(57)【要約】  アルギニノコハク酸合成酵素またはＰＥＧ化アルギニノコハク酸合成酵素を対象に投与し、内毒素を不活性化し、細菌性敗血症の可能性を低減し、患者の治療効果を向上する病原性グラム陰性細菌感染の治療的な処置のための工程および組成物を提供する。
2013527174.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療に有効な量のアルギニノコハク酸合成酵素をそれを必要とする対象に投与することを含む、細菌内毒素への対象の暴露を治療する工程。
【請求項２】
前記アルギニノコハク酸合成酵素が組換えにより発現される、請求項１に記述の工程。
【請求項３】
前記アルギニノコハク酸合成酵素がＰＥＧ化されている、請求項１または２に記述の工程。
【請求項４】
前記アルギニノコハク酸合成酵素がＰＥＧ１２を含むＰＥＧによってＰＥＧ化される、請求項１〜３のいずれかに記載の工程。
【請求項５】
前記アルギニノコハク酸合成酵素が未分岐のＰＥＧ、分岐鎖のＰＥＧまたはこれらの組合せによってＰＥＧ化される、請求項１〜４のいずれかに記載の工程。
【請求項６】
前記のアルギニノコハク酸合成酵素および前記のＰＥＧが１：１から１：４００までの範囲の率で存在する、請求項５に記載の工程。
【請求項７】
前記の対象が病原性グラム陰性細菌に感染している、請求項１〜６のいずれかに記載の工程。
【請求項８】
アルギニノコハク酸合成酵素が配列ＩＤ番号：１のアミノ酸配列またはその変種を有する、請求項１に記載の工程。
【請求項９】
前記のアルギニノコハク酸合成酵素がＰＥＧ化される、請求項８に記載の工程。
【請求項１０】
ＰＥＧ化されたアルギニノコハク酸合成酵素タンパク質を含む、単離されたタンパク質の調製。
【請求項１１】
前記のアルギニノコハク酸合成酵素が無作為にＰＥＧ化される、請求項１０に記載の調製。
【請求項１２】
前記のアルギニノコハク酸合成酵素が部位特異的にＰＥＧ化される、請求項１０に記載の調製。
【請求項１３】
前記のアルギニノコハク酸合成酵素が１つまたは複数のシステイン、リジン、ヒスチジンまたはこれらの組合せで部位特異的にＰＥＧ化される、請求項１２に記載の調製。
【請求項１４】
前記のＰＥＧ化が前記のアルギニノコハク酸合成酵素にアミド結合により共有結合されたＰＥＧ１２を含む、請求項１０〜１２のいずれかに記載の調製。
【請求項１５】
前記のＰＥＧ１２が分岐鎖ＰＥＧである、請求項１４に記載の調製。
【請求項１６】
前記のＰＥＧ化が分岐鎖ＰＥＧを含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の調製。
【請求項１７】
前記のアルギニノコハク酸合成酵素タンパク質が、配列ＩＤ番号：１のアミノ酸配列またはその変種を有する、請求項１０〜１６のいずれかに記載の調製。
【請求項１８】
前記のアルギニノコハク酸合成酵素タンパク質が、ＬＰＳ結合部位を維持している配列ＩＤ番号：１の短縮のアミノ酸配列を有する、請求項１０〜１６のいずれかに記載の調製。
【請求項１９】
試料の入手より前に、細菌内毒素に暴露した前記の対象から試料を入手すること；および
前記の対象から得た前期の試料中のアルギニノコハク酸合成酵素の存在、濃度または活性を測定すること
を含む、対象による細菌内毒素への暴露を検出する工程。
【請求項２０】
試料に血清が含まれる、請求項１９に記載の工程。
【請求項２１】
前記の対象が治療を必要とする対象である、請求項１９〜２０のいずれかに記載の工程。
【請求項２２】
本特許請求の範囲に実質的に記述されている、細菌内毒素への暴露を治療する工程。
【請求項２３】
本特許請求の範囲に実質的に記述されている、対象の細菌内毒素への暴露を検出する工程。
【請求項２４】
前記の対象がヒトである、前記の請求項のいずれかに記載の工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、全内容が参照により本明細書に組み込まれている、２０１０年１月２６日出願の米国仮特許出願第６１／２９８，３０９号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、一般に、対象における細菌感染の検出および治療のための組成物および方法に関する。特定の実施形態において、本発明は、対象における細菌内毒素への暴露の検出および治療のための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
グラム陰性病原菌による感染は、敗血症および内毒素性ショックなど、特に重篤な病変に関連する。内毒素性ショックおよび敗血症の病態生理学の理解の進歩にもかかわらず、治療は主に対症療法および支持療法に留まっている。
【０００４】
敗血症は、一般に、感染創から吸収され、血液中を循環する細菌毒素を原因とする、腎臓、肝臓、心臓および脳を含めた多臓器不全を特徴とする。最近１０年で従来の抗菌剤に対する耐性が蔓延したため、敗血症の課題に対抗するために、新しい薬剤ならびに新しい組成物および方法が必要となった。適時かつ適切な治療介入には、対象における細菌内毒素暴露の検出のための方法および組成物が要求される。
【発明の概要】
【０００５】
以下の本発明の概要は、本発明に特有の革新的な特徴のいくつかの理解を容易にするために示すものであり、完全な記述となることを意図していない。本発明の多様な態様の完全なる理解は、明細書、請求項、図面およびアブストラクト全体を１つのまとまりとして把握することで得られる。
【０００６】
治療に有効な量のアルギニノコハク酸合成酵素をそれを必要とする対象に投与することを含め、細菌内毒素への対象の暴露を治療する工程が示される。
【０００７】
本発明で使用されるアルギニノコハク酸合成酵素は、随意、組換え体で発現される。一部の実施形態において、アルギニノコハク酸合成酵素は配列ＩＤ番号：１のアミノ酸配列またはその変異を有し、任意で、短縮ヒトアルギニノコハク酸合成酵素とすることができる。短縮アルギニノコハク酸合成酵素は、ＬＰＳ結合部位を任意で維持する。
【０００８】
一部の実施形態において、アルギニノコハク酸合成酵素はＰＥＧ化されている。ＰＥＧ化アルギニノコハク酸合成酵素は、任意で、ＰＥＧ１２を含むＰＥＧによりＰＥＧ化される。ＰＥＧ化アルギニノコハク酸合成酵素は、任意で、非分岐ＰＥＧ、分岐ＰＥＧまたはその組合せによりＰＥＧ化される。ＰＥＧに対するアルギノコハク酸合成酵素のいくつかの率は操作可能である。一部の実施形態において、アルギノコハク酸合成酵素およびＰＥＧは、それぞれ１：１から１：４００までの率で存在する。アルギノコハク酸合成酵素のＰＥＧ化は、任意で、無作為的または部位特異的とすることができる。部位特異的なＰＥＧ化は、任意で、アルギノコハク酸合成酵素リジン、ヒシチジンまたはこれらの組合せに対して特異的となる。任意で、ＰＥＧ化には、少なくとも１つのＰＥＧ１２分子が含まれ、任意で、ＰＥＧ１２だけが含まれる。任意で、ＰＥＧ分子は共有アミド結合によりアルギノコハク酸合成酵素と結合される。アルギノコハク酸に付加されたＰＥＧ分子は、任意で、直鎖、分岐鎖またはこれらの組合せとなる。
【０００９】
本発明の工程における対象は、任意でヒトとすることができる。一部の実施形態において、対象は一種または複数のグラム陰性細菌に感染し、その感染により治療の必要が生じている。
【００１０】
試料の入手以前に細菌内毒素に暴露した対象からの試料の入手および対象から得た試料中のアルギノコハク酸合成酵素の存在、濃度または活性の測定も含め、対象による細菌内毒素への暴露を検出する工程も示される。試料は、任意で、血液または血液の分画であり、任意で血清である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＬＰＳ単独でまたは肝障害プライミング剤Ｄ−ガラクトサミンと併せてチャレンジされた対象から得た血清中の内因性アルギノコハク酸合成酵素の増加を示す図である；
【図２】クマシーブルーで染色したまたはウェスタンブロット法により視覚化したＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いて図示されたｒＡＳＳまたはＰＥＧ化ｒＡＳＳの例である；
【図３】ＣｒＡＳＳまたはＰＥＧ化ｒＡＳＳによるＥ．ｃｏｌｉ（大腸菌）の増殖阻害を示す図である；
【図４】マクロファージ細胞培地におけるｒＡＳＳによるＬＰＳ毒性の減衰を示す図である；
【図５】細胞骨格αＩＩスペクトリン（Ａ）またはＭＴＳ減少アッセイ（Ｂ）における分解の減少により測定された、ＬＰＳが誘発する細胞毒性のｒＡＳＳによる減少を示す図である；
【図６】ＬＰＳが誘発する細胞毒性のｒＡＳＳ投与量に依存する形での減少を示す図である；
【図７】ＬＰＳによるチャレンジ後のマウス（Ａ）およびラット（Ｂ）の生存に対するｒＡＳＳ治療の有益な効果を示す図である；
【図８】ラットの内毒素血症におけるｒＡＳＳによるＴＮＦ−α放出（Ａ）およびＣ反応性タンパク（Ｂ）の濃度の抑止を示す図である；
【図９】ｒＡＳＳの同時または順次の投与による対象における血清ＬＤＨ放出の抑止を示す図である；
【図１０】ＰＥＧ化ｒＡＳＳ／ｍｇタンパク質は、非ＰＥＧ化ｒＡＳＳと比較して、ほぼ３倍高い活性を発揮することを示す図である；
【図１１】ＰＥＧ化ｒＡＳＳは、非ＰＥＧ化ｒＡＳＳと比較して、対象に腹腔内注射後、顕著により安定であり、遥かに長時間に渡り、血液循環に留まることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の特定の実施形態の以下の記述は、単に例示的なものであり、当然ながら変化し得る、本発明の範囲、その応用または用途を限定する意図は一切ない。本発明は、本明細書に含まれている非制限的な定義および用語に関係して記述される。これらの定義および用語は、本発明の範囲または実践を限定するためのものではなく、例示および記述の目的でのみ示されている。
【００１３】
組成物および方法は、対象における細菌内毒素暴露の検出および治療のために提供される。したがって、本発明は試料または生物における内毒素の存在の検出およびグラム陰性細菌による感染の治療の用途を有する。
【００１４】
「細菌内毒素」、「リポ多糖体」および「ＬＰＳ」という用語は、本明細書中では同じ意味で使われ、当分野において区別なく呼ばれるグラム陰性細菌の外膜のこのよく知られた構造要素を指す。
【００１５】
対象の細菌内毒素への暴露が最も一般的に起こるのは、対象がグラフ陰性細菌に感染したときである。グラフ陰性細菌の代表的な例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（大腸菌）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（サルモネラ）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ（赤痢菌）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（シュードモナス属）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ（ナイセリア属）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（インフルエンザ菌）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（百日咳菌）およびＶｉｂｒｉｏ  Ｃｈｏｌｅｒａｅ（コレラ菌）が挙げられる。
【００１６】
細菌内毒素への暴露の影響を治療する方法が、アルギニノコハク酸合成酵素または別名アルギノシンターゼ（ＡＳＳ）を、内毒素を含有する細菌への感染および／または細菌内毒素を含んでいる疑いのある物質への暴露を受けた対象、その疑いがある対象、またはその危険がある対象に投与することを含む本発明の実施形態に従って示される。
【００１７】
「アルギノコハク酸合成酵素」および「ＡＳＳ」という用語は、本明細書では同じ意味で使われ、酵素アルギノコハク酸シンテターゼを指し、任意でヒトに由来し、任意で配列ＩＤ番号：１またはその変種として本明細書では同定される。
【００１８】
配列ＩＤ番号：１のアルギノコハク酸合成酵素タンパク質以外に、用語「アルギノコハク酸合成酵素」は、本発明の組成物および方法に含まれ得る配列ＩＤ番号：１の変種も含有する。本明細書で使われる用語「変種」は、配列ＩＤ番号：１の天然に発生する遺伝的変異および配列ＩＤ番号：１の組換えにより調製される変異（その各々には、配列ＩＤ番号：１と比較して、そのアミノ酸配列に１つまたは複数の変化が含まれている）を指す。このような変化には、１つまたは複数のアミノ酸残基が、アミノ酸置換、付加または欠失により修正されている変化が含まれる。用語「変種」は、例えば、哺乳類および鳥類のアルギノコハク酸合成酵素、特にヒト以外の霊長類、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、齧歯類、ブタ、ヒツジ、ヤギ、魚類および家禽由来のアルギノコハク酸合成酵素オーソログも含め、ヒトアルギノコハク酸合成酵素のオーソログも含有する。
【００１９】
変種は、配列ＩＤ番号：１に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を任意で有するアルギノコハク酸合成酵素である。
【００２０】
部位特異的突然変異誘発法およびＰＣＲ介在突然変異誘発法など、標準の分子生物学手法を使って、突然変異を導入することができる。配列ＩＤ番号：１のアルギノコハク酸合成酵素タンパク質の機能特性を変更することなく、１つまたは複数のアミノ酸の突然変異を導入できることを、当業者は認識するであろう。例えば、１つまたは複数のアミノ酸の置換、付加または欠失は、配列ＩＤ番号：１のアルギノコハク酸合成酵素タンパク質の機能特性を変更することなく、行なうことが可能である。
【００２１】
アルギノコハク酸合成酵素タンパク質の変種を生成するために、配列ＩＤ番号：１のアルギノコハク酸合成酵素タンパク質に同類アミノ酸置換を加えることができる。同類アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を類似した特徴を有する別のアミノ酸に置換する、当該技術分野で承認されている置換である。例えば、各アミノ酸は、以下の特徴の１つまたは複数を有するものとして記述し得る：電気的陽性、電気的陰性、脂肪族、芳香族、極性、疎水性および親水性。同類置換は、特定の構造的特性または機能的特性を有する１つのアミノ酸を、同一の特性を有する別のアミノ酸に置換するものである。酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸、ルタミン酸が挙げられ；塩基性アミノ酸としては、ヒスチジン、リジン、アルギニンが挙げられ；脂肪族アミノ酸としては、イソロイシン、ロイシンおよびバリンが挙げられ；芳香族アミノ酸としては、フェニルアラニン、グリシン、チロシンおよびトリプトファンが挙げられ；極性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニンおよびチロシンが挙げられ；疎水性アミノ酸としては、アラニン、システイン、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、バリンおよびトリプトファンが挙げられ；同類置換には、各グループ内のアミノ酸間での置換が含まれる。アミノ酸は、また、相対サイズという観点で記述することもでき、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グリシン、アスパラギン、プロリン、トレオニン、セリン、バリンはすべて、通常、小さいとみなされる。
【００２２】
アルギノコハク酸合成酵素タンパク質の変種には、以下に限定されないが、例示的にα−アミノ酪酸、シトルリン、カナバニン、シアノアラニン、ジアミノ酪酸、ジアミノピメリン酸、ジヒドロキシフェニルアラニン、ジエンコル酸、ホモアルギニン、ヒドロキシプロリン、ノルロイシン、ノルバリン、３−ホスホセリン、ホモセリン、５−ヒドロキシトリプトファン、１−メチルヒスチジン、３−メチルヒスチジンおよびオルニチンを含め、合成アミノ酸類似物、アミノ酸誘導体および／または非標準アミノ酸を含むことができる。
【００２３】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、配列は最適な比較になるように揃えられる（例えば、第１のアミノ酸または核酸の配列には、第２のアミノ酸または核酸配列との最適なアライメントのために、ギャップを導入してもよい）。その後、対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置にあるアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置にあるものと同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占められているとき、その位置で分子は同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列が共有する同一位置の数の関数（すなわち、％同一性＝同一の重複する位置の数／位置の合計数ｘ１００）である。１つの実施形態において、２つの配列は同一長である。
【００２４】
２つの配列間のパーセント同一性は、算術アルゴリズムを使って決定することも可能である。２つの配列の比較に利用される算術アルゴリズムの好ましい、非限定的な例は、、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３，ＰＮＡＳ  ９０：５８７３  ５８７７）によって改変されたＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０，ＰＮＡＳ  ８７：２２６４  ２２６８）のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３）のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムのパラメータを、例えば、スコア＝１００、ワード長＝１２と設定して、本発明の核酸分子に一致するヌクレオチド配列を求める。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラムのパラメータを、例えば、スコア＝５０、ワード長＝３と設定して、本発明のタンパク質分子に一致するアミノ酸配列を求める。比較のためのギャップ付きアラインメントを得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９  ３４０２）に記述されている要領で、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが活用される。あるいは、ＰＳＩ  ＢＬＡＳＴを使って、分子間の距離関係を検出する反復検索を実行する（同書）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ  Ｂｌａｓｔの各プログラムを活用するとき、各々のプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴプログラムおよびＮＢＬＡＳＴプラグラム）のデフォルトのパラメータが使用される（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトを参照されたい）。配列比較のために活用される算術アルゴリズムのもう１つの好ましい、非限定的な例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム（１９９８、ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１  １７）である。このアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部になっているＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列の比較のためにＡＬＩＧＮプログラムを活用するときは、ＰＡＭ１２０重量残基の表、１２のギャップ長さペナルティ、および４のギャップペナルティが使われる。
【００２５】
２つの配列間のパーセント同一性は、上述した手法と類似した手法を使って、ギャップを許容または許容せずに決定される。パーセント同一性の算出では、通常、正確な一致だけが数えられる。
【００２６】
本発明の方法および組成物に含まれるアルギニノコハク酸合成酵素は、任意で、組換え核酸技術を使って産生される。アルギニノコハク酸合成酵素の産生には、アルギニノコハク酸合成酵素をコードするＤＮＡ配列を含有する組換え発現ベクターの導入が含まれる。
【００２７】
アルギニノコハク酸合成酵素を産生するために、宿主細胞に導入されるアルギニノコハク酸合成酵素をコードする核酸配列は、配列ＩＤ番号：１をコードする。本発明の実施形態において、本明細書中、配列ＩＤ番号：２として同定される核酸配列は、配列ＩＤ番号：１をコードし、発現ベクター中に含まれ、発現させると、アルギニノコハク酸合成酵素が産生される。
【００２８】
遺伝子コードの縮重性により、配列ＩＤ番号：２と実質的に同一の核酸配列は、アルギニノコハク酸合成酵素およびアルギニノコハク酸合成酵素の変種をコードすること、ならびに、そのような代替核酸が発現ベクターに含まれていて、発現させることで、アルギニノコハク酸合成酵素およびアルギニノコハク酸合成酵素の変種を産生し得ることが理解されている。
【００２９】
配列ＩＤ番号：２と実質的に同一の核酸配列は、高い厳密性のハイブリダイゼーション条件下で、配列ＩＤ番号：２にハイブリダイズする能力を有する相補的核酸配列を持つことを特徴とする。
【００３０】
用語「核酸」は、単鎖、ニ本鎖、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドも含め、任意の形態の複数のヌクレオチドを有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子を指す。用語「ヌクレオチド配列」は、単鎖形態の核酸におけるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド中のヌクレオチドの順序付けを指す。
【００３１】
用語「相補的」は、ヌクレオチド間のワトソン−クリック塩基対を指し、具体的には、２個の水素結合によりアデニン残基に連結されたチミンまたはウラシル残基、ならびに３個の水素結合により結合されたシトシンおよびグアニン残基によって、互いに水素結合したヌクレオチドを指す。一般に、核酸には、所定の第２のヌクレオチド配列に対して「パーセント相補性」を有すると記述されるヌクレオチド配列が含まれる。例えば、ヌクレオチド配列は、所定の第２のヌクレオチド配列に対して８０％、９０％または１００％の相補性を有することが可能であり、これは、配列のヌクレオチド１０個のうちの８個、１０個のうちの９個または１０個のうちの１０個がその所定の第２のヌクレオチド配列に対して相補的であることを意味する。例えば、ヌクレオチド配列３’−ＴＣＧＡ−５’は、ヌクレオチド配列５’−ＡＧＣＴ−３’に対して１００％相補的である。さらに、ヌクレオチド配列３’−ＴＣＧＡ−は、ヌクレオチド配列５’−ＴＴＡＧＣＴＧＧ−３’のある領域に対して１００％相補的である。
【００３２】
「ハイブリダイゼーション」および「ハイブリダイズする」という用語は、相補的核酸の対および結合を指す。ハイブリダイゼーションは、当分野で周知のように、核酸の相補性の度合い、核酸の融解温度（Ｔｍ）、ハイブリダイゼーション条件の厳密性などの要因に応じて、２つの核酸の間で様々な程度で発生する。用語「ハイブリダイゼーション条件の厳密性」は、温度、イオン強度、ならびにホルムアミドおよびデンハルト液などの特定の一般的な添加剤に対するハイブリダイゼーション培地の組成の条件を指す。所定の核酸に関する特定のハイブリダイゼーション条件の決定は、日常的な作業であり、例えば、Ｊ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．  Ｒｕｓｓｅｌ、  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；第３版、２００１；およびＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編）、  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；第５版、２００２に記述されているように、当該分野では周知である。高度の厳密性ハイブリダイゼーション条件は、実質的に相補的な核酸のハイブリダイゼーションのみを許可するものである。一般に、約８５〜１００％の相補性を有する核酸は相補性が高いとみなされ、高度の厳密性条件下でハイブリダイズする。中度の厳密性条件は、典型的には、中度の相補性、すなわち、約５０〜８４％の相補性を有する核酸、ならびに高度の相補性を有する核酸がハイブリダイズする条件である。対照的に、低度の厳密性ハイブリダイゼーション条件は、低度の相補性を有する核酸がハイブリダイズする条件である。
【００３３】
「特異的ハイブリダイゼーション」および「特異的にハイブリダイズする」は、試料中の標的核酸以外の核酸に実質的にハイブリダイズすることなく、特定の核酸が標的核酸にハイブリダイズすることを指す。
【００３４】
ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件の厳密性は、当業者には周知の通り、プローブおよび標的のＴｍ、ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件のイオン強度を含め、いくつもの要因に依存する。ハイブリダイゼーションおよび所望のハイブリダイゼーション厳密性を達成するための条件については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００１；およびＡｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．ら（編），  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、  Ｗｉｌｅｙ、  ２００２に記述されている。
【００３５】
高い厳密性のハイブリダイゼーション条件の例は、６倍ＳＳＣ、５倍デンハルト溶液、３０％ホルムアミド、および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子を含む溶液中で、長さ約１００ヌクレオチドに渡り、核酸を３７℃で一晩ハイブリダイズした後、０．１倍ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの溶液中で１５分間、６０℃で洗浄するという条件である。ＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌ／０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａである。デンハルト溶液は０．０２％のウシ血清アルブミン／０．０２％のＦＩＣＯＬＬ／０．０２％のポリビニルピロリドンである。高度に厳密な条件下では、配列ＩＤ番号：２は実質的に同一の標的の相補対にはハイブリダイズするが、無関係な配列にはハイブリダイズしない。
【００３６】
用語「発現ベクター」は、アルギニノコハク酸合成酵素をコードする核酸を宿主細胞に導入し、そこでその核酸を発現させて、アルギニノコハク酸合成酵素を産生させる組換えビークルである。特定の実施形態において、配列ＩＤ番号：２または実質的に同一な核酸配列を含む発現ベクターは、その発現ベクターを含む細胞で発現し、アルギニノコハク酸合成酵素を産生する。
【００３７】
アルギニノコハク酸合成酵素をコードする１つまたは複数の核酸以外に、追加タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸配列も発現ベクターに入れることができる。例えば、そのような追加タンパク質としては、以下に限定されないが、β−ガラクトシターゼ、緑色蛍光タンパク質および抗生物質耐性レポーターを含むレポーターなど、アルギニノコハク酸合成酵素以外のタンパク質が挙げられる。
【００３８】
発現ベクターは当該技術分野では周知であり、例えば、プラスミドおよびウイルスが含まれる。発現ベクターは、関心対象のポリペプチドをコードするセグメントの転写を提供する１つまたは複数の制御要素に操作可能に連結された関心対象のポリペプチドをコードするセグメントを含む。このような制御要素としては、以下に限定されないが、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、複製の起点およびポリアデニル化信号が挙げられる。
【００３９】
特定の実施形態において、組換え発現ベクターは、少なくとも配列ＩＤ番号：１のアルギニノコハク酸合成酵素、配列ＩＤ番号：１に対して少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質、または配列ＩＤ番号：２と実質的に同一の核酸配列によってコードされたタンパク質をコードする。
【００４０】
組換え発現ベクターを使用するアルギニノコハク酸合成酵素の発現は、昆虫細胞、哺乳類細胞、酵母細胞、細菌細胞、または当該分野で認められているその他の任意の単細胞もしくは多細胞生物など、真核または原核の宿主細胞の発現系に発現ベクターを導入することにより達成される。宿主細胞は、任意で、初代細胞または不死化した派生細胞である。不死化細胞は、少なくとも複製の５代継代に渡ってｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持できる細胞である。
【００４１】
組換え発現ベクターを含む宿主細胞は、アルギニノコハク酸合成酵素が産生される条件下で維持される。宿主細胞は、Ｃｅｌｉｓ，Ｊｕｌｉｏ編、１９９４、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．に記載されているような、既知の細胞培養技法を用いて、培養し維持することができる。具体的な栄養、酸素、引張、二酸化炭素および血中濃度減少に関する培地形成を含み、これらの細胞の種々の培養条件は、当業者が選択し、最適化することができる。
【００４２】
アルギニノコハク酸合成酵素は、任意で、天然に存在するアルギニノコハク酸合成酵素と同一のアミノ酸配列を有する。例示すると、アルギニノコハク酸合成酵素は、配列ＩＤ番号：１の配列を有する。本発明の一部の実施形態では、天然に存在する配列とは異なるアミノ酸配列を任意で有するアルギニノコハク酸合成酵素の変種が使用される。アルギニノコハク酸合成酵素の変種は、アルギニノコハク酸合成酵素をコードする野生型核酸配列の部位特異的突然変異誘発により、任意で作成される。例示すると、配列ＩＤ番号：２の配列が部位特異的突然変異誘発の源となる核酸配列として使用される。
【００４３】
一部の実施形態では、ＬＰＳ結合部位は維持されるが、分子内の他の部位は改変されているアルギニノコハク酸合成酵素変種が作成される。変種は、任意で、アルギニノコハク酸合成酵素の短縮形である。短縮されたアルギニノコハク酸合成酵素は、任意で、野生型ＬＰＳ結合部位を維持するが、分子内の他の部位は短縮されている。任意で、変種はＬＰＳに対するアルギニノコハク酸合成酵素の親和性を増加または減少させるために、さらに、または独立に、ＬＰＳ結合部位を改変する。部位特異的突然変異誘発および分子間の親和性のスクリーニングの方法は、当該分野で周知である。
【００４４】
アルギニノコハク酸合成酵素は、任意で、ＰＥＧ化される。タンパク質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の１つまたは複数の分子に直接またはリンカーを介して、共有またはその他の方法で結合されているとき、ＰＥＧ化される。不活性で無毒の生分解性の重合体、ＰＥＧの分子への共有結合には、バイオテクノロジーおよび医療で重要な用途がある。生物学的および薬学的に活性のタンパク質のＰＥＧ化は、通常、薬物動態を向上して持続時間を維持し、安全性を向上し（例えば、有毒性、免疫原性および抗原性の低下）、投与頻度を減少させ、薬物の可溶性および安定性を向上し、タンパク質分解を減少させ、制御された毒物放出を容易にする（Ｒｏｂｅｒｔｓら、２００２、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ、５４：４５９−７６；Ｈａｒｒｉｓ＆Ｃｈｅｓｓ、２００３、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ、２：２１４−２２１）。タンパク質のＰＥＧ化のこれらの有益な属性の各々は、タンパク質の薬物動態の改変に起因する。事実、ＰＥＧ化は生物学的活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで低下させることが当該分野で認識されている。この活性の低下は、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、治療存続期間を延長することで克服される（Ｊｅｖｓｅｖａｒ  Ｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｊ．、２０１０；５：１１３−１２８を参照されたい）。
【００４５】
発明者らは、アルギニノコハク酸合成酵素がタンパク質の安定性を増加するだけでなく、アルギニノコハク酸合成酵素の酵素活性を増加することも、思いがけなく発見した。したがって、本発明の一部の実施形態には、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで予想外に優れた効能を示すＰＥＧ化アルギニノコハク酸合成酵素の投与も含まれている。
【００４６】
アルギニノコハク酸合成酵素は、ＰＥＧ単位の数が３から１０００個、任意で３から１００個、任意で３から５０個、またはその間の任意の値もしくは部分範囲に及ぶＰＥＧ分子を用いて、任意で均一または不均一にＰＥＧ化される。アルギニノコハク酸合成酵素に結合されるＰＥＧ分子の合計分子量は、任意で３００ダルトンから５０，０００ダルトンまたはその間の任意の範囲もしくは部分範囲である。
【００４７】
アルギニノコハク酸合成酵素をＰＥＧ化するために使用されるＰＥＧ分子は、任意で直鎖、分岐鎖またはこれらの組合せである。一部の実施形態においては、アルギニノコハク酸合成酵素をＰＥＧ化するために、直鎖のＰＥＧ分子だけが使用される。一部の実施形態においては、アルギニノコハク酸合成酵素をＰＥＧ化するために、分岐鎖のＰＥＧ分子だけが使用される。非分岐鎖のＰＥＧ分子対分岐鎖のＰＥＧ分子の相対比率は、結果として生じるＰＥＧ化されたアルギニノコハク酸合成酵素の安定性を向上するために適切な任意の範囲とすることが理解される。例示的に、非分岐鎖のＰＥＧ分子対分岐鎖のＰＥＧ分子の比率は、０．００１：１から１：０．００１、またはその間の任意の値もしくは範囲に渡る。
【００４８】
個々のアルギニノコハク酸合成酵素分子におけるＰＥＧ化の範囲は、任意に変化する。アルギニノコハク酸合成酵素対ＰＥＧの比率は、任意で１：１から１：５００、またはその間の任意の値もしくは範囲に自由に設定することができる。一部の実施形態においては、アルギニノコハク酸合成酵素対ＰＥＧの比率は、１：１から１：１００、任意で１：１から１：１０、任意で１：１から１：５である。一部の実施形態においては、アルギニノコハク酸合成酵素対ＰＥＧの比率は、１：１０である。これらの範囲は、１モルのアルギニノコハク酸合成酵素が１モルから５００モルまでの任意のモル数のＰＥＧ類に結合されるモル比を示している。
【００４９】
アルギニノコハク酸合成酵素をＰＥＧ化するために、夥しい種類のＰＥＧ類を操作可能である。代表的な例としては、ＰＥＧ−クロロトリアジン、ＰＥＧスクシンイミジルスクシナート（ＳＳ−ＰＥＧ）、スクシンイミジルカーボネートＰＥＧ（ＳＣ−ＰＥＧ）、メチルスクシンイミジルＰＥＧ（ＭＳ−ＰＥＧ）およびトリメチルスクシンイミジルＰＥＧ（ＴＭＳ−ＲＥＧ）を含むＮ−ヒドロキシスクシンイミドＰＥＧ、ならびに当該分野で公知のその他のＰＥＧ分子が挙げられる。ここで操作可能なＰＥＧ分子の具体的な例としては、ＭＳ−ＰＥＧ１２およびＴＭＳ−ＰＥＧ１２が挙げられる。
【００５０】
アルギニノコハク酸合成酵素のＰＥＧ化は、例示すると、無作為または部位特異的である。無作為のＰＥＧ化は、例示すると、タンパク質と相互作用して、アミド結合またはウレタン結合を形成するリンカーによって達成される。アミド結合はリジン残基およびタンパク質のＮ−末端への安定したＰＥＧ結合を可能にする。ウレタン結合はリジンおよびヒスチジン残基と相互作用することができる。ウレタン結合はアミド結合に比べ、相対的に不安定になり得るが、ＰＥＧ化アルギニノコハク酸合成酵素のプロドラッグまたは制御した放出製剤の調製において利点を有し得る。
【００５１】
アルギニノコハク酸合成酵素のＰＥＧ化は、任意で部位特異的であり、これはＰＥＧ化アルギニノコハク酸合成酵素の調製は、通常、無作為のＰＥＧ化に対して均一性を増加したことを意味する。ＰＥＧ化は、任意で、アルギニノコハク酸合成酵素またはその変種上のＮ末端またはその他の位置に対して特異的である。Ｎ末端およびシステインに特異的なＰＥＧ化の技法は、当該分野で周知である。Ｎ−末端ＰＥＧ化は、例示すると、ＰＥＧ−アルデヒド試薬によって達成される。チオール基のＰＥＧ化は、例示すると、当該分野で公知のその他の試薬に並んで、マレイミド、ピリジルジスルフィドおよびビニルスルホンなどのチオール特異的試薬を使用して達成される。部位特異的なＰＥＧ化に適切な技法の代表的な例としては、Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，ＦＭら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．、２００７；１８：１８２４−１８３０に記述された遷移的な変性条件が挙げられる。あるいは、米国特許出願公開第２０１０／０２４７５０８号または第２００９／０４７５００号に提示された方法を使用することもできる。一部の実施形態においては、ＰＥＧ化部位を作成するために、部位特異的突然変異誘発法などにより、遊離システイン（またはその他の特定のアミノ酸またはアミノ酸ケミストリー（ｃｈｅｍｉｓｔｒｉｅｓ））がアルギニノコハク酸合成酵素の配列に組み込まれる。部位特異的ＰＥＧ化のもう１つの任意の方法としては、酵素的ＰＥＧ化法がある。ＰＥＧ−アルキルアミン試薬の酵素的ＰＥＧ化については、Ｓａｔｏ，Ｈ、Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．、２００２：５４：４８７−５０４に例示として記述されている。
【００５２】
アルギニノコハク酸合成酵素に対するＰＥＧ化の範囲は、治療的に有効なＰＥＧ化アルギニノコハク酸合成酵素の溶液全体を通して、任意に均一または非均一することができる。一部の実施形態においては、直鎖または分岐鎖のいずれかのＰＥＧが試料中に存在する。したがって、アルギニノコハク酸合成酵素の溶液には、ＰＥＧ化の種類、範囲または質量が均一または均一でないアルギニノコハク酸合成酵素が任意で含まれる。
【００５３】
細菌内毒素に暴露した兆候および／または症状を特徴とする疾病または疾患を予防または治療する方法は、アルギニノコハク酸合成酵素を含む組成物を治療に有効な量、それを必要とする対象に投与することを含む本発明に従って提供される。特定の実施形態において、本発明に従う組成物は、細菌内毒素に対象が暴露したことを特徴とする疾病または疾患に罹患している対象またはその危険のある対象に投与される。
【００５４】
大雑把に記述すると、本発明の実施形態に従う方法は、生物、細胞または組織にアルギニノコハク酸合成酵素をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで投与することを含む。
【００５５】
アルギニノコハク酸合成酵素の投与に続いて、任意で、対象の生物、細胞または組織におけるアルギニノコハク酸合成酵素の効果のアッセイを実施することができる。
【００５６】
本明細書中で用いられる「治療に有効な量」という用語は、治療の対象となる状態の症状または兆候を緩和、改善または予防するのに効果のある発明組成物の量を意味する。特定の実施形態においては、治療に有効な量は、細菌内毒素に暴露した兆候および／または症状を呈している対象において有益な効果を有する量である。
【００５７】
したがって、例えば、特定の実施形態において、対象における細菌内毒素への暴露の作用を予防または治療するための対象の治療は、細菌内毒素の病原性作用の予防または治療を特徴とする。敗血症および／または内毒素性ショックの改善は、当該分野で公知の、本明細書に記述されている技法によって評価される。
【００５８】
細菌内毒素への暴露の兆候および症状としては、以下に限定されないが、発熱、速い心拍、速い呼吸、低血圧、局所または全身のシュワルツマン反応および臓器不全が挙げられる。
【００５９】
用語「対象」は、本発明の組成物が投与される任意の個人を指す。用語「対象」には、哺乳類および鳥類、特にヒト、ヒト以外の霊長類、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、齧歯類、ブタ、ヒツジ、ヤギおよび家禽が含まれる。治療を必要とする対象は、ある形態の細菌性敗血症に罹患している対象である。治療を必要とする対象は、場合によって、静脈内穿刺；腹腔内または骨盤構造の穿孔、障害または裂傷；細菌尿症；または、例示すると、病原性細菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ（肺炎連鎖球菌）、（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ（髄膜炎菌）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（インフルエンザ菌）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（クレブシエラ・ニューモニエ）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．（レジオネラ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（ストレプトコッカス・アガラクティアエ）、Ｅ．  ｃｏｌｉ（大腸菌）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎桿菌）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（リステリア・モノサイトゲネス）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．（エンテロコッカス）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（化膿レンサ球菌）、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ（ブタ丹毒菌）、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ（アエロモナス・ハイドロフィラ）、Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ（ビブリオ・バルニフィカス）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（ウェルシュ菌）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．（サルモネラ）、または当該分野で公知のその他の病原性グラム陰性細菌の少なくとも１つによるその他の感染を患っていたか、または患っていた。感染が対象の体内に普通に存在する細菌によるとき、治療を必要とする対象は、その細菌が普通、存在している以外のコンパートメントで細菌感染にかかった対象である。したがって、「〜に感染した」という用語は、その細菌が普通は見つからない生物学的コンパートメントにグラム陰性細菌が存在することを意味する。
【００６０】
対象に投与する本発明の組成物の量および投与経路は、対象に影響している感染の重度、アルギニノコハク酸合成酵素の活性および排泄速度、ならびに年齢、性別および体重を含む対象の全体的な身体的特徴などの要因に依存する。当業者であれば、医療の実践の際に一般的な上記およびその他の考慮事項に照らして、治療に有効な量および投与経路を決定できるであろう。
【００６１】
細菌内毒素を阻害するための方法で使用されるアルギニノコハク酸合成酵素の量は、過度な実験を要せずに、当業者によって決定される。
【００６２】
一般に、組成物中のアルギニノコハク酸合成酵素の治療に有効な量は、体重１ｋｇあたり約０．００１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲である。特定の実施形態において、組成物中のアルギニノコハク酸合成酵素の治療に有効な量は、約０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、さらなる実施形態において、組成物中のアルギニノコハク酸合成酵素の治療に有効な量は、約０．１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲である。本発明の組成物の治療に有効な量は、単一または複数の単位用量形態で製造および／または投与することができる。
【００６３】
一部の実施形態において、本発明に従う方法には、アルギニノコハク酸合成酵素に加えて、治療薬剤を対象に投与することを伴う。治療薬剤は、内毒素を含んでいる細菌による感染または細菌内毒素への暴露の改善と併用するのに適した各種の薬剤のいずれにしてもよい。例えば、本発明の１つの実施形態において、治療薬剤は抗生物質である。抗生物質は、例えば、アミノグリコシド、アモキシリン、アンフェニコール類、アンサマイシン類、抗生ポリペプチド、βラクタム類、カルバペネム類、セファロスポリン類、セファマイシン類、オクサセフェン類、リンコサミド類、マクロライド類、モノバクタム類、ニトロフラン類、キノロン類、スルホンアミド類、スルホン類およびテトラサイクリン類を含む。
【００６４】
特定の実施形態において、アルギニノコハク酸合成酵素および薬学的に許容可能な担体を含む組成物が、本発明に従って提供される。
【００６５】
本明細書で使われる「薬学的に許容可能な担体」という用語は、意図した受け手にとって一般に無毒で、組成物中に含まれるアルギニノコハク酸合成酵素またはその他の活性薬剤の活性を大幅に阻害することのない担体または希釈剤を指す。
【００６６】
本発明に従う組成物は、一般に、アルギニノコハク酸合成酵素を約０．１〜９９％含む。
【００６７】
アルギニノコハク酸合成酵素は、特定の実施形態において、本発明の組成物中に遊離酸または遊離塩基の形態で含まれる。さらなる実施形態において、アルギニノコハク酸合成酵素は、酸付加塩または塩基付加塩などの薬学的に許容可能な塩の形態で組成物中に含まれる。薬学的に許容可能な塩は、意図した受け手にとって一般に無毒で、組成物中に含まれるアルギニノコハク酸合成酵素またはその他の活性薬剤の活性を大幅に阻害することのないアルギニノコハク酸合成酵素の任意の塩の形態を指す。アルギニノコハク酸合成酵素は、本発明の実施形態において、水和物の形態で組成物中に含まれる。
【００６８】
アルギニノコハク酸合成酵素プロドラッグは、本発明の特定の実施形態に従って、組成物中に含まれる。アルギニノコハク酸合成酵素プロドラッグは、無傷の活性アルギニノコハク酸合成酵素を産生するアルギニノコハク酸合成酵素から放出される成分に共有結合したアルギニノコハク酸合成酵素の形態である。プロドラッグ形態は、Ｓｌｏａｎ，  Ｋ．Ｂ．、Ｐｒｏｄｒｕｇｓ、Ｍ．  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２；ならびにＴｅｓｔａ，  Ｂ．およびＭａｙｅｒ，  Ｊ．Ｍ．、Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ａｎｄ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ａｎｄｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、Ｚｕｒｉｃｈ、２００３に例示されているように、当該分野では周知である。
【００６９】
複数の形態のアルギニノコハク酸合成酵素が、本発明の実施形態に従って、組成物中に含まれる。したがって、例えば、特定の実施形態においては、ヒトアルギニノコハク酸合成酵素とヒトアルギニノコハク酸合成酵素の１つまたは複数の変種との両方が組成物中に含まれる。
【００７０】
本発明の実施形態に従って、アルギニノコハク酸合成酵素は単離されたアルギニノコハク酸合成酵素タンパク質として対象に投与される。「単離されたアルギニノコハク酸合成酵素タンパク質」という用語は、そのアルギニノコハク酸合成酵素タンパク質が、そのアルギニノコハク酸合成酵素タンパク質を産生した系に存在する可能性のある細胞、細胞破片およびその他のタンパク質などの生物学的物質から分離されたことを表す。「単離された」アルギニノコハク酸合成酵素タンパク質という用語は、必ずしもそうとは限らないが、そのアルギニノコハク酸合成酵素タンパク質が精製されたことを意味する場合もある。本発明の方法および組成物に含まれる精製されたアルギニノコハク酸合成酵素タンパク質は、含まれているタンパク質の質量の約２５重量％、５０重量％、７５重量％、８５重量％、９５重量％、９９重量％または約９９重量％を超えるなどのように、質量の少なくとも約１重量％〜１００重量％を含む。
【００７１】
一部の実施形態において、アルギニノコハク酸合成酵素をコードする核酸を含む発現ベクターが、ｉｎ  ｖｉｖｏでアルギニノコハク酸合成酵素タンパク質を産生させるために、対象に投与される。
【００７２】
本発明に従う組成物は、多様な形態で調製することができる。経口投与向けに調製される組成物は、当該分野で既知の方法に従って調製され、様々な通常の任意の医薬成分を含む固体剤、半固体剤または液体剤とすることができる。
【００７３】
数多くの送達系が既知であり、例示すると、リポソームならびにナノ球体、ナノデンドリマー、ナノコロイド、ナノカラムおよびこれらの組合せなどのナノ粒子を含め、対象にアルギニノコハク酸合成酵素を送達するために使用することができる。リポソームならびにその調製および使用に関する方法のさらに詳しい記述は、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ、２６４）、Ｖ．Ｐ．  ＴｏｒｃｈｉｌｉｎおよびＶ．  Ｗｅｉｓｓｉｇ（編）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；第２版、２００３の中に見つかるだろう。ナノ粒子の詳しい様態は、Ｓ．Ｍ．  Ｍｏｇｈｉｍｉら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２００５、１９、３１１−３０に記載されている。
【００７４】
経口投与のための固体剤形としては、カプセル、錠剤、丸薬、粉末および顆粒が挙げられる。このような固体剤形では、アルギニノコハク酸合成酵素を、充填剤または増量剤（例としては、デンプン、ラクトース、蔗糖、グルコース、マニトールおよび珪酸）；結合剤（例としては、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、蔗糖およびアカシア）；湿潤剤（例としては、グリセロール）；崩壊剤（例としては、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカのデンプンなどの植物性デンプン、アルギン酸、特定の複雑珪酸塩および炭酸ナトリウム）；溶解遅延剤（例としては、パラフィン）；吸収加速剤（例としては、四級アンモニウム化合物；湿潤剤（例としては、セチルアルコール、モノステアリン酸グリセロールおよびグリコール）；吸収剤（例としては、カオリンおよびベントナイト）；クエン酸ナトリウムおよびリン酸ニカリシウムなどの緩衝剤；潤滑剤（例としては、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコールおよび硫酸ラウリルナトリウムなどの少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体と混合される。これらのまたはその他の薬学的に許容可能な担体の混合物も、本発明の組成物の実施形態に含めてもよい。
【００７５】
類似の種類の固体組成物も、例えばラクトース又は乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を用いて、軟質及び重質充填ゼラチンカプセル（ｓｏｆｔ  ａｎｄ  ｈａｒｄ  ｆｉｌｌｅｄ  ｇｅｌａｔｉｎ  ｃａｐｓｕｌｅｓ）に充填剤として用いることもできる。
【００７６】
錠剤、糖衣錠、カプセル、丸薬および顆粒のような固体剤形は、当該分野において周知の、腸溶性コーティングやその他のコーティングおよびシェル付きで調製することができる。これらは不透明化剤も含むことができ、腸管のある一定の部分に遅延式に活性化合物（単数又は複数種類）を放出するような組成物であることもできる。使用可能な包埋用組成物（ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）の例は、重合体物質とワックスである。活性化合物は、適切な場合には、上記賦形剤の１つまたは複数の種類を含むマイクロカプセル封入形（ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒｍ）であることもできる。
【００７７】
腸溶性コーティングは、典型的には、重合物質である。好ましい腸溶性コーティング材料は、生分解性の緩やかに加水分解可能な、および／または緩やかに水溶性となる重合体であるという特徴を有する。固体製剤に施されるコーティング材料の量は、一般に、摂取から薬物放出までの時間間隔に影響を及ぼす。コーティングは、コーティング全体が胃酸に対応するｐＨ３より低いｐＨの胃腸液では分解しないが、ｐＨ３より高い小腸環境では分解するようになる厚さで施される。ｐＨに依存する溶解度プロファイルを示す陰イオン性重合体はどれも、下部消化管への活性成分の送達を達成するために、本発明の実践で腸溶コーティングとして容易に使用される。特定の腸溶コーティング材料の選択は、胃での崩壊に対する耐性；胃に留まる間、胃液および活性薬剤の拡散への不浸透性；標的である腸の部位での分散性；貯蔵期間中の物理的および化学的安定性；無毒性；および適用の容易さなどの性質に依存する。
【００７８】
適切な腸溶性コーティング材料は、例示すると、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、酢酸セルロース、フタル酸酢酸セルロース、トリメリト酸酢酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース系重合体；好ましくは、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸メチル、アクリル酸アンモニウムメチル、アクリル酸エチル、メタクリル酸メチルおよび／またはエチルから形成されるアクリル酸重合体および共重合体；ポリビニルピロリドン、酢酸ポリビニル、フタル酸酢酸ポリビニル、酢酸ビニルクロトン酸共重合体およびエチレン／酢酸ビニル共重合体などのビニル重合体および共重合体；セラック；およびこれらの組合せが挙げられる。特定の腸溶性コーティング材料は、Ｒｏｅｈｍ  Ｐａｒｍａ（ドイツ）社のＥＵＤＲＡＧＩＴという商標名で市販されているアクリル酸重合体および共重合体である。ＥＵＤＲＡＧＩＴシリーズのＬ、Ｌ−３０Ｄ  Ｓの共重合体、および架橋された重合体（例えば、米国特許第６，１３６，３４５号を参照されたい）は、胃では’不溶性で、腸では分解するので、特定の実施形態に適切である。
【００７９】
腸溶性コーティングは、固体製剤への胃液の浸透を可能にする孔および亀裂の形成を防止するために、任意で、可塑剤を含む。適切な可塑剤は、例示すると、クエン酸トリエチル（Ｃｉｔｒｏｆｌｅｘ  ２）、トリアセチン（三酢酸グリセリル）、フタル酸ジエチル、クエン酸アセチルトリエチル（Ｃｉｔｒｏｆｌｅｘ  Ａ２）、Ｃａｒｂｏｗａｘ  ４００（ポリエチレングリコール４００）、フタル酸ジエチル、クエン酸トリブチル、アセチル化モノグリセリド、グリセロール、脂肪酸エステル、プロピレングリコール、フタル酸ジブチルが挙げられる。特に陰イオン性カルボン酸アクリル系ポリマーから構成されているコーティングは、通常約１０重量％〜２５重量％の可塑剤、特にフタル酸ジブチル、ポリエチレングリコール、クエン酸トリエチルおよびトリアセチンを含む。コーティングは、コーティング材料を可溶化または分散させるための、ならびにコーティング性能およびコーティングされた成果物を改善するための、他のコーティング添加剤として、例えば粘着防止剤、消泡剤、潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム）および安定剤（例えばヒドロキシプロピルセルロース、酸および塩基）を含むこともできる。
【００８０】
腸溶性コーティングは、従来のコーティング方法および装置を用いて固体製剤に適用することができる。例えば、腸溶性コーティングは、コーティングパン、エアレススプレー手法、流動床コーティング装置などを用いて、固体製剤に適用することができる。コーティングされた製剤を製造するための材料、装置および工程に関する詳細な情報は、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら編（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．、１９８９）およびＬ．Ｖ．  Ａｌｌｅｎ，  Ｊｒ．ら、Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、第８版（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００４）の中に見出すことができる。
【００８１】
経口投与のための液体剤形は、特定の実施形態において、エマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびリキシル剤として調製される薬学的に許容される担体を含む。液体剤形は、アルギニノコハク酸合成酵素の他に、当該分野で一般的に用いられる１つまたは複数の薬学的に許容可能な担体、例えば、水もしくは他の溶剤、可溶化および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチルカーボネート、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油、特に綿実油、落花生油、コーン油、オリーブ油、ひまし油もしくはゴマ油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、またはこれらの物質の混合物などを含有することができる。
【００８２】
経口投与のために調製される組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、フレーバー剤または芳香剤のような補助剤を包含することもできる。
【００８３】
懸濁液は、アルギニノコハク酸合成酵素の他に、懸濁化剤（例としては、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールまたはソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム（ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｍｅｔａｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）、ベントナイト、寒天もしくはトラガント、またはこれら物質の混合物など）、および／またはその他のこの種の従来用いられる薬物成分などを含有することができる。
【００８４】
特定の実施形態において、本発明のアルギニノコハク酸合成酵素を含む組成物は、無菌の注入可能な溶液または分散液に再構成するための生理学的に許容可能な無菌の水系または非水系の溶液、分散液、懸濁液、エマルジョンまたは無菌粉末として調製される。適切な水系および非水系の担体の例としては、希釈剤、溶剤および水、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロールなど）などの賦形剤ならびにこれらの適切な混合物；オリーブオイルなどの植物油；オレイン酸エチルなどの注入可能な有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合には、要求される粒子サイズの維持により、およびラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤の使用により、維持することができる。
【００８５】
このような製剤は、非経口投与および経口投与を含め、適切な経路により投与される。投与は、全身または局所注射、例えば、静脈注射などを含んでよい。
【００８６】
本発明の組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤など、１つまたは複数の補助剤を含んでもよい。微生物の活動の予防は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールおよびソルビン酸などの各種の抗菌剤および抗真菌剤により、確実にすることができる。糖および塩化ナトリウムで代表される等張剤も含有させることが望ましい場合もあり得る。注入可能な医薬品形態の長期的な送達は、吸収を遅らせる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することで達成することができる。
【００８７】
様々な製剤を調整および製造するための材料、装置および工程に関する詳細な情報は、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ、Ｈ．Ａ．  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら編（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．、１９８９）およびＬ．Ｖ．  Ａｌｌｅｎ，  Ｊｒ．ら、Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、第８版（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００４）の中に見出すことができる。薬理的製剤および成分のさらなる例および詳細は、Ａ．Ｒ．  Ｇｅｎａｒｏ、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒａｍａｃｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、第２０版、２００３；Ｌ．Ｖ．  Ａｌｌｅｎ，  Ｊｒ．ら、Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、第８版（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００４）；およびＪ．Ｇ．  Ｈａｒｄｍａｎら、Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒａｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ、第１０版、２００１のような、標準の文献の中に見出せる。
【００８８】
アルギニノコハク酸合成酵素を含む組成物は、全身経路および／または局所経路により投与することができる。適切な投与経路は、例示すると、静脈内、経口、口腔、非経口、髄腔内、脳室内、腹腔内、眼球、眼内、直腸、膣内、皮下、皮内、筋肉内、局所、鼻内、耳および粘膜が含まれる。
【００８９】
本発明の方法のさらなる実施形態では、アルギニノコハク酸合成酵素の存在、濃度および／または活性を細菌内毒素に暴露した疑いのある試料で評価する。細菌内毒素に暴露した対象から得た試料において、アルギニノコハク酸合成酵素の濃度および活性は、正常な濃度および活性を超えて上昇することが、本発明の発見である。
【００９０】
アルギニノコハク酸合成酵素の濃度および／または活性のアッセイは、対象から得た試料、培養した初代細胞および／または組織または細胞株などのように、細菌内毒素に暴露した疑いのある任意の物質に対して任意で実施される。アルギニノコハク酸合成酵素の濃度および／または活性のアッセイは、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリー、免疫ブロット法、免疫沈降法、免疫細胞化学、放射免疫測定法、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーション、ＲＮＡａｓｅプロテクション、またはこれらの任意の組合せを含む種々のアッセイ方法のいずれかを使用して、任意で実施される。アッセイ方法は、質的および／または量的結果を得るために使用することができる。試料の質的と量的の両方のアッセイに適切なアッセイ方法の具体的な詳細は、標準的な文献に記述されており、例示すると、Ｅ．  ＨａｒｌｏｗおよびＤ．  Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、  １９８８；Ｆ．  ＢｒｅｉｔｌｉｎｇおよびＳ．  Ｄｕｂｅｌ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９９；Ｈ．  Ｚｏｌａ、  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，  Ｂａｓｉｃｓ：  Ｆｒｏｍ  Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｔｏ  Ｂｅｎｃｈ、ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、２０００；  Ｂ．Ｋ．Ｃ．  Ｌｏ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、２００３；Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｗｉｌｅｙ、２００２；Ｓ．  Ｋｌｕｓｓｍａｎ（編）、Ｔｈｅ  Ａｐｔａｍｅｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ：  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｗｉｌｅｙ、２００６；Ｏｒｍｅｒｏｄ，  Ｍ．Ｇ．、Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０００；  Ｇｉｖａｎ，  Ａ．Ｌ．、Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：  ｆｉｒｓｔ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００１；Ｇｏｒｅｚｙｃａ，  Ｗ．、Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ：  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃ−ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ、Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆａｎｃｉｓ，２００６；およびＪ．  ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．  Ｒｕｓｓｅｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第３版��２００１または本明細書中に記述された方法による。
【００９１】
対象から得る試料は、例示すると、組織、細胞、細胞を含んでいてもいなくてもよい体液の試料、または土壌、水またはその他の環境的試料から得た試料である。試料の代表的な例としては、血液、血漿、血清、唾液、粘膜、精液、涙液、リンパ液および尿が挙げられる。したがって、試料の入手には、試料を獲得するための当該分野で公知の任意の方法、例示すると、血液全体を得、例示的には、血液を凝固させ、可溶画分を除去することで血清を達成し、血液全体を遠心分離にかけ、上部の血漿部分を除去することで血漿を得る静脈穿刺、またはその他の標準的な採取技法を用いる。
【００９２】
細菌内毒素への暴露の治療方法は、ヒトの対象ならびにヒト以外の対象に適用可能である。特定の実施形態において、細菌内毒素への暴露を治療する方法は、ヒトまたはヒト以外の対象、例えば、ヒト以外の霊長類、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、齧歯類、ブタ、ヒツジ、ヤギおよび家禽またはその他のヒト以外の哺乳類もしくは鳥類に、アルギニノコハク酸合成酵素を投与することを含む。
【００９３】
以下の実施例で、本発明の組成物および方法の実施形態を説明する。これらの実施例は、説明の目的のために提示するものであり、本発明の組成物および方法の範囲を制限するものとはみなさない。
【００９４】
試薬
【００９５】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（大腸菌）Ｏ１１１：Ｂ４およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ由来のリポ多糖（ＬＰＳ）をＳｉｇｍａ（米国ミズーリ州Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ）から購入した。ラットのＴＮＦ−αおよびＣＲＰ  ＥＬＩＳＡキットを、それぞれｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）とＢｉｏＶｅｎｄｏｒ（チェコ共和国Ｍｏｄｒｉｃｅ）から購入した。ポリヒスチジン、αＩＩ−スペクトリンおよびＬＰＳコア（クローンＷＮ１  ２２２−５）に対する抗体を、それぞれ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（カリフォルニア州Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、Ｂｉｏｍｏｌ  Ｃｏ．（ペンシルバニア州Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ）およびＨｙＣｕｌｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（オランダＵｄｅｎ）から購入した。ヒトＡＳＳに対する抗体は、標準技法によりＢａｎｙａｎ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ，  Ｉｎｃ．で製造された。
【００９６】
実施例１：ＬＰＳ処置により、ｉｎ  ｖｉｖｏで内因性ＡＳＳブロマーカーの血清中の蓄積を誘導する。
【００９７】
雄のＳＤ成ラット（２００〜２２５ｇ）および雄のＢａｌｂ／ｃ成マウス（１９〜２２ｇ）（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．  インディアナ州Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）を、餌および水に自由に（ａｄ  ｌｉｂｉｔｕｍ）近づける状態で１２時間の明暗周期で、一定の温度（２２℃）および湿度のもと飼育した。
【００９８】
血清中の内因性ＡＳＳの濃度を、肝障害のプライミング剤Ｄ−ガラクトサミン（Ｄ−Ｇａｌ）と組み合わせたＬＰＳ処置の後で測定した。Ｅ．  ｃｏｌｉ由来のリポ多糖（ＬＰＳ、１０μｇ／ｋｇ）にＤ−ガラクトサミン（Ｄ−Ｇａｌ、５００ｍｇ／ｋｇ）を加えたもの、ＬＰＳのみ（１００μｇ／ｋｇ）または食塩水をＳＤラットの腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射した。処置の１時間後、２時間後、３時間後、２４時間後および７２時間後に、それぞれの時点ごとに少なくとも３匹のラットを使って、麻酔をかけた動物の心臓から血液を採取した。図１に示すように、ＡＳＳは内毒素によって誘導される肝障害の極めて感度の高いマーカーであり、内毒素およびＤ−ガラクトサミンの注射後１時間以内に、血清中で顕著に増加した（図１Ａ）。血中のＡＳＳの蓄積は、処置の２４時間後に生存していたラットでは１０００ｎｇ／ｍｌに達した。注射から回復しつつあるラットでは、ＡＳＳ血中濃度は７２時間の時点でほぼ基準値まで低いたが下、食塩水で処置した対照のラットと比較すると、まだ高かった（図１Ａ）。ＬＰＳをＤ−Ｇａｌなしで、１０倍の投与量で注射したとき、血中ＡＳＳの増加は同様のプロファイルを示したが、濃度はＤ−ガラクトサミンが存在していた場合よりも、大幅に低いものだった（図１Ｂ）。
【００９９】
実施例２：組換えアルギニノコハク酸合成酵素のクローニング、タンパク質発現および精製
【０１００】
ヒトアルギニノコハク酸合成酵素遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＢＣ００９２４３．２；スイスプロット名ＡＳＳＹ＿ＨＵＭＡＮ）をＯｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（アラバマ州Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ）販売の原型クローン（クローンＩＤ：３０１０１３７）をＰＣＲ増幅の鋳型として使用して増幅した。プライマーは以下の通りである：順方向に３２塩基長（ＡＴＧを含む）、５’−ＡＴＧＴＣＣＡＧＣＡＡＡＧＧＣＴＣＣＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＣＴＡ−３’；逆方向に５０塩基長（ＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＣ末端のＨｉｓタグの融合を含むように作成した）、５’−ＴＡＴＡＡＡＧＣＴＴＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＴＴＴＧＧＣＡＧＴＧＡＣＣＴＴＧＣＴＣ−３’。以下の要領で、ＰＣＲを３０サイクル実施した：９４℃で１分間の変性、５３℃で１分間のアニーリング、そして７２℃で２分間のエロンゲーション。この結果、ゲル精製し、ＡｃｃｅｐＴｏｒ  Ｖｅｃｔｏｒキット（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）を使用して、ｐＥＴＢｌｕｅ−１ベクターに直接結合されたヒトＡＳＳ１−６ｘＨｉｓＨｉｓ融合（１２５４塩基対）に対して予測されたサイズの１つの生成物が複製された。ｃＤＮＡの正しい配列をサンガー法によって確認した。
【０１０１】
Ｔ７ｌａｃプロモーターの制御下でのＡＳＳ１  ｃＤＮＡの誘導発現のために、構造体をＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ  Ｅ．  ｃｏｌｉ株（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。標準的なヒートショック法による形質転換および標準方法を使用するルリア培地（ＬＢ）での液体培地増殖の後、イソプロピル−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することで、組換えヒトアルギニノコハク酸合成酵素（ｒＡＳＳ）の発現を誘導した。誘導条件（０．５ｍＭのＩＰＴＧの存在下で１８℃で１６時間）は、可溶性ｒＡＳＳの収量を最大にするために最適化した。収穫の後、細胞ペレットを−７０℃で凍結し、３７℃で解凍し、プロテアーゼ阻害剤およびＤＮＡａｓｅを補給したＳｏｌｕＬｙｓｅ溶解緩衝液（ＧｅｎＬａｎｔｉｓ、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）に懸濁した。ＨｉｓＰｕｒ  Ｃｏｂａｌｔスピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）で親和性クロマトグラフィーを使用して、ｒＡＳＳを精製した。結合／洗浄緩衝液は、リン酸ナトリウムを５０ｍＭ、ＮａＣｌを３００ｍＭ、およびイミダゾールｐＨ７．４を１０ｍＭ含んだ。溶出緩衝液はイミダゾールの濃度が１５０ｍＭに上昇した点を除き、同一だった。Ｕ−Ｔｕｂｅ濃縮器（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して、タンパク質を濃縮し、緩衝液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と交換した。タンパク質の可溶性および触媒活性を維持するために、ｐＨ７．４の最終的な緩衝溶液に、シトルリン１ｍＭおよびアスパラギン酸塩１ｍＭを補給した。
【０１０２】
親和性精製されたタンパク質は、クマシーブルー染色で示されているように、純度〜９５％のタンパク質である（図２Ａ）。
【０１０３】
Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｃｈｏｎｏｌｏｇｙ社（イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）から販売のＭＳ−ＰＥＧ１２またはＴＭＳ−ＰＥＧ１２のいずれかを使用して、ＰＥＧ化ｒＡＳＳを調製した。簡単に説明すると、ＭＳ−ＰＥＧ１２またはＴＭＳ−ＰＥＧ１２の溶液を無水ジメチルホルムアミド中にて調製し、それぞれＰＥＧ対ＡＳＳの比率を２００：１または４００：１にして、ｒＡＳＳタンパク質の溶液に滴下した。反応混合物を室温で０．５時間インキュベートし、タンパク質の溶液を５分間、１，０００ｘｇで遠心分離にかけ、調整したＤｅｓａｌｔスピンカラム上で精製した。純度および反応の完了は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使って評価した（図２Ａ、Ｅ）。ｒＡＳＳの免疫原性純度は、６ｘＨｉｓに対する抗体（図２Ｂ、Ｅ）ならびにウサギで育てたＡＳＳ誘導ペプチドに対するポリクロナール抗体（ＡＳＳ１）（図２Ｃ、Ｅ）を用いてウエスタンブロット法により確立された。
【０１０４】
実施例３：細菌増殖動態
【０１０５】
ＡＳＳのＬＰＳとの強い物理的な相互作用は、デノボ合成されたｒＡＳＳが３７℃において、細菌中の封入体に堆積したことの原因かもしれない。Ｅ．  ｃｏｌｉまたはＢ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓの細菌増殖に対するｒＡＳＳまたはＰＥＧ化ｒＡＳＳの阻害作用は、様々な濃度のｒＡＳＳで、６００ｎｍにて光学密度として評価される。細胞表面でＬＰＳを発現しているＥ．  ｃｏｌｉ（Ｋ−２０株）またはＢ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（対照）は、（６００ｎｍにて）開始密度を０．０６光学単位として、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地（Ｎｏｖａｇｅｎ）中の９６ウェルプレート内のｒＡＳＳまたはＰＥＧ化ｒＡＳＳ（０．２５または０．５μｇ／ｍｌ）の不在または存在時に増殖することができる。最高６時間まで１時間経過するごとに、６００ｎｍでのＯＤを測定し、細菌増殖速度を求めた。図３は、懸濁培地への添加後、３時間から６時間、５０μｇ／ｍｌのｒＡＳＳ（図３Ａ）またはＰＥＧ化ｒＡＳＳ（図３Ｃ）がＥ．  ｃｏｌｉの増殖を大幅に抑止したことを示し、ｒＡＳＳ補給の直接的な抗菌作用を実証している。ｒＡＳＳおよびＰＥＧ化ｒＡＳＳは、同様に増殖を阻害する。ｒＡＳＳはＢ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓの増殖に対しては、明らかな削減を示さなかった（図３Ｂ）。
【０１０６】
実施例４：ウエスタンブロット分析
【０１０７】
ウエスタンブロット分析のために、ウエスタンブロット緩衝液中、氷上で試料を均質化した。試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけ、ポリビニリデンジフロライド膜に電気ブロテッィングした。膜を１０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、および５％脱脂粉乳を含む０．１％のＴｗｅｅｎ−２０の中で室温で６０分間、ブロッキングする。一次抗体を使って一晩インキュベートした後、ホースラディシュぺルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合した二次抗体および化学発光検出系を使用するか、またはアルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）に結合した二次抗体および比色検出系を使用して、タンパク質を検出した。
【０１０８】
実施例５：マクロファージ細胞培地におけるｒＡＳＳによるＬＰＳ毒性の軽減
【０１０９】
乳酸塩脱水素酵素（ＬＤＨ）の培地への放出をＬＰＳ毒性の指標として使い、培養中の哺乳類細胞で、ＬＰＳ毒性に対するｒＡＳＳの有益な効果について調べた。
【０１１０】
ＲＡＷ  ２６４．７マウスのマクロファージをＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）から購入し、１０％ウシ胎仔血清および抗生抗菌溶液（１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび２５μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ）を補給したＤＭＥＭの中で、３７℃にて５％のＣＯ２の存在下で培養した。培地は３〜５日ごとに継代し、細胞を短いトリプシン処置により剥がし、倒立顕微鏡で視覚化した。
【０１１１】
マクロファージをＬＰＳ（０．１〜１μｇ／ｍｌ）、ｒＡＳＳ（１および１０μｇ／ｍｌ）および抗ＬＰＳコア抗体（０．１μｇ／ｍｌ）で処置した。異なる時点で、各ウェルからの細胞調整培地をＬＤＨ放出アッセイのために保存した。終点の時点（６時間目または１８時間目）の細胞を洗浄し、ＭＴＳアッセイを実施した。αＩＩスペクトリン崩壊生成物のウェスタンブロット分析のために、細胞を溶解した。
【０１１２】
１μｇ／ｍｌにて、Ｅ．  ｃｏｌｉ由来のＬＰＳ（ＬＰＳ（Ｅ））またはＳ．  ｅｎｔｅｒｉｃａ由来のＬＰＳ（ＬＰＳ（Ｓ））はどちらも、ＬＰＳチャレンジの６時間後および１８時間後の培地ＬＤＨ濃度の急激な増加により示されるとおり、顕著な細胞毒性を示した（図４Ａおよび４Ｂ）。添加の前に１時間ｒＡＳＳ（１μｇ／ｍｌ）を使ってＬＰＳのプレインキュベーションを行なうことで、処置の６時間後および１８時間後における２種類のＬＰＳによるＬＤＨ放出は大幅に減少した（図４Ａおよび４Ｂ）。対照的に、抗ＬＰＳ抗体（０．１μｇ／ｍｌ）を使ってＬＰＳをプレインキュベーションした場合、ＬＰＳ（Ｓ）により誘導されるＬＤＨ放出は、添加の６時間後の時点では減少したが、１８時間後では、ＬＰＳ（Ｅ）毒性にもＬＰＳ（Ｓ）効果にも影響は生じなかった（図４Ａおよび４Ｂ）。したがって、Ｅ．  ｃｏｌｉまたはＳ．  ｅｎｔｅｒｉｃａのいずれに由来のＬＰＳにより誘導される細胞障害は、抗ＬＰＳ抗体によるよりも遥かに一貫して、増殖培地中に存在するｒＡＳＳにより軽減することができる。調査した両方の時点（６時間後および１８時間後）でｒＡＳＳの防護的活性は顕著である。
【０１１３】
実施例６：ＬＤＨ放出およびＭＴＳミトコンドリア機能アッセイ
【０１１４】
ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（商標）細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）を使用して、乳酸塩脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を量的に測定し、製造業者の指示に従って、溶解細胞の相対数を算定した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、生きている細胞のミトコンドリアによるテトラゾリウム化合物、ＭＴＳのホルマザン生成物への変化を数量的に測定し、製造業者の指示に従って、相対的な細胞生存能力を算定した。
【０１１５】
多くの組織における細胞毒性および細胞死には、主要細胞骨格αＩＩ−スペクトリンなどのいくつもの一般的なタンパク質の開裂を引き起こすカスパーゼ−３およびカルパイン−２の活性が関与している。ＲＡＷ２６４．７細胞では、どちらの種類のＬＰＳも、１μｇ／ｍｌにて、処置後１８時間以内にαＩＩ−スペクトリンの開裂および１５０ｋＤａフラグメント（ＳＢＤＰ１５０）の生成を誘発した（図５Ａ）が、ｒＡＳＳ（１μｇ／ｍｌ）による事前処置を施すことで、ＬＰＳ誘発によるＳＰＤＳ１５０の形成は大幅に減少した。ＬＰＳへの応答としてのＬＤＨ放出およびαＩＩ−スペクトリンの分解は、ＭＴＳ還元アッセイを使用して測定した培養マクロファージのミトコンドリア呼吸活性により示されるように、細胞生存性の減少を伴った。ｒＡＳＳによるプレインキュベーションによって、細胞は防護され、ＬＰＳによる処置の１８時間後の細胞生存性は増加した（図５Ｂ）。対照的に、ＭＴＳテストにより評価したＬＰＳ誘導の細胞損傷は、抗ＬＰＳ抗体（０．１μｇ／ｍｌ）による影響を受けなかった（図５Ｂ）。ＬＰＳ（Ｅ）およびＬＰＳ（Ｓ）の両方により引き起こされるミトコンドリア機能不全の完全なブロッキングは、ｒＡＳＳ：ＬＰＳの質量比が約１：１のときに達成された。最終的に、ｒＡＳＳはＬＰＳの後に添加されたとき、内毒素誘発の細胞損傷を軽減することが可能だった。図６に示すように、ＬＰＳの１時間後にｒＡＳＳを添加すると、マウスマクロファージでは、ｒＡＳＳの投与量に依存する形でＬＰＳ誘導の細胞毒性がほぼ消滅した。
【０１１６】
実施例７：ＥＬＩＳＡ分析
【０１１７】
ＡＳＳ  ＳＷ  ＥＬＩＳＡアッセイ。ポリクローナルＡＳＳ抗体をキャプチャーとして、マウスモノクローナル抗体を検出抗体として使用し、ＳＷ  ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｂａｎｙａｎ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ，  Ｉｎｃ．）により血清中の内因性ＡＳＳの濃度を測定した。抗マウスＨＲＰに結合したＡｂｓを使用した後、ＴＭＢ基質インキュベーションを行なうことで、色を発現させた。ＡＳＳ標準として上記のように調製したヒトｒＡＳＳまたはＰＥＧ化ｒＡＳＳを使用して、検量線からＡＳＳ濃度を算出した。
【０１１８】
動物血清中のＴＮＦ−αおよびＣＲＰの量的検出を、それぞれｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．およびＢｉｏＶｅｎｄｏｒ  ＬＬＣから販売のサンドイッチＥＬＩＳＡキットを使用して、製造業者の指示に従って実施した。
【０１１９】
実施例８：ＬＰＳおよびＡＳＳの複合体の形成
【０１２０】
ｒＡＳＳ−ＬＰＳ複合体形成のゲルシフトアッセイにより、ｒＡＳＳ調製物をＬＰＳ結合親和性について調べた。精製したＬＰＳ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）、ＬＰＳ（Ｓ．  ｅｎｔｅｒｉｃａ）およびｒＡＳＳ単独または組合せを、３７℃にて１時間インキュベートした後、非変性ゲル電気泳動にかけた。電気泳動は氷水スラリーを満たしたトレイ内で４〜２０％勾配ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を使用して、２．５時間、２５ｍＡにて、１９２ｍＭのトリス、３２５ｍＭのグリシン（ｐＨ８．３）で実施した。最初に、同じ緩衝液を使って１５分間、ゲルを予備泳動した。ｒＡＳＳは単一の帯域として、ゲルの中でクマシーブルーにより視覚化されたが、ＬＰＳ単独の場合は検出されなかった（図２Ｄ）。対照的に、プレインキュベートしたｒＡＳＳ−ＬＰＳ複合体は、この方法では、不均一のパッチとして現れ、その移動度シフトはｒＡＳＳ単独の場合（図２Ｄ）と比較すると劇的で、銀染色法で視覚化されたＬＰＳとは類似していた。
【０１２１】
実施例９：内毒素ショックの齧歯類モデルにおけるｒＡＳＳの有益な効果
【０１２２】
Ｂａｌｂ／ｃマウスの実験的な内毒素血のモデルを使用して、重大なＬＰＳ発病に対して、免疫的にインタクトな宿主の防護におけるｒＡＳＳの効能の特徴を明らかにした。マウス６匹から成るグループに、１５ｍｇ／ｋｇのＥ．  ｃｏｌｉ  ＬＰＳと１５ｍｇ／ｋｇのＳ．  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ＬＰＳのいずれかを含む食塩水を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した後、５ｍｇ／ｋｇでｒＡＳＳを１時間後に注入した。３２時間の期間、生存率を記録した。図７Ａに示すように、ＬＰＳマウスは２４時間目に８０％の死亡率を示し、３０時間目までにすべてが死亡した。対照的に、ＬＰＳチャレンジを受けた後、３：１の質量比でｒＡＳＳで１回処置されたマウスは、５０％が３２時間後に生存していた（図７Ａ）。
【０１２３】
生存実験のために、ＳＤラットを無作為に３つのグループ（各グループに最低４匹）に分割した。グループ１には、５ｍｇ／ｋｇでｒＡＳＳを腹腔内注射し、グループ２には、２５ｍｇ／ｋｇでＥ．ｃｏｌｉ  ＬＰＳを与えた後、１時間後に５ｍｇ／ｋｇでｒＡＳＳを注入し、グループ３には、２５ｍｇ／ｋｇでＥ．  ｃｏｌｉ  ＬＰＳを単独で与えた。７２時間の期間、生存率を記録した。
【０１２４】
ラットの内毒素血モデルでは、ＬＰＳのボーラス注入（２５ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射）では、７２時間後の生存率は６０％であった（図７Ｂ）。対照的に、ＬＰＳチャレンジの１時間後に、ｒＡＳＳ／ＬＰＳの質量比を１：５としてｒＡＳＳを注入したとき、ラットの生存率は１００％となった（図７Ｂ）。
【０１２５】
実施例１０：内毒素ショックに関係するマーカーの放出に対するｒＡＳＳの効果
【０１２６】
内毒素誘引の全身性炎症および臓器障害を評価するために、複数の一般的な血清マーカーを評価した。これらのバイオマーカーの放出を調べるために、ラットに、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＬＰＳ（２５ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇ）のみ、もしくはｒＡＳＳ（５ｍｇ／ｋｇ）を使ってプレインキュベートしたＬＰＳ（１時間、３７℃）を腹腔内注射するか、またはＬＰＳを与えた１時間後にｒＡＳＳを注入した。ＴＮＦ−α、ＬＤＨおよびＣＲＰの濃度を、ＬＰＳ注入の３時間後（ＴＮＦ−α検出）または７２時間後（ＬＤＨおよびＣＲＰの検出）に、ラットの血液試料から調製した血清で測定した。
【０１２７】
実施例１１：ラットの内毒素血におけるｒＡＳＳによるＴＮＦ−α放出およびＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）濃度の抑制
【０１２８】
ＡＳＳの防護効果がｉｎ  ｖｉｖｏでの炎症性サイトカインの減少に関係しているのかを判断するために、実施例１０でチャレンジを与えた内毒素ラットの血清ＴＮＦ−α濃度を測定した。図８Ａに示すように、２５ｍｇ／ｋｇで注入したＬＰＳは、注入の３時間後に、最高約１２５ｐｇ／ｍｌまで血清中のＴＮＦ−αを上昇させたが、ＬＰＳの１時間後に５ｍｇ／ｋｇでｒＡＳＳを投与した場合、ＴＮＦ−αの産生は４０％減少した（図８Ａ）。さらに、５ｍｇ／ｋｇでＬＰＳを腹腔内に注射する処置をすることで誘発されたＴＮＦ−αのより低い規模での上昇は、以降にｒＡＳＳを５ｍｇ／ｋｇで注入することで取り消された（図８Ａ）。
【０１２９】
血清ＣＲＰ濃度の随伴性上昇は、亜致死の２５ｍｇ／ｋｇでのＬＰＳチャレンジの１時間後に、ｒＡＳＳを注入することで消滅し、ＣＲＰは対照濃度に戻った（図８Ｂ）。
【０１３０】
実施例１２：内毒素血ラットにおける血清ＬＤＨ放出の阻害
【０１３１】
乳酸塩脱水素酵素（ＬＤＨ）は、肝臓を含め、数多くの身体組織に存在する細胞質内酵素である。したがって、ＬＤＨの血中濃度の上昇は、様々な侵襲に起因する多臓器の損傷を潜在的な原因とする、組織からのＬＤＨの漏出を意味する。図９は、亜致死量の２５ｍｇ／ｋｇのＬＰＳをラットに投与することで、対照と比較して血中のＬＤＨの約７倍の上昇が誘引されたことを表している。しかし、ＬＰＳチャレンジと同時または後に、５ｍｇ／ｋｇのｒＡＳＳを腹腔内注射すると、対応して、ＬＤＨ放出は４５％および４９％減少した（図９）。
【０１３２】
実施例１３：ＡＳＳのＰＥＧ化によるｒＡＳＳ酵素活性の増加。
【０１３３】
実施例２で記述したとおり、ｒＡＳＳは単独で使用するか、またはＰＥＧ化した。ＰＥＧ化ｒＡＳＳおよびｒＡＳＳの酵素活性試験を、ＡＳＳにより触媒された原理的酵素反応に従って開発し、その後、ピロホスファターゼにより産生された無機リン酸塩を測定した（スキーマ１）。
（スキーマ１）
ＭｇＡＴＰ２−＋シトルリン＋アスパラギン酸塩＜＝＞
・アルギニノコハク酸合成酵素＋ＭｇＰＰｉ＋ＡＭＰ
Ｉ＋１Ｕ／ｍｌのピロホスファターゼ
Ｐｉ
マラカイトグリーンアッセイ
（Ｉ）
【０１３４】
簡単に説明すると、９６ウェルのマイクロタイタープレートで、１ｍＭのアスパラギン酸および１２．５ｍＭのシトルリンの基質を加えるまたは加えずに、６ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＡＴＰおよび１Ｕ／ｍｌのピロホスファターゼを含む４５μｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に、５μｌの試料を添加した。製造業者の指示（ＲＮＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）に従って、マラカイトグリーンを使って、反応で生成された無機リン酸塩（Ｐｉ）を測定した。
【０１３５】
図１０は、ｒＡＳＳ単独（ｐ＜０．０１）に比較して、ＰＥＧ化ｒＡＳＳのｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素活性が２．５倍より多く増加したことを示しており、予想に反し、ＰＥＧ化はｒＡＳＳのｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素活性を向上することが分かった。
【０１３６】
実施例１４：ＡＳＳのＰＥＧ化はｒＡＳＳのｉｎ  ｖｉｖｏの安全性を増加する。
【０１３７】
ＰＥＧ化ｒＡＳＳの安定性を調べ、ｒＡＳＳ単独の安定性と比較した。餌および水に自由に（ａｄ  ｌｉｂｉｔｕｍ）近づける状態で１２時間の明暗周期で、一定の温度（２２℃）および湿度のもと飼育した雄の成ＳＤラット（２００〜２２５ｇ）（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、インディアナ州Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）に５ｍｇ／ｋｇのｒＡＳＳおよびＰＥＧ化ｒＡＳＳを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。注射の３時間後および２０時間後に、各時点で少なくとも３匹のラットｗｐ使って、麻酔した動物の心臓から血液を採取した。実施例７に記述した要領で、ＳＷ−ＥＬＩＳＡでｒＡＳＳまたはＰＥＧ化ｒＡＳＳの濃度を測定した。
【０１３８】
図１１に示すとおり、ＰＥＧ化ｒＡＳＳは大幅により安定し、非ＰＥＧ化ｒＡＳＳに比較して、腹腔内注射後、遥かに長時間、血液循環に留まった。ＰＥＧ化ｒＡＳＳの酵素活性の増加と併せて、以上の結果は、ＰＥＧ化は、ＬＰＳに結合し、病原性グラム陰性細菌に感染した対象からＬＰＳを除去する能力が全体的に予想外に増加した、より堅牢なｒＡＳＳ分子を産生することを示している。
【０１３９】
統計
【０１４０】
統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェアを使用して実施した。データを対応のない両側のｔ検定により評価した。統計的有意性の基準は、ｐ＜０．０５またはｐ＜０．０１に設定された。
【０１４１】
配列
【０１４２】
配列ＩＤ番号：１：ホモサピエンスアルギニノコハク酸合成酵素１（ＡＳＳ）タンパク質（４１２ａａ）：ＭＳＳＫＧＳＶＶＬＡＹＳＧＧＬＤＴＳＣＩＬＶＷＬＫＥＱＧＹＤＶＩＡＹＬＡＮＩＧＱＫＥＤＦＥＥＡＲＫＫＡＬＫＬＧＡＫＫＶＦＩＥＤＶＳＲＥＦＶＥＥＦＩＷＰＡＩＱＳＳＡＬＹＥＤＲＹＬＬＧＴＳＬＡＲＰＣＩＡＲＫＱＶＥＩＡＱＲＥＧＡＫＹＶＳＨＧＡＴＧＫＧＮＤＱＶＲＦＥＬＳＣＹＳＬＡＰＱＩＫＶＩＡＰＷＲＭＰＥＦＹＮＲＦＫＧＲＮＤＬＭＥＹＡＫＱＨＧＩＰＩＰＶＴＰＫＮＰＷＳＭＤＥＮＬＭＨＩＳＹＥＡＧＩＬＥＮＰＫＮＱＡＰＰＧＬＹＴＫＴＱＤＰＡＫＡＰＮＴＰＤＩＬＥＩＥＦＫＫＧＶＰＶＫＶＴＮＶＫＤＧＴＴＨＱＴＳＬＥＬＦＭＹＬＮＥＶＡＧＫＨＧＶＧＲＩＤＩＶＥＮＲＦＩＧＭＫＳＲＧＩＹＥＴＰＡＧＴＩＬＹＨＡＨＬＤＩＥＡＦＴＭＤＲＥＶＲＫＩＫＱＧＬＧＬＫＦＡＥＬＶＹＴＧＦＷＨＳＰＥＣＥＦＶＲＨＣＩＡＫＳＱＥＲＶＥＧＫＶＱＶＳＶＬＫＧＱＶＹＩＬＧＲＥＳＰＬＳＬＹＮＥＥＬＶＳＭＮＶＱＧＤＹＥＰＴＤＡＴＧＦＩＮＩＮＳＬＲＬＫＥＹＨＲＬＱＳＫＶＴＡＫ
【０１４３】
配列ＩＤ番号：２：ホモサピエンスアルギニノコハク酸合成酵素１（ＡＳＳ）タンパク質ｃＤＮＡ（１２３９ｎｔ）：
ＡＴＧＴＣＣＡＧＣＡＡＡＧＧＣＴＣＣＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＣＴＡＣＡＧＴＧＧＣＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＣＣＴＣＧＴＧＣＡＴＣＣＴＣＧＴＧＴＧＧＣＴＧＡＡＧＧＡＡＣＡＡＧＧＣＴＡＴＧＡＣＧＴＣＡＴＴＧＣＣＴＡＴＣＴＧＧＣＣＡＡＣＡＴＴＧＧＣＣＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＣＴＴＣＧＡＧＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＧＣＡＣＴＧＡＡＧＣＴＴＧＧＧＧＣＣＡＡＡＡＡＧＧＴＧＴＴＣＡＴＴＧＡＧＧＡＴＧＴＣＡＧＣＡＧＧＧＡＧＴＴＴＧＴＧＧＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＡＴＣＣＡＧＴＣＣＡＧＣＧＣＡＣＴＧＴＡＴＧＡＧＧＡＣＣＧＣＴＡＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＴＣＴＣＴＴＧＣＣ
ＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＴＣＧＣＣＣＧＣＡＡＡＣＡＡＧＴＧＧＡＡＡＴＣＧＣＣＣＡＧＣＧＧＧＡＧＧＧＧＧＣＣＡＡＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＡＣＧＧＣＧＣＣＡＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＧＡＡＣＧＡＴＣＡＧＧＴＣＣＧＧＴＴＴＧＡＧＣＴＣＡＧＣＴＧＣＴＡＣＴＣＡＣＴＧＧＣＣＣＣＣＣＡＧＡＴＡＡＡＧＧＴＣＡＴＴＧＣＴＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＣＣＴＧＡＡＴＴＣＴＡＣＡＡＣＣＧＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＣＧＣＡＡＴＧＡＣＣＴＧＡＴＧＧＡＧＴＡＣＧＣＡＡＡＧＣＡＡＣＡＣＧＧＧＡＴＴＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＴＣＡＣＴＣＣＣＡＡＧＡＡＣＣＣＧＴＧＧＡＧＣＡＴＧＧＡＴＧＡＧＡＡＣＣＴＣＡＴＧＣＡＣＡＴＣＡＧＣＴＡＣＧＡＧＧＣＴＧＧＡＡＴＣＣＴＧＧＡＧＡＡＣＣＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＡＧＣＧＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＴＣＴＡＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧＧＡＣＣＣＡＧＣＣＡＡＡＧＣＣＣＣＣＡＡＣＡＣＣＣＣＴＧＡＣＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＴＣＧＡＧＴＴＣＡＡＡＡＡＡＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＣＧＴＣＡＡＧＧＡＴＧＧＣＡＣＣＡＣＣＣＡＣＣＡＧＡＣＣＴＣＣＴＴＧＧＡＧＣＴＣＴＴＣＡＴＧＴＡＣＣＴＧＡＡＣＧＡＡＧＴＣＧＣＧＧＧＣＡＡＧＣＡＴＧＧＣＧＴＧＧＧＣＣＧＴＡＴＴＧＡＣＡＴＣＧＴＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＴＴＣＡＴＴＧＧＡＡＴＧＡＡＧＴＣＣＣＧＡＧＧＴＡＴＣＴＡＣＧＡＧＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＣＡＣＣＡＴＣＣＴＴＴＡＣＣＡＴＧＣＴＣＡＴＴＴＡＧＡＣＡＴＣＧＡＧＧＣＣＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＣＧＧＧＡＡＧＴＧＣＧＣＡＡＡＡＴＣＡＡＡＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＴＧＡＡＡＴＴＴＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＴＡＴＡＣＣＧＧＴＴＴＣＴＧＧＣＡＣＡＧＣＣＣＴＧＡＧＴＧＴＧＡＡＴＴＴＧＴＣＣＧＣＣＡＣＴＧＣＡＴＣＧＣＣＡＡＧＴＣＣＣＡＧＧＡＧＣＧＡＧＴＧＧＡＡＧＧＧＡＡＡＧＴＧＣＡＧＧＴＧＴＣＣＧＴＣＣＴＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＴＣＣＴＣＧＧＣＣＧＧＧＡＧＴＣＣＣＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＧＣ
ＡＴＧＡＡＣＧＴＧＣＡＧＧＧＴＧＡＴＴＡＴＧＡＧＣＣＡＡＣＴＧＡＴＧＣＣＡＣＣＧＧＧＴＴＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＡＡＴＴＣＣＣＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＧＡＡＴＡＴＣＡＴＣＧＴＣＴＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＧＴＣＡＣＴＧＣＣＡＡＡＴＡＧ
【０１４４】
すべての試薬は、特に他に規定されている場合を除き、当該分野で既知の供給元から入手可能であることが理解される。ヌクレオチド増幅、細胞形質移入ならびにタンパク質の発現および精製の方法は、当業者の技能の範囲内である。
【０１４５】
本明細書で言及されているどの特許または出版物も、各参照が引用する資料および本明細書の中で教示される他のすべての資料に対して、個々の出版物が参照により組み込まれることを明確かつ個別に明示している場合と同じ程度まで参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４６】
本明細書に記述される組成物および方法は、好ましい実施形態を例示として現在、代表するものであり、本発明の範囲を制限する意図はない。それらへの変更およびその他の用途は、当業者によって加えられる。そのような変更およびその他の用途は、特許請求の範囲により規定される本発明の範囲から逸脱することなく、加えることができる。
【０１４７】
前記の記述は、本発明の特定の実施形態を例示的に示すもので、その実践に対して制限を課すことを意図していない。以下の請求項目は、それらに同等の項目すべてを含め、本発明の範囲を定義することを意図している。
【図１】
2013527174.tif 000003
【図２】
2013527174.tif 000004
【図３】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2013527174.tif 000011
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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2013527174.tif 000016
2013527174.tif 000017
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