(57)【要約】【課題】光線を発射することができるオブジェクトを検出する単一分子検出装置を提供する。【解決手段】単一分子検出装置は光源と導波路を含む。導波路はコア層と第一クラッド層を含む。少なくとも一つのナノウェルが、少なくとも第一クラッド層中に形成される。単一分子検出装置は、更に、光検出器を含む。光検出器は、少なくとも一つのナノウェルに含まれる単一分子オブジェクトから発射される光線を検出することが出来る。【選択図】図１
2013524174.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一分子検出装置であって、
a) コア層、及び、少なくとも一つのナノウェルを、少なくとも中に形成している第一クラッド層を含む導波路と、
b) 少なくとも一つの光検出器と、
を含むことを特徴とする検出装置。
【請求項２】
更に光源を含むことを特徴とする請求項1に記載の検出装置。
【請求項３】
更に光カプラーを含むことを特徴とする請求項2に記載の検出装置。
【請求項４】
前記少なくとも一つのナノウェルの上部開口は、前記少なくとも一つのナノウェル底部より大きいことを特徴とする請求項1に記載の検出装置。
【請求項５】
前記コア層に沿って伝播する光波から誘導される光照射野により、有効な励起領域が、前記少なくとも一つのナノウェル底部付近に形成されることを特徴とする請求項1に記載の検出装置。
【請求項６】
前記少なくとも一つのナノウェルと前記検出器は、前記導波路の反対側に配置されることを特徴とする請求項1に記載の検出装置。
【請求項７】
前記光検出器は、検出された光線に基づいて、信号を生成することを特徴とする請求項1に記載の検出装置。
【請求項８】
前記導波路は、更に、第二クラッド層を含む平面導波路で、前記第一クラッド層と前記第二クラッド層は、前記コア層を挟んで配置されることを特徴とする請求項1に記載の検出装置。
【請求項９】
前記少なくとも一つのナノウェルは、前記第一クラッド層の部分厚さに延伸することを特徴とする請求項1に記載の検出装置。
【請求項１０】
前記少なくとも一つのナノウェルは、前記第一クラッド層の総厚さに延伸することを特徴とする請求項1に記載の検出装置。
【請求項１１】
前記少なくとも一つのナノウェルは、前記第一クラッド層の総厚さとコア層の部分厚さに延伸することを特徴とする請求項1に記載の検出装置。
【請求項１２】
前記少なくとも一つのナノウェルは、前記第一クラッド層の総厚さ、及び、前記コア層の総厚さに延伸することを特徴とする請求項8に記載の検出装置。
【請求項１３】
前記光検出器は、1組の光学センサーを含むことを特徴とする請求項1に記載の検出装置。 
【請求項１４】
更に、ナノウェルアレイを形成する複数のナノウェルを含むことを特徴とする請求項1に記載の検出装置。
【請求項１５】
更に、検出器アレイを形成する複数の光検出器を含み、前記検出器アレイ中の各光検出器は、前記ナノウェルアレイ中の少なくとも一つのナノウェルに対応することを特徴とする請求項14に記載の検出装置。
【請求項１６】
励起光を吸収する前記少なくとも一つのナノウェル中に含まれる単一分子オブジェクトは、蛍光共鳴エネルギー移動により、更に別の単一分子オブジェクトを励起し、前記別の単一分子オブジェクトに、前記検出器により検出される光線を発射させることを特徴とする請求項1に記載の検出装置。  
【請求項１７】
前記コア層は、前記第一クラッド層より高い屈折率を有することを特徴とする請求項1に記載の検出装置。 
【請求項１８】
前記コア層は、前記第一と第二クラッド層より高い屈折率を有することを特徴とする請求項8に記載の検出装置。 
【請求項１９】
前記コア層は、SixTi1-xO2, TiO2, Ta2O5, Nb2O5, HfO2, Al2O3, ZrO2, ZnS, SiNx, AlNx, TiNx, PC, PMMA、又は、Su8から選択される少なくとも一つの材料からなることを特徴とする請求項1に記載の検出装置。 
【請求項２０】
前記第一クラッド層は、SiO2, MgF2, CaF2, Al2O3, PMMA, Su8、又は、ポリカーボネートから選択される少なくとも一つの材料からなることを特徴とする請求項1に記載の検出装置。 
【請求項２１】
前記第一クラッド層と前記第二クラッド層は、SiO2, MgF2, CaF2, Al2O3, PMMA, Su8、又は、ポリカーボネートから選択される少なくとも一つの材料からなることを特徴とする請求項8に記載の検出装置。 
【請求項２２】
更に、前記第一クラッド層上に配置された保護層を含むことを特徴とする請求項1に記載の検出装置。
【請求項２３】
前記保護層は不透明であることを特徴とする請求項22に記載の検出装置。 
【請求項２４】
前記保護層は、Al, Ti, Ni, Cr, Au, Ag, Cu, Pt, Pd, 又は、それらの二個かそれ以上の合金から選択される少なくとも一つの材料でなることを特徴とする請求項23に記載の検出装置。
【請求項２５】
更に、前記第二クラッド層と前記検出器間に配置される不透明層を含むことを特徴とする請求項8に記載の検出装置。 
【請求項２６】
前記不透明層はAl, Ti, Ni, Cr, Au, Ag, Cu, Pt, Pd, 又は、それらの二個かそれ以上の合金から選択される材料でなることを特徴とする請求項25に記載の検出装置。
【請求項２７】
前記不透明層は、前記少なくとも一つのナノウェルと前記光検出器間に配置されたホールを有し、前記少なくとも一つのナノウェルに含まれる単一分子オブジェクトから発射される光線を、前記光検出器に到達させることを特徴とする請求項25に記載の検出装置。
【請求項２８】
前記不透明層は、前記少なくとも一つのナノウェルと前記光検出器間の配置されたナノパターン化された構造を含み、前記少なくとも一つのナノウェルに含まれる単一分子オブジェクトから発射される光線の伝送を可能にし、及び、ノイズの伝送を阻止することを特徴とする請求項25に記載の検出装置。
【請求項２９】
光学フィルターは、前記導波路と前記光検出器間に配置されることを特徴とする請求項1に記載の検出装置。
【請求項３０】
光学フィルターは、前記第二クラッド層と前記光検出器間に配置されることを特徴とする請求項8に記載の検出装置。
【請求項３１】
光学フィルターは、前記不透明層と前記光検出器間に配置されることを特徴とする請求項25に記載の検出装置。
【請求項３２】
前記第二クラッド層は、光学フィルターとしても機能することを特徴とする請求項8に記載の検出装置。
【請求項３３】
更に、前記少なくとも一つのナノウェル上方に、カバーを含むことを特徴とする請求項1に記載の検出装置。
【請求項３４】
前記少なくとも一つのナノウェルの少なくとも一つの第一表面は、前記少なくとも一つのナノウェルの少なくとも一つの第二表面と異なる表面特性を有することを特徴とする請求項1に記載の検出装置。 
【請求項３５】
前記少なくとも一つのナノウェルの側壁表面は親水性で、前記側壁表面は、シリコン、シリカ、金属、又は、金属酸化物から選択される材料を含むことを特徴とする請求項1に記載の検出装置。 
【請求項３６】
前記少なくとも一つのナノウェルの底部表面は疎水性であることを特徴とする請求項1に記載の検出装置。
【請求項３７】
前記少なくとも一つのナノウェルの前記底部表面は、ケイ酸塩、または、親水性の金属から形成され、R1x-Si(O-R2)4-x 、又は、官能基を有するポリマーにより、疎水性に改質され、
R1 はアルキル鎖-(CH2)n-CH3 から選択される疎水基で、且つ、R2はCnH2n+1、及び、前記官能基は、-COOH, -PO3H2, -SH、又は、NH2から選択されることを特徴とする請求項36に記載の検出装置。
【請求項３８】
前記少なくとも一つのナノウェルの前記底部表面は、親水性の金属酸化物から形成され、R1x-Si(O-R2)4-x、又は、官能基を有するポリマーにより、疎水性に改質され、
R1 はアルキル鎖-(CH2)n-CH3 から選択される疎水基、R2 は CnH2n+1、及び、前記官能基は-COOH, -PO3H2, -SH、又は、NH2から選択されることを特徴とする請求項36に記載の検出装置。
【請求項３９】
前記少なくとも一つのナノウェルの底部は、前記少なくとも一つのナノウェルの側壁表面と異なる表面特性を有することを特徴とする請求項1に記載の検出装置。
【請求項４０】
前記表面特性は、疎水性、官能基、官能基密度、材料密度、又は、導電性を含むことを特徴とする請求項34に記載の検出装置。
【請求項４１】
前記表面特性は、疎水性、官能基、官能基密度、材料密度、又は、導電性を含むことを特徴とする請求項39に記載の検出装置。
【請求項４２】
前記光カプラーは格子結合器で、前記コア層上、前記コア層中、又は、前記コア層下に位置することを特徴とする請求項3に記載の検出装置。
【請求項４３】
前記光カプラーはプリズムカプラーであることを特徴とする請求項3に記載の検出装置。
【請求項４４】
前記光カプラーはサイドカプラーであることを特徴とする請求項3に記載の検出装置。
【請求項４５】
前記光カプラーは吸収-発射性カプラーで、前記光源から発射する入射光を吸収し、励起光を発射することを特徴とする請求項3に記載の検出装置。
【請求項４６】
前記吸収-発射性カプラーは、30 nmに等しいか、又は、それより大きいストークスシフトを有する光輝性材料を含むことを特徴とする請求項45に記載の検出装置。
【請求項４７】
前記光輝性材料はポリマー中にドープされることを特徴とする請求項46に記載の検出装置。
【請求項４８】
前記光輝性材料は光輝性染料を含み、前記光輝性染料は、アントラセン、クマリン、ピレン、スチルベン、ポルフィリン、ペリレン、Alq3、エオシン、Bodipy dye、フルオレセイン、ローダミン、ポリメチン染料DCM、又は、その誘導体を含むことを特徴とする請求項46に記載の検出装置。
【請求項４９】
前記光輝性材料は光輝性ポリマーを含み、前記光輝性ポリマーは、PPV、又は、その誘導体を含むことを特徴とする請求項46に記載の検出装置。
【請求項５０】
前記光輝性材料は無機化合物を含み、前記無機化合物は、量子ドット、アルミナ酸化物、又は、酸化亜鉛を含むことを特徴とする請求項46に記載の検出装置。
【請求項５１】
前記光カプラーはコディレクショナル・カプラであることを特徴とする請求項3に記載の検出装置。 
【請求項５２】
前記光源は、レーザー、半導体レーザー、LED、OLED、QLED、ファイバー光源、又は、アーク放電蛍光ランプであることを特徴とする請求項2に記載の検出装置。
【請求項５３】
前記第一クラッド層は、試料液とほぼ等しい屈折率を有することを特徴とする請求項1に記載の検出装置。
【請求項５４】
前記第一クラッド層は、試料液より大きい屈折率を有することを特徴とする請求項1に記載の検出装置。
【請求項５５】
前記少なくとも一つのナノウェル底部の大きさは、前記コア層中の励起光の波長より小さく、前記波長の半分、前記波長の四分の一、前記波長の八分の一より小さいことを特徴とする請求項1に記載の検出装置。
【請求項５６】
前記光源は、前記導波路のサポート基板上に形成されることを特徴とする請求項2に記載の検出装置。
【請求項５７】
前記光検出器は、CCD、CMOS 光学センサー、光伝導型の光学センサー、光起電型光学センサー、APD、p-n フォトダイオード、p-i-n フォトダイオード、又は、多接合フォトダイオードから選択される光学センサーであることを特徴とする請求項1に記載の検出装置。 
【請求項５８】
前記光検出器は、CCD、CMOS 光学センサー、光伝導型の光学センサー、光起電型光学センサー、APDs、p-n フォトダイオード、p-i-n フォトダイオード、又は、多接合フォトダイオードから選択される1組の光学センサーであることを特徴とする請求項1に記載の検出装置。
【請求項５９】
1組中の前記光学センサーは、異なる感知可能波長域を有することを特徴とする請求項58に記載の検出装置。
【請求項６０】
単一分子の検出方法であって、
光源により、入射光を発射する工程と、
カプラーにより、前記入射光を導波路に結合して、前記導波路中に励起光を形成する工程と、
前記励起光、及び、前記導波路の少なくとも一つのクラッド層中に形成される少なくとも一つのナノウェルにより、有効な励起領域を形成する工程と、
前記励起光により、前記有効な励起領域中の単一分子オブジェクトを励起して、前記単一分子オブジェクトに、光検出器により検出される光線を発射させる工程と、
を含むことを特徴とする検出方法。
【請求項６１】
核酸のシークエンシング方法であって、        
コア層と、少なくとも中に、少なくとも一つのナノウェルを形成する第一クラッド層を含む導波路、及び、少なくとも一つの光検出器を含む検出装置を提供する工程と、
少なくとも一つの核酸分子を提供する工程と、
前記少なくとも一つの核酸分子を、個別に、前記少なくとも一つのナノウェル中に配置する工程と、
前記少なくとも一つの核酸分子の単一分子合成時解読を実行し、前記単一分子核酸の合成時解読が、少なくとも一つの前記核酸中の塩基の前記性質に相関する光線の発射を生じる工程と、
前記検出器により前記光線を検出して、出力信号を生成する工程、及び、
前記出力信号を処理して、前記核酸により含まれる少なくとも一つの塩基の性質を決定する工程と、
を含むことを特徴とするシークエンシング方法。
【請求項６２】
前記単一分子核酸の合成時解読は、化学発光により、光線の発射を生じることを特徴とする請求項61に記載のシークエンシング方法。
【請求項６３】
前記検出装置は、更に、光源を含み、前記単一分子核酸合成時解読は、蛍光性により、光線の発射を生じることを特徴とする請求項61に記載のシークエンシング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検出装置、及び、オブジェクトを検出する装置を用いた方法に関するものである。この他、本発明は、単一分子オブジェクト等のオブジェクトから発射する低強度の光線を検出することができる検出装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムプロジェクト (Human Genome Project、HGP)は、シークエンシングスループットにおける快速な増加を刺激し、このような増加は、技術の改良に伴い、シークエンシングコストを下落させている。13年と30億米ドルを費やしたのと対照的に、現在のゲノムシークエンシングコストは、既に大幅に減少し、実際には、最近、既に、2組の個人のゲノムが完成している(McGuire et al., Science 317:1687 (2007))。患者とヘルスケア提供者両方にとって、個人のゲノムは、治療上の方法のパラダイム変化(paradigm shift)を表す。疾病の遺伝的危険因子(genetic risk factor)を管理することにより、ヘルスケア提供者は、更に容易に、予防医学を実践し、カスタマイズされた治療を提供することができる。完成されたゲノムの大きいメモリバンクにより、薬物設計と投与が更に効率的になり、薬理ゲノム学の新生領域の発展を加速する。
【０００３】
大部分の従来の化学、又は、生化学分析は“バルク(bulk)”測定に基づいている。このような測定において、試料液の特定体積中の複数の分子の集団行動(collective behavior)を測定して、分子の特性を決定する。近年、単一分子の検出が可能になった。単一分子検出は、化学と生化学分析に別の選択肢を提供し、従来のバルク測定より高い感度と更に詳細な情報を提供して、すぐに新しい趨勢となった。単一分子検出を達成する基準の概要は、例えば、Moerner et al. (Moerner and Fromm, “（総説）REVIEW ARTICLE: Methods of single-molecule fluorescence apectroscopy and microscopy”, Review of Scientific Instruments 74(8): 3597-3619 (2003)) 、及び、Walter et al. (Walter, et al., “Do-it-yourself guide: how to use the modern single-molecule toolkit”, Nature Methods 5: 475-489 (2008))中で討論されている。これらの論文は、単一分子検出に用いられる、又は、提案される方法と装置も開示している。
【０００４】
例えば特許文献１は、単一分子検出に用いるゼロモード導波路 (ZMW)を提供する。このZMWは、金属膜とその中に形成された複数のホールから構成され、ZMWのコア領域を構成する。ZMW中、コア領域中のカットオフ波長より長い波長を有する光線の伝播が禁止される。カットオフ波長より長い波長を有する光線が、導波路の入射口に入射する時、光線は、コア領域の縦方向に沿って伝播しない。そうではなく、光線強度は、コア領域の縦方向に沿って指数関数的に減衰し、導波路の入射口で、エバネセント場を形成する。これは、特定の励起ゾーンを提供し、励起ゾーン中の分子は励起され、発射された蛍光光線は、共焦点顕微鏡により捕捉される。しかし、ZMWの検出可能な数量は、共焦点顕微鏡の開口数 (NA)により制限され、スループットが制限される。特許文献２は、ZMWを下層基板中に延伸することにより形成される凹型ZMWを提供している。このような構造配置は、観察領域の体積(observation volume)を調整可能にし、導波路下に光学的に配置される信号レベルを高くすることができる。しかし、この配置は、スケールアップ(scale-up)問題とスループットの制限問題が存在する。
【０００５】
よって、オブジェクト、特に、低強度の光線を発射するオブジェクト、例えば、単一分子オブジェクトを検出する装置が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第７１７００５０号明細書
【特許文献２】米国特許第７４８６８６５号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、光線を発射することができるオブジェクトを検出する装置を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、光線を発射することができるオブジェクトを検出する装置を提供する。装置は導波路を含む。導波路は、コア層と第一クラッド層を含む。少なくとも一つのナノウェルが、少なくとも第一クラッド層中に形成される。装置は、更に、光検出器を含む。光検出器は、少なくとも一つのナノウェルに含まれる単一分子オブジェクトから発射する光線を検出することができる。
【０００９】
また、本発明は、単一分子の検出方法を提供し、 (a) 光源により入射光を発射する工程と、 (b)カプラーにより、入射光を導波路中に結合し、導波路中に励起光を形成する工程と、(c)励起光、及び、導波路の少なくとも一つのクラッド層中に形成された少なくとも一つのナノウェルにより、有効な励起領域を形成する工程、および、(d)励起光により、有効な励起領域中の単一分子オブジェクトを励起し、単一分子オブジェクトに、検出器により検出される光線を発射させる工程、を含む。
【００１０】
本発明は、更に、核酸のシークエンシング方法を提供し、 (a) 導波路を含む検出装置を提供し、検出装置が、コア層と、中に少なくとも一つのナノウェルを形成する第一クラッド層と、を含む導波路、及び、検出器を含む工程と、(b)少なくとも一つの核酸分子を提供する工程と、(c)少なくとも一つの核酸分子を、個別に、少なくとも一つのナノウェル中に定位させる工程と、 (d)少なくとも一つの核酸分子の単一分子合成時解読を実行し、単一分子核酸の合成時解読が、光線を発射させ、発射する光線が、少なくとも一つの核酸中の塩基の特性と相関する工程と、(e)検出器により光線を検出し、出力信号を生成する工程と、(f)出力信号を処理して、少なくとも一つの核酸中に含まれる塩基の特性を決定する工程、を含む。
【００１１】
本発明の目的、特徴、及び、長所を更に明確にするため、以下で好ましい実施例と図式により、詳細を説明する。特許請求の範囲で特別に示された要素と組み合わせにより、本発明の目的、特徴、及び、長所を理解することができる。
【００１２】
本明細書中の描写と図式は、説明のためのものであって、本発明を限定するものではないことが理解できる。本発明の保護範囲は、特許請求の範囲で指定した内容を基準とする。
【００１３】
本明細書中の図式は、本発明の説明に併せて用いられると共に、本発明の説明の一部分となり、明細書中の内容と共に、本発明の複数の実施例を共同で描写し、その原理の解釈に用いる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の単一分子検出装置により、スケールアップ(scale-up)問題とスループットの制限問題が解決される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本実施形態に係る検出装置を示す図である。
【図２】本実施形態に係る異なるサイズのナノウェルを示す図である。
【図３】本実施形態に係る異なるナノウェル設計を示す図である。
【図４】本実施形態に係る検出装置を示す図である。
【図５】本実施形態に係る検出装置を示す図である。
【図６】本実施形態に係る検出装置を示す図である。
【図７】本実施形態に係る検出装置を示す図である。
【図８】本実施形態に係る検出装置を示す図である。
【図９】本実施形態に係る検出装置を示す図である。
【図１０】本実施形態に係る検出装置を示す図である。
【図１１】本実施形態に係る検出装置を示す図である。
【図１２】本実施形態に係る吸収-発射性光カプラー(absorbing-emitting light coupler)を示す図である。
【図１３】本実施形態に係る検出装置を示す図である。
【図１４】本実施形態に係る検出装置を示す図である。
【図１５】本実施形態に係る検出装置を示す図である。
【図１６Ａ】異なるナノウェルのコンピュータシミュレーション結果を示す図である。
【図１６Ｂ】異なるナノウェルのコンピュータシミュレーション結果を示す図である。
【図１６Ｃ】異なるナノウェルのコンピュータシミュレーション結果を示す図である。
【図１６Ｄ】異なるナノウェルのコンピュータシミュレーション結果を示す図である。
【図１７Ａ】図5中の金属格子を通過するTE光線の透過率と金属格子の格子周期(grating period)と深さの関係を示す図である。
【図１７Ｂ】図5中の金属格子を通過するTM光線の透過率と金属格子の格子周期と深さの関係を示す図である。
【図１７Ｃ】図17Bと図17A中のデータの比率を示す図である。
【図１８Ａ】図5に示される金属格子を通過する光線の透過率と光線の入射角の関係を示す図である。
【図１８Ｂ】図5に示される金属格子を通過する光線の透過率と光線の入射角の関係を示す図である。
【図１９】図20に示される検出装置のコンピュータシミュレーション結果である。
【図２０】プリズムをカプラーとした例の検出装置を示す図である。
【図２１】図7に示される検出装置の導波路中に結合される入射光のシミュレートされたスペックルを示す図である。
【図２２Ａ】図20に示されるシミュレーションに用いられる検出装置中で使用するレンズを示す図である。
【図２２Ｂ】図20に示されるシミュレーションに用いられる検出装置中で使用するレンズを示す図である。
【図２３】図9に示される検出装置の導波路中に結合される光線の測量率を示す図である。
【図２４】図8に示される検出装置のコンピュータシミュレーション結果を示す図である。
【図２５】図9に示される検出装置のコンピュータシミュレーション結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
従来のバルクアッセイ(bulk assay)に用いる装置は、小型化バルクアッセイを含み、単一分子検出に用いる装置は、本質的要素をシェアし、同様の装置構造を有する。しかし、単一分子検出を実現するため、システムは、少なくとも以下の二個の条件を満たす必要がある。一つ目は、制限された励起空間と制限された観察空間の両方を有することで、二つ目は、上述の二空間は、完全に、又は、部分的にオーバーラップし、且つ、重複面積は十分に小さく、ターゲット単一分子から発射される光線が、バックグラウンドより高く、検出可能な信号対雑音比 (SNR)を提供することができるようにする必要があることである。例えば、重複領域の体積は、通常、フェムトリットル(femto-liter)レベルに近いか、それより小さい必要がある。特に、重複領域の体積は、通常、アトリットル(attoliter)からゼプトリットル(zepto-liter)の範囲でなければならない。この他、励起光が検出器に到達するのを防止することも重要である。
【００１７】
本発明の具体例は、検出装置、及び、オブジェクト、例えば、単一分子オブジェクトを検出する検出装置を用いた方法を含む。検出装置は、オブジェクトから発射する弱い光線を検出することができる。
【００１８】
以下で、図式と併せて、本発明の具体例を詳細に説明する。図中の可能な場所で、類似の素子は、同一の符号を使用する。
【００１９】
１．本発明の装置
一態様中、本開示は、オブジェクト、例えば、単一分子オブジェクトを検出することができる検出装置に関する。本発明によると、オブジェクトは、発光源、例えば、蛍光色素分子、リン光性染料分子量子ドット、又は、発光ナノ粒子である。オブジェクトは光散乱粒子である。更に、オブジェクトは、発光能力がない標的分子であるが、ラベリングオブジェクト(labeling object)に接着されて、光線(例えば、蛍光色素分子リン光性染料分子、又は、量子ドット)を発射することができる。特定のラベリングオブジェクトは、特定の標的分子に接着される。よって、標的分子はラベリングオブジェクトにより識別される。一つ以上のラベリングオブジェクトが、一標的分子に取り付けられる。
【００２０】
１．１装置の概説
本発明の検出装置は、光線を発射することができる少なくとも一つの光源を含み、少なくとも一部が導波路中に結合されて、励起光となり、オブジェクトを励起する。光源は、例えば、ヘリウムネオンレーザー等のレーザー、及び、半導体レーザー (LD)、発光ダイオード (LED)、有機発光ダイオード (OLED)、量子ドット発光ダイオード (QLED)、ファイバー光、又は、アーク放電蛍光ランプである。
【００２１】
本発明の検出装置は導波路を含む。導波路は、チャネル導波路、又は、平面導波路である。導波路は、コア層と少なくとも一つのクラッド層を含む。例えば、導波路がチャネル導波路である場合、コア層と、コア層を囲むクラッド層を含む。別の例によると、導波路が平面導波路の場合、コア層、及び、コア層上に配置された一クラッド層、又は、コア層を挟んだ2層のクラッド層を含む。コア層は、少なくとも一つのクラッド層より屈折率が大きい。励起光は、導波路のコア層で伝播する。
【００２２】
本発明によると、少なくとも一つのナノウェルが、少なくとも一つのクラッド層中に形成される。ナノウェルは、上部開口と底部表面を含み、上部開口は底部表面より大きい。ナノウェルは、少なくとも一つのクラッド層の部分厚さ、少なくとも一つのクラッド層の総厚さ、少なくとも一つのクラッド層の総厚さとコア層の部分厚さ、又は、少なくとも一つのクラッド層の総厚さとコア層の総厚さに延伸する。有効な励起領域が、ナノウェル底部付近に形成される。有効な励起領域の下方境界は、ナノウェル底部である。ナノウェル中、有効な励起領域の上方境界は、コア層の縦方向に垂直な方向 (以下で、垂直方向)で、励起光が到達できる距離により定義される。
【００２３】
本発明の検出装置は、複数のナノウェルを含む。よって、装置は、大量のオブジェクトを監視するのにも用いられる。
【００２４】
本発明の検出装置は、オブジェクトから発射する光線を検出する光検出器を含む。本発明によると、光検出器は光学センサーを含み、その上に入射する光線を少なくとも部分的に吸収し、この光線に対応する出力信号を生成することができる。光学センサーは、例えば、p−n フォトダイオード、p−i−n フォトダイオード、多接合フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード (APD)、フォトトランジスタ、量子井戸型赤外線検出器 (QWIP)、光伝導型の光学センサー、光起電型光学センサー、TFA(thin-film on ASIC)、金属-半導体-金属(MSM) フォト検出器、電荷結合素子 (CCD)、CMOS センサー、又は、それらの組み合わせである。
【００２５】
本発明によると、光検出器は制御回路を含み、光検出器の操作を制御する。制御回路は、信号増幅器の回路、A/D コンバータ、積分器、コンパレータ、論理回路、読み出し回路、メモリ、マイクロプロセッサ、クロック、及び/又は、アドレスを含む。
【００２６】
本発明によると、光検出器は、オブジェクトから発射する光線が到達できる場所に配置される。例えば、光検出器は、コア層のナノウェルに相対する反対側に配置される。つまり、ナノウェルが、垂直方向で、コア層の一側に配置される場合、光検出器は、垂直方向で、コア層のもう一側に配置される。
【００２７】
本発明の検出装置は光カプラーを含む。光カプラーは、少なくとも一つの光源から発射する光線の少なくとも一部を、導波路中に結合する。光カプラーは、例えば、プリズムカプラー、格子結合器、サイド注入カプラー(side-injection coupler)、垂直注入カプラー (vertical-injection coupler)、又は、コディレクショナル・カプラである。
【００２８】
１．２範例の装置
図1を参照すると、本発明の検出装置 100を示す図である。ある具体例中、検出装置100 は、光源102、光カプラー104、光検出器106、及び、平面導波路 110を含む。平面導波路110は基板(図示しない)上に形成される。光検出器は、基板上、又は、基板中に形成される。
【００２９】
光源 102は光線を発射し、少なくとも一部が光カプラー 104により、平面導波路 110中に結合される。平面導波路 110中に結合される光線は、平面導波路 110のコア層に伝播し、励起光となる。
【００３０】
１．２．１導波路
図1に示されるように、ある具体例中、平面導波路 110は、コア層 112、上部クラッド層 114、及び、下部クラッド層 116を含む。コア層 112は、屈折率が n2の材料を含み、例えば、ケイ素-酸化チタン (SixTi1-xO2, 0 < x < 1)、酸化チタン、タンタル酸化物、酸化ニオブ、酸化ハフニウム、酸化アルミニウム、酸化ジルコニウム、窒化ケイ素、窒化アルミニウム、窒化チタン、ポリカーボネート (PC)、PMMA、又は、Su8である。上下部クラッド層114と116は、屈折率がそれぞれ n3と n4である材料を含む。上下部クラッド層114 と 116 の材料は、同じか又は異なる。上部クラッド層 114、又は、下部クラッド層 116に適する材料は、例えば、酸化ケイ素、フッ化マグネシウム、フッ化カルシウム、酸化アルミニウム、Su8、PMMA、又は、ポリカーボネートを含む。コア層 112の屈折率 n2 は、上下部クラッド層114と116の屈折率n3と n4 より大きい。
【００３１】
上述のように、単一分子検出にとって、励起光が検出器に到達するのを防止する必要がある。平面導波路中、コア層表面は、所望の滑らかさではない。コア層の粗い表面は、励起光の散乱部分である。コア層の表面粗さは約 0.3 nmで、約 0.01% の励起光が散乱されて、ノイズを生成することが推測できる。コア中で伝播する励起光の表面散乱によるノイズを減少させるため、コアの表面粗さは約 0.3 nmより小さくなければならない。
【００３２】
１．２．２ナノウェル
ある具体例中、少なくとも一つのナノウェル 120が、少なくとも上部クラッド層 114中に形成される。ナノウェル120の上部開口は、ナノウェル 120底部より大きい。ナノウェル120の形状は限定されない。例えば、ナノウェル120の水平断面は、円形、楕円形、長方形、正方形、又は、ひし形である。図2に示されるように、ナノウェル120底部の大きさも限定されない。例えば、ナノウェル120底部の大きさは、励起光の波長より小さい。ある具体例中、ナノウェル120底部の大きさは、励起光の波長の二分の一、四分の一、又は、八分の一より小さい。ここで、“大きさ(size)”というのは、ナノウェル120の水平断面が、円形、楕円形、又は、長方形である場合、直径、長軸の長さ、長辺の長さである。ナノウェル120の水平断面が正方形、又は、ひし形である場合、“大きさ”は横の長さである。一例中、ナノウェル120の上部開口の直径は約 1 〜約 10 μm、ナノウェル120底部の直径は約 10〜約 500 nm、ナノウェル底部に垂直な方向のナノウェル側壁の角度は約 60度より小さい。このような構造は、一単一分子がナノウェル 120底部付近の領域に進入し、且つ、検出されることを確保することができる。
【００３３】
本発明によると、一部の励起光がナノウェル 120に進入し、且つ、ナノウェル120の空間的制限に従い、有効な励起領域 130を形成する。有効な励起領域 130が、ナノウェル 120底部付近に形成される。オブジェクトが有効な励起領域 130に入る時、励起光により励起され、光検出器 106により検出される光線を発射する。有効な励起領域 130外側で、オブジェクトは、励起光により励起されないか、又は、その発射光線は光検出器に達することができない。図の点線は、おおよその有効な励起領域 130の上方境界を示し、有効な励起領域 130の上方境界の形状を制限するものではないことが理解できる。例えば、有効な励起領域の上方境界は曲面形状である。
【００３４】
異なる状況、例えば、導波路中に延伸するナノウェルの位置、及び/又は、ナノウェルの深さに基づいて、異なる有効な励起領域が形成される。更に、有効な励起領域中の電磁場は、例えば、エバネセント場(evanescent field)、エバネセント場と移動領域(travelling fields)の混合、又は、移動領域であり、以下で詳細を説明する。  
【００３５】
図3 は、本実施形態に係る異なるナノウェル設計を示す図である。ある具体例中、ナノウェル 121 は、上部クラッド層の部分厚さに延伸する。ある具体例中、ナノウェル 122は、上部クラッド層の総厚さに延伸する。ナノウェル 121、又は、122にとって、励起光がコア層中で伝播する時、ナノウェル 121、又は、122中で伝送される光線はないが、コア層中で伝達される一部の光線は、ナノウェル 121、又は、122をわずかに貫通する。ナノウェル 121、又は、122中で伝播する光線は、垂直方向で、指数関数的に減衰し、エバネセント場を形成する。このエバネセント場は、ナノウェル 121、又は、122の空間的制限下で、有効な励起領域 131、又は、132を形成する。
【００３６】
ある具体例中、ナノウェル 123は、上部クラッド層の総厚さとコア層の部分厚さに延伸する。ナノウェル 123にとって、エバネセント場以外に、移動領域コンポーネントも、同時に、ナノウェル中に現れ、有効な励起領域 133を形成する。
【００３７】
ある具体例中、ナノウェル 124は、上部クラッド層の総厚さとコア層の総厚さに延伸する。ナノウェル 124にとって、ナノウェル中の大部分の電磁場は移動領域で、有効な励起領域 134が形成される。
【００３８】
ナノウェル 122を含む平面導波路にとって、ナノウェル底端がコア層上表面の上表面に位置するので、有効な励起領域 132の容量は、エバネセント場の有効領域に等しく、且つ、以下の方程式で概算される。
V=π × (D/2)2 × h
式中、D はナノウェル底部の直径、h は、ナノウェル中のエバネセント場の侵入深さである。例えば、D と h が、それぞれ、100 nm と100 nmの場合、有効な励起領域の計算された容量は、約 1×10-18リットルで、1アトリットルに等しい。
【００３９】
ある具体例中、ナノウェル 120表面と上部クラッド層 114表面 (以下で、上部保護層表面とする。上部保護層表面が上部クラッド層上に形成される場合)は異なる表面特性を有する。表面特性は、例えば、疎水性、官能基、官能基密度、材料密度、又は、導電性を含む。
【００４０】
ある具体例中、ナノウェル120の側壁表面は親水性で、シリコン、シリカ、金属、又は、金属酸化物から選択される一部を含み、且つ、ナノウェル 120の底部表面は疎水性である。しかし、ナノウェル 120の底部表面が親水性材料でなる場合、疎水性に改質される。例えば、ナノウェル 120の底部表面が親水性のケイ酸塩、又は、金属でなる場合、疎水性用途、例えば、R1x-Si(O-R2)4-x (R1 は疎水基、例えば、アルキル鎖 -(CH2)n-CH3、及び、R2はCnH2n+1、xとn は整数、且つ、1≦x≦3)、又は、用途、例えば、−COOH, -PO3H2, -SH、又は、−NH2から選択される官能基を有するポリマーに改質される。別の例によると、ナノウェル 120の底部表面が親水性の金属酸化物でなる場合、疎水性用途、例えば、R1x-Si(O-R2)4-x(R1 は疎水基、例えば、アルキル鎖 -(CH2)n-CH3、及び、R2はCnH2n+1、及び、x とnは整数、且つ、1≦x≦3)、又は、用途、例えば、−COOH, −PO3H2, −SH、又は、NH2から選択される官能基を有するポリマーに改質される。ナノウェル120 の底部表面を疎水性にし、且つ、ナノウェル 120の側壁表面を親水性に維持することにより、検出されるオブジェクトは、ナノウェル 120底部付近の有効な励起領域で保持されるが、ナノウェル 120の側壁表面に粘着されない。よって、オブジェクトは、有効な励起領域に入る励起光により効果的に励起される。  
【００４１】
ある具体例中、複数のナノウェルが導波路中に形成される。ある具体例中、複数のナノウェルそれぞれに対し、光検出器が形成されて、ナノウェルの有効な励起領域中で、オブジェクトにより発射する光線を検出する。ある具体例中、一光検出器が用いられて、複数のナノウェルの有効な励起領域で、オブジェクトにより発射する光線を検出する。
【００４２】
１．２．３保護層
ある具体例中、保護層が検出装置中に形成されて、散乱した励起光を吸収する、及び/又は、検出装置外側から周辺光をブロックして、信号対雑音(S/N)比を増加する。図4を参照すると、ある具体例中、上部保護層 142と下部保護層 144が、それぞれ、上部クラッド層 114上と下部クラッド層 116の下に形成される。つまり、上部保護層 144が、ナノウェル 120と同じように、導波路の同一側上に形成され、下部保護層 144は導波路の反対側上に形成され、下部クラッド層 116と光検出器 106間に配置される。ある具体例中、検出装置は、その中に形成された上部保護層 142を有する。ある具体例中、検出装置はその中に形成された下部保護層 144を有する。ある具体例中、検出装置はその中に形成された上下部保護層142と144両者を有する。
【００４３】
ある具体例中、上下部保護層142と144 は、例えば、金属や合金等の不透明材料でなる。上下部保護層142と144は、同一材料、または、異なる材料でなる。上下部保護層142と144の適当な材料は、例えば、Al, Ti, Ni, Cr, Au, Cu, Pt, Pd、又は、二個又はそれ以上の上述の材料の合金を含む。
【００４４】
ある具体例中、ピンホール 150は、ナノウェル 120下方の位置で、下部保護層144中に形成される。有効な励起領域130中のオブジェクトから発射する光線は、ピンホールを通過し、光検出器106により検出される。
【００４５】
ある具体例中、図5に示されるように、格子となるナノ構造を有する金属パターン 152は、ピンホール中ではなく、下部保護層 144 中に配置される。金属パターン 152のピッチと深さを適切に設計することにより、オブジェクトから発射する光線の大部分は金属パターン 152 を通過するが、励起光からのノイズが最小化する。
【００４６】
オブジェクトから発射する光線はTM モード光線、励起光はTE モード光線である。金属格子を通過するTM モード光線、又は、TE モード光線の透過率は、金属パターン 152のピッチ(即ち、格子周期)と深さに基づく。透過率は、金属と金属周囲の材料間の屈折性の差にも基づく。更に、透過率は金属格子に入射する光線の角度にも基づく。これにより、S/N 比が更に改善される。
【００４７】
１．２．４光カプラー
図1を再度参照する。光カプラー104は、導波路近く、又は、導波路上か中に配置される。光カプラー104は、光源102からの少なくとも一部の入射光を、導波路 110中に結合することができる。
【００４８】
ある具体例中、プリズムカプラーが光カプラー104として用いられる。図6に示されるように、プリズムカプラーは、プリズム 202とコリメーティングレンズ 204を含む。光源 102から発光する入射光は、コリメーティングレンズ 204により、導波路 110の同じ位置に集光される。図6に示されるように、一部の入射光は、プリズムカプラーにより、導波路 110中に結合され、コア層 112に伝播して、励起光となる。光源の位置、及び/又は、コリメーティングレンズ 204に相対する入射光の入射角に基づいて、異なるモードの光線が導波路 110中に結合されて、コア層 112中に伝播し、例えば、図6中の破線曲線で示される。これにより、導波路に伝播する励起光のモードは、調整可能、且つ、選択可能である。ある具体例中、コリメーティングレンズ 204 は、特殊設計により、点光源を線光源に拡張し、線光源は、横方向に拡張した(laterally-expanded )励起光を提供し、横方向、即ち、導波路 110の図6に示される断面に垂直な方向で、大きい領域を被覆する。
【００４９】
ある具体例中、図7に示されるように、サイドカプラー 302は光カプラー 104として用いられる。サイドカプラー302は、光学レンズモジュールである。入射光はサイドカプラー 302により集光され、導波路 110中で結合し、コア層 112中に伝播して、励起光となる。
【００５０】
ある具体例中、格子結合器は、光カプラー 104として用いられる。格子結合器は、規則的パターン(regular pattern)を有する光学部品で、光線を、異なる方向で伝播する各種ビームに分裂させ、回折する。これにより、一部の入射光導波路 110に導かれ、導波路 110のコア層 112中で伝播する。
【００５１】
ある具体例中、図8に示されるように、格子結合器は、上部クラッド層 114とコア層 112間の界面に配置された第一格子 402を含む。下部クラッド層 116の上下表面から反射する光線の干渉のため、このような格子結合器カップリング効率は、下部クラッド層 116の厚さに基づく。
【００５２】
上述のように、入射光は、コア層 112中に完全に結合される。一部の入射光は、垂直に、導波路 110を通過し、衰弱する。ある具体例中、カップリング効率を改善するため、反射器 (図示しない)が導波路 110下方に配置される。反射器は、下部クラッド層 116を通過する光線をコア層 112に反射させ、コア層 112中に部分的に結合させて、コア層 112中に結合される光線の総量を増加させる。
【００５３】
ある具体例中、図9に示されるように、格子結合器は、更に、コア層 112と下部クラッド層 116間の界面に配置された第二格子 404を含む。第二格子 404 は、第一格子 402真下に配置される。ある具体例中、カップリング効率は、更に多くの格子を追加することにより増加する。例えば、検出装置が上下部保護層を含む場合、図10に示されるように、格子は保護層とクラッド層間の界面にも配置される。
【００５４】
ある具体例中、一部の上部クラッド層 114が除去されて、コア層 112を露出する。格子、例えば、図11中の格子 406は、コア層 112の露出部分に配置される。
【００５５】
格子の形状は、図8-11のように限定されない。例えば、ある具体例中、カップリング効率を増加するため、曲面構造を有する格子、例えば、ブレーズ格子やマルチレベル格子が用いられ、ブレーズ（blaze）を幾つかのステップに分割することにより、マルチレベル格子はブレーズ格子をシミュレートする。
【００５６】
ある具体例中、光線は、吸収-発射性光カプラーを用いて、導波路 110 に間接的に結合される。図12 は、吸収-発射性光カプラーを示す図である。吸収-発射性光カプラーは光輝性層を含み、入射光を吸収し、波長が長い蛍光光線を発射する。光源から発射する光線は、吸収-発射性光カプラーの上表面に入射し、蛍光光線は、吸収-発射性光カプラー側面から発射される。一部の蛍光光線は導波路中に結合され、導波路のコア層中に伝播して、励起光となり、オブジェクトを励起させる。電力カップリング効率は以下のように計算される。
P(λ2)/P0(λ1) = (1-T1)(1+R1T1) × ΦFL × T2 × ηc × T3
式中、λ1 と λ2 は、それぞれ、入射光と吸収-発射性光カプラー側辺から発射される光線の波長である。P0(λ1) と P(λ2)は、それぞれ、入射光の出力、導波路 110のコア層 112中に結合される光線の出力である。R1 は、吸収-発射性光カプラーと下部クラッド層116間の界面での反射性である。T1 は、距離d1の移動後の吸収層中の波長λ1の光線の透過率、T2 は、距離d2の移動後の吸収層中の波長λ2 の光線の透過率である。ΦFL はフォトルミネッセンス材料のフォトルミネッセンス量子収量である。ηc は吸収-発射性光カプラーのカップリング効率である。T3 は、総長さ d3の導波路を通過する吸収-発射性光カプラーから発射する光線の透過率である。 
【００５７】
吸収-発射性光カプラーにとって、側面の面積は上表面の面積より小さいので、吸収-発射性光カプラーから発射し、コア層 112中に結合する光線の電力強度は、吸収-発射性光カプラーへの入射光より著しく高い。
【００５８】
吸収-発射性光カプラーに用いられるフォトルミネッセンス材料は、ストークスシフト（Stokes Shift）に基づいて選択される。例えば、フォトルミネッセンス材料は、約30 nmに等しい、又は、それ以上のストークスシフトを有する。ある具体例中、フォトルミネッセンス材料は、フォトルミネッセンス染料、例えば、アントラセン、クマリン、ピレン、スチルベン、ポルフィリン、ペリレン、Alq3、エオシン、Bodipy染料、フルオレセイン、ローダミン、ポリメチン染料、DCM 又は、その誘導体である。ある具体例中、フォトルミネッセンス材料は、フォトルミネッセンスポリマー、例えば、PPV 又は、その誘導体である。ある具体例中、フォトルミネッセンス材料は、無機材料、例えば、量子ドット、アルミナ酸化物、又は、酸化亜鉛である。
【００５９】
ある具体例中、格子と吸収-発射性光カプラーを結合することにより、カップリング効率が増加する。結合された光カプラーは、格子 502と吸収-発射性材料 504を含む。ある具体例中、図13に示されるように、結合された光カプラーは、コア層 112の露出部分表面に配置される。ある具体例中、図14に示されるように、結合された光カプラーはコア層 112中に配置される。格子は、吸収-発射性材料を通過する入射光の経路長さの増加を助け、吸収-発射性材料により吸収される光線量を増加させ、これにより、フォトルミネッセンス効率を増加する。これにより、更に多くの入射光が励起光に転換され、出力カップリング効率が増加する。
【００６０】
１．２．５装置の別の任意選択要素
ある具体例中、図15に示されるように、光学フィルター 160は、下部保護層 144と光検出器106間に配置される。ある具体例中、光学フィルター 160は下部クラッド層 116と検出器 106間に設置され、下部保護層 144がない。ある具体例中、下部保護層 144 自身が光学フィルターとなる。光学フィルターは、特定範囲内の波長を通過させるが、少なくとも一部は、特定範囲以外の波長の光線をブロックする。これにより、光学フィルター 160を適当に選択することにより、オブジェクトから発射する光線を通過させるが、励起光により生じるノイズを減少させ、S/N 比を改善することができる。
【００６１】
本発明によると、オブジェクトは、ナノウェル 120中に充填される試料液中に含まれる。ある具体例中、マイクロ流体チャネル (図示しない)が用いられて、試料液をナノウェル 120に導入する。マイクロ流体チャネルは、一回で、一個のターゲットオブジェクトがナノウェルを通過するように設計され、フローサイトメトリー(flow-cytometry)のような検出を実現する。ある具体例中、カバー (図示しない) が導波路上に形成されて、試料液を保持する、及び/又は、周辺光をブロックする。
【００６２】
上述の図式は、本発明の検出装置の構造を示しているが、簡潔にするため、一部の素子は図示されていない。例えば、図6は、導波路 110、ナノウェル 120、及び、プリズム 202とコリメーティングレンズ 204を含むプリズムカプラーを示す。検出装置の別の素子は図示されない。これらの図中に示される検出装置は、ここで開示される別の素子を含んでもよいことが理解できる。例えば、図6中の検出装置は、光検出器、カバー、保護層、及び/又は、光学フィルターを含む。
【００６３】
２．本発明の検出と応用の方法
別の態様中、本発明は、ここで開示される検出装置を用いて、オブジェクト、例えば、単一分子オブジェクトを検出する方法に関する。本発明によると、オブジェクトを含む試料液が、検出装置の導波路 110中に形成されるナノウェル 120に充填される。光源により発光する入射光は、光カプラーにより、部分的に、導波路 110中に結合され、導波路 110のコア層 112 中で伝播する。導波路 110中で結合される光線は、励起光となる。オブジェクトは、有効な励起領域に入るとき、励起光により励起され、光検出器により検出される光線を発射する。
【００６４】
本発明の検出装置、及び、それを用いた方法は、例えば、核酸検出、DNA シークエンシング、バイオマーカーの同定、又は、フローサイトメトリーに応用される。検出装置は、低強度の光信号を検出、処理することができ、単一分子オブジェクト検出を可能にする。
【００６５】
２．１装置に用いる標識
本発明の方法によるある具体例中、標識を検体 (即ち、検出される物体)、探針、例えば、プライマー、抗体、又は、検体と反応する別の試薬、又は、別の試薬、例えば、ヌクレオチド (ヌクレオチドアナログを含む)に粘着する。あらゆる標識は、検体、又は、探針上に用いられ、信号と検体の量、又は、存在の相互関係に有益である。  
【００６６】
例えば、多種の異なる蛍光分子を使用することができ、蛍光分子は、小分子、蛍光タンパク質、及び、量子ドットを含む。有用な蛍光分子 (蛍光色素分子)は、これに限定されないが: 1,5 IAEDANS; 1,8-ANS; 4-Methylumbelliferone; 5-carboxy-2,7-dichlorofluorescein; 5−Carboxyfluorescein (5-FAM); 5−Carboxynapthofluorescein; 5−Carboxytetramethylrhodamine (5−TAMRA); 5-FAM (5-Carboxyfluorescein); 5-HAT (Hydroxy Tryptamine); 5-Hydroxy Tryptamine (HAT); 5-ROX (carboxy-X-rhodamine); 5−TAMRA (5-Carboxytetramethylrhodamine); 6-Carboxyrhodamine 6G; 6-CR 6G; 6−JOE; 7-Amino-4-methylcoumarin; 7-Aminoactinomycin D (7-AAD); 7-Hydroxy-4-methylcoumarin; 9-Amino-6-chloro-2-methoxyacridine; ABQ; Acid Fuchsin; ACMA (9−Amino-6-chloro-2-methoxyacridine); Acridine Orange; Acridine Red; Acridine Yellow; Acriflavin; Acriflavin Feulgen SITSA; AFPs-AutoFluorescent Protein-(Quantum Biotechnologies); Texas Red; Texas Red-X conjugate; Thiadicarbocyanine (DiSC3); Thiazine Red R; Thiazole Orange; Thioflavin 5; Thioflavin S; Thioflavin TCN; Thiolyte; Thiozole Orange; Tinopol CBS (Calcofluor White); TMR; TO-PRO-1; TO-PRO-3; TO−PRO-5; TOTO-1; TOTO-3; TriColor (PE-Cy5); TRITC (TetramethylRodaminelsoThioCyanate); True Blue; TruRed; Ultralite; Uranine B; Uvitex SFC; WW 781; X-Rhodamine; XRITC; Xylene Orange; Y66F; Y66H; Y66W; YO-PRO-1; YO-PRO-3; YOYO-1; 相互キレート染料(interchelating dyes)、例えば、YOYO-3, Sybr Green, Thiazole orange; Alexa Fluor 染料シリーズの部材(Molecular Probes/Invitrogen)、広域スペクトルを被覆し、コモン励起光源の主要出力波長、例えば、lexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 635, 647, 660, 680, 700, 及び 750に適合する; Cy 染料蛍光色素分子シリーズの部材 (GE Healthcare)、広域スペクトル、例えば、Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7を被覆する;染料蛍光色素分子の部材 (Denovo Biolabels)、例えば、Oyster-500, -550, -556, 645, 650, 656; DY-Labels シリーズの部材(Dyomics)、例えば、範囲が418 nm (DY−415)〜844 nm (DY-831) は、最大吸収の範囲を有し、例えば、DY-415, -495, -505, -547, -548, -549, -550, -554, -555, -556, -560, -590, -610, -615, -630, -631, -632, -633, -634, -635, -636, -647, -648, -649, -650, -651, -652, -675, -676, -677, -680, -681, -682, -700, -701, -730, -731, -732, -734, -750, -751, -752, -776, -780, -781, -782, -831, -480XL, -481XL, -485XL, -510XL, -520XL, -521XL; ATTO蛍光標識シリーズの部材 (ATTO-TEC GmbH)、例えば、TTO 390, 425, 465, 488, 495, 520, 532, 550, 565, 590, 594, 610, 611X, 620, 633, 635, 637, 647, 647N, 655, 680, 700, 725, 740; CAL Fluor シリーズ 、又は、 Quasar 染料シリーズの部材 (Biosearch Technologies)、例えば、CAL Fluor Gold 540, CAL Fluor Orange 560, Quasar 570, CAL Fluor Red 590, CAL Fluor Red 610, CAL Fluor Red 635, Quasar 670; 量子ドット、例えば、EviTags シリーズの量子ドット(Evident Technologies)、又は、Qdot シリーズ (Invitrogen)の量子ドット、例えば、Qdot 525, Qdot565, Qdot585, Qdot605, Qdot655, Qdot705, Qdot 800; フルオレセイン; ローダミン;及び/又は、フィコエリトリン(phycoerythrin); 又は、それらの組み合わせを含む。例えば、米国特許公開番号2008/0081769を参照する。
【００６７】
ある具体例中、少なくとも一つの生物発光、又は、化学発光システムが提供され、実体、例えば、検体、試薬、又は、反応生成物の存在下で、光線を生成する。例えば、生物発光（bioluminescent）、又は、化学発光（chemiluminescent）システムが用いられて、合成反応により、シークエンシングで生成されたピロリン酸塩を検出する (以下で詳述する)。光線生成反応（light-generating reaction）のそれらの触媒により、金属、例えば、鉄、又は、銅の存在を検出する。又は、検体により化合した試薬の量を測定し、試薬は、バイオ、又は、化学発光システムの少なくとも一つの成分を含む。
【００６８】
従来の生物発光システムの例は、少なくとも一つの発光酵素、例えば、Photinus pyralis 発光酵素を含む蛍発光酵素（firefly luciferases）を含むシステムを含む。生物発光システムが用いられて、例えば、発光酵素、ATP スルフリラーゼ、ルシフェリン、及び、アデノシン 5’ホスホ硫酸を提供することにより、ピロリン酸塩と合成反応 (dATPは、例えば、dATPαS の類似物により代替されて、dATPが発光酵素により消耗されることによる非特異性の光線を回避する)によるシークエンシングの成分を検出する。ピロリン酸塩がヌクレオチド加入により生成される時、ATP スルフリラーゼは、アデノシン 5’ホスホ硫酸に基づいて、ATPを生成する。発光酵素に光線をプラスすることにより、ATPは、ルシフェリン（luciferin）をオキシルシフェリン（oxyluciferin）に転換するのを促進する。別の生物発光システムは、発光タンパク質、例えば、イクオリンを基礎とするシステムを含み、セレンテラジン（coelenterazine）を、光線を発射する励起したセレンテラミド（coelenteramide）に酸化する。
【００６９】
化学発光システムの例は、ルミノール（luminol）プラス過酸化水素、金属触媒、又は、補助酸化剤（auxiliary oxidant）の存在下で、発光反応を実行することができる; シュウ酸ジフェニル（diphenyl oxalate）プラス過酸化水素と適当な染料、二酸化炭素を精製する多段式反応中、励起と発光を実行する (適当な染料の例は、フェニル化アントラセン誘導体、例えば、9,10-ジフェニルアントラセン（diphenylanthracene）、9,10-Bis(フェニルエチニル)アントラセン、及び、1-クロロ-9,10-bis(フェニルエチニル)アントラセン、及び、ローダミン、例えば、ローダミン 6Gとローダミン Bを含む); 一重項酸素-生成システム、例えば、過酸化水素プラス次亜塩素酸ナトリウム（sodium hypochlorite）;及び、酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼを含むシステム、ルミノール、又は、別の市販の基板上で作用する；を含む。
【００７０】
ある具体例中、本発明の方法は、例えば、試薬や検体と標識間、又は、試薬、例えば、シークエンシング反応に用いられるポリメラーゼと、例えば、ナノウェル表面等の表面間の共有結合の形成を含む。従来の技術中に、多種の共有結合方法がある。非共有結合（Non-covalent attachment）方法も用いられる。幾つかの異なる化学修飾剤が用いられて、アタッチメント形成を促進する。化学修飾剤の例は、N-ヒドロキシスクシンイミド (NHS) 基、アミン、アルデヒド、エポキシド、カルボキシル基、ヒドロキシル基、ヒドラジド、疎水基、薄膜、マレイミド、ビオチン、ストレプトアビジン、チオール基、ニッケルキレート、光反応基、ホウ素族、チオエステル、システイン、ジスルフィド基、アルキルとアシルハライド基（acyl halide group）、グルタチオンマルトースアジドリン酸塩、及び、ホスフィンを含む。ある具体例中、改質剤(例えば、求電子性改質剤と求核改質剤)の適当な組み合わせを用いることにより、二個の実体間に連結が形成され、各実体は少なくとも一つの改質剤を含む。
【００７１】
ある具体例中、一実体上に存在する化学修飾剤、及び、その他の実体の自然発生部分、例えば、アミン、又は、スルフヒドリル基を用いることにより、2個の実体間に連結が形成される。ある具体例中、アミンに反応する改質剤が用いられる。この反応の長所は、快速に反応し、且つ、有毒副産物の生成を回避することができることである。このような改質剤の例は、NHS-エステル、アルデヒド、エポキシド、ハロゲン化アシル、及び、チオエステルを含む。大部分のたんぱく質、ペプチド、グリコペプチド等は、遊離アミン基を有し、且つ、このような改質剤と反応して、それらをこれらの改質剤に共有結合することができる。内部、又は、末端アミン基を有する核酸探針も合成することができ、且つ、商業利用価値がある (例えば、IDTや Operon)。よって、類似する特性を利用して、生体分子が標識や別の試薬に(例えば、共有、又は、非共有)結合される。  
【００７２】
多くのその他の多機能架橋剤が用いられて、改質剤の化学反応性を別のものに転換する。これらの基は、二価性、三官能性、四官能性である。これらは、ホモ官能性（homo-functional）、又は、ヘテロ官能性（hetero-functional）でもある。二官能性架橋剤の例はX-Y-Z、XとZは2個の反応基、Y は、接続リンカーである。この他、 XとZ が同一の基、例えば、NHS-エステルである場合、得られる架橋剤、NHS-Y-NHSはホモ二官能性架橋剤で、それぞれアミンを含む2個の実体を連結する。X がNHS-エステル、Z がマレイミド基の場合、得られる架橋剤、NHS-Y-マレイミドはヘテロ二官能性架橋剤で、チオ基を含む実体を有するアミンを含む実体を連結する。多くの異なる官能基を有する架橋剤が幅広く応用される。このような官能基の例は、NHS-エステル、チオエステル、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アシル (例えば、ヨードアセトアミド )、チオール、アミン、システイン、ヒスチジン、ジスルフィド、マレイミド、シスジオール、ボロン酸、ヒドロキサム酸、アジド、ヒドラジン、ホスフィン、光反応基(例えば、アントラキノンベンゾフェノン)アクリルアミド (例えば、アクリダイト)、アフィニティー・グループ(例えば、ビオチン、ストレプトアビジン、マルトース、マルトース結合タンパク質(maltose binding protein)、グルタチオン、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、リン酸塩、疎水基(例えば、フェニル、コレステロール)等を含む。  
【００７３】
別の改質剤代替物 (例えば、フォト架橋結合と熱架橋結合) は当業者にはよく知られている。産業上利用可能な技術は、例えば、Mosiac Technologies (Waltham, MA), ExiqonTM(Vedbaek, Denmark), Schleicher and Schuell (Keene, N.H.), Surmodics TM(St. Paul, MN), Xenopore TM(Hawthorne, N.J.), Pamgene (Netherlands), Eppendorf (Germany), Prolinx (Bothell, WA), Spectral Genomics (Houston, TX)、及び、CombimatrixTM (Bothell, WA)等の企業の商品を含む。
【００７４】
２．２核酸検出
本発明の検出装置はシステムの一部となり、分子検出の方法や過程中、例えば、核酸シークエンシングに用いられる。この装置、及び、この装置を用いた方法や過程は、例えば、分析的、診断的適用に有用である。これらの応用は、私的、公的、又は、産業的である。
【００７５】
本発明の検出装置は、各種シークエンシングモダリティに用いられ、シークエンシング単一分子に適する。この他、現存のバイオチップ装置に相対し、本発明の検出装置は、設計、アセンブリ、及び、生産が簡潔である。  
【００７６】
本発明の検出装置はシステムの一部となり、核酸ハイブリダイゼーションやシークエンシング、例えば、全ゲノムシークエンシング、転写プロファイリング、比較転写プロファイリング、又は、遺伝子同定を含む生体分子検出の方法中や過程に用いられる。生体分子検出は、結合相互作用の検出、及び/又は、測定、例えば、たんぱく質/たんぱく質、抗体/抗原、受容体/リガンド、及び、核酸/たんぱく質も含む。これらの応用は、分析的、又は、診断プロセスと方法に有益である。
【００７７】
２．２．１検出される分子
本発明により提供される方法による検出に適する核酸は、例えば、DNA、RNA、又は、PNA (ペプチド 核酸)を含む核酸を含み、且つ、既知か未知のあらゆる順列を含み、自然発生的な、又は、人工的順列を含む。核酸は、天然由来、組み換え技術による製造（recombinantly produced）、又は、化学合成である。核酸は、自然発生のヌクレオチド、自然界に存在しないヌクレオチドアナログ、又は、改質されたヌクレオチドを含む。検出される核酸の長さは、実際の応用に基づいて変化する。ある具体例中、核酸は、少なくとも 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 10000, 20000 個の塩基、又は、それ以上を含む。ある具体例中、核酸は、10〜20、10〜50、10〜100、50〜100、50〜500、50〜1000、50〜5000、500〜2000、500 〜 5000、又は、1000 〜5000 個の塩基である。
【００７８】
核酸は検出の一本鎖である。一本鎖核酸テンプレートは、例えば、加熱、又は、アルカリ、又は、その他の薬品処理を含む既知の手段により、二本鎖分子から派生する。一本鎖核酸テンプレートは、例えば、化学、又は、インビトロ合成（in vitro synthesis）でも製造できる。  
【００７９】
ある具体例中、検出される核酸は環状である。ある具体例中、本発明の方法は、既知の配列の挿入（insert）を含む環状核酸分子を提供する工程を含み、プライマーの結合部位として用いることができる。環状核酸分子は、一本か二本鎖状態で提供され、一般に、少なくとも一つの共有閉鎖ストランド（covalently closed strand）を含む。二本鎖環状分子は、切れ目ストランド（nicked strand）又は、第二共有閉鎖ストランドを含む。
【００８０】
ある具体例中、その一部の序列が既知で、且つ、既知の序列が核酸挿入として作用する場合 (例えば、環状分子中に含まれる遺伝子の序列中の保存モチーフ（conserved motif）が既知であるか、又は、分子が既知で、その能力に基づいた序列を含み、厳しい条件下で、既知の配列の別の核酸に混成する)場合、そのソースから、環状形態で分離されることにより、環状核酸分子が提供される。ある具体例中、核酸挿入の序列は不正確（inexactly）に知られ、序列の認識が、厳格なハイブリダイゼーション特性から派生した時だけ、このようである。ある具体例中、核酸挿入の序列は正確に知られ、環状核酸分子が、既知のバックボーン序列（backbone sequence）を有する、又は、設計により、既知の配列を含む時、このようである。  
【００８１】
ある具体例中、インビトロ反応、又は、数個の反応を実行することにより、線状の核酸サンプルを、核酸挿入と共に環状分子に合併し、環状核酸分子を提供する。ある具体例中、インビトロ反応、又は、数個の反応は、リガーゼによる連鎖反応、及び/又は、別のストランド接合反応を含むことができ、反応は、例えば、リコンビナーゼとトポイソメラーゼを含む各種酵素により触媒される。DNA リガーゼ、又は、RNA リガーゼが用いられて、線形テンプレートの二端に酵素的に接合され、アダプター分子（adapter molecule）やリンカー（linker）があってもなくても、環状を形成する。例えば、T4 RNA リガーゼ は一本鎖 DNA、又は、RNAを結合し、Tessier et al., Anal Biochem, 158: 171-78 (1986)に示されている。CIRCリガーゼ(TM) (Epicentre, Madison, Wis.)も、一本鎖核酸の連鎖反応を触媒するのに用いられる。この他、二本鎖リガーゼ、例えば、E. coli やT4 DNA リガーゼが用いられて、環状化反応を実行する。
【００８２】
ある具体例中、環状核酸分子の提供は、相補領域を含む少なくとも一つのプライマー(プライマーは、既知の配列の5’端を有するランダムプライマーを含み、核酸挿入となる) から延伸することにより、核酸テンプレートを複製し、及び、増幅した核酸を環状化することにより、例えば、リガーゼ、又は、リコンビナーゼにより触媒する工程を含む; ある具体例中、増幅した核酸は、例えば、制限、又は、リン酸化反応により、環状化の前に、その末端で処理される。
【００８３】
ある具体例中、環状核酸分子は、化学環状化を実行することにより提供される。化学法は既知のカップリング剤、例えば、BrCN プラスイミダゾールと二価金属、N-シアノイミダゾールと ZnCl2, 1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3 エチルカルボジイミド HCl、及び、別のカルボジイミド（carbodiimides）とカルボニルジイミダゾール（carbonyl diimidazole）を運用する。線形テンプレートの末端は、5’-リン酸塩と3’-ヒドロキシル基、又は、5’-ヒドロキシル基と3’-リン酸塩を凝縮することにより結合される。 
【００８４】
ある具体例中、環状核酸分子は挿入配列を含み、挿入配列は、この分子が環状なので、挿入配列は末端にない以外は、エンドリンクプライマー (以下で説明)と見なされる。
【００８５】
２．２．１．１エンドリンクプライマー
ある具体例中、線形核酸は、更に、核酸の 5’ 端、 3’ 端、又は、5’ 端と3’端両方に結合される一つ、又は、それ以上のエンドリンクプライマーを含む。特定の具体例中、エンドリンクプライマーは、核酸の 3’端に固定される。エンドリンクプライマーが用いられて、一つ、又は、それ以上の検出プライマー、例えば、シークエンシングプライマーの相補配列を提供する。
【００８６】
エンドリンクプライマーは短い核酸分子で、通常、100個より少ないヌクレオチドから構成される。ある具体例中、エンドリンクプライマーの長さは、少なくとも 5, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 75, 90 個のヌクレオチド、又は、それ以上である。ある具体例中、エンドリンクプライマーの長さは、8〜25、10〜20、10〜30、又は、10〜50個のヌクレオチドである。ある具体例中、エンドリンクプライマーは分岐しない(unbranched)。別の具体例では、それらは分岐する(branched)。  
【００８７】
エンドリンクプライマーは、核酸の検出に用いられる一つ、又は、それ以上のプライマー、例えば、シークエンシングプライマーの相補体として作用する。ある具体例中、プライマーは、ハイブリダイゼーションにより、核酸を検出するのに用いられ、例えば、プライマーは検出可能な標識、例えば、蛍光標識を含む。ある具体例中、エンドリンクプライマーの5’端は、シークエンシングプライマーに相補する配列を含む。ある具体例中、シークエンシングプライマーに相補するエンドリンクプライマー序列が方向付けられ、シークエンシングプライマーの3’端は、直ちに序列される核酸中の第一ヌクレオチドに隣接する。  
【００８８】
ある具体例中、エンドリンクプライマーは、リガーゼ、例えば、DNAリガーゼにより検出される核酸の末端に加えられる。ある具体例中、検出されるエンドリンクプライマーと核酸は、連鎖反応前、共に、一本鎖である。別の具体例中、両方が二本鎖である。さらに別の具体例中、一つは一本鎖で、もう一つは二本鎖である。連鎖反応は、当技術分野で周知のようである。例えば、ポロニーシークエンシング方法中、Shendure et al.は、New England Biolabs’ (NEB) Quick Ligation キットを運用して、T30 エンドリンクプライマー (32 bp)をサンプルDNA セグメントに接合している (Science, 309:1728-1732 (2005))。連鎖反応溶液は、1X Quick Ligation Buffer中に、0.26 pMole のDNA、0.8 pMoleのT30 エンドリンクプライマー、4.0 μl T4 DNA リガーゼを含む。混合後、反応溶液は、室温で、約 10 分間培養し、氷の上に置く。サンプルを65°C で10 分間加熱して、連鎖反応を停止させる。
【００８９】
別の具体例中、エンドリンクプライマーが、検出される核酸上で合成される。例えば、エンドリンクプライマーは、例えば、末端トランスフェラーゼにより加えられたホモポリマーである。例えば、Harris et al., (Science320:106-109 (2008))は、ポリA尾部（poly A tail）をDNA テンプレートに加え、DNA テンプレートは、ウイルスゲノムの単一分子シークエンシング中のポリ T シークエンシングプライマーの相補体として作用する。
【００９０】
２．２．１．２シークエンシングプライマー
シークエンシングプライマーは、一本鎖オリゴヌクレオチドで、検出される核酸のセグメント、又は、その関連エンドリンクプライマーと相補する。ある具体例中、シークエンシングプライマーの長さは、少なくとも 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50個のヌクレオチド、又は、それより多い。特定の具体例中、シークエンシングプライマーの長さは、8 〜25、10〜20、10 〜30、又は、10〜50個のヌクレオチドである。シークエンシングプライマーは、自然発生のヌクレオチド、自然界に存在しないヌクレオチドアナログ、又は、改質されたヌクレオチドを含むあらゆるタイプのヌクレオチドでなる。
【００９１】
ある具体例中、シークエンシングプライマーは、改質されたヌクレオチド、例えば、ロックド核酸(LNAs;改質されたリボヌクレオチド、ポリ核酸中で強化された塩基スタッキング相互作用を提供する)を含む。Levin et alによる(Nucleic Research 34(20):142 (2006)) 中のLNAの効用の説明のように、LNA-含有プライマーは特異性を改善し、対応するロックされていないプライマーに相対して、強い結合を示す。プライマー中の異なる位置で、3 LNA ヌクレオチド (キャップ中)に含まれるMCP1 プライマーの3個の変異体(5’-cttaaattttcttgaat-3’)が生成される:  MCP1-LNA-3’(5’-cttaaattttCtTgaAt-3’); MCP1-LNA-5’ (5’-CtTaAattttcttgaat-3’); 及び、MCP1-LNA-even (5’-ctTaaatTttctTgaat-3’)。全 LNA-代替プライマーは、増強した Tmを有し、MCP1-LNA-5’プライマーは、特に増強したシークエンシング精度(Phred Q30 カウント)を示す。従って、特定の具体例中、その5’ 領域、即ち、5’ の二分の一、三分の一、又、四分の一のシークエンシングプライマー中、シークエンシングプライマーは、少なくとも一つのロックドヌクレオチドを含む。 
【００９２】
本発明の検出装置に応用される前、シークエンシングプライマーと一本鎖サンプル核酸 (即ち、少なくとも一つのエンドリンクプライマーを含む検出される核酸)が混成される。含塩溶液中、例えば、5X SSC (又は、5X SSPE), 0.1% Tween 20 (又は、0.1% SDS)、及び、0.1% BSA バッファで、サンプル核酸とモル過剰のシークエンシングプライマーを混合することにより、シークエンシングプライマーとサンプル核酸が混成される。混合物を65°Cで少なくとも 5 分間加熱し、ゆっくりと室温まで冷却し、プライマー/テンプレート焼きなまし（annealing）を可能にする。例えば、分子篩(molecular sieve)を含む適当な方法により、残留プライマーが消去される。  
【００９３】
適当な方法により設計されるエンドリンクとシークエンシングプライマーを含むプライマーは、目視検査、又は、コンピュータベースのプライマー設計を含む。多くのソフトウェアパッケージは、 DNAStarTM (DNAStar, Inc., Madison, WI), OLIGO 4.0 (National Biosciences, Inc.), Vector NTI(R) (Invitrogen), Primer Premier 5 (Premierbiosoft)、及び、Primer 3 (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA)を含むプライマー設計の補助に適用される。プライマーは、例えば、 配列される分子、特異性、長さ、所望の融解温度、二級構造、プライマー二量体、GC 内容、緩衝液のpH とイオン強度、使用される酵素(即ち、ポリメラーゼ、又はリガーゼ)を考慮して設計される。例えば、 Joseph Sambrook and David Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd edition (2001)を参照する。
【００９４】
２．２．２シークエンシングモダリティ
本発明の実施例は、核酸のシークエンシング方法で、以下の工程を含む。(a) コア層と、第一クラッド層と、少なくとも第一クラッド層中に形成される少なくとも一つのナノウェル、及び、検出器を含む導波路を有する検出装置を提供する工程と、(b)少なくとも一つの核酸分子を提供する工程と、(c)少なくとも一つのナノウェル中に個別に、少なくとも一つの核酸分子を配置する工程と、 (d)少なくとも一つの核酸分子の単一分子合成時解読を実行し、単一分子核酸の合成時解読が、少なくとも一つの核酸中の塩基の特性に関連する光線を発射する工程と、 (e)検出器により光線を検出して、出力信号を生成する工程と、 (f)出力信号を処理して、少なくとも一つの核酸中の塩基の特性を決定する工程、を含む。
【００９５】
これらの方法中、“少なくとも一つのナノウェル中に、個別に、少なくとも一つの核酸分子を配置する” というのは、単一核酸分子が一ナノウェル中にあり、即ち、１個の (且つ、一個を超えない) 核酸分子を、少なくとも一つのナノウェル中に配置することであると理解できる。ある具体例中、複数のナノウェルは、皆、個別に一個の (且つ、一個を超えない) 核酸分子を含む。ある具体例中、操作期間で、ある複数のナノウェルは核酸分子を含み、その他は含まない。つまり、試料液中の核酸分子の濃度はある特定値より低く、よって、全てのナノウェルが核酸分子をその中に含んでいるのではない。これは、シークエンシング完成前、二つ又はそれ以上の分子が、相次いで同一のナノウェルに進入するのを防止して、一シークエンシングの結果が、一つ以上の分子からの情報を含むのを防止する。例えば、本発明のある具体例中、50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 又は 1% に等しい、又は、それより少ないナノウェルは、検出、又は、識別される生体分子の低濃度により、信号を生成する。
【００９６】
ある具体例中、試料液中の核酸分子の濃度は有効な励起領域の容量に基づく。例えば、有効な励起領域の容量が1 アトリットルである場合、試料液中の核酸分子の濃度は約 1.6 μMである。ある具体例中、試料液中の核酸分子の最適濃度は、約 1-100 pM 〜約 1-100 μMである。
【００９７】
ある具体例中、検出される核酸分子は、濃度が、本発明の装置のナノウェルの有効な励起領域の容量に相対し、半化学量論(substoichiometric)の関係をなす。例えば、有効な励起領域が1 アトリットルの場合、核酸分子の濃度は、各アトリットル中、0.01 〜 0.5個の分子、各アトリットル中、0.05〜0.2 個の分子、又は、各アトリットル中、約 0.1 個の分子である。濃度は、有効な励起領域の大きさに基づいて、適切にスケール（scaled）される。ある応用中、同一のナノウェルからの多重信号の減少と大きい比例のナノウェルからの生成信号間の相対重要性等の要素に基づいて、更に高い、又は、更に低い濃度を使用することが望ましい。
【００９８】
ある具体例中、検出される核酸分子は、濃度が、本発明の装置のナノウェルの有効な励起領域の容量に相対して、化学量論等価（stoichiometric equivalence）、又は、過多（excess）の関係である。例えば、有効な励起領域が1アトリットルの場合、核酸分子は、各アトリットル中、1〜50 個の分子、アトリットル中、2 〜20個の分子、又は、アトリットル中、3 〜10 個の分子の濃度で提供される。これらの濃度範囲の使用は、核酸分子シークエンシングの酵素と組み合わせて、半化学量論(substoichiometric)レベルで供給され、例えば、各ナノウェル中、0.01 〜 0.5 活性の使用可能なポリメラーゼ、各ナノウェル中、0.05 〜 0.2 活性の使用可能なポリメラーゼ、又は、各ナノウェル中、約 0.1 活性の使用可能なポリメラーゼである。
【００９９】
ナノウェル表面に反応するシークエンシング、又は、別の検出に用いられる酵素の連結は、連結位置、及び、酵素の構造が影響を受ける等の要素のため、ある酵素を使用不能、不活性、又は、両方の状況にする。過量の正制御（positive control）合成時解読反応のその他の成分を提供することにより、及び、ナノウェルにより生成される、活性の使用可能な酵素の存在と一致する蛍光信号の数量を観察することにより、各ナノウェル中の活性の使用可能なポリメラーゼの数量が推定される。大きな比例、例えば、50%、又は、それ以上のナノウェルが蛍光信号を生成する時、ランダム分布（random distribution）モデルは、多くのナノウェルが、少なくとも二つの活性の使用可能な酵素を含むことを推定する(例えば、50%のウェルが信号を生成する時、約 25%のウェルは少なくとも二つの活性の使用可能な酵素を含むことが見込まれる)。この場合、2個の異なるシークエンシング複合物が、同一のナノウェル中に形成される頻度を減少させるため、序列される核酸分子の濃度を制限することが望ましい。更に、小さい比例、例えば、10% かそれより少ないナノウェルが蛍光信号を生成する時、ランダム分布モデルは、少数のナノウェルが、少なくとも二つの活性の使用可能な酵素を含むことを推定する(例えば、10%のウェルが信号を生成する時、約 1%のウェルは、少なくとも二つの活性の使用可能な酵素を含むことが見込まれる)。この場合、シークエンシング複合物を、使用可能な活性酵素を有するナノウェル中に形成しない頻度を減少させるため、相対して高い濃度の序列される核酸分子を用いることが望ましい。
【０１００】
ある具体例中、単一分子核酸の合成時解読は、化学発光による光線発射を生じる。注意すべきことは、これらの具体例中、化学発光が化学エネルギーからの光線を生成する時、上述の装置は光源を必要としないことである。
【０１０１】
ある具体例中、装置は更に光源を含み、光源は、励磁光の提供に用いられ、例えば、単一分子核酸の合成時解読は、蛍光性により光線を発射する。
【０１０２】
例えば、米国特許番号第 6,946,249 、及び、 Shendure et al., Nat. Rev. Genet. 5:335-44 (2004)等の既知の手段により、本発明により提供される検出装置と方法が、核酸の検出と配列に用いられる。従来知られている単一分子のシークエンシング方法から、シーケンスモダリティが選択される。ある具体例中、シークエンシング方法は、DNA ポリメラーゼ、又は、DNAリガーゼの特異性のどちらにも依存することができ、及び、例えば、塩基拡張シークエンシング (single base stepwise extensions)、及び、多重塩基の合成シークエンシング(例えば、末端標識ヌクレオチドによるシークエンシングを含む)を含む。本方法は、通常、少なくとも一つのエンドリンクプライマーを含むサンプル核酸を提供する工程を含む。核酸は、一本鎖形式で提供されるか、又は、例えば、化学、又は、熱変性（thermal denaturation）により、一本鎖にされる。その後、シークエンシングプライマーで、シークエンシングが開始される。  
【０１０３】
ある具体例中、本発明の方法は共有結合の形成を含み、例えば、試薬、又は、検体、及び、表面、又は、標識間である。例えば、単一分子シークエンシング工程中、核酸分子、又は、酵素、例えば、ポリメラーゼがナノウェル底部に取り付けられる。このような連結は、複数のシークエンシング周期で、データの捕捉を可能にする。本技術領域中に、例えば、試薬から表面、又は、標識への多くの共有結合の形成方法がある。非共有結合方法も用いられる。幾つかの異なる化学修飾剤を用いて、アタッチメント形成を促進する。化学修飾剤の例は、N-ヒドロキシスクシンイミド (NHS)基、アミン、アルデヒド、エポキシド、カルボキシル基、ヒドロキシル基、ヒドラジド、疎水基、薄膜、マレイミド、ビオチン、ストレプトアビジン、チオール基、ニッケルキレート、光反応基、ホウ素族、チオエステル、システイン、ジスルフィド基、アルキルとアシルハライド基、グルタチオン、マルトース、アジド、リン酸塩、及び、ホスフィンを含む。これらの準備は容易で、例えば、標準の方法(Microarray Biochip Technologies, Mark Schena, Editor, March 2000, Biotechniques Books)を用いる。ある具体例中、改質剤の適当な組み合わせ(例えば、求電子性改質剤と求核改質剤)を用いることにより、2個の実体間に連結が形成され、各実体は少なくとも一つの改質剤を含む。
【０１０４】
ある具体例中、一実体上に存在する化学修飾剤、及び、別の実体の自然発生部分、例えば、アミン、又は、スルフヒドリル基を用いることにより、連結が2個の実体間に形成される。ある具体例中、アミンと反応する改質剤が用いられている。この反応の長所は、快速に反応し、且つ、有毒副産物の生成を回避することができることである。このような改質剤の例は、NHS-エステル、アルデヒド、エポキシド、ハロゲン化アシル、及び、チオエステルを含む。大部分のたんぱく質、ペプチド、グリコペプチド等は、遊離アミン基を有し、且つ、このような改質剤と反応して、それらをこれらの改質剤に共有結合することができる。内部、又は、末端アミン基を有する核酸探針も合成することができ、且つ、商業利用価値がある (例えば、IDTや Operon)。よって、類似する特性を利用して、生体分子が標識や別の試薬に(例えば、共有、又は、非共有)結合される。  
【０１０５】
多くのその他の多機能架橋剤が用いられて、改質剤の化学反応性を別のものに転換する。これらの基は、二価性、三官能性、四官能性である。これらは、ホモ官能性（homo-functional）、又は、ヘテロ官能性（hetero-functional）でもある。二官能性架橋剤の例は X-Y-Z、XとZは2個の反応基、Y は、接続リンカーである。この他、 XとZ が同一の基、例えば、NHS-エステルである場合、得られる架橋剤、NHS-Y-NHSはホモ二官能性架橋剤で、それぞれアミンを含む2個の実体を連結する。X がNHS-エステル、Z がマレイミド基の場合、得られる架橋剤、NHS-Y-マレイミドはヘテロ二官能性架橋剤で、チオ基を含む実体を有するアミンを含む実体を連結する。多くの異なる官能基を有する架橋剤が幅広く応用される。このような官能基の例は、NHS-エステル、チオエステル、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アシル (例えば、ヨードアセトアミド )、チオール、アミン、システイン、ヒスチジン、ジスルフィド、マレイミド、シスジオール、ボロン酸、ヒドロキサム酸、アジド、ヒドラジン、ホスフィン、光反応基(例えば、アントラキノンベンゾフェノン)アクリルアミド (例えば、アクリダイト)、アフィニティー・グループ(例えば、ビオチン、ストレプトアビジン、マルトース、マルトース結合｛けつごう｝タンパク質(maltose binding protein)、グルタチオン、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、リン酸塩、疎水基(例えば、フェニル、コレステロール)等を含む。  
【０１０６】
別の改質剤代替物 (例えば、フォト架橋結合と熱架橋結合) は当業者にはよく知られている。産業上利用可能な技術は、例えば、Mosiac Technologies (Waltham, MA), ExiqonTM(Vedbaek, Denmark), Schleicher and Schuell (Keene, N.H.), Surmodics TM(St. Paul, MN), Xenopore TM(Hawthorne, N.J.), Pamgene (Netherlands), Eppendorf (Germany), Prolinx (Bothell, WA), Spectral Genomics (Houston, TX)、及び、CombimatrixTM (Bothell, WA)等の企業の商品を含む。
【０１０７】
単一分子シークエンシングモダリティに対し、本発明は、単一分子の並べ替えが可能である長所を提供することができる。例えば、ポリメラーゼは、ナノウェル表面、例えば、底部に取り付けられる。配列されるテンプレート核酸分子は、環状形状で、シークエンシングプライマーと一緒に提供される。再シークエンシングは複数のシークエンシング周期を実行することにより達成されて、テンプレート核酸分子中のヌクレオチドの数量より多いシーケンス読み取り（sequence read）が得られる。よって、シークエンシング読み取りは、テンプレート核酸分子中の少なくとも一つの位置の塩基を重複して識別する情報を含む。ある具体例中、シークエンシング読み取りは、少なくとも 25%, 50%, 75%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%、又は、100%のテンプレート核酸分子中の塩基を重複して識別する情報を含む。ある具体例中、シークエンシング読み取りは、少なくとも 25%, 50%, 75%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%、又は、100%の3倍、4倍、5倍、7倍、又は、10倍の重複（redundancy）を有するテンプレート核酸分子中の塩基を識別する情報を含む。同じ分子を再シークエンシングすることにより、シークエンシングエラーが減少し、シークエンシング読み取りの数量の出力とすることが望まれる。例えば、各単一読み取りの塩基エラー率が 10-3の場合、二回の読み取り後、(10-3)2に落ち、即ち、10-6である。シークエンシングに用いられる改質されたヌクレオチドは、それらの標識、又は、保護基を失うことができ、例えば、擬似検出（spurious deletion）になるので、これは、単一分子シークエンシングに特に有利である。  
【０１０８】
一般に、単一分子シークエンシング中、配列される少なくとも一つの核酸分子はプライマーと接触する。例えば、少なくとも一つの酵素-触媒重合、又は、連鎖反応を実行することにより、プライマーが改質される。少なくとも一つの反応が、少なくとも一つの核酸中の塩基の性質と相関する光線の反射を生じる。光線の発射を“生じる（Leading to）” というのは、少なくとも一つの反応が、少なくとも一つの状況を生じ、光線と少なくとも一つの核酸中の塩基の性質と相関することであることが理解できる。この状況の発生は、励磁光、化学、又は、生物発光システム等との相互作用によるものである。少なくとも一つの状況は、例えば、蛍光色素分子の少なくとも一つの反応の産物への合併、又は、ピロリン酸塩の釈放である。よって、外部の励起があってもなくても、光線が生成される。例えば、単一分子シークエンシングは、共有結合の検出可能な 標識、例えば、蛍光標識、及び、二次延伸を防止する保護基を含む可逆終端の塩基アナログにより実行され、アナログがプライマーに加えられた後、アナログが励起され、検出され、加入後、標識と保護基が除去されて、もう一度、延伸（extension）を行う。更に、ピロリン酸塩相関方式で光線を発射する化学、又は、生物発光検出システムを提供することにより、外部励起がない状況下で、延伸工程での産物、例えば、ピロリン酸塩が検出される。これら、及び、その他のモダリティは以下で討論する。
【０１０９】
発射する光線は、少なくとも一つの核酸中の塩基の性質と相関する。ある具体例中、相互関係は時間的（temporal）である。例えば、光線発射の時間は、少なくともひとつの塩基の性質を示し、例えば、異なる塩基アナログが、異なる時間での重合反応のために提供される時の状況等である。ある具体例中、相互関係はスペクトルである。例えば、発射光線のスペクトルは、少なくとも一つの塩基の性質を示し、例えば、異なる蛍光色素分子を含む異なる塩基アナログが重合反応のために提供される時の状況等である。  
【０１１０】
ある具体例中、単一分子の核酸シークエンシングは、複数のシークエンシング周期を含む。一シークエンシング周期は、少なくとも一つの塩基の性質と相関する光線の発射を発生する事象であると理解され、第一塩基が識別された後、核酸中の少なくとも一つの第二塩基を識別するために、上述の状況が繰り返される。よって、単一分子の核酸シークエンシングを含む本発明の方法中、単一分子の核酸シークエンシングは、核酸中の少なくとも一定数の塩基の性質に集団的に（collectively）相関する少なくとも一定数の発射光線を生じる少なくとも一定数のシークエンシング周期を含むことができ、及び、本方法は核酸中の少なくとも一定数の塩基を決定する工程を含む。ある具体例中、一定数は、例えば、 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 200、又は、500である。
【０１１１】
シークエンシング方法は、核酸中の一つ、又は、それ以上の塩基の性質を決定する工程を含む。本発明の方法によると、ある具体例中、単一分子の核酸シークエンシングを実行して、生じる光線の発射は、少なくとも一つの第一光学センサーと第二光学センサーを含む少なくとも一つの光検出器により検出され、少なくとも二つの光学センサーからの出力信号が処理され、少なくとも一つの処理結果と、少なくとも一つの既知のタイプに対応する少なくとも一つの既知の結果を比較することにより、核酸中の少なくとも一つの塩基の性質が決定される。 
【０１１２】
例えば、処理結果は、反応発生の時間を示すことができる; 発射光線が時間的に少なくとも一つの核酸中の塩基の性質と相関する時、上述の時間は、少なくとも一つの核酸中の塩基を識別するのに用いられる。  
【０１１３】
別の例中、処理の結果は、蛍光色素分子を反応産物中に合併するのを決定することができる;発射光線がスペクトル的に少なくとも一つの核酸中の塩基の性質に相関する時、上述の決定は、少なくとも一つの核酸中の塩基を識別するのに用いられる。
【０１１４】
２．２．２．１塩基拡張シークエンシング：段階的延伸
ある具体例中、本発明により提供される検出装置が用いられて、塩基拡張シークエンシング期間に生成された光線を検出する。ある具体例中、配列される一本鎖核酸を含む部分重複のサンプル核酸、配列される核酸の 3’端に関連するエンドリンクプライマー、及び、焼きなましされるシークエンシングプライマーを提供することにより、塩基拡張シークエンシングが開始される。ある具体例中、適当なバッファ中、ポリメラーゼと改質されたヌクレオチドが光線検出装置中に適用される。ある具体例中、ヌクレオチドは、共有結合の検出可能な標識、例えば、蛍光標識、及び、二次延伸を防止する保護を含む。従って、単一ヌクレオチドをシークエンシングプライマーの3’端に加えた後、シークエンシングが停止する。  
【０１１５】
塩基拡張シークエンシング反応の具体例の第一ステップ中、DNA ポリメラーゼにより、蛍光保護基を有するヌクレオチドが、シークエンシングプライマーの3’端に加えられる。ある具体例中、蛍光標識は保護基として作用する。別の具体例中、それらは独立した部分である。単一のヌクレオチドがシークエンシングプライマーの3’端で合併されて、その標識により、対応する光検出器によって識別される。その後、蛍光標識と保護基が、例えば、化学、又は、酵素溶解により除去されて、塩基延伸の余分の周期を許容する。ある具体例中、同時に、又は、連続して、及び、あらゆる順序で、標識と保護基が除去される。加えられる塩基の順序を編成することにより、サンプル核酸の序列は3’〜5’の方向で、一回１塩基で推定される。
【０１１６】
一般に、段階的延伸期間で、追加されるヌクレオチドを識別する二種の方法がある。第一種目は、4個のヌクレオチドは全て同一の検出可能なレベルを有するが、所定順序で、1回に1個増加するものである。延伸したヌクレオチドの性質は、ヌクレオチドが延長反応中で加えられる順序により決定される。第二種目の、延伸期間で、組み込まれた塩基を認識する模式中、4個の異なるヌクレオチドが同時に加えられ、それぞれ、異なる検出可能な標識と結合する。異なる具体例中、励起、又は、発光スペクトル、及び/又は、標識の強度が異なる。延伸反応中、加えられるヌクレオチドの性質は、検出された標識の強度、及び/又は、波長 (即ち、励起、又は、発光スペクトル)によって決まる。
【０１１７】
２．２．２．２合成によるシークエンシング：多段階延伸（Multi-step Extension）
ある具体例中、多重連続延伸反応により、例えば、保護基を使用しないで、合成によるシークエンシングが処理される。これらの具体例中、ヌクレオシド3リン酸加水分解（nucleoside triphosphate hydrolysis）、即ち、β と γ リン酸複合体の釈放後、ピロリン酸塩の釈放を検出することにより、重合反応が監視される。例えば、この複合物は、複合物上の蛍光部分により直接検出、又は、例えば、ピロリン酸塩を化学、又は、生物発光検出システムに結合することにより、間接的に検出される。  
【０１１８】
ある具体例中、末端リン酸塩標識のヌクレオチドを用いることにより、サンプル核酸は、基本的に連続して配列される。末端リン酸塩標識のヌクレオチド、及び、それを使用した方法の例の具体例が、例えば、米国特許番号第 7,361,466号と米国特許公開番号第 2007/0141598（2007年6月21日）に記述されている。ヌクレオチドが、本発明により提供されるシステムに簡単に応用され、重合期間に加水分解される時、標識ピロリン酸塩は、対応する光検出器により検出される。ある具体例中、全4個のヌクレオチドは異なる標識を含み、同時に加えられる。ある具体例中、ヌクレオチドは区別が出来ない、例えば、相同の（identical）標識を含み、予め決定された順序で同時に加えられる。区別が出来ない標識を有するヌクレオチドの連続（Sequential）、循環的（cyclical）追加は、更に、複数の、連続重合ステップ、例えば、ホモポリマー配列を許可する。
【０１１９】
２．２．３その他の応用
本発明の検出装置は、数百万個の核酸セグメントを同時に検出する。各セグメントの長さが、例えば、1000 個の塩基の場合、単一装置は、一回で、数十億個以上の塩基配列を獲得する。以下で、本明細書中で提供される装置とっ方法のその他の応用を討論する。
【０１２０】
２．２．３．１全ゲノムシークエンシング
本発明による検出装置が全部、又は、一部のゲノムシークエンシング、例えば、ウィルス、バクテリア、菌類、真核生物、又は、動物や人間等の脊椎動物の実行に用いられる。
【０１２１】
ゲノム DNA は、少なくとも 20, 50, 100, 200, 300, 500, 800, 1200, 1500 個、又は、それより長いヌクレオチドに細かく切り分けられる。ある具体例中、細かく切り分けられたゲノム DNAの長さは、20〜50、20〜100、20〜500、20〜1000、500〜1200、又は、500 〜1500 個のヌクレオチドである。ある具体例中、配列される核酸は、エンドリンクプライマーに相関すると、シークエンシングプライマーに焼きなましされる一本鎖を生成し、本発明により提供されるシークエンシングに用いられるシステムに応用される。
【０１２２】
２．２．３．２遺伝子発現プロファイリング（Gene Expression Profiling）
別の具体例中、本発明の検出装置は、遺伝子発現プロファイリングのcDNA 配列に用いられる。例えば、mRNAレベルは、装置上で検出される特定配列の相対頻度（relative frequency）を測定することにより定量化される。数百万個のcDNA 分子は、本発明により提供される装置上で並列に配列される。一細胞が平均、350,000 個のmRNA 分子を含む場合、百万個のシークエンシング反応中、各セルの1個の複製セルで存在している転写産物（transcript）は約3回配列されることが望まれる。従って、本発明により提供される装置は、シングルコピー数感度（single copy number sensitivity）により、単一分子シークエンシングに適用される。
【０１２３】
cDNA 合成は、当技術分野で周知のようであり、通常、mRNAの選択性濃縮（optional enrichment）を含む全RNA 抽出を含む。mRNA からcDNAを製造するのは、例えば、第一ストランド合成の逆転写（reverse transcription）工程と、RNAse 処理で、残余 RNAを除去する工程と、第一ストランドのランダムヘキサマープライマー（random hexamer priming）、及び、DNA ポリメラーゼによる第二ストランド合成工程を含む。生成された cDNAは本発明により提供される装置のシークエンシングに適する。DNA と RNA両方の分離と準備方法は、当技術分野で周知のようである。例えば、Joseph Sambrook and David Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd edition (2001)を参照する。
【０１２４】
２．２．３．３その他の検出方法
（a）FRET
ある具体例中、蛍光共鳴エネルギー移動（Forster resonance energy transfer、FRET)（蛍光共鳴エネルギー移動として知られることもある）により、本発明により提供される検出装置上で、分子が検出される。当技術分野で周知のように、励起したドナー分子が、非放射（non-radiatively）でエネルギーでエネルギーを受容体分子に移動させる時、FRETが発生し、この分子がエネルギーを発射し、このエネルギーは通常、光線である。有効励起領域と検出される分子の発射波長間の大きいスペクトル分離を提供することにより、FRETは、背景光の減少を助けることができる。FRETの効率は、ドナーと受容体分子間の距離の6乗の速度を減衰するので、FRET は、近接する分子間の相互作用の検出に常用される。例えば、 Zhang et al. (Nature materials4:826-31 (2005)) では、FRETにより核酸のハイブリダイゼーションが検出されている。ビオチン化核酸ターゲットが、アビジンコートされた（avidin-coated）量子ドットドナーに結合され、続いて、Cy5-結合の DNA 探針を励起する。ある具体例中、標識捕捉分子と標識サンプル分子がドナー/受容体 (逆も同様) ペアを形成し、FRETの検出に用いる。  
【０１２５】
本発明により提供される核酸シークエンシングを利用したある具体例中、蛍光標識されたヌクレオチドは、ポリメラーゼ、又は、リガーゼに取り付けられるドナー発色団の受容体発色団となる。従って、これらの具体例中、ポリメラーゼ、又は、リガーゼ上に位置するドナー発色団は、サンプル核酸上で重合される、又は、サンプル核酸に結合されるヌクレオチド上の受容体発色団を励起する。FRET 効率が急速に下降するため、ポリメラーゼに隣接しないヌクレオチドは励起されない。ある具体例中、ドナー分子は、例えば、別の蛍光色素分子、例えば、量子ドットである。半導体量子ドット等の量子ドットは、従来知られていて、例えば、国際公開番号第WO 03/003015で説明されている。量子ドットを、例えば、従来知られている生体分子に結合する方法は、Mednitz et al., Nature 材料s4:235-46 (2005) 、及び、 U.S. Patent Publication Nos. 2006/0068506 と 2008/0087843に掲載されており、それぞれ、2008年3月30日と、2006年4月17日に公開されている。ある具体例中、量子ドットはDNA ポリメラーゼ分子に結合される。前に討論されたように、酵素をリンカーサイトに結合するのは、当業者なら理解できるように、蛍光色素分子を、例えば、DNA ポリメラーゼ、又は、リガーゼに結合する時、注意すべきことは、蛍光色素分子を酵素の初級、二級、三級構造に結合する影響を軽減することにより、酵素の功能を保留することである。
【０１２６】
（b）多光子励起
ある具体例中、発色団は、二つ又はそれ以上の光子により励起される。例えば、ある具体例中、FRET中のドナーか受容体発色団の励起は二個、又は、それ以上の光子によるものである。二個の光子と多光子励起は、例えば、米国特許番号第6,344,653 と 5,034,613で開示されている。
【０１２７】
（c）時間解析検出
ある具体例中、本発明により提供される装置の励起光源と光検出器が調整されて、特徴的な位相シフトを有する。従来知られている方法、例えば、2008年2月14日に開示された米国特許公開番号第 2008/0037008を用いて、本発明により提供される装置で検出される分子から発射する光線は、励起光源から干渉されずに、対応する光検出器により測定される。
【０１２８】
（d）その他の蛍光検出装置および方法
ある具体例中、本発明の方法は、生体細胞中の少なくとも一つのオブジェクトにより発射される光線の検出に関連し、生体細胞は、生細胞か固定細胞（living or fixed cell）である。ある具体例中、少なくとも一つのオブジェクトは、少なくとも一つの量子ドットを含む少なくとも一つのオブジェクト、少なくとも一つの蛍光タンパク質を含む少なくとも一つのオブジェクト、及び、少なくとも一つの蛍光小化学部分（fluorescent small chemical moiety）を含む少なくとも一つのオブジェクトから選択される。ある具体例中、少なくとも一つのオブジェクトは蛍光標識され、少なくとも一つのオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、オリゴ糖、多糖、又は、脂質を含む。  
【０１２９】
ある具体例中、少なくとも一つのオブジェクトは、固定、並びに、制限された数量の蛍光色素分子、例えば、少なくとも20, 10, 5、又は、2 個の蛍光色素分子を含み、蛍光色素分子は、量子ドット、蛍光タンパク質、及び、蛍光小化学部分から選択される。ある具体例中、少なくとも一つのオブジェクトは、量子ドット、蛍光タンパク質および蛍光小化学部分から選択される単一蛍光色素分子を含む。蛍光小化学部分の多くの例が上述で討論されている。ある具体例中、蛍光小化学部分は、300〜800 nmの放出ピーク、及び/又は、少なくとも 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8、又は、0.9の量子収量 (ピーク吸収波長の光子毎に発射される光子の割合)を含む。
【０１３０】
２．３生体分子解析サービス
本発明は、また、本実施形態に係る検出装置を用いた生体分子解析サービスを提供する方法を提供する。ある具体例中、本方法は、サービスリクエスタからサービスプロバイダに、分析される生体分子を含むサンプル、及び、サービスリクエスタが受信したサービスプロバイダからの分析的結果を提供するステップを含み、本発明により提供される装置により、結果が生成される。ある具体例中、利益、例えば、サービス費用やサービス協議同意を考慮（remunerative consideration）して、本方法が実行される。更に、サンプルは、サービスリクエスタとサービスプロバイダ間で直接発送されるか、又は、ベンダーにより媒介される。ある具体例中、サービスプロバイダやベンダーは、地理位置上、米国以外の場所にあり、例えば、別の国である。
【０１３１】
３．実施例
３．１実施例１
図16A-16D は、それぞれ、図3中のナノウェル 121、122、123、及び、124のコンピュータシミュレーション結果を示す図である。シミュレーション中、時間領域差分法 (FDTD) 方法を利用して、波路の縦方向に沿って伝播すると共に、有効な励起領域を経過、通過する励起光の電界分布を計算する。電界の強度は、導波路中の光線の電磁場の強度を示す。図16A-16D中、電界の強度は、任意のユニットで示される。
【０１３２】
実際の状況を更に厳密にシミュレートするため、このシミュレーション中、直径が100 nmの粒子は、ナノウェル底部近くにあると仮定される。粒子の屈折率は2.5に設定される。コア層の屈折率は 2.25に設定され、上下部クラッド層の屈折率は1.45に設定され、ナノウェルを充填される試料液の屈折率は1.33に設定される。コア層の厚さは100 nmに設定される。更に、全4種のナノウェル121、122、123および 124の底部の直径は 50 nm に設定され、コア層と上部クラッド層間の界面に関するナノウェル側壁の角度は60度に設定される。ナノウェル 121のシミュレーションにとって、ナノウェル底部とクラッド層とコア層間の界面の距離は50 nm に設定される。ナノウェル 123のシミュレーションにおいて、コア層中に延伸するナノウェルの深さは50 nmに設定される。つまり、ナノウェル 123 の底部表面は、コア層中央に位置するように設定される。図16A-16Dの各図中の左手側の図は、それぞれ、異なるナノウェル121、122、123および124を有する導波路中の時間平均電界分布を示す。図16A-16Dの各図中の右手側の図は、それぞれ、異なるナノウェル121、122、123、及び、124を有する導波路中、垂直方向に沿った電界分布を示す。
【０１３３】
３．２実施例２
この例は、図5中に示される構造を通過する金属パターンに対する、波長 が473 nm のTE モード光線と波長が550 nm のTM モード光線の透過率のシミュレーション結果を示し、それぞれ、金属パターンの格子周期と深さの函数である。
【０１３４】
図17Aは、金属パターンを通過する TE モード光線のシミュレートされた透過率の金属パターンの格子周期に相対する関係図である。図17A中の異なる曲線は、異なる金属パターン深さの値下の計算結果である。図17B は、金属パターンを通過するTM モード光線のシミュレートされた透過率の金属パターンの格子周期に相対する関係図である。図17B中の異なる曲線は、異なる金属パターン深さの値下における計算結果を示す。
【０１３５】
図17Bから分かるように、金属パターンの格子周期が300 nmより小さい時、TM モード光線の透過率は約 30%より高く、また、TE モード光線の透過率よりも高い。これにより、300 nmより小さい格子周期により、高 SNR (即ち、TM モード光線とTE モード光線間の透過率) が実現することが期待できる。図17C は、SNRの異なる金属パターン深さ値下で計算される金属パターンの格子周期に相対する関係図である。例えば、格子周期が250 nm で、深さが150 nmの箇所で、10より大きいSNRが得られることが分かる。更に、格子周期と深さが、それぞれ、110 nm と 250 nmの場合、SNRは 107より大きい。
【０１３６】
３．３実施例３
この例は、図5に示される構造を通過する金属パターンに対するTE モード光線とTM モード光線の計算された透過率を示す。この例では、ナノ構造を有する金属パターン 152 はアルミニウムでなり、アルミニウムパターンを囲む下部保護層 144 は酸化ケイ素でなる。アルミニウムパターンの周期と深さは、それぞれ、110 nm と245 nmである。図18A と 18Bは、それぞれ、入射角の函数となるとなるTE モード光線とTM モード光線の透過率を示す。図18Aと18B から分かるように、入射角の絶対値が0度 から60度より大きくなるまで増加する時、TE モード光線の透過率は約 10-8 から約 10-12 に下降する。しかし、入射角が約 -60度から約 60度の範囲内にあり、TM モード光線の透過率は常に60%より高い。
【０１３７】
３．４実施例４
図19は、図20に示されるプリズムカプラーのFDTD シミュレーション結果を示す図である。このシミュレーション中、プリズムと導波路間のギャップは73nmに設定される。ポリカーボネート (n = 1.6) はコア層の材料として用いられ、コア層の厚さは2 μmに設定される。TM モードの入射光 (λ = 430 nm) が用いられる。プリズムカプラーのカップリング効率を測定する実験が実行され、例えば、約 60%である。例えば、光源、例えば、ヘリウムネオンレーザーが約 2 mWの出力を有する光線を発射する場合、導波路に結合される励起光となる光線の出力は約 1.2 mWである。
【０１３８】
３．５実施例５
図21は、図7に示される導波路 110に結合される入射光のシミュレートされたスペックルを示す図である。このシミュレーションにおいて、開口直径が0.5 mm、厚さが0.2 mmのPMMAでなる円柱レンズが、レーザービーム成形（laser beam shaping）に用いられる。レンズから導波路の投影距離は 1mmである。図22A と 22Bを参照する。スペックルの厚さは約 300 nm、カップリング効率は約 70%である。例えば、光源、例えば、ヘリウムネオンレーザーが約 2 mWの出力を有する光線を発射する場合、導波路に結合される励起光となる光線の出力は約1.4 mWである。
【０１３９】
３．６実施例６
図23に示されるように、一実施例中、コア層 112 に結合される光線の出力と図9に示される導波路の下部クラッド層 116 の厚さの関係を示す。この測定で、格子周期は約 410 nm、コア層の厚さは約 100 nmである。入射光の波長は約 633 nmである。図23中、入射光の出力に対して、コア層中に結合される光線の出力は標準化される。
【０１４０】
３．７実施例７
図8と図9でそれぞれ示されるように、FDTD シミュレーションが格子結合器で実行される。シミュレーション中、図8と図9の第一格子の周期は410 nm に設定され、図9の第二格子の周期は300 nmに設定される。両格子の深さは55 nmに設定される。入射光の波長は473 nm、ビーム半径（beam radius）は5 μmに設定される。コアとクラッド層の屈折率は、それぞれ、2.196 と 1.445に設定される。図24と図25 は、それぞれ、図8 と9に示される構造中のシミュレートされた瞬間電界分布を示す。図8と図9で示される構造の計算されたカップリング効率は、それぞれ、20%と25%で、第二格子 404を加えることにより、カップリング効率が増加することが裏付けられる。
【０１４１】
３．８実施例８
計算は、図11に示される構造で実行される。この計算にとって、格子 406の効率屈折率は2.2に設定され、コア層 112、クラッド層114 と 116の屈折率は、それぞれ、1.6と 1.45に設定され、格子の周期と深さは、それぞれ、321 nmと120 nmに設定される。このような条件下で、波長が473 nmの入射光、且つ、通常、格子 406に入射する光線にとって、計算されたカップリング効率は29%である。
【０１４２】
３．９実施例９
表1は、フタロシアニン、4−(ジシアノメチレン)−2−メチル−6−(p−ジメチルアミノスチリル)−4H−ピラン (DCM) ドープのポリビニルピロリドン（PVP)を、異なる条件下のフォトルミネッセンス材料とした吸収-発射性光カプラーからの発射光線の電力密度の計算結果を示す。表1 から分かるように、同一の入射光にとって、導波路に結合される光線の電力密度は、37.67 W/cm2に達する。
【０１４３】
【表１】
2013524174.tif 000003
【０１４４】
３．１０実施例１０
DNA分子は、上述の検出装置を用いて配列される。この例の検出装置は、光源、光カプラー、導波路の上部クラッド層中に形成されるナノウェルアレイを有する平面導波路、導波路真下に形成される検出器アレイを含む。
【０１４５】
この例では、光源は、波長が約 633 nmの光線を発射するヘリウムネオンレーザーである。ヘリウムネオンレーザーの出力は、約 2 mWである。光カプラーはPMMAでなる円柱レンズから構成されるサイドカプラーである。円柱レンズは、開口直径が約 0.5 mm、厚さが約 0.2 mmで、且つ、導波路の横から約 1 mm の距離で配置される。検出器アレイは1000 個の光検出器から構成され、それぞれ、シリコンフォトダイオードである。
【０１４６】
平面導波路は、厚さが約 100 nmのコア層、上部クラッド層、及び、下部クラッド層を含む。コア層は、屈折率が約 2.05の窒化ケイ素でなる。上下部クラッド層は、屈折率が約 1.46の酸化ケイ素でなる。ナノウェルアレイ は、1000 個のナノウェルを含む上部クラッド層中に形成される。各ナノウェルに対し、光検出器を用いて、ナノウェル中に閉じ込められる分子により発射される光線を検出する。
【０１４７】
各ナノウェルは、円形断面の漏斗状である。ナノウェルは、上部クラッド層の総厚さに延伸し、コア層を露出する。ナノウェル底部の直径は約 50 nmである。ナノウェル側壁と垂直方向間の角度は約 30度である。各ナノウェル中に形成される有効な励起領域は、約 1 アトリットル (al)である。
【０１４８】
核酸ポリメラーゼは、ナノウェルの底部表面に化学的に取り付けられ、平均密度は、各ナノウェル有効な励起領域中、約 1 個の活性の使用可能なポリメラーゼを有する。
【０１４９】
平均長さが200 個のヌクレオチドの環状の一本鎖 DNA 分子の溶液は、適当なシークエンシング反応バッファ中で、濃度が各アトリットルで0.1 個の分子を有し、検出装置に用いられる。環状 DNA 分子は、約20 個のヌクレオチドの既知の挿入配列を含み、3’端から未知のサンプルシーケンス（unknown sample sequence）に挿入される。既知の挿入配列と相補するシークエンシングプライマー、及び、可逆終端の合成シークエンシングに適する保護基を有する蛍光標識された dNTP アナログを提供する。複数のナノウェル中、ポリメラーゼ、DNA分子、及び、シークエンシングプライマーの三重複合体が形成され、ポリメラーゼは、一蛍光標識された dNTP アナログを、シークエンシングプライマーの3’端に加える。
【０１５０】
ヘリウムネオンレーザーから発射する光線は、サイドカプラーにより、部分的に導波路中に結合される。導波路に結合される光線の一部はコア層中で伝播し、励起光となる。複数のナノウェル中、蛍光標識された dNTP アナログは、励起光がナノウェル底部付近に形成された有効な励起領域に入ることにより励起されると共に、蛍光光線を発射する。この蛍光光線は検出器により検出され、順に、処理される出力信号を生成して、シークエンシングプライマーに加えられるヌクレオチドアナログにより含まれる塩基を識別する。
【０１５１】
複数のナノウェル中、蛍光色素分子と保護基が化学的に除去される。その後、ポリメラーゼは、別の蛍光標識された dNTP アナログを加え、上述のような方式で検出し、その後、除去される。この周期は十分な回数繰り返され、少なくとも二倍の長さのDNA分子のシークエンシング読み取り (即ち、DNA分子が配列、及び、再配列される)を獲得する。
【０１５２】
本発明では好ましい実施例を前述の通り開示したが、これらは決して本発明に限定するものではなく、当該技術を熟知する者なら誰でも、本発明の思想と開示内容を脱しない範囲内で各種の変形や改良を加えることができ、従って本発明の保護範囲は、特許請求の範囲で指定した内容を基準とする。
【符号の説明】
【０１５３】
100  検出装置
102  光源
104  光カプラー
106  光検出器
110  導波器
112  コア層
114  上部クラッド層
116  下部クラッド層
120,121,122,123,124  ナノウェル
130,131,132,133,134  有効な励起領域
142  上部保護層
144  下部保護層
150  ピンホール
152  金属パターン
160  光学フィルター
202  プリズム
204  コリメーティングレンズ 
302  サイドカプラー
402  第一格子
404  第二格子
406  格子
502  格子
504  吸収-発射性材料
d1  距離
d2  距離
【図１】
2013524174.tif 000004
【図２】
2013524174.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
2013524174.tif 000020
【図１７Ｃ】
2013524174.tif 000021
【図１８Ａ】
2013524174.tif 000022
【図１８Ｂ】
2013524174.tif 000023
【図２０】
2013524174.tif 000024
【図２２Ａ】
2013524174.tif 000025
【図２２Ｂ】
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【図２３】
2013524174.tif 000027
【図１６Ａ】
2013524174.tif 000028
【図１６Ｂ】
2013524174.tif 000029
【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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