(57)【要約】本発明は、活性薬学的成分（ＡＰＩ）としてのインスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）タンパク質、等張化剤および緩衝剤を含む薬学的組成物に関する。この組成物は、注射または輸液として投与されることがあり、神経変性障害、特にアルツハイマー病（ＡＤ）、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、特に筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）もしくは脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、または筋ジストロフィー（ＭＤ）、特にデュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）もしくは筋緊張性ジストロフィー（ＭＭＤ）の治療、予防および／または進行の遅延に特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＧＦ−Ｉタンパク質、等張化剤および緩衝剤を含む薬学的組成物。
【請求項２】
緩衝剤が、ヒスチジン、クエン酸、酢酸またはコハク酸緩衝剤であり、ｐＨが、４．５から６．５の間である、請求項１記載の薬学的組成物。
【請求項３】
ｐＨが、５．０から６．０の間である、請求項１〜２のいずれか記載の薬学的組成物。
【請求項４】
緩衝剤が、５〜１００mMのクエン酸緩衝液である、請求項１〜３のいずれか記載の薬学的組成物。
【請求項５】
緩衝剤が、５〜１００mMのヒスチジン緩衝液である、請求項１〜３のいずれか記載の薬学的組成物。
【請求項６】
等張化剤が、アミノ酸、糖またはその組み合わせである、請求項１〜５のいずれか記載の薬学的組成物。
【請求項７】
等張化剤が、濃度１０〜１０００mMのトレハロース、スクロースもしくはアルギニン、またはその組み合わせである、請求項１〜６のいずれか記載の薬学的組成物。
【請求項８】
等張化剤が、濃度５０〜３００mMのアルギニンである、請求項１〜７のいずれか記載の薬学的組成物。
【請求項９】
界面活性剤をさらに含む、請求項１〜８のいずれか記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
界面活性剤が、ポリソルベートもしくはポロキサマー、またはその組み合わせである、請求項９記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
界面活性剤が、濃度０．００１〜１％(w/w)のポリソルベート２０、ポリソルベート８０またはポロキサマー１８８である、請求項９〜１０のいずれか記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
抗酸化剤をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
抗酸化剤が、濃度１〜５０mMのメチオニンである、請求項１１記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
ＩＧＦ−Ｉタンパク質がＩＧＦ−Ｉ変異体であって、該変異体が、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列（配列番号１）由来であり、アミノ酸位置２７、６５および６８の１個または２個のリシンがアルギニンであるように位置２７、６５および６８に１個または２個のアミノ酸変化を有することを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
ＩＧＦ−Ｉタンパク質がＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートである、請求項１〜１４のいずれか記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
前記ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートが、Ｋ６８でモノＰＥＧ化されており、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列のアミノ酸変化Ｋ２７ＲおよびＫ６５Ｒ（配列番号２）によって特徴づけられる、請求項１５記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
前記ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートが、Ｋ６５でモノＰＥＧ化されており、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列のアミノ酸変化Ｋ２７ＲおよびＫ６８Ｒ（配列番号３）によって特徴づけられる、請求項１５記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
前記ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートの各ＰＥＧが、２０〜１００kDaの全体の分子量を有する、請求項１５〜１７のいずれか記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
前記ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートの各ＰＥＧが、分岐状ＰＥＧである、請求項１５〜１８のいずれか記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
ＩＧＦ−Ｉタンパク質が、濃度０．１〜５０mg/mlで存在する、請求項１〜１９のいずれか記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
ＩＧＦ−Ｉタンパク質が、濃度１〜２０mg/mlで存在する、請求項１〜２０のいずれか記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
粘性が、４０mPa・s未満である、請求項１〜２１のいずれか記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
Ｋ６８でモノＰＥＧ化されているＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートであって、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列のアミノ酸変化Ｋ２７ＲおよびＫ６５Ｒ（配列番号２）によって特徴づけられる濃度０．１〜１０mg/mlのＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲート、濃度５０〜５００mMのアルギニン、濃度０．００１〜０．０１％(w/w)のポリソルベート２０、ならびに濃度１〜１００mMのメチオニンをｐＨ５．０〜６．０の５〜１００mMヒスチジン緩衝液中に含む、請求項１〜２２のいずれか記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
Ｋ６８でモノＰＥＧ化されているＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートであって、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列のアミノ酸変化Ｋ２７ＲおよびＫ６５Ｒ（配列番号２）によって特徴づけられる濃度１〜２０mg/mlのＰＥＧ化ＩＧＦ−ＩコンジュゲートをｐＨ５．０〜６．０の５〜１００mMヒスチジン緩衝液中に含み、さらに、以下の群：
５０〜５００mMトレハロース；
５０〜５００mMトレハロースおよび０．００１〜０．１％(w/w)のポロキサマー１８８；
５０〜５００mMトレハロースおよび０．００１〜０．１％(w/w)のポリソルベート８０または２０；
５０〜５００mMトレハロース、０．００１〜０．１％(w/w)のポリソルベート８０または２０、および１〜１００mMメチオニン；
５０〜５００mMスクロース；
５０〜５００mMスクロースおよび０．００１〜０．１％(w/w)のポロキサマー１８８；
５０〜５００mMスクロースおよび０．００１〜０．１％(w/w)のポリソルベート８０または２０；
５０〜５００mMスクロース、０．００１〜０．１％(w/w)のポリソルベート８０または２０、および１〜１００mMメチオニン；
５０〜５００mMアルギニン；
５０〜５００mMアルギニンおよび０．００１〜０．１％(w/w)のポロキサマー１８８；
５０〜５００mMアルギニンおよび０．００１〜０．１％(w/w)のポリソルベート８０または２０；ならびに
５０〜５００mMアルギニン、０．００１〜０．１％(w/w)のポリソルベート８０または２０、および１〜１００mMメチオニン
より選択される等張化剤、随意の界面活性剤および随意の抗酸化剤の組み合わせを含む、請求項１〜２２のいずれか記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
Ｋ６８でモノＰＥＧ化されているＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートであって、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列のアミノ酸変化Ｋ２７ＲおよびＫ６５Ｒ（配列番号２）によって特徴づけられる濃度１〜２０mg/mlのＰＥＧ化ＩＧＦ−ＩコンジュゲートをｐＨ５．０〜６．０の５〜１００mMクエン酸緩衝液中に含み、さらに、以下の群：
５０〜５００mMトレハロース；
５０〜５００mMトレハロースおよび０．００１〜０．１％(w/w)のポロキサマー１８８；
５０〜５００mMトレハロースおよび０．００１〜０．１％(w/w)のポリソルベート８０または２０；
５０〜５００mMトレハロース、０．００１〜０．１％(w/w)のポリソルベート８０または２０、および１〜１００mMメチオニン；
５０〜５００mMスクロース；
５０〜５００mMスクロースおよび０．００１〜０．１％(w/w)のポロキサマー１８８；
５０〜５００mMスクロースおよび０．００１〜０．１％(w/w)のポリソルベート８０または２０；
５０〜５００mMスクロース、０．００１〜０．１％(w/w)のポリソルベート８０または２０、および１〜１００mMメチオニン；
５０〜５００mMアルギニン；
５０〜５００mMアルギニンおよび０．００１〜０．１％(w/w)のポロキサマー１８８；
５０〜５００mMアルギニンおよび０．００１〜０．１％(w/w)のポリソルベート８０または２０；ならびに
５０〜５００mMアルギニン、０．００１〜０．１％(w/w)のポリソルベート８０または２０、および１〜１００mMメチオニン
より選択される等張化剤、随意の界面活性剤および随意の抗酸化剤の組み合わせを含む、請求項１〜２２のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
Ｋ６８でモノＰＥＧ化されているＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートであって、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列のアミノ酸変化Ｋ２７ＲおよびＫ６５Ｒ（配列番号２）によって特徴づけられる濃度１〜２０mg/mlのＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲート、濃度５０〜５００mMのアルギニン、ならびに濃度０．００１〜０．１％(w/w)のポロキサマー１８８をｐＨ５．０〜６．０の５〜１００mMクエン酸緩衝液中に含む、請求項１〜２２のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
Ｋ６８でモノＰＥＧ化されているＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートであって、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列のアミノ酸変化Ｋ２７ＲおよびＫ６５Ｒ（配列番号２）によって特徴づけられる濃度５〜２０mg/mlのＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲート、濃度１００〜２００mMのトレハロースまたはスクロース、ならびに濃度０．０１〜０．０４％(w/w)のポリソルベート８０または２０をｐＨ５．０〜６．０の１０〜４０mMのヒスチジン緩衝液またはクエン酸緩衝液中に含む、請求項１〜２２のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
液体形態であるか、凍結乾燥された組成物であるか、または再構成された組成物である、請求項１〜２７のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
非経口的に、好ましくは静脈内（i.v.）または皮下（s.c.）ボーラス注射として投与することができる、請求項１〜２８のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
ＩＧＦ−Ｉタンパク質溶液が、薬学的組成物に使用されることが意図された緩衝液に対して透析され、所望の最終タンパク質濃度が濃縮または希釈によって調整される、請求項１〜２９のいずれか記載の薬学的組成物を調製するための方法。
【請求項３１】
神経変性障害、特にアルツハイマー病（ＡＤ）、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、特に筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）もしくは脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、または筋ジストロフィー（ＭＤ）、特にデュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）もしくは筋緊張性ジストロフィー（ＭＭＤ）の治療、予防および／または進行の遅延のための医薬を製造するための、請求項１〜３０のいずれか一項記載の薬学的組成物の使用。
【請求項３２】
本明細書に前述の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性薬学的成分（ＡＰＩ）としてのインスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）タンパク質、等張化剤および緩衝剤を含む薬学的組成物に関する。ＩＧＦ−Ｉタンパク質は、さらに、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）とコンジュゲーションされていることがある。この組成物は、注射または輸液として投与されることがあり、神経変性障害、特にアルツハイマー病（ＡＤ）、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、特に筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）もしくは脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、または筋ジストロフィー（ＭＤ）、特にデュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）もしくは筋緊張性ジストロフィー（ＭＭＤ）の治療、予防および／または進行の遅延に特に有用である。
【０００２】
インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）は、インスリンに構造的に関係する循環タンパク同化ホルモンである。ＩＧＦ−Ｉは、従来より末梢組織に及ぼす成長ホルモンの作用の主要な仲介因子と見なされていた。ＩＧＦ−Ｉは、７０個のアミノ酸から成り、ソマトメジンＣとも名付けられ、SwissProt No. P01343によって定義されている。使用、活性および生産は、例えばle Bouc, Y., et al., FEBS Lett. 196 (1986) 108-112; de Pagter-Holthuizen, P., et al., FEBS Lett. 195 (1986) 179-184; Sandberg Nordqvist, A.C., et al., Brain Res. Mol. Brain Res. 12 (1992) 275-277; Steenbergh, P.H., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 175 (1991) 507-514; Tanner, J.M., et al., Acta Endocrinol. (Copenh.) 84 (1977) 681-696; Uthne, K., et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 39 (1974) 548-554; EP 0 123 228; EP 0 128 733；米国特許第５，８６１，３７３号；米国特許第５，７１４，４６０号；EP 0 597 033；国際公開公報第０２／３２４４９号；国際公開公報第９３／０２６９５号に言及されている。
【０００３】
ＩＧＦ−Ｉ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）によるＩＧＦ−Ｉ機能のモデュレーションならびにＩＧＦ−Ｉのｉｎ  ｖｉｖｏ産生および発生に関するさらなる情報は、国際公開公報第２００６／０６６８９１号および国際公開公報第２００９／１２１７５９号に記載されている。これらの参考文献は、さらに、中枢神経系（ＣＮＳ）におけるＩＧＦ−Ｉの吸収、機能および治療応用を記載している。神経変性障害、特にアルツハイマー病（ＡＤ）の治療、予防および／または進行の遅延のためのＩＧＦ−Ｉの使用は、国際公開公報第２００６／０６６８９１号に記載されている。神経筋障害の治療、予防および／または進行の遅延のためのＩＧＦ−Ｉの使用は、国際公開公報第２００９／１２１７５９号に記載されている。ＩＧＦ−Ｉが運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、特に筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）もしくは脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）または筋ジストロフィー（ＭＤ）、特にデュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）もしくは筋緊張性ジストロフィー（ＭＭＤ）の処置に有用であることが、そこに記載されている。
【０００４】
国際公開公報第２００６／０６６８９１号は、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−Ｉ）変異体および１個または２個のポリ（エチレングリコール）基からなるＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートを開示している。記載されたＩＧＦ−Ｉ変異体は、野生型ＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列のアミノ酸位置２７、３７、６５および６８の最大３個のアミノ酸の１個または２個がリシンであり、アミノ酸２７が極性アミノ酸であるがリシンではないように該アミノ酸位置にアミノ酸変化を有する。該ＩＧＦ−Ｉ変異体は、該リシンの第一級アミノ基を介してＰＥＧにコンジュゲーションし、該ポリ（エチレングリコール）基は、２０〜１００kDaの全体の分子量を有する。
【０００５】
国際公開公報第２００９／１２１７５９号に開示されたＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートは、ＩＧＦ−Ｉ変異体が野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列由来であり、アミノ酸位置２７、６５および６８のアミノ酸の１個または２個が極性アミノ酸であるがリシンではないように位置２７、６５および６８に１個または２個のアミノ酸変化を有し、ＰＥＧが少なくとも１個のリシン残基に結合していることを特徴とする、そのＩＧＦ−Ｉ変異体を含む。
【０００６】
特に示さない限り、本明細書において本発明を記載するために使用される様々な用語の意味および範囲を説明および定義するために、以下の定義を述べる。
【０００７】
本明細書に使用される「ＩＧＦ−Ｉタンパク質」という用語は、野生型、任意の種類の変異型およびそのＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートとしてのインスリン様成長因子Ｉを表す。
【０００８】
本明細書に使用される「ＩＧＦ−Ｉ変異体」という用語は、野生型ＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸位置２７、６５および／または６８にアミノ酸変化を有することを特徴とするＩＧＦ−Ｉタンパク質を表す。そのようなＩＧＦ−Ｉ変異体は、ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体を製造するための中間体として有用である。ＩＧＦ−Ｉ変異体は、以下のように名付けられる：Ｋ２７は、アミノ酸２７がリシンであることを意味し、Ｋ６５は、アミノ酸６５がリシンであることを意味し、Ｋ６８は、アミノ酸６８がリシンであることを意味し、Ｒ２７は、アミノ酸２７がアルギニンであることを意味し、Ｒ６５は、アミノ酸６５がアルギニンであることを意味し、Ｒ６８は、アミノ酸６８がアルギニンであることを意味し、Ｋ２７Ｒは、配列番号１のアミノ酸位置２７のリシンがアルギニンに変化していることを意味し、Ｋ６５Ｒは、配列番号１のアミノ酸位置６５のリシンがアルギニンに変化していることを意味し、Ｋ６８Ｒは、配列番号１のアミノ酸位置２８のリシンがアルギニンに変化していることを意味する等。
【０００９】
本明細書に使用される「極性アミノ酸」は、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、およびトレオニン（Ｔ）からなる群より選択されるアミノ酸を表す。リシンもまた極性アミノ酸であるが、リシンが本発明にしたがって置換されるので、除外される。アルギニンが、好ましくは極性アミノ酸として使用される。
【００１０】
本明細書に使用される「ポリ（エチレングリコール）」（または「ＰＥＧ」）という用語は、必須部分としてポリ（エチレングリコール）を含有する残基を意味する。そのようなＰＥＧは、さらに、結合反応に必要な化学基、分子の化学合成から生じた化学基、または分子の部分を相互に最適な距離にするためのスペーサーである化学基を含有することがある。加えて、そのようなＰＥＧは、一緒に連結した一つまたは複数のＰＥＧ側鎖からなることがある。一つよりも多いＰＥＧ鎖を有するそのようなＰＥＧは、分岐状と呼ばれる。好ましくはＰＥＧは、少なくとも２０kDa、より好ましくは約２０〜１００kDa、特に好ましくは２０〜８０kDaの全体の分子量を有する。ＰＥＧは、好ましくは分岐状である。
【００１１】
本明細書に使用される「ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体」は、ＩＧＦ−Ｉ変異体が、ＩＧＦ−Ｉ変異体分子の１個または２個のリシンへのアミノ反応性カップリングによって１個または２個のポリ（エチレングリコール）基に共有結合していることを意味する。ＰＥＧ基は、リシン側鎖の第一級ε−アミノ基であるＩＧＦ−Ｉ変異体分子部位に共有結合している。さらに、ＰＥＧ化がＮ末端のα−アミノ基にもさらに存在することが可能である。使用される合成法および変異体が原因で、ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体は、Ｋ６５、Ｋ６８および／またはＫ２７でＰＥＧ化され、Ｎ末端をＰＥＧ化されているかまたはされていないＩＧＦ−Ｉ変異体混合物からなることがある。ここで、ＰＥＧ化部位は、異なる分子では異なることがあるか、または１分子あたりのポリ（エチレングリコール）側鎖の量および／もしくは分子中のＰＥＧ化部位に関して実質的に均一でありうる。好ましくは、ＩＧＦ−Ｉ変異体は、モノＰＥＧ化されている。
【００１２】
好ましいＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体は、野生型ＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列（配列番号１）の以下のアミノ酸変化によって特徴づけられるリコンビナントヒトＩＧＦ−Ｉ変異体のＰＥＧ化形態である：
Ｋ２７ＲおよびＫ６５Ｒ（配列番号２）；
Ｋ２７ＲおよびＫ６８Ｒ（配列番号３）。
【００１３】
Ｋ６８でのモノＰＥＧ化によって特徴づけられる、アミノ酸変化Ｋ２７ＲおよびＫ６５Ｒを有するリコンビナントヒトＩＧＦ−Ｉ変異体（配列番号２）のＰＥＧ化形態が特に好まれる。
【００１４】
また、上記リシン−ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体およびＮ末端ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の組成物であって、それらのＩＧＦ−Ｉ変異体が、一次アミノ酸配列に関して同一であり、そして位置２７、６５および６８のアミノ酸の１個または２個が極性アミノ酸であるがリシンではないように、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸位置２７、６５および６８に１個または２個のアミノ酸変化を有することにおいて同一である組成物も好まれる。好ましくは、分子比は９：１〜１：９である（比は、リシン−ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体／Ｎ末端ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体を意味する）。さらに好ましいのは、モル比が少なくとも１：１（１部のＮ末端ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体あたり少なくとも１部のリシン−ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体）、好ましくは少なくとも６：４（４部のＮ末端ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体あたり少なくとも６部のリシン−ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体）の組成物である。好ましくは、リシン−ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体およびＮ末端ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の両方がモノＰＥＧ化されている。好ましくは、この組成物において変異体は、リシン−ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体およびＮ末端ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の両方で同一である。
【００１５】
配列番号２および３によるリコンビナントヒトＩＧＦ−Ｉ変異体の好ましいＰＥＧ化形態は、国際公開公報第２００８／０２５５２８号に記載されたような、リシン−ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉまたはリシン−ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の製造方法に従うときに入手可能であり、ここで該変異体は、リシン２７、６５および／または６８からなる群より選択される１個または２個のアミノ酸が別の極性アミノ酸によって独立して置換されたものを含む。国際公開公報第２００８／０２５５２８号に記載された方法は、Ｎ末端ＰＥＧ化を有さない、配列番号２および３によるリコンビナントヒトＩＧＦ−Ｉ変異体の調製を可能にする。
【００１６】
ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体が、Ｎ末端で最大３個（好ましくは３個全部）のアミノ酸がトランケーションされた変異体であることがさらに好ましい。それぞれの野生型突然変異体は、Ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉと名付けられ、それは、Ｎ末端からアミノ酸残基グリシン、プロリンおよびグルタミン酸を欠如している（Kummer, A., et al., Int. J. Exp. Diabesity Res. 4 (2003) 45-57）。
【００１７】
本明細書に使用される「ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲート」という用語は、ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体について記載されたような、１個または２個のＰＥＧに共有結合されたＩＧＦ−Ｉ変異体を表す。
【００１８】
本明細書に使用される「モノＰＥＧ化」は、ＩＧＦ−Ｉ変異体がＩＧＦ−Ｉ変異体１分子あたり１個だけのリシンでＰＥＧ化され、１個だけのＰＥＧ基がこの部位で共有結合していることを意味する。純粋なモノＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体（Ｎ末端ＰＥＧ化を有さない）は、調製物の少なくとも８０％、好ましくは９０％であり、最も好ましくはモノＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体は、調製物の９２％以上であり、残りは例えば未反応の（非ＰＥＧ化）ＩＧＦ−Ｉおよび／またはＮ末端ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体である。したがって、本発明によるモノＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体調製物は、例えば薬学的適用において均一な調製物の利点を示すために十分なほど均一である。同じことが、ジＰＥＧ化化学種にあてはまる。
【００１９】
本明細書に使用される「実質的に均一な」は、製造、含有または使用されたＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体分子が、１個または２個のＰＥＧ基が結合した分子だけであることを意味する。調製物は、少量の未反応（すなわちＰＥＧ基を欠如する）タンパク質を含有することがある。ペプチドマッピングおよびＮ末端配列決定によって確認されるように、下記一実施例により、少なくとも９０％のＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートおよび多くても５％の未反応タンパク質である調製物が用意される。ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体のそのような均一調製物の単離および精製は、通常の精製法、好ましくはサイズ排除クロマトグラフィーによって行うことができる。
【００２０】
本明細書に使用される「薬学的組成物」（または「組成物」）という用語は、例えば治療有効量の活性薬学的成分を、薬学的に許容されうる賦形剤と一緒に含有する、それを必要とする哺乳動物、例えばヒトに投与されるべき混合物または溶液を意味する。
【００２１】
「凍結乾燥された組成物」（または「凍結乾燥組成物（lyocomposition）」）という用語は、液体組成物の凍結乾燥方法によって入手されるかまたは入手可能な組成物を表す。典型的かつ好ましくは、それは、５％未満、好ましくは３％未満の水分含量を有する固体組成物である。
【００２２】
本明細書に使用される「凍結乾燥」という用語は、物質を凍結し、次に水の濃度を生物学的反応も化学反応も支持しないレベルまで昇華および／または蒸発によって減少させる方法を表す。
【００２３】
本明細書に使用される「凍結乾燥物」または「凍結乾燥された形態」という用語は、凍結乾燥によって得られた、５％未満の水分含量を有する、固体形態の物質または組成物を表す。
【００２４】
本発明による組成物に関連して本明細書に使用される「再構成された組成物」という用語は、再構成媒質の添加によって再溶解された、凍結乾燥された組成物を意味する。再構成媒質は、非限定的に、注射用水（ＷＦＩ）、注射用静菌水（bacteriostatic water for injection）（ＢＷＦＩ）、塩化ナトリウム溶液（例えば０．９％(w/v)ＮａＣｌ）、グルコース溶液（例えば５％グルコース）、界面活性剤含有溶液（例えば０．０１％ポリソルベート２０）、またはｐＨ緩衝溶液（例えばリン酸緩衝溶液）を含む。
【００２５】
「活性薬学的成分」（または「ＡＰＩ」）は、薬学的組成物中の生物学的に活性な物質である。
【００２６】
「薬学的に許容されうる賦形剤」という用語は、医薬品の製剤化に使用される、崩壊剤、結合剤、増量剤、緩衝剤、等張化剤、安定化剤、抗酸化剤、界面活性剤または滑沢剤などの治療活性を有さず無毒な任意の成分を表す。それらは、米国食品医薬品局によって公表された基準などの確立された政府機関の基準にしたがうとき、一般にヒトへの投与に安全である。
【００２７】
本明細書に使用される「緩衝剤」という用語は、製剤のｐＨを安定化する、薬学的に許容される賦形剤を意味する。適切な緩衝剤は、当技術分野において周知であり、文献から見出すことができる。薬学的に許容される好ましい緩衝剤は、非限定的に、ヒスチジン緩衝剤、クエン酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、酢酸緩衝剤およびリン酸緩衝剤を含む。最も好ましい緩衝剤は、クエン酸塩、Ｌ−ヒスチジン、またはＬ−ヒスチジンとＬ−ヒスチジン塩酸塩の混合物を含む。他の好ましい緩衝剤は、酢酸緩衝剤である。使用される緩衝剤とは独立して、当技術分野において公知の酸または塩基、例えば塩酸、酢酸、リン酸、硫酸ならびにクエン酸、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムを用いてｐＨを調整することができる。
【００２８】
本明細書に使用される「等張化剤」という用語は、組成物の張性をモデュレーションするために使用される、薬学的に許容されうる賦形剤を意味する。一般に張性は、通常はヒト血清に比べた溶液の浸透圧に関する。組成物は、低張、等張または高張でありうる。組成物は、好ましくは等張である。等張性組成物は、液体であるか、または固体形態から、例えば凍結乾燥された形態から再構成された液体であり、生理食塩溶液および血清などのある他の被比較溶液と同じ張性を有する溶液を意味する。適切な等張化剤は、非限定的にアミノ酸および糖を含む。好ましい等張化剤は、トレハロース、スクロースまたはアルギニンである。
【００２９】
「張性」は、半透膜によって分離された二つの溶液の浸透圧の尺度である。浸透圧は、半透膜を通過する水の内向き流を阻止するために溶液に適用しなければならない圧力である。膜を通過できない溶質だけが浸透圧を及ぼすので、浸透圧および張性はこれらによってのみ影響される。膜を自由に通過する溶質は、膜の両側で常に等濃度であることから、それらは張性に影響しない。
【００３０】
等張化剤または安定化剤に関連して「アミノ酸」という用語は、カルボキシル基のα−位に位置するアミノ部分を有する、薬学的に許容されうる有機分子を意味する。アミノ酸の例には、アルギニン、グリシン、オミチン（omithine）、リシン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸（asparagic acid）、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリンが挙げられる。等張化剤または安定化剤に関連して好ましいアミノ酸は、アルギニンである。
【００３１】
本明細書に使用される「糖」という用語は、単糖またはオリゴ糖を意味する。単糖は、単糖類（simple sugars）およびその誘導体、例えばアミノ糖を含めた、酸によって加水分解可能でないモノマー性糖質である。単糖の例には、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、ソルボース、リボース、デオキシリボース、ノイラミン酸が挙げられる。オリゴ糖は、グリコシド結合を介して結合した一つを超えるモノマー性糖ユニットからなる、分岐状または鎖状のいずれかの糖質である。オリゴ糖内のモノマー性糖ユニットは、同一または異なることがありうる。モノマー性糖ユニットの数に応じて、オリゴ糖は、二糖、三糖、四糖、五糖などである。多糖とは対照的に、単糖およびオリゴ糖は水溶性である。オリゴ糖の例には、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトースおよびラフィノースが挙げられる。好ましい糖は、スクロースおよびトレハロースであり、最も好ましいのはトレハロースである。
【００３２】
本明細書に使用される「界面活性剤」という用語は、タンパク質組成物を撹拌および剪断のような機械的応力から保護するために使用される、薬学的に許容されうる賦形剤を意味する。薬学的に許容される界面活性剤の例には、ポロキサマー、ポリソルベート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Brij）、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル（Triton-X）またはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が挙げられる。好ましい界面活性剤は、ポリソルベートおよびポロキサマーである。
【００３３】
本明細書に使用される「ポリソルベート」という用語は、ソルビトールのオレイン酸エステルおよびその無水物が、典型的にはエチレンオキシドと共重合したものを表す。好ましいポリソルベートは、ポリソルベート２０（ポリ（エチレンオキシド）（２０）ソルビタンモノラウレート、Tween20）またはポリソルベート８０（ポリ（エチレンオキシド）（８０）ソルビタンモノラウレート、Tween80）である。
【００３４】
本明細書に使用される「ポロキサマー」という用語は、ポリ（プロピレンオキシド）（ＰＰＯ）の中心疎水性鎖が２本のポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）の親水性鎖によって隣接されたものから構成される、非イオン性トリブロックコポリマーを表し、各ＰＰＯまたはＰＥＯ鎖は、異なる分子量でありうる。ポロキサマーは、また、商品名Pluronicsによって知られている。好ましいポロキサマーは、ポロキサマー１８８であって、それは、ＰＰＯ鎖が分子量１８００g/molを有し、ＰＥＯ含量が８０％(w/w)のポロキサマーである。
【００３５】
「抗酸化剤」という用語は、活性薬学的成分の酸化を防止する、薬学的に許容されうる賦形剤を意味する。抗酸化剤は、非限定的にアスコルビン酸、グルタチオン、システイン、メチオニン、クエン酸、ＥＤＴＡを含む。好ましい抗酸化剤はメチオニンである。
【００３６】
本明細書に使用される「神経変性障害」は、対象の神経系の部分の退化を引き起こしているか、または引き起こすおそれのある身体状態を意味し、それには、非限定的にアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、および他の類似の疾患が挙げられる。
【００３７】
「神経筋障害」という用語は、筋肉の機能発揮を直接的（内因性の筋肉病態による）または間接的（神経病態による）のいずれかで障害する疾患を包含する。神経筋障害の例には、非限定的に：
筋萎縮性側索硬化症ＡＬＳ（ルー・ゲーリック病としても知られている）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、脊髄性筋萎縮症１型（ＳＭＡ１、ウェルドニッヒ・ホフマン病）、脊髄性筋萎縮症２型（ＳＭＡ２）、脊髄性筋萎縮症３型（ＳＭＡ３、クーゲルベルク・ヴェランデル病）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ、ケネディー病およびＸ連鎖ＳＢＭＡとしても知られている）のような運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）；または
デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ、偽肥大性としても知られている）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、エメリー・ドライフス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、肢帯筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー（ＦＳＨまたはＦＳＨＤ、ランドウジー・デジェリンとしても知られている）、筋緊張性ジストロフィー（ＭＭＤ、シュタイネルト病としても知られている）、眼咽頭筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、遠位型筋ジストロフィー（ＤＤ、三好型）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）のような筋ジストロフィー（ＭＤ）が挙げられる。
【００３８】
医薬品へのＩＧＦ−Ｉ組成物に関連して認識されている一問題は、ポリペプチドの望まれない凝集、したがって安定性低下である。さらに、ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉの既存の組成物は、低い安定性および増大した粘性を損なうが、その両方が、注射または輸液用薬学的組成物にとって高度に望ましくない作用である。したがって、得られた当該組成物は、低濃度の活性薬学的成分だけを伴った。
【００３９】
したがって、増大したＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ濃度であっても、増大した分子安定性および低下した凝集に繋がり、良好な溶解性および許容されうる粘性を提供する、ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉのための薬学的組成物の必要性がある。
【００４０】
この問題は、本発明にしたがってＩＧＦ−Ｉタンパク質、等張化剤および緩衝剤を含む薬学的組成物を提供することによって解決する。
【００４１】
驚くことに、この組成物中にＩＧＦ−Ｉタンパク質を製剤化することで、冷蔵温度よりも高い温度（２〜８℃）、特に室温（すなわち２５℃未満）で、そしてより高い温度、例えば４０℃であってもその安定性が高まることが見出された。これは、その組成物を冷却せずに長時間、活性の著しい量を失わずに、著しい分解なしに保存できることを意味する。
【００４２】
さらに驚くことに、生理的ｐＨおよび冷蔵温度で組成物へのＩＧＦ−Ｉタンパク質の溶解性をかなり改善することができた。
【００４３】
さらに予想外の作用は、ＩＧＦ−Ｉタンパク質の濃度をかなり増大させる、組成物の全体の粘性低下であった。
【００４４】
好ましい態様では、緩衝剤は、ヒスチジン、クエン酸、酢酸またはコハク酸のいずれかである。最も好ましい緩衝剤は、ヒスチジンまたはクエン酸である。他の好ましい緩衝剤は、酢酸緩衝剤である。
【００４５】
好ましい態様では、緩衝剤は、濃度５〜１００mMを有する。
【００４６】
好ましい態様では、緩衝剤は、５〜１００mMのヒスチジン緩衝液である。
【００４７】
好ましい態様では、緩衝剤は、５〜１００mMのクエン酸緩衝液である。
【００４８】
好ましい態様では、ｐＨは、４．５から６．５の間である。いっそうより好ましいのは、５．０から６．０の間のｐＨである。
【００４９】
好ましい態様では、等張化剤は、アミノ酸、糖またはその組み合わせである。いっそうより好ましい態様では、等張化剤は、好ましくは濃度１０〜１０００mMのトレハロース、スクロースもしくはアルギニン、またはその組み合わせである。最も好ましくは、等張化剤は、スクロース、トレハロースまたはアルギニンである。最も好ましくは、等張化剤は、濃度５０〜３００mMである。
【００５０】
好ましい態様では、薬学的組成物は、さらに界面活性剤を含む。いっそうより好ましい態様では、界面活性剤は、ポリソルベートもしくはポロキサマー、またはその組み合わせである。好ましくは、界面活性剤は、濃度０．００１〜１％(w/w)である。
【００５１】
さらに好ましい態様では、界面活性剤は、好ましくは濃度０．００１〜１％(w/w)のポリソルベート２０、ポリソルベート８０またはポロキサマー１８８である。
【００５２】
さらに好ましい態様では、界面活性剤は、好ましくは濃度０．００１〜０．１％(w/w)、より好ましくは濃度０．０１〜０．１％(w/w)のポリソルベート２０である。
【００５３】
さらに好ましい態様では、界面活性剤は、好ましくは濃度０．００１〜０．１％(w/w)、より好ましくは濃度０．０１〜０．１％(w/w)のポリソルベート８０である。
【００５４】
さらに好ましい態様では、界面活性剤は、好ましくは濃度０．００１〜０．１％(w/w)、より好ましくは濃度０．０１〜０．１％(w/w)のポロキサマー１８８である。
【００５５】
好ましい態様では、薬学的組成物は、さらに抗酸化剤を含む。いっそうより好ましい態様では、抗酸化剤はメチオニンである。好ましい態様では、抗酸化剤は、濃度２〜５０mMである。
【００５６】
好ましい態様では、ＩＧＦ−Ｉタンパク質はＩＧＦ−Ｉ変異体であって、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列（配列番号１）由来であること、およびアミノ酸位置２７、６５および６８の１個または２個のリシンがアルギニンであるように位置２７、６５および６８に１個または２個のアミノ酸変化を有することを特徴とするＩＧＦ−Ｉ変異体である。
【００５７】
好ましい態様では、ＩＧＦ−Ｉタンパク質はＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートである。いっそうより好ましい態様では、該ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートは、Ｋ６８でモノＰＥＧ化されており、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列（配列番号１）の以下のアミノ酸変化によって特徴づけられる：Ｋ２７ＲおよびＫ６５Ｒ（配列番号２）。等しく好ましい態様では、該ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートは、Ｋ６５でモノＰＥＧ化されており、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列（配列番号１）の以下のアミノ酸変化によって特徴づけられる：Ｋ２７ＲおよびＫ６８Ｒ（配列番号３）。
【００５８】
好ましい態様では、該ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートの各ＰＥＧは、２０〜１００kDaの全体の分子量を有する。
【００５９】
好ましい態様では、該ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートの各ＰＥＧは分岐状ＰＥＧである。
【００６０】
さらに好ましい態様では、ＩＧＦ−Ｉタンパク質は、参照により本明細書に組み入れられる国際公開公報第２００６／０６６８９１号または国際公開公報第２００９／１２１７５９号に開示されているＩＧＦ−Ｉ分子、変異体およびＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートより選択される。
【００６１】
好ましい態様では、ＩＧＦ−Ｉタンパク質は、濃度０．１〜５０mg/mlで存在する。いっそうより好ましいのは、ＩＧＦ−Ｉタンパク質が濃度１〜２０mg/mlで存在する態様である。
【００６２】
好ましい態様では、組成物は、Ｋ６８でモノＰＥＧ化されているＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートであって、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列のアミノ酸変化Ｋ２７ＲおよびＫ６５Ｒ（配列番号２）によって特徴づけられる濃度０．１〜１０mg/mlのＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲート、濃度５０〜５００mMのアルギニン、濃度０．００１〜０．０１％(w/w)のポリソルベート２０、ならびに濃度５〜２０mMのメチオニンを、ｐＨ５．０〜６．０の１〜１００mMヒスチジン緩衝剤中に含む。
【００６３】
別の好ましい態様では、組成物は、濃度１〜２０mg/mlのＩＧＦ−Ｉタンパク質、好ましくはＫ６８でモノＰＥＧ化されており、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列のアミノ酸変化Ｋ２７ＲおよびＫ６５Ｒ（配列番号２）によって特徴づけられるＰＥＧ化ＩＧＦ−ＩコンジュゲートをｐＨ５．０〜６．０の５〜１００mMヒスチジン緩衝液中に含み、さらに、以下の群より選択される等張化剤、随意の界面活性剤および随意の抗酸化剤の組み合わせを含む：
５０〜５００mMトレハロース；
５０〜５００mMトレハロースおよび０．００１〜０．１％(w/w)のポロキサマー１８８；
５０〜５００mMトレハロースおよび０．００１〜０．１％(w/w)のポリソルベート８０または２０；
５０〜５００mMトレハロース、０．００１〜０．１％(w/w)のポリソルベート８０または２０、および１〜１００mMメチオニン；
５０〜５００mMスクロース；
５０〜５００mMスクロースおよび０．００１〜０．１％(w/w)のポロキサマー１８８；
５０〜５００mMスクロースおよび０．００１〜０．１％(w/w)のポリソルベート８０または２０）；
５０〜５００mMスクロース、０．００１〜０．１％(w/w)のポリソルベート８０または２０、および１〜１００mMメチオニン；
５０〜５００mMアルギニン；
５０〜５００mMアルギニンおよび０．００１〜０．１％(w/w)のポロキサマー１８８；
５０〜５００mMアルギニンおよび０．００１〜０．１％(w/w)のポリソルベート８０または２０；ならびに
５０〜５００mMアルギニン、０．００１〜０．１％(w/w)のポリソルベート８０または２０、および１〜１００mMメチオニン。
【００６４】
別の好ましい態様では、組成物は、濃度１〜２０mg/mlのＩＧＦ−Ｉタンパク質、好ましくはＫ６８でモノＰＥＧ化されており、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列のアミノ酸変化Ｋ２７ＲおよびＫ６５Ｒ（配列番号２）によって特徴づけられるＰＥＧ化ＩＧＦ−ＩコンジュゲートをｐＨ５．０〜６．０の５〜１００mMクエン酸緩衝液中に含み、さらに、以下の群より選択される等張化剤、随意の界面活性剤および随意の抗酸化剤の組み合わせを含む：
５０〜５００mMトレハロース；
５０〜５００mMトレハロースおよびポロキサマー１８８（０．００１〜０．１％(w/w)）；
５０〜５００mMトレハロースおよび０．００１〜０．１％(w/w)のポリソルベート８０または２０；
５０〜５００mMトレハロース、０．００１〜０．１％(w/w)のポリソルベート８０または２０、および１〜１００mMメチオニン；
５０〜５００mMスクロース；
５０〜５００mMスクロースおよび０．００１〜０．１％(w/w)のポロキサマー１８８；
５０〜５００mMスクロースおよび０．００１〜０．１％(w/w)のポリソルベート８０または２０；
５０〜５００mMスクロース、０．００１〜０．１％(w/w)のポリソルベート８０または２０、および１〜１００mMメチオニン；
５０〜５００mMアルギニン；
５０〜５００mMアルギニンおよび０．００１〜０．１％(w/w)のポロキサマー１８８；
５０〜５００mMアルギニンおよび０．００１〜０．１％(w/w)のポリソルベート８０または２０；ならびに
５０〜５００mMアルギニン、０．００１〜０．１％(w/w)のポリソルベート８０または２０、および１〜１００mMメチオニン。
【００６５】
別の好ましい態様では、組成物は、Ｋ６８でモノＰＥＧ化されているＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートであって、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列のアミノ酸変化Ｋ２７ＲおよびＫ６５Ｒ（配列番号２）によって特徴づけられる濃度１〜２０mg/mlのＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲート、濃度５０〜５００mMのアルギニン、ならびに濃度０．００１〜０．１％(w/w)のポロキサマー１８８をｐＨ５．０〜６．０の５〜１００mMクエン酸緩衝液中に含む。
【００６６】
別の好ましい態様では、組成物は、Ｋ６８でモノＰＥＧ化されているＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートであって、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列のアミノ酸変化Ｋ２７ＲおよびＫ６５Ｒ（配列番号２）によって特徴づけられる濃度５〜２０mg/mlのＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲート、濃度１００〜２００mMのトレハロースまたはスクロース、ならびに濃度０．０１〜０．０４％(w/w)のポリソルベート８０または２０を、１０〜４０mMのヒスチジンまたはクエン酸から調製されたｐＨ５．０〜６．０の水性緩衝液中に含む。
【００６７】
好ましい態様では、組成物は、液体形態、凍結乾燥された形態または凍結乾燥された形態から再構成された液体形態である。
【００６８】
ある態様では、本発明による組成物は、凍結乾燥された組成物である。本発明による凍結乾燥された組成物は、通常、同濃度の液体組成物では達成が困難な、より高い分子量の微粒子および凝集物の形成に関して改善された安定性という利点を有する。
【００６９】
好ましい態様では、組成物は、薬学的組成物に使用されることが意図された緩衝液に対してＩＧＦ−Ｉタンパク質溶液が透析され、所望の最終タンパク質濃度が濃縮または希釈によって調整される方法で調製される。
【００７０】
好ましい態様では、組成物は、医薬の製造のために使用される。より好ましい態様では、組成物は、神経変性障害、特にアルツハイマー病（ＡＤ）、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、特に筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）もしくは脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）または筋ジストロフィー（ＭＤ）、特にデュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）もしくは筋緊張性ジストロフィー（ＭＭＤ）の治療、予防および／または進行の遅延のための医薬を製造するために使用される。
【００７１】
本発明の組成物は、特に、バイアル、充填済みシリンジ、アンプル、カートリッジなどの中にＩＧＦ−Ｉタンパク質を保存するために適する。
【００７２】
本発明の組成物は、凍結保存、冷蔵状態または室温での保存を含め、ＩＧＦ−Ｉタンパク質を異なる温度で所定の時間、安定に保存するために使用することができる。
【００７３】
本発明による組成物は、非経口的に、好ましくは静脈内（i.v.）もしくは皮下（s.c.）ボーラス注射として、または薬学の技術分野で公知のものなどの任意の他の親投与手段として投与することができる。組成物は、さらに、薬学的技術分野において公知の輸液によって投与することができる。
【００７４】
実施例
材料および方法
ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉは、国際公開公報第２００６／０６６８９１号に類似した方法で製造した。
【００７５】
酢酸ナトリウム緩衝液は、適切な量の市販の酢酸を秤量し、続いて水酸化ナトリウムを使用してｐＨを調整することによって調製した。
【００７６】
クエン酸ナトリウム緩衝液は、適切な量の市販のクエン酸を秤量し、続いて水酸化ナトリウムを使用してｐＨを調整することによって調製した。
【００７７】
コハク酸ナトリウム緩衝液は、適切な量の市販のコハク酸を秤量し、続いて水酸化ナトリウムを使用してｐＨを調整することによって調製した。
【００７８】
ヒスチジン緩衝剤液は、適切な量の市販のＬ−ヒスチジンＨＣｌ一水和物およびＬ−ヒスチジン塩基を秤量することによって調製した。
【００７９】
ポリソルベート２０は市販されている。それを重量希釈し、高濃縮原液を得た。この原液をさらに薬学的組成物に希釈した。
【００８０】
ポリソルベート８０は市販されている。それを重量希釈し、高濃縮原液を得た。この原液をさらに薬学的組成物に希釈した。
【００８１】
ポロキサマー１８８は市販されている。それを重量希釈し、高濃縮原液を得た。この原液をさらに薬学的組成物に希釈した。
【００８２】
トレハロース二水和物は市販されている。それの適切な量を秤量し、高濃縮原液を得た。この原液をさらに薬学的組成物に希釈した。
【００８３】
スクロースは市販されている。それの適切な量を秤量し、高濃縮原液を得た。この原液をさらに薬学的組成物に希釈した。
【００８４】
Ｌ−アルギニンＨＣｌは市販されている。それの適切な量を秤量し、高濃縮原液を得た。この原液をさらに薬学的組成物に希釈した。
【００８５】
Ｌ−メチオニンは市販されている。それの適切な量を秤量し、高濃縮原液を得た。この原液をさらに薬学的組成物に希釈した。
【００８６】
ストレス試験のための条件
薬学的組成物は、２００rpmの水平振盪機の上で２〜８℃で１週間振盪することによって、および２５℃で１週間振盪することによって機械的応力に供した。薬学的組成物は、それぞれ−２０℃および２〜８℃、または−８０℃および２〜８℃のいずれかで繰り返し凍結および解凍する（５サイクル）ことによって凍結−解凍ストレスに供した。ストレスを加えられた試料を、可視粒子についての目視検査、肉眼不可視の粒子、濁度、ｐＨ、浸透圧、ＵＶ／ＶＩＳ分光測定によるタンパク質濃度、粘性、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、カールフィッシャー滴定（凍結乾燥物のみ）、ＮＭＲ分光測定、ＦＴ−ＩＲ分光測定およびμＤＳＣを含めた多様な分析技法によって分析した。
【００８７】
安定性試験
薬学的組成物の安定性は、それらを−８０℃、−２０℃、２〜８℃、２５℃および４０℃で最長８ヶ月間保存することによって試験した。所定の時点で、試料を安定性チャンバーから取り出し、可視粒子についての目視検査、肉眼不可視の粒子、濁度、ｐＨ、浸透圧、ＵＶ／ＶＩＳ分光測定によるタンパク質濃度、粘性、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、カールフィッシャー滴定（凍結乾燥物のみ）、ＮＭＲ分光測定、ＦＴ−ＩＲ分光測定およびμＤＳＣを含めた多様な分析技法によって分析した。
【００８８】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、組成物中のモノＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲート（主ピーク）、ならびに可溶性高分子量化学種（ＨＭＷ）および低分子量加水分解産物（ＬＭＷ）を検出および定量するために行った。ＨＭＷ化学種は、主ピークの前に溶離するピークとして定義され、一方でＬＭＷ化学種は主ピークの後に溶離する。
【００８９】
実施例１  −  液体組成物の調製
本発明にしたがって静脈内投与および皮下投与するための液体組成物を以下のように開発した：
ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートの緩衝液交換を行い、適切なタンパク質濃度に濃縮した。続いて賦形剤を原液として加えた。得られた薬学的組成物を濾過滅菌し、無菌ガラスバイアルに無菌的に充填し、そのバイアルをゴム栓およびアルミキャップで封栓した。全ての試料を目視検査し、逆さにして人工気候室に入れた。
【００９０】
実施例２  −  凍結乾燥された組成物の調製
本発明による静脈内投与および皮下投与のための凍結乾燥された組成物を以下のように開発した：
ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートの緩衝液交換を行い、適切なタンパク質濃度に濃縮した。続いて賦形剤を原液として加えた。得られた薬学的組成物を濾過滅菌し、無菌ガラスバイアルに無菌的に充填した。そのバイアルを凍結乾燥後にアルミキャップで封栓し、人工気候室に入れた。
【００９１】
実施例３  −  様々な緩衝系の安定性
Ｋ６８でモノＰＥＧ化されており、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列のアミノ酸変化Ｋ２７ＲおよびＫ６５Ｒ（配列番号２）によって特徴づけられる１mg/mlのＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートおよび様々なｐＨ値の２０mM緩衝液を含む組成物を実施例１にしたがって調製した。４０℃で４週間（４ｗ）保存後の安定性のデータを表１に示す。保存中の高分子量化学種（ＨＭＷ）の初期値に比べた増加は、ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートの凝集を示し、一方で保存中の低分子量化学種（ＬＭＷ）の初期値に比べた増加は、例えば分岐状ＰＥＧ側鎖の切断によるＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートの分解を示す。
【００９２】
【表１】
2013514340.tif 000002
【００９３】
表１．  ＳＥＣによって決定された、緩衝液に依存したＡＰＩ濃度１mg/mlの様々な組成物の安定性
【００９４】
Ｋ６８でモノＰＥＧ化されており、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列のアミノ酸変化Ｋ２７ＲおよびＫ６５Ｒ（配列番号２）によって特徴づけられる８mg/mlのＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートおよび様々なｐＨ値の２０mM緩衝液を含むさらなる組成物を、実施例１にしたがって調製した。４０℃で７週間（７ｗ）保存後の安定性のデータを表２に示す。保存中の高分子量化学種（ＨＭＷ）の初期値に比べた増加は、ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートの凝集を示し、一方で保存中の低分子量化学種（ＬＭＷ）の初期値に比べた増加は、例えば分岐状ＰＥＧ側鎖の切断によるＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートの分解を示す。
【００９５】
【表２】
2013514340.tif 000003
【００９６】
表２．  ＳＥＣによって決定された、緩衝液に依存したＡＰＩ濃度８mg/mlの様々な組成物の安定性
【００９７】
実施例４  −  安定性に及ぼす界面活性剤の作用
Ｋ６８でモノＰＥＧ化されており、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列のアミノ酸変化Ｋ２７ＲおよびＫ６５Ｒ（配列番号２）によって特徴づけられる６mg/mlのＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲート、ｐＨ５．５の２０mMヒスチジン／ヒスチジンＨＣｌ緩衝液または２０mMクエン酸Ｎａ緩衝液のいずれか、ならびに場合によりポリソルベート２０、ポリソルベート８０およびポロキサマー１８８より選択される界面活性剤を含む組成物を実施例１にしたがって調製した。ストレス試験後の目視検査の結果および４０℃で２６週間（２６ｗ）保存後の安定性のデータを表３および表４に示す。保存中の高分子量化学種（ＨＭＷ）の初期値に比べた増加は、ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートの凝集を示し、一方で保存中の低分子量化学種（ＬＭＷ）の初期値に比べた増加は、例えば分岐状ＰＥＧ側鎖の切断によるＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートの分解を示す。
【００９８】
【表３】
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【００９９】
表３．  界面活性剤に依存した、ストレス試験でのｐＨ５．５のヒスチジン／ヒスチジンＨＣｌ緩衝液中のＡＰＩ濃度６mg/mlの様々な組成物の目視検査の結果および安定性の結果（−８０℃および２〜８℃で繰り返し凍結−解凍、２〜８℃で振盪および２５℃で振盪）。「−」：可視粒子を検出。「＋」：可視粒子を検出せず。
【０１００】
【表４】
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【０１０１】
表４．  界面活性剤に依存した、ストレス試験でのｐＨ５．５のクエン酸Ｎａ緩衝液中にＡＰＩ濃度６mg/mlの様々な組成物の目視検査の結果および安定性の結果（−８０℃および２〜８℃で繰り返し凍結−解凍、２〜８℃で振盪および２５℃で振盪）。「−」：可視粒子を検出。「＋」：可視粒子を検出せず。
【０１０２】
実施例５  −  安定性および粘性に及ぼす等張化剤および抗酸化剤の作用
Ｋ６８でモノＰＥＧ化されており、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列のアミノ酸変化Ｋ２７ＲおよびＫ６５Ｒ（配列番号２）によって特徴づけられる６mg/mlのＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲート、ｐＨ５．５の２０mMヒスチジン／ヒスチジンＨＣｌ緩衝液または２０mMクエン酸Ｎａ緩衝液のいずれか、場合により濃度０．０１％w/wのポリソルベート８０およびポロキサマー１８８より選択される界面活性剤、トレハロース（Ｔｒｅ、２２０mM）、スクロース（Ｓｕｃ、２００mM）およびアルギニンＨＣｌ（Ａｒｇ、１４２mM）より選択される等張化剤、ならびに場合により抗酸化剤としてメチオニン（Ｍｅｔ、１０mM）を含む組成物を実施例１にしたがって調製した。初期分析の粘性データ、４０℃で１２週間（１２ｗ）保存後の安定性のデータ、および２５℃で６ヶ月（６ｍ）後の目視検査の結果を表５および６に示す。保存中の高分子量化学種（ＨＭＷ）の初期値に比べた増加は、ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートの凝集を示す。
【０１０３】
【表５】
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【０１０４】
表５．  界面活性剤、等張化剤および抗酸化剤に依存した、ｐＨ５．５のヒスチジン／ヒスチジンＨＣｌ緩衝液中にＡＰＩ濃度６mg/mlの様々な組成物の初期分析での粘性、４０℃で１２週間後の安定性、および２５℃で６ヶ月後の目視検査の結果。「−」：可視粒子を検出。「＋」：可視粒子を検出せず。
【０１０５】
【表６】
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【０１０６】
表６．  界面活性剤、等張化剤および抗酸化剤に依存した、ｐＨ５．５のクエン酸Ｎａ緩衝液中にＡＰＩ濃度６mg/mlの様々な組成物の初期分析での粘性、４０℃で１２週間後の安定性、および２５℃で６ヶ月後の目視検査の結果。「−」：可視粒子を検出。「＋」：可視粒子を検出せず。
【０１０７】
実施例６  −  凍結乾燥組成物の安定性および粘性に及ぼす緩衝剤、界面活性剤および等張化剤の作用
Ｋ６８でモノＰＥＧ化されており、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列のアミノ酸変化Ｋ２７ＲおよびＫ６５Ｒ（配列番号２）によって特徴づけられる６mg/mlのＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲート、ｐＨ５．５の２０mMヒスチジン／ヒスチジンＨＣｌ緩衝液または２０mMクエン酸Ｎａ緩衝液のいずれか、界面活性剤としてポリソルベート８０（０．０１％w/w）、ならびに等張化剤としてスクロース（２２０mM）を含む組成物を実施例２にしたがって調製した。４０℃で１２週間（１２ｗ）保存後の粘性データおよび安定性データを表７に示す。保存中の高分子量化学種（ＨＭＷ）の初期値に比べた増加は、ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートの凝集を示す。
【０１０８】
【表７】
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【０１０９】
表７．  緩衝液、界面活性剤および等張化剤に依存した、ＡＰＩ濃度６mg/mlの様々な凍結乾燥組成物の安定性および粘性
【０１１０】
実施例７  −  高度に濃縮された凍結乾燥組成物の安定性に及ぼす緩衝剤、界面活性剤および等張化剤の作用
Ｋ６８でモノＰＥＧ化されており、野生型ヒトＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列のアミノ酸変化Ｋ２７ＲおよびＫ６５Ｒ（配列番号２）によって特徴づけられる１２mg/mlのＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲート（６mg/ml  ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲート凍結乾燥物の再構成後）、ｐＨ５．５の２０mMヒスチジン/ヒスチジンＨＣｌ緩衝液または２０mMクエン酸Ｎａ緩衝液のいずれか、界面活性剤としてポリソルベート８０（０．０２％w/w）、ならびに等張化剤としてスクロース（１３０mM）またはトレハロース（１３０mM）を含む組成物を実施例２にしたがって調製した。４０℃で９週間（９ｗ）保存後の安定性データを表８に示す。保存中の高分子量化学種（ＨＭＷ）の初期値に比べた増加は、ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートの凝集を示す。
【０１１１】
【表８】
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【０１１２】
表８．  緩衝液、界面活性剤および等張化剤に依存した、ＡＰＩ濃度１２mg/mlの様々な凍結乾燥組成物の安定性
【配列表】
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【国際調査報告】
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