(57)【要約】  本発明は、増大した量の油を産生する遺伝子導入藻類細胞、遺伝子導入藻類細胞を作製する方法、及びバイオ燃料を遺伝子導入藻類細胞から得る方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒプシンを含有するタンパク質を過剰発現し、対応する天然の藻類細胞によって産生される油の量と比べて増大した量の油を産生する遺伝子導入藻類細胞。
【請求項２】
真核生物翻訳開始因子５Ａ（ｅＩＦ−５Ａ）を過剰発現する、請求項１に記載の遺伝子導入藻類細胞。
【請求項３】
ｅＩＦ−５Ａは、配列番号３と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の遺伝子導入藻類細胞。
【請求項４】
プロモーターに作動可能に連結したｅＩＦ−５Ａをコードする核酸を含む構築体を含む、請求項２に記載の遺伝子導入藻類細胞。
【請求項５】
プロモーターはサッカロミセスセレビシエ解糖系酵素プロモーターである、請求項４に記載の遺伝子導入藻類細胞。
【請求項６】
構築体は、配列番号１に記載の配列を有する核酸を含む、請求項４に記載の遺伝子導入藻類細胞。
【請求項７】
デオキシヒプシンシンターゼ（ＤＨＳ）を過剰発現する、請求項１に記載の遺伝子導入藻類細胞。
【請求項８】
ＤＨＳは、配列番号４と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の遺伝子導入藻類細胞。
【請求項９】
プロモーターに作動可能に連結したトマトＤＨＳをコードする核酸を含む構築体を含む、請求項７に記載の遺伝子導入藻類細胞。
【請求項１０】
プロモーターはサッカロミセスセレビシエ解糖系酵素プロモーターである、請求項９に記載の遺伝子導入藻類細胞。
【請求項１１】
構築体は、配列番号２に記載の配列を有する核酸を含む、請求項９に記載の遺伝子導入藻類細胞。
【請求項１２】
ＤＨＳをさらに過剰発現する、請求項２に記載の遺伝子導入藻類細胞。
【請求項１３】
サッカロミセスセレビシエ解糖系酵素プロモーターに作動可能に連結したトマトＤＨＳをコードする核酸を含む構築体をさらに含む、請求項４に記載の遺伝子導入藻類細胞。
【請求項１４】
配列番号２に記載の配列を有する核酸を含む構築体をさらに含む、請求項６に記載の遺伝子導入藻類細胞。
【請求項１５】
油を製造する方法であって、バイオリアクター中、油を産生する条件下で、かつ油を産生するのに十分な時間、請求項１に記載の遺伝子導入藻類細胞を増殖させるステップと、遺伝子導入藻類細胞から油を回収するステップと、を含む方法。
【請求項１６】
バイオディーゼル燃料を製造する方法であって、バイオリアクター中、油を産生する条件下で、かつ油を産生するのに十分な時間、請求項１に記載の遺伝子導入藻類細胞を増殖させるステップと、遺伝子導入藻類細胞から油を回収するステップと、回収した油をバイオディーゼル燃料に加工するステップと、を含む方法。
【請求項１７】
対応する天然の藻類細胞によって産生される油の量と比べて増大した量の油を産生する遺伝子導入藻類細胞を作製する方法であって、プロモーターに作動可能に連結したｅＩＦ−５Ａをコードする核酸を含むｅＩＦ−５Ａ構築体を得るステップと、構築体を用いて藻類細胞を形質転換するステップと、藻類細胞の増殖が可能な条件下で、かつ藻類細胞が増殖するのに十分な時間、形質転換された藻類細胞を培養するステップと、藻類細胞を回収するステップと、を含む方法。
【請求項１８】
藻類細胞を形質転換するステップの前に、プロモーターに作動可能に連結したＤＨＳをコードする核酸を含むＤＨＳ構築体を得るステップと、ＤＨＳ構築体及びｅＩＦ−５Ａ構築体の両方を用いて藻類細胞を形質転換するステップと、をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景】
【０００１】
[0001]再生可能エネルギーの持続可能な生産は、政府及び産業の重要な目標となってきている。主に食用作物から生産された第１世代のバイオ燃料は、バイオ燃料生産、気候変化の緩和及び経済成長の目標を達成する能力が限られている（Ｍａｔａ（２０１０）Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  ａｎｄ  Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １４：２１７〜２３２）。したがって、藻類を含む非原料から生産される第２世代のバイオ燃料への関心が増している。最も一般的なバイオ燃料は、現代の自動車において車のエンジンを少しの変更で又は全く変更しないでそれぞれディーゼル及びガソリンに取って替わることができるバイオディーゼル及びバイオエタノールである。バイオディーゼル及びバイオエタノールはまた、既存の技術を使用して生産でき、かつ利用可能な配給システムを通して配給することができる。藻類は、油の産生だけでなく、１ヘクタール当たりのエネルギー収量がはるかに高いという利点も有し、農地を必要とせず、汚染防止、特に排出ＣＯ２及び他の温室効果ガスの生物学的隔離、又は排水処理と組み合わせることができる（Ｍａｔａ（２０１０）Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  ａｎｄ  Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １４：２１７〜２３２）。バイオ燃料生産のために藻類を使用することの主要な制約はコストである。藻類の大規模培養は、最大の増殖をもたらし、その結果油の回収が最大になるように、慎重に制御された条件及び最適な養育環境を有さなければならない。排出された燃焼ガスからのＣＯ２隔離又は排水改善プロセスなどの汚染防止及び／又は他のプロセス産業に適用される高価値化合物の抽出を組み込むためのシステムを設けることは、経済力を高める。
【０００２】
[0002]植物及び動物では、真核生物翻訳開始因子５Ａ（ｅＩＦ−５Ａ）、デオキシヒプシンシンターゼ（ＤＨＳ）及びデオキシヒプシンヒドロキシラーゼ（ＤＨＨ）は、細胞増殖及び細胞死において重要な役割を果たしている。植物では、ｅＩＦ−５Ａ又はＤＨＳのいずれかの発現が改変されると、速く成長して、油の組成に変化がないまま、全体的により大きい植物と種子生産の増大をもたらす（Ｗａｎｇ（２００５）Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ  １２４：４９３〜５０３）。植物における改変されたｅＩＦ−５Ａ又はＤＨＳ発現の別の正の効果は、広範囲のストレスに耐える又は広範囲のストレスから回復する植物の能力である（Ｗａｎｇ（２００１）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６：１７５４１〜１７５４９、（２００３）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５２：１２２３〜１２３５、（２００５）Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ  １２４：４９３〜５０３）。藻類は、バイオディーゼルのための油を生産するのに理想的な生物であり、これらの遺伝子のいずれか又は両方の改変された発現が細胞数の増大をもたらせば、油の組成が維持されたまま油産生が増大することにもなるであろう。藻類をバイオ燃料生産のために使用する際に重要な要素の１つは、最大の藻類増殖を維持するために増殖条件の慎重なモニタリングを必要とする大規模バイオリアクターの使用である。これらの条件におけるいかなる変更も「ストレス」環境をもたらすことになり、したがって藻類の増殖速度に悪影響を与えることになる。ストレスに耐えることができる又はストレスを与えられた後に速く回復できる藻類を有することは生産力を増大させ、したがって油の生産コストをより市場性の高いレベルに低減させることができる。
【発明の概要】
【０００３】
[0003]本発明は、対応する天然の藻類細胞によって産生される油の量と比べて増大した量の油を産生する遺伝子導入藻類細胞を提供する。遺伝子導入藻類細胞は、ヒプシンを含有するタンパク質を過剰発現する。遺伝子導入藻類細胞は、真核生物翻訳開始因子５Ａ（ｅＩＦ−５Ａ）、デオキシヒプシンシンターゼ（ＤＨＳ）、デオキシヒプシンヒドロキシラーゼ（ＤＨＨ）又はそれらの組み合わせを過剰発現することができる。
【０００４】
[0004]ｅＩＦ−５Ａタンパク質は任意の供給源から得ることができる。ｅＩＦ−５Ａタンパク質は、配列番号４と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。ｅＩＦ−５Ａタンパク質は、ポプラｅＩＦ−５Ａタンパク質又は任意の他の植物ｅＩＦ−５Ａタンパク質であってもよい。ｅＩＦ−５Ａタンパク質は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含んでもよい。
【０００５】
[0005]ＤＨＳタンパク質は任意の供給源から得ることができる。ＤＨＳは、配列番号６と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ＤＨＳタンパク質は、トマトＤＨＳタンパク質又は任意の他の植物ＤＨＳタンパク質であってもよい。ＤＨＳタンパク質は、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含んでもよい。
【０００６】
[0006]ＤＨＨは、配列番号８と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ＤＨＨタンパク質は、配列番号８を有するアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＤＨＨは、配列番号７を含むヌクレオチド配列によってコードされている。
【０００７】
[0007]本発明は、対応する天然の藻類細胞と比べて増大した量の油を産生する遺伝子導入藻類細胞を作製する方法を提供する。この方法は、ヒプシンを含有する１種又は複数のタンパク質をコードする或いはヒプシンを含有するタンパク質の発現又は合成に関与する１種又は複数の構築体を得るステップと、１種又は複数の構築体を用いて藻類細胞を形質転換して、遺伝子導入藻類細胞を得るステップと、バイオリアクター中、油を産生する条件下で、かつ油を産生するのに十分な時間、遺伝子導入藻類細胞を培養するステップと、遺伝子導入藻類細胞から油を回収するステップと、を含む。
【０００８】
[0008]藻類細胞は、２種以上の構築体を用いて形質転換させてもよく、それぞれの構築体は、ｅＩＦ−５Ａ、ＤＨＳ又はＤＨＨをコードする核酸を含んでもよい。藻類細胞は、ｅＩＦ−５Ａをコードする核酸を含む構築体及びＤＨＳをコードする核酸を含む構築体を用いて形質転換してもよい。したがって、遺伝子導入藻類細胞は、ｅＩＦ−５Ａ及びＤＨＳをコードする構築体を含み、ｅＩＦ−５Ａ及びＤＨＳを過剰発現してもよい。
【０００９】
[0009]本発明は、ｅＩＦ−５Ａ、ＤＨＳ、ＤＨＨ又はそれらの組み合わせを発現するための構築体を提供する。構築体は、ｅＩＦ−５Ａをコードする核酸、ＤＨＳをコードする核酸及びＤＨＨをコードする核酸からなる群から選択される２種以上の核酸の組み合わせを含んでもよい。
【００１０】
[0010]構築体は、プロモーターに作動可能に連結したｅＩＦ−５Ａ、ＤＨＳ又はＤＨＨをコードする核酸を含んでもよい。プロモーターは、サッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）解糖系酵素プロモーターであってもよい。構築体は、配列番号１、配列番号２に記載の配列を有する核酸を含んでもよい。
【００１１】
[0011]本発明は、バイオディーゼル燃料を製造する方法であって、バイオリアクター中、油を産生する条件下で、かつ油を産生するのに十分な時間、ヒプシンを含有するタンパク質を過剰産生する遺伝子導入藻類細胞を増殖させるステップと、遺伝子導入藻類細胞から油を回収するステップと、回収した油をバイオディーゼル燃料に加工するステップと、を含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】開始４日後のＴ０株スクリーニングデータ（７５％Ｎ−Ｐ−Ｋ栄養素、３反復／株、３０％遮光の振盪機、１２０ｒｐｍ）、７５％ＢＢＭにおける対照に対する増殖速度の増加率（％）を示す。（Ａ）上：ｐＰＧＫ：ＰｄＦ５Ａ３ｃＤＮＡ−ｔＮｏｓ構築体（ＰＦ）（配列番号１）。（Ｂ）下：ｐＰＧＫ：ＰｄＦ５Ａ３ｃＤＮＡ−ｔＮｏｓ＋ｐＰＧＫ：ＴＤＨＳ−ｔＴＥＦ１二重構築体（ＦＤ）（配列番号２）。
【図２】ＣＯ２飽和及び空気回復を示す。ＣＯ２での２４時間バブリング、続いて空気での２４時間バブリング、１００μＭｏｌ光、３反復／株、１００％ＢＢＭ。構築体は、ＰＦ（ＰＧＫ：ＰｄＦ５Ａ）及びＦＤ（ＰＧＫ：ＰｄＦ５Ａ＋ＰＧＫ：ＴＤＨＳ）である。
【図３】バイオリアクター及び培地の次の処方を使用した株スクリーニングデータを示す。４×マクロ、２×Ｎ、２×マイクロ、２４時間増殖、プラス６０％ＣＯ２、１３０μＭｏｌ光（３反復／実験）。
【図４】バイオリアクター中で２４時間増殖させた後の４×マクロ、２×Ｎ、２×マイクロ、プラス６０％ＣＯ２、１３０μＭｏｌ光（３反復／実験）における藻類の油産生を示す。
【図５】バイオリアクター中で７２時間増殖させた後の１０×マクロ、２×Ｎ、２×マイクロ、プラス６０％ＣＯ２、１３０μＭｏｌ光（３反復／実験）における藻類の油産生を示す。
【００１３】
[0017]表１は、（Ａ）ポプラｅＩＦ−５Ａ３及び他の植物由来のｅＩＦ−５Ａに関するアミノ酸配列アライメント及びヌクレオチド配列アライメント、並びに（Ｂ）トマトＤＨＳ及び他の植物由来のＤＨＳに関するアミノ酸配列アライメント及びヌクレオチド配列アライメントからの配列同一性の値を示す。
【発明の詳細な説明】
【００１４】
[0018]本発明は、遺伝子導入藻類細胞におけるポプラ増殖因子５Ａ（ｅＩＦ−５Ａ）の過剰発現はより速い藻類細胞の増殖及び分裂をもたらし、次いでこれにより、培養ごとに産生される油の総量の増大がもたらされるという知見に一部基づいている。遺伝子導入藻類細胞から回収された油の総量は、細胞数の増大だけに起因し得るものを超える。したがって、本発明はまた、ｅＩＦ−５Ａを単独で又はデオキシヒプシンシンターゼ（ＤＨＳ）と併せて過剰発現する遺伝子導入藻類細胞が、１細胞当たりより多くの油を含有するという知見に一部基づいている。
【００１５】
[0019]本発明は、ヒプシンを含有するタンパク質を過剰発現する遺伝子導入藻類細胞を提供する。ヒプシンを含有するタンパク質はｅＩＦ−５Ａであってもよい。遺伝子導入藻類細胞は、ＤＨＳ及びＤＨＨなどの、ｅＩＦ−５Ａを含有するタンパク質の合成、発現、又は翻訳後に関与する酵素を過剰発現することができる。遺伝子導入藻類細胞は、ｅＩＦ−５Ａ、ＤＨＳ、ＤＨＨ又はそれらの組み合わせを過剰発現することができる。本発明の遺伝子導入藻類細胞は原核藻類細胞及び真核藻類細胞の両方を包含する。本発明の遺伝子導入藻類細胞を作製するための藻類細胞は任意の藻類細胞であってもよい。藻類細胞は、紅藻植物（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）、緑藻植物（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、藍藻植物（Ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ）及び褐藻植物（Ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ）からなる門から選択されてもよい。藻類の例には、クラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）に属するクラミドモナスラインハルディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、クラミドモナスモエブシィ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｍｏｅｗｕｓｉｉ）、クラミドモナス属の種のＭＧＡ１６１株、クラミドモナスユーガメタス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｅｕｇａｍｅｔｏｓ）、及びクラミドモナスセグニス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｓｅｇｎｉｓ）；クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）に属するクロレラブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）；セネデスムス属（Ｓｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）に属するセネデスムスオブリガス（Ｓｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｏｂｌｉｇｕｕｓ）及びセネデスムスアクタス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ａｃｕｔｕｓ）；デュナリエラ属（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）に属するデュナリエラテルトロレクタ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｒｏｌｅｃｔａ）；アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）に属するアナベナバリアビリス（Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ  ２９４１３；シアノテセ属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）に属するシアノテセ属の種のＡＴＣＣ  ５１１４２；シネノコッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）に属するシネノコッカス属の種のＰＣＣ  ７９２４；並びにアナシスティス（Ａｎａｃｙｓｔｉｓ）属に属するアナシスティスニデュランス（Ａｎａｃｙｓｔｉｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００１６】
[0020]本発明の藻類細胞は、ｅＩＦ−５Ａ、ＤＨＳ、ＤＨＨ又はそれらの組み合わせをコードする外因性核酸を用いて形質転換させてもよい。ｅＩＦ−５Ａ、ＤＨＳ及びＤＨＨは、任意の供給源由来であってもよい。ｅＩＦ−５Ａ、ＤＨＳ及びＤＨＨの供給源は、植物、菌類又は動物供給源であってもよい。植物は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（Ａｔ１）、アルファルファ、バナナ、カーネーション、キャノーラ、トウモロコシ、レタス、コメ、ジャガイモ、ポプラ、トマト又はタバコであってもよい。植物ｅＩＦ−５Ａの異なるアイソフォームがあってもよい。例えば、表１は、トマトｅＩＦＡ５の異なる４つのアイソフォーム、ジャガイモｅＩＦＡ５の異なる５つのアイソフォーム、ポプラｅＩＦＡ５の異なる４つのアイソフォームなどを示す。菌類は、酵母菌、カビ、粘菌又はアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）であってもよい。
【００１７】
[0021]ｅＩＦ−５Ａは種々の供給源由来であってもよく、配列番号４に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ｅＩＦＡはポプラｅＩＦＡアイソフォーム３（ｅＩＦ−５Ａ３）であってもよく、配列番号３又はその機能的断片を含んでもよい。ｅＩＦ−５Ａは、デフォルトパラメーターを使用した配列アライメントプログラムによって決定される、配列番号４と少なくとも８５％の配列同一性を有してもよい。
【００１８】
[0022]ＤＨＳは種々の供給源由来であってもよく、配列番号４に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ＤＨＳは、配列番号６又はその機能的断片を含んでもよい。ＤＨＳは、デフォルトパラメーターを使用した配列アライメントプログラムによって決定される、配列番号６と少なくとも８５％の配列同一性を有してもよい。
【００１９】
[0023]ＤＨＨは種々の供給源由来であってもよく、配列番号８に対して少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ＤＨＨは、配列番号８又はその機能的断片を含んでもよい。ＤＨＨは、デフォルトパラメーターを使用した配列アライメントプログラムによって決定される、配列番号８と少なくとも８５％の配列同一性を有してもよい。
【００２０】
[0024]ｅＩＦ−５Ａ、ＤＨＳ又はＤＨＨをコードする核酸は、構築体を用いて藻類細胞に導入することができる。ｅＩＦ−５Ａ、ＤＨＳ又はＤＨＨをコードする核酸は構築体内に存在してもよい。構築体は、調節エレメントに作動可能に連結しているｅＩＦ−５Ａ、ＤＨＳ又はＤＨＨをコードする核酸を含んでもよい。調節エレメントは、ｅＩＦ−５Ａ、ＤＨＳ又はＤＨＨの発現を制御するプロモーターであってもよい。プロモーターは、サッカロミセスセレビシエ解糖系酵素プロモーターであってもよい。
【００２１】
[0025]構築体に含むことができる他の調節エレメントには、ターミネーター、所望の細胞を選択するためのマーカー、エンハンサー配列、核酸配列の発現を調節する応答エレメント又は誘導エレメントが含まれる。構築体に含むことができる調節エレメントの選択は、それらに限定されないが、複製効率、選択可能性、誘導能、所望の発現レベル、及び細胞又は組織特異性を含むいくつかの要因によって決まる。
【００２２】
[0026]作動可能に連結したタンパク質コード化配列の発現を調節するのに使用される発現制御エレメントは当技術分野で既知であり、それらに限定されないが、誘導プロモーター、構成プロモーター、分泌シグナル、及び他の調節エレメントを含む。誘導プロモーターは、宿主細胞の培地中の栄養素に応答性であるなど、容易に制御されることが好ましい。
【００２３】
[0027]ｅＩＦ−５Ａ、ＤＨＳ又はＤＨＨをコードする核酸が作動可能に連結したベクター及び／又は発現制御配列の選択は、所望の機能特性、例えばタンパク質発現、及び形質転換させる宿主細胞によって直接決まる。本発明によって意図されるベクターは、藻類細胞中の組換えＤＮＡ分子に含まれる構造遺伝子の複製及び好ましくは発現をも誘導することが少なくとも可能である。
【００２４】
[0028]一実施形態では、コード核酸分子を含むベクターは、原核レプリコン、すなわち、それを用いて形質転換された藻類細胞などの原核宿主細胞中の染色体外で自律複製及び組換えＤＮＡ分子の維持を導く能力を有するＤＮＡ配列を含むことになる。このようなレプリコンは当技術分野でよく知られている。その上、原核レプリコンを含むベクターは、その発現が薬剤耐性などの検出可能なマーカーを付与する遺伝子を含んでもよい。原核レプリコンを含むベクターは、藻類細胞中のコード遺伝子配列の発現（転写及び翻訳）を導くことができる原核又はバクテリオファージプロモーターをさらに含むことができる。
【００２５】
[0029]本発明の組換えＤＮＡ分子を用いた藻類細胞の形質転換は、使用するベクターのタイプ及び用いる宿主系によって通常決まる周知の方法によって達成される。藻類細胞の形質転換に関しては、電気穿孔法及び塩処理法を用いてもよい。構築体は、例えば、外因性ＤＮＡ、酸洗浄ビーズ、ポリエチレングリコール及び微粒子銃の存在下で細胞をボルテックスにかけるなど、他の標準的な形質転換法によって藻類に導入することもできる。
【００２６】
[0030]本発明の遺伝子導入藻類細胞は油を製造するのに使用できる。遺伝子導入藻類細胞は、バイオリアクター中、油を産生する条件下、油を産生するのに十分な時間増殖させることができる。油は、当技術分野で既知の方法によって細胞から回収することができる。遺伝子導入藻類細胞からの油はバイオディーゼル燃料に加工することができる。
【００２７】
[0031]さらなる説明なしに、当業者は、前述の説明及び以下の例示的な実施例を使用して、本発明を作製及び利用でき、特許請求された方法を実施できると考えられる。以下の実施例は、したがって、本発明の好ましい実施形態を具体的に示したものであり、決して開示の残りを限定するものと見なされるべきではない。
【実施例】
【００２８】
実施例１（遺伝子導入藻類）：
藻類培養：
[0032]セネデスムスアクタス（Ｓ．ａ．）及びクロレラブルガリス（Ｃ．ｖ．）細胞を、植物増殖用インキュベーター内、（１００×１０）ｍｍペトリ皿中、凝固ＢＢＭ培地（Ｓｔｅｉｎ（１９７３）（編）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ．  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ．  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）上で、１６ｈ明（１００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１光合成有効放射）／８時間暗期を用いて２１℃で増殖させ、かつ維持した。遺伝子導入株を、植物増殖チャンバー内で、液体ＢＢＭ培地を含む２５ｍｍガラス製試験管中、１６ｈ（１００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１光合成有効放射）／８ｈの明暗サイクルを用いて、１２０ｒｐｍでの振盪機上、２１℃の温度で増殖させた。ＯＤ６００が０．０１になるように細胞を希釈し、振盪機上に戻して、遺伝子導入株の増殖速度の促進が示されたかどうかを判定した。増殖速度は、振盪機上で１０日を経た後にＯＤ６００として測定した。
【００２９】
[0033]増殖チャンバー内、蓋付きの２５ｍｍガラス製試験管中で、１００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１光合成有効放射を用いて２４ｈ、２１℃の温度で増殖させた培養物について、ＣＯ２濃縮実験を最初に行なった。ＣＯ２（１００％）は、先端が各試験管の底に配置された２５ゲージ針に接続された１ｃｃ注射器の切断端にはめられたＴｙｇｏｎチューブを通して、それぞれ個々の試験管にバブリングされた。
【００３０】
[0034]＃３ゴム栓がそれぞれの首部にはめられた２００ｍｌガラス製四角瓶（Ｋｉｍａｘ）からなる小規模バイオリアクターを開発した。栓には穴が２つあり、一方には切断された１ｃｃ注射器を取り付け、その注射器にＣＯ２を供給するＴｙｇｏｎチューブを挿入し、他方の穴には、綿栓を含む１ｍｌプラスチック製ピペット（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃａｎａｄａ）の３ｃｍの後端部（ｐｌｕｇｇｅｄ  ｅｎｄ）を取り付けた。これは、リアクター内の圧力上昇を防ぐために通気孔として使用された。バイオリアクターは、４．０のＯＤ６００での藻類細胞２０ｍｌで開始された。瓶は、７０ｒｐｍでの回転振盪機上の植物増殖チャンバー内に２４時間明下で、１３０μＭｏｌ及び２１℃で置かれた。３Ｌ／分で流れる空気と２Ｌ／分で流れる１００％ＣＯ２とを混合して、約６０％ＣＯ２濃縮をもたらすことによって、炭素濃縮を達成した。
【００３１】
プラスミド構築体及び菌株：
１．ｐＢＩ−ＰＧＫＦ５Ａ構築体（ＰＦ）
[0035]ポプラｅＩＦ−５Ａ３  ｃＤＮＡヌクレオチド配列は配列番号３に示されており、アミノ酸配列は配列番号４に示されている。翻訳開始コドンは、ヌクレオチド４８から始まり、停止コドンは、ヌクレオチド５２５から始まる。サッカロミセスセレビシエ解糖系酵素プロモーター、ＰＧＫ１は、ＳａｌＩ制限部位を含む上流プライマー：５’−ＧＴＣＴＡＣＡＧＧＣＡＴＴＴＧＣＡＡＧＡＡＴＴＡＣＴＣＧ−３’（配列番号９）及びＢａｍＨＩ制限部位を含む下流プライマー：５’−ＧＧＡＴＣＣＴＧＴＴＴＴＡＴＡＴＴＴＧＴＴＧＴＡＡＡＡＡＧＴＡＧ−３’（配列番号１０）を用いてＰＣＲによって増幅された（Ｋｏｎｇ（２００６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｌｅｔｔ  ２８：２０３３〜２０３８）。ＰＧＫ１プロモーターのＰＣＲ産物を、ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩ部位を含むｐＢＩ１０１ベクターに連結した（ｐＢＩ−ＰＧＫと命名した）。
【００３２】
[0036]ＰｄｅＩＦ−５Ａ１、ＰｄｅＩＦ−５Ａ２、ＰｄｅＩＦ−５Ａ３及びＰｄｅＩＦ−５Ａ４と命名された４つの異なる完全長ＰｄｅＩＦ−５Ａ  ｃＤＮＡは、ＡｔｅＩＦ−５Ａ１  ｃＤＮＡを使用してヒロハハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｄｅｌｔｏｉｄｅｓ）の葉のｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすることによって単離された。製造業者の取扱説明書に従ってＱｉａｇｅｎキットを使用して、葉ｍＲＮＡを単離した。製造業者の取扱説明書に従ってＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ及びＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｃＤＮＡ  Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを使用して、ｃＤＮＡライブラリを調製した。ＰｄｅＩＦ−５Ａ１、ＰｄｅＩＦ−５Ａ２、ＰｄｅＩＦ−５Ａ３及びＰｄｅＩＦ−５Ａ４のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は、それぞれＦＪ０３２３０２、ＦＪ０３２３０３、ＦＪ０３２３０４及びＦＪ０３２３０５である。ｐＢＫ−ＣＭＶベクター中に５’−及び３’−ＵＴＲを含むＰｄｅＩＦ−５Ａ３完全長ｃＤＮＡは、ＢａｍＨＩ及びＳａｃＩ制限酵素で消化した。ｐＢＩ−ＰＧＫ中のＧＵＳ遺伝子もＢａｍＨＩ及びＳａｃＩ制限酵素消化によって取り出した。次いで、前消化したＰｄｅＩＦ−５Ａ３  ｃＤＮＡを前消化したｐＢＩ−ＰＧＫベクターと連結して、ｐＢＩ−ＰＧＫＦ５Ａ（ＰＦ）を形成した。ＰＦの最終構築体は、ＰＧＫ１−プロモーター：ＰｄＦ５Ａ３−ｃＤＮＡ：Ｎｏｓ−ターミネーター（配列番号１）を含む。ＰＦベクターをアグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＧＶ３１０１に電気穿孔法によって導入した。
【００３３】
[0037]ｐＰＧＫ：ＰｄＦ５Ａ３ｃＤＮＡ−ｔＮｏｓ構築体のヌクレオチド配列は、配列番号１に示されている。ＰＧＫ１プロモーター領域は、ヌクレオチド１〜７３７に存在する。中間領域は、ポプラｅＩＦ−５Ａ３完全長ｃＤＮＡ（５’−及び３’−ＵＴＲを含む）配列（ヌクレオチド７３８〜１８３２）である。残りの領域は、Ｎｏｓターミネーター（ヌクレオチド１５６２〜１８３２）である。
【００３４】
２．ｐＢＩ−ＰＧＫＦＤ構築体（ＦＤ）
[0038]トマトＤＨＳヌクレオチドコード配列は、配列番号５に示されており、アミノ酸配列は、配列番号６に示されている。ソラナムリコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）＋ＴＥＦ１−ターミネーター由来のＰＧＫ１−プロモーター＋ＴＤＨＳ（トマトデオキシヒプシンシンターゼ）ｃＤＮＡコード配列を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ｐＢＳ−ＫＳ）ベクター中にサブクローニングした。ＰＧＫ１プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含む上流プライマー：５’−ＡＡＧＣＴＴＡＧＧＣＡＴＴＴＧＣＡＡＧＡＡＴＴＡＣＴＣＧ−３’（配列番号１１）及びＸｈｏＩ制限部位を含む下流プライマー：５’−ＡＴＣＧＡＴＴＧＴＴＴＴＡＴＡＴＴＴＧＴＴＧＴＡＡＡＡＡＧＴＡＧ−３’（配列番号１２）を用いてＰＣＲによって増幅された。ＴＤＨＳは、Ｗａｎｇ（２００１）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６：１７５４１〜１７５４９に記載されているようにクローニングし、ＸｈｏＩ制限部位を含む上流プライマー：５’−ＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＧＡＧＡＡＧＣＴＣＴＧＡＡＧＴＡＣＡＧ−３’（配列番号１３）及びＢａｍＨＩ制限部位を含む下流プライマー：５’−ＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＡＣＴＴＧＧＣＡＣＣＴＴＡＴＣＴＧＧＧ（配列番号１４）を用いてＰＣＲによって増幅された。ＴＥＦ１ターミネーターは、ＢａｍＨＩ制限部位を含む上流プライマー：５’−ＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＴＡＣＴＧＡＣＡＡＴＡＡＡＡＡＧＡＴＴＣＴＴＧ（配列番号１５）及びＣｌａＩ制限部位を含む下流プライマー：５’−ＡＴＣＧＡＴＡＴＣＧＡＴＡＣＴＧＧＡＴＧＧＣＧＧＣＧＴＴＡＧＴＡＴＣＧ−３’（配列番号１６）を用いて、酵母菌ｐＦＡ６ａ−ｋａｎＭＸ６（Ｌｏｎｇｔｉｎｅ（１９９８）Ｙｅａｓｔ  １４：９５３〜９６１）ベクターからＰＣＲによって増幅された。ＰＧＫ１プロモーター、ＴＤＨＳ  ｃＤＮＡ及びＴＥＦ１ターミネーターは制限酵素で消化し、ｐＢＳ−ＫＳベクター中にサブクローニングした。
【００３５】
[0039]ＰＧＫ１：ＴＤＨＳ：ＴＥＦ１構築体は、ｐＢＳ−ＫＳベクターからＨｉｎｄＩＩＩ及びＣｌａＩで消化した。ＰＧＫ１：ＰｄＦ５Ａは、ＣｌａＩ制限部位を含む上流プライマー：５’−ＡＴＣＧＡＴＡＡＧＡＡＴＴＡＣＴＣＧＴＧＡＧＴＡＡＧＧ−３’（配列番号１７）及びＳａｃＩ制限部位を含む下流プライマー：５’−ＧＡＧＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号１８）、並びにテンプレートとしてｐＢＩ−ＰＧＫＦ５Ａを用いてＰＣＲによって増幅された。次いでＰＣＲ断片はＣｌａＩ及びＳａｃＩで消化した。ｐＢＩ１０１を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｃＩベクターで消化して、ＧＵＳ遺伝子を取り出した。次いでＰＧＫ１：ＴＤＨＳ：ＴＥＦ１（配列番号２）及びＰＧＫ１：ＰｄＦ５Ａ３の両方を前消化したｐＢＩ１０１に連結して、ｐＢＩ−ＰＧＫＦＤを形成した。ｐＢＩ−ＰＧＫＦＤは、ＰＧＫ１：ＴＤＨＳ：ＴＥＦ１及びＰＧＫ１：ＰｄＦ５Ａ３：Ｎｏｓを含む。ｐＢＩ−ＰＧＫＦＤは、アグロバクテリウムツメファシエンスＧＶ３１０１に電気穿孔法によって導入した。
【００３６】
[0040]ｐＰＧＫ：ＴＤＨＳ−ｔＴＥＦ１構築体のヌクレオチド配列は、配列番号２に示されている。ＰＧＫ１プロモーター領域は、ヌクレオチド１〜７３３に存在する。中間領域は、ポプラＤＨＳコード配列（ヌクレオチド７３４〜１８７９）である。強調された領域は、ＴＥＦ１ターミネーター（ヌクレオチド１８８０〜２１２６）である。
【００３７】
藻類の形質転換：
[0041]Ｓ．ａ．及びＣ．ｖ．は、Ｋｕｍａｒ（２００４）Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６６：７３１〜７３８に従って以下の変更を加えて形質転換させた。ＢＢＭを増殖培地として使用した。アグロバクテリウム細胞を、２×ＹＴ培地中２８℃で終夜増殖させた。抗生物質カナマイシンの代わりにＧ４１８を選択剤として使用した。遺伝子導入藻類コロニーは、形質転換から７〜１０日後に選択培地上に現れた。５０コロニーを選択し、Ｇ４１８への耐性を確認するために新鮮な選択プレート上に２回線条接種した。
【００３８】
[0042]遺伝子操作したＳ．ａ．及びＣ．ｖ．株を生成し、これらの株は単独で又はＴＤＨＳと併せてＰｄｅＩＦ−５Ａ（ｅＩＦ−５Ａ）の過剰発現を示した。遺伝子導入藻類コロニーは、アグロバクテリウム感染から７〜１０日後に選択プレート上に現れた。一例として、２０株の遺伝子導入株を選択し、液体培養で４日増殖させた後分析して、ｅＩＦ−５Ａ発現が増加せず、ＷＴ株と比べて増殖が増加した株を特定した。試験した２０株のうち、ｅＩＦ−５ＡをＰＧＫ１プロモーターの制御下で過剰発現した１２株は、対照株に対して４％〜５５％の範囲の増殖の増加を示した（図１）。Ｆ５Ａ及びＤＨＳの両方を含み、両方ともＰＧＫプロモーターによって駆動される第２の構築体を用いて形質転換した株も試験し、ＷＴ株よりも良好に機能して増殖が３％〜２０％の範囲で増加した株が４株だけもたらされた。これらの実験は、異なる時間に実施されたので、パーセント増加の差は、出発原料の異なる条件又は実験中の増殖条件に起因し得た。したがって、構築体ごとに最も良好な４株を特定し、その後の実験に使用した。
【００３９】
実施例２（遺伝子導入藻類細胞の油含有量）：
[0043]藻類細胞の総脂質含有量は、バニリンリン酸反応（ｓｕｌｐｈｏ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ｖａｎｉｌｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（Ｉｚａａｒｄ（２００３）Ｊ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５５：４１１〜４１８）を使用して測定した。遺伝子導入藻類株を作製することの目標は、バイオディーゼルのための油を産生するためにバイオリアクター中でそれらを使用することである。したがって、バイオリアクターの条件を模倣する実験を設計した。一般に、バイオリアクターは、連続光及び藻類細胞の一定の流動にさらされる藻類増殖チャンバー内に１００％ＣＯ２をバブリングする。これらの条件をシミュレートするために、個々の藻類株を含む試験管内にＣＯ２をバブリングするためのＣＯ２バブラーを開発し、それによって複数の株を同時に同じ増殖条件下で試験することが可能になった。培養を低細胞密度で開始したときに観察されたように、ＣＯ２の添加は必要ではなく、藻類の増殖に有害であることが証明された。連続光及び１００％ＣＯ２濃縮で２４時間培養された藻類細胞は、増殖しなかったが、定常期のままであった。ＣＯ２濃縮を中断し、空気を培養物内にバブリングした場合、増殖は再開され、ＰＦ株５で試験された４遺伝子導入株のうち２株においてより高い増殖速度が観察され、これによりＷＴの増殖速度に対して１５１％の増加が示された（図２）。この実験は、ｅＩＦ−５Ａ及び／又はＤＨＳを過剰発現している藻類が、ストレス事象に耐える又はストレス事象からより速く回復することを実証するものであり、ここで、ストレス事象はＣＯ２濃縮が過度であり、増殖培地における毒性条件をもたらしたことであった。
【００４０】
[0044]小規模バイオリアクターを開発した。遺伝子導入株を、バイオリアクター中、ＣＯ２濃縮条件下かつ増大した多量栄養素［リン（Ｐ）、カリウム（Ｋ）、カルシウム（Ｃａ）、マグネシウム（Ｍｇ）及び硫黄（Ｓ）］レベルでスクリーニングした。従来の藻類増殖は、ＢＢＭなどの培地中で起こる。対照及び遺伝子導入藻類培養物の両方は、多量栄養素レベル（４×）及び微量栄養素レベル（２×、データ示さず）を増大させた培地中で増殖させた場合、より速く増殖し、より多く油を産生する。したがって、遺伝子導入株をこれらの条件下でスクリーニングした。ＰＧＫ：Ｆ５Ａ株の１株及びＰＧＫ：Ｆ５Ａ−ＰＧＫ：ＴＤＨＳ株の４株すべては増殖速度の増加を示したこと、並びにこれらの各株は対照株から産生されたものに比して油産生が増大したこと（２４４〜４０７％増大）が判明した（図３）。油産生をさらに試験するために、２つの遺伝子導入株を選択した。ＰＧＫ：Ｆ５Ａ株８（ＰＦ８）及びＰＧＫ：Ｆ５Ａ−ＰＧＫ：ＴＤＨＳ株１６（ＦＤ１６）の株を使用してバイオリアクターに播種した。４×多量栄養素と一緒に２×微量栄養素及び２×窒素で２４時間増殖させた場合、両方の遺伝子導入株は、同条件下で増殖した対照株よりも著しく多く（それぞれ対照に対して２２６及び２０６％増大）油を産生した（図４）。
【００４１】
[0045]栄養素レベルを１０×多量栄養素、４×窒素及び２×微量栄養素までさらに増大させ、構築体ごとに２つの株をより長期間（７２時間）増殖させて、最大量の油を産生するのに最適な栄養素レベルを決定した。これらの条件下で増殖させた場合、遺伝子導入株と対照との間で細胞増殖に差はなかったが、油産生がＦＤ１６において著しく増大した（対照の５６０％増大、図５）。これらのデータは、藻類細胞におけるｅＩＦ−５Ａ及び／又はＤＨＳの過剰発現が、細胞増殖の増加及び油産生の増大をもたらすことを裏付ける。
【００４２】
[0046]本発明は上記の実施例を参照して詳細に説明されているが、種々の変更形態が本発明の精神から逸脱することなく実施できることは理解されたい。したがって、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。本出願で参照されたすべての引用特許及び刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【図１】
2013524816.tif 000002
【図２】
2013524816.tif 000003
【図３】
2013524816.tif 000004
【図４】
2013524816.tif 000005
【図５】
2013524816.tif 000006
【配列表】
2013524816000001.app
【国際調査報告】
2013524816.tif 000007
2013524816.tif 000008
2013524816.tif 000009
2013524816.tif 000010
2013524816.tif 000011
2013524816.tif 000012