(57)【要約】【解決手段】本発明は、抗体または抗原の存在または非存在を検出するべくその他の成分とともに用いることができるより高密度に官能化された指標細胞を、指標細胞をＩｇＧで標識するべく従来用いられてきたＤ抗原よりも発現度が高いＡ、Ｂ、ＡＢ、およびＭＮＳ抗原を用いることにより産生することに関する。この抗原系は、細胞１個当たり抗原１００万個に近い発現レベルを有しており、従来のＤ抗原部位が細胞１個当たり抗原１万から３万個であることと大きく対照的である。抗原系の発現レベルにおけるこの顕著な増加により、指標細胞が固相に結合する運動性および強度が引き上げられ得、検定の性能が向上する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相抗体スクリーニング検定で抗体を精製して、抗体または抗原の存在または非存在を示すための検定の成分として使用可能な高密度に官能化された指標細胞を産生する方法であって、
Ａ、Ｂ、ＡＢ、およびＭＮＳ抗原のうちの１つである所定の抗原で親和性カラムを被覆する段階と、
ヒト血漿を前記親和性カラムに導入して、前記ヒト血漿に分散された抗体を前記所定の抗原に付着させる段階と、
免疫親和性クロマトグラフィを用いて前記抗体を精製し、精製された前記抗体を残留させ、その他の非所望の抗体を除去する精製段階と、
精製された前記抗体を赤血球に暴露して、精製された前記抗体を前記赤血球に結合させ、前記赤血球を被覆する段階と、
被覆された前記赤血球を、精製された前記抗体に特異性を有する追加的な抗体に暴露して、前記追加的な抗体を精製された前記抗体に付着させ、前記赤血球を被覆することにより、指標細胞を形成する段階と
を備える方法。
【請求項２】
前記所定の抗原はＡ抗原であり、前記抗体は抗Ａ抗体である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
免疫親和性クロマトグラフィ精製を用いて、前記抗Ａ抗体をＩｇＧ抗体またはＩｇＭ抗体に分離する段階をさらに備える請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記精製の産物はＩｇＧ抗体であり、前記追加的な抗体は抗ＩｇＧ抗体である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
被覆された前記赤血球を、前記追加的な抗体に暴露する前に、洗浄する段階をさらに供える請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記精製段階は、
前記ヒト血漿を洗浄する段階と、
緩衝液を用いて前記所定の抗体を溶出する段階と
を有する請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記親和性カラムにおいて２つ以上の抗原を用いて、前記赤血球上の前記抗体の被覆密度を高める請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記２つ以上の抗原は、Ｒｈ、Ｋｅｌｌ、Ｋｉｄｄ、およびＤｕｆｆｙ抗原を含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記洗浄する段階は、所定の遊離抗体を含まない溶液を用いる請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
所定の抗原プロファイルを持つ赤血球で被覆された基質を有する固相システムに、少なくとも血漿およびタンパク質を導入して、前記所定の抗体を前記基質上の前記赤血球に結合させる段階と、
前記システムを緩衝溶液で洗浄して、非結合のタンパク質および残留する所定の抗体を除去する段階と、
前記追加的な抗体で被覆された前記指標細胞を導入して、前記基質上の前記赤血球上に結合した前記所定の抗体に、前記追加的な抗体を結合させる段階と
をさらに備える請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記固相システムに導入された前記少なくとも血漿およびタンパク質を３７℃で定温放置する段階をさらに備える請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記指標細胞を被覆する前記追加的な抗体は抗ＩｇＧ抗体であり、前記所定の抗体はＩｇＧ抗体であり、前記抗ＩｇＧ抗体は前記ＩｇＧ抗体に結合する請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
凝集反応が期待される結合が存在する場合を判定する請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記所定の抗原の発現レベルは、赤血球１個当たり、抗原１万から３万個である請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、抗体でヒト赤血球（ＲＢＣ）を官能化する方法および装置に関し、固相抗体スクリーニング検定に関する。本発明は、抗体または抗原の存在／非存在を検出するべくその他の成分とともに用いることができるより高密度に官能化された指標細胞を、従来用いられてきたＤ抗原よりも発現度が高いＡ、Ｂ、ＡＢ、およびＭＮＳ抗原を標的とすることにより、生成する。さらに、本発明は、特異結合した免疫グロブリンの検出が望まれる任意の免疫学的検定にも拡張してよい。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本発明は、２０１０年５月５日出願の米国仮出願第６１／２８２，９９７号の優先権を主張し、その全体を本明細書に参照として組み込む。
【背景技術】
【０００３】
従来の固相抗体スクリーニング検定では、たとえば固相に特異結合した免疫グロブリンに付着もしくは凝集した、抗ＩｇＧを塗布した赤血球によって、ＩｇＧ抗体を検出する。Ｓｉｎｏｒらに発行された米国特許第４，８１６，４１３号を参照のこと。
【０００４】
従来の固相抗体スクリーニング検定では、通常、ヒト赤血球１０（血液型Ｏ＋）を単クローン性もしくは多クローン性の抗Ｄ抗体１１で最初に感作することにより産生される指標を用いる。Ｄ抗原１２が赤血球１０上に存在する場合は、赤血球１０の感作が生じているとき、Ｄ抗原１２が用いられる。次に、ＩｇＧで感作された細胞を抗ＩｇＧに暴露して、細胞１０に抗ＩｇＧを塗布する。
【０００５】
典型的にＤ抗原１２が使用されるのは、高親和性の抗Ｄ抗体１１が利用可能となるからである。しかし、Ｄ抗原１２の発現度は高くない（細胞１０の１個当たり、抗原１２が１万から３万個）。固相構成では、細胞１０と平面とが相互作用する面積によって相互作用領域が制限され、基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）と相互作用するのは、抗ＩｇＧ分子１０から１００個だけということになりかねない。この制限は、これら指標細胞の運動性（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）およびこれらの指標細胞が固相に結合する強度に大きく影響しうる。
【０００６】
したがって、抗体または抗原の存在または非存在を検出するために使用することができるより高密度に官能化された指標細胞を産生できる方法および装置が必要である。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、抗体または抗原の存在または非存在を検出するべく用いることができるより高密度に官能化された指標細胞を、Ｄ抗原よりも発現度が高いＡ、Ｂ、ＡＢ、およびＭＮＳ抗原を用いることにより産生することに関する。これらの抗原系は、細胞１個当たり抗原１００万個に近い発現レベルを有しており、従来のＤ抗原部位が細胞１個当たり抗原１万から３万個であることと大きく対照的である。抗原系の発現レベルにおけるこの顕著な増加は、予期されぬことであり、指標細胞が固相に結合する運動性および強度を高める可能性があり、検定性能（たとえば、感度、試験時間等）が達成される。
【０００８】
本発明の一典型的実施形態では、カラム親和性精製（つまり、免疫親和性クロマトグラフィ）を用いて（高親和性および高濃度の）抗Ａ抗体を精製することができる。この実施形態では、アミンハンドル（ａｍｉｎｅ  ｈａｎｄｌｅ）を有する合成Ａ抗原を市販の親和性カラムに塗布する。次に、血液型がＢ型のヒト供血者からのソース血漿をカラムに暴露し、抗Ａ抗体を固体担体上のＡ抗原に付着させる。次に、抗Ａ抗体を、親和性カラムから溶出させ、周知の沈殿技術もしくは親和性技術でさらに精製することができる。次に、血液型がＡ型の赤血球（Ａ抗原を有する）をこの精製産物（つまり、ＩｇＧ）に暴露すると、精製された抗Ａ  ＩｇＧ抗体は赤血球に結合し、赤血球は被覆される。抗ＩｇＧ抗体はＩｇＧ抗体に特異性を有するのでＩｇＧ抗体に付着し、ＩｇＧ抗体は部分的または全体的に被覆される。したがって、Ａ、Ｂ、ＡＢ、およびＭＮＳ抗原を用いることにより、抗体または抗原の存在または非存在を検出するべくその他の成分とともに用いることができるより高密度に官能化された指標細胞が産生される。
【０００９】
本発明に係る別の典型的実施形態では、ヒト赤血球は多数の抗原系を有するので、ＩｇＧ被覆の密度を高めるべく同時に複数の抗原系を標的としてよい。
【００１０】
別の典型的実施形態では、本発明は洗浄サイクルの制約を減少させる。抗ＩｇＧ抗体が残留ＩｇＧ抗体によって飽和しないようにするべく、発現度が高い抗原系を選択して、抗ＩｇＧのいくつかが飽和しても（したがって、非活性となっても）、特異結合が検出されるように十分な数の抗ＩｇＧが残るようにする。
【００１１】
別の典型的実施形態では、血漿、タンパク質等を固相システムに導入し、３７℃で定温放置する。固相基質は、既知の抗原プロファイルを持つヒト赤血球で被覆されている。固相上に存在する抗原のうちの１つ（たとえば、Ｋｅｌｌ血液型のＫ抗原）に対して特異性を有する、試験血漿中に存在する抗体（この場合、ＩｇＧクラス）が、基質上の赤血球に特異結合する。次に、システムを溶液で洗浄して、非結合のタンパク質を除去する。多数の結合部位を有する指標赤血球（抗ＩｇＧ抗体で被覆されたプローブ赤血球）を導入し、抗ＩｇＧ抗体（指標に予め塗布されている、またはＩｇＧで被覆された指標に単に付加されている）を、基質上の赤血球上のＩｇＧに結合させる。
【００１２】
凝集反応が予想される溶液内でも、結合が存在するかを判定するべく、本発明を用いてよい。
【００１３】
したがって、以下の本発明の詳細な記載がより良く理解され、当技術分野への本発明の貢献がより良く認識されるように、本発明に係るいくつかの特徴を概観した。もちろん、本発明に係る更なる特徴も存在し、以下に記載され、添付の特許請求の範囲の主題を構成する。
【００１４】
この点において、本発明に係る少なくとも１つの実施形態を説明する前に、以下に記載され図示される構成の詳細および構成要素の配列に、本発明はその用途を限定されないことが理解されるべきである。本発明に係る方法および装置は、その他の実施形態が可能であり、多様な態様で実施可能である。また、本明細書および以下に含められる要約において用いられる言い回しおよび用語は、記載を目的としたものであり、限定を意図したものと見なされるべきではない。
【００１５】
したがって、本開示の基礎となる概念は、本発明のいくつかの目的を実施するためのその他の構造、方法、およびシステムを設計するための基礎として十分に用いられうることが当業者には理解されよう。したがって、このような均等の構成は、本発明に係る方法および装置の趣旨および範囲から逸脱しない限り、特許請求の範囲に含まれると見なすことが重要である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】抗原系がＤ抗原を用いる従来の処理を示す。
【図１Ｂ】抗原系がＡ、Ｂ、ＡＢ、およびＭＮＳ抗原を用いる、本発明に係る一実施形態を示す。
【図２】血漿からの抗体の精製に免疫親和性クロマトグラフィを用いる、本発明に係る一実施形態を示す。本方法では、Ａ、Ｂ、ＡＢ、およびＭＮＳ抗原を用いる。
【図３】血漿、タンパク質等が固相システムに導入され、基質が既知の抗原プロファイルを持つヒト赤血球で被覆される、本発明に係る別の実施形態を示す。抗ＩｇＧ抗体を持つ指標赤血球は、基質上の赤血球のＩｇＧに結合する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
従来用いられてきたＤ抗原よりも、Ａ、Ｂ、ＡＢ、およびＭＮＳ抗原のほうが発現度が顕著に高いので、本発明では、特定の抗体または抗原の存在または非存在を示すべく用いることができるより高密度に官能化された指標細胞を産生するべく、本願発明者らは、より発現度が高い抗原系を標的とした。本発明のこれらの抗原系は、Ａ、Ｂ、もしくはＡＢ抗原、またはＭＮＳ抗原を含んでよい。当業者には周知であるように、ＡＢＯ血液型系はヒトについての最重要の血液型系であり、Ａ型、Ｂ型、ＡＢ型、およびＯ型を含む。ＡＢＯ抗原は、赤血球（ＲＢＣ）膜の陰イオン交換体であるバンド３タンパク質に主に付着する長いポリラクトサミン鎖の末端に発現し、少数の抗原決定基は、中性スフィンゴ糖脂質に発現する。
【００１８】
ＭＮＳ抗原系は、第四染色体上のグリコフォリンＡ遺伝子およびグリコフォリンＢ遺伝子に基づいたヒト血液型系である。４６個の抗原のうち最重要のものは、Ｍ、Ｎ、Ｓ、ｓ、およびＵ抗原である。
【００１９】
たとえば、抗Ａ抗体１３等の抗体（図１Ｂ参照）に高い親和性がある本発明のこれらの抗原系は、発現度が顕著であり、１個の赤血球１０当たり１００万個の抗原という発現度に近い（ＩｇＧ部位の数が１００倍に増える可能性がある）。したがって、Ａ抗原部位として１個の赤血球１０当たり約１００万個の抗原１４があることは、従来、Ｄ抗原部位として、１個の細胞１０当たり約１万個から３万個の抗原１２があること（図１Ａ参照）とは、大いに対照的である。
【００２０】
抗原系の発現度におけるこの顕著な増加によって、指標細胞が固相に結合する運動性および強度が引き上げられ、これにより検定性能が向上しうる。
【００２１】
本発明の一典型的実施形態では、図２に示すように、カラム親和性精製（たとえば、免疫親和性クロマトグラフィ）を用いて、（親和性および濃度が高い）抗Ａ抗体を精製することができる。
【００２２】
免疫親和性クロマトグラフィでは、固形培地をカラム１５に詰め、初期混合物１６をカラム１５に流して凝固（ｓｅｔｔｉｎｇ）させ（図２（ａ））、洗浄緩衝液１７をカラム１５に流し（図２（ｂ））、その後に溶出緩衝液１８をカラム１５に適用して（図２（ｃ））回収するカラムクロマトグラフィにより、固相への結合を実現してよい。これらの段階は、通常、周囲圧力下で実行される。
【００２３】
この手順において、ヒト血液１６からの抗体１９の親和性精製は、たとえば、血液型がＢ型の供血者から得られるヒト血漿１６（つまり、天然の抗体）を用いて行われる（図２（ａ）参照）。したがって、ヒト血漿１６が特定の抗原２０に対する抗体１９を含有していることが分かっている場合、それを親和性精製を用いて精製することができる。次に、関心対象１９の特異性に対応する抗原を、アガロース等の固体担体に共有結合させて、ヒト血漿１６から抗体１９を精製するときに、親和性リガンドとして用いることができる。カラムへの炭水化物（つまり、Ａ抗原）の親和性分離／結合は、たとえば、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓによる『タンパク質精製』第３版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，ＮＹ，ＮＹ、１９９３、およびＧｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎによる『生物学的結合（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）技術』第２版、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮＹ，ＮＹ  ２０００８に開示されており、これらを参照として本明細書に組み込む。
【００２４】
本発明のこの典型的実施例では、段階１００で、アミンハンドル（ａｍｉｎｅ  ｈａｎｄｌｅ）を有する合成Ａ抗原２０を市販の親和性カラム１５に結合させる。カラム１５は、当該Ａ抗原２０で被覆される。
【００２５】
次に、段階１０１（図２（ａ）参照）で、血液型がＢ型のヒト供血者からのソース血漿１６の粗生成物をカラム１５に暴露すると、抗Ａ抗体１９が固体担体上のＡ抗原２０に付着する。
【００２６】
次に、段階１０２で、抗Ａ抗体１９を、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓによる『タンパク質精製』（上記）に開示されるように、周知の沈殿技術もしくは親和性技術により精製して、関心対象の抗体１９を取り出す。これらの技術には、洗浄１７（図２（ｂ）参照）と、ｐＨが２．８のグリシン等の低ｐＨ緩衝液１８を用いた関心対象の抗体１９の溶出（図２（ｃ）参照）とが含まれる。溶出液を中性のトリス緩衝液もしくはリン酸緩衝液に回収して、低ｐＨ溶出緩衝液を中和し、抗体１９の活動の低下を阻止する。この手順により、ヒト血漿１６から非所望の抗体１９が除去され、標的の抗体１９が精製される。
【００２７】
抗Ａ抗体１９は、上記の同じ技術を用いて、さらに、ＩｇＧまたはＩｇＭ抗体２１に分離することができる（たとえば、タンパク質Ｇカラムは、ＩｇＭでなくＩｇＧに選択的に結合する）。
【００２８】
したがって、次に、段階１０３で、血液型がＡ型の赤血球１０（Ａ抗原２０を有する）を、この精製産物（つまり、ＩｇＧ抗体２１）に暴露する（図２（ｄ）参照）と、ＩｇＧ抗体２１の精製産物は、赤血球１０に結合して被覆する。
【００２９】
次に、段階１０４で、被覆された細胞１０を、Ｓｉｎｏｒらに記載されるように、周知の方法にしたがって洗浄する。
【００３０】
次に、段階１０５で、細胞１０を抗ＩｇＧ抗体２２に暴露する。抗ＩｇＧ抗体２２は、ＩｇＧ抗体２１に特異性を有するので、ＩｇＧ抗体２１に付着し、指標細胞２３を被覆する（図２（ｅ）参照）。この段階は、使用前に実行してよく（つまり、ＩｇＧで被覆された赤血球を抗ＩｇＧで予め感作する）、または使用中に実行してよい（単に、ＩｇＧで被覆された指標を抗ＩｇＧと混合する）。
【００３１】
したがって、本発明は、Ｄ抗原よりも発現度が高いＡ、Ｂ、ＡＢ、およびＭＮＳ抗原を用いることにより、抗体または抗原の存在または非存在を示すべく、その他の成分とともに用いることができる、より高密度に官能化された指標細胞２３が産生されるべき新規かつ予期されない手順を開示するものである。
【００３２】
本発明に係る別の実施形態では、ヒト赤血球は多数の抗原系を有しているので、たとえば、ＩｇＧ抗体被覆の密度を高めるべく、同時に複数の抗原系を標的としてよい。
【００３３】
たとえば、Ｒｈ抗原、Ｋｅｌｌ抗原、およびＤｕｆｆｙ抗原を発現する赤血球を選択してこの赤血球を、これらの群（ｇｒｏｕｐｓ）に特異性を有する抗体の混合物に暴露してよい。したがって、同時に複数の群を標的とすることにより、被覆密度をより高くすることができる。
【００３４】
本発明の技術によって、洗浄サイクルに対する制約も減少しうる。クラス特異的（ｃｌａｓｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）な免疫グロブリン（つまり、抗ＩｇＧ抗体）に頼る従来の多くの検定では、非結合の抗体１９をシステムから除去することが必要である（たとえば、図２（ｂ）参照）。これをしない場合は、抗ＩｇＧ抗体２２（図２（ｅ）参照）が、「非特異的（ｇｅｎｅｒｉｃ）」なＩｇＧ抗体２１で飽和し、特異結合が検出されない。これは、遊離ＩｇＧ抗体２１を含まない溶液でシステムを洗浄することにより防止される。
【００３５】
しかし、残留ＩｇＧ抗体２１が超低レベルとなることが求められる場合は、この洗浄プロセスでは不十分となり得るので、抗ＩｇＧ抗体２２が残留ＩｇＧ抗体２１で飽和しないことを確実にすることが重要である。これは、発現度が高い抗原系を選択し、抗ＩｇＧ抗体２２のいくつかが飽和しても（したがって、非活性となっても）、特異結合が検出されるように十分な数の抗ＩｇＧ抗体２２が残るようにすることで、達成できる。
【００３６】
本発明に係る一典型的実施形態において、図３（ａ）は、段階２００で、血漿、タンパク質等２４が固相システムに導入され、３７℃で定温放置される様子を示す。基質２５は、既知の抗原プロファイルを持つヒト赤血球１０で被覆されている。
【００３７】
段階２０１で、所望の特異抗体２１（この場合は、ＩｇＧ抗体２１）が、基質２５上で赤血球１０（つまり、Ｋｅｌｌ系のＫ抗原）に特異結合する。
【００３８】
段階２０２（図３（ｂ）参照）で、システムを溶液２６（つまり、生理食塩水）で洗浄し、非結合のタンパク質を除去する。血漿２４は、複数種類の抗体を多数含んでいるので、洗浄工程を良好に実行して、システムに残存遊離する残留ＩｇＧ抗体２１を除去することが重要である。
【００３９】
段階２０３（図３（ｃ）参照）で、多数の結合部位を有する指標赤血球２３（上記の方法で産生された、抗ＩｇＧ抗体２２で被覆されたプローブ赤血球１０）をシステムに導入し、抗ＩｇＧ抗体２２を基質２５上の赤血球１０の上のＩｇＧ抗体２１に結合させる。上記したように、システムに血漿２４からのＩｇＧ抗体２１が過剰に存在すると、プローブ赤血球２３が被覆され、基質２５での結合が阻止されるので、多数の結合部位を有するプローブ指標細胞２３を用いることと同様、システムを念入りに洗浄することが重要である。
【００４０】
固相上での凝集反応が予想される溶液内でも、結合が存在するかを判定するべく、本発明を用いてよい。
【００４１】
本発明の上記の実施形態は、本発明の原理が明瞭に理解されるように記載された可能な実施例にすぎないということを強調する。本発明の趣旨および原理から逸脱することなく、本発明の上記の実施形態に変更および改変を行ってよい。このような変更および改変の全てが、本明細書において本発明の範囲に含まれ、以下の特許請求の範囲により保護されることが意図されている。
【図１Ａ】
2013524847.tif 000003
【図１Ｂ】
2013524847.tif 000004
【図２】
2013524847.tif 000005
【図３】
2013524847.tif 000006
【国際調査報告】
2013524847.tif 000007