(57)【要約】  本発明は、オリゴヌクレオチドを伴う脂質ナノ粒子を形成するために他の脂質成分、例えばコレステロールおよびＰＥＧ−脂質、と併用することができる新規カチオン性脂質を提供する。強化された効力とともに、より低い肝臓内脂質レベルの結果としてより低い肝毒性を明示するカチオン性脂質足場を提供することが、本発明の目的である。本発明は、少なくとも１本の脂質短鎖を含む低分子量カチオン性脂質を用いて、ｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ送達の効率および耐容性を向上させる。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ａのカチオン性脂質：
【化１】
2013545727.tif 000017
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、ヘテロシクリルおよびポリアミンから独立して選択され、前記アルキル、ヘテロシクリルおよびポリアミンは、Ｒ’から選択される１から３個の置換基で置換されていてもよく、またはＲ１およびＲ２は、それらが結合している窒素と一緒に４〜７員の単環式複素環を形成することができ、前記単環式複素環は、窒素に加えて、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１もしくは２個のさらなるヘテロ原子を含有していてもよく、前記単環式複素環は、Ｒ’から選択される１から３個の置換基で置換されていてもよく；
Ｒ３は、Ｈおよび（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択され、前記アルキルは、Ｒ’から選択される１から３個の置換基で置換されていてもよく；
Ｒ’は、ハロゲン、Ｒ’’、ＯＲ’’、ＳＲ’’、ＣＮ、ＣＯ２Ｒ’’またはＣＯＮ（Ｒ’’）２から独立して選択され；
Ｒ’’は、Ｈおよび（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから独立して選択され、前記アルキルは、ハロゲンおよびＯＨで置換されていてもよく；
ｎは、０、１、２、３、４または５であり；
Ｘは、Ｏ、ＮＲ’’、（Ｃ＝Ｏ）Ｏ、ＮＲ’’（Ｃ＝Ｏ）、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｏ、ＮＲ’’（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ’’、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ’’およびＮＲ’’（Ｃ＝Ｏ）Ｏから選択され；
Ｌ１は、Ｃ４〜Ｃ２４アルキルおよびＣ４〜Ｃ２４アルケニルから選択され、前記アルキルおよびアルケニルは、Ｒ’から選択される１個以上の置換基で置換されていてもよく；ならびに
Ｌ２は、Ｃ３〜Ｃ９アルキルおよびＣ３〜Ｃ９アルケニルから選択され、前記アルキルおよびアルケニルは、Ｒ’から選択される１個以上の置換基で置換されていてもよい）
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体。
【請求項２】
Ｒ１およびＲ２が、それぞれメチルであり；
Ｒ３が、Ｈであり；
ｎが、３であり；
Ｘが、（Ｃ＝Ｏ）Ｏであり；
Ｌ１が、Ｃ４〜Ｃ２４アルキルおよびＣ４〜Ｃ２４アルケニルから選択され；ならびに
Ｌ２が、Ｃ３〜Ｃ９アルキルおよびＣ３〜Ｃ９アルケニルから選択される、
請求項１に記載の式Ａのカチオン性脂質、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体。
【請求項３】
（２０Ｚ，２３Ｚ）−ノナコサ−２０，２３−ジエン−１０−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（化合物１）；および
（１８Ｚ）−ヘプタコサ−１８−エン−１０−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（化合物２）
であるカチオン性脂質、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体。
【請求項４】
脂質ナノ粒子の調製のための、請求項１に記載のカチオン性脂質の使用。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドの送達用の脂質ナノ粒子の成分としての、請求項１に記載のカチオン性脂質の使用。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡである、請求項５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチドを伴う脂質ナノ粒子を形成するために、細胞取り込みおよびエンドソーム脱出を助長するために、ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏでもｉｎ  ｖｉｖｏでも標的ｍＲＮＡをノックダウンするために、他の脂質成分、例えばコレステロールおよびＰＥＧ−脂質、と併用することができる新規カチオン性脂質に関する。
【背景技術】
【０００２】
カチオン性脂質について、ならびにオリゴヌクレオチド、特にｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの送達用の脂質ナノ粒子におけるカチオン性脂質の使用について、これまでに報告されている。脂質ナノ粒子について、ならびにオリゴヌクレオチド、特にｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの送達用の脂質ナノ粒子の使用については、これまでに報告されている。オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを含む）、およびオリゴヌクレオチドの合成は、これまでに報告されている。（米国特許出願：米国特許出願公開第２００６／００８３７８０号、同第２００６／０２４０５５４号、同第２００８／００２００５８号、同第２００９／０２６３４０７号および同第２００９／０２８５８８１号明細書、ならびにＰＣＴ特許出願：国際公開第２００９／０８６５５８号、同第２００９／１２７０６０号、同第２００９／１３２１３１号、同第２０１０／０４２８７７号、同第２０１０／０５４３８４号、同第２０１０／０５４４０１号、同第２０１０／０５４４０５号、同第２０１０／０５４４０６号および同第２０１０／１０５２０９号パンフレット参照）。Ｓｅｍｐｌｅ  Ｓ．Ｃ．ら，Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０年１月１７日オンライン公開；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．ｌ６０２も参照のこと。
【０００３】
他のカチオン性脂質は、米国特許出願：米国特許出願公開第２００９／０２６３４０７号、同第２００９／０２８５８８１号、同第２０１０／００５５１６８号、同第２０１０／００５５１６９号、同第２０１０／００６３１３５号、同第２０１０／００７６０５５号、同第２０１０／００９９７３８号および同第２０１０／０１０４６２９号明細書に開示されている。
【０００４】
さらに、カチオン性脂質ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ（すなわち（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート）は、特許文献１４に開示されている。
【０００５】
旧来のカチオン性脂質、例えばＣＬｉｎＤＭＡおよびＤＬｉｎＤＭＡは、肝臓へのｓｉＲＮＡ送達に用いられているが、最適でない送達効率とともに、高用量での肝毒性を欠点として持つ。強化された効力とともに、より低い肝臓内脂質レベルの結果としてより低い肝毒性を示すカチオン性脂質足場を提供することが、本発明の目的である。本発明は、少なくとも１本の脂質短鎖を含む低分子量カチオン性脂質を用いて、ｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ送達の効率および耐容性を向上させる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／００８３７８０号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００６／０２４０５５４号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００８／００２００５８号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００９／０２６３４０７号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００９／０２８５８８１号明細書
【特許文献６】国際公開第２００９／０８６５５８号パンフレット
【特許文献７】国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレット
【特許文献８】国際公開第２００９／１３２１３１号パンフレット
【特許文献９】国際公開第２０１０／０４２８７７号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第２０１０／０５４３８４号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第２０１０／０５４４０１号パンフレット
【特許文献１２】国際公開第２０１０／０５４４０５号パンフレット
【特許文献１３】国際公開第２０１０／０５４４０６号パンフレット
【特許文献１４】国際公開第２０１０／１０５２０９号パンフレット
【特許文献１５】米国特許出願公開第２００９／０２６３４０７号明細書
【特許文献１６】米国特許出願公開第２００９／０２８５８８１号明細書
【特許文献１７】米国特許出願公開第２０１０／００５５１６８号明細書
【特許文献１８】米国特許出願公開第２０１０／００５５１６９号明細書
【特許文献１９】米国特許出願公開第２０１０／００６３１３５号明細書
【特許文献２０】米国特許出願公開第２０１０／００７６０５５号明細書
【特許文献２１】米国特許出願公開第２０１０／００９９７３８号明細書
【特許文献２２】米国特許出願公開第２０１０／０１０４６２９号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｅｍｐｌｅ  Ｓ．Ｃ．ら，Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０年１月１７日オンライン公開；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．ｌ６０２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、オリゴヌクレオチドを伴う脂質ナノ粒子を形成するために他の脂質成分、例えばコレステロールおよびＰＥＧ−脂質、と併用することができる新規カチオン性脂質を提供する。強化された効力とともに、より低い肝臓内脂質レベルの結果としてより低い肝毒性を明示するカチオン性脂質足場を提供することが、本発明の目的である。本発明は、１本の脂質短鎖を有する低分子量カチオン性脂質を用いて、ｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ送達の効率および耐容性を向上させる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】マウスにおけるＬＮＰ（化合物１）効力である。
【図２】ラットにおけるＬＮＰ（化合物２）効力である。
【図３】ラット肝臓内の脂質（化合物２）レベルである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の様々な態様および実施形態は、オリゴヌクレオチド、特にｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを任意の標的遺伝子に送達するための脂質ナノ粒子において有用な新規カチオン性脂質の使用効果に関する。（米国特許出願：米国特許出願公開第２００６／００８３７８０号、同第２００６／０２４０５５４号、同第２００８／００２００５８号、同第２００９／０２６３４０７号および同第２００９／０２８５８８１号明細書、ならびにＰＣＴ特許出願：国際公開第２００９／０８６５５８号、同第２００９／１２７０６０号、同第２００９／１３２１３１号、同第２０１０／０４２８７７号、同第２０１０／０５４３８４号、同第２０１０／０５４４０１号、同第２０１０／０５４４０５号、同第２０１０／０５４４０６号および同第２０１０／１０５２０９号パンフレット参照）。Ｓｅｍｐｌｅ  Ｓ．Ｃ．ら，Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０年１月１７日オンライン公開；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．ｌ６０２も参照のこと。
【００１１】
本発明のカチオン性脂質は、オリゴヌクレオチド、具体的にはｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの送達用の脂質ナノ粒子の有用な成分である。
【００１２】
本発明の第一の実施形態において、カチオン性脂質は、式Ａ：
【００１３】
【化１】
2013545727.tif 000002
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、ヘテロシクリルおよびポリアミンから独立して選択され、前記アルキル、ヘテロシクリルおよびポリアミンは、Ｒ’から選択される１から３個の置換基で置換されていてもよく、またはＲ１およびＲ２は、それらが結合している窒素と一緒に４〜７員の単環式複素環を形成することができ、前記単環式複素環は、窒素に加えて、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１もしくは２個のさらなるヘテロ原子を含有していてもよく、前記単環式複素環は、Ｒ’から選択される１から３個の置換基で置換されていてもよく；
Ｒ３は、Ｈおよび（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択され、前記アルキルは、Ｒ’から選択される１から３個の置換基で置換されていてもよく；
Ｒ’は、ハロゲン、Ｒ’’、ＯＲ’’、ＳＲ’’、ＣＮ、ＣＯ２Ｒ’’およびＣＯＮ（Ｒ’’）２から独立して選択され；
Ｒ’’は、Ｈおよび（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから独立して選択され、前記アルキルは、ハロゲンおよびＯＨで置換されていてもよく；
ｎは、０、１、２、３、４または５であり；
Ｘは、Ｏ、ＮＲ’’、（Ｃ＝Ｏ）Ｏ、ＮＲ’’（Ｃ＝Ｏ）、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｏ、ＮＲ’’（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ’’、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ’’およびＮＲ’’（Ｃ＝Ｏ）Ｏから選択され；
Ｌ１は、Ｃ４〜Ｃ２４アルキルおよびＣ４〜Ｃ２４アルケニルから選択され、前記アルキルおよびアルケニルは、Ｒ’から選択される１個以上の置換基で置換されていてもよく；ならびに
Ｌ２は、Ｃ３〜Ｃ９アルキルおよびＣ３〜Ｃ９アルケニルから選択され、前記アルキルおよびアルケニルは、Ｒ’から選択される１個以上の置換基で置換されていてもよい）
またはその任意の薬学的に許容される塩もしくは立体異性体によって説明される。
【００１４】
第二の実施形態において、本発明は、
Ｒ１およびＲ２が、それぞれメチルであり；
Ｒ３が、Ｈであり；
ｎが、３であり；
Ｘが、（Ｃ＝Ｏ）Ｏであり；
Ｌ１が、Ｃ４〜Ｃ２４アルキルおよびＣ４〜Ｃ２４アルケニルから選択され；ならびに
Ｌ２が、Ｃ３〜Ｃ９アルキルおよびＣ３〜Ｃ９アルケニルから選択される、
式Ａを有する化合物、またはその任意の薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を特徴とする。
【００１５】
具体的なカチオン性脂質は、
（２０Ｚ，２３Ｚ）−ノナコサ−２０，２３−ジエン−１０−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（化合物１）；および
（１８Ｚ）−ヘプタコサ−１８−エン−１０−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（化合物２）；
またはそれらの任意の薬学的に許容される塩もしくは立体異性体である。
【００１６】
もう１つの実施形態において、開示するカチオン性脂質は、脂質ナノ粒子の調製に有用である。
もう１つの実施形態において、開示するカチオン性脂質は、オリゴヌクレオチドの送達用の脂質ナノ粒子の有用な成分である。
【００１７】
もう１つの実施形態において、開示するカチオン性脂質は、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの送達用の脂質ナノ粒子の有用な成分である。
【００１８】
もう１つの実施形態において、開示するカチオン性脂質は、ｓｉＲＮＡの送達用の脂質ナノ粒子の有用な成分である。
【００１９】
本発明のカチオン性脂質は、（Ｅ．Ｌ．Ｅｌｉｅｌ  ａｎｄ  Ｓ．Ｈ．Ｗｉｌｅｎ，Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４，１１１９−１１９０頁に記載されているような）不斉中心、キラル軸およびキラル面を有することがあり、ラセミ体として、ラセミ混合物としておよび個々のジアステレオマーとして出現することがあり、それらのすべてのあり得る立体異性体および混合物（光学異性体を含む）が本発明に含まれる。加えて、本明細書に開示するカチオン性脂質は、互変異性体として存在することがあり、一方の互変異性体構造しか描かれていなかったとしても両方の互変異性体形態が本発明の範囲に包含されると解釈される。
【００２０】
本発明のカチオン性脂質の置換基および置換パターンを当業者が選択して、化学的に安定しているカチオン性脂質であって、容易に入手できる出発原料から、下に示す方法ばかりでなく当該技術分野において公知の技術によって容易に合成され得るカチオン性脂質を得ることができることは理解される。置換基自体が１つより多くの基で置換されている場合、これらの多数の基は、結果として安定した構造が生ずるのであれば同じ炭素上にあってもよいし、または異なる炭素上にあってもよいことは理解される。
【００２１】
１個以上のＳｉ原子を当業者が本発明のカチオン性脂質に組み込んで、化学的に安定しているカチオン性脂質であって、容易に入手できる出発原料から当該技術分野において公知の技術によって容易に合成され得るカチオン性脂質を得ることができることは理解される。
【００２２】
式Ａの化合物中の原子は、それらの天然の同位体存在度を呈示することもあり、またはそれらの原子のうちの１個以上が、同じ原子番号を有するが天然に主として見出される原子質量もしくは質量数とは異なる原子質量もしくは質量数を有する特定の同位体に関して人工的に富化されていることもある。本発明は、式Ａの化合物のすべての適する同位体を含むことを意図したものである。例えば、水素（Ｈ）の異なる同位体形態としては、プロチウム（１Ｈ）およびジュウテリウム（２Ｈ）が挙げられる。プロチウムは、天然に見出される水素同位体である。ジュウテリウムの富化は、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の増加もしくは投薬必要量低減などの一定の治療的利点をもたらすことができ、または生体試料の特性評価のための標準物質として有用な化合物を生じさせることができる。式Ａの範囲内の同位体富化化合物は、過度の実験を伴うことなく、適切に同位体富化された試薬および／または中間体を使用して、当業者に周知の従来の技術によりまたは本明細書中のスキームおよび実施例において説明するものに類似したプロセスにより調製することができる。
【００２３】
本明細書において用いる場合、「アルキル」は、指定数の炭素原子を有する直鎖、環式または分岐飽和脂肪族炭化水素を意味する。
【００２４】
本明細書において用いる場合、「アルケニル」は、ジエン、トリエンおよびテトラエン不飽和脂肪族炭化水素を含む（しかしこれらに限定されない）、指定数の炭素原子を有する直鎖、環式または分岐不飽和脂肪族炭化水素を意味する。
【００２５】
環式「アルキル」または「アルケニル」の例は、
【００２６】
【化２】
2013545727.tif 000003
である。
【００２７】
本明細書において用いる場合、「ヘテロシクリル」または「複素環」は、Ｏ、ＮおよびＳから成る群より選択される１から４個のヘテロ原子を含有する４員から１０員芳香族または非芳香族複素環を意味し、二環式の基を含む。したがって、「ヘテロシクリル」は、次のもの：ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾフラザニル、ベンゾピラゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、カルバゾリル、カルボリニル、シンノリニル、フラニル、イミダゾリル、インドリニル、インドリル、インドラジニル、インダゾリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ナフトピリジニル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、オキサゾリン、イソオキサゾリン、オキセタニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドピリジニル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、テトラヒドロピラニル、テトラゾリル、テトラゾロピリジル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、アゼチジニル、１，４−ジオキサニル、ヘキサヒドロアゼピニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ジヒドロベンゾイミダゾリル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾチオフェニル、ジヒドロベンゾオキサゾリル、ジヒドロフラニル、ジヒドロイミダゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソオキサゾリル、ジヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジアゾリル、ジヒドロオキサゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジヒドロキノリニル、ジヒドロテトラゾリル、ジヒドロチアジアゾリル、ジヒドロチアゾリル、ジヒドロチエニル、ジヒドロトリアゾリル、ジヒドロアゼチジニル、メチレンジオキシベンゾイル、テトラヒドロフラニルおよびテトラヒドロチエニル、ならびにこれらのＮオキシドを含み、それらのすべてが、Ｒ’’から選択される１から３個の置換基で置換されていてもよい。
【００２８】
本明細書において用いる場合、「ポリアミン」は、２個以上のアミノ酸基を有する化合物を意味する。例としては、プトレシン、カダベリン、スペルミジンおよびスペルミンが挙げられる。
【００２９】
本明細書において用いる場合、「ハロゲン」は、Ｂｒ、Ｃｌ、ＦおよびＩを意味する。
【００３０】
式Ａの１つの実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、Ｈおよび（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから独立して選択され、前記アルキルは、Ｒ’から選択される１から３個の置換基で置換されていてもよく、またはＲ１およびＲ２を、それらが結合されている窒素と一緒に４〜７員の単環式複素環を形成していると考えることができ、前記単環式複素環は、窒素に加えて、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１もしくは２個のさらなるヘテロ原子を含有していてもよく、前記単環式複素環は、Ｒ’から選択される１から３個の置換基で置換されていてもよい。
【００３１】
式Ａの１つの実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、メチル、エチルおよびプロピルから独立して選択され、前記メチル、エチルおよびプロピルは、Ｒ’から選択される１から３個の置換基で置換されていてもよく、またはＲ１およびＲ２を、それらが結合されている窒素と一緒に４〜７員の単環式複素環を形成していると考えることができ、前記単環式複素環は、窒素に加えて、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１もしくは２個のさらなるヘテロ原子を含有していてもよく、前記単環式複素環は、Ｒ’から選択される１から３個の置換基で置換されていてもよい。
【００３２】
式Ａの１つの実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、メチル、エチルおよびプロピルから独立して選択される。
【００３３】
式Ａの１つの実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、それぞれメチルである。
【００３４】
式Ａの１つの実施形態において、Ｒ３は、Ｈおよびメチルから独立して選択される。
【００３５】
式Ａの１つの実施形態において、Ｒ３は、Ｈである。
【００３６】
式Ａの１つの実施形態において、Ｒ’は、Ｒ’’である。
【００３７】
式Ａの１つの実施形態において、Ｒ’’は、Ｈ、メチル、エチルおよびプロピルから独立して選択され、前記メチル、エチルおよびプロピルは、１個以上のハロゲンおよびＯＨで置換されていてもよい。
【００３８】
式Ａの１つの実施形態において、Ｒ’’は、Ｈ、メチル、エチルおよびプロピルから独立して選択される。
【００３９】
式Ａの１つの実施形態において、ｎは、０、１、２、３または４である。
【００４０】
式Ａの１つの実施形態において、ｎは、２、３または４である。
【００４１】
式Ａの１つの実施形態において、ｎは、３である。
【００４２】
式Ａの１つの実施形態において、Ｘは、Ｏ、ＮＲ’’、（Ｃ＝Ｏ）Ｏ、ＮＲ’’（Ｃ＝Ｏ）、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｏ、ＮＲ’’（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ’’、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ’’またはＮＲ’’（Ｃ＝Ｏ）Ｏである。
【００４３】
式Ａの１つの実施形態において、Ｘは、（Ｃ＝Ｏ）Ｏである。
【００４４】
式Ａの１つの実施形態において、Ｌ１は、ハロゲンおよびＯＨで置換されていてもよい、Ｃ４〜Ｃ２４アルキルおよびＣ４〜Ｃ２４アルケニルから選択される。
【００４５】
式Ａの１つの実施形態において、Ｌ１は、Ｃ４〜Ｃ２４アルキルおよびＣ４〜Ｃ２４アルケニルから選択される。
【００４６】
式Ａの１つの実施形態において、Ｌ１は、Ｃ４〜Ｃ２４アルケニルから選択される。
式Ａの１つの実施形態において、Ｌ１は、Ｃ１２〜Ｃ２４アルケニルから選択される。
式Ａの１つの実施形態において、Ｌ１は、Ｃ１９アルケニルである。
【００４７】
式Ａの１つの実施形態において、Ｌ１は、
【００４８】
【化３】
2013545727.tif 000004
である。
【００４９】
式Ａの１つの実施形態において、Ｌ１は、
【００５０】
【化４】
2013545727.tif 000005
である。
【００５１】
式Ａの１つの実施形態において、Ｌ２は、ハロゲンおよびＯＨで置換されていてもよい、Ｃ３〜Ｃ９アルキルおよびＣ３〜Ｃ９アルケニルから選択される。
【００５２】
式Ａの１つの実施形態において、Ｌ２は、ハロゲンおよびＯＨで置換されていてもよい、Ｃ５〜Ｃ９アルキルおよびＣ５〜Ｃ９アルケニルから選択される。
【００５３】
式Ａの１つの実施形態において、Ｌ２は、ハロゲンおよびＯＨで置換されていてもよい、Ｃ７〜Ｃ９アルキルおよびＣ７〜Ｃ９アルケニルから選択される。
【００５４】
式Ａの１つの実施形態において、Ｌ２は、Ｃ３〜Ｃ９アルキルおよびＣ３〜Ｃ９アルケニルから選択される。
【００５５】
式Ａの１つの実施形態において、Ｌ２は、Ｃ５〜Ｃ９アルキルおよびＣ５〜Ｃ９アルケニルから選択される。
【００５６】
式Ａの１つの実施形態において、Ｌ２は、Ｃ７〜Ｃ９アルキルおよびＣ７〜Ｃ９アルケニルから選択される。
【００５７】
式Ａの１つの実施形態において、Ｌ２は、Ｃ３〜Ｃ９アルキルである。
【００５８】
式Ａの１つの実施形態において、Ｌ２は、Ｃ５〜Ｃ９アルキルである。
【００５９】
式Ａの１つの実施形態において、Ｌ２は、Ｃ７〜Ｃ９アルキルである。
【００６０】
式Ａの１つの実施形態において、Ｌ２は、Ｃ９アルキルである。
【００６１】
式Ａの１つの実施形態において、「ヘテロシクリル」は、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、イミダゾールまたはピペラジンである。
【００６２】
式Ａの１つの実施形態において、「単環式ヘテロシクリル」は、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、イミダゾールまたはピペラジンである。
【００６３】
式Ａの１つの実施形態において、「ポリアミン」は、プトレシン、カダベリン、スペルミジンまたはスペルミンである。
【００６４】
１つの実施形態において、「アルキル」は、指定数の炭素原子を有する直鎖飽和脂肪族炭化水素である。
【００６５】
１つの実施形態において、「アルケニル」は、指定数の炭素原子を有する直鎖不飽和脂肪族炭化水素である。
【００６６】
式Ａのカチオン性脂質の遊離形態はもちろん、その薬学的に許容される塩および立体異性体も、本発明に含まれる。本明細書中で例示する単離された特定のカチオン性脂質のいくつかは、アミンカチオン性脂質のプロトン化塩である。用語「遊離形態」は、非塩形態のアミンカチオン性脂質を指す。包含される薬学的に許容される塩としては、本明細書に記載する特定のカチオン性脂質について例示する単離された塩ばかりでなく、式Ａのカチオン性脂質の遊離形態のすべての典型的な薬学的に許容される塩も挙げられる。記載するカチオン性脂質の特定の塩の遊離形態を、当該技術分野において公知の技術を用いて単離することができる。例えば、適する希薄塩基水溶液、例えば希ＮａＯＨ水溶液、希炭酸カリウム水溶液、希アンモニア水溶液および希重炭酸ナトリウム水溶液、で塩を処理することによって、遊離形態を再生することができる。遊離形態は、それらのそれぞれの塩形態と一定の物理的性質、例えば極性溶媒への溶解度、が多少異なるだろうが、他の点では、それらの酸性または塩基性塩は、本発明の目的のために、それらそれぞれの遊離形態と薬学的に等価である。
【００６７】
本発明のカチオン性脂質の薬学的に許容される塩は、塩基性または酸性部分を含有する本発明のカチオン性脂質から従来の化学的方法によって合成することができる。一般に、塩基性カチオン性脂質の塩は、イオン交換クロマトグラフィーによって、または遊離塩基と理論量のもしくは過剰な所望の塩形成性無機もしくは有機酸とを適する溶媒中でもしくは溶媒の様々な組み合わせの中で反応させることによって調製される。同様に、酸性化合物の塩は、適切な無機または有機塩基との反応によって形成される。
【００６８】
したがって、本発明のカチオン性脂質の薬学的に許容される塩は、塩基性の本カチオン性脂質と無機または有機酸とを反応させることによって形成されるような本発明のカチオン性脂質の従来の非毒性塩を含む。例えば、従来の非毒性塩としては、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸およびこれらに類するもの、から誘導されるもの、ならびに有機酸、例えば酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ−安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）およびこれらに類するもの、から誘導される塩が挙げられる。
【００６９】
本発明のカチオン性脂質が酸性であるとき、適する「薬学的に許容される塩」は、無機塩基および有機塩基を含む薬学的に許容される非毒性塩基から調製される塩を指す。無機塩基から誘導される塩としては、アルミニウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、銅塩、第二鉄塩、第一鉄塩、リチウム塩、マグネシウム塩、第二マンガン塩、第一マンガン塩、カリウム塩、ナトリウム塩、亜鉛塩およびこれらに類するものが挙げられる。アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩およびナトリウム塩が特に好ましい。薬学的に許容される有機非毒性塩基から誘導される塩としては、第一、第二および第三アミン、置換アミン（天然に存在する置換アミンを含む）、環式アミンおよび塩基性イオン交換樹脂、例えばアルギニン、ベタイン  カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ１−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リシン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン  トリプロピルアミン、トロメタミンおよびこれらに類するもの、の塩が挙げられる。
【００７０】
上に記載した薬学的に許容される塩および他の典型的な薬学的に許容される塩の調製は、Ｂｅｒｇら，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９７７：６６：１−１９によって、より十分に説明されている。
【００７１】
生理条件下では化合物中の脱プロトン化された酸性部分、例えばカルボキシル基、がアニオン性であり得、そのときこの電荷はプロトン化またはアルキル化された塩基性部分、例えば第四級窒素原子、のカチオン電荷により内部で相殺され得るので、本発明のカチオン性脂質は、分子内塩または双性イオンである可能性があることにも注目されるだろう。
【実施例】
【００７２】
提供する実施例は、本発明のさらなる理解を助けるためのものである。用いる特定の材料、種および条件は、本発明をさらに例証するためのものであり、本発明の妥当な範囲を限定するためのものではない。カチオン性脂質の合成に用いる試薬は、市販されているか、または当業者によって容易に調製される。
【００７３】
新規カチオン性脂質の合成は、脂質酸（ｉ）から出発する線形プロセスである。Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミンへのカップリングによって、ワインレブアミドｉｉを得る。グリニャール付加によってケトンｉｉｉを生成する。ケトンの還元によってアルコールｉｖを生成する。ＥＤＣカップリングによるエステル化によって、タイプｖのエステルを得る。
【００７４】
一般スキーム１
【００７５】
【化５】
2013545727.tif 000006
（２０Ｚ，２３Ｚ）−ノナコサ−２０，２３−ジエン−１０−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（化合物１）
【００７６】
【化６】
2013545727.tif 000007
１１，１４−エイコサジエン酸，（１１Ｚ，１４Ｚ）−（５０ｇ、１６２ｍｍｏｌ）、塩酸Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン（３１．６ｇ、３２４ｍｍｏｌ）、ＨＯＡｔ（４４．１ｇ、３２４ｍｍｏｌ）、Ｅｔ３Ｎ（４５．２ｍＬ、３２４ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（６２．１ｇ、３２４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（８１０ｍＬ）中で混合し、一晩、周囲温度で撹拌した。その後、反応物を５×７００ｍＬの水で洗浄し、その後、１×６００ｍＬの１Ｍ  ＮａＯＨで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、セライトに通して濾過し、蒸発させて、５３．０６ｇ（９３％）の１１，１４−エイコサジエンアミド，Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル−，（１１Ｚ，１４Ｚ）を透明な金色の油として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ５．３５（ｍ，４Ｈ）、３．６８（ｓ，３Ｈ）、３．１８（ｓ，３Ｈ）、２．７７（ｍ，２Ｈ）、２．４１（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ）、２．０５（ｍ，４Ｈ）、１．６３（ｍ，２Ｈ）、１．４０−１．２６（ｍ，１８Ｈ）、０．８９（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，３Ｈ）。
【００７７】
【化７】
2013545727.tif 000008
１１，１４−エイコサジエンアミド，Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル−，（１１Ｚ，１４Ｚ）−１（４ｇ、１１．３８ｍｍｏｌ）を２５０ｍＬフラスコの中で乾燥ＴＨＦ（５０．０ｍｌ）に溶解し、その後、１Ｍノニルマグネシウムブロミド（２２．７６ｍｌ、２２．７６ｍｍｏｌ）を窒素下、周囲温度で添加した。１０分後、過剰な飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液でゆっくりと反応を停止させた。その反応物を分液漏斗に入れてヘキサンおよび水で洗浄し、振盪し、下の水性層を廃棄し、上の層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させて、粗製ケトンを金色の油として得た。そのケトンをそのまま直接次の反応に持ち越した。
【００７８】
【化８】
2013545727.tif 000009
ケトン（６．３２ｇ、１５．１ｍｍｏｌ、１当量）をＥｔＯＨ（７５ｍＬ）に溶解し、ＮａＢＨ４（２．８６ｇ、７５ｍｍｏｌ、５当量）を添加した。室温で１５分の撹拌の後、反応物を蒸発させて残留物を得、それをヘキサン（２００ｍＬ）および水（２００ｍＬ）に溶かし、有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させて、２０，２３−ノナコサジエン−１０−オール，（２０Ｚ，２３Ｚ）−（ｉｖ）を白色の固体として得、それをさらに精製せずに使用した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ５．３５（ｍ，４Ｈ）、３．５８（ｍ，１Ｈ）、２．７７（ｍ，２Ｈ）、２．０５（ｍ，４Ｈ）、１．４８−１．２２（ｍ，３９Ｈ）、０．８９（ｍ，６Ｈ）。
【００７９】
【化９】
2013545727.tif 000010
４−（ジメチルアミノ）酪酸塩酸塩（３．０３ｇ、１８．０５ｍｍｏｌ、１．２当量）、２０，２３−ノナコサジエン−１０−オール，（２０Ｚ，２３Ｚ）−（ｉｖ）（６．３３ｇ、１５．０４ｍｍｏｌ、１当量）、ＥＤＣ（３．４６ｇ、１８．０５ｍｍｏｌ、１．２当量）、ＤＭＡＰ（０．３６８ｇ、３．０１ｍｍｏｌ、０．２当量）およびＤＩＥＡ（７．８８ｍＬ、４５．１ｍｍｏｌ、３当量）をＤＣＭ（１００ｍＬ）中で併せ、周囲温度で１６時間撹拌した。その後、その反応物を１×２５０ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、その後、下の有機層を３３０ｇシリカカラムに直接注入し、３０分かけて０〜１５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶離することによって精製した。ブタン酸，４−（ジメチルアミノ）−，（１１Ｚ，１４Ｚ）−１−ノニル−１１，１４−エイコサジエン−１−イルエステル（１）を黄色の油として回収した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ５．３５（ｍ，４Ｈ）、４．８７（ｍ，１Ｈ）、２．７７（ｍ，２Ｈ）、２．３４−２．２６（ｍ，４Ｈ）、２．２２（ｓ，６Ｈ）、２．０５（ｍ，４Ｈ）、１．７９（ｍ，２Ｈ）、１．５１（ｍ，４Ｈ）、１．３８−１．２２（ｍ，３４Ｈ）、０．８８（ｍ，６Ｈ）。
【００８０】
（１８Ｚ）−ヘプタコサ−１８−エン−１０−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（化合物２）
【００８１】
【化１０】
2013545727.tif 000011
化合物２は、上の化合物１について説明したものに類似した手法で調製した。ＨＲＭＳ（Ｍ＋Ｈ）計算値５０８．５０８８、実測値５０８．５０９１。
【００８２】
化合物３は、国際公開第２０１０／０５４４０１号および国際公開第２０１０／１４４７４０号Ａ１パンフレットに記載されているようなＭＣ３である。
【００８３】
【化１１】
2013545727.tif 000012
化合物４は、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，２８，１７２−１７６、国際公開第２０１０／０４２８７７号Ａｌ、国際公開第２０１０／０４８５３６号Ａ２、国際公開第２０１０／０８８５３７号Ａ２および国際公開第２００９／１２７０６０号Ａ１パンフレットに記載されているようなＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡである。
【００８４】
【化１２】
2013545727.tif 000013
ＬＮＰ組成物
本発明の以下の脂質ナノ粒子組成物（ＬＮＰ）は、オリゴヌクレオチド、具体的にはｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの送達に有用である：
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ５６．６／３８／５．４；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ６０／３８／２；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ６７．３／２９／３．７；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ４９．３／４７／３．７；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ５０．３／４４．３／５．４；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ  ４０／４８／２／１０；
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ／ＤＳＰＣ  ４０／４８／２／１０；および
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ／ＤＳＰＣ  ５８／３０／２／１０。
【００８５】
ＬＮＰプロセス説明：
衝突噴流プロセスにより脂質ナノ粒子（Ｌｉｐｉｄ  Ｎａｎｏ−Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ：ＬＮＰ）を調製する。アルコールに溶解した脂質とクエン酸緩衝液に溶解したｓｉＲＮＡとを混合することにより粒子を形成する。脂質のｓｉＲＮＡに対する混合比の目標を４４〜５５％脂質と６５〜４５％ｓｉＲＮＡに設定する。この脂質溶液は、アルコール（例えばエタノール）中、９〜１２ｍｇ／ｍＬを目標にして５〜１５ｍｇ／ｍＬの濃度で、本発明の新規カチオン性脂質とヘルパー脂質（コレステロール）とＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＭＧ）脂質とＤＳＰＣとを含有する。前記脂質の比は、カチオン性脂質については３５〜６５を目標にして２５〜９８のモルパーセント範囲を有し、前記ヘルパー脂質は、３０〜５０を目標にして０〜７５のモルパーセント範囲を有し、前記ＰＥＧ脂質は、１〜６を目標にして１〜１５のモルパーセント範囲を有し、および前記ＤＳＰＣは、０〜１２を目標にして０〜１５のモルパーセント範囲を有する。前記ｓｉＲＮＡ溶液は、３．５〜５の範囲のｐＨを有するクエン酸ナトリウム緩衝塩溶液中、０．３〜０．９ｍｇ／ｍＬを目標にして０．３から１．０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲で、１つ以上のｓｉＲＮＡ配列を含有する。３０〜４０℃を目標にして１５〜４０℃の範囲の温度に前記２種類の脂質を加熱し、その後、衝突噴流ミキサで混合すると即座にＬＮＰを形成する。そのティーＩＤは、０．２５から１．０ｍｍの範囲を有し、総流量は、１０〜６００ｍＬ／分の範囲を有する。流量とチューブＩＤのこの組み合わせには、ＬＮＰの粒径を３０ｎｍと２００ｎｍの間に制御する効果がある。その後、その溶液をより高いｐＨの緩衝溶液と、１：２（容量：容量）を目標にするが１：１から１：３（容量：容量）の範囲の混合比で混合する。この緩衝溶液は、３０〜４０℃を目標にして、１５〜４０℃の範囲の温度である。混合されたＬＮＰを３０分から２時間保持した後、アニオン交換濾過段階に付す。恒温放置中の温度は、３０〜４０℃を目標にして１５〜４０℃の範囲である。恒温放置後、溶液を０．８ｕｍフィルタに通し、これはアニオン交換分離段階を含む。このプロセスは、１ｍｍＩＤから５ｍｍＩＤの範囲のチューブＩＤ、および１０から２００ｍＬ／分の流量を用いる。ＬＮＰを濃縮し、限外濾過プロセスによって透析濾過し（ｄｉａｆｉｌｔｅｒｅｄ）、このプロセスにおいてアルコールを除去し、クエン酸緩衝液を最終緩衝溶液、例えばリン酸緩衝食塩液、に交換する。前記限外濾過プロセスは、接線流濾過形式（ＴＦＦ）を用いる。このプロセスは、３０〜５００ＫＤの膜名目分子量カットオフ値範囲を用いる。この膜の形式は、中空繊維または平面シートカセットであり得る。正しい分子量カットオフでのＴＦＦプロセスは、残余分中にＬＮＰを保持し、濾液または透過液は、アルコール；クエン酸緩衝液；最終緩衝液廃棄物を含有する。前記ＴＦＦプロセスは、初期濃度から１〜３ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ濃度にする多段階プロセスである。濃縮後、ＬＮＰ溶液を１０〜２０容量について最終緩衝液で透析濾過してアルコールを除去し、緩衝液交換を行う。その後、その材料をさらに１〜３倍濃縮する。ＬＮＰプロセスの最終段階は、濃縮ＬＮＰ溶���の滅菌濾過および生成物のバイアル詰めである。
【００８６】
分析手順：
１）ｓｉＲＮＡ濃度
ｓｉＲＮＡデュプレックス濃度は、２９９６ＰＤＡ検出器を具備するＷａｔｅｒｓ  ２６９５  Ａｌｌｉａｎｃｅシステム（Ｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州ミルフォード）を使用して強アニオン交換高速液体クロマトグラフィー（Ｓｔｏｒｎｇ  Ａｎｉｏｎ−Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｈｉｇｈ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＳＡＸ−ＨＰＬＣ）によって決定する。ＬＮＰ（他にはＲＮＡｉ送達ビヒクル（ＲＮＡｉ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｖｅｈｉｃｌｅ：ＲＤＶ）と呼ばれる）を０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理して全ｓｉＲＮＡを遊離させ、Ｄｉｏｎｅｘ  ＢｉｏＬＣ  ＤＮＡＰａｃ  ＰＡ  ２００（４×２５０ｍｍ）カラムを使用するＳＡＸ分離と２５４ｎｍでのＵＶ検出によって分析する。移動相は、０〜１５分の線形勾配および１ｍｌ／分の流量で、Ａ：２５ｍＭ  ＮａＣｌＯ４、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２０％ＥｔＯＨ、ｐＨ７．０、およびＢ：２５０ｍＭ  ＮａＣｌＯ４、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２０％ＥｔＯＨ、ｐＨ７．０から成る。ｓｉＲＮＡ量をｓｉＲＮＡ標準曲線との比較によって決定する。
【００８７】
２）封入率
蛍光試薬ＳＹＢＲ  ＧｏｌｄをＲＮＡ定量に用いて、ＲＤＶの封入率をモニターする。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いてまたは用いずにＲＤＶを使用して、遊離ｓｉＲＮＡおよび全ｓｉＲＮＡ量を決定する。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（カリフォルニア州サニーヴェール）からのＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５ｅマイクロプレート分光光度計を使用してアッセイを行う。試料を４８５ｎｍで励起させ、蛍光発光を５３０ｎｍで測定した。ｓｉＲＮＡ量をｓｉＲＮＡ標準曲線との比較によって決定する。
【００８８】
封入率＝（１−遊離ｓｉＲＮＡ／全ｓｉＲＮＡ）×１００％
３）粒径および多分散度
１μｇ  ｓｉＲＮＡを含有するＲＤＶを１×ＰＢＳで３ｍｌの最終容量に希釈する。ＺｅｔａＰＡＬＳ計器（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニューヨーク州ホルツヴィル）を使用して動的光散乱法により試料の粒径および多分散度を測定する。Ｈｅ−Ｎｅレーザーを用いて２５℃で９０°の散乱角での散乱強度を測定する。
【００８９】
４）ゼータ電位分析
１μｇ  ｓｉＲＮＡを含有するＲＤＶを１ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）で２ｍｌの最終容量に希釈する。電極と光源としてのＨｅ−Ｎｅとを具備するＺｅｔａＰＡＬＳ計器（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニューヨーク州ホルツヴィル）を使用して、試料の電気泳動移動度を決定する。ゼータ電位の計算の際にスモルコフスキーの極限を仮定する。
【００９０】
５）脂質分析
Ｗａｔｅｒ  ２６９５  Ａｌｌｉａｎｃｅシステム（Ｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州ミルフォード）とコロナ荷電化粒子（Ｃｏｒｏｎａ  ｃｈａｒｇｅｄ  ａｅｒｏｓｏｌ）検出器（ＣＡＤ）（ＥＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州チェルムズフォード）を使用して逆相高速液体クロマトグラフィー（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｈａｓｅ  Ｈｉｇｈ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって個々の脂質濃度を決定する。６０℃のＣＡＤを有するＡｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ１８（５０×４．６ｍｍ、粒径１．８μｍ）カラムを使用して、ＲＤＶ中の個々の脂質を分析する。移動相は、Ａ：Ｈ２Ｏ中０．１％ＴＦＡ、およびＢ：ＩＰＡ中０．１％ＴＦＡから成る。勾配は、時間０からの６０％移動相Ａおよび４０％移動相Ｂから、１．００分の時点で４０％移動相Ａおよび６０％移動相Ｂへ；１．００から５．００分へ４０％移動相Ａおよび６０％移動相Ｂへ；４０％移動相Ａと６０％移動相Ｂの５．００分から、１０．００分の時点で２５％移動相Ａおよび７５％移動相Ｂへ；２５％移動相Ａおよび７５％移動相Ｂの１０．００分から、１５．００分の時点で５％移動相Ａおよび９５％移動相Ｂへ；そして５％移動相Ａおよび９５％移動相Ｂの１５．００分から、２０．００分の時点で６０％移動相Ａおよび４０％移動相Ｂへと、１ｍｌ／分の流量で変化する。ＲＤＶ中のすべての脂質成分を二次曲線に当てはめて標準曲線と比較することにより、個々の脂質濃度を決定する。各脂質のモル百分率をその分子量に基づいて計算する。
【００９１】
上で説明したＬＮＰプロセスを用いて、以下の比を有する特定のＬＮＰを同定した：
［組成式］
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ６０／３８／２；および
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ／ＤＳＰＣ  ５８／３０／２／１０。
【００９２】
オリゴヌクレオチド合成は、当該技術分野において周知である。（米国特許出願：米国特許出願公開第２００６／００８３７８０号、同第２００６／０２４０５５４号、同第２００８／００２００５８号、同第２００９／０２６３４０７号および同第２００９／０２８５８８１号明細書、ならびにＰＣＴ特許出願：国際公開第２００９／０８６５５８号、同第２００９／１２７０６０号、同第２００９／１３２１３１号、同第２０１０／０４２８７７号、同第２０１０／０５４３８４号、同第２０１０／０５４４０１号、同第２０１０／０５４４０５号および同第２０１０／０５４４０６号パンフレット参照）。実施例において開示し、用いるＬＮＰに組み込まれているＬｕｃおよびＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡは、標準的な固相手順によって合成した。
【００９３】
［Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡ］
【００９４】
【化１３】
2013545727.tif 000014
【００９５】
［組成式］
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ  ６０／３８／２
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ／ＤＳＰＣ  ４０／４８／２／１０
カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ／ＤＳＰＣ  ５８／３０／２／１０
［ＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡ］
【００９６】
【化１４】
2013545727.tif 000015
2013545727.tif 000016
【実施例１】
【００９７】
マウスｉｎ  ｖｉｖｏ効力評価
すぐ上に記載した組成式の化合物１を用いるＬＮＰをｉｎ  ｖｉｖｏ効力について評価した。ｓｉＲＮＡは、ホタル（ホチヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼ遺伝子（アクセッション＃  Ｍ１５０７７）のｍＲＮＡ転写産物を標的にする。ルシフェラーゼｓｉＲＮＡの一次配列および化学修飾パターンは、上に表示した。このｉｎ  ｖｉｖｏルシフェラーゼモデルには、ホタルルシフェラーゼコーディング配列がすべての細胞に存在するトランスジェニックマウスを用いる。Ｄａｎａ  Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから使用許諾を受けたＲＯＳＡ２６−ＬｏｘＰ−Ｓｔｏｐ−ＬｏｘＰ−Ｌｕｃ（ＬＳＬ−Ｌｕｃ）トランスジェニックマウスを、先ず組換えＡｄ−Ｃｒｅウイルス（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｂｉｏｌａｂｓ）でＬＳＬ配列を除去することによって、ルシフェラーゼ遺伝子を発現するように誘導する。前記ウイルスの臓器親和性のため、尾静脈注射によって送達しても発現は肝臓に限定される。ルシフェリン基質（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の投与後にＩＶＩＳイメージャー（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を使用して光出力を測定することによって、肝臓内でのルシフェラーゼ発現レベルを定量する。投薬前発光レベルをＲＤＶの投与前に測定する。ＰＢＳ中のルシフェリン（１５ｍｇ／ｍＬ）を１５０μＬの容量で腹腔内（ＩＰ）注射する。４分のインキュベーション時間の後、マウスをイソフルランで麻酔し、ＩＶＩＳイメージャーに配置する。ＰＢＳビヒクル中のＲＤＶ（ｓｉＲＮＡを含有）を０．２ｍＬの容量で尾静脈注射した。最終用量レベルは、０．１から０．５ｍｇ／ｋｇ  ｓｉＲＮＡの範囲であった。対照としてＰＢＳビヒクルのみを投薬した。上で説明した方法を用いて、投薬４８時間後にマウスを撮像した。ルシフェリン光出力の変化は、ルシフェラーゼｍＲＮＡレベルと直接相関し、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ活性の間接的尺度となる。ｉｎ  ｖｉｖｏ効力の結果を、投薬前発光レベルに対する発光の阻害％として表す。ルシフェラーゼ  ｓｉＲＮＡ  ＲＤＶの全身投与は、用量依存的様式でルシフェラーゼ発現を減少させた。オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（ＯＣＤ）カチオン性脂質を含有するＲＤＶを投薬したマウスより化合物１含有ＲＤＶを投薬したマウスでのほうが、大きい効力が観察された（図１）。ＯＣＤは公知であり、国際公開第２０１０／０２１８６５号パンフレットに記載されている。
【実施例２】
【００９８】
ラットｉｎ  ｖｉｖｏ効力および毒性評価
上に記載した組成式の化合物を用いるＬＮＰをＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）雌ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ）においてｉｎ  ｖｉｖｏ効力ならびにアラニンアミノトランスフェラーゼおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ増加について評価した。ｓｉＲＮＡは、ＡｐｏＢ遺伝子（アクセッション＃ＭＮ  ０１９２８７）のｍＲＮＡ転写産物を標的にする。ＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡの一次配列および化学修飾パターンは、上に表示した。ＰＢＳビヒクル中のＲＤＶ（ｓｉＲＮＡを含有）を１から１．５ｍＬの容量で尾静脈注射した。注射速度は、おおよそ３ｍｌ／分である。各投薬群ごとに５匹のラットを使用した。ＬＮＰ投与後、ラットを普通食および水が存在するケージに入れる。投薬６時間後、ケージから餌を除去する。ＬＮＰ投薬２４時間後に動物剖検を行う。ラットを５分間イソフルランで麻酔し、その後、ラットをノーズコーン内に置くことにより麻酔下で維持し、瀉血が完了するまでイソフルランの送達を継続する。２３ゲージバタフライ型静脈穿刺セットを使用して大静脈から血液を採取し、血清化学分析のために血清分離バキュテナーに等分する。切除した肝尾状葉の穿孔を行い、ｍＲＮＡ分析のためにＲＮＡＬａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）内に配置する。保存肝組織をホモジナイズし、ＱｉａｇｅｎビーズミルおよびＱｉａｇｅｎ  ｍｉＲＮＡ−Ｅａｓｙ  ＲＮＡ単離キットを製造業者の指示書に従って使用して全ＲＮＡを単離した。肝臓ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲによって判定した。ラットＡｐｏＢ商用プローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃａｔ  ＃  ＲＮ０１４９９０５４＿ｍ１）を用いて精製ＲＮＡからメッセージを増幅した。ＰＣＲ反応は、ＡＢＩ  ７５００計器と９６ウェルＦａｓｔ  Ｂｌｏｃｋを用いて行った。ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルをハウスキーピングＰＰＩＢ（ＮＭ  ０１１１４９）ｍＲＮＡに正規化した。ＰＰＩＢ  ｍＲＮＡレベルは、商用プローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍｍ００４７８２９５＿ｍ１）を使用してＲＴ−ＰＣＲによって判定した。結果をＡｐｏＢ  ｍＲＮＡ／ＰＰＩＢ  ｍＲＮＡ比として表す。すべてのｍＲＮＡデータをＰＢＳ対照用量に対して表わす。血清ＡＬＴおよびＡＳＴ分析は、Ｓｉｅｍｅｎｓアラニンアミノトランスフェラーゼ（Ｃａｔ＃  ０３０３９６３１）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（Ｃａｔ＃０３０３９６３１）試薬を用いてＳｉｅｍｅｎｓ  Ａｄｖｉａ  １８００  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒで行った。カチオン性脂質ＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡ（化合物４）またはＭＣ３（化合物３）を含有するＲＤＶを投薬したラットに比べて化合物２含有ＲＤＶを投薬したラットにおいて同様の効力が観察された（図２）。加えて、３ｍｇ／ｋｇのＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡ（化合物４）で処置した４匹のラットのうち３匹は、４８時間生存することができず、３ｍｇ／ｋｇのＭＣ３（化合物３）で処置した４匹のラットのうち２匹は、４８時間生存することができなかった。６ｍｇ／ｋｇの化合物２で処置した４匹のラットのうち２匹は、投薬後４８時間の時点で生存していた。
【実施例３】
【００９９】
ラット肝臓内のカチオン性脂質レベルの判定
肝臓組織を２０ｍｌバイアルに計り入れ、ＧｅｎｏＧｒｉｎｄｅｒ  ２０００（ＯＰＳ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、１６００ストローク／分、５分）を使用して９ｖ／ｗの水中でホモジナイズした。各組織ホモジネートの５０μＬアリコートを３００μＬの抽出／タンパク質沈殿用溶媒（５００ｎＭ内部標準物質を含有する、５０／５０  アセトニトリル／メタノール）と混合し、そのプレートを遠心分離機にかけて沈殿タンパク質を沈降させた。その後、各上清の２００μＬ容量を９６ウェルプレートの別のウェルに移し、１０μｌの試料をＬＣ／ＭＳ−ＭＳによって直接分析した。
【０１００】
未処置ラット肝臓ホモジネート（水９容量／肝臓重量）に化合物の既知量のメタノール保存溶液を加えることによって標準物質を調製した。各標準物質／肝臓ホモジネートのアリコート（５０μＬ）を３００μＬの抽出／タンパク質沈殿用溶媒（５００ｎＭ内部標準物質を含有する、５０／５０  アセトニトリル／メタノール）と混合し、そのプレートを遠心分離機にかけて沈殿タンパク質を沈降させた。各上清の２００μＬ容量を９６ウェルプレートの別のウェルに移し、１０μＬの各標準物質をＬＣ／ＭＳ−ＭＳによって直接分析した。
【０１０１】
肝臓ホモジネートから調製し、抽出した標準物質に対する絶対定量を、ＡＰＩ  ４０００トリプル四重極質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に連結されたＡｒｉａ  ＬＸ−２  ＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行った。ランごとに合計１０μＬの試料を周囲温度でＢＤＳ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  Ｃ８  ＨＰＬＣカラム（Ｔｈｅｒｍｏ、５０×２ｍｍ、３μｍ）に注入した。
【０１０２】
移動相Ａ：９５％Ｈ２Ｏ／５％メタノール／１０ｍＭ  ギ酸アンモニウム／０．１％ギ酸
移動相Ｂ：４０％メタノール／６０％ｎ−プロパノール／１０ｍＭ  ギ酸アンモニウム／０．１％ギ酸
流量は、０．５ｍＬ／分であり、勾配溶離プロフィールは、次のとおりであった：８０％Ａで０．２５分間保持、１．６分かけて１００％Ｂへの直線傾斜、１００％Ｂで２．５分間保持、その後、戻して８０％Ａで１．７５分間保持。全ラン時間は、５．８分であった。ＡＰＩ  ４０００ソースパラメータは、ＣＡＤ：４、ＣＵＲ：１５、ＧＳ１：６５、ＧＳ２：３５、ＩＳ：４０００、ＴＥＭ：５５０、ＣＸＰ：１５、ＤＰ：６０、ＥＰ：１０であった。化合物２含有ＲＤＶを投薬したラットでは、カチオン性脂質ＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡ（化合物４）またはＭＣ３（化合物３）を含有するＲＤＶを投薬したラットより肝臓レベルが低かった（図３）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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