(57)【要約】ナノ粒子の蛍光シグナルを安定化するための組成物及びその使用方法の実施態様が開示される。いくつかの実施態様において、組成物は７から１０のｐＨを有し、ホウ酸塩、タンパク質及び／又はタンパク質加水分解物、アミン、防腐剤及び非イオン性界面活性剤を含む。特定の実施態様において、アミンはＮ−エタノール置換アミン（例えばエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、Ｎ−メチルジエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン又はその組み合わせ）である。いくつかの実施態様において、蛍光粒子溶液（例えば量子ドット溶液又は陽子ドットコンジュゲート溶液）は、組成物で希釈され、４℃で保存される。ある実施態様では、希釈された蛍光粒子の蛍光強度は４℃で少なくとも１ヵ月又は３ヵ月の保存後、実質的に同じままである。特定の実施態様において、希釈された量子ドットコンジュゲートは、ハイブリダイズされたプローブ又はタンパク質抗原を検出するために用いられる。【選択図】図２６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光粒子を安定化させるための組成物であって、（ａ）アミノ酸又はアルキル置換アルキルアミン以外の置換アミン、又は（ｂ）アミン及びタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物を含み、少なくとも１つのアミン又はタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物は、（ａ）アミノ酸又はアルキル置換アルキルアミン以外の置換アミン、又は（ｂ）アミン及びタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物を欠く組成物中で保存された蛍光粒子の蛍光強度と比較して、組成物中で保存された蛍光粒子の蛍光強度を安定化及び／又は増加させるのに有効な濃度で存在する、組成物。
【請求項２】
さらにホウ酸バッファーを含み、７以上のｐＨを有する請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
防腐剤；及び
界面活性剤
をさらに含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
０．０２Ｍから０．５Ｍのホウ酸塩；
０．０５重量％から１．５重量％のタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物；
２５ｍＭから２００ｍＭのアミン；
０．０５重量％から０．２重量％の防腐剤；及び
０．００５重量％から０．０５重量％の界面活性剤
を含む、請求項１ないし３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項５】
アミンが化学式ＲｎＮＨ（３−ｎ）（ここで、ｎ＝１、２又は３であり、それぞれのＲは独立して脂肪族基、ヘテロ脂肪族基、アリール基、ヘテロアリール基、アルキルアリール基又はアリールアルキル基であり、少なくとも１つのＲは置換されている）を有するアミンである、請求項１ないし４の何れか一項に記載の組成物。
【請求項６】
少なくとも１つのＲが一又は複数の−ＯＨ、−ＯＲ１、−ＣＯ２Ｒ１、−ＣＮ基又はその組み合わせで置換されており、Ｒ１は置換又は非置換の脂肪族基又はアリール基である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
アミンがアルカノールアミンを含む、請求項１ないし６の何れか一項に記載の組成物。
【請求項８】
アミンがＮ−エタノール置換アミンを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
Ｎ−エタノール置換アミンが５０ｍＭから１００ｍＭまでの濃度を有する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
アミンがエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、Ｎ−メチルジエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン又はその組み合わせである、請求項７ないし９の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
アミンが置換された三級アルキルアミンである、請求項１ないし１０の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
タンパク質及び／又はタンパク質加水分解物が植物性トリプトン、サーモンペプトン、チキンアルブミン加水分解物、カゼイン加水分解物、魚皮のゼラチン又はその組合せである、請求項１ないし１１の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
防腐剤がアジ化ナトリウム、９．５−９．９％の２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンを含む防腐剤組成物、２．３％の５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、０．７％の２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、２−３％アルキルカルボキシレート、９３−９５％の修飾グリコールを含む防腐剤組成物、又はその組合せである、請求項３ないし１２の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、請求項３ないし１３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
界面活性剤がアルキレングリコール又は含酸素アルキレングリコールである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
界面活性剤がポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート、ポリエチレングリコールパラ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）又はポリオキシエチレングリコールドデシルエーテルである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
組成物が７から９のｐＨを有する、請求項１ないし１６の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
組成物が８から９のｐＨを有する、請求項１ないし１６の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
（ａ）アミノ酸又はアルキル置換アルキルアミン以外の置換アミン、又は（ｂ）アミン及びタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物を欠く組成物中の蛍光粒子の蛍光強度と比較して、蛍光粒子の蛍光強度が増加された、蛍光粒子をさらに含む、請求項１ないし１８の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
（ａ）アミノ酸又はアルキル置換アルキルアミン以外の置換アミン、又は（ｂ）アミン及びタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物を欠く組成物中の蛍光粒子の蛍光強度と比較して、蛍光粒子を組成物と混合した後の蛍光強度が、少なくとも５％増加された、蛍光粒子をさらに含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
量子ドット蛍光粒子又は量子ドットコンジュゲート蛍光粒子；
０．３２Ｍのホウ酸塩；
１．０５重量％のカゼイン加水分解物；
５０ｍＭのトリエタノールアミン；
０．０８重量％のアジ化ナトリウム
０．００５重量％のポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート
を含み、８から８．５のｐＨを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
蛍光粒子を安定化する方法であって、
少なくとも一つの蛍光粒子を含む蛍光粒子溶液を提供すること；及び
希釈された蛍光粒子溶液を提供するために組成物に蛍光粒子溶液を希釈すること
を含み、組成物は（ａ）アミノ酸又はアルキル置換アルキルアミン以外の置換アミン、又は（ｂ）アミン及びタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物を含み、少なくとも１つのアミン及びタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物は蛍光粒子の蛍光を安定化及び／又は増加させるのに有効な濃度で存在する、方法。
【請求項２３】
組成物に蛍光粒子溶液を希釈することが、（ａ）アミノ酸又はアルキル置換アルキルアミン以外の置換アミン、又は（ｂ）アミン及びタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物を欠く組成物に蛍光粒子溶液を希釈することによって形成される希釈された蛍光粒子溶液の蛍光強度と比較して、希釈された蛍光粒子溶液の蛍光強度を増加させる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
蛍光粒子溶液を組成物に希釈した後の希釈された蛍光粒子溶液の蛍光強度が、（ａ）アミノ酸又はアルキル置換アルキルアミン以外の置換アミン、又は（ｂ）アミン及びタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物を欠く組成物に蛍光粒子溶液を希釈することによって形成される希釈された蛍光粒子溶液の蛍光強度と比較して、少なくとも５％増加する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
組成物がホウ酸バッファー、防腐剤及び界面活性剤をさらに含み、７以上のｐＨを有する、請求項２２ないし２４の何れか一項に記載の方法。
【請求項２６】
組成物が０．０５Ｍから０．５Ｍのホウ酸塩、０．０５重量％から１．１重量％のタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物、５０ｍＭから１００ｍＭのアミン、０．０５重量％から０．２重量％の防腐剤及び０．００５重量％から０．０５重量％の非イオン性界面活性剤を含む、請求項２２ないし２５の何れか一項に記載の方法。
【請求項２７】
アミンがＮ−エタノール置換アミンである、請求項２２ないし２６の何れか一項に記載の方法。
【請求項２８】
希釈された蛍光粒子溶液を４℃で保存することをさらに含む、請求項２２ないし２７の何れか一項に記載の方法。
【請求項２９】
希釈された蛍光粒子溶液の蛍光強度が、４℃で１ヵ月の保存後、実質的に同じままである請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
希釈された蛍光粒子溶液の蛍光強度が、４℃で３ヵ月の保存後、実質的に同じままである請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
蛍光粒子溶液が少なくとも一つの量子ドットコンジュゲートを含む量子ドットコンジュゲート溶液であり、量子ドットコンジュゲート溶液は希釈された量子ドットコンジュゲート溶液を提供するために０．５ｎＭから１５０ｎＭの濃度に希釈される、請求項２２ないし３０の何れか一項に記載の方法。
【請求項３２】
希釈された量子ドットコンジュゲート溶液を、標的にハイブリダイズされたプローブを検出するために用いることをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
量子ドットコンジュゲートが量子ドット−抗体コンジュゲートであり、方法が
ハイブリダイズされたプローブを提供するために標的にプローブをハイブリダイズさせること；
５ｎＭから１００ｎＭの量子ドット−抗体コンジュゲート、０．０５Ｍから０．５Ｍのホウ酸塩、０．０５重量％から１．１重量％のタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物、５０ｍＭから１００ｍＭのＮ−エタノール置換アミン、０．０５重量％から０．１重量％のアジ化ナトリウム及び０．００５重量％から０．０５重量％の非イオン性界面活性剤を含み、８−９のｐＨを有し、量子ドット−抗体コンジュゲートがプローブに結合可能である、希釈された量子ドット−抗体コンジュゲート溶液を提供すること；
ハイブリダイズされたプローブと希釈された量子ドット−抗体コンジュゲート溶液を組み合わせること；及び
量子ドット−抗体コンジュゲートの蛍光を検出すること
をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
組織試料上のタンパク質抗原を検出するために希釈された量子ドットコンジュゲート溶液を用いることをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
量子ドットコンジュゲートが量子ドット−抗体コンジュゲートであり、方法が
５ｎＭから１００ｎＭの量子ドット−抗体コンジュゲート、０．０５Ｍから０．５Ｍのホウ酸塩、０．０５重量％から１．１重量％のタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物、５０ｍＭから１００ｍＭのＮ−エタノール置換アミン、０．０５重量％から０．１重量％のアジ化ナトリウム及び０．００５重量％から０．０５重量％の非イオン性界面活性剤を含み、８−９のｐＨを有し、量子ドット−抗体コンジュゲートはタンパク質抗原に結合可能である、希釈された量子ドット−抗体コンジュゲート溶液を提供すること；
組織試料と希釈された量子ドット−抗体コンジュゲート溶液を組み合わせること；及び
量子ドット−抗体コンジュゲートの蛍光を検出すること
をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
希釈された量子ドット−抗体コンジュゲート溶液が８から８．５のｐＨを有し、５ｎＭから１００ｎＭの量子ドット−抗体コンジュゲート、０．３２Ｍのホウ酸塩、１．０重量％のカゼイン加水分解物、５０ｍＭのトリエタノールアミン、０．０８重量％のアジ化ナトリウム及び０．００５重量％のポリエチレングリコールソルビタンモノラウレートを含む、請求項３３又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
希釈された量子ドット−抗体コンジュゲート溶液が使用前に４℃で保存される、請求項３３、３５又は３６に記載の方法。
【請求項３８】
希釈された量子ドット−抗体コンジュゲート溶液の蛍光強度が、４℃で１ヵ月の保存後、実質的に同じままである請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
希釈された量子ドット−抗体コンジュゲート溶液の蛍光強度が、４℃で３ヵ月の保存後、実質的に同じままである請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の説明
本出願は２０１０年２月２日に出願の米国仮特許出願第６１／３３７，３６３号の利益を請求し、その全てが出典明示により本願明細書に援用される。
【０００２】
技術分野
この開示は、蛍光粒子を保存するための新規な安定化バッファーの使用及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒト被験者の組織切片などの生体試料は、試料中のタンパク質、タンパク質断片又は他の標的に結合する抗体にコンジュゲートされた有機蛍光体を含む染色で処理することができる。染色された試料は光を照射され、蛍光体は蛍光を発する。試料の像を捕獲するために、顕微鏡に取り付けられたデジタルカメラを用いる。蛍光体／抗体の組合せが興味がある標的（例えば癌細胞によって産生されるタンパク質）に結合した領域は、試料の像において試料に適用された蛍光体の蛍光スペクトルによって影響された領域の色に着色されて見える。可視スペクトルに加えて、蛍光シグナルは、特定の蛍光体の発光スペクトルに依存して、赤外線又は紫外線領域において検出され得る。２以上の蛍光体を含む染色を試料に適用することができる。これらの方法は、疾患診断、処理に対する反応の評価及び疾患と闘うための新薬の開発を含む種々の用途を有する。
近年、量子ドットは、生物学的染色及び画像化適用のための検出材料として開発された。量子ドット（ＱｄｏｔＴＭナノクリスタル又はＱｄｏｔｓＴＭ）は、ナノ結晶発光半導体である。量子ドットは、生物学的染色適用ための従来の有機蛍光体に対していくつかの利点を提供する。これらの利点は、狭い発光帯ピーク、広い吸収スペクトル、強いシグナル及び相対的な蛍光シグナル安定性を含む。しかしながら、不適合の条件下で保存される場合、溶液中の量子ドット及び量子ドットコンジュゲートの蛍光強度は歴史的に見て不安定である。
【発明の概要】
【０００４】
蛍光シグナル安定化のための組成物及び量子ドット（ＱｄｏｔＴＭナノクリスタル）及びＱｄｏｔＴＭコンジュゲートなどのナノ粒子の使用法は、開示される。開示された組成物中でナノ粒子を保存することは、例えば粒子の凝集を最小化し、蛍光に適した条件を提供する。結果として、アッセイフォーマット中のナノ粒子及び／又はナノ粒子コンジュゲートの感受性及び特異性が維持されている間に、少量を自動化されたマニュアル手法において用いることができる。
蛍光粒子（例えば量子ドット及び量子ドットコンジュゲート）を安定化するための新規な組成物及びその使用方法の実施態様は、開示される。特定の組成物の開示された実施態様は、（ａ）アミノ酸又はアルキル置換アルキルアミン以外の置換されたアミン、又は（ｂ）アミン及びタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物を含み、アミン又はタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物のうちの少なくとも１つは、保存される蛍光粒子の蛍光を安定化及び／又は増加させるのに有効な濃度で組成物中に存在する。いくつかの実施態様において、組成物は、７−１０の範囲のｐＨを有し、０．０２Ｍから０．５Ｍのホウ酸塩、０．０５重量％から１．５重量％のタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物、２５ｍＭから２００ｍＭのアルキルアミン、０．０５重量％から０．２重量％の防腐剤及び０．００５重量％から０．０５重量％の界面活性剤を含む。
特定の実施態様において、アミンは化学式ＲｎＮＨ（３−ｎ）を有する置換アミンであって、ｎ＝１、２又は３であり、それぞれのＲは独立して脂肪族基、ヘテロ脂肪族基、アリール基、ヘテロアリール基、アルキルアリール基又はアリールアルキル基であり、少なくとも一つのＲは置換されている。いくつかの実施態様において、少なくとも一つのＲは、一つ以上の−ＯＨ、−ＯＲ１、−ＣＯ２Ｒ１、−ＣＮ基又はその組合せで置換されており、ここでＲ１は置換又は非置換の脂肪族化合物又はアリール基である。
いくつかの実施態様において、アミンは、第１、第２又は第３アミンである。いくつかの実施態様において、アルキルアミンは、アルカノールアミンである。特定の実施態様において、アミンは、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、Ｎ−メチルジエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン、又はその組合せなどのＮ−エタノール置換アミンである。
【０００５】
いくつかの実施態様において、タンパク質及び／又はタンパク質加水分解物は、植物性トリプトン、サーモンペプトン、カゼイン酸加水分解物、カゼイン塩基加水分解物、チキンアルブミン加水分解物、魚皮ゼラチン又はその組合せである。特定の実施態様において、防腐剤は、ａ）アジ化ナトリウム、ｂ）９．５−９．９％の２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンを含む防腐剤組成物、ｃ）２．３％の５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、０．７％の２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、安定化剤としての２−３％アルキルカルボキシレート及び９３−９５％の修飾グリコールを含む防腐剤組成物又はｄ）その組合せである。いくつかの実施態様において、界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００（ポリエチレングリコールパラ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）又はＢｒｉｊ３５（ポリオキシエチレングリコールドデシルエーテル）などの非イオン性界面活性剤である。
特定の実施態様では、組成物は、８から８．５のｐＨを有し、５０ｍＭのホウ酸塩、１．０５％（ｗ／ｗ）のカゼイン加水分解物、５０ｍＭのトリエタノールアミン、０．０８重量％のアジ化ナトリウム及び０．００５重量％ポリエチレングリコールソルビタンモノラウリラウレートを含む。
【０００６】
新規な組成物を用いる方法の実施態様も開示される。いくつかの実施態様において、蛍光粒子溶液（例えば量子ドット溶液又は量子ドットコンジュゲート溶液）は、希釈された蛍光粒子溶液を製造するために組成物で希釈され、希釈された蛍光粒子／組成物溶液は蛍光粒子の貯蔵寿命を増加させるために外気温度以下の温度で保存される。いくつかの実施態様において、懸濁された蛍光粒子の蛍光は、少なくとも１ヵ月、少なくとも２ヵ月、少なくとも３ヵ月又は少なくとも６ヵ月間安定化される。特定の実施態様において、開示された組成物の実施態様に懸濁された量子ドット又は量子ドットコンジュゲートの蛍光強度は、懸濁された蛍光粒子が４℃で少なくとも１ヵ月間保存された場合、実質的に同じ状態のままである。特定の実施態様において、開示された保存組成物の実施態様に懸濁された量子ドット又は量子ドットコンジュゲートの蛍光強度は、４℃において少なくとも３ヵ月間同じ状態のままである。開示された組成物以外（例えば他の又は先行技術の組成物）で保存された量子ドット又は量子ドットコンジュゲートは、４℃で１ヵ月後に蛍光強度の有意な減少を示す。
特定の実施態様において、組成物中に保存される蛍光粒子は、アルキルアミン、タンパク質、界面活性剤及び／又は防腐剤の一つ以上を欠く組成物の実施態様において保存される粒子の蛍光と比較して、特定の時点で増加した蛍光を有する。いくつかの実施態様において、初期の蛍光は増加する。他の実施態様において、蛍光は、初期の処方の後に増加する。いくつかの実施態様において、増加した蛍光は、少なくとも５時間、少なくとも２５時間、少なくとも１００時間、少なくとも２５０時間、少なくとも７５０時間、少なくとも１５００時間、少なくとも３，０００時間又は少なくとも４３００時間（すなわち６ヵ月）の間持続する。具体的な実施態様において、量子ドット又は量子ドットコンジュゲートの蛍光は、開示された保存組成物の実施態様の懸濁させた場合、他の、又は先行技術の組成物に懸濁された量子ドット又は量子ドットコンジュゲートと比較して、５％から１５％、５％から２０％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％又は少なくとも２０％増加する。特定の実施態様において、（組成物と蛍光粒子を混合した後の）蛍光強度は、（ａ）アミノ酸又はアルキル置換アルキルアミン以外の置換アミン、又は（ｂ）アミン及びタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物を欠いた組成物中の蛍光粒子の蛍光強度と比較して少なくとも５％増加する。
【０００７】
いくつかの実施態様において、プローブは、例えば蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイにおいて、ハイブリダイズされたプローブを提供するために、標的にハイブリダイズする。開示された保存組成物に懸濁された量子ドット−抗体コンジュゲートは、ハイブリダイズされたプローブを検出するために用いられる。いくつかの実施態様において、量子ドット−抗体コンジュゲートは、例えば蛍光免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイにおいて、組織上のタンパク質抗原を検出するために用いられる。いくつかの実施態様において、量子ドット−抗体コンジュゲートの濃度は、開示された組成物において０．５ｎＭから１５０ｎＭ、１ｎＭから１２５ｎＭ、５ｎＭから１００ｎＭ、２５ｎＭから７５ｎＭ、１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、７５ｎＭ又は１００ｎＭである。特定の実施態様において、量子ドット−抗体コンジュゲートの濃度は、開示された組成物において５０ｎＭである。
本発明の前述の及び他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明によってより明確となり、添付される図への言及を進める。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、ｐＨ１０．５、５０ｍＭトリエタノールアミンの親和溶出勾配におけるＱｄｏｔＴＭ６５５−３０Ｎナノクリスタルの６５５ｎｍでの蛍光光単位対時間のグラフである。
【図２】図２は、ｐＨ１０．５、１００ｍＭトリエタノールアミンの親和溶出勾配におけるＱｄｏｔＴＭ６５５−３０Ｎナノクリスタルの６５５ｎｍでの蛍光光単位対時間のグラフである。
【図３】図３は、ｐＨ８．５、５０ｍＭトリエタノールアミンの親和溶出勾配におけるＱｄｏｔＴＭ６５５−３０Ｎナノクリスタルの６５５ｎｍでの蛍光光単位対時間のグラフである。
【図４】図４は、５０ｍＭアミン添加物を加えた０．４２Ｍホウ酸バッファー中のＱｄｏｔＴＭ６５５−３０Ｎナノクリスタルの６５５ｎｍにおける蛍光光単位対時間のグラフである。
【図５】図５は、様々なバッファー中のＱｄｏｔＴＭ６５５−３０Ｎナノクリスタルの６５５ｎｍにおける蛍光光単位対時間のグラフである。
【図６】図６は、様々な添加物を含む１０ｍＭＰＢＳバッファー中のＱｄｏｔＴＭ６５５−３０Ｎナノクリスタルの６５５ｎｍにおける蛍光光単位対時間のグラフである。
【図７】図７は、様々な添加物を含む１０×ＰＢＳバッファー中のＱｄｏｔＴＭ６５５−３０Ｎナノクリスタルの６５５ｎｍにおける蛍光光単位対時間のグラフである。
【図８】図８は、様々な添加物を含む０．３２Ｍホウ酸バッファー中のＱｄｏｔＴＭ６５５−３０Ｎナノクリスタルの６５５ｎｍにおける蛍光光単位対時間のグラフである。
【図９】図９は、防腐剤及び界面活性剤添加又は非添加のブロッキングタンパク質及びトリエタノールアミンを含む３つのバッファー系におけるＱｄｏｔＴＭ６５５−３０Ｎナノクリスタルの６５５ｎｍにおける蛍光光単位対時間のグラフである。
【図１０】図１０は、様々な添加物を含む３つのバッファー中のＱｄｏｔＴＭ６５５−３０Ｎナノクリスタル及びＱｄｏｔＴＭ６５５−３０Ｎ−Ｍｓ  ＭＡｂコンジュゲートの６５５ｎｍにおける蛍光光単位対時間のグラフである。
【図１１】図１１は、ｐＨ８．３で様々な塩濃度のホウ酸バッファー中のＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎナノクリスタルの５６５ｎｍにおける蛍光光単位対時間のグラフである。
【図１２】図１２は、様々なｐＨの５０ｍＭホウ酸バッファー中のＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎナノクリスタルの５６５ｎｍにおける蛍光光単位対時間のグラフである。
【図１３】図１３は、ｐＨ８．３で様々なタンパク質濃度の５０ｍＭホウ酸バッファー中のＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎナノクリスタルの５６５ｎｍにおける蛍光光単位対時間のグラフである。
【図１４】図１４は、ｐＨ８．３で１．０５％ｗｔタンパク源を添加した５０ｍＭホウ酸バッファー中のＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎナノクリスタルの５６５ｎｍにおける蛍光光単位対時間のグラフである。
【図１５】図１５は、ｐＨ８．３で様々な濃度のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を添加した５０ｍＭホウ酸バッファー中のＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎナノクリスタルの５６５ｎｍにおける蛍光光単位対時間のグラフである。
【図１６】図１６は、ｐＨ８．３で様々な界面活性剤を添加した５０ｍＭホウ酸バッファー中のＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎナノクリスタルの５６５ｎｍにおける蛍光光単位対時間のグラフである。
【図１７】図１７は、様々な濃度のＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００を添加したバッファー中のＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎナノクリスタル及びＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎ−Ｍｓ  ＭＡｂコンジュゲートの５６５ｎｍにおける蛍光光単位対時間のグラフである。
【図１８】図１８は、様々な濃度のＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００を添加したバッファー中のＱｄｏｔＴＭ６５５−３０Ｎナノクリスタル及びＱｄｏｔＴＭ６５５−３０Ｎ−Ｍｓ  ＭＡｂコンジュゲートの６５５ｎｍにおける蛍光光単位対時間のグラフである。
【図１９】図１９は、０．０８重量％のアジ化ナトリウムを添加したＱｄｏｔＴＭ安定化バッファー組成物中の様々なＱｄｏｔＴＭ−３０Ｎナノクリスタルの蛍光光単位対時間のグラフである。
【図２０】図２０は、図１９の下部の拡大図である。
【図２１】図２１は、０．０５重量％のＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００を添加したＱｄｏｔＴＭ安定化バッファー組成物中の様々なＱｄｏｔＴＭ−３０Ｎナノクリスタルの蛍光光単位対時間のグラフである。
【図２２】図２２は、図２１の下部の拡大図である。
【図２３】図２３は、０．０５重量％のＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００又は０．０８重量％のアジ化ナトリウムを添加した溶液Ａ又はＱｄｏｔＴＭ安定化バッファー組成物中の様々なＱｄｏｔＴＭ−３０Ｎ−Ｍｓ  ＭＡｂコンジュゲートの蛍光光単位対時間のグラフである。それぞれのＱｄｏｔＴＭは、異なる波長で測定される。
【図２４】図２４は、様々な分解されたＱｄｏｔＴＭ安定化バッファー組成物中のＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎ−Ｍｓ  ＭＡｂコンジュゲートの５６５ｎｍにおける蛍光光単位対時間のグラフである。
【図２５】図２５は、様々な分解されたＱｄｏｔＴＭ安定化バッファー組成物中のＱｄｏｔＴＭ５８５−３０Ｎ−Ｍｓ  ＭＡｂコンジュゲートの５８５ｎｍにおける蛍光光単位対時間のグラフである。
【図２６】図２６は、様々な分解されたＱｄｏｔＴＭ安定化バッファー組成物中のＱｄｏｔＴＭ８００−３０Ｎ−Ｍｓ  ＭＡｂコンジュゲートの８００ｎｍにおける蛍光光単位対時間のグラフである。
【図２７】図２７は、ＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎ  Ｍｓ  ＭＡｂ（０日目の前立腺癌細胞についてのＱｄｏｔＴＭ安定化バッファー組成物中のコンジュゲート）でのＦＩＳＨ染色を例示する、複合スペクトル像（倍率４０×）である。
【図２８】図２８は、０日目の前立腺癌細胞についての溶液Ａ中のＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎ  Ｍｓ  アンチハプテンコンジュゲートでのＦＩＳＨ染色を例示する、複合スペクトル像（倍率４０×）である。
【図２９】図２９は、１ヵ月後の前立腺癌細胞についてのＱｄｏｔＴＭ安定化バッファー組成物中のＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎ  ＭｓアンチハプテンコンジュゲートでのＦＩＳＨ染色を例示する、複合スペクトル像（倍率４０×）である。
【図３０】図３０は、１ヵ月後の前立腺癌細胞についての溶液Ａ中のＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎ  ＭｓアンチハプテンコンジュゲートでのＦＩＳＨ染色を例示する、複合スペクトル像（倍率４０×）である。
【図３１】図３１は、３ヵ月後の前立腺癌細胞についてのＱｄｏｔＴＭ安定化バッファー組成物中のＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎ  ＭｓアンチハプテンコンジュゲートでのＦＩＳＨ染色を例示する、複合スペクトル像（倍率４０×）である。
【図３２】図３２は、３ヵ月後の前立腺癌細胞についての溶液Ａ中のＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎ  ＭｓアンチハプテンコンジュゲートでのＦＩＳＨ染色を例示する、複合スペクトル像（倍率４０×）である。
【図３３】図３３は、６ヵ月後の前立腺癌細胞についてのＱｄｏｔＴＭ安定化バッファー組成物中のＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎ  ＭｓアンチハプテンコンジュゲートでのＦＩＳＨ染色を例示する、複合スペクトル像（倍率４０×）である。
【図３４】図３４は、６ヵ月後の前立腺癌細胞についてのＱｄｏｔＴＭ安定化バッファー組成物中のＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎ  Ｍｓアンチハプテンコンジュゲートの標準的なＦＩＳＨ染色である。
【発明の詳細な説明】
【０００９】
Ｉ．用語及び定義
特に明記しない限り、技術用語は、従前の使用法に従って用いられる。分子生物学の共通の用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes VII, published by Oxford University Press, 2000 (ISBN 019879276X)；Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Publishers, 1994 (ISBN 0632021829)；及びRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by Wiley, John & Sons, Inc., 1995 (ISBN 0471186341）；及び他の類似の文献中に見られる。
本願明細書で用いられるように、単数用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に示さない限り、複数の指示対象物を含む。同様に、単語「又は」は、文脈が明確に示さない限り、「及び」を含むことを意図している。また、本願明細書で用いられるように、用語「含む」は「包含する」を意味する。
したがって、「Ａ又はＢを含む」ことは、Ａ、Ｂ、又はＡ及びＢを含むことを意味する。
説明されない限り、本願明細書において用いられる全ての技術的及び科学的な用語は、この開示が属する当業者に通常理解されるのと同じ意味を有する。本願明細書に記載のものに類似又は均等な方法及び材料は、本開示の実施又は試験に用いられ得るにもかかわらず、適切な方法及び材料は以下に記載される。材料、方法及び実施例は、一例にすぎず、限定することを意図していない。開示における他の特徴は、以下の詳細な説明及び請求項から明白である。
特に明記しない限り、成分、分子量、割合、温度、時間等の量を表す数は、明細書又は請求項で用いられるように、用語「約」によって修飾されているかのように理解される。
したがって、黙示的又は明確に示されない限り、記載されるパラメーターは、所望の性質及び／又は標準試験条件／方法下の検出限界に依存した近似値である。検討された先行技術の実施態様を直接及び明確に区別する場合、実施態様の数値は、単語「約」が記載されていない限り、近似されていない。核酸又はポリペプチド又は他の化合物に与えられた、全てのヌクレオチドの大きさ又はアミノ酸の大きさ及び全ての分子量又は分子質量値は近似値であり、記載のために提供されたものであることはよく理解されるところである。    本願明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許及び他の文献は、その全てが出典明示により援用される。矛盾する場合には、用語の説明を含み、本願明細書が統制する。さらに、材料、方法及び実施例は、単に例示であり、限定する意図はない。
【００１０】
この開示の様々な実施例の検討を容易にするために、以下の具体的な用語の説明が提供される：
用語脂肪族化合物は、分岐又は非分岐の炭素鎖を有することを意味する。鎖は、飽和（全て一重結合を有する）又は不飽和（一つ以上の二重又は三重結合を有する）であってもよい。鎖は、直鎖状又は環状（すなわち脂環式）であってもよい。
アルキル：飽和した炭素鎖を有する炭化水素基。鎖は、分枝又は非分岐でもよく、直鎖状又は環状（すなわちシクロアルキル）でもよい。用語低級アルキルは、鎖が１−１０の炭素原子を含むことを意味する。
抗体：「抗体」は、他の分子に結合するものを実質的に除いて、総称して免疫グロブリン又は免疫グロブリン様分子（例示の目的で限定されることなく、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、その組合せ、及び例えば哺乳動物（例えばヒト、ヤギ、ウサギ及びマウス）などの脊椎動物のようなあらゆる脊索動物の免疫応答において産生される類似の分子を含む）、及び対象の分子に特異的に結合するその断片（又は対象の分子に高度に類似した群）を意味する。「抗体」は、一般的に、抗原のエピトープを特異的に認識及び結合する、少なくとも軽鎖又は重鎖免疫グロブリン可変領域を有するポリペプチドリガンドである。免疫グロブリンは、重鎖及び軽鎖から構成され、それぞれ可変重鎖（ＶＨ）領域及び可変軽鎖（ＶＬ）領域と呼ばれる可変領域を有する。同時に、ＶＨ領域及びＶＬ領域は、免疫グロブリンによって認識される抗原への結合に関与する。例示的な免疫グロブリンフラグメントとしては、これに限定されるものではないが、タンパク分解性免疫グロブリンフラグメント［例えば公知技術であるＦ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片及びＦａｂフラグメント］、組換え免疫グロブリンフラグメント（例えばｓＦｖ断片、ｄｓＦｖ断片、二重特異性ｓＦｖ断片、二重特異性ｄｓＦｖ断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）及びジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）を含む。抗体の他の例は、ダイアボディ及びトライボディ（当該技術分野で公知）及びラクダ科動物抗体を含む。「抗体」は、キメラ抗体（例えばヒト化ミューリン抗体）及びヘテロコンジュゲート抗体（例えば二重特異性抗体）などの遺伝子操作された分子を含む。Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W.H. Freeman & Co., New York, 1997を参照のこと。
【００１１】
芳香族又はアリール化合物は、一般的に不飽和な、一重及び二重結合が交互に並んだ環状炭化水素である。ベンゼン（３つの二重結合を含む６炭素環）は、典型的な芳香族化合物である。
バイオコンジュゲート又はコンジュゲート：量子ドットなどのナノ粒子を有する化合物及び生体分子は、あらゆる適した手段によって、ナノ粒子に効果的に、直接的又は間接的に結合する。例えば、生体分子は、ナノ粒子に、共有結合的、又は非共有結合的に（例えば静電的に）結合することができる。リンカーが量子ドットの発光又は生体分子の機能に悪影響を与えない限り、例えば「リンカー」分子を用いることにより、生体分子のナノ粒子への間接的な給合はも起こり得る。リンカーは、好ましくは生体適合性である。公知技術の分子リンカーは、一級アミン、チオール、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、ビオチン又は類似化合物を含む。
生体分子：生物システムに含まれ得るあらゆる分子は、これに限られるものではないが、合成又は自然発生的なタンパク質又はその断片、グリコプロテイン、リポタンパク質、アミノ酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、炭水化物、糖、脂質、脂肪酸、ハプテン、抗体などが含まれる。
ブロッキングタンパク質：タンパク質又はタンパク質加水分解物組成物は、ハイブリダイゼーション及び検出反応における背景の非特異的結合（すなわち非特異性プローブの付着又はタンパク質結合）を減少させるために用いられる。ブロッキングタンパク質の例は、カゼイン、カゼイン加水分解物、植物性トリプトン、植物性タンパク質加水分解物、大豆タンパク質加水分解物、ペプトン、カゼインペプトン、サーモンペプトン、ゼラチン、ゼラチン加水分解物、ヤギグロブリンタンパク質、チキンアルブミン及びウシ血清アルブミンを含むが、これに限定されるものではない。
【００１２】
コンジュゲート、接続、結合又は連結：第一の単位の第二の単位への結合。これは、ある分子の他の分子への共有結合、ある分子の他の分子への非共有結合（例えば静電的な結合）（静電コンジュゲートの方法を開示する米国特許番号６，９２１，４９６を参照）、ある分子の他の分子への水素結合による非共有結合、ある分子の他の分子へのファンデルワールス力による非共有結合、及びそのような結合のあらゆる全ての組合せを含むが、これに限定されるものではない。
検出可能な標識：その分子の検出を容易にするために、他の分子（例えば抗体又はタンパク質）に直接又は間接的に付着した検出可能な化合物又は組成物。ナノ粒子は、検出可能な標識のクラスの非限定的な例である。
デタージェント又は界面活性剤：デタージェント又は界面活性剤は、非極性液体−極性液体境界面（例えば油−水）を集結させ、乳化作用を行う表面活性剤である。化学作用の形態に依存して、デタージェントは、アニオン性、カチオン性又は非イオン性に分類される。非イオン性デタージェントは、水素結合メカニズムを介して機能する。さらに、界面活性剤又はデタージェントは、二つの液体間の界面張力を減少させる。界面活性剤分子は、一般的に極性又はイオン性「頭部」及び非極性炭化水素「尾部」を有する。
水への溶解により、界面活性剤分子は凝集し、ミセルを形成して、非極性尾部が内側を向き、極性又はイオン性頭部が外側の水性環境を向く。非極性尾部は、ミセル中で非極性「ポケット」を作り出す。溶液中の非極性化合物は界面活性剤分子によって形成されるポケットに隔離され、したがって、無極性化合物が水溶液中で混合されたままになる。
蛍光：高い電子状態からより低い電子状態に移行するように、原子又は分子がエネルギーを吸収し、可視光を発する一種の発光。用語「蛍光」は、エネルギーの吸収及び放出間の時間的間隔が例えば１０９から１０−７秒と極めて短い現象に限定される。
蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）：ＦＩＳＨは、特異的核酸配列（例えば染色体上のＤＮＡ配列）の有無を検出、局所化するために用いられる技術である。ＦＩＳＨは、定義された反応条件下で高度な配列類似性を示す染色体の一部に結合する蛍光性標識プローブを用いる。ＦＩＳＨは、組織試料中の特定のｍＲＮＡ配列を検出するためにも用いることができる。
蛍光体：励起源に暴露された場合に分子に蛍光を発させる分子の官能基又は一部。用語「蛍光体」は、蛍光標識を伴うタンパク質をマークするために用いられる蛍光化合物を意味するためにも用いられる。
ヘテロ脂肪族化合物は、少なくとも一つの異種原子を有する脂肪族化合物であり、すなわち一つ以上の炭素原子は他の原子、一般的には窒素、酸素又は硫黄によって置換されている。
【００１３】
ヘテロアリール化合物は、少なくとも一つの異種原子を有する芳香族化合物であり、すなわち環における一つ以上の炭素原子が少なくとも一つの孤立電子対を有する原子、一般的には窒素、酸素又は硫黄で置換されている。
ナノ粒子又はナノクリスタル：例えば少なくとも一つの約１００ｎｍ未満の寸法を有するナノスケールの粒子などの、ナノメートルで測定される大きさを有するナノスケール粒子。ナノ粒子の例は、正磁性ナノ粒子、超常磁性ナノ粒子、金属ナノ粒子、フラーレン様物質、無機ナノチューブ、デンドリマー（例えば共有結合で結合した金属キレートを有するもの）、ナノファイバー、ナノホーン、ナノオニオン、ナノロッド、ナノロープ及び量子ドットを含む。ナノ粒子は、例えば光子（高周波及び可視光子を含む）及びプラスモン反響の吸収及び／又は放出を介して、検出可能なシグナルを産生することができる。
フォトルミネセンス：原子又は分子が光子を吸収し、より高いエネルギー状態へと励起するプロセス。原子又は分子は、光子を発することによって、より低いエネルギー状態へと戻る。フォトルミネセンスの２つの型は、蛍光及びリン光である。蛍光は、吸収と放出間の極めて短い時間（例えば１０−８から１０−３秒）により特徴づけられる。励起が終わった後、リン光はより低いエネルギー状態へ移行するゆっくりとしたプロセスであり、数分又は数時間続くことがある。量子ドットに関して本願明細書に用いられるように、フォトルミネセンスは蛍光を意味する。
量子ドット：量子閉込めによる大きさに依存した電子及び光学特性を示すナノスケール粒子。量子ドットは、例えば、半導体材料（例えばセレン化カドミウム及び硫化鉛）で構成され、結晶子（分子線エピタキシアル成長を経て成長する）等から構成される。様々な界面化学及び蛍光特性を有する種々の量子ドットは、Life Technologies, Inc.(Carlsbad, CA)のInvitrogenから商業的に入手可能である（米国特許番号６，８１５，０６４、６，６８２５９６及び６，６４９，１３８（それぞれ本願明細書に出典明示により引用したものとする））。量子ドットは、例えばEvident Technologies (Troy, NY)及びOcean NanoTech, LLC (Springdale, AR)からも商業的に入手可能である。他の量子ドットは、ＺｎＳＳｅ、ＺｎＳｅＴｅ、ＺｎＳＴｅ、ＣｄＳＳｅ、ＣｄＳｅＴｅ、ＳｃＳＴｅ、ＨｇＳＳｅ、ＨｇＳｅＴｅ、ＨｇＳＴｅ、ＺｎＣｄＳ、ＺｎＣｄＳｅ、ＺｎＣｄＴｅ、ＺｎＨｇＳ、ＺｎＨｇＳｅ、ＺｎＨｇＴｅ、ＣｄＨｇＳ、ＣｄＨｇＳｅ、ＣｄＨｇＴｅ、ＺｎＣｄＳＳｅ、ＺｎＨｇＳＳｅ、ＺｎＣｄＳｅＴｅ、ＺｎＨｇＳｅＴｅ、ＣｄＨｇＳＳｅ、ＣｄＨｇＳｅＴｅ、ＩｎＧａＡｓ、ＧａＡｌＡｓ、ＩｎＧａＮ量子ドットなどの合金量子ドットを含む（合金量子ドット及び製造方法は、例えば米国特許公開第２００５／００１２１８２号及びＰＣＴ公報ＷＯ２００５／００１８８９に開示される）。
【００１４】
安定した／安定化した：蛍光粒子に関して本願明細書で用いられるように、用語「安定した」は、一定の期間（例えば１時間以上、１日以上、１週間以上又は１ヵ月以上）にわたって蛍光強度の損失が実質的にないことを意味する。蛍光粒子を安定化することは、組成物の非存在下での蛍光粒子の蛍光強度と比較して、一定期間にわたって蛍光粒子の蛍光強度減少を予防又は減少させる、又は蛍光粒子の蛍光強度を増加さえする組成物中に蛍光粒子を入れることを意味する。
置換された：一つ以上の原子が官能基、水素以外の原子又は遊離基によって置換された分子又は基についての言及。例えば、アミンは、一般式ＲｎＮＨ（３−ｎ）を有する（ｎ＝１、２又は３、それぞれのＲは独立して脂肪族基、ヘテロ脂肪族基、アリール基、ヘテロアリール基、アルキルアリール基、アリールアルキル基である）。置換アミンは、Ｒ基の少なくとも一つの水素が官能基、水素以外の原子又は遊離基によって置換されたアミンを意味する。例えば、置換されたアルキルアミンは、アルキル鎖の一つ以上水素が他の原子又は官能基によって置換されたアルキルアミンを意味する。エタノールアミンは、置換されたアルキルアミンの一つの例であり、エチル鎖の水素原子が−ＯＨにより置換されている。
【００１５】
ＩＩ．量子ドット
発色性及び／又は蛍光半導体ナノクリスタル（よく量子ドットと称される）は、検出可能な標識として用いることができる。ナノクリスタル結晶量子ドットは、半導体ナノクリスタル粒子であり、特定サイズの粒子発光体を用いる本発明を限定することなく、一般的に２から１０ｎｍの大きさである。
量子ドットは、一般的に安定した蛍光体であって、多くの場合写真漂白に耐性であり、狭い発光スペクトルの広範囲にわたる励起波長を有する。複数の異なる放出特性を有する複数の異なる量子ドットが複数の異なる標的を同定するために用いられ得るように、特定の放出特性（例えば特定の波長の放出）を有する量子ドットを選択することができる。量子ドットバイオコンジュゲートは、利用可能な従来の最も明るい蛍光染料と同等の量子収量によって特徴づけられる。さらに、これらの量子ドットに基づく蛍光体は、従来の蛍光染料より１０−１０００倍の光を吸収する。量子ドットからの発光は狭く、対称的であり、それは他の色との重なりが最小化されることを意味しており、隣接した検出チャネル及び減衰クロストークに最小のブリードを生じさせ、検出目的の量子ドットを差次的に放出する同時多重化に導くことができる。対称的及び調整可能な発光スペクトルは粒子の大きさ及び材料組成物により変化し、実質的にスペクトルが重なることなく異なる量子ドットのフレキシブルかつ狭いスペーシングを可能とする。さらに、それらの吸収スペクトルは広く、単一の励起波長を用いて全ての量子ドットの色彩変異を同時に励起することを可能にし、これにより試料の自己蛍光を最小化させる。
さらにまた、ペグ化（量子ドットコンジット上へのポリエチレングリコール基の導入）が非特異的タンパク質を実質的に減少させることができることが明らかとなっている：量子ドット相互作用。特定の量子ドットは、Life Technologies, Inc.などから商業的に入手可能である。いくつかの有効な実施態様はＱｄｏｔＴＭ５６５及びＱｄｏｔＴＭ８００ナノクリスタルなどの量子ドットナノ粒子を利用し、そのような用語体系で用いられる数値はナノ粒子の発光最大波長の近似値を意味する。例えば、ＱｄｏｔＴＭ５６５ナノクリスタルは、５６５ｎｍの波長を有する光を発し、縁色光を産生する。したがって、量子ドットは、特定の波長で検出可能なシグナルを提供するのに選択され得る。検出は、特定の使用法に従い、種々の手段（例えば蛍光顕微鏡、蛍光光度計、蛍光スキャナ等）によって行われる。
【００１６】
ＩＩＩ．量子ドットコンジュゲート
量子ドット使用は、生体親和性のそれらの欠如によって限られた。表面被覆化学の新しい進歩は、しかしながら、これらの問題を解決するのに役立った。例えばWu, X. et al. Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots, Nature Biotechnol. 21, 41-46 (2003)；Jaiswal, J. K., Mattoussi, H., Mauro, J. M. & Simon, S. M. Long-term multiple color imaging of live cells using quantum dot bioconjugates, Nature Biotechnol. 21, 47-51 (2003)；及びDubertret, B. et al. In vivo imaging of quantum dots encapsulated in phospholipid micelles. Science 298, 1759-1762 (2002)を参照のこと。
量子ドットは、ストレプトアビジンなどのバイオ認識分子（同上）にコンジュゲートされる。これらのコンジュゲートは、固定細胞及び組織切片上の標的検出のために用いられた。さらに、生細胞の細胞表面タンパク質及び細胞内区画は、量子ドットバイオコンジュゲートを用いて検出された。
量子ドットは、生体分子（例えばアミノ酸、ペプチド／タンパク質又はヌクレオシド／ヌクレオチド／核酸）にコンジュゲートすることができる。バイオ・コンジュゲートを製作するために有用な特定の例示的な生体分子は、これに限定されるものではないが：モノクローナル又はポリクローナル抗体（例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）；他の分子に結合するものを実質的に除外するが、興味がある分子（又は興味がある高度に類似する分子群）に特異的に結合する抗体断片（これに限定されるものではないが、タンパク分解性抗体断片（例えば公知技術であるＦ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片及びＦａｂ断片）、組換え抗体断片（例えばｓＦｖ断片、ｄｓＦｖ断片、二重特異性ｓＦｖ断片、二重特異性ｄｓＦｖ断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）及びジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）を含む。他の有用な生体分子は、ダイアボディ、トライアボディ及びラクダ科動物抗体；キメラ抗体などの遺伝子操作された抗体（例えばヒト化ミューリン抗体）；ヘテロコンジュゲート抗体（例えば二重特異性抗体）；ストレプトアビジン；受容体；酵素；ＢＳＡ；ポリペプチド；アプタマー；及びその組合せを含む。
量子ドット及び生体分子を含むバイオコンジュゲートは、商業的に入手可能である。あるいは、量子ドットバイオコンジュゲートは、合成することができる。生体分子／量子ドットコンジュゲートの製造方法は、従来技術において一般に公知であり、有用なバイオコンジュゲートはあらゆる適切な方法によって製作することができる。
例えば、免疫グロブリンはＣｄＳｅ／ＺｎＳ量子ドット・シェルに組み込むことができる：１）ジチオトレイトール（ＤＴＴ）での処理により天然ジスルフィドを還元する；２）適切なヘテロ二官能性ＮＨＳエステル（スペーサー）ｘ−マレイミド（ｘ＝４，８，１２）でアミン終端量子ドットキャッピング基を官能化する；３）これらのチオール化された免疫グロブリンでマレイミド終端量子ドットを誘導体化すること；及び４）適切な技術（例えばサイズ排除クロマトグラフィ）を用いてコンジュゲートを精製する。プロセスは、スキーム１に表される：
【００１７】
スキーム１
2013503951.tif 000003
【００１８】
ストレプトアビジンコンジュゲートは、例えばストレプトアビジン分子を２−イミノチオランで処理するプロセスにおいて、チオール化されたストレプトアビジンをチオール化された免疫グロブリンと置換することによって製造することができる。
上記実施例において用いられる量子ドットは、水溶性を誘導するために、トリオクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）の静電的に結合した有機シェル及び挿入両親媒性ポリマーによって保護されている。このポリマーは、更なる官能基化のための約３０の末端アミン基を有する。E.W. Williams, et. al., "Surface-Modified Semiconductive and Metallic Nanoparticles Having Enhanced Dispersibility in Aqueous Media"、米国特許番号６，６４９，１３８（本願明細書に出典明示により援用したものとする）を参照のこと。高度に感受性の量子ドットコンジュゲートを形成するために、抗体は様々な割合で量子ドットに付着させることができる。化学は米国特許公報第２００６／０２４６５２３号及び第２００９／０１７６２５３号に記載されたものと類似しており、その全てが本願明細書に出典明示により援用されたものとする。
【００１９】
ＩＶ．量子ドット検出
標準の蛍光顕微鏡は、量子ドット及び量子ドットバイオコンジュゲートを検出するための道具である。量子ドットバイオコンジュゲートが実質的に光安定性なので、興味がある領域を見出したり、適切に試料上に焦点を合わせるために顕微鏡に時間をかけることができる。量子ドットバイオコンジュゲートは、一つだけの励起源／フィルターのみが利用可能で、色の間で最小のクロストークが必要な場合に、鮮明な光安定性発光が求められるあらゆる時間において有用であり、特に多色適用において有用である。例えば、量子ドットは細胞表面マーカー及び核抗原を標識化し、微小管及びアクチンを染色するためのストレプトアビジン及びＩｇＧのコンジュゲートを形成するために用いられた（Wu, X. et al. (2003), Nature Biotech, 21, 41-46）。
例として、蛍光はマルチスペクトルイメージングシステムＮｕａｎｃｅＴＭで測定することができる（Cambridge Research & Instrumentation, Woburn, MA）。他の例として、蛍光はスペクトルイメージングシステムＳｐｅｃｔｒａＶｉｅｗＴＭで測定することができる（Applied Spectral Imaging, Vista, CA）。マルチスペクトルイメージングは、イメージのそれぞれのピクセルの分光学的情報を集め、スペクトル画像処理ソフトウェアを用いて結果データを解析する技術である。例えば、ＮｕａｎｃｅＴＭシステムは、電子的及び連続的に選択可能な異なる波長での一連の像を撮影することができ、そのようなデータを扱うために設計された分析プログラムを用いてイメージを利用することができる。染料のスペクトルが高度に重複する場合、又はそれらが試料において共存又は同じ場所で発生している場合、スペクトル曲線が異なると仮定するならば、ＮｕａｎｃｅＴＭ系は同時に複数の染料の定量的情報を得ることができる。多くの生物物質は自発蛍光するか、高−エネルギー光によって励起される場合は低−エネルギー光を発する。このシグナルは、低−コントラストイメージ及びデータをもたらし得る。マルチスペクトル画像化能力のない高感度カメラは、蛍光シグナルとともに自己蛍光シグナルを増加させる。マルチスペクトル画像化は、組織の自己蛍光を純粋化及び取り出すことができ、達成可能な信号対ノイズ比を増加させる。
【００２０】
Ｖ．蛍光粒子の保存
保存された蛍光粒子（例えば溶液中の量子ドット及び量子ドットコンジュゲート）の蛍光強度は、時間とともに減少する。例えば、しばらくの間商業的に入手可能なバッファにおいて保存されたＱｄｏｔＴＭ−抗体コンジュゲートは、新たに調製されたＱｄｏｔＴＭ−抗体コンジュゲート溶液と比較して、ＦＩＳＨアッセイにおける減少した蛍光シグナル強度を有する。動作理論に限定されることなく、信号強度の損失は、潜在的にコンジュゲートの凝集及び／又はナノ材料の量子収量の損失によるものである。
溶液中の蛍光粒子の相対的な蛍光損失を安定化及び減少させる新規な組成物の実施態様が本願明細書に開示される。いくつかの実施態様において、量子ドット又は量子ドットコンジュゲートが外気温度未満の温度（例えば４℃）で組成物中に保存される場合、組成物は量子ドット又は量子ドットコンジュゲートの蛍光強度を少なくとも１ヵ月間以上安定化することができる。この保存の特定の温度は、特定の温度で保存する方法に限定することなく引用され、安定化対非安定化組成物を比較するための基礎を提供する。いくつかの実施態様において、蛍光粒子が４℃で数週間又は数ヶ月間開示された組成物の実施態様中で保存された場合、蛍光強度は実質的に同じままである。特定の実施態様では、蛍光粒子が組成物の開示された実施態様において４℃で少なくとも１日間、少なくとも１週間、少なくとも１ヵ月間、少なくとも２ヵ月間、少なくとも３ヵ月間又は６ヵ月間保存される場合、蛍光粒子の保存とは相対的な蛍光強度が５０％未満の損失、３０％未満の損失、２０％未満の損失、１０％未満の損失、５％未満の損失、１％未満の損失、５％から３０％の損失、５％から２０％の損失、１％から１０％の損失、１％から５％の損失又は０％の損失であることを意味する。例えば、ある実施態様において、組成物中において４℃で１ヵ月間の保存後、相対的な蛍光強度は実質的に同じままである。特定の実施態様では、量子ドット−抗体コンジュゲートが４℃で組成物中に保存される場合、組成物は少なくとも３ヵ月間蛍光強度を安定化することができる。有効な実施例において、量子ドット−抗体コンジュゲートの相対的な蛍光強度は、４℃での３ヵ月間の保存後、実質的に同じままであった。したがって、いくつかの実施態様において、懸濁された蛍光粒子の蛍光は、少なくとも１ヵ月間、少なくとも２ヵ月間、少なくとも３ヵ月間又は少なくとも６ヵ月間安定化される。比較のために、開示された組成物なしで（例えば他の又は先行技術の組成物中で）保存した同一の量子ドット又は量子ドットコンジュゲートは、４℃で１ヵ月後、蛍光強度の有意な減少を示し、２、３ヵ月後（例えば３ヵ月後）に完全な蛍光の損失を示すであろう。本願明細書に開示される安定化組成物もプラットフォーム上での希釈様式のオートメーション化法を可能とする。
【００２１】
ある実施態様では、組成物は、一又は複数のアミン、タンパク質、界面活性剤及び／又は防腐剤を欠く組成物と比較して、蛍光粒子の蛍光強度を増加させることができる。いくつかの実施態様において、初期の蛍光は増加する。他の実施態様において、増加した蛍光は、初期調合後に見られる。いくつかの実施態様において、蛍光は、少なくとも５時間、少なくとも２５時間、少なくとも１００時間、少なくとも２５０時間、少なくとも７５０時間、少なくとも１５００時間、少なくとも３，０００時間又は少なくとも４３００時間（すなわち６ヵ月）増強された状態を維持する。特定の実施態様において、量子ドット又は量子ドットコンジュゲートの蛍光は、組成物中に分散された同一のコンジュゲートと比較して、一般的に少なくとも５％（例えば５％から２０％、５％から１５％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％又は少なくとも２０％）増加する。
ＱｄｏｔＴＭコンジュゲートの潜在的なアフィニティークロマトグラフィ溶出条件を調査すると、まず最初に、エタノール置換基を含む三級アルキルアミンを含む溶出バッファーは溶液中のＱｄｏｔＴＭナノ粒子の蛍光の相対的な損失を安定化するということが発見された。この影響は、多種多様なバッファーにおいて示された。様々な官能性を有するいくつかの異なるアミン（１°、２°及び３°）は、調査され、類似の効果がもたらされた。しかしながら、初期の結果に基づいて、トリアルカノールアミン（例えばトリエタノールアミン）は、３７℃及び４５℃の高温で最も大きな蛍光安定化がもたらされた。高塩濃度（例えば２Ｍ  ＮａＣｌ、２．２５ＭＫＩ又は２．５ＭＭｇＣｌ２）、高い有機濃度（例えば２５％水性ポリエチレングリコール）、又は高度に酸性の条件（例えば５０ｍＭクエン酸、ｐＨ＝３．０）を含むクロマトグラフィ溶出剤は、ＱｄｏｔＴＭフォトルミネセンスを大幅に減少させることが示された。
組成物は、ＱｄｏｔＴＭ蛍光を安定化する能力を測定するために試験された。特定の開示された実施態様は、アミン、バッファー、ブロッキングタンパク質、防腐剤及び界面活性剤を含んでいた。初期のＱｄｏｔＴＭ安定化バッファー（ＱＳＢ）組成物は、調製された。
この初期のＱＳＢ組成物は、０．３２Ｍホウ酸塩（ｐＨ８．３）、１．０５重量％カゼイン塩基加水分解物、５０ｍＭトリエタノールアミン、０．０８重量％アジ化ナトリウム防腐剤（Sigma-Aldrich, St. Louis, MOから入手可能）及び０．００５重量％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０界面活性剤（Sigma-Aldrich, St. Louis, MOから入手可能）を含む。それぞれのＱＳＢ成分は、ＱｄｏｔＴＭ安定性に対するその効果を測定するために評価された。さらに、ＱＳＢは、蛍光インシチューハイブリダイゼイション（ＦＩＳＨ）における染色効率に対する効果を測定するために評価された。
【００２２】
Ａ．アミン
ＱｄｏｔＴＭ安定化バッファー組成物へのアミンの添加は、時間とともにＱｄｏｔＴＭナノクリスタル又はＱｄｏｔＴＭコンジュゲートの蛍光を安定化することができる。動作理論にとらわれることなく、アミンは量子ドット表面欠陥を不動態化し得、したがって量子ドットの発光量子収量を増加させる。アミンは、一級、二級又は三級アミン（例えば脂肪族アミン、ヘテロ脂肪族アミン、アリールアミン、ヘテロアリールアミン、アルキルアリールアミン、アリールアルキルアミン又はシクロヘキシルアミン、ピリジンなどの環状アミン）であってもよい。アミンは一般式ＲｎＮＨ（３−ｎ）（ｎ＝１、２又は３、及びそれぞれのＲは独立して脂肪族基、ヘテロ脂肪族基、アリール基、ヘテロアリール群、アルキルアリール基、又は、アリールアルキル基である）を有する。それぞれのＲは、置換又は非置換であってもよい。いくつかの実施態様において、少なくとも一つのＲは、例えば一つ以上−ＯＨ、−ＯＲ１、−ＣＯ２Ｒ１、−ＣＮ基、又はその組合せで置換されている（Ｒ１は置換又は非置換の脂肪族化合物又はアリール基である）。アミンは、置換又は非置換の環状アミン（例えばシクロヘキシルアミン）であってもよい。一般的に、アミンは、置換アミン、特にアミノ酸又はアルキル置換アルキルアミン以外の置換されたアルキルアミンである。いくつかの実施態様において、アミンは、非置換のより低級のアルキルアミン、又はアミノ酸又はアルキル置換低級アルキルアミン（例えば１−メチルブチルアミン）以外の置換されたより低級のアルキルアミンである。ある実施態様では、置換されたアルキル基は、低級アルキルアルコール又は低級アルキルニトリルである。例えば、置換されたアルキル基は、エタノール又はプロピオニトリルであってもよい。二級又は三級アミンは、アルキル及び／又は置換されたアルキル基の組み合わせを含めることができる。特定の実施態様において、アミンは、アルカノール基（例えばＮ−エタノール基）を含む。Ｎ−エタノール基を有する例示的なアミンは、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、Ｎ−メチルジエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン及びビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−トリス（ヒドロキシメチル）−メタンを含む。
開示された実施態様として、Ｎエタノール置換基（例えばエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、Ｎメチルジエタノールアミン、又は、Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン）を含むアミンが最も大きな蛍光安定化をもたらしたことが結論づけられた。したがって、ヒドロキシ基を含む官能基及び−ＯＲ１及び−ＣＮなどの類似の基は、蛍光安定性を促進する。エタノール−置換アミンが４℃及び室温（例えば２５℃）で類似の効果をもたらしたにもかかわらず、トリエタノールアミンは開示された実施態様において３７℃及び４５℃の高温で最も大きな蛍光安定化をもたらした。
アミンは、０以上、少なくとも２００ｍＭ、一般的に２５ｍＭから２００ｍＭまで、少なくとも３８ｍＭから７５ｍＭまでなどの有効量でＱｄｏｔＴＭ安定化バッファー組成物において用いられ得る。。いくつかの実施態様において、アミンは、２００ｍＭ（例えば２５−２００ｍＭ、５０−１００ｍＭ又は３８−７５ｍＭ）以下の濃度で存在する。ある実施態様において、ＱＳＢ組成物は２５−２００ｍＭのエタノール−置換アミンを含む。例えば、組成物は、５０ｍＭエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、Ｎ−メチルジエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン又はその組合せを含んでもよい。特定の実施態様では、組成物は５０ｍＭトリエタノールアミンを含む。
ある実施態様において、アミンを含むＱＳＢ組成物は、ＱＳＢ組成物中で保存される量子ドット又は量子ドットコンジュゲートの蛍光を増加させる。いくつかの実施態様において、アミンを含まないＱＳＢ組成物と比較して、蛍光の初期の増加（例えばスペクトルスキャニングマルチモードプレートリーダーで測定される）が見られる。ある実施態様において、増加した蛍光は、初期の調合後、少なくとも２５時間持続する。
【００２３】
Ｂ．バッファー塩、濃度及びｐＨ
様々なバッファー系が量子ドットとの互換性を測定するために調査された。バッファーｐＨの影響も評価された。
高いｐＨ値（例えばｐＨ７以上）で適度な塩濃度（例えば０．０２Ｍから０．５Ｍ）を有するバッファーは、少なくともいくつかのＱｄｏｔＴＭナノクリスタル及びＱｄｏｔＴＭ−抗体コンジュゲートを安定化することが見いだされた。一定時間蛍光を安定化し、画像化結果を干渉しないあらゆるバッファーを用いることができる。量子ドットを保存するための例示的なバッファーは、ホウ酸バッファー、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス−緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）及びその組合せを含む。適切な、商業的に入手可能なバッファーは、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｂｕｆｆｅｒ添加物（１０×ＰＢＳに添加された、ｐＨ７．４、ForteBio, Inc., Menlo Park, CA）及びＰｉｅｒｃｅ  ＳＥＡ  ＢＬＯＣＫ（０．１％アジ化ナトリウムを含むスチールヘッドサーモン血清を基にしたＰＢＳバッファーのブロッキング製剤）を含んでもよい。ある実施態様において、約０．４Ｍの濃度のホウ酸バッファー（例えば０．４２Ｍホウ酸塩、ｐＨ８．３）、１０×ＰＢＳ（ｐＨ７．５、１００ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｂｕｆｆｅｒ添加物（１０×ＰＢＳに添加、ｐＨ７．４）、溶液Ａ及びＰｉｅｒｃｅ  ＳＥＡ  ＢＬＯＣＫは、ＱｄｏｔＴＭ蛍光を安定化することが見いだされた。
いくつかの実施態様において、バッファー及びアミンを含む組成物はさらに、ＱｄｏｔＴＭ蛍光と適合する。特定の実施態様において、アミンは、Ｎ−エタノール置換アミン（例えばトリエタノールアミン）である。例えば、５０ｍＭＴＥＡを含む０．４Ｍホウ酸塩（ｐＨ８．６）及び５０ｍＭＴＥＡを含む１０×ＰＢＳ（ｐＨ  ８．３）は、０．４Ｍホウ酸塩又は１０×ＰＢＳ単独と比較して、改良されたＱｄｏｔＴＭ安定性を示す。
ホウ酸バッファーは、適切な例示的ＱｄｏｔＴＭ安定化バッファーとして選択され、塩濃度及びｐＨの影響が評価された。フォトルミネセンスは、高塩濃度（例えば２Ｍを超える）を有するいくつかのバッファーにおいて減少することが知られている。あらゆる動作理論に限定されることなく、高塩濃度は、ポリマーコーティングした量子ドットのホスホリピド外層による小分子の拡散を促進し、フォトルミネセンス又は量子収量の減少又は完全な損失を生じる。したがって、適度な塩濃度（０より大きく約２Ｍまで）は、ＱｄｏｔＴＭ安定化のためにより適切であり得る。
いくつかの実施態様において、例えば、０．０２Ｍから０．５Ｍ、又は０．０５Ｍから０．３２Ｍのホウ酸塩濃度は、ＱｄｏｔＴＭ蛍光と適合する。ある種の実施形態では、下限の塩濃度は量子ドット及び関連するタンパク質と適合し、凝集は最小化される。特定の実施態様において、ＱｄｏｔＴＭ蛍光は、ホウ酸塩濃度が０．３２Ｍであった場合、他のバッファー製剤と比較して、より適合していた。
酸性のｐＨを有するバッファー組成物は、中性又は塩基性ｐＨを有する組成物と比較して、ＱｄｏｔＴＭフォトルミネセンスを減少することが見いだされた。例えば、５０ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ３．０）は、大幅にフォトルミネセンスを減少させることが示された。したがって、７以上のｐＨは、ＱｄｏｔＴＭナノクリスタル及びＱｄｏｔＴＭ−抗体コンジュゲートを保存するために、選択的に適切である。１０．５を超えるｐＨは、しかしながら、抗体の長期安定性に不適切であり得る。したがって、いくつかの実施態様において、組成物は、７〜１０、例えば７〜９．５、７〜９、７．５〜９．５、８〜９又は８〜８．５のｐＨを有する。
【００２４】
Ｃ．タンパク質
非特異性タンパク質、タンパク質加水分解物又はペプチド、つまり「ブロッキングタンパク質」の蛍光インシチューハイブリダイゼイションアッセイへの添加は、バックグラウンドシグナルを減少させ、ハイブリダイズされたプローブ又は抗体コンジュゲートの検出を改善することが示された。いくつかの商業的に入手可能なバッファーは、ブロッキングタンパク質を含む。例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｂｕｆｆｅｒ添加物は、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含む。溶液Ａは、１．５重量％のカゼイン塩基加水分解物を含む。蛍光を安定化するためにタンパク質、タンパク質加水分解物又はペプチドをＱｄｏｔＴＭ保存組成物に含むことは有利である。
ＱｄｏｔＴＭ安定性を促進し、画像化と干渉しないあらゆるタンパク質濃度を用いることができる。しかしながら、タンパク質濃度があまりに高い場合、タンパク質凝集が起こり得、ＱｄｏｔＴＭナノクリスタル又はＱｄｏｔＴＭ−抗体コンジュゲートの蛍光強度を減少させ得る。したがって、適切な組成物は、凝集を最小化するタンパク質濃度を維持しつつ、蛍光強度を安定化し、後のアッセイにおいてバックグラウンドシグナルを減少させるのに充分なタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、ＱＳＢ組成物は、タンパク質、タンパク質加水分解物又はペプチドを、０より多く２重量％まで（０．０５重量部から１．５重量％、１．０重量％から１．１重量％、又は０．０６重量％から０．６０重量％）含む。さらに、当業者は、凝集されたタンパク質をシステムに導入しないようにフィルター処理されたタンパク源を利用することの重要性を認識している。
タンパク質、タンパク質加水分解物及びペプチドの多数の供給源は、商業的に利用可能である。適切な供給源は、植物性トリプトン、カゼイン加水分解物、ゼラチン、サーモンペプトン、ヤギグロブリンタンパク質、チキンアルブミン加水分解物又はその組合せを含んでもよい。いくつかの実施態様において、植物性トリプトン、カゼイン酸加水分解物、カゼイン塩基加水分解物、魚皮ゼラチン又はその組合せを用い得る。したがって、ある実施態様においてＱＳＢ組成物は、植物性トリプトン、カゼイン酸加水分解物、カゼイン塩基加水分解物、魚皮ゼラチン又はその組合せを、０より多く少なくとも２重量％まで（０．５重量％から１．５重量％（例えば０．０５重量％から１．１重量％、１．０重量％から１．１重量％、０．０６重量％から０．６重量％又は０．２５重量％から０．５５重量％））の濃度で含む。
ある実施態様では、ＱＳＢ組成物中にタンパク質を含むことは、ＱＳＢ組成物中の量子ドット又は量子ドットコンジュゲートの蛍光を安定化する。どんな特定の理論によっても限定されることなく、タンパク質、タンパク質加水分解物又はペプチドは、量子ドット又は量子ドットコンジュゲートの周囲でミセルを形成し、それによって凝集を最小化して量子ドット又はコンジュゲートの溶解性を維持することによって、量子ドット又は量子ドットコンジュゲートの蛍光を安定化させる。
【００２５】
Ｄ．界面活性剤
ＱＳＢ組成物への界面活性剤の添加は、タンパク質及びＱｄｏｔＴＭ−抗体コンジュゲートの凝集を減少させ得る。界面活性剤は、水溶液中でＱｄｏｔＴＭ−抗体コンジュゲートを囲むミセルを形成し、凝集プロセスを妨げて、ＱｄｏｔＴＭ蛍光を安定化する。
いくつかのイオン性デタージェント（例えばドデシル硫酸ナトリウム）は、ＱｄｏｔＴＭナノ粒子の相対的な量子収量に弊害をもたらした。いくつかの実施態様において、非イオン性デタージェントは、ＱｄｏｔＴＭ蛍光を安定化することが見いだされた。適切な非イオン性デタージェントは、例えば、脂肪族グリコール、特にアルキレングリコール（例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）２０（ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート）及びＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００（ポリエチレングリコールパラ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル））、含酸素アルキレングリコール（例えばＢｒｉｊ  ３５（ポリオキシエチレングリコールドデシルエーテル））及びアルコールエトキシレート（例えばＴｅｒｇｉｔｏｌＴＭ１５−Ｓ−９、二級アルコールエトキシレート（Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能））を含む。ある実施態様において、０．０５重量％のＢｒｉｊ３５を含む５０ｍＭホウ酸バッファー（ｐＨ８．３）は、ＱｄｏｔＴＭナノクリスタル又はＱｄｏｔＴＭコンジュゲートの蛍光強度を安定化することが示された。
界面活性剤濃度の影響を測定するために、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０は、５０ｍＭホウ酸バッファー（ｐＨ８．３）中０．００２５重量％から０．２０重量％の範囲で評価された。０．００５重量％から０．０５０重量％までの濃度は、より低い濃度又はより高い濃度よりも大きな蛍光安定性を示した。Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００は、同様の濃度において有効だった。したがって、いくつかの実施態様においては、ＱＳＢ組成物は、０より大きく０．０５重量％までの濃度（例えば０．００５重量％から０．０５の重量％又は０．００５重量％から０．０１重量％）で、非イオン性デタージェントを含んでもよい。
ある実施態様において、ＱＳＢ組成物中に界面活性剤を含むことにより、ＱＳＢ組成物において保存された量子ドット又は量子ドットコンジュゲートの蛍光安定性が増加する。
【００２６】
Ｅ．防腐剤
いくつかの実施態様において、ＱＳＢ組成物は、防腐剤（例えば抗菌剤）を含む。適切な防腐剤は、例えば、イソチアゾリノン、グリコール、アジ化物及びその組合せを含む。例示的な防腐剤は、ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００（２．３０％５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、０．７０％２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、２−３％アルキルカルボン酸塩（安定化剤）及び９３−９５％修飾グリコール；Sigma-Aldrich, St. Louis, MOから入手可能）、ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）９５０（９．５−９．９％２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン（Sigma-Aldrich））及びアジ化ナトリウムを含む。他の市販のバッファー組成物に基づいて、０．０１重量％ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００は最初に選択され、評価された。しかしながら、低濃度では、ＱｄｏｔＴＭ安定化バッファーにおいて十分な抗菌保護をもたらさなかった。０．０５重量％の濃度は、効果的な防腐剤であることが見いだされたが、ＱｄｏｔＴＭナノクリスタルの蛍光が減少した。
アジ化ナトリウムもまた潜在的な防腐剤として評価され、ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００と比較された。０．０５重量％のＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００又は０．０８重量％のアジ化ナトリウムを含む組成物は、８つの異なるＱｄｏｔＴＭナノクリスタルと共に評価された。蛍光の相対的な変化はＱｄｏｔＴＭナノクリスタル間で異なり、組成物がアジ化ナトリウムを含む場合は、ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００を含む場合と比較して、総合的な蛍光の損失はより少なかった。同様の結果が、ＱｄｏｔＴＭ−抗体コンジュゲートでも得られた。
したがって、いくつかの実施態様においては、ＱＳＢ組成物は防腐剤を含む。ある実施態様において、ＱＳＢ組成物は、有効量のアジ化ナトリウム（例えば０より大きく０．２重量％まで（例えば０．０５重量％から０．２重量％又は０．０５重量％から０．１重量％の濃度））を含む。特定の実施態様において、ＱＳＢ組成物は０．０８重量％のアジ化ナトリウムを含む。
【００２７】
Ｆ．ＱｄｏｔＴＭ安定化バッファー
ＱｄｏｔＴＭ安定化バッファー組成物の特定の開示された実施態様は、塩（０．０２Ｍから０．５Ｍ）、アミン（２５−２００ｍＭ）、タンパク質（０．０５重量％から１．５の重量％）、界面活性剤（０．００５重量％から０．０５の重量％）及び防腐剤（０．０５重量％から０．１重量％）を含む。ＱＳＢ組成物は、７〜９の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施態様において、塩はホウ酸塩（０．０２Ｍから０．５Ｍ）であり、アミンはＮ−エタノール置換アミン（５０−１００ｍＭ）であり、ｐＨは８〜９の範囲内である。具体例において、ＱＳＢ組成物は、０．３２Ｍホウ酸塩、５０ｍＭトリエタノールアミン、１．１重量％のタンパク質（例えばカゼイン酸加水分解物、カゼイン塩基加水分解物、チキンアルブミン加水分解物、植物性トリプトン、サーモンペプトン、魚皮のゼラチン又はその組合せ）、０．０８重量％のアジ化ナトリウム及び０．００５重量％の界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００又はＢｒｉｊ３５）を含み、８−８．５のｐＨを有する。
分解されたＱＳＢ組成物（すなわちある成分が取り除かれた組成物）中のいくつかのＱｄｏｔＴＭ−抗体コンジュゲートの研究は、完全なＱＳＢ組成物（０．３２Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ＝８．３）、５０ｍＭＴＥＡ、１．０５重量％カゼイン塩基加水分解物、０．０８重量％アジ化ナトリウム及び０．００５重量％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）がコンジュゲートの最良の蛍光安定性をもたらすことを証明した。バッファー中のタンパク質の存在は、蛍光安定性に対して最も効果があった。（実施例９、表２２を参照。）
しかしながら、少なくともいくつかの成分は、併用して用いられる場合、相乗効果を有し得る。例えば、１０ｍＭ  ＰＢＳバッファにおいて、５０ｍＭトリエタノールアミン（バッファーｐＨ＝９．３）又は１．０５重量％のカゼイン塩基加水分解物（バッファーｐＨ＝７．８）の添加は、１０ｍＭＰＢＳバッファー（ｐＨ＝７．４）のみと比較して、ＱｄｏｔＴＭ６５５−３０Ｎナノクリスタルの蛍光安定性に対してほとんど影響しなかった。（実施例３、表６を参照。）
しかしながら、５０ｍＭトリエタノールアミン及び１．０５重量％カゼイン塩基加水分解物がバッファー（ｐＨ＝９．１）に添加された場合、１０ｍＭ  ＰＢＳのみにおける１６．１％の相対的な蛍光減少と比較して、２．６％のみの相対的な蛍光減少が５０時間後に見られた。０．３２Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ＝８．３）において、ＱｄｏｔＴＭ６５５−３０Ｎナノクリスタルは、２３．６％の蛍光減少を示した。５０ｍＭ  ＴＥＡ（最終的なバッファーｐＨ＝８．８）の添加は１４．１％の蛍光減少を引き起こし、１．０５重量％カゼイン塩基加水分解物（バッファーｐＨ＝８．５）の添加は６．４％のみの減少を引き起こした。しかしながら、ＴＥＡ及びカゼイン塩基加水分解物の０．３２Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ＝９．０）への添加は、有意に安定性の増加を生じさせ、５０時間後に０．３％のみの相対的な蛍光減少を伴った。実際、ナノクリスタルの量子収量の変化は、４ヵ月後でさえ最小限だった。凝集が最小化され、ナノクリスタル蛍光が保存されるように、組み合わされたバッファー成分の相乗効果がナノクリスタルに適合した環境をもたらす。
【００２８】
Ｇ．適用
商業的に入手可能なバッファーのＱｄｏｔＴＭ−抗体コンジュゲートの蛍光は、時間とともに減少する。例えば、溶液Ａに希釈され、蛍光インシチューハイブリダイゼイションアッセイで用いられるＱｄｏｔＴＭ−抗体コンジュゲート（ＱｄｏｔＴＭＭ５６５−３０Ｎ−ＭｓＡｎｔｉＨａｐｔｅｎ）は、４℃で１ヵ月間の保存後に蛍光強度の顕著な損失が示される。（実施例１１Ｂを参照。）しかしながら、開示されたＱＳＢ組成物の実施態様に希釈されたＱｄｏｔＴＭ−抗体コンジュゲートは、３ヵ月間の保存後では蛍光の損失を示さず、４ヵ月の保存後に蛍光のわずかな損失を示した。したがって、ＱｄｏｔＴＭ安定化組成物のいくつかの実施態様は、４°Ｃで少なくとも１ヵ月、少なくとも２ヵ月、少なくとも３ヵ月又は少なくとも４ヵ月間、ＱｄｏｔＴＭ−抗体コンジュゲートの蛍光強度を安定化する。
開示されたＱＳＢ組成物の実施態様は、コンジュゲートが組織にハイブリダイズされた標識プローブを検出するために用いられる蛍光インシチューハイブリダイゼイション（ＦＩＳＨ）及び／又はコンジュゲートが組織上のタンパク質抗原を検出するために用いられる蛍光免疫組織化学（ＩＨＣ）への適用において用いられるＱｄｏｔＴＭ−抗体コンジュゲートを保存するために適している。いくつかの実施態様において、量子ドット−抗体コンジュゲートの濃度は、開示されたＱＳＢ組成物中に、０．５ｎＭから１５０ｎＭ、１ｎＭから１２５ｎＭ、５ｎＭから１００ｎＭ、２５ｎＭから７５ｎＭ、１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、７５ｎＭ又は１００ｎＭの濃度で保存される。ある実施態様では、量子ドット−抗体コンジュゲートの濃度は、開示されたＱＳＢ組成物中に５０ｎＭの濃度で保存される。
【実施例】
【００２９】
ＶＩ．実施例
実施例１  ＱｄｏｔＴＭ安定性へのトリエタノールアミンの影響
ＱｄｏｔＴＭ６５５−３０Ｎナノクリスタル及びそれらの抗体バイオコンジュゲートの相対的な蛍光安定性は、室温で、様々なクロマトグラフィ溶出液条件の溶液中で試験された。親和性結合用バッファー（１０ｍＭＰＢＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ＝７．０）中のＱｄｏｔＴＭナノクリスタルの５０ｎＭ溶液の５０μＬのアリコートは、水性トリエタノールアミン（ＴＥＡ、ｐＨ＝１０．５）溶液及び親和性結合用バッファーの混合物の１５０Ｌのアリコートに懸濁された。
ＱｄｏｔＴＭ溶液の相対的な蛍光は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｖａｒｉｏｓｋａｎスペクトルスキャニングマルチモードプレートリーダー（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAから入手可能）を用いて、時間の関数として、λｅｘ＝４００ｎｍ及び５２５ｎｍ、λｅｍ＝６５５ｎｍでモニターされた。５０ｎＭのＱｄｏｔＴＭ６５５−３０Ｎナノクリスタル溶液中の４つの２００μＬの複製物は、低結合プレート（すなわち細胞付着性、タンパク質吸収、酵素活性化及び細胞活性化を最小化する表面を含んでいるプレート）においてモニターされた。割合が設定された時点で変化するように（表１）、蛍光は対時間でグラフ化され（図１−２）、報告された。表１の値は、１８時間後の６５５ｎｍでの蛍光損失の割合である。溶出バッファーは、ｐＨ１０．５でＴＥＡ（表１において見いだされるように）の様々な濃度を含む。
【表１】
2013503951.tif 000004
【００３０】
親和性結合用バッファーへのトリエタノールアミンの添加は、ＱｄｏｔＴＭ６５５  ３０Ｎナノクリスタルの蛍光安定性の増加を示し、時間に伴う蛍光のより少ない変化の割合を有した。親和性結合用バッファーへのトリエタノールアミンの割合の増加は、一般にこの観測蛍光安定性を増加させた。ｐＨ＝１０．５における様々なトリエタノールアミン濃度の初期試験は、５０又は１００ｍＭのトリエタノールアミン溶液で最も大きな効果が達成されることを示し、５０ｍＭは非常に類似した、又はわずかに１００ｍＭより効果的であった。
さらなる実験は、様々な溶出バッファーｐＨにおいて、５０ｍＭのトリエタノールアミンで行われた（図３、表２）。表２の値は、６５５ｎｍでの１８時間後の時間に伴う蛍光損失の割合である。
【表２】
2013503951.tif 000005
【００３１】
親和性結合用バッファーのＱｄｏｔＴＭナノ粒子溶液へのｐＨ＝１０．５の５０ｍＭ水性トリエタノールアミンの添加は、添加していない親和性結合用バッファー中のナノ粒子と比較して、ＱｄｏｔＴＭ試料の観測蛍光のより減少が少なかった。トリエタノールアミン溶液のｐＨの初期試験は、ｐＨ＝１０．５で最も大きな利益が達成されることが示された。しかしながら、ｐＨ１０．５は、長期間の抗体安定性に適していない。蛍光安定性の適度な増加がｐＨ＝８．５で見られた。この増加した蛍光安定性は、０．４２Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ＝８．３）のＱｄｏｔＴＭ６５５−３０Ｎナノクリスタルの５０ｎＭ溶液へ添加された５０ｍＭトリエタノールアミンでも観察された。
【００３２】
実施例２  ＱｄｏｔＴＭ安定性へのアミンの影響
量子ドットは表面欠陥を含み得、それは発光に影響を及ぼす。いくつかのリガンドはこれらの表面欠陥を不動態化し、量子ドットの発光量子収量を増加させ得る。Bullen及びMulvaneyは、発光強度へのアミンの影響を調査し、「Ｃ２からＣ１８にわたるアルキル鎖のルミネセンス強度へのアルキルアミンリガンド鎖長の明確な影響はない。より重要なのは、発光が明確にこの傾向に沿うことである：一級＞＞二級＞三級アミン。」と結論付けた。（Langmuir, 2006, 22:3007-3013, at p. 3009。）
その影響は、少なくとも部分的には、リガンドの大きさが予測される最大の表面リガンド付着量に与える影響に因るものであった：「これは、リガンドの疎水性の増加が表面親和性を増加させるのに対して、それがより大きい吸着フットプリントを相殺しないことを示唆する。飽和時に、より多くの一次リガンドが吸着する。」（Bullen, p. 3012.）
様々な官能基を有する様々な１°、２°及び３°アミンは、ｐＨ＝８．３において０．４２Ｍホウ酸バッファーのＱｄｏｔＴＭ６５５−３０Ｎナノクリスタル５０ｎＭ溶液への他のアミン添加物として調査された。トリエタノールアミン、Ｎメチルジエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン、トリス（２（２メトキシエトキシ）エチル）アミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−シクロブタンジアミン、Ｎ，Ｎジメチルグリシン、３−ジメチルアミノプロピオニトリル、ビシン（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン）及びビス−トリス（ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−トリス（ヒドロキシメチル）−メタン）は、評価された。それぞれのアミンは、５０ｍＭの最終濃度まで添加された。ＱｄｏｔＴＭ６５５−３０Ｎナノ粒子溶液の相対的な蛍光変化は、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｖａｒｉｏｓｋａｎスペクトルスキャニングマルチモードプレートリーダーを用いて測定された。結果は、図４及び表３に示される。表３のデータ値は、溶液のＱｄｏｔＴＭ蛍光の経時的な減少割合として表される。
【表３】
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【００３３】
Bullen及びMulvaneyによって得られた結果とは全く対照的に、蛍光強度の最も大きな安定性はトリエタノールアミン（三級アミン）で得られた。トリエタノールアミンと同様の蛍光安定性への影響は、他の２°及び３°アミン添加物で観察された。しかしながら、トリエタノールアミンは、開示された実施態様において最大の蛍光安定化をもたらした。Ｎ−エタノール置換基（主にＮ−メチルジエタノールアミン及びＮ，Ｎジメチルエタノールアミン）を含む他のＮ−アルキル化アミンは、同等の安定性をもたらした。
Ｎ−エタノール官能化されたアミノ酸（すなわち、ビシン又はＮ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ヒドロキシエチル）グリシン）がＱｄｏｔＴＭ溶液の蛍光安定性を増加させることが判明した。Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンにおけるビシンのＮ−エタノール置換基のメチル置換は、全体的に蛍光安定化を減少させたが、ＱｄｏｔＴＭ溶液の蛍光を減少させなかった。
トリス（２−（２−メトキシエトキシ）エチル）アミンにおいて見いだされるように、２つのメトキシエトキシエーテルでのＮ−エタノール置換基における水酸基のキャッピングは、ホウ酸バッファーのみと同じ結果をもたらした。トリス（ヒドロキシメチル）メタン基でのＮエタノール基の置換は、ビス−ＴＲＩＳ、ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−トリス（ヒドロキシメチル）メタンにおいて見いだされるように、ホウ酸バッファーのみと比較して、全体的に蛍光安定性を増加させた。したがって、官能基「−ＯＨ」は蛍光安定性を促進するようである。
【００３４】
実施例３  ＱｄｏｔＴＭ安定性へのバッファー塩の影響
様々なバッファー組成物中の５０ｎＭＱｄｏｔＴＭ６５５−３０Ｎナノクリスタルの蛍光安定性が評価された。バッファー組成物には、０．４２Ｍホウ酸（ｐＨ８．３）、５０ｍＭトリエタノールアミン（ＴＥＡ）（ｐＨ８．６）を含む０．４２Ｍホウ酸、１０×ＰＢＳ（１００ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５）、５０ｍＭＴＥＡ（ｐＨ８．３）を含む１０×ＰＢＳ、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓバッファー添加物（１０×ＰＢＳ中）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋ（ｐＨ７．５、Thermo Fisher Scientific, Rockford, ILから入手可能）、Ｐｉｅｒｃｅ  ＳＥＡ  ＢＬＯＣＫ（ｐＨ７．５）及びＰｉｅｒｃｅ  Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋ（ｐＨ７．５）が含まれた。結果は、図５及び表４に示される。蛍光データは、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｖａｒｉｏｓｋａｎスペクトルスキャニングマルチモードプレートリーダーを用いて得られた。１９．０時間及び９１．０時間でのデータ値は、ＱｄｏｔＴＭ溶液の蛍光の減少割合として経時的に表される。０時間での値は、初期蛍光表示である。
【表４】
2013503951.tif 000007
【００３５】
ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｂｕｆｆｅｒ添加物は、ブロッキングタンパク質として０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、界面活性剤として〜０．００２重量％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０、及び抗菌剤として〜０．００５重量％のアジ化ナトリウムを含む。溶液Ａは１．５重量％のカゼイン塩基加水分解物及び０．０８重量％のアジ化ナトリウムを含む水溶液であり、ＱｄｏｔＴＭ−抗体コンジュゲートを用いた効率的なＦＩＳＨ染色のために必要とされることが前もって決められていた。これらの添加物の事前評価は、１．０５重量％のカゼイン塩基加水分解物、５０ｍＭのトリエタノールアミン、０．００５重量％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０及び０．００８重量％のＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００を含む３つのバッファー系（１０ｍＭＰＢＳ、１０×ＰＢＳ及び０．４２Ｍホウ酸）の変形型を調製することによって、ｐＨを調製することなく行われた。潜在的なタンパク質凝集を回避するために、カゼイン塩基加水分解物の重量％濃度は、溶液Ａ中のカゼイン濃度と比較すると、まず最初に低下させた。界面活性剤の濃度を、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）レベル（すなわちミセルが自発的に形成させる濃度）より高くするために増加させた。さらに、溶液Ａ、ＳＥＡ  ＢＬＯＣＫ及びＭＡＸｂｌｏｃｋＴＭ（ｐＨ７．４、０．０９％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中の非哺乳動物ブロッキング剤、Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ（登録商標）、Carlsbad, CAから入手可能）が評価された。
蛍光データは、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｖａｒｉｏｓｋａｎスペクトルスキャニングマルチモードプレートリーダーを用いて得られた。結果は、図６−８及び表５−６に示される。表５は、表６で用いられるバッファーの配合組成を提供する。表６のデータ値は、ＱｄｏｔＴＭ溶液の蛍光の減少割合として経時的に表される。
【表５】
2013503951.tif 000008
【表６】
2013503951.tif 000009
【００３６】
初期の結果は、ＱｄｏｔＴＭ溶液の最も大きな蛍光安定性が５０ｍＭのトリエタノールアミン及び１．０５重量％のカゼイン塩基加水分解物の添加により見られたことを示した。蛍光安定性は、０．３２Ｍホウ酸バッファーにおいて最も明白であった。ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００及びＴｗｅｅｎ（登録商標）２０の添加は、蛍光安定性の観測された増加の価値を低下させるように見えた。
これらの知見がｐＨの変化に関連していなかったことを確認するために、ＱｄｏｔＴＭ６５５−３０Ｎナノ粒子の５０ｎＭ溶液の蛍光は、０．００５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０及び０．００８％  ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００を含まない、１．０５％カゼイン塩基加水分解物及び５０ｍＭトリエタノールアミンを含む３つのバッファー系（０．１×ＰＢＳ−ｐＨ７．４、１×ＰＢＳ−ｐＨ７．５及び０．３２Ｍホウ酸塩−ｐＨ８．３）においてモニターされた。いずれの場合においても、ｐＨは「親」バッファーのｐＨに調整された。データは、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｖａｒｉｏｓｋａｎスペクトルスキャニングマルチモードプレートリーダーを用いて得られた。結果は表７及び図９に示される。表７の値は、蛍光の経時的な減少割合である。負の値は、相対的な蛍光の増加を表す。
【００３７】
【表７】
2013503951.tif 000010
Ａ＝１．０５％カゼイン塩基加水分解物及び５０ｍＭ  ＴＥＡ
Ｂ＝Ａ＋０．００８％ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００及び０．００５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０
【００３８】
最も大きなＱｄｏｔＴＭフォトルミネセンス安定性は、０．３２Ｍホウ酸バッファーへの５０ｍＭトリエタノールアミン及び１．０５重量％カゼイン塩基加水分解物の添加により生じた。
ＱｄｏｔＴＭ−抗体コンジュゲートへのこれらの希釈液の影響についてさらに試験された。添加物（１．０５％カゼイン、５０ｍＭＴＥＡ、０．００８％ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００及び０．００５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）の様々な組合せを含む様々なバッファー（溶液Ａ、１０ｍＭＰＢＳ及び０．３２Ｍホウ酸）中のＱｄｏｔＴＭ６５５−３０Ｎナノ粒子及びＱｄｏｔＴＭ６５５−３０Ｎ−Ｍｓ  ＭＡｂコンジュゲートの相対的な蛍光の変化が評価された。蛍光データは、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｖａｒｉｏｓｋａｎスペクトルスキャニングマルチモードプレートリーダーを用いて得られた。結果は、図１０及び表８−９に示される。表８は、図１０及び表９において評価されるバッファー製剤を提供する。表９のデータ値は、蛍光の経時的な減少割合として表される。
【表８】
2013503951.tif 000011
【表９】
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【００３９】
これらの結果は、蛍光安定性がＱｄｏｔＴＭ−抗体コンジュゲートと同程度であることを示した。ＱｄｏｔＴＭ６５５−３０Ｎ−Ｍｓ  ＭＡｂコンジュゲートの場合、１．０５％カゼイン塩基加水分解物及び５０ｍＭトリエタノールアミン、０．００５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０及び０．００８％  ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００を含む０．３２Ｍホウ酸バッファー（図１０、表９）は、他のバッファーより大きな安定性をもたらし、ＱｄｏｔＴＭ安定化バッファー（ＱＳＢ）を開発するための基礎バッファーに選択された。
【００４０】
実施例４  ＱｄｏｔＴＭ安定性へのホウ酸バッファーｐＨ及びモル濃度の影響
ＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎナノクリスタルの５０ｎＭ溶液の蛍光安定性は、様々なホウ酸塩モル濃度を有するホウ酸バッファーを用いて探究された。ｐＨ＝８．３を維持しながら、ホウ酸塩モル濃度を０．０２５Ｍから０．４２Ｍまで変化させた。蛍光データは、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｖａｒｉｏｓｋａｎスペクトルスキャニングマルチモードプレートリーダーを用いて得られた。励起は４００ｎｍで行われ、結果を確認するために４７５ｎｍで繰り返した。結果は、以下の表１０及び図１１に示される。表１０の０時間での値は、初期の蛍光表示である。他の時点でのデータ値は、蛍光の経時的な減少割合として表される。
【表１０】
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【００４１】
ホウ酸塩モル濃度は、経時的なＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎナノクリスタル蛍光安定性に対してごくわずかな影響しか有しなかったようである。ＱｄｏｔＴＭ蛍光の変化は急速であり、主に最初の３時間以内に発生した。より低い塩濃度は、タンパク質を安定化し、凝集を最小化するのに役立ち得る。５０ｍＭのホウ酸塩濃度は、他の変数を調べるために選択された。
次に、ＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎナノクリスタルの５０ｎＭ溶液の蛍光安定性は、様々なｐＨで５０ｍＭホウ酸バッファー中でさらに探究された。ホウ酸バッファーのｐＨは、ＱｄｏｔＴＭフォトルミネセンスの安定性を最適化するために、ｐＨ＝７．０から９．５の間で変化させた。ホウ酸塩濃度は、前の表１０の結果に関連して、５０ｍＭに維持された。蛍光データは、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｖａｒｉｏｓｋａｎスペクトルスキャニングマルチモードプレートリーダーを用いて得られた。実験結果は、以下の表１１及び図１２に示される。表１１の０時間での値は、初期の蛍光表示である。他の時点のデータ値は、蛍光の減少割合として表される。
【表１１】
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【００４２】
バッファーのｐＨの低下と共に、蛍光安定性の減少が時間とともに観測された。ｐＨが低下した場合、ＱｄｏｔＴＭ蛍光は継続して減少したが、より許容できるｐＨではフォトルミネセンスは安定していた。最適ｐＨ安定性は、ｐＨ＝８．０で観測された。ＱｄｏｔＴＭ−抗体コンジュゲートの適切な範囲は、８から９までである。
【００４３】
実施例５  ＱｄｏｔＴＭ安定性へのタンパク質濃度及びタンパク源の影響
以前の安定性についての研究は、タンパク質の凝集が溶液のＱｄｏｔＴＭ−抗体コンジュゲートの減少の原因となることを示した。したがって、実験は、カゼインが蛍光安定性に対する影響を有する最も低い濃度を決定するために設計された。ＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎナノクリスタルの５０ｎＭ溶液の蛍光安定性は、０．０６６重量％から１．０５重量％まで変化させたカゼイン塩基加水分解物の濃度で、ｐＨ＝８．３の５０ｍＭホウ酸バッファーを用いて探究された。蛍光データは、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｖａｒｉｏｓｋａｎスペクトルスキャニングマルチモードプレートリーダーを用いて得られた。結果は、以下の表１２及び図１３に示される。表１２の０時間での値は、初期の蛍光表示である。他の時点のデータ値は、蛍光の経時的な減少割合として表される。
【表１２】
2013503951.tif 000015
Ａ：５０ｍＭホウ酸バッファー；Ｂ：０．４２Ｍホウ酸バッファー
【００４４】
カゼイン塩基加水分解物の濃度を変化させることは、ＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎナノクリスタル蛍光安定性に対して影響した。少ないカゼインを含む組成物は、より大きな蛍光安定性をもたらした。
潜在的なカゼイン塩基加水分解物の置換成分として、ｐＨ＝８．３の５０ｍＭホウ酸バッファー中のいくつかの他の１．０５重量％タンパク源を試験した。タンパク源は、表１３に記載されている。蛍光データは、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｖａｒｉｏｓｋａｎスペクトルスキャニングマルチモードプレートリーダーを用いて得られた。結果を表１４及び図１４に示す。表１４のデータ値は、蛍光の経時的な減少割合として表される。
【表１３】
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【表１４】
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１．０５重量％タンパク質濃度で、カゼイン塩基加水分解物の置換成分として最も高い潜在力を有するタンパク源は、植物性トリプトン、カゼイン酸加水分解物及び魚皮のゼラチンであった。
【００４５】
実施例６  ＱｄｏｔＴＭ安定性への界面活性剤の影響
タンパク質及びＱｄｏｔＴＭ−抗体コンジュゲートの潜在的な凝集に関する懸念により、凝集を阻止し、さらにＱｄｏｔＴＭナノクリスタルを安定化するための界面活性剤の使用が調査された。ＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎナノクリスタルの５０ｎＭ溶液の蛍光安定性は、様々な濃度のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むｐＨ＝８．３の５０ｍＭホウ酸バッファーを用いて探究された。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０は、０．００２５重量％から０．２０重量％まで変更された。蛍光データは、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｖａｒｉｏｓｋａｎスペクトルスキャニングマルチモードプレートリーダーを用いて得られた。結果は、以下の表１５及び図１５に示される。表１５の０時間での値は、初期の蛍光表示である。他の時点のデータ値は、蛍光の経時的な減少割合として表される。
【表１５】
2013503951.tif 000018
【００４６】
Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０の濃度は、ＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎナノクリスタル蛍光安定性に対してある程度の影響を与えた。ｐＨ＝８．３の５０ｍＭホウ酸バッファー溶液にどれだけの量のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を添加しても、ホウ酸バッファーのみと比較して、相対的な蛍光安定性を減少させた。濃度が０．０５と０．００５重量％との間で維持される場合、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０は最も許容できるようである。０．０５重量％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０濃度は、０．００５重量％よりも潜在的にＱｄｏｔＴＭ−抗体コンジュゲートにさらなる蛍光安定性をもたらし得る。界面活性剤はタンパク質を安定化し、それによりＱｄｏｔＴＭの凝集を回避することが意図される。
Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０がｐＨ  ８．３で５０ｍＭホウ酸バッファー中のＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎナノクリスタルの蛍光安定性にネガティブな影響を与えるようなので、他の界面活性剤は潜在的な変形例として試験された。先の実験において、ＱｄｏｔＴＭナノクリスタルが非イオン性界面活性剤で最も安定しているということが見出された。種々の非イオン性界面活性剤は、ｐＨ８．３の５０ｍＭホウ酸バッファーに０．０５重量％の濃度で調製された。界面活性剤は、表１６に記載される。蛍光データは、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｖａｒｉｏｓｋａｎスペクトルスキャニングマルチモードプレートリーダーを用いて得られた。結果を表１７及び図１６に示す。表１７の０時間での値は、初期の蛍光表示である。他の時点のデータ値は、蛍光の経時的な減少割合として表される。
【表１６】
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【表１７】
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Ｂｒｉｊ３５（ポリオキシエチレングリコールドデシルエーテル）（０．０５重量％）は、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０より良い蛍光安定性をもたらし、５０ｍＭホウ酸バッファーよりもナノクリスタルを安定化した。Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００（ポリエチレングリコールパラ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）は、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０と同等の蛍光への影響をもたらした。
【００４７】
実施例７  ＱｄｏｔＴＭ安定化バッファー（ＱＳＢ）の初期製剤
図１０（表８）に示されるＱ６５５−抗体コンジュゲートの安定に用いられる活性成分を利用して、ＱＳＢの以下の初期製剤は、ｐＨ＝８．３で０．４２Ｍホウ酸バッファーを基に用いられた。１００ｍＬのバッファー配合組成は、下記に記載される：
７５ｍＬの０．４２Ｍホウ酸バッファー、ｐＨ＝８．３（最終的に〜０．３２Ｍホウ酸塩）
２５ｍＬのカゼイン塩基加水分解物（４２ｍｇ／ｍＬカゼイン、最終的に〜１．０５重量％カゼイン）
６６４μＬのトリエタノールアミン（〜５０ｍＭ）
８μＬのＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００（〜０．０１重量％）
５μＬのＴｗｅｅｎ（登録商標）２０（〜０．００５重量％）
以下の実施例に記載されるように、後続の変形例が調製され、評価された。
【００４８】
実施例８  ＱｄｏｔＴＭ安定性への抗菌剤の影響
Ａ．０．０５％又は０．０１％のＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００を含むＱＳＢ中のＱｄｏｔＴＭ−３０Ｎナノ粒子及びそれらのコンジュゲートの安定性。
最初に、０．０１重量％のＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００が選択されたが、それは十分な抗菌保護をもたらさなかった。研究により、０．０５重量％が十分な保護をもたらすことが示された。その後、０．００７％及び０．０５％を含むＱＳＢ製剤は調製され、ＱｄｏｔＴＭ蛍光へのＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００濃度の影響が評価された。
３つのバッファーが調製された：
Ａ：溶液Ａ（１．５重量％カゼイン塩基加水分解物、０．０８重量％アジ化ナトリウム）
Ｂ：０．００７％ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００を含むＱＳＢ（「部分的なホウ酸」）
Ｃ：０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００を含むＱＢＳ（「完全なホウ酸」）
データは、Ｖａｒｉｏｓｋａｎスペクトルスキャニングマルチモードプレートリーダーを用いて得られた。結果は、以下の表１８−１９及び図１７−１８に示される。表１８及び１９のデータ値は、蛍光の経時的な減少割合として表される。負の値は蛍光の増加を示す。
【表１８】
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【表１９】
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室温の溶液中のＱｄｏｔＴＭナノ粒子及びそれらのコンジュゲートの蛍光シグナルの解析は、ＱＢＳ中のＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００レベルの０．０１重量％から０．０５重量％への増加は、全てのＱｄｏｔＴＭ材料の観測蛍光安定性の減少を引き起こした。両方のＱＳＢ組成物は、ＱｄｏｔＴＭ５６５ナノクリスタルに対して、溶液Ａより少ない観測蛍光変化をもたらした。しかしながら、ＱｄｏｔＴＭ６５５ナノクリスタルについて、０．０５重量％のＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００を含むＱＳＢは、溶液Ａより大きな蛍光損失が生じさせた。ＱｄｏｔＴＭ６５５−３０Ｎ−Ｍｓ  ＭＡｂコンジュゲートの場合、ＱＢＳ中のＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００の０．０１重量％から０．０５重量％への増加は、ごくわずかな蛍光安定性の減少を引き起こした。しかしながら、ＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎ−Ｍｓ  ＭＡｂコンジュゲートについて、０．０５重量％  ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００を含むＱＳＢは、溶液Ａと同等だった。
【００４９】
Ｂ．０．０５％  ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００又は０．０８％アジ化ナトリウムを含むＱＳＢ中のＱｄｏｔＴＭ−３０Ｎナノ粒子の安定性
ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００についての有効な文献のｐＨ安定域は、ｐＨ＝３．０から８．５である（例えばSigma-Aldrichによって提供される）。ｐＨ＝８．５に近いかそれより高いｐＨにおいて、ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００の有効抗細菌性は減少する。０．０５重量％  ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００を含むＱＳＢ中のＱｄｏｔＴＭナノクリスタルの観測蛍光安定性のさらなる減少は、置換成分としての０．０８重量％アジ化ナトリウムの調査を促した。ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００を含むＱｄｏｔＴＭ５６５及びＱｄｏｔＴＭ６５５−３０Ｎナノクリスタルの観測蛍光安定性に相違があったので、これらの試薬の影響は、さらなるＱｄｏｔＴＭナノクリスタルについて室温で試験された。ＱｄｏｔＴＭ３０Ｎナノ粒子は、いずれの０．０５重量％  ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００又は０．０８重量％アジ化ナトリウムを含むＱＳＢ中で評価された。蛍光データは、Ｖａｒｉｏｓｋａｎスペクトルスキャニングマルチモードプレートリーダーを用いて得られた。データは、以下の表２０Ａ−Ｂ及び図１９−２２に示される。表２０Ａ−Ｂのデータ値は、蛍光の経時的な減少割合として表される。負の値は、蛍光の増加を示す。
【表２０Ａ】
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【表２０Ｂ】
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ＱｄｏｔＴＭナノクリスタルの相対的なフォトルミネセンスのより少ない変化は、０．０５重量％  ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００を含むＱＳＢよりも０．０８重量％アジ化ナトリウムを含むＱＳＢにおいて観測された。さらに、相対的な変化率は、それぞれのＱｄｏｔＴＭナノクリスタルに対して変化した。観測蛍光における最大の損失は、ＱｄｏｔＴＭ５８５−３０Ｎナノクリスタルであった。ＱｄｏｔＴＭ８００−３０Ｎナノクリスタルの相対的な蛍光の純増加があった。
【００５０】
Ｃ．０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００又は０．０８％アジ化ナトリウムを含むＱＳＢ中のＱｄｏｔＴＭ−３０Ｎ−Ｍｓ  ＭＡｂコンジュゲートの安定性
３つのＱｄｏｔＴＭ−３０Ｎ−抗体コンジュゲートの相対的な蛍光は、溶液Ａ又は０．０８重量％アジ化ナトリウム又は０．０５重量％ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００を含むＱＳＢにおいて室温で試験された。観測蛍光に最も幅広い影響を与えるために、ＱｄｏｔＴＭ８００及びＱｄｏｔＴＭ５８５−３０Ｎ−Ｍｓ  ＭＡｂコンジュゲートがこの実験のために選択された。これらのコンジュゲートは、先のデータセットとのデータセットの整合性のために、ＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎ−Ｍｓ  ＭＡｂコンジュゲートと比較された。励起は４００ｎｍで行われた。蛍光データは、Ｖａｒｉｏｓｋａｎスペクトルスキャニングマルチモードプレートリーダーを用いて得られた。データは、以下の表２１及び図２３に示される。表２１のデータ値は、蛍光の経時的な減少割合として表される。３つのコンジュゲートの蛍光の読取りは、それぞれ５６５ｎｍ、５８５ｎｍ及び８００ｎｍで行われた。負の値は、蛍光の増加を示す。
【表２１】
2013503951.tif 000025
同様の蛍光の変化は、表１９のナノクリスタルのデータに関連してＱｄｏｔＴＭ−抗体コンジュゲートについて観測された。観測蛍光の最大の損失は、ＱｄｏｔＴＭ５８５−３０Ｎ−Ｍｓ  ＭＡｂ抗体コンジュゲートであった。ＱｄｏｔＴＭ８００−３０Ｎ−Ｍｓ  ＭＡｂコンジュゲートの蛍光の相対的な増加が観測された。それぞれのＱｄｏｔＴＭ−抗体コンジュゲートに対して、蛍光の減少が最少となるバッファーは異なった。さらに、いくつかのコンジュゲートについては、正味の材料の沈澱が観察された。ＱｄｏｔＴＭ５８５及びＱｄｏｔＴＭ８００のコンジュゲートの場合、混合することで試料の相対的な蛍光が増加した。明らかに、これらのコンジュゲートの凝集及び沈澱は、希釈条件下で溶液中に発生している。
【００５１】
実施例９  分解されたＱｄｏｔＴＭ安定化バッファー中のＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎ−３０Ｎ−ＭｓＡｎｔｉＮＰコンジュゲートの安定性
０．０８重量％アジ化ナトリウムを含むＱＳＢの分解された型におけるＱｄｏｔＴＭ−抗体コンジュゲートの観測蛍光の相対的な変化を試験するための研究が行われた。いずれの場合においても、ＱＢＳバッファーはバッファーの一成分を取り除くことで調製され、実施例８Ｃの同一のＱｄｏｔＴＭ−３０Ｎ−Ｍｓ  ＭＡｂコンジュゲートについて試験した。蛍光データは、Ｖａｒｉｏｓｋａｎスペクトルスキャニングマルチモードプレートリーダーを用いて得られた。結果は、以下の表２２−２３及び図２４−２６に示される。図２４において、λｅｘ＝４００ｎｍ、λｅｍ＝５６５ｎｍ；図２５において、λｅｘ＝４００ｎｍ、λｅｍ＝５８５ｎｍ；図２６において、λｅｘ＝４００ｎｍ、λｅｍ＝６５５ｎｍ。表２２のデータ値は、蛍光の経時的な減少割合として表される。負の値は、蛍光の増加を示す。
【表２２】
2013503951.tif 000026
【表２３】
2013503951.tif 000027
【００５２】
いずれの場合においても、バッファーは、コンジュゲートの全体的な蛍光の変化により、１（最良）から６（最低）までのランクを付けた。総計は、３つ全てのコンジュゲートの順位を合わせることによりつくられた。最終的な順位の概要は表２３に示される。全てのＱｄｏｔＴＭ−３０Ｎ−Ｍｓ  ＭＡｂコンジュゲートについて、相対的な蛍光の変化の類似の傾向は、順位のわずかな変化を伴ってそれぞれのバッファーについて観察された。全体的に見て、最良のバッファーは、０．０８重量％アジ化ナトリウムを含むＱｄｏｔＴＭ安定化バッファーであった。二、三のケースにおいて、前述のように、ある成分を欠失するＱＳＢバッファーは、それぞれのＱｄｏｔＴＭナノクリスタルの個々の安定特性により、完全なＱＳＢより望ましい結果をもたらした。いずれの場合においても、完全なＱＳＢは、二番目に良い結果をもたらした。ＱｄｏｔＴＭ−抗体コンジュゲートの安定性に最も大きな影響を有するように見える主成分は、カゼイン塩基加水分解物である。表６において、いくつかのバッファーにおいて、ＱｄｏｔＴＭ蛍光シグナル強度は、カゼイン塩基加水分解物の添加によって溶液中で安定化されることが証明された。これは、コントロールｐＨ希釈液においてさらに示された。
いくつかの成分（トリエタノールアミン、カゼイン塩基加水分解物、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０及びアジ化ナトリウムを含む）は、少なくともいくつかのＱｄｏｔＴＭ及びＱｄｏｔＴＭコンジュゲートの蛍光を増加させるように見えた。例えば、５０ｍＭトリエタノールアミンを含むＱＳＢ組成物は、トリエタノールアミンの欠如以外の同じ組成を有するＱＳＢ組成物と比較して、ＱｄｏｔＴＭ８００−３０Ｎ−ＭＳ−Ｍａｂコンジュゲートの初期蛍光を６％増加させた。２５時間後、トリエタノールアミンを含むＱＳＢ組成物中でのＱｄｏｔＴＭ８００−３０Ｎ−ＭＳ−Ｍａｂコンジュゲートの蛍光は、トリエタノールアミンのないＱＳＢ組成物中の蛍光より１０％大きかった。
２５時間の１．０５重量％カゼイン塩基加水分解物を含むＱＳＢ組成物中で保存されたＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎ−ＭＳ−Ｍａｂコンジュゲートは、カゼイン塩基加水分解物の欠如以外の同じ組成を有するＱＳＢ組成物中で保存されたＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎ−ＭＳ−Ｍａｂコンジュゲートの蛍光より１４％大きな蛍光を有した。同様に、カゼイン塩基加水分解物を含むＱＳＢ組成物中に２５時間保存されたＱｄｏｔＴＭ８００−３０Ｎ−ＭＳ−Ｍａｂコンジュゲートは、カゼイン塩基加水分解物を含まないＱＳＢ組成物の蛍光より２０％大きい蛍光を有し、ＱｄｏｔＴＭ５８５−３０Ｎ−ＭＳ−Ｍａｂコンジュゲートはカゼイン塩基加水分解物を含まないＱＳＢ組成物の蛍光より大２７％大きい蛍光を有した。カゼイン塩基加水分解物の存在は、量子ドットの凝集を最小化し、溶液中での量子ドットの溶解性を維持することによって、蛍光を安定化する。
０．００５重量％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＱＳＢ組成物中で保存されたＱｄｏｔＴＭ８００−３０Ｎ−ＭＳ−Ｍａｂコンジュゲートは、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０の欠如以外の同じ組成を有するＱＳＢ組成物中で保存されたＱｄｏｔＴＭ８００−３０Ｎ−ＭＳ−Ｍａｂコンジュゲートの蛍光より６％大きい初期蛍光を有した。０．００５重量％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＱＳＢ組成物中に２５時間保存されたＱｄｏｔＴＭ８００−３０Ｎ−ＭＳ−Ｍａｂコンジュゲートは、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含まないＱＳＢ組成物の蛍光より６％大きい蛍光を有した。０．００５重量％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＱＳＢ組成物中に２５時間保存されたＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎ−ＭＳ−Ｍａｂコンジュゲートは、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含まないＱＳＢ組成物中に保存されたＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎ−ＭＳ−Ｍａｂコンジュゲートの蛍光より６％大きい蛍光を有した。０．００５重量％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＱＳＢ組成物中に２５時間保存されたＱｄｏｔＴＭ５８５−３０Ｎ−ＭＳ−Ｍａｂコンジュゲートは、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含まないＱＳＢ組成物中に保存されたＱｄｏｔＴＭ５８５−３０Ｎ−ＭＳ−Ｍａｂコンジュゲートの蛍光より５％大きい蛍光を有した。
０．０８重量％のアジ化ナトリウムを含むＱＳＢ組成物中に保存されたＱｄｏｔＴＭ８００−３０Ｎ−ＭＳ−Ｍａｂコンジュゲートは、アジ化ナトリウムを含まないＱＳＢ組成物の蛍光より６％大きい初期蛍光を有した。０．０８重量％のアジ化ナトリウムを含むＱＳＢ組成物中に２５時間保存されたＱｄｏｔＴＭ８００−３０Ｎ−ＭＳ−Ｍａｂコンジュゲートは、アジ化ナトリウムを含まないＱＳＢ組成物の蛍光より１４％大きい蛍光を有した。０．０８重量％のアジ化ナトリウムを含むＱＳＢ組成物中に２５時間保存されたＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎ−ＭＳ−Ｍａｂコンジュゲートは、アジ化ナトリウムの欠如以外同じ組成を有するＱＳＢ組成物中に保存されたＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎ−ＭＳ−Ｍａｂコンジュゲートの蛍光より１４％大きい蛍光を有した。
【００５３】
実施例１０  ＱｄｏｔＴＭ安定化バッファーの最終的な調製
ＱＳＢの最終的な製剤は、０．０８重量％アジ化ナトリウムを含むＱＳＢの１００ｍＬのアリコートとして以下に示される。最終的なｐＨは、ｐＨ＝８．３に調整された。
０．４２Ｍホウ酸バッファー７５ｍＬ、ｐＨ＝８．３（最終的に〜０．３２ｍＭホウ酸塩）
カゼイン塩基加水分解物２５ｍＬ（４２ｍｇ／ｍＬカゼインストック、最終的に〜１．０５重量％）
トリエタノールアミン６６４μＬ（〜５０ｍＭ）
アジ化ナトリウム８０ｍｇ（〜０．０８重量％）
Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０  ５μＬ（〜０．００５重量％）
【００５４】
実施例１１  ＱｄｏｔＴＭ−抗体コンジュゲート染色
Ａ．ＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎ−ＭｓＡｎｔｉＨａｐｔｅｎコンジュゲートでの染色を評価するためのパラメータ
ＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎ−ＳＭＣＣ−ＭｓＡｎｔｉＨａｐｔｅｎコンジュゲートの機能的性能は、ＱｄｏｔＴＭ安定化バッファー（ＱＳＢ）又は溶液Ａに希釈されたＦＩＳＨアッセイにおいて評価された。ＦＩＳＨアッセイは、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  ＸＴ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ上で完全に自動化された方法で行われた。
試験試料：４μｍ厚（ＦＦＰＥＴ（ホルマリン固定パラフィンで包埋された組織））、前立腺癌と相関するゲノムトランスロケーションを示すことが決定された異種移植片切片が用いられた。前立腺癌細胞株は、前立腺癌の脊椎骨への転移のケースに由来した。細胞は、多染色体性、３’−ＥＲＧ−５’−ＥＲＧの分断及び３’−ＥＲＧ増幅を示す。
ＦＩＳＨアッセイ：ハイブリダイゼーションは５２℃で８時間行われ、ストリンジェントな洗浄は２×ＳＳＣにおいて７２℃で行われた（３×８分）。
プローブ：反複枯渇５’−ＥＲＧ−Ｈａｐｔｅｎプローブは、４０μｇ／ｍｌの濃度で用いられた。
検出：ＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎ−ＭＳＡｎｔｉＨａｐｔｅｎコンジュゲート溶液は、ＱＳＢ（実施例１０の製剤）又は溶液Ａのいずれかで５０ｎＭの濃度に希釈された。調製後、希釈されたコンジュゲート溶液は、４℃で保存された。試料は、ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  ＸＴ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ上で自動化ＦＩＳＨアッセイで毎月試験された。４０×倍率の複合スペクトル像が得られた。
【００５５】
Ｂ．ＱｄｏｔＴＭ安定化バッファー（ＱＳＢ）中のＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎ−ＭｓＡｎｔｉＨａｐｔｅｎコンジュゲートの染色結果
ＱｄｏｔＴＭ５６５−３０Ｎ−ＭｓＡｎｔｉＨａｐｔｅｎコンジュゲートは、観測された６ヵ月を通して、ＱＳＢ中でより鮮明なＦＩＳＨシグナルを産生した。ＦＩＳＨ組織染色の表現は、図２７−３３に見いだされる。図２７−３３は、４０×倍率での複合スペクトル像（ＣＳＩ）である。図３４は、標準的なＦＩＳＨ像である。（ＦＩＳＨ像は狭帯域ミクロンフィルターによって得られる連続した像である。ＣＳＩ像は、規則的な抽出間隔での完全な可視スペクトルの獲得から成るスペクトル像である。）
ＱＳＢ及び溶液Ａの結果は、０日（図２７−２８）、１ヵ月（図２９−３０）及び３ヵ月（図３１−３２）で評価された。図３３−３４は、６ヵ月でのＱＳＢの結果を図示する。１ヵ月の時点で、ＦＩＳＨシグナル強度は、溶液Ａ中のコンジュゲートで顕著に減少し始めた。ＱＳＢは、３ヵ月の時点を超えて本来のシグナル強度を維持した。シグナル強度の穏やかな減少は、６ヵ月目に検出された。
染色は、病理学的スコア基準を用いて評価された。陽性シグナルは、細胞の核において、鮮明な環状の点（直径〜０．１μｍ−０．５μｍ）として見られる。点は、暗視野に現れ、単一、二重又は複数の構成で発生する。表２４で概説されるように、暗視野における明るさの強度は０−３のスケールで記録された。結果の概要は、表２５に提供される。
【表２４】
2013503951.tif 000028
【表２５】
2013503951.tif 000029
病理学的スコアは０−３のスケールであり、３は最も大きなシグナル強度を表していてる。
【００５６】
先に示された染色結果に加えて、十分な染色の提供に失敗した全ての試料は、それらの蛍光、抗体運動活性及び凝集の潜在的な変化について解析された。失敗したそれぞれのケースにおいて、どのバッファーにおける相対的な蛍光又は蛍光発光の波長における有意な変化は観測されなかった。さらに、ＢｉｏＬａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）による試料の解析は、ハプテンプローブ標識の抗体結合活性の有意な損失を示さなかった。
２つのコンジュゲートは、ストレス条件下で溶液Ａにおいて評価された。ストレス条件のコンジュゲートのアリコートは、分配され、スライド上でカバーグラスにより覆われた。試料は、３７℃で１０日間ストレスを加えられ、４℃で保存された。試料中でコンジュゲートの別々の凝集体が形成され、染色が減少したことが分かった。凝集は、溶液中の試薬の量を限定し、細胞に入るには大き過ぎるコンジュゲートを製作することによって、染色を阻害しやすい。対照的に、ＱＳＢバッファー中のＱｄｏｔＴＭコンジュゲートが同じ条件下で評価された場合、コンジュゲートの凝集はより少なかった。
【００５７】
以下の特許及び出願は、本出願の開示の一部であると考慮され、出典明示により本願明細書に援用されたものとする：米国特許出願第１１／８００，３６０号（米国公開第２００８／０２７４４６３号）（２００７年５月４日出願）、米国特許出願第１１／８４９，０６０号（米国公開第２００８／００５７５１３号）（２００７年８月３１日出願）、米国特許出願第１１／９８２，６２７号（米国公開第２００８／０２６８５６２号）（２００７年１１月１日出願）、米国特許出願第１１／９９９，９１４号（米国公開第２００８／０２１２８６６号）（２００７年１２月６日出願）、米国特許出願第１２／１５４，４７２号（米国公開第２００８／０３０５４９７号）（２００８年５月２２日出願）、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４５８４１号（国際公開公報第２００９／１４９０１３号）（２００９年６月１日出願）、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５４６１４号（２００９年８月２１日出願）及び米国仮出願第６１／２８８，２２６号（２００９年１２月１８日出願）。
【００５８】
蛍光粒子を安定化するための組成物の実施態様は、（ａ）アミノ酸又はアルキル置換アルキルアミン以外の置換アミン、又は（ｂ）アミン及びタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物を含み、少なくとも１つのアミン又はタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物は、（ａ）アミノ酸又はアルキル置換アルキルアミン以外の置換アミン又は（ｂ）アミン及びタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物を欠く組成物中で保存される蛍光粒子の蛍光強度と比較して、組成物中に保存される蛍光粒子の蛍光強度を安定化及び／又は増加させるのに有効な濃度で存在する。いくつかの実施態様において、組成物はホウ酸バッファーを更に含み、組成物は７以上のｐＨを有する。上記の何れか又は全ての実施態様において、組成物は防腐剤及び界面活性剤を更に含んでもよい。
上記の何れか又は全ての実施態様において、組成物は、０．０２Ｍから０．５Ｍのホウ酸塩、０．０５重量％から１．５重量％のタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物、２５ｍＭから２００ｍＭのアミン、０．０５重量％から０．２重量％の防腐剤及び０．００５重量％から０．０５重量％の界面活性剤を含んでもよい。
上記の何れか又は全ての実施態様において、アミンは化学式ＲｎＮＨ（３−ｎ）を有する置換アミンであってもよい（ここでｎ＝１、２又は３であり、それぞれのＲは独立して脂肪族基、ヘテロ脂肪族基、アリール基、ヘテロアリール基、アルキルアリール基又はアリールアルキル基であり、少なくとも一つのＲは置換されている）。いくつかの実施態様において、少なくとも一つのＲは、一つ以上の−ＯＨ、−ＯＲ１、−ＣＯ２Ｒ１、−ＣＮ基又はその組合せで置換されている（Ｒ１は置換又は非置換の脂肪族基又はアリール基である）。
上記の何れか又は全ての実施態様において、アミンはアルカノールアミンであってもよい。上記の何れか又は全ての実施態様において、アミンは、Ｎ−エタノール置換アミン（例えばエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、Ｎ−メチルジエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン又はその組合せ）であってもよい。上記の何れか又は全ての実施態様において、アミンは、５０ｍＭから１００ｍＭの濃度のＮ−エタノール置換アミンであってもよい。
上記の何れか又は全ての実施態様において、アミンは、置換された三級アルキルアミンであってもよい。
【００５９】
上記の何れか又は全ての実施態様において、タンパク質及び／又はタンパク質加水分解物は、植物性トリプトン、サーモンペプトン、カゼイン加水分解物、チキンアルブミン加水分解物、魚皮のゼラチン又はその組合せであってもよい。上記の何れか又は全ての実施態様において、防腐剤は、ａ）アジ化ナトリウム、ｂ）９．５−９．９％の２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンを含む防腐剤組成物、ｃ）２．３％の５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、０．７％の２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、２−３％のアルキルカルボキシレート及び９３−９５％の修飾グリコールを含む防腐剤組成物、又はｄ）その組合せであってもよい。
上記の何れか又は全ての実施態様において、界面活性剤は非イオン性界面活性剤であってもよい。いくつかの実施態様において、界面活性剤は、アルキレングリコール又は含酸素アルキレングリコール（例えばポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート、ポリエチレングリコールパラ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）又はポリオキシエチレングリコールドデシルエーテル）であってもよい。
上記の何れか又は全ての実施態様において、組成物は７〜９又は８〜９のｐＨを有してもよい。
上記の何れか又は全ての実施態様において、組成物は蛍光粒子を更に含んでもよく、蛍光粒子の蛍光強度は、（ａ）アミノ酸又はアルキル置換アルキルアミン以外の置換アミン、又は（ｂ）アミン及びタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物を欠く組成物中の蛍光粒子の蛍光強度と比較して増加している。いくつかの実施態様において、蛍光粒子を組成物と混合した後の蛍光強度は、（ａ）アミノ酸又はアルキル置換アルキルアミン以外の置換アミン、又は（ｂ）アミン及びタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物を欠く組成物中の蛍光粒子の蛍光強度と比較して、少なくとも５％増加している。
いくつかの実施態様において、蛍光粒子は量子ドット又は量子ドットコンジュゲートであり、組成物は０．３２Ｍホウ酸塩、１．０５重量％カゼイン加水分解物、５０ｍＭトリエタノールアミン、０．０８重量％アジ化ナトリウム及び０．００５重量％ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレートを含み、組成物は８〜８．５のｐＨを有する。
蛍光粒子を安定化するための方法の実施態様は、少なくとも一つの蛍光粒子を含む蛍光粒子溶液を提供すること、希釈された蛍光粒子溶液を提供するために組成物の蛍光粒子溶液を希釈することを含み、組成物は（ａ）アミノ酸又はアルキル置換アルキルアミン以外の置換アミン、又は（ｂ）アミン及びタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物を含み、少なくとも１つのアミン及びタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物は蛍光粒子の蛍光を安定化及び／又は増加させるのに有効な濃度で存在する。
【００６０】
いくつかの実施態様において、組成物に蛍光粒子溶液を希釈することは、（ａ）アミノ酸又はアルキル置換アルキルアミン以外の置換アミン、又は（ｂ）アミン及びタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物を欠く組成物に蛍光粒子溶液を希釈することによって形成される希釈された蛍光粒子溶液の蛍光強度と比較して、希釈された蛍光粒子溶液の蛍光強度を増加させる。特定の実施態様において、希釈された蛍光粒子溶液（組成物に蛍光粒子溶液を希釈した後）の蛍光強度は、（ａ）アミノ酸又はアルキル置換アルキルアミン以外の置換アミン、又は（ｂ）アミン及びタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物を欠く組成物に蛍光粒子溶液を希釈することによって形成される希釈された蛍光粒子溶液の蛍光強度と比較して、少なくとも５％増加する。
上記の何れか又は全ての実施態様において、組成物はホウ酸バッファー、防腐剤及び界面活性剤を更に含んでもよく、組成物は７以上のｐＨを有してもよい。上記の何れか又は全ての実施態様において、組成物は、０．０５Ｍから０．５Ｍのホウ酸塩、０．０５重量％から１．１重量％のタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物、５０ｍＭから１００ｍＭのアミン、０．０５重量％から０．２重量％の防腐剤及び０．００５重量％から０．０５重量％の非イオン性界面活性剤を含んでもよい。上記の何れか又は全ての実施態様において、アミンは、Ｎ−エタノール置換アミンであってもよい。
上記の何れか又は全ての実施態様において、方法は、希釈された蛍光粒子溶液を４℃で保存することを更に含む。いくつかの実施態様において、希釈された蛍光粒子溶液の蛍光強度は、４℃で１ヵ月の保存後、実質的に同じままである。特定の実施態様において、希釈された蛍光粒子溶液の蛍光強度は、４℃で３ヵ月の保存後、実質的に同じままである。
上記の何れか又は全ての実施態様において、蛍光粒子溶液は少なくとも一つの量子ドットコンジュゲートを含む量子ドットコンジュゲート溶液であってもよく、量子ドットコンジュゲート溶液は希釈された量子ドットコンジュゲート溶液を提供するために０．５ｎＭから１５０ｎＭの濃度に希釈される。
いくつかの実施態様において、希釈された量子ドットコンジュゲート溶液は、標的にハイブリダイズされたプローブを検出するために用いられる。ある実施態様において、量子ドットコンジュゲートは量子ドット−抗体コンジュゲートであり、方法はハイブリダイズされたプローブを提供するために標的にプローブをハイブリダイズさせること；希釈された量子ドット−抗体コンジュゲート溶液を提供すること（ここで、量子ドット−抗体コンジュゲート溶液は、５ｎＭから１００ｎＭの量子ドット−抗体コンジュゲート、０．０５Ｍから０．５Ｍのホウ酸塩、０．０５重量％から１．１重量％のタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物、５０ｍＭから１００ｍＭのＮ−エタノール置換アミン、０．０５重量％から０．１重量％のアジ化ナトリウム及び０．００５重量％から０．０５重量％の非イオン性界面活性剤を含み、８−９のｐＨを有し、量子ドット−抗体コンジュゲートはプローブに結合可能である）；ハイブリダイズされたプローブと希釈された量子ドット−抗体コンジュゲート溶液を組み合わせること；及び量子ドット−抗体コンジュゲートの蛍光を検出することをさらに含む。
【００６１】
いくつかの実施態様において、希釈された量子ドットコンジュゲート溶液は、組織試料上のタンパク質抗原を検出するために用いられる。ある実施態様において、量子ドットコンジュゲートは量子ドット−抗体コンジュゲートであり、方法は希釈された量子ドット−抗体コンジュゲート溶液を提供すること（ここで、量子ドット−抗体コンジュゲート溶液は、５ｎＭから１００ｎＭの量子ドット−抗体コンジュゲート、０．０５Ｍから０．５Ｍのホウ酸塩、０．０５重量％から１．１重量％のタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物、５０ｍＭから１００ｍＭのＮ−エタノール置換アミン、０．０５重量％から０．１重量％のアジ化ナトリウム及び０．００５重量％から０．０５重量％の非イオン性界面活性剤を含み、８−９のｐＨを有し、量子ドット−抗体コンジュゲートはタンパク質抗原に結合可能である）；組織試料と希釈された量子ドット−抗体コンジュゲート溶液を組み合わせること；及び量子ドット−抗体コンジュゲートの蛍光を検出することをさらに含む。
いくつかの実施態様において、希釈された量子ドット−抗体コンジュゲート溶液は、８から８．５のｐＨを有し、５ｎＭから１００ｎＭの量子ドット−抗体コンジュゲート、０．３２Ｍのホウ酸塩、１．０重量％のカゼイン加水分解物、５０ｍＭのトリエタノールアミン、０．０８重量％のアジ化ナトリウム及び０．００５重量％のポリエチレングリコールソルビタンモノラウレートを含む。いくつかの実施態様において、希釈された量子ドット−抗体コンジュゲート溶液は、使用前に４℃で保存される。いくつかの実施態様において、希釈された量子ドット−抗体コンジュゲート溶液の蛍光強度は、４℃で１ヵ月の保存後、実質的に同じままである。いくつかの実施態様において、希釈された量子ドット−抗体コンジュゲート溶液の蛍光強度は、４℃で３ヵ月の保存後、実質的に同じままである。
開示された発明の原理が適用される多くの考えられる実施態様を考慮すると、例示の実施態様は発明の好ましい例にすぎず、発明の範囲を限定するように受け取られるべきでないことは認識されるべきである。それよりも、発明の範囲は、以下の請求項によって定義される。我々は、したがって、これらの請求項の範囲および趣旨の範囲内の全てが本発明であると主張する。
【図１】
2013503951.tif 000030
【図２】
2013503951.tif 000031
【図３】
2013503951.tif 000032
【図４】
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【図５】
2013503951.tif 000034
【図６】
2013503951.tif 000035
【図７】
2013503951.tif 000036
【図８】
2013503951.tif 000037
【図９】
2013503951.tif 000038
【図１０】
2013503951.tif 000039
【図１１】
2013503951.tif 000040
【図１２】
2013503951.tif 000041
【図１３】
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【図１４】
2013503951.tif 000043
【図１５】
2013503951.tif 000044
【図１６】
2013503951.tif 000045
【図１７】
2013503951.tif 000046
【図１８】
2013503951.tif 000047
【図１９】
2013503951.tif 000048
【図２０】
2013503951.tif 000049
【図２１】
2013503951.tif 000050
【図２２】
2013503951.tif 000051
【図２３】
2013503951.tif 000052
【図２４】
2013503951.tif 000053
【図２５】
2013503951.tif 000054
【図２６】
2013503951.tif 000055
【図２７】
2013503951.tif 000056
【図２８】
2013503951.tif 000057
【図２９】
2013503951.tif 000058
【図３０】
2013503951.tif 000059
【図３１】
2013503951.tif 000060
【図３２】
2013503951.tif 000061
【図３３】
2013503951.tif 000062
【図３４】
2013503951.tif 000063
【手続補正書】
【提出日】平成24年3月2日(2012.3.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
量子ドット又は量子ドットコンジュゲートを安定化させるための組成物であって：
（ａ）アミノ酸又はアルキル置換アルキルアミン以外の置換アミン；又は
（ｂ）アミン及びタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物
を含み、
前記組成物はさらに：
（ｃ）ホウ酸バッファー；
（ｄ）防腐剤；及び
（ｅ）界面活性剤
を含み、
前記組成物は７以上のｐＨを有し、
少なくとも１つのアミン又はタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物は、（ａ）アミノ酸又はアルキル置換アルキルアミン以外の置換アミン、又は（ｂ）アミン及びタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物を欠く組成物中で保存された量子ドット又は量子ドットコンジュゲートの蛍光強度と比較して、前記組成物中で保存された量子ドット又は量子ドットコンジュゲートの蛍光強度を安定化及び／又は増加させるのに有効な濃度で存在する、組成物。
【請求項２】
０．０２Ｍから０．５Ｍのホウ酸塩；
０．０５重量％から１．５重量％のタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物；
２５ｍＭから２００ｍＭのアミン；
０．０５重量％から０．２重量％の防腐剤；及び
０．００５重量％から０．０５重量％の界面活性剤
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
アミンが化学式ＲｎＮＨ（３−ｎ）（ここで、ｎ＝１、２又は３であり、それぞれのＲは独立して脂肪族基、ヘテロ脂肪族基、アリール基、ヘテロアリール基、アルキルアリール基又はアリールアルキル基であり、少なくとも１つのＲは置換されている）を有する置換アミンであり；場合によって、
少なくとも１つのＲが一又は複数の−ＯＨ、−ＯＲ１、−ＣＯ２Ｒ１、−ＣＮ基又はその組み合わせで置換されており、Ｒ１は置換又は非置換の脂肪族基又はアリール基であり；場合によって、
アミンがアルカノールアミンを含み；場合によって、
アミンがＮ−エタノール置換アミンを含み；場合によって、
Ｎ−エタノール置換アミンが５０ｍＭから１００ｍＭまでの濃度を有し；場合によって、
アミンがエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、Ｎ−メチルジエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン又はその組み合わせであり；場合によって、
アミンが置換された三級アルキルアミンである、請求項１ないし２の何れか一項に記載の組成物。
【請求項４】
タンパク質及び／又はタンパク質加水分解物が植物性トリプトン、サーモンペプトン、チキンアルブミン加水分解物、カゼイン加水分解物、魚皮のゼラチン又はその組合せである、請求項１ないし３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項５】
防腐剤がアジ化ナトリウム、９．５−９．９％の２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンを含む防腐剤組成物、２．３％の５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、０．７％の２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、２−３％アルキルカルボキシレート、９３−９５％の修飾グリコールを含む防腐剤組成物、又はその組合せである、請求項１ないし４の何れか一項に記載の組成物。
【請求項６】
界面活性剤が非イオン性界面活性剤であり；場合によって、
界面活性剤がアルキレングリコール又は含酸素アルキレングリコールであり；場合によって、
界面活性剤がポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート、ポリエチレングリコールパラ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）又はポリオキシエチレングリコールドデシルエーテルである、請求項１ないし５の何れか一項に記載の組成物。
【請求項７】
組成物が７から９のｐＨを有し；場合によって
組成物が８から９のｐＨを有する、請求項１ないし６の何れか一項に記載の組成物。
【請求項８】
（ａ）アミノ酸又はアルキル置換アルキルアミン以外の置換アミン、又は（ｂ）アミン及びタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物を欠く組成物中の量子ドット又は量子ドットコンジュゲートの蛍光強度と比較して、蛍光強度が増加された量子ドット又は量子ドットコンジュゲートをさらに含み、場合によって、
（ａ）アミノ酸又はアルキル置換アルキルアミン以外の置換アミン、又は（ｂ）アミン及びタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物を欠く組成物中の量子ドット又は量子ドットコンジュゲートの蛍光強度と比較して、量子ドット又は量子ドットコンジュゲートを組成物と混合した後の蛍光強度が少なくとも５％増加された、請求項１ないし７の何れか一項に記載の組成物。
【請求項９】
０．３２Ｍのホウ酸塩；
１．０５重量％のカゼイン加水分解物；
５０ｍＭのトリエタノールアミン；
０．０８重量％のアジ化ナトリウム；
０．００５重量％のポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート
を含み、８から８．５のｐＨを有する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
標的にハイブリダイズしたプローブ又は組織試料上のタンパク質抗原を検出するための請求項８又は９に記載の組成物の使用であって、前記組成物は量子ドットコンジュゲートを含み、前記量子ドットコンジュゲートは量子ドット抗体コンジュゲートであり、前記量子ドット抗体コンジュゲートはプローブ又はタンパク質抗原と特異的に相互作用することができる、使用。
【請求項１１】
量子ドット又は量子ドットコンジュゲートを安定化する方法であって、
少なくとも一つの量子ドット又は量子ドットコンジュゲートを含む量子ドット溶液を提供すること；及び
希釈された量子ドット溶液を提供するために組成物に量子ドット溶液を希釈すること
を含み、組成物は（ａ）アミノ酸又はアルキル置換アルキルアミン以外の置換アミン、又は（ｂ）アミン及びタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物を含み、少なくとも１つのアミン又はタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物は量子ドット又は量子ドットコンジュゲートの蛍光を安定化及び／又は増加させるのに有効な濃度で存在し；場合によって、組成物に量子ドット溶液を希釈することが、（ａ）アミノ酸又はアルキル置換アルキルアミン以外の置換アミン、又は（ｂ）アミン及びタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物を欠く組成物に量子ドット溶液を希釈することによって形成される希釈された量子ドット溶液の蛍光強度と比較して、希釈された蛍光粒子溶液の蛍光強度を増加させ；場合によって、
量子ドット溶液を組成物に希釈した後の希釈された量子ドット溶液の蛍光強度が、（ａ）アミノ酸又はアルキル置換アルキルアミン以外の置換アミン、又は（ｂ）アミン及びタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物を欠く組成物に量子ドット溶液を希釈することによって形成される希釈された量子ドット溶液の蛍光強度と比較して、少なくとも５％増加する、方法。
【請求項１２】
組成物がホウ酸バッファー、防腐剤及び界面活性剤をさらに含み、７以上のｐＨを有し；場合によって、
組成物が０．０５Ｍから０．５Ｍのホウ酸塩、０．０５重量％から１．１重量％のタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物、５０ｍＭから１００ｍＭのアミン、０．０５重量％から０．２重量％の防腐剤及び０．００５重量％から０．０５重量％の非イオン性界面活性剤を含み；場合によって、
アミンがＮ−エタノール置換アミンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
希釈された量子ドット溶液を４℃で保存することをさらに含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
希釈された量子ドット溶液又は量子ドットコンジュゲート溶液の蛍光強度が、４℃で１ヵ月の保存後、実質的に同じままである；場合によって
希釈された量子ドット溶液又は量子ドットコンジュゲート溶液の蛍光強度が、４℃で３ヵ月の保存後、実質的に同じままである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
量子ドット溶液が少なくとも一つの量子ドットコンジュゲートを含む量子ドットコンジュゲート溶液であり、量子ドットコンジュゲート溶液は希釈された量子ドットコンジュゲート溶液を提供するために０．５ｎＭから１５０ｎＭの濃度に希釈されている、請求項１１ないし１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
量子ドットコンジュゲートが量子ドット−抗体コンジュゲートであり、量子ドットコンジュゲート溶液は、５ｎＭから１００ｎＭの量子ドット−抗体コンジュゲート、０．０５Ｍから０．５Ｍのホウ酸塩、０．０５重量％から１．１重量％のタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物、５０ｍＭから１００ｍＭのＮ−エタノール置換アミン、０．０５重量％から０．１重量％のアジ化ナトリウム及び０．００５重量％から０．０５重量％の非イオン性界面活性剤を含む希釈された量子ドットコンジュゲート溶液まで希釈されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
希釈された量子ドット−抗体コンジュゲート溶液が８から８．５のｐＨを有し、５ｎＭから１００ｎＭの量子ドット−抗体コンジュゲート、０．３２Ｍのホウ酸塩、１．０重量％のカゼイン加水分解物、５０ｍＭのトリエタノールアミン、０．０８重量％のアジ化ナトリウム及び０．００５重量％のポリエチレングリコールソルビタンモノラウレートを含む、請求項１６に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成24年11月14日(2012.11.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
量子ドット又は量子ドットコンジュゲートを安定化させるための組成物であって：
（ａ）アミノ酸とアルキル置換アルキルアミンとを除く置換アミン；又は
（ｂ）アミンと、タンパク質及び／又はタンパク質加水分解物
を含み、
前記組成物はさらに：
（ｃ）ホウ酸バッファー；
（ｄ）防腐剤；及び
（ｅ）界面活性剤
を含み、
前記組成物は７以上のｐＨを有し、
（ａ）アミノ酸とアルキル置換アルキルアミンとを除く置換アミンと（ｂ）アミンと、タンパク質及び／又はタンパク質加水分解物とを欠く組成物中で保存された量子ドット又は量子ドットコンジュゲートの蛍光強度と比較して、前記組成物中で保存された量子ドット又は量子ドットコンジュゲートの蛍光強度が安定化及び／又は増加される、組成物。
【請求項２】
０．０２Ｍから０．５Ｍのホウ酸塩；
０．０５重量％から１．５重量％のタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物；
２５ｍＭから２００ｍＭのアミン；
０．０５重量％から０．２重量％の防腐剤；及び
０．００５重量％から０．０５重量％の界面活性剤
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
アミンが化学式ＲｎＮＨ（３−ｎ）（ここで、ｎ＝１、２又は３であり、それぞれのＲは独立して脂肪族基、ヘテロ脂肪族基、アリール基、ヘテロアリール基、アルキルアリール基又はアリールアルキル基であり、少なくとも１つのＲは置換されている）を有する置換アミンであり；場合によって、
少なくとも１つのＲが一又は複数の−ＯＨ、−ＯＲ１、−ＣＯ２Ｒ１、−ＣＮ基又はその組み合わせで置換されており、Ｒ１は置換又は非置換の脂肪族基又はアリール基であり；場合によって、
アミンがアルカノールアミンを含み；場合によって、
アミンがＮ−エタノール置換アミンを含み；場合によって、
Ｎ−エタノール置換アミンが５０ｍＭから１００ｍＭまでの濃度を有し；場合によって、
アミンがエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、Ｎ−メチルジエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン又はその組み合わせであり；場合によって、
アミンが置換された三級アルキルアミンである、請求項１ないし２の何れか一項に記載の組成物。
【請求項４】
タンパク質及び／又はタンパク質加水分解物が植物性トリプトン、サーモンペプトン、チキンアルブミン加水分解物、カゼイン加水分解物、魚皮のゼラチン又はその組合せである、請求項１ないし３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項５】
防腐剤がアジ化ナトリウム、９．５−９．９％の２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンを含む防腐剤組成物、２．３％の５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、０．７％の２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、２−３％アルキルカルボキシレート、９３−９５％の修飾グリコールを含む防腐剤組成物、又はその組合せである、請求項１ないし４の何れか一項に記載の組成物。
【請求項６】
界面活性剤が非イオン性界面活性剤であり；場合によって、
界面活性剤がアルキレングリコール又は含酸素アルキレングリコールであり；場合によって、
界面活性剤がポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート、ポリエチレングリコールパラ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）又はポリオキシエチレングリコールドデシルエーテルである、請求項１ないし５の何れか一項に記載の組成物。
【請求項７】
組成物が７から９のｐＨを有し；場合によって
組成物が８から９のｐＨを有する、請求項１ないし６の何れか一項に記載の組成物。
【請求項８】
（ａ）アミノ酸とアルキル置換アルキルアミンとを除く置換アミンと（ｂ）アミンと、タンパク質及び／又はタンパク質加水分解物とを欠く組成物中の量子ドット又は量子ドットコンジュゲートの蛍光強度と比較して、蛍光強度が増加された量子ドット又は量子ドットコンジュゲートをさらに含み、場合によって、
（ａ）アミノ酸とアルキル置換アルキルアミンとを除く置換アミンと（ｂ）アミンと、タンパク質及び／又はタンパク質加水分解物とを欠く組成物中の量子ドット又は量子ドットコンジュゲートの蛍光強度と比較して、量子ドット又は量子ドットコンジュゲートを組成物と混合した後の蛍光強度が少なくとも５％増加された、請求項１ないし７の何れか一項に記載の組成物。
【請求項９】
０．３２Ｍのホウ酸塩；
１．０５重量％のカゼイン加水分解物；
５０ｍＭのトリエタノールアミン；
０．０８重量％のアジ化ナトリウム；
０．００５重量％のポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート
を含み、８から８．５のｐＨを有する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
組織試料上の標的核酸配列にハイブリダイズしたハプテン標識プローブ又は組織試料上のタンパク質抗原を検出するための請求項８又は９に記載の組成物の使用であって、前記組成物は量子ドットコンジュゲートを含み、前記量子ドットコンジュゲートは量子ドット抗体コンジュゲートであり、前記量子ドット抗体コンジュゲートはプローブ又はタンパク質抗原と特異的に相互作用することができる、使用。
【請求項１１】
量子ドット又は量子ドットコンジュゲートを安定化する方法であって、
少なくとも一つの量子ドット又は量子ドットコンジュゲートを含む量子ドット溶液を提供すること；及び
希釈された量子ドット溶液を提供するために組成物に量子ドット溶液を希釈すること
を含み、（ａ）アミノ酸とアルキル置換アルキルアミンとを除く置換アミンと（ｂ）アミンと、タンパク質及び／又はタンパク質加水分解物とを欠く組成物中で保存された量子ドット又は量子ドットコンジュゲートの蛍光強度と比較して、前記組成物中で保存された量子ドット又は量子ドットコンジュゲートの蛍光強度が安定化及び／又は増加されており、；場合によって、組成物に量子ドット溶液を希釈することが、（ａ）アミノ酸とアルキル置換アルキルアミンとを除く置換アミンと（ｂ）アミンと、タンパク質及び／又はタンパク質加水分解物とを欠く組成物に量子ドット溶液を希釈することによって形成される希釈された量子ドット溶液の蛍光強度と比較して、希釈された量子ドット溶液の蛍光強度を増加させ；場合によって、
量子ドット溶液を組成物に希釈した後の希釈された量子ドット溶液の蛍光強度が、（ａ）アミノ酸とアルキル置換アルキルアミンとを除く置換アミンと（ｂ）アミンと、タンパク質及び／又はタンパク質加水分解物とを欠く組成物に量子ドット溶液を希釈することによって形成される希釈された量子ドット溶液の蛍光強度と比較して、少なくとも５％増加する、方法。
【請求項１２】
組成物がホウ酸バッファー、防腐剤及び界面活性剤をさらに含み、７以上のｐＨを有し；場合によって、
組成物が０．０５Ｍから０．５Ｍのホウ酸塩、０．０５重量％から１．１重量％のタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物、５０ｍＭから１００ｍＭのアミン、０．０５重量％から０．２重量％の防腐剤及び０．００５重量％から０．０５重量％の非イオン性界面活性剤を含み；場合によって、
アミンがＮ−エタノール置換アミンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
希釈された量子ドット溶液を４℃で保存することをさらに含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
希釈された量子ドット溶液又は量子ドットコンジュゲート溶液の蛍光強度が、４℃で１ヵ月の保存後、実質的に同じままである；場合によって
希釈された量子ドット溶液又は量子ドットコンジュゲート溶液の蛍光強度が、４℃で３ヵ月の保存後、実質的に同じままである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
量子ドット溶液が少なくとも一つの量子ドットコンジュゲートを含む量子ドットコンジュゲート溶液であり、量子ドットコンジュゲート溶液は希釈された量子ドットコンジュゲート溶液を提供するために０．５ｎＭから１５０ｎＭの濃度に希釈されている、請求項１１ないし１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
量子ドットコンジュゲートが量子ドット−抗体コンジュゲートであり、量子ドットコンジュゲート溶液は、５ｎＭから１００ｎＭの量子ドット−抗体コンジュゲート、０．０５Ｍから０．５Ｍのホウ酸塩、０．０５重量％から１．１重量％のタンパク質及び／又はタンパク質加水分解物、５０ｍＭから１００ｍＭのＮ−エタノール置換アミン、０．０５重量％から０．１重量％のアジ化ナトリウム及び０．００５重量％から０．０５重量％の非イオン性界面活性剤を含み、ｐＨ８から９を有する希釈された量子ドットコンジュゲート溶液まで希釈されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
希釈された量子ドット−コンジュゲート溶液が８から８．５のｐＨを有し、５ｎＭから１００ｎＭの量子ドット−抗体コンジュゲート、０．３２Ｍのホウ酸塩、１．０重量％のカゼイン加水分解物、５０ｍＭのトリエタノールアミン、０．０８重量％のアジ化ナトリウム及び０．００５重量％のポリエチレングリコールソルビタンモノラウレートを含む、請求項１６に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
Ｉ．用語及び定義
特に明記しない限り、技術用語は、従前の使用法に従って用いられる。分子生物学の共通の用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes VII, published by Oxford University Press, 2000 (ISBN 019879276X)；Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Publishers, 1994 (ISBN 0632021829)；及びRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by Wiley, John & Sons, Inc., 1995 (ISBN 0471186341）；及び他の類似の文献中に見られる。
本願明細書で用いられるように、単数用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に示さない限り、複数の指示対象物を含む。また、本願明細書で用いられるように、用語「含む」は「包含する」を意味する。
説明されない限り、本願明細書において用いられる全ての技術的及び科学的な用語は、この開示が属する当業者に通常理解されるのと同じ意味を有する。本願明細書に記載のものに類似又は均等な方法及び材料は、本開示の実施又は試験に用いられ得るにもかかわらず、適切な方法及び材料は以下に記載される。材料、方法及び実施例は、一例にすぎず、限定することを意図していない。開示における他の特徴は、以下の詳細な説明及び請求項から明白である。
特に明記しない限り、成分、分子量、割合、温度、時間等の量を表す数は、明細書又は請求項で用いられるように、用語「約」によって修飾されているかのように理解される。
したがって、黙示的又は明確に示されない限り、記載されるパラメーターは、所望の性質及び／又は標準試験条件／方法下の検出限界に依存した近似値である。検討された先行技術の実施態様を直接及び明確に区別する場合、実施態様の数値は、単語「約」が記載されていない限り、近似されていない。核酸又はポリペプチド又は他の化合物に与えられた、全てのヌクレオチドの大きさ又はアミノ酸の大きさ及び全ての分子量又は分子質量値は近似値であり、記載のために提供されたものであることはよく理解されるところである。    本願明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許及び他の文献は、その全てが出典明示により援用される。矛盾する場合には、用語の説明を含み、本願明細書が統制する。さらに、材料、方法及び実施例は、単に例示であり、限定する意図はない。
【国際調査報告】
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