(57)【要約】  提供されるのは、統合された試料調製システムおよび安定化酵素混合物である。詳細には、試料を処理し、配列決定法（例えば次世代配列決定法）または他の適切な核酸分析法における使用に適するＤＮＡライブラリーを生成するように構成されたマイクロフリューディックカードが提供される。さらに提供されるのは、酵素（例えば全ゲノム増幅において使用される酵素）、ＢＳＡおよび糖を含有する安定化酵素混合物である。そのような酵素混合物は、凍結乾燥されることができ、酵素活性の顕著な減少を伴うことなく数カ月間室温で保存されうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）生物学的試料の導入のために構成された添加ポート；
ｂ）次の構成要素の１つ以上：
ｉ）廃棄物チャンバー；
ｉｉ）ｉ）混合チャンバーおよびｉｉ）溶解緩衝液を含有する第一密封容器を含む、前記混合チャンバー中の前記生物学的試料を前記溶解緩衝液で溶解して、溶解試料を生成するように構成された、前記添加ポートに作動可能に連結した溶解サブサーキット；
ｉｉｉ）１）前記溶解試料中に存在する核酸に結合するように構成された核酸抽出構成要素、２）洗浄緩衝液を含有する第２密封容器、３）溶出緩衝液を含有する第３密封容器、および４）前記溶出緩衝液を前記核酸抽出構成要素上にポンピングして、抽出核酸の混合物を生成するためにように構成されたポンプ構成要素を含む、前記溶解サブサーキットおよび前記廃棄物チャンバーの両方に作動可能に連結した核酸抽出サブサーキット；
ｉｖ）前記抽出核酸について増幅を実施して、増幅核酸を生成するのに有用である少なくとも１つの増幅関連酵素を含む安定化酵素混合物を含む、前記核酸抽出サブサーキットに作動可能に連結した増幅サブサーキット；
ｃ）ｉ）前記増幅核酸を消化して、断片化核酸を生成するように構成された試薬混合物および／またはｉｉ）前記増幅核酸を機械的に断片化して、断片化核酸を生成するように構成された断片化構成要素を含む、前記増幅サブサーキットに作動可能に連結した断片化サブサーキット；ならびに
ｄ）ｉ）配列決定方法における使用のために構成された核酸リンカー、およびｉｉ）前記核酸リンカーに前記断片化核酸を連結して、核酸配列決定ライブラリーを生成するように構成された連結酵素混合物を含む、前記断片化サブサーキットに作動可能に連結したリンカー連結サブサーキット
を含むマイクロフリューディックカード。
【請求項２】
前記少なくとも１つの増幅関連酵素が、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）、ＰＣＲまたはＴＭＡを実施するのに有用である酵素を含む、請求項１に記載のマイクロフリューディックカード。
【請求項３】
前記少なくとも１つの増幅関連酵素が、Ｐｈｉ−２９ポリメラーゼ、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩ、無機ピロホスファターゼまたはこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１に記載のマイクロフリューディックカード。
【請求項４】
前記安定化酵素混合物が、ｉ）ＢＳＡ、ｉｉ）糖ならびにｉｉｉ）無機塩、二価金属カチオン、緩衝剤、乳化剤および還元剤からなる群から選択される少なくとも１つの追加的構成要素をさらに含む、請求項１に記載のマイクロフリューディックカード。
【請求項５】
前記安定化酵素混合物が、ｉ）ＢＳＡ、ｉｉ）糖，ｉｉｉ）無機塩、ｉｖ）二価金属カチオン、ｖ）緩衝剤、ｖｉ）乳化剤、ｖｉｉ）および還元剤をさらに含む、請求項１に記載のマイクロフリューディックカード。
【請求項６】
ｅ）前記核酸配列決定ライブラリー上の前記リンカーにハイブリダイズするように構成されたアンカー核酸配列を含む核酸精製構成要素を含む、前記リンカー連結構成要素に作動可能に連結した精製サブサーキット
をさらに含む、請求項１に記載のマイクロフリューディックカード。
【請求項７】
前記核酸配列決定ライブラリーの少なくとも一部分を使用者が回収できるように構成された出口ポートをさらに含む、請求項１に記載のマイクロフリューディックカード。
【請求項８】
前記断片化サブサーキットが、前記断片化核酸の末端をポリッシングするように構成された少なくとも１種類の酵素をさらに含む、請求項１に記載のマイクロフリューディックカード。
【請求項９】
前記リンカー連結サブサーキットが、前記核酸配列決定ライブラリーの末端をポリッシングするように構成された少なくとも１種類の酵素をさらに含む、請求項１に記載のマイクロフリューディックカード。
【請求項１０】
ａ）少なくとも１種類の酵素；
ｂ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；
ｃ）糖；
ｄ）無機塩；
ｅ）二価金属カチオン；
ｆ）緩衝剤；
ｇ）乳化剤；および
ｈ）還元剤
を含む安定化酵素混合物。
【請求項１１】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をさらに含む、請求項１０に記載の安定化酵素混合物。
【請求項１２】
凍結乾燥形態である、請求項１０に記載の安定化酵素混合物。
【請求項１３】
前記ＢＳＡが前記安定化酵素混合物中に０．０５％−３．０％の濃度で存在する、請求項１０に記載の安定化酵素混合物。
【請求項１４】
前記糖が前記安定化酵素混合物の５−３５％の濃度で存在する、請求項１０に記載の安定化酵素混合物。
【請求項１５】
前記糖が非還元糖である、請求項１０に記載の安定化酵素混合物。
【請求項１６】
前記少なくとも１種類の酵素がポリメラーゼを含む、請求項１０に記載の安定化酵素混合物。
【請求項１７】
前記少なくとも１種類の酵素が無機ピロホスファターゼを含む、請求項１０に記載の安定化酵素混合物。
【請求項１８】
前記無機塩が前記安定化酵素混合物中に１ｍＭ−２５ｍＭの濃度で存在する、請求項１０に記載の安定化酵素混合物。
【請求項１９】
二価金属カチオンが前記安定化酵素混合物中に１ｍＭ−３０ｍＭの濃度で存在する、請求項１０に記載の安定化酵素混合物。
【請求項２０】
前記緩衝剤が１０ｍＭ−１００ｍＭの濃度で存在する、請求項１０に記載の安定化酵素混合物。
【請求項２１】
前記乳化剤が前記安定化酵素混合物中に０．０１％−０．１５％の濃度で存在する、請求項１０に記載の安定化酵素混合物。
【請求項２２】
前記還元剤が１ｍＭ−１０ｍＭの濃度で存在する、請求項１０に記載の安定化酵素混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、それぞれの全体を全体として参照により本明細書に組み込む、２０１１年５月６日に出願した（本出願と同時出願した）米国特許出願第１３／１０２，５２０号および２０１０年５月６日に出願した米国仮出願第６１／３３１，９１０号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、契約番号ＨＤＴＲＡ−１−０７−Ｃ−００９６の下で合衆国政府の支援と共になされた。合衆国政府は、本発明の一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、統合された試料調製および配列決定システムおよび安定化酵素混合物に関する。詳細には本発明は、試料を処理し、配列決定法（例えば次世代配列決定法）または他の適切な核酸分析法における使用のために適するＤＮＡライブラリーを生成するように構成されたマイクロフリューディックカードを提供し、これらのカードからの出力はＤＮＡ配列決定システムと統合されることができ、自動化および統合された試料を配列決定システムに提供する。本発明は、酵素（例えば全ゲノム増幅において使用される酵素）、ＢＳＡおよび糖を含有する安定化酵素混合物も提供する。そのような酵素混合物は、凍結乾燥されてよく、酵素活性の顕著な減少を伴うことなく数カ月間室温で保存されうる。
【背景技術】
【０００４】
ＤＮＡの配列分析は、配列決定ライブラリーの調製における使用のために多量の抽出されたＤＮＡを必要とする。細胞培養するステップ、細胞を溶解するステップ、ＤＮＡを抽出するステップ、ＤＮＡを断片化するステップ、リンカーを連結するステップおよび配列決定用鋳型の精製の工程は、当業者によって実施されるのに数日間を要しうる多ステップ工程である。配列に基づく検出の問題は、Ｒｏｃｈｅ４５４などの既存の全ゲノム配列決定システムが試料調製のために数日および配列決定のために数日を必要とすることである。図１は、Ｒｏｃｈｅ４５４法などの次世代配列決定技術のための試料調製に関与する現在の冗長な工程を表す流れ図を示している。この図に示すとおり、それは試料前処理；細胞溶解、核酸抽出および全ゲノム増幅（ＷＧＡ）に１日かかる場合がある。次いでそれは、次のステップ：ＤＮＡ断片化；ＤＮＡ末端修復；アダプター連結；断片固定化；ニック修復；１本鎖ＤＮＡ単離；およびエマルジョンＰＣＲ滴定を含むＤＮＡライブラリーの生成のために１から５日間かかる場合がある。最後にそれは、配列決定のための試料調製ならびに次のステップ：バルクエマルジョンＰＣＲ；切断エマルジョンＰＣＲ；ＰＣＲ陽性ビーズ精製；配列決定用ビーズ調製；および配列決定反応の実施を使用する配列決定それ自体に１から４日間かかる場合がある。
【０００５】
必要とされるのは、実施するのがより迅速であり、より容易であるＤＮＡ配列決定ライブラリー調製のための方法およびシークエンサーを伴うこれらの方法の統合である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、統合された試料調製／核酸配列決定システムおよび安定化酵素混合物を提供する。詳細には本発明は、試料を処理し、配列決定法（例えば次世代配列決定法）または他の適切な核酸分析法における使用に適するＤＮＡライブラリーを生成するように構成されたマイクロフリューディックカードを提供する。本発明は、酵素（例えば全ゲノム増幅において使用される酵素）、ＢＳＡおよび糖を含有する安定化酵素混合物も提供する。そのような酵素混合物は、凍結乾燥されてよく、酵素活性の顕著な減少を伴うことなく数カ月間室温で保存されうる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
特定の実施形態において本発明は、ａ）生物学的試料の導入のために構成された添加ポート；ｂ）ｉ）核酸（例えば増幅核酸）を消化して、断片化核酸を生成するように構成された試薬混合物および／またはｉｉ）核酸を機械的に断片化して、断片化核酸を生成するように構成された断片化構成要素を含む断片化サブサーキット、ならびにｃ）ｉ）配列決定法または他の方法における使用のために構成された核酸リンカー、およびｉｉ）前記核酸リンカーを前記断片化核酸に連結して、核酸配列決定ライブラリーを生成するように構成された連結酵素混合物を含む、前記断片化サブサーキットに作動可能に連結したリンカー連結サブサーキット；を含有するマイクロフリューディックカードを提供する。
【０００８】
特定の実施形態において本発明は、ａ）生物学的試料の導入のために構成された添加ポート；ｂ）細胞溶解サブサーキット；ｃ）核酸抽出サブサーキット；ｄ）ｉ）ＰＣＲなどの標的配列特異的増幅またはｉｉ）多置換増幅による全ゲノム増幅などの全核酸増幅サブサーキット、を含む核酸増幅サブサーキット；ｅ）ｉ）核酸（例えば増幅核酸）を消化して、断片化核酸を生成するように構成された試薬混合物および／またはｉｉ）核酸を物理的に断片化して断片化核酸を生成するように構成された断片化構成要素を含む、断片化サブサーキット；ｆ）断片化核酸の末端加工；ｇ）ｉ）配列決定法または他の方法における使用のために構成された核酸リンカー、およびｉｉ）前記核酸リンカーを前記断片化核酸に連結して、核酸配列決定ライブラリーを生成するように構成された連結酵素混合物を含む、前記断片化サブサーキットに作動可能に連結したリンカー連結サブサーキット；ｈ）ｉ）例えばエキソヌクレアーゼを使用して酵素的に、ならびにまたはｉｉ）結合および溶出抽出によって、またはｉｉｉ）ビオチン標識された連結産物などの親和性タグを使用する親和性単離によって実施されうる、連結していないまたは部分的に連結した核酸の除去のための方法；ｉ）酵素的または結合溶出または親和性またはサイズ排除などによる最終的ライブラリー精製；ｊ）配列決定システムとの統合を含む、マイクロフリューディックカードを提供する。
【０００９】
詳細な実施形態において、マイクロフリューディックカードは、次の群１）ｉ）混合チャンバーおよびｉｉ）（例えば密封容器中の）溶解緩衝液を含む、（例えば前記添加ポートに作動可能に連結した）溶解サブサーキット；２）ｉ）溶解試料中に存在する核酸に結合するように構成された核酸抽出構成要素、ｉｉ）（例えば密封容器中の）洗浄緩衝液、ｉｉｉ）（例えば密封容器中の）溶出緩衝液およびｉｖ）（例えば抽出核酸の混合物を生成するために核酸抽出構成要素に溶出緩衝液をポンピングするように構成された）ポンプ構成要素を含む（例えば前記溶解サブサーキットおよび廃棄物チャンバーの両方に作動可能に連結した）核酸抽出サブサーキット；３）抽出核酸について増幅を実施して、増幅核酸を生成するのに有用である少なくとも１つの増幅関連酵素を含む安定化酵素混合物を含む（例えば核酸抽出サブサーキットに作動可能に連結した）増幅サブサーキット；ならびに４）廃棄物チャンバー、から選択される少なくとも１つの追加的サブサーキットをさらに含む。
【００１０】
特定の実施形態において本発明はａ）生物学的試料の導入のために構成された添加ポート、ｂ）核酸について全ゲノム増幅を実施して、増幅核酸を生成するのに有用である少なくとも１つの増幅関連酵素を含む安定化酵素混合物を含む（例えば核酸抽出サブサーキットに作動可能に連結した）増幅サブサーキットを含む、マイクロフリューディックカードを提供する。
【００１１】
いくつかの実施形態において本発明は、ａ）生物学的試料の導入のために構成された添加ポート；ｂ）廃棄物チャンバー；ｃ）ｉ）混合チャンバーおよびｉｉ）溶解緩衝液を含む第１密封容器を含み、混合チャンバー中において溶解緩衝液で生物学的試料を溶解して、溶解試料を生成するように構成された、添加ポートに作動可能に連結した細胞溶解サブサーキット；ｄ）ｉ）溶解試料中に存在する核酸に結合するように構成された核酸抽出構成要素、ｉｉ）洗浄緩衝液を含む第２密封容器、ｉｉｉ）溶出緩衝液を含む第３密封容器およびｉｖ）核酸抽出構成要素に溶出緩衝液をポンピングして、抽出核酸の混合物を生成するように構成されたポンプ構成要素を含む、細胞溶解サブサーキットおよび廃棄物チャンバーの両方に作動可能に連結した核酸抽出サブサーキット；ｅ）抽出核酸において増幅を実施して、増幅核酸を生成するのに有用である少なくとも１種類の増幅関連酵素を含む安定化酵素混合物を含む、核酸抽出サブサーキットに作動可能に連結した増幅サブサーキット；ｆ）ｉ）増幅核酸を消化して、断片化核酸を生成するように構成された試薬混合物および／またはｉｉ）増幅核酸を機械的に断片化して、断片化核酸を生成するように構成された断片化構成要素を含む、増幅サブサーキットに作動可能に連結した断片化サブサーキット；ならびにｇ）ｉ）配列決定法における使用のために構成された核酸リンカー（アダプター）、およびｉｉ）核酸リンカーを断片化核酸に連結して、核酸配列決定ライブラリーを生成するように構成された連結酵素混合物を含む、断片化サブサーキットに作動可能に連結したリンカー連結サブサーキットを含む、マイクロフリューディックカードを提供する。
【００１２】
特定の実施形態において、少なくとも１つの増幅関連酵素は、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）（例えば多置換増幅）を実施するのに有用なまたはＰＣＲを実施するのに有用なまたは転写増幅法（ＴＭＡ）を実施するのに有用な酵素を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの増幅関連酵素は、Ｐｈｉ−２９ポリメラーゼ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、無機ピロホスファターゼまたはこれらの任意の組合せからなる群から選択される。特定の実施形態において増幅関連酵素は、本明細書に記載の次世代配列決定法などの次世代配列決定において使用されるリンカー（アダプター）と組み合わされる。詳細な実施形態において任意の増幅ステップ（例えばＰＣＲ）のために使用されるプライマーは、（例えば増幅産物を固体支持体に繋ぎ止めるために）次世代配列決定法において有用であるリンカーを含む。
【００１３】
詳細な実施形態において安定化酵素混合物は、ｉ）ＢＳＡ、ｉｉ）糖ならびにｉｉｉ）無機塩、二価金属カチオン、緩衝剤、乳化剤および還元剤からなる群から選択される少なくとも１つの追加的構成要素をさらに含む。他の実施形態において安定化酵素混合物は、ｉ）ＢＳＡ、ｉｉ）糖、ｉｉｉ）無機塩、ｉｖ）二価金属カチオン、ｖ）緩衝剤、ｖｉ）乳化剤およびｖｉｉ）還元剤、をさらに含む。
【００１４】
いくつかの実施形態においてマイクロフリューディックカードは、ｈ）核酸配列決定ライブラリー上のリンカーにハイブリダイズするように構成されたアンカー核酸配列を含む核酸精製構成要素を含み、リンカー連結構成要素に作動可能に連結した精製サブサーキット、をさらに含む。他の実施形態においてマイクロフリューディックカードは、核酸配列決定ライブラリーの少なくとも一部分を使用者が回収できるように構成された出口ポートをさらに含む。特定の実施形態において断片化サブサーキットは、断片化核酸の末端をポリッシングするように構成された少なくとも１種類の酵素をさらに含む。詳細な実施形態においてリンカー連結サブサーキットは、核酸配列決定ライブラリーの末端をポリッシングするように構成された少なくとも１種類の酵素をさらに含む。他の実施形態において安定化酵素混合物は、乾燥形態で存在する。いくつかの実施形態において試薬混合物は乾燥形態で存在する。
【００１５】
さらなる実施形態においてポンプ構成要素は、ベローズを含む。他の実施形態において核酸抽出構成要素は、膜を含む。追加的実施形態において核酸抽出構成要素はフィルターを含む。詳細な実施形態においてマイクロフリューディックカードは、複数の弁を含む。追加的実施形態においてカードは、処理機器に作動可能に連結するように、プロセッサーによって操作されるように構成される。他の実施形態においてマイクロフリューディックカードは、処理機器上のニューマチックインターフェースに作動可能に連結するように構成された複数の空気ポートをさらに含む。いくつかの実施形態において核酸リンカーは、ＡＢＩ  ＳＯＬＩＤ、ＩＬＬＵＭＩＮＡ  ＳＯＬＥＸＡ、ＲＯＣＨＥ４５４、ＩＯＮ  ＴＯＲＲＥＮＴ、Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＳＴＡＲＬＩＴＥおよびＰＡＣＩＦＩＣ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ  ＳＭＡＲＴ配列決定からなる群から選択される配列決定法における使用のために構成される。追加的実施形態においてマイクロフリューディックカードは、抽出核酸混合物が増幅を必要とするか否かを測定するように構成された感知器をさらに含む。
【００１６】
本発明の試料調製システムは、（例えばまたは再利用可能なカードまたは使い捨てカードとして）任意の種類の配列決定システムと統合されうる。特定の実施形態において本発明の試料調製システムは、ＨｉＳｅｑ２０００、Ｈｉｓｅｑ１０００、ＨｉＳｃａｎＳＱ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩｘ、ＭｉＳｅｑを含むＩＬＬＩＭＩＮＡ  ＳＯＬＥＸＡシークエンサーと統合され、ＰＩＰＥＬＩＮＥおよび／またはＣＡＳＡＶＡソフトウエアパッケージなどの関連するＩｌｌｕｍｉｎａソフトウエアと共に作動するように構成されうる。他の実施形態において本発明の試料調製システムは、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸ  ＳｙｓｔｅｍおよびＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍを含むＲＯＣＨＥ４５４シークエンサーと統合され、関連するＧＳ  Ｒｕｎ  Ｂｒｏｗｓｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＧＳ  Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＧＳ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｍａｐｐｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＧＳ  Ａｍｐｌｉｃｏｎ  Ｖａｒｉａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＳｏｆｔｗａｒｅおよびＧＳ  ＦＬＸ  Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｃｌｕｓｔｅｒと共に作動するように構成されうる。いくつかの実施形態において本発明の試料調製システムは、Ｉｏｎ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｃｈｉｎｅ（ＰＧＭ）シークエンサーを含むＩＯＮ  ＴＯＲＲＥＮＴシークエンサーと統合され、関連するＤＮＡＳＴＡＲ（登録商標）ＳｅｑＭａｎ（登録商標）ＮＧｅｎ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｐａｒｔｅｋ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｓｕｉｔｅ（商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＳｏｆｔＧｅｎｅｔｉｃｓによるＩｏｎ  ＰＧＭプラットフォームのためのＮｅｘｔＧＥＮｅ（登録商標）ソフトウエアまたはＡｖａｄｉｓ  ＮＧＳ  Ｓｏｆｔｗａｒｅと共に作動するように構成されうる。追加的実施形態において本発明の試料調製システムは、ＰａｃＢｉｏ  ＲＳシークエンサーを含むＰＡＣＩＦＩＣ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳシークエンサーと統合され、関連するＲＳリモートソフトウエア、ＲＳタッチソフトウエア、Ｐｒｉｍａｒｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウエア、ＳＭＲＴ  ＰｏｒｔａｌソフトウエアおよびＳＭＲＴ  Ｖｉｅｗソフトウエアと共に作動するように構成されうる。
【００１７】
いくつかの実施形態において本発明は、本明細書に記載のマイクロフリューディックカード；およびｂ）マイクロフリューディックカードを受け入れ、操作するように構成された処理機器を含むシステムを提供する。特定の実施形態において処理機器は、蓄圧器、真空溜め、少なくとも１つのポンプ、複数の弁、少なくとも１つの加熱器、ニューマチックインターフェースおよび入力−出力コンピューター接続部から選択される少なくとも１つの構成要素を含む。追加的実施形態において処理機器は、蓄圧器、真空溜め、少なくとも１つのポンプ、複数の弁、少なくとも１つの加熱器、ニューマチックインターフェースおよび入力−出力コンピューター接続部を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において本発明は、ａ）少なくとも１種類の酵素；ｂ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；ｃ）糖；およびｄ）緩衝剤ならびに場合によって水を含むまたは本質的にこれらからなるまたはこれらからなる安定化酵素混合物を提供する。特定の実施形態において安定化酵素混合物は、無機塩、二価金属カチオン、乳化剤および還元剤からなる群から選択される少なくとも１つの試薬を、さらに含む、また本質的にこれらからなるまたはこれらからなる。
【００１９】
詳細な実施形態において本発明は、ａ）少なくとも１種類の酵素；ｂ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；ｃ）糖；ｄ）無機塩；ｅ）二価金属カチオン；ｆ）緩衝剤；ｇ）乳化剤およびｈ）還元剤を、含むまたは本質的にこれらからなるまたはこれらからなる安定化酵素混合物を提供する。
【００２０】
特定の実施形態において混合物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えばＰＥＧ−８０００または他の重量）をさらに含む。さらなる実施形態において安定化酵素混合物は、水溶液形態または凍結乾燥形態にある。他の実施形態において安定化酵素混合物は、摂氏２０−４０度で２カ月間保存後に摂氏２０−２５度での水和において酵素にその活性の少なくとも７０％（例えば７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％）を保持させることができる。
【００２１】
さらなる実施形態においてＢＳＡは、安定化酵素混合物中で０．０５％−３．０％の濃度で存在する（例えば０．０５％、０．１０％、０．５％、１．０％、２．０％、３．０％）。さらなる実施形態において糖は、安定化酵素混合物中で５−３５％の濃度で存在する（例えば５％、１５％、２５％、３５％）。他の実施形態において糖は、非還元糖である。さらなる実施形態において糖は、二糖である。追加的実施形態において糖は、トレハロースである。
【００２２】
いくつかの実施形態において少なくとも１種類の酵素は、中温性酵素、熱不安定性酵素または好熱性酵素を含む。追加的実施形態において少なくとも１種類の酵素は、ポリメラーゼを含む。詳細な実施形態においてポリメラーゼは、Ｐｈｉ−２９ポリメラーゼである。さらなる実施形態においてポリメラーゼは、Ｅ．コリポリメラーゼＩである。追加的実施形態において少なくとも１種類の酵素は、無機ピロホスファターゼを含む。特定の実施形態において無機ピロホスファターゼは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）無機ピロホスファターゼである。追加的実施形態において少なくとも１種類の酵素は、Ｐｈｉ−２９ポリメラーゼ、Ｅ．コリＤＮａポリメラーゼＩおよびＳ．セレビシエ無機ピロホスファターゼを含む。
【００２３】
特定の実施形態において無機塩は、安定化酵素混合物中で１ｍＭ−２５ｍＭの濃度で存在する（例えば１ｍＭ、１０ｍＭ、１７ｍＭ、２５ｍＭ）。さらなる実施形態において無機塩は（ＮＨ４）２ＳＯ４である。特定の実施形態において二価金属カチオンは、安定化酵素混合物中で１ｍＭ−３０ｍＭの濃度で存在する（例えば１ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭまたは３０ｍＭ）。詳細な実施形態において二価金属カチオンは、ＭｇＣｌ２である。さらなる実施形態において緩衝剤は、１０ｍＭ−１００ｍＭの濃度で存在する（例えば１０ｍＭ、３５ｍＭ、７５ｍＭ、１００ｍＭ）。いくつかの実施形態において緩衝剤は、Ｔｒｉｓである。
【００２４】
詳細な実施形態において乳化剤は、安定化酵素混合物中で０．０１％−０．１５％の濃度で存在する（例えば０．０１％、０．１％、０．１５％）。いくつかの実施形態において乳化剤は、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ２０またはＴｗｅｅｎ８０である。追加的実施形態において還元剤は、１ｍＭ−１０ｍＭの濃度で存在する（例えば１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ）。特定の実施形態において還元剤は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）である。
【００２５】
いくつかの実施形態において本発明は、ａ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；ｂ）糖；ｃ）無機塩；ならびに場合によって１）二価金属カチオン；２）緩衝剤；３）乳化剤；４）還元剤；および５）水を含む、本質的にこれらからなるまたはこれらからなる、酵素を安定化させるための組成物を提供する。
【００２６】
さらなる実施形態において本発明は、Ｅ．コリポリメラーゼＩおよびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む、本質的にこれらからなるまたはこれらからなり、凍結乾燥組成物である組成物を提供する。詳細な実施形態において凍結乾燥組成物は、摂氏２０−４０度での少なくとも１カ月間、２カ月間または３カ月間保存後の摂氏２０−２５度での水和においてＥ．コリポリメラーゼＩにその活性の少なくとも７０％（例えば７０％、９０％、１００％）を保持させることができる。
【００２７】
特定の実施形態において本発明は、無機ホスファターゼおよびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む、本質的にこれらからなるまたはこれらからなり、凍結乾燥組成物である組成物を提供する。いくつかの実施形態において凍結乾燥組成物は、摂氏２０−４０度での２カ月間の保存後の摂氏２０−２５度での水和において無機ホスファターゼにその活性の少なくとも７０％（例えば７０％、９０％、１００％）を保持させることができる。
【００２８】
さらなる実施形態において本発明は、ａ）ｉ）少なくとも１種類の酵素；ｉｉ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；ｉｉｉ）糖；ｉｖ）無機塩；ｖ）二価金属カチオン；ｖｉ）緩衝剤；ｖｉｉ）乳化剤；およびｖｉｉｉ）還元剤を含む、本質的にこれらからなるまたはこれらからなる凍結乾燥組成物を提供するステップ、ならびにｂ）摂氏２０−２５度での水和において少なくとも１つの酵素がその活性の少なくとも７０％を保持するように摂氏１５−４５度の保存温度で少なくとも１５日間凍結乾燥組成物を保存するステップを含む、凍結乾燥組成物の保存方法を提供する。さらなる実施形態において少なくとも１５日間は、少なくとも３０日間（少なくとも３０日間、６０日間、９０日間、１２０日間またはより長く）である。特定の実施形態において保存温度は、摂氏２０−２５度である。いくつかの実施形態において少なくとも１つの酵素は、Ｅ．コリポリメラーゼＩ、Ｐｈｉ−２９ポリメラーゼおよび無機ピロホスファターゼから選択される。
【００２９】
特定の実施形態において本発明は、ａ）ｉ）Ａ）少なくとも１種類の酵素；Ｂ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；Ｃ）糖；Ｄ）無機塩；Ｅ）二価金属カチオン；Ｆ）緩衝剤；Ｇ）乳化剤；およびＨ）還元剤を含む、本質的にこれらからなるまたはこれらからなる水溶性組成物；ならびにｉｉ）透析膜；を提供するステップ；ならびにｂ）ｉ）糖；ｉｉ）無機塩；ｉｉｉ）二価金属カチオン；ｉｖ）緩衝剤；ｖ）乳化剤；およびｖｉｉ）還元剤を含む、本質的にこれらからなるまたはこれらからなる水溶液中に透析膜で水溶性組成物を透析するステップ、ｃ）凍結組成物を生成するために水溶性組成物を凍結させるステップ；ならびにｄ）凍結乾燥組成物が生成されるように昇華を介して水を除去するために凍結組成物を高真空に供するステップを含む、安定化酵素組成物を生成する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】Ｒｏｃｈｅ４５４法などの次世代配列決定技術のための試料調製に関与する現在の冗長な工程を表すフローチャートである。
【図２】例示的な射出成形マイクロフリューディックカードおよびカードを形成しうる種々の層を示す図である。図２は、細胞溶解、ＤＮＡ抽出および全ゲノム増幅の３つの最初のサブサーキットも記載する。
【図３】試料入口ポート、ＤＮＡ抽出サーキットおよび凍結乾燥酵素（例えば下の実施例１において記載されるものなど）を含む増幅サーキットを含む、表示された種々のサブサーキットを有する例示的マイクロフリューディックカードを示す図である。
【図４】マイクロフリューディックカードを利用する試料調製工程のステップ１を示す図である。この図は、試料入口ポートおよび混合チャンバーを詳細に示す。
【図５】溶解ステップであるステップ２を示す図である。ブリスター包装からの溶解緩衝液は、細胞が溶解されるように試料由来の細胞と共に混合チャンバーに流入する。
【図６】溶解混合物が、捕獲フィルター上を通過し、次いで廃棄物チャンバーに向かうステップ３を示す図である。ブリスター包装からの第１洗浄緩衝液は次いで廃棄物チャンバーへ向かう前にフィルターを通過する。
【図７】第２洗浄液が捕獲フィルターを通過し、次いで廃棄物チャンバーへ向かうステップ４を示す図である。次いでフィルターは、洗浄緩衝液を除くために空気乾燥される。
【図８】溶出ベローズを使用してブリスター包装からの溶出緩衝液がフィルターから精製核酸を取り出す、ステップ５を示す図である。溶出ベローズは、溶出緩衝液をフィルター上にゆっくりポンピングする。
【図９】溶解および抽出ステップを評価するために本発明の実施形態の開発において使用された、３つの参照試料（Ｓ．アルレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）；Ｂ．セレウス（Ｓ．ｃｅｒｅｕｓ）；およびＫ．ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））を記載する図である。
【図１０】Ｓ．アルレウス、Ｂ．セレウスおよびＫ．ニューモニエを使用する溶解および抽出サブサーキットの最終検証の結果を示す図である。示された結果は、Ｂ．セレウスおよびＫ．ニューモニエの１０，０００ＣＦＵならびにＳ．アルレウスの新鮮増殖培地の導入についてである。
【図１１】汚染のない全ゲノム増幅試薬の作製を示す図である。
【図１２】精製核酸試料がカード中の試薬（安定化酵素混合物凍結乾燥ビーズを含む）と共に増幅サブサーキット中を通る、ステップ６を示す図である。
【図１３】カード中に試薬（安定化酵素混合物凍結乾燥ビーズを含む）を備える例示的マイクロフリューディックカードおよび緩衝液包装の配置を示す図である。
【図１４】従来技術ＷＧＡ酵素混合物が、室温では５日間だけの安定性を有して保存時に安定でなかったことを示す図である。図１４は、下の実施例１において提供される増幅酵素の凍結乾燥混合物の有利点も記載する。
【図１５】多数の賦形剤製剤がＰｈｉ−２９、ポリメラーゼＩおよび無機ピロホスファターゼとの適合性について検査された（実施例１において）ことを示す図である。
【図１６】ＢＳＡが増幅酵素の安定化のために重要な構成要素であることを示している、実施例１からの結果を示す図である。
【図１７】実施例１に記載のとおり、多数のＢＳＡレベル（最終濃度０．１３％−１％）および（最終濃度）０．５％のＰＥＧ−８０００の添加が酵素安定化製剤において検査されたことを示す図である。
【図１８】Ｉｂｉｓ製剤３３中の凍結乾燥酵素が室温で４カ月間保存された場合に新鮮酵素と同等に作用したことを示す図である。
【図１９】Ｉｂｉｓ製剤３３中の凍結乾燥酵素が摂氏４０度での２カ月後に新鮮酵素と同等に作用したことを示す図である。
【図２０】（廃棄物パッドおよび液体試薬を備える）成形カートリッジ、上蓋、積層底およびニューマチックガスケットを含む例示的マイクロフリューディックカードを示す図である。
【図２１】例示的緩衝液ブリスター包装の画像を示す図である。図２１は、マイクロフリューディックカード上の成形刃が、ブリスター包装に穴を開けてそれらに保存されている試薬を放出するためにどのように使用されうるかを記載する。
【図２２】マイクロフリューディックカードと相互作用するおよび操作するために使用される例示的処理機器を示す模式図である。
【図２３】処理機器と共に作動する消耗マイクロフリューディックカードの例示的システム概観を示す図である。
【図２４】物理的または酵素的のいずれかの方法での増幅試料の断片化の例示的結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
（定義）
本明細書において使用される用語「マイクロフリューディックカード」は、選択された内部チャネル、空所または少なくとも１つの寸法がおよそ０．１から５００ミクロンである他のマイクロ構造を有するデバイス、カートリッジまたは「カード」を意味する。マイクロフリューディックデバイスは、レーザー謄写、型押し、スタンピング、射出成形、マスキング、エッチングおよび３次元ソフトリソグラフィーなどの技術を使用して種々の材料から作製されうる。積層マイクロフリューディックデバイスは、粘着性中間層または、方向性ポリプロピレンの圧力処置によってなどの熱性非粘着性結合技術でさらに作製される。積層化された成形マイクロフリューディックデバイスの微小構造は、異なっている場合がある。特定の実施形態において本発明のマイクロフリューディックカードは、制御インターフェースならびに場合による温度および磁気的インターフェースを提供するホスト機器と相互作用するまたは「ドッキングされる」ように設計される。しかしカードは、一般にアッセイを実施するために必要な全ての生物学的試薬を含有しており、１つ以上の試料の添加だけを必要とする。これらのカードは一般に使い捨て、１回限りの使用で使用中および廃棄において生物学的有害物質への暴露の危険を最小化するために、一般に衛生的機能を有して製造される。
【００３２】
用語「全ゲノム増幅」または「ＷＧＡ」は、本明細書において一般に、元の試料から識別不能だが高いＤＮＡ濃度を有する新たな試料を生成するために（標的ＷＧＡが使用される場合を除いて）非特異的なやり方で限られた試料の増幅のための方法を意味する。理想的な全ゲノム増幅技術は、元の配列表現を維持する一方で、試料をマイクログラム程度に至るまで増幅する。試料のＤＮＡは、ゲノム全体またはこの一部分を含む場合がある。縮重オリゴヌクレオチドプライムＰＣＲ（ＤＯＰ）、プライマー伸長ＰＣＲ技術（ＰＥＰ）および多置換増幅（ＭＤＡ）は、全ゲノム増幅法の例である。
【００３３】
用語「多置換増幅」は本明細書において、ＤＮＡを変性させるためのランダムヘキサマー（または標的法においては非ランダムプライマー）のアニーリングに続く一定温度での鎖置換合成に基づく、ＰＣＲに基づかない等温性の方法を意味する。これは小さなゲノムのＤＮＡ試料に適用されていて、限定的な配列表現偏向を有する高分子量ＤＮＡの合成を導いている。ＤＮＡが鎖置換によって合成されることから、生じるプライミング事象の数が徐々に増加し、高分岐ＤＮＡ構造のネットワークが形成される。反応は、例えばＰｈｉ−２９ＤＮＡポリメラーゼによってまたはＢｓｔＤＮＡポリメラーゼの大断片によって触媒されうる。
【００３４】
詳細な記載
本発明は、統合試料調製システムおよび安定化酵素混合物を提供する。詳細には本発明は、試料を処理するステップおよび配列決定法（例えば次世代配列決定法）または他の適切な核酸分析法における使用に適しているＤＮＡライブラリーを生成するステップのために構成されたマイクロフリューディックカードを提供する。本発明は、酵素（例えば全ゲノム増幅において使用される酵素）、ＢＳＡおよび糖を含有する安定化酵素混合物も提供する。そのような酵素混合物は、凍結乾燥されることができ、酵素活性の顕著な減少を伴うことなく数カ月間室温で保存されうる。
【００３５】
Ｉ．マイクロフリューディックカードおよび機器
本発明は、いくつかの分子生物学的工程／ステップの、マイクロフリューディックカードを使用する単一の統合されたシステムへの統合を提供する。次いで統合された方法は、例えば（臨床的、生物学的、環境的）試料の採取および細胞の溶解、核酸の抽出、抽出核酸の増幅（例えば全ゲノム増幅）、増幅核酸の断片化、ＤＮＡ断片末端の加工、リンカーの連結および処理された核酸（例えば配列決定に適するＤＮＡ配列決定ライブラリー）の精製のために使用されうる。統合された工程は、処理時間、労働を劇的に低減させ、自動制御および１回限りの使用のシステム内に統合され品質管理された試薬の使用を通じて工程の一貫性を改善する。
【００３６】
工程全体が、工程を実施するために必要な全ての試薬を含む１回限りの使用のマイクロフリューディックカードに統合されうる。いくつかの実施形態において工程の廃棄物もカード中に含まれる。試薬は安定化されることができ、それによりカードは室温で長期間保存されうる。カードは、一般に得られた処理物が取り出され、サンガー配列決定、ＡＢＩ  ＳＯＬＩＤ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｏｌｅｘａ、Ｒｏｃｈｅ４５４、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ、ＡＢＩ  Ｓｔａｒｌｉｔｅ、ＰａｃＢｉｏ  ＳＭＲＴおよび他の核酸分析技術などの種々のＤＮＡ配列決定技術で使用されうるための出口ポートを含む。
【００３７】
特定の実施形態において、Ｍｉｃｒｏｎｉｃｓ  Ｉｎｃ．によって製造され、彼らの特許公報に記載されたマイクロフリューディックカードは、本発明の一部として使用される。Ｍｉｃｒｏｎｉｃｓ’ＰａｎＮＡＴ（商標）分子診断プラットフォームは、それぞれが単一のおよび／または複数の核酸増幅アッセイを実施するように設計された別々のカートリッジの処理が可能な好都合な、電池式および／または商用電源式の機器として記載されている。各アッセイは、必要な全ての試薬を含む使い捨てカートリッジに完全に統合される。少量の生物学的試料だけがアッセイの実施のために必要とされる。特定のＭｉｃｒｏｎｉｃｓカードの記載は、本明細書において全体が説明されたのと同様にその全体を参照により本明細書に組み込む米国特許出願公開第２００９０３２５２７６号において提供される。特定の実施形態において、本発明で使用されるマイクロフリューディックカードは、以下の段落において記載されるものである。
【００３８】
マイクロフリューディックカードは、独立したアッセイモジュールに対応する複数のサブサーキットから形成されるが、単一のデバイスにまたは２つ以上の相互接続したデバイスに合わせて統合される。さらに各サブサーキットは、好ましくはマイクロフリューディック要素または構成要素で構成されている。これらのサブサーキットの要素は、マイクロフリューディックチャネル、ティー、チャンバー、弁、フィルター、固相捕獲要素、単離フィルター、ニューマチック多岐管、ブリスター包装（例えば試薬袋と共に）、廃棄物隔離チャンバー、衛生ベント、ベローズチャンバー、ベローズポンプ、光学的窓、検査用パッドおよび脱水された試薬のマイクロチャネル保管場所を含むことができ、場合によって緩衝剤、溶解剤および不動態化剤を含む。サブサーキットは、一般にプラスチックで製造され、積層化によって、成形によっておよびリソグラフィーによってまたはこれらの技術の組合せによって製造されうる。
【００３９】
典型的にはカードデバイスは、１つ以上の試料を導入した後は、いかなる生物学的有害物質も廃棄用に永久にカード中に封じ込められるようにデバイスが密封されることを意味する一回導入式（ｓｉｎｇｌｅ  ｅｎｔｒｙ）である。しかし特定の実施形態においてカードは、得られたＤＮＡライブラリーを取り出すための出口ポートを有する。典型的にはカードは、内蔵式であり、アッセイのために必要ないかなる試薬も製造者によってデバイスと共に供給される。マイクロフリューディックデバイスが場合によって分析データの処理における助力としてのＲＦＩＤ、マイクロチップ、バーコードおよび標示も含みうることならびにカード接続のためのホスト機器は場合によって高性能の機器であり、患者データおよび検査結果をネットワークに伝達できることは理解される。
【００４０】
「マイクロチャネル」とも称されるマイクロフリューディックチャネルは、種々の長さを有する流路であるが、横断面における一方向は５００ｕｍより短い。マイクロフリューディックチャネルにおけるマイクロフリューディック流体挙動は、非常に非理想的、層状で末端間または横断面の圧力降下よりも、さらに壁面の湿潤特性、粗度、液体の粘性、付着性および粘着性に依存する可能性がある。マイクロフリューディック流動様式は、しばしばチャネル中の「実質的な液体壁」の存在と関連する。マイクロフリューディックチャネルは、「ティー」によって相互にまたは他の処理構成要素と液体的に連結される。弁は、マイクロフリューディックチャネル中に形成され、従来技術で使用されるように逆止め弁、ニューマチック逆止め弁、ピンチ弁、表面張力弁などであってよい。
【００４１】
電気的に活性化される弁も使用されうるが、カードデバイスは一般にそれを覆い、制御および液体操作に役立つニューマチック多岐管を含む。空気孔は、ニューマチック多岐管および一般に稼働ベローズポンプに連結される。弁が空気圧で始動されると、空気ポートも関係する。空気ポートは、デバイス内からの液体の漏出が望ましくないおよび安全でない場合に、疎水性単離フィルター（例えば任意の液体不透過性、気体透過性フィルター膜）と共に提供される場合がある。弁は一般にニューマチック多岐管には直接連結されず、その中の圧力を均一にするために作用する。
【００４２】
反応チャンバーは、マイクロフリューディックカード上に提供され、矩形チャンバー、環状チャンバー、テーパーチャンバー、蛇行チャネルおよび反応を実施するための種々の幾何図形的配置などの任意の適切な形状であってよい。これらのチャンバーは、検出チャンバーにおいてと同様に内容物の調査のための窓を有する場合がある。廃棄物隔離容器は、マイクロフリューディックカード上に一般に提供される。廃棄物容器は、場合によって衛生的疎水成膜と共に排出される。
【００４３】
図２は、例示的な射出成形マイクロフリューディックカードおよびカードを形成しうる種々の層を示す。図２は、細胞溶解、ＤＮＡ抽出および全ゲノム増幅の３つの最初のサブサーキットも記載する。
【００４４】
図３は、試料入口ポート、ＤＮＡ抽出サーキットおよび凍結乾燥酵素（例えば下の実施例１において記載されるものなど）を含む増幅サーキットを含む、表示された種々のサブサーキットを有する例示的マイクロフリューディックカードを示す。
【００４５】
図４は、マイクロフリューディックカードを利用する試料調製工程のステップ１を示す。この図は、試料入口ポートおよび混合チャンバーを詳細に示す。
【００４６】
図５は、溶解ステップであるステップ２を示す。ブリスター包装からの溶解緩衝液は、細胞が溶解されるように試料由来の細胞と共に混合チャンバーに流入する。
【００４７】
図６は、溶解混合物が、捕獲フィルター上を通過し、次いで廃棄物チャンバーに向かうステップ３を示す。ブリスター包装からの第１洗浄緩衝液は次いで廃棄物チャンバーへ向かう前にフィルターを通過する。
【００４８】
図７は、第２洗浄液が捕獲フィルターを通過し、次いで廃棄物チャンバーへ向かうステップ４を示す。次いでフィルターは、洗浄緩衝液を除くために空気乾燥される。
【００４９】
図８は、溶出ベローズを使用してブリスター包装からの溶出緩衝液がフィルターから精製核酸を取り出す、ステップ５を示す。溶出ベローズは、溶出緩衝液をフィルター上にゆっくりポンピングする。
【００５０】
図９は、溶解および抽出ステップを評価するために本発明の実施形態の開発において使用された、３つの参照試料（Ｓ．アルレウス；Ｂ．セレウス；およびＫ．ニューモニエ）を記載する。
【００５１】
図１０は、Ｓ．アルレウス、Ｂ．セレウスおよびＫ．ニューモニエを使用する溶解および抽出サブサーキットの最終検証の結果を示す。示された結果は、Ｂ．セレウスおよびＫ．ニューモニエの１０，０００ＣＦＵならびにＳ．アルレウスの新鮮増殖培地の導入についてである。
【００５２】
図１１、汚染のない全ゲノム増幅試薬の作製。特定の実施形態においてＷＧＡのために使用される試薬は、ＤＮＡ吸着ユニットおよび０．２ｕＭ滅菌フィルターを通過する。得られるのは精製された試薬であり、ネガティブコントロールは１２時間後であってもＤＮＡを産生しない。
【００５３】
図１２は、精製核酸試料が増幅サブサーキットを通過するステップ６を示す。このサーキットにおいて全ゲノム増幅は、精製試料が増幅緩衝液（溶出緩衝液と同じであってよい）と混合し、摂氏９５度まで加熱されるゾーンを使用して実施されることができ、次いで摂氏３０度で増幅酵素と混合する反応ゾーンに移されうる。酵素は、下の実施例１において記載される安定化酵素混合物の部分である凍結乾燥された増幅酵素であることが好ましい。
【００５４】
図１３は、カード中に乾燥された試薬（安定化酵素混合物凍結乾燥ビーズを含む）を備える例示的マイクロフリューディックカードおよび緩衝液包装の配置を示す。
【００５５】
図１４は、従来技術ＷＧＡ酵素混合物が室温では５日間だけの安定性を有して保存時に安定でなかったことを示す。図１４は、下の実施例１において提供される増幅酵素の凍結乾燥混合物の有利点も記載する。
【００５６】
図２０は、（廃棄物パッドおよび液体試薬を備える）成形カートリッジ、上蓋、積層底およびニューマチックガスケットを含む例示的マイクロフリューディックカードを示す。
【００５７】
図２１は、例示的緩衝液ブリスター包装の画像を示す。図２１は、マイクロフリューディックカード上の成形刃がどのようにブリスター包装に穴を開けて、それらに保存されている試薬を放出するために使用されうるかを記載する。
【００５８】
図２２は、マイクロフリューディックカードと相互作用するおよび操作するために使用される例示的処理機器の模式図を示す。この図において記載されるとおり処理機器は、機器を作動させるプロセッサー、ＵＳＢまたはイーサーネット接続を含みうる入出力、使用者に状態を提供するためのＬＣＤ画面および使用者制御のためのタッチスクリーンを含む。処理機器は、空気ポンプ、レギュレーター、多岐弁、圧力／真空リザーバーおよび弁を含むニューマチックシステムも含みうる。プロセッサーは、クランプ、ニューマチック多岐管および加熱器とのカード／カートリッジインターフェースも含みうる。
【００５９】
図２３は、処理機器と共に作動する消耗マイクロフリューディックカードの例示的システム概観を示す。
【００６０】
図２４は、物理的または酵素的手段のいずれかでのＷＧＡ増幅試料の断片化の例示的結果を示す。そのような断片化は、ステップ７でマイクロフリューディックカード中の断片化サブサーキットにおいて実施されうる。増幅された試料は、断片化サブサーキットに移されてよく、次いで機械的剪断を使用して（例えば断片化サブサーキット中の開口部を通過することによって）断片化されうるまたは制限酵素に供されてもよい。使用されうる断片化法は、これだけに限らないが例えば制限酵素または切断プライマーでの切断を含む。制限酵素および切断プライマーを使用する方法は、当業者に十分に周知である。断片の末端は、次いでクレノウ断片のように酵素で加工されうる。
【００６１】
特定の実施形態において、マイクロフリューディックカード中の次のサブサーキットは、リンカー連結サブサーキットである。このサブサーキットにおいてリンカーは、断片化核酸の末端に連結される。好ましくはリンカーは、ＡＢＩ  ＳＯＬＩＤ、ＩＬＬＵＭＩＮＡ  ＳＯＬＥＸＡ、ＲＯＣＨＥ４５４、ＩＯＮ  ＴＯＲＲＥＮＴ、ＡＢＩ  ＳＴＡＲＬＩＴＥおよびＰＡＣＩＦＩＣ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ  ＳＭＲＴ配列決定において使用されるものなどの、配列決定法において使用されるものである。これらの配列決定技術および関連するリンカーについての記載は、下にさらに提供される。
【００６２】
ＩＩ．全ゲノム増幅法
特定の実施形態においてマイクロフリューディックカードは、増幅サブサーキットにおいて全ゲノム増幅（ＷＧＡ）を実施するために必要な、十分なまたは有用な試薬を有する。本発明が増幅方法としてＷＧＡに限定されず、どちらも当技術分野において十分に周知のＰＣＲまたはＴＭＡなどのその他の任意の種類の適切な増幅技術（および対応する試薬）が使用されうることは記載される。
【００６３】
Ａ．非標的ＷＧＡ
遺伝子診断、癌研究または法医学などの研究の多数の分野において、ゲノムＤＮＡの不足は、試料に実施されうる遺伝子検査の種類および量の重大な制限要因となる場合がある。この問題を克服するために設計された１つの手法が全ゲノム増幅（ＷＧＡ）である。元の試料と識別不能だが高いＤＮＡ濃度を有する新たな試料を生成するために、目標は限定的なＤＮＡ試料を非特異的方法で増幅することである。典型的な全ゲノム増幅技術の目的は、元の配列表現を尊重する一方で、試料をマクログラムレベルにまで増幅することである。
【００６４】
最初の全ゲノム増幅法は１９９２年に記載され、ポリメラーゼ連鎖反応の原理に基づいていた。Ｚｈａｎｇら（Ｚｈａｎｇ  Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９２年、８９：５８４７−５８５１頁、参照により本明細書に組み込む）はプライマー伸長ＰＣＲ技術（ＰＥＰ）を開発し、Ｔｅｌｅｎｉｕｓらは（Ｔｅｌｅｎｉｕｓら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１９９２年、１３（３）：７１８−２５頁、参照により本明細書に組み込む）は縮重オリゴヌクレオチドプライマーＰＣＲ法（ＤＯＰ−ＰＣＲ）を設計した  Ｚｈａｎｇ  Ｌ．ら、１９９２年）。
【００６５】
ＤＯＰ−ＰＣＲは、Ｔａｑポリメラーゼおよび、ヒトゲノム中のおよそ１００万部位に低アニーリング温度で結合する半縮重オリゴヌクレオチド（例えばＣＧＡＣＴＣＧＡＧＮＮＮＮＡＴＧＴＧＧ（配列番号１）など、ここでＮ＝Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ）を使用する方法である。最初のサイクルに、高いアニーリング温度の多数のサイクルが続き、最初のステップで標識された断片の増幅を可能にする。
【００６６】
多置換増幅（ＭＤＡ、鎖置換増幅；ＳＤＡとしても周知）は、ランダムヘキサマーの変性ＤＮＡへのアニーリングに続く一定温度での鎖置換合成に基づく、ＰＣＲに基づかない等温性の方法である（Ｂｌａｎｃｏら、１９８９年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：８９３５−４０頁、参照により本明細書に組み込む）。これは小さなゲノムのＤＮＡ試料に適用されており、限定的な配列表現偏向を有する高分子量ＤＮＡの合成を導いている（Ｌｉｚａｒｄｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９８年、１９、２２５−２３２頁；Ｄｅａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００２年、９９、５２６１−５２６６頁、両者を参照により本明細書に組み込む）。ＤＮＡが鎖置換によって合成されることから、生じるプライミング事象の数が徐々に増加し、高分岐ＤＮＡ構造の網目が形成される。反応は、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼによってまたはＢｓｔＤＮＡポリメラーゼの大断片によって触媒されうる。Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼより１００倍低いエラー率をもたらすプルーフリーディング活性を有する。
【００６７】
いくつかの実施形態において、多数の置換増幅のために使用される反応混合物は、複数のポリメラーゼ酵素を含む。いくつかの実施形態において触媒活性は、５’−３’ＤＮＡポリメラーゼ活性、３’−５’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性および、５’−３’除去修復活性などのＤＮＡ修復活性を含む。種々のポリメラーゼ酵素の例は、これだけに限らないが以下の；Ｐｈｉ２９、クレノウ断片、Ｔ４ポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、ＢｓｔＥポリメラーゼ、Ｅ．コリＰｏｌ  Ｉ、Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ、Ｖｅｎｔ  ｅｘｏ−、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ｅｘｏ−、ＫＯＤ  ＨｉＦｉ、Ｐｆｕ  ｕｌｔｒａ、Ｐｆｕ  ｔｕｒｂｏ、Ｐｆｕ  ｎａｔｉｖｅ、Ｐｆｕ  ｅｘｏ−、Ｐｆｕ  ｅｘｏ−Ｃｘ、Ｐｆｕ  ｃｌｏｎｅｄ、ＰＲＯＯＦＳＴＡＲＴ（Ｑｉａｇｅｎ）、ｒＴｔｈ、ＴｇｏおよびＴｆｕ  Ｑｂｉｏを含む。これらのポリメラーゼは周知であり、ほとんどが商業的に入手できる。
【００６８】
他の実施形態において、例えばヘリカーゼ、ジャイレース、Ｔ４Ｇ３２およびＳＳＢＰ例えばなどの、他の非ポリメラーゼ酵素またはアクセサリータンパク質はＭＤＡ反応混合物中に含まれる。いくつかの実施形態においてＭＤＡ用の反応混合物は、ピロリン酸をリン酸に転換するために作用するピロホスファターゼを含む。ピロリン酸は、増幅反応の結果として反応混合物中に蓄積する（１等量のピロリン酸は添加され取り込まれた各デオキシヌクレオチド三リン酸から生成され、増幅反応を阻害することが周知である）。いくつかの実施形態において、約０．００４単位のピロリン酸が反応混合物に添加される。
【００６９】
Ｂ．標的ＷＧＡ
特定の実施形態において標的全ゲノム増幅（ＴＷＧＡ）は、本発明の一部として使用される。標的ＷＧＡは、例えば、参照により本明細書に組み込む米国特許出願公開第２０１０００３５２３２号に記載されている。
【００７０】
標的全ゲノム増幅プライマーの設計のための標的ゲノム
いくつかの好ましい実施形態において、１つ以上の標的ゲノムが選択される。標的ゲノムの選択は分析の目的によって決定される。例えば標的全ゲノム増幅工程の望ましい結果が、生物戦争攻撃の現場において土壌試料中に存在することが疑われるバチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）などの生物戦争生物のゲノムを代表する核酸を得ることである場合は、ただ１つの標的ゲノムとしてバチルス・アントラシスのゲノムを選択することを選ぶことができる。一方標的全ゲノム増幅工程の望ましい結果が、潜在的生物兵器剤の群などの細菌群を代表する核酸を得ることである場合は、次の細菌：バチルス・アントラシス、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、エルシニア・ペスチス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、ブルセラ属種（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐ．）、バークホルデリア・マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ）、リケッチア・プロワゼキイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）およびエシュリキア・コリ０１５７（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ０１５７）の任意または全てを含む群のように複数の標的ゲノムが選択されうる。同様に、異なるゲノムまたはゲノム群が、他の目的のための（１つ以上の）標的ゲノムとして選択されうる。例えばヒトゲノムまたはミトコンドリアＤＮＡは、犯罪が行われた可能性がある場所の土壌試料または他の環境試料中に見出される一般的ゲノムに優先して標的になりうる。したがって従来の方法および組成物は、適用されることができ、ヒトゲノム（標的）はバックグラウンドゲノムに優先して選択的に増幅されうる。他の例は、呼吸器疾患を生じるウイルス群、敗血症を生じる病原体または家庭を汚染することが周知の真菌群のゲノムを含みうる。
【００７１】
標的全ゲノム増幅プライマーの設計のためのバックグラウンドゲノム
バックグラウンドゲノムは、存在する特定の生物の核酸の可能性に基づいて選択されうる。例えばヒトによって取り扱われた土壌試料は、これだけに限らないが、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、ガルス・ガルス（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）、ギラルディア・テータ（Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ  ｔｈｅｔａ）、オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、サッカロマイセス・セレビシエ、デバイヨマイセス・ハンセニイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）、クリベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、シゾサッカロマイセス・ポム（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍ）、アスペルギルス・フミガータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、エンセファリトゾーン・クニクリ（Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎ  ｃｕｎｉｃｕｌｉ）、エレモテシウム・ゴシッピー（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、アピス・メリフェラ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）、ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、トリボリウム・カスタネウム（Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ  ｃａｓｔａｎｅｕｍ）、アノフェレス・ガンビアエ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ）およびカエノルハブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）を含む生物のゲノムを代表する核酸を含有することが期待される。任意のまたはこれら全てのゲノムは、試料中のバックグラウンドゲノムを評価するために適している。任意の特定の試料中の実際の生物は、供給原および／または環境に基づいて各試料について変化する。したがってバックグラウンドゲノムは、試料中に実際に存在する生物の独自性に基づいて選択されうる。試料の成分は、当業者に周知の任意の多数の技術を使用して測定されうる。さらなる実施形態において、プライマーは、試料中の１つ以上のバックグラウンド生物の実際の同定に基づいておよび試料中に存在する任意のさらなる１つ以上のバックグラウンド生物の可能性に基づいて設計されうる。
【００７２】
プライマーハイブリダイゼーション部位としての固有ゲノム配列セグメントの同定
試料の標的およびバックグラウンドゲノムが測定されると、次のステップはプライマーハイブリダイゼーション部位として有用な標的ゲノム中のゲノム配列セグメントを同定することである。所与の標的全ゲノム増幅の効率は、プライマーの効果的な使用に依存する。全ゲノムを代表する増幅産物を産生するためにプライマーハイブリダイゼーション部位は、ゲノムの長さにわたって適切な間隔を有するべきである。好ましくはプライマーハイブリダイゼーション部位間の平均間隔距離は、約１０００核酸塩基またはそれ未満である。より好ましくは平均間隔は長さ約８００核酸塩基またはそれ未満である。さらに好ましくは平均間隔は長さ約６００核酸塩基またはそれ未満である。最も好ましくはプライマーハイブリダイゼーション部位間の平均間隔は長さ約５００核酸塩基またはそれ未満である。
【００７３】
当業者は、全ゲノム増幅に対する効果的なプライミングは、プライマー伸長のために使用されるポリメラーゼ酵素の忠実度および処理能力などのいくつかの要因に依存することを認識する。プライマーハイブリダイゼーション部位間のより長い平均間隔距離は、ポリメラーゼ酵素が高い処理能力を有する場合にはより受け入れられる。これは、ポリメラーゼが核酸鋳型に強く結合していることを示す。ポリメラーゼが鋳型核酸に結合し続けることおよび合成されている相補的核酸鎖の伸長を継続することを可能にすることから、これは標的全ゲノム増幅についての望ましい特徴である。高い処理能力を有するポリメラーゼ酵素の例は、これだけに限らないがＰｈｉ２９ポリメラーゼおよびＴａｑポリメラーゼを含む。タンパク質工学的戦略が、例えばポリメラーゼとＤＮＡ結合タンパク質との共有結合によって、高い処理能力を有するポリメラーゼ酵素を産生するために使用されている（Ｗａｎｇら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２００４年、３２（３）  １１９７−１２０７頁、参照により本明細書に組み込む）。改善された処理能力を有するポリメラーゼが入手可能になることから、１０００核酸塩基を超えさえするより長い平均間隔距離が標的全ゲノム増幅のために許容可能である場合がある。
【００７４】
ハイブリダイゼーション感度および選択性
標的全ゲノム増幅の目的のためにプライマーハイブリダイセーション部位（ゲノム配列決定セグメント）の長さおよびこれらにハイブリダイズする対応するプライマーの長さの選択は、好ましくは２つの要因；（１）所与のプライマーの標的ゲノムへの結合頻度を示す感度、および（２）所与のプライマーがバックグラウンドゲノムにハイブリダイズするよりもより高い頻度で標的ゲノムにハイブリダイズする程度を示す選択性を比較考量する。一般に、より長いプライマーは高い選択性および低い感度である傾向があり、一方短いプライマーについては逆になる。好ましくは長さ約５から約１３核酸塩基のプライマーが標的全ゲノム増幅に有用であるが、この範囲から外れるプライマー長も同様に使用されうる。この範囲が５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３核酸塩基の長さを有するプライマーを含むことは認識される。プライマーの大きさは、プライマーの選択性とプライマーの感度との間のバランスに影響を与える。最適なプライマー長は、このバランスを考慮して各試料について決定される。５核酸塩基より短いまたは１３核酸塩基より長い長さを有するプライマーも、選択性および感度がその試料について最適に維持される場合は有用である。種々の長さを有する複数のプライマーを選択することは、（１つ以上の）標的ゲノム配列にわたる広範なプライミングを提供し、バックグラウンドゲノム配列と比較して（１つ以上の）標的ゲノム配列へのプライマーの優先的な結合も提供する。
【００７５】
選択性限界基準
いくつかの実施形態において、プライマーセットの費用および複雑度を低減するために標的全ゲノム増幅セット中のプライマーの総数を低減するために全ての固有のゲノム配列セグメントの適切なサブセットを決定することは好ましい。いくつかの実施形態において固有のゲノム配列セグメントの適切なサブセットの決定は、所与のゲノム配列セグメントの感度および／または選択性についての有用なおよび実用的なカットオフ点を示す１つ以上の閾値基準を選択することを必要とする。そのような基準の例は、これだけに限らないが発生頻度の選択された閾値（頻度閾値）および選択された選択性比（選択比閾値）を含む。
【００７６】
いくつかの実施形態において、基準に従って全ての固有のゲノム配列セグメントを分類することは有用である。例えば全ての固有のゲノム配列セグメントは、１位が最も高い発生頻度を示し、最も低い順位が最も低い発生頻度を示して発生頻度に従って分類される。次いで発生頻度の閾値は、順位から選択されうる。発生頻度の閾値は、さらなる分析のために選択されたサブセットのメンバーとさらには分析されないメンバーとの間の境界線として働く。
【００７７】
プライマー設計
選択されたゲノム配列セグメントにハイブリダイズするために設計されるプライマーは、好ましくはゲノム配列セグメントに１００％相補的である。他の実施形態において選択されたゲノム配列セグメントにハイブリダイズするために設計されるプライマーは、ゲノム配列セグメントに少なくとも約７０％から約１００％またはこれらの間の任意の整数もしくは小数で相補的である。一般的に、選択された核酸配列にハイブリダイズするためのプライマーの設計は、当業者に十分に周知であり、商業的に入手可能なコンピュータープログラムによって支援されうる。分析され、プライマーハイブリダイセーション部位として選択されるゲノム配列セグメントと同じ長さであるように所与のプライマーを設計することは一般に好ましい。しかしいくつかの場合においては、プライマーハイブリダイセーション部位と比較してプライマーの長さを変更することは有利でありうる。例えばプライマーが分析され好ましくない融解温度を有することが見出された場合および標的ゲノム配列に対する改善された親和性を有するプライマーを生成するために５’または３’末端での延長から利益を得る場合。プライマーの長さは、増大されても、減少されてもよい。当業者は、プライマー長の変更がプライマーハイブリダイセーション部位も変更し、元の選択されたゲノム配列セグメントとはもはや同一でないことを認識する。いくつかの場合において、所与の長さを変更したプライマーのハイブリダイゼーション部位に対応するゲノム配列セグメントを分析することは有益でありうる。この分析は、これだけに限らないが、発生頻度および選択比を含むデータの検討によって実施されることができ、長さを変更したプライマーの実際のインビトロ検査によっても実施されうる。
【００７８】
いくつかの実施形態において、対応するゲノム配列セグメントに１００％より少なく相補的であるプライマーを設計することが有利である可能性がある場合には、対応する元のゲノム配列セグメントに１００％より少なく相補的であるプライマーに１００％相補的な仮説上のゲノム配列セグメントに関して再計算選択基準の補数（発生頻度および選択比など）を検討することも有利である。選択閾値が好ましくない場合は、改善された選択閾値を有する代替プライマー配列の設計を考慮することは有利である。
【００７９】
ＩＩＩ．配列決定技術
上に記載のとおり本発明の実施形態は、マイクロフリューディックカードで生成されるＤＮＡライブラリーを配列決定することに関与する。本発明は、使用される配列決定法によって限定されない。例示的配列決定法は下に記載される。
【００８０】
核酸配列決定技術の説明的非限定的例は、これだけに限らないが連鎖停止（サンガー）配列決定およびダイターミネーター配列決定を含む。連鎖停止配列決定は、修飾ヌクレオチド基質を使用するＤＮＡ合成反応の配列特異的停止を使用する。伸長は、その領域の鋳型に相補的な短い放射活性または他で標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して鋳型ＤＮＡ上の特定の部位で開始される。オリゴヌクレオチドプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ、標準的な４種のデオキシヌクレオチド塩基および低濃度の１種類の連鎖停止ヌクレオチド、最も一般的にはジデオキシヌクレオチドを使用して伸長される。この反応は、塩基それぞれをジデオキシヌクレオチドに替えた４つの別々のチューブ中で反復される。ＤＮＡポリメラーゼによる連鎖停止ヌクレオチドの限定的取り込みは、特定のジデオキシヌクレオチドが使用された位置でだけ停止された一連の関連するＤＮＡ断片を生じる。各反応チューブについて断片は、平板ポリアクリルアミドゲルまたは粘稠なポリマーを充填されたキャピラリーチューブ中で電気泳動によって大きさで分離される。配列は、ゲルの上から下までを走査した際にどのレーンが標識プライマー由来の視覚化された目印を産生しているかを読み取ることによって決定される。
【００８１】
ダイターミネーター配列決定は、転写ターミネーターを代替的に標識する。ジデオキシヌクレオチド鎖転写ターミネーターのそれぞれを異なる波長で蛍光を発する別々の蛍光色素で標識することによって完全な配列決定が単一の反応において実施されうる。
【００８２】
「次世代配列決定」技術と称される一連の方法は、サンガーおよびダイターミネーター配列決定法への代替として現れている（Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．、５５：６４１−６５８頁、２００９年；ＭａｃＬｅａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、７、２８７−２９６頁；それぞれを参照により本明細書に組み込む）。最新の方法は、生物の一次核酸配列を決定するための全ゲノムのｄｅ  ｎｏｖｏ配列決定のための次世代配列決定技術の使用を記載する。追加的に標的化再配列決定（大規模配列決定）は、野生型配列集団中での高感度な変異検出を可能にする。いくつかの例は、ＨＩＶ薬剤耐性変種および抗ＴＫ治療剤への応答を判定するためのＥＧＦＲ変異の同定を記載している最近の研究を含む。典型的な配列決定の実行において複数の試料の同時配列決定を可能にするバーコードプライマー配列の使用を記載している最近の刊行物は、例えばＭａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｍ．ら、“Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｐｉｃｏｌｉｔｒｅ  Ｒｅａｃｔｏｒｓ”、Ｎａｔｕｒｅ、４３７、３７６−８０頁（２００５）；Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ，Ｔ．ら、“Ｇｅｎｏｍｅ−Ｗｉｄｅ  Ｍａｐｓ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｓｔａｔｅ  ｉｎ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｌｉｎｅａｇｅ−Ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  Ｃｅｌｌｓ”、Ｎａｔｕｒｅ、４４８、５５３−６０頁（２００７）；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，Ｓ．ら、“Ｗｈｏｌｅ−Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｓｈｏｒｔ  Ｒｅａｄｓ：Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｗｉｔｈ  Ｍａｔｅ  Ｐａｉｒｓ  ａｎｄ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｖａｌｕｅｓ”、ＡＳＨＧ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  （２００７）；Ｓｈｅｎｄｕｒｅ，Ｊ．ら、“Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｐｏｌｏｎｙ  Ｓｅｑｕｅｎｅｉｎｇ  ｏｆ  ａｎ  Ｅｖｏｌｖｅｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ”、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０９、１７２８−３２頁（２００５）；Ｈａｒｒｉｓ，Ｔ．ら、“Ｓｉｎｇｌｅ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ａ  Ｖｉｒａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ”、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２０、１０６−９頁（２００８）；Ｓｉｍｅｎ，Ｂ．ら、“Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｌｏｗ  Ａｂｕｎｄａｎｃｅ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｖａｒｉａｎｔｓ  ｂｙ  Ｕｌｔｒａ  Ｄｅｅｐ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  Ｃｈｒｏｎｉｃａｌｌｙ  ＨＩＶ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  Ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ（ＡＲＶ）  Ｎａｉｖｅ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ”、１６ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＨＩＶ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔｅｎｃｅ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ、Ｂａｒｂａｄｏｓ（２００７）；Ｔｈｏｍａｓ，Ｒ．ら、“Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ  ｂｙ  Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｐｉｃｏｌｉｔｅｒ  Ｒｅａｃｔｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ”、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、１２，８５２−８５５頁（２００６）；Ｍｉｔｓｕｙａ，Ｙ．ら、“Ｍｉｎｏｒｉｔｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ  Ｔｙｐｅ１  Ｖａｒｉａｎｔｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ−Ｎａｉｖｅ  Ｐｅｒｓｏｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｃｏｄｏｎ  ２１５  Ｒｅｖｅｒｔａｎｔ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ”、Ｊ．Ｖｉｒ．、８２、１０７４７−１０７５５頁（２００８）；Ｂｉｎｌａｄｅｎ，Ｊ．ら、“Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｃｏｄｅｄ  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒｓ  Ｅｎａｂｌｅｓ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｈｏｍｏｌｏｇ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｂｙ  ４５４  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ”、ＰｌｏＳ  ＯＮＥ、２，ｅ１９７（２００７）；およびＨｏｆｆｍａｎｎ，Ｃ．ら、“ＤＮＡ  Ｂａｒ  Ｃｏｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｔｏ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙ  Ｒａｒｅ  ＨＩＶ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔｅｎｃｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ”、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３５、ｅ９１（２００７）を含み、全てを参照により本明細書に組み込む。
【００８３】
伝統的なサンガー配列決定と比較して、次世代配列決定技術は、多量の配列決定データ点を作成する。典型的な実行は、ギガ塩基範囲に達する１日あたりの潜在的作成量を有して、１実行あたり１０から１００メガ塩基を容易に作成できる。これは、典型的な多重実行において数百データ点を作成できる標準的９６ウエルプレートよりも数桁大きいことを表している。１ヌクレオチド程度だけ異なる標的増幅産物は、関連する種由来の複数の標的が存在する場合であっても、容易に区別されうる。これは、正確な遺伝子型判定を実行する能力を非常に増強する。共通配列を作成するために使用される次世代配列アラインメントソフトウエアプログラムは、新たな点変異を容易に同定でき、薬剤耐性に関連する新たな株を生じうる。プライマーバーコードの使用も単回の配列決定での異なる患者試料の多重化を可能にする。
【００８４】
次世代配列決定（ＮＧＳ）法は、古い配列決定法との比較でさらに低コストを目標に、大量に平行する、ハイスループットな戦略の一般的機能を共有する。ＮＧＳ法は鋳型増幅を必要とするものと必要としないものに大きく分類されうる。増幅を必要とする方法は、４５４技術プラットフォーム（例えばＧＳ  ２０およびＧＳ  ＦＬＸ）としてＲｏｃｈｅによって商業化されたピロ配列決定；Ｉｌｌｕｍｉｎａによって商業化されたＳｏｌｅｘａプラットフォームおよびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって商業化されたＳｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＳＯＬｉＤ）プラットフォームを含む。単一分子配列決定としても周知の非増幅手法は、Ｈｅｌｉｃｏｓ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓによって商業化されたＨｅｌｉＳｃｏｐｅプラットフォームおよびＶｉｓｉＧｅｎ  ａｎｄ  Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって商業化された新たなプラットフォームのそれぞれによって例示される。
【００８５】
ピロ配列決定（Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．、５５、６４１−６５８頁、２００９年；ＭａｃＬｅａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、７、２８７−２９６頁；米国特許第６，２１０，８９１号；米国特許第６，２５８，５６８号；それぞれ全体を参照により本明細書に組み込む）において、鋳型ＤＮＡは断片化され、末端修復され、アダプターに連結され、アダプターに相補的なオリゴヌクレオチドを保持しているビーズを有する単一鋳型分子を捕獲することによってｉｎ  ｓｉｔｕでクローン性に増幅される。単一の鋳型を保持している各ビーズは、油中水微小胞中に個々に区画化され、鋳型はエマルジョンＰＣＲと称される技術を使用してクローン性に増幅される。エマルジョンは増幅後に破壊され、ビーズは配列決定反応中にフローセルとして機能するピコタイタープレートの個々のウエルに入れられる。４種のｄＮＴＰ試薬それぞれの整然と反復される導入が配列決定酵素およびルシフェラーゼなどの発光レポーターの存在下でフローセル中で生じる。適切なｄＮＴＰが配列決定プライマーの３’末端に付加される事象において、生じるＡＴＰ産生は、ＣＣＤカメラを使用して記録されるウエル中での突発的発光を引き起こす。４００塩基より長いまたは同等の読み取り長さを達成することは可能であり、配列の５億塩基対（Ｍｂ）に至るまでが得られる１ｘ１０６配列読み取りも達成されうる。
【００８６】
Ｓｏｌｅｘａ／Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームにおいて（Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．、５５、６４１−６５８頁、２００９年；ＭａｃＬｅａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、７、２８７−２９６頁；米国特許第６，８３３，２４６号；米国特許第７，１１５，４００号；米国特許第６，９６９，４８８号；それぞれその全体を参照により本明細書に組み込む）、配列決定データは、短い読み取り長さの形式で作成される。この方法において１本鎖断片化ＤＮＡは、５’−リン酸化平滑末端を生成するために末端修復され、断片の３’末端への単一Ａ塩基のクレノウ介在付加が続く。Ａ付加は、Ｔオーバーハングアダプターオリゴヌクレオチドの付加を促進し、これは、後で、オリゴヌクレオチドアンカーで覆われているフローセルの表面上において鋳型アダプター分子を捕獲するために使用される。アンカーはＰＣＲプライマーとして使用されるが、鋳型の長さおよび他の近くのアンカーオリゴヌクレオチドとの近接性から、ＰＣＲによる伸長は、近接アンカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする分子の「アーチ」を生じ、フローセルの表面上に架橋構造を形成する。ＤＮＡのこれらのループは、変性され、切断される。次いで順方向鎖は、可逆的ダイターミネーターで配列決定される。取り込まれたヌクレオチドの配列は、取り込み後蛍光の検出によって決定され、次のサイクルのｄＮＴＰ添加の前に各蛍光およびブロックは除去される。配列読み取り長さは、３６ヌクレオチドから５０を超えるヌクレオチドまでの範囲であり、全体の出力は分析実行１回あたり１０億ヌクレオチドを超える。
【００８７】
ＳＯＬｉＤ技術（Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ、５５、６４１−６５８頁、２００９年；ＭａｃＬｅａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、７、２８７−２９６頁；米国特許第５，９１２，１４８号：米国特許第６，１３０，０７３号；それぞれその全体を参照により本明細書に組み込む）を使用する配列決定核酸分子は、鋳型の断片化、オリゴヌクレオチドアダプターへの連結、ビーズへの付着およびエマルジョンＰＣＲによるクローン性増幅にも関与する。続いて鋳型を保持しているビーズは、ガラスフローセルの誘導体化表面上に固定され、アダプターオリゴヌクレオチドに相補的なプライマーにアニールされる。しかしこのプライマーを３’伸長に利用するよりも、６個の縮重塩基および４種の蛍光標識の内の１つが続く２つのプローブ特異的塩基を含有する照合プローブへの連結のために５’リン酸基を提供するために代わりに使用される。ＳＯＬｉＤシステムにおいて照合プローブは、各プローブの３’末端での２塩基に１６種の可能な組合せおよび５’末端に４種類の蛍光の内の１つを有する。蛍光色およびそれによる各プローブの独自性は、特定の色−位置コード体系に対応する。複数周期（通常７）のプローブアニーリング、連結および蛍光検出には、変性および、次いで最初のプライマーと比較して１塩基ずれているプライマーを使用する配列決定の第２周期が続く。このやり方において鋳型配列は、コンピューター的に再構築されることができ、鋳型塩基は２回照合され、向上した正確性をもたらす。配列読み取り長は平均３５ヌクレオチドであり、配列決定１実行あたりの総出力は４０億塩基を超える。
【００８８】
特定の実施形態においてナノポア配列決定が使用される（例えば、参照により本明細書に組み込むＡｓｔｉｅｒら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２００６年２月８日；１２８（５）：１７０５−１０頁を参照されたい）。ナノポア配列決定の背景にある理論は、ナノポアが導電性流体に浸漬され、それを超えて電位（電圧）をかける際に生じることに関係があり、これらの条件下でナノポアを通るイオンの伝導によりわずかな電流が観察される場合があり、電流量はナノポアの大きさに非常に影響されやすい。ＤＮＡ分子がナノポアを通過する（またはＤＮＡ分子の一部が通過する）場合、これはナノポアを通じる電流の大きさにおける変化を生じさせることができ、したがってＤＮＡ分子の配列が決定されることを可能にする。ナノポアは、金属および／もしくは非金属製表面またはα−ヘモリジンなどのタンパク質ベースナノポアに成形された固体ポアであってよい（Ｃｌａｒｋｅら、Ｎａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈ．、２００９年２月４日：２６５−２７０頁）。
【００８９】
Ｈｅｌｉｃｏｓ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによるＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．、５５：６４１−６５８頁；２００９年；ＭａｃＬｅａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、７：２８７−２９６頁；米国特許第７，１６９，５６０号；米国特許第７，２８２，３３７号；米国特許第７，４８２，１２０号；米国特許第７，５０１，２４５号；米国特許第６，８１８，３９５号；米国特許第６，９１１，３４５号；米国特許第７，５０１，２４５号；これら全体を参照により本明細書に組み込む）は、最初に商業化された単一分子配列決定プラットフォームである。この方法は、クローン性増幅を必要としない。鋳型ＤＮＡは、断片化され、最後のアデノシンが蛍光標識を保持して３’末端でポリアデニル化される。変性ポリアデニル化鋳型断片は、フローセル表面上のポリ（ｄＴ）オリゴヌクレオチドに連結される。捕獲された鋳型分子の最初の物理的位置はＣＣＤカメラによって記録され、次いで標識が切断され、洗い流される。配列決定は、ポリメラーゼの添加および蛍光標識されたｄＮＴＰ試薬の一連の添加によって達成される。取り込み事象は、ｄＮＴＰに対応する蛍光シグナルを生じ、各回のｄＮＴＰ添加の前にシグナルはＣＣＤカメラによって捕捉される。配列読み取り長さは２５−５０ヌクレオチドの範囲であり、分析１実行あたりの総出力は１０億ヌクレオチド対を超える。ＶｉｓｉＧｅｎプラットフォームを使用する合成による他の新たな単一分子配列法リアルタイム配列決定（Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．、５５：６４１−６５８頁、２００９年；米国特許第７，３２９，４９２号；米国特許出願第１１／６７１９５６号；米国特許出願第１１／７８１１６６号；これら全体を参照により本明細書に組み込む）では、固定化されたプライムＤＮＡ鋳型が蛍光修飾ポリメラーゼおよび蛍光受容体分子を使用する鎖伸長に供され、ヌクレオチドの添加において検出可能な蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じる。Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって開発された他のリアルタイム単一分子配列決定システム（Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．５５：６４１−６５８頁、２００９年；ＭａｃＬｅａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、７：２８７−２９６頁；米国特許第７，１７０，０５０号；米国特許第７，３０２，１４６号；米国特許第７，３１３，３０８号；米国特許第７，４７６，５０３号；これら全体を参照により本明細書に組み込む）は、直径５０−１００ｎｍでおよそ２０ゼプトリットル（１０ｘ１０−２１Ｌ）の反応容量を有する反応ウエルを利用する。配列決定反応は、固定化された鋳型、改変ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼおよび高局所濃度の蛍光標識ｄＮＴＰを使用して実施される。高局所濃度および継続的反応条件は、レーザー励起、光導波路およびＣＣＤカメラを使用する蛍光シグナル検出によってリアルタイムで捕捉される取り込み事象を可能にする。
【００９０】
特定の実施形態において、ゼロモード導波路（ＺＭＷ）を使用するＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって開発された単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）ＤＮＡ配列決定法または同様の方法が使用される。この技術と共にＤＮＡ配列決定は、個々に数千個のゼロモード導波路（ＺＭＷ）を含むＳＭＲＴチップ上で実施される。ＺＭＷは、直径数十ナノメートル、シリコンジオキシド基層上に設置された１００ｎｍ金属フィルムに成形された孔である。各ＺＭＷは、ナノ光学的視覚化チャンバーを形成し、正確に２０ゼプトリットル（１０−２１リットル）の検出容量を提供する。この容量で単一分子の活性は、数千の標識ヌクレオチドのバックグラウンド中で検出されうる。
【００９１】
ＺＭＷは、ＤＮＡポリメラーゼが合成によって配列決定を実施する際にこれを観察するための窓を提供する。各チャンバー内に単一ＤＮＡポリメラーゼ分子は、検出容量中に永続的に存在するように底表面に付着される。異なる色のフルオロフォアで種類ごとに標識されたリン酸結合ヌクレオチドは、次いで酵素の速度、正確性および処理能力を促進する高濃度で反応溶液中に導入される。ＺＭＷの容量が小さいことから、これらの高い、生物学的に適切な濃度であってさえ検出容量は、短時間ヌクレオチドだけによって占められる。追加的に、拡散がヌクレオチドを運ぶ必要があるのが非常に短い距離であることから検出容量の通過は速く、数マイクロ秒間続くだけである。この結果は、バックグラウンドが非常に低かった。
【００９２】
ＤＮＡポリメラーゼが相補的ヌクレオチドを取り込むことから、各塩基は検出容量中に数十ミリ秒間保持され、これはヌクレオチドが検出容量に拡散で入って出るまでにかかる時間数より数桁長い。結合したフルオロフォアは、この時間内にこの色が塩基の独自性に対応する蛍光を発する。次いで天然の取り込み周期の一部として、ポリメラーゼはフルオロフォアを定位置に維持している結合を切断し、色素は検出容量から拡散する。取り込み続いて、シグナルは直ちにベースラインに戻り、工程は反復する。
【００９３】
制約されず、中断されずにＤＮＡポリメラーゼは、１秒あたり１０個の速度で塩基の取り込みを継続する。この方法において完全に天然の長い鎖のＤＮＡが数分で産生される。同時および継続的検出が、ＳＭＲＴチップ上の数千のＺＭＷの全てにわたってリアルタイムで生じる。ＰａｃＢｉｏの研究者らは、この手法が長さ数千ヌクレオチドの読み取りを作成する能力を有することを実証している。
【実施例】
【００９４】
次の実施例は、本発明の特定の例示的実施形態を提供するために提示され、この範囲を限定することを意図しない。
【００９５】
［実施例１］
安定化酵素混合物
この実施例は、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）などの方法において有用である安定化酵素混合物の開発を記載する。図１５において記載のとおり、多数の賦形剤製剤がＰｈｉ−２９、ポリメラーゼＩおよび無機ピロホスファターゼのＷＧＡとの適合性について検査された。１６個の専売の安定化製剤（賦形剤と称される。）は、ＷＧＡにおいて一般に使用される酵素をうまく安定化させることにおいて有用でなかったことが見出された。図１６に示すとおり、ＢＳＡがこれらの酵素を安定化させるために重要な構成要素であったことが見出された。
【００９６】
開発された１つの好ましい賦形剤は、「Ｉｂｉｓ製剤３３」と称される。この製剤を産生する方法の記載は次のとおりである。８９６８ｕ／ｍｌ  Ｐｈｉ−２９ポリメラーゼ（Ｍｏｎｓｅｒａｔｅ）、１８０ｕ／ｍｌ  ポリメラーゼＩ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、３．６ｕ／ｍｌ無機ピロホスファターゼ（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）の混合物を、２０％トレハロース、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１２  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．６、０．０５％Ｔｗｅｅｎ４０、４ｍＭ  ＤＴＴおよび最終濃度０．２５％を達成するレベル（透析中に容量が変化するため透析中はより高濃度のＢＳＡが存在し、それにより溶液は適切な透析後最終容量になる場合がある。）のＢＳＡを含有する溶液と１：１で混合する。この混合物を３０ＫＤａ透析膜を使用して２０％トレハロース、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１２  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．６、０．０５％Ｔｗｅｅｎ４０および４ｍＭ  ＤＴＴを含有する溶液中で４時間、室温で透析する。
【００９７】
次いで透析した酵素混合物を透析膜から出し、２０％トレハロース、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１２  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．６、０．０５％Ｔｗｅｅｎ４０および４ｍＭ  ＤＴＴを含有する溶液を使用して適切な最終容量にする（透析／希釈工程中の希釈レベルが凍結乾燥単位あたりにどれだけの酵素が存在するかを調節する）。次いでこの溶液を適切な一定容量に分注し、凍結させ、凍結乾燥組成物を生成するために昇華を介して水を除去するための高真空に供する。
【００９８】
多数のＢＳＡレベル（最終濃度０．１３％−１％）および０．５％（最終濃度）のＰＥＧ−８０００の添加を上の記載と同じ一般計画を使用して検査した。この検査の結果は図１７に示されている。
【００９９】
この作業において開発された賦形剤を使用して、本発明者らはこれらの酵素３種類全ての酵素活性が凍結乾燥中に維持され、これらの酵素の安定性が室温（２５Ｃまで）で１０日間より短いから４０Ｃで２カ月を超えるまで劇的に増大したことを成功裏に実証した。この製剤は、新鮮酵素混合物（すなわち使用まで−２０Ｃ冷凍庫で保存）と比較した場合に総反応収量も増大させた。室温での保存に関する長期間安定性の結果は、図１８に示されている。この図は、Ｉｂｉｓ製剤３３中の凍結乾燥酵素が室温で４カ月間保存された場合に新鮮酵素と同等に作用したことを示している。図１９は、およそ６カ月間の室温保存と同等である、摂氏４０度、２カ月間の促進熟成を使用した長期保存安定性を示す。図１９はＩｂｉｓ製剤３３中の凍結乾燥された酵素が、２カ月間、摂氏４０度の後に新鮮酵素と同等に作用したことを示している。
【０１００】
［実施例２］
試料調製法
この実施例は、例えばマイクロフリューディックデバイスにおいて使用されうる種々の試料調製法を記載する。このような方法は、単一のユニバーサル緩衝剤の使用を可能にし、試料が単一のチューブ中に留まることを可能にする。このような方法のための概要は、次のステップ：溶解および抽出；全ゲノム増幅（または他の増幅法）；ＤＮＡの断片化；末端の加工；連結；未完成生成物の除去；および最終精製を含む。下に記載されるのは、多数のそのようなステップについての特定の詳細である。
【０１０１】
ｉ．例示的断片化法
増幅試料（例えばＷＧＡ試料）は、次の構成要素：１）ソニケーターアセンブリ：２．４メガヘルツ（ｍｅｇｈａｅｒｔｚ）、Ｓｏｎａｅｒ２４１Ｖ；２）トランスデューサー：金コーティングネブライザークリスタル（ｇｏｌｄ  ｃｏａｔｅｄ  ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ  ｃｒｙｓｔａｌ）、Ｓｏｎａｅｒ２４ＡＵ；３）電源：２４ボルト電源、Ｓｏｎａｅｒ  ＳＴ６２４；および４）蓋：ソニケーター中を封入するために機械加工されたプラスチック、からなるデバイスで断片化されうる。この方法を使用する超音波処理は、１５ｓオン、１５ｓオフの間隔を有する５０％負荷サイクルで合計１０分間実施されうる。
【０１０２】
ｉｉ．連結反応速度最適化
連結速度は（３０分間に生成される最終産物の量における顕著な増加をもたらした）初期条件から最適化された。最適化は、改変緩衝剤構成要素または濃度および改変酵素濃度を含んだ。パラメーターは下の表１に示されている。反応条件は３０Ｃ、３０分間および６５Ｃ、１０分間であった。
【０１０３】
【表１】
2013527769.tif 000002
最適化のために重要なパラメーターは、リガーゼ濃度、ＡＴＰ濃度、ＰＥＧ濃度、反応の１分後のピロリン酸ナトリウムの添加、を含んだ。最適化された条件は、３０分後の最終産物において顕著な増加を導く。
【０１０４】
ｉｉｉ．増幅緩衝剤中のＷＧＡ酵素の末端加工効率
条件を末端加工効率について検査するために検討した。検査した条件は、反応時間、反応温度、ｄＡＴＰ濃度、ＤＴＴ濃度、ＰＥＧ濃度、スペリミジン濃度、ポリリジン濃度を含んだ。使用されたパラメーターは、下の表２に示される。使用された反応条件は、３７Ｃ  ５分間、５０Ｃ、２分間および７５Ｃ、１０分間であった。
【０１０５】
【表２】
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使用された分析法は、エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析法（ＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）であった。見出された１つの重要なパラメーターは、反応温度（これは、５５Ｃより下ではわずかなＡテーリングが観察された一方で、５５Ｃより上では顕著なＡテーリングが観察されたことから重要なパラメーターであった）、ｄＡＴＰ濃度（ｄＡＴＰ濃度が増加するとＡテーリングが増加した）であった。結果は、産生物の１００％が適切に末端平滑化され、およそ７０％の末端がＡテール化されたことを見出した。
【０１０６】
ｉｖ．連結反応物のエキソヌクレアーゼ精製
上の表１に示した「条件１」を（ヘアピン／挿入配列にわずかな変更を有して）使用して実施した連結反応物をｅｘｏＩＩＩおよびｅｘｏＶＩＩを使用して消化した。下に示すヘアピンおよび挿入物の濃度は、連結反応前である。挿入物の大部分は、連結反応中に「最終産物」に転換された。使用した条件は表３に示されている。反応条件は、３７Ｃ、１時間および７０Ｃ、１０分間であった。
【０１０７】
【表３】
2013527769.tif 000004
ＷＧＡ増幅プライマーが、それらが阻害を生じるかどうかを測定する（観察されなかった）ための反応の一部ではないにもかかわらず、これら全ての反応に含まれることは注目される。同様にｄＮＴＰは、それらが阻害を生じるかどうかを測定する（観察されなかった）ための反応に必要でないにもかかわらず反応（連結またはｅｘｏ消化のような）に含まれた。エキソヌクレアーゼは、非環状化鋳型を分解し、最終産物以外のいかなるＤＮＡも除去する。
【０１０８】
本出願において述べられた全ての刊行物および特許を参照により本明細書に組み込む。本発明の記載された方法および組成物の種々の改変および変更は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかである。本発明は、特定の好ましい実施形態との関連において記載されているが、特許請求される本発明がそのような特定の実施形態に過度に限定されるべきでないことは理解されるべきである。実際に、本発明を実施するための記載された様式への関連分野の当業者に明らかである種々の改変は、次の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年1月8日(2013.1.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）生物学的試料の導入のために構成された、添加ポート；
ｂ）前記添加ポートに作動可能に連結した溶解サブサーキットであって、
ｉ）溶解チャンバー、および
ｉｉ）溶解緩衝液
を含み、前記溶解チャンバー中の前記生物学的試料を前記溶解緩衝液で溶解して溶解試料を生成するように構成された、細胞溶解サブサーキット；
ｃ）前記溶解サブサーキットに作動可能に連結した核酸抽出サブサーキットであって、
ｉ）前記溶解試料中に存在する核酸に結合するように構成された核酸抽出構成要素、
ｉｉ）洗浄緩衝液、および
ｉｉｉ）溶出緩衝液
を含み、抽出核酸の混合物を生成する、核酸抽出サブサーキット；
ｄ）前記核酸抽出サブサーキットに作動可能に連結した増幅サブサーキットであって、
前記抽出核酸の混合物について増幅を実施して増幅核酸を生成するのに有用である、少なくとも１つの増幅関連酵素を含む安定化酵素混合物
を含む、増幅サブサーキット；
ｅ）前記増幅サブサーキットに作動可能に連結した断片化サブサーキットであって、
ｉ）前記増幅核酸を消化して、断片化核酸を生成するように構成された試薬混合物、および／または
ｉｉ）前記増幅核酸を機械的に断片化して、断片化核酸を生成するように構成された断片化構成要素
を含む、断片化サブサーキット；並びに
ｆ）前記断片化サブサーキットに作動可能に連結したアダプター連結サブサーキットであって、
ｉ）配列決定方法における使用のために構成された核酸アダプター、および
ｉｉ）前記核酸アダプターを前記断片化核酸に連結して、核酸配列決定ライブラリーを生成するように構成された連結酵素混合物
を含む、リンカー連結サブサーキット；
を含む、マイクロフリューディックカード。
【請求項２】
前記核酸配列決定ライブラリー上の前記リンカーにハイブリダイズするように構成されたアンカー核酸配列を含む核酸精製構成要素を含む、前記リンカー連結構成要素に作動可能に連結した精製サブサーキット
をさらに含む、請求項１に記載のマイクロフリューディックカード。
【請求項３】
前記核酸配列決定ライブラリーの少なくとも一部分を使用者が回収できるように構成された出口ポートをさらに含む、請求項１に記載のマイクロフリューディックカード。
【請求項４】
前記溶解サブサーキット、前記核酸抽出サブサーキット、前記増幅サブサーキット、前記断片化サブサーキット、および／またはアダプター連結サブサーキットの１つ以上に作動可能に連結した廃棄物チャンバーをさらに含む、請求項１に記載のマイクロフリューディックカード。
【請求項５】
前記安定化酵素混合物がｉ）ＢＳＡ、ｉｉ）糖，ｉｉｉ）無機塩、ｉｖ）二価金属カチオン、ｖ）緩衝剤、ｖｉ）乳化剤、およびｖｉｉ）還元剤をさらに含む、請求項１に記載のマイクロフリューディックカード。
【請求項６】
前記安定化酵素混合物中において、前記ＢＳＡが０．０５％−３．０％の濃度で存在し、糖が５−３５％の濃度で存在し、前記無機塩が１ｍＭ−２５ｍＭの濃度で存在し、前記二価金属カチオンが１ｍＭ−３０ｍＭの濃度で存在し、前記緩衝剤が１０ｍＭ−１００ｍＭの濃度で存在し、前記乳化剤が０．０１％−０．１５％の濃度で存在し、前記還元剤が１ｍＭ−１０ｍＭの濃度で存在する、請求項１から５の一項に記載のマイクロフリューディックカード。
【請求項７】
緩衝液および試料を通過させるように構成された処理構成要素をさらに含む、請求項１から６の一項に記載のマイクロフリューディックカード。
【請求項８】
溶解緩衝液、洗浄緩衝液、溶出緩衝液、安定化酵素混合物、前記増幅核酸を消化するように構成された試薬混合物、および前記連結酵素混合物の１つ以上を含む１つ以上の密封容器をさらに含む、請求項１から７の一項に記載のマイクロフリューディックカード。
【請求項９】
（ａ）請求項１から８の一項に記載のマイクロフリューディックカード；および
（ｂ）次世代核酸シークエンサー；および
（ｃ）前記マイクロフリューディックカードおよび前記次世代核酸シークエンサーが統合された処理機器
を含む、試料調製および配列決定システム。
【請求項１０】
前記次世代核酸シークエンサーが、ゼロモード導波路、前記核酸アダプターに相補的なオリゴヌクレオチドが固定化されているフローセル、ＤＮＡが通過するナノポア、および前記核酸アダプターに相補的なオリゴヌクレオチドを保持しているビーズの１つ以上を含む、請求項９の一項に記載の試料調製および配列決定システム。
【請求項１１】
（ａ）生物学的試料を請求項１から２８の一項に記載のマイクロフリューディックカードに導入するステップ；
（ｂ）前記生物学的試料の細胞を溶解して、溶解試料を生成するステップ；
（ｃ）前記溶解試料から核酸を抽出して、抽出核酸の混合物を生成するステップ；
（ｄ）抽出核酸の前記混合物について増幅を実施して、増幅核酸を生成するステップ；
（ｅ）前記増幅核酸を断片化して、断片化核酸を生成するステップ；
（ｆ）核酸アダプターを前記断片化核酸に連結して、核酸配列決定ライブラリーを生成するステップ；
（ｇ）前記マイクロフリューディックカードから前記核酸配列決定ライブラリーの少なくとも一部を回収するステップ；および
（ｈ）前記核酸配列決定ライブラリー由来の１つ以上の核酸を配列決定するステップ
を含む、生物学的試料由来の核酸を配列決定する方法。
【請求項１２】
（ｉ）前記核酸アダプターに相補的なオリゴヌクレオチドを保持しているビーズで前記核酸配列決定ライブラリーから単一分子を捕獲するステップ；
（ｉｉ）前記ビーズを水−油微小胞中に個々に区画化するステップ；
（ｉｉｉ）エマルジョンＰＣＲによって前記単一分子上でクローン性増幅を実施するステップ；
（ｉｖ）ビーズを個々のウエルに入れるステップ；
（ｖ）適切なｄＮＴＰが前記単一分子に付加される際に検出可能な発光が産生されるように、配列決定酵素および発光レポーターの存在下でｄＮＴＰの反復的導入を実施するステップ；および
（ｖｉ）前記単一分子の配列を読み取るためにｄＮＴＰの前記反復的導入によって産生された前記発光を検出するステップ；
を含む、請求項４２に記載の生物学的試料由来の核酸を配列決定する方法。
【請求項１３】
（ｉ）前記核酸アダプターに相補的なオリゴヌクレオチドアンカーで覆われたフローセルの表面上に前記核酸配列決定ライブラリーからの核酸分子を捕獲するステップ；
（ｉｉ）増幅分子と隣接アンカーとのハイブリッド形成が生じる条件下で前記アンカーをプライマーとして使用して前記核酸分子をＰＣＲ増幅して、前記フローセルの前記表面上に架橋構造を形成するステップ；
（ｉｉｉ）前記架橋構造を変性および切断するステップ；
（ｉｖ）色素標識転写ターミネーターヌクレオチドを、切断された架橋構造中に可逆的に取り込むステップ；
（ｖ）取り込み後にヌクレオチド蛍光を検出するステップ；
（ｖｉ）色素およびターミネーターを除去するステップ；および
（ｖｉｉ）ステップ（ｉｖ）から（ｖｉ）を反復して、前記核酸分子を配列決定するステップ
を含む、請求項４２に記載の生物学的試料由来の核酸を配列決定する方法。
【請求項１４】
（ｉ）前記核酸アダプターに相補的なオリゴヌクレオチドを保持しているビーズで前記核酸配列決定ライブラリーから単一分子を捕獲するステップ；
（ｉｉ）前記ビーズを水−油微小胞中に個々に区画化するステップ；
（ｉｉｉ）エマルジョンＰＣＲによって前記単一分子上でクローン性増幅を実施して、鋳型を生成するステップ；
（ｉｖ）前記ビーズをフローセルの誘導体化表面上に固定化するステップ；
（ｖ）前記アダプターに相補的なプライマーをアニーリングするステップ；
（ｖｉ）１つの照合プローブが前記鋳型に結合する条件下で前記鋳型を標識された照合プローブに暴露するステップ；
（ｖｉｉ）蛍光を検出するステップ；
（ｖｉｉｉ）前記鋳型由来の前記照合プローブを変性するステップ；および
（ｉｘ）ステップ（ｖ）から（ｖｉｉｉ）を反復し、これにより前記単一分子を配列決定するステップ
を含む、請求項４２に記載の生物学的試料由来の核酸を配列決定する方法。
【請求項１５】
（ｉ）前記核酸配列決定ライブラリーから単一分子を捕獲するステップ；
（ｉｉ）電導性液中に浸漬したナノポアを通して前記単一分子を通過させるステップであって、前記ナノポアの端から端まで電圧がかけられているステップ；および
（ｉｉｉ）前記単一分子が前記ナノポアを通して通過する際に産生される電流を検出するステップ
を含む、請求項４２に記載の生物学的試料由来の核酸を配列決定する方法。
【請求項１６】
（ｉ）フローセルの表面上のオリゴヌクレオチドに前記核酸配列決定ライブラリー由来の核酸分子のアダプターを連結するステップ；
（ｉｉ）相補的ｄＴＮＰが前記核酸に付加される条件下で、前記核酸分子に蛍光標識されたｄＮＴＰを連続的に付加するステップ；
（ｉｉｉ）取り込まれたｄＮＴＰに関連する蛍光を検出するステップ
を含む、請求項４２に記載の生物学的試料由来の核酸を配列決定する方法。
【請求項１７】
（ｉ）前記核酸配列決定ライブラリー由来の核酸分子を反応溶液中に入れるステップ；
（ｉｉ）ゼロモード導波路（ＺＭＷ）を前記反応溶液に暴露するステップであって、前記ＺＭＷがその底表面に付着したＤＮＡポリメラーゼを含むステップ；
（ｉｉｉ）明確に標識されたリン酸結合ヌクレオチドを前記反応溶液に添加するステップ；および
（ｉｖ）標識されたｄＮＴＰ残基がＺＭＷ中にある時間量に基づいてｄＴＮＰの取り込みを検出するステップ
を含む、請求項４２に記載の生物学的試料由来の核酸を配列決定する方法。
【国際調査報告】
2013527769.tif 000029
2013527769.tif 000030
2013527769.tif 000031