(57)【要約】【課題】本発明は、1つ又は複数のインターカレータ分子を含む相補的プローブによる一本鎖標的ポリヌクレオチドの特異的捕捉のための技術に関する。【解決手段】方法は、相補的プローブとの相互作用の前に、一本鎖標的ポリヌクレオチド内の1つ又は複数の種類の塩基を除去することを更に含む。これにより、インターカレータ分子との相互作用及び/又はインターカレータ分子の挿入が可能な1つ又は複数の脱塩基部位が生成される。【選択図】図1【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料から標的ポリヌクレオチドを捕捉する方法であって、
(i)塩基A、T、U、C、又はG、5-ヒドロキシメチル-dC、5-メチルシトシン(m5C)、プソイドウリジン(Ψ)、ジヒドロウリジン(D)、イノシン(I)、7-メチルグアノシン(m7G)、ヒポキサンチン、キサンチン、及びその2’-O-メチル誘導体及び/又はN-メチル誘導体のうちの1つ又は複数の種類を、前記標的ポリヌクレオチドから除去することにより、1つ又は複数の脱塩基部位を生成するステップと、
(ii)ポリヌクレオチドプローブの骨格構造に挿入され且つ相補的ポリヌクレオチド標的配列の1つ又は複数の脱塩基部位に形態学的に入り込む1個又は複数のインターカレータ分子を含む相補的プローブにより、前記標的ポリヌクレオチドを捕捉するステップと、を備え、
前記標的ポリヌクレオチドは、自然発生ヌクレオチド或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得るものであり、したがって、前記標的ポリヌクレオチドは、例えば、RNA、α-L-RNA、β-D-RNA、2’-R-RNA、DNA、LNA、PNA、PMO、TNA、GNA、オリゴヌクレオチドN3’→P5’ホスホルアミダート、BNA、α-L-LNA、HNA、MNA、ANA、CAN、INA、CeNA、(2’-NH)-TNA、(3’-NH)-TNA、α-L-リボ-LNA、α-L-キシロ-LNA、β-D-リボ-LNA、β-D-キシロ-LNA、[3.2.1]-LNA、ビシクロ-DNA、6-アミノ-ビシクロ-DNA、5-エピ-ビシクロ-DNA、α-ビシクロ-DNA、トリシクロ-DNA、ビシクロ[4.3.0]-DNA、ビシクロ[3.2.1]-DNA、ビシクロ[4.3.0]アミド-DNA、β-D-リボピラノシル-NA、α-L-リキソピラノシル-NA、2’-OR-RNA、2’-AE-RNA、及びそれらの組み合わせ及び修飾物から成る群から選択されたもの等のヌクレオチドにより形成され得る、方法。
【請求項２】
(i)例えばDNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る二本鎖標的ポリヌクレオチドを提供するステップと、
(ii)例えばDNA等の前記二本鎖標的ポリヌクレオチドから1つ又は複数の種類の塩基を除去して、例えばDNA等の前記二本鎖標的ポリヌクレオチドを不安定化することにより、1つ又は複数の脱塩基部位を生成するステップと、
(iii)例えばDNA等の前記不安定化した二本鎖標的ポリヌクレオチドを変性させ、例えばDNA等の一本鎖標的ポリヌクレオチドにするステップと、
(iv)ポリヌクレオチドプローブの骨格構造に挿入され且つ相補的ポリヌクレオチド標的配列の1つ又は複数の脱塩基部位に形態学的に入り込む1個又は複数のインターカレータ分子を含む、例えばDNAプローブ等の相補的ポリヌクレオチドプローブにより、例えばDNA等の前記一本鎖標的ポリヌクレオチドを捕捉するステップと、を備える、請求項1に記載の一本鎖標的DNAを捕捉する方法。
【請求項３】
前記相補的プローブは、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得るポリヌクレオチドにより形成され得るものであり、したがって、前記相補的プローブは、例えば、RNA、α-L-RNA、β-D-RNA、2’-R-RNA、DNA、LNA、PNA、PMO、TNA、GNA、オリゴヌクレオチドN3’→P5’ホスホルアミダート、BNA、α-L-LNA、HNA、MNA、ANA、CAN、INA、CeNA、(2’-NH)-TNA、(3’-NH)-TNA、α-L-リボ-LNA、α-L-キシロ-LNA、β-D-リボ-LNA、β-D-キシロ-LNA、[3.2.1]-LNA、ビシクロ-DNA、6-アミノ-ビシクロ-DNA、5-エピ-ビシクロ-DNA、α-ビシクロ-DNA、トリシクロ-DNA、ビシクロ[4.3.0]-DNA、ビシクロ[3.2.1]-DNA、ビシクロ[4.3.0]アミド-DNA、β-D-リボピラノシル-NA、α-L-リキソピラノシル-NA、2’-OR-RNA、2’-AE-RNA、及びそれらの組み合わせ及び修飾物から成る群から選択されたもの等のヌクレオチドにより形成され得る、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項４】
更に、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る未結合ヌクレオチド材料を除去するために、1回又は複数回の洗浄ステップを含む、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項５】
更に、前記二本鎖標的ポリヌクレオチド内の1つ又は複数の種類の塩基を、別の化学成分に変換することを含む、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項６】
更に、前記二本鎖標的ポリヌクレオチドから1つ又は複数の化学成分を除去して、前記二本鎖標的ポリヌクレオチドを不安定化することを含む、請求項5記載の方法。
【請求項７】
更に、前記標的ポリヌクレオチド内の1個又は複数のCを1個又は複数のUに変換することを含む、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項８】
前記標的ポリヌクレオチド内の1個又は複数のCから1個又は複数のUへの前記変換は、重亜硫酸塩処理により行われる、請求項7記載の方法。
【請求項９】
前記二本鎖標的ポリヌクレオチド及び/又は一本鎖ポリヌクレオチドから、Aを除去する、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
前記二本鎖標的ポリヌクレオチド及び/又は一本鎖ポリヌクレオチドから、Tを除去する、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
前記二本鎖標的ポリヌクレオチド及び/又は一本鎖ポリヌクレオチドから、Cを除去する、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
前記二本鎖標的ポリヌクレオチド及び/又は一本鎖ポリヌクレオチドから、Gを除去する、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項１３】
前記二本鎖標的ポリヌクレオチド及び/又は一本鎖ポリヌクレオチドから、Uを除去する、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項１４】
前記除去は、1つ又は複数の酵素及び/又は物理的応力及び/又は温度変化により行われる、請求項9乃至13の何れかに記載の方法。
【請求項１５】
Uの前記除去は、ウラシルデヒドロゲナーゼを用いて行われる、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
Aの前記除去は、pH値の調節により行われる、請求項9記載の方法。
【請求項１７】
前記標的ポリヌクレオチドから、1、2、又は3種類の前記塩基を除去する、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項１８】
前記標的ポリヌクレオチドから除去する塩基の総数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、及び21個以上から成る群から選択することができる、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項１９】
前記相補的プローブは、1個又は複数のインターカレータ分子を含む、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項２０】
インターカレータ分子の総数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、及び21個以上から成る群から選択することができる、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
前記標的DNA及び/又はRNA内の脱塩基部位の10％乃至100％、例として10％乃至20％、例えば20％乃至30％、例として30％乃至40％、例えば40％乃至50％、例として50％乃至60％、例えば60％乃至70％、例として70％乃至80％、例えば80％乃至90％、例として90％乃至100％、又はそれらの任意の組み合わせにおいて、インターカレータ分子が挿入された状態となる、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項２２】
前記標的DNA及び/又はRNA内の脱塩基部位の10％超、例として20％超、例えば30％超、例として40％超、例えば50％超、例として60％超、例えば70％超、例として80％超、例えば90％超、例として95％超、例えば100％において、インターカレータ分子が挿入された状態となる、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項２３】
前記インターカレータ分子の挿入により、前記標的ポリヌクレオチドと前記相補的プローブとから成るポリヌクレオチド二重鎖の融解温度が上昇する、請求項21及び22記載の方法。
【請求項２４】
前記相補的プローブ内のインターカレータ分子の数と塩基の総数との間の比は1:50乃至1:2、例として1:50乃至1:40、例えば1:40乃至1:30、例として1:30乃至1:20、例えば1:20乃至1:10、例として1:10乃至1:5、例えば1:5乃至1:2、又はこれらの間隔の任意の組み合わせとなる、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項２５】
前記1つ又は複数のインターカレータ分子は、TINA、INA、ortho-TINA、para-TINA、及びAMANYから成る群から選択することができる、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項２６】
前記インターカレータ分子の大きさは、20乃至400Å、例として20乃至40Å、例えば40乃至60Å、例として60乃至80Å、例えば80乃至100Å、例として100乃至120Å、例えば120乃至140Å、例として140乃至160Å、例えば160乃至180Å、例として180乃至200Å、例えば200乃至220Å、例として220乃至240Å、例えば240乃至260Å、例として260乃至280Å、例えば280乃至300Å、例として300乃至320Å、例えば320乃至340Å、例として340乃至360Å、例えば360乃至380Å、例として380乃至400Å、又はこれらの間隔の任意の組み合わせである、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項２７】
前記相補的プローブは、2種類以上のインターカレータ分子、例として2種類、3種類、4種類、5種類、又は5種類以上の異なるインターカレータ分子を含む、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項２８】
前記相補的プローブは、支持体に結合させる、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項２９】
前記支持体は、ポリ(エーテルエーテルケトン)(PEEK)、PP(ポロプロピレン)、PE(ポリエチレン)、ポリ(エチレンテレフタレート)(PET)、ポリ(ビニルクロライド)(PVC)、ポリアミド/ナイロン(PA)、ポリカーボネート(PC)、環状オレフィン共重合体(COC)、濾紙、綿、セルロース、ポリ(4-ビニルベンジルクロライド)(PVBC)、ポリ(ビニリデンフルオライド)(PVDF)、ポリスチレン(PS)、Toyopearl(登録商標)、ヒドロゲル、ポリイミド(PI)、1,2-ポリブタジエン(PB)、LSR(液状シリコーンゴム)、ポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS)、フッ素重合体及び共重合体(例えばポリ(テトラフルオロエチレン)(PTFE)、ペルフルオロエチレンプロピレンコポリマ(FEP)、エチレンテトラフルオロエチレン(ETFE))、ポリ(メチルメタクリレート)(PMMA)ナノ多孔性材料、膜、メソ構造セル状フォーム(MCF)、及び単層又は多層カーボンナノチューブ(SWCNT、MWCNT)、粒状物質、ビーズ、磁性ビーズ、非磁性ビーズ、ポリスチレンビーズ、磁性ポリスチレンビーズ、セファロースビーズ、セファクリルビーズ、ポリスチレンビーズ、アガロースビーズ、多糖類ビーズ、及びポリカーバメートビーズから成る群から選択される、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
前記支持体は、固体支持体である、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
前記固体支持体は、マイクロタイタープレート又は他のプレート形式、試薬チューブ、スライドガラス或いはアレイ又はマイクロアレイ解析に用いられる他の支持体、マイクロ流体チャンバ又はデバイスのチューブ又は導管類、及びBiacoreチップから成る群から選択することができる、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
更に、1つ又は複数の標識を含む相補的検出プローブの使用を含む、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項３３】
前記相補的プローブは、1つ又は複数の標識を含む、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項３４】
前記1つ又は複数の標識は、ビオチン、蛍光標識、5(及び6)-カルボキシフルオレセイン、5-又は6-カルボキシフルオレセイン、6-(フルオレセイン)-5(及び6)-カルボキシアミドヘキサン酸、フルオレセインイソチオシアナート(FITC)、ローダミン、テトラメチルローダミン、染料、Cy2、Cy3、及びCy5、PerCP、フィコビリ蛋白質、R-フィコエリトリン(RPE)、アロフィコエリトリン(APC)、テキサスレッド、プリンストンレッド、緑色蛍光タンパク質(GFP)及びその類似体、R-フィコエリトリン又はアロフィコエリトリンのコンジュゲート、半導体ナノ結晶(量子ドット及びQdotTMナノ結晶等)に基づく無機蛍光標識、Eu3+及びSm3+等のランタニドに基づく時間分解蛍光標識、ハプテン、DNP、ジゴキシゲニン、酵素標識、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ(AP)、ベータガラクトシダーゼ(GAL)、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、β-N-アセチルグルコサミニダーゼ、β-グルクロニダーゼ、インベルターゼ、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ及びグルコースオキシダーゼ(GO)、発光標識、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、1,2-ジオキセタン、ピリドピリダジン、放射能標識、ヨウ化物の同位体、コバルトの同位体、セレンの同位体、トリチウムの同位体、及びリンの同位体から成る群から選択することができる、請求項32乃至33記載の方法。
【請求項３５】
前記ビオチンは、ストレプトアビジン-R-フィコエリトリンを用いて検出される、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
更に、前記検出プローブの添加前及び/又は添加後に洗浄ステップを含む、請求項34記載の方法。
【請求項３７】
相補的検出プローブは、1個又は複数のインターカレータ分子を含む、請求項34乃至36の何れかに記載の方法。
【請求項３８】
インターカレータ分子の総数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、及び21個以上の異なる又は同一のインターカレータ分子から成る群から選択することができる、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
前記標的ポリヌクレオチドは、人間、動物、バクテリア、ウイルス、菌類、プリオン、原虫、及び/又は植物に由来する、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項４０】
前記標的ポリヌクレオチドは、人体又は動物体からの試料から単離される、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項４１】
前記標的ポリヌクレオチドは、人間、動物、鳥、昆虫、植物、藻類、菌類、酵母、ウイルス、バクテリア及びファージ、多細胞及び単細胞生物から単離される、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項４２】
前記標的ポリヌクレオチドは、糞便、血液、精液、脳脊髄液、痰、膣液、尿、唾液、毛髪、他の体液、組織試料、全臓器、汗、涙、皮膚細胞、毛髪、骨、歯、或いは私物(例えば、歯ブラシ、剃刀等)又は試料(例えば、精子又は生検の組織又は液体)からの適切な液体又は組織、或いはヒト又は動物の他の部分構造から単離される、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項４３】
捕捉される異なる標的ポリヌクレオチド配列の総数は、1、2乃至5、5乃至10、10乃至15、15乃至20、20乃至25、25乃至30、30乃至35、35乃至40、40乃至45、45乃至50、50乃至55、55乃至60、60乃至65、65乃至70、70乃至75、75乃至80、80乃至85、85乃至90、95乃至100、100乃至150、150乃至200、200乃至300、300乃至500、500乃至1000、及び1000種以上、又はこれらの間隔の任意の組み合わせから成る群から選択することができる、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項４４】
請求項1乃至43の何れかに記載の方法の使用を含む、1つ又は複数の疾病を診断する方法。
【請求項４５】
前記診断は、検査した個体のゲノムからの標的ポリヌクレオチドの検出を含む、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
前記診断は、検査した個体のゲノムに由来しない標的ポリヌクレオチドの検出を含む、請求項44乃至45の何れかに記載の方法。
【請求項４７】
前記診断は、バクテリア、ウイルス、菌類、プリオン、原虫、及び/又は植物からの標的ポリヌクレオチドの検出を含む、請求項44乃至46の何れかに記載の方法。
【請求項４８】
診断対象となる前記疾病は、1つ又は複数の遺伝性疾患、即ち、遺伝病であり、例としてCADASIL症候群、後期発症型多発性カルボキシラーゼ欠損症、家族性小脳網膜血管腫症、線維性狭窄型クローン病、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ欠乏症、ファブリ病、遺伝性コプロポルフィリン症、色素失調症、小頭症、腎嚢胞、PHF8遺伝子における突然変異により生じるSiderius型X連鎖性精神遅滞症候群、及び軟骨発育不全症から成る群から選択された1つ又は複数の疾病である、請求項44乃至47の何れかに記載の方法。
【請求項４９】
診断対象となる前記疾病は、遺伝性疾患、癌、及び感染症、頭痛、及び本発明の方法が有用となり得る他の疾病といった1つ又は複数の疾病である、請求項44乃至47の何れかに記載の方法。
【請求項５０】
診断対象となる前記疾病は、癌である、請求項44乃至47及び49の何れかに記載の方法。
【請求項５１】
前記癌は、101F6、ABR、ADPRTL3、ANP32C、ANP32D、APC2、APC、ARF、ARHGAP8、ARHI、AT1G14320、ATM、ATP8A2、AXUD1、BAP1、BECN1、BIN1、BRCA1、BRCA2、BTG1、BTG2、C1orf11、C5orf4、C5orf7、Cables、CACNA2D2、CAP-1、CARS、CAV1、CD81、CDC23、CDK2AP1、CDKN1A、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2X、Ciao1-pending、CLCA2、CREBL2、CTNNA1、CUL2、CW17R、DAB2、DAF-18、D-APC、DBC2、DCC、DDX26、DEC1、DLC1、DLEC1、DLEU1、DLEU2、DLG1、DLGH1、DLGH3、DMBT1、DNAJA3、DOC-1、DPC4、DPH2L、EGR1、FABP3、FAT、FGL1、FHIT、FLJ10506、FOXD1、FOXP1、FT、FUS1、FUS2、GAK、GAS1、GAS11、GLD-1、GLTSCR1、GLTSCR2、GRC5、GRLF1、HDAC3、HEMK、HIC1、HRG22、HSAL2、HTS1、HYAL1、HYAL2、IFGBP7、IGSF4、ING1、ING1L、ING4、I(2)tid、I(3)mbn、I(3)mbt、LAPSER1、LATS1、LATS2、LDOC1、LOH11CR2A、LRP1B、LUCA3、MAD、MAP2K4、MAPKAPK3、MCC、MDC、MEN1、ML-1、MLH1、MRVI1、MTAP、MXI1、NAP1L4、NBR2、NF1、NF2、NORE1、NPR2L、NtRb1、OVCA2、PDGFRL、PHEMX、pHyde、PIG8、PIK3CG、PINX1、PLAGL1、PRDM2、PTCH、PTEN、PTPNI3、PTPRG、RASSF1、RB1、RBBP7、RBX1、RBM6、RECK、RFP2、RIS1、RPL10、RPS29、RRM1、S100A2、SEMA3B、SF1、SFRP1、SLC22A1L、SLC26A3、SMARCA4、ST7、ST7L、ST13、ST14、STIM1、TCEB2、THW、TIMP3、TP53、TP63、TRIM8、TSC2、TSG101、TSSC1、TSSC3、TSSC4、VHL、Vhlh、WFDC1、WIT-1、WT1、及びWWOXから成る群内のタンパク質をコードする1つ又は複数の遺伝子における1つ又は複数の突然変異を特徴とする、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
前記癌は、α-アクチニン-4、ARTC1、BCR-ABL融合タンパク質(b3a2)、B-RAF、CASP-5、CASP-8、β-カテニン、Cdc27、CDK4、CDKN2A、COA-1、dek-can融合タンパク質、EFTUD2、伸長因子2、ETV6-AML1融合タンパク質、FLT3-ITD、FN1、GPNMB、LDLR-フコシルトランスフェラーゼAS融合タンパク質、HLA-A2d、HLA-A11d、hsp70-2、KIAAO205、MART2、ME1、MUM-1f、MUM-2、MUM-3、neo-PAP、ミオシンクラスI、NFYC、OGT、OS-9、P53、pml-RARα融合タンパク質、PRDX5、PTPRK、K-ras、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、SYT-SSX1又は-SSX2融合タンパク質、トリオースリン酸イソメラーゼ、BAGE-1、GAGE-1、2、8、GAGE-3、4、5、6、7、GnTVf、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-C2、ムチンk、NA-88、NY-ESO-1/LAGE-2、SAGE、Sp17、SSX-2、SSX-4、TRAG-3、及びTRP2-INT2gから成る群から選択された1つ又は複数の腫瘍抗原を特徴とする、請求項50記載の方法。
【請求項５３】
前記癌は、RASSF2及びSFRP2から成る群から選択された1つ又は複数の遺伝子における1つ又は複数の突然変異を特徴とする、請求項50記載の方法。
【請求項５４】
前記癌は、TFPI2、NDRG4、GATA4、又はGATA5から成る群から選択された1つ又は複数の遺伝子における1つ又は複数の突然変異を特徴とする、請求項50記載の方法。
【請求項５５】
前記診断は、胎児の障害の診断含む、請求項44記載の方法。
【請求項５６】
個別化医療に関する請求項1乃至43の何れかに記載の方法の使用。
【請求項５７】
請求項1乃至43の何れかに記載の方法の使用を含む、標的RNAを定量化する方法。
【請求項５８】
請求項1乃至43の何れかに記載の方法の使用を含む、1つ又は複数の標的ポリヌクレオチドを検出する方法。
【請求項５９】
前記試料は、飼料、土、食物、又は飲用水である、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
前記標的DNA及び/又はRNAは、人間、動物、バクテリア、ウイルス、菌類、プリオン、原虫、及び/又は植物に由来する、請求項57乃至59の何れかに記載の方法。
【請求項６１】
前記バクテリアは、Acetobacter aurantius、アシネトバクター種:Acinetobacter baumannii、Acinetobacter calcoaceticus、Acinetobacter johnsonii、Acinetobacter junii、Acinetobacter lwoffii、Acinetobacter radioresistens、Acinetobacter septicus、Acinetobacter schindleri、Acinetobacter ursingii、アクチノマイセス種:Actinomyces bovis、Actinomyces bowdenii、Actinomyces canis、Actinomyces cardiffensis、Actinomyces catuli、Actinomyces coleocanis、Actinomyces dentalis、Actinomyces denticolens、Actinomyces europaeus、Actinomyces funkei、Actinomyces georgiae、Actinomyces gerencseriae、Actinomyces graevenitzii、Actinomyces hongkongensis、Actinomyces hordeovulneris、Actinomyces howellii、Actinomyces humiferus、Actinomyces hyovaginalis、Actinomyces israelii、Actinomyces marimammalium、Actinomyces meyeri、Actinomyces naeslundii、Actinomyces nasicola、Actinomyces neuii、Actinomyces odontolyticus、Actinomyces oricola、Actinomyces radicidentis、Actinomyces radingae、Actinomyces slackii、Actinomyces streptomycini、Actinomyces suimastitidis、Actinomyces suis、Actinomyces turicensis、Actinomyces urogenitalis、Actinomyces vaccimaxillae、Actinomyces viscosus、アクチノバチルス種:Actinobacillus actinomycetemcomitans、Actinobacillus arthritidis、Actinobacillus capsulatus、Actinobacillus delphinicola、Actinobacillus equuli、Actinobacillus hominis、Actinobacillus indolicus、Actinobacillus lignieresii、Actinobacillus minor、Actinobacillus muris、Actinobacillus pleuropneumoniae、Actinobacillus porcinus、Actinobacillus rossii、Actinobacillus scotiae、Actinobacillus seminis、Actinobacillus succinogenes、Actinobacillus suis、Actinobacillus ureae、アエロモナス種:Aeromonas allosaccharophila、Aeromonas bestiarum、Aeromonas bivalvium、Aeromonas encheleia、Aeromonas enteropelogenes、Aeromonas euchrenophila、Aeromonas hydrophila、Aeromonas ichthiosmia、Aeromonas jandaei、Aeromonas media、Aeromonas molluscorum、Aeromonas popoffii、Aeromonas punctata、Aeromonas salmonicida、Aeromonas schubertii、Aeromonas sharmana、Aeromonas simiae、Aeromonas sobria、Aeromonas veronii、Afipia felis、アグロバクテリウム種:Agrobacterium radiobacter、Agrobacterium rhizogenes、Agrobacterium rubi、Agrobacterium tumefaciens、Agromonas種、アルカリゲネス種:Alcaligenes aquatilis、Alcaligenes eutrophus、Alcaligenes faecalis、Alcaligenes latus、Alcaligenes xylosoxidans、Alishewanella種、Alterococcus種、Anaplasma phagocytophilum、Anaplasma marginale、Aquamonas種、Arcanobacterium haemolyticum、Aranicola種、Arsenophonus種、Azotivirga種、Azotobacter vinelandii、Azotobacter chroococcum、Bacillary dysentery(細菌性赤痢)、バチルス種:Bacillus abortus(Brucella melitensis biovar abortus)、Bacillus anthracis(炭疽菌)、Bacillus brevis、Bacillus cereus、Bacillus coagulans、Bacillus fusiformis、Bacillus globigii、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus mycoides、Bacillus natto、Bacillus stearothermophilus、Bacillus subtilis、Bacillus sphaericus、Bacillus thuringiensis、バクテロイデス種:Bacteroides forsythus(Tannerella forsythensis)、Bacteroides acidifaciens、Bacteroides distasonis(Parabacteroides distasonisとして再分類)、Bacteroides gingivalis、Bacteroides gracilis、Bacteroides fragilis、Bacteroides oris、Bacteroides ovatus、Bacteroides putredinis、Bacteroides pyogenes、Bacteroides stercoris、Bacteroides suis、Bacteroides tectus、Bacteroides thetaiotaomicron、Bacteroides vulgatus、バルトネラ種:Bartonella alsatica、Bartonella bacilliformis、Bartonella birtlesii、Bartonella bovis、Bartonella capreoli、Bartonella clarridgeiae、Bartonella doshiae、Bartonella elizabethae、Bartonella grahamii、Bartonella henselae(ネコ引っ掻き熱)、Bartonella koehlerae、Bartonella muris、Bartonella peromysci、Bartonella quintana、Bartonella rochalimae、Bartonella schoenbuchii、Bartonella talpae、Bartonella taylorii、Bartonella tribocorum、Bartonella vinsonii spp. Arupensis、Bartonella vinsonii spp. Berkhoffii、Bartonella vinsonii spp. Vinsonii、Bartonella washoensis、BCG(カルメット・ゲラン桿菌)、Bergeyella zoohelcum(Weeksella zoohelcum)、Bifidobacterium bifidum、ブラストバクター種、Blochmannia種、ボルデテラ種:'Bordetella ansorpii'、Bordetella avium、Bordetella bronchiseptica、Bordetella hinzii、Bordetella holmesii、Bordetella parapertussis、Bordetella pertussis(百日咳)、Bordetella petrii、Bordetella trematum、ボレリア種、Borrelia burgdorferi、Borrelia afzelii、Borrelia anserina、Borrelia garinii、Borrelia valaisiana、Borrelia hermsii、Borrelia Parkeri、Borrelia recurrentis、Bosea種、Bradyrhizobium種、Brenneria種、ブルセラ種:Brucella abortus、Brucella canis、Brucella melitensis、Brucella neotomae、Brucella ovis、Brucella suis、Brucella pinnipediae、ブフネラ種、Budvicia種、バークホルデリア種:Burkholderia cepacia(Pseudomonas cepacia)、Burkholderia mallei(Pseudomonas mallei/Actinobacillus mallei)、Burkholderia pseudomallei(Pseudomonas pseudomallei)、Buttiauxella種、Calymmatobacterium granulomatis、カンピロバクター種:Campylobacter coli、Campylobacter concisus、Campylobacter curvus、Campylobacter fetus、Campylobacter gracilis、Campylobacter helveticus、Campylobacter hominis、Campylobacter hyointestinalis、Campylobacter insulaenigrae、Campylobacter jejuni、Campylobacter lanienae、Campylobacter lari、Campylobacter mucosalis、Campylobacter rectus、Campylobacter showae、Campylobacter sputorum、Campylobacter upsaliensis、Capnocytophaga canimorsus(Dysgonic fermenter type 2)、コリネバクテリウム種、Cardiobacterium hominis、セデセア種、クラミジア種:Chlamydia trachomatis(性病性リンパ肉芽腫)、Chlamydia muridarum、Chlamydia suis、クラミドフィラ種:Chlamydophila pneumoniae、Chlamydophila psittaci(オウム病)、Chlamydophila pecorum、Chlamydophila abortus、Chlamydophila felis、Chlamydophila caviae、シトロバクター種:Citrobacter amalonaticus、Citrobacter braakii、Citrobacter farmeri、Citrobacter freundii、Citrobacter gillenii、Citrobacter intermedius、Citrobacter koseri別名Citrobacter diversus、Citrobacter murliniae、Citrobacter rodentium、Citrobacter sedlakii、Citrobacter werkmanii、Citrobacter youngae、クロストリジウム種:Clostridium botulinum、Clostridium difficile、Clostridium novyi、Clostridium septicum、Clostridium tetani(破傷風)、Clostridium welchii(ウェルシュ菌)、コリネバクテリウム種:Corynebacterium diphtheriae(ジフテリア)、Corynebacterium amycolatum、Corynebacterium aquaticum、Corynebacterium bovis、Corynebacterium equi、Corynebacterium flavescens、Corynebacterium glutamicum、Corynebacterium haemolyticum、Corynebacterium jeikeiun(JK群コリネバクテリア)、Corynebacterium minutissimum(紅色陰癬)、Corynebacterium parvum(別名Propionibacterium acnes)、Corynebacterium pseudodiptheriticum(別名Corynebacterium hofmannii)、Corynebacterium pseudotuberculosis(別名Corynebacterium ovis)、Corynebacterium pyogenes、Corynebacterium urealyticum(D2群コリネバクテリア)、Corynebacterium renale、Corynebacterium striatum、Corynebacterium tenuis(Trichomycosis palmellina、Trichomycosis axillaris)、Corynebacterium ulcerans、Corynebacterium xerosis、Coxiella burnetii(Q熱)、Cronobacter種:Cronobacter sakazakii、Cronobacter malonaticus、Cronobacter turicensis、Cronobacter muytjensii、Cronobacter dublinensis、Delftia acidovorans(Comamonas acidovorans)、Dickeya種、エドワードシエラ種、Eikenella corrodens、エンテロバクター種:Enterobacter aerogenes、Enterobacter cloacae、Enterobacter sakazakii、エンテロコッカス種:Enterococcus avium、Enterococcus durans、Enterococcus faecalis(Streptococcus faecalis/D群連鎖球菌)、Enterococcus faecium、Enterococcus solitarius、Enterococcus galllinarum、Enterococcus maloratus、Ehrlichia chaffeensis、Erysipelothrix rhusiopathiae、エルウィニア種、エシ��リキア種:Escherichia adecarboxylata、Escherichia albertii、Escherichia blattae、Escherichia coli、Escherichia fergusonii、Escherichia hermannii、Escherichia vulneris、Ewingella種、フラボバクテリウム種:Flavobacterium aquatile、Flavobacterium branchiophilum、Flavobacterium columnare、Flavobacterium flevense、Flavobacterium gondwanense、Flavobacterium hydatis、Flavobacterium johnsoniae、Flavobacterium pectinovorum、Flavobacterium psychrophilum、Flavobacterium saccharophilum、Flavobacterium salegens、Flavobacterium scophthalmum、Flavobacterium succinans、Francisella tularensis(野兎病)、Francisella novicida、Francisella philomiragia、フゾバクテリウム種:Fusobacterium necrophorum(ルミエール症候群/Sphaerophorus necrophorus)、Fusobacterium nucleatum、Fusobacterium polymorphum、Fusobacterium novum、Fusobacterium mortiferum、 Fusobacterium varium、Gardnerella vaginalis、Gemella haemolysans、Gemella morbillorum(Streptococcus morbillorum)、Grimontella種、ヘモフィルス種:Haemophilus aegyptius(コッホ・ウィークス菌)、Haemophilus aphrophilus、Haemophilus avium、Haemophilus ducreyi(軟性下疳)、Haemophilus felis、Haemophilus haemolyticus、Haemophilus influenzae(パイファー菌)、Haemophilus paracuniculus、Haemophilus parahaemolyticus、Haemophilus parainfluenzae、Haemophilus paraphrophilus(Aggregatibacter aphrophilus)、Haemophilus pertussis、Haemophilus pittmaniae、Haemophilus somnus、Haemophilus vaginalis、ハフニア種、Hafnia alvei、ヘリコバクター種:Helicobacter acinonychis、Helicobacter anseris、Helicobacter aurati、Helicobacter bilis、Helicobacter bizzozeronii、Helicobacter brantae、Helicobacter Canadensis、Helicobacter canis、Helicobacter cholecystus、Helicobacter cinaedi、Helicobacter cynogastricus、Helicobacter felis、Helicobacter fennelliae、Helicobacter ganmani、Helicobacter heilmannii(Gastrospirillum hominis)、Helicobacter hepaticus、Helicobacter mesocricetorum、Helicobacter marmotae、Helicobacter muridarum、Helicobacter mustelae、Helicobacter pametensis、Helicobacter pullorum、Helicobacter pylori(胃潰瘍)、Helicobacter rappini、Helicobacter rodentium、Helicobacter salomonis、Helicobacter trogontum、Helicobacter typhlonius、Helicobacter winghamensis、ヒト顆粒球エーリキア症(Anaplasma phagocytophilum/Ehrlichia phagocytophila)、Human monocytotropic ehrlichiosis(Monocytic ehrlichiosis/Ehrlichia chaffeensis)、クレブシエラ種:Klebsiella granulomatis(Calymmatobacterium granulomatis)、Klebsiella mobilis、Klebsiella ornithinolytica、Klebsiella oxytoca、Klebsiella ozaenae、Klebsiella planticola、Klebsiella pneumoniae、Klebsiella rhinoscleromatis、Klebsiella singaporensis、Klebsiella terrigena、Klebsiella trevisanii、Klebsiella variicola、Kingel
la kingae、クライベラ種、ラクトバチルス種: Lactobacillus acetotolerans、Lactobacillus acidifarinae、Lactobacillus acidipiscis、Lactobacillus acidophilus(デーデルライン桿菌)、Lactobacillus agilis、Lactobacillus algidus、Lactobacillus alimentarius、Lactobacillus amylolyticus、Lactobacillus amylophilus、Lactobacillus amylotrophicus、Lactobacillus amylovorus、Lactobacillus animalis、Lactobacillus antri、Lactobacillus apodemi、Lactobacillus aviarius、Lactobacillus bifermentans、Lactobacillus brevis、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus camelliae、Lactobacillus casei、Lactobacillus catenaformis、Lactobacillus ceti、Lactobacillus coleohominis、Lactobacillus collinoides、Lactobacillus composti、Lactobacillus concavus、Lactobacillus coryniformis、Lactobacillus crispatus、Lactobacillus crustorum、Lactobacillus curvatus、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus、Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactis、Lactobacillus diolivorans、Lactobacillus equi、Lactobacillus equigenerosi、Lactobacillus farraginis、Lactobacillus farciminis、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus fornicalis、Lactobacillus fructivorans、Lactobacillus frumenti、Lactobacillus fuchuensis、Lactobacillus gallinarum、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus gastricus、Lactobacillus ghanensis、Lactobacillus graminis、Lactobacillus hammesii、Lactobacillus hamsteri、Lactobacillus harbinensis、Lactobacillus hayakitensis、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus hilgardii、Lactobacillus homohiochii、Lactobacillus iners、Lactobacillus ingluviei、Lactobacillus intestinalis、Lactobacillus jensenii、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus kalixensis、Lactobacillus kefiranofaciens、Lactobacillus kefiri、Lactobacillus kimchii、Lactobacillus kitasatonis、Lactobacillus kunkeei、Lactobacillus leichmannii、Lactobacillus lindneri、Lactobacillus malefermentans、Lactobacillus mali、Lactobacillus manihotivorans、Lactobacillus mindensis、Lactobacillus mucosae、Lactobacillus murinus、Lactobacillus nagelii、Lactobacillus namurensis、Lactobacillus nantensis、Lactobacillus oligofermentans、Lactobacillus oris、Lactobacillus panis、Lactobacillus pantheris、Lactobacillus parabrevis、Lactobacillus parabuchneri、Lactobacillus paracollinoides、Lactobacillus parafarraginis、Lactobacillus parakefiri、Lactobacillus paralimentarius、Lactobacillus paraplantarum、Lactobacillus pentosus、Lactobacillus perolens、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus pontis、Lactobacillus psittaci、Lactobacillus rennini、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus rimae、Lactobacillus rogosae、Lactobacillus rossiae、Lactobacillus ruminis、Lactobacillus saerimneri、Lactobacillus sakei、Lactobacillus salivarius、Lactobacillus sanfranciscensis、Lactobacillus satsumensis、Lactobacillus secaliphilus、Lactobacillus sharpeae、Lactobacillus siliginis、Lactobacillus spicheri、Lactobacillus suebicus、Lactobacillus thailandensis、Lactobacillus ultunensis、Lactobacillus vaccinostercus、Lactobacillus vaginalis、Lactobacillus versmoldensis、Lactobacillus vini、Lactobacillus vitulinus、Lactobacillus zeae、Lactobacillus zymae、Leclercia種、レジオネラ種:Legionella adelaidensis、Legionella anisa、Legionella beliardensis、Legionella birminghamensis、Legionella bozemanii、Legionella brunensis、Legionella busanensis、Legionella cherrii、Legionella cincinnatiensis、Legionella donaldsonii、Legionella drancourtii、Legionella drozanskii、Legionella erythra、Legionella fairfieldensis、Legionella fallonii、Legionella feeleii、Legionella geestiana、Legionella genomospecies、Legionella gratiana、Legionella gresilensis、Legionella hackeliae、Legionella impletisoli、Legionella israelensis、Legionella jamestowniensis、'Candidatus Legionella jeonii'、Legionella jordanis、Legionella lansingensis、Legionella londiniensis、Legionella longbeachae、Legionella lytica、Legionella maceachernii、Legionella micdadei、Legionella moravica、Legionella nautarum、Legionella oakridgensis、Legionella parisiensis、Legionella pneumophila、Legionella quateirensis、Legionella quinlivanii、Legionella rowbothamii、Legionella rubrilucens、Legionella sainthelensi、Legionella santicrucis、Legionella shakespearei、Legionella spiritensis、Legionella steigerwaltii、Legionella taurinensis、Legionella tucsonensis、Legionella wadsworthii、Legionella waltersii、Legionella worsleiensis、Legionella yabuuchiae、Leminorella種、レプトスピラ種:Leptospira interrogans、Leptospira kirschneri、Leptospira noguchii、Leptospira alexanderi、Leptospira weilii、Leptospira genomospecies 1、Leptospira borgpetersenii、Leptospira santarosai、Leptospira inadai、Leptospira fainei、Leptospira broomii、Leptospira licerasiae、Leptospira biflexa、Leptospira meyeri、Leptospira wolbachii、Leptospira genomospecies 3、Leptospira genomospecies 4、Leptospira genomospecies 5、Lepromatous leprosy(Danielssen-Boeck病)、Leptospira canicola、Leptospira hebdomadis、レプトスピラ症(ワイル病/Leptospira icterohaemorrhagiae/Leptospira interrogans serovar icterohaemorrhagiae)、Leptotrichia、リューコノストック種:Leuconostoc carnosum、Leuconostoc citreum、Leuconostoc durionis、Leuconostoc fallax、Leuconostoc ficulneum、Leuconostoc fructosum、Leuconostoc garlicum、Leuconostoc gasicomitatum、Leuconostoc gelidum、Leuconostoc inhae、Leuconostoc kimchii、Leuconostoc lactis、Leuconostoc mesenteroides、Leuconostoc pseudoficulneum、Leuconostoc pseudomesenteroides、リステリア種:Listeria grayi、Listeria innocua、Listeria ivanovii、Listeria monocytogenes(リステリア症)、Listeria seeligeri、Listeria welshimeri、Methanobacterium extroquens、Microbacterium multiforme、ミクロコッカス種:Micrococcus antarcticus、Micrococcus flavus、Micrococcus luteus、Micrococcus lylae、Micrococcus mucilaginosis、Micrococcus roseus、Micrococcus sedentarius、Mobiluncus、Moellerella種、モルガネラ種、モラクセラ種:Moraxella atlantae、Moraxella boevrei、Moraxella bovis、Moraxella canis、Moraxella caprae、Moraxella catarrhalis(Branhamella catarrhalis)、Moraxella caviae、Moraxella cuniculi、Moraxella equi、Moraxella lacunata、Moraxella lincolnii、Moraxella nonliquefaciens、Moraxella oblonga、Moraxella osloensis、Moraxella saccharolytica、Morganella morganii、マイコバクテリウム種:Mycobacterium abscessus、Mycobacterium africanum、Mycobacterium agri、Mycobacterium aichiense、Mycobacterium alvei、Mycobacterium arupense、Mycobacterium asiaticum、Mycobacterium aubagnense、Mycobacterium aurum、Mycobacterium austroafricanum、Mycobacterium avium(バテー病/Lady Windermere症候群)、Mycobacterium avium paratuberculosis(ヒトのクローン病及びヒツジのヨーネ病に関係する)、Mycobacterium avium silvaticum、Mycobacterium avium "hominissuis"、Mycobacterium colombiense、Mycobacterium boenickei、Mycobacterium bohemicum、Mycobacterium bolletii、Mycobacterium botniense、Mycobacterium bovis(牛結核)、Mycobacterium branderi、Mycobacterium brisbanense、Mycobacterium brumae、Mycobacterium canariasense、Mycobacterium caprae、Mycobacterium celatum、Mycobacterium chelonae、Mycobacterium chimaera、Mycobacterium chitae、Mycobacterium chlorophenolicum、Mycobacterium chubuense、Mycobacterium conceptionense、Mycobacterium confluentis、Mycobacterium conspicuum、Mycobacterium cookii、Mycobacterium cosmeticum、Mycobacterium diernhoferi、Mycobacterium doricum、Mycobacterium duvalii、Mycobacterium elephantis、Mycobacterium fallax、Mycobacterium farcinogenes、Mycobacterium flavescens、Mycobacterium florentinum、Mycobacterium fluoroanthenivorans、Mycobacterium fortuitum、Mycobacterium fortuitum subsp. Acetamidolyticum、Mycobacterium frederiksbergense、Mycobacterium gadium、Mycobacterium gastri、Mycobacterium genavense、Mycobacterium gilvum、Mycobacterium goodii、Mycobacterium gordonae(Mycobacterium aquae)、Mycobacterium haemophilum、Mycobacterium hassiacum、Mycobacterium heckeshornense、Mycobacterium heidelbergense、Mycobacterium hiberniae、Mycobacterium hodleri、Mycobacterium holsaticum、Mycobacterium houstonense、Mycobacterium immunogenum、Mycobacterium interjectum、Mycobacterium intermedium、Mycobacterium intracellulare、Mycobacterium kansasii、Mycobacterium komossense、Mycobacterium kubicae、Mycobacterium kumamotonense、Mycobacterium lacus、Mycobacterium lentiflavum、Mycobacterium leprae(癩病又はハンセン病の原因)、Mycobacterium lepraemurium、Mycobacterium madagascariense、Mycobacterium mageritense、Mycobacterium malmoense、Mycobacterium marinum(魚槽肉芽腫)、Mycobacterium massiliense、Mycobacterium microti、Mycobacterium monacense、Mycobacterium montefiorense、Mycobacterium moriokaense、Mycobacterium mucogenicum、Mycobacterium murale、Mycobacterium nebraskense、Mycobacterium neoaurum、Mycobacterium neworleansense、Mycobacterium nonchromogenicum、Mycobacterium novocastrense、Mycobacterium obuense、Mycobacterium palustre、Mycobacterium parafortuitum、Mycobacterium parascrofulaceum、Mycobacterium parmense、Mycobacterium peregrinum、Mycobacterium phlei、Mycobacterium phocaicum、Mycobacterium pinnipedii、Mycobacterium porcinum、Mycobacterium poriferae、Mycobacterium pseudoshottsii、Mycobacterium pulveris、Mycobacterium psychrotolerans、Mycobacterium pyrenivorans、Mycobacterium rhodesiae、Mycobacterium saskatchewanense、Mycobacterium scrofulaceum、Mycobacterium senegalense、Mycobacterium seoulense、Mycobacterium septicum、Mycobacterium shimoidei、Mycobacterium shottsii、Mycobacterium simiae、Mycobacterium smegmatis、Mycobacterium sphagni、Mycobacterium szulgai、Mycobacterium terrae、Mycobacterium thermoresistibile、Mycobacterium tokaiense、Mycobacterium triplex、Mycobacterium triviale、Mycobacterium tuberculosis(ヒトの結核の主要原因)、Mycobacterium bovis、Mycobacterium africanum、Mycobacterium canetti、Mycobacterium caprae、Mycobacterium pinnipedii'、Mycobacterium tusciae、Mycobacterium ulcerans(Bairnsdale潰瘍/Buruli潰瘍の原因)、Mycobacterium vaccae、Mycobacterium vanbaalenii、Mycobacterium wolinskyi、Mycobacterium xenopi、マイコプラズマ種:Mycoplasma fermentans、Mycoplasma genitalium、Mycoplasma hominis、Mycoplasma penetrans、Mycoplasma phocacerebrale、Mycoplasma pneumoniae、Nanukayami(七日熱/Gikiyami)、ナイセリア種:Neisseria gonorrhoea(淋菌/淋病)、Neisseria meningiditis(髄膜炎菌)、Neisseria sicca、Neisseria cinerea、Neisseria elongata、Neisseria flavescens、Neisseria lactamica、Neisseria mucosa、N
eisseria polysaccharea、Neisseria subflava、ニトロバクター種、ノカルジア種:Nocardia asteroides、Nocardia brasiliensis、Nocardia caviae、Noma(水癌/壊疽性口内炎)、Obesumbacterium、Oligotropha種、Orientia tsutsugamushi(つつが虫病)、Oxalobacter formigenes、パンテア種:Pantoea agglomerans、Pantoea ananatis、Pantoea citrea、Pantoea dispersa、Pantoea punctata、Pantoea stewartii、Pantoea terrea、パスツレラ種:Pasteurella aerogenes、Pasteurella anatis、Pasteurella avium、Pasteurella bettyae、Pasteurella caballi、Pasteurella canis、Pasteurella dagmatis、Pasteurella gallicida、Pasteurella gallinarum、Pasteurella granulomatis、Pasteurella langaaensis、Pasteurella lymphangitidis、Pasteurella mairii、Pasteurella multocida、Pasteurella pneumotropica、Pasteurella skyensis、Pasteurella stomatis、Pasteurella testudinis、Pasteurella trehalosi、Pasteurella tularensis、Pasteurella ureae、Pasteurella volantium、ペジオコックス種:Pediococcus acidilactici、Pediococcus cellicola、Pediococcus claussenii、Pediococcus damnosus、Pediococcus dextrinicus、Pediococcus ethanolidurans、Pediococcus inopinatus、Pediococcus parvulus、Pediococcus pentosaceus、Pediococcus stilesii、ペプトストレプトコッカス種:Peptostreptococcus anaerobius、Peptostreptococcus asaccharolyticus、Peptostreptococcus harei、Peptostreptococcus hydrogenalis、Peptostreptococcus indoliticus、Peptostreptococcus ivorii、Peptostreptococcus lacrimalis、Peptostreptococcus lactolyticus、Peptostreptococcus magnus、Peptostreptococcus micros、Peptostreptococcus octavius、Peptostreptococcus prevotii、Peptostreptococcus tetradius、Peptostreptococcus vaginalis、フォトラブダス種、Photorhizobium種、Plesiomonas shigelloides、Porphyromonas gingivalis、Pragia種、プレボテラ、プロピオニバクテリウム種:Propionibacterium acnes、Propionibacterium propionicus、プロテウス種:Proteus mirabilis、Proteus morganii、Proteus penneri、Proteus rettgeri、Proteus vulgaris、プロビデンシア種:Providencia friedericiana、Providencia stuartii、シュードモナス種:Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas alcaligenes、Pseudomonas anguilliseptica、Pseudomonas argentinensis、Pseudomonas borbori、Pseudomonas citronellolis、Pseudomonas flavescens、Pseudomonas mendocina、Pseudomonas nitroreducens、Pseudomonas oleovorans、Pseudomonas pseudoalcaligenes、Pseudomonas resinovorans、Pseudomonas straminea、Pseudomonas aurantiaca、Pseudomonas aureofaciens、Pseudomonas chlororaphis、Pseudomonas fragi、Pseudomonas lundensis、Pseudomonas taetrolens、Pseudomonas Antarctica、Pseudomonas azotoformans、Pseudomonas brassicacearum、Pseudomonas brenneri、Pseudomonas cedrina、Pseudomonas corrugate、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas gessardii、Pseudomonas libanensis、Pseudomonas mandelii、Pseudomonas marginalis、Pseudomonas mediterranea、Pseudomonas meridiana、Pseudomonas migulae、Pseudomonas mucidolens、Pseudomonas orientalis、Pseudomonas panacis、Pseudomonas proteolytica、Pseudomonas rhodesiae、Pseudomonas synxantha、Pseudomonas thivervalensis、Pseudomonas tolaasii、Pseudomonas veronii、Pseudomonas denitrificans、Pseudomonas pertucinogena、Pseudomonas cremoricolorata、Pseudomonas fulva、Pseudomonas monteilii、Pseudomonas mosselii、Pseudomonas oryzihabitans、Pseudomonas parafulva、Pseudomonas plecoglossicida、Pseudomonas putida、Pseudomonas balearica、Pseudomonas luteola、Pseudomonas stutzeri、Pseudomonas amygdale、Pseudomonas avellanae、Pseudomonas caricapapayae、Pseudomonas cichorii、Pseudomonas coronafaciens、Pseudomonas ficuserectae、Pseudomonas meliae、Pseudomonas savastanoi、Pseudomonas syringae、Pseudomonas viridiflava、Pseudomonas abietaniphila、Pseudomonas acidophila、Pseudomonas agarici、Pseudomonas alcaliphila、Pseudomonas alkanolytica、Pseudomonas amyloderamosa、Pseudomonas asplenii、Pseudomonas azotifigens、Pseudomonas cannabina、Pseudomonas coenobios、Pseudomonas congelans、Pseudomonas costantinii、Pseudomonas cruciviae、Pseudomonas delhiensis、Pseudomonas excibis、Pseudomonas extremorientalis、Pseudomonas frederiksbergensis、Pseudomonas fuscovaginae、Pseudomonas gelidicola、Pseudomonas grimontii、Pseudomonas indica、Pseudomonas jessenii、Pseudomonas jinjuensis、Pseudomonas kilonensis、Pseudomonas knackmussii、Pseudomonas koreensis、Pseudomonas lini、Pseudomonas lutea、Pseudomonas moraviensis、Pseudomonas otitidis、Pseudomonas pachastrellae、Pseudomonas palleroniana、Pseudomonas papaveris、Pseudomonas peli、Pseudomonas perolens、Pseudomonas poae、Pseudomonas pohangensis、Pseudomonas psychrophila、Pseudomonas psychrotolerans、Pseudomonas rathonis、Pseudomonas reptilivora、Pseudomonas resiniphila、Pseudomonas rhizosphaerae、Pseudomonas rubescens、Pseudomonas salomonii、Pseudomonas segitis、Pseudomonas septica、Pseudomonas simiae、Pseudomonas suis、Pseudomonas thermotolerans、Pseudomonas tremae、Pseudomonas trivialis、Pseudomonas turbinellae、Pseudomonas tuticorinensis、Pseudomonas umsongensis、Pseudomonas vancouverensis、Pseudomonas vranovensis、Pseudomonas xanthomarina、ラーネラ種、ラルストニア種:Ralstonia basilensis、Ralstonia campinensis、Ralstonia eutropha、Ralstonia gilardii、Ralstonia insidiosa、Ralstonia mannitolilytica、Ralstonia metallidurans、Ralstonia paucula、Ralstonia pickettii、Ralstonia respiraculi、Ralstonia solanacearum、Ralstonia syzygii、Ralstonia taiwanensis、Raoultella種、Rhodoblastus種、ロドソイドモナス種、鼻硬化症、Rhizobium radiobacter、Rhodococcus equi、リケッチア種:Rickettsia africae、Rickettsia akari、Rickettsia australis、Rickettsia conorii、Rickettsia felis、Rickettsia japonica、Rickettsia mooseri、Rickettsia prowazekii(発疹チフス)、Rickettsia rickettsii、Rickettsia siberica、Rickettsia typhi、Rickettsia conorii、Rickettsia africae、Rickettsia psittaci、Rickettsia quintana、Rickettsia rickettsii、Rickettsia trachomae、Rothia dentocariosa、サルモネラ種:Salmonella arizonae、Salmonella Bongori、Salmonella enterica、Salmonella enteriditis、Salmonella paratyphi、Salmonella typhi(腸チフス)、Salmonella typhimurium、Salmonella salamae、Salmonella arizonae、Salmonella diarizonae、Salmonella houtenae、Salmonella indica、Samsonia種、セラチア種:Serratia entomophila、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia grimesii、Serratia liquefaciens、Serratia marcescens、Serratia odoriferae、Serratia plymuthica、Serratia proteamaculans、Serratia quinivorans、Serratia rubidaea、Serratia ureilytica、Shewanella putrefaciens、Shigella boydii、Shigella dysenteriae、Shigella flexneri、Shigella sonnei、Sodalis種、スピリルム種:Spirillum minus鼡咬症、スタヒロコッカス種:Staphylococcus aureus、Staphylococcus auricularis、Staphylococcus capitis、Staphylococcus caprae、Staphylococcus cohnii、Staphylococcus epidermidis、Staphylococcus felis、Staphylococcus haemolyticus、Staphylococcus hominis、Staphylococcus intermedius、Staphylococcus lugdunensis、Staphylococcus pettenkoferi、Staphylococcus saprophyticus、Staphylococcus schleiferi、Staphylococcus simulans、Staphylococcus vitulus、Staphylococcus warneri、Staphylococcus xylosus、ステノトロホモナス種:Stenotrophomonas acidaminiphila、Stenotrophomonas dokdonensis、Stenotrophomonas koreensis、Stenotrophomonas maltophilia、Stenotrophomonas nitritireducens、Stenotrophomonas rhizophila、ストレプトバチルス種:Streptobacillus moniliformis(Streptobacillary鼡咬症)、ストレプトコッカス種:A群連鎖球菌、B群連鎖球菌、Streptococcus agalactiae、Streptococcus aginosus、Streptococcus avium、Streptococcus bovis、Streptococcus canis、Streptococcus cricetus、Streptococcus faceium、Streptococcus faecalis、Streptococcus ferus、Streptococcus gallinarum、Streptococcus lactis、Streptococcus milleri、Streptococcus mitior、Streptococcus mitis、Streptococcus mutans、Streptococcus oralis、Streptococcus peroris、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus pyogenes、Streptococcus ratti、Streptococcus salivarius、Streptococcus sanguinis、Streptococcus sobrinus、Streptococcus parasanguinis、Streptococcus suis、Streptococcus thermophilus、Streptococcus vestibularis、Streptococcus viridans、Streptococcus uberis、Streptococcus zooepidemicus、テイタメラ種、Trabulsiella種、トレポネーマ種:Treponema carateum(ピンタ)、Treponema denticola、Treponema endemicum(ベジェル)、Treponema pallidum(梅毒)、Treponema pertenue(イチゴ腫)、Tropheryma whipplei(ウィップル病)、Tuberculoid leprosy、Ureaplasma urealyticum、ベイヨネラ、ビブリオ種:Vibrio aerogenes、Vibrio aestuarianus、Vibrio agarivorans、Vibrio albensis、Vibrio alginolyticus、Vibrio brasiliensis、Vibrio calviensis、Vibrio campbellii、Vibrio chagasii、Vibrio cholerae(コレラ)、Vibrio cincinnatiensis、Vibrio Comma、Vibrio coralliilyticus、Vibrio crassostreae、Vibrio cyclitrophicus、Vibrio diabolicus、Vibrio diazotrophicus、Vibrio ezurae、Vibrio fischeri、Vibrio fluvialis、Vibrio fortis、Vibrio furnissii、Vibrio gallicus、Vibrio gazogenes、Vibrio gigantis、Vibrio halioticoli、Vibrio harveyi、Vibrio hepatarius、Vibrio hispanicus、Vibrio ichthyoenteri、Vibrio kanaloae、Vibrio lentus、Vibrio litoralis、Vibrio logei、Vibrio mediterranei、Vibrio metschnikovii、Vibrio mimicus、Vibrio mytili、Vibrio natriegens、Vibrio navarrensis、Vibrio neonatus、Vibrio neptunius、Vibrio nereis、Vibrio nigripulchritudo、Vibrio ordalii、Vibrio orientalis、Vibrio pacinii、Vibrio parahaemolyticus、Vibrio pectenicida、Vibrio penaeicida、Vibrio pomeroyi、Vibrio ponticus、Vibrio proteolyticus、Vibrio rotiferianus、Vibrio ruber、Vibrio rumoiensis、Vibrio salmonicida、Vibrio scophthalmi、Vibrio splendidus、Vibrio superstes、Vibrio tapetis、Vibrio tasmaniensis、Vibrio tubiashii、Vibrio vulnificus、Vibrio wodanis、Vibrio xuii、Vogesella indigofera、ウィグルスウォーチア種、Wolbachia secies、ゼノラブダス種、Yersinia enterocolitica、Yersinia pestis、Yersinia pseudotuberculosis、及び Yokenella種から成る群から選択される、請求項39及び60記載の方法。
【請求項６２】
前記ウイルスは、アベルソンマウス白血病ウイルス(Ab-MLV、A-MuLV)、急性喉頭気管気管支炎(又はHPIV)、Adelaide River virus、アデノ随伴ウイルス群(Dependevirus)、アデノウイルス、African horse sickness virus、African swine fever virus、AIDSウイルス、アリューシャンミンク病、parvovirus、アルファルファモザイクウイルス、アルファヘルペスウイルス(HSV 1及び2及び水痘を含む)、アルファレトロウイルス(トリ白血病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス)、Alphavirus、alkhurma virus、ALV関連ウイルス、Amapari virus、Andean potato mottle virus、Aphthovirus、Aquareovirus、アルボウイルス、アルボウイルスC、アルボウイルスA群、アルボウイルスB群、アレナウイルス群、アルゼンチン出血熱ウイルス、アルゼンチン出血熱ウイルス、Arterivirus、Astrovirus、Ateline herpesvirus group、オーエスキー病ウイルス、Aura virus、Ausduk disease virus、Australian bat lyssavirus、アビアデノウイルス、トリ赤芽球症ウイルス、トリ伝染性気管支炎ウイルス、avian leukemia virus、Avian leukosis virus(ALV)、トリリンパ腫症ウイルス、トリ骨髄芽球症ウイルス、トリパラミクソウイルス、avian pneumoencephalitis virus、トリ細網内皮症ウイルス、トリ肉腫ウイルス、avian type C retrovirus group、トリヘパドナウイルス、アビポックスウイルス、Bウイルス(Cercopithecine herpesvirus 1)、B19ウイルス(パルボウイルスB19)、Babanki virus、baboon herpesvirus、細菌ウイルス、バキュロウイルス、オオムギ黄化萎縮ウイルス、Barmah Forest virus、bean pod mottle virus、bean rugose mosaic virus、Bebaru virus、Berrimah virus、ベータヘルペスウイルス、ベータレトロウイルス、鳥インフルエンザ、Birnavirus、Bittner virus、BK virus、Black Creek Canal virus、bluetongue virus、ボリビア出血熱ウイルス、Boma disease virus、border disease of sheep virus、borna virus、bovine alphaherpesvirus 1、bovine alphaherpesvirus 2、ウシコロナウイルス、ウシ流行熱ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、ウシ白血病ウイルス、bovine leukosis virus、bovine mammillitis virus、ウシ乳頭腫ウイルス、ウシ丘疹性口炎ウイルス、ウシパルボウイルス、ウシシンシチアウイルス、bovine type C oncovirus、ウシウイルス性下痢症ウイルス、bracovirus、ソラマメモットルウイルス、broad bean stain virus、ブロムモザイクウイルス、Bromovirus、Buggy Creek virus、bullet shaped virus group、ブンヤムウェラウイルス、ブンヤウイルス、バーキットリンパ腫ウイルス、ブワンバ熱、Bwattany hetero virus、CAウイルス(Croup-associated virus/parainfluenza vius type 2)、カリチウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、ラクダ痘ウイルス、カナリア痘ウイルス、canid herpesvirus、イヌコロナウイルス、イヌジステンパーウイルス、イヌヘルペスウイルス、canine minute virus、イヌパルボウイルス、Cano Delgadito virus、カピロウイルス、caprine arthritis virus、caprine encephalitis virus、ヤギヘルペスウイルス、カプリポックスウイルス、カルジオウイルス、カーラウイルス、カーモウイルス、carrot mottle virus、Cassia yellow blotch virus、カリモウイルス、カリフラワーモザイクウイルス、caviid herpesvirus 1、Cercopithecine herpesvirus 1、Cercopithecine herpesvirus 2、cereal yellow dwarf virus、Chandipura virus、Changuinola virus、channel catfish virus、Charleville virus、水痘ウイルス、チクングニヤウイルス、チンパンジーヘルペスウイルス、Chordopoxvirinae、chub reovirus、chum salmon virus、クロステロウイルス、球菌ウイルス、Coho salmon reovirus、coital exanthema virus、コロラドダニ熱ウイルス、Coltivirus Columbia SK virus、Commelina yellow mottle virus、かぜウイルス、コモウイルス、Condylomata accuminata、先天性サイトメガロウイルス、伝染性膿瘡ウイルス、伝染性膿疱性皮膚炎ウイルス、コロナウイルス、コリパルタウイルス、coryza virus、ササゲクロロティックモットルウイルス、ササゲモザイクウイルス、ササゲウイルス、牛痘ウイルス、コクサッキーウイルス、CPV(細胞質多角体ウイルス)、cricket paralysis virus、クリミア・コンゴ出血性熱ウイルス、croup associated virus、Crypotovirus、ククモウイルス、サイポウイルス、サイトメガロウイルス(HCMV又はヒトヘルペスウイルス5 HHV-5)、細胞質多角体ウイルス、Cytorhabdovirus、deer papillomavirus、デルタレトロウイルス(ヒトTリンパ好性ウイルス)、Deformed wing virus DWV、デング熱、デンソウイルス、ディペンドウイルス、ドーリウイルス、ダイアンソウイルス、ジプロルナウイルス、DNAウイルス、Dobrava-Belgrade Virus、イヌインフルエンザ、Drosophila C virus、アヒルB型肝炎ウイルス、アヒル肝炎ウイルス1、アヒル肝炎ウイルス2、duovirus、Duvenhage virus、eastern equine encephalitis virus、eastern equine encephalomyelitis virus、エボラウイルス、Ebola-like virus、エコーウイルス、エコーウイルス10、エコーウイルス28、エコーウイルス9、エクトロメリアウイルス、EEEウイルス(Eastern equine encephalitis virus)、EIAウイルス(ウマ伝染性貧血)、EMCウイルス(脳心筋炎)、Emiliania huxleyi virus 86、脳炎ウイルス、encephalomyocarditis virus、内在性レトロウイルス、エンテロウイルス、Entomopoxvirinae、Entomopoxvirus A、Entomopoxvirus B、Entomopoxvirus C、enzyme elevating virus、epidemic hemorrhagic fever virus、流行性出血熱ウイルス、イプシロンレトロウイルス、エプスタイン・バーウイルス(EBV;ヒトヘルペスウイルス4 HHV-4)、equid alphaherpesvirus 1、equid alphaherpesvirus 4、equid herpesvirus 2、ウマ流産ウイルス、ウマ動脈炎ウイルス、equine encephalosis virus、ウマ伝染性貧血ウイルス、equine morbillivirus、equine rhinopneumonitis virus、ウマリノウイルス、Eubenangu virus、European elk papillomavirus、European swine fever virus、Everglades virus、Eyach virus、ファバウイルス、felid herpesvirus 1、ネコカリチウイルス、feline fibrosarcoma virus、ネコヘルペスウイルス、feline immunodeficiency virus、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス、ネコ白血病/肉腫ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、ネコ肉腫ウイルス、feline syncytial virus、フィジウイルス、Filovirus、フランダーズウイルス、フラビウイルス、口蹄病ウイルス、Fort Morgan virus、Four Corners hantavirus、トリアデノウイルス1、鶏痘ウイルス、フレンドウイルス、フロウイルス、Gammaherpesvirinae、ガンマレトロウイルス、GBウイルスC (GBV-C、旧G型肝炎ウイルス)、ジェミニウイルス、German measles virus、ゲタウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ミドリザルウイルス(mullburg)、glandular fever virus、ヤギ痘ウイルス、golden shinner virus、Gonometa virus、ガチョウパルボウイルス、granulosis virus、グロスウイルス、ground squirrel hepatitis B virus、A群アルボウイルス、グアナリトウイルス、モルモットサイトメガロウイルス、guinea pig type C virus、ハンタウイルス、hard clam reovirus、hare fibroma virus、HCMV(ヒトサイトメガロウイルス)、ヘルパーウイルス、hemadsorption virus 2、hemagglutinating virus of Japan、出血熱ウイルス、ヘンドラウイルス、Henipaviruses、ヘパドナウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝��ウイルス、C型肝炎ウイルス、D型(デルタ)肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、G型肝炎ウイルス、非A-非B型肝炎ウイルス、hepatoencephalomyelitis reovirus 3、ヘパトウイルス、heron hepatitis B virus、ヘルペスBウイルス、単純疱疹ウイルス、単純疱疹ウイルス1、単純疱疹ウイルス2、ヘルペスウイルス、帯状疱疹、ヘルペスウイルス6、ヘルペスウイルス7、ヘルペスウイルス8、Herpesvirus ateles、Herpesvirus hominis、Herpesvirus saimiri、Herpesvirus suis、Herpesvirus varicellae、Highlands J virus、Hirame rhabdovirus、HIV-1、豚コレラウイルス、ホルデイウイルス、Horse Flu、HTLV-1、HTLV-2、ヒトアデノウイルス2、ヒトアルファヘルペスウイルス1、ヒトアルファヘルペスウイルス2、ヒトアルファヘルペスウイルス3、human B lymphotropic virus、human betaherpesvirus 5、ヒトコロナウイルス、Human enterovirus A、Human enterovirus B、Human Flu、human foamy virus、ヒトガンマヘルペスウイルス4、ヒトガンマヘルペスウイルス6、ヒトA型肝炎ウイルス、ヒトヘルペスウイルス1型、ヒトヘルペスウイルス2型、ヒトヘルペスウイルス3型、ヒトヘルペスウイルス4型、ヒトヘルペスウイルス6型、ヒトヘルペスウイルス8型、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒト免疫不全ウイルス1、ヒト免疫不全ウイルス2、Human metapneumovirus、ヒト乳頭腫ウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルスI型、ヒトT細胞白血病ウイルスII型、ヒトT細胞白血病ウイルスIII型、ヒトT細胞リンパ腫ウイルスI型、ヒトT細胞リンパ腫ウイルスII型、human T cell lymphotropic virus type 1、human T cell lymphotropic virus type 2、human T lymphotropic virus I、human T lymphotropic virus II、human T lymphotropic virus III、ichnovirus、Ilarvirus、乳児胃腸炎ウイルス、ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス、infectious haematopoietic necrosis virus、伝染性膵臓壊死症ウイルス、インフルエンザウイルス、インフルエンザウイルスA、インフルエンザウイルスB、インフルエンザウイルスC、インフルエンザウイルスD、インフルエンザウイルスpr8、insect iridescent virus、昆虫ウイルス、干渉性ウイルス、イリドウイルス、イサウイルス、Japanese B virus、日本脳炎ウイルス、JCウイルス、フニンウイルス、Johnson grass mosaic virus、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、ケメロボウイルス、Kilham's rat virus、Klamath virus、Kolongo virus、Korean hemorrhagic fever virus、kumba virus、Kumlinge virus、Kunjin virus、キャサヌール森林病、Kyzylagach virus、La Crosse virus、lactic dehydrogenase elevating virus、ラゴスコウモリウイルス、ラムダファージ、langat virus、Langur virus、lapine parvovirus、ラッサ熱ウイルス、ラッサウイルス、潜伏性ラットウイルス、LCMウイルス、Leaky virus、レンチウイルス、レポリポックスウイルス、白血病ウイルス、ロイコウイルス、跳躍病ウイルス、lumpy skin disease virus、Luteovirus、リンパ節症関連ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)、Lymphocryptovirus、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、lymphoproliferative virus group、リッサウイルス、Machupo virus、mad itch virus、トウモロコシ白化萎縮ウイルス、maize rough dwarf virus、mammalian type B oncovirus group、mammalian type B retroviruses、mammalian type C retrovirus group、mammalian type D retroviruses、乳癌ウイルス、Mapuera virus、Marafivirus、Marburg virus、Marburg-like virus、Mason Pfizer monkey virus、マストアデノウイルス、マヤロウイルス、MEウイルス、麻疹ウイルス、Melandrium yellow fleck virus、Menangle virus、Mengo virus、Mengovirus、Merkel cell polyomavirus、Middelburg virus、milkers nodule virus、ミンク腸炎ウイルス、マウス微小ウイルス、MLV related virus、MMウイルス、Mokola virus、モルシポックスウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス(M-MuLV)、サルBウイルス、サル痘ウイルス、Mononegavirales、Morbillivirus、Mount Elgon bat virus、マウスサイトメガロウイルス、マウス脳脊髄炎ウイルス、マウス肝炎ウイルス、mouse K virus、マウス白血病ウイルス、マウス乳癌ウイルス、mouse minute virus、mouse pneumonia virus、マウスポリオウイルス、マウスポリオーマウイルス、マウス肉腫ウイルス、マウス痘ウイルス、Mozambique virus、Mucambo virus、粘膜病ウイルス、Mumps virus、murid betaherpesvirus 1、murid cytomegalovirus 2、マウスサ
イトメガロウイルス群、murine encephalomyelitis virus、マウス肝炎ウイルス、マウス白血病ウイルス、murine nodule inducing virus、murine polyomavirus、murine sarcoma virus、Muromegalovirus、Murray Valley encephalitis virus、myxoma virus、Myxovirus、Myxovirus multiforme、Myxovirus parotitidis、Nairobi sheep disease virus、Nairovirus、Nanirnavirus、Nariva virus、Ndumo virus、Necrovirus、Neethling virus、Nelson Bay virus、Nemtick Virus、Nepovirus、向神経性ウイルス、New World Arenavirus、newborn pneumonitis virus、ニューキャッスル病ウイルス、Nipah virus、noncytopathogenic virus、ノロウイルス、Norwalk virus、核多角体病ウイルス(NPV)、nipple neck virus、O'nyong'nyong virus、oat sterile dwarf virus、Ockelbo virus、オムスク出血熱ウイルス、癌ウイルス、oncogenic viruslike particle、oncornavirus、Orbivirus、Orf virus、Oropouche virus、Orthohepadnavirus、orthomyxovirus、Orthopoxvirus、Orthoreovirus、Orungo、ovine papillomavirus、ovine catarrhal fever virus、owl monkey herpesvirus、Palyam virus、パピローマウイルス、Papillomavirus sylvilagi、パポーバウイルス、Parainfluenza virus human(HPIV)、parainfluenza virus type 1 human(HPIV-1)、parainfluenza virus 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virus、South American hemorrhagic fever viruses、SouthAfrican passiflora virus、South River virus、Southern bean mosaic virus、Southern potato latent virus、アカザモザイクウイルス、ノゲシ黄色葉脈ウイルス、Soybean chlorotic mottle virus、Soybean crinkle leaf virus、ダイズ矮化ウイルス、ダイズモザイクウイルス、SPAr-2317 virus、Sparganothis pettitana NPV、スズメ痘ウイルス、Spartina mottle virus、Spectacled caimanpox virus、SPH 114202 virus、Sphenicid herpesvirus 1、Sphinx ligustri NPV、Spider monkey herpesvirus、Spilarctia subcarnea NPV、Spilonota ocellana NPV、Spilosoma lubricipeda NPV、Spinach latent virus、Spinach temperate virus、Spiroplasma phage 1、Spiroplasma phage 4、Spiroplasma phage aa、Spiroplasma phage C1 /TS2、Spodoptera exempta cypovirus、Spodoptera exigua virus、Spodoptera frugiperda virus、Spodoptera latifascia virus、Spodoptera littoralis、Spodoptera mauritia virus、Spodoptera ornithogalli virus、スポンドウェニウイルス、spring beauty latent virus、Spring viremia of carp virus、スプマウイルス(SFV、HFV)、Squash leaf curl virus、squash mosaic virus、リス線維腫ウイルス、Squirrel monkey 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virus、Sugarcane mild mosaic virus、サトウキビモザイクウイルス、Sugarcane streak virus、suid alphaherpesvirus 1、suid herpesvirus 2、スイポックスウイルス、Sulfolobus virus 1、Sunday Canyon virus、Sunflower crinkle virus、ヒマワリモザイクウイルス、Sunflower rugose mosaic virus、Sunflower yellow blotch virus、Sunflower yellow ringspot virus、Sun-hemp mosaic virus、swamp fever virus、Sweet clover necrotic mosaic virus、Sweet potato A virus、Sweet potato chlorotic leafspot virus、Sweet potato feathery mottle virus、Sweet potato internal cork virus、Sweet potato latent virus、Sweet potato mild mottle virus、Sweet potato russet crack virus、Sweet potato vein mosaic virus、Sweet potato yellow dwarf virus、Sweetwater Branch virus、ブタサイトメガロウイルス、ブタインフルエンザ、Swine infertility and respiratory syndrome virus、ブタ痘ウイルス、スイスマウス白血病ウ
イルス、Sword bean distortion mosaic virus、Synaxis jubararia NPV、Synaxis pallulata NPV、Synetaeris tenuifemur virus、Syngrapha selecta NPV、T4ファージ、T7ファージ、TAC virus、Tacaiuma virus、Tacaribe complex virus、タカリベウイルス、Tadpole edema virus LT 1-4、Taggert virus、タヒナウイルス、Tai virus、Taiassui virus、Tamana bat virus、Tamarillo mosaic virus、Tamdy virus、[[Tamiami virus、Tanapox virus、Tanga virus、Tanjong Rabok virus、Taro bacilliform virus、Badnavirus Tataguine virus、Taterapox virus、Taterapox virus、Teasel mosaic virus、Tehran virus、Telfairia mosaic virus、Telok Forest virus、Tembe virus、Tembusu virus、Tench reovirus、Tensaw virus、Tenvivirus、Tephrosia symptomless virus、Termeil virus、Tete virus、Tetralopha scortealis NPV、Tetropium cinnamoptemm NPV、Texas pepper virus、Thailand virus、Thaumetopoea pityocampa virus、 Theiler's encephalomyelitis virus、Theiler's virus、Theophila mandarina NPV、Theretra japonica NPV、Thermoproteus virus 1、Thermoproteus virus 2、Thermoproteus virus 3、Thermoproteus virus 4、Thiafora virus、Thimiri virus、Thistle mottle virus、ソゴトウイルス、Thormodseyjarklettur virus、Thosea asigna virus、Thosea baibarana NPV、Thosea sinensis GV、Thottapalayam virus、Thylidolpteryx ephemeraeformis NPV、Thymelicus lineola NPV、Tibrogargan virus、Ticera castanea NPV、ダニ媒介性脳炎ウイルス(TBEV)-欧州及び極東サブタイプ、Tillamook virus、Tilligerry virus、Timbo virus、Tilmboteua virus、Tilmaroo virus、Tindholmur virus、Tinea pellionella NPV、Tineola hisselliella NPV、Tinpula paludosa NPV、Tinracola plagiata NPV、Tioman virus、Tlacotalpan virus、Tobacco bushy top virus、タバコエッチ病ウイルス、タバコ葉捲ウイルス、Tobacco mild green mosaic virus、タバコモザイクウイルス、タバコモザイクウイルスサテライト、Tobacco mottle virus、タバコネクロシスウイルス、タバコネクロシスウイルスサテライト、Tobacco necrosis virus small satellite、Tobacco necrotic dwarf virus、タバコ茎壊疽ウイルス、タバコ輪点ウイルス、タバコ条斑ウイルス、タバコ矮化ウイルス、Tobacco vein banding mosaic virus、Tobacco vein distorting virus、Tobacco vein mottling virus、Tobacco wilt virus、Tobacco yellow dwarf virus、Tobacco yellow net virus、Tobacco yellow vein virus、タバモウイルス、トブラウイルス、トガウイルス、Tomato apical stunt viroid、Tomato aspermy virus、Tomato black ring virus、Tomato black ring virus satellite、Tomato bunchy top viroid、tomato bushy stunt virus、Tomato bushy stunt virus satellite、Tomato golden mosaic virus、Tomato leaf crumple virus、Tomato leaf curl virus、Tomato leafroll virus、Tomato mosaic virus、Tomato mottle virus、Tomato pale chlorosis virus、Tomato planta macho viroid、Tomato pseudo-curly top virus、Tomato ringspot virus、Tomato spotted wilt virus、Tomato top necrosis virus、Tomato vein yellowing virus、Tomato yellow dwarf virus、Tomato yellow leaf curl virus、Tomato yellow mosaic virus、Tomato yellow top virus、Tombusvirus、Tongan vanilla virus、トロウイルス、トルクテノウイルス、Tortrix loeflingiana NPV、Tortrix viridana NPV、トスカーナウイルス、トスポウイルス、Toxorhynchites brevipalpis NPV、Trabala vishnou NPV、Tradescantia/Zebrina virus、Trager duck spleen necrosis virus、Tranosema sp. Virus、形質変換ウイルス、Tree shrew adenovirus 1、Tree shrew herpesvims、Triatoma virus、Tribec virus、Trichiocampus irregularis NPV、Trichiocampus viminalis NPV、Trichomonas vaginalis virus、Trichoplusia ni cypovirus 5、Trichoplusia ni granulovirus、Trichoplusia ni MNPV、Trichoplusia ni Single SNPV、Trichoplusia ni virus、Trichosanthes mottle virus、Triticum aestivum chlorotic spot virus、Trivittatus virus、Trombetas virus、Tropaeolum virus 1、Tropaeolum virus 2、Trubanarnan virus、Tsuruse virus、Tucunduba virus、Tulare apple mosaic virus、Tulip band breaking virus、Tulip breaking virus、Tulip chlorotic blotch virus、Tulip top breaking virus、Tulip virus X、腫瘍ウイルス、Tupaia virus、Tupaiid herpesvirus 1、Turbot herpesvirus、Turbot reovirus、七面鳥アデノウイルス1乃至3、七面鳥コロナウイルス、七面鳥ヘルペスウイルス1、turkey rhinotracheitis virus、七面鳥痘ウイルス、ターロックウイルス、Turnip crinkle virus、Turnip crinkle virus satellite、Turnip mild yellows virus、Turnip mosaic virus、Turnip rosette virus、turnip yellow mosaic virus、Turuna virus、Tymovirus、Tyuleniy virus、C型レトロウイルス、type D oncovirus、D型レトロウイルス群、Uasin Gishu disease virus、Uganda S virus、Ugymyia sericariae NPV、ulcerative disease rhabdovirus、Ullucus mild mottle virus、Ullucus mosaic virus、Ullucus virus C、Umatilla virus、ウンブレウイルス、ウナウイルス、Upolu virus、UR2 sarcoma virus、Uranotaenia sapphirina NPV、Urbanus proteus NPV、Urucuri virus、Ustilago maydis virus 1、Ustilago maydis virus 4、Ustilago maydis virus 6、ウスツウイルス、Utinga virus、Utive virus、Uukuniemi virus group、ワクシニアウイルス、Vaeroy virus、Vallota mosaic virus、Vanessa atalanta NPV、Vanessa cardui NPV、Vanessa prorsa NPV、Vanilla mosaic virus、Vanilla necrosis virus、Varicella zoster virus、バリセロウイルス、Varicola virus、variola major virus、variola virus、Vasin Gishu disease virus、Vellore virus、Velvet tobacco mottle virus、Velvet tobacco mottle virus satellite、Venezuelan equine encephalitis virus、Venezuelan equine encephalomyelitis virus、Venezuelan hemorrhagic fever virus、水疱性口炎ウイルス、ベシクロウイルス、ビブリオファージ06N-22P、ビブリオファージ06N-58P、ビブリオファージ4996、ビブリオファージa3a、ビブリオファージI、ビブリオファージII、ビブリオファージm、ビブリオファージIV、ビブリオファージkappa、ビブリオファージnt-1、ビブリオファージOXN-52P、ビブリオファージOXN-lOOP、ビブリオファージv6、ビブリオファージVfl2、ビブリオファージVf33、ビブリオファージVP1、ビブリオファージVP11、ビブリオファージVP3、ビブリオファージVP5、ビブリオファージX29、Vicia cryptic virus、Vigna sinensis mosaic virus、Vilyuisk virus、Vinces virus、Viola mottle virus、viper retrovirus、ウイルス性出血性敗血症ウイルス、ウイルス様粒子、Visna Maedi virus、Visna virus、Voandzeia mosaic virus、Voandzeia necrotic mosaic virus、volepox virus、Wad Medani virus、Wallal virus、Walleye epidermal hyperplasia、Walrus calicivirus、Wanowrie virus、Warrego virus、Watermelon chlorotic stunt virus、Watermelon curly mottle virus、Waterrnelon mosaic virus 1、Watermelon mosaic virus 2、Weddel water-borne virus、Weldona virus、Wesselsbron virus、西ナイルウイルス、western equine encephalitis virus、western equine encephalomyelitis virus、Wexford virus、ワタロアウイルス、Wheat American striate mosaic virus、Wheat chlorotic streak virus、Wheat dwarf virus、Wheat rosette stunt virus、Wheat streak mosaic virus、Wheat yellow leaf virus、Wheat yellow mosaic virus、White bryony virus、White clover cryptic virus 1、White clover cryptic virus 2、White clover cryptic virus 3、White clover mosaic virus、White lupinrnosaic virus、Wild cucumber mosaic virus、Wild potato mosaic virus、Wildbeest herpesvirus、Wineberry latent virus、Winter wheat mosaic virus、Winter wheat Russian mosaic virus、Wiseana cervinata virus、Wiseana signata virus、Wiseana umbraculata virus、Wissadula mosaic virus、Wisteria vein mosaic virus、Witwatersrand virus、Wongal virus、Wongorr virus、Winter Vomiting Virus、ウッドチャックB型肝炎ウイルス、Woodchuck herpesvirus marmota 1、ウーリーサル肉腫ウイルス、wound tumor virus、WRSV virus、WVU virus 2937、WW virus 71 to 212、Wyeomyia smithii NPV、Wyeomyia virus、Xanthomonas phage Cf、Xanthomonas phage Cflt、Xanthomonas phage RR66、Xanthomonas phage Xf、Xanthomonas phage Xf2、Xanthomonas phage XP5、Xenopus virus T21、Xiburema virus、Xingu virus、Xylena curvimacula NPV、Y73 sarcoma virus、ヤバサル腫瘍ウイルス、Yaba-1 virus、Yaba-7 virus、Yacaaba virus、Yam mosaic virus、Yaounde virus、Yaquina Head virus、ヤタポックスウイルス、黄熱病ウイルス、Yogue virus、Yokapox virus、Yokase virus、Yponomeuta cognatella NPV、Yponomeuta evonymella NPV、Yponomeuta malinellus NPV、Yponomeuta padella NPV、Yucca baciliform virus、Yug Bogdanovac virus、Zaliv Terpeniya virus、Zea mays virus、Zegla virus、Zeiraphera diniana virus、Zeiraphera pseudotsugana NPV、Zika virus、Zirqa virus、Zoysia mosaic virus、Zucchini yellow fleck virus、ズッキーニ黄斑モザイクウイルス、及びZygocactus virusから成る群から選択される、請求項39及び60記載の方法。
【請求項６３】
ポリヌクレオチド標的との相互作用に適した、正確に1個のインターカレータ分子を含むポリヌクレオチドプローブ。
【請求項６４】
相補的ポリヌクレオチド標的との相互作用に適した、少なくとも2個のインターカレータ分子を含むポリヌクレオチドプローブ。
【請求項６５】
前記ポリヌクレオチドプローブは、RNA、α-L-RNA、β-D-RNA、2’-R-RNA、DNA、LNA、PNA、PMO、TNA、GNA、オリゴヌクレオチドN3’→P5’ホスホルアミダート、BNA、α-L-LNA、HNA、MNA、ANA、CAN、INA、CeNA、(2’-NH)-TNA、(3’-NH)-TNA、α-L-リボ-LNA、α-L-キシロ-LNA、β-D-リボ-LNA、β-D-キシロ-LNA、[3.2.1]-LNA、ビシクロ-DNA、6-アミノ-ビシクロ-DNA、5-エピ-ビシクロ-DNA、α-ビシクロ-DNA、トリシクロ-DNA、ビシクロ[4.3.0]-DNA、ビシクロ[3.2.1]-DNA、ビシクロ[4.3.0]アミド-DNA、β-D-リボピラノシル-NA、α-L-リキソピラノシル-NA、2’-OR-RNA、2’-AE-RNA、及びそれらの組み合わせ及び修飾物から成る群から選択されたもの等のヌクレオチドにより形成され、例えば、DNAプローブ、RNAプローブ、LNAプローブ、及びPNAプローブから成る群から選択されたプローブ等である、請求項63及び64記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項６６】
インターカレータ分子の総数は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、及び21個以上から成る群から選択することができる、請求項63乃至65の何れかに記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項６７】
前記インターカレータ分子の挿入により、前記標的DNA及び/又はRNAと前記相補的プローブとから成るポリヌクレオチド二重鎖の融解温度が上昇する、請求項63乃至66の何れかに記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項６８】
前記相補的プローブ内のインターカレータ分子の数と塩基の総数との間の比は1:50乃至1:2、例として1:50乃至1:40、例えば1:40乃至1:30、例として1:30乃至1:20、例えば1:20乃至1:10、例として1:10乃至1:5、例えば1:5乃至1:2、又はこれらの間隔の任意の組み合わせとなる、請求項63乃至67の何れかに記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項６９】
前記唯一のインターカレータ分子は、TINA、INA、ortho-TINA、para-TINA、及びAMANYから成る群から選択される、請求項63乃至68の何れかに記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項７０】
前記インターカレータ分子は、TINAである、請求項69記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項７１】
前記インターカレータ分子は、INAである、請求項69記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項７２】
前記インターカレータ分子は、ortho-TINAである、請求項69記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項７３】
前記インターカレータ分子は、para-TINAである、請求項69記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項７４】
前記インターカレータ分子は、AMANYである、請求項69記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項７５】
前記2個以上のインターカレータ分子は、TINA、INA、ortho-TINA、para-TINA、及びAMANYから成る群から選択することができる、請求項63乃至69の何れかに記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項７６】
前記ポリヌクレオチドプローブは、2種類以上のインターカレータ分子、例として2種類、3種類、4種類、5種類、又は5種類以上の異なるインターカレータ分子を含む、請求項63乃至69の何れかに記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項７７】
前記相補的プローブは、支持体に結合させる、請求項63乃至76の何れかに記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項７８】
前記支持体は、粒状物質、ビーズ、磁性ビーズ、非磁性ビーズ、ポリスチレンビーズ、磁性ポリスチレンビーズ、セファロースビーズ、セファクリルビーズ、ポリスチレンビーズ、アガロースビーズ、多糖類ビーズ、及びポリカーバメートビーズから成る群から選択される、請求項77記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項７９】
前記支持体は、固体支持体である、請求項77乃至78の何れかに記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項８０】
前記固体支持体は、マイクロタイタープレート又は他のプレート形式、試薬チューブ、スライドガラス或いはアレイ又はマイクロアレイ解析に用いられる他の支持体、マイクロ流体チャンバ又はデバイスのチューブ又は導管類、及びBiacoreチップから成る群から選択することができる、請求項79記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項８１】
前記ポリヌクレオチドプローブは、1つ又は複数の標識を含む、請求項63乃至76の何れかに記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項８２】
前記1つ又は複数の標識は、ビオチン、蛍光標識、5(及び6)-カルボキシフルオレセイン、5-又は6-カルボキシフルオレセイン、6-(フルオレセイン)-5(及び6)-カルボキシアミドヘキサン酸、フルオレセインイソチオシアナート(FITC)、ローダミン、テトラメチルローダミン、染料、Cy2、Cy3、及びCy5、PerCP、フィコビリ蛋白質、R-フィコエリトリン(RPE)、アロフィコエリトリン(APC)、テキサスレッド、プリンストンレッド、緑色蛍光タンパク質(GFP)及びその類似体、R-フィコエリトリン又はアロフィコエリトリンのコンジュゲート、半導体ナノ結晶(量子ドット及びQdotTMナノ結晶等)に基づく無機蛍光標識、Eu3+及びSm3+等のランタニドに基づく時間分解蛍光標識、ハプテン、DNP、ジゴキシゲニン、酵素標識、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ(AP)、ベータガラクトシダーゼ(GAL)、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、β-N-アセチルグルコサミニダーゼ、β-グルクロニダーゼ、インベルターゼ、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ及びグルコースオキシダーゼ(GO)、発光標識、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、1,2-ジオキセタン、ピリドピリダジン、放射能標識、ヨウ化物の同位体、コバルトの同位体、セレンの同位体、トリチウムの同位体、及びリンの同位体から成る群から選択することができる、請求項81記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項８３】
前記インターカレータのインターカレーティング単位は、好ましくは、ポリアロメート及びヘテロポリアロメートから成る群から選択された化学基を含む、請求項63乃至76の何れかに記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項８４】
前記ポリアロメート及びヘテロポリアロメートは、少なくとも2個の芳香環から成り、例として3個、例えば4個、例として5個、例えば6個、例として7個、例えば8個、例として9個以上の芳香環から成る、請求項83記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項８５】
前記ヘテロポリアロメートは、少なくとも1個の炭素原子が窒素及び酸素から選択されたヘテロ原子に置き換わった少なくとも1個の芳香環を含む、請求項83乃至84記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項８６】
前記ヘテロポリアロメートは、少なくとも2個のヘテロ原子、例として3個のヘテロ原子、例えば4個のヘテロ原子、例として5個のヘテロ原子、例えば6個以上のヘテロ原子を含む、請求項83乃至84記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項８７】
前記ヘテロポリアロメートは、酸素を唯一のヘテロ原子として含む、請求項83乃至84及び86記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項８８】
前記ヘテロポリアロメートは、窒素を唯一のヘテロ原子として含む、請求項83乃至84及び86記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項８９】
前記ヘテロポリアロメートは、窒素及ぶ酸素の両方をヘテロ原子として含む、請求項83乃至84及び86記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項９０】
前記ポリアロメート又はヘテロポリアロメートは、ヒドロキシル、ハロゲン、メルカプト、チオ、シアノ、アルキルチオ、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルボアルコイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ニトロ、アミノ、アルコキシル、及びアミドから成る群から選択された1個又は複数の置換基により置換され、或いは2個の隣接する置換基は、共にN=C-CH又はC=Cを形成し得る、請求項83乃至84記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項９１】
前記インターカレータのインターカレーティング単位は、ポリヌクレオチド二重鎖構造の安定性を高めることが可能なポリアロメート及びヘテロポリアロメートから成る群から選択される、請求項83乃至90の何れかに記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項９２】
前記インターカレータのインターカレーティング単位は、フェナントロリンと、フェナジンと、フェナントリジンと、ピレンと、アントラセンと、ナフタレンと、フェナントレンと、ピセンと、クリセンと、ナフタセンと、ベンズアントラセンと、スチルベンと、ポルフィリンと、ヒドロキシル、ハロゲン、メルカプト、チオ、シアノ、アルキルチオ、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルボアルコイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ニトロ、アミノ、アルコキシル、及びアミドから成る群から選択された1個又は複数の置換基により置換された前述のインターカレータの何れかと、から成る群から選択され、或いは2個の隣接する置換基は、共にN=C-CH又はC=Cを形成し得る、請求項84乃至91の何れかに記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項９３】
前記インターカレーティング単位は、2環式芳香環系、3環式芳香環系、4環式芳香環系、5環式芳香環系、及びそれらのヘテロ芳香族類似体及び置換体から成る群から選択され、その特定の実施形態において、前記インターカレーティング単位は、ピレン、フェナントロイミダゾール、及びナフタルイミドから成る群から選択される、請求項63乃至76の何れかに記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項９４】
前記インターカレーティング単位は、修飾核酸塩基からなる群から選択され、その非限定的な例は、MPyU、AMPyU、Oxo-PyU、及びUが本明細書に開示した他の核酸塩基の何れかに置き換わった類似体であり、特定の一実施形態は、MPyU、AMPyU、Oxo-PyUからなる群から選択されたインターカレーティング単位を対象とする、請求項63乃至76の何れかに記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項９５】
-癌又は癌以外の遺伝性疾患、或いは出生前診断の分野等における診断
-アンチセンス療法のモニタリング
-血縁者の識別
-個別化医療
-法遺伝学
-定量的RNA解析
-微生物の検出
-考古学及び古生物病理学
-食品汚染
-環境汚染
から成る群から選択された1つ又は複数の分野において使用する遺伝物質を同定及び捕捉するための請求項1乃至43の何れかに記載の方法の使用であって、
検査した個体のゲノムから標的ポリヌクレオチドを検出することを含む、方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、1つ又は複数のインターカレータ分子を含む相補的プローブによる、例えばDNA及び/又はRNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る、一本鎖標的ポリヌクレオチドの特異的捕捉を含む分子診断のための技術に関する。方法は、相補的プローブとの相互作用の前に、例えばDNA及び/又はRNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る標的ポリヌクレオチドから1つ又は複数の種類の塩基を除去することを更に含む。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、低レベルのDNAしか含まない試料においても、DNAの任意の短配列の解析を可能にする、分子遺伝学及び診断学において広く用いられる手法である。PCRは、DNA又はRNAの選択部分を解析用に増幅するために用いられる。
【０００３】
PCRに基づく診断には幾つかの制限が伴う。まず、PCRは極めて感度が高いため、実験室環境に存在する非鋳型PCRによる(例えば、バクテリア、ウイルス、及びヒトDNAによる)汚染は、大きな問題をもたらす。つぎに、微量の標的の増幅は、豊富な標的の増幅により阻害される場合が多い。加えて、DNAポリメラーゼにより誤りが生じる恐れがある。PCRに用いられるポリメラーゼは、Taqポリメラーゼのように、3’-5’ エキソヌクレアーゼ活性が欠如している場合が多い。この酵素には、誤って組み込まれたヌクレオチドを修正する能力が欠如している。
【０００４】
公知のヌクレオチド短配列解析及び検出方法による他の制限には、少なくとも1回の精製ステップを含むこと、及び特異性が単一塩基ミスマッチの特定には十分ではないことがある。
【０００５】
インターカレータ、インターカレーティング分子、又はインターカレータ分子として知られる疎水性構造の共有結合は、核酸の修飾に以前から用いられてきた。INA、TINA、及びAMANYを含む幾つかのDNAインターカレータは、既に記述されている[3、4、5]。ピレンは、従来、二重鎖DNAの脱塩基部位との対を形成させてきた[6]。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、試料から、例えばDNA又はRNA等、一本鎖標的ポリヌクレオチド等のポリヌクレオチドを捕捉する方法であって、
i)塩基A、T、U、C、又はG、5-ヒドロキシメチル-dC、5-メチルシトシン(m5C)、プソイドウリジン(Ψ)、ジヒドロウリジン(D)、イノシン(I)、7-メチルグアノシン(m7G)、ヒポキサンチン、キサンチン、及びその2’-O-メチル誘導体及び/又はN-メチル誘導体のうちの1つ又は複数の種類を、前記標的ポリヌクレオチドから除去することにより、1つ又は複数の脱塩基部位を生成するステップと、
ii)ポリヌクレオチドプローブの骨格構造に挿入され且つ相補的ポリヌクレオチド標的配列の脱塩基部位に形態学的に入り込む1個又は複数のインターカレータ分子を含む相補的プローブにより、前記標的ポリヌクレオチドを捕捉するステップと、を備え、
前記標的ポリヌクレオチドは、自然発生ヌクレオチド或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得るものであり、したがって、前記標的ポリヌクレオチドは、例えば、RNA、α-L-RNA、β-D-RNA、2’-R-RNA、DNA、LNA、PNA、PMO、TNA、GNA、オリゴヌクレオチドN3’→P5’ホスホルアミダート、BNA、α-L-LNA、HNA、MNA、ANA、CAN、INA、CeNA、(2’-NH)-TNA、(3’-NH)-TNA、α-L-リボ-LNA、α-L-キシロ-LNA、β-D-リボ-LNA、β-D-キシロ-LNA、[3.2.1]-LNA、ビシクロ-DNA、6-アミノ-ビシクロ-DNA、5-エピ-ビシクロ-DNA、α-ビシクロ-DNA、トリシクロ-DNA、ビシクロ[4.3.0]-DNA、ビシクロ[3.2.1]-DNA、ビシクロ[4.3.0]アミド-DNA、β-D-リボピラノシル-NA、α-L-リキソピラノシル-NA、2’-OR-RNA、2’-AE-RNA、及びそれらの組み合わせ及び修飾物から成る群から選択されたもの等のヌクレオチドにより形成され得る、方法に関する。
【０００７】
好適な実施形態において、本発明は、一本鎖標的ポリヌクレオチドを捕捉する方法であって、
(i)例えばDNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る二本鎖標的ポリヌクレオチドを提供するステップと、
(ii)例えばDNA等の前記二本鎖標的ポリヌクレオチドから1つ又は複数の種類の塩基を除去して、例えばDNA等の前記二本鎖標的ポリヌクレオチドを不安定化することにより、1つ又は複数の脱塩基部位を生成するステップと、
(iii)例えばDNA等の前記不安定化した二本鎖標的ポリヌクレオチドを変性させ、例えばDNA等の一本鎖標的ポリヌクレオチドにするステップと、
(iv)ポリヌクレオチドプローブの骨格構造に挿入され且つ相補的ポリヌクレオチド標的配列の脱塩基部位に形態学的に入り込む1個又は複数のインターカレータ分子を含む、例えばDNAプローブ等の相補的ポリヌクレオチドプローブにより、例えばDNA等の前記一本鎖標的ポリヌクレオチドを捕捉するステップと、を備える方法に関する。
【０００８】
特定の実施形態において、本発明は、試料から一本鎖標的DNA又はRNA等のポリヌクレオチドを捕捉する方法であって、
(i)DNA又はRNA等の前記標的ポリヌクレオチドから塩基A、T、U、C、又はGのうち1つ又は複数の種類を除去することにより、1つ又は複数の脱塩基部位を生成するステップと、
(ii)1つ又は複数の脱塩基部位のうち1つ又は複数に挿入可能な1個又は複数のインターカレータ分子を含む相補的プローブにより、DNA又はRNA等の前記標的ポリヌクレオチドを捕捉するステップと、を備える方法に関する。
【０００９】
他の特定の実施形態において、本発明は、一本鎖標的DNAを捕捉する方法であって、
(i)二本鎖標的DNAを提供するステップと、
(ii)前記二本鎖標的DNAから塩基A、T、U、C、又はGのうち1つ又は複数の種類を除去して、前記二本鎖標的DNAを不安定化することにより、1つ又は複数の脱塩基部位を生成するステップと、
(iii)前記不安定化した二本鎖標的DNAを変性させ、一本鎖標的DNAにするステップと、
(iv)1つ又は複数の脱塩基部位に挿入可能な1個又は複数のインターカレータ分子を含む相補的DNAプローブにより、前記一本鎖標的DNAを捕捉するステップと、を備える方法に関する。
【００１０】
本発明は、更に、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得るポリヌクレオチドプローブであって、例えばDNA及び/又はRNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る一本鎖標的ポリヌクレオチドの捕捉に適した2個以上のインターカレータ分子を含むプローブに関する。
【００１１】
定義及び略記
【００１２】
「核酸塩基」又は「塩基」という用語は、相補的ヌクレオチド鎖の水素結合に必要な分子構造を提供する点において、ポリヌクレオチドを形成するために必要であり、且つ安定したポリヌクレオチド分子の形成において重要な構成要素である、窒素に基づく分子の群を示す。核酸塩基の非限定的な例は、A、G、C、T、U、5-ヒドロキシメチル-dC、5-メチルシトシン(m5C)、プソイドウリジン(Ψ)、ジヒドロウリジン(D)、イノシン(I)、7-メチルグアノシン(m7G)、ヒポキサンチン、キサンチン、及びその2’-O-メチル誘導体及び/又はN-メチル誘導体から成る群から選択される。
【００１３】
これらの核酸塩基のうち、
A:アデニン。アデニンは、例えば、チミンと塩基対を形成する。
T:チミン。チミンは、例えば、アデニンと塩基対を形成する。
G:グアニン。グアニンは、例えば、シトシンと塩基対を形成する。
C:シトシン。シトシンは、例えば、グアニンと塩基対を形成する。
U:ウラシル。ウラシルは、例えば、アデニンと塩基対を形成する。
【００１４】
「ポリヌクレオチド配列」という用語は、自然発生する、或いは自然発生が知られていない、ヌクレオチドの配列を示す。こうしたヌクレオチドの非限定的な例は、RNA、α-L-RNA、β-D-RNA、2’-R-RNA、DNA、LNA、PNA、PMO、TNA、GNA、ヌクレオチドN3’→P5’ホスホルアミダート、BNA、α-L-LNA、HNA、MNA、ANA、CAN、INA、CeNA、(2’-NH)-TNA、(3’-NH)-TNA、α-L-リボ-LNA、α-L-キシロ-LNA、β-D-リボ-LNA、β-D-キシロ-LNA、[3.2.1]-LNA、ビシクロ-DNA、6-アミノ-ビシクロ-DNA、5-エピ-ビシクロ-DNA、α-ビシクロ-DNA、トリシクロ-DNA、ビシクロ[4.3.0]-DNA、ビシクロ[3.2.1]-DNA、ビシクロ[4.3.0]アミド-DNA、β-D-リボピラノシル-NA、α-L-リキソピラノシル-NA、2’-OR-RNA、2’-AE-RNA、及びその組み合わせ及び修飾物から成る群から選択される。
【００１５】
「自然発生ポリヌクレオチド」及び「自然発生ポリヌクレオチド配列」という用語は、RNA(例えばα-L-RNA、β-D-RNA、2’-R-RNA)及び/又はDNAを含むもの等、天然に存在するヌクレオチドから成るポリヌクレオチド配列を示す。
【００１６】
「自然発生が知られていないポリヌクレオチド配列」という用語は、自然界では知られていないようなポリヌクレオチド配列、即ち、自然発生ヌクレオチドの1つ又は複数の類似体により形成されたポリヌクレオチド配列を示す。こうした類似体の非限定的な例は、LNA、PNA、PMO、TNA、GNA、オリゴヌクレオチドN3’→P5’ホスホルアミダート、BNA、α-L-LNA、HNA、MNA、ANA、CAN、INA、CeNA、(2’-NH)-TNA、(3’-NH)-TNA、α-L-リボ-LNA、α-L-キシロ-LNA、β-D-リボ-LNA、β-D-キシロ-LNA、[3.2.1]-LNA、及びその組み合わせ及び修飾物から成る群から選択される。こうした「自然発生が知られていないオリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドの唯一の種類として自然発生することが知られていないヌクレオチド類似体により形成され得るものであり、或いは、自然界で知られているヌクレオチド部分と自然発生が知られていないヌクレオチド類似体との混合物であってもよい。
【００１７】
「LNA」という用語は、アクセスが困難なRNAと呼ばれる場合が多く、修飾RNAヌクレオチドであるロックド核酸を示す。LNAヌクレオチドのリボース部分は、2’位の酸素と4’位の炭素とを繋ぐ余分な架橋により修飾されている。架橋により、リボースは、3’-endo(North)型コンフォメーションに「ロック」される。
【化１】
2013544507.tif 000002
【００１８】
「PNA」という用語は、骨格がペプチド結合により連結された反復するN-(2-アミノエチル)-グリシン単位により構成されるペプチド核酸を示す。様々なプリン塩基及びピリミジン塩基が、メチレンカルボニルにより骨格に結合されている。
【化２】
2013544507.tif 000003
【００１９】
「PMO」という用語は、例えば、RNAにより用いられるリボース環の代わりに、モルホリン環に核酸塩基が結合したモルホリノオリゴマを示す。モルホリン環は、ホスホロジアミデートを介して連結されており、したがって、PMOの骨格は、こうした修飾サブユニットにより形成される。
【化３】
2013544507.tif 000004
【００２０】
「TNA」という用語は、DNA又はRNAと類似するが、その「骨格」の組成において異なる重合体であるトレオース核酸を示し、TNAの骨格は、ホスホジエステル結合により連結された反復するトレオース単位から成る点で異なっている。
【化４】
2013544507.tif 000005
【００２１】
「GNA」という用語は、DNA又はRNAと類似するが、その「骨格」の組成において異なる重合体であるグリコール核酸を示し、骨格は、ホスホジエステル結合により連結された反復するグリセロール単位から成る点で異なっている。
【化５】
2013544507.tif 000006
【００２２】
「BNA」という用語は、例えば、次のヌクレオシド群から選択し得るBNAヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを示す。
【化６】
2013544507.tif 000007
【００２３】
「α-L-LNA」という用語は、例えば、次のヌクレオシド群から選択し得る「α-L-LNAヌクレオシド」を含むオリゴヌクレオチドを示す。
【化７】
2013544507.tif 000008
【００２４】
「他の拘束ヌクレオチド」という用語は、例えば、次のヌクレオシド群から選択し得る拘束ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを示す。
【化８】
2013544507.tif 000009
【００２５】
「オリゴヌクレオチドN3’→P5’ホスホルアミダート」という用語は、以下に概略を示すもの等のN3’→P5’ ホスホルアミダートオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを示す。
【化９】
2013544507.tif 000010
【００２６】
標的ポリヌクレオチド:本発明による標的ポリヌクレオチドは、本発明による方法において捕捉の対象となる、DNA、RNA、LNA、又はPNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る核酸である。
【００２７】
プローブ:プローブは、例えばDNA又はRNA分子等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る特異的な標的ポリヌクレオチドを同定するために使用可能な、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る規定された核酸(DNA、RNA、LNA、PNA等を含む)であり、相補配列を有する。好適な一実施形態において、プローブは、DNA及び/又はRNA分子等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る他の一本鎖ポリヌクレオチドの混合物から、相補配列の存在を検出するために用いられる一本鎖DNA、RNA、LNA、PNA分子として規定される。
【００２８】
脱塩基部位:例えばDNA又はRNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得るポリヌクレオチドにおける塩基の喪失により、鎖内には、デオキシリボース残基等のヌクレオシドを残して脱塩基部位が形成される。例えばDNA又はRNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得るポリヌクレオチドにおける塩基の喪失は、自然発生的に、或いは放射線及びアルキル化剤の作用の下で、或いは酵素的に発生し得る、頻度の高い損傷である。
【００２９】
インターカレータ:従来のヌクレオチドのように、ポリヌクレオチドプローブの骨格構造に挿入可能であり、DNAプローブ、RNAプローブ、PNAプローブ、又はLNAプローブ等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る相補的ポリヌクレオチド標的配列の脱塩基部位に形態学的に入り込む分子の種類である。したがって、インターカレータは、プローブ内の核酸塩基の位置において、核酸塩基と置き換わることが可能である。インターカレータは、例えばDNA又はRNA構造等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る相補的ポリヌクレオチドの脱塩基部位へ挿入することができる。この挿入により、ポリヌクレオチド二重鎖構造の安定性を高めることができる。インターカレーションは、適切な大きさ及び化学的性質のリガンドが脱塩基部位に入り込む時に生じる。本願において、インターカレータ及びインターカレータ分子という用語は、同義語として用いられる。インターカレータは、ここで概略を述べたものにすることが可能であり、或いは、ポリヌクレオチドプローブの骨格構造に挿入可能であると同時に、標的ヌクレオチドの脱塩基部位を形態学的に埋めることが可能な任意の単位にすることができる。
【００３０】
TINA:ツイステッドインターカレーティング核酸。TINA、para-TINA、及びortho-TINAの構造を図5に示す。
【００３１】
INA:INAの構造を図5に示す。
【００３２】
AMANY:AMANYの構造を図5に示す。
【００３３】
DNA:本明細書で使用するDNA(デオキシリボ核酸)二重鎖という用語は、エステル結合により接合された糖及びリン酸塩の原子により形成された骨格を有する、ヌクレオチドと呼ばれる単純な単位の重合体である。塩基は、各糖に付着する。塩基は、C、G、T、U、又はAとなる。
【００３４】
標識:標識は、本明細書において、標識分子と相互に交換可能に用いられる。本明細書において説明される標識とは、アッセイにおいて検出可能であり、分子に付着させて標識された分子を形成することができる識別可能な物質である。
【００３５】
アルキル:「アルキル」という用語は、C1-6-alk(en/yn)yl、C3-8-cycloalk(en)yl、又はC3-8-cycloalk(en)yl-C1-6-alk(en/yn)yl基を示す。「C1-6-alk(en/yn)yl」という用語は、C1-6-アルキル、C2-6-アルケニル、又はC2-6-アルキニル基を示し、ここで、「C1-6-アルキル」は、メチル、エチル、1-プロピル、2-プロピル、1-ブチル、2-ブチル、2-メチル-2-プロピル、及び2-メチル-1-プロピル等、1乃至6個の炭素原子を有する分岐又は非分岐アルキル基を示し、「C2-6アルケニル」は、エテニル、プロペニル、及びブテニル等、2乃至6個の炭素原子を有し、少なくとも1つの二重結合を含む基を示し、「C2-6アルキニル」は、エチニル、プロピニル、及びブチニル等、2乃至6個の炭素原子を有し、少なくとも1つの3重結合を含む基を示す。「C3-8-cycloalk(en)yl」という用語は、C3-8-シクロアルキル又はC3-8-シクロアルケニル基を示し、ここで、「C3-8-シクロアルキル」は、シクロプロピル、シクロペンチル、及びシクロヘキシル等、3乃至8個の炭素原子を有する単環又は2環式の炭素環を示し、「C3-8-シクロアルケニル」は、シクロプロペニル、シクロペンテニル、及びシクロヘキセニル等、3乃至8個のC原子及び1つの二重結合を有する単環又は2環式の炭素環を示す。「C3-8-cycloalk(en)yl-C1-6-alk(en/yn)yl」という用語において、「C3-8-cycloalk(en)yl」及び「C1-6-alk(en/yn)yl」という用語は、上述した通りである。
【００３６】
ヘテロ原子:窒素(N)、硫黄(S)、酸素(O)、塩素(Cl)、臭素(Br)、ヨウ素(I)、及びフッ素(F)から成る群から選択された原子。
【００３７】
アリール:例えば、フェニル又はナフチル等、好ましくは単環式又は2環式である炭素環芳香族基。したがって、アリールは、1つ又は複数の置換基、例えば、C1-6-アルキル又はハロゲンにより、任意に置換される。
【００３８】
ヘテロアリール:少なくとも1個の炭素原子とO又はN或いはO及びNの組み合わせから選択された1個又は複数のヘテロ原子とを含み、好ましくは単環又は2環式である芳香族基。
【００３９】
ポリアロメート:少なくとも2つの芳香族基を含む炭素環芳香族基。
【００４０】
ヘテロポリアロメート:少なくとも1個の炭素原子と、O、N、又はS、或いはO及びN、N及びS、又はS及びOの組み合わせから選択された1個又は複数のヘテロ原子とを含み、少なくとも2つの芳香族基を含む芳香族基。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】種類の塩基を二本鎖標的DNAから除去する。これにより生じた不安定化された二本鎖標的DNAを、その後、変性させ、一本鎖標的DNAにする。一本鎖標的DNAを、ortho-TINA等の1つ又は複数のインターカレータを含む相補的プローブと混合する。これにより、標的DNAが相補的プローブに捕捉される。
【図２】種類の塩基を二本鎖標的DNAから除去する。これにより生じた不安定化された二本鎖標的DNAを、その後、変性させ、一本鎖標的DNAにする。一本鎖標的DNAを、ortho-TINA等の1つ又は複数のインターカレータを含む相補的プローブと混合する。相補的プローブをビーズ等の支持体に結合させる。これにより、標的DNAが相補的プローブに捕捉される。その後、標識を含む検出プローブを添加する。一実施形態では、検出プローブの添加前に1回又は複数回の洗浄ステップを実施する。
【図３】二本鎖標的DNA内の1種類の塩基を、ウラシル等の別の化学成分へ変換する。その後、ウラシル等の化学成分を二本鎖標的DNAから除去する。これにより生じた不安定化された二本鎖標的DNAを、その後、変性させ、一本鎖標的DNAにする。一本鎖標的DNAを、ortho-TINA等の1つ又は複数のインターカレータを含む相補的プローブと混合する。これにより、標的DNAが相補的プローブに捕捉される。
【図４】二本鎖標的DNA内の1種類の塩基を、ウラシル等の別の化学成分へ変換する。その後、ウラシル等の化学成分を二本鎖標的DNAから除去する。これにより生じた不安定化された二本鎖標的DNAを、その後、変性させ、一本鎖標的DNAにする。一本鎖標的DNAを、ortho-TINA等の1つ又は複数のインターカレータを含む相補的プローブと混合する。相補的プローブをビーズ等の支持体に結合させる。これにより、標的DNAが相補的プローブに捕捉される。その後、標識を含む検出プローブを添加する。一実施形態では、検出プローブの添加前に1回又は複数回の洗浄ステップを実施する。
【図５】TINA、INA、para-TINA、ortho-TINA、及びAMANYの化学構造を示す。
【図６】二本鎖標的DNA(dsDNA)を重亜硫酸塩により処理し、シトシン残基をウラシル残基に変換する。その後、ウラシル残基をウラシル-DNAグリコシラーゼ(UNG)により除去し、1つ又は複数の脱塩基部位を生成する。dsDNAを一本鎖標的DNAに変換し、TINAを含むオリゴヌクレオチドにより捕捉する。捕捉オリゴヌクレオチドを磁性ビーズに結合させる。加えて、ビオチン化TINA検出オリゴヌクレオチドを、一本鎖標的DNAに対してハイブリダイズさせる。捕捉オリゴヌクレオチド及び/又は検出オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドプローブの骨格構造に挿入されて相補的ポリヌクレオチド標的配列の脱塩基部位に形態学的に入り込む1個又は複数のインターカレータ分子を含むことが可能であり、挿入は、一本鎖標的DNAによるハイブリダイゼーション後に行われる。或いは、捕捉オリゴヌクレオチド及び/又は検出オリゴヌクレオチドは、一本鎖標的DNAによるハイブリダイゼーション後に1つ又は複数の脱塩基部位において挿入可能な1つ又は複数のアデニン残基を含むことができる。図6に示した実験において使用された反応条件下において、好ましくは、インターカレータ分子を有する検出オリゴヌクレオチド及び捕捉オリゴヌクレオチドは、一本鎖標的DNAとハイブリダイズする。検出にはストレプトアビジン-R-フィコエリトリンを用いる。
【図７】二本鎖標的DNA(dsDNA)を重亜硫酸塩により処理し、シトシン残基をウラシル残基に変換する。その後、ウラシル残基をウラシル-DNAグリコシラーゼ(UNG)により除去し、1つ又は複数の脱塩基部位を生成する。dsDNAを一本鎖標的DNAに変換し、TINAを含むオリゴヌクレオチドにより捕捉する。捕捉オリゴヌクレオチドを磁性ビーズに結合させる。加えて、ビオチン化TINA検出オリゴヌクレオチドを、一本鎖標的DNAに対してハイブリダイズさせる。捕捉オリゴヌクレオチド及び/又は検出オリゴヌクレオチドは、一本鎖標的DNAによるハイブリダイゼーション後に、ポリヌクレオチドプローブの骨格構造に挿入され且つ相補的ポリヌクレオチド標的配列の脱塩基部位に形態学的に入り込む1個又は複数のインターカレータ分子を含むことができる。或いは、捕捉オリゴヌクレオチド及び/又は検出オリゴヌクレオチドは、一本鎖標的DNAによるハイブリダイゼーション後に1つ又は複数の脱塩基部位において挿入可能な1つ又は複数のアデニン残基を含むことができる。図7に示した実験において使用された反応条件下において、インターカレータ分子又はアデニン残基を有する検出オリゴヌクレオチド及び捕捉オリゴヌクレオチドは、一本鎖標的DNAとハイブリダイズする。検出にはストレプトアビジン-R-フィコエリトリンを用いる。
【図８】ウラシル-DNAグリコシラーゼ処理後のウラシル修飾dsDNAの検出。X軸は、dsDNA標的の量(mol)を示し、Y軸は、MFIゼロを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明は、例えばDNA及び/又はRNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る、一本鎖標的ポリヌクレオチド等のポリヌクレオチドを捕捉するために用いること等が可能な技術に関する。この手法は、例えば、分子診断に用いることが可能である。したがって、一実施形態は、本明細書に開示した方法の使用を含む、1つ又は複数のメチル化標的DNA及び/又はRNAを検出する方法に関する。
【００４３】
標的ポリヌクレオチドの検出に用いる本明細書に開示した方法は、当技術分野で公知の方法より特異性が高い。Tmにおける有意な偏差のため、標的ポリヌクレオチドと他のヌクレオチド(群)との差が単一の塩基位置のみである場合でも、標的ポリヌクレオチドを他のヌクレオチド(群)から常に分離することが可能となる。
【００４４】
標的ポリヌクレオチドの安定性を向上させることが目的ではあるが、初期段階では不安定化させる。これは大いに議論を呼ぶ内容であり、これまでに記述されていない。したがって、本明細書において開示した方法は、安定性に関して特性が向上した修飾ポリヌクレオチドの作成につながる、標的ポリヌクレオチドの分割を含む。
【００４５】
したがって、本発明は、試料から、例えばDNA又はRNA等、一本鎖標的ポリヌクレオチド等のポリヌクレオチドを捕捉する方法であって、
iii)塩基A、T、U、C、又はG、5-ヒドロキシメチル-dC、5-メチルシトシン(m5C)、プソイドウリジン(Ψ)、ジヒドロウリジン(D)、イノシン(I)、7-メチルグアノシン(m7G)、ヒポキサンチン、キサンチン、及びその2’-O-メチル誘導体及び/又はN-メチル誘導体のうちの1つ又は複数の種類を、標的ポリヌクレオチドから除去することにより、1つ又は複数の脱塩基部位を生成するステップと、
iv)ポリヌクレオチドプローブの骨格構造に挿入されて相補的ポリヌクレオチド標的配列の1つ又は複数の脱塩基部位に形態学的に入り込む1個又は複数のインターカレータ分子を含む相補的プローブにより、標的ポリヌクレオチドを捕捉するステップと、を備え、
標的ポリヌクレオチドは、自然発生ヌクレオチド或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得るものであり、したがって、標的ポリヌクレオチドは、例えば、RNA、α-L-RNA、β-D-RNA、2’-R-RNA、DNA、LNA、PNA、PMO、TNA、GNA、オリゴヌクレオチドN3’→P5’ホスホルアミダート、BNA、α-L-LNA、HNA、MNA、ANA、CAN、INA、CeNA、(2’-NH)-TNA、(3’-NH)-TNA、α-L-リボ-LNA、α-L-キシロ-LNA、β-D-リボ-LNA、β-D-キシロ-LNA、[3.2.1]-LNA、ビシクロ-DNA、6-アミノ-ビシクロ-DNA、5-エピ-ビシクロ-DNA、α-ビシクロ-DNA、トリシクロ-DNA、ビシクロ[4.3.0]-DNA、ビシクロ[3.2.1]-DNA、ビシクロ[4.3.0]アミド-DNA、β-D-リボピラノシル-NA、α-L-リキソピラノシル-NA、2’-OR-RNA、2’-AE-RNA、及びその組み合わせ及び修飾物から成る群から選択されたもの等のヌクレオチドにより形成され得る、方法に関する。
【００４６】
好適な実施形態において、本発明は、一本鎖標的ポリヌクレオチドを捕捉する方法であって、
(v)例えばDNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る二本鎖標的ポリヌクレオチドを提供するステップと、
(vi)例えばDNA等の二本鎖標的ポリヌクレオチドから1つ又は複数の種類の塩基を除去して、例えばDNA等の二本鎖標的ポリヌクレオチドを不安定化することにより、1つ又は複数の脱塩基部位を生成するステップと、
(vii)例えばDNA等の不安定化した二本鎖標的ポリヌクレオチドを変性させ、例えばDNA等の一本鎖標的ポリヌクレオチドにするステップと、
(viii)ポリヌクレオチドプローブの骨格構造に挿入されて相補的ポリヌクレオチド標的配列の1つ又は複数の脱塩基部位に形態学的に入り込む1個又は複数のインターカレータ分子を含む、例えばDNAプローブ等の相補的ポリヌクレオチドプローブにより、例えばDNA等の一本鎖標的ポリヌクレオチドを捕捉するステップと、を備える方法に関する。
【００４７】
特定の実施形態において、本発明は、試料から一本鎖標的DNA又はRNA等のポリヌクレオチドを捕捉する方法であって、
(i)DNA又はRNA等の標的ポリヌクレオチドから塩基A、T、U、C、又はGのうち1つ又は複数の種類を除去することにより、1つ又は複数の脱塩基部位を生成するステップと、
(ii)1つ又は複数の脱塩基部位に対する相互作用及び/又は挿入が可能な1個又は複数のインターカレータ分子を含む相補的プローブにより、DNA又はRNA等の標的ポリヌクレオチドを捕捉するステップと、を備える方法に関する。
【００４８】
本発明による標的ポリヌクレオチドの最適な長さは、除去すべき特異的塩基の数と、標的ポリヌクレオチドにおけるその分布とによって決まる。一般に、こうした標的ポリヌクレオチドの長さは、30塩基未満であることが好ましい。好適な実施形態において、標的ポリヌクレオチドの長さは、25塩基未満である。更に好適な実施形態において、標的ポリヌクレオチドの長さは、20塩基未満であり、例として17乃至18塩基である。
【００４９】
1つ又は複数の種類の塩基が除去された、一本鎖標的ポリヌクレオチドに含まれる脱塩基部位は、好ましくは、互いに接近し過ぎておらず、例えば、1/2又は1螺旋回転の距離を置いて位置する。しかしながら、隣接する2塩基の除去も可能となる。後者の場合、挿入されるインターカレータは、1個の2倍サイズのインターカレータ又は2個の従来のインターカレータとなる。したがって、一実施形態は、このように脱塩基部位が1/2又は1螺旋回転、例として1螺旋回転、例として1/2螺旋回転の距離を置いて位置した標的を対象とする。したがって、一実施形態は、このように脱塩基部位が1/2又は1螺旋回転、例として1螺旋回転、例として1/2螺旋回転の距離を置いて位置した標的を対象とする。好適な実施形態では、1個のインターカレータが、各脱塩基部位に挿入される。一実施形態では、2つ以上の脱塩基部位が存在し、挿入されるインターカレータは同一である。他の実施形態では、2つ以上の脱塩基部位が存在し、挿入されるインターカレータは互いに異なる。
【００５０】
本発明の好適な実施形態において、標的ポリヌクレオチドに存在する脱塩基部位の総数は、5を超えない。更に好適な実施形態において、脱塩基部位の総数は、最大4である。本発明の最も好適な実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、3つ以下、例えば2つの脱塩基部位を備える。本発明の他の実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、1つの脱塩基部位を備える。
【００５１】
本明細書に定めるように1つ又は複数の特定の種類の塩基を除去することにより、例えば、上述したステップ(i)において、標的ポリヌクレオチドから以下の種類の塩基A、T、U、C、又はGの1つ又は複数を除去することにより、関係する塩基の少なくとも70％、例えば少なくとも80％、例として少なくとも85％、例えば少なくとも90％、例として少なくとも95％、例えば少なくとも97％、例として少なくとも99％が、標的ポリヌクレオチドから除去される。好適な実施形態では、関係する塩基の約100％が標的ポリヌクレオチドから除去される。
【００５２】
特定の一実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、RNA又はDNA等、自然発生ヌクレオチド或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る。特定の一実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、自然発生ヌクレオチドにより形成される。特定の一実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、RNAを含む。他の特定の実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、DNAを含む。他の特定の実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、自然発生が知られていないヌクレオチド又は自然発生ヌクレオチドと自然発生が知られていないヌクレオチドとの任意の混合物により形成される。したがって、標的ポリヌクレオチドは、例えば、LNA、PNA、PMO、TNA、GNA、ヌクレオチドN3’→P5’ホスホルアミダート、BNA、α-L-LNA、及び他の拘束ヌクレオチドから成る群から選択され得る自然発生ヌクレオチドの1つ又は複数の類似体を含む。特定の一実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、LNAを含む。特定の一実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、PNAを含む。特定の一実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、PMOを含む。特定の一実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、TNAを含む。特定の一実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、GNAを含む。特定の一実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドN3’→P5’ホスホルアミダートを含む。特定の一実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、BNAを含む。特定の一実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、α-L-LNAを含む。特定の一実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、本明細書に定めるような他の拘束ヌクレオチドを含む。
【００５３】
一実施形態において、除去される塩基は、A、G、C、T、U、及び5-ヒドロキシメチル-dCから成る群から選択される。
【００５４】
一実施形態において、二本鎖標的ポリヌクレオチド及び/又は一本鎖標的ポリヌクレオチドから除去される塩基は、Aである。
【００５５】
一実施形態において、Aは、標的ポリヌクレオチドに酵素処理、例えば、アデニン-DNAグリコシラーゼによる処理を示すANG処理を施すことにより、標的ポリヌクレオチドから除去される。
【００５６】
他の実施形態において、二本鎖標的ポリヌクレオチド及び/又は一本鎖標的ポリヌクレオチドから除去される塩基は、Tである。特定の一実施形態において、Tは、標的ポリヌクレオチドに酵素処理、例えば、チミン-DNAグリコシラーゼによる処理を示すTNG処理を施すことにより、標的ポリヌクレオチドから除去される。
【００５７】
他の実施形態において、二本鎖標的ポリヌクレオチド及び/又は一本鎖標的ポリヌクレオチドから除去される塩基は、Uである。特定の一実施形態において、Uは、標的ポリヌクレオチドに酵素処理、例えば、ウラシル-DNAグリコシラーゼによる処理を示すUNG処理を施すことにより、標的ポリヌクレオチドから除去される。
【００５８】
他の実施形態において、二本鎖標的ポリヌクレオチド及び/又は一本鎖標的ポリヌクレオチドから除去される塩基は、Cである。特定の一実施形態において、Cは、標的ポリヌクレオチドに酵素処理、例えば、シトシン-DNAグリコシラーゼによる処理を示すCNG処理を施すことにより、標的ポリヌクレオチドから除去される。
【００５９】
他の実施形態において、二本鎖標的ポリヌクレオチド及び/又は一本鎖標的ポリヌクレオチドから除去される塩基は、Gである。特定の一実施形態において、Gは、標的ポリヌクレオチドに酵素処理、例えば、グアニン-DNAグリコシラーゼによる処理を示すGNG処理を施すことにより、標的ポリヌクレオチドから除去される。
【００６０】
他の実施形態において、除去される塩基は、5-ヒドロキシメチル-dCである。
【００６１】
他の実施形態において、除去される塩基は、5-メチルシトシン(m5C)である。
【００６２】
他の実施形態において、除去される塩基は、プソイドウリジン(Ψ)である。
【００６３】
他の実施形態において、除去される塩基は、ジヒドロウリジン(D)である。
【００６４】
他の実施形態において、除去される塩基は、イノシン(I)である。
【００６５】
他の実施形態において、除去される塩基は、7-メチルグアノシン(m7G)である。
【００６６】
他の実施形態において、除去される塩基は、ヒポキサンチンである。
【００６７】
他の実施形態において、除去される塩基は、キサンチンである。
【００６８】
他の実施形態において、除去される塩基は、本明細書に開示した塩基の何れかの2’-O-メチル誘導体である。
【００６９】
他の実施形態において、除去される塩基は、本明細書に開示した塩基の何れかのN-メチル誘導体である。
【００７０】
相補的プローブは、例えば、DNAプローブ、RNAプローブ、LNAプローブ、及びPNAプローブ、又はその任意の組み合わせから成る群から選択されたプローブ等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得るプローブ等の任意のポリヌクレオチドプローブにすることができる。
【００７１】
相補的プローブは、DNAプローブ、RNAプローブ、LNAプローブ、及びPNAプローブ、又はその任意の組み合わせ等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る任意のポリヌクレオチドプローブにすることができる。特定の一実施形態において、相補的プローブは、RNA又はDNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成される。一実施形態において、相補的プローブは、RNAを含む。他の実施形態において、相補的プローブは、DNAを含む。他の特定の実施形態において、相補的プローブは、自然発生が知られていないポリヌクレオチド配列により形成される。特定の実施形態において、相補的プローブは、LNA、PNA、PMO、TNA、GNA、オリゴヌクレオチドN3’→P5’ホスホルアミダート、BNA、α-L-LNA、及び他の拘束ヌクレオチドから成る群から選択された1つ又は複数の類似体を含む。特定の一実施形態において、相補的プローブは、LNAを含む。特定の一実施形態において、相補的プローブは、PNAを含む。特定の一実施形態において、相補的プローブは、PMOを含む。特定の一実施形態において、相補的プローブは、TNAを含む。特定の一実施形態において、相補的プローブは、GNAを含む。特定の一実施形態において、相補的プローブは、オリゴヌクレオチドN3’→P5’ホスホルアミダートを含む。特定の一実施形態において、相補的プローブは、BNAを含む。特定の一実施形態において、相補的プローブは、α-L-LNAを含む。特定の一実施形態において、相補的プローブは、本明細書に定めるような他の拘束ヌクレオチドを含む。
【００７２】
手法は、1個又は複数のインターカレータ分子を含む相補的プローブにより、一本鎖標的DNA及び/又はRNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得るポリヌクレオチドを特異的に捕捉することを含む。方法は、更に、相補的プローブとの相互作用の前に、DNA及び/又はRNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る標的ポリヌクレオチドから、1つ又は複数の種類の塩基を除去することを含む。この反応により、1つ又は複数の脱塩基部位、即ち、塩基が除去された部位が発生する。DNA及び/又はRNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る標的ポリヌクレオチドからの塩基の除去は、DNA等の二本鎖標的ポリヌクレオチド、或いはDNA及び/又はRNA等の一本鎖標的ポリヌクレオチドからの除去の何れかにすることができる。一実施形態において、塩基は、二本鎖標的DNAから除去することが好ましい。この実施形態を図1に例示する。
【００７３】
相補的プローブは、ビーズ等の支持体に結合させることができる。これにより、DNA及び/又はRNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る標的ポリヌクレオチドは、相補的プローブにより捕捉される。その後、1つ又は複数の標識を含む検出プローブを添加することができる。一実施形態において、本明細書に開示した方法は、更に、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る未結合ポリヌクレオチド及びヌクレオチドを除去するために、1回又は複数回の洗浄ステップを含む。一実施形態において、洗浄ステップは、例えばDNA及び/又はRNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る未結合ポリヌクレオチド及びヌクレオチドを除去するため等に検出プローブを添加する前に実施される。この実施形態を図2に例示する。
【００７４】
DNA及び/又はRNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る標的ポリヌクレオチドからの塩基の除去は、例えばA、T、C、G、及び/又はU等、本明細書に開示した任意の塩基を特異的に除去する酵素を用いて実行すること等が可能である。或いは、1種類の塩基は、塩基の種類のうち1つを特異的に喪失させる反応条件を用いて除去することができる。Aは、例えば、pHの調節により除去することができる[7、8、9]。特定の実施形態において、標的DNA及び/又はRNA等の標的ポリヌクレオチドから、1、2、又は3種類の塩基が除去される。
【００７５】
一実施形態において、本明細書に開示した方法は、自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る二本鎖標的ポリヌクレオチドを、二本鎖標的ポリヌクレオチドから1つ又は複数の化学成分を除去することにより不安定化することを含む。
【００７６】
一実施形態では、DNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る二本鎖標的ポリヌクレオチド及び/又は一本鎖DNA及び/又はRNAにおいて、1種類の塩基を、ウラシル等の他の化学成分へ変換する。その後、DNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る二本鎖標的ポリヌクレオチドから、及び/又は、DNA及び/又はRNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る一本鎖標的ポリヌクレオチドから、ウラシル等の化学成分を除去する。一実施形態において、化学成分の除去は、1つ又は複数の酵素を用いて、及び/又は塩濃度、pH[7、8、9]、又は温度等の変化といった物理的応力により行われる。MutYは、G-Aミスペアに対する活性を有するアデニングリコシラーゼである。MutYは、一実施形態において、DNAにおける塩基の除去に用いることができる[8]。
【００７７】
他の実施形態において、例えばDNA又はRNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得るポリヌクレオチドからのシトシン及びチミンの切除は、ヒトウラシル-DNAグリコシラーゼの変異体により行うことができる[9]。好適な一実施形態において、ウラシル-DNAグリコシラーゼ内のAsn204のAspによる置換、又はウラシル-DNAグリコシラーゼ内のTyr147のAla、Cys、又はSerによる置換により、それぞれ、シトシン-DNAグリコシラーゼ活性又はチミン-DNAグリコシラーゼ活性を有する酵素が生じる[9]。こうした酵素は、例えばDNA又はRNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得るポリヌクレオチドにおいて、これらの塩基の除去に用いることができる。一実施形態において、ウラシルは、ウラシルデヒドロゲナーゼにより除去される。他の実施形態において、Aの除去は、pH値の調節により行われる。DNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る二本鎖標的ポリヌクレオチドからの化学成分の除去により、DNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る、不安定化された二本鎖標的ポリヌクレオチドが生じ、その後、これを変性させ、DNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る一本鎖標的ポリヌクレオチドにする。DNA及び/又はRNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る一本鎖標的ポリヌクレオチドは、ortho-TINA等の1個又は複数のインターカレータを含む相補的プローブと混合する。これにより、DNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る標的ポリヌクレオチドは、相補的プローブにより捕捉される。この実施形態を図3に示す。
【００７８】
一実施形態では、DNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る二本鎖標的ポリヌクレオチドにおいて、及び/又は、DNA及び/又はRNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る一本鎖標的ポリヌクレオチドにおいて、1種類の塩基を、ウラシル等の他の化学成分へ変換する。ウラシルは、ウラシルデヒドロゲナーゼにより除去することができる。その後、DNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る二本鎖標的ポリヌクレオチドから、及び/又は、DNA及び/又はRNA等の一本鎖標的ポリヌクレオチドから、ウラシル等の化学成分を除去する。化学成分の除去は、1つ又は複数の酵素を用いて、及び/又は塩濃度、pH等の変化といった物理的応力により行うことができる[7、8、9]。ウラシルは、例えば、ウラシルデヒドロゲナーゼにより除去することができる。DNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る二本鎖標的ポリヌクレオチドからの化学成分の除去により、DNA等の不安定化された二本鎖標的ポリヌクレオチドが生じ、その後、これを変性させ、DNA等の一本鎖標的ポリヌクレオチドにする。DNA及び/又はRNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る一本鎖標的ポリヌクレオチドは、ortho-TINA等の1個又は複数のインターカレータを含む相補的プローブと混合する。相補的プローブは、ビーズ等の支持体に結合される。これにより、DNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る標的ポリヌクレオチドは、相補的プローブにより捕捉される。その後、標識を含む検出プローブを添加する。一実施形態では、洗浄ステップを検出プローブの添加前に実行し、例えばDNA及び/又はRNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る非特異的ポリヌクレオチド及びヌクレオチドの除去等を行う。この実施形態を図4に示す。
【００７９】
本発明は、DNA及び/又はRNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る標的ポリヌクレオチドからの1、2、又は3種類の塩基の除去を含む。したがって、第1の実施形態では、本明細書に開示した塩基が除去され、例としてA、T、C、G、又はUが除去される。他の実施形態では、A及びTの除去等、2又は3種類の塩基が除去される。
【００８０】
本発明の方法を用いる時には、標的ポリヌクレオチドと、試験材中の他のヌクレオチド材料との両方から塩基が除去される。したがって、DNA及び/又はRNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る標的ポリヌクレオチドから除去された塩基は、試験材中に存在するヌクレオチド材料の小部分のみを構成する。
【００８１】
本発明の一実施形態は、RNA又はDNA等の標的ポリヌクレオチドから除去される塩基の総数を、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、及び21以上からなる群から選択可能である、本明細書に開示した方法に関する。
【００８２】
特定の一実施形態において、例えばDNA及び/又はRNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る標的ポリヌクレオチドから除去されるウラシル残基又は他の化学成分の総数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又は21以上の異なる又は同一の化学成分又はウラシル残基等、任意の数にすることができる。
【００８３】
他の実施形態において、例えばDNA及び/又はRNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る標的から除去されるウラシル残基又は他の化学成分の総数は、少なくとも1個、例として少なくとも2個、例えば3個、例として少なくとも4個、例えば5個、例として少なくとも6個、例えば7個、例として少なくとも8個、例えば9個、例として少なくとも10個、例えば11個、例として少なくとも12個、例えば13個、例として少なくとも14個、例えば15個、例として少なくとも16個、例えば17個、例として少なくとも18個、例えば19個、又は例として少なくとも20個である。
【００８４】
他の実施形態において、例えばDNA及び/又はRNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る標的ポリヌクレオチドから除去されるウラシル残基又は他の化学成分の総数は、20個未満、例として19個未満、例えば18個未満、例として17個未満、例えば16個未満、例として15個未満、例えば14個未満、例として13個未満、例えば12個未満、例として11個未満、例えば10個未満、例として9個未満、例えば8個未満、例として7個未満、例えば6個未満、例として5個未満、例えば4個未満、例として3個未満、例えば2個未満、又は例として1個未満である。
【００８５】
除去される残基の数は、dsDNAの融解温度の変化に相関する。一実施形態において、融解温度の好適な変化は、5個未満のウラシル残基又は他の化学成分の除去に対応する。他の実施形態において、融解温度の好適な変化は、5乃至10個のウラシル残基又は他の化学成分の除去に対応する。最後に、他の好適な実施形態において、融解温度の好適な変化は、少なくとも10個のウラシル残基又は他の化学成分の除去に対応する。
【００８６】
相補的プローブ内のインターカレータ分子の総数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、及び21個以上の異なる又は同一のインターカレーション分子から成る群から選択することができる。したがって、一実施形態は、相補的RNA及び/又はDNA標的等のヌクレオチド標的との相互作用に適した、正確に1個のインターカレータ分子を含むポリヌクレオチドプローブに関する。他の実施形態は、相補的RNA及び/又はDNA標的等の相補的ヌクレオチド標的との相互作用に適した、少なくとも2個のインターカレータ分子を含むポリヌクレオチドプローブに関する。更に他の実施形態は、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得るポリヌクレオチドプローブに関し、したがって、相補的プローブは、例えば、RNA、α-L-RNA、β-D-RNA、2’-R-RNA、DNA、LNA、PNA、PMO、TNA、GNA、オリゴヌクレオチドN3’→P5’ホスホルアミダート、BNA、α-L-LNA、HNA、MNA、ANA、CAN、INA、CeNA、(2’-NH)-TNA、(3’-NH)-TNA、α-L-リボ-LNA、α-L-キシロ-LNA、β-D-リボ-LNA、β-D-キシロ-LNA、[3.2.1]-LNA、ビシクロ-DNA、6-アミノ-ビシクロ-DNA、5-エピ-ビシクロ-DNA、α-ビシクロ-DNA、トリシクロ-DNA、ビシクロ[4.3.0]-DNA、ビシクロ[3.2.1]-DNA、ビシクロ[4.3.0]アミド-DNA、β-D-リボピラノシル-NA、α-L-リキソピラノシル-NA、2’-OR-RNA、2’-AE-RNA、及びその組み合わせ及び修飾物から成る群から選択されたもの等のヌクレオチドにより形成され得る。特定の一実施形態は、DNAプローブ、RNAプローブ、LNAプローブ、及びPNAプローブから成る群から選択されるようなプローブに関する。更に他の一実施形態は、インターカレータ分子の総数を1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、及び21個以上から成る群から選択可能なポリヌクレオチドプローブに関する。更に他の特定の実施形態において、相補的プローブ内のインターカレータ分子の総数は、少なくとも1個、例として少なくとも2個、例えば3個、例として少なくとも4個、例えば5個、例として少なくとも6個、例えば7個、例として少なくとも8個、例えば9個、例として少なくとも10個、例えば11個、例として少なくとも12個、例えば13個、例として少なくとも14個、例えば15個、例として少なくとも16個、例えば17個、例として少なくとも18個、例えば19個、又は例として少なくとも20個である。
【００８７】
他の実施形態において、相補的プローブ内のインターカレータ分子の総数は、20個未満、例として19個未満、例えば18個未満、例として17個未満、例えば16個未満、例として15個未満、例えば14個未満、例として13個未満、例えば12個未満、例として11個未満、例えば10個未満、例として9個未満、例えば8個未満、例として7個未満、例えば6個未満、例として5個未満、例えば4個未満、例として3個未満、例えば2個未満、又は例として1個未満である。
【００８８】
自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る相補的プローブ内のインターカレータ分子の数は、標的DNA又はRNAと相補的プローブとから成るハイブリダイゼーション産物の融解温度の変化に相関する。一実施形態において、融解温度の好適な変化は、5個未満のインターカレータ分子を有するプローブの使用に対応する。他の実施形態において、融解温度の好適な変化は、5乃至10個のインターカレータプローブを有するプローブの使用に対応する。最後に、他の好適な実施形態において、融解温度の好適な変化は、少なくとも10個のインターカレータ分子を有するプローブの使用に対応する。
【００８９】
好適な実施形態では、1個のインターカレータ分子が、ポリヌクレオチドプローブの骨格構造に挿入され、相補的ポリヌクレオチド標的配列の1つの脱塩基部位に形態学的に入り込む。一実施形態において、2つ以上の脱塩基部位が存在し、挿入されるインターカレータは同一である。他の実施形態において、2つ以上の脱塩基部位が存在し、挿入されるインターカレータは互いに異なる。
【００９０】
本発明の好適な実施形態において、脱塩基部位に挿入されるインターカレータの総数は、標的ポリヌクレオチド内に存在する脱塩基部位の数と同一である。脱塩基部位の数、したがって、脱塩基部位に挿入されるインターカレータの数は、5を超えないことが特に好適である。更に好適な実施形態において、脱塩基部位の総数、したがって、脱塩基部位に挿入されるインターカレータの数は、最大4である。本発明の最も好適な実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、3つ以下の脱塩基部位を含み、したがって、3個以下のインターカレータが脱塩基部位に挿入され、例えば、脱塩基部位及び脱塩基部位に挿入されるインターカレータは2つ等となる。本発明の更に他の実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、1つの脱塩基部位を含み、1個のインターカレータが脱塩基部位に挿入される。
【００９１】
上述したように、プローブ内のインターカレータ分子は、異なっていても同一でもよい。一実施形態では、異なるインターカレータ分子を用いて、例えばDNA又はRNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る標的ポリヌクレオチドに対するプローブのハイブリダイゼーション特異性を最適化する。一部の種類のインターカレータ分子では、インターカレータ分子が互いに隣接する等、プローブ内で互いに近接する場合、或いは、インターカレータ分子間に存在する残基が2個、3個、4個、5個、又は6個未満である場合、異なる種類のインターカレータ分子を用いることが好適となる。他の種類のインターカレータ分子では、インターカレータ分子が互いに隣接する等、プローブ内で互いに近接する場合、或いは、インターカレータ分子間に存在する残基が2個、3個、4個、5個、又は6個未満である場合、同一種類のインターカレータ分子を用いることが好適となる。
【００９２】
相補的プローブの長さは、一実施形態において、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、及び31以上の塩基から成る群から選択される。好ましくは、相補的プローブの長さは、18乃至22塩基である。プローブの長さは、他の実施形態において、ハイブリダイゼーション効率を最適化するために最適化される。ハイブリダイゼーション効率は、特異的配列及び脱塩基部位の数により決まる。
【００９３】
一実施形態において、本明細書に開示した方法は、更に、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る標的ポリヌクレオチド内の1個又は複数のCを、1個又は複数のUに変換することを含む。
【００９４】
一実施形態において、本明細書に開示した方法は、更に、二本鎖標的ポリヌクレオチド内の1つ又は複数の種類の塩基を、別の化学成分に変換することを含む。特定の実施形態において、方法は、更に、例えばDNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る二本鎖標的ポリヌクレオチド内の1個又は複数のCを、任意の塩基の除去前に、1個又は複数のUに変換することを含む。二本鎖標的DNA内の1個又は複数のCから1個又は複数のUへの変換は、重亜硫酸塩処理により行うことができる[1]。
【００９５】
一実施形態において、本明細書に開示した方法では、標的ポリヌクレオチド内の1個又は複数のCから1個又は複数のUへの変換は、重亜硫酸塩処理により行われる。
【００９６】
他の実施形態では、DNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る二本鎖標的ポリヌクレオチドから、及び/又は一本鎖DNA及び/又はRNAから、1種類の塩基を除去する。DNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る二本鎖標的ポリヌクレオチドからの1種類の塩基の除去により、DNA等の不安定化された二本鎖標的ポリヌクレオチドが生じ、その後、これを変性させ、DNA等の一本鎖標的ポリヌクレオチドにする。DNA及び/又はRNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る一本鎖標的ポリヌクレオチドは、その後、ortho-TINA等の1個又は複数のインターカレータを含む相補的プローブと混合する。相補的プローブは、ビーズ等の支持体に結合することができる。これにより、DNA及び/又はRNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る標的ポリヌクレオチドは、相補的プローブにより捕捉される。その後、標識を含む検出プローブを添加することができる。一実施形態では、検出プローブの添加前及び/又は添加後に、洗浄ステップを実施する。
【００９７】
一実施形態において、例えばRNA及び/又はDNA標的等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る相補的ヌクレオチド標的との相互作用に適したポリヌクレオチドプローブは、正確に1個のインターカレータ分子を含む。一実施形態において、例えばRNA及び/又はDNA標的等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る相補的ヌクレオチド標的との相互作用に適したポリヌクレオチドプローブは、少なくとも2個のインターカレータ分子を含む。
【００９８】
好適な一実施形態において、相補的プローブ及び検出プローブは、1個又は複数のインターカレータ分子を含む。これは、相補的プローブ及び検出プローブが互いにハイブリダイズできないという利点を有する。
【００９９】
本発明の方法の実施形態において、相補的プローブは、1個又は複数のインターカレータ分子を含む。特定の実施形態において、インターカレータ分子の総数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、及び21個以上から成る群から選択することができる。
【０１００】
本発明による方法は、一実施形態において、DNA標的及び/又はRNA標的等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る標的ポリヌクレオチド内の脱塩基部位の10％乃至100％、例として10％乃至20％、例えば20％乃至30％、例として30％乃至40％、例えば40％乃至50％、例として50％乃至60％、例えば60％乃至70％、例として70％乃至80％、例えば80％乃至90％、例として90％乃至100％、又はそれらの任意の組み合わせにおいて、インターカレータ分子が挿入された状態となる方法に関する。
【０１０１】
インターカレータ分子の挿入は、DNA及び/又はRNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る標的ポリヌクレオチドと相補的プローブとから成るポリヌクレオチド二重鎖の融解温度を上昇させることができる。好適な一実施形態は、相補的ポリヌクレオチド標的配列の1つ又は複数の脱塩基部位に形態学的に入り込むインターカレータ分子のポリヌクレオチドプローブの骨格構造への挿入により、標的DNA及び/又はRNAと相補的プローブとから成るポリヌクレオチド二重鎖の融解温度が上昇する、ポリヌクレオチドプローブに関する。
【０１０２】
本発明の利点は、例えば標的DNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得るヌクレオチド標的内の単一の突然変異を、従来のハイブリダイゼーション技術と比較して実質的に高い信頼性で検出可能なことである。標的からの1個又は複数の塩基の除去(1つ又は複数の「脱塩基」部位の形成)により、例えば脱塩基部位当たり約12℃の融解温度の低下が生じる。しかしながら、融解温度の正確な低下は、標的の大きさ、更には標的内の脱塩基部位の数に応じて決まる。「塩基対形成」を行う(即ち空所を埋める)インターカレータ分子(群)を含むプローブと標的内の脱塩基部位(群)との相互作用は、この融点の低下を補償する。本発明の好適な実施形態において、相補的ポリヌクレオチド標的配列の1つ又は複数の脱塩基部位に形態学的に入り込むインターカレータ分子のポリヌクレオチドプローブ骨格構造への挿入は、DNA及び/又はRNA等の標的ポリヌクレオチドと相補的プローブとからなるポリヌクレオチド二重鎖の融解温度を上昇させる。したがって、標的DNAに完全に一致するプローブと、単一のミスマッチを有するプローブとの間には、相対的に大きな融解温度の差が存在する。したがって、本手法は、従来のプローブによるハイブリダイゼーションと比較して、単一のミスマッチをより特異的に識別することができる。
【０１０３】
プローブ内の脱塩基部位の存在は、核酸塩基のミスマッチと比較して、Tmを実質的に大きく低下させることが分かった。
【０１０４】
本発明の発明者は、オリゴヌクレオチドの末端側に位置する核酸塩基ミスマッチと比較して、中心の核酸塩基ミスマッチがTmをより大きく低下させることを発見した。したがって、本発明の一実施形態は、脱塩基部位又は核酸塩基ミスマッチがプローブヌクレオチド配列の末端に位置するようなプローブに関する。本発明の他の実施形態は、脱塩基部位又は核酸塩基ミスマッチがプローブヌクレオチド配列の末端側に位置するようなプローブに関する。
【０１０５】
二重鎖内のオリゴヌクレオチドの長さを30から18ヌクレオチドに減少させることにより、二重鎖のTmが低下する。したがって、本発明の1実施形態において、プローブヌクレオチド配列は、25乃至35ヌクレオチド、例として約30ヌクレオチドの長さを有する。他の実施形態において、プローブヌクレオチド配列は、15乃至23ヌクレオチドの長さを有する。好適な実施形態において、プローブヌクレオチド配列は、約18ヌクレオチドの長さを有する。
【０１０６】
しかしながら、二重鎖内のオリゴヌクレオチドの長さを30から18ヌクレオチドに減少させることにより、二重鎖のTmが低下し、核酸塩基ミスマッチにより得られる融解温度変化(ΔTm)が増加する。
【０１０７】
単一の核酸塩基ミスマッチを含む二重鎖プローブで得られるΔTmは、単一の脱塩基部位を含むプローブで得られるΔTmより低い。更に、2つの核酸塩基ミスマッチを含む二重鎖プローブで得られるΔTmは、2つの脱塩基部位を含むプローブで得られるΔTmより低い。そのため、脱塩基部位又はミスマッチの数を1から2へ増加させると、ΔTmは約2乃至3倍増加する。したがって、実施形態において、二重鎖プローブは、少なくとも2つの脱塩基部位又はミスマッチ、例として正確に2つの脱塩基部位又はミスマッチを含む。
【０１０８】
ポリヌクレオチドプローブの骨格構造へのインターカレータ分子の挿入は、プローブ内のインターカレータが標的配列内の脱塩基部位と相補的な位置にある時、プローブの安定性を高め、得られる融解温度の低下を著しく減少させる。1つのミスマッチを含むプローブと比較して、こうしたインターカレータの挿入は、ΔTmを著しく減少させ、約3乃至4分の1にする。同様に、2つのミスマッチ部位を含むプローブにおいて見られる融解温度の低下を、2個のインターカレータを標的配列内の脱塩基部位に相補的に位置決めされたポリヌクレオチドプローブの骨格構造に挿入したプローブにおいて見られる融解温度の低下と比較すると、こうしたインターカレータの挿入は、ΔTmを著しく減少させ、約2分の1、例えば3分の1にする。
【０１０９】
更に具体的には、実施形態では、1つのミスマッチが存在し、22-merの二重鎖のΔTmを約4℃乃至13℃、例として約7℃乃至約10℃、一般に約8℃にする。他の実施形態では、1つの脱塩基部位が存在し、22-merの二重鎖のΔTmを約8℃乃至18℃、例として約10℃乃至約16℃、一般に約12乃至14℃にする。他の実施形態では、2つのミスマッチが存在し、22-merの二重鎖のΔTmを約10℃乃至28℃、例として約13℃乃至約25℃、一般に約18℃にする。他の実施形態では、2つの脱塩基部位が存在し、22-merの二重鎖のΔTmを少なくとも15℃、例として少なくとも17℃、一般に少なくとも約20℃にする。他の実施形態では、3つのミスマッチが存在し、22-merの二重鎖のΔTmを、少なくとも20℃、例として少なくとも23℃、一般に少なくとも約25℃にする。他の実施形態では、3つの脱塩基部位が存在し、22-merの二重鎖のΔTmを、少なくとも25℃、例として少なくとも28℃、一般に少なくとも約30℃にする。
【０１１０】
他の特定の実施形態では、1つのミスマッチが存在し、30-merの二重鎖のΔTmを約2℃乃至8℃、例として約4℃乃至約7℃、一般に約6℃にする。他の実施形態では、1つの脱塩基部位が存在し、30-merの二重鎖のΔTmを約8℃乃至12℃、例として約9℃乃至約10℃、一般に約8.5℃乃至9.5℃にする。他の実施形態では、2つのミスマッチが存在し、30-merの二重鎖のΔTmを約10℃乃至17℃、例として約11℃乃至約14℃、一般に約13℃にする。他の実施形態では、2つの脱塩基部位が存在し、30-merの二重鎖のΔTmを約15℃乃至24℃、例として約17℃乃至23℃、一般に約19℃乃至約22℃にする。他の実施形態では、3つのミスマッチが存在し、30-merの二重鎖のΔTmを、約18℃乃至25℃、例として約21℃乃至22℃、一般に少なくとも約21.5℃にする。他の実施形態では、3つの脱塩基部位が存在し、30-merの二重鎖のΔTmを少なくとも25℃、例として少なくとも約29℃、一般に少なくとも約31℃にする。
【０１１１】
他の実施形態では、1個のインターカレータ分子が、標的配列内の脱塩基部位に対して相補的に位置決めされたポリヌクレオチドプローブの骨格構造内に挿入され、22-merの二重鎖のΔTmを約0℃乃至4℃、例として約1℃乃至2℃、一般に少なくとも約1.5℃にする。他の実施形態では、2個のインターカレータ分子が、標的配列内の2つの脱塩基部位に対して相補的に位置決めされたポリヌクレオチドプローブの骨格構造内に挿入され、22-merの二重鎖のΔTmを約3℃乃至8℃、例として約5℃乃至7℃、一般に少なくとも約6℃にする。他の実施形態では、3個のインターカレータ分子が、標的配列内の3つの脱塩基部位に対して相補的に位置決めされたポリヌクレオチドプローブの骨格構造内に挿入され、22-merの二重鎖のΔTmを約10℃乃至14℃、例として約11℃乃至13℃、一般に約12℃にする。他の実施形態では、1個のインターカレータ分子が、標的配列内の脱塩基部位に対して相補的に位置決めされたポリヌクレオチドプローブの骨格構造内に挿入され、30-merの二重鎖のΔTmを約1℃乃至2℃、一般に約1.5℃にする。他の実施形態では、2個のインターカレータ分子が、標的配列内の2つの脱塩基部位に対して相補的に位置決めされたポリヌクレオチドプローブの骨格構造内に挿入され、30-merの二重鎖のΔTmを約3℃乃至7℃、例として約4℃乃至5℃、一般に少なくとも約4.5℃にする。他の実施形態では、3個のインターカレータ分子が、標的配列内の3つの脱塩基部位に対して相補的に位置決めされたポリヌクレオチドプローブの骨格構造内に挿入され、30-merの二重鎖のΔTmを約6℃乃至11℃、例として約8℃乃至9℃、一般に約8.5℃にする。
【０１１２】
本発明は、更に、DNA及び/又はRNA等の標的ポリヌクレオチド内の脱塩基部位の10％超、例として20％超、例えば30％超、例として40％超、例えば50％超、例として60％超、例えば70％超、例として80％超、例えば90％超、例として95％超、例えば100％において、インターカレータ分子が挿入された状態となる方法に関する。
【０１１３】
相補的プローブ内のインターカレータ分子の総数と塩基の総数との間の比は、一実施形態において、1:50乃至1:2、例として1:50乃至1:40、例えば1:40乃至1:30、例として1:30乃至1:20、例えば1:20乃至1:10、例として1:10乃至1:5、例えば1:5乃至1:2、又はこれらの間隔の任意の組み合わせとなる。本発明の特定の一実施形態は、相補的プローブ内のインターカレータ分子の数と塩基の総数との間の比が、1:50乃至1:2、例として1:50乃至1:40、例えば1:40乃至1:30、例として1:30乃至1:20、例えば1:20乃至1:10、例として1:10乃至1:5、例えば1:5乃至1:2、又はこれらの間隔の任意の組み合わせとなるポリヌクレオチドプローブに関する。
【０１１４】
本明細書の開示による方法の一実施形態において、相補的検出プローブは、1個又は複数のインターカレータ分子を含む。一実施形態において、相補的検出プローブは、1個又は複数のインターカレータ分子、例として1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又は21個以上の異なる又は同一のインターカレータ分子を含むことができる。
【０１１５】
検出プローブの長さは、一実施形態において、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、及び31塩基以上からなる群から選択される。
【０１１６】
検出プローブは、DNA、RNA、LNA、又はPNAプローブ等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得るポリヌクレオチドにより形成された任意のポリヌクレオチドプローブにすることができる。特定の一実施形態において、検出プローブは、RNA又はDNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得るポリヌクレオチドにより形成される。特定の一実施形態において、検出プローブは、RNAを含む。他の特定の実施形態において、検出プローブは、DNAを含む。他の特定の実施形態において、検出プローブは、LNA、PNA、PMO、TNA、GNA、オリゴヌクレオチドN3’→P5’ホスホルアミダート、BNA、α-L-LNA、及び他の拘束ヌクレオチドから成る群から選択された1つ又は複数の類似体を含むもの等、自然発生が知られていないポリヌクレオチドにより形成される。特定の一実施形態において、検出プローブは、LNAを含む。特定の一実施形態において、検出プローブは、PNAを含む。特定の一実施形態において、検出プローブは、PMOを含む。特定の一実施形態において、検出プローブは、TNAを含む。特定の一実施形態において、検出プローブは、GNAを含む。特定の一実施形態において、検出プローブは、ヌクレオチドN3’→P5’ホスホルアミダートを含む。特定の一実施形態において、検出プローブは、BNAを含む。特定の一実施形態において、検出プローブは、α-L-LNAを含む。特定の一実施形態において、検出プローブは、本明細書に定めるような他の拘束ヌクレオチドを含む。
【０１１７】
本発明の方法は、診断、アンチセンス療法のモニタリング、血縁者の識別、個別化医療、法遺伝学、定量的RNA解析、微生物の検出、考古学及び古生物病理学、食品汚染、及び環境汚染等、幅広い用途において使用し得る。したがって、本発明は、診断の目的、及び、医薬品、獣医学、環境医学、食品生産の品質管理において使用し得る。
【０１１８】
インターカレータ
【０１１９】
本発明によるインターカレータは、既に述べたように、従来の核酸塩基(塩基)のように、DNAプローブ、RNAプローブ、PNAプローブ、又はLNAプローブ等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得るポリヌクレオチドプローブの脱塩基部位に挿入可能な分子の種類である。
【０１２０】
上述した脱塩基部位への挿入に加え、本発明によるインターカレータは、自然発生ヌクレオチドとなり得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチドとなり得る二本鎖ポリヌクレオチドの塩基対間に入り込むことも可能となり得る。言い換えると、本発明のインターカレータは、更に、ポリヌクレオチドの塩基対間の空所に入り込むことが可能となり得る。こうした空所は、脱塩基部位により提供されないが、塩基対間の空所に位置する。こうした空所は、例えばポリヌクレオチドの巻き戻しにより、或いは、ポリヌクレオチドの末端位置において提供される。こうした空所への本発明によるインターカレータの組み込みは、酵素的に、或いは酵素を使用することなく行われる。したがって、本明細書に開示した方法の一実施形態において、本明細書に定めるような1個又は複数のインターカレータは、1つ又は複数の脱塩基部位のみに挿入される。本発明の他の実施形態において、本明細書に定めるような1個又は複数の他のインターカレータは、二本鎖ポリヌクレオチドの塩基対間に位置決めされる。
【０１２１】
本発明の実施形態において、本発明によるインターカレータは、核酸残基と結合しない。
【０１２２】
本発明の他の実施形態において、本明細書に開示したインターカレータは、電荷移動を利用しない。
【０１２３】
本発明の特定の実施形態において、インターカレータは、一般構造X-Yの化学成分であり、Xは、核酸の核酸塩基との相互スタッキングが可能な、少なくとも1つの本質的に平坦な共役系を含むインターカレーティング単位であり、Yは、DNAプローブ、RNAプローブ、PNAプローブ、又はLNAプローブ等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得るポリヌクレオチドプローブにインターカレーティング単位を連結するリンカである。本発明の特定の実施形態において、本質的に平坦な共役系は、完全に平面である。
【０１２４】
好適な実施形態において、本発明によるインターカレータは、一般構造X-Yを有するものであり、Xは、インターカレーティング単位であり、Yは、ポリヌクレオチドプローブにインターカレーティング単位を連結するリンカである。
【０１２５】
本発明によるインターカレータのインターカレーティング単位は、好ましくは、ポリアロメート及びヘテロポリアロメートから成る群から選択された化学基を含み、更に好ましくは、インターカレーティング単位は、本質的にポリアロメート又はヘテロポリアロメートから成る。最も好ましくは、インターカレータは、ポリアロメート及びヘテロポリアロメートから成る群から選択される。
【０１２６】
本発明によるポリアロメート及びヘテロポリアロメートは、任意の適切な数の芳香環、例として少なくとも2個、例として2個、例として3個、例えば4個、例として5個、例えば6個、例として7個、例えば8個、例として9個以上の芳香環により構成され得る。
【０１２７】
本発明の一実施形態において、インターカレーティング単位の大きさは、20乃至400Å、例として20乃至40Å、例えば40乃至60Å、例として60乃至80Å、例えば80乃至100Å、例として100乃至120Å、例えば120乃至140Å、例として140乃至160Å、例えば160乃至180Å、例として180乃至200Å、例えば200乃至220Å、例として220乃至240Å、例えば240乃至260Å、例として260乃至280Å、例えば280乃至300Å、例として300乃至320Å、例えば320乃至340Å、例として340乃至360Å、例えば360乃至380Å、例として380乃至400Å、又はこれらの間隔の任意の組み合わせである。
【０１２８】
本発明によるヘテロポリアロメートは、少なくとも1個の炭素原子が窒素及び酸素から選択されたヘテロ原子、例として酸素、例えば窒素に置き換わった少なくとも1個の芳香環を含む。本発明によるヘテロポリアロメートは、例として少なくとも2個のヘテロ原子、例として2個のヘテロ原子、例として3個のヘテロ原子、例えば4個のヘテロ原子、例として5個のヘテロ原子、例えば6個以上のヘテロ原子を含む。2個以上のヘテロ原子を含む本発明によるヘテロポリアロメートは、例として1個又は複数の酸素以外のヘテロ原子を含まず、例として1個の酸素以外のヘテロ原子を含まず、例えば1個又は複数の窒素以外のヘテロ原子を含まず、例えば1個の窒素以外のヘテロ原子を含まず、例として1個又は複数の窒素及び1個又は複数の酸素以外のヘテロ原子を含まない。
【０１２９】
本発明によるポリアロメート又はヘテロポリアロメートは、ヒドロキシル、ハロゲン、メルカプト、チオ、シアノ、アルキルチオ、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルボアルコイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ニトロ、アミノ、アルコキシル、及び/又はアミドから成る群から選択された1個又は複数の置換基により置換されてよく、或いは2個の隣接する置換基は、共にN=C-CH又はC=Cを形成し得る。
【０１３０】
本発明の好適な一実施形態において、インターカレーティング単位は、ポリヌクレオチド二重鎖構造の安定性を高めることが可能なポリアロメート及びヘテロポリアロメートから成る群から選択され得る。
【０１３１】
好適な一実施形態において、インターカレーティング単位は、フェナントロリンと、フェナジンと、フェナントリジンと、ピレンと、アントラセンと、ナフタレンと、フェナントレンと、ピセンと、クリセンと、ナフタセンと、ベンズアントラセンと、スチルベンと、ポルフィリンと、ヒドロキシル、ハロゲン、メルカプト、チオ、シアノ、アルキルチオ、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルボアルコイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ニトロ、アミノ、アルコキシル、及び/又はアミドから成る群から選択された1個又は複数の置換基により置換された前述のインターカレータの何れかと、から成る群から選択され、或いは2個の隣接する置換基は、共にN=C-CH又はC=Cを形成し得る。
【０１３２】
他の好適な実施形態において、インターカレーティング単位は、2環式芳香環系、3環式芳香環系、4環式芳香環系、5環式芳香環系、及びそれらのヘテロ芳香族類似体及び置換体から成る群から選択される。特定の実施形態において、インターカレーティング単位は、ピレン、フェナントロイミダゾール、及びナフタルイミドから成る群から選択される。
【０１３３】
他の好適な実施形態において、インターカレーティング単位は、修飾核酸塩基からなる群から選択される。その非限定的な例は、MPyU、AMPyU、Oxo-PyU、及びUが本明細書に開示した他の核酸塩基の何れかに置き換わった類似体である。特定の一実施形態は、MPyU、AMPyU、Oxo-PyUからなる群から選択されたインターカレーティング単位を対象とする(Bag et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 20 (2010) 3227-3230)。特に好適なものは、Oxo-PyUである。
【０１３４】
好ましくは、インターカレーティング単位は、次の式1である、
【化１０】
2013544507.tif 000011
ここで、
R1は、ヒドロキシル、ハロゲン、メルカプト、チオ、シアノ、アルキルチオ、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルボアルコイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ニトロ、アミノ、アルコキシルから成る群から選択され、
R2は、ヒドロキシル、ハロゲン、メルカプト、チオ、シアノ、アルキルチオ、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルボアルコイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ニトロ、アミノ、アルコキシル、及び/又はアミドから成る群から選択され、或いは2個の隣接する置換基R1及びR2は、共にN=C-CH又はC=Cを形成し、
R3は、ヒドロキシル、ハロゲン、メルカプト、チオ、シアノ、アルキルチオ、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルボアルコイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ニトロ、アミノ、アルコキシルから成る群から選択され、
R4は、ヒドロキシル、ハロゲン、メルカプト、チオ、シアノ、アルキルチオ、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルボアルコイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ニトロ、アミノ、アルコキシル、及び/又はアミドから成る群から選択され、或いは2個の隣接する置換基R3及びR4は、共にN=C-CH又はC=Cを形成する。
【０１３５】
更に好ましくは、インターカレーティング単位は、次の式の何れかである。
【化１１】
2013544507.tif 000012
【０１３６】
式1の特定の好適な実施形態において、インターカレーティング単位は、式2、即ち、ピレン部分である。
【０１３７】
式1の特定の好適な実施形態において、インターカレーティング単位は、式3である。
【０１３８】
インターカレーティング単位は、任意の可能な位置においてリンカに付着し得る。しかしながら、次に示したような付着が好適である。
【化１２】
2013544507.tif 000013
【０１３９】
式2の好適な一実施形態において、インターカレーティング単位は、式2*に示したように付着する。
【０１４０】
式3の好適な一実施形態において、インターカレーティング単位は、式3*に示したように付着する。
【０１４１】
上述した例の一覧は、如何なる形でも限定的と理解するべきではなく、インターカレーティング単位として用いることが可能な構造の例を提供するものに過ぎない。加えて、修飾構造を得るための各インターカレーティング単位における1つ又は複数の化学基の置換も、本発明に含まれる。
【０１４２】
インターカレータ擬似ヌクレオチドのインターカレーティング単位は、リンカYにより、ポリヌクレオチドプローブの骨格単位に連結される。骨格からリンカに沿ってインターカレーティング単位へ向かう時、リンカとインターカレーティング単位との間の結合は、リンカ原子と、インターカレーティング単位の共役系の一部である第1の原子との間の結合として定められる。リンカ分子は、インターカレーティング単位を備えたプローブの骨格と共有的又は非共有的に結合することにより、リンカ分子に含まれる全ての分子から成るより大きな複合体を形成する。
【０１４３】
リンカは、ポリヌクレオチドプローブをインターカレーティング単位に連結する最も短い経路である。リンカは、通常、原子鎖又は分岐した原子鎖から成る。鎖は、飽和している場合と不飽和の場合がある。リンカは、共役結合を有する又は有しない環状構造となり得る。
【０１４４】
リンカは、実施形態において、インターカレーティング単位が直接骨格に連結された結合部である。
【０１４５】
他の実施形態において、リンカは、1つ又は複数の原子或いは原子間の結合部を含む。
【０１４６】
更に他の実施形態において、リンカが共役系を含み、インターカレーティング単位が別の共役系を含む場合がある。この場合、リンカの共役系は、脱塩基部位において核酸塩基との相互スタッキングが不可能となる。
【０１４７】
例えば、リンカは、C、O、S、N、P、Se、Si、Ge、Sn、及びPbから成る群から選択されたm個の原子の鎖を、鎖の一方の末端がインターカレーティング単位に接続され、鎖の他方の末端がポリヌクレオチドプローブの骨格モノマ単位に結合された状態で含み得る。
【０１４８】
一部の実施形態において、本発明によるリンカ及びインターカレーティング単位を合計した長さは、8乃至13Åであることが好ましい。2個の天然の塩基が通常占める面積は269Åである[Kool、6]。したがって、mは、インターカレーティング単位の大きさに応じて選択するべきであり、即ち、インターカレータが小さい時、mは、相対的に大きくなり、インターカレータが大きい時、mは、相対的に小さくなる。
【０１４９】
殆どの目的にとって、mは、1乃至13の整数であり、例として1乃至12、例として1乃至11、例として1乃至10、例として1乃至9、例として1乃至8、例として1乃至7、例として1乃至6、例として1乃至5、例として1乃至4の整数となる。上述したように、リンカは、不飽和鎖等のアルキル、又は共役結合を含む他の系となり得る。例えば、リンカは、環状共役構造を含み得る。好ましくは、mは、リンカが飽和鎖である時、1乃至4であり、リンカが環状共役構造含む時、7乃至13、例として9乃至11となる。
【０１５０】
本発明の一実施形態において、リンカの大きさは、20乃至400Åであり、例として20乃至40Å、例えば40乃至60Å、例として60乃至80Å、例えば80乃至100Å、例として100乃至120Å、例えば120乃至140Å、例として140乃至160Å、例えば160乃至180Å、例として180乃至200Å、例えば200乃至220Å、例として220乃至240Å、例えば240乃至260Å、例として260乃至280Å、例えば280乃至300Å、例として300乃至320Å、例えば320乃至340Å、例として340乃至360Å、例えば360乃至380Å、例として380乃至400Å、又はこれらの間隔の任意の組み合わせである。
【０１５１】
他の実施形態において、C原子1乃至6個、O、S、N原子それぞれ0乃至3個から成る。より好ましくは、リンカは、C原子1乃至6個及びO、S、N原子そらぞれ0乃至1個から成る。
【０１５２】
リンカの鎖は、ハロゲン、ヨウ素、メルカプト、チオ、シアノ、アルキルチオ、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルボアルコイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ニトロ、アミノ、アルコキシル、及びアミドから成る群から選択された1個又は複数の原子により置換され得る。
【０１５３】
更に具体的には、リンカは、C、O、S、N、P、Se、Si、Ge、Sn、及びPbから成る群から選択された原子を含む鎖から構成され得る。こうした鎖は、1個又は複数のアルキル基、例としてC1-6-alk(en/yn)yl、例としてC1-6-アルキル、例えば無分岐アルキル鎖を、鎖の一方の末端がインターカレーティング単位に接続され、鎖の他方の末端がポリヌクレオチドプローブの骨格モノマ単位に結合された状態且つ各Cが2Hにより置換された状態で含み得る。好適な実施形態において、鎖は、1個又は複数の酸素原子(O)を、上述したアルキル鎖に加えて含む。実施形態において、鎖は、C1-6-alk(en/yn)yl-O-C1-6-alk(en/yn)ylであり、例としてC1-6-アルキル-O-C1-6-アルキルである。好ましくは、無分岐アルキル鎖は、長さ1乃至5原子、例として長さ1乃至4原子、例として長さ1乃至3原子、例として長さ2乃至3原子である。好適な実施形態において、リンカは、CH2-O-CH2である。
【０１５４】
更に具体的には、リンカは、C、O、S、N、P、Se、Si、Ge、Sn、及びPbから成る群から選択された原子を含む環状構造及び鎖状構造を含み得る。含まれる環状構造部分の非限定的な例は、アリール又はC3-8-cycloalk(en)ylである。好適な実施形態において、リンカは、フェニル基等のアリールである。含まれる鎖状構造部分は、1個又は複数のアルキル基、例としてC1-6-alk(en/yn)yl、例としてC1-6-アルキル、例えば無分岐アルキル鎖を、鎖の一方の末端がインターカレーティング単位に接続され、鎖の他方の末端がポリヌクレオチドプローブの骨格モノマ単位に結合された状態且つ各Cが2Hにより置換された状態で含み得る。好適な実施形態において、鎖は、1個又は複数の酸素原子(O)を、上述したアルキル鎖に加えて含む。実施形態において、こうしたリンカは、アリール-O-C1-6-alk(en/yn)yl及びC1-6-alk(en/yn)yl-アリール-C1-6-alk(en/yn)yl-O-C1-6-alk(en/yn)ylから成る群から選択される。本発明の好適な実施形態において.リンカは、アリール-O-C1-6-alk(en/yn)ylであり、例としてアリール-O-C1-6-alk(en/yn)yl、例としてアリール-O-C1-6-アルキルである。例えば、こうしたリンカは、ヒドロキシル、ハロゲン、メルカプト、チオ、シアノ、アルキルチオ、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルボアルコイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ニトロ、アミノ、アルコキシル、及び/又はアミドから成る群から選択された1個又は複数の置換基により置換され得る。好適な実施形態において、こうしたリンカは、フェニル-O-エチルである。他の好適な実施形態において、こうしたリンカは、ナフチル-O-エチルである。本発明の好適な実施形態において、リンカは、C1-6-alk(en/yn)yl-アリール-C1-6-alk(en/yn)yl-O-C1-6-alk(en/yn)yl、例としてC1-6-alk(en/yn)yl-アリール-C1-6-alk(en/yn)yl-O-C1-6-alk(en/yn)yl、例としてC1-6-アルキル-アリール-C1-6-アルキル-O-C1-6-アルキルである。好適な実施形態において、こうしたリンカは、エチニル-フェニル-メチル-O-メチルである。
【０１５５】
更に具体的には、リンカは、C、O、S、N、P、Se、Si、Ge、Sn、及びPbから成る群から選択された原子を含む環状構造となり得る。こうした環状構造部分の非限定的な例は、アリールC3-8-cycloalk(en)ylである。例えば、こうしたリンカは、ヒドロキシル、ハロゲン、メルカプト、チオ、シアノ、アルキルチオ、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルボアルコイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ニトロ、アミノ、アルコキシル、及び/又はアミドから成る群から選択された1個又は複数の置換基により置換され得る。好適な実施形態において、リンカは、アリールであり、例としてアリール、フェニル等である。
【０１５６】
一実施形態において、本発明によるリンカは、疎水性を有する。本発明の他の実施形態において、リンカは、親水性を有する。
【０１５７】
一実施形態において、本発明によるリンカは、柔軟な性質を有する。他の実施形態において、本発明によるリンカは、剛体の性質を有する。
【０１５８】
ピレンが占める面積は、220Åである[6]。本発明の一実施形態において、インターカレーティング単位は、ピレンであり、リンカのサイズは、20乃至200Åであり、例として20乃至40Å、例えば40乃至60Å、例として60乃至80Å、例えば80乃至100Å、例として100乃至120Å、例えば120乃至140Å、例として140乃至160Å、例えば160乃至180Å、例として180乃至200Å、又はこれらの間隔の任意の組み合わせである。
【０１５９】
インターカレータがピレンである本発明の実施形態において、mは、1乃至11の整数であることが好ましく、例として1乃至10、例として1乃至9、例として1乃至8、例として1乃至7、例として1乃至6、例として1乃至5、例として1乃至4、例として1乃至3の整数となる。
【０１６０】
実施形態において、インターカレーティング単位は、ピレンであり、リンカは、C1-6-alk(en/yn)yl-O-C1-6-alk(en/yn)yl、例としてC1-6-アルキル-O-C1-6-アルキル、CH2-O-CH2等である。好適な実施形態において、インターカレーティング単位は、リンカと共に、図5にINAとして示す複合体を形成する。
【０１６１】
他の実施形態において、インターカレーティング単位は、ピレンであり、リンカは、C1-6-alk(en/yn)yl-アリール-C1-6-alk(en/yn)yl-O-C1-6-alk(en/yn)yl、例としてC1-6-alk(en/yn)yl-アリール-C1-6-alk(en/yn)yl-O-C1-6-alk(en/yn)yl、例としてC1-6-アルキル-アリール-C1-6-アルキル-O-C1-6-アルキル、例としてエチニル-フェニル-メチル-O-メチルである。好適な実施形態において、インターカレーティング単位は、リンカと共に、図5にTINAとして示す複合体を形成する。他の実施形態において、インターカレーティング単位は、リンカと共に、図5にpara-TINAとして示す複合体を形成する。好適な実施形態において、インターカレーティング単位は、リンカと共に、図5にortho-TINAとして示す複合体を形成する。
【０１６２】
更に他の実施形態において、インターカレーティング単位は、式3のものであり、リンカは、アリール-O-C1-6-alk(en/yn)yl、例としてアリール-O-C1-6-alk(en/yn)yl、例としてアリール-O-C1-6-アルキル、例としてフェニル-O-エチルである。他の好適な実施形態において、インターカレーティング単位は、リンカと共に、図5にAMANYとして示す複合体を形成する。
【０１６３】
好適な実施形態において、本発明によるインターカレータの相補的DNA又はRNA構造の脱塩基部位への挿入により、ポリヌクレオチド二重鎖構造の安定性が増加する。
【０１６４】
一実施形態において、インターカレータ分子の大きさは、20乃至400Åであり、例として20乃至40Å、例えば40乃至60Å、例として60乃至80Å、例えば80乃至100Å、例として100乃至120Å、例えば120乃至140Å、例として140乃至160Å、例えば160乃至180Å、例として180乃至200Å、例えば200乃至220Å、例として220乃至240Å、例えば240乃至260Å、例として260乃至280Å、例えば280乃至300Å、例として300乃至320Å、例えば320乃至340Å、例として340乃至360Å、例えば360乃至380Å、例として380乃至400Å、又はこれらの間隔の任意の組み合わせである。
【０１６５】
一実施形態では、各プローブにおいて、異なるインターカレータ分子が2種類以上、例として2種類、3種類、4種類、5種類、又は5種類以上使用される。したがって、実施形態において、相補的プローブ等のポリヌクレオチドプローブは、異なるインターカレータ分子を2種類以上、例として2種類、3種類、4種類、5種類、又は5種類以上含む。
【０１６６】
好適な実施形態において、インターカレーティング単位は、リンカと共に、図5に示したTINA、INA、ortho-TINA、para-TINA、及びAMANYから成る群から選択された複合体を形成する。
【０１６７】
本発明の特定の実施形態は、TINA、INA、ortho-TINA、para-TINA、及びAMANYから成る群から選択可能である1個又は複数のインターカレータ分子の使用を含む方法に関する[3、4、5、6]。
【０１６８】
本発明の他の一実施形態は、1個又は複数のインターカレータ分子がTINA、INA、ortho-TINA、para-TINA、及びAMANYから成る群から選択されたポリヌクレオチドプローブに関する。更に他の一実施形態は、2個以上のインターカレータ分子がTINA、INA、ortho-TINA、para-TINA、及びAMANYから成る群から選択されたポリヌクレオチドプローブに関する。特定の実施形態は、インターカレータ分子がTINAであるポリヌクレオチドプローブに関する。他の特定の実施形態は、インターカレータ分子がINAであるポリヌクレオチドプローブに関する。他の特定の実施形態は、インターカレータ分子がortho-TINAであるポリヌクレオチドプローブに関する。他の特定の実施形態は、インターカレータ分子がpara-TINAであるポリヌクレオチドプローブに関する。他の特定の実施形態は、インターカレータ分子がAMANYであるポリヌクレオチドプローブに関する。
【０１６９】
TINA、INA、及びAMANYは、フーグスティーン三重鎖DNAを安定化させる設計のインターカレータであるが、驚いたことに、二本鎖DNAを安定化させるために用いることもできる。
【０１７０】
インターカレータ分子は、ハイブリダイゼーションアッセイにおける逆平行二重鎖形成の融解温度(Tm)及びΔTmを高める。
【０１７１】
支持体
【０１７２】
相補的プローブは、上述したように、支持体に結合させ得る。したがって、一実施形態において、ポリヌクレオチドプローブ、即ち、相補的プローブは、固体支持体等の支持体に結合させる。支持体は、固体、半固体、又は可溶性支持体にすることができる。支持体は、先行技術において開示された任意の適切な支持体にすることができる。本発明の実施形態において、相補的プローブ等のポリヌクレオチドプローブは、支持体に結合させる。実施形態において、支持体は、固体支持体である。他の実施形態において、支持体は、粒状物質、ビーズ、磁性ビーズ、非磁性ビーズ、ポリスチレンビーズ、磁性ポリスチレンビーズ、セファロースビーズ、セファクリルビーズ、ポリスチレンビーズ、アガロースビーズ、多糖類ビーズ、及びポリカーバメートビーズから成る群から選択される。
【０１７３】
支持体の非限定的な例を以下に列挙する。
【０１７４】
ポリ(エーテルエーテルケトン)(PEEK)、PP(ポロプロピレン)、PE(ポリエチレン)、ポリ(エチレンテレフタレート)(PET)、ポリ(ビニルクロライド)(PVC)、ポリアミド/ナイロン(PA)、ポリカーボネート(PC)、環状オレフィン共重合体(COC)、濾紙、綿、セルロース、ポリ(4-ビニルベンジルクロライド)(PVBC)、ポリ(ビニリデンフルオライド)(PVDF)、ポリスチレン(PS)、Toyopearl(登録商標)、ヒドロゲル、ポリイミド(PI)、1,2-ポリブタジエン(PB)、LSR(液状シリコーンゴム)、ポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS)、フッ素重合体及び共重合体(例えばポリ(テトラフルオロエチレン)(PTFE)、ペルフルオロエチレンプロピレンコポリマ(FEP)、エチレンテトラフルオロエチレン(ETFE))、ポリ(メチルメタクリレート)(PMMA)、ナノ多孔性材料、膜、メソ構造セル状フォーム(MCF)、及び単層又は多層カーボンナノチューブ(SWCNT、MWCNT)、粒状物質、ビーズ、磁性ビーズ、非磁性ビーズ、ポリスチレンビーズ、磁性ポリスチレンビーズ、セファロースビーズ、セファクリルビーズ、ポリスチレンビーズ、アガロースビーズ、多糖類ビーズ、及びポリカーバメートビーズ。
【０１７５】
特定の一実施形態において、支持体は、ポリ(エーテルエーテルケトン)(PEEK)、PP(ポロプロピレン)、PE(ポリエチレン)、ポリ(エチレンテレフタレート)(PET)、ポリ(ビニルクロライド)(PVC)、ポリアミド/ナイロン(PA)、ポリカーボネート(PC)、環状オレフィン共重合体(COC)、濾紙、綿、セルロース、ポリ(4-ビニルベンジルクロライド)(PVBC)、ポリ(ビニリデンフルオライド)(PVDF)、ポリスチレン(PS)、Toyopearl(登録商標)、ヒドロゲル、ポリイミド(PI)、1,2-ポリブタジエン(PB)、LSR(液状シリコーンゴム)、ポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS)、フッ素重合体及び共重合体(例えばポリ(テトラフルオロエチレン)(PTFE)、ペルフルオロエチレンプロピレンコポリマ(FEP)、エチレンテトラフルオロエチレン(ETFE))、ポリ(メチルメタクリレート)(PMMA)から成る群等、高分子又は有機基質群から選択される。
【０１７６】
他の実施形態において、支持体は、ナノ多孔性材料、膜、メソ構造セル状フォーム(MCF)、及び単層又は多層カーボンナノチューブ(SWCNT、MWCNT)から成る群から選択される。
【０１７７】
更に他の実施形態において、支持体は、粒状物質、ビーズ、磁性ビーズ、非磁性ビーズ、ポリスチレンビーズ、磁性ポリスチレンビーズ、セファロースビーズ、セファクリルビーズ、ポリスチレンビーズ、アガロースビーズ、多糖類ビーズ、及びポリカーバメートビーズから成る群から選択される。
【０１７８】
他の実施形態において、固体支持体は、マイクロタイタープレート、他のプレート形式、試薬チューブ、スライドガラス及びアレイ又はマイクロアレイ解析に用いられる他の支持体、マイクロ流体チャンバ又はデバイスのチューブ又は導管類、及びBiacoreチップから成る群から選択される。
【０１７９】
標識
【０１８０】
上述したように、検出プローブ及び/又は相補的DNAプローブは、1つ又は複数の標識、例として1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又は21個以上の異なる又は同一の標識を含むことができる。
【０１８１】
したがって、一実施形態において、本発明は、1つ又は複数の標識を含むポリヌクレオチドプローブに関する。他の実施形態は、1つ又は複数の標識を含む検出プローブの使用を含む、本明細書に開示した方法を提供する。他の一実施形態において、本明細書に開示した方法は、1つ又は複数の標識を含む相補的プローブの使用を含む。
【０１８２】
1つ又は複数の標識は、任意の最先端の標識にすることが可能であり、例として、ビオチン、蛍光標識、5(及び6)-カルボキシフルオレセイン、5-又は6-カルボキシフルオレセイン、6-(フルオレセイン)-5(及び6)-カルボキシアミドヘキサン酸、フルオレセインイソチオシアナート(FITC)、ローダミン、テトラメチルローダミン、染料、Cy2、Cy3、及びCy5、PerCP、フィコビリ蛋白質、R-フィコエリトリン(RPE)、アロフィコエリトリン(APC)、テキサスレッド、プリンストンレッド、緑色蛍光タンパク質(GFP)及びその類似体、R-フィコエリトリン又はアロフィコエリトリンのコンジュゲート、半導体ナノ結晶(量子ドット及びQdotTMナノ結晶等)に基づく無機蛍光標識、Eu3+及びSm3+等のランタニドに基づく時間分解蛍光標識、ハプテン、DNP、ジゴキシゲニン、酵素標識、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ(AP)、ベータガラクトシダーゼ(GAL)、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、β-N-アセチルグルコサミニダーゼ、β-グルクロニダーゼ、インベルターゼ、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ及びグルコースオキシダーゼ(GO)、発光標識、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、1,2-ジオキセタン、ピリドピリダジン、放射能標識、ヨウ化物の同位体、コバルトの同位体、セレンの同位体、トリチウムの同位体、及びリンの同位体から成る群から選択された1つ又は複数の標識にすることができる。
【０１８３】
好適な一実施形態では、ビオチン標識が用いられる。ビオチンは、ストレプトアビジン-R-フィコエリトリンを用いて検出することができる。
【０１８４】
実施形態において、本発明の方法は、検出プローブの添加前及び/又は添加後に1回又は複数回の洗浄ステップを含む。
【０１８５】
標識は、先行技術において開示された任意の適切な方法により検出することができる。
【０１８６】
複数の標的DNA配列の検出
【０１８７】
本発明の一実施形態は、複数の標的ポリヌクレオチド、例として標的DNA、LNA修飾DNA、RNA、LNA修飾RNA、及び/又はPNA、例えばDNA及び/又はRNA配列を、本明細書に開示した方法を用いて検出することに関する。複数の標的ポリヌクレオチド、例としてDNA、LNA修飾DNA、RNA、LNA修飾RNA、及び/又はPNA、例えば標的DNA及び/又はRNA配列は、一実施形態において、アレイ形式又はマイクロタイタープレート形式の複数の相補的プローブを用いて検査することができる。
【０１８８】
他の特定の一実施形態において、捕捉可能な標的ポリヌクレオチドの総数、例として異なる標的ポリヌクレオチド、例としてDNA、LNA修飾DNA、RNA、LNA修飾RNA、及び/又はPNA、例えば標的DNA及び/又はRNA配列の総数は、1、2乃至5、5乃至10、10乃至15、15乃至20、20乃至25、25乃至30、30乃至35、35乃至40、40乃至45、45乃至50、50乃至55、55乃至60、60乃至65、65乃至70、70乃至75、75乃至80、80乃至85、85乃至90、95乃至100、100乃至150、150乃至200、200乃至300、300乃至500、500乃至1000、及び1001以上、又はこれらの間隔の任意の組み合わせから成る群から選択することができる。
【０１８９】
本発明の方法の用途
【０１９０】
本発明は、例えば、以下から成る群から選択された1つ又は複数の用途等、遺伝物質の同定及び捕捉を含む広範なスクリーニング用途において有用となる。
-癌又は癌以外の遺伝性疾患、或いは出生前診断の分野等における診断
-アンチセンス療法のモニタリング
-血縁者の識別
-個別化医療
-法遺伝学
-定量的RNA解析
-微生物の検出
-考古学及び古生物病理学
-食品汚染
-環境汚染
【０１９１】
診断
【０１９２】
本発明は、1つ又は複数の疾病の診断に用いることができる。疾病は、検査した個体のゲノムから、DNA及び/又はRNA等の標的ポリヌクレオチドを検出することにより、或いは、検査した個体のゲノムに由来しない、DNA及び/又はRNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る標的ポリヌクレオチドを検出することにより、診断可能である。したがって、実施形態において、本発明は、本明細書に開示した方法の使用を含む、1つ又は複数の疾病を診断する方法に関する。他の一実施形態において、診断は、検査した個体のゲノムから、標的DNA及び/又はRNA等の標的ポリヌクレオチドを検出することを含む。他の実施形態において、診断は、検査した個体のゲノムに由来しない、標的DNA及び/又はRNA等の標的ポリヌクレオチドを検出することを含む。
【０１９３】
本発明は、DNA及び/又はRNA配列等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る特異的な標的ポリヌクレオチドが公知である、任意の疾病の診断に用いることができる。
【０１９４】
実施形態において、本発明は、遺伝性疾患、癌、及び感染症、頭痛、及び本発明の方法が有用となり得る他の疾病といった、1つ又は複数の疾病の診断に用いられる。本発明の他の用途は、例えば癌治療等における個別化医療の分野に存在する。
【０１９５】
本発明の実施形態は、対象となる疾病の兆候又は症状を有し得る個体、或いはその疾病の兆候又は症状を有していない場合がある個体の診断のために、本明細書に開示した方法を使用することに関する。本発明の特定の実施形態において、個体は、検査対象の疾病の兆候又は症状を有している。ある人が検査対象の疾病の兆候又は症状を有している場合、その人は、例えば、感染症又は遺伝性の障害又は疾病に罹患している可能性がある。本発明の他の特定の実施形態において、個体は、検査対象の疾病の兆候又は症状を有していない。疾病の臨床徴候を全く有していない人に対して検査を実施する場合は、例えば、初期段階でスクリーニングの対象となる疾病を特定することにより、疾病による死亡率及び苦痛の低減を期待して、早期の介入及び管理を可能にすることを意図したものとなる。こうした検査には幾つかの種類があり、「普遍的スクリーニング」には、特定のカテゴリ(例えば一定年齢の全ての子供)の全個体のスクリーニングが含まれ、「症例発見」には、例えば、家族が遺伝病と診断された等のリスク要因の存在に基づいた、人々のより小さな集団のスクリーニングが含まれる。本発明の特定の一実施形態は、普遍的スクリーニングにおける本明細書に開示した方法の使用に関する。本発明の他の特定の実施形態は、症例発見における本明細書に開示した方法の使用に関する。
【０１９６】
ヒト及び動物の試料には、糞便、血液、精液、脳脊髄液(CSF)、痰、膣液、尿、唾液、毛髪、他の体液、組織試料、全臓器、汗、涙、皮膚細胞、毛髪、骨、歯、或いは私物(例えば、歯ブラシ、剃刀等)又は試料(例えば、精子又は生検の組織又は液体)からの適切な液体又は組織、或いはヒト又は動物の他の部分構造が含まれる。それらの試料は、固体、半固体、又は流動性の試料であってよい。
【０１９７】
癌の診断
【０１９８】
本発明の好適な一実施形態は、癌等の1つ又は複数の疾病を診断するために用いられる。癌は、検査した個体のゲノムから、DNA及び/又はRNA等の標的ポリヌクレオチドを検出することにより診断可能である。
【０１９９】
診断対象の癌は、その初期段階にあってよく、或いは疾病の後期にあってもよい。本発明の一実施形態において、診断対象の癌は、良性段階又は前癌期等、その初期段階の何れかにあることが好ましい。本発明の他の実施形態において、診断対象の癌は、第1又は2期にあることが好ましい。実施形態において、診断対象の癌は、良性である。他の実施形態において、診断対象の癌は、悪性である。好適な実施形態において、診断対象の癌は、前癌期にある。更に他の実施形態において、診断対象の癌は、第4期にある。更に他の実施形態において、診断対象の癌は、第3期にある。更に他の実施形態において、診断対象の癌は、第2期にある。好適な実施形態において、診断対象の癌は、第1期にある。
【０２００】
実施形態では、例えば、以下の表Aに列挙した群から選択されたもの等、様々な種類の癌を本発明による方法により診断する。
【０２０１】
【表Ａ】
2013544507.tif 000014
【０２０２】
好適な一実施形態において、本発明は、結腸癌の診断に関する。この診断は、検査した個体からの糞便中のDNA等の標的ポリヌクレオチドを検出することにより実施可能である。
【０２０３】
他の好適な実施形態において、本発明は、以下の表B及び[2]に列挙されたもののうちの1つ又は複数等、タンパク質をコードする1つ又は複数の遺伝子における1つ又は複数の突然変異を特徴とする、癌等の腫瘍性疾患の診断に用いられる。
【０２０４】
【表Ｂ】
2013544507.tif 000015
【０２０５】
他の実施形態において、本発明は、以下の表Cに列挙した群から選択された1つ又は複数の腫瘍抗原を特徴とする癌の診断に用いることができる。したがって、一実施形態は、以下の表Cに列挙したもの等、1つ又は複数の腫瘍抗原に由来するDNA等の標的ポリヌクレオチドの検出に関する。
【０２０６】
【表Ｃ】
2013544507.tif 000016
【０２０７】
他の実施形態において、本発明は、以下の表Dに列挙したもの等、1つ又は複数の腫瘍抗原又は癌遺伝子に由来するDNA等の標的ポリヌクレオチドの検出による癌の診断に用いることができる。
【０２０８】
【表Ｄ−１】
2013544507.tif 000017
【表Ｄ−２】
2013544507.tif 000018
【表Ｄ−３】
2013544507.tif 000019
【表Ｄ−４】
2013544507.tif 000020
【表Ｄ−５】
2013544507.tif 000021
【表Ｄ−６】
2013544507.tif 000022
【０２０９】
他の実施形態において、本発明は、TFPI2、NDRG4、GATA4、又はGATA5等の1つ又は複数の腫瘍抗原に由来するDNA等のDNA及びRNAから成る群から選択された標的ポリヌクレオチドの検出による癌の診断に用いることができる[2]。こうした癌は、TFPI2、NDRG4、GATA4、又はGATA5から成る群から選択された1つ又は複数の遺伝子における1つ又は複数の突然変異を特徴とする。
【０２１０】
他の実施形態において、本発明は、RASSF2及びSFRP2等の1つ又は複数の腫瘍抗原に由来するDNA等のDNA及びRNAから成る群から選択された標的ポリヌクレオチドの検出による癌の診断に用いることができる[2]。こうした癌は、RASSF2及びSFRP2から成る群から選択された1つ又は複数の遺伝子における1つ又は複数の突然変異を特徴とする。
【０２１１】
癌以外の遺伝性疾患の診断
【０２１２】
他の好適な実施形態において、本発明は、以下の表Eから選択された1つ又は複数の疾患等、癌以外の1つ又は複数の遺伝病、即ち、遺伝性疾患の診断に用いられる。方法が癌以外の遺伝性疾患の診断に用いられる一実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、診断対象の固体に由来するDNA等のDNA及びRNAから成る群から選択される。
【０２１３】
【表Ｅ】
2013544507.tif 000023
【０２１４】
特定の一実施形態は、CADASIL症候群の診断に関する。他の特定の実施形態は後期発症型多発性カルボキシラーゼ欠損症の診断に関する。更に別の特定の実施形態は、家族性小脳網膜血管腫症の診断に関する。更に別の特定の実施形態は、線維性狭窄型クローン病の診断に関する。更に別の特定の実施形態は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ欠乏症の診断に関する。更に別の特定の実施形態は、ファブリ病の診断に関する。更に別の特定の実施形態は、遺伝性コプロポルフィリン症の診断に関する。更に別の特定の実施形態は、色素失調症の診断に関する。更に別の特定の実施形態は、小頭症の診断に関する。更に別の特定の実施形態は、腎嚢胞の診断に関する。更に別の特定の実施形態は、PHF8遺伝子における突然変異により生じるSiderius型X連鎖性精神遅滞症候群の診断に関する。更に別の特定の実施形態は、軟骨発育不全症の診断に関する。
【０２１５】
更に他の実施形態は、血球障害、アミノ酸代謝の異常、有機酸代謝の異常、脂肪酸代謝の異常、及び様々な多系統疾患から成る群から選択された1つ又は複数の障害の検出に関する。
【０２１６】
一実施形態は、例えば鎌状赤血球貧血(Hb SS)、鎌状赤血球症(Hb S/C)、Hb S/Betaサラセミア(Hb S/Th)、変異型異常ヘモグロビン症(Hb Eを含む)、及びグルコース-6-リン酸脱水素酵素欠損症(G6PD)等の血球障害を検出するための、本明細書に開示した方法の使用に関する。
【０２１７】
他の特定の実施形態は、例えばチロシン血症I型(TYR I)、チロシン血症II型(TYR II)、チロシン血症III型(TYR III)、アルギニノコハク酸尿症(ASA)、シトルリン血症(CIT)、シトルリン血症II型(CIT II)、フェニルケトン尿症(PKU)、メープルシロップ尿症(MSUD)、ホモシスチン尿症(HCY)、良性高フェニルアラニン血症、ビオプテリン補助因子生合成不全、ビオプテリン補助因子再生不全、及び高メチオニン血症等のアミノ酸代謝の異常を検出するための、本明細書に開示した方法の使用に関する。
【０２１８】
更に他の特定の実施形態は、例えばグルタル酸血症I型(GA I)、ヒドロキシメチルグルタリルリアーゼ欠損(HMG)、イソ吉草酸血症(IVA)、3-メチルクロトニル-CoAカルボキシラーゼ欠損(3MCC)、メチルマロニル-CoAムターゼ欠損(MUT)、メチルマロン酸尿症cblA及びcblB型(MMA、Cbl A、B)及び、βケトチオラーゼ欠損(BKT)、プロピオン酸血症(PROP)、多種CoAカルボキシラーゼ欠損(MCD)、メチルマロン酸血症(Cbl C、D)、マロン酸血症、2-メチル3-ヒドロキシ酪酸血症、イソブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損、2-メチルブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損、3-メチルグルタコニル-CoAヒドラターゼ欠損、グルタル酸血症II型、HHH症候群(高アンモニア血症、高オルニチン血症、ホモシトルリン尿症症候群)、β-メチルクロトニルルボキシラーゼ欠損、及びアデノシルコバラミン合成不全等の有機酸代謝の異常を検出するための、本明細書に開示した方法の使用に関する。
【０２１９】
更に他の特定の実施形態は、例えば長鎖ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損(LCHAD)、中鎖アシル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損(MCAD)、超長鎖アシル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損(VLCAD)、三官能性タンパク質欠損(TFP)、カルニチン摂取異常(CUD)、中鎖ケトアシル-CoAチオラーゼ欠損、ジエノイル-CoAレダクターゼ欠損、グルタル酸血症II型、カルニチンパルミチルトランスフェラーゼ欠損1型、カルニチンパルミチルトランスフェラーゼ欠損2型、短鎖アシル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損(SCAD)、カルニチン/アシルカルニチントランスフェラーゼ欠損(Translocase)、短鎖ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損(SCHAD)、長鎖アシル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損(LCAD)、多種アシル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損(MADD)等の脂肪酸代謝の異常を検出するための、本明細書に開示した方法の使用に関する。
【０２２０】
更に他の特定の実施形態は、例えば嚢胞性線維症(CF)、先天性甲状腺機能低下症(CH)、ビオチニダーゼ欠損(BIOT)、先天性副腎過形成(CAH)、古典的ガラクトース血症(GALT)、ガラクトキナーゼ欠損、及びガラクトースエピメラーゼ欠損等の様々な多系統疾患を検出するための、本明細書に開示した方法の使用に関する。
【０２２１】
遺伝性疾患の診断は、子供又は成人からの試料において実施し得ることに加え、胎児の試料に対しても診断を実施し得る。
【０２２２】
標的ヌクレオチド出生前診断
【０２２３】
実施形態において、本発明のスクリーニング方法は、出生前診断に用いられる。出生前診断又は出生前診断スクリーニングは、胎児又は胚、即ち、子供が生まれる前の疾病又は状態を検査することである。この実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、DNA等、DNA及びRNAから成る群から選択される。したがって、本発明の一実施形態は、胎児の障害の診断のために、本明細書に開示した方法を使用することに関する。
【０２２４】
出生前診断では、偽陽性の検査結果を避けることが不可欠である。したがって、実際には標的ポリヌクレオチドを有していない試料において、標的ポリヌクレオチドが存在することを示す検査結果が存在しないことが不可欠である。この点において、本発明は、その優れた特異性のため、標的ポリヌクレオチドを同定する公知の方法と比較して優れている。
【０２２５】
出生前診断において、標的ポリヌクレオチドは、例えば生検により取得した組織又は体液の試料から、羊水から、胎盤から、又は母親の血液から等、子供より入手可能な任意の生物材料から取得し得る。特定の一実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、生検により取得した組織又は体液の試料から、羊水から、又は胎盤から取得される。他の特定の実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、母親の血液から取得される。
【０２２６】
一実施形態は、先天異常を検出する出生前診断又は出生前スクリーニングに関する。本発明の特定の一実施形態は、例えば、神経管欠損、ダウン症、染色体異常、遺伝子疾患と、二分脊椎、口蓋裂、テイ・サックス病、鎌状赤血球貧血、サラセミア、嚢胞性線維症、及び脆弱性X症候群等の他の状態から成る群から選択された1つ又は複数の先天異常等、1つ又は複数の先天異常の検出を対象とする。特定の一実施形態は、神経管欠損の出生前診断に関する。他の特定の実施形態は、ダウン症の出生前診断に関する。更に他の特定の実施形態は、染色体異常の出生前診断に関する。更に他の特定の実施形態は、例えば嚢胞性線維症、8トリソミ、9トリソミ、13トリソミ、18トリソミ、21トリソミ、22トリソミ、又は3倍性X染色体症候群から成る群から選択された1つ又は複数の障害等の遺伝子疾患の出生前診断に関する。特定の好適な一実施形態は、21トリソミの検出に関する。他の特定の実施形態は、13トリソミの検出に関する。更に他の特定の実施形態は、18トリソミの検出に関する。他の特定の実施形態は、嚢胞性線維症の検出に関する。更に他の特定の実施形態は、二分脊椎の出生前診断に関する。更に他の特定の実施形態は、口蓋裂の出生前診断に関する。更に他の特定の実施形態は、テイ・サックス病の出生前診断に関する。更に他の特定の実施形態は、鎌状赤血球貧血の出生前診断に関する。更に他の特定の実施形態は、サラセミアの出生前診断に関する。更に他の特定の実施形態は、嚢胞性線維症の出生前診断に関する。更に他の特定の実施形態は、脆弱性X症候群の出生前診断に関する。
【０２２７】
他の一実施形態は、例えば、男女の産み分け又は子供等の父親の判定等、一般に先天異常と見做されない特徴を判断する目的の胎児スクリーニングに関する。特定の一実施形態は、子供の性別判定の出生前検知に関する。他の特定の実施形態は、父親の出生前判定に関する。
【０２２８】
アンチセンス療法のモニタリング
【０２２９】
アンチセンス療法は、例えば遺伝性疾患又は感染症の治療の形態である。特定の遺伝子の遺伝子配列が特定の疾病の原因であることが知られている場合に、例えば、その遺伝子が生成するメッセンジャRNA(mRNA)との結合により、その遺伝子を効果的に「オフ」にすることで、遺伝子を不活性化する核酸の鎖を合成することができる。したがって、本発明の一実施形態は、アンチセンス療法において用いられるポリヌクレオチドを検出するための、本明細書に開示した方法の使用に関する。実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書に定めたような、自然発生が知られていないヌクレオチドにより形成された標的ポリヌクレオチド、或いは、自然発生する標的ポリヌクレオチドと自然発生が知られていないヌクレオチドにより形成された標的ポリヌクレオチドとの混合物である。一実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、LNA修飾DNA、LNA修飾RNA及び/又はPNAを含む。
【０２３０】
特定の実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、疾病の原因である遺伝子が生成するメッセンジャRNA(mRNA)に結合する。他の特定の実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、pre-mRNAのスプライシング部位に結合することにより、mRNAのエクソンの内容を修飾する。
【０２３１】
特定の実施形態において、アンチセンス療法は、本明細書に開示した1つ又は複数の癌、糖尿病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、デュシェンヌ型筋ジストロフィ、サイトメガロウイルス性網膜と、喘息及び炎症性要素のある関節炎等の疾病との治療において使用するためのものである。
【０２３２】
血縁者の識別
【０２３３】
一実施形態において、本発明の方法は、それぞれのDNAプロフィールによる個体の識別に用いられる。
【０２３４】
本明細書に開示した方法が血縁者の識別に用いられる実施形態において、検出される標的ポリヌクレオチドは、1つ又は複数のDNA及び/又はRNA等、自然発生するものである。
【０２３５】
具体的な実施形態は、例えばD21S11、D7S820、TH01、D13S317、及びD19S433をDNAマーカとして使用して、例えば子供の母親又は父親の識別等、血縁者とされる人の識別のために本発明による方法を使用することに関する。
【０２３６】
特定の実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、例えば糞便、血液、精液、脳脊髄液(CSF)、痰、膣液、尿、唾液、毛髪、他の体液、組織試料、全臓器、汗、涙、皮膚細胞、毛髪、骨、歯、或いは私物(例えば、歯ブラシ、剃刀等)又は試料(例えば、精子又は生検の組織又は液体)からの適切な液体又は組織、或いはヒト又は動物の他の部分構造から等、任意の生物材料から取得し得る。
【０２３７】
個別化医療
【０２３８】
個別化医療は、個々の患者に関する情報の系統的使用を重視して、その患者の予防的及び治療的処置を選択又は最適化する医学的モデルである。本発明は、個別化医療に関して使用することができる。1つ又は複数の特定の標的DNA配列の検出は、例えば、投与するべき薬剤及び/又は薬剤投与量を決定するために用いることができる。
【０２３９】
分析対象の試料の種類
【０２４０】
本発明は、人体又は動物体からの試料等、任意の試料に由来するDNA等の標的ポリヌクレオチドの検出に関する。他の実施形態において。標的ヌクレオチドは、人間、動物、バクテリア、ウイルス、菌類、プリオン、原虫、及び/又は植物に由来する。更に他の実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、人体又は動物体からの試料から単離される。
【０２４１】
試料のソースは、人間、動物、鳥、昆虫、植物、藻類、菌類、酵母、ウイルス、バクテリア及びファージ、多細胞及び単細胞生物等を含め、生体及び非生体であるソースからの試料を含む。
【０２４２】
ヒト及び動物試料は、糞便、血液、精液、脳脊髄液(CSF)、痰、膣液、尿、唾液、毛髪、他の体液、組織試料、全臓器、汗、涙、皮膚細胞、毛髪、骨、歯、或いは私物(例えば、歯ブラシ、剃刀等)又は試料(例えば、精子又は生検の組織又は液体)からの適切な液体又は組織、或いはヒト又は動物の他の部分構造を含む。試料は、したがって、固体、半固体、又は流動性試料となり得る。
【０２４３】
病原体のソースは、1つ又は複数のバクテリア、ウイルス、寄生虫、及び他の感染性微生物を含む。他のソースは、飲用水、下水、又は土等の環境試料となり得る。
【０２４４】
単離するべき試料は、侵襲性又は非侵襲性の試料となる場合がある。侵襲性の試料採取の例には、血液の採取、組織、臓器、又はその一部の(例えば生検による)切除、及び脳脊髄液の採取(腰椎穿刺)が含まれる。非侵襲性の試料採取の例には、外部に分泌された流体又は物質(例えば、痰、尿、糞便)の採取が含まれる。
【０２４５】
分析対象となる試料は、DNAの単離、精製、又は濃縮のために処理することができる。
【０２４６】
診断又は検査対象の個人
【０２４７】
診断又は検査の対象となる個人は、男性又は女性等の人間にすることができる。診断対象の個人は、胎児、幼児、小児、又は成人等、あらゆる年齢の人間にすることができる。
【０２４８】
診断対象の胎児は、あらゆる週齢であってよく、例として妊娠8乃至40週、例えば妊娠12乃至25週、例として妊娠16乃至20週であってよい。診断対象の他の任意の個人は、新生児から120歳まで、あらゆる年齢であってよく、例えば0乃至6ヶ月、例として6乃至12ヶ月、例えば1乃至5歳、例として5乃至10歳、例えば10乃至15歳、例として15乃至20歳、例えば20乃至25歳、例として25乃至30歳、例えば30乃至35歳、例として35乃至40歳、例えば40乃至45歳、例として45乃至50歳、例えば50乃至60歳、例として60乃至70歳、例えば70乃至80歳、例として80乃至90歳、例えば90乃至100歳、例として100乃至110歳、例えば110乃至120歳であってよい。
【０２４９】
診断及び/又は治療対象の個人は、白人、黒人、東南アジア人、モンゴロイド人種の人、エチオピア人種の人、黒人種の人、アメリカインディアン人種の人、又はマレー人種の人等、あらゆる人種にすることができる。
【０２５０】
診断及び/又は治療対象の個人は、健康な状態、病気の状態、1つ又は複数の疾病と診断された状態である場合、1つ又は複数の疾病の1つ又は複数の症状を有する場合、無症状である場合、或いは、遺伝的に1つ又は複数の疾病になる傾向を揺する場合がある。
【０２５１】
診断対象の個人は、バクテリア、ウイルス、菌類、プリオン、原虫、及び/又は植物から成る群から選択することができる。
【０２５２】
他の用途
【０２５３】
原則として、本発明は、DNA及び/又はRNA等、自然発生ヌクレオチドにより形成され得る、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得るポリヌクレオチドの検出が関連する、任意の方法において使用し得る。
【０２５４】
法遺伝学
【０２５５】
本発明による方法は、実父確定検査又は実母確定検査を含め、法遺伝学のために使用し得る。本明細書に開示した方法が法遺伝学において使用される実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、自然発生ヌクレオチドにより形成される。
【０２５６】
したがって、本発明の一実施形態は、法遺伝学(法医学と短縮される場合が多い)における本明細書に開示した方法の使用に関する。したがって、方法は、法制度において関心の対象となる問題に答えるために、広範囲の科学において使用し得る。特定の一実施形態は、犯罪又は民事訴訟に関連した本発明の方法の使用に関する。
【０２５７】
一実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、被害者及び/又は犯罪者により提供され得る。特定の一実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、被害者により提供される。他の特定の実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、犯罪容疑者等、犯罪者により提供される。
【０２５８】
本発明の特定の一実施形態は、法医病理学における本明細書に開示した方法の使用に関する。したがって、方法は、死体の検査により死亡の原因を決定することに関する病理学の一分野において使用され得る。
【０２５９】
本発明の他の特定の一実施形態は、例えば犯罪被害者の小埋蔵物又は所持品の特定、犯罪者の小埋蔵物又は所持品の特定、及び/又は、例えば墓地の可能性のある場所及び/又は共同墓地に埋葬された場合等の人間の遺体の回収等、法考古学における本明細書に開示した方法の使用に関する。
【０２６０】
本発明の他の特定の一実施形態は、法医人類学を支援するための本明細書に開示した方法の使用に関する。したがって、実施形態は、例えば人種、性別、年齢、身長等、遺体に基づく特定の特徴の判定等、遺体の識別における方法の使用に関する。
【０２６１】
本発明の他の特定の一実施形態は、法植物学における本明細書に開示した方法の使用に関する。したがって、実施形態は、例えば、身体又は犯罪現場で発見された葉、種子、及び花粉等から、犯罪の可能性に関する情報を得るための方法の使用に関する。
【０２６２】
本発明の他の特定の一実施形態は、例えば、強姦犯の特定等、強姦の捜査における本明細書に開示した方法の使用に関する。
【０２６３】
本発明の他の特定の一実施形態は、実父確定検査又は実母確定検査における本明細書に開示した方法の使用に関する。
【０２６４】
定量的RNA解析
【０２６５】
本発明の他の用途は、人間又は動物における遺伝子発現の解析である。一実施形態において、本明細書に開示した方法は、定量的RNA解析、即ち、標的RNAの定量化のために用いることができる。
【０２６６】
微生物の検出
【０２６７】
本発明は、更に、微生物の分類に使用することもできる。したがって、標的DNA及び/又はRNAは、1つ又は複数のバクテリア、1つ又は複数のウイルス、1つ又は複数の菌類、1つ又は複数のプリオン、及び/又は1つ又は複数の原虫に由来し得る。
【０２６８】
更に、方法は、検査した個人からの試料において発見されたバクテリア、ウイルス、菌類、プリオン、及び/又は原虫から、DNA及び/又はRNA等の標的ポリヌクレオチドを検出するために使用し得る。したがって、一実施形態において、方法は、感染症を引き起こし得る特定の微生物を検出するために使用し得るが、しかしながら、本発明は、連鎖球菌又はサルモネラ菌の様々な血清型等、同じ科のバクテリアの様々な血清型を分類するためにも使用し得るものであり、下記を参照されたい。
【０２６９】
したがって、本発明の一実施形態は、例えば、寄生種による宿主生物のコロニー形成である感染症の検出に関する。特定の実施形態において、感染症は、例えば、1つ又は複数のバクテリア、1つ又は複数のウイルス、1つ又は複数の菌類、1つ又は複数のプリオン、及び/又は1つ又は複数の原虫等の微生物又は寄生微生物により発生する
【０２７０】
感染症の診断は、特異的な兆候及び症状がまれであるため、困難となる場合がある。本発明の一実施形態は、例えば、不快感、発熱、及び悪寒等の症状を引き起こすバクテリア及びウイルス感染症の検出に関する。診断では、特異的感染症の原因を識別することが困難である場合が多い。
【０２７１】
実施形態において、本発明の方法は、以下の疾病群、即ち、ヘリコバクターピロリ、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、骨髄炎、ライム病、クラミジア、ウイルスに起因する感染症、及びバクテリアに起因する感染症の1つ又は複数の診断に使用し得る。
【０２７２】
本発明の特定の一実施形態は、胃の炎症に関連し、胃潰瘍及び胃炎の一般的な原因となるヘリコバクターピロリを検出するための本明細書に開示した方法に関する。
【０２７３】
本発明の特定の一実施形態は、主に皮膚に影響を及ぼすメチシリン耐性黄色ブドウ球菌を検出するための本明細書に開示した方法に関する。
【０２７４】
本発明の特定の一実施形態は、様々なバクテリアに起因する骨感染症である骨髄炎を検出するための本明細書に開示した方法に関する。
【０２７５】
本発明の特定の一実施形態は、ボレリア属に属する少なくとも3種のバクテリアに起因するライム病を検出するための本明細書に開示した方法に関する。
【０２７６】
本発明の特定の一実施形態は、一般的な性感染症であり、女性生殖器に損傷を与え、永久不妊を引き起こす恐れがあるクラミジアを検出するための本明細書に開示した方法に関する。
【０２７７】
本発明の特定の一実施形態は、例えば、はしか、肝炎、ヘルペス、染性単核球症、HIV、肝炎、単純ヘルペス、及び、全ての哺乳類に共通である内在性レトロウイルス及びサイトメガロウイルス(CMV)から成る非限定的な群から選択された感染症等、ウイルス感染に起因する感染症を検出するための本明細書に開示した方法に関する。
【０２７８】
本発明の特定の一実施形態は、バクテリアに起因する感染症を検出するための本明細書に開示した方法に関する。
【０２７９】
実施形態において、本発明の方法は、飼料、食物、飲用水等の試料といった、飼料、食物、土、飲用水等の試料の微生物汚染を分析するために用いられる。
【０２８０】
一実施形態において、標的DNA及び/又はRNAは、以下の表Fに列挙したバクテリアの1つ又は複数に由来するもの等、1つ又は複数のバクテリアに由来する。
【０２８１】
【表Ｆ−１】
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【表Ｆ−２】
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【表Ｆ−３】
2013544507.tif 000026
【表Ｆ−４】
2013544507.tif 000027
【表Ｆ−５】
2013544507.tif 000028
【表Ｆ−６】
2013544507.tif 000029
【表Ｆ−７】
2013544507.tif 000030
【表Ｆ−８】
2013544507.tif 000031
【表Ｆ−９】
2013544507.tif 000032
【表Ｆ−１０】
2013544507.tif 000033
【表Ｆ−１１】
2013544507.tif 000034
【表Ｆ−１２】
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【表Ｆ−１３】
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【０２８２】
一実施形態において、標的DNA及び/又はRNAは、以下の表Gに列挙したウイルスの1つ又は複数に由来する。したがって、実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、以下の表Gに列挙したウイルス群から選択されたウイルスに由来する。
【０２８３】
【表Ｇ−１】
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【表Ｇ−２】
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【表Ｇ−３】
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【表Ｇ−４】
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【表Ｇ−５】
2013544507.tif 000041
【表Ｇ−６】
2013544507.tif 000042
【表Ｇ−７】
2013544507.tif 000043
【表Ｇ−８】
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【表Ｇ−９】
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【表Ｇ−１０】
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【表Ｇ−１１】
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【表Ｇ−１２】
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【０２８４】
考古学及び古生物病理学
【０２８５】
考古学的発見及び化石における感染の証拠は、例えば、絶滅した生命体の負傷及び病気の発生を研究する古病理学者及び科学者にとって調査の対象となる。したがって、本発明の一実施形態は、考古学における本明細書に開示した方法の使用に関する。
【０２８６】
古生物病理学は、古代の疾病の研究である。したがって、本発明の一実施形態は、古生物病理学における本明細書に開示した方法の使用に関する。一実施形態は、本明細書に開示した方法の使用、或いは、例えば性別と、例えば結核又は梅毒等、個体がどのような種類の疾病を有した可能性があるかとを判定することに関する。
【０２８７】
考古学及び古生物病理学の分野において方法が用いられる一実施形態において、検査するポリヌクレオチドは、自然発生ヌクレオチドにより形成される。
【０２８８】
食品汚染
【０２８９】
食品汚染とは、例えば明示されていない食品成分、有害化学物質、及び消費者を病気にする恐れがある微生物等、対象となる食品内部に存在することが意図されていない何らかのものが食物内に存在することを示す。本明細書に開示した方法は、対象となる特定の食品内部に存在することが明示されていない標的ポリヌクレオチドを同定することにより、こうした食品汚染の検出に使用し得る。したがって、本発明の一実施形態は、例えば微生物汚染、遺伝子組み換え食品、及び非明示成分を含む食物等、食品汚染を検出するための本明細書に開示した方法の使用に関する。
【０２９０】
本明細書に開示した方法を食品汚染の検出に用いる一実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、自然発生ヌクレオチドにより形成され得るか、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る。
【０２９１】
本発明の特定の一実施形態は、食品内の微生物汚染を検出するための本明細書に開示した方法の使用に関する。特定の実施形態において、微生物汚染は、対象となる食品を汚染する病原菌、ウイルス、外毒素、又は寄生生物により発生する。他の特定の実施形態において、微生物汚染は、不適切な取り扱い、調製、又は食品保存により発生する。特定の実施形態において、微生物汚染は、食品調製前後及び調整中の良好な衛生習慣の欠如から生じる。一実施形態において、微生物汚染は、カンピロバクタージェジュニ、ウェルシュ菌、サルモネラ菌、大腸菌O157:H7、セレウス菌、腸管侵入性(EIEC)、腸管病原性(EPEC)、腸内毒素原性(ETEC)、又は腸管凝集性(EAEC又はEAgEC)等の大腸菌、リステリア菌、赤痢菌、黄色ブドウ球菌、ブドウ球菌腸炎、連鎖球菌、O1及び非O1を含むコレラ菌、腸炎ビブリオ、ビブリオバルニフィカス、腸炎エルシニア、仮性結核菌、ブルセラ菌、コリネバクテリウムウルセランス、Q熱コクシエラ、プレジオモナスシゲロイデス、ボツリヌス菌、ウェルシュ菌、黄色ブドウ球菌、及びセレウス菌から成る群から選択された細菌性食物由来病原体により発生する。
【０２９２】
本発明の他の特定の実施形態は、食品中の遺伝子組み換え材料を検出するための本明細書に開示した方法の使用に関する。遺伝子組み換え食品は、遺伝子組み換え生物に由来する食品である。特定の一実施形態は、例えば、大豆、トウモロコシ、キャノーラ、及び綿実油等のトランスジェニック植物性産物である遺伝子組み換え食品の識別に関する。他の特定の実施形態は、動物性産物である遺伝子組み換え食品の識別に関する。他の特定の一実施形態は、安全上の理由からの遺伝子組み換え食品の識別に関する。他の特定の実施形態は、生態学的な懸念からの遺伝子組み換え食品の識別に関する。
【０２９３】
本発明の更に他の特定の実施形態は、例えば牛肉、子牛肉、七面鳥の肉、鶏肉、羊肉又はラムとされているもの中の豚肉等、非明示成分を検出するための本明細書に開示した方法の使用に関する。
【０２９４】
環境汚染
【０２９５】
水質汚染は、水域の汚染である。水の汚染につながる具体的な汚染物質には、例えば、病原体が含まれる。したがって、本発明の一実施形態は、例えば家庭への給水、湖、河川、海の水、及び地下水等、水中の病原体の検出に関する。特定の実施形態は、家庭への給水における病原体の検出に関する。
【０２９６】
環境汚染の検出に標的ポリヌクレオチドが用いられる実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、自然発生ヌクレオチド、或いは自然発生が知られていないヌクレオチド又はそれらの任意の混合物により形成され得る。
【０２９７】
コレラ及び腸チフス等の感染症は、汚染水を飲むことにより罹患する恐れがある。汚染水を定期的に消費した場合には、身体組織全体に多くの弊害が生じる。
【０２９８】
したがって、特定の実施形態において、本明細書に開示した方法は、例えば、類鼻疽菌、大腸菌群、クリプトスポリジウム・パルバム、ランブル鞭毛虫、サルモネラ菌、ノロウイルス、及び他のウイルス及び寄生虫(蠕虫類)から成る群から選択された1つ又は複数の病原体等、試水中の1つ又は複数の病原体の検出に用いられる。特定の一実施形態は、試水中の類鼻疽菌を検出するための本発明による方法の使用に関する。他の特定の一実施形態は、試水中の大腸菌群を検出するための本発明による方法の使用に関する。他の特定の一実施形態は、試水中のクリプトスポリジウム・パルバムを検出するための本発明による方法の使用に関する。他の特定の一実施形態は、試水中のランブル鞭毛虫を検出するための本発明による方法の使用に関する。他の特定の一実施形態は、試水中のサルモネラ菌を検出するための本発明による方法の使用に関する。他の特定の一実施形態は、試水中のノロウイルスを検出するための本発明による方法の使用に関する。他の特定の一実施形態は、試水中の寄生虫を検出するための本発明による方法の使用に関する。
【０２９９】
項目
【０３００】
以下の項目1乃至92のそれぞれ、及びこれらの可能な組み合わせそれぞれは、本発明の意図に含まれる別個の実施形態であり、1つ又は複数の従属又は独立請求項の対象となり得る。
1.試料から一本鎖標的DNA又はRNA等のヌクレオチドを捕捉する方法であって、
(i)DNA又はRNA等の前記標的ポリヌクレオチドから塩基A、T、U、C、又はGのうち1つ又は複数の種類を除去することにより、1つ又は複数の脱塩基部位を生成するステップと、
(ii)前記1つ又は複数の脱塩基部位のうち1つ又は複数に挿入可能な1個又は複数のインターカレータ分子を含む相補的プローブにより、DNA又はRNA等の前記標的ポリヌクレオチドを捕捉するステップと、を備える方法。
1.(i)二本鎖標的DNAを提供するステップと、
(ii)前記二本鎖標的DNAから塩基A、T、U、C、又はGのうち1つ又は複数の種類を除去して、前記二本鎖標的DNAを不安定化することにより、1つ又は複数の脱塩基部位を生成するステップと、
(iii)前記不安定化した二本鎖標的DNAを変性させ、一本鎖標的DNAにするステップと、
(iv)前記1つ又は複数の脱塩基部位に挿入可能な1個又は複数のインターカレータ分子を含む相補的DNAプローブにより、前記一本鎖標的DNAを捕捉するステップと、を備える、項目1記載の一本鎖標的DNAを捕捉する方法。
2.前記相補的プローブは、DNAプローブ、RNAプローブ、LNAプローブ、及びPNAプローブから成る群から選択することができる、先行項目の何れかに記載の方法。
3.更に、未結合DNA及び/又はRNAを除去するために、1回又は複数回の洗浄ステップを備える、先行項目の何れかに記載の方法。
4.更に、前記二本鎖標的DNA及び/又は一本鎖DNA及び/又はRNA内の1つ又は複数の種類の塩基を、別の化学成分に変換することを含む、先行項目の何れかに記載の方法。
5.更に、前記二本鎖標的DNAから1つ又は複数の前記化学成分を除去して、前記二本鎖標的DNAを不安定化することを含む、項目5に記載の方法。
6.更に、前記標的DNA及び/又はRNA内の1個又は複数のCを、1個又は複数のUに変換することを含む、先行項目の何れかに記載の方法。
7.前記標的DNA及び/又はRNA内の1個又は複数のCから1個又は複数のUへの前記変換は、重亜硫酸塩処理により行われる、項目7に記載の方法。
8.前記二本鎖標的DNA及び/又は一本鎖DNA及び/又はRNAから、Aを除去する、先行項目の何れかに記載の方法。
9.前記二本鎖標的DNA及び/又は一本鎖DNA及び/又はRNAから、Tを除去する、先行項目の何れかに記載の方法。
10.前記二本鎖標的DNA及び/又は一本鎖DNA及び/又はRNAから、Cを除去する、先行項目の何れかに記載の方法。
11.前記二本鎖標的DNA及び/又は一本鎖DNA及び/又はRNAから、Gを除去する、先行項目の何れかに記載の方法。
12.前記二本鎖標的DNA及び/又は一本鎖DNA及び/又はRNAから、Uを除去する、先行項目の何れかに記載の方法。
13.前記除去は、1つ又は複数の酵素及び/又は物理的応力により行われる、項目9乃至13の何れかに記載の方法。
14. Uの前記除去は、ウラシルデヒドロゲナーゼを用いて行われる、項目13記載の方法。
15. Aの前記除去は、pH値の調節により行われる、項目9記載の方法。
16.前記標的DNA及び/又はRNAから、1、2、又は3種類の前記塩基を除去する、先行項目の何れかに記載の方法。
17.前記標的DNA及び/又はRNAから除去する塩基の総数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、及び21個以上から成る群から選択することができる、先行項目の何れかに記載の方法。
18. 前記相補的プローブは、1個又は複数のインターカレータ分子を含む、先行項目の何れかに記載の方法。
19. インターカレータ分子の総数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、及び21個以上から成る群から選択することができる、項目19記載の方法。
20. 前記標的DNA及び/又はRNA内の脱塩基部位の10％乃至100％、例として10％乃至20％、例えば20％乃至30％、例として30％乃至40％、例えば40％乃至50％、例として50％乃至60％、例えば60％乃至70％、例として70％乃至80％、例えば80％乃至90％、例として90％乃至100％、又はそれらの任意の組み合わせにおいて、インターカレータ分子が挿入された状態となる、先行項目の何れかに記載の方法。
21. 前記標的DNA及び/又はRNA内の脱塩基部位の10％超、例として20％超、例えば30％超、例として40％超、例えば50％超、例として60％超、例えば70％超、例として80％超、例えば90％超、例として95％超、例えば100％において、インターカレータ分子が挿入された状態となる、先行項目の何れかに記載の方法。
22.前記インターカレータ分子の挿入により、前記標的DNA及び/又はRNAと前記相補的プローブとから成るポリヌクレオチド二重鎖の融解温度が上昇する、項目21及び22記載の方法。
23. 前記相補的プローブ内のインターカレータ分子の数と塩基の総数との間の比は1:50乃至1:2、例として1:50乃至1:40、例えば1:40乃至1:30、例として1:30乃至1:20、例えば1:20乃至1:10、例として1:10乃至1:5、例えば1:5乃至1:2、又はこれらの間隔の任意の組み合わせとなる、先行項目の何れかに記載の方法。
24. 前記1つ又は複数のインターカレータ分子は、TINA、INA、ortho-TINA、para-TINA、及びAMANYから成る群から選択することができる、先行項目の何れかに記載の方法。
26. 前記インターカレータ分子の大きさは、20乃至400Å、例として20乃至40Å、例えば40乃至60Å、例として60乃至80Å、例えば80乃至100Å、例として100乃至120Å、例えば120乃至140Å、例として140乃至160Å、例えば160乃至180Å、例として180乃至200Å、例えば200乃至220Å、例として220乃至240Å、例えば240乃至260Å、例として260乃至280Å、例えば280乃至300Å、例として300乃至320Å、例えば320乃至340Å、例として340乃至360Å、例えば360乃至380Å、例として380乃至400Å、又はこれらの間隔の任意の組み合わせである、先行項目の何れかに記載の方法。
26. 前記相補的プローブは、2種類以上のインターカレータ分子、例として2種類、3種類、4種類、5種類、又は5種類以上の異なるインターカレータ分子を含む、先行項目の何れかに記載の方法。
27. 前記相補的プローブは、支持体に結合させる、先行項目の何れかに記載の方法。
28.前記支持体は、粒状物質、ビーズ、磁性ビーズ、非磁性ビーズ、ポリスチレンビーズ、磁性ポリスチレンビーズ、セファロースビーズ、セファクリルビーズ、ポリスチレンビーズ、アガロースビーズ、多糖類ビーズ、及びポリカーバメートビーズから成る群から選択される、項目28記載の方法。
29.前記支持体は、固体支持体である、項目29記載の方法。
30. 前記固体支持体は、マイクロタイタープレート又は他のプレート形式、試薬チューブ、スライドガラス或いはアレイ又はマイクロアレイ解析に用いられる他の支持体、マイクロ流体チャンバ又はデバイスのチューブ又は導管類、及びBiacoreチップから成る群から選択することができる、項目30記載の方法。
31. 更に、1つ又は複数の標識を含む相補的検出プローブの使用を含む、先行項目の何れかに記載の方法。
32. 前記相補的プローブは、1つ又は複数の標識を含む、先行項目の何れかに記載の方法。
33. 前記1つ又は複数の標識は、ビオチン、蛍光標識、5(及び6)-カルボキシフルオレセイン、5-又は6-カルボキシフルオレセイン、6-(フルオレセイン)-5(及び6)-カルボキシアミドヘキサン酸、フルオレセインイソチオシアナート(FITC)、ローダミン、テトラメチルローダミン、染料、Cy2、Cy3、及びCy5、PerCP、フィコビリ蛋白質、R-フィコエリトリン(RPE)、アロフィコエリトリン(APC)、テキサスレッド、プリンストンレッド、緑色蛍光タンパク質(GFP)及びその類似体、R-フィコエリトリン又はアロフィコエリトリンのコンジュゲート、半導体ナノ結晶(量子ドット及びQdotTMナノ結晶等)に基づく無機蛍光標識、Eu3+及びSm3+等のランタニドに基づく時間分解蛍光標識、ハプテン、DNP、ジゴキシゲニン、酵素標識、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ(AP)、ベータガラクトシダーゼ(GAL)、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、β-N-アセチルグルコサミニダーゼ、β-グルクロニダーゼ、インベルターゼ、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ及びグルコースオキシダーゼ(GO)、発光標識、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、1,2-ジオキセタン、ピリドピリダジン、放射能標識、ヨウ化物の同位体、コバルトの同位体、セレンの同位体、トリチウムの同位体、及びリンの同位体から成る群から選択することができる、項目32乃至33記載の方法。
34. 前記ビオチンは、ストレプトアビジン-R-フィコエリトリンを用いて検出される、項目34記載の方法。
35. 更に、前記検出プローブの添加前及び/又は添加後に洗浄ステップを含む、項目34記載の方法。
37. 相補的検出プローブは、1個又は複数のインターカレータ分子を含む、項目34乃至36の何れかに記載の方法。
37. インターカレータ分子の総数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、及び21個以上の異なる又は同一のインターカレータ分子から成る群から選択することができる、項目37記載の方法。
38.前記標的DNA及び/又はRNAは、人間、動物、バクテリア、ウイルス、菌類、プリオン、原虫、及び/又は植物に由来する、先行項目の何れかに記載の方法。
39.前記標的DNA及び/又はRNAは、人体又は動物体からの試料から単離される、先行項目の何れかに記載の方法。
40.前記標的DNA及び/又はRNAは、人間、動物、鳥、昆虫、植物、藻類、菌類、酵母、ウイルス、バクテリア及びファージ、多細胞及び単細胞生物から単離される、先行項目の何れかに記載の方法。
41.前記標的DNA及び/又はRNAは、糞便、血液、精液、脳脊髄液、痰、膣液、尿、唾液、毛髪、他の体液、組織試料、全臓器、汗、涙、或いはヒト又は動物の他の部分構造から単離される、先行項目の何れかに記載の方法。
42.捕捉される異なる標的DNA配列の総数は、1、2乃至5、5乃至10、10乃至15、15乃至20、20乃至25、25乃至30、30乃至35、35乃至40、40乃至45、45乃至50、50乃至55、55乃至60、60乃至65、65乃至70、70乃至75、75乃至80、80乃至85、85乃至90、95乃至100、100乃至150、150乃至200、200乃至300、300乃至500、500乃至1000、及び1001種以上、又はこれらの間隔の任意の組み合わせから成る群から選択することができる、先行項目の何れかに記載の方法。
43.項目1乃至43の何れかに記載の方法の使用を含む、1つ又は複数の疾病を診断する方法。
44.前記診断は、検査した個体のゲノムからの標的DNA及び/又はRNAの検出を含む、項目44記載の方法。
45.前記診断は、検査した個体のゲノムに由来しない標的DNA及び/又はRNAの検出を含む、項目44乃至45の何れかに記載の方法。
46.前記診断は、バクテリア、ウイルス、菌類、プリオン、原虫、及び/又は植物からの標的DNA及び/又はRNAの検出を含む、項目44乃至46の何れかに記載の方法。
47. 診断対象となる前記疾病は、1つ又は複数の遺伝性疾患、即ち、遺伝病であり、例としてCADASIL症候群、後期発症型多発性カルボキシラーゼ欠損症、家族性小脳網膜血管腫症、線維性狭窄型クローン病、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ欠乏症、ファブリ病、遺伝性コプロポルフィリン症、色素失調症、小頭症、腎嚢胞、PHF8遺伝子における突然変異により生じるSiderius型X連鎖性精神遅滞症候群、及び軟骨発育不全症から成る群から選択された1つ又は複数の疾病である、項目44乃至47の何れかに記載の方法。
48. 診断対象となる前記疾病は、遺伝性疾患、癌、及び感染症、頭痛、及び本発明の方法が有用となり得る他の疾病といった1つ又は複数の疾病である、項目44乃至47の何れかに記載の方法。
49. 診断対象となる前記疾病は、癌である、項目44乃至47の何れかに記載の方法。
50. 前記癌は、101F6、ABR、ADPRTL3、ANP32C、ANP32D、APC2、APC、ARF、ARHGAP8、ARHI、AT1G14320、ATM、ATP8A2、AXUD1、BAP1、BECN1、BIN1、BRCA1、BRCA2、BTG1、BTG2、C1orf11、C5orf4、C5orf7、Cables、CACNA2D2、CAP-1、CARS、CAV1、CD81、CDC23、CDK2AP1、CDKN1A、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2X、Ciao1-pending、CLCA2、CREBL2、CTNNA1、CUL2、CW17R、DAB2、DAF-18、D-APC、DBC2、DCC、DDX26、DEC1、DLC1、DLEC1、DLEU1、DLEU2、DLG1、DLGH1、DLGH3、DMBT1、DNAJA3、DOC-1、DPC4、DPH2L、EGR1、FABP3、FAT、FGL1、FHIT、FLJ10506、FOXD1、FOXP1、FT、FUS1、FUS2、GAK、GAS1、GAS11、GLD-1、GLTSCR1、GLTSCR2、GRC5、GRLF1、HDAC3、HEMK、HIC1、HRG22、HSAL2、HTS1、HYAL1、HYAL2、IFGBP7、IGSF4、ING1、ING1L、ING4、I(2)tid、I(3)mbn、I(3)mbt、LAPSER1、LATS1、LATS2、LDOC1、LOH11CR2A、LRP1B、LUCA3、MAD、MAP2K4、MAPKAPK3、MCC、MDC、MEN1、ML-1、MLH1、MRVI1、MTAP、MXI1、NAP1L4、NBR2、NF1、NF2、NORE1、NPR2L、NtRb1、OVCA2、PDGFRL、PHEMX、pHyde、PIG8、PIK3CG、PINX1、PLAGL1、PRDM2、PTCH、PTEN、PTPNI3、PTPRG、RASSF1、RB1、RBBP7、RBX1、RBM6、RECK、RFP2、RIS1、RPL10、RPS29、RRM1、S100A2、SEMA3B、SF1、SFRP1、SLC22A1L、SLC26A3、SMARCA4、ST7、ST7L、ST13、ST14、STIM1、TCEB2、THW、TIMP3、TP53、TP63、TRIM8、TSC2、TSG101、TSSC1、TSSC3、TSSC4、VHL、Vhlh、WFDC1、WIT-1、WT1、及びWWOXから成る群内のタンパク質をコードする1つ又は複数の遺伝子における1つ又は複数の突然変異を特徴とする、項目50記載の方法。
51. 前記癌は、α-アクチニン-4、ARTC1、BCR-ABL融合タンパク質(b3a2)、B-RAF、CASP-5、CASP-8、β-カテニン、Cdc27、CDK4、CDKN2A、COA-1、dek-can融合タンパク質、EFTUD2、伸長因子2、ETV6-AML1融合タンパク質、FLT3-ITD、FN1、GPNMB、LDLR-フコシルトランスフェラーゼAS融合タンパク質、HLA-A2d、HLA-A11d、hsp70-2、KIAAO205、MART2、ME1、MUM-1f、MUM-2、MUM-3、neo-PAP、ミオシンクラスI、NFYC、OGT、OS-9、P53、pml-RARα融合タンパク質、PRDX5、PTPRK、K-ras、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、SYT-SSX1又は-SSX2融合タンパク質、トリオースリン酸イソメラーゼ、BAGE-1、GAGE-1、2、8、GAGE-3、4、5、6、7、GnTVf、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-C2、ムチンk、NA-88、NY-ESO-1/LAGE-2、SAGE、Sp17、SSX-2、SSX-4、TRAG-3、及びTRP2-INT2gから成る群から選択された1つ又は複数の腫瘍抗原を特徴とする、項目50記載の方法。
52. 前記癌は、RASSF2及びSFRP2から成る群から選択された1つ又は複数の遺伝子における1つ又は複数の突然変異を特徴とする、項目50記載の方法。
53. 前記癌は、TFPI2、NDRG4、GATA4、又はGATA5から成る群から選択された1つ又は複数の遺伝子における1つ又は複数の突然変異を特徴とする、項目50記載の方法。
54. 前記診断は、胎児の障害の診断含む、項目44記載の方法。
55. 個別化医療に関する項目1乃至43の何れかに記載の方法の使用。
56. 項目1乃至43の何れかに記載の方法の使用を含む、標的RNAを定量化する方法。
57.項目1乃至43の何れかに記載の方法の使用を含む、1つ又は複数の標的DNA及び/又はRNAを検出する方法。
58.前記試料は、飼料、食物、又は飲用水である、項目58に記載の方法。
59. 前記標的DNA及び/又はRNAは、人間、動物、バクテリア、ウイルス、菌類、プリオン、原虫、及び/又は植物に由来する、項目57乃至59の何れかに記載の方法。
60. 前記バクテリアは、Acetobacter aurantius、アシネトバクター種:Acinetobacter baumannii、Acinetobacter calcoaceticus、Acinetobacter johnsonii、Acinetobacter junii、Acinetobacter lwoffii、Acinetobacter radioresistens、Acinetobacter septicus、Acinetobacter schindleri、Acinetobacter ursingii、アクチノマイセス種:Actinomyces bovis、Actinomyces bowdenii、Actinomyces canis、Actinomyces cardiffensis、Actinomyces catuli、Actinomyces coleocanis、Actinomyces dentalis、Actinomyces denticolens、Actinomyces europaeus、Actinomyces funkei、Actinomyces georgiae、Actinomyces gerencseriae、Actinomyces graevenitzii、Actinomyces hongkongensis、Actinomyces hordeovulneris、Actinomyces howellii、Actinomyces humiferus、Actinomyces hyovaginalis、Actinomyces israelii、Actinomyces marimammalium、Actinomyces meyeri、Actinomyces naeslundii、Actinomyces nasicola、Actinomyces neuii、Actinomyces odontolyticus、Actinomyces oricola、Actinomyces radicidentis、Actinomyces radingae、Actinomyces slackii、Actinomyces streptomycini、Actinomyces suimastitidis、Actinomyces suis、Actinomyces turicensis、Actinomyces urogenitalis、Actinomyces vaccimaxillae、Actinomyces viscosus、アクチノバチルス種:Actinobacillus actinomycetemcomitans、Actinobacillus arthritidis、Actinobacillus capsulatus、Actinobacillus delphinicola、Actinobacillus equuli、Actinobacillus hominis、Actinobacillus indolicus、Actinobacillus lignieresii、Actinobacillus minor、Actinobacillus muris、Actinobacillus pleuropneumoniae、Actinobacillus porcinus、Actinobacillus rossii、Actinobacillus scotiae、Actinobacillus seminis、Actinobacillus succinogenes、Actinobacillus suis、Actinobacillus ureae、アエロモナス種:Aeromonas allosaccharophila、Aeromonas bestiarum、Aeromonas bivalvium、Aeromonas encheleia、Aeromonas enteropelogenes、Aeromonas euchrenophila、Aeromonas hydrophila、Aeromonas ichthiosmia、Aeromonas jandaei、Aeromonas media、Aeromonas molluscorum、Aeromonas popoffii、Aeromonas punctata、Aeromonas salmonicida、Aeromonas schubertii、Aeromonas sharmana、Aeromonas simiae、Aeromonas sobria、Aeromonas veronii、Afipia felis、アグロバクテリウム種:Agrobacterium radiobacter、Agrobacterium rhizogenes、Agrobacterium rubi、Agrobacterium tumefaciens、Agromonas種、アルカリゲネス種:Alcaligenes aquatilis、Alcaligenes eutrophus、Alcaligenes faecalis、Alcaligenes latus、Alcaligenes xylosoxidans、Alishewanella種、Alterococcus種、Anaplasma phagocytophilum、Anaplasma marginale、Aquamonas種、Arcanobacterium haemolyticum、Aranicola種、Arsenophonus種、Azotivirga種、Azotobacter vinelandii、Azotobacter chroococcum、Bacillary dysentery(細菌性赤痢)、バチルス種:Bacillus abortus(Brucella melitensis biovar abortus)、Bacillus anthracis(炭疽菌)、Bacillus brevis、Bacillus cereus、Bacillus coagulans、Bacillus fusiformis、Bacillus globigii、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus mycoides、Bacillus natto、Bacillus stearothermophilus、Bacillus subtilis、Bacillus sphaericus、Bacillus thuringiensis、バクテロイデス種:Bacteroides forsythus(Tannerella forsythensis)、Bacteroides acidifaciens、Bacteroides distasonis(Parabacteroides distasonisとして再分類)、Bacteroides gingivalis、Bacteroides gracilis、Bacteroides fragilis、Bacteroides oris、Bacteroides ovatus、Bacteroides putredinis、Bacteroides pyogenes、Bacteroides stercoris、Bacteroides suis、Bacteroides tectus、Bacteroides thetaiotaomicron、Bacteroides vulgatus、バルトネラ種:Bartonella alsatica、Bartonella bacilliformis、Bartonella birtlesii、Bartonella bovis、Bartonella capreoli、Bartonella clarridgeiae、Bartonella doshiae、Bartonella elizabethae、Bartonella grahamii、Bartonella henselae(ネコ引っ掻き熱)、Bartonella koehlerae、Bartonella muris、Bartonella peromysci、Bartonella quintana、Bartonella rochalimae、Bartonella schoenbuchii、Bartonella talpae、Bartonella taylorii、Bartonella tribocorum、Bartonella vinsonii spp. Arupensis、Bartonella vinsonii spp. Berkhoffii、Bartonella vinsonii spp. Vinsonii、Bartonella washoensis、BCG(カルメット・ゲラン桿菌)、Bergeyella zoohelcum(Weeksella zoohelcum)、Bifidobacterium bifidum、ブラストバクター種、Blochmannia種、ボルデテラ種:'Bordetella ansorpii'、Bordetella avium、Bordetella bronchiseptica、Bordetella hinzii、Bordetella holmesii、Bordetella parapertussis、Bordetella pertussis(百日咳)、Bordetella petrii、Bordetella trematum、ボレリア種、Borrelia burgdorferi、Borrelia afzelii、Borrelia anserina、Borrelia garinii、Borrelia valaisiana、Borrelia hermsii、Borrelia Parkeri、Borrelia recurrentis、Bosea種、Bradyrhizobium種、Brenneria種、ブルセラ種:Brucella abortus、Brucella canis、Brucella melitensis、Brucella neotomae、Brucella ovis、Brucella suis、Brucella pinnipediae、ブフネラ種、Budvicia種、バークホルデリア種:Burkholderia cepacia(Pseudomonas cepacia)、Burkholderia mallei(Pseudomonas mallei/Actinobacillus mallei)、Burkholderia pseudomallei(Pseudomonas pseudomallei)、Buttiauxella種、Calymmatobacterium granulomatis、カンピロバクター種:Campylobacter coli、Campylobacter concisus、Campylobacter curvus、Campylobacter fetus、Campylobacter gracilis、Campylobacter helveticus、Campylobacter hominis、Campylobacter hyointestinalis、Campylobacter insulaenigrae、Campylobacter jejuni、Campylobacter lanienae、Campylobacter lari、Campylobacter mucosalis、Campylobacter rectus、Campylobacter showae、Campylobacter sputorum、Campylobacter upsaliensis、Capnocytophaga canimorsus(Dysgonic fermenter type 2)、コリネバクテリウム種、Cardiobacterium hominis、セデセア種、クラミジア種:Chlamydia trachomatis(性病性リンパ肉芽腫)、Chlamydia muridarum、Chlamydia suis、クラミドフィラ種:Chlamydophila pneumoniae、Chlamydophila psittaci(オウム病)、Chlamydophila pecorum、Chlamydophila abortus、Chlamydophila felis、Chlamydophila caviae、シトロバクター種:Citrobacter amalonaticus、Citrobacter braakii、Citrobacter farmeri、Citrobacter freundii、Citrobacter gillenii、Citrobacter intermedius、Citrobacter koseri別名Citrobacter diversus、Citrobacter murliniae、Citrobacter rodentium、Citrobacter sedlakii、Citrobacter werkmanii、Citrobacter youngae、クロストリジウム種:Clostridium botulinum、Clostridium difficile、Clostridium novyi、Clostridium septicum、Clostridium tetani(破傷風)、Clostridium welchii(ウェルシュ菌)、コリネバクテリウム種:Corynebacterium diphtheriae(ジフテリア)、Corynebacterium amycolatum、Corynebacterium aquaticum、Corynebacterium bovis、Corynebacterium equi、Corynebacterium flavescens、Corynebacterium glutamicum、Corynebacterium haemolyticum、Corynebacterium jeikeiun(JK群コリネバクテリア)、Corynebacterium minutissimum(紅色陰癬)、Corynebacterium parvum(別名Propionibacterium acnes)、Corynebacterium pseudodiptheriticum(別名Corynebacterium hofmannii)、Corynebacterium pseudotuberculosis(別名Corynebacterium ovis)、Corynebacterium pyogenes、Corynebacterium urealyticum(D2群コリネバクテリア)、Corynebacterium renale、Corynebacterium striatum、Corynebacterium tenuis(Trichomycosis palmellina、Trichomycosis axillaris)、Corynebacterium ulcerans、Corynebacterium xerosis、Coxiella burnetii(Q熱)、Cronobacter種:Cronobacter sakazakii、Cronobacter malonaticus、Cronobacter turicensis、Cronobacter muytjensii、Cronobacter dublinensis、Delftia acidovorans(Comamonas acidovorans)、Dickeya種、エドワードシエラ種、Eikenella corrodens、エンテロバクター種:Enterobacter aerogenes、Enterobacter cloacae、Enterobacter sakazakii、エンテロコッカス種:Enterococcus avium、Enterococcus durans、Enterococcus faecalis(Streptococcus faecalis/D群連鎖球菌)、Enterococcus faecium、Enterococcus solitarius、Enterococcus galllinarum、Enterococcus maloratus、Ehrlichia chaffeensis、Erysipelothrix rhusiopathiae、エルウィニア種、エ���ェリキア種:Escherichia adecarboxylata、Escherichia albertii、Escherichia blattae、Escherichia coli、Escherichia fergusonii、Escherichia hermannii、Escherichia vulneris、Ewingella種、フラボバクテリウム種:Flavobacterium aquatile、Flavobacterium branchiophilum、Flavobacterium columnare、Flavobacterium flevense、Flavobacterium gondwanense、Flavobacterium hydatis、Flavobacterium johnsoniae、Flavobacterium pectinovorum、Flavobacterium psychrophilum、Flavobacterium saccharophilum、Flavobacterium salegens、Flavobacterium scophthalmum、Flavobacterium succinans、Francisella tularensis(野兎病)、Francisella novicida、Francisella philomiragia、フゾバクテリウム種:Fusobacterium necrophorum(ルミエール症候群/Sphaerophorus necrophorus)、Fusobacterium nucleatum、Fusobacterium polymorphum、Fusobacterium novum、Fusobacterium mortiferum、 Fusobacterium varium、Gardnerella vaginalis、Gemella haemolysans、Gemella morbillorum(Streptococcus morbillorum)、Grimontella種、ヘモフィルス種:Haemophilus aegyptius(コッホ・ウィークス菌)、Haemophilus aphrophilus、Haemophilus avium、Haemophilus ducreyi(軟性下疳)、Haemophilus felis、Haemophilus haemolyticus、Haemophilus influenzae(パイファー菌)、Haemophilus paracuniculus、Haemophilus parahaemolyticus、Haemophilus parainfluenzae、Haemophilus paraphrophilus(Aggregatibacter aphrophilus)、Haemophilus pertussis、Haemophilus pittmaniae、Haemophilus somnus、Haemophilus vaginalis、ハフニア種、Hafnia alvei、ヘリコバクター種:Helicobacter acinonychis、Helicobacter anseris、Helicobacter aurati、Helicobacter bilis、Helicobacter bizzozeronii、Helicobacter brantae、Helicobacter Canadensis、Helicobacter canis、Helicobacter cholecystus、Helicobacter cinaedi、Helicobacter cynogastricus、Helicobacter felis、Helicobacter fennelliae、Helicobacter ganmani、Helicobacter heilmannii(Gastrospirillum hominis)、Helicobacter hepaticus、Helicobacter mesocricetorum、Helicobacter marmotae、Helicobacter muridarum、Helicobacter mustelae、Helicobacter pametensis、Helicobacter pullorum、Helicobacter pylori(胃潰瘍)、Helicobacter rappini、Helicobacter rodentium、Helicobacter salomonis、Helicobacter trogontum、Helicobacter typhlonius、Helicobacter winghamensis、ヒト顆粒球エーリキア症(Anaplasma phagocytophilum/Ehrlichia phagocytophila)、Human monocytotropic ehrlichiosis(Monocytic ehrlichiosis/Ehrlichia chaffeensis)、クレブシエラ種:Klebsiella granulomatis(Calymmatobacterium granulomatis)、Klebsiella mobilis、Klebsiella ornithinolytica、Klebsiella oxytoca、Klebsiella ozaenae、Klebsiella planticola、Klebsiella pneumoniae、Klebsiella rhinoscleromatis、Klebsiella singaporensis、Klebsiella terrigena、Klebsiella trevisanii、Klebsiella variicola、
Kingella kingae、クライベラ種、ラクトバチルス種: Lactobacillus acetotolerans、Lactobacillus acidifarinae、Lactobacillus acidipiscis、Lactobacillus acidophilus(デーデルライン桿菌)、Lactobacillus agilis、Lactobacillus algidus、Lactobacillus alimentarius、Lactobacillus amylolyticus、Lactobacillus amylophilus、Lactobacillus amylotrophicus、Lactobacillus amylovorus、Lactobacillus animalis、Lactobacillus antri、Lactobacillus apodemi、Lactobacillus aviarius、Lactobacillus bifermentans、Lactobacillus brevis、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus camelliae、Lactobacillus casei、Lactobacillus catenaformis、Lactobacillus ceti、Lactobacillus coleohominis、Lactobacillus collinoides、Lactobacillus composti、Lactobacillus concavus、Lactobacillus coryniformis、Lactobacillus crispatus、Lactobacillus crustorum、Lactobacillus curvatus、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus、Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactis、Lactobacillus diolivorans、Lactobacillus equi、Lactobacillus equigenerosi、Lactobacillus farraginis、Lactobacillus farciminis、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus fornicalis、Lactobacillus fructivorans、Lactobacillus frumenti、Lactobacillus fuchuensis、Lactobacillus gallinarum、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus gastricus、Lactobacillus ghanensis、Lactobacillus graminis、Lactobacillus hammesii、Lactobacillus hamsteri、Lactobacillus harbinensis、Lactobacillus hayakitensis、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus hilgardii、Lactobacillus homohiochii、Lactobacillus iners、Lactobacillus ingluviei、Lactobacillus intestinalis、Lactobacillus jensenii、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus kalixensis、Lactobacillus kefiranofaciens、Lactobacillus kefiri、Lactobacillus kimchii、Lactobacillus kitasatonis、Lactobacillus kunkeei、Lactobacillus leichmannii、Lactobacillus lindneri、Lactobacillus malefermentans、Lactobacillus mali、Lactobacillus manihotivorans、Lactobacillus mindensis、Lactobacillus mucosae、Lactobacillus murinus、Lactobacillus nagelii、Lactobacillus namurensis、Lactobacillus nantensis、Lactobacillus oligofermentans、Lactobacillus oris、Lactobacillus panis、Lactobacillus pantheris、Lactobacillus parabrevis、Lactobacillus parabuchneri、Lactobacillus paracollinoides、Lactobacillus parafarraginis、Lactobacillus parakefiri、Lactobacillus paralimentarius、Lactobacillus paraplantarum、Lactobacillus pentosus、Lactobacillus perolens、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus pontis、Lactobacillus psittaci、Lactobacillus rennini、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus rimae、Lactobacillus rogosae、Lactobacillus rossiae、Lactobacillus ruminis、Lactobacillus saerimneri、Lactobacillus sakei、Lactobacillus salivarius、Lactobacillus sanfranciscensis、Lactobacillus satsumensis、Lactobacillus secaliphilus、Lactobacillus sharpeae、Lactobacillus siliginis、Lactobacillus spicheri、Lactobacillus suebicus、Lactobacillus thailandensis、Lactobacillus ultunensis、Lactobacillus vaccinostercus、Lactobacillus vaginalis、Lactobacillus versmoldensis、Lactobacillus vini、Lactobacillus vitulinus、Lactobacillus zeae、Lactobacillus zymae、Leclercia種、レジオネラ種:Legionella adelaidensis、Legionella anisa、Legionella beliardensis、Legionella birminghamensis、Legionella bozemanii、Legionella brunensis、Legionella busanensis、Legionella cherrii、Legionella cincinnatiensis、Legionella donaldsonii、Legionella drancourtii、Legionella drozanskii、Legionella erythra、Legionella fairfieldensis、Legionella fallonii、Legionella feeleii、Legionella geestiana、Legionella genomospecies、Legionella gratiana、Legionella gresilensis、Legionella hackeliae、Legionella impletisoli、Legionella israelensis、Legionella jamestowniensis、'Candidatus Legionella jeonii'、Legionella jordanis、Legionella lansingensis、Legionella londiniensis、Legionella longbeachae、Legionella lytica、Legionella maceachernii、Legionella micdadei、Legionella moravica、Legionella nautarum、Legionella oakridgensis、Legionella parisiensis、Legionella pneumophila、Legionella quateirensis、Legionella quinlivanii、Legionella rowbothamii、Legionella rubrilucens、Legionella sainthelensi、Legionella santicrucis、Legionella shakespearei、Legionella spiritensis、Legionella steigerwaltii、Legionella taurinensis、Legionella tucsonensis、Legionella wadsworthii、Legionella waltersii、Legionella worsleiensis、Legionella yabuuchiae、Leminorella種、レプトスピラ種:Leptospira interrogans、Leptospira kirschneri、Leptospira noguchii、Leptospira alexanderi、Leptospira weilii、Leptospira genomospecies 1、Leptospira borgpetersenii、Leptospira santarosai、Leptospira inadai、Leptospira fainei、Leptospira broomii、Leptospira licerasiae、Leptospira biflexa、Leptospira meyeri、Leptospira wolbachii、Leptospira genomospecies 3、Leptospira genomospecies 4、Leptospira genomospecies 5、Lepromatous leprosy(Danielssen-Boeck病)、Leptospira canicola、Leptospira hebdomadis、レプトスピラ症(ワイル病/Leptospira icterohaemorrhagiae/Leptospira interrogans serovar icterohaemorrhagiae)、Leptotrichia、リューコノストック種:Leuconostoc carnosum、Leuconostoc citreum、Leuconostoc durionis、Leuconostoc fallax、Leuconostoc ficulneum、Leuconostoc fructosum、Leuconostoc garlicum、Leuconostoc gasicomitatum、Leuconostoc gelidum、Leuconostoc inhae、Leuconostoc kimchii、Leuconostoc lactis、Leuconostoc mesenteroides、Leuconostoc pseudoficulneum、Leuconostoc pseudomesenteroides、リステリア種:Listeria grayi、Listeria innocua、Listeria ivanovii、Listeria monocytogenes(リステリア症)、Listeria seeligeri、Listeria welshimeri、Methanobacterium extroquens、Microbacterium multiforme、ミクロコッカス種:Micrococcus antarcticus、Micrococcus flavus、Micrococcus luteus、Micrococcus lylae、Micrococcus mucilaginosis、Micrococcus roseus、Micrococcus sedentarius、Mobiluncus、Moellerella種、モルガネラ種、モラクセラ種:Moraxella atlantae、Moraxella boevrei、Moraxella bovis、Moraxella canis、Moraxella caprae、Moraxella catarrhalis(Branhamella catarrhalis)、Moraxella caviae、Moraxella cuniculi、Moraxella equi、Moraxella lacunata、Moraxella lincolnii、Moraxella nonliquefaciens、Moraxella oblonga、Moraxella osloensis、Moraxella saccharolytica、Morganella morganii、マイコバクテリウム種:Mycobacterium abscessus、Mycobacterium africanum、Mycobacterium agri、Mycobacterium aichiense、Mycobacterium alvei、Mycobacterium arupense、Mycobacterium asiaticum、Mycobacterium aubagnense、Mycobacterium aurum、Mycobacterium austroafricanum、Mycobacterium avium(バテー病/Lady Windermere症候群)、Mycobacterium avium paratuberculosis(ヒトのクローン病及びヒツジのヨーネ病に関係する)、Mycobacterium avium silvaticum、Mycobacterium avium "hominissuis"、Mycobacterium colombiense、Mycobacterium boenickei、Mycobacterium bohemicum、Mycobacterium bolletii、Mycobacterium botniense、Mycobacterium bovis(牛結核)、Mycobacterium branderi、Mycobacterium brisbanense、Mycobacterium brumae、Mycobacterium canariasense、Mycobacterium caprae、Mycobacterium celatum、Mycobacterium chelonae、Mycobacterium chimaera、Mycobacterium chitae、Mycobacterium chlorophenolicum、Mycobacterium chubuense、Mycobacterium conceptionense、Mycobacterium confluentis、Mycobacterium conspicuum、Mycobacterium cookii、Mycobacterium cosmeticum、Mycobacterium diernhoferi、Mycobacterium doricum、Mycobacterium duvalii、Mycobacterium elephantis、Mycobacterium fallax、Mycobacterium farcinogenes、Mycobacterium flavescens、Mycobacterium florentinum、Mycobacterium fluoroanthenivorans、Mycobacterium fortuitum、Mycobacterium fortuitum subsp. Acetamidolyticum、Mycobacterium frederiksbergense、Mycobacterium gadium、Mycobacterium gastri、Mycobacterium genavense、Mycobacterium gilvum、Mycobacterium goodii、Mycobacterium gordonae(Mycobacterium aquae)、Mycobacterium haemophilum、Mycobacterium hassiacum、Mycobacterium heckeshornense、Mycobacterium heidelbergense、Mycobacterium hiberniae、Mycobacterium hodleri、Mycobacterium holsaticum、Mycobacterium houstonense、Mycobacterium immunogenum、Mycobacterium interjectum、Mycobacterium intermedium、Mycobacterium intracellulare、Mycobacterium kansasii、Mycobacterium komossense、Mycobacterium kubicae、Mycobacterium kumamotonense、Mycobacterium lacus、Mycobacterium lentiflavum、Mycobacterium leprae(癩病又はハンセン病の原因)、Mycobacterium lepraemurium、Mycobacterium madagascariense、Mycobacterium mageritense、Mycobacterium malmoense、Mycobacterium marinum(魚槽肉芽腫)、Mycobacterium massiliense、Mycobacterium microti、Mycobacterium monacense、Mycobacterium montefiorense、Mycobacterium moriokaense、Mycobacterium mucogenicum、Mycobacterium murale、Mycobacterium nebraskense、Mycobacterium neoaurum、Mycobacterium neworleansense、Mycobacterium nonchromogenicum、Mycobacterium novocastrense、Mycobacterium obuense、Mycobacterium palustre、Mycobacterium parafortuitum、Mycobacterium parascrofulaceum、Mycobacterium parmense、Mycobacterium peregrinum、Mycobacterium phlei、Mycobacterium phocaicum、Mycobacterium pinnipedii、Mycobacterium porcinum、Mycobacterium poriferae、Mycobacterium pseudoshottsii、Mycobacterium pulveris、Mycobacterium psychrotolerans、Mycobacterium pyrenivorans、Mycobacterium rhodesiae、Mycobacterium saskatchewanense、Mycobacterium scrofulaceum、Mycobacterium senegalense、Mycobacterium seoulense、Mycobacterium septicum、Mycobacterium shimoidei、Mycobacterium shottsii、Mycobacterium simiae、Mycobacterium smegmatis、Mycobacterium sphagni、Mycobacterium szulgai、Mycobacterium terrae、Mycobacterium thermoresistibile、Mycobacterium tokaiense、Mycobacterium triplex、Mycobacterium triviale、Mycobacterium tuberculosis(ヒトの結核の主要原因)、Mycobacterium bovis、Mycobacterium africanum、Mycobacterium canetti、Mycobacterium caprae、Mycobacterium pinnipedii'、Mycobacterium tusciae、Mycobacterium ulcerans(Bairnsdale潰瘍/Buruli潰瘍の原因)、Mycobacterium vaccae、Mycobacterium vanbaalenii、Mycobacterium wolinskyi、Mycobacterium xenopi、マイコプラズマ種:Mycoplasma fermentans、Mycoplasma genitalium、Mycoplasma hominis、Mycoplasma penetrans、Mycoplasma phocacerebrale、Mycoplasma pneumoniae、Nanukayami(七日熱/Gikiyami)、ナイセリア種:Neisseria gonorrhoea(淋菌/淋病)、Neisseria meningiditis(髄膜炎菌)、Neisseria sicca、Neisseria cinerea、Neisseria elongata、Neisseria flavescens、Neisseria lactamica、Neisseria muc
osa、Neisseria polysaccharea、Neisseria subflava、ニトロバクター種、ノカルジア種:Nocardia asteroides、Nocardia brasiliensis、Nocardia caviae、Noma(水癌/壊疽性口内炎)、Obesumbacterium、Oligotropha種、Orientia tsutsugamushi(つつが虫病)、Oxalobacter formigenes、パンテア種:Pantoea agglomerans、Pantoea ananatis、Pantoea citrea、Pantoea dispersa、Pantoea punctata、Pantoea stewartii、Pantoea terrea、パスツレラ種:Pasteurella aerogenes、Pasteurella anatis、Pasteurella avium、Pasteurella bettyae、Pasteurella caballi、Pasteurella canis、Pasteurella dagmatis、Pasteurella gallicida、Pasteurella gallinarum、Pasteurella granulomatis、Pasteurella langaaensis、Pasteurella lymphangitidis、Pasteurella mairii、Pasteurella multocida、Pasteurella pneumotropica、Pasteurella skyensis、Pasteurella stomatis、Pasteurella testudinis、Pasteurella trehalosi、Pasteurella tularensis、Pasteurella ureae、Pasteurella volantium、ペジオコックス種:Pediococcus acidilactici、Pediococcus cellicola、Pediococcus claussenii、Pediococcus damnosus、Pediococcus dextrinicus、Pediococcus ethanolidurans、Pediococcus inopinatus、Pediococcus parvulus、Pediococcus pentosaceus、Pediococcus stilesii、ペプトストレプトコッカス種:Peptostreptococcus anaerobius、Peptostreptococcus asaccharolyticus、Peptostreptococcus harei、Peptostreptococcus hydrogenalis、Peptostreptococcus indoliticus、Peptostreptococcus ivorii、Peptostreptococcus lacrimalis、Peptostreptococcus lactolyticus、Peptostreptococcus magnus、Peptostreptococcus micros、Peptostreptococcus octavius、Peptostreptococcus prevotii、Peptostreptococcus tetradius、Peptostreptococcus vaginalis、フォトラブダス種、Photorhizobium種、Plesiomonas shigelloides、Porphyromonas gingivalis、Pragia種、プレボテラ、プロピオニバクテリウム種:Propionibacterium acnes、Propionibacterium propionicus、プロテウス種:Proteus mirabilis、Proteus morganii、Proteus penneri、Proteus rettgeri、Proteus vulgaris、プロビデンシア種:Providencia friedericiana、Providencia stuartii、シュードモナス種:Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas alcaligenes、Pseudomonas anguilliseptica、Pseudomonas argentinensis、Pseudomonas borbori、Pseudomonas citronellolis、Pseudomonas flavescens、Pseudomonas mendocina、Pseudomonas nitroreducens、Pseudomonas oleovorans、Pseudomonas pseudoalcaligenes、Pseudomonas resinovorans、Pseudomonas straminea、Pseudomonas aurantiaca、Pseudomonas aureofaciens、Pseudomonas chlororaphis、Pseudomonas fragi、Pseudomonas lundensis、Pseudomonas taetrolens、Pseudomonas Antarctica、Pseudomonas azotoformans、Pseudomonas brassicacearum、Pseudomonas brenneri、Pseudomonas cedrina、Pseudomonas corrugate、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas gessardii、Pseudomonas libanensis、Pseudomonas mandelii、Pseudomonas marginalis、Pseudomonas mediterranea、Pseudomonas meridiana、Pseudomonas migulae、Pseudomonas mucidolens、Pseudomonas orientalis、Pseudomonas panacis、Pseudomonas proteolytica、Pseudomonas rhodesiae、Pseudomonas synxantha、Pseudomonas thivervalensis、Pseudomonas tolaasii、Pseudomonas veronii、Pseudomonas denitrificans、Pseudomonas pertucinogena、Pseudomonas cremoricolorata、Pseudomonas fulva、Pseudomonas monteilii、Pseudomonas mosselii、Pseudomonas oryzihabitans、Pseudomonas parafulva、Pseudomonas plecoglossicida、Pseudomonas putida、Pseudomonas balearica、Pseudomonas luteola、Pseudomonas stutzeri、Pseudomonas amygdale、Pseudomonas avellanae、Pseudomonas caricapapayae、Pseudomonas cichorii、Pseudomonas coronafaciens、Pseudomonas ficuserectae、Pseudomonas meliae、Pseudomonas savastanoi、Pseudomonas syringae、Pseudomonas viridiflava、Pseudomonas abietaniphila、Pseudomonas acidophila、Pseudomonas agarici、Pseudomonas alcaliphila、Pseudomonas alkanolytica、Pseudomonas amyloderamosa、Pseudomonas asplenii、Pseudomonas azotifigens、Pseudomonas cannabina、Pseudomonas coenobios、Pseudomonas congelans、Pseudomonas costantinii、Pseudomonas cruciviae、Pseudomonas delhiensis、Pseudomonas excibis、Pseudomonas extremorientalis、Pseudomonas frederiksbergensis、Pseudomonas fuscovaginae、Pseudomonas gelidicola、Pseudomonas grimontii、Pseudomonas indica、Pseudomonas jessenii、Pseudomonas jinjuensis、Pseudomonas kilonensis、Pseudomonas knackmussii、Pseudomonas koreensis、Pseudomonas lini、Pseudomonas lutea、Pseudomonas moraviensis、Pseudomonas otitidis、Pseudomonas pachastrellae、Pseudomonas palleroniana、Pseudomonas papaveris、Pseudomonas peli、Pseudomonas perolens、Pseudomonas poae、Pseudomonas pohangensis、Pseudomonas psychrophila、Pseudomonas psychrotolerans、Pseudomonas rathonis、Pseudomonas reptilivora、Pseudomonas resiniphila、Pseudomonas rhizosphaerae、Pseudomonas rubescens、Pseudomonas salomonii、Pseudomonas segitis、Pseudomonas septica、Pseudomonas simiae、Pseudomonas suis、Pseudomonas thermotolerans、Pseudomonas tremae、Pseudomonas trivialis、Pseudomonas turbinellae、Pseudomonas tuticorinensis、Pseudomonas umsongensis、Pseudomonas vancouverensis、Pseudomonas vranovensis、Pseudomonas xanthomarina、ラーネラ種、ラルストニア種:Ralstonia basilensis、Ralstonia campinensis、Ralstonia eutropha、Ralstonia gilardii、Ralstonia insidiosa、Ralstonia mannitolilytica、Ralstonia metallidurans、Ralstonia paucula、Ralstonia pickettii、Ralstonia respiraculi、Ralstonia solanacearum、Ralstonia syzygii、Ralstonia taiwanensis、Raoultella種、Rhodoblastus種、ロドソイドモナス種、鼻硬化症、Rhizobium radiobacter、Rhodococcus equi、リケッチア種:Rickettsia africae、Rickettsia akari、Rickettsia australis、Rickettsia conorii、Rickettsia felis、Rickettsia japonica、Rickettsia mooseri、Rickettsia prowazekii(発疹チフス)、Rickettsia rickettsii、Rickettsia siberica、Rickettsia typhi、Rickettsia conorii、Rickettsia africae、Rickettsia psittaci、Rickettsia quintana、Rickettsia rickettsii、Rickettsia trachomae、Rothia dentocariosa、サルモネラ種:Salmonella arizonae、Salmonella Bongori、Salmonella enterica、Salmonella enteriditis、Salmonella paratyphi、Salmonella typhi(腸チフス)、Salmonella typhimurium、Salmonella salamae、Salmonella arizonae、Salmonella diarizonae、Salmonella houtenae、Salmonella indica、Samsonia種、セラチア種:Serratia entomophila、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia grimesii、Serratia liquefaciens、Serratia marcescens、Serratia odoriferae、Serratia plymuthica、Serratia proteamaculans、Serratia quinivorans、Serratia rubidaea、Serratia ureilytica、Shewanella putrefaciens、Shigella boydii、Shigella dysenteriae、Shigella flexneri、Shigella sonnei、Sodalis種、スピリルム種:Spirillum minus鼡咬症、スタヒロコッカス種:Staphylococcus aureus、Staphylococcus auricularis、Staphylococcus capitis、Staphylococcus caprae、Staphylococcus cohnii、Staphylococcus epidermidis、Staphylococcus felis、Staphylococcus haemolyticus、Staphylococcus hominis、Staphylococcus intermedius、Staphylococcus lugdunensis、Staphylococcus pettenkoferi、Staphylococcus saprophyticus、Staphylococcus schleiferi、Staphylococcus simulans、Staphylococcus vitulus、Staphylococcus warneri、Staphylococcus xylosus、ステノトロホモナス種:Stenotrophomonas acidaminiphila、Stenotrophomonas dokdonensis、Stenotrophomonas koreensis、Stenotrophomonas maltophilia、Stenotrophomonas nitritireducens、Stenotrophomonas rhizophila、ストレプトバチルス種:Streptobacillus moniliformis(Streptobacillary鼡咬症)、ストレプトコッカス種:A群連鎖球菌、B群連鎖球菌、Streptococcus agalactiae、Streptococcus aginosus、Streptococcus avium、Streptococcus bovis、Streptococcus canis、Streptococcus cricetus、Streptococcus faceium、Streptococcus faecalis、Streptococcus ferus、Streptococcus gallinarum、Streptococcus lactis、Streptococcus milleri、Streptococcus mitior、Streptococcus mitis、Streptococcus mutans、Streptococcus oralis、Streptococcus peroris、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus pyogenes、Streptococcus ratti、Streptococcus salivarius、Streptococcus sanguinis、Streptococcus sobrinus、Streptococcus parasanguinis、Streptococcus suis、Streptococcus thermophilus、Streptococcus vestibularis、Streptococcus viridans、Streptococcus uberis、Streptococcus zooepidemicus、テイタメラ種、Trabulsiella種、トレポネーマ種:Treponema carateum(ピンタ)、Treponema denticola、Treponema endemicum(ベジェル)、Treponema pallidum(梅毒)、Treponema pertenue(イチゴ腫)、Tropheryma whipplei(ウィップル病)、Tuberculoid leprosy、Ureaplasma urealyticum、ベイヨネラ、ビブリオ種:Vibrio aerogenes、Vibrio aestuarianus、Vibrio agarivorans、Vibrio albensis、Vibrio alginolyticus、Vibrio brasiliensis、Vibrio calviensis、Vibrio campbellii、Vibrio chagasii、Vibrio cholerae(コレラ)、Vibrio cincinnatiensis、Vibrio Comma、Vibrio coralliilyticus、Vibrio crassostreae、Vibrio cyclitrophicus、Vibrio diabolicus、Vibrio diazotrophicus、Vibrio ezurae、Vibrio fischeri、Vibrio fluvialis、Vibrio fortis、Vibrio furnissii、Vibrio gallicus、Vibrio gazogenes、Vibrio gigantis、Vibrio halioticoli、Vibrio harveyi、Vibrio hepatarius、Vibrio hispanicus、Vibrio ichthyoenteri、Vibrio kanaloae、Vibrio lentus、Vibrio litoralis、Vibrio logei、Vibrio mediterranei、Vibrio metschnikovii、Vibrio mimicus、Vibrio mytili、Vibrio natriegens、Vibrio navarrensis、Vibrio neonatus、Vibrio neptunius、Vibrio nereis、Vibrio nigripulchritudo、Vibrio ordalii、Vibrio orientalis、Vibrio pacinii、Vibrio parahaemolyticus、Vibrio pectenicida、Vibrio penaeicida、Vibrio pomeroyi、Vibrio ponticus、Vibrio proteolyticus、Vibrio rotiferianus、Vibrio ruber、Vibrio rumoiensis、Vibrio salmonicida、Vibrio scophthalmi、Vibrio splendidus、Vibrio superstes、Vibrio tapetis、Vibrio tasmaniensis、Vibrio tubiashii、Vibrio vulnificus、Vibrio wodanis、Vibrio xuii、Vogesella indigofera、ウィグルスウォーチア種、Wolbachia secies、ゼノラブダス種、Yersinia enterocolitica、Yersinia pestis、Yersinia pseudotuberculosis、及び Yokenella種から成る群から選択される、項目39及び60記載の方法。
61. 前記ウイルスは、アベルソンマウス白血病ウイルス(Ab-MLV、A-MuLV)、急性喉頭気管気管支炎(又はHPIV)、Adelaide River virus、アデノ随伴ウイルス群(Dependevirus)、アデノウイルス、African horse sickness virus、African swine fever virus、AIDSウイルス、アリューシャンミンク病、parvovirus、アルファルファモザイクウイルス、アルファヘルペスウイルス(HSV 1及び2及び水痘を含む)、アルファレトロウイルス(トリ白血病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス)、Alphavirus、alkhurma virus、ALV関連ウイルス、Amapari virus、Andean potato mottle virus、Aphthovirus、Aquareovirus、アルボウイルス、アルボウイルスC、アルボウイルスA群、アルボウイルスB群、アレナウイルス群、アルゼンチン出血熱ウイルス、アルゼンチン出血熱ウイルス、Arterivirus、Astrovirus、Ateline herpesvirus group、オーエスキー病ウイルス、Aura virus、Ausduk disease virus、Australian bat lyssavirus、アビアデノウイルス、トリ赤芽球症ウイルス、トリ伝染性気管支炎ウイルス、avian leukemia virus、Avian leukosis virus(ALV)、トリリンパ腫症ウイルス、トリ骨髄芽球症ウイルス、トリパラミクソウイルス、avian pneumoencephalitis virus、トリ細網内皮症ウイルス、トリ肉腫ウイルス、avian type C retrovirus group、トリヘパドナウイルス、アビポックスウイルス、Bウイルス(Cercopithecine herpesvirus 1)、B19ウイルス(パルボウイルスB19)、Babanki virus、baboon herpesvirus、細菌ウイルス、バキュロウイルス、オオムギ黄化萎縮ウイルス、Barmah Forest virus、bean pod mottle virus、bean rugose mosaic virus、Bebaru virus、Berrimah virus、ベータヘルペスウイルス、ベータレトロウイルス、鳥インフルエンザ、Birnavirus、Bittner virus、BK virus、Black Creek Canal virus、bluetongue virus、ボリビア出血熱ウイルス、Boma disease virus、border disease of sheep virus、borna virus、bovine alphaherpesvirus 1、bovine alphaherpesvirus 2、ウシコロナウイルス、ウシ流行熱ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、ウシ白血病ウイルス、bovine leukosis virus、bovine mammillitis virus、ウシ乳頭腫ウイルス、ウシ丘疹性口炎ウイルス、ウシパルボウイルス、ウシシンシチアウイルス、bovine type C oncovirus、ウシウイルス性下痢症ウイルス、bracovirus、ソラマメモットルウイルス、broad bean stain virus、ブロムモザイクウイルス、Bromovirus、Buggy Creek virus、bullet shaped virus group、ブンヤムウェラウイルス、ブンヤウイルス、バーキットリンパ腫ウイルス、ブワンバ熱、Bwattany hetero virus、CAウイルス(Croup-associated virus/parainfluenza vius type 2)、カリチウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、ラクダ痘ウイルス、カナリア痘ウイルス、canid herpesvirus、イヌコロナウイルス、イヌジステンパーウイルス、イヌヘルペスウイルス、canine minute virus、イヌパルボウイルス、Cano Delgadito virus、カピロウイルス、caprine arthritis virus、caprine encephalitis virus、ヤギヘルペスウイルス、カプリポックスウイルス、カルジオウイルス、カーラウイルス、カーモウイルス、carrot mottle virus、Cassia yellow blotch virus、カリモウイルス、カリフラワーモザイクウイルス、caviid herpesvirus 1、Cercopithecine herpesvirus 1、Cercopithecine herpesvirus 2、cereal yellow dwarf virus、Chandipura virus、Changuinola virus、channel catfish virus、Charleville virus、水痘ウイルス、チクングニヤウイルス、チンパンジーヘルペスウイルス、Chordopoxvirinae、chub reovirus、chum salmon virus、クロステロウイルス、球菌ウイルス、Coho salmon reovirus、coital exanthema virus、コロラドダニ熱ウイ��ス、Coltivirus Columbia SK virus、Commelina yellow mottle virus、かぜウイルス、コモウイルス、Condylomata accuminata、先天性サイトメガロウイルス、伝染性膿瘡ウイルス、伝染性膿疱性皮膚炎ウイルス、コロナウイルス、コリパルタウイルス、coryza virus、ササゲクロロティックモットルウイルス、ササゲモザイクウイルス、ササゲウイルス、牛痘ウイルス、コクサッキーウイルス、CPV(細胞質多角体ウイルス)、cricket paralysis virus、クリミア・コンゴ出血性熱ウイルス、croup associated virus、Crypotovirus、ククモウイルス、サイポウイルス、サイトメガロウイルス(HCMV又はヒトヘルペスウイルス5 HHV-5)、細胞質多角体ウイルス、Cytorhabdovirus、deer papillomavirus、デルタレトロウイルス(ヒトTリンパ好性ウイルス)、Deformed wing virus DWV、デング熱、デンソウイルス、ディペンドウイルス、ドーリウイルス、ダイアンソウイルス、ジプロルナウイルス、DNAウイルス、Dobrava-Belgrade Virus、イヌインフルエンザ、Drosophila C virus、アヒルB型肝炎ウイルス、アヒル肝炎ウイルス1、アヒル肝炎ウイルス2、duovirus、Duvenhage virus、eastern equine encephalitis virus、eastern equine 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62.相補的なRNA及び/又はDNA標的との相互作用に適した、正確に1個のインターカレータ分子を含むポリヌクレオチドプローブ。
63.相補的なRNA及び/又はDNA標的との相互作用に適した、少なくとも2個のインターカレータ分子を含むポリヌクレオチドプローブ。
64.前記ポリヌクレオチドプローブは、DNAプローブ、RNAプローブ、LNAプローブ、及びPNAプローブから成る群から選択することができる、項目63及び64の何れかに記載のポリヌクレオチドプローブ。
65. インターカレータ分子の総数は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、及び21個以上から成る群から選択することができる、項目63乃至65の何れかに記載のポリヌクレオチドプローブ。
66. 前記インターカレータ分子の挿入により、前記標的DNA及び/又はRNAと前記相補的プローブとから成るポリヌクレオチド二重鎖の融解温度が上昇する、項目63乃至66の何れかに記載のポリヌクレオチドプローブ。
67. 前記相補的プローブ内のインターカレータ分子の数と塩基の総数との間の比は1:50乃至1:2、例として1:50乃至1:40、例えば1:40乃至1:30、例として1:30乃至1:20、例えば1:20乃至1:10、例として1:10乃至1:5、例えば1:5乃至1:2、又はこれらの間隔の任意の組み合わせとなる、項目63乃至67の何れかに記載のポリヌクレオチドプローブ。
68. 前記唯一のインターカレータ分子は、TINA、INA、ortho-TINA、para-TINA、及びAMANYから成る群から選択される、項目63乃至68の何れかに記載のポリヌクレオチドプローブ。
69. 前記インターカレータ分子は、TINAである、項目69記載のポリヌクレオチドプローブ。
70. 前記インターカレータ分子は、INAである、項目69記載のポリヌクレオチドプローブ。
71. 前記インターカレータ分子は、ortho-TINAである、項目69記載のポリヌクレオチドプローブ。
72. 前記インターカレータ分子は、para-TINAである、項目69記載のポリヌクレオチドプローブ。
73. 前記インターカレータ分子は、AMANYである、項目69記載のポリヌクレオチドプローブ。
74. 前記2個以上のインターカレータ分子は、TINA、INA、ortho-TINA、para-TINA、及びAMANYから成る群から選択することができる、項目63乃至69の何れかに記載のポリヌクレオチドプローブ。
75. 前記ポリヌクレオチドプローブは、2種類以上のインターカレータ分子、例として2種類、3種類、4種類、5種類、又は5種類以上の異なるインターカレータ分子を含む、項目63乃至69の何れかに記載のポリヌクレオチドプローブ。
76. 前記相補的プローブは、支持体に結合させる、項目63乃至76の何れかに記載のポリヌクレオチドプローブ。
77. 前記支持体は、粒状物質、ビーズ、磁性ビーズ、非磁性ビーズ、ポリスチレンビーズ、磁性ポリスチレンビーズ、セファロースビーズ、セファクリルビーズ、ポリスチレンビーズ、アガロースビーズ、多糖類ビーズ、及びポリカーバメートビーズから成る群から選択される、項目77記載のポリヌクレオチドプローブ。
78. 前記支持体は、固体支持体である、項目77乃至78の何れかに記載のポリヌクレオチドプローブ。
79. 前記固体支持体は、マイクロタイタープレート又は他のプレート形式、試薬チューブ、スライドガラス或いはアレイ又はマイクロアレイ解析に用いられる他の支持体、マイクロ流体チャンバ又はデバイスのチューブ又は導管類、及びBiacoreチップから成る群から選択することができる、項目79記載のポリヌクレオチドプローブ。
80. 前記ポリヌクレオチドプローブは、1つ又は複数の標識を含む、項目63乃至76の何れかに記載のポリヌクレオチドプローブ。
81. 前記1つ又は複数の標識は、ビオチン、蛍光標識、5(及び6)-カルボキシフルオレセイン、5-又は6-カルボキシフルオレセイン、6-(フルオレセイン)-5(及び6)-カルボキシアミドヘキサン酸、フルオレセインイソチオシアナート(FITC)、ローダミン、テトラメチルローダミン、染料、Cy2、Cy3、及びCy5、PerCP、フィコビリ蛋白質、R-フィコエリトリン(RPE)、アロフィコエリトリン(APC)、テキサスレッド、プリンストンレッド、緑色蛍光タンパク質(GFP)及びその類似体、R-フィコエリトリン又はアロフィコエリトリンのコンジュゲート、半導体ナノ結晶(量子ドット及びQdotTMナノ結晶等)に基づく無機蛍光標識、Eu3+及びSm3+等のランタニドに基づく時間分解蛍光標識、ハプテン、DNP、ジゴキシゲニン、酵素標識、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ(AP)、ベータガラクトシダーゼ(GAL)、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、β-N-アセチルグルコサミニダーゼ、β-グルクロニダーゼ、インベルターゼ、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ及びグルコースオキシダーゼ(GO)、発光標識、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、1,2-ジオキセタン、ピリドピリダジン、放射能標識、ヨウ化物の同位体、コバルトの同位体、セレンの同位体、トリチウムの同位体、及びリンの同位体から成る群から選択することができる、項目81記載のポリヌクレオチドプローブ。
82. 前記インターカレータのインターカレーティング単位は、好ましくは、ポリアロメート及びヘテロポリアロメートから成る群から選択された化学基を含む、項目63乃至76の何れかに記載のポリヌクレオチドプローブ。
83. 前記ポリアロメート及びヘテロポリアロメートは、少なくとも2個の芳香環から成り、例として3個、例えば4個、例として5個、例えば6個、例として7個、例えば8個、例として9個以上の芳香環から成る、項目83記載のポリヌクレオチドプローブ。
84. 前記ヘテロポリアロメートは、少なくとも1個の炭素原子が窒素及び酸素から選択されたヘテロ原子に置き換わった少なくとも1個の芳香環を含む、項目83乃至84記載のポリヌクレオチドプローブ。
85. 前記ヘテロポリアロメートは、少なくとも2個のヘテロ原子、例として3個のヘテロ原子、例えば4個のヘテロ原子、例として5個のヘテロ原子、例えば6個以上のヘテロ原子を含む、項目83乃至84記載のポリヌクレオチドプローブ。
86. 前記ヘテロポリアロメートは、酸素を唯一のヘテロ原子として含む、項目83乃至84及び86記載のポリヌクレオチドプローブ。
87. 前記ヘテロポリアロメートは、窒素を唯一のヘテロ原子として含む、項目83乃至84及び86記載のポリヌクレオチドプローブ。
88. 前記ヘテロポリアロメートは、窒素及ぶ酸素の両方をヘテロ原子として含む、項目83乃至84及び86記載のポリヌクレオチドプローブ。
89.前記ポリアロメート及びヘテロポリアロメートは、ヒドロキシル、ハロゲン、メルカプト、チオ、シアノ、アルキルチオ、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルボアルコイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ニトロ、アミノ、アルコキシル、及び/又はアミドから成る群から選択された1個又は複数の置換基により置換される、項目83乃至84に記載のポリヌクレオチドプローブ。
90. 前記インターカレータのインターカレーティング単位は、ポリヌクレオチド二重鎖構造の安定性を高めることが可能なポリアロメート及びヘテロポリアロメートから成る群から選択される、項目83乃至90の何れかに記載のポリヌクレオチドプローブ。
91.前記インターカレータの前記インターカレーティング単位は、フェナントロリンと、フェナジンと、フェナントリジンと、ピレンと、アントラセンと、ナフタレンと、フェナントレンと、ピセンと、クリセンと、ナフタセンと、ベンズアントラセンと、スチルベンと、ポルフィリンと、ヒドロキシル、ハロゲン、メルカプト、チオ、シアノ、アルキルチオ、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルボアルコイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ニトロ、アミノ、アルコキシル、及びアミドから成る群から選択された1個又は複数の置換基により置換された前述のインターカレータの何れかと、から成る群から選択される、項目84乃至91に記載のポリヌクレオチドプローブ。
【実施例】
【０３０１】
融解曲線の取得によるTmに関する脱塩基部位の評価
【０３０２】
LightCycler(登録商標)2.0上の蛍光共鳴エネルギ移動(FRET)システムを用いて、2つの異なるオリゴポリヌクレオチド配列における塩基ミスマッチ又は脱塩基部位(B)により生じる融解温度(Tm)の変化を評価した。
【０３０３】
オリゴヌクレオチドは、IBA GmbH(ゲッティンゲン、ドイツ)又はDNA Technology A/S(リースコウ、デンマーク)から、0.2μmol合成スケールで、高速液体クロマトグラフィ(HPLC)精製及びその後の品質制御を施されたものを購入した。オリゴヌクレオチドを3’amino-modifier-C7に合成し、その後ATTO495 NHSエステル又は5’-amino-modifier-C6に結合させ、その後ATTO590 NHSエステルに結合させた。ATTO495はFRETのドナーの役割を果たすものであり、励起極大495nm及び発光極大527nmのアクリジンオレンジの修飾体である。ATTO590は、ローダミン染料の誘導体であり、励起極大594nm、発光極大624nmを有する。ATTO495/ATTO590のFRETペアを、470nmでLightCycler(登録商標)2.0(Roche Applied Science、バーゼル、スイス、)において励起し、蛍光発光を640nmで検出した。
【０３０４】
ウラシル含有オリゴヌクレオチドのウラシル-DNAグリコシラーゼ(UNG)処理の評価のため、Tmの判定前に、前培養ステップを実施した。10μMオリゴヌクレオチドを、20mM Tris-HCl(pH 8.2、25℃)、10mM NaCl、1mM EDTAにおいて、オリゴヌクレオチド50pmol当たりUNG1単位を含む状態又は含まない状態で、37℃で1時間培養した。
【０３０５】
融解曲線実験は、LightCycler(登録商標)2.0において、20μL LightCyclerキャピラリを用いて実施した。オリゴヌクレオチド各1.0μMを、pH 7.0のリン酸ナトリウム緩衝液(50mM NaH2PO4/Na2HPO4、100mM NaCl、及び0.1mM EDTA)に混合した。Tmの測定は、(i)傾斜率0.2℃/秒で37℃から95℃とし、95℃で5分間保持する解離ステップと、(ii)傾斜率0.05℃/秒で95℃から37℃とし、継続的に蛍光を測定するアニーリングと、(iii)37℃での5分間の保持と、(iv)傾斜率0.05℃/秒で37℃から95℃とし、継続的に蛍光を測定する変性とによる標準プログラムを用いて実施した。アニーリング及び変性曲線の両方の蛍光データをTmの判定に用いており、ヒステリシスは観測されなかった。Tmは、融解曲線解析用のLightCyclerソフトウェア4.1を使用して特定し、一次導関数のピークとした。全ての融解曲線の判定は、単一のキャピラリによる測定として実施した。Tmの判定前に、各測定では、フルオロフォアのバックグラウンド蛍光を減算することにより色補正を行った。
【０３０６】
結果を表1乃至3に示す。単一の脱塩基部位は、Tmを平均10℃低下させた(表1)。2つのミスマッチ又は2つの脱塩基部位を有するオリゴヌクレオチド(表2)では、2つのミスマッチについて、平均15.7℃のTmの低下(7.8℃/ミスマッチ)が観察された一方、2つの脱塩基部位により、Tmは平均23.8℃低下した(11.9℃/脱塩基部位)。脱塩基部位は、平均すると、ミスマッチ塩基と比較してTmを更に52％低下させた((11.9-7.8)/7.8*100)。
【０３０７】
【表１】
2013544507.tif 000049
【０３０８】
【表２】
2013544507.tif 000050
【０３０９】
表3は、UNG処理した場合又はしない場合のウラシル含有オリゴヌクレオチドの前培養の影響を示す。UNG処理しない場合、2つのミスマッチについて、Tmは平均17.4℃低下し(8.7℃/ミスマッチ)、一方、2つのUNG処理ウラシル塩基により、Tmは平均21.3℃低下した(10.6℃/UNG処理ウラシル)。
【０３１０】
【表３】
2013544507.tif 000051
【０３１１】
結論として、脱塩基部位は、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを、塩基ミスマッチよりも52％効率的に不安定化させることが明らかになった。更に、塩基ミスマッチ部位と比較した脱塩基部位の影響は、安定した脱塩基部位に対してだけではなく、UNG処理ウラシル塩基に対しても認められることが明らかとなった。
【０３１２】
ウラシル含有標的のUNG処理及びpara-TINA含有オリゴヌクレオチド又は従来のDNAオリゴヌクレオチドによる特異的捕捉
【０３１３】
この実験の目的は、dsDNAから特異的塩基を除去し、その後、相補的塩基をpara-TINA(図6及び7)により置換したオリゴヌクレオチドによりDNAを捕捉することとした。
【０３１４】
オリゴヌクレオチドは、IBA GmbH(ゲッティンゲン、ドイツ)又はDNA Technology A/S(リースコウ、デンマーク)から、0.2μmol合成スケールで、高速液体クロマトグラフィ(HPLC)精製及びその後の品質制御の施されたものを購入した。大腸菌からのSTX2遺伝子の塩基対230乃至300を標的配列とした。オリゴヌクレオチドは、STX2 230-300F:5’- GCUGUGGAUAUACGAGGGCUUGAUGUCUAUCAGGCGCGUUUUGACCAUCUUCGUCUGAUUAUUGAGCAAAA-3’及びSTX2 230-300R:5’- UUUUGCUCAAUAAUCAGACGAAGAUGGUCAAAACGCGCCUGAUAGACAUCAAGCCCUCGUAUAUCCACAGC-3’であり、チミンは、デオキシウラシル(dU)により置換されている。捕捉用オリゴヌクレオチドは、従来のDNAオリゴヌクレオチドSTX2-A003C:5’- CGTTTTGACCATCTTCGTCTGATTAA-HEX-CX-NH2 -3’又はpara-TINAオリゴヌクレオチドSTX2-A004C:5’-CGTTTTGXCCXTCTTCGTCTGXTTAA-HEX-CX-NH2 -3’とした。HEGは、ヘキサエチレングリコールスペーサであり、CX-NH2は、アミノ修飾したシクロヘキサンスペーサであり、Xは、para-TINAである。検出は、従来のDNAオリゴヌクレオチドSTX2-A001B:bio-GGGCTTGATGTCTATCAGGC-3’又はpara-TINAオリゴヌクレオチドSTX2-A002B:bio-GGGCTTGXTGTCTXTCXGGC-3’を用いて行った。Bio-は、C6-ビオチンスペーサであり、Xは、para-TINAである。
【０３１５】
dsDNAの前培養及びUNG処理
【０３１６】
dsDNAを形成するため、1.00pmolのSTX2 230-300Rを1.60pmolのSTX2 230-300Fと、20mM Tris-HCl(pH 8.2、25℃)、10mM NaCl、1mM EDTA中において混合し、95℃まで5分間加熱した。再アニーリングを、60℃で15分間、その後15分間、25℃で行った。該当する場合には、1単位のウラシル-DNAグリコシラーゼを添加し、37℃で1時間培養した。UNG処理したdsDNAは、20mM Tris-HCl(pH 8.2、25℃)、10mM NaCl、及び1mM EDTA中において、1.0*10^-12 mol/ウェルから1.0*10^-18 mol/ウェルまで10倍希釈単位で希釈した。
【０３１７】
オリゴヌクレオチドのLuminex MagPlexTMミクロスフェアとの結合
【０３１８】
従来のDNA捕捉オリゴヌクレオチド(STX2-A003C)をMagPlexTM-C磁性カルボキシル化ミクロスフェアと、Luminex社の推奨にしたがって結合させた。つまり、2.5×106のミクロスフェアを0.1M MES(pH 4.5)において活性化し、0.2nmoleのオリゴヌクレオチド及び25μgのEDCを添加した。結合反応のため、30分間暗所で培養し、25μgのEDCを添加して、再度30分間培養した。1.0 mLの0.02％ Tween-20を添加し、上清を除去する前に、DynaMagTM-2 Magnetic Particle Concentrator(Invitrogen、タストルプ、デンマーク)において1分間、磁気分離を行った。1 mLの0.1％ SDSを添加し、ボルテックスした後、磁気分離を行い、100μLのTris-EDTA緩衝液(pH  8.0)に再懸濁させ、冷蔵庫で保存した。
【０３１９】
para-TINA修飾オリゴヌクレオチド(STX2-A004C)は、新たな独自のカルボジイミド/スルホ-NHS結合手順を用いて結合させた。2.5×106のマイクロスフェアを低保持量の微量遠心管(Axygen、ユニオンシティ、CA、米国)に移した。マイクロスフェアを100μLの0.1M MES(pH 6.0)において洗浄及び活性化後、35μL緩衝液に再懸濁させた。125μgのスルホ-NHSを添加した後、625μgのEDCを添加した。マイクロスフェアを暗所で15分間培養し、625μgのEDCを添加後、更に15分間培養した。活性化緩衝液を除去し、97μLの0.1Mリン酸緩衝液(pH 7.2)を添加後、0.3nmolのオリゴヌクレオチドを添加した。マイクロスフェアは、Thermo-shaker TS-100(BioSan、リガ、ラトビア)において、900rpmで2時間、室温で培養した。培養は、振盪せずに一晩継続した(任意)。マイクロスフェアを100μLの0.1Mリン酸緩衝液(pH 7.2)において一度洗浄した後、50mMエタノールアミンを含む0.1Mリン酸緩衝液(pH 7.2)においてブロッキングし、Thermo-shaker TS-100において、900rpmで、15分間室温で培養した。マイクロスフェアを分離し、100μL Tris-EDTA緩衝液(pH 8.0)に再懸濁し、5℃で保存した。全ての分離ステップは、微量遠心管を磁気分離機内に1分間配置することで行い、遠心管は、各緩衝液又は試薬の添加後、低速で20秒間ボルテックスした
【０３２０】
カルボジイミド及びカルボジイミド/スルホ-NHS結合手順の両方で等しい結合効率を確保するため、para-TINAを含む又は含まないビオチン化オリゴヌクレオチドを、各結合プロトコルに含めた。結合効率は、0.2μLのマイクロスフェアを、0.5μgのStreptavidin-R-PhycoErythrin Prem. Grad(S-21388、Invitrogen A/S、タストルプ、デンマーク)により、10μgのAlbumin fraction V(Merck & Co Inc.)、0.03％ Triton X-100、及び200mM NaClを含む10mMリン酸緩衝液(pH 6.4)と共に培養することで評価した。反応混合物は、iEMS(登録商標) Incubator/Shaker HT (Thermo Fisher Scientific)において、900rpmで15分間、25℃で培養した。200mM NaCl及び0.03％ Triton X-100を含む10mMリン酸緩衝液(pH 6.4)により3回洗浄後、Luminex(登録商標)200TM装置において350個のマイクロスフェアを計数した。両方の手順を用いて同様の結合効率が認められた。
【０３２１】
UNG処理dsDNAのLuminexによる検出
【０３２２】
0.2μLのSTX2-A003C又はSTX2-A004Cビーズを、円錐底の96MicroWellTMプレート(NUNC、Thermo Fisher Scientific、ロスキレ、デンマーク)において、検出用オリゴとしての1.0pmol/ウェルのSTX2-A001B又はSTX2-A002Bと、100mM NaCl、0.1mM EDTA、及び0.03％ Triton X-100を含む50mM NaH2PO4/Na2HPO4(pH 7.0)中において混合し、UNG又は非UNG処理dsDNAを1.0*10^-12mol/ウェル乃至1.0*10^-18 mol/ウェルの10倍希単位で添加した。混合物は、iEMS(登録商標) Incubator/Shaker HT(Thermo Fisher Scientific)において、69℃で10分間、900rpmで、その後、35℃で15分間、900rpmで培養した。培養後、プレートを96ウェル磁気分離器(PerkinElmer、Skovlunde、デンマーク)に配置して、上清を除去した後、25mM NaCl、25μM EDTA、及び0.03％ Triton X-100を含むpH 7.0の12.5mM NaH2PO4/Na2HPO4を添加することにより3回洗浄した。各ウェルに0.5μgのStreptavidin-R-PhycoErythrin Prem. Grad(S-21388、Invitrogen A/S、タストルプ、デンマーク)を、100mM NaCl、0.1mM EDTA、及び0.03％ Triton X-100を含む50mM NaH2PO4/Na2HPO4(pH 7.0)中の10μgのAlbumin fraction V(Merck & Co Inc.)と共に追加した。プレートを、iEMS(登録商標) Incubator/Shaker HTにおいて、15分間、35℃、900rpmで培養した。培養後、プレートを以前に説明したように3回洗浄した。25mM NaCl、25μM EDTA、及び0.03％ Triton X-100を含むpH 7.0の12.5mM NaH2PO4/Na2HPO4を添加し、プレートを30分、35℃で培養後、Luminex200TM装置により解析し、各マイクロスフェアセットにおいて150個を計数した。35℃の最終ステップは、不均一なサイズのマイクロスフェアの沈降によるLuminex解析全体でのバックグラウンド蛍光の減少を回避するために必要となる(Hanley BP, Xing L, Cheng RH (2007) Variance in multiplex suspension array assays: microsphere size variation impact. Theor Biol Med Model 4:31)。
【０３２３】
表4及び図8では、非UNG及びUNG処理dsDNAからのLuminexの測定値を両方において比較している。UNG処理しない従来のDNAオリゴヌクレオチド(表4第1及び第2列)では、dsDNAの濃度を高めることでMFIの増加が見られ、これは69℃の培養温度でdsDNAの僅かな部分しか変性しないためである。この信号の増加は、UNG処理により取り除かれており(表4第3及び第4列)、デオキシウラシル塩基がdsDNAから切断され、従来のオリゴヌクレオチドがストリンジェントな緩衝液条件でアニーリングできない脱塩基部位が残されたことを示している。para-TINA含有オリゴヌクレオチドでは、UNG処理していないdsDNAでは信号が観測されず(表4第5及び第6列)、これはpara-TINAがデオキシウラシル塩基の正反対に配置されていることから予期されるものである。UNG処理後、para-TINA含有オリゴヌクレオチドではMFIの直線的な濃度依存性の増加が観測され(表4第7及び第8列及び図8)、これはUNGによりデオキシウラシルが除去され、脱塩基部位が残され、dsDNA螺旋のアニーリング温度が低下することから予期されるものである。
【０３２４】
【表４−１】
2013544507.tif 000052
【０３２５】
結論として、デオキシウラシル塩基をdsDNAから切断し、不安定化されたdsDNAを残すことが可能であり、不安定化されたdsDNAは、変性後に、アデニン塩基がpara-TINAにより置換されたオリゴヌクレオチドとのアニーリングに使用し、DNA鎖とのアニーリングにおいてインターカレータを特定の塩基にすることができることが明らかとなった。
【０３２６】
非修飾標的配列に対向して配置された場合のプローブ内の核酸塩基ミスマッチ及び脱塩基部位の融解温度(Tm)に対する影響、及びオリゴヌクレオチド標的配列において脱塩基部位に対向して配置された場合のプローブ内の核酸塩基ミスマッチ、脱塩基部位、及びortho-TINA分子の影響
【０３２７】
LightCycler(登録商標)2.0上の蛍光共鳴エネルギ移動(FRET)システムを用いて、プローブ内の核酸塩基ミスマッチ又は脱塩基部位(B)により生じる融解温度(Tm)の変化を評価した。同様に、脱塩基部位を有する標的オリゴヌクレオチドを、脱塩基部位、ortho-TINA分子、又は天然DNAヌクレオチドを含む相補的プローブとのハイブリダイゼーションにおいて評価した。
【０３２８】
オリゴヌクレオチドは、Eurofins(エーバースベルク、ドイツ)から0.2μmol合成スケールで購入した。オリゴヌクレオチドは、ABI-3900において合成され、逆相高速液体クロマトグラフィ(RP-HPLC)精製及び質量分析による最終品質制御を施した後、凍結乾燥した。オリゴヌクレオチドをストック濃度100μMで再蒸留水に再溶解し、使用前に5℃で一晩置いた。オリゴヌクレオチドを3’amino-modifier-C7に合成し、その後ATTO647N NHSエステル又は5’-amino-modifier-C6に結合させ、その後ATTO488 NHSエステルに結合させた。ATTO488/ATTO647NのFRETペアを、470nmでLightCycler(登録商標)2.0(Roche Applied Science、バーゼル、スイス)において励起し、蛍光発光を670nmで検出した。
【０３２９】
融解曲線の実験は、LightCycler(登録商標)2.0において、20μL LightCyclerキャピラリを用いて実施した。オリゴヌクレオチド各1.0μMを、pH 7.0のリン酸ナトリウム緩衝液(50mM NaH2PO4/Na2HPO4、100mM NaCl、及び0.1mM EDTA)に混合した。Tmの測定は、(i)傾斜率0.2℃/秒で37℃から95℃とし、95℃で5分間保持する解離ステップと、(ii)傾斜率0.05℃/秒で95℃から37℃とし、継続的に蛍光を測定するアニーリングと、(iii)37℃での5分間の保持と、(iv)傾斜率0.05℃/秒で37℃から95℃とし、継続的に蛍光を測定する変性とによる標準プログラムを用いて実施した。アニーリング及び変性曲線の両方の蛍光データをTmの判定に用いており、ヒステリシスは観測されなかった。Tmは、古典的なTm判定方法により、開始蛍光平坦域と、終了蛍光平坦域とを特定することにより特定した。Tmは、これら2つの平坦域間の中間蛍光として判定した。全ての融解曲線の判定は、単一のキャピラリによる測定として実施した。Tmの判定前に、各測定では、実験に使用した緩衝液のフルオロフォアのバックグラウンド蛍光を減算することにより色補正を行った。
【０３３０】
結果を表4乃至13に示す。
【０３３１】
表4乃至8は、プローブ配列内の1乃至3個の核酸塩基ミスマッチ又は脱塩基部位のTmに対する影響を示す。一般に、中心の核酸塩基ミスマッチは、オリゴヌクレオチドの末端側の核酸塩基ミスマッチと比較して、Tmをより大きく低下させることが観測される。同様に、二重鎖のオリゴヌクレオチドの長さを30から18ヌクレオチドに減少させると二重鎖のTmは低下するが、核酸塩基ミスマッチによるTmの変化は増加するため、ミスマッチ、オリゴ長、及びΔTmの従来の法則が守られる。あらゆる場合において、プローブの脱塩基部位は、核酸塩基ミスマッチよりも実質的に大きくTmを低下させる。
【０３３２】
単一の核酸塩基ミスマッチを有する30-merの二重鎖プローブでは、一致するオリゴヌクレオチドのTmと比較して、平均Tmは、5.9℃低下した(2.8℃乃至7.8℃の範囲)。脱塩基部位によるTmの低下の平均は、9.6℃(8.3℃乃至11.9℃の範囲)であり、即ち、単一の核酸塩基ミスマッチと比較して、脱塩基部位では63％の低下が追加された(データの一部は表4及び5に記載)。同様に、22-merの二重鎖では、単一の核酸塩基ミスマッチによるTmの低下の平均は、8.5℃(4.3℃乃至13.0℃の範囲)であるのに対し、脱塩基部位では12.9℃(12.8℃乃至12.9℃の範囲)であり、即ち、単一の核酸塩基ミスマッチの代わりとして、脱塩基部位により52％の低下が追加された。
【０３３３】
【表４−２】
2013544507.tif 000053
【０３３４】
【表５】
2013544507.tif 000054
【０３３５】
表4及び表5.長さ18乃至30ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドについて判定した単一の核酸塩基ミスマッチ又は脱塩基部位によるTmへの影響
【０３３６】
2つの核酸塩基ミスマッチを有する30-merの二重鎖プローブでは、一致するオリゴヌクレオチドプローブのTmと比較して、平均Tmは、13.2℃低下した(10.5℃乃至16.5℃の範囲)。2つの脱塩基部位によるTmの低下の平均は、21.6℃(19.3℃乃至23.6℃の範囲)であり、即ち、2つの核酸塩基ミスマッチと比較して、2つの脱塩基部位では64％の低下が追加された(データの一部は表6及び7に記載)。同様に、22-merの二重鎖プローブでは、2つの核酸塩基ミスマッチによるTmの低下の平均は、18.2℃(13.4℃乃至25.3℃の範囲)であるのに対し、2つの脱塩基部位では20.9℃を超えた(19.9℃からLightCycler 2.0でのTm判定限界を超える範囲)。
【０３３７】
【表６】
2013544507.tif 000055
【０３３８】
【表７】
2013544507.tif 000056
【０３３９】
表6及び表7.長さ22乃至30ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドについて判定した2つの核酸塩基ミスマッチ又は2つの脱塩基部位によるTmへの影響
【０３４０】
3つの核酸塩基ミスマッチを有する30-merの二重鎖プローブでは、一致するオリゴヌクレオチドプローブのTmと比較して、平均Tmは、21.5℃低下した(19.3℃乃至24.3℃の範囲)。3つの脱塩基部位によるTmの低下の平均は、31.4℃であり、即ち、3つの核酸塩基ミスマッチと比較して、3つの脱塩基部位では46％の低下が追加された(表8)。同様に、22-merの二重鎖プローブでは、3つの核酸塩基ミスマッチによるTmの低下の平均は、26.3℃超(25.0℃からの範囲)であるのに対し、3つの脱塩基部位では30.3℃を超えた。
【０３４１】
【表８】
2013544507.tif 000057
【０３４２】
表8.長さ22乃至30ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドについて判定した3つの核酸塩基ミスマッチ又は3つの脱塩基部位によるTmへの影響
【０３４３】
表9乃至13は、A、T、C、又はGヌクレオチド(群)、脱塩基部位(群)、又はo-TINA分子(群)が脱塩基部位(群)と相補的に配置された相補的オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションおける、オリゴヌクレオチド標的配列内の1つ乃至3つの脱塩基部位(群)の組み合わせのTmに対する影響を占めす。
【０３４４】
天然核酸塩基の1つに対向して配置された脱塩基部位を有する30-merの二重鎖標的では、一致塩基対のTmと比較して、Tmは、平均5.3℃低下した(3.7℃乃至7.2℃の範囲)。二重鎖の両方の鎖が脱塩基部位を有する場合、Tmは、平均8.8℃低下し(7.3℃乃至10.2℃の範囲)、即ち、核酸塩基に対向する脱塩基部位と比較して、66％の低下が追加された。標的内の脱塩基部位に対向して、プローブ内にortho-TINA分子を配置することにより、一致塩基対を有するオリゴヌクレオチドのTmと比較して、Tmは、平均1.6℃低下した(1.5℃乃至1.6℃)。22-merの二重鎖標的では、プローブ内の核酸塩基に対向して標的内の脱塩基部位が配置された際のTmにおける、Tmの低下の平均は、5.8℃となった(2.3℃乃至9.2℃の範囲)。プローブ内の脱塩基部位に対向して、標的内の脱塩基部位が配置された場合、Tmの低下は、平均9.4℃(5.8℃乃至12.9℃の範囲)であり、即ち、核酸塩基に対向する脱塩基部位と比較して、62％の低下が追加された。22-merの二重鎖標的内の脱塩基部位に対向して、プローブ内でortho-TINA分子を配置することにより、Tmは、一致塩基対を有する二重鎖でのTmと比較して、平均1.6℃低下した(3.6℃からTmの0.4℃の上昇の範囲)(データを表9及び10に記載)。
【０３４５】
【表９ａ】
2013544507.tif 000058
【０３４６】
【表９ｂ】
2013544507.tif 000059
【０３４７】
【表１０ａ】
2013544507.tif 000060
【０３４８】
【表１０ｂ】
2013544507.tif 000061
【０３４９】
表9(表9=表9a+表9b)及び表10(表10=表10a+表10b).プローブ内の核酸塩基ミスマッチ、他の脱塩基部位、又はortho-TINA分子に対向して配置された標的内の単一の脱塩基部位によるTmへの影響
【０３５０】
プローブ内の2個の核酸塩基に対向して配置された2つの脱塩基部位を有する30-merの二重鎖標的では、一致塩基対を有する二重鎖のTmと比較して、Tmは、平均13.5℃低下した(10.8℃乃至17.2℃の範囲)。二重鎖の両方の鎖が2つの脱塩基部位を有する場合、Tmは、平均17.7℃低下し(15.4℃乃至20.6℃の範囲)、即ち、核酸塩基に対向する2つの脱塩基部位と比較して、31％の低下が追加された。標的内の脱塩基部位に対向して、プローブ内に2つのortho-TINA分子を配置することにより、一致塩基対を有するオリゴヌクレオチドのTmと比較して、Tmは、平均4.5℃低下した(3.3℃乃至6.4℃)。22-merの二重鎖標的では、プローブ内の核酸塩基に対向して2つの脱塩基部位が配置された際のTmにおける、Tmの低下の平均は、15.9℃となった(11.2℃乃至21.5℃の範囲)。標的内の脱塩基部位に対向して、プローブ内の2つの脱塩基部位が配置された場合、Tmの低下は、平均19.6℃(16.9℃乃至23.2℃の範囲)であり、即ち、核酸塩基に対向する2つの脱塩基部位と比較して、23％の低下が追加された。22-merの二重鎖標的内の脱塩基部位に対向して、プローブ内で2個のortho-TINA分子を配置することにより、Tmは、一致塩基対を有する二重鎖でのTmと比較して、平均5.8℃低下した(3.3℃乃至7.2℃の範囲)(データを表11及び12に記載)。
【０３５１】
【表１１ａ】
2013544507.tif 000062
【０３５２】
【表１１ｂ】
2013544507.tif 000063
【０３５３】
【表１２ａ】
2013544507.tif 000064
【０３５４】
【表１２ｂ】
2013544507.tif 000065
【０３５５】
表11(表11=表11a+表11b)及び表12(表12=表12a+表12b).プローブ内の核酸塩基ミスマッチ、他の脱塩基部位、又はortho-TINA分子に対向して配置された標的内の2つの脱塩基部位によるTmへの影響
【０３５６】
プローブ内の3個の核酸塩基に対向して配置された3つの脱塩基部位を有する30-merの二重鎖標的では、一致塩基対を有する二重鎖のTmと比較して、Tmは、平均22.7℃低下した(21.4℃乃至24.3℃の範囲)。二重鎖の両方の鎖が3つの脱塩基部位を有する場合、Tmは、27.4℃低下し、即ち、核酸塩基に対向する3つの脱塩基部位と比較して、21％の低下が追加された。標的内の脱塩基部位に対向して、プローブ内に3つのortho-TINA分子を配置することにより、一致塩基対を有するオリゴヌクレオチドのTmと比較して、Tmは、8.5℃低下した。22-merの二重鎖標的では、プローブ内の核酸塩基に対向して3つの脱塩基部位が配置された際のTmにおける、Tmの低下の平均は、27.9℃となった(26.2℃乃至29.2℃の範囲)。標的内の脱塩基部位に対向して、プローブ内の3つの脱塩基部位が配置された場合、Tmの低下は、30.3℃を超えた(正確な判定はLightCycler 2.0により制限された)。22-merの二重鎖標的内の脱塩基部位に対向して、プローブ内で3個のortho-TINA分子を配置することにより、Tmは、一致塩基対を有する二重鎖でのTmと比較して、11.8℃低下した(データを表13に記載)。
【０３５７】
【表１３】
2013544507.tif 000066
【０３５８】
表13.プローブ内の核酸塩基ミスマッチ、他の脱塩基部位、又はortho-TINA分子に対向して配置された標的内の3つの脱塩基部位によるTmへの影響
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０３５９】
参考文献
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[8]Nucleic acids Research, vol. 18, No. 13 1990, pp. 3841-3845.
[9]EMBO Journal vol. 15 no. 13 pp. 3442-3447, 1996. Kavli et al.
【図１】
2013544507.tif 000067
【図２】
2013544507.tif 000068
【図３】
2013544507.tif 000069
【図４】
2013544507.tif 000070
【図５】
2013544507.tif 000071
【図６】
2013544507.tif 000072
【図７】
2013544507.tif 000073
【図８】
2013544507.tif 000074
【配列表】
2013544507000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年7月4日(2013.7.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物材料から取得した試料から標的ポリヌクレオチドを捕捉する、以下のステップを含む方法:
(i) 二本鎖標的ポリヌクレオチドを提供するステップ;
(ii) 核酸塩基A、T、U、C、又はG、5-ヒドロキシメチル-dC、5-メチルシトシン(m5C)、プソイドウリジン(Ψ)、ジヒドロウリジン(D)、イノシン(I)、7-メチルグアノシン(m7G)、ヒポキサンチン、キサンチン、及びその2’-O-メチル誘導体及び/又はN-メチル誘導体などの1つ又は複数の塩基を、前記標的ポリヌクレオチドから除去して、1つ又は複数の脱塩基部位を生成することにより、前記二本鎖標的ポリヌクレオチドを不安定化させるステップ;
(iii) 前記不安定化した二本鎖標的ポリヌクレオチドを変性させ、一本鎖標的ポリヌクレオチドを生成するステップ;及び
(iv) 15から35ヌクレオチドの長さを有する相補的オリゴヌクレオチドプローブを用いて前記一本鎖標的ポリヌクレオチドを捕捉するステップ、ここで、前記相補的オリゴヌクレオチドプローブは前記オリゴヌクレオチドプローブの骨格構造に挿入された1個又は複数のインターカレータ分子を含み、当該1個又は複数のインターカレータ分子は相補的ポリヌクレオチド標的配列の1つ又は複数の脱塩基部位に形態学的に入り込む。
【請求項２】
前記相補的オリゴヌクレオチドプローブは、自然発生ヌクレオチド及び/又は自然発生が知られていないヌクレオチド、例えば、RNA、α-L-RNA、β-D-RNA、2’-R-RNA、DNA、LNA、PNA、PMO、TNA、GNA、オリゴヌクレオチドN3’→P5’ホスホルアミダート、BNA、α-L-LNA、HNA、MNA、ANA、CAN、INA、CeNA、(2’-NH)-TNA、(3’-NH)-TNA、α-L-リボ-LNA、α-L-キシロ-LNA、β-D-リボ-LNA、β-D-キシロ-LNA、[3.2.1]-LNA、ビシクロ-DNA、6-アミノ-ビシクロ-DNA、5-エピ-ビシクロ-DNA、α-ビシクロ-DNA、トリシクロ-DNA、ビシクロ[4.3.0]-DNA、ビシクロ[3.2.1]-DNA、ビシクロ[4.3.0]アミド-DNA、β-D-リボピラノシル-NA、α-L-リキソピラノシル-NA、2’-OR-RNA、2’-AE-RNA、及びそれらの組み合わせ及び修飾物から成る群から選択されたヌクレオチドを含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
更に、未結合ヌクレオチド材料を除去するために、1回又は複数回の洗浄ステップを含む、請求項1又は2記載の方法。
【請求項４】
前記1つ又は複数の脱塩基部位が、2つ又はそれ以上の脱塩基部位、例えば、3つ又はそれ以上の脱塩基部位である、請求項1乃至3の何れかに記載の方法。
【請求項５】
更に、前記二本鎖標的ポリヌクレオチド内の1つ又は複数の種類の塩基を、別の化学成分に変換することを含む、請求項1乃至4の何れかに記載の方法。
【請求項６】
更に、前記二本鎖標的ポリヌクレオチドから1つ又は複数の化学成分を除去して、前記二本鎖標的ポリヌクレオチドを不安定化することを含む、請求項5記載の方法。
【請求項７】
更に、前記標的ポリヌクレオチド内の1個又は複数のCを1個又は複数のUに変換することを含む、請求項1乃至6の何れかに記載の方法。
【請求項８】
前記標的ポリヌクレオチド内の1個又は複数のCから1個又は複数のUへの前記変換は、重亜硫酸塩処理により行われる、請求項7記載の方法。
【請求項９】
前記二本鎖標的ポリヌクレオチド及び/又は一本鎖ポリヌクレオチドから、Aを除去する、請求項1乃至8の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
前記二本鎖標的ポリヌクレオチド及び/又は一本鎖ポリヌクレオチドから、Tを除去する、請求項1乃至9の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
前記二本鎖標的ポリヌクレオチド及び/又は一本鎖ポリヌクレオチドから、Cを除去する、請求項1乃至10の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
前記二本鎖標的ポリヌクレオチド及び/又は一本鎖ポリヌクレオチドから、Gを除去する、請求項1乃至11の何れかに記載の方法。
【請求項１３】
前記二本鎖標的ポリヌクレオチド及び/又は一本鎖ポリヌクレオチドから、Uを除去する、請求項1乃至12の何れかに記載の方法。
【請求項１４】
前記除去は、1つ又は複数の酵素及び/又は物理的応力及び/又は温度変化により行われる、請求項9乃至13の何れかに記載の方法。
【請求項１５】
Uの前記除去は、ウラシルデヒドロゲナーゼを用いて行われる、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
Aの前記除去は、pHの調節により行われる、請求項9記載の方法。
【請求項１７】
前記標的ポリヌクレオチドから、1、2、又は3種類の前記塩基を除去する、請求項1乃至16の何れかに記載の方法。
【請求項１８】
前記標的ポリヌクレオチドから除去する塩基の総数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、及び21個以上から成る群から選択することができる、請求項1乃至17の何れかに記載の方法。
【請求項１９】
インターカレータ分子の総数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、及び21個以上から成る群から選択することができる、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
前記標的DNA及び/又はRNA内の脱塩基部位の10％乃至100％、例として10％乃至20％、例えば20％乃至30％、例として30％乃至40％、例えば40％乃至50％、例として50％乃至60％、例えば60％乃至70％、例として70％乃至80％、例えば80％乃至90％、例として90％乃至100％、又はそれらの任意の組み合わせにおいて、インターカレータ分子が挿入された状態となる、請求項1乃至19の何れかに記載の方法。
【請求項２１】
前記標的DNA及び/又はRNA内の脱塩基部位の10％超、例として20％超、例えば30％超、例として40％超、例えば50％超、例として60％超、例えば70％超、例として80％超、例えば90％超、例として95％超、例えば100％において、インターカレータ分子が挿入された状態となる、請求項1乃至20の何れかに記載の方法。
【請求項２２】
前記インターカレータ分子の挿入により、前記標的ポリヌクレオチドと前記相補的プローブとから成るポリヌクレオチド二重鎖の融解温度が上昇する、請求項20及び21記載の方法。
【請求項２３】
前記相補的プローブ内のインターカレータ分子の数と塩基の総数との間の比は1:50乃至1:2、例として1:50乃至1:40、例えば1:40乃至1:30、例として1:30乃至1:20、例えば1:20乃至1:10、例として1:10乃至1:5、例えば1:5乃至1:2、又はこれらの間隔の任意の組み合わせとなる、請求項1乃至22の何れかに記載の方法。
【請求項２４】
前記1つ又は複数のインターカレータ分子は、TINA、INA、ortho-TINA、para-TINA、及びAMANYから成る群から選択することができる、請求項1乃至23の何れかに記載の方法。
【請求項２５】
前記インターカレータ分子の大きさは、20乃至400Å、例として20乃至40Å、例えば40乃至60Å、例として60乃至80Å、例えば80乃至100Å、例として100乃至120Å、例えば120乃至140Å、例として140乃至160Å、例えば160乃至180Å、例として180乃至200Å、例えば200乃至220Å、例として220乃至240Å、例えば240乃至260Å、例として260乃至280Å、例えば280乃至300Å、例として300乃至320Å、例えば320乃至340Å、例として340乃至360Å、例えば360乃至380Å、例として380乃至400Å、又はこれらの間隔の任意の組み合わせである、請求項1乃至24の何れかに記載の方法。
【請求項２６】
前記相補的プローブは、2種類以上のインターカレータ分子、例として2種類、3種類、4種類、5種類、又は5種類以上の異なるインターカレータ分子を含む、請求項1乃至25の何れかに記載の方法。
【請求項２７】
前記相補的プローブは、支持体に結合させる、請求項1乃至26の何れかに記載の方法。
【請求項２８】
前記支持体は、ポリ(エーテルエーテルケトン)(PEEK)、PP(ポロプロピレン)、PE(ポリエチレン)、ポリ(エチレンテレフタレート)(PET)、ポリ(ビニルクロライド)(PVC)、ポリアミド/ナイロン(PA)、ポリカーボネート(PC)、環状オレフィン共重合体(COC)、濾紙、綿、セルロース、ポリ(4-ビニルベンジルクロライド)(PVBC)、ポリ(ビニリデンフルオライド)(PVDF)、ポリスチレン(PS)、Toyopearl(登録商標)、ヒドロゲル、ポリイミド(PI)、1,2-ポリブタジエン(PB)、LSR(液状シリコーンゴム)、ポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS)、フッ素重合体及び共重合体(例えばポリ(テトラフルオロエチレン)(PTFE)、ペルフルオロエチレンプロピレンコポリマ(FEP)、エチレンテトラフルオロエチレン(ETFE))、ポリ(メチルメタクリレート)(PMMA)ナノ多孔性材料、膜、メソ構造セル状フォーム(MCF)、及び単層又は多層カーボンナノチューブ(SWCNT、MWCNT)、粒状物質、ビーズ、磁性ビーズ、非磁性ビーズ、ポリスチレンビーズ、磁性ポリスチレンビーズ、セファロースビーズ、セファクリルビーズ、ポリスチレンビーズ、アガロースビーズ、多糖類ビーズ、及びポリカーバメートビーズから成る群から選択される、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
前記支持体は、固体支持体である、請求項27記載の方法。
【請求項３０】
前記固体支持体は、マイクロタイタープレート又は他のプレート形式、試薬チューブ、スライドガラス或いはアレイ又はマイクロアレイ解析に用いられる他の支持体、マイクロ流体チャンバ又はデバイスのチューブ又は導管類、及びBiacoreチップから成る群から選択することができる、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
更に、1つ又は複数の標識を含む相補的検出プローブの使用を含む、請求項1乃至30の何れかに記載の方法。
【請求項３２】
前記相補的プローブは、1つ又は複数の標識を含む、請求項1乃至31の何れかに記載の方法。
【請求項３３】
前記1つ又は複数の標識は、ビオチン、蛍光標識、5(及び6)-カルボキシフルオレセイン、5-又は6-カルボキシフルオレセイン、6-(フルオレセイン)-5(及び6)-カルボキシアミドヘキサン酸、フルオレセインイソチオシアナート(FITC)、ローダミン、テトラメチルローダミン、染料、Cy2、Cy3、及びCy5、PerCP、フィコビリ蛋白質、R-フィコエリトリン(RPE)、アロフィコエリトリン(APC)、テキサスレッド、プリンストンレッド、緑色蛍光タンパク質(GFP)及びその類似体、R-フィコエリトリン又はアロフィコエリトリンのコンジュゲート、半導体ナノ結晶(量子ドット及びQdotTMナノ結晶等)に基づく無機蛍光標識、Eu3+及びSm3+等のランタニドに基づく時間分解蛍光標識、ハプテン、DNP、ジゴキシゲニン、酵素標識、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ(AP)、ベータガラクトシダーゼ(GAL)、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、β-N-アセチルグルコサミニダーゼ、β-グルクロニダーゼ、インベルターゼ、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ及びグルコースオキシダーゼ(GO)、発光標識、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、1,2-ジオキセタン、ピリドピリダジン、放射能標識、ヨウ化物の同位体、コバルトの同位体、セレンの同位体、トリチウムの同位体、及びリンの同位体から成る群から選択することができる、請求項31乃至32記載の方法。
【請求項３４】
前記ビオチンは、ストレプトアビジン-R-フィコエリトリンを用いて検出される、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
更に、前記検出プローブの添加前及び/又は添加後に洗浄ステップを含む、請求項31記載の方法。
【請求項３６】
相補的検出プローブは、1個又は複数のインターカレータ分子を含む、請求項32乃至35の何れかに記載の方法。
【請求項３７】
インターカレータ分子の総数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、及び21個以上の異なる又は同一のインターカレータ分子から成る群から選択することができる、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
前記標的ポリヌクレオチドは、人間、動物、バクテリア、ウイルス、菌類、原虫、及び/又は植物に由来する、請求項1乃至37の何れかに記載の方法。
【請求項３９】
前記標的ポリヌクレオチドは、人体又は動物体からの試料から単離される、請求項1乃至38の何れかに記載の方法。
【請求項４０】
前記標的ポリヌクレオチドは、人間、動物、鳥、昆虫、植物、藻類、菌類、酵母、ウイルス、バクテリア及びファージ、多細胞及び単細胞生物から単離される、請求項1乃至39の何れかに記載の方法。
【請求項４１】
前記標的ポリヌクレオチドは、糞便、血液、精液、脳脊髄液、痰、膣液、尿、唾液、毛髪、他の体液、組織試料、全臓器、汗、涙、皮膚細胞、毛髪、骨、歯、或いは私物(例えば、歯ブラシ、剃刀等)又は試料(例えば、精子又は生検の組織又は液体)からの適切な液体又は組織、或いはヒト又は動物の他の部分構造から単離される、請求項1乃至40の何れかに記載の方法。
【請求項４２】
捕捉される異なる標的ポリヌクレオチド配列の総数は、1、2乃至5、5乃至10、10乃至15、15乃至20、20乃至25、25乃至30、30乃至35、35乃至40、40乃至45、45乃至50、50乃至55、55乃至60、60乃至65、65乃至70、70乃至75、75乃至80、80乃至85、85乃至90、95乃至100、100乃至150、150乃至200、200乃至300、300乃至500、500乃至1000、及び1000種以上、又はこれらの間隔の任意の組み合わせから成る群から選択することができる、請求項1乃至41の何れかに記載の方法。
【請求項４３】
遺伝子疾患を診断するための請求項1乃至42のいずれかに記載の方法:ここで、当該遺伝的疾患は標的ポリヌクレオチドに関連するものである。
【請求項４４】
前記標的ポリヌクレオチドがバクテリア、ウイルス、菌類、原虫、及び/又は植物から取得したものである、請求項1乃至42の何れかに記載の方法。
【請求項４５】
診断対象となる前記疾病は、CADASIL症候群、後期発症型多発性カルボキシラーゼ欠損症、家族性小脳網膜血管腫症、線維性狭窄型クローン病、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ欠乏症、ファブリ病、遺伝性コプロポルフィリン症、色素失調症、小頭症、腎嚢胞、PHF8遺伝子における突然変異により生じるSiderius型X連鎖性精神遅滞症候群、及び軟骨発育不全症から成る群から選択された1つ又は複数の疾病である、請求項43記載の方法。
【請求項４６】
診断対象となる前記疾病は、癌である、請求項43記載の方法。
【請求項４７】
前記癌は、101F6、ABR、ADPRTL3、ANP32C、ANP32D、APC2、APC、ARF、ARHGAP8、ARHI、AT1G14320、ATM、ATP8A2、AXUD1、BAP1、BECN1、BIN1、BRCA1、BRCA2、BTG1、BTG2、C1orf11、C5orf4、C5orf7、Cables、CACNA2D2、CAP-1、CARS、CAV1、CD81、CDC23、CDK2AP1、CDKN1A、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2X、Ciao1-pending、CLCA2、CREBL2、CTNNA1、CUL2、CW17R、DAB2、DAF-18、D-APC、DBC2、DCC、DDX26、DEC1、DLC1、DLEC1、DLEU1、DLEU2、DLG1、DLGH1、DLGH3、DMBT1、DNAJA3、DOC-1、DPC4、DPH2L、EGR1、FABP3、FAT、FGL1、FHIT、FLJ10506、FOXD1、FOXP1、FT、FUS1、FUS2、GAK、GAS1、GAS11、GLD-1、GLTSCR1、GLTSCR2、GRC5、GRLF1、HDAC3、HEMK、HIC1、HRG22、HSAL2、HTS1、HYAL1、HYAL2、IFGBP7、IGSF4、ING1、ING1L、ING4、I(2)tid、I(3)mbn、I(3)mbt、LAPSER1、LATS1、LATS2、LDOC1、LOH11CR2A、LRP1B、LUCA3、MAD、MAP2K4、MAPKAPK3、MCC、MDC、MEN1、ML-1、MLH1、MRVI1、MTAP、MXI1、NAP1L4、NBR2、NF1、NF2、NORE1、NPR2L、NtRb1、OVCA2、PDGFRL、PHEMX、pHyde、PIG8、PIK3CG、PINX1、PLAGL1、PRDM2、PTCH、PTEN、PTPNI3、PTPRG、RASSF1、RB1、RBBP7、RBX1、RBM6、RECK、RFP2、RIS1、RPL10、RPS29、RRM1、S100A2、SEMA3B、SF1、SFRP1、SLC22A1L、SLC26A3、SMARCA4、ST7、ST7L、ST13、ST14、STIM1、TCEB2、THW、TIMP3、TP53、TP63、TRIM8、TSC2、TSG101、TSSC1、TSSC3、TSSC4、VHL、Vhlh、WFDC1、WIT-1、WT1、及びWWOXから成る群内のタンパク質をコードする1つ又は複数の遺伝子における1つ又は複数の突然変異を特徴とする、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
前記癌は、α-アクチニン-4、ARTC1、BCR-ABL融合タンパク質(b3a2)、B-RAF、CASP-5、CASP-8、β-カテニン、Cdc27、CDK4、CDKN2A、COA-1、dek-can融合タンパク質、EFTUD2、伸長因子2、ETV6-AML1融合タンパク質、FLT3-ITD、FN1、GPNMB、LDLR-フコシルトランスフェラーゼAS融合タンパク質、HLA-A2d、HLA-A11d、hsp70-2、KIAAO205、MART2、ME1、MUM-1f、MUM-2、MUM-3、neo-PAP、ミオシンクラスI、NFYC、OGT、OS-9、P53、pml-RARα融合タンパク質、PRDX5、PTPRK、K-ras、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、SYT-SSX1又は-SSX2融合タンパク質、トリオースリン酸イソメラーゼ、BAGE-1、GAGE-1、2、8、GAGE-3、4、5、6、7、GnTVf、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-C2、ムチンk、NA-88、NY-ESO-1/LAGE-2、SAGE、Sp17、SSX-2、SSX-4、TRAG-3、及びTRP2-INT2gから成る群から選択された1つ又は複数の腫瘍抗原を特徴とする、請求項46記載の方法。
【請求項４９】
前記癌は、RASSF2及びSFRP2から成る群から選択された1つ又は複数の遺伝子における1つ又は複数の突然変異を特徴とする、請求項46記載の方法。
【請求項５０】
前記癌は、TFPI2、NDRG4、GATA4、又はGATA5から成る群から選択された1つ又は複数の遺伝子における1つ又は複数の突然変異を特徴とする、請求項46記載の方法。
【請求項５１】
前記試料は、飼料、土、食物、又は飲用水である、請求項1記載の方法。
【請求項５２】
前記標的DNAは、人間、動物、バクテリア、ウイルス、菌類、原虫、及び/又は植物に由来する、請求項1記載の方法。
【請求項５３】
前記バクテリアは、Acetobacter aurantius、アシネトバクター種:Acinetobacter baumannii、Acinetobacter calcoaceticus、Acinetobacter johnsonii、Acinetobacter junii、Acinetobacter lwoffii、Acinetobacter radioresistens、Acinetobacter septicus、Acinetobacter schindleri、Acinetobacter ursingii、アクチノマイセス種:Actinomyces bovis、Actinomyces bowdenii、Actinomyces canis、Actinomyces cardiffensis、Actinomyces catuli、Actinomyces coleocanis、Actinomyces dentalis、Actinomyces denticolens、Actinomyces europaeus、Actinomyces funkei、Actinomyces georgiae、Actinomyces gerencseriae、Actinomyces graevenitzii、Actinomyces hongkongensis、Actinomyces hordeovulneris、Actinomyces howellii、Actinomyces humiferus、Actinomyces hyovaginalis、Actinomyces israelii、Actinomyces marimammalium、Actinomyces meyeri、Actinomyces naeslundii、Actinomyces nasicola、Actinomyces neuii、Actinomyces odontolyticus、Actinomyces oricola、Actinomyces radicidentis、Actinomyces radingae、Actinomyces slackii、Actinomyces streptomycini、Actinomyces suimastitidis、Actinomyces suis、Actinomyces turicensis、Actinomyces urogenitalis、Actinomyces vaccimaxillae、Actinomyces viscosus、アクチノバチルス種:Actinobacillus actinomycetemcomitans、Actinobacillus arthritidis、Actinobacillus capsulatus、Actinobacillus delphinicola、Actinobacillus equuli、Actinobacillus hominis、Actinobacillus indolicus、Actinobacillus lignieresii、Actinobacillus minor、Actinobacillus muris、Actinobacillus pleuropneumoniae、Actinobacillus porcinus、Actinobacillus rossii、Actinobacillus scotiae、Actinobacillus seminis、Actinobacillus succinogenes、Actinobacillus suis、Actinobacillus ureae、アエロモナス種:Aeromonas allosaccharophila、Aeromonas bestiarum、Aeromonas bivalvium、Aeromonas encheleia、Aeromonas enteropelogenes、Aeromonas euchrenophila、Aeromonas hydrophila、Aeromonas ichthiosmia、Aeromonas jandaei、Aeromonas media、Aeromonas molluscorum、Aeromonas popoffii、Aeromonas punctata、Aeromonas salmonicida、Aeromonas schubertii、Aeromonas sharmana、Aeromonas simiae、Aeromonas sobria、Aeromonas veronii、Afipia felis、アグロバクテリウム種:Agrobacterium radiobacter、Agrobacterium rhizogenes、Agrobacterium rubi、Agrobacterium tumefaciens、Agromonas種、アルカリゲネス種:Alcaligenes aquatilis、Alcaligenes eutrophus、Alcaligenes faecalis、Alcaligenes latus、Alcaligenes xylosoxidans、Alishewanella種、Alterococcus種、Anaplasma phagocytophilum、Anaplasma marginale、Aquamonas種、Arcanobacterium haemolyticum、Aranicola種、Arsenophonus種、Azotivirga種、Azotobacter vinelandii、Azotobacter chroococcum、Bacillary dysentery(細菌性赤痢)、バチルス種:Bacillus abortus(Brucella melitensis biovar abortus)、Bacillus anthracis(炭疽菌)、Bacillus brevis、Bacillus cereus、Bacillus coagulans、Bacillus fusiformis、Bacillus globigii、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus mycoides、Bacillus natto、Bacillus stearothermophilus、Bacillus subtilis、Bacillus sphaericus、Bacillus thuringiensis、バクテロイデス種:Bacteroides forsythus(Tannerella forsythensis)、Bacteroides acidifaciens、Bacteroides distasonis(Parabacteroides distasonisとして再分類)、Bacteroides gingivalis、Bacteroides gracilis、Bacteroides fragilis、Bacteroides oris、Bacteroides ovatus、Bacteroides putredinis、Bacteroides pyogenes、Bacteroides stercoris、Bacteroides suis、Bacteroides tectus、Bacteroides thetaiotaomicron、Bacteroides vulgatus、バルトネラ種:Bartonella alsatica、Bartonella bacilliformis、Bartonella birtlesii、Bartonella bovis、Bartonella capreoli、Bartonella clarridgeiae、Bartonella doshiae、Bartonella elizabethae、Bartonella grahamii、Bartonella henselae(ネコ引っ掻き熱)、Bartonella koehlerae、Bartonella muris、Bartonella peromysci、Bartonella quintana、Bartonella rochalimae、Bartonella schoenbuchii、Bartonella talpae、Bartonella taylorii、Bartonella tribocorum、Bartonella vinsonii spp. Arupensis、Bartonella vinsonii spp. Berkhoffii、Bartonella vinsonii spp. Vinsonii、Bartonella washoensis、BCG(カルメット・ゲラン桿菌)、Bergeyella zoohelcum(Weeksella zoohelcum)、Bifidobacterium bifidum、ブラストバクター種、Blochmannia種、ボルデテラ種:'Bordetella ansorpii'、Bordetella avium、Bordetella bronchiseptica、Bordetella hinzii、Bordetella holmesii、Bordetella parapertussis、Bordetella pertussis(百日咳)、Bordetella petrii、Bordetella trematum、ボレリア種、Borrelia burgdorferi、Borrelia afzelii、Borrelia anserina、Borrelia garinii、Borrelia valaisiana、Borrelia hermsii、Borrelia Parkeri、Borrelia recurrentis、Bosea種、Bradyrhizobium種、Brenneria種、ブルセラ種:Brucella abortus、Brucella canis、Brucella melitensis、Brucella neotomae、Brucella ovis、Brucella suis、Brucella pinnipediae、ブフネラ種、Budvicia種、バークホルデリア種:Burkholderia cepacia(Pseudomonas cepacia)、Burkholderia mallei(Pseudomonas mallei/Actinobacillus mallei)、Burkholderia pseudomallei(Pseudomonas pseudomallei)、Buttiauxella種、Calymmatobacterium granulomatis、カンピロバクター種:Campylobacter coli、Campylobacter concisus、Campylobacter curvus、Campylobacter fetus、Campylobacter gracilis、Campylobacter helveticus、Campylobacter hominis、Campylobacter hyointestinalis、Campylobacter insulaenigrae、Campylobacter jejuni、Campylobacter lanienae、Campylobacter lari、Campylobacter mucosalis、Campylobacter rectus、Campylobacter showae、Campylobacter sputorum、Campylobacter upsaliensis、Capnocytophaga canimorsus(Dysgonic fermenter type 2)、コリネバクテリウム種、Cardiobacterium hominis、セデセア種、クラミジア種:Chlamydia trachomatis(性病性リンパ肉芽腫)、Chlamydia muridarum、Chlamydia suis、クラミドフィラ種:Chlamydophila pneumoniae、Chlamydophila psittaci(オウム病)、Chlamydophila pecorum、Chlamydophila abortus、Chlamydophila felis、Chlamydophila caviae、シトロバクター種:Citrobacter amalonaticus、Citrobacter braakii、Citrobacter farmeri、Citrobacter freundii、Citrobacter gillenii、Citrobacter intermedius、Citrobacter koseri別名Citrobacter diversus、Citrobacter murliniae、Citrobacter rodentium、Citrobacter sedlakii、Citrobacter werkmanii、Citrobacter youngae、クロストリジウム種:Clostridium botulinum、Clostridium difficile、Clostridium novyi、Clostridium septicum、Clostridium tetani(破傷風)、Clostridium welchii(ウェルシュ菌)、コリネバクテリウム種:Corynebacterium diphtheriae(ジフテリア)、Corynebacterium amycolatum、Corynebacterium aquaticum、Corynebacterium bovis、Corynebacterium equi、Corynebacterium flavescens、Corynebacterium glutamicum、Corynebacterium haemolyticum、Corynebacterium jeikeiun(JK群コリネバクテリア)、Corynebacterium minutissimum(紅色陰癬)、Corynebacterium parvum(別名Propionibacterium acnes)、Corynebacterium pseudodiptheriticum(別名Corynebacterium hofmannii)、Corynebacterium pseudotuberculosis(別名Corynebacterium ovis)、Corynebacterium pyogenes、Corynebacterium urealyticum(D2群コリネバクテリア)、Corynebacterium renale、Corynebacterium striatum、Corynebacterium tenuis(Trichomycosis palmellina、Trichomycosis axillaris)、Corynebacterium ulcerans、Corynebacterium xerosis、Coxiella burnetii(Q熱)、Cronobacter種:Cronobacter sakazakii、Cronobacter malonaticus、Cronobacter turicensis、Cronobacter muytjensii、Cronobacter dublinensis、Delftia acidovorans(Comamonas acidovorans)、Dickeya種、エドワードシエラ種、Eikenella corrodens、エンテロバクター種:Enterobacter aerogenes、Enterobacter cloacae、Enterobacter sakazakii、エンテロコッカス種:Enterococcus avium、Enterococcus durans、Enterococcus faecalis(Streptococcus faecalis/D群連鎖球菌)、Enterococcus faecium、Enterococcus solitarius、Enterococcus galllinarum、Enterococcus maloratus、Ehrlichia chaffeensis、Erysipelothrix rhusiopathiae、エルウィニア種、エシ��リキア種:Escherichia adecarboxylata、Escherichia albertii、Escherichia blattae、Escherichia coli、Escherichia fergusonii、Escherichia hermannii、Escherichia vulneris、Ewingella種、フラボバクテリウム種:Flavobacterium aquatile、Flavobacterium branchiophilum、Flavobacterium columnare、Flavobacterium flevense、Flavobacterium gondwanense、Flavobacterium hydatis、Flavobacterium johnsoniae、Flavobacterium pectinovorum、Flavobacterium psychrophilum、Flavobacterium saccharophilum、Flavobacterium salegens、Flavobacterium scophthalmum、Flavobacterium succinans、Francisella tularensis(野兎病)、Francisella novicida、Francisella philomiragia、フゾバクテリウム種:Fusobacterium necrophorum(ルミエール症候群/Sphaerophorus necrophorus)、Fusobacterium nucleatum、Fusobacterium polymorphum、Fusobacterium novum、Fusobacterium mortiferum、 Fusobacterium varium、Gardnerella vaginalis、Gemella haemolysans、Gemella morbillorum(Streptococcus morbillorum)、Grimontella種、ヘモフィルス種:Haemophilus aegyptius(コッホ・ウィークス菌)、Haemophilus aphrophilus、Haemophilus avium、Haemophilus ducreyi(軟性下疳)、Haemophilus felis、Haemophilus haemolyticus、Haemophilus influenzae(パイファー菌)、Haemophilus paracuniculus、Haemophilus parahaemolyticus、Haemophilus parainfluenzae、Haemophilus paraphrophilus(Aggregatibacter aphrophilus)、Haemophilus pertussis、Haemophilus pittmaniae、Haemophilus somnus、Haemophilus vaginalis、ハフニア種、Hafnia alvei、ヘリコバクター種:Helicobacter acinonychis、Helicobacter anseris、Helicobacter aurati、Helicobacter bilis、Helicobacter bizzozeronii、Helicobacter brantae、Helicobacter Canadensis、Helicobacter canis、Helicobacter cholecystus、Helicobacter cinaedi、Helicobacter cynogastricus、Helicobacter felis、Helicobacter fennelliae、Helicobacter ganmani、Helicobacter heilmannii(Gastrospirillum hominis)、Helicobacter hepaticus、Helicobacter mesocricetorum、Helicobacter marmotae、Helicobacter muridarum、Helicobacter mustelae、Helicobacter pametensis、Helicobacter pullorum、Helicobacter pylori(胃潰瘍)、Helicobacter rappini、Helicobacter rodentium、Helicobacter salomonis、Helicobacter trogontum、Helicobacter typhlonius、Helicobacter winghamensis、ヒト顆粒球エーリキア症(Anaplasma phagocytophilum/Ehrlichia phagocytophila)、Human monocytotropic ehrlichiosis(Monocytic ehrlichiosis/Ehrlichia chaffeensis)、クレブシエラ種:Klebsiella granulomatis(Calymmatobacterium granulomatis)、Klebsiella mobilis、Klebsiella ornithinolytica、Klebsiella oxytoca、Klebsiella ozaenae、Klebsiella planticola、Klebsiella pneumoniae、Klebsiella rhinoscleromatis、Klebsiella singaporensis、Klebsiella terrigena、Klebsiella trevisanii、Klebsiella variicola、Kingella kingae、
クライベラ種、ラクトバチルス種: Lactobacillus acetotolerans、Lactobacillus acidifarinae、Lactobacillus acidipiscis、Lactobacillus acidophilus(デーデルライン桿菌)、Lactobacillus agilis、Lactobacillus algidus、Lactobacillus alimentarius、Lactobacillus amylolyticus、Lactobacillus amylophilus、Lactobacillus amylotrophicus、Lactobacillus amylovorus、Lactobacillus animalis、Lactobacillus antri、Lactobacillus apodemi、Lactobacillus aviarius、Lactobacillus bifermentans、Lactobacillus brevis、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus camelliae、Lactobacillus casei、Lactobacillus catenaformis、Lactobacillus ceti、Lactobacillus coleohominis、Lactobacillus collinoides、Lactobacillus composti、Lactobacillus concavus、Lactobacillus coryniformis、Lactobacillus crispatus、Lactobacillus crustorum、Lactobacillus curvatus、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus、Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactis、Lactobacillus diolivorans、Lactobacillus equi、Lactobacillus equigenerosi、Lactobacillus farraginis、Lactobacillus farciminis、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus fornicalis、Lactobacillus fructivorans、Lactobacillus frumenti、Lactobacillus fuchuensis、Lactobacillus gallinarum、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus gastricus、Lactobacillus ghanensis、Lactobacillus graminis、Lactobacillus hammesii、Lactobacillus hamsteri、Lactobacillus harbinensis、Lactobacillus hayakitensis、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus hilgardii、Lactobacillus homohiochii、Lactobacillus iners、Lactobacillus ingluviei、Lactobacillus intestinalis、Lactobacillus jensenii、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus kalixensis、Lactobacillus kefiranofaciens、Lactobacillus kefiri、Lactobacillus kimchii、Lactobacillus kitasatonis、Lactobacillus kunkeei、Lactobacillus leichmannii、Lactobacillus lindneri、Lactobacillus malefermentans、Lactobacillus mali、Lactobacillus manihotivorans、Lactobacillus mindensis、Lactobacillus mucosae、Lactobacillus murinus、Lactobacillus nagelii、Lactobacillus namurensis、Lactobacillus nantensis、Lactobacillus oligofermentans、Lactobacillus oris、Lactobacillus panis、Lactobacillus pantheris、Lactobacillus parabrevis、Lactobacillus parabuchneri、Lactobacillus paracollinoides、Lactobacillus parafarraginis、Lactobacillus parakefiri、Lactobacillus paralimentarius、Lactobacillus paraplantarum、Lactobacillus pentosus、Lactobacillus perolens、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus pontis、Lactobacillus psittaci、Lactobacillus rennini、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus rimae、Lactobacillus rogosae、Lactobacillus rossiae、Lactobacillus ruminis、Lactobacillus saerimneri、Lactobacillus sakei、Lactobacillus salivarius、Lactobacillus sanfranciscensis、Lactobacillus satsumensis、Lactobacillus secaliphilus、Lactobacillus sharpeae、Lactobacillus siliginis、Lactobacillus spicheri、Lactobacillus suebicus、Lactobacillus thailandensis、Lactobacillus ultunensis、Lactobacillus vaccinostercus、Lactobacillus vaginalis、Lactobacillus versmoldensis、Lactobacillus vini、Lactobacillus vitulinus、Lactobacillus zeae、Lactobacillus zymae、Leclercia種、レジオネラ種:Legionella adelaidensis、Legionella anisa、Legionella beliardensis、Legionella birminghamensis、Legionella bozemanii、Legionella brunensis、Legionella busanensis、Legionella cherrii、Legionella cincinnatiensis、Legionella donaldsonii、Legionella drancourtii、Legionella drozanskii、Legionella erythra、Legionella fairfieldensis、Legionella fallonii、Legionella feeleii、Legionella geestiana、Legionella genomospecies、Legionella gratiana、Legionella gresilensis、Legionella hackeliae、Legionella impletisoli、Legionella israelensis、Legionella jamestowniensis、'Candidatus Legionella jeonii'、Legionella jordanis、Legionella lansingensis、Legionella londiniensis、Legionella longbeachae、Legionella lytica、Legionella maceachernii、Legionella micdadei、Legionella moravica、Legionella nautarum、Legionella oakridgensis、Legionella parisiensis、Legionella pneumophila、Legionella quateirensis、Legionella quinlivanii、Legionella rowbothamii、Legionella rubrilucens、Legionella sainthelensi、Legionella santicrucis、Legionella shakespearei、Legionella spiritensis、Legionella steigerwaltii、Legionella taurinensis、Legionella tucsonensis、Legionella wadsworthii、Legionella waltersii、Legionella worsleiensis、Legionella yabuuchiae、Leminorella種、レプトスピラ種:Leptospira interrogans、Leptospira kirschneri、Leptospira noguchii、Leptospira alexanderi、Leptospira weilii、Leptospira genomospecies 1、Leptospira borgpetersenii、Leptospira santarosai、Leptospira inadai、Leptospira fainei、Leptospira broomii、Leptospira licerasiae、Leptospira biflexa、Leptospira meyeri、Leptospira wolbachii、Leptospira genomospecies 3、Leptospira genomospecies 4、Leptospira genomospecies 5、Lepromatous leprosy(Danielssen-Boeck病)、Leptospira canicola、Leptospira hebdomadis、レプトスピラ症(ワイル病/Leptospira icterohaemorrhagiae/Leptospira interrogans serovar icterohaemorrhagiae)、Leptotrichia、リューコノストック種:Leuconostoc carnosum、Leuconostoc citreum、Leuconostoc durionis、Leuconostoc fallax、Leuconostoc ficulneum、Leuconostoc fructosum、Leuconostoc garlicum、Leuconostoc gasicomitatum、Leuconostoc gelidum、Leuconostoc inhae、Leuconostoc kimchii、Leuconostoc lactis、Leuconostoc mesenteroides、Leuconostoc pseudoficulneum、Leuconostoc pseudomesenteroides、リステリア種:Listeria grayi、Listeria innocua、Listeria ivanovii、Listeria monocytogenes(リステリア症)、Listeria seeligeri、Listeria welshimeri、Methanobacterium extroquens、Microbacterium multiforme、ミクロコッカス種:Micrococcus antarcticus、Micrococcus flavus、Micrococcus luteus、Micrococcus lylae、Micrococcus mucilaginosis、Micrococcus roseus、Micrococcus sedentarius、Mobiluncus、Moellerella種、モルガネラ種、モラクセラ種:Moraxella atlantae、Moraxella boevrei、Moraxella bovis、Moraxella canis、Moraxella caprae、Moraxella catarrhalis(Branhamella catarrhalis)、Moraxella caviae、Moraxella cuniculi、Moraxella equi、Moraxella lacunata、Moraxella lincolnii、Moraxella nonliquefaciens、Moraxella oblonga、Moraxella osloensis、Moraxella saccharolytica、Morganella morganii、マイコバクテリウム種:Mycobacterium abscessus、Mycobacterium africanum、Mycobacterium agri、Mycobacterium aichiense、Mycobacterium alvei、Mycobacterium arupense、Mycobacterium asiaticum、Mycobacterium aubagnense、Mycobacterium aurum、Mycobacterium austroafricanum、Mycobacterium avium(バテー病/Lady Windermere症候群)、Mycobacterium avium paratuberculosis(ヒトのクローン病及びヒツジのヨーネ病に関係する)、Mycobacterium avium silvaticum、Mycobacterium avium "hominissuis"、Mycobacterium colombiense、Mycobacterium boenickei、Mycobacterium bohemicum、Mycobacterium bolletii、Mycobacterium botniense、Mycobacterium bovis(牛結核)、Mycobacterium branderi、Mycobacterium brisbanense、Mycobacterium brumae、Mycobacterium canariasense、Mycobacterium caprae、Mycobacterium celatum、Mycobacterium chelonae、Mycobacterium chimaera、Mycobacterium chitae、Mycobacterium chlorophenolicum、Mycobacterium chubuense、Mycobacterium conceptionense、Mycobacterium confluentis、Mycobacterium conspicuum、Mycobacterium cookii、Mycobacterium cosmeticum、Mycobacterium diernhoferi、Mycobacterium doricum、Mycobacterium duvalii、Mycobacterium elephantis、Mycobacterium fallax、Mycobacterium farcinogenes、Mycobacterium flavescens、Mycobacterium florentinum、Mycobacterium fluoroanthenivorans、Mycobacterium fortuitum、Mycobacterium fortuitum subsp. Acetamidolyticum、Mycobacterium frederiksbergense、Mycobacterium gadium、Mycobacterium gastri、Mycobacterium genavense、Mycobacterium gilvum、Mycobacterium goodii、Mycobacterium gordonae(Mycobacterium aquae)、Mycobacterium haemophilum、Mycobacterium hassiacum、Mycobacterium heckeshornense、Mycobacterium heidelbergense、Mycobacterium hiberniae、Mycobacterium hodleri、Mycobacterium holsaticum、Mycobacterium houstonense、Mycobacterium immunogenum、Mycobacterium interjectum、Mycobacterium intermedium、Mycobacterium intracellulare、Mycobacterium kansasii、Mycobacterium komossense、Mycobacterium kubicae、Mycobacterium kumamotonense、Mycobacterium lacus、Mycobacterium lentiflavum、Mycobacterium leprae(癩病又はハンセン病の原因)、Mycobacterium lepraemurium、Mycobacterium madagascariense、Mycobacterium mageritense、Mycobacterium malmoense、Mycobacterium marinum(魚槽肉芽腫)、Mycobacterium massiliense、Mycobacterium microti、Mycobacterium monacense、Mycobacterium montefiorense、Mycobacterium moriokaense、Mycobacterium mucogenicum、Mycobacterium murale、Mycobacterium nebraskense、Mycobacterium neoaurum、Mycobacterium neworleansense、Mycobacterium nonchromogenicum、Mycobacterium novocastrense、Mycobacterium obuense、Mycobacterium palustre、Mycobacterium parafortuitum、Mycobacterium parascrofulaceum、Mycobacterium parmense、Mycobacterium peregrinum、Mycobacterium phlei、Mycobacterium phocaicum、Mycobacterium pinnipedii、Mycobacterium porcinum、Mycobacterium poriferae、Mycobacterium pseudoshottsii、Mycobacterium pulveris、Mycobacterium psychrotolerans、Mycobacterium pyrenivorans、Mycobacterium rhodesiae、Mycobacterium saskatchewanense、Mycobacterium scrofulaceum、Mycobacterium senegalense、Mycobacterium seoulense、Mycobacterium septicum、Mycobacterium shimoidei、Mycobacterium shottsii、Mycobacterium simiae、Mycobacterium smegmatis、Mycobacterium sphagni、Mycobacterium szulgai、Mycobacterium terrae、Mycobacterium thermoresistibile、Mycobacterium tokaiense、Mycobacterium triplex、Mycobacterium triviale、Mycobacterium tuberculosis(ヒトの結核の主要原因)、Mycobacterium bovis、Mycobacterium africanum、Mycobacterium canetti、Mycobacterium caprae、Mycobacterium pinnipedii'、Mycobacterium tusciae、Mycobacterium ulcerans(Bairnsdale潰瘍/Buruli潰瘍の原因)、Mycobacterium vaccae、Mycobacterium vanbaalenii、Mycobacterium wolinskyi、Mycobacterium xenopi、マイコプラズマ種:Mycoplasma fermentans、Mycoplasma genitalium、Mycoplasma hominis、Mycoplasma penetrans、Mycoplasma phocacerebrale、Mycoplasma pneumoniae、Nanukayami(七日熱/Gikiyami)、ナイセリア種:Neisseria gonorrhoea(淋菌/淋病)、Neisseria meningiditis(髄膜炎菌)、Neisseria sicca、Neisseria cinerea、Neisseria elongata、Neisseria flavescens、Neisseria lactamica、Neisseria mucosa、Neisseria po
lysaccharea、Neisseria subflava、ニトロバクター種、ノカルジア種:Nocardia asteroides、Nocardia brasiliensis、Nocardia caviae、Noma(水癌/壊疽性口内炎)、Obesumbacterium、Oligotropha種、Orientia tsutsugamushi(つつが虫病)、Oxalobacter formigenes、パンテア種:Pantoea agglomerans、Pantoea ananatis、Pantoea citrea、Pantoea dispersa、Pantoea punctata、Pantoea stewartii、Pantoea terrea、パスツレラ種:Pasteurella aerogenes、Pasteurella anatis、Pasteurella avium、Pasteurella bettyae、Pasteurella caballi、Pasteurella canis、Pasteurella dagmatis、Pasteurella gallicida、Pasteurella gallinarum、Pasteurella granulomatis、Pasteurella langaaensis、Pasteurella lymphangitidis、Pasteurella mairii、Pasteurella multocida、Pasteurella pneumotropica、Pasteurella skyensis、Pasteurella stomatis、Pasteurella testudinis、Pasteurella trehalosi、Pasteurella tularensis、Pasteurella ureae、Pasteurella volantium、ペジオコックス種:Pediococcus acidilactici、Pediococcus cellicola、Pediococcus claussenii、Pediococcus damnosus、Pediococcus dextrinicus、Pediococcus ethanolidurans、Pediococcus inopinatus、Pediococcus parvulus、Pediococcus pentosaceus、Pediococcus stilesii、ペプトストレプトコッカス種:Peptostreptococcus anaerobius、Peptostreptococcus asaccharolyticus、Peptostreptococcus harei、Peptostreptococcus hydrogenalis、Peptostreptococcus indoliticus、Peptostreptococcus ivorii、Peptostreptococcus lacrimalis、Peptostreptococcus lactolyticus、Peptostreptococcus magnus、Peptostreptococcus micros、Peptostreptococcus octavius、Peptostreptococcus prevotii、Peptostreptococcus tetradius、Peptostreptococcus vaginalis、フォトラブダス種、Photorhizobium種、Plesiomonas shigelloides、Porphyromonas gingivalis、Pragia種、プレボテラ、プロピオニバクテリウム種:Propionibacterium acnes、Propionibacterium propionicus、プロテウス種:Proteus mirabilis、Proteus morganii、Proteus penneri、Proteus rettgeri、Proteus vulgaris、プロビデンシア種:Providencia friedericiana、Providencia stuartii、シュードモナス種:Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas alcaligenes、Pseudomonas anguilliseptica、Pseudomonas argentinensis、Pseudomonas borbori、Pseudomonas citronellolis、Pseudomonas flavescens、Pseudomonas mendocina、Pseudomonas nitroreducens、Pseudomonas oleovorans、Pseudomonas pseudoalcaligenes、Pseudomonas resinovorans、Pseudomonas straminea、Pseudomonas aurantiaca、Pseudomonas aureofaciens、Pseudomonas chlororaphis、Pseudomonas fragi、Pseudomonas lundensis、Pseudomonas taetrolens、Pseudomonas Antarctica、Pseudomonas azotoformans、Pseudomonas brassicacearum、Pseudomonas brenneri、Pseudomonas cedrina、Pseudomonas corrugate、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas gessardii、Pseudomonas libanensis、Pseudomonas mandelii、Pseudomonas marginalis、Pseudomonas mediterranea、Pseudomonas meridiana、Pseudomonas migulae、Pseudomonas mucidolens、Pseudomonas orientalis、Pseudomonas panacis、Pseudomonas proteolytica、Pseudomonas rhodesiae、Pseudomonas synxantha、Pseudomonas thivervalensis、Pseudomonas tolaasii、Pseudomonas veronii、Pseudomonas denitrificans、Pseudomonas pertucinogena、Pseudomonas cremoricolorata、Pseudomonas fulva、Pseudomonas monteilii、Pseudomonas mosselii、Pseudomonas oryzihabitans、Pseudomonas parafulva、Pseudomonas plecoglossicida、Pseudomonas putida、Pseudomonas balearica、Pseudomonas luteola、Pseudomonas stutzeri、Pseudomonas amygdale、Pseudomonas avellanae、Pseudomonas caricapapayae、Pseudomonas cichorii、Pseudomonas coronafaciens、Pseudomonas ficuserectae、Pseudomonas meliae、Pseudomonas savastanoi、Pseudomonas syringae、Pseudomonas viridiflava、Pseudomonas abietaniphila、Pseudomonas acidophila、Pseudomonas agarici、Pseudomonas alcaliphila、Pseudomonas alkanolytica、Pseudomonas amyloderamosa、Pseudomonas asplenii、Pseudomonas azotifigens、Pseudomonas cannabina、Pseudomonas coenobios、Pseudomonas congelans、Pseudomonas costantinii���Pseudomonas cruciviae、Pseudomonas delhiensis、Pseudomonas excibis、Pseudomonas extremorientalis、Pseudomonas frederiksbergensis、Pseudomonas fuscovaginae、Pseudomonas gelidicola、Pseudomonas grimontii、Pseudomonas indica、Pseudomonas jessenii、Pseudomonas jinjuensis、Pseudomonas kilonensis、Pseudomonas knackmussii、Pseudomonas koreensis、Pseudomonas lini、Pseudomonas lutea、Pseudomonas moraviensis、Pseudomonas otitidis、Pseudomonas pachastrellae、Pseudomonas palleroniana、Pseudomonas papaveris、Pseudomonas peli、Pseudomonas perolens、Pseudomonas poae、Pseudomonas pohangensis、Pseudomonas psychrophila、Pseudomonas psychrotolerans、Pseudomonas rathonis、Pseudomonas reptilivora、Pseudomonas resiniphila、Pseudomonas rhizosphaerae、Pseudomonas rubescens、Pseudomonas salomonii、Pseudomonas segitis、Pseudomonas septica、Pseudomonas simiae、Pseudomonas suis、Pseudomonas thermotolerans、Pseudomonas tremae、Pseudomonas trivialis、Pseudomonas turbinellae、Pseudomonas tuticorinensis、Pseudomonas umsongensis、Pseudomonas vancouverensis、Pseudomonas vranovensis、Pseudomonas xanthomarina、ラーネラ種、ラルストニア種:Ralstonia basilensis、Ralstonia campinensis、Ralstonia eutropha、Ralstonia gilardii、Ralstonia insidiosa、Ralstonia mannitolilytica、Ralstonia metallidurans、Ralstonia paucula、Ralstonia pickettii、Ralstonia respiraculi、Ralstonia solanacearum、Ralstonia syzygii、Ralstonia taiwanensis、Raoultella種、Rhodoblastus種、ロドソイドモナス種、鼻硬化症、Rhizobium radiobacter、Rhodococcus equi、リケッチア種:Rickettsia africae、Rickettsia akari、Rickettsia australis、Rickettsia conorii、Rickettsia felis、Rickettsia japonica、Rickettsia mooseri、Rickettsia prowazekii(発疹チフス)、Rickettsia rickettsii、Rickettsia siberica、Rickettsia typhi、Rickettsia conorii、Rickettsia africae、Rickettsia psittaci、Rickettsia quintana、Rickettsia rickettsii、Rickettsia trachomae、Rothia dentocariosa、サルモネラ種:Salmonella arizonae、Salmonella Bongori、Salmonella enterica、Salmonella enteriditis、Salmonella paratyphi、Salmonella typhi(腸チフス)、Salmonella typhimurium、Salmonella salamae、Salmonella arizonae、Salmonella diarizonae、Salmonella houtenae、Salmonella indica、Samsonia種、セラチア種:Serratia entomophila、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia grimesii、Serratia liquefaciens、Serratia marcescens、Serratia odoriferae、Serratia plymuthica、Serratia proteamaculans、Serratia quinivorans、Serratia rubidaea、Serratia ureilytica、Shewanella putrefaciens、Shigella boydii、Shigella dysenteriae、Shigella flexneri、Shigella sonnei、Sodalis種、スピリルム種:Spirillum minus鼡咬症、スタヒロコッカス種:Staphylococcus aureus、Staphylococcus auricularis、Staphylococcus capitis、Staphylococcus caprae、Staphylococcus cohnii、Staphylococcus epidermidis、Staphylococcus felis、Staphylococcus haemolyticus、Staphylococcus hominis、Staphylococcus intermedius、Staphylococcus lugdunensis、Staphylococcus pettenkoferi、Staphylococcus saprophyticus、Staphylococcus schleiferi、Staphylococcus simulans、Staphylococcus vitulus、Staphylococcus warneri、Staphylococcus xylosus、ステノトロホモナス種:Stenotrophomonas acidaminiphila、Stenotrophomonas dokdonensis、Stenotrophomonas koreensis、Stenotrophomonas maltophilia、Stenotrophomonas nitritireducens、Stenotrophomonas rhizophila、ストレプトバチルス種:Streptobacillus moniliformis(Streptobacillary鼡咬症)、ストレプトコッカス種:A群連鎖球菌、B群連鎖球菌、Streptococcus agalactiae、Streptococcus aginosus、Streptococcus avium、Streptococcus bovis、Streptococcus canis、Streptococcus cricetus、Streptococcus faceium、Streptococcus faecalis、Streptococcus ferus、Streptococcus gallinarum、Streptococcus lactis、Streptococcus milleri、Streptococcus mitior、Streptococcus mitis、Streptococcus mutans、Streptococcus oralis、Streptococcus peroris、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus pyogenes、Streptococcus ratti、Streptococcus salivarius、Streptococcus sanguinis、Streptococcus sobrinus、Streptococcus parasanguinis、Streptococcus suis、Streptococcus thermophilus、Streptococcus vestibularis、Streptococcus viridans、Streptococcus uberis、Streptococcus zooepidemicus、テイタメラ種、Trabulsiella種、トレポネーマ種:Treponema carateum(ピンタ)、Treponema denticola、Treponema endemicum(ベジェル)、Treponema pallidum(梅毒)、Treponema pertenue(イチゴ腫)、Tropheryma whipplei(ウィップル病)、Tuberculoid leprosy、Ureaplasma urealyticum、ベイヨネラ、ビブリオ種:Vibrio aerogenes、Vibrio aestuarianus、Vibrio agarivorans、Vibrio albensis、Vibrio alginolyticus、Vibrio brasiliensis、Vibrio calviensis、Vibrio campbellii、Vibrio chagasii、Vibrio cholerae(コレラ)、Vibrio cincinnatiensis、Vibrio Comma、Vibrio coralliilyticus、Vibrio crassostreae、Vibrio cyclitrophicus、Vibrio diabolicus、Vibrio diazotrophicus、Vibrio ezurae、Vibrio fischeri、Vibrio fluvialis、Vibrio fortis、Vibrio furnissii、Vibrio gallicus、Vibrio gazogenes、Vibrio gigantis、Vibrio halioticoli、Vibrio harveyi、Vibrio hepatarius、Vibrio hispanicus、Vibrio ichthyoenteri、Vibrio kanaloae、Vibrio lentus、Vibrio litoralis、Vibrio logei、Vibrio mediterranei、Vibrio metschnikovii、Vibrio mimicus、Vibrio mytili、Vibrio natriegens、Vibrio navarrensis、Vibrio neonatus、Vibrio neptunius、Vibrio nereis、Vibrio nigripulchritudo、Vibrio ordalii、Vibrio orientalis、Vibrio pacinii、Vibrio parahaemolyticus、Vibrio pectenicida、Vibrio penaeicida、Vibrio pomeroyi、Vibrio ponticus、Vibrio proteolyticus、Vibrio rotiferianus、Vibrio ruber、Vibrio rumoiensis、Vibrio salmonicida、Vibrio scophthalmi、Vibrio splendidus、Vibrio superstes、Vibrio tapetis、Vibrio tasmaniensis、Vibrio tubiashii、Vibrio vulnificus、Vibrio wodanis、Vibrio xuii、Vogesella indigofera、ウィグルスウォーチア種、Wolbachia secies、ゼノラブダス種、Yersinia enterocolitica、Yersinia pestis、Yersinia pseudotuberculosis、及び Yokenella種から成る群から選択される、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
前記ウイルスは、アベルソンマウス白血病ウイルス(Ab-MLV、A-MuLV)、急性喉頭気管気管支炎(又はHPIV)、Adelaide River virus、アデノ随伴ウイルス群(Dependevirus)、アデノウイルス、African horse sickness virus、African swine fever virus、AIDSウイルス、アリューシャンミンク病、parvovirus、アルファルファモザイクウイルス、アルファヘルペスウイルス(HSV 1及び2及び水痘を含む)、アルファレトロウイルス(トリ白血病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス)、Alphavirus、alkhurma virus、ALV関連ウイルス、Amapari virus、Andean potato mottle virus、Aphthovirus、Aquareovirus、アルボウイルス、アルボウイルスC、アルボウイルスA群、アルボウイルスB群、アレナウイルス群、アルゼンチン出血熱ウイルス、アルゼンチン出血熱ウイルス、Arterivirus、Astrovirus、Ateline herpesvirus group、オーエスキー病ウイルス、Aura virus、Ausduk disease virus、Australian bat lyssavirus、アビアデノウイルス、トリ赤芽球症ウイルス、トリ伝染性気管支炎ウイルス、avian leukemia virus、Avian leukosis virus(ALV)、トリリンパ腫症ウイルス、トリ骨髄芽球症ウイルス、トリパラミクソウイルス、avian pneumoencephalitis virus、トリ細網内皮症ウイルス、トリ肉腫ウイルス、avian type C retrovirus group、トリヘパドナウイルス、アビポックスウイルス、Bウイルス(Cercopithecine herpesvirus 1)、B19ウイルス(パルボウイルスB19)、Babanki virus、baboon herpesvirus、細菌ウイルス、バキュロウイルス、オオムギ黄化萎縮ウイルス、Barmah Forest virus、bean pod mottle virus、bean rugose mosaic virus、Bebaru virus、Berrimah virus、ベータヘルペスウイルス、ベータレトロウイルス、鳥インフルエンザ、Birnavirus、Bittner virus、BK virus、Black Creek Canal virus、bluetongue virus、ボリビア出血熱ウイルス、Boma disease virus、border disease of sheep virus、borna virus、bovine alphaherpesvirus 1、bovine alphaherpesvirus 2、ウシコロナウイルス、ウシ流行熱ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、ウシ白血病ウイルス、bovine leukosis virus、bovine mammillitis virus、ウシ乳頭腫ウイルス、ウシ丘疹性口炎ウイルス、ウシパルボウイルス、ウシシンシチアウイルス、bovine type C oncovirus、ウシウイルス性下痢症ウイルス、bracovirus、ソラマメモットルウイルス、broad bean stain virus、ブロムモザイクウイルス、Bromovirus、Buggy Creek virus、bullet shaped virus group、ブンヤムウェラウイルス、ブンヤウイルス、バーキットリンパ腫ウイルス、ブワンバ熱、Bwattany hetero virus、CAウイルス(Croup-associated virus/parainfluenza vius type 2)、カリチウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、ラクダ痘ウイルス、カナリア痘ウイルス、canid herpesvirus、イヌコロナウイルス、イヌジステンパーウイルス、イヌヘルペスウイルス、canine minute virus、イヌパルボウイルス、Cano Delgadito virus、カピロウイルス、caprine arthritis virus、caprine encephalitis virus、ヤギヘルペスウイルス、カプリポックスウイルス、カルジオウイルス、カーラウイルス、カーモウイルス、carrot mottle virus、Cassia yellow blotch virus、カリモウイルス、カリフラワーモザイクウイルス、caviid herpesvirus 1、Cercopithecine herpesvirus 1、Cercopithecine herpesvirus 2、cereal yellow dwarf virus、Chandipura virus、Changuinola virus、channel catfish virus、Charleville virus、水痘ウイルス、チクングニヤウイルス、チンパンジーヘルペスウイルス、Chordopoxvirinae、chub reovirus、chum salmon virus、クロステロウイルス、球菌ウイルス、Coho salmon reovirus、coital exanthema virus、コロラドダニ熱ウイルス、Coltivirus Columbia SK virus、Commelina yellow mottle virus、かぜウイルス、コモウイルス、Condylomata accuminata、先天性サイトメガロウイルス、伝染性膿瘡ウイルス、伝染性膿疱性皮膚炎ウイルス、コロナウイルス、コリパルタウイルス、coryza virus、ササゲクロロティックモットルウイルス、ササゲモザイクウイルス、ササゲウイルス、牛痘ウイルス、コクサッキーウイルス、CPV(細胞質多角体ウイルス)、cricket paralysis virus、クリミア・コンゴ出血性熱ウイルス、croup associated virus、Crypotovirus、ククモウイルス、サイポウイルス、サイトメガロウイルス(HCMV又はヒトヘルペスウイルス5 HHV-5)、細胞質多角体ウイルス、Cytorhabdovirus、deer papillomavirus、デルタレトロウイルス(ヒトTリンパ好性ウイルス)、Deformed wing virus DWV、デング熱、デンソウイルス、ディペンドウイルス、ドーリウイルス、ダイアンソウイルス、ジプロルナウイルス、DNAウイルス、Dobrava-Belgrade Virus、イヌインフルエンザ、Drosophila C virus、アヒルB型肝炎ウイルス、アヒル肝炎ウイルス1、アヒル肝炎ウイルス2、duovirus、Duvenhage virus、eastern equine encephalitis virus、eastern equine encephalomyelitis virus、エボラウイルス、Ebola-like virus、エコーウイルス、エコーウイルス10、エコーウイルス28、エコーウイルス9、エクトロメリアウイルス、EEEウイルス(Eastern equine encephalitis virus)、EIAウイルス(ウマ伝染性貧血)、EMCウイルス(脳心筋炎)、Emiliania huxleyi virus 86、脳炎ウイルス、encephalomyocarditis virus、内在性レトロウイルス、エンテロウイルス、Entomopoxvirinae、Entomopoxvirus A、Entomopoxvirus B、Entomopoxvirus C、enzyme elevating virus、epidemic hemorrhagic fever virus、流行性出血熱ウイルス、イプシロンレトロウイルス、エプスタイン・バーウイルス(EBV;ヒトヘルペスウイルス4 HHV-4)、equid alphaherpesvirus 1、equid alphaherpesvirus 4、equid herpesvirus 2、ウマ流産ウイルス、ウマ動脈炎ウイルス、equine encephalosis virus、ウマ伝染性貧血ウイルス、equine morbillivirus、equine rhinopneumonitis virus、ウマリノウイルス、Eubenangu virus、European elk papillomavirus、European swine fever virus、Everglades virus、Eyach virus、ファバウイルス、felid herpesvirus 1、ネコカリチウイルス、feline fibrosarcoma virus、ネコヘルペスウイルス、feline immunodeficiency virus、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス、ネコ白血病/肉腫ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、ネコ肉腫ウイルス、feline syncytial virus、フィジウイルス、Filovirus、フランダーズウイルス、フラビウイルス、口蹄病ウイルス、Fort Morgan virus、Four Corners hantavirus、トリアデノウイルス1、鶏痘ウイルス、フレンドウイルス、フロウイルス、Gammaherpesvirinae、ガンマレトロウイルス、GBウイルスC (GBV-C、旧G型肝炎ウイルス)、ジェミニウイルス、German measles virus、ゲタウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ミドリザルウイルス(mullburg)、glandular fever virus、ヤギ痘ウイルス、golden shinner virus、Gonometa virus、ガチョウパルボウイルス、granulosis virus、グロスウイルス、ground squirrel hepatitis B virus、A群アルボウイルス、グアナリトウイルス、モルモットサイトメガロウイルス、guinea pig type C virus、ハンタウイルス、hard clam reovirus、hare fibroma virus、HCMV(ヒトサイトメガロウイルス)、ヘルパーウイルス、hemadsorption virus 2、hemagglutinating virus of Japan、出血熱ウイルス、ヘンドラウイルス、Henipaviruses、ヘパドナウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝��ウイルス、C型肝炎ウイルス、D型(デルタ)肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、G型肝炎ウイルス、非A-非B型肝炎ウイルス、hepatoencephalomyelitis reovirus 3、ヘパトウイルス、heron hepatitis B virus、ヘルペスBウイルス、単純疱疹ウイルス、単純疱疹ウイルス1、単純疱疹ウイルス2、ヘルペスウイルス、帯状疱疹、ヘルペスウイルス6、ヘルペスウイルス7、ヘルペスウイルス8、Herpesvirus ateles、Herpesvirus hominis、Herpesvirus saimiri、Herpesvirus suis、Herpesvirus varicellae、Highlands J virus、Hirame rhabdovirus、HIV-1、豚コレラウイルス、ホルデイウイルス、Horse Flu、HTLV-1、HTLV-2、ヒトアデノウイルス2、ヒトアルファヘルペスウイルス1、ヒトアルファヘルペスウイルス2、ヒトアルファヘルペスウイルス3、human B lymphotropic virus、human betaherpesvirus 5、ヒトコロナウイルス、Human enterovirus A、Human enterovirus B、Human Flu、human foamy virus、ヒトガンマヘルペスウイルス4、ヒトガンマヘルペスウイルス6、ヒトA型肝炎ウイルス、ヒトヘルペスウイルス1型、ヒトヘルペスウイルス2型、ヒトヘルペスウイルス3型、ヒトヘルペスウイルス4型、ヒトヘルペスウイルス6型、ヒトヘルペスウイルス8型、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒト免疫不全ウイルス1、ヒト免疫不全ウイルス2、Human metapneumovirus、ヒト乳頭腫ウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルスI型、ヒトT細胞白血病ウイルスII型、ヒトT細胞白血病ウイルスIII型、ヒトT細胞リンパ腫ウイルスI型、ヒトT細胞リンパ腫ウイルスII型、human T cell lymphotropic virus type 1、human T cell lymphotropic virus type 2、human T lymphotropic virus I、human T lymphotropic virus II、human T lymphotropic virus III、ichnovirus、Ilarvirus、乳児胃腸炎ウイルス、ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス、infectious haematopoietic necrosis virus、伝染性膵臓壊死症ウイルス、インフルエンザウイルス、インフルエンザウイルスA、インフルエンザウイルスB、インフルエンザウイルスC、インフルエンザウイルスD、インフルエンザウイルスpr8、insect iridescent virus、昆虫ウイルス、干渉性ウイルス、イリドウイルス、イサウイルス、Japanese B virus、日本脳炎ウイルス、JCウイルス、フニンウイルス、Johnson grass mosaic virus、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、ケメロボウイルス、Kilham's rat virus、Klamath virus、Kolongo virus、Korean hemorrhagic fever virus、kumba virus、Kumlinge virus、Kunjin virus、キャサヌール森林病、Kyzylagach virus、La Crosse virus、lactic dehydrogenase elevating virus、ラゴスコウモリウイルス、ラムダファージ、langat virus、Langur virus、lapine parvovirus、ラッサ熱ウイルス、ラッサウイルス、潜伏性ラットウイルス、LCMウイルス、Leaky virus、レンチウイルス、レポリポックスウイルス、白血病ウイルス、ロイコウイルス、跳躍病ウイルス、lumpy skin disease virus、Luteovirus、リンパ節症関連ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)、Lymphocryptovirus、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、lymphoproliferative virus group、リッサウイルス、Machupo virus、mad itch virus、トウモロコシ白化萎縮ウイルス、maize rough dwarf virus、mammalian type B oncovirus group、mammalian type B retroviruses、mammalian type C retrovirus group、mammalian type D retroviruses、乳癌ウイルス、Mapuera virus、Marafivirus、Marburg virus、Marburg-like virus、Mason Pfizer monkey virus、マストアデノウイルス、マヤロウイルス、MEウイルス、麻疹ウイルス、Melandrium yellow fleck virus、Menangle virus、Mengo virus、Mengovirus、Merkel cell polyomavirus、Middelburg virus、milkers nodule virus、ミンク腸炎ウイルス、マウス微小ウイルス、MLV related virus、MMウイルス、Mokola virus、モルシポックスウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス(M-MuLV)、サルBウイルス、サル痘ウイルス、Mononegavirales、Morbillivirus、Mount Elgon bat virus、マウスサイトメガロウイルス、マウス脳脊髄炎ウイルス、マウス肝炎ウイルス、mouse K virus、マウス白血病ウイルス、マウス乳癌ウイルス、mouse minute virus、mouse pneumonia virus、マウスポリオウイルス、マウスポリオーマウイルス、マウス肉腫ウイルス、マウス痘ウイルス、Mozambique virus、Mucambo virus、粘膜病ウイルス、Mumps virus、murid betaherpesvirus 1、murid cytomegalovirus 2、マウスサイトメガロ
ウイルス群、murine encephalomyelitis virus、マウス肝炎ウイルス、マウス白血病ウイルス、murine nodule inducing virus、murine polyomavirus、murine sarcoma virus、Muromegalovirus、Murray Valley encephalitis virus、myxoma virus、Myxovirus、Myxovirus multiforme、Myxovirus parotitidis、Nairobi sheep disease virus、Nairovirus、Nanirnavirus、Nariva virus、Ndumo virus、Necrovirus、Neethling virus、Nelson Bay virus、Nemtick Virus、Nepovirus、向神経性ウイルス、New World Arenavirus、newborn pneumonitis virus、ニューキャッスル病ウイルス、Nipah virus、noncytopathogenic virus、ノロウイルス、Norwalk virus、核多角体病ウイルス(NPV)、nipple neck virus、O'nyong'nyong virus、oat sterile dwarf virus、Ockelbo virus、オムスク出血熱ウイルス、癌ウイルス、oncogenic viruslike particle、oncornavirus、Orbivirus、Orf virus、Oropouche virus、Orthohepadnavirus、orthomyxovirus、Orthopoxvirus、Orthoreovirus、Orungo、ovine papillomavirus、ovine catarrhal fever virus、owl monkey herpesvirus、Palyam virus、パピローマウイルス、Papillomavirus sylvilagi、パポーバウイルス、Parainfluenza virus human(HPIV)、parainfluenza virus type 1 human(HPIV-1)、parainfluenza virus type 2 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hemorrhagic fever viruses、SouthAfrican passiflora virus、South River virus���Southern bean mosaic virus、Southern potato latent virus、アカザモザイクウイルス、ノゲシ黄色葉脈ウイルス、Soybean chlorotic mottle virus、Soybean crinkle leaf virus、ダイズ矮化ウイルス、ダイズモザイクウイルス、SPAr-2317 virus、Sparganothis pettitana NPV、スズメ痘ウイルス、Spartina mottle virus、Spectacled caimanpox virus、SPH 114202 virus、Sphenicid herpesvirus 1、Sphinx ligustri NPV、Spider monkey herpesvirus、Spilarctia subcarnea NPV、Spilonota ocellana NPV、Spilosoma lubricipeda NPV、Spinach latent virus、Spinach temperate virus、Spiroplasma phage 1、Spiroplasma phage 4、Spiroplasma phage aa、Spiroplasma phage C1 /TS2、Spodoptera exempta cypovirus、Spodoptera exigua virus、Spodoptera frugiperda virus、Spodoptera latifascia virus、Spodoptera littoralis、Spodoptera mauritia virus、Spodoptera ornithogalli virus、スポンドウェニウイルス、spring beauty latent virus、Spring viremia of carp virus、スプマウイルス(SFV、HFV)、Squash leaf curl virus、squash mosaic virus、リス線維腫ウイルス、Squirrel monkey herpesvirus、squirrel monkey retrovirus、SR-11 virus、Sri Lankan passionfruit mottle virus、Sripur virus、SSV 1 virus group、StAbbs Head virus、St. Louis encephalitis virus、ブドウ球菌ファージ107、ブドウ球菌ファージ187、ブドウ球菌ファージ2848A、ブドウ球菌ファージ3A、ブドウ球菌ファージ44A HJD、ブドウ球菌ファージ77、ブドウ球菌ファージB11-M15、ブドウ球菌ファージTwort、ムクドリ痘ウイルス、Statice virus Y、P、STLV(simian T lymphotropic virus) type I、STLV(simian T lymphotropic virus) type II、STLV(simian T lymphotropic virus) type III、stomatitis papulosa virus、ストラトフォードウイルス、Strawberry crinkle virus、Strawberry latent ringspot virus、Strawberry mild yellow edge virus、Strawberry vein banding virus、連鎖球菌ファージ182、連鎖球菌ファージ2BV、連鎖球菌ファージA25、連鎖球菌ファージ24、連鎖球菌ファージPE1、連鎖球菌ファージVD13、連鎖球菌ファージfD8、連鎖球菌ファージCP-1、連鎖球菌ファージCvir、連鎖球菌ファージH39、Strigid herpesvirus 1、Striped bass reovirus、Striped Jack nervous、壊死ウイルス、Stump-tailed macaque virus、submaxillary virus、Subterranean clover mottle virus、Subterranean clover mottle virus satellite、Subterranean clover red leaf virus、Subterranean clover stunt virus、Sugarcane bacilliform virus、Sugarcane mild mosaic virus、サトウキビモザイクウイルス、Sugarcane streak virus、suid alphaherpesvirus 1、suid herpesvirus 2、スイポックスウイルス、Sulfolobus virus 1、Sunday Canyon virus、Sunflower crinkle virus、ヒマワリモザイクウイルス、Sunflower rugose mosaic virus、Sunflower yellow blotch virus、Sunflower yellow ringspot virus、Sun-hemp mosaic virus、swamp fever virus、Sweet clover necrotic mosaic virus、Sweet potato A virus、Sweet potato chlorotic leafspot virus、Sweet potato feathery mottle virus、Sweet potato internal cork virus、Sweet potato latent virus、Sweet potato mild mottle virus、Sweet potato russet crack virus、Sweet potato vein mosaic virus、Sweet potato yellow dwarf virus、Sweetwater Branch virus、ブタサイトメガロウイルス、ブタインフルエンザ、Swine infertility and respiratory syndrome virus、ブタ痘ウイルス、スイスマウス白血病ウイルス、Sw
ord bean distortion mosaic virus、Synaxis jubararia NPV、Synaxis pallulata NPV、Synetaeris tenuifemur virus、Syngrapha selecta NPV、T4ファージ、T7ファージ、TAC virus、Tacaiuma virus、Tacaribe complex virus、タカリベウイルス、Tadpole edema virus LT 1-4、Taggert virus、タヒナウイルス、Tai virus、Taiassui virus、Tamana bat virus、Tamarillo mosaic virus、Tamdy virus、[[Tamiami virus、Tanapox virus、Tanga virus、Tanjong Rabok virus、Taro bacilliform virus、Badnavirus Tataguine virus、Taterapox virus、Taterapox virus、Teasel mosaic virus、Tehran virus、Telfairia mosaic virus、Telok Forest virus、Tembe virus、Tembusu virus、Tench reovirus、Tensaw virus、Tenvivirus、Tephrosia symptomless virus、Termeil virus、Tete virus、Tetralopha scortealis NPV、Tetropium cinnamoptemm NPV、Texas pepper virus、Thailand virus、Thaumetopoea pityocampa virus、 Theiler's encephalomyelitis virus、Theiler's virus、Theophila mandarina NPV、Theretra japonica NPV、Thermoproteus virus 1、Thermoproteus virus 2、Thermoproteus virus 3、Thermoproteus virus 4、Thiafora virus、Thimiri virus、Thistle mottle virus、ソゴトウイルス、Thormodseyjarklettur virus、Thosea asigna virus、Thosea baibarana NPV、Thosea sinensis GV、Thottapalayam virus、Thylidolpteryx ephemeraeformis NPV、Thymelicus lineola NPV、Tibrogargan virus、Ticera castanea NPV、ダニ媒介性脳炎ウイルス(TBEV)-欧州及び極東サブタイプ、Tillamook virus、Tilligerry virus、Timbo virus、Tilmboteua virus、Tilmaroo virus、Tindholmur virus、Tinea pellionella NPV、Tineola hisselliella NPV、Tinpula paludosa NPV、Tinracola plagiata NPV、Tioman virus、Tlacotalpan virus、Tobacco bushy top virus、タバコエッチ病ウイルス、タバコ葉捲ウイルス、Tobacco mild green mosaic virus、タバコモザイクウイルス、タバコモザイクウイルスサテライト、Tobacco mottle virus、タバコネクロシスウイルス、タバコネクロシスウイルスサテライト、Tobacco necrosis virus small satellite、Tobacco necrotic dwarf virus、タバコ茎壊疽ウイルス、タバコ輪点ウイルス、タバコ条斑ウイルス、タバコ矮化ウイルス、Tobacco vein banding mosaic virus、Tobacco vein distorting virus、Tobacco vein mottling virus、Tobacco wilt virus、Tobacco yellow dwarf virus、Tobacco yellow net virus、Tobacco yellow vein virus、タバモウイルス、トブラウイルス、トガウイルス、Tomato apical stunt viroid、Tomato aspermy virus、Tomato black ring virus、Tomato black ring virus satellite、Tomato bunchy top viroid、tomato bushy stunt virus、Tomato bushy stunt virus satellite、Tomato golden mosaic virus、Tomato leaf crumple virus、Tomato leaf curl virus、Tomato leafroll virus、Tomato mosaic virus、Tomato mottle virus、Tomato pale chlorosis virus、Tomato planta macho viroid、Tomato pseudo-curly top virus、Tomato ringspot virus、Tomato spotted wilt virus、Tomato top necrosis virus、Tomato vein yellowing virus、Tomato yellow dwarf virus、Tomato yellow leaf curl virus、Tomato yellow mosaic virus、Tomato yellow top virus、Tombusvirus、Tongan vanilla virus、トロウイルス、トルクテノウイルス、Tortrix loeflingiana NPV、Tortrix viridana NPV、トスカーナウイルス、トスポウイルス、Toxorhynchites brevipalpis NPV、Trabala vishnou NPV、Tradescantia/Zebrina virus、Trager duck spleen necrosis virus、Tranosema sp. Virus、形質変換ウイルス、Tree shrew adenovirus 1、Tree shrew herpesvims、Triatoma virus、Tribec virus、Trichiocampus irregularis NPV、Trichiocampus viminalis NPV、Trichomonas vaginalis virus、Trichoplusia ni cypovirus 5、Trichoplusia ni granulovirus、Trichoplusia ni MNPV、Trichoplusia ni Single SNPV、Trichoplusia ni virus、Trichosanthes mottle virus、Triticum aestivum chlorotic spot virus、Trivittatus virus、Trombetas virus、Tropaeolum virus 1、Tropaeolum virus 2、Trubanarnan virus、Tsuruse virus、Tucunduba virus、Tulare apple mosaic virus、Tulip band breaking virus、Tulip breaking virus、Tulip chlorotic blotch virus、Tulip top breaking virus、Tulip virus X、腫瘍ウイルス、Tupaia virus、Tupaiid herpesvirus 1、Turbot herpesvirus、Turbot reovirus、七面鳥アデノウイルス1乃至3、七面鳥コロナウイルス、七面鳥ヘルペスウイルス1、turkey rhinotracheitis virus、七面鳥痘ウイルス、ターロックウイルス、Turnip crinkle virus、Turnip crinkle virus satellite、Turnip mild yellows virus、Turnip mosaic virus、Turnip rosette virus、turnip yellow mosaic virus、Turuna virus、Tymovirus、Tyuleniy virus、C型レトロウイルス、type D oncovirus、D型レトロウイルス群、Uasin Gishu disease virus、Uganda S virus、Ugymyia sericariae NPV、ulcerative disease rhabdovirus、Ullucus mild mottle virus、Ullucus mosaic virus、Ullucus virus C、Umatilla virus、ウンブレウイルス、ウナウイルス、Upolu virus、UR2 sarcoma virus、Uranotaenia sapphirina NPV、Urbanus proteus NPV、Urucuri virus、Ustilago maydis virus 1、Ustilago maydis virus 4、Ustilago maydis virus 6、ウスツウイルス、Utinga virus、Utive virus、Uukuniemi virus group、ワクシニアウイルス、Vaeroy virus、Vallota mosaic virus、Vanessa atalanta NPV、Vanessa cardui NPV、Vanessa prorsa NPV、Vanilla mosaic virus、Vanilla necrosis virus、Varicella zoster virus、バリセロウイルス、Varicola virus、variola major virus、variola virus、Vasin Gishu disease virus、Vellore virus、Velvet tobacco mottle virus、Velvet tobacco mottle virus satellite、Venezuelan equine encephalitis virus、Venezuelan equine encephalomyelitis virus、Venezuelan hemorrhagic fever virus、水疱性口炎ウイルス、ベシクロウイルス、ビブリオファージ06N-22P、ビブリオファージ06N-58P、ビブリオファージ4996、ビブリオファージa3a、ビブリオファージI、ビブリオファージII、ビブリオファージm、ビブリオファージIV、ビブリオファージkappa、ビブリオファージnt-1、ビブリオファージOXN-52P、ビブリオファージOXN-lOOP、ビブリオファージv6、ビブリオファージVfl2、ビブリオファージVf33、ビブリオファージVP1、ビブリオファージVP11、ビブリオファージVP3、ビブリオファージVP5、ビブリオファージX29、Vicia cryptic virus、Vigna sinensis mosaic virus、Vilyuisk virus、Vinces virus、Viola mottle virus、viper retrovirus、ウイルス性出血性敗血症ウイルス、ウイルス様粒子、Visna Maedi virus、Visna virus、Voandzeia mosaic virus、Voandzeia necrotic mosaic virus、volepox virus、Wad Medani virus、Wallal virus、Walleye epidermal hyperplasia、Walrus calicivirus、Wanowrie virus、Warrego virus、Watermelon chlorotic stunt virus、Watermelon curly mottle virus、Waterrnelon mosaic virus 1、Watermelon mosaic virus 2、Weddel water-borne virus、Weldona virus、Wesselsbron virus、西ナイルウイルス、western equine encephalitis virus、western equine encephalomyelitis virus、Wexford virus、ワタロアウイルス、Wheat American striate mosaic virus、Wheat chlorotic streak virus、Wheat dwarf virus、Wheat rosette stunt virus、Wheat streak mosaic virus、Wheat yellow leaf virus、Wheat yellow mosaic virus、White bryony virus、White clover cryptic virus 1、White clover cryptic virus 2、White clover cryptic virus 3、White clover mosaic virus、White lupinrnosaic virus、Wild cucumber mosaic virus、Wild potato mosaic virus、Wildbeest herpesvirus、Wineberry latent virus、Winter wheat mosaic virus、Winter wheat Russian mosaic virus、Wiseana cervinata virus、Wiseana signata virus、Wiseana umbraculata virus、Wissadula mosaic virus、Wisteria vein mosaic virus、Witwatersrand virus、Wongal virus、Wongorr virus、Winter Vomiting Virus、ウッドチャックB型肝炎ウイルス、Woodchuck herpesvirus marmota 1、ウーリーサル肉腫ウイルス、wound tumor virus、WRSV virus、WVU virus 2937、WW virus 71 to 212、Wyeomyia smithii NPV、Wyeomyia virus、Xanthomonas phage Cf、Xanthomonas phage Cflt、Xanthomonas phage RR66、Xanthomonas phage Xf、Xanthomonas phage Xf2、Xanthomonas phage XP5、Xenopus virus T21、Xiburema virus、Xingu virus、Xylena curvimacula NPV、Y73 sarcoma virus、ヤバサル腫瘍ウイルス、Yaba-1 virus、Yaba-7 virus、Yacaaba virus、Yam mosaic virus、Yaounde virus、Yaquina Head virus、ヤタポックスウイルス、黄熱病ウイルス、Yogue virus、Yokapox virus、Yokase virus、Yponomeuta cognatella NPV、Yponomeuta evonymella NPV、Yponomeuta malinellus NPV、Yponomeuta padella NPV、Yucca baciliform virus、Yug Bogdanovac virus、Zaliv Terpeniya virus、Zea mays virus、Zegla virus、Zeiraphera diniana virus、Zeiraphera pseudotsugana NPV、Zika virus、Zirqa virus、Zoysia mosaic virus、Zucchini yellow fleck virus、ズッキーニ黄斑モザイクウイルス、及びZygocactus virusから成る群から選択される、請求項52記載の方法。
【請求項５５】
15から35ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドプローブ: ここで、当該オリゴヌクレオチドプローブは、相補的ポリヌクレオチド標的の脱塩基部位に形態学的に入り込む少なくとも2つのインターカレータ分子を含み、かつ、当該オリゴヌクレオチドプローブのインターカレータ分子に隣接するヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチド標的に相補的である。
【請求項５６】
前記オリゴヌクレオチドプローブは、RNA、α-L-RNA、β-D-RNA、2’-R-RNA、DNA、LNA、PNA、PMO、TNA、GNA、オリゴヌクレオチドN3’→P5’ホスホルアミダート、BNA、α-L-LNA、HNA、MNA、ANA、CAN、INA、CeNA、(2’-NH)-TNA、(3’-NH)-TNA、α-L-リボ-LNA、α-L-キシロ-LNA、β-D-リボ-LNA、β-D-キシロ-LNA、[3.2.1]-LNA、ビシクロ-DNA、6-アミノ-ビシクロ-DNA、5-エピ-ビシクロ-DNA、α-ビシクロ-DNA、トリシクロ-DNA、ビシクロ[4.3.0]-DNA、ビシクロ[3.2.1]-DNA、ビシクロ[4.3.0]アミド-DNA、β-D-リボピラノシル-NA、α-L-リキソピラノシル-NA、2’-OR-RNA、2’-AE-RNA、及びそれらの組み合わせ及び修飾物から成る群から選択されたもの等のヌクレオチドにより形成され、例えば、DNAプローブ、RNAプローブ、LNAプローブ、及びPNAプローブから成る群から選択されたプローブ等である、請求項55記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項５７】
インターカレータ分子の総数は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、及び21個以上から成る群から選択することができる、請求項55記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項５８】
前記インターカレータ分子の挿入により、前記標的DNA及び/又はRNAと前記相補的プローブとから成るポリヌクレオチド二重鎖の融解温度が上昇する、請求項55乃至57の何れかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項５９】
前記相補的プローブ内のインターカレータ分子の数と塩基の総数との間の比は1:50乃至1:2、例として1:50乃至1:40、例えば1:40乃至1:30、例として1:30乃至1:20、例えば1:20乃至1:10、例として1:10乃至1:5、例えば1:5乃至1:2、又はこれらの間隔の任意の組み合わせとなる、請求項55乃至58の何れかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項６０】
前記2個以上のインターカレータ分子は、TINA、INA、ortho-TINA、para-TINA、及びAMANYから成る群から選択することができる、請求項55記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項６１】
前記オリゴヌクレオチドプローブは、2種類以上のインターカレータ分子、例として2種類、3種類、4種類、5種類、又は5種類以上の異なるインターカレータ分子を含む、請求項55乃至60の何れかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項６２】
前記相補的プローブは、支持体に結合させる、請求項55乃至61の何れかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項６３】
前記支持体は、粒状物質、ビーズ、磁性ビーズ、非磁性ビーズ、ポリスチレンビーズ、磁性ポリスチレンビーズ、セファロースビーズ、セファクリルビーズ、ポリスチレンビーズ、アガロースビーズ、多糖類ビーズ、及びポリカーバメートビーズから成る群から選択される、請求項62記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項６４】
前記支持体は、固体支持体である、請求項60乃至63の何れかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項６５】
前記固体支持体は、マイクロタイタープレート又は他のプレート形式、試薬チューブ、スライドガラス或いはアレイ又はマイクロアレイ解析に用いられる他の支持体、マイクロ流体チャンバ又はデバイスのチューブ又は導管類、及びBiacoreチップから成る群から選択することができる、請求項62記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項６６】
前記オリゴヌクレオチドプローブは、1つ又は複数の標識を含む、請求項55乃至61の何れかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項６７】
前記1つ又は複数の標識は、ビオチン、蛍光標識、5(及び6)-カルボキシフルオレセイン、5-又は6-カルボキシフルオレセイン、6-(フルオレセイン)-5(及び6)-カルボキシアミドヘキサン酸、フルオレセインイソチオシアナート(FITC)、ローダミン、テトラメチルローダミン、染料、Cy2、Cy3、及びCy5、PerCP、フィコビリ蛋白質、R-フィコエリトリン(RPE)、アロフィコエリトリン(APC)、テキサスレッド、プリンストンレッド、緑色蛍光タンパク質(GFP)及びその類似体、R-フィコエリトリン又はアロフィコエリトリンのコンジュゲート、半導体ナノ結晶(量子ドット及びQdotTMナノ結晶等)に基づく無機蛍光標識、Eu3+及びSm3+等のランタニドに基づく時間分解蛍光標識、ハプテン、DNP、ジゴキシゲニン、酵素標識、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ(AP)、ベータガラクトシダーゼ(GAL)、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、β-N-アセチルグルコサミニダーゼ、β-グルクロニダーゼ、インベルターゼ、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ及びグルコースオキシダーゼ(GO)、発光標識、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、1,2-ジオキセタン、ピリドピリダジン、放射能標識、ヨウ化物の同位体、コバルトの同位体、セレンの同位体、トリチウムの同位体、及びリンの同位体から成る群から選択することができる、請求項66記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項６８】
前記インターカレータのインターカレーティング単位は、好ましくは、ポリアロメート及びヘテロポリアロメートから成る群から選択された化学基を含む、請求項55乃至61の何れかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項６９】
前記ポリアロメート及びヘテロポリアロメートは、少なくとも2個の芳香環から成り、例として3個、例えば4個、例として5個、例えば6個、例として7個、例えば8個、例として9個以上の芳香環から成る、請求項68記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項７０】
前記ヘテロポリアロメートは、少なくとも1個の炭素原子が窒素及び酸素から選択されたヘテロ原子に置き換わった少なくとも1個の芳香環を含む、請求項68乃至69記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項７１】
前記ヘテロポリアロメートは、少なくとも2個のヘテロ原子、例として3個のヘテロ原子、例えば4個のヘテロ原子、例として5個のヘテロ原子、例えば6個以上のヘテロ原子を含む、請求項68乃至69記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項７２】
前記ヘテロポリアロメートは、酸素を唯一のヘテロ原子として含む、請求項68乃至69及び71記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項７３】
前記ヘテロポリアロメートは、窒素を唯一のヘテロ原子として含む、請求項68乃至69及び71記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項７４】
前記ヘテロポリアロメートは、窒素及ぶ酸素の両方をヘテロ原子として含む、請求項68乃至69及び71記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項７５】
前記ポリアロメート又はヘテロポリアロメートは、ヒドロキシル、ハロゲン、メルカプト、チオ、シアノ、アルキルチオ、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルボアルコイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ニトロ、アミノ、アルコキシル、及びアミドから成る群から選択された1個又は複数の置換基により置換され、或いは2個の隣接する置換基は、共にN=C-CH又はC=Cを形成し得る、請求項68乃至69記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項７６】
前記インターカレータのインターカレーティング単位は、ポリヌクレオチド二重鎖構造の安定性を高めることが可能なポリアロメート及びヘテロポリアロメートから成る群から選択される、請求項68乃至75の何れかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項７７】
前記インターカレータのインターカレーティング単位は、フェナントロリンと、フェナジンと、フェナントリジンと、ピレンと、アントラセンと、ナフタレンと、フェナントレンと、ピセンと、クリセンと、ナフタセンと、ベンズアントラセンと、スチルベンと、ポルフィリンと、ヒドロキシル、ハロゲン、メルカプト、チオ、シアノ、アルキルチオ、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルボアルコイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ニトロ、アミノ、アルコキシル、及びアミドから成る群から選択された1個又は複数の置換基により置換された前述のインターカレータの何れかと、から成る群から選択され、或いは2個の隣接する置換基は、共にN=C-CH又はC=Cを形成し得る、請求項68乃至76の何れかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項７８】
前記インターカレーティング単位は、2環式芳香環系、3環式芳香環系、4環式芳香環系、5環式芳香環系、及びそれらのヘテロ芳香族類似体及び置換体から成る群から選択され、その特定の実施形態において、前記インターカレーティング単位は、ピレン、フェナントロイミダゾール、及びナフタルイミドから成る群から選択される、請求項55乃至61の何れかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項７９】
前記インターカレーティング単位は、修飾核酸塩基からなる群から選択され、その非限定的な例は、MPyU、AMPyU、Oxo-PyU、及びUが本明細書に開示した他の核酸塩基の何れかに置き換わった類似体であり、特定の一実施形態は、MPyU、AMPyU、Oxo-PyUからなる群から選択されたインターカレーティング単位を対象とする、請求項55乃至61の何れかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項８０】
オリゴヌクレオチドプローブ及び少なくとも2つの脱塩基部位を含む相補的ポリヌクレオチド標的を含む複合体:
ここで、当該オリゴヌクレオチドプローブは15から35ヌクレオチドの長さを有し、かつ、当該オリゴヌクレオチドプローブの骨格構造に挿入された少なくとも2つのインターカレータ分子を含み、かつ、前記少なくとも2つのインターカレータ分子は前記相補的ポリヌクレオチド標的の脱塩基部位に形態学的に入り込む。
【請求項８１】
前記オリゴヌクレオチドプローブは、RNA、α-L-RNA、β-D-RNA、2’-R-RNA、DNA、LNA、PNA、PMO、TNA、GNA、オリゴヌクレオチドN3’→P5’ホスホルアミダート、BNA、α-L-LNA、HNA、MNA、ANA、CAN、INA、CeNA、(2’-NH)-TNA、(3’-NH)-TNA、α-L-リボ-LNA、α-L-キシロ-LNA、β-D-リボ-LNA、β-D-キシロ-LNA、[3.2.1]-LNA、ビシクロ-DNA、6-アミノ-ビシクロ-DNA、5-エピ-ビシクロ-DNA、α-ビシクロ-DNA、トリシクロ-DNA、ビシクロ[4.3.0]-DNA、ビシクロ[3.2.1]-DNA、ビシクロ[4.3.0]アミド-DNA、β-D-リボピラノシル-NA、α-L-リキソピラノシル-NA、2’-OR-RNA、2’-AE-RNA、及びそれらの組み合わせ及び修飾物から成る群から選択されたもの等のヌクレオチドにより形成され、例えば、DNAプローブ、RNAプローブ、LNAプローブ、及びPNAプローブから成る群から選択されたプローブ等である、請求項80記載の複合体。
【請求項８２】
インターカレータ分子の総数は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、及び21個以上から成る群から選択することができる、請求項80記載の複合体。
【請求項８３】
前記インターカレータ分子の挿入により、前記標的DNA及び/又はRNAと前記相補的プローブとから成るポリヌクレオチド二重鎖の融解温度が上昇する、請求項80乃至82の何れかに記載の複合体。
【請求項８４】
前記オリゴヌクレオチドプローブ内のインターカレータ分子の数と塩基の総数との間の比は1:50乃至1:2、例として1:50乃至1:40、例えば1:40乃至1:30、例として1:30乃至1:20、例えば1:20乃至1:10、例として1:10乃至1:5、例えば1:5乃至1:2、又はこれらの間隔の任意の組み合わせとなる、請求項81乃至83の何れかに記載の複合体。
【請求項８５】
前記2個以上のインターカレータ分子は、TINA、INA、ortho-TINA、para-TINA、及びAMANYから成る群から選択することができる、請求項80記載の複合体。
【請求項８６】
前記オリゴヌクレオチドプローブは、2種類以上のインターカレータ分子、例として2種類、3種類、4種類、5種類、又は5種類以上の異なるインターカレータ分子を含む、請求項80乃至84の何れかに記載の複合体。
【請求項８７】
前記オリゴヌクレオチドプローブは、支持体に結合させる、請求項80乃至86の何れかに記載の複合体。
【請求項８８】
前記支持体は、粒状物質、ビーズ、磁性ビーズ、非磁性ビーズ、ポリスチレンビーズ、磁性ポリスチレンビーズ、セファロースビーズ、セファクリルビーズ、ポリスチレンビーズ、アガロースビーズ、多糖類ビーズ、及びポリカーバメートビーズから成る群から選択される、請求項87記載の複合体。
【請求項８９】
前記支持体は、固体支持体である、請求項87乃至88の何れかに記載の複合体。
【請求項９０】
前記固体支持体は、マイクロタイタープレート又は他のプレート形式、試薬チューブ、スライドガラス或いはアレイ又はマイクロアレイ解析に用いられる他の支持体、マイクロ流体チャンバ又はデバイスのチューブ又は導管類、及びBiacoreチップから成る群から選択することができる、請求項89記載の複合体。
【請求項９１】
前記オリゴヌクレオチドプローブは、1つ又は複数の標識を含む、請求項80乃至86の何れかに記載の複合体。
【請求項９２】
前記1つ又は複数の標識は、ビオチン、蛍光標識、5(及び6)-カルボキシフルオレセイン、5-又は6-カルボキシフルオレセイン、6-(フルオレセイン)-5(及び6)-カルボキシアミドヘキサン酸、フルオレセインイソチオシアナート(FITC)、ローダミン、テトラメチルローダミン、染料、Cy2、Cy3、及びCy5、PerCP、フィコビリ蛋白質、R-フィコエリトリン(RPE)、アロフィコエリトリン(APC)、テキサスレッド、プリンストンレッド、緑色蛍光タンパク質(GFP)及びその類似体、R-フィコエリトリン又はアロフィコエリトリンのコンジュゲート、半導体ナノ結晶(量子ドット及びQdotTMナノ結晶等)に基づく無機蛍光標識、Eu3+及びSm3+等のランタニドに基づく時間分解蛍光標識、ハプテン、DNP、ジゴキシゲニン、酵素標識、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ(AP)、ベータガラクトシダーゼ(GAL)、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、β-N-アセチルグルコサミニダーゼ、β-グルクロニダーゼ、インベルターゼ、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ及びグルコースオキシダーゼ(GO)、発光標識、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、1,2-ジオキセタン、ピリドピリダジン、放射能標識、ヨウ化物の同位体、コバルトの同位体、セレンの同位体、トリチウムの同位体、及びリンの同位体から成る群から選択することができる、請求項91記載の複合体。
【請求項９３】
前記インターカレータのインターカレーティング単位は、好ましくは、ポリアロメート及びヘテロポリアロメートから成る群から選択された化学基を含む、請求項80乃至86の何れかに記載の複合体。
【請求項９４】
前記ポリアロメート及びヘテロポリアロメートは、少なくとも2個の芳香環から成り、例として3個、例えば4個、例として5個、例えば6個、例として7個、例えば8個、例として9個以上の芳香環から成る、請求項93記載の複合体。
【請求項９５】
前記ヘテロポリアロメートは、少なくとも1個の炭素原子が窒素及び酸素から選択されたヘテロ原子に置き換わった少なくとも1個の芳香環を含む、請求項93乃至94記載の複合体。
【請求項９６】
前記ヘテロポリアロメートは、少なくとも2個のヘテロ原子、例として3個のヘテロ原子、例えば4個のヘテロ原子、例として5個のヘテロ原子、例えば5個以上のヘテロ原子を含む、請求項93乃至95記載の複合体。
【請求項９７】
前記ヘテロポリアロメートは、酸素を唯一のヘテロ原子として含む、請求項80乃至94及び96記載の複合体。
【請求項９８】
前記ヘテロポリアロメートは、窒素を唯一のヘテロ原子として含む、請求項80乃至94及び96記載の複合体。
【請求項９９】
前記ヘテロポリアロメートは、窒素及ぶ酸素の両方をヘテロ原子として含む、請求項80乃至94及び96記載の複合体。
【請求項１００】
前記ポリアロメート又はヘテロポリアロメートは、ヒドロキシル、ハロゲン、メルカプト、チオ、シアノ、アルキルチオ、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルボアルコイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ニトロ、アミノ、アルコキシル、及びアミドから成る群から選択された1個又は複数の置換基により置換され、或いは2個の隣接する置換基は、共にN=C-CH又はC=Cを形成し得る、請求項93乃至94記載の複合体。
【請求項１０１】
前記インターカレータのインターカレーティング単位は、ポリヌクレオチド二重鎖構造の安定性を高めることが可能なポリアロメート及びヘテロポリアロメートから成る群から選択される、請求項93乃至100の何れかに記載の複合体。
【請求項１０２】
前記インターカレータのインターカレーティング単位は、フェナントロリンと、フェナジンと、フェナントリジンと、ピレンと、アントラセンと、ナフタレンと、フェナントレンと、ピセンと、クリセンと、ナフタセンと、ベンズアントラセンと、スチルベンと、ポルフィリンと、ヒドロキシル、ハロゲン、メルカプト、チオ、シアノ、アルキルチオ、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルボアルコイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ニトロ、アミノ、アルコキシル、及びアミドから成る群から選択された1個又は複数の置換基により置換された前述のインターカレータの何れかと、から成る群から選択され、或いは2個の隣接する置換基は、共にN=C-CH又はC=Cを形成し得る、請求項93乃至101の何れかに記載の複合体。
【請求項１０３】
前記インターカレーティング単位は、2環式芳香環系、3環式芳香環系、4環式芳香環系、5環式芳香環系、及びそれらのヘテロ芳香族類似体及び置換体から成る群から選択され、その特定の実施形態において、前記インターカレーティング単位は、ピレン、フェナントロイミダゾール、及びナフタルイミドから成る群から選択される、請求項80乃至86の何れかに記載の複合体。
【請求項１０４】
前記インターカレーティング単位は、修飾核酸塩基からなる群から選択され、その非限定的な例は、MPyU、AMPyU、Oxo-PyU、及びUが本明細書に開示した他の核酸塩基の何れかに置き換わった類似体であり、特定の一実施形態は、MPyU、AMPyU、Oxo-PyUからなる群から選択されたインターカレーティング単位を対象とする、請求項80乃至86の何れかに記載の複合体。
【国際調査報告】
2013544507.tif 000075
2013544507.tif 000076