(57)【要約】  本発明は、完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物、および完全ノックアウトＡＨＡＳアレルと除草剤耐性ＡＨＡＳタンパク質をコードするＡＨＡＳアレルの組合せを含むアブラナ属植物、完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを表す核酸配列、ならびに除草剤耐性植物を得るために用いることができる前記植物およびアレルを作製および同定する方法に関する。
2013514791.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
そのゲノム中に少なくとも１つの突然変異体ＡＨＡＳアレルを含み、前記突然変異体ＡＨＡＳアレルが完全ノックアウトＡＨＡＳアレルである植物。
【請求項２】
前記完全ノックアウトアレルが終止コドン突然変異を含む、請求項１に記載の植物。
【請求項３】
前記完全ノックアウトアレルが、
ａ）配列番号：１のｎｔ８７１〜８７３もしくは配列番号：３のｎｔ８２６〜８２８に対応する位置に終止コドンを含むヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号：１のｎｔ８６２〜８６４もしくは配列番号：５のｎｔ８０８〜８１０に対応する位置に終止コドンを含むヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号：１のｎｔ７７５〜７７７もしくは配列番号：５のｎｔ７２１〜７２３に対応する位置に終止コドンを含むヌクレオチド配列；または
ｄ）配列番号：１のｎｔ７９９〜８０１もしくは配列番号：５のｎｔ７４５〜７４７に対応する位置に終止コドンを含むヌクレオチド配列
からなる群から選択される、請求項１または２に記載の植物。
【請求項４】
そのゲノム中に少なくとも１つの第２の突然変異体ＡＨＡＳアレルをさらに含み、前記第２の突然変異体ＡＨＡＳアレルが除草剤耐性ＡＨＡＳタンパク質をコードする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の植物。
【請求項５】
前記除草剤耐性ＡＨＡＳタンパク質が、配列番号：２の位置１９７、または配列番号：４の位置１８２または配列番号：６の位置１７９に対応する位置にセリンを含む、請求項３または４に記載の植物。
【請求項６】
前記除草剤耐性ＡＨＡＳタンパク質が少なくとも２つのアミノ酸置換を含む、請求項４または５に記載の植物。
【請求項７】
前記除草剤耐性ＡＨＡＳタンパク質が、配列番号：２、配列番号：４または配列番号：６との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の植物。
【請求項８】
前記ＡＨＡＳアレルが、配列番号：１、配列番号：３または配列番号：５との少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の植物。
【請求項９】
カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）、カブ（Ｂ．ｒａｐａ）、アビシニアガラシ（Ｂ．ｃａｒｉｎａｔａ）、ブラッシカ・オレラセア（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ）およびクロガラシ（Ｂ．ｎｉｇｒａ）からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の植物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の植物の植物細胞、種子、または子孫。
【請求項１１】
ａ）受託番号ＮＣＩＭＢ４１６９０の下、２００９年１２月１７日にＮＣＩＭＢ  Ｌｉｍｉｔｅｄに寄託されたＡＨＡＳ１−ＨＥＴＯ１１２を含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種子；
ｂ）受託番号ＮＣＩＭＢ４１６８７の下、２００９年１２月１７日にＮＣＩＭＢ  Ｌｉｍｉｔｅｄに寄託されたＡＨＡＳ３−ＨＥＴＯ１０２を含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種子；
ｃ）受託番号ＮＣＩＭＢ４１６８８の下、２００９年１２月１７日にＮＣＩＭＢ  Ｌｉｍｉｔｅｄに寄託されたＡＨＡＳ３−ＨＥＴＯ１０３を含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種子；または
ｄ）受託番号ＮＣＩＭＢ４１６８９の下、２００９年１２月１７日にＮＣＩＭＢ  Ｌｉｍｉｔｅｄに寄託されたＡＨＡＳ３−ＨＥＴＯ１０４を含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種子
からなる群から選択される、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種子。
【請求項１２】
請求項１１に記載の種子から得られる、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物、またはその細胞、部分、種子もしくは子孫。
【請求項１３】
完全ノックアウトＡＨＡＳアレルをコードする核酸分子。
【請求項１４】
終止コドン突然変異を含む、請求項１３に記載の核酸分子。
【請求項１５】
前記ヌクレオチド配列が、
ａ）配列番号：１のｎｔ８７１〜８７３もしくは配列番号：３のｎｔ８２６〜８２８に対応する位置に終止コドンを含むヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号：１のｎｔ８６２〜８６４もしくは配列番号：５のｎｔ８０８〜８１０に対応する位置に終止コドンを含むヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号：１のｎｔ７７５〜７７７もしくは配列番号：５のｎｔ７２１〜７２３に対応する位置に終止コドンを含むヌクレオチド配列；または
ｄ）配列番号：１のｎｔ７９９〜８０１もしくは配列番号：５のｎｔ７４５〜７４７に対応する位置に終止コドンを含むヌクレオチド配列
からなる群から選択される、請求項１３または１４に記載の核酸分子。
【請求項１６】
配列番号：１、配列番号：３または配列番号：５との少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１７】
１つの植物から別の植物に少なくとも１つの選択された完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを移動させるための方法であって、
ａ）請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの選択された完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを含む第１の植物を同定するかまたは請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの選択された完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを含む第１の植物を作製する工程と、
ｂ）前記第１の植物を前記少なくとも１つの選択された完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを含まない第２の植物と交配し、前記交配種からＦ１雑種種子を回収する工程と、
ｃ）場合により、前記少なくとも１つの選択された完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを含むＦ１植物を同定する工程と、
ｄ）少なくとも１世代（ｘ）の間、前記少なくとも１つの選択された完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを含むＦ１植物を、前記少なくとも１つの選択された完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを含まない第２の植物と戻し交配し、前記交配種からＢＣｘ種子を回収する工程と、
ｅ）前記少なくとも１つの選択された完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを含むＢＣｘ植物を全ての世代で同定する工程と
を含む、方法。
【請求項１８】
１つの植物中で請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを除草剤耐性ＡＨＡＳアレルと組み合わせるための方法であって、
ａ）少なくとも１つの選択された完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを含む少なくとも１つの植物および少なくとも１つの選択された除草剤耐性ＡＨＡＳアレルを含む少なくとも１つの植物を作製および／または同定する工程と、
ｂ）前記少なくとも２つの植物を交配し、前記少なくとも１つの交配種からＦ１雑種種子を回収する工程と、
ｃ）場合により、少なくとも１つの選択された完全ノックアウトＡＨＡＳアレルおよび前記少なくとも１つの選択された除草剤耐性ＡＨＡＳアレルを含むＦ１植物を同定する工程と
を含む、方法。
【請求項１９】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の植物を産生する方法であって、請求項１７または１８に従って、１つの植物中で突然変異体ＡＨＡＳアレルを組み合わせることおよび／または１つの植物に突然変異体ＡＨＡＳアレルを移動させることを含む、方法。
【請求項２０】
植物の除草剤耐性を増大させるための方法であって、前記植物のゲノムＤＮＡ中で少なくとも１つの完全ノックアウトＡＨＡＳアレルと少なくとも１つの除草剤耐性ＡＨＡＳアレルとを組み合わせることを含む、方法。
【請求項２１】
前記完全ノックアウトアレルが、
ａ）配列番号：１のｎｔ８７１〜８７３もしくは配列番号：３のｎｔ８２６〜８２８に対応する位置に終止コドンを含むヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号：１のｎｔ８６２〜８６４もしくは配列番号：５のｎｔ８０８〜８１０に対応する位置に終止コドンを含むヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号：１のｎｔ７７５〜７７７もしくは配列番号：５のｎｔ７２１〜７２３に対応する位置に終止コドンを含むヌクレオチド配列；または
ｄ）配列番号：１のｎｔ７９９〜８０１もしくは配列番号：５のｎｔ７４５〜７４７に対応する位置に終止コドンを含むヌクレオチド配列
からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記完全ノックアウトアレルが、配列番号：１、配列番号：３または配列番号：５との少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
作物植物周辺の雑草を防除する方法であって、
ａ）請求項４〜９のいずれか一項に記載の植物によって産生された種子を圃場に植える工程と、
ｂ）前記雑草を防除するために有効量のＡＨＡＳ阻害除草剤を前記圃場の前記雑草および前記作物植物に適用することと
を含む、方法。
【請求項２４】
工程ａ）の前に、有効量のＡＨＡＳ阻害除草剤を前記圃場に適用する工程をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記植物を１種以上のＡＨＡＳ阻害除草剤で処理することを特徴とする、請求項４〜９のいずれか一項に記載の植物を処理する方法。
【請求項２６】
前記ＡＨＡＳ阻害除草剤が、スルホニル尿素、イミダゾリノン、スルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン、トリアゾロピリミジンおよびピリミジル（オキシ／チオ）ベンゾエートからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＡＨＡＳ阻害除草剤が、メチル４−［（４，５−ジヒドロ−３−メトキシ−４−メチル−５−オキソ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）カルボニルスルファモイル］−５−メチルチオフェン−３−カルボキシレートである、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記植物が、少なくとも５．０ｇ  ａ．ｉ．／ｈａのメチル４−［（４，５−ジヒドロ−３−メトキシ−４−メチル−５−オキソ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）カルボニルスルファモイル］−５−メチルチオフェン−３−カルボキシレートの適用に対して耐性がある、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記植物が、カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）、カブ（Ｂ．ｒａｐａ）、アビシニアガラシ（Ｂ．ｃａｒｉｎａｔａ）、ブラッシカ・オレラセア（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ）およびクロガラシ（Ｂ．ｎｉｇｒａ）からなる群から選択される、請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
除草剤耐性植物を得るための請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の完全ノックアウトＡＨＡＳアレルの使用。
【請求項３１】
１つ以上の完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを含む種子を産生するための請求項１〜９または１２のいずれか一項に記載の植物の使用。
【請求項３２】
１つ以上の完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを含む菜種の作物を産生するための請求項１〜９または１２のいずれか一項に記載の植物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、除草剤、より具体的にはＡＨＡＳ阻害除草剤に耐性のある、作物植物および部分、特にアブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ  ｆａｍｉｌｙ）の植物、特にアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種に関する。本発明はまた、完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを表す突然変異体ＡＨＡＳ核酸に関する。より特には、本発明は、植物のＡＨＡＳ阻害除草剤に対する耐性に影響を及ぼす完全ノックアウトおよび突然変異体ＡＨＡＳタンパク質を表す核酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
アセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＨＡＳ；ＥＣ  ４．１．３．１８、アセト乳酸合成酵素またはＡＬＳとしても知られる）は、植物における分岐鎖アミノ酸の生合成に重要な酵素である（Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｐｅｓｔ  Ｍａｎａｇ  Ｓｃｉ，６１：２４６−２５７）。ＡＨＡＳは、スルホニル尿素、イミダゾリノン、スルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン、トリアゾロピリミジンおよびピリミジル（オキシ／チオ）ベンゾエートを含むいくつかの構造的に異なる除草剤ファミリーの作用部位である。ＡＨＡＳは動物中には存在しないので、ＡＨＡＳ阻害除草剤は動物中でごくわずかな毒性しか示さない（Ｄｕｇｇｌｅｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６，３０９−３２４）。
【０００３】
セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）は、ＡゲノムとＣゲノムを有する異質４倍体であり、５つのＡＨＡＳ遺伝子座を含む。ＡＨＡＳ２、ＡＨＡＳ３およびＡＨＡＳ４がＡゲノムに由来するのに対し、ＡＨＡＳ１およびＡＨＡＳ５はＣゲノムに由来する。ＡＨＡＳ１およびＡＨＡＳ３は構成的に発現される唯一の遺伝子であり、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）の成長および発生に不可欠な主要なＡＨＡＳ活性をコードしている（Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｓｔ  Ｍａｎａｇ  Ｓｃｉ  ６１，ｐ２４６−２５７，２００５）。
【０００４】
１種以上のＡＨＡＳ阻害除草剤に対する耐性を付与するＡＨＡＳの突然変異を有する様々な植物が記載されている（概説については、Ｄｕｇｇｌｅｂｙ，ｅｔ  ａｌ．，２００８，表２を参照されたく、この文献は参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、Ｐｒｏ１９７から、例えば、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ  Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、ＡｌａまたはＴｈｒへの突然変異は、ＳＵ、ＩＭＩ、ＰＣ、ＴＰおよび／またはＳＡＣＴに対する耐性を付与することができ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、シロザ、野ダイコン、シュンギク、タバコおよびキャノーラを含む様々な植物種で記載されている（Ｈａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８  Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２１１：２６６−２７１；Ｓｉｂｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｅｅｄ  Ｒｅｓ  ４１：５０９−５２２，２００１；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｗｅｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，５１（６），ｐ．８３１−８３８；Ｔａｌ  ａｎｄ  Ｒｕｂｉｎ  ２００４，Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｐｅｓｔ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ．１３：ｐ３１−３３．；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ＥＭＢＯ  Ｊ．７（５）：ｐ１２４１−１２４８；Ｒｕｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．５３（５）：ｐ６７５−８９；；Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４７（４）：ｐ１９７６−８３）。
【０００５】
現在、Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ（登録商標）キャノーラとして販売されている菜種のイミダゾリノン耐性突然変異体であるＰＭ１およびＰＭ２は、ＡＨＡＳ１タンパク質のアミノ酸位置６５３におけるアスパラギンからセリンへの置換（ＰＭ１）およびＡＨＡＳ３タンパク質のアミノ酸位置５７４におけるトリプトファンからロイシンへの置換（ＰＭ２）を生じさせる単一ヌクレオチド置換を示す。ＰＭ１は、イミダゾリノンに対してしか耐性がないが、ＰＭ２は、イミダゾリノンとスルホニル尿素の両方に対して交差耐性があり、そのため、ＰＭ２によって与えられるイミダゾリノン耐性レベルは、ＰＭ１由来のイミダゾリノン耐性レベルよりもはるかに高い。イミダゾリノン系除草剤に対する耐性の最大レベルは、ＰＭ１突然変異とＰＭ２突然変異が重なって、ホモ接合性となるときに得られる（Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【０００６】
国際公開第０９／０４６３３４号パンフレットには、突然変異したアセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＨＡＳ）核酸および突然変異した核酸によってコードされるタンパク質、ならびに突然変異した遺伝子を含み、それにより植物がイミダゾリノンおよびスルホニル尿素に対する耐性の増大を示すキャノーラ植物、細胞、および種子が記載されている。
【０００７】
国際公開第０９／０３１０３１号パンフレットには、除草剤抵抗性アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物、ならびに野生型およびイミダゾリノン抵抗性アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）アセトヒドロキシ酸合成酵素の巨大サブユニットタンパク質をコードする新規ポリヌクレオチド配列、種子、ならびにそのような植物の使用方法が開示されている。
【０００８】
米国特許出願第０９／００１３４２４号明細書には、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）を含む改良されたイミダゾリノン系除草剤抵抗性アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）株、そのような株の作製方法、およびそのような株の選択方法、ならびにアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）ＡＨＡＳ遺伝子および配列ならびにイミダゾリノン系除草剤抵抗性を生じる点突然変異を有する遺伝子アレルが記載されている。
【０００９】
国際公開第０８／１２４４９５号パンフレットには、ＡＨＡＳ阻害除草剤に対する改善された耐性レベルを有するトランスジェニックまたは非トランスジェニック植物を産生するのに有用な少なくとも２つの突然変異を含むアセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＨＡＳ）の巨大サブユニットの突然変異体、例えば、二重および三重突然変異体をコードする核酸が開示されている。本発明はまた、ＡＨＡＳ巨大サブユニットの二重および三重突然変異体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、細胞、植物、２以上のＡＨＡＳ巨大サブユニットの単一突然変異体ポリペプチドを含む植物、ならびにそれを作製する方法および使用する方法を提供する。
【００１０】
それでもなお、作物植物、特に菜種植物におけるＡＨＡＳ阻害除草剤に対する耐性のさらなる改善が望ましい。
【００１１】
本発明は、完全ノックアウトアレルを表すＡＨＡＳアレルと除草剤耐性ＡＨＡＳタンパク質をコードするＡＨＡＳアレルの組合せを含む除草剤耐性植物を提供することによって当技術分野に多大な貢献をする。除草剤耐性ＡＨＡＳアレルを完全ノックアウトＡＨＡＳアレルと組み合わせることにより、本発明は、作物植物、特に菜種植物におけるＡＨＡＳ阻害除草剤に対する効率的な耐性を得るための代わりのアプローチを提供する。
【００１２】
この問題は、以下、様々な実施形態、実施例および特許請求の範囲で記載されているように解決される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
第１の実施形態では、本発明は、完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物を提供する。完全ノックアウトＡＨＡＳアレルは、非機能的ＡＨＡＳタンパク質、すなわち、ＡＨＡＳ二量体形成に関与することも影響を及ぼすこともないＡＨＡＳタンパク質をコードするか、またはＡＨＡＳタンパク質を全くコードしないＡＨＡＳ遺伝子の核酸配列を指す。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、完全ノックアウトＡＨＡＳアレルがナンセンス突然変異を含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物を提供するものであり、このナンセンス突然変異は、１つ以上の翻訳終止コドンが、対応する野生型ＡＨＡＳアレルのコードＤＮＡおよび対応するｍＲＮＡ配列に導入され、それにより、終止コドンが非機能的ＡＨＡＳタンパク質の産生をもたらす、ＡＨＡＳアレル中の突然変異である。
【００１５】
また別の実施形態では、本発明は、完全ノックアウトＡＨＡＳアレルが、
ａ）配列番号：１のｎｔ８７１〜８７３または配列番号：３のｎｔ８２６〜８２８に対応する位置に終止コドンを含むヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号：１のｎｔ８６２〜８６４または配列番号：５のｎｔ８０８〜８１０に対応する位置に終止コドンを含むヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号：１のｎｔ７７５〜７７７または配列番号：５のｎｔ７２１〜７２３に対応する位置に終止コドンを含むヌクレオチド配列；または
ｄ）配列番号：１のｎｔ７９９〜８０１または配列番号：５のｎｔ７４５〜７４７に対応する位置に終止コドンを含むヌクレオチド配列
からなる群から選択されるアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物を提供する。
【００１６】
本発明はまた、そのゲノム中に少なくとも１つの第２の突然変異体ＡＨＡＳアレルをさらに含み、該第２の突然変異体ＡＨＡＳアレルが除草剤耐性ＡＨＡＳタンパク質をコードするアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物を提供する。
【００１７】
別の実施形態では、除草剤耐性ＡＨＡＳタンパク質は、配列番号：２の位置１９７、または配列番号：４の位置１８２または配列番号：６の位置１７９に対応する位置にセリンを含む。あるいは、除草剤耐性ＡＨＡＳタンパク質は、少なくとも２つのアミノ酸置換を含む。
【００１８】
また別の実施形態では、除草剤耐性ＡＨＡＳタンパク質は、配列番号：２、配列番号：４または配列番号：６との少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１９】
さらなる実施形態では、本発明のＡＨＡＳアレルは、配列番号：１、配列番号：３または配列番号：５との少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００２０】
本発明の突然変異体ＡＨＡＳアレルを含む植物の植物細胞、配偶子、種子、接合胚もしくは体細胞胚のいずれか、子孫または雑種を提供することも本発明の実施形態である。
【００２１】
本発明はさらに、
ａ）受託番号ＮＣＩＭＢ４１６９０の下、２００９年１２月１７日にＮＣＩＭＢ  Ｌｉｍｉｔｅｄに寄託されたＡＨＡＳ１−ＨＥＴＯ１１２を含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種子；
ｂ）受託番号ＮＣＩＭＢ４１６８７の下、２００９年１２月１７日にＮＣＩＭＢ  Ｌｉｍｉｔｅｄに寄託されたＡＨＡＳ３−ＨＥＴＯ１０２を含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種子；
ｃ）受託番号ＮＣＩＭＢ４１６８８の下、２００９年１２月１７日にＮＣＩＭＢ  Ｌｉｍｉｔｅｄに寄託されたＡＨＡＳ３−ＨＥＴＯ１０３を含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種子；または
ｄ）受託番号ＮＣＩＭＢ４１６８９の下、２００９年１２月１７日にＮＣＩＭＢ  Ｌｉｍｉｔｅｄに寄託されたＡＨＡＳ３−ＨＥＴＯ１０４を含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種子；
からなる群から選択されるアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種子を提供する。
【００２２】
上記の種子から得られる、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物、またはその細胞、部分、種子もしくは子孫も提供する。
【００２３】
一実施形態では、上記のような完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを表す核酸配列を提供する。
【００２４】
本発明はまた、１つの植物から別の植物に少なくとも１つの選択された完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを移動させるための方法であって、
ｅ）少なくとも１つの選択された完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを含む第１の植物を同定するかまたは少なくとも１つの選択された完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを含む第１の植物を作製する工程と、
ｆ）第１の植物を少なくとも１つの選択された完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを含まない第２の植物と交配し、交配種からＦ１雑種種子を回収する工程と、
ｇ）場合により、少なくとも１つの選択された完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを含むＦ１植物を同定する工程と、
ｈ）少なくとも１世代（ｘ）の間、少なくとも１つの選択された完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを含むＦ１植物を、少なくとも１つの選択された完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを含まない第２の植物と戻し交配し、交配種からＢＣｘ種子を回収する工程と、
ｉ）少なくとも１つの選択された完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを含むＢＣｘ植物を全ての世代で同定する工程と
を含む、方法を提供する。
【００２５】
本発明はさらに、１つの植物中で本発明の完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを除草剤耐性ＡＨＡＳアレルと組み合わせるための方法であって、
ｊ）少なくとも１つの選択された完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを含む少なくとも１つの植物および少なくとも１つの選択された除草剤耐性ＡＨＡＳアレルを含む少なくとも１つの植物を作製および／または同定する工程と、
ｋ）少なくとも２つの植物を交配し、少なくとも１つの交配種からＦ１雑種種子を回収する工程と、
ｌ）場合により、少なくとも１つの選択された完全ノックアウトＡＨＡＳアレルおよび少なくとも１つの選択された除草剤耐性ＡＨＡＳアレルを含むＦ１植物を同定する工程と
を含む、方法を提供する。
【００２６】
別の実施形態では、上記のような植物を産生する方法、およびこの植物のゲノムＤＮＡ中で本発明の少なくとも１つの完全ノックアウトＡＨＡＳアレルと少なくとも１つの除草剤耐性ＡＨＡＳアレルとを組み合わせることによって、植物植物の除草剤耐性を増大させる方法を提供する。
【００２７】
本発明はさらに、作物植物周辺の雑草を防除する方法、および完全ノックアウトＡＨＡＳアレルと除草剤耐性ＡＨＡＳアレルの組合せを含む植物を１種以上のＡＨＡＳ阻害除草剤で処理する方法を提供する。
【００２８】
本発明はまた、除草剤耐性植物を得るための本発明の完全ノックアウトＡＨＡＳアレルの使用に関する。
【００２９】
また別の実施形態では、本発明は、１つ以上の完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを含む種子を産生するためのまたは１つ以上の完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを含む菜種の作物を産生するための本発明の植物の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＡＡ７７６１３．１、ＣＡＡ７７６１５．１およびＡＹ０４２８１９．１由来のセイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）ＡＨＡＳ１（ＢＮ１）、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）ＡＨＡＳ３（ＢＮ３）およびシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＡＨＡＳ（ＡＴ）タンパク質のアミノ酸配列の多重配列アラインメント。
【図２】温室内での植付け前のチエンカルバゾン−メチル適用に対する耐性に対するＡＨＡＳ完全ノックアウトとＡＨＡＳミスセンスアレルとの組合せの効果。Ａ．ＡＨＡＳ１ミスセンスアレル（ＨＥＴＯ１０８）とＡＨＡＳ３ミスセンスアレル（ＨＥＴＯ１１１）とを組み合わせたもの。左から右：未処理のＨＥＴＯ１０８／ＨＥＴＯ１０８  ＨＥＴＯ１１１／ＨＥＴＯ１１１；処理したＨＥＴＯ１０８／ＨＥＴＯ１０８  ＨＥＴＯ１１１／ＨＥＴＯ１１１；処理したＨＥＴＯ１０８／ＨＥＴＯ１０８  ＡＨＡＳ３ｗｔ／ＡＨＡＳ３ｗｔ；処理したＡＨＡＳ１ｗｔ／ＡＨＡＳ１ｗｔ  ＨＥＴＯ１１１／ＨＥＴＯ１１１；処理したＡＨＡＳ１ｗｔ／ＡＨＡＳ１ｗｔ  ＡＨＡＳ３ｗｔ／ＡＨＡＳ３ｗｔ。Ｂ．ＡＨＡＳ１ノックアウトアレル（ＨＥＴＯ１１２）とＡＨＡＳ３ミスセンスアレル（ＨＥＴＯ１１１）とを組み合わせたもの。左から右：未処理のＨＥＴＯ１１２／ＨＥＴＯ１１２  ＨＥＴＯ１１１／ＨＥＴＯ１１１；処理したＨＥＴＯ１１２／ＨＥＴＯ１１２  ＨＥＴＯ１１１／ＨＥＴＯ１１１；処理したＨＥＴＯ１１２／ＨＥＴＯ１１２  ＡＨＡＳ３ｗｔ／ＡＨＡＳ３ｗｔ；処理したＡＨＡＳ１ｗｔ／ＡＨＡＳ１ｗｔ  ＨＥＴＯ１１１／ＨＥＴＯ１１１；処理したＡＨＡＳ１ｗｔ／ＡＨＡＳ１ｗｔ  ＡＨＡＳ３ｗｔ／ＡＨＡＳ３ｗｔ。Ｃ．ＡＨＡＳ１ミスセンスアレル（ＨＥＴＯ１０８）とＡＨＡＳ３ノックアウトアレル（ＨＥＴＯ１０４）とを組み合わせたもの。左から右：未処理のＨＥＴＯ１０８／ＨＥＴＯ１０８  ＨＥＴＯ１０４／ＨＥＴＯ１０４；処理したＨＥＴＯ１０８／ＨＥＴＯ１０８  ＨＥＴＯ１０４／ＨＥＴＯ１０４；処理したＨＥＴＯ１０８／ＨＥＴＯ１０８  ＡＨＡＳ３ｗｔ／ＡＨＡＳ３ｗｔ；処理したＡＨＡＳ１ｗｔ／ＡＨＡＳ１ｗｔ  ＨＥＴＯ１０４／ＨＥＴＯ１０４；処理したＡＨＡＳ１ｗｔ／ＡＨＡＳ１ｗｔ  ＡＨＡＳ３ｗｔ／ＡＨＡＳ３ｗｔ。Ｗｔ＝野生型。
【図３】温室内での出芽後のチエンカルバゾン−メチル噴霧に対する耐性に対するＡＨＡＳ完全ノックアウトとＡＨＡＳミスセンスアレルとの組合せの効果。Ａ．ＡＨＡＳ１ミスセンスアレル（ＨＥＴＯ１０８）とＡＨＡＳ３ミスセンスアレル（ＨＥＴＯ１１１）とを組み合わせたもの。左から右：未処理の優良親株；処理したＨＥＴＯ１０８／ＨＥＴＯ１０８  ＨＥＴＯ１１１／ＨＥＴＯ１１１；処理したＨＥＴＯ１０８／ＨＥＴＯ１０８  ＡＨＡＳ３ｗｔ／ＡＨＡＳ３ｗｔ；処理したＡＨＡＳ１ｗｔ／ＡＨＡＳ１ｗｔ  ＨＥＴＯ１１１／ＨＥＴＯ１１１；処理したＡＨＡＳ１ｗｔ／ＡＨＡＳ１ｗｔ  ＡＨＡＳ３ｗｔ／ＡＨＡＳ３ｗｔ。Ｂ．ＡＨＡＳ１ノックアウトアレル（ＨＥＴＯ１１２）とＡＨＡＳ３ミスセンスアレル（ＨＥＴＯ１１１）とを組み合わせたもの。左から右：未処理の優良親株；処理したＨＥＴＯ１１２／ＨＥＴＯ１１２  ＨＥＴＯ１１１／ＨＥＴＯ１１１；処理したＨＥＴＯ１１２／ＨＥＴＯ１１２  ＡＨＡＳ３ｗｔ／ＡＨＡＳ３ｗｔ；処理したＡＨＡＳ１ｗｔ／ＡＨＡＳ１ｗｔ  ＨＥＴＯ１１１／ＨＥＴＯ１１１；処理したＡＨＡＳ１ｗｔ／ＡＨＡＳ１ｗｔ  ＡＨＡＳ３ｗｔ／ＡＨＡＳ３ｗｔ。Ｃ．ＡＨＡＳ１ミスセンスアレル（ＨＥＴＯ１０８）とＡＨＡＳ３ノックアウトアレル（ＨＥＴＯ１０４）とを組み合わせたもの。左から右：未処理の優良親株；処理したＨＥＴＯ１０８／ＨＥＴＯ１０８  ＨＥＴＯ１０４／ＨＥＴＯ１０４；処理したＨＥＴＯ１０８／ＨＥＴＯ１０８  ＡＨＡＳ３ｗｔ／ＡＨＡＳ３ｗｔ；処理したＡＨＡＳ１ｗｔ／ＡＨＡＳ１ｗｔ  ＨＥＴＯ１０４／ＨＥＴＯ１０４；処理したＡＨＡＳ１ｗｔ／ＡＨＡＳ１ｗｔ  ＡＨＡＳ３ｗｔ／ＡＨＡＳ３ｗｔ。Ｗｔ＝野生型。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
一般的な定義
「核酸配列」（または核酸分子）という用語は、一本鎖または二本鎖形態のＤＮＡまたはＲＮＡ分子、特に、本発明によるタンパク質またはタンパク質断片をコードするＤＮＡを指す。「内在性核酸配列」は、植物細胞内にある核酸配列、例えば、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）細胞の核ゲノム内に存在するＡＨＡＳ遺伝子の内在性アレルを指す。「単離された核酸配列」は、その天然環境内にはもはや存在しない、例えば、試験管内または細菌もしくは植物などの組換え宿主細胞内の核酸配列を指すために用いられる。
【００３２】
「遺伝子」という用語は、細胞内で転写されてＲＮＡ分子（例えば、イントロン配列を含むプレ−ｍＲＮＡ、これは後に、スプライシングされて成熟ｍＲＮＡになる）になる領域（転写される領域）を含み、調節領域（例えば、プロモーター）に機能的に連結されている、ＤＮＡ配列を意味する。したがって、遺伝子は、プロモーター、例えば、翻訳開始に関与する配列を含む５’リーダー配列、（タンパク質）コード領域（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）および例えば、転写終結部位を含む３’非翻訳配列などの、いくつかの機能的に連結された配列を含むことができる。「内在性遺伝子」は、「外来遺伝子」、「導入遺伝子」または「キメラ遺伝子」と区別するために用いられ、かつ形質転換によってその植物に導入されたのではなく（すなわち、それは「導入遺伝子」ではなく）、その属、種もしくは品種の植物に通常存在しているか、またはそれが通常存在する別の植物の属、種もしくは品種の植物から、通常の育種技術によってもしくは体細胞ハイブリダイゼーションによって、例えば、プロトプラスト融合によって、その植物に導入された、特定の植物の属、種または品種の植物に由来する遺伝子を指す。同様に、遺伝子の「内在性アレル」は、植物形質転換によって植物または植物組織に導入されるのではなく、例えば、植物突然変異誘発および／もしくは選択によって生成されるか、または植物の自然個体群をスクリーニングすることによって得られる。
【００３３】
「タンパク質」または「ポリペプチド」という用語は互換的に用いられ、かつ特定の作用様式、サイズ、３次元構造または起源に関係なく、アミノ酸の鎖からなる分子を指す。したがって、ＡＨＡＳタンパク質の「断片」または「部分」もやはり、「タンパク質」と呼ぶことができる。「単離されたタンパク質」は、その天然環境内にもはや存在しない、例えば、試験管内または組換え細菌もしくは植物宿主細胞内のタンパク質を指すために用いられる。「酵素」は、機能的ＡＨＡＳ酵素などの、酵素活性を含むタンパク質またはタンパク質複合体である。
【００３４】
本明細書で使用するように、「ＡＨＡＳタンパク質」は、「アセトヒドロキシ酸合成酵素」または「アセト乳酸合成酵素」としても知られる、分岐鎖アミノ酸の生合成に関与するＡＨＡＳ酵素の触媒サブユニットを構成するタンパク質またはポリペプチドを指す。植物および微生物では、これらのアミノ酸の炭素骨格は、ピルベートのみ（バリン合成）、ピルベート＋アセチル−ＣｏＡ（ロイシン）またはピルベート＋２−ケトブチレート（イソロイシン）から合成される。このプロセスの最初の段階では、２−アセトラクテート（ＡＬ）または２−アセト−２−ヒドロキシブチレート（ＡＨＢ）のいずれかが形成されるが、この段階は、アセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＨＡＳ、ＥＣ  ２．２．１．６）によって触媒される。ＡＨＡＳ酵素は、触媒サブユニットおよび調節サブユニット（それぞれ、大サブユニットおよび小サブユニットとも呼ばれる）という２つのサブユニットから構成される。触媒サブユニットは５９〜６６ｋＤａの範囲の分子質量を有し、真核生物では、真菌のミトコンドリアや植物の葉緑体にタンパク質を方向付けるのに必要とされるＮ−末端ペプチドを有するより大きな前駆体タンパク質として合成される。調節サブユニットは、ＡＨＡＳ活性を持たないが、触媒サブユニットの活性を大いに刺激する。調節サブユニットは、植物では５０ｋＤａを超えており、これもまたＮ−末端オルガネラ標的化ペプチドを有するより大きな前駆体タンパク質として合成される。ゲル濾過（Ｇｅｌ  ｉｎ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）により、溶液中では、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＡＨＡＳの触媒サブユニットは二量体として存在することが示された。しかしながら、スルホニルウレア系除草剤のうちのどれかが存在するとき、それは、四量体として結晶化し、調節サブユニットと触媒サブユニット間の複合体の分子質量も、各サブユニットのうちの４つがこの会合体（ａｓｓｅｍｂｌｙ）に存在することを示唆する。シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＡＨＡＳの触媒サブユニットの各々の四量体は４つの活性部位を有する。各々の活性部位は２つの単量体の接合部分にある。したがって、ＡＨＡＳ活性の最小必要要件は、触媒サブユニットの二量体である。この四量体の生物学的関連性は不明である。この四量体は、であることができる（Ｄｕｇｇｌｅｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＡＨＡＳタンパク質、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）由来のＡＨＡＳ１およびＡＨＡＳ３タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号：２、配列番号：４および配列番号：６に記載された配列に表されている。
【００３５】
シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）では、ＡＨＡＳタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＢ６２３４５．１、ＡＡＭ９２５６９．１およびＡＹ０４２８１９．１）は、６６３アミノ酸（ａａ）長の前駆体として合成されるが、葉緑体輸送ペプチドを含まない成熟タンパク質はａａ９８から始まる。セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）では、ＡＨＡＳ１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ７７６１３．１）およびＡＨＡＳ３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ７７６１５．１）前駆体タンパク質は、６５５および６５２ａａ長であり、その成熟タンパク質は、それぞれ、ａａ８３および８０から始まる。シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＡＨＡＳの各ポリペプチドは、各々が６〜９本のヘリックスによって囲まれた６本鎖平行ｂ−シートのよく似た全体的フォールドを有するα（残基８６〜２８０）、β（残基２８１〜４５１）およびγ（残基４６３〜６３９）という３つのドメインからなる。シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）での二量体接合部分の形成に関与する残基は、１１９〜２１７およびａａ５０８〜６０７にある。セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）では、これらは、それぞれ、ａａ１０４〜２０２およびａａ４９３〜５９２（ＡＨＡＳ１）、ならびにａａ１０１〜１９９およびａａ４９０〜５８９（ＡＨＡＳ３）にある。シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＡＨＡＳタンパク質とセイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）ＡＨＡＳタンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを図１に示す。タバコでは、残基Ｍ５４２とＨ１４２が三次構造の安定化と二量体相互作用に関与するようである（Ｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．７；３１７（３），ｐ９３０−９３８）。また、タバコＡＨＡＳタンパク質のａａ５６７〜５８２の領域およびａａ６３０のＣ末端の領域の欠失によって単量体形成が生じたため、これらのドメインが活性型二量体の結合／安定化に関与することが分かった（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１５；３８４，ｐ５９−６８．）。
【００３６】
「ＡＨＡＳ遺伝子」という用語は、本明細書では、アセトヒドロキシ酸合成酵素の触媒サブユニットタンパク質（すなわち、ＡＨＡＳタンパク質）をコードする核酸配列を指す。ＡＨＡＳ遺伝子にはイントロンがない（Ｍａｚｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｄｅｃ；８５，ｐ１１１０−１１１７．）。シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＡＨＡＳ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＹ０４２８１９）ならびにセイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）ＡＨＡＳ１およびＡＨＡＳ３遺伝子／コード配列の配列は、それぞれ、配列表中の配列番号：１、配列番号：３および配列番号：５に示されている。
【００３７】
本明細書で使用するように、「アレル」という用語は、特定の遺伝子座の１つ以上の代替形態の遺伝子のいずれかを意味する。生物の二倍体（または複二倍体）細胞では、所与の遺伝子のアレルは、染色体上の特定の位置または遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）（遺伝子座（ｌｏｃｉ）、複数形）にある。１つのアレルは、相同染色体の対の各染色体上に存在する。
【００３８】
本明細書で使用するように、「相同染色体」という用語は、同じ生物学的特徴に関する情報を含み、同じ遺伝子座の同じ遺伝子を含むが、おそらくそれらの遺伝子の異なるアレルを含む染色体を意味する。相同染色体は、有糸分裂中に対合する染色体である。生物の全ての生物学的特徴を表す「非相同染色体」は、セットを形成し、細胞におけるセットの数は倍数性と呼ばれる。二倍体生物は２セットの非相同染色体を含み、その場合、各相同染色体は異なる親から受け継がれる。複二倍体の種では、本質的に２セットの二倍体ゲノムが存在し、２つのゲノムの染色体は、「相同染色体」と呼ばれる（同様に、２つのゲノムの遺伝子座または遺伝子は、相同遺伝子座または遺伝子と呼ばれる）。二倍体、または複二倍体の植物種は、特定の遺伝子座に多数の異なるアレルを含むことができる。
【００３９】
本明細書で使用するように、「ヘテロ接合性」という用語は、２つの異なるアレルが特定の遺伝子座に存在するが、細胞内の相同染色体の対応する対に個々に位置付けられる場合に存在する遺伝的条件を意味する。逆に、本明細書で使用するように、「ホモ接合性」という用語は、２つの同一のアレルが特定の遺伝子座に存在するが、細胞内の相同染色体の対応する対に個々に位置付けられる場合に存在する遺伝子の状態を意味する。
【００４０】
本明細書で使用するように、「遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）」（遺伝子座（ｌｏｃｉ）、複数形）という用語は、例えば、遺伝子または遺伝子マーカーが見出される染色体上の特定の場所（単数もしくは複数）または部位を意味する。例えば、「ＡＨＡＳ１遺伝子座」は、ＡＨＡＳ１遺伝子（および２つのＡＨＡＳ１アレル）が見出され得る染色体上の位置を指し、一方、「ＡＨＡＳ３遺伝子座」は、ＡＨＡＳ３遺伝子（および２つのＡＨＡＳ３アレル）が見出され得る染色体上の位置を指す。
【００４１】
本明細書で使用される「本質的に同様」は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を指す。これらの核酸配列は、配列表に示されたＡＨＡＳ配列と「実質的に同一」または「本質的に同一」であると表すこともできる。パーセンテージで表される、２つの関連するヌクレオチドまたはアミノ酸配列の「配列同一性」は、比較される位置の数で割った、同一の残基を有する２つの最適に整列された配列中の位置の数（×１００）を指す。ギャップ、すなわち、残基が一方の配列には存在するが、もう一方には存在しないアラインメント中の位置は、非同一残基を含む位置とみなされる。２つの配列の「最適なアラインメント」は、Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ（ＥＭＢＯＳＳ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６（６）：２７６-２７７；例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｌｉｇｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌを参照されたい）におけるＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの全体的アラインメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４８（３）：４４３−５３）に従って、デフォルト設定（ギャップ開始ペナルティ＝１０（ヌクレオチドの場合）／１０（タンパク質の場合）およびギャップ伸長ペナルティ＝０．５（ヌクレオチドの場合）／０．５（タンパク質の場合））を用いて、２つの配列を全長にわたって整列させることにより見出される。ヌクレオチドについて、使用されるデフォルトスコアリングマトリクスはＥＤＮＡＦＵＬＬであり、タンパク質について、デフォルトスコアリングマトリクスはＥＢＬＯＳＵＭ６２である。
【００４２】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」を用いて、所与のヌクレオチド配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を同定することができる。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる環境では異なる。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨで特定の配列について熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が完全にマッチするプローブとハイブリダイズする（規定のイオン強度およびｐＨ下の）温度である。通常、塩濃度が、ｐＨ７で約０．０２モル濃度、温度が少なくとも６０℃であるストリンジェントな条件が選ばれる。塩濃度を低下させることおよび／または温度を増大させることにより、ストリンジェンシーが増大する。ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション（例えば、１００ｎｔのプローブを用いるノーザンブロット）のためのストリンジェントな条件は、例えば、０．２×ＳＳＣ中、６３℃で２０分間の少なくとも１回の洗浄を含む条件、または等価な条件である。
【００４３】
「高ストリンジェンシー条件」は、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは３．０ＭのＮａＣｌ、０．３Ｍのクエン酸−Ｎａ、ｐＨ７．０を含む）、５×デンハルト（１００×デンハルトは２％フィコール、２％ポリビニルピロリドン、２％ウシ血清アルブミンを含む）、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、および非特異的コンペティターとしての２０μｇ／ｍｌの未変性キャリアＤＮＡ（平均長１２０〜３０００ヌクレオチドの一本鎖魚精子ＤＮＡ）を含む水溶液中、６５℃でのハイブリダイゼーションによって提供することができる。ハイブリダイゼーションに続き、高ストリンジェンシー洗浄を数回の工程で行ない、最後に、０．２〜０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、ハイブリダイゼーション温度で洗浄（約３０分）を行なうことができる。
【００４４】
「中程度のストリンジェンシー条件」は、上記の溶液中でのハイブリダイゼーションと等価であるが、約６０〜６２℃での条件を指す。中程度のストリンジェンシー洗浄は、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、ハイブリダイゼーション温度で行なうことができる。
【００４５】
「低ストリンジェンシー」は、上記の溶液中、約５０〜５２℃でのハイブリダイゼーションと等価な条件を指す。低ストリンジェンシー洗浄は、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、ハイブリダイゼーション温度で行なうことができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）ならびにＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）も参照されたい。
【００４６】
遺伝子またはタンパク質の「オルソログ」という用語は、本明細書では、別の種に見られる相同遺伝子またはタンパク質を指し、これは、その遺伝子またはタンパク質と同じ機能を有するが、その遺伝子を持つ種が分岐した（すなわち、その遺伝子が種分化により共通の祖先から進化した）時点から配列が（通常）分岐している。したがって、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）ＡＨＡＳ遺伝子のオルソログは、配列比較（例えば、全配列にわたるもしくは特定のドメインにわたる配列同一性パーセンテージに基づくもの）および／または機能解析の両方に基づいて、他の植物種（例えば、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）など）で同定することができる。
【００４７】
「突然変異体」または「突然変異」という用語は、例えば、いわゆる「野生型（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）」変異体（「野生型（ｗｉｌｄｔｙｐｅ）」または「野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）」とも書く）とは異なる植物または遺伝子を指す。「野生型」は、例えば、それが最も一般的に天然に生じる植物または遺伝子の典型的な形態を指す。「野生型植物」は、自然個体群においてそのような植物の最も一般的な表現型を有する植物を指す。「野生型アレル」は、野生型表現型を生じさせるのに必要とされる遺伝子のアレルを指す。突然変異体植物またはアレルは、自然個体群に生じるか、またはヒトの介入によって、例えば、突然変異誘発によって生じさせることができ、したがって、「突然変異体アレル」は、突然変異体表現型を生じさせるのに必要とされる遺伝子のアレルを指す。本明細書で使用するように、「突然変異体ＡＨＡＳアレル」（例えば、突然変異体ＡＨＡＳ１またはＡＨＡＳ３）という用語は、１つ以上のヌクレオチド位置で野生型ＡＨＡＳアレルと異なるＡＨＡＳアレルを指す。すなわち、それは、野生型アレルと比較したときに、その核酸配列中に１つ以上の突然変異を含む。
【００４８】
核酸配列中の突然変異は、例えば、以下を含むことができる：
（ａ）アミノ酸を別のアミノ酸に置換する核酸配列の変化である「ミスセンス突然変異」；
（ｂ）早過ぎる終止コドンの導入、ひいては（切断タンパク質を生じさせる）翻訳の終結をもたらす核酸配列の変化である「ナンセンス突然変異」または「終止コドン突然変異」；植物遺伝子は、翻訳終止コドン「ＴＧＡ」（ＲＮＡ中ではＵＧＡ）、「ＴＡＡ」（ＲＮＡ中ではＵＡＡ）および「ＴＡＧ」（ＲＮＡ中ではＵＡＧ）を含む。したがって、これらのコドンのうちの１つを（リーディングフレーム中の）翻訳されている成熟ｍＲＮＡ中に存在させる任意のヌクレオチド置換、挿入、欠失は、翻訳を終結させることになる。
（ｃ）核酸のコード配列中に付加された１つ以上のコドンによる、１つ以上のアミノ酸の「挿入突然変異」；
（ｄ）核酸のコード配列中で欠失している１つ以上のコドンによる、１つ以上のアミノ酸の「欠失突然変異」；
（ｅ）突然変異の下流で異なるフレームで翻訳される核酸配列を生じさせる、「フレームシフト突然変異」。フレームシフト突然変異には、１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失または重複などの様々な原因があり得るが、プレ−ｍＲＮＡスプライシングに影響を及ぼす突然変異（スプライス部位突然変異）によってフレームシフトが生じることもある；
（ｆ）プレ−ｍＲＮＡ配列の正確なスプライシングを変化させるかまたは無効にし、野生型とは異なるアミノ酸配列のタンパク質を生じさせる、「スプライス部位突然変異」。例えば、ＲＮＡスプライシングの間に１つ以上のエキソンが飛ばされて、飛ばされたエキソンによってコードされるアミノ酸を欠くタンパク質が生じる場合がある。あるいは、リーディングフレームが不正確なスプライシングを通して変化する場合があるか、または１つ以上のイントロンが保持される場合があるか、または別のスプライスドナーもしくはアクセプターが生成される場合があるか、またはスプライシングが別の位置（例えば、イントロン内）で開始される場合があるか、または別のポリアデニル化シグナルが生成される場合がある。正確なプレ−ｍＲＮＡスプライシングは、遺伝子のヌクレオチド配列中の様々な突然変異によって影響され得る複雑な過程である。植物などの高等生物では、主要なスプライソソームは、５’スプライス部位（ドナー部位）のＧＵおよび３’スプライス部位（アクセプター部位）のＡＧを含むイントロンをスプライスする。このＧＵ−ＡＧ則（またはＧＴ−ＡＧ則；Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  ＶＩ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９８，ｐｐ８８５−９２０，ＩＳＢＮ  ０１９８５７７７８８を参照されたい）は、真核生物の核遺伝子のスプライス部位の約９９％で見られるが、ＧＣ−ＡＧおよびＡＵ−ＡＣなどの他のジヌクレオチドを５’および３’スプライス部位で含むイントロンは、それぞれ、約１％および０．１％しか占めない。
【００４９】
本明細書で使用するように、「完全ノックアウトアレル」は、インビボの細胞で、機能的ＡＨＡＳ発現の顕著な低下または機能的ＡＨＡＳの無発現、すなわち、機能的ＡＨＡＳタンパク質量の顕著な低下または機能的ＡＨＡＳタンパク質の消失を導く突然変異体アレルである。基本的に、野生型タンパク質と比べて少なくとも１つのアミノ酸挿入、欠失および／または置換を含むタンパク質を生じさせる任意の突然変異は、酵素活性の顕著な低下または酵素活性の消失を生じさせることができる。しかしながら、タンパク質をコードする配列の特定の部分における突然変異、例えば、機能ドメインおよび／または構造ドメインの重要な部分が欠けている切断タンパク質を生じさせる突然変異は、突然変異体ＡＨＡＳタンパク質の機能の低下をもたらす可能性がより高いことが理解される。
【００５０】
突然変異体ＡＨＡＳアレルが完全ノックアウトアレルであるかどうかを決定するために、その特定のアレルが実際に、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルで、発現されていないのか、それとも発現が顕著に少ないのか、およびそれが依然として発現されている場合、例えば、Ｋｉｍら（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１５；３８４，ｐ５９−６８，２００４）に記載されているように、タンパク質の分子質量が多量体を示すのか、単量体形成を示すのかを解析することができる。あるいは、例えば、ＡＨＡＳ機能が不可欠である植物に対して交配を行なうことができる。この交配によって、突然変異体アレルの（二重）ホモ接合が得られることが予想され、これらが回復されない場合、突然変異体アレルは、例えば、本明細書で以下に記載されるように、ノックアウトアレルとして機能する。
【００５１】
本明細書で使用するように、「顕著に低下した量の機能的ＡＨＡＳタンパク質」（例えば、機能的ＡＨＡＳ１またはＡＨＡＳ２タンパク質）は、完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを含まない細胞により産生される機能的ＡＨＡＳタンパク質の量と比較したときの、完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを含む細胞により産生される機能的ＡＨＡＳタンパク質の量の、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％の低下（すなわち、機能的タンパク質は細胞により産生されない）を指す。この定義は、インビボで生物活性がない「非機能的」ＡＨＡＳタンパク質（例えば、切断ＡＨＡＳタンパク質）の産生、機能的ＡＨＡＳタンパク質の絶対量の低下（例えば、ＡＨＡＳ遺伝子における突然変異のために、機能的ＡＨＡＳタンパク質が作られない）および／または機能的な野生型ＡＨＡＳタンパク質の活性と比較して生物活性が顕著に低下したＡＨＡＳタンパク質（例えば、コードされるＡＨＡＳタンパク質の生物活性に重要な１つ以上のアミノ酸残基が、別のアミノ酸残基に置換されているかもしくは欠失しているＡＨＡＳタンパク質）の産生を包含する。
【００５２】
本明細書で使用される「非機能的ＡＨＡＳタンパク質」は、二量体および／もしくは四量体形成に関与することができず、かつ／または細胞内に存在し得る他の野生型もしくは（ミスセンス）突然変異体ＡＨＡＳタンパク質の酵素活性に影響を及ぼさないＡＨＡＳタンパク質を指すことが理解される。非機能的ＡＨＡＳタンパク質は、完全ノックアウトＡＨＡＳアレルによってコードされる。
【００５３】
活性型ＡＨＡＳタンパク質は活性型ＡＨＡＳアレルによってコードされており、かつ野生型ＡＨＡＳタンパク質と、依然として生体活性はあるが、ＡＨＡＳ阻害除草剤によって阻害されない突然変異体ＡＨＡＳタンパク質（例えば、ミスセンス突然変異を含む核酸配列によってコードされるＡＨＡＳタンパク質）、すなわち、除草剤耐性ＡＨＡＳタンパク質の両方であることができる。
【００５４】
本明細書で使用される「突然変異体ＡＨＡＳタンパク質」という用語は、突然変異体ＡＨＡＳ核酸配列（「ＡＨＡＳアレル」）によってコードされるＡＨＡＳタンパク質を指し、ここで、この突然変異は、ＡＨＡＳタンパク質のアミノ酸配列の変化を生じさせる。突然変異体ＡＨＡＳは、生物活性に不可欠なアミノ酸が置換されているかまたは欠失している非機能的ＡＨＡＳタンパク質であることができる。あるいは、突然変異体ＡＨＡＳタンパク質は、そのためにＡＨＡＳ阻害除草剤によって阻害されなくなる突然変異を含むことができる。そのような除草剤耐性または除草剤抵抗性ＡＨＡＳタンパク質は、その天然の機能、すなわち、分岐アミノ酸の合成を依然として果たすことができることが好ましい。
【００５５】
そのような突然変異体除草剤耐性ＡＨＡＳタンパク質の例は当技術分野で公知であり、例えば、全て参照により本明細書に組み入れられる、Ｄｕｇｇｌｅｂｙら，２００８；国際公開第０９／０４６３３４号パンフレット、国際公開第０９／０３１０３１号パンフレット、米国特許出願第０９／００１３４２４号明細書に記載されている。２以上のアミノ酸置換を含む突然変異体除草剤耐性ＡＨＡＳタンパク質は、例えば、国際公開第０８／１２４４９５号パンフレットに記載されており、この文献も参照により本明細書に組み入れられる。
【００５６】
【表１】
2013514791.tif 000003
【００５７】
【表２】
2013514791.tif 000004
【００５８】
【表３】
2013514791.tif 000005
【００５９】
本明細書で使用するように、「除草剤」は、植物、特に、雑草の成長を損なわせるかまたは阻害するために用いられる化学物質である。「ＡＨＡＳ阻害除草剤」または「ＡＬＳ阻害除草剤」は、ＡＨＡＳ酵素の活性を妨害する除草剤である。そのようなＡＨＡＳ阻害除草剤は、スルホニルウレア系除草剤、イミダゾリノン系除草剤、スルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン系除草剤、トリアゾロピリミジン系除草剤、ピリミジル（オキシ／チオ）ベンゾエート系除草剤、またはそれらの混合物であることが好ましい。ＡＨＡＳ阻害除草剤の例としては、例えば、アミドスルフロン、アジムスルフロン、ベンスルフロン、クロリムロン、クロルスルフロン、シノスルフロン、シクロスルファムロン、エタメトスルフロン、エトキシスルフロン、フラザスルフロン、フルピルスルフロン、フォラムスルフロン、ハロスルフロン、イマゾスルフロン、ヨードスルフロン、メソスルフロン、メトスルフロン、ニコスルフロン、オキサスルフロン、プリミスルフロン、プロスルフロン、ピラゾスルフロン、キンクロラック、リムスルフロン、スルフェントラゾン、スルホメツロン、スルホスルフロン、チエンカルバゾン−メチル、チフェンスルフロン、トリアスルフロン、トリベヌロン、トリフロキシスルフロン、トリフルスルフロン、トリトスルフロン、イマザメタベンズ、イマザモックス、イマザピック、イマザピル、イマザクイン、イマゼタピル、クロランスラム、ジクロスラム、フロラスラム、フルメトスラム、メトスラム、ペノクススラム、ビスピリバック、ピリミノバック、プロポキシカルバゾン、フルカルバゾン、ピリベンゾキシム、ピリフタリドおよびピリチオバックが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
本明細書で使用するように、「チエンカルバゾン−メチル」は、メチル４−［（４，５−ジヒドロ−３−メトキシ−４−メチル−５−オキソ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）カルボニルスルファモイル］−５−メチルチオフェン−３−カルボキシレート（ＩＵＰＡＣ）またはメチル４−［［［（４，５−ジヒドロ−３−メトキシ−４−メチル−５−オキソ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）カルボニル］アミノ］スルホニル］−５−メチル−３−チオフェンカルボキシレート（ＣＡＳ）としても知られる除草剤である。
【００６１】
本明細書で使用するように、「増大した除草剤耐性」または「増大した除草剤抵抗性」は、対応する野生型ＡＨＡＳタンパク質よりもＡＨＡＳ阻害除草剤よる阻害が顕著に少ないＡＨＡＳタンパク質（例えば、突然変異体ＡＨＡＳタンパク質）を指すが、これは、例えば、他の種のＡＨＡＳタンパク質と比較して増大した耐性を示す天然の変異体も指す。これは、そのような除草剤耐性ＡＨＡＳタンパク質（をコードするアレル）を含まないが、その代わりに、除草剤不耐性ＡＨＡＳタンパク質（をコードするアレル）を含む植物と比較したとき、除草剤によるその正常な成長および発生の妨害が顕著に少ないそのような除草剤耐性ＡＨＡＳタンパク質（をコードするアレル）を含む植物も指す。
【００６２】
ＡＨＡＳタンパク質の除草剤耐性は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（国際公開第０８／１２４４９５号パンフレット）における相補性アッセイ、またはＡＨＡＳ酵素アッセイ（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７１：１７３−１７９，１９８８）などの当技術分野で公知の方法によって測定することができる。あるいは、ＡＨＡＳタンパク質を含む植物の除草剤耐性は、これらの植物の（例えば、胚軸の）外植片を、除草剤を含む成長培地（例えば、カルス誘導培地）上で培養し、その後、様々な除草剤濃度下での外植片の成長を測定することによって評価することができる。
【００６３】
本明細書で使用するように、除草剤の好ましい量または濃度は、「有効量」または「有効濃度」である。「有効量」および「有効濃度」とは、それぞれ、除草剤耐性ＡＨＡＳアレルおよびタンパク質を欠く、類似した野生型植物、植物組織、植物細胞もしくは種子を死滅させるかまたはこれらの成長を阻害するのに十分であるが、該量が、本発明の除草剤抵抗性植物、植物組織、植物細胞、および種子を死滅させないかまたはこれらの成長をそれほどひどくは阻害しない量および濃度を意図するものである。通常、除草剤の有効量は、目的の雑草を死滅させるために農業生産系で日常的に用いられている量である。そのような量は、当業者に公知である。
【００６４】
本明細書で使用される「突然変異誘発」は、植物細胞（例えば、複数のアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種子または他の部分、例えば、花粉など）を、細胞のＤＮＡ中で突然変異を誘発する技術、例えば、突然変異誘発物質、例えば、化学物質（例えば、エチルメチルスルホネート（ＥＭＳ）、エチルニトロソ尿素（ＥＮＵ）など）または電離放射線（中性子（例えば、高速中性子突然変異誘発など）、アルファ線、ガンマ線（例えば、コバルト６０供給源により供給されるもの）、Ｘ線、ＵＶ照射など）、またはこれらのうちの２つ以上の組合せに供するプロセスを指す。したがって、１つ以上のＡＨＡＳアレルの所望の突然変異誘発は、化学的手段（例えば、１つ以上の植物組織とエチルメチルスルホネート（ＥＭＳ）、エチルニトロソ尿素などとの接触によるもの）の使用によるか、物理的手段（例えば、ｘ線など）の使用によるか、またはガンマ照射（例えば、コバルト６０供給源により供給されるもの）によって達成することができる。放射線照射によって引き起こされる突然変異が、転座または複雑な再配列などの、大きな欠失または他の甚だしい損傷であることが多いのに対し、化学的突然変異原によって引き起こされる突然変異は、点突然変異などの、より不連続な損傷であることが多い。例えば、ＥＭＳはグアニン塩基をアルキル化し、それにより、塩基の誤対合が生じる：アルキル化されたグアニンはチミン塩基と対合し、主にＧ／ＣからＡ／Ｔへの移行が生じる。突然変異誘発後、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物を、処理した細胞から公知の技術を用いて再生させる。例えば、結果として得られたアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種子を従来の成長手順に従って植えることができ、自家受粉後に、種子を植物上に形成させる。あるいは、例えば、Ｃｏｖｅｎｔｒｙら（１９８８，Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ．Ｄｅｐ．Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎ．Ｂｕｌｌ．ＯＡＣ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ０４８９．Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｇｕｅｌｐｈ，Ｇｕｅｌｐｈ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）によって記載されているように、倍加半数体小植物を取り出して、ホモ接合植物を直ちに形成させることができる。この世代またはその後の世代でのそのような自家受粉の結果として形成されるさらなる種子を収穫し、突然変異体ＡＨＡＳアレルの存在についてスクリーニングすることができる。特定の突然変異アレルをスクリーニングするためのいくつかの技術が公知であり、例えば、Ｄｅｌｅｔｅａｇｅｎｅ（商標）（Ｄｅｌｅｔｅ−ａ−ｇｅｎｅ；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ２７：２３５−２４２）では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイを用いて、高速中性子突然変異誘発により生成される欠失突然変異体についてスクリーニングし、ＴＩＬＬＩＮＧ（ゲノム中の標的化局所損傷誘導（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｏｃａｌ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｇｅｎｏｍｅｓ）；ＭｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １８：４５５−４５７）によって、ＥＭＳ誘発性点突然変異などが同定される。特定の突然変異体ＡＨＡＳアレルの存在についてスクリーニングするためのさらなる技術は、以下の実施例に記載されている。
【００６５】
本発明による「植物（ｐｌａｎｔ）」または「植物（ｐｌａｎｔｓ）」に言及する場合はいつでも、植物部分（細胞、組織または器官、子嚢、種子、切断部分、例えば、根、葉、花、花粉など）、親の識別特徴を保持する植物の子孫、例えば、自家受粉または交配により得られる種子、例えば、雑種種子（２つの近交親系統を交配させることにより得られる）、雑種植物およびそれに由来する植物部分もまた、別途指示しない限り、本明細書に包含されることが理解される。
【００６６】
「作物植物」は、限定するものではないが、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）（ＡＡＣＣ、２ｎ＝３８）、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）（ＡＡＢＢ、２ｎ＝３６）、アビシニアガラシ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｒｉｎａｔａ）（ＢＢＣＣ、２ｎ＝３４）、ハクサイ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ（ｓｙｎ．Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ））（ＡＡ、２ｎ＝２０）、ブラッシカ・オレラセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）（ＣＣ、２ｎ＝１８）またはクロガラシ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎｉｇｒａ）（ＢＢ、２ｎ＝１６）などの、作物として栽培される植物種を指す。この定義は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）などの雑草を包含しない。
【００６７】
本明細書で使用される「雑草」という用語は、望ましくないにもかかわらず作物植物と作物植物の間で成長し、作物植物の成長および発生を阻害し得る、例えば、圃場における望ましくない草木、または意図的に植え付けられる作物植物以外の植物を指す。
【００６８】
「品種」は、本明細書では、ＵＰＯＶ条約に準拠して用いられており、既知の最も低い階層の単一植物分類群内での植物分類を指す。この分類は、所与の遺伝子型または遺伝子型の組合せに起因する特徴の発現によって定義することができ、該特徴の少なくとも１つの発現によって任意の他の植物分類から識別することができ、かつ不変のまま繁殖させる（安定である）ためのその好適性に関する単位と考えられる。
【００６９】
本明細書で使用するように、植物を参照して用いられる場合の「非天然の」または「栽培された」という用語は、人間によって改変されたゲノムを有する植物を意味する。トランスジェニック植物は、例えば、外因性の核酸分子、例えば、転写されたときに内在性遺伝子（例えば、本発明によるＡＨＡＳ遺伝子）の発現を低下させることができる生物学的に活性のあるＲＮＡ分子を生じる転写領域を含むキメラ遺伝子を含み、したがって、人間により遺伝子改変されている非天然植物である。さらに、内在性遺伝子における突然変異、例えば、突然変異誘発物質への曝露の結果としての内在性ＡＨＡＳ遺伝子における（例えば、調節エレメントにおけるまたはコード配列における）突然変異を含む植物も、人間によって遺伝子改変されているので、非天然の植物と考えられる。さらに、特定の種の植物、例えば、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）は、例えば、その植物の同じ種または別の種の植物、例えば、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）またはカブ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ）を用いた、方向性のある育種プロセス、例えば、マーカー利用育種および選択または遺伝子移入の結果として、天然ではその特定の植物種に生じない内在性遺伝子（例えば、内在性ＡＨＡＳ遺伝子）に突然変異を含むが、このような植物もまた非天然の植物と考えられる。対照的に、自然発生的なまたは天然の突然変異だけ含む植物、すなわち、人間により遺伝子改変されていない植物は、本明細書で定義される「非天然の植物」ではなく、したがって、本発明に包含されない。当業者は、非天然の植物は、通常、天然の植物と比較したときに変化したヌクレオチド配列を有するが、非天然の植物はまた、そのヌクレオチド配列を変えることなく、例えば、そのメチル化パターンを改変することによって、人間により遺伝子改変され得ることを理解する。
【００７０】
本明細書で使用するように、「農業的に好適な植物の発生」は、通常の農作業でのその性能、より具体的には、圃場でのその樹立、活力、開花期、高さ、成熟、耐倒伏性、収穫高、疾患抵抗性、耐裂莢性などに悪影響を及ぼさない植物、特に、菜種植物の発生を指す。したがって、農業的に好適な植物の発生によって顕著に増大した除草剤耐性を有する株は、他の植物と比較したときに増大した除草剤耐性を有する一方で、同様の圃場での樹立、活力、開花期、高さ、成熟、耐倒伏性、収穫高、疾患抵抗性、耐裂莢性などを維持する。
【００７１】
本明細書で使用するように、「位置Ｘから位置Ｙまでの配列番号：Ｚのヌクレオチド配列」は、両方のヌクレオチド終点を含むヌクレオチド配列を示す。
【００７２】
「含む」という用語は、記載した部分、工程、または構成要素の存在を特定するものと解釈されるべきであるが、１つ以上のさらなる部分、工程、または構成要素の存在を除外するものではない。したがって、特定の形質を含む植物は、さらなる形質を含むことができる。
【００７３】
単数形の単語（例えば、植物または根）に言及するとき、複数形もまた本明細書に含まれることが理解される（例えば、複数の植物、複数の根）。したがって、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による要素への言及は、要素のうちの１つおよびただ１つが存在することが文脈から明らかに要求されない限り、要素のうちの２つ以上が存在する可能性を排除するものではない。したがって、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【００７４】
詳細な説明
セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）（ゲノムＡＡＣＣ、２ｎ＝４ｘ＝３８）は、二倍体祖先が起源であるために本質的に２つの二倍体ゲノム（ＡゲノムとＣゲノム）を含む異質四倍体（複二倍体）種であるが、これは、そのゲノムに５つのＡＨＡＳ遺伝子座遺伝子を含むと記載されている。ＡＨＡＳ２、ＡＨＡＳ３およびＡＨＡＳ４は、Ａゲノムが起源であるのに対し、ＡＨＡＳ１およびＡＨＡＳ５は、Ｃゲノムが起源である。ＡＨＡＳ１およびＡＨＡＳ３は、構成的に発現され、かつセイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）の成長および発生に不可欠な主要なＡＨＡＳ活性をコードする唯一の遺伝子である（Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【００７５】
セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物の突然変異を誘発させた個体群では、植物が、アミノ酸置換（ミスセンス突然変異）、すなわち、ＡＨＡＳ１とＡＨＡＳ３の両方におけるＰ１７９Ｓを生じさせ、かつ早過ぎる終止コドンの導入をもたらす突然変異をそのＡＨＡＳゲノムＤＮＡ中に有することを同定することができた。Ｐ１９７Ｓは、あるレベルのＳＵ耐性を付与するように見えた。しかしながら、驚くことに、一方のＡＨＡＳ遺伝子中のＰ１９７Ｓ突然変異をもう一方の遺伝子中の終止コドン突然変異（完全ノックアウトアレル）と組み合わせたとき、一方の遺伝子のみにおけるＰ１９７Ｓ突然変異と比較して、除草剤耐性が増大した。野生型アレルを、完全ノックアウトＡＨＡＳアレルと除草剤耐性ＡＨＡＳアレルの組合せと次第に置き換えることによって、ＡＨＡＳ多量体に対するミスセンス除草剤耐性ＡＨＡＳアレルの寄与が高くなれば高くなるほど、植物の除草剤耐性のレベルが高くなることが分かった。
【００７６】
したがって、第１の実施形態では、本発明は、完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物を提供する。
【００７７】
本明細書で使用するように、「完全ノックアウトＡＨＡＳアレル」は、非機能的ＡＨＡＳタンパク質、すなわち、ＡＨＡＳ二量体形成に関与することも、それに影響を及ぼすこともないＡＨＡＳタンパク質をコードするか、またはＡＨＡＳタンパク質を全くコードしないＡＨＡＳ遺伝子の核酸配列を指す。一実施形態では、完全ノックアウトＡＨＡＳアレルは、（配列番号：２のａａ１１９〜２１７もしくは５０８〜６０７、または配列番号：４のａａ１０４〜２０２もしくは４９３〜５９２または配列番号：６のａａ１０１〜１９９もしくは４９０〜５８９をコードする）２つの二量体接触部分のうちの少なくとも１つの破壊または欠失をもたらし、そのコードされるタンパク質が二量体形成に関与することができないので、完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを生じさせると考えられる、ＡＨＡＳコード配列中の任意の突然変異（ミスセンス、ナンセンスまたはフレームシフト突然変異）を指す。
【００７８】
特定の実施形態では、完全ノックアウトＡＨＡＳアレルは、１つ以上の翻訳終止コドンが対応する野生型ＡＨＡＳアレルのコードＤＮＡおよび対応するｍＲＮＡ配列に導入されているＡＨＡＳアレル中の突然変異であるナンセンス突然変異を含むことができる。翻訳終止コドンは、「ＴＧＡ」（ＲＮＡ中ではＵＧＡ）、「ＴＡＡ」（ＲＮＡ中ではＵＡＡ）および「ＴＡＧ」（ＲＮＡ中ではＵＡＧ）である。したがって、コード配列中にインフレームの終止コドンを生成させる任意の突然変異（欠失、挿入または置換）は、翻訳の終結およびアミノ酸鎖の切断をもたらす。一実施形態では、ナンセンス突然変異を含む突然変異体ＡＨＡＳアレルは、インフレームの終止コドンが、単一ヌクレオチド置換によってＡＨＡＳコドン配列中に導入されているＡＨＡＳアレル、例えば、ＨＥＴＯ１１２、ＨＥＴＯ１０２、ＨＥＴＯ１０およびＨＥＴＯ１０４である。別の実施形態では、完全ノックアウトＡＨＡＳアレルは、インフレームの終止コドンが二重ヌクレオチド置換によってＡＨＡＳコード配列に導入されているナンセンス突然変異を含むＡＨＡＳアレルである。また別の実施形態では、完全ノックアウトＡＨＡＳは、インフレームの終止コドンが三重ヌクレオチド置換によってＡＨＡＳコード配列に導入されているナンセンス突然変異を含むＡＨＡＳアレルである。切断タンパク質は、突然変異の下流（３’）のコードＤＮＡによってコードされたアミノ酸（すなわち、ＡＨＡＳタンパク質のＣ末端部分）を欠き、突然変異の上流（５’）のコードＤＮＡによってコードされたアミノ酸（すなわち、ＡＨＡＳタンパク質のＮ−末端部分）を保持する。したがって、（配列番号：２のａａ５０８〜６０７もしくは配列番号：４のａａ４９３〜５９２もしくは配列番号：６のａａ４９０〜５８９をコードする）第２の二量体接触部分をコードするヌクレオチドの上流のどこかにあるまたはそのようなヌクレオチドを含むナンセンス突然変異を含む突然変異体ＡＨＡＳアレルは、完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを生じさせる。また、タバコＡＨＡＳタンパク質のＭ５４２およびＨ１４２に対応するアミノ酸が改変されているＡＨＡＳタンパク質、ならびにタバコＡＨＡＳタンパク質に対応するａａ５６７〜５８２の領域とａａ６３０のＣ末端の領域が改変されているＡＨＡＳタンパク質をコードするＡＨＡＳアレルも、完全ノックアウトＡＨＡＳアレルであると考えられる。
【００７９】
本発明はまた、そのゲノム中に少なくとも１つの第２の突然変異体ＡＨＡＳアレルをさらに含む植物であって、この第２の突然変異体ＡＨＡＳアレルが除草剤耐性ＡＨＡＳタンパク質をコードする、植物を提供する。除草剤耐性ＡＨＡＳタンパク質の例は、本出願中の他の場所に、ならびに例えば、Ｄｕｇｇｌｅｂｙら（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４６，ｐ３０９−３２４，２００８）、国際公開第０８／１２４４９５号パンフレットおよび国際公開第０９／０３１０３１号パンフレットに記載されている。当業者は、特定の除草剤耐性ＡＨＡＳアレルを選ぶことにより、特定のＡＨＡＳ阻害除草剤に対する植物の耐性を決定することができる。例えば、Ｐ１９７Ｓ置換は、例えば、チエンカルバゾン−メチルに対する耐性を付与するが、例えば、残基６５３におけるＳｅｒからＡｓｎへの置換は、イミダゾリノンに対する耐性を付与する（Ｓａｔｈａｓｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９７（３）：１０４４−１０５０，１９９１）。
【００８０】
本発明によるそのような除草剤耐性ＡＨＡＳタンパク質、またはその変異体のアミノ酸配列は、配列番号：２、配列番号：４または配列番号：６との少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列は、配列表に示したＡＨＡＳ配列と「本質的に同様」または「本質的に同一」であると表すこともできる。
【００８１】
植物中のノックアウトＡＨＡＳアレルと除草剤耐性ＡＨＡＳアレルの組合せによって置き換えられる野生型（非除草剤耐性）ＡＨＡＳアレルが多ければ多いほど、除草剤耐性ＡＨＡＳタンパク質から構成されるＡＨＡＳ多量体が多くなり、植物の除草剤耐性が大きくなることが理解されるであろう。
【００８２】
したがって、別の実施形態では、除草剤耐性ＡＨＡＳアレルおよび完全ノックアウトＡＨＡＳアレルだけを含み、もはや活性型ＡＨＡＳ遺伝子の野生型（非除草剤耐性）ＡＨＡＳアレルを含まない植物を提供する。この実施形態は、全ての（非除草剤耐性）野生型アレルが完全ノックアウトＡＨＡＳアレルによって置き換えられているが、除草剤耐性ＡＨＡＳをコードする導入遺伝子が導入されている植物も包含する。
【００８３】
本明細書で使用するように、活性型ＡＨＡＳ遺伝子は、ＡＨＡＳタンパク質機能に寄与するＡＨＡＳ遺伝子を指す。例えば、本出願中の他の場所に記載したようなセイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）では、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）ゲノム中に存在する合計５つのＡＨＡＳ遺伝子のうちのＡＨＡＳ１遺伝子およびＡＨＡＳ３遺伝子だけが活性型ＡＨＡＳ遺伝子である。
【００８４】
本発明の突然変異体ＡＨＡＳアレルを含む植物細胞を提供することも本発明の実施形態である。伝統的な育種法によって生産される、本発明の突然変異体ＡＨＡＳアレルを含む植物の配偶子、種子、接合胚もしくは体細胞胚のいずれか、子孫または雑種もまた、本発明の範囲内に含まれる。
【００８５】
本発明はさらに、
ｅ）受託番号ＮＣＩＭＢ４１６９０の下、２００９年１２月１７日にＮＣＩＭＢ  Ｌｉｍｉｔｅｄに寄託されたＡＨＡＳ１−ＨＥＴＯ１１２を含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種子；
ｆ）受託番号ＮＣＩＭＢ４１６８７の下、２００９年１２月１７日にＮＣＩＭＢ  Ｌｉｍｉｔｅｄに寄託されたＡＨＡＳ３−ＨＥＴＯ１０２を含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種子；
ｇ）受託番号ＮＣＩＭＢ４１６８８の下、２００９年１２月１７日にＮＣＩＭＢ  Ｌｉｍｉｔｅｄに寄託されたＡＨＡＳ３−ＨＥＴＯ１０３を含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種子；または
ｈ）受託番号ＮＣＩＭＢ４１６８９の下、２００９年１２月１７日にＮＣＩＭＢ  Ｌｉｍｉｔｅｄに寄託されたＡＨＡＳ３−ＨＥＴＯ１０４を含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種子
からなる群から選択されるアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種子を提供する。
【００８６】
上記の種子から得られる、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物、またはその細胞、部分、種子もしくは子孫も提供する。
【００８７】
本発明はさらに、完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを表す核酸配列を提供する。野生型ＡＨＡＳアレルの核酸配列は配列表に示されており、一方、これらの配列ならびにこれらと本質的に同様の配列の突然変異体ＡＨＡＳ配列（ミスセンスおよびノックアウト）は、野生型ＡＨＡＳ配列を参照しながら、以下本明細書中におよび実施例に記載されている。
【００８８】
本発明による「ＡＨＡＳ核酸配列」または「ＡＨＡＳ変異体核酸配列」は、配列番号：２、配列番号：４もしくは配列番号：６との少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列、または配列番号：１、配列番号：３もしくは配列番号：５との少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する核酸配列である。これらの核酸配列は、配列表に示したＡＨＡＳ配列と「本質的に同様」または「本質的に同一」であると表すこともできる。
【００８９】
ＡＨＡＳ遺伝子の（産生されるコードされた機能的なＡＨＡＳタンパク質の消失もしくはその量の顕著な低下または産生されるＡＨＡＳタンパク質の消失をもたらす１つ以上の突然変異を含む）完全ノックアウト突然変異体ＡＨＡＳ核酸配列を提供する。そのような突然変異体核酸配列（ａｈａｓ配列と表す）は、以下でさらに記載するような、様々な公知の方法を用いて作製および／または同定することができ、かつ内在性形態と単離された形態の両方で提供される。一実施形態では、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、特に、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種、とりわけ、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）由来の完全ノックアウト突然変異体ＡＨＡＳ核酸配列を提供するが、他のアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）作物種由来の完全ノックアウト突然変異体ＡＨＡＳ核酸配列も提供する。例えば、Ａゲノムおよび／またはＣゲノムを含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種は、本発明による単一の植物中で同定し、かつ組み合わせることができるＡＨＡＳ遺伝子の異なるアレルを含むことができる。さらに、突然変異誘発法を用いて、野生型ＡＨＡＳアレル中に突然変異を生成させ、それにより、本発明に従って用いられる突然変異体ＡＨＡＳアレルを生成させることができる。特定のＡＨＡＳアレルは交配および選択によって植物中で組み合わせることが好ましいので、一実施形態では、ＡＨＡＳ核酸配列を、植物、例えば、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物、好ましくは、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）と交配することができるかまたは「合成」セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物を作製するために用いることができるアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物内で（すなわち、内在性に）提供する。異なるアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種間の交雑は、例えば、Ｓｎｏｗｄｏｎ（２００７，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：８５−９５）で言及されているように、当技術分野で記載されている。例えば、種間交雑を用いて、（そのＣゲノムとＢゲノムの間での非正統的組換えの散発的事象によって）例えば、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）のＣゲノム（ＡＡＣＣ）からアビシニアガラシ（Ｂ．ｃａｒｉｎａｔａ）のＣゲノム（ＢＢＣＣ）に、または例えば、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）のＣゲノム（ＡＡＣＣ）からカラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）のＢゲノム（ＡＡＢＢ）にさえも遺伝子を移動させることができる。「再合成」または「合成」セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）株は、もとの祖先であるブラッシカ・オレラセア（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ）（ＣＣ）とカブ（Ｂ．ｒａｐａ）（ＡＡ）を交配することによって産生することができる。種間、そしてまた属間の不和合性障壁は、例えば、胚救出技術またはプロトプラスト融合によって、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）作物種とその近縁種との交配においてうまく乗り越えることができる（例えば、Ｓｎｏｗｄｏｎ、上記を参照されたい）。
【００９０】
したがって、核酸分子は、既に上で詳細に記載されているような、１つ以上の突然変異、例えば、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異もしくは「終止コドン突然変異、挿入もしくは欠失突然変異、フレームシフト突然変異および／またはスプライス部位突然変異を含むことができる。基本的に、非機能的ＡＨＡＳタンパク質を形成させるかまたはＡＨＡＳタンパク質を全く形成させない、野生型タンパク質と比べて少なくとも１つのアミノ酸挿入、欠失および／または置換を含むタンパク質を生じさせる突然変異はいずれも、完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを生じさせる。しかしながら、タンパク質の特定の部分における突然変異、例えば、機能的なアミノ酸残基またはドメインの重要な部分、例えば、二量体接触部分のうちの１つが欠失しているかまたは置換されている切断タンパク質を生じさせる突然変異は、非機能的ＡＨＡＳタンパク質を生じさせる可能性がより高いことが理解される。
【００９１】
したがって、一実施形態では、上で記載した突然変異のタイプのいずれかのうちの１つ以上を含む核酸配列を提供する。別の実施形態では、１つ以上の終止コドン（ナンセンス）突然変異を含むａｈａｓ配列を提供する。そのような配列を内在性に含む植物および植物部分と同様に、上記の突然変異体核酸配列のいずれかをそれ自体で（単離された形態で）提供する。本明細書中の下記表２には、最も好ましい完全ノックアウトＡＨＡＳアレルが記載されている。
【００９２】
突然変異体ＡＨＡＳアレルは、当技術分野で標準的な様々な方法を用いて、例えば、ＡＨＡＳゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡの一部もしくは全てを増幅するＰＣＲに基づく方法を用いて、作製し（例えば、突然変異誘発によって誘導し）、かつ／または同定することができる。
【００９３】
突然変異誘発後、植物を、処理した種子から成長させるか、または処理した細胞から既知の技術を用いて再生させる。例えば、突然変異させた種子を従来の成長手順に従って植え、自家受粉後に、種子を植物上に形成させる。あるいは、例えば、Ｃｏｖｅｎｔｒｙら（１９８８，Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ．Ｄｅｐ．Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎ．Ｂｕｌｌ．ＯＡＣ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ０４８９．Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｇｕｅｌｐｈ，Ｇｕｅｌｐｈ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）によって記載されているように、処理した小胞子または花粉細胞から倍加半数体の小植物体を取り出し、ホモ接合植物を直ちに形成させることができる。この世代またはその後の世代でのそのような自家受粉の結果として形成されるさらなる種子を収穫し、当技術分野で標準的な技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく技術（ＡＨＡＳアレルの増幅）もしくはハイブリダイゼーションに基づく技術、例えば、サザンブロット解析、ＢＡＣライブラリースクリーニングなど、および／またはＡＨＡＳアレルの直接シークエンシングを用いて、突然変異体ＡＨＡＳアレルの存在についてスクリーニングすることができる。突然変異体ＡＨＡＳアレル中の点突然変異（いわゆる単一ヌクレオチド多型またはＳＮＰ）の存在についてスクリーニングするために、当技術分野で標準的なＳＮＰ検出法、例えば、オリゴライゲーションに基づく技術、１塩基伸長に基づく技術（例えば、パイロシークエンシング）、または制限部位の違いに基づく技術（例えば、ＴＩＬＬＩＮＧ）を用いることができる。
【００９４】
あるいは、１つ以上の突然変異体ＡＨＡＳアレルを含む植物または植物部分を、他の方法、例えば、ＰＣＲを用いて、高速中性子突然変異誘発により生成される欠失突然変異体についてスクリーニングする「Ｄｅｌｅｔｅ−ａ−ｇｅｎｅ（商標）」法（Ｌｉ  ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，２００２，Ｆｕｎｃｔ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２：２５４−２５８により概説されている）、変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）を用いて、ＥＭＳ誘導性点突然変異を同定し、ヘテロ二重鎖解析によって塩基対変化を検出するＴＩＬＬＩＮＧ（ゲノム中の局所損傷の標的化（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｌｏｃａｌ  Ｌｅｓｉｏｎｓ  ＩＮ  Ｇｅｎｏｍｅｓ））法（ＭｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １８：４５５、およびＭｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３，４３９−４４２）などを用いて作製および同定することができる。記述したように、ＴＩＬＬＩＮＧでは、（例えば、突然変異体−野生型ＤＮＡヘテロ二重鎖のＣｅｌ  １切断およびシークエンシングゲルシステムを用いる検出を用いる）突然変異のハイスループットスクリーニングが用いられる。したがって、１つ以上の突然変異体ＡＨＡＳアレルを含む植物または植物部分を同定するためのＴＩＬＬＩＮＧの使用、ならびにそのような植物、植物器官、組織および種子を作製および同定するための方法が本明細書に包含される。したがって、一実施形態では、本発明による方法は、植物種子の突然変異誘発（例えば、ＥＭＳ突然変異誘発）、植物個体またはＤＮＡのプール、目的の領域のＰＣＲ増幅、ヘテロ二重鎖形成およびハイスループット検出、突然変異体植物の同定、突然変異体ＰＣＲ産物のシークエンシングといった工程を含む。他の突然変異誘発法および選択法を用いて、そのような突然変異体植物を同じように作製することができることが理解される。
【００９５】
ＡＨＡＳアレルに突然変異を誘導する代わりに、当技術分野で公知の方法によって、天然の（自然発生的な）突然変異体アレルを同定することができる。例えば、ＥＣＯＴＩＬＬＩＮＧ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １３５（２）：６３０−６）を用いて、複数の植物または植物部分を天然の突然変異体ＡＨＡＳアレルの存在についてスクリーニングすることができる。上記の突然変異誘発技術については、同定されたＡＨＡＳアレルを後で交配（種間または種内交配）および選択によって他のアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種、例えば、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）に導入することができるように、Ａゲノムおよび／またはＣゲノムを含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種をスクリーニングすることが好ましい。ＥＣＯＴＩＬＬＩＮＧでは、個々の植物または植物のプールをＡＨＡＳ標的のＰＣＲ増幅、ヘテロ二重鎖形成およびハイスループット解析に用いる上記のＴＩＬＬＩＮＧ法によって、育種系統または関連種における天然の多型をスクリーニングする。この後、必要とされる突然変異を有する個々の植物を選択することができ、この植物を後に、所望の突然変異体アレルを組み入れる育種プログラムで用いることができる。
【００９６】
次に、同定した突然変異体アレルをシークエンシングすることができ、配列を野生型アレルと比較して、突然変異を同定することができる。場合により、突然変異体アレルが除草剤耐性ＡＨＡＳ突然変異体アレルまたは完全ノックアウトＡＨＡＳ突然変異体アレルとして機能するかどうかを上で示したように試験することができる。このアプローチを用いて、複数の突然変異体ＡＨＡＳアレル（およびこれらのうちの１つ以上を含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物）を同定することができる。次に、所望の突然変異体アレルを、以下でさらに記載するような交配および選択法によって所望の野生型アレルと組み合わせることができる。最後に、所望の数の突然変異体ＡＨＡＳならびに所望の数の野生型およびまたは除草剤耐性ＡＨＡＳアレルを含む単一の植物を作製する。
【００９７】
突然変異体ＡＨＡＳアレルまたは突然変異体ＡＨＡＳアレルを含む植物は、当技術分野で公知の方法、例えば、直接シークエンシング、ＰＣＲに基づくアッセイまたはハイブリダイゼーションに基づくアッセイによって同定または検出することができる。あるいは、本明細書で提供された特定の突然変異体ＡＨＡＳアレル特異的配列情報を用いて方法を開発することもできる。そのような代わりの検出法としては、インベーダー（商標）技術としても知られる、特定の核酸構造の侵襲的切断に基づく線形シグナル増幅検出法（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９８５，５５７号明細書「核酸の侵襲的切断（Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）」、同第６，００１，５６７号明細書「インベーダー介在性の切断による核酸配列の検出（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｂｙ  Ｉｎｖａｄｅｒ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｃｌｅａｖａｇｅ）」に記載されているもの）、ＲＴ−ＰＣＲに基づく検出法（例えば、Ｔａｑｍａｎ）、または他の検出法（例えば、ＳＮＰｌｅｘ）が挙げられる。簡潔に述べると、インベーダー（商標）技術では、標的突然変異配列を、例えば、突然変異配列のヌクレオチド配列または５’フランキング領域と突然変異領域の間の接続領域にまたがる配列を含む標識した第１の核酸オリゴヌクレオチドと、ならびに突然変異配列のすぐ下流および突然変異配列に隣接する３’フランキング配列を含む第２の核酸オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることができ、ここで、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１ヌクレオチド重複する。このハイブリダイゼーションによって生成される二重鎖または三重鎖構造は、標的配列を無傷にしたままで、酵素（クリベース（登録商標））による選択的プローブ切断を可能にする。切断された標識プローブは、その後、さらなるシグナル増幅をもたらす中間工程を介して検出される可能性がある。
【００９８】
本発明はまた、１つの植物中での特定のＡＨＡＳアレルの組合せ、１つの植物から別の植物への１つ以上の特定の突然変異体ＡＨＡＳアレルの移動、１つ以上の特定の突然変異体ＡＨＡＳアレルを含む植物、これらの植物から得られる子孫、ならびにこれらの植物に由来する植物細胞、植物部分、および植物種子に関する。
【００９９】
したがって、本発明の一実施形態では、１つの植物から別の植物に少なくとも１つの選択された完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを移動させる方法であって、
ａ．上で記載したような、少なくとも１つの完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを含む第１の植物を作製および／もしくは同定するか、または上で記載したような第１の植物（ここで、第１の植物は、少なくとも１つの完全ノックアウトＡＨＡＳアレルについてホモ接合性またはヘテロ接合性である）を作製する工程と、
ｂ．少なくとも１つの完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを含む第１の植物を、少なくとも１つの完全ノックアウトアレルを含まない第２の植物と交配し、交配種からＦ１種子（ここで、第１の植物がその完全ノックアウトＡＨＡＳアレルについてホモ接合性である場合、種子は完全ノックアウトＡＨＡＳアレルについてヘテロ接合性であり、第１の植物がその完全ノックアウトＡＨＡＳアレルについてヘテロ接合性である場合、種子の半分はヘテロ接合性であり、種子の半分は非接合性である、すなわち、突然変異体ＡＨＡＳアレルを含まない）を回収し、場合により、上で記載したような、１つ以上の選択された完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを含むＦ１植物を同定する工程と、
ｃ．１つ以上の世代（ｘ）の間、少なくとも１つの選択された完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを含むＦ１植物を、少なくとも１つの選択された突然変異体ＡＨＡＳアレルを含まない第２の植物と戻し交配し、交配種からＢＣｘ種子を回収し、上で記載したような、少なくとも１つの選択された突然変異体ＡＨＡＳアレルを含むＢＣｘ植物を全ての世代で同定する工程と
を含む、方法を提供する。
【０１００】
本発明の別の実施形態では、１つの植物中で、上で記載したような完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを除草剤耐性ＡＨＡＳアレルと組み合わせる方法であって、
ａ．上で記載したような、少なくとも１つの選択された完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを含む少なくとも１つの植物および少なくとも１つの選択された除草剤耐性ＡＨＡＳアレルを含む少なくとも１つの植物を作製および／または同定する工程と、
ｂ．少なくとも１つの選択された完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを含む第１の植物を、少なくとも１つの選択された除草剤耐性ＡＨＡＳアレルを含む第２の植物と交配し、交配種からＦ１種子を回収し、場合により、上で記載したような、第１の植物由来の少なくとも１つの選択された完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを、第２の植物由来の少なくとも１つの選択された除草剤耐性ＡＨＡＳアレルとともに含むＦ１植物を同定する工程と、
ｃ．場合により、全ての選択されたＡＨＡＳアレルを含むＦ１植物が得られるまで工程（ｂ）を繰り返す工程と
を含む、方法を提供する。
【０１０１】
別の実施形態では、本発明は、完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを含むが、好ましくは農業的に好適な発生を維持する、植物、特に、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）作物植物、例えば、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物を産生する方法であって、上で記載したように、本発明によるＡＨＡＳアレルを１つの植物中で組み合わせ、かつ／またはそのようなアレルを１つの植物に移動させることを含む、方法を提供する。
【０１０２】
本発明のまた別の実施形態では、除草剤に対して耐性があるが、農業的に好適な発生を維持する、植物、特に、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）作物植物、例えば、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物を作製する方法であって、上で記載したように、本発明によるＡＨＡＳアレルを１つの植物中で組み合わせ、かつ／またはそのようなアレルを１つの植物に移動させることを含む、方法を提供する。
【０１０３】
作物植物周辺の雑草を防除する方法であって、
ａ）少なくとも１つの完全ノックアウトＡＨＡＳアレルおよび少なくとも１つの除草剤耐性ＡＨＡＳアレルを含む植物によって産生された種子を圃場に播種する工程と、
ｂ）雑草を防除するために有効量のＡＨＡＳ阻害除草剤を圃場の雑草および作物植物に適用することと、
ｃ）場合により、工程ａ）の前に、有効量のＡＨＡＳ阻害除草剤を圃場に適用する工程をさらに含む工程と
を含む、方法も提供する。
【０１０４】
本発明はまた、除草剤耐性植物を得るための、除草剤耐性植物、特に、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）作物植物、例えば、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物を得るための本発明の完全ノックアウトＡＨＡＳアレルの使用に関する。
【０１０５】
本発明はさらに、１つ以上の完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを含む種子を産生するための、または１つ以上の完全ノックアウトＡＨＡＳアレルを含む菜種の作物を産生するための、植物、特に、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）作物植物、例えば、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物の使用に関する。
【０１０６】
本明細書に記載の方法および手段は、全ての植物細胞および植物、双子葉植物と単子葉植物の両方の植物細胞、ならびに限定するものではないが、綿、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）野菜、菜種、小麦、コーンまたはトウモロコシ、大麦、アルファルファ、落花生、ヒマワリ、イネ、オート麦、サトウキビ、大豆、芝草、大麦、ライ麦、ソルガム、サトウキビ、野菜（チコリ、レタス、トマト、ズッキーニ、ピーマン、ナス、キュウリ、メロン、タマネギ、ニラネギを含む）、タバコ、ジャガイモ、テンサイ、パパイヤ、パイナップル、マンゴー、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）をはじめとする植物だけでなく、園芸、草花栽培または林業（ポプラ、モミ、ユーカリなど）で用いられる植物にも好適であると考えられることが当業者には明白であろう。
【０１０７】
配列
配列番号：１：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＹ０４２８１９．１）由来のＡＨＡＳ１遺伝子のゲノムＤＮＡ／コード配列
配列番号：２：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のＡＨＡＳタンパク質のアミノ酸配列
配列番号：３：セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）由来のＡＨＡＳ１遺伝子のゲノムＤＮＡ／コード配列
配列番号：４：セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）由来のＡＨＡＳ１タンパク質のアミノ酸配列
配列番号：５：セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）由来のＡＨＡＳ３遺伝子のゲノムＤＮＡ／コード配列
配列番号：６：セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）由来のＡＨＡＳ３タンパク質のアミノ酸配列
【実施例】
【０１０８】
実施例１−突然変異体アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）ＡＨＡＳアレルの作製および単離
実施例１で同定されるＡＨＡＳ１およびＡＨＡＳ３遺伝子の突然変異は、以下の通りに作製および同定された：
−  優良な春菜種育種系統由来の３０，０００個の種子（Ｍ０種子）に、脱イオン水または蒸留水中の湿った濾紙の上で２時間水分を吸収させた。これらの種子の半分を０．８％のＥＭＳに、半分を１％のＥＭＳ（Ｓｉｇｍａ：Ｍ０８８０）に曝露させて、４時間インキュベートした。
−  突然変異させた種子（Ｍ１種子）を３回すすぎ、ドラフト内で一晩乾燥させた。３０，０００個のＭ１植物を土壌中で成長させ、自家受粉させて、Ｍ２種子を作製した。Ｍ２種子を各々１つ１つのＭ１植物について収穫した。
−  二度、異なるＭ１植物に由来する４８００個のＭ２植物を成長させ、ＣＴＡＢ法（Ｄｏｙｌｅ  ａｎｄ  Ｄｏｙｌｅ，１９８７，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  １９：１１−１５）に従って、ＤＮＡサンプルを各々１つ１つのＭ２植物の葉サンプルから調製した。
−  標準的なシークエンシング技術（Ａｇｏｗａ）によって直接的にシークエンシングし、ＮｏｖｏＳＮＰソフトウェア（ＶＩＢ  Ａｎｔｗｅｒｐ）を用いて点突然変異の存在について配列を解析することによって、ＤＮＡサンプルを、アミノ酸置換（ミスセンス突然変異）を引き起こすＡＨＡＳ１およびＡＨＡＳ３遺伝子中の点突然変異の存在またはＡＨＡＳ遺伝子のタンパク質コード領域中の終止コドン（潜在的な完全ノックアウト突然変異）の導入についてスクリーニングした。
−  このようにして、以下の突然変異体ＡＨＡＳアレルを同定した。
【０１０９】
【表４】
2013514791.tif 000006
【０１１０】
結論として、上記実施例は、いかにして突然変異体ＡＨＡＳアレルを作製し、単離することができるかということを示している。また、そのような突然変異体アレルを含む植物材料を用いて、以下の実施例で記載されているように、選択された突然変異体および／またはノックアウトアレルを植物中で組み合わせることができる。
【０１１１】
実施例２−突然変異体アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）ＡＨＡＳアレルを含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の同定
実施例１で同定したＡＨＡＳ遺伝子中の突然変異を含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物を以下のように同定した：
−  Ｍ２植物のＤＮＡサンプルで同定した各々の突然変異体ＡＨＡＳアレルについて、ＡＨＡＳ突然変異を含むＭ２植物と同じＭ１植物に由来する少なくとも４８個のＭ２植物を成長させ、ＤＮＡサンプルを各々１つ１つのＭ２植物の葉サンプルから調製した。
−  ＤＮＡサンプルを、上で実施例１に記載されているように、同定されたＡＨＡＳ点突然変異の存在についてスクリーニングした。
−  同じ突然変異を含むヘテロ接合およびホモ接合（電気泳動図に基づいて決定される）Ｍ２植物を自家受粉させて、戻し交配し、ＢＣ１種子を収穫した。
【０１１２】
実施例３−完全ノックアウトＡＨＡＳアレルの評価
終止コドン突然変異（ＨＥＴＯ１０２、ＨＥＴＯ１０３、ＨＥＴＯ１０４、ＨＥＴＯ１１２）が、実際に、完全ノックアウトＡＨＡＳアレル、すなわち、二量体化することができないＡＨＡＳタンパク質をコードするかまたは全くＡＨＡＳタンパク質をコードしないＡＨＡＳアレルを生じさせたかどうかを評価するために、以下の交配を実施した：
１回のＢＣ１交配：
（＋＝野生型アレル、−＝突然変異体アレル）
ＡＨＡＳ１  ＋／−  ×  ＡＨＡＳ３  ＋／−
二重ＢＣ１植物を生じさせる：
２５％ＡＨＡＳ１  ＋／−、ＡＨＡＳ３  ＋／−、２５％ＡＨＡＳ１  ＋／−、ＡＨＡＳ３  ＋／＋、２５％ＡＨＡＳ１  ＋／＋、ＡＨＡＳ３  ＋／−および２５％ＡＨＡＳ１  ＋／＋、ＡＨＡＳ３＋／＋。
二重ＢＣ２交配：     
ＡＨＡＳ１  ＋／−、ＡＨＡＳ３  ＋／−（選択された二重ＢＣ１植物）  ×  ＡＨＡＳ１  ＋／＋、ＡＨＡＳ３  ＋／＋
二重ＢＣ２植物を生じると考えられる：
２５％ＡＨＡＳ１  ＋／−、ＡＨＡＳ３  ＋／−、２５％ＡＨＡＳ１  ＋／−、ＡＨＡＳ３  ＋／＋、２５％ＡＨＡＳ１  ＋／＋、ＡＨＡＳ３  ＋／−および２５％ＡＨＡＳ１  ＋／＋、ＡＨＡＳ３  ＋／＋
【０１１３】
各々のＡＨＡＳ１  ＋／−、ＡＨＡＳ３  ＋／−  ×  ＡＨＡＳ１  ＋／＋、ＡＨＡＳ３  ＋／＋交配のうち、２４個の子孫植物（二重ＢＣ２）を直接シークエンシングによって遺伝子型について解析した（表３）。
【０１１４】
【表５】
2013514791.tif 000007
【０１１５】
二重ヘテロ接合ＢＣ１植物は回収されなかったので、これらの結果は、ＡＨＡＳ１ノックアウトアレルとＡＨＡＳ３ノックアウトアレルの両方を含む花粉が生育不能であることを示し、ＨＥＴＯ１０２、ＨＥＴＯ１０３、ＨＥＴＯ１０４およびＨＥＴＯ１１２終止コドン突然変異が実際に、完全ノックアウトアレルとして機能することを示唆する。
【０１１６】
実施例４−突然変異体ＡＨＡＳアレルを含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の除草剤耐性の測定
温室内で成長したアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物中のミスセンスおよび／または完全ノックアウトＡＨＡＳアレルの存在とチエンカルバゾン−メチルに対する耐性の相関を以下のように決定した。実施例１および２で同定したアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の中から、交配を行なって、突然変異体ＡＨＡＳ１とＡＨＡＳ３アレルの両方を含む植物（Ｆ１）を得た。その後、これを戻し交配して、自家受粉させた（ＢＣ１Ｓ１）。単一遺伝子ＡＨＡＳミスセンス突然変異体を２回戻し交配した（ＢＣ２）。これらのＢＣ１Ｓ１（あり得る全ての遺伝子型組合せを表す）、およびＢＣ２単一ＡＨＡＳ遺伝子突然変異体植物（５０％  ＋／＋、５０％  ＋／−）を温室内で植え付けた。１〜２葉期での出芽後処理を５ｇ  ａ．ｉ．／ｈａの用量のチエンカルバゾン−メチルを用いて実施し、噴霧１０日後、生き残った植物を９ｃｍの鉢に移植した。これらの植物を、移植２０日後の表現型（高さ、枝分かれおよび葉の形態）について５〜１のスケールで評価した；タイプ５＝正常（噴霧されていない野生型表現型に対応する）；タイプ４＝正常な高さ、若干の枝分かれ、正常な葉；タイプ３＝中間の高さ、中間の枝分かれ、正常な葉；タイプ２＝低い、重度の枝分かれ（「株立ち（ｂｕｓｈｙ）」）、若干の葉の奇形；タイプ１＝低い、重度の枝分かれ（「株立ち」）、重度の葉の奇形（表４）。
【０１１７】
【表６】
2013514791.tif 000008
【０１１８】
ＨＥＴＯ１０８またはＨＥＴＯ１１１のみを含むＢＣ２種子のうち、発芽した種子の約半分が噴霧を切り抜けて生き残り、全てタイプ１植物またはタイプ２植物へと成長した。これは、ＡＨＡＳ１−Ｐ１９７ＳとＡＨＡＳ３−Ｐ１９７Ｓ突然変異が両方とも除草剤耐性を付与すること、およびこれらの生き残った植物が単一ミスセンス突然変異についてヘテロ接合性の植物（ＡＨＡＳ１  ＨＥＴＯ１０８／＋、ＡＨＡＳ３  ＋／＋およびＡＨＡＳ１  ＋／＋、ＡＨＡＳ３  ＨＥＴＯ１１１／＋）であったのに対し、生き残れなかった植物は野生型分離個体（ＡＨＡＳ１  ＋／＋、ＡＨＡＳ３  ＋／＋）であった可能性が高いことを示している。驚くことに、ＢＣ１Ｓ１植物において、一方のＡＨＡＳ遺伝子中のＰ１９７Ｓ突然変異をもう一方のＡＨＡＳ遺伝子中のノックアウトアレル（ＨＥＴＯ１０８／ＨＥＴＯ１０２、ＨＥＴＯ１０８／ＨＥＴＯ１０３、ＨＥＴＯ１０８／ＨＥＴＯ１０４、ＨＥＴＯ１１２／ＨＥＴＯ１１１）と組み合わせたとき、発芽した種子の約４分の３が噴霧を切り抜けて生き残り、そのうちの約４分の１がタイプ３の植物へと成長し、残りはタイプ２また１へと成長した。これは、生き残れなかった植物の４分の１がやはり野生型分離個体であり、生き残った植物は突然変異体アレルを含むことを示唆している。
【０１１９】
次に、２つのＰ１９７Ｓ−ノックアウト組合せ、ＨＥＴＯ１０８／ＨＥＴＯ１０４およびＨＥＴＯ１１１／ＨＥＴＯ１１２の中から、各植物タイプの１０個の植物（入手可能な場合）を直接シークエンシングによりジェノタイピングした（表５）。植物タイプごとの遺伝子型分布を比較したとき、ミスセンスアレルの量および完全ノックアウトアレルの量がタイプ１からタイプ３、４および５へと徐々に増加しているようであった。ミスセンスアレル対活性型ＡＨＡＳアレル（ミスセンスアレル＋野生型アレル）の比もまた、ＨＥＴＯ１０８／ＨＥＴＯ１０４およびＨＥＴＯ１１１／ＨＥＴＯ１１２について、ぞれぞれ、タイプ１植物の平均値０．３２および０．３３、タイプ２植物の平均値０．６５および０．６５から、タイプ３植物の平均値０．７４および０．８８へと植物タイプに伴って増加した。タイプ４植物およびタイプ５植物は、ＨＥＴＯ１０８／ＨＥＴＯ１０４植物でのみ観察され、このうち、タイプ４植物は、０．８３という平均のミスセンスアレル対活性型アレル比を示した。１つのタイプ５植物は、おそらく噴霧の間に失われた。
【０１２０】
【表７】
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【０１２１】
これらの結果は、ＡＨＡＳタンパク質プールに対する除草剤耐性ＡＨＡＳタンパク質の寄与が大きければ大きいほど、植物の除草剤耐性のレベルが高いことを示している。
【０１２２】
別の実験では、チエンカルバゾン−メチルの植付け前適用およびチエンカルバゾン−メチル出芽後噴霧に対する耐性に対するＡＨＡＳ完全ノックアウトとＡＨＡＳミスセンス除草剤耐性アレルの組合せの効果を温室内で試験した。この目的のために、実施例１および２で同定したアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物を優良親株と２回戻し交配し、その後、２回自家受粉させて、ホモ接合植物（ＢＣ２Ｓ２）を得た。２０ｇ  ａ．ｉ．／ｈａの用量のチエンカルバゾンメチルを散布した直後に土壌に対して植付け前処理を実施した。活力スコアの評価のために、植物を１〜９のスケールで評価した。この場合、１＝枯死、３＝不良、６＝一部の異常な表現型および９＝活力ありである。活力スコアは、処理の２、３および４週間後に計られたスコアの平均である。第１葉期での出芽後処理を１０ｇ  ａ．ｉ．／ｈａの用量のチエンカルバゾン−メチルを用いて実施した。活力スコアは、処理後の１、２および３週間後に計られたスコアの平均である。活力スコアの平均値（Ａｖ）および標準偏差（ＳＤ）を表６に示す。処理後の植物の代表的な写真を図２および３に示す。
【０１２３】
【表８】
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【０１２４】
表６ならびに図２および３は、チエンカルバゾン−メチルによる植付け前処理と出芽後噴霧の両方により、一方のＡＨＡＳ遺伝子がミスセンス除草剤耐性アレルについてホモ接合性であり、もう一方のＡＨＡＳ遺伝子が完全ノックアウトアレルについてホモ接合性である植物が、一方のＡＨＡＳ遺伝子がミスセンス除草剤耐性アレルについてホモ接合性であり、もう一方のＡＨＡＳ遺伝子がホモ接合野生型である植物よりも高いチエンカルバゾン−メチル耐性を示すことを示している。これらの結果は、ＡＨＡＳタンパク質プールに対する除草剤耐性ＡＨＡＳタンパク質の寄与が大きければ大きいほど、植物の除草剤耐性のレベルが高いという考えをさらに支持するものである。
【０１２５】
実施例５−圃場での突然変異体ＡＨＡＳアレルを含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の除草剤耐性の測定
ＡＨＡＳ完全ノックアウトアレルを含む植物の成長および性能を評価するために、ならびにアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物中の完全ノックアウトおよびミスセンスＡＨＡＳ遺伝子の存在と圃場でのアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の植物成長および除草剤耐性との相関をさらに解析するために、試験を設定し、実施した。この目的のために、実施例１および２で同定したアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物を優良親株と２回戻し交配し、その後、２回自家受粉させて、ホモ接合植物（ＢＣ２Ｓ２）を得た。植物は、３つの複製物を作って、分割法（ｓｐｌｉｔ  ｐｌｏｔ  ｄｅｓｉｇｎ）の列条試験区（ｒｏｗ  ｐｌｏｔｓ）（主試験区＝除草剤処理、副試験区＝遺伝子型）としてカナダの２つの場所で成長させた。０（処理Ａ）、１０（処理Ｂ）、２０（処理Ｃ）または３０（処理Ｄ）ｇ  ａ．ｉ．／ｈａの用量のチエンカルバゾンメチルを散布する約２日前に土壌に対して植付け前処理を実施した。様々なパラメータについてスコア化することにより、除草剤耐性を測定した。子葉期にパラメータ出現（ＥＲＧ）をスケール１〜９でスコア化した。この場合、１は後期出現を意味し、９は早期出現を意味する。散布１４日後（ＥＳＴ１）および散布２１日後（ＥＳＴ２）に、樹立をスコア化した。スコアは１〜９であった。この場合、１は最も悪い樹立（出現した植物が最も少ない）であり、９は最も良好な樹立（大部分の植物が出現する）である。樹立後に植物毒性（ＰＰＴＯＸ）を決定した。植物を１〜９のスケールで評価した。この場合、１＝完全黄変、５＝植物の５０％が黄色および９＝黄変なしである。活力スコア（上記参照）を１〜２葉期（ＶＩＧ１）、ＶＩＧ１の７日後（ＶＩＧ２）およびＶＩＧ１の１４日後（ＶＩＧ３）に決定した。様々なパラメータについてのスコアの平均値（Ａｖ）および標準偏差（ＳＤ）を表７ａ〜ｇに示す。
【０１２６】
【表９】
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【０１２７】
【表１０】
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【０１２８】
【表１１】
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【０１２９】
【表１２】
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【０１３０】
【表１３】
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【０１３１】
【表１４】
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【０１３２】
【表１５】
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【０１３３】
【表１６】
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【０１３４】
【表１７】
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【０１３５】
【表１８】
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【０１３６】
【表１９】
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【０１３７】
【表２０】
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【０１３８】
【表２１】
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【０１３９】
【表２２】
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【０１４０】
表７は、ホモ接合形態のどちらのノックアウトアレルの存在も、驚くことに、未処理条件下での全体的な植物の見た目および圃場での成長に対して負の効果を与えないことを示している。さらに、ミスセンスアレルによって付与された除草剤耐性に対するノックアウトアレルの寄与を求めた。まず、除草剤処理とは無関係に、成長それ自体の考えられる効果についてスコアを補正した。この目的のために、処理Ｂ、ＣおよびＤのスコアを、同じ遺伝子型および同じパラメータの処理Ａのスコアで割った（補正した除草剤耐性スコア）。次に、ミスセンスアレルによって得られるこれらの補正した除草剤耐性スコアに対するノックアウトアレルの効果を求めた。そのため、ミスセンス−ノックアウトアレル組合せの補正した除草剤耐性スコアを、ミスセンスアレル−野生型組合せの補正した除草剤耐性スコアで割った。ノックアウトアレルが、ミスセンスアレルによって付与された除草剤耐性に対して効果がない場合、この比は１となるはずである。ノックアウトアレルがミスセンスアレルによって付与された除草剤耐性に対して正に寄与する場合、この比は１より大きいはずである。上で求められたミスセンスアレルによって付与された除草剤耐性に対するノックアウトアレルの寄与の結果を表８に示す。
【０１４１】
【表２３】
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【０１４２】
表８において、特定の条件下では、ノックアウトアレルが存在するときに除草剤耐性が向上する傾向があることを理解することができる。例えば、ノックアウトアレルＨＥＴＯ１０４が、場所Ｂにおけるより高い除草剤濃度のＰＰＴＯＸ、ＶＩＧ１、ＶＩＧ２およびＶＩＧ３に対して正の効果を有するのに対し、ノックアウトアレルＨＥＴＯ１１２は、場所Ａにおける中間から高い除草剤濃度のＥＲＧ、ＥＳＴ１、ＥＳＴ２、ＰＰＴＯＸ、ＶＩＧ１、ＶＩＧ２およびＶＩＧ３に対して正の効果を有する。場所ＡとＢの違いは、場所Ｂにおける処理後の、記録されたより激しい降雨によって説明することができる。この降雨は、場所Ｂで除草剤処理したときの野生型植物のわずかにより優れた性能（表７；雨は、土壌中の除草剤濃度を希釈した可能性がある）、および場所Ｂで除草剤処理をしていない場合の野生型植物のわずかにより劣った性能（表７；正常な成長のための準最適（湿）条件）を説明することもできる。
【０１４３】
場所Ａの圃場でのアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の植物成長および除草剤耐性に対するアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物中の完全ノックアウト遺伝子の存在とミスセンスＡＨＡＳ遺伝子の存在の相関も、出芽後除草剤処理によって試験した。圃場の設定は、植付け前試験と同じにした。出芽後処理は、０（処理Ａ）、１０（処理Ｂ）、２０（処理Ｃ）ｇ  ａ．ｉ．／ｈａのチエンカルバゾンメチルの割合で２〜４葉期に実施した。上で記載した通りに、植物毒性（ＰＰＴＯＸ）および活力１（ＶＩＧ１；除草剤噴霧７日後の活力スコア）を決定した。様々なパラメータについてのスコアの平均値（Ａｖ）および標準偏差（ＳＤ）を表９に示す。
【０１４４】
【表２４】
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【０１４５】
表９に示すように、この圃場試験でも、植物成長それ自体に対するノックアウトＡＨＡＳアレルの負の効果はない。出芽後処理による除草剤耐性に対するノックアウトアレルの寄与に関しては、データが１つの場所からしか得られずに数が限られているので、結論を出すことができない。
【０１４６】
まとめると、表７、８および９に示す圃場結果は、重要なことに、ホモ接合状態でのノックアウトアレルＨＥＴＯ１１２（ＡＨＡＳ１）およびＨＥＴＯ１０４（ＡＨＡＳ３）の存在が圃場での植物成長に負の影響を与えないことを示している。さらに、表８において、特定の条件下では、ノックアウトＡＨＡＳアレルが、圃場でのミスセンスアレルによって付与された除草剤耐性に対して正に寄与することを理解することができる。
【０１４７】
実施例６−突然変異体ＡＨＡＳアレルの検出および／または（優良）アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）株への移動
突然変異体ＡＨＡＳ遺伝子を以下の方法で（優良）アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）育種系統に移動させた：突然変異体ＡＨＡＳ遺伝子（ドナー植物）を含む植物を（優良）アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）株（優良親／反復親）または突然変異体ＡＨＡＳ遺伝子を欠く品種と交配する。以下の遺伝子移入スキームを用いる（突然変異体ＡＨＡＳアレルはＡＨＡＳと略し、野生型はＡＨＡＳと表す）：
初回交配：ａｈａｓ／ａｈａｓ（ドナー植物）  ×  ＡＨＡＳ／ＡＨＡＳ（優良親）
Ｆ１植物：ＡＨＡＳ／ａｈａｓ
ＢＣ１交配：ＡＨＡＳ／ａｈａｓ  ×  ＡＨＡＳ／ＡＨＡＳ（反復親）
ＢＣ１植物：５０％ＡＨＡＳ／ａｈａｓおよび５０％ＡＨＡＳ／ＡＨＡＳ
５０％ａｈａｓ／ＡＨＡＳは、直接シークエンシングによって、または突然変異体ＡＨＡＳアレル（ａｈａｓ）の分子マーカー（例えば、ＡＦＬＰ、ＰＣＲ、Ｉｎｖａｄｅｒ（商標）、ＴａｑＭａｎ（登録商標）など）を用いて選択する。
ＢＣ２交配：ＡＨＡＳ／ＡＨＡＳ（ＢＣ１植物）  ×  ＡＨＡＳ／ＡＨＡＳ（反復親）
ＢＣ２植物：５０％ＡＨＡＳ／ａｈａｓおよび５０％ＡＨＡＳ／ＡＨＡＳ
５０％ＡＨＡＳ／ＡＨＡＳは、直接シークエンシングによって、または突然変異体ＡＨＡＳアレル（ａｈａｓ）の分子マーカーを用いて選択する。
戻し交配をＢＣ３〜ＢＣ６まで繰り返す。
ＢＣ３〜６植物：５０％ＡＨＡＳ／ａｈａｓおよび５０％ＡＨＡＳ／ａｈａｓ
５０％ＡＨＡＳ／ａｈａｓは、突然変異体ＡＨＡＳアレル（ａｈａｓ）の分子マーカーを用いて選択する。（例えば、ＢＣ６の代わりにＢＣ３まで）戻し交配の数を減らすために、優良親の遺伝子バックグラウンドに特異的な分子マーカーを用いることができる。
ＢＣ３〜６  Ｓ１交配：ＡＨＡＳ／ａｈａｓ  ×  ＡＨＡＳ／ａｈａｓ
ＢＣ３〜６  Ｓ１植物：      ２５％ＡＨＡＳ／ＡＨＡＳおよび５０％ＡＨＡＳ／ａｈａｓおよび２５％ａｈａｓ／ａｈａｓ
ａｈａｓを含む植物は、突然変異体ＡＨＡＳアレル（ＡＨＡＳ）の分子マーカーを用いて選択する。突然変異体ＡＨＡＳアレル（ａｈａｓ／ａｈａｓ）についてホモ接合性である個々のＢＣ３〜６  Ｓ１またはＢＣ３〜６  Ｓ２植物は、突然変異体および野生型ＡＨＡＳアレルの分子マーカーを用いて選択する。次に、これらの植物を種子産生に用いる。
【０１４８】
ＡＨＡＳアレル中に点突然変異を含む植物について選択するために、当技術分野で公知の標準的なシークエンシング技術（例えば、実施例１に記載したもの）による直接シークエンシングを用いることができる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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