(57)【要約】  本開示の実施形態により、静電紡糸デバイスを提供し、使用方法および非圧縮繊維メッシュ等が開示される。
2013524039.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
静電紡糸装置であって、
繊維が引き出されるデバイスと、
各プローブが遠位端を有する複数の導電性プローブを含む構造体と
を含み、
前記繊維が引き出される前記デバイスの先端が第１電位にあり、
各プローブの一部分が前記構造体の非導電性表面から延在し、前記遠位端の第１組が第２組の遠位端に対して陥凹し、
前記第１組および前記組の遠位端が目標体積の第１境界を形成し、
前記目標体積の第２境界が、前記複数のプローブの前記遠位端によっては境界を定められておらず、
前記デバイスは前記第２境界に隣接して位置付けられ、前記導電性プローブは第２電位にあり、
前記第１電位と前記第２電位との間に、前記第２境界を通じて前記繊維を前記目標体積に配向させる電位差が存在する、静電紡糸装置。
【請求項２】
前記第１組の遠位端は、前記第２組の遠位端よりも、前記構造体の前記先端からさらに離れている、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記目標体積の前記第１境界が、実質的に凹形状、実質的に円錐形状、実質的に半球形状（ｈｅｍｉ−ｓｐｈｅｒｉｃａｌ）、実質的に半球形状（ｓｅｍｉ−ｓｐｈｅｒｉｃａｌ）、弓形形状、半多角形状、実質的にＶ字形状、実質的にＣ字形状、および実質的にＵ字形状から選択される断面形状を有し、
前記第１組の前記遠位端が、前記第２組の前記遠位端よりも、前記構造体の前記先端からさらに離れている、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記目標体積の第１境界が、実質的に円錐形状、実質的に半球形状（ｈｅｍｉ−ｓｐｈｅｒｉｃａｌ）、実質的に半球形状（ｓｅｍｉ−ｓｐｈｅｒｉｃａｌ）から選択される三次元形状を有し、
前記第１組の前記遠位端が、前記第２組の前記遠位端よりも、前記構造体の前記先端からさらに離れている、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記非導電性表面は平面である、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記複数のプローブは、同一の長さではない少なくとも２つの群のプローブを含む、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
前記非導電性表面は平面ではない、請求項１に記載の装置。
【請求項８】
前記非導電性表面は、実質的に凹形状、弓形形状、実質的にＶ字形状、実質的にＣ字形状、および実質的にＵ字形状から選択される断面形状を有する、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記非導電性表面は、実質的に円錐形状、実質的に半球形状（ｈｅｍｉ−ｓｐｈｅｒｉｃａｌ）、実質的に半球形状（ｓｅｍｉ−ｓｐｈｅｒｉｃａｌ）から選択される三次元形状を有し、
前記第１組の遠位端が、前記第２組の遠位端よりも、前記構造体の先端からさらに離れている、請求項７に記載の装置。
【請求項１０】
前記複数のプローブは同一の長さである、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
前記複数のプローブは、同一の長さではない少なくとも２つの群のプローブを含む、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記複数のプローブは同一の電位にある、請求項１に記載の装置。
【請求項１３】
前記複数のプローブのうちの１つ以上が、前記複数のプローブのうちの他の１つ以上とは異なる電位にある、請求項１に記載の装置。
【請求項１４】
前記目標体積は、最長寸法と、最大幅点で前記最長寸法に垂直である第２寸法とを有し、
前記最長寸法は約５から５０ｃｍであり、
前記第２寸法は約３から５０ｃｍであり、
前記目標体積は約１５から２５００ｃｍ３である、請求項１に記載の装置。
【請求項１５】
前記複数のプローブは、１平方ｃｍあたり約０．１から４個のプローブを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１６】
各プローブは、前記構造体の前記非導電性表面から延在する、約０．５から１０ｃｍの長さを有し、
前記プローブの直径が約１００μｍから０．５ｃｍである、請求項１に記載の装置。
【請求項１７】
前記デバイスはシリンジを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１８】
前記非導電性構造体の高さが約５から１０ｃｍであり、
前記非導電性構造体の奥行きが約５から７５ｃｍであり、
前記非導電性構造体の幅が約５から１００である、請求項１に記載の装置。
【請求項１９】
非圧縮繊維メッシュを形成する方法であって、
デバイスの先端と複数の導電性プローブとの間の電位差を構造体上に印加することと、
前記先端から、前記第２の境界を通じて、前記目標体積に向かって繊維を引き出すことと、
前記目標体積内に、前記非圧縮繊維メッシュを形成することと
を含み、
各プローブは遠位端を有し、
各プローブの一部分が前記構造体の非導電性表面から延在し、前記遠位端の第１組が第２組の遠位端に対して陥凹し、
前記第１組および前記組の遠位端が目標体積の第１境界を形成し、
前記目標体積の第２境界が、前記複数のプローブの前記遠位端によっては境界を定められていない、方法。
【請求項２０】
前記電位は約５ｋＶから６０ｋＶである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記繊維は約１から１０００ｎｍの直径を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記目標体積は約１５から２５００ｃｍ３である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記非圧縮繊維メッシュは約５０から１８００ｃｍ３の体積を有し、前記繊維は、前記非圧縮性繊維メッシュの前記体積のうち、約５から２０％を占める、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記電位は約５ｋＶから６０ｋＶであり、前記目標体積は約１５から２５００ｃｍ３であり、前記非圧縮繊維メッシュは約８０から９０％の気孔率を有し、前記非圧縮繊維メッシュは約５０から１８００ｃｍ３の体積を有し、前記繊維は前記非圧縮繊維メッシュの前記体積のうち約５から２０％を占める、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
構造体であって、
繊維を含む非圧縮繊維メッシュを含み、
前記非圧縮繊維メッシュは約５０から１８００ｃｍ３の体積を有し、
前記繊維は、前記非圧縮繊維メッシュの前記体積のうち、約５から２０％を占める、構造体。
【請求項２６】
前記非圧縮繊維メッシュは、最長寸法と、最大幅点で前記最長寸法に垂直である第２の寸法とを有し、前記最長寸法は約１から１５ｃｍであり、前記第２の寸法は約１から１５ｃｍである、請求項２５に記載の構造体。
【請求項２７】
前記非圧縮繊維メッシュは約８０から９０％の気孔率を有する、請求項２５に記載の構造体。
【請求項２８】
前記繊維はナノ繊維であり、約１から５００μｍの直径を有する、請求項２５に記載の構造体。
【請求項２９】
前記繊維はナノ繊維であり、約１から１０００ｎｍの直径を有する、請求項２５に記載の構造体。
【請求項３０】
前記ナノ繊維は、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリビニルアルコール、ポリ乳酸、ポリ乳酸グリコール酸共重合体、ポリ（エーテルウレタン尿素）、コラーゲン、エラスチン、キトサン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される材料から作製される、請求項２５に記載の構造体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年４月７日に出願された、「Electrospinning Apparatus, Methods of Use,and Uncompressed Fibrous Mesh」と題される、米国特許出願第１３／０８１，８２０号、ならびに２０１０年４月１２日に出願された、「Electrospun Nanofiber Matrix with Cotton-Ball like Three-Dimensional Macroporous Structure」と題される米国特許仮出願第６１／３２３，１７９号の優先権を主張し、いずれも参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府の支援
本発明は、契約／認可第ＣＢＥＴ−０９５２９７４号の下に、政府の支援によりなされ、国立科学財団（ＮＳＦ）によって認定された。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
従来の静電紡糸は、緻密に密集したナノ繊維からなる、平坦な、高く相互連結した足場を生成する。これらの静電紡糸された足場は、様々な細胞型の付着、成長、および機能を支持しながら、特定の組織系統へのそれらの成熟化もまた促進することが可能である。しかしながら、従来の静電紡糸の足場の主な制限は、表面的に多孔性の網目のみを有する堅く密集したナノ繊維の層を有し、シート状の構成のみへの制限をもたらしていることである。この避けられない特性は、足場を通じた細胞の浸潤および成長を制限する。したがって、これらの制限を克服する静電紡糸足場を製作する能力のある、革新的戦略を開発する必要性がある。
【発明の概要】
【０００４】
本開示の実施形態により、静電紡糸デバイスを提供し、使用方法および非圧縮繊維メッシュ等を開示する。
【０００５】
１つの例示的な静電紡糸装置は、とりわけ、繊維がそこから引き出されるデバイスであって、繊維が引き出されるデバイスの先端が、第１の電位にある、デバイスと、複数の導電性プローブを含む構造体であって、各プローブが遠位端を有し、各プローブの一部分が、構造体の非導電性表面から延在し、遠位端の第１の組が、第２の組の遠位端に対して陥凹し、第１の組およびその組の遠位端が、目標体積の第１の境界を形成し、目標体積の第２の境界が、複数のプローブの遠位端によって境界を定められておらず、デバイスが、第２の境界に隣接して位置付けられ、導電性プローブが第２の電位にあり、第１の電位と第２の電位との間に、第２の境界を通じて繊維を目標体積に配向させる電位差が存在する、構造体と、を含む。
【０００６】
非圧縮繊維メッシュを形成する方法の一例は、とりわけ、デバイスの先端と複数の導電性プローブとの間の電位差を構造体上に印加することであって、各プローブが遠位端を有し、各プローブの一部分が構造体の非導電性表面から延在し、遠位端の第１の組が、第２の組の遠位端に対して陥凹し、第１の組およびその組の遠位端が、目標体積の第１の境界を形成し、目標体積の第２の境界が、複数のプローブの遠位端によって境界を定められていない、印加することと、先端から、第２の境界を通じて目標体積の方へ繊維を引き出すことと、目標体積内に非圧縮繊維メッシュを形成することと、を含む。
【０００７】
１つの構造体の例は、とりわけ、繊維を含む非圧縮繊維メッシュであって、約５０から１８００ｃｍ３の体積を有し、繊維が約５から２０％の非圧縮繊維メッシュの体積を占める、非圧縮繊維メッシュを含む。
【０００８】
本開示の他の装置、システム、方法、特徴、および利点は、以下の図面および詳細説明の検証によって、当業者には明らかであるか、または明らかになる。全てのこのような追加の装置、システム、方法、特徴、および利点が本明細書に含まれ、本開示の範囲内であり、添付の請求項によって保護されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
本開示のさらなる態様は、添付の図面と合わされる際、以下に記載されるその様々な実施形態の検討により、より容易に理解されるであろう。
【図１．１】静電紡糸デバイスの実施形態の例示である。
【図１．２】構造体の実施形態の断面を図示する。
【図１．３】構造体の実施形態の断面を図示する。
【図１．４】図１．２Ａに示される構造体のＡ−Ａ面の断面を図示する。
【図１．５】プローブを有しない構造体の形状の斜視図を図示する。
【図２．１（ａ）】従来の静電紡糸のスキームを図示する。
【図２．１（ｂ）】球状皿および金属配列を使用して、綿ボール状の静電紡糸足場を作製するためのスキームを図示する。シリンジ（Ｉ）内のＰＣＬ溶液は、シリンジノズル（ＩＩ）から放出される。溶液は、（ＩＩＩ）によって発生される電圧差によって、接地する収集体に引き付けられる。図２．１ａにおいて、従来の平板収集体（ＩＶ）上の堅く密集した層として蓄積する静電紡糸のＰＣＬナノ繊維を図示し、図２．１ｂでは、球状皿収集体（Ｖ）は、ナノ繊維が綿ボールに類似する構造体内で蓄積することを可能にする。
【図２．２（ａ）】従来の足場に奥行きを有しない、平面の、二次元構造体を有する従来のｅＰＣＬ足場を図示する。図２．２（ｂ）は、綿毛状の三次元構造体で示される綿ボール状のｅＰＣＬ足場を図示する。図２．２（ｃ）は、綿ボールを図示し、静電紡糸されたナノ繊維の相対的な形状および密度を図示する。
【図２．３（ａ）】直径が３００〜４００ｎｍで細孔寸法が１μｍ未満のナノ繊維を有する、平面シートを使用して収集された従来のｅＰＣＬナノ繊維のＳＥＭ画像を図示する。
【図２．３（ｂ）】直径がおおよそ５００ｎｍで細孔寸法が２〜５μｍのナノ繊維を有する、球状皿および金属配列収集体を使用して収集された、綿ボール状のｅＰＣＬナノ繊維のＳＥＭ画像を図示する。いずれの画像についても、倍率は５０００倍であり、スケールバーは５μｍである。
【図２．４】従来のｅＰＣＬ足場の三次元レンダリングである図２．４（ａ）、および従来のｅＰＣＬの二次元投影である図２．４（ｂ）の共焦点顕微鏡画像を図示し、堅く密集したナノ繊維構造を示す。対照的に、綿ボール状のｅＰＣＬ足場（図２．４（ｃ））の三次元レンダリング、および綿ボール状のｅＰＣＬ足場の二次元投影の共焦点顕微鏡画像は、その奥行き全体にわたって、密度が低く、緩く密集した網目構造を示す（図２．４（ｄ））。スケールバー＝５０μｍ。
【図２．５】（ＩＮＳ−１細胞で播種された従来的なｅＰＣＬ足場の、（ａ）１日後、（ｃ）３日後、および（ｅ）７日後のＨ＆Ｅ染色切片の画像を図示し、細胞浸潤が、７日後でさえも、足場の最上層に制限されることを示す。綿ボール状のｅＰＣＬ足場の、（ｂ）１日後、（ｄ）３日後、および（ｆ）７日後のＨ＆Ｅ染色断片の画像は、７日間全体にわたり、足場内への進行的な浸潤および成長が存在することを示す。全ての画像に対して、断面の厚さ＝２０μｍ、倍率＝２０倍、およびスケールバー＝１００μｍ。
【図２．６】正規化されたＩＮＳ−１細胞の成長を図示し、（図２．６（ａ））の従来のｅＰＣＬ足場上において７日まで細胞数の緩やかな増加を示す一方で、（図２．６（ｂ））の綿ボール状のｅＰＣＬ足場では、７日目で細胞数に劇的な増加が見られる。いずれの画像においても、水平の正規化線が、細胞増殖における差異をよりよく図示するために含まれている。＊３日目での細胞数は、１日目よりも有意に多い（ｐ＜０．０５）。＊＊７日目での細胞数は、１日目および３日目よりも有意に多い（ｐ＜０．０５）。エラーバーは、平均±標準偏差を表す。ｎ＝４。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本開示のより詳しい記載の前に、本開示が、記載される特定の実施形態に限定されず、当然ながら変形可能であることを理解されたい。本明細書に使用される用語は、特定の実施形態のみを説明することを目的とし、本開示の範囲は添付の請求項によってのみ制限されるため、制限的であるように意図されないこともまた理解されたい。
【００１１】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間に介在する各値、ならびに記載された範囲内の任意の他の記載されるもしくは介在する値は、文脈により明確に別段の指示がない限り下限の単位の１０分の１まで、本開示内に包含されることを理解されたい。これらのより小さな範囲の上限および下限は、独立して、そのより小さな範囲内に含まれ、また、記載される範囲内で明確に除外される限度を条件として、本開示内に包含される。記載される範囲が限度のうちの１つまたは両方を含む場合、それらの含まれる限度のうちのいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、本開示に含まれる。
【００１２】
別段の定義がない限り、本明細書に記載の全ての技術および科学用語は、本開示が属する当該技術分野の当業者によって広く理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載のものに類似または同等のいずれの方法および材料もまた、本開示の実施または試験に使用可能であるが、好ましい方法および材料をこれから記載する。
【００１３】
本明細書に引用される全ての出版物および特許は、それぞれ個々の出版物または特許が、参照によって具体的かつ個別に組み込まれるように指示されているかのように、参照によって本明細書に組み込まれ、また出版物の引用に関連して、方法および／または材料を開示および説明するために、参照によって本明細書に組み込まれる。いずれの出版物の引用も、出願日に先立つその開示のためであり、本開示が、先行する開示のために、このような出版物に先行する権利を有さないことの承認として解釈されるべきではない。さらに、提供される出版物の日付は、実際の刊行日とは異なる場合があり、個別に確認が必要とされる。
【００１４】
本開示を読めば当業者には明らかなように、本明細書に記載および図示される個別の実施形態はそれぞれ、本開示の範囲または精神から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離されるか、またはそれと組み合わされてもよい、別個の構成要素および特徴を有する。記載される方法はいずれも、記載される事象の順序または、論理的に可能な任意の他の順序で実行することができる。
【００１５】
本開示の実施形態は、別段の指示がない限り、当該技術分野内の、流動的な電気化学、材料化学、および化学等の技術を採用する。
【００１６】
以下の実施例は、本明細書に開示および特許請求される方法の実行方法およびプローブの使用方法の完全な開示および説明を、当業者に提供するために提示される。数字（例えば、量、温度等）に関する正確さを確保するために、努力を尽くしたが、いくつかの誤差および偏差が、考慮されるべきである。別段の指示がない限り、部は重量部であり、温度は℃であり、気圧は大気圧またはその付近である。標準温度および気圧は、２０℃および１気圧として定義される。
【００１７】
本開示の実施形態を詳細に説明する前に、別段の指示がない限り、本開示は特定の材料、試薬、反応材料、製造プロセス等に限定されず、変形可能であることを理解されたい。本明細書に使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、限定する意図はないこともまた、理解されたい。本開示において、ステップを、論理的に可能な異なる順序で実行することもまた、可能である。
【００１８】
本明細書および添付の請求項に使用される際、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈により明確に異なって指定されない限り、複数指示対象を含むこともまた、留意されるべきである。
【００１９】
定義
「静電紡糸」は、繊維が、電位勾配の空孔を通じて荷電溶液または融液を流し込むことによって、溶液または融液から形成されるプロセスである。
【００２０】
「静電紡糸材料」は、静電紡糸プロセスの結果として、構造体または構造体の群（繊維、ウェブ、または液滴等）を形成する任意の分子または物質である。この材料は、天然、合成、またはそのようなものの組み合わせであってもよい。
【００２１】
「ポリマー」は、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリエステル、ポリウレタン、ポリペプチド、ポリサッカライド、およびそれらの組み合わせ等の、長い分子鎖を形成することができる任意の天然または合成分子である。具体的には、ポリマーには、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリビニルアルコール、ポリ乳酸、ポリ乳酸グリコール酸共重合体、ポリ（エーテルウレタン尿素）、コラーゲン、エラスチン、キトサン、またはこれらの組み合わせである。
【００２２】
説明
本開示の実施形態は、静電紡糸デバイス、使用方法、および非圧縮繊維メッシュを提供する。本開示の実施形態は、静電紡糸デバイスを使用して、非圧縮の、極めて多孔性の、厚い繊維メッシュを生成することができるため、有利である。一般的に、本開示の実施形態は、繊維（１つまたは複数）の網目が綿毛状の外見をした小さな綿ボールに似ている、非導電性表面から（例えば、空中に）延在する導電性プローブに隣接する体積中で、繊維（１つまたは複数）を収集する能力がある。本開示の実施形態は、結果として得られる構造体が、極めて多孔性である（例えば、直径約２μｍ以上の細孔を有する）ように、非圧縮繊維（１つまたは複数）の捕捉を可能にする。一実施形態において、密度は、細胞がメッシュ内に分散するために十分に低い（例えば、密度約３０〜２００ｋｇ／ｍ３）が、組織培養を支持するために十分に機械的に安定している。メッシュの実施形態は、足場、または細胞培養、細胞分配、および／もしくは薬物送達等の材料のための容器として使用することができる。別の実施形態において、メッシュは、目的の分子を含むことができる、フィルタ、スポンジ、または基質として使用可能である。本開示の実施形態のさらなる利点および態様は、以下ならびに実施例に記載される。
【００２３】
一般的に、静電紡糸デバイスは、デバイス（例えば、シリンジ）と、収集構造体とを含むことができる。デバイスは、デバイスの先端（例えば、当該技術分野で既知の、シリンジの先端）またはデバイスと収集構造体との間の隙間（例えば、数ｃｍから数十ｃｍの距離）を越える他のデバイスから、繊維を収集構造体に向かって引き出すことができるように、先端と収集構造体との間の電位差に基づいて、収集構造体に隣接して（例えば、収集構造体に向いて）位置付けられる。一実施形態において、２つ以上のデバイスが、メッシュ内で繊維の混合をもたらすために、異なる位置から収集構造体に繊維を供給してもよい。繊維は、本明細書に記載のように、ポリマーから作製することができる。一実施形態において、繊維は、ナノ繊維であってもよく、１から１０００ｎｍ、約１ｎｍから５００ｎｍ、約１０ｎｍから３００ｎｍ、または約５０ｎｍから２００ｎｍの直径を有してもよい。電界（例えば、約１ｋＶ／ｃｍから３ｋＶ／ｃｍ）は、適切な電気システムを使用して、デバイスと収集構造体との間に生成される。デバイスと収集構造体（例えば、導電性プローブ）との間の電位差は、約５ｋＶから６０ｋＶ、または約２０ｋＶであり、さらに、デバイスと収集構造体との間の距離は、約５ｃｍから３０ｃｍである。電位差は、様々な距離および寸法、ならびに繊維を作製するために使用されるポリマーに応じて変化し得る。
【００２４】
図１．１は、静電紡糸デバイス１０の実施形態の説明図である。静電紡糸デバイス１０は、繊維１６を供給するデバイス１２および収集構造体２２を含む。デバイス１２は、収集構造体２２に隣接する先端１４（例えば、シリンジの先端）を含む。同一または異なる種類のポリマーの１つ以上の繊維は、デバイス１２から引き出すことができる。一実施形態において、デバイスおよび収集構造体２２のうちの１つまたは両方は、繊維メッシュ１８を生成するために、もう一方に対して移動することができる。
【００２５】
一実施形態において、収集デバイス２２は、複数の導電性プローブ２４を有する非導電性構造体２６を含むことができる。各プローブ２４は、デバイス１２に近い側面上に、非導電性構造体２６から延在し、プローブ２６の先端で終結する遠位端を有する。各プローブ２４の一部分は、構造体の非導電性構造体２６の表面から、ある距離で延在する。一実施形態において、プローブ２４の遠位端は、２つ以上の組の遠位端としてみなすことができ、各組が、１個、１０個、１００個、１０００個、１０，０００個またはそれ以上の遠位端を含むことができる。一実施形態において、遠位端の第１の組は、第２の組の遠位端に対して陥凹する（例えば、凹形の三次元体積を形成する）。第１の組およびその組の遠位端は、目標体積４２の第１の境界４４を形成し（図１．２Ａを参照）、目標体積４２の第２の境界４６は、複数のプローブ２４の遠位端によっては、境界を定められていない。デバイス１２は、第２の境界４６の隣接（例えば、約２から３０ｃｍ）に位置付けられる。一実施形態において、非圧縮繊維メッシュ１８は、実質的に（例えば、非圧縮繊維メッシュ１８の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれ以上が）目標体積４２内に形成される。目標体積、第１の境界、および第２の境界は、明瞭さの理由により、図１．１には含まれなかった。図１．１および図１．２Ａに示される収集構造は異なるが、目標体積、第１の境界、および第２の境界の相対的位置を示すめには、図１．２Ａを参照されたい。したがって、図１．２Ａにおける目標体積、第１の境界、および第２の境界への参照が、図１．１における目標体積、第１の境界、および第２の境界を制限するものではない。
【００２６】
一実施形態において、収集デバイスは、１つまたは少数の導電性プローブのみを有する非導電性構造体を含んでもよい。１つ以上のプローブは、本明細書に記載のように、第１の境界を定義することができる。別の実施形態において、収集デバイスは、非導電性構造体上に、導電性である（しかし、図１．１のように、表面から延在するプローブがない）１つ以上の領域を有する非導電性構造体を含んでもよい。導電性部分は、本明細書に記載のように、第１の境界を形成することができる。
【００２７】
プローブ２４は、互いに対して同一または異なる電位で設置することができる。複数のプローブ２４は、１平方ｃｍあたり、約０．１から４、または約０．２５から１個のプローブを含むことができる。各プローブ２４間、または複数のプローブ２４間の距離は、約０．２５から１０ｃｍもしくは約１から５ｃｍであってもよい。各プローブ２４が、非導電性構造体２６の表面から延在する距離は、同一であるか、または異なってもよく、その距離は０．５から１０ｃｍもしくは約１から６ｃｍであってもよい。プローブ２４は、約１００μｍから０．５ｃｍまたは約５００μｍから１ｍｍの直径を有する。一実施形態において、プローブ２４は、プローブ２４の遠位端の先端が、プローブ２４の残りの部分よりも細いかまたは太いかのいずれかになるように、先細りになっていてもよい。プローブ２４は、鋼、ニッケル、アルミニウム、貴金属（例えば、金、銀、白金、および銅等）、またはそれらの組み合わせ等の導電性材料で作製されるか、またはコーティングされていてもよい。一実施形態において、プローブ２４は、プローブ２４の遠位端の表面の一部分のみ（例えば、プローブの先端のみ）が導電性であり、プローブ２４は導電性であるが、残りの表面が非導電性材料で被覆されるように、設計されてもよい。一般的に、プローブ２４の先端は、目標体積４２に配向される。
【００２８】
プローブの遠位端の構成は、繊維が入り込む電界を形成し、したがって、遠位端の構成の結果として形成される電界は、目標体積全体の少なくとも一部分を画定し、繊維を目標体積内に集中させる。本開示の実施形態の設計は、従来の平面上に蓄積するであろう繊維の密度を大いに減少させる。
【００２９】
非導電性構造体２６の構造および寸法（例えば、厚さ）は、収集構造体２２に大いに依存する場合がある。一実施形態において、非導電性構造体２６は、薄い（例えば、導電性および非導電性構造体２６を分離するのに十分な厚さ）か、または厚い（例えば、収集デバイス２２の大部分を包含する）かであってもよい。非導電性構造体２６の構造および寸法は、用途に応じて大いに変化し得る。多数の非導電性構造体２６の実施形態が、本明細書および図面に記載される。一実施形態において、非導電性構造体２６は、非導電性構造体２６を非導電性構造体２６の下の導電性表面から分離する、薄い材料であってもよい。一実施形態において、非導電性構造体２６は、開放領域（いずれの材料もない）が非導電性構造体２６の背部にある、自立した薄い材料であってもよい。非導電性構造体２６は、発泡体、プラスチック、ゴム、木材製品、およびそれらの組み合わせ等の材料から作製されてもよい。非導電性構造体２６の高さ（ｙ軸）は、約５から１０ｃｍまたは約２０から５０ｃｍであってもよい。非導電性構造体２６の奥行き（ｘ軸）は、約５から７５ｃｍ、約２０から５０ｃｍ、または約１５から３５ｃｍであってもよい。非導電性構造体２６の幅（ｚ軸）は、約５から１００ｃｍであってもよい。収集構造体に関するさらなる詳細は、以下に説明される。非導電性構造体２６の厚さは、約１ナノメートルから１０センチメートル以上（例えば、約２０、約３０、約４０、または約５０ｃｍ）であってもよく、デバイスの設計に基づいて選択することができる。非導電性構造体２６が平面である場合、厚さは、約１ナノメートルから１０センチメートル以上（例えば、約２０、約３０、約４０、または約５０ｃｍ）であってもよく、ｘ、ｙ、および／もしくはｚ方向が変化してもよい。
【００３０】
図１．２Ａから１．２Ｄは、収集構造体２２ａ、２２ｂ、２２ｃ、および２２ｄの実施形態の断面図をそれぞれ図示する。図１．２Ａは、プローブ２４の遠位端が、非導電性構造体４０から延在する、複数のプローブ２４を含む非導電性構造体４０を図示する。遠位端は、目標体積４２を画定する。目標体積４２は、プローブ２４の遠位端によって画定される第１の境界４４を含む。第２の境界４６は、デバイス１２（示されない）が位置される場所に最も近い側面上にある。非導電性構造体４０は、実質的にＣ型の断面を有し、三次元では半球状であり得る。
【００３１】
図１．２Ｂは、プローブ２４の遠位端が、非導電性構造体５０から延在する、複数のプローブ２４を含む非導電性構造体５０を図示する。遠位端は、目標体積５２を画定する。目標体積５２は、プローブ２４の遠位端によって画定される第１の境界５４を含む。第２の境界５６は、デバイス１２（示されない）が位置される場所に最も近い側面上にある。非導電性構造体５０は、実質的にＶ型の断面を有し、三次元では円錐形状である。
【００３２】
図１．２Ｃは、プローブ２４の遠位端が、非導電性構造体６０から延在する、複数のプローブ２４を含む非導電性構造体６０を図示する。遠位端は、目標体積６２を画定する。目標体積６２は、プローブ２４の遠位端によって画定される、第１の境界６４を含む。第２の境界６６は、デバイス１２（示されない）が位置される場所に最も近い側面上にある。非導電性構造体６０は、実質的にＣ型の断面を有し、「Ｃ」は、滑らかな曲線ではなく、むしろ１組の直線部が実質的にＣ型の断面を形成する、互いに接続された多数の直線部である。
【００３３】
図１．２Ｄは、プローブ２４の遠位端が、非導電性構造体７０から延在する、複数のプローブ２４を含む非導電性構造体７０を図示する。遠位端は、目標体積７２を画定する。目標体積７２は、プローブ２４の遠位端によって画定される、第１の境界７４を含む。第２の境界７６は、デバイス１２（示されない）が位置される場所に最も近い側面上にある。非導電性構造体７０は、プローブ２６が異なる長さで非導電性構造体７０から延在する、平面である。
【００３４】
目標体積の一実施形態（例えば、いくつかは図１．２Ａから１．２Ｄに示される）は、実質的に凹形状、実質的に円錐形状、実質的に半球形状（ｈｅｍｉ−ｓｐｈｅｒｉｃａｌ）、実質的に半球形状（ｓｅｍｉ−ｓｐｈｅｒｉｃａｌ）、弓形形状、半多角形形状、実質的にＶ字形状（図１．２Ｂ）、実質的にＣ字形状（図１．２ＡおよびＣ）、ならびに実質的にＵ字形状等の断面形状を有する、目標体積の第１の境界を有することができる。前述の断面の三次元形状が大幅に異なる場合のある実施形態においては、例えば、三次元形状は、特定の距離に対して、幅（ｚ軸）に沿って断面を延在させてもよく、高さおよび奥行きは、幅に沿った断面が同一になるように一定に保たれる。別の実施例において、三次元形状は、特定の距離に対して、幅（ｚ軸）に沿って断面を延在させてもよく、高さおよび／または奥行きは、幅に沿った断面が異なるように変更されてもよい。この点については、目標体積の第１の境界は、実質的に円錐形状、実質的に半球形状（ｈｅｍｉ−ｓｐｈｅｒｉｃａｌ）、および実質的に半球形状（ｓｅｍｉ−ｓｐｈｅｒｉｃａｌ）等の三次元形状を有する。上述の形状のそれぞれにおいて、第１の組の遠位端は、第２の組の遠位端よりも、構造体の先端からさらに離れている。形状を修飾するために使用される用語「実質的に」は、実際の形状、ならびに滑らかな曲線（図１．２Ａ）、弓形表面（図１．１Ｃ）を形成するために角度で調整可能な１組の接続された直線部分、および／または元の形状の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％等の形状への修正を含むことができる。言い換えると、形状は、多いに変化し得るが、全ての形状は、繊維（１つまたは複数）が目標体積内へ引き出されるように、デバイスの先端に対して陥凹した部分を有する。
【００３５】
非導電性構造体の実施形態（例えば、いくつかは、図１．２Ａから１．２Ｄに示される）は、実質的に凹形状、実質的に円錐形状、実質的に半球形状（ｈｅｍｉ−ｓｐｈｅｒｉｃａｌ）、実質的に半球形状（ｓｅｍｉ−ｓｐｈｅｒｉｃａｌ）、弓形形状、半多角形状、実質的にＶ字形状（図１．２Ｂ）、実質的にＣ字形状（図１．２ＡおよびＣ）、実質的にＵ字形状等の、断面形状を有してもよい。前述の断面の三次元形状が大幅に変化し得る実施形態は、例えば、三次元形状は、特定の距離に対して、幅（ｚ軸）に沿って断面を延在してもよく、高さおよび奥行きは、幅に沿った断面が同一になるように一定に保たれる。別の実施例において、三次元形状は、特定の距離に対して、幅（ｚ軸）に沿って断面を延在させてもよく、高さおよび／または奥行きは、幅に沿った断面が異なるように変更されてもよい。この点については、非導電性構造体は、実質的に円錐形状、実質的に半球形状（ｈｅｍｉ−ｓｐｈｅｒｉｃａｌ）、および実質的に半球形状（ｓｅｍｉ−ｓｐｈｅｒｉｃａｌ）等の三次元形状を有する。上述の形状のそれぞれにおいて、第１の組の遠位端は、第２の組の遠位端よりも、構造体の先端からさらに離れている。形状を修飾するために使用される用語「実質的に」は、実際の形状、ならびに滑らかな曲線（図１．２Ａ）、弓形表面（図１．１Ｃ）を形成するために角度で調整可能な１組の接続された直線部分、および／または元の形状の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％等の形状への修正を含むことができる。言い換えると、形状は、多いに変化し得るが、全ての形状は、繊維（１つまたは複数）が目標体積内へ引き出されるように、デバイスの先端に対して陥凹した部分を有する。
【００３６】
一実施形態において、目標体積は、最長寸法と、最大幅点において最長寸法に対して垂直の第２の寸法を有し、最長寸法は約５から５０ｃｍであり、第２の寸法は約３から５０ｃｍであり、目標体積は、約１５から２５００ｃｍ３である。
【００３７】
図１．３Ａおよび１．３Ｂは、構造体２２ｅおよび２２ｆの実施形態の断面を図示する。図１．３Ａは、非導電性構造体８０を図示し、そこでプローブ２４の遠位端は、非導電性構造体８０から延在する複数のプローブ２４を含む。遠位端は、目標体積８２を画定する。プローブ２４は、電気的接続８６（例えば、ワイヤー）を介して、電位源８８（例えば、電力供給）に接続される。電気的接続８６は、非導電性構造体８０の目標体積８２とは逆の側面上で、プローブ２４に接続される。非導電性構造体８０は、保持構造８４内に配置され、プローブ２４は、電気的接続以外のものには接触しない（例えば、空中で自立している）。
【００３８】
図１．３Ｂは、複数のプローブ２４を含む非導電性構造体９０を図示し、そこでプローブ２４の遠位端は、非導電性構造体９０から延在する。遠位端は、目標体積９２を画定する。プローブ２４は、電気的接続９６（例えば、ワイヤー）を介して、電位源９８（例えば、電力供給）に接続される。電気的接続９６は、非導電性構造体９０の目標体積８２とは逆の側面上でプローブ２４に接続される。非導電性構造体９０は、支持材料９４（例えば、プラスチック、発泡材、木質材料、およびそれらの組み合わせ）上に配置され、プローブ２４は、支持材料９４を通じて延在し、電気的接続９６に接触する。
【００３９】
図１．３Ａおよび１．３Ｂは、本開示の２つの可能な構造のみを図示する。異なる電位が印加されるように（例えば、電位が一定に保たれるか、または変化する場合に（例えばメッシュの形状を制御するために））、複数の電気的接続が、異なる電位源にプローブの組を接続するために使用可能であることに留意されたい。
【００４０】
図１．４Ａから１．４Ｃは、図１．２Ａに示される構造体のＡ−Ａ平面の断面を図示し、これらの図は、それぞれ２２ａ１、２２ａ２、および２２ａ３として記載される。図１．４Ａから１．４Ｃは、非導電性構造体４０の寸法が、変化可能であり、プローブ２４の数が変化可能であることを図示する。図１．５Ａから１．５Ｄは、プローブを有しない収集構造体の斜視図を図示する。したがって、図１．１から１．３Ｄは、収集構造体の断面のみを示すが、図１．４Ａから１．５Ｄは、その断面が、様々な手段で三次元に延在して様々な収集構造体を生成することが可能であることを示す。収集構造体の設計および選択は、繊維メッシュの所望の三次元形状、気孔率、および寸法等によって導かれてもよい。
【００４１】
上記で簡単に説明したように、本開示の実施形態は、本明細書に記載の静電紡糸デバイスを使用して、繊維メッシュを形成することを含む。本方法は、デバイスの先端（例えば、正バイアス）と複数の導電性プローブ（例えば、接地の）との間の電位差を、構造体上に印加することを含む。繊維（例えば、ナノ繊維）は、先端から、第２の境界を通じて目標体積の方向に引き出され、非圧縮繊維メッシュを形成する。一実施形態において、単一材料の単一繊維が、繊維メッシュを作製するために使用可能であり、または繊維の長さの機能として異なる材料で作られた単一の繊維が使用されてもよい。別の実施形態において、同一または異なる材料を使用する１つ以上の先端からの複数の繊維が、（例えば、同時または順次に）繊維メッシュを形成するために使用可能である。電位および材料等に関するさらなる詳細は、本明細書および実施例に記載される。
【００４２】
非圧縮繊維メッシュの実施形態は、１つ以上の材料から作製された、１つ以上の繊維（例えば、ナノ繊維および／またはマイクロ繊維（例えば、５００ｎｍから約５００μｍ））を含むことができる。非圧縮繊維メッシュは、繊維メッシュ内に、空気または流体のための空間（例えば、メッシュの約８５％、約９５％、もしくはそれ以上、またはメッシュの体積）を含むことができ、一方で圧縮繊維メッシュは、空気または流体のための空間の大半（例えば、９０％超、９５％超、または９９％超）が除去されている。一実施形態において、繊維メッシュの隣接する層は、互いに接触せず、空間（例えば、空気または流体）を、非圧縮繊維メッシュの層の間に配置することができる。一実施形態において、非圧縮繊維メッシュは、約５から１５％の繊維を含み、そこで非圧縮繊維メッシュは、約５０ｃｍ３から１８００ｃｍ３の体積を有する。一実施形態において、繊維の量は、非圧縮繊維メッシュの体積の約５から２０％を占める。一実施形態において、非圧縮繊維メッシュは、最長寸法、最大幅点で最長寸法に垂直な第２の寸法、ならびに最長寸法および第２の寸法に垂直な第３の寸法を有し、最長寸法は、約１から１５ｃｍであり、第２の寸法は約１から１５ｃｍであり、第３の寸法は約１から１０ｃｍである。一実施形態において、非圧縮繊維メッシュは、約８０から９０％の気孔率を有する。
【００４３】
実施例
本開示の実施形態は、実施例、ならびに対応する文章および図に関連して記載されるが、本開示をこれらの記載の実施形態に制限する意図はない。逆に、全ての代替物、変更、均等物が、本開示の実施形態の精神および範囲内に含まれることを意図する。
【００４４】
実施例１
簡単な序文：
従来の静電紡糸の制限因子は、静電紡糸の足場が、シート状の結集プロセスのために、表面的な多孔性構造を提供するだけの、全体が堅く密集したナノ繊維層を含むことである。この避けられない特性は、ナノ繊維足場全体にわたり細胞の浸潤および成長を妨げる。気孔率を高めるために、ナノ粒子の取り込み、より大きなマイクロ繊維の使用、または埋め込み塩もしくは水溶性繊維の除去を含む、多数の戦略がこの課題を克服するために試されてきた。しかしながら、これらの方法は、依然として、シート状のナノ繊維足場を作り出し、良好な構造的完全性を有する多孔性の三次元足場を作り出すことができない。したがって、低密度および非圧縮様式でのナノ繊維の集積を含む、三次元の綿ボール状の静電紡糸足場を開発した。従来の平板収集体の代わりに、接地した球状皿および並んだ針状のプローブを使用して、集中的な、低密度の、非圧縮ナノ繊維（ＦＬＵＦ）メッシュ足場を作り出した。走査型電子顕微鏡は、綿ボール状の足場が、従来の静電紡糸足場と比較して、類似の直径を有するが、より大きな細孔およびより低い密度の構造体を有する、静電紡糸のナノ繊維を含むことを示した。さらに、従来の静電紡糸足場の、表面上多孔性であり固く密集した構造とは対照的に、レーザー共焦点顕微鏡は、綿ボール状の足場の奥行き全体にわたる開放気孔率および緩く密集した構造体を示した。綿ボール状の足場に播種された細胞は、浸潤成長のない従来の静電紡糸足場と比較して、７日間の成長後、足場内に浸潤した。定量分析は、おそらくは三次元足場内の、内殖のための空間の増加に起因して、７日の期間にわたる綿ボール状の足場上の細胞に対して、おおよそ４０％高い成長率を示した。全体的に、この方法は、極めて多孔性の相互連結性に対してより有利なナノ繊維足場を構築し、静電紡糸足場の現在の課題に取り組むことに大きな可能性を示す。
【００４５】
序文：
従来の静電紡糸は、緻密に密集したナノ繊維からなる、平面の、堅く相互連結した足場を生成する。これらの静電紡糸足場は、様々な細胞型の付着、成長、および機能を支持することができ、一方で、特定の組織系統、例えば骨[1-3]、軟骨[4]、腱、靭帯[5]、皮膚[6、7]、神経細胞[8]、肝臓[9]、平滑筋[10]、横紋筋[11、12]、および角膜[13]へさえも、それらの成熟を促進する。さらに、静電紡糸ナノ繊維足場の形態学は、ポリマー溶液の濃度、またはノズルと収集体との間の電圧等、製造パラメータの任意の数を単純に修正することによって、大いに調整可能である[14]。これは、繊維直径[15]、細孔寸法[16]、および使用された溶媒[17]でさえもが、静電紡糸生体材料に対する細胞応答に影響することを示しているため、組織工学システムに非常に有利である。しかしながら、従来の静電紡糸足場の主な制限は、それらが、表面的な多孔性の網目のみを有する堅く密集したナノ繊維を有し、シート状の形状のみへの限定をもたらすことである。この避けられない特性により、足場を通じて細胞の浸潤および成長を制限する。したがって、安定した三次元構造を有しながら、ナノ繊維の形態、および深く、相互連結した細孔を示す、静電紡糸足場を製作する能力のある革新的戦略を開発することが肝要である。このような足場は、天然の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の構造を模倣するのが良く、それによって、生体模倣環境において、長期の細胞生存および機能性組織の生成の見込みを最大化する。
【００４６】
従来の静電紡糸に使用される技術は、ポリマー溶液を含有する荷電ノズルから一定の距離を置いたところに位置される、静的な平板収集体を採用する。結果として得られる静電紡糸足場は、固く密集した構造で配設されるナノ繊維層でできており、その層は、浅い表面付近で細胞の成長および浸潤を可能にするが、内部構造内の深くにではない。多数の可能性のある溶液が、この足場の欠点を改善するために調査されてきたが、静電紡糸プロセスの逆説的性質が、良好な細胞付着および深い細胞浸潤の両方を可能にする理想的な形態を達成することに反する働きをする。特に、繊維の直径が、最適な細胞付着に対してナノスケール領域まで減少するため、気孔率も同様に減少し、それによって、マイクロスケールの繊維直径に戻すことによって最も容易に克服される深い細胞浸潤を妨害する[18]。この欠点は、静電紡糸足場のみを既に阻止しており、マイクロ繊維を含む、より多孔性の足場材料のためのコーティング等、他の静電紡糸ナノ繊維の用途の探求につながった[19]。
【００４７】
細胞浸潤を改善するために探求された従来の方法の中で、１つの一般的な戦略は、ポリマー溶液中に溶解された塩を利用して、静電紡糸後に粒子を浸出させることによって足場中に特定の細孔寸法を作り出すことである[20、21]。これは、足場内に多孔性の空間を形成するが、その空間は、足場内に独立した層を作り出すための仕切りとして作用し、多層化した足場のようであり[22、23]、均一な形態および安定性を提供しない。別の従来の戦略は、所望のポリマーを、水に溶けやすい材料と共に静電紡糸し、次にそれを溶出することを伴う[24]。これは、足場内の連続的な区分を除去するが、これらの繊維の急な除去は、繊維の再編成および収縮をもたらし、しばしば、新たに作り出される細孔の妨害につながり[16]、足場のメッシュ網目を崩壊させる[25]。別のアプローチは、足場が形成されているときに、足場内にヒドロゲルを電気スプレーすることである[25]。これは、細胞がそこを通って足場内の深くに浸潤可能なヒドロゲルのポケットを作り出す。しかしながら、この方法は、スプレーされたヒドロゲルが均等に分散することが困難なため、相互連結した細孔を有する実際の三次元足場を生成せず、再度、全域にわたって一定した成長を誘発しそうにない非均一の足場をもたらす。さらに、回転ドラムを収集体として使用して中空形状を作り出すが、しかしながら、それは、依然としてナノ繊維を堅く密集した層として収集する[26]。
【００４８】
上述の方法が静電紡糸足場の現在の課題を完全に克服しない主な原因は、それらが、従来の静電紡糸技術の応用であるためである。したがって、現在の変更方法全てに対して、静電紡糸ナノ繊維の作製は、印加される電荷のために、ポリマー溶液の滴がナノスケール繊維内に引き出されることを伴う。ナノ繊維が分散されると、次いで、最高（荷電ノズル）から最低（接地電源）への電位勾配へと続き、近接する収集体上への沈着につながる。この力の結果として、その後の繊維層は、最終的に緻密に密集した構造体を形成する二次元構造として、順に重ねて堆積される。したがって、各堆積層が、平面の二次元空間内で細孔を有するように見えるとしても、これらの細孔は、層に対して直角の断面（すなわち、足場の奥行き）内へと続かず、細胞浸潤を、表面層のみに制限する。
【００４９】
全体的に、静電紡糸足場を作り出すための現在の戦略は全て、非集中的な平面様式でナノ繊維を収集し、それは、次の層に、緻密に密集した網目を採用させ、良好な安定性を有する三次元構造の形成を妨げる。したがって、これらの障害を克服するためには、依然として集中的な形状を維持する、より開放的な空間内に、ナノ繊維が蓄積することが可能な場合に、静電紡糸足場が、繊維を並べて堆積させることなく、三次元構造として製作可能であると仮定する。この実施例において、非導電性球状皿に埋め込まれた、並んだ金属プローブからなる収集システムを使用して、集中的な、低密度の、非圧縮ナノ繊維（ＦＬＵＦ）メッシュを作製するための革新的戦略を実証する。これは、静電紡糸ナノ繊維が、球状皿がそれらを拘束領域内に集中させる間に、より合わさり、プローブ間の空気中に蓄積することを促す。この組み合わせは、静電紡糸ナノ繊維が、素晴らしい三次元構造安定性を有する、綿ボールに類似の形状を採用することにつながる。
【００５０】
材料および方法：
材料の製作
従来の平面の静電紡糸足場の静電紡糸
ポリ−ｅ−カプロラクトン（ＰＣＬ）ペレット（Ｍｎ：８０，０００、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、クロロホルムとメタノールとの１：１（ｖ：ｖ）の溶媒溶液中に、２２５ｍｇ／ｍｌの割合で、混合物が透明、粘着性、かつ均質になるまで、一定した攪拌の下で溶解した。ＰＣＬ溶液を、２５ゲージの丸い先端の針ノズルで蓋をされたシリンジに注ぎ込んだ。シリンジを、設定流速１．０ｍｌ／ｈｒでシリンジポンプ（ＫＤ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）内に搭載した。平面の静電紡糸足場を、次いで、上述の従来の方法論により製作した[27]。簡潔に言うと、ノズルを、接地した平板のアルミニウム箔から２８ｃｍ離して設置し、高電圧源（Ｇａｍｍａ  Ｈｉｇｈ−Ｖｏｌｔａｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒｍｏｎｄ  Ｂｅａｃｈ，ＦＬ）の正極に取り付けた。＋２１ｋＶの電圧を、針の開口部から１ｍｍ離して印加し、足場を、シートとして接地収集体上に静電紡糸した。
【００５１】
静電紡糸綿ボール状の静電紡糸足場
従来の静電紡糸と同様に、ＰＣＬペレットを、クロロホルムとメタノールの１：１（ｖ：ｖ）の溶媒溶液中に、７５ｍｇ／ｍｌの割合で溶解し、シリンジチャンバーに移した。２５ゲージの丸い先端の針ノズルを装着された充填済みシリンジを、次いで、収集体の前平面から１５ｃｍの距離で、設定流速２．０ｍｌ／ｈｒでシリンジポンプ内に設置した。ノズルを、＋１５ｋＶの電圧が針の開口部から１ｍｍ離れて印加される、高電圧源の正極に取り付け、三次元の静電紡糸足場を、特注の収集体上に製作した。
【００５２】
綿ボール状の静電紡糸足場のための収集体は、電気的接地を提供するためにステンレス鋼加工で裏打ちされた、球状気泡皿（ｆｏａｍ  ｄｉｓｈ）（直径８インチ、シェル厚０．１２５インチ、Ｆｉｂｒｅ  Ｃｒａｆｔ，Ｎｉｌｅｓ，ＩＬ）内に、並んだ１．５インチの長さのステンレス鋼プローブを埋め込むことによって特別に作られた。針を、皿の中央から放射状の５つの等距離方向に、２インチ間隔で設置した。ナノ繊維を、静電紡糸プロセスを通じて蓄積させ、次いでガラスロッドで除去した。
【００５３】
足場の特性
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像
ｅＰＣＬ足場を、アルミニウムスタブ上に備え付け、金およびパラジウムでスパッタリングコーティングした。加速電圧２０ｋＶでＰｈｉｌｉｐｓ  ＳＥＭ  ５１０（ＦＥＩ，Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ，ＯＲ）を使用して、足場を画像化し、繊維の直径を、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用ＧＩＭＰ２．６を使用して測定した。
共焦点顕微鏡画像
【００５４】
従来の平面静電紡糸足場におけるナノ繊維の網目編成を、綿ボール状の静電紡糸足場と視覚的に対比するために、足場を、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で４時間インキュベートした。足場を、次いで、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７１０  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）を使用して画像化し、Ｚｅｎ  ２００９ソフトウェアを使用して分析した。ＤＡＰＩは、疎水性のＰＣＬに強く引き付けられるため、蛍光は、足場のナノ繊維構造を明確に照射した。
【００５５】
細胞培養
Ｄｒ．Ｊｏｈｎ  Ａ．Ｃｏｒｂｅｔｔ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）からの結構な贈り物であるＩＮＳ−１（８３２／１３）細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌａｗｒｅｎｃｅｖｉｌｌｅ，ＧＡ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、および５５μＭの２−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が配合された、ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。細胞を、静電紡糸足場に播種する前に、通常の培養条件下（３７℃、９５％相対湿度、５％ＣＯ２）で、８０〜９０％の培養密度で伸張させた。
【００５６】
従来の平面ｅＰＣＬ足場を、０．５ｃｍの円盤に切断し、前述の方法に従って、９６ウェルプレートに設置した[27]。綿ボール状のｅＰＣＬ足場の寸法を、滅菌剃刀でトリミングして直径０．５ｃｍに正規化し、次いで、９６ウェルプレートに設置した。滅菌を、静電紡糸足場を７０％エタノールおよび３０％リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の溶液中に、滅菌条件下で１２時間浸漬し、続いてＰＢＳ中で６時間にわたり連続希釈することによって実行した。全ての足場を、次いで、上述で指定した培地形態に一晩浸漬し、タンパク質吸着させた。
【００５７】
細胞の播種前に、全ての足場に対して、一晩の浸潤からの余剰細胞培養液を除去した。足場内への細胞浸潤を研究し、細胞の増殖を測定するために、６４，０００個のＩＮＳ−１細胞の細胞懸濁液を、各足場に添加した。足場を、加湿インキュベーターで２時間インキュベートし、次いで４８ウェル組織培養プレートに移した。追加の４００μｌ培地を各ウェルに添加し、培地を４８時間ごとに取り替えた。細胞挙動を、１、３、および７日後に、足場を収集して分析した。
【００５８】
組織学
細胞浸潤の範囲を定量化するために、適切な時点で足場を培地から除去し、ホルマリン中に一晩固定した。それらを、次いで２０％のショ糖溶液に浸漬し、２４時間後に５０％のショ糖溶液と入れ替えた。一晩の浸漬後、足場を、Ｈｉｓｔｏ−Ｐｒｅｐ埋め込み培地（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）内に埋め込み、液体窒素で急速凍結した。結果として得られたブロックを、ＣｒｙｏＪａｎｅ  Ｔａｐｅ−Ｔｒａｎｓｆｅｒを伴うＭｉｃｒｏｍ  ＨＭ  ５０５Ｅ  Ｃｒｙｏｓｔａｔ（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｄｉｃｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＩＬ）を使用して、２０μｍ区分に切断し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ／Ｐｌｕｓ顕微鏡スライド（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に備え付けた。細胞の中核および細胞質を視覚化するために、区分をＨｅｍｏｔｏｘｙｌｉｎおよびＥｏｓｉｎ染料（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ＭａｓｔｅｒＴｅｃｈ  Ｓｃｉ．，Ｌｏｄｉ，ＣＡ）で染色した。次いで、Ｎｉｋｏｎ  ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００−Ｓ顕微鏡（Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を使用して画像を撮影し、ＮＩＳ−ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ＡＲ  ２．３０ソフトウェアを使用して分析した。
【００５９】
細胞増殖分析
特定の時点で、細胞増殖を、製造業者の使用説明書に従って、細胞集計キット８試薬（ＣＣＫ−８；Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用して定量化した。簡潔に言うと、各時点で、ＣＣＫ−８試薬を、総細胞培養体積１：１０の割合で特定のウェルに添加し、加湿インキュベーターで４時間インキュベートした。各サンプルを、全ての時点が収集されるまで、４℃の冷蔵庫に保管した。全てのサンプルに対する吸光度（４５０ｎｍ）を、マイクロプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＫ，ＢＩＯ−ＴＥＫ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を使用して同時に測定し、細胞数を、既知の細胞濃度の吸光度基準に対して検査した。
【００６０】
統計的分析
全ての実験を、少なくとも３回独立して４通りに実行し、提示される結果は、代表的なデータセットである。全ての値を、平均±標準偏差で表した。全てのデータを、ＳＰＳＳソフトウェアを使用して、一方向の分散分析試験と比較した。テューキー多重比較試験を実行して、ペア間の有意差を評価した。ｐ＜０．０５の値は、統計的に有意と考えられた。
【００６１】
結果および考察：
組織工学における合成生体材料の役割数の増加は、微環境を模倣する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を作り出すための新しい戦略を促進している。現在使用されている多数の生体材料製作方法の中でも、静電紡糸は、様々な用途のための生体適合性ポリマーの足場を生成するとして繰り返して示されてきた[28、29]。静電紡糸は、合成法を使用して、ナノ繊維足場を繰り返して製作するための、多用途で費用効果的な方法であるため、特に魅力的である。しかしながら、既存の静電紡糸方法の１つの制限因子は、安定した三次元の網目構造内で、深い、相互連結した細孔を依然として維持しながらも、ナノ繊維の形態を同時に組み込む能力である。これは、足場内深くの細胞浸潤および成長に対する重大な障害を提示し、静電紡糸足場の可能性を制限する。したがって、ＥＣＭ模倣微環境を細胞に基づく組織工学用途に提供する、新しい変形可能な静電紡糸戦略に対する重大な必要性がある。そのため、この研究において、１）三次元の綿ボール状構造体、２）緩く密集したナノ繊維の連続メッシュ、３）３つの次元全てにおける、深い、相互連結した細孔、および４）良好な構造安定性を組み込む静電紡糸足場を開発した。
【００６２】
ポリマー繊維を静電紡糸する基本的な方法は、接地された収集体を、導電性ポリマー溶液を含有する、荷電シリンジノズルの付近に設置することである。印加電圧が増加するにつれて、溶液は、摩擦力を克服し、ポリマー流体が針から放出されるスピン噴出をもたらす。この放出された溶液は、予測される距離を超えて移動するにつれて、蒸発し、繊維のメッシュを収集体上に堆積させる（図２．１ａ）。結果として得られた繊維の特性は、大部分が、溶液の粘着性、流速、およびノズルと収集体との間の距離によって決まる。（低粘着性、低流速、および遠距離は、一般的に、より小さな直径につながる。）しかしながら、全体的な足場の特性は、大部分が収集体によって決まる。
【００６３】
従来の平面収集体上では、接地電荷は、広範囲にわたって、均一に拡散される。結果として、繊維の群は、１つの層内で隣り合って堆積し、各後続の層は、既存の層の上に堆積する。しかしながら、各層は、依然として接地収集体に強く付着しており、したがって、下の層を圧縮する。これが、緻密に密集した繊維の層、および足場内に深く続かない表面上の平面細孔を有する平面のシート状の構造体を作り出す（図１．２ａ）。蓄積された繊維層が、足場に厚さを提供する一方で、隣接する層の間の空間の欠如は、特に細胞の成長および浸潤が表面層に制限されるため、本質的に、二次元の足場を作り出す。
【００６４】
したがって、ナノ繊維形態、およびより現実的な三次元構造内に組み込まれる、深い、相互連結した細孔を有する静電紡糸足場を作り出すために、従来の収集体を、並んで埋め込まれた金属プローブを有する非導電性の球状皿で置き換えた（図２．１ｂ）。この革新的な配設は、均等に分散し、接地電荷をプローブ上に集中させた。プローブは、プローブ間のナノ繊維を空中で収集することができ、収集体全体を通じて均一な電荷の欠如は、ナノ繊維層が、足場を圧縮することなく、前に堆積された層の隣に定着することを可能にする。さらに、球状皿は、集中的な領域内で、ナノ繊維を収集することを助け、それによって、それらを、良好な安定性を有する綿毛状の三次元構造体として蓄積する（図２．２ｂ）。
【００６５】
図２．２ａおよび２．２ｂを比較して、収集体システムを変更することが、全体的な足場特性に劇的な影響を有することは明らかである。従来の収集体の均一に集中した電荷の結果として、生成された足場には、平面のシート状の配設にあるように、非常に堅く密集した構造体が結集される。逆に、球状皿および金属配列の収集体は、極めて大きな三次元の奥行きを有する、集中的な、低密度の、非圧縮ナノ繊維（ＦＬＵＦ）メッシュを作り出す。したがって、収集体は、新しい足場が、複数面に、安定した、相互に連結するナノ繊維構造を有して作り出されたように、静電紡糸製作に直面する現在の課題のうちの１つを克服するための、代替的な戦略を提供する。本明細書では、これらの新しい三次元アセンブリを、綿ボールのマクロ構造に非常に酷似したＦＬＵＦ足場として指定している（図２．２ｃ）。追加の利点として、本研究で生成される、綿ボール状の静電紡糸の足場は、蓄積するのに２０分とかからず、一方で、従来の製作方法を使用して同様の次元の足場を収集するためには、典型的には数時間かかり、さらには数日かかる場合もある。
【００６６】
ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）は、生体適合性があり、生物医学的応用での使用がＦＤＡ認可されているため、本研究のモデルポリマーとして選択した。さらに、ＰＣＬは、容易にナノ繊維に静電紡糸可能であり（ｅＰＣＬ）、軟骨細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、線維芽細胞、およびヒト間充織幹細胞の成長を支持することができる[10、15、27、30〜35]。本研究のために、ラットのインスリノーマＩＮＳ−１（８３２／１３）細胞（ＩＮＳ−１細胞）細胞株を用いて、ｅＰＣＬ静電紡糸の足場の生物学的応答を評価した。ＩＮＳ−１細胞は、迅速で入手が容易な生物学的分析を可能にする、非常に頑丈な細胞株である。さらに、この細胞株を、関心領域を急速に浮上させる、膵臓の組織工学的応用の研究に対して大きな実用性を有する、模倣β細胞機能に発達させた[36〜38]。したがって、本研究において、ナノ繊維の特徴と細胞の性能とを正確に比較するために、従来の平面収集体および球状皿および金属配列収集体の両方を使用して、ＰＣＬを静電紡糸し、続いて両方の足場タイプを、ＩＮＳ−１細胞を用いて生物学評価した。
【００６７】
ＥＣＭ機能性は、ナノスケール次元で生物活性を実行する、異なる線維状タンパク質との複雑な細胞間相互作用によって高度に調節される[39〜42]。さらに、多数の報告が、ナノ繊維生体材料構造の細胞活動に対する肯定的な影響を示している[15、43]。したがって、本研究のために設計される足場のパラメータは、特に、スケールが天然のＥＣＭ高分子と同様の静電紡糸ナノ繊維を作り出すように選択された。図２．３に示されるように、従来のｅＰＣＬ足場における繊維直径の大半は、３００〜４００ｎｍであり、一方で綿ボール状のｅＰＣＬ足場は、おおよそ５００ｎｍの直径を有する繊維形態を示した。したがって、これらの両方は、天然のＥＣＭに見られるコラーゲン繊維束の典型的な寸法範囲内である[44]。さらに、異なるパラメータ（ＰＣＬ濃度、流速、および電圧）を用いてでさえも、２Ｄおよび３Ｄのナノ繊維特徴は、類似していた。しかしながら、全体の足場形態は、収集体により有意に影響され、従来の収集体は、固く密集した繊維の網目を生成したが、新しい収集体は非圧縮の、緩く密集した、より多孔性のナノ繊維構造体を作り出すことができた。
【００６８】
ナノ繊維の直径が細胞挙動に与える影響が確立されているにも関わらず、細孔寸法の影響は、それほどはっきりしていない。細胞の成長および骨内の血管新生について、３００μｍを超える細孔寸法が推奨されており[45]、一方で線維芽細胞は、６〜２０μｍの細孔寸法が好ましいことが示されている[16]。最適な細孔寸法は組織特異性であるとはいえ、全体的な相互連結性を有する気孔率に対する最小閾値は、局在化された細胞および栄養素が、内部環境へのアクセスを有することを確実にするために、依然として組織工学的に作られた足場内にある必要があり、それによって、ＥＣＭ状の三次元構造を作り出す。しかしながら、従来の静電紡糸は、大きな細孔寸法の相互連結性を有するナノスケール寸法において、繊維の同時生成に貢献しない。以前は、これが、製作後の修正を要する静電紡糸の足場につながっていた。しかしながら、これらの修正は、典型的に、ナノ繊維の特徴および足場の安定性を変化させる[20、21、24、25]。さらに、静電紡糸の足場を修正することに対する以前の取り組みは、細胞浸潤の増加を可能にするための多面的な細孔よりもむしろ、表面上の平面的な細孔に焦点を当ててきた。そのため、本研究は、従来の静電紡糸手法によって生成されるような表面的に多孔性の足場との関連で、製作における相対的な調査および綿ボール状のｅＰＣＬ足場を介する多面的な細孔のさらなる利点を提供する。
【００６９】
表面的な細孔特性を特定するために、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用して、両方の足場を画像化した。図２．３のＳＥＭ画像の調査により、２つの足場におけるナノ繊維密度は容易に区別することができ、従来のｅＰＣＬ足場と比較すると、綿ボール状のｅＰＣＬ足場内の同一空間を占有するナノ繊維は有意に少なかった。さらに、従来のｅＰＣＬ足場は、１μｍを超える細孔を一貫して示したが、綿ボール状のｅＰＣＬ足場は、２〜５μｍの典型的な細孔寸法を有した。綿ボール状の足場における細孔寸法の増加は、細胞が足場に深く浸潤するのに十分な空間を与えながらも、依然として複数のナノ繊維にわたって、細孔を繋ぐために必要な相互連結性を提供すると確信している。
【００７０】
ＳＥＭ画像は、両方の静電紡糸足場タイプの表面領域を分析したが、依然として内部構造および配設についての疑問が残った。特に、足場深くのナノ繊維特性の定量分析が、依然として必要であった。この問題に取り組むために、ｅＰＣＬサンプルをＤＡＰＩ内でインキュベートすることを決めた。波長３６０ｎｍで照射した際に、結果として得られる蛍光性は、ナノ繊維形態の輪郭をはっきりと示すことができた。したがって、蛍光フィルタ下で共焦点顕微鏡を使用して、両方の足場タイプの形態をそれらの厚さ全体にわたり研究した。図２．４に示されるように、従来のｅＰＣＬ足場は、非常に固く密集したナノ繊維構造を有し、一方で、綿ボール状のｅＰＣＬ足場は、その奥行き全体にわたり、より開放的な構造を有した。これらの対照的なナノ繊維特性は、使用される収集体システムが大幅に異なることの影響を示し、球状皿および金属配列収集体が非圧縮手段でナノ繊維の蓄積を助け、それが続くナノ繊維層間のさらなる分離を可能にする。注目すべきことに、従来のｅＰＣＬ足場は、約１０μｍの奥行きで画像化することのみが可能であったが、綿ボール状のｅＰＣＬ足場は、約３５μｍまでの奥行きで観察可能であった。これは、従来のｅＰＣＬ足場の増加した密度が、共焦点顕微鏡からの励起光が、足場に深く浸透することを妨げたことを示した。逆に、低密度で、より多孔性の綿ボール状のｅＰＣＬ足場は、より深く共焦点浸透する傾向にあった。共焦点顕微鏡画像におけるこの著しい対照は、細胞浸潤について、従来の足場の、緻密で堅く密集した性質と比較して、綿ボール状の足場の、密度が低く、緩く密集した網目構造体の有利な設計をさらに検証する。我々の知る限り、安定した三次元構造における、深い、多面的な細孔と一体化した、連続した網目状のナノ繊維のこの組み合わせは、紡糸状態の、非修正の静電紡糸足場において、これまでに示されたことは一度もない。
【００７１】
理想的な組織工学的に作られた足場は、良好な細胞付着および浸潤の両方を促進すべきであり、両方のバランスの取れた組み合わせが、全体の組織形成を最終的に促進するために必要である。静電紡糸の足場においてこのバランスを達成することは、しかしながら、捉えづらいことが証明されている。特に、従来的に静電紡糸された足場は、細胞が表面的に付着することを可能にするが、それらは、実質的な細胞浸潤に必要とされる大きな細孔寸法を提供しない[7、19、46]。さらに、浸潤を改善するための現在の修正技術は、足場の安定性を妨げることがわかっている[23、25]。したがって、上述のように、ナノ繊維形態を、安定した綿ボール状の構造体内で、深い細孔とうまく組み合わせる能力のある、球状皿および金属配列の収集体を設計した。従来および綿ボール状のｅＰＣＬ足場上での細胞応答を特定および対比させるために、ＩＮＳ−１細胞を播種し、それらの浸潤および成長を研究した。細胞応答を評価するために、両方の足場（それぞれ直径０．５ｃｍ）を、６４，０００個の細胞で播種し、それは、上面約９０％のコンフルエンスである。これは、細胞の成長が足場内へ配向されるように促し、それによって、両方の足場タイプ内での内殖のための相対能力を示した。
【００７２】
従来のｅＰＣＬ足場上のＩＮＳ−１細胞は、７日後でさえも、最も表面的な層より下に浸潤しなかったが、一方で、綿ボール状のｅＰＣＬ足場上の細胞は、徐々に足場内の深くに浸潤した（図２．５）。１日目に、ＩＮＳ−１細胞は綿ボール状のｅＰＣＬ足場の表面に付着し、それらの浸潤は上面に限定された（図２．５ｂ）。３日目までに、細胞の大半が表面閾値を越えて浸潤し（約１２５μｍ）、少数は、さらに深さ約２６０μｍまで足場内に深く浸潤した（図５ｄ）。さらに、７日目までに、細胞は、表面から約３００μｍの深さで足場全体に存在し、細胞数は、表面付近および足場内の深くの両方において著しく増加した（図２．５ｆ）。これらの有望な結果は、図２．４ｂに示される、より開放的で、緩く密集した網目構造に直接の相関があり、深い浸潤およびより良い増殖のための、より簡単な経路を細胞に与えた。対照的に、従来のｅＰＣＬ足場（図２．４ａ、ｃ、ｅ）の堅く密集した構造は、細胞の付着を最も上の表面層に制限する障害を提示する。
【００７３】
次に、細胞応答を、定量的に評価し、図２．６に示されるように、１日目から３日目の細胞の成長は、従来および綿ボール状のｅＰＣＬ足場の両方において同様であった。従来のｅＰＣＬ足場上の細胞数は、３日目で（１日目の細胞数に正規化されるように）１２３．１８±６．２３％まで増加したが、一方で綿ボール状のｅＰＣＬ足場は、１３０．６９±２５．４９％まで増加した。最も顕著な変化は、しかしながら、３日目から７日目に観察された。この間に、細胞数は、従来のｅＰＣＬ足場上で、７日目（１日目に正規化されるように）で１３７．３５±３．１４％まで増加し、一方でボール状のｅＰＣＬ足場の値は、１７８．９６±３７．０９％まで急増した。これらの結果は、図２．５の定量的組織学画像との組み合わせで、細胞浸潤および成長の増加に対する、綿ボール状のｅＰＣＬ足場の影響を強く示した。高い初期播種密度のために、従来のｅＰＣＬ足場上の細胞は、３日目までに、足場の表面上の利用可能な空間を埋めるように素早く増殖し、その後、成長の速度は、少ない細胞浸潤のために減速する。したがって、従来のｅＰＣＬ足場上での３日目から７日目の成長はわずか約１１％であった。一方で、三次元性を有する綿ボール状のｅＰＣＬ足場の、より厚く、より開放的で、多孔性のナノ繊維網目（図２．２ｂ）は、連続的な細胞浸潤のための空間（図２．５ｂ、２．５ｄ、および２．５ｆ）および全体的な成長を可能にし、３日目から７日目に付着細胞数の約３７％の増加をもたらした。これらの累積データは、綿ボール状のｅＰＣＬ足場が、従来のｅＰＣＬ足場よりも、細胞浸潤および成長のためのより良好なホスト環境を提供することを決定的に証明した。
【００７４】
結論：
現在の静電紡糸技術は、安定した、三次元のナノ繊維構造を有する、深く、相互に連結する細孔を同時に提供しない。この問題に取り組むために、金属プローブの埋め込み配列を有する皿を使用して、綿ボール状の構造体の中に共に結集する、ｅＰＣＬナノ繊維の集中的な蓄積を作り出す、静電紡糸技術を開発した。ＳＥＭおよび共焦点顕微鏡は、より多孔性の、広範囲のナノ繊維足場を示した。組織学および定量的な細胞の成長は、従来のｅＰＣＬ足場よりも、増加した綿ボール状の足場の細胞の浸透性ならびに増殖を示した。この戦略は、静電紡糸プロセスに直面する現在の課題を克服するための新しい解決策を提供し、広い範囲の組織工学的応用にわたる大きな潜在性を有する。
【００７５】
それぞれ参照により本明細書に組み込まれる参考文献
[1] Gupta D, Venugopal J, Mitra S, Dev VG, Ramakrishna S. Nanostructured biocomposite substrates by electrospinning and electrospraying for the mineralization of osteoblasts. Biomaterials. 2009;30(11):2085-94. 
[2] Shin M, Yoshimoto H, Vacanti J. In vivo bone tissue engineering using mesenchymal stem cells on a novel electrospun nanofibrous scaffold. Tissue Eng. 2004;10(1-2):33-41. 
[3] Zhang Y, Venugopal J, El-Turki A, Tamakrishna S, Su B, Lim C. Electrospun biomimetic nanocomposite nanofibers of hydroxyapatite/chitosan for bone tissue engineering. Biomaterials. 2008;29(32):4314-22. 
[4] Tortelli F, Cancedda R. Three-Dimensional Cultures of Osteogenic and Chondrogenic Cells: A Tissue Engineering Approach to Mimic Bone and Cartilage In Vitro. Eur Cells Mater. 2009;17:1-14. 
[5] Chen J, Xu J, Wang A, Zheng M. Scaffolds for tendon and ligament repair: review of the efficacy of commercial products. Expert Rev Med Devic. 2009;6(1):61-73. 
[6] Kumbar S, Nukavarapu S, James R, Nair L, Laurencin C. Electrospun poly(lactic acid-co-glycolic acid) scaffolds for skin tissue engineering. Biomaterials. 2008;29(30):4100-7. 
[7] Zhu X, Cui W, Li X, Jin Y. Electrospun fibrous mats with high porosity as potential scaffolds for skin tissue engineering. Biomacromolecules. 2008;9(7):1795-801. 
[8] Prabhakaran M, Venugopal J, Ramakrishna S. Mesenchymal stem cell differentiation to neuronal cells on electrospun nanofibrous substrates for nerve tissue engineering. Biomaterials. 2009;30(28):4996-5003. 
[9] Feng Z, Chu X, Huang N, Wang T, Wang Y, Shi X, et al. The effect of nanofibrous galactosylated chitosan scaffolds on the formation of rat primary hepatocyte aggregates and the maintenance of liver function. Biomaterials. 2009;30(14):2753-63. 
[10] Venugopal J, Ma LL, Yong T, Ramakrishna S. In vitro study of smooth muscle cells on polycaprolactone and collagen nanofibrous matrices. Cell Biol Int. 2005;29(10):861-7. 
[11] Jun I, Jeong S, Shin H. The stimulation of myoblast differentiation by electrically conductive sub-micron fibers. Biomaterials. 2009;30(11):2038-47. 
[12] Shin M, Ishii O, Sueda T, Vacanti JP. Contractile cardiac grafts using a novel nanofibrous mesh. Biomaterials. 2004;25(17):3717-23. 
[13] Wray L, Orwin E. Recreating the microenvironment of the native cornea for tissue engineering applications. Tissue Eng Pt A. 2009;15(7):1463-72. 
[14] Pham QP, Sharma U, Mikos AG. Electrospinning of Polymeric Nanofibers for Tissue Engineering Applications: A Review. Tissue Eng. 2006;12(5):1197-211. 
[15] Li WJ, Jiang YJ, Tuan RS. Chondrocyte Phenotype in Engineered Fibrous Matrix is Regulated by Fiber Size. Tissue Eng. 2006;17(7):1775-85. 
[16] Lowery J, Datta N, Rutledge G. Effect of fiber diameter, pore size and seeding method on growth of human dermal fibroblasts in electrospun poly(epsilon-caprolactone) fibrous mats. Biomaterials. 2010;31(2):491-504. 
[17] Patlolla A, Collins G, Arinzeh TL. Solvent-dependent properties of electrospun fibrous composites for bone tissue regeneration. Acta Biomater. 2010;6(1):90-101. 
[18] Eichhorn SJ, Sampson WW. Statistical geometry of pores and statistics of porous nanofibrous assemblies. J R Soc Interface. 2005;2(4):309-18. 
[19] Thorvaldsson A, Stenhamre H, Gatenholm P, Walkenstrom P. Electrospinning of highly porous scaffolds for cartilage regeneration. Biomacromolecules. 2008;9(3):1044-9. 
[20] Kim T, Chung H, Park T. Macroporous and nanofibrous hyaluronic acid/collagen hybrid scaffold fabricated by concurrent electrospinning and deposition/leaching of salt particles. Acta Biomaterialia. 2008;4(6):1611-9. 
[21] Nam J, Huang Y, Agarwai S, Lannutti J. Improved Cellular Infiltration in Electrospun Fiber via Engineered Porosity. Tissue Eng. 2007;13(9):2249-57. 
[22] Wei H-J, Chen C-H, Lee W-Y, Chiu I, Hwang S-M, Lin W-W, et al. Bioengineered cardiac patch constructed from multilayered mesenchymal stem cells for myocardial repair. Biomaterials. 2008;29(26):3547-56. 
[23] Yang X, Shah JD, Wang H. Nanofiber Enabled Layer-by-Layer Approach Toward Three-Dimensional Tissue Formation. Tissue Eng Pt A. 2009;15(4):945-56. 
[24] Baker BM, Gee AO, Metter RB, Nathan AS, Marklein RA, Burdick JA, et al. The potential to improve cell infiltration in composite fiber-aligned electrospun scaffolds by the selective removal of sacrificial fibers. Biomaterials. 2008;29(15):2348-58. 
[25] Ekaputra A, Prestwich G, Cool S, Hutmacher D. Combining Electrospun Scaffolds with Electrosprayed Hydrogels Leads to Three-Dimensional Cellularization of Hybrid Constructs. Biomacromolecules. 2008;9(8):2097-103.
[26] Baker SC, Atkin N, Gunning PA, Granville N, Wilson K, Wilson D, Southgate J. Characterisation of electrospun polystyrene scaffolds for three-dimensional in vitro biological studies. Biomaterials. 2006; 27(16): 3136-46. 
[27] Tambralli A, Blakeney B, Anderson J, Kushwaha M, Andukuri A, Dean D, et al. A hybrid biomimetic scaffold composed of electrospun polycaprolactone nanofibers and self-assembled peptide amphiphile nanofibers. Biofabrication. 2009;1(2):025001. 
[28] Murugan R, Ramakrishna S. Design strategies of tissue engineering scaffolds with controlled fiber orientation. Tissue Eng. 2007;13(8):1845-66. 
[29] Yang S, Leong KF, Du Z, Chua CK. The design of scaffolds for use in tissue engineering: I. Traditional Factors. Tissue Eng. 2001;7(6):679-89. 
[30] Choi JS, Lee SJ, Chris GJ, Atala A, Yoo JJ. The influence of electrospun aligned poly(epsilon-caprolactone)/collagen nanofiber meshes on the formation of self-aligned skeletal muscle myotubes. Biomaterials. 2008;29(19):2899-906. 
[31] Li WJ, Danielson KG, Alexander PG, Tuan RS. Biological response of chondrocytes cultured in three-dimensional nanofibrous poly(epsilon-caprolactone) scaffolds. J Biomed Mater Res A. 2003;67(4):1105-14. 
[32] Li WJ, Tuli R, Okafor C, Derfoul A, Danielson KG, Hall DJ, et al. A three-dimensional nanofibrous scaffold for cartilage tissue engineering using human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 2005;26(6):599-609. 
[33] Ma Z, He W, Yong T, Ramakrishna S. Grafting of gelatin on electrospun poly(caprolactone) nanofibers to improve endothelial cell spreading and proliferation and to control cell orientation. Tissue Eng. 2005;11(7-8):1149-58. 
[34] Yoshimoto H, Shin YM, Terai H, Vacanti JP. A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering. Biomaterials. 2003;24(12):2077-82. 
[35] Zhang YZ, Venugopal J, Huang ZM, Lim CT, Ramakrishna S. Characterization of the surface biocompatibility of the electrospun PCL-collagen nanofibers using fibroblasts. Biomacromolecules. 2005;6(5):2583-9. 
[36] Asfari M, Janjic D, Meda P, Li G, Halban PA, Wollheim CB. Establishment of 2-mercaptoethanol-dependent differentiated insulin-secreting cell lines. Endocrinology. 1992;130(1):167-78. 
[37] Hohmeier HE, Mulder H, Chen G, Henkel-Rieger R, Prentki M, Newgard CB. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 2000;49(3):424-30. 
[38] Yang S, Fransson U, Fagerhus L, Holst LS, Hohmeier HE, Renstrom R, et al. Enhanced cAMP protein kinase A signaling determines improved insulin secretion in a clonal insulin-producing deta-cell line (INS-1 832/13). Mol Endocrinol. 2004;18(9):2312-20. 
[39] Daley WP, Peters SB, Larsen M. Extracellular matrix dynamics in development and regenerative medicine. J Cell Sci. 2008;121(Pt 3):255-64. 
[40] Hubbell JA. Materials as morphogenetic guides in tissue engineering. Curr Opin Biotechnol. 2003;14(5):551-8. 
[41] Kleinman HK, Philip D, Hoffman MP. Role of the extracellular matrix in morphogenesis. Curr Opin Biotechnol. 2003;14(5):526-32. 
[42] Streuli C. Extracellular matrix remodeling and cellular differentiation. Curr Opin Cell Biol. 1999;11(5):643-40. 
[43] Kwon IK, Kidoaki S, Matsuda T. Electrospun nano- to microfiber fabrics made of biodegradable copolyesters: structural characteristics, mechanical properties and cell adhesion potential. Biomaterials. 2005;26(18):3929-39. 
[44] Elsdale T, Bard J. Collagen substrata for studies on cell behavior. J Cell Biol. 1972;54(3):626-37. 
[45] Karageorgiou V, Kaplan D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Biomaterials. 2005;26(27):5474-91. 
[46] Telemeco TA, Ayres C, Bowlin GL, Wnek GE, Boland ED, Cohen N, et al. Regulation of cellular infiltration into tissue engineering scaffolds composed of submicron diameter fibrils produced by electrospinning. Acta Biomater. 2005;1(4):377-85.
【００７６】
割合、濃度、量、および他の数値的データは、本明細書において、範囲形式で表されることに留意されたい。このような範囲形式は、便宜および簡潔さのために使用され、したがって、範囲の限度として明確に記載される数値だけでなく、各数値および副範囲内に明確に記載されるように、その範囲内に包含される全ての独立した数値または副範囲もまた含むように、柔軟な様式で解釈されるべきであることを理解されたい。説明として、濃度範囲「約０．１％から約５％」は、明確に記載される０．１重量％から約５重量％までの濃度だけでなく、示される範囲内の独立した濃度（例えば、１％、２％、３％、および４％）ならびに副範囲（例えば、０．５％、１．１％、２．２％、３．３％、および４．４％）もまた含むように解釈されるべきである。一実施形態において、用語「約」は、数値の有効数字により従来の丸めを含んでもよい。さらに、語句「約『ｘ』から『ｙ』」は、「約『ｘ』から約『ｙ』」を含む。
【００７７】
上述の本開示の実施形態が、単なる実装の可能な例であり、本開示の原理の明確な理解のためだけに記載されることを強調されたい。多数の変形および修正が、本開示の精神および原理から実質的に逸脱することなく、本開示の上述の実施形態になされ得る。全てのこのような修正および変形は、本開示の範囲内に含まれることが意図される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図２．１Ａ】
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【図２．１Ｂ】
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【図２．２Ａ−Ｃ】
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【図２．３】
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【図２．４】
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【図２．５】
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【図２−６】
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【国際調査報告】
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