(57)【要約】  本発明は、本明細書中でＤＩＧ−１０９およびＤＩＧ−１５２と呼ばれるタンパク質ならびにＤＩＧ１０９およびＤＩＧ−１５２の変異体を含む改変された殺虫性Ｂ．ｔ．Ｃｒｙ１Ｃａタンパク質；これらのタンパク質をコードする核酸；該タンパク質を使用して有害生物を防除する方法；遺伝子導入宿主細胞中で該タンパク質を産生させる方法；ならびに該タンパク質を産生する遺伝子導入植物を包含する。ＤＩＧ−１０９およびＤＩＧ−１５２タンパク質は、Ｂ．ｔ．Ｃｒｙ１Ｃａのコア毒素セグメントおよびＣｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントから構成されるキメラペプチドを含む。ＤＩＧ−１０９およびＤＩＧ−１５２タンパク質の殺虫活性のある変異体についても記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
殺虫活性を有するＣｒｙ１Ｃａ変異体タンパク質であって、対応する野生型Ｃｒｙ１ＣａのＮ末端αヘリックス１、２Ａ、および／または２Ｂの全部または一部が欠失している、変異体タンパク質。
【請求項２】
欠失により、ドメインＩ中のα−ヘリックス１の全部、およびα−ヘリックス２の全部または一部を除去される、前記タンパク質がα−ヘリックス３〜７を含む、請求項１に記載の変異体タンパク質。
【請求項３】
前記欠失により殺虫性タンパク質ＤＩＧ−１０９の殺虫活性が改善され、前記欠失が、α−ヘリックス２Ａの開始点の前で始まり、α−ヘリックス２Ｂの終端の後で終結し、α−ヘリックス３中に拡がっていない、請求項１に記載の変異体タンパク質。
【請求項４】
前記欠失により殺虫性タンパク質ＤＩＧ−１５２の殺虫活性を改善され、前記欠失が、α−ヘリックス２Ａの開始点の前で始まり、α−ヘリックス２Ｂの終端の後で終結し、α−ヘリックス３中に拡がっていない、請求項１に記載の変異体タンパク質。
【請求項５】
Ｎ末端欠失が少なくとも１つの不安定化アミノ酸で始まり、前記タンパク質が、翻訳開始メチオニンと不安定化アミノ酸との間のグリシンアミノ酸を指定する付加コドンを含む、請求項１に記載の変異体タンパク質。
【請求項６】
Ｃ末端プロトキシン配列を欠く、請求項１に記載の変異体タンパク質。
【請求項７】
α−ヘリックス２Ｂとα−ヘリックス３との間のスペーサー領域内に導入されたプロテアーゼ開裂部位を含む、改変されたＣｒｙ１Ｃａタンパク質。
【請求項８】
前記プロテアーゼ開裂部位が、配列番号１のＣｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質のアミノ酸８５〜９０の範囲内に導入されている、請求項７に記載の改変されたタンパク質。
【請求項９】
昆虫に対して改善された活性を有する、請求項１または７に記載のタンパク質。
【請求項１０】
前記昆虫が、フォールアーミーワームおよびシュガーケーンボーラーからなる群から選択される、請求項９に記載のタンパク質。
【請求項１１】
ドメインＩＩおよびドメインＩＩＩからなる群から選択される交換されたまたは組み換えられたドメインを含む、改変されたＣｒｙ１Ｃａタンパク質。
【請求項１２】
配列番号１のアミノ酸１〜６１９を含むコア毒素セグメントを含み、１０まで、１５までまたは２０個までのアミノ酸の付加、欠失、または置換がなされている、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１３】
コア毒素セグメントを越えた箇所で異種のδエンドトキシンプロトキシンセグメントに融合されたＣｒｙ１Ｃａ殺虫性タンパク質に由来するＮ末端コア毒素セグメントを含む、融合された殺虫性タンパク質。
【請求項１４】
２０個までのアミノ酸の置換、欠失、または修飾を伴う、配列番号１の残基２８〜６１９のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のタンパク質。
【請求項１５】
２０個までのアミノ酸の置換、欠失、または修飾を伴う、配列番号１の残基１〜６１９を含む、請求項１２に記載のタンパク質。
【請求項１６】
配列番号３、配列番号５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、および配列番号１からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一である、単離されたタンパク質。
【請求項１７】
配列番号３、配列番号５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、および配列番号１からなる群から選択される配列を含む、請求項１６に記載のタンパク質。
【請求項１８】
請求項１６に記載のタンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１９】
配列番号４、配列番号８、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、および配列番号２からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一である、請求項１８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
鱗翅目昆虫を防除する方法であって、前記昆虫を請求項１６に記載のタンパク質と接触させることを含む方法。
【請求項２１】
請求項１６に記載のタンパク質を産生する植物細胞。
【請求項２２】
請求項１８に記載のポリヌクレオチドを含む微生物細胞。
【請求項２３】
請求項２１に記載の複数の細胞を含む植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な殺虫性Ｃｒｙタンパク質、および昆虫を防除するためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
フォールアーミーワーム（ＦＡＷ；スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda））は、トウモロコシ、ならびにダイズおよびワタなどのその他の農作物に重大な損傷を引き起こす。
【０００３】
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）（Ｂ．ｔ．）は、δ−エンドトキシンまたはＣｒｙタンパク質として知られる殺有害生物性結晶タンパク質を産生する土壌伝播性細菌である。Ｃｒｙタンパク質は、感受性のある昆虫の中腸細胞に作用することによって機能する経口中毒性物質である。δ−エンドトキシンの広範なリストが、ウェブサイト、http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/intro.htmlに維持され、定期的に更新されている。
【０００４】
Ｃｒｙタンパク質、最も顕著にはＣｒｙ１Ｆをコードする遺伝子を発現する遺伝子導入トウモロコシは、ＦＡＷに対して商業的レベルの効力を提供する。
【０００５】
ＦＡＷ抵抗性遺伝子導入トウモロコシが成功したにもかかわらず、抵抗性昆虫集団の発生の可能性により、ＦＡＷ防除におけるＣｒｙタンパク質の長期耐用性がおびやかされ、ＦＡＷおよびその他の有害生物を防除するための新規なＣｒｙタンパク質を発見および開発する必要性が生じる。Ｂ．ｔ．Ｃｒｙタンパク質に対する昆虫の抵抗性は、いくつかの機構を介して発生する可能性がある（Ｈｅｃｋｅｌら、２００７年；ＰｉｇｏｔｔおよびＥｌｌａｒ、２００７年）。Ｃｒｙタンパク質に対する多数のクラスの受容体タンパク質が、昆虫内で確認され、多数の例が各受容体クラス内に存在する。特定のＣｒｙタンパク質に対する抵抗性は、例えば、受容体タンパク質のカドヘリン領域の毒素結合部分内での突然変異によって発生する可能性がある。抵抗性のさらなる手段は、プロトキシンを処理するプロテアーゼによって介在される可能性がある。したがって、鱗翅目（Lepidoptera）の種におけるＣｒｙ毒素に対する抵抗性は、少なくとも４つの独特で重要な抵抗性遺伝子を伴う複雑な遺伝子的根拠を有する。Ｃｒｙタンパク質に対して抵抗性である鱗翅目昆虫は、コナガ（Plutella xylostella）（Ｔａｂａｓｈｎｉｋら、１９９４年）、キンウワバ（Trichoplusia ni）（ＪａｎｍａａｔおよびＭｙｅｒｓ、２００３、２００５年）、およびオオタバコガ（Helicoverpa zeae）（Ｔａｂａｓｈｎｉｋら、２００８年）の分野で発生した。新規で効力の高いＣｒｙタンパク質の開発は、ＦＡＷおよびその他の害虫を管理するためのさらなるツールを提供するであろう。遺伝子導入トウモロコシ中で組み合わせて作られる異なる作用機序を有するＣｒｙタンパク質は、ＦＡＷ昆虫の抵抗性の発生を防ぎ、害虫防除のためのＢ．ｔ．技術の長期有用性を保護するであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、本明細書中でＤＩＧ−１０９およびＤＩＧ−１５２と呼ばれるタンパク質ならびにＤＩＧ−１０９およびＤＩＧ−１５２の変異体を含む殺虫性Ｂ．ｔ．Ｃｒｙタンパク質、これらのタンパク質をコードする核酸、該タンパク質を使用して有害生物を防除する方法、遺伝子導入宿主細胞中でタンパク質を産生させる方法、および該タンパク質を産生する遺伝子導入植物を提供する。
【０００７】
実施例１に記載のように、ＤＩＧ−１０９およびＤＩＧ−１５２タンパク質は、Ｂ．ｔ．Ｃｒｙ１Ｃａのコア毒素セグメントおよびＣｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントから構成されるキメラペプチドを含む。ＤＩＧ−１０９およびＤＩＧ−１５２タンパク質の殺虫活性のある変異体についても説明する。
【０００８】
本明細書中で報告する驚くべき発見は、ＤＩＧ−１０９およびＤＩＧ−１５２タンパク質が、Ｃｒｙ１Ｆに対して抵抗性であるフォールアーミーワームの幼虫およびシュガーケーンボーラーの幼虫の集団に対して活性であることである。したがって、ＤＩＧ−１０９およびＤＩＧ−１５２タンパク質は、鱗翅目の有害生物を防除するのに使用するための理想的な候補である。該タンパク質は、抵抗性昆虫集団の発生を抑制するために、単独で、またはＣｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ１Ａｃなどのその他のＣｒｙタンパク質と組み合わせて使用することができる。このような有害生物の考察については、たとえば、Tabashnik、PNAS (2008)、vol. 105、no. 49、19029〜19030を参照されたい。
【０００９】
ＤＩＧ−１０９およびＤＩＧ−１５２の殺虫活性のあるフラグメント、およびこのようなフラグメントをコードするヌクレオチドは、本発明の別の態様である。
【００１０】
一実施形態において、本発明は、
（ａ）配列番号１の残基２８〜６１９のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号１の残基２８〜６１９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）配列番号１によってコードされるタンパク質の発現または活性に不都合な影響を及ぼさない２０個までのアミノ酸の置換、欠失または修飾を伴う、配列番号１の残基２８〜６１９のアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択されるコア毒素セグメントを含む、単離されたＤＩＧ−１０９タンパク質ポリペプチドを提供する。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、
（ａ）配列番号１の残基１〜６１９のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号１の残基１〜６１９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）配列番号１によってコードされるタンパク質の発現または活性に不都合な影響を及ぼさない２０個までのアミノ酸の置換、欠失または修飾を伴う、配列番号１の残基１〜６１９のアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択されるＤＩＧ−１０９コア毒素セグメントを含む、単離されたＤＩＧ−１０９毒素ポリペプチドを提供する。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、ＤＩＧ−１０９タンパク質を含む植物を提供する。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、有害生物集団を防除する方法であって、前記集団を殺有害生物上有効な量のＤＩＧ−１０９タンパク質と接触させることを含む方法を提供する。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は、ＤＩＧ−１０９タンパク質をコードする単離された核酸を提供する。
【００１５】
別の実施形態において、本発明は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）由来でなく植物中での発現を駆動する能力のあるプロモーターに作動可能的に連結された、ＤＩＧ−１０９タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築体を提供する。本発明は、また、そのゲノム中に安定的に組み込まれたＤＮＡ構築体を含む遺伝子導入植物、および有害生物から植物を保護する方法であって、前記植物中に該構築体を導入することを含む方法を提供する。
【００１６】
配列の簡単な説明
配列番号１は、Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素セグメントである（６１９個のアミノ酸）
【００１７】
配列番号２は、第１Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントである（５４５個のアミノ酸）
【００１８】
配列番号３は、ＤＩＧ−１５２キメラタンパク質である（１１６４個のアミノ酸）（Ｐｆバージョン）
【００１９】
配列番号４は、第２Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントである（５４５個のアミノ酸）
【００２０】
配列番号５は、ＤＩＧ−１０９キメラタンパク質である（１１６４個のアミノ酸）（トウモロコシバージョン）
【００２１】
配列番号６は、Ｃｒｙ１Ｃａ４３６ペプチドである（１０個のアミノ酸）
【００２２】
配列番号７は、Ｃｒｙ１Ｃａ５９１ペプチドである（１０個のアミノ酸）
【００２３】
配列番号８は、ＤＩＧ−１０９をコードする、トウモロコシに対して最適化されたＣＤＳである（３４９２個の塩基対）
【００２４】
配列番号９は、ＺＧＰ３Ｓオリゴヌクレオチドである（２１個のヌクレオチド）
【００２５】
配列番号１０は、ＺＧＰ３Ａオリゴヌクレオチドである（２１個のヌクレオチド）
【００２６】
配列番号１１は、ＴＱＺＧＰ３オリゴヌクレオチドである（２３個のヌクレオチド）
【００２７】
配列番号１２は、ＤＳＭ２Ｓオリゴヌクレオチドである（１７個のヌクレオチド）
【００２８】
配列番号１３は、ＤＳＭ２Ａオリゴヌクレオチドである（１９個のヌクレオチド）
【００２９】
配列番号１４は、ＤＳＭ２ＦＱオリゴヌクレオチドである（２０個のヌクレオチド）
【００３０】
配列番号１５は、ＣＲＹ１ＣａＳオリゴヌクレオチドである（１８個のヌクレオチド）
【００３１】
配列番号１６は、ＣＲＹ１ＣａＡオリゴヌクレオチドである（１８個のヌクレオチド）
【００３２】
配列番号１７は、Ｃｒｙ１Ｃａオリゴヌクレオチドである（２３個のヌクレオチド）
【００３３】
配列番号１８は、ＡＡＤ１Ｓオリゴヌクレオチドである（２０個のヌクレオチド）
【００３４】
配列番号１９は、ＡＡＤ１Ａオリゴヌクレオチドである（２２個のヌクレオチド）
【００３５】
配列番号２０は、ＡＡＤ１オリゴヌクレオチドである（２４個のヌクレオチド）
【００３６】
配列番号２１は、Ｙ１ＣＡＳオリゴヌクレオチドである（１８個のヌクレオチド）
【００３７】
配列番号２２は、Ｙ１ＣＡＲオリゴヌクレオチドである（１８個のヌクレオチド）
【００３８】
配列番号２３は、Ｆ６Ｙ１ＣＡオリゴヌクレオチドである（２３個のヌクレオチド）
【００３９】
配列番号２４は、ＩＶＦ−Ｔａｑオリゴヌクレオチドである（１８個のヌクレオチド）
【００４０】
配列番号２５は、ＩＶＲ−ＴＡＱオリゴヌクレオチドである（１９個のヌクレオチド）
【００４１】
配列番号２６は、ＩＶ−Ｐｒｏｂｅオリゴヌクレオチドである（２６個のヌクレオチド）
【００４２】
配列番号２７は、ＤＩＧ−１１０である（１０７９個のアミノ酸）
【００４３】
配列番号２８は、トウモロコシに対して最適化された、ＤＩＧ−１１０のためのコード領域である（３２３７個の塩基対）
【００４４】
配列番号２９は、ＤＩＧ−１１１である（５４３個のアミノ酸）
【００４５】
配列番号３０は、トウモロコシに対して最適化された、ＤＩＧ−１１１のためのコード領域である（１６２９個の塩基対）
【００４６】
配列番号３１は、ＤＩＧ−１１２である（１０４４個のアミノ酸）
【００４７】
配列番号３２は、トウモロコシに対して最適化された、ＤＩＧ−１１２のためのコード領域である（３１３２個の塩基対）
【００４８】
配列番号３３は、ＤＩＧ−１１３である（５０８個のアミノ酸）
【００４９】
配列番号３４は、トウモロコシに対して最適化された、ＤＩＧ−１１３のためのコード領域である（１５２４個の塩基対）
【００５０】
配列番号３５は、ＤＩＧ−１１４である（５８２個のアミノ酸）
【００５１】
配列番号３６は、トウモロコシに対して最適化された、ＤＩＧ−１１４のためのコード領域である（１７４６個の塩基対）
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】フォールアーミーワーム（ＦＡＷ）およびＣｒｙ１Ｆに抵抗性のあるフォールアーミーワーム（ｒＦＡＷ）の新生幼虫によりin vitroで攻撃されたトウモロコシ葉片の摂食損傷率の図である。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
ＤＩＧ−１０９およびＤＩＧ−１５２タンパク質、ならびに殺虫活性のある変異体。配列番号５の完全長ＤＩＧ−１０９タンパク質および配列番号３のＤＩＧ−１５２タンパク質に加えて、本発明は、殺虫活性のある変異体も包含する。用語「変異体」とは、本出願人らによれば、フラグメント、特定の欠失および挿入突然変異体、ならびに特定の融合タンパク質を包含することを意図する。ＤＩＧ−１０９およびＤＩＧ−１５２タンパク質のＣｒｙ１Ｃａコア毒素セグメントは、典型的な３ドメイン型Ｃｒｙタンパク質である。本発明に包含されるＤＩＧ−１０９およびＤＩＧ−１５２タンパク質の変異体を説明する前置きとして、概括的に３ドメイン型Ｃｒｙタンパク質、とりわけＤＩＧ−１０９およびＤＩＧ−１５２タンパク質毒素の構成を簡単に概観することが有用であろう。
【００５４】
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のδ−エンドトキシン結晶タンパク質分子の大部分は、２つの機能性セグメントから構成されている。プロテアーゼ抵抗性のコア毒素が、第１セグメントであり、タンパク分子の最初の約半分に相当する。約１３０ｋＤａの完全なプロトキシン分子は、昆虫消化管中のプロテアーゼによって迅速に処理されて、抵抗性のあるコアセグメントになる。この処理によって除去されるセグメントは、本明細書中で「プロトキシンセグメント」と呼ぶ。プロトキシンセグメントは、毒素結晶の形成に関与すると考えられる（Ａｒｖｉｄｓｏｎら、１９８９）。プロトキシンセグメントは、かくして、毒素分子のプロテアーゼ処理を低減することによって（Ｈａｉｄｅｒら、１９８６）、または毒素の溶解性を低下させることによって（Ａｒｏｎｓｏｎら、１９９１）、昆虫へのコアの接近可能性を制約して毒素に対する部分的昆虫特異性を伝達することができる。Ｂ．ｔ．毒素は、特定のクラス内でさえも、コア毒素セグメントからプロトキシンセグメントまでの長さおよび変異の正確な配置においてある程度変化する。コア毒素セグメントからプロトキシンセグメントまでの変異は、典型的には、完全長毒素の約５０％〜約６０％で起こることになる。配列番号３は、完全長ＤＩＧ−１５２ポリペプチドの１１６４個のアミノ酸配列を開示し、その中のＮ末端の６１９個のアミノ酸が、配列番号１として開示されるＣｒｙ１Ｃａコア毒素を含む。配列番号５は、完全長ＤＩＧ−１０９ポリペプチドの１１６４個のアミノ酸配列を開示し、その中のＮ末端の６１９個のアミノ酸が、Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素を含む。
【００５５】
三次元結晶構造が、Ｃｒｙ１Ａａ１、Ｃｒｙ２Ａａ１、Ｃｒｙ３Ａａ１、Ｃｒｙ３Ｂｂ１、Ｃｒｙ４Ａａ、Ｃｒｙ４ＢａおよびＣｒｙ８Ｅａ１について決定されている。コア毒素に関するこれらの構造は、著しく類似しており、後記の特徴を有する３つの異なるドメインから構成される（ｄｅ  Ｍａａｇｄら、２００３年で概説されている）。
【００５６】
ドメインＩは、７つのα−ヘリックスの束であり、そのヘリックス５は、６つの両親媒性ヘリックスで取り囲まれている。このドメインは、細孔形成に関連し、溶血毒およびコリシンを含む他の細孔生成タンパク質と相同性を有している。Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質のドメインＩは、配列番号１のアミノ酸残基３６〜２５４を含む。［ＤＩＧ−１０９およびＤＩＧ−１５２キメラタンパク質は、Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素セグメントを含み、それゆえ配列番号１に開示のようなＣｒｙ１Ｃａコア毒素セグメントのアミノ酸配列に割り当てられた座標は、配列番号５に開示のＤＩＧ−１０９キメラタンパク質のアミノ酸配列、および配列番号３に開示のＤＩＧ−１５２キメラタンパク質のアミノ酸配列に好都合に当てはまることを理解されたい。］
【００５７】
ドメインＩＩは、β−プリズム中に一緒に詰められた３つの逆並行βシートによって形成されている。このドメインのループは、昆虫の中腸受容体に結合する上で重要な役割を演じる。Ｃｒｙ１Ａタンパク質において、ドメインＩＩのβシートの頂端で表面に露出されたループは、鱗翅目類のカドヘリン受容体に結合する上で必要とされる。Ｃｒｙ３ＡａのドメインＩＩのループは、レプチノタルサ・デセムリネアタ（Leptinotarsa decemlineata）（Ｓａｙ）（コロラドポテトビートル（Colorado potato beetle））の膜結合型メタロプロテアーゼを類似の方式で結合する（Ｏｃｈｏａ−Ｃａｍｐｕｚａｎｏら、２００７）。ドメインＩＩは、卵黄およびジャカリンを含めた特定の炭水化物結合性タンパク質と相同性を有する。Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質のドメインＩＩは配列番号１のアミノ酸残基２６２〜４５８を含む。
【００５８】
ドメインＩＩＩは、２つの逆平行βシートのβサンドイッチである。構造的に、このドメインは、グルカナーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、シアリダーゼなどのタンパク質の炭水化物結合ドメインに関連する。ドメインＩＩＩは、特定のクラスの受容体タンパク質を結合し、第２のクラスの受容体（その例が、Ｃｒｙ１Ａタンパク質の場合のアミノペプチダーゼおよびアルカリホスファターゼである）と相互作用するオリゴマー毒素プレ細孔の挿入に関係する（ＰｉｇｏｔｔおよびＥｌｌａｒ、２００７）。類似のＣｒｙドメインＩＩＩ受容体が、さらに鞘翅目で確認されている。保存されたＢ．ｔ．配列のブロック２および３は、ドメイン２のそれぞれＮ末端およびＣ末端近くに位置する。それゆえ、これらの保存された配列のブロック２および３は、３つの機能性ドメイン間の隣接境界領域である。これらの領域の保存されたＤＮＡおよびタンパク質の相同性は、組み換えＢ．ｔ．毒素を遺伝子操作するために活用されている（米国特許第６０９０９３１号、国際公開第１９９１／０１０８７号、国際公開第１９９５／０６７３０号、国際公開第１９９８／０２２５９５号）。Ｃｒｙ１Ｃａタンパク質のドメインＩＩＩは、配列番号１のアミノ酸残基４６８〜６１７を含む。
【００５９】
ドメインＩのα−ヘリックス１は、受容体に結合した後、除去されることが報告されている。Ａｒｏｎｓｏｎら（１９９９）は、ＢＢＭＶに結合したＣｒｙ１Ａｃが、α−ヘリックス１の直後の残基５９で始まるプロテイナーゼＫによる開裂から保護されたことを立証し、Ｃｒｙ１Ａｂについて同様の結果が述べられている。Ｇｏｍｅｚら（２００２）は、ＢＢＭＶ受容体に結合して形成されるＣｒｙ１Ａｂオリゴマーが、ドメインＩのα−ヘリックス１部分を欠くことを見出した。また、Ｓｏｂｅｒｏｎら（２００７）は、三次元Ｃｒｙ構造上のα−ヘリックス１を包含するほぼ６０個のアミノ酸を欠くＣｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ１ＡｃのＮ末端欠失突然変異体が、カドヘリン結合の不在下で、分子量約６０ｋＤａのモノマーをプレ細孔に組み立てる能力があることを示した。これらのＮ末端欠失突然変異体は、Ｃｒｙ抵抗性の昆虫幼生に対して活性であると報告された。さらに、Ｄｉａｚ−Ｍｅｎｄｏｚａら（２００７）は、地中海コーンボーラー（Mediterranean corn borer）（Sesamia nonagrioides）に対する活性を保持している４３ｋＤａおよび４６ｋＤａのＣｒｙ１Ａｂフラグメントを発表した。これらのフラグメントは、アミノ酸残基１１６〜４２３を含むことが立証されたが、正確なアミノ酸配列は解明されておらず、これらのタンパク質分解フラグメントの活性の機構は未知である。Ｇｏｍｅｚら（２００２）、Ｓｏｂｅｒｏｎら、２００７およびＤｉａｚ−Ｍｅｎｄｏｚａら（２００７）の結果は、Ｃｒｙ１ＡｂのＮ末端からの３６個のアミノ酸の欠失により殺虫活性の喪失がもたらされることを報告したＨｏｆｔｅら（１９８６）の結果と対比する。
【００６０】
本発明者らは、Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素のドメインＩ中のヘリックス１、２Ａ、２Ｂ、３および４の始まりおよび終端、ならびにそれらの間のスペーサー領域の位置を、Ｃｒｙ１Ｃａのアミノ酸配列をその構造が既知であるＣｒｙ８Ｅａ１のためのアミノ酸配列と比較することによって推定した。これらの位置を表１に記す。
【００６１】
【表１】
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【００６２】
ＤＩＧ−１０９およびＤＩＧ−１５２のアミノ末端欠失変異体。その一態様において、本発明は、殺虫活性を改善し、昆虫による抵抗性の発生を回避するために、α−ヘリックス１、２Ａ、および２Ｂのすべてまたは一部が欠失したＤＩＧ−１０９およびＤＩＧ−１５２変異体を提供する。これらの改変は、改善された標的有害生物スペクトル、効力、および昆虫の抵抗性の管理などの改善された特性を備えたＤＩＧ−１０９およびＤＩＧ−１５２変異体を提供するために行われた。本発明の一部の実施形態において、対象とする改変は、昆虫の中毒につながるプロトキシン活性化および細孔形成の有効性に影響を及ぼす可能性がある。より具体的には、改善された特性を備えたＤＩＧ−１０９およびＤＩＧ−１５２変異体を提供するために、Ｎ末端をコードする遺伝子の一部を除去する段階的欠失が記述される。その欠失は、ドメインＩのα−ヘリックス１のすべて、およびα−ヘリックス２のすべてまたは一部を、α−ヘリックス３〜７の構造的完全性を維持しながら除去する。したがって、本発明は、部分的には、より有効な細孔形成のためのドメイン１のα−ヘリックス構成部分を遺伝子操作することによってなされるＣｒｙタンパク質の有効性の改善に関する。より具体的には、本発明は、部分的には、Ｃｒｙ１タンパク質のドメインＩ中のα−ヘリックス１および２に対する推定上の二次的な構造相同性を備えた領域中にＮ末端欠失を有するように設計された、改善されたＤＩＧ−１０９およびＤＩＧ−１５２タンパク質に関する。
【００６３】
ＤＩＧ−１０９およびＤＩＧ−１５２毒素の殺虫特性を改善するための欠失は、予想されるα−ヘリックス２Ａの開始前に始まることができ、かつα−ヘリックス２Ｂの終結後に終わることができるが、好ましくはα−ヘリックス３中に拡がることはない。
【００６４】
Ｎ末端欠失変異体のためのコード配列の設計において、メチオニンをコードするＡＴＧ開始コドンは、欠失変異体をコードするように設計されたヌクレオチド配列の５’末端で挿入される。遺伝子導入植物中で使用するために設計された配列の場合、Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ（１９９７）の「Ｎ末端則」に従うことが有益である可能性がある。一部のアミノ酸は、タンパク質のＮ末端残基として提示されると真核細胞中でのタンパク質の不安定性および分解の一因となることが教示されている。例えば、酵母および哺乳動物細胞中での観察から集められたデータは、Ｎ末端を不安定化するアミノ酸は、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｙ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｉ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅおよび可能性としてはＰであることを示している。タンパク質の分解機構の詳細は、生物間で多少異なる可能性があるが、上で観察されるＮ末端を不安定化するアミノ酸の同一性が保存されていることは、類似の機構が植物細胞中で機能できることを示唆している。例えば、Ｗｏｒｌｅｙら（１９９８）は、植物において、Ｎ末端則は、塩基性および芳香族残基を包含することを見出した。主題のＢ．ｔ．殺虫性タンパク質のα−ヘリックス３の開始点近くでの植物プロテアーゼによるタンパク質分解開裂は、不安定化Ｎ末端アミノ酸を露出する可能性があることがあり得る。このようなプロセシングは、開裂されたタンパク質を急速な崩壊に導き、Ｂ．ｔ．殺虫性タンパク質の蓄積を、有効な昆虫防除に不十分なレベルまでに制限する可能性がある。したがって、不安定安化アミノ酸の１つで始まるＮ末端欠失変異体の場合、本出願人らは、翻訳開始メチオニンと不安定化アミノ酸との間にＧ（グリシン）アミノ酸を指定するコドンを付加することを選択する。
【００６５】
実施例１３および１４は、本発明によるＤＩＧ−１０９およびＤＩＧ−１５２のアミノ酸末端欠失変異体の具体例を与える。さらなる有用な断片は、完全長の可溶化結晶タンパク質のトリプシンまたはキモトリプシン消化によって生じる断片の昆虫でのバイオアッセイによって確認して、どの断片が毒性を維持しているかを判定することができ、あるいはＣｒｙタンパク質をコードする領域のＤＮＡ断片によってコードされた毒性タンパク質断片の配列を決定することによって同定することができる。このタンパク質は、大部分が、プロトキシンに比較して短いＮ末端および長いＣ末端の切断を有する。最も短い毒性フラグメントのＮ末端終端は、当技術分野で日常的に利用可能な技術によるトリプシンまたはキモトリプシンで処理された可溶性結晶タンパク質のＮ末端アミノ酸配列決定によって好都合に決定される。
【００６６】
キメラ毒素。別のＣｒｙ毒素のプロトキシンセグメントに融合された１つのＣｒｙ毒素のコア毒素セグメントを利用するキメラタンパク質が、以前に報告されている。ＤＩＧ−１０９およびＤＩＧ−１５２変異体は、コア毒素セグメントの終端を越えたいくつかの箇所で異種プロトキシンセグメントに融合されたＣｒｙ１Ｃａ毒素のＮ末端毒素コアセグメントを含む毒素（完全長であっても、前記のＮ末端欠失を有してもよい）を包含する。異種プロトキシンセグメントへの変異は、ほぼコア毒素／プロトキシン結合点で起こることができ、あるいは代わりに、本来のプロトキシンの一部（コア毒素セグメントを越えて拡がる）を、下流中で起こる異種プロトキシンへの変異を伴って保持することができる。例として、本発明のキメラ毒素は、Ｃｒｙ１Ｃａの完全長コア毒素セグメント（アミノ酸１〜６１９）および異種プロトキシン（アミノ酸６２０〜Ｃ末端）を有する。好ましい実施形態において、プロトキシンの異種セグメントは、配列番号２および配列番号４に示したような、Ｃｒｙ１Ａｂδ−エンドトキシンから得られる。
【００６７】
プロテアーゼ感受性変異体。昆虫の消化管内プロテアーゼは、典型的には、飼料のタンパク質から必要なアミノ酸を得ることにおいて昆虫を助けることで機能する。最も理解されている昆虫の消化性プロテアーゼは、とりわけ鱗翅目種中で最も一般的であると思われるセリンプロテアーゼである（ＥｎｇｌｅｍａｎｎおよびＧｅｒａｅｒｔｓ、１９８０）。鞘翅目昆虫は、鱗翅目の消化管に比べてより中性〜酸性である消化管を有する。鞘翅目の幼虫および成虫の大部分、例えば、コロラドポテトビートル（Colorado potato beetle）は、わずかに酸性の中腸を有し、システインプロテアーゼが、重要なタンパク質分解活性を提供する（ＷｏｌｆｓｏｎおよびＭｕｒｄｏｃｋ，１９９０）。より正確には、ＴｈｉｅおよびＨｏｕｓｅｍａｎ（１９９０）は、コロラドポテトビートル（Colorado potato beetle）中にシステインプロテアーゼ、カテプシンＢ様、およびカテプシンＨ様、ならびにアスパルチルプロテアーゼ、カテプシンＤ様を確認し、特徴付けた。Ｇｉｌｌｉｋｉｎら（１９９２）は、ウェスターンコーンルートワーム（western corn rootworm）幼虫の消化管中でのタンパク質分解活性を特徴付け、主としてシステインプロテアーゼを見出した。米国特許第７２３０１６７号には、セリンプロテアーゼ、カテプシンＧが、ウェスターンコーンルートワーム（western corn rootworm）中に存在することが開示されている。昆虫消化管プロテアーゼの多様性および異なる活性レベルは、特定のＢ．ｔ．毒素に対する昆虫の感受性に影響を及ぼす可能性がある。
【００６８】
本発明の別の実施形態において、プロテアーゼの開裂部位は、特定の害虫の感受性幼虫の中腸内でのタンパク質プロセシングに影響を及ぼすように所望の位置で遺伝子操作することができる（Ｗａｌｔｅｒｓら、２００８）。これらのプロテアーゼ開裂部位は、化学的遺伝子合成またはスプライス重複ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎら、１９８９）などの方法で導入することができる。例えば、セリンプロテアーゼ認識配列は、感受性幼虫の中腸内で所望の欠失点でのタンパク質プロセシングを実施するように、Ｃｒｙタンパク質構造中の特定部位で任意選択により挿入することができる。このような方式で利用できるセリンプロテアーゼには、トリプシンまたはトリプシン様酵素、キモトリプシン、エラスターゼなどの、鱗翅目中腸セリンプロテアーゼが含まれる（Ｃｈｒｉｓｔｅｌｌｅｒら、１９９２）。さらに、未分画幼虫中腸プロテアーゼ標本で作り出されるＣｒｙタンパク質消化産物を配列決定することによって、または刷子縁膜小胞への結合によって経験的に同定される欠失部位を、タンパク質活性化をもたらすように遺伝子操作することができる。遺伝子欠失によって、またはプロテアーゼ開裂部位の導入によって作り出される改変Ｃｒｙタンパク質は、オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）、ジアトラエア・グランジオセラ（Diatraea grandiosella）、ヘリコベルパ・ジア（Helicoverpa zea）、アグロチス・イプシロン（Agrotis ipsilon）、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）、スポドプテラ・イクシグア（Spodoptera exigua）、ジアトラエア・サッカラリス（Diatraea saccharalis）、ロクサグロチス・アルビコスタ（Loxagrotis albicosta）、およびその他の標的有害生物を含む、鱗翅目有害生物に対して改善された活性を有する。
【００６９】
トリプシン、キモトリプシン、およびカテプシンＧ様プロテアーゼなどの鞘翅目セリンプロテアーゼ、カテプシン（Ｂ様、Ｌ様、Ｏ様、およびＫ様プロテアーゼ）などの鞘翅目システインプロテアーゼ（Ｋｏｉｗａら、２０００；およびＢｏｗｎら、２００４）、ＡＤＡＭ１０などの鞘翅目メタロプロテアーゼ（Ｏｃｈｏａ−Ｃａｍｐｕｚａｎｏら、２００７）、およびカテプシンＤ様およびＥ様、ペプシン、プラスメプシン、ならびにキモシンなどの鞘翅目アスパラギン酸プロテアーゼを、特定害虫の感受性幼虫の中腸内でのＣｒｙタンパク質のプロセシングに影響を及ぼすように、所望のプロセシング部位で適切な認識配列を遺伝子操作することによってさらに利用することができる。
【００７０】
このようなプロテアーゼ開裂部位を導入するのに好ましい位置は、α−ヘリックス２Ｂとα−ヘリックス３との間の「スペーサー」領域内に、例えば、Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質のアミノ酸８５〜９０内に存在する可能性がある（配列番号１および表１）。遺伝子欠失によって、またはプロテアーゼ開裂部位の導入によって作り出される改変Ｃｒｙタンパク質は、限定はされないが、フォールアーミーワーム、シュガーケーンボーラーなどを含む害虫に対して改善された活性を有する。
【００７１】
ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端残基を含むアミノ酸の配列決定を可能にする種々の技術が存在する。例えば、自動化されたエドマン分解法を逐次方式で使用して、３０アミノ酸残基までのＮ末端アミノ酸配列を残基につき９８％の正確さで決定することができる。さらに、ポリペプチドのカルボキシ終端を含むアミノ酸配列の決定も可能である（Ｂａｉｌｅｙら、１９９２；米国特許第６０４６０５３号）。したがって、一部の実施形態において、例えば昆虫の消化管から調製されたプロテアーゼによるタンパク質分解処理によって活性化されたＢ．ｔ．Ｃｒｙタンパク質を、特徴付け、活性化された毒素フラグメントのＮ末端またはＣ末端アミノ酸を確認することができる。昆虫、植物または微生物プロテアーゼによるより大きな変異体タンパク質のタンパク質分解開裂を可能にするまたは排除するためのコード配列中の適切な位置でのプロテアーゼプロセシング部位の導入または排除によって作られるＤＩＧ−１０９およびＤＩＧ−１５２変異体は、本発明の範囲に包含される。このような操作の最終結果は、無傷の（完全長）毒素タンパク質と同様またはより良好な活性を有する毒素フラグメント分子の生成であると理解される。
【００７２】
ＤＩＧ−１０９およびＤＩＧ−１５２毒素のドメイン。ＤＩＧ−１０９およびＤＩＧ−１５２毒素において例示されるようなＣｒｙ１Ｃａコア毒素セグメントの分離ドメイン（およびこのようなドメインと９０％、９５％または９７％同一である変異体）は、増大された有害生物毒性スペクトル、改善された有効性、または改善されたタンパク質の安定性を備えた新規毒素を提供するために、他のＣｒｙ毒素からのドメインとの組合せを形成する上で有用であると予想される。Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質のドメインＩは、配列番号１のアミノ酸残基３６〜２５４からなる。Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質のドメインＩＩは、配列番号１のアミノ酸残基２６２〜４５８からなる。Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質のドメインＩＩＩは、配列番号１のアミノ酸残基４６８〜６１７からなる。ドメインの交換または組み換えは、変えられたδ−エンドトキシンタンパク質を作り出すための機構である。ドメインＩＩおよびＩＩＩは、δ−エンドトキシンタンパク質間で交換することができ、改善された殺有害生物活性または標的スペクトルを備えたハイブリッドまたはキメラ毒素をもたらす。ドメインＩＩは、受容体結合に関連する。ドメインＩＩＩは、特定クラスの受容体タンパク質を結合し、恐らく、オリゴマー毒素プレ細孔の挿入に関与する。他の毒素中での一部のドメインＩＩＩの置換は、スポドプテラ・エクシグア（Spodoptera exigua）に対して優れた毒性を生じることが示され（ｄｅ  Ｍａａｇｄら、１９９６）、Ｃｒｙ毒素ドメイン交換の設計に関する指針が存在する（Ｋｎｉｇｈｔら、２００４）。
【００７３】
組み換えタンパク質を作り出し、それらを殺有害生物活性について試験するための方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｎａｉｍｏｖら、２００１；ｄｅ  Ｍａａｇｄら、１９９６；Ｇｅら、１９９１；Ｓｃｈｎｅｐｆら、１９９０；Ｒａｎｇら、１９９９を参照されたい）。Ｃｒｙ１ＡおよびＣｒｙ３Ａタンパク質からのドメインＩは、膜中に細孔を挿入および形成する能力について研究された。ドメインＩのα−ヘリックス４および５は、膜内挿入および細孔形成において重要な役割を演じ（Ｗａｌｔｅｒｓら、１９９３；Ｇａｚｉｔら、１９９８；Ｎｕｎｅｚ−Ｖａｌｄｅｚら、２００１）、他のヘリックスは、傘の骨のように膜表面に接触させるように提案された（Ｂｒａｖｏら、２００７；Ｇａｚｉｔら、１９９８）。
【００７４】
限られた数のアミノ酸の欠失、置換、または付加することによって創り出されるＤＩＧ−１０９およびＤＩＧ−１５２変異体。配列番号１のＣｒｙ１Ｃａコア毒素セグメントのアミノ酸配列に対するアミノ酸の欠失、置換、および付加は、逐次的方式で容易に行うことができ、このような変更の殺虫活性に対する効果は、バイオアッセイで試験することができる。変化の数が数の上で限られているなら、このような試験は、不合理な実験を必要としない。本発明は、コア毒素の殺虫活性のある変異体（配列番号１のアミノ酸１〜６１９）を包含し、その中で、１０個まで、１５個まで、または２０個までの独立なアミノ酸の付加、欠失、または置換がなされた。
【００７５】
本発明は、配列番号１のアミノ酸１〜６１９に９０％、９５％または９７％同一であるコア毒素セグメントを有するＤＩＧ−１０９およびＤＩＧ−１５２変異体を包含する。変異体は、ランダムな突然変異をもたらすことによって調製することができ、あるいは変異体を設計することができる。設計された突然変異体の場合には、アミノ酸の同一性が、生物学的活性の原因である、または最終的に生物学的活性の原因である三次元配置の決定に関与する、毒素の重要な領域中で維持されるなら、天然の毒素に類似の活性を備えた変異体を作り出す確率が高くなる。また、置換が保存的である場合にも、活性を保持する確率が高くなる。アミノ酸は、次のクラス、すなわち、無極性、無電荷極性、塩基性、および酸性に分けることができる。あるクラスのアミノ酸を、同一タイプの別のアミノ酸で置き換える保存的置換は、変異体の生物学的活性を著しく変える可能性が最も少ない。表２に各クラスに属するアミノ酸の例を列挙する。
【００７６】
【表２】
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【００７７】
一部の例において、非保守的置換も行うことができる。重要な要素は、これらの置換が、毒素の生物学的活性を顕著に損なうべきではないことである。変異体は、突然変異誘発のためアミノ酸配列が異なるポリペプチドを包含する。本発明に包含される変異体タンパク質は、生物学的に活性であり、すなわち、それらは、天然タンパク質の所望される生物学的活性を有し続ける、すなわち、殺虫活性を保持する。
【００７８】
また、配列レベルを異にするが、同様のまたは類似の総合的に必須な三次元構造、表面電荷分布などを有する変異体タンパク質も設計することができる。例えば、米国特許第７０５８５１５号；Ｌａｒｓｏｎら、２００２；Ｓｔｅｍｍｅｒ、１９９４ａ、１９９４ｂ、１９９５；およびＣｒａｍｅｒｉら、１９９６ａ、１９９６ｂ、１９９７を参照されたい。
【００７９】
核酸。ＤＩＧ−１０９毒素をコードする、またはＤＩＧ−１５２毒素をコードする単離核酸は、本発明の一態様である。これは、配列番号１、配列番号３、および配列番号５をコードする核酸、ならびにその相補配列、ならびに配列番号１、配列番号３、および配列番号５の殺虫性変異体をコードするその他の核酸を包含する。「単離」とは、本発明者らにとって、該核酸分子が、人間の手によって、それらの本来の環境から取り出され、かつ異なる環境中に配置されていることを意味する。遺伝子コードの冗長性のため、種々の異なるＤＮＡ配列が、本明細書に開示のアミノ酸配列をコードすることができる。同一または本質的に同一の毒素をコードするこれらの代わりのＤＮＡ配列を創り出すことは、当業者の技術に包含される。
【００８０】
遺伝子合成。本明細書に記載の改善されたＣｒｙタンパク質をコードする遺伝子は、当技術分野で周知の種々の方法によって調製することができる。例えば、合成遺伝子セグメントおよび合成遺伝子は、亜リン酸トリエステルおよびホスホラミダイト化学物質（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、１９８７）によって調製することができ、必要に応じて、遺伝子合成を実施するためにコマーシャルベンダーを利用可能である。完全長遺伝子は、例えば、制限断片のライゲーションまたはポリメラーゼ連鎖反応、重複オリゴヌクレオチドの組立てを含む、種々の方法で組み立てることができる（ＳｔｅｗａｒｔおよびＢｕｒｇｉｎ、２００５）。さらに、末端遺伝子欠失は、部位特異的末端オリコヌクレオチドを使用するＰＣＲ増幅によって調製することができる。
【００８１】
ＤＩＧ−１０９毒素およびＤＩＧ−１５２毒素をコードする核酸は、例えば、いくつかの商業的供給業者のいずれかによって現在実施されている方法による合成的構築によって調製することができる（例えば、米国特許第７４８２１１９号参照）。これらの遺伝子またはその部分もしくは変異体は、また、例を挙げれば、例えば米国特許第５３８０８３１号の遺伝子シンセサイザーおよび設計方法を使用して、合成的に構築することができる。別法として、合成または天然に存在する遺伝子の変形形態を、点突然変異を生じさせるための標準的な分子生物学的技術を使用して容易に構築することができる。これらの遺伝子のフラグメントは、また、市販のエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを使用して標準的手順により調製することができる。例えば、Ｂａｌ３１などの酵素または部位特異的突然変異誘発を利用して、これらの遺伝子の終端からヌクレオチドを規則正しく切り離すことができる。また、活性毒素フラグメントをコードする遺伝子フラグメントを、種々の制限酵素を使用して得ることができる。
【００８２】
ＤＩＧ−１０９毒素およびＤＩＧ−１５２毒素のためのアミノ酸配列が得られると、意図した宿主によって好まれるコドンを使用してタンパク質配列を逆翻訳し、次いで問題を引き起こす可能性のある配列を除去するために代わりの（冗長）コドンを使用して配列を精製することによって、コード配列を設計することができる。さらに、長い偶発性オープン読取り枠を除去するために、周期的停止コドンを遺伝子操作して非コード読取り枠に作り変えることができる。
【００８３】
配列同一性の定量。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を測定するため、配列を最適な比較目的のために整列させる。２つの配列間のパーセント同一性は、配列が共有する同一位置の数の関数である（すなわち、パーセント同一性＝同一位置の数／位置の総数（例えば、重複位置）×１００）。一実施形態において、２つの配列は、同じ長さである。２つの配列間のパーセント同一性は、ギャップを許容するまたはしない後記技術に類似した技術を使用して測定することができる。パーセント同一性の計算では、典型的には、正確な一致を計数する。
【００８４】
２つの配列間のパーセント同一性の測定は、数学的アルゴリズムを使用して完遂できる。このようなアルゴリズムの非限定的例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）中のように修正され、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸ各プログラム中に組み込まれた、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、ならびにＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、１９９０）である。ＢＬＡＳＴサーチは、核またはタンパク質データベース中の問い合わせ配列に一致（類似）する配列を同定するのに好都合に使用することができる。ＢＬＡＳＴＮサーチは、本発明の要求された核酸分子に対して相同性を有するヌクレオチド配列を同定するために実施することができる（スコア＝１００、ワード長＝１２）。ＢＬＡＳＴＸサーチは、本発明の要求された殺虫性タンパク質分子に対して相同性を有するアミノ酸配列を同定するために実施することができる（スコア＝５０、ワード長＝３）。
【００８５】
ギャップ化ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）は、比較の目的でギャップのあるアラインメントを得るのに利用できる。別法として、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔは、分子間の遠隔関係を検出する反復サーチを実施するのに使用することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、同書）。ＢＬＡＳＴ、ギャップ化ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔ各プログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーターを使用することができる。www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。
【００８６】
配列を比較するために利用される数学的アルゴリズムの非限定的例が、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムである（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４）。ＣｌｕｓｔａｌＷは、配列を比較し、アミノ酸またはＤＮＡ配列の全体を整列し、かくして、すべてのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の配列保存に関するデータを提供することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムは、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩプログラムスイート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）のＡＬＩＧＮＸモジュールなどの、市販ＤＮＡ／アミノ酸解析ソフトウェアパッケージ中で使用されている。アミノ酸配列をＡＬＩＧＮＸで整列する場合には、２つの配列間のパーセントアミノ酸類似性（コンセンサス）または同一性を評価するために、１０のギャップオープンペナルティ、０．１のギャップ伸張ペナルティ、およびｂｌｏｓｕｍ６３ｍｔ２比較マトリックスでのデフォルト設定を好都合に使用することができる。ＤＮＡ配列をＡＬＩＧＮＸで整列する場合には、２つの配列間のパーセント同一性を評価するために、１５のギャップオープンペナルティ、６．６のギャップ伸張ペナルティ、およびｓｗｇａｐｄｎａｍｔ比較マトリックスでのデフォルト設定を好都合に使用することができる。
【００８７】
配列比較のために利用される数学的アルゴリズムの別の非限定的例が、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９８８）の例である。このようなアルゴリズムは、ｗＥＭＢＯＳＳ配列整列ソフトウェアパッケージ（http://emboss.sourceforge.net/で利用可能）の一部であるｗＳＴＲＥＴＣＨＥＲプログラム中に組み込まれている。ｗＳＴＲＥＴＣＨＥＲは、線形空間を使用する標準的な動的プログラミングアルゴリズムの修正形態を使用して、２つの配列の最適な大域的アラインメントを計算する。アラインメントを計算するのに使用される置換マトリックス、ギャップ挿入ペナルティ、およびギャップ伸張ペナルティを指定することができる。ヌクレオチド配列を比較するためにｗＳＴＲＥＴＣＨＥＲを利用する場合には、１６のギャップオープンペナルティおよび４のギャップ伸張ペナルティを、スコアリングマトリックスファイルＥＤＮＡＦＵＬＬと共に使用することができる。アミノ酸配列を比較するために使用する場合には、１２のギャップオープンペナルティおよび２のギャップ伸張ペナルティを、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスファイルと共に使用することができる。
【００８８】
配列比較のために利用される数学的アルゴリズムのさらなる非限定的例は、配列アラインメントソフトウェアパッケージＧＡＰバージョン１０およびｗＮＥＥＤＬＥ（http://emboss.sourceforge.net/）中に組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）の例である。ＧＡＰバージョン１０は、次のパラメーターを使用して配列の同一性または類似性を測定するのに使用することができ、ヌクレオチド配列の場合、％同一性および％類似性は、５０のギャップウェイトおよび３の長さウェイト、ならびにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用して検索される。アミノ酸の配列比較の場合、％同一性または％類似性は、８のギャップウェイトおよび２の長さウェイト、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングプログラムを使用して測定される。
【００８９】
ｗＮＥＥＤＬＥは、２つの入力配列を読み取り、それらの全長に沿って最適アラインメント（ギャップを含む）を検索し、それらの最適な大域的配列アラインメントをファイルに書き込む。アルゴリズムは、すべての可能なアラインメントを探索し、それぞれの可能な残基またはヌクレオチドの一致に関する値を含むスコアリングマトリックスを使用して最良のものを選択する。ｗＮＥＥＤＬＥは、最大の可能なスコアを有するアラインメントを検索し、ここで、アラインメントのスコアは、スコアリングマトリックスから得られる一致の合計マイナス整列された配列中のオープンおよび伸張各ギャップから生じるペナルティに等しい。置換マトリックスおよびギャップオープンおよび伸張各ペナルティは、ユーザー指定である。アミノ酸配列を比較する場合には、１０のデフォルトギャップオープンペナルティ、０．５のギャップ伸張ペナルティ、およびＥＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックスを使用する。ｗＮＥＥＤＬＥを使用してＤＮＡ配列を比較する場合には、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップ伸張ペナルティ、およびＥＤＮＡＦＵＬＬ比較マトリックスを使用する。
【００９０】
同等のプログラムも使用することができる。「同等のプログラム」とは、問題の任意の２つの配列に関して、ＡＬＩＧＮＸ  ｗＮＥＥＤＬＥ、またはｗＳＴＲＥＴＣＨＥＲによって作り出される対応するアラインメントに比較した場合に、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の一致および同一のパーセント配列同一性を有するアラインメントを作り出す任意の配列比較プログラムを意図する。％同一性は、報告される整列領域にわたる２つの配列（長さ中の任意のギャップを含む）間の同じ一致のパーセンテージであり、％類似性は、報告される整列領域にわたる２つの配列（長さ中の任意のギャップを含む）間の一致のパーセンテージである。
【００９１】
アラインメントは、点検によってマニュアル的に実施することもできる。
【００９２】
組換え宿主。本発明の毒素をコードする遺伝子は、広範な種類の微生物または植物宿主中に導入することができる。毒素遺伝子の発現は、直接的または間接的に、殺有害生物性タンパク質の細胞内産生および維持をもたらす。適切な微生物宿主、例えば、シュードモナス（Pseudomonas）の場合、該微生物を、それらが増殖し、取り込まれる有害生物の環境に適用することができる。結果は、有害生物の防除である。別法として、毒素遺伝子を宿す微生物を、毒素の活性を延長し、かつ細胞を安定化する条件下で処理することができる。毒性活性を維持している処理細胞を、次いで、標的有害生物の環境に適用することができる。
【００９３】
Ｂ．ｔ．毒素遺伝子が適当なベクターを介して微生物宿主中に導入され、前記宿主が生存状態で環境に適用される場合、特定の宿主微生物を使用することが必須である。注目の１種または複数の作物の「植物圏」（葉面、葉圏、根圏、および／または根面）を占拠することが知られている微生物宿主が選択される。これらの微生物は、特定の環境（作物およびその他の昆虫生息地）中で野生型土着微生物と成功裡に競争する能力があり、ポリペプチド殺有害生物剤を発現する遺伝子の安定な維持および発現を提供し、望ましくは環境での分解および不活性化からの殺有害生物剤の改善された保護を提供するように選択される。
【００９４】
多数の微生物が、広範な種類の重要作物の葉面（植物の葉の表面）および／または根圏（植物の根を取り囲む土壌）に存在することが知られている。これらの微生物には、細菌、藻類、および真菌が含まれる。とりわけ重要なのは、細菌、例えば、シュードモナス（Pseudomonas）、エルウィニア（Erwinia）、セラチア（Serratia）、クレブシエラ（Klebsiella）、キサントモナス（Xanthomonas）、ストレプトミセス（Streptomyces）、リゾビウム（Rhizobium）、シノリゾビウム（Sinorhizobium）、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）、メチロフィリウス（Methylophilius）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、アセトバクター（Acetobacter）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、アルスロバクター（Arthrobacter）、アゾトバクター（Azotobacter）、ロイコノストック（Leuconostoc）、およびアルカリゲネス（Alcaligenes）属；真菌とりわけ酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、クリベロマイセス（Kluyveromyces）、スポロボロマイセス（Sporobolomyces）、ロドトルラ（Rhodotorula）、およびアウレオバシジウム（Aureobasidium）属などの微生物である。とりわけ興味のあるのは、シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）、ロドシュードモナス・スフェロイデス（Rhodopseudomonas spheroides）、キサントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）、シノリゾビウム・メリロチ（Sinorhizobium meliloti）（以前にはリゾビウム・メリロチ（Rhizobium meliloti））、アルカリゲネス・ユートロフス（Alcaligenes eutrophus）、およびアゾトバクター・ビネランジ（Azotobacter vinelandii）などの植物圏細菌種；ならびにロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra）、Ｒ．グルチニス（R.glutinis）、Ｒ．マリナ（R.marina）、Ｒ．アウランティアカ（R.aurantiaca）、クリプトコッカス・アルビダス（Cryptococcus albidus）、Ｃ．ジフルエンス（C.diffluens）、Ｃ．ラウレンティ（C.laurentii）、サッカロミセス・ロセイ（Saccharomyces rosei）、Ｓ．プレトリエンシス（S.Pretoriensis）、Ｓ．セレビシエ（S.cerevisiae）、スポロボロマイセス・ロセウス（Sporobolomyces roseus）、Ｓ．オドルス（S.odorus）、クリベロマイセス・ベロナエ（Kluyveromyces veronae）、およびアウレオバシジウム・ポルランス（Aureobasidium pollulans）などの植物圏酵母種である。とりわけ興味のあるのは、有色微生物である。
【００９５】
害虫の防除方法。
昆虫が、遺伝子導入植物の発現、製剤化されたタンパク質組成物（群）、噴霧可能なタンパク質組成物（群）、ベイトマトリックス、またはその他の送達システムを介して送達された有効量の毒素と接触すると、結果は、典型的には昆虫の死亡であり、あるいは昆虫は、毒素を昆虫にとって利用可能にする供給源を餌にしない。
【００９６】
対象とするタンパク質毒素は、種々の方式で標的昆虫に接触するように「適用」または提供できる。例えば、遺伝子導入植物（ここで、タンパク質は、植物によって産生され、植物中に存在する）を使用することができ、それは当技術分野で周知である。毒素遺伝子の発現は、また、根、葉などの植物の特定組織中で選択的に達成することができる。これは、例えば、組織特異的プロモーターの使用を介して完遂することができる。スプレー式適用は、もう１つの例であり、これも当技術分野で周知である。対象とするタンパク質は、所望の最終用途向けに適切に製剤化され、次いで、蔓延が発見される前に、標的昆虫が発見された後に、前および後の双方などに、保護すべき植物上に、および／または植物の周りに／植物の付近に噴霧（そうでなければ適用）することができる。例えば、ベイト顆粒も使用することができ、当技術分野で周知である。
【００９７】
遺伝子導入植物
対象とするタンパク質は、任意のクラスの植物を鱗翅目昆虫による損傷から実際に保護するために使用することができる。このような植物の例には、少し例を挙げれば、トウモロコシ、ヒマワリ、ダイズ、ワタ、カノーラ、イネ、モロコシ、タバコ、コムギ、オオムギ、野菜、観賞植物、コショウ（トウガラシを含む）、サトウダイコン、果実、および芝生が含まれる。植物を形質転換する方法は、当技術分野で周知であり、実例となる形質転換法は、実施例中に記載される。
【００９８】
本発明の好ましい実施形態は、対象とする殺虫性タンパク質またはその変異体をコードする遺伝子での植物の形質転換である。形質転換された植物は、形質転換された植物の細胞中の抑制量の対象とする殺虫性タンパク質またはその変異体の存在によって、昆虫標的有害生物による攻撃に抵抗性がある。Ｂ．ｔ．殺虫性毒素の殺虫特性をコードする遺伝子材料を、特定の害虫によって食される植物のゲノム中に組み込むことによって、成虫または幼虫は、食用植物の摂取後に死亡するであろう。単子葉および双子葉各類の多数のメンバーが、形質転換されている。遺伝子導入農耕作物、ならびに果実および野菜は、商業的に重要である。このような作物には、限定はされないが、トウモロコシ、イネ、ダイズ、カノーラ、ヒマワリ、アルファルファ、モロコシ、コムギ、ワタ、ピーナツ、トマト、ジャガイモなどが含まれる。外来遺伝子材料を植物細胞中に導入するための、および導入された遺伝子を安定的に維持し発現する植物を得るためのいくつかの技術が存在する。このような技術には、ミクロ粒子上に被覆された遺伝子材料の直接的な細胞中への促進（米国特許第４９４５０５０号および米国特許第５１４１１３１号）が含まれる。アグロバクテリウム（Agrobacterium）技術を使用して植物を形質転換することができ、米国特許第５１７７０１０号、米国特許第５１０４３１０号、欧州特許出願公開第０１３１６２４号、欧州特許出願公開第１２０５１６号、欧州特許出願公開第１５９４１８号、欧州特許出願公開第１７６１１２号、米国特許第５１４９６４５号、米国特許第５４６９９７６号、米国特許第５４６４７６３号、米国特許第４９４０８３８号、米国特許第４６９３９７６号、欧州特許出願公開第１１６７１８号、欧州特許出願公開第２９０７９９号、欧州特許出願公開第３２０５００号、欧州特許出願公開第６０４６６２号、欧州特許出願公開６２７７５２号、欧州特許出願公開第０２６７１５９号、欧州特許出願公開第０２９２４３５号、米国特許第５２３１０１９号、米国特許第５４６３１７４号、米国特許第４７６２７８５号、米国特許第５００４８６３号、および米国特許第５１５９１３５号を参照されたい。その他の形質転換技術には、ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）技術が含まれ、米国特許第５３０２５２３号および米国特許第５４６４７６５号を参照されたい。また、エレクトロポレーション技術を使用して植物を形質転換しており、国際公開第１９８７／０６６１４号、米国特許第５４７２８６９号、米国特許第５３８４２５３号、国際公開第１９９２／０９６９６号、および国際公開第１９９３／２１３３５号を参照されたい。これらの形質転換の特許および刊行物はすべて、参照により本明細書に組み込まれる。植物を形質転換するための多数の技術に加えて、外来遺伝子と接触させる組織のクラスも変えることができる。このような組織には、限定はされないが、胚形成組織、カルス組織Ｉ型およびＩＩ型、胚軸、分裂組織などが含まれる。ほとんどすべての植物組織を、当業者の技術範囲内の適切な技術を使用して、脱分化中に形質転換することができる。
【００９９】
ＤＩＧ−１０９もしくはＤＩＧ−１５２毒素またはその変異体をコードする遺伝子を、上で開示した、当技術分野で周知の種々の技術を使用して、植物細胞中に挿入することができる。例えば、形質転換される微生物細胞および大腸菌（Escherichia coli）中で機能する複製系の選択を許容するマーカーを含む多数のクローニングベクターを、高等植物中への挿入のための外来遺伝子の調製および改変に利用できる。このような操作には、例えば、意図した用途のために望まれるような、突然変異の挿入、切り詰め、付加、または置換が含まれ得る。ベクターは、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ系、Ｍ１３ｍｐ系、ｐＡＣＹＣ１８４などを含む。したがって、Ｃｒｙタンパク質または変異体をコードする配列を、ベクター中に適切な制限酵素部位で挿入することができる。得られるプラスミドは、大腸菌（E.coli）の形質転換のために使用され、その細胞を、適切な栄養培地中で培養し、次いで、収集、溶菌して、有効な量のプラスミドを回収する。配列解析、制限酵素フラグメント解析、電気泳動、およびその他の生化学−分子生物学的方法が、解析の方法として一般に実施される。各操作の後、使用するＤＮＡ配列を、開裂させ、次のＤＮＡ配列に連結することができる。操作された各ＤＮＡ配列を、同じまたは他のプラスミド中でクローン化することができる。
【０１００】
植物細胞の形質転換のためにＴ−ＤＮＡを含むベクターを使用することは、徹底的に研究され、欧州特許出願公開第１２０５１６号；ＬｅｅおよびＧｅｌｖｉｎ、２００８；Ｆｒａｌｅｙら、１９８６；およびＡｎら、１９８５中に十分に記載されており、その分野で確立されている。
【０１０１】
挿入されるＤＮＡが植物ゲノム中に組み込まれると、それは、後の世代を通して比較的安定である。植物細胞を形質転換するのに使用されるベクターは、通常、形質転換された植物細胞に、とりわけビアラホス、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、またはヒグロマイシンなどの除草剤または抗生物質に対する抵抗性を付与するタンパク質をコードする選択マーカー遺伝子を含む。個別に採用される選択マーカー遺伝子は、したがって、挿入されるＤＮＡを含まない細胞の増殖を選別化合物によって抑制しながら、形質転換された細胞の選択を許容すべきである。
【０１０２】
多数の技術が、宿主植物細胞中にＤＮＡを挿入するために利用可能である。それらの技術には、形質転換剤としてのアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）によって送達されるＴ−ＤＮＡを用いる形質転換が含まれる。さらに、植物プロトプラストの、送達されるべきＤＮＡを含むリポソームとの融合、ＤＮＡの直接注入、遺伝子銃形質転換（微粒子衝突）、またはエレクトロポレーション、ならびにその他の可能な方法を採用することができる。
【０１０３】
本発明の好ましい実施形態において、植物は、タンパク質コード領域のコドン使用頻度が植物に対して最適化されている遺伝子で形質転換される。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５３８０８３１号を参照されたい。また、有利には、切り詰められた毒素をコードしている植物が使用される。切り詰められた毒素は、典型的には、完全長毒素の約５５％〜約８０％をコードしている。植物中で使用するための合成Ｂ．ｔ．遺伝子を創り出す方法は、当技術分野で公知である（Ｓｔｅｗａｒｔ、２００７）。
【０１０４】
形質転換技術にかかわらず、遺伝子は、ベクター中に植物プロモーターを含めることによって植物細胞中でＢ．ｔ．殺虫性毒素遺伝子および変異体を発現するように適合された遺伝子移入ベクター中に好ましくは組み込まれる。植物プロモーターに加えて、種々の供給源からのプロモーターを、各植物細胞で効率的に使用して外来遺伝子を発現することができる。たとえば、オクトピンシンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、マンノピンシンターゼプロモーターなどの細菌起源のプロモーター；カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターなどの植物ウイルス起源のプロモーターなどを使用することができる。植物プロモーターには、限定はされないが、リブロース−１，６−ビスホスフェート（ＲＵＢＰ）カルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓｕ）、β−コングリシニンプロモーター、ファセオリンプロモーター、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、熱ショックプロモーター、ＡＤＦ（アクチン解重合因子）プロモーター、および組織特異的プロモーターが含まれる。プロモーターは、また、転写効率を改善できる特定のエンハンサー配列要素を含むことができる。典型的なエンハンサーには、限定はされないが、ＡＤＨ１−イントロン１およびＡＤＨ１−イントロン６が含まれる。構成プロモーターを使用することもできる。構成的プロモーターは、ほとんどすべての細胞型中で、およびほとんどすべての時点で連続的な遺伝子発現を指令する（例えば、アクチン、ユビキチン、ＣａＭＶ３５Ｓ）。組織特異的プロモーターは、葉または種子など、特定の細胞または組織型中での遺伝子発現の原因であり（例えば、ゼイン、オレオシン、ナピン、ＡＣＰ（アシル担体タンパク質））、これらのプロモーターを使用することもできる。植物発育の特定段階で活性である、および特定の植物組織および器官中で活性であるプロモーターを使用することもできる。このようなプロモーターの例には、限定はされないが、根特異的、花粉特異的、胚特異的、コーンシルク特異的、ワタ繊維特異的、種子胚乳特異的、師部特異的であるなどのプロモーターが含まれる。
【０１０５】
特定の状況下では、誘導性プロモーターを使用することが望ましいことがある。誘導性プロモーターは、物理的刺激（例えば、熱ショック遺伝子）、光（例えば、ＲＵＢＰカルボキシラーゼ）、ホルモン（例えば、グルココルチコイド）、抗生物質（例えば、テトラサイクリン）、代謝産物、およびストレス（例えば、欠乏）などの特定のシグナルに応答した遺伝子発現の原因である。５’未翻訳リーダー配列、ＲＮＡ転写終結配列、およびポリ−アデニレート付加シグナル配列などの、植物中で機能するその他の望ましい転写および翻訳各要素を使用することができる。多数の植物特異的遺伝子移入ベクターが、当技術分野で知られている。
【０１０６】
昆虫抵抗性（ＩＲ）形質を含む遺伝子導入作物は、コーンおよびワタ各植物において北米全体で普及しており、これらの形質の利用は、世界的に拡大している。ＩＲと除草剤耐性（ＨＴ）を組み合わせた市販の形質転換作物が、多数の種子会社によって開発されてきた。これらには、Ｂ．ｔ．殺虫性タンパク質によって付与されるＩＲ形質と、スルホニルウレア類、イミダゾリノン類、トリアゾロピリミジン、スルホンアニリド類などのアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）阻害剤；ビアロホス、グルホシネートなどのグルタミンシンターゼ（ＧＳ）阻害剤；メソトリオン、イソキサフルトールなどの４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）阻害剤；グリホサートなどの５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）阻害剤；およびハロキシホップ、キザロホップ、ジクロホップなどのアセチル−補酵素Ａカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）阻害剤に対する耐性などのＨＴ形質との組合せが含まれる。形質転換で準備されたタンパク質が、植物に、フェノキシ酸系除草剤およびピリジルオキシ酢酸オーキシン系除草剤（国際公開第２００７／０５３４８２号を参照されたい）、またはフェノキシ酸系除草剤、およびアリールオキシフェノキシプロピオン酸系除草剤（国際公開第２００５／１０７４３７号を参照されたい）などの除草剤の化学クラスに対する耐性を提供する、その他の例が知られている。ＩＲ形質を介して複数の有害生物の問題を抑制する能力は、価値ある商品構想であり、この製品構想の便益は、昆虫防除形質および雑草防除形質が同一植物中で組み合わされる場合に、増強される。さらに、改善された価値は、本発明のタンパク質などのＢ．ｔ．殺虫性タンパク質によって付与されるＩＲ形質の、前述のような１種または複数のさらなるＨＴ形質＋１種または複数のさらなる移入形質（例えば、Ｂ．ｔ．由来またはその他の殺虫性タンパク質によって付与されるその他の昆虫抵抗性、ＲＮＡｉなどの機構によって付与される昆虫抵抗性、Ｂ．ｔ．由来またはその他の殺線虫性タンパク質によって付与される線虫抵抗性、ＲＮＡｉなどの機構によって付与される線虫抵抗性、病気抵抗性、ストレス耐性、改善された窒素使用性など）、または移出形質（例えば、高い油脂流量、健康的な油脂組成、栄養改善など）との単一植物での組合せを介して得ることができる。このような組合せは、通常的な育種（育種の積み重ね）を介して、または共同的に複数の遺伝子の同時導入を含む新規な形質転換事象（分子の積み重ね）として得ることができる。利益には、生産者および／または消費者に二次的利益を提供する、作物植物における害虫および改善された雑草防除を管理する能力が含まれる。したがって、本発明は、任意の数の農学的問題を柔軟かつ高い費用効果で制御する能力を有する改善された作物品質の完全な農学的パッケージを提供するために、その他の形質と組み合わせて使用することができる。
【０１０７】
標的有害生物
本発明のＤＩＧ−１０９毒素およびＤＩＧ−１５２毒素は、鱗翅目昆虫の防除で使用するのにとりわけ適している。鱗翅目は、毎年極めて大きな総額の損害をもたらす、農業、園芸、および家庭の有害生物の重要な群である。この昆虫目は、葉および根を摂食する幼虫および成虫を包含する。鱗翅目害虫には、限定はされないが、アコロイア・グリセラ（Achoroia grisella）、アクレリス・グロベラナ（Acleris gloverana）、アクレリス・バリアナ（Acleris variana）、アドキソフィエス・オラナ（Adoxophyes orana）、アグロチス・イプシロン（Agrotis ipsilon）（ブラックカットワーム）、アラバマ・アルギラセア（Alabama argillacea）、アルソフィラ・ポメタリア（Alsophila pometaria）、アメロイス・トランシテラ（Amyelois transitella）、アナガスタ・クエニエラ（Anagasta kuehniella）、アナルシア・リネアテラ（Anarsia lineatella）、アニソタ・セナトリア（Anisota senatoria）、アンテラエア・ペルニイ（Antheraea pernyi）、アンチカルシア・ゲマタリス（Anticarsia gemmatalis）、アルキプス（Archips）種、アルギロタエニア（Argyrotaenia）種、アテチス・ミンダラ（Athetis mindara）、ボンビクス・モリ（Bombyx mori）、ブクラトリックス・ツルベリエラ（Bucculatrix thurberiella）、カドラ・カウテラ（Cadra cautella）、コリストネウラ（Choristoneura）種、コチルス・ホスペス（Cochylls hospes）、コリアス・ユリセマ（Colias eurytheme）、コルシラ・セファロニカ（Corcyra cephalonica）、シディア・ラチフェレナス（Cydia latiferreanus）、シディア・ポモネラ（Cydia pomonella）、ダタナ・インテゲリマ（Datana integerrima）、デンドロリムス・シベリカス（Dendrolimus sibericus）、デスミア・フェネラリス（Desmia feneralis）、ジアファニア・ヒアリナタ（Diaphania hyalinata）、ジアファニア・ニチダリス（Diaphania nitidalis）、ジアトラエア・グランジオセラ（Diatraea grandiosella）（サウスウェスターンコーンボーラー）、ジアトラエア・サッカラリス（Diatraea saccharalis）（シュガーケインボーラー）、エノモス・サブシグナリア（Ennomos subsignaria）、エオレウマ・ロフチニ（Eoreuma loftini）、エスフェスチア・エルテラ（Esphestia elutella）、エラニス・チラリア（Erannis tilaria）、エスチグメネ・アクレア（Estigmene acrea）、エウリア・サルブリコラ（Eulia salubricola）、エウポコエリア・アンビグエラ（Eupocoellia ambiguella）、エウポエシリア・アンビグエラ（Eupoecilia ambiguella）、エウプロクチス・クリソロエア（Euproctis chrysorrhoea）、エウゾア・メソリア（Euxoa messoria）、ガレリア・メロネラ（Galleria mellonella）、グラホリタ・モレスタ（Grapholita molesta）、ハリシナ・アメリカナ（Harrisina americana）、ヘリコベルパ・サブフレクサ（Helicoverpa subflexa）、ヘリコベルパ・ゼア（Helicoverpa zea）（コーンイアーワーム）、ヘリオチス・ビレセンス（Heliothis virescens）、ヘミロイカ・オリビア（Hemileuca oliviae）、ホモエオソマ・エレクテルム（Homoeosoma electellum）、ヒファンチア・クネア（Hyphantia cunea）、ケイフェリア・リコペルシセラ（Keiferia lycopersicella）、ランブジナ・フィセラリア・フィセラリア（Lambdina fiscellaria fiscellaria）、ランブジナ・フィセラリア・ルグブロサ（Lambdina fiscellaria lugubrosa）、ロイコーマ・サリシス（Leucoma salicis）、ロベシア・ボトラナ（Lobesia botrana）、ロクサグロチス・アルビコスタ（Loxagrotis albicosta）（ウェスターンビーンカットワー��）、ロクソステジ・スチクチカリス（Loxostege sticticalis）、リマントリア・ジスパル（Lymantria dispar）、マカラ・チリサリス（Macalla thyrisalis）、マラコソマ（Malacosoma）種、マメストラ・ブラシカエ（Mamestra brassicae）、マメストラ・コンフィグラタ（Mamestra configurata）、マンデュカ・キンクエマクラタ（Manduca quinquemaculata）、マンデュカ・セクスタ（Manduca sexta）、マルカ・テスツラリス（Maruca testulalis）、メランクラ・ピクタ（Melanchra picta）、オペロフテラ・ブルマタ（Operophtera brumata）、オリジア（Orgyia）種、オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）（ユーロピアンコーンボーラー）、パレアクリタ・ベルナタ（Paleacrita vernata）、パピアペマ・ネブリス（Papiapema nebris）（コモンストークボーラー）、パピリオ・クレスホンテス（Papilio cresphontes）、ペクチノホラ・ゴシピエラ（Pectinophora gossypiella）、フィリガニジア・カリフォルニカ（Phryganidia californica）、フィロノリクテル・ブランカルデラ（Phyllonorycter blancardella）、ピエリス・ナピ（Pieris napi）、ピエリス・ラパエ（Pieris rapae）、プラチペナ・スカブラ（Plathypena scabra）、プラチノタ・フロエンダナ（Platynota flouendana）、プラチノタ・スツルタナ（Platynota stultana）、プラチプチリア・カルヅイダクチラ（Platyptilia carduidactyla）、プロジア・インテルプンクテラ（Plodia interpunctella）、プルテラ・キシロステラ（Plutella xylostella）（ダイアモンドバックモス）、ポンティア・プロトダイス（Pontia protodice）、プソイダレチア・ユニプンクタ（Pseudaletia unipuncta）（アーミーワーム）、プソイドプラシア・インクルデンス（Pseudoplasia includens）、サブロデス・アエグロタタ（Sabulodes aegrotata）、シズラ・コンシナ（Schizura concinna）、シトトロガ・セレアレラ（Sitotroga cerealella）、スピロンタ・オセラナ（Spilonta ocellana）、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（フォールアーミーワーム）、スポドプテラ・エクシグア（Spodoptera exigua）（ビートアーミーワーム）、タウルンストポエア・ピチオカンパ（Thaurnstopoea pityocampa）、エンソラ・ビセリエラ（Ensola bisselliella）、トリコプルシア・ヒ（Trichoplusia hi）、ウデア・ルビガリス（Udea rubigalis）、キシロミゲス・クリアイルス（Xylomyges curiails）、およびイポノメウタ・パデラ（Yponomeuta padella）が含まれる。
【０１０８】
作物植物の鞘翅目有害生物を防除するためのＤＩＧ−１０９毒素およびＤＩＧ−１５２毒素ならびにその変異体の使用も想定される。一部の実施形態において、Ｃｒｙタンパク質は、限定はされないが、例えば、ジアブロチカ・ウンデシンプンクタタ・ホワルジ（Diabrotica undecimpunctata howardi）（サザンコーンルートワーム）、ジアブロチカ・ロンジコルニス・バルベリ（Diabrotica longicornis barberi）（ノーザンコーンルートワーム）およびジアブロチカ・ベルギフェラ（Diabrotica virgifera）（ウェスターンコーンルートワーム）などのルートワーム、ならびにシクロセファラ・ボレアリス（Cyclocephala borealis）（ノーザンマスクドコガネムシ）、シクロセファラ・イマクラテ（Cyclocephala immaculate）（サザンマスクドコガネムシ）、およびポピリア・ジャポニカ（Popillia japonica）（ジャパニーズビートル）の幼虫などの地虫が含まれる害虫の防除向けに、経済的に導入できる。
【０１０９】
ＤＩＧ−１０９およびＤＩＧ−１５２毒素の抗体検出
抗毒素抗体。本明細書に開示のＢ．ｔ．毒素に対する、または同等の毒素、あるいはこれらの毒素の断片に対する抗体は、例えば、Coliganら、2007およびその更新版によって教示されるように、本技術分野の標準的手順を使用して容易に調製することができる、このような抗体は、ＤＩＧ−１０９毒素、ＤＩＧ−１５２毒素、およびこれらの変異体の存在を検出するのに有用である。
【０１１０】
Ｂ．ｔ．殺虫性毒素が単離されたら、該毒素に特異的な抗体を、当技術分野で周知である通常の方法によって生じさせることができる。選択した宿主への数週間または数ヶ月にわたる反復注入は、免疫応答を誘発し、かなりの抗Ｂ．ｔ．毒素血清価をもたらす。好ましい宿主は哺乳動物種であり、より好ましい種は、ウサギ、ヤギ、ヒツジおよびマウスである。このような免疫化された動物から採取した血液を、確立された方法で処理して、Ｂ．ｔ．殺虫性毒素と反応性のある抗血清（ポリクロナール抗体）を得ることができる。次いで、抗血清を、当技術分野で既知の技術による毒素への吸着によって親和性精製することができる。親和性精製された抗血清を、当技術分野で既知の手順を使用して抗血清内の免疫グロブリン画分を単離することによってさらに精製することができる。得られる材料は、Ｂ．ｔ．殺虫性毒素と反応性のある免疫グロブリンの異種集団となる。
【０１１１】
抗Ｂ．ｔ．毒素の抗体は、また、免疫原性担体に複合されたＢ．ｔ．殺虫性毒素の合成ペプチドフラグメントからなる半合成免疫原を調製することによって作り出すことができる。ペプチドフラグメントを作製するのに有用な多数のスキームおよび装置が、当技術分野で周知である。ウシ血清アルブミンまたはスカシ貝ヘモシアニンなどの多くの適切な免疫原性担体も、当技術分野で周知であり、免疫原と担体タンパク質とをカップリングするための技術も同様である。半合成免疫原が構築されると、Ｂ．ｔ．殺虫性毒素フラグメントに特異的な抗体の調製手順は、天然Ｂ．ｔ．毒素と反応性のある抗体を調製するのに使用されるものと同じである。
【０１１２】
抗Ｂ．ｔ．毒素のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、精製されたＢ．ｔ．殺虫性毒素を使用して容易に調製される。ＭＡｂの産生方法は、１５年にわたって実施されており、当業者に周知である。免疫賦活剤中の精製されたＢ．ｔ．殺虫性毒素の腹腔内または皮下反復注入は、ほとんどの動物で免疫応答を誘発する。過免疫のＢ−リンパ球を、動物から取り出し、無期限に培養される能力のある適切な融合パートナー細胞系と融合する。そのＢ−リンパ球が過免疫であり、ＭＡｂの産生で使用される可能性のある好ましい動物は、哺乳動物である。より好ましい動物は、ラットおよびマウスであり、最も好ましいのは、ＢＡＬＢ／ｃマウス系統である。
【０１１３】
多数の哺乳動物細胞系が、ハイブリドーマの産生に適した融合パートナーである。多くのこのような系は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、バージニア州）および商業的供給業者から入手可能である。好ましい融合パートナー細胞系は、マウスの骨髄腫に由来し、ＨＬ−１（登録商標）フレンドリー骨髄腫−６５３細胞系（Ｖｅｎｔｒｅｘ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、メイン州）が最も好ましい。融合したら、得られるハイブリドーマを、選択増殖培地中で１〜２週間培養する。２種の周知の選択系が、未融合骨髄腫細胞または骨髄腫細胞間の融合物を混合ハイブリドーマ培養物から除去するために利用することができる。選択系の選択は、免疫されるマウスの系統、および使用される骨髄腫融合パートナーに依存する。ＴａｇｇａｒｔおよびＳａｍｌｏｆｆ（１９８３）によって発表されたａａＴ選択系を使用することができるが、Ｌｉｔｔｌｅｆｉｅｌｄ（１９６４）によって発表されたＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択系が、好ましいマウス系統および前述の融合パートナーとのその適合性のため、好ましい。次いで、費やされた増殖培地を、免疫特異的ＭＡｂ分泌についてスクリーニングする。酵素結合性免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法が、この目的に最も適しているが、大規模なスクリーニング用に適合されたラジオイムノアッセイも許容される。関連性のないまたはあまり所望されない培養物の著しい数を連続的に削減するように設計された複数のスクリーニングを実施することができる。Ｂ．ｔ．殺虫性毒素と反応性のあるＭＡｂを分泌する培養物を、既知のＢ．ｔ．殺虫性毒素との交差反応性についてスクリーニングすることができる。好ましいＢ．ｔ．殺虫性毒素に優先的に結合するＭＡｂは、市販のアッセイを使用してイソタイプに分けられる。好ましいＭＡｂは、ＩｇＧクラスに属し、より高度に好ましいＭＡｂはＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａサブイソタイプに属する。
【０１１４】
好ましいＭＡｂを分泌するハイブリドーマ培養物を数回サブクローニングして、単クローン性および安定性を確立することができる。真核生物の非接着性細胞培養物をサブクローニングするための周知の方法は、限界希釈法、軟質アガロースおよび蛍光活性化細胞ソーティング技術を包含する。各サブクローニングの後、生じた培養物を、好ましくは、抗体分泌およびイソタイプについて再アッセイして、安定な好ましいＭＡｂ分泌培養物が確立されたことを確実にする。
【０１１５】
抗Ｂ．ｔ．毒素抗体は、特許請求された本発明のＢ．ｔ．殺虫性毒素、およびその変異体またはフラグメントを検出する種々の方法において有用である。レポーティング基（reporting group）で標識された抗体を使用して、多様な環境中での抗原の存在を確認することができることは広く知られている。放射性同位体で標識された抗体は、卓越した正確さおよび感度で、多様な生物学的流体中での抗原の存在を確認するためのラジオイムノアッセイにおいて数十年の間使用されてきた。より最近になって、酵素で標識された抗体が、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて放射能標識化抗体の代替として使用されている。さらに、本発明のＢ．ｔ．殺虫性毒素に対して免疫反応性のある抗体を、ポリスチレンウェルなどの固定化物質または粒子に結合させ、Ｂ．ｔ．毒素が試験サンプル中に存在するかどうかを判定するための免疫アッセイで使用することができる。
【０１１６】
プローブを使用する検出
本発明の毒素および遺伝子を同定するためのさらなる方法は、オリゴヌクレオチドプローブの使用による。これらのプローブは、ヌクレオチド配列を検出できる。これらの配列を、適切な放射性標識によって検出可能にすることができ、あるいは米国特許第６２６８１３２号中に記載のように本質的に蛍光性にすることができる。当技術分野で周知のように、プローブ分子および核酸サンプルが、２つの分子間で強力な塩基対形成結合を形成することによってハイブリッドを形成すると、プローブおよびサンプルが実質的に配列相同性を有することを、合理的に想定することができる。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、例えばＫｅｌｌｅｒおよびＭａｎａｋ（１９９３）の論文中に記載のような当技術分野で周知の技術によって厳密な条件下で実施される。プローブの検出は、ハイブリダイゼーションが起こったかどうかを既知の方式で判定する手段を提供する。このようなプローブ分析は、本発明の毒素をコードする遺伝子を同定するための迅速な方法を提供する。本発明によるプローブとして使用されるヌクレオチドセグメントは、ＤＮＡシンセサイザーおよび標準的手順を使用して合成することができる。これらのヌクレオチド配列は、また、本発明の遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマーとして使用することができる。
【０１１７】
ハイブリダイゼーション
分子生物学の当業者にとって周知であるように、２つの核酸の類似性は、それらのハイブリダイズする傾向によって特徴付けることができる。本明細書中で使用する場合、「厳密な条件」または「厳密なハイブリダイゼーション条件」という用語は、プローブがその標的配列に他の配列に比べて検出可能なより大きな程度まで（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍超）ハイブリダイズ（アニール）する条件を指すと解釈される。厳密な条件は、配列に依存し、環境により異なる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の厳密性を制御することによって、プローブに対して１００％相補的である標的配列を同定することができる（相同プロービング）。別法として、より低度の類似性を検出するように、厳密性の条件を、配列中の一部の不一致を認めるように調節することができる（非相同プロービング）。一般に、プローブは、約１０００未満のヌクレオチド長、好ましくは５００未満のヌクレオチド長である。
【０１１８】
典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．３で約１．５Ｍ未満のＮａイオン、典型的には約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（またはその他の塩）であり、温度は、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）で少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば、５０を超えるヌクレオチド）で少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件は、また、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加で達成することができる。典型的なストリンジェンシーが低い条件には、３７℃の３０％〜３５％ホルムアミドの緩衝溶液、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーション、および５０℃〜５５℃での１Ｘ〜２Ｘ  ＳＳＣ（２０Ｘ  ＳＳＣ＝３．０Ｍ  ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）中での洗浄が含まれる。典型的なストリンジェンシーが中等度の条件には、３７℃での、４０％〜４５％のホルムアミド、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、および５５℃〜６０℃での０．５Ｘ〜１Ｘ  ＳＳＣ中での洗浄が含まれる。典型的なストリンジェンシーが高い条件には、３７℃での５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、および６０℃〜６５℃での０．１Ｘ  ＳＳＣ中での洗浄が含まれる。任意選択で、洗浄緩衝液は、約０．１％〜約１％のＳＤＳを含むことができる。ハイブリダイゼーションの継続時間は、一般に、約２４時間未満、通常、約４〜約１２時間である。
【０１１９】
特異性は、典型的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、最も重要な因子は、最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの場合、熱融解温度（Ｔｍ）は、（規定のイオン強度およびｐＨの下で）相補性標的配列の５０％が、完全に一致したプローブにハイブリダイズする温度である。Ｔｍは、各１％の不一致に対し約１℃低下し、したがって、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション条件、および／または洗浄条件を調節して、所望の同一性をもつ配列のアニーリングを促進することができる。例えば、９０％を超える同一性を備えた配列を求めるなら、Ｔｍを１０℃下げることができる。一般に、厳密な条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで、特定の配列およびその相補配列に対するＴｍに比べて約５℃低いように選択される。しかし、高度に厳密な条件は、Ｔｍに比べて１℃、２℃、３℃または４℃より低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができ、中等度に厳密な条件は、Ｔｍに比べて６℃、７℃、８℃、９℃または１０℃より低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができ、ストリンジェンシーが低い条件は、Ｔｍに比べて１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃または２０℃より低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができる。
【０１２０】
Ｔｍ（℃）は、実験的に測定することができ、あるいは計算によって近似することができる。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの場合、Ｔｍは、ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌの式（１９８４）で近似することができる：
Ｔｍ（℃）＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ；
ここで、Ｍは一価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、％ホルムアミドはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、Ｌは塩基対中のハイブリッドの長さである。
【０１２１】
別法として、Ｔｍは、次式によって記述される（Ｂｅｌｔｚら、１９８３）。
Ｔｍ（℃）＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ホルムアミド）−６００／Ｌ
ここで、［Ｎａ＋］はナトリウムイオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、％ホルムアミドはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、Ｌは塩基対中のハイブリッドの長さである。
【０１２２】
該式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、および所望のＴｍを使用して、当業者は、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーの変更が本質的に記述されることを理解するであろう。所望の不一致度が、４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）未満のＴｍをもたらすなら、より高い温度を使用できるように、ＳＳＣ濃度を高めることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションへの完璧な指針が、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９５）の論文中およびその更新版に見出される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）の論文およびその更新版も参照されたい。
【０１２３】
サザンブロット上に固定化されたＤＮＡの放射能標識化された遺伝子特異的プローブとのハイブリダイゼーションは、標準的な方法によって実施することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同上）。ポリヌクレオチドプローブを標識化するのに使用される放射性同位体としては、３２Ｐ、３３Ｐ、１４Ｃ、または３Ｈを挙げることができる。放射性同位体のポリヌクレオチドプローブ分子中への組み込みは、分子生物学の分野の当業者にとって周知であるいくつかの方法のいずれかによって行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同上を参照されたい）。一般に、ハイブリダイゼーションおよびそれに続く洗浄は、要求される毒素をコードする遺伝子に対して相同性を有する標的配列の検出を可能にする厳密な条件下で実施することができる。二本鎖ＤＮＡ遺伝子プローブの場合、ハイブリダイゼーションは、６Ｘ  ＳＳＰＥ、５Ｘデンハート液、０．１％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬ変性ＤＮＡ中、ＤＮＡハイブリッドのＴｍより２０〜２５℃低い温度で一夜実施することができる［２０Ｘ  ＳＳＰＥは３Ｍ  ＮａＣｌ、０．２Ｍ  ＮａＨＰＯ４、および０．０２Ｍ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩）であり；１００Ｘデンハート液は、２０ｇ／Ｌポリビニルピロリドン，２０ｇ／Ｌ  Ｆｉｃｏｌｌ４００型、および２０ｇ／Ｌウシ血清アルブミン（分画Ｖ）である］。
【０１２４】
洗浄は、典型的には、次のように実施することができる：
１Ｘ  ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１５分間、２回（低ストリンジェンシーの洗浄）。
０．２Ｘ  ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中、Ｔｍ−２０℃で１５分間、１回（高ストリンジェンシーの洗浄）。
【０１２５】
オリゴヌクレオチドプローブの場合、ハイブリダイゼーションは、６Ｘ  ＳＳＰＥ、５Ｘデンハート液、０．１％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬ変性ＤＮＡ中、ハイブリッドのＴｍより１０℃〜２０℃低い温度で一夜実施することができる。オリゴヌクレオチドプローブのためのＴｍは、次式によって決定することができる（Ｓｕｇｇｓら、１９８１）。
Ｔｍ（℃）＝２（Ｔ／Ａ塩基対の数）＋４（Ｇ／Ｃ塩基対の数）
【０１２６】
洗浄は、典型的には、次のように実施することができる：
１Ｘ  ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１５分間、２回（低ストリンジェンシーの洗浄）。
１Ｘ  ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中、ハイブリダイゼーション温度で１５分間、１回（高ストリンジェンシーの洗浄）。
【０１２７】
塩濃度と温度との組合せのいくつかの例（ストリンジェンシーの増加順）は次の通りである：室温で２Ｘ  ＳＳＰＥまたはＳＳＣ；４２℃で１Ｘ  ＳＳＰＥまたはＳＳＣ；４２℃で０．１Ｘ  ＳＳＰＥまたはＳＳＣ；６５℃で０．１Ｘ  ＳＳＰＥまたはＳＳＣ。
【０１２８】
ハイブリダイゼーション用プローブ分子、およびプローブと標的分子との間で形成されるハイブリッド分子を、放射能標識化以外の手段によって検出できるようにすることができる。このような代わりの方法は、本発明の範囲に包含されると解釈される。
【０１２９】
本明細書に記載の実施例および実施形態は、単に例示の目的のためであること、およびそれらを考慮した種々の修正形態または変更は、当業者に対して示唆され、本出願の精神および範囲内に、ならびに添付の特許請求の範囲内に包含されることを理解されたい。
【０１３０】
特別に指摘または暗示しない限り、不定冠詞（ａ、ａｎ）および定冠詞（ｔｈｅ）は、本明細書中で使用する場合、「少なくとも１つ」を意味する。
【０１３１】
以下は、本発明を実施するための手順を例示する実施例である。これらの実施例を、限定と解釈すべきでない。特記しない限り、パーセンテージは、すべて重量によるものであり、溶媒混合物の比率は、すべて容積による。温度は、すべて摂氏温度である。
【実施例】
【０１３２】
〔実施例１〕
キメラＣｒｙ１Ｃａコア毒素およびＣｒｙ１Ａｂプロトキシンの設計
キメラ毒素。別のＣｒｙ毒素のプロトキシンセグメントに融合された１つのＣｒｙ毒素のコア毒素ドメインを利用するキメラタンパク質は、以前に、例えば米国特許第５５９３８８１号および米国特許第５９３２２０９号中に報告されている。Ｃｒｙ１Ｃａ３δエンドトキシンのタンパク質配列は、旧式の用語ＣｒｙＩＣ（ｂ）の下にＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ２２３４３として寄託されている。
【０１３３】
本発明のＣｒｙ１Ｃａキメラタンパク質変異体は、コア毒素セグメントの終端を越えたいくつかの箇所で異種δ−エンドトキシンプロトキシンセグメントに融合されたＣｒｙ１Ｃａ３殺虫性毒素に由来するＮ末端コア毒素セグメントを含む毒素を包含する。コア毒素から異種プロトキシンセグメントへの変異は、ほぼ本来のコア毒素／プロトキシンの結合点で起こることができ、あるいは代わりに、本来のプロトキシンの一部（コア毒素セグメントを越えて拡がる）を、下流中で起こる異種プロトキシンへの変異を伴って保持することができる。変異体の型式において、コア毒素およびプロトキシンセグメントは、それらが由来する本来の毒素のアミノ酸配列を正確に含んでいてもよく、あるいは互いに融合された場合に該セグメントの生物学的機能を縮小せず、増強する可能性もあるアミノ酸の付加、欠失または置換を含むことができる。
【０１３４】
例えば、本発明のキメラ毒素は、Ｃｒｙ１Ｃａ３に由来するコア毒素セグメントおよび異種プロトキシンを含む。本発明の好ましい実施形態において、Ｃｒｙ１Ｃａ３に由来し、配列番号１のＣｒｙ１Ｃａコア毒素セグメント（６１９個のアミノ酸）として開示されているコア毒素セグメントは、Ｃｒｙ１Ａｂδ−エンドトキシンに由来するプロトキシンセグメントを含む異種セグメントに融合される。配列番号２は、Ｃｒｙ１Ａｂに由来し、本発明のＣｒｙ１Ｃａ変異体で有用な１つのプロトキシンセグメントの５４５個のアミノ酸の配列を開示する。本発明のキメラ毒素中に含めることが重要である、配列番号２のこのプロトキシンセグメントの末尾の約１００〜１５０個のアミノ酸が注目される。したがって、本発明の好ましい実施形態は、配列番号１として開示されたＣｒｙ１Ｃａコア毒素セグメントが配列番号２中で開示されたようなＣｒｙ１Ａｂに由来するプロトキシンセグメントに連結されているキメラタンパク質を含む。本明細書中でＤＩＧ−１５２と呼ばれるキメラタンパク質の１１６４個のアミノ酸配列は、配列番号３として開示される（ｐＭＹＣ２５４７バージョン）。本発明の第２の好ましい実施形態は、配列番号１として開示されたＣｒｙ１Ｃａコア毒素セグメントが、配列番号４に示すようなＣｒｙ１Ａｂに由来する、アミノ酸が５４５個の第２のプロトキシンセグメントに連結されているキメラタンパク質を含む。本発明のキメラ毒素中に含めることが重要であるこのプロトキシンセグメントの末尾の約１００〜１５０個のアミノ酸が注目される。ＤＩＧ−１０９と呼ばれる第２キメラタンパク質の１１６４個のアミノ酸の配列は、配列番号５（トウモロコシに対して最適化されたバージョン）として開示される。Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素変異体およびＣｒｙ１Ａｂに由来するプロトキシンを含むその他のキメラ融合は、本発明の範囲に包含されることを理解されたい。
【０１３５】
配列番号２および配列番号４で示されるようなＣｒｙ１Ａｂに由来するプロトキシンセグメントは、本質的には互いに機能的に同等であり、１つの（第１）位置でのみ配列を異にすることに留意されたい。
【０１３６】
〔実施例２〕
Ｃｒｙ１Ｃａコア／Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンのキメラタンパク質をコードする発現プラスミドの構築およびシュードモナス（Pseudomonas）中での発現
Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンに融合されたＣｒｙ１Ｃａコアから構成される完全長キメラタンパク質（ＤＩＧ−１５２、配列番号３）を産生するように遺伝子操作された、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）（Ｐｆ）発現構築体ｐＭＹＣ２５４７の構築では、標準的なクローニング法［例えば、Sambrookら、(1989)およびAusubelら、(1995)、およびこれらの更新版中に記載のような］を使用した。タンパク質の産生は、米国特許第５１６９７６０号中に開示のように、改変されたｌａｃオペロンの挿入を有するシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）株ＭＢ２１４（株ＭＢ１０１の誘導体；Ｐ．フルオレセンス（P.fluorescens）次亜種Ｉ）中で実施した。基本的なクローニング戦略は、ＤＩＧ−１５２をコードするＤＮＡ断片をプラスミドベクター中にサブクローニングすることを必要とし、それによって、それは、ＰｔａｃプロモーターおよびプラスミドｐＫＫ２２３−３（ＰＬ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ウィスコンシン州）からのｒｒｎＢＴＩＴ２ターミネーターの発現調節下に置かれる。１つのこのようなプラスミドは、ｐＭＹＣ２５４７と命名され、このプラスミドを抱えるＭＢ２１４分離株はＤｐｆ１０８と命名される。
【０１３７】
振盪フラスコ中での増殖および発現の解析。特徴付けおよび昆虫でのバイオアッセイのためのＤＩＧ−１５２タンパク質の製造は、振盪フラスコ中で増殖させたＰ．フルオレセンス（P.fluorescens）株Ｄｐｆ１０８によって完遂された。Ｐｔａｃプロモーターによって駆動されるＤＩＧ−１５２タンパク質の製造は、米国特許第５５２７８８３号に以前に記載のように実施した。振盪しながらの３０℃で２４時間の初期インキュベーションの後に、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって発現を誘導した。培養物を、誘導の時点および誘導後の異なる時点でサンプリングした。細胞密度を、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）によって測定した。
【０１３８】
振盪フラスコ中のサンプルの細胞分画およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。各サンプリングの時点で、サンプルの細胞密度をＯＤ６００＝２０に調節し、１ｍＬのアリコートを１４０００×ｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを−８０℃で凍結した。凍結された振盪フラスコ内細胞ペレットサンプルからの溶性および不溶性画分を、ＥａｓｙＬｙｓｅ（商標）細菌タンパク質抽出溶液（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）を使用して作り出した。各細胞ペレットを、１ｍＬのＥａｓｙＬｙｓｅ（商標）溶液に再懸濁し、さらに溶解緩衝液中に１：４で希釈し、振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。溶菌液を、４℃、１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清液を溶性画分として回収した。次いで、ペレット（不溶性画分）を等容積のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）に再懸濁した。
【０１３９】
サンプルを、β−メルカプトエタノールを含む２Ｘ  Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液（Sambrookら、同上）と１：１で混合し、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＸＴ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  １２％ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア州）に挿入するに先立って５分間沸騰させた。推奨されたＸＴ  ＭＯＰＳ緩衝液中で電気泳動を実施した。ゲルを、製造業者（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のプロトコールに従ってＢｉｏ−Ｓａｆｅクーマシー染色液で染色し、Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｉｍａｇｉｎｇシステム（Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ、カリフォルニア州）を使用して画像化した。
【０１４０】
封入体の調製。ＤＩＧ−１５２タンパク質封入体（ＩＢ）の調製は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分光測定法）によって立証されるように、不溶性Ｂ．ｔ．殺虫性タンパク質を産生するＰ．フルオレセンス（P.fluorescens）発酵からの細胞で実施した。Ｐ．フルオレセンス（P.fluorescens）発酵のペレットを、３７℃の水浴中で解凍した。細胞を、溶菌緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）二ナトリウム塩、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、５ｍＬ／Ｌの細菌プロテアーゼ阻害剤カクテル（カタログ番号Ｐ８４６５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）を使用直前に添加した）中に２５％ｗ／ｖまで再懸濁した。細胞を、最低に設定した携帯型ホモジナイザー（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅａｒｏｒ、ＢｉｏＳｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．、Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ、オクラホマ州）を使用して懸濁した。細胞懸濁液にリゾチーム（２５ｍｇのＳｉｇｍａ  Ｌ７６５１、チキン卵白由来）を、金属スパチュラで混合しながら添加し、懸濁液を室温で１時間インキュベートした。懸濁液を、氷上で１５分間冷却し、次いで、Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ２５０（１分の持続期間で２回、動作周期５０％、出力３０％）を使用して超音波処理した。細胞溶菌は、顕微鏡法でチェックした。必要に応じて、さらなる２５ｍｇのリゾチームを添加し、インキュベーションおよび超音波処理を繰り返した。細胞溶菌を顕微鏡法で確認した後、溶菌液を１１，５００×ｇで２５分間（４℃）遠心分離して、ＩＢペレットを形成し、上清液を廃棄した。ＩＢペレットを、１００ｍＬの溶菌緩衝液で再懸濁し、携帯型ミキサーでホモジナイズし、上記のように遠心分離した。ＩＢペレットを、上清液が無色になり、かつＩＢペレットが硬くオフホワイト色になるまで、再懸濁（５０ｍＬの溶菌緩衝液中に）、ホモジナイズ、超音波処理、および遠心分離によって反復洗浄した。最終洗浄では、ＩＢペレットを、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む滅菌濾過（０．２２μｍ）蒸留水中に再懸濁し、遠心分離した。最終ペレットを、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む滅菌濾過蒸留水中に再懸濁し、１ｍＬアリコートの状態で、−８０℃で貯蔵した。
【０１４１】
ＩＢ調製物中のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および定量を、ＩＢペレットの１ｍＬアリコートを解凍すること、および滅菌濾過蒸留水で１：２０に希釈することによって実施した。希釈されたサンプルを、次いで、４Ｘ還元サンプル緩衝液［２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８、４０％グリセロール（ｖ／ｖ）、０．４％ブロモフェノールブルー（ｗ／ｖ）、８％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）、および８％β−メルカプトエタノール（ｖ／ｖ）］と共に煮沸し、１Ｘ  Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳ緩衝液（ＢｉｏＲａｄ）で展開される、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシン、１２＋２ウェルゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。ゲルを、２００ボルトで６０分間展開し、次いでクーマシーブルー（４５％メタノール、１０％酢酸中の５０％Ｇ−２５０／５０％Ｒ−２５０）で染色し、蒸留水中の７％酢酸、５％メタノールで脱染した。標的バンドの定量化は、該バンドの濃度測定値を、標準曲線を作出するために同一ゲル上で展開されたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準サンプルに対比して行った。
【０１４２】
封入体の可溶化。ＰｆクローンＤＰｆ１０８からのＤＩＧ−１５２封入体懸濁液６ｍＬを、最高に設定したＥｐｐｅｎｄｏｒｆモデル５４１５Ｃ微量遠心管で遠心分離（ほぼ１４０００×ｇ）して封入体をペレットにした。貯蔵緩衝液の上清液を除去し、５０ｍＬコニカル管中、２５ｍＬの１００ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１）で置き換えた。封入体を、ピペットを使用して再懸濁し、渦撹拌して完全に混合した。管を、静かに揺れる台上に４℃で一夜載せ、標的タンパク質を抽出した。抽出物を、４℃、３０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、生じた上清液を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５再生セルロース遠心フィルター装置（３０，０００の分子量カットオフ；Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を使用して５分の１に濃縮した。次いで、サンプル緩衝液を、使い捨てのＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州）を使用して１０ｍＭ  ＣＡＰＳ［３−（シクロヘキサミノ）１−プロパンスルホン酸］、ｐＨ１０に変更した。
【０１４３】
封入体タンパク質の可溶化およびトリプシンでの活性化。一部の例において、ＰｆクローンＤＰｆ１０８からのＤＩＧ−１５２封入体の懸濁液を、最高に設定したＥｐｐｅｎｄｏｒｆモデル５４１５Ｃ微量遠心管で遠心分離（ほぼ１４０００×ｇ）して封入体をペレットにした。貯蔵緩衝液の上清液を除去し、１００ｍＭのＣＡＰＳ（ｐＨ１１）で置き換えて、ほぼ５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得た。チューブを室温で３時間揺り動かして、タンパク質を完全に可溶化した。トリプシンを５％〜１０％（ｗ：ｗ、ＩＢ粉末の初期重量を基準にして）に等しい量で添加し、４℃で一夜揺動しながらの、または室温で９０〜１２０分間揺り動かすことによるインキュベーションによって消化を完遂した。不溶性材料を、１０，０００×ｇで１５分間遠心分離することによって除去し、上清液を、ＭｏｎｏＱアニオン交換カラム（１０ｍｍ×１０ｃｍ）にかけた。活性化されたＤＩＧ−１５２タンパク質を、カラム容積の２５倍を超える０％〜１００％の１Ｍ  ＮａＣｌでの勾配で溶離した（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判定されるように、後記参照）。活性化されたタンパク質を含む画分をプールし、必要に応じて、前記のようなＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５再生セルロース遠心濾過装置を使用して１０ｍＬ未満まで濃縮した。次いで、材料を、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む緩衝液でＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（１６ｍｍ×６０ｃｍ）に通した。活性化された（酵素的に切断された）タンパク質が６５〜７０ｍＬで溶離することがＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析よって判定された。活性化されたタンパク質を含む画分をプールし、前記のような遠心濃縮装置を使用して濃縮した。
【０１４４】
ゲル電気泳動。電気泳動のために、濃縮されたタンパク質調製物を、還元剤として５ｍＭ  ＤＴＴを含むＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１：５０に希釈することによって調製し、９５℃で４分間加熱した。サンプルを、０．２μｇ〜２μｇ／レーンの範囲の５つのＢＳＡ標準（標準曲線の作出のため）と並んで、４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲルの二つ組みレーンに挿入した。ＭＯＰＳ  ＳＤＳ展開緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、追跡用色素がゲルの底部に到達するまで、２００Ｖの電圧を印加した。ゲルを、４５％メタノール、１０％酢酸中の０．２％クーマシーブルーＧ−２５０で染色し、まず４５％メタノール、１０％酢酸で簡単に、次いで７％酢酸、５％メタノールで、背景が澄明になるまで十分に脱染した。脱染に続いて、ゲルをＢｉｏＲａｄ  Ｆｌｕｏｒ−Ｓ  ＭｕｌｔｉIｍａｇｅｒで走査した。装置のＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェア  ｖ．４．５．２を使用して、染色されたタンパク質バンドの背景控除容積を得てＢＳＡ標準曲線を作出し、その曲線を使用して原液中のキメラＤＩＧ−１５２タンパク質の濃度を計算した。
【０１４５】
〔実施例３〕
シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）中で産生されるＤＩＧ−１５２タンパク質の殺虫活性
ＤＩＧ−１５２タンパク質の殺虫活性は、ユーロピアンコーンボーラー（ＥＣＢ；オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）（Ｈｕｂｎｅｒ））、Ｃｒｙ１Ｆ抵抗性ＥＣＢ（ｒＥＣＢ）、コーンイアーワーム（ＣＥＷ；ヘリコベルパ・ゼア（Helicoverpa zea）（Ｂｏｄｄｉｅ））、ブラックカットワーム（ＢＣＷ；アグロチス・イプシロン（Agrotis ipsilon）（Ｈｕｆｎａｇｅｌ））、フォールアームーワーム（ＦＡＷ；スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（Ｊ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ））、Ｃｒｙ１Ｆ抵抗性ＦＡＷ（ｒＦＡＷ）、およびサウスウェスターンコーンボーラー（ＳＷＣＢ；ジアロラエ・グランジオセラ（Diatraea grandiosella））を含む鱗翅目種に関して立証された。
【０１４６】
サンプルの調製およびバイオアッセイ。封入体調製物（本来の完全長タンパク質またはトリプシンで活性化されたタンパク質）を、透析またはＰＤ−１０カラムなどの交換方法によって、１０ｍＭ  ＣＡＰＳ（ｐＨ１０）緩衝液に移した。次いで、サンプルを、１０ｍＭ  ＣＡＰＳ（ｐＨ１０）で適切に希釈し、すべてのバイオアッセイに、この緩衝液からなる対照処理を含めた。この対照処理は、死亡率または成長阻害に関するバックグラウンドのチェックとして役立った。
【０１４７】
前記のようなＢｉｏＲａｄ画像化システムを使用して測定されるゲルデンシトメトリー用の標準曲線を作り出すために、ＢＳＡを使用するゲル電気泳動によって、バイオアッセイ緩衝液中のタンパク質濃度を推定した。ゲルマトリックス中のタンパク質を、クーマシーブルーをベースにした染色液で染色し、読取り前に脱染した。
【０１４８】
精製されたタンパク質を、殺虫活性について、人工昆虫飼料の新生鱗翅目幼虫を用いて実施されるバイオアッセイで試験した。ＥＣＢ、ＣＥＷ、ＢＣＷ、ＦＡＷ、およびＳＷＣＢの幼虫を、商業的昆虫飼育場（Ｂｅｎｚｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｉｓｌｅ、ペンシルベニア州）によって養育されたコロニーから入手した卵から孵化させた。ｒＥＣＢおよびｒＦＡＷの幼虫は、所有コロニー（Ｄｏｗ  ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、インディアナ州）から集めた卵から孵化させた。
【０１４９】
バイオアッセイは、昆虫でのバイオアッセイ用に特別に設計された１２８ウェルのプラスチックトレー（Ｃ−Ｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｐｉｔｍａｎ、ニュージャージー州）中で実施した。各ウェルには、１．０ｍＬの多種用鱗翅目飼料（Ｓｏｕｔｈｌａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｌａｋｅ  Ｖｉｌｌａｇｅ、アーカンサス州）を入れた。各ウェルの１．５ｃｍ２の飼料表面上にピペットで４０μＬアリコートのタンパク質サンプル（すなわち、２６．７μＬ／ｃｍ２）を送達した。飼料の濃度は、ウェル中の表面積の平方センチメートル当たりのＤＩＧ−１５２タンパク質の量（ｎｇ）として計算した。処理されるトレーは、飼料表面上の液体が蒸発、または飼料中に吸収されるまで換気フード中に保存した。
【０１５０】
孵化の数時間以内に、個々の幼虫を湿らせたラクダ毛ブラシで拾い上げ、ウェル毎に１幼虫を、処理された飼料上に置いた。次いで、寄生されたウェルを、透明プラスチックの粘着シート（Ｃ−Ｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で密封し、ガス交換を可能にするため穴を開けた。バイオアッセイトレーを、調節された環境条件［２８℃、相対湿度（ＲＨ）約４０％、１６時間：８時間（明：暗）］下に５日間保存した後、各タンパク質サンプルに曝露された昆虫の総数、死亡昆虫数、および生き残り昆虫の重量を記録した。各処理について、パーセント死亡率およびパーセント成長阻害を計算した。パーセント成長阻害（ＧＩ）は、次の通り計算した：
％ＧＩ＝［１−（ＴＷＩＴ／ＴＮＩＴ）／（ＴＷＩＢＣ／ＴＮＩＢＣ）］×１００
ここで、
ＴＷＩＴは、その処理における昆虫の総重量であり、
ＴＮＩＴは、その処理における昆虫の総数であり、
ＴＷＩＢＣは、バックグラウンドチェック（緩衝液対照）における昆虫の総重量であり、
ＴＮＩＢＣは、バックグラウンドチェック（緩衝液対照）における昆虫の総数である。
【０１５１】
ＧＩ５０は、％ＧＩ値が５０となる飼料中のキメラＤＩＧ−１５２タンパク質の濃度であると定めた。ＬＣ５０（５０％致死濃度）を、試験昆虫の５０％が死滅する飼料中のＤＩＧ−１５２タンパク質濃度として記録した。ＪＭＰソフトウェア（ＳＡＳ、Ｃａｒｙ、ノースカロナイナ州）を使用して統計解析（一方向ＡＮＯＶＡ）を行った。
【０１５２】
表３は、７種の試験昆虫幼虫に関するＤＩＧ−１５２タンパク質の摂取バイオアッセイの結果を示す。
【０１５３】
【表３】
2013514772.tif 000004
【０１５４】
フォールアーミーワーム（スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda））およびサウスウェスターンコーンボーラー（ジアトラエア・グランジオセラ（Diatraea grandiosella））の新生幼虫の成長が、ＤＩＧ−１５２タンパク質の摂取後に阻害されることは、本発明のＤＩＧ−１５２タンパク質の特徴である。さらに、Ｃｒｙ１Ｆによる中毒に対して抵抗性であるフォールアーミーワームの幼虫は、野生型フォールアーミーワームの幼虫と同様にＤＩＧ−１５２の活性に対して感受性を有する。
【０１５５】
〔実施例４〕
シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）中で産生されるＤＩＧ−１５２タンパク質のさらなる殺虫活性
ＤＩＧ−１５２タンパク質（トリプシンで活性化されていない）の鱗翅目殺虫活性は、さらに、飼料組込み法を利用する用量−反応実験において、シュガーケーンボーラー（ＳＣＢ；ジアトラエア・サッカラリス（Diatraea saccharalis））およびＣｒｙ１Ａｂ抵抗性ＳＣＢ（ｒＳＣＢ）の新生幼虫について立証された。ＤＩＧ−１５２封入体を、７．５ｍＬの１００ｍＭ  ＣＡＰＳ（ｐＨ１１）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中、４℃で４時間静かに揺動することによって可溶化し、それに、２００μＬの細菌プロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ  Ｐ４８６５；供給業者の説明書により調製された）を添加した。不溶性材料をペレット化するための遠心分離に続いて、原液のタンパク質濃度を、１００ｍＭ  ＣＡＰＳ（ｐＨ１１）中、４．０ｍｇ／ｍＬに調整した。昆虫でのバイオアッセイの場合、０．０３０μｇ〜１０２μｇ／飼料（ｇ）のＤＩＧ−１５２タンパク質濃度は、１２８−セルトレー（Ｂｉｏ−Ｂａ−１２８、Ｃ−Ｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の個々のセル中にほぼ０．７ｍＬの飼料を分配する直前に、適切な量をメリディック飼料（meridic diet）（Ｂｉｏ−Ｓｅｒｖ、Ｆｒｅｎｃｈｔｏｗｎ、ニュージャージー州）と混合することによって準備した。
【０１５６】
トリプシンで活性化されたＣｒｙ１Ａｂタンパク質（殺虫活性に関する陽性対照として使用される）を、０．０３１２５μｇ〜３２μｇ／飼料（ｇ）（飼料調製の前に凍結乾燥粉末を適切な量の蒸留水と混合することによって調製された）の範囲で試験した。
【０１５７】
蒸留水（ブランク対照、Ｃｒｙ１Ａｂの試験用）または緩衝液（１００ｍＭ  ＣＡＰＳ、ｐＨ１１、ＤＩＧ−１５２の試験用）のみで調製された飼料を、対照処理として使用した。Ｄ．サッカラリス（D.saccharalis）の１つの新生幼虫（孵化後２４時間未満）を各セル中の飼料表面上に放出した。幼虫播種の後、セルを、穴を開けた蓋（Ｃ−Ｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で覆い、バイオアッセイトレーを、２８℃、５０％ＲＨ、および１６時間：８時間（明：暗）の光周期に維持された環境チャンバー中に配置した。幼虫死亡率、幼虫重量、重量増加を示さなかった（幼虫につき０．１ｍｇ未満）生き残り幼虫の数を、播種の７日後に記録した。昆虫系統／Ｃｒｙタンパク質濃度の各組合せを、各繰り返しにおいて１６〜３２頭の幼虫を用いて、４回繰り返した。
【０１５８】
幼虫死亡率の判定基準は、死亡（病的）幼虫、および有意な体重増加を示さなかった（すなわち、幼虫当たり０．１ｍｇ未満）生き残り（発育を阻害された、摂食しない）幼虫の双方を考慮に入れた「実質的」死亡率として評定した。処理中の幼虫の実質的死亡率は、次式を使用して計算した：
実質的死亡率（％）＝［ＴＤＳ／ＴＮＩＴ］×１００
ここで、ＴＤＳは、死亡幼虫の総数＋発育を阻害された幼虫数であり、ＴＮＩＴは、処理中の昆虫の総数である。
【０１５９】
各Ｄ．サッカラリス（D.saccharalis）系統の「実質的」死亡率（以後、死亡率と簡略化する）を、Ｃｒｙ１Ａｂ処理に続く結果を分析するための水ブランク対照飼料、またはＤＩＧ−１５２処理のための緩衝液のみで処理された飼料に関して観察された幼虫死亡率に対して補正した。
【０１６０】
用量反応実験の結果を、さらに分析して、ＧＩ５０値［すなわち、幼虫成長阻害（％ＧＩ）値が５０になる、飼料中のＢ．ｔ．タンパク質の濃度］を確立した。Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質を含む飼料に関する幼虫の％ＧＩ値を、次式を使用して計算した：
％ＧＩ＝［ＴＷＣ−ＴＷＴ］／ＴＷＣ×１００
ここで、ＴＷＣは、水対照飼料で給餌されている幼虫の総体重であり、ＴＷＴは、Ｃｒｙ１Ａｂ処理飼料で給餌されている幼虫の総体重であり、一方、ＤＩＧ−１５２タンパク質摂取の結果としての幼虫の％ＧＩを分析するには、次式を使用して計算した：
％ＧＩ＝［ＴＷＢ−ＴＷＴ］／ＴＷＢ×１００
ここで、ＴＷＢは、緩衝液のみの対照処理飼料で給餌されている幼虫の総体重であり、ＴＷＴは、ＤＩＧ−１５２処理飼料で給餌されている幼虫の総体重である。
【０１６１】
１００％の幼虫成長阻害は、有意な体重増加（幼虫につき０．１ｍｇ未満）を有する幼虫が存在しない場合に繰返しに割り当てられた。成長阻害データを、昆虫系統およびＣｒｙタンパク質濃度を２つの主要因子とした二方向ＡＮＯＶＡを使用して解析した。ＬＳＭＥＡＮＳ検定を使用して、α＝０．０５のレベルでの処理差を判定した。
【０１６２】
ジアトラエア・サッカラリス（Diatraea saccharalis）幼虫での飼料組込みバイオアッセイの結果を表４に示す。
【０１６３】
【表４】
2013514772.tif 000005
【０１６４】
データ解析。補正した用量／死亡率データを、次いで、５０％死亡率（ＬＣ５０）値および対応する９５％信頼区間（ＣＩ）をもたらす処理タンパク質濃度を決定するためのプロビット分析に供した。プロビット分析で使用する処理には、ゼロ死亡率をもたらした最高濃度、１００％死亡率をもたらした最低濃度、およびそれらの極値間のすべての結果を含めた。抵抗率を、ｒＳＣＢ系統のＬＣ５０値をＳＣＢ昆虫のそれで割ることによって計算した。致死量の比率の検定を使用して、抵抗率がα＝０．０５のレベルで有意であるかどうかを判定した。また、二元ＡＮＯＶＡを使用して、死亡率データを解析し、続いて、α＝０．０５のレベルでのＬＳＭＥＡＮＳ検定を使用して処理差を判定した。解析の結果を表５に示す。
【０１６５】
【表５】
2013514772.tif 000006
【０１６６】
同様の生物学的応答を与える活性化されたＣｒｙ１Ａｂタンパク質のそれに類似したレベルでのＤＩＧ−１５２タンパク質の摂取のあとに、新生シュガーケーンボーラー（Diatraea saccharalis）幼虫の成長を阻害する、または幼虫を死滅させることは、本発明のＤＩＧ−１５２タンパク質の特徴である。さらに、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質の毒性効果に対して抵抗性であるジアトラエア・サッカラリス（Diatraea saccharalis）幼虫が、それにもかかわらず、ＤＩＧ−１５２タンパク質の毒性作用に対して感受性であることは、ＤＩＧ−１５２タンパク質の特徴である。
【０１６７】
〔実施例５〕
キメラＣｒｙ１Ｃａタンパク質に対して免疫反応性のあるウサギポリクローナルおよびマウスモノクローナル抗体の産生
例えば本発明のタンパク質を産生する遺伝子導入植物から調製された抽出物中でキメラＣｒｙ１Ｃａタンパク質およびキメラＣｒｙ１Ｃａタンパク質の変異体を検出および定量するための抗体を開発した。抗体を特徴付けるのに、およびＢ．ｔ．タンパク質を検出するために、標準的な免疫ブロットの調製／分析方法およびＥＬＩＳＡ法を使用した（例えば、Coliganら、2007およびその更新版中で教示されているように）。
【０１６８】
ポリクローナル抗体の製造。ポリクローナル免疫処置に使用するタンパク質抗原は、実施例２中で教示したようなＰ．フルオレセンス（P.fluorescens）細胞中で産生されたＤＩＧ−１５２タンパク質から調製されたトリプシンで切断されたコア毒素とした。加えて、Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素セグメントに特異的な２つのペプチドを、キーホールリンペットヘモシアニンに接合し、免疫原として使用した。該ペプチドは、配列番号１のアミノ酸４３６〜４４５（ＶＱＲＳＧＴＰＦＬＴ；Ｃｒｙ１Ｃａ４３６；配列番号６）およびアミノ酸５９１〜６００（ＳＥＱＰＬＦＧＡＧＳ；Ｃｒｙ１Ｃａ５９１；配列番号７）に相当した。これらのペプチド配列は、Ｃｒｙ１Ｃａのタンパク質配列をいくつかの他のクラスのＣｒｙ１Ｂ．ｔ．タンパク質の配列と比較した場合、Ｃｒｙ１Ｃａに特有であると確認された。さらに、該ペプチドは、本来のＣｒｙ１Ｃａタンパク質の表面上に露出されると予想される。
【０１６９】
免疫処置および血清採取は、契約業者が標準的手順で実施した。ポリクローナル抗体は、Ｃｏｖａｎｃｅ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ニュージャージー州）を介して入手した。ニュージーランドホワイト種ウサギを使用して、トリプシンで活性化されたＤＩＧ−１５２タンパク質に対するポリクローナル抗体を産生させた。免疫処置と血清採取との間に１４日のサイクル時間を利用した。投与は、０．５ｍｇのタンパク質または共役ペプチドを含むフロインド完全アジュバントを用いて開始した。その後の注入液は、不完全フロインドアジュバントを用いて調製した。
【０１７０】
２羽のウサギからの血清を合わせて、Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質と反応性のある単一ロットのタンパク質Ａ精製抗体（ＤＩＧ１５２ＲＰＣ１と名づける）を製造した。抗体の特徴付けの分野の当業者にとって周知のように、無傷のタンパク質に対して作出されたポリクローナル抗体は、一般に、極度に特異的ではなく、しばしば、免疫化するタンパク質およびその他の関連タンパク質上の多くのエピトープを検出する。したがって、免疫ブロット分析は、ＤＩＧ１５２ＲＰＣ１が他のＣｒｙ１−クラスのＢ．ｔ．毒素、特に、トリプシンで活性化されたＣｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｄａ、およびＣｒｙ１Ｆａ、ならびにキモトリプシンで活性化されたＣｒｙ１ＢｅおよびＣｒｙ１Ｅａを検出することを明らかにした。商業的背景において、農作物植物は、他のＣｒｙ１−クラスのタンパク質を産生することができ、したがって、ＤＩＧ１５２ＰＲＣ１は、タンパク質の切断およびその他形態を含むこれらのタンパク質を検出するのに有用な試薬になる。
【０１７１】
ウサギポリクローナル抗体の２つの共役ペプチドに特異的なロットを、Ｃｒｙ１Ｃａのために開発した。２羽のニュージーランドホワイト種ウサギを、各ペプチドに関して使用し、各ペプチドに関して血清をプールし、２つのペプチドのそれぞれに関して１ロットのペプチド抗体を得た。免疫処置および血清採取は、免疫処置と血清採取との間に１４日のサイクル期間を設け、標準的手順によって実施した。最終ロットの血清を、対応するペプチドとの親和性で精製した。双方のペプチド−特異的抗体の直接ＥＬＩＳＡによる評価は、ペプチドＣｒｙ１Ｃａ５９１に対する抗体が、他のＣｒｙ１クラスのタンパク質との反応と比較した場合Ｃｒｙ１Ｃａを特異的に検出し、一方、ペプチドＣｒｙ１Ｃａ４３６に対する抗体は特異的でないことを明らかにした（表６）。
【０１７２】
【表６】
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【０１７３】
モノクローナル抗体の製造。モノクローナル抗体は、Ｏｐｅｎ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、アラバマ州）によって調製された。マウス抗Ｃｒｙ１Ｃａモノクローナル抗体の開発は、実施例２に記載のようなＰ．フルオレセンス（P.fluorescens）細胞中で産生されたＤＩＧ−１５２タンパク質から調製された、トリプシンで切断されたコア毒素を使用した。免疫処置および細胞株の開発は、腹水産生法ではなく細胞培養における標準的な抗体開発法によって実施した。モノクローナル細胞株は、免疫されたマウスの脾臓細胞を適合性のあるＮＤ４マウス骨髄腫細胞株と融合することによる標準的手順で開発した。
【０１７４】
直接結合ＥＬＩＳＡスクリーニングは、マウスＭ４血清を、Ｃｒｙ１Ｃａタンパク質に対してかなりの特異性を有すると認定した（表７）。
【０１７５】
【表７】
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【０１７６】
すべてのＭ４由来モノクローナル株を、Ｃｒｙ１Ｃａ、Ｃｒｙ１Ｄａ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ｆａ、Ｃｒｙ１Ｂｅ、およびＣｒｙ１Ａｂに対する結合について直接結合ＥＬＩＳＡで試験した。Ｃｒｙ１Ｃａを検出する［すなわち、高い光学密度（ＯＤ）の読みを与える］が、他のＣｒｙ１クラスのタンパク質を検出しない[すなわち、ＯＤの読みを与えない、または非常に低いＯＤの読みを与える]能力が立証されたＭ４−３４およびＭ４−２３株は、とりわけ重要である（表８）。好ましいＭ４−３４株からのモノクローナル抗体は、抗体ＤＩＧ１５２ＭａｂＭ４−３４と呼ばれる。
【０１７７】
【表８】
2013514772.tif 000009
【０１７８】
したがって、切断型Ｃｒｙ１Ｃａ  Ｂ．ｔ．タンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体を提供することは、本発明の主題である。
【０１７９】
〔実施例６〕
ＤＩＧ−１０９タンパク質をコードする、トウモロコシのコドンに対して最適化された配列の設計
植物分子生物学に関わる当業者は、単一のアミノ酸配列をコードするのに、複数のＤＮＡ配列を設計することができることを理解するであろう。対象のタンパク質のためのコード領域の発現を増大させることの一般的意味は、そのコドン組成が、遺伝子を発現するように運命付ける宿主の全コドン組成に似ているような方式で、該コード領域を仕立てることである。合成遺伝子の設計および製造に関する指針は、例えば、国際公開第１９９７／１３４０２号および米国特許第５３８０８３１号中に見出すことができる。
【０１８０】
トウモロコシのコドン偏位を有するＤＮＡ配列を、遺伝子導入単子葉植物中で殺虫性ＤＩＧ−１０９キメラタンパク質を産生するように設計し、合成した。トウモロコシ（Zea mays L.）に関するコドン使用頻度表を、ＧｅｎＢａｎｋに寄託された配列から得られる７０６のタンパク質コード配列から計算した（www.ncbi.nlm.nih.gov）。トウモロコシの重量平均コドンセットを、アミノ酸の総コドン使用数の約１０％未満で使用される任意の冗長コドンを削除した後に計算した。各コドンについての重量平均表示は、次式を使用して計算した：
Ｃ１の重量平均％＝１／（％Ｃ１＋％Ｃ２＋％Ｃ３＋など）×％Ｃ１×１００
ここで、Ｃ１は、当該コドンであり、％Ｃ２、％Ｃ３などは、残りの同義コドンの平均％使用頻度値を表す。
【０１８１】
配列番号５のＤＩＧ−１０９タンパク質の１１６４個のアミノ酸をコードする、トウモロコシのコドンに対して最適化されたＤＮＡ配列を得るために、Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素セグメントをコードする本来のＣｒｙ１ＣａのＤＮＡ配列に対するコドン置換を、得られるＤＮＡ配列が、トウモロコシに対して最適化されたコドン偏位表の全コドン組成を有するように調製した。類似の方式で、配列番号４のＣｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントをコードする本来のＣｒｙ１ＡｂのＤＮＡ配列に対するコドン置換を、得られるＤＮＡ配列が、トウモロコシに対して最適化されたコドン偏位表の全コドン組成を有するように調製した。植物細胞中のコード領域の望ましくない制限酵素認識部位、潜在的植物イントロンスプライス部位、Ａ／ＴまたはＣ／Ｇ残基の長い並び、およびＲＮＡの安定性、転写、または翻訳を妨害する可能性のあるその他のモチーフを排除するために、配列に対するさらなる純化を行った。所望される制限酵素認識部位を導入するために、および長い内部オープン読取り枠（＋１以外のフレーム）を排除するために、その他の変更を行った。これらの変更は、すべて、トウモロコシに対して偏位されたコドン組成をほぼ維持するという制約内で行われた。ＤＩＧ−１０９タンパク質をコードする、トウモロコシのコドンに対して最適化された完全配列は、配列番号８として開示される。配列番号８に相当するＤＮＡ断片の合成は、コマーシャルベンダー（ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、カリフォルニア州）によって実施された。
【０１８２】
〔実施例７〕
ＤＩＧ−１０９タンパク質をコードする植物で発現可能な遺伝子を含む植物形質転換ベクターの構築
単子葉植物宿主の形質転換には、アグロバクテリウム（Agrobacterium）スーパーバイナリー系（日本たばこ、東京、日本）を好都合には使用した。該スーパーバイナリー系は、複数のクローニング部位で分離された右Ｔ−ＤＮＡボーダー反復（ＲＢ）および左Ｔ−ＤＮＡボーダー反復（ＬＢ）のための配列を含むｐＳＢ１１シャトルベクタープラスミドを採用する。ｐＳＢ１１の誘導体（ｐＤＡＢ７６９１と呼ばれる）を、標準的なＤＮＡクローニング法によって調製した。プラスミドｐＤＡＢ７６９１は、トウモロコシのユビキチン１プロモーターの関連イントロン１（米国特許第５５１０４７４号）およびトウモロコシＰｅｒ５  ３’未翻訳領域（３’ＵＴＲ）（米国特許第７１７９９０２号）での転写制御下で、トウモロコシに対して最適化されたＤＩＧ−１０９をコードする配列（ＣＤＳ；すなわち配列番号８）を含む。さらに、ｐＤＡＢ７６９１は、コメのアクチン１プロモーターの関連イントロン１（米国特許第５６４１８７６号）およびトウモロコシのリパーゼ３’ＵＴＲ（米国特許第７１７９９０２号）での転写制御下で、Ｄｏｗ  ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  ＤＳＭ２  ＣＤＳ（国際公開第２００８／０７０８４５号）を含む植物の選択マーカー遺伝子を含む。ｐＤＡＢ７６９１のＴ−領域の要素の物理的配置は、好都合には、
ＲＢ＞トウモロコシＵｂｉ１プロモーター：ＤＩＧ−１０９  ＣＤＳ：トウモロコシＰｅｒ５  ３’ＵＴＲ＞コメＡｃｔ１プロモーター：ＤＳＭ２  ＣＤＳ：トウモロコシＬｉｐ３’ＵＴＲ＞ＬＢ：として例示される。
【０１８３】
ｐＳＢ１１の第２誘導体（ｐＤＡＢ１００２７６と呼ぶ）を、標準的なＤＮＡクローニング法で調製した。プラスミドｐＤＡＢ１００２７６は、トウモロコシのユビキチン１プロモーターの関連イントロン１およびトウモロコシＰｅｒ５  ３’ＵＴＲでの転写制御下で、トウモロコシに対して最適化されたＤＩＧ−１０９をコードする配列（ＣＤＳ；すなわち配列番号８）を含む。さらに、ｐＤＡＢ１００２７６は、トウモロコシのユビキチン１プロモーターの関連イントロン１およびトウモロコシのリパーゼ３’ＵＴＲでの転写制御下で、Ｄｏｗ  ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＡＤ１  ＣＤＳ（米国特許出願公開第２００９／００９３３６６号）を含む植物の選択マーカー遺伝子を含む。ｐＤＡＢ１００２７６のＴ−領域の要素の物理的配置は、好都合には、
ＲＢ＞トウモロコシＵｂｉ１プロモーター：ＤＩＧ−１０９  ＣＤＳ：トウモロコシＰｅｒ５  ３’ＵＴＲ＞トウモロコシＵｂｉ１プロモーター：ＡＡＤ−１  ＣＤＳ：トウモロコシＬｉｐ３’ＵＴＲ＞ＬＢとして示される。
【０１８４】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）の形質転換を準備するために、プラスミドｐＤＡＢ７６９１またはプラスミドｐＤＡＢ１００２７６を抱える大腸菌（Escherichia coli）クローニング株ＤＨ５αの細胞を、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を中に含むＬＢ寒天培地（ｇ／Ｌ：Ｂａｃｔｏトリプトン、１０；Ｂａｃｔｏ酵母エキス、５；ＮａＣｌ、１０；寒天、１５）上、３７℃で一夜増殖させた。接合起動性プラスミドｐＲＫ２０１３を含むＤＨ５α細胞株を、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天上で増殖させた。インキュベーションの後、プラスミドｐＳＢ１を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株ＬＢＡ４４０４のアベイラビリティーを待つために、プレートを４℃に置いた。
【０１８５】
〔実施例８〕
スーパーバイナリーベクターを作出するためのアグロバクテリウム（Agrobacterium）の形質転換
プラスミドｐＳＢ１を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株ＬＢＡ４４０４を採用するアグロバクテリウム（Agrobacterium）スーパーバイナリー系を、単子葉植物宿主の形質転換のために好都合に使用する。スーパーバイナリーベクターを構築および検証するための方法論は、ｐＳＢ１用操作マニュアル（日本たばこ）中に提供されているように十分確立されている。標準的な微生物学的および分子生物学的方法を使用して、プラスミドｐＳＢ１およびｐＤＡＢ７６９１を含む共組込み型プラスミドであるスーパーバイナリープラスミドｐＤＡＳ５１６２、ならびにプラスミドｐＳＢ１およびｐＤＡＢ１００２７６を含む共組込み型プラスミドであるスーパーバイナリープラスミドｐＤＡＳ５８４８を作出および検証した。
【０１８６】
〔実施例９〕
トウモロコシ植物中でのＤＩＧ−１０９タンパク質の産生
トウモロコシのアグロバクテリウム（Agrobacterium）介在型形質転換。Ｈｉ−ＩＩ  Ｆ１交雑種（Armstrongら、1991）からの種子を、９５％Ｍｅｔｒｏ−Ｍｉｘ３６０無土壌成長培地（Ｓｕｎ  Ｇｒｏ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ、Ｂｅｌｌｅｖｕｅ、ワシントン州）と５％粘土／ローム土壌との混合物を含む５ガロンポット中に播種した。高圧ナトリウムランプとメタルハライドランプとの組合せを１６時間の明：８時間の暗の光周期で使用し、温室中で植物を育成した。形質転換のための未熟Ｆ２胚を得るために、制御された同胞受粉を実施した。トウモロコシの穂を、未熟胚が１．０ｍｍ〜２．０ｍｍの大きさである、受粉のほぼ８〜１０日目に収穫した。
【０１８７】
感染および共培養。トウモロコシの穂を脱穀し、液体石鹸でこすり洗いすること、２０％市販漂白剤（５％次亜塩素酸ナトリウムを含む）に約２０分間浸漬すること、次いで滅菌水で３回すすぎ洗うことによって表面を滅菌した。ＤＩＧ−１０９タンパク質をコードする遺伝子を抱き、かつＤＳＭ２植物選択マーカー遺伝子を含むスーパーバイナリーベクターｐＤＡＳ５１６２を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）細胞の懸濁液を、細菌［１００ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン、１０ｍｇ／Ｌテトラサイクリン、および２５０ｍｇ／Ｌストレプトマイシンを含むＹＥＰ固形培地（ｇ／Ｌ：Ｂａｃｔｏ酵母エキス、１０；Ｂａｃｔｏペプトン、１０；ＮａＣｌ；５；寒天、１５）上、２８℃で、２〜３日間増殖させる］１または２ループを、１００μＭのアセトシリンゴンを含む５ｍＬの液体感染培地［ＬＳ基本培地（LinsmaierおよびSkoog、1965）、Ｎ６ビタミン（Chuら、1975）、１．５ｍｇ／Ｌ  ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、６８．５ｇ／Ｌ蔗糖、３６．０ｇ／Ｌグルコース、６ｍＭ  Ｌ−プロリン、ｐＨ５．２］中に移すことによって調製した。
【０１８８】
別法として、ＤＩＧ−１０９をコードする遺伝子を抱き、かつＡＡＤ−１植物選択マーカー遺伝子を含むスーパーバイナリーベクターｐＤＡＳ５８４８を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）細胞の懸濁液を、前記のように増殖させた細菌の１または２ループを１００〜２００μＭアセトシリンゴンを含む５ｍＬの液体感染培地中に移すことによって調製した。
【０１８９】
双方の場合において、溶液を、均一な懸濁が達成されるまで渦撹拌し、紫色フィルターを備えたＫｌｅｔｔ−Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎ比色計を使用して２００ｋｌｅｔｔ単位の最終密度まで（ｐＤＡＳ５１６２の形質転換の場合）、または５５０ｎｍで１．２の光学密度まで（ｐＤＡＳ５８４８の形質転換の場合）濃度を調節した。未熟胚を、２ｍＬの感染培地を含むミクロ遠心管中に直接的に単離した。培地を除去し、１ｍＬのアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液で置き換え、アグロバクテリウム（Agrobacterium）／胚溶液を室温で５〜１０分間インキュベートした。次いで、胚を、１００μＭアセトシリンゴン（ｐＤＡＳ５１６２での形質転換細胞の場合）または１００〜２００μＭアセトシリンゴン（ｐＤＡＳ５８４８での形質転換細胞の場合）を含む共培養培地［ＬＳ基本培地、Ｎ６ビタミン、１．５ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ、３０．０ｇ／Ｌ蔗糖、６ｍＭ  Ｌ−プロリン、０．８５ｍｇ／Ｌ  ＡｇＮＯ３、２．８ｇ／Ｌ  ゲランガム（ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｅｎｅｘａ、カンサス州）、ｐＨ５．８］に移し、暗所にて２０℃で３〜４日間共培養した。
【０１９０】
共培養の後、胚を、ＭＳ塩およびビタミン、６ｍＭ  Ｌ−プロリン、１００ｍｇ／Ｌミオイノシトール、５００ｍｇ／Ｌ  ＭES、３０ｇ／Ｌ蔗糖、１．５ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ、０．８５ｍｇ／Ｌ  ＡｇＮＯ３、２５０ｍｇ／Ｌセフォタキシム、２．８ｇ／Ｌゲランガムを含む休止培地（ｐＨ５．８）へ移した。ほぼ７日後に、胚を、３ｍｇ／Ｌビアラホスで補足された（ｐＤＡＳ５１６２での形質転換細胞の場合）、または１００ｎＭハロキシホップで補足された（ｐＤＡＳ５８４８での形質転換細胞の場合）同一培地（選択培地）へ移した。形質転換された分離株を、ほぼ８週間後に同定し、再生および分析のために２週間間隔で新鮮な選択培地へ移すことによって大きくした。
【０１９１】
再生および種子生産。再生のため、培養物を、３ｍｇ／Ｌビアラホスで補足された（ｐＤＡＳ５１６２での形質転換細胞の場合）、または１００ｎＭハロキシホップで補足された（ｐＤＡＳ５８４８での形質転換細胞の場合）「２８」誘導培地（ＭＳ塩およびビタミン、３０ｇ／Ｌ蔗糖、５ｍｇ／Ｌベンジルアミノプリン、０．２５ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ、２５０ｍｇ／Ｌセフォタキシム、２．５ｇ／Ｌゲランガム、ｐＨ５．７）へ移した。低照度条件（１４μＥｍ−２ｓ−１）下で１週間、次いで高照度条件（ほぼ８９μＥｍ−２ｓ−１）下で１週間インキュベートした。続いて、組織を、「３６」再生培地（植物成長調節剤を欠くことを除けば誘導培地と同じ）へ移した。小植物が３〜５ｃｍの長さである時に、それらを、ＳＨＧＡ培地［（Ｓｃｈｅｎｋ−Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ（１９７２）塩およびビタミン；ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌａｂｒ．）、１．０ｇ／Ｌミオイノシトール、１０ｇ／Ｌ蔗糖、および２．０ｇ／Ｌゲランガム、ｐＨ５．８］を含むガラス培養管に移し、茎および根のさらなる成長および発生を可能にした。植物を、前に記載したと同様の土壌混合物に移植し、温室中で開花まで育成した。種子生産のための制御された受粉を実行した。
【０１９２】
トウモロコシの形質転換に関わる当業者は、他の植物で発現可能なで選択マーカー遺伝子（例えば、除草剤耐性遺伝子）を使用すると、トウモロコシの形質転換に、および形質転換された植物の選択に他の方法を利用できることを理解するであろう。
【０１９３】
〔実施例１０〕
ＤＩＧ−１０９タンパク質を産生するトウモロコシ植物の生化学的分析および昆虫でのバイオアッセイ
遺伝子導入トウモロコシ植物中でのＤＩＧ−１０９タンパク質の産生を、若木（Ｔ０世代）の葉から抽出したタンパク質中で試験した。トウモロコシの葉の直径６ｍｍの円板２枚を、ディープウェル９６クラスターチューブボックス（Ｃｏｓｔａｒカタログ番号３９５７）からサンプル管中に配置し、分析当日まで−８０℃で凍結した。その時点で、各管（凍結された）に、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水；Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号ＢＰ６６５−１）＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０から構成される２００μＬの抽出緩衝液と一緒に、２つの４．５ｍｍ亜鉛被覆Ｄａｉｓｙ（商標）ＢＢ‘ｓを添加した。各管に蓋をし、ボックスを、最大設定のビーズミル（Ｋｌｅｃｏ（商標）４−９６パルベライザー；Ｇａｒｃｉａ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ、Ｖｉｓａｌｉａ、カリフォルニア州）中に３分間配置した。粉砕したサンプルを、２，５００×ｇで５分間遠心分離し、溶性タンパク質を含む上清液をイムノアッセイに使用した。
【０１９４】
抽出されたトウモロコシ葉タンパク質の免疫ブロット分析は、ＤＩＧ１５２ＲＰＣ１ポリクローナル抗体が、非遺伝子導入植物の葉から抽出されたタンパク質と交差反応しないことを明らかにした。ｐＤＡS５１６２で形質転換された植物の抽出物において、いくつかのタンパク質種が、ＤＩＧ１５２ＰＲＣ１抗体によって検出された。少なくとも４種の主な免疫反応バンドが通常的に検出された。多くの場合、ほぼ７０ｋＤａのタンパク質に相当する移動度で移動する豊富なタンパク質種が観察された。その他の主なタンパク質種は、実施例２でＤｐｆ１０８から調製されたＤＩＧ−１５２のトリプシン制限ペプチドのそれと同一物である６５ｋＤａ、６０ｋＤａ、および５５ｋＤａであると見積もられる分子サイズを有した。ｐＤＡＳ５１６２遺伝子導入トウモロコシの葉の抽出物を、ＤＩＧ−１５２ポリクローナル抗体を使用する免疫ブロットで試験すると、一部の植物において、６０ｋＤａおよび５５ｋＤａの種がもっとも豊富であった。どちらの抗体でも、少数の植物のみが、完全長ＤＩＧ−１０９（１３０ｋＤａ）タンパク質を有することが見出され、見出される場合、それは少数の種として存在した。
【０１９５】
ｐＤＡＳ５１６２での形質転換を介してトウモロコシ中に導入された導入遺伝子は完全長ＤＩＧ−１０９タンパク質をコードするが、トウモロコシの細胞内でのタンパク質分解活性は、新生タンパク質を安定でより小さな分子量の多数の種に処理する。
【０１９６】
ｐＤＡＳ５１６２構築物で形質転換された独立に単離された遺伝子導入トウモロコシ植物から収穫された葉の昆虫毒性を、フォールアーミーワーム（ＦＡＷ、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（Ｊ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ））の新生幼虫およびＣｒｙ１Ｆ抵抗性ＦＡＷ（ｒＦＡＷ）幼虫を使用してin vitroで試験した。ＦＡＷの卵は商業的昆虫飼育場（Ｂｅｎｚｏｎ）から入手し、ｒＦＡＷの卵は所有集団（Ｄｏｗ  ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）から入手した。昆虫でのバイオアッセイのために、植物を実験室から温室中に移植してほぼ２週間後に、温室育成のＴ０植物から葉の切片サンプルを採取した。各植物から２枚の葉片（それぞれほぼ１平方インチ）を、３２ウェルトレー（ＣＤ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）のセパレートウェル中に、約３ｍＬの固化２％寒天の上部に配置した。卵を、複数種用の鱗翅目用飼料（Ｓｏｕｔｈｌａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）上で孵化させ、２４時齢未満で新生幼虫を選択した。葉切片につきほぼ１０頭の幼虫を、ラクダ毛ペイントブラシを使用して各ウェル中に注意して配置した。外寄生されたトレーを、トレーと一緒に供給される穴を開けた蓋で封止し、次いで、２８℃、４０％ＲＨ、１６時間の明：８時間の暗で３日間保存した。各葉片に対するパーセント損傷（％ＤＡＭ）を、試験の終結時点で記録した。損傷率を、平均化し、どの植物が、各種の試験昆虫から最小の損傷を受けたかを判定するのに使用した。この試験をすべての昆虫において何回か繰り返した。
【０１９７】
データは、ＪＭＰ統計ソフトウェア（ＳＡＳ、Ｃａｒｙ、ノースカロライナ州）を使用し、各植物、各昆虫類に対する％ＤＡＭスコアを平均化して解析した。一方向ＡＮＯＶＡ解析には「Ｙ／Ｘフィット」モデルを使用した。Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ平均値分離を、各処理に対する平均％ＤＡＭスコア間の有意差について解析する必要がある場合に使用した。比較は、類似齢の対照植物から得られた％ＤＡＭスコアに対して実施した。陽性対照植物を、Ｃｒｙ１Ｆａ  Ｂ．ｔ．毒素を産生する市販のＨｅｒｃｕｌｅｘ  Ｉ（商標）ハイブリッドの種子から育成した。陰性対照（すなわち、非形質転換植物）を、Ｈｉ  ＩＩおよびＢ１０４系統、およびＨｅｒｃｕｌｅｘ  Ｉ（商標）Ｉｓｏｌｉｎｅ（Ｈｅｒｃｕｌｅｘ  Ｉ（商標）ハイブリッドの非Ｃｒｙを含む親）とした。
【０１９８】
図１に、昆虫でのこのようなバイオアッセイ試験で得られた結果を要約する。遺伝子導入葉でのＤＩＧ−１０９の産生と％ＤＡＭ評価との間に正の相関が存在することは驚くべき発見である。ＦＡＷの場合、Ｆ＝３５．３；ｄ．ｆ．＝１、３３；Ｐ＜０．０００１；ｒ２＝０．５２、ｒＦＡＷの場合、Ｆ＝２５．３；ｄ．ｆ．＝１、３３；Ｐ＜０．０００１；ｒ２＝０．４３である。Ｃｒｙ１ＦａＢ．ｔ．毒素による中毒に対して抵抗性であるフォールアーミーワームの幼虫が、ＤＩＧ−１０９  Ｂ．ｔ．毒素による給餌からやはり阻害されることは、さらに驚くべき新規な発見である。
【０１９９】
トウモロコシのその他の害虫を類似の方式で試験することができることが理解される。これらの有害生物には、限定はされないが、アグロミザ・パルビコルニス（Agromyza parvicornis）（コーンブロットリーフマイナー）、アグロチス・イプシロン（Agrotis ipsilon）（ブラックカットワーム）、アンチカルシア・ゲマタリス（Anticarsia gemmatalis）（ベルベットビーンキャタピラー）、ジアトラエア・グランジオセラ（Diatraea grandiosella）（サウスウェスターンコーンボーラー）、ジアトラエア・サッカラリス（Diatraea saccharalis）（シュガーケーンボーラー）、エラスモパルプス・リグノセルス（Elasmopalpus lignosellus）（レッサーコーンスタークボーラー）、ヘリコベルパ・ゼア（Helicoverpa zea）（コーンイアーワーム）、ヘリオチス・ビレセンス（Heliothis virescens）（タバコバットワーム）、オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）（ユーロピアンコーンボーラー）、Ｃｒｙ１Ｆ抵抗性Ｏ．ヌビラリス（O.nubilalis）、プルテラ・キシロステラ（Plutella xylostella）（ダイアモンドバックモス）、Ｃｒｙ１抵抗性Ｐ．キシロステラ（P.xylostella）、スポドプテラ・エキシグア（Spodoptera exigua）（ビートアーミーワーム）、およびトリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）（キャベツルーパー）が含まれる。
【０２００】
ｐＤＡＳ５８４８で形質転換された遺伝子導入トウモロコシ植物（Ｔ０世代）も、昆虫でのバイオアッセイ、および免疫分析によって試験した。葉抽出物中のＤＩＧ−１０９タンパク質の量は、市販のＣｒｙ１Ｃ  ＥＬＩＳＡ検出キット（Ｅｎｖｉｒｏｌｏｇｉｘ（商標）、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、マサチュセッツ州；カタログ番号ＡＰ００７）を使用して定量され、検出されるＤＩＧ−１０９タンパク質のレベルは、１００万分の１（ｐｐｍ；１ｐｐｍは、抽出物中の総溶性タンパク質のｍｇ当たり１ｎｇのＤＩＧ−１０９タンパク質を意味する）として表現される。ＦＡＷおよびｒＦＡＷによる摂食損傷は、次のように分類した：０＝損傷なしまたは少数のピンホール状摂食マーク、１＝葉の２５％〜５０％が食されている、２＝葉のほとんどすべてが食い尽くされているか、葉が残っていない。保護された植物とは、その損傷スコアが０．６７以下のものである。
【０２０１】
表９のデータは、Ｔ０植物中のＥＬＩＳＡで検出されるＤＩＧ−１０９タンパク質種の存在と、in vitroでのバイオアッセイにおけるフォールアーミーワームの幼虫によってなされた摂食損傷の抑制との間に正の相関が存在することを示す。最も高い検出レベルのＤＩＧ−１０９タンパク質を有する植物（植物５８４８−００５．４）は、最も低い葉の摂食損傷スコアを有した。また、１９０〜２３０ｐｐｍの範囲のより低いレベルの検出可能なＤＩＧ−１０９タンパク質を有する植物からの葉は、１．７および１．８の平均損傷スコアを有した陰性対照植物（すなわち、非形質転換対照Ｂ１０４およびＨｉ  ＩＩ）からの葉で観察されるのに比べて受けた摂食損傷がより少なかった。試験したすべてのｐＤＡＳ５８４８の葉において、検出された有力なＤＩＧ−１０９タンパク質種は、ほぼ６０ｋＤａおよび５５ｋＤａの大きさのペプチドのダブレットから構成されていた。
【０２０２】
【表９】
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【０２０３】
したがって、本発明の特徴は、トウモロコシ植物中で産生させた場合のＤＩＧ−１０９タンパク質が、植物をフォールアーミーワームの幼虫およびＣｒｙ１Ｆ抵抗性フォールアーミーワームの幼虫による摂食損傷に対して抵抗性にすることである。
【０２０４】
〔実施例１１〕
ＤＩＧ−１０９タンパク質を産生するトウモロコシ植物の分子解析
組織抽出。ゲノムＤＮＡを、ｐＤＡＳ５１６２およびｐＤＡＳ５８４８で形質転換されたＴ０遺伝子導入トウモロコシ植物の葉から単離した。組織サンプルを、９６ウェルのコレクションプレート（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号１９５６０）中に集め、２日間凍結乾燥した。組織の破壊は、Ｋｌｅｃｋｏ（商標）組織パルベライザーおよび実施例１０で本質的には開示したようなタングステンビーズを用いて実施した。加水分解プローブ（ＨＰ）でのアッセイのため、ゲノムＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ（商標）９６Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の提唱するプロトコールに従って使用するハイスループットフォーマットで単離した。サザンブロット分析のため、ゲノムＤＮＡを、ＭｕｒｒａｙおよびＴｈｏｍｐｓｏｎのＣＴＡＢ  ＤＮＡ抽出プロトコール（１９８０）の修正形態を使用するハイスループットフォーマットで単離した。Murray, M. G.、Thompson, W. F.(1980)、「Rapid isolation of high molecular weight plant DNA」Nucl. Acids Res. 8:4321〜4325。
【０２０５】
どちらかのプロトコールによって抽出されたＤＮＡを、Ｑｕａｎｔ−ＩＴ  Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＡアッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｐ７５８９）を用いて定量した。この手順中、８８の未知のサンプルを、２０ｎｇ／μＬ〜１．２５ｎｇ／μＬの範囲の２倍逐次希釈標準、プラス緩衝液ブランク、水ブランク、および空ウェルを含む第１のカラムを用いる９６ウェルフォーマットでアッセイした。次いで、試験ＤＮＡサンプル、５μＬの１：５〜１：４０の希釈液（予想初期濃度に応じて）を、適切に希釈され緩衝化された挿入染料と混合し、１０５μＬの反応液中、暗所で１０分間インキュベートした。インキュベーションの後に、Ｓｙｎｅｒｇｙ２プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、バーモント州）を使用して蛍光を記録した。ゲノムＤＮＡ濃度を、バックグラウンド蛍光を補正した後に計算した標準曲線から見積もった。
【０２０６】
サザンブロットの準備。ｐＤＡＳ５８４８で形質転換された１０のトウモロコシ系統からの１０μｇのゲノムＤＮＡを、制限酵素ＢｓｍＩを用い３７℃で一夜消化した。消化されたＤＮＡサンプルの断片を、１％アガロースゲル（ＳＡＳ、Ｃａｒｙ、ノースカロライナ州）によるゲル電気泳動によって分離し、ナイロン膜（ＩＮＹＣ０００１０  ＩＭＭＯＢＩＬＯＮ−ＮＹ＋、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移行させた。サザンブロットを、配列番号８の塩基２５１〜６３０に相当するジゴキシゲニン標識化ＰＣＲ−増幅プローブ（ＤＩＧ  ＰＣＲプローブ合成キット；Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、インディアナ州）とハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションおよび検出は、供給業者のプロトコールに従って実施した。ＤＩＧ−１０９をコードする遺伝子の単一コピーを収容するためのサザンブロット分析で確認されたｐＤＡＳ５８４８で形質転換された系統からのＤＮＡを、定量的ＰＣＲコピー数アッセイのための参照対照として使用した。
【０２０７】
加水分解プローブでのアッセイ。加水分解プローブ（ＨＰ）アッセイによる導入遺伝子のコピー数判定を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０システム（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用するリアルタイムＰＣＲで実施した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）Ｐｒｏｂｅ  Ｄｅｓｉｇｎソフトウェアｖ２．０を使用して、ＤＳＭ２およびＡＡＤ−１選択マーカー遺伝子、ＧＬＰ１（トウモロコシ胚様タンパク質１；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ３９４０１０）およびＩＮＶ（トウモロコシインベルターゼ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ１６１２３）参照遺伝子、およびＤＩＧ−１０９をコードする遺伝子を検出するためのアッセイを設計した。増幅のため、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０Ｐｒｏｂｅｓ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを、０．４μＭの各プライマーおよび０．２μＭの各プローブを含む１０μＬ容積の複合反応における１ｘ最終濃度で調製した（オリゴヌクレオチドの配列および蛍光標識を表１０に列挙する）。２段階増幅反応を、５６℃で４０秒間の伸張、蛍光捕捉で実施した。すべてのサンプルを、三つ組みで実行し、平均したＣｔ値を、各サンプルの分類に使用した。
【０２０８】
【表１０】
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【０２０９】
ＤＳＭ２に関するＨＰ分析を、ｐＤＡＳ５１６２で形質転換された３６系統上で完結した。遺伝子の１〜２のコピーとして定義される単純組込み事象を、サンプルの９５％（３４事象）中で検出した。
【０２１０】
ＡＡＤ−１およびＤＩＧ−１０９に関するＨＰ分析を、ｐＤＡＳ５８４８で形質転換された１３系統上で完結した。単純組込み事象を、ＡＡＤ−１では９３％（１２系統）、ＤＩＧ−１０９では５４％（７系統）で検出した。系統の５４％（７系統）は、双方の遺伝子に対して単純組込み事象を含んでいた。
【０２１１】
〔実施例１２〕
トウモロコシのＤＩＧ−１０９切断種の生化学的特徴付け
より詳細な分析を、ｐＤＡＳ５１６２で形質転換されたＴ０トウモロコシ植物の葉から抽出されたタンパク質に関して実施した。ＤＩＧ１５２ＲＰＣ１ポリクローナル抗体で探索されたタンパク質抽出物の免疫ブロットは、５種のＤＩＧ−１０９タンパク質種の存在を明らかにした。これらのペプチドの相対移動度をベースにして、次の正体を割り当てた：種１は配列番号５中で示されるような完全長ＤＩＧ−１０９（１３０ｋＤａ）タンパク質に相当し；種２は７０ｋＤａのＤＩＧ−１０９産物に相当する。同一移動度のペプチドが、完全長ＤＩＧ−１５２タンパク質をコードする遺伝子を発現する細菌細胞の抽出物中に見出される。これらのほぼ７０ｋＤａの断片の生成は、トウモロコシおよび細菌の双方中で見出されるプロテアーゼに曝露される完全長タンパク質上の優勢開裂部位の存在を指摘する。種３は、大きさにおいて、実施例２で調製されるようなほぼ６５ｋＤａのサイズを有するＤＩＧ−１５２のトリプシン制限ペプチドに相当し、種４は、ほぼ６０ｋＤａの切断型ＤＩＧ−１０９産物に相当し、種５は、ほぼ５５ｋＤａの切断型ＤＩＧ−１０９産物に相当する。ほぼ７０ｋＤａ、６０ｋＤａおよび５５ｋＤａのペプチドは、実施例１４中でさらに特徴付けられる。
【０２１２】
〔実施例１３〕
ＤＩＧ−１０９の変異体をコードする遺伝子の設計およびドメインＩのα−ヘリックスの欠失
ＤＩＧ−１０９タンパク質の殺虫特性を改善するために、そのそれぞれの欠失により、配列番号５に開示されるようなＤＩＧ−１０９タンパク質のＮ末端の一部が除去される、逐次的、段階的欠失を実施した。該欠失は、α−ヘリックス３からα−ヘリックス７までの構造的完全性を維持しながら、ドメインＩ中のα−ヘリックス１の一部またはすべてを、またα−ヘリックス２の一部またはすべてを除去する。本発明者らは、α−ヘリックス１、α−ヘリックス２Ａ、α−ヘリックス２Ｂ、α−ヘリックス３、およびα−ヘリックス４の始まりおよび終端、ならびにＣｒｙ１Ｃａコア毒素のドメインＩ中におけるそれらのヘリックス間スペーサー領域の位置を、Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素のアミノ酸配列を構造が既知であるＣｒｙ１Ａａタンパク質のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ２２３５３）［ＲＣＢＳ  タンパク質構造データベース番号：ＣＲＹ１Ａ（Ａ）；Grochulskiら、(1995)］と比較することによって推定した。これらの位置を表１に記載する。
【０２１３】
Ｎ末端欠失変異体に対するコード配列の設計において、メチオニンをコードするＡＴＧ開始コドンを、欠失変異体を発現するように設計されたヌクレオチド配列の５’終端に挿入する。遺伝子導入植物で使用するために設計された配列の場合、Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙの「Ｎ末端則」（１９９７）に固執することが有益であり得る。一部のアミノ酸は、タンパク質のＮ末端残基として呈示される場合に、真核細胞中でのタンパク質の不安定性および分解に寄与する可能性があることが教示される。例えば、酵母および哺乳動物細胞中での観察から集められたデータは、Ｎ末端を不安定化するアミノ酸は、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｙ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｉ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、あるいは場合によりＰであることを指摘している。タンパク質の分解機構の特性は、生物体間で若干異なる可能性があるが、上で観察されるＮ末端を不安定化するアミノ酸の同一性の保存は、類似の機構が、植物細胞中で機能する可能性があることを示唆している。例えば、Worleyら(1998)は、植物中で、Ｎ末端則は、塩基性および芳香族残基を包含することを見出した。対照Ｂ．ｔ．殺虫性タンパク質のα−ヘリックス３の開始点近くの植物プロテアーゼによるタンパク質分解性開裂が、不安定化Ｎ末端アミノ酸を曝露することはあり得る。このような処理は、開裂されたタンパク質を迅速な崩壊に向ける可能性があり、Ｂ．ｔ．殺虫性タンパク質の蓄積を、有効な昆虫防除には不十分なレベルに制限する。したがって、不安定化アミノ酸の１つで始まるＮ末端欠失変異体の場合、本発明者らは、翻訳開始メチオニンと不安定化アミノ酸との間にＧ（グリシン）アミノ酸を指定するコドンを付加することを好む。
【０２１４】
欠失は、次のように設計される。この実施例は、完全長１１６４アミノ酸キメラＤＩＧ−１０９タンパク質（すなわち配列番号５）をコードする、トウモロコシのコドンに対して最適化された完全長３４９２ｂｐのＤＮＡ配列（すなわち配列番号８）を利用して、６５の特定変異体で設計原理を例示する。当業者は、Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素セグメントのすべてまたはＮ末端部分をコードするその他のＤＮＡ配列を、同様に操作して所望の結果を達成することができることを理解するであろう。最初の欠失変異体をコードする配列を考案するため、α−ヘリックス２Ａの始めに近いバリン残基（すなわち、配列番号５の完全長ＤＩＧ−１０９タンパク質のＶ５１）に対するコドンを含む、α−ヘリックス１をコードする塩基のすべてを除去する。したがって、配列番号８の１から１５３の塩基の排除は、配列番号５の１から５１のアミノ酸のためのコード配列を除去する。初め（すなわち、完全長タンパク質のアミノ酸５２に対応するコドンの前）の翻訳開始ＡＴＧ（メチオニン）コドンの再導入は、１１１４個のアミノ酸（すなわち、メチオニン＋完全長ＤＩＧ−１０９タンパク質のアミノ酸５２〜１１６４）を含む欠失変異体ＤＩＧ−１０９タンパク質をコードする３３４２塩基のオープン読取り枠を含む欠失変異体のコード配列を提供する。配列番号５の完全長ＤＩＧ−１０９タンパク質の残基５２〜９１に対応する単一アミノ酸のための付加的コドンを除去する逐次的、段階的欠失は、α−ヘリックス２Ａおよびα−ヘリックス２Ｂの一部または全部を欠く変異体を提供する。したがって、第２の設計される欠失変異体をコードする配列は、配列番号８の塩基１〜１５６を排除し、それによって、アミノ酸１〜５２のためのコード配列を除去することを必要とする。機能性オープン読取り枠の回復は、残りのコード配列の初めに翻訳開始メチオニンコドンを再導入すること、かくして、１１１３個のアミノ酸（すなわち、メチオニン＋完全長ＤＩＧ−１０９タンパク質のアミノ酸５３〜１１６４）を含む欠失変異体ＤＩＧ−１０９タンパク質をコードする３３３９個の塩基のオープン読取り枠を有する第２の欠失変異体のコード配列を提供することによって再び完遂される。最後に設計される欠失変異体のコード配列は、配列番号８の塩基１〜２７３を除去すること、かくして、アミノ酸１〜９１のためのコード配列を排除すること、および、翻訳開始メチオニンコドンの再導入の後に、１０７４個のアミノ酸（すなわち、メチオニン＋完全長ＤＩＧ−１０９タンパク質のアミノ酸９２〜１１６４）の欠失変異体ＤＩＧ−１０９タンパク質をコードする３２２２塩基のオープン読取り枠を有する欠失変異体のコード配列を提供することを必要とする。例示したように、欠失配列を排除した後、残りのコード配列の初めに開始メチオニンコドンを付加して、機能性オープン読取り枠を回復する。また、記載のように、欠失配列の除去が、前に示したような不安定性を決めるアミノ酸の１つである完全長タンパク質の残りの部分のＮ末端で曝露されて残る場合、付加的なグリシンコドンを、メチオニンコドンと不安定性を決めるアミノ酸のためのコドンとの間に付加すべきである。
【０２１５】
表１１に、前記の戦略により設計された特定の変異体を記載する。
【０２１６】
【表１１】
2013514772.tif 000012
【０２１７】
表１１に記載のＤＩＧ−１０９タンパク質変異体をコードする付加的核酸は、実施例６で教示したように、植物中での発現を意図した合成遺伝子に関する一般原理に従って設計される。
【０２１８】
〔実施例１４〕
さらなるＤＩＧ−１０９タンパク質変異体の設計
実施例１２で開示したように、完全長ＤＩＧ−１０９タンパク質を含む最初の翻訳産物を、植物中で種々の程度まで処理すると、産物の１つは、大きさにおいて、６５ｋＤａのトリプシンで切断されたコア毒素ペプチドに相当する。このコア毒素は、昆虫中腸中の受容体に結合し毒性をもたらす、毒素の活性化形態であると考えられる。トリプシンは、アルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）残基のＣ末端側でタンパク質を開裂するエンドペプチダーゼである。したがって、トウモロコシ中に見出される６５ｋＤａのＤＩＧ−１０９ペプチドは、トウモロコシのトリプシン様プロテアーゼによる配列番号５の残基Ｒ２８およびＲ６２８の後での開裂によって作出される６５ｋＤａの断片に相当する可能性がある。この６５ｋＤａのコア毒素ペプチドは、配列番号１のＣｒｙ１Ｃａコア毒素セグメントのアミノ酸２８〜６１９、および配列番号４のＣｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントのアミノ酸１〜９を含むことができることが注目される。しかし、遺伝子導入トウモロコシ中で観察される、および後で考察される６５ｋＤａの切断産物またはその他の切断産物の正確なＣ末端は、実験的に決定されていないことを理解されたい。したがって、本明細書中で考察されるＤＩＧ−１０９変異体タンパク質の設計は、例示であることを意図し、殺虫活性を保持するその他のＤＩＧ−１０９切断型変異体タンパク質も、本発明の範囲内に包含される。
【０２１９】
ほとんどの遺伝子導入トウモロコシ植物中に存在するＤＩＧ−１０９ペプチド産物の濃度は、ほぼ２００ｐｐｍであると判定された。したがって、ＤＩＧ−１０９ペプチドのアミノ酸配列を決定するためには、手近な植物組織から精製するのに利用可能である材料では不十分である。トウモロコシ中で検出される切断型産物に大きさが類似している代用ペプチドを、完全長ＤＩＧ−１５２タンパク質を開裂させるための種々のプロテアーゼを使用することによって作出した。
【０２２０】
７０ｋＤａのペプチドの同定。シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）（Ｐｆ）中の封入体として産生される完全長ＤＩＧ−１５２のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルは、７０ｋＤａの見かけ分子サイズを有し、トリプシン処理に対して比較的安定であるかなりの量のタンパク質を明らかにした。アニオン交換とサイズ排除クロマトグラフィーとの組合せによる、可溶化された完全長ＤＩＧ−１５２封入体からの精製の後に、このペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに関して、遺伝子導入トウモロコシ植物からの抽出物中で検出されるほぼ７０ｋＤａのＤＩＧ−１０９ペプチドと同一の移動度を有した。双方のペプチドは、ＤＩＧ−１５２に向けられたポリクローナル抗体によって認識され、Ｐｆにより産生されるペプチドのアミノ酸配列分析は、ＭＤＮＮＰをＮ末端配列（配列番号５のＤＩＧ−１０９の残基１〜５）と同定した。したがって、７０ｋＤａのペプチドは、完全長ＤＩＧ−１０９タンパク質の本来のＮ末端を含む。推定上のコア毒素のＣ末端開裂部位（Ｒ６２８）でのトリプシン開裂は、コア毒素を作り出すためのＲ２８でのトリプシン開裂によってＤＩＧ−１０９タンパク質から特徴的に除去される最初の２８残基を無傷で残しながら、Ｐｆ封入体から単離され、遺伝子導入トウモロコシ植物中で検出されるＤＩＧ−１５２ペプチドの見かけ分子量にほぼ同一の７０．５ｋＤａの計算された大きさを有するペプチド（ＤＩＧ−１０９の残基１〜６２８から構成される）を作り出す。したがって、７０ｋＤａのタンパク質の正体は、アミノ酸１〜６２８から構成される切断型ＤＩＧ−１０９ペプチドに相当することが提案される。
【０２２１】
６０ｋＤａおよび５５ｋＤａのペプチドの正体。ｐＤＡＳ５１６２およびｐＤＡＳ５８４８で形質転換されたトウモロコシ植物は、６０ｋＤａおよび５５ｋＤａに相当する移動度のＤＩＧ−１０９由来タンパク質を産生することも見出された。これらの大きさのペプチドは、トリプシンで完全長ＤＩＧ−１５２タンパク質をまず開裂すること、続いて、トリプシンで開裂された産生物をキモトリプシンで処理することによって実験的に作り出された。［完全長ＤＩＧ−１５２タンパク質のキモトリプシン単独での処理は、６０ｋＤａより若干大きな複数の切断型産生物をもたらした］。トリプシン／キモトリプシンで開裂された産生物を、大量に調製し、次いでアニオン交換クロマトグラフィー、続いてＳｕｐｅｒｏｓｅ２００サイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。３つの主要ピークが、１２．５ｍＬ、１８．３ｍＬ、および２０ｍＬの採集容積で溶離されるサイズ排除クロマトグラフィーの段階で観察された。最初の大きなピーク（１２．５ｍＬ）はＤＩＧ−１５２タンパク質の高分子量（７００ｋＤａ〜１０００ｋＤａ）凝集物を含み、３番目の大きなピーク（２０ｍＬ）は、過剰のキモトリプシンを含んでいた。１２．５ｍＬの画分も、ＤＩＧ−１５２の６５ｋＤａおよび６０ｋＤａの産生物に相当する移動度を有するバンドを含んでおり、したがって、ＤＩＧ−１５２由来ペプチドのオリゴマー化または凝集は可逆的であると思われる。
【０２２２】
１８．３ｍＬピーク中のタンパク質を、トリプシンのみで開裂されたＤＩＧ−１５２タンパク質と一緒に、還元および変性条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。これらのタンパク質は、６０ｋＤａおよび５５ｋＤａに相当する移動度を有する２つの主な種を含んでいた。１４ｋＤａおよび９ｋＤａのより小さなタンパク質も観察され、精製中にＤＩＧ−１５２ペプチドに見かけ上結合されていたキモトリプシンと同定された。さらに、２４０ｋＤａに相当する移動度を有する高分子量バンドが観察された。このバンド中のタンパク質は、ＤＩＧ１５２ＲＰＣ１抗体によって認識され、それはＤＩＧ−１５２の開裂産物のオリゴマー（テトラマー）らしいことを立証した。
【０２２３】
ＤＩＧ−１０９を産生する植物からの抽出物中のタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、次いで、精製されトリプシンで開裂されたＤＩＧ−１５２およびトリプシン次いでキモトリプシンで開裂されたＤＩＧ−１５２タンパク質のサンプルと一緒に、ニトロセルロース上にエレクトロブロットした。ＤＩＧ−１０９またはＤＩＧ−１５２ペプチドに相当するバンドを、一次ＤＩＧ１５２ＲＰＣ１ウサギ抗体と二次抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化抗体との組合せによって誘発される増強された化学発光を使用して可視化した。トリプシンで処理されたＤＩＧ−１５２サンプルは、ほぼ６５ｋＤａの移動度に単一バンドを呈示した。ＤＩＧ−１０９ペプチドを産生する植物からの抽出物は、４つのバンド：１３０ｋＤａ（完全長ＤＩＧ−１０９タンパク質を意味する）に相当する移動度を有する１つのバンド、６０ｋＤａおよび５５ｋＤａに相当する移動度の２つのバンド、およびほぼ２０ｋＤａに相当する移動度の１つのバンドを呈示した。ＤＩＧ−１０９の２０ｋＤａの開裂産物について、さらなる特徴付けは行わなかった。トリプシン次いでキモトリプシンで処理されたＤＩＧ−１５２タンパク質は、ほぼ６０ｋＤａおよび５５ｋＤａに相当する移動度を有し、植物抽出物中で観察される６０ｋＤａおよび５５ｋＤａのバンドと共に移動する２つのバンドを呈示した。また、トリプシン次いでキモトリプシンで処理されたＤＩＧ−１５２タンパク質サンプル中に、約２４０ｋＤａに相当する移動度を有する高分子量のバンドも存在した。
【０２２４】
したがって、トウモロコシ中で産生されるＤＩＧ−１０９の主要開裂産物は、完全長ＤＩＧ−１５２タンパク質が、まずトリプシンで開裂され次いでキモトリプシンでさらに開裂される場合に得られる２つの産物に大きさの上で相当する。酵素的に産生された６０ｋＤａおよび５５ｋＤａのペプチドからの最初の５つのＮ末端残基は、双方とも、ＤＡＦＬＶ（配列番号５のＤＩＧ−１０９タンパク質の残基７４〜７８に相当する）であると判定された。完全長ＤＩＧ−１０９タンパク質のＷ７３の後のこのような開裂が、α−ヘリックス１、α−ヘリックス２Ａ、およびα−ヘリックス２Ｂの一部の除去をもたらすことは注目される（表１）。
【０２２５】
さらに、６０ｋＤａおよび５５ｋＤａの双方のペプチドは、同一のＮ末端配列を有するので、より小さな（５５ｋＤａ）ペプチドの産生中に除去される５ｋＤａのセグメントは、６０ｋＤａのペプチドのＣ末端終端からのさらなるプロセッシングを意味するはずである。
【０２２６】
ｐＤＡＳ５１６２およびｐＤＡＳ５８４８で形質転換されたトウモロコシ植物中で産生される５つの主要ＤＩＧ−１０９ペプチドの推定アミノ酸座標を表１２に要約する。これらの種の正確なＣ末端は決定しなかった。６０ｋＤａの種４のＲ５６９の後でのトリプシン開裂は、５６ｋＤａ（すなわち、種５のそれに近い）のペプチドを作り出すことは注目される。
【０２２７】
【表１２】
2013514772.tif 000013
【０２２８】
ＤＩＧ−１０９切断型変異体の設計。表１に示したように、ＤＩＧ−１０９コア毒素のα−ヘリックス１〜α−ヘリックス４は、ＤＩＧ−１０９タンパク質の最初の１４５個のアミノ酸内に存在する。ＤＩＧ−１０９コア毒素のＮ末端終端上の最初の潜在的部位（ＤＩＧ−１０９のＲ８７；コア毒素のＲ５９）での開裂は、ＤＩＧ−１０９コアから５９個のアミノ酸を除去し、α−ヘリックス１、α−ヘリックス２Ａ、およびα−ヘリックス２Ｂが除去された６１．０２ｋＤａの分子量を有するタンパク質をもたらす。Ｃｒｙ１Ａｂのα−ヘリックス１の除去は、タンパク質がカドヘリン受容体への初期結合を迂回することを可能にする上で影響を及ぼし、昆虫中腸細胞膜中への挿入に先立つオリゴマーのプレ細孔構造の形成をもたらし、結局、細孔形成をもたらす。それらの研究の類推により、α−ヘリックス１の喪失をもたらすトリプシンで切断されたＤＩＧ−１０９コアのＮ末端部分の除去は、オリゴマーの形成、および機能性細孔の形成につながる第２のアミノペプチダーゼＮ受容体への結合を可能にするのに必須のステップであることが予測される。したがって、このような方式での植物中でのＤＩＧ−１０９タンパク質の開裂は、昆虫による摂食によりカドヘリン受容体への結合のための要件を迂回するＤＩＧ−１０９毒素ペプチドをもたらす可能性がある。このような効果は、突然変異カドヘリン受容体タンパク質を有する昆虫におけるＢｔタンパク質中毒に対する抵抗性の克服をもたらすことを示した。
【０２２９】
ｐＤＡＳ５１６２およびｐＤＡＳ５８４８で形質転換されたトウモロコシ植物中で見出されるより小さいペプチド（６０ｋＤａおよび５５ｋＤａ）は、トリプシン様プロテアーゼによるさらなる開裂の産物に相当する可能性がある。これらのペプチドは、６５ｋＤａのコアペプチドに比べて５ｋＤａ〜１０ｋＤａだけ小さいので、このようなさらなる開裂は、コア毒素のどちらかの終端から全部に満たないほぼ８０残基を除去する。ＤＩＧ−１０９タンパク質のＮ末端から最初の１３０残基以内で、潜在的トリプシン開裂部位は、Ｒ２８（コア毒素のＲ−１）、Ｒ８７（コア毒素のＲ５９）、Ｒ９３（コア毒素のＲ６５）、Ｋ１１５（コア毒素のＫ８７）、Ｋ１２２（コア毒素のＫ９４）、Ｒ１２７（コア毒素のＲ９９）、およびＲ１２９（コア毒素のＲ１０１）に位置する。コア毒素のＣ末端の最後の１００個のアミノ酸内で、潜在的トリプシン開裂部位は、Ｒ５３０（コア毒素のＲ５０２）、Ｒ５３３（コア毒素のＲ５０５）、Ｋ５５７（コア毒素のＫ５２９）、Ｒ５６８（コア毒素のＲ５４０）、Ｒ５７１（コア毒素のＲ５４３）、Ｒ５８２（コア毒素のＲ５５４）、およびＫ６１０（コア毒素のＫ５８２）に位置する。
【０２３０】
上記の確認された潜在的プロテアーゼ開裂部位の位置をガイドとして利用して、トウモロコシに対して最適化された、配列番号８で開示されるＤＩＧ−１０９のコード配列に由来するＤＮＡ配列を、遺伝的に切断されたＤＩＧ−１０９タンパク質変異体をコードするように設計した。実施例１３で開示したような切断型コード領域を開始するための５’末端のメチオニンおよびグリシンコドンを付加するための指針を、これらの構築体のためにも採用した。最初のこのような実施形態、配列番号２７として開示されたＤＩＧ−１１０は、メチオニンおよびグリシンのＮ末端付加を伴うＤＩＧ−１０９タンパク質のアミノ酸８８〜１１６４を含む。トウモロコシに対して最適化された、ＤＩＧ−１１０をコードするＤＮＡ配列は、配列番号２８として開示される。第２の実施形態、配列番号２９として開示されたＤＩＧ−１１１は、メチオニンおよびグリシンのＮ末端付加を伴うＤＩＧ−１０９タンパク質のアミノ酸８８〜６２８を含む。トウモロコシに対して最適化された、ＤＩＧ−１１１をコードするＤＮＡ配列は、配列番号３０として開示される。第３の実施形態、配列番号３１として開示されたＤＩＧ−１１２は、メチオニンおよびグリシンのＮ末端付加を伴うＤＩＧ−１０９タンパク質のアミノ酸１２３〜１１６４を含む。トウモロコシに対して最適化された、ＤＩＧ−１１２をコードするＤＮＡ配列は、配列番号３２として開示される。第４の実施形態、配列番号３３として開示されたＤＩＧ−１１３は、メチオニンおよびグリシンのＮ末端付加を伴うＤＩＧ−１０９タンパク質のアミノ酸１２３〜６２８を含む。トウモロコシに対して最適化された、ＤＩＧ−１１３をコードするＤＮＡ配列は、配列番号３４として開示される。第５の実施形態、配列番号３５として開示されたＤＩＧ−１１４は、ＤＩＧ１０９タンパク質のアミノ酸１〜５８２を含む。トウモロコシに対して最適化された、ＤＩＧ−１１４をコードするＤＮＡ配列は、配列番号３６として開示される。
【０２３１】
ＤＩＧ−１１０およびＤＩＧ−１１２タンパク質は、配列番号４で開示されたＣｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントを含むことに留意されたい。このＣ末端プロトキシンセグメントは、一部の例において、植物中のタンパク質を安定化するように、またはそれをより溶解性にするように機能する可能性があると考えられる。ＤＩＧ−１１０のＲ５４３、トリプシン部位での開裂、したがって、プロトキシンセグメントのほとんどを除去することは、計算で６１．２ｋＤａの大きさのペプチドを作り出し、その大きさは、ｐＤＡＳ５１６２およびｐＤＡＳ５８４８で形質転換されたトウモロコシ植物において観察される６０ｋＤａのＤＩＧ−１０９切断型ペプチドのそれにきわめて近い。ＤＩＧ−１１１タンパク質（最初の９個のアミノ酸を除いてＣｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントのすべてを欠く）は、このような開裂に由来するＤＩＧ−１１０のセグメント（すなわち、ＤＩＧ−１１０のアミノ酸１〜５４３；計算で６１．２ｋＤａの大きさ）を含む。
【０２３２】
同様に、ＤＩＧ−１１２の類似のＲ５０８部位での開裂は、計算で５７．２ｋＤａの大きさのペプチドを作出し、その大きさは、ｐＤＡＳ５１６２およびｐＤＡＳ５８４８で形質転換されたトウモロコシ植物において観察される５５ｋＤａのＤＩＧ−１０９ペプチドのそれにきわめて近い。ＤＩＧ−１１３タンパク質（最初の９個のアミノ酸を除いてＣｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントのすべてを欠く）は、このような開裂に由来するＤＩＧ−１１２のセグメント（すなわち、ＤＩＧ−１１２のアミノ酸１〜５０８；計算で５７．２ｋＤａの大きさ）を含む。
【０２３３】
ＤＩＧ−１１４タンパク質は、ＤＩＧ−１０９タンパク質のアミノ酸１〜２８（これらの残基は、植物細胞中または昆虫の中腸中で酵素的に除去できる）を保持し、ＤＩＧ−１０９タンパク質のＲ５８２、潜在的トリプシン開裂部位で終結する。したがって、このＤＩＧ−１０９変異体は、Ｎ末端の２８個のアミノ酸がin vivoで除去されるかどうかに応じて、６５．７ｋＤａのタンパク質として、または６２．６ｋＤａのペプチドとして存在することができる。
【０２３４】
トウモロコシに対して最適化されたさらなるコード配列を、本明細書に開示の原理によってさらなるＤＩＧ−１０９タンパク質変異体をコードするように設計することができる。
【０２３５】
〔実施例１５〕
ＤＩＧ−１０９およびＤＩＧ−１０９変異体タンパク質をコードする発現プラスミドの構築およびシュードモナス（Pseudomonas）中での発現
ＤＩＧ−１０９タンパク質、あるいはＤＩＧ−１１０、ＤＩＧ−１１１、ＤＩＧ−１１２、ＤＩＧ１１３またはＤＩＧ−１１４タンパク質（集合的にＤＩＧ−１０９変異体タンパク質と呼ぶ）を産生するように遺伝子操作されたシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）（Ｐｆ）発現構築物の構築では、標準的なクローニング技術［例えば、Sambrookら、(1989)およびAusubelら、(1995)、およびこれらの更新版］を使用した。タンパク質の産生は、米国特許第５１６９７６０号中に開示されているような改変されたｌａｃオペロンの挿入を有するシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）株ＭＢ２１４（株ＭＢ１０１の誘導体；Ｐ．フルオレセンス（P.fluorescens）次亜種Ｉ）中で実施した。基本的なクローニング戦略は、ＤＩＧ−１０９またはＤＩＧ−１０９変異体タンパク質をコードするＤＮＡ断片をプラスミドｐＤＯＷ１１６９中にサブクローニングすることを必要とし、それによって、それは、プラスミドｐＫＫ２２３−３（ＰＬ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ウィスコンシン州）からのＰｔａｃプロモーターおよびｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーターの発現調節の下に置かれる。ｐＤＯＷ１１６９は、ＲＳＦ１０１０複製起点、ｐｙｒＦ遺伝子、およびタンパク質コード領域を含むＤＮＡ断片を導入することのできる制限酵素認識部位に先立つリボソーム結合部位を備えた中程度のコピープラスミドである（米国特許出願公開第２００８／０１９３９７４号）。発現プラスミドを、エレクトロポレーションによってＤＣ４５４（突然変異ΔｐｙｒＦおよびＩｓｃ：：ｌａｃＩＱＩを有する野生型に近いＰ．フルオレセンス（P.fluorescens）株）またはその誘導体に形質転換し、ＳＯＣ−ダイズ水解物培地中に回収し、選択培地（ウラシルを欠くＭ９グルコース寒天、Sambrookら、同上）上に播種した。微生物学的操作の詳細は、参照により本明細書に組み込まれるSquiresら(2004)、米国特許出願公開第２００６／０００８８７７号、米国特許出願公開第２００８／０１９３９７４号、および米国特許出願公開第２００８／００５８２６２号中から入手可能である。コロニーを、まずＰＣＲでスクリーニングし、陽性クローンを、次いで、ミニプレッププラスミドＤＮＡの制限消化によって分析した。挿入物を含む選択されたクローンのプラスミドＤＮＡを、ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、アラバマ州）などの商業的配列決定業者との契約によって配列決定した。配列データを集め、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ミシガン州）を使用して解析した。
【０２３６】
振盪フラスコ中での増殖および発現分析。特徴付けおよび昆虫でのバイオアッセイのためのＤＩＧ−１０９タンパク質またはＤＩＧ−１０９変異体タンパク質の産生は、適切な発現プラスミドを含む振盪フラスコで増殖させたＰ．フルオレセンス（P.fluorescens）株によって完遂された。ＤＩＧ−１０９タンパク質またはＤＩＧ−１０９変異体タンパク質の産生は、Ｐｔａｃプロモーターによって駆動され、米国特許第５５２７８８３号中に既に記載されているように実施した。発現は、振盪しながら３０℃で２４時間の最初のインキュベーションをした後に、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって誘導された。誘導の時点および誘導後のいくつかの時点で培養物をサンプリングした。６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）によって細胞密度を測定した。各サンプリング時点で、サンプルの細胞密度をＯＤ６００＝２０に調節し、１ｍＬのアリコートを１４０００×ｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを−８０℃で凍結した。
【０２３７】
〔実施例１６〕
シュードモナス（Pseudomonas）によるＤＩＧ−１０９およびＤＩＧ−１０９変異体タンパク質の産生に関する振盪フラスコサンプルの細胞分画およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
振盪フラスコ細胞ペレットの凍結サンプルから、ＥａｓｙＬｙｓｅ（商標）細菌タンパク質抽出溶解液（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）を使用して、溶性および不溶性画分を作出する。実施例２で開示したような方法および指針を採用する。
【０２３８】
〔実施例１７〕
シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）中で産生されるＤＩＧ−１０９変異体タンパク質の殺虫活性
ＤＩＧ−１０９変異体タンパク質の殺虫活性は、ユーロピアンコーンボーラー（ＥＣＢ；オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）（Ｈｕｂｎｅｒ））、Ｃｒｙ１Ｆ抵抗性ＥＣＢ（ｒＥＣＢ）、コーンイアーワーム（ＣＥＷ；ヘリコベルパ・ゼア（Helicoverpa zea）（Ｂｏｄｄｉｅ））、ブラックカットワーム（ＢＣＷ；アグロチス・イプシロン（Agrotis ipsilon）（Ｈｕｆｎａｇｅｌ））、フォールアーミーワーム（ＦＡＷ；スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（Ｊ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ））、Ｃｒｙ１Ｆ抵抗性ＦＡＷ（ｒＦＡＷ）、サウスウェスターンコーンボーラー（ＳＷＣＢ；ジアトラエア・グランジオセラ（Diatraea grandiosella））、シュガーケーンボーラー（ＳＣＢ；ジアトラエア・サッカラリス（Diatraea saccharalis））、およびＣｒｙ１Ａｂ抵抗性ＳＣＢ（ｒＳＣＢ）を含む鱗翅目種に対して立証される。
【０２３９】
実施例３および実施例４に開示の方法、指針、およびデータ解析に従う。
【０２４０】
〔実施例１８〕
ＤＩＧ−１０９変異体タンパク質をコードする植物で発現可能な遺伝子を含む植物形質転換ベクターの構築
アグロバクテリウム（Agrobacterium）スーパーバイナリー系（日本たばこ、東京、日本）を、単子葉植物宿主の形質転換に好都合には使用する。植物発現ベクターの構築、およびスーパーバイナリープラスミドの作出、およびそれらの検証は、実施例７および実施例８に開示のような方法によって実施する。ｐＳＢ１１誘導体プラスミドのＴ−ＤＮＡ成分の物理的配置は、好都合には、
ＲＢ＞トウモロコシＵｂｉ１プロモーター：ＤＩＧ−１０９変異体ＣＤＳ：トウモロコシＰｅｒ５  ３’ＵＴＲ＞コメＡｃｔ１プロモーター：ＤＳＭ２  ＣＤＳ：トウモロコシＬｉｐ３’ＵＴＲ＞ＬＢ、または
ＲＢ＞トウモロコシＵｂｉ１プロモーター：ＤＩＧ−１０９変異体ＣＤＳ：トウモロコシＰｅｒ５  ３’ＵＴＲ＞トウモロコシＵｂｉ１プロモーター：ＡＡＤ−１  ＣＤＳ：トウモロコシＬｉｐ３’ＵＴＲ＞ＬＢとして例示される。
【０２４１】
〔実施例１９〕
トウモロコシ植物中でのＤＩＧ−１０９タンパク質変異体の産生
トウモロコシのアグロバクテリウム（Agrobacterium）介在性形質転換。ＤＩＧ−１０９変異体タンパク質を産生する遺伝子導入トウモロコシ植物を、実施例９で開示した方法で作出する。
【０２４２】
トウモロコシの形質転換に関わる当業者は、他の植物で発現可能な選択マーカー遺伝子（例えば、除草剤耐性遺伝子）を使用する場合、トウモロコシの形質転換および形質転換された植物の選択のためにその他の方法を利用可能であることを理解するであろう。
【０２４３】
〔実施例２０〕
ＤＩＧ−１０９変異体タンパク質をコードする遺伝子を発現する遺伝子導入トウモロコシ植物の生化学的および分子的分析ならびに昆虫でのバイオアッセイ。
ＤＩＧ−１０９変異体タンパク質をコードする遺伝子を抱え、発現する遺伝子導入トウモロコシ植物によって産生されたＤＩＧ−１０９変異体タンパク質の生化学的特徴付けは、実施例１０および実施例１２の方法および試薬を用いて実施される。ＤＩＧ−１０９変異体タンパク質をコードする遺伝子の導入遺伝子分析は、実施例１１に開示の方法および試薬により実施される。ＤＩＧ−１０９変異体タンパク質をコードする遺伝子を抱え、発現する遺伝子導入トウモロコシ植物に由来する葉片の昆虫でのバイオアッセイは、実施例１０に開示の方法によって行われる。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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