(57)【要約】  本発明は、ＰＡＫ１が過剰発現又は増幅されている腫瘍を、ＰＡＫ１阻害物質及び第二抗過剰増殖剤を共投与することによって治療する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍の治療のための、ＰＡＫ１阻害物質と第二抗過剰増殖化合物との組合せ。
【請求項２】
前記腫瘍が上昇レベルのＰＡＫ１タンパク質を呈する請求項１に記載の組合せ。
【請求項３】
前記腫瘍が乳房腫瘍、扁平非小細胞肺腫瘍又は扁平頭頸部腫瘍である請求項１又は２に記載の組合せ。
【請求項４】
ＰＡＫ１阻害物質が式Ｉの化合物である請求項１〜３の何れか一項に記載の組合せ：
2013542965.tif 000004
【請求項５】
前記第二抗過剰増殖化合物がアポトーシスタンパク質の阻害物質の阻害物質である請求項１〜４の何れか一項に記載の組合せ。
【請求項６】
アポトーシスタンパク質の阻害物質の前記阻害物質がＢＶ６又はＧ２４４１６である請求項５に記載の組合せ。
【請求項７】
前記第二抗過剰増殖化合物がＥＧＦＲ阻害物質又はアンタゴニストである請求項１〜６の何れか一項に記載の組合せ。
【請求項８】
前記ＥＧＦＲ阻害物質がエルロチニブ、ゲフィチニブ又はラパチニブである請求項７に記載の組合せ。
【請求項９】
前記第二抗過剰増殖化合物がＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／Ｅｒｋシグナル伝達カスケードの阻害物質である請求項１〜４の何れか一項に記載の組合せ。
【請求項１０】
前記第二抗過剰増殖化合物がＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達カスケードの阻害物質である請求項１〜４の何れか一項に記載の組合せ。
【請求項１１】
第二抗過剰増殖化合物がＳｒｃキナーゼの阻害物質である請求項１〜４の何れか一項に記載の組合せ。
【請求項１２】
癌又は過剰増殖障害の治療のための、ＰＡＫ１阻害物質及び第二抗過剰増殖剤の共投与。
【請求項１３】
腫瘍の治療のための医薬の調製のための、ＰＡＫ１阻害物質と第二抗過剰増殖化合物との組合せの使用。
【請求項１４】
前記腫瘍が上昇レベルのＰＡＫ１タンパク質を呈する請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記腫瘍が乳房腫瘍、扁平非小細胞肺腫瘍又は扁平頭頸部腫瘍である請求項１３又は１４に記載の使用。
【請求項１６】
ＰＡＫ１阻害物質が式Ｉの化合物である請求項１３〜１５の何れか一項に記載の使用：
2013542965.tif 000005
【請求項１７】
前記第二抗過剰増殖化合物がアポトーシスタンパク質の阻害物質の阻害物質である請求項１３〜１６の何れか一項に記載の使用。
【請求項１８】
アポトーシスタンパク質の阻害物質の前記阻害物質がＢＶ６又はＧ２４４１６である請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記第二抗過剰増殖化合物がＥＧＦＲ阻害物質又はアンタゴニストである請求項１３〜１６の何れか一項に記載の使用。
【請求項２０】
前記ＥＧＦＲ阻害物質がエルロチニブ、ゲフィチニブ又はラパチニブである請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記第二抗過剰増殖化合物がＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／Ｅｒｋシグナル伝達カスケードの阻害物質である請求項１３〜１６の何れか一項に記載の使用。
【請求項２２】
前記第二抗過剰増殖化合物がＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達カスケードの阻害物質である請求項１３〜１６の何れか一項に記載の使用。
【請求項２３】
第二抗過剰増殖化合物がＳｒｃキナーゼの阻害物質である請求項１３〜１６の何れか一項に記載の使用。
【請求項２４】
癌又は過剰増殖障害の治療のための医薬の調製のための、ＰＡＫ１阻害物質及び第二抗過剰増殖剤の使用。
【請求項２５】
腫瘍の治療方法であって、前記腫瘍を、第二抗過剰増殖化合物との組合せにおいてＰＡＫ１阻害物質と接触させる工程を含んでなる方法。
【請求項２６】
前記腫瘍が上昇レベルのＰＡＫ１タンパク質を呈する請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記腫瘍が乳房腫瘍、扁平非小細胞肺腫瘍又は扁平頭頸部腫瘍である請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＰＡＫ１阻害物質が式Ｉの化合物である請求項２７に記載の方法：
2013542965.tif 000006
【請求項２９】
前記第二抗過剰増殖化合物がアポトーシスタンパク質の阻害物質の阻害物質である請求項２５−２８の何れかに記載の方法。
【請求項３０】
アポトーシスタンパク質の阻害物質の前記阻害物質がＢＶ６又はＧ２４４１６である請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗過剰増殖化合物がＥＧＦＲ阻害物質又はアンタゴニストである請求項２５−２８の何れかに記載の方法。
【請求項３２】
前記ＥＧＦＲ阻害物質がエルロチニブ、ゲフィチニブ又はラパチニブである請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記第二抗過剰増殖化合物がＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／Ｅｒｋシグナル伝達カスケードの阻害物質である請求項２５−２８の何れかに記載の方法。
【請求項３４】
前記第二抗過剰増殖化合物がＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達カスケードの阻害物質である請求項２５−２８の何れかに記載の方法。
【請求項３５】
第二抗過剰増殖化合物がＳｒｃキナーゼの阻害物質である請求項２５−２８の何れかに記載の方法。
【請求項３６】
癌又は過剰増殖障害を患っている患者を治療する方法であって、それを必要としている患者にＰＡＫ１阻害物質及び第二抗過剰増殖剤を共投与することを含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＡＫ１を増幅又は過剰発現する癌性腫瘍を、腫瘍を第二抗過剰増殖剤との組合せにおいてＰＡＫ１阻害物質と接触させることによって治療する方法を開示する。
【０００２】
プロテインキナーゼは、タンパク質における特定のチロシン、セリン、又はスレオニン残基のヒドロキシル基のリン酸化を触媒する酵素のファミリーである。典型的には、このようなリン酸化はタンパク質の機能を劇的に変化させ、従ってプロテインキナーゼは、代謝、細胞増殖、細胞分化、及び細胞生存を含む様々な細胞プロセスの制御において中心的でありうる。これらの細胞プロセスのメカニズムは、プロテインキナーゼを標的にし、これらの細胞プロセスの障害から生じるか又はそれを含む疾患状態を治療する基礎を提供する。このような疾患の例は、限定するものではないが癌及び糖尿病を含む。
【０００３】
プロテインキナーゼはタンパク質チロシンキナーゼ(ＰＴＫ)及びセリン-スレオニンキナーゼ(ＳＴＫ)の２つのタイプに分けられる。ＰＴＫ及びＳＴＫ双方とも、受容体プロテインキナーゼ又は非受容体プロテインキナーゼでありうる。ＰＡＫは非受容体ＳＴＫのファミリーである。セリン／スレオニンプロテインキナーゼのｐ２１活性化プロテインキナーゼ(ＰＡＫ)は、細胞骨格形成、細胞形態形成、細胞プロセス及び細胞生存において重要な役割を果たす(Daniels等, Trends Biochem. Sci. 1999 24: 350-355; Sells等, Trends Cell. Biol. 1997 7: 162-167)。ＰＡＫファミリーは２つのグループに細分される６のメンバーから成る：ＰＡＫ１-３(グループＩ)及びグループＩのＰＡＫにおける自己阻害領域の存在及び配列相同性に基づき区別されるＰＡＫ４-６(グループＩＩ)。ｐ２１-活性化キナーゼ(ＰＡＫｓ)はＲａｃ及びＣｄｃ４２  ＧＴＰａｓｅ機能並びにＲａｓ駆動腫瘍形成に必要な経路の重要なメディエーターとして作用する。(Manser等, Nature 1994 367:40-46; B Dummler等, Cancer Metathesis Rev. 2009 28:51-63; R. Kumar等, Nature Rev. Cancer 2006 6:459-473)。
【０００４】
本発明は、ＰＡＫ１阻害物質、及びＥＧＦＲ、Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路、Ｓｒｃ、Ａｋｔ又はアポトーシスタンパク質の阻害物質の阻害物質から選択される第二抗過剰増殖又は抗腫瘍剤と腫瘍を接触させるか又はそれによって患者を処置することによって、腫瘍細胞又は過剰増殖細胞がＰＡＫ１を過剰発現又は増幅している腫瘍又は過剰増殖状態を治療する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】ヒト乳房腫瘍におけるＰＡＫ１ゲノム増幅及び機能的役割の分析。(Ａ)１１ｑ１３コピー数ゲインのGenomic Identification of Significant Targets in Cancer(GISTIC)分析。ポイントを比例的に間隔を空け、ゲノム順に配置した。鉛直線はＰＡＫ１遺伝子の染色体位置を表す。ＤＮＡゲインのＧＩＳＴＩＣ Ｑ-値を、ゲイン度数の多重検定補正確率及び各プローブセットについてＱ-値のネガティブｌｏｇ１０としてディスプレイされる偶然に生じる平均コピーゲインによって定義する。(Ｂ)ＰＡＫ１ ＤＮＡコピー及びｍＲＮＡ発現ドットプロットは、５１の腫瘍サンプルの226507 at Affymetrix MAS 5.0シグナルに対するＤＮＡコピー数の関係を示す。ピアソン相関統計(０．７５)をプロットに示す。実線はこれらの点を通るベストフィットラインを表す。(Ｃ)ＰＡＫ１発現のノックダウン後のアネキシンＶ陽性細胞の増加割合を、限局性ＰＡＫ１ゲノム増幅を有する３の乳癌細胞株、ＭＤＡ-ＭＢ-１７５、ＨＣＣ１５００及びＭＤＡ-ＭＢ-１３４ ＩＶについて示す。プールされたｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの一過性トランスフェクションの３−５日後、細胞を収集した。(Ｄ)アネキシンＶ／ＰＩ．ＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞の蛍光活性化細胞ソーティング分析を、４８時間、ＩＰＡ-３の有無において培養した。次いで、アネキシンＶ／ＰＩ染色をアポトーシス／壊死を評価するために実施した。アネキシンＶ標識(右下象限)は、初期アポトーシスを受けた集団を表す。アネキシンＶ及びＰＩ二重標識(右上象限)は、アポトーシスによって既に死んだ細胞を表す。生細胞は左下象限に表される。細胞のパーセンテージを各象限について示す。
【図２】ＰＡＫ１はヒト肺腫瘍において高く発現され、扁平ＮＳＣＬＣ細胞株の増幅において決定的役割を果たす。(Ａ)レーザーマイクロダイセクション肺組織におけるＰＡＫ１ ｍＲＮＡ発現の分析。Affymetrix probe 226507_atについてのデータを平均(横線)、データの中央５０％(ボックス)、及び９５％信頼区間(線)としてプロットする。対比較をスチューデントのｔ検定によって実施した。正常組織(ｎ＝９)と比較して、ＰＡＫ１発現は扁平ＮＳＣＬＣ(ｎ＝１６；＊＊，ｐ＝０．０００５)及び腺癌ＮＳＣＬＣ(ｎ＝２９；＊，ｐ＝０．００８)において有意に大きかった。扁平及び腺癌ＮＳＣＬＣ間のＰＡＫ１ ｍＲＮＡ発現における差は、このパネルの肺腫瘍において有意ではなかった(ｐ＝０．１)。(Ｂ)扁平ＮＳＣＬＣ細胞株のパネルの増殖を、［３Ｈ］チミジン取込みアッセイによって測定した。ＥＢＣ-１、ＮＣＩ-Ｈ５２０、ＫＮＳ-６２、ＳＫ-ＭＥＳ-１及びＮＣＩ-Ｈ４４１細胞を非標的コントロールｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド(黒カラム)又はＰＡＫ１及びＰＡＫ２に対するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドのプール(白カラム)のどちらかでトランスフェクトした。各条件下での増殖の程度を各細胞について正規化非標的コントロール値のパーセンテージとしてプロットし、平均±ＳＤとして示した。
【図３】(Ａ)細胞周期のＧ１期における細胞の蓄積が、ＰＡＫ１ノックダウン後に明らかである。ＮＣＩ-Ｈ５２０．Ｘ１細胞を４日間２００ｎｇ／ｍＬのＤｏｘで処理し、ヨウ化プロピジウム染色及びフローサイトメトリーで分析した。(Ｂ)ＮＣＩ-Ｈ５２０．Ｘ１細胞を２４時間血清飢餓にし、１０％血清含有培地における増殖後、細胞周期再進入を記載の時点で細胞溶解物を収集することによってモニタした。細胞溶解物をＰＡＫ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、Ｅ２Ｆ１及びアクチンに対する抗体を使用してイムノブロッティングによって分析した。(Ｃ)ｐ２７Ｋｉｐ１の核集積を有する細胞のパーセンテージを示す(条件につき２０００合計細胞)。カラムは平均±ＳＤを表す。＊，ｐ＜０．０５。＊＊，ｐ＜０．０００１。
【図４】ＰＡＫ１は、樹立ＮＣＩ-Ｈ５２０．Ｘ１及びＥＢＣ-１扁平ＮＳＣＬＣ腫瘍の増殖に必要である。(Ａ)ＬａｃＺ、ＰＡＫ１、ＰＡＫ２又はＰＡＫ１＋ＰＡＫ２に対し誘発性ｓｈＲＮＡを発現するＮＣＩ-Ｈ５２０．Ｘ１細胞を、材料及び方法に記載のように胸腺欠損マウスの側腹部に移植した。各実験における処置を、腫瘍サイズが２００〜２５０ｍｍ３の範囲のときに開始した。飲料水による１ｍｇ／ｍＬのドキシサイクリンの投与は、ｓｈＰＡＫ１及びｓｈＰＡＫ１＋２ ＮＣＩ-Ｈ５２０．Ｘ１細胞を有するマウスの腫瘍増殖の阻害をもたらした。ＰＡＫ２-又はＬａｃＺ-特異的ｓｈＲＮＡの導入は腫瘍増殖キネティクスに影響しなかった。動物の体重減少は観察されなかった。データは処理グループあたり１０のマウスから成り、エラーバーは標準誤差を表す。腫瘍が２０００ｍｍ３の体積エンドポイントに達した時、個々のマウスをデータプロットから外した：ｓｈＬａｃＺ コントロールｎ＝５；ｓｈＬａｃＺ＋Ｄｏｘ ｎ＝３；ｓｈＰＡＫ１ コントロールｎ＝２；ｓｈＰＡＫ２ コントロールｎ＝５；ｓｈＰＡＫ２＋Ｄｏｘ ｎ＝２；ｓｈＰＡＫ１＋２ コントロールｎ＝５。(Ｂ)等しいサイズの腫瘍を有するマウスのグループにＰＡＫ１を阻害するためにドキシサイクリンを投与する前に、ｓｈＬａｃＺ又はｓｈＰＡＫ１を発現するＥＢＣ-１腫瘍を２００−２５０ｍｍ３まで成長させた。データは処理グループあたり１０のマウスから成り、エラーバーは標準誤差を表す。
【図５】ＰＡＫ１阻害はＮＦ-κＢ経路活性化を低下させ、ＩＡＰアンタゴニストと組み合わさりＮＳＣＬＣ細胞のアポトーシスを促進する。(Ａ)ＥＢＣ-１-ｓｈＰＡＫ１及び-ｓｈＬａｃＺ細胞をＢＶ６ ＩＡＰアンタゴニスト及び３００ｎｇ／ｍＬドキシサイクリン(Ｄｏｘ)で処理した。ＢＶ６の最高濃度は２０μＭであり、２倍段階希釈を１０ポイント希釈曲線において評価した。細胞を、３日間Ｄｏｘの存在下においてプレインキュベートした後、更に３日間ＢＶ６を添加した。次いで細胞培養物をCellTiterGlo生死判別アッセイによって分析した。データポイントを四つ組において実施した。(Ｂ)アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム(ＰＩ)染色についての蛍光活性化細胞ソーティング分析。ＥＢＣ-１-ｓｈＰＡＫ１細胞を３００ｎｇ／ｍＬのドキシサイクリン(Ｄｏｘ)の有無において７２時間培養し、５μＭのＢＶ６について更に２４時間培養した。次いでアネキシンＶ／ＰＩ染色及び蛍光活性化細胞ソーティング(ＦＡＣＳ)分析をアポトーシス／壊死を評価するために実施した。
【図６】(Ａ)ＸＩＡＰ発現の下方制御はＰＦ-３７５８３０９ ＰＡＫ小分子阻害物質のアポトーシス促進性活性を増強する(PAK SMI; p < 0.0001, Dunnettのt検定)。細胞を非標的コントロール(ＮＴＣ)又はＸＩＡＰ-特異的ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドで４８時間トランスフェクトした後、記載のようにＤＭＳＯ又はＰＡＫ ＳＭＩで更に７２時間処理した。細胞生存をＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイによって決定し、結果は３つの実験からの平均±標準偏差を表す。(Ｂ)ＸＩＡＰ及びＰＡＫ１の組合せアンタゴニズムはＰＡＲＰ及びカスパーゼ-３の効果的切断を促進する。ＸＩＡＰ ｓｉＲＮＡを処理の７２時間より前にＤＭＳＯ又は５ｍＭのＰＡＫ ＳＭＩでトランスフェクトした。
【図７】(Ａ)ＰＡＫ１及びＩＡＰアンタゴニズムによる切断ＰＡＲＰ及びカスパーゼ-３の組合せ蓄積。細胞を記載の時間点Ｄｏｘ及び５μＭでインキュベートし、溶解し、次いでウエスタンブロット分析に使用した。(Ｂ)二重ＰＡＫ１及びＩＡＰ阻害は、ＳＫ-ＭＥＳ-１(扁平サブタイプ)及びＮＣＩ-Ｈ４４１(腺癌サブタイプ)ＮＳＣＬＣ細胞の生存度において相乗的低下をもたらす。記載のＰＡＫ１の一過性ｓｉＲＮＡ-媒介阻害及び５μＭのＢＶ６処理後、細胞ＡＴＰ消費をＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏによって決定した。細胞生存度の阻害は、単剤よりＰＡＫ１ ｓｉＲＮＡ及びＢＶ６の組合せにおいて有意に大きかった(ｐ＜０．０００１，スチューデントのｔ検定)。
【図８】ＰＡＫ１の局所ゲノム増殖を有する乳癌細胞において、ＰＡＫ１阻害はカスパーゼ及びポリＡＤＰリボースポリメラーゼの切断を誘導する。(Ａ)ＰＡＫ１ノックダウンを導入するためにＨＣＣ-１５００細胞を個々又はプールｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド(１００ｎＭ)で一過性にトランスフェクトした。アポトーシス導入を、４８時間後に細胞溶解物を収集し、切断カスパーゼ-３、切断カスパーゼ-７及び切断ＰＡＲＰに対する抗体を使用してイムノブロットすることによってモニタした。(Ｂ)ＭＤＡ-ＭＢ-１３４ ＩＶ細胞におけるＰＡＫ１タンパク質発現のアブレーションはまた、ＭＥＫ１(Ｓｅｒ２９８)及びＥＲＫ１／２(Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４)リン酸化における低下と関連した。全タンパク質及びβ-アクチンをコントロールとして使用した。
【図９】組合せＰＡＫ１及びＩＡＰ阻害は、扁平ＮＳＣＬＣ細胞のアポトーシスをもたらす。(Ａ)アネキシンＶ-陽性細胞のパーセンテージを各処理条件について示す。(Ｂ)細胞アポトーシスマーカーが、記載の時間のＰＡＫ１及びＩＡＰアンタゴニスト処理の遺伝子破壊後、増加した。細胞溶解物をイムノブロッティングによって分析した。ＰＡＲＰ切断及びカスパーゼ−３／６／７／９活性は、組合せＤｏｘ及びＢＶ６処理によって劇的に上昇した。
【図１０】ＡＴＰ-競合パン-ＰＡＫ阻害物質ＰＦ-３７５８３０９(B.W. Murray等 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 2010 107(20):9446-9471及びＩＡＰ小分子アンタゴニストの組合せは、扁平ＮＳＣＬＣ細胞のアポトーシスをもたらす。(Ａ)ＰＦ-３７５８３０９処理によるＰＡＫ１の触媒阻害を、４日ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ生存度アッセイを使用してＥＢＣ-１細胞においてインビトロ組合せ効果についてＢＶ６を用いて試験した。相乗作用を算出するChou及びTalalay(Chou TC, Talalay P. Quantitative analysis of dose-effect relationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors. Adv. Enzyme Regul. 1984; 22:27-55)法を利用するプログラムCalcusynを使用し組合せインデックスを算出し、相乗作用のレベルを決定した。組合せインデックス(ＣＩ)値≦０．３によって示される強い相乗作用が観察された(ＣＩ＝０．１１３)。(Ｂ)記載した時間の５μＭのＰＡＫ阻害物質(ＰＡＫｉ)及び５μＭのＢＶ６の組合せは、細胞アポトーシスマーカーの劇的な誘導をもたらした。
【図１１】腫瘍細胞生存度に対するＰＡＫ１、ＰＡＫ２、ＭＥＫ及びＰＩ３Ｋ阻害物質の組合せ効果。細胞生存度のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ-Ｇｌｏ(登録商標)(ＣＴＧ)アッセイを、記載の通りＰＡＫ１及びＰＡＫ２ ｓｉＲＮＡトランスフェクション及び３日間の化合物処理後、実施した。ＧＤＣ-０６２３はＭＥＫ１及びＭＥＫ２の強力で高度に選択的な阻害物質である。ＧＤＣ-０９４１はクラスＩ ＰＩ３Ｋアイソフォームの強力な阻害物質であり、ＰＩ３Ｋの４つのクラスＩアイソフォームについて３−７５ｎＭの生化学ＩＣ５０値を有する。(Ａ)ＰＡＫ１及びＰＡＫ２ ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド、０．２μＭのＧＤＣ-０６２３及び０．５μＭのＧＤＣ-０９４１で処理されたＳＫＭＥＳ-１(ＫＲＡＳＮ８５Ｋ変異)肺癌細胞の生存度。(Ｂ)ＰＡＫ１及びＰＡＫ２ ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド、０．２μＭのＧＤＣ-０６２３及び０．４μＭのＧＤＣ-０９４１で処理されたＣａｌｕ-６(ＫＲＡＳＱ６１Ｋ変異)肺癌細胞の生存度。(Ｃ)ＰＡＫ１及びＰＡＫ２ ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド、２μＭのＧＤＣ-０６２３及び２．５μＭのＧＤＣ-０９４１で処理されたＣａｌ-１２０(ｂａｓａｌサブタイプ)乳癌細胞の生存度。
【図１２】ＮＳＣＬＣ細胞における組合せＰＡＫ１、ＰＡＫ２、ＭＥＫ及びＰＩ３Ｋ阻害後のアポトーシス及び増殖バイオマーカーの組合せ制御。ＳＫＭＥＳ-１(ＫＲＡＳＮ８５Ｋ変異)ＮＳＣＬＣ細胞をＰＡＫ１及びＰＡＫ２ ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド、０．４μＭ ＧＤＣ-０６２３及び１μＭ ＧＤＣ-０９４１で２４時間処理した。切断カスパーゼ−３及びポリＡＤＰリボースポリメラーゼ(ＰＡＲＰ)の蓄積、及びサイクリンＤ１タンパク質の低下は、ＭＥＫ及びＰＩ３Ｋ経路の阻害物質によるＰＡＫノックダウンの組合せによって増強された。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
「ａ」又は「ａｎ」実体なる表現は、ここで使用される場合、一又は複数のその実体を指し；例えば化合物(a compound)は一又は複数の化合物又は少なくとも一つの化合物を指す。このように、「ａ」(又は「ａｎ」)、「一又は複数の」、及び「少なくとも一つの」なる用語はここでは互換的に使用されうる。
【０００７】
本明細書中及び特許請求の範囲において用いられる「含む」、「含んでいる」、「包含する(include)」、「包含している」及び「包含する(includes)」なる用語は、述べられた形質、整数、成分又は工程の存在を特定することを意図するが、一又は複数の他の形質、整数、成分、工程、又はその群の存在又は付加を妨げない。
【０００８】
「処置する」および「処置」なる用語は、治療的処置の両方をいい、その目的は、望ましくない生理学的変化または障害、例えば、癌の増殖、発生または広がりを予防するかまたは遅くする(減らす)ことである。本発明の目的で、有利または望ましい臨床結果としては、検出可能であれ検出不可能であれ、症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患の安定化された(すなわち、悪化しない)状態、疾患の進行の遅延または減速、疾患状態の軽減または緩和、および寛解(部分的であれ全体的であれ)が含まれる。また、「処置」は、処置を受けない場合に予測される生存と比較される場合に、生存を延長することを意味し得る。処置を必要とするものとしては、その状態または障害をすでに有するもの、並びにその状態または障害を有しやすいもの、あるいはその状態または障害が予防されるべきであるものが含まれる。
【０００９】
「治療上の有効量」なる表現は、(ｉ)本明細書中に記載される特定の疾患、状態又は障害を処置するか、(ｉｉ)特定の疾患、状態または障害の一又は複数の症状を寛解、軽減または排除するか、あるいは(ｉｉｉ)特定の疾患、状態、または障害の一又は複数の症状の発生を予防または遅延させる、本発明の化合物の量を意味する。癌の場合、薬物の治療上の有効量は、癌細胞の数を減少させ得；腫瘍のサイズを減少させ得；周辺器官への癌細胞の浸潤を阻害し得(すなわち、ある程度まで遅くし得、そして好ましくは停止させ得)；腫瘍の転移を阻害し得(すなわち、ある程度まで遅くし得、そして好ましくは停止させ得)；腫瘍の増殖をある程度まで阻害し得；そして／または癌に関連する症状のうちの一又は複数をある程度まで緩和し得る。薬物が、存在する癌細胞の増殖を防止し得、そして／または殺傷し得る場合、この薬物は、細胞増殖抑制性および／または細胞障害性であり得る。癌治療のためには、効力は、例えば、疾患の進行までの時間(ＴＴＰ)を評価すること、および／または応答速度(ＲＲ)を決定することによって測定され得る。
【００１０】
本明細書中で用いる「相乗的」なる用語は、２以上の単一の薬剤の相加効果よりも効果が高い治療的併用を指す。ＰＡＫ１阻害物質及び第二抗過剰増殖剤間の相乗的相互作用の決定は、ここに記載のアッセイから得られる結果に基づきうる。この本発明によって提供される組合せは、いくつかのアッセイシステムで評価され、データは、抗癌薬間の相乗作用、相加作用および拮抗作用を定量化するために、標準的なプログラムを利用して分析されうる。好適に利用されるプログラムは、"New Avenues in Developmental Cancer Chemotherapy,"Academic Press, 1987, Chapter 2のChou and Talalayによって記述されるものである。０．８未満の併用インデックス値は相乗効果を示し、１．２を超える値は拮抗作用を示し、０．８〜１．２の値は相加効果を示す。併用療法は「相乗効果」を示してよく、「相乗的」である、つまり、共に用いる活性成分が別々の化合物を用いて得られる効果の合計よりも大きい場合に得られる効果である。相乗効果は、活性成分が：(１)同時に処方され、併用された単位投薬製剤として同時に投与又は送達されるか、(２)別個の製剤として交互に又は並列して送達されるか、又は(３)ある種の他の計画による場合に、達成することができる。交互療法で送達される場合、相乗効果は、化合物が、例えば別々のシリンジで異なった注射によって逐次的に投与されるか又は送達される場合に達成されうる。一般に、交互療法の間、各活性成分の有効用量は逐次的、つまり連続的に投与されるが、組合せ療法では有効量の２つ異常の活性成分は共に投与される。
【００１１】
「癌」及び「癌性」なる用語は、典型的に制御されない細胞増殖によって特徴付けられる哺乳動物の生理的な状態を指すか又は表す。「腫瘍」は一又は複数の癌性細胞を含む。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病またはリンパ悪性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。このような癌のより具体的な例としては、扁平上皮癌(例えば、上皮扁平上皮癌)、小細胞肺癌、非小細胞肺癌(「ＮＳＣＬＣ」)、肺の腺癌および肺の鱗状癌腫を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃癌(gastric or stomach)、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞種、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮の癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌または腎性癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝性癌腫、肛門癌腫、陰茎癌腫ならびに頭頸部癌が含まれる。
【００１２】
「癌腫(carcinoma)」なる用語は、形質転換した上皮細胞から成る浸潤性悪性腫瘍を指す。「扁平上皮癌(squamous cell carcinoma)」(ＳＣＣ)なる用語は、皮膚、唇、口、食道、膀胱、前立腺、肺、膣、及び子宮頸部を含む多くの異なる臓器において生じうる扁平上皮細胞に作用する癌腫のサブセットを指す。それは扁平上皮の悪性腫瘍である。
【００１３】
作用機構に関係なく、「化学療法剤」は癌の治療において有用な生物学的(大分子)又は化学(小分子)化合物である。化学療法剤の種類には、限定するものではないが、アルキル化剤(alkyating agent)、アンチメタボライ、紡錘体阻害剤植物アルカロイド、細胞障害性／抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害薬、タンパク質、抗体、光増感剤及びキナーゼ阻害薬が含まれる。化学療法剤は、「ターゲティング療法」と非ターゲティングの従来の化学療法において用いられる化合物を含む。
【００１４】
化学療法剤の例は、エルロチニブ(ＴＡＲＣＥＶＡ(登録商標), Genentech/OSI Pharm.)、ボルテゾミブ(ＶＥＬＣＡＤＥ(登録商標), Millennium Pharm.)、フルベストラント(ＦＡＳＬＯＤＥＸ(登録商標), AstraZeneca)、スニチブ(sunitib)(ＳＵＴＥＮＴ(登録商標), Pfizer/Sugen)、レトロゾール(ＦＥＭＡＲＡ(登録商標), Novartis)、メシル酸イマチニブ(ＧＬＥＥＶＥＣ(登録商標), Novartis)、フィナスネート(ＶＡＴＡＬＡＮＩＢ(登録商標), Novartis)、オキサリプラチン(ＥＬＯＸＡＴＩＮ(登録商標), Sanofi)、５-ＦＵ(５-フルオロウラシル)、ロイコボリン、ラパマイシン(Sirolimus, ＲＡＰＡＭＵＮＥ(登録商標), Wyeth)、ラパチニブ(ＴＹＫＥＲＢ(登録商標), GSK572016, Glaxo Smith Kline)、ロナファーミブ(Lonafamib)(SCH 66336)、ソラフェニブ(ＮＥＸＡＶＡＲ(登録商標), Bayer Labs)、ゲフィチニブ(ＩＲＥＳＳＡ(登録商標), AstraZeneca)、ＡＧ１４７８、アルキル化剤、例えばチオテパ及びＣＹＴＯＸＡＮ(登録商標)シクロスホスファミド(cyclosphosphamide)；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(acetogenins)(特にブラタシン(bullatacin)及びブラタシノン(bullatacinone))；カンプトセシン(合成類似体トポテカン(topotecan)を含む)；ブリオスタチン；カリスタチン(callystatin)；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)及びバイゼレシン(bizelesin)合成類似体を含む)；クリプトフィシン(cryptophycin)(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン(dolastatin)；デュオカルマイシン(duocarmycin )(合成類似体、ＫＷ-２１８９及びＣＢＩ-ＴＭ１を含む)； エレトロビン(eleutherobin)；パンクラチスタチン(pancratistatin)；サルコディクチン(sarcodictyin)；スポンジスタチン(spongistatin)；クロランブシル、クロルマファジン(chlomaphazine)、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、ラニムスチン；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１、例えば、Agnew  Chem Intl. Ed. Engl., 33：183-186(1994)を参照のこと；ダイネミシン(dynemicin)、ダイネミシンＡ(dynemicinＡ)を含む；クロドロネート(clodronate)などのビスホスホネート(bisphosphonates)；エスペラマイシン(esperamicin)； 同様にネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン(enediyne) 抗生物質発光団)、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カミノマイシン(caminomycin)、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ(登録商標)(ドキソルビシン)、モルフォリノ-ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin)、イダルビシン、マセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン(mitomycins)、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)のような抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル(eniluracil)；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォミチン(elfomithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン(ansamitocin)のようなメイタンシノイド(maytansinoid)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダムノール(mopidamnol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖類複合体(JHS Natural Products)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフラン(sizofuran)；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特にＴ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリデンＡ(roridin A)及びアングイデン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ａｒａ-Ｃ」)；シクロホスファミド；チ���テパ；タキソイド、例えばＴＡＸＯＬ(パクリタキセル; Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)、ＡＢＲＡＸＡＮＥ(登録商標)(Cremophor-free)、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Ill.)、及びＴＡＸＯＴＥＲＥ(登録商標)(ドセタキセル、ドキセタキセル(doxetaxel);Sanofi-Aventis)；クロラムブシル；ＧＥＭＺＡＲ(登録商標)(ゲムシタビン)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；エトポシド(ＶＰ-１６)；ミトキサントン；ビンクリスチン；ビノレルビン(ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ(登録商標))；ナベルビン(Navelbine)；ノバントロン(novantrone)；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；カペシタビン(ＸＥＬＯＤＡ(登録商標))；イバンドロナート(ibandronate)；ＣＰＴ-１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド類；並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類及び誘導体が含まれる。
【００１５】
また、「化学療法剤」の定義には、(i) 腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、抗エストロゲン及び選択的エストロゲンレセプターモジュレーター(ＳＥＲＭ)など、例えばタモキシフェン(ＮＯＬＶＡＤＥＸ(登録商標)タモキシフェンクエン酸塩を含む)、ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びＦＡＲＥＳＴＯＮ(登録商標)(クエン酸トレミフェン)；(ii) アロマターゼ酵素を阻害するアロマターゼ阻害物質、それらは副腎でのエストロゲン産生を調節するものであり、例えば４(５)-イミダゾール類、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ(登録商標)(メゲストロールアセテート)、ＡＲＯＭＡＳＩＮ(登録商標)(エキセメスタン, Pfizer)、ホルメスタイン(formestanie)、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ(登録商標)(ゾロゾール(vorozole))、ＦＥＭＡＲＡ(登録商標)(レトロゾール, Novartis)及びＡＲＩＭＩＤＥＸ(登録商標)(アナストロゾール, AstraZeneca)；(iii) 抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びにトロキサシタビン(troxacitabine)(１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；(iv) プロテインキナーゼインヒビター；(v) 脂質キナーゼインヒビター；(vi) アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に不粘着性細胞増殖に関係するシグナル伝達経路の遺伝子の発現を抑制するもの、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｆ及びＨ-Ｒａｓ；(vii) リボザイム、例えばＶＥＧＦ発現インヒビター(例えばＡＮＧＩＯＺＹＭＥ(登録商標))及びＨＥＲ２発現インヒビター；(viii) 遺伝子治療ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ(登録商標)、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ(登録商標)及びＶＡＸＩＤ(登録商標)などのワクチン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ(登録商標)ｒＩＬ-２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ(登録商標)などのトポイソメラーゼ１インヒビター；ＡＢＡＲＥＬＩＸ(登録商標)ｒｍＲＨ；(ix) ベバシズマブ(ＡＶＡＳＴＩＮ(登録商標), Genentech)などの抗血管形成剤；及び(x)上記のものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【００１６】
また、「化学療法剤」の定義には、治療的抗体、例として、アレムツズマブ(Ｃａｍｐａｔｈ)、ベバシズマブ(アバスチン(登録商標), Genentech)；セツキシマブ(ＥＲＢＩＴＵＸ(登録商標), Imclone)；パニツムマブ(ＶＥＣＴＩＢＩＸ(登録商標), Amgen)、リツキシマブ(ＲＩＴＵＸＡＮ(登録商標), Genentech/Biogen Idec)、ペルツズマブ(ＯＭＮＩＴＡＲＧ(登録商標), ２Ｃ４, Genentech)、トラスツズマブ(ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ(登録商標), Genentech)、及びトシツモマブ(Bexxar, Corixia)が含まれる。
【００１７】
発明のＰＩ３Ｋ阻害物質と組み合わされる化学療法剤としての治療的能力を有するヒト化モノクローナル抗体には、アレムツズマブ、アポリズマブ、アセリズマブ、アトリズマブ、バピネオズマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ・メルタンシン、カンツズマブ・メルタンシン、セデリズマブ、セルトリズマブ・ペゴール、シドフシツズマブ、シドツズマブ、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エピラツズマブ、エルリズマブ、フェルビズマブ、フォントリズマブ、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、イノツズマブ・オゾガマイシン、イピリムマブ、ラベツズマブ、リンツズマブ、マツズマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、モトビズマブ、ナタリズマブ、ニモツズマブ、ノロビズマブ、ヌマビズマブ、オクレリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パスコリズマブ、ペクフシツズマブ、ペクツズマブ、パーツズマブ、パキセリズマブ、ラリビズマブ、ラニビズマブ、レスリビズマブ、レスリズマブ、レシビズマブ、ロベリズマブ、ルプリズマブ、シブロツズマブ、シプリズマブ、ソンツズマブ、タカツズマブ・テトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、テフィバズマブ、トシリズマブ、トラリズマブ、トラスツズマブ、ツコツズマブ・セルモロイキン、ツクシツズマブ、ウマビズマブ、ウルトキサズマブおよびビシリズマブが含まれる。
【００１８】
次の省略を本出願において使用する：ＤＣＩＳ(腺管癌インサイツ)、ＳＣＬＣ(小細胞肺癌)、ＮＳＣＬＣ(非小細胞肺癌)；ＳＣＣ(扁平上皮癌)。
【００１９】
ＰＡＫは、ヒト癌細胞において一般的に制御解除された多くの経路に関与する。ＰＡＫ１はマイトジェン活性化プロテインキナーゼ(ＭＡＰＫ)、ＪＵＮ Ｎ-末端キナーゼ(ＪＮＫ)、ステロイドホルモン受容体、及び核内因子κβ(ＮＦκβ)シグナル伝達経路の要素であり、全て発癌に関与してきた。ＰＡＫはＭＥＫ及びＲＡＦ１をそれぞれセリン２９８及びセリン３３８においてそれらをリン酸化することによって活性化する。ＰＡＫ１によるＲａｓ誘発形質転換の増加は、細胞外シグナル制御キナーゼ(ＥＲＫ)-ＭＡＰＫ経路を通したシグナル伝達へのその効果と相関し、ＪＮＫ又はｐ３８-ＭＡＰＫ経路への効果と分離可能だった。(R. Kumar等Nature Rev. Cancer 2006 6:459)ＥＲＫ／ＭＥＫ経路の構成的活性化は腫瘍の形成、進行及び生存に関わり、更に無秩序な増殖、アポトーシスの制御の喪失及び予後不良を特徴とする攻撃的表現型に関連する。(J.A.Spicer, Expert Opin.Drug Discov.2008 3:7)
【００２０】
腫瘍形成及び進行は、癌細胞におけるアポトーシス促進性シグナルの不活性化を必要とする。ＰＡＫ活性は幾つかの重要なアポトーシス促進性経路を下方制御することが示されている。ＲＡＦ１のＰＡＫ１リン酸化はミトコンドリアへのＲＡＦ１トランスロケーションを誘導し、そこでそれはアポトーシス促進タンパク質細胞死のＢＣＬ２-アンタゴニスト(ＢＡＤ)をリン酸化する。ＰＡＫ１、ＰＡＫ２、ＰＡＫ４及びＰＡＫ５はまた、ＣＶ-１(シグマ)由来ＳＶ４０保有(ＣＯＳ)腎臓、チャイニーズハムスター(ＣＨＯ)及びヒト胎児由来腎臓(ＨＥＫ)２９３Ｔ細胞等の選ばれた細胞タイプにおいてＢＡＤを直接リン酸化し不活性化することが報告されている。(R. Kumar等, supra)しかしながら、ヒト腫瘍細胞におけるＰＡＫ１下流の関連経路は部分的にのみ理解されたままである。
【００２１】
ＰＡＫ１は様々な正常組織において広く発現される；しかしながら、発現は卵巣、乳房及び膀胱癌において著しく増加される。(S. Balasenthil等, J. Biol.Chem.2004 279:4743; M. Ito等, J. Urol.2007 178:1073; P. Schraml等, Am. J. Pathol.2003 163:985)ｌｕｍｉｎａｌ乳癌では、ＰＡＫ１のゲノム増幅はタモキシフェン治療への耐性と関連し、おそらくPAK1によるエストロゲン受容体の直接リン酸化及びリガンド非依存トランス活性化の結果として生じる。(S. K. Rayala等, Cancer Res. 2006. 66:1694-1701)ＰＡＫ１は、過剰増殖障害の治療における使用に効果的な治療剤の開発のための魅力的な標的である。(R Kumar等supra)
【００２２】
増殖実験−ＰＡＫ１ゲノムコピー数及び遺伝子発現を乳房、肺及び頭頸部腫瘍の大規模パネルについて決定した。ＰＡＫ１ゲノム増幅はｌｕｍｉｎａｌ乳癌に蔓延し、ＰＡＫ１タンパク質発現はリンパ節浸潤及び転移に関連する。  
【００２３】
コピー数ゲインをを有する幾つかのゲノム領域が比較ゲノムハイブリダイゼーションアプローチによって乳癌において同定されている(J. Climent等, Biochem. Cell Biol. 2007 85:497-508; E.H. van Beers and P. M. Nederlof, Breast Cancer Res. 2006 8:210)。ＤＮＡコピー数に関する５１の乳房腫瘍のアッセイは高分解能一塩基多型(ＳＮＰ)アッセイを使用して変化し、Genomic Identification of Significant Targets in Cancer (GISTIC)法(P. M. Haverty等, Genes Chromosomes Cancer 2008 47:530-542. 21; R. Beroukhim等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2007 104:20007-20012.を使用してデータを分析した。染色体11領域の増幅を図1Aに示す。２つの異なるGISTICピークが69及び76Mbに観察され、11q13.5領域が２つの独立アンプリコンを有することを示唆する。６９-ＭｂピークはＣＣＮＤ１の増幅に対応し、乳癌において非常によく説明されたゲノム変化である。(C. Dickson,等, Cancer Lett. 1995 90:43-50)  76-MbのプラトーはPAK1遺伝子を有する(点線として示す)。ＰＡＫ１増幅の度数はこの腫瘍パネルにおいて１７％(コピー数?２．５)であり、コピー数ゲインはｍＲＮＡ発現と良く相関した(ピアソン相関＝０．７５；図１Ｂ)。類似な結果がまた大規模パネル（ｎ＝１６５）の乳房腫瘍において得られ、高分解能ＳＮＰ分析によってゲノム増幅についてまた分析した。ＰＡＫ１遺伝子増幅はまん延し、平均ＤＮＡコピー数はｌｕｍｉｎａｌホルモン受容体陽性腫瘍において最も多く(７．７平均コピー数)、ｂａｓａｌ乳房腫瘍において最も少なかった(２．８平均コピー数)。(Z. Kan等, Nature 2010 466:869-873)  これらの実験は、ＰＡＫ１が染色体１１の７６-Ｍｂアンプリコンにおいて腫瘍促進性「駆動」遺伝子でありうることを示唆する。ＰＡＫ１発現は正常乳房上皮細胞に不在であるが、一次乳腺癌の３９％の悪性細胞において検出された。
【００２４】
ＰＡＫ１タンパク質発現レベル及び細胞内局在を、組織マイクロアレイの免疫組織化学(ＩＨＣ)染色によって確認した。並行して、ＰＡＫ１抗体の強固で選択的なＩＨＣ反応性を、これらの細胞からのタンパク質抽出物の免疫ブロット分析により癌細胞株において確認した。２２６の一次乳癌、１５のＤＣＩＳ、３２の乳癌リンパ節転移、９７のＮＳＣＬＣ、２７のＳＣＬＣ及び１３０の頭頸部扁平上皮癌についてのＰＡＫ１タンパク質発現を表１にまとめた。ＰＡＫ１染色強度は、細胞質及び／又は核において無又は低染色から非常に強い染色まで腫瘍組織間で異なった。
【００２５】
ＲＮＡを８８の一次乳癌試料から精製し、細胞質ＰＡＫ１ ＩＨＣ染色は増加ｍＲＮＡ発現と相関した。これらのデータはＰＡＫ１発現が乳癌において広範に上方制御され、高発現が疾患攻撃性と相関することを示す。
【００２６】
強い核及び細胞質ＰＡＫ１発現は扁平非小細胞肺においても蔓延し、選択的ＰＡＫ１阻害はインビトロ及びインビボにおける遅延細胞周期と相関した。
【００２７】
ＰＡＫ１タンパク質の発現を２７のＳＣＬＣ及び９７のＮＳＣＬＣの組織マイクロアレイにおいて分析し、後者は３０の腺癌及び６７のＳＣＣから成った。４３／６７(６４％)扁平ＮＳＣＬＣサンプルはＰＡＫ１発現について陽性であり、全ケースの５２％は悪性細胞において中程度(２＋)又は強の(３＋)強度の染色を示した。ＰＡＫ１の核局在化はまた、有意な割合の扁平ＮＳＣＬＣ腫瘍において明らかだった(１７／６７；２５％)。扁平上皮癌とは対照的に、ＮＳＣＬＣ腺癌(ｐ＝０．０００８)及びＳＣＬＣ(ｐ＝０．００３)腫瘍は、細胞質のみにおいて弱〜中程度レベルのみのＰＡＫ１を発現した。隣接する正常肺組織ははっきりと確認できるレベルのＰＡＫ１を発現しなかった。上昇ＰＡＫ１発現は、頭頸部腫瘍、扁平上皮癌の他の徴候においても蔓延した(７９／１３０；６１％)。
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頭頸部腫瘍において、上昇ＰＡＫ１発現は、頭頸部腫瘍、扁平上皮癌の他の徴候においても蔓延した(７９／１３０；６１％)(表１)。
【００２８】
扁平ＮＳＣＬＣの前臨床腫瘍モデルにおけるＰＡＫ１阻害の抗腫瘍効果-ＮＣＩ-Ｈ５２０．Ｘ１及びＥＢＣ-１異種移植片モデルにおけるｓｈＲＮＡを使用したＰＡＫ１発現の阻害は腫瘍増殖の有意な阻害をもたらした(図４Ａ及びＢ)。腫瘍確立後(２００−２５０ｍｍ３)、動物にスクロース飲料水中においてＤｏｘを投与し、腫瘍増殖を２１−２４日間モニタした。ＮＣＩ-Ｈ５２０．Ｘ１腫瘍保有動物では、ＰＡＫ２ではなくＰＡＫ１の阻害がコントロールｓｈＬａｃＺマウスと比較して腫瘍増殖を有意に減少させ、投与の最終日に測定された(Ｄｕｎｎｅｔｔのｔ検定，ｐ＜０．０００１；図４Ａ)。ＰＡＫ１及びＰＡＫ２の組合せノックダウンは、ＰＡＫ１阻害単独のものに匹敵する腫瘍増殖の阻害をもたらした(それぞれ６３．７％及び５９．７％)。等しい結果がＥＢＣ-１腫瘍異種移植片を使用して得られ、腫瘍増殖の６６．８％阻害がＰＡＫ１のインビボノックダウン後に観察された(図４Ｂ)。最後に、異種移植片モデル双方の腫瘍進行データを、腫瘍サイズが治療の開始から２倍になるのに必要な時間分析した。この計量では、ＰＡＫ１阻害はまたほかのコホートと比較して有意な抗腫瘍効果をもたらした(ｐ＜０．０００１)。Ｄｏｘ治療は良好な耐容性を示し、どの動物も明らかな体重減少を示さなかった。免疫組織化学による異種移植片腫瘍の分析は、ｓｈＬａｃＺコントロールと比較してｓｈＰＡＫ１を発現するＤｏｘ処置腫瘍において、Ｋｉ-６７陽性腫瘍細胞において有意な低下を示した。Ｋｉ-６７陽性核の割合を定量化し、インビボでのＰＡＫ１ノックダウンの抗増殖効果は統計的に有意であると示された(p<0.01;NCI-H520.X1 shLacZ 69±6%;NCI-H520.X1 shPAK1 50±4%;EBC-1 shLacZ 91±3%;EBC-1 shPAK1 75±11%)。ＰＡＫ１及びＰＡＫ２はＤｏｘ処置腫瘍において８０％超低減され、ＰＡＫ１ノックダウンは示唆されたように低下ＡＫＴ活性化と関連しなかった。(T.C. Hallstrom and J.R. Nevins, Cell Cycle 2009 8:532-535.)
【００２９】
ＰＡＫ１ゲノムコピー数ゲインを伴う細胞株の分析は、細胞生存についてＰＡＫ１発現及び活性への依存を示した。ＲｈｏファミリーＧＴＰａｓｅによってＰＡＫ１-３活性化を防止するＩＰＡ-３、アロステリック阻害物質を使用したＰＡＫ１触媒活性の阻害は(J. Viaud, J. and J.R. Peterson, Mol. Cancer Ther. 2009 8:2559-2565)、アポトーシスの明白な誘発をもたらし、死細胞のアネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム染色について蛍光活性化細胞ソーティング分析によって決定された(７倍増加；図１Ｄ)。この表現型は２４−４８時間内で明瞭であり、ＰＡＫ１発現の選択ｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンを使用して確認された(アネキシンＶ取込みにおける２−６倍増加；図１Ｃ)。ＰＡＫ１阻害によって誘発される細胞死はまた、カスパーゼ活性化、ＰＡＲＰ切断及びＭＥＫ１-Ｓ２９８及びＥＲＫ１／２の減衰リン酸化と関連した(図８)。このように、ＰＡＫ１増幅を伴う乳癌細胞におけるＰＡＫ１阻害から生じる細胞死の強い導入は、このキナーゼが少なくとも一部では腫瘍細胞アポトーシスを抑制することによって発癌性表現型に寄与することを示唆する。  
【００３０】
ＰＡＫ１への依存は、それが乳癌のサブポピュレーションについて「弱点」でありうることを示唆し、癌遺伝子依存性のエビデンス(I.B. Weinstein and A. Joe, Cancer Res. 2008 68:3077-3080)及びこの疾患徴候におけるＰＡＫ１標的治療の根拠を提供する。
【００３１】
５０％を超える扁平非小細胞肺癌及び頭頸部扁平上皮癌におけるＰＡＫ１の異常細胞質発現は、それらがまた持続増殖及び生存についてＰＡＫ１発現に依存しうることを更に示唆する。
【００３２】
現在では、扁平ＮＳＣＬＣにおける更なる既知の遺伝子異常は、変異又はメチル化によるｐ５３、ｐ１６Ｉｎｋ４ａ、ＰＴＥＮ及びＬＫＢ１機能喪失、及びＥＧＦＲ、ＭＥＴ、ＨＥＲ２及びＰＩＫ３ＣＡなどのプロテインキナーゼの変異又は増幅活性化を含む。(R.S. Herbst等, N. Engl. J. Med. 2008 359:1367-1380) 従って、ＰＡＫ１を過剰増幅又は過剰発現する腫瘍細胞における抗腫瘍効果及び腫瘍細胞死を増加するために、ＰＡＫ１酵素活性又はスカフォールド機能の阻害は、これらのクリティカルな増殖及び生存経路を標的にする治療剤と相乗的に組合せられうる。このような腫瘍細胞は、限定するものではないが、ＤＣＩＳ、扁平ＮＳＣＬＣ及び頭頸部ＳＣＣを含む。  
【００３３】
ＰＡＫキナーゼの阻害物質が記載されている。(D. Bouzida等７／１３／２００６に公開のＷＯ２００６０７２８３１；C. Guo等,３／１／２００７に公開のＷＯ２００７０２３３８２、L. Dong等，６／３０／２００７に公開のＷＯ２００７０７２１５３；D. Campbell等，６／２４／２０１０に公開のＷＯ２０１０／０７１８４６;K. Daly等，１１／５／２００９に公開のＵＳ２００９０２７５５７０)。
【００３４】
ｓｈＲＮＡ誘発ＰＡＫ１ノックダウンと分子標的治療との組合せはＮＳＣＬＣ細胞のアポトーシスを誘発する-小分子ライブラリーをＰＡＫ１アンタゴニスト及び他の抗過剰増殖剤間の強力な相乗相互作用を同定するためにスクリーニングした(表１)。
【００３５】
細胞生存度スクリーニングを、ＥＢＣ-１-ｓｈＰＡＫ１同質遺伝子細胞、及び食品医薬品局(ＦＤＡ)承認オンコロジー薬物、シグナル伝達経路阻害物質及びＤＮＡ傷害剤を含む２００の小分子化合物のパネルを使用して実施した。試験化合物の中で、アポトーシスタンパク質の阻害物質のアンタゴニスト(ＩＡＰ；１２及び５７-倍)、上皮増殖因子受容体(ＥＧＦＲ；２．９、７．４、１２．８及び１５-倍)、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ-１／２(ＭＥＫ１／２；８．５-倍)及びＳｒｃファミリーキナーゼ(５．４-倍)が、ＰＦ-３７５８３０９との組合せにおいて劇的な増強効果を示した(表１)。これらの薬剤の何れも、ＰＡＫ１阻害の不在においては、ＥＢＣ-１細胞の増殖及び生存に強い単剤効果を示さなかった(ＥＣ５０＞６μＭ)。このように、ＰＡＫ１阻害は、幾つかのクラスのよく特徴付けられた分子標的治療の効果を大いに増大できる。
【００３６】
ＭＥＫキナーゼの阻害物質(S. Price, Expert Opin.Ther.Patents 2008 18(6):603-626; E. M. Wallace等, Curr.Topics Med.Chem.2005 5(2):215), Akt (C. Lindsley, Curr.Top.Med.Chem.2010 10:458-477; S.E.Ghayad and P.A.Cohen, Rec.Pat.Anti-Cancer Drug Discov.2010 5:29-57), Src (X.Cao等, Mini-Rev. Med.Chem.2008 8:1053-1063) and Inibitor of Apoptosis Proteins (IAP) (D. Vucic and W.J.Fairbrother, Clin.Cancer Res.2007 13(20)5995; A.D.Schimmer and S. Dalili, Hematology 2005 215)が総説されている。
【００３７】
ＩＡＰタンパク質の生存促進性活性は、カスパーゼの第二ミトコンドリアアクチベーター(ＳＭＡＣ)(C. Du等, Cell 2000 102:33-42; A.M. Verhagen,等,. Cell 2000 102:43-53)によってアンタゴナイズされ、多くのアンタゴニストが記載されており、ＳＭＡＣアミノ末端ペプチドを模倣しＩＡＰとＳＭＡＣ及び活性化カスパーゼ-９との関連を破壊する( K. Zobel等, ACS Chem. Biol. 2006 1:525-533; E. Varfolomeev等, Cell 2007 131:669-681)。特に、ＢＶ６(C. Ndubaku等, Future Med. Chem.  2009 1(8):1509)は、バキュロウイルスＩＡＰリピート(BIR)ドメインに結合するこのようなクラスの小分子アンタゴニストの一つを代表し、ｃ-ＩＡＰ１及びｃＩＡＰ-２の急速な自己ユビキチン化及びプロテアソーム分解を促進する(Zobel supra)。小分子スクリーニングデータと一致して、強い組合せ活性を、ＥＢＣ-１細胞におけるＰＡＫ１及びＩＡＰの二重阻害について確認した。コントロール(ＥＣ５０＝３．０ｘ１０−３μＭ)と比較した、Ｄｏｘ(ＥＣ５０＝４．１ｘ１０−７  μＭ)で共処理された場合のＥＢＣ-１-ｓｈＰＡＫ１細胞へのＢＶ６効力における劇的な増加は、アネキシン-Ｖフローサイトメトリーアッセイ(図５Ｂ)及び切断カスパーゼ-３、６、７及び９のイムノブロッティング(図９)によって決定される細胞アポトーシスの強い誘発に反映される。重要なことには、増強された細胞殺傷のエビデンスはまた、ＰＡＫ(IPA-3, PF-3758309)又はＲａｃ１(ＮＳＣ２３７６６)触媒活性の薬理学的阻害物質を使用して観察された。この明瞭な相乗作用を更に探索するために、我々はアポトーシスの誘導に対するＰＡＫ１及びＩＡＰ阻害のありうる分子メカニズムを調査した。組合せＰＡＫ１及びＩＡＰ阻害は、ＢＶ６によって誘発されるＩＡＰタンパク質分解の改変キネティックス又はＴＮＦαによる増加された自己分泌シグナル伝達を含まなかった。最後に、更なるＮＳＣＬＣ細胞株を、どちらかの単剤の活性に最小限のみ関与するものを含め、ＰＡＫ１及びＩＡＰの組合せ阻害から生じる抗腫瘍効果について調査した。ＰＡＫ１発現の一過性ｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンと、その後のＢＶ６処置は、ＳＫ-ＭＥＳ-１及びＮＣＩ−Ｈ４４１細胞生存度の有意な低下をもたらした(図７Ｂ)。
【００３８】
ＭＥＫ(ＧＤＣ-０６２３)及びＰＩ３Ｋ(ＧＤＣ-０９４１； A.J. Folkes等, J. Med. Chem. 2008 57:5522-5532)経路の阻害によるＰＡＫ１及びＰＡＫ２の組合せ阻害も調査した。低減された細胞生存度(図１１)及びアポトーシスバイオマーカーの誘導(図１２)によって決定される組合せ効果を、ＰＡＫ、ＭＥＫ及びＰＩ３Ｋシグナル伝達の阻害後に観察した。まとめると、これらの研究は、乳房及びＮＳＣＬＣがＰＡＫ１阻害物質を伴う合理的組合せ療法に関して幾つかの機会を提供しうる強い前臨床サポートを提供する。本発明の一実施態様では、腫瘍を治療する方法であって、腫瘍をＰＡＫ１阻害物質及び第二抗過剰増殖化合物と接触させる工程を含んでなる方法が提供される。
【００３９】
本発明の別の実施態様では、腫瘍を治療する方法であって、腫瘍をＰＡＫ１阻害物質及びＥＧＦＲ、Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路、Ｓｒｃ、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路又はアポトーシスタンパク質の阻害物質の阻害物質又はアンタゴニストと接触させることを含んでなる方法が提供される。
【００４０】
本発明の別の実施態様では、腫瘍を治療する方法であって、前記腫瘍が上昇レベルのＰＡＫ１を呈し、腫瘍をＰＡＫ１阻害物質及び第二抗過剰増殖化合物と接触させる工程を含んでなる方法が提供される。
【００４１】
本発明の別の実施態様では、腫瘍を治療する方法であって、前記腫瘍が上昇レベルのＰＡＫ１を呈し、腫瘍をＰＡＫ１阻害物質及びＥＧＦＲ、Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路、Ｓｒｃ、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路又はアポトーシスタンパク質の阻害物質の阻害物質又はアンタゴニストと接触させることを含んでなる方法が提供される。
【００４２】
本発明の一実施態様では、腫瘍を治療する方法であって、前記腫瘍が乳房腫瘍、扁平非小細胞肺腫瘍又は扁平頭頸部腫瘍であり、腫瘍をＰＡＫ１阻害物質及び第二抗過剰増殖化合物と接触させる工程を含んでなる方法が提供される。
【００４３】
本発明の別の実施態様では、腫瘍を治療する方法であって、前記腫瘍が乳房腫瘍、扁平非小細胞肺腫瘍又は扁平頭頸部腫瘍であり、腫瘍をＰＡＫ１阻害物質及びＥＧＦＲ、Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路、Ｓｒｃ、Ａｋｔ又はアポトーシスタンパク質の阻害物質の阻害物質又はアンタゴニストと接触させる工程を含んでなる方法が提供される。
【００４４】
本発明の別の実施態様では、腫瘍を治療する方法であって、前記腫瘍が上昇レベルのＰＡＫ１を呈する乳房腫瘍、扁平非小細胞肺腫瘍又は扁平頭頸部腫瘍であり、腫瘍をＰＡＫ１阻害物質及び第二抗過剰増殖化合物と接触させる工程を含んでなる方法が提供される。
【００４５】
本発明の別の実施態様では、腫瘍を治療する方法であって、前記腫瘍が上昇レベルのＰＡＫ１を呈する乳房腫瘍、扁平非小細胞肺腫瘍又は扁平頭頸部腫瘍であり、腫瘍をＰＡＫ１阻害物質及びＥＧＦＲ、Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路、Ｓｒｃ、Ａｋｔ又はアポトーシスタンパク質の阻害物質の阻害物質又はアンタゴニストと接触させる工程を含んでなる方法が提供される。
2013542965.tif 000003
【００４６】
本発明の一実施態様では、腫瘍を治療する方法であって、腫瘍を式Ｉの化合物(ＰＦ-３７５８３０９)及び第二抗過剰増殖化合物と接触させる工程を含んでなる方法が提供される。
【００４７】
本発明の別の実施態様では、腫瘍を治療する方法であって、腫瘍を式Ｉの化合物及びＥＧＦＲ、Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路、Ｓｒｃ、Ａｋｔ又はアポトーシスタンパク質の阻害物質の阻害物質又はアンタゴニストと接触させることを含んでなる方法が提供される。
【００４８】
本発明の別の実施態様では、腫瘍を治療する方法であって、前記腫瘍が上昇レベルのＰＡＫ１を呈し、腫瘍を式Ｉの化合物及び第二抗過剰増殖化合物と接触させる工程を含んでなる方法が提供される。
【００４９】
本発明の別の実施態様では、腫瘍を治療する方法であって、前記腫瘍が上昇レベルのＰＡＫ１を呈し、腫瘍を式Ｉの化合物及びＥＧＦＲ、Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路、Ｓｒｃ、Ａｋｔ又はアポトーシスタンパク質の阻害物質の阻害物質又はアンタゴニストと接触させることを含んでなる方法が提供される。
【００５０】
本発明の別の実施態様では、腫瘍を治療する方法であって、前記腫瘍が上昇レベルのＰＡＫ１を呈する乳房腫瘍、扁平非小細胞肺腫瘍又は扁平頭頸部腫瘍であり、腫瘍を式Ｉの化合物及び第二抗過剰増殖化合物と接触させる工程を含んでなる方法が提供される。
【００５１】
本発明の別の実施態様では、腫瘍を治療する方法であって、前記腫瘍が上昇レベルのＰＡＫ１を呈する乳房腫瘍、扁平非小細胞肺腫瘍又は扁平頭頸部腫瘍であり、腫瘍を式Ｉの化合物及びＥＧＦＲ、Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路、Ｓｒｃ、Ａｋｔ又はアポトーシスタンパク質の阻害物質の阻害物質又はアンタゴニストと接触させる工程を含んでなる方法が提供される。
【００５２】
本発明の一実施態様では、腫瘍を治療する方法であって、腫瘍を式Ｉの化合物及びアポトーシスタンパク質の阻害物質の阻害物質と接触させる工程を含んでなる方法が提供される。
【００５３】
本発明の別の実施態様では、腫瘍を治療する方法であって、前記腫瘍が上昇レベルのＰＡＫ１を呈し、腫瘍を式Ｉの化合物及びアポトーシスタンパク質の阻害物質の阻害物質と接触させる工程を含んでなる方法が提供される。
【００５４】
本発明の一実施態様では、腫瘍を治療する方法であって、腫瘍を式Ｉの化合物及びＢＶ６又はＧ２４４１６と接触させる工程を含んでなる方法が提供される。
【００５５】
本発明の別の実施態様では、腫瘍を治療する方法であって、前記腫瘍が上昇レベルのＰＡＫ１を呈し、腫瘍を式Ｉの化合物及びＢＶ６又はＧ２４４１６と接触させる工程を含んでなる方法が提供される。
【００５６】
本発明の一実施態様では、腫瘍を治療する方法であって、腫瘍を式Ｉの化合物及びＥＧＦＲ阻害物質アンタゴニストと接触させる工程を含んでなる方法が提供される。
【００５７】
本発明の別の実施態様では、腫瘍を治療する方法であって、前記腫瘍が上昇レベルのＰＡＫ１を呈し、腫瘍を式Ｉの化合物及びＥＧＦＲ阻害物質又はアンタゴニストと接触させる工程を含んでなる方法が提供される。
【００５８】
本発明の一実施態様では、腫瘍を治療する方法であって、腫瘍を式Ｉの化合物及びエルロチニブ、ゲフィチニブ又はラパチニブと接触させる工程を含んでなる方法が提供される。
【００５９】
本発明の別の実施態様では、腫瘍を治療する方法であって、前記腫瘍が上昇レベルのＰＡＫ１を呈し、腫瘍を式Ｉの化合物及びエルロチニブ、ゲフィチニブ又はラパチニブと接触させる工程を含んでなる方法が提供される。
【００６０】
本発明の一実施態様では、腫瘍を治療する方法であって、腫瘍を式Ｉの化合物及びＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／Ｅｒｋシグナル伝達カスケードの阻害物質と接触させる工程を含んでなる方法が提供される。
【００６１】
本発明の別の実施態様では、腫瘍を治療する方法であって、前記腫瘍が上昇レベルのＰＡＫ１を呈し、腫瘍を式Ｉの化合物及びＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／Ｅｒｋシグナル伝達カスケードの阻害物質と接触させる工程を含んでなる方法が提供される。
【００６２】
本発明の一実施態様では、腫瘍を治療する方法であって、腫瘍を式Ｉの化合物及びＡｋｔキナーゼの阻害物質と接触させる工程を含んでなる方法が提供される。
【００６３】
本発明の別の実施態様では、腫瘍を治療する方法であって、前記腫瘍が上昇レベルのＰＡＫ１を呈し、腫瘍を式Ｉの化合物及びＡｋｔキナーゼの阻害物質と接触させる工程を含んでなる方法が提供される。
【００６４】
本発明の一実施態様では、腫瘍を治療する方法であって、腫瘍を式Ｉの化合物及びＳｒｃキナーゼの阻害物質と接触させる工程を含んでなる方法が提供される。
【００６５】
本発明の別の実施態様では、腫瘍を治療する方法であって、前記腫瘍が上昇レベルのＰＡＫ１を呈し、腫瘍を式Ｉの化合物及びＳｒｃキナーゼの阻害物質と接触させる工程を含んでなる方法が提供される。
【００６６】
本発明の別の実施態様では、癌又は過剰増殖障害を患っている患者を治療する方法であって、それを必要としている患者にＰＡＫ１阻害物質及び第二抗過剰増殖剤を共投与することを含んでなる方法が提供される。
【００６７】
本発明の別の実施態様では、癌又は過剰増殖障害を患っている患者を治療する方法であって、それを必要としている患者に、ＰＡＫ１阻害物質及びＥＧＦＲ、Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路、Ｓｒｃ、Ａｋｔ又はアポトーシスタンパク質の阻害物質の阻害物質又はアンタゴニストを共投与することを含んでなる方法が提供される。
【００６８】
別の実施態様では、本発明は、腫瘍の治療のための、ＰＡＫ１阻害物質と第二抗過剰増殖化合物との組合せを提供する。
【００６９】
別の実施態様では、本発明は、癌又は過剰増殖障害の治療のための、ＰＡＫ１阻害物質及び第二抗過剰増殖剤の共投与を提供する。
【００７０】
別の実施態様では、本発明は、腫瘍の治療のための医薬の調製のための、ＰＡＫ１阻害物質と第二抗過剰増殖化合物との組合せの使用を提供する。
【００７１】
別の実施態様では、本発明は、癌又は過剰増殖障害の治療のための医薬の調製のための、ＰＡＫ１阻害物質及び第二抗過剰増殖剤の使用を提供する。
【００７２】
以下の実施例は、発明の範囲内の化合物の生物学的評価を説明する。以下のこれらの実施例は、当業者がより明瞭に理解し、本発明を実施するのを可能にするために提供される。それらは発明の範囲を制限するものとして考えられるできではなく、単にその説明的及び例示的なものである。
【００７３】
実施例１
組織サンプル
ホルマリン固定パラフィン包埋組織塊及び対応する病理学報告を、９７の逐次(sequential)ＮＳＣＬＣ及び２７の逐次ＳＣＬＣ、１３０の頭頸部ＳＣＣ、１５のＤＣＩＳ、２２６の一次乳癌及び３２の乳癌リンパ節転移から得た(John Radcliffe Hospital, Oxford, UK)。組織マイクロアレイ(ＴＭＡ)を前述のように組み立てた(L. Bubendorf,等, J. Pathol. 2001 195:72-79.)。
【００７４】
乳腺癌を有する逐次患者では、手術を１９８９及び１９９８間で実施し、患者は広範囲局所切除術及び術後放射線治療又は乳房切除術(術後放射線治療の有無)を受けた。患者はアジュバント化学療法及び／又はアジュバントホルモン療法を受けたか又はアジュバント治療を受けなかった。エストロゲン受容体(ＥＲ)陽性患者において、タモキシフェンを５年間、内分泌療法として使用した。リンパ節陽性腫瘍、又はＥＲ-及び／又は一次腫瘍＞３ｃｍ(直径)を有する＜５０才の患者は、３ウィークリー静脈内レジメンにおいて６サイクル、アジュバントシクロホスファミド、メトトレキサート、及び５-フルオロウラシル(ＣＭＦ)を受けた。ＥＲ-、リンパ節陽性腫瘍を有する＞５０才の患者はまたＣＭＦを受けた。エストロゲン受容体(ＥＲ)量を、酵素結合免疫吸着測定法技術(Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)を使用して決定した。サイトゾルＥＲレベルが全サイトゾルタンパク質の＞１０ｆｍｏｌ／ｍｇである時、腫瘍が陽性であると考えた。ＨＥＲ２ステータスをHercepTest (DAKO, Carpinteria, CA)で評価した。受容体値を、ＥＯＲＴＣクオリティ-コントロールスキームにおける参加によってモニタした。
【００７５】
手術可能なＮＳＣＬＣシリーズは、３０の腺癌及び６７の扁平上皮癌からの外科的切除試料を含んだ(手術は１９８４〜２０００に実施された)。臨床及び病理学データは７５の癌について入手可能だった。３５のケース(４７％)はステージＴ１であり、４０ケース(５３％)はステージＴ２だった。５３のケース(７１％)はステージＮ０であり、２２のケース(２９％)はステージＮ１だった。患者はアジュバント化学療法を受けず、放射線療法に関する情報は入手不可だった。
【００７６】
頭頸部扁平上皮癌シリーズは、１１の中咽頭癌、２７の口腔に生じる癌、１７の喉頭癌及び７５の下咽頭癌を含んだ(根治手術は１９９５〜２００５に実施された)。９の癌はＵＩＣＣステージ１であり、１６はステージ２であり、２９はステージ３であり、７６はステージ４だった。術後に１０８の患者(８３％)は放射線治療を受けた。
【００７７】
実施例２
ゲノムコピー数及び発現分析
Affymetrix 500K SNPアレイ分析では、ゲノムＤＮＡ調製、チッププロセシング及びデータ分析を過去に公開のように実施した。(P.M. Haverty等, Genes Chromosomes Cancer 2008 47:530-542)有意ゲイン又はロスの領域を、ＧＩＳＴＩＣ(Genomic Identification of Significant Targets in Cancer)アルゴリズム(R. Beroukhim,等, Proc Natl Acad Sci U S A 2007 104:20007-20012)を使用して同定した。適合腫瘍サンプルの発現アレイデータを収集するために、ＲＮＡを８８ケースの一次乳癌からの凍結組織から抽出し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ(Santa Clara, CA)ＨＧＵ１３３遺伝子発現マイクロアレイに適用した。遺伝子プローブ強度データを、腫瘍を公開基準に従いｂａｓａｌ、ｌｕｍｉｎａｌ-Ａ、ｌｕｍｉｎａｌ-Ｂ、Ｈｅｒ２及び正常タイプに再分類するために使用した(C.M. Perou等, 2000 Nature 2000 406:747-752)。226507_atプローブセットを、ＰＡＫ１ ｍＲＮＡ発現を代表するために選択した。
【００７８】
実施例３
細胞培養及び生存度アッセイ
細胞株をHealth Science Research Resources Bank(HSRRB, Japan)又はAmerican Type Culture Collection(ATCC; Manassas, VA)から入手し、１０％ウシ胎児血清及び４ｍＭのＬ-グルタミンを有するRoswell Park Memorial Institute 1640(RPMI 1640)培地又はダルベッコ変法イーグル培地(ＤＭＥＭ)において３７℃及び５％ＣＯ２で維持した。ＤＮＡへのチミジン取り込みによる細胞増殖の分析では、細胞を１８時間、１μＣｉ／ウェル［３Ｈ］チミジンでインキュベートし、FiltermateＴＭ196 harvester (Perkin Elmer, Waltham, MA)を使用してＵｎｉｆｉｌｔｅｒ(登録商標)ＧＦ／Ｃプレートに収集した。MicroScintＴＭ20液体シンチレーションカクテルを乾燥フィルタープレートに加え、続いて密封し、TopcountＴＭ(Perkin Elmer, Waltham, MA)においてカウントした。フローサイトメトリーによる細胞周期分析では、１×１０６の密度の細胞を７０％氷冷エタノールにおいて１時間固定し、次いでＰＢＳで洗浄し、ヨウ化プロピジウム(ＰＩ)溶液(ＰＢＳ中に０．０５ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ溶液(Sigma, St. Louis, MO)、０．０５ｍｇ／ｍｌのＰＩ(Sigma, St. Louis, MO))において３時間４℃でインキュベートした。細胞をＦａｃＳｃａｎフローサイトメーター(Becton Dickinson, San Jose, CA)で直ちに分析した。
【００７９】
細胞生存におけるＰＡＫ１の役割を確認するために、細胞質ヒストン関連ＤＮＡ断片の量をRoche(Mannheim, Germany)のCell Death Detection ELISA Plus kitを使用して定量化した。また、フローサイトメトリーによる細胞死分析では、細胞を遠心分離によって収集し、製造者の指示に従ってアネキシンＶ-ＦＩＴＣ及びＰＩ溶液(BD Biosciences, San Jose)で染色した。
【００８０】
２００化合物ライブラリーを使用したpharmarray生存度スクリーンでは、ＥＢＣ１-ｓｈＰＡＫ１細胞をcomplete growth mediumにおいて培養し、化合物の添加より前に、未処理か又は３００ｎｇ／ｍＬのドキシサイクリンで３日間処理した。次いで細胞を３８４ウェルプレートに適切な密度で再播種し、７２時間、各化合物の６濃度(１０μＭからの４倍段階希釈)で処理した。細胞生存度を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ-Ｇｌｏ(登録商標)Luminescent Assay(Promega, Madison, WI)を使用してＡＴＰ量によって評価した。細胞増殖阻害及びＥＣ５０差異を、ＰＡＫ１ノックダウン及び野生型細胞について決定した。
【００８１】
実施例４
ＲＮＡ干渉及び誘導性ｓｈＲＮＡ細胞プールの生成
ＰＡＫ１及びＰＡＫ２の低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)オリゴヌクレオチドをDharmacon RNAi Technologies (Chicago, IL)から得た。この研究において使用された低分子ヘアピン型ＲＮＡオリゴヌクレオチドは次の通りである：ＬａｃＺ ｓｈＲＮＡ(センス)５’-ＣＴＴ ＡＴＡ ＡＧＴ ＴＣＣ ＣＴＡ ＴＣＡ ＧＴＧ ＡＴＡ ＧＡＧ ＡＴＣ ＣＣＣ ＡＡＴ ＡＡＧ ＣＧＴ ＴＧＧ ＣＡＡ ＴＴＴ ＡＴＴ ＣＡＡ ＧＡＧ ＡＴＡ ＡＡＴ ＴＧＣ ＣＡＡ ＣＧＣ ＴＴＡ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＧ ＧＡＡ-３’、ＬａｃＺ ｓｈＲＮＡ(アンチセンス)５’-ＴＴＣ ＣＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＴＡＡ ＧＣＧ ＴＴＧ ＧＣＡ ＡＴＴ ＴＡＴ ＣＴＣ ＴＴＧ ＡＡＴ ＡＡＡ ＴＴＧ ＣＣＡ ＡＣＧ ＣＴＴ ＡＴＴ ＧＧＧ ＧＡＴ ＣＴＣ ＴＡＴ ＣＡＣ ＴＧＡ ＴＡＧ ＧＧＡ ＡＣＴ ＴＡＴ ＡＡＧ-３’、ＰＡＫ１ ｓｈＲＮＡ-１(センス)５’-ＧＡＴ ＣＣＣ ＣＧＡ ＡＧＡ ＧＡＧ ＧＴＴ ＣＡＧ ＣＴＡ ＡＡＴ ＴＣＡ ＡＧＡ ＧＡＴ ＴＴＡ ＧＣＴ ＧＡＡ ＣＣＴ ＣＴＣ ＴＴＣ ＴＴＴ ＴＴＴ ＧＧＡ ＡＡ-３’、ＰＡＫ１ ｓｈＲＮＡ-１(アンチセンス)５’-ＡＧＣ ＴＴＴ ＴＣＣ ＡＡＡ ＡＡＡ ＧＡＡ ＧＡＧ ＡＧＧ ＴＴＣ ＡＧＣ ＴＡＡ ＡＴＣ ＴＣＴ ＴＧＡ ＡＴＴ ＴＡＧ ＣＴＧ ＡＡＣ ＣＴＣ ＴＣＴ ＴＣＧ ＧＧ-３’、ＰＡＫ２ ｓｈＲＮＡ-３(センス)５’-ＧＡＴ ＣＣＣ ＣＣＴ ＧＣＡ ＴＡＡ ＣＣＴ ＧＡＡ ＴＧＡ ＡＡＴ ＴＣＡ ＡＧＡ ＧＡＴ ＴＴＣ ＡＴＴ ＣＡＧ ＧＴＴ ＡＴＧ ＣＡＧ ＴＴＴ ＴＴＴ ＧＧＡ ＡＡ-３’、ＰＡＫ２ ｓｈＲＮＡ-３(アンチセンス)５’-ＡＧＣ ＴＴＴ ＴＣＣ ＡＡＡ ＡＡＡ ＣＴＧ ＣＡＴ ＡＡＣ ＣＴＧ ＡＡＴ ＧＡＡ ＡＴＣ ＴＣＴ ＴＧＡ ＡＴＴ ＴＣＡ ＴＴＣ ＡＧＧ ＴＴＡ ＴＧＣ ＡＧＧ ＧＧ−３’。誘発性ｓｈＲＮＡ保有レンチウイルスコンストラクトを、前述の方法に基づき(K.P. Hoeflich等, Cancer Res. 2006 66:999-1006; J. Climent等, Biochem. Cell Biol. 2007 85:497-508.)、LipofectamineＴＭ(Invitrogen, Carlsbad, CA)使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞において水疱性口内炎ウイルス(ＶＳＶ-Ｇ)エンベロープ糖タンパク質及びＨＩＶ-１パッケージングタンパク質(ＧＡＧ-ＰＯＬ)を発現するプラスミドを用いて、所望のｓｈＲＮＡを有するｐＨＵＳＨ-Ｌｅｎｔｉ-ＧＦＰ及びｐＨＵＳＨ-Ｌｅｎｔｉ-ｄｓＲｅｄコンストラクトを共トランスフェクトすることによって作成した。標的細胞をこれらのウイルスで形質導入し、ｄｓＲｅｄ又はＧＦＰ又は双方の存在についてフローサイトメトリーによって滅菌ソーティングした(top 2-5%)。細胞をウエスタンブロット分析によってドキシサイクリン誘発タンパク質ノックダウンについて特徴付けた。
【００８２】
実施例５
イムノブロッティング及び免疫蛍光
凍結腫瘍を小Bessman組織粉砕機(Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA)を使用して乾燥氷上において粉砕し、タンパク質抽出物を細胞抽出バッファー(Invitrogen, Carlsbad, CA)、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル(ＰＭＳＦ)、ホスファターゼインヒビターカクテル１／２(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)、及び１錠のComplete EDTA-free MiniTMプロテアーゼインヒビターカクテル(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)で４℃で調製した。溶解物を１５分間１６，１００ｇで遠心分離し、タンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイ(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)を使用して決定した。ウエスタンブロット分析では、タンパク質を４−１２％ＳＤＳ-ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜に移した(Millipore Corporation, Billerica, MA)。イムノブロッティングを、ＰＡＫ１、ｐ２７、Ｅ２Ｆ１(Cell Signaling Technology, Danvers, MA)及び抗β-アクチン(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)について一次抗体を使用して実施した。二次抗体をPierce Biotechnology(Rockford, IL)から得た。
【００８３】
免疫蛍光イメージングをｐ２７Ｋｉｐ１について一次抗体を使用して実施した(Becton Dickinson, San Jose, CA)。二次抗体をMillipore Corporation(Billerica, MA)から得た。画像を自動分析ルーチンを使用してＭｅｔａｍｏｒｐｈ(version 7.5.3.0, MDS Analytical; Sunnyvale, CA)において分析した。簡潔には、核染色パターンを均一にするために平滑化フィルタをＤＡＰＩチャンネルに適用した。次いでＭｅｔａｍｏｒｐｈにおけるＭＷＣＳアプリケーションを使用し、ＤＡＰＩ染色核を同定しカウントし、Ｃｙ３チャンネルにおいてｐ２７について陽性又は陰性としてそれらを分類した。
【００８４】
実施例６
腫瘍異種移植片モデル
培養ＮＣＩ-Ｈ５２０．Ｘ１及びＥＢＣ１細胞を培養物からとり、ハンクス平衡塩液(ＨＢＳＳ)に懸濁し、Matrigel(BD Biosciences, USA)と１：１に混合し、その後ナイーブ雌ＮＣＲヌードマウス(Taconic Farms, Hudson, NY)の右脇腹に移植した。およそ２５０ｍｍ３の平均体積の腫瘍を有するマウスを、各１０マウスの治療コホートにグループ化した。マウスは５％スクロースのみ又は５％スクロース＋１ｍｇ／ｍｌのドキシサイクリン(Clontech, Mountain View, CA)を、コントロール及びノックダウンコホートでそれぞれ受けた。全水ボトルを週に３回変えた。体重及び腫瘍体積測定(キャリパーにより長さ及び幅から得られる)を研究の間、週に２回測定した。全実験手順はAmerican Physiology Societyの指針に従い、Genentech's Institutional Animal Care and Use Committeeに承認された。腫瘍体積を次の式によって算出した：腫瘍体積＝０．５＊(ａ＊ｂ２)、ここで「ａ」は最大腫瘍直径であり、「ｂ」は垂直腫瘍直径である。腫瘍体積結果を平均腫瘍体積±平均の標準誤差(ＳＥＭ)として表す。研究の終了時点(ＥＯＳ)でのパーセント増殖阻害を、％ＩＮＨ＝１００［（ＥＯＳビヒクル−ＥＯＳ処理）／（ＥＯＳビヒクル）］として算出した。Dunnetのｔ検定を使用したデータ分析及びｐ値の生成をＪＭＰソフトウェア(SAS Institute, Cary, NC)を使用して実施した。
【００８５】
異種移植片組織を１０％の中性緩衝化ホルマリンにおいて２４時間固定し、次いでプロセシングし、パラフィン包埋した。切片を３μｍの厚さでカットし、十分な生腫瘍を有する試料(Ｈ＆Ｅ−染色スライドにおいて評価)を免疫組織化学によって更に評価した。抗Ｋｉ-６７(クローンＭＩＢ-１、マウス抗ヒト)を検出のためにＤＡＫＯ ＡＲＫ Ｋｉｔと共に使用した。組織をヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、マウントした。抗原回復を製造者の指示に従いＤＡＫＯ Ｔａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｋｉｔを用いて実施した。免疫組織化学的Ｋｉ-６７陽性細胞の定量化のために、画像をｘ１００の最終倍率でＡｒｉｏｌ ＳＬ-５０自動スライドスキャニングプラットフォーム(Genetix Ltd.)によって取得した。腫瘍特異的領域をＡｒｉｏｌソフトウェアにおいて分析のために手動で同定した。３,３'-ジアミノベンジジン特異的色範囲を色相、彩度、及び強度色空間を使用して特定し、染色の領域を定量化し、アウトプットは全細胞数に対する全Ｋｉ-６７陽性細胞だった。
【００８６】
前述の説明又は以下の請求の範囲に開示される特性は、それらの特定の形態において、又は開示の機能を実施するための手段、又は開示の結果を得るための方法又はプロセスによって表現され、その多様な形態において発明を実現するために、適宜別々に、又はこのような特性の何れかの組合せにおいて活用されうる。
【００８７】
前述の発明を、例えば理解の明瞭化のために、説明及び実施例によって幾らか詳細に記載した。変化及び改良が添付の請求の範囲内において実施されうることが、当業者に明らかだろう。従って、上記記載は説明を意図するものであり、制限するものではないことが理解される。従って、発明の範囲は上記記載を基準にして決定されるべきではなく、以下の添付の請求の範囲を、かかる請求の範囲が有する全範囲の均等なものと共に基準にして決定されるべきである。
【００８８】
ここに引用される特許、公開出願、及び科学文献は当業者の知識を確立し、各々が特異的及び個々に出典明記によって援用されるように記載されるのと同じ程度に、それらの全体を出典明記によってここに援用する。ここに引用される何れかの参照文献及びこの明細書の特定の教示間の何れかの矛盾は、後者により解消される。同様に、単語又は表現の分野で理解される定義及びこの明細書において特に示される単語又は表現の定義は、後者によって解消される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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