(57)【要約】  本発明は、（ＨＲ）−ＨＰＶに感染している対象において、重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染と軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染とを識別するための方法に関する。それは更に、オリゴヌクレオチドプローブ混合物を含む組成物、デバイス、及び本発明の方法と合わせて使用のためのキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＲ−ＨＰＶに感染している対象において、（ｉ）重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染と（ｉｉ）軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染とを識別するための方法であって、
ａ）前記対象のサンプル中のＥ１Ｃの遺伝子産物の存在又は不存在を決定するステップ、及び
ｂ）（ｉ）重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染と（ｉｉ）軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染とを識別するステップ
を含み、ここで前記対象は統合された形態でHR-HPVゲノムを含まない、方法。
【請求項２】
Ｅ１Ｃの遺伝子産物がＥ１のスプライスされた転写産物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＨＲ−ＨＰＶ及びＥ１の対応するスプライスされた転写産物が、
ａ）ＨＰＶ１８及び９２９＾２７７９ジャンクションを含むスプライスされた転写産物、
ｂ）ＨＰＶ３３及び８９４＾２７０２ジャンクションを含むスプライスされた転写産物、
ｃ）ＨＰＶ３５及び８８３＾２６４９ジャンクションを含むスプライスされた転写産物、
ｄ）ＨＰＶ５２及び８７９＾２６９６ジャンクションを含むスプライスされた転写産物、又は
ｅ）ＨＰＶ５８及び８９８＾２７０６ジャンクションを含むスプライスされた転写産物、
である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記転写産物の存在又は不存在の決定が、前記転写産物を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドが存在する場合、前記転写産物を増幅し、及びこのようにして増幅された転写産物の量を決定するステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
Ｅ１Ｃの遺伝子産物が、Ｅ１のスプライスされた転写産物から細胞により翻訳されるポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
Ｅ１Ｃの遺伝子産物がポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｅ１Ｃの遺伝子産物の存在が、重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
Ｅ１Ｃの遺伝子産物の不存在が、軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ａ）ＨＲ−ＨＰＶが、ＨＰＶ１８であり、Ｅ１Ｃの遺伝子産物が９２９＾２７７９ジャンクションを含む遺伝子産物である、
ｂ）ＨＲ−ＨＰＶが、ＨＰＶ３３であり、Ｅ１Ｃの遺伝子産物が８９４＾２７０２ジャンクションを含む遺伝子産物である、又は
ｃ）ＨＲ−ＨＰＶが、ＨＰＶ３５であり、Ｅ１Ｃの遺伝子産物が８８３＾２６４９ジャンクションを含む遺伝子産物である、
請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
Ｅ１Ｃのスプライスされた転写産物の存在又は不存在を決定することが、前記Ｅ１Ｃのスプライスされた転写産物のＰＣＲ増幅を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
ＰＣＲ増幅が、プライマーの混合物を使用する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
転写産物の存在が、前記転写産物を特異的に検出するオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより決定される、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象の前記サンプルにおいてＨＲ−ＨＰＶゲノムの統合状態を評価する更なるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ＨＲ−ＨＰＶに感染している対象において、（ｉ）重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染と（ｉｉ）軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染とを識別するための方法であって、
ａ）前記対象のサンプル中の第一の遺伝子産物の量を決定するステップであって、前記第一の遺伝子産物は、Ｅ１Ｃの遺伝子産物であるステップ、
ｂ）前記サンプル中の第二の遺伝子産物の量を決定するステップ、
ｃ）ステップａ）で決定された前記第一の遺伝子産物の量と、ステップｂ）で決定された前記第二の遺伝子産物の量との比を計算するステップ、
ｄ）ステップｃ）で計算された比と参照比とを比較するステップ、及び
ｅ）（ｉ）重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染と（ｉｉ）軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染とを識別するステップ
を含む、方法。
【請求項１５】
前記第二の遺伝子産物が、Ｅ６*Ｉの遺伝子産物、Ｅ１＾Ｅ４の遺伝子産物、Ａｐｍ１の遺伝子産物、Ｕｂｃの遺伝子産物、Ｕ１Ａの遺伝子産物、Ｅ１の遺伝子産物、Ｅ５の遺伝子産物、及びＬ１の遺伝子産物からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
第一の遺伝子産物がＥ１Ｃのスプライスされた転写産物であり、前記第二の遺伝子産物が、Ｅ６*Ｉの転写産物、Ｅ１＾Ｅ４の転写産物、Ａｐｍ１の転写産物、Ｕｂｃの転写産物、Ｕ１Ａの転写産物、Ｅ１の転写産物、Ｅ５の転写産物、及びＬ１の転写産物からなる群から選択される転写産物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＨＲ−ＨＰＶ及びＥ１Ｃの対応するスプライスされた転写産物が、
ａ）ＨＰＶ１８及び９２９＾２７７９ジャンクションを含むスプライスされた転写産物、
ｂ）ＨＰＶ３３及び８９４＾２７０２ジャンクションを含むスプライスされた転写産物、
ｃ）ＨＰＶ３５及び８８３＾２６４９ジャンクションを含むスプライスされた転写産物、
ｄ）ＨＰＶ５２及び８７９＾２６９６ジャンクションを含むスプライスされた転写産物、又は
ｅ）ＨＰＶ５８及び８９８＾２７０６ジャンクションを含むスプライスされた転写産物
である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
第一の遺伝子産物がＥ１Ｃのスプライスされた転写産物から翻訳される第一のポリペプチドであり、前記第二の遺伝子産物が、Ｅ６*Ｉの転写産物、Ｅ１＾Ｅ４の転写産物、Ａｐｍ１の転写産物、Ｕｂｃの転写産物、Ｕ１Ａの転写産物、Ｅ１の転写産物、Ｅ５の転写産物、及びＬ１の転写産物からなる群から選択される転写産物から翻訳される第二のポリペプチドであり、ここで第一のポリペプチドの量及び第二のポリペプチドの量が、前記第一、及び第二のポリペプチドをそれぞれ特異的に検出する抗体を用いることにより決定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記第一の遺伝子産物の量と計算される前記第二の遺伝子産物の量との比が計算され、（ｉ）参照比よりも大きい比が重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染を示し、及び／又は（ｉｉ）参照比よりも小さい比が軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染を示す、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象の前記サンプルにおいてＨＲ−ＨＰＶゲノムの統合状態を評価する更なるステップを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
オリゴヌクレオチドプローブ混合物を含む組成物であって、前記オリゴヌクレオチド混合物は少なくとも一つの請求項１５に記載の第一の遺伝子産物を特異的に検出するオリゴヌクレオチドプローブ、及び請求項１５に記載の第二の遺伝子産物を特異的に検出するオリゴヌクレオチドプローブを含む、組成物。
【請求項２２】
ＨＲ−ＨＰＶに感染している対象において（ｉ）重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染と（ｉｉ）軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染とを識別するためのデバイスであって、Ｅ１Ｃの遺伝子産物の存在及び／又は量を決定するための検出試薬、及び前記量と参照量とを比較するための手段を含み、（ｉ）重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染と（ｉｉ）軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染とを識別することを可能にする、デバイス。
【請求項２３】
ＨＲ−ＨＰＶ及びＥ１Ｃの対応する転写産物が、
ａ）ＨＰＶ１８及び９２９＾２７７９ジャンクションを含むスプライスされた転写産物、
ｂ）ＨＰＶ３３及び８９４＾２７０２ジャンクションを含むスプライスされた転写産物、
ｃ）ＨＰＶ３５及び８８３＾２６４９ジャンクションを含むスプライスされた転写産物、
ｄ）ＨＰＶ５２及び８７９＾２６９６ジャンクションを含むスプライスされた転写産物、又は
ｅ）ＨＰＶ５８及び８９８＾２７０６ジャンクションを含むスプライスされた転写産物
である、請求項２２に記載のデバイス。
【請求項２４】
好ましくは、請求項１に記載の方法を実行するために適合されたキットであって、前記方法を実行するための取扱説明書、及びＥ１Ｃの遺伝子産物の存在及び／又は量を決定するための検出試薬、及び前記量と参照量とを比較するための手段を含み、（ｉ）重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染と（ｉｉ）軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染とを識別することを可能にする、キット。
【請求項２５】
スプライスジャンクションを含むＨＲ−ＨＰＶゲノムの転写産物であって、ＨＲ−ＨＰＶとスプライスジャンクションの組み合わせが、ａ）ＨＰＶ１８及び９２９＾２７７９ジャンクション、ｂ）ＨＰＶ３３及び８９４＾２７０２ジャンクション、ｃ）ＨＰＶ３５及び８８３＾２６４９ジャンクション、ｄ）ＨＰＶ５２及び８７９＾２６９６ジャンクション、並びにｅ）ＨＰＶ５８及び８９８＾２７０６ジャンクションからなるリストから選択される、転写産物。
【請求項２６】
ｉ）Ｅ１Ｃ転写産物のスプライスジャンクションと特異的にハイブリダイズする少なくとも一つの第一のオリゴヌクレオチド、並びにｉｉ）Ｅ６*Ｉの転写産物、Ｅ１＾Ｅ４の転写産物、Ａｐｍ１の転写産物、Ｕｂｃの転写産物、Ｕ１Ａの転写産物、Ｅ１の転写産物、Ｅ５の転写産物、及びＬ１の転写産物からなる群から選択される転写産物と特異的にハイブリダイズする少なくとも一つの第二のオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドの混合物。
【請求項２７】
第一のオリゴヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２５、及び配列番号２６からなるリストから選択される配列と特異的にハイブリダイズする、請求項２６に記載の混合物。
【請求項２８】
ｉ）前記スプライス部位の上流の請求項２５に記載の転写産物の翻訳産物の連続的な少なくとも二つのアミノ酸、及びｉｉ）前記スプライス部位の下流の請求項２５に記載の転写産物の翻訳産物の少なくとも二つの連続的なアミノ酸、ここでｉ）及びｉｉ）のアミノ酸が多くても一つのアミノ酸により分けられている、を含むペプチド配列を特異的に認識する抗体。
【請求項２９】
抗体が、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号３４、及び配列番号３５からなるリストから選択されるペプチド配列を特異的に認識する、請求項２７に記載の抗体。
【請求項３０】
ＨＲ−ＨＰＶがＨＰＶ５２であり、ここでＥ１Ｃの遺伝子産物が８７９＾２６９６ジャンクションを含む転写産物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
ＨＲ−ＨＰＶがＨＰＶ５８であり、ここでＥ１Ｃの遺伝子産物が８９８＾２７０６ジャンクションを含む転写産物である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高リスクの（ＨＲ）−ＨＰＶに感染している対象において、重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染と軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染とを識別するための方法に関する。それは更に、オリゴヌクレオチドプローブ混合物を含む組成物、デバイス、及び本発明の方法と合わせて使用のためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
子宮頸部の癌（ＣｘＣａ）は、世界の女性において二番目に最も一般的な悪性腫瘍であり、最も流行している種類であるＨＰＶ１６を含む高リスクのヒトパピローマウイルスにより引き起こされる。先進国において、従来の細胞学的スクリーニングプログラムは、癌のこの種類の発生率を大幅に減少させている。これらの細胞学的スクリーニングプログラムは、しかしながら、いくつかの欠点を有する。
【０００３】
パパコロニー試験（しばしばパップ試験（Ｐａｐ  ｔｅｓｔ）と称される）は、子宮頸部の前悪性及び悪性病変の検出のために設計された診断方法である。パパコロニー試験のために、サンプルは、子宮頸部から得られ、悪性及び前悪性細胞を示す細胞形態学における変化について光学顕微鏡によりスクリーニングされる。その後、サンプルは観察された病変の重症度に応じて分類される。しかしながら、子宮頸部細胞診による診断は、主観的な方法であり、その品質は、サービスを提供する実験室の基準に依存する。そのため、病変分類は、中程度の再現性しかなく、膣鏡検査と比較して感度は低い（Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｐ．，Ｒ．Ｌａｓｋｅｙ，ａｎｄ  Ｎ．Ｃｏｌｅｍａｎ．２００３．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ３：２１７−２６）。さらに、擬陽性の結果は過剰に治療される多数の患者をもたらす。
【０００４】
ここ２０年間、ＨＰＶについての様々な新しい診断試験は開発されてきている。これらの方法は、ウイルスマーカー、分子マーカー、及び生化学的マーカー、例えばＨＰＶタンパク質、ＤＮＡ及びＲＮＡに基づく。
【０００５】
ＦＤＡに認可されたＨｙｂｒｉｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ  ＩＩ  Ｔｅｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＨＣ２）（旧Ｄｉｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐ．，ＵＳＡ、現在Ｑｉａｇｅｎ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）は、臨床診療においてＨＰＶＤＮＡ試験についてのゴールドスタンダードと考えられているが、それはいくつかの不都合な点：ａ）遺伝子型分類は行なわれず、代わりにＨＰＶ感染は、専ら「低リスク」又は「高リスク」群に起因する、ｂ）多重感染を同定することができない、ｃ）それは、ＨＰＶ検出についてＰＣＲに基づく方法よりも感度が低い（Ｂｉｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．１４：７０２−７０９）、及びｄ）それは子宮頸部の前癌及び癌リスクの予測に多少特異的である、を示す。臨床的エンドポイントに対するいくつかの非特異性は、非発癌性のＨＰＶ遺伝子型との交差反応性に起因し得る（Ｃａｓｔｌｅ，Ｐ．Ｅ．，Ｄ．Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ｃ．Ｍ．Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｐ．Ｅ．Ｇｒａｖｉｔｔ，Ｓ．Ｗａｃｈｏｌｄｅｒ，ａｎｄ  Ｍ．Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ．２００８．Ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄ  ｃａｐｔｕｒｅ  ２．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４６：２５９５−６０４）。さらに、それは、対象がＨＰＶに感染しているか否かの評価のみを可能にする。試験は、ＨＰＶ感染の重症度を評価することは可能ではない。従って、一度ＨＰＶが診断されると、更なる試験が要求される。
【０００６】
いくつかのＰＣＲに基づく方法は、近年開発されており、ＨＰＶ感染のより正確な検出を可能にしている。これらのＰＣＲシステムの大部分は、ＨＰＶゲノムの高度に保存された領域、例えばＬ１領域に結合するコンセンサスな又は一般的なプライマーを用いる。増幅されたＰＣＲ産物は、特異的な粘膜型ＨＰＶの遺伝子型を同定するために、その後更なる分析（例えば配列決定、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析、又はハイブリダイゼーション）に供される。長期的なコホート研究は、組み合わされたパップ及びＨＰＶ試験が、優れた感度を示し、細胞学的試験単独よりもＣＩＮ３に対して（双方の試験の正常な結果を有する女性間で）優れた長期保護を予測することを示している（Ｂｕｌｋｍａｎｓ，Ｎ．Ｗ．，Ｊ．Ｂｅｒｋｈｏｆ，Ｌ．Ｒｏｚｅｎｄａａｌ，Ｆ．Ｊ．ｖａｎ  Ｋｅｍｅｎａｄｅ，Ａ．Ｊ．Ｂｏｅｋｅ，Ｓ．Ｂｕｌｋ，Ｆ．Ｊ．Ｖｏｏｒｈｏｒｓｔ，Ｒ．Ｈ．Ｖｅｒｈｅｉｊｅｎ，Ｋ．ｖａｎ  Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｍ．Ｅ．Ｂｏｏｎ，Ｗ．Ｒｕｉｔｉｎｇａ，Ｍ．ｖａｎ  Ｂａｌｌｅｇｏｏｉｊｅｎ，Ｐ．Ｊ．Ｓｎｉｊｄｅｒｓ，ａｎｄ  Ｃ．Ｊ．Ｍｅｉｊｅｒ．２００７．ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ｇｒａｄｅ  ３  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ：５−ｙｅａｒ  ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ  ｏｆ  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  ３７０：１７６４−７２，Ｈｏｙｅｒ，Ｈ．，Ｃ．Ｓｃｈｅｕｎｇｒａｂｅｒ，Ｒ．Ｋｕｅｈｎｅ−Ｈｅｉｄ，Ｋ．Ｔｅｌｌｅｒ，Ｃ．Ｇｒｅｉｎｋｅ，Ｓ．Ｌｅｉｓｔｒｉｔｚ，Ｂ．Ｌｕｄｗｉｇ，Ｍ．Ｄｕｒｓｔ，ａｎｄ  Ａ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ．２００５．Ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ  ５−ｙｅａｒ  ｄｉａｇｎｏｓｅｓ  ｏｆ  ＣＩＮ２，ＣＩＮ３  ｏｒ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ａｆｔｅｒ  ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ  ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ  ＨＰＶ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｌｏｇｙ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｉｎ  ａ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｓｅｔｔｉｎｇ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １１６：１３６−４３．）。しかしながら、ＨＰＶ  ＰＣＲ試験の高い感度はまた、臨床的に関連性のない感染又は退行性病変の同定を導く。それ故、個人の高リスクＨＰＶ  ＤＮＡ陽性の結果後の進行性病変又は子宮頸癌の進行の存在についての陽性予測値（ＰＰＶ）は低い。結果として生じる高比率の、検査では陽性であったのに疾患は陰性であった診断は、関係する女性について、過剰治療、更なるコスト、及び大きな懸念を引き起こす（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ．２００５．Ｃｅｒｖｉｘ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．ＩＡＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｙｏｎ）。
【０００７】
ＨＰＶ  ＤＮＡ試験と異なり、ＲＮＡ検出は、転写活性のあるウイルスの同定及び分析を可能にする。ＤＮＡ及び細胞形態学と離れてＲＮＡを保存する、子宮頸部スメアのための保存培地の近年の導入はまた、ＲＮＡ検出方法の開発を促進した。これまで、二つの市販されているＨＰＶ  ＲＮＡ検出アッセイ：ｉ）ＨＲ−ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、及び４５型からＥ６及びＥ７配列（Ｅ６／Ｅ７）を標的とする初期の完全長ｍＲＮＡを検出するＢｉｏｍｅｒｉｅｕｘ（旧ＮｏｒＣｈｉｐ）製のＰｒｅＴｅｃｔ  ＨＰＶ  Ｐｒｏｏｆｅｒ（登録商標）、及びｉｉ）ＧｅｎＰｒｏｂｅ製の広範囲のＥ６／Ｅ７完全長ｍＲＮＡ増幅法であるＡｐｔｉｍａ（登録商標）ＨＰＶ試験は、導入されている。これらの試験からの限られたデータは、完全長ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７  ｍＲＮＡについての試験は、ＨＰＶ  ＤＮＡ単独よりも子宮頸癌の進行、及びその前兆についてのＰＰＶをわずかに増加させる一方で同時に、感度、従って陰性予測値（ＮＰＶ）を減少させることを示す（Ｃｕｓｃｈｉｅｒｉ，Ｋ．Ｓ．，Ｍ．Ｊ．Ｗｈｉｔｌｅｙ，ａｎｄ  Ｈ．Ａ．Ｃｕｂｉｅ．２００４．ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ−ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：６５−７０）。これらの技術の主な不都合は、単一の完全長ウイルス癌遺伝子転写物の定性的測定のみのために、それらが疾患を予測できないという事実に言及する。さらに、子宮頸部スメアは、これらの技術により制御不可能なＨＰＶ感染した細胞の様々な量を含み得る。
【０００８】
子宮頸癌の進行は、宿主細胞の染色体へのＨＰＶゲノムの統合と密接に関連する。軽度の病変では、ＨＰＶゲノムの大部分は、エピソーム状態で存在するのに対し、重度の病変及び癌では、ＨＰＶゲノムは、宿主ゲノムに統合され得る。しかしながら、子宮頸癌の全ての症例で、ＨＰＶゲノムが統合された形態で存在するわけではないことが示されている（Ｖｉｎｏｋｕｒｏｖａ，Ｓ．，Ｎ．Ｗｅｎｔｚｅｎｓｅｎ，Ｉ．Ｋｒａｕｓ，Ｒ．Ｋｌａｅｓ，Ｃ．Ｄｒｉｅｓｃｈ，Ｐ．Ｍｅｌｓｈｅｉｍｅｒ，Ｆ．Ｋｉｓｓｅｌｊｏｖ，Ｍ．Ｄｕｒｓｔ，Ａ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，ａｎｄ  Ｍ．ｖｏｎ  Ｋｎｅｂｅｌ  Ｄｏｅｂｅｒｉｔｚ．２００８．Ｔｙｐｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｉｎ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｌｅｓｉｏｎｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８：３０７−１３．）。ＨＰＶ１６ゲノムの宿主ゲノムへの統合は、子宮頸癌の症例の約６０％でのみ見られる。従って、ＨＰＶゲノムの統合状態のみを決定する診断手法は、リスク分類について信用できない。
【０００９】
疾患進行の予測において、ＨＰＶ１６の特定の転写産物、例えばＥ１Ｃ転写産物の定量、及びこれらの転写物の量と参照転写産物の量とを比較することに、大きな価値があることは、提案されている（Ｓｃｈｍｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０），“Ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ  Ｃｅｒｖｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｈｉｇｈ−Ｇｒａｄｅ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｂｙ  ＨＰＶ１６  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ”，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７０：２４９−２５６）。これは、しかしながら、これまでＨＰ  １６についてのみ示され得る。
【００１０】
膣鏡検査は、子宮頸部及び膣を検査することを可能にする。この外観検査により、これらの領域の多くの前悪性病変及び悪性病変は検出され得る。その高い信頼性のために、膣鏡検査は子宮頸部疾患を診断するためのゴールドスタンダードと見なされている。この診断手順は、しかしながらコスト及び時間がかかる。膣鏡検査は、高度に訓練された人員を要求し、しばしば侵襲的手順（後の組織学的分析を含む生検）を含む。結果として、膣鏡検査は、子宮頸癌前兆スクリーニングプログラムに用いることはできない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の基礎をなす技術的な課題は、上述の欠点を有さずに、効率的及び確実に、高リスクＨＰＶ遺伝子型（ＨＲ−ＨＰＶ）の感染の軽症度と重症型とを識別するための手段及び方法の提供として見なされてもよい。また、手段及び方法は、ゲノムに統合されたＨＰＶゲノムを有さない対象の信頼できるリスク分類に要求される。技術的課題は、添付の特許請求の範囲及び以下の本明細書において特徴付けられる実施形態により解決される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
従って、本発明は、ＨＲ−ＨＰＶに感染している対象において（ｉ）重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染と（ｉｉ）軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染とを識別するための方法であって（ここで前記対象は、統合された形態のＨＲ−ＨＰＶゲノムを含まない）、ａ）前記対象のサンプルにおいてＥ１Ｃの遺伝子産物の存在又は不存在を決定するステップ、及びｂ）（ｉ）重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染と（ｉｉ）軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染とを識別するステップを含む方法、に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の方法は、好ましくは、インビトロ方法である。さらに、それは、上記で明確に言及されたもの加えて、ステップを含んでもよい。例えば、更なるステップは、サンプル前処理、又は方法により得られる結果の評価に関連してもよい。本発明の方法は、好ましくは、ＨＲ−ＨＰＶに感染した対象において、ＨＲ−ＨＰＶ感染の軽症型と重症型とを識別するために用いられる。しかしながら、本発明の方法はまた、前記対象のモニタリング、確認、及び下位分類のために用いられてもよい。本方法は、手動で行なわれてもよく、又は自動化により補助されてもよい。好ましくは、ステップ（ａ）及び／又は（ｂ）は、自動化により、例えばステップ（ａ）の決定のための好適なロボット及びセンサー装置、又はステップ（ｂ）におけるコンピュータに実装された計算又は比較のステップにより、全て又は一部において補助されてもよい。
【００１４】
本明細書で用いられる用語「識別する」とは、（ｉ）軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染と（ｉｉ）重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染を識別することを意味する。本明細書で用いられる前記用語は、好ましくは、ＨＲ−ＨＰＶ感染の軽症型と重症型とを別個に診断／検出することを含む。
【００１５】
当業者に理解されるように、前述の識別は、通常、分析される対象の１００％について正確であることを意図しない。前記用語は、しかしながら、評価は、分析される対象について統計学的に有意な割合については有効であることを要求する。割合が統計学的に有意であるかどうかは、様々な既知の統計学的評価手段、例えば信頼区間の決定、ｐ値決定、スチューデントのｔ−検定、マン・ホイットニー検定等を用いて、当業者により余分な手間をかけることなく決定され得る。詳細は、Ｄｏｗｄｙ  ａｎｄ  Ｗｅａｒｄｅｎ，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８３で見られる。好ましい信頼区間は、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％である。ｐ値は、好ましくは、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、又は０．００１である。好ましくは、本発明により想定される確率は、識別が所定のコホートの対象の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％について正確であることを可能にする。
【００１６】
本明細書で用いられる用語「対象」とは、動物、好ましくは哺乳動物、及びより好ましくはヒトに関する。しかしながら、本発明の前述の方法に従って、対象がＨＲ−ＨＰＶに感染していなければならないということが想定される。好ましくは、対象は、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ５２、又はＨＯＶ５８（本明細書の他の場所を参照のこと）からなる群から選択されるＨＲ−ＨＰＶで感染される。対象がＨＲ−ＨＰＶに感染しているか否かを評価するための方法は、本技術分野においてよく知られている。例えば、ＨＲ−ＨＰＶ感染は、サザン及びドットブロットハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーションによる、対象のサンプル中のＨＲ−ＨＰＶ  ＤＮＡ遺伝型解析、シグナル増幅アッセイ、又は様々なＰＣＲ手法により評価され得る（Ｍｏｌｉｊｎ，Ａ．，Ｂ．Ｋｌｅｔｅｒ，Ｗ．Ｑｕｉｎｔ，ａｎｄ  Ｌ．Ｊ．ｖａｎ  Ｄｏｏｍ．２００５．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ（ＨＰＶ）ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｖｉｒｏｌ  ３２  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ４３−５１）。
【００１７】
本明細書で用いられる用語「統合された形態にＨＲ−ＨＰＶゲノムを含まない」（ｎｏｔ  ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＨＲ−ＨＰＶ  ｇｅｎｏｍｅ  ｉｎ  ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｆｏｒｍ）とは、宿主細胞の染色体ＤＮＡに共有結合的に結合したＨＲ−ＨＰＶ  ＤＮＡが存在しないことに関する。用語「統合された」（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）及び「エピソームの」（ｅｐｉｓｏｍａｌ）とは、当業者により理解される。ＨＲ−ＨＰＶゲノムが対象のゲノムに統合される場合、前記対象の全ての細胞がそのゲノムに統合されたＨＲ−ＨＰＶゲノムを有するわけではないことは、理解される。好ましくは、ＨＲ−ＨＰＶに感染した細胞のみが、統合された形態においてＨＲ−ＨＰＶゲノムを含み得る。好ましくは、前記細胞は、前記対象の尿生殖器管又は口腔咽頭管に存在する。用語「統合された形態」（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｆｏｒｍ）とはまた、宿主細胞の染色体ＤＮＡへのＨＲ−ＨＰＶの一部の統合を含むことは理解される。好ましくは、Ｅ６、Ｅ７の遺伝子及びＥ１  Ｎ−末端の一部を含む、ＨＲ−ＨＰＶゲノムの初期領域は宿主ゲノムに統合される。ＨＲ−ＨＰＶゲノムのＥ４、Ｅ５及びＬ１遺伝子を含む後期領域はまた、宿主ゲノムに統合され得るが、最も好ましくは、ゲノム再編成による転写的に不活性であることは理解される。さらに、Ｅ２遺伝子は、通常、統合中に消失する、又は転写的に不活性になることが知られている（Ｐｅｔｔ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｎ．Ｃｏｌｅｍａｎ．２００７．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ：ａ  ｋｅｙ  ｅｖｅｎｔ  ｉｎ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ？  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２１２：３５６−６７）。ＨＲ−ＨＰＶゲノムは、好ましくは、前記ゲノムが、宿主細胞の染色体ＤＮＡに統合されないで前記宿主細胞において複製される場合、宿主細胞において「エピソーマル形態」で存在する（Ｖｉｎｏｋｕｒｏｖａ，Ｓ．，Ｎ．Ｗｅｎｔｚｅｎｓｅｎ，Ｉ．Ｋｒａｕｓ，Ｒ．Ｋｌａｅｓ，Ｃ．Ｄｒｉｅｓｃｈ，Ｐ．Ｍｅｌｓｈｅｉｍｅｒ，Ｆ．Ｋｉｓｓｅｌｊｏｖ，Ｍ．Ｄｕｒｓｔ，Ａ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，ａｎｄ  Ｍ．ｖｏｎ  Ｋｎｅｂｅｌ  Ｄｏｅｂｅｒｉｔｚ．２００８．Ｔｙｐｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｉｎ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｌｅｓｉｏｎｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８：３０７−１３）。
【００１８】
ＨＰＶ１６とは別に高リスクＨＰＶ型は、全ての子宮頸癌の約４５％に起因することはよく知られている。全ての高リスクＨＰＶ型の発癌において、統合は、重要な役割を担うことが示されている。しかしながら、高リスクＨＰＶ１６型、及び系統学的に関連する３１型、及び３３型について、統合は、低い頻度で生じ、進行の第二のモード、例えば潜在的にＥ１Ｃに仲介されるＬＣＲの上方調節、又はＥ１Ｃの翻訳終結後のＥ２翻訳の抑制によるＥ１Ｃ及びＥ２オープンリーディングフレームオーバーラップを提案する。しかし、これらのＨＰＶ型により引き起こされる多くの子宮頸癌について、及びＨＰＶ１８、及び４５を含む他の種類により引き起こされる大変多くの子宮頸癌について、統合は、未だ子宮頸がんの進行における重要なイベントである（Ｖｉｎｏｋｕｒｏｖａ，Ｓ．，Ｎ．Ｗｅｎｔｚｅｎｓｅｎ，Ｉ．Ｋｒａｕｓ，Ｒ．Ｋｌａｅｓ，Ｃ．Ｄｒｉｅｓｃｈ，Ｐ．Ｍｅｌｓｈｅｉｍｅｒ，Ｆ．Ｋｉｓｓｅｌｊｏｖ，Ｍ．Ｄｕｒｓｔ，Ａ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，ａｎｄ  Ｍ．ｖｏｎ  Ｋｎｅｂｅｌ  Ｄｏｅｂｅｒｉｔｚ．２００８．Ｔｙｐｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｉｎ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｌｅｓｉｏｎｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８：３０７−１３）。
【００１９】
ＨＲ−ＨＰＶゲノムの統合状態を評価する方法は、本技術分野においてよく知られている。好ましくは、統合状態は、対象のサンプルにおいて決定される。統合状態を決定するための好ましい方法は、（ｉ）ウイルス−宿主融合転写産物、特に、例えばパピローマウイルス癌遺伝子転写産物の増幅（ＡＰＯＴ−アッセイ）、及びＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）により転写活性のあるウイルス組み込み体を検出する方法；及び（ｉｉ）その転写状態に関わらず、統合されたウイルスＤＮＡを検出する方法、例えば、サザンブロッティング、定量リアルタイムＰＣＲ、制限部位ＰＣＲ、及びＤＮＡ  ＩＳＨ（Ｐｅｒｔ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｎ．Ｃｏｌｅｍａｎ．２００７．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ：ａ  ｋｅｙ  ｅｖｅｎｔ  ｉｎ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ？  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２１２：３５６−６７）である。
【００２０】
一般的に、エピソーマル形態でＨＲ−ＨＰＶゲノムを有する対象は、統合された形態でＨＰＶ１６ゲノムを有する対象よりも、ＨＳＩＬ又は癌に罹患するリスクは低いと考えられる（用語「エピソーマル形態」及び「統合された形態」の説明については、上記を参照のこと）。しかしながら、エピソーマル形態でのみＨＰＶゲノムを含む何人かの対象が、重症型のＨＰＶ感染に罹患する、又はそれらに罹患する上昇したリスクを有する証拠は存在する（Ｖｉｎｏｋｕｒｏｖａ，Ｓ．，Ｎ．Ｗｅｎｔｚｅｎｓｅｎ，Ｉ．Ｋｒａｕｓ，Ｒ．Ｋｌａｅｓ，Ｃ．Ｄｒｉｅｓｃｈ，Ｐ．Ｍｅｌｓｈｅｉｍｅｒ，Ｆ．Ｋｉｓｓｅｌｊｏｖ，Ｍ．Ｄｕｒｓｔ，Ａ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，ａｎｄ  Ｍ．ｖｏｎ  Ｋｎｅｂｅｌ  Ｄｏｅｂｅｒｉｔｚ．２００８．Ｔｙｐｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｉｎ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｌｅｓｉｏｎｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８：３０７−１３，Ｐｅｔｔ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｎ．Ｃｏｌｅｍａｎ．２００７．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ：ａ  ｋｅｙ  ｅｖｅｎｔ  ｉｎ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ？  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２１２：３５６−６７）。
【００２１】
用語「ヒトパピローマウイルス」（ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）とは、ヒトの皮膚及び粘膜に感染するウイルスのパピローマウイルスファミリーのＤＮＡウイルスに関する。１１０を超えるＨＰＶ遺伝子型が、記載されている（ｄｅ  Ｖｉｌｌｉｅｒｓ，Ｅ．Ｍ．，Ｃ．Ｆａｕｑｕｅｔ，Ｔ．Ｒ．Ｂｒｏｋｅｒ，Ｈ．Ｕ．Ｂｅｒｎａｒｄ，ａｎｄ  Ｈ．ｚｕｒ  Ｈａｕｓｅｎ．２００４．Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３２４：１７−２７）。約５０のＨＰＶ遺伝子型は、粘膜に感染することが知られている。これらの粘膜の遺伝子型は、それらの癌との疫学的関連性に基づいて３つの異なる群：「低リスク」ヒトパピローマウイルス（ＬＲ−ＨＰＶ）、「高リスク」ヒトパピローマウイルス（ＨＲ−ＨＰＶ）、及び「推定上高リスク」ヒトパピローマウイルス（ｐＨＲ−ＨＰＶ）に分類される。好ましくは、ＨＰＶは、子宮頸癌の進行の主な要因である高リスクＨＰＶ遺伝子型（ＨＲ−ＨＰＶ）であり、より好ましくは、ＨＰＶはＨＰＶ３１、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８、７３、及び８２であり、最も好ましくはＨＰＶ１８（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ：ＮＣ  ００１３５７．１，ＧＩ：９６２６０６９）、ＨＰＶ３３（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ：Ｍ１２７３２．１，ＧＩ：３３３０４９）、ＨＰＶ３５（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ：Ｍ７４１１７．１，ＧＩ：３３３０５０）、ＨＰＶ５２（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ：Ｘ７４４８１．１  ＧＩ：３９７０３８）、又はＨＰＶ５８（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ：Ｄ９０４００．１  ＧＩ：２２２３８６）である。ＨＲ−ＨＰＶは、外陰部癌、肛門癌、膣癌、陰茎癌、及び口腔咽頭癌、並びに膣上皮内新生物、肛門上皮内新生物、外陰上皮内新生物、及び陰茎上皮内新生物を引き起こし得ることが知られている。
【００２２】
ＨＰＶゲノムは、通常、二重鎖で閉環状のＤＮＡの単一分子である。例えば、ＨＰＶ１６ゲノムは、約７，９０６塩基対を有する、二重鎖で閉環状のＤＮＡの単一分子からなる（例えばＭｙｅｒｓ，Ｇ．，Ｈ．Ｄｅｌｉｕｓ，Ｊ．Ｉｃｅｎｏｇｌｅ，Ｈ．Ｕ．Ｂｅｒｎａｒｄ，Ｍ．Ｆａｖｒｅ，Ｍ．ｖａｎ  Ｒａｎｓｔ，ａｎｄ  Ｃ．Ｍ．Ｗｈｅｅｌｅｒ．１９９７．ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ  １９９７：ａ  ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ，Ｎ．Ｍｅｘ．を参照のこと）。３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、一本鎖上に位置する。３つの機能領域、長調節領域（ＬＣＲ）、並びに「初期」及び「後期」転写領域は規定されている。ＬＣＲは、ＤＮＡ複製及び転写の調節に関与する、８５０ｂｐ長のノンコーディング上流領域である。それは、ウイルスＥ２及び他の細胞性転写因子のためのいくつかの結合部位、並びにウイルスＥ１複製タンパク質のための結合部位を含む。さらに、それは、サイレンサー及びエンハンサー配列を含み、Ｅ６  ＯＲＦ付近にｐ９７コアプロモーターを有し；それはウイルスゲノムの変化の程度が最も高い領域である。「初期」領域は、ＯＲＦ  Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、及びＥ７からなり、それはウイルス複製及び細胞形質転換に関与する。「後期」領域は、ウイルスのキャプシドを形成するＬ１及びＬ２構造タンパク質をコードする。「初期」タンパク質の中でも、悪性疾患について２つの最も重要なＨＰＶタンパク質は、Ｅ６及びＥ７であり、それは相乗的に作用し、細胞を正常状態から不死状態に形質転換する。ＨＰＶトランスクリプトームが、少なくとも１１個の異なるスプライスジャンクションをもたらす（例えばＨＰＶ１６Ｒ参照ゲノムの位置２２６、８８０、１３０２、及び３６３２のヌクレオチドにおける）いくつかのスプライスドナー部位、及び（例えばＨＰＶ１６Ｒ参照ゲノムの位置４０９、５２６、７４２、２５８２、２７０９、３３５８、及び５６３９のヌクレオチドにおける）スプライスアクセプター部位を示すことは本技術分野において知られている（Ｂａｋｅｒ，Ｃ，ａｎｄ  Ｃ．Ｃａｌｅｆ．１９９６．Ｍａｐｓ  ｏｆ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｍＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ．Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ，ＮＭ，ＵＳＡ．；Ｚｈｅｎｇ，Ｚ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂａｋｅｒ．２００６．Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ  １１：２２８６−３０２．）。スプライシング産物は、産物を生成するために用いられるスプライスドナー及びアクセプター部位に基づいて、本明細書で特徴付けられる。それぞれのスプライスドナーとアクセプターとは、「＾」により区切られる。
【００２３】
ＨＲ−ＨＰＶの感染が、様々な兆候に下位分類され得ることは、本技術分野において知られている。子宮頸癌は、子宮頸部上皮内新生物１〜３（ＣＩＮ１〜ＣＩＮ３）として組織学的に分類される明確に定義された一連のステージを経て、持続したＨＲ−ＨＰＶ感染の領域から進行する。ＨＲ−ＨＰＶの進行のステージはまた、軽度及び重度の扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ及びＨＳＩＬ）として細胞学的に知られている。ＬＳＩＬは、ＣＩＮ１に相当するのに対し、ＣＩＮ２及びＣＩＮ３は、好ましくはＨＳＩＬに相当する。ＨＰＶ１６の初期の感染は、上皮の下部三分の一におけるわずかな分化の阻害により現われるＣＩＮ１の進行を導く。これらの病変の大部分は、免疫が保たれている個人において、細胞性免疫によりおそらく仲介され、自発的に退行する。しかしながら、一部の人では、例えば、遺伝性、又は誘導性免疫不全症により、ＨＲ−ＨＰＶの感染が持続する、及びＣＩＮ１病変がＣＩＮ２病変に進行するリスクが存在する。ＣＩＮ２病変はまた、高い退行速度を示すが、ＣＩＮ２病変はまた、癌（上皮内癌、又はさらには浸潤癌）に進行し得る重度疾患（ＣＩＮ３）に進行し得る。
【００２４】
本明細書で意味する「軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染」は、好ましくは、正常な子宮頸部組織、又はＣＩＮ１（ごく小さい、又は軽症の子宮頸部異形成）として組織学的に分類される、又はＮＩＬ／Ｍ（上皮内病変又は悪性腫瘍について陰性）又はＬＳＩＬ（軽度の扁平上皮内病変）として細胞学的に分類されるＨＲ−ＨＰＶ感染の形態を意味する。従って、軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染は、好ましくは子宮頸部病変、従って軽度のＨＲ−ＨＰＶ病変を含む（概説については、Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｈ．２００２．Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ２００１．Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １３：４−１０を参照のこと）。
【００２５】
本明細書で意味する「重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染」は、好ましくは、ＣＩＮ２（軽度の子宮頸部上皮異形成）又はＣＩＮ３（重度の子宮頸部異形成）、又は癌（上皮内癌、又はさらには浸潤癌）として組織学的に分類される、ＨＲ−ＨＰＶ感染の形態を意味する。従って、用語「重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染」（重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染）とは、好ましくは、ＨＳＩＬ又は癌として細胞学的に分類されるＨＲ−ＨＰＶ感染の形態を意味する。従って、重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染は、好ましくは、悪性子宮頸部病変、従って重度のＨＲ−ＨＰＶ病変を含む（概説についてはＳｍｉｔｈ，Ｊ．Ｈ．２００２．Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ２００１．Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １３：４−１０を参照のこと）。
【００２６】
サンプルは、よく知られている技術により得られ、本明細書で言及される遺伝子産物を発現若しくは産生するそれらの細胞、組織、又は臓器からのサンプルを含み得る。好ましくは、サンプルは、尿生殖器管又は口腔咽頭管からスクラップされ、又は生検を行なわれる。斯かるサンプルは、ブラシ、（綿）スワブ、スパチュラ、リンス／洗浄液体、パンチ生検デバイス、ニードル又は外科用器具を用いた空洞穿刺の使用により得られ得る。好ましくは、スクラップは、粘膜細胞を含む。より好ましくは、サンプルは、子宮頸部スメア又はパップスメアである。分離された細胞は、分離技術、例えば濾過、遠心分離、又は細胞ソーティングにより、体液又は組織若しくは臓器から得られてもよい。さらに、サンプルは、本明細書で言及される遺伝子産物を更に濃縮及び／又は精製するために、よく知られて方法により、更に加工される。遺伝子産物の更なる加工は、好ましくは、遺伝子産物の性質、即ち、遺伝子産物がポリペプチドであるか、ＲＮＡ分子であるかに依存する。好ましくは、遺伝子産物がポリペプチドである場合、その後、ポリペプチドは、当業者によく知られている方法により濃縮及び／又は精製される。好ましくは、遺伝子産物がｍＲＮＡ分子である場合、前記ｍＲＮＡ分子は、本技術分野においてよく知られている方法により濃縮及び／又は精製されてもよい。
【００２７】
本明細書で用いられる用語「遺伝子産物」とは、好ましくは、転写産物、及び従ってｍＲＮＡ、又はポリペプチドに関する。
【００２８】
Ｅ１Ｃの遺伝子産物は、好ましくは、重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染に感染した個人から単離されたＥ１遺伝子からの転写産物であり、それはスプライスされ、ＨＰＶゲノムの位置８００〜１０００、好ましくは位置８５０〜９５０にスプライスドナー部位と、ＨＰＶゲノムの位置２４００〜２９００、好ましくは位置２５００〜２８００にスプライスアクセプター部位を有するスプライスジャンクションを含む。好ましくは、Ｅ１Ｃの前記産物は、Ｅ１遺伝子からの転写産物であり、それはスプライスされ、Ｅ１遺伝子の５’部分の１５００〜２１００、好ましくは１６００〜２０００、又はより好ましくは１７００〜１９００ヌクレオチド、より好ましくは上記の部位の間に欠失を含む。より好ましくは、遺伝子産物は、ＨＰＶ１８の９２９＾２７７９ジャンクションを含むスプライスされた転写産物、ＨＰＶ３３の８９４＾２７０２ジャンクションを含むスプライスされた転写産物、ＨＰＶ３５の８８３＾２６４９ジャンクションを含むスプライスされた転写産物、ＨＰＶ５２の８７９＾２６９６ジャンクションを含むスプライスされた転写産物、又はＨＰＶ５８の８９８＾２７０６ジャンクションを含むスプライスされた転写産物である。最も好ましくは、遺伝子産物は、配列番号１に示される配列に含まれるＨＰＶ１８の９２９＾２７７９ジャンクションを含む、配列番号２に示される配列に含まれるＨＰＶ３３の８９４＾２７０２ジャンクションを含む、配列番号３に示される配列に含まれるＨＰＶ３５の８８３＾２６４９ジャンクションを含む、配列番号２５に示される配列に含まれるＨＰＶ５２の８７９＾２６９６ジャンクションを含む、又は配列番号２６に示される配列に含まれるＨＰＶ５８の８９８＾２７０６ジャンクションを含むスプライスされた転写産物である（表１）。
【００２９】
表１：ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３３、及びＨＰＶ３５についての、Ｅ１Ｃスプライスジャンクション、タンパク質、並びに好ましいプローブ
全ての配列は、それらが配列決定により得られるのでＤＮＡ配列として示される。それにもかかわらず、スプライスドナー及びスプライスアクセプター配列、並びにスプライスジャンクションを含む配列は、細胞中のＲＮＡに含まれる。当業者は、ＤＮＡ配列からＲＮＡ配列に転写する方法を知っている。
【００３０】
【表１】
2013534806.tif 000002
【００３１】
しかしながら、Ｅ１Ｃの遺伝子産物は、Ｅ１遺伝子の前記スプライスされた転写産物から翻訳されたポリペプチドであることはまた、意図される。好ましくは、Ｅ１Ｃの遺伝子産物は、ＨＰＶ１８についてｍａｄｐｅｇｈｇｐｄ（配列番号２２）、ＨＰＶ３３についてｍａｄｐｅｇｒｇａｎ（配列番号２３）、ＨＰＶ３５についてｍａｄｐａｇｒｇａｄ（配列番号２４）、ＨＰＶ５２についてｍｅｄｐｅｇｒｇａｎ（配列番号３４）、又はＨＰＶ５８についてｍｄｄｐｅｇｒｇａｎ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。より好ましくは、Ｅ１Ｃの遺伝子産物は、ＨＰＶ１８についてｍａｄｐｅｇｈｇｐｄ（配列番号２２）、ＨＰＶ３３についてｍａｄｐｅｇｒｇａｎ（配列番号２３）、ＨＰＶ３５についてｍａｄｐａｇｒｇａｄ（配列番号２４）、ＨＰＶ５２についてｍｅｄｐｅｇｒｇａｎ（配列番号３４）、又はＨＰＶ５８についてｍｄｄｐｅｇｒｇａｎ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含むペプチドである。
【００３２】
本明細書で用いられる用語「量」（ａｍｏｕｎｔ）とは、遺伝子産物の絶対量、前記遺伝子産物の相対量若しくは濃度、並びにそれらに相関する又はそれらに由来する任意の値若しくはパラメータを含む。斯かる値又はパラメータは、直接測定による前記遺伝子産物から得られる全ての特定の物理的又は化学的特性からの強度シグナル値を含む。さらに、本明細書の他の場所で特定される、直接測定により得られる全ての値又はパラメータは、含まれる。例えば、ポリペプチドについては、応答レベルは、ペプチドに応答する生物学的読み出しシステム、又は特異的に結合したリガンドから得られる強度シグナルから決定され得る。前述の量又はパラメータに相関する値はまた、全ての標準的な数学的操作により得られ得ることは理解される。
【００３３】
好ましくは、本発明で言及されるポリヌクレオチド又は増幅産物の量を決定することは、好ましくは、半定量的に、又は定量的に、量又は濃度を測定することに関する。好ましくは、決定は、転写産物の定量化のための標準化ステップを含む。典型的に、この標準化プロセスは、ＮＡＳＢＡ標的増幅法について簡潔に記載される。標準化及び定量化は、好ましくは、増幅混合物に規定量の較正用ＲＮＡ（Ｑ−ＲＮＡ）を添加することにより達成される。前記較正用ＲＮＡは、好ましくは、分析される転写産物を特異的に増幅し得る同一のオリゴヌクレオチドにより増幅され得るインビトロで転写されたＲＮＡであるべきである。しかしながら、前記Ｑ−ＲＮＡは、オリゴヌクレオチドプローブについて特異的な標的配列（即ち、分析される転写産物に含まれない標的領域）を含むべきである。前記の特異的な標的領域は、分析される転写産物の増幅産物とＱ−ＲＮＡの増幅産物とを識別することが可能でなければならない。標準化の原理は、同一のオリゴヌクレオチド対で分析されるＱ−ＲＮＡと、ｍＲＮＡの競合的な共増幅である（ｖａｎ  Ｇｅｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９３：Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ＲＮＡ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ  ｕｓｉｎｇ  ＮＡＳＢＡ  ｄｕｒｉｎｇ  ＨＩＶ−１  ｐｒｉｍａｒｙ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４３：１７７−８７）。Ｑ−ＲＮＡの量は、好ましくは、本発明との関連において、分析される各ｍＲＮＡについて用量決定される必要がある。定量化のために、発現レベルは、インビトロで転写されたｍＲＮＡ、又は好適な参照材料を用いた標準曲線と比較され得る。これは、当業者により余分な手間をかけることなくなされ得る。
【００３４】
用語「遺伝子産物の存在又は不存在を決定すること」（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｒ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ）とは、当業者により理解される。本明細書で用いられる前記用語は、好ましくは遺伝子産物がサンプル中に存在するか、不存在であるかを評価することに関する。好ましくは、対象からのサンプル中のＥ１Ｃの遺伝子産物の存在は、前記対象が重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染に罹患していることを示す。好ましくは、対象からのサンプル中のＥ１Ｃの遺伝子産物の不存在は、前記対象が、軽症型のＨＰＶ感染に罹患していることを示す。
【００３５】
遺伝子産物がサンプル中に存在する又は存在しないかどうかを評価することは、よく知られている方法により行なわれ得る。例えば、遺伝子産物の分子の数が、検出限界未満である場合には、遺伝子産物は存在しないと結論づけられ；前記分子の数が検出限界を超える場合には、遺伝子産物はサンプル中に存在すると結論づけられる。検出限界が用いられる検出システムの種類に依存し得ること；例えば、ＰＣＲ型アッセイでは、転写産物の１分子が検出され得るのに対し、ＥＬＩＳＡアッセイでは、いくつかのポリペプチド分子が、検出可能なシグナルを提供するために必要と得ることは理解される。当業者は、適切な管理の介在を含む、最大感度、及び信頼性のために用いられる検出システムを調節する方法を知っている。遺伝子産物の量の決定のために用いられる方法は、遺伝子産物の性質、即ち、遺伝子産物が転写産物であるか、ポリペプチドであるかに依存する。
【００３６】
サンプル中の遺伝子産物の存在又は不存在を決定することはまた、前記サンプル中の遺伝子産物の量を決定すること、このようにして決定された量と参照量を比較することにより行なわれ得る。対象のサンプル中の転写産物の量、従ってｍＲＮＡの量の決定は、適切であるとみなされた任意の方法により行なわれ得る。好ましくは、転写産物の量は、分析される転写産物を特異的に検出するオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより決定される。転写産物の量を決定するための全ての方法はまた、上述のように遺伝子産物の存在又は不存在を決定するために用いられ得る。
【００３７】
特異的なオリゴヌクレオチドプローブによる転写産物又はそれらの増幅産物の量の決定は、好ましくは、転写産物又はそれらの増幅産物（「増幅産物」の説明については、下記を参照のこと）と、転写産物又はそれらの増幅産物と特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブとをハイブリダイズさせるステップを含む。本発明との関連において、オリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは、前記転写産物又はそれらの増幅産物に特異的である一本鎖核酸分子である。当業者は、オリゴヌクレオチドプローブが、標的と特異的にハイブリダイズし、従って標的ポリヌクレオチドに相補的であるヌクレオチドのストレッチを含むことを知っている。ヌクレオチドの前記ストレッチは、標的ポリヌクレオチドにより含まれる配列領域と、好ましくは８５％、９０％、９５％、９９％、又はより好ましくは１００％の同一である。
【００３８】
転写産物又はそれらの増幅産物の特異的な検出を可能にするために、オリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは、検出される転写産物又は増幅産物と特異的に結合するが、前記サンプルに含まれる他のポリヌクレオチドとは結合しない。好適なオリゴヌクレオチドプローブを選択する方法は、本技術分野において知られている。
【００３９】
スプライスジャンクションを検出するためのオリゴヌクレオチドプローブに好適に含まれる配列の例は、表１に示される（「プローブ配列」、配列番号：１０、１１、１２、及び３１）。好適に含まれる前記配列は、ＨＰＶ３３及びＨＰＶ５２と同一であることは理解され；当業者は、所定の配列と特異的にハイブリダイズする、例えば、ＨＰＶ３３のＥ１Ｃ転写産物とＨＰＶ５２のＥ１Ｃ転写産物との識別が望まれる場合、ＨＰＶ３３のＥ１Ｃ転写産物、又はＨＰＶ５２のＥ１Ｃ転写産物のいずれかと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを得るために、オリゴヌクレオチドプローブに伸長物を付加する方法を知っている。Ｅ１Ｃ転写産物を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブの特異性の増加は、５’及び／又は３’側、好ましくは両側にプローブ配列を伸長することにより得られた。最も好ましくは、前記プローブ配列は、Ｅ１Ｃ転写産物を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブの中央に、又は中央近くに位置する。当業者は、所定の配列と特異的にハイブリダイズするリゴヌクレオチドプローブを得るために、プローブ配列に新長物を付加する方法を知っている。
【００４０】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、標識されてもよく、又はそれらの転写産物又は増幅産物の量の決定を可能にする酵素を含む他の修飾を含んでもよい。標識は、本技術分野においてよく知られている様々な技術により行なわれ得、用いられる標識に依存する。好ましい標識は、本明細書の他の場所で記載される。
【００４１】
オリゴヌクレオチドプローブは、固体表面と結合しても、液相に存在してもよい。例として、オリゴヌクレオチドプローブは、固体表面を提供する担体と結合する。好ましくは、前記担体は、小粒子又はビーズである。小粒子又はビーズの外形寸法は、好ましくは、マイクロメーター又はナノメーター範囲でもよい。前記ビーズ及び粒子は、特定の染料、より好ましくは、特定の蛍光染料を用いて、着色されてもよい。好ましくは、様々な担体を様々な染料を用いて着色することにより、担体が互いに識別され得る。特定のオリゴヌクレオチドプローブについて特定の染料を含む担体（従って、特定の配列の増幅されたポリヌクレオチドを標的とする核酸）を用いることにより、前記担体は、様々な染料を含む他の担体から識別される。一つの好ましい実施形態では、市販されているＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）が用いられる。従って、転写産物又はそれらの増幅産物の検出のために、プローブは、蛍光標識されたポリスチレンビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ａｒｒａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と結合し、それは好適な、好ましくはストリンジェントな条件下で、増幅産物とハイブリダイズする。さらに、増幅産物は、マイクロアレイ、逆ラインブロット（Ｒｅｖｅｒｓｅ−Ｌｉｎｅ  Ｂｌｏｔｓ）（ＲＬＢ）、ドットブロット、又は好適な担体と結合した特異的なオリゴヌクレオチドを含む同様の技術により同定されてもよい。液相に存在するオリゴヌクレオチドプローブは、固定化された標的核酸分子、又は増幅されたポリヌクレオチドと結合してもよい。当業者により知られている特異的な標識又は修飾は、標的検出又はシグナル増幅を可能にし得る。加えて、増幅産物は、サイズ分離、例えばゲル又はキャピラリー電気泳動により、例えば核磁気共鳴を用いたヌクレオチド組成物により、又は本明細書の他の場所で記載されるようなリアルタイム及びシグナル増幅方法により検出されてもよい。
【００４２】
当業者は、好適なオリゴヌクレオチドプローブを選択することができる。スプライスされた転写産物の決定について、スプライスジャンクションをフランキングする（ｆｌａｎｋｉｎｇ）ヌクレオチドと特異的に結合する、従って、それぞれ特異的なスプライスドナー及びスプライアクセプターヌクレオチドと結合することにより生成される核酸配列と結合するオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより、前記の代わりにスプライスされたｍＲＮＡの量を決定することが、特に意図される。
【００４３】
好ましくは、転写産物の量の決定は、前記転写産物を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドを用いて前記転写産物を増幅し、及びこのようにして増幅された転写産物の量を決定するステップを含む。従って、転写産物の量の決定のために、本明細書の他の場所で記載される好適な方法により転写産物を増幅すること、及びその結果増幅産物の量を決定することは、特に好ましい。或いは、転写産物の量の決定は、前記転写産物が特異的に結合し、直線的なシグナル増幅、続く増幅されたシグナルの決定を可能にするオリゴヌクレオチドプローブを用いたシグナル増幅方法により達成される。
【００４４】
本発明との関連において、転写産物の増幅のためのオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの配列ストレッチと特異的に結合するのに十分な多数のヌクレオチドを含むべきである。好ましくは、本明細書で意味するオリゴヌクレオチドは、１５〜４０ヌクレオチド長、より好ましくは１８〜３０ヌクレオチド長、及び最も好ましくは２０〜２７ヌクレオチド長を有する。本発明との関連において、オリゴヌクレオチドプローブは、本明細書で言及されるような転写産物及び／又は前記転写産物の増幅産物の検出を可能にする（本明細書の他の場所を参照のこと）。転写産物又はそれらの増幅産物を検出するために、特異的な転写産物の量は、ＨＰＶ１６に感染した対象のサンプルにおいて評価され得る。転写産物若しくはそれらの増幅産物の特異的な検出を可能にするために、オリゴヌクレオチドプローブは、転写産物若しくはそれらの増幅産物と、又は前記転写産物若しくは前記増幅産物の一部と十分に相補的でなければならない。特に好ましいオリゴヌクレオチドは、特異的な配列、及び／又は本明細書で言及される特性を有する。
【００４５】
具体的には、増幅産物とストレプトアビジン表面又は蛍光コンジュゲートとの結合を可能にするために、オリゴヌクレオチドはビオチン化されてもよい。さらに、本発明との関連において、用いられる標識は、これらに限定されないが、とりわけ蛍光色素、例えばＲ−フィコエリトリン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、フルオレセイン、ローダミン、Ａｌｅｘａ、又はＴｅｘａｓ  Ｒｅｄを含む蛍光標識でもよい。しかしながら、標識はまた、酵素又は抗体でもよい。標識として用いられる酵素は、基質と反応することにより検出可能なシグナルを生成することが想定される。好適な酵素、基質、及び技術は、本技術分野においてよく知られている。標識として用いられる抗体は、直接的に（例えばそれ自身が蛍光性である標的分子）又は間接的に（例えば検出可能なシグナルを生成する標的分子、例えば酵素）検出され得る標的分子を特異的に認識してもよい。さらに、オリゴヌクレオチドは、相補的な検出プローブとハイブリダイゼーションによる検出を可能にするジェネリック（ｇｅｎｅｒｉｃ）配列を含み、それは任意の前述の標識又は修飾を含んでもよい。本発明のオリゴヌクレオチドはまた、５’制限部位、固定された核酸分子（ＬＮＡ）、又はペプチド核酸分子（ＰＮＡ）の一部を含んでもよい。斯かるＰＮＡは、原則的に例えば抗体によりペプチド部分を介して検出され得る。
【００４６】
転写産物を増幅する方法は、本技術分野においてよく知られている。転写産物の増幅は、好ましくは、初期量と比較して、対応する核酸分子の量の増加をもたらす、鋳型依存的なプロセスである。増幅産物は、好ましくは核酸、ＤＮＡ、又はＲＮＡである。転写産物の増幅は、更なるステップ、例えば、よく知られている方法による転写産物の逆転写を含んでもよいことは、理解される。
【００４７】
標的シグナルを増幅する方法は、本技術分野においてよく知られている。シグナルの増幅は、好ましくは、初期量と比較してレポーターシグナルの量の増加をもたらす鋳型依存的なプロセスである。レポーターシグナルは、好ましくは、可視光、蛍光、化学発光、及び発光である。シグナル増幅のための方法は、本技術分野においてよく知られており、チラミドシグナル増幅、分岐ＤＮＡ増幅、Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ（登録商標）増幅、錠型プローブ及びローリングサークル増幅、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）シグナル増幅、及び他のシグナル増幅方法に基づいてもよい。
【００４８】
対象の転写産物の増幅は、よく知られている方法、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素（ＲＴ）ＰCＲ、リアルタイムＰＣＲ、核酸配列型増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写仲介増幅（ＴＭＡ）、及び酵素、及びプライマーとして特異的なオリゴヌクレオチドを用いる他の等温増幅法により行なわれてもよい。ＰＣＲ法は、本技術分野においてよく知られている。好ましくは、増幅は、好適なオリゴヌクレオチド対を用いることによる。
【００４９】
本発明は、任意の前述の技術に制限されない。転写産物の増幅のための典型的な方法として、ＮＡＳＢＡ技術は、簡潔に要約される。ＮＡＳＢＡは、一つの鋳型における核酸の増幅のためのオリゴヌクレオチド依存的技術である。増幅される転写産物を含むサンプルは、前記転写産物の増幅のための少なくとも二つの転写産物特異的なオリゴヌクレオチドを含む反応混合物に添加される。Ｔ７ＲＮＡプロモーター配列を含む第一のオリゴヌクレオチドは、鋳型の３’末端における標的部位と結合する。逆転写によりＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは生成される。酵素ＲＮＡｓｅ  Ｈは、ＲＮＡ部分を分解する。ＲＮＡ鋳型の分解後、第二のオリゴヌクレオチドは、一本鎖ｃＤＮＡの３’末端と結合し、無傷のＴ７ＲＮＡプロモーターを含む二本鎖ＤＮＡは生成される。その後、酵素Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、アンチセンスRＮＡを直線的に生成する。それぞれの新しく合成されたアンチセンスＲＮＡ分子は、それ自体第二のプライマーを含む鋳型として作用することができ、機能的なＴ７プロモーターを含むＤＮＡ中間体に変換される。しかしながら、この場合、新しく生成されたＲＮＡ分子は、元の標的の逆の向きであり、得られるＤＮＡ中間体は、部分的にのみ二重鎖であるので、オリゴヌクレオチドプライマーは、逆の順序にアニールされる。このように、多くのＲＮＡコピーは、等温条件下でＲＮＡ生成物の直線的合成をもたらす反応に再入する各ＲＮＡ標的から生成される。約１０6〜１０9倍の増幅が９０分以内で得られる（Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｊ．１９９１．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ３５０：９１−２）。
【００５０】
本明細書で言及されたように、スプライスされたｍＲＮＡを特異的に増幅するために、転写産物の増幅のためのオリゴヌクレオチド対は、好ましくは、それぞれスプライスされたジャンクションを含む核酸領域を特異的に増幅することができる。それ故、増幅のためのオリゴヌクレオチドは、スプライシングジャンクションからの５’及び３’（一つの３’ プライマー、一つの５’ プライマー）転写産物（又はそれらの相補鎖、特に本明細書の他の場所で記載される手法により生成される相補的なＤＮＡ又はＲＮＡ鎖）と特異的に結合する。前述のオリゴヌクレオチドを用いることにより生成される増幅産物は、それぞれのスプライスジャンクションを含む。しかしながら、前記Ｅ１Ｃ転写産物がサンプル中に存在する場合のみ、特異的な結合、従って増幅が生じるように、オリゴヌクレオチド対の一つのオリゴヌクレオチドが、スプライシングジャンクションを含むＥ１Ｃ転写産物の領域と特異的に結合することはまた、本発明により意図される。斯かる場合、予期される長さの転写産物が無いことは、前記転写産物が無いこと、及び従って軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染がないことの診断である。
【００５１】
本明細書で言及されたポリペプチドの量を決定することは、好ましくは半定量的に、又は定量的に量又は濃度を測定することに関する。測定は、直接的又は間接的に行なわれ得る。直接測定することは、ペプチド又はポリペプチドそれ自身から得られるシグナルに基づくペプチド又はポリペプチドの量又は濃度を測定することに関し、その強度はサンプル中に存在するペプチドの分子の数と直接相関する。斯かるシグナル（本明細書で強度シグナルとも称される）は、例えばペプチド又はポリペプチドの特異的な物理的又は化学的特性の強度値を測定することにより、得られてもよい。間接的に測定することは、二次的な成分（即ち、ペプチド又はポリペプチドそれ自身でない成分）、又は生物学的読み出しシステム、例えば測定可能な細胞応答、リガンド、標識、又は酵素反応生成物から得られるシグナルを測定することを含む。
【００５２】
本発明に従って、ポリペプチドの量を決定することは、サンプル中のペプチドの量を決定するための全ての知られた手段により達成され得る。前記手段は、イムノアッセイデバイス、及び様々なサンドイッチ、競合、又は他のアッセイフォーマットにおいて標識された分子を用い得る方法を含む。前記アッセイは、ペプチド又はポリペプチドの存在又は不存在を示すシグナルを生じる。さらに、シグナル強度は、好ましくは、サンプル中に存在するポリペプチドの量に直接的又は間接的（例えば反比例）に相関する。さらに好適な方法は、ペプチド又はポリペプチドに特異的な物理的又は化学的な特性、例えばその正確な分子量又はＮＭＲスペクトルを測定することを含む。前記方法は、好ましくは、バイオセンサー、イムノアッセイと連結した光学デバイス、バイオチップ、分析的デバイス、例えば質量分析計、ＮＭＲ分析器、又はクロマトグラフィーデバイスを含む。さらに、方法は、マイクロプレートＥＬＩＳＡ型方法、完全に自動化された、又はロボットによるイムノアッセイ（例えばＥｌｅｃｓｙｓ（商標）分析器で可能である）、ＣＢＡ（酵素コバルト結合アッセイ（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｃｏｂａｌｔ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｓｓａｙ）、例えばＲｏｃｈｅ−Ｈｉｔａｃｈｉ（商標）分析器である）、及びラテックス凝集アッセイ（例えばＲｏｃｈｅ−Ｈｉｔａｃｈｉ（商標）分析器である）を含む。
【００５３】
ポリペプチドの量の決定は、好ましくは、決定されるポリペプチドと特異的に結合する抗体の使用を含む。好ましくは、決定されるポリペプチドが特異的にスプライスされたＨＲ−ＨＰＶ転写産物の翻訳に由来する場合、その結果抗体は、特異的にスプライスジャンクションをフランキングする核酸によりコードされるポリペプチドの領域と結合すべきである。好ましい抗体は、本明細書の他の場所で記載される。
【００５４】
用語「参照量」（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ａｍｏｕｎｔ）とは、ＨＲ−ＨＰＶ感染が重症型の感染であるか、軽症型の感染であるかを決定するために用いられる閾値である。サンプル中の決定されるＥ１Ｃの遺伝子産物の量が参照量を超える場合、ＨＲ−ＨＰＶ感染は重症であり；サンプル中の決定されるＥ１Ｃの遺伝子産物の量が参照量と等しい、又は参照量よりも低い場合、ＨＲ−ＨＰＶ感染は軽症である。当業者は、例えば、重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染が評価（例えばパップ試験）されたサンプルの代表的なセット中のＥ１Ｃの遺伝子産物の量を決定すること、及び参照量を決定するために得られる結果の統計学的分析を用いることによる、参照量を決定する方法を知っている。参照量がゼロであり得ることは理解される。
【００５５】
上記でされた定義は、必要な変更を加えて以下に適用される：
更なる実施形態では、本発明は、ＨＲ−ＨＰＶに感染している対象において（ｉ）重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染と（ｉｉ）軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染とを識別するための方法であって、ａ）前記対象のサンプル中の第一の遺伝子産物の量を決定するステップ（前記第一の遺伝子産物は、Ｅ１Ｃの遺伝子産物である）、ｂ）前記サンプル中の第二の遺伝子産物の量を決定するステップ、ｃ）ステップａ）で決定された前記第一の遺伝子産物の量と、ステップｂ）で決定された前記第二の遺伝子産物の量との比を計算するステップ、ｄ）ステップｃ）で計算された比を参照比と比較するステップ、及びｅ）（ｉ）重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染と（ｉｉ）軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染とを識別するステップを含む方法、に関する。
【００５６】
好ましくは、前述の方法は、Ｅ１Ｃの遺伝子産物の量と参照量との比の計算を含む。本発明の参照量は、第二の遺伝子産物の量であり、ここで前記第二の遺伝子産物の量は、それが例えば細胞のハウスキーピング遺伝子、又は例えばＥ１＾Ｅ４、Ｌ１、又はＥ５の遺伝子産物であるの場合、その発現は、重症のＨＲ−ＨＰＶ感染において一定又は減少するので、重症のＨＲ−ＨＰＶ感染の場合、増加しないことが知られている。本明細書の上記で説明されるように、Ｅ１Ｃの遺伝子産物（又は前記スプライスされたｍＲＮＡによりコードされるポリペプチド）の量の決定は、ＨＲ−ＨＰＶ感染の軽症型と重症型とを識別するために、特に有利である。
【００５７】
本発明の前述の方法との関連において、第二の遺伝子産物は、好ましくは、Ｅ１＾Ｅ４の遺伝子産物、Ａｐｍ１の遺伝子産物、Ｕｂｃの遺伝子産物、Ｕ１Ａの遺伝子産物、Ｅ１の遺伝子産物、Ｅ５の遺伝子産物、Ｌ１の遺伝子産物、Ｅ６*Ｉの遺伝子産物からなる群から選択される。
【００５８】
Ｅ１＾Ｅ４の及びＥ６*Ｉの遺伝子産物は、好ましくは、ＨＲ−ＨＰＶの代わりにスプライスされたｍＲＮＡ、又は前記の代わりにスプライスされたｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドである。前記の代わりにスプライスされたｍＲＮＡのスプライス部位は、表２に要約される。
【００５９】
【表２】
2013534806.tif 000003
【００６０】
表２：ＨＰＶ１８、３３、３５、５２、及び５８のＥ１＾Ｅ４及びＥ６*Ｉの転写産物についてのスプライスジャンクション。*Ｅ１＾Ｅ４のスプライスジャンクションの正確な位置は、参考文献に記載される方法に従って、決定される。
【００６１】
（参考文献：−Ｓｏｔｌａｒ  Ｋ，Ｓｔｕｂｎｅｒ  Ａ，Ｄｉｅｍｅｒ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  Ｅ６  ａｎｄ  Ｅ７  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｉｎ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｓｃｒａｐｅｓ  ｂｙ  ｎｅｓｔｅｄ  ＲＴ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００４；７４：１０７−１６．
−Ｐｉｒｎ  Ｄ，Ｍａｓｓｉｍｉ  Ｐ，Ｂａｎｋｓ  Ｌ．Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ  ｓｐｌｉｃｅｄ  ＨＰＶ−１８  Ｅ６*  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｅ６  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ５３  ａｎｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９９７；１５：２５７−６４．
−Ｍｅｙｅｒｓ  Ｃ，Ｍａｙｅｒ  ＴＪ，Ｏｚｂｕｎ  ＭＡ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １８  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９９７；７１：７３８１−６．
−Ｓｎｉｊｄｅｒｓ  ＰＪ，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｕｌｅ  ＡＪ，Ｓｃｈｒｉｊｎｅｍａｋｅｒｓ  ＨＰ，Ｒａａｐｈｏｒｓｔ  ＰＭ，Ｍｅｉｊｅｒ  ＣＪ，Ｗａｌｂｏｏｍｅｒｓ  ＪＭ．ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ３３  ｉｎ  ａ  ｔｏｎｓｉｌｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  ｉｔｓ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  Ｅ７  ｍＲＮＡ  ｖｉａ  ｔｗｏ  Ｅ６*  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｗｈｉｃｈ  ａｒｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ  ａｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｅａｒｌｙ  ｒｅｇｉｏｎ  ｐｏｌｙ（Ａ）ｓｉｔｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９９２；６６：３１７２−８．）
【００６２】
本明細書で用いられる用語「Ｅ１＾Ｅ４の遺伝子産物」（ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｏｆ  Ｅ１＾Ｅ４）とは、好ましくはＨＰＶ１６の８８０＾３３５８でスプライスされたｍＲＮＡに対応するＲＮＡ、好ましくはＨＰＶ１８の９２９＾３４３４スプライスジャンクションを含む転写産物、若しくはＨＰＶ３３の８９４＾３３５１スプライスジャンクションを含む転写産物を意味し；又は前記用語は、ＨＰＶ１６の８８０＾３３５８でスプライスされたｍＲＮＡに対応する前記転写産物によりコードされるポリペプチド（前記ポリペプチドは、好ましくはＨＰＶのＮ−末端のＥ１ポリペプチドとＥ４ポリペプチドとの融合ポリペプチドである）に関する。前記ポリペプチドは、ウイルス生活環の後期に発現する。それらは、棘及び顆粒細胞層で検出され、ＨＰＶの感染の後期にいくつかの機能を有する。
【００６３】
本明細書で用いられる用語「Ｅ６*Ｉの遺伝子産物」（ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｏｆ  Ｅ６*Ｉ）とは、好ましくはＨＰＶ１６の２２６＾４０９でスプライスされたｍＲＮＡに対応するｍＲＮＡ、好ましくはＨＰＶ１８の２３３＾４１６スプライスジャンクションを含む転写産物、ＨＰＶ３３の２３１＾５０９スプライスジャンクションを含む転写産物、若しくはＨＰＶ３３の２３２＾４１５スプライスジャンクションを含む転写産物を意味し；又は前記用語は、ＨＰＶ１６の２２６＾４０９でスプライスされたｍＲＮＡに対応する前記転写産物によりコードされるポリペプチドに関する。Ｅ６*Ｉポリペプチドは、ウイルスＬＣＲを転写活性化し得ることが提案されている（Ａｌｌｏｕｌ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｌ．Ｓｈｅｒｍａｎ．１９９９．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｓｐｌｉｃｅｄ  ｃＤＮＡｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅ２  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １６．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８０（Ｐｔ  ９）：２４６１−７０．）。
【００６４】
Ｕｂｃ、Ｕ１Ａ、及びＡｐｍ１は宿主細胞のゲノムにより含まれる遺伝子である。従って、前記遺伝子は、ＨＰＶ１６のゲノムによりコードされない。本発明との関連において、宿主特異的である遺伝子はまた、細胞性遺伝子と称される。Ｕｂｃ、Ｕ１Ａ、及びＡｐｍ１の遺伝子産物は、好ましくは、ｍＲＮＡ、及び前記遺伝子によりコードされるポリペプチドである。本発明の方法は、従って、Ｕｂｃ、Ｕ１Ａ、及びＡｐｍ１  ｍＲＮＡｓ、又はＵｂｃ、Ｕ１Ａ、及びＡｐｍ１ポリペプチドの量の決定を意図する。
【００６５】
本明細書で用いられる用語「Ｕｂｃ」とは、好ましくは、ユビキチンＣ、好ましくはヒトユビキチンＣを意味する。ヒトＵｂｃ１の核酸配列及びアミノ酸配列は、本技術分野においてよく知られており、例えばＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ：ＮＭ＿０２１００９．４（核酸配列、配列番号１６）、及びＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ：ＮＰ＿０６６２８９．２（アミノ酸配列、配列番号１７）に示される。
【００６６】
本明細書で意味する用語Ｕ１Ａとは、好ましくは、Ｕ１小核のリボヌクレオタンパク質ポリペプチドＡ、好ましくはヒトＵ１小核のリボヌクレオタンパク質ポリペプチドＡを意味する。ヒトＵ１Ａの核酸配列及びアミノ酸配列は、本技術分野においてよく知られており、例えばＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ：ＮＭ＿００４５９６．３（核酸配列、配列番号１８）、及びＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ：ＮＰ＿００４５８７．１（アミノ酸配列、配列番号１９）に示される。
【００６７】
本明細書で意味する用語Ａｐｍ１とは、好ましくは、「ＭＥ１８０細胞においてパピローマウイルスＤＮＡ統合により感染された」又は「ジンクフィンガー及び７Ｃを含むＢＴＢドメイン」（ＺＢＴＢ７Ｃ）を意味する。ヒトＡｐｍ１の核酸配列及びアミノ酸配列は、本技術分野においてよく知られており、例えばＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ：ＮＭ＿＿００１０３９３６０．１（核酸配列、配列番号２０）、及びＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ：ＮＰ＿００１０３４４４９．１（アミノ酸配列、配列番号２１）に示される。
【００６８】
本発明の方法はまた、Ｅ１転写産物を含むポリヌクレオチドの量の決定、又はＥ１ポリペプチドの量の決定を意図する。前記ポリヌクレオチド及び前記ポリペプチドは、ＨＲ−ＨＰＶゲノムによりコードされる。
【００６９】
Ｅ１ポリペプチドは、スプライスされてないＥ１  ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）を含む転写産物によりコード化される。Ｅ１はウイルス複製に必須であり、ＳＶ４０ラージ腫瘍抗原と構造的類似性を共有する。Ｅ１は、ＡＴＰａｓｅ、ヘリカーゼ、及びヌクレオチド結合活性を示し、細胞性ＤＮＡポリメラーゼαと相互作用し、細胞複製開始機構をＬＣＲの複製のウイルス起源に動員する。
【００７０】
本発明の方法はまた、Ｅ５転写産物を含むポリヌクレオチドの量の決定、又はＥ５ポリペプチドの量の決定を意図する。前記ポリヌクレオチド及び前記ポリペプチドは、ＨＲ−ＨＰＶゲノムによりコード化される。
【００７１】
Ｅ５ポリペプチドは、スプライスされていないＥ２／Ｅ５転写産物から発現されるが、Ｅ１＾Ｅ４／Ｅ５転写産物から発現されない。ＨＰＶゲノムの宿主ゲノムへの統合の場合、Ｅ５ポリペプチド及び転写産物発現は、Ｅ２領域の妨害のために中断される。Ｅ５は、細胞内膜及び細胞膜で発見される疎水性膜タンパク質である。Ｅ５ダイマーは、それが増殖因子受容体、ＥＧＦ−又はＰＤＧＦ受容体と相互作用し、それらのリガンドと独立したダイマー化、続く細胞質チロシン残基のトランスリン酸化、及び細胞内シグナル変換タンパク質の動員を引き起こすので、感染の初期の過程において重要であると考えられている。
【００７２】
本発明の方法はまた、Ｌ１転写産物を含むポリヌクレオチドの量の決定、又はＬ１ポリペプチドの量の決定を意図する。前記ポリヌクレオチド及び前記ポリペプチドは、ＨＲ−ＨＰＶゲノムによりコードされる。
【００７３】
上記で説明されるように、ＨＰＶのＬ１ポリペプチドは、キャプシドタンパク質である。増殖感染の後期の間、主なキャプシドタンパク質であるＬ１ポリペプチドは、上皮の一番上に近い分化した細胞において発現され、ＨＰＶ１６のＬ２ポリペプチドとともに顆粒層においてウイルスキャプシドを形成する。
【００７４】
本明細書で用いられる用語「比較すること」（ｃｏｍｐａｒｉｎｇ）とは、本発明の方法のステップａ）で決定された第一の遺伝子産物の量と、本発明の方法のステップｂ）で決定された第二の遺伝子産物の量との比を計算することにより決定される値と、本明細書の他の場所に規定された好適な参照源とを比較することを含む。本明細書で用いられる、比較することとは、値の比較を意味することは理解される。本発明の方法のステップｄ）で言及される比較は、手動で又はコンピュータを用いて行なわれてもよい。コンピュータを用いた比較のために、決定された量の値は、コンピュータプログラムによるデータベースに保存される好適な参照に対応する値と比較されてもよい。コンピュータプログラムは、比較の結果を更に評価してもよく、即ち好適なアウトプットフォーマットにおいて所望の評価を自動的に提供してもよい。本発明の方法のステップｃ）で計算される比と参照比との比較に基づいて、ＨＲ−ＨＰＶに感染している対象において、ＨＲ−ＨＰＶの軽症型の感染と、ＨＲ−ＨＰＶの重症型の感染に識別することは可能である。それ故、参照比は、比較される値における相違性又は類似性が、ＨＰＶ１６の軽症型感染とＨＰＶの重症型感染とを識別することを可能にするように、選択される。
【００７５】
従って、本明細書で用いられる用語「参照比」（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｒａｔｉｏ）は、好ましくは、軽症型と重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染とを識別することを可能にする値を意味する。従って、参照は、本発明の方法のステップａ）及びｂ）を行い、本発明の方法のステップａ）で決定されるようなＨＲ−ＨＰＶ感染に罹患した対象のサンプル中の第一の遺伝子産物の量と、本発明の方法のステップｂ）で決定されるような前記第二の遺伝子産物の量の比を計算すること（前記対象は、重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染、例えばＨＳＩＬ又は子宮頸癌に罹患していることが知られている）に由来してもよい。また、参照は、本発明の方法のステップａ）及びｂ）を行い、本発明の方法のステップａ）で決定されるようなＨＲ−ＨＰＶ感染に罹患した対象のサンプル中の第一の遺伝子産物の量と、本発明の方法のステップｂ）で決定されるような対象におけるＨＲ−ＨＰＶに感染している対象のサンプル中の前記第二の遺伝子産物の量の比を計算すること（前記対象は、軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染（例えばＬＳＩＬとして分類される形態）を示すことが知られている）に由来してもよい。好適な参照比又は閾値は、試験サンプルと一緒に、即ち、同時に、又はその後に分析される参照サンプルから本発明の方法により決定されてもよい。参照比又は閾値の値は、遺伝子産物（転写産物又はポリペプチド）の性質に応じて、及び遺伝子産物の量がサンプル中で決定される方法に応じて変更されてもよいことは理解される。例えば、第一及び第二の遺伝子産物の量の決定がＰＣＲによる遺伝子産物の増幅を含む場合、決定された遺伝子産物の量は、特異的な遺伝子産物の増幅のための様々なオリゴヌクレオチド対の増幅効率は変化するので、例えば、ＰＣＲ反応に用いられるオリゴヌクレオチドに依存し得る。しかしながら、当業者は、参照を計算する場合、これを考慮する。特に、当業者は、好ましくは、参照サンプル及び試験サンプルにおいて、同一の手段及び方法が特異的な遺伝子産物の量を決定するために用いられなければならないことを知っている。
【００７６】
本明細書で説明されるように、マーカーについての参照量、又は本発明との関連における参照比は、容易に確立され得る。さらに、試験サンプル中のマーカーの量、又は対象からの試験サンプル中の二つのマーカーの比は、それぞれ参照比及び参照量と単純に比較され得る。診断試験の感度及び特異性は、単に試験の分析的「質」に依存するのではなく、それらはまた、異常な結果を構成するものの定義に依存する。実際には、受信者動作特性（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線、又は「ＲＯＣ」曲線は、典型的に、変数の値に対して軽症型のＨＰＶ感染に罹患した集団及び重型のＨＰＶ感染に罹患した集団におけるその相対頻度をプロットすることにより計算される。任意の特定のマーカー又はマーカーの比について、マーカーレベルの分布又は対象についてのマーカーの比は、重なり得る。斯かる条件下で、試験は、軽症型のＨＰＶ感染に罹患した患者と重症型のＨＰＶ感染に罹患した患者とを１００％の正確性をもって完全に識別することはできず、重複の面積は、試験が軽症型のＨＰＶ感染の患者と重症型のＨＰＶ感染の患者とを識別できない場合を示す。閾値は選択され、閾値を上回る場合には、試験が重症型を示すと考えられ、閾値を下回る場合には、試験は線維症を示すと考えられる。ＲＯＣ曲線の下の面積は、感知された測定が対象の正確な診断を可能にする可能性の評価基準である。これらの方法は、本技術分野においてよく知られている。例えば、Ｈａｎｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  １４３：２９−３６（１９８２）を参照のこと。
【００７７】
特定の実施形態では、選択される参照量／比は、少なくとも約７０％の特異性、より好ましくは少なくとも約８０％の特異性、より一層好ましくは少なくとも約８５％の特異性、さらにより好ましくは少なくとも約９０％の特異性、及び最も好ましくは少なくとも約９５％の特異性と合わせて、少なくとも約７０％の感度、より好ましくは少なくとも約８０％の感度、より一層好ましくは少なくとも約８５％の感度、更により好ましくは少なくとも約９０％の感度、及び最も好ましくは少なくとも約９５％の感度を示すために、選択された。特に好ましい実施形態では、感度及び特異性の双方は、少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、より一層好ましくは少なくとも約８５％、更により好ましくは少なくとも約９０％、及び最も好ましくは少なくとも約９５％である。
【００７８】
上記で説明されるように、参照は、好ましくは、重症型のＨＰＶ感染に罹患している対象、又は軽症型のＨＰＶ感染に罹患していることが知られている対象のサンプルから得られてもよい。参照はまた、斯かるサンプルの群から得られる平均（ａｖｅｒａｇｅ）又は平均（ｍｅａｎ）であり得る。参照の結果は、本発明の方法を適用することにより得られてもよい。集団の前記個人のバイオマーカー（単数又は複数）の絶対又は相対量は、本明細書の他の場所で特定されるように決定され得る。好適な参照値又は比、好ましくは平均又は中央値を計算する方法は、本技術分野においてよく知られている。前述の対象の集団は、複数の対象、好ましくは少なくとも５、１０、５０、１００、１，０００、１０，０００人の対象を含むべきである。本発明の方法により評価される対象、及び前記複数の対象の対象は、同じ種類の中であることは理解される。
【００７９】
「参照」（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）が、参照対象の群、即ち重症型のＨＰＶ感染に罹患していることが知られている対象の群、又は軽症型のＨＰＶ感染に罹患していることが知られている対象の群におけるバイオマーカーの量、又は二つのバイオマーカーの比を決定し、本明細書の他の場所で言及されるもの、例えば中央値、平均、変位置、ＰＬＳ−ＤＡ、ロジスティック回帰法、ランダムフォレスト分類、又は所定の閾値を与える他のものを含む、適切な統計学的な測定による参照を計算することにより得られることは更に意図される。閾値は、試験の感度及び特異性の所望の臨床背景を考慮に入れるべきである。
【００８０】
対象が重症型のＨＰＶ感染に罹患しているか、軽症型のＨＰＶ感染に罹患しているかどうかの評価は、試験サンプルから得られる試験と前述の参照結果との同一性又は類似性の程度、即ち、バイオマーカーに関して同一又は類似の量に基づいて実行され得ることはまた、想定される。例えば、参照サンプルが軽症型のＨＰＶ感染に罹患する対象から得られた場合、及びバイオマーカーの量又は試験サンプルにおける比が前記バイオマーカーの量又は参照サンプルにおける比と同一又は類似である場合、その結果軽症型のＨＰＶ感染の存在は診断され得る。特性についての値、及び定量的決定の場合に強度値が同一である場合、試験サンプルの結果及び参照結果が同一である。特性の値／比が同一であるが強度値／比が異なる場合、前記結果は類似である。斯かる差は、好ましくは著しくなく、強度についての値が、参照値の少なくとも１〜９９パーセンタイル、５〜９５パーセンタイル、１０〜９０パーセンタイル、２０〜８０パーセンタイル、３０〜７０パーセンタイル、４０〜６０パーセンタイルの間であり、参照値の５０パーセンタイル、６０パーセンタイル、７０パーセンタイル、８０パーセンタイル、９０パーセンタイル、又は９５パーセンタイルであることを特徴とすべきである。
【００８１】
評価は、試験サンプルから得られる試験結果と前述の参照結果との差に基づいてもよいことはまた、本発明の方法との関連において意図される。上記で特定されたような計算された参照が用いられる場合、それは適用される。差は、好ましくは、本明細書で説明されるような比について、又は本発明の診断マーカーの絶対量又は相対量についての増加又は減少であるべきである。好ましくは、絶対量又は相対量の増加又は減少は著しく、即ち参照値の４５〜５５パーセンタイル、４０〜６０パーセンタイル、３０〜７０パーセンタイル、２０〜８０パーセンタイル、１０〜９０パーセンタイル、５〜９５パーセンタイル、１〜９９パーセンタイルの間の外である。
【００８２】
閾値として役割を果たす好ましい参照比は、正常の上限（ＵＬＮ）、即ち、対象の集団（例えば、臨床試験に参加した患者）にみられる生理学的な量の上限に由来する。対象の所定の集団についてのＵＬＮは、様々なよく知られている技術により決定され得る。
【００８３】
好ましくは、本発明との関連において、計算される比は、第一の遺伝子産物の量と第二の遺伝子産物の量との比である。第二の遺伝子産物の量と第一の遺伝子産物の量との比もまた、計算され得ることは理解される。第一の遺伝子産物の量と第二の遺伝子産物の量との比が計算される場合、好ましくは以下が適用される：
【００８４】
好ましくは、参照比よりも大きい試験サンプルの計算された比は、重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染を示す。より好ましくは、参照比よりも著しく大きい試験サンプルの計算された比は、重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染を示す。最も好ましくは、参照比よりもよりも統計学的に有意に大きい試験サンプルの計算された比は、重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染を示す。
【００８５】
好ましくは、参照比よりも小さい試験サンプルの計算された比は、軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染を示す。より好ましくは、参照比よりも著しく小さい試験サンプルの計算された比は、軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染を示す。最も好ましくは、参照比よりもよりも統計学的に有意に小さい試験サンプルの計算された比は、軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染を示す。
【００８６】
具体的には、参照比よりも著しく大きい（若しくは小さい）、又は統計学的に有意に大きい（若しくは小さい）比は、本明細書で言及される識別のために重要であると考えられる大きさの比である。用語「大きい」（ｌａｒｇｅｒ）、「著しく大きい」（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｌａｒｇｅｒ）、及び「統計学的に有意に大きい」（ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｌａｒｇｅｒ）、「小さい」（ｌｏｗｅｒ）、「著しく小さい」（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｌｏｗｅｒ）、及び「統計学的に有意に小さい」（ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｌｏｗｅｒ）は、当業者により知られている。従って、比が大きい（若しくは小さい）、著しく大きい（若しくは小さい）、又は統計学的に有意に大きい（若しくは小さい）かどうかは、よく知られている統計学的な評価手段を用いて、当業者により余分な手間をかけることなく決定され得る。
【００８７】
更なる実施形態では、本発明は、ＨＲ−ＨＰＶに感染している対象において、（ｉ）重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染と（ｉｉ）軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染とを識別するためのデバイスであって、Ｅ１Ｃの遺伝子産物の存在及び／又は量を決定するための手段、及び前記量と参照量とを比較するための手段を含み、（ｉ）重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染と（ｉｉ）軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染とを識別することを可能にするデバイスに関する。
【００８８】
さらに、本発明は、ＨＲ−ＨＰＶに感染している対象において、（ｉ）重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染と（ｉｉ）軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染とを識別するためのデバイスであって、Ｅ１Ｃの遺伝子産物の存在及び／又は量を決定するための検出試薬を含み、（ｉ）重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染と（ｉｉ）軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染とを識別することを可能にするデバイスに関する。
【００８９】
好ましくは、前記デバイスは、Ｅ１Ｃの遺伝子産物の量と参照量とを比較するための手段を更に含む。
【００９０】
発明はまた、ＨＲ−ＨＰＶに罹患した対象において、（ｉ）重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染と（ｉｉ）軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染とを識別するためのデバイスであって、前記対象のサンプル中の第一の遺伝子産物の量を決定するための検出試薬（前記第一の遺伝子産物はＥ１Ｃの遺伝子産物である）、前記サンプル中の第二の遺伝子産物の量を決定するための検出試薬、前記第一の遺伝子産物の量と前記第二の遺伝子産物の量の比を計算するための手段、前記比と参照比を比較するための手段、及び（ｉ）重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染と（ｉｉ）軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染とを識別する手段を含むデバイスを想定する。
【００９１】
更に、本発明は、上記で開示された本発明の方法を実行するために適合されたデバイスであって、以下：
ａ）Ｅ１Ｃの遺伝子産物の量及び／又は存在を決定するために適合される、Ｅ１Ｃの遺伝子産物と特異的に結合する検出試薬を含む分析するユニット、及び好ましくは、
ｂ）前記量と参照量を比較するための評価ユニット、それによって、ＨＲ−ＨＰＶに罹患した対象において（ｉ）重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染と（ｉｉ）軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染とを識別し得、前記ユニットは、軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染に罹患した対象由来、又は重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染に罹患した対象由来の少なくとも一つの参照比を含むデータベース、及び比較を実行するためのコンピュータにより実装されるアルゴリズムを含む、
を含むデバイスを想定する。
【００９２】
本発明はまた、上記で開示された本発明の方法を実行するために適合されたデバイスであって、以下：
ａ）第一の遺伝子産物の量を決定するために適合された、第一の遺伝子産物と特異的に結合する検出試薬（前記第一の遺伝子産物はＥ１Ｃの遺伝子産物である）、と好ましくは、第二の遺伝子産物の量を決定するために適合された、前記第二の遺伝子産物と特異的に結合する検出試薬を比較する分析ユニット；並びに
ｂ）前記第一及び前記第二の遺伝子産物の量の比を計算するための、及び前記比と参照比を比較するための評価ユニット、それによってＨＲ−ＨＰＶに罹患した対象において（ｉ）重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染と（ｉｉ）軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染とを識別し得、前記ユニットは、軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染に罹患した対象由来、又は重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染に罹患した対象由来の少なくとも一つの参照比を含むデータベース、及び比較を実行するためのコンピュータにより実装されるアルゴリズムを含む、
を含むデバイスに関する。
【００９３】
好ましいＥ１Ｃの遺伝子産物及び第二の遺伝子産物は、本明細書の他の場所で特定される。好ましくは、ＨＲ−ＨＰＶ及び対応するＥ１Ｃの遺伝子産物は、
ａ）ＨＰＶ１８及び９２９＾２７７９ジャンクションを含むスプライスされた転写産物、
ｂ）ＨＰＶ３３及び８９４＾２７０２ジャンクションを含むスプライスされた転写産物、
ｃ）ＨＰＶ３５及び８８３＾２６４９ジャンクションを含むスプライスされた転写産物、
ｄ）ＨＰＶ５２及び８７９＾２６９６ジャンクションを含むスプライスされた転写産物、又は
ｅ）ＨＰＶ５８及び８９８＾２７０６ジャンクションを含むスプライスされた転写産物、
である。
【００９４】
本明細書に用いられる用語「デバイス」（ｄｅｖｉｃｅ）は、本発明の方法に従って、診断又はモニタリングを可能にする互いに動作可能なように連結された前述のユニットを含むシステムに関する。本明細書に用いられる用語「検出試薬」（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）は、サンプル中に存在する遺伝子産物を特異的に認識及び結合し得る試薬を意味する。好ましい検出試薬（例えばプローブ又は抗体、転写産物を特異的に増幅するオリゴヌクレオチド）は、本明細書の他の場所で詳細に開示される。遺伝子産物の決定される量及び／又は存在若しくは不存在は、評価ユニットに送られ得る。前記評価ユニットは、データ処理構成要素、例えば、決定される量と好適な参照との比較を実行するための実装されたアルゴリズムを有するコンピュータを含む。好適な参照は、他の場所で記載されるように、軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染に罹患した対象、又は重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染に罹患した対象に由来する。結果は、パラメータの診断の生データのアウトプットとして、好ましくは絶対量、又はより好ましくは相対量として得られてもよい。これらのデータは、臨床医による解釈を必要とすることは理解される。しかしながら、アウトプットが、その解釈に専門分野の臨床医を必要としない加工された診断の生データを含む、エキスパートシステムデバイスはまた想定される。
【００９５】
好ましくは、本発明を実行するために適合されたキットであって、前記方法を実行するための取扱説明書を含み、前記キットは更に、Ｅ１Ｃの遺伝子産物の存在及び／又は量を決定するための検出試薬、及び好ましくは前記量と参照量とを比較するための手段を含み、（ｉ）重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染と（ｉｉ）軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染とを識別することを可能にするキットは、本発明により更に含まれる。
【００９６】
本発明はまた、好ましくは、本発明の方法を実行するために適合されたキットであって、前記方法を実行するための取扱説明書を含み、前記キットは、更に、前記対象のサンプル中の第一の遺伝子産物の量を決定するための検出試薬（前記第一の遺伝子産物はＥ１Ｃの遺伝子産物である）、前記サンプル中の第二の遺伝子産物の量を決定するための検出試薬、前記第一の遺伝子産物の量と前記第二の遺伝子産物の量との比を計算するための手段、前記比と参照比とを比較するための手段、及び（ｉ）重症型のＨＲ−ＨＰＶ感染と（ｉｉ）軽症型のＨＲ−ＨＰＶ感染とを識別する手段を含むキットに関する。
【００９７】
好ましいＥ１Ｃの遺伝子産物及び第二の遺伝子産物は、本明細書の他の場所で特定される。好ましくは、ＨＲ−ＨＰＶ及び対応するＥ１Ｃの遺伝子産物は、
ａ）ＨＰＶ１８及び９２９＾２７７９ジャンクションを含むスプライスされた転写産物、
ｂ）ＨＰＶ３３及び８９４＾２７０２ジャンクションを含むスプライスされた転写産物、
ｃ）ＨＰＶ３５及び８８３＾２６４９ジャンクションを含むスプライスされた転写産物、
ｄ）ＨＰＶ５２及び８７９＾２６９６ジャンクションを含むスプライスされた転写産物、又は
ｅ）ＨＰＶ５８及び８９８＾２７０６ジャンクションを含むスプライスされた転写産物
である。
【００９８】
本明細書で用いられる用語「キット」（ｋｉｔ）は、好ましくは、分離して、又は一つの容器内に提供される前述の構成要素の集合物を意味する。容器はまた、本発明の方法を実行するための取扱説明書を含む。これらの取扱説明書は、冊子の形態でもよく、コンピュータプログラムコードにより提供されてもよく、それは本発明の方法において言及される比較を実行することを可能にし、コンピュータ又はデータ処理デバイスに実装される場合、適宜診断を確立する。コンピュータプログラムコードは、データ記憶媒体若しくはデバイス、例えば光学式記憶媒体（例えばコンパクトディスク）上で、又はコンピュータ若しくはデータ処理デバイス上に直接提供されてもよい。
【００９９】
更に好ましい実施形態では、本発明は、スプライスジャンクションを含むＨＲ−ＨＰＶゲノムの転写産物に関し、ここでＨＲ−ＨＰＶとスプライスジャンクションの組み合わせは、ａ）ＨＰＶ１８及び９２９＾２７７９ジャンクション、ｂ）ＨＰＶ３３及び８９４＾２７０２ジャンクション、ｃ）ＨＰＶ３５及び８８３＾２６４９ジャンクション、ｄ）ＨＰＶ５２及び８７９＾２６９６ジャンクション、並びにｅ）ＨＰＶ５８及び８９８＾２７０６ジャンクションからなるリストから選択される。
【０１００】
更に、本発明は、ｉ）Ｅ１Ｃ転写産物のスプライスジャンクションと特異的にハイブリダイズする少なくとも一つの第一のオリゴヌクレオチド、並びにｉｉ）Ｅ６*Ｉの転写産物、Ｅ１＾Ｅ４の転写産物、Ａｐｍ１の転写産物、Ｕｂｃの転写産物、Ｕ１Ａの転写産物、Ｅ１の転写産物、Ｅ５の転写産物、及びＬ１の転写産物からなる群から選択される転写産物と特異的にハイブリダイズする少なくとも一つの第二のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの混合物に関する。
【０１０１】
更に、本発明は、配列番号２２、２３、２４、３４、又は３５に示されるような配列を有するペプチドを特異的に認識する抗体に関する。好ましくは、前記抗体は、配列番号２２、２３、２４、３４、又は３５に示されるような配列を有するペプチドの少なくとも５、６、７又は８個の連続するアミノ酸を特異的に認識する。
【０１０２】
本発明のポリペプチドに対する抗体は、抗原として本発明の精製されたポリペプチドの好適なフラグメントから調製され得る。斯かるフラグメントは、タンパク質分解により本発明のポリペプチドから得られてもよく、また合成ペプチドでもよい。好ましくは、本発明の抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、ヒト又はヒト化抗体、又は霊長類化された（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）、キメラ化された抗体、又はそれらのフラグメントである。本発明による抗体はまた、二重特異性抗体、合成抗体、抗体フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆｖ、若しくはｓｃＦｖフラグメント等、又は化学的に修飾されたそれらの任意の誘導体を含む。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドと特異的に結合する（即ち、他のポリペプチド又はペプチドと交差反応しない）べきである。特異的な結合は、様々なよく知られている技術により試験される。
【０１０３】
抗体又はそれらのフラグメントは、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８８に記載される方法を用いることにより得られ得る。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６（１９７５），４９５，ａｎｄ  Ｇａｌｆｒｅ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３（１９８１），３に最初に記載される技術により調製され得、それはマウス骨髄腫細胞と免疫付与された哺乳動物由来の脾臓細胞との融合を含む。
【０１０４】
抗体は、例えば、本発明の様々なポリペプチドの免疫沈降及び免疫学的局在決定のために、並びに前記ポリペプチドの量の存在を観察するために、並びに本発明のタンパク質と相互作用する化合物を同定するために用いられ得る。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステムで用いられるような表面プラズモン共鳴は、本発明のタンパク質のエピトープと結合するファージ抗体の効率を増加させるために用いられ得る（Ｓｃｈｉｅｒ，Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ７（１９９６），９７−１０５；Ｍａｌｍｂｏｒｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８３（１９９５），７−１３）。
【０１０５】
本明細書に引用される全ての参照は、それらの開示内容全体に関して参照により本明細書に援用され、開示内容は本明細書で特に言及される。
【０１０６】
以下の実施例は、本発明を単に説明するものとする。それは、何であれ本発明の範囲を限定するものとして解釈されない。
【実施例】
【０１０７】
実施例１
ＨＲ−ＨＰＶ１８、３３、３５、５２、及び５８におけるＨＰＶ１６アナログＥ１Ｃ転写産物の同定
軽度〜重度の病変又はＣｘＣａに罹患する患者からの子宮頸部の剥離された細胞は、ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（商標）培地（ＴｈｉｎＰｒｅｐサンプリングデバイス）で保存され、先のＨＰＶ１８、３３、３５、５２、及び５８遺伝子型データに基づいてＲＮＡ単離のために選択された。激しいホモジナイゼーションの後、３〜１２ｍｌの細胞懸濁液は１５ｍｌのファルコンチューブに移され、１０℃で１０分間、４０００ｒｐｍ（３００ｘｇ）で遠心分離された。上清は取り除かれ、細胞ペレットは、チューブをフリッキングすることにより、残留量に再懸濁された。無水エタノール（２．５ｍｌ）は添加され、混合物は、ピペッティングによりよくホモジナイズされた。１．５ｍｌの懸濁液は、２ｍｌのエッペンドルフチューブ（ＥＺｌ  ＲＮＡキットで提供されない）に移され、遠心分離され、上清は廃棄され、−８０℃で保存された。ＲＮＡ単離は、ＤＮａｓｅ処理を除いて、製造者の取扱説明書に従って行なわれた。
【０１０８】
Ｑｉａｇｅｎ  ワンステップＲＴ−ＰＣＲキットを用いて、Ｅ７及びＥ２遺伝子中にアリーリングするフォワード及びバックワードプライマーはそれぞれ新しく設計され、重度の病変又はＣｘＣａを有する患者からの全ＲＮＡにおいてのみ検出される切断型ＰＣＲ産物を増幅した。クローニング及び配列決定することにより、それぞれのスプライスジャンクションは、配列決定により同定され得た。
【配列表】
2013534806000001.app