(57)【要約】  ストレス耐性植物またはその前駆体を生産する方法である。該方法では、（ｉ）１つまたは複数の親植物を、相対湿度、水可用性、周期的な乾燥、栄養、太陽光、風、温度、ｐＨ、外来化学物質、塩類等の化学的毒素、植食、予防用化学物質、肥料、細菌／真菌／ウィルス感染等の病原体攻撃および害虫被害に関与する好適ではない条件から選択される１つまたは複数のストレス条件にかけ、（ｉｉ）前記１つまたは複数の親植物から子孫を形成する方法である。前記子孫の、相対湿度、水可用性、周期的な乾燥、栄養、太陽光、風、温度、ｐＨ、外来化学物質、塩類等の化学的毒素、植食、予防用化学物質、肥料、細菌／真菌／ウィルス感染等の病原体攻撃および害虫被害に関与する好適ではない条件から選択される１つまたは複数のストレス条件に対する耐性が、１つまたは複数の親植物との比較において増強している。また、該方法により生産された植物またはその前駆体、および、該方法により生産された植物またはその前駆体を特定するためのアッセイが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレス耐性植物またはその前駆体を生産する方法であり、
（ｉ）１つまたは複数の親植物を、相対湿度、水可用性、周期的な乾燥、栄養、太陽光、風、温度、ｐＨ、外来化学物質、塩類等の化学的毒素、植食、予防用化学物質、肥料、細菌／真菌／ウィルス感染等の病原体攻撃および害虫被害に関与する好適ではない条件から選択される１つまたは複数のストレス条件にかけ、
（ｉｉ）前記１つまたは複数の親植物から子孫を形成する方法であって、
前記子孫の、相対湿度、水可用性、周期的な乾燥、栄養、太陽光、風、温度、ｐＨ、外来化学物質、塩類等の化学的毒素、植食、予防用化学物質、肥料、細菌／真菌／ウィルス感染等の病原体攻撃および害虫被害に関与する好適ではない条件から選択される１つまたは複数のストレス条件に対する耐性が、１つまたは複数の親植物との比較において増強している方法。
【請求項２】
子孫が、植物成体またはその前駆体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
子孫が種子または栄養繁殖体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
子孫が、１つまたは複数の親植物によって経験された１つまたは複数のストレス条件に対し耐性を持つ、上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
子孫が、１つまたは複数の親植物によって経験されていない１つまたは複数のストレス条件に対し耐性を持つ、上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
１つまたは複数の親植物が、低い相対湿度、周期的な乾燥およびボトリチス属（例えば灰色カビ病菌）への感染から選択される１つまたは複数のストレス条件にかけられ、および／または前記子孫の、低い相対湿度、周期的な乾燥およびボトリチス属（例えば灰色カビ病菌）への感染から選択される１つまたは複数のストレス条件に対する耐性が増強している、上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
１つまたは複数の親植物が、高等植物、顕花植物、および双子葉植物から選択される、上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
１つまたは複数の親植物が作物植物である、上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
１つまたは複数の親植物が真正双子葉類に属し、好ましくは、１つまたは複数の親植物がアブラナ科またはアオイ科の一員であり、好ましくは、１つまたは複数の植物がシロイヌナズナ科植物およびカカオ科植物から選択される、例えばシロイヌナズナおよびチョコレートノキから選択される、上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
子孫の生物量、花数、種子数および／または種子重量が、収穫の時期を問わず、１つまたは複数の親植物と比べて増加している、上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記請求項のいずれかによる方法で生産される植物またはその前駆体。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれかによる方法で生産される植物またはその前駆体を特定するためのアッセイであり、前記アッセイにおいて、ゲノムのメチル化の１つまたは複数の部位の有無について、前記方法によって生産されたと考えられる植物またはその前駆体を解析し、前記１つまたは複数の部位でのメチル化の有無が、前記方法で生産された植物またはその前駆体の指標となるアッセイ。
【請求項１３】
SPEECHLESSまたはFAMA遺伝子もしくはいずれかの遺伝子の機能的同族体に、あるいは約１０ｋｂ以内におけるゲノムのメチル化の存在が、低い相対湿度および／または周期的な乾燥に耐性のある植物またはその前駆体の指標となる、請求項１２に記載のアッセイ。
【請求項１４】
相対湿度、水可用性、周期的な乾燥、栄養、太陽光、風、温度、ｐＨ、外来化学物質、塩類等の化学的毒素、植食、予防用化学物質、肥料、細菌／真菌／ウィルス感染等の病原体攻撃および害虫被害に関与する好適ではない条件から選択される１つまたは複数のストレス条件に対し耐性のある植物またはその前駆体を特定するためのアッセイであり、前記アッセイにおいて、ゲノムのメチル化の１つまたは複数の部位の有無について、前記方法によって生産されたと考えられる植物またはその前駆体を解析し、前記１つまたは複数の部位でのメチル化の有無が、前記植物が前記１つまたは複数のストレス条件に対し耐性を持つという指標になるアッセイ。
【請求項１５】
SPEECHLESSまたはFAMA遺伝子もしくはいずれかの遺伝子の機能的同族体に、あるいは１０ｋｂ以内におけるゲノムのメチル化の存在が、低い相対湿度および／または周期的な乾燥に対し耐性を持つ植物またはその前駆体の指標となる、請求項１４に記載のアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、１つまたは複数のストレスに対する植物および／またはその子孫の耐性を増強させる方法に関し、特に、ストレス耐性植物およびその種子／繁殖体の形成に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的には好適でないとされる環境条件に対し耐性を持つ植物を提供できれば、非常に望ましい。例えば、発芽して、自身の親よりも乾燥その他の水ストレスに対し高い耐性を持つ農作植物になる種子は、特に有用であるといえよう。さらに、水の利用が限られるが故に現時点で収穫高が制限されている気候で用いるための耐性種子／繁殖体を生産できれば望ましい。
【発明の概要】
【０００３】
本発明の１形態によると、ストレス耐性植物またはその前駆体の生産方法が提供され、その方法は、（ｉ）１つまたは複数の親植物を、相対湿度、水可用性、周期的な乾燥、栄養、太陽光、風、温度、ｐＨ、外来化学物質、塩類等の化学的毒素、植食、予防用化学物質、肥料、細菌／真菌／ウィルス感染等の病原体攻撃および害虫被害に関与する好適ではない条件から選択される１つまたは複数のストレス条件にかけ、（ｉｉ）前記１つまたは複数の植物から子孫を形成する方法であって、前記子孫が、相対湿度、水可用性、周期的な乾燥、栄養、太陽光、風、温度、ｐＨ、外来化学物質、塩類等の化学的毒素、植食、予防用化学物質、肥料、細菌／真菌／ウィルス感染等の病原体攻撃および害虫被害に関与する好適ではない条件から選択される１つまたは複数のストレス条件に対する耐性が、１つまたは複数の親植物との比較において強化される方法、である。
【０００４】
子孫が、植物成体もしくは、種子または栄養繁殖体等その前駆体であるのが好ましい。
【０００５】
特筆すべきことに、親植物を１つまたは複数のストレス条件にかけることによって、その親植物から生産される種子または栄養系の子孫が、同じ１つまたは複数のストレス条件に対し増強した耐性を発揮し得ることが見出されている。また、その子孫が、１つまたは複数の親植物によって経験されたものとは異なる１つまたは複数のストレス条件に対し耐性を有し得ることも分かっている。例えば、わずかに低い相対湿度というストレスにさらされたシロイヌナズナ科の植物は、それでも、周期的な乾燥ストレスに対する耐性が増強する（以下の実施例２を参照）。したがって、一実施態様では、子孫が、１つまたは複数の親植物によって経験されていない１つまたは複数のストレス条件に対し耐性を持つことが好ましい。
【０００６】
ここで、「好適ではない(unfavorable)」という用語は、問題になっている植物についてであって、相対的な用語であると理解していただきたい。例えば、通常は中程度または高い湿度で育つ植物にとっては、低い相対湿度は「好適ではない」ので、ストレス条件とみなされるであろう。例えば、食用穀物の場合、収量すなわち収穫高または持続可能な収穫の減少につながる条件であれば、「好適ではない」とみなされるであろう。
【０００７】
１つまたは複数のストレス条件が、低い相対湿度、周期的な乾燥、およびボトリチス属(Botrytis)（例えば灰色カビ病菌(Botrytis cynerea)）感染から選択されるのが好ましい。
【０００８】
１つまたは複数の親植物が、半制御条件、より好ましくは制御条件下で、１つまたは複数のストレス条件にかけられるのが好ましい。
【０００９】
１つまたは複数の親植物が、高等植物、顕花植物、および双子葉植物から選択されることが好ましい。
【００１０】
１つまたは複数の親植物が作物植物であるのが好ましい。
【００１１】
１つまたは複数の親植物が真正双子葉類に属すことが好ましい。１つまたは複数の親植物がアブラナ科またはアオイ科の一員であることが好ましい。１つまたは複数の植物がシロイヌナズナ科植物およびカカオ科植物から、例えばシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)およびチョコレートノキ(Theobroma cacao)から選択されるのが好ましい。
【００１２】
１つまたは複数の親植物が顕花植物（モクレン科）であり、１つまたは複数のストレス条件が、収穫高におそらくは影響を与えるのが好ましい。例として、水可用性に関連するストレス（低い相対湿度、または周期的な乾燥）、毒性化学物質(塩等)、外来化学物質または病原菌（例えばボトリチス属）や害虫への暴露等が挙げられる。
【００１３】
本発明の方法が、１つまたは複数の親植物によって経験された／されなかった１つまたは複数のストレス条件下で、より高い収穫を実現できる植物を生産するためのものであるのが好ましい。例えば、本発明の方法によって生産された植物によって、収穫の時期を問わず、生物量、花数、種子数、種子重量の生産量が増加するのが好ましい。
【００１４】
上記のように、本発明の方法は、種子または栄養繁殖体といった、ストレス耐性植物の前駆体の生産に用いることができる。例えば、本発明の一形態では、以下の工程を含む方法が提供される。
（ｉ）１つまたは複数の親植物を、相対湿度、水可用性、周期的な乾燥、栄養、太陽光、風、温度、ｐＨ、外来化学物質、塩類等の化学的毒素、植食、予防用化学物質、肥料、細菌／真菌／ウィルス感染等の病原体攻撃および害虫被害に関与する、好適ではない条件から選択される１つまたは複数のストレス条件にかけ、
（ｉｉ）前記１つまたは複数の親植物から子孫用前駆体を形成する方法であって、前記前駆体が、相対湿度、水可用性、周期的な乾燥、栄養、太陽光、風、温度、ｐＨ、外来化学物質、塩類等の化学的毒素、植食、予防用化学物質、肥料、細菌／真菌／ウィルス感染等の病原体攻撃および害虫被害に関与する好適ではない条件から選択される１つまたは複数のストレス条件に対する耐性が、１つまたは複数の親植物との比較において増強し、および／または前記のストレス条件下で１つまたは複数の親植物よりも高い収穫高を挙げる植物に生育可能な方法である。
【００１５】
前駆体が種子または插穂のような栄養繁殖体であるのが好ましい。例えば、前駆体が、低い相対湿度および／または周期的な乾燥に対する耐性を持つ植物に生長可能なシロイヌナズナ科種子であってもよい。別の例では、前駆体が、低い相対湿度および／または周期的な乾燥に対する耐性を持つ植物に育つことのできるカカオ（チョコレートノキ(Theobroma cacao L.)）の插穂または体細胞胚(somatic embryo)である。さらに別の例としては、ボトリチス属に対する抵抗性の優れた植物に生長可能なシロイヌナズナ科の種子が挙げられる。
【００１６】
本発明の方法において、２体の親植物を交配する（すなわち他家受粉）か、単独の親植物を自家受粉させるのが好ましい。別の例では、１つまたは複数のストレス条件にさらされたことのある１体の親植物から栄養繁殖体を作成する。
【００１７】
本発明の方法において、単独の親の遺伝子型から例えば自家受精によって、または処理済の親植物１体を第２の（未処理の）親植物と他家受精させることによって、種子の子孫を形成するのが好ましい。
【００１８】
親植物を１つまたは複数のストレス条件にかける際に、その植物の一部または全身を１つまたは複数のストレス条件にかけるのが適切であろう。例えば、低い相対湿度の場合は、植物の全身を暴露してもよいであろう。ボトリチス属に感染させる場合であれば、葉の１枚またはその葉の一部を暴露してもよいであろう。
【００１９】
本発明の別の形態では、ここで記載されている方法により生産された植物またはその前駆体が提供されている。
【００２０】
本発明はしたがって、１つまたは複数のストレス条件に対する耐性を持つ植物またはその前駆体を提供する。
【００２１】
本発明の別の形態は、ここに記載されている方法で生産される植物またはその前駆体を特定するためのアッセイに関し、前記アッセイでは、ゲノムのメチル化の１つまたは複数の部位の有無について、前記方法によって生産されたと考えられる植物またはその前駆体を解析し、前記１つまたは複数の部位でのメチル化の有無が、前記方法で生産された植物またはその前駆体の指標となる。
【００２２】
該方法が、低い相対湿度および／または周期的な乾燥に対し耐性を持つ植物（例えばシロイヌナズナ科植物）またはその種子を生産するためのものであり、SPEECHLESSもしくはFAMA遺伝子またはそのいずれかの遺伝子の機能的同族体に、あるいはその約１０ｋｂ以内、好ましくは約５ｋｂ以内、好ましくは約２ｋｂ以内にメチル化状態が存在すれば、ここに記載されている方法により生産された植物または種子における後天的なストレス耐性の指標となることが好ましい。
【００２３】
本発明の他の形態は、植物またはその前駆体を特定するためのアッセイを提供するものであって、そのような植物またはその前駆体は、相対湿度、水可用性、周期的な乾燥、栄養、太陽光、風、温度、ｐＨ、外来化学物質、塩類等の化学的毒素、植食、予防用化学物質、肥料、細菌／真菌／ウィルス感染等の病原体攻撃および害虫被害に関与する好適ではない条件から選択される１つまたは複数のストレス条件に対し耐性を持ち、該アッセイでは、ゲノムDNAメチル化部位が１つまたは複数あるかどうかについて植物またはその前駆体を解析し、その場合に前記１つまたは複数の部位でのメチル化の有無が、前記１つまたは複数のストレス条件に対し耐性を持つ植物またはその前駆体の指標となる。SPEECHLESSもしくはFAMA遺伝子またはそのいずれかの遺伝子の機能的同族体に、あるいは約１０ｋｂ以内、好ましくは約５ｋｂ以内、好ましくは約２ｋｂ以内にゲノムのメチル化があれば、低い相対湿度および／または周期的な乾燥に対し耐性を持つ植物またはその前駆体があるという指標であることが好ましい。
【００２４】
本発明によると、ある植物の１つまたは複数の親を同一または異なる１つまたは複数のストレス（ここでは調整ストレスとも呼ぶ）に予め（受精／接合体形成の前に）さらすことによって、該植物の子孫のストレス応答を変化させる方法が提供されることが分かるであろう。
【００２５】
ここに詳細に記載しているように、幾つかの実施態様では、子孫におけるストレス応答の変化は、親によって経験された異なるタイプのストレスに関連している。すなわち、調整ストレスへの暴露が、子孫におけるもう一方のストレスへの応答の変化を引き起こす。
【００２６】
その子孫が親植物のクローン繁殖体であることが好ましい。言い方を変えれば、ストレス応答における変化が、調整ストレスにさらされた親植物のクローン繁殖体中で誘発されるのが好ましい。
【００２７】
親植物のいずれか一方または双方が１つまたは複数の調整ストレスにさらされたことのある作物植物の種子が、前記種子由来の植物のストレス耐性を向上させる目的で生産されるのが好都合であろう。
【００２８】
本発明の方法にしたがって、１つまたは複数の調整ストレスにさらされたことのある植物を、例えば、１つまたは複数のストレス条件に対する耐性が変化（好ましくは向上）している挿穂、マイクロプロパゲーション、カルス媒介分げつ(callus-mediated adentitious shooting)または体細胞性胚形成(somatic embryogenesis)等の栄養繁殖体の生産に用いることができれば、さらに好都合であろう。
【００２９】
以下に、発明の特に好ましい例を挙げる。
【００３０】
親のいずれかまたは双方が低相対湿度ストレスにさらされたことのある植物の種子が、前記種子由来の植物の、水ストレス（例として、低相対湿度ストレスおよび周期的な乾燥が挙げられるが、これらに限定されない）に対する耐性を変化させる（好ましくは向上させる）目的で生産されるのが好ましい。
【００３１】
親のいずれかまたは双方が低相対湿度ストレスにさらされたことのある植物の種子が、前記種子由来の植物の、低相対湿度ストレスに対する耐性を変化させる（好ましくは向上させる）目的で生産されるのが好ましい。
【００３２】
親のいずれかまたは双方が低相対湿度ストレスにさらされたことのある真正双子葉類植物の種子が、前記種子由来の植物の、水ストレス（例として、低相対湿度ストレスおよび周期的な乾燥が挙げられるが、これらに限定されない）に対する耐性を向上させる目的で生産されるのが好ましい。
【００３３】
親のいずれかまたは双方が低相対湿度ストレスにさらされたことのある真正双子葉類植物の種子が、前記種子由来の植物の、低相対湿度ストレス（例として、低相対湿度ストレスおよび周期的な乾燥が挙げられるが、これらに限定されない）に対する耐性を変化させる（好ましくは向上させる）目的で生産されるのが好ましい。
【００３４】
親のいずれかまたは双方が低相対湿度ストレスにさらされたことのあるアブラナ科またはアオイ科植物の種子が、前記種子由来の植物の、水ストレス（例として、低相対湿度ストレスおよび周期的な乾燥が挙げられるが、これらに限定されない）に対する耐性を向上させる目的で生産されるのが好ましい。
【００３５】
親のいずれかまたは双方が低相対湿度ストレスにさらされたことのあるアブラナ科またはアオイ科植物の種子が、前記種子由来の植物の、低相対湿度ストレスに対する耐性を変化させる（好ましくは向上させる）目的で生産されるのが好ましい。
【００３６】
低相対湿度ストレスにさらされたことのある植物が、水ストレス（例として、低相対湿度ストレスおよび周期的な乾燥が挙げられるが、これらに限定されない）に対する耐性が変化した（好ましくは向上した）栄養繁殖体を生産するために用いられるのが好ましい。
【００３７】
低相対湿度ストレスにさらされたことのある植物が、低相対湿度ストレスに対する耐性が変化した（好ましくは向上した）栄養繁殖体を生産するために用いられるのが好ましい。
【００３８】
親のいずれかまたは双方が生物的ストレス（例として病原体としての真菌への暴露が挙げられるが、これに限定されない）にさらされたことのある植物の種子が、前記種子由来の植物の、同じ生物的ストレスに対する抵抗性を変化させる（好ましくは向上させる）目的で生産されるのが好ましい。
【００３９】
親のいずれかまたは双方が生物的ストレス（例として病原体としての真菌への暴露が挙げられるが、これに限定されない）にさらされたことのある真正双子葉類植物の種子が、前記種子由来の植物の、同じ生物的ストレスに対する抵抗性を変化させる（好ましくは向上させる）目的で生産するのが好ましい。
【００４０】
親のいずれかまたは双方が生物的ストレス（例として病原体としての真菌への暴露が挙げられるが、これに限定されない）にさらされたことのあるアブラナ科またはアオイ科植物の種子が、前記種子由来の植物の、同じ生物的ストレスに対する抵抗性を変化させる（好ましくは向上させる）目的で生産されるのが好ましい。
【００４１】
親のいずれかまたは双方がボトリチス属真菌にさらされたことのある植物の種子が、前記種子由来の植物の、ボトリチス属真菌感染に対する抵抗性を変化させる（好ましくは向上させる）目的で生産されるのが好ましい。
【００４２】
親のいずれかまたは双方がボトリチス属真菌にさらされたことのある真正双子葉類植物の種子が、前記種子由来の植物の、ボトリチス属真菌感染に対する抵抗性を変化させる（好ましくは向上させる）目的で生産されるのが好ましい。
【００４３】
親のいずれかまたは双方がボトリチス属真菌にさらされたことのあるアブラナ科またはアオイ科植物の種子が、前記種子由来の植物の、ボトリチス真菌感染に対する抵抗性を変化させる（好ましくは向上させる）目的で生産されるのが好ましい。
【００４４】
その親が（上記で特定したような）調整ストレスにさらされたことのある植物（好ましくは作物植物）のストレス応答の変化によって、収穫の時期を問わず、生物量生産、花数、種子数、種子重量が変化する（好ましくは増強する）のが好ましい。
【００４５】
水ストレスへの耐性が変化した植物を、ここに記載されている方法に従って生産し、SPEECHLESSおよび／またはFAMA遺伝子（またはその機能的同族体）をコードするDNA（重亜硫酸塩(bisulfate)処理を含むがこれに限定されない標準的な技術を用いての測定後、SangerまたはNextGenシーケンシング、高解像溶融解析またはメチル捕捉およびpPCRが行われる）ならびに／あるいは前記遺伝子に直ちにフランキングするDNA配列のメチル化ステータス(methylation status)の変化にしたがって検出するのが好ましく、その場合に、フランキング配列はスタートコドンまたはストップコドンの＜１０ｋｂであるのが好ましく、より好ましくは＜３ｋｂ、最も好ましくは＜１．５ｋｂである。
【００４６】
以下、本発明の実施態様を、図面を参照しつつ説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１Ａ】図１に、低相対湿度処理＊親のディファレンシャル気孔指数（SI）がSPCHおよびFAMA遺伝子の発現と正に相関し、SPCHのDNAメチル化とは逆相関していることを示す。野生型（WT）SIは、低相対湿度（LRH）では減少する。しかし、LRHで生長したLRH処理親の後代子孫では、SIは上昇する（ANOVA:処理P=0.001、親P=<0.001、交互作用P=<0.001）。この効果は、メチルトランスフェラーゼ変異種metlおよびdrml/2では無効化する。示されているデータは、ｎ＝４８である１実験についての中間値（±s.e.m.）である。SPCHおよびFAMA気孔路(stomata pathway)遺伝子の発現も、LRHの親では減少するが後代子孫ではそうではない。metl、drml/2またはsiRNA変異種rdr6においても、SPCHやFAMAの発現はLRHにより有意に減少しない。示されているデータは、それら自身のコントロール（ｘ軸の０ライン）に対するLRHでの各標的について３回繰り返されたアッセイからの[mRNAs]における中間パーセンテージ増加である。重亜硫酸塩変換後の標本の配列は、SPCH（ａ−コンセンサス第１世代）およびFAMA（ｄ−コンセンサス第１世代）におけるLRHでのデ・ノボシトシンメチル化を示すものであり、これは、metlまたはdrml/2変異種（ｂとｅ）では再現され(reproduce)ない。このメチル化はSPCHでは遺伝するが、LRHで生長したLRH生長親の後代子孫（ａ−コンセンサス第２世代）では喪失している。SPCH座（TAIR v. 9.0）でのLRHストレスによる特異的メチル化のパターンは、三世代にわたり示される。Ｇ１植物（第１暴露）植物は、LRHストレス下の全コンテクスト(context)においてデ・ノボメチル化している(4.25 kbでの追加７８部位)。これらの植物の後代子孫（Ｇ２）はメチル化の大部分を受け継いでいる（LRH−コントロール）が、LRHストレスに戻される(return)（LRH−LRH）と、実質的に脱メチル化する。次の世代（Ｇ３、LRH−コントロール−コントロール）では、上流調節領域(regulatory region)および転写開始部位においても、受け継がれたメチル化の喪失が生じるが、この領域は２回目のストレスへの暴露中に（LRH−LRH−コントロール）遺伝的に再メチル化される。図１Ｅの影付エリア（破線部）は、クロロゾーム５で、メチル捕捉＋qPCRによって21584.3kから21589.3kへメチル化された領域を示す。横棒(bars)は、重亜硫酸塩転換後の４５４シーケンスによりメチル化した塩基対である（グリーン＝ＣＧ、ブルー＝ＣＨＧ、ピンク＝ＣＨＨコンテクスト)。黒い横線は、正常な(successful)４５４シーケンシングの程度および方法を示す。箱内の領域は、重亜硫酸塩転換後のサブクローニングによって塩基対解像度(resolution)でアッセイされたものであり、そこからの代表的な配列をａ−ｃに示す。
【図１Ｂ】（同上）
【図１Ｃ】（同上）
【図１Ｄ】（同上）
【図１Ｅ−１】（同上）
【図１Ｅ−２】（同上）
【図２Ａ】図２は、後代子孫の（Ａ）寸法（収穫時の乾燥重量（ｇ））および（Ｂ）生産性（生産された種子数）も、親のストレス経験に影響されることを示す。LRHストレスにさらされた親の子孫は、LRH処理およびコントロール条件のいずれにおいても寸法および生産性が増加した（ANOVA:処理P= <0.001、親P-<0.001、相互作用P= 0.39）。この効果は、４回繰り返された実験で暴露された親（繰り返された各試験でｎ＝４８）からの一連の(in a line)テストされた後代子孫植物全てに特徴的であった。
【図２Ｂ】（同上）
【図３Ａ】図３Ａと３Ｂは、LRH処理＊親の実験におけるsiRNAsの濃度を示す。24 nt siRNAsの総濃度は、１回目のLRHへの暴露では増加し、LRH処理親の子孫をLRHストレス下で育成すると減少した。SPCHの転置因子上流(transposable elements upstream)（ゲノムにおいて）でのsiRNAsの誘発は、遺伝子発現と逆相関し、SPCHのメチル化と正に相関した。
【図３Ｂ】（同上）
【図４】図４は、４日間乾燥させた後の葉緑素含有率についての低相対湿度（LRH）での予備調整の効果を示すものである。LRHストレスにさらされた親の子孫は、LRH処理においても、周期的な乾燥にかけられたときも、葉緑素含有量が増加した。
【図５】図５は、４日間乾燥させた後の乾燥重量で低相対湿度での植物に対する予備調整の効果を示すものである。LRHストレスにさらされた親の子孫は、LRH処理および周期的な乾燥にかけられた場合のいずれにおいても、最終的な乾燥重量が増加した。
【図６】図６は、先の世代に対し枯死しない程度の(non-lethal)接種を行うことによって灰色カビ病菌への抵抗性が増加することを示す。２世代目の植物を、灰色カビ病菌で処理した。写真は、Langsberg erectaでの接種から３日後の真菌感染に関与する病巣を示す。（Ａ）は非接種植物の子孫、（Ｂ）は接種植物の子孫である。矢印は、接種された葉を示す。（Ｃ）は非接種植物の子孫からの接種葉、（Ｄ）は接種植物の子孫からの接種葉を詳細に示す。
【図７】図７に、制限酵素MspIを用いての灰色カビ病菌の感染により誘発された全体的なメチル化変化の解析を示す。異なる５つのシロイヌナズナ遺伝子型（野生型−Laer、ならびにメチル化変異種：drml/2、chrl、cmt3-7およびkyp2)の、接種済み（菱形）および無菌(pathogen free)（円形）（各２４標本）からのDNAを、（CpHpGモチーフにおいてメチル化に対し感受性のある）MspI/EcoRI酵素の組み合わせを用いて制限処理した。処理間で顕著な相違は認められなかった。エラーバーは、標準的な偏差の計算値を示す。
【図８】図８に、制限酵素MspIを用いての灰色カビ病菌の感染によって誘発された全体的なメチル化変化の解析を示す。異なる５つのシロイヌナズナ遺伝子型（野生型−Laer、ならびにメチル化変異種：drml/2、chrl、cmt3-7およびkyp2）の、接種済み（菱形）、無菌（円形）（各２４標本）からのDNAを、（CpHpGおよびCpGモチーフにおいてメチル化に対し感受性のある）HpaII/EcoRI酵素の組み合わせを用いて制限した。野生型−Laerおよびkyp2遺伝子型については、処理間の相違は全く認められなかった。遺伝子型cmt3-7は、ボトリチス属に感染した標本と非感染の標本間で（顕著ではないが）若干の差が生じた。遺伝子型drm1/2およびchr1は、ボトリチス属の感染により誘発された顕著な全体的DNAメチル化を示した。エラーバーは、標準偏差の計算値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本発明は、１つまたは複数のストレス条件に耐性のある植物およびその前駆体を生産する方法に関する。特に本発明は、１つまたは複数の最適以下の(suboptimal)生育条件（ストレス）下に置かれたときに生き残り、生長および／または収穫可能な生産物を生産する能力が増強された種子および／または栄養繁殖体を生産する方法に関し、ここで最適以下の生育条件とは、「親の」植物および未処理の系統において生長、生存率、生物量、種子生産および／または収穫高（作物の場合）に重大な減少を引き起こすものである。
【００４９】
本発明で用いられている方法および本発明の具体例を以下に説明する。
【００５０】
本明細書中で、実施態様は、明細書の記載が明瞭かつ簡潔になるように記載されているが、実施態様が、本発明から離れることなく様々に組み合わせられたり区別されたりし得ることが意図されており、そのように解釈されるであろう。
【００５１】
本明細書中で、「〜で構成される／〜を含む("comprise"および"comprising")」は、「他のものと一緒に含む」と解釈されることとする。これらの用語は「それのみを含む(consists of only)」を意図するものではない。
【００５２】
本明細書中で、「約(about)」という用語は、プラスマイナス２０％、より好ましくはプラスマイナス１０％、さらに好ましくはプラスマイナス５％、最も好ましくはプラスマイナス２％を意味する。
【００５３】
本明細書において、「同族体(homolog)」という用語は、祖先が共通であるDNA配列に遡る第２の遺伝子に関与する遺伝子を意味するとしてもよい。この用語が、構造および進化の起点において別の種での遺伝子に類似している遺伝子を意味するものであってもよい。
【００５４】
本明細書において、「後代子孫(propagule)」という用語は、植物の繁殖を目的として用いることのできるあらゆる植物材料を意味する。無性生殖においては、後代子孫は、木質／半熟枝(semi-hardwood)／緑枝(softwood)の挿穂、葉の切片、またはその他あらゆる植物の部分であってもよい。
【００５５】
有性生殖における後代子孫は、種子または胞子である。マイクロプロパゲーション（無性生殖の１タイプ）ではその植物のどの部分を用いてもよいが、通常は、根および茎の先端または芽等、分裂の盛んな部分である。
【００５６】
本明細書において、「栄養繁殖体(vegetative propagule)」という用語は、生物学的種子以外の植物性材料を経由して伝わる単一の親植物のクローンの（すなわち、遺伝的に同一の）末裔である子孫を意味する。これは、通常は有性生殖の結果つまり２体以上の親植物の末裔である種子とは対照的である。
【００５７】
本明細書において、「耐性(tolerant)」という用語は、その子孫／栄養繁殖体が、親植物と比べて１つまたは複数のストレスに対する耐性が増大していることを意味する。この増加が統計的に顕著であることが好ましい。
【実施例】
【００５８】
実施例１: シロイヌナズナ科の子孫における低湿度ストレスに対する遺伝性応答
水ストレスの一形態（低相対湿度LRH）にさらされたシロイヌナズナ科の植物が、葉の気孔（孔）の数を減少させることによって短期間で応答し、それによって余分な量の水を失わず生き残ることが発見されている。結果としてできた植物は小型ではあるが生き残り、多少は結実する。しかしながら特筆すべきことに、これらの植物から採取された種子は、同一の条件に置かれたときに、より優れた能力を発揮する(perform better)。また、それらの植物は、より大型化しはるかに多くの種子を生産する。使用されるそれらの植物は近親交配されすぎているため、子孫が事実上親と遺伝的に全く同一である。よって、親植物にストレスを与えると、次の世代で子孫が同じストレスに対して予め適応させられることが、はっきり証明された。同様の現象が、他のストレス、すなわち寒さや熱のストレス（Whittle et al, 2009）、ＵＶ−Ｃ光（Molinier et al, 2006）および細菌等の病原体（Molinier et al, 2006）についてもみられる。ここに記載されている発明は、作物の商業的種子生産に特に適している。その上、適正なストレス条件下で商業用種子のロットを生産するために用いられる親クローン／個体群を育成するにあたっては、発芽時に同じストレスに適応する能力を増大させるために、その種子の後成プロファイル(epigenetic profiles)を事前にプログラミングする必要がある。重要なのは、そのような効果が多くの世代に渡って持続することなく急速に消滅することである。よって、本発明は、遺伝子コードを変えることなく植物生産を向上させる手段を提供する。
【００５９】
葉表面の気孔の密度および動作（開口）はいずれも、環境的な合図(cue)に大いに影響される。それらは共に、短時間（分〜時間）および長時間（季節〜寿命）規模で、水蒸気（ｇs）に対する葉の気孔コンダクタンス(stomatal conductance)を制御する。そのような可塑性(plasticity)のおかげで、植物は、光合成のために大気中の二酸化炭素（ＣＯ2）を捕捉することと蒸散による水の喪失を最小限にすることという相反する需要のバランスを取ることができ、水使用効果率（ｗｕｅ）は植物の一生を通して葉の気孔密度と逆相関する。気孔の発生の遺伝的規則については、我々の理解に近年進展があった。気孔の孔辺細胞の発生を支配する経路は、前表皮細胞(protoderm epidermal cell)が気孔を形成するという「デフォルト」の運命(fate)を伴うが、一連のパターニング遺伝子の発現が、気孔系統への参入(entry)（そして口辺細胞の形成）をブロックして、結果的に気孔密度を設定する。正のレギュレーターが気孔系統への参入および口辺細胞を形成する非対称性分裂(asymmetric division)を決定する。植物が、受け取った環境的合図に応答して保水性および炭素固定の可塑性を維持できるようにするメカニズムは余りはっきりしていない。その植物の一生の初期に経験された環境ストレスへの可塑的応答が、後に発生中、または精液形成中でさえも、同様のストレスを予期して順応的な調整を実現する可能性が調査された。
【００６０】
異なるレベルの周囲湿度に対する気孔経路の応答が解析された。シロイヌナズナ生態型Landsberg erectaまたはColumbiaを、常時低相対湿度（LRH；４５％±５）または実験用コントロール（６５％±５）湿度下で、種子から種子の収穫まで育成した。気孔度数（表皮細胞のパーセンテージとしての気孔指数）（SI）は、LRHストレスの影響を受けた（図１）。Landsberg erecta生態型では、繰り返し実施された各実験で、各回で大きな成果を伴って減少し（Cohen's d-test > 0.80）、wueは増加した。しかしながらLRH処理親の同質遺伝子的後代子孫では、後代子孫が同じLRHストレスにさらされたとき（LRH-LRH）、SIはそれ以上減少しなかった（図１）。Wueはそれ以上SIと相関することなく増加した。同様に、フィットネス（パラメータとして生物量および種子数を測定）は、最初の暴露世代でLRHストレスによって減少したが、LRH−LRH植物ではそうではなかった（図２）。ストレスを受けた植物が生育途中にコントロールＲＨに戻されると（LRH→コントロール）、SIはなおも減少し続け（２５％減、p=0.028）、ストレスを受けた植物がコントロール植物と交配されると（LRH×コントロール）コントロール植物からの雑種（コントロール×コントロール−LRH)と比較して、SIはLRHストレス下で（コントロール×コントロール−LRH)増加した(４０％増、P=<0.01）。全標本植物が同様に影響を受けた。
【００６１】
気孔経路における遺伝子用の座のDNAメチル化について、それが環境で特異的に規制(impose)されるか否かをみるため、調査が行われた。DNAメチル化の相違を、コントロール環境と比較するため、１１の気孔パターニングおよび形成遺伝子で、LRH下においてスクリーニングした（表１）。ＲＨ処理に関連した特異的メチル化が、SPEECHLESS（SPCH）およびFAMA遺伝子の調節(regulatory)領域および５’コーディング領域の両方で見つかった(表１)。SPCHおよびFAMA遺伝子は、転写因子と推定される(putative transcription factors)basic-Helix Loop Helix（bHLH）タンパク質をコードするパラログである。MUTEおよびその二量化パートナーICE1ならびにSCREAM2を備えた経路において、これらの遺伝子の発現は、前表皮細胞の気孔系統への参入を調節し、その後の、気孔の孔辺細胞形成で終結する非対称的・増幅性細胞分裂を制御する。SPCHはメリステモイド(meristemoid)を形成する非対称細胞分裂を開始することに必要であり、FAMAは孔辺母細胞の最終分裂を調節する。SPCHとFAMAはLRHにさらされた葉から、有意により多くメチル化された。転写因子遺伝子の５’領域でのメチル化はシロイヌナズナ科ゲノムでは稀であり、異常(aberrant)発現によって引き起こされるか、または同発現を引き起こす可能性がある。両方の遺伝子の発現はLRH条件下で抑制された。遺伝子発現は、DNAがLRH下でメチル化すると抑制され（３１〜５８％）（図１）、葉の表皮上の気孔数の減少と相関関係にあった。
【００６２】
【表１】
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【００６３】
気孔度数を調節する上でのメチル化の役割を、メチルトランスフェラーゼ変異種(methyltransferase mutant)を用いてさらに調査した。維持(maintenance)シトシンメチルトランスフェラーゼMET1用の変異種（減メチル化２DNA(met1)）では、SIはLRHで増加し、処理による特異的メチル化は、PSCHとFAMAの双方で減少した。SPCHの発現はLRH処理によってそれ以上減少することはなく、FAMA発現は増加した（図１）。Domain Rearranged Methyltransferase 1および2の二重変異種(drml/drm2)において、SIはLRHによって減少せず、FAMAの発現もなく、SPCH発現は増加し、処理によって特異的メチル化は検出されなかった（図１）。DOMAINS REARRANGED METHYLTRANSFERASE 2 (DRM2)は、シロイヌナズナ科でDNAをデ・ノボメチル化することが知られている今のところ唯一の酵素である。SPCHとFAMAのデ・ノボメチル化は、LRHストレスへの応答で生じた。SPCHとFAMA遺伝子座の断片の単一塩基解像配列(single base-resolution sequence)により、対称（CG）および非対称（Hが塩基であるCHH）のコンテクストでの処理による特異的メチル化が示された（図１）。野生型（WT）におけるLRH下での追加的非対称メチル化は、いずれの遺伝子座においても、drml/2植物で課されなかった（図１）。非CGメチル化は、DRM2およびタンパク質CHROMOMETHYLASE 3（CMT3）によって重複して維持された。我々はまた、cmt3変異種の応答についても検査を行い、それが、WT植物同様に、SI減少、発現減少、LRHにおけるメチル化の増加というように、LRHに応答させられることを発見した（データ提示無し）。FAMAのLRH誘発非対称メチル化は、cmt3植物で無効化された。２つの遺伝子間のこのような相違により、非対称メチル化のデ・ノボ確立(establishment)がFAMAでの応答には必要であるが、誘発されたメチル化のCG依存維持がSPCHの特異的な環境応答にとって、同程度に重要であり得ることが暗示された。
【００６４】
シロイヌナズナ科での遺伝子プロモーター配列の単方向性メチル化によるDRM-2媒介転写遺伝子サイレンシング(TGS)は、24 nt低分子干渉RNAs（siRNAs）によって指令される。21-22 nt二次siRNAsによる転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）もまた、転写された領域の双方向メチル化と関連する。観察されたDNAメチル化および物理的応答におけるsiRNA方向の調節を調査する目的で、RNA指令DNAメチル化（RdDM）用のある範囲の変異種を、コントロールおよびLRH環境で育成した。TGSでは、RDR2（rna依存rnaポリメラーゼ2）が、２本鎖短RNAの合成に必要である。PTGSの維持および他動性(transitivity)のいずれもRDR6を必要とし標的遺伝子の転写に依存している。ダイサー様RNAIIIタンパク質は、手始めにRDR2産生RNAに作用するDCL3およびRDR6産生RNAに作用するDCL4を用いて、dsRNAまたはヘアピンRNAを加工する(process)。しかしながら、単一のdcl変異種に４つのシロイヌナズナ科DCLsによる若干の重複および代償性プロセシングが存在する。本当のrdr2またはdcl3変異種は、いずれもLRHストレス下で発芽しなかった。どちらの遺伝子も発現され（データは示されず）、トータル小型RNA量がWTと比べて増加し、24 nt siRNAは、極低いレベルではあったが実生に存在した（図３）。コントロールの処理では、興味深いことに、rdr2とdcl3変異種双方の気孔度数が（それらのバックグラウンド生態型Columbiaに比べて）高かった（データは示されず）。このことにより、siRNAがその経路のいずれかのポイントで気孔形成の抑制に必要とされるかもしれないことが示唆される。SPCHもFAMAも、drm1/2同様rdr2での非対照的塩基において、比較的非メチル化の状態を維持し（図１）、FAMAの発現は、先の観察を裏付けるように増加した。いずれの処理でも21 nt siRNAsはdcl4植物に存在したが、rdr6では測定可能なレベルではなかった（データは示されず）。LRH誘発メチル化は、rdr6では全体的に減少したが、SPCHまたはFAMAの対称または非対称コンテクストのいずれにおいても無効化されなかった（図１）。SPCHとFAMA両方の発現はrdr6で増加し（図１、先の結果を裏付ける）、SIはWTコントロールとLRH下の両方で増加した。これらのデータは、環境ストレス下でSPCHとFAMAがいずれもRdDMの標的であることを証明するものであり、両方の座がTGSおよびPTGSの対象になり得ることを暗示するものである。
【００６５】
シロイヌナズナのハイスループットシーケンシングデータからの小型RNAの読取値(reads)は、FAMA遺伝子の上流３００ｂｐ内に位置する７個の小型RNAを示す（TAIR 9 http://gbrowse.arabidopsis.orgにアクセス）。これらの小型RNAの発現はFAMAと共に定量化され、驚くべきことに、rdr2植物においてFAMAの発現が増加した場合、FAMAの発現と正に相関した（P=0.014, R2 0.97）。SPCHの上流（および未知のタンパク質については予測(predicted)177bp遺伝子At5g53205）は、42小型RNAsと427bp分散反復領域内で40bpタンデムリピートに対応するローリングカーブ型(rolling-curve-type)ヘリトロンファミリートランスポゾンのクラスターである。これらのような小型トランスポゾンは、サイレンシング用のDRM1/2を介してRdDMに優先的に依存すると考えられる。SUPPRESSOR OF drm1 drm2 cmt3（SDC）によりコードされたＦボックスタンパク質の７個のタンデムリピートおよびFWAの転写開始部位周辺でタンデムダイレクトリピートから生じる(arising)RdDMについて示されているように、転移性エレメント（TEs）を越えて拡大しSPCHの転写に影響を及ぼした非CGメチル化を、これらの小型RNAが指令可能か否かが仮定された。SPCHの発現を、これらのsiRNAのサブセットと共に測定した。それは、これらsiRNAsの発現が増加調節されSPCHがLRHでメチル化されたときにSPCHが減少調節(downregulate)されるように逆相関する（P=0.004, R2 0.87)ことが判明した。LRHストレスに暴露されると、SPCH座のTEs上流に対応する24 nt siRNAsは誘発され、SPCHの調節領域および遺伝子領域まで拡大したDNAメチル化をアッセイした。
【００６６】
次に、LRHにさらされた単独親(single parents)からの同質遺伝的後代子孫におけるSPCHおよびFAMAのメチル化について、それが遺伝子発現およびSIに相関するかどうかみるために検査を行った。LRH-コントロール後代子孫は、SPCHについてはコーディング領域および非コーディング領域で親のメチル化ステータス(methylated status)を保持し(retain)(図１)、同様に抑制された発現を呈示した。したがって、SPCH座のメチル化は遺伝性であると結論付けられた。一方、SPCHのメチル化ステータスはLRH-LRH後代子孫では喪失した。そのためこの遺伝子は非メチル化されかつ過剰発現(hyper-express)された（図１）。Drm 1/2後代子孫（LRH-コントロール）は、非メチル状態のままであった（表２）。WTとは異なり、cmt3 LRH-コントロール後代子孫はSPCHでメチル化されなかったが、メチル化は、パーセンテージを問わずLRHによって誘発された（cmt3 LRH-LRHおよびcmt3コントロール-LRH植物）。
【００６７】
LRH-LRH植物のSPCHでのメチル化の喪失については、RdDMの喪失を含め、幾つかの原因が考えられる。後代子孫からのトータルRNAの等量において、小型RNA二体鎖の完全相補体(entire complement)はLRH-LRH植物では減少し（図３）、SPCHについての上流siRNAsの発現が減少した（図３）。これは、LRH誘発メチル化の遺伝性保持(heritable retention)がRdDMに影響を及ぼした結果、繰り返されたストレス下で進行(proceed)不可能になったことを暗示するものであった。これは、cmt3植物がメチル化をその後代子孫に伝達できなかったこととも一致する。世代を超えたDNAメチル化およびsiRNAsがコントロール環境で喪失しなかったので、親の生殖相間のゲノムのリセットおよびメチル化の再活性化よりもむしろ、後でのLRHストレス負担(impression)が原因(causative factor)となったことは間違いない。
【００６８】
【表２】
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【００６９】
ここで、siRNAsの喪失は活発な脱メチル反応を引き起こす可能性がある。LRH-LRH植物およびcmt3変異種（LRH-コントロール）のSPCHで遺伝されたメチル化の喪失は、対称配列で明らかであった（図１）。met1の後続世代からの証拠(evidence)は、メチル化CGの維持がシロイヌナズナ科シトシンデメチラーゼの発現に必要であること、および、脱メチル化CGが、DRM2を含むデ・ノボ再メチル化から引き続き保護されることを示唆している。実生全体で、脱メチル化DNAグリコシラーゼのサイレンシング阻害剤(REPRESSOR OF SILENCING) 1 (ROS1)の転写物(transcripts)は、WT植物のLRHによって無効化され、LRH-LRH植物では検出できなくなって（そこではSPCHのCGメチル化が既に無効化）いたが、世代を超えてメチル化した後代子孫で発現された（0.43×コントロール、P= <0.001）。デメチラーゼDEMETER（DME）の発現も同様に、WT植物ではLRHによって無効化され、LRH親のメチル化後代子孫では減少した（0.74×コントロール）が、LRH-LRHでは大幅に増加した（50.3×コントロール）。両デメチラーゼの発現はmet1コントロール植物では検出不可能であったが、LRH処理によりmet1ではWTに対して増加した（ROS1 10.3×、およびDME 5.7×コントロール）。これらのデータは、ストレスへの応答におけるCGメチル化の動的パターンを編成する(orchestrate)際の脱メチル化での役割を示唆するものである。LRHはCGメチル化を誘発するが、ここでこれが複製され持続されない場合、デメチラーゼが、おそらくは、確率型のデ・ノボのゲノム全般での非対称メチル化および表現型異常物(phenotypic abnormalities)増加に対抗する保護目的で誘発される。SPCH座では、CGメチル化の喪失は非対称メチル化での増加を引き起こさなかった(図１)が、met1におけるFWA座に関して既に証明されているように、SPCHのメチル化CGの喪失に関連したsiRNA転写物の減少(decrease)があった。DMEはシロイヌナズナ科刷り込み遺伝子における母方の対立遺伝子の活性メチル化の原因となっており、生育中の種子では、中央細胞でのその発現が胚および胚乳ゲノムでの特異的メチル化を引き起こす。種子の生育中のDME介在型特異的組織脱メチル化は、TEs（ヘリトロンTE残余を含む）の活性化および抑制、特異的siRNAの集積および分配ならびに極近接した遺伝子のメチル化と関連する。ここで提示されている発見は、類似のメカニズムが気孔前駆体細胞のSPCH座での遺伝的メチル化を動作させている(operate)ことを強力に示唆している。ROS1もまた早期の段階で世代を超えたメチル化CGの活性脱メチル化に関わっていたことを除外する(rule out)ことは不可能である。このことから、SPCHが脱メチル化済の時点でLRH−LRH実生でその検出が不可能であった理由が説明できる。しかしながら、このタイプの急速かつ進行型脱メチル化については、ROS1は他のDMEファミリーの酵素に比べ不適かもしれないという点に注意を要する。rdr2およびdcl3変異種はLRHで発芽しないので、TE関連siRNA集積およびそれに続くRdDMが、ストレス下での種子の適切な生育のために必要であると思われる。
【００７０】
SPCHの遺伝性メチル化は、世代を超えてメチル化した親の後代子孫（LRH-コントロール-コントロール）では喪失しており（図１）、脱メチル化した親の後代子孫（LRH-LRH-コントロール）では、LRHストレス下で復活(regain)した（図１）。完全な(entire)標的SPCH遺伝子断片の予測性(predictability)（第１世代植物で特異的にメチル化された）は、３世代を通して高いままであった（それぞれ８５％、９５％および８０％）。SPCHの転写開始部位での配列反復の下流にある１つの対称部位のメチル化ステータスは、その遺伝子の観察された処理＊親メチル化パターンおよびその発現を、高い忠実度で明らかにするものであった。反復配列自体はパーセンテージまたは処理を問わず、全標本植物で低メチル化した(図１)。全ての調査標本およびアンプリコン（図１）で、CpGはコントロール植物では常に(invariably)非メチル化(hypomethylate)し、LRHではメチル化し、LRH-コントロール後代子孫では世代を超えてメチル化した。この塩基で(at this base)、LRH-LRHにおける脱メチル化の予測性は７１％まで減少し第３世代でのメチル化の喪失および獲得の予測性はLRH-コントロール-コントロールではさらに５５％、LRH-LRH-コントロールでは４３％まで減少した。この部位での世代間LRH誘発メチル化の予測性の減少は、したがって、脱メチル化のプロセスと関連付けられた。SPCHでの遺伝に続くストレス下の脱メチル化と再建メチル化(re-establishing methylation)のプロセスは、異なる段階での核のコホートを引き起こすので、（有系分裂および減数分裂の）生殖で異なるメチル化ステータスを有する。換言するなら、先に提案したように、シトシンは脱メチル化の後に起こる再メチル化から保護されるが、この保護は不完全である。
【００７１】
SPCHとは対照的に、FAMAでは、親植物によって呈示される特異的メチル化のパターンは、FAMAが全てのLRH植物でメチル化されるように、後代子孫で複製(replicate)された（図１）。LRH-コントロールの子孫の極一部（５％）にFAMAの遺伝的メチル化の証拠が存在したが、これはそれほど予測できるものではなかった。FAMAの特異的メチル化生育中の植物の経験した育成条件によって優先的に決定され、SPCHとは異なり遺伝性は弱いものに過ぎなかった。遺伝子のCGメチル化はLRH-LRHに存在し、LRH-コントロール植物では第１世代のWTコントロールに対し緩和され(relieve)、rdr6では不在だった（ただしrdr2ではそうでもなかった）（図１）。このメチル化は、減数分裂の間に稀に放出された(release)古いほうのPTGSイベント(event)の顕著な特徴(hallmark)といえるものであったかもしれない。アッセイされたsiRNAsはLRH-コントロール子孫に引き続き存在し、FAMA発現と正に相関した（P=0.035, R2=0.80)。ただし例外は遺伝子の21 nt siRNA転写物で、これらは今度はFAMA mRNAと逆相関した（P=0.006, R2=0.98)。このような実験から、減数分裂に先立つストレス誘導性RdDMが遺伝子メチル化のこのような放出に役割を果たすことが示唆される。タバコの場合のように、PTGS由来の遺伝子のメチル化の存在は、FAMA発現にもその放出にも影響を及ぼさなかった。全ての処理＊親条件で、FAMA発現はSPCHの発現および最終SIと高い相関関係があった。このことは、FAMAと気孔経路上流にある他の遺伝子との間の相互作用により説明がつく。これらの遺伝子は、用量依存的に、SPCHとFAMAのICE1.SCRM2のヘテロダイマーパートナーおよびSPCH自体を含むその後の分裂を推進する(drive)。LRH-LRH植物でのFAMAの発現の増加は、FAMAのデ・ノボメチル化よりむしろ、SPCHの発現の増加により大きく推進されたと考えられ、CGメチル化の喪失およびsiRNA相補体の減少後のSPCHの再抑制(redepression)と密接な関係がある(consistent with)。SPCH→FAMA気孔発生経路と相互作用する分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼシグナリングカスケードの２種のストレス関連キナーゼ（MKK7およびMKK9）もまた、系統決定段階(lineage-defining stage)でSPCHプロモーターによって促進されるかあるいは孔辺母細胞でFAMAプロモーターによって促進されるかで、逆の結果をもたらすことが証明されたといえよう。気孔発生の通常の阻害剤を、気孔形成分裂を促進するために導入(induce)することができる。ここで提示されているデータは、植物体で、SPCHで一旦気孔系統に関係付けられると、メリステモイドの大部分が機能性孔辺細胞を形成することになり、これは、少なくともSPCHとFAMAの協調(co-ordinated)発現によるものである。LRH-LRH植物のｇsはSIの増加時に減少したが、これらの植物では、変形気孔腫(aberrant stomatal tumours)、奇形前駆体または気孔のクラスターが、WT程は認められなかった。さらに、SPCHは気孔パターニング経路での幾つかの遺伝子の発現を調節し、YDA指令MAPK信号送受信滝の末端でのMPK3およびMPK6によるリン酸化用の基板となっている。したがってSPCHは、発生合図および環境合図を協調させるための重要なハブであり、それ自身がRdDMを介して環境ストレスに応答するように思われる。
【００７２】
SPCHにおけるデ・ノボおよび遺伝性のメチル化および脱メチル化のわずかな相互作用(interplay)が、自身の親たちが経験した気孔発生中の同じストレスに対して後代子孫を効果的に「免疫化(immunize)した」と考えられる。このことは、標的DNAメチル化によって媒介(mediate)されている、世代を超えた「適応刷り込み(adaptive imprinting)」応答として説明することができる。
【００７３】
LRH-LRHおよびLRH-コントロール後代子孫が、生物量および種子生産の増加という点で有利になった(benefit)のは明らかである（図２）。これらの後代子孫のフィットネスプロファイルは、それらの親の経験にしたがって変更(alter)された。シロイヌナズナは自家受粉性・一年生の種であり、個体群間の変異と比較して、個体群中では通常極わずかな遺伝的変異を包含することになる(harbour)であろう。局地的には、個体群はしたがって生長条件の変動に順応するための可塑的弾性(plastic resilience)に依拠するところが大きいはずである。このコンテクストでみると、親の経験に照らして欠陥生理学的応答(default physiological response)を中和する能力は、同系交配の個体群にとって、局地的な遺伝子的変異性(variability)の欠如を補う(mitigate)上でかなり有効であるといえよう。個体が多くの季節に渡って環境の変動に否応なく周期的にさらされる同系交配または無性生殖の多年生植物の間では、それが最も強固に適用されることが予想される。
【００７４】
方法−要約
提供されたシロイヌナズナ(L.) Heynh Landsberg erectaの種子を、相対湿度（RH）が低い（４５％）グロースチャンバおよびコントロール（６５％）用グロースチャンバで育成して、種子を採取した。両方の処理を施された個々の親から採取した種子を、未処理の種子および、幾つかの周知のメチルトランスフェラーゼ変異種用に提供された種子と一緒に育成した。この実験は４回繰り返された。周知のRNAi変異種として提供された種子は、４度目に繰り返された実験で育成された。各回で、気孔密度（気孔ｍｍ-2）および指数（気孔を形成する表皮細胞のパーセンテージ）を成長の同じ段階で、背軸葉表面の刷(impressions)を顕微鏡で調べることにより評価した。老化(senescence)後に植物の乾燥重量、種子重量および種子数を評価した。標本DNAの重亜硫酸塩転換(bisulfite conversion)後に、処理および親子関係による特異的メチル化を、気孔形成経路における周知の遺伝子からのPCR生成物の高解像性(high resolution melt (HRM))解析によりスクリーニングした。標本ゲノムのメチル化部分を捕捉し、対象となる遺伝子の300bp断片について得られた(resulting)DNAのqPCRを実施することによって、標的遺伝子の全長および上流を特異的メチル化について解析した。研究対象の標的遺伝子領域についての≧３２のクローン化PCR断片の重亜硫酸塩シーケンシングによって、単独の塩基解析メチル化プロファイルが確認された。SPCHおよびFAMA発現レベルは、実生RNAで多重タンデムqPCR（MT-qPCR）によって測定された。MT-qPCRデータは、二標準曲線(two standard curve)解析により標的遺伝子に対し同等の効果のあるハウスキーピング(housekeeping)遺伝子との比較で解析された。多重siRNA発現は、溶液内交雑(in solution hybridization)および特殊用途合成プローブ(custom synthesized probes)を備えた強化小型RNAフラクションのRNase温浸法(digestion)によって解析され、その後、保護されたプローブの電気泳動分離や定量化が行われた。
【００７５】
方法−植物と育成環境
シロイヌナズナ（L.）Heynh.生態型Landsberg erecta（Ler ref. NW20）およびColumbia（Col-0 ref. N1092）、MET1のメチルトランスフェラーゼ（減メチル化2DNA、metl ref. N854300）、Chromomethylase（cmt3 ref. N6365）およびDomains rearranged methyl transferase 1/2（drml/drm2 ref. N6366）ならびにRNAi変異種としてRNA依存rnaポリメラーゼ 2（rdr2 ref. N850602）、RNA依存rnaポリメラーゼ 6（rdr6 ref. N24285）、ダイサー様 3（dcl3 ref. N505512）およびダイサー様 4（dcl4 ref. N6954）の種子は、NASC（Nottingham, UK）から提供された。ARBC要綱に沿って、実生コンポスト(seedling compost)（Sinclair, Lincoln, U.K.）に播種し、発芽させ、環境を制御したグロースキャビネット（Saxcil, R.K. Saxton, Bredbury, Cheshire, U.K.）内で収穫まで育成した。ただし、一方のキャビネットの相対湿度は４５％±５、他方のキャビネットの相対湿度は６５％±５に制御されていた。６４日後の段階9.70で、各個体から種子を採取した。採取したLer種子、提供されたLer種子（前述）、および提供された変異種の種子（前述）を前記同様に播種し、発芽させて育成した。ただし、グロースキャビネットの交換を行い、層積処理は行わなかった。グロースチャンバ間のバラツキを抑えるため、４回繰り返された実験では各回で別々のグロースキャビネット(Sanyo Gallenkamp, Loughborough, U.K.)を巡回させて(rotated)用いた。目の細かさを段階的に変えた一連のメッシュ(a series of graded meshes)で脱穀を行ってから、収穫された個々の植物の完全乾燥生物量および種子量の計量を行い、採取された種子のデジタル画像をEpson Perfection 3170 scanner (Epson (U.K.), Hemel Hempstead, U.K.)を用いて取り込む(capture)ことによって、種子数を数えた。その後、ImageJ software version 1.37 (freeware NIH, USA)を用いて、粒子の解析を行った。
【００７６】
方法−気孔解析
４８体の植物（処理＊親実験における３体の各親からの１６体の複製(replicate)植物それぞれ）から１枚の成熟したロゼッタ葉（挿入6−8、長さ略４０ｍｍ）および１枚の茎出葉(cauline leaf)（挿入(insertion)13−15、長さ略１５ｍｍ）の全背軸表面の刷を作ることにより、反復実験毎に同じ生理学的段階（6.50）で気孔密度（気孔ｍｍ-2）および指数（気孔を形成する表皮細胞のパーセンテージ）を判断した。その後Axio Vision3.1（Image Associates, Oxfordshire, UK）ソフトウェアおよびImageJソフトウェア（前述）を用いて数えた単位面積毎の気孔およびその他の表皮細胞の数を用いて、Axiocamカメラ（Carl Zeiss Ltd）を搭載したAxioscope 2顕微鏡からデジタル画像を取り込んだ。シロイヌナズナ科葉チャンバを備えたLcpro+赤外線ガス解析器（ADC BioScientific, Great Amwell, U.K.)を用い、１２時間暗所の周囲RHで予備調整された６体の複製植物で、ガス交換（水蒸気および瞬間リーフレベル水使用効率に対する気孔コンダクタンス）の測定を行った。
【００７７】
方法−DNAメチル化解析
≧１２の複製植物から得られた実生株（第１本葉段階）の全身、成熟葉および未成熟葉を液体窒素中で瞬間冷凍(snap frozen)して−８０℃で貯蔵した。Dneasy Plant mini-kit（Qiagen, U.K.）を用いて、メーカーの指示に従いDNAを抽出した。それから、２μｇのゲノムのDNAを、EZ DNA Methylation kit（Zymo Research, Orange, CA.）を用いて、メーカーの指示に従い、重亜硫酸塩処理により修飾した。脱硫処理した(desulphonated)DNAを５分の１に希釈した。Wojdacz, T.K. & Dobrovic, A. Methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM): a new approach for sensitive and high-throughput assessment of methylation. Nucleic Acids Res. 35, No. 6 e41（この内容は参照のため本文中に全文記載されている）にあるような処理でもって特異的メチル化を解析する目的で、高解像度溶解（HRM）解析が用いられた。ただし、２０μｌの各反応混合物は１×Biomix（Bioline, London, U.K.）、２５μΜのSyto9染料（Invitrogen, Carlsbad, CA.）、および、対象遺伝子用としてそれぞれ３００ｎＭのフォワードおよびリバース重亜硫酸塩特異プライマーを含有していた。用いられたPCR増幅条件は、９５℃で２分の後、９５℃で１５秒および５０℃で３０秒を５０サイクル、６０℃で１分間保留して(hold)５８〜８０℃で０．５℃ｓ-1からHRM。各遺伝子について、未処理のゲノムのDNA（１０００分の１に希釈）が、等価物（ただし重亜硫酸塩特異ではない）プライマーを用いた正のコントロールとして含まれていた。処理による特異的メチル化は、RotorGene（登録商標）6000 Series Software version 1.7（Corbett Research UK Ltd., Cambs., U.K.）を用いて、８０％の信頼度で特定された。特異的にメチル化したと推定的に特定された遺伝子について、アッセイが６〜８回繰り返された。
【００７８】
SPCHおよびFAMA遺伝子の特異的メチル化を示す正の結果を、Methylamp Methylated DNA Capture Kit（Epigentek, Cambridge Bioscience, Cambridge, U.K.）を用いてゲノムDNAのメチル化部分を捕捉しそのキットに設けられた負のコントロール（Igマウス抗体）を用いて比較qPCR解析を実施することで実証した。その後、SPCHおよびFAMA遺伝子の（５’）上流領域の６００ｂｐについて、またSPCHのゲノム領域の２．３ｋｂ上流について、コーディング領域の各３００ｂｐを標的とするようプライマーを設計した。qPCRおよびHRM条件は、上記の通りであった。ただし、１５ｎｇのテンプレートDNAが用いられ、Ｔaは５６℃で、１分間保留の代わりに６６℃で６分間の延伸位相(extension phase)とした。HRMは６８〜９０℃からであった。
【００７９】
塩基対解像メチル化プロファイルは、上記のように、重亜硫酸塩処理およびPCRの後で、プール(pool)した複製植物（Geneservice, Source Bioscience PLC, Nottingham, U.K.）３標本毎に≧３２のクローン化アンプリコン（ベクトルpCR2.1； Invitrogen, Carlsbad, CA.）をシーケンシングすることにより得られた。ただし、完全な重亜硫酸塩転換についての正コントロールとして、重亜硫酸塩処理に先立って各PCR生成物（Sigma-Aldrich Ltd., Gillingham, U.K.）用の、メチル化および非メチル化シトシンを備えた５ｎＭ標識の合成DNAを２μｇの標本DNAに添加した。特異的メチル化を、非修飾ゲノムDNA配列および処理間のシトシンからチミンへの転換の比較を参照して評価した。ClustalW2を用いて配列を一列に並べ、BioEdit v. 7.0.9.0.を用いてエントロピーの逆数(inverse)として予測性を計算した。
【００８０】
HRM、qPCRおよびPCRの各ラウンド(round)の後、生成物の標本を、Agilent Bioanalyzer Series II DNA 1000 chip（Agilent, Winnersh, U.K.）を用いて寸法精密度および純度について解析した。
【００８１】
方法−RNA発現解析
RNeasy Plant Mini kit（Qiagen, U.K.）を用い、メーカーの指示に従ってトータルRNAを凍結した葉材料から分離した。Multiplexed Tandem PCR (MT-PCR)用のプライマーを、標的遺伝子SPCHおよびFAMA用として、ならびに内的コントロール(internal control)遺伝子PP2AおよびSAND用として設計した。Stanley, K.K. & Szewczuk, E. Multiplexed tandem PCR: gene profiling from small amounts of RNA using SYBR green detection. Nucleic Acids Res. 33, 20 el 80 (2005)（この内容は参照のため本文中に全文記載されている)にあるように、５００ｎｇの出発RNAを用いて、MT-PCRを実施した。ただし、ここではSensimix（Quantace, London, U.K.）逆転写酵素およびバッファーが用いられ、逆転写は４５℃で１５分間、その後７０℃で１５分間実行された。第１ラウンドの複合増幅(round multiplexed amplification)は、ABI9700サーマルサイクラー内で、Sybr Premix Ex Taqポリメラーゼ（Takara Bio Europe, Saint-Germain-en-Laye, France）を用いて実施され、プライマー毎の最終的な容量は、２００ｎＭであった。PCRは、以下の条件下で実施された。すなわち、９５℃で１分、それから、９５℃で１５秒、５８℃で２０秒および７２℃で１５秒を１０〜１５サイクル実施した後に７２℃で７分であった。予備増幅生成物を１：１に希釈し、（前述）Sybr Premix Ex Taqおよび内的プライマーならびに１μｌテンプレートcDNAを用いて第２ラウンドのPCRを作成した。qPCRは、RotorGene（登録商標）6000サーマルサイクラー（Corbett Research UK Ltd., Cambs., U.K.）内で、以下の条件を用いて実施された。すなわち、９５℃で１分、その後、９５℃で１０秒、６０℃で２０秒、および７２℃で８秒を４０サイクルの後、０．５℃ｓ-1で７０〜９６℃からのHRMであった。全ての反応を３回繰り返して行い(prepared in triplicate)、対象遺伝子およびコントロールについての連続希釈を完了した。二標準曲線法を用いて遺伝子増幅能率およびRNA定量化（前述）を判断するのに、RotorGene（登録商標）6000 Series software version 1.7を用いた。
【００８２】
PCRおよびqPCRの各ラウンドの後、生成物の標本を、寸法精密度および純度について、（前述）Agilent Bioanalyzer DNA 1000 chip and kitを用いて解析した。
【００８３】
方法−siRNA解析
トータルRNAを、mirVana miRNA isolation kit (Ambion, Warrington, U.K.)を用い、メーカーの指示にしたがって、実生標本から分離し、Agilent Bioanalyzer RNA 6000 Nano and Small RNA chips and kits (Agilent, Winnersh, U.K.)を用いて点検(check)および小型dsRNA標準（New England Biolabs, Hitchin, U.K.）に対する定量化を行った。各標本からの２００ｎｇのトータルRNAを、分離キット（前述）を用いて小型RNAフラクション用に濃縮した。ｎｔ長の異なる標識無し(unlabelled)アンチセンスRNAプローブを、SPCH、FAMAおよびローカルsmRNAs用のmirVana probe construction kit（Ambion, Warrington, U.K.）を用いて設計および構築(construct)した。メーカーの指示に従い、mirVana probe construction kit（Ambion, Warrington, U.K.）を用いた反応毎に≦４個のプローブが検出された。Agilent Bioanalyzer Small RNA chip（前述）および小型dsRNA標準ラダー（前述）を用いて、プローブを後標識化(post-label)および蛍光可視化した。
【００８４】
方法−プライマー設計
DNAメチル化、RNAおよびsiRNA解析用のプライマー設計は、表１および３〜５として記載されている。全てのプライマーはPrimer3 softwareを用いて設計された。重亜硫酸塩特異的プライマーは、MethPrimer softwareからの返還(returned)重亜硫酸塩特異的配列に基づくものであった。
【００８５】
【表３】
2013534818.tif 000004
【００８６】
【表４】
2013534818.tif 000005
【００８７】
【表５】
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【００８８】
実施例２  シロイヌナズナ科における低相対湿度により誘発された遺伝性後天的乾燥耐性(inherited acquired drought tolerance)
親植物をコントロール相対湿度下で育成すると、短期間乾燥させることによって葉緑素含有量（図４、Gen1、コントロールRH）および総植物乾燥質量（図５、GenlコントロールRH）の顕著かつ重大な減少が生じた。対照的に、同じ遺伝子型を常時低い相対湿度（LRH）下で育成すると、同じく周期的な乾燥に遭わせたときに、そのような乾燥を経験しないコントロールと比べ、葉緑素含有量の減少が生じ（図４、Gen1 LRH）、驚くべきことに、最終乾燥質量の増加にも関連した（図５、Gen1コントロールRH）。コントロール相対湿度にさらされた植物から採取された種子から作成された子孫は、コントロール条件では同様の反応を示し(behave)、葉緑素含有量（図４、コントロール-コントロール）および最終乾燥生物量（図５、コントロール-コントロール）の減少が顕著であった。特筆すべきことに、低相対湿度にさらされた親植物から採取された種子から作成された子孫は、同じ周期的な乾燥（図４、LRH-コントロール）にさらされたときに葉緑素含有量が大幅に増加し、同様に総乾燥生物量（図５、LRH-コントロール）も大幅に増加した。よって、親がLRHにさらされると、周期的な乾燥に対する子孫の応答が正方向に変化した。さらに特筆すべきことに、低相対湿度下で成長した親植物からの子孫が親と同レベルの低相対湿度にさらされると、葉緑素含有量（図４、LRH-LRH）および乾燥生物量（図５、LRH-LRH）でみると、それらの子孫は周期的な乾燥に対する感受性が低くなった。意外にも、第１世代からの低RH予備調整の効果は、葉緑素含有量（図４、LRH-コントロール-コントロール）および生物量（図５、LRH-コントロール-コントロール）でみると、コントロール条件下で育てられた場合、第３世代まで遺伝するものではないということであった。２回連続してLRH条件にさらされた後で乾燥を伴うまたは伴わないコントロール条件にさらされた第３世代は、LRH-コントロール処理と略同様の反応を示した（図４および５）。デ・ノボメチル化（drm1/2）用および（余分に）メチル化の維持（cmt3）の変異種は、同様にコントロールRHで乾燥の影響を受けたが、drm1/2変異種のみが低RH予備調整のおかげで生き残った(rescued)。よって、親植物を可変的な相対湿度条件にさらすと、その世代およびその後の世代では周期的な乾燥への後成的な応答の変化が引き起こされることになった。
【００８９】
方法−植物と育成環境
シロイヌナズナ（L.）Heynh.生態型Landsberg erecta（Ler ref. NW20）、Chromomethylase（cmt3 ref. N6365）およびDomains rearranged methyl transferase 1/2（drml/drm2 ref. N6366）の種子が、NASC（Nottingham, UK）から提供された。ARBC要綱に沿って、苗床(seedling compost)（Sinclair, Lincoln, U.K.）に播種し、発芽させ、制御環境グロースキャビネット（Saxcil, R.K. Saxton, Bredbury, Cheshire, U.K.）内で収穫まで育成した。ただし、一方のキャビネットの相対湿度は４５％±５、他方のキャビネットの相対湿度は６５％±５に制御されていた。採取したLer種子、提供されたLer種子（前述）、および提供された変異種の種子（前述）を先にコントロールRH下で播種し、発芽させて育成した。ただし、各遺伝子型からの植物に対し４０日半後に(after 40 d half)、４日間(4d)水遣りを控えることによる乾燥処理を行った。この処理の後、６４日目(day 64)(段階9.70)に各個体から種子が収穫されるまで、水遣りを再開した。グロースキャビネットを取り替え、層積処理は行われなかった。グロースチャンバ間のバラツキを抑えるために、４度繰り返された実験では各回で別々のグロースチャンバ（Sanyo Gallenkamp, Loughborough, U.K.）を（巡回させて(rotated)）用いた。各回で、同じ生長段階での気孔密度（気孔ｍｍ-2）および指数（気孔を形成する表皮細胞のパーセンテージ）を、背軸表面の刷を顕微鏡で検査することにより評価した（前述）。目の細かさを段階的に変えた一連のメッシュで脱穀を行ってから、採取された種子のデジタル画像をEpson Perfection 3170 scanner (Epson (U.K.), Hemel Hempstead, U.K.)を用いて取り込むことによって、収穫された個々の植物の完全乾燥生物量および種子量の計量を行い、種子数を数えた。その後、ImageJ software version 1.37 (freeware NIH, USA)を用いて、粒子の解析を行った。
【００９０】
実施例３：シロイヌナズナ科子孫における病原体灰色カビ病菌に対する遺伝的抵抗性の増加
シロイヌナズナ科植物は、灰色カビ病菌の病原株を接種したとき、特異な病気抵抗性遺伝子の発現を活性化することにより短期間で応答することが判明した。それと同時に、植物ゲノムの全体的な(global)メチル化パターンも変化する。しかしながら特筆すべきことに、これらの植物から採取された種子は、接種時に病原体に対しより高い抵抗性を呈示する。用いられている植物は同系交配が進んでいるため、子孫は、遺伝子的にみると親と実質的に(to all intents and purposes)同一になる。
【００９１】
第２世代野生型植物を、メチル化レベルの何らかの変化が次の世代に伝達されるかどうかを比較する目的で播種した。形態学的データから、野生型Langsberg erecta遺伝子型において灰色カビ病菌への抵抗性が世代を超えて後天的に増加することが明らかになった。一方で、メチル化変異種の場合はいずれも、抵抗性にそのような増加がみられなかった（図６）。ジェネレーション２の植物を、灰色カビ病菌で処理した。写真には、Langsberg erectaでの接種から３日後の真菌感染によって生じた病巣が示されている。非接種植物（Ａ）の子孫、接種植物（Ｂ）の子孫。矢印は、接種された葉を示す。非接種植物の子孫（Ｃ）、非接種植物の子孫（Ｄ）から採った接種葉の細部。
【００９２】
【表６】
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【００９３】
（CpHpGモチーフ上のメチル化に感受性のある酵素コンビネーションMspI/EcoRIとの）MSAPを用いた灰色カビ病菌の感染により誘発された全体的なメチル化変化の解析では、感染植物および非感染植物との間に大きな差異が認められなかった（図７）。逆に、（CpHpGおよびCpGモチーフ上のメチル化に感受性のある）酵素コンビネーションHpaII/EcoRIが用いられたとき、遺伝子型drml/2およびchrlが、ボトリチス属の感染により誘発された全体的なDNAメチル化で大きな変化を示した。驚くべきことに、遺伝子型野生型-Laerおよびkyp2の処理の間で差異は認められなかった。一方で遺伝子型cmt3-7は、ボトリチス属に感染した標本と非感染の標本との間である程度の（有意ではない）差を示した（図８）。特筆すべきことに、ボトリチス属感染に関する全体的なDNAメチル化で観察された変化は、上記の後天的に増加した抵抗性と逆相関することが判明した。これらの結果は、DNAメチル化の維持が、後天的な抵抗性を形成するのに必要であることを示唆するものである。
【００９４】
方法−植物および育成環境
シロイヌナズナ（L.）Heynh.生態型Landsberg erecta（Ler ref. NW20）および変異種Chromatin-remodeling ATPase（CHR1 ref. N30937）、Chromomethylase（cmt3 ref. N6365）およびDomains rearranged methyltransferase 1/2（drml/drml ref. N6366）およびKryptonite-2（KYP-2 ref. N6367）の種子を、European Arabidopsis Stock Centreから入手した。
【００９５】
植物を、２４個のセルトレイで、実生コンポスト（Sinclair, Lincoln, U.K.）で育成した。４ｃｍ×４ｃｍのセル毎に１体の植物を入れて、ARBC要綱に従って発芽させ、制御環境のグロースキャビネット（Saxcil, R.K. Saxton, Bredbury, Cheshire, U.K.）内で収穫まで育成した。底面給水ができるように、セルの１つを除去した。種子を４℃で発芽させ、制御環境のグロースルーム内で実験条件に移すまでフレーム内で１週間育成した。開花させないように８時間の光周期（約７０μmol/m2/s）下２２℃で植物を育成した。６４日後、段階9.70で、各個体から種子を収穫した。目の細かさを段階的に変えた一連のメッシュで脱穀を行ってから、採取された種子のデジタル画像をEpson Perfection 3170 scanner (Epson (U.K.), Hemel Hempstead, U.K.)を用いて取り込むことによって、収穫された個々の植物の完全乾燥生物量および種子量の計量を行い、種子数を数えた。その後、ImageJ software version 1.37 (freeware NIH, USA)を用いて、粒子の解析を行った。
【００９６】
ジェネレーション０（Ｇ０）
植物材料全体でメチル化のレベルを均質にしかつ標準化するために、ジェネレーション０（遺伝子型毎に植物５体）を標準的な条件、すなわち、２４℃の短日（８時間明／１６時間暗）、光度１００μmol m-2s-1、で育成した。その結果、種子の貯蔵条件の多様性により生じ得る後成変異の可能性を排除することが可能となった。ジェネレーション０の各遺伝子型のそれぞれ単独の植物から得られた種子を、後続の部分実験、すなわち、ジェネレーション１（Ｇ１）の育成に用いた。植物材料全体で遺伝子の均質性を確実に最大レベルにするために、単独の個体から種子を採取した。収穫されたLer種子、提供されたLer種子、および収穫された変異種種子と変異種として提供された種子である。前述のように種子を播種し、発芽させ育成した。ただし、グロースキャビネットは交換された。
【００９７】
ジェネレーション１（Ｇ１）
４個のトレイに植物（９２体）を植え付けた。植物のトレイを、２種類の処理（灰色カビ病菌の接種およびコントロール）に無作為に割り当てた。発芽の５週間後に、植物に寄生灰色カビ病真菌(necrotrophic gray mold fungus Botrytis cynerea)（iMi 169558株、International Mycological Institute, Kew, U.K.)を接種した。植物を、１×１０5芽胞ｍＬ-1懸濁液で処理した。すなわち、ピペットを用いて、（それらが確実に同じ生育段階にあるようにするため）葉Ｎｏ．５の上面に直接２滴たらした。接種の７日後、葉Ｎｏ．６を、処理毎に半数の植物から標本として採取し、標本を採取した植物を廃棄した。残りの個体のうち５体から種子を採取し、処理によって誘発される後成の変異性がはっきり分かる(significant representation)ようにプールした。それらは収穫されたLer種子、提供されたLer種子および収穫された変異種種子、変異種用に提供された種子である。前記のように種子を播種し、発芽させて育成した。ただし、後の部分実験、つまりジェネレーション２（Ｇ２）の育成でグロースキャビネットを交換した。
【００９８】
ジェネレーション２（Ｇ２）
８個のトレイに植物を植え付けた（１８４体）。上記同様、植物のトレイを、２種類の処理（灰色カビ病菌の接種およびコントロール）に無作為に割り当てた。処理済および未処理の植物から得られた種子から成長した(arising)植物に、上記のように再度菌を接種した（表６参照）。接種の５日後に、資料管理および画像解析目的で遺伝子型Ｇ１−Ｇ２処理グループのそれぞれについて、植物の全身(the whole plant)および接種された葉を撮影した。真菌感染に対する感受率または抵抗性を、灰色カビ病菌接種から生じた病巣の寸法および強度(intensity)を測定することにより評価した。接種の７日後に、処理別に半数の植物から葉Ｎｏ．６(leaf six)を標本として採取し、標本を採取した植物を廃棄した。残りの個体のうち５体から種子が採取され、処理によって誘発される後成の変異性がはっきりわかるようにプールされた。ジェネレーション２植物については特に、同じＧ２処理グループ内で異なるバックグラウンド（Ｇ１処理）に関連した形態学的変化をみた。
【００９９】
【表７】
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【０１００】
方法−DNA抽出
Quiagenのキットを用い、メーカーの指示に従って、全DNA抽出が実施された。DNeasy（商品名）plant mini kitを用いて、処理毎に４６体の植物中２３体のシロイヌナズナ標本からDNAを抽出した。下記の試薬はいずれもこのキットに由来する。
【０１０１】
植物組織約１００ｍｇを、１．５ｍｌマイクロ遠心管に入った液体窒素中で鋏を用いて粉砕した。組織が融解しないよう、直ちに、６５℃まで予備加熱した４００μｌのリーシスバッファーAP1および４μｌのRNase Aを各遠心管に添加した。管を上下逆にして内容物を混ぜ、２〜３分おきに混ぜながら６５℃で１０分間培養した。
【０１０２】
引き続き、１３０μｌのAP2バッファーを各標本に添加し、遠心管を氷の上で５分間培養してタンパク質と多糖類を析出させた。それから遠心管を５分間１３，０００ｒｐｍで遠心分離にかけ、粘性溶解物およびその他の固形物を析出させた。
【０１０３】
それから上澄み液をQIAshredder（商標）カラム（シリカゲルマトリックス入）に移し替えて１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離することで、析出物および細胞破壊片を除去した。カラムのフロースルーを集めて新しい試験管に移し替え、０．５容積(volume)の洗浄バッファーおよび１容積のエタノールと混合した。この混合物を第２のDNeasyミニスピンカラムに移し替え、８，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。DNA分子がカラム上に残留する(retain)ので、フロースルーを廃棄した。８，０００ｒｐｍの１分間遠心分離でカラムに５００μｌの洗浄バッファーAWを通過させることにより、結合(bound)DNAを２度洗浄した。
【０１０４】
その後、６５℃に予備加熱した１００μｌのバッファーAEを添加しかつ室温で５分間培養してから、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離することによって、皮膜(membrane)を乾燥させた。
【０１０５】
方法−アガロースゲルによる定量化
DNAのアリコート（１〜５μｌ）を１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動にかけて、存在するDNAの質および量を判断した。ゲルの製造にあたっては、適量のアガロースを適切な容積の１×ＴＡＥバッファー（トリスアセテート(tris-acetate)を４０ｍＭ、ＥＤＴＡを１ｍＭ）に溶解させ、その後、アガロースが全て溶融するまで電子レンジ内で加熱した。ゲル溶液を５０℃まで冷却してから１０ｍｇ／ｍｌの臭化エチジウムを、最終濃度が０．３５μｇ／ｍｌになるまで添加し、適切なコームを設置したキャスティングトレイに注ぐことによりローディングウェル(loading well)を作成した。
【０１０６】
硬化時に、ゲルを、陰極端にゲルコームを備えた水平電気泳動装置に移し替えた。ゲルコームを除去し、十分な１×ＴＡＥバッファーを電極チャンバに添加してゲルを約１ｍｍまで被覆した。製造されたDNA標本（５μｌ DNA：１μｌブルーローディング染料［０．２３％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー、６０ｍＭのＥＤＴＡ、４０％（ｗ／ｖ）の蔗糖］）をそれからゲルウェルにローディングした。HyperLadderll（Bioline、BIO-33040）サイズマーカーをフランキングレーンにローディングした。ゲルを３〜５Ｖ／ｃｍ範囲の定電圧で１５〜６０分間電気泳動にかけた。ＵＶトランスイルミネーター（波長３２０ｎｍ）を用いてDNAを可視化した。
【０１０７】
方法−メチル化感受性(sensitive)増幅断片長多型
処理毎に無作為に選択された８つのDNA標本上でメチル化感受性増幅断片長多型（AFLP）を実施した。Vos et al（１９９５）に記載されているAFLPプロトコルを根拠としつつも、同じ認識モチーフを標的とするアイソシゾマーが用いられた。
【０１０８】
同技術の基本は、ポリメラーゼ(polymase)連鎖反応（PCR）増幅を介してゲノムDNAの制限された断片を検出することである。それにより、限られた遺伝子プライマーのセットを用いていかなる起点(origin)または複合体(complexity)のDNAからも指紋の作成が可能となり、配列の予備知識を必要としない。メチル化に感受性のある制限酵素の使用により、この方法をメチル化の検出に適用できるようになっている。
【０１０９】
そのDNAは、２つの制限酵素、すなわち、シトシンメチル化に感受性のあるコモンカッター１つとレアカッター１つによって制限された。２つの別々の制限は、異なるタイプのシトシンメチル化に感受性のあるコモンカッターのアイソシゾマーを用いて実施された。酵素は全て、カナダのFermentasから入手したものである。
【０１１０】
MspI酵素：配列5'CCGG3'の２つのシトシン間の切断およびその作用(action)は最初のＣ上のメチル化によって防止されるのであり、２番目のＣ上のメチル化によってではない。
【０１１１】
Hpall酵素：配列5'CCGG3'の２つのシトシン間の切断およびその作用は２番目のＣ上のメチル化によって防止されるのであり、最初のＣ上のメチル化によってではない。
【０１１２】
【表８】
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【０１１３】
制限部位に特異的なアダプターをDNA表面に連結反応(litigate)させることにより、遺伝子プライマーで断片を増幅することが可能になり、配列情報を最初に入手する必要はない。酵素は全てFermentas製、アダプターはSigma-Genosys Ltd.製である。
【０１１４】
【表９】
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【０１１５】
アダプターミックス(adaptor mix)は、１ｎＭのEcoRIアダプターと１０ｎＭのMspI/HpaIIアダプターとを組み合わせることにより作成された。
【０１１６】
【表１０】
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【０１１７】
増幅ラウンドは、EcoRI末端に対応する１つのオリゴヌクレオチドプライマーおよびMspI/HpaII末端に対応する１つのオリゴヌクレオチドプライマーとを用いて実施された。増幅の第１ラウンドは、プライマーの３'末端で余分な塩基を１つ添加することにより、候補の(possible)断片の数を減少させ、その一方で、増幅の第２ラウンドは、プライマーの３'末端で１個か２個の追加塩基を添加することにより候補の断片の量をさらに減少させる。第２ラウンドのEcoRIプライマーが6- Fam（カルボキシフルオレセイン）と標識され、それにより生成物の可視化が実現した。
【０１１８】
【表１１】
2013534818.tif 000012
【０１１９】
【表１２】
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【０１２０】
【表１３】
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【０１２１】
【表１４】
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【０１２２】
【表１５】
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【０１２３】
【表１６】
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【０１２４】
選択的増幅ステップの生成物を、Applied Biosystems Genetic Analyzerで処理(run)した。その結果はGeneMapper解析ソフトウェアを用いて可視化および解明され、さらなる解析のためMicrosoft Excelにデータ転送された。
【０１２５】
AFLPプロトコル内部の各バンドは、単独の座の単独の対立遺伝子であると考えられた。各処理についてまず、それぞれの座についての対立形質素性を、各複製個体について、１（存在）または０（不在）というシンプルな定性法で割り当てた。その座の個体の対立遺伝子のプロファイルが３以上の個体間で異なる場合、１つの座は１対のストレス処理間で、またはコントロールとストレス処理間で異なる（例えば、11111111対11111000は異なるが、11111111対00111111はそうではないと考えられるかもしれない）と考えられた。多変量解析（主座標解析）が、GenAlex（http://www.kovcomp.co.u/mvsp/）を用いて実施された。
【０１２６】
AFLPの性質が優勢である結果、（例えば、細胞型特異メチル化変化のため）個体間後成変異の一部は存在／不在スコアに捕捉されない。しかしながら、これらの変化は断片ピーク強度における有意義な変異に貢献するかもしれない。（例えば、AFLPプロトコルにおけるPCRステップのせいで）当初の断片コピー数とピーク高さとの関係が直線状でなくても（Rodriguez Lopez et al 2004、Verhoeven et al 2009）、強度データが、定量解析を用いて捕捉可能な後成の変異についての生物学的な情報を、少なくともいくらか含有しているかもしれない（Castiglioni et al.、1999；Klahr et al.、2004）。従って第２のアプローチは、MS-AFLPマーカー（存在／不在スコアリングでは単一形(monomorphic)）の更に小さいセットを定量的に解析するのに用いられ、それについての、断片強度スコアが、GeneMapperソフトウェアを用いて得られた。各断片ピーク高さスコアを、各標本から得られた全断片のトータル蛍光値で除算することにより、強度の素点を規格化した(normalize)。この規格化は、例えば、標本間の当初のDNA濃度のわずかな差異の結果としての、標本間の強度スコアにおける総合的な差異の根拠となる(account for)。規格化された強度は、Minitab 15 (http://www.minitab.com/en-GB/default.apsx?WT.srch=l&WT.mc_id=SE004815）を用いた主要構成要素解析にかけられた。
【０１２７】
ここに記載されているような、現在好ましいとされる実施態様に対するあらゆる変化および改変が、当業者にとって明白なものであろうことは理解されねばならない。そのような変化および改変は、本発明の精神および権利範囲から離れることなく、またその付随する利益を損なうことなくなされ得る。したがって、すなわちそのような変化および改変は、付帯の請求項によってカバーされている。
【０１２８】
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【図１Ａ】
2013534818.tif 000018
【図１Ｂ】
2013534818.tif 000019
【図１Ｃ】
2013534818.tif 000020
【図１Ｄ】
2013534818.tif 000021
【図１Ｅ−１】
2013534818.tif 000022
【図１Ｅ−２】
2013534818.tif 000023
【図２Ａ】
2013534818.tif 000024
【図２Ｂ】
2013534818.tif 000025
【図３Ａ】
2013534818.tif 000026
【図３Ｂ】
2013534818.tif 000027
【図４】
2013534818.tif 000028
【図５】
2013534818.tif 000029
【図６】
2013534818.tif 000030
【図７】
2013534818.tif 000031
【図８】
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【配列表】
2013534818000001.app
【国際調査報告】
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2013534818.tif 000034
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