(57)【要約】本発明は、微小胞における発癌タンパク質および癌に関するタンパク質の検出による、癌の診断のための方法ならびに被験体のサンプルにおける癌の進行および／または抗癌治療の治療有効性のモニタリングのための方法に関し、癌の治療ための微小胞の交換を遮断する薬剤の使用に関する。【選択図】  なし
2013524247.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質の存在を検出する方法であって、
被験体からサンプルを採取する工程と；
サンプルから微小胞を単離する工程と；
微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質の存在を検出する工程
とを含む方法。
【請求項２】
被験体における癌の予後を診断または決定する方法であって、
請求項１の方法に従って微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質の存在を検出する工程を含み、
サンプル中の発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質の存在が被験体が癌を有し得ることを示す方法。
【請求項３】
被験体における癌の進行または抗癌治療の治療有効性をモニターする方法であって、
ａ）癌を有する被験体から第１のサンプルを第１のタイムポイントで採取する工程と、第１のサンプルから微小胞を単離する工程と、第１のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質を測定する工程と；
ｂ）癌を有する被験体から第２のサンプルを第２のタイムポイントで採取する工程であって、第２のタイムポイントが第１のタイムポイント後に起こる工程と、第２のサンプルから微小胞を単離する工程と、第２のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質を測定する工程
とを含み；
被験体が抗癌治療を受ける前に第１のタイムポイントが起こり、被験体が抗癌治療を受けた後に第２のタイムポイントが起こる場合、第１のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質もしくは腫瘍に関するタンパク質の量に比較して、第２のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質もしくは腫瘍に関するタンパク質の量における変化が癌の進行を示すか、または第１のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質もしくは腫瘍に関するタンパク質の量に比較して、第２のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質もしくは腫瘍に関するタンパク質の量の減少または無変化が抗癌治療の治療有効性を示し；
該サンプルが、血液、リンパ液、尿、脳脊髄液、腹水、唾液、洗浄物、精液、腺分泌物、滲出液、嚢胞の内容物および糞便からなる群から選択される体液である方法。
【請求項４】
前記発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質が、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＭＥＴ、ｃＫｉｔ、ＰＤＧＦＲ、Ｗｎｔ、β−カテニン、Ｋ−ｒａｓ、Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｎ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｃ、ＩＧＦＲ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ３、ＥｐｈＢ２、ＲＯＲ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ４、ならびにＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−１、Ｔｉｅ−２、ＴＥＭ−１およびＣＤ２７６からなる群から選択された癌関連細胞の受容体、ならびに表１〜４中でリストされたタンパク質からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法
【請求項５】
前記発癌タンパク質のリン酸化状態を測定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質の量に比較して、前記第２のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質の量の増加が、癌の進行または継続的増殖を示し；
前記第１のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質もしくは腫瘍に関するタンパク質の量または微小胞の組成物に比較して、前記第２のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質もしくは腫瘍に関するタンパク質の量の減少または第２のサンプルから得られた微小胞の組成物における変化が、癌の退縮を示し；
前記第１のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質の量に比較して、前記第２のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質の量の無変化が、癌が進行していないことを示す、
請求項３に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも２つの前記発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質が微小胞中で検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記微小胞が、超遠心、免疫沈殿、親和性精製または精密濾過によって単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質の存在が、免疫ブロット、免疫沈殿、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、フローサイトメトリー、電子顕微鏡または質量分析によって検出または測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質が、アネキシンＶでコートしたウェルを用いるＥＬＩＳＡによって検出または測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗癌治療が、外科手術、放射線医学、化学療法、標的化癌治療またはその組み合わせである、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記癌が、乳癌、神経膠腫、脳腫瘍、肺癌、膵臓癌、皮膚癌、前立腺癌および結腸直腸癌からなる群から選択される、請求項２、３または１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
被験体からサンプル中の癌を検出するためのキットであって、
発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質に対する少なくとも１つの抗体、および該少なくとも１つの抗体を使用してサンプル中の微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質を検出するための説明書
を含むキット。
【請求項１４】
前記癌が、乳癌、神経膠腫、脳腫瘍、肺癌、膵臓癌、皮膚癌、前立腺癌および結腸直腸癌からなる群から選択される、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質が、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＭＥＴ、ｃＫｉｔ、ＰＤＧＦＲ、Ｗｎｔ、β−カテニン、Ｋ−ｒａｓ、Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｎ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｃ、ＩＧＦＲ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＴＥＮ、ＦＧＦＲ３、ＥｐｈＢ２、ＲＯＲ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ４、ならびにＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−１、Ｔｉｅ−２、ＴＥＭ−１およびＣＤ２７６からなる群から選択される癌関連細胞の受容体からなる群から選択される、請求項１３に記載のキット。
【請求項１６】
前記サンプルが、血液、リンパ液、尿、脳脊髄液、腹水、唾液、洗浄物、精液、腺分泌物、滲出液および糞便からなる群から選択される体液である、請求項１３のキット。
【請求項１７】
リン酸化部位特異的抗体をさらに含む請求項１３に記載のキット。
【請求項１８】
１つより多い発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質が前記微小胞において検出され、該微小胞において検出された該発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質の組み合わせが癌型の診断に役立つ、請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
前記発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質のリン酸化状態が決定される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
被験体において癌の進行または抗癌治療の治療有効性をモニタリングする方法であって、
ａ）癌を有する被験体から第１の血液サンプルを第１のタイムポイントで採取する工程と、微小胞を第１の血液サンプルから単離する工程と、第１の血液サンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質のリン酸化状態を測定する工程と；
ｂ）癌を有する被験体から第２の血液サンプルを第２のタイムポイントで採取する工程であって、第２のタイムポイントが第１のタイムポイント後に起こる工程と、微小胞を第２の血液サンプルから単離する工程と、第２の血液サンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質のリン酸化状態を測定する工程
とを含み；
被験体が抗癌治療を受ける前に第１のタイムポイントが起こり、被験体が抗癌治療を受けた後に第２のタイムポイントが起こる場合、第１の血液サンプルから得られた微小胞に比較して、第２の血液サンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質もしくは腫瘍に関するタンパク質のリン酸化状態における変化、またはリン酸化もしくは非リン酸化の発癌タンパク質もしくは腫瘍に関するタンパク質の量における変化が、癌の進行もしくは退縮を示すかまたは抗癌治療の治療有効性もしくは非有効性を示し、；
ＭＶにおいて検出されるリン酸化状態またはリン酸化されたタンパク質の量によって決定されるように、癌の退縮または抗癌治療の治療有効性が発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質の非活性形態の増加によって示され、癌の進行または抗癌治療の非有効性が発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質の活性化形態の増加によって示される方法。
【請求項２１】
前記発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質が受容体チロシンキナーゼである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
腫瘍における発癌受容体チロシンキナーゼの活性化をモニタリングする方法であって、
腫瘍を有する被験体から血液サンプルを採取する工程と、血液サンプルから微小胞を単離する工程と、微小胞における発癌受容体チロシンキナーゼのリン酸化状態を測定する工程とを含み、
発癌受容体チロシンキナーゼのリン酸化状態が受容体チロシンキナーゼの活性化または非活性化を示す方法。
【請求項２３】
発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質を含む、単離された微小胞。
【請求項２４】
被験体における腫瘍において発現される発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質を決定する方法であって、
被験体から体液のサンプルを採取する工程と；サンプルから微小胞を単離する工程と；微小胞において存在する発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質を決定する工程とを含み、
微小胞において存在する発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質が発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質が腫瘍において発現されることを示す方法。
【請求項２５】
被験体における癌を検出する方法であって、
被験体から体液のサンプルを採取する工程と；サンプルから微小胞を単離する工程と；微小胞をアッセイして微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質の存在を決定する工程とを含み、
微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質の存在が被験体が癌を有することを示す方法。
【請求項２６】
前記発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質が、前記被験体から得られた生検標本において検出されない、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記体液が血液である、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〔関連出願の相互参照〕
本出願は、出願第１２／６７３５２８号（２００７年８月１６日に出願された米国仮出願第６０／９３５５０５号に対する優先権を主張する２００８年８月８日に出願されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＣＡ２００８／００１４４１の国内段階）の一部継続出願である。これらの出願の内容全体は参照として本明細書に援用される。
〔技術分野〕
【０００２】
本発明は、微小胞（microvesicles）における発癌タンパク質および／または分子的なメディエーターの形質転換活性の検出による、癌の診断および予後のための方法、ならびに被験体のサンプルにおける癌の進行および／または抗癌治療の治療有効性のモニタリングのための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
悪性細胞への正常細胞の形質転換は、とりわけ、子孫細胞の制御されない増殖をもたらし、この子孫細胞は未成熟で未分化な形態、生存の亢進および血管新生促進特性、ならびに正常な成熟細胞によってこの形態では通常は発現されない癌遺伝子の発現、過剰発現または構成的活性化を示す。
【０００４】
発癌突然変異および結果として生じる細胞のシグナル伝達における内因性変動は癌の発生における原因事象として考察される。例えば、ヒト脳腫瘍（神経膠腫）の侵攻性増殖は、多くの場合、表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）およびＥＧＦＲｖＩＩＩとして公知のリガンド非依存性の短縮型突然変異体の過剰発現および増幅に関連する（Ｃａｖｅｎｅｅ，２００２，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，２３：６８３−６８６）。この発癌受容体の持続的活性化は、形質転換シグナル伝達経路、調節機構、ならびに最終的に細胞増殖、存続および血管新生に関与する遺伝子の発現の異常活性化  を誘導する。
【０００５】
癌遺伝子の活性化をもたらし、それによって正常細胞が腫瘍細胞へと発達する機会を増加させる多くの遺伝的突然変異が公知である。加えて、腫瘍抑制遺伝子（通常はＤＮＡ損傷の修復によってまたは損傷した細胞のアポトーシスを誘導し細胞活性を抑えることによって、癌遺伝子を相殺するように機能する）の不活性化も、癌を引き起こし得る。癌遺伝子の活性化または腫瘍抑制因子の不活性化が癌を引き起こし得るという概念を支持する多くの証拠がある（Ｈａｎａｈａｎ  ＆  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，２０００，Ｃｅｌｌ，１００：５７−７０）。体細胞における癌原遺伝子の突然変異は、ヒト癌の開始に重要なものとしてますます認識される。かかる突然変異によって形成される癌遺伝子のいくつかの例は、ｎｅｕ、ｆｅｓ、ｆｏｓおよびｍｙｃ、ｍｙｂ、ｆｍｓ、Ｈａ−ｒａｓおよびＫｉ−ｒａｓを包括する。癌遺伝子およびそれらの発現産物がどのように機能して正常細胞を癌細胞に形質転換するかを理解するために多くを学ぶ必要がある。
【０００６】
増殖因子およびそれらの受容体は細胞増加の調節に関与し、それらは発癌においても鍵となる役割を果たすようである。例えば、３つの以下の癌原遺伝子は、増殖因子または増殖因子受容体に関する。１）ｃ−ｓｉｓは、サル肉腫ウイルスの形質転換遺伝子に相同であり、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）のＢ鎖である；２）ｃ−ｆｍｓは、ネコ肉腫ウイルスの形質転換遺伝子に相同であり、マクロファージコロニー刺激因子受容体（ＣＳＦ−１Ｒ）に密接に関する；および３）ｃ−ｅｒｂＢは、表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）をコードし、ニワトリ赤芽球症ウイルス（ｖ−ｅｒｂＢ）の形質転換遺伝子に相同である。２つの受容体に関する癌原遺伝子（ｃ−ｆｍｓおよびｃ−ｅｒｂＢ）は、多くの癌原遺伝子が属するチロシン特異的タンパク質キナーゼファミリーのメンバーである。
【０００７】
加えて、ヒト脳腫瘍（神経膠腫）の侵攻性増殖は、多くの場合、ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩとして公知のリガンド非依存性の短縮型突然変異体の過剰発現および増幅に関連する。この発癌受容体の持続的活性化は、細胞増殖、生存および血管新生に関与する遺伝子の異常な発現を引き起こす。
【０００８】
複数のグループは、定量的免疫組織化学法に加えて半定量的免疫組織化学法を使用して、様々な腫瘍におけるＥＧＦＲの発現を調べた。調べられた腫瘍のタイプは、婦人科癌、膀胱癌、頭頸部癌、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌および乳癌を包括する。かかる研究では、組織サンプルにおけるＥＧＦＲの定量については放射性リガンド結合法または免疫認識にほとんどもっぱら依存する。
【０００９】
数十年間さかのぼる乳癌患者の研究において、臨床データーとＥＧＦＲ発現の最も広範囲な相関性が調べられた（例えばＮｉｃｈｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４２：３６−４１）。最大２４６人の患者による複数の研究において、ＥＧＦＲは乳癌の予後不良の極めて重要なマーカーであることが実証された。それは、リンパ節陰性患者における無再発および粗生存率の予測に最も重要な変数の１つであり、結節状態後のリンパ節陽性患者における第２の最も重要な変数であると考えられる。一般に、ＥＧＦＲ陽性腫瘍はより大きく、リンパ節関与のある患者でより高い比率で起こる。ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１／ＨＥＲ−１の予後有意性は、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１／ＨＥＲ−１に関連し、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１／ＨＥＲ−１と相互作用し、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎの標的）として公知の発癌受容体チロシンキナーゼの同時検出によって促進される（Ｃｉｔｒｉ  ＆  Ｙａｒｄｅｎ，２００６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：５０５−５１６）。
【００１０】
それゆえ、突然変異癌遺伝子は悪性病態または前悪性病態のマーカーである。その他のゲノムの非発癌部分は新生物の状態で変化し得ることも公知である。癌の早期検出のための試験が重要であることは広く認識されている。いくつかの事例において、臓器の表面から剥離した異常細胞または悪性細胞は、擦過物および体液の細胞学的検査によって同定することができる。例えば、ＰＡＰスミア（パパニコロウ試験）は、子宮頚部の異常な（例えば、前癌性または癌性の）細胞を検出することができる。あるいは、癌細胞または前癌細胞における遺伝的異常は分子的技法を使用して検出することができる。例えば、ＤＮＡ配列またはメチル化分析等の技法を使用して特異的突然変異および／またはＤＮＡ中の構造的変化に加えてエピジェネティック変化を検出することができる。
【００１１】
癌細胞またはそれらに関する細胞残屑が分析のために直接入手可能であるならば（例えば外科手術材料もしくは生検材料中、洗浄物、便または循環癌細胞）、突然変異または非突然変異に関わらず、核酸ベースのアッセイは発癌ＤＮＡおよび非発癌ＤＮＡを検出することができる。特に、核酸増幅方法（例えばポリメラーゼ連鎖反応による）は、正常分子のバックグラウンドの中の少数の突然変異分子の検出を可能にする。少数の腫瘍細胞を検出する代替の手段（フローサイトメトリー等）は、一般的に血液悪性腫瘍に限定されているが、核酸増幅アッセイは、悪性細胞の同定および化学療法後の予後の予測に対して感度が高く特異的であることが証明されている（Ｆｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２７：８９−９４）。
【００１２】
充実性腫瘍組織において少数の突然変異分子を検出するための様々な核酸増幅戦略は、ｒａｓ癌遺伝子について特に開発されている（Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｖｉｏｌａ，１９９１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９５：５１−５６）。例えば、感度が高く特異的な１つの方法は、重要な１２番目のコドンの制限部位が切断できないにこと基づいて突然変異ｒａｓ癌遺伝子ＤＮＡを同定する（Ｋａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，６：１０７９−１０８３）。類似した手順を適用して腫瘍中のＤＮＡの任意の突然変異領域を検出することができ、他の癌遺伝子含有ＤＮＡまたは腫瘍関連ＤＮＡの検出を可能にする。
【００１３】
多くの研究が、循環癌細胞から抽出される細胞内ＤＮＡを検出するために、核酸増幅アッセイを使用して癌に罹患した患者の末梢血を分析する（循環膵臓癌細胞から細胞内ｒａｓ癌遺伝子を検出する１つの研究を含む）（Ｔａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：２４７２−４）。アッセイは血液の細胞画分（すなわち全血中の細胞ペレットまたは細胞）で実行され、血清または血漿画分は分析前に無視または廃棄される。かかるアプローチが転移性循環癌細胞の存在を必要とするので（非血液腫瘍については）、早期癌に罹患した患者においては限定的な臨床用途であり、非侵襲性腫瘍または前悪性状態の検出に有用ではない。
【００１４】
核酸増幅アッセイにより腫瘍関連の細胞外の突然変異ＤＮＡ（血液の血漿または血清画分中の癌遺伝子ＤＮＡを含む）を検出できるとは一般的に認識されていない。さらに、臨床的に有用な様式（すなわち迅速に１日以内または８時間未満以内）で達成することができるとは認識されていない。
【００１５】
末梢血の血漿または血清における核酸増幅アッセイによる突然変異癌遺伝子の検出は、先行技術における報告の主題であった。しかしながら、この方法は時間がかかり高度な技法が要求されるＤＮＡ抽出アプローチを必要とし、したがって臨床的有用性は限定的である。
【００１６】
特定の癌により発現されるタンパク質についての試験を行うことができる。例えば、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）のスクリーニングを使用して、前立腺癌のリスクのある患者または前立腺癌の患者を同定することができる。今もなお、ＰＳＡスクリーニングは、アッセイ方法のばらつきおよび特異性の欠如に悩まされる。例えば、悪性前立腺細胞はより多量のＰＳＡを産生するが、ＰＳＡは癌細胞に特異的ではなく、正常前立腺細胞および癌性前立腺細胞の両方とも産生する。ＰＳＡのレベルは、患者の年齢、前立腺の生理的機能、癌のグレード、および薬理作用剤に対するＰＳＡのレベルの感度に依存して変動し得る。さらに、多くの癌についての分子的基盤は同様にまだ未知であり、それゆえ分子的試験は大部分の癌を検出するにはまだ十分に包括的でない。
【００１７】
したがって、多くの癌の検出は今もなお対象となる臓器における異常な腫瘤の検出に依存する。多くの事例において、悪性腫瘍が進行し他の臓器に転移した後にのみ、大抵腫瘍は検出される。例えば、乳癌は、マンモグラムまたは乳房の身体検査によって検出されたしこりから生検を得ることによって典型的には検出される。さらに、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の測定は前立腺癌の検出を有意に改善したが、前立腺癌の確認は典型的には前立腺の異常な形態またはテクスチャーの検出を必要とする。したがって、癌のより早期の検出のための方法および装置に対する必要性がある。かかる方法は、不確実性の限界を減少させ、医学的意思決定のための根拠を拡張して、例えば既存のものを補充または相補することができる。
【００１８】
上で示されるように、複数の方法を使用して腫瘍組織中のＥＧＦＲレベルを検出する。しかしながら、組織が容易に入手可能でないか、または腫瘍から生検組織を採取することが所望されないかもしくは可能でない多くの事例がある。それゆえ、患者にとっても好都合で非外傷性である、迅速で正確で信頼できる診断試験のための医学技術の必要性がある。
【００１９】
したがって、癌遺伝子の癌関連活性の分子的な伝達物質、モジュレーターおよびエフェクターと共に突然変異癌遺伝子の検出を可能にする、医学的に有用で迅速で感度の高い方法の提供が強く所望される。
【発明の概要】
【００２０】
本発明は、被験体における癌の予後または治療的予測を診断または決定する方法であり、被験体からサンプルを採取する工程と、サンプルから微小胞を単離する工程と、微小胞における発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質の存在を検出する工程とを含む方法であり、サンプル中の発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質の存在が、被験体が癌を有し得ることを示す方法に関する。
【００２１】
本発明によれば、被験体における発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質の存在を検出する方法であり、被験体からサンプルを採取する工程と、サンプルから微小胞を単離する工程と、微小胞における発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質の存在を検出する工程とを含む方法も提供される。
【００２２】
さらに、本明細書において開示される方法は、発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質（例えば発癌シグナル伝達タンパク質または発癌効果媒介タンパク質）および／またはＭＶ関連タンパク質のリン酸化または他の翻訳後修飾状態を測定する工程をさらに含むことができる。
【００２３】
本発明によれば、発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質に対する少なくとも１つの抗体を含む、被験体からのサンプル中の癌を検出するためのキット、ならびに該少なくとも１つの抗体を使用して、サンプル中の微小胞における発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質を検出するための説明書も開示される。
【００２４】
本発明によれば、被験体のサンプル中の癌の予後の診断または決定ための少なくとも１つの抗体の使用も提供され、そこで該少なくとも１つの抗体は、微小胞において存在する発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質に結合する。
【００２５】
特定の実施形態において、少なくとも１つの抗体はリン酸化部位特異的抗体（phosphospecific antibody）である。
【００２６】
癌の治療ための微小胞の交換を遮断する薬剤の使用も本明細書において開示する。特定の実施形態において、薬剤は、アネキシンＶもしくはその誘導体またはＰ−セレクチンもしくはそのリガンドＰＳＧＬを遮断する薬剤、または癌に関するＭＶを標的細胞によって取り込むことに関与する分子の受容体を遮断する他の類似薬剤である。
【００２７】
本発明によれば、被験体における癌の進行をモニターする方法であり、癌を有する被験体から第１のサンプルを第１のタイムポイントで採取する工程と、第１のサンプルから微小胞を単離する工程と、第１のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質を測定する工程と；第２のタイムポイントが第１のタイムポイント後に起こり、癌を有する被験体から第２のサンプルを第２のタイムポイントで採取する工程と、第２のサンプルから微小胞を単離する工程と、第２のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質を測定する工程とを含む方法であり、第１のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質の量に比較して、第２のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質の量における変化が癌の進行を示す方法も提供される。
【００２８】
被験体が抗癌治療を受ける前に第１のタイムポイントが起こり、被験体が抗癌治療を受けた後に第２のタイムポイントが起こり得ることも包含される。別の実施形態において、被験体が抗癌治療を受けた後に両方のタイムポイントが起こってもよい。一実施形態において、抗癌治療は腫瘍の外科的な切除または除去である。
【００２９】
別の実施形態において、第１のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質の量に比較して、第２のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質の量の減少または無変化は、抗癌治療の治療有効性を示す。
【００３０】
本発明によれば、抗癌治療の治療有効性をモニターする方法であり、癌を有する被験体から第１のサンプルを第１のタイムポイントで採取する工程と、第１のサンプルから微小胞を単離する工程と、第１のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質を測定する工程と；第２のタイムポイントが第１のタイムポイント後に起こり、癌を有する被験体から第２のサンプルを第２のタイムポイントで採取する工程と、第２のサンプルから微小胞を単離する工程と、第２のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質を測定する工程とを含む方法であり；第１のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質の量に比較して、第２のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質の量の減少または無変化が抗癌治療の治療有効性を示す方法も提供される。
【００３１】
他の実施形態において、ＭＶの組成物における変化は治療有効性を示す。一実施形態において、被験体が抗癌治療を受ける前に第１のタイムポイントが起こり、被験体が抗癌治療を受けた後に第２のタイムポイントが起こる。あるいは、被験体が抗癌治療を受けた後に第１および第２のタイムポイントが両方とも起こってもよい。さらに他の実施形態において、第１および第２のタイムポイントが、抗癌治療の非存在下または被験体が抗癌治療を受ける前において起こってもよく、第１のサンプルにおけるものに比較して、第２のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質の量は、癌の進行または侵攻性の指標を提供するだろう。
【００３２】
別の実施形態において、少なくとも２つの発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質が微小胞において検出される。より具体的には、発癌タンパク質またはＭＶ関連タンパク質は、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ−２、またはＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３、またはＨＥＲ−２およびＥＧＦＲ２、またはＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＨＥＲ−２であり得る。別の実施形態において、ＭＶ関連タンパク質は、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ３、ＥｐｈＢ２、ＲＯＲ１、ＥｐｈＡ２およびＥｐｈＡ４の単独または組み合わせであり得る。
【００３３】
別の実施形態において、微小胞は、超遠心、免疫沈殿、親和性クロマトグラフィー、ゲル濾過、親和性精製、精密濾過もしくはその組み合わせ、または多くが当該技術分野において公知である他の類似した方法によって単離される。
【００３４】
さらに、微小胞における発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質またはＭＶ関連タンパク質の存在は、免疫ブロット、免疫沈殿、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡ、フローサイトメトリー、電子顕微鏡、抗体アレイプラットフォーム、抗体ベースの多重プラットフォームまたは質量分析によって検出または測定することができる。
【００３５】
本明細書において記載されるような方法は、第１および第２のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質またはＭＶ関連タンパク質のリン酸化状態を測定する工程をさらに含むことができる。
【００３６】
別の実施形態において、第１のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質のリン酸化の量に比較して、第２のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質のリン酸化の減少または無変化は、抗癌治療の治療有効性を示す。
【００３７】
あるいは、第１のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質のリン酸化の量に比較して、第２のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質のリン酸化の増加は、癌の進行または継続的増殖を示す。
【００３８】
さらに、第１のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質のリン酸化の量に比較して、第２のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質のリン酸化の減少は、癌の退縮または活発な増殖相の停止（安定化）を示す。
【００３９】
さらに、第１のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質のリン酸化の量に比較して、第２のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質のリン酸化の無変化は、癌が進行していないことを示す。
【００４０】
他の実施形態において、タンパク質組成物またはＭＶのプロテオームにおける変化は、腫瘍の検出、診断、予後、モニタリングなどのために使用される。
【００４１】
本発明によれば、発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質、またはＭＶ関連タンパク質を含む単離微小胞も提供される。
【００４２】
特定の実施形態において、抗癌治療は外科手術、放射線医学、化学療法または標的化癌治療である。より具体的には、標的化癌治療は、低分子、単クローン抗体、癌ワクチン、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、遺伝子治療およびその組み合わせからなる群から選択される。
【００４３】
別の実施形態において、包含される癌は、乳癌、神経膠腫、大腸癌、肺癌、小細胞肺癌、胃癌、肝臓癌、白血病、骨肉腫、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚メラノーマまたは眼内メラノーマ、子宮肉腫、卵巣癌、直腸癌または結腸直腸癌、肛門癌、結腸癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、外陰部癌、扁平上皮癌、膣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織腫瘍、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性白血病（または急性白血病）、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓癌、尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系腫瘍、星状細胞腫、多形膠芽腫、乏突起膠腫、原発性中枢神経系リンパ腫、骨髄腫瘍、脳幹神経神経膠腫、下垂体腺腫、ぶどう膜メラノーマ、睾丸癌、口腔癌、咽頭癌、小児腫瘍、白血病、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、小児神経膠腫、髄芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、骨肉腫、奇形腫、横紋筋芽細胞腫および肉腫からなる群から選択される。
【００４４】
さらに他の実施形態において、発癌タンパク質またはＭＶ関連タンパク質は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＭＥＴ、ｃＫｉｔ、ＰＤＧＦＲ、Ｗｎｔ、β−カテニン、Ｋ−ｒａｓ、Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｎ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｃ、ＩＧＦＲ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＴＥＮ、ならびにＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−１、Ｔｉｅ−２、ＴＥＭ−１およびＣＤ２７６等の癌に関連する細胞の受容体（癌に関する受容体）からなる群から選択される。
【００４５】
一実施形態において、１つ以上の発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／もしくはＭＶ関連タンパク質、または発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／もしくはＭＶ関連タンパク質の組み合わせは、微小胞において検出され、および／または本発明の方法において使用される。別の実施形態において、発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／もしくはＭＶ関連タンパク質または微小胞におけるタンパク質のリン酸化状態は、本発明の方法において決定および／または使用される。さらに他の実施形態において、微小胞において検出される発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質の組み合わせは、癌型の診断に役立つ。微小胞において存在する発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質の組み合わせの決定は、診断および／または予後のために使用することができる。
【００４６】
一実施形態において、ＭＶ関連タンパク質は、膜に付加されている（例えば、膜内在性タンパク質、または膜結合型）。代替の実施形態において、ＭＶ関連タンパク質は微小胞の内腔中に存在する可溶性タンパク質である。
【００４７】
加えて、サンプルは、体液、またはより具体的には、血液、尿、リンパ液、脳脊髄液、腹水、唾液、洗浄物、精液、腺分泌物、滲出液、嚢胞の内容物（contents of cysts）および糞便からなる群から選択される体液である。
【００４８】
一態様において、被験体における癌の進行または抗癌治療の治療有効性をモニターする方法であり、癌を有する被験体から第１の血液サンプルを第１のタイムポイントで採取する工程と、第１の血液サンプルから微小胞を単離する工程と、第１の血液サンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質のリン酸化状態を測定する工程と；第２のタイムポイントが第１のタイムポイント後に起こり、癌を有する被験体から第２の血液サンプルを第２のタイムポイントで採取する工程と、第２の血液サンプルから微小胞を単離する工程と、第２の血液サンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質のリン酸化状態を測定する工程とを含む方法であり；被験体が抗癌治療を受ける前に第１のタイムポイントが起こり、被験体が抗癌治療を受けた後に第２のタイムポイントが起こる場合、第１の血液サンプルから得られた微小胞に比較して、第２の血液サンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／もしくはＭＶ関連タンパク質のリン酸化状態における変化、またはリン酸化もしくは非リン酸化の発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質の量における変化が、癌の進行もしくは退縮を示すかまたは抗癌治療の治療の有効性もしくは非有効性を示す方法であり；ＭＶにおいて検出されるリン酸化状態またはリン酸化タンパクの量によって決定されるように、癌の退縮または抗癌治療の治療有効性が発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質の非活性形態の増加によって示され、癌の進行または抗癌治療の非有効性が発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質の活性化形態の増加によって示される方法が本明細書において提供される。一態様において、発癌タンパク質またはＭＶ関連タンパク質は、受容体チロシンキナーゼ、悪性腫瘍に関する他のタンパク質（癌遺伝子、腫瘍抑制因子または細胞のシグナル伝達のメディエーター）、または本明細書において記載されるＭＶ関連リンタンパク質の１つであり得る。発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質の組み合わせも、本明細書において提供される方法において使用することができる。
【００４９】
腫瘍における発癌受容体チロシンキナーゼの活性化をモニターする方法であり、腫瘍を有する被験体から血液サンプルを採取する工程と、血液サンプルから微小胞を単離する工程と、微小胞における発癌受容体チロシンキナーゼのリン酸化状態を測定する工程とを含む方法であり、発癌受容体チロシンキナーゼのリン酸化状態が受容体チロシンキナーゼの活性化または非活性化を示す方法がさらに提供される。
【００５０】
特定の実施形態において、癌のタイプは、乳癌、神経膠腫、脳腫瘍、肺癌、膵臓癌、皮膚癌、前立腺癌および結腸直腸癌である。
【００５１】
本明細書において提供される方法およびキットは発癌タンパク質に限定されておらず、本明細書において同定されるＭＶ関連タンパク質（例えば腫瘍に関するタンパク質）に加えて、他の癌に関するタンパク質または公知の悪性腫瘍に関するタンパク質（癌遺伝子、腫瘍抑制因子または細胞シグナル伝達のメディエーター等）、および腫瘍に関することが見出され得る微小胞において検出される他のタンパク質が包含されることを理解するべきである。本明細書において使用される時、「ＭＶ関連タンパク質」という用語は、腫瘍から得た微小胞において検出され、本明細書において提供された方法に従う腫瘍の検出、診断、予後、モニタリングなどに有用な任意の癌関連タンパク質を指す。ＭＶ関連タンパク質の非限定例は、発癌タンパク質、腫瘍抑制因子タンパク質、細胞シグナル伝達のメディエーター、受容体チロシンキナーゼ、バイオマーカー、および本明細書の表１〜４中にリストしたタンパク質を含む。
【００５２】
いくつかの事例において、正常組織において通常存在するタンパク質の非存在または減少が癌のための診断または予後であることを理解すべきである。例えば、ＭＶにおける腫瘍抑制因子タンパク質の非存在またはレベルの減少は、腫瘍の検出、診断、予後、モニタリングなどに有用であり得る。
【００５３】
いくつかの実施形態において、ＭＶ関連タンパク質における他の翻訳後修飾（アイソフォームの切断、糖鎖付加パターンなど）の測定は、腫瘍の検出、診断、予後、モニタリングなどのために使用することができる。
【００５４】
さらなる実施形態において、被験体における癌を検出する方法であり、体液（例えば血液）のサンプルを被験体から採取し、微小胞をサンプルから単離し、微小胞をアッセイして微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質の存在を決定し、微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質の存在が被験体が癌を有することを示す方法が提供される。いくつかの実施形態において、発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質は、被験体から得られた生検標本（例えば組織サンプル）において検出されない。
【００５５】
以上で本発明の性質を一般的に記載してきたが、ここでその実施形態（複数可）が例示として示される添付の図面が参照される。図面の説明は以下のとおりである。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１Ａ】ヒト神経膠腫細胞によるＥＧＦＲｖＩＩＩ含有微小胞の産生を説明する図である。ＥＧＦＲｖＩＩＩ癌遺伝子を保有するＵ３７３ｖＩＩＩ神経膠腫細胞の表面上で複数の微小胞構造が生成されるが（白色の矢頭；ＳＥＭ画像）、低悪性度の親Ｕ３７３対応細胞によっては生成されないことが示される。
【図１Ｂ】ヒト神経膠腫細胞によるＥＧＦＲｖＩＩＩ含有微小胞の産生を説明する図である。馴化培地の微小胞画分の存在量の増加はＵ３７３神経膠腫におけるＥＧＦＲｖＩＩＩ発現の関数（全タンパク質含有物によって測定される）として示される。
【図１Ｃ】ヒト神経膠腫細胞によるＥＧＦＲｖＩＩＩ含有微小胞の産生を説明する図である。ＥＧＦＲ発現癌細胞によって放出された脂質ラフト由来微小胞における発癌ＥＧＦＲの含有が示される。
【図１Ｄ】ヒト神経膠腫細胞によるＥＧＦＲｖＩＩＩ含有微小胞の産生を説明する図である。Ｕ３７３ｖＩＩＩ細胞の腫瘍形成特性が機能的ＥＧＦＲｖＩＩＩに依存することが示される。
【図１Ｅ】ヒト神経膠腫細胞によるＥＧＦＲｖＩＩＩ含有微小胞の産生を説明する図である。Ｕ３７３ｖＩＩＩ腫瘍においてＥＧＦＲではなくＥＧＦＲｖＩＩＩが優勢的に発現されることが示される。
【図１Ｆ】ヒト神経膠腫細胞によるＥＧＦＲｖＩＩＩ含有微小胞の産生を説明する図である。Ｕ３７３ｖＩＩＩ腫瘍を保持するＳＣＩＤマウス（上部パネル）が、ＥＧＦＲｖＩＩＩを含有しフロチリン−１陽性である微小胞を循環血液へ放出することが示される。
【図２Ａ】神経膠腫細胞間での発癌ＥＧＦＲｖＩＩＩの微小胞移行を説明した図である。ＥＧＦＲｖＩＩＩで形質転換した対応細胞（Ｕ３７３ｖＩＩＩ）によって放出された微小胞と共にインキュベーションしたＵ３７３細胞が、それらの表面上にＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原の発現を捕捉したことが示される（ＦＡＣＳ）。
【図２Ｂ】神経膠腫細胞間での発癌ＥＧＦＲｖＩＩＩの微小胞移行を説明した図である。Ｕ３７３ｖＩＩＩ由来微小胞と共にインキュベーションされたＵ３７３細胞の表面上でＥＧＦＲｖＩＩＩの検出が示される；
【図２Ｃ】神経膠腫細胞間での発癌ＥＧＦＲｖＩＩＩの微小胞移行を説明した図である。Ｕ３７３細胞におけるＧＦＰタグ付加ＥＧＦＲｖＩＩＩの発現によるＵ３７３／ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＧＦＰ株化細胞の生成が観察される。
【図２Ｄ】神経膠腫細胞間での発癌ＥＧＦＲｖＩＩＩの微小胞移行を説明した図である。ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＧＦＰ含有微小胞と共にインキュベーションしたＵ３７３細胞の直接ＧＦＰ蛍光が観察される。
【図３Ａ】微小胞媒介性細胞間移行を介して発癌ＥＧＦＲｖＩＩＩを捕捉した細胞における増殖促進シグナル経路の活性化を説明した図である。Ｕ３７３ｖＩＩＩ細胞が脱落させた微小胞を取り込んだＵ３７３細胞において、Ｅｒｋ１／２リン酸化がＥＧＦＲｖＩＩＩ依存的に増加したことが示される。
【図３Ｂ】微小胞媒介性細胞間移行を介して発癌ＥＧＦＲｖＩＩＩを捕捉した細胞における増殖促進シグナル経路の活性化を説明した図である。アネキシンＶによるＥＧＦＲｖＩＩＩ含有微小胞の取り込みの遮断によってＵ３７３細胞におけるＥｒｋ１／２リン酸化が阻害されることが観察される。
【図３Ｃ】微小胞媒介性細胞間移行を介して発癌ＥＧＦＲｖＩＩＩを捕捉した細胞における増殖促進シグナル経路の活性化を説明した図である。ＥＧＦＲｖＩＩＩ含有微小胞を取り込んだＵ３７３細胞におけるＡｋｔのリン酸化の増加が観察される。
【図４Ａ】ＥＧＦＲｖＩＩＩ含有微小胞の取り込みによる細胞の形質転換の誘導を示した図である。Ｕ３７３ｖＩＩＩ微小胞を取り込んだＵ３７３細胞によるＶＥＧＦ分泌のＥＧＦＲｖＩＩＩ依存的な増加が示される。
【図４Ｂ】ＥＧＦＲｖＩＩＩ含有微小胞の取り込みによる細胞の形質転換の誘導を示した図である。ＥＧＦＲｖＩＩＩ含有微小胞の取り込みによるＵ３７３細胞におけるＶＥＧＦプロモーター活性の刺激を、アネキシンＶによる前処理によって遮断できることが示される。
【図４Ｃ】ＥＧＦＲｖＩＩＩ含有微小胞の取り込みによる細胞の形質転換の誘導を示した図である。ＥＧＦＲｖＩＩＩ含有微小胞に曝露したＵ３７３細胞におけるＢｃｌｘＬ（生存促進）の発現の増加およびｐ２７（細胞周期阻害因子）の発現の減少が示される。
【図４Ｄ】ＥＧＦＲｖＩＩＩ含有微小胞の取り込みによる細胞の形質転換の誘導を示した図である。ＥＧＦＲｖＩＩＩ含有微小胞により前処理した後に、Ｕ３７３細胞の軟寒天コロニー形成能力の増加が観察される。
【図４Ｅ】ＥＧＦＲｖＩＩＩ含有微小胞の取り込みによる細胞の形質転換の誘導を示した図である。ＥＧＦＲｖＩＩＩ含有微小胞により前処理した後に、Ｕ３７３細胞の軟寒天コロニー形成能力の増加が観察される。
【図５】血液由来微小胞のウエスタンブロット分析を示した図であり、多形膠芽腫に罹患した６名の患者（レーン１〜６）の血液サンプルからの循環ＥＧＦＲｖＩＩＩの検出は、患者２（円で囲まれたバンド）、および可能性として患者３で実証される。
【図６Ａ】インビボの微小胞様構造を示した図である。ＳＣＩＤマウスにおける混合腫瘍異種移植中の２つの癌細胞の間の細胞間隙に存在する微小胞構造（黒色矢印）の透過型電子顕微鏡写真が示される（バー−１μｍ）。
【図６Ｂ】インビボの微小胞様構造を示した図である。ＥＧＦＲｖＩＩＩについての免疫金染色により、混合Ｕ３７３ｖＩＩＩ／Ｕ３７３−ＧＦＰ腫瘍内で見出される微小胞様構造と関連してこの受容体（白色矢印）が存在することが明らかにされる（バー−１００ｎｍ）。
【図７】図７は、インビボの混合腫瘍におけるＵ３７３ｖＩＩＩ細胞からのＦＬＡＧ／ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性材料の排出を示す。写真表示は、Ｕ３７３−ＧＦＰ神経膠腫細胞（緑色）およびＵ３７３ｖＩＩＩ−ＦＬＡＧ神経膠腫細胞（赤色）からなり、ＧＦＰ（緑色、パネルＡ）およびＦＬＡＧ（赤色、パネルＢ）についてそれぞれ染色した混合腫瘍の共焦点顕微鏡を示し；融合チャンネル（ＣおよびＤ）により、明らかにＦＬＡＧ／ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性細胞（Ｕ３７３ｖＩＩＩ−ＦＬＡＧ、パネルＣおよびＤの右側）だけではなく、ＧＦＰ陽性（Ｕ３７３−ＧＦＰ）細胞とも関連する、ＦＬＡＧ／ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性微小胞様構造（矢印）の存在が明らかにされる（バー−５μｍ）。
【図８】多形膠芽腫（ＧＢＭ）患者のコホートにおける微小胞（ＭＶ）関連ＥＧＦＲＩＩＩ癌遺伝子の検出を示した図であり、Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｔｕｍｏｒ  Ｂａｎｋ（ＴＯ）からの２４人の患者のコホート（ｃｏｈ．）において、（＋）は血液サンプル中の微小胞（ＭＶ）における癌タンパク質の検出またはＰＣＲを使用する腫瘍サンプルにおける癌遺伝子の検出を示し、（−）は癌タンパク質／癌遺伝子が検出されなかったことを示す。
【図９】ヒト癌株化細胞の異種移植を保持するＳＣＩＤマウスの血液から採取したＭＶにおけるＥＧＦＲシグナル（野生型ＥＧＦＲ（ｗｔ  ＥＧＦＲ）またはＥＧＦＲｖＩＩＩ突然変異体）の検出を示した図であり、ＳＣＣ由来４３１細胞は野生型ＥＧＦＲを発現し、神経膠腫由来Ｕ３７３ｖＩＩＩはＥＧＦＲｖＩＩＩ突然変異体を主として発現し、Ｃｃは対照マウス血漿サンプルであり、ＥＧＦＲシグナルはＥＧＦＲ  ＥＬＩＳＡを使用して検出される。
【図１０Ａ】ヒト腫瘍細胞によって培養培地の中へ放出された微小胞の積載物中の複数の癌に関する分子標的の検出を示した図である。示した株化細胞はウエスタン分析を使用して示したタンパク質について試験し、そこで（＋）は強い反応性を示し、（＋／−）は弱い反応性を示し、（−）は検出可能な反応性を示さない。
【図１０Ｂ】ヒト腫瘍細胞によって培養培地の中へ放出された微小胞の積載物中の複数の癌に関する分子標的の検出を示した図である。ウエスタンブロット分析の例を示し、検出されたタンパク質を右側に示し、細胞株を上で示す。
【図１１Ａ】４２個のリン酸化ＲＴＫについてのプローブを含有するリン酸化タンパク質の抗体アレイを使用する、複数のタイプのヒト癌細胞によって培養培地の中へ放出されたＭＶ中の複数のリン酸化受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のインビトロ検出を示した図である。相対的リン酸化が、アレイを使用して単一サンプルにおいて同時に検出できるＲＴＫの例をリストする。
【図１１Ｂ】４２個のリン酸化ＲＴＫについてのプローブを含有するリン酸化タンパク質の抗体アレイを使用する、複数のタイプのヒト癌細胞によって培養培地の中へ放出されたＭＶ中の複数のリン酸化受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のインビトロ検出を示した図である。示した細胞株からのＭＶにおいて検出された主要なリン酸化ＲＴＫを示す。
【図１１Ｃ】４２個のリン酸化ＲＴＫについてのプローブを含有するリン酸化タンパク質の抗体アレイを使用する、複数のタイプのヒト癌細胞によって培養培地の中へ放出されたＭＶ中の複数のリン酸化受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のインビトロ検出を示した図である。アッセイのアウトプットの例を示し、細胞株を右側に示す。
【図１２】ヒトＡ４３１腫瘍異種移植を保持するマウスの血液中の循環ＭＶのリンタンパク質プロファイルを調査するＲＴＫアッセイの一例を示した図である。ＥＧＦＲ／ＨＥＲ−１は表皮増殖因子受容体であり；ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ−２は表皮増殖因子受容体２であり；ＥｒｂＢ３／ＨＥＲ−３は表皮増殖因子受容体３であり；ＥｒｂＢ４／ＨＥＲ−４は表皮増殖因子受容体４であり；ＦＧＦＲ１は線維芽細胞増殖因子受容体１であり；ＦＧＦＲ２αは線維芽細胞増殖因子受容体αであり；ＩｎｓｕｌｉｎＲはインスリン受容体であり；ＩＧＦ−１Ｒはインスリン様増殖因子１受容体であり；ＡｘｌはＧａｓ６受容体であり；Ｄｔｋ／ＴＹＲ０３はＰＩ３Ｋと相互作用するＧａｓ６受容体であり；Ｍｅｒ／ＭＥＲＴＫは網膜色素変性症タンパク質であり；ＨＧＦＲ／ＭＥＴは肝細胞増殖因子受容体であり；ＭＳＰＲ／ＭＳＴ１Ｒ／ＲＯＮはマクロファージ刺激タンパク質受容体であり；ＰＤＧＦＲａは血小板由来増殖因子受容体αであり；ＰＤＧＦＲｂは血小板由来増殖因子受容体βであり；ＳＣＦＲ／ｃＫｉｔ／ＣＤ１１７は幹細胞刺激因子受容体であり；Ｆｌｔ−３／ＣＤ１３５はｆｍｓ−様チロシンキナーゼ受容体３であり；Ｍ−ＣＳＦＲ／ＣＳＦ１Ｒ／ＣＤ−１１５はマクロファージコロニー刺激因子受容体であり；ｃ−ＲｅｔはリガンドのＧＤＮＦファミリーの受容体であり；ＲＯＲ１はＲＡＲに関するオーファン受容体１（核、メラトニン結合）であり；ＲＯＲ２はＲＡＲ関するオーファン受容体１（核）であり；Ｔｉｅ−１は血管新生に関与するオーファン受容体であり；Ｔｉｅ−２はアンジオポイエチン受容体であり；ＴｒｋＡ／ＮＴＲＫ１は神経増殖因子（ＮＧＦ）受容体Ａであり；ＴｒｋＢ／ＮＴＲＫ２は脳由来神経栄養（ＢＤＮＦ）因子受容体であり；ＴｒｋＣ／ＮＴＲＫ３はニューロトロフィン３（ＮＴ−３）受容体であり；ＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ−１はＶＥＧＦ／ＰＩＧＦ受容体であり；ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１はＶＥＧＦシグナル伝達受容体であり；ＶＥＧＦＲ３／Ｆｌｔ−４はＶＥＧＦＣ／Ｄ受容体（リンパ管形成）であり；ＭｕＳＫは筋肉特異的キナーゼ／アグリン受容体（神経と筋肉のシグナル伝達）であり；ＥｐｈＡ１はエフリンタイプＡ受容体１であり；ＥｐｈＡ２はエフリンタイプＡ受容体２であり；ＥｐｈＡ３はエフリンタイプＡ受容体３であり；ＥｐｈＡ４／ＴＹＲＯ１／ＳＥＫはエフリンタイプＡ受容体４であり；ＥｐｈＡ６はエフリンタイプＡ受容体６であり；ＥｐｈＡ７はエフリンタイプＡ受容体７であり；ＥｐｈＢ１はエフリンタイプＢ受容体１であり；ＥｐｈＢ２／ＤＲＴ／Ｔｙｒｏ５はエフリンタイプＢ受容体２であり；ＥｐｈＢ４／ＭＹＫ１／ＴＹＲＯ１１はエフリンタイプＢ受容体４であり；ＥｐｈＢ６はエフリンタイプＢ受容体６である。
【図１３Ａ】ＥＧＦＲ駆動性の皮下腫瘍を有し、ＥＧＦＲ阻害剤ＣＩ−１０２２により処理したマウスの血液中の循環ＭＶにおけるリン酸化ヒトＥＧＦＲの減少を示した図である。ＣＩ−１０３３の毎日の用量への曝露に対するＡ４３１腫瘍およびＵ３７３ｖＩＩＩ腫瘍の反応性を示し、腫瘍体積（ｍｍ3）をＹ軸に示し、接種後の日数をＸ軸に示す。
【図１３Ｂ】ＥＧＦＲ駆動性の皮下腫瘍を有し、ＥＧＦＲ阻害剤ＣＩ−１０２２により処理したマウスの血液中の循環ＭＶにおけるリン酸化ヒトＥＧＦＲの減少を示した図である。２０ｍｇ／ｋｇのＣＩ−１０３３を７日間腹腔内処理したＡ４３１皮下腫瘍を有するマウス（上部）、および２０ｍｇ／ｋｇのＣＩ−１０３３を７日間腹腔内処理したＵ３７３ｖＩＩＩ腫瘍を有するマウス（下部）からのＭＶのウエスタンブロットを示し、抗リン酸化−ＥＧＦＲ抗体をウエスタン分析のために使用した。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
本発明によれば、被験体における発癌タンパク質の存在を検出する方法であり、被験体からサンプルを採取する工程と、サンプルから微小胞（ＭＶ）を単離する工程と、および微小胞における発癌タンパク質の存在を検出する工程とを含む方法が提供される。
【００５８】
微小胞における発癌タンパク質の検出によって被験体のサンプル中の癌を診断する方法も本明細書において提供される。
【００５９】
一実施形態において、癌はサンプル、例えば体液（血液、尿、脳脊髄液、リンパ液、腹水、唾液、洗浄物、精液および腺分泌物に加えて、糞便、滲出液、嚢胞の内容物および他のソース等）中の微小胞の分析によって検出される。
【００６０】
別の実施形態において、微小胞における発癌タンパク質の検出による癌の予後のための方法が提供される。
【００６１】
さらに他の実施形態において、癌の進行および／または治療への応答をモニタリングする方法が提供される。
【００６２】
本明細書において癌とは、増殖の非調和による過剰増加および細胞の分化能力の喪失に起因する細胞の増加を示す癌細胞の塊を指す。
【００６３】
「癌」という用語は、乳癌、大腸癌、肺癌、小細胞肺癌、胃癌、肝臓癌、白血病、骨肉腫、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚メラノーマもしくは眼内メラノーマ、子宮肉腫、卵巣癌、直腸癌もしくは結腸直腸癌、肛門癌、結腸癌（一般的には同じ実体が結腸直腸癌および大腸癌として判断される）、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、外陰部癌、扁平上皮癌、膣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織腫瘍、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性白血病もしくは急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓癌、尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系の腫瘍、神経膠腫、星状細胞腫、多形膠芽腫、原発性中枢神経系のリンパ腫、骨髄腫瘍、脳幹神経神経膠腫、下垂体腺腫、ぶどう膜メラノーマ（眼内メラノーマとしても公知）、睾丸癌、口腔癌、咽頭癌またはその組み合わせを含むが、これらに限定されない。一実施形態において、癌は脳腫瘍（例えば神経膠腫）である。別の実施形態において、癌は特定の癌タンパク質（例えばＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３など）を発現する。「癌」という用語は、小児腫瘍（白血病、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、神経膠腫、横紋筋芽細胞腫、肉腫および他の悪性腫瘍を含む）を含む小児癌も含む。
【００６４】
本発明の方法を使用して検出できる発癌タンパク質の非限定例は以下のとおりである。（ｉ）癌細胞に由来する膜関連癌タンパク質、例えば神経膠腫におけるＥＧＦＲｖＩＩＩ、扁平上皮癌、神経膠腫、肺癌または膀胱癌におけるＥＧＦＲ、乳癌突然変異体（例えばイレッサ感受性型、突然変異体型、または非発現型の腫瘍抑制タンパク質ＢＲＣＡ１および／またはＢＲＣＡ２）、肺癌におけるＥＧＦＲ、乳癌および卵巣癌におけるＨＥＲ−２、様々な転移性および侵襲性の癌におけるＭｅｔ、胃腸間質性腫瘍におけるＫｉｔ、神経膠腫におけるＰＤＧＦＲ、様々な腫瘍におけるＷｎｔ、様々なホスファターゼ；（ｉｉ）形質転換受容体の組み合わせクラスタ、例えば乳癌におけるＥＧＦＲ／ＨＥＲ−２、様々な腫瘍におけるＨＥＲ−２／ＨＥＲ−３；（ｉｉｉ）形質転換特性を備えた膜関連細胞質分子、例えば結腸直腸癌、膵臓癌および肺癌におけるＫ−ｒａｓ、神経膠腫および前立腺癌におけるＰＴＥＮ（欠損または不活性化）；（ｉｖ）脂質ラフトおよび微小胞において存在する（および活性のある）ことができるシグナル伝達複合体、例えばＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ、Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＭＡＰＫ；および（ｖ）腫瘍血管新生および抗血管新生に関係する腫瘍に関する内皮受容体、例えばＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−１、Ｔｉｅ−２およびＴＥＭ（例えばＴＥＭ−１、ＣＤ２７６）。これらのタンパク質は単独でまたは組み合わせで検出することができる。
【００６５】
発癌タンパク質の他の非限定例は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＭＥＴ、ｃＫｉｔ、ＰＤＧＦＲ、Ｗｎｔ、β−カテニン、Ｋ−ｒａｓ、Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｎ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｃ、ＩＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＰＩ３Ｋ、およびＡｋｔ；腫瘍抑制因子タンパク質（ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２およびＰＴＥＮ等）；癌に関するホスト受容体および微小胞関連分子（例えば、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−１、Ｔｉｅ−２、ＴＥＭ−１およびＣＤ２７６等の血管新生に関与するもの）を含む。発癌タンパク質、腫瘍抑制因子タンパク質、ホスト細胞に関する受容体および微小胞関連分子はすべて、本発明の方法、組成物およびキットにおいて単独でまたは組み合わせで使用できることが意図される。癌について機構的、診断的、予後上または治療法上重要であると判断される任意の発癌タンパク質および発癌タンパク質の任意の組み合わせは、本発明の方法、組成物およびキットにおいて使用できることがさらに意図される。
【００６６】
「発癌タンパク質」が突然変異遺伝子の産物であり、正常細胞の癌性腫瘍細胞への形質転換または悪性度低い癌の悪性度の高い癌への形質転換を引き起こすかまたはそれらに寄与するタンパク質であることは当該技術分野において周知である（総説に関しては、Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１０（８）：７８９−７９９，２００４；Ｃｒｏｃｅ，Ｃ．Ｍ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５８（５）：５０２−５１１，２００８を参照されたい）。
【００６７】
腫瘍形成の原因である３つの主なタイプの遺伝子があり、それらは癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子および安定性遺伝子である。癌遺伝子は一般的に、遺伝子によりコードされたタンパク質（発癌タンパク質）が、構成的に活性化、過剰発現、誤発現（例えば間違った時間または場所で）、または野生型タンパク質が活性化されない条件下で活性化されるように突然変異する。
【００６８】
これとは対照的に、腫瘍抑制遺伝子は一般的にそれらの遺伝子活性を減少させるように変異し、それは制御されない細胞増加および腫瘍形成をもたらす。安定性遺伝子も突然変異により一般的に不活性化される。これらの遺伝子は野生型形態において遺伝的突然変異を最小限にするように働くので「安定性遺伝子」と称される。それらは例えばＤＮＡ修復、体細胞組換えおよび染色体分離に関与する。これらの遺伝子の不活性化は全体的な突然変異率の増加を引き起こし、それは癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子において起こる腫瘍形成性突然変異の機会を増加させる。発癌タンパク質に加えて、腫瘍抑制因子および安定性遺伝子における変化も癌と関連し、癌を暗示し得ることはそれゆえ明らかである。
【００６９】
腫瘍抑制因子が突然変異を保有する細胞でのアポトーシスの誘導に役立つことも公知である。
【００７０】
腫瘍遺伝子突然変異が多くの場合経路またはネットワークにおいて機能することも十分に立証される。例えば、発癌タンパク質は下流のエフェクタータンパク質を調節するように作用することができ、それは今度は他のタンパク質を調節し、癌性形質転換を最終的にもたらすシグナル伝達事象のカスケードを引き起こす。したがって、発癌タンパク質自体における変化に加えて、かかる下流のエフェクタータンパク質またはメディエータータンパク質の変化も癌と関連し、癌を暗示し得ることは理解すべきである。
【００７１】
それゆえ、細胞形質転換を引き起こす発癌タンパク質に加えて、他のタンパク質における変化も腫瘍形成と関連し、腫瘍由来微小胞において検出できることは理解すべきである。他のかかるタンパク質は本明細書において「腫瘍に関するタンパク質」と称される。腫瘍に関するタンパク質の非限定例は以下のものを含む。腫瘍抑制因子タンパク質；安定性タンパク質；ならびに腫瘍に関する細胞受容体、細胞シグナル伝達のメディエーター、転写因子、核内受容体、癌および腫瘍形成と関連するバイオマーカー、ならびに腫瘍の血管新生、遊走または侵入と関連するタンパク質等の発癌タンパク質の下流タンパク質（すなわち下流のエフェクタータンパク質）。例えば、「腫瘍に関するタンパク質」という用語は、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−１、Ｔｉｅ−２およびＴＥＭ（例えばＴＥＭ−１、ＣＤ２７６）等の、腫瘍の血管新生および抗血管新生に関する腫瘍に関する内皮受容体を含む。腫瘍形成と関連する「腫瘍に関するタンパク質」の発現または活性における変化は腫瘍由来微小胞において決定することができる（例えば、腫瘍抑制因子タンパク質のダウンレギュレーションが腫瘍由来微小胞において観察できるか、または腫瘍に関する内皮受容体（ＶＥＧＲ−２またはＶＥＧＦＲ−１）の発現増加または活性化が観察できる）。発癌タンパク質に加えて、癌について機構的、診断的に、予後上または治療法上重要であると判断される任意の腫瘍に関するタンパク質は、本発明の方法および組成物およびキットにおいて使用できることが意図される。
【００７２】
一実施形態において、「ＭＶ関連タンパク質」という用語は、上で定義されるように、発癌タンパク質および腫瘍に関するタンパク質の両方を含み、それは本明細書において提供された方法に従って、腫瘍に由来する微小胞において検出され、腫瘍の検出、診断、予後、モニタリングなどに有用である。
【００７３】
本明細書において記載された本発明は、変異タンパク質を産生する細胞から放出される膜由来微小胞の積載物として存在する活性化受容体の細胞間移行を介して、神経膠腫細胞の間でＥＧＦＲｖＩＩＩ癌タンパク質を排出および共有することができるという新規で意外な観察に少なくとも部分的に基づく。実際、ＥＧＦＲｖＩＩＩは脂質ラフトに関する微小胞の形成を刺激し、この微小胞にＥＧＦＲｖＩＩＩは取り込まれるようになる。
【００７４】
ＥＧＦＲｖＩＩＩ癌タンパク質を含有する微小胞は、癌を有するマウスの馴化培地または血液に放出され、この受容体を欠損する腫瘍細胞の原形質膜と融合することができる。ＥＧＦＲｖＩＩＩのかかる移行は、下流のシグナル経路の活性化（ＭＡＰＫおよびＡｋｔ）、進行に関する遺伝子発現の変化（ＶＥＧＦ、ＢｃｌｘＬ、ｐ２７）、および細胞形質転換の悪化の兆候（特に形態変化および軟寒天コロニー形成効率の増加）を引き起こす。これらの観察は、癌細胞の異なるサブセットの間での形質転換タンパク質の水平伝播における膜微小胞の役割を指摘し、膜関連癌タンパク質の形質転換影響力が対応する突然変異遺伝子を保有する細胞を越えて広がり得ることを示唆する。
【００７５】
様々なタイプの活性化細胞は、膜微小胞（微粒子、エクトソームまたはアルゴソームとしても公知）を細胞周囲中へ産生および脱落させることが公知であり；かかる小胞がリソソーム経路から生じる事例ではそれらは大抵エキソソームと称される。これらの構造の生物学的役割はよく理解されていないが、分泌プロセス、免疫修飾、凝集および細胞間コミュニケーションを含み得る（Ｊａｎｏｗｓｋａ−Ｗｉｅｃｚｏｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｉｎｔ．Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，２０：７５２−７６０）。
【００７６】
微小胞の生成の機構、サイズおよび組成物は変動し得るが、多くの場合（特にエクトソーム）、機能的膜貫通タンパク質を含む膜脂質ラフトと関連する材料を含有する。例えば、凝固促進組織因子（ＴＦ）はこの様式で炎症性細胞から放出されることができ、重要なことには、その生物学的効果を発揮する血小板、内皮および他の細胞の膜の中へ続いて取り込まれるようになる。本明細書において使用される時、「微小胞」という用語は、微小胞、微粒子、エクトソーム、アルゴソーム、エキソソーム、腫瘍小胞、および細胞から放出された他のすべての小胞性構造体を含む。
【００７７】
ｐ５３腫瘍抑制遺伝子を欠損する癌細胞は、いくつかの実例において血液および細胞周囲環境に変化した量のＴＦ含有微小胞（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｌｏｏｄ，１０５：１７３４−１７４１）、または分泌性微小胞（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，６６：４７９５−４７８０１）を放出することによって、このプロセスを模倣することができる。
【００７８】
発癌受容体は多くの場合原形質膜の領域内に存在し、そこから微小胞は癌細胞において生じる（例えば脂質ラフト）。発癌受容体それ自体が微小胞積載物中に含まれようになり得ることが本明細書において開示される。このことは例えば悪性脳腫瘍（神経膠腫）において特に興味深く、そこでは膜関連ＥＧＦＲの活性化が主要な形質転換事象を示し、多形膠芽腫（ＧＢＭ）の症例の約３０％でＥＧＦＲｖＩＩＩ発癌突然変異体の発現が容易に検出可能である。
【００７９】
この現象をさらに探究するために、培養された活性化ＥＧＦＲ欠損Ｕ３７３神経膠腫細胞、およびＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するように操作したそれらの対応細胞（Ｕ３７３ｖＩＩＩ細胞）による微小胞の産生を検討した。興味深いことには、後者の細胞株におけるＥＧＦＲｖＩＩＩ癌遺伝子の存在は細胞表面上に複数の小胞の突出の形成、および培養培地の微小胞画分からのタンパク質の回収の増加が伴う効果をもたらした（図１Ａ、Ｂを参照されたい）。この材料は、比例する量のフロチリン−１（膜脂質ラフトと関連し、多くの場合様々なソースからのラフトに関する微小胞において見出されるタンパク質）を含有していた。まとめて、それは、膜脂質ラフトに由来する微小胞の産生の増加とＵ３７３ｖＩＩＩ細胞において観察されるＥＧＦＲｖＩＩＩに関する形質転換が結び付けられることを実証する。
【００８０】
特定の実施形態において、微小胞において濃縮されるタンパク質（ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ−２およびＭＥＴ等）は、当該技術分野において公知の様々な技法により検出することができる。例えば、微小胞の溶解物は抗体（抗ＥＧＦＲｖＩＩＩまたは抗ＥＧＦＲ）を使用する免疫ブロットにより分析できる。遠心分離による微小胞の濃縮は必要なことではあるが、全血漿の分析にわたって多くの定量的および定性的な利点も提供する。これは、微小胞単離が、特定の分子（例えばＥＧＦＲｖＩＩＩ）の検出の感度を改善（微小胞におけるそれらの濃縮に起因して）、特異性を増加（微小胞は原形質膜分子のランダムな採取でないので）、タンパク質分解、脱リン酸化または破壊から積載物を保護（微小胞膜に起因して）、および分析の範囲を拡大（微小胞積載物におけるタンパク質のユニークで診断的に有益な組み合わせの存在に起因して）できるからである。これに関しては、微小胞分析の感度は超遠心から精密濾過へ切り替えることによって増加させることができ、精密濾過は微小胞の回収を単純化し改善できる。微小胞タンパク質を検出する他の技法は、例えばアネキシンＶ（ＭＶが多量のホスファチジルセリンを発現するので）、またはＭＶの表面上で発現される発癌タンパク質を結合する抗体（抗ＥＧＦＲｖＩＩＩの抗体等）によりコートした磁性ビーズからの微小胞に関する材料の免疫沈殿である。さらに、２つの抗体（例えば２×抗ＥＧＦＲｖＩＩＩまたは抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋抗ＥＧＦＲ）に基づくＥＬＩＳＡアッセイ、または２つの抗体（例えば２×抗ＥＧＦＲｖＩＩＩまたは抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋抗ＥＧＦＲ）に基づく放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）も使用することができる。加えて、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体に基づく検出コンポーネントと併用して、アネキシンＶ（例えば市販のＴＦアッセイでのように）またはＥＧＦＲｖＩＩＩ／ＥＧＦＲ抗体によりコートした表面に対する微小胞の結合に基づくＥＬＩＳＡを使用することができる。使用することができる他の技法はフローサイトメトリー（微小胞が、例えばアネキシンＶもしくは微小胞の表面上に存在する分子（タンパク質、炭水化物および他のもの）に特異的な抗体または非抗体親和性試薬（受容体、アプタマー、レクチン、核酸配列など）によりコートしたビーズによって捕捉され、例えば抗ＥＧＦＲｖＩＩＩの抗体で染色される）、および質量分析（ＥＧＦＲが微小胞調製物のプロテオームにおいて検出される）を含む。親和性精製カラムおよびマルチプレックスプラットフォームを使用して微小胞を単離するために、すべてのかかる試薬および捕捉方法を使用することもできる。微小胞の調製およびタンパク質の検出のために当該技術分野において公知の標準的技法を本明細書において記載された方法において使用できることが意図される。
【００８１】
本発明は、ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質の大量発現がＵ３７３ｖＩＩＩ細胞自体だけでなくそれらに由来する微小胞の溶解物において検出されるという観察に少なくとも部分的に基づき、完全な形の癌タンパク質がこの様式で循環の中へ放出されることを実証する。親Ｕ３７３細胞は検出可能な量のフロチリン−１含有する微小胞を放出したが、それらは野生型ＥＧＦＲ（ｗｔＥＧＦＲ）の微量のみを含有し、ＥＧＦＲｖＩＩＩはない。これらの結果は、ＥＧＦＲ陰性内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびｗｔＥＧＦＲのみを発現するＡ４３１細胞に加えて、それぞれの微小胞調製物に対して確認された（図１Ｃ）。Ｕ３７３細胞はインビボで低悪性度の表現型を示すが、それらのＵ３７３ｖＩＩＩ対応細胞は、不可逆性低分子ｐａｎ−Ｅｒｂ阻害剤ＣＩ−１０３３の毎日の用量による阻害を受けやすい様式で、免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにおいて皮下腫瘍を容易に形成する（図１Ｄ）。Ｕ３７３ｖＩＩＩ腫瘍はＥＧＦＲｖＩＩＩについて強く染色されたが、ｗｔＥＧＦＲについては染色されず、興味深いことには、全身循環の中へＥＧＦＲｖＩＩＩ含有微小胞が排出された（図１Ｅ、Ｆ）。したがって、突然変異体ＥＧＦＲｖＩＩＩ遺伝子の発現は、完全な形のＥＧＦＲｖＩＩＩ癌タンパク質を含有する微小胞の細胞外放出と結び付いた神経膠腫細胞の侵攻性の増加を引き起こす。
【００８２】
ヒト神経膠腫における不均一なＥＧＦＲｖＩＩＩ発現は、異なる腫瘍細胞サブセットが共通の細胞間隙の中へＥＧＦＲｖＩＩＩ含有微小胞を脱落させ得ることを示唆する。微小胞がホスファチジルセリン依存性機構を介して細胞膜と容易に融合することができるので、この様式でより侵攻性の細胞から低悪性度の神経膠腫細胞へ発癌ＥＧＦＲｖＩＩＩを移すことができることは本明細書において実証される。そこで、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−陰性Ｕ３７３細胞を、ＥＧＦＲｖＩＩＩを保有するそれらのＵ３７３ｖＩＩＩ対応細胞、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タグ付加ＥＧＦＲｖＩＩＩ癌遺伝子（ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＧＦＰ）を発現するように操作したＵ３７３ｖＩＩＩ−ＧＦＰ細胞のいずれかから得られた微小胞の調製物と共にインキュベーションした。興味深いことには、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原およびＧＦＰ蛍光それぞれのデノボの表面発現によって実証されるように、これは、Ｕ３７３細胞による微小胞含有物の広汎な取り込みをもたらした（図２Ａ〜Ｄ）。
【００８３】
表向きは完全な形のＥＧＦＲｖＩＩＩ受容体の明らかな細胞間微小胞媒介性の移行は、「アクセプター」（Ｕ３７３）細胞についてこの事象のシグナル伝達効果（もしあれば）に関する疑問を提起する。この問題に取り組むために、Ｕ３７３細胞を、ＥＧＦＲｖＩＩＩ含有微小胞への曝露の２４時間後に、ＭＡＰＫおよびＡｋｔのカスケード（両者ともこの癌遺伝子の形質転換効果を下流に媒介することが公知である）の活性化について検査した。実際、Ｕ３７３原形質膜の中へＥＧＦＲｖＩＩＩの取り込みはＥｒｋ１／２リン酸化の一貫した増加をもたらした。この事象はＵ３７３由来微小胞として活性のあるＥＧＦＲｖＩＩＩの移行に依存し、ＥＧＦＲｖＩＩＩを含有しないものは効果がなかった。さらに、ｐａｎ−ＥｒｂＢ阻害剤（ＣＩ−１０３３）と共にＵ３７３ｖＩＩＩ由来微小胞を前インキュベーションすることによって、この受容体の不可逆性遮断剤はＥｒｋ１／２リン酸化を著しく減少させた（図３Ａ）。Ｅｒｋ１／２のリン酸化も、アネキシンＶ（微小胞の露出したホスファチジルセリン残基を遮断し、それによってＵ３７３細胞による微小胞の取り込みを遮断する）と共にこれらの微小胞を前インキュベーションすることによって停止された。これらの結果は、アクセプター細胞におけるＭＡＰＫ経路の活性化を引き起こすためには、Ｕ３７３細胞の表面とのＥＧＦＲｖＩＩＩ含有微小胞の間の単なる接触だけでなく、むしろそれらの実際の（ホスファチジルセリン依存性の）組み込みおよびＥＧＦＲｖＩＩＩ移行が必要とされることを実証する（図３Ｂ）。Ｕ３７３ｖＩＩＩ由来微小胞の取り込みは、アネキシンＶによって阻害できる様式で、Ｕ３７３細胞におけるＡｋｔのリン酸化も誘導し（図３Ｃ）、他の複数の事象（特にＰＤＫ１およびＲａｆのリン酸化）を引き起こした。
【００８４】
ＥＧＦＲｖＩＩＩ依存性経路の形質転換効果は、腫瘍増殖、生存および血管新生の原因である複数の遺伝子の脱調節によって最終的に媒介される。後者に関しては、Ｕ３７３ｖＩＩＩ由来微小胞に曝露されたＵ３７３細胞は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）（脳腫瘍血管新生の強力なメディエーターおよび公知のＥＧＦＲ標的）の産生において著しい（２〜３倍の）増加を示すことが指摘された。Ｕ３７３由来微小胞（ＥＧＦＲｖＩＩＩを欠く）、またはＵ３７３ｖＩＩＩからだがＣＩ−１０３３によりプレインキュベーションしたものは、ＶＥＧＦのこの放出を誘導することができなかったので、ＥＧＦＲｖＩＩＩ活性はこの効果について不可欠であった（図４Ａ）。これらの設定において、ＥＧＦＲｖＩＩＩ含有微小胞はＶＥＧＦプロモーター活性も強く刺激し、この効果はこの微小胞のアネキシンＶによる前処理によって停止された（図４Ｂ）。まとめて、これらの観察は、Ｕ３７３ｖＩＩＩ微小胞の取り込みが、ＭＡＰＫおよびＡｋｔ経路の活性化を介して、Ｕ３７３細胞によるＶＥＧＦ遺伝子発現およびタンパク質産生のＥＧＦＲｖＩＩＩ依存性増加を引き起こすことを実証する。
【００８５】
多くの場合ＶＥＧＦアップレギュレーションは発癌経路の活性化を予告するが、ＥＧＦＲｖＩＩＩの下流の細胞形質転換は細胞増殖および生存に直接関与する遺伝子の発現の変化によって媒介される。これに関しては、ＥＧＦＲｖＩＩＩ含有微小胞により処理したＵ３７３細胞は、抗アポトーシス性タンパク質ＢｃｌｘＬの発現の増加およびｐ２７／Ｋｉｐ１サイクリン依存性キナーゼ阻害因子のレベルの減少（両者とも公知のＥＧＦＲ標的）を示した（図４Ｃ、Ｄ）。この場合もやはり、これらの効果は、アクセプターＵ３７３細胞による微小胞取り込みをアネキシンＶを媒介して遮断することによって阻害された。他のＥＧＦＲｖＩＩＩ標的遺伝子（例えばｐ２１／Ｃｉｐ）の発現における類似のＥＧＦＲｖＩＩＩ依存性変化も観察された。
【００８６】
この材料に曝露されたＵ３７３細胞のより紡錘型の形態によって実証されるように、ＥＧＦＲｖＩＩＩ含有微小胞の取り込みによって誘発される前述の分子反応のレパートリーの機能的帰結は、より高度の細胞形質転換に引き起こすことができる（図２Ｂ）。Ｕ３７３細胞をＥＧＦＲｖＩＩＩ含有微小胞によりプレインキュベーションし、半固形培地における増殖について試験した（典型的な形質転換アッセイ）。顕著なことには、この様式での癌タンパク質の取り込みは、Ｕ３７３細胞による足場非依存性の軟寒天コロニー形成の２倍の増加を引き起こしたが、ＥＧＦＲｖＩＩＩ含有を欠く等量の微小胞への曝露は増加させなかった（図４  Ｄ、Ｅ）。
【００８７】
ヒトＧＢＭにおいて、腫瘍全体の増殖は増加するが、腫瘍細胞の少数の亜集団のみがＥＧＦＲｖＩＩＩ発現を引き起こす原発性遺伝子突然変異を保有することが十分認識される。これに関しては、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現が細胞微小胞の形成を誘発し、この膜貫通タンパク質が微小胞に取り込まれるようになり、細胞周囲微小環境（図６および７）および血液（図１Ｆ）に脱落されることが本明細書において開示される。本明細書において開示される実験は、脳腫瘍を占める細胞の間での形質転換活性の急速な細胞間移行のためのベヒクルとしてかかる活性のある癌遺伝子を含有する微小胞（オンコソーム）が働き得ることを実証する。これは、それぞれの突然変異を保持する細胞の濃縮なし（濃縮前）でさえ、増加した増殖能、生存能および血管新生能の水平伝播を引き起こすことができた。この従来は好ましいとされない細胞間相互作用の形態は、今までに提唱された、アポトーシスを起こした癌細胞からの非形質転換性（ファゴサイトーシス性）の対応細胞への発癌配列含有ＤＮＡ断片の移行とは根本的に異なる。微小胞交換は腫瘍刺激可溶性リガンドの分泌によって誘導されるパラクリン効果とも異なるが、膜関連（およびその結果として不溶性）の活性のある受容体の細胞間共有により後者の効果を増幅／修飾することができた。
【００８８】
ヒトＧＢＭにおいて、腫瘍細胞の少数の亜集団のみがＥＧＦＲｖＩＩＩ発現を引き起こす原発性遺伝子突然変異を保有することが確認されており、ＧＢＭに罹患する患者のヒト血漿から採取された微小胞において野生型ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩの両方のバンドは予想されるサイズで検出され、標準的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ手順を使用して分離された（図５）。
【００８９】
類似の微小胞移行は、様々なヒト腫瘍において作動可能な他の形質転換性の、突然変異の、アップレギュレートされた、またはそうでなければ活性化された膜関連発癌チロシンキナーゼ（例えばＨＥＲ−２、ｗｔＥＧＦＲ、ｃＫｉｔまたはＭＥＴ）およびタンパク質にも関与できることが包含される。ホスト細胞（例えば内皮）も癌遺伝子含有微小胞の標的であり得る。一態様において、ホスト細胞の腫瘍促進機能（例えば血管新生）は、微小胞移行によって悪化させることができた。反対に、腫瘍関連ホスト細胞は、多くの場合非常に変化するか、または顕在的な細胞遺伝学的変化でさえも含有し（Ａｋｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ  Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２００９）、それらに由来する微小胞（例えば内皮細胞の腫瘍内皮マーカー（ＴＥＭ）を含有する）は、診断、予後および予測の値を保持することができた。
【００９０】
細胞間の微小胞の交換を遮断できる薬剤（例えばアネキシンＶ誘導体）が、例えば、細胞と微小胞の融合の阻害によって、癌の広がりおよび増殖を阻害する治療剤として有用であり得ることも本明細書において包含される。一実施形態において、癌を治療する方法は、微小胞の交換を遮断する薬剤（例えばアネキシンＶおよび／またはその誘導体）を、それを必要とする被験体に対して投与することを含んで提供される。微小胞、微粒子、エクトソームまたはエキソソームの移行の遮断のために使用できる任意の薬剤も、本明細書において記載される本発明の方法において使用できることが意図される。かかる薬剤の他の非限定例は、Ｐ−セレクチンまたはそのリガンド（ＰＳＧＬ）を遮断する薬剤を含む。
【００９１】
他の態様において、本発明は、微小胞における分析の実行により複数の発癌タンパク質および／またはそれらの内部の複数のリン酸化部位の検出を可能にすることによって癌を診断する方法を提供する。例えば、微小胞のタンパク質組成物の分析によって、微小胞が、単独でまたは組み合わせで、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ−２、ｗｔＥＧＦＲ、ｃＫｉｔまたはＭＥＴを保有するかどうかを決定することによって癌を特徴づけることができる。体液中に見出される発癌タンパク質含有微小胞の数も、腫瘍の侵攻性（すなわち播種または転移の傾向）を決定する方法として使用することができる。本発明の方法はしたがって診断および／または予後を支援することができる。一実施形態において、乳癌の診断および／または予後はＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ−２の存在の検出によって決定することができる。別の実施形態において、腫瘍の診断および／または予後はＨＥＲ−２および／またはＨＥＲ−３の存在の検出によって決定される。別の実施形態において、結腸直腸癌の診断および／または予後は、腫瘍抑制因子ＰＴＥＮおよび／またはｐ５３等の腫瘍に関するタンパク質の非存在、ならびにＫ−ｒａｓおよび／またはｃ−Ｍｅｔ（侵攻性腫瘍を示す）等の発癌タンパク質の存在の検出によって決定される。
【００９２】
別の実施形態において、本発明は、癌の進行のモニタリングおよび／または治療または治療法レジメンの有効性のモニタリングの方法を提供する。例えば、発癌タンパク質（複数可）（例えば微小胞中に放出されたＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、ｃＫｉｔまたはＭＥＴ）の量および組成物のモニタリングによって腫瘍のサイズおよび性質を追跡することができる。例えば、より大きな腫瘍がより小さな腫瘍よりもより多くの細胞を含み、それゆえより多くの微小胞を放出するであろうことが期待される。これを使用して、腫瘍のサイズの変化（収縮、増殖、または同じ大きさで留まる、のいずれか）を測定する手段の提供によって、治療法をモニタリングすることができる。かかる方法は、全体としての患者集団または個々の患者における治療法の有効性の評価に価値があるだろう。癌の進行および／または治療への応答は、微小胞中に見出される発癌タンパク質の組み合わせの測定によってモニタリングできることも意図される。一実施形態において、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ−２は例えば乳癌において組み合わせて測定することができ、それによって、ある態様において実際の腫瘍サイズに関係ない、遺伝的状態（例えば遺伝子型）および悪性腫瘍の進行（または再発）に関する指標を提供する。他の実施形態において、例えばＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３またはＨＥＲ−２およびＥＧＦＲを組み合わせて測定することができる。さらに別の実施形態において、微小胞は完全な形の癌タンパク質を含有し得るので、癌タンパク質のリン酸化状態を決定して、標的化治療の効率をモニタリングまたは測定することができる。例えば、乳癌に由来する微小胞におけるＥＧＦＲ／ＨＥＲ−２の組み合わせのリン酸化状態のモニタリングは、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）等のＨＥＲ−２−指向性薬物、Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）等のＥＧＦＲ指向性薬物または類似の抗癌治療の効率を単独でまたは組み合わせで示すことができる。他の態様において、微小胞における発癌タンパク質を取り巻く分子環境（例えば他の分子、全体のプロテオームまたはリン酸化プロテオーム）を使用して癌の進行および／または抗癌治療の効率をモニタリングすることができる。例えば、微小胞におけるＰＴＥＮのリン酸化状態の存在または非存在は癌の進行および／または抗癌治療の効率を示し得る。
【００９３】
さらなる態様において、本発明は、抗癌治療または治療法レジメンの効率をモニタリングするおよび／または癌の進行をモニタリングする方法を提供する。本明細書において記載される方法において当該技術分野において公知の任意の抗癌治療または治療法レジメンを使用できることが意図される。本明細書において包含される治療および治療法レジメンの非限定例は、外科手術、放射線、化学療法、ならびに発癌および腫瘍増殖に関与する特異的機構を妨害する標的化癌療法および治療の投与を含む。標的化癌療法の非限定例は、チロシンキナーゼ関連標的を阻害する治療法（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標）、ＣＩ−１０３３、Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）およびＧｌｅｅｖｅｃ（登録商標）等）、ホルモン、サイトカイニンおよび増殖因子についての細胞外受容体結合部位の阻害剤（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、プロテアソーム阻害剤（Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標））、ならびにアポトーシスの刺激剤（Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ（登録商標））を含む。かかる標的化療法は、低分子、単クローン抗体、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、アプタマーおよび遺伝子治療を介して達成することができる。被験体に治療または治療法レジメンの組み合わせも投与することができる。当該技術分野において公知の他の任意の治療または治療法レジメンは、単独で、または他の治療または治療法レジメンと組み合わせて本明細書において記載される方法において使用することができる。
【００９４】
他の態様において、本発明は、微小胞における分析の実行により複数のリン酸化発癌タンパク質および／またはそれらの内部の複数のリン酸化部位の検出を可能にすることによって癌を診断する方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、微小胞における発癌タンパク質のリン酸化状態を測定することによる癌の進行のモニタリングおよび／または治療または治療法レジメンの有効性のモニタリングの方法を提供する。
【００９５】
ＥＧＦＲ等の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、単一の膜貫通ヘリックスによって細胞質ドメインに連結された細胞外リガンド結合ドメインを含有する。細胞質ドメインは、自己リン酸化および相同でないタンパク質キナーゼによるリン酸化に受ける保存されたタンパク質チロシンキナーゼコアおよび追加の調節配列を含有する。リガンドがＲＴＫの細胞外ドメインに結合する場合、他の隣接するＲＴＫとのＲＴＫの二量体化が誘発される。二量体化はタンパク質の細胞質キナーゼドメインの急速な活性化を引き起こし、これらのドメインについての第１の基質は受容体それ自体である。結果として、活性化受容体は複数の特異的細胞内チロシン残基上で自己リン酸化されるようになる。活性化受容体中の特異的チロシン残基のリン酸化は、Ｓｒｃ相同２（ＳＨ２）およびホスホチロシン結合（ＰＴＢ）ドメイン含有タンパク質についての結合部位を生成する。これらのドメインを含有する特異的タンパク質はＳｒｃおよびホスホリパーゼＣγを含み、受容体結合に際してこれらの２つのタンパク質のリン酸化および活性化はシグナル伝達経路の開始を引き起こす。相互作用する他のタンパク質はアダプタータンパク質として活性化受容体と共に作用し、それら自体の固有の酵素活性はない。これらのアダプタータンパク質は、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達カスケード等の下流のシグナル伝達経路にＲＴＫ活性化を結びつける。実質的にはすべてのＲＴＫの活性は、リガンド結合の不在においてでさえ、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤による細胞の処理によって促進することができる。したがって、細胞増加、生存および血管新生に関与する遺伝子の異常な発現を引き起こすＲＴＫまたは発癌受容体の持続的活性化は、活性化ループにおける１つまたは複数のホスホチロシン部位によって正に調節される。
【００９６】
ＲＴＫのリン酸化は複数の方法を使用して測定することができる。かかる方法の非限定例は、リン酸化特異的抗体、リン酸化の抗体のアレイ、ホスホチロシン残基に対する抗体による染色、およびリン酸化可能な基質による直接キナーゼアッセイを含む。微小胞上の複数の受容体のリン酸化状態を決定する他の方法は、質量分析計（ＭＳ）に関する方法を使用して全リン酸化プロテオームを査定することであり得る。リン酸化されたタンパク質（リン酸化タンパク質とも称される）およびタンパク質のリン酸化状態の測定および検出のための当該技術分野において公知の標準的技法は、本明細書において記載される方法において使用できることが意図される。
【００９７】
発癌形質転換は、ＭＶ関連タンパク質（癌遺伝子の誘発へのそのつながりは機構的に明らかであってもなくてもよいが、バイオマーカーとして使用のための意味がある）のより広い範囲の変化を引き起こすという手段で癌細胞に影響を与え得ることを本明細書においてさらに報告する。そこで、皮下のヒト腫瘍異種移植を保持するマウスの循環ＭＶ、またはヒト腫瘍細胞株の培養培地からのＭＶにおいて存在する癌関連タンパク質の同定を本明細書において報告する。これらのタンパク質は、例えば腫瘍の進行または抗腫瘍療法への応答のモニタリングに使用できるバイオマーカーを表わす。バイオマーカーは被験体における腫瘍の診断および予後のために使用することもできる。悪性腫瘍に関する多くのタンパク質（癌遺伝子、腫瘍抑制因子、受容体チロシンキナーゼおよび細胞シグナル伝達のメディエーター等）が、複数のタイプのヒト癌細胞に由来するＭＶにおいて検出されることを本明細書において実証する。バイオマーカーとして使用することができる、腫瘍由来ＭＶにおいて見出されるかかる癌関連タンパク質およびリンタンパク質の例は、表１〜４中で以下に与えられる。
【００９８】
ＭＶにおいて見出される癌関連タンパク質およびリンタンパク質は、ＨＥＲ−２等の公知の発癌タンパク質、およびＶＥＧＦＲ２またはＴｉｅ  ２（通常は上皮細胞上で見出される血管新生受容体）等の予想外のタンパク質の両方を含むことが指摘される。したがって、本明細書において実証されるような腫瘍由来ＭＶのタンパク質の含有物の分析は、腫瘍の微小環境およびホスト間質の複雑性を含む、腫瘍の特徴づけ、予後および診断を支援するだろう。腫瘍由来ＭＶのタンパク質含有物の決定は可能性のある新規治療標的の同定ももたらし得る。例えば、ＰＡＮＣ−１異種移植を保持するマウスからのＭＶにおいてヒトＶＥＧＦＲ３リンタンパク質が同定され、癌細胞関連ＶＥＧＦＲ３リンタンパク質が、少なくとも膵臓癌のサブセットについては、従来は好ましいとされないバイオマーカーおよび／または治療標的であったかもしれないことを示唆する（表４を参照されたい）。加えて、ＭＶにおいて存在するタンパク質の組み合わせはＭＶが由来する腫瘍の特徴であり得る（例えば、表４を参照されたい）。したがって、ＭＶのタンパク質もしくはリンタンパク質プロファイルまたはそのサブセットは、例えば抗腫瘍の療法のモニタリングのためにまたは腫瘍の診断もしくは予後のために本明細書において提供される方法において使用することができる。
【００９９】
本明細書において同定されたタンパク質の多くがリン酸化によって活性化または不活性化されることが公知のリンタンパク質であるので、癌関連タンパク質の活性化または機能的状態はそれらのリン酸化状態のモニタリングによる査定することができる。したがって、ＭＶ関連タンパク質のリン酸化状態も、単独でまたは組み合わせで、例えば抗腫瘍療法のモニタリングのためにまたは腫瘍の診断もしくは予後のために本明細書において提供される方法において使用することができる。
【０１００】
ＭＶ関連タンパク質およびリンタンパク質が本明細書において同定され、その組み合わせを本発明の方法およびキットにおいて使用できることを理解すべきである。
【０１０１】
一態様において、微小胞ベースの血液検査が本明細書において提供され、そこではＭＶが被験体からの血液のサンプルから単離され、ＭＶ関連タンパク質についてアッセイされるか、またはＭＶ関連タンパク質のリン酸化状態を査定するためにアッセイされる。かかる方法は、例えばＥＧＦＲｖＩＩＩおよび野生型ＥＧＦＲを発現するＭＶ、ヒト腫瘍細胞株の異種移植を有するマウス、および膠芽腫（ＧＢＭ）患者において以下に実証される。多数の癌細胞タイプ（乳癌、神経膠腫、脳腫瘍、肺癌、膵臓癌、皮膚癌、前立腺癌および結腸直腸癌等）におけるこのアプローチの実行可能性を実証した。
【０１０２】
生検標本ではなく循環ＭＶを使用するという他の潜在的利点は腫瘍不均質性の問題であることが注目される。腫瘍生検サンプルがＥＧＦＲｖＩＩＩについては陰性であるが、対応する血液ＭＶサンプルが陽性であることが１つの場合で観察された（実施例３を参照されたい）。したがって、全体的な腫瘍表現型／遺伝子型の代表でない組織生検サンプルを得ることで結果は誤解を招くが、血液サンプルは腫瘍全体の代表であり、したがってより信頼できる。
【０１０３】
一実施形態において、被験体の腫瘍における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質の存在を検出する方法であり、ＭＶが被験体からの体液（例えば血液）のサンプルから単離されて発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質についてアッセイされ、ＭＶにおけるタンパク質の存在が腫瘍におけるタンパク質の存在を示す方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、本明細書において提供された方法は、被験体からの生検標本において検出されない発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質を検出することができる。標準的な組織生検方法および組織病理学サンプリングによって発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質を見逃し得る場合、これらの方法は特に不均一な腫瘍の分析に有用かもしれない。したがって一態様において、本明細書において提供される方法は、被験体から得られた生検標本の発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質を検出しないリスクを減少または除去する。これらの方法は組織生検に対する非侵襲的な代替物も提供する。
【０１０４】
別の実施形態において、被験体から採取された体液（例えば血液）のサンプルから得られた微小胞において発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質が検出される、被験体の癌を検出する方法が提供される。一実施形態において、前記発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質は前記被験体から得られた生検標本において検出されない。他の実施形態において、被験体から採取された体液（例えば血液）のサンプルから得られた微小胞において発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質が検出される、被験体の転移癌を検出する方法が提供される。被験体のすべての転移部から生検標本を得ることが実際的でないかまたは不可能ないくつかの事例において、微小胞の分析を使用して、腫瘍における発癌タンパク質もしくは腫瘍に関するタンパク質の存在を決定、および／または発癌タンパク質もしくは腫瘍に関するタンパク質を検出しないリスクを減少もしくは除去することができる。
【０１０５】
他の態様において、被験体の腫瘍における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質のリン酸化状態を決定する方法であり、被験体から体液のサンプルを採取する工程と；サンプルから微小胞を単離する工程と；微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質のリン酸化状態を検出する工程とを含む方法であり、微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質のリン酸化状態が腫瘍における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質のリン酸化状態を示す方法が提供される。一態様において、体液は血液である。
【０１０６】
さらなる態様において、被験体における癌の予後を診断または決定する方法であり、被験体から体液（例えば血液）のサンプルを採取する工程と；サンプルから微小胞を単離する工程と；微小胞における発癌タンパク質および／または腫瘍に関するタンパク質を決定する工程とを含む方法が提供される。
【０１０７】
一態様において、微小胞における発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および／またはＭＶ関連タンパク質は、（例えば癌型の）診断および／または予後に役立つ。
【０１０８】
本発明は、本発明の範囲を限定するのではなく説明するために与えられる以下の実施例の参照により容易に理解される。
【０１０９】
実施例１
細胞培養および微小胞（ＭＶ）の単離
微小胞を枯渇されたウシ胎仔血清ＦＢＳを含有する培地中で、以前に記載されたように（Ｖｉｌｏｒｉａ−Ｐｅｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ  Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９７，６：１５２３−１５３０；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｌｏｏｄ，１０５：１７３４−１７４１）、Ｕ３７３（ヒト星状細胞腫）細胞、Ｔｅｔ−ｏｆｆ調節されるＥＧＦＲｖＩＩＩまたは緑色蛍光タンパク質（ｐＥＧＦＰＮ１）カセットにＣ末端で融合したＥＧＦＲｖＩＩＩ（Ｕ３７３ｖＩＩＩ−ＧＦＰ））を発現する安定したバリアントＵ３７３ｖＩＩＩおよびＡ４３１が維持される。ＨＵＶＥＣ細胞はＥＧＭ−２（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗａｌｋｅｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）中で維持される。以前に記載されたように（Ｙｕ  ＆  Ｒａｋ，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ，２００４，２：２０６５−６７；Ａｌ−Ｎｅｄａｗｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，２５：１７４４−１７４９）、微小胞を馴化培地またはマウス血漿から採取する。簡潔には、培地に３００ｇおよび１２０００ｇで２つの連続した遠心分離を行ない、細胞および残屑を除去する。微小胞を１０００００ｇで２時間の超遠心によってペレットにし、タンパク質含有量を定量し、ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩについて含有物を分析した。走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）のために、細胞をカバースリップ上で増殖させ、２．５％グルタルアルデヒドで固定し、１％ＯｓＯ４で染色し、金で覆い、ＪＥＯＬ  ８４０Ａ装置の使用して可視化する。インビボの分析のために、免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、カナダ）への１〜１０×１０6のＵ３７３ｖＩＩＩ細胞またはＵ３７３細胞の注入によって、腫瘍を生じさせる。いくつかの事例において示されるようにｐａｎ−ＥｒｂＢ阻害剤ＣＩ−１０３３により毎日マウスを処理する。血液を、癌を有するマウスまたは対照マウスから心臓穿刺によって採取し、ヘパリン処理注射器の中へ入れる。血小板不含有の血漿を使用して微小胞を調製する。
【０１１０】
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）は用いて生存しており透過性ではない細胞の表面上でＥＧＦＲｖＩＩＩまたはＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＧＦＰを検出し、これらの受容体を内因的に発現した細胞、または微小胞の移行に際してかかる発現を捕捉した細胞で行う。典型的には、Ｕ３７３細胞を、Ｕ３７３ｖＩＩＩまたはＵ３７３ｖＩＩＩ−ＧＦＰ細胞から得られた微小胞（ＭＶ）により２４時間処理する。次いで細胞を２ｍＭ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を使用して剥がして単一細胞懸濁液を得て、その小分け（１．５×１０6／サンプル）を１％ＦＢＳおよび０．１％アジ化ナトリウム含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄する。次いでＵ３７３ｖＩＩＩ由来ＭＶにより処理された細胞を例えばＥＧＦＲｖＩＩＩに対する単クローン抗体（Ｚｙｍｅｄ）により４℃で３０分間染色する。洗浄後に、サンプルをＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗マウス二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）により４℃で３０分間インキュベーションし、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）により洗浄し、分析する。Ｕ３７３ｖＩＩＩ−ＧＦＰ細胞に由来するＭＶによる処理の事例では、新鮮な細胞懸濁物をＧＦＰ蛍光について直接分析する。データーは、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して捕捉することができる。
【０１１１】
インビボの実験はすべて、６〜８週間齢の重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｓａｉｎｔ−Ｃｏｕｓｔａｎｔ、ＱＣ、カナダ）中で実行される。簡潔には、１〜１０×１０6のＵ３７３ｖＩＩＩ細胞またはＵ３７３細胞を０．２ｍｌのＰＢＳ中で皮下注射する。血液を心臓穿刺によってマウスから採取し、ヘパリンナトリウム溶液の中へ入れる。血小板不含有血漿を２０００ｇで１５分間、２０００ｇで５分間、および１６０００ｇで５分間の遠心分離によって調製して、微小胞を単離した。
【０１１２】
実施例２
微小胞移行アッセイ
Ｕ３７３（アクセプター）細胞を２４時間微小胞により処理し、単一細胞懸濁液をＥＧＦＲｖＩＩＩまたはＧＦＰの発現についてフローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡によって分析する。シグナル伝達事象を検出するために、微小胞の添加前にＵ３７３を０．５％ＦＢＳ（ＤＭＥＭ）中で飢餓状態にし、そのまま、または示された濃度のアネキシン−ＶもしくはＣＩ−１０３３によりプレインキュベーションする。微小胞関連分子（ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＴＦ）の発現、ならびに全体のおよび活性化されたＭＡＰＫおよびＡｋｔの発現に加えて、他の変化は、免疫ブロット（ＢｃｌｘＬ、ｐ２７／Ｋｉｐ１）、ＥＬＩＳＡ（ＶＥＧＦ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはプロモーター活性アッセイ（ＶＥＧＦ）によって、別記されるように（Ｌｏｐｅｚ−Ｏｃｅｊｏ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，４０：４６１１−４６２０）、アッセイされる。軟寒天コロニー形成アッセイのために、微小胞または対照培地により前処理した等しい数の細胞からの単一細胞懸濁液を０．３％アガロース中で調製する。培養を０．５％アガロースによりプレコートしたプレート中で樹立し、４を超える細胞を含有するコロニーをすべてカウントする。
【０１１３】
実施例３
多形膠芽腫に罹患した患者における循環ＥＧＦＲｖＩＩＩの検出
癌を有するマウスの血漿について以前に記載されたものと類似の様式（Ａｌ−Ｎｅｄａｗｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０：６１９−６２４）で、微小胞をヒト血漿から採取する。簡潔には、保管された血液サンプルに３００ｇで５分間および次いで１２０００ｇで２０分間の連続した２つの遠心分離を行って、細胞および残屑を除去する。最終的に、１０００００ｇで２時間の遠心分離後に微小胞を得て、大量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄する。タンパク質溶解物は、１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ６．８）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＮａＦ、３０ｍＭピロリン酸ナトリウム、２％（重量／体積）ＳＤＳ、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）および１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４を含有する溶解緩衝液中で、氷上で１０分間調製する。特別の指示の無い限り、溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、例えばマウスもしくはヒツジの抗ヒトＥＧＦＲポリクローナル抗体または適切なマウス単クローン抗体による免疫ブロットに行う。適切なＨＲＰコンジュゲート二次抗体および化学発光プラスキット（ＥＣＬキット；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）を使用して免疫検出を遂行し、その後ブロットをスキャンし、例えばＳｔｏｒｍ  ８６０スキャナ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してタンパク質バンドを定量する。野生型ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩバンドの両方はこの様式で予想されるサイズで検出され、標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ手順を使用して分離される。
【０１１４】
ＥＧＦＲｖＩＩＩ癌タンパク質は、ウエスタン分析を使用して、Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｔｕｍｏｒ  Ｂａｎｋからの２４名のＧＢＭ患者のコホートから採取された循環ＭＶにおいても検出された（図８）。ＭＶにおける癌タンパク質の検出は、同じ患者からの腫瘍サンプルにおけるＥＧＦＲｖＩＩＩ癌遺伝子の検出とよく相関していた（図８）。これらの結果は、癌患者における循環ＭＶにおける癌タンパク質検出の実行可能性を実証する。特に、患者＃４については、癌遺伝子は腫瘍サンプルにおいてＰＣＲを使用して検出されなかったが、癌タンパク質はＭＶにおいて検出された。この結果は、いくつかの事例において、ＭＶ分析は、癌関連バイオマーカー（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）の検出についてはＰＣＲよりも感度が高いかもしれないことを示す。さらに、ＭＶに関するＥＧＦＲシグナルが腫瘍細胞から発散され得る可能性があり、これは除去されず、再発を引き起こすことが予想される。
【０１１５】
ＥＧＦＲシグナルは、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ヒト異種移植を有するＳＣＩＤマウスの血液から採取したＭＶにおいて検出された（図９）。ＥＧＦＲｖＩＩＩと交差反応する抗ＥＧＦＲの抗体を含有する市販のＥＧＦＲ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＹＣ  １８５４−５）を使用して、神経膠腫由来Ｕ３７３ｖＩＩＩ細胞の異種移植を保持するマウスからのＭＶにおけるＥＧＦＲｖＩＩＩ、および扁平上皮癌（ＳＣＣ）由来Ａ４３１細胞における野生型ＥＧＦＲを検出した。これらの結果は、ＥＧＦＲの両方の形態がＥＬＩＳＡアッセイによって容易に検出されることを示し、ＭＶベースのバイオマーカー検出の実行可能性を確認する。
【０１１６】
実施例４
ＭＶにおける複数の癌に関する分子標的の検出
ヒト腫瘍細胞株によって培養培地の中へ放出された微小胞を単離し、ウエスタン分析を使用して微小胞の積載物における悪性腫瘍に関する複数のタンパク質（癌遺伝子、腫瘍抑制因子および細胞シグナル伝達のメディエーター等）を検出した。神経膠腫細胞株（Ｕ３７３、Ｕ３７３ｖＩＩＩ、Ｕ８７およびＵ８７ｖＩＩＩ）、肺癌細胞（Ａ５４９）、乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、前立腺癌細胞（ＰＣ−３）および結腸直腸癌細胞（ＤＬＤ−１、ＨＣＴ１１６およびＣａＣｏ２）を使用した。推定上の癌タンパク質Ｋ−ｒａｓ、ｃ−Ｍｅｔ、β−カテニンおよびＰＤＧＦＲならびに腫瘍抑制遺伝子産物ＰＴＥＮ、ＴＰ５３およびＥ−カドヘリンを、微小胞において試験した。結果は図１０Ａ中に示され、（＋）は着実な反応性を示し、（＋／−）は弱い反応性を示し、（−）検出可能な反応性がないことを示す。ウエスタンブロット分析の例は図１０Ｂ中に示される。
【０１１７】
示されるように、培養した細胞株から得られたＭＶ調製物の全細胞溶解物に対してウエスタンブロット分析を実行した。使用した抗体は以下を含んでいた。Ｐａｎ  Ｒａｓ：ウサギモノクローナル［Ｙ１３１］、カタログ番号（ａｂ３２４４２）、Ａｂｃａｍ；Ｋ−ｒａｓ：マウスモノクローナル抗体、カタログ番号ＡＴ２６５０ａ、Ｂｉｏｌｙｎｘ  Ｉｎｃ．；Ｃ−Ｍｅｔ：ウサギモノクローナル［ＥＰ１４５Ｙ］、カタログ番号（ａｂ５１０６７）、Ａｂｃａｍ；ＰＤＧＦＲ−ｂ２：マウスモノクローナル、カタログ番号（ａｂ１０８４７−１００）、Ａｂｃａｍ；β−カテニン：マウスモノクローナル、カタログ番号（ＭＡ  １−３０１）、ＡＢＲ；Ｅ−カドヘリン：マウスモノクローナル［ＭＢ２］、カタログ番号（ａｂ８９９３）、Ａｂｃａｍ；ＰＴＥＮ：ウサギモノクローナル、カタログ番号（＃９１８８）、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；Ｐ５３：ウサギモノクローナル、カタログ番号（＃２５２７）、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ。この研究において使用される細胞株は研究室において現在使用され、様々なソース（ＡＴＣＣ、共同研究者）から得られたストックを表わし、それゆえほかの場所で維持された類似した名前の細胞株とは分子的な状態が異なり得ることが指摘される。これらの結果は、ＭＶにおいて存在し検出可能な癌に関連する分子標的の範囲が広いことを実証する。例えば、リン酸化されたＭＶ関連ＲＴＫはインビボで検出することができる。この結果は、この様式でヒト腫瘍タイプの多様性を分析できることも実証する。
【０１１８】
実施例５
ＭＶに関連する癌に関するタンパク質の持続的機能的状態（リン酸化／活性化）の実証
４２のＲＴＫについてのプローブを含有するリン酸化タンパク質の抗体アレイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、複数のタイプのヒト腫瘍細胞株によって培養培地の中へ放出された微小胞における複数のリン酸化ＲＴＫをインビトロで検出した（図１１）。図１１Ａは、リン酸化ＲＴＫの抗体アレイを使用して、相対的リン酸化が単一のサンプルにおいて同時に検出できるＲＴＫの例をリストする。アレイは１１９のスポットを有し、４２の異なるリン酸化されたＲＴＫを検出できる。図１１Ｂは、示された細胞株からのＭＶにおいて検出された主要なリン酸化ＲＴＫを示す。アッセイのアウトプットの例は図１１Ｃ中に与えられる。この結果は多数のＭＶ関連リン酸化タンパク質を検出できることも示す。主要なＭＶ関連リン酸化タンパク質は、例えば、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ３、ＥｐｈＢ２、ＲＯＲ１、ＥｐｈＡ２およびＥｐｈＡ４を含む。
【０１１９】
この研究において使用される細胞株は研究室において現在使用され、様々なソース（ＡＴＣＣ、共同研究者）から得られたストックを表わし、それゆえほかの場所で維持された類似した名前の細胞株とは分子的な状態が異なり得る。加えて、得られた結果は、この検出のために使用された特異的抗体およびそれらが標的化するリン酸化エピトープに依存することが指摘される。アレイにおいて使用される抗体はユニークであり、同じＲＴＫに指向性のある他のリン酸化特異的抗体と重複しない反応性を有する可能性がある。
【０１２０】
これらの結果は、癌細胞の微小胞において含有される受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）が持続的リン酸化を有し、それゆえ持続的活性化および機能的状態を有することを実証する。
【０１２１】
ＥＧＦＲｖＩＩＩ駆動性ＧＢＭ細胞から放出されたＭＶにおいて含有または濃縮されるリン酸化タンパク質のインビトロプロファイリングを大スケールでも実行した。細胞シグナル伝達タンパク質発現およびリン酸化のプロファイリングのために６５０を超える異なるリン酸化部位特異的抗体からなるＫｉｎｅｘ（商標）抗体マイクロアレイを使用した（Ｋｉｎｅｘｕｓ  Ｉｎｃ．）。アレイは、調節サブユニットおよび他のタンパク質において、２４８のユニークなリン酸化特異的抗体リン酸化部位、１２１のキナーゼリン酸化部位、２つのホスファターゼリン酸化部位および１２５のリン酸化部位を検出することができる。Ｋｉｎｅｘ（商標）抗体マイクロアレイを使用して、ヒトＧＢＭ細胞によって産生されたＭＶのリン酸化プロテオームを分析した。ＭＶのリン酸化プロテオームにおけるＥＧＦＲｖＩＩＩ依存性変化を同定するために、Ｕ３７３Ｐ（親Ｕ３７３とも称される）細胞（非トランスフェクション、非腫瘍形成性細胞）およびＵ３７３ｖＩＩＩ細胞の両方を使用した。各々の事例において、ＭＶから得られた値を細胞から得られた値に対して正規化した。例示的な結果は表１および２において以下に与えられ、そこではリン酸化タンパク質（Ｐ−タンパク質）は左側カラムにおいて与えられ、正規化正味中央値シグナル（ＮＮＭＳ）は右側カラムにおいて与えられる。ＭＶにおいて最も多量に見出されるタンパク質が表１および２中に示される。表３は、Ｋｉｎｅｘ（商標）抗体アレイを使用してＵ３７３−ＭＶにおいて検出されたリンタンパク質のさらなる例を示す；これらのタンパク質は、検出された２００を超えるリンタンパク質のサンプリングを表わす。表３．１は、ＭＶにおける別の部位（例えばＥＧＦＲのＹ１０６８またはＹ１１１０）のリン酸化をモニタリングできることを示す。
【０１２２】
この結果は、ＭＶにおいて多数のリン酸化され、それゆえ活性化されたタンパク質があることを示し、その多くは癌における役割および／または予測値を有することが公知である。加えて、Ｋｉｎｅｘ（商標）抗体アレイおよびＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓからのリン酸化タンパク質の抗体アレイの両方を使用する本明細書において示された結果は、複数の発癌分子、シグナル伝達分子および生物学的活性分子の標的が、癌細胞由来ＭＶにおいて（細胞培養馴化培地から回収されたＭＶおよびヒト腫瘍異種移植を保持するマウスの血液から回収されたＭＶの両方について）同時に検出できることを実証する。
【０１２３】
表１  Ｋｉｎｅｘ（商標）アレイ−最も高い正味正規化中央値シグナルのＭＶ関連リンタンパク質（Ｕ３７３Ｐ−細胞対Ｕ３７３Ｐ−ＭＶ）
【表１】
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【０１２４】
表２  Ｋｉｎｅｘ（商標）アレイ−最も高い正味正規化中央値シグナルのＭＶ関連リンタンパク質（Ｕ３７３ｖＩＩＩ−細胞対Ｕ３７３ｖＩＩＩ−ＭＶ）
【表２】
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【０１２５】
表３  Ｕ３７３−ＭＶにおいて検出されたリンタンパク質の例
【表３】
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【０１２６】
表３．１  Ｋｉｎｅｘ（商標）−癌細胞（Ｕ３７３）によって放出されたＭＶにおける受容体（ＥＧＦＲ）リン酸化部位の冗長および非冗長検出の例
【表３．１】
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【０１２７】
これらの結果は、リン酸化形態でＭＶにおいて見出すことができる分子のタイプの範囲を示す。これはインビトロアッセイであるが、ＭＶにおける癌遺伝子に関する変化（そのいくつかはＭＶ関連変化であり得るが必ずしも発癌変化というわけではない）の範囲が、予想外に大きいことが注目される。
【０１２８】
この結果は、リン酸化−脱リン酸化を決定できるだけでなく、分子の異なる機能（異なる標的との相互作用および再利用など）に関与する別個のリン酸化部位の状態をモニタリングすることができる（例えばＥＧＦＲのＹ１０６８またはＹ１１１０）ことも示す。この情報はＭＶの分析から容易に入手可能であるが、腫瘍サンプルの同等の分析を使用してこの情報を得ることは困難で、恐らく可能ではないだろう。
【０１２９】
実施例６
ヒト腫瘍異種移植を有するマウスにおける循環ＭＶのリンタンパク質プロファイルの決定
次いで、ヒト腫瘍異種移植を保持するマウスの血液中の循環ＭＶのヒトリンタンパク質プロファイルをインビボで解析した（表４；図１２）。示されたヒト癌細胞株の異種移植を、細胞の皮下接種によってＳＣＩＤマウスにおいて行った。腫瘍を形成させた。腫瘍が直径１７ｍｍのエンドポイントに到達した時にマウスを屠殺し、腫瘍を有するマウス４〜５匹をプールした血漿からＭＶを単離した。タンパク質溶解物を生成し、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓからの抗ヒトＲＴＫリンタンパク質抗体アレイをプロービングするために使用した。
【０１３０】
結果は以下の表４中に与えられ、Ａ４３１異種移植を持つマウスからの循環ＭＶについてのＲＴＫアッセイの一例は図１２中に示される。この結果は、複数のタイプのヒト腫瘍（乳房腫瘍、結腸腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍、肺腫瘍、皮膚腫瘍および脳腫瘍等）の代表の腫瘍異種移植を保持するマウスにおける循環ＭＶにおいて複数のリン酸化ＲＴＫが含有されること、およびこれらのリン酸化ＲＴＫはＭＶにおいて容易に検出できることを実証する。
【０１３１】
表４  ヒト腫瘍異種移植を保持するマウスの血液における循環ＭＶのリンタンパク質プロファイル
【表４】
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【０１３２】
実施例７
ＭＶ関連ＲＴＫのリン酸化状態が標的化療法に応答性であるという実証
バイオマーカーとしてＭＶを使用して癌遺伝子指向性治療剤への応答をインビボでモニタリングきるかどうかを決定するために、ＥＧＦＲ駆動性の皮下腫瘍を有するマウスをＥＧＦＲ阻害因子ＣＩ−１０３３により処理した（図１３）。２０ｍｇ／ｋｇのＣＩ−１０３３の腹腔内投与による７日間の処理後に、マウスの腫瘍サイズを測定し（図１３Ａ）、抗リン酸化ＥＧＦＲ抗体を使用するウエスタンブロット分析を使用して、マウスの循環ＭＶにおけるＥＧＦＲのリン酸化状態を決定した（図１３Ｂ、Ａ４３１の皮下腫瘍を有するマウスからのＭＶを上部に示し、Ｕ３７３ｖＩＩＩ腫瘍を有するマウスからのＭＶを下部に示す）。Ａ４３１腫瘍およびＵ３７３ｖＩＩＩ腫瘍の両方はＣＩ−１０３３の毎日の用量への曝露に対して応答性であった。さらに、ウエスタン分析によって見られるように、ＥＧＦＲ駆動性の皮下腫瘍を有しＥＧＦＲ阻害因子ＣＩ−１０３３により処理されたマウスの血液中の循環ＭＶにおけるリン酸化ヒトＥＧＦＲの存在は減少した。野生型ＥＧＦＲ（Ａ４３１細胞）に比較して、変異受容体ＥＧＦＲｖＩＩＩ（Ｕ３７３ｖＩＩＩ）の事例におけるＥＧＦＲ阻害の程度はより低く、これは差異的な抗腫瘍効果に反映されている。
【０１３３】
この結果は、ＭＶ関連活性のあるＲＴＫのリン酸化状態（それは発癌性である）が、これらの受容体で指向性のある全身性標的療法に対して応答性であり、これらの発癌標的の状態が、ＭＶの単離およびそれらの含有物の分析に基づいた血液検査を使用してモニタリングできることを実証する。これらの結果は、バイオマーカーとして循環ＭＶを使用して癌遺伝子に指向性のある治療剤への応答をインビボでモニタリングできることを示す。
【０１３４】
本明細書において引用されたすべての文書および参照文献の内容の全体は、参照として本明細書に援用される。本発明はその具体的な実施形態と関連して記載されているが、さらなる修飾が可能であることが理解され、本出願は一般に本発明の原則に従って本発明のいかなる変形、使用または改造をカバーすることを意図し、本発明が属する当該技術分野で公知または慣習的な実施の範囲内に生ずるような、および上文に記載される本質的特徴に適用され得るような、ならびに添付の請求項の範囲に従うような、本開示からのかかる逸脱を含む。
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図１０Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ｂ】
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【国際調査報告】
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