の好ましい実施形態では、可溶化バッファーおよび／または復元バッファーは界面活性剤を含まない。本発明によれば、界面活性剤の使用はプレトロンビンの可溶化および／または折り畳みに必要ではないことが判明した。このことは有利である。何故なら、ある種の界面活性剤は、医薬製剤が含むべきではない、または少量でしか含むべきではない比較的攻撃的な物質であるため、費用のかかる方法で除去しなければならないためである。従って、本発明の方法は、タンパク質を折り畳むのにこのような攻撃的な界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００またはＢｒｉｊ（登録商標）−５８）を用いる非特許文献１６の方法に比べて有利である。
【００３２】
この好ましい界面活性剤の不在は、上記で言及した可溶化バッファーおよび復元バッファーに対してだけでなく、用いられるあらゆる試薬および方法に対しても当てはまる。言い換えれば、本発明の生産方法全体に界面活性剤は使用されず、従って、本生産方法は界面活性剤フリーである。これは、折り畳まれたプレトロンビンの生産とこの折り畳まれたプレトロンビンからのトロンビンの生産の双方の態様について言える。
【００３３】
驚くことに、本発明の方法を用いれば高い復元収率が達成される。例えば、封入体の総プレトロンビンに対して最大２５％の復元収率を達成することが可能となった。好ましくは、少なくとも１０％または少なくとも２０％の復元収率が達成される。タンパク質終濃度は例えば０．６ｇ／ｌであり得る。生産中に大量の折り畳みを避けるには、０．１〜２ｇ／ｌの間、特に、０．３ｇ／ｌ超が好ましい。
【００３４】
可溶化とその後の復元を伴う本発明の方法を実施することにより、折り畳まれたプレトロンビンの水溶液が得られる。折り畳まれたプレトロンビンはその後、既知の方法によってさらに精製することができる。
【００３５】
本発明によれば、クロマトグラフィー精製、特に、疎水性相互作用クロマトグラフィーの手段によるクロマトグラフィー精製がさらなる精製に特に有利であることが判明した。使用カラムは例えば、ＧＥヘルスケア社（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のフェニルセファロースＨＰであり得る。ＨＩＣクロマトグラフィーは、好ましくは高塩バッファー中１．１５Ｍの濃度の硫酸アンモニウムの存在下で行われる。これらの条件下で段階的勾配の手段による溶出において７０〜９５％の生成物収率が達成可能であることが判明した。
【００３６】
好ましくは、精製は、ヒルディンに基づくアフィニティークロマトグラフィーにより行われない。好ましくは、本発明の方法では、ヒルディンに基づくアフィニティークロマトグラフィーを用いた精製工程は行われない。
【００３７】
好ましくは、復元されたプレトロンビンは、特に小型の毒液プロテアーゼ、好ましくはエカリンを用いた酵素的タンパク質分解によりトロンビンに変換される。セリンプロテアーゼエカリンは、プレトロンビン−２のアルギニン３２０およびイソロイシン３２１の位置でＡ鎖とＢ鎖の間のペプチド結合を切断する。このようにして形成されたトロンビンは、その固有のＮ末端の自己触媒的切り離しによりα−トロンビンとなる。本発明の方法では、インキュベーション時間が十分であれば、このように、トロンビンが中間生成物として得られ、α−トロンビンが最終産物として得られる。自己触媒的切断が完全でなければ、トロンビンとα−トロンビンの混合物が得られる。以下、「トロンビン」という用語は、この混合物も表す。エカリンと類似の機能性を有するプロテアーゼもまたタンパク質分解切断に使用可能である。好ましくは、プロテアーゼは２Ｕ／ｍｌ未満、好ましくは１Ｕ／ｍｌ未満、または０．５Ｕ／ｍｌ未満の濃度で用いられる。
【００３８】
好ましくは、トロンビンおよび／またはα−トロンビンは、タンパク質分解後にクロマトグラフィーにより精製される。好ましくは、この精製は疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ: ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）により行われる。プロセス手順中にα−トロンビンによって起こる自己溶解産物の形成（プレトロンビン−２の活性化後の比較的長い保存中に自然に形成され得る）が重要であることが分かった。α−トロンビンとその自己溶解産物のｐＩ値は実質的に同じであるので、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ: ｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）によるこれらの生成物に関連する不純物の除去は困難であることが分かっている。代わりに疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いたところ、より好適な除去効果が顕著に見られた。従って、本発明によれば、復元後の折り畳まれたプレトロンビンに対する、また、プレトロンビンのタンパク質分解切断後のトロンビンに対するＨＩＣの手段による精製を行うことが好適である。一般に、水溶液中での切断型プレトロンビン、または水溶液中でのトロンビンまたはα−トロンビンのＨＩＣによる精製には、請求項１の特徴を備えた、封入体から折り畳まれたプレトロンビンを生産する具体的な本方法に限定されない利点がある。よって、本発明はまた、一般に、折り畳まれたプレトロンビンまたはトロンビンまたはα−トロンビンを含む水溶液の、ＨＩＣの手段による精製を提供する。
【００３９】
本発明の好ましい実施形態では、得られたトロンビンの、ＨＩＣの手段による精製の他、さらなるクロマトグラフィー精製工程が行われる。好ましくは、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）が用いられる。この手段によれば、内毒素、ＤＮＡおよび宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ: ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の含量を最小限に抑えることができる。
【００４０】
ダイアフィルトレーションは、その後の活性化合物の濃縮と合わせて、このプロセス手順の最後に配備することができる。しかしながら、トロンビンの純度および濃度をさらに高めるための、他の既知の方法も使用可能である。
【００４１】
α−トロンビンの保存安定性に関する試験では、アミノ酸および塩の添加が自己溶解を抑えると同時に、４℃で少なくとも３か月にわたってα−トロンビンの安定性を保証することが示された。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の方法は以下の工程を含む：
ａ）原核細胞での組換えプレトロンビンの発現およびプレトロンビン含有封入体の単離、
ｂ）少なくとも１種のカオトロピック物質、および封入体中のタンパク質の−ＳＨ基と混合ジスルフィドを形成し得るジスルフィド化合物を含む好適な可溶化バッファーと封入体との混合、
ｃ）過剰なジスルフィドの除去、
ｄ）少なくとも１種の還元剤、折り畳み補助剤、および二価の陽イオンを含む好適な界面活性剤非含有バッファー中での復元、
ｅ）復元されたプレトロンビンの精製、
ｆ）活性型への切断、および
ｇ）トロンビンおよび／またはα−トロンビンの単離および精製。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態では、工程ｂ）において、封入体と好適なバッファー（１０ｍＭ〜０．５ＭのＧＳＳＧ、４〜８Ｍのグアニジニウム塩酸塩（ＧｕａＨＣｌ）および０．１〜１０ｍＭのＥＤＴＡを含み、中性〜塩基性の範囲のｐＨを持つ）との１：４〜１：１９比（１ｇのＩＢペースト＋４ｍｌの可溶化バッファー）での混合を行う。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態では、工程ｂ）において、封入体と好適なバッファー（０．１２ＭのＧＳＳＧ、５Ｍのグアニジン塩酸塩（ＧｕａＨＣｌ）および１ｍＭのＥＤＴＡを含み、中性〜やや塩基性領域のｐＨを持つ）とが１：９比で混合される。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態では、工程ｃ）において、３〜８Ｍ、好ましくは５Ｍグアニジン塩酸塩、酸性ｐＨ（ｐＨ３．０）中でのバッファー交換による、混合ジスルフィド形成のための過剰な試薬の除去が達成される。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態では、工程ｄ）のパルス復元は、好適な界面活性剤非含有バッファー（０．１〜３ｍＭのＧＳＨ、０．１〜２Ｍのアルギニン、０．００１〜１ＭのＣａＣｌ２、０．１〜５０ｍＭのＥＤＴＡおよび１〜４０％のグリセロールを含み、中性〜やや塩基性のｐＨを持つ）中、０．０１〜１．０ｇ／ｌのタンパク質（パルス１回当たりの折り畳みバッチ中のタンパク質濃度に基づく）で行われる。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態では、工程ｄ）は、０．１ｇ／ｌの可溶化物を好適な界面活性剤非含有バッファー（０．７５ｍＭのＧＳＨ、１Ｍのアルギニン、５０ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡおよび２０％のグリセロールを含み、中性〜やや塩基性のｐＨを有する）で急速希釈することにより行われ、折り畳みバッチのタンパク質濃度は１回のパルス当たり０．１ｇ／ｌだけ増加し、各場合２４時間の間隔で６パルスが行われる。
【００４８】
本発明は、工業的規模でトロンビンを生産するための新規な原核生物法を記載し、この場合、既知の方法に比べて、プレトロンビン収量は数倍高まり、従って、経費およびコストは顕著に削減される。この収量増加は特に新規な可溶化および復元方法によって達成される。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける、復元後のプレトロンビン−２の純度を示す。プレトロンビン−２の復元はタンパク質終濃度０．６ｇ／ｌまでパルス復元法により行った。最大２５％の復元収率が達成された。クーマシー染色を行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで復元バッチを示す。
【図２】疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｂｕｔｙｌ−６５０Ｓ）によるα−トロンビンの精製を示す。濾過したエカリン切断バッチ（４．５ｍｌ＋４．５ｍｌの高塩バッファー：２Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ６．０）を４ｍｌ  ＨＩＣカラム（Ｔｒｉｃｏｒｎ（登録商標）５／２００）で精製した。平衡化は５０％高塩バッファーで行い、溶出は２０ＣＶから５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ６．０への直線勾配により行った。
【図３】プレトロンビン−２のアミノ酸配列、構造および重要な特性を示す。
【図４】α−トロンビンのアミノ酸配列、構造および重要な特性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
実施例１：ｒｈ−プレトロンビン−２の発現
ｒｈ−プレトロンビン−２の発現に用いる細菌宿主大腸菌ＪＭ１０８（ＤＳＭＺ  ５５８５；Ｆ−  ｔｈｉΔ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）  ｅｎｄ  Ａ１  ｇｙｒＡ９６  ｒｅｌＡ１  ｐｈｘ  ｈｓｄＲ１７  ｓｕｐＥ４４  ｒｅｃＡ）はプロリン栄養要求性であり、この栄養要求性はｐＳＣＩＬ０４８と呼ばれるプラスミドを用いることで無効となった。プラスミドｐＳＣＩＬ０４８はプラスミドｐＳＣＩＬ００８に基づくものである（国際公開第０５／０６１７１６号参照）。この株はチアミンを合成できない（Ｖｉｅｉｒａ  ＆  Ｍｅｓｓｉｎｇ，  １９８２  Ｇｅｎｅ．  Ｏｃｔ；１９（３）：２５９−６８）。プレトロンビン−２はｐＳＣＩＬ０４８上にあるｔａｃプロモーターの制御下で発現される。ここで用いたベクターｐＳＣＩＬ０４８は、カナマイシン耐性を有する高コピープラスミドである。発現は定義された無機塩培地で行い、ＩＰＴＧの添加により誘導される。プレトロンビン−２はサイトゾル内に封入体（ＩＢ）の形態で堆積する。
【００５１】
バイオマス生産は３７℃で行った。この発酵の目的は、次のプロセス工程のために生成物およびバイオマスを得ることであった。発酵プロセス中、目的タンパク質の過剰発現をモニタリングするために、誘導前と誘導後にサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥの手段により分析した。バイオマス特異的なタンパク質濃度の増加は誘導３時間後までに見られた。
実施例２：細胞の破壊と封入体（ＩＢ）の調製
目的タンパク質プレトロンビン−２の発現はＩＢの形態で起こる。細胞の破壊とＩＢの調製は標準プロトコールに従って行い、実験室規模でおよそ２００ｇのバイオマスまで増やすことができる。
実施例３：可溶化と復元
本発明の至適化された復元プロトコールで、混合ジスルフィドに基づいて再折り畳みを行った。
【００５２】
混合ジスルフィドの調製では、ＩＢを１ｇのＩＢペースト＋９ｍｌの可溶化バッファー（５Ｍ  ＧｕａＨＣｌ；０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；０．１Ｍ  ＧＳＳＧを含む、ｐＨ８．５）の比率でホモジナイズし、室温で３時間可溶化した。５０，０００×ｇで３０分の遠心分離工程の後、遊離ＧＳＳＧ／ＧＳＨ混合物を分離するために５Ｍ  ＧｕａＨＣｌ；１ｍＭ  ＨＣｌ  ｐＨ３．０中で再緩衝工程を行った。
【００５３】
５０，０００×ｇで３０分の遠心分離工程（任意）の後、遊離ＧＳＳＧ／ＧＳＨ混合物を分離するために、５Ｍ  ＧｕａＨＣｌ（３〜８Ｍ）、１ｍＭ  ＨＣｌ  ｐＨ３．０（その後、可溶化物を折り畳みバッチに直接加えない場合は、酸性ｐＨが重要である）中で再緩衝工程を行った。
【００５４】
パルス復元は、可溶化物を折り畳みバッファー（１Ｍアルギニン、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０％グリセロール、０．７５ｍＭ  ＧＳＨ  ｐＨ８．５）で急速希釈することにより行った（好ましくは、２４時間間隔で最大６パルスを行った）。１回のパルス当たり０．１ｇ／ｌのタンパク質が新たに折り畳みバッチに移行した（可溶化物の添加後の折り畳みバッチ中のタンパク質濃度に基づく）。折り畳みタンク内で０．６ｇ／ｌのタンパク質終濃度が達成された。
【００５５】
図１は、復元後の生成物の純度を示す。この方法により、２５％の復元収率（折り畳みバッチ中に導入された可溶化物の量に基づく）が達成された。
実施例４：プレトロンビン−２の精製
ダイアフィルトレーションの手段による交換の際には比較的高い収量損失が起こったことから、代わりに硫酸アンモニウムを添加した（好ましくは、終濃度１．１５Ｍ）。沈殿を遠心分離の手段により分離し、上清をＨＩＣカラム（好ましくは、フェニルセファロースＨＰ、ＧＥヘルスケア社）に適用し、次いで、所望のバッファーにてプレトロンビンを溶出させた。
実施例５：プレトロンビンの活性化
プレトロンビン−２の活性化によるα−トロンビンの獲得は、プレトロンビン−２のＡ鎖とＢ鎖の間（Ａｒｇ３２０−Ｉｌｅ３２１）のペプチド結合を特異的に切断するセリンプロテアーゼ、エカリンを用いて行った。このようにして形成されたトロンビンから、その固有のＮ末端の自己触媒的切り離しによりα−トロンビンが形成される。この切断条件は、最小可能エカリン要求で最大切断収率が達成されるように選択した。これに関して、振動インキュベーターにて、３７℃、６００ｒｐｍにて２４時間内に、１Ｕのエカリンで、２，０００μｇのプレトロンビン−２（０．５〜０．８ｍｇ／ｍｌ）が切断された。反応は、ＥＤＴＡを終濃度２５ｍＭとなるように添加することにより停止させた。切断後、沈殿したタンパク質が見られたので、この溶液を濾過（０．２μｍ）した後に、クロマトグラフィーによる精製を行った。切断収率は、沈殿の量によって、７０％〜９０％の間であった。
実施例６：α−トロンビンの精製
濾過したエカリン切断バッチをクロマトグラフィー精製のための出発材料として用いた。この精製の目的は、宿主細胞タンパク質の分離の他、とりわけ、切断されていないプレトロンビン−２の、およびα−トロンビンの自己触媒的切断産物の除去であった。エカリン切断の際、プレトロンビン−２は９５％を超える純度で存在する。切断産物の除去のより良い検討のために、これらを、切断バッチを３７℃でさらに２４時間インキュベートすることにより濃縮した。
【００５６】
トロンビン誘導体をイオン交換クロマトグラフィーの手段により分離することは、それらが実質的に同じｐＩ値（ｐＩ約９）を持つために困難であることが分かった。α−トロンビンとその自己溶解産物のｐＩ値は二次元ゲル電気泳動の手段により実験的に測定した。従って、陽イオン交換材料の他、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料を試験した。
【００５７】
図２は４ｍｌ  ＨＩＣカラム（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｂｕｔｈｙｌ−６５０Ｓ）での精製のクロマトグラムを示す。これのために、カラムに適用する前に、４．５ｍｌの濾過済みエカリン切断バッチを高塩バッファー（２Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭリン酸バッファー  ｐＨ６．０）で１：１希釈した。溶出は、５０％高塩バッファーで開始して２０ＣＶにわたり５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ６．０に至る直線勾配の手段により行った。精製の結果を検討するために、クロマトグラフィー直後に、さらなる自己溶解を阻害するために主要画分にＰＭＳＦを１ｍＭの終濃度まで加えた。合計すると、主要なピークにおけるα−トロンビンの収率は６５％である（ＵＶ２８０で測定）。
結果：
大腸菌においてｒｈ−トロンビンを生産するための本発明の方法では、文献に記載されている収率を顕著に超えている。例えば、真核生物発現系における天然プレトロンビン−２に関して文献に記載されている生成物収量は２５〜２００ｍｇ／ｌ発酵培地の間である（非特許文献１４、１５）。
【００５８】
これに対し、本発明によって達成される天然プレトロンビン−２の収量は４００ｍｇ／ｌ発酵培地である。少なくとも９５％のｒｐ−ＨＰＬＣ純度のα−トロンビンでは、２００ｍｇ／ｌ発酵培地の収量が達成される。さらに、用いた原核生物発現系は既知の真核生物法よりも確立が簡単である。
【００５９】
非特許文献１６に記載されている原核生物法では、復元後の天然プレトロンビン−２の折り畳み収率４〜７％が達成される。一方、本発明に従う方法では、２５％の折り畳み収率が得られた。その上、使用される折り畳みバッチの体積は減少した（折り畳み中のタンパク質濃度は増加）。
【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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