(57)【要約】【解決手段】本発明は、その活性が補助因子のリソソームＢＭＰの存在とは直接には関連しない酵素の欠陥によって生じるリソソーム蓄積症、例えば、グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型の治療に使用するため、Ｈｓｐ７０の細胞内濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤に関する。【選択図】図１２
2013544263.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型からなる群から選択される疾患の治療に使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内濃度および／または活性を上昇させることができる、
生理活性剤。
【請求項２】
活性が補助因子のリソソームＢＭＰの存在とは直接には関連しない酵素の欠陥によって生じるリソソーム蓄積症の治療に使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内濃度および／または活性を上昇させることができる、
生理活性剤。
【請求項３】
前記リソソーム蓄積症が、ニーマンピック病、ファーバー病、クラッベ病、シアリドーシスI型、異染性白質ジストロフィー、ゴーシェ病、ファブリー病、およびサポシン欠損症からなる群から選択されない、
請求項２に記載の生理活性剤。
【請求項４】
前記生理活性剤が、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体、アリモクロモル、およびイロキサナジンからなる群から選択される、
前述のいずれかの請求項に記載の生理活性剤。
【請求項５】
前記Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体は、ヒトＨｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体である、
請求項４に記載の生理活性剤。
【請求項６】
前記Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体が、ヒト野生型Ｈｓｐ７０に対して、少なくとも６０％の同一性、好ましくは少なくとも７０％の同一性、より好ましくは少なくとも７５％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも８５％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９１％の同一性、より好ましくは少なくとも９２％の同一性、より好ましくは少なくとも９３％の同一性、より好ましくは少なくとも９４％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、より好ましくは少なくとも９６％の同一性、より好ましくは少なくとも９７％の同一性、より好ましくは少なくとも９８％の同一性、より好ましくは少なくとも９９％の同一性、より好ましくは少なくとも９９．５％の同一性、より好ましくは少なくとも９９．９％の同一性を有する、
請求項４又は請求項５に記載の生理活性剤。
【請求項７】
前記野生型Ｈｓｐ７０は、配列番号1および配列番号３からなる群から選択される配列を有する、請求項５又は請求項６に記載の生理活性剤。
【請求項８】
前記生理活性剤が、完全長Ｈｓｐ７０、およびＨｓｐ７０の機能的断片もしくは機能的変異体を含むＨｓｐ７０からなる群から選択される、
前述のいずれかの請求項に記載の生理活性剤。
【請求項９】
Ｈｓｐ７０の前記機能的断片もしくは機能的変異体が、６４１未満のアミノ酸、例えば、６２５未満のアミノ酸、例えば、６００未満のアミノ酸、例えば、５７５未満のアミノ酸、例えば、５５０未満のアミノ酸、例えば、５２５未満のアミノ酸、例えば、５００未満のアミノ酸、例えば、４７５未満のアミノ酸、例えば、４５０未満のアミノ酸、例えば、４２５未満のアミノ酸、例えば、４００未満のアミノ酸、例えば、３７５未満のアミノ酸、例えば、３５０未満のアミノ酸、例えば、３２５未満のアミノ酸、例えば、３００未満のアミノ酸、例えば、２７５未満のアミノ酸、例えば、２５０未満のアミノ酸、例えば、２２５未満のアミノ酸、例えば、２００未満のアミノ酸、例えば、１７５未満のアミノ酸、例えば、１５０未満のアミノ酸、例えば、１２５未満のアミノ酸、例えば、１００未満のアミノ酸、例えば、７５未満のアミノ酸、例えば、５０未満のアミノ酸、例えば、２５未満のアミノ酸の全長を有する、
前述のいずれかの請求項に記載の生理活性剤。
【請求項１０】
Ｈｓｐ７０の前記機能的断片または機能的変異体が、１０超のアミノ酸、例えば、２６以上のアミノ酸、例えば、５１以上のアミノ酸、例えば、７６以上のアミノ酸、例えば、１０１以上のアミノ酸、例えば、１２６以上のアミノ酸、例えば、１５１以上のアミノ酸、例えば、１７６以上のアミノ酸、例えば、２０１以上のアミノ酸、例えば、２２６以上のアミノ酸、例えば、２５１以上のアミノ酸、例えば、２７６以上のアミノ酸、例えば、３０１以上のアミノ酸、例えば、３２６以上のアミノ酸、例えば、３５１以上のアミノ酸、例えば、３７６以上のアミノ酸、例えば、４０１以上のアミノ酸、例えば、４２６以上のアミノ酸、例えば、４５１以上のアミノ酸、例えば、４７６以上のアミノ酸、例えば、５０１以上のアミノ酸、例えば、５２６以上のアミノ酸、例えば、５５１以上のアミノ酸、例えば、５７６以上のアミノ酸、例えば、６０１以上のアミノ酸、例えば、６２６以上のアミノ酸の全長を有する、
前述のいずれかの請求項に記載の生理活性剤。
【請求項１１】
Ｈｓｐ７０の前記機能的断片または機能的変異体が、Ｈｓｐ７０のアミノ酸残基の０．１〜１％、例えば、アミノ酸残基の１〜２％、例えば、アミノ酸残基の２〜３％、例えば、アミノ酸残基の３〜４％、例えば、アミノ酸残基の４〜５％、例えば、アミノ酸残基の５〜１０％、例えば、アミノ酸残基の１０〜１５％、例えば、アミノ酸残基の１５〜２０％、例えば、アミノ酸残基の２０〜３０％、例えば、アミノ酸残基の３０〜４０％、例えば、アミノ酸残基の４０〜５０％、例えば、アミノ酸残基の５０〜６０％、例えば、アミノ酸残基の６０〜７０％、例えば、アミノ酸残基の７０〜８０％、例えば、アミノ酸残基の８０〜９０％、例えば、アミノ酸残基の９０〜１００％のアミノ酸の置換を有する、
前述のいずれかの請求項に記載の生理活性剤。
【請求項１２】
Ｈｓｐ７０の前記機能的断片または機能的変異体が、５〜２５のアミノ酸、例えば、２５〜５０のアミノ酸、例えば、５０〜７５のアミノ酸、例えば、７５〜１００のアミノ酸、例えば、１００〜１２５のアミノ酸、例えば、１２５〜１５０のアミノ酸、例えば、１５０〜１７５のアミノ酸、例えば、１７５〜２００のアミノ酸、例えば、２００〜２２５のアミノ酸、例えば、２２５〜２５０のアミノ酸、例えば、２５０〜２７５のアミノ酸、例えば、２７５〜３００のアミノ酸、例えば、３００〜３２５のアミノ酸、例えば、３２５〜３５０のアミノ酸、例えば、３５０〜３７５のアミノ酸、例えば、３７５〜４００のアミノ酸、例えば、４００〜４２５のアミノ酸、例えば、４２５〜４５０のアミノ酸、例えば、４５０〜４７５のアミノ酸、例えば、４７５〜５００のアミノ酸、例えば、５００〜５２５のアミノ酸、例えば、５２５〜５５０のアミノ酸、例えば、５５０〜５７５のアミノ酸、例えば、５７５〜６００のアミノ酸、例えば、６００〜６２５のアミノ酸、例えば、６２５〜６４０のアミノ酸の範囲の全長を有する、
前述のいずれかの請求項に記載の生理活性剤。
【請求項１３】
Ｈｓｐ７０の前記機能的断片または機能的変異体が、Ｈｓｐ７０のＡＴＰアーゼドメインのすべてまたは一部を含む、
前述のいずれかの請求項に記載の生理活性剤。
【請求項１４】
Ｈｓｐ７０の前記機能的断片または機能的変異体が、Ｈｓｐ７０のＡＴＰアーゼドメインのアミノ酸位置９０にトリプトファンを含む、前述のいずれかの請求項に記載の生理活性剤。
【請求項１５】
前記Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体が、組換えＨｓｐ７０（ｒＨｓｐ７０）である、
前述のいずれかの請求項に記載の生理活性剤。
【請求項１６】
前記Ｈｓｐ７０が、ヒト（ホモサピエンス）、マウス（ハツカネズミ）、ウシ、イヌ、ラット、フェレット、ブタ、ヒツジ、およびサルからなる群から選択される哺乳動物に由来する、
前述のいずれかの請求項に記載の生理活性剤。
【請求項１７】
前記生理活性剤が、Ｈｓｐ７０誘導物質またはＨｓｐ７０共誘導物質である、
請求項１又は請求項２に記載の生理活性剤。
【請求項１８】
前記生理活性剤が、Ｈｓｐ７０誘導物質である、
請求項１又は請求項２に記載の生理活性剤。
【請求項１９】
前記生理活性剤が、Ｈｓｐ７０共誘導物質である、
請求項１又は請求項２に記載の生理活性剤。
【請求項２０】
前記Ｈｓｐ７０共誘導物質が、ヒドロキシルアミン誘導体である、
請求項１９に記載の生理活性剤。
【請求項２１】
前記ヒドロキシルアミン誘導体が、ビモクロモル（ＢＲＬＰ−４２）、アリモクロモル（ＢＲＸ−２２０）、ＢＲＸ−３４５、およびＢＧＰ−１５からなる群から選択される、
請求項２０に記載の生理活性剤。
【請求項２２】
前記ヒドロキシルアミン誘導体が、アリモクロモル（ＢＲＸ−２２０）である、
請求項２０に記載の生理活性剤。
【請求項２３】
前記生理活性剤が、イロキサナジン（ｉｒｏｘａｎａｄｉｎｅ）（５−（ピペリジン−１−イルメチル）−３−ピリジン−３−イル−５，６−ジヒドロ−２Ｈ−１，２，４−オキサジアジン）（５−（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ−１−ｙｌｍｅｔｈｙｌ）−３−ｐｙｒｉｄｉｎ−３−ｙｌ−５，６−ｄｉｈｙｄｒｏ−２Ｈ−１，２，４−ｏｘａｄｉａｚｉｎｅ）である、
請求項１７に記載の生理活性剤。
【請求項２４】
前記Ｈｓｐ７０誘導物質が、膜流動化剤である、
請求項１８に記載の生理活性剤。
【請求項２５】
前記膜流動化剤が、ベンジルアルコール、ヘプタノール、ＡＬ７２１、ドコサヘキサエン酸、脂肪族アルコール、オレイルアルコール、ジメチルアミノエタノール、Ａ２Ｃ、ファルネソール、リドカイン、ロピバカイン、ブピバカイン、およびメピバカインからなる群から選択される、
請求項２４に記載の生理活性剤。
【請求項２６】
前記Ｈｓｐ７０誘導物質または前記Ｈｓｐ７０共誘導物質が、エデルホシン（ＥＴ−１８−ＯＣＨ３または１−オクタデシル−２−メチル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホコリン）、セレコキシブ、ロフェコキシブ、アセチル−サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、インドメタシン、ＰＧＡ１、ＰＧｊ２  ２−シクロペンテン−１−オン、ペルオキシダーゼ増殖因子活性化受容体−γ作動薬、ビンクリスチン、パクリタキセル、ピオグリタゾン、カルボプラチン、ドキソルビシン、フルダラビン、イホスファミド  シタラビン、ゲルダナマイシン、１７−ＡＡＧ、１７−ＤＭＡＧ、ラジシコール、ハービマイシン−Ａ、アラキドン酸、ＭＧ１３２、ラクタシスチン、ＤＣＩＣ、ＴＬＣＫ、ＴＰＣＫ、ゲラニルゲラニルアセトン（ＧＧＡ）、レバミピド、カルベノキソロン、ポラプレジンク（亜鉛Ｌ−カルノシン）、デキサメタゾン、コカイン、ニコチン、アルコール、α−アドレナリン作動薬、シクロペンテノンプロスタノイド、ペオニフロリン、グリチルリジン、セラストロール、ジヒドロセラストロール、２酢酸ジヒドロセラストロール、およびクルクミンからなる群から選択される、
請求項１７に記載の生理活性剤。
【請求項２７】
前記生理活性剤が、亜致死温熱療法である、
請求項１又は請求項２に記載の生理活性剤。
【請求項２８】
前記亜致死温熱療法が、個体の温度を、約３８℃、例えば、約３９℃、例えば、約４０℃、例えば、約４１℃、例えば、約４２℃、例えば、約４３℃の中核体温まで上昇させるステップを含む、
請求項２７に記載の生理活性剤。
【請求項２９】
前記生理活性剤が、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体とＨｓｐ７０誘導物質またはＨｓｐ７０共誘導物質との組合せを含む、
請求項１又は請求項２に記載の生理活性剤。
【請求項３０】
前記治療が、予防、治癒、または改善である、
請求項１又は請求項２に記載の生理活性剤。
【請求項３１】
前記生理活性剤が、それを必要とする個体に非経口投与される、
請求項１又は請求項２に記載の生理活性剤。
【請求項３２】
前記非経口投与が、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、動脈内注射、皮下注射、または腹膜内注射である、
請求項３１に記載の生理活性剤。
【請求項３３】
前記非経口投与が、静脈内注入である、
請求項３１に記載の生理活性剤。
【請求項３４】
前記静脈内注入が、１０〜２０分、例えば、２０〜３０分、例えば、３０〜４０分、例えば、４０〜５０分、例えば、５０〜６０分、例えば、６０〜９０分、例えば、９０〜１２０分、例えば、２〜３時間、例えば、３〜４時間、例えば、４〜５時間、例えば、５〜６時間、例えば、６〜７時間、例えば、７〜８時間の期間に渡って行われる、
請求項３３に記載の生理活性剤。
【請求項３５】
前記非経口投与が経粘膜送達である、
請求項３１に記載の生理活性剤。
【請求項３６】
前記経粘膜送達が舌下送達である、
請求項３５に記載の生理活性剤。
【請求項３７】
前記経粘膜送達が口腔送達である、
請求項３５に記載の生理活性剤。
【請求項３８】
前記経粘膜送達が吸入である、
請求項３５に記載の生理活性剤。
【請求項３９】
前記経粘膜送達が鼻腔内送達である、
請求項３５に記載の生理活性剤。
【請求項４０】
請求項１から請求項３９のいずれか一項に記載の生理活性剤を、それを必要とする個体に投与することを含む、グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型からなる群から選択される疾患の治療方法。
【請求項４１】
請求項１から請求項３９のいずれか一項に記載の生理活性剤を、それを必要とする個体に投与することを含む、酵素活性が補助因子のリソソームＢＭＰの存在とは直接には関連しない、前記酵素の欠陥によって生じるリソソーム蓄積症の治療方法。
【請求項４２】
前記リソソーム蓄積症が、ニーマンピック病、ファーバー病、クラッベ病、シアリドーシスI型、異染性白質ジストロフィー、ゴーシェ病、ファブリー病、およびサポシン欠損症からなる群から選択されない、
請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記治療が、予防、治癒、および／または改善である、
請求項４１又は請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記治療が、コントロールに比べて前記個体の寿命を延ばす、
請求項４１又は請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記寿命が、６ヶ月〜１年、例えば、１〜２年、例えば、２〜３年、例えば、３〜４年、例えば、４〜５年、例えば、５〜６年、例えば、６〜７年、例えば、７〜８年、例えば、８〜９年、例えば、９〜１０年、例えば、１０〜１２年、例えば、１２〜１４年、例えば、１４〜１６年、例えば、１６〜１８年、例えば、１８〜２０年、例えば、２０〜２５年、例えば、２５〜３０年、例えば、３０〜４０年、例えば、４０〜５０年、例えば、５０〜６０年、例えば、６０〜７０年、例えば、７０〜８０年、例えば、８０〜９０年、例えば、９０〜１００年延長される、
請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記生理活性剤が、医薬組成物として調製される、
請求項４４０又は請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記疾患が、心臓グリコーゲン蓄積症（ｃａｒｄｉａｃ  ｇｌｙｃｏｇｅｎｏｓｉｓ）、アンダーセン病（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）、コーリ病（Ｃｏｒｉ  ｄｉｓｅａｓｅ）（フォーブス病（Ｆｏｒｂｅｓ  ｄｉｓｅａｓｅ））、ハース病（Ｈｅｒｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、マックアードル病（ＭｃＡｒｄｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ポンぺ病（Ｐｏｍｐｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、Ｔａｕｒｉ病（垂井病（Ｔａｒｕｉ  ｄｉｓｅａｓｅ））、およびフォンギールケ病（ｖｏｎ  Ｇｉｅｒｋｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）からなる群から選択される、
請求項１又は請求項２に記載の生理活性剤、あるいは、請求項４０又は請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
前記疾患が、サンドホフ病（またはＧＭ２ガングリオシドーシスII型）、古典的な小児サンドホフ病、若年性サンドホフ病、成人／後期発症サンドホフ病、テイ・サックス病（またはＧＭ２ガングリオシドーシスI型）、小児テイ・サックス病、若年性テイ・サックス病、成人／後期発症テイ・サックス病、ＧＭ２−ガングリオシドーシスＡＢバリアント、ＧＭ１ガングリオシドーシス、初期小児ＧＭ１ガングリオシドーシス、後期小児ＧＭ１ガングリオシドーシス、成人ＧＭ１ガングリオシドーシス、ＧＭ３ガングリオシドーシス、およびムコリピドーシスIＶ型からなる群から選択される、
請求項１又は請求項２に記載の生理活性剤、あるいは、請求項４０又は請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記疾患が、バッテン病（Ｂａｔｔｅｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）（シュピールマイアー−フォークト病（Ｓｐｉｅｌｍｅｙｅｒ−Ｖｏｇｔ  ｄｉｓｅａｓｅ））、ビールショスキー−ヤンスキー病（Ｂｉｅｌｓｃｈｏｗｓｋｙ−Ｊａｎｓｋｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）、クーフス病（Ｋｕｆｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、およびＳａｎｔａｖｕｏｒｉ−Ｈａｌｔｉａ病からなる群から選択される、
請求項１又は請求項２に記載の生理活性剤、あるいは、請求項４０又は請求項４１に記載の方法。
【請求項５０】
前記疾患が、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、およびコレステリルエステル蓄積症からなる群から選択される、
請求項１又は請求項２に記載の生理活性剤、あるいは、請求項４０又は請求項４１に記載の方法。
【請求項５１】
前記疾患が、I型ムコ多糖症、II型ムコ多糖症、、III型ムコ多糖症、、IV型ムコ多糖症、VI型ムコ多糖症、VII型ムコ多糖症、VIII型ムコ多糖症、およびIX型ムコ多糖症からなる群から選択される、
請求項１又は請求項２に記載の生理活性剤、あるいは、請求項４０又は請求項４１に記載の方法。
【請求項５２】
前記疾患が、ハーラー症候群（Ｈｕｒｌｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ハーラー−シャイエ症候群（Ｈｕｒｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、シャイエ症候群（Ｓｃｈｅｉｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ハンター症候群（Ｈｕｎｔｅｒ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ＤｉＦｅｒｒａｎｔｅ症候群、マロト−ラミー症候群（Ｍａｒｏｔｅａｕｘ−Ｌａｍｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（軽度または重篤）、モルキオ症候群（Ｍｏｒｑｕｉｏ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）(古典的またはモルキオ様)、およびサンフィリッポ症候群（Ｓａｎｆｉｌｉｐｐｏ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤ型）からなる群から選択される、
請求項１又は請求項２に記載の生理活性剤、あるいは、請求項４０又は請求項４１に記載の方法。
【請求項５３】
前記疾患が、ムコリピドーシスII（Ｉ−セル病）およびムコリピドーシスIII（偽ハーラー多発性ジストロフィー）（ｐｓｅｕｄｏ−Ｈｕｒｌｅｒ  ｐｏｌｙｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）からなる群から選択される、
請求項１又は請求項２に記載の生理活性剤、あるいは、請求項４０又は請求項４１に記載の方法。
【請求項５４】
前記疾患が、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、α−マンノシド症、α−マンノシド症I型、α−マンノシド症II型、β−マンノシド症、およびシアリドーシスII型（ムコリピドーシスI）からなる群から選択される、
請求項１又は請求項２に記載の生理活性剤、あるいは、請求項４０又は請求項４１に記載の方法。
【請求項５５】
前記疾患が、酵素の欠陥を含む、
請求項１又は請求項２に記載の生理活性剤、あるいは、請求項４０又は請求項４１に記載の方法。
【請求項５６】
前記疾患が、酵素の翻訳後修飾における欠陥を含む、
請求項１又は請求項２に記載の生理活性剤、あるいは、請求項４０又は請求項４１に記載の方法。
【請求項５７】
前記疾患が、非酵素タンパク質における欠陥を含む、
請求項１又は請求項２に記載の生理活性剤、あるいは、請求項４０又は請求項４１に記載の方法。
【請求項５８】
前記疾患が、膜輸送タンパク質における欠陥を含む、
請求項１又は請求項２に記載の生理活性剤、あるいは、請求項４０又は請求項４１に記載の方法。
【請求項５９】
前記疾患が、酵素保護タンパク質における欠陥を含む、
請求項１又は請求項２に記載の生理活性剤、あるいは、請求項４０又は請求項４１に記載の方法。
【請求項６０】
前記疾患が、膜貫通タンパク質における欠陥を含む、
請求項１又は請求項２に記載の生理活性剤、あるいは、請求項４０又は請求項４１に記載の方法。
【請求項６１】
前記疾患が、膜貫通型でないタンパク質における欠陥を含む、
請求項１又は請求項２に記載の生理活性剤、あるいは、請求項４０又は請求項４１に記載の方法。
【請求項６２】
請求項１から請求項３９のいずれか一項に記載の生理活性剤を、少なくとも１つの他の治療方式と併用して投与することを含む、
グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型からなる群から選択される疾患の治療方法。
【請求項６３】
請求項１から請求項３９のいずれか一項に記載の生理活性剤を、少なくとも１つの他の治療方式と併用して投与することを含む、
活性が補助因子のリソソームＢＭＰの存在とは直接には関連しない酵素の欠陥によって生じるリソソーム蓄積症の治療方法。
【請求項６４】
前記リソソーム蓄積症が、ニーマンピック病、ファーバー病、クラッベ病、シアリドーシスI型、異染性白質ジストロフィー、ゴーシェ病、ファブリー病、およびサポシン欠損症からなる群から選択されない、
請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記少なくとも１つの他の治療方式が、同時または連続的に実施される、
請求項６２又は請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記少なくとも１つの他の治療方式が、酵素補充療法（ＥＲＴ）である、
請求項６２又は請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記少なくとも１つの他の治療方式が、鎮痛剤である、
請求項６２又は請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
前記少なくとも１つの他の治療方式が、コルチコステロイドである、
請求項６２又は請求項６３に記載の方法。
【請求項６９】
前記少なくとも１つの他の治療方式が、移植である、
請求項６２又は請求項６３のに記載の方法。
【請求項７０】
前記移植が、骨髄移植、臍帯血移植、および幹細胞移植からなる群から選択される、
請求項６２又は請求項６３に記載の方法。
【請求項７１】
前記少なくとも１つの他の治療方式が、基質抑制療法である、
請求項６２又は請求項６３に記載の方法。
【請求項７２】
前記少なくとも１つの他の治療方式が、理学療法などの対症および支持療法である、
請求項６２又は請求項６３に記載の方法。
【請求項７３】
Ｈｓｐ７０の細胞内濃度および／または活性を高める方法であって、
前記方法が、治療上有効量のアリモクロモルおよび／またはイロキサナジンを細胞に投与することを含む方法。
【請求項７４】
Ｈｓｐ７０の細胞内濃度および／または活性を高める  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  の方法であって、
前記方法が、治療上有効量のアリモクロモルおよび／またはイロキサナジンを細胞に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１０年１１月３０日出願のデンマーク特許出願番号ＰＡ  ２０１０  ７０５２０の優先権主張をするＰＣＴ出願である。本出願で言及した全ての特許文献および非特許文献は、参照によりその全容が本明細書に組み入れられるものとする。
【０００２】
本発明は、その活性が補助因子のリソソームＢＭＰの存在とは直接には関連しない酵素の欠陥によって生じるリソソーム蓄積症、例えば、グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型の治療に使用するため、Ｈｓｐ７０の細胞内濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
分子シャペロンは、タンパク質の立体配座の再構成が起こる細胞の全ての区画内に見られ、タンパク質合成が細胞内の折り畳まれていないペプチドの主な供給源であるが、タンパク質を構造的に不安定にさせ得る高温または他の刺激への細胞の曝露、従って折り畳み構造がほどけて凝集する傾向は、防御タンパク質の産生に関与する特定の細胞応答に一致する。この応答は、原核細胞から真核細胞に至るどの細胞型でも観察され、熱ショック応答またはストレス応答と呼ばれる。この応答によって誘導されるタンパク質は、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）として知られ、いくつかのファミリーが存在する。
【０００４】
シャペロンのファミリーの主な例はＨｓｐ７０タンパク質である。このファミリーは、最近、その抗アポトーシス特性によって最も際立っているシャペロンとしての機能、免疫におけるその機能、および癌細胞のＨｓｐ７０のアップレギュレーションへの明らかな依存に加えて、細胞恒常性の他の側面に関係するとされている。さらに、Ｈｓｐ７０は、リソソーム完全性の保護の役割を果たすことができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
リソソーム蓄積症は、リソソーム区画内での物質の蓄積、および罹病した個体に対する致命的な影響をもたらす、結果として起こるリソソーム区画の不安定化によって特徴付けられる希少な疾患群である。物質は、その異化作用に関与する酵素の欠乏によってリソソーム区画内に蓄積する。現在まで、殆どのリソソーム蓄積症に利用可能な治療が存在しない。患者に、欠損している組換え酵素を与えるという酵素補充療法（ＥＲＴ）が、これらの疾患の一部に対して行われている。しかし、ＥＲＴは、その使用を一部の分野に限定し得る非常に高価な形態の療法であり、しかも、組換え酵素が産生される特定のタイプの疾患のみに有効である。
【０００６】
国際特許出願  ＷＯ  ２００９／１５５９３６は、リソソームの安定化を促進する、Ｈｓｐ７０とリソソームリン脂質ビス（モノアシルグリセロ）リン酸（ＢＭＰ）との間の新たに同定された相互作用を利用することによって、リソソーム蓄積症を治療する新規な方法を提供することを目的とする。この相互作用は、その活性が、補助因子のリソソームＢＭＰの存在と関連する酵素の欠陥によって生じるリソソーム蓄積症、例えば、ニーマンピック病（Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ  ｄｉｓｅａｓｅ）およびファーバー病（Ｆａｒｂｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）の病状を逆戻りさせることが示された。
【０００７】
本発明は、驚くべきことに、Ｈｓｐ７０が、その活性が補助因子のリソソームＢＭＰの存在とは直接には関連しない酵素の欠陥によって生じるリソソーム蓄積症、例えば、グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型の病状を逆戻りさせることにも有益であることをさらに見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
Ｈｓｐ７０が、リソソームの完全性を保護する役割を果たすことができることが文献から分かっている。しかし、その分子機構は、未解明のままである。本発明では、リソソーム膜安定化に対するＨｓｐ７０の寄与の分子機構をさらに検証し、リソソーム蓄積症の病状を逆戻りさせるその効果、特に、その活性が補助因子のリソソームＢＭＰの存在と関連する酵素の欠陥によって生じない前記リソソーム蓄積症における、その病状を逆戻りさせる効果について検討する。
【０００９】
本発明は、それを必要とする個体におけるＨｓｐ７０の細胞内濃度および／または活性を直接または間接的に上昇させることによって、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体を提供することによって、またはＨｓｐ７０誘導物質またはＨｓｐ７０共誘導物質を提供することによってリソソーム蓄積症を治療する方法を提供する。
【００１０】
本発明は、一態様では、その活性が補助因子のリソソームＢＭＰの存在と関連する酵素の欠陥によって生じないリソソーム蓄積症の治療に使用するため、Ｈｓｐ７０の細胞内濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤に関する。
【００１１】
本発明は、一態様では、グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型からなる群から選択される疾患の治療に使用するため、Ｈｓｐ７０の細胞内濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤に関する。
【００１２】
ニーマンピック病（Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ファーバー病（Ｆａｒｂｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）、クラッベ病（Ｋｒａｂｂｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、I型シアリドーシス（Ｓｉａｌｉｄｏｓｉｓ  ｔｙｐｅ  I）、異染性白質ジストロフィー（Ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ  ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、ゴーシェ病（Ｇａｕｃｈｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）、
ファブリー病（Ｆａｂｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）、およびサポシン欠損症（ｓａｐｏｓｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）からなる群から選択されないリソソーム蓄積症の治療に使用するため、Ｈｓｐ７０の細胞内濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性を提供することが、本発明のさらなる一つの態様である。
【００１３】
一実施形態では、前記生理活性剤は、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体であり、別の実施形態では、前記生理活性剤は、Ｈｓｐ７０誘導物質またはＨｓｐ７０共誘導物質である。
【００１４】
また、本発明の一態様は、本発明による生理活性剤を、それを必要とする個体に投与することを含むリソソーム蓄積症を治療するための方法を提供することである。前記治療は、予防、治癒、または改善とすることができる。
【００１５】
本発明はまた、化合物の取り込みを増加させるための方法であって、前記化合物をＨｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体と共に投与するステップを含む、方法に関する。一実施形態では、前記Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体は、前記化合物に共有結合している。別の実施形態では、前記Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体が、前記化合物に非共有結合している。
【００１６】
本発明はまた、本発明による生理活性剤を、少なくとも１つの他の治療方式と併用して投与することを含むリソソーム蓄積症の治療方法に関する。
【００１７】
本発明の一実施形態では、Ｈｓｐ７０は、リソソーム蓄積障害の治療において酵素補充療法と併用して投与される。
【００１８】
別の実施形態では、Ｈｓｐ７０は、酵素補充療法において酵素の取り込みを促進するために使用され、その結果、関連する細胞によって取り込まれる酵素量を増加させた。
【００１９】
定義
リソソーム蓄積障害（ＬＳＤ）：用語「リソソーム蓄積障害」と「リソソーム蓄積症」は同義語として使用される。
【００２０】
Ｈｓｐ７０の機能的断片：用語「Ｈｓｐ７０の機能的断片」は、所望の機能を有するＨｓｐ７０の任意の断片を意味すると解釈されたい。一実施形態では、本明細書に記載するように、機能的断片は、リソソーム蓄積症の病状を逆戻りさせることのできる断片である。別の実施形態では、機能的断片は、自己貪食を引き起こすことのできる断片である。物質の取り込みの増加に関しては、Ｈｓｐ７０の機能的断片は、前記物質の取り込みを増加させることができる断片である。機能的断片の正確な定量的効果は、完全長分子の効果とは異なるであろうことを理解されたい。場合によっては、機能的断片は、実際に、完全長分子よりも効果的であり得る。さらに、完全長分子の代わりとしての断片の使用は、断片の大きさが小さいため有利であろう。
【００２１】
Ｈｓｐ７０の機能的変異体：用語「Ｈｓｐ７０の機能的変異体」は、所望の機能を有するＨｓｐ７０の任意の変異体を意味すると解釈されたい。一実施形態では、本明細書に記載するように、機能的断片は、リソソーム蓄積症の病状を逆戻りさせることのできる断片である。別の実施形態では、機能的変異体は、自己貪食を引き起こすことのできる断片である。物質の取り込みの増加に関しては、Ｈｓｐ７０の機能的変異体は、前記物質の取り込みを増加させることができる断片である。機能的変異体の正確な定量的効果は、完全長分子の効果とは異なるであろうことを理解されたい。場合によっては、機能的変異体は、実際に、完全長分子よりも効果的であり得る。
【００２２】
「生理活性剤」（すなわち、生物学的に活性な物質／作用物質）は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで実証できる、有利な場合が多いある種の薬理学的効果を提供する物質または混合物の任意の作用物質、薬物、化合物、組成物である。本明細書で使用されるこの用語には、個体に局所効果または全身効果を生じさせる任意の生理学的または薬理学的に活性な物質がさらに含まれる。生理活性剤のさらなる例には、限定されるものではないが、オリゴ糖を含むまたはこれからなる作用物質、多糖を含むまたはこれからなる作用物質、任意選択でグリコシル化されたペプチドを含むまたはこれからなる作用物質、任意選択でグリコシル化されたポリペプチドを含むまたはこれからなる作用物質、核酸を含むまたはこれからなる作用物質、オリゴヌクレオチドを含むまたはこれからなる作用物質、ポリヌクレオチドを含むまたはこれからなる作用物質、脂質を含むまたはこれからなる作用物質、脂肪酸を含むまたはこれからなる作用物質、脂肪酸エステルを含むまたはこれからなる作用物質、および二次代謝産物を含むまたはこれからなる作用物質が含まれる。生理活性剤は、ヒトまたは任意の他の動物などの個体の治療において予防的または治療的に用いることができる。本明細書で使用される生理活性剤は、Ｈｓｐ７０の細胞内濃度および／または活性を上昇させることができる物質である。
【００２３】
本明細書で使用される用語「薬物」または「薬剤」には、ヒトまたは動物の体で局所的または全身に作用する生物学的、生理学的、または薬理学的に活性な物質が含まれる。
【００２４】
本明細書で使用される用語「治療すること」、「治療」、および「療法」は等しく、治癒療法、予防または防止療法、および改善または姑息療法を指す。この用語には、有利または所望の生理学的な結果を得る方法が含まれ、この方法は臨床的に確立することができる。本発明の趣旨において、有利または所望の臨床結果には、限定されるものではないが、検出可能または検出不能にかかわらず、症状の軽減、疾患の範囲の減少、安定した（すなわち、悪化しない）状態、状態／症状の進行または悪化の遅延または遅れ、状態または症状の改善または緩和、および寛解（部分的でも完全でもよい）が含まれる。本明細書で使用される用語「緩和」およびその変形語は、本発明の組成物を投与しない場合と比較して、生理学的状態または症状の範囲および／または不所望の発現が減少すること、および／または進行の時間経過が遅くなるまたは長くなることを意味する。
【００２５】
「治療効果」または「療法効果」は、用語「治療すること」および「治療」の定義を構成する基準によって測定されたときに治療されている状態に変化がある場合に現われる。少なくとも５％の改善、好ましくは１０％の改善、より好ましくは少なくとも２５％の改善、さらに好ましくは少なくとも５０％、例えば、少なくとも７５％、そして最も好ましくは少なくとも１００％の改善がある場合に治療されている状態に「変化」がある。この変化は、個体の治療された状態の重症度の改善に基づく、または生理活性剤もしくは本発明の医薬組成物と組み合わせた生理活性剤で治療されたもしくは治療されていない個体の集団における改善された状態の頻度の差に基づくことができる。
【００２６】
「生理活性剤」の「薬理学的有効量」、「薬学的有効量」、または「生理学的有効量」は、治療される個体の血中または作用部位（例えば、肺、胃系、結腸直腸系、前立腺など）に所望のレベルの活性剤を供給して、本明細書に記載されている医薬組成物が投与されたときに予想された生理学的応答を付与するために必要である、このような組成物中に存在する活性剤の量である。正確な量は、多数の因子、例えば、活性剤、組成物の活性、利用する送達装置、組成物の物理特性、意図する患者の使用（すなわち、１日当たりの投与回数）、および患者の考慮すべき事項などに依存し、本明細書で提供される情報に基づいて当業者が容易に決定することができる。生理活性剤の「有効量」は、１回の投与で投与する、または好ましくは２４時間以内に、合計すると有効量になる量を複数回に分けて投与することができる。有効量は、適切な量および投与のタイミングを決定するための標準的な臨床診断法で決定することができる。「有効量」は、治療を行う医療関係者および／または個人の側の経験的および／または個体に合わせた（ケースバイケース）決定の結果とすることができることを理解されたい。
【００２７】
本明細書で使用される用語、有利な効果を「促進する」および「向上させる」ならびにそれらの変形は、プラセボに対する生理活性剤の治療効果、または本発明の生理活性剤を用いずに医薬組成物を投与した時に通常得られるよりも高い最新医療の治療効果の上昇を指す。「治療効果の上昇」は、生理活性剤（複数可）の投与の結果として得られる治療効果の強さおよび／または範囲における促進および／または増加がある場合に現われる。「治療効果の上昇」には、治療効果の期間の延長も含まれる。「治療効果の上昇」は、生理活性剤の非存在下での多量の医薬組成物の投与と比較して、本発明によって提供される生理活性剤（複数可）と同時投与される場合、同じ恩恵および／または効果を得るためにより少ない量の医薬組成物で済む場合にも現われ得る。効果の促進は、必ずしもではないが好ましくは、医薬組成物単独では治療効果がないまたは低い急性の症状の治療となる。促進は、医薬組成物単独の投与と比較して、本発明の生理活性剤が、医薬組成物と同時投与された場合に、治療効果が少なくとも５％、例えば、治療効果が少なくとも１０％上昇すると達成される。好ましくは、この上昇は、少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも１００％である。
【００２８】
本明細書で使用される、生理活性剤（複数可）または生理活性剤と最新の薬剤を「同時に投与する」またはそれらの「同時投与」は、一定の期間以内での、本発明の１つ以上の生理活性剤の投与、または本発明の１つ以上の生理活性剤と最新の医薬組成物の投与を指す。この期間は、好ましくは７２時間未満、例えば、４８時間未満、例えば、２４時間未満、例えば、１２時間未満、例えば、６時間未満、例えば、３時間未満である。しかし、これらの用語は、生理活性剤と治療組成物を一緒に（同時にあるいは実質的に同時に）投与できることも意味する。
【００２９】
用語「個体」は、脊椎動物、特に哺乳動物種のメンバー、好ましくはヒトを含む霊長類を指す。好適な実施形態では、本明細書で使用される個体は、どの年齢でもよい男性または女性のヒトである。
【００３０】
「それを必要とする個体」は、本発明の恩恵を受け得る個体を指す。一実施形態では、前記それを必要とする個体は、病気の個体であり、前記病気はリソソーム蓄積症である。
【００３１】
用語「天然ヌクレオチド」または「ヌクレオチド」は、天然に見られる４つのデオキシリボヌクレオチド、ｄＡ、ｄＧ、ｄＴ、およびｄＣ（ＤＮＡの構成成分）ならびに４つのリボヌクレオチド、Ａ、Ｇ、Ｕ、およびＣ（ＲＮＡの構成成分）のいずれかを指す。各天然ヌクレオチドは、糖部分（リボースまたはデオキシリボース）、リン酸部分、および天然／基準塩基部分を含むまたは実質的にこれらからなる。天然ヌクレオチドは、アデニン（Ａ）がチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）と対を形成し；そしてグアニン（Ｇ）がシトシン（Ｃ）と対を形成し、対応する塩基対が２本の相補的な逆平行鎖の一部である公知の塩基対の規則（ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋ）に従ってヌクレオチドに相補的に結合する。塩基対形成は、所定のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドとの間の特異的なハイブリダイゼーションをもたらす。塩基対形成は、基礎であり、この基礎により、鋳型オリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドの合成を酵素が触媒することができる。この合成では、形成ブロック（通常は、Ａ、Ｔ、Ｕ、Ｃ、またはＧのリボまたはデオキシリボ誘導体の三リン酸）が、鋳型オリゴヌクレオチドによって誘導されて、正しい相補的な配列を持つ相補的なオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチド配列のその相補的な配列による認識は、塩基対を形成している、対応および相互作用する塩基によって媒介される。本来は、塩基対形成に導く特異的な相互作用は、塩基のサイズならびに塩基の水素結合供与体および受容体のパターンによって制御されている。大きいプリン塩基（ＡまたはＧ）は、小さいピリミジン塩基（Ｔ、Ｕ、またはＣ）と対を形成する。加えて、塩基間の塩基対の認識は、塩基間で形成される水素結合による影響を受ける。Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対のジオメトリでは、６員環（天然オリゴヌクレオチドのピリミジン）は、中間の水素結合が２つの環の原子を結合し、両側の水素結合が各環に付加された官能基を結合し、供与基が受容基と対を形成した、融合した６員環と５員環（天然オリゴヌクレオチドのプリン）からなる環系に並置されている。
【００３２】
本明細書で使用される「核酸」または「核酸分子」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって作製された断片、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって作製された断片を指す。核酸分子は、自然発生のヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡなど）、自然発生のヌクレオチドの類似体（例えば、自然発生のヌクレオチドのα−鏡像異性型）、または両方の組合せである単量体から構成することができる。修飾ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジンまたはプリン塩基部分における変更を有することができる。糖修飾には、例えば、１つまたは複数のヒドロキシル基のハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基での置換が含まれ、または、糖は、エーテルもしくはエステルとして官能性を持たせることができる。さらに、糖部分全体を、アザ−糖および炭素環糖類似体などの立体的および電子的に類似の構造で置換することができる。塩基部分の修飾の例には、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、または他の公知の複素環置換が含まれる。核酸単量体は、ホスホジエステル結合またはこのような結合の類似体によって連結することができる。ホスホジエステル結合の類似体には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニリデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌｉｄａｔｅ）、ホスホロアミダートなどが含まれる。用語「核酸分子」には、例えば、いわゆる「ペプチド核酸」も含まれ、ペプチド核酸には、ポリアミドバックボーンに取り付けられた自然発生または修飾された核酸塩基が含まれる。核酸は、１本鎖または２本鎖であり得る。
【００３３】
用語「核酸分子の相補体」は、基準ヌクレオチド配列と比較して逆方向である相補的なヌクレオチド配列を有するヌクレオチド分子を指す。例えば、配列５’ＡＴＧＣＡＣＧＧＧ３’は、５’ＣＣＣＧＴＧＣＡＴ３’に相補的である。
【００３４】
「単離核酸分子」は、生物のゲノムＤＮＡに組み込まれていない核酸分子である。例えば、細胞のゲノムＤＮＡから分離された成長因子をコードするＤＮＡ分子は、単離ＤＮＡ分子である。単離核酸分子の別の例は、生物のゲノムに組み込まれていない化学的に合成された核酸分子である。特定の種から単離された核酸分子は、その種由来の染色体の完全ＤＮＡ分子よりも小さい。
【００３５】
「核酸分子構築物」は、天然に存在しない構成に組み合わされて並置された核酸のセグメントを含むように人間の介入によって改変された１本鎖または２本鎖の核酸分子である。
【００３６】
「線状ＤＮＡ」は、遊離５’末端および遊離３’末端を有する非環状ＤＮＡ分子を指す。線状ＤＮＡは、酵素消化または物理的破壊によってプラスミドなどの閉じた環状のＤＮＡ分子から調製することができる。
【００３７】
「相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）」は、逆転写酵素によって鋳型ｍＲＮＡから形成された１本鎖ＤＮＡ分子である。典型的には、ｍＲＮＡの一部に相補的なプライマーを、逆転写の開始に利用する。当業者はまた、このような１本鎖ＤＮＡ分子とその相補的なＤＮＡ鎖からなる２本鎖ＤＮＡ分子を指す際にも用語「ｃＤＮＡ」を使用する。用語「ｃＤＮＡ」は、鋳型ＲＮＡから合成されたｃＤＮＡ分子のクローンも指す。
【００３８】
「異種ＤＮＡ」は、所与の宿主細胞内で自然には存在しないＤＮＡ分子またはＤＮＡ分子の集団を指す。特定の宿主細胞に対して異種のＤＮＡ分子は、その宿主ＤＮＡが非宿主ＤＮＡ（すなわち、外来性ＤＮＡ）と組み合わせられれば、宿主細胞種（すなわち、内在性ＤＮＡ）由来のＤＮＡを含み得る。例えば、転写プロモーターを含む宿主ＤＮＡセグメントに機能的に連結されたポリペプチドをコードする非宿主ＤＮＡセグメントを含むＤＮＡ分子は、異種ＤＮＡ分子と見なされる。逆に、異種ＤＮＡ分子は、外来性プロモーターに機能的に連結された内在性遺伝子を含み得る。別の例示として、野生型細胞由来の遺伝子を含むＤＮＡ分子は、そのＤＮＡ分子が、野生型遺伝子が欠失した突然変異細胞内に導入された場合、異種ＤＮＡであると見なされる。
【００３９】
「ポリペプチド」は、天然または合成的に作製されたにかかわらず、好ましくはペプチド結合のみによって結合されたアミノ酸残基のポリマーである。非宿主ＤＮＡ分子の発現によって産生されるポリペプチドは、「異種」ペプチドまたはポリペプチドである。本明細書で使用される用語「ポリペプチド」は、タンパク質、ペプチド、およびポリペプチドを含み、前記タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、翻訳後修飾されてもされなくてもよい。翻訳後修飾は、例えば、リン酸化、メチル化、およびグリコシル化であり得る。
【００４０】
用語「発現」は、遺伝子または遺伝子産物の生合成を指す。
【００４１】
「ハイブリダイズする」は、異なる源に由来する核酸鎖をアニーリングすること；すなわち元は対でなかったＤＮＡの２本の鎖の相補的な領域間で塩基対を形成することを意味する。用語「ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）、１．１０１−１．１０４に従って定義されている。好ましくは、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、５０℃、好ましくは５５℃、より好ましくは６２℃、最も好ましくは６８℃で、１XＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで１時間洗浄した後、特に、５０℃、好ましくは５５℃、より好ましくは６２℃、最も好ましくは６８℃で、０．２XＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで１時間洗浄した後に、正のハイブリダイゼーションシグナルが観察されることを意味する。
【００４２】
「完全な相同性」の伸長は、相互作用するヌクレオチドの配列に沿って対を形成しているヌクレオチドの一致として定義され、例えば、自然発生のＲＮＡでは、ＡとＵおよびＧとＣが対を形成する。
【００４３】
「プロモーター」は、構造遺伝子の転写を導くヌクレオチド配列である。典型的には、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位に近接した、遺伝子の５’非コード領域に位置する。転写の開始で機能するプロモーター内の配列要素は、しばしば、コンセンサスヌクレオチド配列によって特徴付けられる。プロモーターが誘導プロモーターの場合は、転写速度が、誘導剤に応答して上昇する。対照的に、プロモーターが構成的プロモーターの場合は、転写速度は、誘導剤によって調節されない。抑制プロモーターも知られている。
【００４４】
「調節要素」は、プロモーターの活性を調節するヌクレオチド配列である。例えば、調節要素は、特定の細胞、組織、または細胞小器官で排他的または優先的に転写を可能にする細胞因子と結合するヌクレオチド配列を含み得る。これらのタイプの調節要素は、通常は、「細胞特異的」、「組織特異的」、または「細胞小器官特異的」に発現される遺伝子に結合する。
【００４５】
「エンハンサー」は、転写開始部位に対するエンハンサーの距離または方向にかかわらず、転写の効率を上げることができる一種の調節要素である。
【００４６】
「クローニングベクター」は、宿主細胞で自律的に複製する能力を有するプラスミド、コスミド、またはバクテリオファージなどの核酸分子である。クローニングベクターは、典型的には、ベクターの必須の生物学的機能を失わずに確実に核酸分子の挿入を可能にする１つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、およびクローニングベクターで形質転換される細胞の識別および選択に使用するのに適したマーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む。マーカー遺伝子は、典型的には、テトラサイクリンまたはアンピシリン耐性を与える遺伝子を含む。
【００４７】
「発現ベクター」は、宿主細胞で発現される遺伝子をコードする核酸分子である。典型的には、発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子、および転写終結因子を含む。遺伝子発現は、通常はプロモーターの制御下に置かれ、このような遺伝子は、プロモーターに「機能的に連結」されていると言われる。同様に、調節要素およびコアプロモーターは、調節要素がコアプロモーターの活性を調節する場合は機能的に連結されている。「転写ベクター」と呼ばれるより単純なベクターは、転写され得るだけで翻訳され得ない：発現ベクターとは異なり、標的細胞で複製され得るが発現され得ない。転写ベクターは、それらの挿入断片を増幅するために使用される。
【００４８】
「組換え宿主」は、クローニングベクターまたは発現ベクターなどの異種核酸分子を含む細胞である。
【００４９】
トランスフェクションは、真核細胞内への外来物質の導入を表す。非ウイルス法に用いる用語「トランスフェクション」は、哺乳動物細胞に関する場合に最も頻繁に使用されるが、用語「形質転換」は、細菌ならびに菌類、藻類、および植物などの非動物真核細胞における非ウイルスＤＮＡ移入を表す際に好まれる。両方の化学的および物理的方法は、細胞を形質移入するために利用することができる。
【００５０】
「ポリペプチド」は、天然または合成的に作製されるかにかかわらず、好ましくはペプチド結合のみによって結合されたアミノ酸残基のポリマーである。非宿主ＤＮＡ分子の発現によって産生されるポリペプチドは、「異種」ペプチドまたはポリペプチドである。本明細書で使用される用語「ポリペプチド」は、タンパク質、ペプチド、およびポリペプチドを含み、前記タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、翻訳後修飾されてもされなくてもよい。翻訳後修飾は、例えば、リン酸化、メチル化、およびグルコシル化であり得る。
【００５１】
「アミノ酸残基」は、ペプチド結合またはペプチド結合とは異なる結合によって連結された天然または非天然アミノ酸残基とすることができる。アミノ酸残基は、Ｄ立体配置またはＬ立体配置とすることができる。アミノ酸残基は、炭素原子または炭素原子鎖を含む中心部分によって分離されたアミノ末端部分（ＮＨ２）およびカルボキシ末端部分（ＣＯＯＨ）を含み、これらの少なくとも一方は、少なくとも１つの側鎖または官能基を含む。ＮＨ２は、アミノ酸またはペプチドのアミノ末端に存在するアミノ基を指し、ＣＯＯＨは、アミノ酸またはペプチドのカルボキシ末端に存在するカルボキシ基を指す。一般用語、アミノ酸は、天然および非天然のアミノ酸の両方を含む。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４３：３５５２−５９（１９６９）に列記され、そして３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．、節１．８２２（ｂ）（２）に採用されている標準的な命名法の天然アミノ酸は、以下に示す表１に列記されているアミノ酸の群に属する。非天然アミノ酸は、以下の表１に列記されていないアミノ酸である。非天然アミノ酸の例は、例えば、参照によりその全容が本明細書に組み入れられる３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．、節１．８２２（ｂ）（４）に列記されているアミノ酸である。また、非天然アミノ酸残基には、限定されるものではないが、修飾されたアミノ酸残基、Ｌ−アミノ酸残基、およびＤ−アミノ酸残基の立体異性体が含まれる。
【００５２】
【表１】
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【００５３】
「等価なアミノ酸残基」は、ポリペプチドの構造および／または機能性を実質的に変更することなく、ポリペプチドにおけるアミノ酸残基に取って代わることができる別のアミノ酸残基を指す。したがって、等価なアミノ酸は、側鎖の嵩、側鎖の極性（極性または非極性）、疎水性（疎水性または親水性）、ｐＨ（酸性、中性、塩基性）、および炭素分子の側鎖機構（芳香族／脂肪族）などの類似の特性を有する。したがって、「等価なアミノ酸残基」は、「保存的なアミノ酸置換」と見なすことができる。
【００５４】
等価なアミノ酸の分類は、一実施形態では、次のクラス：（１）ＨＲＫ、（２）ＤＥＮＱ、（３）Ｃ、（４）ＳＴＰＡＧ、（５）ＭＩＬＶ、および（６）ＦＹＷとなる。
【００５５】
本明細書で使用される用語「等価なアミノ酸置換」の意味の範囲内で、１つのアミノ酸を、一実施形態では、以下に示すアミノ酸群の中の別のアミノ酸で置換することができる。
（ｉ）極性側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、およびＣｙｓ）
（ｉｉ）非極性側鎖を有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、およびＭｅｔ）
（ｉｉｉ）脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ）
（ｉｖ）環側鎖を有するアミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ）
（ｖ）芳香族側鎖を有するアミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）
（ｖｉ）酸性側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）
（ｖｉｉ）塩基性側鎖を有するアミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）
（ｖｉｉｉ）アミド側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｎ、Ｇｌｎ）
（ｉｘ）ヒドロキシ側鎖を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）
（ｘ）硫黄（ｓｕｌｐｈｏｒ）含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃｙｓ、Ｍｅｔ）
（ｘｉ）中性の弱い疎水性アミノ酸（Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）
（ｘｉｉ）親水性酸性アミノ酸（Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ）
（ｘｉｉｉ）疎水性アミノ酸（Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ）
【００５６】
本発明はまた、Ｈｓｐ７０の変異体またはその断片にも関し、置換が、配列相同性を使用して置換がタンパク質機能に影響を与えるか否かを予測するコンピューター分析によって設計された（例えば、Ｐａｕｌｉｎｅ  Ｃ．ＮｇおよびＳｔｅｖｅｎ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第１１巻、第５版、８６３−８７４、Ｍａｙ  ２００１）。
【００５７】
標準分析法の不正確さにより、ポリマーの分子量および長さは、概略値であることを理解されたい。このような値が、「約」Ｘまたは「概ね」Ｘとして表される場合、Ｘの表示値は、±２０％、例えば、±１０％、例えば、±５％の精度であることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】主なスフィンゴ脂質加水分解および関連する疾患の模式図である。短い親水性頭基を有するスフィンゴ脂質のエキソ加水分解（ｅｘｏｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ  ｂｒｅａｋｄｏｗｎ）には、非酵素補助因子、スフィンゴ脂質活性化タンパク質（ＳＡＰまたはサポシン）が必要である。それぞれの酵素の先天性欠損および対応する活性化タンパク質の先天性欠損が、リソソーム脂質の蓄積をもたらし、結果として様々なスフィンゴリピドーシスが発現する。Ｆｅｒｌｉｎｔｚら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ、（１０２）３５−４３、１９９９を参照。点線で描いた円で示された疾患は、ＢＭＰと相互作用する酵素の欠損と関連する疾患であり、点線で描いた円で示されない疾患は、したがって、ＢＭＰ依存性酵素と関連しない疾患である。
【図２】リソソームＨｓｐ７０がリソソーム膜を安定させることを示す図である。（ａ）３００ｎＭ  ｒＨｓｐ７０−ＡＦ４８８（緑色）と共に２４時間インキュベートし、固定し、そしてリソソーム内在性膜タンパク質１（ＬＭＰ−１；赤色）で染色したＵ−２−ＯＳ細胞の代表的な共焦点画像。他の細胞小器官マーカーとの共局在化については図３を参照。（ｂ）Ｕ−２−ＯＳ細胞を３００ｎＭ  ｒＨｓｐ７０−ＡＦ４８８と共に２４時間インキュベートし、その後冷凍／解凍サイクルを繰り返し、軽い膜画分（ＬＭＦ）を遠心分離して得た上清（ｓｕｐ．）および膜（ｍｅｍｂ．）におけるｒＨｓｐ７０−ＡＦ４８８の定量を行った。リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ−２）およびカテプシンＢ（Ｃａｔ  Ｂ）の免疫ブロット分析が、分画法の有効性を実証する。（ｃ）光酸化（アクリジンオレンジおよび青色光）に曝露されたＵ−２−ＯＳ細胞の代表的な静止画。リソソーム完全性の喪失は、赤色染色の消失および緑色染色の増加によって可視化された。（ｄおよびｅ）Ｕ−２−ＯＳ細胞を示された組換えタンパク質（３００ｎＭ）と共に２４時間インキュベートし、光酸化時のリソソーム完全性について分析した。示されている場合は、組換えタンパク質の添加の前に、細胞を示されたｓｉＲＮＡで４８時間処理した（ｅ）。値は、３つ（ｄ）または５つ（ｅ）の独立した実験についての平均±ＳＤ（標準偏差）を表す。未処理のまま、またはコントロールもしくはＨｓｐ７０  ｓｉＲＮＡで処理したＵ−２−ＯＳ細胞由来の示されたタンパク質の代表的な免疫ブロットが、右側に示されている。スケールバー：２０μｍ（ａおよびｃ）。
【図３】エンドサイトーシスされたｒＨｓｐ７０−ＡＦ４８８とリソソームの共局在化を示す図である。３００ｎＭ  ｒＨｓｐ７０−ＡＦ４８８（緑色）と共に２４時間インキュベートし、固定し、そして次の細胞小器官マーカー（赤色）：リソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ−１；リソソーム）、ＬＡＭＰ−２（リソソーム）、ＬＢＰＡ／ＢＭＰ（６Ｃ４；エンドリソソーム区画）、ｃｕｔ  ｃ（ミトコンドリア）、ＳＥＲＣＡ（ＥＲ）、およびｇｏｌｇｉｎ−９７（Ｇｏｌｇｉ）で染色したＵ−２−ＯＳ細胞の代表的な共焦点画像。スケールバー：２０μｍ（ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、およびＢＭＰ）または１０μｍ（Ｃｙｔ  ｃ、ＳＥＲＣＡ、およびＧｏｌｇｉｎ−９７）。
【図４】Ｈｓｐ７０が他の分子のエンドサイトーシスによる取り込みを増加させることを示す図である。グラフＡ：野生型（ＷＴ）またはＨｓｐ７０トランスジェニック（ＴＧ）の不死化マウス胎児線維芽細胞（ｉＭＥＦ）を、２０μｇ／ｍＬ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−４８８標識ＢＳＡ（ＢＳＡ＊）と共に２４時間インキュベートした。エンドサイトーシスによる取り込みを、蛍光顕微鏡検査によって検証した（不図示）。次いで、細胞を収集し、ＢＳＡ＊の取り込みについて分析した。図から分かるように、Ｈｓｐ７０−トランスジェニックｉＭＥＦは、野生型ｉＭＥＦよりも有意に多くＢＳＡ＊を取り込んでいた。グラフＢ：Ｕ２ＯＳ骨肉腫細胞を、示されているように３０００ｎＭ  ｒＨｓｐ７０を用いてまたは用いずに２０μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ＊と共に２４時間インキュベートした。エンドサイトーシスによる取り込みを、蛍光顕微鏡検査によって検証した（不図示）。次いで、細胞を収集し、ＢＳＡ＊の取り込みについて分析した。図から分かるように、ＢＳＡ＊およびｒＨｓｐ７０が一緒に添加されたＵ２ＯＳ細胞は、ＢＳＡ＊のみと共にインキュベートした細胞よりも有意に多くＢＳＡ＊を取り込んでいた。
【図５】パルスチェイス実験を示す図である。Ｔ＝０で、ｒｈＨＳＰ７０（組換えヒトＨｓｐ７０）をニーマンピック病Ａ型患者(患者識別名：８３／２４)由来の初代線維芽細胞に添加した。投与後、２４時間、４８時間、７２時間、および1週間のリソソーム断面積を測定した。上図Ａは生のデータを示し、下図Ｂは同時点での未処理細胞のデータで基準化されたｒｈＨＳＰ７０処理細胞のデータを示す。結論：ｒｈＨＳＰ７０の効果は、逆転性を有し、約１週間持続する。
【図６】アリモクロモル用量滴定実験を示す図である。様々な濃度のアリモクロモル（「Ａｒｉ」）を、ニーマンピック病Ａ型患者(患者識別名：８３／２４)由来の初代線維芽細胞に４８時間加した。リソソーム断面積を読み取った。結論：低分子ＨＳＰ７０誘導物質アリモクロモルは、リソソーム初期病状（リソソーム蓄積）を、用量依存的に効果的に逆戻りさせる。
【図７】非スフィンゴリピドーシスにおけるｒｈＨＳＰ７０試験を示す図である。(取込みの視覚化のため)Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で標識されたｒｈＨＳＰ７０を、ニーマンピック病Ｃ１型患者(Ｃｏｒｉｅｌｌ  細胞バンク  識別番号：ＧＭ１７９１８)由来の初代線維芽細胞に４８時間添加した。リソソーム断面積（初期の細胞病状）の読み取りは、レーザー共焦顕微鏡法によって実施した。結論：ｒｈＨＳＰ７０は、ニーマンピック病Ｃ１型におけるリソソーム初期病状（すなわち、リソソーム蓄積）を効果的に逆戻りさせる。
【図８】非スフィンゴリピドーシスにおけるｒｈＨＳＰ７０試験を示す図である。(取込みの視覚化のため)Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で標識されたｒｈＨＳＰ７０を、ムコ多糖症IIIＡ型（別名  サンフィリポ症（Ｓａｎｆｉｌｉｐｐｏ）IIIＡ型）患者(Ｃｏｒｉｅｌｌ  細胞バンク  識別番号：ＧＭ００８７９)由来の初代線維芽細胞に４８時間添加した。リソソーム断面積（初期の細胞病状）の読み取りは、レーザー共焦顕微鏡法によって実施した。結論：ｒｈＨＳＰ７０は、ムコ多糖症IIIＡ型におけるリソソーム初期病状（すなわち、リソソーム蓄積）を効果的に逆戻りさせる。
【図９】非スフィンゴリピドーシスにおけるｒｈＨＳＰ７０試験を示す図である。(取込みの視覚化のため)Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で標識されたｒｈＨＳＰ７０を、ムコ多糖症IVＡ型（別名  (疾病)モルキオ症（Ｍｏｒｑｕｉｏ）IVＡ型）患者(Ｃｏｒｉｅｌｌ  細胞バンク  識別番号：ＧＭ００９５８)由来の初代線維芽細胞に４８時間添加した。リソソーム断面積（初期の細胞病状）の読み取りは、レーザー共焦顕微鏡法によって実施した。結論：ｒｈＨＳＰ７０は、ムコ多糖症IVＡ型におけるリソソーム初期病状（すなわち、リソソーム蓄積）を効果的に逆戻りさせる。
【図１０】非スフィンゴリピドーシスにおけるｒｈＨＳＰ７０試験を示す図である。ｒｈＨＳＰ７０を、サンドホフ病（Ｓａｎｄｈｏｆｆ  ｄｉｓｅａｓｅ）およびムコ多糖症IIIＡ型（別名  サンフィリポ症（Ｓａｎｆｉｌｉｐｐｏ）IIIＡ型）患者(Ｃｏｒｉｅｌｌ  細胞バンク  識別番号：サンドホフ病：ＧＭ１１０９８，ＭＰＳIIIＡ型：ＧＭ００８７９)由来の初代線維芽細胞に４８時間添加した。Ｃｔｒｌは、正常なコントロール線維芽細胞を表す。酸性画分量（ＶＡＣ）（初期の細胞病状）の読み取りは、ＦＡＣＳによって実施した。結論：ｒｈＨＳＰ７０は、サンドホフ病（Ｓａｎｄｈｏｆｆ  ｄｉｓｅａｓｅ）およびムコ多糖症IIIＡ型患者の初代線維芽細胞におけるリソソーム初期病状（すなわち、リソソーム蓄積）を効果的に逆戻りさせる。
【図１１】ｒｈＨＳＰ７０は、ＭＣＦ−７−ＬＣ３−ＥＧＦＰ細胞において自己貪食を誘導する。２０μｇ／ｍｌのｒｈＨＳＰ７０を培地へ添加すると、マクロオートファジーのマーカーであるＬＣ３−ＥＧＦＰのトランスロケーションおよび蓄積が誘導される。
【図１２】コントロールＮＰＣ−／−マウス（Ａ）は、Ｈｓｐ７０処理マウス（Ｂ）よりも、より浅く、かつ、より散発性の成長パターンを示す。成長曲線が突然止まっている箇所は、マウスが器官不全のため死に至ったことを示す。パネルＡ：系１および系３は雌、系２および系５から８は雄である。パネルＢ：系２および系４から７は雌、系１，３、および系８は雄である。
【図１３】（Ａ）表示された振戦度数分布は、処理マウスにおける、特に低い度数分布での平均増加量を示す。（処理マウスおよびコントロールマウス：ｎ＝５、野生型（Ｗｔ）：ｎ＝１）側後部（Ｂ）は比較的同等であるが、コントロールマウスにおいてはまったく制御されることはない（Ｃ）。中央後部においても状況は同じである（Ｄ）が、コントロールマウスにおける制御は５０％である（Ｅ）。（処理マウス：ｎ＝５、コントロールマウス：ｎ＝４）
【図１４】処理動物とコントロールにおける、７週間後（パネルＡ）および９週間後（パネルＢ）のコレステロール測定値を示す図である。
【図１５】処理動物とコントロールにおける、７週間後（パネルＡ）および９週間後（パネルＢ）のＧＳＬ測定値を示す図である。
【図１６】処理動物とコントロールにおける、７週間後および９週間後のスフィンゴシン測定値を示す図である。
【図１７】アリモクロモルは、ニーマンピック病Ｃ型患者細胞においてＨｓｐ７０の発現を増大させる。パネルＡ：４２度、６０分のＨＳにさらしたＮＰＣ  ＧＭ１８４５３患者細胞を示す。パネルＢ：ＨＳを受けていないＮＰＣ  ＧＭ１８４５３患者細胞を示す。
【図１８】イロキサナジン（ｉｒｏｘａｎａｄｉｎｅ）は、ニーマンピック病Ａ型患者細胞においてＨｓｐ７０の発現を増大させる。ＮＰＤＡ細胞（Ｂ５３４  Ｒ４９６Ｌ）、４０度、熱ショック（Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ）６０分。縦軸は、熱ショックタンパク質７０（Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ７０）誘導（Ａ．Ｕ．）を示す。
【図１９】アリモクロモルは、ファブリー病患者細胞においてＨｓｐ７０の発現を増大させる。アリモクロモルで処理されたファブリー病患者細胞を示す。縦軸は、熱ショックタンパク質７０（Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ７０）誘導（Ａ．Ｕ．）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
本発明者らによって実証されるように、Ｈｓｐ７０は、その活性が補助因子のリソソームＢＭＰの存在とは直接には関連しない酵素の欠陥によって生じるこれらのリソソーム蓄積症、例えば、グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型の病状を逆戻りさせることに有益である。
【００６０】
リソソーム
１９５５年のｄｅ  Ｄｕｖｅによるリソソームの発見以来、この細胞小器官の見方は、単に動物細胞におけるエンドサイトーシス経路の終点、すなわち細胞質ゾル内に放出されると壊死おび組織の炎症を引き起こす様々な加水分解酵素を収容する区画であるというドグマによって支配されてきた。良くてもゴミ箱、悪いと曖昧な「自殺バッグ」というリソソームに対する見方は、リソソームおよびその内容物の様々なより明確な役割についての証拠を提供する最近の発見によって劇的に変化した。
【００６１】
リソソーム加水分解酵素
細胞内の分解およびそれに続く細胞成分の再利用のための主な区画として、リソソームは、この細胞小器官の内腔で最終目的地を見つける異種および自己貪食カーゴの両方を受け取る。分解は、全ての主な細胞巨大分子を消化することができる多数の酸性加水分解酵素（ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、グリコシダーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、スルファターゼ、リパーゼなど）によって行われる。この中で最も研究されたリソソームプロテアーゼは、カテプシンプロテアーゼのファミリーである。カテプシンは、それらの活性部位のアミノ酸によって３つのサブグループ、すなわちシステイン（Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｏ、Ｓ、Ｖ、Ｗ、およびＸ／Ｚ）、アスパラギン酸（ＤおよびＥ）、およびセリン（Ｇ）カテプシンに分けられる。カテプシンは、リソソームの酸性ｐＨ（ｐＨ４〜５）で最適に機能し、中性ｐＨのリソソームの外部でも、安定性の低下および／または特異性の変更があるがなお機能することができる。
【００６２】
最近まで、カテプシンの機能は、リソソーム内タンパク質の代謝回転、および分泌された後の細胞外マトリックスの分解に限定されていると思われていた。しかし、過去２、３年の間に、多くのカテプシンは、プログラム細胞死（ＰＣＤ）はもちろん、骨リモデリング、抗原提示、表皮恒常性、プロホルモンのプロセシング、脱顆粒後の自己破壊からの細胞傷害性リンパ球の保護、マウスにおける中枢神経系の維持、脈管形成、癌細胞の侵入における役割を含め、より明確な機能を持つと見なされている。
【００６３】
タンパク質の分解とは別に、リソソームおよび後期エンドソームは、適切な機能がイントラリソソーム膜（ｉｎｔｒａ−ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）の脂質組成に依存する一連のエンドリソソーム酵素（ｅｎｄｏｌｙｓｏｍａｌ  ｅｎｚｙｍｅ）および補酵素（ｃｏ−ｅｎｓｙｍｅ）によってスフィンゴ糖脂質などの細胞内脂質の代謝にも関与する。機能性エンドリソソーム脂質代謝の重要性は、臨床疾患が、スフィンゴ脂質の代謝のいずれかの段階で機能障害の場合に、テイサックス病（Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、サンドホフ病（Ｓａｎｄｈｏｆｆ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ファーバー病、ファブリー病、ゴーシェ病、クラッベ病、およびニーマンピック病などの疾患を生じさせることが明らかであるという事実によって容易に理解され得る。
【００６４】
リソソームの内外への輸送
細胞内膜の輸送は、膜構成成分、様々な溶質分子、および受容体結合リガンドの様々な細胞内区画への送達によって哺乳動物細胞に必須の役割を果たす。主な経路がリソソームで１つになり、そこで分解され場合によっては原形質膜に戻り再利用が行われるため、様々なエンドサイトーシス経路が最近まで単純であると思われていたが、最近の証拠は、これらの経路が初めに考えられていたよりも複雑であることを示している。
【００６５】
エンドサイトーシス経路
エンドサイトーシスは、クラスリン被覆ピットの形成による分子の受容体媒介エンドサイトーシスに関して最もよく理解されているが、様々な非クラスリン媒介エンドサイトーシス経路（例えば、マクロピノサイトーシス、食作用、カベオラ形成および非クラスリン被覆ピット形成による取り込み）も同定された。エンドサイトーシス系の命名法は、完全に標準化されているものではなく、一般的に使用される用語「初期エンドソーム」は、実際は、ソーティングエンドソーム区画およびエンドサイトーシス再利用区画（ＥＲＣ）の２つの異なるエンドソーム区画を表す。従来の受容体媒介エンドサイトーシス経路では、トランスフェリン受容体、低密度リポタンパク質受容体、およびマンノース６−リン酸受容体（ＭＰＲ）などの受容体は、それらの細胞質尾部の配列モチーフとクラスリン被覆の要素との間の相互作用によって原形質膜の表面におけるクラスリン被覆ピット内に集中する。クラスリン被覆の脱落後、新規に形成されたエンドソームが、他のエンドソームおよび既存のソーティングエンドソームに融合してソーティングエンドソームになる。この名称が示唆するように、その主な役割は、新規に得た構成成分を正しい位置に振り分けることである。３つの既知の目的地には、原形質膜、後期エンドソーム、およびＥＲＣが含まれる。ソーティングエンドソームが成熟すると、そのｐＨが低下し、これにより受容体結合リガンドのエンドソームの内腔内への放出が促進される。しかし、ソーティングエンドソームが後期エンドソームに完全に成熟する前に、再利用される運命の分子は選別されなければならない。このプロセスは、微細管の表面積と容積の比が小胞ソーティングエンドソームの表面積と容積の比よりも大きいため、膜タンパク質の溶質分子からの選別を好むプロセスである微細管の締め付けによって起こると考えられている。締め付けられた微細管は、膜タンパク質を原形質膜に直接戻す（直接戻し経路）かまたはＥＲＣに送ることができる。ＥＲＣは、主に、細胞型間で局在化が異なる管状細胞小器官の集まりである。ＥＲＣは、分子をいくつかの異なる目的地に振り分けることができるが、ＥＲＣを介して送られる分子の殆どは原形質膜に戻る。
【００６６】
ソーティングエンドソームが成熟すると、主に液胞型プロトンＡＴＰアーゼ（Ｖ−ＡＴＰａｓｅ）の作用によって、その内腔のｐＨが確実に低下し、膜脂質およびタンパク質組成の変化も起こる。ソーティングエンドソームから後期エンドソームを経たリソソームへの膜の輸送は論議を呼んでいる。この論争は、この輸送が、小胞輸送によって、またはソーティングエンドソームの成熟によって最もよく説明されるかについてのものである。両方のモデルは、ソーティングエンドソームと後期エンドソームの間の中間体を提供する。成熟モデルは、後期エンドソームに達する小胞が、前ソーティングエンドソームからの構成成分の除去後に残る物であることを主張し、既存の区画モデルは、分子の後期エンドソームへの輸送が、既存のソーティングエンドソーム区画と後期エンドソーム区画との間の特定の輸送小胞であるエンドサイトーシスキャリア小胞（ＥＣＶ）によって起こることを主張している。ソーティングエンドソーム区画および後期エンドソーム区画の両方は、キャリア小胞よりも構造的に複雑であり、かつより特殊化した機能を有すると考えられている。しかし、最近の生細胞の画像研究により、動的な初期エンドソームネットワークから生じる小胞が、低分子量ＧＴＰアーゼＲＡＢ５を放ち後期エンドソームのマーカーであるＲＡＢ７を補充する転換を受け得るため、両方のモデルの機構的な側面が一致した。エンドサイトーシス経路の機構は、機能的には十分に定義されているが、この命名法は混乱を招き得る。機能上、エンドサイトーシス経路は、ハウスキーピング受容体（例えば、トランスフェリン受容体）と、タンパク質分解が起こり得る後期エンドソームではなく受容体−リガンド脱共役が起こる初期エンドソーム／ソーティングエンドソームによって循環される他の脂質およびタンパク質によって規定されている。しかし、これらの機能基準を超越して、命名法になると、特に、初期エンドソームで始まり、後期エンドソームへの成熟の際にますます顕著になる内腔小胞の産生が、用語「多小胞体」（ＭＶＢ）を生んでいるため、概念が不透明になる。この用語は、リソソームが後期エンドソーム（多小胞体構造を含む）に融合すると形成するハイブリッド細胞小器官を含め、多小胞体領域または要素を含むすべてのエンドサイトーシス小胞はもちろん、ＥＣＶおよび後期エンドソームの別名として同義的に使用されている。しかし、後期エンドソームは、初期エンドソームよりも多くの内腔膜小胞を含むため、この区画は、しばしば用語「多小胞体」を用いて表現される。
【００６７】
最終的に、後期エンドソームのリソソームに対する定義から、いやむしろその定義の不足から、当分野でかなりの混乱が生じている。両方の区画は、同等に酸性であり、リソソーム内に存在するすべてではないにしても殆どのタンパク質が、後期エンドソームにも見られる。成熟モデルによると、後期エンドソームは、恐らくリソソームの前駆体であるが、理論が示すように徐々に発生するため、厳密な分類を実現することは非常に困難であろう。しかし、最近、リソソームと後期エンドソームが別個の区画であり、これらの区画が、「キッシング（ｋｉｓｓｉｎｇ）」事象（一過性の融合）および完全な融合事象の両方を経て、リソソームがハイブリッド細胞小器官から再形成され得る証拠が提示された。
【００６８】
生合成経路
エンドサイトーシスとは別に、後期エンドソームも、トランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）からＭＰＲ経路を介してカーゴを受け取る（生合成経路）。陽イオン依存性ＭＰＲおよび陽イオン非依存性ＭＰＲ／インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）受容体は、新規に合成された酸性加水分解酵素のＴＧＮからリソソームへの送達の役割を共有する。ＭＰＲによる酸性加水分解酵素の認識には、小胞体における糖の付加およびこれに続く修飾、ならびにシスゴルジにおけるマンノース６−リン酸部分に対する糖残基のリン酸化が必要である。ＭＰＲ結合加水分解酵素は、まずエンドソームに送達され、そこで内腔ｐＨの低下により受容体から解離し、これにより受容体がＴＧＮに戻り再利用可能となる。ＴＧＮにおけるクラスリン被覆ピットにＭＰＲをふるい分けることに主に関与するこのタンパク質は、アダプタータンパク質−１（ＡＰ−１）であるが、ゴルジ局在性γ−ｅａｒ含有ＡＤＰリボシル化因子結合タンパク質（ＧＧＡ）も役割を果たす。ＡＰ−１およびＧＧＡが、協働するか、または実際に２つのＭＰＲを細胞内の異なる場所に局在化させるか否かは、現在は未知である。ＡＰ−１は、４つのメンバーからなるアダプタータンパク質ファミリーの一部であり、メンバーのすべては、分泌経路およびエンドサイトーシス経路で広範に利用されているヘテロ四量体タンパク質である。ＴＧＮで形成されるクラスリン被覆ピットにおけるＡＰ−１の上述の役割に加えて、ＡＰ−１およびＡＰ−２は、原形質膜でのエンドサイトーシス中にクラスリン被覆ピットで使用される一方、ＡＰ−３およびＡＰ−４は、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ）の輸送において機能する。
【００６９】
自己貪食経路
自己貪食は、巨大分子をリソソームに到達させる第３の十分に特徴付けられた経路である。自己貪食は、長寿のタンパク質および細胞小器官の代謝回転に関与する進化的に保存された経路である。自己貪食は、通常は低い基礎レベルで機能するが、例えば、栄養飢餓の条件下で誘導され得る。これらの条件下では、マクロオートファジーは、物質のリソソームへの送達に関与する主経路である。マクロオートファジーは、細胞質小器官および／または細胞質ゾルの一部の回りを覆って閉じた二重膜結合液胞、すなわちオートファゴソームを形成する平坦な膜の槽によって特徴付けられる。オートファゴソームは、最終的にリソソームに融合して、飲み込まれた巨大分子の分解および再利用が行われるオートファゴリソソーム／オートリソソームを形成する。オートファゴソーム膜の起源は、いまだ解明されていない。小胞体、ゴルジ、デノボ合成と同様、ファーゴフォア（ｐｈａｇｏｐｈｏｒｅ）と呼ばれる十分には特徴付けられていない膜画分は、すべて、オートファゴソーム膜の起源として提唱された。酵母遺伝学による最近の進歩および続く哺乳動物相同体の発見により、自己貪食プロセスの理解が急速に深まり、近い将来、オートファゴソーム膜の起源が明らかになることが望まれる。
【００７０】
また、リソソームが自己貪食カーゴを受け取る他の経路も存在する。ミクロオートファジーと呼ばれるかなり無差別的なプロセスは、リソソーム膜の陥入によるリソソームの細胞質ゾルの飲み込みによって特徴付けられる。飲み込まれた細胞質内に存在する巨大分子に加えて、このプロセスは、ペルオキシソームなどの細胞小器官の取り込みにも関与し得る。最終的に、細胞質ゾルタンパク質のリソソーム内腔へのシャペロン媒介輸送は、より直接的かつ選択的な自己貪食の形態である。この経路は、リソソーム膜の両側における、熱ショックタンパク質７０ファミリーの恒常的に発現されるメンバー、Ｈｓｃ７０の存在に依存する。このプロセスは、ＬＡＭＰ−２ａによる標的タンパク質におけるＫＤＥＬ配列モチーフの認識にさらに依存する。
【００７１】
本発明によってこれまでに示されてきたように、ｒｈＨｓｐ７０は、ＢＭＰと結合し、補助因子であるＢＭＰに依存するこれらの酵素に対して、その活性化を促進する。このＨｓｐ７０−ＢＭＰ相互作用は、ＢＭＰと相互作用する酵素と関連するリソソーム蓄積症の病状を逆戻りさせることにおいて重要な役割を果たすことが示された。（ＷＯ２００９／１５５９３６）
【００７２】
本発明者らは、Ｈｓｐ７０が自己貪食の潜在的な誘導物質であることを、ここでさらに明らかにしてきた（図１１参照）。自己貪食的流動が増大することによる、自己貪食経路の最終ステップとしてのリソソームへのオートファゴソームの融合が起こることによって、リソソームに影響を与えることが考えられ得る。Ｈｓｐ７０による自己貪食の誘導が、リソソーム蓄積症による基質の異常蓄積をともなうリソソームの自己貪食クリアランスの増加を誘導することも考えられる。
【００７３】
リソソームの再構築およびリソソーム分泌
リソソームの後期エンドソームまたはオートファゴソームとの融合後、リソソームは、膜タンパク質の隔離および内腔内容物の凝縮によって得られるハイブリッド細胞小器官から再構築される。ハイブリッド細胞小器官から除去または再利用される必要がある膜タンパク質のうち、最も明白なものは、定義によるとＭＰＲはリソソームに存在しないためＭＰＲである。しかし、リソソームは、造血起源の分泌細胞で最初に認められたＣａ２＋依存性のプロセスである、分泌顆粒との融合によって分泌リソソームを形成することもできるため、エンドサイトーシス経路の終点として見ることができない。しかし、非分泌細胞でエキソサイトーシスに関与するＣａ２＋調節膜−近位リソソーム画分の証拠も存在する。エキソサイトーシスのプロセスは、６０を超えるメンバーを数えるＲａｂタンパク質ファミリーのメンバーであるタンパク質Ｒａｂ２７ａに依存する。Ｒａｂは、小胞形成、運動性、ドッキング、および融合を含む殆どの膜−輸送ステップにおいて重要な調節の役割を有する低分子量ＧＴＰアーゼである。少なくとも１３のＲａｂタンパク質が、様々なエンドサイトーシスされた分子およびそれらの小胞の運命を決定するためにエンドサイトーシス経路で利用される。
【００７４】
プログラム細胞死
全細胞数および様々な組織を構成する細胞の量の調節は、不要な細胞を除去する機構の必要性と共に、多細胞生物において根本的に重要である。プログラム細胞死は、この目的を達成するための手段であり、細胞成分を漏らさず、このためプログラム細胞死に対する概念的な対応物であるネクローシスに関連した炎症をおこさせることなく、不要な細胞を除去する潜在能力を多細胞生物に付与する。
【００７５】
アポトーシス
アポトーシスという語は、花から花弁または樹木から葉の「脱落」または「落下」を表現するためにギリシャ語で使用されており、多数の組織および細胞型で観察した一般的なタイプのプログラム細胞死を表現するために１９７２年にＣｕｒｒｉｅおよび同僚らによって最初に作成された。作成者らは、観察した事象が、病理学的なネクローシスで死ぬ細胞を特徴付ける形態学的特徴とは異なる有意な形態学的類似性を有することに気付き、これらの一般的な形態学的特徴が同一の基本的なプロセスによるものであり得ることを提唱した。
【００７６】
細胞がアポトーシスによって死ぬ場合、細胞は、一連の転換事象を受ける。これらの事象の中で、特徴的なアポトーシス表現型に必須な事象は、名称のように、特定のアスパラギン酸残基で基質を切断するシステインエンドペプチダーゼのファミリーであるカスパーゼ（システインアスパラギン酸−特異的プロテアーゼ）の活性化である。カスパーゼの活性化により、他のカスパーゼのタンパク質分解プロセシングおよび細胞内のすべてのタンパク質活性の多数の他の変化が起こり、最終的にカスパーゼ活性化に関連した特徴的な形態学的特徴が形成され、従って定義通りにアポトーシスがもたらされる。古典的なアポトーシスの特徴には、細胞収縮および細胞質膜の小疱形成、明確な幾何学的形状での核内でのクロマチンの凝縮、約２００塩基対の整数倍の長さへのＤＮＡの断片化、いわゆるヌクレオソームラダー、隣接細胞からの細胞の解離、およびアポトーシス小体と呼ばれる微小の閉じた小胞への細胞の分解が含まれる。多細胞環境では、これらのアポトーシス小体は、マクロファージまたは隣接する細胞によって最終的に取り込まれ、これにより不要な細胞の除去が完了する。
【００７７】
プログラム細胞死
プログラム細胞死（ＰＣＤ）はアポトーシスと同義ではないが、これらを区別しないで使用する大量の文献に基づいて、これらを同義と見なす傾向にある。用語ＰＣＤは、徐々に取って代わってきているが、用語アポトーシスは今なお、カスパーゼ、特にカスパーゼ３の活性化によって構成される細胞死プログラムを表現するために使用されている。しかし、カスパーゼ活性化が全く存在しないＰＣＤおよび非アポトーシスＰＣＤをもたらすカスパーゼ活性化はもちろん、プロアポトーシスカスパーゼの活性化から生き延びる特定の細胞の能力が、細胞死プログラム（複数可）の顕著な柔軟性を明らかにしたため、ＰＣＤは、死ぬ細胞内のシグナルまたは活性化に依存する細胞死としてより正確に定義され得る。それぞれの定義が固有の形態学的特徴によって作られた死ぬ細胞の核の形態、クロマチン凝縮の形状である主な特徴、またはクロマチン凝縮の非存在に従って、ＰＣＤをアポトーシス、アポトーシス様ＰＣＤ、およびネクローシス様ＰＣＤに細かく分類され得ることが提唱されたが、ＰＣＤに導く所与のセットの条件下で関与するシグナル伝達経路に基づいてＰＣＤを区別することが好ましいであろう。しかし、ＰＣＤの異なるモデル間でのこの区別の方法は、なお適切ではなく、様々な種類の細胞死に導く経路は、まだ判明していない。
【００７８】
ネクローシス
ネクローシスは、ネクローシスをもたらす刺激を除去する以外の他の手段によって防止することができないため、ＰＣＤに対する概念的な対応物である。通常、この細胞死のモデルは、生物体に対する病理学的傷害の際に見られる。
【００７９】
プログラム細胞死の分子機構
アポトーシス
前節で述べたように、アポトーシスは、カスパーゼとして知られているシステインエンドペプチダーゼのファミリーのメンバーの活性化およびその活性化に関連した形態学によって定義される。カスパーゼは、タンパク質分解プロセシングによって急速に活性化され得る不活性のチモーゲンとして細胞内に存在する。このプロセシングは、階層カスケードに進み、そこでアポトーシス刺激がイニシエーターカスパーゼ（例えば、カスパーゼ８および９）を活性化させ、次にこのイニシエーターカスパーゼが、次のレベルの階層でエフェクターカスパーゼ（例えば、カスパーゼ３、６、および７）を活性化させる。後者は、多数の基質を切断するためアポトーシスの実行者と見なされ、このプロセシングが、最終的にアポトーシスに関連した表現型をもたらす。アポトーシスプログラムは、細胞外刺激および細胞内刺激に大きく分類され得る様々な刺激によって活性化され得、細胞内刺激は、ミトコンドリアを必須のプレーヤーとしている。細胞外刺激およびこれに続くアポトーシスをもたらす応答は、外因性シグナル伝達経路とも呼ばれ、Ｆａｓ／Ａｐｏ−１／ＣＤ９５、ＴＮＦＲ、またはＴＲＡＩＬなどの様々な死受容体の１つの活性化で始まる一連の事象からなる。それらの適切なリガンドの結合時に、これらの受容体が、受容体内に存在する死ドメイン（ＤＤ）との相互作用によって、ＴＲＡＤＤ（ＴＮＦＲ１−関連死ドメインタンパク質）およびＦＡＤＤ（死ドメインを持つＦａｓ関連タンパク質）などのＤＤ含有アダプター分子を補充する。次いで、これらのアダプター分子は、受容体複合体にカスパーゼ８を補充し、カスパーゼが、場合によっては近接誘導自己触媒プロセシングによって活性化される。次いで、特定の細胞（いわゆるＩ型細胞）では、カスパーゼ８がプロカスパーゼ３を直接切断して活性化する一方、ＩＩ型細胞では、カスパーゼ８の基層（ｓｕｂｓｔｒａｔｕｍ）が、細胞質タンパク質Ｂｉｄである。Ｂｉｄの切断により、断片（切断型Ｂｉｄ（ｔＢｉｄ））が形成され、この断片が、２つのプロアポトーシスＢｃｌ−２ファミリーメンバー、ＢａｘおよびＢａｋのオリゴマー化、転位置、および外側ミトコンドリア膜への挿入を誘導する。この挿入は、多数の他のタンパク質と共に電子キャリアシトクロムｃ（ＣｙｔＣ）のミトコンドリア内膜空間からの放出を媒介し、これらのタンパク質の最も顕著なものには、アポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）、アポトーシス阻害（ＩＡＰ）タンパク質として知られるタンパク質の効果を無効にするＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ、およびデオキシリボヌクレアーゼであるエンドヌクレアーゼＧが含まれる。これは、ミトコンドリアによるカスパーゼ活性化の理論において極めて重要な点であるが、ＢａｘおよびＢａｋの挿入がどのようにシトクロムｃの放出を促進するかについての決定的な証拠は提示されていないことに留意されたい。ミトコンドリアからの放出時に、ＣｙｔＣが細胞質内に蓄積し、そこでＣｔｙＣがタンパク質Ａｐａｆ−１（アポトーシスプロテアーゼ−活性化因子１）に結合し、Ａｐａｆ−１のオリゴマー化を促進する構造変化が起こる。次いで、このオリゴマーが、カスパーゼリクルートメントドメイン（ＣＡＲＤ）間の同型相互作用によってプロカスパーゼ９に結合し、アポトソーム（ａｐｏｐｔｏｓｏｍｅ）と呼ばれる複合体が形成される。この複合体の形成により、プロカスパーゼ９の酵素活性が大幅に上昇し、この活性がカスパーゼ３のタンパク質分解活性をもたらす。
【００８０】
アポトーシスはまた、内因性経路として知られるプロセスであるミトコンドリア外膜の透過化（ＭＯＭＰ）を誘発する細胞内因子によって引き起こされ得る。これらの因子には、ビリルビン、胆汁酸塩、ならびにタンパク質の変性、核ＤＮＡ損傷、およびミトコンドリアＤＮＡ損傷を生じさせ得る刺激、例えば、電離放射線、熱ストレス、活性酸素種（ＲＯＳ）、および化学療法剤はもちろん、Ｃａ２＋、ＮＯ、およびアラキドン酸などの細胞ストレスに関連した第２のメッセンジャーが含まれる。核ＤＮＡ損傷の事象では、これは、ＤＮＡ損傷の形態だけではなくＤＮＡ損傷を誘発する病毒にも依存する様々なプロテインキナーゼによって検出される。これらのキナーゼの活性は、ｐ５３の蓄積を誘導し、ｐ５３は、すべてがＭＯＭＰを誘導し得るＢａｘ、Ｎｏｘａ、およびＰＵＭＡなどのプロアポトーシス遺伝子の転写を促進させる転写因子として機能し得る。ミトコンドリアレベルにおいて、ｐ５３は、過剰発現がミトコンドリア膜電位の消失およびアポトーシスを引き起こすミトコンドリアマトリックスタンパク質（ｐ５３ＡＩＰ１）はもちろん、ＲＯＳを局所的に産生するミトコンドリア酵素の発現を誘導する。
【００８１】
ｐ５３または上述の内因性刺激の作用によるＭＯＭＰの誘導は、内因性経路および外因性経路が１つになる時点であり、内因性経路のルートは、シトクロムｃの放出、アポトソームの形成、および不要な細胞の死を目的とする最終ステップを構成するカスパーゼ３の活性化を用いて既に説明した外因性経路のルートの後である。
【００８２】
アポトーシス代替物
過去１０年間、ＰＣＤの実行者としてのカスパーゼの独占的な役割に疑問が持たれ、多くの証拠が、カスパーゼのみに帰するのではなく、細胞の生命、特に細胞の死にはもっと多くが存在することを示唆している。
【００８３】
エネルギー枯渇、ニトロ化／酸化ストレス、およびアポトーシスタンパク質の阻害剤（ＩＡＰ）ファミリーのメンバーなどの因子によるカスパーゼ経路の不活化はもちろん、新規に開発されたカスパーゼ特異的な薬理学的な阻害剤は、死に向かった進行を常に停止するものではなく、基本的なカスパーゼ依存性死プログラムのサブセットを明らかにし、促進さえもした。これらのプログラムには、抗癌剤、成長因子欠乏、スタウロスポリン、Ｂａｘ関連タンパク質、およびＨｓｐ７０の欠乏によって誘導される経路はもちろん、死受容体開始経路が含まれる。これらのカスパーゼ依存性死プログラムの形態学的特徴は、しばしば、古典的なアポトーシスで観察されるプログラムを連想させ、カスパーゼの上流または下流の必須の補助因子としてのカテプシン、カルパイン、およびセリンプロテアーゼなどの他のプロテアーゼの役割についての実験的裏付けが急速に増えている。この根拠は、多くの非カスパーゼプロテアーゼが、古典的カスパーゼ基質の少なくとも一部を切断でき、これが、カスパーゼ依存性死プログラムとカスパーゼ非依存性死プログラムとの間で観察される類似点の一部を説明し得るという知見によって補強される。
【００８４】
このような死プログラムの関連性を主張することができるが、死プログラムはカスパーゼの効力によって隠れているものの、腫瘍壊死因子受容体ファミリーの死受容体、低酸素、酸化ストレス、浸透ストレス、熱、および抗癌剤などの様々な刺激に対する応答として開始される細胞死プログラムにおけるリソソームカテプシンプロテアーゼの進化的に保存された役割についての証拠が集まっている。
【００８５】
プログラム細胞死におけるリソソームの関与
ＰＣＤの除去段階、すなわちアポトーシス細胞およびアポトーシス小体の近接細胞または貪食細胞による飲み込みにおけるリソソームおよびその加水分解酵素の役割は十分に確立されているが、ＰＣＤの直近の事象でのリソソームおよびリソソーム加水分解酵素の重要性を認識するには長い時間がかかった。この遅れの１つの理由は、ＰＣＤにおけるカスパーゼの役割を評価するために一般的に使用されるメチルケトンペプチド阻害剤（例えば、ｚＶＡＤ−ｆｍｋ、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋ、Ｂｏｃ−Ｄ−ｆｍｋなど）も、いくつかのシステインカテプシンを含む他のシステインプロテアーゼを阻害するという事実によるものであり得る。この交差反応の認識から９年経っても、非カスパーゼプロテアーゼを阻害できる濃度でのこれらの阻害剤による保護効果は、しばしば、カスパーゼ媒介死経路の証拠としてなお理解され、従ってＰＣＤにおける他のシステインプロテアーゼの役割が、過小評価され続けている。リソソームＰＣＤの発見は、リソソームの超微細構造が、電子顕微鏡法によって分析されたアポトーシス細胞で無傷であるように見えたためにさらに遅れたのであろう。したがって、リソソーム破裂は、制御されていないネクローシス細胞死および組織自己分解の後期段階中の全か無かのスイッチとして最近まで見なされていた。しかし、リソソーム膜完全性のより正確な評価を可能にする新規な技術は、正常な超微細構造を持つリソソームが、その酵素の一部を漏洩させ得ること、および部分的なリソソーム膜透過化（ＬＭＰ）が多くの死プログラムの初期で起こるだけではなく、実際にアポトーシスおよびアポトーシス様ＰＣＤを引き起こし得るということを明らかにした。
【００８６】
リソソーム膜透過化（ＬＭＰ）およびその結果
リソソーム膜の完全性を直接標的とする様々な複合物、例えば、Ｈ２Ｏ２、Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシンメチルエステル、浸透ストレス、スフィンゴシン、リソソーム向性抗生物質（ｌｙｓｏｓｏｍｏｔｒｏｐｉｃ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）ノルフロキサシンおよびシプロフロキサン、ならびに光酸化リソソーム損傷（光分解）を用いた研究が、適度なリソソーム透過化がＰＣＤをもたらし得ることを納得できるように証明した。リソソーム破裂の量と細胞死のモデルとの間の量的関係が、ＬＭＰの後の大きく異なる形態学的結果を説明すると提唱された。このモデルによると、低いストレス強度が、リソソーム内容物の細胞質への限定的な放出を引き起こし、アポトーシスまたはアポトーシス様細胞死が起こるが、高強度ストレスは、全体的なリソソーム破裂および急速な細胞ネクローシスをもたらす。したがって、低いｐＨで界面活性剤様の特性を持つセラミドの酸性セラミダーゼによって生成される代謝産物である、低濃度のスフィンゴシンは、部分的なＬＭＰおよびカスパーゼ媒介アポトーシスを誘導する一方、高濃度では、広範囲のＬＭＰおよびカスパーゼ非依存性ネクローシス細胞死となる。このモデルでは、部分的なＬＭＰによって引き起こされる細胞死は、システインカテプシンおよびアスパラギン酸カテプシンの薬理学的阻害剤によって阻害することができ、細胞質ゾルカテプシン活性の上昇により、カスパーゼの活性化、および細胞死プロセスにおける細胞質ゾルカテプシンの直接的な役割を示唆するミトコンドリア膜電位の変化が起こる。重要なことに、細胞死におけるＬＭＰおよびカテプシンの役割は、直接のリソソーム破裂物質を利用する実験的なモデルに限定されるものではない。ＬＭＰはまた、様々な古典的なアポトーシス刺激、例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリー、インターロイキン１の死受容体の活性化、ｐ５３の活性化、成長因子飢餓、微小管安定化剤、エトポシド、σ−２受容体の活性化、合成レチノイドＣＤ４３７、Ｂ細胞受容体の活性化、スタウロスポリン、浸透ストレス、およびｐ５３非依存性アポトーシスを誘導する新規な抗癌剤のスクリーニングで同定された小分子に応答した細胞死の実行に寄与する。
【００８７】
ミトコンドリアアポトーシス経路のトリガーとしてのＬＭＰ
ＬＭＰの細胞傷害効果は、しばしば、ミトコンドリア死経路の活性化に少なくとも部分的に依存する。的確な微量注入研究により、細胞質ゾルに局在すると、１つのリソソーム加水分解酵素、カテプシンＤは、全細胞カテプシンＤ活性の半分に相当する細胞用量でヒト線維芽細胞におけるミトコンドリア外膜透過化およびアポトーシスを引き起こすのに十分であることが実証された。しかし、カテプシンＤは、ＬＭＰが関与するすべての細胞死モデルにおいてＰＣＤを引き起こすには十分でない。文書で十分に立証された他のＬＭＰ誘発ＰＣＤのメディエーターには、活性酸素種はもちろん、システインカテプシンＢおよびＬが含まれる。しかし、他のリソソーム加水分解酵素、リソソーム由来の第２のメッセンジャー、および細胞質ゾルのＬＭＰ誘発酸性化の役割がこれまで適切に除外されていないことを重視されたい。カテプシンとミトコンドリア膜透過化との間の関連の１つは、細胞質ゾルｐＨで、いくつかのシステインカテプシンによって処理および活性化され得るがカテプシンＤによっては処理および活性化されないＢｃｌ−２ファミリーのプロアポトーシスＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質、Ｂｉｄであり得る。しかし、カテプシンＤは、ＴＮＦ受容体１（ＴＮＦ−Ｒ１）の内在化の後にエンドリソソーム画分の酸性環境でＢｉｄを切断し活性化させることが示唆された。このモデルによると、リガンド活性化ＴＮＦ−Ｒ１のエンドサイトーシスが、酸性スフィンゴミエリナーゼを介したセラミドの産生をもたらし、このセラミドが、不活性カテプシンＤに結合し、不活性カテプシンＤを自己触媒的プロセシングによって活性化させる。カテプシンＤはまた、スタウロスポリン処理Ｔ細胞で実証されたように、Ｂｉｄに依存しないでＢａｘを活性化させ得る。また、シプロフロキサシンで処理した線維芽細胞でも、ＬＭＰが、ＢａｘおよびＢａｋのＢｉｄに依存しない活性化によってミトコンドリア膜透過化を引き起こす。このモデル系では、Ｂａｘの活性化は、カテプシンＤに依存しないが、代わりに活性酸素種に依存する。シプロフロキサシン誘導ミトコンドリア膜透過化が、ＢａｘおよびＢａｋの両方が欠如している細胞で完全には阻害されないことに留意されたい。ＬＭＰをミトコンドリア膜透過化につなげる代替機構には、活性酸素種および／またはカテプシンＢ依存的に生成され得るアラキドン酸などの脂質メディエーターの直接の効果が含まれ得る。
【００８８】
個々のカテプシンが欠損したマウス由来の不死化マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）を利用する研究により、様々なカテプシンが、ＬＭＰを引き起こす刺激に依存する細胞死の実行に関与することが明らかになった。カテプシンＤ欠損マウス由来ではなく、カテプシンＢおよびＬ欠損マウス由来の不死化ＭＥＦは、ＴＮＦに対して高い耐性を有するが、細胞がスタウロスポリンで処理されると反対の状況が現れる。ＴＮＦ誘導細胞死経路に対する広範囲な研究により、ＰＣＤにおける個々のカテプシンの役割が、研究された細胞型によって決まることがさらに明らかにされた。上記したように、不死化ＭＥＦのＴＮＦ誘導死は、カテプシンＤではなくシステインカテプシンに依存する。しかし、カテプシンＤの欠乏は、ＨｅＬａ頸癌細胞をＴＮＦ誘導細胞傷害性およびシスプラチン誘導細胞傷害性から効果的に保護する。この差異は、ヒト細胞とマウス細胞との間の一般的な差異によるものであるとは思えない。なぜなら、単独のカテプシンＢまたは他のシステインカテプシンと合わせたカテプシンＢは、ヒト頸癌細胞系（ＭＥ−１８０）および乳癌細胞系（ＭＣＦ−７）における事実上のＴＮＦ誘導死にとっても極めて重要である。この多様性の意味は、まだ分かっていないが、異なる細胞系における個々のカテプシンおよびそれらの阻害剤の様々な発現レベルがある役割を果たし得るということである。したがって、個々のカテプシンまたはそれらの阻害剤の発現レベルを調節する異なる死刺激の様々な能力が、異なる刺激に対する応答の差異を説明し得る。例えば、アドリアマイシンおよびエトポシドは、ｐ５３の活性化によってカテプシンＤの発現を促進することが知られている。あるいは、様々な刺激によって誘導される他のシグナル伝達経路は、特定のカテプシンと協働し得る。
【００８９】
ＬＭＰによって誘導されるミトコンドリア非依存死経路
重要なことに、ＬＭＰおよび細胞質カテプシンの致死効果は、内因性アポトーシス経路の活性化に限定されるものではない。微小管安定化剤（パクリタキセル、エポチロンＢ（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ  Ｂ）、およびディスコデルモライド（ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｏｌｉｄｅ））で処理した小細胞性肺癌細胞では、ＬＭＰは、死プロセスの初期で起こり、システインカテプシンが、カスパーゼ非依存的に微小核生成および細胞死を媒介する。ＴＮＦ処理ヒト癌細胞系では、ＬＭＰは、ミトコンドリア外膜透過化の下流で起こる。しかし、システインカテプシンの活性または発現の阻害は、エフェクターカスパーゼの活性化を有意に阻害することなく、ＴＮＦ誘導細胞死に対して優位な防御を与える。さらに、カテプシンＢは、ＴＮＦ処理マウスＷＥＨＩ−Ｓ線維肉腫細胞において、カスパーゼ活性の非存在下で、クロマチン凝縮、ホスファチジルセリン曝露、および原形質膜小疱形成などのアポトーシス様変化に関与する。さらに、Ｔ細胞の最適上の活性化はもちろん、様々なヒト癌細胞における熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）の欠乏は、内因性アポトーシス経路を活性化することなく、ＬＭＰおよびカテプシン媒介アポトーシス様ＰＣＤを引き起こす。これらのデータに一致して、カテプシンＢは、単離された核で核アポトーシスを誘導し得る。したがって、カテプシンは、刺激および細胞の状況に依存するプログラム細胞死のイニシエータープロテアーゼおよびエフェクタープロテアーゼの両方として機能する能力を有するようである。特に、ミトコンドリア死経路が、例えば、Ｂｃｌ−２の過剰発現によって遮断される癌細胞においてＰＣＤを媒介するカテプシンの能力は、ＬＭＰを誘導する治療が、古典的なアポトーシスの誘導物質に対して耐性がある癌の治療で有効性を証明できるという希望をもたらす。この考えは、不死化および形質転換が、リソソーム細胞死に対して感作させ得ることを示すデータによってさらに裏付けられる。
【００９０】
ＬＭＰへのシグナル伝達
上記したように、リソソーム内容物、特にカテプシンの細胞質への放出の前のＬＭＰは、リソソーム死経路の重要な活性化ステップであると見なされる。しかし、ＬＭＰをもたらすシグナル伝達経路は、出現の始まりに過ぎない。最も良く研究された機構の１つは、腫瘍壊死因子受容体１からのシグナル伝達であるが、このＬＭＰへのシグナル伝達経路の解明は、異なる標的細胞での多様な応答により非常に複雑である。
【００９１】
要約すれば、ＴＮＦは、細胞の状況によってカスパーゼ依存性ＬＭＰまたはカスパーゼ非依存性ＬＭＰを誘導することができる。加えて、ＴＮＦ関連リガンドＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬ、およびＴＷＥＡＫも、アポトーシス形態またはネクローシス形態のカスパーゼ非依存性ＰＣＤに関連している。薬理学的および遺伝学的研究により、ＴＮＦからＬＭＰに至るカスパーゼ媒介経路が、カスパーゼ８および９に依存するが、カスパーゼ９の活性化が、ヒト細胞とマウス細胞との間で大きく異なっていることが示された。カスパーゼとＬＭＰとの間の関連性は、なお不明であり、ＢｉｄのＴＮＦ誘導カスパーゼ８媒介切断がＬＭＰに寄与することが提唱されているが、これらの知見は、Ｂｉｄ欠損ｉＭＥＦにおけるＴＮＦ誘導ＬＭＰによって検証することができない。さらに、Ｂｉｄが、ＬＭＰの上流ではなくＢｉｄの下流に関係するリソソーム死経路におけるカテプシンの標的であることが提唱されている。
【００９２】
また、ＴＮＦは、原形質膜における中性スフィンゴミエリナーゼ（ＳＭａｓｅ）およびリソソーム画分内の酸または酸性ＳＭａｓｅ（ａＳＭａｓｅ）を活性化することによってスフィンゴミエリンのホスホリルコリンおよびセラミドへの分解を刺激する。両方の事象は、ＴＮＦ誘導細胞死経路に関係しているが、これまでのところ、中性ＳＭａｓｅのみが、中性ＳＭａｓｅに関連した因子（ＦＡＮ）によってＬＭＰに関係している。ドミナントネガティブ型のＦＡＮを発現するヒト線維芽細胞はもちろん、ＦＡＮ欠損ｉＭＥＦに基づいた研究により、ＦＮＡがＴＮＦ誘導セラミド産生を媒介するだけではなく、カスパーゼ８プロセシングおよび細胞死にも寄与することが示された。マウス肝細胞におけるＴＮＦ誘導ＬＭＰがカスパーゼ８に依存するため、カスパーゼ８のプロセシングの減少が、ドミナントネガティブＦＡＮを発現するＴＮＦ処理肝細胞におけるＬＭＰの低下を説明し得る。しかし、セラミドおよびその代謝産物の役割は除外することはできない。ＴＮＦ誘導死シグナル伝達におけるそれらの役割は、カスパーゼ８の下流で活性化されるａＳＭａｓｅが欠損したマウスにおけるＴＮＦおよびＦａｓ誘導肝毒性の減少によって裏付けられている。特に、リソソーム酵素酸性セラミダーゼによって触媒される反応においてセラミドから生成されるスフィンゴシンは、セラミドとは反対に、リソソーム膜を直接不安定化する界面活性剤として機能し得るため魅力的な候補である。ＳＭａｓｅを活性化することによってスフィンゴシン前駆体、セラミドの産生を増大させることに加えて、ＴＮＦは、プロアポトーシススフィンゴシンを抗アポトーシススフィンゴシン１−リン酸に変換する酵素であるスフィンゴシンキナーゼ１のカテプシンＢ媒介ダウンレギュレーションによってスフィンゴシンのレベルも調節する。このカテプシンＢの活性化は、リソソームにおけるスフィンゴシンの蓄積をもたらし得るため、ＴＮＦ処理肝細胞における効率的なＬＭＰに対するカテプシンＢの必要性を少なくとも部分的に説明し得る。
【００９３】
ＴＮＦはまた、カスパーゼ阻害剤の存在下で、ＬＭＰおよび細胞死を引き起こすこともできる。この経路は、カスパーゼ８に依存しないが、死ドメイン含有受容体相互作用タンパク質１（ＲＩＰ−１）を必要とし、活性酸素種の生成に関与する。酸化ストレスは、リソソーム内の鉄と共に、Ｆｅｎｔｏｎ型化学種によって酸素ラジカルを生成し、これによりリソソーム膜脂質の酸化を引き起こし、膜の不安定化およびリソソーム内容物の放出がもたらされ得る。しかし、ＲＩＰ−１、酸化ストレス、およびＬＭＰ間の分子リンクは、なお不明である。
【００９４】
いくつかの古典的なアポトーシス誘導物質（例えば、ｐ５３、エトポシド、およびスタウロスポリン）による細胞死の誘導は、ＬＭＰの後のカテプシン依存性ミトコンドリア膜透過化も伴う。しかし、これらの刺激からＬＭＰへのシグナル伝達経路は、まだ明らかになっていない。
【００９５】
ＬＭＰに対する細胞防御機構
ＬＭＰの潜在的な致死的結果から、ＬＭＰ自体を阻害することによって、またはＬＭＰの結果として細胞質ゾルに漏れる酸性加水分解酵素から細胞を保護することによって、細胞がＬＭＰに対抗する様々な戦略を立てることは驚きではない。
【００９６】
その多くの他の機能の中で、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）は、リソソームを不安定化から保護することが報告されている。ヒト血管内皮細胞におけるＰＩ３Ｋの阻害は、リソソーム膜完全性の維持におけるＰＩ３Ｋのかなり直接的な役割を立証するカテプシンＢの細胞質ゾルへの放出を誘導する。さらに、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＴＮＦ誘導およびインターロイキン１−誘導リソソーム死経路に対して細胞を感作させる。癌細胞における変更されたリソソーム機能およびカテプシンの発現レベルの上昇は、リソソームの安定性の低下という形で脅威を与え得る。したがって、ヒト癌細胞で一般に活性化されるＰＩ３Ｋは、腫瘍細胞のリソソーム安定性にも寄与し、これにより腫瘍細胞の細胞死耐性を高め得る。腫瘍細胞のリソソームの安定性に対するＰＩ３Ｋの役割は単に推測であるが、最近のデータは、膜破壊刺激からのリソソームの保護におけるＨｓｐ７０の役割を支持する。この研究は、主に腫瘍細胞で行われ、しばしば、エンドリソソーム区画内はもちろん、原形質膜におけるＨｓｐ７０の局在化も実証する。
【００９７】
ＬＭＰ時のリソソームプロテアーゼの細胞質ゾルへの放出の事象では、細胞質ゾルプロテアーゼ阻害剤が、その有害な結果に対する防御手段となる。カテプシンＤの内因性阻害剤は一切知られていないが、システインカテプシンは、少なくとも３つの細胞質ゾルプロテアーゼ阻害剤、すなわちシスタチンＡおよびＢ、ならびにいくつかのシステインカテプシン（Ｂ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、およびＶ）およびカテプシンＧに対しても強力な阻害活性を有することが最近分かったセリンプロテアーゼ阻害剤２Ａ（Ｓｐｉ２Ａ）によって効果的に阻害され得る。生理的および病的状態でのＰＣＤの防止におけるこれらの阻害剤の重要性は、小脳顆粒細胞のアポトーシスの増加を示すシスタチンＢ欠損マウスによって実証された。さらに、Ｓｐｉ２Ａの発現が、ＮＦ−κＢ経路を介したＴＮＦ処理時に誘導され、ＭＥＦにおけるＴＮＦ誘導細胞質ゾルカテプシンＢ活性および細胞死を効果的に阻害する。興味深いことに、Ｃ．Ｅｌｅｇａｎｓでは、細胞質ゾルセリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン）６は、低浸透ストレスおよび様々な他のリソソームストレスによって引き起こされるリソソーム傷害による致死効果および誘導の両方から保護することができ、ＬＭＰからの保護が進化的に保存された機構であることを実証している。
【００９８】
リソソーム蓄積症
リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）は、リソソーム機能の異常から起こる約４０の稀な一群の遺伝性代謝障害である。ＬＳＤは、通常は、脂質、糖タンパク質、またはムコ多糖の代謝に必要な１つの酵素の欠損の結果としてのリソソーム機能不全によって引き起こされる。それぞれの障害は、酵素活性の欠損に翻訳される様々な遺伝子の突然変異から生じるが、これらはすべて、共通の生化学的特徴を共有する、すなわちすべてのリソソーム障害は、リソソーム内の物質の異常な蓄積に起因する。
【００９９】
ほとんどのＬＳＤは、個々としては、１：１００，０００未満の発生率であるが、群とすると、発生率は、約１：５，０００〜１：１０，０００である。これらの障害の殆どは、常染色体劣性遺伝であるが、いくつかのものは、、Ｘ連鎖劣性遺伝である。ムコ多糖症は、およそ１：２５，０００の有病率を有する一群の疾患である。
【０１００】
リソソーム蓄積症は、一般に、関係する主に蓄積された物質の性質によって分類され、以下に示すように大きく分けることができる。
−脂質蓄積障害（またはリピドーシス）
・スフィンゴリピドーシス（ゴーシェ病およびニーマンピック病を含む）
・ガングリオシドーシス（ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ）（テイサックス病を含む）
・白質ジストロフィー（ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｉｅｓ）
−ムコ多糖症（ハンター症候群（Ｈｕｎｔｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）およびハーラー病（Ｈｕｒｌｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）を含む）
−ムコリピドーシス
−糖タンパク質蓄積障害（糖タンパク質異常症）
・マンノシドーシス
・フコシド蓄積症
−グリコーゲン蓄積症（ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）
【０１０１】
疾患の重症度によって、患者は、多くが生後２、３ヶ月または若い予測不可能な年齢で死亡するが、成人早期まで生存する者もあり、最終的にそれらの特定の障害の様々な病状で死亡する。ＬＳＤの症状は、特定の障害によって様々であり、軽度から重度まであり得る。ＬＳＤの症状には、発育遅延、運動障害、発作、痴呆、難聴、および／または失明が含まれ得る。一部のＬＳＤ患者は、肝臓肥大（肝腫）および脾臓肥大（脾腫）、肺および心臓の問題、ならびに異常な骨成長を伴う。
【０１０２】
患者の大半は、確実な診断に至る最も効率的な方法である酵素アッセイによってまず検査される。疾患による突然変異（複数可）が知られている一部のファミリーおよび特定の遺伝子単離では、突然変異分析が行われることがある。多数の異なる突然変異が存在し得るため、特に影響を受ける酵素をコードする遺伝子の配列決定が、診断を確定するために時には必要である。出生前診断は、既知の遺伝子リスク因子がある場合に有用であり得る。
【０１０３】
本発明は、一実施形態では、その活性が補助因子のリソソームＢＭＰの存在とは直接には関連しない酵素の欠陥によって生じるリソソーム蓄積症を治療するための方法に関する。
【０１０４】
一実施形態では、前記リソソーム蓄積症は、ニーマンピック病、ファーバー病、クラッベ病、シアリドーシスI型、異染性白質ジストロフィー、ゴーシェ病、ファブリー病、およびサポシン欠損症からなる群から選択されない。
【０１０５】
一実施形態では、前記リソソーム蓄積症は、グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型からなる群から選択される。
【０１０６】
リソソームスフィンゴ脂質加水分解
多数の酵素が、スフィンゴ脂質（またはフィンゴ糖脂質（ｇｌｙｃｏｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ））のリソソーム異化作用に関与する（図１を参照）。これらの酵素、より具体的には加水分解酵素はそれぞれ、特定のスフィンゴ脂質の分解に関与する。
【０１０７】
リソソームスフィンゴ脂質加水分解酵素は、スフィンゴ脂質活性化タンパク質（ＳＡＰまたはサポシン）と相互作用して前記加水分解酵素の活性を刺激する。ＳＡＰは、水溶性酵素と膜結合基質との間の酵素／基質相互作用を促進すると考えられる。
【０１０８】
さらに、後期エンドソーム区画およびリソソーム区画の脂質成分は、一部の加水分解酵素の活性も刺激するＢＭＰおよびＰＩ（ホスファチジルイノシトール）などの負に帯電したリン脂質の存在によって特徴付けられる。ＢＭＰ依存性リソソーム加水分解酵素には、シアリダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、グルコシルセラミダーゼ、β−ガラクトシルセラミダーゼ、アリールスルファターゼＡ、酸性セラミダーゼ、およびスフィンゴミエリナーゼが含まれる。
【０１０９】
補助因子サポシン
サポシンは、様々なリソソーム脂質分解酵素の活性化因子として機能する低分子リソソームタンパク質である。サポシンは、恐らく、脂質基質を膜周囲から分離することによって機能するため、可溶性分解酵素にアクセスしやすくする。すべての哺乳動物サポシンは、タンパク質分解による切断後に活性化サポシンを生成する４つのサポシンＢドメイン、および活性化反応で除去される２つのサポシンＡドメインを含む１つの前駆体分子（プロサポシン）として合成される。サポシンＢドメインは、他のタンパク質でも生じ、それらの多くは、膜の溶解に活性がある。
【０１１０】
プロサポシン（ＰＳＡＰ）は、ＰＳＡＰ遺伝子によってコードされるヒトのタンパク質である。この遺伝子は、サポシンＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤの４つの切断産物の前駆体である高度に保存された糖タンパク質をコードする。サポシンは、スフィンゴ脂質活性化タンパク質（Ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）またはＳＡＰの頭字語である。前駆タンパク質の各ドメインは、約８０のアミノ酸残基の長さであり、システイン残基およびグリコシル化部位がほぼ同一の配置である。サポシンＡ〜Ｄは、リソソーム画分に主に局在し、そこで短いオリゴ糖基を有するスフィンゴ糖脂質の異化作用を促進する。前駆タンパク質は、分泌タンパク質および膜内在性タンパク質の両方として存在し、神経栄養活性を有する。サポシンＡ〜Ｄは、特異的なリソソーム加水分解酵素による特定のスフィンゴ脂質の加水分解に必要である。
【０１１１】
サポシンは、シアリダーゼ（ＳＡＰ−Ｂ）、α−ガラクトシダーゼＡ（ＳＡＰ−Ｂ）、グルコシルセラミダーゼ（ＳＡＰ−Ｃ）、β−ガラクトシルセラミダーゼ（ＳＡＰ−Ｃ）、アリールスルファターゼＡ（ＳＡＰ−Ｂ）、および酸性セラミダーゼ（ＳＡＰ−Ｄ）の重要な活性化補助因子である。酸性スフィンゴミエリナーゼ（ａＳＭａｓｅ）は、既知の活性化タンパク質のいずれにも大きくは依存していないが、サポシンの存在が、この酵素の活性を高める。第５のサポシン；ＧＭ２−活性化タンパク質も特徴付けられた。
【０１１２】
ＢＭＰ
リゾビスホスファチジン酸としても知られるビス（モノアシルグリセロ）リン酸（ＢＭＰ）は、後期エンドソーム区画およびリソソーム区画の脂質組成の主な部分である。ＢＭＰは、負に帯電したリン脂質、より具体的にはグリセロール−リン脂質である。
【０１１３】
ＢＭＰは、ウサギ肺から初めに単離されたが、現在は、すべての動物組織の微量成分なら一般的であることが知られている。ＢＭＰの立体化学構造は、ホスホジエステル部分が、グリセロールの位置ｓｎ−３ではなくｓｎ−１およびｓｎ−１’に結合されているという点で他の動物グリセロ−リン脂質の立体化学構造とは異なっている。グリセロール部分における位置ｓｎ−３および３’またはｓｎ−２およびｓｎ−２’が脂肪酸でエステル化されるか否かはなお不明である。グリセロール分子における脂肪酸の位置がどこであろうと、それらの組成は、１８：１（ｎ−９）および１８：２（ｎ−６）、２０：４および２２：６（ｎ−３）が豊富で特徴的であり得るが、これは、特定の組織、細胞型、または細胞小器官に大きく依存する。このような特有の組成は、かなり特殊な機能を意味するが、それらの一部はまだ解明されていない。
【０１１４】
ＢＭＰは、通常は、動物組織のかなり微量な成分である。しかし、ＢＭＰは、肝臓組織および他の組織のリソソームでかなり豊富であり、そこでは膜リン脂質の１５％以上に達することがあり、現在は、この細胞小器官のマーカーとして認められている。独特の脂質、ＢＭＰを含むのは後期エンドソームおよびリソソームである。実際、ＢＭＰとして７０％ものリン脂質含むのは後期エンドソームの内膜であるようである。
【０１１５】
ＢＭＰが、主にエンドソーム系でホスファチジルグリセロールから合成されるという十分な証拠が存在する。主経路であると考えられる経路では、ホスホリパーゼＡ２が、第１のステップでホスファチジルグリセロールの位置ｓｎ−２から脂肪酸を除去する。第２のステップで、リゾホスファチジルグリセロールが、頭部基グリセロール部分のｓｎ−２’位置でアシル化されて、アシル供与体およびアシル受容体の両方としてのリゾホスファチジルグリセロールとのトランスアシラーゼ反応によってｓｎ−３：ｓｎ−１’リゾビスホスファチジン酸を産生する。第３のステップは、十分に説明されるべきであるが、主たるグリセロール単位（ｐｒｉｍａｒｙ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｕｎｉｔ）の位置ｓｎ−１からの脂肪酸の除去、およびｓｎ−３からｓｎ−１位置へのホスホリルエステルの再配列を伴わなければならない。最後に、主たるグリセロール単位の位置ｓｎ−２が、恐らく、供与体としての別のリン脂質とのアシル基転移反応によってエステル化される（従って、独特の脂肪酸組成）。他の生合成経路も可能であろう。
【０１１６】
リソソームにおけるＢＭＰの機能は、積極的に研究中である。ＢＭＰは、二重層を形成しない性質によって助けられる、複合腔内膜系の発生において構造的役割を有し得る。ＢＭＰは、円錐型の分子であり、エンドソーム内のｐＨで膜の融合を促進する。さらに、その独特な立体化学は、ホスホリパーゼに対して耐性があるため、リソソーム膜の自己消化を妨げる、または防止する。脂肪酸成分は、アシル基転移によって迅速に代謝回転し得るが、グリセロリン酸骨格は安定である。さらなる可能性として、この脂質が、ラフト（ｒａｆｔ）に機能的に類似した膜ドメインにおける特定のタンパク質に結合し得る。多小胞後期エンドソーム内に含まれるＢＭＰリッチ膜の特徴的なネットワークが、収集および再分配点として作用することによってコレステロール輸送を調節することが示唆されている。例えば、リソソーム膜が、ＢＭＰの抗体と共にインキュベートされると、コレステロールが蓄積する傾向にある。このプロセスは、ＢＭＰと特異的に相互作用し、かつ多小胞エンドソーム内への選別に関与するタンパク質であるＡｌｉｘ／ＡｌＰ１の制御下である。ＢＭＰは、サポシンのようなスフィンゴ脂質活性化タンパク質などのグリコシルセラミドの分解に関与する酵素を大きく刺激することが知られている。この場合、ＢＭＰは、スフィンゴ糖脂質加水分解酵素とそれらの活性化因子の相互作用に適した環境を提供するように単純に機能し得る。加えて、ＢＭＰは、肺胞マクロファージにおけるエイコサノイド産生のためのアラキドン酸の提供において動的な役割を有する。
【０１１７】
ＢＭＰ依存性酵素の場合、加水分解の速度は、ａＳＭａｓｅでは、サポシンなどの活性化タンパク質が存在しなくても、ＢＭＰが膜に存在すると劇的に上昇する。図１では、点線の円は、酵素、またはＢＭＰ依存を示すこの酵素に欠陥がある疾患を示している。
【０１１８】
ＢＭＰは、ニーマンピックＣ病（コレステロール蓄積）および特定の薬物誘導リピドーシスなどのリソソーム蓄積症の病理に関与する。これらの場合には、ＢＭＰの組成は、少ないポリ不飽和成分を含む分子種を好むように変化する傾向にある。ＢＭＰは、抗リン脂質症候群として知られる稀であまり理解されていない疾患の患者に由来する自己免疫血清によって認識される抗原であるため、ＢＭＰは、恐らく、この疾患の病理学的根拠における因子である。
【０１１９】
脂質蓄積障害
脂質蓄積障害（またはリピドーシス）は、脂質を代謝するために必要な酵素の発現または機能の低下によって有害な量の脂質が細胞内空間に蓄積するリソソーム蓄積障害のサブグループである。時間が経つと、この過剰な脂質の蓄積が、特に、脳、末梢神経系、肝臓、脾臓、および骨髄で永久的な細胞および組織の損傷を引き起こし得る。
【０１２０】
脂質の蓄積によって特徴付けられるいくつかのリソソーム蓄積障害（すなわち、脂質蓄積障害）は、ニーマンピック病（ＮＰＤ）、ファーバー病、クラッベ病、ファブリー病、ゴーシェ病、シアリドーシスI型、異染性白質ジストロフィー、およびサポシン欠損症を含むものとして特徴付けられている。
【０１２１】
さらに、脂質蓄積障害は、以下に概略が示されるように、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、およびその他の脂質蓄積障害を含む。
【０１２２】
ガングリオシドーシス
ガングリオシドーシスの治療に使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤を提供することが本発明の一態様である。
【０１２３】
サンドホフ病（またはＧＭ２ガングリオシドーシスII型）、古典的な小児サンドホフ病、若年性サンドホフ病、成人／後期発症サンドホフ病、テイ・サックス病（またはＧＭ２ガングリオシドーシスI型）、小児テイ・サックス病、若年性テイ・サックス病、成人／後期発症テイ・サックス病、ＧＭ２−ガングリオシドーシスＡＢバリアント、ＧＭ１ガングリオシドーシス、初期小児ＧＭ１ガングリオシドーシス、後期小児ＧＭ１ガングリオシドーシス、成人ＧＭ１ガングリオシドーシス、ＧＭ３ガングリオシドーシス、およびムコリピドーシスIＶ型からなる群から選択される、ガングリオシドーシスの治療に使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤を提供することが本発明の一態様である。
。
【０１２４】
上述の疾患は、ＷＨＯによる国際疾病分類によれば、ガングリオシドーシスに分類される。
【０１２５】
ガングリオシドーシスは、ガングリオシドとして知られる脂質の蓄積によって引き起こされる脂質蓄積障害である。ガングリオシドは、糖鎖上に一つまたはそれ以上のシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸、ＮＡＮＡとしても知られる）が結合しているスフィンゴ糖脂質（セラミドおよびオリゴ糖）からなる分子である。主にＮＡＮＡ残基の数と位置が異なる、６０＋のガングリオシドが知られている。それは、細胞の情報伝達事象を調節する細胞原形質膜の構成要素である。それらは、全てのリン脂質の６％を構成している神経系で主に認められる。
【０１２６】
ＧＭ１ガングリオシドーシス（ＮＯＳガングリオシドーシスとしても知られる）は、β−ガラクトシダーゼの欠損によって引き起こされ、その結果として、中枢および末梢神経系細胞、特に神経細胞における酸性脂質の異常蓄積を生じる。ＧＭ１は３つの型がある。すなわち、初期小児型、後期小児型、および成人型ＧＭ１である。
【０１２７】
ＧＭ２ガングリオシドーシスは、酵素β−ヘキソサミニダーゼ（ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ）の欠損に起因する一群の関連する遺伝性疾患である。この酵素は、ガングリオシドとして知られる脂肪酸誘導体の生分解を触媒する。この疾患は、その特有の名前によってよりよく知られている。
【０１２８】
β−ヘキソサミニダーゼは、リソソーム中に認められる、生命維持に必要な加水分解酵素であり、脂質を分解する。β−ヘキソサミニダーゼが正常に機能しなくなると、脂質が脳の神経組織に蓄積する。ガングリオシドは生成され、脳が発達する若齢期に急速に生物分解される。
【０１２９】
３つのすべての障害は、一般的にはまれな疾患である。テイ・サックス病、ＡＢバリアント、およびサンドホフ病は、この３つの疾患が同じ代謝経路の不全と関連し、同じ結果となっているため、単一の疾患として、ともに安易に定義されてしまったのかもしれない。それぞれの疾患は、酵素の活性化に必要なサブユニットに分子的に明確な不全部分を表す。
【０１３０】
テイ・サックス病（ＴＳＤと省略され、ＧＭ２ガングリオシドーシスI型、またはヘキソサミニダーゼＡ欠損症としても知られる）は、まれな疾患であり、脳および脊髄における神経細胞の進行性の破壊を引き起こす常染色体劣性代謝性障害である。この疾患は、リソソーム酵素β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼＡのα−サブユニットをコードする、ＨＥＸＡ遺伝子の１５番染色体上の変異に起因する。
【０１３１】
テイ・サックス病は、神経症状の発症時期に基づいて、いくつかのバリアント型に分類される。このバリアント型は、変異塩基における変化を反映し、小児型、若年性型、および成人／後期発症型ＴＳＤがある。
【０１３２】
サンドホフ病（Ｊａｔｚｋｅｗｉｔｚ−Ｐｉｌｚ症候群、ＧＭ２ガングリオシドーシスII型、およびヘキソサミニダーゼＡおよびＢ欠損症としても知られる）は、まれな疾患であり、脳および脊髄における神経細胞の進行性の破壊を引き起こす常染色体劣性代謝性障害である。この疾患は、リソソーム酵素β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼＡおよびＢにとって重要な、ＨＥＸＢ遺伝子の５番染色体上の変異に起因する。サンドホフ病は、臨床上はテイ・サックス病と区別がつかない。患者が症状を示す時期に基づいて、古典的な小児型、若年性型、および成人後期発症型疾患の３つのサブセットが存在する。
【０１３３】
ＧＭ２−ガングリオシドーシスＡＢバリアントは、まれな疾患であり、脳および脊髄における神経細胞の進行性の破壊を引き起こす常染色体劣性代謝性障害である。ＡＢバリアントは、
ＧＭ２活性化因子と呼ばれる、β−ヘキソサミニダーゼの酵素補助因子を生成する遺伝子の不全によって引き起こされる。
【０１３４】
ＧＭ３ガングリオシドーシスは、肝臓および脳組織におけるガングリオシドＧＭ３の過剰蓄積およびより高位のガングリオシド同族体の欠乏を伴う、Ｎ−（アセチルノイラミニル）−ガラクトシルグリコシルセラミド  Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｙｌ）−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｇｌｕｃｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）欠損によって引き起こされるガングリオシド生合成障害である。
【０１３５】
ムコリピドーシスIＶ型（ＭＬ  IＶ）は、常染色体劣性リソソーム蓄積障害である。この障害は、非選択性陽イオンチャンネル、ムコリピン１（ｍｕｃｏｌｉｐｉｎ１）をコードする、
ＭＣＯＬＮ１遺伝子の変異によって引き起こされる。ムコリピン１は、エンドソームに局在化すると考えられている。ムコリピン１の重要な特性は、ＰＨを下げること(酸性化)によってタンパク質の非活性化を生じ、タンパク質の構築阻害などをを引き起こすことである。ＭＣＯＬＮ１遺伝子の至る所に位置する、少なくとも２９のＭＣＯＬＮ１の変異が知られている。この既知の変異はムコリピン１の発現を抑制するものが多いが、一方、陽イオンチャンネルの機能不全形を産生するようなより軽度の変異も存在する。タンパク質のＣ末端のみを変える変異は、この障害の軽度の表現型を生じ、通常脳は保護される。ＭＬ  IＶでは、罹患した細胞に、異常型リソソームと考えられている自己蛍光性液胞の蓄積が生じる。
【０１３６】
神経セロイドリポフスチン症
神経セロイドリポフスチン症の治療に使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤を提供することが本発明の一態様である。
【０１３７】
バッテン病（Ｂａｔｔｅｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）（またはシュピールマイアー−フォークト病（Ｓｐｉｅｌｍｅｙｅｒ−Ｖｏｇｔ  ｄｉｓｅａｓｅ））、ビールショスキー−ヤンスキー病（Ｂｉｅｌｓｃｈｏｗｓｋｙ−Ｊａｎｓｋｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）、クーフス病（Ｋｕｆｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、およびＳａｎｔａｖｕｏｒｉ−Ｈａｌｔｉａ病からなる群から選択される神経セロイドリポフスチン症の治療に使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤を提供することが本発明の一態様である。
【０１３８】
上述の疾患は、ＷＨＯによる国際疾病分類によれば、神経セロイドリポフスチン症に分類される。
【０１３９】
神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）は、体組織に脂肪色素（リポフスチン）の過剰蓄積を生じる遺伝学的に別の神経変性障害のファミリーの総称である。これらの脂肪色素は、脂肪およびタンパク質で構成される。以前のＮＣＬの分類では、発症の年齢に基づいて４つの型にその状態が分けられたが、最近の分類では関連する遺伝子によって分けられる。
−  小児ＮＣＬ（Ｓａｎｔａｖｕｏｒｉ−Ｈａｌｔｉａ病、ＩＮＣＬまたはI型）は、パルミトイル−タンパク質  チオエステラーゼ（ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｉｏｅｓｔｅｒａｓｅ）に関連する。
−  後期小児ＮＣＬ（ビールショスキー−ヤンスキー病またはヤンスキー−ビールショスキー病、ＬＩＮＣＬあるいはII型）は、トリペプチジルぺプチダーゼIの欠損に関連する。
−  若年性ＮＣＬ（バッテン病、ＪＮＣＬまたはIII型、シュピールマイアー−フォークト−シェーグレン−バッテン病、またはシュピールマイアー−フォークト病としても知られる）は、ＣＬＮ３遺伝子の変異に関連づけられている。この疾患が、もっとも一般的な型である。
−  成人ＮＣＬ（クーフス病、ＡＮＣＬまたはIV型）については、関連遺伝子は同定されていない。
【０１４０】
その他の脂質蓄積障害
脳腱コレステローシス（ｃｅｒｅｂｒｏｔｅｎｄｉｎｏｕｓ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｓｉｓ）、ウォルマン病（Ｗｏｌｍａｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、およびコレステリルエステル蓄積症（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ  ｅｓｔｅｒ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）からなる群から選択される疾患の治療に使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤を提供することが本発明の一態様である。
【０１４１】
リソソーム酸性リパーゼは、リソソームにおけるトリグリセリドおよびコレステリルエステルの加水分解に必須の酵素である。その欠損は、ウォルマン病およびコレステリルエステル蓄積症という２つのヒト表現型を生み出す。ウォルマン病は幼児において致死性である。コレステリルエステル蓄積症はより軽度のタイプであり、通常は成人期に表れる。
【０１４２】
ウォルマン病のより厳しい経過は、酵素活性がまったくないようなリソソーム酸性リパーゼの遺伝的欠陥によって引き起こされる。ウォルマン病は、副腎の石灰化を併発する、原発性家族性黄色腫症（ｐｒｉｍａｒｙ  ｆａｍｉｌｉａｌ  ｘａｎｔｈｏｍａｔｏｓｉｓ）とも呼ばれる。ウォルマン病は，トリグリセリドおよびコレステリルエステルの両方を蓄積し、一方、コレステリルエステル蓄積症は、主にコレステリルエステルを上昇させる。リソソーム酸性リパーゼ遺伝子型は、残存酵素活性の程度に関連し、その表現型の重症度を決める。
【０１４３】
脳腱黄色腫症（ｃｅｒｅｂｒｏｔｅｎｄｉｎｅｏｕｓ  ｘａｎｔｈｏｍａｔｏｓｉｓまたはｃｅｒｅｂｒｏｔｅｎｄｉｎｏｕｓ  ｘａｎｔｈｏｍａｔｏｓｉｓ）（ＣＴＸ）は、脳コレステローシス（ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｓｉｓ）（またはＶａｎ  Ｂｏｇａｅｒｔ−Ｓｃｈｅｒｅｒ−Ｅｐｓｔｅｉｎ症候群）とも呼ばれ、脳および他の組織においてコレステロール（コレスタノール）の形状の沈着と関連し、血漿中のコレステロール濃度を上昇させるが総コレステロール濃度は正常である、常染色体劣性型黄色腫症である。ＣＴＸは、ＣＹＰ２７Ａ１遺伝子（ステロール２７−ヒドロキシラーゼ）の変異と関連する。
【０１４４】
ムコ多糖症
ムコ多糖症の治療に使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤を提供することが本発明の一態様である。
【０１４５】
I型ムコ多糖症、II型ムコ多糖症、、III型ムコ多糖症、、IV型ムコ多糖症、VI型ムコ多糖症、VII型ムコ多糖症、VIII型ムコ多糖症、およびIX型ムコ多糖症からなる群から選択される疾患の治療に使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤を提供することが本発明の一態様である。
【０１４６】
ハーラー症候群（Ｈｕｒｌｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ハーラー−シャイエ症候群（Ｈｕｒｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、シャイエ症候群（Ｓｃｈｅｉｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ハンター症候群（Ｈｕｎｔｅｒ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ＤｉＦｅｒｒａｎｔｅ症候群、マロト−ラミー症候群（Ｍａｒｏｔｅａｕｘ−Ｌａｍｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（軽度または重篤）、モルキオ症候群（Ｍｏｒｑｕｉｏ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）(古典的またはモルキオ様)、およびサンフィリッポ症候群（Ｓａｎｆｉｌｉｐｐｏ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤ型）からなる群から選択される疾患の治療に使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤を提供することも本発明の一態様である。
【０１４７】
上述の疾患は、ＷＨＯによる国際疾病分類によれば、ムコ多糖症に分類される。
【０１４８】
ムコ多糖は、通常、リソソームで無機硫酸化単糖類に分解される繰り返しの二糖類分枝に結合した中央タンパク質部分から構成される硫酸化ポリマーである。
−  デルマタン硫酸は、Ｌ−イズロン酸およびＮ−アセチルガラクトサミンの繰り返しユニットからなり、通常、多くの異なる結合組織の基質に認められる。
−  ヘパラン硫酸は、ウロン酸（Ｄ−グルクロン酸またはＬ−イズロン酸）とＮ−アセチルグルコサミンの結合の繰り返しによって形成され、ほぼすべての細胞の原形質膜に関連する。
−  ケラタン硫酸は、Ｄ−ガラクトース残基とＮ−アセチルグルコサミンとの繰り返しよって形成され、主として、軟骨、髄核、および角膜に認められる。
−  コンドロイチン硫酸は、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチルガラクトサミンから構成され、主として軟骨および角膜に認められる。
【０１４９】
ムコ多糖症（ＭＳＰ）は、例えば、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、およびコンドロイチン硫酸などのグリコサミノグリカンの異常な分解に起因し、器官における蓄積およびその結果起こる機能不全に至る。グリコサミノグリカンまたはムコ多糖は、通常は、角膜、軟骨、骨、結合組織、および細胞内皮系の成分であるため、これらは過剰な蓄積の標的器官となる。
【０１５０】
グリコサミノグリカンまたはムコ多糖の分解にかかわる異化酵素が欠損している。グリコサミノグリカンの段階的分解には、４つのグリコシダーゼ、５つのスルファターゼ、および１つの非加水分解トランスフェラーゼが必要である。ＭＰＳは、慢性および進行性の経過において同様な臨床的特徴を有し、多くの系が関連し、臓器肥大、多発性骨形成不全症、異常顔面を伴う。伝達様式は、Ｘ染色体にリンクしているＭＰＳ  IIを除いて、常染色体劣性遺伝である。種々の変異が報告されており、疾患の重症度と遺伝子型の相関関係が、変異解析から明らかになりつつある。
【０１５１】
一般に、ＭＰＳは進行性の障害であり、脳、肝臓、脾臓、心臓、および血管を含む多臓器が関連する障害であることが特徴であり、多くのＭＰＳでは、異常な顔面特徴、角膜混濁、および精神発達遅滞を伴う。診断は、主に尿検査によって行うことができ、グリコサミノグリカン断片の濃度の増加がみられる。
【０１５２】
ＭＰＳ  I型には、ハーラー症候群（ＭＰＳ  IＨ型）、ハーラー−シャイエ症候群（ＭＰＳ  IＨ／Ｓ型）、およびシャイエ症候群（ＭＰＳ  IＳ型）がある。デルマタン硫酸およびヘパラン硫酸の両方から末端Ｌ−イズロン酸残基を切断するα−Ｌ−イズロニダーゼが欠損している。
【０１５３】
ＭＰＳ  II型（ハンター症候群）では、デルマタン硫酸およびヘパラン硫酸のＬ−イズロン酸の２位から硫酸基を特異的に取り除くイズロン酸−２  スルファターゼ（ハンター矯正因子として知られる）が欠損している。精製ヒト組換え型イズルスルファーゼは、ハンター症候群の患者において病気の症状を変えることが示されている。
【０１５４】
ＭＰＳ  III型（サンフィリッポ症候群）では、ヘパラン  Ｎ−スルファターゼ（Ａ型）、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｂ型）、アセチルＣｏＡ：α−グルコサミニド  アセチルトランスフェラーゼ（Ｃ型）、およびＮ−アセチルグルコサミン  ６−スルファターゼ（Ｄ型）の欠損が生じている。４つの酵素すべてが、ヘパラン硫酸の分解に必要である。
【０１５５】
ＭＰＳ  IV型（モルキオ症候群）は、ケラタン硫酸の分解の欠陥に起因する。IV  Ａ型ではＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ガラクトース−６−スルファターゼとしても知られる）、およびIV  Ｂ型では、β−ガラクトシダーゼの、２つの酵素の欠損が認められている。
【０１５６】
ＭＰＳ  VI型（マロト−ラミー症候群）では、アリルスルファターゼＢ（すなわち、Ｎ−アセチルガラクトサミン  ４−スルファターゼ）の欠損が生じている。この酵素は、デルマタン硫酸のＮ−アセチルガラクトサミン残基の４位の硫酸基を加水分解する。
【０１５７】
ＭＰＳ  VII型（スライ症候群またはβ−グルクロニダーゼ欠損症）では、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、およびコンドロイチン硫酸に存在するグルクロン酸残基を取り除くβ−グルクロニダーゼの欠損によって引き起こされる。
【０１５８】
ＤｉＦｅｒｒａｎｔｅ症候群（ムコ多糖症VIII）は、報告されている患者数が非常に少ない障害である。
【０１５９】
グリコーゲン蓄積症
グリコーゲン蓄積症（ＧＳＤ）の治療に使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤を提供することが本発明の一態様である。
【０１６０】
心臓グリコーゲン蓄積症（ｃａｒｄｉａｃ  ｇｌｙｃｏｇｅｎｏｓｉｓ）、アンダーセン病（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）、コーリ病（Ｃｏｒｉ  ｄｉｓｅａｓｅ）（またはフォーブス病（Ｆｏｒｂｅｓ  ｄｉｓｅａｓｅ））、ハース病（Ｈｅｒｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、マックアードル病（ＭｃＡｒｄｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ポンぺ病（Ｐｏｍｐｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、Ｔａｕｒｉ病（または垂井病（Ｔａｒｕｉ  ｄｉｓｅａｓｅ））、およびフォンギールケ病（ｖｏｎ  Ｇｉｅｒｋｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）からなる群から選択されるグリコーゲン蓄積症の治療に使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤を提供することが本発明の一態様である。
【０１６１】
上述の疾患は、ＷＨＯによる国際疾病分類によれば、グリコーゲン蓄積症に分類される。（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ／ｉｃｄ／ｅｎ／）
【０１６２】
グリコーゲン蓄積症（ＧＳＤ、または糖原病およびデキストリン形成病）は、グリコーゲン合成のプロセシンングまたは筋肉、肝臓、およびその他の細胞内部での分解における欠陥の結果である。ＧＳＤには、遺伝性と後天性の二種類の原因がある。遺伝性ＧＳＤは、これらのプロセスに含まれる先天性代謝異常（遺伝的欠陥酵素）によって引き起こされる。
【０１６３】
一実施形態では、心臓グリコーゲン蓄積症（全身性糖原病の一環として、心筋における過剰なグリコーゲン沈着による心臓肥大）の治療に使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤が提供される。
【０１６４】
一実施形態では、アンダーセン病（ＧＳＤ  IV型としても知られる：グリコーゲン分枝酵素の酵素欠損）の治療に使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤が提供される。
【０１６５】
一実施形態では、コーリ病またはフォーブス病（ＧＳＤ  III型としても知られる：グリコーゲン脱分枝酵素の酵素欠損）の治療に使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤が提供される。
【０１６６】
一実施形態では、ハース病（ＧＳＤ  VI型としても知られる：肝グリコーゲンホスホリラーゼの酵素欠損）の治療に使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤が提供される。
【０１６７】
一実施形態では、マックアードル病（ＧＳＤ  V型としても知られる：筋グリコーゲンホスホリラーゼの酵素欠損）の治療に使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤が提供される。
【０１６８】
一実施形態では、ポンぺ病（ＧＳＤ  II型としても知られる：酸性α−グルコシダーゼ／酸性マルターゼの酵素欠損）の治療に使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤が提供される。
【０１６９】
ポンぺ病は、小児酸性マルターゼ病：ＧＳＤ  II型バリアントとしても知られる。他のＧＳＤ  II型バリアントには、「進行の遅い酸性マルターゼ病」またはダノン病がある。
【０１７０】
一実施形態では、Ｔａｕｒｉ病または垂井病（ＧＳＤ  VII型としても知られる：筋ホスホフルクトキナーゼの酵素欠損）の治療に使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤が提供される。
【０１７１】
一実施形態では、フォンギールケ病（ＧＳＤ  I型としても知られる：グルコース−６−ホスファターゼの酵素欠損）の治療に使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤が提供される。
【０１７２】
リソソーム酵素の翻訳後修飾における欠陥
ムコリピドーシスII（Ｉ−セル病）およびムコリピドーシスIII（偽ハーラー多発性ジストロフィー）（ｐｓｅｕｄｏ−Ｈｕｒｌｅｒ  ｐｏｌｙｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）からなる群から選択される疾患の治療に使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤を提供することが本発明の一態様である。
【０１７３】
I−セル病（ムコリピドーシスII）および偽ハーラー多発性ジストロフィー（ムコリピドーシスIII）の両方は、新しく合成されたリソソーム酵素が、リソソームへ正しく導かれないで細胞外の媒質へ分泌される、リソソーム酵素の輸送における異常に起因する。
【０１７４】
欠陥している酵素は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン  リソソーム酵素  Ｎ−アセチルグルコサミン  １−フォスフォトランスフェラーゼである。この酵素は、ゴルジ複合体で加工された後、リソソーム酵素をその標的とするリソソームヘ到達させるのを媒介する、マンノース  ６−リン酸認識マーカーの合成における最初の段階を触媒する。その伝達様式は、常染色体劣性遺伝である。
【０１７５】
糖タンパク質分解における欠陥−糖タンパク質蓄積障害
アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、α−マンノシド症、α−マンノシド症I型、α−マンノシド症II型、β−マンノシド症、およびシアリドーシスII型（ムコリピドーシスI）からなる群から選択される疾患の治療に使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤を提供することが本発明の一態様である。
【０１７６】
一実施形態では、α−マンノシド症および／またはβ−マンノシド症などのマンノシド症の治療に使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤が提供される。
【０１７７】
リソソームα−マンノシダーゼは、糖タンパク質分解経路における主要なエキソグリコシダーゼである。この酵素の欠損は、リソソーム蓄積症α−マンノシド症を引き起こす。リソソームα−Ｄ−マンノシダーゼは、高マンノース、混成オリゴ糖類、および複合体オリゴ糖類の逐次分解を通してＮ−結合糖タンパク質の異化作用に含まれる。
【０１７８】
α−マンノシド症は、その臨床上の症状により、小児表現型（またはI型）および若年性−成人表現型（またはII型）に分類することができる。
【０１７９】
β−マンノシド症は、リソソーム酵素β−マンノシダーゼの欠損に起因する、常染色体劣性リソソーム蓄積症である。ヒト報告例におけるこの疾患の臨床上の症状は不均一であり、比較的軽度のものからやや重度のものまで幅がある。この酵素は、二糖類  β−マンノース  １，４−Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｍａｎ−ｂｅｔａ  １，４−  ＧｌｃＮＡｃ）のβ−マンノシド結合を切断する。本酵素活性の遺伝的欠損によって、β−１，４結合を含む未分解の蓄積産物の蓄積および排出を特徴とする、リソソーム蓄積症βマンノシド症の病的な症状に至る。
【０１８０】
一実施形態では、アスパルチルグルコサミン尿症の治療に使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤が提供される。
【０１８１】
アスパルチルグリコサミン尿症とも呼ばれるアスパルチルグルコサミン尿症（ＡＧＵ）は、Ｎ−アスパルチル−β−グルコサミニダーゼ（アスパルチルグルコサミニダーゼ）酵素の活性欠損によって引き起こされる、まれな、常染色体劣性リソソーム蓄積症である。この酵素は、通常リソソーム中のオリゴ糖として知られる長い糖鎖を切断する。
【０１８２】
一実施形態では、フコシド蓄積症の治療に使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤が提供される。
【０１８３】
α−フコシダーゼ欠損症とも呼ばれるフコシド蓄積症は、まれな、常染色体劣性リソソーム蓄積症であり、この疾患では、細胞中でフコースを分解する酵素フコシダーゼが適切に働かない。この酵素は、通常リソソーム中のオリゴ糖として知られる長い糖鎖を切断する。
【０１８４】
一実施形態では、シアリドーシスII型またはムコリピドーシスI（ノイラミニダーゼ欠損症
としても知られる）の治療に使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤が提供される。
【０１８５】
一実施形態では、シアリドーシスI型は本発明の標的ではない。
【０１８６】
本発明の記載中、シアリドーシスII型は、補助因子のＢＭＰに直接依存しない酵素と関連する疾患またはそのバリアントを意味し、より正確には、ムコリピドーシスI（またはノイラミニダーゼ欠損症）を表すと理解されたい。
【０１８７】
ムコリピドーシスＩ型（ＭＬ  Ｉ）は、まれな遺伝性リソソーム蓄積障害であり、ムコ多糖症およびスフィンゴリピドーシスに臨床上および組織学上似た所見を示す。この疾患は、最初はリポムコ多糖体症に分類されたが、後に、現在はムコリピドーシスとして知られる一群の同様の疾患に分類された。その後、ＭＬ  Ｉを有する患者は、白血球および培養線維芽細胞において、α−Ｎ−アセチルノイラミニダーゼ（ノイラミニダーゼまたはシアリダーゼ）の単一の欠損を有すること、および、その結果尿中にシアリルオリゴ糖の増加がみられることが発見された。ノイラミニダーゼ欠損のため、ＭＬ  Ｉは、現在では単一のノイラミニダーゼ欠損に起因する一群の生化学的に別個の疾患である、シアリドーシスに分類されている。ＭＬ  Ｉの二つの主要な臨床上の表現型が認められている。
【０１８８】
種々の欠陥型
酵素の翻訳後修飾における欠陥、非酵素タンパク質の欠陥、膜輸送タンパク質の欠陥、酵素保護タンパク質の欠陥、膜貫通タンパク質の欠陥、および／または膜貫通型でないタンパク質の欠陥といった、酵素の欠陥を伴う疾患からなる群から選択されるリソソーム蓄積症の治療に使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤を提供することが本発明の一態様である。
【０１８９】
ＬＳＤの現在の治療方式
リソソーム蓄積症の治癒法は存在せず、骨髄移植および酵素補充療法（ＥＲＴ）が試され、ある程度の成功を収めているが、治療は殆どが対症である。加えて、臍帯血移植は、多数のこれらの疾患用の専門センターで行われている。しかし、移植療法は、大きな副作用を伴い、しばしば、患者に合併症をもたらす。加えて、基質抑制療法、すなわち貯蔵物質の蓄積を減少させるために使用される方法は、現在、これらの一部の疾患に対して評価されている。
【０１９０】
殆どのリソソーム蓄積症には、有効な治療方式を提供するという、満たされていない重要な要求が残っている。
【０１９１】
酵素補充療法は、一部のリソソーム蓄積症に対して開発され、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）が、ゴーシェ病の治療のために何年も前から市販されている。欠陥酵素、グルコセレブロシダーゼは、組換え技術によって作製され、２、３時間に渡って静脈内注射によって投与される。治療は、治癒ではなく、患者は、疾患の進行を止めるために生涯の治療を必要とする。一部の症状は、ＥＲＴによって改善することができる。
【０１９２】
しかし、殆どのＬＳＤでは、有効なＥＲＴが開発されていない。これは、欠陥酵素の複雑なサブユニット構造のために活性酵素の生産が困難な課題であることが立証されたためであろう。実際、酵素は、生産時に不正確に折り畳まれることがある。
【０１９３】
ＥＲＴが利用可能なそれらのＬＳＤでは、この治療形態の価値を下げる欠点が存在する。第１に、ＥＲＴは、極めて高価な治療形態であり、社会に財政負担をかけ、一部の患者には手が届かない。また、ＥＲＴは、明確に１つの疾患のみを標的とする。Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）に対して、免疫応答の発生、悪心、嘔吐、腹痛、下痢、発疹、疲労、頭痛、発熱、眩暈、悪寒、背痛、および頻脈、ならびにアレルギー反応を示す症状を含む一部の副作用が報告されている。
【０１９４】
したがって、本発明で行う開示は、リソソーム蓄積症の新規かつ革新的な治療法を提供する。この治療法は、有効な療法が開発されていないリソソーム蓄積症、安価な治療の恩恵を受け得るリソソーム蓄積症、および本発明の生理活性剤を含む併用療法の恩恵を受け得るリソソーム蓄積症に特に適している。
【０１９５】
上記開示したように、本発明による方法は、製造がＥＲＴよりもかなり安価であり、かつ２つ以上の特定のリソソーム蓄積障害を標的にする治療方式を提供する。
【０１９６】
分子シャペロン
ＤＮＡの遺伝子コードをまず転写し、次いで翻訳する際に大量のエネルギーを消費して、細胞は、その時点で細胞の生存に必要と推定される機能を持つポリペプチドを最終的に産生する。しかし、これらの１つがこの未完成ポリペプチド鎖の正しい折り畳みである最終的な障害の一部を、完全に機能的なタンパク質を得るために乗り越えなければならない。正しい折り畳みを達成するための進化的な指令は、疑う余地がないほど明白である。なぜなら、適切な構造、従って機能を持たないペプチドを合成するためにはエネルギーをひどく無駄に浪費するだけではなく、細胞の内腔内でのこのようなタンパク質の凝集が細胞に有害であることを証明できるからである。この凝集は、実際、高いタンパク質濃度の細胞内環境を考慮すると、非常に起こりそうな結果であるため、タンパク質の複雑かつ高度な機構が、タンパク質の折り畳みを助けるために存在し、このような条件下でタンパク質の機能的な状態を維持可能であることは驚きではない。これらのタンパク質は、人間の場合と同様に、未成熟のクライアント（ｃｌｉｅｎｔ）間の不所望の相互作用を防止するため、まとめて分子シャペロンと呼ばれる。
【０１９７】
分子シャペロンは、タンパク質の構造の再構成が起こる細胞のすべての区画内で見られ、タンパク質合成が、細胞内の折り畳まれていないペプチドの主な源であるが、タンパク質を構造的に不安定にする、従って折り畳みがほどけて凝集させ得る高温または他の刺激への細胞の曝露によって、防御タンパク質の産生に関係する特定の細胞応答が行われる。この応答は、原核細胞から真核細胞に渡るどの細胞型でも観察される現象であり、熱ショック応答またはストレス応答と呼ばれる。この応答によって誘導されるタンパク質は、いくつかのファミリーが存在する熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）として知られている。これらのファミリーは、経時的、構造的、および機能的にも関連したタンパク質から構成される一方、異なるファミリーのシャペロンは、構造および細胞機能の両方で大きく異なり得る。シャペロンファミリーの主な例は、真核細胞の殆どの区画、真正細菌、および多くの古細菌に存在する遍在性シャペロン系の中心部分を構成するＨｓｐ７０タンパク質である。このファミリーは、その抗アポトーシス特性、免疫におけるその機能、および癌細胞のＨｓｐ７０のアップレギュレーションへの明白な依存という最も際立ったシャペロンとしての役割に加えて、最近、細胞恒常性の他の側面にも関係していると見なされた。
【０１９８】
熱ショックタンパク質７０ファミリー
Ｈｓｐ７０タンパク質は、タンパク質の折り畳み、不安定な細胞タンパク質の分解、および他の細胞防御の役割を果たすことを含め、多様な細胞プロセスに関与する。これらのプロセスにおけるＨｓｐ７０の一般的な機能は、部分的に折り畳まれたポリペプチドの短い疎水性セグメントを結合して、これにより適切な折り畳みを促進し、凝集を防止することであると思われる。真核生物では、Ｈｓｐ７０シャペロンは、それらの機能的なサイクルの重要なステップを調節する働きをする異なるクラスのタンパク質；特にＪドメインファミリータンパク質Ｈｓｐ４０とｉｎ  ｖｉｖｏで相互作用する。さらに、別のパートナータンパク質も同定され、その一部は、Ｈｓｐ７０をＨＳＰ９０系などの他のシャペロン系に結合している。
【０１９９】
ヒトＨｓｐ７０ファミリーのメンバー
分子シャペロンによる重要な機能の一部には、タンパク質の細胞区画内への輸入、細胞質ゾル、小胞体、およびミトコンドリア内でのタンパク質の折り畳み、タンパク質凝集の防止、ならびに誤って折り畳まれたタンパク質の再折り畳みが含まれる。現在、ヒトＨｓｐ７０ファミリーには、異なる遺伝子によってコードされる１０のメンバーが含まれ、この節は、機能、発現パターン、および相同性／配列同一性に関するこれらのファミリーメンバーの概略を説明するものとする。異なるヒトＨｓｐ７０ファミリーメンバーの命名法にはある種の混同が存在するが、遺伝子座名、遺伝子、およびタンパク質の間の論理的な関連性を提供する一連の一般ガイドラインがＴａｖａｒｉａらによって示されている。しかし、一部の種間の混同がなお存在するため、Ｈｓｐ７０遺伝子およびタンパク質は、本明細書では遺伝子座名で呼ばれる。名称Ｈｓｐ７０は、遺伝子座名がＨＳＰＡ１ＡおよびＨＳＰＡ１Ｂである２つの誘導性Ｈｓｐ７０ファミリーメンバー、またはテキストの一致から明らかなように、一般にＨｓｐ７０ファミリー全般を指すことがある。しかし、本発明中で用いられる場合は、Ｈｓｐ７０は、遺伝子座名がＨＳＰＡ１ＡおよびＨＳＰＡ１Ｂである２つの誘導性Ｈｓｐ７０ファミリーメンバーのいずれかを指すこと意味する。
【０２００】
ＨｓｐＡ１ＡおよびＨｓｐＡ１Ｂ
遺伝子座ＨＳＰＡ１ＡおよびＨＳＰＡ１Ｂから転写される遺伝子は、２つの熱／ストレス誘導性Ｈｓｐ７０遺伝子であり、ヒトＨｓｐ７０に関する文献の殆どは、それらの２つの遺伝子によってコードされるタンパク質に言及する。これらの遺伝子は、互いに９９％の同一性を有し、かつ最初にクローニングされ特徴付けられたヒトＨｓｐ７０ファミリーメンバーである、６４１のアミノ酸からなるタンパク質を産生する。これらの遺伝子は、６ｐ２１．３でＭＨＣクラスＩＩＩ複合体に結合され、イントロンが無く、プロモーター領域がＨＳＥを含み、これにより遺伝子をＨＳＦへ結合することが可能であり、様々な細胞攻撃に応答して転写を誘導する。
【０２０１】
ホモサピエンス熱ショック７０ｋＤａタンパク質１Ａ（ＨＳＰＡ１Ａ）のタンパク質配列は、（配列番号１）（受託番号ＮＭ＿００５３４５．５）：
ＭＡＫＡＡＡＩＧＩＤＬＧＴＴＹＳＣＶＧＶＦＱＨＧＫＶＥＩ  ＩＡＮＤＱＧＮＲＴＴＰＳＹＶＡＦＴＤＴＥＲＬＩＧＤＡＡＫＮＱＶＡＬＮＰＱＮＴＶＦＤＡ  ＫＲＬＩＧＲＫＦＧＤＰＶＶＱＳＤＭＫＨＷＰＦＱＶＩＮＤＧＤＫＰＫＶＱＶＳＹＫＧＥＴＫＡＦＹＰＥＥＩＳＳＭＶＬＴＫＭＫＥＩＡＥＡＹＬＧＹＰＶＴ  ＮＡＶＩＴＶＰＡＹＦＮＤＳＱＲＱＡＴＫＤＡＧＶＩＡＧＬＮＶＬＲＩＩＮＥＰＴＡＡＡＩＡＹＧＬＤＲＴＧＫＧＥＲＮＶＬＩＦＤＬＧＧＧＴＦＤＶＳＩＬ  ＴＩＤＤＧＩＦＥＶＫＡＴＡＧＤＴＨＬＧＧＥＤＦＤＮＲＬＶＮＨＦＶＥＥＦＫＲＫＨＫＫＤＩＳＱＮＫＲＡＶＲＲＬＲＴＡＣＥＲＡＫＲＴＬＳＳＳＴＱＡ  ＳＬＥＩＤＳＬＦＥＧＩＤＦＹＴＳＩＴＲＡＲＦＥＥＬＣＳＤＬＦＲＳＴＬＥＰＶＥＫＡＬＲＤＡＫＬＤＫＡＱＩＨＤＬＶＬＶＧＧＳＴＲＩＰＫＶＱＫＬＬ  ＱＤＦＦＮＧＲＤＬＮＫＳＩＮＰＤＥＡＶＡＹＧＡＡＶＱＡＡＩＬＭＧＤＫＳＥＮＶＱＤＬＬＬＬＤＶＡＰＬＳＬＧＬＥＴＡＧＧＶＭＴＡＬＩＫＲＮＳＴＩ  ＰＴＫＱＴＱＩＦＴＴＹＳＤＮＱＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧＥＲＡＭＴＫＤＮＮＬＬＧＲＦＥＬＳＧＩＰＰＡＰＲＧＶＰＱＩＥＶＴＦＤＩＤＡＮＧＩＬＮＶＴＡ  ＴＤＫＳＴＧＫＡＮＫＩＴＩＴＮＤＫＧＲＬＳＫＥＥＩＥＲＭＶＱＥＡＥＫＹＫＡＥＤＥＶＱＲＥＲＶＳＡＫＮＡＬＥＳＹＡＦＮＭＫＳＡＶＥＤＥＧＬＫＧ  ＫＩＳＥＡＤＫＫＫＶＬＤＫＣＱＥＶＩＳＷＬＤＡＮＴＬＡＥＫＤＥＦＥＨＫＲＫＥＬＥＱＶＣＮＰＩ  ＩＳＧＬＹＱＧＡＧＧＰＧＰＧＧＦＧＡＱＧＰＫＧＧ  ＳＧＳＧＰＴＩＥＥＶＤ
【０２０２】
ホモサピエンス熱ショック７０ｋＤａタンパク質１Ａ（ＨＳＰＡ１Ａ）の核酸（ＤＮＡ）配列は、（配列番号２）（受託番号ＮＭ＿００５３４５．５）：
１  ａｔａａａａｇｃｃｃ  ａｇｇｇｇｃａａｇｃ  ｇｇｔｃｃｇｇａｔａ  ａｃｇｇｃｔａｇｃｃ  ｔｇａｇｇａｇｃｔｇ  ｃｔｇｃｇａｃａｇｔ
６１  ｃｃａｃｔａｃｃｔｔ  ｔｔｔｃｇａｇａｇｔ  ｇａｃｔｃｃｃｇｔｔ  ｇｔｃｃｃａａｇｇｃ  ｔｔｃｃｃａｇａｇｃ  ｇａａｃｃｔｇｔｇｃ  
１２１  ｇｇｃｔｇｃａｇｇｃ  ａｃｃｇｇｃｇｃｇｔ  ｃｇａｇｔｔｔｃｃｇ  ｇｃｇｔｃｃｇｇａａ  ｇｇａｃｃｇａｇｃｔ  ｃｔｔｃｔｃｇｃｇｇ
１８１  ａｔｃｃａｇｔｇｔｔ  ｃｃｇｔｔｔｃｃａｇ  ｃｃｃｃｃａａｔｃｔ  ｃａｇａｇｃｇｇａｇ  ｃｃｇａｃａｇａｇａ  ｇｃａｇｇｇａａｃｃ  
２４１  ｇｇｃａｔｇｇｃｃａ  ａａｇｃｃｇｃｇｇｃ  ｇａｔｃｇｇｃａｔｃ  ｇａｃｃｔｇｇｇｃａ  ｃｃａｃｃｔａｃｔｃ  ｃｔｇｃｇｔｇｇｇｇ
３０１  ｇｔｇｔｔｃｃａａｃ  ａｃｇｇｃａａｇｇｔ  ｇｇａｇａｔｃａｔｃ  ｇｃｃａａｃｇａｃｃ  ａｇｇｇｃａａｃｃｇ  ｃａｃｃａｃｃｃｃｃ
３６１  ａｇｃｔａｃｇｔｇｇ  ｃｃｔｔｃａｃｇｇａ  ｃａｃｃｇａｇｃｇｇ  ｃｔｃａｔｃｇｇｇｇ  ａｔｇｃｇｇｃｃａａ  ｇａａｃｃａｇｇｔｇ
４２１  ｇｃｇｃｔｇａａｃｃ  ｃｇｃａｇａａｃａｃ  ｃｇｔｇｔｔｔｇａｃ  ｇｃｇａａｇｃｇｇｃ  ｔｇａｔｔｇｇｃｃｇ  ｃａａｇｔｔｃｇｇｃ
４８１  ｇａｃｃｃｇｇｔｇｇ  ｔｇｃａｇｔｃｇｇａ  ｃａｔｇａａｇｃａｃ  ｔｇｇｃｃｔｔｔｃｃ  ａｇｇｔｇａｔｃａａ  ｃｇａｃｇｇａｇａｃ
５４１  ａａｇｃｃｃａａｇｇ  ｔｇｃａｇｇｔｇａｇ  ｃｔａｃａａｇｇｇｇ  ｇａｇａｃｃａａｇｇ  ｃａｔｔｃｔａｃｃｃ  ｃｇａｇｇａｇａｔｃ
６０１  ｔｃｇｔｃｃａｔｇｇ  ｔｇｃｔｇａｃｃａａ  ｇａｔｇａａｇｇａｇ  ａｔｃｇｃｃｇａｇｇ  ｃｇｔａｃｃｔｇｇｇ  ｃｔａｃｃｃｇｇｔｇ
６６１  ａｃｃａａｃｇｃｇｇ  ｔｇａｔｃａｃｃｇｔ  ｇｃｃｇｇｃｃｔａｃ  ｔｔｃａａｃｇａｃｔ  ｃｇｃａｇｃｇｃｃａ  ｇｇｃｃａｃｃａａｇ
７２１  ｇａｔｇｃｇｇｇｔｇ  ｔｇａｔｃｇｃｇｇｇ  ｇｃｔｃａａｃｇｔｇ  ｃｔｇｃｇｇａｔｃａ  ｔｃａａｃｇａｇｃｃ  ｃａｃｇｇｃｃｇｃｃ
７８１  ｇｃｃａｔｃｇｃｃｔ  ａｃｇｇｃｃｔｇｇａ  ｃａｇａａｃｇｇｇｃ  ａａｇｇｇｇｇａｇｃ  ｇｃａａｃｇｔｇｃｔ  ｃａｔｃｔｔｔｇａｃ
８４１  ｃｔｇｇｇｃｇｇｇｇ  ｇｃａｃｃｔｔｃｇａ  ｃｇｔｇｔｃｃａｔｃ  ｃｔｇａｃｇａｔｃｇ  ａｃｇａｃｇｇｃａｔ  ｃｔｔｃｇａｇｇｔｇ
９０１  ａａｇｇｃｃａｃｇｇ  ｃｃｇｇｇｇａｃａｃ  ｃｃａｃｃｔｇｇｇｔ  ｇｇｇｇａｇｇａｃｔ  ｔｔｇａｃａａｃａｇ  ｇｃｔｇｇｔｇａａｃ
９６１  ｃａｃｔｔｃｇｔｇｇ  ａｇｇａｇｔｔｃａａ  ｇａｇａａａａｃａｃ  ａａｇａａｇｇａｃａ  ｔｃａｇｃｃａｇａａ  ｃａａｇｃｇａｇｃｃ
１０２１  ｇｔｇａｇｇｃｇｇｃ  ｔｇｃｇｃａｃｃｇｃ  ｃｔｇｃｇａｇａｇｇ  ｇｃｃａａｇａｇｇａ  ｃｃｃｔｇｔｃｇｔｃ  ｃａｇｃａｃｃｃａｇ
１０８１  ｇｃｃａｇｃｃｔｇｇ  ａｇａｔｃｇａｃｔｃ  ｃｃｔｇｔｔｔｇａｇ  ｇｇｃａｔｃｇａｃｔ  ｔｃｔａｃａｃｇｔｃ  ｃａｔｃａｃｃａｇｇ
１１４１  ｇｃｇａｇｇｔｔｃｇ  ａｇｇａｇｃｔｇｔｇ  ｃｔｃｃｇａｃｃｔｇ  ｔｔｃｃｇａａｇｃａ  ｃｃｃｔｇｇａｇｃｃ  ｃｇｔｇｇａｇａａｇ
１２０１  ｇｃｔｃｔｇｃｇｃｇ  ａｃｇｃｃａａｇｃｔ  ｇｇａｃａａｇｇｃｃ  ｃａｇａｔｔｃａｃｇ  ａｃｃｔｇｇｔｃｃｔ  ｇｇｔｃｇｇｇｇｇｃ
１２６１  ｔｃｃａｃｃｃｇｃａ  ｔｃｃｃｃａａｇｇｔ  ｇｃａｇａａｇｃｔｇ  ｃｔｇｃａｇｇａｃｔ  ｔｃｔｔｃａａｃｇｇ  ｇｃｇｃｇａｃｃｔｇ
１３２１  ａａｃａａｇａｇｃａ  ｔｃａａｃｃｃｃｇａ  ｃｇａｇｇｃｔｇｔｇ  ｇｃｃｔａｃｇｇｇｇ  ｃｇｇｃｇｇｔｇｃａ  ｇｇｃｇｇｃｃａｔｃ
１３８１  ｃｔｇａｔｇｇｇｇｇ  ａｃａａｇｔｃｃｇａ  ｇａａｃｇｔｇｃａｇ  ｇａｃｃｔｇｃｔｇｃ  ｔｇｃｔｇｇａｃｇｔ  ｇｇｃｔｃｃｃｃｔｇ
１４４１  ｔｃｇｃｔｇｇｇｇｃ  ｔｇｇａｇａｃｇｇｃ  ｃｇｇａｇｇｃｇｔｇ  ａｔｇａｃｔｇｃｃｃ  ｔｇａｔｃａａｇｃｇ  ｃａａｃｔｃｃａｃｃ
１５０１  ａｔｃｃｃｃａｃｃａ  ａｇｃａｇａｃｇｃａ  ｇａｔｃｔｔｃａｃｃ  ａｃｃｔａｃｔｃｃｇ  ａｃａａｃｃａａｃｃ  ｃｇｇｇｇｔｇｃｔｇ
１５６１  ａｔｃｃａｇｇｔｇｔ  ａｃｇａｇｇｇｃｇａ  ｇａｇｇｇｃｃａｔｇ  ａｃｇａａａｇａｃａ  ａｃａａｔｃｔｇｔｔ  ｇｇｇｇｃｇｃｔｔｃ
１６２１  ｇａｇｃｔｇａｇｃｇ  ｇｃａｔｃｃｃｔｃｃ  ｇｇｃｃｃｃｃａｇｇ  ｇｇｃｇｔｇｃｃｃｃ  ａｇａｔｃｇａｇｇｔ  ｇａｃｃｔｔｃｇａｃ
１６８１  ａｔｃｇａｔｇｃｃａ  ａｃｇｇｃａｔｃｃｔ  ｇａａｃｇｔｃａｃｇ  ｇｃｃａｃｇｇａｃａ  ａｇａｇｃａｃｃｇｇ  ｃａａｇｇｃｃａａｃ
１７４１  ａａｇａｔｃａｃｃａ  ｔｃａｃｃａａｃｇａ  ｃａａｇｇｇｃｃｇｃ  ｃｔｇａｇｃａａｇｇ  ａｇｇａｇａｔｃｇａ  ｇｃｇｃａｔｇｇｔｇ
１８０１  ｃａｇｇａｇｇｃｇｇ  ａｇａａｇｔａｃａａ  ａｇｃｇｇａｇｇａｃ  ｇａｇｇｔｇｃａｇｃ  ｇｃｇａｇａｇｇｇｔ  ｇｔｃａｇｃｃａａｇ
１８６１  ａａｃｇｃｃｃｔｇｇ  ａｇｔｃｃｔａｃｇｃ  ｃｔｔｃａａｃａｔｇ  ａａｇａｇｃｇｃｃｇ  ｔｇｇａｇｇａｔｇａ  ｇｇｇｇｃｔｃａａｇ
１９２１  ｇｇｃａａｇａｔｃａ  ｇｃｇａｇｇｃｇｇａ  ｃａａｇａａｇａａｇ  ｇｔｇｃｔｇｇａｃａ  ａｇｔｇｔｃａａｇａ  ｇｇｔｃａｔｃｔｃｇ
１９８１  ｔｇｇｃｔｇｇａｃｇ  ｃｃａａｃａｃｃｔｔ  ｇｇｃｃｇａｇａａｇ  ｇａｃｇａｇｔｔｔｇ  ａｇｃａｃａａｇａｇ  ｇａａｇｇａｇｃｔｇ
２０４１  ｇａｇｃａｇｇｔｇｔ  ｇｔａａｃｃｃｃａｔ  ｃａｔｃａｇｃｇｇａ  ｃｔｇｔａｃｃａｇｇ  ｇｔｇｃｃｇｇｔｇｇ  ｔｃｃｃｇｇｇｃｃｔ
２１０１  ｇｇｇｇｇｃｔｔｃｇ  ｇｇｇｃｔｃａｇｇｇ  ｔｃｃｃａａｇｇｇａ  ｇｇｇｔｃｔｇｇｇｔ  ｃａｇｇｃｃｃｃａｃ  ｃａｔｔｇａｇｇａｇ
２１６１  ｇｔａｇａｔｔａｇｇ  ｇｇｃｃｔｔｔｃｃａ  ａｇａｔｔｇｃｔｇｔ  ｔｔｔｔｇｔｔｔｔｇ  ｇａｇｃｔｔｃａａｇ  ａｃｔｔｔｇｃａｔｔ
２２２１  ｔｃｃｔａｇｔａｔｔ  ｔｃｔｇｔｔｔｇｔｃ  ａｇｔｔｃｔｃａａｔ  ｔｔｃｃｔｇｔｇｔｔ  ｔｇｃａａｔｇｔｔｇ  ａａａｔｔｔｔｔｔｇ
２２８１  ｇｔｇａａｇｔａｃｔ  ｇａａｃｔｔｇｃｔｔ  ｔｔｔｔｔｃｃｇｇｔ  ｔｔｃｔａｃａｔｇｃ  ａｇａｇａｔｇａａｔ  ｔｔａｔａｃｔｇｃｃ
２３４１  ａｔｃｔｔａｃｇａｃ  ｔａｔｔｔｃｔｔｃｔ  ｔｔｔｔａａｔａｃａ  ｃｔｔａａｃｔｃａｇ  ｇｃｃａｔｔｔｔｔｔ  ａａｇｔｔｇｇｔｔａ
２４０１  ｃｔｔｃａａａｇｔａ  ａａｔａａａｃｔｔｔ  ａａａａｔｔｃａａａ  ａａａａａａａａａａ  ａａａａａ
【０２０３】
ホモサピエンス熱ショック７０ｋＤａタンパク質１Ｂ（ＨＳＰＡ１Ｂ）のタンパク質配列は、（配列番号３）（受託番号ＮＭ＿００５３４６）：
ＭＡＫＡＡＡＩＧＩＤＬＧＴＴＹＳＣＶＧＶＦＱＨＧＫＶＥＩ  ＩＡＮＤＱＧＮＲＴＴＰＳＹＶＡＦＴＤＴＥＲＬＩＧＤＡＡＫＮＱＶＡＬＮＰＱＮＴＶＦＤＡ  ＫＲＬＩＧＲＫＦＧＤＰＶＶＱＳＤＭＫＨＷＰＦＱＶＩＮＤＧＤＫＰＫＶＱＶＳＹＫＧＥＴＫＡＦＹＰＥＥＩＳＳＭＶＬＴＫＭＫＥＩＡＥＡＹＬＧＹＰＶＴ  ＮＡＶＩＴＶＰＡＹＦＮＤＳＱＲＱＡＴＫＤＡＧＶＩＡＧＬＮＶＬＲＩＩＮＥＰＴＡＡＡＩＡＹＧＬＤＲＴＧＫＧＥＲＮＶＬＩＦＤＬＧＧＧＴＦＤＶＳＩＬ  ＴＩＤＤＧＩＦＥＶＫＡＴＡＧＤＴＨＬＧＧＥＤＦＤＮＲＬＶＮＨＦＶＥＥＦＫＲＫＨＫＫＤＩＳＱＮＫＲＡＶＲＲＬＲＴＡＣＥＲＡＫＲＴＬＳＳＳＴＱＡ  ＳＬＥＩＤＳＬＦＥＧＩＤＦＹＴＳＩＴＲＡＲＦＥＥＬＣＳＤＬＦＲＳＴＬＥＰＶＥＫＡＬＲＤＡＫＬＤＫＡＱＩＨＤＬＶＬＶＧＧＳＴＲＩＰＫＶＱＫＬＬ  ＱＤＦＦＮＧＲＤＬＮＫＳＩＮＰＤＥＡＶＡＹＧＡＡＶＱＡＡＩＬＭＧＤＫＳＥＮＶＱＤＬＬＬＬＤＶＡＰＬＳＬＧＬＥＴＡＧＧＶＭＴＡＬＩＫＲＮＳＴＩ  ＰＴＫＱＴＱＩＦＴＴＹＳＤＮＱＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧＥＲＡＭＴＫＤＮＮＬＬＧＲＦＥＬＳＧＩＰＰＡＰＲＧＶＰＱＩＥＶＴＦＤＩＤＡＮＧＩＬＮＶＴＡ  ＴＤＫＳＴＧＫＡＮＫＩＴＩＴＮＤＫＧＲＬＳＫＥＥＩＥＲＭＶＱＥＡＥＫＹＫＡＥＤＥＶＱＲＥＲＶＳＡＫＮＡＬＥＳＹＡＦＮＭＫＳＡＶＥＤＥＧＬＫＧ  ＫＩＳＥＡＤＫＫＫＶＬＤＫＣＱＥＶＩＳＷＬＤＡＮＴＬＡＥＫＤＥＦＥＨＫＲＫＥＬＥＱＶＣＮＰＩ  ＩＳＧＬＹＱＧＡＧＧＰＧＰＧＧＦＧＡＱＧＰＫＧＧ  ＳＧＳＧＰＴＩＥＥＶＤ
【０２０４】
ホモサピエンス熱ショック７０ｋＤａタンパク質１Ｂ（ＨＳＰＡ１Ｂ）の核酸（ＤＮＡ）配列は、（配列番号４）（受託番号ＮＭ＿００５３４６）：
１  ｇｇａａａａｃｇｇｃ  ｃａｇｃｃｔｇａｇｇ  ａｇｃｔｇｃｔｇｃｇ  ａｇｇｇｔｃｃｇｃｔ  ｔｃｇｔｃｔｔｔｃｇ  ａｇａｇｔｇａｃｔｃ
６１  ｃｃｇｃｇｇｔｃｃｃ  ａａｇｇｃｔｔｔｃｃ  ａｇａｇｃｇａａｃｃ  ｔｇｔｇｃｇｇｃｔｇ  ｃａｇｇｃａｃｃｇｇ  ｃｇｔｇｔｔｇａｇｔ
１２１  ｔｔｃｃｇｇｃｇｔｔ  ｃｃｇａａｇｇａｃｔ  ｇａｇｃｔｃｔｔｇｔ  ｃｇｃｇｇａｔｃｃｃ  ｇｔｃｃｇｃｃｇｔｔ  ｔｃｃａｇｃｃｃｃｃ
１８１  ａｇｔｃｔｃａｇａｇ  ｃｇｇａｇｃｃｃａｃ  ａｇａｇｃａｇｇｇｃ  ａｃｃｇｇｃａｔｇｇ  ｃｃａａａｇｃｃｇｃ  ｇｇｃｇａｔｃｇｇｃ
２４１  ａｔｃｇａｃｃｔｇｇ  ｇｃａｃｃａｃｃｔａ  ｃｔｃｃｔｇｃｇｔｇ  ｇｇｇｇｔｇｔｔｃｃ  ａａｃａｃｇｇｃａａ  ｇｇｔｇｇａｇａｔｃ
３０１  ａｔｃｇｃｃａａｃｇ  ａｃｃａｇｇｇｃａａ  ｃｃｇｃａｃｃａｃｃ  ｃｃｃａｇｃｔａｃｇ  ｔｇｇｃｃｔｔｃａｃ  ｇｇａｃａｃｃｇａｇ
３６１  ｃｇｇｃｔｃａｔｃｇ  ｇｇｇａｔｇｃｇｇｃ  ｃａａｇａａｃｃａｇ  ｇｔｇｇｃｇｃｔｇａ  ａｃｃｃｇｃａｇａａ  ｃａｃｃｇｔｇｔｔｔ
４２１  ｇａｃｇｃｇａａｇｃ  ｇｇｃｔｇａｔｃｇｇ  ｃｃｇｃａａｇｔｔｃ  ｇｇｃｇａｃｃｃｇｇ  ｔｇｇｔｇｃａｇｔｃ  ｇｇａｃａｔｇａａｇ
４８１  ｃａｃｔｇｇｃｃｔｔ  ｔｃｃａｇｇｔｇａｔ  ｃａａｃｇａｃｇｇａ  ｇａｃａａｇｃｃｃａ  ａｇｇｔｇｃａｇｇｔ  ｇａｇｃｔａｃａａｇ
５４１  ｇｇｇｇａｇａｃｃａ  ａｇｇｃａｔｔｃｔａ  ｃｃｃｃｇａｇｇａｇ  ａｔｃｔｃｇｔｃｃａ  ｔｇｇｔｇｃｔｇａｃ  ｃａａｇａｔｇａａｇ
６０１  ｇａｇａｔｃｇｃｃｇ  ａｇｇｃｇｔａｃｃｔ  ｇｇｇｃｔａｃｃｃｇ  ｇｔｇａｃｃａａｃｇ  ｃｇｇｔｇａｔｃａｃ  ｃｇｔｇｃｃｇｇｃｃ
６６１  ｔａｃｔｔｃａａｃｇ  ａｃｔｃｇｃａｇｃｇ  ｃｃａｇｇｃｃａｃｃ  ａａｇｇａｔｇｃｇｇ  ｇｔｇｔｇａｔｃｇｃ  ｇｇｇｇｃｔｃａａｃ
７２１  ｇｔｇｃｔｇｃｇｇａ  ｔｃａｔｃａａｃｇａ  ｇｃｃｃａｃｇｇｃｃ  ｇｃｃｇｃｃａｔｃｇ  ｃｃｔａｃｇｇｃｃｔ  ｇｇａｃａｇａａｃｇ
７８１  ｇｇｃａａｇｇｇｇｇ  ａｇｃｇｃａａｃｇｔ  ｇｃｔｃａｔｃｔｔｔ  ｇａｃｃｔｇｇｇｃｇ  ｇｇｇｇｃａｃｃｔｔ  ｃｇａｃｇｔｇｔｃｃ
８４１  ａｔｃｃｔｇａｃｇａ  ｔｃｇａｃｇａｃｇｇ  ｃａｔｃｔｔｃｇａｇ  ｇｔｇａａｇｇｃｃａ  ｃｇｇｃｃｇｇｇｇａ  ｃａｃｃｃａｃｃｔｇ
９０１  ｇｇｔｇｇｇｇａｇｇ  ａｃｔｔｔｇａｃａａ  ｃａｇｇｃｔｇｇｔｇ  ａａｃｃａｃｔｔｃｇ  ｔｇｇａｇｇａｇｔｔ  ｃａａｇａｇａａａａ
９６１  ｃａｃａａｇａａｇｇ  ａｃａｔｃａｇｃｃａ  ｇａａｃａａｇｃｇａ  ｇｃｃｇｔｇａｇｇｃ  ｇｇｃｔｇｃｇｃａｃ  ｃｇｃｃｔｇｃｇａｇ
１０２１  ａｇｇｇｃｃａａｇａ  ｇｇａｃｃｃｔｇｔｃ  ｇｔｃｃａｇｃａｃｃ  ｃａｇｇｃｃａｇｃｃ  ｔｇｇａｇａｔｃｇａ  ｃｔｃｃｃｔｇｔｔｔ
１０８１  ｇａｇｇｇｃａｔｃｇ  ａｃｔｔｃｔａｃａｃ  ｇｔｃｃａｔｃａｃｃ  ａｇｇｇｃｇａｇｇｔ  ｔｃｇａｇｇａｇｃｔ  ｇｔｇｃｔｃｃｇａｃ
１１４１  ｃｔｇｔｔｃｃｇａａ  ｇｃａｃｃｃｔｇｇａ  ｇｃｃｃｇｔｇｇａｇ  ａａｇｇｃｔｃｔｇｃ  ｇｃｇａｃｇｃｃａａ  ｇｃｔｇｇａｃａａｇ
１２０１  ｇｃｃｃａｇａｔｔｃ  ａｃｇａｃｃｔｇｇｔ  ｃｃｔｇｇｔｃｇｇｇ  ｇｇｃｔｃｃａｃｃｃ  ｇｃａｔｃｃｃｃａａ  ｇｇｔｇｃａｇａａｇ
１２６１  ｃｔｇｃｔｇｃａｇｇ  ａｃｔｔｃｔｔｃａａ  ｃｇｇｇｃｇｃｇａｃ  ｃｔｇａａｃａａｇａ  ｇｃａｔｃａａｃｃｃ  ｃｇａｃｇａｇｇｃｔ
１３２１  ｇｔｇｇｃｃｔａｃｇ  ｇｇｇｃｇｇｃｇｇｔ  ｇｃａｇｇｃｇｇｃｃ  ａｔｃｃｔｇａｔｇｇ  ｇｇｇａｃａａｇｔｃ  ｃｇａｇａａｃｇｔｇ
１３８１  ｃａｇｇａｃｃｔｇｃ  ｔｇｃｔｇｃｔｇｇａ  ｃｇｔｇｇｃｔｃｃｃ  ｃｔｇｔｃｇｃｔｇｇ  ｇｇｃｔｇｇａｇａｃ  ｇｇｃｃｇｇａｇｇｃ
１４４１  ｇｔｇａｔｇａｃｔｇ  ｃｃｃｔｇａｔｃａａ  ｇｃｇｃａａｃｔｃｃ  ａｃｃａｔｃｃｃｃａ  ｃｃａａｇｃａｇａｃ  ｇｃａｇａｔｃｔｔｃ
１５０１  ａｃｃａｃｃｔａｃｔ  ｃｃｇａｃａａｃｃａ  ａｃｃｃｇｇｇｇｔｇ  ｃｔｇａｔｃｃａｇｇ  ｔｇｔａｃｇａｇｇｇ  ｃｇａｇａｇｇｇｃｃ
１５６１  ａｔｇａｃｇａａａｇ  ａｃａａｃａａｔｃｔ  ｇｔｔｇｇｇｇｃｇｃ  ｔｔｃｇａｇｃｔｇａ  ｇｃｇｇｃａｔｃｃｃ  ｔｃｃｇｇｃｃｃｃｃ
１６２１  ａｇｇｇｇｃｇｔｇｃ  ｃｃｃａｇａｔｃｇａ  ｇｇｔｇａｃｃｔｔｃ  ｇａｃａｔｃｇａｔｇ  ｃｃａａｃｇｇｃａｔ  ｃｃｔｇａａｃｇｔｃ
１６８１  ａｃｇｇｃｃａｃｇｇ  ａｃａａｇａｇｃａｃ  ｃｇｇｃａａｇｇｃｃ  ａａｃａａｇａｔｃａ  ｃｃａｔｃａｃｃａａ  ｃｇａｃａａｇｇｇｃ
１７４１  ｃｇｃｃｔｇａｇｃａ  ａｇｇａｇｇａｇａｔ  ｃｇａｇｃｇｃａｔｇ  ｇｔｇｃａｇｇａｇｇ  ｃｇｇａｇａａｇｔａ  ｃａａａｇｃｇｇａｇ
１８０１  ｇａｃｇａｇｇｔｇｃ  ａｇｃｇｃｇａｇａｇ  ｇｇｔｇｔｃａｇｃｃ  ａａｇａａｃｇｃｃｃ  ｔｇｇａｇｔｃｃｔａ  ｃｇｃｃｔｔｃａａｃ
１８６１  ａｔｇａａｇａｇｃｇ  ｃｃｇｔｇｇａｇｇａ  ｔｇａｇｇｇｇｃｔｃ  ａａｇｇｇｃａａｇａ  ｔｃａｇｃｇａｇｇｃ  ｇｇａｃａａｇａａｇ
１９２１  ａａｇｇｔｔｃｔｇｇ  ａｃａａｇｔｇｔｃａ  ａｇａｇｇｔｃａｔｃ  ｔｃｇｔｇｇｃｔｇｇ  ａｃｇｃｃａａｃａｃ  ｃｔｔｇｇｃｃｇａｇ
１９８１  ａａｇｇａｃｇａｇｔ  ｔｔｇａｇｃａｃａａ  ｇａｇｇａａｇｇａｇ  ｃｔｇｇａｇｃａｇｇ  ｔｇｔｇｔａａｃｃｃ  ｃａｔｃａｔｃａｇｃ
２０４１  ｇｇａｃｔｇｔａｃｃ  ａｇｇｇｔｇｃｃｇｇ  ｔｇｇｔｃｃｃｇｇｇ  ｃｃｔｇｇｃｇｇｃｔ  ｔｃｇｇｇｇｃｔｃａ  ｇｇｇｔｃｃｃａａｇ
２１０１  ｇｇａｇｇｇｔｃｔｇ  ｇｇｔｃａｇｇｃｃｃ  ｔａｃｃａｔｔｇａｇ  ｇａｇｇｔｇｇａｔｔ  ａｇｇｇｇｃｃｔｔｔ  ｇｔｔｃｔｔｔａｇｔ
２１６１  ａｔｇｔｔｔｇｔｃｔ  ｔｔｇａｇｇｔｇｇａ  ｃｔｇｔｔｇｇｇａｃ  ｔｃａａｇｇａｃｔｔ  ｔｇｃｔｇｃｔｇｔｔ  ｔｔｃｃｔａｔｇｔｃ
２２２１  ａｔｔｔｃｔｇｃｔｔ  ｃａｇｃｔｃｔｔｔｇ  ｃｔｇｃｔｔｃａｃｔ  ｔｃｔｔｔｇｔａａａ  ｇｔｔｇｔａａｃｃｔ  ｇａｔｇｇｔａａｔｔ
２２８１  ａｇｃｔｇｇｃｔｔｃ  ａｔｔａｔｔｔｔｔｇ  ｔａｇｔａｃａａｃｃ  ｇａｔａｔｇｔｔｃａ  ｔｔａｇａａｔｔｃｔ  ｔｔｇｃａｔｔｔａａ
２３４１  ｔｇｔｔｇａｔａｃｔ  ｇｔａａｇｇｇｔｇｔ  ｔｔｃｇｔｔｃｃｃｔ  ｔｔａａａｔｇａａｔ  ｃａａｃａｃｔｇｃｃ  ａｃｃｔｔｃｔｇｔａ
２４０１  ｃｇａｇｔｔｔｇｔｔ  ｔｇｔｔｔｔｔｔｔｔ  ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ  ｔｔｔｔｔｔｇｃｔｔ  ｇｇｃｇａａａａｃａ  ｃｔａｃａａａｇｇｃ
２４６１  ｔｇｇｇａａｔｇｔａ  ｔｇｔｔｔｔｔａｔａ  ａｔｔｔｇｔｔｔａｔ  ｔｔａａａｔａｔｇａ  ａａａａｔａａａａｔ  ｇｔｔａａａｃｔｔｔ
２５２１  ａａａａａａａａａａ  ａａａａａａａａａａ  ａａａａａａａａａａ  ａ
【０２０５】
ＨｓｐＡ１ＬおよびＨｓｐＡ２
２つのＨｓｐ７０ファミリーメンバーは、雄生殖細胞が強い偏見でそれらの発現を優先するため、「優越主義遺伝子（ｃｈａｕｖｉｎｉｓｔ  ｇｅｎｅ）」と呼ばれる。ｈｓｐＡ１Ｌ遺伝子は、第６染色体上の同じＭＨＣクラスＩＩＩ複合体におけるＨＳＰＡ１Ａ遺伝子座の４ｋｂテロメア側に位置する、恒常的に発現される無イントロンＨｓｐ７０ファミリーメンバーである。ｈｓｐＡ１Ｌ遺伝子は、熱ショックの前後で低量発現されるが、その発現パターンが、マウス、ラット、およびヒトの精巣に有利に働き、その６４１のアミノ酸（ａａ）タンパク質が、ＨｓｐＡ１Ａに対して９０％同一である。ｈｓｐＡ２遺伝子は、マウスゲノムライブラリーから最初に単離され、骨格筋、卵巣、小腸、結腸、脳、胎盤、および腎臓を含むヒトの体の様々な組織で低レベルであるが、精巣では高レベルで恒常的に発現されることが後に示された。その発現または逆にその欠如は、異常なヒト精子形成と関連があり、雄ｈｓｐＡ２（−／−）マウスは、生殖不能である。この遺伝子は、第１４染色体に位置し、ＨｓｐＡ１Ａに対して８４％同一の６３９ａａのタンパク質を産生するが、正確な位置は、２つの研究論文が異なる遺伝子座位置１４ｑ２４．１と１４ｑ２２を示しているため議論が必要である。
【０２０６】
ＨｓｐＡ６およびＨｓｐＡ７
ｈｓｐＡ６およびｈｓｐＡ７遺伝子は、マウスには明確な対応物がないＨｓｐ７０ファミリーの熱誘導性メンバーである。ｈｓｐＡ６およびｈｓｐＡ７遺伝子は、プロモーター部位にＨＳＥを含み、これらの遺伝子はイントロンが無い。ｈｓｐＡ６およびｈｓｐＡ７遺伝子は、第１染色体上に共局在化し、互いにヌクレオチド配列が９４％同一である。しかし、ｈｓｐＡ７遺伝子が、＋１３２４に中途終止コドンを生成する１つのヌクレオチド挿入を有するため、ＨｓｐＡ６のみが機能的である。ＨｓｐＡ６タンパク質は、６４３ａａの長さであり、ＨｓｐＡ１ＡおよびＨｓｐＡ１Ｂに対して７７％の同一性を示す。
【０２０７】
ＨｓｐＡ５およびＨｓｐＡ９
ｈｓｐＡ５およびｈｓｐＡ９遺伝子は、Ｈｓｐ７０ファミリーの２つの区画特異的メンバーである。６５５ａａのＨｓｐＡ５タンパク質は、小胞体（ＥＲ）内に位置し、この区画内で新規に合成されたタンパク質の折り畳みおよび輸送を促進する。このタンパク質は、ＨｓｐＡ１Ａに対して６４％同一であり、この遺伝子は、９ｑ３４に位置している。６７９ａａのＨｓｐＡ９タンパク質は、ミトコンドリア内に位置し、ミトコンドリア膜を渡って輸送されたタンパク質の折り畳みを助ける。ＨｓｐＡ９は、５ｑ３１．１に位置し、このタンパク質は、ＨｓｐＡ１Ａに対して５２％同一である。
【０２０８】
ＨｓｐＡ８
Ｈｓｃ７０として知られる同種Ｈｓｐ７０メンバーは、ＨｓｐＡ１Ａに対して８６％同一の６４６ａａのタンパク質を産生する、１１ｑ２４にあるｈｓｐＡ８という名称の遺伝子によってコードされ、すべての組織および細胞系で恒常的に発現される。このタンパク質は、細胞機能がＨｓｐ７０に類似し、通常の状況下で必要なシャペロン機能を提供するが、クラスリン被覆小胞の脱被覆およびシャペロン媒介自己貪食における役割も果たす。
【０２０９】
ＨｓｐＡ３およびＨｓｐＡ４
ＨＳＰＡ４がＨｓｐ１１０ファミリーのメンバーである可能性が高く、これまでのところ、その染色体の位置が５ｑ３１．１−２であることを除き何も知られておらず、ＨＳＰＡ３がそもそも存在するかさえも疑わしいため、これらは本明細書では説明しない。
【０２１０】
【表２】
2013544263.tif 000004
【０２１１】
Ｈｓｐ７０の転写調節
ヒトＨｓｐ７０プロモーターのゲノムフットプリント法により、熱ショック／ストレスが、熱ショック要素（ＨＳＥ）という名称のｎＧＡＡｎ配列を含む領域への熱ショック転写因子（ＨＳＦ）の迅速な結合を誘導することが明らかにされた。通常の条件下では、Ｈｓｐ７０は、細胞質ゾル内に存在するＨＳＦに結合するが、ストレスの間は、ＨＳＦは、Ｈｓｐ７０から分離し、ＰＫＣまたは他のセリン／トレオニンキナーゼによってリン酸化されてホモ三量体構造をとる。このＨＳＦ三量体は、核内に侵入して、そこで、Ｈｓｐ７０遺伝子のプロモーター領域に位置するＨＳＥに結合し、ＨＳＦキナーゼによってさらにリン酸化される。
【０２１２】
３つのＨＳＦは、これまでのところヒトで特徴付けられた（ＨＳＦ１、ＨＳＦ２、およびＨＳＦ４）。ＨＳＦ１は、殆どのストレス条件下で活性化される主な転写因子であり、様々な刺激に応答し、ストレス条件は、生理学的条件（例えば、細胞分裂、ホルモン刺激）、病理学的条件（例えば、感染、発熱、炎症、悪性腫瘍）、および環境条件（例えば、熱ショック、重金属、エタノール）に分類することができる。ＨＳＦ２は、ヘミンのみに応答するが、ＨＳＦ４は、ヒトの心臓、膵臓、脳、および骨格筋で優先的に発現され、すべての脊椎動物ＨＳＦ間で共有されるＣ末端疎水性反復が欠損し、かつＨＳＰの発現を抑制するようである。恒常的に発現されるＨｓｐ７０（Ｈｓｃ７０）の合成に関与するＨｓｐ７０遺伝子調節は、明確には理解されていないが、ＨＳＦは関与していないようである。
【０２１３】
ＨＳＦは、ＨＳＰの発現を調節する最も顕著な因子であるが、他の転写因子も、同じ能力を有することが示された。特異的なＣＣＡＡＴボックス結合因子（ＣＢＦ）は、Ｈｓｐ７０の転写を誘導することが示され、腫瘍抑制因子ｐ５３は、Ｈｓｐ７０のプロモーター領域に結合し、ＣＢＦを中和することによって転写を抑制することができ、ＨＳＦは、熱ショック因子結合タンパク質１（ＨＳＢＰ１）によってアンタゴナイズされ得、このようにＨｓｐ７０の転写が抑制される。
【０２１４】
Ｈｓｐ７０の構造的および機能的特性
Ｈｓｐ７０系の構造および機能は、真正細菌Ｈｓｐ７０、ＤｎａＫ、そのＨｓｐ４０コシャペロンＤｎａＪ、およびヌクレオチド交換因子ＧｒｐＥに関して最もよく理解されている。しかし、その機構は、一般的に真核生物では類似していると考えられるが、証拠がＧｒｐＥの分離を示唆している。この節は、真核生物Ｈｓｐ７０系に焦点を当てるが、適切であると考えられる場合は、真正細菌系に対する論評も含む。
【０２１５】
Ｈｓｐ７０は、Ｎ末端ＡＴＰアーゼドメインおよび比較的小さいＣ末端ペプチド結合ドメインの２つの機能単位から構成されている。ＡＴＰアーゼドメインは、ヌクレオチド結合部位を含むクレフト（ｃｌｅｆｔ）によって分離された２つのサブドメインから構成され、このヌクレオチド結合部位が、Ｃ末端ドメインのペプチド結合特性を決定する。ＡＴＰが結合すると、ペプチド基質が、低親和性であるが迅速に結合および解離し、ヌクレオチドまたはＡＤＰのいずれもがＮ末端ドメインに結合していない状態では、ペプチドの結合率および解離率が低下し、親和性が上昇する。したがって、ＡＴＰ加水分解は、Ｈｓｐ７０の２つの状態間の分子スイッチとして機能し、そのサイクリングは、真核生物のＪドメインファミリータンパク質Ｈｓｐ４０ならびに真正細菌のＤｎａＪおよびＧｒｐＥによって調節される。Ｈｓｐ４０のＮ末端Ｊドメインが、ＡＴＰ加水分解を促進するＨｓｐ７０に結合し、これによりペプチドの捕捉を促進する一方、Ｈｓｐ４０のＣ末端部分が、疎水性ペプチドを認識することによってシャペロンとして機能し、これによりＨｓｐ７０が新生ポリペプチド鎖に補充される。分子シャペロンは、結合したタンパク質の折り畳みについての特定の立体情報は提供しないが、非生産的な相互作用を阻害し、これによりタンパク質がその天然構造により効率的な折り畳み可能となることに留意することが重要である。
【０２１６】
真正細菌では、ＧｒｐＥが、ＡＤＰのＤｎａＫ（細菌Ｈｓｐ７０）からの放出を誘導するが、真核生物Ｈｓｐ７０タンパク質では、このＡＴＰアーゼサイクルの律速段階が、結合ＡＤＰの解離ではなく、むしろＡＴＰ加水分解自体であるため、このような因子は重要ではないと思われる。しかし、別のタンパク質が、真核生物でＨｓｐ７０の機能を調節するように役割を果たし；ホモオリゴマータンパク質ヒップ（Ｈｉｐ）（Ｈｓｐ７０相互作用タンパク質）が、Ｈｓｐ７０のＡＤＰ結合状態を安定させることによって正の調節因子として役割を果たすが、Ｈｓｐ７０結合タンパク質（ＣＨＩＰ）およびＢｃｌ−２関連アタノジーン−１（Ｂｃｌ−２−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｔｈａｎｏｇｅｎｅ−１）（Ｂａｇ−１）の両方のタンパク質カルボキシ末端が、Ｈｓｐ７０のＡＴＰアーゼ活性を阻害することによるＣＨＩＰの阻害効果、およびＨｓｐ７０の再折り畳み活性をアンタゴナイズすることによるＢａｇ−１の阻害効果を有する。２つのヒトＨｓｐ４０タンパク質Ｈｄｊ１とＨｄｊ２によってさらなる相互作用が起こり、これらのタンパク質は、Ｈｓｐ４０機能（上述）に加えて、Ｈｏｐ（Ｈｓｐ−組織化タンパク質）によるＨｓｐ７０とＨｓｐ９０の結合を促進することが示され、Ｈｏｐは、Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ９０の延長Ｃ末端配列のそれぞれに結合するその２つのテトラトリコペプチド反復（ＴＰＲ）ドメインによってシャペロン同士を物理的に連結するアダプタータンパク質である。一部の上述のタンパク質は、非天然または不可逆的に誤って折り畳まれたタンパク質のシャペロンからユビキチン−プロテアソーム機構への輸送において調節機能を果たすことが最近示された。タンパク質ＣＨＩＰは、Ｈｓｐ７０に対する負の調節の役割とは別に、Ｎ末端ＴＰＲドメインを介してＨｓｐ９０と結合することができ、Ｃ末端ユビキチンリガーゼドメインによる分解のためにＨｓｐ９０基質を標的とするが、ＢＡＧ−１と機能的に協働することもでき、ＢＡＧ−１は、Ｈｓｐ７０（およびプロテアソーム）に結合する。これらの知見は、細胞質ゾルにおけるタンパク質の質の管理の２つ主な構成要素である、シャペロン支援折り畳みとタンパク質分解を統合する機構間のリンクを可能にする。
【０２１７】
Ｈｓｐ７０による細胞保護
分子シャペロンであることの結果としてのＨｓｐ７０の抗アポトーシス能力、すなわち通常であれば変性する条件下でタンパク質の折り畳みを促進することは別として、Ｈｓｐ７０は、虚血再灌流傷害後のミトコンドリア機能の保護、初代線維芽細胞のＴＮＦでの刺激時にストレスキナーゼｃ−ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）の活性化の阻害を含む様々な他の方法で細胞の生存に影響を与えることもでき、Ｈｓｐ７０／Ｂａｇ−１複合体が、細胞ストレスの状態の際に細胞増殖および有糸分裂誘発を調節することが示されている。ＴＮＦ、ＴＲＡＩＬ、酸化ストレス、ＵＶ照射、ならびに抗癌剤ドキソルビシン、エトポシド、およびタキソールなどの様々な刺激によって誘導される細胞死から細胞を保護するＨｓｐ７０の能力は、その抗アポトーシス特性をさらに強める。最後に、研究報告により、Ｈｓｐ７０がアポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）をアンタゴナイズし、カスパーゼ３の下流の抗アポトーシス機能を働かせるため、Ｈｓｐ７０とアポトーシス機構との間のより直接的な相互作用の証拠も示された。
【０２１８】
最近の証拠は、Ｈｓｐ７０の強力な細胞保護効果の一部がリソソーム膜の安定化によるものであることも示唆している。この証拠から、Ｈｓｐ７０の欠乏が、癌細胞におけるリソソーム膜の早期透過化およびカテプシン媒介細胞死を引き起こし、外来性Ｈｓｐ７０が、様々なストレスによって誘導されるリソソームの不安定化を効果的に抑制する。さらに、Ｈｓｐ７０が欠損したマウスは、リソソームプロテアーゼの細胞質ゾル内への漏出によって引き起こされる膵炎に罹病する。これらの事象のすべては、ＰＣＤの重要な制御因子、従って細胞の生存因子としてのＨｓｐ７０の役割を強調する。
【０２１９】
細胞外Ｈｓｐ７０
前の段落から明らかなように、Ｈｓｐ７０の細胞内機能は、適切な細胞恒常性、特に有害な攻撃の際に必須である。しかし、特に、免疫および炎症応答に関して、細胞外Ｈｓｐ７０（ｅＨｓｐ７０）の興味深い役割も浮上し、ｅＨｓｐ７０は、癌細胞の除去に重要な役割を有するであろう。さらに、ストレスおよび細胞損傷に対する保護への一般的な生理学的適応への関与も、ｅＨｓｐ７０の新しいテーマである。
【０２２０】
細胞外Ｈｓｐ７０および神経保護
ｅＨｓｐ７０の存在についての最初の証拠は、温度の上昇が、一連の熱ショックタンパク質を、軸索内に移送される軸索を取り囲んでいるグリア鞘に誘導したことを示すイカ巨大軸索の研究からもたらされた。これらの知見は、培養ラット胚細胞ですぐに再現され、そして重要なことに既にこの時点で、共に古典的な分泌経路の阻害剤であるモネンジンもコルヒチンもＨｓｐ７０の分泌を阻害できないため、Ｈｓｐ７０の放出に関与するエキソサイトーシスの非古典的経路に関する証拠が示された。これらが公表されてから、他の研究報告が、カエル、ザリガニ、およびラットなどの様々な動物モデル系におけるグリアによるＨｓｐｓの放出およびニューロンによる取り込みの例を提供した。ヒトにおけるｅＨｓｐ７０の源としてのグリア細胞の役割の裏づけが、培養ヒトグリア芽細胞腫細胞の研究によって示された。この研究は、コントロール条件下で、細胞が、２４時間の期間に１００万細胞当たり約１０ｐｇのＨｓｐ７０を培地に放出したことを示した。この放出は、この期間の初めに２０分間の熱ショックを与えられると２．５〜５倍に増加した。重要なことに、この研究は、ｅＨｓｐ７０の放出が細胞死によって説明できる放出よりも多いことも示した。これらのデータはすべて、Ｈｓｐｓのグリア放出が、代謝ストレス中のニューロンの機能を支持する方法であり得るというＴｙｔｅｌｌらによって初めに提唱された仮説を裏付ける。
【０２２１】
急性ストレス中の神経保護の役割を有するｅＨｓｐ７０のｉｎ  ｖｉｖｏでの証拠は、様々な研究から得られたものである。Ｔｉｄｅｗｅｌｌらによる研究は、軸索切断後にｅＨｓｐ７０がゲルスポンジによって加えられると、ｅＨｓｐ７０が、軸索切断後の運動ニューロンの細胞死の量を減少させることができることを見出した。同じ研究で、Ｈｓｐ７０投与時に、後根神経節感覚ニューロン細胞の生存率の上昇も観察されたが、これは、運動ニューロンよりもやや高いＨｓｐ７０の用量に依存する。加えて、ｅＨｓｐ７０は、通常であればニワトリ胚発生中に死亡する運命にある運動ニューロンを保護し、栄養素欠乏時にニワトリ脊髄から分離される運動ニューロンも保護することを示した。ｅＨｓｐ７０のｉｎ  ｖｉｖｏでの保護の役割も、網膜の光損傷に関して説明されている。この研究では、Ｙｕらが、損傷誘発光に曝露した後の組換えＨｓｐ７０とＨｓｃ７０を組み合わせた溶液を、広範な光受容体の変性を引き起こすことが既に説明された用量で硝子体内注射した。興味深いことに、右眼の硝子体腔におけるｅＨｓｐ７０混合物の存在により、網膜に有意に多い光受容体の生存がもたらされた。さらに、蛍光標識Ｈｓｃ／Ｈｓｐ７０の取り込みの評価により、投与から６時間後に蛍光標識Ｈｓｃ／Ｈｓｐ７０が網膜に存在することが実証された。鼻腔内治療により投与された細胞外Ｈｓｐ７０は、ラットにおける不可避のストレスの影響を防止することを示し、腹膜内注射された組換えヒトＨｓｐ７０は、筋萎縮性側索硬化症のマウスモデルの寿命の延長、症状の発症の遅延、運動機能の維持、および運動ニューロンの生存の延長に有効であることが最近示された。ニューロン系でのＨｓｐ７０またはＨｓｃ／Ｈｓｐ７０混合物を用いた別のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの研究により、ｅＨｓｐ７０が、ニューロン細胞ストレス耐性を向上させ、ポリグルタミン毒性および凝集を減少させ得ることがさらに示された。
【０２２２】
細胞外Ｈｓｐ７０および免疫
細胞保護の役割に加えて、原形質膜結合ｅＨｓｐ７０および遊離全身ｅＨｓｐ７０の両方が、免疫において役割を果たすことが立証された。Ｈｓｐ７０の主な機能の１つが、細胞内タンパク質をシャペロンすることを考慮すると、Ｈｓｐ７０が、免疫原性ペプチドの結合に関与し、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラス１分子によるこれらの提示を助け得ることは驚きではない。さらに、腫瘍由来ｅＨｓｐ７０は、免疫原性ペプチドをシャペロンし、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に選択的に結合することが示された。受容体媒介エンドサイトーシスの後、これらのＨｓｐ７０−ペプチド複合体が、ＭＨＣクラス１分子に提示され、細胞傷害性Ｔ細胞の応答がもたらされる。自己抗原のシャペロニング（ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎｇ）に加えて、Ｈｓｐ７０は、微生物ペプチドと細菌ＤＮＡの非メチル化ＣｐＧモチーフを結合させることもできる。
【０２２３】
ｅＨｓｐ７０は、その抗原提示シャペロンとしての役割に加えて、先天免疫の刺激にも関係している。多数の細胞型がＨｓｐ７０を放出することが示されているが、ｅＨｓｐ７０は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、単球、および樹状細胞を含む様々な白血球亜集団の多数の受容体に結合することも示された。ｅＨｓｐ７０の認識に関与する受容体は、主にパターン認識受容体（ＰＲＲ）を含み、トール様受容体（ＴＬＲ）、スカベンジャー受容体、およびＣ型レクチン等の異なる受容体ファミリーからの様々な受容体から構成される。受容体が結合すると、ｅＨｓｐ７０は、ＮＦ−ｋＢの核への転位によって引き起こされるプロセスである、ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−１２、ＩＬ−６、およびＧＭ−ＣＳＦなどの前炎症性サイトカインの放出を含む多様なサイトカイン反応を誘発することができ、ｅＨｓｐ７０のサイトカイン作用を示唆し、これにより、シャペロンおよびサイトカインの両方としてのｅＨｓｐ７０の固有の機能をより良く説明するために、ｅＨｓｐ７０に対して用語、シャペロカイン（ｃｈａｐｅｒｏｋｉｎｅ）を当てる提案がなされた。
【０２２４】
免疫におけるｅＨｓｐ７０の役割に関するｉｎ  ｖｉｖｏでの研究の殆どが、げっ歯類モデルで行われた。例えば、尾部ショックに応答したｅＨｓｐ７０の濃度の上昇は、皮下大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）注射後の炎症の減少および迅速な回復時間に関係している。加えて、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＨｓｐ７０のマウスへの送達は、傷口が閉じるのを早くし、これは、傷口の壊死組織片のマクロファージの食作用の促進による可能性が高い特徴である。
【０２２５】
ヒトにおけるＨｓｐ７０の免疫調節の役割の証拠は十分ではないが、研究により、ｅＨｓｐ７０の上昇と脳損傷の予後／結果の改善との間の関係が実証されたが、反論も示されている。しかし、ｅＨｓｐ７０の濃度が加齢と共に減少することも知られており、これは、完全なストレス応答を開始する能力の加齢に関連した低下を示唆し得、また、全く推測の域を出ないが、加齢で見られる罹患率および死亡率の上昇を説明し得る。
【０２２６】
Ｈｓｐ７０の放出
グリア／軸索モデルなどにおける隣接細胞間のｅＨｓｐ７０の転移を実証するデータとは別に、いくつかの研究報告が、循環中における遊離ｅＨｓｐ７０の存在を立証している。この区画内に存在するＨｓｐ７０の場合、Ｈｓｐ７０は、器官／細胞から放出されなければならない。通常は、これを達成する２つの主な経路が考えられる。１つは、末梢循環中のｅＨｓｐ７０の観察が、細胞溶解または細胞死によるＨｓｐ７０の細胞内プールからの放出の結果である受動経路である。あるいは、または場合によってはこれに加えて、Ｈｓｐ７０は、非古典的なエキソサイトーシス経路によって能動的に放出される。
【０２２７】
Ｈｓｐ７０が、他の熱ショックタンパク質と共に、壊死をもたらす生理学的条件下でのみ放出され、プログラム細胞死の際には放出されないことが示唆された。間違いなく、重度の損傷および壊死を引き起こす重度の外傷および生理学的条件が、Ｈｓｐ７０の血中への放出をもたらし得る。これは、十分に立証され、理論的にも予想される。しかし、最近の研究により、Ｈｓｐ７０が、能動機構によって無傷の細胞から放出され得ること、および刺激の程度が放出の方式を決定することが示された。Ｈｓｐ７０の非壊死放出の強力な証拠が、ｅＨｓｐ７０の末梢血流への運動誘導放出に関する研究から得られた。運動の方式によって（肉体的緊張が大きければ大きいほど、多く放出される）、ｅＨｓｐ７０の主な増加を、末梢血流中で検出することができ、重要なことに、ｅＨｓｐ７０と筋肉損傷のマーカーとの間の直接的な相関関係を報告した既知の研究は知られていない。細胞または組織の損傷にかかわらずｅＨｓｐ７０が放出され得ることが、さらに、Ｆｌｅｓｈｎｅｒおよび同僚らによってすっきりと実証された。Ｆｌｅｓｈｎｅｒおよび同僚らは、捕食される恐れおよび電気ショックなどの心理的ストレスが、カテコールアミンシグナル伝達に依存することが示唆されているプロセスであるストレス誘導ｅＨｓｐ７０放出を引き起こし得ることを示した。
【０２２８】
ｈｓｐ７０が細胞を離れる経路はまだ不明確であるが、特に、Ｈｓｐ７０が、古典的なペプチドリーダー配列を一切含まないためであり、ペプチドリーダー配列は、分泌のためにそれを標的にすることができる。加えて、古典的な分泌が既に以前から疑問を持たれているため、これは、ｅＨｓｐ７０の放出の代替の機構が存在するはずであることを示唆している。ｅＨｓｐ７０は、エキソソームとして特徴付けられた小胞で放出され得ることが実証されたが、ｅＨｓｐ７０が細胞系およびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で遊離ｅＨｓｐ７０として放出され得る証拠も提示された。脂質ラフトがｅＨｓｐ７０の放出に必要であることが示唆されたが、これも論争中である。さらに、機能的なリソソーム区画が、ｅＨｓｐ７０の放出に必要であること、およびこの放出が、細胞の表面におけるリソソームマーカータンパク質の存在を伴うことが示され、分泌が原形質膜とリソソーム膜の融合に依存することを示唆している。放出がエキソソームを介するか、またはリソソームからの直接の放出であるかにかかわらず、ある種の分泌ＭＶＢ／後期エンドソーム／リソソーム区画が、一見したところすべての放出方式に関与することは興味深い。
【０２２９】
α１−アドレナリン受容体を経由するカテコールアミンが、細胞内カルシウム流入を導くことができ、そして同じカルシウム流入が、エキソソーム、多小胞体、およびリソソームのエキソサイトーシスを引き起こすことを示唆しているため、現行の仮説は、ストレスを受けると、α１−アドレナリン受容体に作用するノルアドレナリンの上昇が、細胞内でのカルシウム流入およびこれに続くエキソソーム内でのＨｓｐ７０の放出をもたらすというものである。
【０２３０】
本発明による生理活性剤
本発明は、一実施形態では、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤の使用に関する。
【０２３１】
本発明によるＨｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性の上昇は、以下に示す種類の化合物または療法の１つを提供することによって達成することができる。
−Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体
−Ｈｓｐ７０誘導物質およびＨｓｐ７０共誘導物質（ｃｏ−ｉｎｄｕｃｅｒ）
・ビモクロモル（Ｂｉｍｏｃｌｏｍｏｌ）およびアリモクロモル（Ａｒｉｍｏｃｌｏｍｏｌ）などの低分子薬物
・ベンジルアルコールなどの膜流動化剤
・亜致死温熱療法（ｓｕｂ−ｌｅｔｈａｌ  ｈｅａｔ−ｔｈｅｒａｐｙ）（≦４２℃）または温熱療法
・抗炎症薬および抗腫瘍薬からなる特定の薬物
・細胞ストレス
・活性酸素種（ＲＯＳ）、アドレナリン、ノルアドレナリン、ＵＶ光、放射線療法
【０２３２】
したがって、本発明による生理活性剤は、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させる任意の作用物質、化学物質、または化合物であり；この生理活性剤には、ＨＳＰ７０自体またはその機能的断片もしくは機能的変異体、および当業者に既知の任意のＨｓｐ７０誘導物質またはＨｓｐ７０共誘導物質が含まれる。
【０２３３】
結果として、生理活性剤は、直接または間接的にＨｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる。
【０２３４】
一実施形態では、本発明による生理活性剤は、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体である。
【０２３５】
別の実施形態では、本発明による生理活性剤は、Ｈｓｐ７０誘導物質またはＨｓｐ７０共誘導物質である。
【０２３６】
一実施形態では、本発明による生理活性剤には、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体とＨｓｐ７０誘導物質またはＨｓｐ７０共誘導物質の組合せが含まれる。
【０２３７】
薬剤として使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤を提供することが本発明の一態様である。
【０２３８】
グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型からなる群から選択される疾患の治療に使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤を提供することが本発明のさらなる態様である。
【０２３９】
グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型からなる群から選択される疾患の治療用の薬剤の製造のための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤の使用を提供することが本発明のさらなる態様である。
【０２４０】
その活性が、補助因子のリソソームＢＭＰの存在とは直接には関連しない酵素の欠陥によって生じるリソソーム蓄積症の治療に使用するため、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤を提供することが本発明のなおさらなる態様である。
【０２４１】
一実施形態では、前記リソソーム蓄積障害は、ニーマンピック病、ファーバー病、クラッベ病、シアリドーシスI型、異染性白質ジストロフィー、ゴーシェ病、ファブリー病、およびサポシン欠損症からなる群から選択されない。
【０２４２】
一実施形態では、前記リソソーム蓄積障害は、グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型からなる群から選択される。
【０２４３】
一実施形態では、前記治療は、予防、治癒、または改善であり得る。特定の一実施形態では、前記治療は予防である。別の実施形態では、前記治療は治癒である。さらなる実施形態では、前記治療は改善である。
【０２４４】
生理活性剤−Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体
薬剤として使用するための、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体を提供することが本発明の態様である。
【０２４５】
グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型からなる群から選択される疾患の治療に使用するための、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体を提供することが本発明のさらなる態様である。
【０２４６】
グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型からなる群から選択される疾患の治療用の薬剤の製造のための、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体の使用を提供することが本発明のさらなる態様である。
【０２４７】
その活性が、補助因子のリソソームＢＭＰの存在とは直接には関連しない酵素の欠陥によって生じるリソソーム蓄積症の治療に使用するため、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体を提供することが本発明のなおさらなる態様である。
【０２４８】
一実施形態では、前記リソソーム蓄積症は、ニーマンピック病、ファーバー病、クラッベ病、シアリドーシスI型、異染性白質ジストロフィー、ゴーシェ病、ファブリー病、およびサポシン欠損症からなる群から選択されない。
【０２４９】
一実施形態では、前記リソソーム蓄積症は、グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型からなる群から選択される。
【０２５０】
本発明によるＨｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体は、任意の天然産物または合成生成物とすることができ、当業者に既知の任意の従来の技術によって生産することができることを理解されたい。
【０２５１】
一実施形態では、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体は、天然源から精製される。前記天然源は、それを必要とする個体に投与するのに適した形態のＨｓｐ７０を発現する、または発現するように誘導することができる任意の植物、動物、または細菌とすることができる。
【０２５２】
しかし、好適な実施形態では、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体は合成的に生産される。結果として、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体は、好適な一実施形態では、従来の技術によって作製された組換えタンパク質とすることができ、従ってｒＨｓｐ７０と呼ばれる。
【０２５３】
合成または天然の本発明によるＨｓｐ７０は、任意の適した種の植物、動物、または細菌に由来する配列を有することができる。一実施形態では、前記ｒＨｓｐ７０は、哺乳動物に由来する。前記哺乳動物は、ヒト（ホモサピエンス）、マウス（ハツカネズミ）、ウシ、イヌ、ラット、フェレット、ブタ、ヒツジ、およびサルからなる群から選択することができる。別の実施形態では、前記Ｈｓｐ７０は、細菌に由来する。
【０２５４】
Ｈｓｐ７０は、非常に高度の種間の配列保存性を有することによって部分的に特徴付けられるため、有害な免疫応答を引き起こすことなく、ある種に由来するＨｓｐ７０の別の種への使用を可能にする可能性がある。
【０２５５】
特定の一実施形態では、前記ｒＨｓｐ７０は、ヒトＨｓｐ７０に由来する配列を有する。
【０２５６】
特定の一実施形態では、前記ｒＨｓｐ７０は、２種以上に由来する配列を有する。前記Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体は、一実施形態では、キメラとすることができる。
【０２５７】
組換えタンパク質は、組換えＤＮＡに由来するタンパク質である。組換えＤＮＡは、天然には存在しないＤＮＡの型であり、恐らく通常は一緒に発生しないＤＮＡ配列を結合することによって作製される。遺伝子改変に関しては、組換えＤＮＡが、特定の目的のために異なる形質をコードするために、細菌のプラスミドなどのように、既存の生物ＤＮＡ内への関連ＤＮＡの追加により導入される。これは、細胞内のプロセスによって起こるものではなく人間によって操作されるため、遺伝子組換えとは異なる。
【０２５８】
一実施形態では、本発明によるＨｓｐ７０は、野生型Ｈｓｐ７０タンパク質に対して１００％の同一性を有する。別の実施形態では、本発明によるＨｓｐ７０は、野生型Ｈｓｐ７０タンパク質に対して１００％未満、例えば、野生型タンパク質に対して９９．９〜９５％の同一性、例えば、９５〜９０％の同一性、例えば、９０〜８５％の同一性、例えば、８５〜８０％の同一性、例えば、８０〜７５％の同一性、例えば、７５〜６０％の同一性を有する。同一性の程度にかかわらず、その生物学的な機能のすべてを、またはその生物学的な機能のほとんどを維持するＨｓｐ７０の任意の変異体も本発明に包含される。
【０２５９】
一実施形態では、生理活性剤は、Ｈｓｐ７０である。一実施形態では、前記Ｈｓｐ７０は、完全長Ｈｓｐ７０である。
【０２６０】
また、Ｈｓｐ７０の機能的断片または機能的変異体を提供することも実施形態である。本明細書で定義されているように、機能的断片または機能的変異体は、本発明では、リソソーム蓄積症の病状を逆戻りさせる能力および／または他の分子の細胞内取込みを増大させる能力である所望の機能を有するＨｓｐ７０の任意の断片である。
【０２６１】
一実施形態では、生理活性剤は、Ｈｓｐ７０の機能的断片または機能的変異体である。
【０２６２】
一実施形態では、生理活性剤は、Ｈｓｐ７０が、野生型Ｈｓｐ７０の欠失（複数可）、付加（複数可）、または置換（複数可）によって改変されたＨｓｐ７０の機能的断片または機能的変異体である。
【０２６３】
野生型Ｈｓｐ７０タンパク質は、６４１のアミノ酸の全長を有する。Ｈｓｐ７０の断片は、一実施形態では、６４１のアミノ酸の野生型タンパク質よりも短い全長の任意の断片、例えば、６２５未満のアミノ酸、例えば、６００未満のアミノ酸、例えば、５７５未満のアミノ酸、例えば、５５０未満のアミノ酸、例えば、５２５未満のアミノ酸、例えば、５００未満のアミノ酸、例えば、４７５未満のアミノ酸、例えば、４５０未満のアミノ酸、例えば、４２５未満のアミノ酸、例えば、４００未満のアミノ酸、例えば、３７５未満のアミノ酸、例えば、３５０未満のアミノ酸、例えば、３２５未満のアミノ酸、例えば、３００未満のアミノ酸、例えば、２７５未満のアミノ酸、例えば、２５０未満のアミノ酸、例えば、２２５未満のアミノ酸、例えば、２００未満のアミノ酸、例えば、１７５未満のアミノ酸、例えば、１５０未満のアミノ酸、例えば、１２５未満のアミノ酸、例えば、１００未満のアミノ酸、例えば、７５未満のアミノ酸、例えば、５０未満のアミノ酸、例えば、２５未満のアミノ酸の断片を含むことを意味する。
【０２６４】
野生型Ｈｓｐ７０タンパク質は、６４１のアミノ酸の全長を有する。Ｈｓｐ７０の断片は、一実施形態では、１０のアミノ酸よりも長い全長の任意の断片、例えば、２６以上のアミノ酸、例えば、５１以上のアミノ酸、例えば、７６以上のアミノ酸、例えば、１０１以上のアミノ酸、例えば、１２６以上のアミノ酸、例えば、１５１以上のアミノ酸、例えば、１７６以上のアミノ酸、例えば、２０１以上のアミノ酸、例えば、２２６以上のアミノ酸、例えば、２５１以上のアミノ酸、例えば、２７６以上のアミノ酸、例えば、３０１以上のアミノ酸、例えば、３２６以上のアミノ酸、例えば、３５１以上のアミノ酸、例えば、３７６以上のアミノ酸、例えば、４０１以上のアミノ酸、例えば、４２６以上のアミノ酸、例えば、４５１以上のアミノ酸、例えば、４７６以上のアミノ酸、例えば、５０１以上のアミノ酸、例えば、５２６以上のアミノ酸、例えば、５５１以上のアミノ酸、例えば、５７６以上のアミノ酸、例えば、６０１以上のアミノ酸、例えば、６２６以上のアミノ酸の断片を含むことを意味する。
【０２６５】
結果として、本発明によるＨｓｐ７０の断片の全長は、一実施形態では、５〜２５のアミノ酸、例えば、２５〜５０のアミノ酸、例えば、５０〜７５のアミノ酸、例えば、７５〜１００のアミノ酸、例えば、１００〜１２５のアミノ酸、例えば、１２５〜１５０のアミノ酸、例えば、１５０〜１７５のアミノ酸、例えば、１７５〜２００のアミノ酸、例えば、２００〜２２５のアミノ酸、例えば、２２５〜２５０のアミノ酸、例えば、２５０〜２７５のアミノ酸、例えば、２７５〜３００のアミノ酸、例えば、３００〜３２５のアミノ酸、例えば、３２５〜３５０のアミノ酸、例えば、３５０〜３７５のアミノ酸、例えば、３７５〜４００のアミノ酸、例えば、４００〜４２５のアミノ酸、例えば、４２５〜４５０のアミノ酸、例えば、４５０〜４７５のアミノ酸、例えば、４７５〜５００のアミノ酸、例えば、５００〜５２５のアミノ酸、例えば、５２５〜５５０のアミノ酸、例えば、５５０〜５７５のアミノ酸、例えば、５７５〜６００のアミノ酸、例えば、６００〜６２５のアミノ酸、例えば、６２５〜６４０のアミノ酸の範囲内とすることができる。
【０２６６】
一実施形態では、Ｈｓｐ７０の断片または変異体は、Ｈｓｐ７０のＡＴＰアーゼドメインのすべてまたは一部を含む。結果として、本発明によるＨｓｐ７０の断片または変異体は、一実施形態では、アミノ酸番号３０〜３８２のすべてまたは一部を含む。別の実施形態では、Ｈｓｐ７０の断片または変異体は、Ｈｓｐ７０のＡＴＰアーゼドメインのアミノ酸位置９０にトリプトファンを含む。
【０２６７】
Ｈｓｐ７０の断片は、野生型タンパク質の切り詰め型、つまり短い型とすることができる。断片は、タンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかからタンパク質を短くすることによって切り詰めるか、またはタンパク質の任意のサイズの１つまたは複数の内部領域の欠失によって切り詰めることができる。
【０２６８】
Ｈｓｐ７０の断片または変異体は、一実施形態では、野生型タンパク質に対して１００％の同一性を有する。別の実施形態では、Ｈｓｐ７０の断片または変異体は、野生型タンパク質に対して１００％未満の同一性、例えば、９９．９〜９５％の同一性、例えば、９５〜９０％の同一性、例えば、９０〜８５％の同一性、例えば、８５〜８０％の同一性、例えば、８０〜７５％の同一性、例えば、７５〜６０％の同一性を有するＨｓｐ７０の変異体とすることもできる。
Ｈｓｐ７０の断片または変異体は、一実施形態では、野生型タンパク質に対して１００％の同一性を有する。別の実施形態では、Ｈｓｐ７０の断片または変異体は、野生型タンパク質に対して１００％未満の同一性、例えば、９９．９〜９５％の同一性、例えば、９５〜９０％の同一性、例えば、９０〜８５％の同一性、例えば、８５〜８０％の同一性、例えば、８０〜７５％の同一性、例えば、７５〜６０％の同一性を有するＨｓｐ７０の変異体とすることもできる。
【０２６９】
機能的断片または機能的変異体の正確な定量的効果が、完全長の分子の効果とは異なり得ることを理解されたい。場合によっては、機能的断片または機能的変異体は、完全長の分子よりも実際により効果的であり得る。さらに、完全長の分子の代わりに断片を使用することは、より小さいサイズの断片の点から有利であり得る。
【０２７０】
一実施形態では、Ｈｓｐ７０の機能的断片または機能的変異体は、１つまたは複数のアミノ酸が置換されたＨｓｐ７０の変異体とすることができる。前記置換（複数可）は、等価もしくは保存的置換（複数可）または非等価もしくは非保存的置換（複数可）とすることができる。
【０２７１】
一実施形態では、野生型Ｈｓｐ７０の、０．１〜１％のアミノ酸残基、例えば、１〜２％のアミノ酸残基、例えば、２〜３％のアミノ酸残基、例えば、３〜４％のアミノ酸残基、例えば、４〜５％のアミノ酸残基、例えば、５〜１０％のアミノ酸残基、例えば、１０〜１５％のアミノ酸残基、例えば、１５〜２０％のアミノ酸残基、例えば、２０〜３０％のアミノ酸残基、例えば、３０〜４０％のアミノ酸残基、例えば、４０〜５０％のアミノ酸残基、例えば、５０〜６０％のアミノ酸残基、例えば、６０〜７０％のアミノ酸残基、例えば、７０〜８０％のアミノ酸残基、例えば、８０〜９０％のアミノ酸残基、例えば、９０〜１００％のアミノ酸残基が置換されている。
【０２７２】
一実施形態では、野生型Ｈｓｐ７０の、１〜５のアミノ酸残基、例えば、５〜１０のアミノ酸残基、例えば、１０〜１５のアミノ酸残基、例えば、１５〜２０のアミノ酸残基、例えば、２０〜３０のアミノ酸残基、例えば、３０〜４０のアミノ酸残基、例えば、４０〜５０のアミノ酸残基、例えば、５０〜７５のアミノ酸残基、例えば、７５〜１００のアミノ酸残基、例えば、１００〜１５０のアミノ酸残基、例えば、１５０〜２００のアミノ酸残基、例えば、２００〜３００のアミノ酸残基、例えば、３００〜４００のアミノ酸残基、例えば、４００〜５００のアミノ酸残基が置換されている。
【０２７３】
一実施形態では、Ｈｓｐ７０の機能的断片または機能的変異体は、融合タンパク質である。一実施形態では、Ｈｓｐ７０の前記機能的断片または機能的変異体は、タグに融合されている。
【０２７４】
Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体を使用することの利点
上記したように、リソソーム蓄積症の治癒法は存在せず、治療は、ゴーシェ病およびファブリー病に対する酵素補充療法（ＥＲＴ）の開発を除き、殆どが対症療法である。上述したように、ＥＲＴは、１つの特定の疾患のみに対して有効な非常に高価な形態の療法である。
【０２７５】
本発明者らの知る限りでは、現在まで、脂質の蓄積に関連した残りのリソソーム蓄積症に対するＥＲＴは、成功した試しがないため、これらのＬＳＤの有効かつ特異的な治療に対する満たされていない重要な要求が現在も残っている。
【０２７６】
それを必要とする個体へのＨｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体の投与は、リソソーム蓄積障害のための従来の治療方式に対して多数の利点を有する。
【０２７７】
まず、ｒＨｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体などの組換えタンパク質の作製は、最新技術を用いた、十分な量のｒＨｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体を作製する単純で簡単な方法である。組換え酵素を作製する従来の技術は、当業者には周知である。
【０２７８】
さらに、ｒＨｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体などの組換えタンパク質の作製は、十分な量のｒＨｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体を作製するための安価な方法である。ＥＲＴの酵素の作製と比較して、コストが大幅に削減される。
【０２７９】
また、ｒＨｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体の使用は、２つ以上の特定のリソソーム蓄積障害の治療に使用することができる。これは、本発明のＨｓｐ７０誘導物質およびＨｓｐ７０共誘導物質にも当てはまる。実際、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤は、関係する欠陥酵素の酵素活性を調節することによって回復され得る任意のリソソーム蓄積症の治療に使用することができ、前記酵素はＢＭＰと相互作用する。
【０２８０】
最後に、Ｈｓｐ７０は、内因性に発生する分子、すなわち生物、組織、または細胞内を起源とする分子であるため、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体を投与しても全くまたは非常に限られた免疫応答しか引き起こされないと期待されている。これは、個体に投与した際に治療を促進し、副作用の可能性を低減するため大きな利点である。
【０２８１】
Ｈｓｐ７０の異所性発現
一実施形態では、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体は、ベクターから発現させることができる。したがって、本発明は、一実施形態では、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体をコードするベクターに関する。
【０２８２】
本発明の一実施形態では、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体は、それを必要とする個体にベクターの形態で投与することができる。
【０２８３】
Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体の発現に使用されるベクターは、ウイルスベクター（レトロウイルスおよびアデノウイルス）または非ウイルスベクター（プラスミド、コスミド、バクテリオファージ）からなる群から選択することができる。
【０２８４】
一実施形態では、前記ベクターは、１つまたは複数の複製起点、選択用のマーカー、および制限エンドヌクレアーゼ用の１つまたは複数の認識部位を含む。別の実施形態では、前記ベクターは、適した宿主細胞における前記Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体の転写を制御する調節配列に機能的に連結されている。
【０２８５】
本発明は、一実施形態では、本明細書に記載された、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体の作製方法に関し；前記方法は、前記Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体をコードするベクターを用意するステップと、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは適した宿主生物のｉｎ  ｖｉｖｏで前記ベクターを発現させて前記Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体を作製するステップを含む。
【０２８６】
本発明はさらに、本発明による、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体をコードするベクターを含む、単離された組換えまたはトランスジェニック宿主細胞に関する。
【０２８７】
本発明はまた、組換えまたはトランスジェニック宿主細胞を作製するための方法に関し、前記方法は、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体をコードするベクターを用意するステップと、前記ベクターを前記組換えまたはトランスジェニック宿主細胞に導入するステップと、前記ベクターを前記組換えまたはトランスジェニック宿主細胞で発現させて、前記Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体を産生する組換えまたはトランスジェニック宿主細胞を作製する任意選択のステップを含む。
【０２８８】
別の実施形態では、本発明は、上記した宿主細胞を含むトランスジェニック哺乳動物に関する。
【０２８９】
さらなる実施形態では、本発明による組換えまたはトランスジェニック宿主細胞を含むトランスジェニック哺乳動物はヒトではない。
【０２９０】
トランスジェニック宿主細胞は、哺乳動物、植物、細菌、酵母、または真菌宿主細胞からなる群から選択することができる。
【０２９１】
ＤＮＡの細胞内への送達を改善するために、ＤＮＡは、損傷から保護されなければならず、その細胞内への侵入が促進されなければならない。トランスフェクションプロセスの際に不所望の分解からＤＮＡを保護する能力を有するリポプレックスおよびポリプレックスが考案された。プラスミドＤＮＡは、ミセルまたはリポソームのような組織構造に脂質で覆うことができる。組織構造がＤＮＡと複合体を形成すると、リポプレックスと呼ばれる。リポソームの形成に利用できる３種類の脂質；陰イオン性（負に帯電した）脂質、中性脂質、または陽イオン性（正に帯電した）脂質が存在する。ポリマーとＤＮＡの複合体はポリプレックスと呼ばれる。殆どのポリプレックスは、陽イオン性ポリマーからなり、これらの形成は、イオン相互作用によって調節される。
【０２９２】
別の実施形態では、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体は、裸のＤＮＡとして投与することができる。これは、非ウイルストランスフェクションの単純な形態である。裸のＤＮＡの送達は、エレクトロポレーション、ソノポレーション、または高圧ガスを用いて細胞内にＤＮＡ被覆金粒子を打ち込む「遺伝子ガン」の使用によって行うことができる。
【０２９３】
生理活性剤−Ｈｓｐ７０誘導物質およびＨｓｐ７０共誘導物質
一実施形態では、本発明による生理活性剤は、Ｈｓｐ７０誘導物質またはＨｓｐ７０共誘導物質である。
【０２９４】
Ｈｓｐ７０誘導物質は、それ自体によって、同時ストレスを起こさずにＨｓｐ７０の遺伝子発現およびタンパク質発現を増幅できる化合物である。
【０２９５】
Ｈｓｐ７０共誘導物質は、同時（軽度）ストレスを起こさずにＨｓｐ７０の遺伝子発現およびタンパク質発現を増幅できない化合物であるが、Ｈｓｐ７０レベルのストレスによる上昇が、これらの存在によってさらに上昇または促進される。
【０２９６】
薬剤として使用するためのＨｓｐ７０誘導物質およびＨｓｐ７０共誘導物質を提供することが本発明の態様である。
【０２９７】
グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型からなる群から選択される疾患の治療に使用するためのＨｓｐ７０誘導物質およびＨｓｐ７０共誘導物質を提供することが本発明のさらなる態様である。
【０２９８】
グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型からなる群から選択される疾患の治療用の薬剤の製造のためのＨｓｐ７０誘導物質およびＨｓｐ７０共誘導物質の使用を提供することが本発明のさらなる態様である。
【０２９９】
その活性が、補助因子のリソソームＢＭＰの存在とは直接には関連しない酵素の欠陥によって生じるリソソーム蓄積症の治療に使用するために、Ｈｓｐ７０誘導物質およびＨｓｐ７０共誘導物質を提供することが本発明のなおさらなる態様である。
【０３００】
一実施形態では、前記リソソーム蓄積症は、ニーマンピック病、ファーバー病、クラッベ病、シアリドーシスI型、異染性白質ジストロフィー、ゴーシェ病、ファブリー病、およびサポシン欠損症からなる群から選択されない。
【０３０１】
一実施形態では、前記リソソーム蓄積症は、グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型からなる群から選択される。
【０３０２】
一実施形態では、本発明による生理活性剤は、Ｈｓｐ７０誘導物質およびＨｓｐ７０共誘導物質である。特定の実施形態では、本発明による生理活性剤は、Ｈｓｐ７０誘導物質である。別の特定の実施形態では、本発明による生理活性剤は、Ｈｓｐ７０共誘導物質である。
【０３０３】
低分子薬物−ヒドロキシルアミン誘導体
一実施形態では、本発明による生理活性剤は、Ｈｓｐ７０共誘導物質である。さらなる実施形態では、前記Ｈｓｐ７０共誘導物質は低分子薬物である。
【０３０４】
特定の実施形態では、本発明によるＨｓｐ７０共誘導物質は、ヒドロキシルアミン誘導体である。前記ヒドロキシルアミン誘導体は、さらなる実施形態では、ビモクロモル（ＢＲＬＰ−４２）、アリモクロモル（ＢＲＸ−２２０）、ＢＲＸ−３４５、およびＢＧＰ−１５からなる群から選択することができる。
【０３０５】
特定の実施形態では、前記ヒドロキシルアミン誘導体は、アリモクロモル（ＢＲＸ−２２０）である。
【０３０６】
ビモクロモル（［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ］−３−ピリジン−カルボキシイミドイル−マレイン酸クロライド）（［２−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−（１−ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）ｐｒｏｐｏｘｙ］−３−ｐｙｒｉｄｉｎｅ−ｃａｒｂｏｘｉｍｉｄｏｙｌ−ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｍａｌｅａｔｅ）は、元々は神経障害などの糖尿病合併症の治療のために開発された非毒性化合物である。ビモクロモルは、ＨＳＦ−１の活性化によってＨｓｐ７０を含む細胞内熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）を増加させることによって、実験ストレス条件下で部分的に細胞の生存率を改善することが示された。ビモクロモルが、折り畳まれていないタンパク質の非存在下でＨｓｐ７０共誘導の能力を有すること、およびビモクロモルが、相互作用して負に帯電した膜脂質の流動性を高めることが示された。ＢＲＸ−３４５は、ＨＳＰを誘導する能力がやや低いビモクロモルの構造類似体である。
【０３０７】
アリモクロモル（ＢＲＸ−２２０）は、同様に相互作用して熱ショック応答を増幅するビモクロモルの類似体である。アリモクロモルは、現在、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）；進行性の神経変性障害の治療のために臨床試験中である。アリモクロモルは、ＣｙｔＲｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって所有されている。
【０３０８】
いくつかの実施形態では、本発明による生理活性剤は、イロキサナジン（ｉｒｏｘａｎａｄｉｎｅ）（５−（ピペリジン−１−イルメチル）−３−ピリジン−３−イル−５，６−ジヒドロ−２Ｈ−１，２，４−オキサジアジン）（５−（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ−１−ｙｌｍｅｔｈｙｌ）−３−ｐｙｒｉｄｉｎ−３−ｙｌ−５，６−ｄｉｈｙｄｒｏ−２Ｈ−１，２，４−ｏｘａｄｉａｚｉｎｅ）である。
【０３０９】
したがって、グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型からなる群から選択される疾患の治療に使用するためのヒドロキシルアミン誘導体Ｈｓｐ７０共誘導物質を提供することが本発明の態様である。
【０３１０】
グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型からなる群から選択される疾患の治療用の薬剤の製造のためのヒドロキシルアミン誘導体Ｈｓｐ７０共誘導物質の使用を提供することが本発明のさらなる態様である。
【０３１１】
その活性が、補助因子のリソソームＢＭＰの存在とは直接には関連しない酵素の欠陥によって生じるリソソーム蓄積症の治療に使用するために、ヒドロキシルアミン誘導体Ｈｓｐ７０共誘導物質を提供することが本発明のなおさらなる態様である。
【０３１２】
一実施形態では、前記リソソーム蓄積症は、ニーマンピック病、ファーバー病、クラッベ病、シアリドーシスI型、異染性白質ジストロフィー、ゴーシェ病、ファブリー病、およびサポシン欠損症からなる群から選択されない。
【０３１３】
一実施形態では、前記リソソーム蓄積症は、グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型からなる群から選択される。
【０３１４】
膜流動化剤
一実施形態では、本発明による生理活性剤は、Ｈｓｐ７０誘導物質である。さらなる実施形態では、前記Ｈｓｐ７０誘導物質は、膜流動化剤である。
【０３１５】
膜流動化剤を用いた治療も、脂質療法と呼ぶことができる。
【０３１６】
特定の実施形態では、本発明によるＨｓｐ７０誘導物質は、ベンジルアルコール、ヘプタノール、ＡＬ７２１、ドコサヘキサエン酸、脂肪族アルコール、オレイルアルコール、ジメチルアミノエタノール、Ａ２Ｃ、ファルネソール、および麻酔薬、例えば、リドカイン、ロピバカイン、ブピバカイン、およびメピバカイン、ならびに当業者に既知の他の物質からなる群から選択される膜流動化剤である。
【０３１７】
加熱中の一定の割合の細胞タンパク質の変性（タンパク質毒性（ｐｒｏｔｅｏｔｏｘｉｃｉｔｙ））に加えて、膜の流動性の変化も、熱ショック応答を開始してＨＳＰを誘導する細胞内熱センサであると提唱された。実際、熱誘導される原形質膜の流動化に類似した化学的に誘導される膜の撹乱は、タンパク質の変性を引き起こさずにＨＳＰを活性化することができる。
【０３１８】
膜流動性は、細胞膜の脂質二重層の粘度を指す。膜リン脂質は、様々な長さおよび飽和度の脂肪酸を取り込む。
【０３１９】
膜流動化剤は、膜脂質間に入ることによって作用するため、脂質アシル鎖間のファンデルワールス（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖａａｌｓ）相互作用の弱体化による障害効果を誘導する。
【０３２０】
したがって、グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型からなる群から選択される疾患の治療に使用するための、ベンジルアルコール、ヘプタノール、ＡＬ７２１、ドコサヘキサエン酸、脂肪族アルコール、オレイルアルコール、ジメチルアミノエタノール、Ａ２Ｃ、ファルネソール、および麻酔薬、例えば、リドカイン、ロピバカイン、ブピバカイン、およびメピバカイン、ならびに当業者に既知の他の物質からなる群から選択される膜流動化剤を提供することが本発明の態様である。
【０３２１】
グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型からなる群から選択される疾患の治療用の薬剤の製造のための、ベンジルアルコール、ヘプタノール、ＡＬ７２１、ドコサヘキサエン酸、脂肪族アルコール、オレイルアルコール、ジメチルアミノエタノール、Ａ２Ｃ、ファルネソール、および麻酔薬、例えば、リドカイン、ロピバカイン、ブピバカイン、およびメピバカイン、ならびに当業者に既知の他の物質からなる群から選択される膜流動化剤の使用を提供することが本発明のさらなる態様である。
【０３２２】
その活性が、補助因子のリソソームＢＭＰの存在とは関連しない酵素の欠陥によって生じるリソソーム蓄積症の治療に使用するための、ベンジルアルコール、ヘプタノール、ＡＬ７２１、ドコサヘキサエン酸、脂肪族アルコール、オレイルアルコール、ジメチルアミノエタノール、Ａ２Ｃ、ファルネソール、および麻酔薬、例えば、リドカイン、ロピバカイン、ブピバカイン、およびメピバカイン、ならびに当業者に既知の他の物質からなる群から選択される膜流動化剤を提供することが本発明のなおさらなる態様である。
【０３２３】
一実施形態では、前記リソソーム蓄積症は、ニーマンピック病、ファーバー病、クラッベ病、シアリドーシスI型、異染性白質ジストロフィー、ゴーシェ病、ファブリー病、およびサポシン欠損症からなる群から選択されない。
【０３２４】
一実施形態では、前記リソソーム蓄積症は、グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型からなる群から選択される。
【０３２５】
Ｈｓｐ７０を誘導するための他の手段
以下に一部の概要を説明するＨｓｐ７０の発現を誘導するためのどの手段も、本発明に包含されるものとする。
【０３２６】
個体の温度を上昇させるのは、Ｈｓｐ７０を含むＨＳＰの強力な誘導物質であるため、亜致死温熱療法は、本発明の態様である。一実施形態では、亜致死温熱療法は、個体の温度を、約３８℃、例えば、約３９℃、例えば、約４０℃、例えば、約４１℃、例えば、約４２℃、例えば、約４３℃の中核体温まで上昇させることを含む。
【０３２７】
したがって、グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型からなる群から選択される疾患の治療に使用するための亜致死温熱療法を提供することが本発明の態様である。
【０３２８】
その活性が、補助因子のリソソームＢＭＰの存在とは直接には関連しない酵素の欠陥によって生じるリソソーム蓄積症の治療に使用するための、亜致死温熱療法を提供することも本発明の態様である。
【０３２９】
捕食される恐れおよび電気ショックなどの心理的ストレスが、カテコールアミンシグナル伝達に依存することが提唱されているプロセスであるストレス誘導ｅＨｓｐ７０放出を引き起こすことができる。さらに、アドレナリンおよびノルアドレナリンも、Ｈｓｐ７０の放出を引き起こすことができる。
【０３３０】
以下に示す化合物は、Ｈｓｐ７０を含むＨＳＰを誘導（または共誘導）することが示された：膜相互作用化合物アルキルリゾリン脂質エデルホシン（ＥＴ−１８−ＯＣＨ３または１−オクタデシル−２−メチル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホコリン）；セレコキシブおよびロフェコキシブなどのシクロオキシゲナーゼ１／２阻害剤ならびにアセチル−サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、およびインドメタシンなどのＮＳＡＩＤを含む抗炎症薬；プロスタグランジン（ｐｒｏｄｓｔａｇｌａｎｄｉｎ）ＰＧＡ１、ＰＧｊ２、および２−シクロペンテン−１−オン；ペルオキシダーゼ増殖因子活性化受容体−γ作動薬；ビンクリスチンおよびパクリタキセルを含むチューブリン相互作用抗癌剤；インスリン増感剤ピオグリタゾン；カルボプラチン、ドキソルビシン、フルダラビン、イホスファミド、およびシタラビンなどの抗腫瘍薬；Ｈｓｐ９０阻害剤ゲルダナマイシン、１７−ＡＡＧ、１７−ＤＭＡＧ、ラジシコール、ハービマイシン−Ａ、およびアラキドン酸；プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２およびラクタシスチン；セリンプロテアーゼ阻害剤ＤＣＩＣ、ＴＬＣＫ、およびＴＰＣＫ；抗潰瘍薬ゲラニルゲラニルアセトン（ＧＧＡ）、レバミピド、カルベノキソロン、およびポラプレジンク（亜鉛Ｌ−カルノシン）；重金属（亜鉛および錫）；抗炎症薬デキサメタゾン；コカイン；ニコチン；アルコール；α−アドレナリン作動薬；シクロペンテノンプロスタノイド；ならびに漢方薬ペオニフロリン、グリチルリジン、セラストロール、ジヒドロセラストロール、２酢酸ジヒドロセラストロール、およびクルクミン。
【０３３１】
したがって、グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型からなる群から選択される疾患の治療に使用するための、エデルホシン（ＥＴ−１８−ＯＣＨ３または１−オクタデシル−２−メチル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホコリン）、セレコキシブ、ロフェコキシブ、アセチル−サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、インドメタシン、ＰＧＡ１、ＰＧｊ２  ２−シクロペンテン−１−オン、ペルオキシダーゼ増殖因子活性化受容体−γ作動薬、ビンクリスチン、パクリタキセル、ピオグリタゾン、カルボプラチン、ドキソルビシン、フルダラビン、イホスファミド  シタラビン、ゲルダナマイシン、１７−ＡＡＧ、１７−ＤＭＡＧ、ラジシコール、ハービマイシン−Ａ、アラキドン酸、ＭＧ１３２、ラクタシスチン、ＤＣＩＣ、ＴＬＣＫ、ＴＰＣＫ、ゲラニルゲラニルアセトン（ＧＧＡ）、レバミピド、カルベノキソロン、ポラプレジンク（亜鉛Ｌ−カルノシン）、デキサメタゾン、コカイン、ニコチン、アルコール、α−アドレナリン作動薬、シクロペンテノンプロスタノイド、ペオニフロリン、グリチルリジン、セラストロール、ジヒドロセラストロール、２酢酸ジヒドロセラストロール、およびクルクミン、ならびに当業者に既知の他のＨＳＰ誘導物質からなる群から選択される化合物を提供することが本発明の態様である。
【０３３２】
その活性が、補助因子のリソソームＢＭＰの存在とは直接には関連しない酵素の欠陥によって生じるリソソーム蓄積症の治療に使用するための、エデルホシン（ＥＴ−１８−ＯＣＨ３または１−オクタデシル−２−メチル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホコリン）、セレコキシブ、ロフェコキシブ、アセチル−サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、インドメタシン、ＰＧＡ１、ＰＧｊ２  ２−シクロペンテン−１−オン、ペルオキシダーゼ増殖因子活性化受容体−γ作動薬、ビンクリスチン、パクリタキセル、ピオグリタゾン、カルボプラチン、ドキソルビシン、フルダラビン、イホスファミド  シタラビン、ゲルダナマイシン、１７−ＡＡＧ、１７−ＤＭＡＧ、ラジシコール、ハービマイシン−Ａ、アラキドン酸、ＭＧ１３２、ラクタシスチン、ＤＣＩＣ、ＴＬＣＫ、ＴＰＣＫ、ゲラニルゲラニルアセトン（ＧＧＡ）、レバミピド、カルベノキソロン、ポラプレジンク（亜鉛Ｌ−カルノシン）、デキサメタゾン、コカイン、ニコチン、アルコール、α−アドレナリン作動薬、シクロペンテノンプロスタノイド、ペオニフロリン、グリチルリジン、セラストロール、ジヒドロセラストロール、２酢酸ジヒドロセラストロール、およびクルクミン、ならびに当業者に既知の他のＨＳＰ誘導物質からなる群から選択される化合物を提供することも本発明の態様である。
【０３３３】
本発明による医薬組成物
本発明は、Ｈｓｐ７０の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤の使用により、グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型からなる群から選択される疾患の患者に恩恵をもたらすことに関する。
【０３３４】
本発明の生理活性剤を原料化学物質として投与することが可能であるが、医薬製剤の形態で提供することが好ましい。したがって、本発明は、本明細書で定義された本発明の生理活性剤またはその薬学的に許容される塩と、その薬学的に許容される担体を含む医療用の医薬組成物をさらに提供する。
【０３３５】
それを必要とする個体に投与することができる本明細書で定義された生理活性剤を含む医薬組成物などの組成物を提供することが本発明の態様である。医薬組成物は、個体に安全に投与される組成物であり、したがって、薬学的に安全な組成物であり得る。
【０３３６】
一実施形態では、本発明は、本発明による生理活性剤を含む組成物に関する。本明細書に開示されたこの組成物は、一実施形態では、生理学的に許容される担体と組み合わせて製剤することができる。本明細書に開示されたこの組成物は、一実施形態では、薬学的に許容される担体と組み合わせて製剤することができる。
【０３３７】
本発明の生理活性剤を含む医薬組成物は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １９９５、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、第１９版、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａに開示されている従来の技術によって調製することができる。
【０３３８】
本発明の生理活性剤は、非経口投与用に製剤することができ、アンプル、充填済み注射器、少量の注入液、または保存剤が添加された複数の用量容器の単位用量形態で提供することができる。組成物は、懸濁液、溶液、または油性もしくは水性ビヒクル中のエマルジョン、担体、希釈剤、または無機塩もしくは他の水溶解性分子の水性溶液を含む溶媒、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、動物油、合成油、注射用有機エステルなどの形態をとり得、そして保存剤、湿潤剤、乳化剤または懸濁剤、安定剤および／または分散剤、着色剤、緩衝剤、増粘剤、および可溶化剤などの製剤化剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）を含み得る。あるいは、活性成分は、適したビヒクル、例えば、発熱物質を含まない滅菌水と共に使用する前に合わせるために、滅菌固形物（ｓｔｅｒｉｌｅ  ｓｏｌｉｄ）の無菌分離または溶液の凍結乾燥により得られる粉末形態をとり得る。
【０３３９】
調製できる生理活性剤の薬学的に許容される塩も、塩の特定の水和形態であるため、本発明に包含されるものとする。これらの塩は、薬学的使用への適用で許容される塩である。このため、塩が親化合物の生理活性を維持し、その塩がその適用および疾患の治療での使用において予期しないまたは有害な影響を与えないことを意味する。
【０３４０】
薬学的に許容される塩は、標準的な方法で調製される。親化合物が塩基である場合は、適当な溶媒に溶解された過剰な有機酸または無機酸で処理される。親化合物が酸である場合は、適当な溶媒に溶解された無機塩基または有機塩基で処理される。
【０３４１】
当業者に既知の本発明による生理活性剤のあらゆる適当な製剤を利用することができる。
【０３４２】
一実施形態では、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体は、リポソームなどの生分解性マイクロスフェアに製剤される。
【０３４３】
投与
本発明による有効量の生理活性剤を哺乳動物、好ましくはヒトに送達するために投与のあらゆる適当な経路を利用することができ、前記生理活性剤は、一実施形態では、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体することができる。
【０３４４】
それを必要とする個体への生理活性剤または医薬組成物の投与は、３つの主な送達経路；（１）局所（皮膚または粘膜などの体の表面への塗布）、（２）経腸（胃腸管または消化管を経由）、および（３）非経口（胃腸管または消化管以外の経路）を介して行うことができる。
【０３４５】
局所投与には、経皮（皮膚に塗布）、吸入、浣腸、点眼（結膜への）、点耳、鼻腔内経路、および膣内投与が含まれる。
【０３４６】
経腸投与は、胃腸管の任意の一部が関与するあらゆる形態の投与であり、経腸投与には、胃または十二指腸摂食チューブに加えて、経口投与（口から、例えば、タブレット、カプセル、または液滴）、直腸内（例えば、坐剤または浣腸）投与が含まれる。
【０３４７】
注射または注入などによる非経口投与は、生理活性剤を標的部位に送達する、または薬物を血流に導入するのに有効であり、そして非経口投与には、静脈内（静脈の中）、動脈内（動脈の中）、筋肉内（筋肉の中）、心臓内（心臓の中）、皮下（皮膚の下）、骨内（骨髄の中）、皮内（皮膚自体の中）、クモ膜下または脊髄内（脊柱管の中）、腹膜内（腹膜の中）、経皮（無傷の皮膚を介した拡散）、経粘膜（粘膜を介した拡散、例えば、吸入（鼻から）、舌下、口腔、および膣座剤）、吸入、硬膜外（硬膜外腔の中）、および硝子体内（眼の中）が含まれる。舌下投与（舌の下側）も、非経口投与の一形態であり、生理活性剤が舌の下側の粘膜組織を介して血流内に拡散される。本発明の生理活性剤は、送達のあらゆる非経口経路、好ましくは上記のいずれかの経路によって投与することができる。
【０３４８】
非経口送達は、腸内送達に関連した胃腸管内での分解を回避するという利点を有する。
【０３４９】
非経口送達は、化合物が体循環に直接吸収されるのを可能にするため、腸内送達に関連した初回通過代謝を無効にするというさらなる利点を有する。
【０３５０】
初回通過代謝は、体循環に達する前に薬物の濃度が大幅に低下する薬物代謝の現象である。初回通過代謝は、一般に肝臓および腸壁に関連した吸収のプロセスの際の薬物の僅かな消失である。
【０３５１】
薬物が嚥下されると、薬物は、消化系によって吸収され、肝門脈系に進入する。薬物は、他の体の部位に達する前に門脈を通って肝臓内に送達される。肝臓は、多くの薬物を代謝し、時にはほんの少量の活性薬物しか肝臓を出て循環系の他の部位に達しない程度まで代謝する。したがって、この初回の肝臓の通過は、薬物のバイオアベイラビリティーを大幅に低下させる。
【０３５２】
薬物の初回通過効果に影響を与える４つの主な系は、胃腸管腔の酵素、腸壁酵素、細菌酵素、および肝酵素である。
【０３５３】
このような投与に適した剤形は、従来の技術によって調製することができる。エアロゾル剤形または定量吸入器などの吸入によって投与するのに適した剤形は、従来の技術によって調製することができる。
【０３５４】
一実施形態では、本発明による生理活性剤の投与の特定方式は、非経口投与によるものである。
【０３５５】
一実施形態では、本発明の生理活性剤の非経口投与の特定の方式は、静脈内、皮下、粘膜内、動脈内、皮下、または腹膜内注射によるものである。
【０３５６】
一実施形態では、本発明の生理活性剤の非経口投与の特定の方式は、吸入によるものである。
【０３５７】
一実施形態では、本発明の生理活性剤の非経口投与の特定の方式は、静脈内注入によるものである。
【０３５８】
本発明による静脈内注射は、一実施形態では、１０〜２０分、例えば、２０〜３０分、例えば、３０〜４０分、例えば、４０〜５０分、例えば、５０〜６０分、例えば、６０〜９０分、例えば、９０〜１２０分、例えば、２〜３時間、例えば、３〜４時間、例えば、４〜５時間、例えば、５〜６時間、例えば、６〜７時間、例えば、７〜８時間の期間に渡って行うことができる。
【０３５９】
特定の実施形態では、本発明の生理活性剤の非経口投与の方式は、経粘膜送達によるものである。前記経粘膜送達は、一実施形態では、舌下送達であり、別の実施形態では、前記経粘膜送達は、口腔送達であり、なお別の実施形態では、前記経粘膜送達は、吸入または鼻腔内送達である。
【０３６０】
剤形には、タブレット、トローチ、分散液、懸濁液、溶液、カプセル、クリーム、軟膏、エマルジョン、ゲル、ローション、ペースト、エアロゾル、または当技術分野で既知の他の形態が含まれる。
【０３６１】
利用される活性成分の有効量は、利用される特定の組成、投与の方式、治療される状態、および治療される状態の重症度によって異なり得る。このような有効量は、当業者が容易に確認することができる。
【０３６２】
一実施形態では、本発明の生理活性剤は、毎日１回の投与または分割投与、または持続放出形態で、動物の体重１ｋｇ当たり約１μｇ〜約１００ｍｇの１日の投与量で投与される。投与計画は、最適な治療応答を提供するために、この範囲内またはこの範囲外でも調整することができる。
【０３６３】
一実施形態では、本発明の生理活性剤は、体重１ｋｇ当たり約１μｇ〜約１０μｇ、例えば、体重１ｋｇ当たり約１０μｇ〜約５０μｇ、例えば、体重１ｋｇ当たり約５０μｇ〜約１００μｇ、例えば、体重１ｋｇ当たり約１００μｇ〜約２５０μｇ、例えば、体重１ｋｇ当たり約２５０μｇ〜約５００μｇ、例えば、体重１ｋｇ当たり約５００μｇ〜約７５０μｇ、例えば、体重１ｋｇ当たり約７５０μｇ〜約１０００μｇ、例えば、体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜約１０ｍｇ、例えば、体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇ〜約５０ｍｇ、例えば、体重１ｋｇ当たり約５０ｍｇ〜約１００ｍｇの用量で投与される。
【０３６４】
前記用量は、一定の時間間隔で投与することができ、単位時間当たり、体重１ｋｇ当たりｍｇとして表すことができる。前記単位時間は、一実施形態では、１分当たり、例えば、１時間当たり、例えば、１日当たり、例えば、１週間当たりとすることができる。
【０３６５】
併用治療
他の治療方式と共に、グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型からなる群から選択される疾患の治療に使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤を提供することが本発明の態様である。
【０３６６】
他の治療方式と共に、その活性が、補助因子のリソソームＢＭＰの存在とは直接には関連しない酵素の欠陥によって生じるリソソーム蓄積症の治療に使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤を提供することも本発明の態様である。
【０３６７】
本発明は、一態様では、少なくとも１つの他の治療方式と併用する、本発明による生理活性剤を投与することを含む、グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型からなる群から選択される疾患の治療方法に関する。
【０３６８】
したがって、一実施形態では、本発明による生理活性剤は、当該疾患の従来または既知の治療方式などの少なくとも１つの他の治療方式と併用して、それを必要する個体に投与される。
【０３６９】
本発明による生理活性剤は、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体、あるいはＨｓｐ７０誘導物質またはＨｓｐ７０共誘導物質であり得ることを理解されたい。
【０３７０】
併用する２つ以上の治療方式の実施は、同時または連続的に行うことができる。同時実施は、同じ組成物または別個の組成物に含められた２つの化合物とするか、または必然的に同時に行われる１つの組成物および他の治療方式とすることができる。連続実施は、まず１つの治療方式を実施、次いで第２の治療方式を実施するなど、異なる時点で２つの治療方式が実施されることを意味する。２つ以上の治療方式を連続的に実施するための時間枠は、最適な効果を得るために当業者が判定することができ、一実施形態では、３０分〜７２時間とすることができる。
【０３７１】
化学化合物の形態の治療方式は、それぞれその最も有効な量で、一緒または別個に実施することができる。２つ以上の化合物の投与は、相乗効果を有することができるため、各薬物の必要な用量が効果的に低減することができる。
【０３７２】
一実施形態では、本発明による生理活性剤は、一またはそれ以上の酵素補充療法（ＥＲＴ）、鎮痛剤、コルチコステロイド、骨髄移植、臍帯血移植、または幹細胞移植などの移植、基質抑制療法、および／または理学療法などの対症および支持療法と併用して、それを必要とする個体に投与される。
【０３７３】
Ｈｓｐ７０は化合物の取り込みを増加させる
本発明者らは、Ｈｓｐ７０が他の分子のエンドサイトーシスによる取り込みを増加させることをさらに示した（図４）。この取り込みの増加は、Ｈｓｐ７０の存在下で化合物が細胞により容易に取り込まれるようにする受動機構によってＨｓｐ７０に依存しないで起こり得る、またはＨｓｐ７０との直接的な関連によってＨｓｐ７０に依存して起こり得る。
【０３７４】
細胞の化合物の取り込みを増加させるＨｓｐ７０の能力は、細胞に投与されるＨｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体が細胞に容易に取り込まれるようにするという点で有利である。
【０３７５】
さらに、細胞の化合物の取り込みを増加させるＨｓｐ７０の能力は、Ｈｓｐ７０の存在が、Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ７０と組み合わせて与えられる化合物の両方の取り込みを増加し得るため、併用治療計画で有利である。
【０３７６】
１つの化合物がＥＲＴ用の酵素であり、もう１つがＨｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体である併用療法では、これは、有効な細胞内用量を達成するために必要なＥＲＴ用の酵素の量を効果的に低減するのに役立ち得る。これは、ＥＲＴが非常に高価であるため適切である。
【０３７７】
したがって、本発明による生理活性剤が、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体とＨｓｐ７０誘導物質またはＨｓｐ７０共誘導物質の組合せを含む場合は、Ｈｓｐ７０の存在が、前記Ｈｓｐ７０誘導物質または前記Ｈｓｐ７０共誘導物質の取り込みを増加させ得る。
【０３７８】
治療方法
本発明は、一態様では、それを必要とする個体を治療するための方法に関する。
【０３７９】
したがって、本発明による生理活性剤を、それを必要とする個体に投与することを含む、グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型からなる群から選択される疾患の治療方法を提供することが本発明の態様である。
【０３８０】
本発明による生理活性剤を、それを必要とする個体に投与することを含む、その活性が、補助因子のリソソームＢＭＰの存在とは直接関連しない酵素の欠陥によって生じるリソソーム蓄積症の治療方法を提供することも本発明の態様である。
【０３８１】
結果として、一実施形態では、前記治療は、予防、治癒、または改善することができる。特定の一実施形態では、前記治療は予防である。別の実施形態では、前記治療は治癒である。さらなる実施形態では、前記治療は改善である。
【０３８２】
本発明にしたがって使用される生理活性剤は、一実施形態では、医薬組成物として製剤することができる。
【０３８３】
一実施形態では、前記治療は、それを必要とする個体における細胞内の物質の蓄積を減少させる。前記物質は、通常はリソソーム内で分解される物質とすることができる。一実施形態では、前記物質は、スフィンゴ脂質である。
【０３８４】
一実施形態では、本発明による治療は、リソソーム分解性物質の細胞内の蓄積を、蓄積された量の１００％未満、例えば、蓄積された量の９０％未満、例えば、蓄積された量の８０％未満、例えば、蓄積された量の７０％未満、例えば、蓄積された量の６０％未満、例えば、蓄積された量の５０％未満、例えば、蓄積された量の４０％未満、例えば、蓄積された量の３０％未満、例えば、蓄積された量の２０％未満、例えば、蓄積された量の１０％未満、例えば、蓄積された量の５％未満まで減少させる。
【０３８５】
一実施形態では、本発明による治療は、リソソーム分解性物質の細胞内の蓄積を、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、例えば、少なくとも１５％、例えば、少なくとも２０％、例えば、少なくとも２５％、例えば、少なくとも３０％、例えば、少なくとも３５％、例えば、少なくとも４０％、例えば、少なくとも４５％、例えば、少なくとも５０％、例えば、少なくとも５５％、例えば、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、例えば、少なくとも７０％、例えば、少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、例えば、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも１００％減少させる。
【０３８６】
リソソーム分解性物質の細胞内の濃度の低下速度は、投与形態および投与計画などの因子によって左右され得る。
【０３８７】
一実施形態では、前記治療は、それを必要とする前記個体の寿命を延ばす。
【０３８８】
結果として、寿命は、一実施形態では、６ヶ月〜１年、例えば、１〜２年、例えば、２〜３年、例えば、３〜４年、例えば、４〜５年、例えば、５〜６年、例えば、６〜７年、例えば、７〜８年、例えば、８〜９年、例えば、９〜１０年、例えば、１０〜１２年、例えば、１２〜１４年、例えば、１４〜１６年、例えば、１６〜１８年、例えば、１８〜２０年、例えば、２０〜２５年、例えば、２５〜３０年、例えば、３０〜４０年、例えば、４０〜５０年、例えば、５０〜６０年、例えば、６０〜７０年、例えば、７０〜８０年、例えば、８０〜９０年、例えば、９０〜１００年延び得る。
【０３８９】
一実施形態では、寿命は、少なくとも６ヶ月、例えば、少なくとも１年、例えば、少なくとも２年、例えば、３年、例えば、少なくとも４年、例えば、５年、例えば、少なくとも６年、例えば、７年、例えば、少なくとも８年、例えば、９年、例えば、少なくとも１０年、例えば、１２年、例えば、少なくとも１４年、例えば、１６年、例えば、少なくとも１８年、例えば、２０年、例えば、少なくとも２５年、例えば、３０年、例えば、少なくとも４０年、例えば、５０年、例えば、少なくとも６０年、例えば、７０年、例えば、少なくとも８０年、例えば、９０年、例えば、少なくとも１００年延びる。
【０３９０】
その活性が、補助因子のリソソームＢＭＰの存在とは直接関連しない酵素の欠陥によって生じるリソソーム蓄積症の患者の寿命を延ばす方法であって、本発明による生理活性剤を、それを必要とする個体に投与することを含む、方法を提供することが本発明の態様である。
【０３９１】
グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型からなる群から選択される疾患の患者の寿命を延ばす方法であって、本発明による生理活性剤を、それを必要とする個体に投与することを含む、方法を提供することも本発明の態様である。
【０３９２】
一実施形態では、本発明は、グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型からなる群から選択される疾患の患者の寿命を延ばす方法であって、本発明による生理活性剤を、それを必要とする個体に投与することを含み、前記寿命が、６ヶ月〜１年、例えば、１〜２年、例えば、２〜３年、例えば、３〜４年、例えば、４〜５年、例えば、５〜６年、例えば、６〜７年、例えば、７〜８年、例えば、８〜９年、例えば、９〜１０年、例えば、１０〜１２年、例えば、１２〜１４年、例えば、１４〜１６年、例えば、１６〜１８年、例えば、１８〜２０年、例えば、２０〜２５年、例えば、２５〜３０年、例えば、３０〜４０年、例えば、４０〜５０年、例えば、５０〜６０年、例えば、６０〜７０年、例えば、７０〜８０年、例えば、８０〜９０年、例えば、９０〜１００年延びる、方法に関する。
【０３９３】
一実施形態では、本発明は、グリコーゲン蓄積症、ガングリオシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、脳腱コレステローシス、ウォルマン病、コレステリルエステル蓄積症、グリコサミノグリカン代謝障害、ムコ多糖症、糖タンパク質代謝障害、ムコリピドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシド蓄積症、マンノシド症、およびシアリドーシスII型からなる群から選択される疾患の患者の寿命を延ばす方法であって、本発明による生理活性剤を、それを必要とする個体に投与することを含み、前記寿命が、少なくとも６ヶ月、例えば、少なくとも１年、例えば、少なくとも２年、例えば、３年、例えば、少なくとも４年、例えば、５年、例えば、少なくとも６年、例えば、７年、例えば、少なくとも８年、例えば、９年、例えば、少なくとも１０年、例えば、１２年、例えば、少なくとも１４年、例えば、１６年、例えば、少なくとも１８年、例えば、２０年、例えば、少なくとも２５年、例えば、３０年、例えば、少なくとも４０年、例えば、５０年、例えば、少なくとも６０年、例えば、７０年、例えば、少なくとも８０年、例えば、９０年、例えば、少なくとも１００年延びる、方法に関する。
【０３９４】
＜実施例＞
実施例１：Ｈｓｐ７０とビス（モノアシルグリセロ）リン酸との間の相互作用が、酸性スフィンゴミエリナーゼを活性化し、リソソーム膜を安定させ、細胞の生存を向上させる
【０３９５】
熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）は、ストレス誘導細胞死の特徴であるリソソーム膜の透過化を阻害することによってストレスを受けた細胞の生存を向上させる進化的に高度に保存された分子シャペロンである。その分子機構の動作の手がかりは、最近報告されたＨｓｐ７０の小部分のリソソーム区画へのストレスおよび癌に関連した転位にあり得る。ここで、我々は、Ｈｓｐ７０が、酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）、すなわちスフィンゴミエリンをセラミドおよびホスホリルコリンに加水分解するリソソームリパーゼの活性を促進することによってリソソームを安定させることを示す。酸性環境では、Ｈｓｐ７０は、ＡＳＭの必須の補助因子であるエンドリソソーム陰イオン性リン脂質ビス（モノアシルグリセロ）リン酸（ＢＭＰ）に対して高親和性かつ特異的に結合し、これによりＡＳＭのＢＭＰに対する結合を促進し、ＡＳＭ活性を刺激する。ＢＭＰ抗体またはＨｓｐ７０における点突然変異（Ｗ９０Ａ）によるＨｓｐ７０とＢＭＰの相互作用の阻害およびデシプラミンによるＡＳＭ活性の阻害は、Ｈｓｐ７０媒介リソソーム安定化を効果的に元に戻す。注目すべきことに、ＡＳＭ遺伝子の突然変異によって引き起こされる重度のリソソーム蓄積障害であるニーマンピック病Ａ型（ＮＰＤＡ）の患者由来の細胞におけるＡＳＭ活性の低下は、リソソーム安定性の劇的な低下にも関係しており、この表現型は、組換えＨｓｐ７０またはＡＳＭでの処理によってリソソームＡＳＭ活性を回復させることによって効果的に修正することができる。総合すると、これらのデータは、エンドサイトーシス送達経路によってリソソーム内腔内に侵入する細胞透過化合物を一切用いない、リソソーム蓄積障害および癌の治療の刺激的な可能性を開く。
【０３９６】
リソソームプロテアーゼ、カテプシンは、様々なストレスによって誘導される進化的に保存された細胞死プログラムにおける重要なエフェクターである。カテプシン依存性細胞死は、初期リソソーム膜透過化、およびこれに続くカテプシンがカスパーゼ依存性および非依存性細胞死経路を開始することができる細胞質ゾルへのカテプシンの転位によって特徴付けられる。リソソーム局在化が、リソソーム膜を安定化させてストレス誘導細胞死から細胞を保護することが報告されたＨｓｐ７０の能力にとって極めて重要であるか否かを調べるために、我々は、細胞のエンドサイトーシス機構を利用して組換えＨｓｐ７０（ｒＨｓｐ７０）をリソソームに送達した。フルオロクロム標識ｒＨｓｐ７０と共にインキュベートしたＵ−２−ＯＳ骨肉腫細胞の免疫細胞化学および生化学分析により、ｒＨｓｐ７０の効果的な取り込み、後期エンドソームおよびリソソームマーカーとのその特異的な共局在化、およびリソソーム膜への結合が明らかにされた（図２ａ、図２ｂ、および図３）。リソソーム膜完全性を観察するためにリアルタイムイメージング（図３ｃ）を用いて、我々は、エンドサイトーシスされたｒＨｓｐ７０が、光酸化からリソソームを保護することを示した（図３ｄ）。さらに、Ｈｓｐ７０に特異的な低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が、光酸化に対してリソソームを感作させ、この効果が、エンドサイトーシスされたｒＨｓｐ７０によって完全に元に戻され、内在性Ｈｓｐ７０の保護効果がリソソーム内腔のタンパク質の小画分によって媒介されることを適切に実証している（図３ｅ）。同様の取り込み量にもかかわらず（データは不図示）、Ｈｓｐ７０とそれぞれ８６％および８４％のアミノ酸配列同一性を有する組換えＨｓｃ７０およびＨｓｐ７０−２では、リソソーム安定化が全く観察されなかった（図３ｄ）。
【０３９７】
リソソーム膜におけるＨｓｐ７０の存在および加水分解性リソソーム環境で生存するその能力は、Ｈｓｐ７０がリソソーム膜脂質に結合することを示唆する。したがって、我々は、様々な膜結合陰イオン性脂質、すなわちパルミトイル−オレオイル−ホスファチジルセリン（ＰＯＰＳ；主に原形質膜に存在）、カルジオリピン（主にミトコンドリア）、およびＢＭＰ（主に後期エンドソーム／リソソームに存在）を含むパルミトイル−オレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）大型単層小胞（ＬＵＶ）とＨｓｐ７０の相互作用を調べた。リソソームへの成熟の際のエンドリソソーム区画の酸性環境の増大を考慮して、我々は、中性（ｐＨ７．４）および酸性（ｐＨ６．０）の条件でタンパク質と脂質の相互作用を比較した。ｐＨ７．４では、ｒＨｓｐ７０は、ＰＯＰＣリポソームでの９０度光散乱で僅かな相対変化を引き起こし、非常に弱い結合を示唆する。ＰＯＰＳに関して過去に報告されたように、すべての負に帯電した脂質は、リポソーム表面の電荷密度（−１〜−２の範囲）にかかわらず、中性ｐＨで、ｒＨｓｐ７０のリポソームに対する結合を約４倍に促進した。注目すべきことに、ＢＭＰに対する結合は、中性ｐＨと比較すると酸性ｐＨで約２０倍強いが、ＰＯＰＳに対する結合は、酸性化時に僅かに上昇しただけであった。酸性ｐＨでのＨｓｐ７０のＢＭＰに対する高親和性結合が、独立した一連のＢＩＡｃｏｒｅ実験で確認された。重要なことに、エンドサイトーシスによってエンドリソソーム区画に送達されたＢＭＰ抗体は、生細胞におけるリソソームを安定させるｒＨｓｐ７０の能力を効果的に阻害し、そしてリソソーム漏出を誘導する抗癌剤であるシスプラチンに対して細胞を感作させた。
【０３９８】
Ｈｓｐ７０タンパク質のどの部分がＢＭＰとの結合に関与しているかを調べるために、我々は、ｒＨｓｐ７０およびその変異体のＢＭＰ含有リポソームへのドッキング時のトリプトファンの蛍光シフトを測定した。カルボキシ末端ペプチド結合ドメイン（ｒＨｓｐ７０−ΔＰＢＤ）のアミノ酸４３７〜６１７が欠失したＨｓｐ７０変異体ではなく、アミノ末端ＡＴＰアーゼドメイン（ｒＨｓｐ７０−ΔＡＴＰ）のアミノ酸１１９〜４２６が欠失したＨｓｐ７０変異体の相対ピーク蛍光強度におけるシグナルの消失は、ＡＴＰアーゼドメインが、Ｈｓｐ７０のＢＭＰに対する高親和性結合に必要であることを示唆した(図６ｄ)。次に、我々は、Ｈｓｐ７０の２つのトリプトファンをフェニルアラニン（Ｗ９０ＦおよびＷ５８０Ｆ）で置換し、どのトリプトファンが脂質結合によって誘導される蛍光シフトに関与するかを調べた。ｒＨｓｐ７０−Ｗ９０Ｆのみでのシグナルの低下は、タンパク質のＮＨ２末端が脂質層内にドッキングしたことを示唆した。ＢＭＰとｒＨｓｐ７０の相互作用のより定量的なＢＩＡｃｏｒｅ分析により、Ｈｓｐ７０が、主にそのＡＴＰアーゼドメインによってＢＭＰと相互作用することが確認された。驚くべきことに、Ｗ９０Ｆ突然変異は、Ｈｓｐシャペロンの構造的（遠紫外線および近紫外線円形二色性測定によって分析される折り畳み）および機能的（ルシフェラーゼ折り畳みおよびＡＴＰ加水分解）側面を維持したまま、ｒＨｓｐ７０とＢＭＰとの間の相互作用を明確に消失させた。したがって、ｒＨｓｐ７０−Ｗ９０Ｆ突然変異は、Ｈｓｐ７０とＢＭＰとの間の直接的な相互作用がそのリソソーム保護特性をＨｓｐ７０に付与するか否かについてさらに調べるための貴重なツールを我々に提供した。実際、ｒＨｓｐ７０−Ｗ９０Ｆ突然変異は、光酸化からリソソーム膜を保護してシスプラチン誘導リソソーム細胞死から細胞を保護するその能力を完全に失ったが、ｒＨｓｐ７０−Ｗ５８０Ｆ突然変異は、野生型タンパク質と同じ保護効果を示した。重要なことに、突然変異Ｈｓｐ７０タンパク質は、野生型Ｈｓｐ７０と同程度に効果的に本質的にエンドサイトーシスされた。
【０３９９】
エンドソームが成熟してリソソームを形成する際にエンドサイトーシス小胞におけるＢＭＰの濃度が上昇するため、ｐＨ調節は、Ｈｓｐ７０をリソソームに送達する方法であり得る。計算（ＰＲＯＴＰＡＲＡＭ、ＥＸＰａＳｙプロテオミクスサーバー、Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）により、Ｈｓｐ７０のＡＴＰアーゼドメインが、ペプチド結合ドメインよりも１．７２単位高い理論ｐｌを有することが明らかにされた（６．６２対４．９）。この特徴は、酸性ｐＨで、ＡＴＰアーゼドメインが優先的に正に帯電され、これによりＡＴＰアーゼドメインの陰イオン性脂質との相互作用が促進され得ることを示唆する。Ｈｓｐ７０とＢＭＰの相互作用の酸性ｐＨおよびＡＴＰアーゼドメインへの依存を実証する我々のデータは、この理論を支持する。さらに、Ｈｓｐ７０のＡＴＰアーゼドメインの静電表面の分子モデリングは、ＢＭＰと相互作用してリソソームを安定化させるＨｓｐ７０の能力に対するＷ９０Ｆ突然変異の重大な影響を場合によっては説明する、Ｗ９０を含むウェッジの底部に主に正の電荷を有するほぼウェッジ様の構造を形成することを明らかにした。
【０４００】
ＢＭＰは、高い親和性でＡＳＭに結合し、スフィンゴミエリンをセラミドおよびホスホリルコリンに加水分解するその能力を刺激する。ＢＩＡｃｏｒｅ分析により、等モル濃度以下でのｒＨｓｐ７０を用いたＢＭＰ含有ＬＵＶの前処理は、後のＡＳＭの結合を促進するが、より高い濃度のｒＨｓｐ７０は、阻害効果を示すことが明らかにされた。注目すべきことに、ストレス誘導リソソーム損傷から保護されたＨｓｐ７０トランスジェニックマウス胎児線維芽細胞（Ｈｓｐ７０−ＭＥＦ）は、野生型ＭＥＦ（ＷＴ−ＭＥＦ）よりも有意に高いＡＳＭ活性を示し、細胞保護濃度（３００ｎＭ）でのｒＨｓｐ７０を用いたＷＴ−ＭＥＦの処理により、ＡＳＭ活性が、Ｈｓｐ７０−ＭＥＦにおけるレベルに匹敵するレベルまで上昇した。ＡＳＭがリソソーム安定効果に関与するか否かを調べるために、我々は、十分に特徴付けられた薬理学的ＡＳＭ阻害剤であるデシプラミンで細胞を処理した。デシプラミンは、ＭＥＦの生存度を用量依存的に低下させ、この細胞死は、リソソームカテプシンの細胞質ゾルへの漏出によって実証されるようにリソソームの広範囲の透過化に関係していた。注目すべきことに、デシプラミン誘導細胞死およびリソソーム漏出は、ＷＴ−ＭＥＦと比較するとＨｓｐ７０−ＭＥＦで有意に減少した。さらに、毒性水準以下の濃度のデシプラミンでのＡＳＭの阻害により、Ｈｓｐ７０−ＭＥＦのリソソームストレス耐性が、光酸化時のリソソーム膜完全性の加速度的な低下からも分かるようにＷＴ−ＭＥＦのレベルまで戻った(図７ｅ)。ＡＳＭのリソソーム保護の役割は、ＡＳＭ遺伝子における突然変異によって引き起こされる致死性のリソソーム蓄積障害であるＮＰＤＡの患者由来の線維芽細胞におけるリソソームが、光酸化誘導損傷に対して極端な感受性を有することを示すデータによってさらに裏付けられた。注目すべきことに、ｒＨｓｐ７０は、患者の細胞における内在性突然変異ＡＳＭおよび同時に添加されたｒＡＳＭの酵素活性を促進することもできた。ｒＨｓｐ７０、ｒＡＳＭ、またはこれら２つの組合せをリソソームに添加することによって得られるＡＳＭ活性の上昇は、リソソームを安定させて、ＮＰＤＡ細胞における劇的に拡大したリソソーム区画の体積を標準化するそれらの能力に相関していた（図８ｂ〜図８ｄ）。ｒＨｓｐ７０と同様に、ｒＡＳＭも、リソソームに局在したことに留意されたい。
【０４０１】
総合すると、我々のデータは、ニーマンピック病において、Ｈｓｐ７０とＢＭＰの相互作用が、膜の直接的な物理的安定化ではなく、スフィンゴミエリン代謝の調節に関係する機構によってリソソームを安定化させることを示唆している。このような間接的な効果は、ＢＭＰが、エンドリソソーム区画の内膜のみに局在し、この内膜で、ＢＭＰの重要な機能が、ＡＳＭおよびスフィンゴ脂質活性化タンパク質による分解および脂質小胞からの脂質の抽出を助けるという事実によって裏付けられる。興味深いことに、ＡＳＭによって媒介されるリソソームセラミド濃度の上昇は、リソソーム膜の立体配座を変更して、リソソーム膜の他の細胞内小胞および原形質膜との融合を促進する。したがって、セラミドに誘導された融合能力の向上の結果としてのリソソーム膜の組成および体積の変化が、Ｈｓｐ７０によって媒介されるリソソーム安定性の上昇に寄与し得る。他方、様々なアポトーシス刺激が、原形質膜の外側小葉へのＡＳＭの転位を誘導し、そこで、セラミドが、アポトーシスシグナル伝達に関与する膜結合シグナル伝達分子の活性化の部位として機能する脂質微小ドメインを形成することができる。したがって、セラミドは、リソソームの内側で産生されるかまたは原形質膜上で産生されるかによって細胞の生存に対して反対の効果を有し得る。
【０４０２】
Ｈｓｐ７０の細胞保護効果の基礎をなす上記の分子機構は、Ｈｓｐ７０のリソソーム安定化機能の特異的な阻害によってリソソーム細胞死経路を誘導する作用物質に対する癌細胞の感作の新たな刺激的な可能性を開く。逆に、単独またはｒＡＳＭと組み合わせて外部から投与されるｒＨｓｐ７０の能力は、現在は治療選択肢が遺伝子療法および幹細胞療法に限定されているＮＰＤ患者の新規な治療として直接試すことができる。
【０４０３】
方法の要約
ＷＴ−ＭＥＦおよびＨｓｐ７０−ＭＥＦは、当技術分野で述べられているように作製し、不死化し、そして維持した。ヒトＮＰＤＡ線維芽細胞（８３／２４）は、生後５ヶ月の肝脾腫の患者の皮膚生検に由来する。組換えタンパク質は、ｐＥＴ−１６ｂベクター系およびＮｉ２＋アフィニティ精製（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて作製し、製造業者（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）のプロトコルに従ってＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８で標識した。リソソーム完全性を分析するために、我々は、リソソームを赤色に染色して光酸化に対して感作させる細胞の酸性区画内に蓄積する異染性弱塩基であるアクリジンオレンジで染色した細胞のリアルタイムイメージング法を開発した。リソソームｐＨ勾配の光酸化に誘導された消失およびアクリジンオレンジの個々のリソソームから細胞質ゾルへの漏出を、Ｕ２−Ｏ−Ｓ細胞における「赤色点の消失」として、および線維芽細胞におけるＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ＤＵＯソフトウエアによる赤色蛍光の減少および緑色蛍光の増加として視覚的に定量した。全カテプシン活性および細胞質（ジギトニン抽出）カテプシン活性を、当技術分野で述べられているようにｚＦＲ−ＡＦＣ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）プローブを用いてジギトニン処理サンプルで測定した。トリプトファン蛍光スペクトルおよびリポソーム９０度光散乱を、本質的に当技術分野で述べられているようにＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、示されているｐＨ）で分析した。表面プラズモン共鳴測定を、当技術分野で述べられているようにＢＩＡｃｏｒｅ２０００システムを用いて固定したＬＵＶで行った。Ｈｓｐ７０  ｓｉＲＮＡ（５’−ＧＣＣＡＵＧＡＣＧＡＡＡＧＡＣＡＡＣＡＡＵＣＵＧＵ−３’）およびコントロールＨｓｐ７０  ｓｉＲＮＡをＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクトした。標準的なプロトコルで免疫検出を行った。アポトーシス様細胞死およびリソソーム膜透過化を、本質的に当技術分野で述べられているように分析した。当技術分野で述べられているように変更を加えたＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＰｒｏｂｅｓからのＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ  Ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ａ１２２２０）によってＡＳＭ活性を分析した。対応のあるスチューデントの両側ｔ検定を用いて統計分析を行い、すべての群のデータを、Ｆ検定を用いてそれらの分散の比較可能性について調べた。
【０４０４】
方法
細胞培養および試薬。ヒトＵ−２−ＯＳ骨肉腫細胞を、６％熱不活化ウシ血清およびペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。Ｈｓｐ７０トランスジェニックＭＥＦおよび適切なコントロールＭＥＦを、当技術分野で述べられているように作製し維持した。ヒト一次ＮＰＤＡ線維芽細胞を、１％Ｎａ−Ｐｙｒｕｖａｔｅ、１％ＨＥＰＥＳ、１％Ｌ−グルタミンをさらに添加したＭＥＦ培地で増殖させた。すべての細胞を、ＣＯ２が５％の加湿大気中で、３７℃で増殖させ、マイコプラズマについて繰り返し試験し、陰性であることを確認した。特に明記されていない限り、すべての化学種は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｄｅｎｍａｒｋ  Ａ／Ｓ）から購入した。
【０４０５】
リソソーム完全性についてのアッセイ。２μｇ／ｍｌアクリジンオレンジと共に３７℃で１５分間インキュベートしたサブコンフルエント細胞を、洗浄し、照射し、そして３％ウシ胎児血清を添加したハンクス平衡塩溶液で分析した。１つの細胞イメージングのための細胞を、透過光モードの各ウェルの８つの所定の領域から選択し、次いで同じ細胞を、Ｕ−ＵＬＳ１００ＨＧハウジング（Ｏｌｙｍｐｕｓ）に装着したＵＳＨ１０２  １００Ｗ水銀アークバーナー（Ｕｓｈｉｏ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ）からの青色光に２０秒間曝露して迅速に可視化した。蛍光顕微鏡検査を、ＮＡ＝０．４０のＬＣＰｌａｎＦ１X２０対物レンズを備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ−７０倒立顕微鏡で行った。リソソームのｐＨ勾配の消失を、強い赤色染色の消失をカウントすることによって定量した。この研究で使用される様々な線維芽細胞の大きなリソソーム区画に対応するために、リソソーム完全性をアッセイするためのより精密な方法を開発した。１つの細胞イメージングのための細胞を、透過光モードの各ウェルの８つの所定の領域から選択し、次いで同じ細胞を、１００ｍＷダイオードレーザーからの４８９ｎｍの光に迅速かつ連続的に曝露する一方で、レーザー走査顕微鏡写真を、４９５〜５５５ｎｍ（緑色）およびＬＰ６５０ｎｍ（赤色）の光のバンドパスフィルターによって画定された２つのチャンネルで、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ＬＩＶＥ  ＤＵＯ共焦点系で３３０ミリ秒毎に撮影した。次いで、得られた低速度撮影映画を、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ＤＵＯ統合ソフトウエアによって分析した。全カテプシン活性および細胞質（ジギトニン抽出）カテプシン活性を、当技術分野で述べられているようにｚＦＲ−ＡＦＣ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）プローブを用いてジギトニン処理サンプルで測定した。
【０４０６】
細胞の生存についてのアッセイ。細胞密度を、本質的に当技術分野で述べられている３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾディウムブロミド（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｅ−２−ｙ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）（ＭＴＴ  ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ）減少アッセイによって評価した。０．０５μｇ／ｍｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で細胞を染色して、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ−７０倒立蛍光顕微鏡（Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕ−ＭＷＵ  ３３０−３８５ｎｍ）で核が凝縮した細胞をカウントすることによってアポトーシス様細胞死を評価した。各実験では、最少で８つの無作為に選択した領域をカウントした。
【０４０７】
免疫検出および顕微鏡検査。使用した一次抗体には、Ｈｓｐ７０に対するマウスモノクローナル抗体（２Ｈ９；Ｂｏｒｉｓ  Ｍａｒｇｕｌｉｓ、Ｒｕｓｓｉａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ、Ｒｕｓｓｉａによって提供された）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、ＢＭＰ（６Ｃ４）、リソソーム内在性膜タンパク質１（Ｈ５Ｃ６；Ｊ．Ｔｈｏｍａｓ  ＡｕｇｕｓｔおよびＪａｍｅｓ  Ｅ．Ｋ．Ｈｉｌｄｒｅｔｈによって開発され、ＮＩＣＨＤの主催で設立され、Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｏｗａ  Ｃｉｔｙ、ＵＳＡによって維持されているＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋから入手した）が含まれる。１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離してニトロセルロース膜に移したタンパク質を、示された一次抗体、Ｄａｋｏからの適切なペルオキシダーゼ共役二次抗体、ＥＣＬウエスタンブロッティング試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、およびＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍａｇｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＬＡＳ−１０００Ｐｌｕｓ、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）を用いて検出した。免疫細胞化学では、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５７６またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８共役二次抗体を使用した。リソトラッカー  レッド（Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ）（登録商標）を、リソソーム区画のライブの可視化に使用した。Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ１００Ｍレーザー走査顕微鏡で蛍光画像を撮影した。リソソームの完全性についてのリソトラッカー（Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ）定量および低速度撮影映画を、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ＬＩＶＥ  ＤＵＯシステムで行った。
【０４０８】
トリプトファン蛍光スペクトルおよびリポソーム９０度光散乱。トリプトファン蛍光スペクトル（ＲＦＩ）およびリポソーム９０度光散乱（ＲＳＩ）を、本質的に当技術分野で述べられているように、示された脂質からなるＬＵＶを利用するＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、示されたｐＨ７．４または６．０）で分析した。ＲＦＩでは、ＬＵＶを１０μＭアリコートで添加し、２０分の安定化時間の後にスペクトルを記録した。ＲＳＩでは、組換えタンパク質を０．１２ナノモルのアリコートで添加した。
【０４０９】
表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）。ＬＵＶの調製のために、有機溶媒に溶解した１０モル％スフィンゴミエリン、５０モル％ホスファチジルコリン、２０モル％コレステロール、および２０モル％ＢＭＰからなる脂質混合物を、アルゴン流下で乾燥させ、トリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中で再水和した。この混合物を、液体窒素中で凍結−解凍を９回繰り返してから３７℃のインキュベーターに入れた。１５分間の超音波槽の後、混合物を、孔径が１００ｎｍのポリカーボネート膜を２１回通過させた。表面プラズモン共鳴測定を、２５℃で、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００システムを用いて行った。ＬＵＶ（全脂質濃度０．１ｍＭ）をＰＢＳ（ローディング緩衝液）中のＬ１センサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ）の表面に固定した。使用したランニング緩衝液は、酢酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ４．５）であった。コントロールとして、ランニング緩衝液に溶解した酸性スフィンゴミエリナーゼ（０．２μＭ、６０μｌ）をリポソーム表面に直接注入した。４１００ＲＵ〜５２５０ＲＵの反応単位が得られた。目的のタンパク質を、示された濃度で、２０μｌ／分の流速でランニング緩衝液に注入した。注入後、１０分間の解離相を追加した。ｒＡＳＭがｒＨｓｐ７０の後に続く場合は、この１０分のｒＨｓｐ７０の解離相の後のさらなる１０分間の解離相の後にｒＡＳＭを１８０秒間加えた。
【０４１０】
分子モデリング。一次構造分析および分子モデリングを、Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）のＥｘｐｅｒｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＥＸＰａＳｙ）プロテオミクスサーバーから入手可能なソフトウエアで行った。分子モデリングは、ＤｅｅｐＶｉｅｗ−Ｓｗｉｓｓ  ＰＤＢ  Ｖｉｅｗｅｒを用いて、ヒトＨｓｐ７０−ＡＴＰアーゼドメイン（ｐｄｂコード：１Ｓ３Ｘ）およびヒトＨｓｃ７０基質結合ドメイン（ｐｄｂコード：７ＨＳＣ）の結晶構造に基づいて行った。表面モデルは、溶媒誘電率８０（Ｈ２Ｏ）を用いたｐＨ７．０でのクーロン相互作用に基づいていた。
【０４１１】
統計分析。帰無仮説を評価するために対応のあるスチューデントの両側ｔ検定を用いて統計分析を行った。統計的有意性のためのカットオフレベルは、５％に設定し、すべての群のデータを、Ｆ検定を用いてそれらの分散の比較可能性について調べた。すべての統計は、最少でｎ＝３の独立した実験で行った。
【０４１２】
実施例２：ｉｎ  ｖｉｖｏ  予備実験におけるＮＰＣ１
目的
ｉｎ  ｖｉｖｏ  におけるＨｓｐ７０治療効果を、ＮＰＣ病理学の以下の基準で判定する。
・身体的成果（体重、臓器重量、および生存時間）
・振戦、歩行、および養育における行動変化
・脂質蓄積(コレステロール、ＧＳＬ、およびスフィンゴシン)の生化学的変化
・小脳の病理の免疫組織学的分析（プルキンエ細胞の減少程度）
【０４１３】
実験
治療計画
８匹のＮＰＣ−／−コントロール（ＰＢＳのみ）に対して、８匹の処理（ｒＨｓｐ７０）ＮＰＣ−／−を使用した。生後３週間から、それぞれ１０ｍｇ／ｋｇのｒＨｓｐ７０またはビヒクルのみ（ＰＢＳ）を一週間に３回、マウスに腹腔内投与処理した。３匹のコントロールおよび３匹の処理マウスを生後７週間または９週間で（すなわち、処理後それぞれ４週間または６週間で）屠殺した。臓器を潅流し（ＰＢＳ）、重量測定後、生化学的分析および免疫組織学的分析のため凍結した。
【０４１４】
行動分析
行動に関する実験は、前述のとおり、生後３週間から行った。暫時、自動振戦モニター（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）を用いて、振戦分析を行った。歩行分析は、マウスの前足および後足に無毒性の塗料を塗り、Ｗｈａｔｍａｎ  ３Ｍ  紙の上を歩かせて行った。足の配置を測定して、前足と後足の重なり具合、一歩きの長さ、および歩行の幅を決定した。
【０４１５】
養育分析は、生後９週間および１０週間でのみ行った。暫時、動物は、開放した野外箱で順応させた。５分後、支持体のない箱の中央で、あるいは壁を支持体として使用した箱の端で、マウスが養育する頻度を含むマウスの行動を数えた。
【０４１６】
生化学的分析
臓器に緩衝液を加えずにすりつぶし、１０μｌずつ凍結した。新鮮な資料にＰＢＳを加えて１００μｌとし、生化学的分析に供した。それぞれの資料の蛋白定量はＢＣＡタンパク質アッセイにより行った。コレステロールアッセイは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ  コレステロールアッセイを用いて行った。スフィンゴシンは、スフィンゴイド塩基抽出によって単離され、ＨＰＬＣによって分析された。ＧＳＬは、抽出後、蛍光ＨＰＬＣによって分析した。すべての結果は、タンパク質量で標準化した。
【０４１７】
免疫組織化学
潅流した脳は、ＯＣＴ用に包埋され、ドライアイスで冷却したイソペンタンで凍結した。脳はゼラチン被覆スライド上で切片とし、−８０℃保存した後、抗体染色した。
【０４１８】
結果
成長曲線(図１２を参照)
コントロール動物（上図）は浅めの成長曲線を示し、処理動物は着実に体重が増加し、より重量となる。
【０４１９】
臓器重量
臓器重量に違いは認められなかった。
【０４２０】
生存時間
７週間および９週間後の時点で残っている個体数が少なかったため、生存時間の延長という結論は得られなかった。９週間または１０週間目のマウスを記録した映像によると、Ｈｓｐ７０処理動物は、毛並みがよく、体も大きい。加えて、より活動的であり、より強い振戦を示し、随意運動については悪化するようにみえた。
【０４２１】
採取の時点で、処理マウスは数日の間に状態が悪化したようであった。
【０４２２】
その原因は、思いがけない急激な体重低下に起因する可能性がある。それは、マウスが小さくなったため、数日前に用意された薬剤の用量が、事実上過剰投与となってしまい、何らかの毒性を増幅させた可能性があることによる。
【０４２３】
行動に関する結果（図１３を参照）
Ｈｓｐ７０処理マウスは、処理の３週目から振戦の増加が認められ、末期に至るまで増加したままであった。この振戦は、明確に最低の頻度範囲ではあったが、裸眼ではっきりと確認できるものであった。
【０４２４】
歩行分析は、３種の測定結果（前足：後足の配置、一歩きの長さ、または歩行の幅）のいずれにおいても差は認められなった。
【０４２５】
養育分析について、処理６週間後に差は認められなかった。マウスの観察に基づいて、９週目に、成功裡に修了した養育行為と、失敗に終わった養育行為とを別々にカウントすることにした。これによって、両グループには明確な相違が認められ、コントロールマウスのみに養育行為の失敗が認められた。この時点でのサンプル数が少なかった（処理マウス数５、コントロールマウス数４）ものの、これは、処理マウスがより良い協調関係にあることを示唆している。
【０４２６】
生化学−コレステロール（図１４を参照）
７週時点において（図１４Ａ）、Ｈｓｐ７０処理マウスは、コントロールに比べて、末梢組織における有意な減少が認められる（各グループ個体数は３、二重試験、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１）。
実験の１つの繰り返しでのみ生じたものであるが、脳コレステロールは減少を示した。他の二匹の処理マウスでは、コントロールと正に同じレベルを示した（各グループ個体数は３、三重試験）。
【０４２７】
９週時点では（図１４Ｂ）、二つのグループ間で相違は認められない（各グループ個体数は３、三重試験）。
【０４２８】
ここで、コントロールマウスおよび処理マウスのそれぞれの組織サンプルを並行して分析することによって、各キット内の差異を抑制するようにしたが、各時点間の総コレステロール量を、直接比較することはできないことに注意されたい。
【０４２９】
生化学−ＧＳＬ（図１５を参照）
７週目で、肝臓ではＨｓｐ７０処理マウスにおいてＧＳＬの有意な減少が認められる（ｐ＜０．０５、＊）（図１５Ａ）。また、脾臓および脳においても減少が認められるが、統計学上有意な差ではない（恐らく個体数が少ないためである）。
【０４３０】
９週目までには（図１５Ｂ）、処理動物および未処理動物の組織に有意な差は認められない。
【０４３１】
９週目において、脳の総ＧＳＬレベルは、処理マウスおよび未処理マウス両方において、有意に減少する（ｐ＜０．０５）。この現象は、ＮＰＣ１の脳におけるＧＳＬ測定に関する従来研究と矛盾しないものであり、おそらく神経細胞死の結果である。興味深いことに、コントロールマウスでは、総ＧＳＬ量の５倍の減少となるのに対して、処理マウスにおける減少は、あまり厳格でないようである。
【０４３２】
生化学−スフィンゴシン（図１６を参照）
スフィンゴシン分析は、すべての臓器においてまだ終了していない。７週目から９週目の脳におけるデータでは、７週目の処理マウスおよびコントロールマウスの間に、有意な差は認められない。９週目の時点では両グループにおいて全体的な減少が認められるが、処理動物の脳におけるスフィンゴシンの量は、わずかであるものの有意に（ｐ＜０．００５、＊＊）増加したままである。
【０４３３】
結論
成長曲線
特に初期においては、通常のマウスの一般的な増加を示す。
【０４３４】
行動学的データ
振戦の増加は、中枢神経系（ＣＮＳ）で生じ得る効果を指し示すものとして興味深い（患者に高容量で投与された場合のミグルスタット（Ｍｉｇｌｕｓｔａｔ）が、極端な効果ではないが、同様の効果を示す）。
【０４３５】
生化学
Ｈｓｐ７０処理は、７週目のコントロールマウスに比べて、コレステロールの末梢部における蓄積を減少させる。ただし、脳においては、３回の繰り返しのうち１回で減少を示しただけであるので、まだ検討中である。一方、９週目までに、コレステロール値は処理マウスおよびコントロールマウスにおいて同等になる。これには、複数の要因が関連しているのかもしれない。本マウスでは、まず、当該タンパク質に対する抗体が作られ、薬剤の効果を阻害し、さらには薬剤の初期効果を弱めていることが考えられる。次に、高容量の投与によって、慢性毒性を引き起こし、コレステロール代謝およびマウスの全体的な健康状態に有害な影響を与えていることが考えられる。
【０４３６】
７週目の処理動物におけるコレステロールの減少は、同時に起こるＧＳＬ蓄積の減少によってサポートされる。９週目の処理動物における末梢ＧＳＬは、有意に変化していない。生後７週目のＨｓｐ処理マウスの脳においてＧＳＬは減少していたが、その結果は統計学的に有意ではなかった。個体数を増やした実験を行うことによって、この点が明らかとなるであろう。９週目の時点で、総ＧＳＬ量は、両方のグループで有意に減少した。これは、おそらく細胞死によるものと考えられるが、ＮＰＣ１の末期において、著しく明確に減少するという過去のデータと一致する。処理マウスの脳におけるＧＳＬ量の減少は、あまり厳格ではないようにみえるが、これが有意であるか否かは不明である。
【０４３７】
これは、スフィンゴシンにおけるデータによってもサポートされ、（おそらく細胞死の影響である）生後７週目から９週目においてみられる減少は、これまでの傾向と同様である。処理グループにおけるわずかであるが有意な増加は、細胞の生存時間が改善されたことを反映している可能性がある。この問題点は、免疫細胞学的方法によって小脳のプルキンエ細胞の数を測定し、処理動物における神経委縮／喪失の割合を知ることにより、より明確になるだろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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