(57)【要約】  本発明は、プロテインチロシンキナーゼ阻害活性を有する新規フルオロ置換２−アリール−３,５−ジシアノ−４−(１Ｈ−インダゾール−５−イル)−６−メチル−１,４−ジヒドロピリジン誘導体、その製造方法、ならびにｃ−Ｍｅｔ媒介疾患またはｃ−Ｍｅｔ媒介症状、特に癌および他の増殖性障害の処置のためのその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2013510814.tif 000043
［式中、
Ａｒは、フェニルまたは５員もしくは６員ヘテロフェニルであり、これらは、各々、フルオロ、クロロ、ブロモ、シアノ、ニトロ、(Ｃ1−Ｃ4)−アルキル、(Ｃ1−Ｃ4)−アルコキシ、アミノおよびモノ−(Ｃ1−Ｃ4)−アルキルアミノからなる群から独立に選択される１個または２個の置換基で置換されていてもよく（ここで、この(Ｃ1−Ｃ4)−アルキル置換基および(Ｃ1−Ｃ4)−アルコキシ置換基は、さらに、３個までのフルオロ原子で置換されていてもよい）、
Ｒ1は、水素またはフルオロであり、
Ｒ2は、水素またはメチルであり、
Ｒ3は、水素またはフルオロであり、
Ｒ4は、水素または(Ｃ1−Ｃ4)−アルキルである］
で示される化合物またはその医薬上許容される塩、水和物および／または溶媒和物。
【請求項２】
Ａｒが、フェニル、ピリジル、ピリミジニル、チエニル、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、イソオキサゾリルまたはイソチアゾリルであり、これらは、各々、フルオロ、クロロ、シアノ、メチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、エチル、メトキシ、トリフルオロメトキシおよびエトキシからなる群から独立に選択される１個または２個の置換基で置換され得、
Ｒ1が水素またはフルオロであり、
Ｒ2が水素であり、
Ｒ3が水素またはフルオロであり、
Ｒ4が水素、メチルまたはエチルである、
請求項１記載の式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩、水和物および／または溶媒和物。
【請求項３】
Ａｒが、フェニル、ピリジルまたはオキサゾリルであり、これらは、各々、フルオロ、クロロ、メチル、トリフルオロメチルおよびメトキシからなる群から独立に選択される１個または２個の置換基で置換され得、
Ｒ1が水素またはフルオロであり、
Ｒ2が水素であり、
Ｒ3が水素またはフルオロであり、
Ｒ4がメチルである、
請求項１または２記載の式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩、水和物および／または溶媒和物。
【請求項４】
請求項１〜３に記載の式（Ｉ）で示される化合物の製造方法であって、式（ＩＩ）
【化２】
2013510814.tif 000044
［式中、Ｒ3およびＲ4は、請求項１〜３に示される意味を有する］
で示されるインダゾリルアルデヒドを、
［Ａ］酸、酸／塩基併用および／または脱水剤の存在下にて式（ＩＩＩ)
【化３】
2013510814.tif 000045
［式中、Ａｒは、請求項１〜３に示される意味を有する］
で示されるケトニトリルと反応させて、式（ＩＶ）
【化４】
2013510814.tif 000046
［式中、Ａｒ、Ｒ3およびＲ4は、請求項１〜３に示される意味を有する］
で示される化合物を得、
次いで、後者を式（Ｖ）
【化５】
2013510814.tif 000047
［式中、Ｒ1は、請求項１〜３に示される意味を有する］
で示されるエナミノニトリルと縮合させて、式（Ｉ−Ａ）
【化６】
2013510814.tif 000048
［式中、Ａｒ、Ｒ1、Ｒ3およびＲ4は、請求項１〜３に示される意味を有する］
で示される化合物を得ること、
または
［Ｂ］任意に塩基および／または脱水剤の存在下にて、式（ＶＩ）
【化７】
2013510814.tif 000049
［式中、Ｒ1は、請求項１〜３に示される意味を有する］
で示されるケトニトリルと反応させて、式（ＶＩＩ）
【化８】
2013510814.tif 000050
［式中、Ｒ1、Ｒ3およびＲ4は、請求項１〜３に示される意味を有する］
で示される化合物を得、
次いで、後者を酸の存在下にて式（ＶＩＩＩ）
【化９】
2013510814.tif 000051
［式中、Ａｒは、請求項１〜３に示される意味を有する］
で示されるエナミノニトリルと縮合させて、式（Ｉ−Ａ）
【化１０】
2013510814.tif 000052
［式中、Ａｒ、Ｒ1、Ｒ3およびＲ4は、請求項１〜３に示される意味を有する］
で示される化合物を得、
任意に、次いで、塩基の存在下にて式（ＩＸ）
ＣＨ3−Ｘ      （ＩＸ）
［式中、Ｘは、ハロゲン、メシラート、トリフラート、トシラートまたはスルファートのような脱離基を表す］
で示される化合物を用いてジヒドロピリジンＮ−メチル化を行って、式（Ｉ−Ｂ）
【化１１】
2013510814.tif 000053
［式中、Ａｒ、Ｒ1、Ｒ3およびＲ4は、請求項１〜３に示される意味を有する］
で示される化合物を得ること、
ならびに、次いで、任意に、所望により、（ｉ）好ましくはクロマトグラフィー法を使用して、化合物（Ｉ−Ａ）および（Ｉ−Ｂ）をそれらの各々のエナンチオマーおよび／またはジアステレオマーに分離し、および／または（ｉｉ）化合物（Ｉ−Ａ）および（Ｉ−Ｂ）をそれらの各々の水和物または溶媒和物へ、対応する溶媒で処理して変換してもよいこと
を特徴とする方法。
【請求項５】
疾患の処置または予防のための請求項１〜３いずれか１項記載の化合物。
【請求項６】
細胞増殖性障害の処置または予防のための医薬組成物の製造のための請求項１〜３いずれか１項記載の化合物の使用。
【請求項７】
細胞増殖性障害が癌である、請求項６記載の使用。
【請求項８】
請求項１〜３いずれか１項記載の化合物またはその医薬上許容される水和物または溶媒和物および医薬上許容される補助剤を含む医薬組成物。
【請求項９】
さらに、１種以上のさらなる治療剤を含む、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
さらなる治療剤が、抗腫瘍剤である、請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
細胞増殖性障害の処置または予防のための請求項８〜１０いずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１２】
哺乳動物における細胞増殖性障害の処置または予防方法であって、この処置または予防を必要とする哺乳動物に、１種以上の請求項１〜３いずれか１項記載の化合物の治療上有効量または請求項８〜１０いずれか１項記載の医薬組成物の治療上有効量を投与することを含む、方法。
【請求項１３】
細胞増殖性障害が癌である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
癌が、乳房、呼吸器、脳、生殖器官、消化管、尿路、眼、肝臓、皮膚、頭頸部、甲状腺および副甲状腺の癌、または固体腫瘍の遠隔転移である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜３いずれか１項記載化合物または請求項８〜１０いずれか１項記載の医薬組成物が、外科的手術または放射線療法と併せて施される、請求項１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテインチロシンキナーゼ阻害活性を有する新規なフルオロ置換２−アリール−３,５−ジシアノ−４−(１Ｈ−インダゾール−５−イル)−６−メチル−１,４−ジヒドロピリジン誘導体、その製造方法、およびｃ−Ｍｅｔ媒介疾患またはｃ−Ｍｅｔ媒介症状、特に癌および他の増殖性障害の処置のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、最も一般的な広範囲に及ぶ疾患の１つである。２００２年には世界中の４４０万人を超える人々が乳癌、大腸癌、卵巣癌、肺癌または前立腺癌と診断され、２５０万人を超える人々がこれらの破壊的な疾患で死亡した（非特許文献１）。米国だけでも、２００５年には、新しいケースが１２５万件を超え、５００,０００人を超える人々が死亡すると予想されていた。これらの新しいケースの大半は、大腸癌（約１００,０００件）、肺癌（約１７０,０００件）、乳癌（約２１０,０００件）および前立腺癌（約２３０,０００件）であると予想された。癌の発生率および罹患率はどちらも今後１０年間で約１５％増加すると予想され、１.４％の平均増加率となる（非特許文献２；非特許文献３）。
【０００３】
癌が生じ得る方法はたくさんあり、それがそれらの治療を困難にする理由の１つである。１つの方法は、正常な細胞性タンパク質の非生理的活性化を引き起こす遺伝子の変異によってこの正常な細胞性タンパク質から生じる腫瘍性タンパク質による細胞の形質転換である。数多くの腫瘍性タンパク質を誘導する１つのファミリーのタンパク質は、チロシンキナーゼ（例えば、ｓｒｃキナーゼ）であり、特に、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）である。過去２０年間に、哺乳動物の細胞増殖の調節における受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）媒介シグナル伝達の重要性が、多くの研究方法によって示されてきた。最近、抗腫瘍剤としてチロシンキナーゼの選択的小分子阻害剤を用いた臨床結果が得られた。
【０００４】
ｃ−Ｍｅｔ受容体もまた受容体チロシンキナーゼである。１９８０年代初めに、その発癌能が同定され、その頃、Ｎ末端で二量体形成ドメインと縮合したＭｅｔ遺伝子のキナーゼドメインを含有する化学的に誘導されたヒトの骨肉腫細胞株から変異Ｍｅｔが単離された［非特許文献４］。
【０００５】
細胞性Ｍｅｔタンパク質は、一本鎖１９０ｋｄ前駆体として合成されたヘテロ二量体膜貫通型タンパク質である［非特許文献５］。この前駆体は、アミノ酸残基３０７の後で細胞内切断されて、ジスルフィド架橋により連結された５０ｋｄのα鎖と１４５ｋｄのβ鎖を形成する。α鎖が完全に細胞外にあるのに対して、β鎖は細胞膜の内外にまたがっている。β鎖は、α鎖と一緒にリガンド結合を媒介するＮ末端ｓｅｍａドメインを含む。β鎖の外部ドメインの残部は、システインリッチドメインおよび４個の免疫グロブリンドメインを含み、膜貫通領域および細胞内ドメインが続いている。細胞内ドメインは、膜近傍ドメイン、キナーゼドメイン、および下流シグナル伝達を媒介するＣ末端ドメインを含んでいる。リガンドが結合すると、受容体の二量体化が誘発され、膜近傍領域（Ｙ１００３）、キナーゼの活性化ループ（Ｙ１２３４およびＹ１２３５）およびカルボキシ末端ドメイン（Ｙ１３４９およびＹ１３５６）におけるチロシン自己リン酸化工程のカスケードによってキナーゼドメインが活性化される。リン酸化Ｙ１３４９およびＹ１３５６は、下流ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達に必要なアダプタータンパク質を結合するための複数基質ドッキング部位を含む［非特許文献６］。ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達に対して最も重要な基質の１つは、独特の長期にわたる細胞内シグナルを生じる異常なホスホチロシン結合部位（ｍｂｓ（ｍｅｔ結合部位）と称される）を介してＹ１３４９またはＹ１３５６のいずれかと結合する足場アダプタータンパク質Ｇａｂ１である。もう１つの重要な基質は、アダプタータンパク質Ｇｒｂ２である。細胞状況に応じて、これらのアダプターは、ＥＲＫ／ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ、Ｒａｓ、ＪＮＫ、ＳＴＡＴ、ＮＦκＢおよびβ−カテニンを介してシグナル伝達するもののような種々の細胞内シグナル伝達経路の活性化を媒介する。
【０００６】
ｃ−Ｍｅｔは、散乱因子としても知られている肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）およびその唯一の既知の生物学的に活性なリガンドであるそのスプライスバリアントによって独自に活性化される［非特許文献７］。ＨＧＦは、プラスミノーゲンファミリーのプロテイナーゼとの類似性を明らかにする特徴的な構造を有する。それは、アミノ末端ドメイン、続いて４個のクリングルドメイン、および酵素的に活性ではないセリンプロテアーゼホモロジードメインを含む。ｃ−Ｍｅｔと同様に、ＨＧＦは、不活性な一本鎖前駆体（ｐｒｏ−ＨＧＦ）として合成され、セリンプロテアーゼ（例えば、プラスミノーゲン活性化因子および凝固因子）によって細胞外で切断され、ジスルフィド結合した活性なα鎖およびβ鎖ヘテロ二量体に変換される。ＨＧＦは、ヘパラン硫酸プロテオグリカンに高い親和性で結合し、それは、ＨＧＦを主に細胞外マトリックスと結合させ続け、その拡散を制限する。結晶構造分析は、ＨＧＦが二量体を形成し、ｃ−Ｍｅｔと結合すると受容体の二量体化を誘導することを示す。
【０００７】
ＨＧＦは、間葉系細胞により発現され、特に上皮細胞で広く発現されるｃ−ＭｅｔへのＨＧＦの結合は、上皮、内皮、神経および造血細胞を含む様々な組織で多面的な作用をもたらす。その作用は、一般的に、以下の現象の１つまたは全てを含む：ｉ）有糸分裂誘発の刺激；ＨＧＦは、肝細胞に対する分裂促進活性により同定された；ｉｉ）浸潤および遊走の刺激；独立した実験アプローチにおいて、ＨＧＦは、細胞運動（「散乱」）の誘導に基づき、散乱因子として同定された；および、ｉｉｉ）形態形成（管形成）の刺激。ＨＧＦは、コラーゲンマトリックス中でイヌの腎臓細胞から分岐した細管の形成を誘導する。さらに、遺伝子改変マウスおよび細胞培養実験からの証拠は、ｃ−Ｍｅｔが生存受容体として作用し、細胞をアポトーシスから保護することを示す［非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１;非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４］。ＨＧＦによるこれらの生物学的過程の協調的な実行は、「浸潤性増殖」と呼ばれる特異的な遺伝子的プログラムをもたらす。
【０００８】
正常な状態では、ｃ−ＭｅｔおよびＨＧＦは、マウスの胚発生に、特に胎盤および肝臓の発生に、そして、四肢の体節からの筋芽細胞の方向性のある遊走に必須である。ｃ−ＭｅｔまたはＨＧＦ遺伝子の遺伝子的破壊は、同一の表現型をもたらし、このことは、それらの独特の相互作用を示す。成体におけるｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦの生理的役割はあまり理解されていないが、実験的証拠は、それらが創傷治癒、組織再生、造血および組織の恒常性維持に関与することを示唆する。
【０００９】
腫瘍性タンパク質ＴＰＲ−ＭＥＴの同定は、ｃ−Ｍｅｔが腫瘍形成において役割を果たし得ることの最初のヒントとなった。さらなる実質的な証拠は、数々の異なる実験アプローチに由来する。ヒトおよびマウス細胞株におけるｃ−ＭｅｔまたはＨＧＦの過剰発現は、ヌードマウスで発現されると、腫瘍形成能および転移性形質を誘導する。遺伝子導入によるｃ−ＭｅｔまたはＨＧＦの過剰発現は、マウスで腫瘍形成を誘導する。
【００１０】
最も興味深いことに、ｃ−Ｍｅｔのミスセンス変異または受容体を活性化する変異が、孤発性および遺伝性乳頭状腎癌（ＨＰＲＣ）、ならびに、肺、胃、肝臓、頭頸部、卵巣および脳の癌などの他の癌のタイプにおいて同定された。重要なことに、ＨＰＲＣファミリーにおける特異的ｃ−Ｍｅｔ変異は疾患によって分離しており、ｃ−Ｍｅｔ活性化とヒトの癌の因果関係を形成している［非特許文献１５；非特許文献１６］。最強の形質転換活性を有する活性化変異は、活性化ループ（Ｄ１２２８Ｎ／ＨおよびＹ１２３０Ｈ／Ｄ／Ｃ）および隣接するＰ＋１ループ（Ｍ１２５０Ｔ）に位置する。それより弱いさらなる変異が、触媒ループ近傍およびキナーゼドメインのＡローブ内に見出された。さらに、ｃ−Ｍｅｔの膜近傍ドメインのいくつかの変異が肺の腫瘍で観察され、それは、キナーゼを直接活性化しないが、ユビキチン化および後続の分解に対する耐性を与えることによりタンパク質を安定化する［非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９］。興味深いことに、ｃ−Ｍｅｔの体細胞変異は、様々な癌における攻撃性の増加および広範な転移と関連する。生殖系および体細胞変異の頻度は低いが（５％未満）、パラ分泌または自己分泌メカニズムによる変異なしでのｃ−Ｍｅｔシグナル伝達の調節解除を導く他の主要なメカニズムが観察された。骨肉腫または横紋筋肉腫などの生理的にＨＧＦを産生する間葉系細胞に由来する腫瘍において、そして、外胚葉由来の神経膠芽腫および乳癌において、パラ分泌の活性化が観察された。
【００１１】
しかしながら、最も頻繁な症例は、大腸、膵臓、胃、乳房、前立腺、卵巣および肝臓の癌腫で観察されるように、ｃ−Ｍｅｔが過剰発現される癌腫である。過剰発現は、例えば、胃および肺の腫瘍細胞株で観察されるように、遺伝子の増幅により生じ得る。ごく最近、ｃ−Ｍｅｔの過剰発現が、ＥＧＦ受容体阻害への耐性を獲得した肺腫瘍細胞株で検出された［非特許文献２０］。ｃ−Ｍｅｔを過剰発現するいくつかの上皮腫瘍は、ＨＧＦも共発現し、その結果、自己分泌のｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ刺激ループをもたらし、それにより間質性細胞に由来するＨＧＦの必要性を回避する。
【００１２】
一般に、ヒトの癌におけるｃ−Ｍｅｔの異常な活性化は、特定のメカニズムに関係なく、典型的には予後不良と関連することが見出された［非特許文献２１］。
【００１３】
まとめると、ｃ−Ｍｅｔを重要な癌の標的として実証する多数のインビトロおよびインビボの研究が行われ、総合的なリストを非特許文献２２で見ることができる［非特許文献２３］。ヒトの腫瘍における異常なＭｅｔシグナル伝達を弱めるためのいくつかの戦略が続き、それには、とりわけ、ＨＧＦアンタゴニストおよび小分子阻害物質が含まれる。ＡＲＱ−１９７（Arqule）、フォレチニブ（ＸＬ−８８０、Exelixis/GSK）およびＰＨ−２３４１０６６（Pfizer）などの数々の小分子阻害物質が現在臨床開発中である；それらは、最近論評された［非特許文献２４］。
【００１４】
特許文献１では、アリールまたはヘテロアリール基を４位に有するハロアルキル置換３−シアノ−１,４−ジヒドロピリジン誘導体は、ステロイド受容体およびカルシウムチャネルの活性の両方のモジュレーターとして記載され、したがって、心血管疾患の処置に特に有用である。４−フェニル−１,４−ジヒドロピリジン誘導体を使用するアルツハイマー病の処置方法は、特許文献２で特許請求された。
【００１５】
ｃ−Ｍｅｔキナーゼ阻害活性を有する様々に置換された３−シアノ−４−ヘテロアリール−１,４−ジヒドロピリジン類が、最近、特許文献３で開示された。しかしながら、このｃ−Ｍｅｔ阻害剤の新規構造クラスのさらなる研究中に、候補化合物は、ラットの血液クリアランス測定から最初に予測されたものよりも有意に低いと判明した不満足な経口バイオアベイラビリティーにより頻繁に損なわれることが明らかになった。経口バイオアベイラビリティーは化合物がどのくらい良好に吸収されるかにも依存するので、これらの化合物の薬物動態および物理化学的プロフィールを前提に、低い溶解性および／または不適切な胃腸管の透過性がこのような吸収の限定を導き得るという仮説が立てられた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】国際公開第２００６／０６６０１１号
【特許文献２】国際公開第２００６／０７４４１９号
【特許文献３】国際公開第２００８／０７１４５１号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Globocan 2002 Report, http://www-dep.iarc.fr/globocan/downloads.htm
【非特許文献２】American Cancer Society, Cancer Facts and Figures 2005
【非特許文献３】http://www.cancer.org/docroot/STT/content/STT_1x_Cancer_Facts_Figures_2007.asp
【非特許文献４】C.S. Cooper et al., Nature 311: 29-33 (1984)
【非特許文献５】G.A. Rodrigues et al., Mol. Cell Biol. 11: 2962-70 (1991)
【非特許文献６】C. Ponzetto et al., Cell 77: 261-71 (1994)
【非特許文献７】L. Naldini et al., Oncogene 6: 501-4 (1991)
【非特許文献８】N. Tomita et al., Circulation 107: 1411-1417 (2003)
【非特許文献９】S. Ding et al., Blood 101: 4816-4822 (2003)
【非特許文献１０】Q. Zeng et al., J. Biol. Chem. 277: 25203-25208 (2002)
【非特許文献１１】N. Horiguchi et al., Oncogene 21: 1791-1799 (2002)
【非特許文献１２】A. Bardelli et al., Embo J. 15: 6205-6212 (1996)
【非特許文献１３】P. Longati et al., Cell Death Differ. 3: 23-28 (1996)
【非特許文献１４】E.M. Rosen, Symp. Soc. Exp. Biol. 47: 227-234 (1993)
【非特許文献１５】L. Schmidt et al., Nat. Genet. 16: 68-73 (1997)
【非特許文献１６】B. Zbar et al., Adv. Cancer Res. 75: 163-201 (1998)
【非特許文献１７】M. Kong-Beltran et al., Cancer Res. 66: 283-9 (2006)
【非特許文献１８】T.E. Taher et al., J. Immunol. 169: 3793-800 (2002)
【非特許文献１９】P. Peschard et al., Mol. Cell 8: 995-1004 (2001)
【非特許文献２０】J.A. Engelmann et al., Science 316: 1039-1043 (2007)
【非特許文献２１】J.G. Christensen et al., Cancer Lett. 225: 1-26 (2005)
【非特許文献２２】http://www.vai.org/met
【非特許文献２３】C. Birchmeier et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4: 915-25 (2003)
【非特許文献２４】J.J. Cui, Expert Opin. Ther. Patents 17: 1035-45 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
したがって、本発明によって解決されるべき技術的課題は、溶解性および／または透過性の増加を示し、続いてこれらの化合物の経口投与後に吸収される割合の増加を導く、強力なｃ−Ｍｅｔキナーゼ阻害活性を有する代替的化合物を同定することにあると思われる。
【００１９】
驚くべきことに、この度、６位のメチル基がジフルオロ置換またはトリフルオロ置換を有する２−アリール−３,５−ジシアノ−４−(１Ｈ−インダゾール−５−イル)−６−メチル−１,４−ジヒドロピリジン誘導体が、十分に確立された腸細胞のアッセイで確認されるとおり、有意に改善されたインビトロの透過特性を示すことが見出された。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
かくして、一の態様では、本発明は、一般式（Ｉ）：
【化１】
2013510814.tif 000002
［式中、
Ａｒは、フェニルまたは５員もしくは６員ヘテロフェニルであり、これらは、各々、フルオロ、クロロ、ブロモ、シアノ、ニトロ、(Ｃ1−Ｃ4)−アルキル、(Ｃ1−Ｃ4)−アルコキシ、アミノおよびモノ−(Ｃ1−Ｃ4)−アルキルアミノからなる群から独立に選択される１個または２個の置換基で置換されていてもよく（ここで、この(Ｃ1−Ｃ4)−アルキル置換基および(Ｃ1−Ｃ4)−アルコキシ置換基は、さらに、３個までのフルオロ原子で置換されていてもよい）、
Ｒ1は、水素またはフルオロであり、
Ｒ2は、水素またはメチルであり、
Ｒ3は、水素またはフルオロであり、
Ｒ4は、水素または(Ｃ1−Ｃ4)−アルキルである］
で示されるフルオロ置換２−アリール−３,５−ジシアノ−４−(１Ｈ−インダゾール−５−イル)−６−メチル−１,４−ジヒドロピリジン誘導体に関する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の化合物は、それらの塩、水和物および／または溶媒和物の形態であり得る。
【００２２】
本発明の目的で、塩は、好ましくは、本発明の化合物の医薬上許容される塩である（例えば、S. M. Berge et al., “Pharmaceutical Salts”, J. Pharm. Sci. 1977, 66, 1-19）。
【００２３】
本発明の化合物またはそれらの塩の水和物は、該化合物または塩と水との化学量論組成物であり、例えば、半水和物、一水和物または二水和物などである。
【００２４】
本発明の化合物またはそれらの塩の溶媒和物は、該化合物または塩と溶媒との化学量論組成物である。
【００２５】
本発明の化合物は、不斉中心の性質によって、または、束縛回転によって、異性体（エナンチオマー、ジアステレオマー）の形態で存在し得る。不斉中心が(Ｒ)配置、(Ｓ)配置または(Ｒ,Ｓ)配置であるいずれかの異性体が存在し得る。
【００２６】
本発明の化合物に２つ以上の不斉中心が存在する場合、しばしば、例示した構造のいくつかのジアステレオマーおよびエナンチオマーが起こり得ること、そして、純粋なジアステレオマーおよび純粋なエナンチオマーが好ましい実施態様であることが認識されるであろう。
【００２７】
本発明の化合物の異性体は全て、分離されているか、純粋であるか、ある程度純粋であるか、または、ジアステレオマー混合物もしくはラセミ混合物であるかにかかわらず、本発明の範囲内に包含される。該異性体の精製および該異性体混合物の分離は、当該分野で知られている標準的技法により行われ得る。例えば、ジアステレオマー混合物は、クロマトグラフィー処理または結晶化により個々の異性体に分離され得、ラセミ体は、キラル相でのクロマトグラフィー処理または分割により、各々のエナンチオマーに分離され得る。
【００２８】
さらに、上記の化合物の可能な全ての互変異性体も、本発明に従って包含される。
【００２９】
他に明記しない限り、以下の定義は、本明細書および特許請求の範囲の全体にわたって使用される置換基および残基に適用される：
【００３０】
アルキルは、一般に、１〜４個に炭素原子を有する直鎖または分枝状の飽和炭化水素残基を表す。非限定的な例として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチルが挙げられる。これらは、アルコキシ、アルキルアミノなどの残基にも適用される。
【００３１】
アルコキシは、例示的に、かつ、好ましくは、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉｓｏ−プロポキシ、ｎ−ブトキシおよびｔｅｒｔ−ブトキシを表す。
【００３２】
モノアルキルアミノは、一般に、その窒素原子に結合した１個のアルキル残基を有するアミノ残基を表す。非限定的な例として、メチルアミノ、エチルアミノ、ｎ−プロピルアミノ、ｉｓｏ−プロピルアミノ、ｎ−ブチルアミノおよびｔｅｒｔ−ブチルアミノが挙げられる。
【００３３】
ヘテロフェニルは、一般に、３〜５個の炭素原子、ならびにＮ、ＯおよびＳからなる群から独立に選択される２個までのヘテロ原子を含む合計５個または６個の環原子を有する単環式芳香族複素環の基を表し、この環系は、環炭素原子を介して結合される。非限定的な例として、フリル、ピロリル、チエニル、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニルおよびピラジニルが挙げられる。ピリジルおよびピリミジニルのような６員ヘテロフェニル基、ならびにチエニル、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、イソオキサゾリルおよびイソチアゾリルのような５員ヘテロフェニル基を優先する。
【００３４】
好ましい実施態様では、本発明は、
Ａｒが、フェニル、ピリジル、ピリミジニル、チエニル、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、イソオキサゾリルまたはイソチアゾリルであり、これらは、各々、フルオロ、クロロ、シアノ、メチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、エチル、メトキシ、トリフルオロメトキシおよびエトキシからなる群から独立に選択される１個または２個の置換基で置換され得、
Ｒ1が水素またはフルオロであり、
Ｒ2が水素であり、
Ｒ3が水素またはフルオロであり、
Ｒ4が水素、メチルまたはエチルである、
式（Ｉ）で示される化合物に関する。
【００３５】
特に好ましい実施態様では、本発明は、
Ａｒが、フェニル、ピリジルまたはオキサゾリルであり、これらは、各々、フルオロ、クロロ、メチル、トリフルオロメチルおよびメトキシからなる群から独立に選択される１個または２個の置換基で置換され得、
Ｒ1が水素またはフルオロであり、
Ｒ2が水素であり、
Ｒ3が水素またはフルオロであり、
Ｒ4がメチルである、
式（Ｉ）で示される化合物に関する。
【００３６】
もう１つの実施態様では、本発明は、一般式（Ｉ）で示される化合物の製造方法であって、式（ＩＩ）
【化２】
2013510814.tif 000003
［式中、Ｒ3およびＲ4は、上記の意味を有する」
で示されるインダゾリルアルデヒドを、
［Ａ］酸、酸／塩基併用および／または脱水剤の存在下にて式（ＩＩＩ)
【化３】
2013510814.tif 000004
［式中、Ａｒは、上記の意味を有する］
で示されるケトニトリルと反応させて、式（ＩＶ）
【化４】
2013510814.tif 000005
［式中、Ａｒ、Ｒ3およびＲ4は、上記の意味を有する］
で示される化合物を得、
次いで、後者を式（Ｖ）
【化５】
2013510814.tif 000006
［式中、Ｒ1は、上記の意味を有する］
で示されるエナミノニトリルと縮合させて、式（Ｉ−Ａ）
【化６】
2013510814.tif 000007
［式中、Ａｒ、Ｒ1、Ｒ3およびＲ4は、上記の意味を有する］
で示される化合物を得ること、
または
［Ｂ］任意に塩基および／または脱水剤の存在下にて、式（ＶＩ）
【化７】
2013510814.tif 000008
［式中、Ｒ1は、上記の意味を有する］
で示されるケトニトリルと反応させて、式（ＶＩＩ）
【化８】
2013510814.tif 000009
［式中、Ｒ1、Ｒ3およびＲ4は、上記の意味を有する］
で示される化合物を得、
次いで、後者を酸の存在下にて式（ＶＩＩＩ）
【化９】
2013510814.tif 000010
［式中、Ａｒは、上記の意味を有する］
で示されるエナミノニトリルと縮合させて、式（Ｉ−Ａ）
【化１０】
2013510814.tif 000011
［式中、Ａｒ、Ｒ1、Ｒ3およびＲ4は、上記の意味を有する］
で示される化合物を得、
任意に、次いで、塩基の存在下にて式（ＩＸ）
ＣＨ3−Ｘ      （ＩＸ）
［式中、Ｘは、ハロゲン、メシラート、トリフラート、トシラートまたはスルファートのような脱離基を表す］
で示される化合物を用いてジヒドロピリジンＮ−メチル化を行って、式（Ｉ−Ｂ）
【化１１】
2013510814.tif 000012
［式中、Ａｒ、Ｒ1、Ｒ3およびＲ4は、上記の意味を有する］
で示される化合物を得ること、
ならびに、次いで、任意に、所望により、（ｉ）好ましくはクロマトグラフィー法を使用して、化合物（Ｉ−Ａ）および（Ｉ−Ｂ）をそれらの各々のエナンチオマーおよび／またはジアステレオマーに分離し、および／または（ｉｉ）化合物（Ｉ−Ａ）および（Ｉ−Ｂ）をそれらの各々の水和物または溶媒和物へ、対応する溶媒で処理して変換してもよいこと
を特徴とする方法に関する。
【００３７】
プロセス変形［Ａ］（ＩＩ）＋（ＩＩＩ）→（ＩＶ）、（ＩＶ）＋（Ｖ）→（Ｉ−Ａ）および［Ｂ］（ＩＩ）＋（ＶＩ）→（ＶＩＩ）、（ＶＩＩ）+（ＶＩＩＩ）→（Ｉ−Ａ）は、どちらも、上記のように分けられた２つに工程で、またはワンポット法を用いて、すなわち、中間化合物（ＩＶ）および（ＶＩＩ）の各々をあからさまに単離せずに、行われ得る。場合によっては、個々の反応物の反応性に依存して、１本のフラスコで化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（Ｖ）［Ａ］または化合物（ＩＩ）、（ＶＩ）および（ＶＩＩＩ）［Ｂ］の三成分縮合反応を行うこともまた、式（Ｉ−Ａ）で示される化合物の製造に適していることがある［一般に，１,４−ジヒドロピリジン類の合成について、例えば、D. M. Stout, A.I. Meyers, Chem. Rev. 1982, 82, 223-243；H. Meier et al., Liebigs Ann. Chem. 1977, 1888；H. Meier et al., 同書, 1977, 1895；H. Meier et al., 同書, 1976, 1762；F. Bossert et al., Angew. Chem. 1981, 93, 755を参照］。
【００３８】
工程段階（ＩＩ）＋（ＩＩＩ）→（ＩＶ）、（ＩＶ）＋（Ｖ）→（Ｉ−Ａ）、（ＩＩ）＋（ＶＩ）→（ＶＩＩ）および（ＶＩＩ）＋（ＶＩＩＩ）→（Ｉ−Ａ）は、一般に、大気圧下にて＋２０℃から溶媒の沸点までの範囲の温度で不活性溶媒中にて行われる。
【００３９】
この目的に適する溶媒は、例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノールもしくはｎ−ペンタノールのようなアルコール類、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエンもしくはシレンのような炭化水素類、ジクロロメタン、トリクロロメタン、テトラクロロメタン、トリクロロエタン、１,２−ジクロロエタン、クロロベンゼンもしくはクロロトルエンのようなハロ炭化水素類、テトラヒドロフラン、１,４−ジオキサンもしくは１,２−ジメトキシエタンのようなエーテル類、またはアセトニトリルもしくは酢酸のような他の溶媒である。これらの溶媒の混合物も同様に使用することができる。反応（ＩＩ）＋（ＩＩＩ）→（ＩＶ）および（ＩＩ）＋（ＶＩ）→（ＶＩＩ）は、好ましくは、ジクロロメタン、トルエン、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノールまたはｎ−ペンタノール中、大気圧下にてそれぞれの還流温度で行われ、また、反応（ＩＶ）＋（Ｖ）→（Ｉ−Ａ）および（ＶＩＩ）＋（ＶＩＩＩ）→（Ｉ−Ａ）は、好ましくは、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｎ−ペンタノール、キシレン、酢酸またはそれらの混合物中、大気圧下にて還流温度で行われる。
【００４０】
反応（ＩＩ）＋（ＩＩＩ）→（ＩＶ）は、好都合には、酸、酸／塩基併用、および／またはモレキュラーシーブのような脱水剤の存在下で生じ得る。好適な酸触媒の例は、酢酸、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸またはｐ−トルエンスルホン酸であり；好適な塩基は、特に、ピペリジンまたはピリジンである。変換（ＩＩ）＋（ＶＩ）→（ＶＩＩ）は、成分の反応性に応じて、さらなる補助試薬なしで行われ得るか、または、ピペリジンのような慣用のアミン塩基、および／またはモレキュラーシーブのような脱水剤によって促進させることができる。反応（ＩＶ）＋（Ｖ）→（Ｉ−Ａ）および（ＶＩＩ）＋（ＶＩＩＩ）→（Ｉ−Ａ）は、通常、酸の存在下にて行われ得；好ましくは、酢酸が、酸触媒および溶媒または共溶媒のいずれにも使用される。
【００４１】
メチル化反応（Ｉ−Ａ）＋（ＩＸ）→（Ｉ−Ｂ）のための不活性溶媒は、例えば、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、テトラヒドロフラン、１,４−ジオキサンもしくは１,２−ジメトキシエタンのようなエーテル類、ベンゼン、トルエン、キシレン、ヘキサンもしくはシクロヘキサンのような炭化水素類、ジクロロメタン、トリクロロメタン、テトラクロロメタン、１,２−ジクロロエタン、トリクロロエタン、テトラクロロエタン、クロロベンゼンもしくはクロロトルエンのようなハロ炭化水素類、またはアセトニトリル、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ,Ｎ'−ジメチルプロピレン尿素（ＤＭＰＵ）、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）もしくはピリジンのような他の溶媒である。これらの溶媒の混合物の使用もまた適している。好ましくは、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミドまたはこれらの混合物が使用される。
【００４２】
工程段階（Ｉ−Ａ）＋（ＩＸ）→（Ｉ−Ｂ）に適する塩基は、特に、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウムもしくは炭酸セシウムのようなアルカリ金属またはアルカリ土類金属の炭酸塩、水素化ナトリウムもしくは水素化カリウムのようなアルカリ金属の水素化物、ナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシドもしくはカリウムｔｅｒｔ−ブトキシドのような立体障害性のアルカリアルコキシド、リチウムビス(トリメチルシリル)アミド、ナトリウムビス(トリメチルシリル)アミドもしくはカリウムビス(トリメチルシリル)アミドもしくはリチウムジイソプロピルアミドのような立体障害性のアルカリアミド類、またはトリエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンもしくはピリジンのような有機アミン類である。好ましくは、炭酸カリウム、炭酸セシウムまたは水素化ナトリウムが使用される。
【００４３】
反応（Ｉ−Ａ）＋（ＩＸ）→（Ｉ−Ｂ）は、一般に、−２０℃〜＋１００℃、好ましくは０℃〜＋５０℃の温度範囲で大気圧下にて行われる。
【００４４】
式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩＩ）および（ＩＸ）で示される化合物は、商業的に入手可能なものであるか、文献公知のものであるか、または、文献に記載されている標準的な方法の適応によって入手可能な出発物質から調製され得る（さらなる参考のため、下記実験セクションを参照）。
【００４５】
本発明の化合物の調製は、以下の合成スキームによって例示され得る。より詳しい手順は、実施例を記載する実験セクションで後述する。
【００４６】
【化１２】
2013510814.tif 000013
【００４７】
【化１３】
2013510814.tif 000014
【００４８】
【化１４】
2013510814.tif 000015
【００４９】
使用方法
本発明の化合物は、受容体チロシンキナーゼ類、特にｃ−Ｍｅｔ受容体チロシンキナーゼの活性または発現の強力な阻害剤である。さらに、本発明の化合物は、腸上皮細胞における高い透過性を特徴とし、経口投与後のこれらの化合物の吸収を促進する。したがって、式（Ｉ）で示される化合物は、治療剤として有効であると期待される。
【００５０】
したがって、別の実施態様において、本発明は、上記定義の式（Ｉ）で示される化合物の有効量を患者に投与することを含む、ｃ−Ｍｅｔキナーゼ活性に関連するかまたはそれにより媒介される障害の処置を必要としている患者における該障害の処置方法を提供する。ある種の実施態様では、ｃ−Ｍｅｔキナーゼ活性に関連する障害は、細胞増殖性障害、特に癌である。
【００５１】
本明細書全体で述べられる用語「処置する」または「処置」は、慣用的に使用されており、例えば、疾患または障害、例えば癌腫の症状と戦うか、それを緩和、縮小、軽減、改善することを目的とする対象体の管理またはケアである。
【００５２】
用語「対象体」または「患者」は、細胞増殖性障害に罹患し得るかまたは本発明の化合物の投与により利益を得ることができる生物、例えばヒトおよびヒト以外の動物を包含する。好ましいヒトとしては、本明細書に記載の細胞増殖性障害または関連状態に罹患しているかまたは罹患し易いヒトの患者が挙げられる。用語「ヒト以外の動物」としては、脊椎動物、例えば哺乳動物、例えばヒト以外の霊長類、ヒツジ、乳牛、イヌ、ネコおよび齧歯類、例えばマウス、および、非哺乳動物、例えばニワトリ、両生類、爬虫類などが挙げられる。
【００５３】
用語「ｃ−Ｍｅｔに関連するかまたはそれにより媒介される障害」は、ｃ−Ｍｅｔ活性と関連または関係する疾患、例えば、ｃ−Ｍｅｔの機能亢進、および、これらの疾患に伴う症状を含む。「ｃ−Ｍｅｔに関連するかまたはそれにより媒介される障害」の例としては、異常に多量のｃ−Ｍｅｔまたはｃ−Ｍｅｔの変異によるｃ−Ｍｅｔの過剰刺激に起因する障害、または、異常に多量のｃ−Ｍｅｔまたはｃ−Ｍｅｔの変異による異常に多量のｃ−Ｍｅｔ活性に起因する障害が含まれる。
【００５４】
用語「ｃ−Ｍｅｔの機能亢進」は、通常はｃ−Ｍｅｔを発現しない細胞におけるｃ−Ｍｅｔ発現、または、通常は活性なｃ−Ｍｅｔを持たない細胞によるｃ−Ｍｅｔ活性、または、望まれない細胞増殖を導くｃ−Ｍｅｔ発現増加、または、ｃ−Ｍｅｔの構成的活性化を導く変異を表す。
【００５５】
用語「細胞増殖性障害」は、細胞の望ましくない増殖または制御されない増殖を伴う障害を含む。本発明の化合物は、細胞増殖および／または細胞分裂の防止、阻害、遮断、縮小、低減、制御等、および／または、アポトーシスの誘発に利用できる。この方法は、本発明の化合物またはその医薬的に許容し得る塩、異性体、多形、代謝物、水和物もしくは溶媒和物の、該障害の処置または予防に有効な量を、ヒトを含む哺乳動物を含む、それを必要としている対象に投与することを含む。
【００５６】
本発明に関する細胞増殖性または過増殖性障害としては、例えば乾癬、ケロイドおよび皮膚を侵す他の過形成、骨格障害、血管新生性または血管増殖性障害、肺高血圧、線維性障害、メサンギウム細胞増殖性障害、結腸ポリープ、多嚢胞性腎疾患、良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）および固形腫瘍、例えば乳房、呼吸器、脳、生殖器官、消化管、尿路、眼、肝臓、皮膚、頭頸部、甲状腺および副甲状腺の癌、ならびにそれらの遠隔転移が挙げられるが、これらに限定されない。また、これらの障害としては、リンパ腫、肉腫および白血病も挙げられる。
【００５７】
乳癌の例としては、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌、非浸潤性乳管癌および非浸潤性小葉癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
呼吸器の癌の例としては、小細胞肺癌および非小細胞肺癌、ならびに気管支腺腫および胸膜肺芽腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
脳の癌の例としては、脳幹および視床下部（hypophtalmic）のグリオーマ、小脳および大脳の星状細胞腫、膠芽腫、髄芽腫、上衣腫、ならびに、神経外胚葉および松果体の腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
雄性生殖器の腫瘍としては、前立腺癌および精巣癌が挙げられるが、これらに限定されない。雌性生殖器の腫瘍としては、子宮内膜癌、子宮頸癌、卵巣癌、膣癌および外陰癌、ならびに、子宮肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
消化器の腫瘍としては、肛門癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、膵癌、直腸癌、小腸癌および唾液腺癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
泌尿器の腫瘍としては、膀胱癌、陰茎癌、腎癌、腎盂癌、尿管癌、尿道癌、ならびに、遺伝性および孤発性乳頭状腎癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
眼癌としては、眼球内黒色腫および網膜芽細胞腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
肝臓癌の例としては、肝細胞癌（線維層板型変異体を含むかまたは含まない肝細胞癌腫）、胆管細胞癌（肝内胆管癌）および混合型肝細胞性胆管癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
皮膚癌としては、扁平上皮癌、カポジ肉腫、悪性黒色腫、メルケル細胞皮膚癌および非黒色腫皮膚癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
頭頸部の癌としては、喉頭癌、下咽頭癌、上咽頭癌、中咽頭癌、口唇癌および口腔癌、ならびに扁平上皮癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
リンパ腫としては、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、ホジキン病および中枢神経系リンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
肉腫としては、軟部組織肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、リンパ肉腫および横紋筋肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
白血病としては、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病およびヘアリーセル白血病が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
本発明の化合物および方法で処置され得る線維性増殖障害、すなわち、細胞外マトリックスの異常形成としては、肺線維症、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、肝硬変、ならびに糸球体腎炎、糖尿病性ネフロパシー、悪性腎硬化症、血栓性微小血管症症候群、移植拒絶および糸球体症などの腎疾患を含むメサンギウム細胞増殖性障害が挙げられる。
【００７１】
本発明の化合物の投与により処置され得るヒトまたは他の哺乳動物における他の症状としては、腫瘍増大、網膜症（糖尿病性網膜症、虚血性網膜静脈閉塞、未熟児網膜症および加齢性黄斑変性を含む）、関節リウマチ、乾癬、および、表皮下水疱形成を伴う水疱性障害（類天疱瘡、多形性紅斑および疱疹状皮膚炎を含む）が挙げられる。
【００７２】
本発明の化合物はまた、気道および肺の疾患、消化管の疾患、ならびに膀胱および胆管の疾患の予防および処置に使用され得る。
【００７３】
上記の障害は、ヒトでは十分に特徴付けられているが、哺乳動物を含む他の動物においても類似の病因で存在し、本発明の医薬組成物を投与することにより処置され得る。
【００７４】
式（Ｉ）で示される化合物は、単一の薬剤として、または、１種以上のさらなる治療剤と組み合わせて投与され得、ここで、その組合せは許容されない有害作用を引き起こさない。この併用療法には、式（Ｉ）で示される化合物および１種以上のさらなる治療剤を含む単一の医薬投与製剤の投与、ならびに、式（Ｉ）で示される化合物およびさらなる治療剤の各々の個別医薬投与製剤での投与が含まれる。例えば、式（Ｉ）で示される化合物および治療剤は、錠剤またはカプセル剤などの単一の経口投与組成物で一体となって患者に投与され得るか、または、各剤は個別の投与製剤で投与され得る。
【００７５】
個別投与製剤を使用する場合、式（Ｉ）で示される化合物および１種以上のさらなる治療剤は、本質的に同じ時に（例えば、同時に）、または、少しずつ時間をずらして（例えば、連続的に）投与され得る。
【００７６】
特に、本発明の化合物は、他の抗腫瘍剤、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗物質、植物由来の抗腫瘍剤、ホルモン療法剤、トポイソメラーゼ阻害剤、カンプトテシン誘導体、キナーゼ阻害剤、標的薬物、抗体、インターフェロンおよび／または生物応答修飾物、抗血管新生化合物、および他の抗腫瘍剤との固定または分離した組み合わせとして使用され得る。これに関して、本発明の化合物と組み合わせて使用し得る第２の物質の例の非限定的なリストを以下に示す：
【００７７】
・アルキル化剤としては、ナイトロジェンマスタードＮ−オキシド、シクロホスファミド、イフォスファミド、チオテパ、ラニムスチン、ニムスチン、テモゾロミド、アルトレタミン、アパジコン、ブロスタリシン、ベンダムスチン、カルムスチン、エストラムスチン、フォテムスチン、グルフォスファミド、マフォスファミド、ベンダムスチンおよびミトラクトールが挙げられるが、これらに限定されない；白金が配位したアルキル化化合物としては、シスプラチン、カルボプラチン、エプタプラチン、ロバプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチンおよびサトラプラチンが挙げられるが、これらに限定されない；
【００７８】
・代謝拮抗物質としては、メトトレキサート、６−メルカプトプリンリボシド、メルカプトプリン、５−フルオロウラシル単独またはロイコボリンとの組み合わせ、テガフール、ドキシフルリジン、カルモフール、シタラビン、シタラビンオクホスファート、エノシタビン、ゲムシタビン、フルダラビン、５−アザシチジン、カペシタビン、クラドリビン、クロファラビン、デシタビン、エフロルニチン、エチニルシチジン、シトシンアラビノシド、ヒドロキシ尿素、メルファラン、ネララビン、ノラトレキセド、オクフォスファイト、ペメトレキセド（premetrexed）二ナトリウム、ペントスタチン、ペリトレキソール、ラルチトレキセド、トリアピン、トリメトレキサート、ビダラビン、ビンクリスチンおよびビノレルビンが挙げられるが、これらに限定されない；
【００７９】
・ホルモン療法剤としては、エキセメスタン、ルプロン（Ｌｕｐｒｏｎ）、アナストロゾール、ドキセルカルシフェロール、ファドロゾール、ホルメスタン、１１−ベータヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１阻害剤、１７−アルファヒドロキシラーゼ／１７,２０リアーゼ阻害剤、例えば酢酸アビラテロン、５−アルファレダクターゼ阻害剤、例えばフィナステリドおよびエプリステリド、抗エストロゲン類、例えばクエン酸タモキシフェンおよびフルベストラント、トレルスター（Ｔｒｅｌｓｔａｒ）、トレミフェン、ラロキシフェン、ラソフォキシフェン、レトロゾール、抗アンドロゲン類、例えばビカルタミド、フルタミド、ミフェプリストン、ニルタミド、カソデックス（Ｃａｓｏｄｅｘ）、および抗プロゲステロン類ならびにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない；
【００８０】
・植物由来の抗腫瘍物質としては、例えば有糸分裂阻害剤から選択されるもの、例えばエポチロン類、例えばサゴピロン、イクサベピロンおよびエポチロンＢ、ビンブラスチン、ビンフルニン、ドセタキセルおよびパクリタキセルが挙げられる；
【００８１】
・細胞傷害性トポイソメラーゼ阻害剤としては、アクラルビシン、ドキソルビシン、アモナフィド、ベロテカン、カンプトテシン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、９−アミノカンプトテシン、ジフロモテカン、イリノテカン、トポテカン、エドテカリン、エピムビシン、エトポシド、エキサテカン、ギマテカン、ルルトテカン、ミトキサントロン、ピラムビシン、ピキサントロン、ルビテカン、ソブゾキサン、タフルポシドおよびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない；
【００８２】
・免疫学的作用物質としては、インターフェロン、例えばインターフェロンアルファ、インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ−１ａおよびインターフェロンガンマ−ｎ１、および、他の免疫促進剤、例えばＬ１９−ＩＬ２および他のＩＬ２誘導体、フィルグラスチム、レンチナン、シゾフィラン、セラシス（ＴｈｅｒａＣｙｓ）、ウベニメクス、アルデスロイキン、アレムツズマブ、ＢＡＭ−００２、ダカルバジン、ダクリズマブ、デニロイキン、ゲムツズマブ、オゾガミシン、イブリツモマブ、イミキモド、レノグラスチム、レンチナン、黒色腫ワクチン（Ｃｏｒｉｘａ）、モルグラモスチム、サルグラモスチム、タソネルミン、テクロイキン、チマラシン、トシツモマブ、ビムリジン（Ｖｉｍｌｉｚｉｎ）、エプラツズマブ、ミツモマブ、オレゴボマブ、ペムツモマブおよびプロベンジ（Ｐｒｏｖｅｎｇｅ）が挙げられる；
【００８３】
・生物応答修飾剤は、生物の防御機構または生物学的応答、例えば、組織細胞の生存、増殖または分化を改変して、該細胞が抗腫瘍活性を有するように導く物質である；そのような物質としては、例えばクレスチン、レンチナン、シゾフィラン、ピシバニル、プロムン（ＰｒｏＭｕｎｅ）およびウベニメクスが挙げられる；
【００８４】
・抗血管新生化合物としては、アシトレチン、アフリベルセプト、アンギオスタチン、アプリジン、アセンタール、アキシチニブ、ベバシズマブ、ブリバニブ・アラニナト、シレングチド、コンブレタスタチン、エンドスタチン、フェンレチニド、ハロフギノン、パゾパニブ、ラニビズマブ、レビマスタット、レセンチン、レゴラフェニブ（regorafenib）、レモバブ、レブリミド、ソラフェニブ、スクアラミン、スニチニブ、テラチニブ、サリドマイド、ウクライン、バタラニブおよびビタキシンが挙げられるが、これらに限定されない；
【００８５】
・抗体としては、トラスツズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、リツキシマブ、チシリムマブ、イピリムマブ、ルミリキシマブ、カツマキソマブ、アタシセプト、オレゴボマブおよびアレムツズマブが挙げられるが、これらに限定されない；
【００８６】
・ＶＥＧＦ阻害剤、例えば、ソラフェニブ、レゴラフェニブ、ベバシズマブ、スニチニブ、レセンチン、アキシチニブ、アフリベルセプト、テラチニブ、ブリバニブ・アラニネート、バタラニブ、パゾパニブおよびラニビズマブ；
【００８７】
・ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）阻害剤、例えば、セツキシマブ、パニツムマブ、ベクチビクス、ゲフィチニブ、エルロチニブおよびザクチマ（Ｚａｃｔｉｍａ）；
【００８８】
・ＨＥＲ２阻害剤、例えば、ラパチニブ、トラスツズマブ（tratuzumab）およびペルツズマブ；
【００８９】
・ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、テムシロリムス、シロリムス／ラパマイシンおよびエベロリムス；
【００９０】
・ｃＭｅｔ阻害剤；
【００９１】
・ＰＩ３ＫおよびＡＫＴ阻害剤；
【００９２】
・ＣＤＫ阻害剤、例えばレスコビチンおよびフラボピリドール；
【００９３】
・紡錘体形成チェックポイント阻害剤および標的有糸分裂阻害剤、例えば、ＰＬＫ阻害剤、オーロラ阻害剤（例えば、ヘスペラジン（Ｈｅｓｐｅｒａｄｉｎ））、チェックポイントキナーゼ阻害剤およびＫＳＰ阻害剤；
【００９４】
・ＨＤＡＣ阻害剤、例えば、パノビノスタット、ボリノスタット、ＭＳ２７５、ベリノスタットおよびＬＢＨ５８９；
【００９５】
・ＨＳＰ９０およびＨＳＰ７０阻害剤；
【００９６】
・プロテアソーム阻害剤、例えば、ボルテゾミブおよびカーフィルゾミブ；
【００９７】
・ＭＥＫ阻害剤およびＲａｆ阻害剤を含むセリン／スレオニンキナーゼ阻害剤、例えばソラフェニブ；
【００９８】
・ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、例えばチピファルニブ；
【００９９】
・チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、ダサチニブ、ニロチニブ（nilotibib）、レゴラフェニブ、ボスチニブ、ソラフェニブ、ベバシズマブ、スニチニブ、セジラニブ、アキシチニブ、アフリベルセプト、テラチニブ、メシル酸イマチニブ、ブリバニブ・アラニネート、パゾパニブ、ラニビズマブ、バタラニブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ベクティビックス、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、トラスツズマブ（tratuzumab）、ペルツズマブおよびｃ−Ｋｉｔ阻害剤；
【０１００】
・ビタミンＤ受容体アゴニスト；
【０１０１】
・Ｂｃｌ−２タンパク質阻害剤、例えば、オバトクラクス、オブリメルセンナトリウムおよびゴシポール；
【０１０２】
・表面抗原分類２０受容体アンタゴニスト、例えばリツキシマブ；
【０１０３】
・リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤、例えばゲムシタビン；
【０１０４】
・腫瘍壊死アポトーシス誘導リガンド受容体１アゴニスト、例えばマパツムマブ；
【０１０５】
・５−ヒドロキシトリプタミン受容体拮抗物質、例えば、ｒＥＶ５９８、キサリプロド、塩酸パロノセトロン、グラニセトロン、ＺｉｎｄｏｌおよびＡＢ−１００１；
【０１０６】
・アルファ５−ベータ１インテグリン阻害剤を含むインテグリン阻害剤、例えば、Ｅ７８２０、ＪＳＭ６４２５、ボロシキシマブおよびエンドスタチン；
【０１０７】
・アンドロゲン受容体拮抗物質、例えば、ナンドロロンデカノエート、フルオキシメステロン、アンドロイド（Ａｎｄｒｏｉｄ）、プロスト−エイド（Ｐｒｏｓｔ−ａｉｄ）、アンドロムスチン、ビカルタミド、フルタミド、アポ−シプロテロン、アポ−フルタミド、酢酸クロルマジノン、アンドロクール（Ａｎｄｒｏｃｕｒ）、タビ（Ｔａｂｉ）、酢酸シプロテロンおよびニルタミド；
【０１０８】
・アロマターゼ阻害剤、例えば、アナストロゾール、レトロゾール、テストラクトン、エキセメスタン、アミノグルテチミドおよびホルメスタン；
【０１０９】
・マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤；
【０１１０】
・他の抗癌剤、例えば、アリトレチノイン、アンプリゲン、アトラセンタン・ベキサロテン、ボルテゾミブ、ボセンタン、カルシトリオール、エキシスリンド、フォテムスチン、イバンドロン酸、ミルテフォシン、ミトキサントロン、Ｉ−アスパラギナーゼ、プロカルバジン、ダカルバジン、ヒドロキシカルバミド、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、タザロテン、ベルケード、硝酸ガリウム、カンフォスファミド、ダリナパルシンおよびトレチノイン。
【０１１１】
好ましい実施態様では、本発明の化合物は、化学療法（すなわち、細胞傷害剤）、抗ホルモン剤および／または標的化療法、例えば他のキナーゼ阻害剤（例えば、ＥＧＦＲ阻害剤）、ｍＴＯＲ阻害剤および血管新生阻害剤と組み合わせて使用され得る。
【０１１２】
本発明の化合物はまた、放射線療法および／または外科的処置と併せて癌の処置において用いられ得る。
【０１１３】
さらに、式（Ｉ）で示される化合物は、それ自体または組成物として、研究および診断で、または、分析の標準試料としてなど利用され得、これは当分野で周知である。
【０１１４】
医薬組成物および処置方法
別の態様では、本発明は、上記定義の式（Ｉ）で示される化合物を、医薬的に許容し得る担体と共に含む医薬組成物を提供する。
【０１１５】
さらに別の態様において、本発明は、医薬組成物の製造方法を提供する。その方法は、少なくとも１種の上記定義の式（Ｉ）で示される化合物を少なくとも１種の医薬的に許容し得る担体と組み合わせ、得られる組合せを適する投与形にすることを含む工程を含む。
【０１１６】
式（Ｉ）で示される活性成分は、全身的および／または局所的に作用し得る。この目的で、それは、適する方法で、例えば経口で、非経口で、肺に、鼻腔に、舌下に、舌に、頬側に、直腸に、経皮で、結膜に、耳に、または、インプラントもしくはステントとして、適用され得る。
【０１１７】
これらの投与経路のために、式（Ｉ）で示される活性成分を適する投与形で投与し得る。
【０１１８】
有用な経口適用形としては、活性成分を迅速に、および／または、改変された形態で放出する投与形、例えば、錠剤（非被覆および被覆錠剤、例えば腸溶性被覆によるもの）、カプセル剤、糖衣錠、顆粒剤、ペレット剤、散剤、乳剤、懸濁剤、液剤およびエアゾール剤が挙げられる。
【０１１９】
非経口投与は、吸収段階を回避して（静脈内、動脈内、心臓内、脊髄内または腰椎内）、または、吸収を含めて（筋肉内、皮下、皮内、経皮または腹腔内）実施され得る。有用な非経口投与形としては、液剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥剤および滅菌散剤の形態の注射および点滴製剤が挙げられる。
【０１２０】
他の投与経路に適する形態としては、例えば、吸入医薬形態（粉末吸入器、噴霧器を含む）、点鼻薬、鼻液剤または鼻スプレー剤、舌、舌下または頬側に投与される錠剤またはカプセル剤、坐剤、耳および眼用製剤、膣用カプセル剤、水性懸濁剤（ローション剤、振盪混合物）、親油性懸濁剤、軟膏、クリーム剤、ミルク、ペースト剤、散布剤、インプラントまたはステントが挙げられる。
【０１２１】
好ましい実施態様では、上記定義の式（Ｉ）で示される化合物を含む医薬組成物は、経口投与に適する形態で提供される。別の好ましい実施態様では、上記の式（Ｉ）で示される化合物を含む医薬組成物は、静脈内投与に適する形態で提供される。
【０１２２】
式（Ｉ）で示される活性成分は、自体公知の方法で、列挙した投与形に変換できる。これは、不活性で非毒性の医薬的に適する補助剤を使用して行われる。これらの補助剤としては、とりわけ、担体（例えば微結晶セルロース）、溶媒（例えば液体ポリエチレングリコール類）、乳化剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム）、分散剤（例えばポリビニルピロリドン）、合成および天然生体高分子（例えばアルブミン）、安定剤（例えば抗酸化剤、例えばアスコルビン酸）、着色剤（例えば無機色素、例えば酸化鉄）または風味および／または臭気の矯正剤が挙げられる。
【０１２３】
別の実施態様では、本発明は、上記定義の式（Ｉ）で示される化合物の有効量を患者に投与することを含む、細胞増殖性障害の処置を必要としている患者におけるその処置方法を提供する。ある実施態様では、細胞増殖性障害は癌である。
【０１２４】
さらに別の態様では、本発明は、細胞増殖性障害の処置用または予防用の医薬組成物を製造するための、上記定義の式（Ｉ）で示される化合物の使用を提供する。ある実施態様では、細胞増殖性障害は癌である。
【０１２５】
本発明の化合物を医薬としてヒトおよび動物に投与するとき、それらは、それ自体で、または、医薬的に許容し得る担体と組み合わせて、例えば０.１〜９９.５％（より好ましくは、０.５〜９０％）の有効成分を含有する医薬組成物として、与えられ得る。
【０１２６】
選択された投与経路とは関係なく、適する水和形態で使用され得る本発明の化合物、および／または本発明の医薬組成物は、当業者に知られている慣用方法により、医薬的に許容し得る投与形に製剤化される。
【０１２７】
本発明の医薬組成物における有効成分の実際の投薬レベルおよび投与時間経過を変えて、患者に毒性ではなく、特定の患者、組成物および投与様式について所望の治療応答を達成するのに有効な、有効成分の量を得ることが可能である。例示的な用量範囲は、１日当たり０.０１〜１００ｍｇ／ｋｇまたは１日当たり０.１〜１５０ｍｇ／ｋｇである。
【０１２８】
ある実施態様では、本発明の化合物は、慣用の癌化学療法剤との併用療法で使用できる。白血病および他の腫瘍についての慣用の治療計画は、放射線、薬物または両者の組み合わせを含む。
【０１２９】
本発明の化合物の治療的に有効な抗増殖量または予防的に有効な抗増殖量の決定は、当業者としての医師または獣医師（「担当医」）により、既知技術の使用および類似環境下で得られる結果の観察により、容易に行われ得る。投薬量は、担当医の判断における患者の要求、処置されている症状の重症度および用いられている特定の化合物に応じて異なり得る。治療的に有効な抗増殖量または用量、および、予防的に有効な抗増殖量または用量の決定において、数々の要因が担当医により考慮され、この要因としては、関与する特定の細胞増殖性障害；特定の物質の薬物動態的特徴およびその投与様式および経路；所望の処置の時間経過；哺乳動物の種；その大きさ、年齢および全般的健康状態；関与する特定の疾患；関与の程度または疾患の重症度；個々の患者の応答；投与される特定の化合物；投与方式；投与される製剤のバイオアベイラビリティーの特徴；選択された投薬計画；同時処置の種類（すなわち、他の同時投与される治療剤と本発明の化合物との相互作用）；および他の関連する状況が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【０１３０】
処置は、化合物の最適用量より少ない、少量から開始され得る。その後、環境下で最適な効果に達するまで、投薬量を少量ずつ漸増させ得る。便宜上、所望により総一日量を分割し、１日の間に分けて投与し得る。本発明の化合物の治療的に有効な抗増殖量および予防的に有効な抗増殖量は、１日に体重１ｋｇにつき約０.０１ｍｇ（ｍｇ／ｋｇ／日）〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲で変動すると予測され得る。
【０１３１】
本発明の場合、本発明の化合物の好ましい用量は、患者が耐容し得て深刻な副作用を起こさない最大量である。例示として、本発明の化合物は、体重１ｋｇにつき約０.０１ｍｇ〜約１００ｍｇ、約０.０１ｍｇ〜約１０ｍｇ、または約０.１ｍｇ〜約１０ｍｇの用量で投与される。上記で列挙した値の間の範囲も本発明の一部であると企図する。
【０１３２】
他に明記しない限り、下記の試験および実施例における百分率は、重量に基づく；部は重量部である。液体／液体溶液について報告する溶媒比、希釈率および濃度は、各々体積に基づく。
【実施例】
【０１３３】
Ａ．実施例
略語および頭字語：
Ａｃ              アセチル
ａｑ．            水性（溶液）
ｂｒ．ｓ          幅広い一重線（ＮＭＲ）
ｃａｔ．          触媒の
ｃｏｎｃ．        濃
ｄ                二重線（ＮＭＲ）
ＤＣＩ            直接化学イオン化法（ＭＳ）
ｄｄ              二重の二重線（ＮＭＲ）
ＤＭＦ            Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ          ジメチルスルホキシド
ＤＭＳＯ−ｄ6      ジメチルスルホキシド−ｄ6
ｅｅ              エナンチオマー過剰率
ＥＩ              電子衝撃イオン化法（ＭＳ）
ｅｑｕｉｖ．      当量
ＥＳＩ            エレクトロスプレーイオン化法（ＭＳ）
Ｅｔ              エチル
ＧＣ−ＭＳ        ガスクロマトグラフィーと組み合わせた質量分析
ｈ                時間
1Ｈ−ＮＭＲ        プロトン核磁気共鳴分光法
ＨＯＡｃ          酢酸
ＨＰＬＣ          高速液体クロマトグラフィー
ＬＣ−ＭＳ        液体クロマトグラフィーと組み合わせた質量分析
ｍ                多重線（ＮＭＲ）
Ｍｅ              メチル
ｍｉｎ            分
ＭＳ              質量分析
ｍ／ｚ            質量電荷比
ＮＭＰ            Ｎ−メチルピロリジン−２−オン
ｏｆ  ｔｈ．      理論値の（化学的収率）
ｑ                四重線（ＮＭＲ）
ｑｕｉｎ          五重線（ＮＭＲ）
Ｒf                ＴＬＣ保持係数
ＲＰ              逆相（ＨＰＬＣ）
ｒｔ              室温
Ｒt                保持時間（ＨＰＬＣ）
ｓ                一重線（ＮＭＲ）
ＴＢＡＦ          テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリド
ｔＢｕ            ｔｅｒｔ−ブチル
ＴＦＡ            トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ            テトラヒドロフラン
ＴＬＣ            薄層クロマトグラフィー
ｔ                三重線（ＮＭＲ）
ｖ／ｖ            体積対体積比
ｗ／ｖ            重量対体積比
ｗ／ｗ            重量対重量比
【０１３４】
ＬＣ−ＭＳおよびＧＣ−ＭＳの方法：
方法１（ＬＣ−ＭＳ）：
装置：ＨＰＬＣ  Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２７９５を備えたＭｉｃｒｏｍａｓｓ  ＺＱ；カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｓｙｎｅｒｇｉ  ２.５μ  ＭＡＸ−ＲＰ  １００Ａ  Ｍｅｒｃｕｒｙ、２０ｍｍ×４ｍｍ；溶離剤Ａ：水１Ｌ＋５０％ギ酸０.５ｍＬ、溶離剤Ｂ：アセトニトリル１Ｌ＋５０％ギ酸０.５ｍＬ；勾配：０.０分９０％Ａ→０.１分９０％Ａ→３.０分５％Ａ→４.０分５％Ａ→４.０１分９０％Ａ；流速：２ｍＬ／分；オーブン：５０℃；ＵＶ検出：２１０ｎｍ。
【０１３５】
方法２（ＬＣ−ＭＳ）：
装置：ＨＰＬＣ  Ｗａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣ  Ａｃｑｕｉｔｙを備えたＭｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ  Ｐｒｅｍｉｅｒ；カラム：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＧＯＬＤ  １.９μ、５０ｍｍ×１ｍｍ；溶離剤Ａ：水１Ｌ＋５０％ギ酸０.５ｍＬ、溶離剤Ｂ：アセトニトリル１Ｌ＋５０％ギ酸０.５ｍＬ；勾配：０.０分９０％Ａ→０.１分９０％Ａ→１.５分１０％Ａ→２.２分１０％Ａ；オーブン：５０℃；流速：０.３３ｍＬ／分；ＵＶ検出：２１０ｎｍ。
【０１３６】
方法３（ＬＣ−ＭＳ）：
装置：ＨＰＬＣ  Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  Ｓｅｒｉｅｓを備えたＭｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ  Ｍｉｃｒｏ；カラム：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＧＯＬＤ  ３μ、２０ｍ×４ｍｍ；溶離剤Ａ：水１Ｌ＋５０％ギ酸０.５ｍＬ、溶離剤Ｂ：アセトニトリル１Ｌ＋５０％ギ酸０.５ｍＬ；勾配：０.０分１００％Ａ→３.０分１０％Ａ→４.０分１０％Ａ→４.０１分１００％Ａ（流速２.５ｍＬ／分）→５.００分１００％Ａ；オーブン：５０℃；流速：２ｍＬ／分；ＵＶ検出：２１０ｎｍ。
【０１３７】
方法４（ＬＣ−ＭＳ）：
装置：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＳＱＤ  ＵＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ；カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＨＳＳ  Ｔ３  １.８μ、５０ｍｍ×１ｍｍ；溶離剤Ａ：水１Ｌ＋９９％ギ酸０.２５ｍＬ、溶離剤Ｂ：アセトニトリル１Ｌ＋０.２５ｍＬ９９％ギ酸；勾配：０.０分９０％Ａ→１.２分５％Ａ→２.０分５％Ａ；オーブン：５０℃；流速：０.４０ｍＬ／分；ＵＶ検出：２１０−４００ｎｍ。
【０１３８】
方法５（ＧＣ−ＭＳ）：
装置：Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＧＣＴ、ＧＣ  ６８９０；カラム：Ｒｅｓｔｅｋ  ＲＴＸ−３５、１５ｍ×２００μｍ×０.３３μｍ；ヘリウムの一定流速：０.８８ｍＬ／分；オーブン：７０℃；入口：２５０℃；勾配：７０℃、３０℃／分→３１０℃（３分間維持）。
【０１３９】
方法６（ＬＣ−ＭＳ）：
装置：ＨＰＬＣ  Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  Ｓｅｒｉｅｓを備えたＷａｔｅｒｓ  ＺＱ；ＵＶ  ＤＡＤ；カラム：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＧＯＬＤ  ３μ、２０ｍｍ×４ｍｍ；溶離剤Ａ：水１Ｌ＋５０％ギ酸０.５ｍＬ、溶離剤Ｂ：アセトニトリル１Ｌ＋５０％ギ酸０.５ｍＬ；勾配：０.０分１００％Ａ→３.０分１０％Ａ→４.０分１０％Ａ→４.１分１００％Ａ（流速２.５ｍＬ／分）；オーブン：５５℃；流速：２ｍＬ／分；ＵＶ検出：２１０ｎｍ。
【０１４０】
出発物質および中間体：
実施例１Ａ
３−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−カルボアルデヒド
【化１５】
2013510814.tif 000016
テトラヒドロフラン（６００ｍｌ）をアルゴン雰囲気下にて−７８℃に冷却した。この温度で、ｔｅｒｔ−ブチルリチウムのｎ−ペンタン（２００ｍｌ）中１.７Ｍ溶液を滴下した。−７８℃で１５分後、５−ブロモ−３−メチル−１Ｈ−インダゾール２２.４ｇ（１０６.１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３００ｍｌ）中溶液を、該溶液の温度が−７０℃を超えないような速度で滴下した。混合物を３０分間撹拌した後、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（２４.５ｍｌ）を滴下した。２０分後、冷却浴を外し、１時間撹拌し続けた後、水（２５０ｍｌ）を注意深く添加した。この混合物を酢酸エチル（５００ｍｌ）で数回抽出した。合わせた有機層を塩化ナトリウム飽和水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮して、粗３−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−カルボアルデヒド１８.５ｇを得、さらなる精製を行わずに次工程で使用した。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ＝１３.１３（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）、１０.０１（ｓ，１Ｈ）、８.４０（ｓ，１Ｈ）、７.８１（ｄ，１Ｈ）、７.５８（ｄ，１Ｈ）、２.５６（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ。
【０１４１】
実施例２Ａ
(２Ｅ)−２−[(３−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−イル)メチリデン]−３−オキソブタンニトリル
【化１６】
2013510814.tif 000017
３−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−カルボアルデヒド（実施例１Ａ）５.０ｇ（３１.２ｍｍｏｌ）、(１Ｚ)−１−シアノプロパ−１−エン−２−オレイン酸ナトリウム３.６１ｇ（３４.３ｍｍｏｌ）、酢酸２.２３ｍｌ（３９ｍｍｏｌ）およびピペリジン０.３１ｍｌ（３.１２ｍｍｏｌ）の４Åモレキュラーシーブを含有する乾燥ジクロロメタン（２５０ｍｌ）中混合物を還流下にて１２時間撹拌した。冷却後、沈殿物が形成され、これを濾過により回収し、重炭酸ナトリウム飽和水溶液および水で洗浄した。固体をエタノールに溶解し、モレキュラーシーブを濾去した。濾液を減圧濃縮し、残留物を酢酸エチルおよび炭酸ナトリウム飽和水溶液で処理した。有機層を水で洗浄し、乾燥させ、減圧濃縮して、薄黄色の固体として標記化合物（３.５ｇ、理論値の５０％）を得、さらなる精製を行わずに次工程で使用した。
ＬＣ−ＭＳ（方法１）：Ｒt＝１.３２分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝２２６（Ｍ＋Ｈ）+
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ＝１３.１８（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）、８.５２（ｓ，１Ｈ）、８.４９（ｓ，１Ｈ）、８.１９（ｄ，１Ｈ）、７.６９（ｄ，１Ｈ）、２.５５（ｂｒ．ｍ，６Ｈ）ｐｐｍ。
【０１４２】
実施例３Ａ
６−フルオロ−３−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−カルボアルデヒド
【化１７】
2013510814.tif 000018
５−ブロモ−６−フルオロ−３−メチル−１Ｈ−インダゾール［製造方法はＷＯ２００５／０８５２２７−Ａ１の実施例１０４ｃ）に記載；また、市販されている、ＣＡＳ  Ｒｅｇ．−Ｎｏ．８６４７７３−６６−０］３０ｇ（１３１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５２５ｍｌ）中溶液を−４５℃に冷却した。塩化メチルマグネシウムのＴＨＦ中溶液（３Ｍ；５０.２ｍｌ、１５１ｍｍｏｌ）を−４５℃で滴下し、得られた溶液をこの温度で４０分間撹拌した。投入ポンプ（dosing pump）使用して、２−ブチルリチウム溶液（シクロヘキサン中１.４Ｍ）２５３ｍｌ（３５４ｍｍｏｌ）を、温度が−４０℃を超えないようにして添加した。得られた混合物を−４０℃で３０分間撹拌し、次いで、温度を−４０℃に維持しながらＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド３０.２ｍｌ（３９３ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を−４０℃で３０分間撹拌し、次いで、室温まで加温し、５℃に冷却した（氷浴）２Ｎ塩酸２.８Ｌ中にゆっくりと注いだ。この混合物を酢酸エチルで数回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧濃縮した。残留物をジクロロメタンに溶解し、シリカゲルクロマトグラフィー（溶離剤：ペンタン／酢酸エチル（６：４  ｖ／ｖ）により精製して、薄黄色固体として標記化合物１９.６ｇ（理論値の７８％）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝１７９（Ｍ＋Ｈ）+
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6)：δ＝１３.１４（ｓ，１Ｈ）、１０.１７（ｓ，１Ｈ）、８.３３（ｄ，１Ｈ）、７.３７（ｄ，１Ｈ）、２.５４（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ。
【０１４３】
実施例４Ａ
(２Ｅ)−２−[(６−フルオロ−３−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−イル)メチリデン]−３−オキソブタンニトリル
【化１８】
2013510814.tif 000019
実施例２Ａに記載の方法に従って、２.７４ｇ（１５.５ｍｍｏｌ）６−フルオロ−３−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−カルボアルデヒド（実施例３Ａ）および(１Ｚ)−１−シアノプロパ−１−エン−２−オレイン酸ナトリウム２.６ｇ（２４.８ｍｍｏｌ）を使用して標記化合物を製造して、粗生成物１.６ｇ（理論値の４２％）を得、さらなる精製を行わずに次工程で使用した。
ＬＣ−ＭＳ（方法４）：Ｒt＝０.８３分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝２４４（Ｍ＋Ｈ）+。
【０１４４】
実施例５Ａ
(２Ｅ)−３−(６−フルオロ−３−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−イル)−２−[(４−フルオロフェニル)カルボニル]プロパ−２−エンニトリル
【化１９】
2013510814.tif 000020
実施例２Ａに記載の方法に従って、６−フルオロ−３−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−カルボアルデヒド（実施例３Ａ）５００ｍｇ（２.８１ｍｍｏｌ）および３−(４−フルオロフェニル)−３−オキソプロパンニトリル５０４ｍｇ（３.０９ｍｍｏｌ）を使用して標記化合物を製造して、粗生成物（純度８１％）７６８ｍｇ（理論値の６９％）を得、さらなる精製を行わずに次工程で使用した。
ＬＣ−ＭＳ（方法６）：Ｒt＝２.２４分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝３２４（Ｍ＋Ｈ）+。
【０１４５】
実施例６Ａ
(２Ｅ)−２−[(４−クロロフェニル)カルボニル]−３−(６−フルオロ−３−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−イル)プロパ−２−エンニトリル
【化２０】
2013510814.tif 000021
実施例２Ａに記載の方法に従って、６−フルオロ−３−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−カルボアルデヒド（実施例３Ａ）５００ｍｇ（２.８１ｍｍｏｌ）および３−(４−クロロフェニル)−３−オキソプロパンニトリル５６６ｍｇ（３.０９ｍｍｏｌ）を使用して標記化合物を製造して、粗生成物（純度７６％）８３０ｍｇ（理論値の６６％）を得、さらなる精製を行わずに次工程で使用した。
ＬＣ−ＭＳ（方法６）：Ｒt＝２.３９分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝３４０（Ｍ＋Ｈ）+。
【０１４６】
実施例７Ａ
３−アミノ−３−[６−(トリフルオロメチル)ピリジン−２−イル]プロパ−２−エンニトリル
【化２１】
2013510814.tif 000022
ジイソプロピルアミン２.０８ｍｌ（１３.０７ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（１２ｍｌ）中溶液を不活性ガス下にて−７０℃に冷却し、ｎ−ブチルリチウム溶液（ヘキサン中１.６Ｍ）９.２６ｍｌ（１４.８ｍｍｏｌ）を滴下した。次いで、アセトニトリル６８８μｌ（１３.０７ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（１０ｍｌ）中溶液を１０分間にわたってゆっくりと添加した。得られた溶液を−７０℃でさらに３０分間撹拌した後、６−(トリフルオロメチル)ピリジン−２−カルボニトリル１.５０ｇ（８.７２ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（１０ｍｌ）中溶液を添加した。混合物を室温に加温し１２時間撹拌した後、水（２００ｍｌ）ｗｐゆっくりと添加した。混合物をジクロロメタン（１００ｍｌ）で数回抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮して、粗標記化合物（純度８９％）１.２ｇ（理論値の５７％）を得、さらなる精製を行わずに次工程で使用した。
ＬＣ−ＭＳ（方法４）：Ｒt＝０.８８分；ＭＳ（ＥＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝２１４（Ｍ＋Ｈ）+。
【０１４７】
実施例８Ａ
４,４,４−トリフルオロ−３−オキソブタンニトリル
【化２２】
2013510814.tif 000023
フレーム乾燥フラスコに、不活性ガス雰囲気下にて、乾燥ＴＨＦ（１００ｍｌ）中にてｎ−ブチルリチウム溶液（ヘキサン中１.６Ｍ）２０ｍｌ（３２ｍｍｏｌ）を充填し、−７８℃に冷却した。次いで、アセトニトリル１.４７ｍｌ（２８ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加し、得られた混合物を−７４℃で１時間撹拌した。次いで、温度を−６９℃以下に維持しながらトリフルオロ酢酸エチル２.２８ｍｌ（２０ｍｍｏｌ）を５分間にわたってゆっくりと添加した。反応混合物を−４５℃で２時間撹拌し、次いで、温度を−２０℃以下に維持しながら塩酸（２Ｍ、９.６ｍｌ）の添加によってクエンチした。得られた明澄溶液を室温に加温し、次いで、減圧濃縮した。残留した水性スラリーをジエチルエーテル（１００ｍｌずつ）で数回抽出し、合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮して、粗標記化合物（純度５４％）４.２５ｇ（理論値の８４％）を得、さらなる精製を行わずに次工程で使用した。
ＧＣ−ＭＳ（方法５）：Ｒt＝１.０５分；ＭＳ（ＥＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝１３７（Ｍ）+。
【０１４８】
実施例９Ａ
４,４−ジフルオロ−３−オキソブタンニトリル
【化２３】
2013510814.tif 000024
フレーム乾燥フラスコに、不活性ガス雰囲気下にて、乾燥ＴＨＦ（１９ｍｌ）中にて、ｎ−ブチルリチウム溶液（ヘキサン中１.６Ｍ）３.８ｍｌ（６.１ｍｍｏｌ）を充填し、−７８℃に冷却した。次いで、アセトニトリル０.２８ｍｌ（５.３ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加し、得られた混合物を−７０℃で１時間撹拌した。次いで、温度を−６９℃以下に維持しながらジフルオロ酢酸エチル０.４ｍｌ（３.８ｍｍｏｌ）を５分間にわたってゆっくりと添加した。反応混合物を−４５℃で２時間撹拌し、次いで、温度を−２０℃以下に維持しながら塩酸（２Ｍ、４.８ｍｌ）の添加によってクエンチした。得られた明澄溶液を室温に加温し、次いで、減圧濃縮した。得られた粗生成物（純度４６％、１.０ｇ、理論値の９９％）を−２１℃で貯蔵し、さらなる精製を行わずに次工程で使用した。
ＧＣ−ＭＳ（方法５）：Ｒt＝１.４９分；ＭＳ（ＥＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝１１９（Ｍ）+。
【０１４９】
製造実施例：
実施例１
２−(４−クロロフェニル)−６−(ジフルオロメチル)−４−(６−フルオロ−３−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−イル)−１,４−ジヒドロピリジン−３,５−ジカルボニトリル
【化２４】
2013510814.tif 000025
(２Ｅ)−２−(４−クロロベンゾイル)−３−(６−フルオロ−３−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−イル)プロパ−２−エンニトリル（実施例６Ａ）２００ｍｇ（０.５４２ｍｍｏｌ）および３−アミノ−４,４−ジフルオロブタ−２−エンニトリル［アセトニトリルと２,２−ジフルオロアセトニトリルとのＴｈｏｒｐｅ反応によって得られる；Org. React. 15, 1 (1967)、同31, 1(1984)を参照］６６ｍｇ（０.５４２ｍｍｏｌ）の２−プロパノール（１ｍｌ）中混合物を還流下にて１２時間撹拌した。次いで、酢酸（１.５ｍｌ）を添加し、還流下での撹拌を６時間続けた。冷却後、混合物を減圧濃縮し、残留物を分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（メタノール／水＋０.１％ＴＦＡ勾配液、最終混合物８０：２０（ｖ／ｖ））によって直接精製して、標記化合物ラセミ体３３ｍｇ（理論値の１４％）を得た。
ＬＣ−ＭＳ（方法２）：Ｒt＝１.１４分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝４４０（Ｍ＋Ｈ）+
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ＝１２.８６（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）、１０.４６（ｓ，１Ｈ）、７.７９（ｄ，１Ｈ）、７.６３−７.５５（ｍ，４Ｈ）、７.３８（ｄ，１Ｈ）、６.７９（ｔ，１Ｈ，2ＪH,F＝５１.８Ｈｚ）、５.０９（ｓ，１Ｈ）、２.５４（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ。
【０１５０】
実施例２
２−(ジフルオロメチル)−４−(６−フルオロ−３−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−イル)−６−(４−フルオロフェニル)−１,４−ジヒドロピリジン−３,５−ジカルボニトリル
【化２５】
2013510814.tif 000026
(２Ｅ)−２−(４−フルオロベンゾイル)−３−(６−フルオロ−３−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−イル)プロパ−２−エンニトリル（実施例５Ａ）２００ｍｇ（０.５６９ｍｍｏｌ）および３−アミノ−４,４−ジフルオロブタ−２−エンニトリル［アセトニトリルと２,２−ジフルオロアセトニトリルとのＴｈｏｒｐｅ反応により得られる；Org. React. 15, 1 (1967)、同書, 31, 1(1984)を参照］６９ｍｇ（０.５６９ｍｍｏｌ）の２−プロパノール（１ｍｌ）中混合物を還流下にて１２時間撹拌した。次いで、酢酸（１.５ｍｌ）を添加し、還流下での撹拌を６時間続けた。冷却後、混合物を減圧濃縮し、残留物を分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（メタノール／水＋０.１％ＴＦＡ勾配液、最終混合物８０：２０（ｖ／ｖ）によって直接精製して、標記化合物ラセミ体３６ｍｇ（理論値の１５％）を得た。
ＬＣ−ＭＳ（方法４）：Ｒt＝０.９７分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝４２４（Ｍ＋Ｈ）+
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ＝１２.８７（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）、１０.４４（ｓ，１Ｈ）、７.７８（ｄ，１Ｈ）、７.６１（ｍ，２Ｈ）、７.４１−７.３５（ｍ，３Ｈ）、６.７９（ｔ，１Ｈ，2ＪH,F＝５１.８Ｈｚ）、５.０８（ｓ，１Ｈ）、２.５４（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ。
【０１５１】
実施例３
４−(３−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−イル)−６,６'−ビス(トリフルオロメチル)−１,４−ジヒドロ−２,２'−ジピリジン−３,５−ジカルボニトリル
【化２６】
2013510814.tif 000027
３−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−カルボアルデヒド（実施例１Ａ）１５０ｍｇ（０.９３６ｍｍｏｌ）の４Åモレキュラーシーブ粉末を含有するｎ−ペンタノール（４ｍｌ）中溶液を４,４,４−トリフルオロ−３−オキソブタンニトリル（実施例８Ａ）１２８ｍｇ（０.９３６ｍｍｏｌ）で処理し、１３０℃で１時間撹拌した。次いで、３−アミノ−３−[６−(トリフルオロメチル)ピリジン−２−イル]プロパ−２−エンニトリル（実施例７Ａ）９４ｍｇ（０.４４ｍｍｏｌ）および酢酸（１.２ｍｌ）を添加し、混合物を１３０℃でさらに１分間撹拌した。冷却後、水（６ｍｌ）を添加し、混合物を濾過し、濾液を減圧濃縮した。残留物を酢酸エチル（３０ｍｌ）に溶解し、この溶液をブラインで数回洗浄し、次いで、水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮した。残留物を、４Åモレキュラーシーブを含有するＴＨＦ（１ｍｌ）に溶解した。テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリドの溶液（ＴＢＡＦ、ＴＨＦ中１Ｎ、１.５ｍｌ）を添加し、混合物を７０℃で５時間撹拌した。冷却後、混合物を減圧濃縮し、粗生成物を分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（メタノール／水＋０.１％ＴＦＡ勾配液）によって最終精製して、標記化合物ラセミ体１５ｍｇ（理論値の７％）を得た。
ＬＣ−ＭＳ（方法２）：Ｒt＝１.２３分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝４７５（Ｍ＋Ｈ）+
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ＝１２.８０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）、１０.７０（ｓ，１Ｈ）、８.３２（ｔ，１Ｈ）、８.１０（ｍ，２Ｈ）、７.７４（ｓ，１Ｈ）、７.６１（ｄ，１Ｈ）、７.４４（ｄｄ，１Ｈ）、５.０３（ｓ，１Ｈ）、２.５０（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ。
【０１５２】
実施例４
２−(ジフルオロメチル)−４−(３−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−イル)−６−フェニル−１,４−ジヒドロピリジン−３,５−ジカルボニトリル
【化２７】
2013510814.tif 000028
３−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−カルボアルデヒド（実施例１Ａ）２００ｍｇ（１.２５ｍｍｏｌ）、３−オキソ−３−フェニルプロパンニトリル２１７ｍｇ（１.５０ｍｍｏｌ）および３−アミノ−４,４−ジフルオロブタ−２−エンニトリル［アセトニトリルと２,２−ジフルオロアセトニトリルとのＴｈｏｒｐｅ反応によって得られる；Org. React. 15, 1 (1967)、同書, 31, 1 (1984)を参照］１４７ｍｇ（１.２５ｍｍｏｌ）の４Åモレキュラーシーブ粉末を含有する１−ペンタノール（１.２ｍｌ）中混合物を１０５℃に一夜加熱した。冷却後、反応混合物をアセトニトリルで希釈し、分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（アセトニトリル／水＋０.１％ＴＦＡ勾配液）、次いで、シリカゲルクロマトグラフィー（溶離剤：トルエン／ジクロロメタン／メタノール（１０：５：１ ｖ／ｖ）によって直接精製して、標記化合物ラセミ体９３ｍｇ（理論値の１９％）を得た。
ＬＣ−ＭＳ（方法４）：Ｒt＝０.９３分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝３８８（Ｍ＋Ｈ）+
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ＝１２.７８（ｓ，１Ｈ）、１０.３８（ｓ，１Ｈ）、７.６８（ｓ，１Ｈ）、７.６０−７.４９（ｍ，６Ｈ）、７.４０（ｄ，１Ｈ）、６.７８（ｔ，１Ｈ，2ＪH,F＝５２Ｈｚ）、４.８３（ｓ，１Ｈ）、２.４８（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ。
【０１５３】
実施例４に記載の方法と類似の方法で以下の化合物を製造した；精製は、メタノール／水＋０.１％ＴＦＡ勾配液を使用した分取ＲＰ−ＨＰＬＣ、次いで、シリカゲルクロマトグラフィー（溶離剤：トルエン／ジクロロメタン／メタノール（１０：１０：１ ｖ／ｖ）によって行った：
【０１５４】
【表１−１】
2013510814.tif 000029
【表１−２】
2013510814.tif 000030
1)  溶離剤としてトルエン／ジクロロメタン／メタノール（１０：１０：０.５ ｖ／ｖ）を使用してシリカゲルクロマトグラフィー処理を行った；
2)  最初にメタノール／水＋０.１％ＴＦＡ勾配液を使用して分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、次いで、さらに、まずシリカゲルクロマトグラフィー（溶離剤：トルエン／ジクロロメタン／メタノール（１０：１０：０.５ ｖ／ｖ））、次に、分取ＲＰ−ＨＰＬＣ［カラム：Ｓｕｎｆｉｒｅ  Ｃ１８  ＯＢＤ、５μｍ、１９ｍｍ×１５０ｍｍ；溶離剤：水／メタノール（６０：４０→０：１００ ｖ／ｖ勾配液；流速：２５ｍｌ／分；温度：４０℃；ＵＶ検出：２５４ｎｍ］によって精製した。
【０１５５】
実施例９および実施例１０
２−(ジフルオロメチル)−６−(４−フルオロフェニル)−４−(３−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−イル)−１,４−ジヒドロピリジン−３,５−ジカルボニトリル（エナンチオマー１および２）
【化２８】
2013510814.tif 000031
キラル相でのＨＰＬＣクロマトグラフィー［カラム：Ｄａｉｃｅｌ  Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈ、５μｍ、２５０ｍｍ×２０ｍｍ；溶離剤：イソヘキサン／エタノール ８０：２０ ｖ／ｖ；流速：１５ｍｌ／分；温度：３０℃；ＵＶ検出：２２０ｎｍ］によって、実施例６からのラセミ化合物（６０ｍｇ）を各エナンチオマーに分離させた：
【０１５６】
実施例９（エナンチオマー１）：
収量：２５ｍｇ（＞９９％ｅｅ）
Ｒt＝４.８８分［カラム：Ｄａｉｃｅｌ  Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＡＤ−Ｈ、５μｍ、２５０ｍｍ×４.６ｍｍ；溶離剤：イソヘキサン／エタノール ８０：２０＋０.２％ジエチルアミン；流速：１ｍｌ／分；温度：３０℃；ＵＶ検出：２３５ｎｍ］。
【０１５７】
実施例１０（エナンチオマー２)：
収量：２６ｍｇ（＞９９％ｅｅ）
Ｒt＝６.０３分［カラム：Ｄａｉｃｅｌ  Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＡＤ−Ｈ、５μｍ、２５０ｍｍ×４.６ｍｍ；溶離剤：イソヘキサン／エタノール ８０：２０＋０.２％ジエチルアミン；流速：１ｍｌ／分；温度：３０℃；ＵＶ検出：２３５ｎｍ］。
【０１５８】
実施例１１
４−(３−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−イル)−２−フェニル−６−(トリフルオロメチル)−１,４−ジヒドロピリジン−３,５−ジカルボニトリル
【化２９】
2013510814.tif 000032
３−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−カルボアルデヒド（実施例１Ａ）３００ｍｇ（１.８７ｍｍｏｌ）、３−オキソ−３−フェニルプロパンニトリル２７２ｍｇ（１.８７ｍｍｏｌ）および３−アミノ−４,４,４−トリフルオロブタ−２−エンニトリル［製造：A.W. Lutz、米国特許第３,６３５,９７７号；C.G. Krespan、J. Org. Chem. 34, 42 (1969)］１０１９ｍｇ（７.４９ｍｍｏｌ）の４Åモレキュラーシーブ粉末を含有する１−ペンタノール（１.９ｍｌ）中混合物を１０５℃に一夜加熱した。冷却後、反応混合物をアセトニトリルで希釈し、分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（アセトニトリル／水＋０.１％ＴＦＡ勾配液）によって直接精製して、標記化合物ラセミ体２８５ｍｇ（理論値の３７％）を得た。
ＬＣ−ＭＳ（方法４）：Ｒt＝０.９９分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝４０６（Ｍ＋Ｈ）+
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ＝１２.８０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）、１０.６８（ｓ，１Ｈ）、７.７０（ｓ，１Ｈ）、７.６２−７.５０（ｍ，６Ｈ）、７.４２（ｄ，１Ｈ）、４.９２（ｓ，１Ｈ）、２.５４（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ。
【０１５９】
実施例１１に記載の方法と類似の方法で以下の化合物を製造した；精製は、メタノール／水＋０.１％ＴＦＡ勾配液を使用した分取ＲＰ−ＨＰＬＣ、次いで、シリカゲルクロマトグラフィー（溶離剤：トルエン／ジクロロメタン／メタノール １０：１０：１ ｖ／ｖ）によって行った：
【０１６０】
【表２−１】
2013510814.tif 000033
【表２−２】
2013510814.tif 000034
【表２−３】
2013510814.tif 000035
【表２−４】
2013510814.tif 000036
【表２−５】
2013510814.tif 000037
1)  シリカゲルクロマトグラフィーによるさらなる精製を行わなかった；
2)  反応は、１５０℃（３０分）でマイクロ波オーブン中にて行った；精製は、メタノール／水＋０.１％ＴＦＡ勾配液を使用する分取ＲＰ−ＨＰＬＣ、次いで、シリカゲルクロマトグラフィー（溶離剤：トルエン／ジクロロメタン／メタノール ５：５：１ ｖ／ｖ）によって行った。
【０１６１】
実施例２２および実施例２３
２−(４−フルオロフェニル)−４−(３−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−イル)−６−(トリフルオロメチル)−１,４−ジヒドロピリジン−３,５−ジカルボニトリル（エナンチオマー１および２）
【化３０】
2013510814.tif 000038
キラル相でのＨＰＬＣクロマトグラフィー［カラム：Ｄａｉｃｅｌ  Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈ、５μｍ、２５０ｍｍ×２０ｍｍ；溶離剤：イソヘキサン／エタノール ８５：１５ ｖ／ｖ；流速：１５ｍｌ／分；温度：３０℃；ＵＶ検出：２２０ｎｍ］によって、実施例１３からのラセミ化合物（２００ｍｇ）を各エナンチオマーに分離させた：
【０１６２】
実施例２２（エナンチオマー１)：
収量：８７ｍｇ（＞９９％ｅｅ）
Ｒt＝４.０１分［カラム：Ｄａｉｃｅｌ  Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＡＤ−Ｈ、５μｍ、２５０ｍｍ×４.６ｍｍ；溶離剤：イソヘキサン／エタノール ８０：２０＋０.２％ジエチルアミン；流速：１ｍｌ／分；温度：３０℃；ＵＶ検出：２３５ｎｍ］。
【０１６３】
実施例２３（エナンチオマー２)：
収量：９２ｍｇ（＞９９％ｅｅ）
Ｒt＝４.４５分［カラム：Ｄａｉｃｅｌ  Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＡＤ−Ｈ、５μｍ、２５０ｍｍ×４.６ｍｍ；溶離剤：イソヘキサン／エタノール ８０：２０＋０.２％ジエチルアミン；流速：１ｍｌ／分；温度：３０℃；ＵＶ検出：２３５ｎｍ］。
【０１６４】
下記実施例ＡおよびＢは、１,４−ジヒドロピリジン環の６位にあるフルオロ置換されていない（すなわち、非置換）メチル基を特徴とする、本発明の化合物と非常に類似する構造を有する。この種のｃ−Ｍｅｔキナーゼ阻害化合物は、従前にＷＯ２００８／０７１４５１−Ａ１に記載されている。本発明に関して、実施例ＡおよびＢで詳述されている化合物は、構造−活性および構造−透過性の関係の比較研究（下記生物学セクションを参照）のために、ＷＯ２００８／０７１４５１−Ａ１の一般的な開示内容から選択された。これらの化合物の製造は、上記方法の適用によって行われた。
【０１６５】
比較実施例Ａ
２−(４−メトキシフェニル)−６−メチル−４−(３−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−イル)−１,４−ジヒドロピリジン−３,５−ジカルボニトリル
【化３１】
2013510814.tif 000039
３−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−カルボアルデヒド（実施例１Ａ）２５０ｍｇ（１.５６ｍｍｏｌ）、３−(４−メトキシフェニル)−３−オキソプロパンニトリル３２８ｍｇ（１.８８ｍｍｏｌ）および３−アミノブタ−２−エンニトリル１２８ｍｇ（１.５６ｍｍｏｌ）の４Åモレキュラーシーブ粉末を含有する１−ペンタノール（１.５５ｍｌ）中混合物を１０５℃に一夜加熱した。冷却後、反応混合物をアセトニトリルで希釈し、分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（アセトニトリル／水＋０.１％ＴＦＡ勾配液）によって直接精製して、標記化合物ラセミ体１８０ｍｇ（理論値の３０％）を得た。
ＬＣ−ＭＳ（方法４）：Ｒt＝０.９１分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝３８２（Ｍ＋Ｈ）+
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ＝１２.７０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）、９.６４（ｓ，１Ｈ）、７.６０（ｓ，１Ｈ）、７.５７−７.４８（ｍ，３Ｈ）、７.３８（ｄ，１Ｈ）、７.０８（d、２H）、４.６２（ｓ，１Ｈ）、３.８０（ｓ，３Ｈ）、２.４８（ｓ，３Ｈ）、２.１１（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ。
【０１６６】
比較実施例Ｂ
２−(４−フルオロフェニル)−６−メチル−４−(３−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−イル)−１,４−ジヒドロピリジン−３,５−ジカルボニトリル
【化３２】
2013510814.tif 000040
(２Ｅ)−２−[(３−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−イル)メチリデン]−３−オキソブタンニトリル（実施例２Ａ）２００ｍｇ（０.８９ｍｍｏｌ）、３−(４−フルオロフェニル)−３−オキソプロパンニトリル１５９ｍｇ（０.９８ｍｍｏｌ）および酢酸アンモニウム２０５ｍｇ（２.６６ｍｍｏｌ）のエタノール／酢酸（４：１ ｖ／ｖ、１１ｍｌ）中混合物を一夜加熱還流した。冷却後、反応混合物を分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（アセトニトリル／水＋０.１％ＴＦＡ勾配液）によって直接精製して、標記化合物ラセミ体１３６ｍｇ（理論値の４１％）を得た。
ＬＣ−ＭＳ（方法２）：Ｒt＝１.０４分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝３７０（Ｍ＋Ｈ）+
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）：δ＝１２.７０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）、９.７４（ｓ，１Ｈ）、７.６４−７.５９（ｍ，３Ｈ）、７.５３（ｄ，１Ｈ）、７.４０−７.３３（ｍ，３Ｈ）、４.６８（ｓ，１Ｈ）、２.４８（ｓ，３Ｈ）、２.１１（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ。
【０１６７】
Ｂ．生物活性の評価
本発明の化合物の活性の立証は、当分野で周知のインビトロ、エクスビボおよびインビボのアッセイを通して達成され得る。例えば、本発明の化合物の活性を立証するために、以下のアッセイを使用し得る。
【０１６８】
ｃ−Ｍｅｔ受容体チロシンキナーゼ活性アッセイ（ＮＡＤＨ読み取り）：
組換えヒトｃ−Ｍｅｔタンパク質（Invitrogen, Carlsbad, California, USA）を使用する。キナーゼ反応の基質として、ペプチドＫＫＫＳＰＧＥＹＶＮＩＥＦＧ（JPT, Germany）を使用する。アッセイのために、試験化合物のＤＭＳＯ中５１倍濃縮溶液１μＬを、白色３８４ウェルマイクロタイタープレート（Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany）にピペットで加える。アッセイバッファー［３−(Ｎ−モルホリノ)プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、５０ｍＭ、ｐＨ７；ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ；ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０.０１％；Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００、０.０１％；ＤＴＴ、２ｍＭ］中のｃ−Ｍｅｔ（最終濃度３０ｎＭ）およびピルビン酸キナーゼ／乳酸デヒドロゲナーゼ（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany；最終濃度８ｍｇ／Ｌ）の溶液２５μＬを添加し、混合物を室温で５分間インキュベートする。次いで、アッセイバッファー中のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ、最終濃度３０μＭ）、基質（最終濃度１００μＭ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ、最終濃度５０μＭ）およびジチオスレイトール（ＤＴＴ、最終濃度２ｍＭ）の溶液２５μＬの添加によりキナーゼ反応を開始させ、得られる混合物を３２℃で１００分間の反応時間にわたりインキュベートする。
【０１６９】
次いで、リン酸化された基質の量を、ＮＡＤＨ蛍光の減少の測定により評価する。したがって、３４０ｎｍでの励起後の４６５ｎｍでの蛍光の放出を蛍光リーダー、例えば、Ｔｅｃａｎ  Ｕｌｔｒａ（Tecan, Maennedorf, Switzerland）で測定する。データを標準化する（阻害剤なしの酵素反応＝０％阻害；全ての他のアッセイ成分であるが酵素を含まない＝１００％阻害）。通常、試験化合物を同じマイクロタイタープレートで、１０μＭ〜１ｎＭの範囲の９つの異なる濃度（１０μＭ、３.１μＭ、１.０μＭ、０.３μＭ、０.１μＭ、０.０３μＭ、０.０１μＭ、０.００３μＭ、０.００１μＭ；アッセイ前に、５１倍濃縮原液のレベルで、連続１：３希釈により調製した連続希釈物）で、各濃度につきデュプリケート（duplicate）で試験し、自社のソフトウェアを使用して、ＩＣ50値を算出する。
【０１７０】
いくつかの代表的なＩＣ50値を、１,４−ジヒドロピリジン環の６位にある非置換メチル基を有する２つの構造類似物（比較実施例ＡおよびＢ、実験セクションを参照；ＷＯ２００８／０７１４５１−Ａ１に一般的に開示されている）についての対応するデータと共に、下記の表１に挙げる：
【０１７１】
【表３】
2013510814.tif 000041
【０１７２】
ｃ−Ｍｅｔ受容体チロシンキナーゼの均一時間分解蛍光法（代替的フォーマット）：
ヒトｃ−ＭｅｔのＮ末端にＨｉｓ６−タグを有する組換えキナーゼドメイン（アミノ酸９６０−１３９０）を、昆虫細胞（ＳＦ２１）で発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡ親和性クロマトグラフィーにより精製し、連続的サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００）を使用する。別法として、購入できるｃ−Ｍｅｔ（Millipore）を使用できる。キナーゼ反応の基質として、ビオチン化ポリ−Ｇｌｕ,Ｔｙｒ（４：１）コポリマー（＃  ６１ＧＴ０ＢＬＣ, Cis Biointernational, Marcoule, France）を使用する。
【０１７３】
アッセイのために、ＤＭＳＯ中の試験化合物の１００倍濃縮溶液５０ｎＬを、黒色低容積３８４ウェルマイクロタイタープレート（Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany）にピペットで加える。アッセイバッファー［２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／ＮａＯＨ、ｐＨ７.５；５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；５ｍＭ  ＭｎＣｌ２；２ｍＭジチオスレイトール；０.１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０（Sigma）；０.１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン］中のｃ−Ｍｅｔの溶液２μＬを添加し、混合物を２２℃で１５分間インキュベートし、キナーゼ反応の開始前に試験化合物を酵素に予め結合させる。次いで、アッセイバッファー中のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ、１６.７μＭ；アッセイ体積５μＬ中の最終濃度は１０μＭである）および基質（２.２７μｇ／ｍＬ、アッセイ体積５μＬ中の最終濃度は、１.３６μｇ／ｍＬ〜３０ｎＭである）の溶液３μＬの添加により、キナーゼ反応を開始させ、得られる混合物を２２℃で３０分間の反応時間にわたりインキュベートする。アッセイ中のｃ−Ｍｅｔの濃度を酵素ロットの活性に応じて調節し、アッセイが線形の範囲にあるように適当に選択する；典型的な酵素濃度は、約０.０３ｎＭ（アッセイ体積５μＬ中の最終濃度）の範囲にある。水性ＥＤＴＡ溶液［１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、０.２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ中、ｐＨ７.５］中のＨＴＲＦ検出試薬［４０ｎＭストレプトアビジン−ＸＬｅｎｔおよび２.４ｎＭ  ＰＴ６６−Ｅｕ−キレート（ユーロピウムキレートで標識された抗ホスホチロシン抗体（Perkin-Elmer）］の溶液５μＬの添加により、反応を停止させる。
【０１７４】
得られる混合物を２２℃で１時間インキュベートし、ビオチン化されたリン酸化ペプチドをストレプトアビジン−ＸＬｅｎｔおよびＰＴ６６−Ｅｕ−キレートへ結合させる。次いで、リン酸化基質の量を、ＰＴ６６−Ｅｕ−キレートからストレプトアビジン−ＸＬｅｎｔへの共鳴エネルギー移動の測定により評価する。したがって、３５０ｎｍでの励起後の６２０ｎｍおよび６６５ｎｍでの蛍光の放出を、ＨＴＲＦリーダー、例えば、Ｒｕｂｙｓｔａｒ（BMG Labtechnologies, Offenburg, Germany）またはＶｉｅｗｌｕｘ（Perkin-Elmer）で測定する。６６５ｎｍおよび６２２ｎｍでの発光の比を、リン酸化基質の量の尺度として取る。データを標準化する（阻害剤なしの酵素反応＝０％阻害；全ての他のアッセイ成分であるが酵素を含まない＝１００％阻害）。通常、試験化合物を同じマイクロタイタープレートで、２０μＭ〜１ｎＭの範囲の１０個の異なる濃度（２０μＭ、６.７μＭ、２.２μＭ、０.７４μＭ、０.２５μＭ、８２ｎＭ、２７ｎＭ、９.２ｎＭ、３.１ｎＭおよび１ｎＭ；アッセイ前に、１００倍濃縮原液のレベルで、連続１：３希釈により調製した連続希釈物）で、各濃度につきデュプリケートで試験し、自社のソフトウェアを使用して、４パラメーターフィットによりＩＣ50値を算出する。
【０１７５】
ホスホ−ｃ−Ｍｅｔアッセイ：
これは、ＭＫＮ−４５腫瘍細胞（胃癌、ＡＴＣＣから購入）を増殖因子で刺激せずに使用する、細胞をベースとするＥＬＩＳＡ様アッセイ［Meso Scale Discovery (MSD), Gaithersburg, MD, USA］である。１日目に、細胞を９６ウェルプレート中の完全増殖培地に播く（１００００細胞／ウェル）。２日目に、無血清培地中での２時間の薬物処理の後、細胞を洗浄し、次いで溶解させ（６０μｌ／ウェル、ＭＳＤ推奨の溶解バッファーを使用する）、−８０℃で凍結させる。また、２日目に、ＭＳＤホスホ−Ｍｅｔプレートの非特異的抗体結合部位をＭＳＤ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａで、終夜４℃でブロックする。３日目に、凍結した溶解物を氷上で解凍し、溶解物２５μｌをＭＳＤホスホ−Ｍｅｔプレートに移し、１時間振盪し、その後Ｔｒｉｓ緩衝食塩水＋０.０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＴＢＳＴ）で１回洗浄する。非結合タンパク質を除去した後、ＭＳＤのＳｕｌｆａ−ＴＡＧ抗Ｍｅｔ抗体を、抗体希釈バッファー（ＭＳＤのプロトコールに従う）中の最終濃度５ｎＭでプレートに添加し、１時間振盪する。次いで、プレートをＴＢＳＴバッファーで３回洗浄し、その後、１ｘ  ＭＳＤ  Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒを加える。次いで、プレートをＭＳＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ装置で読む。参照化合物１０μＭのウェル（最小のシグナル）および薬物処理を行わないＤＭＳＯのウェル（最大のシグナル）を含む未加工のデータを、ＩＣ50値の決定のためにＡｎａｌｙｚｅ  ５プログラムに入力する。
【０１７６】
細胞のホスホ−ｃ−Ｍｅｔアッセイ：
３８４ウェルのマイクロタイタープレートに播いたヒト胃腺腫細胞（ＭＫＮ４５、ＡＴＣＣから購入）（９０００細胞／ウェル）を、完全増殖培地２５μｌ中、３７℃にて５％ＣＯ2で２４時間インキュベートする。２日目に、０.１％ＦＣＳを含有する低血清培地中、２時間の薬物処理の後、細胞を洗浄し、溶解させる。溶解物を、予め結合したｃ−Ｍｅｔ捕捉抗体［Mesoscale Discovery (MSD), Gaithersburg, MD, USAから購入］を有するＢＳＡでブロックしたプレートに移し、１時間震盪し、その後Ｔｒｉｓ緩衝食塩水＋０.０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＴＢＳＴ）で１回洗浄する。ＭＳＤのプロトコールに従い、Ｓｕｌｆａ−ＴＡＧ抗ホスホ−ｃ−Ｍｅｔ検出抗体を抗体希釈バッファー中の最終濃度５ｎＭでプレートに添加し、室温で１時間振盪する。ウェルをＴｒｉｓバッファーで洗浄した後、１ｘリーディングバッファーを添加し、プレートをＳｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００（Mesoscale から購入）で測定する。Ｍａｒｑｕａｒｄｔ−Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｆｉｔを使用して、用量応答曲線からＩＣ50値を算出する。
【０１７７】
インビトロの腫瘍細胞増殖アッセイ：
本発明の化合物を試験するのに使用する接着性腫瘍細胞増殖アッセイは、Promega により開発されたＣｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ−Ｇｌｏと呼ばれる読み取りを含む［B.A. Cunningham, "A Growing Issue: Cell Proliferation Assays. Modern kits ease quantification of cell growth", The Scientist 2001, 15 (13), 26；S.P. Crouch et al., "The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity", Journal of Immunological Methods 1993, 160, 81-88］。発光シグナルの生成は、存在するＡＴＰの量に対応し、それは、代謝的に活性な（増殖している）細胞の数に直接比例する。
【０１７８】
Ｈ４６０細胞（肺癌、ＡＴＣＣから購入）を、９６ウェルプレートに、３０００細胞／ウェルで、１０％ウシ胎仔血清を含む完全培地中に播き、３７℃で２４時間インキュベートする。播種の２４時間後、試験化合物を連続希釈の１０ｎＭ〜２０μＭの最終濃度範囲で、最終ＤＭＳＯ濃度０.２％で添加する。試験化合物の添加後、細胞を３７℃で７２時間、完全増殖培地中でインキュベートする。４日目に、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ（登録商標）アッセイキットを使用して、細胞を溶解させ、基質／バッファー混合物１００μｌを各ウェルに添加し、混合し、室温で８分間インキュベートする。サンプルをルミノメーターで読み、各ウェルの細胞溶解物中に存在するＡＴＰの量を測定し、それは、そのウェル中の生存可能な細胞の数に対応する。２４時間のインキュベーションで読まれた値を、０日目として差し引く。ＩＣ50値の測定に、線形回帰分析を使用して、このアッセイフォーマットを使用する細胞増殖の５０％阻害をもたらす薬物濃度を判定することができる。このプロトコールを、ＣＡＫＩ−１、ＭＮＫ−４５、ＧＴＬ−１６、ＨＣＣ２９９８、Ｋ５６２、Ｈ４４１、Ｋ８１２、ＭＥＧ０１、ＳＵＰ１５およびＨＣＴ１１６を含むがこれらに限定されない様々な関心のある細胞株に適用できる。
【０１７９】
Ｃａｃｏ−２透過性アッセイ：
Ｃａｃｏ−２細胞単層を通過する試験化合物のインビトロ透過は、胃腸管からの透過性を予測するための十分に確立されたアッセイ系である［P. Artursson and J. Karlsson: Correlation between oral drug absorption in humans and apparent drug permeability coefficients in human intestinal epithelial (Caco-2) cells, Biochem. Biophys. 175 (3), 880-885 (1991)を参照］。そのようなＣａｃｏ−２細胞での本発明の化合物の透過性を、下記の通りに測定した：
【０１８０】
ヒトｃａｃｏ−２細胞（ＡＣＣ  Ｎｏ．１６９, DSMZ, German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Germany）を、２４ウェルの挿入プレートに播き、１４〜１６日間増殖させる。透過性の研究のために、試験化合物をＤＭＳＯに溶解し、輸送バッファー［ハンクス緩衝塩溶液、Gibco / Invitrogen、さらにグルコース（最終濃度１９.９ｍＭ）およびＨＥＰＥＳ（最終濃度９.８ｍＭ）を添加］で２μＭの最終試験濃度に希釈する。頂端側から基底側への透過性（ＰappＡ−Ｂ）を測定するために、試験化合物溶液を細胞単層の頂端側に添加し、輸送バッファーを単層の基底側に添加する；基底側から頂端側への透過性（ＰappＢ−Ａ）を測定するために、試験化合物溶液を細胞単層の基底側に添加し、輸送バッファーを単層の頂端側に添加する。実験開始時にサンプルをドナー区画から採取し、質量平衡を確かめる。３７℃で２時間インキュベートした後、サンプルを両方の区画から採取する。サンプルをＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析し、明確な透過率を算出する。ルシファーイエローの透過性を各細胞単層についてアッセイし、細胞単層の完全性を保証し、品質管理として各バッチのアテノロール（低透過性マーカー）およびスルファサラジン（能動的排出のマーカー）の透過性を測定する。
【０１８１】
これらのアッセイの代表的な結果を、１,４−ジヒドロピリジン環の６位に非置換メチル基を有する２つの構造類似物（比較実施例ＡおよびＢ、上記実験セクションを参照；ＷＯ２００８／０７１４５１−Ａ１に一般的に開示されている）についての対応するデータと共に、下記の表２に挙げる：
【０１８２】
【表４】
2013510814.tif 000042
【０１８３】
本発明を特定の実施態様を参照して開示したが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の他の実施態様および変形が他の当業者により考案され得ることは明白である。特許請求の範囲は、全てのそのような実施態様および等価の変形も包含すると解釈されることを企図している。
【０１８４】
Ｃ．医薬組成物に関する実施例
本発明による医薬組成物は以下の通りに例示説明できる：
【０１８５】
滅菌ｉ.ｖ.液剤：
本発明の所望の化合物の５ｍｇ／ｍｌ溶液を、注射用滅菌水を使用して調製でき、必要であればｐＨを調節する。投与用に溶液を滅菌５％デキストロースで１〜２ｍｇ／ｍｌに希釈し、約６０分間にわたってｉ.ｖ.注入液として投与する。
【０１８６】
ｉ.ｖ.投与用凍結乾燥粉末剤：
滅菌調製物を、（ｉ）凍結乾燥粉末としての本発明の所望の化合物１００〜１０００ｍｇ、（ｉｉ）クエン酸ナトリウム３２〜３２７ｍｇ／ｍｌ、および（ｉｉｉ）３００〜３０００ｍｇのデキストラン４０により製造できる。この製剤を滅菌注射用食塩水または５％デキストロースにより１０〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度に再構成し、さらにこれを食塩水または５％デキストロースで０.２ないし０.４ｍｇ／ｍｌに希釈し、ｉ.ｖ.ボーラスとして、または１５〜６０分間にわたるｉ.ｖ.注入により投与する。
【０１８７】
筋肉内懸濁剤：
次の液剤または懸濁剤を、筋肉注射用に調製できる：
所望の水不溶性の本発明の化合物５０ｍｇ／ｍｌ、カルボキシメチルセルロースナトリウム５ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍＬのＴＷＥＥＮ  ８０、９ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウム、９ｍｇ／ｍｌのベンジルアルコール。
【０１８８】
ハードシェルカプセル剤：
粉末状有効成分１００ｍｇ、乳糖１５０ｍｇ、セルロース５０ｍｇおよびステアリン酸マグネシウム６ｍｇを標準的な２ピースのハードゼラチンカプセルに充填することにより、多数の単位カプセル剤を製造する。
【０１８９】
ソフトゼラチンカプセル剤：
大豆油、綿実油またはオリーブ油などの食用油中の有効成分の混合物を調製し、容積移送式ポンプによって溶解ゼラチンへ注入し、有効成分１００ｍｇを含むソフトゼラチンカプセルを形成する。カプセルを洗浄し、乾燥させる。有効成分をポリエチレングリコール、グリセリンおよびソルビトールの混合物に溶解し、水混和性医薬ミックスを調製できる。
【０１９０】
錠剤：
単位用量が、有効成分１００ｍｇ、コロイド状二酸化ケイ素０.２ｍｇ、ステアリン酸マグネシウム５ｍｇ、微結晶セルロース２７５ｍｇ、澱粉１１ｍｇおよび乳糖９８.８ｍｇであるように、慣用の方法により多数の錠剤を製造する。適切な水性および非水性被覆を適用して、嗜好性を高めるか、美しさ（elegance）と安定性を改善するか、または吸収を遅延させ得る。
【国際調査報告】
2013510814.tif 000054
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