(57)【要約】  本開示は、２−イミノビオチンの水溶解度の向上に関する。特定の態様では、本発明は、前記投与で効果が得られる障害または状態に罹患している哺乳動物への２−イミノビオチンの投与に好適な製剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
約３〜約７のｐＨを有し、かつ約１ｍｇ／ｍｌ以上の２−イミノビオチンおよび約２．５〜約４０％の置換β−シクロデキストリンを含む、２−イミノビオチンの水溶性製剤。
【請求項２】
約４〜約７のｐＨを有し、かつ約２ｍｇ／ｍｌ以上の２−イミノビオチンおよび約２．５〜約２０％の置換β−シクロデキストリンを含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
約４〜約６．５のｐＨを有し、かつ約０．５〜３．５ｍｇ／ｍｌ以上の２−イミノビオチンおよび約５〜約４０、好ましくは約５〜約１０％の置換β−シクロデキストリンを含む、請求項１または２に記載の製剤
【請求項４】
ｐＨ約４を有し、かつ約３．５ｍｇ／ｍｌ以上の２−イミノビオチンおよび約２．５〜約４０％、好ましくは約２．５〜約１０％のＳＢＥ−ＣＤを含む、請求項１または２に記載の製剤。
【請求項５】
約４〜約５のｐＨを有し、かつ約０．５〜約５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約４〜約５ｍｇ／ｍｌの２−イミノビオチンおよび約２．５〜約５％のＳＢＥ−ＣＤを含む、請求項１または２に記載の製剤。
【請求項６】
クエン酸、その脱プロトン化体またはそれらの混合物をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項７】
約３〜約７のｐＨを有し、かつ約１ｍｇ／ｍｌ以上の２−イミノビオチンと、クエン酸、その脱プロトン化体またはそれらの混合物、好ましくは少なくとも２０ｍＭのクエン酸、その脱プロトン化体またはそれらの混合物とを含む、２−イミノビオチンの水溶性製剤。
【請求項８】
新生仔／新生児の周産期仮死の処置に使用される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項９】
前記製剤は前記新生仔／新生児に投与される、請求項７に記載の製剤。
【請求項１０】
前記製剤は分娩の前および／または分娩中に前記新生仔／新生児の母親に投与される、請求項８または９に記載の製剤。
【請求項１１】
前記処置は前記新生仔／新生児への低体温法と組み合わせて実施される、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１２】
出産時の合併症の影響の処置に使用される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１３】
出産時の合併症の影響の処置に使用される、好ましくは周産期仮死を処置するための２−イミノビオチンであって、前記処置は、前記新生仔／新生児への低体温法と組み合わせて実施される、２−イミノビオチン。
【請求項１４】
２−イミノビオチンによる処置に反応する疾患または障害の処置に使用される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１５】
約３〜約６のｐＨを有し、かつ約０．５ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの２−イミノビオチンと、クエン酸、その脱プロトン化体またはそれらの混合物とを含む２−イミノビオチンの水溶性製剤であって、好ましくは前記クエン酸、その脱プロトン化体またはそれらの混合物は約１０ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度で存在する、２−イミノビオチンの水溶性製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、２−イミノビオチンの水溶解度の向上に関する。特定の態様では、本発明は、２−イミノビオチンの投与で効果が得られる障害または状態に罹患している哺乳動物への前記投与に好適な製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
２−イミノビオチンは、新生仔／新生児の周産期仮死（低酸素虚血）の予防および／または処置に使用することができることが報告されている（その全体を本明細書に援用する米国特許第６，８９４，０６９号）。特に、子ブタを対象としたインビボ試験では、２−イミノビオチンは、こうした影響を予防および／または処置する際にアロプリノールまたはデフェロキサミンのいずれより効果的であることが明らかになった。
【０００３】
しかしながら、２−イミノビオチンは生理的ｐＨで低溶解度であるため、その治療薬としての有用性が限られている。当該技術分野において、改良された２−イミノビオチン製剤、およびその溶解度を高める方法が求められている。本開示は、そうした改良を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示の一態様は、約３〜約７のｐＨを有し、かつ約１ｍｇ／ｍｌ以上の２−イミノビオチンまたはその誘導体と、約２．５〜約４０％の置換β−シクロデキストリンとを含む、２−イミノビオチン（２−ＩＢ：２−ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ）またはその誘導体の水溶性製剤を提供する。
【０００５】
いくつかの実施形態では、製剤は、約４〜約７のｐＨを有し、かつ約２ｍｇ／ｍｌ以上の２−イミノビオチンまたはその誘導体と、好ましくはスルホブチル−エーテル−β−シクロデキストリン（ＳＢＥ−ＣＤ：ｓｕｌｆｏｂｕｔｙｌ−ｅｔｈｅｒ−ｂｅｔａ−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）およびヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰ−ＣＤ：ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−ｂｅｔａ−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）から選択される約２．５〜約２０％の置換β−シクロデキストリンとを含む。
【０００６】
いくつかの実施形態では、製剤は、約４〜約５のｐＨを有し、かつ約３．５ｍｇ／ｍｌ以上の２−イミノビオチンと、好ましくはスルホブチル−エーテル−β−シクロデキストリン（ＳＢＥ−ＣＤ）およびヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰ−ＣＤ）から選択される約２．５〜約４０、好ましくは約５〜約１０％の置換β−シクロデキストリンとを含む
【０００７】
いくつかの実施形態では、製剤は、約４〜約５のｐＨを有し、かつ約３〜約５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約４〜約５ｍｇ／ｍｌの２−イミノビオチンと、好ましくはスルホブチル−エーテル−β−シクロデキストリン（ＳＢＥ−ＣＤ）およびヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰ−ＣＤ）から選択される約２．５〜約５％の置換β−シクロデキストリンとを含む。
【０００８】
好ましくは、製剤は、溶解促進剤としてクエン酸またはその脱プロトン化体（シトレート）をさらに含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、ｐＨ約５を有し、かつ約３ｍｇ／ｍｌ以上の２−イミノビオチンおよび約３〜約４０％、好ましくは約５％のＳＢＥ−ＣＤを含む、２−イミノビオチンまたはその誘導体の可溶性製剤を提供する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ｐＨ約４を有し、かつ約３ｍｇ／ｍｌ以上の２−イミノビオチンおよび約５〜約４０％のＨＰ−ＣＤを含む、２−イミノビオチンまたはその誘導体の可溶性製剤を提供する。好ましくは製剤は、約５〜約２０％のＨＰ−ＣＤを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、製剤は、等張化剤としてＮａＣｌを好ましくは０．１〜２％、一層好ましくは０．５〜０．８％さらに含む。
【００１２】
本開示の本発明のさらなる態様は、約３〜約７のｐＨを有し、かつ約０，７５ｍｇ／ｍｌ以上の２−イミノビオチンと、クエン酸、その脱プロトン化体またはそれらの混合物とを含む、２−イミノビオチン（２−ＩＢ）またはその誘導体の水溶性製剤を提供する。驚いたことに、２−ＩＢは、クエン酸緩衝液に対してより高い溶解度を有することが明らかになった。本明細書で使用する場合、クエン酸緩衝液とは、クエン酸、その脱プロトン化体またはそれらの混合物をいい、たとえば、クエン酸ナトリウム脱水物の水溶液を含む。
【００１３】
好ましくは、前記製剤は、約３〜約７のｐＨ、好ましくは約３〜約６のｐＨ、一層好ましくは約３．５〜約４．５のｐＨ、なお一層好ましくは約ｐＨ４を有し、かつ約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの２−イミノビオチン、一層好ましくは約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、なお一層好ましくは約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの２−イミノビオチンと、クエン酸、その脱プロトン化体またはそれらの混合物とを含む。好ましくは、製剤は、約１〜約４０、約５〜約３０、好ましくは約１０〜約２０、一層好ましくは約１２．５〜約１７．５ｍＭ、なお一層好ましくは約１５ｍＭのクエン酸、その脱プロトン化体またはそれらの混合物を含む。所望のｐＨレベルを得るため緩衝液の量を調整してもよいことは、当業者には明らかである。好ましくは、前記製剤は、等張化剤として０．１〜２％、一層好ましくは０．５〜１．５％のＮａＣｌを含む。例示的な製剤は、約０．９％ＮａＣｌの濃度を有する。
【００１４】
好ましくは、製剤は、ヒト新生児への投与に好適である。好ましくは、２−イミノビオチンまたはその誘導体は５℃で少なくとも３日間可溶性を維持する。いくつかの実施形態では、２−イミノビオチンまたはその誘導体は５℃で少なくとも０．５年間、１年間、１．５年間、２年間または３年間可溶性を維持する。
【００１５】
本開示の別の態様は、好ましくは新生仔／新生児の周産期仮死またはそのリスクの処置のため、出産時の合併症の影響の処置に使用される本明細書に記載するような２−イミノビオチンまたはその誘導体、製剤を提供する。いくつかの実施形態では、製剤を新生仔／新生児に投与する。いくつかの実施形態では、分娩の前および／または分娩中に製剤を新生仔／新生児の母親に投与する。
【００１６】
本開示の別の態様は、出産時の合併症の影響の処置に使用され、好ましくは周産期仮死またはそのリスクを処置するための２−イミノビオチンまたはその誘導体の使用であって、処置を新生仔／新生児への低体温法と組み合わせて実施する、使用を提供する。
【００１７】
本開示のさらなる態様は、新生仔／新生児の出産時の合併症の影響を処置する方法であって、それを必要とする新生仔／新生児に治療有効量の本明細書に記載の製剤を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、製剤を分娩の前および／または分娩中に製剤の投与を必要とする新生仔／新生児の母親にも投与するか、あるいは、代わりに製剤の投与を必要とする新生仔／新生児の母親に投与する。好ましくは、合併症は周産期仮死またはそのリスクである。
【００１８】
本開示のさらなる態様は、新生仔／新生児の出産時の合併症の影響を処置する方法であって、それを必要とする新生仔／新生児に治療有効量の２−イミノビオチンまたはその誘導体を投与すること、および新生仔／新生児に低体温法を実施することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、分娩の前および／または分娩中に、２−イミノビオチンまたはその誘導体の投与を必要とする新生仔／新生児の母親にも２−イミノビオチンまたはその誘導体を投与するか、あるいは、代わりに２−イミノビオチンまたはその誘導体を投与を必要とする新生仔／新生児の母親に投与する。好ましくは、合併症は周産期仮死またはそのリスクである。好ましくは、２−イミノビオチンまたはその誘導体は、本明細書に記載するような製剤中にある。
【００１９】
本開示のさらなる態様は、出産時の合併症の影響を処置するための、本明細書に記載するような製剤を用いた薬物の製造のための、２−イミノビオチンまたはその誘導体の使用を提供する。いくつかの実施形態では、処置を新生仔／新生児への低体温法と組み合わせて実施する。好ましくは、合併症は周産期仮死である。また、２−イミノビオチンによる処置に反応する疾患または障害の処置に使用される製剤も提供する。
【００２０】
本開示のさらなる態様は、本明細書に記載の製剤を調製する方法であって、β−シクロデキストリンを含む水溶液に２−イミノビオチンまたはその誘導体を溶解させ、続いて溶液のｐＨを調整して２−イミノビオチンまたはその誘導体の溶液を得るステップを含む方法を提供する。好ましくは、２−イミノビオチン溶液のｐＨはクエン酸を用いて調製する。好ましくは、ｐＨは約３〜約７に調整する。好ましくは、水溶液はｐＨ４〜６．６である。好ましくは、β−シクロデキストリンはＳＢＥ−ＣＤである。好ましくは、水溶液はＮａＣｌを含む。好ましくは、水溶液はクエン酸またはその脱プロトン化体を含む。
【００２１】
好ましくは、２−ＩＢ誘導体は２−イミノビオチンカルボキシ誘導体である。好ましくは、２−イミノビオチンカルボキシ誘導体は、２−イミノビオチンヒドラジドおよび／または２−イミノビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。好ましくは、本明細書に記載の製剤は、２−ＩＢを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】１０％ＳＢＥ−ＣＤを用いたあるいは用いない２−ＩＢの様々なｐＨでの溶解度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
２−イミノビオチン（２−ＩＢ）は水溶性が低く、したがって投与用水溶液として製剤化しにくい（比較例を参照）。本開示により、２−ＩＢをクエン酸／クエン酸塩緩衝液および／または置換β−シクロデキストリンに加えることにより水溶液として製剤化できるのに十分に、２−ＩＢの水溶解度を高め得ることが明らかになった。本明細書において「不溶性」および「難溶性」という用語は、水溶性の点で薬剤を特徴付けるために使用される。本明細書で使用する場合、不溶性とは、０．１ｍｇ／ｍｌ未満の溶解度をいい、難溶性とは、０．１〜１ｍｇ／ｍｌの範囲の溶解度をいう。
【００２４】
２−ＩＢの溶解度はｐＨ依存性である。２−ＩＢの水に対する溶解度はｐＨ７．４で約０．３４ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５で約０．５９ｍｇ／ｍｌ、およびｐＨ３．５で約４．５ｍｇ／ｍｌである。低ｐＨ溶液を筋肉内投与すると、被検体に疼痛を引き起こす可能性があり（ルクウィード（Ｒｕｋｗｉｅｄ）Ｒ．、「ジャーナル・オブ・ペイン（Ｊ  Ｐａｉｎ）」２００７年５月；８（５）：ｐ．４４３−５１）、持続点滴静注として投与すると、代謝性アシドーシスを起こす恐れがある（フェーダーマン（Ｆｅｄｅｒｍａｎ）ＭＤ、「クリニカル・ニューロファーマコロジー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」２００９年１１月−１２月；３２（６）：ｐ．３４０−１）ため、本開示の１つの目的は、治療現場での投与に好適なｐＨおよび２−ＩＢ濃度を有する２−ＩＢ製剤を提供することである。
【００２５】
たとえば、仮死または低酸素に関連する状態の処置では、効果を発揮するには一定の期間以内に治療有効量の薬剤を投与する必要がある。従来技術に存在する製剤の場合、２−ＩＢの低溶解度のため、かなりの量の２−ＩＢ溶液を投与する必要がある。投与に必要とされる溶液の量が多くなるほど、体内で治療有効濃度に到達するまでの時間が長くなる。新生仔／新生児の処置など一部の用途では、治療域内の投与に必要とされる溶液の量が限定要因となっている。典型的には、正期産仮死仔／仮死児に静脈内投与するのに安全と考えられる液体の最大量は、５０ｍｌ／ｋｇ／日である。２−ＩＢの溶解度を高めることにより、薬剤をより迅速かつ少量で投与することができる。
【００２６】
２−ＩＢ製剤は、最も望ましくは長期にわたり、好ましくは数年間安定であるべきである。さらに、製剤は、５℃など低温保存された場合、沈殿すべきではない。
【００２７】
様々な溶媒、共溶媒、界面活性剤、シクロデキストリンおよび他の賦形剤を用いて様々な薬剤製剤の製造を行った。２−ＩＢの溶解度は低いか、あるいは、製剤は毒性であった（比較可能な実施例を参照）。驚いたことに、１％を超える置換β−シクロデキストリン、特に２．５％以上の置換β−シクロデキストリン、および／またはクエン酸緩衝液を用いて２−ＩＢを製剤化したところ、好適なｐＨレベルで高溶解度を有する溶液が得られた。
【００２８】
本明細書に記載の製剤は、２−ＩＢ（Ｃ１０Ｈ１７Ｎ３Ｏ２Ｓ）および２−ＩＢ誘導体の医薬品溶液を調製するのに好適である。２−ＩＢ誘導体として、２−イミノビオチンカルボキシ誘導体がある。２−イミノビオチンカルボキシ誘導体は、ｉＮＯＳの阻害剤であることが示されており、２−ＩＢの遊離カルボキシル基が、ｉＮＯＳの阻害に必要のないことが示唆される（サップ（Ｓｕｐ）ＳＪら「バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）」１９９４年２０４：ｐ．９６２−９６８）。好ましくは、２−イミノビオチンカルボキシ誘導体は２−イミノビオチンヒドラジドおよび／または２−イミノビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。好ましくは、本明細書に記載の製剤は２−ＩＢを含む。
【００２９】
シクロデキストリン類は構造および特性が異なる。たとえば、置換および非置換のα−、β−およびγ−シクロデキストリンによって疎水性空洞の大きさ（たとえば直径および深さ）、および機能性（たとえば疎水性、電荷、反応性および水素結合能）が異なる。「シクロデキストリン」という用語は、環状α結合したＤ−グルコピラノース単位を含む化合物をいう。α−シクロデキストリンとは、環状に結合した６個のＤ−グルコピラノース単位を有するシクロデキストリンをいい、β−シクロデキストリンは、環状に結合した７個のＤ−グルコピラノース単位を有し、γ−シクロデキストリンは環状に結合した８個のＤ−グルコピラノース単位を有する。これらの環状に結合したＤ−グルコピラノース単位は疎水性空洞を規定し、シクロデキストリンは、固体状態あるいは水溶液の状態で他の有機分子、塩、およびハロゲンと包接化合物を形成することが知られている。典型的には、製剤に選択されるシクロデキストリンは、標的成分および製剤の他の成分に好適な大きさおよび機能性を有する。残念ながら、シクロデキストリンとの複合体形成が不可能であるか、あるいは、明確な利点が得られない薬剤が多くある（Ｊ．スゼジトリ（Ｓｚｅｊｔｌｉ）、「薬剤製剤におけるシクロデキストリン（Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ）：パート（Ｐａｒｔ）ＩＩ」、ファーマシューティカル・テクノロジー（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｐ．２４−３８、１９９１年８月）。
【００３０】
置換シクロデキストリンは、側鎖としてどのような有機部分、またはヘテロ有機部分を含んでもよい。好ましいシクロデキストリンとして、アルキル化、ヒドロキシアルキル化、または反応してスルホアルキルエーテルを形成した置換β−シクロデキストリンが挙げられる。好ましいβ−シクロデキストリンとしては、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、たとえば、（Ｓ）−２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、２−Ｏ−［（Ｓ）−２’−ヒドロキシルプロピル］−β−シクロデキストリン、２−Ｏ−［（Ｒ）−２’−ヒドロキシルプロピル］−β−シクロデキストリン、６−Ｏ−［（Ｓ）−２’−ヒドロキシルプロピル］−β−シクロデキストリン、２−Ｏ−［（Ｒ）−２’，３’−ヒドロキシルプロピル］−β−シクロデキストリン；ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン；カルボキシメチル−β−シクロデキストリン；カルボキシメチル−エチル−β−シクロデキストリン；ジエチル−β−シクロデキストリン；ジメチル−β−シクロデキストリン；グルコシル−β−シクロデキストリン；ヒドロキシブテニル−β−シクロデキストリン；マルトシル−β−シクロデキストリン；およびスルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンが挙げられる。本製剤および方法では、たとえば、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンおよびスルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンなどの置換β−シクロデキストリンが、製剤の他の成分を補完する大きさおよび機能性を有すると考えられる。一層好ましくは、シクロデキストリンは、スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリン（「ＳＢＥ−ＣＤ」）である。
【００３１】
２−ＩＢ製剤で２種の置換β−シクロデキストリンを試験した。どちらも２−ＩＢの溶解度を著しく高めた（実施例を参照）。スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリン（ＳＢＥ−ＣＤ）は、ブチルエーテルスペーサー基、またはスルホブチルエーテルにより疎水性空洞から引き離されたスルホン酸ナトリウム塩を含む市販されているポリアニオン性β−シクロデキストリン誘導体である（Ｃａｐｔｉｓｏｌ（商標）は、サイデックスインク（ＣｙＤｅｘ  Ｉｎｃ．）から入手可能なヘプタ置換スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンの商標名である）。ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰ−ＣＤ）は、ロケッテ・ファルマ（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ  Ｐｈａｒｍａ）Ｓ．Ａ．から入手可能でＫｌｅｐｔｏｓｅ（商標）として市販されているβ−シクロデキストリン誘導体である。シクロデキストリンは、その内容を本明細書に援用する米国特許第５，１３４，１２７号および同第５，３７６，６４５号に詳述されている。
【００３２】
本明細書に開示された２−ＩＢ製剤は、水の添加時に再構成して水性製剤を形成する、２−ＩＢと置換β−シクロデキストリンとの乾燥した物理的混合物、またはその乾燥した包接複合体から形成されてもよい。あるいは、水性製剤は凍結乾燥し、その後水で再構成してもよい。
【００３３】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示された２−ＩＢ製剤は水溶液の形態であり、ｐＨを約４〜約７の範囲内に調節するための酸緩衝液を含む。本明細書で使用するのに好適な酸緩衝液の例は、たとえば塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素酸および同種のものなどの酸、ならびにシュウ酸、マレイン酸、フマル酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、酢酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、エタンスルホン酸および同種のものなどの有機酸が挙げられる。上記の酸の酸性塩を利用してもよい。好ましくは、製剤は、所望のｐＨに達するのに十分なクエン酸および／もしくはクエン酸ナトリウム、または他のシトレート塩を含む。いくつかの実施形態では、製剤は、１〜２５ｍＭのクエン酸を含む。いくつかの実施形態では製剤は、０．１〜５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、少なくとも２０ｍＭのクエン酸／シトレートを含む。好ましくは、製剤は、約１〜約４０ｍＭ、約５〜約３０ｍＭ、好ましくは約１０〜約２０ｍＭ、一層好ましくは約１２．５〜約１７．５ｍＭのクエン酸、その脱プロトン化体またはそれらの混合物を含む。好ましくは製剤は、約１５ｍＭのクエン酸、その脱プロトン化体またはそれらの混合物を含む。
【００３４】
本明細書に開示された２−ＩＢ製剤は、以下の通り調製してもよい：クエン酸または他の酸緩衝液を注射用蒸留水に溶解させる。置換β−シクロデキストリン（好ましくはＳＢＥ−ＣＤ）を使用する場合、酸緩衝液水溶液に溶解させる。次いでこの溶液に２−ＩＢを溶解させる。あるいは、置換β−シクロデキストリン（好ましくは  ＳＢＥ−ＣＤ）を使用する場合、水溶液に溶解させ、次いでこの溶液に２−ＩＢを溶解させる。ｐＨを約３〜約６の範囲内に調節する。
【００３５】
製剤は、好ましくは無菌およびパイロジェンフリーとして使用されるように調製し、包装する。たとえば、得られた溶液は、たとえば、０．２２ミクロンのメンブランフィルターで無菌濾過し、無菌バイアルに充填してもよい。バイアルに栓をし、密閉し、最後に滅菌してもよい。溶液はまた、アンプル、シリンジ、点滴バッグまたは他のディスペンサーに入れてもよい。好ましくは、製剤は、１回の服用単位で提供する。溶液は、２−ＩＢの安定性に影響を与えることなくオートクレーブしてもよい（表２４）。
【００３６】
また、等張剤、たとえば、糖、塩化ナトリウムおよび同種のものを含めると望ましい場合がある。吸収を遅延させる作用物質、たとえば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することにより、注射用医薬品形態の吸収を持続化させることができる。
【００３７】
小児投与向けの２−ＩＢ製剤は、好ましくは禁忌の賦形剤（たとえば、乳酸、ドクサートナトリウム、プロピレングリコール等）を含まない。好ましくは、小児投与用の製剤はさらに、ベンジルアルコール、没食子酸プロプリ、ポリソルベート２０、４０もしくは６０、安息香酸ナトリウム、チメロサール、ピーナッツ油またはホウ酸を含まない。好適な追加の作用物質を選択することは、当業者の範囲内である。
【００３８】
好ましくは、２−ＩＢ製剤は等張である。いくつかの実施形態では、２−ＩＢ製剤はさらにＮａＣｌを、好ましくは０．１〜０．９％、一層好ましくは０．２〜０．９％含む。いくつかの実施形態では、２−ＩＢ製剤はさらにグルコース、ラクトースまたはマンニトールなどの糖を、好ましくは１〜５％、一層好ましくは２〜５％含む。好ましくは糖は、特に小児製剤の場合、グルコースである。製剤は、製剤が等張となる量でＮａＣｌと糖との組み合わせをさらに含んでもよい。
【００３９】
本開示は、好ましくは非経口投与のための２−ＩＢの溶液および剤形を提供する。本明細書で使用する場合、非経口投与とは、以下に限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄膜内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、髄腔内および胸骨内の注射および注入などの投与モードをいう。好ましくは、製剤を静脈内投与する。
【００４０】
製剤は、バイアル、アンプル、シリンジ、点滴バッグまたは他のディスペンサーに入れてもよい。製剤は、被検体に直接投与しても、またはさらに希釈してもよい。提供される製剤の服用量の濃縮物は、希釈直後、または必要に応じて希釈から最大２４時間など標準的な処置間隔に利用される一定量の製剤を収容する密閉容器に入れておいてもよい。静脈内投与用の溶液は、たとえば、服用量の濃縮物製剤を希釈液と組み合わせて所望の投与濃度になるように容器（たとえば、ガラスまたはプラスチックビン、バイアル、アンプル）に加えることにより調製してもよい。
【００４１】
好都合には、水性溶媒を服用量の液体濃縮物に加えて、希釈のため服用量の濃縮物のいくつかのアリコートまたは全含有量を取り出すことにより、単位投与量の液体医薬製剤を形成してもよい。服用量の濃縮物は、好適な水性溶媒を含む点滴（ＩＶ：ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ）容器に加えてもよい。有用な溶媒は、標準的な注射用溶液である（たとえば、５％デキストロース、食塩水、乳酸加リンゲル液または無菌注射用水等）。典型的な単位投与量の点滴バッグは、入口手段および出口手段を有し、標準的な（たとえば、２５ｍＬ、５０ｍＬ、１００ｍＬおよび１５０ｍＬ）容量を持つ従来のガラスまたはプラスチック容器である。
【００４２】
他の実施形態では、製剤を使用まで遮光するため提供される剤形を容器に包装するとが望ましい場合がある。いくつかの実施形態では、こうした遮光容器を使用すると、１つまたは複数の分解経路を阻害することができる。たとえば、バイアルは、内容物に光が当たるのを防ぐ軽量容器であってもよい。それに加えて、および／または、その代わりに、製剤に光が当たるのを防ぐ任意の種類の容器でバイアルを包装してもよい（たとえば、バイアルの２次包装）。同様に、任意の他の種類の容器も遮光容器であっても、または遮光容器内に包装してもよい。
【００４３】
製剤は、任意の脊椎動物を含む被検体、好ましくは哺乳動物、一層好ましくはヒトに投与してもよい。被検体の例として、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯動物、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、雌ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、トリおよび魚が挙げられる。
【００４４】
いくつかの実施形態では、２−ＩＢ製剤は生まれたばかりの子供、特に出産時に合併症、特に低酸素虚血をきたし得る周産期仮死に罹患する、罹患すると予想される、または、そうでなければ出産時に合併症のリスク、特に低酸素虚血をきたし得る周産期仮死のリスクがあると判断される新生仔／新生児への投与に好適である。また、周産期仮死は出産のかなり前または後に起こることもあり、やはり本明細書に記載の２−ＩＢ製剤による処置に好適である。「生まれたばかりの子供」および「新生仔／新生児」という用語は、自然分娩により生まれた子供のほか、たとえば帝王切開により出産された子供を含み、さらに未熟児で生まれた、および／または、人工分娩で生まれた子供を含む。
【００４５】
いくつかの実施形態では、２−ＩＢ製剤は、新生児仮死仔／仮死児が生まれる場合、胎仔／胎児の母親への投与に好適である。母親という用語は、自然分娩の母親、授精を受けた母親、人工分娩の母親および保因者の母親を含む、胎仔／胎児または生まれたばかりの子供の母親をいう。
【００４６】
通常、２−ＩＢ製剤による新生仔／新生児の処置は、出産後あまり時間をおかずに、たとえば治療介入の「ウィンドウ」期に行われる。通常、このウィンドウは、出産後１日目、特に出産後最初の０〜２４時間の範囲である。しかしながら、仮死の子供が生まれる可能性がある場合、処置は、予想される分娩の前、特に分娩の約０〜２４時間前に母親に行ってもよい。
【００４７】
こうした処置の一部として、２−ＩＢ製剤は一般に、１つまたは複数の薬学的有効量、および特に上記の影響の予防および／または処置に効果的な１つまたは複数の量で新生仔／新生児に投与する。こうした処置は、単回投与のみしか含まなくてもよいが、通常、好ましくはたとえば投与レジメンまたは処置レジメンの一部として、または投与レジメンまたは処置レジメンに従い数時間または数日にわたる複数回投与を含んでもよい。こうした処置レジメンは、たとえば、以下の通りである：最初の２４時間に本物質を４時間毎に静脈内注射する。
【００４８】
通常、新生仔／新生児に投与される２−ＩＢの量は、１日に体重１ｋｇ当たり０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは０．１〜２５ｍｇ／ｋｇ／日、一層好ましくは１．８〜１２ｍｇ／ｋｇ／日である。これらの量は活性成分をいい、キャリアまたはアジュバント材料、たとえば糖質、脂質もしくはタンパク質または同種のものを含まない。これらの量は、単回投与もしくは複数回投与として投与しても、あるいは、たとえば持続注入により一定期間にわたり本質的に連続的に投与してもよい。好ましくは、２−ＩＢは３〜６回／日投与する。好ましくは、２−ＩＢは、０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０５〜０．７５ｍｇ／ｋｇ、一層好ましくは０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇの用量でヒト新生児に投与する。例示的な用量は、０．０７５ｍｇ／ｋｇ、０．４５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１５ｍｇ／ｋｇである。
【００４９】
処置は、仮死後最大２４時間、４８時間または７２時間、または、そうでない場合、新生仔／新生児が上述の影響のリスクがもはやないと判断されるまで継続してもよい。一方、処置、特に予防処置は、分配の前または分配中に２−ＩＢ製剤を母親に投与することを含んでもよい。製剤は、母親に、たとえば、経口、皮下または静脈内注射により投与してもよい。したがって、投与する量は、胎盤通過性および代謝、肝初回通過効果、ならびに化合物の分布容積に応じて、同じでもまたはより多くてもよい。このため母親に投与する活性成分の量は、たとえば１日に母親の体重の１ｋｇ当たり０．０１〜２５ｍｇの幅があってもよい。
【００５０】
本開示の一態様は、出産の合併症の処置であって、低体温法と組み合わせて２−ＩＢを投与することを含む処置を提供する。低体温法は、脳傷害のいくつかのモデルで治療効果を有することが明らかになっている。たとえば、インビトロ（オニツカ（Ｏｎｉｔｓｕｋａ），Ｍ．ら１９９８年。「中等度低体温法は、実験的虚血による不可逆的神経細胞死からラット海馬ＣＡ１ニューロンを保護する（Ｍｉｌｄ  ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｉａ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｒａｔ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ＣＡ１  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ）」。ニューロサイエンスリサーチ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）３０：ｐ．１−６）と、新生仔／新生児仮死のインビボモデル（デビロン（Ｄｅｂｉｌｌｏｎ），Ｔ．ら２００３年。「周産期仮死後の全身冷却：正期産児のパイロット研究（Ｗｈｏｌｅ−ｂｏｄｙ  ｃｏｏｌｉｎｇ  ａｆｔｅｒ  ｐｅｒｉｎａｔａｌ  ａｓｐｈｙｘｉａ：ａ  ｐｉｌｏｔ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ｔｅｒｍ  ｎｅｏｎａｔｅｓ）」。デベロップメンタル・メディシン・アンド・チャイルド・ニューロロジー（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｃｈｉｌｄ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）４５：ｐ．１７−２３）との両方で低体温法の有益な作用を示す多くの刊行物が存在する。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「低体温法」という用語は、たとえば、受動的または能動的技術により体温を低下させることによって特定の被検体（この場合、新生仔／新生児被検体）を低体温状態にすることをいう。典型的には、低体温状態にすると、被検体の体組織の代謝が低下し、それにより酸素の必要性も低下する。
【００５２】
いくつかの実施形態では、哺乳動物の中核体温を哺乳動物の通常の中核体温より少なくとも１°、２°、３°、４°、５°、６°、７°、８°、９°または１０°低下させる。いくつかの実施形態では、哺乳動物の中核体温を哺乳動物の通常の中核体温より１〜１０°、２〜６°または好ましくは２〜４°低下させる。
【００５３】
好ましい一実施形態では、哺乳動物の温度を約３１°〜約３７℃の温度で維持する。一層好ましくは、哺乳動物の温度を約３２℃〜約３６℃、一層好ましくは約３２℃〜約３５℃、なお一層好ましくは約３３℃〜約３５℃の温度で維持する。
【００５４】
身体の中核温度を低下させることによる低体温の導入は、当該技術分野において公知のどのような方法により行ってもよい。典型的な低体温の誘導手段は、全身冷却または頭部冷却のどちらかを使用する。低体温は、氷／冷水を用いて誘導しても、または機械的冷却装置、たとえば表面冷却するＯｌｙｍｐｉｃ  ＣｏｏｌＣａｐ（商標）システム、および大型の容器に入れたカテーテルを使用した冷却を用いて誘導してもよい。あるいは、低体温は、医薬剤、たとえば、バニロイド受容体アゴニスト、カプサイシノイドまたはカプサイシノイド様アゴニスト（米国特許出願公開第２００９／０１９７９６６号、その内容を本明細書に援用する）、およびＮＴ６９ＬおよびＮＴ７７など血液脳関門を通過できるニューロテンシンアナログ（米国特許第７，３１９，０９０号に記載、その内容を本明細書に援用する）を用いて誘導してもよい。
【００５５】
低体温法および２−ＩＢを同時に与えても、連続的に与えても、または別々に与えてもよい。本明細書で使用する場合、「同時に」は、２−ＩＢを低体温法と同時に与えるという意味で使用するのに対し、「組み合わせて」という用語は、同時でない場合に、２−ＩＢおよび低体温法の両方が治療効果を示す時間枠内で「連続的に」２−ＩＢを与える、すなわち、同じ時間枠内で２−ＩＢおよび低体温法が共に治療的に作用するのに有用であるという意味で使用する。このため、「連続的に」投与は、低体温法の前後５分以内、１０分以内または数時間内に２−ＩＢを投与してもよい。ただし、２−ＩＢの循環半減期は、新生仔／新生児被検体を低体温状態したときに２−ＩＢが治療有効量で存在するような半減期である。
【００５６】
本明細書では「組み合わせて」または「連続的に」とは異なり、「別々に」は、２−ＩＢを投与するのと、新生仔／新生児被検体を低体温法にするのとの間隙が著しい、すなわち新生仔／新生児被検体を低体温状態にしたときに、２−ＩＢが血流中に治療有効量でもはや存在しない場合があるという意味で使用する。
【００５７】
好ましい一実施形態では、２−ＩＢを治療有効量で投与する。
【００５８】
別の好ましい実施形態では、２−ＩＢを治療有効量未満で投与する。言い換えれば、低体温状態の非存在下で投与する場合、所望の治療効果を発揮するのに不十分と考えられる量で２−ＩＢを投与する。なお一層好ましくは、２−ＩＢと低体温法との組み合わせは相乗効果を有する、すなわち、組み合わせに相乗作用がある。
【００５９】
ある実施形態では、低酸素虚血性（ＨＩ：ｈｙｐｏｘｉｃ−ｉｓｃｈｅｍｉｃ）障害後または出生後、少なくとも約６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間または９６時間の期間低体温法を維持する。好ましい一実施形態では、低酸素虚血性（ＨＩ）障害または出生後約６〜約２４時間の期間、好ましくは少なくとも７２時間の期間低体温法を維持する。
【００６０】
好ましくは、本発明の方法による処置は、低酸素虚血性（ＨＩ）障害から約６時間以内、一層好ましくは低酸素虚血性障害の約２時間以内、一層好ましくは１時間以内に開始する。
【００６１】
別の態様では、２−ＩＢを低酸素障害の前に投与する。このため、好ましい一実施形態では、たとえば、分娩の前または分娩中に母親に投与することにより、出生前に母親を介して新生仔／新生児に２−ＩＢを投与する。新生仔／新生児仮死の処置を必要とする哺乳動物の新生仔／新生児仮死を処置する方法であって、（ａ）分娩の前および／または分娩中に治療有効量の２−ＩＢを哺乳動物の母親に投与すること；および（ｂ）出生後に哺乳動物に低体温法を施すことを含む、方法を提供する。
【００６２】
好ましくは、２−ＩＢは出生の最大約４８時間または２４時間前に母親に投与する、次いで出生後、新生仔／新生児を低体温状態にする。いくつかの実施形態では、母親にリスクがあることが分かり次第、あるいは、胎仔／胎児が仮死状態である、または成長遅延を有することが分かり次第、２−ＩＢを母親に投与する。
【００６３】
「約」および「ほぼ」は一般に、測定の性質または精度を踏まえ、測定された量に許容可能な誤差の程度を意味する。典型的には、例示的な誤差の程度は、所定の値または値の範囲の２０パーセント（％）以内、好ましくは１０％以内、一層好ましくは５％以内である。
【００６４】
本明細書で使用する場合、障害または状態を「予防する」治療剤とは、統計学的サンプルにおいて、未処置対照サンプルと比較して処置サンプルの障害または状態の発生を減少させる、あるいは、未処置対照サンプルと比較して障害または状態の１つまたは複数の症状の発現を遅延させる、障害または状態の１つまたは複数の症状の重症度を低下させる化合物をいう。
【００６５】
「処置する」という用語は、予防処置および／または治療処置するを含む。「予防または治療」処置という用語は、当該技術分野で知られており、本組成物の１つまたは複数の宿主への投与を含む。望ましくない状態（たとえば、宿主動物の疾患または他の望ましくない状況）の臨床症状の発現前に本組成物を投与する場合、その処置は、予防処置である（すなわち、処置により宿主に、望ましくない状態が発症しないようにする）のに対し、望ましくない状態の発現後に本組成物を投与する場合、処置は治療処置である（すなわち、処置は、すでに存在する望ましくない状態またはその副作用を減弱させる、軽減する、または安定化する）。
【実施例】
【００６６】
２−ＩＢは、酸性のカルボン酸基、および塩基性のアミノ基の両方を有する。ＰｒｏｌｏｇＰ計算ソフトウェアを用いて計算したこれらの基のｐＫａは、カルボン酸基が４．７８、およびアミノ基が１１．４８である。２−ＩＢには酸性基および塩基性基が存在するため、２−ＩＢは、中性ｐＨ範囲で両性イオンの挙動を示す。このため、２−ＩＢの水溶性は強くｐＨに依存しており、中性ｐＨ状態で計算される３５ｇ／ｌという値よりかなり低い（表１を参照）。２−ＩＢの両性イオン性に基づき、好適な製剤を開発することが難しい。以下の比較例は、２−ＩＢのＩＶ投与に好適な製剤を開発するいくつかの試みを明らかにする。
【００６７】
比較例１；溶媒の選択
以下の溶媒を用いて２−ＩＢの溶解度を判定した：
−０．９％塩化ナトリウム水溶液
−５％デキストロース水溶液
−Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
−Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
−ジメチルスルホキシド
−エタノール
−プロポリエングリコール
−ポリエチレングリコール４００
−トウモロコシ油
ほぼ１０ｍｇの２−ＩＢを１０ｍｌチューブに秤量した。続いて、それぞれの溶媒をアリコートに分けて（１００μｌ−１００μｌ−２００μｌ−４００μｌ−８００μｌ−１６００μｌ−３２００μｌ）段階的に加えた。それぞれの添加後、溶液を激しく混合し、溶解度を目視で判定した。溶媒の最終量はすべて６４００μｌ（１．６ｍｇ／ｍｌ）であった。
【００６８】
すべての実験において、６４００μｌの溶媒の添加後、大量の不溶解の２−ＩＢが残存したことから、２−ＩＢは、これらの溶媒のいずれにも十分な可溶性がないことが示唆される。１Ｎの塩酸１００μｌの添加後、２−ＩＢは、全溶媒に十分に溶解した。このことから、２−ＩＢの両性イオンの挙動、およびｐＨの溶解度に対する強い影響がさらに説明される。目視では、プロピレングリコールに溶解した２−ＩＢの割合が最も高かった。したがってプロピレングリコールの実験を繰り返したが、２００μｌのプロピレングリコールの後に１Ｎの塩酸１００μｌを添加した（すなわち１０ｍｇの２−ＩＢ＋２００μｌのプロピレングリコール＋１Ｎの塩酸１００μｌ）。この結果、２−ＩＢの３３ｍｇ／ｍｌの溶液は十分に溶解し、安定であった。この製剤に水を添加したところ、直ちに２−ＩＢの沈殿が生じたことから、これがＩＶ製剤の実行可能な手段ではないことが説明される。
【００６９】
試験したすべての溶媒は、２−ＩＢを十分に可溶化するのに酸の添加を必要としたことから、５％デキストロース水溶液を継続することを決定した。他の溶媒はＩＶ導入時の生体適合性が明らかにかなり低かったか、または塩析作用（０．９％塩化ナトリウム水溶液）のリスクがより高いためである。５％デキストロースを用いて酸性化２−ＩＢ製剤を調製すると、１〜５ｍｇ／ｍｌの範囲の２−ＩＢの酸性化後のｐＨは、設定濃度でほぼ２である。０．１％水酸化ナトリウムでｐＨ３〜３．５まで（設定濃度に応じて）部分的に中和することができるが、最終的には、まず非常に微細な「毛髪」に似た針状の２−ＩＢの沈殿が生じ、これがより大きな凝集物に成長する。目視観察に基づき、ｐＨ７でほぼすべての２−ＩＢが溶液から沈殿した。
【００７０】
比較例２；界面活性剤
以下の界面活性剤についてその溶解度を高める作用を試験した：
−ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（カチオン性界面活性剤、１％）
−ポリオキシエチレン（４０）ステアレート（非イオン界面活性剤、１％、０．１％および０．０１％）
−ポリソルベート８０（非イオン界面活性剤、１％）
−硫酸ドデシルナトリウム（アニオン性界面活性剤、１％、０．１％、０．０１％）
５％デキストロースを用いて界面活性剤の原液を調製した。使用した試験手順は、比較例１に記載されているように、それぞれの界面活性剤溶液を少量の２−ＩＢ（１０ｍｇ）に段階的に添加するものであった。２−ＩＢは、酸の添加なしでは設定濃度１．６ｍｇ／ｍｌで界面活性剤溶液のいずれにも溶解しなかった。酸の添加後、２−ＩＢは、十分に溶解したが、その後０．１Ｎの水酸化ナトリウムで（部分的に）中和した後、２−ＩＢは、界面活性剤を用いない実験で観察されたのとちょうど同じように再び沈殿した。このことから、界面活性剤は、２−ＩＢの溶解度を高めず（低ｐＨであっても）、したがって添加が製剤に対して有用でないと結論される。
【００７１】
表１は、様々な製剤中の２−ＩＢの溶解度の複数の例を示す。過剰の２−ｌＢを溶媒／界面活性剤溶液に加え、室温で混合し、次いで濾過して非可溶化２−ｌＢを除去した。次いでこれらの溶液をＲＰ−ＨＰＬＣにより解析して２−ｌＢの可溶化含有量を判定した。
【００７２】
【表１】
2013527200.tif 000002
【００７３】
比較例３；シクロデキストリン
５％デキストロース溶液中の１％濃度で以下のシクロデキストリンをすべて試験した：
−α−シクロデキストリン
−β−シクロデキストリン
−ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン
−（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリン
−（２−ヒドロキシプロピル）−γ−シクロデキストリン
界面活性剤と同様に、実験のいずれにおいても溶解度の上昇は観察されず、低ｐＨでも同様であった。
【００７４】
比較例４；新規な賦形剤
最後に２種の新規な賦形剤Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬおよびＳｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ  １５を試験した。これらの賦形剤の原液を、５％デキストロースを用いて１０％の濃度で調製し、次いで段階的溶解法を実施した。Ｓｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ  １５を用いて最良の結果が得られ（塩酸の添加後）、したがって次のステップは、Ｓｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ  １５の濃度を最適化した。
【００７５】
製剤の濃度ほぼ５ｍｇ／ｍｌでＳｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ  １５の５つの濃度、５％−１０％−１５％−２０％−２５％を試験した（表２）。２−ＩＢの最適な溶解度は、２０％Ｓｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ  １５で観察されるが、２−ＩＢを完全に溶解させるには、やはり非常に酸性（ｐＨ＜２）の最初の溶液を必要とした。しかしながら、その後水酸化ナトリウムで部分的に中和すると、デキストロース中の２−ＩＢの製剤で観察された場合より、高いｐＨでかなり少量の２−ＩＢの沈殿が生じた。一定範囲の２−ＩＢ製剤を調製し、４８時間保存し、２−ＩＢの含有量を測定した。
【００７６】
【表２】
2013527200.tif 000003
【００７７】
本計画中に実施した研究に基づき、２０％Ｓｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ  １５および５％デキストロース水溶液からなるビヒクルを２−ＩＢ製剤の調製に最適なビヒクルとして選択した。２−ＩＢの両性イオン性のため、この製剤は、比較的低ｐＨ（すなわち＜３．５〜３．６）でのみ調製することができた。
【００７８】
比較例５；Ｓｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ  １５の毒性研究
ウィスター系ラットの持続点滴静注による予備的毒性研究。
群Ｉ：ビヒクル２０％Ｓｏｌｕｔｏｌ（持続点滴静注）
各動物に４ｍＬ／ｋｇ／ｈの投与用量で２４時間ビヒクル（２０％Ｓｏｌｕｔｏｌを含む５％デキストロース）の持続注入を行った。
【００７９】
死亡は起こらず、体重は正常であった。猫背の姿勢および立毛が、注入の開始からほぼ１２時間以降からすべての動物で確認された。剖検を行ってＳｏｌｕｔｏｌ処置の任意の肉眼的影響を調査した。剖検での肉眼的所見は、全身および体腔の黄変（２／４）、大静脈におけるわずかなフィブリンに似たコーティング（４／４）、顕著な肝小葉のパターン（１／４）、肝臓の萎縮（１／４）、および骨盤腎の拡張（１／４）からなっていた。
【００８０】
群ＩＩ：ビヒクル５％Ｓｏｌｕｔｏｌ（持続点滴静注）
動物に４ｍＬ／ｋｇ／ｈの投与用量でほぼ９６時間ビヒクル（５％Ｓｏｌｕｔｏｌを含む５％デキストロース）のみの持続注入を行った。
【００８１】
死亡が起こらず、一定した臨床徴候も観察されず、体重は正常であった。処置の終了時にアラニンアミノトランスフェラーゼ（２／３）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（２／３）およびビリルビン（２／３）の中程度からかなりの程度の増加、およびアルカリホスファターゼ（３／３）およびグルコース（３／３）の若干の増加が認められた。血漿の黄変が２匹の動物で観察された。
【００８２】
群ＩＩＩ：５％Ｓｏｌｕｔｏｌに溶かした２−ＩＢの９６０ｍｇ／ｋｇ／２４ｈ（持続点滴静注）。
動物に５％Ｓｏｌｕｔｏｌ／５％デキストロースを用いて持続注入を行った（４ｍＬ／ｋｇ／ｈの投与用量で１０ｍｇ／ｍＬの用量濃度）（デキストロースおよび食塩水の最終濃度は低張性であり、それぞれほぼ２．５％および０．４５％であった）。有害な臨床効果、および注入系における製剤の問題（ポンプのアラームから、注入系がおそらく回り継手で閉塞されたことが示唆された）のため、注入は４６時間後に終了した。
【００８３】
一匹の動物が注入から４６時間後に死亡した。２匹の動物で体重が増加した。すべての動物で処置の２〜３日目に猫背の姿勢、立毛および蒼白が観察された。処置の終了時にアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（１／２）、アルカリホスファターゼ（１／２）およびグルコース（２／２）の軽度から中等度の増加、ならびにクレアチニンおよび尿の高値（１／２）が認められた。ビリルビンレベルは正常範囲内であった。
【００８４】
剖検での肉眼的所見は、浮腫（２／３）、骨盤腎の拡張（２／３）、肝腫大（１／３）、腸骨リンパ節腫大（１／３）、肺の暗斑（１／３）、および大腿静脈内または大腿静脈周囲のフィブリンに似たコーティングからなっていた。組織の黄変は認められなかった。
【００８５】
これらの結果に基づき、５〜２０％Ｓｏｌｕｔｏｌにおいて２−ＩＢの溶解特性の改善が認められたものの、適用した投与用量および速度では、このビヒクルはラットの持続点滴静注に好適ではないと結論された。
【００８６】
比較例６；ｐＨ
様々な酸を用いて２−ＩＢ（５ｍｇ／ｍｌ）の溶解度を試験した。溶解度は、ＨＣｌを用いたｐＨ３．０と比較して弱酸（酢酸およびクエン酸）を用いた比較的高いｐＨ（ｐＨ３．３）で達成された。この相違はおそらく、ｐＨ調節と、２−ＩＢおよび弱酸のカルボキシル基の間の水素結合の形成との相乗効果による。
【００８７】
比較例７；クエン酸塩緩衝液
過剰の２−ｌＢをクエン酸塩緩衝液に加え、室温で混合し、次いで濾過して非可溶化２−ｌＢを除去した。次いでこれらの溶液をＲＰ−ＨＰＬＣにより解析して２−ｌＢの可溶化量を判定した（表３）。一定範囲のｐＨの５０ｍＭのクエン酸塩緩衝液における２−ｌＢの溶解度は、ｐＨ３．０（室温）で１１ｍｇ／ｍｌであると判定された。ｐＨ３．５では２−ｌＢの量のほぼ半分が可溶化する。
【００８８】
【表３】
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【実施例１】
【００８９】
前の実験ではシクロデキストリンが著しく２−ＩＢの溶解度を高めないことが明らかになったが、より高濃度のシクロデキストリンを用いて実験を繰り返した。驚いたことに、１％シクロデキストリンを使用した場合の結果とは異なり、より高濃度のシクロデキストリンが２−ＩＢの溶解度を高めることが明らかになった。シクロデキストリン溶液に過剰の２−ｌＢを加え、室温で３日間混合し、次いで濾過して包接されない／非可溶化２−ｌＢを除去した。次いでこれらの溶液をＲＰ−ＨＰＬＣにより解析して２−ｌＢの可溶化量を判定した（表１３を参照）。４０％ＳＢＥ−ＣＤ、および最終的な製剤ｐＨを５．１とした５０ｍＭのシトレートｐＨ４．０に、ほぼ１４ｍｇ／ｍｌの２−ｌＢが溶解された／包接された。４０％ＳＢＥ−ＣＤであるが、最終ｐＨを５．５としてクエン酸塩緩衝液ｐＨ５を用いると、ほぼ１０ｍｇ／ｍｌが包接された。４０％ＳＢＥ−ＣＤであるが、最終ｐＨを６．８として水を用いると、ほぼ４．２ｍｇ／ｍｌが溶解された／包接された。この実験の結果から、比較的低ｐＨと、低い開始ｐＨと、５〜２０％シクロデキストリン濃度とを組み合わせて用いると、好適なレベルの２−ｌＢを包接させることができることが明らかになる。
【００９０】
こうした結果から、使用した２種類のシクロデキストリンで２−ＩＢの包接効率に明確な相違があることが示される。水を用いたＳＢＥ−ＣＤ（スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリン）に対する２−ｌＢの溶解度は、４０％ＳＢＥ−ＣＤで４．２ｍｇ／ｍｌの２−ｌＢが包接されることを示し、これは、４０％ＨＰ−ＣＤ（ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）を使用して包接された１．２ｍｇ／ｍｌの２−ｌＢより著しく高い。ＨＰ−ＣＤに対するよりＳＢＥ−ＣＤに対する２−ＩＢの溶解度が高いのは、ＳＢＥ−ＣＤのＭｗ（２１６３）がＨＰ−ＣＤ（１４００）より大きいため、包接による包接複合体形成のみが原因ではない可能性がある。水素結合または電荷相互作用など、２−ＩＢ分子とＳＢＥ−ＣＤ分子との間の他の物理的相互作用がより高い溶解度に寄与している可能性がある。
【００９１】
５℃で１２時間保存後のシクロデキストリン製剤の目視検査から、製剤ｐＨとシクロデキストリンの濃度との両方が、沈殿／包接脱離の点で製剤の安定性に影響を与えることが示される（表１３）。ＳＢＥ−ＣＤ製剤の場合、すべての製剤は、最も低いシクロデキストリン濃度、すなわち２．５％、ｐＨ４．４の製剤を除いて包接されたままであった（透明な溶液）。比較可能なｐＨ（４．５）でより高い濃度のシクロデキストリン（５％）では、２−ＩＢは可溶化したままであった。同様に、比較可能なシクロデキストリン濃度（２．５％）であるが、より高ｐＨ（５．０）でも、２−ＩＢは可溶化したままであったことから、ｐＨ５での保存中には、ｐＨとシクロデキストリン濃度の両方がＳＢＥ−ＣＤ製剤の安定性に寄与する。表４Ａおよび４Ｂは、ｐＨおよびシクロデキストリンの種類および濃度の２−ＩＢに対する作用をまとめたものである。
【００９２】
【表４】
2013527200.tif 000005
【実施例２】
【００９３】
０．１Ｍのクエン酸溶液で調整した様々なｐＨの１０％ＳＢＥ−ＣＤ溶液を用いて２−ＩＢの溶解度をスクリーニングした。実験ステップを下記に示す。
１．０．５ｇのＳＢＥ−ＣＤを１０ｍｌのガラスバイアルに秤量する
２．３ｍｌのＷＦＩを各バイアルに加えてＳＢＥ−ＣＤを溶解する
３．過剰量の２−ＩＢ（２５ｍｇ〜１００ｍｇ）を別々のバイアルに秤量する
４．１時間磁気撹拌する
５．０．１Ｍのクエン酸でｐＨを目標ｐＨに調整する
６．加えた０．１Ｍのクエン酸の重量を判定する
７．ＷＦＩを加えて総重量５ｇとする
８．１時間の撹拌後に再びｐＨを判定する
９．この製剤を０．２２ｕｍのＰＶＤＦフィルターで濾過する
１０．２−ＩＢの溶解度をＨＰＬＣ法によりにより判定する
【００９４】
２−ＩＢの溶解度は、ｐＨが７．０から４．０に低下すると、１．７１ｍｇ／ｇから１３．０８ｍｇ／ｇに増加した（表５）。飽和溶液は物理的に安定であり、室温で沈殿物は観察されなかった。しかしながら、５℃で５日間保存した後には２−ＩＢの沈殿物が観察された（表５）。１０％ＳＢＥ−ＣＤの存在下では、ｐＨ調整のみの場合と比較して２−ＩＢの溶解度は著しく増加した（ｐＨ５．０：５．２に対して０．５９ｍｇ／ｇ；ｐＨ４．０：１３．０８に対して１．７２ｍｇ／ｇ）。１０％ＳＢＥ−ＣＤの存在下で溶解度は、７．６〜８．８倍増加した（図１）。
【００９５】
【表５】
2013527200.tif 000006
−：２−ＩＢの沈殿；＋沈殿なし
【実施例３】
【００９６】
８〜１０％のＳＢＥ−ＣＤを含む６種の製剤を調製した（表６）。各製剤中の２−ＩＢの濃度は２−ＩＢの溶解度のほぼ７５％であり、低温で２−ＩＢの沈殿を防止した（表６と表５）。最終ｐＨは０．１Ｍのクエン酸溶液（または０．１Ｍのクエン酸ナトリウム）でｐＨ４．０〜６．０に調整した。一例として、Ｆ４２９−０２−００１Ｐ００４を用いた製剤調製の詳細な手順を以下に記載する（表１４を参照）。
【００９７】
Ｆ４２９−０２−００１ｐ００４：３．９ｍｇ／ｇの２−ＩＢ、１０％ＳＢＥ−ＣＤ、ｐＨ５．０
１．８２．９３ｇの注射用蒸留水を２００ｍｌのガラスビンに加える
２．１０ｇのＳＢＥ−ＣＤ粉末をガラスビンに秤量し、磁気撹拌しながら溶解させる
３．４００ｍｇの２−ＩＢを秤量する
４．６．６７ｇの０．１ｍＭのクエン酸溶液を加える
５．５分磁気撹拌して２−ＩＢを十分に溶解する
６．０．１Ｍのクエン酸ナトリウムでｐＨを５．０に調整する
７．この溶液を０．２２μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ（ＰＥＳ））で濾過する
８．１．５ｍｌを６ｍｌのガラスバイアルに充填し、５℃、２５℃および４０℃で保存する
【００９８】
【表６】
2013527200.tif 000007
【００９９】
ｐＨ７．０での２−ＩＢの溶解度は１．７１ｍｇ／ｇであり、１．５ｍｇ／ｇの２−ＩＢ水溶液を用いたｐＨ７．０の製剤を試験したところ、うまくいかなかった。２−ＩＢは一晩撹拌後十分に溶解しなかったためである。これは、溶解度試験および製剤調製のアプローチの相違によるかもしれない。溶解度試験では、過剰量の２−ＩＢ粉末を１０％ＳＢＥ−ＣＤ溶液に加えると、２−ＩＢの小粒子は迅速に溶解して平衡状態に達し得る。しかしながら、製剤調製では、正確な量の２−ＩＢ粉末を加えたが、これには異なる大きさの２−ＩＢ粒子が含まれる。大きい大きさの２−ＩＢ粒子は、ｐＨ７．０の水中で非常の遅い溶解速度を有する可能性がある。表６の６種の製剤の場合、２−ＩＢは３０分以内に迅速に溶解することから、溶解速度が速いことが示される。６種の製剤はすべて透明かつ無色の溶液であった。
【０１００】
最初に低ｐＨで製剤を調製し、次いで高ｐＨに調整することにより、溶解度を増加させることは実現できない。０．１Ｍのトリ−クエン酸でナトリウム製剤Ｆ４２９−０２−００１Ｐ００４をｐＨ５．０からｐＨ５．９に、製剤Ｆ４２９−０２−００１Ｐ００６をｐＨ４．０からｐＨ５．１に調整すると、沈殿が観察された。
【０１０１】
表６の６種の製剤は、５℃、２５℃および４０℃で６週間保存した。Ｔ＝０週、２週、４週および６週の時点で、製剤の外観、ｐＨ、重量オスモル濃度および純度ならびに２−ＩＢの含有量（ＨＰＬＣ）を試験した（表１５）。６週間保存後、３つの保存条件で製剤の沈殿が観察されなかった（表１６）。６種の製剤の外観は、目視検査により５℃および２５℃で変化しなかった。しかしながら、４０℃でやや褐色が観察された。色の強度は、２−ＩＢ濃度の上昇およびｐＨの低下と共に増加したようであった。この理由は不明である。２−イミノビオチンは安定であるように見え、純度および含有量に変化はなかった。ＳＢＥ−ＣＤは極端な低ｐＨかつ高温でのみ分解した。５℃、２５℃および４０℃で２週間、４週間および６週間の保存後、６種の製剤のｐＨおよび重量オスモル濃度はＴ＝０の値と比較して安定のままである。
【０１０２】
６種の製剤中の２−ＩＢは、５℃、２５℃および４０℃で６週間保存後、純度、含有量および回収率に基づき安定のままである（表１７）。６種の製剤中の２−ＩＢの純度は、ＨＰＬＣ法により測定した２−ＩＢのピーク面積比に基づき算出した。純度はほぼ９９％であり、５℃、２５℃および４０℃で６週間の保存後に低下しなかった。Ｔ＝０と比較してやや多い含有量および回収率の理由は、ＨＰＬＣ法の分析のばらつきによる可能性があった。
【実施例４】
【０１０３】
表１８および１９に示すように製剤の状態をさらに試験した。各製剤は、１０ｍｌの最終容量になるように調製した。２−ＩＢは、製剤調製のため、このバッチのＣｏＡに記載された含水量（４．２％ｗ／ｗ）を考慮して秤量した。製剤の暫定的な安定性は、５℃、２５℃および４０℃での３日間の保存について目視検査により変化した。Ｔ−０でサンプルのｐＨおよび重量オスモル濃度について特徴付けを行った。
【実施例５】
【０１０４】
実施例４の２つの製剤をより詳細に試験した。製剤Ｆ３０およびＦ３４は、以下の通り調製した。２−ＩＢを、含水量（４．２％ｗ／ｗ）を考慮して、予め秤量したガラスビンに秤量した。クエン酸１００ｍＭ（総量から９０％）、ＮａＣｌ／ＳＢＥ−ＣＤ原液およびＷＦＩ（注射用蒸留水）（総量から８０％）を加えた。混合物を、マグネチックスターラープレートを用いて撹拌した。ｐＨは、４．０を上回っており、１００ｍＭのクエン酸溶液を用いて４．０±０．２に調整した。溶液の最終重量は、７５０ｇを得るためＷＦＩを加えて補正した。。得られた製剤を、Ｍｉｌｌｉｐａｋ  ２０  Ｄｕｒａｐｏｒｅ（ＰＶＤＦ膜）を用いて濾過した。どちらの製剤も、ほぼ７０ｍｌの溶液を含む９つのエチレン酢酸ビニル注入バッグに分けた。製剤の組成を表６に示す。
【０１０５】
【表７】
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【０１０６】
調製の直後、試験対象の２つの製剤のサンプルの外観、ｐＨ、重量オスモル濃度、２−ＩＢ含有量および純度を試験した。安定性のためサンプルを３つの温度：５℃、２５℃および４０℃で保存した。安定性の時点は、１日、２日および３日であった。安定性の各時点で、全保存条件での２−ＩＢサンプルの外観、ｐＨ、２−ＩＢ含有量および純度を試験した。試験した製剤はどちらも５℃、２５℃および４０℃で３日間安定であることが明らかになった（表１９Ａおよび１９Ｂを参照）。
【実施例６】
【０１０７】
実施例４の２種の製剤を試験して、リ（Ｌｉ）Ｐ．；フシュヌヴァジャーラ（Ｖｓｈｎｕｖａｊｊａｌａ）Ｒ．；タビビ（Ｔａｂｉｂｉ）Ｓ．Ｅ．；ヤルコフスキー（Ｙａｌｋｏｖｓｋｙ）Ｓ．Ｈ．「インビトロ沈殿法の評価（Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎ−ｖｉｔｒｏ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ）」、ジャーナル・オブ・ファーマシューティカル・サイエンシズ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１９９８年２月；８７（２）：ｐ．１９６−９に記載されているインビトロスタティック段階希釈モデルに基づき、注射時に沈殿する可能性を予測した。
【０１０８】
その手順は、以下の通り行った：
３ｍｌの製剤を３ｍｌのＩＳＰＢまたはビヒクルで希釈し、撹拌した（等張セーレンセンリン酸塩緩衝液（ＩＳＰＢ：Ｉｓｏｔｏｎｉｃ  Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）ｐＨ７．４は、リン酸二ナトリウム七水和物−２．１４６％、リン酸二水素ナトリウム脱水物−０．２９６％および塩化ナトリウム−０．１７８％を用いて調製した）。次いで３ｍｌの得られた溶液／懸濁液を別のＩＳＰＢ／ビヒクル３ｍｌと混合した。このステップを７倍段階希釈が得られるまで繰り返した。さらに、ＩＳＰＢの代わりにビヒクルを希釈液として用いて各希釈の対照チューブも調製した。
【０１０９】
混合時に目視観察により沈殿物の有無を判定した。この最初の観察後、製剤−緩衝液混合物を３７℃で水浴に浸し、次いで５０ｒｐｍで１時間遠心した。上相をＨＰＬＣ法により解析した。
【０１１０】
データ解析のため、製剤−希釈液比を、製剤の容量と全容量（製剤の容量＋ＩＳＰＢの容量）との比と定義する。各希釈における対照濃度と測定濃度との差は、元の製剤１ｍｌ当たりに存在しくなくなった薬剤の量である。
【０１１１】
製剤Ｆ３０のインビトロスタティック段階希釈モデル
インビトロスタティック段階希釈モデルを用いて製剤Ｆ３０を試験して、注射時に沈殿する可能性を予測した。この方法では、製剤をＩＳＰＢと１対１の割合で連続的に希釈した。様々な希釈段階での製剤の外観を表７に示す。各希釈段階で得られた２−ＩＢの平衡濃度、および１ｍｌ当たりに存在しくなくなった薬剤の量を表８に示す（各希釈ともｎ＝３）。各希釈溶液の平衡濃度は、ＨＰＬＣ法により判定した。各希釈における対照濃度と測定濃度との差は、元の製剤１ｍｌから沈殿した薬剤の量と等しい。製剤−希釈液比は、製剤の容量と全容量との比と定義する。製剤−希釈液比０．５で、製剤は半透明に変わり、静置すると若干の沈殿が観察された。これらの希釈率で失われた薬剤の量はわずかであり、おそらく薬剤の沈殿の結果と考えられる。製剤−希釈液比０．２５〜０．０６２５では、透明な溶液が得られたが、分析の結果から、薬剤が失われたことが立証された。失われた薬剤量は、目視で観察されなかった微量の沈殿、または薬剤のチューブの管壁への吸着の結果かもしれない。
【０１１２】
【表８】
2013527200.tif 000009
【０１１３】
製剤Ｆ３４インビトロスタティック段階希釈モデル
インビトロスタティック段階希釈モデルを用いて製剤Ｆ３４を試験して注射時に沈殿する可能性を予測した。様々な希釈段階での製剤の外観を表９に示す。各希釈段階で得られた２−ＩＢの平衡濃度、および１ｍｌ当たりに存在しくなくなった薬剤の量の平均値を表１０に示した。製剤−希釈液比０．５〜０．１２５で、製剤は不透明から半透明に変わり、沈殿が観察された。これらの希釈率で失われた薬剤の量は識別可能あり、おそらく薬剤の沈殿の結果と考えられる。希釈が進み、比が０．０６２５に達すると、沈殿物が観察されたが、分析試験により検出されなかった。おそらく沈殿物が少量であったことによると考えられる。比０．０６２５未満では、平衡濃度点が対照曲線と重なり、沈殿物の再溶解が観察される。
【０１１４】
【表９】
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【０１１５】
４ｍｇ／ｍｌのＦ３０製剤では、この結果から、段階希釈後に曇りまたは沈殿がないことが示され、予想された２−ＩＢ濃度が確認されたことから、２−イミノビオチン（４ｍｇ／ｍｌ）のＳＢＥ−ＣＤベースの製剤は、静脈内投与時の血流による生理的希釈を原因としてインビボで沈殿しないと考えられることが示された。
【実施例７】
【０１１６】
本試験の本質および目的は、交尾後２０日目に雌ウィスター系ラットに２回の皮下注射により投与したときの２−イミノビオチン（２−ＩＢ）の胎盤通過、および２−ＩＢが血液脳関門を通過する可能性を評価することにあった。
【０１１７】
交尾後２０日目、４匹の雌ウィスター系ラットに５５ｍｇ／ｋｇの２−ＩＢを皮下注射した（それぞれ２７．５ｍｇ／ｋｇの注射）。２−ＩＢは、生理食塩水溶液、ｐＨ３．６〜３．８を用いて２．７５ｍｇ／ｍｌの濃度で調製した。試験期間中、材料動物の中で死亡は起こらず、胎仔はすべて生存していた。第２の注射からほぼ１時間後に剖検を行った。母親および胎仔の両方の血液および脳サンプルを採取した。
【０１１８】
母動物および胎仔の血漿サンプル中の２−ＩＢはすべて定量化できた。母動物の２−ＩＢの血漿中濃度は、その胎仔（雄の平均濃度は１，７６５ｎｇ／ｍＬ、および雌の平均濃度は１，９０３ｎｇ／ｍＬ）より３〜７倍高かった（平均濃度は１０，０３９ｎｇ／ｍＬ）。
【０１１９】
【表１０】
2013527200.tif 000011
定量下限（ＬＬＯＱ：Ｌｏｗｅｒ  Ｌｉｍｉｔ  ｏｆ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は５．０ｎｇ／ｍＬ、定量上限は（ＵＬＯＱ：Ｕｐｐｅｒ  Ｌｉｍｉｔ  ｏｆ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は５０００ｎｇ／ｍＬであった。
＊暫定値（最初の分析バッチを拒否したが、低容量のため、このサンプルを再解析することができなかった）。
【０１２０】
母動物および胎仔の脳サンプルの２−ＩＢはすべて定量化できた。２−ＩＢの脳中濃度は、母動物（平均濃度は２６８ｎｇ／ｇであった）およびその胎仔（雄の平均濃度は３２９ｎｇ／ｇ、雌は３６９ｎｇ／ｇであった）で同程度であった。
【０１２１】
【表１１】
2013527200.tif 000012
ＬＬＯＱは２０．０ｎｇ／ｇ、ＵＬＯＱは５０００ｎｇ／ｇであった。
【０１２２】
一般に、２−ＩＢの脳通過は、母動物（脳／血漿比は０．０２〜０．０４の範囲で平均０．０３であった）の方がその胎仔（雄の脳／血漿比は０．１５〜０．２１の範囲で平均０．１９、雌は０．１５〜０．２２の範囲で平均０．２０であった）より比較的低い。
【０１２３】
生物分析の結果から、母動物およびその胎仔はすべて皮下注射後に２−ＩＢに曝露されたことが示され、母動物はその胎児より３〜７倍高い血漿中濃度を示した（２−ＩＢの平均血漿中濃度は母動物が１０，０３９ｎｇ／ｍＬ、雄胎仔が１，７６５ｎｇ／ｍＬ、雌胎仔が１，９０３ｎｇ／ｍＬであった）。さらに、脳中の２−ＩＢ濃度も、すべての母動物（平均濃度は２６８ｎｇ／ｇであった）およびその胎仔（平均濃度は雄胎仔３２９ｎｇ／ｇ、および雌胎仔が３６９ｎｇ／ｇであった）で測定することができた。２−ＩＢの脳通過は、母動物（平均の脳／血漿比は０．０３であった）の方がその胎仔（平均の脳／血漿比は０．２０であった）より比較的低いようであった。上記の結果に基づき、総投与量レベル５５ｍｇ／ｋｇでウィスター系ラットに２回皮下注射した後、２−ＩＢの胎盤および血液脳関門の通過が確認される。
【実施例８】
【０１２４】
２−ＩＢを濃度０．６ｍｇ／ｇ、０．７５ｍｇ／ｇおよび１ｍｇ／ｇでクエン酸塩緩衝液に溶かした溶液を、ｐＨ３．８、４．０および４．２で最終重量２０ｇとして以下の通り調製した（ｐＨ４．０の緩衝能の目標値は１５ｍＭであった）。
【０１２５】
０．１Ｍのクエン酸溶液および０．１Ｍのクエン酸ナトリウム二水和物溶液をそれぞれ、ＷＦＩを用いて調製した。クエン酸溶液を２−ＩＢに加え、予め秤量したガラスバイアルに秤量した（このバッチのＣｏＡに記載された含水量（４．２％ｗ／ｗ）を考慮した。希釈のためＷＦＩを加え、次いで０．１Ｍのクエン酸ナトリウム二水和物溶液を加えてｐＨを必要とされるｐＨ値まで調整した。ＷＦＩを加えて総重量２０ｇとし、続いてｐＨを測定した。
【０１２６】
その後、得られた１２のバルク溶液を分けて、５℃±３℃および２５℃±２℃で３日間スタビリティーチャンバーに保存した。保存した溶液はすべて、各時点（０日、１日、２日、３日）でｐＨおよび外観について評価した。
【０１２７】
表２０は、クエン酸緩衝液製剤の組成と、製剤の総重量２０ｇまでＷＦＩを添加する前および後の目標ｐＨおよび測定ｐＨとを示す。
【実施例９】
【０１２８】
その後の試験では、１５℃±３℃および２５℃±２℃の温度、ｐＨ４±０．２での２−ＩＢクエン酸塩緩衝液製剤の安定性を調べた。２−ＩＢ−クエン酸塩緩衝液製剤は、実施例８に記載されているように、クエン酸塩緩衝液ｐＨ３．８、４．０および４．２を用いて、２−ＩＢ濃度０ｍｇ／ｍｌ（プラセボ）、０．７５ｍｇ／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌで調製した。各製剤は、最終重量２０ｇになるように調製し（緩衝能の目標値はｐＨ４．０で１５ｍＭであった）、それぞれについて目視で外観を調べ、ｐＨを判定した。これらの溶液を分けて、１５℃±３℃および２５℃±２℃で３日間スタビリティーチャンバーに保存した。保存した溶液はすべて、Ｔ＝０日、１日、２日および３日の時点でｐＨおよび外観について評価した。
【０１２９】
表２１は、各クエン酸緩衝液製剤の組成、および製剤の総重量２０ｇまでＷＦＩを添加する前および後の目標ｐＨ値および測定ｐＨ値を示す。各時点の外観およびｐＨデータも示す。
【実施例１０】
【０１３０】
ｐＨ値４．０〜６．２に緩衝した５％Ｃａｐｔｉｓｏｌ溶液を用いて２−イミノビオチンの溶解度を評価した。製剤は、重量オスモル濃度の調整のためＮａＣｌをさらに含んでおり、ｐＨ４．０で目標としたクエン酸塩緩衝液濃度は、１５ｍＭであった。これらの溶液の２−ＩＢ濃度は、４．０ｍｇ／ｇ、２．０ｍｇ／ｇ、１．０ｍｇ／ｇ、０．７５ｍｇ／ｇおよび０ｍｇ／ｇ（プラセボ）の２−ＩＢであった。
【０１３１】
０．１Ｍのクエン酸溶液および０．１Ｍのクエン酸二水和物溶液の調製については、実施例８に記載されている。２５％Ｃａｐｔｉｓｏｌ−２．４５％ＮａＣｌ溶液のバルク溶液を調製し、さらに製剤の調製に使用した。
【０１３２】
最終バルク製剤についてそれぞれ目視で外観を調べ、ｐＨを判定した。これらの溶液を分けて、５℃±３℃および２５℃±２℃で３日間スタビリティーチャンバーに保存した。保存した溶液はすべて、Ｔ＝０日、１日、２日および３日の時点でｐＨおよび外観について評価した。
【０１３３】
表２２および２３は、２−ＩＢクエン酸塩緩衝液の組成と、外観とｐＨデータとを示す
【実施例１１】
【０１３４】
以下の製剤について、クエン酸塩緩衝液中の２−ＩＢの短期安定性（ＳＴＳ：ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）試験を行った（時点：Ｔ＝０週、２週、４週および６週）：
以下を含む製剤０３−１５：５％ｃａｐｔｉｓｏｌおよび２．４５％ＮａＣｌ（等張化用）溶液と共に０．７５ｍｇ／ｇの２−ＩＢを含むクエン酸塩緩衝液ｐＨ６．０、および
以下を含む製剤０２−５Ｂ：等張化用ＮａＣｌと共に０．７５ｍｇ／ｇの２−ＩＢを含むクエン酸塩緩衝液ｐＨ４．０。
【０１３５】
以下のパラメーターを調査した：目視による外観、ｐＨ、重量オスモル濃度、アッセイ、ＩＤＤ、清澄度、可視粒子および肉眼で見えない粒子。ｐＨの変動（ｐＨ６．０で６週間に０．１単位）は、大きくなかった。試験した温度のいずれにも安定性に問題があるという証拠はなかった。
【実施例１２】
【０１３６】
乾燥２−ＩＢの溶解度試験を水和２−ＩＢと比較して行った。製剤＃０２−５をベースに３つの製剤を調製した。０７−１製剤は、乾燥した後、２−ＩＢ「そのまま」の材料（すなわち、バイアルから直接取り出した２−ＩＢ）から得た。０７−２製剤は、「そのまま」の２−ＩＢ材料を２０℃／ＲＨ（７０±５％）で放置して２−ＩＢを十分に水和した材料から得た。０７−３製剤は、２−ＩＢ「そのまま」の材料から得た。各溶液の外観およびｐＨを調査した。１。乾燥した材料、「そのまま」の材料、および十分に水和した材料の含水量はそれぞれ、１％、１２％および１８％と判定された。
【０１３７】
以下の表１２は、製剤（０７−１、０７−２および０７−３）の調製に使用した成分の量、２−ＩＢ材料（各製剤に使用）が０．１Ｍのクエン酸溶液に溶解するのに要した時間、３つの製剤の最終ｐＨおよびそれらの外観を示す。
【０１３８】
【表１２】
2013527200.tif 000013
【実施例１３】
【０１３９】
ｃａｐｔｉｓｏｌを用いてあるいは用いずに、２−ＩＢを含むクエン酸塩緩衝液の２つの製剤について最終滅菌法の試験を行い、どの滅菌法が２−ＩＢを分解することなく使用できるか判定した。
【０１４０】
２−ＩＢを含まないプラセボ製剤を含む４つの緩衝２−ＩＢ製剤を調製した。これらの各溶液を０．２２μｍのＰＥＳフィルターで濾過した。ｐＨ、重量オスモル濃度、目視による外観、および２−ＩＢ含有量を判定した。クエン酸ナトリウム溶液で２−ＩＢクエン酸溶液を調整した後のｐＨも判定した。
【０１４１】
各製剤を４×１０ｇ分に分割した。分割分をそれぞれ２０ｍｌのガラスバイアルに分配した。４つのサンプルをそれぞれＴｕｔｔｎａｕｅｒ蒸気滅菌器に入れ、オートクレーブした（プログラム６（液体の場合、１２１℃、１５分間））。オートクレーブ後、サンプルを室温まで放冷した。４つのバイアルからそれぞれ５ｇのサンプルを取り出し、外観、ｐＨおよび重量オスモル濃度を判定した。残りの製剤５ｇは、アッセイに利用した。
【０１４２】
表２４は、４つの製剤それぞれの調製に使用した材料およびその量、シトレート緩衝能、目視による外観、最終滅菌の前後のｐＨおよびアッセイを示す。表２４に示したアッセイは、ＨＰＬＣ解析によりモニターした溶液の安定性である。表２４で明らかなように、製剤は、２−ＩＢの安定性を大きく低下させることなくオートクレーブすることができる。
【実施例１４】
【０１４３】
選択した２つの製剤のインビボでの沈殿の可能性を評価するための試験を行った。このため、実施例６に記載されているようなインビトロスタティック段階モデルを使用した。
【０１４４】
表２５は、０９−１、０９−１Ｖ、０９−２および０９−２Ｖの調製に使用した材料の量、それらの緩衝能、ならびにクエン酸ナトリウムで２−ＩＢクエン酸溶液を調整した前後のｐＨおよび外観を示す。表２６および２７は、０９−１および０９−１ＶをＩＳＰＢで希釈した場合の外観およびｐＨ値と、０９−１をビヒクルで希釈した場合の外観およびｐＨ値とを示す。表２６および２７に示した外観およびｐＨの結果から、生理的ｐＨに類似したセーレンセン緩衝液で希釈した場合、実施した希釈のすべてで、調整物０９−１および０９−２はどちらも沈殿を示さないことが示される。したがって、これらの製剤のインビボでの沈殿リスクは低いであろう。さらに、より生理的な値へのｐＨの変化が迅速であり、インビボでの適合性／安全性が高まる。
【０１４５】
【表１３】
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【０１４６】
【表１４】
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【０１４７】
【表１５】
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【０１４８】
【表１６】
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【０１４９】
【表１７】
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【０１５０】
【表１８】
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【０１５１】
【表１９】
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【０１５２】
【表２０】
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【０１５３】
【表２１】
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【０１５４】
【表２２−１】
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【０１５５】
【表２２−２】
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【０１５６】
【表２３】
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【０１５７】
【表２４】
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【０１５８】
【表２５】
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【０１５９】
【表２６】
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【０１６０】
【表２７】
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【図１】
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【国際調査報告】
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