(57)【要約】本発明は、β細胞をアデノシンキナーゼ（ADK）の阻害剤、S-アデノシルホモシステインヒドロラーゼ（SAHH）の阻害剤、またはAMP活性化プロテインキナーゼ（AMPK）の活性化剤と接触させることにより、β細胞の複製または増殖を刺激するかまたは増大させる方法を提供する。2013514781.tif 000030
2013514781.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵細胞集団においてβ細胞複製を増大させる方法であって、膵細胞集団をアデノシンキナーゼ（ADK）の阻害剤、S-アデノシルホモシステインヒドロラーゼ（SAHH）の阻害剤、またはAMP活性化プロテインキナーゼ（AMPK）の活性化剤と接触させる段階を含む、方法。
【請求項２】
アデノシンキナーゼの阻害剤が式（I）、ならびにその薬学的に許容される塩およびアミドである、請求項1記載の方法：
2013514781.tif 000025
式中、
R1はH、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、OR5、SR5、N(R6)2、(CH2)mR7であるか、またはR1およびR2はそれらが連結している原子と一緒になって、置換されていてもよい5〜8員複素環を形成し；
R2およびR3はそれぞれ独立にH、OR5、SR5、N(R5)2であるか、またはR2およびR3はそれらが連結している原子と一緒になって、置換されていてもよい5〜8員ヘテロシクリルを形成し；
R4はH、ハロゲン、CN、N2、OR5、SR5、N(R5)2、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
R5はそれぞれの場合で独立にH、C(O)R7、C(O)OR7、C(O)N(R7)2、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであるか、または2つのR5はそれらが連結している窒素原子と一緒になって、N、OもしくはSから選択される1〜3個の追加のヘテロ原子を含んでいてもよい5〜7員環を形成し；
R6はR5、OR5、SR5、N(R5)2、N2、CN、ハロゲン、または
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であり；
R7はそれぞれの場合で独立にH、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
XはO、S、NH、またはCH2であり；
YおよびZはそれぞれ独立にNまたはCR8であり；
R8はそれぞれの場合で独立にH、ハロゲン、CN、C(O)R7、C(O)OR7、C(O)N(R7)2、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
Z1はそれぞれの場合で独立にOまたはSであり；
Z2はそれぞれの場合で独立にOM、SM、OR5、SR5、N(R5)2、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
Mはアルカリ金属カチオンであり；
mは1、2、3、または4であり；
nは0、1、または2である。
【請求項３】
アデノシンキナーゼの阻害剤が式（II）、ならびにその薬学的に許容される塩およびアミドである、請求項1記載の方法：
2013514781.tif 000027
式中、
R9はそれぞれ独立にH、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであるか、または2つのR9はそれらが連結している窒素原子と一緒になって、N、OもしくはSから選択される1〜3個の追加のヘテロ原子を含んでいてもよい5〜7員環を形成し；
R10、R11およびR12はそれぞれ独立にH、OR14、N(R14)2、N2、NO2、CN、ハロゲン、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
R13はそれぞれの場合で独立にハロゲン、CN、NH2、または置換されていてもよいC1〜C6アルキルであり；
R14はH、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであるか、または2つのR14はそれらが連結している窒素原子と一緒になって、N、OもしくはSから選択される1〜3個の追加のヘテロ原子を含んでいてもよい5〜7員環を形成し；
X2はNまたはCR15であり；
R15はNHR16、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
R16はH、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
Y2はNまたはCHであり；
qは0、1、2、または3である。
【請求項４】
ADK阻害剤阻害剤のIC50が、500nM以下、250nM以下、200nM以下、100nM以下、75nM以下、50nM以下、25nM以下、10nM以下、1nM以下、0.1nM以下、0.01nM以下、または0.001nM以下である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
ADK活性が、非阻害対照に比べて、少なくとも5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、または100％（例えば、活性の完全な消失）阻害されるかまたは低減する、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
ADK阻害剤が、アリステロマイシン、5'-デオキシアデノシン、5'-アミノアデノシン、5'-デオキシ-5-ヨードツベルシジン、5-ヨードツベルシジン（A10）、7-デアザ-7-ヨード-2',3'-ジデオキシアデノシン、ノル-アリステロマイシン、ノル-ツベルシジン、A-134974、トヨカマイシン、GP-515（(2R,3R,4S,5R)-2-(4-アミノ-3-ブロモ-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)-5-(アミノメチル)-テトラヒドロフラン-3,4-ジオール）、GP-3269（(2R,3R,4S,5R)-2-(4-(4-フルオロフェニルアミノ)-5-フェニル-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)-テトラヒドロ-5-メチルフラン-3,4-ジオール）、GP-683（(2R,3S,4R,5R)-テトラヒドロ-2-メチル-5-(5-フェニル-4-(フェニルアミノ)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)フラン-3,4-ジオール）、GP-947（(2S,3S,4R,5R)-テトラヒドロ-2-メチル-5-(5-フェニル-4-(フェニルアミノ)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)フラン-3,4-ジオール）、ABT-702（5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-モルホリノピリジン-3-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン-4-アミン、B8）、化合物1（(2R,3R,4S,5R)-2-(4-アミノ-5-ヨード-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)-5-(アミノメチル)-テトラヒドロフラン-3,4-ジオール）、化合物2（(2R,3R,4S,5R)-2-(4-クロロ-5-ヨード-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)-5-(アミノメチル)-テトラヒドロフラン-3,4-ジオール）、化合物3（(1S,2R,3S,5R)-3-アミノ-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)シクロペンタン-1,2-ジオール）、化合物4（(1S,2R,3S,5R)-3-アミノ-5-(7-アミノ-3H-[1,2,3]トリアゾロ[4,5-d]ピリミジン-3-イル)シクロペンタン-1,2-ジオール）、化合物5（(1S,2R,3S,4R)-4-(4-アミノ-5-ヨード-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)シクロペンタン-1,2,3-トリオール）、化合物6（7-(4-(ジメチルアミノ)フェニル)プテリジン-4-アミン）、化合物7（5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(ジメチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン-4-アミン）、化合物8（5-(2-ブロモベンジル)-7-(6-モルホリノピリジン-3-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン-4-アミン）、化合物9（5-シクロヘキシル-7-(6-モルホリノピリジン-3-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン-4-アミン)、化合物10（5-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)-7-(6-モルホリノピリジン-3-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン-4-アミン）、化合物11（5-(1-(2-ブロモフェニル)エチル)-7-(6-モルホリノピリジン-3-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン-4-アミン）、化合物12（5-(2-メチルペンタ-4-エン-2-イル)-7-(6-モルホリノピリジン-3-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン-4-アミン）、化合物13（N5-((1H-インドール-3-イル)メチル)-7-(6-モルホリノピリジン-3-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン-4,5-ジアミン）、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
AMPKの活性化剤が式（III）、ならびにその薬学的に許容される塩およびアミドである、請求項1記載の方法：
2013514781.tif 000028
式中、
R17はH、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、OR22、SR22、N(R22)2、(CH2)mR23であるか、またはR17およびR18はそれらが連結している原子と一緒になって、置換されていてもよい5〜8員複素環を形成し；
R18およびR19はそれぞれ独立にH、OR22、SR22、N(R22)2であるか、またはR18およびR19はそれらが連結している原子と一緒になって、置換されていてもよい5〜8員複素環を形成し；
R20およびR21はそれぞれ独立にハロゲン、CN、N2、OR22、SR22、N(R22)2、C(O)R24、C(O)OR24、C(O)N(R24)2、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
R22はそれぞれの場合で独立にH、C(O)R24、C(O)OR24、C(O)N(R24)2、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
R23はR22、OR22 、SR22、N(R22)2、N2、CN、ハロゲン、または
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であり；
R24はそれぞれの場合で独立にH、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
XはO、S、NH、またはCH2であり；
YおよびZはそれぞれ独立にNまたはCR25であり；
R25はそれぞれの場合で独立にH、ハロゲン、CN、C(O)R24、C(O)OR24、C(O)N(R24)2、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
Z1はそれぞれの場合で独立にOまたはSであり；
Z2はそれぞれの場合で独立にH、OM、SM、OR22、SR22、N(R22)2、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
Mはアルカリ金属カチオンであり；
mは1、2、3、または4であり；
nは0、1、または2である。
【請求項８】
AMP活性化キナーゼの活性が、非活性化対照に比べて、少なくとも5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1倍、1.1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍またはそれ以上増大する、請求項1または7記載の方法。
【請求項９】
AMPK活性化剤のEC50が、500nM以下、250nM以下、100nM以下、50nM以下、10nM以下、1nM以下、0.1nM以下、0.01nM以下、または0.001nM以下である、請求項1、7または8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
AMPK活性化剤が5-アミノイミダゾール-4-カルボキサミドリボヌクレオシド（AICAR）である、請求項1、7〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
SAHH阻害剤阻害剤のIC50が、500nM以下、250nM以下、200nM以下、100nM以下、75nM以下、50nM以下、25nM以下、10nM以下、1nM以下、0.1nM以下、0.01nM以下、0.001nM以下である、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
SAHH活性が、非阻害対照に比べて少なくとも5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、または100％（例えば、活性の完全な消失）阻害されるかまたは低減する、請求項1または11記載の方法。
【請求項１３】
SAHH阻害剤が、9(S)-(2,3-ジヒドロキシプロピル)アデニン［(S)-DHPA］；D-エリタジン；(R,S)-3-アデニン-9-イル-2-ヒドロキシプロパン酸［(R,S)-AHPA］；アデノシン（Ado）ジアルデヒド；3-デアザアデノシン（c3-Ado）；アリステロマイシン（Ari）；ネプラノシンA（NPAまたはNpcA）；ジヒドロキシシクロペンテニルアデニン（DHCeA）；ジヒドロキシシクロペンテニル-3-デアザアデニン（c3-DHCeA）；ジヒドロキシシクロペンタニルアデニン（DHCaA）；ジヒドロキシシクロペンタニル-3-デアザアデニン（c3-DHCaA）；3-デアザネプラノシンA（c3-NpcA）；3-デアザアリステロマイシン（c3Ari）；炭素環式-3-デアザアデノシン（C-c3Ado）；6'-CメチルネプラノシンA；2'-デオキシアデノシン；ツベルシジン；リバビリン；ピラアゾフリン；2'-デオキシ-2'-クロロアデノシン；イソペンテニルアデノシン；メチルチオアデノシン（MTA）；9-β-アラビノフラノシルアデニン（Ara-A、ビダラビン）；2'-デオキシアデノシン；N-メチルアリステロマイシン、8-アザアリステロマイシンおよび3-デアザアリステロマイシン、ならびにそれらのジアルデヒドおよびジオール誘導体；(±)-5ノルアリステロマイシンおよびその2,6-ジアミノ類似体；2'-デオキシ-アリステロマイシン；3'-デオキシ-アリステロマイシン；3'-アミノ-3'-デオキシ-アリステロマイシン；3'-アミノ-3'-デオキシアラビノフラノシル-アリステロマイシン；6'-ヒドロキシ-アリステロマイシン；6'-メルカプト-アリステロマイシン；8'-ブロモ-アリステロマイシン；8-ヒドロキシアリステロマイシン、アリステロマイシン-3'-環状ホスフェート、アリステロマイシン-6'-環状ホスフェート；2-フルオロ-S-アデノシルホモシステイン（2-FSAH）、S-アデノシル-L-ホモシステインスルホキシド；S-アデノシル-Lホモシステインスルホン；S-アリステロマイシニル-L-ホモシステイン；5'-S-(3-カルボキシル-4-ニトロフェニル)チオアデノシン；5'-S(メチル)-5'-S-(ブチル)チオアデノシン；ならびにこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項1、11または12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
膵細胞が対象由来であり、該対象がさらなるβ細胞を必要としている、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
膵細胞が対象由来であり、該対象がさらなるβ細胞を必要としていない、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
対象が哺乳動物である、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
対象がヒトである、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
対象がマウスである、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
膵細胞が一次膵細胞である、請求項1〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
膵細胞が脱分化細胞由来である、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
接触がインビトロである、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
接触がエクスビボである、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
接触がインビボである、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
インビボでの接触が哺乳動物内である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
インビボでの接触がマウス内である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
インビボでの接触がヒト内である、請求項24記載の方法。
【請求項２７】
インビボでの接触が対象内であり、該対象がさらなるβ細胞を必要としている、請求項23記載の方法。
【請求項２８】
対象が1型糖尿病を患っている、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
対象が2型糖尿病を患っている、請求項27記載の方法。
【請求項３０】
対象が哺乳動物である、請求項27記載の方法。
【請求項３１】
対象がヒトである、請求項27〜30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
β細胞複製が、対照に比べて少なくとも5％、10％、20％、30％、40％、50％、50％、70％、80％、90％、1倍、1.1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍またはそれ以上増大する、請求項1〜31のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
下記の段階を含む、膵細胞の集団におけるβ細胞複製を増大させる化合物をスクリーニングするためのハイスループットアッセイ法：
（a）一次膵細胞である膵細胞の集団または調製物を、試験化合物と接触させる段階；
（b）β細胞の複製または増殖を評価する段階；および
（c）β細胞の複製または増殖を増大させるかまたは増強する化合物を選択する段階。
【請求項３４】
表面がラット膀胱癌細胞株804G由来の条件培地でコーティングされている細胞培養容器内で、膵細胞を培養する、請求項33記載のアッセイ法。
【請求項３５】
β細胞複製を評価する段階が、β細胞マーカーおよび細胞複製マーカーを検出することを含む、請求項33または34記載のアッセイ法。
【請求項３６】
細胞複製マーカーがKi-67またはPH3である、請求項35記載のアッセイ法。
【請求項３７】
β細胞マーカーがPDX-1、インスリン、c-ペプチド、アミリン、E-カドヘリン、Hnf3β、PCI/3、Beta2、Nkx2.2、Nkx6.1、GLUT2、PC2、ZnT-8、MAFA、MAFB、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項35または36記載のアッセイ法。
【請求項３８】
β細胞マーカーがPDX-1である、請求項35〜37のいずれか一項記載のアッセイ法。
【請求項３９】
β細胞マーカーがインスリンではない、請求項35〜38のいずれか一項記載のアッセイ法。
【請求項４０】
試験化合物が0.1nM〜1000mMの範囲の濃度を有する、請求項33〜39のいずれか一項記載のアッセイ法。
【請求項４１】
約15℃〜約55℃の範囲の温度で実施される、請求項33〜40のいずれか一項記載のアッセイ法。
【請求項４２】
試験化合物を膵細胞と少なくとも1時間接触させる、請求項33〜41のいずれか一項記載のアッセイ法。
【請求項４３】
試験化合物がβ細胞の複製または増殖を、未処理対照に比べて、少なくとも5％、10％、20％、30％、40％、50％、50％、70％、80％、90％、1倍、1.1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍またはそれ以上増大させる、請求項30〜42のいずれか一項記載のアッセイ法。
【請求項４４】
膵細胞が膵細胞株ではない、請求項33〜43のいずれか一項記載のアッセイ法。
【請求項４５】
膵細胞集団がランゲルハンス島またはその断片である、請求項33〜44のいずれか一項記載のアッセイ法。
【請求項４６】
膵細胞が一次膵β細胞である、請求項33〜45のいずれか一項記載のアッセイ法。
【請求項４７】
試験化合物との接触の前に、膵細胞を細胞培養容器の表面に約12〜48時間接着させる、請求項33〜46のいずれか一項記載のアッセイ法。
【請求項４８】
膵細胞が脱分化細胞由来である、請求項33〜47のいずれか一項記載のアッセイ法。
【請求項４９】
脱分化細胞が多能性幹細胞から誘導される、請求項33〜48のいずれか一項記載のアッセイ法。
【請求項５０】
下記の段階を含む、請求項33〜49のいずれか一項記載のアッセイ法：
（a）ランゲルハンス島をトリプシン処理して、細胞1〜3個からなる細胞塊とする段階；
（b）該細胞を一晩回復させる段階；
（c）段階（b）の細胞を96穴プレートのウェルに播種する段階であって、該ウェルが804G条件培地でコーティングされており、細胞播種密度が細胞60,000個/ウェルである、段階；
（d）該細胞を該ウェルの表面に48時間接着させる段階；
（e）1μMの試験化合物をβ細胞と24時間接触させる段階；
（f）該細胞をPDX-1抗体ならびにKi-67および/またはPH3抗体で染色する段階；
（g）β細胞複製を評価する段階；ならびに
（h）β細胞複製を増大させるかまたは増強する化合物を選択する段階。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2009年12月18日提出の米国特許仮出願第61/288,001号の35 U.S.C. § 119(e)の下での恩典を主張し、その内容は全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
政府の支援
本発明は、米国立衛生研究所によって授与された助成金番号第DK072505号および第DK084206号の下、政府の支援を受けて行った。
【０００３】
発明の分野
本発明は、β細胞の複製および/または増殖を促進する組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
真性糖尿病には二つの型がある：（1）インスリン依存性または1型糖尿病（若年性糖尿病、不安定型糖尿病、インスリン依存性真性糖尿病（IDDM）としても知られる）および（2）インスリン非依存性またはII型糖尿病（NIDDMとしても知られる）。1型糖尿病はほとんどの場合青少年に発症するが、成人で見られることもある。2型糖尿病はほとんどの場合中高年に発症するが、青少年で見られることもある。糖尿病は複数の原因因子に由来し、空腹状態または経口糖負荷試験中のグルコース投与後の血漿グルコースレベル上昇（高血糖）によって特徴付けられる。β細胞量の低減はI型およびII型糖尿病の両方で起こる。
【０００５】
1型糖尿病は、全体的なインスリンの不足、すなわち、膵β細胞の機能および量の減損が原因の高血糖値によって特徴付けられる自己免疫疾患状態である。1型糖尿病は、個人の免疫系が膵臓のインスリン産生β細胞を攻撃し、これらを破壊する場合に起こる。サイトカインのインターロイキン12（IL-12）ファミリー、および、免疫応答に関与するT細胞分化の調節因子であると考えられるシグナル伝達性転写因子（STAT）ファミリーメンバー、例えばSTAT-4の下流活性化は、自己免疫β細胞破壊を引き起こすプロセスにおいて主要な役割を果たすと考えられている。そのときの膵臓はインスリンをほとんどまたはまったく産生しない。経験される最も一般的な1型糖尿病の症状には、過度の口渇（多飲症）、頻回の排尿（多尿症）、極度の空腹（多食症）、極度の疲労、および体重減少が含まれる。これらの症状は高血糖および体脂肪の分解によって引き起こされる。1型糖尿病と診断された人は典型的には300mgを超える血糖値および尿中のケトンを示す。β細胞量およびインスリン産生の回復によって、糖尿病状態を完全に逆転させることができる。この事実から、長年にわたり1型糖尿病を患う患者では、β細胞は生成され続けているものの、好ましくないことに、持続する自己免疫破壊によって破壊されていることが、示唆される。したがって、β細胞複製を増大させるための組成物および方法は、正常なβ細胞量を回復し、1型糖尿病を逆転または治癒させるための有効な方法を提供するであろう。
【０００６】
LADAは新しく認められた1型糖尿病のサブセットであり、糖尿病の全症例の最大10％〜20％の原因であると考えられる。LADAは1.5型糖尿病としても知られている。LADAは当初2型糖尿病と診断された人で見られることが多い。これは成人発症1型糖尿病と類似の特徴を有するが、その進行においてβ細胞破壊の攻撃性は低いと考えられる。
【０００７】
2型糖尿病はインスリン抵抗性およびインスリン分泌障害の組み合わせによって起こるが、最終的に多くの2型糖尿病患者は膵β細胞の量および機能の著しい低下を示し、これにより、2型糖尿病患者はインスリンの「相対的」不足を示すことになる。なぜなら、膵β細胞はいくらかのインスリンを産生してはいるが、エネルギーを産生するためにグルコースを細胞内に十分に移行させるにはインスリンが少なすぎるか、または適切にはたらいていないからである。最近の剖検による研究から、2型糖尿病患者において進行中のβ細胞死（アポトーシス）の明らかな証拠が示されている。したがって、より多くのβ細胞を提供するための治療的アプローチは、2型糖尿病の逆転または治癒のための重要な治療を提供しうるであろう。
【０００８】
コントロールされていない2型糖尿病は血中の過剰なグルコースをもたらし、高血糖、すなわち高い血中の糖分を引き起こす。2型糖尿病患者は疲労、口渇の増大、頻回の排尿、乾燥した痒みのある皮膚、かすみ目、切創またはただれの治癒遅延、通常よりも多い感染、足の無感覚および刺痛を経験する。治療しなければ、2型糖尿病患者は脱水を起こし、深刻な血液量低下をきたすことになる。2型糖尿病が長期間コントロールされないままの場合、重度の高血糖（600mgを超える血糖）嗜眠、錯乱、ショック、および最終的には「高浸透圧性高血糖性非ケトン性昏睡」を含む、より重篤な症状が生じうる。持続性またはコントロールされていない高血糖は高く、早期の罹患率および死亡率を伴う。したがって、グルコースホメオスタシス、脂質代謝、肥満、および高血圧の治療的コントロールは、真性糖尿病の臨床管理および治療において極めて重要である。
【０００９】
糖尿病治療の目的は、前述の慢性合併症の発症を予防し、高血糖状態を改善することにより疾患の進行を遅らせ、またはそれを逆転/治癒させることである。糖尿病治療の通常の方法は、1型糖尿病の症例における液体およびインスリンの投与ならびに2型糖尿病の症例における様々な血糖降下剤の投与を含んだ。インスリン製剤、インスリン分泌促進物質、インスリン増感剤およびa-グルコシダーゼ阻害剤などの血糖降下剤は、臨床治療法として広く適用されてきた。例には、アカルボース（PrecoseJ）、グリメプリミド（glimeprimide）（AmarylJ）、メトホルミン（GlucophageV）、ナテグリニド（StarlixV）、ピオグリタゾン（ActosV）、レパグリニド（PrandinJ）、ロシグリタゾン（AvandiaV）、スルホニル尿素、オルリスタット（XenicalV）、エキセナチド（Byetta）などが含まれる。しかし、公知の血糖降下剤の多くは望まれない副作用を示し、特定の症例では毒性である。例えば、膵インスリン分泌が重篤に低下している糖尿病患者の場合には、インスリン分泌促進物質およびインスリン増感剤の有効性は低下する。同様に、インスリン抵抗性が著しく高い糖尿病患者の場合、インスリン製剤およびインスリン分泌促進物質の有効性は低下する。
【００１０】
原則として、真性糖尿病はインスリンを分泌または産生する細胞を含む組織、すなわちランゲルハンス島の正常な移植によって治療することができた。インスリン産生細胞の移植は1型糖尿病を逆転または治癒させる方法として試みられてきたが、手術ならびに同種移植拒絶反応および自己免疫再発を予防または緩和するために服用しなければならない毒性の免疫抑制型薬物には著しいリスクが伴う。加えて、今日では米国内に100万人を超える1型糖尿病患者がいるが、島のための死体膵組織は限られている。例えば、1年に6,000の臓器しか入手できず、1人の1型糖尿病を逆転させるのに十分な島を提供するには2または3つの臓器が必要である。したがって、機能している（インスリン産生している）β細胞の新しい供給源を提供することが至急に必要とされている。
【００１１】
β細胞増殖を誘導しうる化合物のハイスループットスクリーニングアッセイ法の唯一の例が当技術分野において記載されている。スクリーニング法は増殖停止した逆不死化マウスβ細胞を用いる。このアプローチの主な欠点は、このスクリーニングアッセイ法で特定された化合物が一次β細胞において同じ効果を持たないことがある、例えば特定の化合物は増殖停止した逆不死化マウスβ細胞における増殖誘導に対してのみ特異的でありうるということである。したがって、一次β細胞、例えば形質転換を経験したことのないβ細胞の増殖を誘導しうる化合物のスクリーニング法が必要とされている。
【発明の概要】
【００１２】
一つの局面において、本発明は、膵細胞集団においてβ細胞複製を増大させる方法であって、膵細胞集団をアデノシンキナーゼ（ADK）の阻害剤、S-アデノシルホモシステインヒドロラーゼ（SAHH）の阻害剤、またはAMP活性化プロテインキナーゼ（AMPK）の活性化剤と接触させる段階を含む方法を提供する。
【００１３】
もう一つの局面において、本発明は、以下の段階を含む、β細胞複製を増大させるための候補化合物をスクリーニングする方法を提供する：（a）膵細胞集団を試験化合物と接触させる段階；（b）（i）培養物中の全細胞数を増加させる、（ii）未処理対照と比べて、培養物中の少なくとも1つのβ細胞マーカーを発現する全細胞数を増加させる、（iii）未処理対照と比べて、培養物中の全細胞数に対する少なくとも1つのβ細胞マーカーを発現する細胞の比を高める、（iv）未処理対照と比べて、少なくとも1つの細胞複製マーカーを発現する細胞数を増加させる、または（iv）未処理対照と比べて、少なくとも1つの細胞複製マーカーを発現する細胞の比を高める化合物を、選択する段階；ここで膵細胞は一次膵細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】A10およびB8による、PDX1に対するPH3の増加％を示す棒グラフを示す。
【図２】β細胞（図2a）およびマウス皮膚線維芽細胞（図2b）増殖に対する化合物A10（5-IT）濃度の効果を示す折れ線グラフを示す。β細胞のEC50は0.47μMと判定された。
【図３】β細胞増殖に対する化合物B8濃度の効果を示す折れ線グラフを示す（EC50＝9.1μM）。
【図４】処理後4日間のKi-67誘導倍率に対する化合物A10およびB8の効果を示す折れ線グラフを示す。化合物は第0日に細胞に加え、培地は第2日に交換した。
【図５】1μMのA10によるβ細胞におけるKi-67誘導に対する培地血清濃度の影響を示す棒グラフを示す。
【図６】グルコースがβ細胞におけるA10によるKi-67およびPDX+発現の誘導に影響しないことを示す折れ線グラフを示す。
【図７】アデノシンが濃度依存的様式でラット島におけるPDX+およびKi-67の誘導を引き起こさないことを示す折れ線グラフを示す。
【図８】A10が誘導するKi-67の増大に対するアデノシン受容体アンタゴニストの影響を示す棒グラフを示す。図9a、アンタゴニストを2μM、1μM、0.2μM、0.04μM、または0.0μM（アンタゴニストなし）の濃度で試験した。図9b、アンタゴニストを0.2μMの濃度で試験した。
【図９】β細胞複製に対するアデノシンキナーゼ阻害剤A10およびアデノシン一リン酸活性化キナーゼ活性化剤AICARの効果を示す棒グラフを示す。
【図１０】A10が誘導したβ細胞複製に対するAMPK阻害の影響を示す棒グラフを示す。
【図１１ａ】いくつかの例示的なヌクレオシド系アデノシンキナーゼ阻害剤活性化剤の構造を示す。
【図１１ｂ】いくつかの例示的な非ヌクレオシド系アデノシンキナーゼ阻害剤活性化剤の構造を示す。
【図１２】インビボでのβ細胞複製の増加を示す棒グラフである。
【図１３ａ】アデノシンキナーゼ阻害剤（ADK-I）がラット、マウスおよびブタβ細胞の増殖を誘導することを示す。図13aは、β細胞複製を促進するいくつかの例示的なADK-Iの化学構造および名称を示す。誤差バーは標準偏差を表し、*溶媒処理条件に比べてP<0.01。
【図１３ｂ】アデノシンキナーゼ阻害剤（ADK-I）がラット、マウスおよびブタβ細胞の増殖を誘導することを示す。図13bは、ABT-702処理に応答したマウス（上図）およびブタ（下図）のβ細胞増殖の間の関係を示す用量反応曲線を示す。誤差バーは標準偏差を表し、*溶媒処理条件に比べてP<0.01。
【図１３ｃ】アデノシンキナーゼ阻害剤（ADK-I）がラット、マウスおよびブタβ細胞の増殖を誘導することを示す。図13cは、β細胞増殖と5-IT（左；EC50＝4.7μM）およびABT-702（右；EC50＝7.0μM）による化合物処理との間の関係を示すラット島培養物の用量反応曲線を示す。誤差バーは標準偏差を表し、*溶媒処理条件に比べてP<0.01。
【図１３ｄ】アデノシンキナーゼ阻害剤（ADK-I）がラット、マウスおよびブタβ細胞の増殖を誘導することを示す。図13dは、DMSOまたは5-IT（2μM）で96時間または144時間処理した後のβ細胞数の定量を示す。誤差バーは標準偏差を表し、*溶媒処理条件に比べてP<0.01。
【図１４】β細胞が、増殖の細胞自律的な負の調節因子として作用する核アデノシンキナーゼ（ADK）を発現することを示す。図14aは、陰性対照siRNA（レーン1、3）またはADK指向siRNA（レーン2、4）のいずれかを安定に導入した細胞からのH4IIE（ラット肝細胞細胞株）溶解物を用いて評価したsiRNA仲介ADKノックダウンを示すウェスタンブロットである。ローディングをγ-チューブリンを用いて標準化した。図14bは、対照siRNA配列（左）またはADK指向siRNA配列（右）のいずれかを含むウイルス感染後のβ細胞複製の定量を示す棒グラフである。同じウェル内の非感染細胞および感染細胞の複製速度を、ウイルスによってコードされるGFP発現に基づいて別々に分析した。誤差バーはSEM（個別のウェルでn＝8）を表し；*P<0.01。
【図１５】ADK-Iによるβ細胞複製の誘導はグルコースおよびグルカゴン様ペプチド1受容体（GLP-1R）アゴニストに相加的であることを示す。図15aは、様々なグルコース濃度プラスDMSOまたは5-IT（2μM）存在下で24時間、48時間または96時間培養した後のβ細胞複製速度を示す棒グラフである。値は各時点で5mMグルコースプラスDMSO処理条件に対して標準化している。標準偏差は各処理条件で10％未満であり、誤差バーは示していない。*同じグルコース濃度および時点で5-IT処理したウェルをDMSO処理したウェルと比べた場合、P<0.01；**同じ時点および同じ処理（DMSOまたは5-IT）でDMSOまたは5-IT処理したウェルを5mMグルコース処理条件と比べた場合、P<0.01。図15bは、DMSO、5-IT、GLP-1、Ex4、5-ITプラスGLP-1または5-ITプラスEx4で24時間処理した後のβ細胞複製速度の定量を示す棒グラフである。5-ITの濃度は2μMとした。GLP-1およびEx-4の濃度は、20nM（左バー）および4nM（右バー）とした。値はDMSO処理条件に対して標準化している。誤差バーは標準偏差を表し；示した比較について*P<0.01および**P<0.03。
【図１６】ADK-Iがインビトロおよびインビボでβ細胞複製を選択的に促進することを示す。図18aは、DMSO、5-IT（2μM）またはABT-702（15μM）で処理した後のδ細胞（ソマトスタチン+；左図）、α細胞（グルカゴン+；中図）および線維芽細胞（ビメンチン+；右図）のインビトロ複製速度の定量を示す棒グラフを示す。DMSO処理状態と比べて*P<0.01および**P<0.05。図16bは、EGF（40ng/ml）およびHGF（20ng/ml）プラスDMSOまたはABT-702（15μM）存在下で増殖させた単離マウス肝細胞の複製速度の定量を示す棒グラフである。図16cは、BRDUおよび溶媒またはABT-702のいずれかで処理した24時間後のマウス島β細胞のインビボ複製速度の定量を示す棒グラフである。図16dは、BRDUおよび溶媒またはABT-702のいずれかで処理した24時間後のマウス外分泌細胞のインビボ複製速度の定量を示す棒グラフである。図16eは、BRDUおよび溶媒またはABT-702のいずれかで処理した24時間後のマウス肝細胞のインビボ複製速度の定量を示す棒グラフである。誤差バーは標準偏差を表し、p値は両側t検定を用いて得た。
【図１７】β細胞複製がADK-Iによって増大することを示す棒グラフである。図17aは、DMSOまたは5-IT（2μM）で処理した後のβ細胞複製の定量を示す。β細胞をPDX-1の存在およびインスリン染色によって特定した。*P<0.001。図17bは、DMSO、7-ヨード-2,3-ジデオキシ-7-デアザアデノシン（20μM、10μM）またはアリステロマイシン（6μM、1μM）で処理した後のβ細胞複製の定量を示す。誤差バーは標準偏差を表す。
【図１８】図18aは、PDX-1およびホスホヒストンH3の同時発現を用いたβ細胞複製の定量を示す棒グラフである。培養物をDMSO、5-IT（2μM）またはABT-702（15μM）で処理した。*DMSO処理条件に比べてP<0.001。図18bは、DMSO、5-IT（2μM）またはABT-702（15μM）存在下での2日間のBRDUパルスと、続く化合物処理なしの2日間の追跡を用いたβ細胞複製の定量を示す棒グラフである。データはDMSO処理ウェルと比べた化合物処理ウェルにおけるBRDU+ PDX-1+細胞の増加倍率で示す。*DMSOに比べてP<0.002。
【図１９】対照siRNAまたはADK指向siRNAによる感染後のADK陽性島細胞のパーセンテージの自動定量を示す棒グラフである。誤差バーは標準偏差で表し；*P<0.001。
【図２０】マウスのABT-702によるインビボ処理はβ細胞複製を増大させるが、外分泌細胞の複製は増大させないことを示す棒グラフである。β細胞を特定するためのインスリン免疫染色および複製中の細胞を特定するためのBRDU免疫染色を用いた、インビボβ細胞複製速度の定量（左）。島外の外分泌細胞複製速度の定量を、同じ組織切片を用いて同時に行った（右）。
【図２１】β細胞複製を促進する化合物を特定するために用いたスクリーニングプロトコルの概略図を示す。
【図２２】β細胞複製に対するSAHH阻害剤ビダラビンの効果を示す棒グラフを示す。
【図２３】ADK経路の全体像を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
一つの局面において、本発明は、膵細胞集団においてβ細胞複製を増大させる方法であって、膵細胞の集団、または調製物をアデノシンキナーゼ（ADK）の阻害剤、S-アデノシルホモシステインヒドロラーゼ（SAHH）の阻害剤、またはAMP活性化プロテインキナーゼ（AMPK）の活性化剤と接触させる段階を含む方法を提供する。
【００１６】
本明細書において用いられる「β細胞複製を増大させること」とは、β細胞がより速い速度および/またはより高頻度で複製することを意味する。本発明のこの局面および他の局面のいくつかの態様において、β細胞複製は未処理対照に比べて少なくとも5％、10％、20％、30％、40％、50％、50％、70％、80％、90％、1倍、1.1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍またはそれ以上増大する。β細胞複製の増大％または倍率は、β細胞が化合物と接触していない対照に比べて、本明細書に記載の化合物と接触している間の複製β細胞の数を測定することによって判定することができる。複製の増大は、それぞれの処理および未処理対照における細胞の総数に対する複製細胞の比を基にすることもできる。いくつかの態様において、処理および未処理対照における細胞の総数を用いて複製頻度を求める。
【００１７】
いくつかの態様において、「β細胞複製を増大させること」は、β細胞前駆体のβ細胞への分化によるβ細胞数の増大も含む。代替態様において、「β細胞複製を増大させること」は、β細胞前駆体のβ細胞への分化によるβ細胞数の増大を含まない。
【００１８】
本明細書において用いられる「β細胞」なる用語は、一次膵β細胞、脱分化細胞由来の、例えば人工多能性幹細胞（iPSC）由来の膵β様細胞、または内胚葉起源の細胞（例えば、肝細胞または膵外分泌細胞）から直接リプログラミングされた膵β様細胞を含む。一つの態様において、β細胞は不死化細胞株（例えば、培養中に無限に増殖する）ではない。一つの態様において、β細胞は、軟寒天中での増殖などの形質転換特性を示すまたは接触阻害の非存在を示す細胞などの、形質転換細胞ではない。
【００１９】
本明細書において用いられる「膵β様細胞」なる用語は、内因性膵β細胞によって発現されたインスリンの量の少なくとも15％、もしくは少なくとも約20％、もしくは少なくとも約30％、もしくは少なくとも約40％、もしくは少なくとも約50％、もしくは少なくとも約60％、もしくは少なくとも約70％、もしくは少なくとも約80％、もしくは少なくとも約90％、もしくは少なくとも約100％、もしくは100％超、例えば少なくとも約1.5倍、もしくは少なくとも約2倍、もしくは少なくとも約2.5倍、もしくは少なくとも約3倍、もしくは少なくとも約4倍、もしくは少なくとも約5倍、もしくは約5倍超を発現する細胞を意味する。一つの態様において、膵β様細胞は内因性膵β細胞の少なくとも1つ、または少なくとも2つの特徴、例えばグルコースに応答したインスリンの分泌、ならびに、例えばc-ペプチド、Pdx-1およびglut-2などのβ細胞マーカーの発現を示すが、それらに限定されるわけではない。膵β様細胞は本明細書において「リプログラミングβ細胞」と呼ぶこともあり、これは「膵β様細胞」なる用語と本明細書において交換可能に用いられる。一つの態様において、膵β様細胞は不死化細胞（例えば、培養中に無限に増殖する）ではない。一つの態様において、膵β様細胞は、軟寒天中での増殖などの形質転換特性を示すまたは接触阻害の非存在を示す細胞などの、形質転換細胞ではない。
【００２０】
本明細書において用いられる「脱分化細胞」なる用語は、分化細胞からリプログラミングされた細胞を意味する。本明細書において用いられる「リプログラミングされた」または「リプログラミング」なる用語は、体細胞の分化状態を変化または逆転させるプロセスを意味する。細胞はリプログラミングの前に部分または最終分化していてもよい。リプログラミングは体細胞から多能性細胞への分化状態の完全な逆転を含む。そのような分化の完全な逆転は、人工多能性（iPS）細胞を生じる。リプログラミングはまた、例えば多分化能状態への、または、多能性でも多分化能性でもないがそれが由来する分化細胞の1つもしくは複数の特異的特徴を失った細胞である体細胞への、分化状態の部分的逆転を、例えば分化細胞の別の体細胞型への直接リプログラミングを含む。リプログラミングは一般に、接合子が生体へと発達する際の細胞分化中に起こる、核酸修飾（例えば、メチル化）、クロマチン凝縮、後成的変化、ゲノムインプリンティングなどの遺伝的パターンの少なくともいくつかの変化、例えば逆転を含む。
【００２１】
本明細書に記載の方法は、リプログラミング（脱分化）細胞から誘導された膵β様細胞に適用可能である。例えば、当業者に公知の因子および条件を用いてiPS細胞から分化させた膵β様細胞を得る。膵β様細胞は、例えばZhou, et al. Nature, Vol 455, October 2, 2008, pages 627-633)に記載されているとおり、多能性幹細胞状態（例えば、iPS細胞）への逆転なしに、内胚葉/外分泌体細胞の直接リプログラミングによって誘導することもでき、前記文献はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００２２】
本明細書において用いられる「iPS細胞」および「人工多能性幹細胞」なる用語は交換可能に用いられ、非多能性細胞、典型的には成体体細胞から、例えば1つまたは複数の遺伝子の強制発現を誘導することにより、人工的に誘導、すなわち脱分化（リプログラミング）させた多能性幹細胞を意味する。
【００２３】
本明細書において用いられる「内因性膵β細胞」、または「一次膵β細胞」なる用語は、哺乳動物の膵臓のインスリン産生細胞、または哺乳動物の膵β細胞（β細胞）表現型の細胞を意味する。膵β細胞の表現型は当業者には周知であり、例えばグルコースレベルの上昇に応答したインスリンの分泌、c-ペプチド、PDX-1ポリペプチドおよびGlut 2などのマーカーの発現、ならびにインビボで膵島内に組織化されているなどの明確な形態学的特徴を含み、かつ典型的には直径約9〜15μmの小さな紡錘様細胞を有する。内因性膵β細胞は、ランゲルハンス島において見出すことができる。本発明の方法において、一次膵β細胞をランゲルハンス島の一部としてインビトロで接触させることができる。
【００２４】
本明細書において用いられる「インスリン産生細胞」なる用語は、構成性または誘導性の様式でインスリンを合成する（すなわち、インスリン遺伝子を転写する、プロインスリンmRNAを翻訳する、およびプロインスリンmRNAをインスリンタンパク質に改変する）、発現する（すなわち、インスリン遺伝子が担持する表現型形質を示す）、または分泌する（インスリンを細胞外空間に放出する）、本明細書において説明された一次β細胞、ならびに本明細書において説明された膵β様細胞を含む。
【００２５】
本明細書において用いられる「内胚葉起源の細胞」なる用語は、分化して胚腸を生じ、次いで気道および消化管の内層を生じ、そして肝臓および膵臓を生じる、ごく初期の胚における3つの一次胚葉の1つ由来の細胞である、内胚葉細胞から発達した任意の細胞を含む、内胚葉起源の細胞を意味する。肝および膵細胞の分化を誘発し、多様な幹細胞型および前駆細胞型からの肝細胞およびβ細胞の分化がどのように促進されるのかについての案内を提供する、進化的に保存された誘導性シグナルおよび転写因子ネットワークが、多様なモデル生物およびヒトにおける研究によって明らかになっている。
【００２６】
本発明のこの局面および他の局面のいくつかの態様において、アデノシンキナーゼの活性は、非阻害対照に比べて、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％（例えば、活性の完全な消失）阻害されるかまたは低減する。特定の理論に縛られることを望むわけではないが、アデノシンキナーゼの活性は、そのようなリン酸化反応を測定するための当技術分野において公知の方法を用いることにより、アデノシンのリン酸化を測定することによって測定することができる。
【００２７】
本発明のこの局面および他の局面のいくつかの態様において、アデノシンキナーゼ阻害剤は500nM以下、250nM以下、100nM以下、50nM以下、10nM以下、1nM以下、0.1nM以下、0.01nM以下、または0.001nM以下のIC50を有する。
【００２８】
本発明のこの局面および他の局面のいくつかの態様において、AMP活性化キナーゼの活性は、非活性化対照に比べて、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも1倍、少なくとも1.1倍、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、またはそれ以上増大する。
【００２９】
本発明のこの局面および他の局面のいくつかの態様において、AMP活性化キナーゼの活性化剤は500nM以下、250nM以下、100nM以下、50nM以下、10nM以下、1nM以下、0.1nM以下、0.01nM以下、または0.001nM以下のEC50を有する。
【００３０】
本発明のこの局面および他の局面のいくつかの態様において、SAHHの活性は、非阻害対照に比べて、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または100％（例えば、活性の完全な消失）阻害されるかまたは低減する。SAHHの活性は、例えばその全内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願第10/836,953号および第11/389,393号に記載の方法を用いて測定することができる。
【００３１】
本発明のこの局面および他の局面のいくつかの態様において、SAHH阻害剤は500nM以下、250nM以下、100nM以下、50nM以下、10nM以下、1nM以下、0.1nM以下、0.01nM以下、または0.001nM以下のIC50を有する。
【００３２】
本明細書に記載の多くの化合物は細胞に対して複数の効果を発揮しうることが理解されるであろう。例えば、SAH類似体およびツベルシジンはメチル化経路の様々な点で作用する。したがって、化合物および分子の特定の群、例えばADK阻害剤またはSAHH阻害剤への分類は、正確かつ重複のない科学的分類であることを意図するものではない。むしろ、そのような情報は、当業者が本発明者らが考察した特定の科学的データを理解するのを助けるために示すものである。例えば、本明細書に記載のADK阻害剤の多くも、SAHH阻害剤と同様、本発明に適用可能である。
【００３３】
本発明のこの局面および他の局面のいくつかの態様において、アデノシンキナーゼ阻害剤は式（I）、ならびにその薬学的に許容される塩およびアミドである：
2013514781.tif 000003
式中、
R1はH、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、OR5、SR5、N(R6)2、(CH2)mR7であるか、またはR1およびR2はそれらが連結している原子と一緒になって、置換されていてもよい5〜8員複素環を形成し；
R2およびR3はそれぞれ独立にH、OR5、SR5、N(R5)2であるか、またはR2およびR3はそれらが連結している原子と一緒になって、置換されていてもよい5〜8員ヘテロシクリルを形成し；
R4はH、ハロゲン、CN、N2、OR5、SR5、N(R5)2、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
R5はそれぞれの場合で独立にH、C(O)R7、C(O)OR7、C(O)N(R7)2、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであるか、または2つのR5はそれらが連結している窒素原子と一緒になって、N、OもしくはSから選択される1〜3個の追加のヘテロ原子を含んでいてもよい5〜7員環を形成し；
R6はR5、OR5、SR5、N(R5)2、N2、CN、ハロゲン、または
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であり；
R7はそれぞれの場合で独立にH、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
XはO、S、NH、またはCH2であり；
YおよびZはそれぞれ独立にNまたはCR8であり；
R8はそれぞれの場合で独立にH、ハロゲン、CN、C(O)R7、C(O)OR7、C(O)N(R7)2、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
Z1はそれぞれの場合で独立にOまたはSであり；
Z2はそれぞれの場合で独立にOM、SM、OR5、SR5、N(R5)2、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
Mはアルカリ金属カチオンであり；
mは1、2、3、または4であり；
nは0、1、または2である。
【００３４】
いくつかの好ましい態様において、MはNa+である。
【００３５】
いくつかの態様において、R1は置換されていてもよいC1〜C6アルキル、OR5、N(R5)2、または(CH2)mR6である。好ましくはC1〜C6アルキルはメチルである。R1がN(R5)2である場合、R5の少なくとも1つはHであり、好ましくはR5はいずれもHである。R1がOR5である場合、R5はHまたはC1〜C6アルキルでありえ、好ましくはR5はHである。
【００３６】
R1が(CH2)mR6である場合、mは1または2であり、好ましくはmは1である。いくつかの態様において、R6はOR5またはN(R5)2である。R6がN(R5)2である場合、R5の少なくとも1つはHであり、好ましくはR5はいずれもHである。R6がOR5である場合、R5はHまたは置換されていてもよいC1〜C6アルキルでありえ、好ましくはR5はHである。最も好ましくはR1はCH3、CH2OHまたはNH2である。
【００３７】
いくつかの態様において、式（I）の化合物のR1およびR2は、それらが連結している原子と一緒になって、5〜8員複素環を形成し、ここで複素環の骨格は
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を含み、ここでZ3はそれぞれの場合で独立にOまたはSであり、かつZ4はH、OM、SM、OR5、SR5、N(R5)2、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルである。
【００３８】
いくつかの態様において、YまたはZの少なくとも1つはCR8であり、好ましくはYはCR8であり、より好ましくはYはCH2である。一つの態様において、YはCR8であり、かつZはNである。
【００３９】
いくつかの他の態様において、YおよびZはいずれもCR8である。好ましくはYはCH2であり、かつZはCR8であり、ここでR8はCN、ハロゲン、アリール、およびヘテロアリールからなる群より選択される。好ましくは、アリール基はフェニル基であり、これは置換されていてもよい。R8がハロゲンである場合、IおよびBrが好ましく、Iがより好ましい。
【００４０】
さらにいくつかの他の態様において、R4はハロゲンまたはN(R5)2である。ハロゲンにはBr、F、I、またはClが含まれ、好ましくはハロゲンはClである。R4がN(R5)である場合、R5はいずれもHでありえ、または好ましくは1つのR5はHであり、他のR5はアリールおよびヘテロアリールからなる群より選択される。好ましくはアリール基はフェニル基である。いくつかの場合に、フェニル基は置換されていてもよいフェニル基、例えば4フルオロ-フェニル基である。
【００４１】
さらにいくつかの他の態様において、XはO、NHおよびCH2からなる群より選択される。いくつかの好ましい態様において、XはOである。
【００４２】
いくつかの態様において、R2およびR3はいずれもOR5である。好ましくはR2およびR3はいずれもOHである。
【００４３】
いくつかの態様において、式（I）の化合物は式（Ia）に示す立体化学的配置を有する。
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【００４４】
他の態様において、式（I）の化合物は式（Ib）に示す立体化学的配置を有する。
2013514781.tif 000007
【００４５】
いくつかの態様において、式（I）の化合物は7-デアザ-7-ヨード-2'-デオキシアデノシン、7-デアザ-2'-デオキシアデノシン、7-デアザ-2',3'-ジデオキシアデノシン、サンギバマイシン、ツベルシジン、またはアデノシンではない。
【００４６】
いくつかの態様において、式（I）の化合物は以下である：アリステロマイシン、5'-デオキシアデノシン、5'-アミノアデノシン、5'-デオキシ-5-ヨードツベルシジン、5-ヨードツベルシジン（本明細書においてA10または5-ITとも呼ぶ）、7-デアザ-7-ヨード-2',3'-ジデオキシアデノシン（本明細書においてジデオキシ-7-ヨード-デアザアデノシンまたはd7IdAdoとも呼ぶ）、ノル-アリステロマイシン、ノル-ツベルシジン、A-134974、トヨカマイシン、GP-515（(2R,3R,4S,5R)-2-(4-アミノ-3-ブロモ-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)-5-(アミノメチル)-テトラヒドロフラン-3,4-ジオール）、GP-3269（(2R,3R,4S,5R)-2-(4-(4-フルオロフェニルアミノ)-5-フェニル-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)-テトラヒドロ-5-メチルフラン-3,4-ジオール）、GP-683（(2R,3S,4R,5R)-テトラヒドロ-2-メチル-5-(5-フェニル-4-(フェニルアミノ)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)フラン-3,4-ジオール）、GP-947（(2S,3S,4R,5R)-テトラヒドロ-2-メチル-5-(5-フェニル-4-(フェニルアミノ)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)フラン-3,4-ジオール）、化合物1（(2R,3R,4S,5R)-2-(4-アミノ-5-ヨード-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)-5-(アミノメチル)-テトラヒドロフラン-3,4-ジオール）、化合物2（(2R,3R,4S,5R)-2-(4-クロロ-5-ヨード-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)-5-(アミノメチル)-テトラヒドロフラン-3,4-ジオール）、化合物3（(1S,2R,3S,5R)-3-アミノ-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)シクロペンタン-1,2-ジオール）、化合物4（(1S,2R,3S,5R)-3-アミノ-5-(7-アミノ-3H-[1,2,3]トリアゾロ[4,5-d]ピリミジン-3-イル)シクロペンタン-1,2-ジオール）、または化合物5（(1S,2R,3S,4R)-4-(4-アミノ-5-ヨード-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)シクロペンタン-1,2,3-トリオール）。
【００４７】
本発明のこの局面および他の局面のいくつかの態様において、アデノシンキナーゼ阻害剤は式（II）、ならびにその薬学的に許容される塩およびアミドである：
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式中、
R9はそれぞれ独立にH、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであるか、または2つのR9はそれらが連結している窒素原子と一緒になって、N、OもしくはSから選択される1〜3個の追加のヘテロ原子を含んでいてもよい5〜7員環を形成し；
R10、R11およびR12はそれぞれ独立にH、OR14、N(R14)2、N2、NO2、CN、ハロゲン、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
R13はそれぞれの場合で独立にハロゲン、CN、NH2、または置換されていてもよいC1〜C6アルキルであり；
R14はH、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであるか、または2つのR14はそれらが連結している窒素原子と一緒になって、N、OもしくはSから選択される1〜3個の追加のヘテロ原子を含んでいてもよい5〜7員環を形成し；
X2はNまたはCR15であり；
R15はNHR16、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
R16はH、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
Y2はNまたはCHであり；
qは0、1、2、または3である。
【００４８】
いくつかの態様において、R9はHまたは置換されていてもよいC1〜C6アルキルである。
【００４９】
好ましい態様において、R10はHである。
【００５０】
いくつかの態様において、R11はH、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいアリールアルキル、および置換されていてもよいヘテロアリールアルキルからなる群より選択される。R11が置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいアリールアルキルまたは置換されていてもよいヘテロアリールアルキルである場合。R14はフェニル、チオフェン-2-イル、1-メチル-2-オキソベンゾキサゾリン-5-イル、2-(ジメチルアミノ)-5-ピリミジニル、2-(N-ホルミル-N-メチルアミノ)-3-ピリミジニル、2-(N-(2-メトキシエチル)-N-メチルアミノ)-5-ピリミジニル、5-ジメチルアミノ-2-ピリジニル、5-(N-(2-メトキシエチル)-N-メチルアミノ)-2-ピリジニル、2-(Nメチルアミノ)-5-ピリミジニル、2-(1-モルホリニル)-5ピリミジニル、2-(1-ピロリジニル)-5-ピリミジニル、2-ジメチルアミノ-5-ピリミジニル、2-フラニル、2-オキソベンゾキサゾリン-5-イル、2-ピリジル、3-(ジメチルアミノ)フェニル、3-アミノ-4-メトキシフェニル、3-ブロモ-4-(ジメチルアミノ)フェニル、3-メトキシフェニル、3-メチル-4-(N-アセチル-N-メチルアミノ)フェニル、3-メチル-4-(N-ホルミル-Nメチルアミノ)フェニル、3-メチル-4-(N-メチル-N-(トリフルオロアセチル)アミノ)フェニル、3-メチル-4-(N-メチルアミノ)フェニル、3-メチル-4-ピロリジニルフェニル、3-ピリジル、3,4-ジクロロフェニル、3,4-メチレンジオキシフェニル、3,4,5-トリメトキシフェニル、4-(アセチルアミノ)フェニル、4-(ジメチルアミノ)-3-フルオロフェニル、4-(ジメチルアミノ)フェニル、4-(イミダゾル-1-イル)フェニル、4-(メチルチオ)フェニル、4-(モルホリニル)フェニル、4-(N-(2-(ジメチルアミノ)エチル)アミノ)フェニル、4-(N-(2-メトキシエチル)アミノ)フェニル、4-(Nアセチル-N-メチルアミノ)フェニル、4-(N-エチル-N-ホルミルアミノ)フェニル、4-(N-エチルアミノ)フェニル、4-(N-ホルミル-N-(2-メトキシエチル)アミノ)フェニル、4-(N-イソプロピルアミノ)フェニル、4-(N-メチル-N-((2-ジメチルアミノ)エチル)アミノ)フェニル、4-(N-メチル-N-(2-(N-フタルイミジル)アセチル)アミノ)フェニル、4-(N-メチル-N-(2-シアノ)エチルアミノ)フェニル、4-(N-メチルN-(2-メトキシエチル)アミノ)フェニル、4-(N-メチル-N-(3-メトキシ)プロピオニルアミノ)フェニル、4-(N-メチル-Nアセチルアミノ)フェニル、4(N-メチル-N-ホルミルアミノ)フェニル、4-(N-メチル-N-トリフルオロアセチルアミノ)フェニル、4-(Nモルホリニル)フェニル、4-(チオフェン-2-イル)フェニル、4-(ウレイド)フェニル、4-(2-(ジメチルアミノ)アセチルアミノ)フェニル、4-(2-(2-メトキシ)アセチルアミノ)エチル)アミノ)フェニル、4-(2-メトキシ)エトキシフェニル、4-(2-オキソ-1-オキサゾリジニル)フェニル、4-(4メトキシ-2-ブチル)フェニル、4-(4-メチルピペリジニル)フェニル、4-(5-ピリミジニル)フェニル、4-ブトキシフェニル、4-カルボキサミドフェニル、4-クロロフェニル、4-シアノフェニル、4-ジエチルアミノフェニル、4-ジエチルマロニルアリルフェニル)、4-ジメチルアミノフェニル、4-エトキシフェニル、4-エチルフェニル、4-ヒドロキシフェニル、4-イミダゾリルフェニル、4-ヨードフェニル、4-イソプロピルフェニル、4-メトキシフェニル、4-メチルアミノフェニル、4-メチルスルホニルフェニル、4-モルホリニルフェニル、4-N-(2-(ジメチルアミノ)エチル)-Nホルミルアミノ)フェニル、4-N-(3-メトキシプロピオニル)-N-5イソプロピル-アミノ)フェニル、4-N-エチル-N-(2-メトキシエチル)アミノ)フェニル、4-N-ホルミルピペリジニルフェニル、4-ニトロフェニル、4-ピペリジニルフェニル、4-ピリジルフェニル、4-ピロリジニルフェニル、4-t-ブチルアクリルフェニル、5-(ジメチルアミノ)チオフェン-2-イル、5-アミノ-2-ピリジル、5-ジメチルアミノ-2-ピラジニル、10 3-ジメチルアミノピリダジン-6-イル、5-ジメチルアミノ-2ピリジル、5-ピリミジニルフェニル、6-(N-メチル-Nホルミルアミノ)-3-ピリジニル、6-(N-メチル-N-(2メトキシエチル)アミノ)-3-ピリジニル、6-(2-オキソ-オキサゾリジニル)3-ピリジニル、6-ジメチルアミノ-3-ピリジニル、6-イミダゾリル-3-ピリジニル、6-モルホリニル-3-ピリジニル、6-ピロリジニル-3ピリジニル、(2-プロピル)-3-ピリジニル、および(4-ホルミルアミノ)フェニル、(チオフェン-2-イル)メチル、(チオフェン-3-イル)メチル、ブチル、シクロヘプチル、ペンチル、チオフェン-2-イル、1-(3-ブロモフェニル)エチル、2-(N-フェニルメトキシカルボニル)アミノフェニル、2-(3-ブロモフェニル)エチル、2-(3-シアノフェニル)メチル、2-(4-ブロモフェニル)エチル、2-(5-クロロ-2-(チオフェン3-イル)フェニル、2-ブロモフェニル、2-フラニル、2-メチルプロピル、2-フェニルエチル、フェニルメチル、2,3-ジメトキシフェニル、2,3メチレンジオキシフェニル、3-(フラン-2-イル)フェニル、3-(チオフェン-2-イル)フェニル、3-(2-ピリジル)フェニル、3-(3-メトキシベンジル)フェニル、3-(アミノ)プロピニル、3-ベンジルオキシフェニル、3-ブロモ4-フルオロフェニル、3-ブロモ-5-ヨードフェニル、3-ブロモ-5-メトキシフェニル、3-ブロモフェニル、3-ブロモフェニルメチル、3-カルボキサミドフェニル、3-クロロフェニル、3-シアノフェニル、3-ジエチルマロニルアリルフェニル、3-ジメチルアミノフェニル、3-エトキシフェニル、3-フルオロ-5-トリフルオロメチルフェニル、3-フルオロフェニル、3-ヒドロキシフェニル、3-ヨードフェニル、3-メトキシエトキシフェニル、3-メトキシフェニル、3-メチルフェニル、3-メチルスルホニルフェニル、3-メチルチオフェニル、3-t-ブチルアクリルフェニル、3-トリフルオロメトキシフェニル、3-トリフルオロメチルフェニル、3-ビニルピリジニルフェニル、3,4-ジクロロフェニル、3,4-ジメトキシフェニル、3,4-メチレンジオキシフェニル、3,4,5トリメトキシフェニル、3,5-ジ(トリフルオロメチル)フェニル、3,5-ジブロモフェニル、3,5-ジクロロフェニル、3,5-ジメトキシフェニル、3,5-ジメチルフェニル、4(2-プロピル)フェニル、4-(2-プロピル)オキシフェニル、4-ベンジルオキシフェニル、4-ブロモフェニル、4-ブロモチオフェン-2-イル、4-ブトキシフェニル、4-ジメチルアミノフェニル、4-フルオロ-3-トリフルオロメチルフェニル、4-メトキシフェニル、4-ネオペンチルフェニル、4-フェノキシフェニル、5-ブロモチオフェン-2-イル、シクロヘキシル、シクロプロピル、ヘキシル、メチル、フェニル、(2-ブロモ-5-クロロフェニル)メチル、(2-ブロモフェニル)メチル、6-シクロプロピルメチルアミノ-3-ピリジニル、および(5-クロロ-2-(3-メトキシフェニル)フェニル)メチルからなる群より選択されうる。いくつかの態様において、R11はHである。
【００５１】
いくつかの態様において、R12はN(R14)2、OR14、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいアリールアルキル、および置換されていてもよいヘテロアリールアルキルからなる群より選択される。R12がN(R14)2である場合、1つまたは両方のR14はHでありうる。好ましくは少なくとも1つのR14はHではなく、例えば1つのR14はHであり、他のR14は置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいアリールアルキルまたは置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり、最も好ましくは両方のR14は独立にC1〜C6アルキルである。いくつかの態様において、R12はジアルキルアミノ（例えば、ジメチルアミノ）および置換されていてもよい5〜8員ヘテロシクリルからなる群より選択され、ここでヘテロシクリルは少なくとも1つの窒素原子を含む（例えば、モルホリン、ピリジン）。
【００５２】
いくつかの好ましい態様において、qは0である。
【００５３】
いくつかの態様において、R14は置換されていてもよいC1〜C6アルキル、例えば置換されていてもよいメチルまたは置換されていてもよいエチルである。C1〜C6アルキルはC1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、アリール、またはシクリルで置換されていてもよく、これらもそれぞれ置換されていてもよい。いくつかの態様において、R14は置換メチルまたは置換エチルであり、ここでメチルおよびまたはエチルは置換されていてもよいアリールで置換されている。いくつかの態様において、R14はシクリル、例えばシクロペンタン、シクロヘキサン、またはシクロヘプタンである。好ましくはシクリルはシクロヘキサンである。いくつかの態様において、R14はヘテロシクリルであり、好ましくはヘテロシクリルは少なくとも1つのOまたはN原子を含む。いくつかの態様において、R14は置換されていてもよいアリールである。例えば、置換されていてもよいフェニル、例えば少なくとも1つのハロゲンで置換されているアリール。
【００５４】
いくつかの態様において、X2はCR15であり、R15はNHR16、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、および置換されていてもよいヘテロアリールアルキルからなる群より選択される。好ましくはR16は置換されていてもよいアルキル、例えば置換されていてもよいメチル、置換されていてもよいエチル、例えばアリールまたはヘテロアリール、例えばインドリルで置換されているメチルである。
【００５５】
いくつかの態様において、R15はフェニル、チオフェン-2-イル、1-メチル-2-オキソベンゾキサゾリン-5-イル、2-(ジメチルアミノ)-5-ピリミジニル、2-(N-ホルミル-N-メチルアミノ)-3-ピリミジニル、2-(N-(2-メトキシエチル)-N-メチルアミノ)-5-ピリミジニル、5-ジメチルアミノ-2-ピリジニル、5-(N-(2-メトキシエチル)-N-メチルアミノ)-2-ピリジニル、2-(Nメチルアミノ)-5-ピリミジニル、2-(1-モルホリニル)-5ピリミジニル、2-(1-ピロリジニル)-5-ピリミジニル、2-ジメチルアミノ-5-ピリミジニル、2-フラニル、2-オキソベンゾキサゾリン-5-イル、2-ピリジル、3-(ジメチルアミノ)フェニル、3-アミノ-4-メトキシフェニル、3-ブロモ-4-(ジメチルアミノ)フェニル、3-メトキシフェニル、3-メチル-4-(N-アセチル-N-メチルアミノ)フェニル、3-メチル-4-(N-ホルミル-Nメチルアミノ)フェニル、3-メチル-4-(N-メチル-N-(トリフルオロアセチル)アミノ)フェニル、3-メチル-4-(N-メチルアミノ)フェニル、3-メチル-4-ピロリジニルフェニル、3-ピリジル、3,4-ジクロロフェニル、3,4-メチレンジオキシフェニル、3,4,5-トリメトキシフェニル、4-(アセチルアミノ)フェニル、4-(ジメチルアミノ)-3-フルオロフェニル、4-(ジメチルアミノ)フェニル、4-(イミダゾル-1-イル)フェニル、4-(メチルチオ)フェニル、4-(モルホリニル)フェニル、4-(N-(2-(ジメチルアミノ)エチル)アミノ)フェニル、4-(N-(2-メトキシエチル)アミノ)フェニル、4-(Nアセチル-N-メチルアミノ)フェニル、4-(N-エチル-N-ホルミルアミノ)フェニル、4-(N-エチルアミノ)フェニル、4-(N-ホルミル-N-(2-メトキシエチル)アミノ)フェニル、4-(N-イソプロピルアミノ)フェニル、4-(N-メチル-N-((2-ジメチルアミノ)エチル)アミノ)フェニル、4-(N-メチル-N-(2-(N-フタルイミジル)アセチル)アミノ)フェニル、4-(N-メチル-N-(2-シアノ)エチルアミノ)フェニル、4-(N-メチルN-(2-メトキシエチル)アミノ)フェニル、4-(N-メチル-N-(3-メトキシ)プロピオニルアミノ)フェニル、4-(N-メチル-Nアセチルアミノ)フェニル、4(N-メチル-N-ホルミルアミノ)フェニル、4-(N-メチル-N-トリフルオロアセチルアミノ)フェニル、4-(N-モルホリニル)フェニル、4-(チオフェン-2-イル)フェニル、4-(ウレイド)フェニル、4-(2-(ジメチルアミノ)アセチルアミノ)フェニル、4-(2-(2-メトキシ)アセチルアミノ)エチル)アミノ)フェニル、4-(2-メトキシ)エトキシフェニル、4-(2-オキソ-1-オキサゾリジニル)フェニル、4-(4メトキシ-2-ブチル)フェニル、4-(4-メチルピペリジニル)フェニル、4-(5-ピリミジニル)フェニル、4-ブトキシフェニル、4-カルボキサミドフェニル、4-クロロフェニル、4-シアノフェニル、4-ジエチルアミノフェニル、4-ジエチルマロニルアリルフェニル)、4-ジメチルアミノフェニル、4-エトキシフェニル、4-エチルフェニル、4-ヒドロキシフェニル、4-イミダゾリルフェニル、4-ヨードフェニル、4-イソプロピルフェニル、4-メトキシフェニル、4-メチルアミノフェニル、4-メチルスルホニルフェニル、4-モルホリニルフェニル、4-N-(2-(ジメチルアミノ)エチル)-Nホルミルアミノ)フェニル、4-N-(3-メトキシプロピオニル)-N-5イソプロピル-アミノ)フェニル、4-N-エチル-N-(2-メトキシエチル)アミノ)フェニル、4-N-ホルミルピペリジニルフェニル、4-ニトロフェニル、4-ピペリジニルフェニル、4-ピリジルフェニル、4-ピロリジニルフェニル、4-t-ブチルアクリルフェニル、5-(ジメチルアミノ)チオフェン-2-イル、5-アミノ-2-ピリジル、5-ジ��チルアミノ-2-ピラジニル、10 3-ジメチルアミノピリダジン-6-イル、5-ジメチルアミノ-2-ピリジル、5-ピリミジニルフェニル、6-(N-メチル-Nホルミルアミノ)-3-ピリジニル、6-(N-メチル-N-(2メトキシエチル)アミノ)-3-ピリジニル、6-(2-オキソ-オキサゾリジニル)3-ピリジニル、6-ジメチルアミノ-3-ピリジニル、6-イミダゾリル-3-ピリジニル、6-モルホリニル-3-ピリジニル、6-ピロリジニル-3ピリジニル、(2-プロピル)-3-ピリジニル、および(4-ホルミルアミノ)フェニル、(チオフェン-2-イル)メチル、(チオフェン-3-イル)メチル、ブチル、シクロヘプチル、ペンチル、チオフェン-2-イル、1-(3-ブロモフェニル)エチル、2-(N-フェニルメトキシカルボニル)アミノフェニル、2-(3-ブロモフェニル)エチル、2-(3-シアノフェニル)メチル、2-(4-ブロモフェニル)エチル、2-(5-クロロ-2-(チオフェン3-イル)フェニル、2-ブロモフェニル、2-フラニル、2-メチルプロピル、2-フェニルエチル、フェニルメチル、2,3-ジメトキシフェニル、2,3メチレンジオキシフェニル、3-(フラン-2-イル)フェニル、3-(チオフェン-2-イル)フェニル、3-(2-ピリジル)フェニル、3-(3-メトキシベンジル)フェニル、3-(アミノ)プロピニル、3-ベンジルオキシフェニル、3-ブロモ-4-フルオロフェニル、3-ブロモ-5-ヨードフェニル、3-ブロモ-5-メトキシフェニル、3-ブロモフェニル、3-ブロモフェニルメチル、3-カルボキサミドフェニル、3-クロロフェニル、3-シアノフェニル、3-ジエチルマロニルアリルフェニル、3-ジメチルアミノフェニル、3-エトキシフェニル、3-フルオロ-5-トリフルオロメチルフェニル、3-フルオロフェニル、3-ヒドロキシフェニル、3-ヨードフェニル、3-メトキシエトキシフェニル、3-メトキシフェニル、3-メチルフェニル、3-メチルスルホニルフェニル、3-メチルチオフェニル、3-t-ブチルアクリルフェニル、3-トリフルオロメトキシフェニル、3-トリフルオロメチルフェニル、3-ビニルピリジニルフェニル、3,4-ジクロロフェニル、3,4-ジメトキシフェニル、3,4-メチレンジオキシフェニル、3,4,5トリメトキシフェニル、3,5-ジ(トリフルオロメチル)フェニル、3,5-ジブロモフェニル、3,5-ジクロロフェニル、3,5-ジメトキシフェニル、3,5-ジメチルフェニル、4(2-プロピル)フェニル、4-(2-プロピル)オキシフェニル、4-ベンジルオキシフェニル、4-ブロモフェニル、4-ブロモチオフェン-2-イル、4-ブトキシフェニル、4-ジメチルアミノフェニル、4-フルオロ-3-トリフルオロメチルフェニル、4-メトキシフェニル、4-ネオペンチルフェニル、4-フェノキシフェニル、5-ブロモチオフェン-2-イル、シクロヘキシル、シクロプロピル、ヘキシル、メチル、フェニル、(2-ブロモ-5-クロロフェニル)メチル、(2-ブロモフェニル)メチル、6-シクロプロピルメチルアミノ-3-ピリジニル、(5-クロロ-2-(3-メトキシフェニル)フェニル)メチル、2-ブロモフェニル、3-ブロモフェニル、4-ブロモフェニル、(2-ブロモフェニル)メチル、2-クロロフェニル、3-クロロフェニル、4-クロロフェニル、2-フルオロフェニル、3-フルオロフェニル、4-フルオロフェニル、2-ニトロフェニル、3-ニトロフェニル、4-ニトロフェニル、2-メトキシフェニル、3-メトキシフェニル、4-メトキシフェニル、3-アミノフェニル、3-アミノフェニル、4-アミノフェニル、シクロヘキサン、テトラヒドロピラン（例えば、テトラヒドロピラン-4-イル）、1-(2-ブロモフェニル)エチル、4-メチルペンタ-1-エン-4-イル、および(インドール-2-イル-メチル)アミノからなる群より選択される。
【００５６】
いくつかの態様において、Y2はNである。
【００５７】
いくつかの態様において、式（II）の化合物は以下である：ABT-702（5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-モルホリノピリジン-3-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン-4-アミン、本明細書においてB8とも呼ぶ）、化合物6（7-(4-(ジメチルアミノ)フェニル)プテリジン-4-アミン）、化合物7（5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(ジメチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン-4-アミン）、化合物8（5-(2-ブロモベンジル)-7-(6-モルホリノピリジン-3-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン-4-アミン）、化合物9（5-シクロヘキシル-7-(6-モルホリノピリジン-3-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン-4-アミン)、化合物10（5-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)-7-(6-モルホリノピリジン-3-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン-4-アミン）、化合物11（5-(1-(2-ブロモフェニル)エチル)-7-(6-モルホリノピリジン-3-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン-4-アミン）、化合物12（5-(2-メチルペンタ-4-エン-2-イル)-7-(6-モルホリノピリジン-3-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン-4-アミン）、または化合物13（N5-((1H-インドール-3-イル)メチル)-7-(6-モルホリノピリジン-3-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン-4,5-ジアミン）。
【００５８】
いくつかの態様において、式（II）の化合物は、以下およびこれらの薬学的に許容される塩からなる群より選択される：4-アミノ-5-(4-クロロフェニル)-7-(4-ニトロフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-メトキシフェニル)-7-(4-ニトロフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-フルオロフェニル)-7-(4-フルオロフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-クロルフェニル)-7-(4-フルオルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-フェニル-7-(4-アミノフェニル)ピリド[2,3-d] ピリミジン；4-アミノ-5-フェニル-7-(4-ブロムフェニル)ピリド[2,3-d] ピリミジン；4-アミノ-5-(4-メトキシフェニル)-7-(4-アミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5,7-ジフェニルピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-ジメチルアミノフェニル)-7-(4-ブロモフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミホ-5-(4-ジメチルアミノフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-S-(4-メトキシフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-ジメチルアミノフェニル)-7-(4-メトキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-(2-プロピル)フェニル)-7-(4-メトキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-ネオペンチルフェニル)-7-(4-メトキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-ブチルオキシフェニル)-7-(4-メトキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-メトキシフェニル)-7-(4-ブロモフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-(2-プロピル)オキシフェニル)-7-(4-メトキシフェニル)ピンド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-ブトキシフェニル)-7-(4-N-ホルミルピペラジニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-ベンジルオキシフェニル)-7-(4-メトキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピンミジン；4-アミノ-5-(4-フェノキシフェニル)-7-(4-メトキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-(2-プロピル)フェニル)-7-(4-ジエチルマロニルアリルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-(2-プロピル)フェニル)-7-(4-t-ブチルアクリルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,4-ジメトキシフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-t-ブチルアクリルフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-メトキシフェニル-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,5-ジメトキシフェニル-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ジエチルマロニルアリルフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ビニルピリジニルフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-トリフルオロメチルフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピンド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-カルボキサミドフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-シアノフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ベンジルオキシフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-メトキシフェニル)-7-(4-メトキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ブトキシフェニル)���リド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-(2-ピリジル)フェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-メチルフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-クロロピエニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-フルオロフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-メトキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-メトキシフェニル)-7-(4-ブロモフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-フェニルピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-エチルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ブロモフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-シアノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ヒドロキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ヨードフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-エトキシフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-トリフルオロメチルオキシフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,5-ジクロロフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ヒドロキシフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-モルホリニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ピペリジニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(イミダゾル1-イル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-クロロフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-イソプロピルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-S-(3-ブロモフェニル)-7-(4-トリルルオロフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(3,4,5-トリメトキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-(3-メトキシベンジル)フェニル)-7-(4-ジメチルアミノピエニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；
4-アミノ-5-(3-メトキシエトキシフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,4-メチレンジオキシフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-エトキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(チオフェン-2-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-フルオロフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ジメチルアミノフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-フェニル-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,4,5-トリメトキシフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ニトロフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ヨードフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(3,4-メチレンジオクスフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(チオフェン-2-イル)-7-(4-モルホリニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,5-ジメトキシフェニル)-7-(チオフェン-2-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-カルボキサミドフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(2-メトキシ)エトキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,5-ジメトキシフェニル)-7-(4-モルホリニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-トリフルオロメチルフェニル)-7-(チオフェン-2-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-アミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-7-(チオフェン-2-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-7-(2-フラニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,5-ジメトキシフェニル)-7-(4-ヨードフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,5-ジメトキシフェニル)-7-(4-イミダゾリルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,5-ジメトキシフェニル)-7-(4-(チオフェン-2-イル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,5-ジメトキシフェニル)-7-(4-(3-ピンジル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピンミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(4-メチルピペリジニル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ピロリジニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-ブロモチオフェン-)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-ブロモチオフェン-2-イル)-7-(4-モルホリニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-モルホリニル-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(5-ブロモチオフェン-2-イル)-7-(4-モルホリニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(アセチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,5-ジメトキシフェニル)-7-(5-ピリミジニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-(4-フルオロフェニル)アミノ)-5-(3-ブロモフェニイ)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-ブロモチオフェン-2-イル)-7-(4-ピロリジニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-ブロモチオフェン-2-イル)-7-(チオフェン-2-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(5-(ジメチルアミノ)チオピエン-2-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモ-5-ヨードフェニル)-7-(4-(ジメチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,5-ジ(トリフルオロメチル)フェニル)-7-(4-(ジメチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,5-ジ(トリフルオロメチル)フェニル)-7-(4-モルホリニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,5-ジブロモフェニル)-7-(4-(ジメチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,S-ジブロモフェニル)-7-(4-モルホリニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-ブロモチオフェン-2-イル)-7-(4-(4-メチルピペリジニル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,5-ジブロモフェニル)-7-(4(ジメチルアミノ)フェン)ピリド[2,3 d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(3-(ジメチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-メチルスルホニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(3-メトキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(メチルチオ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3.ブロモフェニル)-7-(3,4-ジクロロフェニル)ピリド[2,3-d]ピムミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(N-メチル-N-ホルミルアミノ)フェニル)ピンド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-メチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-7-(4-メチルスルホニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(3-アミノ-4-メトキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピンミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(3-ブロモ-4-(ジメチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；
4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(3-メチル-4-(ジメチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(N-メチル-N-トリフルオロアセチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(ジメチルアミノ)-3-フルオロフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(N-エチル-N-ホルミルアミノ)フェニル)ピリド[2,3 d]ピリミジン；4,4-ビス(アセチルアミノ)-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(N-メチル-N-アセチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(N-アセチル-N-メチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(N-エチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(N-メチル-N-(2-メトキシエチル)アミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(N-イソプロピルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-N-エチル-N-(2-メトキシエチル)アミノ)フェニル)ピリド[2,3-diピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-N-(3-メトキシプロピオニル)-N-イソプロピル-アミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-N-(2-(ジメチルアミノ)エチル)-N-ホルミルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(N-(2-(ジメチルアミノ)エチル)アミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(N-メチル-N-(2-シアノ)エチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(N-メチル-N-(3-メトキシ)プロピオニルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(3-メチル-4-(N-ホルミル-N-メチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(3-メチル-4-(N-メチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(4-メトキシ-2-ブチル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(N-メチル-N-(2-(N-フタルイミジル)アセチル)アミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(3-メチル-4-(N-メチル-N-(トリフルオロアセチル)アミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピロリジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(3-メチル-4-(N-アセチル-N-メチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-ジメチルアミノ-3-ピリジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-シアノフェニル)-7-(4-メチルスルホニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-シアノフェニル)-7-(4-(N-メチル-N-ホルミルアミノ)-フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(N-メチル-N-ホルミルアミノ)-3-ピリジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-モルホリニル-3-ピリジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(N-メチル-N-メトキシエチルアミノ)-3-ピリジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-ピロリジニル-3-ピリジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(2-(ジメチルアミノ)-5-ピリミジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(2-(N-メトキシエチル-N-メチルアミノ)-5-ピリミジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブ��モフェニル)-7-(2-(N-ホルミル-N-メチルアミノ)-5-ピリミジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-S-(3-ブロモフェニル)-7-(2-(N-メチルアミノ)5-ピリミジニル)ピリド[2,3-diピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(2-(1-ピロリジニル)-5-ピリミジニル)ピリド[2,3 d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(2-(1-モルホリニル)-5-ピリミジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(2-オキソ-3-オキサゾリジニル)-3-ピリジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(2-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-(チオフェン-2-イル)フェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-(フラン-2-イル)フェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-(3-メトキシフェニル)フェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリドr2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-フェニル-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-クロロフェニル)-7-(4-(モルホリニル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-7-(4-(モルホリニル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-クロロフェニル)-7-(4-ヨードフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-クロロフェニル)-7-(4-(チオフェン-2-イル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-クロロフェニル)-7-(4-(5-ピリミジニル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-7-(4-ヨードフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-ブロモチオフェン-2-イル)-7-(4-メトキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)メチル-7-(4-(ジメチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(2-フェニルエチル)-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(2-メチルプロピル)-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；
4-アミノ-5-(ブチル)-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(2-(4-ブロモフェニル)エチル)-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(ブチル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(2-(3-シアノフェニル)メチル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(2-(N-フェニルメトキシカルボニル)アミノエチル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(シクロヘプチル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(2-(5-クロロ-2-(チオフェン-3-イル)フェニルメチル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(ペンチル)-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-ヘキシル-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(2-(3-ブロモフェニル)エチル)-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-((2-ブロモフェニル)メチル)-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロプロピル-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-((2-ブロモ-5-クロロフェニル)メチル)-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-メチル-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(2,3-メチレンジオキシフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-フルオロ-5-トリフルオロメチルフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(2-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,5-ジメチルフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,4-ジクロロフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-フルオロ-3-トリフルオロメチルフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモ-5-メトキシフェニル)-7-(4-モルホリニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモ-5-メトキシフェニル)-7-(4-ピロリジニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモ-5-メトキシフェニル)-7-(4-ピペリジニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモ-5-メトキシフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-メチルチオフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモ-5-メトキシフェニル)-7-(チオフェン-2-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(2,3-ジメトキシフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-メチルスルホニルフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アセチルアミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-ホルミルアミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-(メトキシアセチル)アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-トリフルオロアセチルアミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-ペンタノイルアミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-ベンゾイルアミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-(N-BOC-グリシル)アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-(N-フタルイミジルグリシル)アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-(エトキシカルボニル)アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-(エチルアミノカルボニル)アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アリルアミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-(2-(N,N-ジメチルアミノ)エチルアミノ)-5-(4-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-(4-(N,N-ジメチルアミノ)ブチルアミノ)-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-(N-アリル-N-ホルミルアミノ)-5-(4-ジメチルアミノフェニル)-7-(4-ブロモフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-ジアセチルアミノ-5-(p-ジメチルアミノフェニル)-7-(4-ブロモフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(5-アミノ-2-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(5-ジメチルアミノ-2-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(5-ジメチルアミノ-2-ピラジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(2-オキソベンゾキサゾリン-6-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(1-メチル-2-オキソベンゾキサゾリン-6-イル)ピリド[2,3-djピリミジン；4-アミノ-5-((5-クロロ-2-(3-メトキシフェニル)フェニル)メチル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-((チオフェン-2-イル)メチル)-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-((チオフェン-3-イル)メチル)-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-((2-ブロモフェニル)メチル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(N-ホルミル-N-(2-メトキシエチル)アミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(N-(2-メトキシエチル)アミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(N-メチル-N-((2-ジメチルアミノ)エチル)アミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(2-メトキシ)アセチルアミノ)エチル)アミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-((4-ホルミルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(2-(ジメチルアミノ)アセチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(2-オキソ-3-オキサゾリジン)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(2-プロピル)-3-ピリジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；
4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(3-メチル-4-ピロリジニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-イミダゾリル-3-ピリジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-フェニルメチル-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(2-(3-アミノプロピニル)フェニルメチル)-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(1-(3-ブロモフェニル)エチル)-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3 d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-ジメチルアミノフェニル)-7-(4-ブロモフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(2-フラニル)-7-(4-(N-モルホリニル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(2-ジメチルアミノ-5-ピリミジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(ウレイド)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(1-フェニルメチル-3-ピペリジニル)-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(3-メチル-5-イソキサゾリル))-3-ピリジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-クロロ-3-ピリジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-メトキシ-3-ピリジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(1,2,4-トリアゾル-4-イル)-3-ピリジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(2-モルホリニル-5-ピリムジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(2-チアゾリル)-7-(4-ピロリジニルフェニル)-ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-ピラゾリル-3-ピリジニル))-ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(1-メチル-ウレイド)フェニル)-ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(N-メチル-N-(2-ピリミジニル)アミノ)フェニル)-ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(3-フルオロ-4-(N-ホルミル-N-メチルアミノ)フェニル)-ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-ホルミルアミノ-S-(3-ブロモフェニル)-7-(3-フルオロ4-(N-ホルミル-N-メチルアミノ)フェニル)-ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(N-メチル-N-メチルスルホニルアミノ)-フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(N-メチル-N-メチルスルホニルアミノ)-3-ピリジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(1-メチル-5-インドリニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(1-メチル-5-ベンズイミダゾリル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-ジメチルアミノ-3-ピリダジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3ブロモフェニル)-7-(6-モルホリニル-3-ピリダジニル)ピリド[2,3-diピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-ピロリジニル-3-ピリダジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(5-モルホリニル-2-ピラジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(5-(N-(2-メトキシエチル)-N-メチルアミノ)-2-ピラジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(モルホリニルメチル)-フェニル)ピリド[2,3-diピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(5-(N,N-ビス(2-メトキシエチル)アミノ)-2-ピリジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(イミダゾリルメチル)-フェニル)ピリド[2,3-d]ピリ��ジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(5-(1-モルホリニル)-2-ピリジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-((ジメチルアミノ)メチル)-フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(5-(4-ヒドロキシ-1-ピペリジニル)-2-ピリジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(5-(N-ホルミル-N-メチルアミノ)-2-ピリジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(5-(2-プロペニル)-2-ピリジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(3-(2-メトキシエチル)-2-オキソ-6-ベンゾキサゾリル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(1-(N-ホルミルアミノ)-エチル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-(メチルアミノ)-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン塩酸塩；
4-(2-メトキシエチルアミノ)-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン塩酸塩；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(1-メチル-2-イミダゾリル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン3塩酸塩；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(アミノメチル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(2-ブロモ-4-(ジメチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(ジメチルアミノエチル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(3-(ジメチルアミノ)プロピニル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(3-アミノ-3-メチルブチニル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルホスホナトフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(3-(メトキシプロピニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-カルボキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-メチル-3-オキソ-2H-4H-ピリド[3,2-b]-1,4-オキサジン-7-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(2-ジメチルアミノ)エチル)-3-オキソ-2H-4H-ピリド[3,2-b]-1,4-オキサジン-7-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(2,3-ジヒドロ-3-(ジメチルアミノエチル)-2-オキソベンゾキサゾル-6-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-メチル-3-オキソ-2H-4H-ベンゾ-1,4-オキサジン-7-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(2,2,4-トリメチル-3-オキソ-2H-4H-ベンゾ-1,4-オキサジン-7-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(4-(2-ジメチルアミノ)エチル)-2H-4H-ベンゾ-3-オキソ-1,4-オキサジン-7-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(5-(1-メチルエチル)-2-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(5-ピペリジン1-イルピリド-2-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(1-(4-ブロモフェニル)エチル)-7-(6-モルホリニルピリド-3-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-((N-ホルミルアミノ)メチル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(1-メチル-1-(N-メチルアミノ)エチル)フェニル)-ピリド[2,3-d]ピリミジン: 4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(1-(ジメチルアミノ)-1-メチルエチル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(N-アセチル-5-インドリニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-クロロ-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(1-(2-ブロモフェニル)エチル)-7-(6-ジエチルアミノ-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(1-(2-ブロモフェニル)エチル)-7-(6-モルホリニル-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(1-(2-ブロモフェニル)エチル)-7-(4-(N-メチル-N-ホルミル)アミノ)-フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-モルホリニル-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-((2-ブロモフェニル)メチル)-7-(6-モルホリニル-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-S-(4-テトラヒドロピラニル)-7-(6-モルホリニル-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-ジメチルアミノ-3-ピリジル)ピンド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(1-エチルプロピル)-7-(6-ジメチルアミノ-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロペンチル-7-(6-モルホリニル-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(2-クロロ-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,5-ジメチルシクロヘキシル)-7-(6-ジメチルアミノ-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-((N-(ベンジルオキシカルボニル)-4-ピペリジニル)メチル)-7-(6-モルホリニル-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-ブロモ-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(3-シアノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-S-(1-(2-ブロモフェニル)エチル)-7-(6-ジメチルアミノ-3-ピリダジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-イミダゾリル-3-ピリダジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(アザシクロヘプタニル)-3-ピリダジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(N-メチル-N-(1-メチルエチル)アミノ)-3-ピリダジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(1-(2-ブロモフェニル)エチル)-7-(6-モルホリニル-3-ピリダジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-(4-アセチルピペラジニル)-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-(4-アセチル-1,4-ジアザシクロヘプタニル)-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-S-シクロヘキシル-7-(6-(4-メチル-1,4-ジアザシクロヘプタニル)-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-(N-メチル-N-(2-(2-ピリジル)エチル)アミノ)-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-2-(N-(N',N'-ジメチルアミノエチル)-N-メチルアミノ)-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-アゼチジニル-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-(3-(N-メチルアセトアミド)ピロリジニル)ピリジル)ピリド[2,3 d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-(3-(ホルムアミド)ピロリジニル)ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；
4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(4-オキソ-1-フェニル-1,3,8-トリアザスピロ[4,5[デカン-8-イル)ピリド[2,3-dlピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-(2-メトキシメチル)ピロリジン-1-イル)ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-(N-メクトキシエチル-N-プロピルアミノ)ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(N-メチル-N-(2,2-ジメトキシエチル)アミノ)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-(4-(ジメチルアミノ)ピペリジニル)ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-(4-(アミノカルボニル))ピペリジニル)ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(N-メチル-N-(3-(ジエチルアミノ)プロピル)アミノピリド-3-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-(N-メチル-N-(4-ピリジル)エチルアミノ)ピリド-3-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-(N-メチル-N-(3-ピリジルメチルアミノ)ピリド-3-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(1-(2-ブロモフェニル)エチル)-7-(1-メチル-5-インドリル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(1-(2-ブロモフェニル)エチル)-7-(1-メチル-2,3-ジオキソ-5-インドリル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(3-フルオロ-4-(1-モルホリニル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ヒドロキシ-3-ニトロフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(4,4-エチレンジオキシピペリジニル)-3-ピンジル)ピンド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(4-オキソピペリジニル)-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(4-ホルミルピペラジニル)-3-ピリジル)ピリド[2,3 d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(4-メチルピペラジニル)-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-チオモルホリニル-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(4,4-ジオキソチオモルホリニル)-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(2-ブロモフェニル)-7-(6-モルホリニル-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモ-4-メトキシフェニル)-7-(6-モルホリニル-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-ブロモフェニル)-7-(6-モルホリニル-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-クロロフェニル)-7-(6-モルホリニル-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(5-クロロ-6-モルホリニル-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(N-オキシドモルホリニル)-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(N-(2-ヒドロキシエトキシエチル)アミノ)-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(N-(2-ヒドロキシエトキシエチル)-N-ホルミルアミノ)-3-ピリジイ)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(N-(2-ヒドロキシエトキシエチル)-3-ピリジル-N-オキシド)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(3-ヒドロキシ)モルホリニル)-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；1-(5-(4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン-7-イル)-2-ピリジル)-ピペリジン-4-ホスフェート、2ナトリウム塩；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-メチレニル���ペリジニル)-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ヒドロキシ-4-(ヒドロキシメチル)ピペリジニル)-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(4,4-エチレンジオキシピペリジニル)-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-(4-オキソ-ピペリジニル)-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-(4-メチレニルピペリジニル)-3-ピルジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-N-(イミノメチル)アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-ジメチルアミノ-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-ジメチルアミノフェニル)-7-(4-ブロモフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-S-(4-ジメチルアミノフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-S-(4-メトキシフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-S-(4-ジメチルアミノフェニル)-7-(4-メトキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-(2-プロピル)フェニル)-7-(4-メトキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-ネオペンチルフェニル)-7-(4-メトキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-ブチルオキシフェニル)-7-(4-メトキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-メトキシフェニル)-7-(4-ブロモフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-(2-プロピル)オキシフェニル)-7-(4-メトキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-ブトキシフェニル)-7-(4-N-ホルミルピペラジニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-ベンジルオキシフェニル)-7-(4-メトキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-フェノキシフェニル)-7-(4-メトキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-(2-プロピル)フェニル)-7-(4-ジエチルマロニルアリルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-(2-プロピル)フェニル)-7-(4-t-ブチルアクリルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,4-ジメトキシフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-t-ブチルアクリルフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-メトキシフェニル-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,5-ジメトキシフェニル-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ジエチルマロニルアリルフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；
4-アミノ-5-(3-ビニルピリジニルフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-トリフルオロメチルフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-カルボキサミドフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-シアノフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ベンジルオキシフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-メトキシフェニル)-7-(4-メトキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ブトキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-(2-ピリジル)フェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-メチルフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-クロロフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-S-(3-フルオロフェニD-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-メトキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-メトキシフェニル)-7-(4-ブロモフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-フェニルピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-エチルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ブロモフェニル)ピンド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-シアノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ヒドロキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ヨードフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-エトキシフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-トリフルオロメトキシフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,5-ジクロロフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ヒドロキシフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-モルホリニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ピペリジニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(イミダゾル1-イル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-クロロフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-イソプロピルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-トリフィウオロフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(3,4,5-トリメトキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-(3-メトキシベンジル)フェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；sアミノ-5-(3-メトキシエトキシフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,4-メチレンジオキシフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-エトキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピンミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(2'-チオフェン)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-フルオロフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ジメチルアミノフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-フェニル-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,4,5-トリメトキシフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ニトロフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ヨードフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-アミノ-S-(3-ブロモフェニル)-7-(3,4-メチレンジオキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(チオフェン-2-イル)-7-(4-モルホリニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-S-(3,S-ジメトキシフェニル)-7-(チオフェン-2-イレ)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-カルボキサミドフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(2-メトキシ)エトキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,5-ジメトキシフェニル)-7-(4-モルホリニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-トリフルオロメチルフェニル)-7-(チオフェン-2-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-アミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-7-(チオフェン-2-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-7-(2-フラニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,5-ジメトキシフェニル)-7-(4-ヨードフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,5-ジメトキシフェニル)-7-(4-イミダゾリルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,5-ジメトキシフェニル)-7-(4-(チオフェン-2-イル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,5-ジメトキシフェニル)-7-(4-(3-ピリジル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(4-メチルピペリジニル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ピロリジニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-ブロモチオフェン-)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド「2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-ブロモチオフェニル-2-イル)-7-(4-モルホリニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-モルホリニル-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(5-ブロモチオフェン-2-イル)-7-(4-モルホリニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；
4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(アセチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,5-ジメトキシフェニル)-7-(5-ピンミジニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-(4-フルオロフェニル)アミノ)-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジルネチルアルニノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-ブロモチオフェン-2-イル)-7-(4-ピロリジニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-ブロモチオフェン-2-イル)-7-(チオフェン-2-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(5-(ジメチルアミノ)チオフェン-2-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモ-5-ヨードフェニル)-7-(4-(ジメチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,5-ジ(トリフルオロメチル)フェニル)-7-(4-(ジメチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,5-ジ(トリフルオロメチル)フェニル)-7-(4-モルホリニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,5-ジブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,5-ジブロモフェニル)-7-(4-モルホリニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-ブロモチオフェン-2-イル)-7-(4-(4-メチルピペリジニル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,5-ジブロモフェニル)-7-(4-(ジメチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(3-(ジメチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-メチルスルホニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(3-メトキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(メチルチオ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(3,4-ジクロロフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(N-メチル-N-ホルミルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-メチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；sアミノ-5-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-7-(4-メチルスルホニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(3-アミノ-4-メトキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン9 4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(3-ブロモ-4-(ジメチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(3-メチル-4-(ジメチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(N-メチル-N-トリフルオロアセチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(ジメチルアミノ)-3-フルオロフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(N-エチル-N-ホルミルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4,4-ビス(アセチルアミノ)-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(N-メチル-N-アセチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(N-アセチル-N-メチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(N-エチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(N-メチル-N-(2-メトキシエチル)アミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(N-イソプロピルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-N-エチル-N-(2-メトキシエチル)アミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-N-(3-メトキシプロピオニル)-N-イソプロピル-アミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-N-(2-(ジメチルアミノ)エチル)-N-ホルミルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(N-(2-(ジメチルアミノ)エチル)アミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(N-メチル-N-(2-シアノ)エチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(N-メチル-N-(3-メトキシ)プロピオニルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(3-メチル-4-(N-ホルミル-N-メチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(3-メチル-4-(N-メチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-メトキシ-2-ブチル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン: 4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(N-メチル-N-(2-(N-フタルイミジル)アセチル)アミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-S-(3-ブロモフェニル)-7-(3-メチル-4-(N-メチル-N-(トリフルオロアセチル)アミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(3-メチル-4-(N-アセチル-N-メチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-ジメチルアミノ-3-ピリジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-シアノフェニル)-7-(4-メチルスルホニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-シアノフェニル)-7-(4-N-メチル-N-ホルミルアミノ)-フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(N-メチル-N-ホルミルアミノ)-3-ピリジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-モルホリニル-3-ピリジニル)-イリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(N-メチル-N-メトキシエチルアミノ)-3-ピリジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-ピロリジニル-3-ピリジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(2-(ジメチルアミノ)-5-ピリミジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(2-(N-メトキシエチル-N-メチルアミノ)-5-ピリミジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-S-(3-ブロモフェニル)-7-(2-(N-ホルミル-N-メチルアミノ)-5-ピリミジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(2-(N-メチルアミノ)5-ピリミジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(2-(1-ピロリジニル)-5-イルリミジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(2-(1-モルホリニル)-5-ピリミジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(2-オキソ-3-オキサゾリジニル)-3-ピリジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(2-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン:
4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-(チオフェン-2-イル)フェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-(フラン-2-イル)フェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-(3-メトキシフェニル)フェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-S-フェニル-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-クロロフェニル)-7-(4-(モルホリニル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-7-(4-(モルホリニル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-S-(3-チオロフェニル)-7-(4-ヨードフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-クロロフェニル)-7-(4-(チオフェン-2-イル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-クロロフェニル)-7-(4-(5-ピリミジニル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモ-4-フルオロフェニル)-7-(4-ヨードフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-ブロモチオフェン-2-イル)-7-(4-メトキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)メチル-7-(4-(ジメチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(2-フェニルエチル)-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(2-メチルプロピル)-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(ブチル)-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(2-(4-ブロモフェニル)エチル)-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(ブチル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(2-(3-シアノフェニル)メチル-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-S-(2-(N-フェニルメトキシカルボニル)アイリノエチル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(シクロヘプチル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(2-(5-クロロ-2-(チオフェン-3-イル)フェニルメチル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(ペンチル)-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-ヘキシル-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(2-(3-ブロモフェニル)エチル)-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-((2-ブロモフェニル)メチル)-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロプロピル-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-((2-ブロモ-5-クロロフェニル)メチル)-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-メチル-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン: 4-アミノ-5-(2,3-メチレンジオキシフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-フルオロ-5-トリフルオロメチルフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(2-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,5-ジメチルフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,4-ジクロロフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)��リド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-フルオロ-3-トリフルオロメチルフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモ-5-メトキシフェニル)-7-(4-モルホリニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモ-5-メトキシフェニル)-7-(4-ピロリジニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモ-5-メトキシフェニル)-7-(4-ピペリジニルフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモ-5-メトキシフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-メチルチオフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモ-5-メトキシフェニル)-7-(チオフェン-2-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(2,3-ジメトキシフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-メチルスルホニルフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-diピリミジン；4-アセチルアミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-ホルミルアミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；
4-(メトキシアセチル)アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-トリフルオロアセチルアミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-ペンタノイルアミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-diピリミジン；4-ベンゾイルアミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-djピリミジン；4-(N-BOC-グリシル)アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-(N-フタルイミジルグリシル)アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-(エトキシカルボニル)アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-(エチルアミノカルボニル)アミノ-S-(3-ブロモフェニト)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピンミジン；4-アリルアミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-(2-(N,N-ジメチルアミノ)エチルアミノ)-5-(4-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-(4-(N,N-ジメチルアミノ)ブチルアミノ)-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-(N-アリル-N-ホルミルアミノ)-5-(4-ジメチルアミノフェニル)-7-(4-ブロモフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-ジアセチルアミノ-5-(p-ジメチルアミノフェニル)-7-(4-ブロモフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(5-アミノ-2-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(5-ジメチルアミノ-2-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(5-ジメチルアミノ-2-ピラジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(2-オキソベンゾキサゾリン-6-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(1-メチル-2-オキソベンゾキサゾリン-6-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-((5-クロロ-2-(3-メトキシフェニル)フェニル)メチル-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-((チオフェン-2-イル)メチル)-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-((チオフェン-3-イル)メチル)-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-((2-ブロモフェニル)メチル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピンド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(N-ホルミル-N-(2-メトキシエチル)アミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(N-(2-メトキシエチル)アミノ)フェニル)ピリドr2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(N-メチル-N-((2-ジメチルアミノ)エチル)アミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(2-メトキシ)アセチルアミノ)エチル)アミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-((4-ホルミルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(2-ジメチルアミノ)アセチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(2-オキソ-3-オキサゾリジニル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(2-プロピル)-3-ピリジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(3-メチル-4-ピロリジニルフェ��ル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-イミダゾリル-3-ピリジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-フェニルメチル-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(2-(3-アミノプロピニル)フェニルメチル)-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(1-(3-ブロモフェニル)エチル)-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-ジメチルアミノフェニル)-7-(4-ブロモフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(2-フラニル)-7-(4-(N-モルホリニル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(2-ジメチルアミノ-5-ピリミジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(ウレイド)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(1-フェニルメチル-3-ピペリジニル)-7-(4-ジエチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(3-メチル-5-イソキサゾリル))-3-ピリジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-クロロ-3-ピリジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-メトキシ-3-ピリジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(1,2,4-トリアゾル-4-イル)-3-ピリジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(2-モルホリニル-5-ピリミジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン: 4-アミノ-5-(2-チアゾリル)-7-(4-ピロリジニルフェニル)-ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-ピラゾリル-3-ピリジニル))-ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(1-メチル-ウレイド)フェニル)-ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(N-メチル-N-(2-ピリミジニル)アミノ)フェニル)-ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(3-フルオロ-4-(N-ホルミル-N-メチルアミノ)フェニル)-ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-ホルミルアミノ-5-(3-ブロモエチル)-7-(3-フルオロ-4-(N-ホルミル-N-メチルアミノ)フェニル)-ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(N-メチル-N-メチルスルホニルアミノ)-フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(N-メチル-N-メチルスルホニルアミノ)-3-ピリジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(1-メチル-5-インドリニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(1-メチル-5-ベンズイミダゾリル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-ジメチルアミノ-3-ピリダジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3ブロモフェニル)-7-(6-モルホリニル-3-ピリダジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；
4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-ピロリジニル-3-ピリダジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(5-モルホリニル-2-ピラジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(5-(N-(2-メトキシエチル)-N-メチルアミノ)-2-ピラジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(モルホリニルメチル)-フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(5-(N,N-ビス(2-メトキシエチル)アミノ)-2-ピリジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(イミダゾリルメチル)-フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(5-(1-モルホリニル)-2-ピリジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-((ジメチルアミノ)メチル)-フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(5-(4-ヒドロキシ-1-ピペリジニル)-2-ピリジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；A-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(5-(N-ホルミル-N-メチルアミノ)-2-ピリジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(5-(2-プロペニル)-2-ピリジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(3-(2-メトキシエチル)-2-オキソ-6-ベンゾキサゾリル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(1-(N-ホルミルアミノ)-エチル)フェニル)ピリド[2,3-diピリミジン；4-(メチルアミノ)-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン塩酸塩；4-(2-メトキシエチルアミノ)-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルアミノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン塩酸塩；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(1-メチル-2-イミダゾリル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン3塩酸塩；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(アミノメチル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(2-ブロモ-4-(ジメチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(ジメチルアミノエチル)フェニル)ピリド[2,3-diピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(3-(ジメチルアミノ)ピロピニル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(3-アミノ-3-メチルブチニル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ジメチルホスホナトフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(3-(メトキシプロピニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(カルボキシフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-メチル-3-オキソ-2H-4H-ピリド[3,2-b]-1,4-オキサジン-7-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(2-(ジメチルアミノ)エチル)-3-オキソ-2H-4H-ピリド[3.2-b]-1,4-オキサジン-7-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(2,3-ジヒドロ-3-(ジメチルアミノエチル)-2-オキソベンゾキサゾル-6-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-メチル-3-オキソ-2H-4H-ベンゾ-1,4-オキサジン-7-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(2,2,4-トリメチル-3-オキソ-2H-4H-ベンゾ-1,4-オキサジン-7-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(4-(2-ジメチルアミノ)エチル)-2H-4H-ベンゾ-3-オキソ-1,4-オキサジン-7-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(5-(1-メチル���チル)-2-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(5-ピペリジン1-イルピリド-2-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(1-(4-ブロモフェニル)エチル)-7-(6-モルホリニルピリド-3-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-((N-ホルミルアミノ)メチル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(1-メチル-1-(N-メチルアミノ)エチル)フェニル)-ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(1-(ジメチルアミノ)-1-メチルエチル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(N-アセチル-5-インドリニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-クロロ-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(1-(2-ブロモフェニル)エチル)-7-(6-ジエチルアミノ-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(1-(2-ブロモフェニル)エチル)-7-(6-モルホリニル-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(1-(2-ブロモフェニル)エチル)-7-(4-(N-メチル-N-ホルミル)アミノ)-フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-モルホリニル-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン: 4-アミノ-5-((2-ブロモフェニル)メチル)-7-(6-モルホリニル-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-テトラヒドロピラニル)-7-(6-モルホリニル-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-ジメチルアミノ-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(1-エチルプロピル)-7-(6-ジメチルアミノ-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロペンチル-7-(6-モルホリニル-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(2-クロロ-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3,5-ジメチルシクロヘキシル)-7-(6-ジメチルアミノ-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-((N-(ベンジルオキシカルボニル)-4-ピペリジニル)メチル)-7-(6-モルホリニル-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-ブロモ-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(3-シアノフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(1-(2-ブロモフェニル)エチル)-7-(6-ジメチルアミノ-3-ピリダジニル)ピリド[2,3 d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-イミダゾリル-3-ピリダジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン: 4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(アザシクロヘプタニル)-3-ピリダジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(N-メチル-N-(1-メチルエチル))アミノ)-3-ピリダジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(1-(2-ブロモフェニル)エチル)-7-(6-モルホリニル-3-ピリダジニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-(4-アセチルピペラジニル)-3-ピリジルピリド[2,3-d]ピリミジン；
4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-(4-アセチル-1,4-ジアザシクロヘプタニル)-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-(4-メチル-1,4-ジアザシクロヘプタニル)-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-(N-メチル-N-(2-(2-ピリジル)エチル)アミノ)-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-2-(N-(N',N-ジメチルアミノエチル)-N-メチルアミノ)-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-アゼチジニル-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-(3-(N-メチルアセトアミド)ピロリジニル)ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-(3-(ホルムアミド)ピロリジニル)ピリジル)ピリド[2,3-d]ピロリジニル；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(4-オキソ-1-フェニル-1,3,8-トリアザスピロ[4,5[デカン-8-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-(2-メトキシメチル)ピロリジン-1-イル)ピリジイ)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-(N-メトキシエチル-N-プロピルアミノ)ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(N-メチル-N-(2,2-ジメトキシエチル)アミノ)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-(4-(ジメチルアミノ)ピペリジニル)ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-(4-(アミノカルボニル))ピペリジニル)ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(N-メチル-N-(3-(ジエチルアミノ)ピオピル)アミノピリド-3-イイ)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-(N-メチル-N-(4-ピリジル)エチルアミノ)ピリド-3-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-(N-メチル-N-(3-ピリジルメチルアミノ)ピリド-3-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(1-(2-ブロモフェニル)エチル)-7-(1-メチル-S-インドリル)ピリド[2,3-diピリミジン: 4-アミノ-5-(1-(2-ブロモフェニル)エチル)-7-(1-メチル-2,3-ジオキソ-S-インドリイ)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(3-フルオロ-4-(1-モルホリニル)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ヒドロキシ-3-ニトロフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(4,4-エチレンジオキシピペリジニル)-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(4-オキソピペリジニル)-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(4-ホルミルピペラジニル)-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(4-メチルピペラジニル)-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-チオモルホリニル-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(4,4-ジオキソチオモルホリニル)-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(2-ブロモフェニル)-7-(6-モルホリニル-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモ-4-メトキシフェニル)-7-(6-モルホリニル-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(4-ブロモフェニル)-7-(6-モルホリニル-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-クロロフェニル)-7-(6-モルホリニル-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(5-クロロ-6-モルホリニル-3-ピリジル)ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(N-オキシドモルホリニル)-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(N-(2-ヒドロキシエトキシエチル)アミノ)-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(N-(2-ヒドロキシエトキシエチル)-N-ホルミルアミノ)-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(N-(2-ヒドロキシエトキシエチル)-3-ピリジル-N-オキシド)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(3-ヒドロキシ)モルホリニル)-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；1-(5-(4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン-7-イル)-2-ピリジル)-ピペリジン-4-ホスフェート、2ナトリウム塩；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-メチレニルピペリジニル)-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-ヒドロキシ-4-(ヒドロキシメチル)ピペリジニル)-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-(4,4-エチレンジオキシピペリジニル)-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-(4-オキソ-ピペリジニル)-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-アミノ-S-シクロヘキシル-7-(6-(4-メチレニルピペリジニル)-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン；4-N-(イミノメチル)アミノ-5-シクロヘキシル-7-(6-ジメチルアミノ-3-ピリジル)ピリド[2,3-d]ピリミジン。
【００５９】
式（II）の化合物は、当技術分野において公知であり、当業者には容易に利用可能な方法を用いて合成することができる。例えば、5,7-二置換および5,6,7-三置換-4-アミノピリド[2,3-d]ピリミジン化合物の調製が国際公開公報第98/46605号および米国特許第6,0303,969号に記載されており、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる。Victory, P. et al., Tetrahedron (1995), 51, 10253-10258は、4-アミノ-5,7-ジフェニルピリド[2,3-d]ピリミジン化合物の合成を記載しており、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【００６０】
本発明に適用可能な他のアデノシンキナーゼ阻害剤は、米国特許第5,506,347号；第5,763,696号；第5,763,597号；第5,674,998号；第5,721,356号；第5,726,302号；第5,795,977号；および第5,864,033号に記載されており、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【００６１】
S-アデノシルホモシステインヒドロラーゼ（SAHH）は、S-アデノシルホモシステイン（SAH）の細胞内レベルを制御する遍在性の細胞酵素である。SAHHは当技術分野においてAA987153、アデノシルホモシステイナーゼ、AdoHcyase、AL024110、CuBP、CUBP、肝銅結合タンパク質、MGC102079、MGC118063、MGC19228、S-アデノシル-L-ホモシステインヒドロラーゼ、およびSAHヒドロラーゼとしても公知である。SAHHはS-アデノシルホモシステインのアデノシンおよびホモシステインへの加水分解を触媒する。SAHはいくつかのS-アデノシルメチオニン依存性メチルトランスフェラーゼの強力な生成物阻害剤で、SAHHの阻害はS-アデノシル-L-メチオニン（SAM）依存性メチル化反応の阻害を引き起こす。
【００６２】
S-アデノシルホモシステインヒドロラーゼ阻害剤には、アデノシンならびにその類似体および誘導体が含まれるが、それらに限定されるわけではない。例示的なアデノシン類似体および誘導体には、9(S)-(2,3-ジヒドロキシプロピル)アデニン［(S)-DHPA］；D-エリタジン；(R,S)-3-アデニン-9-イル-2-ヒドロキシプロパン酸［(R,S)-AHPA］；アデノシン（Ado）ジアルデヒド；3-デアザアデノシン（c3-Ado）；アリステロマイシン（Ari）および類似体；ネプラノシンA（NPAまたはNpcA）；ジヒドロキシシクロペンテニルアデニン（DHCeA）；ジヒドロキシシクロペンテニル-3-デアザアデニン（c3-DHCeA）；ジヒドロキシシクロペンタニルアデニン（DHCaA）；ジヒドロキシシクロペンタニル-3-デアザアデニン（c3-DHCaA）；3-デアザネプラノシンA（c3-NpcA）；3-デアザアリステロマイシン（c3Ari）；炭素環式-3-デアザアデノシン（C-c3Ado）；6'-CメチルネプラノシンA；2'-デオキシアデノシン；ツベルシジン；リバビリン；ピラアゾフリン；2'-デオキシ-2'-クロロアデノシン；イソペンテニルアデノシン；メチルチオアデノシン（MTA）；9-β-アラビノフラノシルアデニン（Ara-A、ビダラビン）；2'-デオキシアデノシン；N-メチルアリステロマイシン、8-アザアリステロマイシンおよび3-デアザアリステロマイシン、ならびにそれらのジアルデヒドおよびジオール誘導体；(±)-5ノルアリステロマイシンおよびその2,6-ジアミノ類似体が含まれるが、それらに限定されるわけではない。アリステロマイシン類似体および誘導体には、2'-デオキシ-、3'-デオキシ-、3'-アミノ-3'-デオキシ-、3'-アミノ-3'-デオキシアラビノフラノシル、6'-ヒドロキシ、6'-メルカプト、8'-ブロモ、8-ヒドロキシアリステロマイシン、アリステロマイシン-3'-環状ホスフェートおよびアリステロマイシン-6'-環状ホスフェートが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００６３】
分子のアミノ酸、塩基または糖部分に修飾されたS-アデノシルホモシステイン（SAH）の特定の構造類似体も、SAHヒドロラーゼ阻害剤として用いることができる。例示的SAH類似体には、2-フルオロ-S-アデノシルホモシステイン（2-FSAH）、S-アデノシル-L-ホモシステインスルホキシド、S-アデノシル-Lホモシステインスルホン、S-アリステロマイシニル-L-ホモシステイン、5'-S-(3-カルボキシル-4-ニトロフェニル)チオアデノシンおよび5'-S(メチル)-5'-S-(ブチル)チオアデノシンが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００６４】
SAHHの他の阻害剤には、例えばYuan et al., Exp. Opin. Ther. Patents, 1999, 9: 1197-1206；Wolfe and Borchardt, Journal of Medicinal Chemistry, 1991, 34:1521-1530)；Votruba and Holy, Coll Czech. Chem. Commun., 1980, 45:3039；Schanche et al., Molecular Plarmacology, 1984, 26:553-558；De Clercq E., Nucleosides Nucleotides, 1998, 17(1-3):625-34；および米国特許出願第10/410,879号に記載のものが含まれ、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【００６５】
AMP活性化プロテインキナーゼは、AMPの濃度上昇により、またはAMPに類似の化合物により、アロステリックに活性化されうる。例えば、AMP類似体はアデノシン-5'-チオ一リン酸、アデノシン5'-ホスホラミデート、ホルミシンA5'-一リン酸、または5'-一リン酸-5-アミノイミダゾール-4-カルボキサミドリボヌクレオシド（ZMP）でありうる。
【００６６】
本発明のこの局面および他の局面のいくつかの態様において、AMP活性化プロテインキナーゼ活性化剤は式（III）、ならびにその薬学的に許容される塩およびアミドである：
2013514781.tif 000009
式中、
R17はH、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、OR22、SR22、N(R22)2、(CH2)mR23であるか、またはR17およびR18はそれらが連結している原子と一緒になって、置換されていてもよい5〜8員複素環を形成し；
R18およびR19はそれぞれ独立にH、OR22、SR22、N(R22)2であるか、またはR18およびR19はそれらが連結している原子と一緒になって、置換されていてもよい5〜8員複素環を形成し；
R20およびR21はそれぞれ独立にハロゲン、CN、N2、OR22、SR22、N(R22)2、C(O)R24、C(O)OR24、C(O)N(R24)2、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
R22はそれぞれの場合で独立にH、C(O)R24、C(O)OR24、C(O)N(R24)2、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
R23はR22、OR22 、SR22、N(R22)2、N2、CN、ハロゲン、または
2013514781.tif 000010
であり；
R24はそれぞれの場合で独立にH、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
XはO、S、NH、またはCH2であり；
YおよびZはそれぞれ独立にNまたはCR25であり；
R25はそれぞれの場合で独立にH、ハロゲン、CN、C(O)R24、C(O)OR24、C(O)N(R24)2、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
Z1はそれぞれの場合で独立にOまたはSであり；
Z2はそれぞれの場合で独立にH、OM、SM、OR22、SR22、N(R22)2、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
Mはアルカリ金属カチオンであり；
mは1、2、3、または4であり；
nは0、1、または2である。
【００６７】
いくつかの態様において、MはNa+である。
【００６８】
いくつかの態様において、R17は置換されていてもよいC1〜C6アルキル、OR22、N(R22)2または(CH2)mR23である。好ましくはC1〜C6アルキルはメチルである。R17がN(R22)2である場合、R22の少なくとも1つはHであり、好ましくはR22はいずれもHである。R17がOR22である場合、R22はHまたはC1〜C6アルキルでありえ、好ましくはR22はHである。
【００６９】
R17が(CH2)mR23である場合、mは1または2であり、好ましくはmは1である。いくつかの態様において、R23はOR22またはN(R22)2である。R23がN(R22)2である場合、R22の少なくとも1つはHであり、好ましくはR22はいずれもHである。R23がOR33である場合、R33はHまたはC1〜C6アルキルでありえ、好ましくはR5はHである。いくつかの態様において、R17はCH2OHである。
【００７０】
いくつかの態様において、式（III）の化合物のR17およびR18は、それらが連結している原子と一緒になって、5〜8員複素環を形成し、ここで複素環の骨格は
2013514781.tif 000011
を含み、ここでZ3はそれぞれの場合で独立にOまたはSであり、かつZ4はH、OM、SM、OR22、SR22、N(R22)2、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルである。好ましくはZ3はOであり、かつZ4はOMまたはSMである。
【００７１】
いくつかの他の態様において、XはO、NHおよびCH2からなる群より選択される。好ましくはXはOである。
【００７２】
さらにいくつかの他の態様において、R18およびR19はいずれもOR22である。いくつかの好ましい態様において、R18およびR19はいずれもOHである。
【００７３】
いくつかの態様において、R20はハロゲン、CN、OR22、任意にC1〜C6アルキル、N(R22)2、C(O)R24、C(O)OR24、およびC(O)N(R24)2からなる群より選択され、ここでR22およびR24は上で定義したとおりである。好ましくはR20はNHR22であり、より好ましくはR20はNH2である。
【００７４】
いくつかの態様において、R21はハロゲン、CN、OR22、C1〜C6アルキル、N(R22)2、C(O)R24、C(O)OR24、およびC(O)N(R24)2からなる群より選択され、ここでR22およびR24は上で定義したとおりである。好ましくはR21はC(O)NHR24であり、より好ましくはR21はC(O)NH2である。
【００７５】
いくつかの態様において、R20はNH2ではなく、かつR21はC(O)NH2ではない。
【００７６】
いくつかの態様において、YまたはZの少なくとも1つはCR25であり、好ましくはYはCR25であり、より好ましくはYはCH2である。いくつかの態様において、YはCR25であり、かつZはNである。
【００７７】
いくつかの態様において、YおよびZはいずれもCR25である。好ましくはYはCH2であり、ZはCR25であり、ここでR25はCN、ハロゲン、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいアリールアルキル、および置換されていてもよいヘテロアリールアルキルからなる群より選択される。好ましくはアリール基はフェニル基であり、これは置換されていてもよい。
【００７８】
いくつかの態様において、式（III）の化合物は式（IIIa）に示す立体化学的配置を有する。
2013514781.tif 000012
【００７９】
いくつかの態様において、式（III）の化合物は式（IIIb）に示す立体化学的配置を有する。
2013514781.tif 000013
【００８０】
いくつかの態様において、AMP活性化キナーゼ活性化剤は5-アミノイミダゾール-4-カルボキサミドリボヌクレオシド（本明細書においてAICARとも呼ぶ）である。
【００８１】
式（III）の化合物は、例えば米国特許第3,450,693号および第5,658,889号に記載の方法を用いて調製することができ、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる。Mioyoshi et al., Chem. Pharm. Bull. (1976), 24:2089-2093；Chambers et. al., Nucleosides & Nucleotides (1988), 7: 339-346；およびSrivastava et al. J. Org. Chem. (1975) 40:2920-2924は、5-アミノイミダゾール-4-カルボキサミドリボヌクレオシドの誘導体および類似体を記載している。
【００８２】
本発明に適用可能な他のAMPK活性化剤は、米国特許第7,119,205号および米国特許公報第2006/0287356号；第2007/0015665号；および第2007/024420号に記載されており、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【００８３】
膵細胞
本明細書において用いられる「膵細胞」なる用語は、内分泌および外分泌組織の両方を含みうる膵組織の細胞、または細胞集団、または細胞の調製物、ならびにそれら由来の細胞株を意味する。膵内分泌部は、ランゲルハンス島として公知のクラスタ内に配置されたホルモン産生細胞からなる。島を形成する4つの主な細胞型（「島細胞」）のうち、α細胞はグルカゴンを産生し、β細胞はインスリンを産生し、δ細胞はソマトスタチンを産生し、PP細胞は膵ポリペプチド（PP）を産生する。膵外分泌部は膵腺房および膵管を含む。膵腺房細胞は一連の消化酵素を合成する。膵管細胞は消化管から分泌されるホルモンに応答して炭酸水素イオンおよび水を分泌する。したがって、「膵細胞」なる用語は、α細胞、β細胞、δ細胞、PP細胞、腺房細胞、膵管細胞、間葉細胞、線維芽細胞および膵結合組織にある他の細胞を含む、膵臓で見られる細胞、もしくは他の細胞（例えば、分化していない、または十分に分化していない、またはまだ分化する、内皮細胞、神経細胞、および前駆細胞）、またはその混合物もしくは組み合わせを含む。
【００８４】
膵細胞に特徴的なマーカーには、細胞表面タンパク質またはコーディング遺伝子の発現、細胞内タンパク質またはコーディング遺伝子の発現、細胞の形態学的特徴、ならびにグルカゴン、インスリンおよびソマトスタチンなどの分泌生成物の産生が含まれる。当業者であれば、公知の免疫蛍光、免疫化学、ポリメラーゼ連鎖反応、インサイチューハイブリダイゼーション、ノーザンブロットアッセイ法、化学または放射化学または生物学的方法により、島細胞特異的な特徴の有無を容易に確認しうることを理解するであろう。
【００８５】
望まれる場合には、膵細胞の集団における細胞の型を、当技術分野において周知の技術を用いて判定してもよい。例えば、島細胞に特異的なジチゾンなどの細胞型特異的染色剤の使用。または、例えばインスリン、ソマトスタチン、グルカゴン、膵ポリペプチドサイトケラチン、アミラーゼ、およびリパーゼなどの、様々な膵細胞特異的タンパク質を指向する抗体を用いて免疫蛍光染色を実施してもよい。加えて、細胞型を、例えば光学顕微鏡、または電子顕微鏡などの技術を用いて、その形態により判定してもよい。
【００８６】
いくつかの態様において、膵細胞は膵内分泌組織由来である。いくつかの態様において、膵細胞はランゲルハンス島内にある。本明細書において用いられる「島（islet）」または「島（islets）」なる用語は、α、β、δ、およびε細胞を含むランゲルハンス島内の成分である細胞型、完全な島、島断片またはこれらの組み合わせを含む。
【００８７】
本明細書において用いられる「膵細胞」なる用語は、一次膵細胞、脱分化細胞由来の、例えば人工多能性幹細胞（iPSC）由来の膵細胞様細胞、または内胚葉起源の細胞（例えば、肝細胞または膵外分泌細胞）から直接リプログラミングされた膵細胞様細胞を含む。一つの態様において、膵細胞は不死化細胞株（例えば、培養中に無限に増殖する）ではない。一つの態様において、膵細胞は、例えば軟寒天中での増殖などの形質転換特性を示すまたは接触阻害の非存在を示す細胞などの形質転換細胞ではない。
【００８８】
膵細胞集団は、単一の膵細胞型からなってもよく、異なる膵細胞型の混合物からなってもよい。本明細書に記載の本発明のこの局面および他の局面のいくつかの態様において、膵細胞集団はα細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される膵細胞型からなる。いくつかの態様において、膵細胞集団はβ細胞の集団である。いくつかの態様において、膵細胞集団は非膵細胞型も含む。
【００８９】
膵細胞集団が異なる膵細胞型の混合物を含む場合、異なる細胞型は互いに任意の比で存在しうることが理解されるべきである。特定の理論に縛られることを望むわけではないが、混合物中の各細胞型は全細胞の1〜99％の間で存在しうる。いくつかの態様において、膵細胞集団は集団中の全細胞に対して1〜99％の間のβ細胞を含む。いくつかの態様において、膵細胞集団は集団中の全細胞に対して1〜50％の間のβ細胞を含む。
【００９０】
一つの態様において、膵細胞は一次膵細胞である。いくつかの態様において、膵細胞は一次膵β細胞である。いくつかの態様において、膵細胞は形質転換膵細胞ではない。いくつかの態様において、膵細胞は形質転換膵β細胞ではない。いくつかの態様において、膵細胞は不死化膵細胞ではない。いくつかの態様において、膵細胞は不死化膵β細胞ではない。
【００９１】
いくつかの態様において、膵細胞は再分化膵細胞である。本明細書において用いられる「再分化膵細胞」なる用語は、脱分化膵細胞から分化した膵細胞を意味する。いくつかの態様において、膵細胞は再分化β細胞である。本明細書において用いられる「再分化β細胞」なる用語は、脱分化β細胞から分化したβ細胞を意味する。再分化β細胞はグルコース調節性の様式でインスリンを分泌することができ、β細胞型の形態を有し、アドヘレンスジャンクションを形成することができる。例えば、Volk et al., Arch Pathol. 88(4): 413-22 (1969)を参照されたい。
【００９２】
いくつかの態様において、膵細胞は脱分化体細胞（例えば、リプログラミング細胞）由来である。例えば、多能性幹細胞、または膵細胞へと脱分化した体細胞（例えば、内胚葉起源の細胞の直接リプログラミングによる）。特定の理論に縛られることを望むわけではないが、脱分化細胞はその元であるより原始的な細胞型に似た形態、例えば間葉性の形態を有する。
【００９３】
膵細胞は対象またはドナーの胚幹細胞（ESC）から誘導する（すなわち脱分化させる）こともできる。いくつかの態様において、人工多能性幹細胞を対象またはドナーから生成させ、次いで膵細胞または膵細胞様細胞に分化させることができる。ヒト細胞におけるβ細胞分化の誘導は、米国特許第6,84,585号；第6,911,324号；および第7,276,352号ならびに米国特許第公報米国特許出願公報第2006/02,922,127号に記載されており、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる。Brolen, G.K. et al., Diabetes (2005), 54:2867-2874およびSegev, H., Stem Cells (2004), 22:265-274はヒト胚幹細胞のβ細胞様細胞への分化の方法を記載しており、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【００９４】
いくつかの態様において、膵細胞は安定化状態にあり、例えば細胞を対象から採取し、一定期間の保存を可能にするような様式で処理した。例えば、細胞を、解凍したときに生存可能であるように、例えば一次細胞を凍結させるために当技術分野において公知の方法を用いて凍結させることができる。例えば、当技術分野において公知の、生きた哺乳動物を産生するための胚を凍結させかつ解凍する方法を、本発明の方法において用いるために適合させることができる。そのような方法は、例えば1つまたは複数の凍結保護物質、例えば細胞に対する凍結-解凍による損傷を防止する物質と共に、液体窒素を用いることを含んでいてもよい。
【００９５】
対象またはドナーから得た膵細胞の集団は実質的に純粋であり、例えば未分化細胞が約40％以下、すなわち、完全に分化した膵細胞が少なくとも約60％でありうる。いくつかの態様において、集団は少なくとも約70％、75％、80％、90％、95％またはそれ以上の完全に分化した膵細胞である。集団の純度は、当技術分野において公知の方法を用いて判定し、操作することができる。例えば、蛍光活性化細胞選別を用いる方法を用いることができる。例えば、管上皮細胞を、例えば本明細書に記載のとおり、蛍光標識管特異的レクチン（例えば、ドリコス（Dolichos biflorus）アグルチニン（DBA））で細胞を標識することにより検出および計数し、蛍光活性化細胞選別法（例えば、フローソーティング）またはDBAに結合したカラムもしくはビーズなどの基質への免疫吸着により、集団から除去することができる。他の非β細胞を、自己蛍光に基づくフローソーティングを含む、同様の方法を用いて除去することもできる。
【００９６】
対象から得た膵細胞の集団は均質または不均質でありうる。いくつかの態様において、対象から得た膵細胞は1つの細胞型のもの、例えばα細胞、β細胞、δ細胞、またはε細胞である。他の態様において、対象から得た膵細胞は異なる膵細胞型の混合物を含む。
【００９７】
いくつかの態様において、膵細胞は哺乳動物、例えばマウス、ラットまたはヒト由来である。いくつかの態様において、膵細胞は、さらなるβ細胞の必要性に基づいて選択した対象由来である。
【００９８】
膵細胞と化合物との接触
膵細胞集団を、本明細書に記載の化合物と、細胞培養物中で、例えばインビトロまたはエクスビボで接触させることができ、または該化合物を、対象に、例えばインビボで投与することもできる。本発明のいくつかの態様において、本明細書に記載の化合物を対象に投与して、β細胞の機能および/または数の低減により引き起こされる障害、例えば高血糖または糖尿病を治療および/または予防することができる。
【００９９】
「エクスビボ」なる用語は、生きている生物から除去され、生物の外部（例えば、試験管内）で培養された細胞を意味する。
【０１００】
膵細胞の集団を接触させることに関連した、本明細書において用いられる「接触させること」または「接触させる」なる用語は、膵細胞を、示される化合物または物質を含む適切な培地に供することを含む。膵細胞集団がインビボである場合、「接触させること」または「接触させる」は、薬学的組成物中の化合物または物質を、該化合物または物質がインビボで膵細胞集団に接触するような適切な投与経路を介して対象に投与することを含む。
【０１０１】
インビボ法のために、本明細書に記載の化合物の治療的有効量を対象に投与することができる。化合物を対象に投与する方法は当技術分野において公知であり、当業者であれば容易に利用可能である。
【０１０２】
対象においてβ細胞複製を促進することは、β細胞の機能および/または数の低減によって引き起こされるいくつかの障害、例えば高血糖または糖尿病の治療、予防または回復につながりうる。特定の理論に縛られることを望むわけではないが、対象においてβ細胞複製を増大させることは、β細胞の密度および/または数、例えばβ細胞量の増大につながる。
【０１０３】
本明細書において用いられるβ細胞量の増大とは、β細胞の数の増大、例えば本明細書に記載の化合物で治療している対象におけるβ細胞（例えば、膵β細胞）の数の、治療開始前の対象におけるβ細胞の数と比べた増大を意味する。β細胞量の増大は、治療開始前の対象におけるβ細胞量に比べて、治療した対象において少なくとも5％、10％、20％、30％、40％、50％、50％、70％、80％、90％、1倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍またはそれ以上でありうる。
【０１０４】
エクスビボ法での使用に適した膵細胞は、当業者には周知の方法に従って膵臓から調製することができる。例えば、回収した膵臓を酵素溶液と共に37℃または約37℃でインキュベートして、膵組織を消化し、組織および細胞の小さなクラスタにすることができる。適切な消化時間の後、組織消化物をろ過して大きな未消化組織を除去することができる。次いで、消化した組織をFicoll、ポリスクロース、デキストランなどの密度勾配にかけることができる。密度勾配は連続または不連続のいずれであってもよい。次いで、密度勾配を負荷した組織を遠心分離することができ、消化物中に含まれる細胞はそれらの密度に応じて勾配内を移動する。細胞を勾配から回収し、洗浄し、培養物中に加えることができる。この様式で調製した膵細胞は複数の細胞型を含みうる。
【０１０５】
エクスビボ法に関して、膵細胞は自己膵細胞、すなわち、さらなるβ細胞を必要としている対象から入手した細胞を含みうる（すなわち、ドナーとレシピエントは同一個体である）。自己膵細胞は細胞の免疫学に基づく全ての拒絶反応を回避するという利点を有する。または、細胞は異種、例えばドナーから入手したものでもよい。第二の対象は同種または異種でありうる。典型的には、細胞がドナー由来である場合、免疫抑制の必要性を低減または消失させるため、それらはレシピエントとの十分な免疫学的適合性を有するドナーに由来する、すなわち、移植拒絶反応を受けない。いくつかの態様において、細胞は、異種原料、すなわち、レシピエント、またはレシピエントの種との十分な免疫学的適合性を有するよう遺伝子操作された非ヒト哺乳動物から入手する。免疫学的適合性を判定する方法は当技術分野において公知で、HLAおよびABO決定因子のドナー-レシピエント適合性を評価するための組織分類を含む。例えば、Transplantation Immunology, Bach and Auchincloss, Eds. (Wiley, John & Sons, Incorporated 1994)を参照されたい。いくつかの態様において、膵細胞は組換えβ細胞、例えばその全内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,114,599号；第6,242,254号；および第6,448,045号に記載のものである。
【０１０６】
いくつかの態様において、対象はI型、1.5型もしくは2型糖尿病を患っているか、または前糖尿病状態を有する。
【０１０７】
特定の理論に縛られることを望むわけではないが、任意の適切な細胞培地を本発明のエクスビボ法のために用いることができる。いくつかの態様において、β細胞を、半接着斑形成を促進することができる細胞マトリックスタンパク質存在下で培養する。例えば、ラット膀胱（bladed）癌細胞株804GまたはNBT-IIによって産生された細胞マトリックスタンパク質は、半接着斑形成を促進することが当技術分野において公知である。したがって、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,510,263号は、804GおよびNBT-IIマトリックス上で培養した膵島細胞増殖の増強を開示している。
【０１０８】
いくつかの態様において、細胞をラット膀胱癌細胞株804GまたはNBT-II由来の条件培地中で培養する。細胞を条件培地由来の1つまたは複数のマトリックスタンパク質を加えた培地中で培養することもできる。そのようなマトリックスタンパク質は天然原料から精製するか、または当技術分野において公知の組換え法を用いて産生することができる。
【０１０９】
いくつかの他の態様において、ラミニン5と接触している培地中で細胞を培養する。好ましくは、ラミニン5はカリニンおよびエピリグリンからなる群より選択される。ラミニン5は、例えば、これに限定されるわけではないが、MCF 10A細胞から得た細胞外マトリックスなど、いくつかの原料から得ることができる。
【０１１０】
本明細書記載の化合物とのエクスビボでの接触後、膵細胞、例えばβ細胞が所望の集団数または密度、例えば細胞約1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107個またはそれ以上に達したら、該細胞をさらなるβ細胞を必要としている対象に移植することができる。細胞は、当初該細胞を得た対象または別の対象に移植することができる。哺乳動物から適切な膵細胞、例えばβ細胞を外科的に摘出および移植する方法は当技術分野において公知であり；例えば、Shapiro et al., N. Engl. J. Med. 343(4):230-8 (2000)；Ryan et al., Diabetes 50(4):710-9 (2001)を参照されたい。
【０１１１】
膵細胞が化合物と接触する際、化合物はβ細胞に直接的または間接的効果を有しうる。本明細書において用いられる「直接的効果」とは、化合物がβ細胞と直接相互作用する、例えばβ細胞上の細胞表面受容体に結合し、β細胞中に取り込まれることを意味する。本明細書において用いられる「間接的効果」とは、化合物がβ細胞と直接相互作用しないことを意味する。例えば、化合物は非β細胞と相互作用し、β細胞の複製または増殖の速度に間接的に影響することができる。特定の理論に縛られることを望むわけではないが、化合物は非β細胞からの分子の発現および/または分泌を誘導し、次いでこの分子はβ細胞の複製または増殖の速度に直接または間接的に影響することにより、β細胞に間接的に影響することができる。
【０１１２】
β細胞複製の増大をモニターする方法
本発明のエクスビボ法のために、β細胞複製の増大を、細胞複製を測定するための当技術分野において公知の任意の方法によりモニターすることができる。例えば、β細胞複製を、少なくとも1つの細胞複製マーカー、例えばKi-67またはPH3の発現を測定することにより判定することができる。非限定例は、有糸分裂特異的事象である、セリン10上のヒストンH3リン酸化（H3-P）をモニターすることにより分裂指数を測定する、定量的免疫蛍光アッセイ法である（Ajiro et al., J Biol. Chem. 271:13197-201. 1996；Goto et al, J Biol Chem. 274:25543-9, 1999）。β細胞複製の増大は、未処理対照に対する処理群のβ細胞の総数の増大に基づいてもよい。いくつかの場合には、β細胞複製の増大は処理群および未処理対照に関する、全細胞に対するβ細胞の割合に基づいてもよい。B細胞複製はKi-67および/またはPH3、ならびにPDX-1を同時発現する細胞の数をモニターすることにより測定することができる。
【０１１３】
本発明のインビボ法のために、β細胞複製の増大を、血液インスリンレベルを測定することにより間接的に評価することができる。特定の理論に縛られることを望むわけではないが、血液インスリンレベルは対象におけるβ細胞の数の間接的尺度、例えばβ細胞量である。したがって、治療開始前および後の血液インスリンレベルは、治療開始前および後の対象におけるβ細胞の数の相対的尺度を間接的に提供することができる。対象におけるβ細胞量は、対象における空腹時血糖濃度を測定することによっても決定することができる。ヒトにおけるβ細胞量と空腹時血糖濃度との間の曲線的関係が、Ritzel, et. al., Diabetes Care (2006), 29:717-718に開示されており、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる。または、VMAT2に特異的に結合する放射性リガンド[11C]DTBZ（ジヒドロテトラベナジン）のβ細胞によるインビボでの取り込みを、ポジトロン放出断層撮影（P.E.T.）走査により測定することもできる。この放射性リガンドは以前、双極性疾患および統合失調症患者の脳のP.E.T.走査を健常対照対象と比べて評価する臨床試験においてヒト対象で用いられている。米国特許公報第2009/0202428号は、1型糖尿病の膵内分泌β細胞量を撮像するためのDTBZの使用を記載しており、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１１４】
インビボでのβ細胞量を推定する方法は、例えばAntkowiak, P.F., et al., Noninvasive assessment of pancreatic-beta-cell function in vivo with manganese-enhanced magnetic resonance imaging. Am J Physiol Endocrinol Metab (2009), 296:E573-E5788；Bergman, R. N., et al., Quantitative estimation of insulin sensitivity. Am J Physiol (1979), 236: E667-E677；Brunzell J.D., et al., Relationships between fasting plasma glucose levels and insulin secretion during intravenous glucose tolerance tests. J. Clin. Endocrinol. Metab (1976), 42 :222-229；DeFronzo, R. A., et al., Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. Am J Physiol (1979), 237: E214-E223；Evgenov N.V., et al., In vivo imaging of islet transplantation. Nat Med (2006), 12:144-148；Kjems, L. L., et al., Decrease in beta-cell mass leads to impaired pulsatile insulin secretion, reduced postprandial hepatic insulin clearance, and relative hyperglucagonemia in the minipig. Diabetes (2001), 50: 2001-2012；Larsen, M. O., et al.,. Loss of beta-cell mass leads to a reduction of pulse mass with normal periodicity, regularity and entrainment of pulsatile insulin secretion in Gottingen minipigs. Diabetologia (2003), 46: 195-202；Larsen, M. O., et al., Measurements of insulin secretory capacity and glucose tolerance to predict pancreatic beta-cell mass in vivo in the nicotinamide/streptozotocin Gottingen minipig, a model of moderate insulin deficiency and diabetes. Diabetes (2003), 52: 118-123；Larsen, M.O. et al., Measuress of Insulin Responses as Predictive Markers of Pancreatic Beta-Cell Mass in Normal and Bet-Cell Reduced Lean and Obese Gottingen minipigs in vivo. Am J Physiol Endocrinol Metab (2005), 2006, 290: E670-E677；McCulloch, D. K., et al., Correlations of in vivo beta-cell function tests with beta-cell mass and pancreatic insulin content in streptozocin-administered baboons. Diabetes (1991), 40: 673-679；Meier, J.J., et al. Functional Assessment of Pancreatic {beta}-Cell Area in Humans. Diabetes, (2009), 58: 1595-1603；Souza F, et al., Longitudinal noninvasive PET-based beta cell mass estimates in a spontaneous diabetes rat model. J. Clin. Invest. (2006), 116: 1506-1513；Tobin B.W., et al., Insulin secretory function in relation to transplanted islet mass in STZ-induced diabetic rats. Diabetes (1993), 42 :98-105；およびWard, W. K., et al., Diminished B cell secretory capacity in patients with noninsulin dependent diabetes mellitus. J Clin Invest (1984), 74: 1318-1328にも記載されており、これらの全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１１５】
糖尿病の治療
本明細書に記載の方法は、β細胞の損失に関連する障害、例えば高血糖または糖尿病を治療する際に有用である。本方法はADK阻害剤、SAHH阻害剤、および/またはAMPK活性化剤を対象に投与することを含みうる。化合物は、例えば、化合物の一定量を膵組織、例えば島に供給する装置の注射または埋め込みにより、全身的または局所的に投与することができる。そのような装置は当技術分野において公知であり、マイクロポンプおよび制御放出マトリックス、例えば経時的に崩壊して調節物質を組織内に放出するマトリックスを含む。
【０１１６】
代替的に、本方法は、細胞に基づく治療法を含む。例えば、本方法は、本明細書に記載の方法によって増殖または増大させたβ細胞集団を対象に埋め込むことを含みうる。いくつかの態様において、細胞は自己由来であり、例えば細胞はそれらを移植する対象と同じ対象由来である。そのような細胞を埋め込むための外科的方法は当技術分野において公知であり、低侵襲性の内視鏡による方法を含む。一般に、ヒトに対しては、体重1キログラムあたり10,000島当量の少なくともほぼ平均（±SD）島量を埋め込むことが望ましく、例えばShapiro et al, N. Engl. J. Med. 343(4):230-8 (2000)を参照されたい。
【０１１７】
一つの局面において、本発明は、以下の段階を含む、対象におけるβ細胞量またはインスリン産生を増大させる方法を提供する：（a）β細胞を細胞培養中でADK阻害剤、SAHH阻害剤、またはAMPK活性化剤と接触させる段階；（b）細胞を、所望の細胞の数または密度を生じるのに十分な時間複製させる段階；および（c）段階（b）の細胞を対象に導入する段階。
【０１１８】
いくつかの態様において、方法は対象からβ細胞を得る追加の段階を含む。
【０１１９】
いくつかの態様において、細胞培養物中の細胞がおよそ1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107個、またはそれ以上となるように、細胞を十分な時間複製させる。
【０１２０】
そのような細胞を対象に導入しうる方法を本明細書に記載する。1つの代表的方法は、生体適合性コーティング中の細胞のカプセル化を含む。このアプローチにおいて、カプセル化した細胞を免疫学的応答から保護しかつ細胞の無制限の増殖および拡散を防止するのにも役立つカプセル状のコーティング中に、細胞を封入する。例示的カプセル化技術は、アルギン酸-ポリリジン-アルギン酸によるカプセル化を含む。特定の態様において、この技術を用いて作成したカプセルは一般に数百の細胞を含み、約1mmの直径を有する。
【０１２１】
O'Shea and Sun (1986), Diabetes 35:943のアルギン酸-ポリリジンカプセル化技術を用い、Fritschy et al. (1991) Diabetes 40:37によって記載された改変を加えて、細胞を埋め込むことができる。この方法に従い、細胞を1.3％アルギン酸ナトリウムに懸濁し、細胞/アルギン酸懸濁液の液滴をシリンジからCaCl2中に押し出すことによりカプセル化する。数回の洗浄段階の後、液滴をポリリジンに懸濁し、再度洗浄する。次いで、カプセル内のアルギン酸を1ml EGTA中に懸濁することにより再度液化し、次いでクレブス平衡塩類緩衝液で再度洗浄する。それぞれのカプセルは数百の細胞を含み、約1mmの直径を有するべきである。
【０１２２】
前述の方法によるカプセル化した島の糖尿病動物モデルへの埋め込みは、非カプセル化島に比べて異種移植片の生存を延長させることにより、正常血糖制御の期間を有意に延ばすことが判明した（O'Shea and Sun (1986), Diabetes 35:943；Fritschy, et al. (1991) Diabetes 40:37）。同様に、カプセル化はクローン化細胞の無制限増殖を防止することができる。細胞を含むカプセルを腹腔内に埋め込み（例えば、細胞約500、1,000または2,000個〜細胞約5,000、10,000または20,000個/動物）、血糖およびインスリンをモニターするために血液試料を毎日採取することができる。
【０１２３】
代替アプローチはアミコン繊維に細胞を播種することである。細胞は半透性の繊維中で網の目にからみ、したがってマイクロカプセル化と類似の様式で保護される（Altman et al., (1986) Diabetes 35:625）。
【０１２４】
カプセル化または繊維播種に成功すると、一般には約1,000〜10,000個の細胞を、通常は、大きなゲージの針（23ゲージ）を通じた腹腔内注射によって、腹腔内に埋め込むことができる。
【０１２５】
本発明の実施に適用可能な、様々な他のカプセル化技法が開発されている（例えば、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる、Lacy et al., (1991), Science, 254:1782-1784；Sullivan et al. Science, 252:718-721；PCT国際公開公報第91/10470号；国際公開公報第91/10425号；国際公開公報第90/15637号；国際公開公報第90/02580号；国際公開公報第8901967号；米国特許第5,011,472号；米国特許第4,892,538号を参照されたい。Cyto Therapeutics社は、現在商業的に利用可能で、本発明の適用において有用な、カプセル化技法を開発した。また、血管装置がマサチューセッツ州ShrewsburyのBiohybridによって開発され、これは本発明の技術に適用可能である。
【０１２６】
埋め込み法に関して、Lacy et al. (1991), Science, 254:1782-1784、およびSullivan et al, (1991) Science, 252:718-721によって最近記載された方法において特定の利点を見いだすことができ、これらはそれぞれ埋め込み法の教示のために全体が参照により本明細書に組み入れられる。これらは、第一に、カプセル化した島の皮下異種移植、第二に、動静脈シャントとしての血管系に接続しうる「人工膵」の島組織の長期埋め込みに言及している。これらの埋め込み法は、これらの出版物に記載の「島組織」の部分で本明細書に開示した、増殖細胞を用いることにより、本発明で用いるために有利に適合させることができる。
【０１２７】
Lacyら（(1991), Science, 254:1782-1784）はアクリル中空繊維中でのラット島のカプセル化およびこれらのアルギン酸ヒドロゲル中での固定化を記載している。カプセル化した島の糖尿病マウスへの腹腔内移植後、正常血糖が回復したことが報告された。また、適切に構築した外部表面を繊維上に有する皮下埋込物を用いて、同様の結果が得られた。本発明の増殖細胞も、同様の皮下注射により哺乳動物に直接に「移植」することができる。
【０１２８】
選択的透過性膜内に島組織をカプセル化したバイオハイブリッド灌流「人工膵」も用いることができる（Sullivan et al, (1991) Science, 252:718-721）。この態様において、管状半透膜を保護ハウジング内で輪状にし、島細胞のための区画を提供する。次いで、ハウジングを越えて延び、動静脈シャントとしての血管系に装置を連結する、動脈ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）移植片に、膜のそれぞれの末端を接続する。島同種移植片を含むそのような装置の膵切除イヌへの埋め込みは、空腹時グルコースレベルの制御をもたらすと報告された。本明細書に記載の改変細胞をカプセル化しているこの型の移植片も、本発明に従って用いることができる。
【０１２９】
カプセル化のもう一つのアプローチは、細胞を糖尿病マウスまたはラットの肩甲部または腹腔内に単に注射することであり、ここでこれらの細胞は腫瘍を形成すると報告されている（Sato et al, (1962) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:1184）。
【０１３０】
薬学的組成物
対象への投与のために、化合物を薬学的に許容される組成物中に供給することができる。これらの薬学的に許容される組成物は、1つまたは複数の薬学的に許容される担体（添加物）および/または希釈剤と共に製剤した、1つまたは複数のADK阻害剤およびAMPK活性化剤の治療的有効量を含む。以下に詳細に記載するとおり、本発明の薬学的組成物は、下記のために適合させたものを含む、固体または液体剤形での投与のために特に製剤することができる：（1）経口投与、例えば水薬（水性または非水性液剤または懸濁剤）、ロゼンジ、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、錠剤（例えば、口腔、舌下、および全身吸収を標的とするもの）、ボーラス、散剤、顆粒剤、舌に適用するためのペースト；（2）例えば皮下、筋肉内、静脈内または硬膜外注射による非経口投与、例えば滅菌液剤もしくは懸濁剤、または徐放性製剤として；（3）局所適用、例えばクリーム、軟膏、または皮膚に適用する制御放出パッチもしくはスプレーとして；（4）腟内または直腸内、例えばペッサリー、クリームまたはフォームとして；（5）舌下；（6）眼；（7）経皮；（8）経粘膜；または（9）鼻内。加えて、化合物を患者に埋め込むか、または薬物送達系を用いて注射することもできる。例えば、Urquhart, et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24: 199-236 (1984)；Lewis, ed. ''Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals'' (Plenum Press, New York, 1981)；米国特許第3,773,919号；および米国特許第35 3,270,960号を参照されたい。
【０１３１】
本明細書において用いられる「薬学的に許容される」なる用語は、健全な医学的判断の範囲内で、妥当なリスク/ベネフィット比に見合う、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしに、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適した、化合物、材料、組成物、および/または剤形を意味する。
【０１３２】
本明細書において用いられる「薬学的に許容される担体」なる用語は、目標化合物を一つの器官、または体の一部から、もう一つの器官、または体の一部へ運ぶ、または輸送することに関連する、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、滑沢剤、タルクマグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくは亜鉛、またはステアリン酸）、または溶媒カプセル化材料などの、薬学的に許容される材料、組成物または溶媒を意味する。それぞれの担体は、製剤の他の成分と適合性であり、患者に有害ではないという意味で「許容され」なければならない。薬学的に許容される担体として役立ちうる材料のいくつかの例には下記が含まれる：（1）ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；（2）トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；（3）カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；（4）粉末トラガカント；（5）麦芽；（6）ゼラチン；（7）ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクなどの滑沢剤；（8）カカオ脂および坐剤ワックスなどの賦形剤；（9）落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油などの油；（10）プロピレングリコールなどのグリコール；（11）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール（PEG）などのポリオール；（12）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；（13）寒天；（14）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝化剤；（15）アルギン酸；（16）発熱物質を含まない水；（17）等張化食塩水；（18）リンゲル液；（19）エチルアルコール；（20）pH緩衝化溶液；（21）ポリエステル、ポリカーボネートおよび/またはポリ無水物；（22）ポリペプチドおよびアミノ酸などの充填剤；（23）血清アルブミン、HDLおよびLDLなどの血清成分；（22）エタノールなどのC2〜C12アルコール；ならびに（23）薬学的製剤において用いられる他の非毒性適合性物質。湿潤剤、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、着香剤、保存剤および抗酸化剤も製剤中に存在しうる。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」などの用語は本明細書において交換可能に用いられる。
【０１３３】
本明細書において用いられる「治療的有効量」なる語句は、任意の医学的治療に適用可能な、妥当なリスク/ベネフィット比を有し、動物における細胞の少なくとも亜集団において一定の所望の治療効果を生じるのに有効な、本発明の化合物を含む化合物、材料、または組成物の量を意味する。例えば、グリコシル化ヘモグロビンレベル、空腹時血糖値、低インスリン血症などの、1型、1.5型または2型糖尿病の少なくとも1つの症状の統計学的に有意かつ測定可能な変化を生じるのに十分な、対象に投与される化合物の量。治療的有効量の判定は十分に当業者の能力の範囲内である。一般に、治療的有効量は対象の既往、年齢、状態、性別、ならびに対象の医学的状態の重症度および種類や、他の薬学的に活性な剤の投与によって変動しうる。
【０１３４】
本明細書において用いられる「投与する」なる用語は、所望の効果が生じるような所望の部位への組成物の少なくとも部分的局在をもたらす方法または経路による、対象への組成物の配置を意味する。本明細書に記載の化合物または組成物を、経口または静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、肺、鼻、直腸、および局所（口腔および舌下を含む）投与を含む非経口経路を含むが、それらに限定されるわけではない、当技術分野において公知の任意の適切な経路により投与することができる。
【０１３５】
例示的な投与様式には、注射、注入、滴下、吸入、または経口摂取が含まれるが、それらに限定されるわけではない。「注射」には、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、嚢内、眼窩内、心内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、脳脊髄内、および胸骨内注射および注入が含まれるが、それらに限定されるわけではない。好ましい態様において、組成物を静脈内注入または注射により投与する。
【０１３６】
疾患または障害の「治療」、「予防」または「回復」とは、そのような疾患または障害の発症を遅延または予防すること、そのような疾患または障害に関連する状態の進行、悪化もしくは増悪進行または重症度を逆転、軽減、回復、阻害、遅延または停止することを意味する。一つの態様において、疾患または障害の症状を少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、または少なくとも50％軽減する。
【０１３７】
糖尿病の治療は標準の医学的方法によって判定する。糖尿病治療の目標は糖のレベルを安全上可能なかぎり正常近くまで引き下げることである。一般に設定される目標は食前で1デシリットルあたり80〜120ミリグラム（mg/dl）、就寝前で100〜140mg/dlである。特定の医師は、患者が低血糖反応を起こす頻度などの他の要素に応じて、該患者のために異なる標的を設定することもある。有用な医学的検査には、血糖値を求めるための患者の血液および尿の検査、グリコシル化ヘモグロビンレベル（HbA1c：過去2〜3か月間の平均血糖値の尺度、正常範囲は4〜6％）の検査、コレステロールおよび脂肪レベルの検査、ならびに尿タンパク質レベルの検査が含まれる。そのような検査は当業者には公知の標準的検査である（例えば、American Diabetes Association, 1998参照）。治療プログラムの成功は、プログラムにおいて眼の疾患、腎疾患、または神経疾患などの糖尿病に関連する合併症を有する患者数の低下によっても判定することができる。
【０１３８】
対象における糖尿病の発症を遅延させることは、糖尿病の少なくとも1つの症状、例えば高血糖、低インスリン血症、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、失明、記憶喪失、腎不全、心血管疾患（冠動脈疾患、末梢動脈疾患、脳血管疾患、アテローム性動脈硬化症、および高血圧を含む）、神経障害、自立神経障害、高血糖性高浸透圧性昏睡、またはこれらの組み合わせの発症の、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも1か月、少なくとも2か月、少なくとも6か月、少なくとも1年、少なくとも2年、少なくとも5年、少なくとも10年、少なくとも20年、少なくとも30年、少なくとも40年またはそれ以上の遅延を意味し、対象の全寿命を含みうる。
【０１３９】
本明細書において用いられる「対象」とは、ヒトまたは動物を意味する。通常、動物は霊長類、齧歯類、家畜または狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類にはチンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、例えばアカゲザルが含まれる。齧歯類にはマウス、ラット、マーモット、フェレット、ウサギおよびハムスターが含まれる。家畜および狩猟動物には、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ属、例えばイエネコ、イヌ属、例えばイヌ、キツネ、オオカミ、鳥類、例えばニワトリ、エミュー、ダチョウ、ならびに魚、例えばマス、ナマズおよびサケが含まれる。患者または対象には前述の、例えば上記したすべての任意のサブセットが含まれるが、ヒト、霊長類または齧歯類などの1つまたは複数の群もしくは種を除く。特定の態様において、対象は哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒトである。「患者」および「対象」なる用語は本明細書において交換可能に用いられる。「患者」および「対象」なる用語は本明細書において交換可能に用いられる。
【０１４０】
好ましくは、対象は哺乳動物である。哺乳動物はヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシでありうるが、これらの例に限定されるわけではない。ヒト以外の哺乳動物を、1型糖尿病、2型真性糖尿病、または前糖尿病状態の動物モデルを代表する対象として有利に用いることができる。加えて、本明細書に記載の方法を家畜および/またはペットを治療するために用いることができる。対象は雄または雌でありうる。対象は、以前に糖尿病（例えば、1型または2型）、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症、または前糖尿病状態と診断されているか、またはこれらを患っている、もしくは有すると特定されており、かつ任意で、糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症、または前糖尿病状態に対する治療をすでに受けているが、その必要はない。対象は、糖尿病または前糖尿病状態を患っていない対象であってもよい。対象は、糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症、または前糖尿病状態と診断されているか、またはこれらを患うことが特定されているものの、糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症、または前糖尿病状態に対する1つまたは複数の治療を受けた結果として公知の糖尿病危険因子の改善を示す、対象であってもよい。または、対象は、以前に糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症、または前糖尿病状態と診断されたことがない対象であってもよい。例えば、対象は、糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症、または前糖尿病状態の1つまたは複数の危険因子を示す対象、あるいは糖尿病危険因子を示さない対象、あるいは糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症、または前糖尿病状態について無症候性である対象でありうる。対象は、糖尿病または前糖尿病状態を患っている患者、またはこれを発症するリスクが高い対象であってもよい。対象は、本明細書において定義する糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症、または前糖尿病状態と診断されているか、またはこれらを有すると特定されている対象でありえ、または、対象は、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症、または前糖尿病状態と診断されたことがないか、またはこれらを有すると特定されたことがない対象でありうる。
【０１４１】
本明細書において用いられる「さらなるβ細胞を必要としている対象」なる語句は、糖尿病（例えば、1型、1.5型または2型）、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症、もしくは前糖尿病状態と診断されるか、または、これらを患っている、有する、もしくは発症するリスクが高いと特定される、対象を意味する。
【０１４２】
さらなるβ細胞を必要としている対象は、糖尿病の診断に用いられる任意の方法を用いて特定することができる。例えば、1型糖尿病は、グリコシル化ヘモグロビン（A1C）検査、無作為血糖検査および/または空腹時血糖検査を用いて診断することができる。糖尿病の診断のパラメーターは当技術分野において公知であり、当業者であれば特段の労力無しに利用可能である。
【０１４３】
いくつかの態様において、本発明の方法は、さらなるβ細胞を必要としていると特定された対象を選択する段階をさらに含む。さらなるβ細胞を必要としている対象は、1型、1.5型または2型糖尿病の症状などの、提示される症状に基づいて選択することができる。糖尿病の例示的症状には、過度の口渇（多飲症）、頻回の排尿（多尿症）、極度の空腹（多食症）、極度の疲労、体重減少、高血糖（hyperglycemia）、低インスリンレベル、高血糖（high blood sugar）（例えば、250mgを超える、300mgを超える血糖値）、尿中のケトンの存在、疲労、乾燥および/または痒みのある皮膚、かすみ目、切創またはただれの治癒遅延、通常よりも多い感染、足の無感覚および刺痛、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、失明、記憶喪失、腎不全、心血管疾患（冠動脈疾患、末梢動脈疾患、脳血管疾患、アテローム性動脈硬化症、および高血圧を含む）、神経障害、自立神経障害、高血糖性高浸透圧性昏睡、およびこれらの組み合わせが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１４４】
ADK阻害剤、SAHH阻害剤、および/またはAMPK活性化剤を対象に、薬学的活性剤との組み合わせで投与することができる。例示的な薬学的活性化合物には、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる、Harrison's Principles of Internal Medicine, 13th Edition, Eds. T.R. Harrison et al. McGraw-Hill N.Y., NY；Physicians Desk Reference, 50th Edition, 1997, Oradell New Jersey, Medical Economics Co.；Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th Edition, Goodman and Gilman, 1990；United States Pharmacopeia, The National Formulary, USP XII NF XVII, 1990；Goodman and Oilman's The Pharmacological Basis of Therapeuticsの最新版；およびThe Merck Indexの最新版に見られるものが含まれるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、薬学的活性剤には、糖尿病の治療のために、およびまたは抗高血糖活性を有するとして当技術分野において公知の薬剤、例えばジペプチジルペプチダーゼ4（DPP-4）の阻害剤（例えば、アログリプチン、リナグリプチン、サクサグリプチン、シタグリプチン、ビルダグリプチン、およびベルベリン）、ビグアニド（例えば、メトホルミン、ブホルミンおよびフェンホルミン）、チアゾリジンジオン（TZD）（例えば、ピオグリタゾン、リボグリタゾン、ロシグリタゾンおよびトログリタゾン）などのペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（PPAR）調節物質、二重PPARアゴニスト（例えば、アレグリタザール、ムラグリタザールおよびテサグリタザール）、スルホニル尿素（例えば、アセトヘキサミド、カルブタミド、クロルプロパミド、グリクラジド、トルブタミド、トラザミド、グリベンクラミド（グリブリド）、グリピジド、グリキドン、グリクロピラミド、およびグリメピリド）、メグリチニド（「グリニド」）（例えば、ナテグリニド、レパグリニドおよびミチグリニド）、グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）および類似体（例えば、エキセンディン-4、エキセナチド、リラグルチド、アルビグルチド）、インスリンおよびインスリン類似体（例えば、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングルリジン、インスリングラルギン、インスリンデテミル、エクスベラおよびNPHインスリン）、α-グルコシダーゼ阻害剤（例えば、アカルボース、ミグリトールおよびボグリボース）、アミリン類似体（例えばプラムリンチド）、ナトリウム依存性グルコース共輸送体T2（SGLT T2）阻害剤（例えば、ダプグリフロジン（Dapgliflozin）、レモグリフロジンおよびセルグリフロジン）ならびにその他（例えばベンフルオレックスおよびトルレスタット）が含まれる。
【０１４５】
1型糖尿病において、β細胞は持続的自己免疫応答によって望ましくない破壊を受ける。この自己免疫応答は、そのような自己免疫応答を阻害または遮断する化合物の使用によって減弱することができる。これは必要とされ、かつ/または要求されるβ細胞量レベルを確立するのに必要な治療法の期間を短縮することができる。いくつかの態様において、薬学的活性剤は免疫応答調節物質である。本明細書において用いられる「免疫応答調節物質」なる用語は、対象の自己免疫応答を阻害する化合物（例えば、低分子、抗体、ペプチド、核酸、または遺伝子療法剤）を意味する。特定の理論に縛られることを望むわけではないが、免疫応答調節物質は炎症性サイトカイン（例えば、IL-12、IL-23またはIL-27）、またはSTAT-4の活性、活性化、または発現を阻害することによって自己免疫応答を阻害する。例示的な免疫応答調節物質には、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,774,130号記載のリソフィリン（LSF）ならびにLSF類似体および誘導体からなる群のメンバーが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１４６】
ADK阻害剤、SAHH阻害剤、および/またはAMPK活性化剤と薬学的活性剤とを同じ薬学的組成物中または異なる薬学的組成物中で（同時にまたは異なる時点で）対象に投与することができる。異なる時点で投与する場合、本発明の化合物および薬学的活性剤は互いの投与の5分、10分、20分、60分、2時間、3時間、4時間、8時間、12時間、24時間以内に投与することができる。ADK阻害剤、SAHH阻害剤またはAMPK活性化剤、および薬学的活性剤を異なる薬学的組成物中で投与する場合、投与経路は異なりうる。例えば、ADK阻害剤、SAHH阻害剤またはAMPK活性化剤を、経口または静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、肺、鼻、直腸、および局所（口腔および舌下を含む）投与を含む非経口経路を含むが、それらに限定されるわけではない、当技術分野において公知の任意の適切な経路で投与し、薬学的活性剤を異なる経路、例えば該薬学的活性剤の投与のために当技術分野において一般に用いられる経路で投与する。非限定例において、式（II）のADK阻害剤（例えば、B8）を経口投与することができる一方で、薬学的活性剤（例えば、DPP-4阻害剤）を皮下投与することができる。
【０１４７】
1つの剤形を生成するために担体材料と組み合わせうる化合物の量は、一般には治療効果を生じる化合物の量である。一般には100パーセントのうち、この量は化合物の約0.1％から99％の範囲、好ましくは約5％から約70％、最も好ましくは10％から約30％である。
【０１４８】
毒性および治療的有効性は、例えばLD50（集団の50％に対して致死的な用量）およびED50（集団の50％において治療的に有効な用量）を判定するための、細胞培養および実験動物における標準の薬学的手順によって判定することができる。毒性効果と治療的効果との間の用量比が治療指数であり、これはLD50/ED50の比で表すことができる。大きな治療指数を示す組成物が好ましい。
【０１４９】
細胞培養アッセイ法および動物試験から得たデータを、ヒトで用いるための用量範囲を製剤化するために用いることができる。そのような化合物の用量は好ましくは、毒性をほとんどまたは全く伴わない、ED50を含む循環濃度の範囲内にある。用量は、用いる剤形および利用する投与経路に応じて、この範囲内で変動してもよい。
【０１５０】
治療的有効用量は最初は細胞培養アッセイ法から推定することができる。動物モデルにおいて、用量を、細胞培養において求めたIC50（すなわち、症状の最大阻害の50％を達成する治療薬の濃度）を含む循環血漿濃度を達成するよう製剤化してもよい。血漿中のレベルを、例えば高性能液体クロマトグラフィにより測定してもよい。任意の特定の用量の効果を適切な生物アッセイ法によってモニターすることもできる。
【０１５１】
用量は医師が決定し、必要に応じて、観察される治療効果に適するように調節してもよい。一般に、組成物を、ADK阻害剤、SAHH阻害剤、および/またはAMPK活性化剤を1μg/kgから150mg/kg、1μg/kgから100mg/kg、1μg/kgから50mg/kg、1μg/kgから20mg/kg、1μg/kgから10mg/kg、1μg/kgから1mg/kg、100μg/kgから100mg/kg、100μg/kgから50mg/kg、100μg/kgから20mg/kg、100μg/kgから10mg/kg、100μg/kgから1mg/kg、1mg/kgから100mg/kg、1mg/kgから50mg/kg、1mg/kgから20mg/kg、1mg/kgから10mg/kg、10mg/kgから100mg/kg、10mg/kgから50mg/kg、または10mg/kgから20mg/kgの用量で与えるように投与する。本明細書において示す範囲はすべての中間の範囲を含む、例えば1tmg/kgから10mg/kgは1mg/kgから2mg/kg、1mg/kgから3mg/kg、1mg/kgから4mg/kg、1mg/kgから5mg/kg、1mg/kgから6mg/kg、1mg/kgから7mg/kg、1mg/kgから8mg/kg、1mg/kgから9mg/kg、2mg/kgから10mg/kg、3mg/kgから10mg/kg、4mg/kgから10mg/kg、5mg/kgから10mg/kg、6mg/kgから10mg/kg、7mg/kgから10mg/kg、8mg/kgから10mg/kg、9mg/kgから10mg/kgなどを含むことが理解されるべきである。前述の中間の範囲も本発明の範囲内であり、例えば1mg/kgから10mg/kgの範囲において、用量は2mg/kgから8mg/kg、3mg/kgから7mg/kg、4mg/kgから6mg/kgなどの範囲であることがさらに理解されるべきである。
【０１５２】
治療の期間および頻度に関して、治療が治療的恩恵を提供している時点を判定するためおよび、用量を増減するかどうか、投与頻度を増減するかどうか、治療を中止するかどうか、治療を再開するかどうか、または治療法に対する他の代替法を行うかどうかを決定するために対象をモニターすることは、熟練した医師にとっては典型的である。投与スケジュールは、対象のポリペプチドに対する感受性などのいくつかの臨床因子に応じて、1週間に1回から毎日まで変動しうる。所望の用量を1回で、または部分用量、例えば2〜4の部分用量に分割して、一定期間で、例えば1日を通して適切な間隔で、または他の適切なスケジュールで投与することができる。そのような部分用量は単位剤形で投与することができる。いくつかの態様において、投与は長期、例えば1日に1回または複数回を数週間または数か月間にわたる。投与スケジュールの例は、1日1回、1日2回、1日3回または1日4回以上を1週間、2週間、3週間、4週間、1か月、2か月、3か月、4か月、5か月、または6か月以上にわたる投与である。
【０１５３】
スクリーニングアッセイ法
さらにもう一つの局面において、本発明は、下記の段階を含む、膵細胞集団におけるβ細胞の複製または増殖を刺激するかまたは増大させるための候補化合物のスクリーニング法を提供する：
（a）膵細胞の集団を試験化合物と接触させる段階；
（b）β細胞複製を評価する段階；および
（c）β細胞複製を増大させるかまたは増強する化合物を選択する段階。
【０１５４】
膵細胞集団は、α細胞、β細胞、δ細胞、および線維芽細胞を含むが、それらに限定されるわけではない、異なる型の膵細胞を含みうる。したがって、いくつかの態様において、膵細胞集団における細胞の少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも95％がβ細胞である。
【０１５５】
いくつかの態様において、膵細胞集団における細胞の90％以下、80％以下、70％以下、60％以下、50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、10％以下、または5％以下がα細胞である。
【０１５６】
いくつかの態様において、膵細胞集団における細胞の90％以下、80％以下、70％以下、60％以下、50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、10％以下、または5％以下がδ細胞である。
【０１５７】
いくつかの態様において、膵細胞集団における細胞の90％以下、80％以下、70％以下、60％以下、50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、10％以下、または5％以下が線維芽細胞である。
【０１５８】
いくつかの態様において、膵細胞集団は50〜90％のβ細胞、10〜30％のα細胞、5〜10％の線維芽細胞、および5〜10％の他の細胞型を含む。この一つのさらなる態様において、膵細胞集団は約75％のβ細胞、約18％のα細胞、約3％の線維芽細胞、および約5％の他の細胞型を含む。
【０１５９】
本明細書において用いられる「試験化合物」なる用語は、β細胞の複製および/または増殖を刺激しかつ/または増大させるそれらの能力についてスクリーニングすることになる、化合物および/または組成物を意味する。試験化合物は、化学物質および化学物質の混合物、例えば有機または無機低分子；オリゴ糖；多糖；生物学的高分子、例えばペプチド、タンパク質、ならびにペプチド類似体および誘導体；ペプチド様物質；核酸；核酸類似体および誘導体；細菌、植物、真菌、または動物細胞などの生物学的材料から作成された抽出物；動物組織；天然または合成組成物；およびこれらの任意の組み合わせを含む、多様な異なる化合物を含みうる。いくつかの態様において、試験化合物は低分子である。
【０１６０】
本明細書において用いられる「低分子」なる用語は、「天然物様」の化合物を意味しうるが、「低分子」なる用語は「天然物様」化合物に限定されることはない。それよりも、低分子は典型的にはいくつかの炭素-炭素結合を含むことによって特徴付けられ、5000ダルトン（5kD）未満、好ましくは3kD未満、さらにより好ましくは2kD未満、最も好ましくは1kD未満の分子量を有する。いくつかの態様において、低分子は700ダルトン以下の分子量を有することが好ましい。
【０１６１】
可能性のある試験化合物の数は数百万におよぶ。低分子、ポリマーおよびゲノムに基づくライブラリを生成する方法は、例えばDing, et al. J Am. Chem. Soc. 124: 1594-1596 (2002)およびLynn, et al., J. Am. Chem. Soc. 123: 8155-8156 (2001)に記載されている。市販の化合物ライブラリは、例えばArQule、Pharmacopia、graffinity、Panvera、Vitas-M Lab、Biomol InternationalおよびOxfordから入手することができる。これらのライブラリを、スクリーニング装置および本明細書に記載の方法を用いてスクリーニングすることができる。NIH Roadmap、Molecular Libraries Screening Centers Network (MLSCN)からのものなどの化学物質ライブラリも用いることができる。化合物ライブラリの包括的リストはwww.broad.harvard.edu/chembio/platform/screening/compound_libraries/index.htm.で見いだすことができる。化学物質ライブラリまたは化合物ライブラリは、最終的にハイスループットスクリーニングまたは工業的製造において通常用いられる保存化学物質の集まりである。化学物質ライブラリは簡単に言うと一連の保存化学物質からなりうる。それぞれの化学物質は、化合物の化学構造、純度、量、および物理化学的特徴などの情報を含むなんらかの種類のデータベースに保存された関連情報を有する。
【０１６２】
実施している特定の態様に依存して、試験化合物は溶液中に遊離で提供することもでき、または担体、もしくは固体支持体、例えばビーズに連結してもよい。いくつかの適切な固体支持体を試験化合物の固定化のために用いてもよい。適切な固体支持体の例には、アガロース、セルロース、デキストラン（すなわち、Sephadex、Sepharoseとして市販されている）カルボキシメチルセルロース、ポリスチレン、ポリエチレングリコール（PEG）、ろ紙、ニトロセルロース、イオン交換樹脂、プラスティックフィルム、ポリアミンメチルビニルエーテルマレイン酸コポリマー、ガラスビーズ、アミノ酸コポリマー、エチレン-マレイン酸コポリマー、ナイロン、絹などが含まれる。加えて、本明細書に記載の方法のために、試験化合物を個別に、またはグループでスクリーニングしてもよい。グループスクリーニングは、所与のグループで複数の陽性結果が期待されないような、有効な試験化合物のヒット率が低い場合には特に有用である。
【０１６３】
いくつかの態様において、試験化合物はβ細胞の複製または増殖を、未処理対照に比べて、少なくとも5％、10％、20％、30％、40％、50％、50％、70％、80％、90％、1倍、1.1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍またはそれ以上増大させる。
【０１６４】
いくつかの態様において、β細胞複製を評価する段階は、β細胞マーカーおよび細胞複製マーカーを検出することを含む。選択した試験化合物を、β細胞マーカーおよび細胞複製マーカーが同じ細胞中に共存している化合物にさらに限定することができる。
【０１６５】
増大したまたは増強されたβ細胞複製を下記によって評価することができる：（i）未処理対照と比べた、培養物中の細胞総数の増大；（ii）未処理対照と比べた、培養物中の少なくとも1つのβ細胞マーカーを発現している細胞総数の増大；（iii）未処理対照と比べた、培養物中の少なくとも1つのβ細胞マーカーを発現している細胞の、細胞総数に対する比の増大；（iv）未処理対照と比べた、少なくとも1つの細胞複製マーカーを発現している細胞数の増大；（v）未処理対照と比べた、少なくとも1つの細胞複製マーカーを発現している細胞の比の増大；または（vi）これらの組み合わせ。
【０１６６】
いくつかの態様において、β細胞複製を自動画像収集およびCellomics ArrayScanVTIを用いた解析により評価する。収集限界/パラメーターは、複製事象のコンピューターによる呼び出しがヒトによる呼び出しと一致するように確立する。そのような自動画像収集および解析により、化合物のハイスループットスクリーニングが可能になる。
【０１６７】
本発明のこの局面および他の局面のいくつかの態様において、膵細胞を、ラット膀胱（bladed）癌細胞株804GまたはNBT-IIによって産生されるものなどの、半接着斑形成を促進することができる細胞マトリックスタンパク質存在下で培養する。米国特許第5,510,263号は804GおよびNBT-IIマトリックス上で培養した膵島細胞増殖の増強を開示しており、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１６８】
本発明のこの局面および他の局面のいくつかの態様において、細胞をラット膀胱癌細胞株804GまたはNBT-II由来の条件培地中で培養する。細胞を条件培地由来の1つまたは複数のマトリックスタンパク質を加えた培地中で培養することもできる。そのようなマトリックスタンパク質は天然原料から精製するか、または当技術分野において公知の組換え法を用いて産生することができる。
【０１６９】
本発明のこの局面および他の局面のいくつかの態様において、細胞をラミニン5と接触している培地中で培養する。好ましくは、ラミニン5はカリニンおよびエピリグリンからなる群より選択される。ラミニン5は、MCF 10A細胞から得た細胞外マトリックスを含むが、それに限定されるわけではない、いくつかの原料から得ることができる。
【０１７０】
条件培地またはマトリックスタンパク質を培地に加えうることが理解されるべきである。または、条件培地またはマトリックスタンパク質を、膵細胞を培養する容器の表面をあらかじめコーティングするために用いることもできる。好ましくは、容器の表面を、膵細胞の播種の前に、804GまたはNBT-II条件培地でコーティングする。
【０１７１】
一般には、播種密度は細胞約10,000個/ウェル〜細胞約100,000個/ウェルの範囲でありうる。いくつかの態様において、細胞播種密度は細胞約25,000個/ウェル〜細胞約75,000個/ウェルの範囲である。一つの態様において、細胞播種密度は細胞約60,000個/ウェルである。一般には、播種時に細胞の少なくとも75％、80％、85％、90％、95％またはそれ以上が生存している。
【０１７２】
播種後、試験化合物との接触前に、膵細胞を表面に十分な時間、例えば少なくとも少なくとも1時間、2時間、3時間、4時間、6時間、8時間、12時間、24時間、36時間、48時間またはそれ以上接着させることができる。いくつかの態様において、細胞を化合物処理の前に48時間接着させる。細胞を十分な時間接着させた後、関心対象の化合物による処理前に培地を変えることができる。
【０１７３】
一般には、適切な期間にわたり対照に比べてβ細胞の複製を増強しうる任意の濃度で、化合物を試験することができる。いくつかの態様において、化合物を約0.1nM〜約1000mMの範囲の濃度で試験する。好ましくは、化合物を約0.1μM〜約20μM、約0.1μM〜約10μM、または約0.1μM〜約5μMの範囲で試験する。一つの態様において、化合物を1μMで試験する。
【０１７４】
膵細胞集団は膵細胞培養に適した任意の温度で維持することができる。一つの態様において、膵細胞は約15℃〜約55℃の範囲の温度で維持する。一つの態様において、膵細胞は37℃で維持する。
【０１７５】
一般には、培養中のβ細胞の数を、膵細胞が試験化合物と十分な時間、例えば少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも3時間、少なくとも4時間、少なくとも5時間、少なくとも6時間、少なくとも7時間、少なくとも8時間、少なくとも9時間、少なくとも10時間、少なくとも11時間、少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも36時間、少なくとも48時間、少なくとも5日間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、またはそれ以上接触した後に計数することができる。細胞を手動で、または自動装置により計数することができる。自動装置の使用により、化合物のハイスループットスクリーニングが可能になる。
【０１７６】
β細胞および複製細胞マーカー検出は、膵細胞が試験化合物と十分な時間、例えば少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも3時間、少なくとも4時間、少なくとも5時間、少なくとも6時間、少なくとも7時間、少なくとも8時間、少なくとも9時間、少なくとも10時間、少なくとも11時間、少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも36時間、少なくとも48時間、少なくとも5日間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、またはそれ以上接触した後に行うことができる。マーカー検出の後、細胞複製および/またはβ細胞マーカーを発現している細胞の数を計数することができる。マーカー検出は、細胞を適切なアッセイ法のために調製する段階、例えば細胞細胞を固定および/または染色する段階を含みうる。
【０１７７】
いくつかの態様において、方法はさらに、未処理対照に比べて細胞総数に対するβ細胞の比を増大させた化合物を選択する段階を含む。
【０１７８】
「β細胞マーカー」なる用語は、β細胞中で特異的に発現される、または存在する、タンパク質、ペプチド、核酸、タンパク質および核酸の多型、スプライスバリアント、タンパク質または核酸の断片、要素、ならびに他の分析物を意味するが、それらに限定されるわけではない。例示的なβ細胞マーカーには、膵および十二指腸ホメオボックス1（PDX-1）ポリペプチド、インスリン、c-ペプチド、アミリン、E-カドヘリン、Hnf3β、PCI/3、Beta2、Nkx2.2、Nkx6.1、GLUT2、PC2、ZnT-8、MAFA、MAFB、ならびにZhang et al., Diabetes. 50(10):2231-6 (2001)に記載のものが含まれるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、β細胞マーカーは核β細胞マーカーである。いくつかの態様において、β細胞マーカーはPDX-1またはPH3である。
【０１７９】
特定の理論に縛られることを望むわけではないが、以前のβ細胞複製スクリーニングの失敗は主にβ細胞識別体として細胞質マーカー（インスリン）を用いた結果である。細胞質マーカーの使用によって、核複製を特定の細胞の身元へと正確に帰属させることが妨害され、すなわち、高密度培養では、複数の核に近いことを考慮すると、細胞質を特定の核へと帰属させることは不可能である。したがって、いくつかの態様において、β細胞マーカーは細胞質β細胞マーカーではない。一つの態様において、β細胞マーカーはインスリンではない。
【０１８０】
「細胞複製マーカー」なる用語は、細胞増殖に特異的に関連する、タンパク質、ペプチド、核酸、タンパク質および核酸の多型、スプライスバリアント、タンパク質または核酸の断片、要素、ならびに他の分析物を意味するが、それらに限定されるわけではない。加えて、「細胞複製マーカー」には、酵素活性の変化、例えば増大または低減が細胞増殖に特異的に関連する場合、酵素活性が含まれる。例示的な細胞複製マーカーには、リン酸化ヒストンH3（PH3）、Ki-67タンパク質、リン酸化MPM-2抗原、増殖細胞核抗原（PCNA、細胞周期のDNA合成期中に細胞の核内で発現されるタンパク質）、ホスホ-S780-Rbエピトープ（Jacobberger, JW, et al, Cytometry A (2007), 73A:5-15）、Cenp-F（マイトシン）、クラスIII βチューブリン、スピンドルチェックポイントタンパク質hMad2、リン酸化ミオシン軽鎖キナーゼ、トポイソメラーゼII、チェックポイントキナーゼ1（Chk1）、小胞モノアミン輸送体2（VMAT2）、サイクリン依存性キナーゼ1（Cdk1）キナーゼ活性の消失が含まれるが、それらに限定されるわけではない。ヒストンH3はSer28またはSer10でリン酸化されうる。
【０１８１】
いくつかの態様において、細胞複製マーカーはKi-67タンパク質またはPH3である。
【０１８２】
Ki-67タンパク質（MKI67としても公知）は増殖に関する細胞マーカーである。これは細胞増殖に緊密に関連している。間期中には、Ki-67タンパク質は細胞核内でもっぱら検出されうるが、有糸分裂ではタンパク質のほとんどは染色体の表面に移動する。Ki-67タンパク質は細胞周期のすべての活動期（G1、S、G2、および有糸分裂）中は存在するが、休止細胞（G0）には存在しない。Ki-67は所与の細胞集団の増殖画分を判定するための優れたマーカーである。
【０１８３】
細胞複製マーカーおよびβ細胞マーカーは当技術分野において公知の方法によって検出することができ、当業者であれば容易に利用可能で、例えば検出のために適切なELISA、免疫蛍光、または免疫組織化学的アッセイ法を用いることができる。MIB-1は、Ki-67タンパク質を検出する一般に用いられるモノクローナル抗体である。これはKi-67陽性率（labelling index）を求めるために臨床適用において用いられる。Ki-67 ELISAはKlein, CL, et al., J. Mater. Sci. Mater. Med. (2000), 11:125-132；Frahm, SO, et al., J. Immunol. Methods (199*0、211:43-50；およびKey G, et al., ,J. Immunol. Methods (1994), 177:113-117に記載されている。リン酸化ヒストンH3検出のためのホスホヒストンH3抗体はCell Signaling TechnologyおよびMilliporeから市販されている。PCNAに対する抗体はSigma Aldrichから市販されている。MPM-2抗原の抗体は有糸分裂中の細胞に特異的で、共通のリン酸化エピトープを有するタンパク質のファミリーを認識する。
【０１８４】
本発明のこの局面および他の局面のいくつかの態様において、膵細胞はランゲルハンス島またはその断片である。いくつかの態様において、膵細胞は哺乳動物、例えばマウス、ラットまたはヒト由来である。いくつかの態様において、膵細胞は対象由来であって、対象はそのさらなるβ細胞の必要性に基づいて選択される。いくつかの態様において、膵細胞は一次膵細胞、例えば一次島細胞である。いくつかの態様において、膵細胞は形質転換膵細胞ではない。
【０１８５】
本発明のこの局面および他の局面のいくつかの態様において、膵細胞を対象から単離し、一晩培養する。
【０１８６】
本発明のこの局面および他の局面のいくつかの態様において、膵細胞をトリプシン処理して細胞1〜10個からなる細胞塊とする。好ましくは、膵細胞をトリプシン処理して細胞1〜7個、より好ましくは細胞1〜5個、最も好ましくは細胞1〜3個からなる細胞塊とする。トリプシン処理した膵細胞を播種前に適切な島培地に再懸濁することができる。いくつかの態様において、トリプシン処理した膵細胞を播種前に一晩回復させる。
【０１８７】
一つの態様において、β細胞複製を刺激するかまたは増大させるための候補化合物のスクリーニング法は下記の段階を含む：
（a）島をトリプシン処理して、細胞1〜3個からなる細胞塊とする段階；
（b）該細胞を一晩回復させる段階；
（c）段階（b）の細胞を96穴プレートのウェルに播種する段階であって、該ウェルが804G条件培地でコーティングされており、細胞播種密度が細胞60,000個/ウェルである、段階；
（d）該細胞を該ウェルの表面に48時間接着させる段階；
（e）1μMの試験化合物をβ細胞と24時間接触させる段階；
（f）該細胞をPDX-1抗体ならびにKi-67および/またはPH3抗体で染色する段階；およびβ細胞複製を評価する段階。
【０１８８】
本明細書において用いられる「形質転換細胞」なる用語は、当技術分野において認められており、無制限増殖の状態に変換されている、すなわち、培養中に無限の分裂回数により増殖する能力を獲得している、細胞を意味する。形質転換細胞は、それらの増殖制御の消失に関して、新生物形成性、未分化、および/または過形成性などの用語により特徴付けられてもよい。一般に、「形質転換β細胞」なる用語は、連続継代培養中で存続する能力の増大またはインビトロでの増殖速度の増大を示す、β細胞を意味する。
【０１８９】
いくつかの態様において、スクリーニング法はハイスループットスクリーニングである。ハイスループットスクリーニング（HTS）は、ロボット工学、データ処理および制御ソフトウェア、液体取り扱い装置、ならびに高感度検出器を用いる科学実験の方法である。ハイスループットスクリーニングすなわちHTSは研究者が何百万もの生化学、遺伝学または薬理学試験を迅速に行うことを可能にする。ハイスループットスクリーニングは当業者には周知で、例えば米国特許第5,976,813号；第6,472,144号；第6,692,856号；第6,824,982号；および第7,091,048号に記載されており、それぞれの全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１９０】
HTSは候補化合物のライブラリに対してアッセイ法のスクリーニングを行うために自動化を用いる。アッセイ法とは、生化学的または生物学的メカニズムの特定の活性について、通常は阻害または刺激についての、試験である。典型的なHTSスクリーニングライブラリまたは「デッキ」は100,000〜2,000,000超の化合物を含みうる。
【０１９１】
HTSの重要な実験器具または試験容器はマイクロタイタープレートである：すなわち、ウェルと呼ばれる小さな開口ディボット（divot）のグリッドを特徴とする、通常は使い捨てであるプラスティック製の小さな容器である。HTS用の最新のマイクロプレートは一般には384、1536、または3456個のウェルを有する。これらはすべて96の倍数で、8×12の9mm間隔のウェルを有する元の96穴マイクロプレートを反映している。
【０１９２】
アッセイ法の準備をするために、研究者はプレートの各ウェルに、膵細胞集団などの、彼らがそれで実験を行いたいと思う適切な試薬を充填する。試薬をウェル内の化合物に吸収、結合、またはそれ以外の反応をさせる（または反応に失敗させる）ために、いくらかのインキュベーション時間が経過した後、プレートのウェルすべてに対して手動または機械のいずれかにより測定を行う。研究者が、例えばコンピューターがそれ自体では容易に判定することができない変化を探るために、顕微鏡を用いる場合、手動測定が必要となることが多い。それ以外では、専用の自動分析機がウェル上で、比色測定、放射能計数などのいくつかの実験を行うことができる。この場合、機械が各実験の結果を数値のグリッドとして出力し、値に対する各数字マッピングは1つのウェルから得る。高性能分析機はこのように2〜3分間隔で数十のプレートを測定することができ、何千もの実験データ点を非常に迅速に生成する。
【０１９３】
もう一つの局面において、本発明は本明細書に記載のスクリーニングアッセイ法によって選択された化合物を提供する。本明細書に記載のスクリーニングアッセイ法によって選択された化合物の類似体、誘導体、および異性体も本明細書において特許請求されることが理解されるべきである。
【０１９４】
糖尿病の診断
1型糖尿病は、膵臓のインスリン産生β細胞の破壊を引き起こす自己免疫疾患である。インスリンの欠乏は空腹時血糖（非糖尿病の人ではおよそ70〜120mg/dL）の上昇を引き起こし、これは、腎限界値（ほとんどの人々で約190〜200mg/dl）を超えると尿中に現れ始める。世界保健機構は真性糖尿病の空腹時血漿グルコース濃度の診断値を7.0mmol/l（126mg/dl）以上（全血では6.1mmol/lまたは110mg/dl）、または2時間グルコースレベル11.1mmol/L以上（200mg/dL以上）と規定している。
【０１９５】
1型糖尿病は、下記を含むがそれらに限定されるわけではない、様々な診断検査を用いて診断することができる：（1）糖化ヘモグロビン（A1C）検査、（2）無作為血糖検査、および/または（3）空腹時血糖検査。
【０１９６】
糖化ヘモグロビン（A1C）検査は、過去2〜3か月間の対象の平均血糖値を反映する血液検査である。この検査はヘモグロビンに結合している血糖のパーセンテージを測定し、これは血糖値に相関する（例えば、血糖値が高いほど多くのヘモグロビンが糖化される）。2回の別々の検査でのA1Cレベル6.5％以上は糖尿病を示している。6から6.5％の間の結果は前糖尿病と考えられ、これは糖尿病発症のリスクが高いことを示す。
【０１９７】
無作為血糖検査は、糖尿病を有することが疑われる対象から無作為の時点で血液試料を採取する段階を含む。血糖値はデシリットルあたりのミリグラム（mg/dL）またはリットルあたりのミリモル（mmol/L）で表すことができる。無作為血糖値200mg/dL（11.1mmol/L）以上は、特に頻回の排尿および極度の口渇などの、糖尿病の任意の徴候および症状と一緒になっている場合は、対象がおそらく糖尿病を有することを示す。
【０１９８】
空腹時血糖検査のために、一晩絶食後に血液試料を採取する。空腹時血糖値100mg/dL（5.6mmol/L）未満は正常と考えられる。空腹時血糖値が100から125mg/dL（5.6から6.9mmol/L）は前糖尿病と考えられるが、2回の別々の検査での126mg/dL（7mmol/L）以上のレベルは糖尿病を示す。
【０１９９】
1型糖尿病は、内因性インスリン産生の尺度であるC-ペプチドアッセイ法を用いて2型糖尿病から区別することもできる。多くの2型糖尿病患者はインスリンを体内で産生し続け、全員がある程度のインスリン耐性を有するため、抗島抗体（グルタミン酸デカルボキシラーゼ、インスリノーマ関連ペプチド-2またはインスリンに対する）の存在、または耐糖能検査により判定したインスリン耐性の欠如も、1型糖尿病を示すものである。
【０２００】
免疫系が1型糖尿病の病因に関与していると思われるため、1型および2型糖尿病を区別するための改善された検査としてGAD 65抗体の検査が提唱されている。
【０２０１】
定義
本明細書において特に記載がないかぎり、本出願と関連して用いられる科学技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。さらに、文脈からそうではないことが求められないかぎり、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数形を含む。
【０２０２】
「糖尿病」および「真性糖尿病」なる用語は本明細書において交換可能に用いられる。世界保健機構は真性糖尿病の空腹時血漿グルコース濃度の診断値を7.0mmol/l（126mg/dl）以上（全血では6.1mmol/lまたは110mg/dl）、または2時間グルコースレベル11.1mmol/L以上（200mg/dL以上）と規定している。真性糖尿病のリスクが高いことを示唆する、または示す他の値には、140/90mmHg以上の高い動脈圧；高い血漿トリグリセリド（1.7mmol/L；150mg/dL）および/または低いHDLコレステロール（男性で0.9mmol/L、35mg/dl未満；女性で1.0mmol/L、39mg/dL未満）；中心性肥満（男性：ヒップに対するウエストの比が0.90超；女性：ヒップに対するウエストの比が0.85超）および/または30kg/m2を超える肥満指数；尿アルブミン排出速度が20μg/分以上、またはアルブミンクレアチニン比が30mg/g以上のミクロアルブミン尿症が含まれる。
【０２０３】
本明細書において用いられる「含む（comprising）」または「含む（comprises）」なる用語は、本発明にとって必須の組成物、方法、およびそのそれぞれの成分に関して用いられるが、必須かそうでないかにかかわらず、明記されていない要素の包含も受け入れられる。
【０２０４】
本明細書において用いられる「本質的に〜からなる」なる用語は、所与の態様に必要とされる要素を意味する。この用語は、本発明のその態様の基本的かつ新規の、または機能的特徴にあまり影響しない、追加の要素の存在を許容する。
【０２０５】
「からなる」なる用語は、態様のその記載中に列挙されていない任意の要素を除く、本明細書に記載の組成物、方法、およびそのそれぞれの成分を意味する。
【０２０６】
実施例中、または特に記載されている場合を除き、本明細書において用いられる成分の量または反応条件を表すすべての数は、すべての場合に「約」なる用語によって修飾されると理解されるべきである。「約」なる用語は、パーセンテージに関して用いられる場合、±1％を意味しうる。
【０２０７】
「ある（a）」、「一つの（an）」、および「その（the）」なる単数形の用語は、文脈から明らかにそうでないことが示されないかぎり、複数の指示物を含む。同様に、「または」なる単語は、文脈から明らかにそうでないことが示されないかぎり、「および」を含むことが意図される。すべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および核酸またはポリペプチドについて示すすべての分子量または分子質量値は近似値であり、説明のために提供されることがさらに理解されるべきである。
【０２０８】
本明細書に記載のものと類似または等価の方法および材料を本開示の実施または試験において用いることができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。「含む（comprises）」なる用語は「含む（includes）」を意味する。「e.g.」なる略語はラテン語のexempli gratiaに由来し、本明細書において非限定例を示すために用いられる。したがって、「e.g.」なる略語は「例えば」なる用語と同義である。
【０２０９】
「低減」、「減少した」、「減少」、「低減する」または「阻害する」なる用語は、すべて本明細書において、一般には統計学的に有意な量の低減を意味するために用いられる。しかし、疑いを避けるために、「減少した」、「減少」または「低減する」または「阻害する」は、参照レベルに比べて少なくとも10％の低減、例えば少なくとも約20％、もしくは少なくとも約30％、もしくは少なくとも約40％、もしくは少なくとも約50％、もしくは少なくとも約60％、もしくは少なくとも約70％、もしくは少なくとも約80％、もしくは少なくとも約90％の低減または最大100％までの低減（例えば参照試料に比べて存在しないレベル）、あるいは参照レベルに比べて10〜100％の間の任意の低減を意味する。
【０２１０】
「増大させた」、「増大させる」または「増強する」または「活性化する」なる用語は、すべて本明細書において、一般には統計学的に有意な量の増大を意味するために用いられ；いかなる疑いも避けるために、「増大させた」、「増大させる」または「増強する」または「活性化する」なる用語は、参照レベルに比べて少なくとも10％の増大、例えば少なくとも約20％、もしくは少なくとも約30％、もしくは少なくとも約40％、もしくは少なくとも約50％、もしくは少なくとも約60％、もしくは少なくとも約70％、もしくは少なくとも約80％、もしくは少なくとも約90％の増大または最大100％までの増大、あるいは参照レベルに比べて10〜100％の間の任意の増大、あるいは参照レベルに比べて少なくとも約2倍、もしくは少なくとも約3倍、もしくは少なくとも約4倍、もしくは少なくとも約5倍もしくは少なくとも約10倍の増大、または2倍から10倍の間もしくはそれ以上の任意の増大を意味する。
【０２１１】
「統計学的に有意な」または「有意に」なる用語は、統計学的有意性を指し、一般にはマーカーの正常濃度未満、またはそれよりも低い2標準偏差（2SD）を意味する。この用語は差があることの統計学的証拠を指す。帰無仮説が実際に真実である場合、帰無仮説を棄却する決定を行う確率と定義される。決定はp値を用いて行うことが多い。
【０２１２】
本明細書において用いられる「IC50」なる用語は、阻害剤非存在下と同じアッセイ法を用いて測定可能なADK活性の最大阻害の50％を生じる阻害剤の濃度を意味する。IC50はインビトロまたはインビボで測定することができる。IC50は、通常のインビトロキナーゼアッセイ法を用いて、インビトロアデノシンキナーゼ活性を測定することにより求めることができる。アデノシンキナーゼの阻害は、例えば当技術分野において周知の標準の手順に従って実施することができる（Yamada, et al., Comp. Biochem, Physiol. 1982, 71B: 367-372）。典型的には、アデノシンキナーゼを阻害剤化合物と、典型的には化合物を酵素、放射性標識した基質アデノシン、塩化マグネシウムおよびATPを含む水溶液に加えることにより、接触させる。酵素は完全な細胞中、または酵素を含む単離細胞成分分画に存在しうる。次いで、酵素を阻害剤存在下、適切な生理的条件下で一定期間維持する。維持時間を決定する手段は当技術分野において周知で、特に酵素濃度および生理的条件に依存する。適切な生理的条件はアデノシンキナーゼの生存性を維持するのに必要なもので、温度、酸性度、張性などが含まれる。例として、IMR-32ヒト神経芽細胞腫細胞などの、アデノシンキナーゼを含む細胞を阻害剤存在下および非存在下で培養する。阻害を、これらの細胞による内因性のまたは外部から適用した14C-アデノシンのリン酸化を阻害する能力として測定する。いくつかの態様において、それぞれの全内容が参照により本明細書に組み入れられる、Cowart M., et al. Structure-activity studies of 5-substituted pyridopyrimidines as adenosine kinase inhibitors. Bioorg Med Chem Lett 2001, 1:83-86；Davies LP, et al. Halogenated pyrrolopyrimidine analogues of adenosine from marine organisms: Pharmacological activities and potent inhibition of adenosine kinase. Biochem Pharmacol 1984, 33:347-355；Erion MD, et al. Design, synthesis and anticonvulsant activity of the potent adenosine kinase inhibitor GP3269. Nucleosides Nucleotides 1997, 16:1013-1021；Hajduk PJ, et al. Design of adenosine kinase inhibitors from the NMR-based screening of fragments. J Med Chem 2000, 3:4781-4786；Jarvis, MF, et al. ABT-702, a novel orally effective adenosine kinase (AK) inhibitor analgesic with antiinflammatory properties: I. In vitro characterization and acute antinociceptive effects in mice. J Pharmacol Exp Ther 2000, 295:1156-1164；Kowaluk EA, Bhagwat SS, Jarvis MF. Adenosine kinase inhibitors. Curr Pharmaceut Des 1998, 4:403-416；Kowaluk EA, et al. Characterization of the effects of adenosine kinase inhibitors on acute thermal nociception in mice. Pharmacol Biochem Behav 1999, 63:83-91；Miller LP, et al. Pre-and peristroke treatment with the adenosine kinase inhibitor, 5' deoxyiodotubercidin, significantly reduces infarct volume after temporary occlusion of the middle cerebral artery in rats. Neurosci Lett 1996, 220:73-76；Miller RL, Adamczyk DL, Miller WH, et al. Adenosine kinase from rabbit liver. II. Substrate and inhibitor specificity. J Biol Chem 1979, 254:2346-2352；Ugarkar BG, et al. Adenosine kinase inhibitors. 2. Synthesis, enzyme inhibition, and antiseizure activity of diaryltubercidin analogues, J Med Chem 2000, 43:2984-2905；Ugarkar BG, et al. Adenosine kinase inhibitors. 1. Synthesis, enzyme inhibition, and antiseizure activity of 5-iodotubercidin analogues. J Med Chem 2000, 43:2883-2893；Wiesner JB, et al. Adenosine kinase inhibitors as a novel pproach to anticonvulsant therapy. J Pharmacol Exp Ther 1999, 289:1669-1677に記載のアッセイ法により、ADK活性を測定する。
【０２１３】
本明細書において用いられる「EC50」なる用語は、活性化剤非存在下と同じアッセイ法を用いて測定可能なAMPK活性の最大活性化の50％を生じる活性化剤の濃度を意味する。言い換えると、「EC50」は、100％活性化をさらなる活性化剤の追加によって増大しない活性の量に設定した場合、50％活性化を生じる活性化剤の濃度である。EC50はインビトロまたはインビボで測定することができる。EC50は、通常のインビトロキナーゼアッセイ法を用いて、インビトロAMPK活性を測定することにより求めることができる。いくつかの態様において、その全内容が参照により本明細書に組み入れられるGorton, JM, et al., 5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside: a specific method for activating AMP-activated protein kinase in intact cells? Eur. J. Biochem. 1995, 229:558-565に記載のアッセイ法により、AMPK活性が得られる。
【０２１４】
「耐糖能異常」（IGT）は、正常よりも高いが、真性糖尿病と分類するには不十分な血糖値を有すると定義される。IGTを有する対象は、75g経口耐糖能試験において、140から199mg/dL（7.8から11.0mmol）の2時間グルコースレベルを有する。これらのグルコースレベルは正常よりも高いが、糖尿病の診断となるレベルよりも低い。耐糖能異常または空腹時グルコース損傷を有する対象は、有意な糖尿病発症リスクを有し、したがって一次予防の重要な標的群である。
【０２１５】
「正常グルコースレベル」は「正常血糖」なる用語と交換可能に用いられ、空腹時静脈血漿グルコース濃度6.1mmol/L（110mg/dL）未満を意味する。この量は任意であるが、そのような値は正常な耐糖能が証明された対象で観察されており、しかし一部の対象は経口耐糖能試験（OGTT）により測定してIGTを有することもある。本発明の文脈における、本明細書において定義された、ベースライン値、指数値、または参照値は、例えば「正常グルコースレベル」を含みうる。
【０２１６】
「前糖尿病状態」とは、正常なグルコースホメオスタシス、代謝、および明白な真性糖尿病で見られる状態の中間である代謝状態を意味する。前糖尿病状態には、メタボリックシンドローム（「X症候群」）、耐糖能異常（IGT）、および空腹時血糖異常（IFG）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。IGTはグルコース調節の食後異常を意味する一方で、IFGは空腹状態で測定される異常を意味する。世界保健機構はIFGの値を空腹時血漿グルコース濃度6.1mmol/L（100mg/dL）以上（全血では5.6mmol/L；100mg/dL）であるが、7.0mmol/L（126mg/dL）（全血では6.1mmol/L；110mg/dL）未満と規定している。米国コレステロール教育プログラム（National Cholesterol Education Program）（NCEP）基準によるメタボリックシンドロームは、下記の少なくとも3つを有すると規定されている：血圧130/85mmHg以上；空腹時血漿グルコース6.1mmol/L以上；ウエスト周り＞102cm（男性）または＞88cm（女性）；トリグリセリド1.7mmol/L以上；およびHDLコレステロール＜1.0mmol/L（男性）または＜1.3mmol/L（女性）。
【０２１７】
「2型糖尿病に関連する合併症」または「前糖尿病状態に関連する合併症」には、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、失明、記憶喪失、腎不全、心血管疾患（冠動脈疾患、末梢動脈疾患、脳血管疾患、アテローム性動脈硬化症、および高血圧を含む）、神経障害、自立神経障害、高血糖性高浸透圧性昏睡、またはこれらの組み合わせが含まれうるが、それらに限定されるわけではない。
【０２１８】
本明細書において用いられる「HBA1c」なる用語は、糖化ヘモグロビンまたは糖化ヘモグロビンを意味し、一定期間（例えば、2〜3か月）にわたる血糖値の指標である。HBA1cのレベルは、対象における治療開始前のHBA1cのレベルに比べて、本明細書に記載の化合物による治療後に少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、またはそれ以上の低減がある場合に、「減少」している。同様に、ケトン体は、本明細書に記載の化合物による治療後に少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、またはそれ以上の低減がある場合に、「減少」している。
【０２１９】
単純にするために、化学部分は一貫して、当業者には明白である適切な構造的状況下の一価の化学部分（例えば、アルキル、アリールなど）または多価の部分でありうると定義および言及される。例えば、「アルキル」部分は一価の基（例えばCH3-CH2-）と呼ぶことができ、または他の場合には、二価の連結部分が「アルキル」であり得、この場合、当業者はアルキルは二価の基（例えば、-CH2-CH2-）であると理解し、これは「アルキレン」なる用語と等価である。同様に、二価の部分が必要とされ、「アルコキシ」、「アルキルアミノ」、「アリールオキシ」、「アルキルチオ」、「アリール」、「ヘテロアリール」、「複素環式」、「アルキル」「アルケニル」、「アルキニル」、「脂肪族」、または「シクロアルキル」であると述べられている状況において、当業者であれば「アルコキシ」、「アルキルアミノ」、「アリールオキシ」、「アルキルチオ」、「アリール」、「ヘテロアリール」、「複素環式」、「アルキル」、「アルケニル」、「アルキニル」、「脂肪族」、または「シクロアルキル」なる用語は対応する二価の部分を指すことを理解するであろう。
【０２２０】
「ハロ」なる用語はフッ素、塩素、臭素またはヨウ素の任意の基を意味する。
【０２２１】
「アシル」なる用語は、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、またはヘテロアリールカルボニル置換基を意味し、それらはいずれも置換基によってさらに置換されていてもよい。例示的アシル基には、(C1〜C6)アルカノイル（例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、バレリル、カプロイル、t-ブチルアセチルなど）、(C3〜C6)シクロアルキルカルボニル（例えば、シクロプロピルカルボニル、シクロブチルカルボニル、シクロペンチルカルボニル、シクロヘキシルカルボニルなど）、複素環式カルボニル（例えば、ピロリジニルカルボニル、ピロリド-2-オン-5-カルボニル、ピペリジニルカルボニル、ピペラジニルカルボニル、テトラヒドロフラニルカルボニルなど）、アロイル（例えば、ベンゾイル）およびヘテロアロイル（例えば、チオフェニル-2-カルボニル、チオフェニル-3-カルボニル、フラニル-2-カルボニル、フラニル-3-カルボニル、1H-ピロイル-2-カルボニル、1H-ピロイル-3-カルボニル、ベンゾ[b]チオフェニル-2-カルボニルなど）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。加えて、アシル基のアルキル、シクロアルキル、複素環、アリールおよびヘテロアリール部分はそれぞれの定義において記載する基の任意の1つであってもよい。
【０２２２】
「アルキル」なる用語は、指定の数の炭素原子を含む、直鎖でも分枝鎖でもよい、飽和非芳香族炭化水素鎖（これらはメチル、エチル、プロピル、アリル、またはプロパルギルを含むが、それらに限定されるわけではない）を意味し、これらは任意にN、O、S、SS、SO2、C(O)、C(O)O、OC(O)、C(O)NまたはNC(O)が挿入されていてもよい。例えば、C1〜C6は基が1から6個（両端を含む）の炭素原子をその中に含みうることを示す。
【０２２３】
「アルケニル」なる用語は、少なくとも1つの二重結合を含むアルキルを意味する。例示的なアルケニル基には、例えばエテニル、プロペニル、ブテニル、1-メチル-2-ブテン-1-イルなどが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０２２４】
「アルキニル」なる用語は、少なくとも1つの三重結合を含むアルキルを意味する。
【０２２５】
「アルコキシ」なる用語は、-O-アルキル基を意味する。
【０２２６】
「アミノアルキル」なる用語は、アミノで置換されているアルキルを意味する。
【０２２７】
「メルカプト」なる用語は、-SH基を意味する。
【０２２８】
「チオアルコキシ」なる用語は、-S-アルキル基を意味する。
【０２２９】
「アリール」なる用語は、各環の0、1、2、3、または4個の原子が置換基によって置換されていてもよい、単環式、二環式、または三環式芳香環系を意味する。例示的なアリール基には、フェニル、ナフチル、アントラセニル、アズレニル、フルオレニル、インダニル、インデニル、ナフチル、フェニル、テトラヒドロナフチルなどが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０２３０】
「アリールアルキル」なる用語は、アリールで置換されているアルキルを意味する。
【０２３１】
「シクリル」、「環式」または「シクロアルキル」なる用語は、3から12個の炭素、例えば3から8個の炭素、および例えば、3から6個の炭素を有する、飽和および部分不飽和環式炭化水素基を意味し、ここでシクロアルキル基はさらに置換されていてもよい。例示的なシクロアルキル基には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、シクロオクチルなどが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０２３２】
「ヘテロアリール」なる用語は、単環式の場合は1〜3個のヘテロ原子、二環式の場合は1〜6個のヘテロ原子、または三環式の場合は1〜9個のヘテロ原子を有し、該ヘテロ原子はO、N、またはSから選択される（例えば、単環式、二環式、または三環式の場合にそれぞれ、炭素原子およびN、O、またはSの1〜3個、1〜6個、または1〜9個のヘテロ原子）、芳香族5〜8員単環式、8〜12員二環式、または11〜14員三環式環系を意味し、ここで各環の0、1、2、3、または4個の原子は置換基によって置換されていてもよい。例示的なヘテロアリール基には、ピリジル、フリルまたはフラニル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、ピリミジニル、チオフェニルまたはチエニル、ピリダジニル、ピラジニル、キノリニル、インドリル、チアゾリル、ナフチリジニルなどが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０２３３】
「ヘテロアリールアルキル」なる用語は、ヘテロアリールで置換されているアルキルを意味する。
【０２３４】
「ヘテロシクリル」、「複素環」または「複素環式」なる用語は、単環式の場合は1〜3個のヘテロ原子、二環式の場合は1〜6個のヘテロ原子、または三環式の場合は1〜9個のヘテロ原子を有し、該ヘテロ原子はO、N、またはSから選択される（例えば、単環式、二環式、または三環式の場合にそれぞれ、炭素原子およびN、O、またはSの1〜3個、1〜6個、または1〜9個のヘテロ原子）、非芳香族5〜8員単環式、8〜12員二環式、または11〜14員三環式環系を意味し、ここで各環の0、1、2、または3個の原子は置換基によって置換されていてもよい。例示的なヘテロシクリル基には、ピペラジニル、ピロリジニル、ジオキサニル、モルホリニル、テトラヒドロフラニルなどが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０２３５】
「ハロアルキル」なる用語は、それに連結している1、2、3個またはそれ以上のハロゲン原子を有するアルキル基を意味する。例示的なハロアルキル基には、クロロメチル、ブロモエチル、トリフルオロメチルなどが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０２３６】
「置換されていてもよい」なる用語は、アルキル、アリール基、ヘテロアリール基などの、指定の基または部分が無置換であるか、または「置換基」の定義において以下に列挙する置換基の群から独立に選択されるか、もしくはそれ以外に指定する、1つもしくは複数（典型的には1〜4つの置換基）で置換されている。
【０２３７】
「置換基」なる用語は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アシル、アミノ基上で、その基の任意の原子において「置換されている」基を意味する。適切な置換基には、ハロ、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アリール、アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アシルアミノ、アルキルカルバノイル、アリールカルバノイル、アミノアルキル、アルコキシカルボニル、カルボキシ、ヒドロキシアルキル、アルキルチオ、CF3、N-モルホリノ、フェニルチオ、アルカンスルホニル、アレンスルホニル、アルカンスルホンアミド、アレンするホンアミド、アラルキルスルホンアミド、アルキルカルボニル、アシルオキシ、シアノまたはウレイドが含まれるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、置換基はそれ自体置換されていてもよい。いくつかの場合には、2つの置換基は、それらが連結している炭素と一緒になって、環を形成することもできる。
【０２３８】
本明細書に記載の化合物およびそれらの塩は不斉炭素原子を含み、したがって1つの立体異性体、ラセミ体、ならびに鏡像異性体およびジアステレオマーの混合物として存在しうる。典型的には、そのような化合物をラセミ混合物として調製することになる。しかし、望まれる場合には、そのような化合物を純粋な立体異性体として、すなわち、個々の鏡像異性体もしくはジアステレオマーとして、または立体異性体濃縮混合物として調製または単離することもできる。以下により詳細に論じるとおり、化合物の個々の立体異性体を、所望のキラル中心を含む光学活性出発原料からの合成により、あるいは鏡像異性生成物の混合物調製に続く、ジアステレオマーの混合物への変換と、その後の分離または再結晶、クロマトグラフィ技術、キラル分割剤の使用、もしくはキラルクロマトグラフィカラムでの鏡像異性体の直接分離などの、分離または分割により、調製する。特定の立体化学の出発化合物は市販されているか、または以下に記載の方法により作成し、当技術分野において周知の方法により分割する。
【０２３９】
本明細書において用いられる「立体異性体」または「光学異性体」なる用語は、少なくとも1つのキラル原子または束縛回転を有して、垂直の非対称平面を生じ（例えば、特定のビフェニル、アレン、およびスピロ化合物）、平面偏光を回転させうる、安定な異性体を意味する。立体異性を生じうる不斉中心および他の化学構造が本明細書に記載の化合物において本発明における使用に適切に存在するため、本発明は立体異性体およびその混合物を企図する。「鏡像異性体」なる用語は、互いに重ね合わせることができない鏡像である一対の立体異性体を意味する。「ジアステレオ異性体」または「ジアステレオマー」なる用語は、互いに鏡像ではない光学異性体を意味する。「ラセミ混合物」または「ラセミ体」なる用語は、等しい割合の個々の鏡像異性体を含む混合物を意味する。「非ラセミ混合物」なる用語は、等しくない割合の個々の鏡像異性体を含む混合物を意味する。
【０２４０】
本明細書において用いられる「鏡像異性体濃縮」なる用語は、一方の鏡像異性体の量の他方と比べた増大を意味する。得られた鏡像異性体濃縮を表す簡便な方法は鏡像体過剰率、すなわち「ee」の概念で、以下の式を用いて求められる：
ee＝100×(E1-E2)/(E1+E2)
式中、E1は第一の鏡像異性体の量であり、E2は第二の鏡像異性体の量である。
【０２４１】
いくつかの態様において、本明細書に記載の化合物は、少なくとも1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％またはそれ以上の鏡像体過剰率を有する。一般に、90％よりも高いeeが好ましく、95％よりも高いeeが最も好ましく、99％よりも高いeeが特に最も好ましい。
【０２４２】
鏡像異性体濃縮は当業者により、キラルカラムによるガスまたは高性能液体クロマトグラフィなどの、標準の技術および手順を用いて、容易に判定される。鏡像異性対の分離を行うのに必要な、適切なキラルカラム、溶離剤および条件の選択は、十分に当業者の知識の範囲内である。加えて、化合物の鏡像異性体は、当業者であれば、J. Jacques, et al., ''Enantiomers, Racemates, and Resolutions'', John Wiley and Sons, Inc., 1981. Examples of resolutions include recrystallization techniques or chiral chromatographyに記載のものなどの、当技術分野において周知の標準的技術を用いて分割することができる。
【０２４３】
特定されたすべての特許および他の出版物は、例えば本発明に関連して用いうるそのような出版物中に記載の方法論を記載および開示する目的のために、特に参照により本明細書に組み入れられる。これらの出版物は、本出願の提出日よりも前にそれらが開示されたことによってのみ提供されるものである。これに関して、発明者らは先行発明によって、または任意の他の理由のために、そのような開示に先行する権利がないと自認したと解釈されるべきではない。これらの文書の日付に関する記載または内容に関する表現はすべて、出願者らが入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関してのいかなる自認をなすものでもない。
【０２４４】
本発明は、以下の番号付けしたパラグラフのいずれかにおいて規定されうる：
１．膵細胞集団においてβ細胞複製を増大させる方法であって、膵細胞集団をアデノシンキナーゼ（ADK）の阻害剤、S-アデノシルホモシステインヒドロラーゼ（SAHH）の阻害剤、またはAMP活性化プロテインキナーゼ（AMPK）の活性化剤と接触させる段階を含む、方法。
２．アデノシンキナーゼの阻害剤が式（I）、ならびにその薬学的に許容される塩およびアミドである、パラグラフ1の方法：
2013514781.tif 000014
式中、
R1はH、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、OR5、SR5、N(R6)2、(CH2)mR7であるか、またはR1およびR2はそれらが連結している原子と一緒になって、置換されていてもよい5〜8員複素環を形成し；
R2およびR3はそれぞれ独立にH、OR5、SR5、N(R5)2であるか、またはR2およびR3はそれらが連結している原子と一緒になって、置換されていてもよい5〜8員ヘテロシクリルを形成し；
R4はH、ハロゲン、CN、N2、OR5、SR5、N(R5)2、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
R5はそれぞれの場合で独立にH、C(O)R7、C(O)OR7、C(O)N(R7)2、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであるか、または2つのR5はそれらが連結している窒素原子と一緒になって、N、OもしくはSから選択される1〜3個の追加のヘテロ原子を含んでいてもよい5〜7員環を形成し；
R6はR5、OR5、SR5、N(R5)2、N2、CN、ハロゲン、または
2013514781.tif 000015
であり；
R7はそれぞれの場合で独立にH、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
XはO、S、NH、またはCH2であり；
YおよびZはそれぞれ独立にNまたはCR8であり；
R8はそれぞれの場合で独立にH、ハロゲン、CN、C(O)R7、C(O)OR7、C(O)N(R7)2、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
Z1はそれぞれの場合で独立にOまたはSであり；
Z2はそれぞれの場合で独立にOM、SM、OR5、SR5、N(R5)2、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
Mはアルカリ金属カチオンであり；
mは1、2、3、または4であり；
nは0、1、または2である。
３．アデノシンキナーゼの阻害剤が式（II）、ならびにその薬学的に許容される塩およびアミドである、パラグラフ1の方法：
2013514781.tif 000016
式中、
R9はそれぞれ独立にH、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであるか、または2つのR9はそれらが連結している窒素原子と一緒になって、N、OもしくはSから選択される1〜3個の追加のヘテロ原子を含んでいてもよい5〜7員環を形成し；
R10、R11およびR12はそれぞれ独立にH、OR14、N(R14)2、N2、NO2、CN、ハロゲン、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
R13はそれぞれの場合で独立にハロゲン、CN、NH2、または置換されていてもよいC1〜C6アルキルであり；
R14はH、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであるか、または2つのR14はそれらが連結している窒素原子と一緒になって、N、OもしくはSから選択される1〜3個の追加のヘテロ原子を含んでいてもよい5〜7員環を形成し；
X2はNまたはCR15であり；
R15はNHR16、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
R16はH、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
Y2はNまたはCHであり；
qは0、1、2、または3である。
４．ADK阻害剤阻害剤のIC50が、500nM以下、250nM以下、200nM以下、100nM以下、75nM以下、50nM以下、25nM以下、10nM以下、1nM以下、0.1nM以下、0.01nM以下、または0.001nM以下である、パラグラフ1〜3のいずれか一つの方法。
５．ADK活性が、非阻害対照に比べて、少なくとも5％、10％、20％、30％、40％、50％、50％、70％、80％、90％、95％、98％、または100％（例えば、活性の完全な消失）阻害されるかまたは低減する、パラグラフ1〜4のいずれか一つの方法。
６．ADK阻害剤が、アリステロマイシン、5'-デオキシアデノシン、5'-アミノアデノシン、5'-デオキシ-5-ヨードツベルシジン、5-ヨードツベルシジン（A10）、7-デアザ-7-ヨード-2',3'-ジデオキシアデノシン、ノル-アリステロマイシン、ノル-ツベルシジン、A-134974、トヨカマイシン、GP-515（(2R,3R,4S,5R)-2-(4-アミノ-3-ブロモ-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)-5-(アミノメチル)-テトラヒドロフラン-3,4-ジオール）、GP-3269（(2R,3R,4S,5R)-2-(4-(4-フルオロフェニルアミノ)-5-フェニル-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)-テトラヒドロ-5-メチルフラン-3,4-ジオール）、GP-683（(2R,3S,4R,5R)-テトラヒドロ-2-メチル-5-(5-フェニル-4-(フェニルアミノ)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)フラン-3,4-ジオール）、GP-947（(2S,3S,4R,5R)-テトラヒドロ-2-メチル-5-(5-フェニル-4-(フェニルアミノ)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)フラン-3,4-ジオール）、ABT-702（5-(3-ブロモフェニル)-7-(6-モルホリノピリジン-3-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン-4-アミン、B8）、化合物1（(2R,3R,4S,5R)-2-(4-アミノ-5-ヨード-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)-5-(アミノメチル)-テトラヒドロフラン-3,4-ジオール）、化合物2（(2R,3R,4S,5R)-2-(4-クロロ-5-ヨード-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)-5-(アミノメチル)-テトラヒドロフラン-3,4-ジオール）、化合物3（(1S,2R,3S,5R)-3-アミノ-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)シクロペンタン-1,2-ジオール）、化合物4（(1S,2R,3S,5R)-3-アミノ-5-(7-アミノ-3H-[1,2,3]トリアゾロ[4,5-d]ピリミジン-3-イル)シクロペンタン-1,2-ジオール）、化合物5（(1S,2R,3S,4R)-4-(4-アミノ-5-ヨード-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)シクロペンタン-1,2,3-トリオール）、化合物6（7-(4-(ジメチルアミノ)フェニル)プテリジン-4-アミン）、化合物7（5-(3-ブロモフェニル)-7-(4-(ジメチルアミノ)フェニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン-4-アミン）、化合物8（5-(2-ブロモベンジル)-7-(6-モルホリノピリジン-3-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン-4-アミン）、化合物9（5-シクロヘキシル-7-(6-モルホリノピリジン-3-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン-4-アミン)、化合物10（5-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)-7-(6-モルホリノピリジン-3-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン-4-アミン）、化合物11（5-(1-(2-ブロモフェニル)エチル)-7-(6-モルホリノピリジン-3-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン-4-アミン）、化合物12（5-(2-メチルペンタ-4-エン-2-イル)-7-(6-モルホリノピリジン-3-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン-4-アミン）、化合物13（N5-((1H-インドール-3-イル)メチル)-7-(6-モルホリノピリジン-3-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン-4,5-ジアミン）、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、パラグラフ1〜5のいずれか一つの方法。
７．AMPKの活性化剤が式（III）、ならびにその薬学的に許容される塩およびアミドである、パラグラフ1の方法：
2013514781.tif 000017
式中、
R17はH、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、OR22、SR22、N(R22)2、(CH2)mR23であるか、またはR17およびR18はそれらが連結している原子と一緒になって、置換されていてもよい5〜8員複素環を形成し；
R18およびR19はそれぞれ独立にH、OR22、SR22、N(R22)2であるか、またはR18およびR19はそれらが連結している原子と一緒になって、置換されていてもよい5〜8員複素環を形成し；
R20およびR21はそれぞれ独立にハロゲン、CN、N2、OR22、SR22、N(R22)2、C(O)R24、C(O)OR24、C(O)N(R24)2、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
R22はそれぞれの場合で独立にH、C(O)R24、C(O)OR24、C(O)N(R24)2、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
R23はR22、OR22 、SR22、N(R22)2、N2、CN、ハロゲン、または
2013514781.tif 000018
であり；
R24はそれぞれの場合で独立にH、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
XはO、S、NH、またはCH2であり；
YおよびZはそれぞれ独立にNまたはCR25であり；
R25はそれぞれの場合で独立にH、ハロゲン、CN、C(O)R24、C(O)OR24、C(O)N(R24)2、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
Z1はそれぞれの場合で独立にOまたはSであり；
Z2はそれぞれの場合で独立にH、OM、SM、OR22、SR22、N(R22)2、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC2〜C6アルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルであり；
Mはアルカリ金属カチオンであり；
mは1、2、3、または4であり；
nは0、1、または2である。
８．AMP活性化キナーゼの活性が、非活性化対照に比べて、少なくとも5％、10％、20％、30％、40％、50％、50％、70％、80％、90％、1倍、1.1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍またはそれ以上増大する、パラグラフ1または7の方法。
９．AMPK活性化剤のEC50が、500nM以下、250nM以下、100nM以下、50nM以下、10nM以下、1nM以下、0.1nM以下、0.01nM以下、または0.001nM以下である、パラグラフ1、7または8のいずれか一つの方法。
１０．AMPK活性化剤が5-アミノイミダゾール-4-カルボキサミドリボヌクレオシド（AICAR）である、パラグラフ1、7〜9のいずれか一つの方法。
１１．SAHH阻害剤阻害剤のIC50が、500nM以下、250nM以下、200nM以下、100nM以下、75nM以下、50nM以下、25nM以下、10nM以下、1nM以下、0.1nM以下、0.01nM以下、0.001nM以下である、パラグラフ1の方法。
１２．SAHH活性が、非阻害対照に比べて少なくとも5％、10％、20％、30％、40％、50％、50％、70％、80％、90％、95％、98％、または100％（例えば、活性の完全な消失）阻害されるかまたは低減する、パラグラフ1または11の方法。
１３．SAHH阻害剤が、9(S)-(2,3-ジヒドロキシプロピル)アデニン［(S)-DHPA］；D-エリタジン；(R,S)-3-アデニン-9-イル-2-ヒドロキシプロパン酸［(R,S)-AHPA］；アデノシン（Ado）ジアルデヒド；3-デアザアデノシン（c3-Ado）；アリステロマイシン（Ari）；ネプラノシンA（NPAまたはNpcA）；ジヒドロキシシクロペンテニルアデニン（DHCeA）；ジヒドロキシシクロペンテニル-3-デアザアデニン（c3-DHCeA）；ジヒドロキシシクロペンタニルアデニン（DHCaA）；ジヒドロキシシクロペンタニル-3-デアザアデニン（c3-DHCaA）；3-デアザネプラノシンA（c3-NpcA）；3-デアザアリステロマイシン（c3Ari）；炭素環式-3-デアザアデノシン（C-c3Ado）；6'-CメチルネプラノシンA；2'-デオキシアデノシン；ツベルシジン；リバビリン；ピラアゾフリン；2'-デオキシ-2'-クロロアデノシン；イソペンテニルアデノシン；メチルチオアデノシン（MTA）；9-β-アラビノフラノシルアデニン（Ara-A、ビダラビン）；2'-デオキシアデノシン；N-メチルアリステロマイシン、8-アザアリステロマイシンおよび3-デアザアリステロマイシン、ならびにそれらのジアルデヒドおよびジオール誘導体；(±)-5ノルアリステロマイシンおよびその2,6-ジアミノ類似体；2'-デオキシ-アリステロマイシン；3'-デオキシ-アリステロマイシン；3'-アミノ-3'-デオキシ-アリステロマイシン；3'-アミノ-3'-デオキシアラビノフラノシル-アリステロマイシン；6'-ヒドロキシ-アリステロマイシン；6'-メルカプト-アリステロマイシン；8'-ブロモ-アリステロマイシン；8-ヒドロキシアリステロマイシン、アリステロマイシン-3'-環状ホスフェート、アリステロマイシン-6'-環状ホスフェート；2-フルオロ-S-アデノシルホモシステイン（2-FSAH）、S-アデノシル-L-ホモシステインスルホキシド；S-アデノシル-Lホモシステインスルホン；S-アリステロマイシニル-L-ホモシステイン；5'-S-(3-カルボキシル-4-ニトロフェニル)チオアデノシン；5'-S(メチル)-5'-S-(ブチル)チオアデノシン；ならびにこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、パラグラフ1、11または12のいずれか一つの方法。
１４．膵細胞が対象由来であり、該対象がさらなるβ細胞を必要としている、パラグラフ1〜13のいずれか一つの方法。
１５．膵細胞が対象由来であり、該対象がさらなるβ細胞を必要としていない、パラグラフ1〜14のいずれか一つの方法。
１６．対象が哺乳動物である、パラグラフ1〜15のいずれか一つの方法。
１７．対象がヒトである、パラグラフ1〜16のいずれか一つの方法。
１８．対象がマウスである、パラグラフ1〜16のいずれか一つの方法。
１９．膵細胞が一次膵細胞である、パラグラフ1〜18のいずれか一つの方法。
２０．膵細胞が脱分化細胞由来である、パラグラフ1〜19のいずれか一つの方法。
２１．接触がインビトロである、パラグラフ1〜20のいずれか一つの方法。
２２．接触がエクスビボである、パラグラフ1〜20のいずれか一つの方法。
２３．接触がインビボである、パラグラフ1〜20のいずれか一つの方法。
２４．インビボでの接触が哺乳動物内である、パラグラフ23の方法。
２５．インビボでの接触がマウス内である、パラグラフ24の方法。
２６．インビボでの接触がヒト内である、パラグラフ24の方法。
２７．インビボでの接触が対象内であり、該対象がさらなるβ細胞を必要としている、パラグラフ23の方法。
２８．対象が1型糖尿病を患っている、パラグラフ27の方法。
２９．対象が2型糖尿病を患っている、パラグラフ27の方法。
３０．対象が哺乳動物である、パラグラフ27の方法。
３１．対象がヒトである、パラグラフ27〜30のいずれか一つの方法。
３２．β細胞複製が、対照に比べて少なくとも5％、10％、20％、30％、40％、50％、50％、70％、80％、90％、1倍、1.1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍またはそれ以上増大する、パラグラフ1〜31のいずれか一つの方法。
３３．下記の段階を含む、膵細胞の集団におけるβ細胞複製を増大させる化合物をスクリーニングするためのハイスループットアッセイ法：
（a）一次膵細胞である膵細胞の集団または調製物を、試験化合物と接触させる段階；
（b）β細胞の複製または増殖を評価する段階；および
（c）β細胞の複製または増殖を増大させるかまたは増強する化合物を選択する段階。
３４．表面がラット膀胱癌細胞株804G由来の条件培地でコーティングされている細胞培養容器内で、膵細胞を培養する、パラグラフ33のアッセイ法。
３５．β細胞複製を評価する段階が、β細胞マーカーおよび細胞複製マーカーを検出することを含む、パラグラフ33または34のアッセイ法。
３６．細胞複製マーカーがKi-67またはPH3である、パラグラフ35のアッセイ法。
３７．β細胞マーカーがPDX-1、インスリン、c-ペプチド、アミリン、E-カドヘリン、Hnf3β、PCI/3、Beta2、Nkx2.2、Nkx6.1、GLUT2、PC2、ZnT-8、MAFA、MAFB、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、パラグラフ35または36のアッセイ法。
３８．β細胞マーカーがPDX-1である、パラグラフ35〜37のいずれか一つのアッセイ法。
３９．β細胞マーカーがインスリンではない、パラグラフ35〜38のいずれか一つのアッセイ法。
４０．試験化合物が0.1nM〜1000mMの範囲の濃度を有する、パラグラフ33〜39のいずれか一つのアッセイ法。
４１．約15℃〜約55℃の範囲の温度で実施される、パラグラフ33〜40のいずれか一つのアッセイ法。
４２．試験化合物を膵細胞と少なくとも1時間接触させる、パラグラフ33〜41のいずれか一つのアッセイ法。
４３．試験化合物がβ細胞の複製または増殖を、未処理対照に比べて、少なくとも5％、10％、20％、30％、40％、50％、50％、70％、80％、90％、1倍、1.1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍またはそれ以上増大させる、パラグラフ30〜42のいずれか一つのアッセイ法。
４４．膵細胞が膵細胞株ではない、パラグラフ33〜43のいずれか一つのアッセイ法。
４５．膵細胞集団がランゲルハンス島またはその断片である、パラグラフ33〜44のいずれか一つのアッセイ法。
４６．膵細胞が一次膵β細胞である、パラグラフ33〜45のいずれか一つのアッセイ法。
４７．試験化合物との接触の前に、膵細胞を細胞培養容器の表面に約12〜48時間接着させる、パラグラフ33〜46のいずれか一つのアッセイ法。
４８．膵細胞が脱分化細胞由来である、パラグラフ33〜47のいずれか一つのアッセイ法。
４９．脱分化細胞が多能性幹細胞から誘導される、パラグラフ33〜48のいずれか一つのアッセイ法。
５０．下記の段階を含む、パラグラフ33〜49のいずれか一つのアッセイ法：
（a）ランゲルハンス島をトリプシン処理して、細胞1〜3個からなる細胞塊とする段階；
（b）該細胞を一晩回復させる段階；
（c）段階（b）の細胞を96穴プレートのウェルに播種する段階であって、該ウェルが804G条件培地でコーティングされており、細胞播種密度が細胞60,000個/ウェルである、段階；
（d）該細胞を該ウェルの表面に48時間接着させる段階；
（e）1μMの試験化合物をβ細胞と24時間接触させる段階；
（f）該細胞をPDX-1抗体ならびにKi-67および/またはPH3抗体で染色する段階；
（g）β細胞複製を評価する段階；ならびに
（h）β細胞複製を増大させるかまたは増強する化合物を選択する段階。
【０２４５】
まだ示していない範囲で、当業者であれば、本明細書に記載し、例示する様々な態様のどの1つもさらに改変して、本明細書に開示する他の態様のいずれかに示す特徴を組み込みうることを理解するであろう。
【０２４６】
以下の実施例は、本発明のいくつかの態様および局面を例示するものである。関連分野の当業者には、本発明の精神または範囲を変えることなく様々な改変、追加、置換などを実施することができ、そのような改変および変動は添付の特許請求の範囲において規定する本発明の範囲内に含まれることが明らかであろう。以下の実施例は、いかなる様式でも、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０２４７】
実施例1：スクリーニングアッセイ法。
その全内容が参照により本明細書に組み入れられるGotoh M, Maki T, Kiyoizumi T, Satomi S, Monaco AP: An improved methodfor isolation of mouse pancreatic islets. Transplantation 40:437-438, 1985に以前に記載されたとおりに、ラット島を単離した。単離した島を組織培養インキュベーター内で一晩培養した。翌朝、島をトリプシン処理して細胞1〜3個からなる細胞塊とし、島培地（Mediatech 99-786-CV；10％FBS血清（Valley Biomedial BS3033）；8.3mMグルコース（Sigma G7528）；1×ペニシリン/ストレプトマイシン（Invitrogen 15070-063）；1×Glutamax（Invitrogen 35050-079））中に再懸濁し、804G（ラット膀胱癌細胞株）条件培地でコーティングされている96穴プレート（Sigma CLS3904）のウェルに播種した。細胞播種密度は細胞60,000個/ウェルで、播種時に95％よりも高い生存度が確認された。島細胞を48時間接着させ、その時点で培地を交換し（Mediatech 99-786-CV 2％血清、5mMグルコース、1×ペニシリン/ストレプトマイシン、1×glutamax）、細胞を試験化合物で処理した。スクリーニングのために、化合物を1uMの濃度で二つ組で試験した。24時間の化合物処理後、細胞を新鮮4％PFA（Electron Microscopy Services 15710）で20分間固定し、PBS（VWR 45000-446）で洗浄した。PBS中の0.1mM EDTA（Ambion AM9260G）中で、細胞を摂氏90度まで加熱することにより、抗原賦活化を実施した。次いで、細胞を洗浄し、PBS/0.3％Triton X-100（J.T.Baker X198-07）で15分間透過化処理した。次いで、免疫組織化学的染色を以下のとおりに実施した。PBS中5％ロバ正常血清（Jackson ImmunoResearch 017-000-121）を用いて1時間、抗原ブロッキングを実施した。摂氏4度での一次抗体との一晩インキュベーションにより、染色を実施した。一次スクリーニングのために、PDX-1抗体（R&D AF2419）を用いてβ細胞を明らかにし、ki-67抗体（BD Bioscience 556003）を用いて増殖中の細胞を可視化した。
【０２４８】
特定の理論に縛られることを望むわけではないが、以前のβ細胞複製スクリーニングの失敗は主にβ細胞識別体として細胞質マーカー（インスリン）を用いた結果である。細胞質マーカーの使用によって、核複製を特定の細胞の身元へと正確に帰属させることが妨害され、すなわち、高密度培養では、複数の核に近いことを考慮すると、細胞質を特定の核へと帰属させることは不可能である。さらなる免疫組織化学的抗体には、ホスホヒストン3（Millipore 06-570）、インスリン（Dako A0564）、グルカゴン（Millipore 4031-01F）およびビメンチン（Millipore ab5733）が含まれていた。ウェスタンブロッティングのために、抗体にはADK（Abcam ab38010、ab64825）およびローディング対照としてRAN（BD Bioscience 610340）が含まれていた。
【０２４９】
化合物処理した島細胞を染色した後、β細胞複製を自動画像収集およびCellomics ArrayScanVTIを用いた解析により評価した。収集限界/パラメーターは、複製事象のコンピューターによる呼び出しがヒトによる呼び出しと一致するように確立した。用いたパラメーターは（1）PDX-1+細胞、および（2）PDX-1陽性領域内のki-67陽性染色の特定を目的とした。アルゴリズムは三段階プロセスであった。第一に、予想されるPDX-1染色パターンに基づきソフトウェアにより核領域を予測した。第二に、予測した核領域内の平均染色強度に基づきPDX-1陽性細胞（選択された目標）を計数した（注：全シグナル強度は質において本質的に等しかったが、典型的には用いなかった）。第三に、同時にKi-67陽性であったPDX-1陽性細胞（選択された目標）の数を、予測した核領域内のki-67染色の平均蛍光強度を判定することによって判定した（ここでも、有効性が等しい全強度を、時折用いた）。特定の限界（蛍光強度）は実験ごとに変動した。一般に、基底複製速度はおおよそ1％に設定し、すなわち、アルゴリズムは、DMSO処理したPDX+細胞がPDX-1およびki67に対して二重陽性であると報告されるまで変動した。スクリーニングした高含有率ライブラリには、キナーゼ阻害剤ライブラリ（約300化合物）、カンナビノイドライブラリ（80化合物）、ホルモンライブラリ（80化合物）およびホスホジエステラーゼ阻害剤ライブラリ（40化合物）が含まれていた。合計で約500の化合物を試験した。ヒットした化合物は続いて購入し（A10、5-ヨードツベルシジン（Calbiochem 407900）；ABT-702（B8、Sigma A2721））用量曲線および他の試験で確認した。スクリーニングアッセイ法において、β細胞複製の2.3倍の誘導がA10に対応する化合物で見られた（データは示していない）。化合物D7およびF3も蛍光の2標準偏差を超える増大を示したが、これら2つの化合物は自己蛍光を発することが観察された。
【０２５０】
実施例2：A10およびB8によるPH3誘導。
実施例1に記載のものと類似のプロトコルを用いて、β細胞をA10（2μM）、またはB8（15μM）で処理した。ホスホヒストン3抗体（Millipore 06-570）を用いて増殖中の細胞を可視化した。図1に見られるとおり、A10およびB8はいずれも対照のDMSO処理に比べて、PDX-1に対するPH3の比を増大させた。
【０２５１】
実施例3：A10はβ細胞の複製を特異的に増大させる。
実施例1に記載のものと類似のプロトコルを用いて、β細胞またはマウス皮膚線維芽細胞を10uM、5uM、2.5uM、1.25um、0.625uM、0.3125uM、0.156uM、0.078uM、0.04uM、または0.019uMのA10で処理した。図2aに見られるとおり、Ki-67陽性β細胞の％は用量依存的様式で増大することが認められた。しかし、図2bに見られるとおり、Ki-67陽性マウス皮膚線維芽細胞の％はA10処理後に変化しなかった。これらの結果は、ウェスタンブロット分析（データは示していない）から見られたとおり、マウス島に比べてマウス線維芽細胞ではADK発現がほとんどまたは全くないことと一致している。
【０２５２】
実施例4：B8の用量曲線。
実施例1に記載のものと類似のプロトコルを用いて、β細胞を30uM、15uM、7.5uM、3.75uM、1.875uM、0.94uM、0.47uM、または0.23uMのB8で処理した。図3に見られるとおり、PDX-1およびKi-67陽性細胞の％はB8処理後に用量依存的様式で増大した。
【０２５３】
実施例5：A10およびB8処理の時間経過。
実施例1に記載のものと類似のプロトコルを用いて、β細胞をA10（2μM）またはB8（15μM）で処理した。DMSO対照と比べたKi-67の誘導を異なる時点で測定した。化合物は第0日に加え、培地は第2日に交換した。結果を図4に示す。
【０２５４】
実施例6：A10処理に対する血清濃度の影響。
実施例1に記載のものと類似のプロトコルを用いて、β細胞を異なる0.2％、2.0％、または20％の血清を含む培地中、A10（2μM）で処理した。図5に見られるとおり、A10処理試料において、Ki-67陽性細胞の％は血清濃度が増大するにつれて増大した。その一方で、DMSO処理試料では、Ki-67陽性細胞の％は血清濃度が増大するにつれて低減した。
【０２５５】
実施例7：A10処理に対するグルコースの影響。
実施例1に記載のものと類似のプロトコルを用いて、β細胞を25mM、20mM、15mM、12.5mM、10mM、8mM、6mM、4mM、1mM、または0mMのグルコースを含む培地中、2μMのA10またはDMSOで処理した。図6に見られるとおり、グルコース濃度はA10またはDMSO処理試料におけるβ細胞複製の％にほとんど影響しなかった。
【０２５６】
実施例8：β細胞複製に対するアデノシンの効果。
A10のβ細胞複製に対する効果が細胞内のアデノシン濃度の増大によるものかどうかを試験するために、ラット島を1000uM、330uM、110uM、37uM、12uM、4uM、1.4uM、0.46uM、0.156uM、または0.05uMのアデノシンで処理した。図7に見られるとおり、アデノシンはPDX-1およびKi-67発現細胞の％にほとんど影響しなかった。
【０２５７】
実施例9：A10によるβ細胞複製増強に対するアデノシン受容体アンタゴニストの影響。
A10の効果がアデノシン受容体によって仲介されるかどうかを試験するために、β細胞を異なる濃度のアデノシン受容体アンタゴニスト、テオフィリン、CPT、カフェイン、アロックス（Allox）、およびMRSを含む培地中、5uM、1uM、0.2uM、または0.04uMのA10またはDMSOで処理した。結果を図8aおよび8bに示す。図8bに見られるとおり、0.2μMのアデノシンアンタゴニストはA10処理によるβ細胞複製の増大倍数にほとんど影響しなかった。
【０２５８】
実施例10：AMPK活性化。
A10はAMPKを間接的に活性化することによってβ細胞複製の増大を引き起こすとの仮説が立てられた。これを試験するために、β細胞をA10（2μM）、AMPK活性化剤AICAR（3.3μM）で処理した。図9に見られるとおり、AICARによるAMPKの活性化はβ細胞複製％の増大を引き起こす。
【０２５９】
実施例11：A10によるβ細胞複製増強に対するAMPK阻害の効果。
Cpd CによるAMPK阻害の効果をA10によるβ細胞複製増強に対して試験した。図10に見られるとおり、Cpd C（10μM）によるAMPKの阻害は、非阻害対照に比べて、β細胞複製の低減を引き起こす。
【０２６０】
実施例12：インビボでのβ細胞複製。
12週齢のC57/B6雌動物にBRDU 10ul/g（Sigma B5002）およびABT-702（21mg/kg）またはDMSO溶媒のいずれかを注射した。処理の24時間後、動物を屠殺し、膵臓を固定し、切片化し、PDX-1およびBRDU（Amaersham RPN202）について染色した。4切片毎に1切片を分析に加え、1匹あたり最低2000のPDX-1+を計数した。結果を図12に示す。
【０２６１】
実施例13：アデノシンキナーゼ阻害は島β細胞複製を選択的に促進する。
島単離および一次スクリーニングプロトコル：ラットおよびマウス島を以前に記載されたとおりに単離した。（M. Gotoh, et al., Transplantation 43, 725-730 (1987)）すべての動物研究は、発明者らの施設の動物管理使用委員会に従って承認され、実施した。ブタ島はVitaCyte（Indianapolis, ID）により提供された。島を島培地（Mediatech 99-786-CV；10％FBS血清（Valley Biomedial BS3033）；8.3mMグルコース（Sigma G7528）；1×ペニシリン/ストレプトマイシン（Invitrogen 15070-063）；1×Glutamax（Invitrogen 35050-079））中で一晩インキュベート（37℃、5％CO2）した。翌朝、島をトリプシン処理して細胞1〜3個からなる細胞塊とし、島培地中に再懸濁し、804G（ラット膀胱癌細胞株）条件培地でコーティングされている96穴プレート（Sigma CLS3904）のウェルに播種した。細胞播種密度は細胞60,000個/ウェルで、播種時に95％よりも高い生存度が確認された。島細胞を48時間接着させ、その時点で培地を交換し（2％血清、5mMグルコース以外は前述のとおり）、細胞を試験化合物で処理した。スクリーニングのために、化合物を1回に1μMおよび10μMの濃度で二つ組で試験した。24時間の化合物処理後、細胞を新鮮4％PFAで固定した。蒸留水中の0.1M EDTA中、摂氏90度まで細胞を加熱することにより、抗原賦活化を実施した。次いで、細胞を洗浄し、PBS/0.3％Triton X-100（J.T.Baker X198-07）で15分間透過化処理した。次いで、免疫組織化学的染色を以下のとおりに実施した。抗原ブロッキングをPBS中5％ロバ正常血清（Jackson ImmunoResearch 017-000-121）で1時間実施した。PBS中摂氏4度での一次抗体との一晩インキュベーションにより、染色を実施した。一次スクリーニングのために、PDX-1抗体（R&D AF2419；1：300）を用いてβ細胞を明らかにし、ki-67抗体（BD Bioscience 556003、1：300）を用いて増殖中の細胞を可視化した。
【０２６２】
β細胞複製を自動画像収集およびCellomics ArrayScanVTIを用いた解析により評価した。収集限界/パラメーターは、複製事象のコンピューターによる呼び出しがヒトによる呼び出しと一致するように確立した。スクリーニングした高含有率ライブラリには、キナーゼ阻害剤ライブラリ（約300化合物）、カンナビノイドライブラリ（80化合物）、ホルモンライブラリ（80化合物）、ホスホジエステラーゼ阻害剤ライブラリ（40化合物）およびNIH臨床コレクション（250化合物）が含まれていた。すべての有機化合物をDMSOに懸濁し、最小希釈率1：1000で用いた。続いて、化合物を様々な供給元から購入した：5-ヨードツベルシジン（Calbiochem 407900）；ABT-702（Sigma A2721；Tocris）；アリステロマイシン（Sigma A0928）およびジデオキシ-7-ヨード-デアザアデノシン（chem-ipex 15132）。エキセンディン-4（Sigma E7114）およびGLP-1（AbCam、ab50245）によるβ細胞複製実験を前述のとおりに行った。グルコースによるβ細胞複製実験は、グルコース濃度および培養期間を改変して、前述のとおりに行った。すべての長期培養において、培地は48時間ごとに交換した。
【０２６３】
免疫組織化学：様々な細胞集団を免疫組織化学的マーカーにより特定した：β細胞（モルモット抗ブタインスリン；Dako、A0564）；α細胞（モルモット抗グルカゴン；Millipore、4031-01F）；PP細胞（ウサギ抗膵ポリペプチド；Pierce、PAI-36141）；δ細胞（ウサギ抗ソマトスタチン；Dako、A0566）および線維芽細胞（ニワトリ抗ビメンチン；Millipore、AB5733）。N末端特異的抗体を伴うアデノシンキナーゼ（ADK）（ADKに対するウサギpAB；Abcam, ab38010-100）をアデノシンキナーゼ免疫蛍光法のために用いた。免疫蛍光法のために用いたADK抗体はCos-7細胞（ATCC；CRL-1651）のADK cDNA（Invitrogen；）による一過的形質移入により確認した。さらなる抗体にはホスホヒストン3抗体（Millipore 06-570）、BRDUが含まれていた。
【０２６４】
β細胞数の定量：培養0時間、96時間および144時間におけるβ細胞の数を定量するために、細胞を前述のとおり96穴プレートに溶媒のみまたは5-ITおよび15mMグルコース存在下で播種し；最終DMSO希釈率はすべてのウェルで1：1000であった。0時間は細胞を48時間接着させた後であった。播種密度の小さな変動を吸収するために、各条件を1つのプレートにつき16の別々のウェルで表した。培地の交換は48時間ごとに行った。細胞を適切な時点で固定し、PDX-1と同時に染色するために保存した。自動細胞計数を、PDX-1+細胞を特定したCellomics ArrayScanVTIを用いて行った。
【０２６５】
BRDUアッセイ法：島細胞を前述のとおりに播種し、48時間接着させた。培地を交換し、BRDUおよびDMSOまたは5-IT（2μM）またはABT-702（15μM）を含めた。48時間後、細胞を洗浄し、通常の培地を加えた。培養物をさらに48時間増殖させた後、固定した。0.1M EDTA中、90℃で10分間加熱することにより、抗原賦活化を実施した。β細胞を特定するためのPDX-1免疫蛍光（前述のとおり）と、複製中の細胞を特定するためのBRDU染色キット（Amersham、RPN20）を用いて染色を実施した。定量的画像分析をCellomics ArrayScanVTIを用いて行い、BRDU+でもあるPDX-1+細胞のパーセンテージを計数した。
【０２６６】
ADKノックダウン：EmGFP付きのBlock-iT pol II miR RNAi発現系（Invitrogen、K4938-00）をADKのレンチウイルスノックダウンに用いた。ウイルス濃縮をFast-Trapキット（Millipore、FTLV00003）を用いて実施した。いくつかのADK指向miRNAを、ラットH4IIE肝細胞癌細胞株（ATCC、CRL-1600）の安定なレンチウイルス形質導入と、続くウェスタンブロットによるADKレベルの評価を用いて試験した。最も有効な配列
2013514781.tif 000019
を島細胞実験で用いるために選択した。陰性対照配列は
2013514781.tif 000020
であった。分散ラット島細胞培養物（前述のとおり）を、播種の48時間後に開始する96穴様式で形質導入した。濃縮ウイルスを用いて、48時間にわたり島培養物に連続的に感染させ、続いて4日間培養した後に細胞を固定した。Cellomics ArrayScanVTIを用いて蛍光強度を定量し、様々なパラメーターを求めた：ウイルス形質導入効率（DAPI+、GFP+）、ADK発現細胞のパーセンテージ（DAPI+、ADK+）、感染β細胞（GFP+、PDX-1+、ki-67+）および非感染β細胞（GFP-、PDX-1+、ki-67+）の複製速度。ADK発現を、長短両方のアイソフォームを検出するためのC末端特異的抗体（Abgent、AP7091b、1：100）を用いてウェスタンブロットにより判定した。
【０２６７】
肝細胞単離および増幅：肝細胞を、以前に記載された2段階のコラゲナーゼ灌流技術を用いて単離し、10％FBS、hEGF（40ng/ml；R&D Systems 236-EG-200）およびmHGF（20ng/ml；R&D Systems 2207-HG-025）を補足したウィリアムE培地中で培養した。（P. O. Seglen, Methods in cell biology 13, 29-83 (1976)）培養物を上に示したとおり一晩化合物処理し、次いで固定し、染色した。合計細胞数をDAPIにより評価し、複製中の細胞はki-67+であった。画像収集および解析にはCellomics ArrayScanVTIを用いた。
【０２６８】
インビボ複製の定量：12週齢のC57/B6雌動物にBRDU（Sigma B5002；10ul/g）およびABT-702（21mg/kg）またはDMSO溶媒のいずれかを注射した。処理の24時間後、動物を屠殺し、関連する臓器を回収した。すべての実験を処理群ごとに最低4匹の動物で実施した。12μM切片4つ毎に1切片を分析に用い、1匹あたり臓器ごとに最低2000個のβ細胞、外分泌細胞および肝細胞を計数した。分析を手動の画像収集および細胞計数により行い、β細胞をPDX-1染色またはインスリン染色によって特定し、結果はほぼ同等であった。外分泌細胞を、島構造の外側のすべての核を計数することにより概算した。これらの細胞の少数は外分泌細胞ではなかった。肝細胞をDAPI+アルブミン+細胞として特定した（Bethyl Laboratories、A90-234A）。分裂中の細胞はBRDU+であった（Amaersham RPN202）。
【０２６９】
統計学：データは同時に実施した複数の重複測定（示すデータ点あたり最低4ウェル）の平均で示す。示した実験結果はすべて3回以上繰り返した。誤差バーは特に記載がないかぎり標準偏差を示す。結果を両側t検定を用いて比較した。EC50は、一番高い複製速度を制限して非線形回帰を用いて計算した。
【０２７０】
結果
ハイスループット一次β細胞複製アッセイ法の開発および性能：β細胞複製を増大させる化合物を特定するために、本発明は、新しく単離したラット島細胞を用いたスクリーニングプラットフォームを提供する（図21）。一次細胞の使用はβ細胞の供給を制限し、挙動上の変動をもたらすと予想されるが、このアプローチは、β細胞の有糸分裂挙動に関係するインビボ代謝特性の維持を最大にする。（Y. Zimmer, et al., FEBS letters 457, 65-70 (1999)）これらの分散培養物は約75％のβ細胞（PDX-1+）、約18％のα細胞（グルカゴン+）、約3％の線維芽細胞（ビメンチン+）、および約5％の他の細胞型を含んでいた。分散ラット島細胞を、β細胞転写因子であるPDX-1、α細胞ホルモンであるグルカゴン、線維芽細胞マーカーであるビメンチンおよびこれらの組み合わせによりDNAについて免疫蛍光染色した（データは示していない）。パーセンテージを自動画像収集および解析（代表的ラット島調製物からn＝80画像）により得た。すべての値の標準偏差は10％未満であった。PDX-1陽性細胞はインスリンまたはソマトスタチンのいずれかを発現した（データは示していない）。これらの一次島培養物中の複数の細胞集団の分析により、複製アッセイ法におけるβ細胞特異性のチェックが可能となる。
【０２７１】
単離した島を組織培養インキュベーター内で一晩回復させた後、翌日分散させ、播種した。細胞を接着させるために、島細胞を48時間インキュベートした後、新鮮培地を加えて、化合物処理した。24時間の化合物処理後、細胞を固定し、染色し、アッセイした。PDX-1はβ細胞およびδ細胞により発現される転写因子である。（P. Serup, et al., The Biochemical journal 310 (Pt 3), 997-1003 (1995)）PDX-1集団の中で、＞90％の細胞はインスリン+β細胞である（データは示していない）（J. Suckale, et al., Front Biosci 13, 7156-7171 (2008)）。島細胞は増殖して密で不規則なクラスタとなり、これが、インスリンなどの細胞質染色剤を複数の核と不明瞭に関連させるので、核PDX-1染色を一次β細胞マーカーとして用いた。この不明瞭さの結果として、線維芽細胞などの急速に複製している細胞由来のki-67+核が、インスリン+細胞へと誤って帰属される可能性がある。インビトロβ細胞複製の基底速度は中程度の実験間変動（0.4〜3.5％）を示し、典型的には、ki-67を同時発現するPDX-1+細胞のパーセンテージによって判定した、ほぼ同齢の動物のインビボβ細胞複製速度（0.8±0.2％）よりも高かった。
【０２７２】
ADK-Iはβ細胞複製を促進する：細胞透過性生物活性化合物の注意深く選択したライブラリからの約750の化合物を、β細胞複製を増大させるそれらの能力についてスクリーニングした。β細胞を特定するためのPDX-1免疫染色および分裂中の細胞を特定するためのki-67免疫染色を用いることにより、複製中のPDX-1+細胞は分裂中のPDX-1-細胞から、PDX-1およびki-67の共存により容易に区別された（データは示していない）。2つの化合物を特定し；いずれも詳細に特徴付けられたアデノシンキナーゼ（ADK）阻害剤（ADK-I）であった。5-ヨードツベルシジン（5-IT；CAS 24386-93-4）およびABT-702（CAS 214697-26-4）は24時間後に分裂中のβ細胞のパーセンテージをバックグラウンドの2〜3倍に増大させ、β細胞数に有意な影響を有する（下記参照）。変動するベースラインβ細胞複製速度とは無関係に、ADK-Iは一貫してβ細胞複製速度の2〜3倍の増大を引き起こした。示した実験において、ヒットした化合物はβ細胞複製速度を約2.5％から約6.5％に増大させた。β細胞を特定するためにPDX-1を用いた発明者らの結果を確認するために、β細胞を特定するためにPDX-1およびインスリン同時染色を用いて同様の実験を実施した（図17a）。
【０２７３】
次にさらなるADK-Iをそれらのβ細胞複製を促進する能力について試験した。2つのさらなるADK-Iが最初のヒットした化合物（図17b）と類似の有効性を示し、図13aに示す。（E. A. Kowaluk and M. F. Jarvis, Expert opinion on investigational drugs 9, 551-564 (2000)）ABT-702のマウスおよびブタ島に対する効果も試験した。これらの種由来の分散島細胞の正常培養物を樹立し、以前にラット島細胞培養物に用いたものと同じ抗体がβ細胞（PDX-1）および複製中の細胞（ki-67）の両方を有効に特定した（データは示していない）。
【０２７４】
これらの両方の種由来の島細胞を化合物処理すると、ラット島細胞で観察されたものと同様のβ細胞複製の誘導を引き起こしたが、効力は幾分異なっていた（図13bおよび13c）。両化合物は用量の増大につれて有効性の増大を示した。5-ITはABT-702よりも強力であったが、化合物はいずれも約2〜3倍の最大誘導を示した。1つの注目すべき知見は、約20μMを超える濃度でのABT-702の分析はバックグラウンド蛍光によって制限された。
【０２７５】
これらの化合物の複製効果を、化合物処理に応答して分裂期マーカーであるホスホヒストンH3（PH3）を発現したβ細胞のパーセンテージを評価することによって、確認した（データは示していない）。PH3を用いて、β細胞複製において類似した2から3倍の増大が観察された（図18a）。加えて、S期細胞を標識するためにBRDUを用いてパルスチェイス実験を行った。島細胞をBRDUおよび溶媒または化合物存在下で2日間培養した後、2日間の洗い出しを行った。ADK-Iで処理した島培養物は、BRDU細胞を取り込んだβ細胞のパーセンテージの2倍の増大を示した（図18b）。ADK-Iの広範な細胞周期マーカー（ki-67）および狭い分裂期マーカー（PH3）の同様の誘導を引き起こす能力ならびにBRDU取り込みを増大させる能力はすべて、これらの化合物が有糸分裂活性を増大させることを示唆している。
【０２７６】
ADK-Iがβ細胞の絶対数を高めうるかどうかを試験するために、島細胞を5-ITまたはDMSO存在下で数日間培養し、次いでβ細胞の総数を計数し、時間0の時点で存在するβ細胞の数と比較した。96時間後にはβ細胞数にわずかな違いしか見られなかったが、144時間後にはβ細胞数はかなり大きく増大した（図13d）。第6日に、対照ウェルのβ細胞数の増大20％に比べて5-IT処理したウェルのβ細胞数は40％増大した。ADK-I処理によって生じる増大はβ細胞複製における2倍の増大と一致し、発明者らの培養における約3％/日〜約6％/日までの基底複製速度からの変化を示唆している。
【０２７７】
ADKはβ細胞によって発現され、β細胞複製を負に調節する：ADKは、細胞代謝において重要な役割を果たす3つの代謝ファミリー（ヘキソキナーゼ、リボキナーゼおよびガラクトキナーゼ）からなる、糖質キナーゼ群の酵素のメンバーである。（P. Bork, C. Sander and A. Valencia, Protein Sci 2, 31-40 (1993)）ADKは、リン酸供与体としてATPを用いてアデノシンのAMPへのリン酸化を触媒するその能力を通じて、細胞内および細胞外アデノシンレベルを調節するリボキナーゼである。（T. A. Krenitsky, R. L. Miller & J. A. Fyfe, Biochemical pharmacology 23, 70-72 (1974)およびJ. Park &R. S. Gupta, Cell Mol Life Sci 65, 2875-2896 (2008)）。この酵素は広範に発現されるが、肝臓および膵臓で高度に発現される。（M. Andres & I. H. Fox, The Journal of biological chemistry 254, 11388-11393 (1979)）ADKは2つの公知の型、すなわち長い核アイソフォームおよび短い細胞質アイソフォームを有する。（X. A. Cui, et al., Biochemical and biophysical research communications 388, 46-50 (2009)）細胞質型はプリンサルベージ経路に関与するが、長い型はアデノシンによるS-アデノシルホモシステインヒドロラーゼ活性のフィードバック調節を介してのメチルトランスフェラーゼ反応の包括的調節因子である。（N. M. Kredich & D. V. Martin, Jr., Cell 12, 931-938 (1977)およびBoison, L. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99, 6985-6990 (2002)）したがって、ADKの阻害は細胞外アデノシンを増加させることおよびメチルトランスフェラーゼ反応を阻害することの二重効果を有する。
【０２７８】
ADK免疫染色により、β細胞におけるADKの核発現が明らかとなった（データは示していない）。これとは対照的に、ADK染色は、線維芽細胞およびα細胞において、核ではなく細胞質中であった（データは示していない）。δ細胞（ソマトスタチン+細胞）におけるADK局在は変動性であったが、ADKは一般にこれらの細胞の核に存在した（データは示していない）。染色が特異的であることを確実にするために、用いる抗体を、強い核発現パターンを示す完全長ADK cDNAによるCOS細胞の一過的形質移入により確認し、発明者らの島細胞染色の特異性を確認した（データは示していない）。β細胞では核染色が見られたが、α細胞では見られなかったことは、長い型のADKはβ細胞中で発現されるが、α細胞では発現されないことを示唆している。
【０２７９】
次に、β細胞中のADKは複製の負の調節因子として作用するかどうかを試験した。発明者らは、GFPの発現を誘導するためのレンチウイルス感染と、非特異的阻害RNA（siRNA）またはADKを標的とするもののいずれかを用いた。ADK指向siRNAのADKタンパク質レベルをノックダウンする能力を、ウェスタンブロットおよび免疫染色で確認した（図14aおよび19）。GFP発現により判定して、島細胞培養物のおよそ半分を感染させることにより、同じウェル内の感染細胞および非感染細胞のβ細胞複製速度を別々に分析することができた。ADKがβ細胞複製の細胞自律調節因子として作用するならば、負制御プラスミドを受け取るβ細胞および非感染のままのβ細胞はすべて同じ複製速度を有するが、ADK指向siRNAウイルスに感染したβ細胞は高い複製速度を有するであろうと推論された。事実、結果はこの予測を確認した（図14b）。非感染β細胞および対照の感染β細胞はすべて、約2％の基底増殖速度を有した。これとは対照的に、ADK指向siRNAを受け取ったβ細胞はそれらの複製速度の2.5倍の増大を示した。この結果は、ADKはβ細胞複製の細胞自律的な負の調節因子であり、ADK-Iの分子標的でありうることを示していた。
【０２８０】
ADK-IおよびグルコースまたはGLP-1Rアゴニストはβ細胞複製に対する相加的効果を有する：高血糖はβ細胞増殖の主な生理的駆動因子であると考えられるが、この広く認められた原理を支持するインビトロでの証拠はあまりない。（S. Bonner-Weir, et al., Diabetes 38, 49-53 (1989)およびL. C. Alonso, et al., Diabetes 56, 1792-1801 (2007)）本明細書に記載のβ細胞複製プラットフォームを利用して、グルコースがβ細胞複製に対して濃度依存的効果を有することが示された（図15a）。しかし、反応の動力学はAKD-Iのものとは異なるようであった。ADK-Iは24時間までのki-67染色を増大させたが、グルコースの効果はそれよりも後（48時間）まで見られなかった。特定の理論に縛られることを望むわけではないが、グルコースおよびADK-Iの明確な作用メカニズムは、試験したグルコース濃度すべてでの5-ITの相加的効果によって支持される（図15a）。高グルコースおよび5-ITの組み合わせはベースラインの複製速度の5倍の誘導を引き起こした。この実験の結果は、高血糖環境にADK-Iを加えると、β細胞増殖を有意に高めうることを示した。
【０２８１】
GLP-1Rアゴニストは、インスリン放出を促進し、血糖コントロールを改善し、かつβ細胞複製を増大させるそれらの能力について、注目されてきた。（J. H. Nielsen, et al., Diabetes 50 Suppl 1, S25-29 (2001)およびD. J. Drucker & M. A. Nauck, Lancet 368, 1696-1705 (2006)）これらのアゴニストがグルコースに対するβ細胞反応を増強することによって作用することから、これらはADK-Iのβ細胞複製効果も増強することができる。したがって、ラット島培養物をGLP-1Rアゴニスト（グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）またはエキセナチド-4（Ex-4））と共に、5-IT存在下、または非存在下でインキュベートした。GLP-1Rアゴニストはβ細胞複製を5-IT（約2.5倍）に比べてささやかに増大させた（約1.5倍）にすぎなかったが、GLP-1Rアゴニストに5-ITを加えると相加的複製効果（約4倍）が得られた（図15b）。これらの結果は、GLP-1に無関係の様式で作用するADK-Iに一致し、かつ、β細胞複製の増大に組み合わせてこれら2つの経路を調節する可能性を示している。
【０２８２】
ADK-Iはβ細胞複製を選択的に促進する：複数の細胞の複製速度を島培養物中で評価した：PP細胞、α細胞、δ細胞および線維芽細胞（図16b）。δ細胞は、β細胞と同様、核ADKを発現し、グルコースに応答してそのホルモンを分泌する特性を共有しているため、ADK-Iに応答して複製の増大を示すこともできる。（M. Braun, et al., Diabetologia 52, 1566-1578 (2009)）事実、δ細胞はADK-I処理に応答して複製の有意な増大を示したが、線維芽細胞、α細胞およびPP細胞は示さなかった（図16a）。PP細胞の分裂は本明細書において用いた培養条件下では非常に稀であったため、その複製速度は示していない。
【０２８３】
β細胞に加えて、肝細胞も高レベルのADKを発現し、したがってADK-Iに応答して増殖すると予想することができる。（Boison, L. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99, 6985-6990 (2002)）この可能性を試験するために、マウス肝細胞を単離し、培養物に加え、ABT-702で処理した（5-ITは肝細胞によって十分に耐容されなかった）。これらの細胞の複製速度は、薬物処理に応答して増大することはなかった（図16b）。したがって、ADK-Iの複製効果は選択的であった。
【０２８４】
ADK-Iはインビボでβ細胞複製を促進する：インビトロでの結果を元に、ABT-702がインビボでβ細胞複製を選択的に促進する能力を試験した。ABT-702は、5-ITに比べてその半減期が長いことから選択した。（G. Z. Zheng, et al., Bioorganic & medicinal chemistry letters 11, 2071-2074 (2001)）事実、ABT-702を１回腹腔内注射すると、β細胞によるBRDU取り込みが2倍に増大した（図16c）。PDX-1ではなくインスリンの存在によってβ細胞を特定した、別の動物コホートで、結果を確認した（図20）。特に、ABT-702による処理は外分泌細胞の複製速度を増大させず、ここでもADK-Iの選択性を強調している（図16dおよび20）。加えて、同じ動物コホートにおけるABT-702処理に応答した肝細胞によるBRDU取り込みも試験した（図16e）。肝細胞は薬物処理に応答した細胞分裂速度の増大を示さなかった。したがって、ABT-702はインビトロおよびインビボでβ細胞複製を選択的に促進した。
【０２８５】
考察
DM2は治療の改善が必要とされる世界的な流行病である。食事および行動的習慣の改変による疾患予防はいまだに最も重要ではあるが、これらの戦略は広く成功にはいたっていない。歴史的に、DM2療法はインスリン分泌を増強する（スルホニル尿素）、または末梢耐性を下げることによりインスリン需要を低減する（ビグアニド、チアゾリジンジオン）試みを行ってきた。しかし、DM2患者は適応β細胞増殖に対する限られた能力しか持たないようで、これらのアプローチはこの不備に対処していない。その結果、ほとんどの糖尿病患者は進行性のβ細胞欠損を示す。したがって、本発明は、β細胞分裂の増大を促進する薬理学的物質を特定するためのプラットフォームを提供する。本試験は1つの薬剤クラス、すなわちアデノシンキナーゼ阻害剤に焦点を当てているが、本明細書に記載のスクリーニングアッセイ法はその他の化合物を発見するために用いることもできる。
【０２８６】
β細胞量を増大させるための増殖促進剤の適用は、主にそれらの特異性によって制限される。サイクリン2などの細胞周期調節剤、AKT2のようなシグナル伝達分子、肝細胞増殖因子、増殖ホルモンおよびプロラクチンを含む増殖因子およびホルモン、ならびにいくつかの低分子を含む、β細胞複製を促進する多種多様な因子が特定されている（S. Georgia & A. Bhushan, The Journal of clinical investigation 114, 963-968 (2004)；S. Fatrai, et al., Diabetes 55, 318-325 (2006)；J. H. Nielsen, et al., Diabetes 50 Suppl 1, S25-29 (2001)；R. C. Vasavada, et al., The international journal of biochemistry & cell biology 38, 931-950 (2006)；およびW. Wang, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 1427-1432 (2009)）。しかし、これらの実体のほとんどは、それらの有用性を制限する多面発現効果を示すか、またはβ細胞複製を一貫して増大させることができない。本発明は、インビトロおよびインビボでβ細胞複製を促進することが可能な、新しいクラスの剤としてのADK-Iを提供する。非常に重要であるのは、これらの化合物がβ細胞に対して選択的増殖効果を有し、α細胞、肝細胞、外分泌細胞または線維芽細胞に対する効果はもたないことである。加えて、本明細書に示す結果は、ADK-IがGLP-1Rアゴニストおよび高血糖のβ細胞複製効果を増強するという魅力的な性質を有することを示している。
【０２８７】
β細胞複製の調節剤としてのADKの特定は、新しい生物学を明らかにするために化学的スクリーニングを用いる価値を強調する予想外の発見であった。アデノシンまたはADK-Iで処理したほぼすべての他の細胞型において、増殖阻害が観察された。いくつか挙げてみると、心線維芽細胞、大動脈平滑筋細胞、糸球体間質細胞、軟骨細胞、星状細胞、リンパ球、結腸癌細胞株、乳癌細胞株、胃癌細胞株、肝細胞癌細胞株および甲状腺細胞株において、ADK-Iの効果は複製を刺激することではなく、阻害することである。例えば、R. K. Dubey, et al., Circulation 96, 2656-2666 (1997)；R. K. Dubey, et al., Hypertension 31, 516-521 (1998)；R. K. Dubey, et al., Hypertension 46, 628-634 (2005)；Mistry, M. G. Chambers & R. M. Mason, Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarthritis Research Society 14, 486-495 (2006)；J. Faller, et al., Metabolism: clinical and experimental 33, 369-374 (1984)；M. Saito, et al., Cancer letters 290, 211-215；Y. Yasuda, et al., Journal of gastroenterology 44, 56-65 (2009)；M. Hashemi, et al., Cell proliferation 38, 269-285 (2005)；K. Sai, et al., Neurotoxicology 27, 458-467 (2006)；M. Saitoh, et al., Biochemical pharmacology 67, 2005-2011 (2004)；L. T. Wen & A. F. Knowles, British journal of pharmacology 140, 1009-1018 (2003)；L. F. Wu, et al., Acta pharmacologica Sinica 27, 477-484 (2006)；およびM. Vainio, P. Saarinen & K. Tornquist, Journal of cellular physiology 171, 336-342 (1997)を参照されたい。これらの以前の結果は、肝細胞、線維芽細胞、外分泌細胞およびα細胞がADK-Iに応答して増殖しないという発明者らの観察と一致している。
【０２８８】
特定の理論に縛られることを望むわけではないが、PDX-1+細胞におけるADK-Iの異常な増殖促進効果は、3つの理由により、細胞外アデノシンシグナル伝達によって仲介されるものではないようである。第一に、ADKノックダウンに応答してβ細胞増殖における細胞自律的増大が観察された。この効果が細胞外アデノシンによって仲介されたとすると、パラ分泌効果が予想されるであろう。第二に、アッセイでアデノシンまたはアデノシン受容体アンタゴニストを加えても、β細胞増殖に影響はなかった（データは示していない）。第三に、β細胞は主にADKの核アイソフォームを発現し、主にメチル基転移活性を調節すると考えられる。特定の理論に縛られることを望むわけではないが、ADK活性はβ細胞複製を防止するよう作用するメチル化反応を防止する。例えば、メニンは、ヒストンメチルトランスフェラーゼ複合体の一部として機能する、β細胞複製の重要な負の調節因子である。（S. K. Karnik, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102, 14659-14664 (2005)）。したがって、メニン活性はADK阻害によって阻害することができる。
【０２８９】
ADK-Iは動物によって十分に耐容されるようであり、てんかん、脳虚血、疼痛および炎症を含む様々な状態の治療薬として開発中である。（E. A. Kowaluk & M. F. Jarvis, Expert opinion on investigational drugs 9, 551-564 (2000)）本発明は、β細胞複製に対して選択的活性を有する、以前に認められていないβ細胞複製の調節剤を提供する。したがって、ADKは糖尿病の治療および予防のための治療的標的でありうる。さらに、β細胞のエクスビボ増殖によって、1型糖尿病を治療するために用いる死体島の限られた入手可能性を克服することができる。
【０２９０】
参照文献
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2013514781.tif 000023
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【０２９１】
本明細書および実施例において特定されるすべての特許および他の出版物は、すべての目的のために特に参照により本明細書に組み入れられる。これらの出版物は、本出願の提出日よりも前にそれらが開示されたことによってのみ提供されるものである。これに関して、発明者らは先行発明によって、または任意の他の理由のために、そのような開示に先行する権利がないと自認したと解釈されるべきではない。これらの文書の日付に関する記載または内容に関する表現はすべて、出願者らが入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関してのいかなる自認をなすものでもない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１３ｄ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年8月16日(2012.8.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2013514781000001.app
【国際調査報告】
2013514781.tif 000058
2013514781.tif 000059
2013514781.tif 000060