(57)【要約】  本発明は、対象における結腸直腸癌をスクリーニングする方法であって、前記対象から得られた生物学的試料中のＮＰＹ、ＰＥＮＫおよびそれらの断片または変異体から選択される遺伝子のうちの少なくとも１つのメチル化度を測定するステップを含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における結腸直腸癌をスクリーニングする方法であって、前記対象から得られた生物学的試料中のＮＰＹ、ＰＥＮＫおよびそれらの断片または変異体から選択される遺伝子のうちの少なくとも１つのメチル化度を測定するステップを含む方法。
【請求項２】
前記断片が、配列番号１および配列番号２の配列から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象から得られた生物学的試料中のＷｉｆ１遺伝子またはその断片もしくは変異体のメチル化度を測定するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記断片が、配列番号３の配列であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ハウスキーピング遺伝子、好ましくはアルブミン遺伝子、またはそれらの断片もしくは変異体のメチル化度を測定するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記断片が、配列番号４の配列であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＮＰＹおよびＰＥＮＫ遺伝子またはそれらのそれぞれの断片もしくは変異体、ならびに／あるいは
ＮＰＹおよびＷｉｆ１遺伝子またはそれらのそれぞれの断片もしくは変異体、ならびに／あるいは
ＰＥＮＫおよびＷｉｆ１遺伝子またはそれらのそれぞれの断片もしくは変異体
のメチル化度の同時測定を含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
配列番号１および配列番号２の配列、ならびに／または
配列番号１および配列番号３の配列、ならびに／または
配列番号２および配列番号３の配列
のメチル化度の同時測定を含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
一方でＷｉｆ１遺伝子およびハウスキーピング遺伝子またはそれらのそれぞれの断片もしくは変異体、他方でＮＰＹおよびＰＥＮＫ遺伝子またはそれらのそれぞれの断片もしくは変異体のメチル化度の同時測定を含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記メチル化度を、１．５から３％の間である閾値と比較するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記閾値が２％であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記生物学的試料が、前記対象由来の全血、血漿、尿および糞便から選択されることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記生物学的試料が、前記対象由来の全血、血漿および尿から選択されることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象の結腸を検査するステップ、続いて、組織学的検査をするステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象における結腸直腸癌をスクリーニングする方法であって、前記対象から得られた生物学的試料中のＮＰＹ、ＰＥＮＫおよびそれらの断片または変異体から選択される遺伝子のうちの少なくとも１つのメチル化度を測定するステップを含む方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
結腸直腸癌は、世界中の癌の１０．５％に相当する非常に広範に発生する疾患であり、ますます一般的になっている（フランスにおいて１９７０年代に１年に２５０００件の新たな症例、２０００年代に１年に４００００件の新たな症例）。患者の平均余命はいまだに低く、全ステージを合わせても５年で５０％未満と評価されている。結腸直腸癌は一般的で重篤な費用のかかる疾患であり、ほとんどの国では中リスクの人（無症状、５０歳を超える）についての系統的スクリーニングにおいて検出される。
【０００３】
現在、潜血試験が、結腸直腸癌をスクリーニングするために最も使用されている試験である。この試験は排泄物中の潜血を試験することからなる。次いでスクリーニングは２つのステップ：潜血を検出するために連続した３つの排泄物試料で潜血試験を実施するステップ、この試験が陽性である場合、続いて、結腸直腸腫瘍を検出するために結腸内視鏡検査を実施するステップを含む。この試験は、２つの制限：無用の結腸内視鏡検査につながる偽陽性（５０％）、および結腸内視鏡検査が腫瘍を有する患者で実施されなくなる偽陰性を有することが認識されている。５０〜７５歳の年齢範囲の無症状の集団における試験の陽性の程度は２〜３％である。結腸内視鏡検査に関して、その陽性予測値は５０％である。
【０００４】
このように、現在のスクリーニング条件では実施される結腸内視鏡検査のほぼ５０％は正常である。しかしながら、良性または悪性の結腸腫瘍を有する対象のほぼ５０％はこのスクリーニング戦略によってはそのように識別されない。
【０００５】
この試験（潜血試験）は、特異的でなく低感度であるため、批判を受けている。さらに、糞便を扱うことは気が進まないため、この種のスクリーニング試験を受ける標的集団の割合は減少する。したがって、現在、結腸直腸癌についての対象の素因またはリスクを検出するための、特異的で、高感度であり、かつ非侵襲性である試験の必要性が存在している。
【０００６】
最近の研究により、種々の癌の診断または予後マーカーとしてメチル化を検出する利点が注目されている。「診断」とは、ヒトが所与の病状を有すると決定することを意味し、「予後」とは、病状の重症度およびその後の発症を意味する。メチル化はＤＮＡ遺伝子発現を調節する天然の制御機構である。例えば、特定の遺伝子の異常なメチル化は遺伝子発現を減少させる場合があり、癌の発症に関連し得る。現在、腫瘍抑制遺伝子のプロモーターにおけるＣｐＧ島の過剰メチル化が、癌の開始および進行において基本的な役割を果たすことが認められている。
【０００７】
仏国特許出願第２９２７０９１号は、マーカーの過剰メチル化の検出に基づいた結腸直腸癌のためのスクリーニングキットを記載している。しかしながら、この試験は単一マーカーに基づいており、許容可能な感度を有さない。
【０００８】
驚くべきことに、本発明者らは、過剰メチル化が結腸直腸癌に特異的であるいくつかの対象マーカーを識別するために分子試験を利用することに成功した。本発明者らは、広範な研究の末に腸腫瘍細胞に由来するＤＮＡを生物学的流出物中で分析できる方法を開発した。これによって、このＤＮＡの機能的異常を研究することが可能となる。この研究は、結腸直腸癌に特異的である新たなマーカーに注目している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本発明は、マルチプレックス（multiplex）方式のメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、すなわちＭＳＰＭの概念に基づいた分子試験に関する。ＭＳＰＭは、モノプレックス（monoplex）方式に対して、必要なＰＣＲの数を減少させる大きな利点を有する。それ故、マルチプレックス方式は、いくつかのモノプレックスより迅速であるので時間の節約をもたらし、経済的に有利である。血液中に循環するＤＮＡの量は比較的少ないので、遺伝子試験を適用するために選択される生物学的試料が血液である場合、ＭＳＰＭ技術の使用はまた明らかな利点をもたらす。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
「マルチプレックスＰＣＲ」とは、１つまたは複数の特異的プライマーを使用して、単一ステップにおいて対象とするいくつかの標的の同時増幅を可能にするＰＣＲの形態（通常、定量的ＰＣＲ）を意味する。この技術は、いくつかのマーカーの欠失、変異、多型または過剰メチル化の存在を決定するのに非常に有利である。
【００１１】
対照的に、「モノプレックスＰＣＲ」という語句は、対象とする単一標的の増幅を可能にするＰＣＲの形態（通常、定量的ＰＣＲ）を指す。
【００１２】
「メチル化特異的ＰＣＲ」とは、遺伝子のメチル化度を測定するための先行技術の従来的技術を意味する。この技術は定量的ＰＣＲの原理に基づく。典型的に、この技術は、調査されるＤＮＡ試料を亜硫酸水素ナトリウムで処理することに基づく。この処理により、処理されたＤＮＡにおいて非メチル化シトシンの各々をウラシルに転換することが可能となる。次いでこのように処理された試料は、処理される遺伝子に特異的なプライマーを用いるＰＣＲを受ける。特異的プライマーの性質の決定は増幅されるヌクレオチド配列に依存する。本発明の状況において、メチル化特異的ＰＣＲは好ましくはマルチプレックス方式で利用され、その場合、マルチプレックス方式のメチル化特異的ＰＣＲ、またはＭＳＰＭと呼ばれる。
【００１３】
それ故、本発明は、対象における結腸直腸癌をスクリーニングする方法であって、前記対象から得られた生物学的試料中のＮＰＹ、ＰＥＮＫ遺伝子およびそれらの断片または変異体から選択される遺伝子のうちの少なくとも１つのメチル化度を測定するステップを含む方法に関する。「結腸直腸癌をスクリーニングする」とは、結腸直腸癌を発症する素因の検出、および対象に既に存在している結腸直腸癌の検出を意味する。
【００１４】
「メチル化」とは、ＣｐＧジヌクレオチド中のシトシンの５位炭素へのメチル基の付加を意味する。これらのジヌクレオチドは、ＣｐＧ「島」を除いてＤＮＡの構造中には高頻度では存在しない。それらの島は典型的に、遺伝子のプロモーター領域のレベルで表される。それ故、本発明者らが遺伝子のメチル化について言及する場合、前記遺伝子のプロモーター領域のメチル化を指している。正確な部位におけるメチル基の存在は、遺伝子と転写因子との間の相互作用を防ぐ。典型的に、メチル基は、転写因子が増幅部位およびプロモーターに結合することを防ぎ、ＲＮＡポリメラーゼが開始部位に結合することを防ぐ。それ故、プロモーター領域のメチル化により、ＤＮＡ転写の抑制が生じる。「遺伝子のメチル化」という語句は、遺伝子のヌクレオチド配列のＣｐＧ島のメチル化を包含するが、前記語句が適用される遺伝子のプロモーターのヌクレオチド配列のメチル化も包含する。
【００１５】
「ＮＰＹ遺伝子」とは、神経ペプチドＹすなわちＮＰＹをコードする遺伝子を意味する。
【００１６】
「ＰＥＮＫ遺伝子」とは、神経ペプチドプロエンケファリンＡすなわちＰＥＮＫをコードする遺伝子を意味する。
【００１７】
これらの２つの神経ペプチドは、食物摂取、栄養素の吸収および身体のエネルギー消費の平衡に関与する。それらは、消化機能を調節する神経ペプチドであり、食物摂取および神経性消化挙動（neuro-digestive behavior）も調節できる。
【００１８】
「遺伝子の断片」とは、少なくとも５０塩基対の長さを有する、好ましくは６０から１１０塩基対の間の長さを有する前記遺伝子の配列を意味する。
【００１９】
「遺伝子の変異体」とは、前記遺伝子または前記遺伝子の断片に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性パーセントを有する核酸配列を意味する。
【００２０】
２つの核酸配列の間の、または本発明の意味における「同一性パーセント」とは、最適アラインメントの後に得られた、比較される２つの配列の間のヌクレオチドのパーセントを示し、このパーセントは純粋に統計的であり、２つの配列の間の相違は無作為に、かつそれらの長さ全体にわたって分布する。「最良アラインメント」または「最適アラインメント」は、下記のように決定された同一性パーセントが最高であるアラインメントを示す。２つの核酸配列の間の配列比較は、それらを最適にアラインメントした後にそれらの配列を比較することによって伝統的に実施され、前記比較は、配列類似性を有する局所領域を識別し比較するために、１つのセグメントごとにまたは１つの「比較ウインドウ」ごとに実施される。比較のための配列の最適アラインメントは、手動の他に、SmithおよびWaterman(1981)の局所ホモロジーアルゴリズムを使用して、NeddlemanおよびWunsch(1970)の局所ホモロジーアルゴリズムを使用して、PearsonおよびLipman(1988)の類似性検索法を使用して、またはこれらのアルゴリズムを使用するコンピュータソフトウェア(Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ  Ｐ、ＢＬＡＳＴ  Ｎ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ)によって行われてもよい。最適アラインメントを得るために、好ましくはＢＬＡＳＴプログラムが、ＢＬＯＳＵＭ  ６２マトリクスと共に使用される。
【００２１】
２つの核酸配列の間の同一性パーセントは、最適に並べられたこれらの２つの配列を比較することによって決定され、比較される核酸配列は、これらの２つの配列の間の最適アラインメントのための参照配列に対して付加または欠失を含んでもよい。同一性パーセントは、２つの配列の間でヌクレオチドが同一である同一の位置の数を決定すること、同一の位置のこの数を比較された位置の総数で割ること、および得られた結果に１００を掛けて、これらの２つの配列の間の同一性パーセントを得ることによって算出される。
【００２２】
「少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性パーセントを有する変異体」は、参照核酸配列に対して、特定の修飾、例えば特に欠失、切断、伸長、キメラ融合、および／または置換、とりわけ点置換を有し、参照核酸配列との最適アラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有する核酸配列を示す。
【００２３】
特定の実施形態において、本発明による結腸直腸癌をスクリーニングする方法は、配列番号１および配列番号２から選択されるポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つのメチル化度を測定するステップを含む。配列番号１の配列はＮＰＹ遺伝子の配列の断片に対応する。配列番号２の配列に関して、それはＰＥＮＫ遺伝子の配列の断片に対応する。
【００２４】
「対象」とは、健康である、または癌を有し得る個体、またはスクリーニング、診断もしくは監視を必要とする個体を意味する。
【００２５】
「生物学的試料」とは、生物学的物質を含有する試料を意味する。より好ましくは、それは、核酸などの遺伝物質を含有する任意の試料を意味する。この試料は、生物（ヒト患者、動物、植物）で実施される生物学的試料採取に由来してもよい。好ましくは、本発明による生物学的試料は、ヒト対象から得られる全ての体液、例えば全血、血漿、血清、リンパ液、尿、唾液、糞便、または汗から選択される。
【００２６】
「核酸物質」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）の任意の配列を意味する。好ましくは、生物学的試料は、メチル化度を測定するステップの前に核酸物質を抽出するステップに供される。核酸物質のこの抽出は、当業者に周知である古典的技術に従って実施される。例えば、この抽出は、生物学的試料から得られた細胞の細胞溶解により実施されてもよい。この溶解は、化学的、物理的、または熱的性質のものであってもよい。この細胞溶解に続いて、通常、他の細胞残屑から核酸を分離し、濃縮するための精製ステップがある。前記抽出および前記精製は、ＱＩＡＧＥＮおよびＺｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈタイプの市販のキットを使用して実施されてもよい。当然ながら、関連技術は、試験される生物学的試料の性質に応じて異なる。当業者は、その見識により、これらの溶解および精製ステップを、試験される前記生物学的試料に容易に適合できる。
【００２７】
好ましくは、本発明による方法は、前記対象から得られた生物学的試料中のＷｉｆ１遺伝子、その断片または変異体のうちの１つのメチル化度を測定するステップをさらに含む。特定の実施形態において、本発明による結腸直腸癌をスクリーニングする方法は、配列番号３のポリヌクレオチド配列のメチル化度を測定するステップを含む。配列番号３の配列はＷｉｆ１遺伝子の配列の断片に対応する。
【００２８】
より好ましくは、Ｗｉｆ１遺伝子またはその断片もしくは変異体のメチル化度の測定は、前記対象から得られた生物学的試料中のＮＰＹ、ＰＥＮＫおよびそれらの断片もしくは変異体から選択される遺伝子のうちの少なくとも１つのメチル化度の測定と同時に実施される。
【００２９】
Ｗｉｆ１遺伝子はＷｎｔ経路の阻害因子である。これは結腸直腸癌発生の開始因子であり、ＡＰＣ遺伝子を不活性化し、このＡＰＣ遺伝子のタンパク質は腸上皮細胞の増殖、アポトーシスおよび遊走の制御に関連して役割を果たす。この不活性化により、ＷＮＴ／β−カテニンなどの特定のシグナル伝達経路の活性化、および初期腺腫の形成が引き起こされる。Ｗｉｆ１が、Ｗｎｔシグナル伝達経路の阻害に関与する遺伝子の１つであることは知られている。それ故、Ｗｉｆ１遺伝子の過剰メチル化は、このＷｎｔ経路の阻害を取り除くことを伴う。
【００３０】
好ましくは、本発明による方法は、ハウスキーピング遺伝子のメチル化度を測定するステップをさらに含む。好ましくは、ハウスキーピング遺伝子のメチル化度を測定するこのステップは、ＮＰＹ、ＰＥＮＫおよびそれらの断片または変異体から選択される遺伝子のうちの少なくとも１つのメチル化度の測定と同時に、ならびに／あるいはＷｉｆ１遺伝子またはその断片もしくは変異体のメチル化度の測定と同時に実施される。
【００３１】
特定の実施形態において、本発明による結腸直腸癌をスクリーニングする方法は、配列番号４の配列のメチル化度を測定するステップを含む。配列番号４の配列はアルブミン遺伝子の配列の断片に対応する。
【００３２】
「ハウスキーピング遺伝子」、または「構成的遺伝子」とは、主に基本的な細胞機能に必須であるタンパク質をコードする構成的遺伝子を意味する。好ましくは、本発明によるハウスキーピング遺伝子の発現は、種々の組織の中で遍在し、安定である。ハウスキーピング遺伝子は好ましくは、アルブミン、βアクチン、αアクチン、βミクログロブリン、好ましくはアルブミンをコードする遺伝子から選択される。これらのハウスキーピング遺伝子が、本発明の状況において主な対象となる。実際に、ＮＰＹ、ＰＥＮＫおよびＷｉｆ１遺伝子またはそれらの断片もしくは変異体のメチル化度は、発現が安定であるハウスキーピング遺伝子のメチル化に関して表される。
【００３３】
典型的に、本発明の状況において、対象とする遺伝子のメチル化度の測定は、先行技術の古典的技術に従って実施される。好ましくは、前記測定は、「メチル化特異的ＰＣＲ」技術に従って実施される。
【００３４】
典型的に、Ｗｉｆ１遺伝子の増幅のために、１９塩基および３つのＣｐＧ部位を有するセンスプライマー配列番号９、ならびに２４塩基および２つのＣｐＧ部位を有するアンチセンスプライマー配列番号１０を使用する。ＴａｑＭａｎ−ＭＧＢプローブ配列番号１１は１６塩基および２つのＣｐＧ部位を有する。
【００３５】
典型的に、ＮＰＹ遺伝子の増幅のために、２０塩基および３つのＣｐＧ部位を有するセンスプライマー配列番号１２、ならびに２３塩基および４つのＣｐＧ部位を有するアンチセンスプライマー配列番号１３を使用する。ＴａｑＭａｎ−ＭＧＢプローブ配列番号１４は１８塩基および３つのＣｐＧ部位を有する。
【００３６】
典型的に、ＰＥＮＫ遺伝子の増幅のために、２１塩基および３つのＣｐＧ部位を有するセンスプライマー配列番号１５、ならびに２１塩基および２つのＣｐＧ部位を有するアンチセンスプライマー配列番号１６を使用する。ＴａｑＭａｎ−ＭＧＢプローブ配列番号１７は１８塩基および３つのＣｐＧ部位を有する。
【００３７】
典型的に、アルブミン遺伝子の増幅のために、２２塩基を有し、ＣｐＧ部位を有さないセンスプライマー配列番号１８、ならびに２２塩基を有し、ＣｐＧ部位を有さないアンチセンスプライマー配列番号１９を使用する。ＴａｑＭａｎ−ＭＧＢプローブ配列番号２０は１７塩基を有し、ＣｐＧ部位を有さない。
【００３８】
「メチル化度」または「メチル化のレベル」とは、標準に対する、標的遺伝子のメチル化ＣｐＧ部位の数のパーセントを意味する。標的遺伝子とは、本発明者らがメチル化度を測定することを望む遺伝子を意味する。本発明の状況において、これらの標的遺伝子はＷｉｆ１、ＮＰＹ、ＰＥＮＫ、アルブミンおよびそれらの断片または変異体である。標準とは、前記標的遺伝子の野生型配列またはそうでなければハウスキーピング遺伝子の配列を意味する。
【００３９】
メチル化度は当業者に周知である定量化技術により算出される。この定量化は絶対的であっても、または相対的であってもよい。好ましくは、それはいわゆるΔΔＣｔ技術により算出される。この方法は、参照遺伝子で正規化することによって、標的遺伝子のメチル化度を表すための演算式を利用する。まず、標的遺伝子のＣｔの値と、参照遺伝子のＣｔの値との間の差ΔＣｔを、分析する試料および標準ＤＮＡについて決定する。標準ＤＮＡは典型的に、ユニバーサルなメチル化ＤＮＡである。これにより、遺伝子のメチル化度の正規化が可能となる。この種のＤＮＡは例えば、商品参照番号Ｄ５０１１としてＺｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社により市販されている。市販のキットであるＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ（参照番号Ｄ５００２、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）などの適切なキットを使用する修飾の後、この標準ＤＮＡを参照として使用する。アルブミン、Ｗｉｆ１、ＮＰＹおよびＰＥＮＫ遺伝子について得られたＣｔ値は、デフォルトにより１００％のメチル化コピーに対応する。
ΔＣｔ試料＝Ｃｔ（標的試料）−Ｃｔ（参照試料）
ΔＣｔ標準＝Ｃｔ（標的標準）−Ｃｔ（参照標準）
次いで標準と試料との間のΔΔＣｔを算出する：
ΔΔＣｔ＝ΔＣｔ標準−ΔＣｔ試料
【００４０】
ΔΔＣｔ値の算出法は、２つの遺伝子のＰＣＲ増幅効率が１００％に等しいと仮定する。それ故、言い換えれば、この算出法は、生成物の濃度がＰＣＲの対数期の各サイクルで２倍になることを仮定する。したがって、このことから、標的遺伝子の正規化されたメチル化度は以下の式により決定されると推論される
２−ΔΔＣｔ＝２（Ｃｔ遺伝子−Ｃｔアルブミン）標準−（Ｃｔ遺伝子−Ｃｔアルブミン）試料
【００４１】
この方法により、使用された陽性対照（標準ＤＮＡ）に応じて相対的なメチル化度が得られる。さらに、それは、使用された参照遺伝子のコピー数の変化を考慮に入れる。それらの変化は、必然的にＰＣＲを実施するために使用されるＤＮＡの量の変化に起因する。それ故、結果は参照遺伝子の性質により歪曲されない。
【００４２】
好ましくは、参照遺伝子はハウスキーピング遺伝子である。さらにより好ましくは、それはアルブミン遺伝子である。
【００４３】
好ましくは、本発明の方法は、
ＮＰＹおよびＰＥＮＫ遺伝子またはそれらのそれぞれの断片もしくは変異体、ならびに／あるいは
ＮＰＹおよびＷｉｆ１遺伝子またはそれらのそれぞれの断片もしくは変異体、ならびに／あるいは
ＰＥＮＫおよびＷｉｆ１遺伝子またはそれらのそれぞれの断片もしくは変異体
のメチル化度の同時測定を含む。
【００４４】
より好ましくは、本発明の方法は、
配列番号１および配列番号２の配列、ならびに／または
配列番号１および配列番号３の配列、ならびに／または
配列番号２および配列番号３の配列
のメチル化度の同時測定を含む。
【００４５】
より好ましくは、本発明の方法は、一方でＷｉｆ１遺伝子およびハウスキーピング遺伝子またはそれらのそれぞれの断片もしくは変異体のメチル化度、他方でＮＰＹおよびＰＥＮＫ遺伝子またはそれらのそれぞれの断片もしくは変異体のメチル化度の同時測定を含む。好ましくは、ハウスキーピング遺伝子はアルブミンである。本発明者らは、一方でＷｉｆ１およびアルブミン遺伝子またはそれらの断片もしくは変異体でのマルチプレックスＭＳＰの適用、他方でＮＰＹおよびＰＥＮＫ遺伝子またはそれらの断片もしくは変異体でのマルチプレックスＭＳＰの適用が、結腸直腸癌についてのスクリーニング試験の感度を増加させることを有効に実証した。
【００４６】
それ故、ＮＰＹ、ＰＥＮＫ、Ｗｉｆ１およびそれらの断片または変異体から選択される遺伝子のうちの２つでのメチル化度の同時測定により、先行技術の古典的技術に従って陰性と検出されたが結腸直腸癌を有する対象を回収できる。
【００４７】
好ましくは、本発明の方法は、メチル化度を閾値と比較するステップをさらに含む。ＮＰＹおよびＰＥＮＫまたはそれらのそれぞれの断片もしくは変異体、ＮＰＹおよびＷｉｆ１またはそれらのそれぞれの断片もしくは変異体、ならびにＰＥＮＫおよびＷｉｆ１またはそれらのそれぞれの断片もしくは変異体からなる群から選択される２つの遺伝子の組合せのメチル化度の合計が、この閾値を超える場合、試験されたその試料が得られた対象は結腸直腸癌について陽性であるとみなされる。
【００４８】
好ましくは、本発明の方法は、一方でＷｉｆ１遺伝子およびハウスキーピング遺伝子またはそれらの断片もしくは変異体のメチル化度、他方でＮＰＹおよびＰＥＮＫ遺伝子またはそれらの断片もしくは変異体のメチル化度を、特異度および感度に関する要件に応じて特定される閾値と比較するステップをさらに含む。許容可能な試験を得るために、この閾値は約２％である。それ故、一方でＷｉｆ１遺伝子およびハウスキーピング遺伝子のメチル化度を閾値と比較し、他方でＮＰＹおよびＰＥＮＫ遺伝子のメチル化度を前記閾値と比較する必要がある。
【００４９】
「感度」とは、結腸直腸癌を有する対象における陽性試験の割合を意味する。
【００５０】
「特異度」とは、結腸直腸癌を有さない対象における陰性試験の割合を意味する。
【００５１】
「カットオフ」または「閾値」とは、標的遺伝子のメチル化度の限界値を意味し、その閾値を超える試料、したがってその試料が得られた対象は、本発明の方法による結腸直腸癌の診断について陽性であるとみなされる。
【００５２】
本発明者らは２４６人の対象の群で広範な研究を行い、そのうちの２３人が結腸直腸癌と診断され、４４人が別の種類の癌を有し、１７９人が健康であった。
【００５３】
対象の血清由来の標的遺伝子の組合せにマルチプレックス遺伝子試験を適用することによって、本発明者らは、閾値（その閾値を超える対象を、結腸直腸癌について陽性であると正確にスクリーニングする）を所与の感度および特異度で決定できた。したがってスクリーニング試験の感度および特異度は選択される閾値に依存する。それ故、この閾値は、適切な感度および特異度に関して調節されなければならない。感度および特異度の関連値は、通常、診断される集団に応じていくつかの基準に依存する。好ましくは、この閾値は、１から５％の間であり、好ましくは１から３．５％の間であり、好ましくは１．５から３％の間であり、好ましくは２から３％の間であり、さらにより好ましくはこの閾値は２％である。
【００５４】
本発明者らは、２％の閾値により、スクリーニング試験が６５．２％の感度および９５％の特異度を有し得ることを示した。本発明者らがこの閾値を低くした場合、感度は増加するが、特異度は減少する。段階的なアプローチを採用することにより、本発明者らは、結腸直腸癌の遺伝子マーカーに対する感度、ならびに偽陽性および偽陰性を除外するのに十分な特異度がある試験を開発するための最も信頼性ある閾値を同定することに成功した。それ故、標的集団および結腸直腸癌に対する前記集団の素因に応じて、本発明の試験は異なる閾値で適用でき、それ故、改良された感度および特異度で適用できる。実際に、標的集団が、対象が結腸直腸癌を発症する可能性の高い高リスクの集団である場合、試験の感度および特異度を調節するために閾値を変更することが可能である。
【００５５】
好ましくは、本発明の方法は、前記対象の全血、血漿、尿および糞便から選択される生物学的試料を使用する。より好ましくは、前記生物学的試料は、前記対象の全血、血漿および尿から選択される。したがって、本発明の方法は、対象の糞便で試験を実施する必要がなくなるので、非常に有利である。それ故、本発明の方法は非侵襲性であり、結腸直腸癌のためのスクリーニング試験を必要とする対象にとっての妨げとはならない。
【００５６】
好ましくは、本発明の方法は、前記対象の結腸を検査するステップをさらに含む。好ましくは、この検査ステップは視覚的な結腸内視鏡検査に対応する。代替として、この検査ステップは、「結腸スキャナ(coloscanner)」とも呼ばれている仮想的な結腸内視鏡検査に対応する。結腸スキャナ技術は、スキャナによる結腸の検査および３次元での消化管の内部画像の再構築に基づく。この結腸内視鏡検査により、本発明の方法による結腸直腸癌の診断について陽性とみなされた対象における結腸直腸癌の存在を検証可能となる。好ましくは、癌組織の検出が次いで、組織学的検査により確認される。
【実施例】
【００５７】
候補遺伝子の選択
１．生物学的物質およびゲノムＤＮＡの抽出
スクリーニング状況とは別にヒトで行われた研究において、本発明者らは、結腸内視鏡検査の前に糞便、血液、および尿を採取し、これらの流出物からＤＮＡを抽出した。組織から抽出されたＤＮＡも、結腸内視鏡検査の間の内視鏡バイオプシーによって、または外科的検体からのいずれかで正常粘膜および病的粘膜（腺腫性ポリープ、癌）から得た。これらの対象は、専門的な診察の後に結腸内視鏡検査を受けていた（したがって、それは明確な病因を有さない機能障害または貧血を有する集団である）。この研究の目的は、潜血試験と比較して糞便分子試験を検証することであった。
【００５８】
合計で、６４８人の患者を含み、本発明者らは５７７個の異なる試料を分析した。いくつかの分子マーカー（点変異、メチル化）を調査した。本発明者らはマーカーメチル化アプローチを優先し、それ故、マルチプレックス試験を考案するために使用されるいくつかの遺伝子（ＮＰＹ、ＰＥＮＫ）を選択する戦略を採用した。
【００５９】
結腸内視鏡検査の前に、生物学的試料（血液、尿、糞便）および組織試料（正常粘膜、腺腫ポリープ、浸潤癌）を、ＱｉＡｍｐミディキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡ抽出に供した。これは、正常な対象（Ｎ＝１０）、および癌を有する対象（Ｎ＝１０）から得られた糞便由来のＤＮＡであった。
【００６０】
２．メチル化チップ
Ｉｌｌｕｍｉｎａ社（ＵＳＡ）により市販されている、「ゴールデンゲート(Goldengate)」メチル化チップを、８０７個の遺伝子（そのうちの２８．６％は１つの遺伝子につき１つのＣｐＧ部位を含有し、５７．３％は１つの遺伝子につき２つのＣｐＧ部位を含有し、１４．１％は少なくとも３つの部位を含有する）に対応する、１５０５個のＣｐＧ部位のメチル化を分析するために使用できる。ＤＮＡ試料を、ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎキット（参照番号Ｄ５００２、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、亜硫酸水素ナトリウム溶液で処理し、次いでＤＮＡ鎖のメチル化（ベータ）および非メチル化（アルファ）形態を別々に標的とする２つの蛍光プローブでタグを付け、遺伝子増幅（ＰＣＲ）に供した。調査中の遺伝子のメチル化度を、０（非メチル化）〜１（全てメチル化）の範囲の（ベータ）／（アルファ＋ベータ）の比の値に基づいて確立した。報告された各値に関して、対応するｐ値が存在したが、これはメチル化度の不十分な推定の可能性を示す。記述的バイオインフォマティクス分析を、閾値ｐ＜０．０１に基づいて実施した。
【００６１】
３．関連遺伝子を選択するためのアプローチ
本発明者らによって採用されたアプローチにより、組織（正常および腫瘍）に関して異なる生物学的流出物（血液、糞便、尿）中の関連標的を識別することが可能となった。
【００６２】
一方で組織または同じ生物学的流出物についての最良の集団間の差異的なマーカー（正常対癌）の識別に基づいた戦略、他方で異なる生物学的流出物の間のシグナルの一致に基づいた戦略を用いて集団間比較を実施した。メチル化を受けている可能性があるとみなされた１０１５個の遺伝子の中から、過剰メチル化遺伝子（専門用語でｐ＜０．０００１の値を用いて癌−正常≧２０％）のリストを組織について確立し、それは１４６個の過剰メチル化標的を含有していた。
【００６３】
同じように、同じ基準に従った過剰メチル化遺伝子のリストは、排泄物中で１３４個の標的および血液中で１２２個の標的を含有していた。次いで、個々の値に基づいてリストを互いに合わせることにより、組織と血液との間に３４個の共通の標的および糞便と血液との間に４６個の標的が見出された。最終的に、本発明者らは、関連遺伝子としてＮＰＹ、ＰＥＮＫおよびＷｉｆ１遺伝子、特に、それらの遺伝子の断片、それぞれ配列番号１、２および３を同定した。
【００６４】
このように、本発明者らは、３個の候補遺伝子（Ｗｉｆ１、ＮＰＹ、およびＰＥＮＫ）を同定した。本発明者らは、マルチプレックスメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）を実施することに基づいた遺伝子試験を開発するためのこれらの遺伝子の利点を実証した。
【００６５】
４．ＭＳＰ技術によるリアルタイムでの遺伝子増幅
ＤＮＡの修飾を考慮に入れて、ＴａｑＭａｎ−ＭＧＢプライマーおよびプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を生成した。以下の表は、「ハウスキーピング」遺伝子：アルブミンに対応するプライマーおよびプローブの配列ならびに３個の遺伝子ＮＰＹ、ＰＥＮＫおよびＷｉｆ１の断片のもの（それぞれ配列番号１、２および３）をまとめている。
【００６６】
以下の表は、ハウスキーピング遺伝子および標的遺伝子の増幅産物のヌクレオチド配列を示す。
【表１】
2013542733.tif 000002
【００６７】
以下の表は、使用されたセンスプライマー、アンチセンスプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブの配列を示す。
【表２】
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【００６８】
ｑＰＣＲと適合性のある光学グレードフィルム（ＡＢｇｅｎｅ）で密封された９６ウェルプレート中で増幅を実施する。５．８μｌの修飾ＤＮＡ（１０ｎｇの標準ＤＮＡおよび患者由来のＤＮＡ）を、最終濃度４００ｎｍｏｌの各プライマー（センスおよびアンチセンス）および最終濃度２５０ｎｍｏｌのＴａｑＭａｎ−ＭＧＢプローブおよび１倍のＰＣＲ溶液（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で加える。反応体積は２０μｌである。増幅条件は以下の通りである：
ホットスタート：１５分間、９４℃、
４８サイクルまで：１５秒間、９４℃、変性ステップ、
６０秒間、６０℃、ハイブリダイゼーション（アニーリング）および伸長ステップ。
【００６９】
標準ＤＮＡは、ユニバーサルにメチル化されているＤＮＡ（参照番号Ｄ５０１１、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）である。ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎキット（参照番号Ｄ５００２、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用する修飾に続いて、それを参照としてＭＳＰにおいて使用する。アルブミン、Ｗｉｆ１、ＮＰＹおよびＰＥＮＫ遺伝子の断片で得られたＣｔ値は、デフォルトにより１００％のメチル化コピーに対応する。
【００７０】
ａ）ΔΔＣｔ法に従ったメチル化パーセント
ΔΔＣｔ＝２−（Ｃｔ遺伝子−Ｃｔアルブミン）試料＋（Ｃｔ遺伝子−Ｃｔアルブミン）標準の方法に従ってメチル化度を定量する。この方法は、使用された陽性対照（標準ＤＮＡ）に応じてメチル化度の相対値を与える。それは、ＭＳＰを実施するために使用されたＤＮＡの量の変化にのみ起因し得るアルブミン遺伝子のコピー数の変化を考慮に入れる。
【００７１】
ｂ）組織ＤＮＡでのＭＳＰＭ分子試験の評価段階
１６個の腫瘍ＤＮＡおよび１６個のいわゆる「正常」自己組織ＤＮＡを含む３２個のヒト組織ＤＮＡを使用して評価段階を実施した。
【表３】
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【００７２】
ｃ）「メチル化特異的ＰＣＲ」による血清ＤＮＡでの遺伝子試験の性能の決定
本発明者らは、組織ＤＮＡに基づいてマルチプレックスＭＳＰを開発した。マルチプレックス試験の非常に良好な性能が特異度および感度に関して組織試料で得られたことにより、血清試料についての検証に取りかかった。
【００７３】
ｉ．生物学的物質
本発明者らは、マルチプレックス試験プロトコールを受けた入院患者から得られた２４６個の血清の試料でのマルチプレックス遺伝子試験の適合性を評価した。
【００７４】
ｉｉ．血清ＤＮＡの抽出：抽出キットの選択
本発明者らは、Ｑｉａｇｅｎ社により市販されているＤＮＡ抽出キットである、ＱｉＡｍｐミディキット、およびＺｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社により市販されているＺＲ  Ｓｅｒｕｍ  Ｋｉｔ（参照番号Ｄ３０１３）の適合性を評価した。採用されたのはＺＲ  Ｓｅｒｕｍ  Ｋｉｔの方である。組合せ［（Ｗｉｆ１＋アルブミン）および（ＮＰＹ＋ＰＥＮＫ）］において実施される２つのデュプレックスに対応する４回のＭＳＰの適用に必要な十分な量の核酸分子を得るため、４ｍｌ体積の血清（８〜１０ｍｌの全血）が推奨される。
【００７５】
ｄ）検証
最初に試料採取された２４６個の血清でマルチプレックス試験の検証段階を行った。これらの２４６個の血清のうち、２３個は結腸または直腸の癌を有する個体由来であり、４４個は別の種類の癌を有する個体由来であり、１７９個は癌を有さない個体由来であった。特異度および感度に関して考慮すると、組合せ（２つのＭＳＰのデュプレックス）において３つの候補遺伝子を標的とするマルチプレックスＭＳＰの性能を以下の表に示す。デュプレックス１はＷｉｆ１およびアルブミンのマルチプレックスＭＳＰに対応し、一方、デュプレックス２はＮＰＹおよびＰＥＮＫのマルチプレックスＭＳＰに対応する。
【表４】
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【００７６】
特異度および感度は最初に選択された閾値に依存するようである。このように、３％の閾値（またはカットオフ）は５６．５％の感度および９８．３％の特異度を与えるのに対して、２％の閾値は６５．２％の感度および９５％の特異度を与える。このように、閾値は診断される個体の集団に応じて調節されるべきである。
【００７７】
ｅ）性能の比較：マルチプレックス試験対モノプレックス試験
本発明によるマルチプレックス試験の検証段階は、この試験の性能を、感度（６５．２％）（１５個の結腸直腸癌ＣＲＣが合計２３個の中から検出された）に関して、および特異度に関して９５％と決定した。以下の表は、モノプレックス方式で得られた結果と比較して、マルチプレックス方式およびマルチプレックスの組合せ方式において結腸直腸癌および陽性を有する１５の個体の結果を示す。
【表５】
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【００７８】
デュプレックス１はＷｉｆ１およびアルブミンの断片のマルチプレックスＭＳＰに対応し、一方、デュプレックス２はＮＰＹおよびＰＥＮＫの断片のマルチプレックスＭＳＰに対応する。
【００７９】
このように、本発明者らは、マルチプレックス（デュプレックス）ＭＳＰを実施することにより試験の感度値を増加させること（モノプレックスＭＳＰにおいて陰性と分類された結腸直腸癌を有する対象の回収）を実証した。
【００８０】
本発明者らはまた、マルチプレックスＭＳＰの組合せ（特に、デュプレックス１とデュプレックス２との組合せ）が、より良好な結果を与えることを実証した。結腸直腸癌を有する１５の個体は試験において全て陽性である。
【配列表】
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【国際調査報告】
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