(57)【要約】  本発明は、一般的に、ＨＩＶ−１特異的抗体に、そして特に、ｇｐ４１膜近位外部領域（ＭＰＥＲ）をターゲットとする広範囲中和性ＨＩＶ−１特異的抗体に対する該抗体に関する。本発明はまた、細胞培養系、より具体的には、慢性リンパ球性白血病Ｂ細胞を不死化する方法、およびこうした細胞のクローンから抗ウイルス抗体を単離する方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体細胞のＨＩＶ−１による感染を阻害する方法であって、前記被験体に、２Ｆ５エピトープに結合する２Ｆ５以外のＨＩＶ−１特異的抗体、またはその結合断片を、前記抗体またはその断片が前記感染を阻害するような量および条件下で投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２】
前記被験体または前記被験体の免疫系とＨＩＶ−１が接触する前に、あるいはＨＩＶ−１での前記被験体の脆弱性細胞の感染後に、前記抗体を投与する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記抗体が、Ｍ６６抗体の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）配列を含むモノクローナル抗体である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記抗体が、Ｍ６６．６抗体の可変重鎖および可変軽鎖配列を含むモノクローナル抗体である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記抗体が、モノクローナル抗体Ｍ６６またはＭ６６．６  ＶＨおよびＶＬ鎖のＩｇＡ、ＩｇＭあるいはＩｇＧ１、２、３または４型を含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ｇｐ４１  ＭＰＥＲに選択的に結合し、そして表２または図４に示すように、１またはそれより多いＣＤＲを含む、単離抗体またはその断片。
【請求項７】
請求項６記載の抗体またはその断片およびキャリアーを含む、組成物。
【請求項８】
Ｂ慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）細胞の不死化クローンを生成する方法であって、前記Ｂ−ＣＬＬ細胞を、マクロファージ・フィーダー細胞株でのＥＢＶ感染後の培養中で培養する工程を含む、前記方法。
【請求項９】
前記マクロファージ細胞株がマウス株Ｊ７７４Ａ．１である、請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、どちらもその全内容が本明細書に援用される、２００９年９月１６日出願の米国仮出願第６１／２７２，３４９号および２００９年１０月５日出願の米国仮出願第６１／２４８，７９６号に優先権を請求する。
【０００２】
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号第ＡＩ０６７８５４−０５号および助成金番号第ＵＯ１  ＡＩ０６７８５４−０２のもとに米国政府の援助を受けて作成された。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本発明は、一般的に、ＨＩＶ−１特異的抗体に、そして特に、ｇｐ４１膜近位外部領域（ＭＰＥＲ）をターゲットとする広範囲中和性ＨＩＶ−１特異的抗体に関する。
【０００４】
本発明はまた、細胞培養系、より具体的には、慢性リンパ球性白血病Ｂ細胞を不死化する方法、およびこうした細胞のクローンから抗ウイルス抗体を単離する方法にも関する。
【背景技術】
【０００５】
Ｔ細胞および単核食細胞のＨＩＶ−１感染を強力に阻害するヒト抗体を利用する戦略の開発は、ＨＩＶ−１感染の治療および防止のため、高い優先度を持つ（Ｍａｓｃｏｌａら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９：１０１０３−１０１０７（２００５））。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＩＶ−１を広範囲に中和可能であり、そしてｉｎ  ｖｉｖｏでＳＨＩＶ感染から非ヒト霊長類を防御可能である、ｇｐ１６０に対するいくつかのまれなヒト・モノクローナル抗体（ｍＡｂ）が単離されてきている（Ｍａｓｃｏｌａら，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ６：２０７−２１０（２０００）、Ｂａｂａら，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ６：２００−２０６（２０００））。これらのｍＡｂには、ｇｐ４１の膜近位外部領域（ＭＰＥＲ）に対する抗体２Ｆ５および４Ｅ１０（Ｍｕｓｔｅｒら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６７：６６４２−６６４７（１９９３）；  Ｓｔｉｅｇｌｅｒら，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  ＆  Ｈｕｍ．  Ｒｅｔｒｏ．  １７：１７５７−１７６５（２００１）、Ｚｗｉｃｋら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７５：１０８９２−１０９０５（２００１））、ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位に対するＩｇＧ１ｂ１２（Ｒｏｂｅｎら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６８：４８２１−４８２８（１９９４））、ならびにｇｐ１２０高マンノース残基に対するｍＡｂ  ２Ｇ１２（Ｓａｎｄｅｒｓら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７６：７２９３−７３０５（２００２））が含まれる。
【０００６】
ＨＩＶ−１は、中和抗体から回避するためのいくつかの有効な戦略を発展させてきており、これには中和エピトープのグリカン遮蔽（Ｗｅｉら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４２２：３０７−３１２（２００３））、中和抗体結合に対するエントロピーバリア（Ｋｗｏｎｇら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４２０：６７８−６８２（２００２））、および非中和抗体による抗体反応のマスキングまたは転換（Ａｌａｍら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８２：１１５−１２５（２００８））が含まれる。熱心な研究にもかかわらず、ｇｐ１２０  ＣＤ４結合部位またはｇｐ４１の膜近位領域のいずれかに対する広範囲中和抗体が、動物またはヒトのいずれにおいてもルーチンに誘導されないのはなぜであるかは謎のままである。
【０００７】
広範囲中和抗体を誘導するのが困難であるのはなぜかに関する１つの手がかりは、上記ｍＡｂがすべて、珍しい特性を有するという事実の中に見出されうる。ｍＡｂ  ２Ｇ１２は、宿主グリコシルトランスフェラーゼによって合成され、そして修飾され、そして従って、自己炭水化物と認識される可能性がある炭水化物に対するものである（Ｃａｌａｒｅｓｅら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０２：１３３７２−１３３７７（２００５））。２Ｇ１２はまた、連結されたＶＨドメイン交換二量体に組み立てられるＦａｂを持つユニークな抗体でもある（Ｃａｌａｒｅｓｅら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：２０６５−２０７１（２００３））。２Ｆ５および４Ｅ１０はどちらも、長いＣＤＲ３ループを持ち、そして宿主脂質を含む多数の宿主抗原と反応する（Ｚｗｉｃｋら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７５：１０８９２−１０９０５（２００１）、Ａｌａｍら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎ．  １７８：４４２４−４４３５（２００７）、Ｚｗｉｃｋら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８：３１５５−３１６１（２００４）、Ｓｕｎら，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２８：５２−６３（２００８））。同様に、ＩｇＧ１ｂ１２もまた、長いＣＤＲ３ループを持ち、そしてｄｓＤＮＡと反応する（Ｈａｙｎｅｓら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０８：１９０６−１９０８（２００５）、Ｓａｐｈｉｒｅら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：１１５５−１１５９（２００１））。これらの発見を、自己免疫疾患患者において臨床的ＨＩＶ−１感染がまれであるという知見（ＰａｌａｃｉｏｓおよびＳａｎｔｏｓ，  Ｉｎｔｅｒ．  Ｊ．  ＳＴＤ  ＡＩＤＳ  １５：２７７−２７８（２００４））と合わせると、広範囲反応性中和抗体のいくつかの種は、免疫寛容機構による下方制御のために作製されないという仮説が生じた（Ｈａｙｎｅｓら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０８：１９０６−１９０８（２００５）、Ｈａｙｎｅｓら，  Ｈｕｍ．  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  １４：５９−６７（２００５））。この仮説の帰結として、自己免疫疾患患者には、防御に相関するものとしてのあるタイプの中和抗体を持つ、「曝露され、そして感染していない」被験体がいる可能性もある（Ｋａｙ，  Ａｎｎ．  Ｉｎｔｅｒ．  Ｍｅｄ．  １１１：１５８−１６７（１９８９））。ｇｐ４１のＭＰＥＲの２Ｆ５エピトープ領域をターゲットとする広範囲中和性抗体を持つ患者が定義されてきている（Ｓｈｅｎら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８３：３６１７−２５（２００９））。
【０００８】
本発明は、少なくとも部分的に、広範囲中和活性を与える、Ｓｈｅｎら（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８３：３６１７−２５（２００９））の患者由来の２Ｆ５様ｍＡｂを同定するよう設計された研究から生じる。これらの研究は、ＨＩＶ−１感染個体由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来の、酵母またはファージ上にディスプレイされる抗体断片（ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ）からライブラリーを調製することを伴った。２Ｆ５エピトープを含有するペプチドで、ならびにｇｐ１４０で、ライブラリーをパニングし、そしてスクリーニングした。ペプチドに特異的に結合する抗体が同定され、こうした結合は、２Ｆ５で競合された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍａｓｃｏｌａら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９：１０１０３−１０１０７（２００５）
【非特許文献２】Ｍａｓｃｏｌａら，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ６：２０７−２１０（２０００）
【非特許文献３】Ｂａｂａら，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ６：２００−２０６（２０００）
【非特許文献４】Ｍｕｓｔｅｒら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６７：６６４２−６６４７（１９９３）
【非特許文献５】Ｓｔｉｅｇｌｅｒら，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  ＆  Ｈｕｍ．  Ｒｅｔｒｏ．  １７：１７５７−１７６５（２００１）
【非特許文献６】Ｚｗｉｃｋら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７５：１０８９２−１０９０５（２００１）
【非特許文献７】Ｒｏｂｅｎら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６８：４８２１−４８２８（１９９４）
【非特許文献８】Ｓａｎｄｅｒｓら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７６：７２９３−７３０５（２００２）
【非特許文献９】Ｗｅｉら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４２２：３０７−３１２（２００３）
【非特許文献１０】Ｋｗｏｎｇら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４２０：６７８−６８２（２００２）
【非特許文献１１】Ａｌａｍら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８２：１１５−１２５（２００８）
【非特許文献１２】Ｃａｌａｒｅｓｅら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０２：１３３７２−１３３７７（２００５）
【非特許文献１３】Ｃａｌａｒｅｓｅら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：２０６５−２０７１（２００３）
【非特許文献１４】Ａｌａｍら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎ．  １７８：４４２４−４４３５（２００７）
【非特許文献１５】Ｚｗｉｃｋら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８：３１５５−３１６１（２００４）
【非特許文献１６】Ｓｕｎら，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２８：５２−６３（２００８）
【非特許文献１７】Ｈａｙｎｅｓら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０８：１９０６−１９０８（２００５）
【非特許文献１８】Ｓａｐｈｉｒｅら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：１１５５−１１５９（２００１）
【非特許文献１９】ＰａｌａｃｉｏｓおよびＳａｎｔｏｓ，  Ｉｎｔｅｒ．  Ｊ．  ＳＴＤ  ＡＩＤＳ  １５：２７７−２７８（２００４）
【非特許文献２０】Ｈａｙｎｅｓら，  Ｈｕｍ．  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  １４：５９−６７（２００５）
【非特許文献２１】Ｋａｙ，  Ａｎｎ．  Ｉｎｔｅｒ．  Ｍｅｄ．  １１１：１５８−１６７（１９８９）
【非特許文献２２】Ｓｈｅｎら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８３：３６１７−２５（２００９）
【発明の概要】
【００１０】
一般的に、本発明は、ＨＩＶ−１特異的抗体に関する。より具体的には、本発明は、ｇｐ４１  ＭＰＥＲをターゲットとする広範囲中和性ＨＩＶ−１特異的抗体に、そして該抗体を用いて、ＨＩＶ−１感染を治療し、そしてかつ防止する方法に関する。本発明はまた、慢性リンパ球性白血病Ｂ細胞を不死化する方法に、そしてこうした細胞のクローンから抗ウイルス抗体を単離する方法にも関する。
【００１１】
本発明の目的および利点は、以下の説明から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】高レベルのｂｎＡｂＳを持つ患者における慢性ＨＩＶ−１感染。２Ｆ５様抗体を持つ患者（ＳＣ４４）由来の末梢血における抗体。
【図１Ｂ】高レベルのｂｎＡｂＳを持つ患者における慢性ＨＩＶ−１感染。２Ｆ５様抗体を持つ患者（ＳＣ４４）由来の末梢血における抗体。
【図１Ｃ】高レベルのｂｎＡｂＳを持つ患者における慢性ＨＩＶ−１感染。２Ｆ５様抗体を持つ患者（ＳＣ４４）由来の末梢血における抗体。
【図１Ｄ】高レベルのｂｎＡｂＳを持つ患者における慢性ＨＩＶ−１感染。２Ｆ５様抗体を持つ患者（ＳＣ４４）由来の末梢血における抗体。
【図１Ｅ】高レベルのｂｎＡｂＳを持つ患者における慢性ＨＩＶ−１感染。２Ｆ５様抗体を持つ患者（ＳＣ４４）由来の末梢血における抗体。
【図１Ｆ】高レベルのｂｎＡｂＳを持つ患者における慢性ＨＩＶ−１感染。２Ｆ５様抗体を持つ患者（ＳＣ４４）由来の末梢血における抗体。
【図１Ｇ】高レベルのｂｎＡｂＳを持つ患者における慢性ＨＩＶ−１感染。２Ｆ５様抗体を持つ患者（ＳＣ４４）由来の末梢血における抗体。
【図１Ｈ】高レベルのｂｎＡｂＳを持つ患者における慢性ＨＩＶ−１感染。２Ｆ５様抗体を持つ患者（ＳＣ４４）由来の末梢血における抗体。
【図１Ｉ】高レベルのｂｎＡｂＳを持つ患者における慢性ＨＩＶ−１感染。２Ｆ５様抗体を持つ患者（ＳＣ４４）由来の末梢血における抗体。
【図１Ｊ】高レベルのｂｎＡｂＳを持つ患者における慢性ＨＩＶ−１感染。２Ｆ５様抗体を持つ患者（ＳＣ４４）由来の末梢血における抗体。
【図１Ｋ】高レベルのｂｎＡｂＳを持つ患者における慢性ＨＩＶ−１感染。２Ｆ５様抗体を持つ患者（ＳＣ４４）由来の末梢血における抗体。
【図１Ｌ】高レベルのｂｎＡｂＳを持つ患者における慢性ＨＩＶ−１感染。２Ｆ５様抗体を持つ患者（ＳＣ４４）由来の末梢血における抗体。
【図２Ａ】広範囲中和性ＨＩＶ−１抗体の個体発生（ｏｎｔｏｇｅｎｙ）および単離。
【図２Ｂ】広範囲中和性ＨＩＶ−１抗体の個体発生（ｏｎｔｏｇｅｎｙ）および単離。
【図２Ｃ】広範囲中和性ＨＩＶ−１抗体の個体発生（ｏｎｔｏｇｅｎｙ）および単離。
【図２Ｄ】広範囲中和性ＨＩＶ−１抗体の個体発生（ｏｎｔｏｇｅｎｙ）および単離。
【図２Ｅ】広範囲中和性ＨＩＶ−１抗体の個体発生（ｏｎｔｏｇｅｎｙ）および単離。
【図２Ｆ】広範囲中和性ＨＩＶ−１抗体の個体発生（ｏｎｔｏｇｅｎｙ）および単離。
【図２Ｇ】広範囲中和性ＨＩＶ−１抗体の個体発生（ｏｎｔｏｇｅｎｙ）および単離。
【図２Ｈ】広範囲中和性ＨＩＶ−１抗体の個体発生（ｏｎｔｏｇｅｎｙ）および単離。
【図３】Ｍ６６抗体結合データ。
【図４】図４Ａおよび４Ｂ。ｍ６６  ＶＨおよびＶＬのＩＭＧＴ  Ｖ−Ｑｕｅｓｔ分析。図４Ａに示すようにＶＨと、そして図４Ｂに示すようにＶＬと、最も近い生殖系列Ｖ遺伝子セグメントを整列させる。生殖系列配列と異なる突然変異部位を太字フォントで強調し；ＩＭＧＴデータベースに従って、フレームワークおよびＣＤＲもまた、定義し、そして標識した。
【図５】図５Ａおよび５Ｂ。ＥＬＩＳＡを通じたＭＰＥＲペプチドおよびＪＲＦＬ  ｇｐ１４０タンパク質両方への結合に関するｍ６６．６および２Ｆ５の比較。（図５Ａ）ストレプトアビジンを、結合アッセイのためのターゲットとしてプレート上にコーティングすることによって、ビオチン化ＭＰＥＲペプチドを捕捉した。（図５Ｂ）精製可溶性ｇｐ１４０タンパク質を、結合アッセイのためのターゲットとして、プレート上に直接コーティングした。
【図６】７つの重鎖サブファミリー由来の７つの生殖系列Ｖ遺伝子をプローブとして用いる類似性マッチを通じた、ＳＣ４４患者由来ＩｇＧ特異的ＶＨ遺伝子レパートリー・プロファイリング。
【図７】ｍ６６変異体の系統樹。
【図８】Ｂ細胞のエプスタイン−バー・ウイルス（ＥＢＶ）形質転換（Ｂ−ＣＬＬ細胞に関する）。
【図９】完全培地の調製。
【図１０】電気融合法。
【図１１】Ｂ−ＣＬＬ細胞のＥＢＶ形質転換およびモノクローナル抗体の産生。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜１２Ｄ。包括的ＣＬＬスクリーニング結果。
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜１２Ｄ。包括的ＣＬＬスクリーニング結果。
【図１２Ｃ】図１２Ａ〜１２Ｄ。包括的ＣＬＬスクリーニング結果。
【図１２Ｄ】図１２Ａ〜１２Ｄ。包括的ＣＬＬスクリーニング結果。
【図１３】ＣＬＬ１０７５ハイブリドーマ（ＣＬＬ１０７５−２）由来のｇｐ４１反応性ＩｇＭのルミネックス分析。
【図１４】Ｊ７７４Ａ．１フィーダー細胞は、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）感染後のＢ−ＣＬＬ細胞（ＣＬＬ２４６）の増殖および該細胞由来のＩｇＭ産生を増進させる。ＥＢＶとインキュベーションした後、Ｂ−ＣＬＬ細胞を５，０００細胞／ウェルで、（Ａ）Ｊ７７４Ａ．１細胞の非存在下または（Ｂ）放射線照射したＪ７７４Ａ．１細胞の存在下（５０，０００細胞／ウェル）でプレーティングした。感染３週後、ＥＬＩＳＡによってＩｇＭレベルを検出し、そしてμｇ／ｍｌで表した。
【図１５】Ｂ−ＣＬＬ細胞株、ＣＬＬ２４６は、ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０およびＣ型肝炎ウイルスＥ２（ＨＣＶ  Ｅ２）エンベロープタンパク質両方に対するＩｇＭを産生する。試験抗原に対するＩｇＭをＥＬＩＳＡによって検出し、そしてＯＤで表した。
【図１６Ａ】Ｂ−ＣＬＬ培養の要約。目的：ｉ）Ｂ−ＣＬＬ細胞をＥＢＶに感染させ、そしてＩｇＭ産生ハイブリドーマを生成すること、ならびにｉｉ）Ｂ−ＣＬＬ  ＩｇＭの反応性およびＨＩＶ中和活性をプロファイリングすること。
【図１６Ｂ】Ｂ−ＣＬＬ培養の要約。目的：ｉ）Ｂ−ＣＬＬ細胞をＥＢＶに感染させ、そしてＩｇＭ産生ハイブリドーマを生成すること、ならびにｉｉ）Ｂ−ＣＬＬ  ＩｇＭの反応性およびＨＩＶ中和活性をプロファイリングすること。
【図１６Ｃ】Ｂ−ＣＬＬ培養の要約。目的：ｉ）Ｂ−ＣＬＬ細胞をＥＢＶに感染させ、そしてＩｇＭ産生ハイブリドーマを生成すること、ならびにｉｉ）Ｂ−ＣＬＬ  ＩｇＭの反応性およびＨＩＶ中和活性をプロファイリングすること。
【図１６Ｄ】Ｂ−ＣＬＬ培養の要約。目的：ｉ）Ｂ−ＣＬＬ細胞をＥＢＶに感染させ、そしてＩｇＭ産生ハイブリドーマを生成すること、ならびにｉｉ）Ｂ−ＣＬＬ  ＩｇＭの反応性およびＨＩＶ中和活性をプロファイリングすること。
【図１６Ｅ】Ｂ−ＣＬＬ培養の要約。目的：ｉ）Ｂ−ＣＬＬ細胞をＥＢＶに感染させ、そしてＩｇＭ産生ハイブリドーマを生成すること、ならびにｉｉ）Ｂ−ＣＬＬ  ＩｇＭの反応性およびＨＩＶ中和活性をプロファイリングすること。
【図１６Ｆ】Ｂ−ＣＬＬ培養の要約。目的：ｉ）Ｂ−ＣＬＬ細胞をＥＢＶに感染させ、そしてＩｇＭ産生ハイブリドーマを生成すること、ならびにｉｉ）Ｂ−ＣＬＬ  ＩｇＭの反応性およびＨＩＶ中和活性をプロファイリングすること。
【図１６Ｇ】Ｂ−ＣＬＬ培養の要約。目的：ｉ）Ｂ−ＣＬＬ細胞をＥＢＶに感染させ、そしてＩｇＭ産生ハイブリドーマを生成すること、ならびにｉｉ）Ｂ−ＣＬＬ  ＩｇＭの反応性およびＨＩＶ中和活性をプロファイリングすること。
【図１６Ｈ】Ｂ−ＣＬＬ培養の要約。目的：ｉ）Ｂ−ＣＬＬ細胞をＥＢＶに感染させ、そしてＩｇＭ産生ハイブリドーマを生成すること、ならびにｉｉ）Ｂ−ＣＬＬ  ＩｇＭの反応性およびＨＩＶ中和活性をプロファイリングすること。
【図１６Ｉ】Ｂ−ＣＬＬ培養の要約。目的：ｉ）Ｂ−ＣＬＬ細胞をＥＢＶに感染させ、そしてＩｇＭ産生ハイブリドーマを生成すること、ならびにｉｉ）Ｂ−ＣＬＬ  ＩｇＭの反応性およびＨＩＶ中和活性をプロファイリングすること。
【図１６Ｊ】Ｂ−ＣＬＬ培養の要約。目的：ｉ）Ｂ−ＣＬＬ細胞をＥＢＶに感染させ、そしてＩｇＭ産生ハイブリドーマを生成すること、ならびにｉｉ）Ｂ−ＣＬＬ  ＩｇＭの反応性およびＨＩＶ中和活性をプロファイリングすること。
【図１６Ｋ】Ｂ−ＣＬＬ培養の要約。目的：ｉ）Ｂ−ＣＬＬ細胞をＥＢＶに感染させ、そしてＩｇＭ産生ハイブリドーマを生成すること、ならびにｉｉ）Ｂ−ＣＬＬ  ＩｇＭの反応性およびＨＩＶ中和活性をプロファイリングすること。
【図１６Ｌ】Ｂ−ＣＬＬ培養の要約。目的：ｉ）Ｂ−ＣＬＬ細胞をＥＢＶに感染させ、そしてＩｇＭ産生ハイブリドーマを生成すること、ならびにｉｉ）Ｂ−ＣＬＬ  ＩｇＭの反応性およびＨＩＶ中和活性をプロファイリングすること。
【図１６Ｍ】Ｂ−ＣＬＬ培養の要約。目的：ｉ）Ｂ−ＣＬＬ細胞をＥＢＶに感染させ、そしてＩｇＭ産生ハイブリドーマを生成すること、ならびにｉｉ）Ｂ−ＣＬＬ  ＩｇＭの反応性およびＨＩＶ中和活性をプロファイリングすること。
【図１６Ｎ】Ｂ−ＣＬＬ培養の要約。目的：ｉ）Ｂ−ＣＬＬ細胞をＥＢＶに感染させ、そしてＩｇＭ産生ハイブリドーマを生成すること、ならびにｉｉ）Ｂ−ＣＬＬ  ＩｇＭの反応性およびＨＩＶ中和活性をプロファイリングすること。
【図１６Ｏ】Ｂ−ＣＬＬ培養の要約。目的：ｉ）Ｂ−ＣＬＬ細胞をＥＢＶに感染させ、そしてＩｇＭ産生ハイブリドーマを生成すること、ならびにｉｉ）Ｂ−ＣＬＬ  ＩｇＭの反応性およびＨＩＶ中和活性をプロファイリングすること。
【図１６Ｐ】Ｂ−ＣＬＬ培養の要約。目的：ｉ）Ｂ−ＣＬＬ細胞をＥＢＶに感染させ、そしてＩｇＭ産生ハイブリドーマを生成すること、ならびにｉｉ）Ｂ−ＣＬＬ  ＩｇＭの反応性およびＨＩＶ中和活性をプロファイリングすること。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、１つの態様において、被験体細胞（例えばＴ細胞）のＨＩＶ−１による感染を阻害する方法に関する。本発明はまた、初期ウイルス負荷を制御し、そしてＣＤ４＋  Ｔ細胞プールを保持し、そしてＣＤ４＋  Ｔ細胞破壊を防止する方法にも関する。該方法は、被験体（例えばヒト被験体）に、２Ｆ５エピトープに結合するＨＩＶ−１特異的抗体（２Ｆ５以外）、またはその結合断片を、該抗体またはその断片が感染を阻害するような量および条件下で投与する工程を含む。
【００１４】
本発明に従って、被験体または被験体の免疫系／細胞とＨＩＶ−１が接触する前に、あるいは脆弱性細胞の感染後に、抗体を投与してもよい。接触前または接触直後の投与は、被験体の脆弱性細胞（例えばＴ細胞）の感染の阻害を最大限にしうる。
【００１５】
本発明で使用するのに好ましい１つの抗体は、表１に示すようなＭ６６抗体の可変重鎖および可変軽鎖配列を有するｍＡｂである。ＨＩＶ−１感染個体由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来の酵母またはファージ上にディスプレイされる抗体断片（ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ）からライブラリーを調製した。２Ｆ５エピトープを含有するペプチド（図１を参照されたい、「ＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤ−ＫＷＡＳＬＷＮ」）で、ならびにｇｐ１４０で、ライブラリーをパニングし、そしてスクリーニングした。ペプチドに特異的に結合する抗体が同定され、こうした結合は、２Ｆ５で競合された。Ｍ６６抗体は、クレードＢ由来の４つの試験した単離体のうち４つを中和した。Ｍ６６の最も近い対応する生殖系列可変重鎖（ＶＨ）遺伝子は、ＩＧＨＶ５−５１＊０１であり、そしてその重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）は、２Ｆ５のもの（２４残基）と匹敵する長さ（２３アミノ酸残基）である。Ｍ６６  ＶＨ遺伝子の体細胞超変異の度合いは、２Ｆ５のものより低い。Ｍ６６抗体の可変重鎖および可変軽鎖遺伝子およびアミノ酸配列を表１に示す。表２には、同定されるＣＤＲ領域の詳細が含まれる。
【００１６】
表１
【００１７】
【表１】
2013505236.tif 000002
【００１８】
表２
【００１９】
【表２】
2013505236.tif 000003
【００２０】
本発明で使用するための別の好ましい抗体は、表３に示すＭ６６．６抗体のような可変重鎖および可変軽鎖配列を有するｍＡｂである。Ｍ６６．６抗体の同一性の詳細を実施例３に提供する。
【００２１】
表３
【００２２】
【表３】
2013505236.tif 000004
【００２３】
上述のように、損なわれていない抗体またはその断片（例えば抗原結合断片）を本発明の方法で用いてもよい。例示的な機能性断片（領域）には、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が含まれる。一本鎖抗体もまた用いてもよい。適切な断片および一本鎖抗体を調製するための技術が当該技術分野に周知である（例えば、ＵＳＰ５，８５５，８６６；  ５，８７７，２８９；  ５，９６５，１３２；  ６，０９３，３９９；  ６，２６１，５３５；  ６，００４，５５５；  ７，４１７，１２５および７，０７８，４９１、ならびにＷＯ  ９８／４５３３１を参照されたい）。本発明にはまた、具体的に開示される抗体（および断片）の結合特性を保持する変異体を含む、本明細書開示の抗体の変異体（および断片）、および本方法において該変異体を用いる方法も含まれる。例えば、本発明には、ｇｐ４１  ＭＰＥＲに選択的に結合し、そして表２および図４に示すような１またはそれより多いＣＤＲを含む、単離ヒト抗体またはその断片が含まれる。本発明に従って療法的に使用可能なＭ６６およびＭ６６．６の修飾には、Ｍ６６、Ｍ６６．６  ＶＨおよびＶＬ鎖のＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧ１、２、３または４型が含まれる。
【００２４】
上述の抗体およびその断片を組成物（例えば医薬組成物）として配合してもよい。適切な組成物は、医薬的に許容されうるキャリアー（例えば水性媒体）中に溶解されるかまたは分散された抗体（または抗体断片）を含んでもよい。組成物は、無菌であってもよいし、そして注射可能型であってもよい。抗体（およびその断片）は、また、皮膚または粘膜に対する局所投与に適した組成物として配合されてもよい。こうした組成物は、液体、軟膏、クリーム、ゲルおよびペーストの形を取ってもよい。適切な組成物を調製する際に、標準的配合技術を用いてもよい。性交後膣洗浄として、またはコンドームとともに投与するように、抗体を配合してもよい。
【００２５】
本発明の抗体および抗体断片は、例えば、以下の環境において、予防のための該抗体の有用性を示す：
ｉ）ＨＩＶ−１感染に対して予期される曝露が知られる環境において、本明細書記載の抗体（またはその結合断片）を、消毒剤（ｍｉｃｒｏｂｉｏｃｉｄｅ）として予防的に（例えばＩＶまたは局所的に）投与してもよく、
ｉｉ）レイプ被害者、または商業的風俗店従業員、またはコンドーム保護を伴わないあらゆる異性愛者間の感染で生じるものなどの、曝露が知られるかまたは推測される環境において、本明細書記載の抗体（またはその断片）を、曝露後予防剤として、例えばＩＶまたは局所的に投与してもよく、
ｉｉｉ）急性ＨＩＶ感染（ＡＨＩ）の環境において、本明細書記載の抗体（またはその結合断片）を、初期ウイルス負荷を制御し、そしてＣＤ４＋  Ｔ細胞プールを保持し、そしてＣＤ４＋  Ｔ細胞破壊を防止する、ＡＨＩに関する治療として、投与してもよく、そして
ｉｖ）小児が授乳されている間の母子感染環境において用いてもよい。
【００２６】
適切な用量範囲は、例えば、抗体、そして配合物の性質および投与経路に依存しうる。当業者は過度の実験を伴わずに、最適用量を決定可能である。１０ｎｇ〜２０μｇ／ｍｌの範囲の抗体用量が適切でありうる。
【００２７】
別の態様において、本発明は、Ｂ慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）細胞レパートリー由来のモノクローナル抗ウイルス抗体の産生を可能にする細胞培養系を提供する。本発明のこの態様に従って、ＥＢＶ感染後、培養中でＢ−ＣＬＬ細胞を増殖させるフィーダー細胞として、マクロファージ細胞を用いる。
【００２８】
Ｂ−ＣＬＬ細胞の不死化クローンを生成する際に使用するのに適したプロトコルの特定の例を図８に示す。一般的に、マクロファージ細胞株（例えばげっ歯類マクロファージ細胞株）をフィーダーとして用いる。好ましいマクロファージ細胞株はマウス株Ｊ７７４Ａ．１である。Ｊ７７４Ａ．１マクロファージ細胞は、ハイブリドーマ増殖およびクローニングに適した増殖因子を産生することが示されてきている（ＲａｔｈｊｅｎおよびＧｅｃｚｙ，  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ５：２５５−２６１（１９８６））。Ｊ７７４Ａ．１細胞から調製した馴化培地は、ハイブリドーマ生存性を増進させるために広く用いられてきている。Ｔ細胞ならびにＥＢＶ感染Ｂ細胞と、フィーダーとしてのＪ７７４Ａ．１細胞株を同時培養すると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアポトーシス細胞のクリアランスが補助されることもまた示されてきている（Ｋａｇａｎら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６９：４８７−４９９（２００２））。
【００２９】
本発明に従って、マクロファージ細胞株を放射線照射に供して、フィーダー細胞の成長を防止する。最適γ照射用量は、例えば、細胞株を試験して、細胞増殖を完全に阻害するのに必要な最低用量（例えば約４，０００Ｒａｄ）を決定することによって、実験的に決定可能である。次いで、放射線照射細胞を培養容器内に分配してもよい（例えば９６ウェルプレートを用いる場合、約５０，０００細胞／ウェル（約１００μｌ／ウェル）を分配してもよい）。放射線照射細胞の最適数は、異なる密度で細胞を試験することによって、実験的に決定可能である。
【００３０】
標準的技術を用いて、Ｂ−ＣＬＬ細胞のＥＢＶ感染を達成してもよい。例えば、標準的技術を用いて、ＣＬＬ患者由来の血液試料から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離してもよく、次いで、細胞を完全培地（例えば図９を参照されたい）中で洗浄して、そして例えばＰＳ２００６およびシクロスポリンＡを含む完全培地中に懸濁してもよい。先に記載される方法（Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａら，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １８：５２３−５２８（２００７））に従って、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ−９）アゴニストであるＰＳ２００６を添加して、Ｂ細胞を刺激してもよい。シクロスポリンＡを添加して、いかなるＥＢＶ−Ｂ細胞特異的細胞傷害性Ｔ細胞反応を抑制してもよい。ＥＢＶ−Ｂ細胞刺激能を試験することによって、最適濃度を実験的に決定してもよい。
【００３１】
本発明のこの態様に従って、次いで、ＥＢＶ懸濁物を細胞懸濁物に添加する。約３７℃で（例えば約１〜約２４時間、好ましくは約４時間）インキュベーションした後、例えばＰＳ２００６を含む完全培地中にＥＢＶ感染細胞を再懸濁して、放射線照射したマクロファージ細胞とともに、培養容器内に分配して、そして約３７℃でインキュベーションしてもよい。培地を定期的に交換し、そしてＥＢＶ感染細胞が十分に増殖したら（例えば感染約３〜約４週後）、例えばＥＬＩＳＡを用いて抗体産生を評価してもよい。次いで、例えば、図１０に記載するものなどのハイブリドーマ細胞融合法を用いて、ＣＬＬ細胞由来のＩｇＭ産生ハイブリドーマ細胞株を産生し、そしてクローニングしてもよい（一般的に、図１１を参照されたい）。３つのモノクローナルＢ−ＣＬＬハイブリドーマ細胞株が、ＣＬＬ２４６（ＶＨ１−６９、非突然変異症例）、ＣＬＬ１０７５（ＶＨ１−６９、突然変異症例）、およびＣＬＬ４９３（ＶＨ１−６９、非突然変異症例）から得られている（図１２および１３を参照されたい）。
【００３２】
上記方法に従って不死化されたＢ−ＣＬＬ細胞から産生される療法抗体（例えば抗ＨＩＶ抗体、抗Ｃ型肝炎抗体または抗インフルエンザ抗体）、またはその断片（例えば抗原結合断片−例示的な機能性断片（領域）には、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）’２断片が含まれる）を、組成物（例えば医薬組成物）として配合してもよい。適切な組成物は、医薬的に許容されうるキャリアー（例えば水性媒体）中に溶解されるかまたは分散された抗体（または抗体断片）を含んでもよい。組成物は無菌であってもよく、そして注射可能型であってもよい。抗体（およびその断片）は、また、皮膚または粘膜に対する局所投与に適した組成物として配合されてもよい。こうした組成物は、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ペーストまたはエアロゾルの形を取ってもよい。適切な組成物を調製する際に、標準的配合技術を用いてもよい。
【００３３】
抗ＨＩＶ抗体およびその断片は、例えば、以下の環境において、予防のための該抗体の有用性を示す：
ｉ）ＨＩＶ−１感染に対して予期される曝露が知られる環境において、本明細書記載の抗体（またはその結合断片）を、消毒剤として予防的に（例えばＩＶまたは局所的に）投与してもよく、
ｉｉ）レイプ被害者、または商業的風俗店従業員、またはコンドーム保護を伴わないあらゆる異性愛者間の感染で生じるものなどの、曝露が知られるかまたは推測される環境において、本明細書記載の抗体（またはその断片）を、曝露後予防剤として、例えばＩＶまたは局所的に投与してもよく、
ｉｉｉ）急性ＨＩＶ感染（ＡＨＩ）の環境において、本明細書記載の抗体（またはその結合断片）を、初期ウイルス負荷を制御し、そしてＣＤ４＋  Ｔ細胞プールを保持し、そしてＣＤ４＋  Ｔ細胞破壊を防止する、ＡＨＩに関する治療として、投与してもよく、そして
ｉｖ）小児が授乳されている間の母子感染環境において用いてもよい。
【００３４】
上述のような、抗Ｃ型肝炎抗体および抗インフルエンザ抗体、またはその断片を用いて、それぞれ、Ｃ型肝炎感染およびインフルエンザ感染を治療するかまたは防止してもよい。
【００３５】
適切な用量範囲は、例えば、抗体、配合物の性質、投与経路、および患者（例えばヒト患者）に応じる可能性もある。当業者は過度の実験を伴わずに、最適用量を決定可能である。１０ｎｇ〜２０μｇ／ｍｌの範囲の抗体用量が適切でありうる。
【００３６】
本発明の特定の側面は、以下の限定されない実施例に、より詳細に記載されうる（米国仮特許出願第６１／２７２，３４９号および第６１／２４８，７６９号、Ｓｈｅｎら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８３（８）：３６１７−２５  Ｅｐｕｂ  ２００９、ＺｈｕおよびＤｉｍｉｔｒｏｖ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５２５：１２９−１４２（２００９）、ＤｉｍｉｔｒｏｖおよびＭａｒｋｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５２５：１−２７（２００９）、Ｚｈａｎｇら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８２（１４）：６８６９−６８７９（２００８）、Ｐｒａｂａｋａｒａｎら，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ５５：３３−９７（２００７）、Ｐｅｒｅｚら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８３（１５）：７３９７−７４１０（２００９）もまた参照されたい）。（Ｃｈａｎら，  Ｂｌｏｏｄ  ９７：  １０２３−１０２６（２００１）；  Ｇｏｒｎｙら，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４６：９１７−９２６（２００９））もまた参照されたい）。
【実施例】
【００３７】
実施例１
急性感染の患者および２Ｆ５様抗体を持つ患者由来のＩｇＭおよびＩｇＧライブラリーを生成し、そしてハイスループット（４５４）配列決定および他の方法によって分析した。２つの時点（４０日および８ヶ月）の急性感染患者の血液から得たＩｇＧライブラリー由来のＨＩＶ−１特異的抗体を同定した。これらの抗体は、高アフィニティでエンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）に結合したが、９つの偽ウイルス団を中和しなかった。４０日の試料由来の抗体は、８ヶ月の時点では見出されず、そして８ヶ月の試料由来の抗体は、４０日で優勢なＥｎｖに結合しなかった。同じ患者由来の骨髄由来ライブラリーのパニングは、いかなる抗体の選択も生じなかった。
【００３８】
２Ｆ５様抗体を持つ患者由来のＩｇＭ＋ＩｇＧファージおよび酵母ディスプレイライブラリーから新規抗体を選択した。これらの抗体の１つであるＭ６６は、長い（２３残基の）重鎖ＣＤＲ３を有し、そしてそのＶＨ遺伝子は、比較的少数の体細胞突然変異を有する。該抗体は、２Ｆ５エピトープを含有するｇｐ４１  ＭＰＥＲペプチドに特異的に結合し、そして交差反応性にＨＩＶ−１単離体を中和した。他の抗体が性質決定中である。これらの結果は、体液性免疫反応およびワクチン免疫原の設計を理解するために意味を有しうる（図１および２を参照されたい）。
【００３９】
実施例２
カスタムＨＩＶ−１ルミネックスによって、Ｍ６６抗体遺伝子で安定トランスフェクションされた２９３Ｔ細胞由来の上清を、２Ｆ５エピトープに対する結合に関して評価した。上清の連続希釈を、エピトープに対する結合（平均蛍光強度−ＭＦＩの読み取り値）に関して評価した。実験のための陽性対照には、２Ｆ５  ｍＡｂが含まれ、そしてＨＩＶＩＧ力価測定および陰性対照は、モックトランスフェクション上清であった。Ｍ６６抗体に関する結合データを図３に示す。
【００４０】
実施例３
実験詳細
ｃＤＮＡ、抗体、ｇｐ１４０およびペプチド
登録１２ヶ月後、患者ＳＣ４４から採取したＰＢＭＬから抽出した総ＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡを調製した（Ｓｈｅｎら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８３：３６１７−２５（２００９））。ＨＩＶ−１  ｇｐ４１  Ｍａｂ  ２Ｆ５を、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ，  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ＡＩＤＳ，  ＮＩＡＩＤ，  ＮＩＨから得た（Ｈｅｒｍａｎｎ  Ｋａｔｉｎｇｅｒ）。組換えｇｐ１４０は、Ｃ．  Ｂｒｏｄｅｒ（Ｕｎｉｆｏｒｍｅｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  メリーランド州ベセスダ）の厚意によって提供された。２Ｆ５エピトープ配列を含有する２つのビオチン化ペプチド（２Ｆ５ペプチド）をパニングおよび結合アッセイに用いた：  ＳＰ６２  ＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮおよびＳＰ６２スクランブル化ペプチド。これらのペプチドは、Ｐｒｉｍｍ  ＢｉｏｔｅｃｈおよびＣＰＣによって、カスタム作製された。西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート化抗ＦＬＡＧタグ抗体およびＨＲＰコンジュゲート化抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス）から購入した。
【００４１】
ファージディスプレイＦａｂライブラリー構築およびライブラリーパニング、スクリーニング
抗体遺伝子レパートリークローニングのためのテンプレートとして、患者ＳＣ４４のＰＢＭＣから調製されたｃＤＮＡを用いて、公表されたプロトコル（Ｚｈｕら，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５２５：１２９−４２，  ｘｖ（２００９））に主に従って、ファージディスプレイＦａｂライブラリーを構築した。ビオチン化ペプチドＳＰ６２およびｇｐ１４０タンパク質を用いて、連続パニングを行い、パニングの最初の３周期は、ストレプトアビジン・コンジュゲート化磁気ビーズ上の１μｇのビオチン化ペプチドに対するパニング、そして第四および第五のパニングは、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上に１μｇ／ウェルでコーティングされたｇｐ１４０（ＪＲＦＬ）に対するパニングであった。ビーズまたはプレートウェル上の結合したファージを直接用いて、対数増殖期のＴＧ１細胞を感染させ、そしてＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージによってレスキューし、そして次の周期のパニングのために増幅した。第五周期のパニング後、１９０の個々のコロニーを摘み取り、そして記載されるようなファージＥＬＩＳＡスクリーニング（Ｚｈｕら，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５２５：１２９−４２，  ｘｖ（２００９））において、２ＹＴ培地内に接種した。同定された陽性結合物を配列決定し、そしてユニークなクローンを発現させ、そして精製したＦａｂを予備的性質決定に用いた。
【００４２】
軽鎖シャッフリング・ファージディスプレイライブラリーの生成および選択
本質的に記載されるように（Ｚｈｕら，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５２５：１２９−４２，  ｘｖ（２００９））、ｍ６６  Ｆａｂ構築物のＦｄ断片をＰＣＲ増幅し、そして重複ＰＣＲを用いて、元来のＦａｂライブラリー構築中に得られた軽鎖遺伝子レパートリーと融合させ、そしてファージミドベクター内にクローニングした。増幅された鎖シャッフリング・ファージライブラリーをアリコットし、そしてＰＢＳ中の５０％グリセロール中、−８０℃で保存した。ファージライブラリーストックの１つのアリコットを標準プロトコルに従って沈殿させ、そしてビオチン化ＭＰＥＲペプチドに対する２周期のパニングに用い、そしてその後、ターゲットとしてＪＲＦＬ  ｇｐ１４０を用いるモノクローナルファージＥＬＩＳＡスクリーニングに用いて、ＭＰＥＲペプチドおよびＪＲＦＬ  ｇｐ１４０タンパク質両方に交差反応性に結合可能なクローンを単離した。
【００４３】
ＦａｂのＩｇＧ１への変換
重鎖および軽鎖の同時発現を可能にする、Ｄｅｎｎｉｓ  Ｂｕｒｔｏｎ（Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  カリフォルニア州ラホヤ）の厚意によって提供されたｐＤＲ１２内に、ｐＣｏｍｂ３Ｘ中のｍ６６およびｍ６６．６  Ｆａｂをクローニングした。簡潔には、ＸｂａＩおよびＳａｃＩ部位を通じて、重鎖可変領域をまずｐＤＲ１２内にクローニングした。次いで、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位を通じて、完全軽鎖をｐＤＲ１２内にクローニングした。
【００４４】
ＦａｂおよびＩｇＧ１の発現
ｍ６６  Ｆａｂ配列を含有するプラスミドでＨＢ２１５１細胞を形質転換した。単一の新鮮なコロニーを２ＹＴ培地＋１００Ａｇ／ｍＬアンピシリン＋０．２％グルコース内に接種した。Ａ６００＝０．５まで、培養物を２５０ｒｐｍ、３７℃で振盪した。イソプロピル−Ｌ−チオ−ｈ−Ｄ−ガラクトピラノシド（１ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加して発現を誘導した。３０℃で一晩増殖させた後、培養物を採取した。細菌を５，０００ｇで１５分間遠心分離した。ポリマイシンＢ（１０，０００単位／ｍＬ）を含むＰＢＳ中にペレットを再懸濁した。室温で４５分間インキュベーションすることによって、可溶性Ｆａｂを周辺質から溶出させた。１５，０００ｇで３０分間、抽出物を清澄化した。ＱｉａｇｅｎのＮｉｋｅｌカラム上での精製のため、透明な上清を回収した。
【００４５】
２９３フリースタイル細胞中で、ｍ６６およびｍ６６．６  ＩｇＧ１を発現させた。製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の指示に従って、２９３Ｆｅｃｔｉｎを用いて、２９３フリースタイル細胞をトランスフェクションした。トランスフェクション４日後、培養上清を採取した。プロテインＡカラム上で、ＩｇＧ１を精製した。
【００４６】
ＥＬＩＳＡ結合アッセイ
ビオチン化ペプチドまたはｇｐ１４０を捕捉するための抗原（ストレプトアビジン）を、ＰＢＳ中、５０ｎｇ／ウェルで、狭小ウェル９６ウェルプレート上に、４℃で一晩コーティングした。ファージＥＬＩＳＡのため、各周期のパニング由来の１０１０のファージを、抗原とインキュベーションした。抗Ｍ１３−ＨＲＰポリクローナル抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，  ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いて、結合したファージを検出した。可溶性Ｆａｂ結合アッセイのため、抗Ｆｌａｇ  ＨＲＰコンジュゲートを用いて、結合を検出した。ＩｇＧ１結合ＥＬＩＳＡのため、ＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を検出に用いた。
【００４７】
偽ウイルス中和アッセイ
製造者の指示に従って、ＰｏｌｙＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を用いることにより、７０〜８０％集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）の２９３Ｔ細胞を、ｐＮＬ４−３．ｌｕｃ．Ｅ−Ｒ−、およびＨＩＶ−１  ＥｎｖをコードするｐＳＶ７ｄ構築物（Ｇ．  Ｑｕｉｎｎａｎ，  ＵＳＵＨＳ，  メリーランド州ベセスダより寄贈）で同時トランスフェクションすることによって、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖで偽型化されたウイルスを調製した。２４時間後、遠心分離および０．４５μｍフィルターを通じた細胞培養ろ過によって、偽型化ウイルスを得た。中和のため、異なる濃度の抗体とウイルスを３７℃で１時間混合し、そして次いで、９６ウェルプレートの各ウェル中で増殖させた、≒１．５ｘ１０４  ＨＯＳ−ＣＤ４−ＣＣＲ５（Ｒ５および二重向性ウイルスに用いる）またはＨＯＳ−ＣＤ４−ＣＸＣＲ４細胞に混合物を添加した。Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ，  ウィスコンシン州マディソン）およびＬｕｍｉＣｏｕｎｔマイクロプレート・ルミノメーター（Ｔｕｒｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ）を用いることによって、４８時間後に発光を測定した。２つ組ウェルに関する平均相対光単位（ＲＬＵ）を測定した。以下の式：（１−抗体含有ウェルの平均ＲＬＵ／ウイルスのみのウェルの平均ＲＬＵ）ｘ１００によって、阻害パーセントを計算した。
【００４８】
ＰＢＭＣに基づく中和アッセイ
多周期のウイルス複製後、ＬｕｃＲレポーター遺伝子発現における減少として、ＰＢＭＣアッセイにおいてＨＩＶ−１の中和を測定した。９６ウェルＵ底培養プレート中、総体積１５０μｌのＩＬ−２含有増殖培地中、２つ組で、試験試料の連続３倍希釈（全部で８希釈）とウイルスを３７℃で１時間インキュベーションした。１日齢のＰＨＡ−ＰＢＭＣ（５０μｌのＩＬ−２含有増殖培地中、２ｘ１０５細胞）を各ウェルに添加した。対照ウェルの１セットは、ウイルスを加えた細胞を添加され（ウイルス対照）、そして別のセットは細胞のみを添加された（バックグラウンド対照）。４日間のインキュベーション後、ＶｉｖｉＲｅｎ生細胞基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、レニラ属（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ発光を測定するため、１００μｌの細胞を９６ウェル白色固体プレート（Ｃｏｓｔａｒ）にトランスファーした。
【００４９】
ＴＺＭ／ｂｌおよびＴＺＭ−ｂｌ／ＦｃγＲＩに基づく、偽ウイルス中和アッセイ
ＴＺＭ／ｂｌ細胞およびＦｃγＲＩを発現しているＴＺＭ−ｂｌ細胞に基づく偽ウイルス中和アッセイは、先に、Ｐｅｒｅｚら（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８３（１５）：７３９７−７４１０（２００９））に記載された。
【００５０】
患者ＳＣ４４由来の全ＩｇＧ由来ＶＨ遺伝子レパートリーの４５４配列決定
テンプレートとして患者から単離されたｃＤＮＡを用いることによって、ＩｇＧ由来Ｆｄ断片をＰＣＲ増幅した。用いたセンスプライマーは、先に記載され（Ｚｈｕら，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５２５：  １２９−４２，  ｘｖ（２００９））；アンチセンスプライマーはＩｇＧＲ（５’−ＡＣＴＡＧＴＴＴＴＧＴＣＡＣＡＡＧＡＴＴＴＧＧＧＣＴＣＡＡＣＴＢＴＣＴＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＧ  ＴＴＧＣ−３’）であり、これはＩｇＧ１〜４すべてに共有される。５０μｌの体積で２５周期、ＰＣＲを行った。産物をゲル精製し、そして次いで、４５４配列特異的アダプターを含有するプライマー（ＨＦ１２：  ５’−ＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＣＧＡＣＴＣＡＧＴＡＣＴＧＡＧＣＴＡＧＣＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＣＣＡＴＧＧＣＣ−３’およびＨＲ２：  ５’ＣＣＴＡＴＣＣＣＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＴＧＧＣＡＧＴＣＴＣＡＧＧＴＣＡＣＡＡＧＡＴＴＴＧＧＧＣＴ  ＣＡＡＣ−３’）を用いた、さらに１２周期の二次ＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして用いた。生じた産物をゲル精製し、そして記載されるように、４５４配列決定に供した（ｗｗｗ．４５４．ｃｏｍ）。
【００５１】
４５４配列決定を通じて得られたＶＨ遺伝子レパートリーに対して、ｍ６６ＶＨおよび生殖系列Ｖ遺伝子セグメントを用いた、類似性検索
各データベース・エントリーに対して、標準的Ｐｅｒｌ  Ｓｔｒｉｎｇ：：Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙモジュール（Ｍａｒｃ  ＬｅｈｍａｎｎによるＣＰＡＮ  Ｓｔｒｉｎｇ−Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ−１．０４）を適用することによって、ｍ６６  ＶＨ、生殖系列プローブおよびＳＣ４４  ＶＨ遺伝子レパートリーデータベース間の類似性マッチを得た。開始位置１・・ｎにＳｔｒｉｎｇ：：Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙアルゴリズムを連続して適用することによって、各配列比較に関する単一最適スコアを得た。選択した閾値（類似性パーセント）に、またはそれより上に属するスコアを、後の分析のために保持した。
【００５２】
結果
ファージディスプレイライブラリーを通じたｍ６６の単離およびアフィニティ成熟
ＭＰＥＲペプチドおよびｇｐ１４０タンパク質に対する５周期のパニング後、モノクローナルファージスクリーニングのため、１９０のランダムクローンを摘み取った。これらの同定された陽性クローンの配列分析によって、ｍ６６と称される１つのユニークなクローンが同定されることが示され、ｍ６６  ＶＨ遺伝子をプローブとして用いて、ＩＭＧＴオンラインデータベースを検索した。図４に示すように、ｍ６６  ＶＨは、ＶＨ５１−１  Ｖ遺伝子から得られ、重鎖Ｖ遺伝子セグメントに８つの突然変異があり；ｍ６６ＶＬはＶＫ−１−３９から得られ、軽鎖Ｖ遺伝子セグメントには３つの突然変異がある。２Ｆ５および４Ｅ１０とは対照的に、ｍ６６  ＶＨおよびＶＬは、その生殖系列先祖から有意に少数の突然変異しか経ておらず、これはｍ６６がなお、抗体成熟プロセスの初期段階にあることを示す可能性もある。重鎖ＣＤＲ３が、多数のチロシンおよび１つのフェニルアラニンを含む２３残基を有することが観察された。
【００５３】
ｍ６６の結合アフィニティをさらに改善するため、２ｘ１０８のサイズの軽鎖シャッフリングライブラリーを上記のように構築した。鎖シャッフリングライブラリーをＭＰＥＲペプチドに対して２周期パニングし、その後、ターゲットとしてｇｐ１４０タンパク質を用いてファージＥＬＩＳＡスクリーニングを行った。予期されるように、同じ重鎖を共有するが、同じＶＬサブファミリーからいくつかの突然変異を含む異なる軽鎖と対形成する、６つのユニークなクローンが同定された。ＥＬＩＳＡデータは、これらがすべて、該ペプチドおよびｇｐ１４０の両方に、同様によく結合することを示した（データ未提示）。６つのクローンのうち、軽鎖Ｖ遺伝子セグメント中に９つの突然変異を有するものをｍ６６．６と称し、そしてこれをさらなる性質決定のため、ＩｇＧ１に変換した。
【００５４】
ＭＰＥＲペプチドおよびｇｐ１４０両方に対するｍ６６の特異的結合
図５に示すように、ＭＰＥＲペプチドおよびＪＲＦＬ  ｇｐ１４０の両方に対する結合に関して、２Ｆ５  ＩｇＧと、２９３フリースタイル細胞における一過性発現由来の精製ｍ６６．６  ＩｇＧ１を並べて試験した。データは、ｍ６６．６および２Ｆ５  ＩｇＧ１が、ＥＬＩＳＡにおいて、ＭＰＥＲペプチドおよびｇｐ１４０タンパク質の両方に、同様によく結合することを示した。先の報告と一致して、ｍ６６．６および２Ｆ５  ＩｇＧ１はどちらも、ｇｐ１４０タンパク質よりもＭＰＥＲペプチドによりよく結合した。
【００５５】
ｍ６６  ＦａｂおよびＩｇＧ１の中和活性
ＭＰＥＲ領域への結合は、必ずしも抗体が中和することを意味しないことが報告されてきている。ｍ６６およびｍ６６．６  ＩｇＧの中和をさらに試験し、そして中和活性を２Ｆ５と並べて比較した。結果は、ｍ６６．６中和幅が２Ｆ５と非常に似ていることを立証した。また、表４に示すように、ｍ６６．６中和は、ｍ６６に比較して劇的に増加するが、ｇｐ１４０タンパク質に対するｍ６６およびｍ６６．６  ＩｇＧの結合活性は非常に類似である（データ未提示）。同様に、ｍ６６．６および２Ｆ５  ＩｇＧ１は、ＭＰＥＲペプチドおよびＪＲＦＬ  ｇｐ１４０タンパク質の両方に等しくよく結合するが、総合して、ｍ６６．６の中和能は、中和アッセイのこのセットにおいて、２Ｆ５のものより低い。
【００５６】
表４  一連のＨＩＶ単離体に対するｍ６６およびｍ６６．６の中和活性
【００５７】
【表４】
2013505236.tif 000005
【００５８】
ＦｃγＲＩ受容体によって仲介されるｍ６６．６  ＩｇＧ１の中和強化
ＭＰＥＲ領域をターゲットとする、２Ｆ５および４Ｅ１０などの広範囲中和抗体が、中和アッセイにおいて、ターゲット細胞上でＦｃγＲＩもまた発現されている場合、はるかにより高い強度で偽ウイルス感染を中和可能であることが繰り返し示されてきている（Ｐｅｒｅｚら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８３（１５）：７３９７−４１０（２００９），  Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｍａｙ  ２０）。ｍ６６．６もまた同じ特徴を共有するかどうかを試験するため、ｍ６６．６  ＩｇＧ１の中和活性もまた、ＴＺＭ−ｂｌ／ＦｃγＲＩ細胞に対して試験し、ｍ６６Ｆａｂおよび関連しない抗体、ｍ１０２．４を対照として用いた。表５に示すデータは、ｍ６６．６  ＩｇＧ１の中和能が、１０００倍より増加した一方、対照ｍ６６Ｆａｂに関しては増加がまったく観察されなかったことを示し、劇的な増加は、ｍ６６．６  ＩｇＧ１のＦｃ部分が、ターゲット細胞表面上の過剰発現されたＦｃγＲＩに結合したことに起因することが示された。
【００５９】
表５  ＴＺＭ−ｂｌ／ＦｃγＲＩ細胞のＨＩＶ偽ウイルス感染の強力な中和
【００６０】
【表５】
2013505236.tif 000006
【００６１】
１値は相対発光単位（ＲＬＵ）がウイルス対照ウェル（試験試料なし）に比較して５０％減少した濃度（μｇ／ｍｌ）である。
４５４配列決定および配列分析を通じた、ＩｇＧ特異的ＶＨ遺伝子レパートリー分析
他のｍ６６変異体もまた、このレパートリー中に存在するが、ライブラリー構築およびパニング中に同定されなかったことが予期される。ｍ６６様抗体の存在をさらに確認するため、そしてまたｍ６６のアフィニティ成熟経路を探索するため、患者ＳＣ４４  ＰＢＭＣ由来ｃＤＮＡから増幅されたＳＣ４４  ＩｇＧ特異的ＶＨ遺伝子レパートリーを用いて、４５４ハイスループット配列決定を行い、配列決定実験から総数３９２，１９８のユニークな機能性ＶＨ配列を得た。Ｍ６６  ＶＨをプローブとして用いて、ＶＨ遺伝子レパートリーを検索し、そして上述のような類似性検索を通じて、一連のｍ６６  ＶＨ変異体もまた同定した。これらの配列から作製された系統樹は、ｍ６６  ＶＨがなお、進化プロセスの初期段階にあることを示し（図７）、これは、より遅い時点での抗体に比較して、登録１２ヶ月後の血清抗体のＭＰＥＲペプチド結合活性がなお、比較的中程度であることを示した、先の報告と一致する（Ｓｈｅｎら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８３：３６１７−２５（２００９））。
【００６２】
全レパートリーにおけるＶＨ生殖系列遺伝子使用をプロファイリングするため、７つのＶＨサブファミリー、すなわちＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ３−２３、ＶＨ４−１、ＶＨ５１−１、ＶＨ６−１およびＶＨ７−１の各々由来の７つの生殖系列遺伝子セグメントをプローブとして用いて、全ＶＨ遺伝子レパートリーに対する類似性検索を行った。各検索由来のすべての配列をプローブに対する類似性に従ってランク付けし、そして図６に示すように類似性パーセントおよび７つのプローブに対してプロットした。この患者から血液試料を採取した特定の時点で、このレパートリー中、ＶＨ５１−１由来遺伝子が、不均衡に拡大されていることが見出された。このファミリーにおいて、やはり多数のｖ遺伝子が、生殖系列配列に対して非常に高い相同性を示し、このうちいくつかは生殖系列配列に同一のＶ遺伝子配列さえ示す。これらのクローンのＨＣＤＲ３がまた、非常に多様な配列を示すという事実（データ未提示）によって、このユニークなＩｇＧレパートリーが、単一Ｂ細胞ではなく、近い関係のＢ細胞プールから得られることも示した。しかし、他のサブファミリー由来の他のＶ遺伝子プローブを用いた他の類似性検索では、こうした現象は観察されなかった。このデータセットは、Ｂ細胞のこの特定のプールが、ＩｇＭ段階での体細胞超変異およびアフィニティ変異を経ずに、Ｂ細胞発達プロセスの極初期段階で活性化され、そしてＩｇＭからＩｇＧのクラススイッチを経ていることを示す可能性もある。これはまた、これらの多重特異性自己反応性抗体が、ｉｎ  ｖｉｖｏで、免疫寛容をどのように克服し、そしてＨＩＶに対する広範囲中和抗体に進化するのかを説明する可能性もある。
【００６３】
実施例４
図１４に示すように、Ｊ７７４Ａ．１フィーダー細胞は、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）感染後、Ｂ−ＣＬＬ細胞（ＣＬＬ２４６）の増殖および該細胞からのＩｇＭ産生を増進させる。ＥＢＶとインキュベーションした後、Ｂ−ＣＬＬ細胞を５，０００細胞／ウェルで、（Ａ）Ｊ７７４Ａ．１細胞の非存在下または（Ｂ）放射線照射したＪ７７４Ａ．１細胞の存在下（５０，０００細胞／ウェル）でプレーティングした。感染３週後、ＥＬＩＳＡによってＩｇＭレベルを検出し、そしてμｇ／ｍｌで表した。
【００６４】
図１５に示すように、ＣＬＬ２４６細胞は、ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０およびＣ型肝炎ウイルスＥ２（ＨＣＶ  Ｅ２）エンベロープタンパク質の両方に対するＩｇＭを産生する。試験抗原に対するＩｇＭをＥＬＩＳＡによって検出し、そしてＯＤで表した（図１６もまた参照されたい）。
【００６５】
上に引用するすべての文書および他の情報供給源は、その全体が本明細書に援用される。
【図１Ａ】
2013505236.tif 000007
【図１Ｂ】
2013505236.tif 000008
【図１Ｃ】
2013505236.tif 000009
【図１Ｄ】
2013505236.tif 000010
【図１Ｅ】
2013505236.tif 000011
【図１Ｆ】
2013505236.tif 000012
【図１Ｇ】
2013505236.tif 000013
【図１Ｈ】
2013505236.tif 000014
【図１Ｉ】
2013505236.tif 000015
【図１Ｊ】
2013505236.tif 000016
【図１Ｋ】
2013505236.tif 000017
【図１Ｌ】
2013505236.tif 000018
【図２Ａ】
2013505236.tif 000019
【図２Ｂ】
2013505236.tif 000020
【図２Ｃ】
2013505236.tif 000021
【図２Ｄ】
2013505236.tif 000022
【図２Ｅ】
2013505236.tif 000023
【図２Ｆ】
2013505236.tif 000024
【図２Ｇ】
2013505236.tif 000025
【図２Ｈ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2013505236.tif 000029
【図６】
2013505236.tif 000030
【図７】
2013505236.tif 000031
【図８】
2013505236.tif 000032
【図９】
2013505236.tif 000033
【図１０】
2013505236.tif 000034
【図１１】
2013505236.tif 000035
【図１２Ａ】
2013505236.tif 000036
【図１２Ｂ】
2013505236.tif 000037
【図１２Ｃ】
2013505236.tif 000038
【図１２Ｄ】
2013505236.tif 000039
【図１３】
2013505236.tif 000040
【図１４】
2013505236.tif 000041
【図１５】
2013505236.tif 000042
【図１６Ａ】
2013505236.tif 000043
【図１６Ｂ】
2013505236.tif 000044
【図１６Ｃ】
2013505236.tif 000045
【図１６Ｄ】
2013505236.tif 000046
【図１６Ｅ】
2013505236.tif 000047
【図１６Ｆ】
2013505236.tif 000048
【図１６Ｇ】
2013505236.tif 000049
【図１６Ｈ】
2013505236.tif 000050
【図１６Ｉ】
2013505236.tif 000051
【図１６Ｊ】
2013505236.tif 000052
【図１６Ｋ】
2013505236.tif 000053
【図１６Ｌ】
2013505236.tif 000054
【図１６Ｍ】
2013505236.tif 000055
【図１６Ｎ】
2013505236.tif 000056
【図１６Ｏ】
2013505236.tif 000057
【図１６Ｐ】
2013505236.tif 000058
【国際調査報告】
2013505236.tif 000059
2013505236.tif 000060
2013505236.tif 000061
2013505236.tif 000062
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