(57)【要約】  本発明は、南極地衣類であるＲａｍａｌｉｎａ ｔｅｒｅｂｒａｔａから分離したラマリンの新規用途である抗炎症活性に関し、より詳細にはラマリンを有効性分として含有する医薬組成物に関するものである。本発明のラマリンは、天然物由来の物質で、毒性及び副作用がなく、ｉＮＯＳ（酸化窒素生成酵素）の発現を転写段階で抑制して、炎症反応の核心媒介物質であるＮＯ（酸化窒素）の生成を顕著に抑制し、炎症媒介前駆物質であるＮＦ−κＢの活性化を抑制し、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＥＲＫ１／２及びＪＮＫ信号伝達経路を抑制し、ＬＰＳレセプターであるＴＬＲ４の発現も抑制した結果、優れた抗炎症効果を持つため、これを含有する組成物は、炎症疾患または免疫疾患を根本的に治療及び予防するだけでなく、症状を緩和又は改善させるのに有用である。
2013534517.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）の構造を持つラマリン（Ramalin）、または、薬学的に許容可能なその塩を有効性分として含有する炎症疾患または免疫疾患の予防または治療用医薬組成物：
【化１】
2013534517.tif 000007
【請求項２】
前記炎症疾患、または免疫疾患は、アトピー皮膚炎、関節炎、尿道炎、膀胱炎、動脈硬化症、アレルギー疾患、鼻炎、喘息、急性痛み、慢性痛み、歯周炎、歯肉炎、炎症性腸疾患、痛風、心筋梗塞、鬱血性心不全、高血圧、狭心症、胃潰瘍、脳梗塞、ダウン症候群、多発性硬化症、肥満、糖尿病、認知症、うつ病、統合失調症（精神分裂症）、結核、睡眠障害、敗血症、火傷、すい臓炎、パーキンソン病、脳卒中、発作による脳損傷、または自己免疫疾患であることを特徴とする請求項１に記載の予防または治療用医薬組成物。
【請求項３】
前記組成物は、医薬組成物の製造に通常用いられる適切な担体、賦形剤または、希釈剤を追加で含むことを特徴とする請求項１に記載の予防または治療用医薬組成物。
【請求項４】
前記組成物は、抗ヒスタミン剤、消炎鎮痛剤、抗癌剤及び抗生剤からなる群から選択された一つ以上の薬剤と共に製剤化したり、併用して用いることを特徴とする請求項１に記載の予防または治療用医薬組成物。
【請求項５】
下記一般式（１）の構造を持つラマリンを有効性分として含有する炎症疾患または免疫疾患の予防または改善用機能性食品：
【化２】
2013534517.tif 000008
【請求項６】
前記炎症疾患、または免疫疾患は、アトピー皮膚炎、関節炎、尿道炎、膀胱炎、動脈硬化症、アレルギー疾患、鼻炎、喘息、急性痛み、慢性痛み、歯周炎、歯肉炎、炎症性腸疾患、痛風、心筋梗塞、鬱血性心不全、高血圧、狭心症、胃潰瘍、脳梗塞、ダウン症候群、多発性硬化症、肥満、糖尿病、認知症、うつ病、統合失調症（精神分裂症）、結核、睡眠障害、敗血症、火傷、すい臓炎、パーキンソン病、脳卒中、発作による脳損傷、または自己免疫疾患であることを特徴とする請求項５に記載の予防または改善用機能性食品。
【請求項７】
下記一般式（１）の構造を持つラマリンを有効性分として含有する機能性化粧品：
【化３】
2013534517.tif 000009
【請求項８】
前記機能性化粧品は、炎症疾患改善用であることを特徴とする請求項７に記載の機能性化粧品。
【請求項９】
前記炎症疾患は、アトピー皮膚炎症または火傷炎症であることを特徴とする請求項８に記載の機能性化粧品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラマリンの新しい用途である炎症疾患、または免疫疾患治療用途に関するものである。より詳細には、抗炎症活性を持つラマリン、またはその塩を含有する組成物で、炎症疾患、または免疫疾患の予防及び治療用医薬組成物、及び前記組成物を利用した炎症疾患、または免疫疾患の予防または治療方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
炎症反応は、病原体による感染や組織の損傷のような種々の要因によって起きる生体防御反応であり、感染部位や損傷部位にだけ被害を限定させるための初期保護作用を行う。多くの場合、このような炎症反応は、内在免疫の構成要素を利用した病原性要因の除去及び特異的適応免疫の誘導等につながる（Hawiger J., Innate Immunity and Inflammation: A Transcriptional Paradigm. Immunologic Research. 23, pp.99-109, 2001）。炎症に伴う特徴として知られる発赤（rubor）、浮腫（tumor）、熱（calor）、痛み（dolor）等は、炎症部位での炎症媒介体とサイトカイン等の作用による血管の拡張に伴う局所血流の増加及び局所血流速度の減少、血管の透過性増加に伴う血漿成分の血管外流出増加、血管内皮細胞の循環免疫細胞に対する付着性増加に伴う免疫細胞の血管外流出増加及び走化性による感染部位での移動増加等といった連続的な免疫反応の結果である（Gallo RL, Murakami M, Takaaki O, Zaiou M., Biology and clinical relevance of naturally occurring antimicrobial peptides. J. Allergy. Clin. Immunol. 110, pp.823-831. 2002; Graeme B. Ryan, MB, and Guido M., Acute Inflammation. American Journal of Pathology. 86(1), pp.185-274, 1977）。組織損傷に対する反応として、一部細胞で生成されるヒスタミン、そして血液内において非活性化状態で存在しながら組織損傷によって活性化する低分子ペプチド性キニンも炎症関連血管拡張及び血管の透過性増加に寄与する（Yamaki K, Thorlacius H, Xie X, Lindbom L, Hedqvist P, Raud J., Characteristics of histamineinduced leukocyte rolling in the undisturbed microcirculation of the rat mesentry. British J.Pharmacol. 123, pp.390-399, 1998; Brocklehurst WE, Role of Kinins and Prostaglandins in Inflammation. Proc. Roy. Soc. Med. 64, pp.4-6, 1971）。
【０００３】
一般に、急性炎症反応は、早く進行されて短い期間維持され、急性炎症には急性期反応という全身性反応が伴う。一方、感染や自己免疫疾患のように一部疾患と関連して、持続的な免疫活性化の結果から慢性炎症が誘発され、大食細胞（macrophages）の蓄積と活性化は、慢性炎症反応の証拠である（Huang AL, Vita JA, Effects of Systemic Inflammation on Endothelium-Dependent Vasodilation. Trends, Cardiovasc. Med. 16, p.1520, 2006）。しかし、持続的な慢性炎症反応の場合、宿主細胞や組織に深刻な損傷を誘発することがある。
【０００４】
感染部位での炎症反応は、病原体に対する大食細胞の反応によって開始される。病原体によって活性化した大食細胞が生成する反応性活性酸素種及び活性窒素種（例えばＮＯ）、プロスタグランジン、ロイコトリエン等のような炎症性メディエーター、そしてＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−８等の炎症誘発性サイトカイン等が炎症反応に関与すると知られている（Renauld JC, New insights into the role of cytokines in asthma. J. Clin. Pathol. 54, pp.577-589, 2001; Blake GJ, Ridker PM, Tumour necrosis factor-α, inflammatory biomarkers, and atherogenesis. Eur. Heart J. 23, pp.345347, 2002）。このような炎症媒介体の生成に関連した遺伝子の転写因子であるＮＦ−κＢの活性化が、大食細胞の炎症関連作用に大変重要である。大食細胞内で誘導性酸化窒素合成酵素（inducible nitric oxide synthase、ｉＮＯＳ２）、シクロオキシゲナーゼ（cyclooxygenase、ＣＯＸ−２）、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８等の炎症関連遺伝子がＮＦ−κＢによって転写すると報告されている。
【０００５】
酸化窒素（ＮＯ）は、人体の大食細胞（macrophage）で酸化窒素合成酵素（nitric oxide synthetase、以下ＮＯＳと称する）によりＬ−アルギニン（L-arginine）から生成される（Kerwin, J.F. et al., J. Med. Chem., 38:4343, 1995）。人体のＮＯＳには内皮細胞構成型ＮＯＳ （endothelial constitutive NOS、以下、ｅｃＮＯＳと称する）、神経細胞構成型ＮＯＳ （neuronal constitutive NOS、以下ｎｃＮＯＳと称する）及び誘導性ＮＯＳ（inducible NOS、以下、ｉＮＯＳと称する）の三つの異性体が存在する。この中でｅｃＮＯＳとｎｃＮＯＳは、各々内皮細胞と神経外皮細胞で発現し、カルシウム及びカルモジュリン（calmodulin）に依存的である反面、ｉＮＯＳは病原菌の細胞膜成分であるリポ多糖（lipopolysaccharide、以下、ＬＰＳと称する）、ＩＬ−１、ＴＮＦ−αのようなサイトカイン（cytokine）、放射線等の免疫刺激剤によって細胞が活性化する時にだけ多くの細胞で多量に発現し、カルシウム及びカルモジュリンに非依存的である。ＮＯは、高濃度では腫瘍細胞と病原菌に対して防御機能をし、血管内皮細胞で生成された低濃度のＮＯは、血圧調節作用を、神経細胞で生成されるＮＯは、神経伝達物質（neurotransmitter）、学習、記憶等に関連した多様な生理反応を行う。誘導型でない構成型ＮＯＳ（ｃＮＯＳ）は、人体の恒常性維持に重要な役割を果たすが、ｅｃＮＯＳによって生成されたＮＯは、血管系に作用して、血管拡張、血小板付着や凝集を抑制させ、ｎｃＮＯＳによって生成されたＮＯは、神経系に作用して、記憶能力に重要な長期記憶能力を上昇させたり、神経伝達物質としてうつ病を起こすだけでなく、消化器官の運動性や陰茎の勃起にも関与する。
【０００６】
その反面、特定サイトカインやＬＰＳによって誘導されたｉＮＯＳ発現によって生成されるＮＯは、炎症発現や宿主防御機序等に作用する。また、菌体内毒素（endotoxin）の刺激によって、大食細胞（macrophage）で転写因子ＮＦ−κＢが活性化されてｉＮＯＳ発現が誘導され、これからＮＯの生成が増加する（Butler, A.R., Chemistry & Industry, 16:828, 1995）。ＬＰＳ、炎症誘発因子、放射線照射等の外部刺激によってｉＮＯＳの発現が誘導されると、多量のＮＯが４〜６時間継続的に生成され、これは人体に炎症反応を誘発すると知られている。また、ラットの場合、ＬＰＳの外部刺激によって大食細胞で多量のｉＮＯＳ ｍＲＮＡと蛋白質が発現して、ここで合成されたＮＯは、微生物殺菌作用と抗腫瘍作用を行う。しかし、必要以上の過度のＮＯの生成は、関節炎及び敗血症等の炎症疾患、組織移植拒否反応、自己免疫疾患糖尿病等の免疫疾患、並びに神経細胞の死滅を惹起させると知られている。
【０００７】
従って、ｉＮＯＳ活性抑制剤の開発は、このような疾患治療剤としての開発可能性が高く、このような観点からｉＮＯＳによるＮＯ生成を抑制する化合物は、人体の種々の炎症疾患の治療剤として利用できる。ＮＯの産生を抑制する物質の研究は、主にｉＮＯＳの酵素活性を特異的に阻害する物質の開発に集中して研究されたが、前駆体であるＬ−アルギニン（arginine）誘導体、Ｌ−シトルリン（citrulline）誘導体、アミノグアニジン（amino guanidine）誘導体、イソチオウレア（isothiourea）誘導体等の開発研究が進められている（Babu, B.R.B. and Griffith O.W., Current Opinionin Chemical Biology, 2:491, 1998）。
【０００８】
しかし、炎症反応においてｉＮＯＳの転写段階での発現調節は、ＮＯの生成程度を決めるに当たり非常に重要であるため、大食細胞内の転写因子ＮＦ−κＢの阻害制であるＩｋＢのリン酸化によるＮＦ−κＢの活性調節に係る薬品、またはＮＦ−κＢの活性調節に係るＡｋｔ信号伝達、ＥＲＫ、ｃ−ｊｕｎ−及びｐ３８−ＭＡＰＫ信号伝達経路に係る薬剤の開発が求められているのが現状である。
【０００９】
地衣類は、非開花植物（non-flowering plants）と似ており、菌体（mycobiont）及び藻類（alga, photobiant）及び／または、シアノバクテリアの共生連合である。地衣類において、菌体は葉状体、または典型的な二次代謝産物を含有している苔化された基質を形成する（Ahmadjin V., The lichen symbiosis, Wiley, New York, pp.1-6, 1993）。地衣類は、十分量の天然サンプルの収集が難しく、大量栽培技術が知られていないために、高等植物よりは研究がそれほど行われていなかった。地衣類の組織培養法、大量産生方法及び生化学的分析方法等が改善されるにつれて、これに対する研究が活発に行われている。細胞毒性、抗かび、抗微生物、抗酸化等の種々の生物学的活性を持つ脂肪酸、デプシド（depside）及びデプシドン（depsidones）、ジベンゾフラン（debenzofurans）、ジテルペン（diterpenes）、アントラキノン（anthraquinones）、ナフトキノン（naphtoquinones）、ウスニン酸（usninic acid）、プルビン酸（pulvinic acids）、キサントン（xanthones）及びエピジチオピペラジンジオン（epidithiopiperazinediones）を含む化合物が地衣類から分離された研究がある（Muller, K., Appl. Microbiol. Biotechnol., 56:9-16, 2001）。
【００１０】
ラマリナ・テレブラタ（Ramalina terebrata）は、南極大陸キングジョージ島に群落を成し自生する地衣類であり、キングジョージ島で容易に採取できる。本発明者等は、前記南極地衣類Ｒａｍａｌｉｎａ ｔｅｒｅｂｒａｔａを研究し、優秀な抗酸化活性を持ったラマリン（Ramalin）といった新規化合物を分離したことがある（ＫＲ出願番号２００８−１１１０２１号）。しかし、ラマリン（Ramalin）が、抗炎症活性があることを報告した例はない。
【００１１】
そこで、本発明者等は、マウス大食細胞ＲＡＷ２６４．７を対象に、ＬＰＳ誘導ＮＯ産生に及ぼすラマリン（Ramalin）の効果を調べるために、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏで比較実験を行って細胞免疫抑制活性を検討した結果、ラマリンが炎症反応を抑制する効果があることを初めて確認した。より詳細には、本発明のラマリンが、ｉＮＯＳのｍＲＮＡ発現を抑制して、ＮＯの生成を有意的に抑制し、ＮＦ−κＢ活性化を抑制し、ｐ３８  ＭＡＰＫ、ＥＲＫ１／２及びＪＮＫ信号伝達経路を抑制し、ＬＰＳレセプターであるＴＬＲ４の発現も抑制し、それと共にｉｎ ｖｉｖｏ実験において、優秀な抗炎症及び免疫調節効果を示すことを確認して、本発明を完成することになった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、抗炎症及び免疫調節活性を持つラマリン（Ramalin）の新規用途を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記目的を達成するために、本発明は下記一般式（１）の構造を持つラマリン（Ramalin）、または、薬学的に許容可能なその塩を有効性分として含有する炎症疾患または免疫疾患の予防または治療用医薬組成物を提供する：
【化１】
2013534517.tif 000003
【００１４】
本発明において、前記ラマリン（Ramalin）は、ｉＮＯＳ遺伝子の発現を阻害して酸化窒素（nitric oxide、ＮＯ）の過剰生成を抑制することを特徴とする。
【００１５】
本発明において、前記炎症疾患、または免疫疾患は、アトピー皮膚炎、関節炎、尿道炎、膀胱炎、動脈硬化症、アレルギー疾患、鼻炎、喘息、急性痛み、慢性痛み、歯周炎、歯肉炎、炎症性腸疾患、痛風、心筋梗塞、鬱血性心不全、高血圧、狭心症、胃潰瘍、脳梗塞、ダウン症候群、多発性硬化症、肥満、糖尿病、認知症、うつ病、統合失調症（精神分裂症）、結核、睡眠障害、敗血症、火傷、すい臓炎、パーキンソン病、脳卒中、発作による脳損傷、または自己免疫疾患であることを特徴とする。
【００１６】
本発明において、前記組成物は、医薬組成物の製造に通常用いられる適切な担体、賦形剤または、希釈剤を追加で含むことを特徴とする。
【００１７】
本発明において、前記組成物は抗ヒスタミン剤、消炎鎮痛剤、抗癌剤及び抗生剤からなる群から選択された一つ以上の薬剤と共に製剤化したり、併用して用いることを特徴とする。
【００１８】
本発明は、前記一般式（１）の構造を持つラマリン（Ramalin）、または薬学的に許容可能なその塩の炎症疾患または免疫疾患の予防または治療のための用途を提供する。
【００１９】
本発明は、前記一般式（１）の構造を持つラマリン（Ramalin）、または薬学的に許容可能なその塩を利用して、炎症疾患または免疫疾患の予防または治療する方法を提供する。
【００２０】
本発明は、前記一般式（１）の構造を持つラマリン（Ramalin）、または薬学的に許容可能なその塩を対象に処理（投与）する段階を含む炎症疾患または免疫疾患の予防または治療する方法を提供する。
【００２１】
本発明は、また、前記一般式（１）の構造を持つラマリンを有効性分として含有する免疫疾患または炎症疾患の予防または改善用機能性食品及び機能性化粧品を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１はＬＰＳ処理後、２４時間培地にある亜硝酸ナトリウム（nitrite）の量を測定した結果である。
【図２】図２はｉＮＯＳ ｍＲＮＡと、対照群としてＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ発現量をＲＴ−ＰＣＲ分析で調べた結果である。
【図３】図３は、ｉＮＯＳ蛋白質の量と、対照群としてベータアクチン（β-actin）蛋白質の量をウェスタンブロット（Western blot）分析で調べた結果である。
【図４】図４は、ＬＰＳ処理後、２４時間表面発現するＴＬＲ４の量を測定した結果である。
【図５】図５は、ＴＬＲ４ ｍＲＮＡと、対照群としてＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ発現量をＲＴ−ＰＣＲ分析で調べた結果である。
【図６】図６は、ＴＬＲ４蛋白質の量と、対照群としてベータアクチン（β-actin）蛋白質の量をウェスタンブロット（Western blot）分析で調べた結果である。
【図７】図７は、ＲＡＷ２６４．７細胞を、ｐＧＬ３−ＮＦ−κＢ−ＬｕｃリポータープラスミドとｐＣＭＶ−β−ｇａｌで形質転換させた後、これをＬＰＳ処理（４時間）した後、相対的なルシフェラーゼ値を測定した結果である。
【図８】図８は、ＮＦ−κＢのｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎを分析するために、ｐ６５核蛋白質の量を測定したウェスタンブロット分析結果である。
【図９】図９は、ラマリン１０μｇ／ｍＬを２時間前処理するか、しなくてＬＰＳ１μｇ／ｍＬを表示された時間だけ処理した後、抗ＩκＢα抗体でウェスタンブロット分析した結果である。
【図１０】図１０は、ＬＰＳ刺激を受けた大食細胞（macrophages）でｐ−ｐ３８、ｐ−ＪＮＫ、ｐ−ＥＲＫ活性化に対するラマリンの効果を示す結果であり、一時間ラマリンを前処理した後、ＬＰＳを２０分処理した後、全体細胞溶解物をウェスタンブロットで分析した結果である。
【図１１】図１１は、カラギナン（carrageenan）により誘導されたラットの足浮腫の大きさを示し、賦形剤を投与した対照群とインドメタシン（Indomethacin、ＳｉｇｍａＩ−７３７８）を投与した陽性対照群と比較すると、ラマリン投与群（１００ｍｇ／ｋｇ）は６時間後５０％程度の抗炎症効果があることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
一観点において、本発明は、下記一般式（１）の構造を持つラマリン（Ramalin）の新規用途に関する：
【化２】
2013534517.tif 000004
【００２４】
本発明のラマリンは、南極地衣類のラマリナテレブラタから分離した抗酸化活性を持つ化合物で、前記ラマリンは、高分解能ＥＳ−ＭＳを利用して確認した結果、分子量が２５４．１１４１で、分子式Ｃ１１Ｈ１６Ｎ３Ｏ４の化合物で前記一般式（１）の構造を持つことを確認し、ラマリナテレブラタから分離した化合物であるため、ラマリンでと命名された。
【００２５】
本発明では、ラマリンの新規効能である抗炎症活性を分析するために、ｉＮＯＳ（酸化窒素生成酵素）の発現を転写段階で抑制して、炎症反応の核心媒介物質であるＮＯ（酸化窒素）の生成を顕著に抑制し、炎症媒介前駆物質であるＮＦ−κＢのリン酸化を抑制し、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＥＲＫ１／２及びＪＮＫ信号伝達経路を抑制し、ＬＰＳレセプターであるＴＬＲ４の発現も抑制することを確認した。前記確認結果を下記実施例等に詳細に説明する。
【００２６】
本発明は、前記一般式（１）の構造を持つラマリン（Ramalin）、または薬学的に許容可能なその塩の炎症疾患または免疫疾患の予防または治療のための用途に関する。
【００２７】
本発明は、一般式（１）の構造を持つラマリン（Ramalin）、または薬学的に許容可能なその塩を有効性分として含有する炎症疾患または免疫疾患の予防または治療用医薬組成物に関する。本発明は、前記一般式（１）の構造を持つラマリン（Ramalin）、または薬学的に許容可能なその塩を利用して、炎症疾患または免疫疾患の予防または治療する方法を提供する。一具現例として、前記一般式（１）の構造を持つラマリン（Ramalin）、または薬学的に許容可能なその塩を対象に処理（投与）する段階を含む炎症疾患または免疫疾患の予防または治療する方法に関するものである。ここで、前記処理または投与は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことができる。
【００２８】
本発明において、前記炎症疾患、または免疫疾患は、アトピー皮膚炎、関節炎、尿道炎、膀胱炎、動脈硬化症、アレルギー疾患、鼻炎、喘息、急性痛み、慢性痛み、歯周炎、歯肉炎、炎症性腸疾患、痛風、心筋梗塞、鬱血性心不全、高血圧、狭心症、胃潰瘍、脳梗塞、ダウン症候群、多発性硬化症、肥満、糖尿病、認知症、うつ病、統合失調症（精神分裂症）、結核、睡眠障害、敗血症、火傷、すい臓炎、パーキンソン病、脳卒中、発作による脳損傷、または自己免疫疾患を意味する。 
【００２９】
本発明に用いられた用語「炎症疾患」とは、外部物質または内部物質から由来する炎症反応により起きる疾患で、代表的には神経炎症疾患、及び関節炎等が挙げられる。本発明に用いられた用語「免疫疾患」とは、人体内の免疫系の過度な反応により起きる疾患を意味して、代表的にはアレルギー疾患等が挙げられる。しかし、炎症反応とは、生体内免疫系の反応により起きることになるため、炎症疾患と免疫疾患は、大きく見ると類似する範囲を指す用語として用いることができ、本明細書では明確に区別する用語として用いず、混用するようにする。
【００３０】
本発明に係る医薬組成物の投与経路は、これらに限定されるものではないが、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下または直腸が含まれる。経口及び非経口投与が望ましい。本願に用いられた用語「非経口」とは、皮下、血内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、硬膜、病巣内及び頭蓋骨内注射または注入技術を含む。本発明の医薬組成物は、また直腸投与のための座薬の形態で投与される。
【００３１】
本発明の医薬組成物はこれらに限定されるのではないが、カプセル、錠剤及び水性懸濁液及び溶液を含んで経口的に許容されるいかなる調剤（dosage）でも経口投与される。経口用精製の場合、よく使われる担体としてはラクトース及びとうもろこし澱粉が含まれる。さらに、マグネシウムステアレートのような潤滑剤が典型的に添加される。カプセル型として経口投与する場合、有用な希釈剤としては、ラクトース及び乾燥されたとうもろこし澱粉が含まれる。水性懸濁液が経口投与される際に活性成分は、乳化剤及び懸濁化剤と配合される。必要に応じて、甘味剤及び／または風味剤及び／または着色剤が添加される。
【００３２】
本発明の医薬組成物は、用いられた特定化合物の活性、年令、体重、一般的な健康、性別、規定式、投与時間、投与経路、排出率、薬品配合及び予防または治療される特定疾患の重症を含んだ多くの要因によって多様に変わる。本発明に係る医薬組成物は、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤に剤形できる。
【００３３】
本発明において、前記医薬組成物は、抗ヒスタミン剤、消炎鎮痛剤、抗癌剤及び抗生剤からなる群で選択された一つ以上の薬剤と共に製剤化するか、併用してもよい。
【００３４】
また他の観点において、本発明は、一般式（１）の構造を持つラマリン（Ramalin）、または、薬学的に許容可能なその塩を有効性分として含有する炎症疾患または免疫疾患の予防または治療用医薬組成物を投与する炎症疾患または免疫疾患の予防または治療する方法に関する。
【００３５】
本発明の医薬組成物、及び予防または治療方法は、抗炎症活性に優れて、毒性と副作用がない天産物由来の化合物であるラマリンを利用したため、有用である。
【００３６】
また他の観点において、本発明は、一般式（１）の構造を持つラマリンを有効性分として含有する免疫疾患または炎症疾患の予防または改善用機能性食品に関する。
【００３７】
本発明の機能性食品は、炎症予防のための薬剤、食品及び飲料等に多様に利用される。本発明の機能性食品は、例えば、各種食品類、キャンディ、チョコレート、飲料、ガム、茶、ビタミン複合剤、健康補助食品類などがあって、粉末、顆粒、精製、カプセルまたは飲料の形態で使える。本発明の免疫疾患または炎症疾患は、アトピー皮膚炎、関節炎、尿道炎、膀胱炎、動脈硬化症、アレルギー疾患、鼻炎、喘息、急性痛み、慢性痛み、歯周炎、歯肉炎、炎症性腸疾患、痛風、心筋梗塞、鬱血性心不全、高血圧、狭心症、胃潰瘍、脳梗塞、ダウン症候群、多発性硬化症、肥満、糖尿病、認知症、うつ病、統合失調症（精神分裂症）、結核、睡眠障害、敗血症、火傷、すい臓炎、パーキンソン病、脳卒中、発作による脳損傷または自己免疫疾患を意味する。
【００３８】
本発明の機能性食品に有効性分として含まれたラマリンは、下記生物学的メカニズムを分析した結果から、明らかに抗炎症活性が優れているため、食品に用いる場合、優れた効能を示すことは当業者には自明であろう。
【００３９】
また他の観点において、本発明は、一般式（１）の構造を持つラマリンを有効性分として含有する免疫疾患または炎症疾患の予防または改善用機能性化粧品に関する。
【００４０】
本発明の機能性化粧品は、一般的な乳化剤形及び可溶化剤形の形態で製造することができる。乳化剤形の化粧品としては、栄養化粧水、クリーム、エッセンス等があって、可溶化剤形の化粧品としては柔軟化粧水がある。
【００４１】
本発明に適合する化粧品の剤形としては、例えば、溶液、ゲル、固体または練りこねた無水生成物、水相に油相を分散させて得たエマルジョン、懸濁液、マイクロエマルジョン、マイクロカプセル、微細顆粒球、またはイオン型（リポソーム）、非イオン型の小嚢分散剤の形態、クリーム、スキンローション、パウダー、軟膏、スプレーまたはコンシールスティックの形態で提供される。また、泡沫（foam）の形態または圧縮された高圧ガス（propellants）をさらに含有したエアゾール組成物の形態にも製造される。
【００４２】
本発明の化粧料組成物は、さらに脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤及びゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁化剤、安定化剤、発泡剤（foaming agent）、芳香剤、界面活性剤、水、イオン型または非イオン型乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤及びキレート化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤化剤、精油（essential oils）、染料、顔料、親水性または親油性活性化剤（hydrophilic or lipophilic activating agents）、脂質小嚢または化粧品に通常用いられる任意の他の成分のような補助剤を含有してもよい。そして、前記成分等は、皮膚科学分野において一般に用いられる量で導入される。
【００４３】
本発明の機能性化粧品は、特に抗炎症効果が優れており、化粧品が主に用いられる皮膚の炎症疾患のアトピー皮膚炎または火傷疾患等による炎症の症状を緩和させる機能性化粧品として有用である。
【００４４】
本発明の機能性食品に有効性分として含まれたラマリンは、下記生物学的メカニズムを分析した結果から、明らかに抗炎症活性が優れているため、化粧品に用いる場合、優れた効能を示すことは当業者には自明であろう。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００４６】
実施例１：ラマリンの分離
完全凍結乾燥され、粉砕された地衣類ラマリナテレブラタのサンプル６７２ｇをメタノール：水（５Ｌ、８０：２０ｖ／ｖ）混合溶液を利用して３回繰り返して抽出した後、凍結乾燥を経て８３ｇの粗抽出物を得た。前記粗抽出物を１Ｌの蒸溜水に溶かした後、１Ｌのノルマルヘキサン（n-hexane）とクロロホルム（ＣＨＣｌ３）で抽出してノルマルヘキサン１２．７ｇとクロロホルム（ＣＨＣｌ３）９．１ｇ、水溶性抽出物６１．０ｇを得た。前記水溶性抽出物は、ＤＰＰＨ自由ラジカルに対して高い活性ＩＣ５０＝９μｇ／ｍＬを示した。前記水溶性抽出物中５ｇを利用して、自動化されたＭＰＬＣ（mild pressure liquid chromatography）を適用させ、０％、２０％、４０％、６０％、８０％、１００％メタノール−水物混合溶液で段階的にグラジエント溶媒システムを実施した。０％メタノール−水混合溶液に溶かした抽出物は、ＤＰＰＨ自由ラジカルに対して高い活性ＩＣ５０＝８μｇ／ｍＬを示し、その中１００ｍｇ部分をＣ１８ＯＤＳカラム（２５０ｃｍ×１０ｃｍ）を用いてセミ分取逆相ＨＰＬＣ（semi-preparative reverse phase HPLC）で分析した。用いられた溶媒システムは、０．１％ギ酸を混合した水に対して０％メタノール−水物混合溶液の場合、１０分、２０％メタノール−水物混合溶液は２０分、１００％メタノール溶液に対しては３０分以上行った。流速は２ｍＬ／分とした。
【００４７】
その結果、化合物は紫外線２８０ｎｍで吸収された。５回目の分画（４５ｍｇ；ｔＲ＝１８．８８分）の場合、ＤＰＰＨ自由ラジカルに対して最も高い活性ＩＣ５０＝１μｇ／ｍＬを示し、その分画をＣ１８ＯＤＳカラム（２５０ｃｍ×１０ｃｍ）を用いてセミ分取逆相ＨＰＬＣ（semi-preparative reverse phase HPLC）で繰り返し精製した。グラジエント溶媒システムは、１０〜３０％アセトニトリル（acetonitrile）水溶液（０．１％ギ酸）を用いて５０分以上行い、流速は２ｍＬ／分であった。その結果、８．２６分にＤＰＰＨ自由ラジカルに対する活性がＩＣ５０＝０．９９μｇ／ｍＬであるラマリン３０ｍｇを得た。
【００４８】
ＥＳＩＭＳ（Electrospray ionization mass spectrometry）データは、Ｍａｒｉｎｅｒ ＥＳＩ−ＭＳ機械（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、ＵＳＡ）を用いて得た。ＮＭＲスペクトル（１Ｄ及び２Ｄ）はＤ２Ｏに加えて、アセトン−ｄ６を用いて、ＪＥＯＬ ＪＮＭ ＥＣＰ−４００スペクトロメーター（１３Ｃ１Ｈ及び４００ＭＨｚに対する４００ＭＨｚ）を利用して記録した。この時、ケミカルシフトは残余アセトン−ｄ６（ｄＨ／ｄＣ＝２．２２／２１．０）を参照した。ＨＭＱＣ及びＨＭＢＣ実験は、１ＪＣＨ＝１４０Ｈｚ、ｎＪＣＨ＝８Ｈｚの条件で最適化された。その結果、構造は下記のように明らかになった。
【化３】
2013534517.tif 000005
【００４９】
以下、特に断らない限り全ての化合物はシグマケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ＵＳ））で購入した。また、以下、全ての細胞培養物、チオグリコレート培養物及びラマリンは、Ｌｉｍｕｌｕｓ ｌｙｓａｔｅ ｔｅｓｔ（Ｅ−Ｔｏｘａｔｅ ｋｉｔ、Ｓｉｇｍａ、ＵＳ）を利用してエンドトキシン（endotoxin）汚染の有無を調べて１０ｐｇ／ｍＬ以下であることを確認した。
【００５０】
実施例２：ＬＰＳ処理された大食細胞で酸化窒素発生量に対するラマリン処理の効果
ＬＰＳ誘導ＮＯ発生量に対するラマリンの前処理効果を調べるために、マウス大食細胞株ＲＡＱ２６４．７（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳ）を利用して検証した。細胞は、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳ）に２ｍＭＬグルタミン、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μＬ／ｍＬストレプトマイシン、及び１０％熱不活性化ウシ血清アルブミン（ＦＢＳ：Ｃａｒｌｓｂａｎｄ、ＵＳ）を供給して培養した。また、３７℃、５％ＣＯ２、湿った空気条件で培養され、一週間に二回培地を交換した。
【００５１】
大食細胞の濃度は、９６ウエル組織培養皿に１×１０５ｃｅｌｌｓ／ウエル濃度で培養され、細胞毒性を調べるためにラマリンを２時間の間処理した。細胞生存率は、生きている細胞のミトコンドリア活動を示し、細胞生存率を測定可能なＭＴＴ（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）量的色度計分析で施行した。ＭＴＴがホルマザンに還元された量をモレキュラー・デバイス・マイクロプレート・リーダー（Molecular Device microplate reader；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳ）を利用して５５０ｎｍにおいて光学密度で分析した。
【００５２】
その結果、０．１、１、１０μｇ／ｍＬの濃度のラマリンを処理した場合、細胞毒性がなく生存率に変化はなかった。ただ、データに示していないが、１００μｇ／ｍＬでは細胞毒性が現れた。
【００５３】
二酸化窒素（ＮＯ２−）蓄積量を把握するために、ラマリン前処理した実験群と何の処理もしない対照群を準備した。ラマリン前処理は、ＬＰＳ１μｇ／ｍＬを処理する２時間前に０．１、１、１０μｇ／ｍＬの濃度で行った。培地に蓄積された二酸化窒素の量は、１００μＬの上澄液を各ウエルから分離して、後、１００μＬのグリース（Griess）溶液（蒸溜水に溶解した０．１％ナフチルエチレンジアミンジヒドロクロライドと５％Ｈ３ＰＯ４に溶解した１％スルファニルアミドの１：１混合液）を追加した後、モレキュラー・デバイス・マイクロプレート・リーダー（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳ）を利用して５５０ｎｍで吸光度を測定した。二酸化窒素濃度は、亜硝酸ナトリウム（nitrite；ＮａＮＯ２）標準曲線で計算できる。二酸化窒素レベルは、酸化窒素（ＮＯ）の量を示す指標になることができる。
【００５４】
その結果、図１に示した亜硝酸ナトリウムの濃度から、１０μｇ／ｍＬのラマリンを前処理により、酸化窒素の産生の減少が有意に現れ、それより低い濃度においても酸化窒素の産生の減少が現れることを確認することができた。
【００５５】
統計分析は、Ｆｉｓｈｅｒ'ｓ ＰＬＳＤによる単方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いたグループ間の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．統計差を測定することによって確認し、有意値を星印で表した。特別な記述がない限り、下記の実施例にも同じ統計分析方法を使った。
【００５６】
実施例３：ＬＰＳ処理された大食細胞でｉＮＯＳ発生量に対するラマリン処理の効果
ＬＰＳ誘導ｉＮＯＳ発生量に対するラマリンの前処理効果を調べるために、ｍＲＮＡ発生量をＲＴ−ＰＣＲで調べ、蛋白質発生量をウェスタンブロット（Western Blot）分析で調べた。ＮＯ産生減少は、ｉＮＯＳ生成抑制によるものだからである。ＲＴ−ＰＣＲは、実施例２のようにＬＤＳとラマリンを処理した後、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｔｒｏｖｉｇｅｎ、ＵＳ）を用いて培養された細胞の全てのＲＮＡを回収した。その後、全てのＲＮＡをＰＬＡＴＩＮＵＭ Ｔａｑ ｋｉｔ（Ｉｎｔｒｏｖｉｇｅｎ、ＵＳ）を利用して、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ｏｎｅ ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲを行って増幅した。ＰＣＲ結果は、１．２％アガロースゲルに掛けてＥｔＢｒで染色した。ＧＡＰＤＨは、対照群として調べた。ＰＣＲに用いたプライマーの配列は下記のようになる。ｉＮＯＳ−Ｆは、５'−ＡＧＡ  ＣＴＧ  ＧＡＴ  ＴＴＧ  ＧＣＴ  ＧＧＴ  ＣＣＣ  ＴＣＣ−３'（配列番号１）、ｉＮＯＳ−Ｒは、５'−ＡＧＡ  ＡＣＴ  ＧＡＧ  ＧＧＴ  ＡＣＡ  ＴＧＣ  ＴＧＧ  ＡＧＣ−３'（配列番号２）、ＧＡＰＤＨ−Ｆは、５’−ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＡＧＡ  ＡＧＧ  ＣＴＧ  ＧＧＧ−３'（配列番号３）、ＧＡＰＤＨ−Ｒは、５'−ＣＡＡ  ＡＧＴ  ＴＧＴ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＴＧＡ  ＣＣ−３'（配列番号４）のようになった。
【００５７】
その結果、図２に示したように、対照群に比べてラマリンを各濃度で前処理した場合、ｉＮＯＳ ｍＲＮＡ発現量が少ないことが確認できた。濃度依存的結果を示し、対照群であるＧＡＤＰＨと比較した結果、抑制効果が特異的であることを確認した。
【００５８】
ウェスタンブロットは、実施例２のようにＬＤＳとラマリンを処理した後、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で二回洗浄して、溶解バッファー（lysis buffer）（５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１％ＮＰ４０、１００μｇ／ｍＬフェニルスルホニルフロリド、２μｇ／ｍＬアプロチニン、１μｇ／ｍＬペプスタチン、及び１０μｇ／ｍＬロイペプチン）に溶かした。その後、３０分間氷に置いた後、１５０００ｇ、４０℃で２０分間遠心分離して上澄液を集めた。蛋白質密度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄプロテインアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）とＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を利用して分析した。全溶解物（lysates、２０μｇ）を７．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析し、これをｉｍｍｏｂｉｌｏｎ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｕｒｉｄｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）に移して抗体で標識した。ブロットは、Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＣＬ）ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を利用し、分析した。全ての抗体ブロット実験は、蛋白質ローディング対照群として抗ベータアクチン抗体を用いた。
【００５９】
その結果、図３に示したように、対照群に比べてラマリンを各濃度で前処理した場合、ｉＮＯＳ蛋白質の発現量が少ないことが確認できた。濃度依存的結果を示し、対照群であるＧＡＤＰＨと比較した結果、抑制効果が特異的であることを確認した。
【００６０】
実施例４：ＬＰＳ処理された大食細胞でＴＬＲ４に対するラマリン前処理の効果
ＴＬＲ４（Toll-like Receptor 4）信号伝達は、炎症反応の誘導の中枢的役割を果たしていると把握されており、ＬＰＳはＴＬＲ４が認識するリガンドであるため、ラマリン前処理が、ＴＬＲ４の発現に及ぼす影響を分析するために、表面発現程度、ｍＲＮＡ量及び蛋白質量を測定した。ＴＬＲ４実験方法は下記のとおりである。
【００６１】
大食細胞の細胞株であるＲａｗ２６４.７を継代培養後、１〜４×１０４ｃｅｌｌｓ／ウエルの濃度で希釈して９６ウエルプレートに分株して培養した。１２時間培養後、ラマリンを０.１、１、１０μｇ／ｍＬの濃度で処理した後、２時間培養を行った。培養された細胞の上澄液を取り除き、ｄ−ＰＢＳで洗浄した後、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）を処理した。８時間後にＥＬＩＳＡ方法を利用して細胞表面で発現するＴＬＲ４を測定した。細胞培養上澄液を取り除き、ｄ−ＰＢＳで二回洗浄した後、ブロッキングバッファー（ｄ−ＰＢＳに１％牛血清ＦＢＳ）２００ｍＬを入れて、常温で３０分非特異的に結合させた。洗浄液（washing buffer）（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０ ｉｎ ｄ−ＰＢＳ）で三回洗浄して一次抗体ＴＬＲ４をブロッキングバッファーで１：５００に希釈して１００μＬずつ添加して、常温で２時間放置した。その後、洗浄液で五回洗浄して、アルカリホスファターゼ標識二次抗体（alkaline phosphatase-conjugated anti-rat secondary antibody）をブロッキングバッファーで１：１０００倍に希釈して１００μＬずつ添加し、常温で１時間放置後、洗浄液で七回洗浄した。ペルオキシダーゼ基質（peroxidase substrate）を１００μＬ添加して遮光させ、３０分常温でインキュベートした。マイクロプレートリーダーを利用して６５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００６２】
ｍＲＮＡ量と蛋白質量の測定方法は、実施例３に記述したとおりである。
その結果、図４に示したように、ラマリンを前処理した実験群においては、ＬＰＳ−誘導ＴＬＲ４の表面発現が顕著に減った。また、ＴＬＲ４のｍＲＮＡ及び蛋白質が、共に減少したことを確認した（図５、６）。
【００６３】
実施例５：ＬＰＳ処理された大食細胞でＮＦ−κＢに対するラマリン前処理の効果
ＮＦ−κＢはｉＮＯＳ発現に最も重要な転写因子であるため、ラマリン前処理が、ＮＦ−κＢに及ぼす効果を検討するために、ルシフェラーゼ発現量を観察した。ＮＦ−κＢの発現を確認するための一つの方法が、ルシフェラーゼアッセイである。ルシフェラーゼアッセイは、プロモーター活性化の有無を確認する実験である。特定遺伝子のプロモーターの部分をルシフェラーゼを有するベクターにライゲーションさせてそのプロモーターが活性化されると、発光する原理を利用した。
【００６４】
詳細な実験方法は、細胞にＮＦ−κＢのプロモーターの部分を導入するために、細胞（１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を１０％ＦＢＳ、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍＬ）とストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ）を含有した培地に懸濁し、６０ｍｍ ｐｅｔｒｉ ｄｉｓｈで培養して、２４時間細胞を安定させた。その後、導入しようとするプロモーター部位を含むトランスフェクション混合物で、細胞を処理した後、２４時間培養した。その後、多様な条件で、細胞を培養した。培養された細胞から上澄液を取り除き、ｄ−ＰＢＳを利用して洗浄した後、ウエル当たり２００μＬの１ｘ溶解バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ７．８、２ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ １，２−ｄｉａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ' ｔｅｔｒａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、１０％グリセロール、１％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１．２５ｍｇ／ｍＬリゾチーム、２．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）を加えて、常温で撹拌して細胞を溶解した。細胞溶解物のルシフェラーゼ活性を測定するために、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍを利用し、製造元の提供する方法に従って、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【００６５】
また、ＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットが、炎症遺伝子の転写開始に重要な役割を果たすと知られている。従って、ｐ６５サブユニット蛋白質の発現量をウェスタンブロットで解析することによって、ラマリンの効果を調べた。それに加えて、ＩκＢαは、通常ＮＦ−κＢと結合して活性を抑制しているＮＦ−κＢ抑制剤であり、ＬＰＳやＩＦＮ−ガンマが、ＩκＢαの分離を促して、ＮＦ−κＢが活性化されると知られている従って、６０分間のＩκＢα蛋白質量のレベルを解析した。
【００６６】
ルシフェラーゼ量は、トランスファクション（Transfection）とリポーター分析で調べた。詳細には、ＲＡＷ２６４．７細胞（５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を６ウエルプレート各々に播種して、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ Ｐｌｕｓ（Ｓｉｇｍａ）を利用して、ｐＧＬ３−ＮＦ−κＢとｐＣＭＶ−ベータ−ｇａｌプラスミドをトランスファクションした。トランスファクションは、０．５μｇ ｐＧＬ３−ＮＦ−κＢと０．２μｇ ｐＣＭＶ−ｂｅｔａ−ｇａｌをＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ Ｐｌｕｓ溶液と混ぜて細胞に入れてから４時間後、４時間ラマリンを前処理し、２時間後ＬＤＳを処理して実施した。その後、２００μＬの溶解バッファー（２４ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（７．８ＰＨ）、２ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｒｅｉｔｏｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール及び１％トリトンＸ−１００）に溶かした後、１０μＬの細胞溶解水を利用して、ルシフェラーゼ活性分析を行った。ルシフェラーゼとβ−ガラクトシダーゼに対して実験を、異なる三実験者が各三回以上行った後、β−ガラクトシダーゼの量でルシフェラーゼ量を標準化した。
【００６７】
その結果、図７に示したように、ＬＰＳ処理によってルシフェラーゼ量は、１．５倍増加したが、ラマリンを処理した場合、ルシフェラーゼ量の増加が生じないことを確認した。
【００６８】
ｐ６５とＩκＢα蛋白質は、実施例３で用いたウェスタンブロット分析法でその量を分析した。その結果、図８に示したように、ラマリンを大食細胞に前処理した場合、前処理しなかったものに比べてｐ６５ＮＦ−κＢの生成が顕著に少なかった。また、図９に示したように、ラマリンを大食細胞に前処理した場合、前処理しなかったものに比べてＩκＢαが分解できなく、依然とＮＦ−κＢと結合してその量が少なく示された。従って、前記結果をまとめると、ラマリンは、ＬＰＳまたはＩＦＮ−ガンマによって誘導される炎症反応中間段階を妨げＮＦ−κＢの活性化を阻害することを確認した。
【００６９】
実施例６：ＬＰＳ処理された大食細胞でｐ３８ＭＡＰＫ、ＥＲＫ１／２及びＪＮＫに対するラマリン前処理の効果
ｐ３８ＭＡＰＫ、ＥＲＫ１／２及びＪＮＫキナーゼ経路は、炎症反応中間段階を調節する信号伝達段階として知られているため、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＥＲＫ１／２及びＪＮＫ発現レベルを分析して、ラマリン前処理の効果を調べてみた。実験プロトコールは、前記実施例３と同じであり、蛋白質量を分析する方法はウェスタンブロットを用いて、そのプロトコールも実施例３と同じであった。
【００７０】
その結果、図１０に示したように、ｐ３８、ＥＲＫ及びＪＮＫの蛋白質量は、ラマリン前処理に関係なく同じであるが、各々リン酸化された形態であるｐ−ｐ３８、ｐ−ＥＲＫ及びｐ−ＪＮＫの蛋白質量は、前処理したラマリンの濃度依存的に減少することを確認し、ラマリンが、前記各蛋白質のリン酸化を阻害して結果的に炎症反応を阻害することが確認できた。
【００７１】
実施例７：ＬＰＳ処理されたラットで浮腫の大きさに対するラマリン前処理の効果
前記実施例２−６では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ状態でラマリンの処理効果を分析した。実施例７では生きているラットを利用して実際ラマリンに抗炎症効果があるか否かを実験した。従って、各々賦形剤（対照群）、ラマリン５０ｍｇ／ｋｇ、ラマリン１００ｍｇ／ｋｇ、インドメタシン（抗炎症剤、陽性対照群）を投与させた後、ＩＤＳの一種のカラギナンを利用して炎症反応を起こして、抗炎症効果を、足浮腫の大きさ増加比から測定した。前記一般式（１）の構造を持つラマリン（Ramalin）または薬学的に許容可能なその塩を有効性分として含有する炎症疾患または免疫疾患の予防または治療用医薬組成物：
【化４】
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【００７２】
実験に用いたカラギナン（Carrageenan）は、ＣＡＳ番号：９０００−０７−１、ＥＣ番号２３２−５２４−２、製造社（製品番号）ｓｉｇｍａ（Ｃ−１８６７）を用いて、特に、カッパカラギナンとラムダカラギナンとを混合した製品を用いた。食品の粘着性及び粘度を増加させて、乳化安全性を増進して、食品の物性及び触感を向上するための食品添加物として、増粘剤、ゲル化剤、安定剤等として用いられている。カラギナンは、Ｉｒｉｓｈ ｍｏｓｓともいわれる紅藻類であるＣｈｏｎｄｒｕｓ属、Ｅｕｃｈｅｕｍａ属、Ｇｉｇａｒｔｉｎａ属、Ｈｙｐｎｅａ属、Ｉｒｉｄａｅａ属の海藻をお湯または熱いアルカリ性水溶液で抽出した後、精製して得られるもので、その主成分はｉ（Ｉｏｔａ）−カラギナン、ｋ（Ｋａｐｐａ）−カラギナン、ｌ（Ｌａｍｂｄａ）−カラギナンである。特に、ｌ（Ｌａｍｂｄａ）−カラギナン（１〜２％程度）は、炎症関連動物実験において、浮腫を誘発する物質として用いられている。
【００７３】
実験に用いられたラットは、雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットで、体重１５０−２００ｇ、６週令以前のものであり、大韓Ｂｉｏ社から、韓国で購入した。実験室では、動物を国家衛生機関の実験室動物使用に対する適切な治療及び使用に対する明示された指針に従って世話した。カラギナンは、カッパカラギナンとラムダカラギナンを混合した製品を用いており、インドメタシン製品同様Ｓｉｇｍａ社（米国）で購入した。
【００７４】
ラマリンは、５００μＬの食塩水（saline）に各５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇを混ぜて用いて、賦形剤は食塩水を用いて、インドメタシンは、５００μＬの食塩水（saline）に各１０ｍｇ／ｋｇの濃度にして各ラットに投与した。１時間後、カラギナン１％、食塩水溶液１００μＬをラットの後足にカラギナンを皮下注射して、６時間の間、足の厚さを測定して、浮腫の大きさの増加比を観察した結果を図１１に示した。各時点において三回測定して平均値を求めた。
【００７５】
図１１に示したように、抗炎症効果は、高い濃度のラマリン１００ｍｇ／ｋｇで高く示されており、賦形剤を投与した対照群とは浮腫の大きさにおいて相当な差を見せた。従って、ラマリン前処理時、炎症反応が顕著に抑制されることを確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明に係るラマリンを有効性分として含有する医薬組成物は、既存の医薬組成物に比べて優れたｉＮＯＳ生成抑制による酸化窒素（ＮＯ）生成抑制効果を示しており、過度な炎症反応及び免疫反応を抑制して、炎症疾患または免疫疾患を治療する効果があって、機能性食品及び機能性化粧品等に活用できる。
【００７７】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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