(57)【要約】本発明は、アピコンプレクサＦｅｒｌｉｎ、Ｆｅｒｌｉｎ様タンパク質、及び／又は別のＣ２ドメイン含有タンパク質の少なくとも１つの抗原決定基又はエピトープを含む、マラリアワクチンとしての使用のためのペプチドに関する。それは、さらに、前記ペプチドを含む組成物及びマラリアワクチンとしてのそのような組成物の使用に関する。
2013512866.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
Ｆｅｒｌｉｎ、
Ｆｅｒｌｉｎ様タンパク質ファミリーのメンバー、及び
他のＣ２ドメイン含有タンパク質
より選択されるアピコンプレクサタンパク質の少なくとも１つの抗原決定基又はエピトープを含む、マラリアワクチンとしての使用のためのペプチド。
【請求項２】
アピコンプレクサタンパク質が以下：
プラスモディウム・ベルゲイＦｅｒｌｉｎ（Ｐｂ  ＦＥＲ）、
プラスモディウム・ファルシパラムＦｅｒｌｉｎ（Ｐｆ  ＦＥＲ）、
プラスモディウム・ヨエリＦｅｒｌｉｎ（Ｐｙ  ＦＥＲ）、
トキソプラズマ・ゴンディＦｅｒｌｉｎ（Ｔｇ  ＦＥＲ）、
プラスモディウム・ベルゲイＦｅｒｌｉｎ様タンパク質（Ｐｂ  ＦＬＰ）、
プラスモディウム・ファルシパラムＦｅｒｌｉｎ様タンパク質（Ｐｆ  ＦＬＰ）、
プラスモディウム・ヨエリＦｅｒｌｉｎ様タンパク質（Ｐｙ  ＦＬＰ）、
トキソプラズマ・ゴンディＦｅｒｌｉｎ様タンパク質（Ｔｇ  ＦＬＰ）、
プラスモディウム・ベルゲイＣ２ドメイン含有タンパク質（Ｐｂ  Ｃ２ＣＰ）、及び、
上のタンパク質のいずれかと少なくとも８０%、好ましくは少なくとも８５%、より好ましくは少なくとも９０%、さらにより好ましくは少なくとも９５%同一であるポリペプチド
より選択される、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
抗原決定基又はエピトープが、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ又はＢ細胞エピトープ、好ましくＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープである、請求項１又は２記載のペプチド。
【請求項４】
抗原決定基又はエピトープのアミノ酸配列が、少なくとも８アミノ酸の長さを有する、請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項５】
アピコンプレクサタンパク質がプラスモディウム・ベルゲイＦｅｒｌｉｎ（Ｐｂ  ＦＥＲ）であり、抗原決定基又はエピトープのアミノ酸配列が以下：
【化６】
2013512866.tif 000012
より選択される、請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項６】
アピコンプレクサタンパク質がプラスモディウム・ファルシパラムＦｅｒｌｉｎ（Ｐｆ  ＦＥＲ）であり、抗原決定基又はエピトープのアミノ酸配列が以下：
【化７】
2013512866.tif 000013
より選択される、請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項７】
アピコンプレクサタンパク質がプラスモディウム・ベルゲイＦｅｒｌｉｎ様タンパク質（Ｐｂ  ＦＬＰ）であり、抗原決定基又はエピトープのアミノ酸配列が以下：
【化８】
2013512866.tif 000014
より選択される、請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項８】
アピコンプレクサタンパク質がプラスモディウム・ファルシパラムＦｅｒｌｉｎ様タンパク質（Ｐｆ  ＦＬＰ）であり、抗原決定基又はエピトープのアミノ酸配列が以下：
【化９】
2013512866.tif 000015
より選択される、請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項９】
アピコンプレクサタンパク質がプラスモディウム・ベルゲイＣ２ドメイン含有タンパク質（Ｐｂ  Ｃ２ＣＰ）であり、抗原決定基又はエピトープのアミノ酸配列が以下：
【化１０】
2013512866.tif 000016
より選択される、請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項１０】
以下：
Ｆｅｒｌｉｎ、
Ｆｅｒｌｉｎ様タンパク質ファミリーのメンバー、及び
他のＣ２ドメイン含有タンパク質
より選択されるアピコンプレクサタンパク質の少なくとも２つの抗原決定基又はエピトープを含む、請求項１〜９のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項１１】
以下：
Ｆｅｒｌｉｎ、
Ｆｅｒｌｉｎ様タンパク質ファミリーのメンバー、及び
他のＣ２ドメイン含有タンパク質
とは異なるアピコンプレクサタンパク質の少なくとも１つの抗原決定基又はエピトープをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項１２】
さらなる成分、例えば標識、Ｎ及び／又はＣ末端修飾、さらなる薬物又は薬剤などを含む、請求項１〜１１のいずれか一項記載のペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項記載の少なくとも１つのペプチドをコードする核酸分子又はマラリアワクチンとしての使用のため少なくとも１つのそのような核酸分子を含むプラスミド。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか一項記載のペプチドに対する抗体。
【請求項１５】
以下：
（ｉ）請求項１〜１２のいずれか一項記載の少なくとも１つのペプチド、
（ｉｉ）場合により、キャリア、
（ｉｉｉ）場合により、アジュバント
を含む組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか一項記載の少なくとも２つのペプチドを含む、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
以下：
Ｆｅｒｌｉｎ、
Ｆｅｒｌｉｎ様タンパク質ファミリーのメンバー、及び
他のＣ２ドメイン含有タンパク質
とは異なるアピコンプレクサタンパク質の少なくとも１つの抗原決定基又はエピトープを含む少なくとも１つのペプチドをさらに含む、請求項１５又は１６記載の組成物。
【請求項１８】
キャリア（ｉｉ）が、ウイルス粒子又はその部分、ウイルスベクターの又はウイルス粒子のエンベロープタンパク質、ナノキャリアである、請求項１５〜１７のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１９】
ウイルス粒子がＢ型肝炎ウイルス粒子又はその部分である、請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
ナノキャリアが細胞ターゲティングナノキャリアである、請求項１８記載の組成物。
【請求項２１】
アジュバント（ｉｉｉ）が、一般的にＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘発している、例えばＩＣ３１などである、請求項１５〜２０のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２２】
マラリアワクチンとしての使用のための請求項１５〜２１のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２３】
請求項１〜１２のいずれか一項記載の少なくとも２つのペプチドを混合する工程を含む、請求項１６〜２２のいずれか一項記載の組成物を産生する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アピコンプレクサＦｅｒｌｉｎ、Ｆｅｒｌｉｎ様タンパク質、及び／又は別のＣ２ドメイン含有タンパク質の少なくとも１つの抗原決定基又はエピトープを含む、マラリアワクチンとしての使用のためのペプチドに関する。それは、さらに、前記ペプチドを含む組成物及びマラリアワクチンとしてのそのような組成物の使用に関する。
【０００２】
発明の背景
マラリアは、主にアフリカにおいて、毎年２００万人以上の死亡を起こす。しかし、疾患の持続的な制御のために必要である効果的なワクチンは、見つけにくいままである。マラリアに対するワクチン接種の実施可能性は、放射線弱毒化スポロゾイト（ＲＡＳ）を使用して十分に実証されており、それは、スポロゾイト（刺咬性ハマダラカ蚊により皮膚中に接種される）をターゲティングすること及び寄生虫のその後の肝臓段階により、げっ歯類、非ヒト霊長類、及びヒトを保護する。ＲＡＳの発生は肝臓において中断され、このように、これらの寄生虫は疾患誘発性の血液段階感染に進行しない（図１）。しかし、γ線照射された寄生虫により提供される殺菌免疫にもかかわらず、実際的な問題（大規模産生及び最終産物の均一性を確保することを含む）は、このワクチンがヒト使用のために認可される可能性を低くする。それにもかかわらず、ＲＡＳは、実験室において十分に試験された実験的ワクチン接種モデルである。ＲＡＳモデルにおける最も優性の免疫応答は、スポロゾイト周囲表面タンパク質により活性化される（ＣＳＰ；図２）。これらの知見は、ＣＳタンパク質に基づくＲＴＳ，Ｓワクチンの開発を後押しした。今日まで、ＲＴＳ，Ｓは市販されている最先端のマラリアワクチンであり、それは、現在、臨床第ＩＩＩ相にある。流行区域に生存している健常ボランティア及びアフリカ系小児での試験では、ワクチンの良好な寛容性及び安全性が示された。しかし、異なるアジュバントシステムも伴うＲＴＳ，Ｓの効力は、わずか４０〜６０%である。加えて、ＣＳトランスジェニックマウスにおける観察は、保護が、ＣＳＰに寛容であるマウスにおいても観察できることを示したが、それは、宿主の免疫応答を誘導する他の抗原の存在を示す。ＲＡＳ誘導性免疫応答を試験することは、注射されたスポロゾイトの遺伝的背景が、個々のスポロゾイトの間で、及び、また、スポロゾイトの異なるバッチ間で高度に変動し、異なって発現される抗原ももたらすという事実により常に限定される。遺伝子ターゲティング技術における最近の進歩によって、寄生虫の発生のために不可欠な遺伝子における定められた変異を持つ遺伝的弱毒化寄生虫（ＧＡＰ）の生成が促進されてきた。ＲＡＳのように、ＧＡＰは肝臓において弱毒化され、それにより段階特異的な殺菌免疫を与えるが、しかし、ＧＡＰは、感染の開始に続く特定の時点（〜２４時間）で、及び、分化の非常に特定の段階で停止される（図１）。対照的に、ＲＡＳは複数の異種の変異を持ち、増殖停止が複数の段階で生じる。十分に定義された遺伝的弱毒化寄生虫（ｕｉｓ３（−）及び／又はｕｉｓ４（−））は、従って、肝臓段階の寄生虫に対する防御免疫応答のさらなる特徴付けのための理想的なツールである。ノックアウトマウスにおける試験では、インターフェロンγ産生Ｔリンパ球がＧＡＰ誘導性免疫を媒介すること、及び、Ｂ細胞が重要ではないことが示された。よく見ると、ＣＤ８＋Ｔ細胞が主要なプレーヤーであることがさらに明らかになった。しかし、その免疫に関与する抗原特異性及びエフェクター機構はまだ理解されていない。
【０００３】
効果的なマラリアワクチンのための手段を提供することが本発明の目的であった。より具体的には、免疫のために決定的である新規抗原を同定することが本発明の目的であった。
【０００４】
本発明の好ましい実施態様の説明
本発明を以下でより詳細に記載する前に、本発明が、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコール、及び試薬に限定されないことを理解すべきである。なぜなら、これらは変動しうるからである。本明細書において使用する用語は、特定の実施態様だけを記載する目的のためであり、添付の請求項だけにより限定される本発明の範囲を限定することを意図しないことも理解すべきである。別に定義しない限り、本明細書において使用する全ての技術用語及び科学用語は、当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本発明の目的のために、本明細書において引用する全ての参考文献が、その全体において参照により組み入れられる。
【０００５】
本発明によれば、上の目的は、以下：
Ｆｅｒｌｉｎ、
Ｆｅｒｌｉｎ様タンパク質ファミリーのメンバー、及び
他のＣ２ドメイン含有タンパク質
より選択されるアピコンプレクサタンパク質の少なくとも１つの抗原決定基又はエピトープを含む、マラリアワクチンとしての使用のためのペプチドにより解決される。
【０００６】
用語「ペプチド」は、本明細書において使用する通り、その長さ及びサイズに関して限定されないペプチドを指すことを意味する。故に、一実施態様において、ペプチドは、アピコンプレクサタンパク質自体又はその（より大きな）フラグメントである。別の実施態様において、ペプチドは５〜５０アミノ酸、より好ましくは８〜２５アミノ酸、より好ましく８〜１５アミノ酸の範囲にある。
【０００７】
用語「アピコンプレクサタンパク質」は、本明細書において使用する通り、アピコンプレクサ生物からのタンパク質を指すことを意味する。アピコンプレクサ生物（また、アピコンプレックス門又はアピコンプレクサ亜門として言及される）は原生生物の大きなグループであり、その大半が、アピコプラストと呼ばれるユニークなオルガネラ及び宿主細胞の侵入に関与する尖端の複雑な構造を持つ。それらは、哺乳類の単細胞の芽胞形成寄生虫である。好ましくは、アピコンプレクサ生物は、プラスモディウム・ファルシパラム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、プラスモディウム・ベルゲイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ）、プラスモディウム・ヨエリ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ）、及びトキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）より選択される。好ましくは、アピコンプレクサタンパク質は、マラリアのアピコンプレクサタンパク質であり、即ち、それは、哺乳類においてマラリアを起こすアピコンプレクサ生物、好ましくはプラスモディウム・ファルシパラム及びプラスモディウム・ベルゲイ、最も好ましくはプラスモディウム・ファルシパラムからである。
【０００８】
Ｃ２ドメインは、細胞膜へのタンパク質のターゲティングに関与するタンパク質構造ドメインである。それは、膜結合面上で、ドメインの最初及び最後のループにより形成される空洞において結合する、２つ又は３つのカルシウムイオンを配位させる８つのβ鎖で構成されるベータサンドイッチである。Ｃ２ドメイン含有タンパク質は、それらのアミノ酸配列に基づいて当業者により容易に同定されることができる。
【０００９】
一実施態様において、他のＣ２ドメイン含有タンパク質は、プラスモディウム・ベルゲイＣ２ドメイン含有タンパク質（Ｐｂ  Ｃ２ＣＰ）、プラスモディウム・ファルシパラムにおけるそのオルソログ、及び、これらのタンパク質と少なくとも８０%、好ましくは少なくとも８５%、より好ましくは少なくとも９０%、さらにより好ましくは少なくとも９５%、さらにより好ましくは少なくとも９６%、さらにより好ましくは少なくとも９７%、さらにより好ましくは少なくとも９８%、さらにより好ましくは少なくとも９９%同一であるタンパク質より選択される。
【００１０】
本発明のマラリアワクチンは、好ましくは、サブユニットワクチンである。
【００１１】
一実施態様において、アピコンプレクサタンパク質は以下：
プラスモディウム・ベルゲイＦｅｒｌｉｎ（Ｐｂ  ＦＥＲ）、
プラスモディウム・ファルシパラムＦｅｒｌｉｎ（Ｐｆ  ＦＥＲ）、
プラスモディウム・ヨエリＦｅｒｌｉｎ（Ｐｙ  ＦＥＲ）、
トキソプラズマ・ゴンディＦｅｒｌｉｎ（Ｔｇ  ＦＥＲ）、
プラスモディウム・ベルゲイＦｅｒｌｉｎ様タンパク質（Ｐｂ  ＦＬＰ）、
プラスモディウム・ファルシパラムＦｅｒｌｉｎ様タンパク質（Ｐｆ  ＦＬＰ）、
プラスモディウム・ヨエリＦｅｒｌｉｎ様タンパク質（Ｐｙ  ＦＬＰ）、
トキソプラズマ・ゴンディＦｅｒｌｉｎ様タンパク質（Ｔｇ  ＦＬＰ）、
プラスモディウム・ベルゲイＣ２ドメイン含有タンパク質（Ｐｂ  Ｃ２ＣＰ）、及び、
上のタンパク質のいずれかと少なくとも８０%、好ましくは少なくとも８５%、より好ましくは少なくとも９０%、さらにより好ましくは少なくとも９５%、さらにより好ましくは少なくとも９６%、さらにより好ましくは少なくとも９７%、さらにより好ましくは少なくとも９８%、さらにより好ましくは少なくとも９９%同一であるタンパク質
より選択される。
【００１２】
Ｐｂ  ＦＥＲはＰＢＡＮＫＡ＿１３１９３０（配列番号２６）を指し、
Ｐｆ  ＦＥＲはＰＦ１４＿０５３０（配列番号２７）を指し、
Ｐｙ  ＦＥＲはＰＹ０５７４５（配列番号２８）を指し、
Ｔｇ  ＦＥＲはＴＧＶＥＧ＿０７３９２０（配列番号２９）を指し、
Ｐｂ  ＦＬＰはＰＢＡＮＫＡ＿１２２４４０（配列番号３０）を指し、
Ｐｆ  ＦＬＰはＭＡＬ８Ｐ１．１３４（配列番号３１）を指し、
Ｐｙ  ＦＬＰはＰＹ０４６９５（配列番号３２）を指し、
Ｔｇ  ＦＬＰはＴＧＶＥＧ＿０９３５６０（配列番号３３）を指し、及び
Ｐｂ  Ｃ２ＣＰはＰＢ４０２１０９．００．０（配列番号３４）を指し、
それにおいて、上のアクセッションナンバーはＰｌａｓｍｏＤＢ／ＧｅｎｅＤＢアクセッションナンバーである（www.plasmodb.org, version：７．１、２０１０年１１月２２日；www.genedb.org, version：２０１０年１１月）。
【００１３】
本明細書において使用する通り、用語「パーセント（%）同一である」は、２つのアミノ酸配列の間での配列同一性を指す。同一性は、比較の目的ために整列させられうる、両方の配列中の位置を比較することにより決定することができる。比較される配列中の相当する位置が同じアミノ酸により占められている場合、分子はその位置で同一であると考えられる。
【００１４】
一般的には、当業者は、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列における一部のアミノ酸交換が、タンパク質又はペプチドの（二次又は三次）構造、機能、及び活性に全く影響を有さないという事実を知っている。本明細書において開示するアミノ酸配列と比較した、そのような「ニュートラルな」アミノ酸交換を伴うアミノ酸配列は、本発明の範囲内に該当する。非アピコンプレクサ生物（例えば大腸菌など）において、ペプチド、特にアピコンプレクサタンパク質自体又はそのより大きなフラグメントの産生を許す又は促進する元のアミノ酸配列における変異も含まれる。
【００１５】
好ましい実施態様において、アピコンプレクサタンパク質は、Ｐｆ  ＦＥＲ、Ｐｆ  ＦＬＰ、及び、Ｐｆ  ＦＥＲ又はＰｆ  ＦＬＰと少なくとも８０%、好ましくは少なくとも８５%、より好ましくは少なくとも９０%、さらにより好ましくは少なくとも９５%、さらにより好ましくは少なくとも９６%、さらにより好ましくは少なくとも９７%、さらにより好ましくは少なくとも９８%、さらにより好ましくは少なくとも９９%同一であるタンパク質より選択される。
【００１６】
一実施態様において、抗原決定基又はエピトープは、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ又はＢ細胞エピトープ、好ましくＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープである。好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、Ｐ．ファルシパラム特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ（例えばＨＬＡ−Ａ  ０２０１制限ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープなど）又はＰ．  ベルゲイ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ（例えばＨ２ｂ制限ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープなど）である。当業者は、所与のアミノ酸配列において上のエピトープをどのように同定／予測するかを知っている（例、エピトープ予測プログラム、例えばＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（http://www.syfpeithi.de）などによる）。
【００１７】
一実施態様において、抗原決定基又はエピトープは、Ｆｅｒｌｉｎ、Ｆｅｒｌｉｎ様タンパク質ファミリーのメンバー、及び他のＣ２ドメイン含有タンパク質のドメインに由来し、それにおいてドメインは以下：
Ｃ２ドメイン、
ＡＴＰアーゼドメイン、
エキソドメイン
より選択される。
【００１８】
一実施態様において、抗原決定基又はエピトープのアミノ酸配列は、少なくとも８アミノ酸の長さを有する。好ましくは、抗原決定基又はエピトープのアミノ酸配列は、８、９、又は１０アミノ酸の長さを有する。
【００１９】
一実施態様において、アピコンプレクサタンパク質はプラスモディウム・ベルゲイＦｅｒｌｉｎ（Ｐｂ  ＦＥＲ）であり、抗原決定基又はエピトープのアミノ酸配列は以下：
【化１】
2013512866.tif 000003
より選択される。
【００２０】
一実施態様において、アピコンプレクサタンパク質はプラスモディウム・ファルシパラムＦｅｒｌｉｎ（Ｐｆ  ＦＥＲ）であり、抗原決定基又はエピトープのアミノ酸配列は以下：
【化２】
2013512866.tif 000004
より選択される。
【００２１】
一実施態様において、アピコンプレクサタンパク質はプラスモディウム・ベルゲイＦｅｒｌｉｎ様タンパク質（Ｐｂ  ＦＬＰ）であり、抗原決定基又はエピトープのアミノ酸配列は以下：
【化３】
2013512866.tif 000005
より選択される。
【００２２】
一実施態様において、アピコンプレクサタンパク質はプラスモディウム・ファルシパラムＦｅｒｌｉｎ様タンパク質（Ｐｆ  ＦＬＰ）であり、抗原決定基又はエピトープのアミノ酸配列は以下：
【化４】
2013512866.tif 000006
より選択される。
【００２３】
一実施態様において、アピコンプレクサタンパク質はプラスモディウム・ベルゲイＣ２ドメイン含有タンパク質（Ｐｂ  Ｃ２ＣＰ）であり、抗原決定基又はエピトープのアミノ酸配列は以下：
【化５】
2013512866.tif 000007
より選択される。
【００２４】
一実施態様において、抗原決定基又はエピトープのアミノ酸配列は、配列番号１〜２５より、好ましくは配列番号４〜９及び配列番号１４〜２１より選択される。
【００２５】
一実施態様において、本発明のペプチドは、上に定義するアピコンプレクサタンパク質の少なくとも２つの抗原決定基又はエピトープをさらに含む。
【００２６】
さらなる実施態様において、本発明のペプチドは、３、４、５又はそれ以上のそのような抗原決定基又はエピトープを含む。
【００２７】
一実施態様において、本発明のペプチドは、以下：
Ｆｅｒｌｉｎ、
Ｆｅｒｌｉｎ様タンパク質ファミリーのメンバー、及び
他のＣ２ドメイン含有タンパク質
とは異なるアピコンプレクサタンパク質の少なくとも１つの抗原決定基又はエピトープをさらに含む。
【００２８】
上に列挙するタンパク質とは異なるアピコンプレクサタンパク質は、公知の潜在的なサブユニットワクチン候補、例えば、ＭＳＰ１、ＣＳＰ（リードワクチン候補、ＲＴＳ，Ｓ、ＧＳＫ）、あるいは本発明者らのＳＳＨスクリーンに由来する１つ又は複数の候補ペプチドでありうる。
【００２９】
一実施態様において、ペプチドは、さらなる成分、例えば標識、Ｎ及び／又はＣ末端修飾、さらなる薬物又は薬剤などを含む。当業者は、適したさらなる成分を選択することができる。
【００３０】
本発明の目的は、また、上に定義する少なくとも１つのペプチドをコードする核酸分子により解決される。それは、さらに、少なくとも１つのそのような核酸分子を含むプラスミドにより解決される。
【００３１】
一実施態様において、核酸分子又はプラスミドは、マラリアワクチンとしての使用のために提供される。
【００３２】
本発明の目的は、また、上に定義するペプチドに対する抗体により解決される。
【００３３】
本発明の目的は、以下：
（ｉ）上に定義する少なくとも１つのペプチド、
（ｉｉ）場合により、キャリア、
（ｉｉｉ）場合により、アジュバント
を含む組成物によりさらに解決される。
【００３４】
一実施態様において、組成物は、少なくとも２つのペプチド（ｉ）を含む。さらなる実施態様において、本発明の組成物は、３、４、５又はそれ以上の上に定義するペプチドを含む。
【００３５】
一実施態様において、組成物は、以下：
Ｆｅｒｌｉｎ、
Ｆｅｒｌｉｎ様タンパク質ファミリーのメンバー、及び
他のＣ２ドメイン含有タンパク質
とは異なるアピコンプレクサタンパク質の少なくとも１つの抗原決定基又はエピトープを含む少なくとも１つのペプチドをさらに含む。
【００３６】
したがって、組成物において、本発明のペプチドを、公知の潜在的なサブユニットワクチン候補、例えば、ＭＳＰ１、ＣＳＰ（リードワクチン候補、ＲＴＳ，Ｓ、ＧＳＫ）からの他のペプチド（フラグメント）と、最終的には、本発明者らのＳＳＨスクリーンに由来する１つ又は複数の候補ペプチドと組み合わせることができる。
【００３７】
一実施態様において、キャリア（ｉｉ）をペプチドに融合する。
【００３８】
一実施態様において、キャリア（ｉｉ）は、ウイルス粒子又はその部分、ウイルスベクターの又はウイルス粒子のエンベロープタンパク質、ナノキャリアである。
【００３９】
一実施態様において、ウイルス粒子はＢ型肝炎ウイルス粒子又はその部分である。
【００４０】
そのような実施態様において、キャリア（ｉｉ）（例、Ｂ型肝炎ウイルス粒子又はその部分）は、本発明のペプチドの肝臓ターゲティングのために適する。
【００４１】
一実施態様において、ナノキャリアは、細胞ターゲティングナノキャリア、例えばRodos BioTarget GmbH（ハノーバー）（www.biotargeting.org）から入手可能な細胞ターゲティングナノキャリアなど（例、TargoSphere（登録商標）デリバリーシステム）である。これらのナノキャリアは、所望のペプチドと組み合わせて、抗原提示免疫細胞（ＡＰＣ、ＤＣ、マクロファージなど）に特異的に向けることができる。
【００４２】
一実施態様において、アジュバント（ｉｉｉ）は、一般的にＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘発している。好ましくは、アジュバントは、商業的に入手可能なアジュバントシステム、例、ＩＣ３１（Intercell社、ウィーン）である。なぜなら、そのアジュバントシステムは、抗体媒介性免疫よりもむしろＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘発しているからである。
【００４３】
一実施態様において、上に定義する組成物は、マラリアワクチンとしての使用のために提供される。
【００４４】
本発明の目的は、また、上に定義する少なくとも２つのペプチドを混合する工程を含む、上に定義する組成物を産生する方法により解決される。
【００４５】
本発明の目的は、また、上に定義するペプチド、又は上に定義する核酸分子もしくはプラスミド、又は上に定義する組成物を、それを必要とする人に投与する工程を含む、マラリアの予防の方法により解決される。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、放射線弱毒化スポロゾイト（ＲＡＳ）又は遺伝的弱毒化寄生虫（ＧＡＰ）を使用したマラリアに対する２つのワクチン接種戦略を示し、それらは両方が弱毒化肝臓段階（ＬＳ）の発生に基づく。ＲＡＳの投与は、依然としてワクチン接種のための「ゴールドスタンダード」である。
【図２】図２は、スポロゾイト周囲の表面タンパク質（ＣＳＰ）の一次構造及びその細胞局在化（プラスモディウムスポロゾイトの表面染色）（免疫蛍光染色により明らかにする通り）を示す。また、その単一の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ（Ｈ２Ｋｄ）制限ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ（Ｐ．ベルゲイについてのＳＹＶＰＳＡＥＱＩ及びＰ．ヨエリについてのＳＹＩＰＳＡＥＫＩ）のおよその位置を示す。
【図３】図３は、２０時間の肝臓段階の発生後にマラリアＷＴ、ＧＡＰ、及びＲＡＳ寄生虫の転写物を比較するための改変されたサプレッションサブトラクティブハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）アッセイの実験セットアップを示す。
【図４】図４は、サプレッションサブトラクティブハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）によりＷＴ配列と比較した遺伝的弱毒化（ＧＡＰ特異的）又は放射線弱毒化（ＲＡＳ特異的）寄生虫の２００の分析配列において同定された、特定の肝臓段階での転写物のパーセンテージを示す。配列分析を、ＰｌａｓｍｏＤＢ（http://plasmodb.org）及びＧｅｎｅＤＢ（www.genedb.org）ホームページ上でＢＬＡＳＴ検索を使用して実施した。
【図５Ａ】図５Ａは、注釈付きのアピコンプレクサＦｅｒｌｉｎ及びＦｅｒｌｉｎ様タンパク質（ＦＬＰ）及びＰ．ベルゲイのＣ２ドメイン含有タンパク質（Ｐｂ  Ｃ２ＣＰ）の一次構造を示す。Ｐ．ファルシパラムＦｅｒｌｉｎ及びＰ．ベルゲイＦｅｒｌｉｎ及びＦＬＰパラログ、ならびにトキソプラズマ・ゴンディオルソログ（Ｂ）を示す。Ｐ．ベルゲイ及びＰ．ファルシパラムのＦｅｒｌｉｎオルソログは、約２０%アミノ酸（ＡＡ）同一性を共有する。特徴的なＣ２ドメインは、他に記載されるＦｅｒｌｉｎタンパク質におけるＣａ２＋センシング及びシグナル伝達に関与する。これらのドメインの他、ＳＭＡＲＴ分析（http://smart.embl-heidelberg.de/）によって、Ｐｂ  Ｃ２ＣＰにおける予測されるエキソヌクレアーゼ（ｅｘｏ）及びＡＴＰアーゼ活性を伴うドメインが明らかになった。また、Ｎ末端の予測されるシグナルペプチドならびにＣ末端の注釈付き膜貫通ドメイン（ａｔｄ）及び予測される膜貫通スパン（ｐｔｓ）を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、注釈付きのアピコンプレクサＦｅｒｌｉｎ及びＦｅｒｌｉｎ様タンパク質（ＦＬＰ）及びＰ．ベルゲイのＣ２ドメイン含有タンパク質（Ｐｂ  Ｃ２ＣＰ）の一次構造を示す。Ｐ．ファルシパラムＦｅｒｌｉｎ及びＰ．ベルゲイＦｅｒｌｉｎ及びＦＬＰパラログ、ならびにトキソプラズマ・ゴンディオルソログ（Ｂ）を示す。Ｐ．ベルゲイ及びＰ．ファルシパラムのＦｅｒｌｉｎオルソログは、約２０%アミノ酸（ＡＡ）同一性を共有する。特徴的なＣ２ドメインは、他に記載されるＦｅｒｌｉｎタンパク質におけるＣａ２＋センシング及びシグナル伝達に関与する。これらのドメインの他、ＳＭＡＲＴ分析（http://smart.embl-heidelberg.de/）によって、Ｐｂ  Ｃ２ＣＰにおける予測されるエキソヌクレアーゼ（ｅｘｏ）及びＡＴＰアーゼ活性を伴うドメインが明らかになった。また、Ｎ末端の予測されるシグナルペプチドならびにＣ末端の注釈付き膜貫通ドメイン（ａｔｄ）及び予測される膜貫通スパン（ｐｔｓ）を示す。
【図６】図６は、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマー対を使用し、テンプレートとして野生型（ＷＴ）、放射線弱毒化（ＲＡＳ）、又は遺伝的弱毒化（ＧＡＰ）寄生虫のいずれかからの２０時間のＰ．ベルゲイ肝臓段階から単離した全ＲＮＡを用いた定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを示す。Ｐ．ベルゲイ  Ｃ２ＣＰの転写物レベルを示す。転写物の量を、遺伝子特異的プラスミドを用いて産生される外部標準曲線と比較したコピー数（＋／−  ＳＤ）として表す。
【図７】図７Ａは、いくつかのプログラム（エピトープ予測プログラムＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（http://www.syfpeithi.de）を含む）により予測される、Ｐｂ  Ｃ２ＣＰのＨ−２Ｂ制限ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを示す。一次構造上に示すバーは、予測されるＴ細胞エピトープのおよその局在化を示す。図７Ｂは、プライム−ツー−ブースト免疫化プロトコールの概略図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、Ｐ．ベルゲイのＲＡＳ又はＧＡＰを用いて０日目に静脈内注射した。第１のブーストを典型的には１４日後に、第２のブーストをそれから１４日後に投与した。ブースター用量は、典型的には、プライミング用量よりも低かった。最後のブーストから７日後、動物を、ＷＴスポロゾイト（ｓｐｚ）を用いて攻撃した、又は、臓器を免疫学的試験のために解剖した（攻撃前に収集）。攻撃したマウスをＷＴ攻撃から７日後に屠殺した（攻撃後に収集）。
【図８】図８は、免疫化動物におけるＰｂ  Ｃ２ＣＰパルス標的細胞の溶解に基づくインビボ細胞毒性アッセイを示す。未感作脾細胞を、Ｐｂ  Ｃ２ＣＰ由来エピトーププールを用いて負荷し、２μMのＣＦＳＥ（ＣＦＳＥｈｉｇｈ）（５−（及び６）−カルボキシフルオレセインジアセテート、スクシンイミジルエステル、Invitrogen）を用いて標識した。コントロール細胞集団を、０．２μMのＣＦＳＥ（ＣＦＳＥｌｏｗ）を用いて標識した。細胞集団を等しい数（１：１）で混合し、それぞれ１μM又は０．１μMの最終ＣＦＳＥ濃度をもたらした。この混合集団の１×１０７個細胞を、細胞単離の１８時間前に免疫化動物又は未感作コントロール動物の尾静脈中に静脈内注射した。ＣＦＳＥ標識細胞を、脾臓及び肝臓におけるフローサイトメトリーにより検出した。特異的溶解をＣＦＳＥｈｉｇｈ細胞及びＣＦＳＥｌｏｗ細胞の比率として算出し、未感作動物において検出された比率と比較した。３つの独立した実験（各々３〜５匹マウス／群を用いる）における溶解細胞の平均パーセンテージを示す。
【図９】図９は、マウス（ｎ＝５）のＧＡＰ及びＲＡＳ免疫化後の肝臓におけるＣＤ８＋ＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞の平均パーセンテージを示し、肝臓中のエフェクターメモリーＴ細胞集団（ＣＤ８＋ＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ６２Ｌｌｏｗ）がＧＡＰ及びＲＡＳ免疫化後に増加することを示す。肝臓リンパ球を、ＢＭＤＣ及びＰｂ  Ｃ２ＣＰ由来ペプチドＴ９Ｌを用いて一晩インキュベートした。表面染色を、抗ＣＤ８ａ−ＰａｃＢｌｕｅ結合抗体（１：１００、BD biosciences）、抗ＣＤ４４−ＦＩＴＣ（１：１００、BD biosciences）、抗ＣＤ６２Ｌ−ＰＥ（１：２００、BD biosciences）、及び抗ＣＤ２５−Ａｌｅｘａ６４７（１：５０、BD biosciences）を用いて実施した。染色細胞の分析を、ＦＡＣＳＣａｎｔｏシステム（BD biosciences）を使用したフローサイトメトリーにより実施した。結果として生じるデータを、flowjo分析ソフトウェア（http://www.flowjo.com）を使用してさらに分析した。
【図１０】図１０は、ＲＡＳ及びＧＡＰ免疫化マウスからのエフェクターＴ細胞のインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）応答を測定するサイトカインベースＥＬＩＳｐｏｔアッセイを示す。免疫化動物からの培養リンパ球を、１μMのＰｂ  Ｃ２ＣＰ由来ペプチドＴ９Ｌを用いて一晩再刺激した、又は、刺激なしにインキュベートした。細胞を、その後、５μg/mlのＩＦＮ−γ抗体を用いてコーティングされたMultiScreenフィルタープレートにトランスファーした。検出されたＩＦＮ−γ応答を、カウントされたスポット／１００万個の培養細胞として示す。未感作コントロール動物のカウントを引いた。カウントした５匹の動物の３通りの群での平均を示す。
【図１１】図１１Ａは、エピトープ予測プログラムＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（http://www.syfpeithi.de）により予測される、Ｐｆ  ＦＥＲのＨＬＡ−Ａ  ０２０１制限ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを示す。一次構造上に示すバーは、予測されるＴ細胞エピトープのおよその局在化を示す。図１１Ｂは、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマー対を使用し、テンプレートとして野生型（ＷＴ）又は放射線弱毒化（ＲＡＳ）寄生虫のいずれかからのＰ．ファルシパラム肝臓段階から単離した全ＲＮＡを用いた定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを示す。Ｐ．ファルシパラムＦｅｒｌｉｎ（Ｐｆ  ＦＥＲ）の相対的な転写物レベルを示す。
【図１２】図１２Ａは、Ｐｆ  Ｆｅｒｌｉｎ特異的エピトープを用いた再刺激後のＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を決定するための１０日間にわたる培養ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを示す。各々のエピトープを個々に及びエピトープのプールにおいてテストしたが、それはこの図に要約されている。マラリア曝露及び非曝露（未感作）個人の血液からの新たに単離したＰＢＭＣを、Ｐｆ  Ｆｅｒｌｉｎエピトープを用いて刺激した。ＩＦＮγの分泌をＥＬＩＳｐｏｔにより分析した。Ｐｆ  ＡＭＡ１（公知のマラリア血液段階抗原）を陽性コントロールとして使用した（図１２Ｂ）。
【図１３】図１３は、Ｐ．ベルゲイＦｅｒｌｉｎ（ＦＥＲ）及びＦｅｒｌｉｎ様タンパク質（ＦＬＰ）のノックアウト（Ａ）及び相補性（Ｂ）戦略を示す。置換コンストラクト（Ａ）は、ＴｇＤＨＦＲ／ＴＳ選択マーカーに隣接するＰ．ベルゲイのＦＥＲ又はＦＬＰオープンリーディングフレームの５’及び３’非翻訳領域を含む。野生型（ＷＴ）ゲノム遺伝子座を、直線化ＫｐｎＩ／ＸｂａＩターゲティングベクターを用いてターゲティングする。ダブルクロスオーバー事象によって、選択マーカーにより、それぞれ内因性ＦＥＲ又はＦＬＰ  ＯＲＦが置換される。相補性コントロールコンストラクト（ｐＣＯＮＴ）（Ｂ）は、Ｐ．ベルゲイのＦＥＲ又はＦＬＰ  ＯＲＦ（ｆｅｒ／ｆｌｐ）の５’切断バージョン及びＴｇＤＨＦＲ／Ｔｓ選択マーカーを含む。ＸｂａＩ直線化プラスミドは、ＦＥＲ又はＦＬＰ  ＷＴゲノム遺伝子座をそれぞれターゲティングし、選択マーカー及び追加の切断ｆｅｒ又はｆｌｐコピーを挿入する。Ｐ．ベルゲイＦｅｒｌｉｎ（ＦＥＲ）及びＦｅｒｌｉｎ様タンパク質（ＦＬＰ）ノックアウト又は相補性トランスフェクタントのジェノタイピングＰＣＲを、それぞれＣ及びＤに示す。標準的ＰＣＲを、ＯＲＦ、テスト、及びエピソーム（ｅｐｉ）特異的オリゴヌクレオチド対を用いて実行した。テンプレートとして、異なるトランスファートランスフェクタント（Δｆｌｐ／Δｆｅｒ／ｆｌｐＣＯＮＴ／ｆｅｒＣＯＮＴ）のｇＤＮＡ及びＰ．ベルゲイ野生型ｇＤＮＡ（ＷＴ）又はそれぞれのターゲティングコンストラクト（ｖ）（ＰＣＲコントロールとして）が役割を果たした。特定のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離した。
【図１４】図１４は、マラリアのライフサイクルを通じた、Ｐ．ベルゲイＦｅｒｌｉｎ（Ａ）及びコントロール酵素アルドラーゼ（Ｂ）の転写プロファイルのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す（ＢＳ＝血液段階；ＧＡ＝生殖母体；Ｓｇ  Ｓｐｚ＝唾液腺スポロゾイト；ＬＳ＝肝臓段階）。
【００４７】
本発明を、本明細書において、以下の実施例の参照によりさらに記載し、それらは、例証することを意味するが、しかし、本発明を限定しない。
【００４８】
初期プラスモジウム肝臓段階の比較分析によって、防御免疫の潜在的な標的が同定される。
【００４９】
遺伝的弱毒化寄生虫（ＧＡＰ）は肝臓段階（ＬＳ）発生の間に停止し、従って、通常はＬＳ発生の間に発現される遺伝子の全てが発現されるわけではない。野生型（ＷＴ）スポロゾイトのＬＳ（しかし、ＧＡＰではない）により発現される任意の遺伝子が、防御免疫応答の開始のために非必須であると仮定することができる。このように、ｕｉｓ３（−）  ＬＳにより発現される遺伝子のレパートリーを分析することによって、前赤血球免疫の決定的な標的である抗原を絞り込むことが許される。
【００５０】
サプレッションサブトラクティブハイブリダイゼーションによって、弱毒化寄生虫において特異的に上方調節された転写物のセットがもたらされる。
【００５１】
本発明者らはサプレッションサブトラクティブハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）を利用し、２０時間のＬＳ発生後でのＷＴ、ＧＡＰ、及びＲＡＳ寄生虫の転写物を比較した（図３）。この高度に効果的な方法によって、２つの異なるｃＤＮＡ集団において異なって発現される転写物を同定することが許される（Diatchenko, 1996）。プラスモジウム寄生虫のＬＳ発生が培養肝細胞において達成された。Ｐ．ベルゲイのスポロゾイトがヒト肝癌細胞に入り、形質転換することが記載されている（Hollingdale, 1983）。従って、ヒト肝癌細胞株Ｈｕｈ７細胞を、ＬＳ発生のための適切な宿主として使用した。このインビトロ培養は、寄生虫と宿主細胞の比率を高め、従って、その後のサブトラクションのための十分なＲＮＡ材料を得ることを許した。ＧＡＰ、ＲＡＳ、又はＷＴ  ＬＳのいずれか１つのｃＤＮＡ集団について、２５，０００個のＨｕｈ７細胞及び２５，０００〜３５，０００個のスポロゾイト／ウェルを伴う２〜３つの８ウェルチャンバースライドを接種し、ＬＳ発生を２０時間後に停止させた。この時間点を選んだ。なぜなら、ｕｉｓ３（−）寄生虫が２４時間後に肝臓において発生停止を受けるためである。従って、既に、この期間の間に発現されるこれらの初期遺伝子は前赤血球免疫のために重要でなければならない。回収した細胞を、０．０５%ジギトニンを用いて処理し、それは、細胞内寄生虫に影響を与えることなく、宿主細胞の原形質膜を選択的に透過処理し、このように、宿主細胞ＲＮＡを伴う混入を低下させた。寄生虫特異的ＲＮＡを、その後、RNeasy Mini Kit（Qiagen）を使用して単離した。得られたＲＮＡ濃度は、容積４０μl中で約１５０〜２５０μg/mlに達し、最終量６〜１０μgの全ＲＮＡを意味した。適用したＳＭＡＲＴ方法（Clontech；SMART（商標）PCR cDNA Synthesis Kit, Protocol No. PT3041-1）を用いたｃＤＮＡ合成は０．０５〜１μgの全ＲＮＡを要求する。従って、この技術は、出発材料が限られていたため、このアプローチのために特に有用であった。約０．５μgの全ＲＮＡを、ＳＭＡＲＴ技術を用いたｃＤＮＡ合成のために使用した。このｃＤＮＡを、その後、サブトラクションのために使用した。サブトラクション手順を、製造者のマニュアルに従って実施した（Clontech；PCR-Select（商標）cDNA Subtraction Kit, Protocol No. PT1117-1）。結果として得られたｃＤＮＡ断片を、pGEMT-easy T/Aクローニングベクター（Promega）中に直接的にクローン化し、従来の方法を用いて配列決定した。
【００５２】
ＳＳＨスクリーンに起因する配列を、ＰｌａｓｍｏＤＢデータベース（http://plasmodb.org）を使用して、ＢＬＡＳＴにより検索した。顕著な上方調節遺伝子の大部分が、両方の弱毒化寄生虫株の間で共有された（図４）。最も顕著な遺伝子の間には、Ｆｅｒｌｉｎ、Ｆｅｒｌｉｎ様タンパク質、及びＳＭＡＲＴデータベース（http://smart.embl-heidelberg.de/）により同定されたＣ２ドメイン含有タンパク質があった。
【００５３】
アピコンプレクサＦｅｒｌｉｎ、Ｆｅｒｌｉｎ様タンパク質、及びＰｂ  Ｃ２ＣＰ（ＰＢ４０２１０９．００．０）の一次構造を図５Ａ及びＢに示す。Ｐ．ベルゲイのＦｅｒｌｉｎ様タンパク質（ＰｂＡＮＫＡ＿１２２４４０）及びＰｂ  Ｆｅｒｌｉｎパラログ（ＰＢＡＮＫＡ＿１３１９３０）がある。Ｐ．ファルシパラムゲノムにおいて、１つのＦｅｒｌｉｎ（ＰＦ１４＿０５３０）及び１つのＦｅｒｌｉｎ様タンパク質（ＭＡＬ８Ｐ１．１３４）（注釈付き）がある。いくつかのＦｅｒｌｉｎが、Ｐ．ヨエリゲノムにおいて注釈が付けられている（示さず）。Ｆｅｒｌｉｎ及びＦＬＰオルソログは、また、アピコンプレクサ寄生虫トキソプラズマ・ゴンディにおいて見出される（図５Ｂ）。
【００５４】
Ｆｅｒｌｉｎ及びＦｅｒｌｉｎ様タンパク質は、可変数の特徴的なＣ２ドメインを伴う膜タンパク質である。これらのドメインは、一般的に、Ｃａ２＋依存的な脂質プロセシング事象に関与する。Ｆｅｒｌｉｎファミリーのメンバーは、細胞型特異的な膜融合事象を調節するための保存された機構を共有する（Mc Neil et al., 2005に概説されている）。プラスモディウムにおいて、このタンパク質ファミリーの機能はまだ特徴付けられていない。Ｐ．ベルゲイ  Ｃ２ドメイン含有タンパク質（Ｃ２ＣＰ）は、１つの特徴的なＣ２ドメインの他、予測エキソヌクレアーゼ活性を伴う１つのドメイン及び１つの予測ＡＴＰアーゼドメインを含む。さらに、全てのＦｅｒｌｉｎ及びＦｅｒｌｉｎ様タンパク質が膜貫通ドメインを含み、Ｎ末端シグナルペプチドがＰｆ  Ｆｅｒｌｉｎ及びＰｂ  Ｃ２ＣＰにおいて見出される。
【００５５】
Ｐ．ベルゲイ  Ｃ２ＣＰ（実施例１）
ＧＡＰ及びＲＡＳ肝臓段階におけるＰ．ベルゲイのＣ２ドメイン含有タンパク質（Ｃ２ＣＰ）の上方調節を検証し、遺伝子特異的プライマーを使用した定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により定量した。テンプレートとして、２０時間のＬＳ発生後に肝臓段階から単離されたＰ．ベルゲイのＧＡＰ、ＲＡＳ、及びＷＴ  ＲＮＡが役割を果たし、ｃＤＮＡに転写された。図６は、ＧＡＰ、ＲＡＳ、及びＷＴ  ＬＳにおけるＰｂ  Ｃ２ＣＰのｍＲＮＡのコピー数を示す。
【００５６】
抗原候補としてのＰｂ  Ｃ２ＣＰの潜在力が、４つの予測Ｈ−２Ｂ制限ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを、いくつかの予測プログラム（エピトープ予測プログラムＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（http://www.syfpeithi.de）を含む）の助けを用いて検出した場合に明らかになった（図７Ａ）。予測Ｐｂ  Ｃ２ＣＰ  ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープＡ９Ｉ、Ｔ９Ｌ、Ｓ８Ｖ、及びＡ８Ｉのアミノ酸配列を表１に示す。
【００５７】
【表１】
2013512866.tif 000008
【００５８】
免疫学的試験のために、ＧＡＰ（ｕｉｓ３（−））及びＲＡＳを用いたマウスの免疫化を、プライム−ツー−ブーストプロトコールに従って実施した（図７Ｂ）。
【００５９】
インビボ細胞毒性アッセイを、その表面にＰｂ  Ｃ２ＣＰ由来エピトープを運ぶ細胞を認識し、殺すＧＡＰ及びＲＡＳ免疫化動物の能力を解明するために実施した。４つの予測ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープＡ９Ｉ、Ｔ９Ｌ、Ｓ８Ｖ、及びＡ８Ｉのプールを、ＣＦＳＥ標識脾細胞上に負荷し、エピトープを運ばず、より低濃度のＣＦＳＥを用いて標識したコントロール細胞集団と一緒に免疫化マウスに注射した。マウスを１８時間後に屠殺し、肝臓のリンパ球及び脾細胞を単離した。これらの細胞の一部をフローサイトメトリーにより直接測定し、そこではＣＦＳＥ標識細胞を、BD FACSCalibur（励起４８８nm、発光５１７nm）のＦＬ１チャンネルで見ることができる。特異的に溶解された細胞のパーセンテージを、以下：
【数１】
2013512866.tif 000009
の数学関数を用いて算出した。
【００６０】
その後のＷＴ攻撃から７日後のＲＡＳ及びＧＡＰ免疫化マウスの脾臓及び肝臓における特異的に溶解された細胞のパーセンテージを図８に示す。免疫化動物の脾臓において検出される特異的な細胞毒性溶解はなかった。ＲＡＳ及びＧＡＰ免疫化マウスの肝臓においては、しかし、１１．８%及び１９．６%のＰｂ  Ｃ２ＣＰ特異的細胞がそれぞれ溶解する。これは、未感作コントロール動物（蛍光標識Ｐｂ  Ｃ２ＣＰ特異的細胞の平均０．００１%未満が溶解した）におけるよりも有意に多い。ＷＴ攻撃マウスにおいて、また、Ｐｂ  Ｃ２ＣＰ特異的の１０．５%が殺された。これらのマウスは、以前にＰ．ベルゲイのＷＴ肝臓段階を見ていたが、しかし、免疫化マウスとは対照的に、それらは血液段階感染を発生していた。これらの結果は、Ｐｂ  Ｃ２ＣＰ特異的細胞が、実際に、免疫化又は曝露動物を認識し、殺したことを実証する。Ｐｂ  Ｃ２ＣＰ由来エピトープに対して向けられる免疫機構を検出することができた。
【００６１】
ＲＡＳ及びＧＡＰ免疫化動物においてＰｂ  Ｃ２ＣＰ特異的な免疫応答をより詳細に解読するために、単一ペプチドＴ９Ｌを、以下の実験における再刺激のために使用した。エピトープＴ９Ｌを選んだ。なぜなら、それはＨ２Ｂに対して最も高い予測される結合親和性を有したからである。ＧＡＰ及びＲＡＳ免疫化マウスからの再刺激リンパ球の表面活性化マーカーについての染色は、未感作マウスと比較して、明らかに増強されたエフェクターメモリーＴ細胞集団（ＴＥＭ；ＣＤ８＋ＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ６２Ｌｌｏｗ）を示した（図９）。未感作マウスの肝臓における４２．４%のＴＥＭ細胞の平均パーセンテージは、ＲＡＳ免疫化動物において７１．５%に及びＧＡＰ免疫化動物において６５．１%に有意に増加した（ｐ＜０．０００１及びｐ＝０．０５８；対応のないｔ検定）。ＴＥＭ細胞集団は、加えて、表面マーカーＣＤ２５を発現した（示さず）。これは、さらに、特定のエフェクター機構がＲＡＳ及びＧＡＰ免疫化動物においてＰｂ  Ｃ２ＣＰに対して存在していることを示す。
【００６２】
ＥＬＩＳｐｏｔ（酵素結合免疫吸着スポット）は、単一細胞レベルでのサイトカインの検出を許す極めて高感度なアッセイであり、ＲＡＳ及びＧＡＰ免疫化マウスの肝臓及び脾臓における低ＩＦＮ−γ応答を測定するために適用した。免疫化マウスからの精製した肝臓リンパ球又は全脾細胞を、Ｐｂ  Ｃ２ＣＰ由来ペプチドＴ９Ｌを用いて一晩再刺激した。ＩＦＮ−γコーティングMultiScreenフィルタープレートに再刺激した細胞をトランスファーする前に、培養培地を、新鮮培地を用いて交換し、培養上清中の分泌ＩＦＮ−γを希釈し、バックグラウンドを低下させた。フィルタープレート上での刺激細胞の２４時間インキュベーション後、スポットを、二次ビオチン化抗ＩＦＮ−γ抗体により検出した。膜上に発生したすべてのスポットが、単一の反応細胞を示した。スポットを解剖顕微鏡下でカウントした。免疫化動物からの刺激細胞についてのコントロールは、刺激なしでインキュベートした細胞及び未感作動物から単離した細胞であった。陽性コントロール（抗ＣＤ３抗体を用いて活性化された未感作リンパ球）を一緒に実行し、アッセイが機能していることを証明した。
【００６３】
ＧＡＰ及びＲＡＳ免疫化後の再刺激された脾細胞でのＩＦＮ−γ応答は非常に低かった（図１０）。残念なことに、抗ＣＤ３陽性コントロールも予想外に低く、１００万個の全脾細胞当たりわずか平均１６８スポットであった。しかし、ＩＦＮ−γ応答は、Ｐｂ  Ｃ２ＣＰ由来ペプチドＴ９Ｌを用いて再刺激した場合、ＧＡＰ免疫化Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの脾臓において有意に増加した（ｐ＝０．０３４６；対応のないｔ検定）。精製した肝臓リンパ球のＩＦＮ−γ応答は、全体で、脾細胞のものよりも高く、寄生虫感染が生じた肝臓におけるより活性化したＴ細胞を示唆する。ＧＡＰ免疫化動物からの肝臓リンパ球を、Ｐｂ  Ｃ２ＣＰ由来ペプチドＴ９Ｌを用いて特異的に再刺激した場合は６２２個の細胞の反応を、ＲＡＳ免疫化動物からの場合には８２５個もの応答リンパ球／１００万個細胞の応答を検出した。コントロールとして、抗ＣＤ３抗体を用いた未感作細胞の非特異的刺激は、平均して、６８１個の反応細胞／１００万個の肝臓リンパ球をもたらした。残念なことに、また、無刺激のバックグラウンドがかなり高かったため、再刺激後の有意な増加は、ＲＡＳ免疫化マウスからの肝臓においてだけ検出可能であった（ｐ＝０．０４４６；対応のないｔ検定）。これらの結果は、ＧＡＰ及びＲＡＳ免疫化Ｃ５７Ｂｌ／６マウスからのＴ細胞を、実際に、少なくとも１つのＰｂ  Ｃ２ＣＰ由来エピトープを用いて特異的に再刺激することができることを示した。
【００６４】
Ｐ．ファルシパラムＦｅｒｌｉｎ（実施例２）
ＲＡＳ肝臓段階におけるＰ．ファルシパラムＦｅｒｌｉｎ（Ｐｆ  ＦＥＲ）の上方調節を検証し、遺伝子特異的プライマーを使用した定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により定量した。図１１Ｂは、Ｐ．ファルシパラムＦｅｒｌｉｎ（Ｐｆ  ＦＥＲ）の相対的な転写物レベルを示す。
【００６５】
６つの予測ＨＬＡ−Ａ  ０２０１制限ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを、いくつかの予測プログラム（エピトープ予測プログラムＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（http://www.syfpeithi.de）を含む）の助けを用いて検出した（図１１Ａ）。
【００６６】
マラリアに曝露された個人におけるＰｆ  Ｆｅｒｌｉｎ特異的Ｔ細胞の存在を研究するために、Ｐｆ  Ｆｅｒｌｉｎペプチド（ＮＬＬＤＰＬＶＶＶ、ＹＬＹＶＮＩＨＫＩ、ＬＬＬＥＧＮＦＹＬ、ＫＬＩＰＶＮＹＥＬ、ＹＬＹＥＫＱＱＥＬ、ＩＬＩＰＳＬＰＬＩ）に対するＴ細胞応答を、Kenyan Medical Research Institute-Wellcome Trust Research Programme（KEMRI）のBritta Urban博士との共同研究において半免疫ケニア成人においてテストした。全ての成人がJunju地区（ケニア海岸のモンバサの約６０km北）に居住している。この区域は２つの高伝染季節を有し、しかし、低レベル伝染が一年中生じる（感染性咬傷／年：２３〜５３）（Mwangi et al., 2005）。
【００６７】
活性化した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）による抗原特異的ＩＦＮ−γの産生を決定するために、培養ＥＬＩＳｐｏｔ分析を、マラリアに曝露された成人及びマラリア未感作個人において１０日の期間にわたり行った。興味深いことに、活性化したＦｅｒｌｉｎ特異的Ｔ細胞を検出することができた（図１２）。さらに、１２人のマラリアに曝露された成人及び５人のマラリア未感作個人において活性化した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）による抗原特異的ＩＦＮ−γの産生を試験する際、Ｐｆ  Ｆｅｒｌｉｎ特異的Ｔ細胞が、１２人中４人において少なくとも１つのペプチドに対して、及び、１２人のマラリアに曝露された成人中３人において１を上回るペプチドに対して検出された（表２）。
【００６８】
【表２】
2013512866.tif 000010
【００６９】
Ｆｅｒｌｉｎ及びＦｅｒｌｉｎ様タンパク質の機能的特徴付け
Ｐ．ベルゲイＦｅｒｌｉｎ（ＦＥＲ）及びＦｅｒｌｉｎ様タンパク質（ＦＬＰ）を機能的に特徴付けるために、ターゲティング遺伝子枯渇を実施した。なぜなら、結果として得られた枯渇の表現型は、タンパク質の潜在的な機能を示唆しうるからである。プラスモジウムにおけるターゲティング遺伝子枯渇は、血液段階の寄生虫において行われる。従って、血液段階の発生の間に必須の遺伝子をターゲティングすることはできない。ターゲティングコンストラクトの組み込みでの失敗は、しかし、相同組換えのためのゲノム遺伝子座の不良な接近可能性にも起因しうる。従って、Ｐｂ  ＦＥＲ及びＰｂ  ＦＬＰについてのノックアウトコンストラクト及び相補性コンストラクトを生成し、それらを同じ実験の間に別々にトランスフェクトした。
【００７０】
異なる遺伝的戦略を図１３Ａ及びＢに示す。ノックアウトターゲティングコンストラクトのために、それぞれの遺伝子の５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）からの２つの断片を特定のオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。予想される断片サイズを、アガロースゲル電気泳動により確認した。Ｐｂ  ＦＥＲ断片は５’及び３’ＵＴＲ断片についてそれぞれ６７６bp及び７７３bpであり、Ｐｂ  ＦＬＰ断片はそれぞれ６７８bp及び６１２bpの長さを有した（示さず）。２つの対応する断片を、記載する通りにターゲティングベクターｂ３Ｄ中にクローン化し、ＴｇＤＨＦＲ／ＴＳ選択マーカーに隣接させ、コンストラクトｐΔｆｅｒ及びｐΔｆｌｐをもたらした。コントロール相補性コンストラクトについては、終止コドンを含むＣ末端断片を２つの部分において増幅し、トランスフェクションの前での線形化のために必要な固有の制限部位を挿入した。Ｐｂ  ＦＥＲ相補性については９５２bp及び７４４bpならびにＰｂ  ＦＬＰ相補性については４９７bp及び４８１bpのサイズを、それぞれ、アガロースゲル電気泳動により再び確認した（示さず）。２つの対応する断片をクローニングベクターｂ３Ｄ＋中に次々にクローン化することで、相補性コンストラクトｐｆｅｒＣＯＮＴ及びｐｆｌｐＣＯＮＴをもたらした。
【００７１】
Ｐ．ベルゲイ  ＡＮＫＡ  ＧＦＰｃｏｎ株（Franke-Fayard, 2004）を、ＫｐｎＩ／ＸｂａＩ消化したΔｆｅｒ及びΔｆｌｐコンストラクトを用いて、ならびにＸｂａＩ線形化コンストラクトｆｅｒＣＯＮＴ及びｆｌｐＣＯＮＴを用いて、記載されているＡＭＡＸＡトランスフェクションプロトコールに従ってトランスフェクトした。トランスフェクトしたメロゾイトを、ＮＭＲＩマウス中に直接的に静脈内注射（ｉ．ｖ．）した。寄生虫血を、トランスフェクション後１日目にギムザ染色した血液スミアによりチェックした。開始時の寄生虫血はかなり低く、３つの独立した実験について０．１%〜０．３%を伴った。１日目から、ピリメタミンを、飲料水を用いて提供し、トランスフェクトされた寄生虫を選択した。２日目に、寄生虫血は、ギムザ染色した血液スミアにおいて検出不可能なレベルまで減少した。連続的な薬物選択下で、耐性寄生虫が、７〜９日目に血液中に最初に現れた。ノックアウトコンストラクトを用いてトランスフェクトした耐性寄生虫は、薄い血液スミアにおいて検出可能になるまでに、Δｆｌｐについて平均９日及びΔｆｅｒについて８．５日を要した。相補性コンストラクトｆｅｒＣＯＮＴ及びｆｌｐＣＯＮＴを用いてトランスフェクトした寄生虫はわずかに速かったが、それぞれのマウスは、トランスフェクションから平均７．５日後に陽性である血液段階を得た。血液中の寄生虫レベルが０．５%〜１%まで増加するとすぐに、マウスを屠殺した。感染血液を凍結ストックとして保存し、単離した寄生虫を、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）のための親集団として保持した。約５０〜１００μlの感染血液を、未感作ＮＭＲＩマウス中に腹腔内（ｉ．ｐ．）にトランスファーし、寄生虫血を薬物圧力下で再びモニターした。次回の寄生虫を感染血液から再び回収し、トランスファー集団として保持した。トランスフェクタントを、ターゲティングコンストラクトの組込みについて特異的ＰＣＲによりチェックした（図１３Ｃ及びＤ）。
【００７２】
特異的オリゴヌクレオチド対ＯＲＦ  Ｉ及びＯＲＦ  ＩＩは、Ｐｂ  ＦＥＲ又はＰｂ  ＦＬＰオープンリーディングフレームの異なる部分を増幅した。ノックアウトジェノタイピングＰＣＲについて、ＯＲＦ  Ｉオリゴヌクレオチドを用いて増幅したＤＮＡ断片は、Ｐｂ  ＦＬＰについては９７８bp及びＰｂ  ＦＥＲについては１６９６bpであると予想された。それぞれのバンドを、ＰＣＲテンプレートとしてＷＴ  ｇＤＮＡ又はΔｆｌｐ／Δｆｅｒ  ｇＤＮＡを使用した場合、アガロースゲル上で見ることができた（図１３Ｃ）。予想通り、ＯＲＦ  Ｉ特異的ＤＮＡ断片は、ターゲティングノックアウトコンストラクトをテンプレートとして使用した場合、増幅はなかった。エピソーム特異的オリゴヌクレオチド対ｅｐｉ  Ｉ及びｅｐｉ  ＩＩは、ベクター特異的断片を増幅する。従って、ｅｐｉ  Ｉ特異的ＤＮＡバンド（Ｐｂ  ＦＬＰ及びＰｂ  ＦＥＲについてそれぞれ１１６５bp及び１３２６bpの予想サイズを伴う）を、それぞれ、それぞれのターゲティングコンストラクトｐΔｆｌｐ及びｐΔｆｅｒをテンプレートとして、ならびに、プラスミドを運ぶ耐性トランスフェクタントΔｆｌｐ及びΔｆｅｒのｇＤＮＡを使用する場合、アガロースゲル上で検出することができた。テストオリゴヌクレオチド対テストＩ及びＩＩは、寄生虫ゲノム中へのターゲティングコンストラクトの組込みを証明し、従って、陽性トランスフェクタントのｇＤＮＡからだけ増幅することができた。予想されるテストＩ特異的ＤＮＡ断片（１３０１bp及び１５５７bpのサイズを伴う）を、トランスフェクタントｇＤＮＡから増幅することができなかったことは、ターゲティングコンストラクトｐΔｆｌｐ及びｐΔｆｅｒの組込みがなく、従って、それぞれの遺伝子Ｐｂ  ＦＬＰ及びＰｂ  ＦＥＲの枯渇がないことを示す。それは、コントロール相補性ジェノタイピングＰＣＲについて異なって見えた（図１３Ｄ）。９７８bp又は１０６８bpのサイズを有するＯＲＦ  ＩＩ特異的ＤＮＡ断片は、テンプレートとしてＷＴｇＤＮＡ又はトランスフェクタントｆｌｐＣＯＮＴ及びｆｅｒＣＯＮＴのｇＤＮＡを使用した場合、アガロースゲル上で可視化することができ、ＣＯＮＴ相補性コンストラクトから増幅されなかった。ｅｐｉ  ＩＩ特異的ＤＮＡバンドを、トランスフェクタントのｇＤＮＡ及びベクターコントロールだけについて、それぞれ１４７８bp及び２１９６bpのサイズを伴いアガロースゲル上で検出することができた。ｆｌｐＣＯＮＴについて２８７９bp及びｆｅｒＣＯＮＴについて４３０４bpのサイズを伴うテストＩＩ特異的ＤＮＡ断片は、コントロール相補性コンストラクトｐｆｌｐＣＯＮＴ及びｐｆｅｒＣＯＮＴの成功裏の組込みを実証した。それにより、両方のゲノム遺伝子座の接近可能性を証明することができた。同じジェノタイピング結果が、３つの独立したトランスフェクション実験から達成された。
【００７３】
Ｐ．ベルゲイＦｅｒｌｉｎ及びＦｅｒｌｉｎ様タンパク質が血液段階の発生の間に必須であることを示すこれらの結果は、また、マラリアのライフサイクルを通じたＰ．ベルゲイＦｅｒｌｉｎの転写プロファイルのＲＴ−ＰＣＲ分析により確認された（図１４）。
【００７４】
先行する記載において、請求項において及び／又は添付の図面において開示する特徴は、別々に又はその任意の組み合わせの両方で、その多様な形態において本発明を実現するための材料でありうる。
【００７５】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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