(57)【要約】一般式（Ｉ）    R-AA1-シクロ(AA2-Tyr3-D-Trp4- AA5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2    (I)で表される新規なオクタペプチド化合物を提供する。これらの生成物は、ソマトスタチン受容体の或る種のサブタイプに対して良好な親和性を示すので、ソマトスタチン受容体がひとつ（又は複数）関与する病理的状態又は疾病の治療に特に有効である。本発明はまた、前記生成物を含む医薬組成物、及びこれらの医薬製造への使用にも関する。
2013534920.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）で表されるオクタペプチド化合物
R-AA1-シクロ(AA2-Tyr3-D-Trp4-AA5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2   (I)
｛式中、AA1は次式（ＩＩ）で表される如くR基とアミノ酸AA2とに結合したアミノ酸の基を表し
【化１】
2013534920.tif 000009
（式中、
R1は１つ又はそれ以上のアルキルの基で置換されていてもよいナフチルの基を表し、
Rは水素原子又はアルキル又はアセチルの基を表す）、
AA2は次式（ＩＩＩ）で表される如くアミノ酸AA1とTyr3とに結合したアミノ酸の基を表し
【化２】
2013534920.tif 000010
（式中、n2は１〜２の整数である）、
AA5は次式（ＩＶ）で表される如くアミノ酸Trp4とアミノ酸Val6とに結合したアミノ酸の基を表し
【化３】
2013534920.tif 000011
（式中、R5及びR'5はそれぞれ独立に水素原子又はアルキル又はアセチルの基を表し、n5は１〜６の整数である）｝、
AA2がシステインのアミノ酸の基を表す時は、
AA1がナフチルアラニンのアミノ酸の基を表さず、且つ、AA5がリジンのアミノ酸の基を表すか、又は
AA1がナフチルアラニンのアミノ酸の基を表し、且つ、AA5がリジンのアミノ酸の基を表さないか、又は
AA1がナフチルアラニンの基を表さず、且つ、AA5がリジンの基を表さず、
AA2がシステインの基を表さない時は、AA1がナフチルアラニンのアミノ酸の基を表し、且つ、AA5がリジンのアミノ酸の基を表し、
また、全てのアミノ酸がＤ体又はＬ体、若しくはこれら化合物の薬学的に許容される塩であってよい、オクタペプチド化合物。
【請求項２】
n5 が１〜４の整数である、請求項１に記載の一般式（Ｉ）で表されるオクタペプチド化合物。
【請求項３】
一般式（Ｉ）で表され、AA2がシステインのアミノ酸の基を表す、請求項１又は２に記載のオクタペプチド化合物。
【請求項４】
AA2がシステインのアミノ酸の基を表さない、請求項１又は２に記載の一般式（Ｉ）で表されるオクタペプチド化合物。
【請求項５】
AA1がナフチルアラニンのアミノ酸の基を表さず、且つ、AA5がリジンのアミノ酸の基を表す、請求項１〜３のいずれか１項に記載の一般式（Ｉ）で表されるオクタペプチド化合物。
【請求項６】
AA1がナフチルアラニンのアミノ酸の基を表し、且つ、AA5がリジンのアミノ酸の基を表さない、請求項１〜３に記載の一般式（Ｉ）で表されるオクタペプチド化合物。
【請求項７】
AA1がナフチルアラニンのアミノ酸の基を表さず、且つ、AA5がリジンのアミノ酸の基を表さない、請求項１〜３に記載の一般式（Ｉ）で表されるオクタペプチド化合物。
【請求項８】
AA1が2-Nal、Ac-2-Nal及びCH3-2-Nalから選択されるアミノ酸の基である、請求項１または２に記載の一般式（Ｉ）で表されるオクタペプチド化合物。
【請求項９】
AA2がCys及びHcyから選択されるアミノ酸の基である、請求項１または２に記載の一般式（Ｉ）で表されるオクタペプチド化合物。
【請求項１０】
AA5がLys、Lys(Ac)、Orn、(CH3)2Lys、Dab及びDapから選択されるアミノ酸の基である、請求項１または２に記載の一般式（Ｉ）で表されるオクタペプチド化合物。
【請求項１１】
一般式（Ｉ）で表され、
H-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-Lys(Ac)5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2；
Ac-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-Lys(Ac)5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2；
H-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-Orn5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2；
H-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-(Me)2Lys5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2；
H-D-2-Nal1-シクロ(Hcy2-Tyr3-D-Trp4-Lys5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2；
Ac-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-Lys5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2；
CH3-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-Lys5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2；
H-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-Dab5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2；及び
H-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-Dap5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2；
又はこれら化合物の薬学的に許容される塩から選択される、請求項１または２に記載のオクタペプチド化合物。
【請求項１２】
H-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-Orn5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2；
H-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-(Me)2Lys5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2；
H-D-2-Nal1-シクロ(Hcy2-Tyr3-D-Trp4-Lys5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2；及び
Ac-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-Lys5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2；
又はこれら化合物の薬学的に許容される塩から選択される、請求項１１に記載の一般式（Ｉ）で表されるオクタペプチド化合物。
【請求項１３】
式H-D-2-Nal1-シクロ(Hcy2-Tyr3-D-Trp4-Lys5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2で表される化合物、又は薬学的に許容されるその塩である、請求項１２に記載の一般式（Ｉ）で表されるオクタペプチド化合物。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の一般式（Ｉ）で表される化合物を含む医薬。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の一般式（Ｉ）で表される化合物を有効成分とし、これを少なくとも１種類の薬学的に許容される賦形剤と共に含む、治療用組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の一般式（Ｉ）で表される化合物の、医薬製造への使用。
【請求項１７】
前記医薬が、成長ホルモン関連疾患から選択される病状の治療を目的とする、請求項１６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なオクタペプチド化合物及びその治療目的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
これらの生成物は、ソマトスタチン受容体の或る種のサブタイプに対して良好な親和性を示すので、ソマトスタチン受容体がひとつ（又は複数）関与する病理的状態又は疾病の治療に特に有効である。本発明はまた、前記生成物を含む医薬組成物、及びこれらの医薬製造への使用にも関する。
【０００３】
ソマトスタチン（ＳＳＴ）は、成長ホルモン阻害物質として視床下部から最初に単離された環状テトラデカペプチドである (Brazeau P. et al., Science 1973, 179, 77-79)。ＳＳＴはまた、脳内の神経伝達物質としても働く(Reisine T. et al., Neuroscience 1995, 67, 777-790; Reisine et al., Endocrinology 1995, 16, 427-442)。ソマトスタチンの生物学的活性の不均一性と、そのペプチドアナログの構造と活性との関係から、膜受容体のサブタイプが５種類発見された(Yamada et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 89, 251-255, 1992; Raynor, K. et al, Mol. Pharmacol., 44, 385-392, 1993)。分子クローニングにより、ソマトスタチンの生物学的活性がこれら５種類の受容体のサブタイプに直接依存していることが示されている。
【０００４】
現在、これら受容体の機能的役割についての研究が盛んに行われている。サブタイプ ２と５の優先的な活性化と、成長ホルモンＧＨ（先端巨大症）、ＴＳＨ及びプロラクチンの、これらのホルモンを分泌するアデノーマにおける抑制との関連が解っているが、各サブタイプの詳しい役割はまだ解っていない。
【０００５】
ソマトスタチンに関連する病理学的異常(Moreau J.P. et al., Life Sciences 1987, 40, 419; Harris A.G. et al., The European Journal of Medicine, 1993, 2, 97-105)としては、先端巨大症、下垂体腺腫、クッシング病、ゴナドトロピン症及びプロラクチノーマ、糖質コルチコイドの異化副作用、糖尿病、糖尿病性網膜症、糖尿病性ネフロパシー、甲状腺機能亢進症、巨人症、カルチノイド症候群を含む内分泌性胃腸膵管系腫瘍、ビポーマ、インスリノーマ、膵島細胞症、項インスリン血症、グルカゴノーマ、ガストリノーマ及びゾリンガー−エリソン症候群、GRF産生腫瘍、及び、食道静脈瘤の急性出血、胃食道逆流、胃十二指腸逆流、膵炎、腸皮及び膵臓フィステルが例示され、さらに、下痢、後天性免疫不全症候群の難治性下痢、慢性の分泌性下痢、過敏性大腸症候群に併発する下痢、ガストリン放出ペプチドに関連した疾病、腸移植片に伴う二次的病変、門脈高血圧並びに肝硬変患者における静脈瘤の出血、胃腸の出血、胃十二指腸潰瘍の出血、クローン病、全身性硬化症、ダンピング症候群、小腸症候群、低血圧症、硬皮症、及び甲状腺髄質癌腫、細胞増殖亢進に関連した疾病例えば癌、より具体的には乳癌、前立腺癌、甲状腺癌並びに膵臓癌及び結腸直腸癌、繊維症、より具体的には腎繊維症、肝繊維症、肺繊維症、皮膚繊維症、中枢神経系の繊維症並びに鼻繊維症、及び化学療法により誘発される繊維症、及び他の治療分野例えば下垂体腫瘍と関連する頭痛を含む頭痛、疼痛、パニック発作、化学療法、傷の瘢痕化、発育遅延に起因する腎不全、肥満及び肥満に関連した発育遅延、子宮の発育遅延、骨格形成異常、ヌーナン症候群、睡眠時無呼吸症候群、グレーブス病、卵巣の多嚢胞性疾患、膵偽嚢胞及び腹水症、白血病、髄膜腫、癌性悪液質、Ｈ幽門の阻害、乾癬、並びにアルツハイマー病も例示される。さらに、骨粗鬆症も挙げられる。
【０００６】
近年、ソマトスタチン受容体に親和性を有するペプチドへの注目が高まっている。このような中、成長ホルモンに関連する疾病の治療を目的として、ランレオチドに関する研究が盛んに行われている(Cendros JM, Peraire C, Troconiz IF, Obach R. Pharmacokinetics and population pharmacodynamic analysis of lanreotide Autogel. Metabolism. 2005 Oct, 54(10), 1276-81)。
【０００７】
４位が修飾されたランレオチドを含むオクタペプチド化合物が、国際特許出願PCT/FR09/001162に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際特許出願ＰＣＴ／ＦＲ０９／００１１６２
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Brazeau P. et al., Science 1973, 179, 77-79
【非特許文献２】Reisine T. et al., Neuroscience 1995, 67, 777-790
【非特許文献３】Reisine et al., Endocrinology 1995, 16, 427-442
【非特許文献４】Yamada et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 89, 251-255, 1992
【非特許文献５】Raynor, K. et al, Mol. Pharmacol., 44, 385-392, 1993
【非特許文献６】Moreau J.P. et al., Life Sciences 1987, 40, 419
【非特許文献７】Harris A.G. et al., The European Journal of Medicine, 1993, 2, 97-105
【非特許文献８】Cendros JM, Peraire C, Troconiz IF, Obach R. Pharmacokinetics and population pharmacodynamic analysis of lanreotide Autogel. Metabolism. 2005 Oct, 54(10), 1276-81
【発明の概要】
【００１０】
したがって、既存の解決法への代替法を見出すことへの要望は、大きな挑戦を意味する。本発明はかかる背景から為されるものである。
【００１１】
本願出願人は、ソマトスタチン受容体に高い親和性を示す新規なオクタペプチド化合物を提案する。
【００１２】
本発明の主題は、一般式（Ｉ）で表されるオクタペプチド化合物
R-AA1-シクロ(AA2-Tyr3-D-Trp4- AA5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2   (I)
｛式中、AA1 は次式（ＩＩ）で表される如くRの基とアミノ酸AA2とに結合したアミノ酸の基を表し
【化１】
2013534920.tif 000003
（式中、
R1は１つ又はそれ以上のアルキルの基で置換されていてもよい ナフチルの基を表し、
Rは水素原子又はアルキル又はアセチルの基を表す）、
AA2 は次式（ＩＩＩ）で表される如くアミノ酸AA1とTyr3とに結合したアミノ酸の基を表し
【化２】
2013534920.tif 000004
（式中、n2は１〜２の整数である）、
AA5 は次式（ＩＶ）で表される如くアミノ酸Trp4とアミノ酸Val6とに結合したアミノ酸の基を表し
【化３】
2013534920.tif 000005
（式中、R5及びR'5はそれぞれ独立に水素原子又はアルキル又はアセチルの基を表し、n5 は１〜４の整数である）｝、
AA2がシステインのアミノ酸の基を表す時は、
AA5がリジンのアミノ酸の基を表し、且つ、AA1がナフチルアラニンのアミノ酸の基を表さないか、又は
AA1 がナフチルアラニンのアミノ酸の基を表し、且つ、AA5 がリジンのアミノ酸の基を表さないか、又は
AA1がナフチルアラニンのアミノ酸の基を表さず、且つ、AA5がリジンのアミノ酸の基を表さず、
AA2がシステインの基を表さない時は、AA1がナフチルアラニンのアミノ酸の基を表し、且つ、AA5がリジンのアミノ酸の基を表し、
また、全てのアミノ酸がＤ体又はＬ体、若しくはこれら化合物の薬学的に許容される 塩であってよい、オクタペプチド化合物である。
【００１３】
本発明において、アミノ酸の基とは、ペプチド結合に組み込まれているアミノ酸からそのアミン及び酸の機能によって生成する基を意味する。したがって、側鎖にＸを持つアミノ酸の基は、基として、式-NH-CH(X)-C(O)-で表される基を有することになる。
【００１４】
本発明において、一般式中の３文字コードで表される各アミノ酸は、それが原形であっても基であっても、特に断らない限りＤ体又はＬ体の形をとり得る。
【００１５】
さらに、本発明においては慣例に倣い、３文字コードによるアミノ酸配列で示されるペプチドの表記は、何も指定がなければＬ体のアミノ酸を表すこととし、Ｄ体のアミノ酸のみ該当するアミノ酸の３文字コードの頭に文字Ｄを付けて明示することにする。
【００１６】
本発明において、アルキルとは特に断らない限り炭素原子数１〜６の直鎖又は分岐アルキルの基を意味し、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert-ブチル、ペンチル又はヘキシルであり、好ましくは炭素原子数１〜４である。
【００１７】
本発明によれば、薬学的に許容される塩という表現は、無機酸との付加塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、二リン酸塩及び硝酸塩等、又は、有機酸との付加塩、例えば酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、メタンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、パモ酸塩及びステアリン酸塩を定義する。薬学的に許容される塩の他の例については、"Salt selection for basic drugs", Int. J. Pharm. (1986), 33, 201-217を参照することができる。
【００１８】
本発明によれば、上記アミノ酸は当業者に公知のＤ体又はＬ体のアミノ酸を通常の命名法にしたがって表し、またこれらのアミノ酸の側鎖を修飾した合成アナログを表し、これらの中で、
D-2-Nal1、Ac-D-2-Nal1及びCH3-D-2-Nal1 は、ナフチルの基がβ位で置換したアラニンであって、それぞれ無置換、及びそのアミン基にアセチルの基又はメチルの基が１位で置換したものを表し、
Hcy はホモシステイン、即ち、システインの側鎖がメチレン単位１つ分伸長したものを表し、
Ornはオルニチン、即ち、リジンの側鎖がメチレン単位１つ分短縮したものを表し、
Dabはジアミノ酪酸 、即ち、リジンの側鎖がメチレン単位２つ分短縮したものを表し、
Dapはジアミノプロピオン酸、即ち、リジンの側鎖がメチレン単位３つ分短縮したものを表し、
Lys(Ac)及び(Me)2Lysはリジンの側鎖のアミノ基がそれぞれ１つ又はそれ以上のアセチル又はメチルの基で置換されたものを表す。
【００１９】
好ましくは、n5は１〜４の整数を表し、より好ましくは、n5は３〜４の整数を表す。
【００２０】
好ましくは、AA2はシステインのアミノ酸の基を表し、即ちn2は１である。
【００２１】
好ましくは、AA2はシステインのアミノ酸の基を表さず、即ちn2は２である。
【００２２】
好ましくは、AA1は ナフチルアラニンのアミノ酸の基を表さず、即ちRはアルキル又はアセチルの基を表し、且つAA5はリジンのアミノ酸の基を表し、即ちn5は４であり、且つR5とR'5とは水素原子を表す。
【００２３】
好ましくは、AA1はナフチルアラニンのアミノ酸の基を表し、即ちRは水素原子を表し、且つAA5 はリジンのアミノ酸の基を表さず、即ちn5が１〜３の整数であるか又はn5が４であるかのいずれかであり、且つR5とR'5とはアルキル又はアセチルの基を表す。
【００２４】
好ましくは、AA1はナフチルアラニンのアミノ酸の基を表さず、即ちRはアルキル又はアセチルの基を表し、且つAA5はリジンのアミノ酸の基を表さず、即ちn5が１〜３の整数であるか又はn5が４であるかのいずれかであり、且つR5とR'5とはアルキル又はアセチルの基を表す。
【００２５】
好ましくは、AA1 は2-Nal、Ac-2-Nal及びCH3-2-Nalから選択されるアミノ酸の基を表す。好ましくは、AA1 はＤ体である。
【００２６】
好ましくは、AA2 はCys及びHcyから選択されるアミノ酸の基を表す。
【００２７】
好ましくは、AA5 はLys、Lys(Ac)、Orn、 (CH3)2Lys、Dab及びDapから選択されるアミノ酸の基を表す。
【００２８】
好ましくは、一般式（Ｉ）で表される上記オクタペプチド化合物は下記：
H-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-Lys(Ac)5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2；
Ac-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-Lys(Ac)5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2；
H-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-Orn5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2；
H-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-(Me)2Lys5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2；
H-D-2-Nal1-シクロ(Hcy2-Tyr3-D-Trp4-Lys5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2；
Ac-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-Lys5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2；
CH3-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-Lys5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2；
H-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-Dab5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2；及び
H-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-Dap5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2；
又はこれらの化合物の 薬学的に許容される塩から選択される。
【００２９】
さらに優先的には、一般式（Ｉ）で表される上記オクタペプチド化合物は下記：
H-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-Orn5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2；
H-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-(Me)2Lys5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2；
H-D-2-Nal1-シクロ(Hcy2-Tyr3-D-Trp4-Lys5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2；及び
Ac-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-Lys5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2；
又はこれらの化合物の 薬学的に許容される塩から選択される。
【００３０】
より一層優先的には、一般式（Ｉ）で表される上記オクタペプチド化合物はH-D-2-Nal1-シクロ(Hcy2-Tyr3-D-Trp4-Lys5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2又はこの化合物の薬学的に許容される塩である。
【００３１】
本発明の主題はまた、先に定義した本発明の化合物を含む医薬である。
【００３２】
本発明の主題はまた、先に定義した本発明の化合物を含む医薬組成物であり、特に上記化合物が有効成分として用いられるものである。
【００３３】
本発明の主題はまた、先に定義した一般式（Ｉ）で表される化合物を有効成分とし、これを少なくとも１種類の薬学的に許容される賦形剤と共に含む、治療用組成物である。
【００３４】
本発明の主題はまた、先に定義した一般式（Ｉ）で表されるオクタペプチド化合物の、医薬製造への使用である。
【００３５】
本発明の主題はまた、前記医薬が成長ホルモン関連疾患から選択される病状の治療を目的とする、先に定義した使用である。
【００３６】
最後に、本発明は、先に定義した化合物の医薬製造への使用に関し、優先的には、ソマトスタチン受容体がひとつ（又は複数）関与する病状例えば先端巨大症、神経内分泌性腫瘍、糖尿病性網膜症、血管、関節及び皮膚の治療；優先的には、先端巨大症又は神経内分泌性腫瘍の治療を目的とした医薬に関する。
【００３７】
本発明の治療用組成物は固形、例えば粉末、顆粒、錠剤、ゼラチンカプセル、リポソーム又は坐薬であってよい。適当な固体基剤は、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖類、ラクトース、デキストリン、澱粉、ゼラチン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリジン及びワックスであってよい。
【００３８】
本発明の治療用組成物はまた、液体、例えば溶液、エマルジョン、懸濁液又はシロップであってもよい。適当な液体基剤は、例えば、水、有機溶媒例えばグリセロール又はグリコール、並びに水中での比率を様々に変化させたこれらの混合物であってよい。
【００３９】
本発明の組成物の投与は、局所的、経口、非経口経路にて、筋肉内注射、皮下注射等によって行なうことができる。
【００４０】
特に定義しない限り、本願で用いられるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の一般的な専門家によって通常理解されている用語と同義である。
【００４１】
下記の実験の部は上記の手順を説明することを目的としており、何ら本発明の範囲を制限すると考えるべきでない。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
実験の部
１．合成の説明
１．１  材料と装置
ＨＰＬＣ−ＭＳ： 
本システムは、インライン型の脱気装置とオートインジェクタシステム(2767)とを備えたウォーターズ(Waters：商標名)2525である。溶出は０．１％蟻酸の存在下、水とアセトニトリルの勾配溶出で行う。溶出種の検出は、ダイオードアレイ(2996)、蒸発光散乱検出器(ELSD)及び質量分析器を用いて行う（後述）。カラムは、逆相タイプのグラフト型Ｃ１８カラムX-Bridge（１００×４．６ｍｍ）、粒径３．５μｍ、ポアサイズ１３．５ｎｍである。流量は１ｍＬ／分、注射量は２０μＬとする。
【００４３】
質量分析器は、ウォーターズMicromass ZQである。イオン化はエレクトロスプレー法で行い、イオン源温度１２０℃、コーン電圧２０Ｖとする。試料は０．３ｍＬ／分で連続供給する。本機は四重極型（モデルZQ2000）である。スペクトルは、Mass Lynx 4.0 ソフトウェアを用い、有機分子についてはm/z 100-1000、ペプチドについてはm/z 100-2000の範囲内で記録する。
【００４４】
分取ＨＰＬＣ：
ペプチド精製には２つのシステムを使用する。一方は前述のシステムで、逆相タイプのグラフト型Ｃ１８カラムX-Bridge（１５０×１９ｍｍ）、粒径３．５μｍ、ポアサイズ１３．５ｎｍを備える。流速は１７ｍＬ／分である。他方はウォーターズ2545である。これは上述のシステムに似ているが、質量分析器を備えていない。カラムは、逆相タイプのグラフト型Ｃ１８カラムThermo Hypurity（２１．２×２５０ｍｍ）である。溶出は０．１％ＴＦＡの存在下、水−アセトニトリル混合液を用い、流速２０ｍＬ／分で行う。これら２つの分取ＨＰＬＣシステムは、最適条件を決定した後、アイソクラティック・モードで運用する。
【００４５】
ＮＭＲ 分析：
核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析は、ブルカー社製 Advance400 Ultrashield を用いて行う。分析周波数は、プロトンＮＭＲの場合４００ＭＨｚ、13Ｃ-ＮＭＲの場合１００ＭＨｚとする。スペクトルは室温で記録し、化学シフトはｐｐｍ、結合定数はＨｚで表す。多重度の表記は以下の通り：ｓ＝一重線、ｂｓ＝ブロード一重線、ｄ＝二重線、ｂｄ＝ブロード二重線、ｄｄ＝二重線の二重線、ｄｄｄ＝二重線の二重線の二重線、ｔ＝三重線、ｂｔ＝ブロード三重線、ｑ＝四重線、ｄｑ＝四重線の二重線、ｍ＝多重線。
【００４６】
ＨＲＭＳ分析：
高精度質量分析は、英マイクロマス社の飛行時間型質量分析装置（ＬＣＴ）に、ポジティブモードのエレクトロスプレーイオン源(Z-spray)を装備して行う。質量測定の正確を期するため、サンプルと並行して外部標準物質を連続的に導入する(LocksprayTM構成)。今回用いる外部標準物質はロイシンエンケファリンで、m/z = 578.2591で[M+Na]+イオンを生成する。本機の分解能は６５００、理論質量からの偏差は５ｍＤa未満である。本機はMasslynx 4.0（登録商標）ソフトウェアで動作する。 自動サンプルチェンジャー(英ウォーターズ社Alliance 2795)を備えた HＰＬＣ装置を通じ、水に溶解した試料を５０％水−５０％メタノール移動相中へ流速２００μＬ／分で注入する。注入量は１０μＬ、キャピラリー電圧は２８００Ｖ、コーン電圧は４０Ｖ、イオン源温度は１２０℃、脱溶媒和温度は２５０℃、脱溶媒和ガス（窒素）の流速は５００リットル／時、コーンガス（窒素）流量は２０リットル／時、ＴＤＣストップ電圧は１００ｍＶである。
【００４７】
ＩＲ分光分析：
ペプチドの赤外（ＩＲ）スペクトルは、減衰全反射法およびフーリエ変換法により記録する。装置は45°N ZnSe ATRモジュールを装備したブルカー社IFS 66で、窒素を用いた連続パージを行う。結晶上にサンプル溶液１０μＬを被着させ、４ｃｍ-1の分解能で３０回スキャンを行った結果を平均した。OPUS 4.2 ソフトウェアを使用し、水に由来する信号を未補正スペクトルから差し引く。
【００４８】
凍結乾燥機：
使用する凍結乾燥機はクリスト社製 Alpha 2-4 LDplusで、ベーンポンプに接続して約１５μｂａｒの真空度を達成する。本機に接続する前に、水溶液サンプルは液体窒素中で凍結する。
【００４９】
顕微鏡観察：
フィリップス社製CM-20 型透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ：加速電圧２００ｋＶ）、及びフィールドエミッションガン搭載のLeo-Gemini型走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用する。
【００５０】
１．２使用する試薬
合成ペプチド樹脂はメルクバイオサイエンス(Merck Biosciences)社(シュバルバッハ、ドイツ)の一部門であるノババイオケム(Novabiochem)社の製品である。イオン交換樹脂はバイオラッド・ラボラトリーズ(Bio-Rad Laboratories)社(ハーキュリーズ、米国)の製品である。
【００５１】
使用する水は、ミリポア(Millipore)社 (ビラリカ、米国)のMilli-Q Plus 交換システムを用いた２回脱イオン水である。これら合成と精製に用いる溶媒は、特に断らない限りアルドリッチ(Aldrich)社とVWR社 (ウェストチェスター、米国)からの購入品であり、精製せずに用いる。
【００５２】
アミノ酸は、バケム(Bachem)社 (ヴァイルアムライン、ドイツ)、フルカ(Fluka)社 (ブッフス、スイス)、アクロスオーガニクス(Acros Organics)社 (ヘール、ベルギー)、及びNeoMPS (ストラスブール、フランス)からの購入品である。
【００５３】
アミノ酸市販品：
Fmoc-Lys(Ac)-OH、アセチル-β -(2-ナフチル)-D-アラニン、Fmoc-Orn(Boc)-OH、Fmoc-Homocys(Trt)-OH、Fmoc-Dab(Boc)-OH、Fmoc-Dap(Boc)-OHの各アミノ酸は市販品である。
【００５４】
アミノ酸N-メチル-Boc-D-2-Nal-OHの合成
【化４】
2013534920.tif 000006
Boc-D-2-Nal-OH ３．２ｇ（１０ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ２０ｍＬに溶解した溶液を、ＮａＨ（鉱物油中、濃度６０％）２．４ｇ（６０ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ８０ｍＬに懸濁させた懸濁液に添加し、０℃で放置する。反応液を０℃で１５分間撹拌し、続いてＭｅＩ を１０ｍＬ（１６０ｍｍｏｌ）滴下する。反応を０℃で４時間進行させ、さらにＭｅＩを５ｍＬ添加し、反応液を室温に戻し、一晩撹拌する。飽和ＮＨ4Ｃｌ溶液２０ｍＬを用いて０℃で反応液を中和し、続いてＴＨＦとＭｅＩとをロータリーエバポレータで蒸発除去する。ヘキサン１００ｍＬを添加し、水相を回収し、ヘキサン１００ｍＬで２回洗浄する。酢酸エチル１００ｍＬを添加し、水相を酸性（ｐＨ２）に調整し、続いて酢酸エチル１００ｍＬを用いて水相から３回抽出を行う。有機相を集め、Ｎａ2ＳＯ4を用いて乾燥させた後、濾過し、濾液を蒸発させる。得られた生成物をヘキサン／酢酸エチル混合液から結晶化させる（収量１．８２ｇ、収率５５％）。
1H-NMR (CD3OD): δ 1.22 (S, 6H, tBu), 1.27 (s, 3H, tBu), 2.72 (s, 3H, Me), 3.42-3.49 (m, 1H), 4.78 (dd, 1H, J = 4.1, J = 11.5), 4.97 (dd, 1H, J = 4.7, J = 11.5), 7.37-7.46 (m, 3H), 7.67 (s, 1H), 7.76-7.82 (m, 3H)
MS (ESI): m/z 330.0 [M+H]+
【００５５】
アミノ酸Fmoc Nε,εジメチルリジンの合成 (Int. J. Peptide Res. Ther. (2006), 12, 187-193による)
【化５】
2013534920.tif 000007
Fmoc-Lys-OH 塩酸塩２０３ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）をエタノール１０ｍＬに溶解し、この溶液を０℃とする。 ホルムアルデヒド（３７％溶液）８６μＬ（１．１ｍｍｏｌ）を添加し、この混合物を０℃に１５分間保つ。続いてＮａＢＨ3ＣＮ ９５ｍｇ(１．５ｍｍｏｌ)を添加し、反応を０℃に１５分間継続し、さらにホルムアルデヒド８６μＬ及びＮａＢＨ3ＣＮ ９５ｍｇを加え、反応を０℃で４時間継続した。１Ｎ ＨＣｌ溶液１０ｍＬを添加し、生成した沈殿を濾別し、濾液を乾燥させ、得られた化合物をクロマトグラフィー (溶出液は９５／５ ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ)で精製し、目的の化合物１１０ｍｇを得る（ごく少量のトリメチル化リジンを含む）。
1H-NMR (CD3OD): δ 1.4-1.9 (m, 6H); 2.7 (s, 6H); 2.91 (t, J = 7.7, 2H); 4.02 (dd, J = 5.3, J = 7.1, 1H); 4.19 (t, J = 6.8, 1H); 4.22-4.35 (m, 2H); 7.28- 7.32 (m, 2H); 7.38 (t, J = 7.2, 2H); 7.63-7.72 (m, 2H); 7.79 (d, J = 7.5, 2H).
MS (ESI) m/z: 397.0 [M+H]+
【００５６】
１．３  オクタペプチド化合物の調製
１．３．１  ペプチド合成の一般的な手順
ペプチド合成は下記の図１に示す如く、大きく４段階で行われる。
2013534920.tif 000008
【００５７】
１／樹脂の膨潤：
樹脂４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−フルオレニルメトキシカルボニル−アミノメチル）−フェノキシアセタミド−ノルロイシル−（４−メチル）−ベンズヒドリルアミン−ポリスチレン系ジビニルベンゼン (Rink Amide MBHA) を、ガラス焼結フィルター付きシリンジに（一端をネジキャップ、他端をストッパーで封止）に入れ、シリンジをＮＭＰで満たし、この混合物を穏やかに撹拌しながら１時間保つ。その後、溶媒を濾化により除く。
【００５８】
２／アミノ酸の結合：
カップリング反応を利用して、上記各アミノ酸を所望の順序で結合させる。アミノ酸（２当量）を１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、２．２当量）及びＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ、２．２当量）と共に試験管内のＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ、５ｍＬ／樹脂１ｇ） に投入し、数分間撹拌する。これを上記樹脂を入れた容器に移す。この反応混合物を１時間３０分撹拌し、濾過する。ここで、ダブルカップリング法を用いる。反応が約５０％進行した所で反応混合物を濾過し、新しい試薬を再投入することで、反応速度と最終生成物の純度を最適化する。第２段階では、新たなカップリング反応を進行させるために、新たなアミノ酸の保護基を外す。この脱保護では、ＮＭＰ（２０％ｖ／ｖ）中でピペリジン処理（５ｍＬ／樹脂１ｇ）を３回行い、続いてＮＭＰ（１０ｍＬ／樹脂１ｇ）で３回洗浄する。 反応をモニターするため、初回の処理に対応する濾液 を５μＬ、続く２回の処理に対応する濾液を各１０μＬ、並びに初回の洗浄液の計４サンプルをピペリジン２ｍＬに加え、ＵＶ吸光度を２９０ｎｍで測定する。各段階の間で、ＮＭＰ（１０ｍＬ／樹脂１ｇ）を用いて樹脂を３回ずつ洗浄する。つまり、この組み立て段階は、アミノ酸のカップリング反応と、Fmoc基の脱保護の２段階からなり、ペプチド配列が完成するまで反復される。
【００５９】
３／ジスルフィド架橋の形成：
配列を組み立てたら、ジスルフィド架橋を形成してこのペプチドを環化させる必要がある。このジスルフィド架橋は、ＮＭＰ（５ｍＬ／樹脂１ｇ）中で二ヨウ素１当量を用いた処理を各々２分間、３分間、及び５分間の計３回行うことで形成する。続いて樹脂を ＤＣＭで５回、ＮＭＰで５回洗浄し、樹脂中に取りこまれている過剰量のヨウ素を除去する（１０ｍＬ／樹脂１ｇ）。
【００６０】
４／開裂：
上記樹脂を開裂により除去するため、ＮＭＰを用いて２回、メタノール（ＭｅＯＨ）を用いて２回、ジクロロメタン（ＤＣＭ）を用いて２回、及びジエチルエーテル（ＤＥＥ）を用いて２回（各１０ｍＬ／樹脂１ｇ）洗浄を行う。樹脂を真空下に１日放置する。開裂反応は、磁気撹拌子を入れたガラス製フラスコ中で進行させる。この反応混合物は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、１０ｍＬ／樹脂１ｇ）並びにトリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）及び水（３％及び２％ｖ／ｖ）から成る。反応物を室温で４時間撹拌する。反応物をガラス焼結フィルターで濾過し、固体をＴＦＡで２回洗浄する。続いて濾液を蒸発させ、粘稠な白色の液体を得る。この液体を水−アセトニトリル１：１混合液に溶解し、凍結乾燥する。かかる段階を経た後のペプチドは、トリフルオロ酢酸塩となっている。
【００６１】
１．３．２  精製
精製は分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で行う。固定相はＣ18アルキル鎖がグラフトされていることから「逆相」と称される。移動相は水とアセトニトリルの一定比率 (イソクラティック) の混合物で構成され、グラフトされずに固定相内に残留している可能性があるシラノールを中和する目的でＴＦＡ０．１％又は蟻酸１％を含む。
【００６２】
ペプチドは、分取ＨＰＬＣに注入するために水−アセトニトリル混合物に溶解する必要がある。先ず少量で溶解度を検討する。これにより、アセトニトリルの最適比率とペプチドの最大量とを決定することができる。アセトニトリルの比率は出来るだけ低く、ペプチド濃度は高く、得られる溶液は透明、というのが理想的な条件である。
【００６３】
精製後、精製ペプチドを含む各画分を合わせ、真空下で蒸発させる。次に、大量の溶媒を用いてこれを蒸発させることにより純ペプチドを回収し、凍結乾燥する。このペプチドは通常、トリフルオロ酢酸塩として存在し、物理化学分析を行う前に酢酸塩に変換する必要がある。
【００６４】
１．３．３  イオン交換
イオン交換は強アニオン交換型樹脂(バイオラッド社、AG1-X8)を用いて行う。この樹脂２４５ｍｇをまず１．６Ｎ酢酸１０ｍＬで３回洗浄し、次に０．１６Ｍ酢酸１０ｍＬで３回洗浄する。次に、ＴＦＡ塩であるペプチドを水４ｍＬに溶解し、容器を１時間、回転撹拌する。次に、この液体を濾過し、樹脂を蒸留水１ｍＬで２回洗浄する。各画分を合わせ、凍結乾燥する。
【実施例】
【００６５】
１．４  実施例
これらの生成の特性を、前述の当業者に公知の常法にしたがって決定した。
【００６６】
実施例1：  H-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-Orn5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2
上記の開環ペプチドは、前述の手順にしたがい、カップリング、Fmoc （９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）保護基の除去、次のアミノ酸のカップリング、という一連の段階を固体支持体上において下記の順序で行うことにより得られる： Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、次にFmoc-L-Cys(Trt)-OH、次にFmoc-L-Val-OH、次にFmoc-L-Orn(Boc)-OH、次にFmoc-D-Trp-OH、次にFmoc-L-Tyr(tBu)-OH、次にFmoc-L-Cys(Trt)-OH、そして最後にBoc-β-(2-ナフチル)-D-Ala-OH。
【００６７】
上記化合物は、化合物H-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-Orn5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2を得るための前述の手順にしたがい、ジスルフィド架橋の形成により環化させ、続いて樹脂を開裂させ、精製し、最終的に酢酸塩の形で得られる。
HPLC: rt = 8.65分
HRMS (H2O) m/z = 1082.46102 [M+H]+ (計算値  1082.45866)
1H NMR (400 Mhz, D2O): δ 0.3-0.44 (m, 1H); 0.49-0.64 (m, 1H); 0.76 (d, J = 8, 3H); 0.78(d, J = 7, 3H); 1-1.12 (m, 1H); 1.06 (d, J = 6.5, 3H); 1.45-1.57 (m, 1H); 1.94-2.07 (m, 1H); 2.31 (dd, J = 4, J = 14.7, 1H); 2.36-2.5 (m, 3H); 2.54-2.68 (m, 2H); 2.77 (d, J = 7.5, 2H); 2.82-2.95 (m, 2H); 3.19 (dd, J = 9, J = 13.6, 1H); 3.33 (dd, J = 6, J = 13.6, 1H); 3.74(dd, J = 4, J = 10.8, 1H); 3.82 (d, J = 9.6, 1H); 4.04-4.14 (m, 2H); 4.17 (d, J = 3.8, 1H); 4.24 (dd, J = 6, J = 8.7, 1H); 4.49 (t, J = 7.5, 1H); 4.61-4.76 (m, 3H); 6.69 (d, J = 8.5, 2H); 6.97 (d, J = 8.5, 2H); 6.97-7.05 (m, 2H); 7.1 (bt, J = 7.5, 1H); 7.29-7.45 (m, 4H); 7.65(bs, 1H); 7.72-7.81 (m, 3H)。
【００６８】
実施例２：  H-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-Nε,ε-ジメチル-Lys5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2 (H-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-(Me)2Lys5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2)
上記の開環ペプチドは、前述の手順にしたがい、カップリング、Fmoc（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）保護基の除去、次のアミノ酸のカップリング、という一連の段階を固体支持体上において下記の順序で行うことにより得られる：Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、次にFmoc-L-Cys(Trt)-OH、次にFmoc-L-Val-OH、次にFmoc-(Me)2Lys-OH、次にFmoc-D-Trp-OH、次にFmoc-L-Tyr(tBu)-OH、次にFmoc-L-Cys(Trt)-OH、そして最後にBoc-β-(2-ナフチル)-D-Ala-OH。
【００６９】
上記化合物は、化合物 H-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-Nε,ε-ジメチル-Lys5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2を得るための前述の手順にしたがい、ジスルフィド架橋の形成により環化させ、続いて樹脂を開裂させ、精製し、最終的に酢酸塩の形で得られる。
HPLC: rt = 10.48分 
HRMS (H2O) m/z = 1124.50620 [M+H]+ (計算値  1124.50561)
1H NMR (400 Mhz, D2O): δ -0.03-0.1 (m, 1H); 0.17-0.31 (m, 1H); 0.76 (d, J = 7.2, 3H); 0.78 (d, J = 7, 3H); 0.97-1.18 (m, 3H); 1.07 (d, J = 6.3, 3H); 1.38-1.51 (m, 1H); 1.95-2.07(m, 1H); 2.25-2.33 (m, 1H); 2.36-2.69 (m, 5H); 2.63 (s, 6H); 2.78 (bd, J = 7.3, 2H); 2.78-2.95 (m, 2H); 3.13 (dd, J = 9.5, J = 12.8, 1H); 3.27 (dd, J = 5.9, J = 13.3, 1H); 3.7(dd, J = 2.1, J = 9.9, 1H); 3.81 (d, J = 9.6, 1H); 4.05-4.16 (m, 3H); 4.18 (d, J = 3.6, 1H); 4.5 (t, J = 7.5, 1H); 4.64-4.73 (m, 3H); 6.7 (d, J = 8.4, 2H); 6.95-7.05 (m, 4H); 7.1 (t, J = 7.5, 1H); 7.33 (t, J = 8.4, 2H); 7.36-7.45 (m, 3H); 7.63 (bs, 1H); 7.70-7.75 (m, 1H); 7.77 (d, J = 8.6, 1H)。
【００７０】
実施例３：  N-メチル-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-Lys5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2 (CH3-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-Lys5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2)
上記の開環ペプチドは、前述の手順にしたがい、カップリング、Fmoc（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）保護基の除去、次のアミノ酸のカップリング、という一連の段階を固体支持体上において下記の順序で行うことにより得られる： Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、次にFmoc-L-Cys(Trt)-OH、次にFmoc-L-Val-OH、次にFmoc-L-Lys(Boc)-OH、次にFmoc-D-Trp-OH、次にFmoc-L-Tyr(tBu)-OH、次にFmoc-L-Cys(Trt)-OH、そして最後にBoc-N-メチル-D-(2-ナフチル)-Ala-OH。
【００７１】
上記化合物は、化合物 N-メチル-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-Lys5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2を得るための前述の手順にしたがい、ジスルフィド架橋の形成により環化させ、続いて樹脂を開裂させ、精製し、最終的に酢酸塩の形で得られる。
HPLC: rt = 8.83分
HRMS (H2O) m/z = 1110.48991 [M+H]+ (計算値  1110.48996)
1H NMR (400 Mhz, D2O): δ -0.05-0.1 (m, 1H); 0.2-0.32 (m, 1H); 0.76 (d, J = 6.4, 3H); 0.78(d, J = 6.4, 3H); 0.94-1.16 (m, 3H); 1.08 (d, J = 6.4, 3H); 1.35-1.48 (m, 1H); 1.96-2.09 (m, 1H); 2.16 (dd, J = 3.8, J = 14.8, 1H); 2.35 (dd, J = 9.3, J = 14.8, 1H); 2.39-2.64(m, 4H); 2.52 (s, 3H); 2.69-2.96 (m, 4H); 3.16 (dd, J = 10.2, J = 13.3, 1H); 3.38(dd, J = 5, J = 13.3, 1H); 3.65 (dd, J = 3.5, J = 11, 1H); 3.78 (d, J = 9.8, 1H); 4.06-4.19 (m, 3H); 4.22 (d, J = 4, 1H); 4.5 (t, J = 7.6, 1H); 4.55-4.75 (m, 3H); 6.68 (d, J = 8.5, 2H); 6.95-7.03 (m, 3H); 7.09 (t, J = 7.2, 1H); 7.29 (dd, J = 1.3, J = 8.4, 1H); 7.33 (d, J = 8.2, 1H); 7.37-7.44 (m, 3H); 7.62 (bs, 1H); 7.68-7.73 (m, 1H); 7,75-7.8 (m, 2H)。
【００７２】
実施例４：  H-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-Dab5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2
上記の開環ペプチドは、前述の手順にしたがい、カップリング、Fmoc（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）保護基の除去、次のアミノ酸のカップリング、という一連の段階を固体支持体上において下記の順序で行うことにより得られる： Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、次にFmoc-L-Cys(Trt)-OH、次にFmoc-L-Val-OH、次にFmoc-Dab(Boc)-OH、次にFmoc-D-Trp-OH、次にFmoc-L-Tyr(tBu)-OH、次にFmoc-L-Cys(Trt)-OH、そして最後にBoc-β-(2-ナフチル)-D-Ala-OH。
【００７３】
上記化合物は、化合物H-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-Dab5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2を得るための前述の手順にしたがい、ジスルフィド架橋の形成により環化させ、続いて樹脂を開裂させ、精製し、最終的に酢酸塩の形で得られる。
HPLC: rt = 8.68分
HRMS (H2O) m/z = 1068.44355 [M+H]+ (計算値  1068.44301)
1H NMR (400 Mhz, D2O): 0.76 (d, J = 6.7, 3H); 0.77 (d, J = 6.7, 3H); 1.06 (d, J = 6.4, 3H); 1.21-1.36 (m, 1H); 1.37-1.47 (m, 1H); 1.78-1.9 (m, 2H); 1.96-2.08 (m, 1H); 2.34 (dd, J = 3.8, J = 14.8, 1H); 2.46 (dd, J = 9.7, J = 14.8, 1H); 2.54-2.68 (m, 2H); 2.78 (d, J = 7.4, 2H); 2.91 (d, J = 8.3, 2H); 3.16 (dd, J = 9.2, J = 13.5, 1H); 3.29 (dd, J = 5.6, J = 13.5, 1H); 3.82 (d, J = 9.8, 1H); 3.86 (dd, J = 3.2, J = 11, 1H); 4.03-4.13 (m, 2H); 4.13-4.21 (m, 2H); 4.49 (t, J = 7.4, 1H); 4.63-4.78 (m, 3H); 6.69 (d, J = 8.4, 2H); 6.97 (d, J = 8.5, 2H); 6.99-7.06 (m, 2H); 7.11 (t, J = 7.5, 1H); 7.35 (dd, J = 1, J = 8.5, 1H); 7.37 (d, J = 8.2, 1H); 7.38-7.44 (m, 2H); 7.65 (bs, 1H); 7.70-7.82 (m, 3H)。
【００７４】
実施例５：  H-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-Dap5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2
上記の開環ペプチドは、前述の手順にしたがい、カップリング、Fmoc（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）保護基の除去、次のアミノ酸のカップリング、という一連の段階を固体支持体上において下記の順序で行うことにより得られる：Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、次にFmoc-L-Cys(Trt)-OH、次にFmoc-L-Val-OH、次にFmoc-Dap(Boc)-OH、次にFmoc-D-Trp-OH、次にFmoc-L-Tyr(tBu)-OH、次にFmoc-L-Cys(Trt)-OH、そして最後にBoc-β-(2-ナフチル)-D-Ala-OH。
【００７５】
上記化合物は、化合物 H-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-Dap5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2を得るための前述の手順にしたがい、ジスルフィド架橋の形成により環化させ、続いて樹脂を開裂させ、精製し、最終的に酢酸塩の形で得られる。
HPLC: rt = 8.65分
HRMS (H2O) m/z = 1054.42780 [M+H]+ (計算値  1054.42736)
1H NMR (400 Mhz, D2O): 0.76 (d, J = 6.7, 3H); 0.77 (d, J = 6.7, 3H); 1.06 (d, J = 6.4, 3H); 1.21-1.36 (m, 1H); 1.37-1.47 (m, 1H); 1.78-1.9 (m, 2H); 1.96-2.08 (m, 1H); 2.34 (dd, J = 3.8, J = 14.8, 1H); 2.46 (dd, J = 9.7, J = 14.8, 1H); 2.54-2.68 (m, 2H); 2.78 (d, J = 7.4, 2H); 2.91 (d, J = 8.3, 2H); 3.16 (dd, J = 9.2, J = 13.5, 1H); 3.29 (dd, J = 5.6, J = 13.5, 1H); 3.82 (d, J = 9.8, 1H); 3.86 (dd, J = 3.2, J = 11, 1H); 4.03-4.13 (m, 2H); 4.13-4.21 (m, 2H); 4.49 (t, J = 7.4, 1H); 4.63-4.78 (m, 3H); 6.69 (d, J = 8.4, 2H); 6.97 (d, J = 8.5, 2H); 6.99-7.06 (m, 2H); 7.11 (t, J = 7.5, 1H); 7.35 (dd, J = 1, J = 8.5, 1H); 7.37 (d, J = 8.2, 1H); 7.38-7.44 (m, 2H); 7.65 (bs, 1H); 7.70-7.82 (m, 3H)。
【００７６】
実施例６：  H-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-N-Ac-Lys5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2 (H-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-Lys(Ac)5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2)
上記の開環ペプチドは、前述の手順にしたがい、カップリング、Fmoc（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）保護基の除去、次のアミノ酸のカップリング、という一連の段階を固体支持体上において下記の順序で行うことにより得られる：Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、次にFmoc-L-Cys(Trt)-OH、次にFmoc-L-Val-OH、次にFmoc-Lys(Ac)-OH、次にFmoc-D-Trp-OH、次にFmoc-L-Tyr(tBu)-OH、次にFmoc-L-Cys(Trt)-OH、そして最後にBoc-β-(2-ナフチル)-D-Ala-OH。
【００７７】
上記化合物は、化合物 H-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-N-Ac-Lys5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2を得るための前述の手順にしたがい、ジスルフィド架橋の形成により環化させ、続いて樹脂を開裂させ、精製し、最終的に酢酸塩の形で得られる。
HPLC: rt = 10.58分
HRMS (H2O) m/z = 1138.4886 [M+H]+ (計算値 1138.4854)
1H NMR (400 Mhz, D2O/CD3CN): δ 0.45-0.59 (m, 1H); 0.62-0.73 (m, 1H); 1.10 (d, J = 6.7, 3H); 1.13 (d, J = 6.7, 3H); 1.3-1.45 (m, 3H); 1.36 (d, J = 6.4, 3H);1.7-1.82 (m, 1H); 2.07(s, 3H); 2,35-2.45 (m, 1H); 2.87 (d, J = 6.9, 1H); 3-3.28 (m, 4H); 3.54 (d, J = 7.1, 1H); 4.08 (dd, J = 3.1, J = 10.7, 1H); 4.19 (d, J = 9.4, 1H); 4.37-4.47 (m, 2H); 4.5 (d, J = 3.4, 1H); 4.75-4.8 (m, 2H); 5.25-5.29 (m, 2H); 6.99 (d, J = 8.4, 2H); 7.26-7.39 (m, 5H); 7.63 (d, J = 8.1, 1H); 7.67-7.76 (m, 4H); 8 (s, 1H); 8.07-8.12 (m, 3H)。
【００７８】
実施例７：  N-Ac-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-N-Ac-Lys5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2 (Ac-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-Lys(Ac)5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2)
上記の開環ペプチドは、前述の手順にしたがい、カップリング、Fmoc（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）保護基の除去、次のアミノ酸のカップリング、という一連の段階を固体支持体上において下記の順序で行うことにより得られる：Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、次にFmoc-L-Cys(Trt)-OH、次にFmoc-L-Val-OH、次にFmoc-Lys(Ac)-OH、次にFmoc-D-Trp-OH、次にFmoc-L-Tyr(tBu)-OH、次にFmoc-L-Cys(Trt)-OH、そして最後にAc-β-(2-ナフチル)-D-Ala-OH。
【００７９】
上記化合物は、化合物 N-Ac-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-N-Ac-Lys5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2を得るための前述の手順にしたがい、ジスルフィド架橋の形成により環化させ、続いて樹脂を開裂させ、精製し、最終的に酢酸塩の形で得られる。
HPLC: rt = 12.75分
HRMS (H2O) m/z = 1202.4800 [M+Na]+ (計算値  1202.4779)
1H NMR (400 Mhz, D2O/CD3CN): δ 0.28-0.40 (m, 1H); 0.41-0.58 (m, 1H); 0.86 (d, J = 6.7, 3H); 0.89 (d, J = 6.7, 3H); 1.13 (d, J = 6.4, 3H); 1.55-1.65 (m, 1H); 1.81 (s, 3H); 1.85 (s, 3H); 2.16-2.22 (m, 1H); 2.73-2.94 (m, 7H); 3-3.07 (m, 1H); 3.29 (dd, J = 5.7, J = 13.8, 1H); 3.89 (dd, J = 3.1, J = 11, 1H); 4 (d, J = 9.3, 1H); 4.13-4.22 (m, 2H); 4.24 (d, J = 3.8, 1H); 4.53 (dd, J = 6.9, J = 8, 1H); 4.77 (dd, J = 5.7, J = 8.9, 1H); 5.22 (dd, J = 4.7, J = 9.6, 1H); 5.29 (dd, J = 7.3, J = 7.9, 1H); 6.69 (d, J = 8.4, 2H); 6.99-7.11 (m, 5H); 7.36 (d, J = 8, 1H); 7.41-7.49 (m, 4H); 7.73-7.82 (m, 4H)。
【００８０】
実施例８：  H-D-2-Nal1-シクロ(HomoCys2-Tyr3-D-Trp4-Lys5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2 (H-D-2-Nal1-シクロ(Hcy2-Tyr3-D-Trp4-Lys5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2)
上記の開環ペプチドは、前述の手順にしたがい、カップリング、Fmoc（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）保護基の除去、次のアミノ酸のカップリング、という一連の段階を固体支持体上において下記の順序で行うことにより得られる：Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、次にFmoc-L-Cys(Trt)-OH、次にFmoc-L-Val-OH、次にFmoc-L-Lys(Boc)-OH、次にFmoc-D-Trp-OH、次にFmoc-L-Tyr(tBu)-OH、次にFmoc-L-HomoCys(Trt)-OH、そして最後にBoc-β-(2-ナフチル)-D-Ala-OH。
【００８１】
上記化合物は、化合物H-D-2-Nal1-シクロ(HomoCys2-Tyr3-D-Trp4-Lys5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2を得るための前述の手順にしたがい、ジスルフィド架橋の形成により環化させ、続いて樹脂を開裂させ、精製し、最終的に酢酸塩の形で得られる。
HPLC: rt = 10.27分
HRMS (H2O) m/z = 1132.4719 [M+Na]+ (計算値  1132.4749)
1H NMR (400 Mhz, D2O): δ 0.29-0.45 (m, 1H); 0.46-0.56 (m, 1H); 0.79 (d, J = 6.7, 3H); 0.82 (d, J = 6.7, 3H); 1.08 (d, J = 6.4, 3H); 1.15-1.63 (m, 5H); 1.92-2.06 (m, 1H); 2.49-2.62 (m, 2H); 2,65-2.91 (m, 5H); 3.08 (dd, J = 11.1, J = 12.8, 2H); 3.21 (s, 1H); 3.37(dd, J = 5.1, J = 13, 2H); 3.74 (d, J = 9.3, 2H); 3.92 (dd, J = 4.1, J = 9.6, 2H); 4.5-4.21 (m, 6H); 4.25 (d, J = 3.9, 2H); 4.42 (dd, J = 6.5, J = 8.8, 2H); 4.56 (dd, J = 5.3, J = 9.3, 2H); 6.68 (d, J = 8.5, 2H); 6.91-7.12 (m, 5H); 7.29-7.44 (m, 5H); 7.62 (s, 1H); 7.75-7.83 (m, 3H)。
【００８２】
実施例９：  N-Ac-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-Lys5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2 (Ac-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-Lys5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2)
上記の開環ペプチドは、前述の手順にしたがい、カップリング、Fmoc（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）保護基の除去、次のアミノ酸のカップリング、という一連の段階を固体支持体上において下記の順序で行うことにより得られる：Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、次にFmoc-L-Cys(Trt)-OH、次にFmoc-L-Val-OH、次にFmoc-L-Lys(Boc)-OH、次にFmoc-D-Trp-OH、次にFmoc-L-Tyr(tBu)-OH、次にFmoc-L-Cys(Trt)-OH、そして最後にAc-β-(2-naphthyl)-D-Ala-OH。
【００８３】
上記化合物は、化合物N-Ac-D-2-Nal1-シクロ(Cys2-Tyr3-D-Trp4-Lys5-Val6-Cys7)-Thr8-NH2を得るための前述の手順にしたがい、ジスルフィド架橋の形成により環化させ、続いて樹脂を開裂させ、精製し、最終的に酢酸塩の形で得られる。
HPLC: rt = 10.77分
HRMS (H2O) m/z = 1138.4884 [M+H]+ (計算値 1138.4854)
1H NMR (400 Mhz, D2O): δ 0.29-0.40 (m, 1H); 0.42-0.58 (m, 1H); 0.81 (t, J = 6.7, 6H); 1.11 (d, J = 6.3, 3H); 1.1-1.23 (m, 2H); 1.44-1.55 (m, 1H); 1.9 (s, 3H); 1.95-2.03 (m, 1H); 2.37-2.45 (m, 2H); 2.47-2.62 (m, 2H); 2.65-2.78 (m, 3H); 2.87-2.99 (m, 2H); 3.07-3.2 (m, 2H); 3.8 (dd, J = 3.5, J = 10.5, 1H); 3.86 (d, J = 9.1, 1H); 4.13-4.22 (m, 3H); 4.47 (t, J = 7.4, 1H); 4.59-4.78 (m, 2H); 6.69 (d, J = 8.4, 2H); 6.94 (d, J = 8.4, 2H); 7.03-7.16 (m, 3H); 7.34-7.46 (m, 5H); 7.63 (s, 1H); 7.75-7.8 (m, 3H)。
【００８４】
２．本発明の化合物の検討
２．１ オクタペプチド化合物のソマトスタチン受容体に対する活性
２．１．１  ソマトスタチン受容体に対するペプチドの親和性の測定 プロトコール
ソマトスタチン受容体に対する本発明の化合物の親和性を、トランスフェクションされたＣＨＯ-Ｋ１細胞の膜調製物に対する [125I-Tyr11]ＳＲＩＦ−１４の結合の阻害を測定することにより決定する。
【００８５】
ソマトスタチン受容体の各サブタイプを安定して発現しているＣＨＯ-Ｋ１細胞を０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて集め、 ５００ｇ、４℃で５分間遠心する。得られたペレットをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に再懸濁し、 ５００ｇ、４℃で５分間遠心する。得られたペレットを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）に再懸濁し、５００ｇ、４℃で５分間遠心する。 細胞を超音波処理により破壊し、３９，０００ｇで１０分間遠心する。得られたペレットを ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）に再懸濁し、一定分量をタンパク分析用に取り出し、残部を５０，０００ｇで１０分間遠心する。 この最終ペレットに回収される膜を−８０℃保存する。
【００８６】
ソマトスタチン受容体の各サブタイプに対する[125I-Tyr11]ＳＲＩＦ−１４ (Perkin Elmer) の結合の競争阻害の測定を、９６ウェルのポリプロピレンプレートを用いる二重反復測定にて行った。５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝培地（ｐＨ７．４）中で、細胞膜（タンパク５〜２０μｇ／ウェル）を[125I-Tyr11]ＳＲＩＦ−１４（０．０５〜０．１ｎＭ）と共に３７℃で５０〜９０分間インキュベートする（条件は、受容体のサブタイプに依存する）。上記緩衝培地は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）０．２％、ＭｇＣｌ2  ５ｍＭ、トラシロール２００ＫＩＵ／ｍＬ、バシトラシン０．０２ｍｇ／ｍＬ、フェニルメチルスルホニルフルオリド０．０２ｍｇ／ｍＬを含む。
【００８７】
結合した[125I-Tyr11]ＳＲＩＦ−１４を遊離の[125I-Tyr11]ＳＲＩＦ−１４から濾過により分離する。濾過にはFiltermate 96 (Perkin Elmer社)を用い、予め 0.1% ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含浸させたGF/C ガラス繊維プレートと(Perkin Elmer社、Unifilter)を通過させる。フィルターを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ 緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて４℃で洗浄し、洗液中の放射能をカウンター(Perkin Elmer社、TopCount)を用いて測定する。
【００８８】
XLfit 4.2 (IDBS社) ソフトウェアを用い、コンピュータによるデータの非線形回帰分析を行う。
【００８９】
２．１．２  結果
実施例１、２、３、４、５、６、７、８及び９は、５μＭ以下のソマトスタチン受容体サブタイプ２に対する親和性を有する。
実施例１、２、３、４、６、７、８及び９は、７００ｎＭ以下のソマトスタチン受容体サブタイプ２に対する親和性を有する。
実施例１、２、３、８及び９は、６ｎＭ以下のソマトスタチン受容体サブタイプ２に対する親和性を有する。
実施例１、２、３、４、５、６、８及び９は、５μＭ以下のソマトスタチン受容体サブタイプ５に対する親和性を有する。
実施例１、２、３、８及び９は、５００ｎＭ以下のソマトスタチン受容体サブタイプ５に対する親和性を有する。
実施例３、８及び９は、１０ｎＭ以下のソマトスタチン受容体サブタイプ５に対する親和性を有する。
実施例１、２、３、４、５、８及び９は、１μＭ以下のソマトスタチン受容体サブタイプ３に対する親和性を有する。
実施例２、３、８及び９は、２００ｎＭ以下のソマトスタチン受容体サブタイプ３に対する親和性を有する。
実施例８及び９は、１００ｎＭ以下のソマトスタチン受容体サブタイプ３に対する親和性を有する。
【国際調査報告】
2013534920.tif 000012
2013534920.tif 000013
2013534920.tif 000014
2013534920.tif 000015