(57)【要約】  本発明は、組換え型ＰｌＧＦ−１の新規のホモ二量体型、その調製の方法、及びそれを含有する組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離した胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）ホモ二量体であって、前記ホモ二量体を形成する単量体タンパク質２個のＣ末端システイン残基が、単量体間ジスルフィド結合に関与することを特徴とする上記ホモ二量体。
【請求項２】
単量体間ジスルフィド架橋を２つ又は３つ含有するホモ二量体を特徴とする、請求項１に記載のＰｌＧＦホモ二量体。
【請求項３】
前記Ｃ末端ジスルフィド架橋が、組換え型ＰＬＧＦ−１の１２５位、ｗｔＰＬＧＦ１３１の１２４位、組換え型ＰＬＧＦ−２の１４６位、ｗｔＰＬＧＦ１５２の１４５位、組換え型ＰＬＧＦ−３の１９７位、ｗｔＰＬＧＦ２０３の１９６位、組換え型ＰＬＧＦ−４の２１８位、ｗｔＰＬＧＦ２２４の２１７位から選択された各単量体の位置にある、システイン残基２個の間にあることを特徴とする、請求項１又は２に記載のＰｌＧＦホモ二量体。
【請求項４】
ＰｌＧＦが組換え型ＰＬＧＦ−１であり、前記ジスルフィド架橋がＣｙｓ６０〜Ｃｙｓ６９、Ｃｙｓ６９〜Ｃｙｓ６０及びＣｙｓ１２５〜Ｃｙｓ１２５間にあることを特徴とする、請求項１又は３に記載のＰｌＧＦホモ二量体。
【請求項５】
請求項１から４までのいずれか一項に記載のＰｌＧＦホモ二量体の調製のための方法であって、下記のステップ、
Ｉ．ＰｌＧＦ単量体タンパク質を得るステップ；
ＩＩ．前記単量体を、ｐＨが中性から塩基性であるバッファー中でインキュベートすること、及び／又は還元剤がある場合は、酸化を妨げない程度に還元剤を除去又は不活性化することによって、酸化させて、ＰＬＧＦホモ二量体を得るステップ；及び任意選択で
ＩＩＩ．ＰＬＧＦホモ二量体を精製するステップ
を含む上記方法。
【請求項６】
前記ステップＩが、還元剤を含有し且つｐＨが中性から塩基性であるバッファー中で、鎖間ジスルフィド架橋を３つ未満含有するＰｌＧＦホモ二量体をインキュベートして、ＰＬＧＦ単量体タンパク質を得るステップを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ステップＩが、変性剤を含有するバッファー中で、ＰＬＧＦを含有する細菌封入体をインキュベートするステップと、こうして得られたタンパク質溶液を還元剤で還元するステップとを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記還元剤がトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ＊ＨＣｌ）及びジチオスレイトール（ＤＤＴ）、又はそれらの混合物を含むグループから選択される、請求項５から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記還元剤が、還元剤／ＰＬＧＦタンパク質のモル比５：１〜１００：１の範囲で使用される、請求項５から８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記還元剤のインキュベーションが１０から３０時間の範囲で行われる、請求項５から９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項５から１０までのいずれか一項に記載の方法であって、さらにＰＬＧＦ単量体タンパク質の精製を含む上記方法。
【請求項１２】
ステップＩＩの酸化が、温度が１５℃から３０℃の間に構成されたバッファー中でインキュベートすることによって行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
前記酸化が、１２から４８時間の間に含まれる時間で行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップＩＩの還元剤の除去又は不活性化が、バッファーを、還元剤を全く含有していないバッファーで希釈、透析又は置換することによって行われる、請求項５から１３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
還元剤の除去が、単量体を精製することによって行われる、請求項５から１３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ステップＩＩＩの前記精製が、クロマトグラフィーの精製によって行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１から４までのいずれか一項に記載の、医学的処置に利用するための単離したＰｌＧＦホモ二量体。
【請求項１８】
治療を必要としている対象の血液幹細胞の動員促進に利用するための、請求項１７に記載のＰｌＧＦホモ二量体。
【請求項１９】
前記対象が化学療法を受けている患者である、請求項１８に記載のＰｌＧＦホモ二量体。
【請求項２０】
医学的処置が虚血性疾患の治療である、請求項１７に記載のＰｌＧＦホモ二量体。
【請求項２１】
虚血性疾患が、心筋組織虚血、心筋梗塞、虚血性発作、及び慢性虚血性心筋疾患、脳虚血、及び虚血性発作、腸管虚血、四肢の末梢性虚血である、請求項２０に記載のＰＬＧＦホモ二量体。
【請求項２２】
医学的処置が皮膚強皮症又は進行性全身性強皮症の治療である、請求項１７に記載のＰｌＧＦホモ二量体。
【請求項２３】
強皮症が心筋強皮症である、請求項２２に記載のＰｌＧＦホモ二量体。
【請求項２４】
医学的処置が皮膚潰瘍、創傷、熱傷、術後処置の治療である、請求項１７に記載のＰｌＧＦホモ二量体。
【請求項２５】
医学的処置が自然又は早期の皮膚組織老化の治療である、請求項１７に記載のＰｌＧＦホモ二量体。
【請求項２６】
医学的処置が病理学的脱毛の治療である、請求項１７に記載のＰｌＧＦホモ二量体。
【請求項２７】
少なくとも薬学的に許容される賦形剤との混合物中に、請求項１から４までのいずれか一項に記載のＰｌＧＦホモ二量体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、１鎖間ジスルフィド結合のＣ末端領域内に存在することを特徴とするＰｌＧＦの、新規のホモ二量体型に関する。さらに本出願は、その産生及び精製の方法、同一物を含む組成物、並びに薬剤又は化粧剤としてのその利用に関する。本出願は、他の目的にも関するが、それについては以下の説明から明らかになろう。
【背景技術】
【０００２】
胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ファミリーの１員であり、主に血管内皮細胞、単球、マクロファージだけでなくヒトＣＤ３４＋骨髄再増殖幹細胞によっても発現するＶＥＧＦ受容体−１を介したシグナル伝達によって、血管新生の増幅因子として作用する。
【０００３】
ＰｌＧＦは、少なくとも４種のスプライシングアイソフォーム（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ）のＰｌＧＦ−１からＰｌＧＦ−４となって現れ、これらは大きさ及び結合特性が異なる。
【０００４】
ＰｌＧＦ−１の全ペプチド配列及び全ヌクレオチド配列は、特許出願ＷＯ９２／０６１９４に記載されている。
【０００５】
詳細には、ＰｌＧＦ−１配列は、９個のシステイン残基を３５、６０、６６、６９、７０、７７、１１１、１１３位及び１２５位に含有し、これらは鎖内及び鎖間ジスルフィド結合を形成する潜在的な候補である。システイン残基の上記付番号は、天然型ＰｌＧＦ−１中には存在しないＮ末端メチオニンを含む、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）内で産生される組換え型ＰｌＧＦ−１に関する（例えば、組換え型ＰｌＧＦ−１中のＣｙｓ３５は、ＰｌＧＦ１３１としても知られる天然型ＰｌＧＦ−１中のＣｙｓ３４に相当する）。
【０００６】
ジスルフィド結合の存在は、ＰｌＧＦ−１の結晶構造を２．０Å分解能で解析することによって確認された（ＩｙｅｒＳ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００１、２７６、１２１５３−１２１６１）。Ｉｙｅｒらによれば、ＰｌＧＦ−１は、Ｃｙｓ６０〜Ｃｙｓ６９、Ｃｙｓ６９〜Ｃｙｓ６０間の２つの鎖間ジスルフィド結合、並びにＣｙｓ３５〜Ｃｙｓ７７、Ｃｙｓ６６〜Ｃｙｓ１１１及びＣｙｓ７０〜Ｃｙｓ１１３の３つの鎖内ジスルフィド結合で共有結合した、逆平行配置に編成されたホモ二量体分子として記述されている。
【０００７】
結晶解析によって証明された最も関連深い特色は、シスチン−ノットモチーフの存在である。１１４位に続くＰｌＧＦ−１のＣ末端配列は、組織的構造を示しておらず、したがって、関連する結晶構造が確定していない。
【０００８】
しかし、ホモ二量体の１２５位の２個のシステイン残基間の距離からすると、分子の歪みが必要と思われるので、これら２位間に鎖間共有結合の存在は考えにくい。
【０００９】
ホモ二量体型は、ＰｌＧＦの生物活性型であることが示されているが、単量体のＰｌＧＦは不活性である。
【００１０】
いくつもの研究により、ＰｌＧＦ−１の薬理活性が証明されてきた。
【００１１】
例えば、予備的な観察では、５−フルオロウラシル抑制マウスの初期及び後期の骨髄造血に対して、並びに血流中への幹細胞／前駆細胞の動員において、ｈＰＬＧＦ（ヒト胎盤増殖因子）を発現するアデノウイルスベクターによって得られる正の効果が示された。
【００１２】
さらにＰｌＧＦ−１は、ｉｎ  ｖｉｖｏで血管新生を誘導し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで内皮細胞の遊走及び増殖を刺激することが示された（Ｚｉｃｈｅ  Ｍ．ら、Ｌａｂ.Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９７、７６、５１７−５３１）。虚血状態に対するＰｌＧＦタンパク質又は遺伝子治療の有益な効果は、例えばＷＯ−Ａ−０１／５６５９３及びＵＳ−２００７／００２７１００中で開示された。虚血状態には、脳虚血、急性心筋梗塞及び虚血後肢を含める。
【００１３】
参考として本明細書に添付した特許出願ＷＯ−Ａ−０３／０６６６７６は、遺伝子組換え細菌細胞から組換え型ＰｌＧＦ−１を抽出及び精製する方法を記載する。得られた産物は、以後［ＤＩＭ１／２］ＰｌＧＦ−１と称するが、少なくとも９８．５％の二量体及び多量体の活性型、少なくとも７０％の二量体型、並びに１．５％未満の不活性な単量体型を含む。
【００１４】
この方法によれば、ＰｌＧＦ−１は、組換え型ＤＮＡ技術によって大腸菌中に封入体として発現する。次いで、変性バッファー内で封入体の可溶化によって抽出され、酸化還元系の存在下でリフォールディングされ、続いて２段階のクロマトグラフィー手順（アニオン交換クロマトグラフィーの次に逆相クロマトグラフィー）によって精製される。
【００１５】
ＷＯ−Ａ−０３／０６６６７６に開示された方法で得られたＰｌＧＦ−１タンパク質は、高純度な活性型であるが、本発明者らは、この産物が水溶液中で最適な安定性を示さず、時々バッチ間不均質を示すことを発見した（質量分析法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＩＥＦ分析による）。
【００１６】
ＷＯ−Ａ−０３／０９７６８８は、ＰｌＧＦ−１分子の１２５位にあるシステインが、ジスルフィド結合を形成できない別のアミノ酸で置き換えられた、ＰｌＧＦ−１分子の変異タンパク質の調製を開示している。
【００１７】
上記変異タンパク質は、水溶液中で野生型ＰｌＧＦ−１より良い安定性を示す。
【００１８】
本発明の範囲は、活性ＰＬＧＦの新規の安定した型を提供することである。
【発明の概要】
【００１９】
本発明者らは、再現性及び安定性の予期せぬ特性を示す新規の活性なＰＬＧＦホモ二量体、及びその調製のための新規の方法を生み出した。
【００２０】
したがって、本発明の一実施形態の目的は、ＰｌＧＦの新規のホモ二量体型が、各単量体タンパク質のＣ末端領域で２個のシステイン残基間に１つの鎖間ジスルフィド結合を有することである。Ｃ末端鎖間結合の外では、二量体は１又は２つの追加の鎖間結合を有する可能性がある。本目的を実現した形として、前記Ｃ末端ジスルフィド架橋は、組換え型ＰＬＧＦ−１の１２５位、ｗｔＰＬＧＦ１３１の１２４位、組換え型ＰＬＧＦ−２の１４６位、ｗｔＰＬＧＦ１５２の１４５位、組換え型ＰＬＧＦ−３の１９７位、ｗｔＰＬＧＦ２０３の１９６位、組換え型ＰＬＧＦ−４の２１８位、ｗｔＰＬＧＦ２２４の２１７位から選択された各単量体の位置にある、２個のシステイン残基の間にある。
【００２１】
本目的を特異的に実現した形として、３つの鎖間ジスルフィド結合を有することが可能な組換え型ＰＬＧＦ−１二量体があり、［ＤＩＭ３］ＰＬＧＦ−１と称される。さらにより特異的に本目的を実現した形として、鎖間ジスルフィド結合は、残基間Ｃｙｓ６０〜Ｃｙｓ６９、Ｃｙｓ６９〜Ｃｙｓ６０及びＣｙｓ１２５〜Ｃｙｓ１２５にある。
【００２２】
本発明の別の実施形態の目的は、前記ＰｌＧＦホモ二量体の調製のための方法が、ＰｌＧＦ単量体タンパク質を得るステップを含み、前記単量体をバッファー中でインキュベートすることによって酸化させ、還元剤がある場合はいずれも除去することによって所望のＰＬＧＦホモ二量体を得、任意選択で前記ＰＬＧＦホモ二量体を精製することである。
【００２３】
本実施形態を実現した形として、ＰｌＧＦ単量体は、還元剤を含有し且つｐＨが中性から弱塩基性であるバッファー中で、３つ未満のジスルフィド鎖間架橋を含有するＰｌＧＦホモ二量体をインキュベートするステップによって得られる。
【００２４】
本発明の他の実施形態の目的は、本発明に記載のＰｌＧＦホモ二量体が、治療を必要としている対象の血液幹細胞の動員促進、虚血性疾患、皮膚強皮症又は進行性全身性強皮症、皮膚潰瘍、創傷、熱傷、術後処置、自然又は早期の皮膚組織老化、及び病理学的脱毛の治療などの医学的処置で使用されることである。
【００２５】
本発明のさらに他の実施形態の目的は、本発明のＰＬＧＦを含む医薬組成物である。
【００２６】
本発明の他の目的は、以下の詳細な説明を踏まえて明らかになるであろう。
【００２７】
ＰｌＧＦ二量体分子の鎖間ジスルフィド結合の３つ以上の存在は、そのうちひとつが２個のＣ末端システイン残基間に位置するが、これまで記述されることがなかった。この発見は、公表されている結晶構造の二量体タンパク質が逆平行に配置されていることを考慮すると、特に驚異的で予想外のものである。こうした理由から、２個のＣ末端システイン間の距離は、ジスルフィド架橋を形成するには、分子立体配座の劇的歪みが必要になると思われるほどである。それ故、３番目のジスルフィド架橋の形成は、単量体の好ましくない立体配座に基づいていることからも、まったく予測不可能である。
【００２８】
しかしながら、実験項で示したとおり、得られた産物の全構造的及び全機能的特性決定は、その可能性だけでなく、３つ未満のジスルフィド結合を有する既知のホモ二量体、すなわち［ＤＩＭ１／２］ＰｌＧＦ−１と比較して、その高い安定性及び高いバッチ間再現性も証明した。さらに、ＰｌＧＦ−１の新規の型は、既知の二量体と比較して生物活性の向上を予想外に表している。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】［ＤＩＭ１／２］ＰｌＧＦ−１のＲＰ−ＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示す図である。
【図２】［ＤＩＭ１／２］ＰｌＧＦ−１のマルチチャージＭＳスペクトルを示す図である。
【図３】［ＤＩＭ１／２］ＰｌＧＦ−１のデコンボリューションした（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ）質量スペクトルを示す図である。
【図４】［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１のＲＰ−ＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示す図である。
【図５】［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１のマルチチャージＭＳスペクトルを示す図である。
【図６】［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１のデコンボリューションした質量スペクトルを示す図である。
【図７】レーンＬが分子量標準に相当し、レーン１が［ＤＩＭ１／２］ＰｌＧＦ−１、及びレーン２が［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１に相当する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図８】［ＤＩＭ１／２］ＰｌＧＦ−１又は［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１の濃度増加性の走化活性を示すヒストグラムである。
【図９】Ｇ−ＣＳＦ単独、又は［ＤＩＭ１／２］ＰｌＧＦ−１若しくは［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１と組み合わせたＧ−ＣＳＦで得られた１２日間の動員の効果を示す図である。
【図１０】ニワトリ絨毛尿膜血管新生試験（ＣＡＭ）を用いた、［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１、［ＤＩＭ１／２］ＰＬＧＦ−１、及び陽性参照として塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の血管新生活性の比較を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明によるＰＬＧＦホモ二量体は、既知のＰＬＧＦタイプ、すなわちＰＬＧＦ−１、ＰＬＧＦ−２、ＰＬＧＦ−３又はＰＬＧＦ−４のいずれの１種でもよい。
【００３１】
単量体のＰｌＧＦタンパク質２個のＣ末端システイン残基は、単量体間ジスルフィド結合に関与している。
【００３２】
「単量体間」及び「鎖間」という表現は、同意義であり、入替え可能と考えられる。
【００３３】
「ジスルフィド架橋」及び「ジスルフィド結合」という表現も、同意義であり、入替え可能と考えられる。
【００３４】
本発明による「Ｃ末端の」という表現は、唯一で最後のシステイン残基を含む単量体Ｃ末端領域という意味である。鎖間結合に関与した、こうした残基は、組換え型ＰＬＧＦ−１の１２５位（ｗｔＰｌＧＦ１３１の１２４位に相当）、組換え型ＰｌＧＦ−２の１４６位（ｗｔＰｌＧＦ１５２の１４５位に相当）、組換え型ＰｌＧＦ−３の１９７位（ｗｔＰｌＧＦ２０３の１９６位に相当）、及び組換え型ＰｌＧＦ−４の２１８位（ｗｔＰｌＧＦ２２４の２１７位に相当）にある。したがって、本発明のホモ二量体は、ＰＬＧＦ−１のＣｙｓ１２５〜Ｃｙｓ１２５、ＰＬＧＦ−２のＣｙｓ１４６〜Ｃｙｓ１４６、ＰＬＧＦ−３のＣｙｓ１９７〜Ｃｙｓ１９７又はＰＬＧＦ−４のＣｙｓ２１８〜Ｃｙｓ２１８に１つの鎖間ジスルフィド結合を含む。本発明の例示的な一実施形態では、ホモ二量体は、３つの鎖間ジスルフィド架橋を有する単離したＰｌＧＦ−１タンパク質ホモ二量体である。本発明の特異的な形によれば、架橋は２個の単量体間、好ましくはＣｙｓ６０〜Ｃｙｓ６９、Ｃｙｓ６９〜Ｃｙｓ６０及びＣｙｓ１２５〜Ｃｙｓ１２５にある。こうした新規のＰｌＧＦ−１タンパク質は、以後［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１と称する。
【００３５】
本発明によると「ＰｌＧＦの単量体」という用語は、天然型の単量体タンパク質（ｗ．ｔ．）すなわち単量体ＰｌＧＦ１３１、単量体ＰｌＧＦ１５２、単量体ＰｌＧＦ２０３若しくは単量体ＰｌＧＦ２２４、又は修正された宿主細胞に発現した組換え型単量体タンパク質の、どちらかの意味である。ＰｌＧＦ単量体は、ＷＯ−Ａ−９２／０６１９４又はＷＯ−Ａ−０３／０６６６７６に開示されているとおり、バクテリアなどの原核細胞に発現した場合は非グリコシル化であり、酵母又は哺乳類細胞などの真核細胞に発現した場合は少なくとも部分的グリコシル化である可能性がある。
【００３６】
付加的鎖間ジスルフィド結合の存在は、本発明のホモ二量体に、既知のＰＬＧＦ二量体に対して新規の予測できない特性を与える。
【００３７】
例えば、より詳細に実験項で実証すると、本発明の産物は、既知の［ＤＩＭ１／２］ＰｌＧＦ−１と比較して、より高い安全性が賦与され、実質的により均一であり、Ｃｙｓ６０及びＣｙｓ６９に係る鎖間ジスルフィド結合を２つだけ有している。
【００３８】
さらに、新規のホモ二量体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ走化性アッセイで驚くほど高い固有活性を示すが、このアッセイは［ＤＩＭ１／２］ＰｌＧＦ−１と比較して、向上したｉｎ  ｖｉｖｏ有効性に相関している。
【００３９】
本発明のさらなる態様は、ＰｌＧＦホモ二量体、例として［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１を調製する方法である。
【００４０】
こうした方法は、下記のステップを含む：
Ｉ．ＰｌＧＦ単量体タンパク質を得るステップ、
ＩＩ．ＰＬＧＦホモ二量体を得るために前記単量体を酸化させる、又は酸化するステップ、及び任意選択で
ＩＩＩ．ＰＬＧＦホモ二量体を精製するステップ。
【００４１】
ステップＩ：
いくつかの異なる手順が、単量体ＰｌＧＦ、好ましくは鎖内ジスルフィド結合の全ての保持されている天然構造を得るために、ステップＩに続くことができる。
【００４２】
本発明の一実施形態によれば、ステップＩは、Ｃ末端システイン残基間に鎖間ジスルフィド架橋を欠いたＰｌＧＦのホモ二量体型からの、単量体ＰｌＧＦの調製を含む。こうした場合、ステップＩは下記のステップ：
ｐＨが中性から塩基性、例えば範囲が７から９．５であり且つ還元剤を含有するバッファー中で、ＰｌＧＦのホモ二量体型をインキュベートし、次いで以下に記載の手順に従って還元剤を除去又は不活性化するステップを含む。
【００４３】
出発産物がＰｌＧＦ−１のホモ二量体型である場合、出発産物は鎖間ジスルフィド結合を３つ未満含有することになろう。例えば、ジスルフィド結合を１つ若しくは２つ、又はその混合物を有するホモ二量体が使用できる。好ましい出発産物は、ＷＯ−Ａ−０３／０６６６７６に記載の方法によって得られるホモ二量体型［ＤＩＭ１／２］ＰｌＧＦ−１である。
【００４４】
タンパク質化学で一般に利用されるいずれのタイプの還元剤も、該方法の上記ステップで使用できる。例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ＊ＨＣｌ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）若しくは同等の薬剤、又はその混合物である。
【００４５】
還元剤は、還元剤／ＰＬＧＦタンパク質のモル比が５：１〜１００：１の範囲で使用されることが好ましく、前記還元剤のインキュベーションは、１０分から３０時間の間、好ましくは３０分から２時間の間に含まれる時間で行われることが好ましい。
【００４６】
代替の一実施形態によれば、ステップＩは、組換え型ＤＮＡ技術によってバクテリア宿主細胞で得られた、ＰｌＧＦ−１分子を含有する封入体からの、単量体ＰｌＧＦの調製を含む。封入体は、好ましくは、ＷＯ−Ａ−０３／０６６６７６に記載の方法によって得られる。こうした場合、ステップＩは下記のステップ：
ｐＨが中性から塩基性、例えば範囲が７から９．５、好ましくはトリスバッファー（ｐＨ８）であり、且つ変性剤として例えば８Ｍの尿素又は６Ｍのグアニジンをカオトロピック剤（例えばエチレンジアミン、アルギニン、他）の存在下で任意に含有するバッファー中で、ＰｌＧＦを含有する封入体をインキュベートするステップと、
こうして還元剤で得られたタンパク質溶液を還元するステップを含み、
タンパク質化学で一般に利用されるいずれのタイプの還元剤も、該方法の上記ステップで使用できる。例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ＊ＨＣｌ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）若しくは同等の薬剤、又はその混合物である。
【００４７】
還元剤は、還元剤／ＰＬＧＦタンパク質のモル比が５：１〜１００：１の範囲で使用されることが好ましく、前記還元剤のインキュベーションは、１０分から３０時間の間、好ましくは３０分から２時間の間に含まれる時間で行われることが好ましい。
【００４８】
こうして得られた単量体は、完全な還元型でもよく、又は好ましくは、全ての鎖内ジスルフィド結合を保持することによって天然のフォールディングを維持する。
【００４９】
還元後、得られた単量体は、いかなる予備的な精製もなしに直接ステップＩＩの酸化にかけることができる。
【００５０】
この場合、精製ステップＩＩＩは、精製された最終的なホモ二量体ＰｌＧＦを得るために行われることが望ましい。
【００５１】
精製されていないＰＬＧＦ単量体とは、本発明によれば、５０％から９０％までの単量体を含有するタンパク質混合物という意味である。
【００５２】
或いは、得られた単量体は、酸化前に予備的な精製にかけることができる。精製された型の単量体のＰｌＧＦ−１とは、本発明によれば、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、及び、より好ましくは少なくとも９８％、又はそれ以上のＰｌＧＦ単量体を含有するタンパク質混合物である。
【００５３】
精製された単量体、例としてＰｌＧＦ−１単量体に酸化ステップが行われた場合、酸化は通常、精製されたホモ二量体、例えば［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１という結果になり、それ以上の精製ステップＩＩＩを必要としない。
【００５４】
ステップＩＩ
還元後、得られた単量体は、還元剤、及び／又は変性剤を適した技法で除去又は不活性化することによって、ステップＩＩの酸化にかけることができる。技法は透析など、例えば１０〜１００倍での適切な希釈、又はクロマトグラフィーといったその他の手段である。
【００５５】
最初の選択肢では、酸化は精製されていない単量体のＰｌＧＦで行われる。通常、溶液は、充分に希釈されて、還元剤及び存在する場合は変性剤が、システイン残基のチオール基と反応すること及び／又はタンパク質フォールディングを妨害することを妨げる。
【００５６】
こうしたケースに該当しない場合、ステップＩＩを実施する前に、還元剤及び存在する場合は変性剤は、以後記述するとおり、遊離システインとの反応及びタンパク質フォールディングの妨害に向けて、上記溶液から取り出されるか、或いは不活性化されなくてはならない。
【００５７】
タンパク性物質を精製するのに適した既知の任意の技術を、該方法のこの段階で使用することができる。使用される可能性のある技法は、例えば濾過、イオン交換クロマトグラフィーを含むクロマトグラフィー精製、及び／又はゲル排除クロマトグラフィーである。よく知られているように、これらの技法の中には、低分子のみの除去を引き起こすものがあり、例えば還元剤だが、他のものではタンパク性混入物の除去も発生する。
【００５８】
所望のホモ二量体ＰｌＧＦタンパク質を得るため、単量体は、単量体ＰｌＧＦのシステイン残基の酸化を妨害する能力がある任意の変性剤の非存在下、及び任意の還元剤の非存在下で、及びｐＨ範囲が中性から塩基性の値であるバッファー中で、インキュベートによって酸化される。ＰｌＧＦがＰｌＧＦ−１である場合には、その酸化の産物すなわちホモ二量体は、普通、３つの鎖間ジスルフィド結合すなわち［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１を含む。
【００５９】
本発明による「還元剤の非存在」とは、還元剤の完全な欠如、又はＰｌＧＦ単量体のシステイン残基のチオール基の酸化を妨害できない量若しくは状態での還元剤の存在、のいずれかを意味する。
【００６０】
本発明による「変性剤の非存在」とは、変性剤の完全な欠如、又はタンパク質のフォールディングを妨害できないような量若しくは状態の変性剤の存在、のいずれかを意味する。
【００６１】
Ｃ末端ジスルフィド結合を含む、全ての鎖間ジスルフィド結合の完全形成のためには、酸化は、単純に大気中で行われることが好ましい。或いは、少量の酸化剤を加えて、酸化をより早めることもできる。後者の場合、タンパク質多量体の形成は、酸化剤の量の単純制御で簡単に避けることができる。酸化時間は、通常１２から４８時間までの間で変動する。反応は、１５℃から３０℃の間の温度で、好ましくは室温で行われる。酸化プロセスが起こるバッファーは、ｐＨが中性から塩基性の任意のバッファーでもよく、具体的にはｐＨ７からｐＨ９．５、例えばｐＨ７．２、ｐＨ８．３又はｐＨ９でもよい。適切なバッファーは、リン酸ナトリウムバッファー、トリス塩酸バッファー、リン酸アンモニウムバッファー又は任意の同等のバッファーから選択される。最終的に、単量体のＰｌＧＦは、初濃度範囲３から１０ｍｇ／ｍＬ溶液で反応する。
【００６２】
ＰＬＧＦ単量体を得るステップが還元剤の使用に関与する場合、こうした薬剤は、酸化溶液から完全に、又は少なくとも酸化を妨げない程度に、除去又は不活性化されなくてはならない。
【００６３】
還元剤の除去は、該バッファーを、ｐＨが中性から塩基性、例えば７〜９．５の間で、還元剤を全く含有しないバッファーで置換することにより行われる。或いは還元剤の除去は、１つ又は複数のクロマトグラフィー精製ステップを経由して、少なくとも部分的に達成され、例えば任意のタイプのイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーで、順序は任意である。例えば、１陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィーに、ゲル濾過、及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィーが続く。
【００６４】
クロマトグラフィーの還元剤除去法は、任意のその他のタンパク性物質からのＰＬＧＦ単量体タンパク質の、付随物精製又は追加精製を可能にするという、追加の利点を提供する。
【００６５】
最終的に還元剤は、タンパク質溶液の希釈によって、及び／又は前記溶液に、タンパク質の存在下で使用するのに適する、当技術分野で知られた任意の酸化剤を過剰に加えることによって、不活性化できる。
【００６６】
ステップＩＩＩ：
ステップＩＩＩの目的は、純度９０％以上、好ましくは少なくとも９５％、及び、より好ましくは少なくとも９８％の最終的なホモ二量体を有することである。
【００６７】
通常、ステップＩＩＩの精製は、１つ又は複数のクロマトグラフィー精製からなる。好ましくは、前記クロマトグラフィー精製は、イオン交換クロマトグラフィーを含み、任意に、サイズ排除クロマトグラフィー及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィーがそれに続く。
【００６８】
精製ステップＩＩＩが行われる機会は、ステップＩで得られた単量体のＰｌＧＦの純度、及び、達成が望まれた最終生成物の純度次第である。
【００６９】
実験項で示すように、本発明の方法は、ＰＬＧＦ−１で行われる場合、純粋で、安定し、活性の高いホモ二量体を導き、このホモ二量体は、単量体残基Ｃｙｓ６０〜Ｃｙｓ６９、Ｃｙｓ６９〜Ｃｙｓ６０及びＣｙｓ１２５〜Ｃｙｓ１２５間に主に３つの鎖間ジスルフィド結合を有する。
【００７０】
得られた産物の生物活性／薬理活性の存在は、ヒト単球及び動物モデル、ＢＡＬＢ／ｃマウス（例９及び１０を参照）で実施された走化性の実験によって評価された。［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１は、上記両方の実験で［ＤＩＭ１／２］ＰｌＧＦ−１と比較された。
【００７１】
図８及び図９及び図１０に示す得られた結果は、［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１が血管新生活性、走化活性、及び細胞コロニー形成活性を発揮するだけでなく、生物学的刺激を活性化する能力である固有活性が［ＤＩＭ１／２］ＰｌＧＦ−１で観察されるよりも高いことも実証する。
【００７２】
これらの生物学的効果は、野生型ＰＬＧＦ並びに初期のＷＯ−Ａ−２００３／０６６６７６及びＷＯ−Ａ−２００３／０９７６８８で産生された組換え型ＰＬＧＦとして、当技術分野で知られた全ての薬理学的特性及び治療への適用に反映する。
【００７３】
本発明は、患者又は治療を必要としている対象の血液幹細胞の動員を促進する調製薬のための、新規のホモ二量体ＰｌＧＦの使用にも関する。本発明の薬物の使用から恩恵を受け得る患者の例は、化学療法を受けている患者である。
【００７４】
さらに、血管新生活性を有する新規のホモ二量体ＰｌＧＦは、虚血性疾患の治療措置に使用される。心筋組織の虚血、心筋梗塞、虚血発作性及び慢性虚血性心筋疾患、脳虚血及び虚血性発作、腸管虚血、四肢の末梢性虚血などである。加えて、強皮症の治療、皮膚潰瘍、創傷、熱傷、術後処置の治療、自然及び早期の皮膚組織老化の治療、並びに自然又は病的脱毛の治療に使用される。
【００７５】
その安定性及び純度特性を鑑みると、本発明の二量体は、医薬産業での製造に高い適合性がある。
【００７６】
したがって、よりさらなる本発明の目的は、本発明のホモ二量体ＰｌＧＦを、少なくとも１種の薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤、又は補助剤との混合物中に含む組成物に関する。
【００７７】
治療薬の全身又は局所投与に適切な任意の製剤を、本発明に従って使用することができる。局所使用のための製剤は、化粧用途の分野で使用される。
【００７８】
具体的には、新規のホモ二量体は、全身的若しくは局所的効果を有する場合は非経口経路で投与することができ、又は主に局所的効果を有する場合は皮膚若しくは粘膜に外用経路で投与することができる。全身的効果は、主に静脈投与によって達成されるが、腹腔内投与又は筋肉内投与も適している。局所的効果は、外用経由、又は非経口で筋肉内投与、皮下投与、関節間投与によって達成される。同様に、ＰＬＧＦ−１因子を、電気輸送又はイオン泳動経由で局所的に投与できる。因子の経口投与は、活性産物の性質が変わりやすいことを鑑みると、あまり勧められない。
【００７９】
全身的又は局所的非経口使用の組成物は、溶液、懸濁液、リポソーム懸濁液、Ｗ／Ｏ型又はＯ／Ｗ型エマルションを含む。外用使用の組成物は、溶液、ローション、懸濁液、リポソーム懸濁液、Ｗ／Ｏ型又はＯ／Ｗ型エマルション、ゲル、軟膏、クリーム、ポマード及びペーストを含む。好ましい実施形態では、活性物質は、適切な凍結乾燥添加剤と混合した凍結乾燥体として製剤化し、治療上許容される希釈剤による再溶解に備える。有益な凍結乾燥添加剤は、バッファー、多糖類、スクロース、マンニトール、イノシトール、ポリペプチド、アミノ酸及び活性物質と両立するその他の添加剤である。本発明の好ましい実施形態では、活性物質を、凍結乾燥後のＰＬＧＦ１／ホスフェート比が１：１〜１：２の間に含まれるような量で、ホスフェートバッファー（ＮａＨ２ＰＯ４／Ｈ２Ｏ−Ｎａ２ＨＰＯ４／２Ｈ２Ｏ）に溶解させる。非経口使用に適した希釈剤は、水、生理溶液、糖溶液、含水アルコール溶液、油性希釈剤、ポリオール（グリセロール、エチレン若しくはポリプロピレングリコールなど）又は、無菌性、ｐＨ、イオン強度及び粘度の点で投与方法と両立する他の任意の希釈剤である。
【００８０】
エマルション又は懸濁液の場合、組成物は、薬物の製剤に一般に使用される非イオン、双性イオン、陰イオン又は陽イオンタイプの適切な界面活性剤を含有することができる。油／水（Ｏ／Ｗ型）親水性エマルションは、非経口で全身的使用に好ましく、水／油（Ｗ／Ｏ型）親油性エマルションは、局所又は外用使用に好ましい。
【００８１】
さらに本発明の組成物は、糖類又はポリアルコール類などの等張剤、バッファー、キレート剤、酸化防止剤、抗菌薬といった任意の添加剤を含有することができる。
【００８２】
外用使用の組成物は、液体形状、又は半流動の形状を含む。液体形状は、溶液又はローションを含む。これらは、水溶性、エタノール／水などの含水アルコール性、又はアルコール性であってよく、凍結乾燥物質を可溶化して得られる。
【００８３】
或いは、活性物質溶液は、デンプン、グリセリン、ポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコール、ポリ（メタ）アクリレート、イソプロピルアルコール、ヒドロキシステアレートなどの既知のゲル化剤の添加によってゲル形態に製剤化することができる。
【００８４】
外用使用用の他のタイプの組成物は、ポマード、ペースト、クリーム状のエマルション又は懸濁液である。Ｗ／Ｏ型エマルションは、吸収が早いので好ましい。親油性賦形剤の例は、流動パラフィン、無水ラノリン、白色ワセリン、セチルアルコール、ステアリルアルコール、植物油、鉱物油である。吸収を促進するために皮膚浸透性を増大させる薬剤を有利に使用することができる。こうした薬剤の例は、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの生理学的に許容される添加剤である。
【００８５】
外用組成物に使用される他の添加剤は、糖類又はポリアルコール類などの等張剤、バッファー、キレート剤、酸化防止剤、抗菌薬、増粘剤、分散剤である。
【００８６】
同様に、局所的又は全身的使用のための徐放性組成物は有用であり、ポリ乳酸、ポリ（メタ）アクリレート、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどのポリマー、及び当分野で既知の他の物質を含むことができる。例えば、ポリ乳酸又は他の生分解性ポリマーに基づく皮下埋込体の形状の徐放性組成物も有用であり得る。
【００８７】
活性物質は、凍結乾燥し故に安定した形でパッケージされるのが好ましいが、医薬組成物は、活性な二量体の形にホモ二量体を安定化させる物質を有利に含む。
【００８８】
実験項
（例１）［ＤＩＭ１／ＤＩＭ２］ＰｌＧＦの特性決定
ＷＯ０３／０６６６７６に記載の手順で得られた試料［ＤＩＭ１／２］ＰｌＧＦ−１を、ＮａＨ２ＰＯ４バッファー溶液（ｐＨ７．２）中、１ｍｇ／ｍＬ濃度で、グラジエント条件のＣ１８分析カラムに注入し、次いでＥＳＩ−ＭＳ分析を行った。
【００８９】
分析条件:下記を搭載したＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ製ＬＴＱイオントラップ
マイクロＨＰＬＣシステム；
Ｃ１８ＨＰＬＣカラム；
溶出システム：システムＡ：Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ／ＨＣＯＯＨ  ９７：２：１
システムＢ：Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ／ＨＣＯＯＨ  ２：９７：１
溶出グラジエント：
ｔ＝０  システムＡ／システムＢ  ８０：２０
ｔ＝１２分  システムＡ／システムＢ  ５０：５０
ｔ＝１５分  システムＡ／システムＢ  ５０：５０
ｔ＝１６分  システムＡ／システムＢ  ８０：２０
【００９０】
得られたＴＩＣクロマトグラムを図１に示す。
【００９１】
クロマトグラムは、［ＤＩＭ１／２］ＰｌＧＦ−１のメインピークをｒｔ＝７．９１分に示す。関連するマルチチャージＭＳスペクトル及びデコンボリューションしたＭＳスペクトル（それぞれ図２及び図３）は、異なる種の複数のＰｌＧＦ−１が試料中に存在していることを立証する。
【００９２】
図２は、広い一団のタンパク質の存在を図示する。
【００９３】
図３は、［ＤＩＭ１／２］ＰｌＧＦ−１の化学種が、実際は２９．７〜３０．５ＫＤａの範囲に分子量を有するタンパク質の混合物である詳細を示す。
【００９４】
得られたデータは、分子量２９６９０の予期された二量体のタンパク質の存在を、より大きな分子量を有する、より大量の変異体と共に実証し、そのうちいくつかは該分子のシステイン残基に共有結合する有機低分子の存在を説明する。
【００９５】
（例２）［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１の産生
ＷＯ−Ａ−０３／０６６６７６に記載の精製したＤＩＭ１／２ＰｌＧＦ−１（濃度０．９ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．２）２．５ｍＬを、バッファー交換を行うためにＰＤ−１０脱塩カラムにロードした。試料は、５０ｍＭのＮＨ４Ｈ２ＰＯ４バッファー（ｐＨ９、タンパク質濃度０．７５ｍｇ／ｍＬ）３ｍＬで溶出した。得られた溶液２．５ｍＬは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（４ｍｇ／ｍＬ）１２μＬで還元し、したがって還元剤／タンパク質のモル比５／１（還元時間：３０分）を確立した。こうした反応の結果として鎖間ジスルフィド架橋を還元したが、鎖内ジスルフィド架橋は変化せず、単量体型のＰｌＧＦを得た。次いで還元型タンパク質溶液（２．５ｍＬ）を、還元剤を除去するためＰＤ−１０カラムにロードし、５０ｍＭのＮＨ４Ｈ２ＰＯ４バッファー（ｐＨ９）３ｍＬで溶出した。得られた溶出液を、室温で１８時間インキュベートした。
【００９６】
産物の特性決定
上記方法で得られた試料０．６２ｍｇ／ｍＬの［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１に、ＬＣ−ＭＳ分析を実施した。詳細には、試料を、例１の［ＤＩＭ１／２］ＰｌＧＦ−１で使用されたのと同じ手順で、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析によって実施されるグラジエント条件でＣ１８分析カラムに注入した。
【００９７】
この分析結果は図４に示され、精製された単一タンパク質種を生じる実質的に完全な再酸化を示す（クロマトグラフィーのシャープなピーク滞留時間を参照：９．８８分）。さらに、関連するマルチチャージスペクトル（図５）は、唯一の高純度タンパク質の絶対的な普及を強調している。分子量２９６９０±１５Ｄａ（理論的分子量＝２９７０２）を有するＰｌＧＦ−１ホモ二量体としてのこうした単一種の識別性は、さらに、産物のデコンボリューションした質量スペクトルによって確認した（図６）。
【００９８】
ＨＰＬＣ−ＭＳ分析の結果を要約すると、産物［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１は、流行性の種からなり、［ＤＩＭ１／２］ＰｌＧＦ−１とは異なっている。主な差異は、下記により推測されている:
ａ）ＨＰＬＣ分析は、２つの産物の異なる滞留時間（［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１、ｒｔ＝９．８８分）対（［ＤＩＭ１／２］ＰｌＧＦ−１、ｒｔ＝７．９１分）の定量を認めた；
ｂ）［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１のＨＰＬＣ−ＭＳスペクトルは、理論的重量（２９７００Ｄａ）に相当する分子量の単一ホモ二量体タンパク質種の獲得を確定した。これは、異型遺伝子のタンパク質混合物（１９．７〜３０．５ｋＤａ）からなる［ＤＩＭ１／２］ＰｌＧＦ−１と対照をなしている。
【００９９】
二量体タンパク質の鎖間ジスルフィド架橋の存在、すなわち、遊離システインチオール基の欠如は、エルマン試薬の手段で検証された。［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１中に遊離システイン−チオールは全く検出されなかった。
【０１００】
こうした結果はさらに、ヨードアセトアミドでアルキル化した［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１の質量分析によって確定された。アルキル化の非存在は、［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１中の遊離システイン−チオール残基の完全な欠如を表した。
【０１０１】
最終的に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図７）が、内在的に高純度の［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１を確定した。［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１並びに［ＤＩＭ１／２］ＰｌＧＦ−１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、自動チップシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｅｘｐｅｒｉｏｎ）を使用して実施された。図７に示すように、［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１は、［ＤＩＭ１／２］ＰｌＧＦ−１より有意により純度が高い。精製プロトコルの後に産生される新規の産物に起因するバンドは検出されなかった。
【０１０２】
３番目の鎖間ジスルフィド架橋の存在は、非還元条件及び下記の古典的手順のもとで実施されたトリプシンマッピングによっても確定された。
【０１０３】
これらすべてのデータが一緒になって、高純度タンパク質［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１における３つの鎖間ジスルフィド架橋の存在を確定する。
【０１０４】
（例３）［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１の産生
ＷＯ−Ａ−０３／０６６６７６に記載の精製したＤＩＭ１／２ＰｌＧＦ−１（濃度４．５ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．２）２．５ｍＬを、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（３０．７ｍｇ／ｍＬ）２０．８μＬで還元し、還元剤／タンパク質のモル比１１／１（還元時間：１２０分）を得た。こうした反応に続いて鎖間ジスルフィド架橋を還元したが、鎖内ジスルフィド架橋は変化せず、したがって単量体型のＰｌＧＦを得た。次いで還元型タンパク質溶液（２．５ｍＬ）を、還元剤を除去するためＰＤ−１０カラムにロードし、５０ｍＭのＮＡＨ２ＰＯ４バッファー（ｐＨ７．２）３ｍＬで溶出した。得られた溶液を、室温で４８時間インキュベートした。
【０１０５】
得られた産物は、二量体の形成が３つの鎖間ジスルフィド結合を含有することを立証すると等価の結果を得ることで、例２に記載のとおり特徴づけられた。
【０１０６】
（例４）［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１の産生
ＷＯ−Ａ−０３／０６６６７６に記載の精製したＤＩＭ１／２ＰｌＧＦ−１（濃度０．９ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．２）１ｍＬを、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（３０．７ｍｇ／ｍＬ）５μＬで還元し、還元剤／タンパク質のモル比３３／１（還元時間：６０分）を得た。こうした反応に続いて鎖間ジスルフィド架橋を還元したが、鎖内ジスルフィド架橋は変化せず、単量体型のＰｌＧＦを得た。タンパク質溶液から酸化還元種をすべて除去するため、並びに該バッファーを１００ｍＭのＴＲＩＳバッファー（ｐＨ８．３）に交換するため、バッファー交換を行った。詳細には、バッファー交換は、１０，０００のカットオフを有するＡｍｉｃｏｎ  ＭｉｃｒｏｃｏｎＹＭ−１０の遠心分離濾過システムを介して行った。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆの遠心分離機を使用して、１００００×ｇで濾過を５サイクル行い、次いで分子量１０，０００Ｄａ未満の分子を９８〜９９％除去した。得られた溶液を、室温で４８時間インキュベートした。
【０１０７】
得られた産物は、二量体の形成が３つの鎖間ジスルフィド結合を含有することを立証すると等価の結果を得ることで、例２に記載のとおり特徴づけられた。
【０１０８】
（例５）［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１の産生
精製したＤＩＭ１／２ＰｌＧＦ−１（濃度４．５ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．２）１ｍＬを、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（６１．７ｍｇ／ｍＬ）１５μＬで還元し、還元剤／タンパク質のモル比４０／１（還元時間：６０分）を得た。こうした反応に続いて鎖間ジスルフィド架橋を還元したが、鎖内ジスルフィド架橋は変化せず、単量体型のＰｌＧＦを得た。タンパク質溶液から酸化還元種をすべて除去するため、並びに該バッファーを１００ｍＭのＴＲＩＳバッファー（ｐＨ８．３）に交換するため、バッファー交換を行った。バッファー交換は、１０，０００のカットオフを有するＡｍｉｃｏｎ  ＭｉｃｒｏｃｏｎＹＭ−１０の遠心分離濾過システムを介して行った。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆの遠心分離機を使用して、１００００×ｇで濾過を５サイクル行い、次いで分子量１０，０００Ｄａ未満の分子を９８〜９９％除去した。得られた溶液を、室温で４８時間インキュベートした。
【０１０９】
得られた産物は、二量体の形成が３つの鎖間ジスルフィド結合を含有することを立証すると等価の結果を得ることで、例２に記載のとおり特徴づけられた。
【０１１０】
（例６）［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１の産生
精製したＤＩＭ１／２ＰｌＧＦ−１（濃度０．９ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．２）３ｍＬを、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（１３．３ｍｇ／ｍＬ）１０μＬで還元し、還元剤／タンパク質のモル比１０／１（還元時間：１００分）を得た。こうした反応に続いて鎖間ジスルフィド架橋を還元したが、鎖内ジスルフィド架橋は変化せず、単量体型のＰｌＧＦを得た。還元型タンパク質溶液２．５ｍＬを、還元剤を除去するため並びにバッファー交換を行うために、ＰＤ−１０カラムにロードし、試料は、５０ｍＭのＮＨ４Ｈ２ＰＯ４（ｐＨ９）３ｍＬで溶出した。得られた溶液を、室温で２４時間インキュベートした。
【０１１１】
得られた産物は、二量体の形成が３つの鎖間ジスルフィド結合を含有することを立証すると等価の結果を得ることで、例２に記載のとおり特徴づけられた。
【０１１２】
（例７）封入体からの［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１の産生
充分な量の封入体を、尿素８Ｍ及びエチレンジアミン２０ｍＭを含有する、５０ｍＭのＴｒｉｓ＊ＨＣｌバッファー（ｐＨ８）で溶解し、約１ｍｇ／ｍＬの終濃度でＰｌＧＦ−１を得た。上記の溶液３ｍＬを、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（１３．３ｍｇ／ｍＬ）１０μＬで還元し、還元剤／タンパク質のモル比１０／１（還元時間：１００分）を得た。こうした反応に続いて、可溶化した単量体型のＰｌＧＦを得た。還元型タンパク質溶液２．５ｍＬは、還元剤及び変性剤を除去するため、５０ｍＭのＮＨ４Ｈ２ＰＯ４（ｐＨ９．２）２０容量で、室温で１６時間透析した。
【０１１３】
得られた産物は、二量体の形成が３つの鎖間ジスルフィド結合を含有することを立証すると等価の結果を得ることで、例２に記載のとおり特徴づけられた。
【０１１４】
（例８）封入体からの［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１の産生
充分な量の封入体を、尿素８Ｍ及びエチレンジアミン２０ｍＭを含有する、５０ｍＭのＴｒｉｓ＊ＨＣｌバッファー（ｐＨ８）で溶解し、約１ｍｇ／ｍＬの終濃度でＰｌＧＦ−１を得た。上記の溶液３ｍＬを、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（１３．３ｍｇ／ｍＬ）１０μＬで還元し、還元剤／タンパク質のモル比１０／１（還元時間：１００分）を得た。こうした反応に続いて、可溶化した単量体型のＰｌＧＦ−１を得た。還元型タンパク質溶液２．５ｍＬを、還元剤及び変性剤を除去するため並びにバッファー交換を行うために、ＰＤ−１０カラムにロードし、試料は、５０ｍＭのＮＨ４Ｈ２ＰＯ４（ｐＨ９．２）３ｍＬで溶出した。得られた溶液を、室温で２４時間さらにインキュベートした。
【０１１５】
得られた産物は、二量体の形成が３つの鎖間ジスルフィド結合を含有することを立証すると等価の結果を得ることで、例２に記載のとおり特徴づけられた。
【０１１６】
（例９）封入体からの［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１の産生
ＷＯ−Ａ−０３／０６６６７６に記載の精製したＤＩＭ１／２ＰｌＧＦ−１（濃度４．５ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．２）２．５ｍＬを、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（３０．７ｍｇ／ｍＬ）２０．８μＬで還元し、還元剤／タンパク質のモル比１１／１（還元時間：１２０分）を得た。こうした反応に続いて鎖間ジスルフィド架橋を還元したが、鎖内ジスルフィド架橋は変化せず、単量体型のＰｌＧＦを得た。還元型タンパク質溶液２．５ｍＬを、還元剤を除去するため、及びバッファー交換を行うため、ＰＤ−１０カラムにロードし、試料は、５０ｍＭのＮＨ４Ｈ２ＰＯ４（ｐＨ９）３ｍＬで溶出した。得られた溶液を、室温で２４時間インキュベートした。
【０１１７】
得られた産物は、二量体の形成が３つの鎖間ジスルフィド結合を含有することを立証すると等価の結果を得ることで、例２に記載のとおり特徴づけられた。
【０１１８】
（例１０）安定性評価
例２から７までのいずれか一項に記載のとおり得られた［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１の試料、及びＤＩＭ１／２の試料を、室温で１カ月間貯蔵した。試料は、ＨＰＬＣ−ＵＶ（溶液中のタンパク質濃度検証用）及び、ＨＰＬＣ−ＭＳ（試料の整合性検証用）で分析した。得られた結果は、［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１が試験の条件下では安定していることを示し、事実、タンパク質の沈殿と修飾のどちらも構造中に検出されなかった。それに反して、ＤＩＭ１／２タンパク質試料には、部分的な沈殿が観察された。
【０１１９】
（例１１）
走化性アッセイ
［ＤＩＭ１／２］ＰＬＧＦ−１及び［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１の有効性を試験するために使用される細胞を、Ｃｅｎｔｒｏ  Ｔｒａｓｆｕｓｉｏｎａｌｅ、Ｏｓｐｅｄａｌｅ  Ｓ．Ｓａｌｖａｔｏｒｅ、Ｌ’Ａｑｕｉｌａ、Ｉｔａｌｙの厚意を介して、健常志願者のヘパリン処置された血液のバフィーコートから得た。単核細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ／Ｈｉｐａｑｕｅの遠心分離によって得た。細胞生存率は、トリパンブルー色素排除で測定したところ、全ての実験で９５％以上だった。単球の遊走は、以前記述されたとおり（Ｂｉｚｚａｒｒｉ  Ｃ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ＰＨａｒｍ．、２００１、６１、１４２９〜１４３７）４８ウェルのマイクロケモタキシスチャンバーを使用して評価した。手短に言うと、制御媒体（ＰＢＳ＋０．２％ＢＳＡ）２９μｌ又は、濃度増加性タンパク質溶液を、ケモタキシスチャンバーの下方区画に播種した。細胞懸濁液（３ｘ１０６ＰＢＭＣｓ／ｍＬ）５０μｌは、上方区画に播種した。ケモタキシスチャンバーの２つの区画を、５−μｍのポリカーボネートフィルターで区分した。チャンバーを、ＣＯ２が５％の大気中で３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーションの最後に、フィルターを取り出して、固定し、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋで染色し、試料符号化の後に高倍率（１００Ｘ）の油浸視野（ｏｉｌ  ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ  ｆｉｅｌｄｓ）５つをカウントした。
【０１２０】
［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１を、用量反応実験で［ＤＩＭ１／２］ＰＬＧＦ−１と比較した。
【０１２１】
図８に表したとおり、結果は、走化性が濃度依存性であることを示している。事実、［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１及び［ＤＩＭ１／２］ＰｌＧＦ−１（０．１１ｎＭ対０．１５ｎＭ）の両方のＥＣ５０が同じような値であるにもかかわらず、このｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでの高い固有活性は、［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１に明らかである。こうした高い活性は、［ＤＩＭ１／２］ＰｌＧＦ−１に比較して、より高い、生物学的走化性効果を産生する能力を実証している。
【０１２２】
（例１２）動員及びコロニー形成細胞アッセイ
［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１の向上した生物活性の、さらにとても重要な確証を、ある動物モデル（ＢＡＬＢ／ｃマウス）で、臨床的状況でのＰＢＭＣ動員をシミュレーションして得た。
【０１２３】
動員プロトコルは、生後６週間から８週間のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（体重２０〜２５ｇ）への組換え型ヒト顆粒球コロニー刺激因子の腹腔内注射（ｒｈＧ−ＣＳＦ；１０μｇ／日、１〜５日）からなる。組み合わせ処置は、ｒｈＧ−ＣＳＦ（１０μｇ／日）に［ＤＩＭ１／２］ＰｌＧＦ−１（５、１０又は１５μｇ／日）又は［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１（１．７、３．３、又は５μｇ／日）のどちらかをプラスした５日間の処置からなる。組み合わせ調査で使用するＰｌＧＦ−１の用量範囲は、予備的な実験において同定した。各実験は、少なくとも３回実施し、動物は最終処置の２〜３時間後に屠殺した。末梢血は、ヘパリン含有チューブに収集して白血球数算定後にＰＢＳで希釈し、単核細胞はＦｉｃｏｌｌの不連続勾配遠心分離で分離した。コロニー形成細胞（ＣＦＣｓ）の総量は、（Ｃａｒｌｏ−Ｓｔｅｌｌａ  Ｃ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００２、６２、６１５２〜６１５７）に記載のメチルセルロース培養液中で査定した。
【０１２４】
得られた結果は、［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１がＧ−ＣＳＦと協同して、循環する造血前駆細胞の、関連コロニー形成細胞（ＣＦＣｓ）、高増殖能コロニー形成細胞（ＨＰＰ−ＣＦＣｓ）、原始的な長期培養開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣｓ）及び放射能防護細胞を含めた、広域スペクトルの絶対数及び頻度を亢進することを示した。詳細には、Ｇ−ＣＳＦと［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１の組み合わせの効果を、Ｇ−ＣＳＦと［ＤＩＭ１／２］ＰｌＧＦ−１の組み合わせとの比較で、１ｍＬあたりのＣＦＣ数の増加について造血活性を描写するパラメータで図９に示した。
【０１２５】
観察できるとおり、［ＤＩＭ１／２］又は［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１との組み合わせはどちらも、Ｇ−ＣＳＦ効果と強力に協同して、１ｍＬあたりのＣＦＣ数を、Ｇ−ＣＳＦ単体と比較して少なくとも３倍に増加させている。しかしながら驚いたことに、こうした効果は、［ＤＩＭ１／２］ＰｌＧＦと比較して、有意に低い濃度の［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１で得られた。（［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１／［ＤＩＭ１／２］ＰｌＧＦ−１、用量比１：３）。このことは、どちらもＧ−ＣＳＦと組み合わせたときに、［ＤＩＭ１／２］ＰｌＧＦ−１に比較して［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１の造血活性がより高いことを明確に示している。
【０１２６】
（例１３）［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１の血管新生活性の評価
［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１、［ＤＩＭ１／２］ＰＬＧＦ−１因子、及び陽性参照としての塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の血管新生活性を、Ｍａｇｌｉｏｎｅら（「Ｉｌ  Ｆａｒｍａｃｏ」に前掲）によって既に記述されているニワトリ絨毛尿膜血管新生試験（ＣＡＭ）を使用して比較した。異なる量の［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１及び［ＤＩＭ１／２］ＰｌＧＦ−１（０〜３ｍｃｇ／スポンジ）を、１ｍｍ３ゼラチンスポンジに吸収させ、続いてＣＡＭの表面に植え込んだ。１２日後、試料と接触しているＣＡＭ領域を切片にし、着色して、「ポイントカウント法」として知られる形態計測技法を使用して血管新生効果を定量化した。具体的には、１４４個の交点を有するグリッド上でＣＡＭ切片を顕微鏡で分析し、結果を、横断面上で毛細血管が占める交点の割合（血管新生した面積の割合）として表した。示した結果（図１０）では、［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１及び［ＤＩＭ１／２］ＰｌＧＦ−１の血管新生活性は本質的に同じである。
【０１２７】
（例１４）［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１のイソプレナリン誘発性心臓虚血に対する効果の評価
心臓の虚血及び梗塞に対する［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１の効果は、野生型因子に関してＭａｇｌｉｏｎｅら（前掲）によって記述されたように、動物モデルにイソプレナリンを利用して誘発された虚血で評価できる。実験はウサギで行い、１日１回の用量１６０ｍｃｇ／Ｋｇの［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１、又は同量の賦形剤のみを１〜５日間、静脈内投与した。イソプレナリンは、１日目及び２日目に皮下投与した。Ｔ波の反転、Ｓ波の拡幅、Ｑ波の突出など、主な虚血性損傷を示す典型的な特徴の心電図（ＥＣＧ）をモニターした。処置動物及び未処置動物のＥＣＧの変化を、以下説明するように０〜６の範囲のポイントで段階評価した。
０、病変無し；１、Ｓ波の突出；２、Ｔ波の突出；３、Ｔ波下降部の低下；４、Ｓ波の拡幅；５、Ｔ波の反転；６、Ｑ波の突出。５日間の試験中のＥＣＧポイントによって定義される曲線下の全面積を、処置動物及び未処置動物について計算した。心電図の特性によって明らかになった結果は、虚血性組織の巨視的観察及び微視的観察によって確認できる。前記検査は、賦形剤のみで処置した動物の心臓組織で観察されるものに関して、重症度は中程度の組織学的変化及び虚血性病変が存在することを示した。
【０１２８】
（例１５）［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１のネオマイシン誘発性強皮症に対する効果の評価
ネオマイシン誘発性強皮症に対する［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１の効果は、Ｙａｍａｍｏｔｏら（前掲）によって記述された動物の強皮症モデルで研究できる。第１のＣ３Ｈマウス群は、３週間毎日皮下注射したブレオマイシン（１００ｍｃｇ／ｍＬ）で処置する。他の３つのＣ３Ｈマウス群に、それぞれ０．１、１及び１０ｍｃｇ／ｍＬのＰｌＧＦ−１ＣＧ変異タンパク質を毎日の注射に添加した以外は上記と同様に処置した。３週間の処置後、動物を屠殺し、処置部位から皮膚試料を採取して組織学的分析に供した。［ＤＩＭ３］ＰｌＧＦ−１処置の効果は、ブレオマイシンに誘発される皮膚の硬化に起因し得るヒドロキシプロリンレベル及び皮膚肥厚といった、組織学的な特異現象の減少を明確に示した。
【図１】
2013503914.tif 000002
【図２】
2013503914.tif 000003
【図３】
2013503914.tif 000004
【図４】
2013503914.tif 000005
【図５】
2013503914.tif 000006
【図６】
2013503914.tif 000007
【図７】
2013503914.tif 000008
【図８】
2013503914.tif 000009
【図９】
2013503914.tif 000010
【図１０】
2013503914.tif 000011
【国際調査報告】
2013503914.tif 000012
2013503914.tif 000013
2013503914.tif 000014