(57)【要約】  試験サンプルのゲノムＤＮＡにおけるコピー数の不均衡の存在を決定する方法が提供される。該方法は、単一の試験サンプルと第１のハイブリダイゼーションアレイとのハイブリダイゼーションと、複数の参照サンプルと複数の他の各試験アレイとのハイブリダイゼーションとを別々に測定することができる。コピー数の決定は、試験アレイに対するベストフィットの参照アレイに基づくものとする。ベストフィットは測定シグナルの最も近い又は最も類似したシグナル対ノイズ比に基づき決定することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験サンプルのゲノムＤＮＡにおけるコピー数の不均衡の存在を決定する方法であって、
ａ）試験サンプル由来のサンプルゲノムＤＮＡ又はその増幅産物を標識し、それにより標識した試験ＤＮＡを形成する、標識することと、
ｂ）該標識した試験ＤＮＡを第１のハイブリダイゼーションアレイとハイブリダイズすることと、
ｃ）参照サンプル由来の第１の参照ゲノムＤＮＡ、又はその増幅産物を標識し、標識した第１の参照ＤＮＡを形成する、標識することと、
ｄ）該標識した第１の参照ＤＮＡを第２のハイブリダイゼーションアレイとハイブリダイズすることと、
ｅ）第２の参照サンプル由来の第２の参照ゲノムＤＮＡ、又はその増幅産物を標識し、標識した第２の参照ＤＮＡを形成する、標識することと、
ｆ）該標識した第２の参照ＤＮＡを第３のハイブリダイゼーションアレイとハイブリダイズすることと、
ｇ）該標識した試験ＤＮＡのハイブリダイゼーション後に該第１のハイブリダイゼーションアレイを分析し、それにより該標識した試験ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより生じたシグナル強度を決定する、分析することと、
ｈ）該標識した第１の参照ＤＮＡのハイブリダイゼーション後に該第２のハイブリダイゼーションアレイを分析し、それにより該標識した第１の参照ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより生じたシグナル強度を決定する、分析することと、
ｉ）該標識した第２の参照ＤＮＡのハイブリダイゼーション後に該第３のハイブリダイゼーションアレイを分析し、それにより該標識した第２の参照ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより生じたシグナル強度を決定する、分析することと、
ｊ）該第１のハイブリダイゼーションアレイのシグナル強度を該第２のハイブリダイゼーションアレイ及び該第３のハイブリダイゼーションアレイのうちの少なくとも１つのシグナル強度と比較することにより、該サンプルゲノムＤＮＡの少なくとも１つの領域のコピー数を推測することと、
を含む、試験サンプルのゲノムＤＮＡにおけるコピー数の不均衡の存在を決定する方法。
【請求項２】
標識した第１の参照ＤＮＡが、該標識した試験ＤＮＡに対する、ゲノムの１つ又は複数の所定の領域における少なくとも１つのコピー数の変化を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標識した第２の参照ＤＮＡが、該標識した試験ＤＮＡに対する、該標識した第１の参照ＤＮＡと同じコピー数の変化を有しない少なくとも１つの所定の領域を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
標識した試験ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより生じたシグナル強度を、該１つ又は複数の所定の領域における該標識した第１の参照ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより生じたシグナル強度と比較し、該標識した試験ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより生じたシグナル強度を、該１つ又は複数の所定の領域における該標識した第２の参照ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより生じたシグナル強度と比較し、該方法が、予測されるコピー数に基づき該方法のダイナミックレンジを決定することを更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
標識した第１の参照ＤＮＡが第１の種の雄の動物由来であり、該標識した第２の参照ＤＮＡが該第１の種の雌の動物由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
標識した第１の参照ＤＮＡ及び該標識した第２の参照ＤＮＡが、同じ種の動物の雄及び雌由来のＤＮＡの混合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
標識した試験ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより生じたシグナル強度を、該１つ又は複数の所定の領域における該標識した第１の参照ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより生じたシグナル強度と比較し、それによりコピー数の第１の推測値を決定し、該標識した試験ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより生じたシグナル強度を、該１つ又は複数の所定の領域における該標識した第２の参照ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより生じたシグナル強度と比較し、それによりコピー数の第２の推測値を決定し、コピー数の該第１の推測値と該第２の推測値とを組み合わせて、コピー数の総合的な推測値を得る、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
シグナル強度を正規化した後、該コピー数を推測する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
参照サンプル由来の該第１の参照ゲノムＤＮＡ又はその増幅産物が第１の増幅技法により生じた増幅産物を含み、参照サンプル由来の該第２の参照ゲノムＤＮＡ又はその増幅産物が同じ第１の増幅技法により生じた増幅産物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
参照サンプル由来の該第１の参照ゲノムＤＮＡ又はその増幅産物が、異なる各濃度で複数の異なる参照を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
標識した第３の参照ＤＮＡを第４のハイブリダイゼーションアレイとハイブリダイズすることと、
標識した第４の参照ＤＮＡを第５のハイブリダイゼーションアレイとハイブリダイズすることと、
標識した第５の参照ＤＮＡを第６のハイブリダイゼーションアレイとハイブリダイズすることと、
を更に含み、コピー数の推測が該第１のハイブリダイゼーションアレイのシグナル強度を該第２のハイブリダイゼーションアレイ、該第３のハイブリダイゼーションアレイ、該第４のハイブリダイゼーションアレイ、該第５のハイブリダイゼーションアレイ及び該第６のハイブリダイゼーションアレイのそれぞれにより発生したシグナル強度と比較することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
コピー数の推測値に基づきヒトの極体又は胚の異数性の状態を決定することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＩＶＦ手順で決定した異数性の状態に基づき胚を着床させることを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ゲノムＤＮＡを該試験サンプルから単離し、それにより該サンプルゲノムＤＮＡ又はその増幅産物を形成する、単離することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
試験サンプルが胚又は関連の生検材料由来の少なくとも１つの細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
第１のゲノム参照ＤＮＡが染色体異常を有する動物の組織又は細胞から得られたＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
第１のゲノム参照ＤＮＡがモザイク組織又は細胞から得られたＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
標識した第１の参照ＤＮＡが第１の濃度のＤＮＡを有し、第１の濃度の第１のＤＮＡの増幅産物を含み、該標識した第２の参照ＤＮＡが該第１の濃度の第１のＤＮＡを希釈した後で生じた該第１のＤＮＡの増幅産物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
標識した第１の参照ＤＮＡが、少なくとも２つの個体から採取した血液サンプルから抽出されたプールゲノムＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
試験サンプルのゲノムＤＮＡにおけるコピー数の不均衡の存在を決定する方法であって、
ａ）試験ＤＮＡを標識し、それにより標識した試験ＤＮＡを形成する、標識することと、
ｂ）該標識した試験ＤＮＡを第１のハイブリダイゼーションアレイとハイブリダイズすることと、
ｃ）ハイブリダイゼーション後に該第１のハイブリダイゼーションアレイを分析して、第１のハイブリダイゼーションの結果を得る、分析することと、
ｄ）該第１のハイブリダイゼーションの結果を、標識した第１の参照ＤＮＡと第２のハイブリダイゼーションアレイとのハイブリダイゼーションによる過去の参照ハイブリダイゼーションの結果のうちの少なくとも１つを含む参照データ、又は数学モデルを用いて合成的に生じたデータと比較することと、
ｄ）該第１のハイブリダイゼーションの結果を、標識した第２の参照ＤＮＡと第３のハイブリダイゼーションアレイとのハイブリダイゼーションによる過去の参照ハイブリダイゼーションの結果と比較することと、
ｅ）シグナル強度が、該第２のハイブリダイゼーションアレイ及び該第３のハイブリダイゼーションアレイのうちの少なくとも１つの１つ又は複数の対応する領域において生じたシグナル強度と異なる該第１のハイブリダイゼーションアレイの１つ又は複数の領域を特定することによりコピー数の不均衡の存在を決定することと、
を含む、試験サンプルのゲノムＤＮＡにおけるコピー数の不均衡の存在を決定する方法。
【請求項２１】
標識した第１の参照ＤＮＡが第１の種の雄の動物由来であり、該標識した第２の参照ＤＮＡが該第１の種の雌の動物由来である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
プロセッサに記憶された参照アレイデータセットのライブラリであって、それぞれの参照アレイデータセットが、各参照アレイで実施されたコピー数ハイブリダイゼーションアッセイ中に各参照アレイから集められたデータを含み、
（１）各データセットが集められるそれぞれの参照アレイが、データセットが集められる互いの参照アレイと実質的に同一又は同一であり、
（２）各データセットが集められるそれぞれのコピー数ハイブリダイゼーションアッセイを、データセットが集められる互いのコピー数ハイブリダイゼーションアッセイと同じ条件又は該コピー数ハイブリダイゼーションアッセイと１つ又は複数の異なる条件下で実施し、
（３）該ライブラリの少なくとも２つの参照アレイデータセットが互いに異なる、プロセッサに記憶された参照アレイデータセットのライブラリ。
【請求項２３】
それぞれの参照アレイデータセットが蛍光シグナル強度のデータを含む、請求項２２に記載のライブラリ。
【請求項２４】
それぞれの参照アレイデータセットを、ハイブリダイゼーションに頼らずに算出する、請求項２２に記載のライブラリ。
【請求項２５】
コピー数ハイブリダイゼーションアッセイ中に試験アレイから集められた試験アレイデータセットを、請求項２２に記載のライブラリの参照アレイデータセットと比較することと、
シグナルプロセッサを用いて、試験アレイデータセットと該ライブラリ由来のデータセットとの比を決定する、用いることと、
を含む方法。
【請求項２６】
ライブラリ由来のベストフィットデータセットが、比プロファイルのＳＮＲを最大にするために該プロセッサにより決定された参照アレイデータセットである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
第１のコピー数ハイブリダイゼーションアレイと、
該第１のコピー数ハイブリダイゼーションアレイと同一の第２のコピー数ハイブリダイゼーションアレイと、
該第１のコピー数ハイブリダイゼーションアレイと同一の第３のコピー数ハイブリダイゼーションアレイと、
第１の参照ゲノムＤＮＡと、
第２の参照ゲノムＤＮＡと、
（１）該第１のコピー数ハイブリダイゼーションアレイで実施されるハイブリダイゼーションアッセイから生じた試験結果を、該第１の参照ゲノムＤＮＡを用いて該第２のコピー数ハイブリダイゼーションアレイで実施されるハイブリダイゼーションアッセイから生じた試験結果と比較するため、及び（２）該第１のコピー数ハイブリダイゼーションアレイで実施されるハイブリダイゼーションアッセイから生じた試験結果を、該第２の参照ゲノムＤＮＡを用いて該第３のコピー数ハイブリダイゼーションアレイで実施されるハイブリダイゼーションアッセイから生じた試験結果と比較するための指示書とを、
備えるキット。
【請求項２８】
第１の参照ゲノムＤＮＡが参照ゲノムＤＮＡの増幅産物を含む、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
コピー数ハイブリダイゼーションアレイと、
複数の参照アレイデータセットと、
該コピー数ハイブリダイゼーションアレイで実施されるハイブリダイゼーションアッセイから生じる試験結果に対応するデータセットを、該複数の参照アレイデータセットと比較するための指示書とを、
備えるキット。
【請求項３０】
電子記憶媒体を更に備え、該複数の参照アレイデータセットが該電子記憶媒体に記憶される、請求項２９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本教示は、胚の細胞、卵母細胞、極体又は関連の生検材料内の遺伝的異常を検出する方法に関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本願は、２０１０年３月１６日付けで出願された先願の米国特許出願第１２／７２４，８６５号（その全体が参照により本明細書に援用される）からの利益を主張している。
【背景技術】
【０００３】
ＩＶＦ（体外受精）の分野内において、着床前に胚の細胞内の染色体の数及び補体を特定することが望ましい。胚の生存能力に影響を与える最も重要な因子の１つは、コピー数の過剰／減少及び染色体全体の異数性（染色体の異常数）を含む染色体の不均衡であるとする証拠が増えてきている。
【０００４】
現在の試験方法は初めに、試験のための胚を代表するものである遺伝物質の単離を含む。異数性の分析に現在使用されているサンプルは、卵母細胞に関連する極体の生検材料、割球の生検材料（３日目の胚に関連する）由来の単細胞、又は栄養外胚葉（trophectoderm）の生検材料（５日目の胚又は胚盤胞に関連する）である。しかしながら場合によっては、プロセスの他の又は複数の時点で採取されたサンプルがより効果的であることが分かっている。それから、極体又は細胞（複数の場合もあり）を、選択されたコピー数の不均衡を検出する方法により試験する。本願では、かかる試験方法は着床前遺伝学的スクリーニング（ＰＧＳ）と称されるが、文献中ではＰＧＤという用語がよく見られる。ＰＧＳという用語は、卵母細胞の品質を利用可能にするため、例えば情報に基づく卵バンキングを可能にするための極体の試験も含むものとする。
【０００５】
比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）は、いわゆるコピー数の変化に対応するゲノムＤＮＡにおける増幅配列又は欠失配列の存在を検出し、その位置を特定するのに用いられている技法である。典型的には、ゲノムＤＮＡを正常な参照細胞から、及び試験細胞から単離する。２つの核酸サンプルを別々に標識し、その後参照細胞の中期染色体とｉｎ  ｓｉｔｕでハイブリダイズする。参照ＤＮＡ及び試験ＤＮＡの両方における反復配列は除去するか、又はそれらのハイブリダイゼーション能を何らかの手段により低減する。コピー数が増加又は減少した、試験細胞における染色体領域を、２つのＤＮＡからのシグナルの比が変化する領域を検出することにより特定することができる。コピー数が変化したかかる領域の検出は遺伝的障害の診断に特に重要であるとされる。
【０００６】
上で示される中期ＣＧＨはまた、全ての染色体に適用されており、異常に関して全ての染色体をスクリーニングする能力を有する。ＰＧＳに関連して適用されるＣＧＨ分析では、分析前に単細胞（５ｐｇ〜１０ｐｇ）から中期ＣＧＨに好適なレベル（１μｇ）までＤＮＡ量を増大させるのに、全ゲノムの増幅が必要とされる。増幅に一般的に使用される方法には、ＤＯＰ−ＰＣＲ（Telenius et al., 1992）又は最近ではＧＥＮＯＭＥＰＬＥＸ（Rubicongenomics）及びＲＥＰＬＩ−Ｇ（Qiagen）のような全ゲノム増幅キットが含まれる。臨床状況で中期ＣＧＨを使用する主な問題点は、完了するまでおよそ４日かかる場合があり、これでは胚を凍結せずに、また次のサイクルの着床を行わずに、ＩＶＦにおいて着床前の胚に必要とされる時間枠に適合することができないことである。加えて、該方法は技術課題があり、実施し、分析するのには高度な専門知識を必要とする。これらの問題が、ＰＧＳにおける中期ＣＧＨの広範な使用を制限している。
【０００７】
１９９８年及び２００３年にPinkel et al.は、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションとして広く知られるようになる技法（以下、アレイＣＧＨと称される）を開示した。１９９８年に、Solinas-Toldo et al.は類似の「マトリクスベースの比較ゲノムハイブリダイゼーション」アプローチを説明している。
【０００８】
アレイＣＧＨ技法は、二本鎖ＤＮＡの結合特異性の利用に関してはＣＧＨと類似のアッセイ原理に依存する。アレイＣＧＨでは、参照細胞の中期染色体を固体支持体に結合した潜在的に数千の非標識の標的核酸（プローブ）の集合体、例えば染色体位置にマッピングしたクローンのアレイに置き換える。このためアレイＣＧＨは、ともに同じハイブリダイゼーション区域とハイブリダイズする２つのＤＮＡサンプル間のコピー数の違いのハイスループット検出のための比較技法の一種である。アレイＣＧＨには、より大きい分解能を達成し、コピー数の検出が重要である他の分野のみならず、コピー数の変化により誘導される遺伝的障害の検出及び診断に適用されるという点でＣＧＨを上回る利点がある。詳細は異なるが、オリゴヌクレオチド、ＰＡＣ及び細菌性人工染色体（ＢＡＣ）のアレイに見られるものを含む広範な様々なプローブタイプを使用することができる。
【０００９】
アレイＣＧＨは現在、体質性細胞遺伝学及び近年では腫瘍学におけるゲノムの不均衡の研究における臨床医の努力を支持するのに使用されている。これらの用途では、これらの用途のために設計されたマイクロアレイを、学術的な又は臨床前の研究用途に用いられるものよりもはるかに厳しい基準で作製することが強く望まれている。
【００１０】
アレイＣＧＨには、解釈がかなり単純であり、容易に自動化され、加えて完全な分析にかかる時間がより短いという中期ＣＧＨを上回る利点がある。アレイＣＧＨは、単細胞において異数性を検出するために使用することができ、ＰＧＳに適用することに成功している。該技法では単細胞を増幅しなければならず、中期ＣＧＨに用いられるものと同じ方法が利用される。アレイＣＧＨにより、全ゲノムの包括的な分析が４８時間以内に完了し、これによりＰＧＳにおいて低温保存することなく異数性スクリーニングが可能になる。
【００１１】
最適なアッセイ結果を達成するために、アレイＣＧＨでは、試験サンプルと参照サンプルとを品質及び濃度に関して十分に適合させる必要がある。ＰＧＳに関しては、任意の分析の出発点は、卵バンキングに関連して受精胚又は卵母細胞を可能な限り代表するものである遺伝物質である。現在、極体若しくは割球、８細胞期の胚から抽出される単細胞、又は代替的に胚盤胞若しくは関連の生検材料由来の少数の細胞内に含有される遺伝物質を検査することが可能である。かかる材料からは限られた量のＤＮＡしか得ることができないために、ほとんどの下流の分析には出発材料の多数のコピーを得るためにＤＮＡ増幅手順を使用する必要がある。受精プロセスが始まると、極体が放出され、ＰＢ１及びＰＢ２の２つの極体が存在することが理解されよう。該プロセスは単純なものではない。本明細書中で「極体」という用語は、一次卵母細胞又は二次卵母細胞から放出された又は生検された極体を含み得る。
【００１２】
増幅されていないゲノム参照材料を使用することができるが、対応するアレイＣＧＨ結果は、増幅された試験サンプルと増幅されていない参照との適合不全のため、高いノイズレベルを示す場合がある。このため、これに関連して使用される参照材料は多くの場合、少数の単細胞とさほど変わらない（broadly similar）量のＤＮＡを含有するように希釈した「正常な」プールＤＮＡサンプルである。その後、この希釈した参照材料を、試験サンプルと同じ方法を用いて増幅する。試験サンプル及び参照サンプルの特性を適合させるためにこれらの工程を採用したとしても、これが常に有効であるわけではなく、結果の明瞭さにはばらつきがある場合がある。このことは、出発ＤＮＡの定量における僅かの誤差、及びそれによる希釈サンプルにおけるＤＮＡ量の変化；増幅プロセスの確率的特質による変動；参照に存在しないサンプル中の不純物の増幅；非特異的な増幅の増大をもたらす低いサンプルＤＮＡ「品質」；サンプルの抽出及び保存に使用される試薬の量及びタイプの変動を含む様々な理由によるものであり得る。全ての場合で、サンプルと参照との増幅の間で生じる差異は様々であり、実際の増幅の結果を曖昧なものにする場合があり、これによりアレイＣＧＨプロファイルの変化、並びに頻繁にノイズの増大及びダイナミックレンジの抑制が起こる。
【００１３】
ＰＧＳは診断的適用であり、実験の首尾よい機能化を実証し、また例えば先に記載の増幅問題のために生じ得る、実験間のダイナミックレンジの変動を評価するための内部対照を含むことが、それぞれの実験で標準的である。アレイＣＧＨを使用する場合、この問題点に対処するために最も一般的に用いられるアプローチは、試験サンプルに対してコピー数の過剰／減少が既知の参照サンプルを使用することである。これらはそれぞれ個々のアッセイでの性能の評価基準として使用することができる。
【００１４】
多くの場合、参照サンプルは試験サンプルと性別が不適合であり、それによりＸ染色体及びＹ染色体に関する参照に対する試験サンプルのｌｏｇ２比、及び結果としてダイナミックレンジの評価基準の変化が生じる。多くの状況に当てはまるが、ＰＧＳの場合、特にいずれかの性別であり得る割球又は胚盤胞の生検サンプルの異数性スクリーニングでは、一般的にサンプルの性別を先見的に知ることは不可能である。したがって内部対照としての単一参照の使用が確実に可能というわけではない。その上、胚／卵母細胞におけるコピー数の変動の程度が極めて高いため、試験サンプルに対する性染色体以外の領域における既知のコピー数の不均衡を有する適切な単一参照の選択は一般的に不可能であり、最近の研究から、安定であると予測される領域がないことが示されている。幾つかの実施の形態では、異数性の状況に基づき着床のための胚を選択することができる。他の実施の形態では、より小さい遺伝子異常に基づき選択することができる。
【００１５】
代替法は、非ヒト制御配列を含む参照を使用することである。しかしながら、このアプローチは、ヒト配列の挙動を正確に模倣する非ヒト配列を選ぶのが困難であるために理想的とはいえない。いずれの場合でも、非ヒト制御配列の使用には、同じ増幅バイアスと他のバイアスとが問題となる場合があり、このため単一参照を選ぶことが困難である場合がある。
【００１６】
ＰＧＳにおけるこの問題点を克服するために、１つが雄の参照に対するものであり、もう１つが雌の参照に対するものである単一の試験サンプルを分析するための２つの従来型のアレイＣＧＨハイブリダイゼーションを実施し、アッセイを正確に作用させる必要がある。しかしながら、このアプローチに関連するコストは適用のために許容できないほど高い。
【００１７】
２つ以上の細胞を胚から、例えば胚盤胞／栄養外胚葉）から採取する場合、胚が多くの場合モザイクであるため、試験サンプルにおけるモザイク現象の可能性がＰＧＳに関連して重要となる。厄介なことには、生検方法が不正確であることにより、胚から採取された細胞の数が未知であることがある。アレイＣＧＨはモザイク現象を検出することができるが、十分洗練された内部対照がないために、このモザイク現象を直接定量する手段は提供されず、さらに同じ理由から、実験ノイズをモザイク現象と間違える場合がある。単一の参照サンプルに対するアレイＣＧＨの信頼性もこれに関連して問題となる。
【００１８】
アレイＣＧＨは、試験サンプル及び参照サンプルを標識する蛍光色素を対比させる必要がある。一般的な色素対であるＣｙ３及びＣｙ５がアレイＣＧＨによく使用される。Ｃｙ５色素は環境中のオゾンにより分解されやすく、特に高い湿度と組み合わせると、アッセイ品質に対するこの影響により、実験データの損失を引き起こす場合がある。２つの蛍光標識したサンプルを同じハイブリダイゼーション区域と競合的にハイブリダイズするアレイＣＧＨを使用し、これによりレシオメトリック比較を介して、遺伝物質の相対的な過剰／減少を確認することができる。典型的には、正規性が対象の適用で規定される場合、１つのサンプルは未知の遺伝的性質（genetic make-up）の試験サンプルであり、１つのサンプルは正常なコピー数を有することが知られている参照サンプルである。アレイＣＧＨは有効でかつロバストな技法であるが、ＰＧＳの適用は独自の技術的課題を示す。幾つかの実施の形態では、胚の染色体の内容の評価は、受精後に細胞を採取することにより直接的に、又は極体、及びひいては胚を発生する卵母細胞を評価することにより間接的に行うことができる。幾つかの実施の形態では、卵母細胞の内容を評価することだけが目的である用途が存在し、必ずしも胚を発生させなくてもよい。これは本明細書中で卵バンキングと称される。
【００１９】
Buffart et al. (2008)は、現在の技術の改良として「交差アレイＣＧＨ」（ａａＣＧＨ）と呼ばれる改良型アレイＣＧＨ技法を提案している。ａａＣＧＨはアレイＣＧＨと類似しているが、試験サンプル及び参照サンプルと単一のハイブリダイゼーション区域とのハイブリダイゼーションの代わりに、試験サンプルと参照サンプルとを別々のハイブリダイゼーション区域で比較する。この特許の著者らにより独自に開発されたこの方法には、色素バイアスによりあらゆるノイズが取り除かれるため、コスト及び潜在的にデータ品質における利点がある。ａａＣＧＨを用いて得られるプロファイルの品質は、通常の二重チャネルアレイＣＧＨを用いて得られるものに匹敵するか、又は更にはそれを上回ることが報告された。参照はマルチフォーマットアレイを用いて、試験サンプルと同時に同じスライド上でハイブリダイズすると説明されており、試験サンプル及び参照が同じ蛍光色素で標識される。これらは単一の試験サンプルを単一の参照サンプルと比較する。しかしながら、該方法はＰＧＳの特有の課題を克服してはいない。
【００２０】
ＳＮＰアレイ技法はアレイＣＧＨとは異なり、ＤＮＡサンプルにおけるコピー数を決定するのにも用いることができ、またＰＧＳ用途のために開発されている。ＳＮＰアレイは全ての染色体のスクリーニングを提供し、同時に遺伝子型決定を可能にする。用いられる機構は、該技法が比較によるものではないという点でアレイＣＧＨの機構とは実質的に異なる。参照サンプルを用いず、また同時ハイブリダイゼーションを実施せずに、コピー数の割り当て方法は、個々の対立遺伝子を評価しないアレイＣＧＨとは対照的に個々の対立遺伝子の定量、及びその後のレシオメトリック分析に依存する。ＳＮＰアレイの不利点には、ノイズレベルの増大、より長いプロトコル、データ解釈の複雑さ及び倫理的影響、並びに可能性として半数体サンプルの適用性の低下が含まれる。
【００２１】
染色体特異的なＤＮＡプローブを用いるＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）の分子細胞遺伝学的技法はＰＧＳによく適用されており、中期核に検出可能なシグナルを与える。増幅工程は必要とされないが、ＤＮＡプローブの標識に利用可能な異なる色の数によって限定される、限られた数の染色体しか同時に評価することができないという重大な不利点が存在する。通常の胚スクリーニングに用いられる最も包括的なＦＩＳＨ方法は現在、染色体の半分しか評価できず、このために一部の染色体異常が見逃される。ＦＩＳＨの他の不利点には、スコアリングが困難なシグナルの重複が含まれる。
【発明の概要】
【００２２】
本教示の特徴は、従来型のアレイＣＧＨに関連する試験サンプル及び参照サンプルの適合不全によるアッセイ失敗のリスクを軽減する、試験ＤＮＡサンプルのゲノムＤＮＡにおけるコピー数の不均衡の存在を決定する方法を提供することである。この方法は、アッセイの品質、正確さ及び収率を増大させることができる。
【００２３】
本教示の別の特徴は、単一の試験サンプルと１つのハイブリダイゼーションアレイとのハイブリダイゼーション、及び参照サンプルのセットと１つ又は複数の他のハイブリダイゼーションアレイとのハイブリダイゼーションを別々に測定する、試験ＤＮＡサンプルのゲノムＤＮＡにおけるコピー数の不均衡の存在を決定する方法を提供することである。
【００２４】
本教示の更なる特徴は、試験ＤＮＡサンプルと参照ＤＮＡサンプルとの単一の最適な対合の選択を含む、ゲノムＤＮＡにおけるコピー数の不均衡の存在を決定する方法を提供することである。
【００２５】
本教示は、試験サンプルのゲノムＤＮＡにおけるコピー数の不均衡の存在を決定する方法を提供する。サンプルは、試験サンプル由来のサンプルゲノムＤＮＡ又はその増幅産物を標識し、それにより標識した試験ＤＮＡを形成する、標識することと、標識した試験ＤＮＡを第１のハイブリダイゼーションアレイとハイブリダイズすることと、参照サンプル由来の第１の参照ゲノムＤＮＡ、又はその増幅産物を標識し、標識した第１の参照ＤＮＡを形成する、標識することと、標識した第１の参照ＤＮＡを第２のハイブリダイゼーションアレイとハイブリダイズすることと、第２の参照サンプル由来の第２の参照ゲノムＤＮＡ、又はその増幅産物を標識し、標識した第２の参照ＤＮＡを形成する、標識することと、標識した第２の参照ＤＮＡを第３のハイブリダイゼーションアレイとハイブリダイズすることとを含み得る。該方法は、標識した試験ＤＮＡのハイブリダイゼーション後に第１のハイブリダイゼーションアレイを分析し、それにより標識した試験ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより生じたシグナル強度を決定する、分析することと、標識した第１の参照ＤＮＡのハイブリダイゼーション後に第２のハイブリダイゼーションアレイを分析し、それにより標識した第１の参照ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより生じたシグナル強度を決定する、分析することと、標識した第２の参照ＤＮＡのハイブリダイゼーション後に第３のハイブリダイゼーションアレイを分析し、それにより標識した第２の参照ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより生じたシグナル強度を決定する、分析することとを含み得る。
【００２６】
本教示は、試験ハイブリダイゼーションアレイのシグナル強度を２つ以上の参照ハイブリダイゼーションアレイのうちの少なくとも１つのシグナル強度と比較することによりサンプルゲノムＤＮＡの少なくとも１つの領域に対するコピー数を推測する方法を提供する。
【００２７】
本教示の更なる特徴及び利点は続く本明細書に一部記載されているか、本明細書から一部明らかであるか、又は本教示の実施により知ることができる。本教示の目的及び他の利点は、本明細書及び添付の特許請求の範囲に具体的に言及された要素及び組合せにより実現又は達成される。
【００２８】
上述の概要及び以下の詳細な説明は両方とも例示及び説明的なものにすぎず、請求項に記載の本教示の更なる説明を提供することを意図することが理解されよう。
【００２９】
本願に組み込まれ、その一部を構成する添付の図面は、本教示の実施形態の一部を例示し、本明細書とともに本教示の原理を説明する働きがある。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本教示により試験ＤＮＡサンプルのコピー数を決定するための例示的な方法を記載するフローチャートである。
【図２】本教示により参照ＤＮＡサンプルのセットを調製するための例示的な方法を示すフローチャートである。
【図３】本教示により試験ＤＮＡサンプルのコピー数をどのように決定することができるかを示すフローチャートである。
【図４】本教示により２つの比プロファイルに基づき、試験ＤＮＡサンプルにおけるコピー数の変化の領域をどのように決定することができるかを示すフローチャートである。
【図５】上部のプロットは雄の参照と比較してサンプルを示し、下部のプロットは雌の参照と比較してサンプルを示す一対のプロットを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本教示は、異数性、又はより小さいコピー数の不均衡若しくはゲノムＤＮＡにおけるより小さい不均衡の存在を検出する方法に関する。本教示による異数性を検出する方法又はコピー数の不均衡の検出のための方法（「検出方法」）は卵バンキングの前に卵母細胞を分析するのに有用であり得る、又は体外受精手順を用いる着床の前に胚の細胞内の染色体の数及び補体を特定する着床前遺伝学的スクリーニング（ＰＧＳ）に有用であり得る。該検出方法は、増加又は減少したコピー数を含有する、試験のための胚を代表するものであるゲノムＤＮＡ（「試験ＤＮＡ」）における染色体領域を特定することができる。該検出方法は、試験ＤＮＡをハイブリダイゼーションアレイとハイブリダイズし、コピー数が既知である１つ又は複数のＤＮＡ分子（「参照ＤＮＡ」）を１つ又は複数の異なるハイブリダイゼーションアレイとハイブリダイズする、単一チャネルのアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（「単一チャネルのアレイＣＧＨ」）を用いることを含み得る。試験ＤＮＡにおけるコピー数の不均衡は、参照ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより生じるシグナル強度と、試験ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより生じるシグナル強度とが異なる領域を検出することにより特定することができる。本教示の様々な特徴は、国際公開第９６／１７９５８号、及び２００９年１０月３０日付けで提出された米国特許出願第１２／６０９，１５６号（これらの内容はその全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されたゲノムハイブリダイゼーションの方法、装置及びキットを含み得る。
【００３２】
該検出方法は、試験サンプルから得られる試験サンプルＤＮＡを標識し、それにより試験ＤＮＡを形成する、標識することと、標識した試験ＤＮＡを第１のハイブリダイゼーションアレイとハイブリダイズすることとを含み得る。試験サンプルＤＮＡを標識し、試験サンプルＤＮＡと第１のハイブリダイゼーションアレイとのハイブリダイゼーションの検出及び／又は測定を可能にすることができる。標識した試験ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより発生するシグナルを検出及び分析し、第１のハイブリダイゼーションアレイから生じたシグナル強度を決定し、それにより試験ハイブリダイゼーションの結果を得ることができる。試験ハイブリダイゼーションの結果を参照ハイブリダイゼーションの結果、すなわち１つ又は複数の参照ＤＮＡと、第１のハイブリダイゼーションアレイとは別の１つ又は複数の他のハイブリダイゼーションアレイとのハイブリダイゼーションにより発生するシグナル強度と比較することができる。例えば、参照ＤＮＡに対するシグナル強度は、参照ＤＮＡを標識し、標識した参照ＤＮＡを第２のハイブリダイゼーションアレイとハイブリダイズすることにより決定することができる。標識した参照ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより発生するシグナルを検出及び分析し、参照ＤＮＡのシグナル強度を決定することができる。試験ＤＮＡにおけるコピー数の不均衡の存在を、シグナル強度が第２のハイブリダイゼーションアレイの１つ又は複数の対応する領域で生じたシグナル強度と異なる第１のハイブリダイゼーションアレイの１つ又は複数の領域を特定することにより決定することができる。
【００３３】
標識した参照ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより生じたシグナル強度の決定を、標識した試験ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより生じたシグナル強度の決定前又は決定後に行うことができる。標識した参照ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより生じたシグナル強度の決定を、標識した試験ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより生じたシグナル強度の決定の前に行う場合、参照ハイブリダイゼーションの結果は過去の参照ハイブリダイゼーションの結果として記録及び記憶することができる。それから、後に試験サンプルＤＮＡで得られる試験ハイブリダイゼーションの結果を過去の参照ハイブリダイゼーションの結果と比較して、試験ＤＮＡにおけるコピー数の不均衡を決定することができる。過去の参照ハイブリダイゼーションの結果の使用により、特定の試験ハイブリダイゼーションの結果との比較が望まれるたびに参照サンプルに対して実際のハイブリダイゼーションを実施する必要がなくなり得る。
【００３４】
２つ以上の参照ＤＮＡ又は複数の参照ＤＮＡサンプルを検出方法に使用することができる。例えば、参照ＤＮＡのシグナル強度を決定した後に、第２の参照ＤＮＡのシグナル強度を決定することができる。第２の参照ＤＮＡのシグナル強度を、第２の参照ＤＮＡを標識し、それを第３のハイブリダイゼーションアレイとハイブリダイズすることにより決定することができる。標識した第２の参照ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより発生するシグナルを検出及び分析し、第２の参照ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより生じたシグナル強度を決定することができる。コピー数の不均衡の存在を、シグナル強度が第２のハイブリダイゼーションアレイ及び／又は第３のハイブリダイゼーションアレイの１つ又は複数の対応する領域で生じたシグナル強度と異なる第１のハイブリダイゼーションアレイの１つ又は複数の領域を特定することにより決定することができる。
【００３５】
試験サンプルのゲノムＤＮＡにおけるコピー数の不均衡の存在を決定する方法は、試験サンプル由来のサンプルゲノムＤＮＡ又はその増幅産物を標識し、それにより標識した試験ＤＮＡを形成する、標識することと、標識した試験ＤＮＡを第１のハイブリダイゼーションアレイとハイブリダイズすることと、参照サンプル由来の第１の参照ゲノムＤＮＡ、又はその増幅産物を標識し、標識した第１の参照ＤＮＡを形成する、標識することと、標識した第１の参照ＤＮＡを第２のハイブリダイゼーションアレイとハイブリダイズすることと、第２の参照サンプル由来の第２の参照ゲノムＤＮＡ、又はその増幅産物を標識し、標識した第２の参照ＤＮＡを形成する、標識することと、標識した第２の参照ＤＮＡを第３のハイブリダイゼーションアレイとハイブリダイズすることとを含み得る。該方法は、標識した試験ＤＮＡのハイブリダイゼーション後に第１のハイブリダイゼーションアレイを分析し、それにより標識した試験ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより生じたシグナル強度を決定する、分析することと、標識した第１の参照ＤＮＡのハイブリダイゼーション後に第２のハイブリダイゼーションアレイを分析し、それにより標識した第１の参照ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより生じたシグナル強度を決定する、分析することと、標識した第２の参照ＤＮＡのハイブリダイゼーション後に第３のハイブリダイゼーションアレイを分析し、それにより標識した第２の参照ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより生じたシグナル強度を決定する、分析することとを含み得る。コピー数は、第１のハイブリダイゼーションアレイのシグナル強度を、第２のハイブリダイゼーションアレイ及び第３のハイブリダイゼーションアレイのうちの少なくとも１つのシグナル強度と比較することによりサンプルゲノムＤＮＡの少なくとも１つの領域に対して推測することができる。
【００３６】
標識した第１の参照ＤＮＡは、標識した試験ＤＮＡに対する、ゲノムの１つ又は複数の所定の領域における少なくとも１つのコピー数の変化を含み得る。標識した第２の参照ＤＮＡは、標識した試験ＤＮＡに対する、標識した第１の参照ＤＮＡと同じコピー数の変化を有しない少なくとも１つの所定の領域を含み得る。幾つかの場合、標識した試験ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより生じたシグナル強度を、１つ又は複数の所定の領域における標識した第１の参照ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより生じたシグナル強度と比較し、標識した試験ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより生じたシグナル強度を、１つ又は複数の所定の領域における標識した第２の参照ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより生じたシグナル強度と比較し、該方法は、予測されるコピー数に基づき該方法のダイナミックレンジを決定することを更に含む。標識した第１の参照ＤＮＡは第１の種、例えばヒト等の哺乳動物の雄の動物由来のものであり、標識した第２の参照ＤＮＡは第１の種の雌の動物由来のものであり得る。標識した第１の参照ＤＮＡ及び標識した第２の参照ＤＮＡは、同じ種の動物の雄由来のＤＮＡと雌由来のＤＮＡとの混合物を含み得る。標識した第１の参照ＤＮＡはトリソミーを含み、第２の参照ＤＮＡはモノソミーを含み得る。幾つかの実施形態では、第１の参照ＤＮＡは任意の染色体上での小さい増幅を含み、第２の参照ＤＮＡはそのようなものを排除し得る。
【００３７】
標識した試験ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより生じたシグナル強度を、１つ又は複数の所定の領域における標識した第１の参照ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより生じたシグナル強度と比較し、それによりコピー数の第１の推測値を決定することができ、標識した試験ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより生じたシグナル強度を、１つ又は複数の所定の領域における標識した第２の参照ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより生じたシグナル強度と比較し、それによりコピー数の第２の推測値を求めることができ、コピー数の第１の推測値と第２の推測値とを組み合わせて、コピー数の総合的な推測値を得ることができる。幾つかの実施形態では、シグナル強度を正規化した後にコピー数を推測する。
【００３８】
幾つかの場合、参照サンプル由来の第１の参照ゲノムＤＮＡ又はその増幅産物は第１の増幅技法により生じた増幅産物を含み、参照サンプル由来の第２の参照ゲノムＤＮＡ又はその増幅産物は同じ第１の増幅技法により生じた増幅産物を含み得る。参照サンプル由来の第１の参照ゲノムＤＮＡ又はその増幅産物は、異なる出発濃度の同じ第１の参照ゲノムＤＮＡを増幅することによりそれぞれ生成される複数の異なる増幅産物を含み得る。該方法は、コピー数の推測値に基づきヒトの極体又は胚の異数性の状況を決定することを含み得る。該方法は、ＩＶＦ手順における着床のための胚を選択するのにコピー数の情報、例えば異数性の状況を使用することを更に含み得る。該方法は、試験サンプルからゲノムＤＮＡを単離し、サンプルゲノムＤＮＡ又はその増幅産物を形成する、単離することを含み得る。
【００３９】
試験サンプルは胚由来の少なくとも１つの細胞を含み得る。第１のゲノム参照ＤＮＡは、染色体異常を有する動物の組織又は細胞から得られるＤＮＡを含み得る。幾つかの実施形態では、第１のゲノム参照ＤＮＡは、モザイク組織又はモザイク細胞から得られるＤＮＡを含む。幾つかの場合、標識した第１の参照ＤＮＡは第１の濃度のＤＮＡを有し、正常な雄のＤＮＡを含み、標識した第２の参照ＤＮＡは第２の濃度のＤＮＡを有し、標識した第１の参照ＤＮＡと同じ正常な雄のＤＮＡを含み、第２の濃度は第１の濃度に比べると希釈されている。雌のＤＮＡを雄のＤＮＡの代わりに、又は雄のＤＮＡに加えて使用することができる。標識した第１の参照ＤＮＡは少なくとも２つの個体から採取した血液サンプルから抽出されるプールゲノムＤＮＡを含み得る。
【００４０】
本教示によれば、試験ＤＮＡを標識し、それにより標識した試験ＤＮＡを形成する、標識することと、標識した試験ＤＮＡを第１のハイブリダイゼーションアレイとハイブリダイズすることと、ハイブリダイゼーション後に第１のハイブリダイゼーションアレイを分析して、第１のハイブリダイゼーションの結果を得る、分析することと、第１のハイブリダイゼーションの結果を、標識した第１の参照ＤＮＡと第２のハイブリダイゼーションアレイとのハイブリダイゼーションによる過去の参照ハイブリダイゼーションの結果と比較することとを含む、試験サンプルのゲノムＤＮＡにおけるコピー数の不均衡の存在を決定する方法が提供される。該方法は、第１のハイブリダイゼーションの結果を、標識した第２の参照ＤＮＡと第３のハイブリダイゼーションアレイとのハイブリダイゼーションによる過去の参照ハイブリダイゼーションの結果と比較することと、シグナル強度が、第２のハイブリダイゼーションアレイ及び第３のハイブリダイゼーションアレイのうちの少なくとも１つの１つ又は複数の対応する領域において生じたシグナル強度と異なる第１のハイブリダイゼーションアレイの１つ又は複数の領域を特定することによりコピー数の不均衡の存在を決定することとを更に含み得る。標識した第１の参照ＤＮＡは、第１の種の雄の動物由来であり、標識した第２の参照ＤＮＡは、第１の種の雌の動物由来であり得る。
【００４１】
本教示は、プロセッサに記憶される参照アレイデータセットのライブラリも提供する。それぞれの参照アレイデータセットは、各参照アレイで実施されたコピー数ハイブリダイゼーションアッセイ中に各参照アレイから集められたデータを含み得るが、（１）各データセットが集められるそれぞれの参照アレイが、データセットが集められた互いの参照アレイと共通する要素を含み、（２）各データセットが集められるそれぞれのコピー数ハイブリダイゼーションアッセイを、データセットが集められた互いのコピー数ハイブリダイゼーションアッセイと１つ又は複数の異なる条件下で実施する。ライブラリの少なくとも２つの参照アレイデータセットが互いに異なり得る。幾つかの実施形態では、参照データセットの幾つかが、該技法における変動を評価するために同一の条件下で生成される。それぞれの参照アレイデータセットは蛍光シグナル強度のデータを含み得る。
【００４２】
本教示は、コピー数ハイブリダイゼーションアッセイ中に試験アレイから集められた試験アレイデータセットを、ライブラリの参照アレイデータセットと比較することと、シグナルプロセッサを用いて、試験アレイデータセットとライブラリ由来のデータセットとの比を決定する、用いることとを含む方法も提供する。ベストフィットデータセットは、ライブラリから決定することができ、このようにして得られた比のセットのＳＮＲを最大にするためにプロセッサにより決定される参照アレイデータセットであり得る。
【００４３】
本教示によれば、第１のコピー数ハイブリダイゼーションアレイと、第１のコピー数ハイブリダイゼーションアレイと同一の第２のコピー数ハイブリダイゼーションアレイと、第１のコピー数ハイブリダイゼーションアレイと同一の第３のコピー数ハイブリダイゼーションアレイと、第１の参照ゲノムＤＮＡと、第２の参照ゲノムＤＮＡと、第１のコピー数ハイブリダイゼーションアレイで実施されるハイブリダイゼーションアッセイから生じた試験結果を、第１の参照ゲノムＤＮＡを用いて第２のコピー数ハイブリダイゼーションアレイで実施されるハイブリダイゼーションアッセイから生じた試験結果と比較するための指示書とを備えるキットも提供される。指示書は、第１のコピー数ハイブリダイゼーションアレイで実施されるハイブリダイゼーションアッセイから生じる試験結果を、第２の参照ゲノムＤＮＡを用いて第３のコピー数ハイブリダイゼーションアレイで実施されるハイブリダイゼーションアッセイから生じた試験結果と比較するためのものでもあり得る。場合によっては、第１の参照ゲノムＤＮＡは参照ゲノムＤＮＡの増幅産物を含み得る。本教示は、コピー数ハイブリダイゼーションアレイと、複数の参照アレイデータセットを記憶する電子記憶媒体と、コピー数ハイブリダイゼーションアレイで実施されるハイブリダイゼーションアッセイから生じる試験結果に対応するデータセットを、複数の参照アレイデータセットと比較するための指示書とを備えるキットも提供する。
【００４４】
試験ＤＮＡサンプル及び参照ＤＮＡサンプルの測定を別々のハイブリダイゼーションアレイで行うことができるので、検出方法を実施するのに標識用の色素を対比させる必要がない。また、試験ＤＮＡを単に同時にハイブリダイズした参照ではなく、無限数の参照サンプルと比較することができる。このように、要求される数の比較を、試験サンプルに対して最適なアッセイの結果を決定するために実施することができる。
【００４５】
２つ以上の参照ＤＮＡの使用は、試験ＤＮＡと参照ＤＮＡとの適合不全によるアッセイの失敗の危険性を更に回避することができ、試験ＤＮＡと参照ＤＮＡとの単一の最適な対合の選択を可能にする。複数の参照ＤＮＡは単細胞のＤＮＡ増幅から得られる試験ＤＮＡと十分に適合した参照ＤＮＡを含み得る。換言すると、発生した広範な参照ＤＮＡから、試験ＤＮＡに対する最良の比較を与える単一の参照ＤＮＡを選択することができる。例えば、試験ＤＮＡと十分に適合した参照ＤＮＡを、増幅プロトコルにおける僅かな修正により広範な参照ＤＮＡサンプルを発生させることにより得ることができる。増幅プロトコルにおけるこのような僅かな修正により、技術的変動の広がりをもたらすことができる。加えて、発生される参照ＤＮＡは特定の既知の生物学的特性を有し得る。例えば、発生される参照ＤＮＡは、モザイク個体から、又は特定の性別の個体から誘導することができる。発生される参照ＤＮＡは１つ又は複数の染色体異常を有し得る。参照ＤＮＡは試験サンプルの条件に適合させるために損傷細胞（compromised cell）から誘導することができる。参照ＤＮＡは試験サンプルと生物学的に関連する個体から誘導することができる。
【００４６】
ハイブリダイゼーションアレイは、本明細書で使用する場合、マイクロアレイ、すなわち固体支持体と結合した非標識の標的核酸（プローブ）の集合体、例えば染色体位置にマッピングされたクローンのアレイを含み得る。ハイブリダイゼーションアレイは、固体支持体又は固体表面に結合した複数のプローブ又は標的核酸分子、例えば少なくとも２つの標的核酸分子を含み得る。標的核酸分子をそれぞれのプローブに対して別々の位置で固体表面上の所定の位置において組織化することができる。固体表面に結合した標的核酸分子は、複数の同じ標的核酸分子、複数の異なる核酸分子、又はその２つの組合せであり得る。例えば、検出アッセイを多重化する（すなわち２つ以上の核酸分子を一度に検出する）ことが望まれる実施形態では、異なる核酸分子と結合する複数の異なる標的核酸分子を使用することができる。固体表面は可撓性表面と剛性表面との両方を含む、アレイＣＧＨに好適な任意の表面であり得る。可撓性表面には、ナイロン膜が含まれ得るが、これに限定されない。剛性表面には、スライドガラスが含まれ得るが、これに限定されない。固体表面は、三次元マトリクス又は複数のビーズを更に含み得る。固体表面上に標的核酸を固定するための任意の好適な方法を使用することができる。
【００４７】
ＤＮＡのハイブリダイゼーションが本明細書で説明されているが、任意の種類の核酸、例えばＲＮＡ、ＤＮＡ又はｃＤＮＡを使用することができることが理解されるものとする。同様に、標的核酸分子又はプローブも、例えばＲＮＡ、ＤＮＡ又はｃＤＮＡであり得る。核酸を任意の生物から誘導することができる。プローブは合成オリゴヌクレオチドであり得るか、又はクローン化したＤＮＡ若しくはＰＣＲ産物から誘導することができる。オリゴヌクレオチドをｉｎ  ｓｉｔｕで合成するか、又は合成した後にｅｘ  ｓｉｔｕでアレイ化する（arrayed）ことができる。クローン化したＤＮＡは細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローン又はＰＩ誘導性人工染色体（ＰＡＣ）であり得る。核酸分子の配列は、疾患に関連することが知られている染色体位置を基にすることができ、疾患との関連性が試験される染色体領域を代表するものとなるように選択することができ、又は転写を化学分析する遺伝子に対応し得る。
【００４８】
参照ＤＮＡを標識して、ハイブリダイゼーションアレイとハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーションアレイを洗浄して、あらゆる非特異的に結合した標識物質を除去することができる。それからハイブリダイゼーションアレイをスキャンすることができ、参照ＤＮＡのシグナル強度を試験ＤＮＡサンプルに対する試験ハイブリダイゼーションの結果とのその後の比較のために過去の参照ハイブリダイゼーションの結果として記録及び記憶することができる。同様に、複数の異なる参照ＤＮＡに対して一組の過去の参照ハイブリダイゼーションの結果を生成し、記録させることができる。複数の参照ＤＮＡサンプルを標識し、同じアレイ設計を有する別個のハイブリダイゼーションアレイと個々にハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーションアレイをスキャンすることができ、スキャンしたデータを過去の参照ハイブリダイゼーションの結果に変換し、後の使用のために記憶することができる。過去の参照ハイブリダイゼーションの結果を記録することができるため、複数の参照ＤＮＡのハイブリダイゼーションを何度も行う必要はない。過去の参照ハイブリダイゼーションの結果を、１つ又は複数の異なる試験ＤＮＡを用いてその後のアッセイに繰り返し使用することができる。試験ＤＮＡを標識し、過去の参照ハイブリダイゼーションの結果を得るのに使用されるハイブリダイゼーションアレイと同じアレイ設計を有するハイブリダイゼーションアレイとハイブリダイズすることができる。過去の参照ハイブリダイゼーションの結果を、コンピュータを用いて又は電子記憶媒体に入れてエンドユーザーに転送することができる。
【００４９】
「スキャニング」は、本明細書で使用される場合、サンプルとハイブリダイゼーションアレイとのハイブリダイゼーションの検出を可能にするスキャナーにより実施される任意の従来型の方法を表すことが理解されるものとする。スキャニングは、例えばスキャナーの光源からの光の放出、及びスキャナーの検出器でハイブリダイゼーションアレイの各位置から反射する放出光を受け取ることを含み得る。幾つかの実施形態では、スキャニングは、例えばマイクロアレイ上での蛍光色素の励起、及びスキャナーの検出器での放出された蛍光の強度の測定を含み得る。スキャニングは、例えば国際公開第９６／１７９５８号、及び２００９年１０月３０日付けで提出された米国特許出願第１２／６０９，１５６号（それぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される）で更に説明されている。
【００５０】
図１は、試験ＤＮＡサンプルのコピー数を決定する一方法を示すフローチャートである。図１に示されるように、標識した試験ＤＮＡサンプルをハイブリダイゼーション区域Ａとハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーションにより発生されるシグナル強度又はシグナル振幅を測定し、試験ＤＮＡサンプルの振幅プロファイルを構築することができる。試験ＤＮＡサンプルの振幅プロファイルを正規化することができる。参照ＤＮＡサンプルのセットを選択し、ハイブリダイゼーション区域Ａ以外のハイブリダイゼーション区域と別々にハイブリダイズすることができる。それぞれの参照ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより発生されるシグナル強度又はシグナル振幅を測定し、参照ＤＮＡの振幅プロファイルを構築することができる。参照ＤＮＡの振幅プロファイルを正規化することができる。試験ＤＮＡサンプルに対するコピー数を、試験ＤＮＡサンプルの振幅プロファイルを参照ＤＮＡの振幅プロファイルと比較することにより決定することができる。幾つかの実施形態では、同一のアレイとは、多くの同じ内容物、例えば少なくとも９０％の同じ内容物を含むが、他の内容物が異なり得るアレイを意味する。同様に、僅かに変更した増幅手順も使用することができ、これも依然として同一のものであるとみなされる。
【００５１】
幾つかの実施形態では、それぞれの参照ＤＮＡは関連した振幅プロファイルを有する。それからコピー数の初期推測値を、試験ＤＮＡの振幅と参照の振幅（又は複数の参照の振幅）との比をとること、及び場合によっては様々な正規化により決定する。このコピー数の推測値には必然的にノイズがあり、更なる工程を用いて、推測したコピー数が生物学的なコピー数の真の変化に対応すると考えられるか、又は単純にノイズによるもの（したがってコピー数はゼロ）であるのかを決定することができる。
【００５２】
複数の異なる参照ＤＮＡは、特定の既知の生物学的特性を有する参照ＤＮＡを含み得る。例えば、参照ＤＮＡを雄又は雌のサンプルから得ることができる。参照ＤＮＡを所望の染色体異常を有する細胞株から得ることができる。参照ＤＮＡをモザイクサンプルから得ることができる。合成によるモザイク参照サンプルを、モザイク核型パターンを複製するように、細胞又は抽出ＤＮＡを異なるが既知の核型と組み合わせることにより構築することができる。この組合せは参照ＤＮＡの調製中、又は標識後のいずれの段階でも実施することができる。
【００５３】
参照ＤＮＡは試験サンプルの条件に適合させるために損傷細胞から誘導することができる。参照ＤＮＡは試験サンプルを採取した個体に生物学的に関連する個体から誘導することができる。
【００５４】
試験ＤＮＡを、研究中の試験サンプル、例えば試験細胞、試験細胞集団、又は試験組織から調製することができる。試験ＤＮＡを１つ又は複数の試験細胞から単離することができる。試験ＤＮＡを、卵の染色体補体の半分が受精前に放出された極体から得ることができる。試験ＤＮＡを、割球、８細胞期の胚から抽出された単細胞、又は胚盤胞若しくは関連の生検材料、例えば栄養外胚葉（trophoectoderm）の生検材料由来の少数の細胞から得ることができる。試験細胞は胚由来の少なくとも１つの細胞を含み得る。ＤＮＡ増幅手順を、試験ＤＮＡの多くのコピー数を生じるために使用することができる。
【００５５】
参照ＤＮＡを、参照細胞、参照細胞集団、又は参照組織から調製することができる。参照細胞は正常な非罹患細胞であり得るか、又は疾患の他の態様の標準として働く罹患組織のサンプル由来であり得る。参照ＤＮＡは対象の遺伝子又は核酸分子のコピー数が既知であるゲノム材料である。
【００５６】
参照ＤＮＡは、多様な出発材料を用いて生成することができる。出発材料の例としては、１つ又は複数の個体から提供される組織、例えば血液が挙げられ得る。出発材料の他の供給源には単細胞が含まれ得る。標準的な手順を用いて、参照ＤＮＡを適切な組織又は細胞から単離することができる。参照ＤＮＡ又は出発材料は、正常な染色体を有する個体、及び／又は染色体異常、例えば１つ若しくは複数の染色体の過剰若しくは減少、若しくは代替的には１つ若しくは複数の染色分体の過剰若しくは減少を有する個体から選ぶことができる。単細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞培養物から誘導することができるか、又は意図される試験サンプルと同じタイプ又は異なるタイプのいずれかのｅｘ  ｖｉｖｏヒト細胞であり得る。単細胞は、意図される試験サンプルのものに類似した又は類似していないクロマチン構造を有するため選択することができる。例えば高密度クロマチンを有する精子細胞を選択することができる。同様に細胞周期の異なる段階にある細胞を選ぶことができる。代替的に、高品質で濃縮されたゲノム参照ＤＮＡを細胞培養物又は血液から抽出することができ、単細胞から得られる濃度に匹敵するレベルまで抽出後に希釈することができる。
【００５７】
参照ＤＮＡを得るのに使用される材料のドナーと試験サンプルとの間の家族性の関係が存在する場合があるが、このような関係は必要というわけではない。参照材料を試験サンプルと親サンプルとの間の直接比較を行うことができるように、片親又は両親から得ることができる。
【００５８】
多様な条件を用いて、異なる品質の複数の参照ＤＮＡを生成することができる。参照ＤＮＡを異なる完全性の細胞から生成することができる、例えば参照サンプルを損傷細胞から生成する。参照ＤＮＡ、例えばホルマリン固定したパラフィン包埋組織から抽出したＤＮＡをサンプル回収後に処理することができる。参照ＤＮＡを物理的処理、例えば加熱処理又は超音波処理にかけることができる。化学処理、例えば酵素消化又はプロテイナーゼ消化を使用することもできる。、ＩＶＦ手順中の試験サンプル条件をシミュレートする他の処理を行うことができる。このような処理には、任意の寄与を正規化するための鉱油混入及び培養培地の混入が含まれ得る。これらの因子が試験サンプルと参照サンプルとの間のアッセイ性能に差異をもたらす。
【００５９】
参照ＤＮＡの調製は全ゲノム増幅の適用を伴い得る。全ゲノム増幅プロトコルを、増幅ＤＮＡ産物に変動を導入させるように変えることができる。増幅のために、ＳＵＲＥＰＬＥＸのＤＮＡ増幅又は他の好適な増幅を使用することができる。使用するＤＮＡ増幅の正確な性質は本教示に重要ではない。増幅していないゲノム参照ＤＮＡを使用することができるが、増幅した試験ＤＮＡと増幅していない参照ＤＮＡとの適合不全により、高いノイズレベルが生じる場合がある。このため、使用する参照材料は少数の単細胞とさほど変わらない量のＤＮＡを含有するように希釈した「正常な」プールＤＮＡサンプルであり得る。それからこの希釈した参照材料を、試験サンプルと同じ方法を用いて増幅することができる。試験ＤＮＡ及び参照ＤＮＡの増幅の間の差異を補うために、参照サンプルのセットを、適合不全に関与する変動の空間に広がるように慎重に構築することができる。この戦略は従来型のアレイＣＧＨと関連する、試験サンプルと参照サンプルとの適合不全によるアッセイの失敗の危険性を低減することができる。本明細書に記載のように、試験サンプル及び参照サンプルの測定を分離することにより、単一の試験サンプルで得られる測定値と一連の参照サンプルで得られる測定値との比較が可能になる。このようにして、試験サンプルと参照サンプルとの単一の最適な対合を見つけることができる、又は代替的に複数の比較による結果を組み合わせて、試験ＤＮＡと比較することができる。
【００６０】
図２は参照ＤＮＡサンプルのセットを調製するための例示的な方法を示すフローチャートである。図２に示すように、参照ＤＮＡサンプルのセットを作製するのに使用される増幅プロトコルを変えることにより変動を参照ＤＮＡに導入することができる。多くの同一の参照ＤＮＡサンプル対を構築することができる。それぞれの参照ＤＮＡサンプル対は、正常な雄の参照ＤＮＡと、正常な雌の参照ＤＮＡとを含み得る。それぞれのサンプル対を、連続希釈物を作製するために異なる程度まで希釈することができる。対となる（with a pair）それぞれの参照ＤＮＡを同じ程度まで希釈することができる。それぞれのサンプル対のそれぞれの参照ＤＮＡを、試験ＤＮＡを増幅するのに使用されるものと同じ増幅方法を用いて別々に増幅することができる。
【００６１】
試験ＤＮＡ及び参照ＤＮＡを標識して、ハイブリダイゼーション複合体の検出を可能にすることができる。ＤＮＡに結合した特定の標識は、該標識がＤＮＡと標的核酸分子とのハイブリダイゼーションに著しく干渉しなければ、本教示の重要な態様ではない。標識は、検出可能な物理的特性又は化学的特性を有する任意の材料であり得る。標識には、例えば、蛍光色素、放射性標識又は酵素が含まれ得る。概して、アレイＣＧＨに一般的に用いられる蛍光標識、例えばＣｙ３及びＣｙ５が好ましい。例えばBLUEGNOME製のＣＹＴＯＣＨＩＰ標識キットを使用することができる。標識により発生するシグナルの検出及び分析のための標準的な方法を使用することができる。蛍光標識には、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（「アレイＣＧＨ」）に一般的に用いられる標準的な方法を使用することができる。ハイブリダイゼーションアレイを、多色ビームスプリッタを備える蛍光顕微鏡で画像化することができる。様々なカラー画像をＣＣＤカメラ、レーザースキャナー、その組合せ等を用いて取得することができ、デジタル画像をコンピュータに記憶することができる。それから、コンピュータプログラムを用いて、アレイにより生じたシグナルを分析することができる。
【００６２】
試験ＤＮＡと参照ＤＮＡとの単一の最適な対合の選択、及び試験ＤＮＡにおけるコピー数の不均衡の決定を自動化して、データの分析及び解釈を簡略化し、かつ／又は再現性を増大させることができる。参照データの選択及びアッセイのスコアリングを自動化させるルゴリズムのセットを提供することができる。これらのアルゴリズムにより、データの分析、解釈を簡略化し、かつ／又は再現性を増大させることができる。アルゴリズムは、参照選択アルゴリズムと、呼び出し（calling）アルゴリズムとを含み得る。参照選択アルゴリズムは、試験ＤＮＡに対する試験ハイブリダイゼーションの結果を一組の対応する過去の参照ハイブリダイゼーションの結果と比較し、複数の参照ＤＮＡのうちどの参照ＤＮＡが試験ＤＮＡとの最良の比較をもたらすかを決定することができる。
【００６３】
このような事象において、検出方法では、アレイ間のハイブリダイゼーションの変動、及び／又は異なる日にちでのサンプルのハイブリダイゼーションのために空間ノイズが問題となることがある。このような場合、検出方法は、空間バイアス補正のための方法、又はアレイ間のハイブリダイゼーションに関して空間的に補正するための方法を含み得る。試験ＤＮＡ及び参照ＤＮＡのハイブリダイゼーションの差異のために存在し得る任意の空間バイアスを、当該技術分野で既知の方法により、例えば２００９年１０月３０日付けで提出された米国特許出願第１２／６０９，１５６号（この内容はその全体が参照により本明細書中に援用される）に記載のように検出及び除去することができる。
【００６４】
参照選択アルゴリズムは、性能測定基準とのそれぞれの試験／参照比較の結果を特徴付けることができる。性能測定基準は、例えばシグナル対ノイズ比であり得る。シグナル構成要素は、比が試験と参照との間にあるハイブリダイゼーションアレイの選ばれた染色体対のｌｏｇ２比の中央値間の差異と定義することができる。ノイズ構成要素を、それぞれの染色体に対するハイブリダイゼーションアレイにおいて標的核酸又はプローブのセットをとり、それぞれの個々のプローブのｌｏｇ２比から染色体の中央値のｌｏｇ２比を減算することにより得ることができる。染色体の傾向が取り除かれれば、ノイズを全てのプローブにわたる四分位範囲を算出することにより決定することができる。
【００６５】
参照選択アルゴリズムにより、試験ＤＮＡにおけるコピー数の指標であるレシオメトリックデータのＳＮＲが最大となる参照ＤＮＡを選択することができる。それから、試験−参照の対合を呼び出しアルゴリズムへと自動的に提示させることができる。呼び出しアルゴリズムを適用し、試験サンプルと参照サンプルとの間のコピー数の不均衡領域を特定することができる。呼び出しアルゴリズムにより、観察される不均衡のパターンを、予測される不均衡のパターンと比較することができる。参照サンプルの核型が知られているため、それにより試験サンプルの核型を推測することができる。サンプルの最終的な分類は、「正倍数体」（コピー数の不均衡がない）又は「異数体」（コピー数の不均衡がある）のいずれかであり得る。幾つかの場合、試験データは品質が低い場合があり、そのため得られる任意の結果には信頼性がない。これらの状況では、呼び出しアルゴリズムは、該結果を「結果なし」に分類するものとする。
【００６６】
図３は、試験ＤＮＡサンプルのコピー数をどのように決定することができるかを示すフローチャートである。図３に示されるように、仮の比プロファイルのセットを、試験ＤＮＡサンプルの振幅プロファイルをそれぞれの参照ＤＮＡの参照ＤＮＡの振幅プロファイルで除算することにより構築することができる。それぞれの仮の比プロファイルの「ノイズ」及び「ダイナミックレンジ」を算出することができる。ダイナミックレンジをＸ／Ｙ染色体の比に基づき算出することができる。低いノイズと予測されるダイナミックレンジとの最良の組合せを有する比プロファイルの対を参照サンプル対に対応して選択することができる。換言すると、試験ＤＮＡと参照ＤＮＡとの対の最良の「増幅」適合を選択することができる。呼び出しアルゴリズムを用いて、比プロファイルの対に基づき試験ＤＮＡにおけるコピー数の変化の領域を決定することができる。
【００６７】
試験ＤＮＡが単離される試験サンプルが第一極体由来である場合、参照ＤＮＡと試験ＤＮＡとの最適な対合を作製することができるが、他に概説される理由から第二極体を選択することが依然として望まれ得ることを理解すべきである。試験ＤＮＡがサンプルの性別が事前に分かっていない割球生検材料から単離される場合、参照選択アルゴリズムにより、２つの最適な対合を選択することができる。幾つかの実施形態では、無限数の対合を選ぶことができる。試験ＤＮＡが割球生検材料から単離される場合、参照ＤＮＡは様々な品質の雄のゲノムＤＮＡ及び雌のゲノムＤＮＡを含み得る。２つの最適な対合は試験ＤＮＡと雄の参照ＤＮＡとの対合、試験ＤＮＡと雌の参照ＤＮＡとの対合を含み得る。それから呼び出しアルゴリズムにより、対合の一方又は両方に存在するコピー数の不均衡を特定することができる。これらの不均衡を、予想される不均衡のパターンと比較することができる。両方の参照サンプルの核型が既知であるため、試験サンプルの核型を推測することができる。
【００６８】
図４は、２つの比プロファイルに基づく試験ＤＮＡサンプルにおけるコピー数の変化の領域をどのように決定することができるかを示すフローチャートである。図４に示すように、正常な試験ＤＮＡサンプルのハイブリダイゼーション後のシグナル強度を正常な雄及び雌の参照ＤＮＡのシグナル強度と比較し、コピー数の不均衡を決定することができる。試験ＤＮＡサンプルは試験ＤＮＡと同じコピー数を有する参照ＤＮＡと同じ性別であり得る。正常な試験ＤＮＡと正常な雄の参照ＤＮＡとの比プロファイル、及び試験ＤＮＡと、正常な雌の参照ＤＮＡとの比プロファイルを得ることができる。それぞれの比プロファイルでは、アルゴリズムを用いて、試験ＤＮＡにおける潜在的に有意な異常領域、換言するとプロファイルにおけるベースラインノイズよりも有意に大きい異常領域を決定することができる。真のコピー数変化と一致する有意な比のレベルを、試験ＤＮＡサンプル及びその性別を不適合させた参照ＤＮＡに対応する比プロファイルにおけるＸ／Ｙ比を考慮することにより決定することができる。先の段階で得られた有意な比レベルを用いて、それぞれの異常領域が真のコピー数変化に一致するか又は一致しないかを決定することができる。個々の比プロファイルからのコピー数の呼び出しを組み合わせて、例えば平均化することにより試験ＤＮＡに対する単一のコピー数呼び出しを形成することができる。しかしながら、Ｘ染色体領域及びＹ染色体領域の呼び出しは選択的に、サンプルと参照との性別適合に一致した比プロファイルに基づき得ることを理解すべきである。
【００６９】
２つ以上の試験ＤＮＡを同じハイブリダイゼーション区域とハイブリダイズすることができる。例えば、２つ以上の試験ＤＮＡサンプルを異なる色素で標識し、同じハイブリダイゼーション区域とハイブリダイズすることができる。
【００７０】
幾つかの実施形態では、試験サンプルは雄であり、第１の参照は雌であり、第２の参照は雄である。幾つかの場合、試験サンプルは雌であり、第１の参照は雄であり、第２の参照は雌である。いずれの場合であっても、第１の参照を用いて、全ての染色体を検出するのに使用することができるダイナミックレンジを決定することができ、第２の参照をＸ／Ｙでの呼び出しに使用することができる。サンプルの性別が分からないことにより生じる課題に対処するために、試験サンプルが極体である場合、雌の参照及び雄の参照の両方を使用することができ、このようにして１つの参照をサンプルに適合させ、もう１つの参照がダイナミックレンジ情報を提供する。
【００７１】
「コピー数」は本明細書で使用する場合、参照ゲノムに対して相対的なものであることを理解すべきである。例えば、参照が雄のＤＮＡと雌のＤＮＡとの混合物である場合、コピー数は必ずしも整数でなくてもよい。幾つかの場合、三倍体参照を標準として使用することができるが、異なるコピー数を有したままである。
【００７２】
本教示によれば、第１の参照は第１の規定の参照におけるコピー数の変化を含むサンプルの増幅産物である。幾つかの実施形態では、第１の参照は第１の規定の領域の増幅産物であり、第２の参照は規定の領域における変化ではなく規定の領域における欠失を有する。
【００７３】
本教示によれば、異なる標識を使用する場合、第１、第２、第３及び任意の他のハイブリダイゼーション区域は同じにすることができる。
【００７４】
本明細書に記載の方法はＩＶＦのために設計されているが、該方法を出生前診断に、腫瘍学に及び／又は幹細胞に関連して適用することもできる。さらに検出方法により、様々な増幅条件下で様々なモザイク現象の程度を示す多数の参照の使用が可能となる。
【００７５】
サンプルの性別が既知であったとしても、性別を適合させた参照と性別不適合させた参照との両方に対してサンプルを使用することが可能であることが依然として一般的に有用である。例えば、極体を試験する場合、サンプルが雌であれば、雄参照が内部ダイナミックレンジ対照を得るための参照の事実上の選択肢（defacto choice）であることが分かっている。しかしながら、これには、極体のＸ染色体及びＹ染色体の解釈を複雑にするという悪影響があるとされる。そのため依然として、性別の不適合は、ダイナミックレンジを算出するのに使用され、第１染色体〜第２２染色体での呼び出しを提供し、性の適合は、全ての染色体を呼び出すのに使用されるという利点がある。
【００７６】
幾つかの場合、所定の領域において、少なくとも１つの参照サンプルが試験サンプルとのコピー数の差異を有する。このコピー数の差異を「対照」として使用し、実験のダイナミックレンジ（対象となる個々の試験サンプル及びハイブリダイゼーション条件に依存する）を効果的に示すことができる。例えば、「１つ」のコピー数の差異が試験サンプルと参照における特定の所定の領域との間で予測される場合、実験的な理由から差異は僅か「０．２５」であり、０．２５が特定の実験において有意であり得るという、実験のダイナミックレンジに関する情報が与えられる。それからこのダイナミックレンジの推測値、又は有意性」を用いて、他の参照データセットにおけるコピー数の変化、又は同じ参照データセットで異なる染色体を評価することができる。
【実施例】
【００７７】
第１３染色体及び第１９染色体の１つのコピーが欠失した正常な雌を含むサンプルを準備した。図５は、それぞれの上部プロットが雄参照と比較したサンプルを示し、それぞれの下部プロットが雌参照と比較したサンプルを示す一組のプロットを示す。図５の上部プロットでは、サンプルを雄参照と比較し、Ｘ染色体は、雌でＸの２つのコピーが存在し、雄参照では１つだけであるため過剰を示し、同様にＹ染色体は、雌ではＹがなく、雄参照では１つあることから減少を示す。これらの予測されるＸ／Ｙ変化は、有意であるものの指標を与える。第１３染色体及び第１９染色体は明らかに欠失している。
【００７８】
図５の下部プロットは、雌参照と比較した同じサンプルを示す。この場合、Ｘ染色体及びＹ染色体の数は、サンプルと参照との両方で同じであると予測される。ここでもまた、特に上部プロットにおけるＸ／Ｙ比較により得られたダイナミックレンジに関する情報と組み合わせた場合に、第１３染色体及び第１９染色体での減少を見ることができる。
【００７９】
本開示における全ての引用文献はその内容全体が参照により本明細書中に援用される。さらに、量、濃度又は他の値若しくはパラメータが、範囲、好ましい範囲又は上側の好ましい値及び下側の好ましい値のリストのいずれかとして挙げられる場合、これは、範囲が別々に開示されているかに関係なく、任意の上側の範囲限定又は好ましい値と、任意の下側の範囲限定又は好ましい値との任意の対からなる全ての範囲を具体的に開示していることを理解されたい。数値の範囲が本明細書中に列挙される場合、特に指定のない限り、その範囲は、その端点、並びに範囲内の全ての整数及び小数を含むことを意図する。範囲を規定する場合、本教示の範囲が記載の特定の値に限定されることを意図するものではない。
【００８０】
本教示の他の実施形態は、本明細書及び本明細書中に開示される本教示の実施を考慮することにより、当業者に明らかとなるであろう。本明細書及び実施例は、例示的なものにすぎないと見なされ、本教示の真の範囲及び精神は添付の特許請求の範囲及びその均等範囲によって示されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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