(57)【要約】  本発明は、プログラニュリン・ポリペプチドまたはエフェクターを使用して、例えば前頭皮質または嗅内皮質におけるネプリライシンの発現または活性を増大させるための方法および組成物を対象とする。さらに、本発明は、プログラニュリン・ポリペプチドまたはエフェクターを使用して、神経変性疾患の患者の脳内のミクログリアを減少させる方法を対象とする。【選択図】  図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性疾患の患者の前頭皮質または嗅内皮質におけるネプリライシンの活性を増大させる方法であって、
プログラニュリン・ポリペプチドを含む組成物を前記患者に投与するステップであって、前記患者の前記前頭皮質または前記嗅内皮質における前記ネプリライシンの前記活性が増大するステップを含む、方法。
【請求項２】
神経変性疾患の患者の前頭皮質または嗅内皮質におけるネプリライシンの発現を増大させる方法であって、
プログラニュリン・ポリペプチドを含む組成物を前記患者に投与するステップであって、前記患者の前記前頭皮質または前記嗅内皮質における前記ネプリライシンの前記発現が増大するステップを含む、方法。
【請求項３】
神経変性疾患の患者の前頭皮質または嗅内皮質におけるネプリライシンの活性を増大させる方法であって、
プログラニュリンの発現を修飾するエフェクターを含む組成物を前記患者に投与するステップであって、前記患者の前記前頭皮質または前記嗅内皮質における前記ネプリライシンの前記活性が増大するステップを含む、方法。
【請求項４】
神経変性疾患の患者の前頭皮質または嗅内皮質におけるネプリライシンの発現を増大させる方法であって、
プログラニュリンの発現を修飾するエフェクターを含む組成物を前記患者に投与するステップであって、前記患者の前記前頭皮質または前記嗅内皮質における前記ネプリライシンの前記発現が増大するステップを含む、方法。
【請求項５】
神経変性疾患の患者の脳内のミクログリアを減少させる方法であって、
プログラニュリン・ポリペプチドを含む組成物を前記患者に投与するステップであって、前記患者の脳内の前記ミクログリアが減少するステップを含む、方法。
【請求項６】
神経変性疾患の患者の脳内のミクログリアを減少させる方法であって、
プログラニュリンの発現を修飾するエフェクターを含む組成物を前記患者に投与するステップであって、前記患者の脳内の前記ミクログリアが減少するステップを含む、方法。
【請求項７】
神経変性疾患を発症していない個人の脳におけるネプリライシンの活性または発現を増大させて前記神経変性疾患を予防する方法であって、
プログラニュリン・ポリペプチドを含む組成物を前記個人に投与するステップであって、前記神経変性疾患が予防されるステップを含む、方法。
【請求項８】
神経変性疾患を発症していない個人の脳におけるネプリライシンの活性または発現を増大させて前記神経変性疾患を予防する方法であって、
プログラニュリンの発現を修飾するエフェクターを含む組成物を前記個人に投与するステップであって、前記神経変性疾患が予防されるステップを含む、方法。
【請求項９】
前記患者に投与される前記プログラニュリン・ポリペプチドの量が、患者の体重１ｋｇあたり約１ｎｇから患者の体重１ｋｇあたり約１ｍｇの範囲内である、請求項１、請求項２、請求項５、または請求項７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記患者に投与される前記プログラニュリン・ポリペプチドの量が、患者の体重１ｋｇあたり約１ｎｇから患者の体重１ｋｇあたり約５００ｎｇの範囲内である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記患者に投与される前記プログラニュリン・ポリペプチドの量が、患者の体重１ｋｇあたり約１ｎｇから患者の体重１ｋｇあたり約１００ｎｇの範囲内である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記プログラニュリン・ポリペプチドを含む前記組成物が、非経口投与用に調製されている、請求項１、請求項２、請求項５、請求項７、請求項９、請求項１０、または請求項１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
非経口投与の経路が、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、脳室内投与、髄腔内投与、脳内投与、および声帯内投与からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記患者に投与される前記エフェクターの量が、患者の体重１ｋｇあたり約１ｎｇから患者の体重１ｋｇあたり約１ｍｇの範囲内である、請求項３、請求項４、請求項６、または請求項８のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記患者に投与される前記エフェクターの量が、患者の体重１ｋｇあたり約１ｎｇから患者の体重１ｋｇあたり約５００ｎｇの範囲内である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記患者に投与される前記エフェクターの量が、患者の体重１ｋｇあたり約１ｎｇから患者の体重１ｋｇあたり約１００ｎｇの範囲内である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記エフェクターを含む前記組成物が、非経口投与用に調製されている、請求項３、請求項４、請求項６、請求項８、請求項１４、請求項１５、または請求項１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
非経口投与の経路が、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、脳室内投与、髄腔内投与、脳内投与、および声帯内投与からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項１から請求項４のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記神経変性疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病、および筋萎縮性側索硬化症からなる群から選択される、請求項５または請求項６のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記プログラニュリン・ポリペプチドが、配列番号２と少なくとも９５％の相同性を有する、請求項１、請求項２、請求項５、または請求項７のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記エフェクターが、配列番号１と少なくとも９５％の相同性を有する核酸を含むベクターである、請求項３、請求項４、請求項６、または請求項８のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記ネプリライシンが斑負荷（plaque burden）を減少させる、請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項７、または請求項８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プログラニュリン・ポリペプチドまたはエフェクターを使用して、例えば前頭皮質または嗅内皮質におけるネプリライシンの発現または活性を増大させるための方法および組成物を対象とする。さらに、本発明は、プログラニュリン・ポリペプチドまたはエフェクターを使用して、神経変性疾患の患者の脳内のミクログリアを減少させる方法を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
プログラニュリン（ＰＧＲＮ）は、増殖因子様タンパク質であり、発生、創傷治癒、血管新生、神経細胞の成長・維持、炎症など複数のプロセスの調節に関与する。複数の神経変性疾患（例えば、クロイツフェルト・ヤコブ病、運動ニューロン疾患、アルツハイマー病）において、ＰＧＲＮの発現の修飾が示されている。例えば、神経変性疾患の遺伝病因学の最近の研究によると、ＰＧＲＮ遺伝子の遺伝的変異が神経細胞の生存の減少に起因する成人発症型の神経変性疾患につながりうることが示されている。
【０００３】
選択的な神経細胞死は、さまざまな神経変性障害に共通する特徴である。散発性のアルツハイマー病、パーキンソン病、およびルー・ゲーリック病（筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ））は、神経細胞死を引き起こす環境要因に関連付けられ、この場合の神経細胞死は、興奮毒性、酸化ストレス、電子伝達系の一部分の阻害、細胞膜およびミトコンドリア膜の損傷、細胞小器官の変化、染色質の変化、一般的および特定の遺伝毒性作用、細胞表面のタンパク質受容体およびエフェクターの阻害もしくは過剰活性化またはその両方によるものである。実験文献および臨床文献によると、いくつかの形態の神経変性（特に、ＡＬＳおよびアルツハイマー病）において興奮毒が潜在的な役割を果たすことが裏付けられている。特に、グルタミン酸輸送の異常はＡＬＳに関連付けられており、ドーモイ酸（カイニン酸受容体（すなわちイオンチャネル型グルタミン酸受容体）アゴニスト）は、アルツハイマー病において報告されているのと同様に、いくつかの形態の記憶喪失の原因因子であることが示されている。酸化ストレスも同じ病状に関連付けられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第４，７１３，２４９号明細書
【特許文献２】米国特許第５，２６６，３３３号明細書
【特許文献３】米国特許第５，４１７，９８２号明細書
【特許文献４】米国特許第６，３３３，１９４号明細書
【特許文献５】米国特許第７，１０５，３４２号明細書
【特許文献６】米国特許第７，１１２，６６８号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２００６−０２５２７０５号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)
【非特許文献２】Shaw et al., Neuroscience and Biobehavioral Reviews, 27: 493 (2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在、ＡＬＳ、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病には治療法が存在しない。現状の治療では、一般的に医師が症状の進行を遅らせて患者の快適性を高めるように努力している。数多くの薬剤が開発中であり、その一部は治療用としてＦＤＡによって承認されているが（ＡＬＳ治療用のリルゾール（Ｒｉｌｕｚｏｌｅ）、パーキンソン病治療用のＬ−ドーパ（Ｌ−ｄｏｐａ）、ＡＤ治療用の向知性薬（アリセプト（Ａｒｉｃｅｐｔ）など））、これらの治療は神経疾患の進行を隠すにすぎず、患者によっては寿命がわずかに延びるように作用する。したがって、神経変性疾患の治療を対象とする方法および組成物の大きなニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のいくつかの実施形態は、以下に列挙する項によって説明される。
１．  神経変性疾患の患者の前頭皮質または嗅内皮質におけるネプリライシンの活性を増大させる方法であって、
プログラニュリン・ポリペプチドを含む組成物を患者に投与するステップであって、患者の前頭皮質または嗅内皮質におけるネプリライシンの活性が増大するステップを含む、方法。
２．  神経変性疾患の患者の前頭皮質または嗅内皮質におけるネプリライシンの発現を増大させる方法であって、
プログラニュリン・ポリペプチドを含む組成物を患者に投与するステップであって、患者の前頭皮質または嗅内皮質におけるネプリライシンの発現が増大するステップを含む、方法。
３．  神経変性疾患の患者の前頭皮質または嗅内皮質におけるネプリライシンの活性を増大させる方法であって、
プログラニュリンの発現を修飾するエフェクターを含む組成物を患者に投与するステップであって、患者の前頭皮質または嗅内皮質におけるネプリライシンの活性が増大するステップ、を含む、方法。
４．  神経変性疾患の患者の前頭皮質または嗅内皮質におけるネプリライシンの発現を増大させる方法であって、
プログラニュリンの発現を修飾するエフェクターを含む組成物を患者に投与するステップであって、患者の前頭皮質または嗅内皮質におけるネプリライシンの発現が増大するステップ、を含む、方法。
５．  神経変性疾患の患者の脳内のミクログリアを減少させる方法であって、
プログラニュリン・ポリペプチドを含む組成物を患者に投与するステップであって、患者の脳内のミクログリアが減少するステップ、を含む、方法。
６．  神経変性疾患の患者の脳内のミクログリアを減少させる方法であって、
プログラニュリンの発現を修飾するエフェクターを含む組成物を患者に投与するステップであって、患者の脳内のミクログリアが減少するステップを含む、方法。
７．  神経変性疾患を発症していない個人の脳におけるネプリライシンの活性または発現を増大させて神経変性疾患を予防する方法であって、
プログラニュリン・ポリペプチドを含む組成物を個人に投与するステップであって、神経変性疾患が予防されるステップを含む、方法。
８．  神経変性疾患を発症していない個人の脳におけるネプリライシンの活性または発現を増大させて神経変性疾患を予防する方法であって、
プログラニュリンの発現を修飾するエフェクターを含む組成物を個人に投与するステップであって、神経変性疾患が予防されるステップを含む方法。
９．  患者に投与されるプログラニュリン・ポリペプチドの量が、患者の体重１ｋｇあたり約１ｎｇから患者の体重１ｋｇあたり約１ｍｇの範囲内である、項１、項２、項５、または項７のいずれかに記載の方法。
１０．  患者に投与されるプログラニュリン・ポリペプチドの量が、患者の体重１ｋｇあたり約１ｎｇから患者の体重１ｋｇあたり約５００ｎｇの範囲内である、項９に記載の方法。
１１．  患者に投与されるプログラニュリン・ポリペプチドの量が、患者の体重１ｋｇあたり約１ｎｇから患者の体重１ｋｇあたり約１００ｎｇの範囲内である、項９に記載の方法。
１２．  プログラニュリン・ポリペプチドを含む組成物が、非経口投与用に調製されている、項１、項２、項５、項７、項９、項１０、または項１１のいずれかに記載の方法。
１３．  非経口投与の経路が、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、脳室内投与、髄腔内投与、脳内投与、および声帯内投与からなる群から選択される、項１２に記載の方法。
１４．  患者に投与されるエフェクターの量が、患者の体重１ｋｇあたり約１ｎｇから患者の体重１ｋｇあたり約１ｍｇの範囲内である、項３、項４、項６、または項８のいずれかに記載の方法。
１５．  患者に投与されるエフェクターの量が、患者の体重１ｋｇあたり約１ｎｇから患者の体重１ｋｇあたり約５００ｎｇの範囲内である、項１４に記載の方法。
１６．  患者に投与されるエフェクターの量が、患者の体重１ｋｇあたり約１ｎｇから患者の体重１ｋｇあたり約１００ｎｇの範囲内である、項１４に記載の方法。
１７．  エフェクターを含む組成物が、非経口投与用に調製されている、項３、項４、項６、項８、項１４、項１５、または項１６のいずれかに記載の方法。
１８．  非経口投与の経路が、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、脳室内投与、髄腔内投与、脳内投与、および声帯内投与からなる群から選択される、項１７に記載の方法。
１９．  神経変性疾患がアルツハイマー病である、項１から項４のいずれかに記載の方法。
２０．  神経変性疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病、および筋萎縮性側索硬化症からなる群から選択される、項５または項６のいずれかに記載の方法。
２１．  プログラニュリン・ポリペプチドが、配列番号２と少なくとも９５％の相同性を有する、項１、項２、項５、または項７のいずれかに記載の方法。
２２．  エフェクターが、配列番号１と少なくとも９５％の相同性を有する核酸を含むベクターである、項３、項４、項６、または項８のいずれかに記載の方法。
２３．  ネプリライシンが斑負荷（plaque burden）を減少させる、項１、項２、項３、項４、項７、または項８のいずれかに記載の方法。
【０００８】
本明細書に記載されているさまざまな実施形態のいずれにおいても、適用可能な場合、以下に説明する特徴を備えていることができ、これにより本発明の追加の実施形態が提供される。
【０００９】
実施形態のすべてについて、適用可能な場合に実施形態を任意に組み合わせることも意図されている。上述した実施形態の任意の適用可能な組合せは、本発明によるものとみなされる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】海馬におけるプログラニュリン（ＰＧＲＮ）の発現がＮＤ−６０２によって増大することを示している。パネルＡは、Ｔｇ２５７６マウスの海馬の冠状切片の顕微鏡写真における、プログラニュリンの免疫蛍光検出を示している。元の倍率は２０倍である。パネルＢは、プログラニュリン含有量の濃度定量（densitometric quantitation）を示している。Ｍｅａｎ  ＋／＿Ｓ．Ｅ．Ｍ．＊＊Ｐ＜０．００１，＊Ｐ＜０．０５
【図２】嗅内皮質および前頭皮質におけるＰＧＲＮ含有量がＮＤ−６０２によって変化することを示している。パネルＡは、嗅内皮質におけるＰＧＲＮ含有量が統計的に有意に増大することを示しており、パネルＢは、ＮＤ−６０２によって処理したＴｇ２５７６マウスの前頭皮質においてＰＧＲＮが増大する傾向を示している。Ｍｅａｎ  ＋／＿Ｓ．Ｅ．Ｍ．＊＊Ｐ＜０．００１，＊Ｐ＜０．０５
【図３】Ｔｇ２５７６マウスにおいて海馬におけるネプリライシンの発現がＮＤ−６０２によって増大することを示している。顕微鏡写真は、コントロールベクター（パネルＡ、ＧＦＰ）またはＮＤ−６０２（パネルＢ、ＰＧＲＮ）によって処理した後の海馬におけるネプリライシンの発現を示している。グラフは、ネプリライシンの発現の濃度定量を示している（パネルＣ）。Ｍｅａｎ  ＋／＿Ｓ．Ｅ．Ｍ．＊＊Ｐ＜０．００１，＊Ｐ＜０．０５
【図４】通常のＣ５７／Ｂｌ６マウスにおいて海馬におけるネプリライシンの発現がＮＤ−６０２によって増大することを示している（パネルＡ）。ＮＤ−６０２によって処理したマウスの前頭皮質において、ネプリライシンの活性が増大する傾向が観察される（パネルＢ）。湿組織重量１ｍｇあたりのネプリライシンの活性の定量である。ｍｅａｎ  ＋／＿Ｓ．Ｅ．Ｍ．＊＊Ｐ＜０．００１，＊Ｐ＜０．０５
【図５】湿組織重量１ｍｇに正規化したとき、海馬におけるタンパク質含有量がＮＤ−６０２によって増大することを示しており（パネルＡ）、ネプリライシンの活性を組織のタンパク質含有量に正規化したとき、ネプリライシンの安定的な活性プロファイルにつながることを示している（パネルＢ）。
【図６】ＮＤ−６０２が送り込まれた脳の領域を示している。
【図７】Ｔｇ２５７６マウスの海馬における斑負荷（plaque burden）がＮＤ−６０２によって減少することを示している。パネルＡ（元の倍率は２０倍）は、斑を検出するためのチオフラビンＳの組織化学写真を示している。チオフラビンＳ反応性の斑の濃度定量では、海馬における有意な減少が実証されている（パネルＢ）。Ｍｅａｎ  ＋／＿Ｓ．Ｅ．Ｍ．＊＊Ｐ＜０．００１，＊Ｐ＜０．０５
【図８】Ｔｇ２５７６マウスの嗅内皮質および前頭皮質における斑負荷がＮＤ−６０２によって変化することを示している。チオフラビンＳ反応性の斑の濃度定量では、嗅内皮質において有意に減少することと（パネルＡ）、前頭皮質において斑負荷が減少傾向にあること（パネルＢ）が実証されている。Ｍｅａｎ  ＋／＿Ｓ．Ｅ．Ｍ．＊Ｐ＜０．０５
【図９】Ｔｇ２５７６マウスの海馬におけるミクログリア細胞の数の減少によって、ＮＤ−６０２によって神経炎症が軽減することが実証されている。顕微鏡写真は、ＮＤ−６０２によって処理されたＴｇ２５７６マウスにおいて、ＩＬＢ４反応性のミクログリア細胞が減少することを実証している（パネルＡ：ＧＦＰ、パネルＢ：ＧＦＡＰ、パネルＣ：ＮＤ−６０２、パネルＤ：ＮＤ−６０２）。ＩＬＢ４反応性の濃度定量は、ＮＤ−６０２の注入と同側のミクログリア細胞の数が有意に減少することを示している（パネルＥ）。Ｍｅａｎ  ＋／＿Ｓ．Ｅ．Ｍ．＊＊Ｐ＜０．００１
【発明を実施するための形態】
【００１１】
神経変性疾患の患者の嗅内皮質または前頭皮質におけるネプリライシンの活性または発現を増大させる方法および組成物を提供する。例示的な一実施形態において、患者の嗅内皮質または前頭皮質におけるネプリライシンの活性または発現は、プログラニュリン・ポリペプチドを含む組成物、またはプログラニュリンの発現を修飾するエフェクターを含む組成物を患者に投与することによって、増大させることができ、この場合、患者の嗅内皮質または前頭皮質におけるネプリライシンの活性が増大する。
【００１２】
別の実施形態において、神経変性疾患を発症していない個人にプログラニュリン・ポリペプチドまたはエフェクターを投与して、神経変性疾患の発症を予防することができる。この実施形態において、プログラニュリン・ポリペプチドを含む組成物、またはプログラニュリンの発現を修飾するエフェクターを含む組成物を個人に投与することによって、個人の脳におけるネプリライシンの発現または活性を増大させることができる。例えば、個人の嗅内皮質または前頭皮質におけるネプリライシンの活性または発現を増大させることができる。
【００１３】
別の実施形態において、プログラニュリン・ポリペプチドを含む組成物、またはプログラニュリンの発現を修飾するエフェクターを含む組成物を患者に投与することによって、神経変性疾患の患者の脳内のミクログリアの数を減少させることができ、この場合、個人の脳内のミクログリアが減少する。
【００１４】
上述した例示的な実施形態において、神経変性疾患は、環境的刺激（environmental insult）によって介在されることがある。
【００１５】
本明細書では、「プログラニュリン」または「プログラニュリン・ポリペプチド」は、配列番号２のポリペプチド、および配列番号２と約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％の相同性を有するポリペプチド、配列番号１２のポリペプチド、および配列番号１２と約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％の相同性を有するポリペプチド、配列番号３のポリペプチド、および配列番号３と約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％の相同性を有するポリペプチド、配列番号４のポリペプチド、および配列番号４と約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％の相同性を有するポリペプチド、配列番号５のポリペプチド、および配列番号５と約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％の相同性を有するポリペプチド、配列番号６のポリペプチド、および配列番号６と約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％の相同性を有するポリペプチド、配列番号７のポリペプチド、および配列番号７と約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％の相同性を有するポリペプチド、配列番号８のポリペプチド、および配列番号８と約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％の相同性を有するポリペプチド、配列番号９のポリペプチド、および配列番号９と約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％の相同性を有するポリペプチド、から選択されるポリペプチド、を意味する。
【００１６】
別の実施形態において、配列番号１０のポリペプチド、配列番号１０と約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の相同性を有するポリペプチドを使用することができる。別の実施形態において、配列番号１１のポリペプチド、配列番号１１と約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の相同性を有するポリペプチドを使用することができる。
【００１７】
ヒトのプログラニュリン  配列番号２
MWTLVSWVALTAGLVAGTRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQLL
【００１８】
ヒトのプログラニュリンのＤＮＡ  配列番号１
1 ggcgagagga agcagggagg agagtgattt gagtagaaaa gaaacacagc attccaggct
61 ggccccacct ctatattgat aagtagccaa tgggagcggg tagccctgat ccctggccaa
121 tggaaactga ggtaggcggg tcatcgcgct ggggtctgta gtctgagcgc tacccggttg
181 ctgctgccca aggaccgcgg agtcggacgc aggcagacca tgtggaccct ggtgagctgg
241 gtggccttaa cagcagggct ggtggctgga acgcggtgcc cagatggtca gttctgccct
301 gtggcctgct gcctggaccc cggaggagcc agctacagct gctgccgtcc ccttctggac
361 aaatggccca caacactgag caggcatctg ggtggcccct gccaggttga tgcccactgc
421 tctgccggcc actcctgcat ctttaccgtc tcagggactt ccagttgctg ccccttccca
481 gaggccgtgg catgcgggga tggccatcac tgctgcccac ggggcttcca ctgcagtgca
541 gacgggcgat cctgcttcca aagatcaggt aacaactccg tgggtgccat ccagtgccct
601 gatagtcagt tcgaatgccc ggacttctcc acgtgctgtg ttatggtcga tggctcctgg
661 gggtgctgcc ccatgcccca ggcttcctgc tgtgaagaca gggtgcactg ctgtccgcac
721 ggtgccttct gcgacctggt tcacacccgc tgcatcacac ccacgggcac ccaccccctg
781 gcaaagaagc tccctgccca gaggactaac agggcagtgg ccttgtccag ctcggtcatg
841 tgtccggacg cacggtcccg gtgccctgat ggttctacct gctgtgagct gcccagtggg
901 aagtatggct gctgcccaat gcccaacgcc acctgctgct ccgatcacct gcactgctgc
961 ccccaagaca ctgtgtgtga cctgatccag agtaagtgcc tctccaagga gaacgctacc
1021 acggacctcc tcactaagct gcctgcgcac acagtggggg atgtgaaatg tgacatggag
1081 gtgagctgcc cagatggcta tacctgctgc cgtctacagt cgggggcctg gggctgctgc
1141 ccttttaccc aggctgtgtg ctgtgaggac cacatacact gctgtcccgc ggggtttacg
1201 tgtgacacgc agaagggtac ctgtgaacag gggccccacc aggtgccctg gatggagaag
1261 gccccagctc acctcagcct gccagaccca caagccttga agagagatgt cccctgtgat
1321 aatgtcagca gctgtccctc ctccgatacc tgctgccaac tcacgtctgg ggagtggggc
1381 tgctgtccaa tcccagaggc tgtctgctgc tcggaccacc agcactgctg cccccagggc
1441 tacacgtgtg tagctgaggg gcagtgtcag cgaggaagcg agatcgtggc tggactggag
1501 aagatgcctg cccgccgggc ttccttatcc caccccagag acatcggctg tgaccagcac
1561 accagctgcc cggtggggca gacctgctgc ccgagcctgg gtgggagctg ggcctgctgc
1621 cagttgcccc atgctgtgtg ctgcgaggat cgccagcact gctgcccggc tggctacacc
1681 tgcaacgtga aggctcgatc ctgcgagaag gaagtggtct ctgcccagcc tgccaccttc
1741 ctggcccgta gccctcacgt gggtgtgaag gacgtggagt gtggggaagg acacttctgc
1801 catgataacc agacctgctg ccgagacaac cgacagggct gggcctgctg tccctaccgc
1861 cagggcgtct gttgtgctga tcggcgccac tgctgtcctg ctggcttccg ctgcgcagcc
1921 aggggtacca agtgtttgcg cagggaggcc ccgcgctggg acgccccttt gagggaccca
1981 gccttgagac agctgctgtg agggacagta ctgaagactc tgcagccctc gggaccccac
2041 tcggagggtg ccctctgctc aggcctccct agcacctccc cctaaccaaa ttctccctgg
2101 accccattct gagctcccca tcaccatggg aggtggggcc tcaatctaag gccttccctg
2161 tcagaagggg gttgtggcaa aagccacatt acaagctgcc atcccctccc cgtttcagtg
2221 gaccctgtgg ccaggtgctt ttccctatcc acaggggtgt ttgtgtgtgt gcgcgtgtgc
2281 gtttcaataa agtttgtaca ctttcaaaaa aaaaaaaaaa aaa
【００１９】
マウスのプログラニュリン  配列番号１２
MWVLMSWLAFAAGLVAGTQCPDGQFCPVACCLDQGGANYSCCNPLLDTWPRITSHHLDGSCQTHGHCPAGYSCLLTVSGTSSCCPFSKGVSCGDGYHCCPQGFHCSADGKSCFQMSDNPLGAVQCPGSQFECPDSATCCIMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGASCDLVHTRCVSPTGTHTLLKKFPAQKTNRAVSLPFSVVCPDAKTQCPDDSTCCELPTGKYGCCPMPNAICCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKNYTTDLLTKLPGYPVKEVKCDMEVSCPEGYTCCRLNTGAWGCCPFAKAVCCEDHIHCCPAGFQCHTEKGTCEMGILQVPWMKKVIAPLRLPDPQILKSDTPCDDFTRCPTNNTCCKLNSGDWGCCPIPEAVCCSDNQHCCPQGFTCLAQGYCQKGDTMVAGLEKIPARQTTPLQIGDIGCDQHTSCPV
GQTCCPSLKGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARTCEKDVDFIQPPVLLTLGPKVGNVECGEGHFCHDNQTCCKDSAGVWACCPYLKGVCCRDGRHCCPGGFHCSARGTKCLRKKIPRWDMFLRDPVPRPLL
【００２０】
マウスのプログラニュリンのＤＮＡ  配列番号１３
1 gagatgcctc ccagggagcc cggaccccga cgcaggcaga ccatgtgggt cctgatgagc
61 tggctggcct tcgcggcagg gctggtagcc ggaacacagt gtccagatgg gcagttctgc
121 cctgttgcct gctgccttga ccagggagga gccaactaca gctgctgtaa ccctcttctg
181 gacacatggc ctagaataac gagccatcat ctagatggct cctgccagac ccatggccac
241 tgtcctgctg gctattcttg tcttctcact gtgtctggga cttccagctg ctgcccgttc
301 tctaagggtg tgtcttgtgg tgatggctac cactgctgcc cccagggctt ccactgtagt
361 gcagatggga aatcctgctt ccagatgtca gataacccct tgggtgctgt ccagtgtcct
421 gggagccagt ttgaatgtcc tgactctgcc acctgctgca ttatggttga tggttcgtgg
481 ggatgttgtc ccatgcccca ggcctcttgc tgtgaagaca gagtgcattg ctgtccccat
541 ggggcctcct gtgacctggt tcacacacga tgcgtttcac ccacgggcac ccacacccta
601 ctaaagaagt tccctgcaca aaagaccaac agggcagtgt ctttgccttt ttctgtcgtg
661 tgccctgatg ctaagaccca gtgtcccgat gattctacct gctgtgagct acccactggg
721 aagtatggct gctgtccaat gcccaatgcc atctgctgtt ccgaccacct gcactgctgc
781 ccccaggaca ctgtatgtga cctgatccag agtaagtgcc tatccaagaa ctacaccacg
841 gatctcctga ccaagctgcc tggataccca gtgaaggagg tgaagtgcga catggaggtg
901 agctgccctg aaggatatac ctgctgccgc ctcaacactg gggcctgggg ctgctgtcca
961 tttgccaagg ccgtgtgttg tgaggatcac attcattgct gcccggcagg gtttcagtgt
1021 cacacagaga aaggaacctg cgaaatgggt atcctccaag taccctggat gaagaaggtc
1081 atagcccccc tccgcctgcc agacccacag atcttgaaga gtgatacacc ttgtgatgac
1141 ttcactaggt gtcctacaaa caatacctgc tgcaaactca attctgggga ctggggctgc
1201 tgtcccatcc cagaggctgt ctgctgctca gacaaccagc attgctgccc tcagggcttc
1261 acatgtctgg ctcaggggta ctgtcagaag ggagacacaa tggtggctgg cctggagaag
1321 atacctgccc gccagacaac cccgctccaa attggagata tcggttgtga ccagcatacc
1381 agctgcccag tagggcaaac ctgctgccca agcctcaagg gaagttgggc ctgctgccag
1441 ctgccccatg ctgtgtgctg tgaggaccgg cagcactgtt gcccggccgg gtacacctgc
1501 aatgtgaagg cgaggacctg tgagaaggat gtcgatttta tccagcctcc cgtgctcctg
1561 accctcggcc ctaaggttgg gaatgtggag tgtggagaag ggcatttctg ccatgataac
1621 cagacctgtt gtaaagacag tgcaggagtc tgggcctgct gtccctacct aaagggtgtc
1681 tgctgtagag atggacgtca ctgttgcccc ggtggcttcc actgttcagc caggggaacc
1741 aagtgtttgc gaaagaagat tcctcgctgg gacatgtttt tgagggatcc ggtcccaaga
1801 ccgctactgt aaggaagggc tacagactta aggaactcca cagtcctggg aaccctgttc
1861 cgagggtacc cactactcag gcctccctag cgcctcctcc cctaacgtct ccccggccta
1921 ctcatcctga gtcaccctat caccatggga ggtggagcct caaactaaaa ccttctttta
1981 tggaaagaag gctgtggcca aaagccccgt atcaaactgc catttcttcc ggtttctgtg
2041 gaccttgtgg ccaggtgctc ttcccgagcc acaggtgttc tgtgagcttg cttgtgtgtg
2101 tgtgcgcgtg tgcgtgtgtt gctccaataa agtttgtaca ctttc
【００２１】
配列番号３  ｈＧｒｎＡ
DVKCDMEVS-CPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQ
【００２２】
配列番号４  ｈＧｒｎＢ
-VMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLS
【００２３】
配列番号５  ｈＧｒｎＣ
-VPCDNVSS-CPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQ-CQ
【００２４】
配列番号６  ｈＧｒｎＤ
DIGCDQHTS-CPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCE
【００２５】
配列番号７  ｈＧｒｎＥ
DVECGEGHF-CHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCL
【００２６】
配列番号８  ｈＧｒｎＦ
AIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCI
【００２７】
配列番号９  ｈＧｒｎＧ
GGPCQVDAH-CSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCF
【００２８】
配列番号１０  ｇｒｎＤ
AMDIGCDQHTS-CPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCE-KLAAALEHHHHHH
【００２９】
配列番号１１  ｇｒｎＦ
AMAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCI-KLAAALEHHHHHH
【００３０】
当業者には周知であるように、タンパク質の非本質的なアミノ酸を保存的置換によって変更するとき、それによってタンパク質の活性が大幅に変化するべきではない。天然アミノ酸の置換に使用されるアミノ酸の側鎖は、置換されたアミノ酸の側鎖と同様の結合および接触を形成できるべきであるためである。
【００３１】
非保存的置換が可能であるのは、それによってプログラニュリン・ポリペプチドの活性が過度に影響されない、もしくはプログラニュリン・ポリペプチドの有効性が減少しない、またはその両方の条件下である。
【００３２】
当該技術分野において周知であるように、アミノ酸の「保存的置換」またはポリペプチドの「保存的置換変異体」とは、１）ポリペプチドの骨格構造（例：βシート構造またはαらせん構造）、２）アミノ酸の電荷または疎水性、３）側鎖の嵩、またはこれらの特性の１つまたは複数が維持されるアミノ酸置換を意味する。より具体的には、周知の用語「親水性残基」は、セリンまたはトレオニンに関連する。「疎水性残基」は、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、またはアラニンに関連する。「正電荷を持つ残基」は、リジン、アルギニン、またはヒスチジンに関連する。「負電荷を持つ残基」は、アスパラギン酸またはグルタミン酸に関連する。「嵩の大きい側鎖」を有する残基は、フェニルアラニン、トリプトファン、またはチロシンに関連する。
【００３３】
用語「アミノ酸の保存的置換」は、当該技術分野において周知であり、特定のアミノ酸を類似する特徴（例：類似する電荷または疎水性、類似する嵩）を有するアミノ酸によって置換することに関連する。例として、グルタミン酸の場合のアスパラギン酸、ロイシンの場合のイソロイシンが挙げられる。表１は、例示的なアミノ酸の保存的置換のリストを示している。保存的置換変異体は、１）親配列に対する保存的アミノ酸置換のみを有し、２）親配列を基準として少なくとも９０％の配列相同性、好ましくは少なくとも９５％の相同性、９６％の相同性、９７％の相同性、９８％の相同性、９９％の相同性、または９９％より高い相同性を有し、３）プログラニュリン・ポリペプチドの活性を維持する。この点において、上に記載したポリペプチド配列の任意の保存的置換変異体は、本発明によるものとして意図されている。このような変異体は、プログラニュリンであるものとみなされる。
【００３４】
【表１】
2013544245.tif 000003
例示的な一態様において、神経変性疾患としては、以下に限定されないが、パーキンソン病、および進行性核上性麻痺を含むパーキンソン症候群、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患（例：筋萎縮性側索硬化症）のほか、プログラニュリンの発現変化によって介在される任意の他の神経変性疾患が挙げられる。
【００３５】
別の実施形態において、医薬組成物が提供される。本医薬組成物は、治療有効量のプログラニュリンと、薬学的に許容される担体とを含んでおり、治療有効量は、神経変性疾患の患者の嗅内皮質または前頭皮質、または神経変性疾患を発症していない個人の脳におけるネプリライシンの活性または発現を増大させる効果を有するプログラニュリンの量を含む。別の実施形態において、本医薬組成物は、治療有効量のプログラニュリンと薬学的に許容される担体とを含んでおり、治療有効量は、神経変性疾患の患者の脳内のミクログリアを減少させる効果を有する量を含む。
【００３６】
プログラニュリン・ポリペプチドを含む組成物の１日用量は、患者の状態、治療する病気の状態、プログラニュリンの投与経路および組織分布、他の治療法を併用する可能性に応じて大きく変わりうる。患者に投与されるプログラニュリンの有効量は、体表面積、患者の体重、医師による患者の状態の評価などに基づく。例示的な一実施形態において、プログラニュリンの有効量は、患者の体重１ｋｇあたり約１ｎｇから患者の体重１ｋｇあたり約１ｍｇの範囲、より好ましくは患者の体重１ｋｇあたり約１ｎｇから患者の体重１ｋｇあたり約５００ｎｇの範囲、最も好ましくは患者の体重１ｋｇあたり約１ｎｇから患者の体重１ｋｇあたり約１００ｎｇの範囲とすることができる。
【００３７】
別の例示的な実施形態において、プログラニュリン・ポリペプチドの有効量は、患者の体重１ｋｇあたり約１ｐｇから患者の体重１ｋｇあたり約１ｍｇの範囲とすることができる。さまざまな例示的な実施形態において、有効量は、患者の体重１ｋｇあたり約１ｐｇから患者の体重１ｋｇあたり約５００ｎｇの範囲、患者の体重１ｋｇあたり約５００ｐｇから患者の体重１ｋｇあたり約５００ｎｇの範囲、患者の体重１ｋｇあたり約１ｎｇから患者の体重１ｋｇあたり約５００ｎｇの範囲、患者の体重１ｋｇあたり約１００ｎｇから患者の体重１ｋｇあたり約５００ｎｇの範囲、または患者の体重１ｋｇあたり約１ｎｇから患者の体重１ｋｇあたり約１００ｎｇの範囲とすることができる。
【００３８】
別の例示的な一実施形態において、プログラニュリン・ポリペプチドの有効量は、患者の体重１ｋｇあたり約１μｇから患者の体重１ｋｇあたり約１ｍｇの範囲とすることができる。さまざまな例示的な実施形態において、有効量は、患者の体重１ｋｇあたり約１μｇから患者の体重１ｋｇあたり約５００μｇの範囲、患者の体重１ｋｇあたり約５００ｎｇから患者の体重１ｋｇあたり約５００μｇの範囲、患者の体重１ｋｇあたり約１μｇから患者の体重１ｋｇあたり約５００μｇの範囲、患者の体重１ｋｇあたり約０．１μｇから患者の体重１ｋｇあたり約５μｇの範囲、患者の体重１ｋｇあたり約０．１μｇから患者の体重１ｋｇあたり約１０μｇの範囲、または患者の体重１ｋｇあたり約０．１μｇから患者の体重１ｋｇあたり約１００μｇの範囲とすることができる。
【００３９】
プログラニュリンを含む組成物は、患者に非経口的に投与される、例えば、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、脳室内投与、髄腔内投与、脳内投与、または声帯内投与（脊髄）されることが好ましい。これに代えて、医学的に有用な他のプロセスによってプログラニュリン組成物を患者に投与することができ、任意の有効量と、適切な剤形（例えば持続放出剤形または除放剤形）を使用することができる。注射によって投与することができる。さらに、プログラニュリンを含む組成物を、徐放ポンプ（slow pump）を使用して注入することもできる。
【００４０】
非経口剤形の例としては、薬剤を含有する、等張生理食塩水、５％ブドウ糖またはその他の薬学的に許容される周知の液体担体（例えば、液体アルコール、液体グリコール、液体エステル、液体アミド）の水溶液が挙げられる。本発明による非経口剤形は、プログラニュリンを含む組成物の投与量を含んだ解凍可能な凍結乾燥物の形とすることができる。この実施形態の一態様において、当該技術分野において公知である多数の持続放出・除放剤形（例えば、特許文献１、特許文献２、および特許文献３に記載されている生物分解性炭水化物マトリックスなど）のいずれも投与することができる（これらの文書の開示内容は参照によって本明細書に援用する）。
【００４１】
例示的な実施形態において、プログラニュリンを非経口投与する目的で一般的に使用される医薬製剤としては、ａ）薬学的有効量のプログラニュリン、ｂ）約ｐＨ４．５〜約ｐＨ９の範囲内のｐＨを提供するための薬学的に許容されるｐＨ緩衝剤、ｃ）約０〜約２５０ミリモルの濃度範囲内のイオン強度調整剤、およびｄ）全製剤重量に対して約０．５％〜約７％の濃度範囲内の水溶性の粘度調整剤を含むもの、または、ａ）、ｂ）、ｃ）、およびｄ）の任意の組合せを含むものが記載される。
【００４２】
さまざまな例示的な実施形態において、本明細書に記載されている組成物および方法において使用するｐＨ緩衝剤は、当業者に公知のｐＨ緩衝剤であり、例えば、酢酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、さらには、塩酸、水酸化ナトリウム、酸化マグネシウム、リン酸１カリウム、重炭酸塩、アンモニア、炭酸、塩酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸、酢酸、リン酸水素二ナトリウム、ホウ砂、ホウ酸、水酸化ナトリウム、ジエチルバルビツール酸、タンパク質、さらには、さまざまな生物学的緩衝剤、例えば、ＴＡＰＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、カコジル酸塩、ＭＥＳが挙げられる。
【００４３】
別の例示的な実施形態において、イオン強度調整剤としては、当該技術分野において公知の調整剤、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、マンニトール、ブドウ糖、デキストロース、ソルビトール、塩化ナトリウム、塩化カリウム、およびその他の電解質が挙げられる。
【００４４】
有用な粘度調整剤としては、以下に限定されないが、イオン性および非イオン性の水溶性高分子、アクリル酸架橋重合体（例えば「カルボマー」系重合体、例：商標Ｃａｒｂｏｐｏｌ（Ｒ）として購入できるカルボキシポリアルキレン）、親水性ポリマー（例えば、ポリエチレンオキシド、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体、ポリビニルアルコール）、セルロース系重合体およびセルロース系重合体の誘導体（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エーテル化セルロース）、ゴム（例えば、トラガカントゴム、キサンタンガム）、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、ヒアルロン酸およびヒアルロン酸塩、キトサン、ジェラン、またはこれらの任意の組合せ、が挙げられる。製剤の所望のｐＨの達成を容易にする目的で、非酸性の増粘剤（例えば、天然または塩基性の増粘剤）を採用することが好ましい。均一なゲルが望ましい場合、分散剤（例えば、アルコール、ソルビトール、またはグリセリン）を加えることができ、あるいは、ゲル化剤を、粉砕、機械的な混合、または攪拌によって分散させることができ、またはこれらを組み合わせることができる。一実施形態において、増粘剤は、上述した基剤を提供することもできる。好ましい一実施形態において、粘度調整剤は、エーテル化またはエステル化などによって修飾されたセルロースである。
【００４５】
さまざまな例示的な実施形態において、提供されるプログラニュリン組成物は、プログラニュリン・ポリペプチドの全体または一部分を、単独で含む、または少なくとも１種類の別の薬剤（例えば、賦形剤、安定化剤、可溶化剤のうちの少なくとも１種類）と組み合わせて含むことができ、無菌の生体適合性医薬担体（例えば、以下に限定されないが、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、ブドウ糖、水）において投与することができる。適切な賦形剤は、炭水化物またはタンパク質の充填剤、例えば、糖類（ラクトース、ショ糖、マンニトール、ソルビトールなど）、スターチ（トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモなどからのスターチ）、セルロース（例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム）、ゴム（例えば、アラビアゴム、トラガカントゴム）、タンパク質（例えば、ゼラチン、コラーゲン）である。適切な崩壊剤または可溶化剤としては、寒天、アルギン酸、またはその塩（例えばアルギン酸ナトリウム）が挙げられる。
【００４６】
例示的な実施形態において、プログラニュリン・ポリペプチドは、単独で、あるいは、別の剤、薬剤、またはホルモンと組み合わせて、あるいは、賦形剤または他の薬学的に許容される担体と混合された医薬組成物として、患者に投与することができる。一実施形態において、薬学的に許容される担体は、薬学的に不活性である。別の実施形態において、神経系疾患を患う患者に、または神経変性疾患を発症していない個人に、プログラニュリンを単独で投与することができる。
【００４７】
プログラニュリンを含む組成物を投与するための任意の有効なレジメンを使用することができる。例えば、プログラニュリンを含む組成物を単回用量として投与することができ、または、プログラニュリンを含む組成物を分割して、１日あたり複数用量のレジメンとして投与することができる。さらには、毎日治療する代わりに、変則的なレジメン（例えば１週間あたり１〜３日）を使用することができ、本発明の目的においては、そのような断続的または変則的なレジメンは、毎日の治療と同等であるものとみなされ、本発明の範囲内である。一実施形態において、患者、または神経変性疾患を発症していない個人を、プログラニュリンを含む組成物の複数回の注射によって治療する。別の実施形態において、プログラニュリンを含む組成物を、例えば１２〜７２時間間隔または４８〜７２時間間隔で、患者に複数回（例：約２回〜最大で約５０回）注射する。（１回または複数回の）最初の注射の後、何日か、または何ヶ月かの間隔で、プログラニュリンを含む組成物の追加の注射を患者に投与することができ、追加の注射によって疾患の再発が予防される。あるいは、プログラニュリンを含む組成物の（１回または複数回の）最初の注射によって、疾患の再発を予防することができる。別の例示的な実施形態において、プログラニュリンを含む組成物を、神経変性疾患を発症していない個人に投与して、神経変性疾患を予防することができる。
【００４８】
別の例示的な実施形態において、プログラニュリンの発現を修飾する、エフェクター（例：治療用分子をコードするＤＮＡ、例えばプログラニュリンまたはプログラニュリンの一部をコードするＤＮＡ）または複数のエフェクターの組合せを含む組成物を、神経変性疾患の患者に投与することによって、患者を治療することができる。この場合、プログラニュリンの発現を修飾するエフェクターを含む組成物によって患者を治療することにより、神経変性疾患の患者の嗅内皮質または前頭皮質、または神経変性疾患を発症していない個人の脳の任意の部分において、ネプリライシンの活性または発現が増大する。
【００４９】
別の実施形態において、プログラニュリンの発現を修飾するエフェクターまたはエフェクターの組合せを含む組成物を、神経変性疾患の患者に投与することによって、患者を治療することができ、この場合、プログラニュリンの発現を修飾するエフェクターを含む組成物によって患者を治療することにより、神経変性疾患の患者の脳内のミクログリアが減少する。
【００５０】
別の実施形態において、エフェクターを含む組成物を、神経変性疾患を発症していない個人に投与して、神経変性疾患を予防することができる。
【００５１】
プログラニュリンのエフェクターを投与するステップを含む、本明細書に記載されている実施形態のいずれにおいても、任意の製剤、治療レジメン、投与レジメンなどを使用することができる。
【００５２】
さらに別の実施形態において、医薬組成物が提供される。本医薬組成物は、プログラニュリンの発現を修飾する、治療有効量のエフェクターと、薬学的に許容される担体とを含み、治療有効量は、神経変性疾患の患者の嗅内皮質または前頭皮質におけるネプリライシンの活性または発現を増大させることのできる量を含む。
【００５３】
別の実施形態において、神経変性疾患の患者の嗅内皮質または前頭皮質におけるネプリライシンの活性または発現を増大させる方法が提供される。本方法は、プログラニュリンの発現を修飾する、治療有効量のエフェクターを、神経変性疾患の患者に投与するステップであって、エフェクターの量が、神経変性疾患の患者の嗅内皮質または前頭皮質におけるネプリライシンの活性または発現を増大させるうえで有効である、ステップ、を含む。
【００５４】
別の実施形態において、神経変性疾患の患者の脳内のミクログリアを減少させる方法を提供される。本方法は、プログラニュリンの発現を修飾する、治療有効量のエフェクターを、神経変性疾患の患者に投与するステップであって、エフェクターの量が、神経変性疾患の患者の脳内のミクログリアを減少させるうえで有効である、ステップ、を含む。
【００５５】
上述した実施形態において、エフェクターを含む組成物を、神経変性疾患を発症していない個人に投与して、神経変性疾患を予防することができる。
【００５６】
本明細書では、プログラニュリンの発現を修飾するエフェクターとは、対象の細胞におけるプログラニュリンの発現を増大させる核酸（例：ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ）を意味する（例：配列番号１）。本明細書では、対象の細胞は、神経細胞を含む。プログラニュリンの発現を修飾するエフェクターを含む組成物の１日用量は、患者の状態、治療する病気の状態、エフェクターの分子量、エフェクターの投与経路および組織分布、他の治療法を併用する可能性に応じて、大きく変わりうる。患者に投与される有効量は、体表面積、患者の体重、医師による患者の状態の評価に基づく。例示的な一実施形態において、エフェクターの有効量は、患者の体重１ｋｇあたり約１ｎｇから患者の体重１ｋｇあたり約１ｍｇの範囲、より好ましくは患者の体重１ｋｇあたり約１ｎｇから患者の体重１ｋｇあたり約５００ｎｇの範囲、最も好ましくは患者の体重１ｋｇあたり約１ｎｇから患者の体重１ｋｇあたり約１００ｎｇの範囲とすることができる。
【００５７】
別の例示的な実施形態において、エフェクターの有効量は、患者の体重１ｋｇあたり約１ｐｇから患者の体重１ｋｇあたり約１ｍｇの範囲とすることができる。さまざまな例示的な実施形態において、有効量は、患者の体重１ｋｇあたり約１ｐｇから患者の体重１ｋｇあたり約５００ｎｇの範囲、患者の体重１ｋｇあたり約５００ｐｇから患者の体重１ｋｇあたり約５００ｎｇの範囲、患者の体重１ｋｇあたり約１ｎｇから患者の体重１ｋｇあたり約５００ｎｇの範囲、患者の体重１ｋｇあたり約１００ｎｇから患者の体重１ｋｇあたり約５００ｎｇの範囲、または患者の体重１ｋｇあたり約１ｎｇから患者の体重１ｋｇあたり約１００ｎｇの範囲とすることができる。
【００５８】
別の例示的な実施形態において、エフェクターの有効量は、７０ｋｇの患者あたり約１００万個のエフェクター分子から７０ｋｇの患者あたり約１０億個のエフェクター分子の範囲とすることができる。さまざまな例示的な実施形態において、有効量は、７０ｋｇの患者あたり約１００万個のエフェクター分子から７０ｋｇの患者あたり約５億個のエフェクター分子の範囲、７０ｋｇの患者あたり約２０万個のエフェクター分子から７０ｋｇの患者あたり約２億個のエフェクター分子の範囲、または７０ｋｇの患者あたり約１００万個のエフェクター分子から７０ｋｇの患者あたり約２億個のエフェクター分子の範囲とすることができる。
【００５９】
プログラニュリンの発現を修飾するエフェクターを含む組成物は、患者に非経口投与されることが好ましく、例えば、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、脳室内投与、髄腔内投与、脳内投与、または声帯内投与（脊髄）されることが好ましい。これに代えて、プログラニュリンの発現を修飾するエフェクターを含む組成物を、医学的に有用な他のプロセスによって患者に投与することができ、任意の有効量と、適切な剤形（例えば持続放出剤形）を使用することができる。注射によって投与を達成することができる。
【００６０】
プログラニュリンの発現を修飾するエフェクターを含む組成物は、非経口的に注射されることが好ましく、このような注射は、皮内注射、腹腔内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、脳室内注射、髄腔内注射、脳内注射、声帯内注射（脊髄）とすることができる。プログラニュリンの発現を修飾するエフェクターを含む組成物を、徐放ポンプを使用して注入することもできる。さらには、適切な経路として、例えば経口投与または経粘膜投与も挙げられる。プログラニュリンの発現を修飾するエフェクターを細胞内に投与する治療法も、後述するように達成することができる。
【００６１】
非経口剤形の例としては、薬剤を含む、等張生理食塩水、５％ブドウ糖またはその他の薬学的に許容される周知の液体担体（例えば、液体アルコール、液体グリコール、液体エステル、液体アミド）の水溶液が挙げられる。本発明による非経口剤形は、プログラニュリンの発現を修飾するエフェクターを含む組成物の投与量を含んだ解凍可能な凍結乾燥物の形とすることができる。この実施形態の一態様において、当該技術分野において公知である多数の持続放出剤形（例えば、特許文献１、特許文献２、および特許文献３に記載されている生物分解性炭水化物マトリックスなど）のいずれも投与することができる（これらの文書の開示内容は参照によって本明細書に援用する）。
【００６２】
プログラニュリンの発現を修飾するエフェクターを含む組成物を投与するための任意の有効なレジメンを使用することができる。例えば、プログラニュリンの発現を修飾するエフェクターを含む組成物を単回用量として投与することができ、または、プログラニュリンの発現を修飾するエフェクターを含む組成物を、複数回の用量として投与することができる。さらには、毎日治療する代わりに、変則的なレジメン（例えば１週間あたり１〜３日）を使用することができ、本発明の目的においては、そのような断続的または変則的なレジメンは、毎日の治療と同等であるものとみなされ、本発明の範囲内である。一実施形態において、プログラニュリンの発現を修飾するエフェクターを含む組成物の１回または複数回の注射によって患者を治療する。別の実施形態において、プログラニュリンの発現を修飾するエフェクターを含む組成物を、例えば１２〜７２時間間隔または４８〜７２時間間隔で、患者に複数回（例：約２回〜最大で約５０回）注射する。（１回または複数回の）最初の注射の後、何日か、または何ヶ月かの間隔で、プログラニュリンの発現を修飾するエフェクターを含む組成物の追加の注射を患者に投与することができ、追加の注射によって疾患の再発が予防される。あるいは、プログラニュリンの発現を修飾するエフェクターを含む組成物の１回または複数回の最初の注射によって、疾患の再発を予防することができる。別の実施形態において、エフェクターを含む組成物を、神経変性疾患を発症していない個人に投与して、神経変性疾患を予防することができる。
【００６３】
さまざまな例示的な実施形態において、本明細書に記載されている組成物は、プログラニュリンまたはその一部分をコードする、分離精製された核酸配列を含む。核酸を精製する方法は、当業者に周知である。一実施形態において、配列は、プログラニュリンの発現を指示する調節配列に操作可能に連結されている。さらなる実施形態において、配列は、異種プロモーターまたは同種プロモーターに操作可能に連結されている。さらなる実施形態において、配列はベクター内に含まれている。いくつかの実施形態において、ベクターは宿主細胞（例：神経細胞）の中に存在する。一実施形態において、ベクターはレンチウイルスベクター（例：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド）である。
【００６４】
本明細書では、用語「ベクター」は、ＤＮＡまたはｍＲＮＡの断片を患者の細胞に運搬する核酸分子に関連して使用される。ベクターは、核酸配列と、操作可能に連結された配列コード核酸を患者内で発現させるのに必要な適切な核酸配列とを含んでいる。ベクターは、ベクター内に挿入された核酸分子を発現させて、ポリペプチドまたはタンパク質、またはその一部を作成することができる。発現に必要な核酸配列は、通常、プロモーターと、オペレーター（任意）と、リボソーム結合部位とを含み、しばしば、さらにそれ以外の配列（例えばエンハンサー、終結シグナルおよびポリアデニル化シグナル）も含む。
【００６５】
核酸の運搬に細胞を使用する場合、トランスダクション、トランスフェクション、マイクロインジェクション、またはエレクトロポレーションによって核酸を細胞内に導入することができる。送達用細胞は、外因性核酸または異種核酸が細胞の中に導入されたとき、このような核酸によって、トランスフォーメーション、トランスダクション、またはトランスフェクトすることができる（例：リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、ポリブレン介在トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、バイオリスティクスなどによる）。例えば、形質転換ＤＮＡは、送達用細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組み込まれる（共有結合される）、または組み込まれない。例えば哺乳類の細胞において、形質転換ＤＮＡは、エピソーム要素（例えばプラスミド）において維持することができる。真核細胞において、安定して形質転換された細胞は、染色体複製を通じて娘細胞によって継承されるように形質転換ＤＮＡが染色体に組み込まれた細胞である。
【００６６】
本明細書では、プログラニュリンの発現を修飾するエフェクターは、プログラニュリンの核酸を含んでいることができ、プログラニュリンの核酸は、完全なプログラニュリンのコード配列、その一部分、または本明細書に記載されている相同配列を含む。
【００６７】
別の例示的な実施形態において、当該技術分野において公知である任意の手順、例えば特許文献４、特許文献５、および特許文献６（これらの文書は参照によって本明細書に援用する）に記載されている手順によって、プログラニュリンの核酸をベクターに組み込んで患者に投与することができる。例示的な実施形態において、プログラニュリンの核酸は、患者の組織から抽出した細胞にインビトロで導入する（この場合、修飾された細胞を再び体内に導入する）、または適切な組織の中にインビボで直接導入する、あるいは対象のベクターとプログラニュリンの核酸のコンストラクトを使用して導入することができる。さまざまな例示的な実施形態において、例えば、ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを使用して、あるいは非ウイルス法、例えば、トランスフェクション、裸のＤＮＡの注入、エレクトロポレーション、ソノポレーション、遺伝子銃（例：ＤＮＡで覆われた金粒子を高圧ガスで細胞内に打ち込む）、合成オリゴマー、リポプレックス、ポリプレックス、ビロソーム、またはデンドリマーを使用して、プログラニュリンの核酸を細胞または組織に導入することができる。
【００６８】
細胞または組織を処理する一実施形態において、プログラニュリンの核酸は、ウイルスベクターを使用して細胞または組織に導入することができる。ウイルスベクターは、当該技術分野において公知の任意のウイルスベクターとすることができる。例えば、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、修飾されたヘルペスウイルスベクターなどとすることができる。一実施形態において、ベクターはレンチウイルスベクター（例：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド）である。細胞にトランスフェクトする別の例示的な実施形態において、直接的なＤＮＡトランスフェクション（リポフェクション、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーションなど）によって、プログラニュリンの核酸を細胞に導入することができる。
【００６９】
さまざまな例示的な実施形態において、プログラニュリンの核酸は、例えば、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、またはプログラニュリンの核酸を含む発現コンストラクトとすることができる。
【００７０】
本明細書に記載されているプログラニュリンの核酸は、核酸を合成または単離する目的に一般に使用される任意の従来手段によって合成または単離することができ、配列番号（１）および配列番号（１３）の核酸を含む。例えば、当該技術分野において公知である方法によって、市販の試薬および合成装置を使用して、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を化学的に合成することができる。本明細書に記載されているプログラニュリンの核酸は、核酸を精製する目的で当該技術分野において一般に使用されている任意の従来手段によって、精製することができる。例えば、電気泳動法と、当該技術分野において公知の核酸精製キット（例：Ｑｕｉａｇｅｎ  ｋｉｔ）とを使用して、プログラニュリンの核酸を精製することができる。ウイルスベクターを使用して送達する場合、または直接的なＤＮＡトランスフェクションによって細胞に導入する場合に適しているプログラニュリンの核酸は、当該技術分野において公知である組換え法のいずれかを使用して合成することもできる。
【００７１】
本明細書に記載されている方法および組成物において、修飾ヌクレオシド間結合を有する核酸を使用することもできる。修飾ヌクレオシド間結合を含む核酸は、当該技術分野において公知である試薬および方法を使用して合成することができ、例えば、ホスホン酸塩、ホスホロチオエート、ジチオリン酸、ホスホロアミデートメトキシエチルホスホロアミデート（phosphoramidate methoxyethyl phosphoramidate）、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、ジイソプロピルシリル、アセトアミデート、カルバメート、ジメチレン−スルフィド（−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−）、ジメチレン−スルホキシド（−ＣＨ２−ＳＯ−ＣＨ２−）、ジメチレン−スルホン（−ＣＨ２−ＳＯ２−ＣＨ２−）、２’−Ｏ−アルキル、または２’−デオキシ−２’−フルオロホスホロチオエートのヌクレオシド間結合を含む核酸を合成する方法を使用することができる。
【００７２】
さらに、修飾されたプログラニュリンの配列（すなわち天然のプログラニュリンをコードする配列とは異なる配列）についても、そのような修飾された配列が、活性レベルの程度の差はあっても天然のプログラニュリンの生物活性を示すタンパク質を依然としてコードする限りは、本発明に含まれる。これらの修飾されたプログラニュリンの配列には、点突然変異に起因する修飾、遺伝暗号の縮重または自然に起こる対立遺伝子変異型による修飾、あるいは組換え型のプログラニュリンの核酸を合成するために遺伝子工学によって導入されるさらなる修飾が含まれる。
【００７３】
プログラニュリンの核酸としては、配列番号１または１３と９５％の相同性を有する核酸、または、極めてストリンジェントな条件下でプログラニュリンの配列番号１または１３のＤＮＡコード配列の相補体とハイブリダイズする核酸と９５％の相同性を有する核酸が挙げられる。本明細書では、用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的な核酸の対形成に関連して使用している。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強さ（例：核酸間の関連の強さ）は、核酸間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのＴｍ（融解温度）、核酸内のＧ：Ｃ比などの要因によって影響を受ける。本明細書では、用語「ストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションが行われるときの条件（温度、イオン強度、および他の化合物（例えば有機溶媒）の存在）に関連して使用している。
【００７４】
例示的な実施例において、極めてストリンジェントな条件とは、５×ＳＳＰＥおよび５０％ホルムアミド中で６５℃にてハイブリダイズさせ、０．５×ＳＳＰＥにおいて６５℃で洗浄することを意味する。別の例示的な実施例において、極めてストリンジェントな条件とは、５０％ホルムアミド（ｖｏｌ／ｖｏｌ）と、１０％デキストラン硫酸と、１×デンハート溶液と、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）と、５×ＳＳＣと、ハイブリダイゼーション緩衝液１ｍｌあたり２００μｇのサケ精子ＤＮＡとからなるハイブリダイゼーション緩衝液において、５５℃で１８〜２４時間ハイブリダイズさせ、２倍のＳＳＣおよび１％ＳＤＳによって室温で４回洗浄し（それぞれ５分間ずつ）、０．１×ＳＳＣによって５０〜５５℃で１５分間洗浄することを意味する。別の例示的な実施例において、極めてストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件は、非特許文献１に記載されている（この文書は参照によって本明細書に組み込まれている）。いくつかの態様において、ハイブリダイゼーションは、核酸の全長に沿って起こる。
【００７５】
本発明において、極めてストリンジェントなハイブリダイゼーションが検出されることは、例えば本明細書で提供される核酸と、強い構造的な類似性または相同性（例：ヌクレオチド構造、塩基組成、配列、順序）があることを示す。
【００７６】
プログラニュリンの配列番号１または１３のＤＮＡコード配列と約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有する核酸分子も含まれる。本明細書では、２つの配列の間の相同性の割合は、配列間の同一性の割合と等価である。配列の間の相同性または同一性の割合の判定は、例えば、ＧＡＰプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ社のソフトウェアであり、現在はＡｃｃｅｌｒｙｓ社（http://www.accelrys.com）を通じて入手可能である）を使用することによって行うことができ、アラインメントは、例えばＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（ＶＮＴＩソフトウェア、ＩｎｆｏｒＭａｘ社）を使用して行うことができる。目的の核酸配列を使用して配列データベースを検索することができる。データベース検索用のアルゴリズムは、一般にはＢＬＡＳＴソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年）に基づく。いくつかの実施形態において、相同性または同一性の割合は、核酸の全長に沿って求めることができる。
【００７７】
本明細書では、用語「相補的な」は、プリンおよびピリミジンのヌクレオチド配列が、水素結合を通じて結び付いて二本鎖核酸分子を形成する能力を意味する。グアニンとシトシン、アデニンとチミン、アデニンとウラシルは相補的であり、水素結合を通じて結び付くことができ、２個の核酸分子が相補配列を有するときに二本鎖核酸分子が形成される。相補配列は、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列とすることができる。相補的なＤＮＡ配列または相補的なＲＮＡ配列は、相補体と称される。相補性は部分的であってもよく、その場合、核酸の塩基の一部のみが塩基対形成則に従って合致する。あるいは、核酸間に完全つまり全体的な相補性が存在していてもよい。
【００７８】
例示的な実施形態において、神経変性疾患は、患者への環境的刺激によって介在される。本明細書では、患者への環境的刺激によって介在される神経変性疾患は、プログラニュリンの発現を修飾するプログラニュリンの遺伝子の永続的な突然変異に起因するのではなく環境的刺激に起因する疾患を意味する。遺伝的変異は、患者のＤＮＡにおける永続的な突然変異であり、患者の子孫に伝えられうる。しかしながら、これらの例示的な実施形態は、例えば神経毒の代謝に関与する変更遺伝子の対立遺伝子変異型（神経変性疾患を多かれ少なかれ発症しやすくする）の影響を除外することを意図するものではない。本明細書では、これらの変更遺伝子は、疾患発症の過程を変化させ得る。
【００７９】
患者への環境的刺激によって介在される神経変性疾患は、遺伝子の発現を修飾することによって直接的または間接的に神経細胞死を引き起こす環境要因に関連する散発性疾患でありうる。別のさまざまな例示的な実施形態において、環境的刺激は、患者の食事由来、体内合成、またはその両方である。例示的な一実施形態において、環境的刺激は、インビボで有害な影響を引き起こす化合物が合成される原因となる。神経細胞死は、さまざまな原因、例えば、以下に限定されないが、興奮毒性または酸化ストレスによって起こりうる。例えば、環境有害物質によって神経細胞死が起こるさまざまな原因は、特許文献７に記載されており、この文書は参照によって本明細書に組み込まれている。
【００８０】
別の例示的な実施形態において、神経変性疾患状態は、興奮毒によって介在される。興奮毒は、受容体（例えば、興奮性の神経伝達物質であるグルタミン酸の受容体）の過剰な活性化によって神経細胞を損傷させて神経細胞死を引き起こす種類の物質である。興奮毒の例としては興奮性アミノ酸が挙げられ、興奮性アミノ酸は中枢神経系に損傷を発生させ得る。興奮毒のさらなる例としては、以下に限定されないが、ステロールグルコシド（例えばβ−シトステロール−β−Ｄ−グルコシド、コレステロールグルコシド）、メチオニンスルホキシミンのほか、患者に神経興奮毒性反応を引き起こす、当該技術分野において公知の他の物質が挙げられる。例示的な一実施形態において、興奮毒はステロールグリコシドである。さらなる例示的な実施形態において、ステロールグリコシドは、β−シトステロール−β−Ｄ−グルコシド、コレステロールグルコシド、その類似体または誘導体からなる群から選択される。
【００８１】
例示的な一実施形態において、神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、およびＡＬＳからなる群から選択される。アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳなどの神経系疾患では、一般的には、臨床的に観察することのできる行動欠陥が生じる。これらの疾患では、神経細胞集団が標的となり、神経病理学的症状および行動上の症状が発生する。アルツハイマー病では、大脳皮質および海馬のさまざまな領域の神経細胞が死に、結果として記憶や学習などの認識機能が失われる。パーキンソン病では、黒質−線条体系の一部分が変成する。初期段階では、黒質からドーパミン含有神経細胞の末端突起が消失する。次に黒質内の神経細胞体が死に、運動制御が影響を受け、震えおよび歩行障害が起こる。
【００８２】
運動ニューロン疾患の例は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。ＡＬＳでは、主として、脊髄および皮質の運動ニューロンが失われ、これにより麻痺が増大し、最終的には死に至る。ＡＬＳの初期症状としては、以下に限定されないが、患者の脚、足、または足首における下垂足または衰弱、手の衰弱または動かしづらさ、筋けいれん、腕、肩、および舌における単収縮が挙げられる。ＡＬＳでは、一般的に、咀嚼、嚥下、発声、および呼吸が影響を受け、最終的には、これらの機能を行うのに必要な筋肉が麻痺する。さまざまな神経系疾患の概要については非特許文献２に記載されており、この文書は参照によって本明細書に援用する。本発明の方法および組成物は、ヒトの臨床医学用途および獣医学用途の両方に使用することができる。本明細書に記載されている方法および組成物は、単独で使用する、または他の方法または組成物と組み合わせて使用することができる。
【００８３】
別の例示的な実施形態において、プログラニュリンの発現を修飾するエフェクター（例：治療用分子をコードするＤＮＡ）またはエフェクターの組合せを含む組成物を、神経変性疾患の患者に投与することによって、患者を治療することができ、この場合、プログラニュリンの発現を修飾するエフェクターを含む組成物によって患者を治療することにより、患者における神経変性疾患の症状が軽減する。この実施形態には、プログラニュリンの発現を修飾するエフェクターを使用する上記の実施形態のいずれも適用することができる。
【００８４】
さらに別の実施形態において、医薬組成物が提供される。本医薬生成物は、プログラニュリンの発現を修飾する、治療有効量のエフェクターと、薬学的に許容される担体とを含み、治療有効量は、神経変性疾患の患者において神経変性疾患の症状を軽減することのできる量、または神経変性疾患を発症していない個人において神経変性疾患の症状を予防することのできる量を含む。この実施形態には、プログラニュリンの発現を修飾するエフェクターを使用する上記の実施形態（例：製剤の実施形態、投与レジメンの実施形態、治療レジメンの実施形態など）のいずれも適用することができる。
【実施例】
【００８５】
実施例１
動物
野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはアルツハイマー病のＴｇ２５７６マウスモデルに対して、レンチウイルスの注入を行った。アルツハイマー病のＴｇ２５７６マウスモデルは、ハムスターのプリオンタンパク質プロモーターの制御下で高いレベルにおけるＡＰＰ（ＡＰＰＫ６７ＯＮ，Ｍ６７１Ｌ）のスウェーデン変異を発現する。これらのマウスでは、高レベルの脳Ａβが生成され、海馬、嗅内皮質、および前頭皮質においてアミロイド斑の形の、年齢に関係する進行性の沈着が形成される（ヒトにおいて見られるものに類似する）。これらの斑の形成に対するプログラニュリンの影響と、ネプリライシンの発現に対するプログラニュリンの効果とを評価する目的で、８ヶ月齢のマウスを、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはプログラニュリン（ＰＧＲＮ）のいずれかをコードする組換えレンチウイルスベクターを用いて、片側から海馬内に注入することによって処置した。次に、マウスを１２ヶ月齢において潅流によって屠殺した。次に、プログラニュリンの発現、斑負荷、およびネプリライシンの発現について、組織を分析した。
【００８６】
動物：研究には、２０〜２５ｇの雌のＴｇ２５７６マウスを使用した。マウスは、１２時間ごとの昼夜サイクルの温度制御された環境において、標準的な食物および水にいつでもアクセスできる状態で飼育した。本研究において使用した手順は、ＩＡＣＵＣ（Mayo Foundation Institutional Animal Care and Use Committee）によって承認された。
【００８７】
マウスを、０．９％生理食塩水の経心腔的灌流によって屠殺し、脳を取り出して、組織化学的分析および免疫組織学的解析を行うことができるように４％のパラホルムアルデヒド中で固定した。クリオスタット上で、対称的な厚さ２０μｍの冠状切片を切り取り、使用するまでＭｉｌｌｏｎｉｇ溶液中で保存した。
【００８８】
実施例２
顕微鏡観察
マウスの切片の顕微鏡観察およびすべての顕微鏡写真は、Ｍｏｔｉｃ社のカメラＢ５  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ  ３．０  （Ｍｏｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．、カナダ、リッチモンド）およびＺｅｉｓｓ社の顕微鏡Ａｘｉｏｖｅｒｔ  Ｅｐｉｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ２０００を使用して実施および撮影した。データの解析は、Ｍｏｔｉｃ社のＢ５  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ、Ｍｏｔｉｃ社のＩｍａｇｅｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ３．０、およびＺｅｉｓｓ社のＡｘｉｏｖｅｒｔ  Ｚｏｏｍ  Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ  ３．１（ＡｘｉｏＣａｍ  ＨＲＭを装着）を使用して行った。
【００８９】
実施例３
レンチウイルスベクター
プログラニュリンを発現させるレンチウイルスベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カリフォルニア州カールズバッド））の力価は、ブラストサイジン耐性アッセイ（blasticidin resistance assay）によって、１×１０８ＴＵ／ｍＬであるものと判定された。レンチウイルスをクライオバイアル中で−８０℃に凍結させ、注入の日まで保存した。
【００９０】
実施例４
プログラニュリンの免疫組織化学的検査
浮遊切片（free-floating section）を、１×ＴＢＳ−Ｔｒｉｔｏｎ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、０．９％  ＮａＣｌ、０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中で室温にて静かに撹拌しながら１０分間ずつ３回洗浄した。次に、切片をＴＢＳ−ｔ中の５％ロバ血清中で室温にて静かに撹拌しながら３０分間ブロックした。その後、切片をヒツジの抗プログラニュリン抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、２％ロバ血清で１：１０００の希釈）にさらし、この場合、最初の２時間は室温で、その後４℃で静かに攪拌しながら一晩インキュベートした。翌日、一次抗体を取り除き、切片を、１×ＴＢＳ−ｔ中で室温にて静かに撹拌しながら１０分間ずつ３回洗浄した。次に、切片を室温にて静かに撹拌しながら、二次抗体（ロバ抗ヒツジ抗体の１％ロバ血清／ＴＢＳ−ｔ溶液（１：５００）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、分子プローブ、カタログ番号Ａ−２１０９７）に４時間さらした。１×ＴＢＳ−ｔ中で室温にて静かに攪拌しながら１０分間ずつ３回洗浄することによって、二次抗体を取り除いた。次に、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ  Ｇ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カタログ番号１７９８４−２５）を使用して、切片をスライドの上に載せ、２４×６０ｍｍのＮｏ．０カバースリップ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カタログ番号６３７５１−０１）を用いてカバーガラスを取り付けて撮影した。結果は図１を参照。
【００９１】
実施例５
プログラニュリンの免疫組織化学的検査
実施例４に説明したものと同じ手順を使用して、図２に提示した結果を得た。
【００９２】
実施例６
ネプリライシンの免疫反応性
ネプリライシンは、アミロイド−βの分解における律速酵素と考えられる。ネプリライシンタンパク質の発現（図３）およびネプリライシンの活性（後述する図４および図５を参照）の両方に対するプログラニュリンの効果を調べた。組織の操作すべては、プログラニュリンの免疫組織化学的検査について上述したとおりである。この場合、５％ヤギ血清で切片をブロックし、使用した一次抗体は、ウサギ抗ネプリライシン抗体（２％ヤギ血清で１：５００希釈  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、カタログ番号ＡＢ５４５８）であった。二次抗体は、ヤギ抗ウサギ抗体（１：５００の希釈）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、分子プローブ、カタログ番号Ａ−１１０３７）であった。
【００９３】
実施例７
ネプリライシンの活性
このアッセイは、レンチウイルスを注入した野生型Ｃ５７／ＢＬ６マウスに対して行った。コロニーで飼育された雌のＣ５７／ＢＬ６マウス（３ヶ月齢）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社（ケベック州セントヒヤシンス）から購入した。マウスに対するすべての手順は、プリンスエドワードアイランド大学におけるＡｔｌａｎｔｉｃ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ＣｏｌｌｅｇｅのＡｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認され、Ｔｇ２５７６マウスにウイルスを注入する場合の前述した手順と同じである。マウスは、ウイルスを注入してから１ヶ月後に断頭によって屠殺し、背側海馬の全体または前頭部のいずれかが含まれるように脳をブロックした（ｎ＝６匹のマウス）。結果は図４および図５に示してある。
【００９４】
ＤＡＧＮＰＧ（Ｎ−ｄａｎｓｙｌ−Ａｌｐｈａ−Ｇｌｙ−Ｄ−ｎｉｔｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ、Ｐ’１位置に芳香族部分、Ｐ’２位置に短い残基を有する、エンケファリンを模したもの）は、ネプリライシン（ＮＥＰ）の内部消光基質である。ネプリライシンはＤＡＧＮＰＧをＤＡＧに分解し（Ｋｍ＝４５μＭ、Ｖ＝０．６５μｍｏｌ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｉｎ）、遊離したダンシル基は、３４２ｎｍの波長で励起させることができ、５６２ｎｍで発光する。ＡＣＥもＤＡＧＮＰＧを分解することができるため、ネプリライシンの活性を分離するためにはＡＣＥ抑制物質が必要である（少なくとも０．５μＭのカプトプリルを使用して１０分間プレインキュベートしなければならない）。ネプリライシンは、５０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣＬ（ｐＨ７．４）において最適な活性を有し、２０ｎＭのチオルファン（Ｋｉ＝３ｎＭ）によって抑制される。
【００９５】
組織の溶解：
秤量した組織を、氷冷した５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）（３ｍｇ／ｍｌ）に入れた。次に、位置１にセットされたホモジナイザー（ＶＷＲ社、Ｍｏｄｅｌ  ＶＢＩ  ２５）を３０ストロークして氷上で組織をホモジナイズした。氷上での１５秒間の超音波処理（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＳｏｎｉｃ  Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ  Ｍｏｄｅｌ  １００）（設定＃５）によって、マイクロプローブを使用して、組織をさらに破壊した。ホモジネートを、無菌のマイクロ遠心チューブに移し、４℃、１００００Ｇにおいて３０分間、遠心分離した。次に、上清を、別の無菌のマイクロ遠心チューブに移し、同じ遠心分離手順を繰り返した。次に、この上清２００μｌを使用して、ネプリライシンの活性をアッセイした。
【００９６】
酵素のアッセイ：
最終体積２００μｌの試料に、カプトプリル（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｃ４０４０２、最終濃度０．５μＭ）を、チオルファン（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｔ６０３１、最終濃度２０ｎＭ）とともに、またはチオルファンなしで、加えた。反応混合物を３７℃で３０分間インキュベートした後、１ｍＭのＤＡＧＮＰＧ（Ｎ−ｄａｎｓｙｌ−Ａｌｐｈａ−Ｇｌｙ−Ｄ−ｎｉｔｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ、Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｄ２１５５、最終濃度５０μＭ）を試料に加え、混合し、３７℃でさらに２時間インキュベートした。１００℃に５分間加熱することで酵素活性を変性させることにより、反応を停止させた。得られた混合物を、室温で５０００Ｇにおいて５分間、遠心分離した。得られた上清の１７５μｌを取り出し、４００μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．４）に希釈して混合した（ボルテックス、１０秒）。次に、混合物の２００μｌを９６ウェルプレートに分注し、Ｓｐｅｃｔｒａ  ｍａｘ  Ｍ２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）プレートリーダー（３５５ｎｍで励起）を使用して、５５０ｎｍにおける発光を読み取った。
【００９７】
実施例８
ネプリライシンの活性および発現
ネプリライシンの活性アッセイを、実施例７に説明したように行った（図４および図５を参照）。市販されているタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号２３２２２５）を使用し、標準物質としてウシ血清アルブミンを用いて、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）をベースとするタンパク質アッセイをメーカーの指示に従って行った（図５を参照）。
【００９８】
実施例９
プログラニュリンのエフェクターの投与
イソフルラン（１％）を使用してマウスを麻酔し、Ｋｏｐｆ社の定位固定フレームに置いた。海馬への形質導入のため、Ｈａｒｖａｒｄ社のポンプによって駆動されるＨａｍｉｌｔｏｎ社の５０μｌシリンジにポリエチレンチューブ（５０ＰＥ）によって接続された注入カニューレを介して、ＧＦＰまたはＰＧＲＮレンチウイルスベクターのいずれかを０．２５μｌ／分の速度で左側海馬に片側から注入した（Ａ．Ｐ．−１．７，Ｍ．Ｌ．−１５  １．５，Ｄ．Ｖ．−２．３）（２μｌ／部位）。注入後、機器回収前に４分間にわたり、カニューレからベクターを拡散させた（図６）。
【００９９】
実施例１０
プログラニュリンのエフェクターによる斑負荷の減少
アミロイドの沈着を検出するため、切片を脱イオン水において５分間リンスした後、用事調製した１％チオフラビンＳ（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｔ１８９２）水溶液に、暗下で室温にて２０分間さらした。７０％エタノール：水の溶液中で５分間染色を識別化した。その後、脱イオン水で５秒間ずつ２回リンスすることによってエタノールを除去した。次に、プログラニュリンの免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）手順において上述したように、切片を載せて撮影した。結果を図７に示す。
【０１００】
実施例１１
プログラニュリンのエフェクターによる斑負荷の減少
実施例１０に説明したようにアッセイを行った。結果を図８に示す。
【０１０１】
実施例１２
プログラニュリンのエフェクターによるミクログリアの減少
Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ  ＳｉｍｐｌｉｆｉｃｏｌｉａからのイソレクチンＢ４は、ミクログリア細胞（特に活性化したミクログリア）に活発に結合する。Ｔｇ２５７６マウスにおいて進行している神経病理に対する神経炎症反応に対するプログラニュリン治療の効果を評価した（図９を参照）。浮遊切片を、１×ＴＢＳ−ｔ中で室温にて静かに撹拌しながら１０分間ずつ３回洗浄した。次に、切片をＴＢＳ−ｔ中の５％ヤギ血清中で室温にて静かに撹拌しながら３０分間ブロックした。その後、切片を、ＦＩＴＣ共役ＩＬＢ４（３％ヤギ血清中の１：１００希釈、Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂ社、カタログ番号ＦＬ１２０１）に、４℃で静かに攪拌しながら一晩さらした。翌日、１×ＴＢＳ−ｔ中で室温にて静かに撹拌しながら１０分間ずつ３回洗浄することで、未結合ＩＬＢ４−ＦＩＴＣを除去した。次に、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ  Ｇ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カタログ番号１７９８４−２５）を使用して、切片をスライドの上に載せ、２４×６０ｍｍのＮｏ．０カバースリップ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カタログ番号６３７５１−０１）を用いてカバーガラスを取り付けて撮影した。
【０１０２】
定量解析：
コンピュータ支援画像解析システムと、Ｚｅｉｓｓ社の画像解析ソフトウェアＡｘｉｏｖｉｓｉｏｎ  ４．７とを使用して、１匹のマウスあたり４枚の冠状切片に存在する海馬全体と、嗅内皮質および前頭皮質の領域を撮影することによって、プログラニュリンＩＨＣの濃度定量を行った（ｎ＝１２）（図１、図２）。ネプリライシンＩＨＣの評価にも、同じ解析を適用した（図３）。２０倍の対物レンズを使用して得られた画像をＡｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアを使用して解析することで、海馬、嗅内皮質、および前頭皮質における斑負荷（図７および図８）を、各領域におけるチオフラビンＳ陽性要素によって占有される総面積の割合（％）を測定することによって求めた。
【０１０３】
ＩＬＢ４陽性のミクログリアの数を求めるため（図９）、各マウスにおいて（ｎ＝１２）、海馬を含む冠状切片を評価した。ネプリライシンの活性を求めるため、チオルファンの非存在時に得られた活性から、チオルファンの存在時に得られた活性を差し引いた。すべての解析において、実験者には処置条件を知らせなかった。
【０１０４】
統計解析：
二元配置分散分析を使用してデータ解析を行った。有意なＦ値が得られた場合、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定を使用して、計画ペアワイズ比較（planned pair-wise comparisons）を行った。ｐ＜０．０５のとき、差は統計的に有意であるとみなした。
【０１０５】
本明細書には、本発明のさまざまな実施形態が開示されているが、当業者の一般的な知識に従って、数多くの適合化および修正を、本発明の範囲内で行うことができる。このような修正としては、実質的に同じ方法で同じ結果が達成されるように、本発明の任意の態様を既知の同等の態様に置き換えることが挙げられる。数値の範囲には、範囲を定義している両端値が含まれる。本明細書において、語「備えている／含んでいる」は、非制限的な語として使用されており、「〜を含んでおり、ただしこれらに限定されない」という表現と実質的に同等であり、語「備える／含む」も、同じ意味を有する。本明細書における参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明の従来技術であることを認めるようには解釈されないものとする。本明細書において引用されているすべての刊行物、例えば特許および特許出願（ただしこれらに限定されない）は、これら個々の刊行物それぞれが、参照によって本明細書に援用されることを明示的かつ個別に示されている場合と同様に、または内容全体が本明細書に記載されている場合と同様に、参照によって本明細書に援用される。実施例および図面を参照しながら実質的に上に記載されているすべての実施形態および変形形態は、本発明に含まれる。
【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図１】
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【図３】
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【図７】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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