(57)【要約】本明細書では、野生型生物と比較してケト酸フラックスが増加していること、および、発現すると野生型生物と比較して大量の化学生成物の生成をもたらす酵素をコードするポリヌクレオチドを少なくとも１つ含むことを特徴とする、代謝的に改変した微生物が提供される。組換え微生物は、多数の化学組成物を種々の窒素含有バイオマス組成物および他の炭素源から生成するために有用である。一実施形態では、アミノ酸を分解して、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ならびにそれらの混合物を含むタンパク質性バイオマスを単一の炭素源として利用することを可能にする強力な能力を有する特定の微生物株を開発する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え微生物であって、
野生型生物と比較してケト酸フラックスが増加していること、および、
発現すると野生型生物と比較してより多くの量の化学生成物の生成をもたらす酵素をコードするポリヌクレオチドを少なくとも１つ含むこと
を特徴とする組換え微生物。
【請求項２】
デヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ、および／またはデアミナーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項３】
前記デヒドロゲナーゼが、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）（Ｅ．Ｃ．１．４．１．２およびＥ．Ｃ．１．４．１．４）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）（Ｅ．Ｃ．１．４．１．３）、バリンデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．４．１．８）、ロイシンデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．４．１．９）、およびフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．４．１．２０）からなる群から選択される、請求項２に記載の組換え微生物。
【請求項４】
前記ロイシンデヒドロゲナーゼがＬｅｕＤＨである、請求項３に記載の組換え微生物。
【請求項５】
前記ロイシンデヒドロゲナーゼＬｅｕＤＨが、Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ由来である、請求項４に記載の組換え微生物。
【請求項６】
前記デアミナーゼが、アスパラギン酸アンモニアリアーゼ（４．３．１．１）、Ｌ−セリンアンモニアリアーゼ（Ｅ．Ｃ．４．３．１．１７）、Ｄ−セリンアンモニアリアーゼ（４．３．１．１８）、トレオニンアンモニアリアーゼ（Ｅ．Ｃ．４．３．１．１９）、チロシンアンモニアリアーゼ（Ｅ．Ｃ．４．３．１．２３）、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（Ｅ．Ｃ．４．３．１．２４）、およびフェニルアラニン／チロシンアンモニアリアーゼ（Ｅ．Ｃ．４．３．１．２５）からなる群から選択される、請求項２に記載の組換え微生物。
【請求項７】
前記デアミナーゼがセリンデアミナーゼＳｄａＢである、請求項６に記載の組換え微生物。
【請求項８】
前記セリンデアミナーゼ（ｄｅａｍｉｎｓａｓｅ）ＳｄａＢが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｒｏｓｅｂａｃｔｅｒ  ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｅｒｉｃａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、またはＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ由来である、請求項７に記載の組換え微生物。
【請求項９】
前記トランスアミナーゼが、Ｌ−α−トランスアミナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．Ｘ（式中、Ｘは任意の数である））である、請求項２に記載の組換え微生物。
【請求項１０】
前記Ｌ−α−トランスアミナーゼが、Ｌ−アスパラギン酸トランスアミナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．１）、Ｌ−アラニントランスアミナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．１２およびＥ．Ｃ．２．６．１．４７）、Ｌ−アスパラギントランスアミナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．１４）、およびグリシントランスアミナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．３５）からなる群から選択される、請求項９に記載の組換え微生物。
【請求項１１】
前記Ｌ−アスパラギン酸トランスアミナーゼがＡｖｔＡである、請求項１０に記載の組換え微生物。
【請求項１２】
ＡｖｔＡが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ、またはＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ由来である、請求項１１に記載の組換え微生物。
【請求項１３】
野生型生物と比較して、アンモニア再取り込み活性の低下、オートインデューサー２再取り込み活性の低下、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）活性の低下、グルタミンシンターゼ活性の低下、グルタミン酸シンターゼ活性の低下、クオラムセンシング遺伝子活性の低下、および／または全体的な調節因子活性の低下をさらに特徴とする、請求項２から１２のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項１４】
前記クオラムセンシング活性の低下が、遺伝子ｌｕｘＳもしくはｌｓｒＡの欠失、またはその発現もしくは機能の低下に由来する、請求項１３に記載の組換え微生物。
【請求項１５】
前記アンモニア再取り込み活性の低下が、遺伝子ｇｄｈＡおよびｇｌｎＡの欠失、またはその発現もしくは機能の低下に由来する、請求項１３に記載の組換え微生物。
【請求項１６】
前記全体的な調節因子活性の低下が、遺伝子ＣＲＰ、ＬＲＰ、Ｆｉｓ、および／またはＩＨＦの欠失、またはその発現もしくは機能の低下に由来する、請求項１３に記載の組換え微生物。
【請求項１７】
前記化学生成物が、アルコール、アセトアルデヒド、アセテート、イソブチルアルデヒド、イソ酪酸、ｎ−ブチルアルデヒド、ｎ−酪酸、２−メチル−１−ブチルアルデヒド、２−メチル−１−酪酸、３−メチル−１−ブチルアルデヒド、３−メチル−１−酪酸、アンモニア、アンモニウム、グルタミン酸、トレオニン、メチオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、２−メチル−１，４−ブタンジオール、２−メチル−１，４−ブタンジアミン、イソブテン、イタコネート、アセトイン、アセトン、イソブテン、１，５−ジアミノペンタン、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、シキミ酸、メバロネート、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、イソプレノイド、脂肪酸、ホモアラニン、４−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、アジピン酸、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸、テトラヒドロフラン、３−メチル−テトラヒドロフラン、ガンマ−ブチロラクトン、ピロリジノン、ｎ−メチルピロリドン、アスパラギン酸、リシン、カダベリン、２−ケトアジピン酸、およびＳ−アデノシル−メチオニン（ＳＡＭ）からなる群から選択される、請求項１から１６までのいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項１８】
前記アルコールが、エタノール、１−プロパノール（ｐｒｏｐｏｎｏｌ）、ｎ−ブタノール、イソブタノール、２−メチル−１−ブタノールおよび３−メチル−ブタノールからなる群から選択される、請求項１７に記載の組換え微生物。
【請求項１９】
前記化学生成物がピルベートから生成する、請求項１から１６までのいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項２０】
前記化学物質が、アセテート、アセトアルデヒド、イソブチルアルデヒド、ｎ−ブチルアルデヒド、２，３−ブタンジオール、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、芳香族物質、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、メバロネート、イソプレノイド、エタノール、イソブタノール、ｎ−ブタノール、および脂肪酸からなる群から選択される、請求項１９に記載の組換え微生物。
【請求項２１】
前記芳香族物質が、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、およびシキミ酸からなる群から選択される、請求項２０に記載の組換え微生物。
【請求項２２】
前記化学生成物が２−ケトグルタル酸から生成する、請求項１から１６までのいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項２３】
前記化学生成物が、ＧＡＢＡ（４−アミノ酪酸）、グルタミン酸、スクシネートおよびリンゴ酸からなる群から選択される、請求項２２に記載の組換え微生物。
【請求項２４】
前記化学物質がオキサロアセテートから生成する、請求項１から１６までのいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項２５】
前記化学物質が、アスパラギン酸、リシン、カダベリン（ｃａｄｅｖｅｒｉｎｅ）、２−ケトアジピン酸、トレオニン、メチオニンおよびＳ−アデノシル−メチオニン（ＳＡＭ）からなる群から選択される、請求項２４に記載の組換え微生物。
【請求項２６】
前記化学物質が２−ケトブチレートから生成する、請求項１から１６までのいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項２７】
前記化学物質が、２−メチル−１−ブチルアルデヒド、イソロイシン、ホモアラニン、および２−メチル−１−ブタノールである、請求項２６に記載の組換え微生物。
【請求項２８】
前記化学物質が２−ケトイソバレレートから生成する、請求項１から１６までのいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項２９】
前記化学物質が、イソブチルアルデヒド、３−メチル−１−ブチルアルデヒド、イソブタノール、３−メチル−１−ブタノール、およびバリンからなる群から選択される、請求項２８に記載の組換え微生物。
【請求項３０】
前記化学物質が２−ケトイソカプロエートから生成する、請求項１から１６までのいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項３１】
前記化学物質が、３−メチル−１−ブチルアルデヒド、ロイシン、および１−ブタノールからなる群から選択される、請求項３０に記載の組換え微生物。
【請求項３２】
前記化学生成物が２−ケト−３−メチルバレレートから生成する、請求項１から１６までのいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項３３】
前記化学物質が、２−メチル−１−ブチルアルデヒド、イソロイシン、および２−メチル−１−ブタノールからなる群から選択される、請求項３２に記載の組換え微生物。
【請求項３４】
前記野生型生物が、細菌、シアノバクテリア、糸状菌、および酵母からなる群から選択される、請求項１から３３までのいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項３５】
前記野生型生物が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｚｙｍｏｎｏｍａｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｓｉｅｌｌａ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、およびＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍからなる属から選択される、請求項３４に記載の組換え微生物。
【請求項３６】
前記野生型生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｚｙｍｏｎｏｍａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．、Ａｎａｂａｅｎａ  ｓｐ．、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、およびＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓからなる群から選択される、請求項３５に記載の組換え微生物。
【請求項３７】
タンパク質、ポリペプチド、またはアミノ酸を含むバイオマスを、請求項１から３６までのいずれかに記載の組換え微生物と、化学生成物の生成を促す条件下で接触させることにより、前記バイオマスから化学生成物を生成するためのプロセスであって、生成された化学生成物の量が、野生型生物によって生成される量より多いプロセス。
【請求項３８】
前記バイオマスが、藻類、可溶性物質添加乾燥蒸留穀物残渣（ＤＤＧＳ；Ｄｒｉｅｄ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  Ｇｒａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｏｌｕｂｌｅｓ）、細菌、動物残渣、植物、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、またはそれらの混合物、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項３７に記載のプロセス。
【請求項３９】
前記バイオマスが、緑藻類、紅藻類、藍藻類、シアノバクテリア、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、またはＢａｃｃｉｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓであった、請求項３８に記載のプロセス。
【請求項４０】
前記バイオマスが、Ｃｈｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、またはＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｅｓであった、請求項３９に記載のプロセス。
【請求項４１】
前記バイオマスが、前記組換え微生物と接触させる前に部分的に分解されている、請求項３７から４０までのいずれかに記載のプロセス。
【請求項４２】
前記バイオマスがプロテアーゼおよび／または熱で処理されたものである、請求項４１に記載のプロセス。
【請求項４３】
前記バイオマスが、６０〜１００℃にわたる温度で加熱し、プロテアーゼで処理することによって加水分解されたものである、請求項４２に記載のプロセス。
【請求項４４】
前記バイオマスを前記組換え微生物と接触させ、前記バイオマスを、リシン、メチオニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンを２０種全てのアミノ酸残基の混合物に変換する第２の微生物と接触させることをさらに含む、請求項３７から４３までのいずれかに記載のプロセス。
【請求項４５】
前記二次的な微生物を、前記組換え微生物と接触させる前に前記バイオマスと接触させる、請求項４４に記載のプロセス。
【請求項４６】
前記第２の微生物がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよび／またはＢａｃｉｌｌｕｓである、請求項４４または４５に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２０１０年１１月３日に出願された米国仮特許出願第６１／４０９，７６０号、２０１０年１１月４日に出願された米国仮特許出願第６１／４１０，１７４号への優先権を主張し、これらの米国仮特許出願の開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
政府支援
本発明は、米国エネルギー省により授与された助成金番号ＤＥ−ＦＣ０２−０２ＥＲ６３４２１の下、政府支援により成された。合衆国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
代謝的に改変した微生物およびそのような生物を生成する方法が提供される。本開示は、タンパク質性バイオマスからバイオ燃料を生成するためのバイオ燃料反応器系を提供する。適切な基質を、代謝的に改変された微生物または組換え微生物およびそれに由来する酵素的調製物と接触させることによってバイオ燃料および化学物質を生成する方法も提供される。
【背景技術】
【０００４】
背景
経済的懸念および環境的懸念により、石油の代替としてのバイオ燃料に対する需要は増加することが予想される。一般的なバイオ燃料であるエタノールは、ガソリンよりエネルギー密度が低く、輸送燃料とするには、限られた濃度範囲でガソリンと混合しなければならないので、理想的ではない。エタノールはまた、吸湿性かつ腐食性であり、これにより、保管および流通系に関する問題が提起される。
【０００５】
さらに、アジピン酸は、例えば、ナイロン６−６を含めた種々の合成物質の生産における工業的目的、ならびに種々の医薬品の製剤における使用のどちらにおいても役立つ化合物である。
【０００６】
さらに、ガンマアミノ酪酸は、例えば、ナイロン４を含めた種々の合成物質の生産における工業的目的、ならびに神経細胞伝達におけるものなどの生物学的役割のどちらにおいても役立つ化合物である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
要旨
本開示は、窒素に富む材料（例えば、タンパク質性材料）の、炭素ベースの燃料および化学物質などの種々の化学化合物を生成するための原料としての使用について記載する。種々の実施形態では、本開示は、任意の発酵の主要原料としてタンパク質を使用する方法に関し得る。該方法は、細胞バイオマスを加熱し、消化して、タンパク質を部分的に破壊し、次いで、処理した細胞バイオマスを、種々の微生物発酵において単一の炭素源として用いて、アルコール、有機酸および他の化学物質を含めた種々の生物由来物質（ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔ）を生成することを含み得る。別の実施形態では、本開示は、前記細胞バイオマスを効率的に利用するための特定の微生物株の開発を含み得る。細胞バイオマスは、タンパク質性バイオマス（可溶性物質添加乾燥蒸留穀物残渣（ＤＤＧＳ；Ｄｒｉｅｄ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  Ｇｒａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｏｌｕｂｌｅｓ）、藻類の粗粉または粕、細菌の発酵粕など）を含有するあらゆる種類の細菌、酵母、真菌、シアノバクテリア、藻類、および任意の粗材料を含む。
【０００８】
一実施形態では、アミノ酸を分解して、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ならびにそれらの混合物を含むタンパク質性バイオマスを単一の炭素源として利用することを可能にする強力な能力を有する特定の微生物株を開発する。種々のアミノ酸を消化するための代謝経路は、遺伝子突然変異誘発およびランダム突然変異誘発のどちらによっても工学的に操作される。ある特定の実施形態では、タンパク質およびポリペプチドを小さなペプチドに消化することができ、それらを組換え微生物に輸送し、アミノ酸に分解することができる。アミノ酸は種々の２−ケト酸に変換される。最後に、これらの２−ケト酸は、微生物に導入された種々の組換え経路を通じて、例えば、より長い鎖のアルデヒドまたはアルコールなどの所望の化学的実体に変換される。それらの中で、ロイシン、イソロイシン、およびバリンは、ロイシンデヒドロゲナーゼまたはこれらのアミノ酸を２−ケト酸に変換する他の酵素により、対応する２−ケト酸に直接変換される。セリン、システイン、トリプトファン、およびアラニンおよびグリシンは、ピルベートに変換され、それがさらに２−ケトイソバレレートに変換され、それはさらに、例えば、イソブタノールを合成するために使用され得る。グルタミン酸、グルタミン、アルギニン、およびプロリンは、２−ケトグルタル酸に変換され、それがさらにトレオニンに変換され、それは、例えば、１−プロパノールの生成に使用され得る、またはリンゴ酸酵素により、またピルベートに変換され得る。ピルベートは、例えば、イソブタノールの生成に使用され得る。または、ピルベートに変換されるタンパク質性バイオマスは全てエタノールを生成するようにも変換され得る。残りのアミノ酸は、成長を支持する、またはエネルギーの供給源としての機能を果たすようにランダム突然変異誘発によって工学的操作をした。
【０００９】
別の実施形態では、タンパク質性バイオマスを処理し、さまざまな種類の化学物質生成の重要な中間体、例えば、ピルビン酸、２−ケトグルタル酸などに変換する。前記化学物質は、例えば、これに限定するものではなく、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸およびガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を含み得る。本発明は列挙されている化学物質の生成のみに限定されない。
【００１０】
本開示は、ある実施形態では、野生型生物と比較してケト酸フラックスが増加していること、および、発現すると野生型生物と比較して大量の化学生成物の生成をもたらす酵素をコードするポリヌクレオチドを少なくとも１つ含むことを特徴とする組換え微生物を提供する。より詳細には、組換え微生物は、デヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ、および／またはデアミナーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、デヒドロゲナーゼは、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）（Ｅ．Ｃ．１．４．１．２およびＥ．Ｃ．１．４．１．４）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）（Ｅ．Ｃ．１．４．１．３）、バリンデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．４．１．８）、ロイシンデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．４．１．９）、またはフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．４．１．２０）である。典型的な実施形態では、ロイシンデヒドロゲナーゼはＬｅｕＤＨであってよく、これは、Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓから単離することができる。特定の他の実施形態では、組換え微生物は、アスパラギン酸アンモニアリアーゼ（４．３．１．１）、Ｌ−セリンアンモニアリアーゼ（Ｅ．Ｃ．４．３．１．１７）、Ｄ−セリンアンモニアリアーゼ（４．３．１．１８）、トレオニンアンモニアリアーゼ（Ｅ．Ｃ．４．３．１．１９）、チロシンアンモニアリアーゼ（Ｅ．Ｃ．４．３．１．２３）、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（Ｅ．Ｃ．４．３．１．２４）、およびフェニルアラニン／チロシンアンモニアリアーゼ（Ｅ．Ｃ．４．３．１．２５）から選択されるデアミナーゼを含んでよい。より詳細には、デアミナーゼはセリンデアミナーゼＳｄａＢであってよく、これは、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｒｏｓｅｂａｃｔｅｒ  ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｅｒｉｃａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、またはＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ由来であってよい。さらに、組換え微生物は、Ｌ−α−トランスアミナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．Ｘ、Ｘは任意の数である）であるトランスアミナーゼを含んでよい。特定の実施形態では、Ｌ−α−トランスアミナーゼは、Ｌ−アスパラギン酸トランスアミナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．１）、Ｌ−アラニントランスアミナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．１２およびＥ．Ｃ．２．６．１．４７）、Ｌ−アスパラギントランスアミナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．１４）、またはグリシントランスアミナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．３５）であってよい。ある特定の実施形態では、Ｌ−アスパラギン酸トランスアミナーゼはＡｖｔＡであってよく、これは、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ、またはＹｅｒｓｉｎ��ａ  ｐｅｓｔｉｓ由来であってよい。
【００１１】
本開示は、野生型生物と比較して、アンモニア再取り込み活性の低下、オートインデューサー２再取り込み活性の低下、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）活性の低下、グルタミンシンターゼ活性の低下、グルタミン酸シンターゼ活性の低下、クオラムセンシング遺伝子（ｑｕｏｒｕｍ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｇｅｎｅ）活性の低下、および／または全体的な調節因子活性の低下をさらに特徴とする組換え微生物も提供する。ある特定の実施形態では、クオラムセンシング活性の低下は遺伝子ｌｕｘＳまたはｌｓｒＡの欠失、またはその発現もしくは機能の低下に由来し、アンモニア再取り込み活性の低下は遺伝子ｇｄｈＡおよびｇｌｎＡの欠失、またはその発現もしくは機能の低下に由来し、全体的な調節因子活性の低下は遺伝子ＣＲＰ、ＬＲＰ、Ｆｉｓ、および／またはＩＨＦの欠失、またはその発現もしくは機能の低下に由来する。
【００１２】
本発明の組換え微生物は、特に、例えば、アルコール、アセトアルデヒド、アセテート、イソブチルアルデヒド、イソ酪酸、ｎ−ブチルアルデヒド、ｎ−酪酸、２−メチル−１−ブチルアルデヒド、２−メチル−１−酪酸、３−メチル−１−ブチルアルデヒド、３−メチル−１−酪酸、アンモニア、アンモニウム、グルタミン酸、トレオニン、メチオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、２−メチル−１，４−ブタンジオール、２−メチル−１，４−ブタンジアミン、イソブテン、イタコネート、アセトイン、アセトン、イソブテン、１，５−ジアミノペンタン、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、シキミ酸、メバロネート、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、イソプレノイド、脂肪酸、ホモアラニン、４−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、アジピン酸、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸、テトラヒドロフラン、３−メチル−テトラヒドロフラン、ガンマ−ブチロラクトン、ピロリジノン、ｎ−メチルピロリドン、アスパラギン酸、リシン、カダベリン（ｃａｄｅｖｅｒｉｎｅ）、２−ケトアジピン酸、およびＳ−アデノシル−メチオニン（ＳＡＭ）などの化学生成物を生成することが開示されている。ある特定の実施形態では、アルコールは、エタノール、１−プロパノール（ｐｒｏｐｏｎａｌ）、ｎ−ブタノール、イソブタノール、２−メチル−１−ブタノールおよび３−メチル−ブタノールからなる群から選択される。
【００１３】
さらに、本開示は、細菌、シアノバクテリア、糸状菌、または酵母である野生型生物に由来し得る組換え微生物を提供する。より詳細には、野生型微生物は、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｚｙｍｏｎｏｍａｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｓｉｅｌｌａ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、またはＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍなどの属由来である。より詳細には、野生型生物は、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｚｙｍｏｎｏｍａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．、Ａｎａｂａｅｎａ  ｓｐ．、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、およびＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓであってよい。
【００１４】
本開示は、２−ケト酸を含む代謝産物から、アミノ酸源を用いて所望の化学的実体を生成する組換え微生物も提供する。一実施形態では、微生物を、ロイシンデヒドロゲナーゼまたはバリンデヒドロゲナーゼからなる群から選択される活性を有するポリペプチドを発現または過剰発現するように改変する。さらに別の実施形態では、微生物を、それぞれ、ＧｌｙからＬ−Ｓｅｒ、それからピルベートへの変換；Ｌ−Ｃｙｓからピルベートへの変換；Ｌ−ＡｌａからＤ−Ａｌａ、それからピルベートへの変換に有用であるｇｌｙＡ、ｓｄａ、ｔｎａＡ、ｄａｄＸ、ｄａｄＡと示される酵素を発現または過剰発現するように工学的に操作する。さらに別の実施形態では、微生物は、ｙｂａＳ、ｙｎｅＨ、ｐｕｔＡ、ａｓｔＡＢＣＤＥから選択される酵素を発現または過剰発現し、これにより、グルタミン、プロリン、およびアルギニンがそれぞれグルタミン酸に変換され、今度はそれが酵素ｇｄｈＡにより代謝されて２−ケトグルタル酸になる。
【００１５】
一実施形態では、組換え微生物は、工学的に操作して微生物に入れた１つまたは複数のポリペプチドの発現によりアルファ−アジピン酸を生成する。グルタミン酸経路では、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）（ｇｄｈ）活性を有するポリペプチドにより、グルタミン酸が２−ＫＧ（２−ケトグルタル酸）に変換される。ホモクエン酸シンターゼ（ｈｃｓ）活性およびホモアコニターゼ（ｈｏｍｏａｃｏｒｎｉｔａｓｅ）（ｈａｃＡＢ）活性を有するポリペプチドの連続した反応により、２−ＫＧがホモイソシトレートに変換され、それが、ホモイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ｈｉｃＤＨ）活性を有するポリペプチドにより還元的脱炭酸されてアルファケトアジピン酸になる。本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、および当技術分野で公知のその他の微生物を含む任意の数の微生物に由来してよい。ポリヌクレオチドは、供給源である生物から得、次いで、活性が改善されるように改変したまたは工学的操作をした突然変異酵素または変異酵素であってよい。一実施形態では、グルタミン酸経路に関与する酵素をコードするポリヌクレオチドを、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを含む種々の生物からクローニングする。
【００１６】
本開示のリシン経路では、リシンアミノトランスフェラーゼ（ｌａｔ）活性を有するポリペプチドによりリシンが脱アミノ化されて２−アミノアジピン酸−６−セミアルデヒドになる。次いで、ピペリデイン６−カルボン酸デヒドロゲナーゼ（ｐｃｄ）活性を有するポリペプチドによりアルファアミノアジピン酸の形成が触媒される。次いで、２−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ（ａａｄａｔ）活性を有するポリペプチドによりアミン基が脱アミノ化される。本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、および当技術分野で公知のその他の微生物を含む任意の数の微生物に由来してよい。ポリヌクレオチドは、供給源である生物から得、次いで、活性が改善されるように改変したまたは工学的操作をした突然変異酵素または変異酵素であってよい。一実施形態では、酵素をコードするポリヌクレオチドを、例えば、Ｆ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ、Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓなどを含む種々の生物からクローニングすることができる。
【００１７】
アジピン酸を中間体であるアルファケトアジピン酸から生成するために、図３に示されている通り、１つの化学的経路に加えて２つの生物学的経路（ＣｏＡ非依存性経路およびＣｏＡ依存性経路）を工学的に操作した。生物学的変換については、アルファケトアジピン酸は、種々の微生物由来のロイシンデヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）活性を有するポリペプチド、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）活性を有するポリペプチドおよびヒドロキシイソカプリル酸デヒドロゲナーゼ（ｈｄｈ）活性を有するポリペプチドを含むデヒドロゲナーゼ活性を有する種々のポリペプチドによりアルファ−ヒドロキシアジピン酸に変換される。ＣｏＡ非依存性経路では、嫌気的条件下で、オキサロアセテートを、マレートおよびフマレートを経由してスクシネートに変換する天然の還元的ＴＣＡ回路の模倣経路を工学的に操作した。フマル酸レダクターゼ（ｆｕｍＡまたはｆｕｍＢ）の突然変異誘発により、アルファ−ヒドロキシアジピン酸の脱水を促進するポリペプチドがもたらされ得る。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ由来のクロトン酸エステルデヒドロゲナーゼの突然変異体により、さらなるステップを構築することができる。ＣｏＡ依存性経路では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｌｅにおけるイソカプロエート生成経路を用いて、アルファヒドロキシアジピン酸をアジピン酸に変換するポリペプチドを引き出すことができる。第１のステップは、Ｒ−２−ヒドロキシイソカプロイル−ＣｏＡを生じるＣｏＡトランスフェラーゼ（ｈａｄＡ）活性を有するポリペプチドによって触媒される。次いで、デヒドラターゼ−活性化因子複合体（例えば、ｈａｄＢＣ−ｈａｄＩ）によるＲ−２−ヒドロキシイソカプロイル−ＣｏＡの脱水によって２−イソカプレノイル−ＣｏＡが生じ、これは、アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ａｃｄＢ−ｅｔｆＢＡ）活性を有するポリペプチドにより還元されてイソカプロイルＣｏＡになる。最後に、ＣｏＡ部分がＣｏＡトランスフェラーゼ（ｈａｄＡ）によって除去されて、アジピン酸を生成する。プラチナを含む種々の金属触媒を用いて、アルファケトアジピン酸を化学的還元してアジピン酸にすることも可能である。
【００１８】
一実施形態では、本開示は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）（ｇｄｈ）活性を有するポリペプチド、ホモクエン酸シンターゼ（ｈｃｓ）活性を有するポリペプチド、ホモアコニターゼ（ｈａｃＡＢ）活性を有するポリペプチド、ホモイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ｈｉｃＤＨ）活性を有するポリペプチド、前述のポリペプチドの任意の組み合わせをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリペプチドを発現する異種ポリヌクレオチドを導入することによって改変した組換え細菌を提供する。
【００１９】
別の実施形態では、本開示は、リシンアミノトランスフェラーゼ（ｌａｔ）活性を有するポリペプチド、ピペリデイン６−カルボン酸デヒドロゲナーゼ（ｐｃｄ）活性を有するポリペプチド、２−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ（ａａｄａｔ）活性を有するポリペプチド、前述のポリペプチドの任意の組み合わせをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリペプチドを発現する異種ポリヌクレオチドを導入することによって改変した組換え細菌を提供する。
【００２０】
さらに別の実施形態では、種々の微生物由来のロイシンデヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）活性を有するポリペプチド、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）活性を有するポリペプチドおよびヒドロキシイソカプリル酸デヒドロゲナーゼ（ｈｄｈ）活性を有するポリペプチドを含む、デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドを発現させるために、同じ細菌または異なる細菌を組換えによって改変することができる。
【００２１】
別の実施形態では、本開示は、アジピン酸がアルファケトアジピン酸から生成するように、ＣｏＡトランスフェラーゼ（ｈａｄＡ）活性を有するポリペプチド、デヒドラターゼ−活性化因子複合体（例えば、ｈａｄＢＣ−ｈａｄＯ）活性を有するポリペプチド、アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ａｃｄＢ−ｅｔｆＢＡ）活性を有するポリペプチド、ＣｏＡトランスフェラーゼ（ｈａｄＡ）活性を有するポリペプチドおよび前述のポリペプチドの任意の組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドを発現する異種ポリヌクレオチドを導入することによって改変した組換え細菌を提供する。
【００２２】
さらに、本開示は、タンパク質、ポリペプチド、またはアミノ酸を含むバイオマスを、上記の組換え微生物のいずれかを有するバイオマスと、化学生成物の生成を促す条件下で接触させることにより、バイオマスから化学生成物を生成するためのプロセスであって、生成された化学生成物の量が、野生型生物によって生成される量より多いプロセスを提供する。組換え微生物を成長させるために使用するバイオマスは、例えば、藻類、可溶性物質添加乾燥蒸留穀物残渣（ＤＤＧＳ）、細菌、動物残渣、植物、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、またはそれらの混合物、およびそれらの任意の組み合わせであってよい。本明細書に記載のある特定の実施形態では、バイオマスは、緑藻類、紅藻類、藍藻類、シアノバクテリア、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、またはＢａｃｃｉｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓであってよい。記載されている特定の実施形態では、バイオマスはＣｈｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、またはＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｅｓであった。さらに、バイオマスは、組換え微生物と接触させる前に部分的に分解することができる。ある特定の実施形態では、バイオマスは、プロテアーゼおよび／または熱で処理することができる。例えば、バイオマスを加熱することによって、例えば、６０〜１００℃にわたる温度で加熱すること、およびプロテアーゼで処理することによって加水分解した。ある特定の実施形態では、バイオマスを、リシン、メチオニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンを２０種全てのアミノ酸残基の混合物に変換する第２の微生物と接触させることができるプロセスが開示されている。具体的には、バイオマスを、組換え微生物と接触させる前に第２の微生物と接触させる。第２の微生物は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよび／またはＢａｃｉｌｌｕｓであってよい。
【００２３】
本開示の１つまたは複数の実施形態の詳細は、付属図および以下の説明に記載されている。他の特徴、目的、および利点は、明細書および図から、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００２４】
本明細書に組み入れられ、その一部を構成する付属図は、本開示の１つまたは複数の実施形態を例示し、発明を実施するための形態と共に、本発明の原理および実施を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｅは、種々のバイオ燃料生成プロセスの比較を示す。（Ａ）セルロース系植物プロセスである。（Ｂ）藻類脂質プロセスである。（Ｃ）種々のバイオ燃料生成プロセスによるエネルギー費およびＮに富むバイオマスの蓄積である。詳細な算出については下記を参照されたい。（Ｄ）本研究において開発された藻類タンパク質から燃料へのプロセスである。（Ｅ）タンパク質からのバイオ燃料の理論収量（原料１グラム当たりの生成物のグラム数）である。濃淡のない棒：正味の収量、原料のアミノ基を除いて算出したもの。斜交平行線が付いた棒：総収量、原料のアミノ基を含めて算出したもの。詳細については表３を参照されたい。
【図１Ｂ】図１Ａ〜Ｅは、種々のバイオ燃料生成プロセスの比較を示す。（Ａ）セルロース系植物プロセスである。（Ｂ）藻類脂質プロセスである。（Ｃ）種々のバイオ燃料生成プロセスによるエネルギー費およびＮに富むバイオマスの蓄積である。詳細な算出については下記を参照されたい。（Ｄ）本研究において開発された藻類タンパク質から燃料へのプロセスである。（Ｅ）タンパク質からのバイオ燃料の理論収量（原料１グラム当たりの生成物のグラム数）である。濃淡のない棒：正味の収量、原料のアミノ基を除いて算出したもの。斜交平行線が付いた棒：総収量、原料のアミノ基を含めて算出したもの。詳細については表３を参照されたい。
【図１Ｃ】図１Ａ〜Ｅは、種々のバイオ燃料生成プロセスの比較を示す。（Ａ）セルロース系植物プロセスである。（Ｂ）藻類脂質プロセスである。（Ｃ）種々のバイオ燃料生成プロセスによるエネルギー費およびＮに富むバイオマスの蓄積である。詳細な算出については下記を参照されたい。（Ｄ）本研究において開発された藻類タンパク質から燃料へのプロセスである。（Ｅ）タンパク質からのバイオ燃料の理論収量（原料１グラム当たりの生成物のグラム数）である。濃淡のない棒：正味の収量、原料のアミノ基を除いて算出したもの。斜交平行線が付いた棒：総収量、原料のアミノ基を含めて算出したもの。詳細については表３を参照されたい。
【図１Ｄ】図１Ａ〜Ｅは、種々のバイオ燃料生成プロセスの比較を示す。（Ａ）セルロース系植物プロセスである。（Ｂ）藻類脂質プロセスである。（Ｃ）種々のバイオ燃料生成プロセスによるエネルギー費およびＮに富むバイオマスの蓄積である。詳細な算出については下記を参照されたい。（Ｄ）本研究において開発された藻類タンパク質から燃料へのプロセスである。（Ｅ）タンパク質からのバイオ燃料の理論収量（原料１グラム当たりの生成物のグラム数）である。濃淡のない棒：正味の収量、原料のアミノ基を除いて算出したもの。斜交平行線が付いた棒：総収量、原料のアミノ基を含めて算出したもの。詳細については表３を参照されたい。
【図１Ｅ】図１Ａ〜Ｅは、種々のバイオ燃料生成プロセスの比較を示す。（Ａ）セルロース系植物プロセスである。（Ｂ）藻類脂質プロセスである。（Ｃ）種々のバイオ燃料生成プロセスによるエネルギー費およびＮに富むバイオマスの蓄積である。詳細な算出については下記を参照されたい。（Ｄ）本研究において開発された藻類タンパク質から燃料へのプロセスである。（Ｅ）タンパク質からのバイオ燃料の理論収量（原料１グラム当たりの生成物のグラム数）である。濃淡のない棒：正味の収量、原料のアミノ基を除いて算出したもの。斜交平行線が付いた棒：総収量、原料のアミノ基を含めて算出したもの。詳細については表３を参照されたい。
【図２Ａ】図２Ａ〜Ｃは、クオラムセンシングの不活化のバイオ燃料生成に対する効果を示す。エラーバーは標準偏差を示す。（Ａ）異なる遺伝子ノックアウトを含有する２０種の株からの相対的なバイオ燃料生成の力価である。野生型株からのバイオ燃料生成力価を正規化の基準として使用する（ＢおよびＣ）。イソブタノール生成経路遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのａｌｓＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのｉｌｖＣＤ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓのｋｉｖｄおよびａｄｈＡ）の過剰発現を伴う、または伴わない、ＹＨ１９（改善されたアミノ酸利用株）およびそのクオラムセンシング遺伝子ノックアウト誘導体からのバイオ燃料生成（Ｂ）およびＯＤ（Ｃ）である。
【図２Ｂ】図２Ａ〜Ｃは、クオラムセンシングの不活化のバイオ燃料生成に対する効果を示す。エラーバーは標準偏差を示す。（Ａ）異なる遺伝子ノックアウトを含有する２０種の株からの相対的なバイオ燃料生成の力価である。野生型株からのバイオ燃料生成力価を正規化の基準として使用する（ＢおよびＣ）。イソブタノール生成経路遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのａｌｓＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのｉｌｖＣＤ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓのｋｉｖｄおよびａｄｈＡ）の過剰発現を伴う、または伴わない、ＹＨ１９（改善されたアミノ酸利用株）およびそのクオラムセンシング遺伝子ノックアウト誘導体からのバイオ燃料生成（Ｂ）およびＯＤ（Ｃ）である。
【図２Ｃ】図２Ａ〜Ｃは、クオラムセンシングの不活化のバイオ燃料生成に対する効果を示す。エラーバーは標準偏差を示す。（Ａ）異なる遺伝子ノックアウトを含有する２０種の株からの相対的なバイオ燃料生成の力価である。野生型株からのバイオ燃料生成力価を正規化の基準として使用する（ＢおよびＣ）。イソブタノール生成経路遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのａｌｓＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのｉｌｖＣＤ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓのｋｉｖｄおよびａｄｈＡ）の過剰発現を伴う、または伴わない、ＹＨ１９（改善されたアミノ酸利用株）およびそのクオラムセンシング遺伝子ノックアウト誘導体からのバイオ燃料生成（Ｂ）およびＯＤ（Ｃ）である。
【図３】図３Ａ〜Ｅは、窒素中心の代謝的な工学的操作戦略の全体的な設計を示す。アンモニアの放出を用いてアミノ酸分解反応を駆動して、２−ケト酸を生成する。ｇｄｈＡ遺伝子およびｇｌｎＡ遺伝子を欠失させて、アンモニアの再取り込みを遮断する。過剰発現した遺伝子が黒色で示されている。（Ａ）直接的な脱アミノ化およびＮＨ３の生成により分解されるアミノ酸である。（Ｂ）アミノ基転移およびグルタミン酸の生成により分解されるアミノ酸である。（Ｃ〜Ｅ）ＩｌｖＥおよびＬｅｕＤＨ（Ｃ）、ＩｌｖＥ、ＡｖｔＡ、ＤａｄＸおよびＤａｄＡ（Ｄ）、およびＳｅｒＣ、ＳｅｒＢ、ＳｄａＢ、ＰｐｓＡ、ＥｎｏおよびＧｐｍＡ（Ｅ）による設計されたアミノ基転移および脱アミノ化のサイクル。
【図４−１】図４Ａ〜Ｄは、バイオ燃料の生産性の全体的な設計および最適化を示す。（Ａ）バイオ燃料（６００億ｇａｌ／年、米国における輸送燃料の消費の約３０％）に対する開放池での藻類培養の全体的なプロセスのフローシートである。各流れにおけるＣ（黒色）、Ｎ（灰色）およびＳ（薄い灰色）の基本的な質量流量が流れの隣に列挙されており、ＨおよびＯの関連する質量は示されていない。特に指定のない限り、全ての値の単位は１年当たり１００万トンである。算出のためにタンパク質から高級アルコールへの変換収量を使用するが、Ｎに富むバイオマスは、タンパク質および炭水化物を含むことが意図されている。藻類種の脂質含有量は１０％であると想定される。四角い枠は、主要な加工ステップを示し、楕円は流れの構成要素を識別する。１年当たり１０億ガロンをＢｇａｌ／年と表す。（Ｂ）脂質含有量に応じた藻類のバイオマス生産性を示す。データ（１１）は、池の深さを０．２ｍと仮定して、ｇ／Ｌ／日からｇ／ｍ２／日に変換した。傾向線はこの図に示されている指数関数に対する最良あてはめである。（Ｃ）（Ｂ）のバイオマス生産性およびタンパク質のバイオ燃料への理論的な変換収量を考慮して、混合タンパク質−脂質プロセス（実線）または脂質プロセスのみ（点線）を通して全体的なバイオ燃料の生産性に対する脂質含有量の影響を算出する。タンパク質−脂質プロセスの全体的な生産性は、脂質含有量が増加するにつれて減少し、これによりタンパク質部分がより効率的であることが示唆されていることに留意されたい。（Ｄ）混合タンパク質−脂質プロセスにおける最適な脂質含有量はタンパク質から高級アルコールへの変換収量に応じる。タンパク質からバイオ燃料への変換が理論収量の６１％を超える限りは、このプロセスのタンパク質の加工部分は脂質の加工より効率的である。脂質から燃料への炭素変換は１００％であると想定される。
【図４−２】図４Ａ〜Ｄは、バイオ燃料の生産性の全体的な設計および最適化を示す。（Ａ）バイオ燃料（６００億ｇａｌ／年、米国における輸送燃料の消費の約３０％）に対する開放池での藻類培養の全体的なプロセスのフローシートである。各流れにおけるＣ（黒色）、Ｎ（灰色）およびＳ（薄い灰色）の基本的な質量流量が流れの隣に列挙されており、ＨおよびＯの関連する質量は示されていない。特に指定のない限り、全ての値の単位は１年当たり１００万トンである。算出のためにタンパク質から高級アルコールへの変換収量を使用するが、Ｎに富むバイオマスは、タンパク質および炭水化物を含むことが意図されている。藻類種の脂質含有量は１０％であると想定される。四角い枠は、主要な加工ステップを示し、楕円は流れの構成要素を識別する。１年当たり１０億ガロンをＢｇａｌ／年と表す。（Ｂ）脂質含有量に応じた藻類のバイオマス生産性を示す。データ（１１）は、池の深さを０．２ｍと仮定して、ｇ／Ｌ／日からｇ／ｍ２／日に変換した。傾向線はこの図に示されている指数関数に対する最良あてはめである。（Ｃ）（Ｂ）のバイオマス生産性およびタンパク質のバイオ燃料への理論的な変換収量を考慮して、混合タンパク質−脂質プロセス（実線）または脂質プロセスのみ（点線）を通して全体的なバイオ燃料の生産性に対する脂質含有量の影響を算出する。タンパク質−脂質プロセスの全体的な生産性は、脂質含有量が増加するにつれて減少し、これによりタンパク質部分がより効率的であることが示唆されていることに留意されたい。（Ｄ）混合タンパク質−脂質プロセスにおける最適な脂質含有量はタンパク質から高級アルコールへの変換収量に応じる。タンパク質からバイオ燃料への変換が理論収量の６１％を超える限りは、このプロセスのタンパク質の加工部分は脂質の加工より効率的である。脂質から燃料への炭素変換は１００％であると想定される。
【図４−３】図４Ａ〜Ｄは、バイオ燃料の生産性の全体的な設計および最適化を示す。（Ａ）バイオ燃料（６００億ｇａｌ／年、米国における輸送燃料の消費の約３０％）に対する開放池での藻類培養の全体的なプロセスのフローシートである。各流れにおけるＣ（黒色）、Ｎ（灰色）およびＳ（薄い灰色）の基本的な質量流量が流れの隣に列挙されており、ＨおよびＯの関連する質量は示されていない。特に指定のない限り、全ての値の単位は１年当たり１００万トンである。算出のためにタンパク質から高級アルコールへの変換収量を使用するが、Ｎに富むバイオマスは、タンパク質および炭水化物を含むことが意図されている。藻類種の脂質含有量は１０％であると想定される。四角い枠は、主要な加工ステップを示し、楕円は流れの構成要素を識別する。１年当たり１０億ガロンをＢｇａｌ／年と表す。（Ｂ）脂質含有量に応じた藻類のバイオマス生産性を示す。データ（１１）は、池の深さを０．２ｍと仮定して、ｇ／Ｌ／日からｇ／ｍ２／日に変換した。傾向線はこの図に示されている指数関数に対する最良あてはめである。（Ｃ）（Ｂ）のバイオマス生産性およびタンパク質のバイオ燃料への理論的な変換収量を考慮して、混合タンパク質−脂質プロセス（実線）または脂質プロセスのみ（点線）を通して全体的なバイオ燃料の生産性に対する脂質含有量の影響を算出する。タンパク質−脂質プロセスの全体的な生産性は、脂質含有量が増加するにつれて減少し、これによりタンパク質部分がより効率的であることが示唆されていることに留意されたい。（Ｄ）混合タンパク質−脂質プロセスにおける最適な脂質含有量はタンパク質から高級アルコールへの変換収量に応じる。タンパク質からバイオ燃料への変換が理論収量の６１％を超える限りは、このプロセスのタンパク質の加工部分は脂質の加工より効率的である。脂質から燃料への炭素変換は１００％であると想定される。
【図５】図５は、異なる藻類種、酵母抽出物および２種の慣習的なタンパク質供給源の間のアミノ酸プロファイルの類似性を示す。
【図６Ａ】図６Ａ〜Ｂは、種々のアミノ酸から高級アルコールを生成するための炭素フラックス駆動性戦略を示す。（Ａ）炭素フラックス駆動性高級アルコール生成についての代謝ネットワークである。アミノ酸が種々の２−ケト酸に分解され、それが、２−ケト酸デカルボキシラーゼ（ＫｉｖＤ）およびアルコールデヒドロゲナーゼ（ＹｑｈＤ）により高級アルコールに変換され得る。過剰発現した遺伝子が赤色で示されている。（Ｂ）過剰発現した遺伝子を有する工学的操作をしたＥ．ｃｏｌｉにおけるイソブタノール生成の結果が軸の下に示されている。エラーバーは標準偏差を示す。
【図６Ｂ】図６Ａ〜Ｂは、種々のアミノ酸から高級アルコールを生成するための炭素フラックス駆動性戦略を示す。（Ａ）炭素フラックス駆動性高級アルコール生成についての代謝ネットワークである。アミノ酸が種々の２−ケト酸に分解され、それが、２−ケト酸デカルボキシラーゼ（ＫｉｖＤ）およびアルコールデヒドロゲナーゼ（ＹｑｈＤ）により高級アルコールに変換され得る。過剰発現した遺伝子が赤色で示されている。（Ｂ）過剰発現した遺伝子を有する工学的操作をしたＥ．ｃｏｌｉにおけるイソブタノール生成の結果が軸の下に示されている。エラーバーは標準偏差を示す。
【図７】図７は、窒素中心の戦略を用いて工学的操作をしたＥ．ｃｏｌｉにより生成されたバイオ燃料鎖長の分布を示す。株はＹＨ８３（＝ＹＨ１９Δｇ１ｎＡΔＬｇｄｈＡΔｌｓｒＡ／ａｌｓＳ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＤ、ａｖｔＡ、ｌｅｕＤＨ、ｋｉｖＤ、ｙｑｈＤ、ｉｌｖＥ、ｉｌｖＡおよびｓｄａＢの過剰発現）である。
【図８】図８は、藻類細胞または細菌細胞の加水分解物を用いてフラスコ中で成長させた工学的操作をしたＥ．ｃｏｌｉ株ＹＨ８３により生成されたバイオ燃料（ＥｔＯＨ、ｉＢＯＨ、２ＭＢ、３ＭＢ）を示す。小さな実験室規模の反応器（１リットルまたは３０リットル）を使用して、細菌細胞および藻類細胞を個別に成長させた。藻類バイオマス混合物は、Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｐ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ、Ｓ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓおよびＳ．ｅｌｏｎｇａｔｅｓを含む。タンパク質源は全て、４％の酵母抽出物中のタンパク質の量と等しい２１．６ｇ／ｌのペプチドおよびアミノ酸を含有するように調整した。エラーバーは標準偏差を示す（ｎ＝３）。
【図９】図９は、ケト酸のイソブタノールおよび３−メチル−１−ブタノールへの変換の概略図を示す。
【図１０】図１０は、ケト酸の高級アルコールへの変換の全体的な概略図を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜Ｃは、アジピン酸生成の概略図を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜Ｃは、アジピン酸生成の概略図を示す。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜Ｃは、アジピン酸生成の概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される単数形「ａ（１つの）」「ａｎｄ（および）」、および「ｔｈｅ（その）」は、文脈により明確に別段の規定がなされない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ａ（１つの）ポリヌクレオチド」への言及は、複数のそのようなポリヌクレオチドを含み、「ｔｈｅ（その）微生物」への言及は、１つまたは複数の微生物への言及を含む、などである。
【００２７】
別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等である方法および材料を本開示の方法および組成物の実施において用いることができるが、本明細書には典型的な方法、デバイスおよび材料が記載されている。
【００２８】
上記および本文全体にわたって記載されている刊行物はいずれも、単に、本出願の出願日より前のそれらの開示について提供されている。本明細書における全てが、本発明者らが、先行開示に基づいてそのような開示に先行する権限がないことを容認するものと解釈されるべきではない。
【００２９】
本明細書において提供される特定の例を用いて、例えば、タンパク質性バイオマス、タンパク質加水分解物（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｙｄｒｏｓｙｌａｔｅ）、アミノ酸の混合物、および単一の遊離アミノ酸などを含む基質の、種々の２−ケト酸の生成における転換および使用を実証する。下により詳しく記載されている通り、２−ケト酸はその後、バイオ燃料に加えて追加的な化学的実体にさらに代謝され得る。
【００３０】
植物および藻類は窒素を固定しないので、植物または藻類による大規模なバイオ燃料生成はいずれも、後で主にタンパク質および少量の核酸としてバイオマスに組み入れられるアンモニウムまたは硝酸の形態に固定された窒素を必要とする。生物学的窒素固定は、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍなどの一部の共生細菌、およびＡｎａｂａｅｎａなどの一部の自由生活微生物によって行われる、遅く、大量のエネルギーを消費するプロセスである。非生物学的窒素固定は、ハーバーボッシュ（Ｈａｂｅｒ−Ｂｏｓｃｈ）プロセスとして公知の触媒作用によるプロセスによって実現され、これもまた大量のエネルギーを消費し、環境的に都合が悪い。ＮＨ３を１モル生成するためには、生物学的窒素固定ではＡＴＰ８モルおよび４還元当量、またはハーバーボッシュ（Ｈａｂｅｒ−Ｂｏｓｃｈ）プロセスでは０．８ＭＪ（窒素１ｋｇ当たり５７ＭＪ）が必要である。
【００３１】
バイオ燃料を生成するために、植物バイオマスまたは藻類の脂質を炭素ベースの燃料に変換し、残りの窒素に富むバイオマスは動物用飼料として使用する（図１Ａおよび１Ｂ）。これらの場合、ハーバーボッシュ（Ｈａｂｅｒ−Ｂｏｓｃｈ）プロセスを通じて固定された窒素の正味の投入が必要である（図１Ｃ）。現行の窒素肥料の化学合成はすでに１年当たり１億トンに達しており、全体的な一次エネルギー供給の約１．２％を消費しており、バイオ燃料プロセスの規模を拡大すれば実質的に増加することになる。
【００３２】
動物用飼料として使用される窒素に富む残渣は、動物の排泄物を通じて間接的に温室効果ガス（Ｇｒｅｅｎ  Ｈｏｕｓｅ  Ｇａｓｅｓ）（ＧＨＧ）を創出する。動物用飼料には現在のところ高値が付いているが、市場はすぐに飽和するであろう（図１Ｃ）。潜在的な米国の家畜への窒素に富むバイオ燃料残渣（すなわち、可溶性物質添加乾燥蒸留穀物残渣、ＤＤＧＳ）の需要の総量は約４，２００万トンであり、これは植物ベースのバイオ燃料１５４億ガロンまたは藻類バイオ燃料４３億ガロンの副生成物に対応し、これは、それぞれ、米国における液体燃料の使用総量のおよそ７．７％、または２．１％である。したがって、窒素を再利用しなければ、バイオ燃料の大規模生産は上記のレベルを越え、その結果、還元された窒素またはＧＨＧが地球上に最終的に蓄積し、実施を持続できなくなる。
【００３３】
２つの主要なバイオ燃料生成のスキーム（図１Ａおよび１Ｂ）の間で、一般には、藻類は植物より速く成長し（倍加時間が２４時間未満である）、食物の生産と競合しない。しかし、藻類バイオマスは大量のタンパク質を含有し（図５）、大規模な正味の窒素投入を必要とする。さらに、成長が速い種は、多量のタンパク質および少量の液体を含有する。一般には、窒素制限を用いて、成長速度を犠牲にして脂質の蓄積を促進する。したがって、脂質生成種は、閉鎖バイオリアクター内で培養しなければならないか、または、タンパク質に富む天然種に占領される可能性に直面するかのいずれかである。この状況は、高価な閉鎖培養系を使用するか脂質含有量が低い種を利用するかのいずれかという逆説を創出する。この問題を解決するためには、ネイティブな成長が早い藻類種はその地方の塩度、温度、およびｐＨに気候順化するので、これらの種を開放池で用い、同時に窒素を再利用することが理想的である。成長が速い種は、一般には高タンパク質低脂質を含有するので、燃料を生成するためにタンパク質に富むバイオマスを利用すること、および固定された窒素を再利用することにより、低費用の開放培養系を活用しながら、アンモニア合成のためのエネルギー費および間接的なＧＨＧの放出を著しく低下させることができる（図１Ｄ）。
【００３４】
リグニンと不応性の複合物を形成するセルロースとは異なり、単細胞タンパク質は、プロテアーゼにより、短いペプチドおよびアミノ酸に容易に加水分解することができ、これはすでに種々の適用のために工業的に使用されている。ペプチド結合の解離エネルギー（３０８ＫＪ／ｍｏｌ）は、セルロースのβ−グリコシド結合より低く（３６０ＫＪ／ｍｏｌ）、容易に破壊される。さらに、微生物は短いペプチドを利用することができるので、タンパク質の加水分解は完全である必要はない。Ｋｃａｔがおよそ１００〜１０００ｓ−１であるプロテアーゼはセルラーゼ（Ｋｃａｔが、前処理した後の可溶性基質に対してさえ、およそ０．１〜１０ｓ−１である）より有効な酵素であり、多くの微生物はプロテアーゼを自然に分泌することができ、これにより、一段階の最終的な強化されたバイオプロセシングの可能性がもたらされる。下により詳しく記載されている通り、本開示は、微生物タンパク質バイオマスを含む基質は、前処理および酵素による加水分解の単純なプロセスによって容易に加水分解することができることを実証している。例として、前処理は、水中で１０分間煮沸することからなってよい。酵素による加水分解は、３７℃で４時間、プロテアーゼを最小限添加することによって実現することができる。このタンパク質バイオマスの加水分解プロセスは、セルロースの加水分解プロセスでは一般的である高圧、高温、化学物質の添加、より長い前処理、またはより長い酵素による加水分解時間のいずれも必要としない。
【００３５】
ペプチドおよびアミノ酸を基質としてバイオ燃料に変換し、同時に窒素を再利用するために、デアミナーゼ、アミノトランスフェラーゼまたはデヒドロゲナーゼなどの酵素によって触媒される脱アミノ化反応を通じてアミノ酸からアミノ基を切断して、アンモニウムを形成することができる。これらの反応の生成物の多くは２−ケト酸であり、これは、種々の化学生成物に変換することができる。他のアミノ酸はＴＣＡ回路の中間体に分解され、これは、例えば、リンゴ酸酵素またはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼなどの糖新生酵素によってピルベートに導き、その後、アセトヒドロキシ酸シンターゼ鎖伸長経路またはイソプロピルリンゴ酸シンターゼ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅａｓｅ）鎖伸長経路によってより長いケト酸に導くことができる。
【００３６】
アミノ酸は全て、種々の生物から集められた経路によって完全に分解することができ、個々のアミノ酸からのアルコール（Ｃ２〜Ｃ５）の最大理論収量は３５〜８４％である（表１Ａ）。この収量は、加水分解生成物ではなくタンパク質を算出の基準として用いた場合、または正味の収量の算出からアミノ基を排除した場合はさらに高い（表１ＢおよびＣ）。典型的な藻類のアミノ酸組成を用いることによって（図５）、藻類のタンパク質からの混合アルコールの最大理論収量は６０％（図１Ｅ；表２ＡおよびＢ）または７３％（正味の収量、窒素を除いて算出）であると算出され、これは、糖からのエタノールの最大理論収量（５０％）より高い］。
【００３７】
微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）は、生成物の形成より成長のためにアミノ酸を使用することを選ぶので、残念ながらペプチドまたはアミノ酸は発酵性が乏しい基質である。アミノ酸は、微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）に炭素および窒素の両方をもたらす。そのようなものとして、細胞または微生物群集の利益になる栄養分の最適な消費を確実にするために種々の調節系が置かれている。アミノ酸を高級アルコールに変換するためのネイティブな経路は、少量生成物の形成のみを支持する。非能率は、アミノ酸生合成の方向に向かうアミノ基転移反応を駆動する好ましくない熱力学的勾配に大きく起因する。したがって、細菌におけるアミノ酸代謝ネットワークを工学的に操作する必要がある。
【００３８】
【表１Ａ】
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【００３９】
【表１Ｂ】
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【００４０】
【表１Ｃ】
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【００４１】
【表２Ａ】
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【００４２】
【表２Ｂ】
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本開示は、本開示の組換え微生物を全体的な化学生成系の一部分として利用する化学生成系を提供する。例えば、本開示は、バイオマスを生成するために藻類を開放池において太陽光の下で生成する、図４に記載のバイオ燃料生成系を提供する。バイオマスの脂質含分はバイオディーゼルを生成するために利用され、一方窒素に富むバイオマスは、本開示の組換え微生物の基質として加水分解される。次いで、加水分解された窒素に富むバイオマスは、本開示の組換え微生物を含む反応器系に供給される。組換え微生物は、窒素に富むバイオマスを代謝して、種々の化学物質を生成する（特定の組換え経路、例えば、高級アルコールなどのアルコール、アジピン酸などを生成するための酵素経路に応じて）。次いで、アンモニウム、ＣＯ２および副生成物を開放池において成長している藻類に戻して、藻類の成長を支持する。次いで、残留したタンパク質（例えば、残留したＮに富むバイオマス）を、種々の代謝産物をさらに再利用するための第２のバイオリアクター系に供給することができる。図４の窒素と炭素が中立したバイオ燃料プロセスの概略図では、エネルギーの供給源として太陽光を利用し、炭素源はＣＯ２である。窒素源および硫黄源はこのプロセスから再利用されるアンモニアおよび硫酸塩である。頻繁にまたは連続的に回収される状態の下での自然選択では、一般に、成長が速く頑強な生物が選ばれる。回収後、生成したバイオマスを、まず、従来のバイオディーゼル生成のための脂質を得るために加工する。タンパク質部分を加水分解し、第１段階の変換器に供給して高級アルコールを生成する。次いで、第１段階で残留したアミノ酸を第２段階に供給して、加水分解ユニットに戻して再利用することになる追加的なバイオマスを生成する。第二段階の変換において生成したＣＯ２を藻類培養物に戻して、大気から得られたＣＯ２を富化することができる。
【００４３】
系の一実施形態では、藻類は、タンパク質に富む藻類またはタンパク質に富む任意の他の光独立栄養性微生物である。
【００４４】
この設計の利益は、成長が早い藻類種およびＮに富む成長条件を利用し、それにより高タンパク質および低脂質の蓄積を伴う成長が促進されることである（図４Ｂ）。理論的な導出によっても、高タンパク質をもたらす種の成長速度がより速いことが示される。実際に、高タンパク質種は、高脂質種の約１０倍のバイオマス生産性を有し、これはタンパク質が指数関数的に複製する一方で脂質は直線的に増加することに主に起因する（図４Ｂ）。藻類のバイオマス生産性と脂質含有量と脂質の変換およびタンパク質の変換の両方の燃料の理論収量との間の相関を用いて、バイオ燃料の全体的な生産性を計算することができる（図４Ｃ）。藻類バイオマスの脂質部分のみを利用した場合、全体的な生産性は、脂質含有量が０〜２０％増加するにつれて増大するが、脂質含有量が２０％を越えて増加すると横ばい状態になる（図４Ｃ、破線）。この結果は、藻類種の脂質含有量が増加することにより全体的な燃料生産性は実際には増加しないと考えた場合と一致する。藻類バイオマスの脂質部分およびタンパク質部分の両方を使用すると、全体的な生産性は、脂質含有量が増加するにつれて実際に減少し、これは、全体的な生産性の点でタンパク質プロセスが脂質プロセスより効率的であることを示している。
【００４５】
本開示は、適切な基質、例えば、単一のアミノ酸残基、アミノ酸残基の混合物、ならびにＮに富むバイオマスを含む基質などから種々の化学化合物を生成するための生化学的経路を含む、代謝的な工学的操作をした微生物、または代謝的組換え微生物を提供する。本開示の代謝的な工学的操作をした微生物は、その生物のゲノム内またはその生物内のゲノムの外に１つまたは複数の組換えポリヌクレオチドを含む。微生物は、デヒドロゲナーゼ、デアミナーゼ、および／またはトランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００４６】
微生物は、野生型生物と比較して、アンモニア再取り込み活性の低下、クオラムセンシング系の低下または攪乱、例えば、オートインデューサー−２（ＡＩ−２）の再取り込みの低下または攪乱など、全体的な調節因子活性の低下を有することをさらに特徴としてよい。この低下は、アンモニアの再取り込み、クオラムセンシング、例えば、オートインデューサー−２の再取り込み、および／または全体的な調節因子活性に関連する遺伝子の発現を低下させる、攪乱する、または遮断することによって実現することができる。そのようなものとして、微生物は、野生型生物に見いだされるｇｌｎＡ、ｇｄｈＡ、ｌｓｒＡ、ｌｕｘＳ、ＣＲＰ、ＬＲＰ、Ｆｉｓ、および／またはＩＨＦ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子の低下、破壊またはノックアウトを含んでよく、また、異種ポリヌクレオチドの導入も含んでよい。
【００４７】
一実施形態では、本開示は、親の微生物と比較して少なくとも１つの標的酵素の発現が上昇している、または親の生物においては見いだされない酵素をコードする組換え微生物を提供する。微生物は、ｇｌｎＡ、ｇｄｈＡ、ｌｓｒＡ、ｌｕｘＳ、ＣＲＰ、Ｌｒｐ、Ｆｉｓ、ＩＨＦ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、アンモニアの再取り込み、オートインデューサー−２（ＡＩ−２）の再取り込み、全体的な調節因子、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、グルタミンシンターゼ、および／またはグルタミン酸シンターゼに関与するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子の低下、攪乱またはノックアウトを含んでよい。
【００４８】
上記の実施形態の組換え微生物の生成するケト酸フラックスは増大し、それにより、野生型微生物と比較して化学化合物の生成レベルを上昇させるための生合成経路に関与する少なくとも１つの代謝産物を生成する。化学化合物は、例えば、これらに限定されないが、アルコール、アセトアルデヒド、アセテート、イソブチルアルデヒド（ｉｓｏｂｕｔｙａｌｄｅｈｙｄｅ）、イソ酪酸、ｎ−ブチルアルデヒド、ｎ−酪酸、２−メチル−１−ブチルアルデヒド、２−メチル−１−酪酸、３−メチル−１−ブチルアルデヒド、３−メチル−１−酪酸、アンモニア、アンモニウム、グルタミン酸、トレオニン、メチオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、２−メチル−１，４−ブタンジオール、２−メチル−１，４−ブタンジアミン、イソブテン、イタコネート、アセトイン、アセトン、イソブテン、１，５−ジアミノペンタン、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、シキミ酸、メバロネート、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、イソプレノイド、脂肪酸、ホモアラニン、４−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、アジピン酸、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸、テトラヒドロフラン、３−メチル−テトラヒドロフラン、ガンマ−ブチロラクトン、ピロリジノン、ｎ−メチルピロリドン、アスパラギン酸、リシン、カダベリン、２−ケトアジピン酸、Ｓ−アデノシル−メチオニン（ＳＡＭ）などであってよい。アルコールは、例えば、適切な基質由来の、イソブタノール、１−ブタノール、１−プロパノール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノールおよび２−フェニルエタノールを含む高級アルコールであってよい。一般に、組換え微生物は、標的酵素を含む少なくとも１つの組換え代謝経路を含み、場合によっては、ｇｌｎＡ、ｇｄｈＡ、ｌｓｒＡ、ｌｕｘＳ、ＣＲＰ、ＬＲＰ、Ｆｉｓ、および／またはＩＨＦ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される酵素の活性または発現の低下をさらに含んでよい。該経路は、上で提供された化学組成物の生成における基質または代謝中間体を改変するように作用する。標的酵素は、適切な生物学的供給源に由来するポリヌクレオチドによりコードされ、発現される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、細菌または酵母である供給源に由来する遺伝子を含み、組換え工学的操作により本開示の微生物に入れられる。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「代謝的な工学的操作をした」または「代謝的工学的操作」という用語は、２−ケト酸などの所望の代謝産物におけるフラックスを増加させるための合理的な経路設計および生合成遺伝子、オペロンに関連する遺伝子、およびそのようなポリヌクレオチドの制御エレメントの組み立てを含む。追加的な経路を設計することができ、微生物における、例えば、アルコール、アセトアルデヒド、アセテート、イソブチルアルデヒド、イソ酪酸、ｎ−ブチルアルデヒド、ｎ−酪酸、２−メチル−１−ブチルアルデヒド、２−メチル−１−酪酸、３−メチル−１−ブチルアルデヒド、３−メチル−１−酪酸、アンモニア、アンモニウム、グルタミン酸、トレオニン、メチオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、２−メチル−１，４−ブタンジオール、２−メチル−１，４−ブタンジアミン、イソブテン、イタコネート、アセトイン、アセトン、イソブテン、１，５−ジアミノペンタン、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、シキミ酸、メバロネート、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、イソプレノイド、脂肪酸、ホモアラニン、４−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、アジピン酸、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸、テトラヒドロフラン、３−メチル−テトラヒドロフラン、ガンマ−ブチロラクトン、ピロリジノン、ｎ−メチルピロリドン、アスパラギン酸、リシン、カダベリン、２−ケトアジピン酸、Ｓ−アデノシル−メチオニン（ＳＡＭ）などを含む種々の化学化合物の生成を増加させるため、または新規に生成するための生合成遺伝子、オペロンに関連する遺伝子、およびそのようなポリヌクレオチドの制御エレメントを組み立てることができる。「代謝的な工学的操作をした」とは、所望の経路につながる中間体と競合する競合代謝経路の低下、攪乱、またはノックアウトを含む遺伝子工学的操作および適切な培養条件を用いて、転写、翻訳、タンパク質の安定性およびタンパク質の機能性を調節し、最適化することによって代謝フラックスを最適化することをさらに含んでよい。生合成遺伝子は、宿主に対して外来であることによってか、または突然変異誘発、組換え、および／または内在性宿主細胞内の異種発現制御配列との結び付きによって改変されていることによって、宿主微生物に対して異種性であってよい。一態様では、ポリヌクレオチドが宿主生物に対して異種性である場合、ポリヌクレオチドをコドン最適化することができる。
【００５０】
「生合成経路」という用語は、「代謝経路」とも称され、ある化学種を別の化学種に変換する（変質させる）ための生化学的な同化反応または異化反応のセットを指す。遺伝子産物は、それらが、平行してまたは順番に、同じ基質に対して作用し、同じ生成物を生成する、または同じ基質と最終代謝産物の間の代謝中間体（すなわち、代謝産物）に作用する、もしくは生成する場合、同じ「代謝経路」に属する。
【００５１】
ｌｅｕＡＢＣＤオペロンは、例えば、ｌｅｕＡ遺伝子、ｌｅｕＢ遺伝子、ｌｅｕＣ遺伝子およびｌｅｕＤ遺伝子を含む。それらの中で、ｌｅｕＡはα−イソプロピルリンゴ酸シンターゼをコードし、ｌｅｕＢは、β−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードし、ｌｅｕＣおよびｌｅｕＤはα−イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼをコードする。これらの酵素のうち、α−イソプロピルリンゴ酸シンターゼはα−ケトイソバレレートからα−イソプロピルマレートへの合成反応を触媒し、α−イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼは、α−イソプロピルマレートからβ−イソプロピルマレートへの異性化反応を触媒し、β−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼは、β−イソプロピルマレートからＬ−ロイシン生合成の最終的な中間体であるα−ケトイソカプロン酸への脱水素反応を触媒する。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａは、４種類のトランスアミナーゼ、すなわち、ａｓｐＣ遺伝子によりコードされるトランスアミナーゼＡ（アスパラギン酸−グルタミン酸アミノトランスフェラーゼ）、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロン内に含まれるｉｌｖＥ遺伝子によりコードされるトランスアミナーゼＢ（ＢＣＡＡアミノトランスフェラーゼ）、ａｖｔＡ遺伝子によりコードされるトランスアミナーゼＣ（アラニン−バリンアミノトランスフェラーゼ）およびｔｙｒＢ遺伝子によりコードされるトランスアミナーゼＤ（チロシンアミノトランスフェラーゼ）を保有する。これらの酵素は、種々のアミノ化反応に関与する。これらの酵素のうち、トランスアミナーゼＢおよびトランスアミナーゼＤは上記のα−ケトイソカプロン酸からＬ−ロイシンへのアミノ化反応を触媒し、逆もまた同じである。トランスアミナーゼＣおよびトランスアミナーゼＤは、Ｌ−バリン生合成とＬ−ロイシン生合成の間で共通する経路を含む、Ｌ−バリン生合成経路の最終的なステップを触媒する。
【００５２】
また、ｌｅｕＡＢＣＤオペロンの発現はＬ−ロイシンにより抑制される。アセトヒドロキシ酸シンターゼＩをコードするｉｌｖＢＮ遺伝子の発現は、Ｌ−バリンおよびＬ−ロイシンによる協奏的な抑制を受け、アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩをコードするｉｌｖＧＭ遺伝子の発現はＬ−イソロイシン、Ｌ−バリンおよびＬ−ロイシンによる協奏的な抑制を受け、アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩＩをコードするｉｌｖＩＨ遺伝子の発現はＬ−ロイシンによる抑制を受ける。
【００５３】
「基質」または「適切な基質」という用語は、酵素の作用によって別の化合物に変換されるまたは変換されることを意味する任意の基質または化合物を指す。この用語は、単一の化合物だけでなく、化合物の組み合わせ、例えば、溶液、混合物および少なくとも１つの基質またはその誘導体を含有する他の材料なども含む。さらに、「基質」という用語は、出発材料として使用するのに適した炭素源をもたらす化合物、例えば、任意のバイオマス由来の糖またはＣＯ２などだけでなく、本明細書に記載の代謝的な工学的操作をした微生物に関連する経路において使用される中間体および最終代謝産物も包含する。「バイオマス由来の糖」は、これらに限定されないが、グルコース、スクロース、マンノース、キシロース、およびアラビノースなどの分子を含む。「バイオマス由来の糖」という用語は、微生物によって通常使用される適切な炭素基質、例えば、これらに限定されないが、全てＤ型またはＬ型のいずれかのグルコース、ラクトース、ソルボース、フルクトース、イドース、ガラクトースおよびマンノースを含む６炭糖、またはグルコースとフルクトースなどの６炭糖の組み合わせ、ならびに／または、これらに限定されないが、２−ケト−Ｌ−グロン酸、イドン酸（ＩＡ）、グルコン酸（ＧＡ）、６−ホスホグルコネート、２−ケト−Ｄ−グルコン酸（２ＫＤＧ）、５−ケト−Ｄ−グルコン酸、２−ケトグルコネートホスフェート、２，５−ジケト−Ｌ−グロン酸、２，３−Ｌ−ジケトグロン酸、デヒドロアスコルビン酸、エリソルビン酸（ＥＡ）およびＤ−マンノン酸を含む６炭糖酸などを包含する。窒素に富むバイオマスとは、例えば、加水分解することができ、窒素が組み込まれているタンパク質、ペプチド、アミノ酸、アミノ酸の混合物、核酸または他の分子に富むバイオマスを指す。そのような窒素に富むバイオマスは、大きなタンパク質ならびに小さなペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドまたはそれより長いペプチド）、アミノ酸およびアミノ酸の混合物も含む。
【００５４】
「アルコール」という用語は、例えば、１−プロパノール、イソブタノール、１−ブタノール、２−メチル１−ブタノール、３−メチル１−ブタノールまたは２−フェニルエタノールを含む。
【００５５】
本明細書において提供される組換え微生物は、例えば、アルコール、アセトアルデヒド、アセテート、イソブチルアルデヒド、イソ酪酸、ｎ−ブチルアルデヒド、ｎ−酪酸、２−メチル−１−ブチルアルデヒド、２−メチル−１−酪酸、３−メチル−１−ブチルアルデヒド、３−メチル−１−酪酸、アンモニア、アンモニウム、グルタミン酸、トレオニン、メチオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、２−メチル−１，４−ブタンジオール、２−メチル−１，４−ブタンジアミン、イソブテン、イタコネート、アセトイン、アセトン、イソブテン、１，５−ジアミノペンタン、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、シキミ酸、メバロネート、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、イソプレノイド、脂肪酸、ホモアラニン、４−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、アジピン酸、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸、テトラヒドロフラン、３−メチル−テトラヒドロフラン、ガンマ−ブチロラクトン、ピロリジノン、ｎ−メチルピロリドン、アスパラギン酸、リシン、カダベリン、２−ケトアジピン酸、Ｓ−アデノシル−メチオニン（ＳＡＭ）などを、適切な炭素基質および／または窒素源を使用することにより生成するための経路に関与する複数の標的酵素を発現することができる。特定の実施形態では、組換え微生物は、ｇｌｎＡ、ｇｄｈＡ、ｌｓｒＡ、ｌｕｘＳまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子またはホモログにノックアウトを含む。そのようなノックアウトにより、微生物の代謝フラックスが、アミノ酸の蓄積から、より多量のケト酸の生成、ケト酸フラックスの増加、それから、上記の所望の化学化合物の生成に転換する。
【００５６】
したがって、代謝的な「工学的操作をした」、代謝的に「改変した」、または代謝的「組換え」微生物は、選択された宿主または親の微生物に遺伝物質を導入し、それにより、細胞の生理機能および微生物の生化学を改変することまたは変化させることより生成される。遺伝物質の導入を通じて、親の微生物は新規の性質、例えば、新規の、またはより多量の細胞内代謝産物を生成する能力を獲得する。例示的な実施形態では、親の微生物に遺伝物質を導入することにより、代謝を通じて所望の化学化合物を生成する、または窒素に富むバイオマスを２−ケト酸、および最終的に、例えば、アルコール、アセトアルデヒド、アセテート、イソブチルアルデヒド、イソ酪酸、ｎ−ブチルアルデヒド、ｎ−酪酸、２−メチル−１−ブチルアルデヒド、２−メチル−１−酪酸、３−メチル−１−ブチルアルデヒド、３−メチル−１−酪酸、アンモニア、アンモニウム、グルタミン酸、トレオニン、メチオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、２−メチル−１，４−ブタンジオール、２−メチル−１，４−ブタンジアミン、イソブテン、イタコネート、アセトイン、アセトン、イソブテン、１，５−ジアミノペンタン、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、シキミ酸、メバロネート、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、イソプレノイド、脂肪酸、ホモアラニン、４−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、アジピン酸、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸、テトラヒドロフラン、３−メチル−テトラヒドロフラン、ガンマ−ブチロラクトン、ピロリジノン、ｎ−メチルピロリドン、アスパラギン酸、リシン、カダベリン、２−ケトアジピン酸、Ｓ−アデノシル−メチオニン（ＳＡＭ）などにする新規の、または改変された能力がもたらされる。親の微生物に導入された遺伝物質は、例えば、上記の化学化合物のいずれかを生成するための生合成経路に関与する酵素のうちの１つまたは複数をコードする遺伝子（複数可）または遺伝子の部分を含有し、また、これらの遺伝子を発現させ、かつ／またはその発現を調節するための追加的なエレメント、例えば、プロモーター配列を含む場合もある。
【００５７】
上記の通り、工学的操作をした、または改変した微生物は、宿主または親の微生物への遺伝物質の導入に加えて、細胞の生理機能および微生物の生化学を変化させる遺伝子またはポリヌクレオチドの攪乱、欠失またはノックアウトを含む。遺伝子またはポリヌクレオチドの低下、攪乱またはノックアウトを通じて、微生物は新規の、または改善された性質（例えば、新規の、またはより大量の細胞内代謝産物を生成する能力、ケト酸などの代謝産物のフラックスを改善する能力、所望の経路を下げる能力、および／または望ましくない副生成物の生成を減少させる能力）を獲得する。
【００５８】
例えば、本開示は、異種性のｋｉｖｄ、ｙｑｈＤ、または他のアルコールデヒドロゲナーゼおよびｉｌｖＡ、ｌｅｕＡ、ｌｅｕＢ、ｌｅｕＣ、ｌｅｕＤ（またはＬｅｕオペロン、例えば、ｌｅｕＡＢＣＤ）、ａｎｓＢ、ａｓｐＣ、ｒｏｃＧ、ｐｕｔＡ、ｙｂａＳ、ｉｌｖＡ、ｇｌｙＡ、ｓｄａＡ、ｔｎａＡ、ａｌｓＳ、ｉｌｖＣＤ、ｉｌｖＥの過剰発現または異種発現を用いて、Ｎを含む、またはタンパク質性のバイオマスから高級アルコールを生成することができることを実証している。タンパク質性材料からの２−ケト酸の発生により、２−ケト酸から、例えば、アルコール、アセトアルデヒド、アセテート、イソブチルアルデヒド、イソ酪酸、ｎ−ブチルアルデヒド、ｎ−酪酸、２−メチル−１−ブチルアルデヒド、２−メチル−１−酪酸、３−メチル−１−ブチルアルデヒド、３−メチル−１−酪酸、アンモニア、アンモニウム、グルタミン酸、トレオニン、メチオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、２−メチル−１，４−ブタンジオール、２−メチル−１，４−ブタンジアミン、イソブテン、イタコネート、アセトイン、アセトン、イソブテン、１，５−ジアミノペンタン、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、シキミ酸、メバロネート、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、イソプレノイド、脂肪酸、ホモアラニン、４−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、アジピン酸、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸、テトラヒドロフラン、３−メチル−テトラヒドロフラン、ガンマ−ブチロラクトン、ピロリジノン、ｎ−メチルピロリドン、アスパラギン酸、リシン、カダベリン、２−ケトアジピン酸、またはＳ−アデノシル−メチオニン（ＳＡＭ）などの他の対象の化学的実体の生成を導くこともできる。ある特定の実施形態は、アンモニアの再取り込み、クオラムセンシング遺伝子活性、例えば、オートインデューサー２（ＡＩ−２）の再取り込みなど、および／または全体的な調節因子遺伝子などの低下またはノックアウトを伴う上記の遺伝子の任意の１つまたは複数の発現または過剰発現を含んでよい。特定の実施形態では、上記の遺伝子の任意の１つまたは複数の発現または過剰発現は、ｇｌｎＡ、ｇｄｈＡ、ｌｓｒＡ、ｌｕｘＳ、ＣＲＰ、ＬＲＰ、Ｆｉｓ、および／またはＩＨＦ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子または相同体の発現のノックアウトまたは低下も伴ってよい。アルコール、アセトアルデヒド、アセテート、イソブチルアルデヒド、イソ酪酸、ｎ−ブチルアルデヒド、ｎ−酪酸、２−メチル−１−ブチルアルデヒド、２−メチル−１−酪酸、３−メチル−１−ブチルアルデヒド、３−メチル−１−酪酸、アンモニア、アンモニウム、グルタミン酸、トレオニン、メチオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、２−メチル−１，４−ブタンジオール、２−メチル−１，４−ブタンジアミン、イソブテン、イタコネート、アセトイン、アセトン、イソブテン、１，５−ジアミノペンタン、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、シキミ酸、メバロネート、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、イソプレノイド、脂肪酸、ホモアラニン、４−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、アジピン酸、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸、テトラヒドロフラン、３−メチル−テトラヒドロフラン、ガンマ−ブチロラクトン、ピロリジノン、ｎ−メチルピロリドン、アスパラギン酸、リシン、カダベリン、２−ケトアジピン酸、Ｓ−アデノシル−メチオニン（ＳＡＭ）などの生成は種々の２−ケト酸中間体を伴う。
【００５９】
本開示は、１つまたは複数の異種ポリヌクレオチドの発現または下記のポリペプチドをコードする１つまたは複数の内在性ポリヌクレオチドの過剰発現が、任意の数の他の所望の化学化合物を生成するための代謝経路を生じるのに有用であることも実証している。例えば、グルタミン酸経路では、グルタミン酸は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）（ｇｄｈ）活性を有するポリペプチドにより、２−ＫＧ（２−ケトグルタレート）に変換される。ホモクエン酸シンターゼ（ｈｃｓ）活性およびホモアコニターゼ（ｈａｃＡＢ）活性を有するポリペプチドの連続した反応により、２−ＫＧがホモイソシトレートに変換され、それが、ホモイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ｈｉｃＤＨ）活性を有するポリペプチドにより還元的脱炭酸されてアルファケトアジピン酸になる。本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよび当技術分野で公知のその他の微生物を含む任意の数の微生物に由来してよい。ポリヌクレオチドは、供給源である生物から得、次いで、発現および／または活性が改善されるように改変したまたは工学的操作をした突然変異酵素または変異酵素であってよい。一実施形態では、グルタミン酸経路に関与する酵素をコードするポリヌクレオチドは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、およびＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを含む種々の生物からクローニングする。
【００６０】
本開示のリシン経路では、リシンアミノトランスフェラーゼ（ｌａｔ）活性を有するポリペプチドによりリシンが脱アミノ化されて２−アミノアジペート−６−セミアルデヒドになる。次いで、ピペリデイン６−カルボン酸デヒドロゲナーゼ（ｐｃｄ）活性を有するポリペプチドによりアルファアミノアジピン酸の形成が触媒される。次いで、２−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ（ａａｄａｔ）活性を有するポリペプチドによりアミン基が脱アミノ化される。本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、Ｆ．ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ、Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ、および当技術分野で公知のその他の微生物を含む任意の数の微生物に由来してよい。ポリヌクレオチドは、供給源である生物から得、次いで、発現および／または活性が改善されるように改変したまたは工学的操作をした突然変異酵素または変異酵素であってよい。一実施形態では、酵素をコードするポリヌクレオチドは、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、および当技術分野で公知のその他の生物を含む種々の生物からクローニングすることができる。
【００６１】
例えば、アジピン酸を中間体であるアルファケトアジピン酸から生成するために、図３に示されている通り、１つの化学的経路に加えて２つの生物学的経路（ＣｏＡ非依存性経路およびＣｏＡ依存性経路）を工学的に操作した。生物学的変換については、アルファケトアジピン酸は、種々の微生物由来のロイシンデヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）活性を有するポリペプチド、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）活性を有するポリペプチドおよびヒドロキシイソカプリル酸デヒドロゲナーゼ（ｈｄｈ）活性を有するポリペプチドを含むデヒドロゲナーゼ活性を有する種々のポリペプチドによりアルファ−ヒドロキシアジピン酸に変換される。ＣｏＡ非依存性経路では、嫌気的条件下で、オキサロアセテートを、マレートおよびフマレートを経由してスクシネートに変換する天然の還元的ＴＣＡ回路の模倣経路を工学的に操作した。フマル酸レダクターゼ遺伝子（例えばｆｕｍＡまたはｆｕｍＢ）の突然変異誘発により、アルファ−ヒドロキシアジピン酸の脱水を促進するポリペプチドがもたらされ得る。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ由来のクロトン酸エステルデヒドロゲナーゼの突然変異体により、さらなるステップを構築することができる。ＣｏＡ依存性経路では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｌｅにおけるイソカプロエート生成経路を用いて、アルファヒドロキシアジピン酸をアジピン酸に変換するポリペプチドを引き出すことができる。第１のステップは、Ｒ−２−ヒドロキシイソカプロイル−ＣｏＡを生じるＣｏＡトランスフェラーゼ（ｈａｄＡ）活性を有するポリペプチドによって触媒される。次いで、デヒドラターゼ−活性化因子複合体（例えば、ｈａｄＢＣ−ｈａｄＩ）によるＲ−２−ヒドロキシイソカプロイル−ＣｏＡの脱水によって２−イソカプレノイル−ＣｏＡが生じ、これは、アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ａｃｄＢ−ｅｔｆＢＡ）活性を有するポリペプチドにより還元されてイソカプロイルＣｏＡになる。最後に、ＣｏＡ部分がＣｏＡトランスフェラーゼ（ｈａｄＡ）によって除去されて、アジピン酸を生成する。プラチナを含む種々の金属触媒を用いて、アルファケトアジピン酸を化学的還元してアジピン酸にすることも可能である。さらに別の実施形態では、微生物は、内在性グルタメート生成経路を含む。例えば、グルタメート生成経路を有する有用な生物としては、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍなどの属の細菌種または酵母種などを含む。
【００６２】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）（ｇｄｈ）を有するポリペプチドは、活性が増大したまたは改善された天然に存在しないポリペプチドを含み、当技術分野で公知である、または組換えによって生成することができる。グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）活性を有する例示的なポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して８０％〜９９％の同一性を有し得る（対応するヌクレオチド配列は配列番号１に記載されている）。例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＱ５３１４３（参照により本明細書に組み込まれる）に記載の配列を有する、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＣａｎｄｉｄａ  ｆａｍａｔａ変異体由来の配列番号２を含んでよい。本開示の方法および組成物において有用な他の適切なグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）は、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用することによって容易に同定することができる。
【００６３】
ホモクエン酸シンターゼを有するポリペプチドは、活性が増大したまたは改善された天然に存在しないポリペプチドを含み、当技術分野で公知である、または組換えによって生成することができる。ホモクエン酸シンターゼ活性を有する例示的なポリペプチドは、配列番号４に記載の配列に対して８０％〜９９％の同一性を有し得る（対応するヌクレオチド配列は配列番号３に記載されている）。例えば、ホモクエン酸シンターゼは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＡ３３７８５（参照により本明細書に組み込まれる）に記載の配列を有する、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の配列番号４を含んでよい。本開示の方法および組成物において有用な他の適切なホモクエン酸シンターゼは、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用することによって容易に同定することができる。
【００６４】
ホモアコニターゼ活性を有するポリペプチドは、当技術分野で公知である、または、活性が増加したまたは改善された天然に存在しないポリペプチドを含む組換えによって生成することができる。ホモアコニターゼ活性を有する例示的なポリペプチドは、配列番号６に記載の配列に対して８０％〜９９％の同一性を有し得る（対応するヌクレオチド配列は配列番号５に記載されている）。例えば、ホモアコニターゼは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ＿００２６２０２０４（参照により本明細書に組み込まれる）に記載の配列を有する、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＡｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ由来の配列番号６を含んでよい。本開示の方法および組成物において有用な他の適切なホモクエン酸シンターゼは、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用することによって容易に同定することができる。
【００６５】
ホモイソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、活性が増大したまたは改善された天然に存在しないポリペプチドを含む、当技術分野で公知である、または組換えによって生成することができる。ホモイソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する例示的なポリペプチドは、配列番号８に記載の配列に対して８０％〜９９％の同一性を有し得る（対応するヌクレオチド配列は配列番号７に記載されている）。例えば、ホモイソクエン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の配列番号８を含んでよい。本開示の方法および組成物において有用な他の適切なホモクエン酸シンターゼは、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用することによって容易に同定することができる。
【００６６】
リシンアミノトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、活性が増大したまたは改善された天然に存在しないポリペプチドを含む、当技術分野で公知である、または組換えによって生成することができる。リシンアミノトランスフェラーゼ活性を有する例示的なポリペプチドは、配列番号１０に記載の配列に対して８０％〜９９％の同一性を有し得る（対応するヌクレオチド配列は配列番号９に記載されている）。例えば、リシンアミノトランスフェラーゼポリペプチドは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ由来の配列番号１０を含んでよい。本開示の方法および組成物において有用な他の適切なリシンアミノトランスフェラーゼは、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用することによって容易に同定することができる。
【００６７】
ピペリデイン６−カルボン酸デヒドロゲナーゼ（ｐｃｄ）活性を有するポリペプチドは、活性が増大したまたは改善された天然に存在しないポリペプチドを含み、当技術分野で公知である、または組換えによって生成することができる。ピペリデイン６−カルボン酸デヒドロゲナーゼ（ｐｃｄ）活性を有する例示的なポリペプチドは、配列番号１２に記載の配列に対して８０％〜９９％の同一性を有し得る（対応するヌクレオチド配列は配列番号１１に記載されている）。例えば、ピペリデイン６−カルボン酸デヒドロゲナーゼ（ｐｃｄ）ポリペプチドは、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ由来の配列番号１２を含んでよい。本開示の方法および組成物において有用な他の適切なピペリデイン６−カルボン酸デヒドロゲナーゼ（ｐｃｄ）は、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用することによって容易に同定することができる。
【００６８】
２−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ（ａａｄａｔ）活性を有するポリペプチドは、活性が増大したまたは改善された天然に存在しないポリペプチドを含み、当技術分野で公知である、または組換えによって生成することができる。２−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ（ａａｄａｔ）活性を有する例示的なポリペプチドは、配列番号１４に記載の配列に対して８０％〜９９％の同一性を有し得る（対応するヌクレオチド配列は配列番号１３に記載されている）。例えば、２−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ（ａａｄａｔ）ポリペプチドは、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来の配列番号１４を含んでよい。本開示の方法および組成物において有用な他の適切な２−アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ（ａａｄａｔ）は、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用することによって容易に同定することができる。
【００６９】
ロイシンデヒドロゲナーゼ（ｌｄｈ）活性を有するポリペプチドは、活性が増大したまたは改善された天然に存在しないポリペプチドを含み、当技術分野で公知である、または組換えによって生成することができる。ロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有する例示的なポリペプチドは、配列番号１６に記載の配列に対して８０％〜９９％の同一性を有し得る（対応するヌクレオチド配列は配列番号１５に記載されている）。例えば、ロイシンデヒドロゲナーゼポリペプチドは、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の配列番号１６を含んでよい。本開示の方法および組成物において有用な他の適切なロイシンデヒドロゲナーゼ酵素は、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用することによって容易に同定することができる。
【００７０】
リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）活性を有するポリペプチドは、活性が増大したまたは改善された天然に存在しないポリペプチドを含み、当技術分野で公知である、または組換えによって生成することができる。リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有する例示的なポリペプチドは、配列番号１８に記載の配列に対して８０％〜９９％の同一性を有し得る（対応するヌクレオチド配列は配列番号１７に記載されている）。例えば、リンゴ酸デヒドロゲナーゼポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の配列番号１８を含んでよい。本開示の方法および組成物において有用な他の適切なリンゴ酸デヒドロゲナーゼ酵素は、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用することによって容易に同定することができる。
【００７１】
ヒドロキシイソカプリル酸デヒドロゲナーゼ（ｈｄｈ）活性を有するポリペプチドは、活性が増大したまたは改善された天然に存在しないポリペプチドを含み、当技術分野で公知である、または組換えによって生成することができる。ヒドロキシイソカプリル酸デヒドロゲナーゼ活性を有する例示的なポリペプチドは、配列番号２０に記載の配列に対して８０％〜９９％の同一性を有し得る（対応するヌクレオチド配列は配列番号１９に記載されている）。例えば、ヒドロキシイソカプリル酸デヒドロゲナーゼポリペプチドは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来の配列番号２０を含んでよい。本開示の方法および組成物において有用な他の適切なヒドロキシイソカプリル酸デヒドロゲナーゼ酵素は、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用することによって容易に同定することができる。
【００７２】
膜に結合しＦＡＤを含有する２種の酵素がフマレートとスクシネートの相互変換の触媒作用に関与する；嫌気的成長にはフマル酸レダクターゼが使用され、好気的成長にはコハク酸デヒドロゲナーゼが使用される。フマル酸レダクターゼは、多数のサブユニット（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｆｒｄＡ、ｆｒｄＢ、およびｆｒｄＣ）を含む。サブユニットのうちの任意の１つを改変することにより、本明細書における所望の活性がもたらされ得る。例えば、ｆｒｄＢ、ｆｒｄＣまたはｆｒｄＢＣをノックアウトすることは本開示の方法において有用である。Ｆｒｄホモログおよび変異体は公知である。例えば、ホモログおよび変異体としては、例えば、フマル酸レダクターゼサブユニットＤ（フマル酸レダクターゼの１３ｋＤａの疎水性タンパク質）ｇｉ｜６７４６３５４３｜ｓｐ｜Ｐ０Ａ８Ｑ３．１｜ＦＲＤＤ＿ＥＣＯＬＩ（６７４６３５４３）；フマル酸レダクターゼサブユニットＣ（フマル酸レダクターゼの１５ｋＤａの疎水性タンパク質）ｇｉ｜１３４６０３７｜ｓｐ｜Ｐ２０９２３．２｜ＦＲＤＣ＿ＰＲＯＶＵ（１３４６０３７）；フマル酸レダクターゼサブユニットＤ（フマル酸レダクターゼの１３ｋＤａの疎水性タンパク質）ｇｉ｜１２０４９９｜ｓｐ｜Ｐ２０９２４．１｜ＦＲＤＤ＿ＰＲＯＶＵ（１２０４９９）；フマル酸レダクターゼサブユニットＣ（フマル酸レダクターゼの１５ｋＤａの疎水性タンパク質）ｇｉ｜６７４６３５３８｜ｓｐ｜ＰＯＡ８Ｑ０．１｜ＦＲＤＣ＿ＥＣＯＬＩ（６７４６３５３８）；フマル酸レダクターゼ鉄−硫黄サブユニット（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ｇｉ｜１４５２６４｜ｇｂ｜ＡＡＡ２３４３８．１｜（１４５２６４）；フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニット（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ｇｉ｜１４５２６３｜ｇｂ｜ＡＡＡ２３４３７．１｜（１４５２６３）；フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットｇｉ｜３７５３８２９０｜ｓｐ｜Ｐ１７４１２．３｜ＦＲＤＡ＿ＷＯＬＳＵ（３７５３８２９０）；フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットｇｉ｜１２０４８９｜ｓｐ｜Ｐ００３６３．３｜ＦＲＤＡ＿ＥＣＯＬＩ（１２０４８９）；フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットｇｉ｜１２０４９０｜ｓｐ｜Ｐ２０９２２．１｜ＦＲＤＡ＿ＰＲＯＶＵ（１２０４９０）；フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニット前駆体（フラボシトクロムｃ）（フラボシトクロムｃ３）（Ｆｃｃ３）ｇｉ｜１１９３７００８７｜ｓｐ｜Ｑ０７ＷＵ７．２｜ＦＲＤＡ＿ＳＨＥＦＮ（１１９３７００８７）；フマル酸レダクターゼ鉄−硫黄サブユニットｇｉ｜８１１７５３０８｜ｓｐ｜ＰＯＡＣ４７．２｜ＦＲＤＢ＿ＥＣＯＬＩ（８１１７５３０８）；フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニット（フラボシトクロムｃ）（フラボシトクロムｃ３）（Ｆｃｃ３）ｇｉ｜１１９３７００８８｜ｓｐ｜ＰＯＣ２７８．１｜ＦＲＤＡ＿ＳＨＥＦＲ（１１９３７００８８）；Ｆｒｄオペロンの特徴付けられていないタンパク質Ｃ  ｇｉ｜１４０６６３｜ｓｐ｜Ｐ２０９２７．１｜ＹＦＲＣ＿ＰＲＯＶＵ（１４０６６３）；ｆｒｄオペロンの推測鉄−硫黄サブユニットＡ  ｇｉ｜１４０６６１｜ｓｐ｜Ｐ２０９２５．１｜ＹＦ���Ａ＿ＰＲＯＶＵ（１４０６６１）；フマル酸（ｕｍａｒａｔｅ）レダクターゼ鉄−硫黄サブユニットｇｉ｜１２０４９３｜ｓｐ｜Ｐ２０９２１．２｜ＦＲＤＢ＿ＰＲＯＶＵ（１２０４９３）；フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットｇｉ｜２４９４６１７｜ｓｐ｜００６９１３．２｜ＦＲＤＡ＿ＨＥＬＰＹ（２４９４６１７）；フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニット前駆体（鉄（ＩＩＩ）誘導性フラボシトクロムＣ３）（Ｉｆｃ３）ｇｉ｜１３８７８４９９｜ｓｐ｜Ｑ９Ｚ４Ｐ０．１｜ＦＲＤ２＿ＳＨＥＦＮ（１３８７８４９９）；フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットｇｉ｜５４０４１００９｜ｓｐ｜Ｐ６４１７４．１｜ＦＲＤＡ＿ＭＹＣＴＵ（５４０４１００９）；フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットｇｉ｜５４０３７１３２｜ｓｐ｜Ｐ６４１７５．１｜ＦＲＤＡ＿ＭＹＣＢＯ（５４０３７１３２）；フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットｇｉ｜１２２３０１１４｜ｓｐ｜Ｑ９ＺＭＰ０．１｜ＦＲＤＡ＿ＨＥＬＰＪ（１２２３０１１４）；フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットｇｉ｜１１６９７３７｜ｓｐ｜Ｐ４４８９４．１｜ＦＲＤＡ＿ＨＡＥＩＮ（１１６９７３７）；フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニット（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）ｇｉ｜１３１６００５８｜ｅｍｂ｜ＣＡＡ０４２１４．２｜（１３１６００５８）；フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニット前駆体（フラボシトクロムｃ）（ＦＬ  ｃｙｔ）ｇｉ｜２５４５２９４７｜ｓｐ｜Ｐ８３２２３．２｜ＦＲＤＡ＿ＳＨＥＯＮ（２５４５２９４７）；フマル酸レダクターゼ鉄−硫黄サブユニット（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）ｇｉ｜２２８２０００｜ｅｍｂ｜ＣＡＡ０４２１５．１｜（２２８２０００）；およびフマル酸レダクターゼシトクロムｂサブユニット（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）ｇｉ｜２２８１９９８｜ｅｍｂ｜ＣＡＡ０４２１３．１｜（２２８１９９８）が含まれ、受託番号に関連づけられる各配列は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７３】
ヒドロキシイソカプリル酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ｈａｄＡ）活性を有するポリペプチドは、活性が増大したまたは改善された天然に存在しないポリペプチドを含む、当技術分野で公知である、または組換えによって生成することができる。ヒドロキシイソカプリル酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ活性を有する例示的なポリペプチドは、配列番号２２に記載の配列に対して８０％〜９９％の同一性を有し得る（対応するヌクレオチド配列は、配列番号２１に記載されている）。例えば、ヒドロキシイソカプリル酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼポリペプチドは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｌｅ由来の配列番号２２を含んでよい。本開示の方法および組成物において有用な他の適切なヒドロキシイソカプリル酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ酵素は、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用することによって容易に同定することができる。
【００７４】
２−ヒドロキシイソカプロイル−ＣｏＡデヒドラターゼ活性を有するポリペプチドは、活性が増大したまたは改善された天然に存在しないポリペプチドを含む、当技術分野で公知である、または組換えによって生成することができる。２−ヒドロキシイソカプロイル−ＣｏＡデヒドラターゼ活性を有する例示的なポリペプチドは、配列番号２４に記載の配列に対して８０％〜９９％の同一性を有し得（対応するヌクレオチド配列は、配列番号２３に記載されている）、配列番号２６に記載の配列に対して８０％〜９９％の同一性を有し得る（対応するヌクレオチド配列は、配列番号２５に記載されている）。例えば、２−ヒドロキシイソカプロイル−ＣｏＡデヒドラターゼポリペプチドは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｌｅ由来の配列番号２４または配列番号２６を含んでよい。本開示の方法および組成物において有用な他の適切な２−ヒドロキシイソカプロイル−ＣｏＡデヒドラターゼ酵素は、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用することによって容易に同定することができる。
【００７５】
２−ヒドロキシイソカプロイル−ＣｏＡ活性化因子ポリペプチドは、活性が増大したまたは改善された天然に存在しないポリペプチドを含む、当技術分野で公知である、または組換えによって生成することができる。２−ヒドロキシイソカプロイル−ＣｏＡデヒドラターゼ活性化活性を有する例示的なポリペプチドは、配列番号２７に記載の配列に対して８０％〜９９％の同一性を有し得る（対応するヌクレオチド配列は、配列番号２６に記載されている）。例えば、２−ヒドロキシイソカプロイル−ＣｏＡデヒドラターゼ活性化ポリペプチドは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の配列番号２７を含んでよい。本開示の方法および組成物において有用な他の適切な２−ヒドロキシイソカプロイル−ＣｏＡデヒドラターゼ活性化酵素は、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用することによって容易に同定することができる。
【００７６】
アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、活性が増大したまたは改善された天然に存在しないポリペプチドを含む、当技術分野で公知である、または組換えによって生成することができる。アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性を有する例示的なポリペプチドは、配列番号２９に記載の配列に対して８０％〜９９％の同一性を有し得る（対応するヌクレオチド配列は、配列番号２８に記載されている）。例えば、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼポリペプチドは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の配列番号２９を含んでよい。本開示の方法および組成物において有用な他の適切なアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素は、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用することによって容易に同定することができる。
【００７７】
本明細書において提供される微生物は、親の微生物では得ることができない量の代謝産物を生成するように改変されている。「代謝産物」とは、代謝により生成する任意の物質または特定の代謝プロセスに必要であるもしくはそれに関与する任意の物質を指す。代謝産物は、代謝の出発材料（例えば、グルコース、タンパク質／ペプチド、アミノ酸、アミノ酸の混合物またはピルベート）、代謝の中間体（例えば、２−ケト酸）、または代謝の最終産物（例えば、アルコール（例えば、１−プロパノール、イソブタノール、１−ブタノール、２−メチル１−ブタノール、３−メチル１−ブタノールまたは２−フェニルエタノールなど）、アセトアルデヒド、アセテート、イソブチルアルデヒド、イソ酪酸、ｎ−ブチルアルデヒド、ｎ−酪酸、２−メチル−１−ブチルアルデヒド、２−メチル−１−酪酸、３−メチル−１−ブチルアルデヒド、３−メチル−１−酪酸、アンモニア、アンモニウム、グルタミン酸、トレオニン、メチオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、２−メチル−１，４−ブタンジオール、２−メチル−１，４−ブタンジアミン、イソブテン、イタコネート、アセトイン、アセトン、イソブテン、１，５−ジアミノペンタン、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、シキミ酸、メバロネート、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、イソプレノイド、脂肪酸、ホモアラニン、４−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、アジピン酸、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸、テトラヒドロフラン、３−メチル−テトラヒドロフラン、ガンマ−ブチロラクトン、ピロリジノン、ｎ−メチルピロリドン、アスパラギン酸、リシン、カダベリン、２−ケトアジピン酸、および／またはＳ−アデノシル−メチオニン（ＳＡＭ）である有機化合物であり得る。代謝産物は、より複雑な分子を構築するために使用することができる、または、より単純なものに分解することができる。中間代謝産物は、他の代謝産物から合成することができ、おそらくより複雑な物質を作製するために使用される、またはより単純な化合物に分解され、多くの場合、化学エネルギーの放出を伴う。
【００７８】
例示的な代謝産物としては、タンパク質、ペプチド、窒素に富むバイオマテリアル、グルコース、ピルベート、１−プロパノール、イソブタノール、１−ブタノール、２−メチル１−ブタノール、３−メチル１−ブタノールまたは２−フェニルエタノール、および２−ケト酸が含まれる。図１２に示されている通り、例示的な２−ケト酸中間体としては、２−ケトブチレート、２−ケトイソバレレート、２−ケトバレレート、２−ケト３−メチルバレレート、２−ケト４−メチル−ペンタノエート、およびフェニルピルベートが含まれる。図１２に示されている例示的な２−ケト酸は、アルコール（例えば、１−プロパノール、イソブタノール、１−ブタノール、２−メチル１−ブタノール、３−メチル１−ブタノールまたは２−フェニルエタノールなど）、アセトアルデヒド、アセテート、イソブチルアルデヒド、イソ酪酸、ｎ−ブチルアルデヒド、ｎ−酪酸、２−メチル−１−ブチルアルデヒド、２−メチル−１−酪酸、３−メチル−１−ブチルアルデヒド、３−メチル−１−酪酸、アンモニア、アンモニウム、グルタミン酸、トレオニン、メチオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、２−メチル−１，４−ブタンジオール、２−メチル−１，４−ブタンジアミン、イソブテン、イタコネート、アセトイン、アセトン、イソブテン、１，５−ジアミノペンタン、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、シキミ酸、メバロネート、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、イソプレノイド、脂肪酸、ホモアラニン、４−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、アジピン酸、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸、テトラヒドロフラン、３−メチル−テトラヒドロフラン、ガンマ−ブチロラクトン、ピロリジノン、ｎ−メチルピロリドン、アスパラギン酸、リシン、カダベリン、２−ケトアジピン酸、および／またはＳ−アデノシル−メチオニン（ＳＡＭ）の生成において代謝中間体として使用することができる。例えば、Ｌｅｕオペロン（例えば、ＬｅｕＡＢＣＤ）によりコードされる２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ、ベータ−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ酵素の発現の上昇をもたらすように代謝的な工学的操作をした組換え微生物により、２−ケトブチレートから２−ケトバレレートを生成する。２−ケトバレレート代謝産物を使用して、代謝的に改変した微生物によって生成する追加的な酵素により、１−ブタノールを生成することができる。さらに、例えば、ｉｌｖＩＨＤＣ遺伝子、ｋｄｃ遺伝子およびａｄｈ遺伝子によりコードされるアセトヒドロキシ酸シンターゼ、アルファ−ケト酸デカルボキシラーゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼ酵素を発現または過剰発現するように代謝的な工学的操作をした組換え微生物により、２−ケトブチレートおよび２−ケト−３−メチル−バレレートから１−プロパノールおよび２−メチル１−ブタノールを生成することができる。さらに、代謝産物２−ケトイソバレレートは、例えば、ｉｌｖＩＨＣＤ遺伝子によりコードされるアセトヒドロキシ酸シンターゼ酵素を発現または過剰発現するように代謝的な工学的操作をした組換え微生物によって生成することができる。次いで、この代謝産物は、イソブタノールまたは３−メチル１−ブタノールの生成において使用することができる。さらに、代謝産物２−ケトイソバレレートは、アミノ酸／タンパク質分解酵素に加えて、例えば、ｉｌｖＩＨＣＤ遺伝子によりコードされるアセトヒドロキシ酸シンターゼ酵素を発現または過剰発現するように代謝的な工学的操作をした組換え微生物によって生成することができる。次いで、この代謝産物は、イソブチルアルデヒド、３−メチル−１−ブチルアルデヒド、およびバリンの生成において使用することができる。代謝産物であるピルベートおよび／またはフェニルピルベートは、例えば、ｋｄｃおよびｙｑｈＤによりコードされるアルファ−ケト酸デカルボキシラーゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼ酵素を発現または過剰発現するように代謝的な工学的操作をした組換え微生物による生成のために使用することができる。同様に、ピルベートは、２−フェニルエタノール、アセテート、アセトアルデヒド、イソブチルアルデヒド、ｎ−ブチルアルデヒド、２，３−ブタンジオール、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、芳香族物質（トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、シキミ酸）、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、メバロネート、イソプレノイド、および脂肪酸を生成するために使用することができる。
【００７９】
したがって、本明細書では、例えば、イソブタノールなどのアルコールを生成する組換え微生物が提供され、一部の態様は、アミノ酸または中間体をピルベートまたは２−ケト酸に変換する酵素に加えて、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（ｉｓｏｍｅｒｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）（例えば、ｉｌｖＣ）、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（例えば、ｉｌｖＤ）、２−ケト酸デカルボキシラーゼ（例えば、ＰＤＣ６、ＡＲＯ１０、ＴＨＩ３、ｋｉｖｄ、またはｐｄｃ）、およびアルコールデヒドロゲナーゼ（例えば、ＡＤＨ２またはＹＱＨＤ）などの標的酵素の発現の上昇を含み得る。微生物は、ピルベートの利用可能性を増大させるため、または所望の生合成経路において代謝産物について競合する酵素を減少させるため、または代謝フラックスをアミノ窒素の蓄積から放出に転換させるために、エタノールデヒドロゲナーゼ（例えば、ａｄｈＥ）遺伝子、ｌｄｈ（例えば、ｌｄｈＡ）遺伝子、ｆｒｄ（例えば、ｆｒｄＢ、ｆｒｄＣまたはｆｒｄＢＣ）遺伝子、ｆｎｒ遺伝子、ｌｅｕＡ遺伝子、ｉｌｖＥ遺伝子、ｐｏｘＢ遺伝子、ｉｌｖＡ遺伝子、ｐｆｌＢ遺伝子、またはｐｔａ遺伝子、またはそれらの任意の組み合わせ、ならびにｇｌｎＡ、ｇｄｈＡ、ｌｓｒＡ、ｌｕｘＳ、ＣＲＰ、ＬＲＰ、Ｆｉｓ、および／またはＩＨＦ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子またはホモログの発現の欠失または阻害をさらに含み得る。一部の態様では、組換え微生物は、アセト乳酸シンターゼ（例えば、ａｌｓＳ）、アセトヒドロキシ酸（ａｃｔｅｏｈｙｄｒｏｘｙ  ａｃｉｄ）イソメロレダクターゼ（例えば、ｉｌｖＣ）、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（例えば、ｉｌｖＤ）、２−ケト酸デカルボキシラーゼ（例えば、ＰＤＣ６、ＡＲＯ１０、ＴＨＩ３、ｋｉｖｄ、またはｐｄｃ）、およびアルコールデヒドロゲナーゼ（例えば、ＡＤＨ２、ＹＱＨＤ）の発現の上昇を含み得る。アルコールデヒドロゲナーゼに関して、エタノールデヒドロゲナーゼはアルコールデヒドロゲナーゼであるが、生合成経路において副生成物としてエタノールが合成されることは望ましくない。したがって、微生物におけるアルコールデヒドロゲナーゼの活性または発現の増大への言及では、エタノールデヒドロゲナーゼ活性は具体的に排除される。
【００８０】
例えば、２−メチル１−ブタノールを生成する組換え微生物も提供され、一部の態様は、アミノ酸または中間体をピルベートまたは２−ケト酸に変換する酵素に加えて、トレオニンデヒドラターゼ（例えば、ｉｌｖＡまたはｔｄｃＢ）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（例えば、ｉｌｖＩＨオペロン）、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（例えば、ｉｌｖＣ）、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（例えば、ｉｌｖＤ）、２−ケト酸デカルボキシラーゼ（例えば、ＰＤＣ６、ＡＲＯ１０、ＴＨＩ３、ｋｉｖｄ、および／またはｐｄｃ、およびアルコールデヒドロゲナーゼ（例えば、ＡＤＨ２、ＹＱＨＤ）などの標的酵素の発現の上昇を含み得る。微生物は、ピルベートの利用可能性を増大させるため、または所望の生合成経路において代謝産物について競合する酵素を減少させるため、または代謝フラックスを窒素の蓄積から放出に転換させるために、エタノールデヒドロゲナーゼ（例えば、ａｄｈＥ）遺伝子、ｌｄｈ（例えば、ｌｄｈＡ）遺伝子、ｆｒｄ（例えば、ｆｒｄＢ、ｆｒｄＣまたはｆｒｄＢＣ）遺伝子、ｆｎｒ遺伝子、ｌｅｕＡ遺伝子、ｉｌｖＥ遺伝子、ｐｏｘＢ遺伝子、ｉｌｖＡ遺伝子、ｐｆｌＢ遺伝子、またはｐｔａ遺伝子、またはそれらの任意の組み合わせ、ならびにｇｌｎＡ、ｇｄｈＡ、ｌｓｒＡ、ｌｕｘＳ、ＣＲＰ、ＬＲＰ、Ｆｉｓ、および／またはＩＨＦ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子またはホモログの発現の欠失または阻害をさらに含み得る。アルコールデヒドロゲナーゼに関して、エタノールデヒドロゲナーゼはアルコールデヒドロゲナーゼであるが、生合成経路において副生成物としてエタノールが合成されることは望ましくない。したがって、微生物におけるアルコールデヒドロゲナーゼの活性または発現の増大への言及では、エタノールデヒドロゲナーゼ活性は具体的に排除される。
【００８１】
例えば、３−メチル１−ブタノールを生成する組換え微生物も提供され、一部の態様は、アミノ酸または中間体をピルベートまたは２−ケト酸に変換する酵素に加えて、アセト乳酸シンターゼ（例えば、ａｌｓＳ）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（例えば、ｉｌｖＩＨ）、アセト乳酸シンターゼ（例えば、ｉｌｖＭＧまたはｉｌｖＮＢ、例えば、配列番号６３および配列番号６４、または配列番号６５および配列番号６６に記載のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を有するｉｌｖＮＢなど）、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（例えば、ｉｌｖＣ）、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（例えば、ｉｌｖＤ）、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（ｌｅｕＡ）、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ（例えば、ｌｅｕＣ、ＤまたはｌｅｕＣＤオペロン）、ベータ−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（例えば、ｌｅｕＢ）、２−ケト酸デカルボキシラーゼ（例えば、ｋｉｖｄ、ＰＤＣ６、またはＴＨＩ３）、およびアルコールデヒドロゲナーゼ（例えば、ＡＤＨ２、ＹＱＨＤ）などの標的酵素の発現の上昇を含み得る。微生物は、ピルベートの利用可能性を増大させるため、または所望の生合成経路において代謝産物について競合する酵素を減少させるため、または代謝フラックスを窒素の蓄積から放出に転換させるために、エタノールデヒドロゲナーゼ（例えば、ａｄｈＥ）遺伝子、ｌｄｈ（例えば、ｌｄｈＡ）遺伝子、ｆｒｄ（例えば、ｆｒｄＢ、ｆｒｄＣまたはｆｒｄＢＣ）遺伝子、ｆｎｒ遺伝子、ｌｅｕＡ遺伝子、ｉｌｖＥ遺伝子、ｐｏｘＢ遺伝子、ｉｌｖＡ遺伝子、ｐｆｌＢ遺伝子、またはｐｔａ遺伝子、またはそれらの任意の組み合わせ、ならびにｇｌｎＡ、ｇｄｈＡ、ｌｓｒＡ、ｌｕｘＳ、ＣＲＰ、ＬＲＰ、Ｆｉｓ、およびまたはＩＨＦ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子またはホモログの発現の欠失または阻害をさらに含み得る。アルコールデヒドロゲナーゼに関して、エタノールデヒドロゲナーゼはアルコールデヒドロゲナーゼであるが、生合成経路において副生成物としてエタノールが合成されることは望ましくない。したがって、微生物におけるアルコールデヒドロゲナーゼの活性または発現の増大への言及では、エタノールデヒドロゲナーゼ活性は具体的に排除される。
【００８２】
さらに、本明細書では、アセテート、アセトアルデヒド、イソブチルアルデヒド、ｎ−ブチルアルデヒド、２，３−ブタンジオール、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、芳香族物質（例えば、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、シキミ酸など）、ＰＨＢ（ポリヒドロキシブチレート）、メバロネート、イソプレノイド、脂肪酸、ＧＡＢＡ（４−アミノ酪酸）、グルタミン酸、スクシネート、リンゴ酸、アスパラギン酸（ｓｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ）、リシン、カダベリン、２−ケトアジピン酸、トレオニン、メチオニン、ＳＡＭ（Ｓ−アデノシル−メチオニン）、２−メチル−１−ブチルアルデヒド、イソロイシン、ホモアラニン、イソブチルアルデヒド、３−メチル−１−ブチルアルデヒド、バリン、３−メチル−１−ブチルアルデヒド、ロイシン、２−メチル−１−ブチルアルデヒド、イソロイシンを生成する組換え微生物が提供され、一部の態様は、アミノ酸または中間体をピルベートまたは２−ケト酸に変換する酵素に加えて、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（例えば、ｉｌｖＣ）、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（例えば、ｉｌｖＤ）、２−ケト酸デカルボキシラーゼ（例えば、ＰＤＣ６、ＡＲＯ１０、ＴＨＩ３、ｋｉｖｄ、またはｐｄｃ）、およびアルコールデヒドロゲナーゼ（例えば、ＡＤＨ２またはＹＱＨＤ）などの標的酵素の発現の上昇を含み得る。微生物は、ピルベートの利用可能性を増大させるため、または所望の生合成経路において代謝産物について競合する酵素を減少させるため、または代謝フラックスをアミノ窒素の蓄積から放出に転換させるために、エタノールデヒドロゲナーゼ（例えば、ａｄｈＥ）遺伝子、ｌｄｈ（例えば、ｌｄｈＡ）遺伝子、ｆｒｄ（例えば、ｆｒｄＢ、ｆｒｄＣまたはｆｒｄＢＣ）遺伝子、ｆｎｒ遺伝子、ｌｅｕＡ遺伝子、ｉｌｖＥ遺伝子、ｐｏｘＢ遺伝子、ｉｌｖＡ遺伝子、ｐｆ１Ｂ遺伝子、またはｐｔａ遺伝子、またはそれらの任意の組み合わせの発現の欠失または阻害、ならびに、例えば、ｇｉｎＡ、ｇｄｈＡ、ｌｓｒＡ、ｌｕｘＳ、ＣＲＰ、ＬＲＰ、Ｆｉｓ、および／またはＩＨＰからなる群から選択される遺伝子またはホモログ、またはそれらの任意の組み合わせなどのアンモニアの再取り込み、オートインデューサー−２（ＡＩ−２）の再取り込み、および／または全体的な調節に関与するポリペプチドの発現の欠失または阻害をさらに含み得る。一部の態様では、組換え微生物は、アセト乳酸シンターゼ（例えば、ａｌｓＳ）、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（例えば、ｉｌｖＣ）、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（例えば、ｉｌｖＤ）、２−ケト酸デカルボキシラーゼ（例えば、ＰＤＣ６、ＡＲＯ１０、ＴＨＩ３、ｋｉｖｄ、またはｐｄｃ）、およびアルコールデヒドロゲナーゼ（例えば、ＡＤＨ２、ＹＱＨＤ）の発現の上昇を含み得る。アルコールデヒドロゲナーゼに関して、エタノールデヒドロゲナーゼはアルコールデヒドロゲナーゼであるが、生合成経路において副生成物としてエタノールが合成されることは望ましくない。したがって、微生物におけるアルコールデヒドロゲナーゼの活性または発現の増大への言及では、エタノールデヒドロゲナーゼ活性は具体的に排除される。
【００８３】
さらに別の実施形態では、トレオニンデヒドラターゼ（例えば、ｉｌｖＡまたはｔｄｃＢ）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（例えば、ｉｌｖＩＨオペロン）、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（例えば、ｉｌｖＣ）、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（例えば、ｉｌｖＤ）、２−ケト酸デカルボキシラーゼ（例えば、ＰＤＣ６、ＡＲＯ１０、ＴＨＩ３、ｋｉｖｄ、および／またはｐｄｃ、およびアルコールデヒドロゲナーゼ（例えば、ＡＤＨ２、ＹＱＨＤ）などの標的酵素の発現の上昇も存在し得る。微生物は、ピルベートの利用可能性を増大させるため、または所望の生合成経路において代謝産物について競合する酵素を減少させるため、または代謝フラックスを窒素の蓄積から放出に転換させるために、エタノールデヒドロゲナーゼ（例えば、ａｄｈＥ）遺伝子、ｌｄｈ（例えば、ｌｄｈＡ）遺伝子、ｆｒｄ（例えば、ｆｒｄＢ、ｆｒｄＣまたはｆｒｄＢＣ）遺伝子、ｆｎｒ遺伝子、ｌｅｕＡ遺伝子、ｉｌｖＥ遺伝子、ｐｏｘＢ遺伝子、ｉｌｖＡ遺伝子、ｐｆｌＢ遺伝子、またはｐｔａ遺伝子、またはそれらの任意の組み合わせの発現の欠失または阻害、ならびに、例えば、ｇｌｎＡ、ｇｄｈＡ、ｌｓｒＡ、ｌｕｘＳ  ＣＲＰ、ＬＲＰ、Ｆｉｓ、および／またはＩＨＰ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子またはホモログなどのアンモニアの再取り込み、クオラムセンシング、例えば、オートインデューサー−２（ＡＩ−２）の再取り込みなど、および／または全体的な調節に関与するポリペプチドの発現の欠失または阻害をさらに含有し得る。アルコールデヒドロゲナーゼに関して、エタノールデヒドロゲナーゼはアルコールデヒドロゲナーゼであるが、生合成経路において副生成物としてエタノールが合成されることは望ましくない。したがって、微生物におけるアルコールデヒドロゲナーゼの活性または発現の増大への言及では、エタノールデヒドロゲナーゼ活性は具体的に排除される。
【００８４】
さらに別の実施形態では、アセト乳酸シンターゼ（例えば、ａｌｓＳ）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（例えば、ｉｌｖＩＨ）、アセト乳酸シンターゼ（例えば、ｉｌｖＭＧまたはｉｌｖＮＢ）、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（例えば、ｉｌｖＣ）、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（例えば、ｉｌｖＤ）、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（ｌｅｕＡ）、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ（例えば、ｌｅｕＣ、ＤまたはｌｅｕＣＤオペロン）、ベータ−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（例えば、ｌｅｕＢ）、２−ケト酸デカルボキシラーゼ（例えば、ｋｉｖｄ、ＰＤＣ６、またはＴＨＩ３）、およびアルコールデヒドロゲナーゼ（例えば、ＡＤＨ２、ＹＱＨＤ）などの標的酵素の発現の上昇が存在し得る。微生物は、ピルベートの利用可能性を増大させるため、または所望の生合成経路において代謝産物について競合する酵素を減少させるため、または代謝フラックスを窒素の蓄積から放出に転換させるために、エタノールデヒドロゲナーゼ（例えば、ａｄｈＥ）遺伝子、ｌｄｈ（例えば、ｌｄｈＡ）遺伝子、ｆｒｄ（例えば、ｆｒｄＢ、ｆｒｄＣまたはｆｒｄＢＣ）遺伝子、ｆｎｒ遺伝子、ｌｅｕＡ遺伝子、ｉｌｖＥ遺伝子、ｐｏｘＢ遺伝子、ｉｌｖＡ遺伝子、ｐｆｌＢ遺伝子、またはｐｔａ遺伝子、またはそれらの任意の組み合わせの発現の欠失または阻害、ならびに、例えば、ｇｌｎＡ、ｇｄｈＡ、ｌｓｒＡ、ｌｕｘＳ  ＣＲＰ、ＬＲＰ、Ｆｉｓ、および／またはＩＨＰ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子またはホモログなどのアンモニアの再取り込み、クオラムセンシング、例えば、オートインデューサー−２（ＡＩ−２）の再取り込みなど、および／または全体的な調節に関与するポリペプチドの発現の欠失または阻害をさらに含み得る。アルコールデヒドロゲナーゼに関して、エタノールデヒドロゲナーゼはアルコールデヒドロゲナーゼであるが、生合成経路において副生成物としてエタノールが合成されることは望ましくない。したがって、微生物におけるアルコールデヒドロゲナーゼの活性または発現の増大への言及では、エタノールデヒドロゲナーゼ活性は具体的に排除される。
【００８５】
上記の通り、本開示全体を通して記載されている標的酵素により、一般に代謝産物を生成する。例えば、酵素２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（ｌｅｕＡ）、ベータ−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｌｅｕＢ）、およびイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ（ｌｅｕＣ、ｌｅｕＤまたはｌｅｕＣＤオペロン）により、２−ケトブチレートを含む基質から２−ケトバレレートが生成し得る。さらに、本開示全体にわたって記載されている標的酵素は、ポリヌクレオチドによりコードされる。例えば、トレオニンデヒドラターゼは、ｉｌｖＡ遺伝子に由来するポリヌクレオチドによりコードされ得る。アセトヒドロキシ酸シンターゼは、ｉｌｖＩＨオペロンに由来するポリヌクレオチドによりコードされ得る。アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼは、ｉｌｖＣ遺伝子に由来するポリヌクレオチドによりコードされ得る。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼは、ｉｌｖＤ遺伝子に由来するポリヌクレオチドによりコードされ得る。２−ケト酸デカルボキシラーゼは、ＰＤＣ６遺伝子、ＡＲＯ１０遺伝子、ＴＨＩ３遺伝子、ｋｉｖｄ遺伝子、および／またはｐｄｃ遺伝子に由来するポリヌクレオチドによりコードされ得る。アルコールデヒドロゲナーゼは、ＡＤＨ２またはＹＱＨＤ遺伝子に由来するポリヌクレオチドによりコードされ得る。追加的な酵素および例示的な遺伝子は、本文書全体にわたって記載されている。種々のポリペプチドおよびポリヌクレオチドのホモログは、適切な酵素をコードする適切なポリヌクレオチドをもたらす任意の生物学的供給源に由来してよい。ホモログは、例えば、種々のデータベースを参照することによって同定することができる。
【００８６】
本開示は、本開示の方法、組成物および生物において有用な特定の遺伝子を同定するが、そのような遺伝子との絶対的な同一性は必要ないことが認識されよう。例えば、ポリペプチドまたは酵素をコードする配列を含む特定の遺伝子またはポリヌクレオチドの変化を行い、活性についてスクリーニングすることができる。一般には、そのような変化は、保存された突然変異およびサイレント突然変異を含む。そのような改変または突然変異したポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、機能酵素活性の発現について当技術分野で公知の方法を用いてスクリーニングすることができる。
【００８７】
遺伝暗号の固有の縮退に起因して、実質的に同じものをコードする他のポリヌクレオチドまたは機能的に等しいポリペプチドも、そのような酵素をコードするポリヌクレオチドをクローニングし、それを発現させるために使用することができる。
【００８８】
当業者には理解される通り、コード配列を、特定の宿主におけるその発現が増強されるように改変することが有利であり得る。遺伝暗号は、６４種の可能性のあるコドンを伴い余剰であるが、大多数の生物は、一般には、これらのコドンのサブセットを使用する。ある種において最も多く利用されるコドンは、最適コドンと称され、それほど利用されないコドンは、めったに使用されないコドンまたは低使用コドンに分類される。コドンは、宿主の好ましいコドンの使用を反映するように置換することができ、プロセスは、時には「コドン最適化」または「種によるコドンの偏りの制御」と称される。
【００８９】
例えば、翻訳の速度を増大させるため、または、最適化されていない配列から生成した転写物と比較して長い半減期などの望ましい特性を有する組換えＲＮＡ転写物を生成するために、特定の原核生物宿主または真核生物宿主に好まれるコドンを含有する最適化されたコード配列（Ｍｕｒｒａｙら（１９８９年）Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １７巻：４７７〜５０８頁も参照されたい）を調製することができる。翻訳終止コドンも、宿主による優先度を反映するように改変することができる。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび哺乳動物の典型的な終止コドンは、それぞれＵＡＡおよびＵＧＡである。単子葉植物の典型的な終止コドンはＵＧＡであり、一方、昆虫およびＥ．ｃｏｌｉは、一般に、ＵＡＡを終止コドンとして使用する（Ｄａｌｐｈｉｎら（１９９６年）Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２４巻：２１６〜２１８頁）。植物において発現させるためのヌクレオチド配列を最適化するための方法体系は、例えば、米国特許第６，０１５，８９１号、およびそこに引用されている参考文献において提供される。
【００９０】
当業者には、遺伝暗号の縮退性に起因して、ヌクレオチド配列が異なる種々のＤＮＡ化合物が、本開示の所与の酵素をコードするために使用され得ることが理解されよう。上記の生合成酵素をコードするネイティブなＤＮＡ配列は、ただ単に本開示の実施形態を例示するために本明細書において参照されており、本開示は、本開示の方法において利用される酵素のポリペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列をコードする任意の配列のＤＮＡ化合物を含む。同様に、ポリペプチドは、一般には、所望の活性を損失または著しく損失することなく、そのアミノ酸配列において１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、および挿入を許容し得る。本開示は、改変または変異体ポリペプチドが参照ポリペプチドの酵素的な同化活性または異化活性を有する限りは、本明細書に記載の特定のタンパク質と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。さらに、本明細書において示されているＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列は、ただ単に本開示の複数の実施形態を例示するものである。
【００９１】
さらに、代謝産物（例えば、ケトチオラーゼ、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、クロトニルＣｏＡレダクターゼ、ブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ））を発生させるために有用な酵素のホモログが本明細書において提供される微生物および方法に包含される。第１のファミリーまたは種の元の酵素または遺伝子に関して使用される「ホモログ」という用語は、別個の、第２のファミリーまたは種の酵素または遺伝子を指し、これは、第１のファミリーまたは種の元の酵素または遺伝子に対応する第２のファミリーまたは種の酵素または遺伝子であることが、機能解析、構造解析またはゲノム解析によって決定される。ほとんどの場合、ホモログは機能的、構造的またはゲノムの類似性を有する。酵素または遺伝子のホモログを、遺伝子プローブおよびＰＣＲを用いて容易にクローニングすることができる技法が公知である。ホモログとしてクローニングされた配列の同一性は、機能アッセイを用いて、かつ／または遺伝子のゲノムマッピングによって確認することができる。
【００９２】
タンパク質は、そのタンパク質をコードする核酸配列が第２のタンパク質をコードする核酸配列と類似した配列を有する場合、第２のタンパク質との「相同性」を有する、またはそれと「相同」である。あるいは、タンパク質は、２つのタンパク質が「類似した」アミノ酸配列を有する場合、第２のタンパク質との相同性を有する。（したがって、「相同タンパク質」という用語は、２つのタンパク質が類似したアミノ酸配列を有することを意味すると定義される）。
【００９３】
本明細書で使用される場合、２つのタンパク質（またはタンパク質のある領域）は、アミノ酸配列が少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する場合、実質的に相同である。２つのアミノ酸配列の％同一性、または２つの核酸配列の％同一性を決定するために、配列を最適に比較する目的でアラインメントする（例えば、比較する目的で、最適なアラインメントのために、第１のアミノ酸配列または核酸配列および第２のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、また、非相同配列を無視することができる）。一実施形態では、比較する目的でアラインメントされた参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、一般には、少なくとも４０％、より一般には、少なくとも５０％、さらに一般には、少なくとも６０％、およびさらに一般には、少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次に、対応するアミノ酸位またはヌクレオチド位のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列のある位置が第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、それらの分子はその位置において同一である（本明細書で使用される場合、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と等しい）。２つの配列間の％同一性は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮に入れた、それらの配列が共有する同一の位置の数の関数である。例えば、ｋｉｖｄ遺伝子への言及は、実質的に類似した酵素活性を有する酵素をコードする、他の生物由来のホモログ（例えば、ｐｄｃ６、ａｒｏ１０、ｔｈＩ３、ｐｄｃ、ｋｄｃＡ、ｐｄｃ１、ｐｄｃ５）、ならびに言及されている遺伝子に対して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有する遺伝子および言及されている遺伝子と実質的に類似した酵素活性を有する酵素をコードする遺伝子を含む。例えば、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓのピルビン酸デカルボキシラーゼはＫｉｖｄに対してアミノ酸レベルで３７％の同一性を有し、ｋｉｖｄおよびｔｈＩ３は核酸レベルで３２％同一であり、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅのアルコールデヒドロゲナーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＤＨ２に対してアミノ酸配列レベルで５２％の同一性を有し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ａｄｈ２およびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ａｄｈは４９％同一であり、ＫＩＶＤ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ（配列番号３１および３２））とＰＤＣ６（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（配列番号３３および３４））は、３６％の同一性を共有し（類似度（Ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）＝３２２／５６２（５７％）、ギャップ（Ｇａｐｓ）＝２４／５６２（４％））、ＫＩＶＤ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓとＴＨＩ３（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉ���ｉａｅ）は３２％の同一性を共有し（類似度（Ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）＝３０７／５７１（５３％）、ギャップ（Ｇａｐｓ）＝３５／５７１（６％））、ｋｉｖｄ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）とＡＲＯ１０（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（配列番号３５および配列番号３６））は３０％の同一性を共有し（類似度（Ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）＝２９６／５９８（４９％）、ギャップ（Ｇａｐｓ）＝６５／５９８（１０％））、ＡＲＯ１０（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）とＰＤＣ６（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は３４％の同一性を共有し（類似度（Ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）＝３２０／６１６（５１％）、ギャップ（Ｇａｐｓ）＝６１／６１６（９％））ＡＲＯ１０（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）とＴＨＩ３（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（配列番号３７および配列番号３８））は３０％の同一性を共有し（類似度（Ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）＝３０４／５９９（５０％）、ギャップ（Ｇａｐｓ）＝４８／５９９（８％））、ＡＲＯ１０（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）とピルビン酸デカルボキシラーゼ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  ８２４）は３０％の同一性を共有し（類似度（Ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）＝２９１／６１３（４７％）、ギャップ（Ｇａｐｓ）＝７３／６１３（１１％））、ＰＤＣ６（（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）とＴＨＩ３（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は５０％の同一性を共有し（類似度（Ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）＝４０２／５６１（７１％）、ギャップ（Ｇａｐｓ）＝１７／５６１（３％））、ＰＤＣ６（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）とピルビン酸デカルボキシラーゼ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  ８２４（配列番号３９および配列番号４０））は３８％の同一性を共有し（類似度（Ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）＝３２８／５７０（５７％）、ギャップ（Ｇａｐｓ）＝３０／５７０（５％））、ＴＨＩ３（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）とピルビン酸デカルボキシラーゼ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  ８２４）は３５％の同一性を共有する（類似度（Ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）＝２８４／５２１（５４％）、ギャップ（Ｇａｐｓ）＝２５／５２１（４％））。本明細書において列挙されている遺伝子およびポリペプチド／酵素のそれぞれの配列は、ワールドワイドウェブ上で利用可能なデータベースを使用して容易に同定することができる（例えば、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｋｏｒｅａ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにより維持されているＥ．ｃｏｌｉ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅを参照されたい。さらに、アミノ酸配列および核酸配列は、同一性について、当技術分野で周知の一般に使用されるアルゴリズムを使用して容易に比較することができる。
【００９４】
タンパク質またはペプチドへの言及において「相同」が使用される場合、同一ではない残基の位置は、多くの場合、保存的アミノ酸置換により異なることが理解される。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が同様の化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を持つ側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基で置換されたものである。一般に、保存的アミノ酸置換では、タンパク質の機能的性質は実質的に変化しない。２つ以上のアミノ酸配列が、保存的置換により互いに異なる場合では、％配列同一性または相同性の程度を上向きに調整して置換の保存的性質を補正することができる。この調整を行う手段は当業者に周知である（例えば、これにより、参照により本明細書に組み込まれるＰｅａｒｓｏｎら（１９９４年）、Ｍｅｔｈ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２５巻：３６５〜３８９頁を参照されたい）。
【００９５】
以下の６群はそれぞれ、互いに保存された置換であるアミノ酸を含有する：１）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００９６】
ポリペプチドの配列相同性は、％配列同一性とも称され、一般には、配列解析ソフトウェアを使用して測定される。例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ、９１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．５３７０５を参照されたい。タンパク質解析ソフトウェアでは、保存的アミノ酸置換を含む種々の置換、欠失および他の修飾に割り当てられた相同性の測定を用いて同様の配列をマッチさせる。例えば、ＧＣＧは、異なる種の生物由来の相同なポリペプチドまたは野生型タンパク質とその突然変異タンパク質の間の相同なポリペプチドなどの、密接に関連するポリペプチド間の配列相同性または配列同一性を決定するために初期状態のパラメータを用いて使用することができる「Ｇａｐ」および「Ｂｅｓｔｆｉｔ」などのプログラムを含有する。例えばＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１を参照されたい。
【００９７】
分子配列を、異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと比較するために使用する典型的なアルゴリズムはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５巻：４０３〜４４１頁；Ｇｉｓｈ（１９９３年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ３巻：２６６〜２７２頁；Ｍａｄｄｅｎ（１９９６年）Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２６６巻：１３１〜１４１頁；Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９７年）Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５巻：３３８９〜３４０２頁；Ｚｈａｎｇ（１９９７年）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ７巻：６４９〜６５６頁）、特にｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９７年）Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５巻：３３８９〜３４０２頁）である。ＢＬＡＳＴｐの典型的なパラメータは、期待値（Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅ）：１０（初期値）；フィルター（Ｆｉｌｔｅｒ）：ｓｅｇ（初期値）；ギャップを入れるためのコスト（Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ａ  ｇａｐ）：１１（初期値）；ギャップを延長するためのコスト（Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ａ  ｇａｐ）：１（初期値）；最大アラインメント（Ｍａｘ．ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ）：１００（初期値）；ワードサイズ（Ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ）：１１（初期値）；記述数（Ｎｏ．ｏｆ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）：１００（初期値）；ペナルティマトリックス（Ｐｅｎａｌｔｙ  Ｍａｔｒｉｘ）：ＢＬＯＷＳＵＭ６２である。
【００９８】
表３および本開示は、当業者が利用可能なポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を有する遺伝子および各遺伝子のホモログの非限定的な例を提供する。
【００９９】
【表３−１】
2013544516.tif 000007
【０１００】
【表３−２】
2013544516.tif 000008
本開示は、本明細書に記載の組換え微生物の作製において有用な種々の遺伝子、ホモログおよび変異体の受託番号を提供する。本明細書に記載のホモログおよび変異体は、例示的なものであり、限定するものではないことが理解されるべきである。当業者は、例えば、ワールドワイドウェブ上で利用可能なＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）を含む種々のデータベースを使用して、追加的なホモログ、変異体および配列を利用可能である。
【０１０１】
エタノールデヒドロゲナーゼ（アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼとも称される）は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてａｄｈＥによりコードされる。ａｄｈＥは、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）活性；アセトアルデヒド／アセチルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤＨ）活性；ピルビン酸−ギ酸−リアーゼデアクチバーゼ（ｄｅａｃｔｉｖａｓｅ）（ＰＦＬデアクチバーゼ）活性の３つの活性を含み、ＰＦＬデアクチバーゼ活性は、鉄、ＮＡＤ、およびＣｏＡ依存性反応におけるピルビン酸−ギ酸−リアーゼ触媒の消失を触媒する。ホモログは、当技術分野で公知である（例えば、アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｐｏｌｙｔｏｍｅｌｌａ  ｓｐ．ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ１９８．８０）ｇｉ｜４０６４４９１０｜ｅｍｂ｜ＣＡＤ４２６５３．２｜（４０６４４９１０）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ａ  ｓｔｒ．ＡＴＣＣ  ３５０２）ｇｉ｜１４８３７８３４８｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１２５２８８９．１｜（１４８３７８３４８）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ＣＯ９２）ｇｉ｜１６１２２４１０｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿４０５７２３．１｜（１６１２２４１０）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＩＰ  ３２９５３）ｇｉ｜５１５９６４２９｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿０７０６２０．１｜（５１５９６４２９）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ＣＯ９２）ｇｉ｜１１５３４７８８９｜ｅｍｂ｜ＣＡＬ２０８１０．１｜（１１５３４７８８９）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＩＰ  ３２９５３）ｇｉ｜５１５８９７１１｜ｅｍｂ｜ＣＡＨ２１３４１．１｜（５１５８９７１１）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＣＦＴ０７３）ｇｉ｜２６１０７９７２｜ｇｂ｜ＡＡＮ８０１７２．１｜ＡＥ０１６７６０＿３１（２６１０７９７２）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ｂｉｏｖａｒ  Ｍｉｃｒｏｔｕｓ  ｓｔｒ．９１００１）ｇｉ｜４５４４１７７７｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿９９３３１６．１｜（４５４４１７７７）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ｂｉｏｖａｒ  Ｍｉｃｒｏｔｕｓ  ｓｔｒ．９１００１）ｇｉ｜４５４３６６３９｜ｇｂ｜ＡＡＳ６２１９３．１｜（４５４３６６３９）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  ＡＴＣＣ１３１２４）ｇｉ｜１１０７９８５７４｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿６９７２１９．１｜（１１０７９８５７４）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ  ＭＲ−１）ｇｉ｜２４３７３６９６｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿７１７７３９．１｜（２４３７３６９６）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ａ  ｓｔｒ．ＡＴＣＣ  １９３９７）ｇｉ｜１５３９３２４４５｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１３８２７４７．１｜（１５３９３２４４５）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ｂｉｏｖａｒ  Ａｎｔｉｑｕａ  ｓｔｒ．Ｅ１９７９００１）ｇｉ｜１６５９９１８３３｜ｇｂ｜ＥＤＲ４４１３４．１｜（１６５９９１８３３）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ａ  ｓｔｒ．Ｈａｌｌ）ｇｉ｜１５３９３７５３０｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１３８６２９８．１｜（１５３９３７５３０）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  ＡＴＣＣ１３１２４）ｇｉ｜１１０６７３２２１｜ｇｂ｜ＡＢＧ８２２０８．１｜（１１０６７３２２１）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ａ  ｓｔｒ．Ｈａｌｌ）ｇｉ｜１５２９３３４４４｜ｇｂ｜ＡＢＳ３８９４３．１｜（１５２９３３４４４）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ｂｉｏｖａｒ  Ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ  ｓｔｒ．Ｆ１９９１０１６）ｇｉ｜１６５９２０６４０｜ｇｂ｜ＥＤＲ３７８８８．１｜（１６５９２０６４０）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ｂｉｏｖａｒ  Ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ  ｓｔｒ．ＩＰ２７５）ｇｉ｜１６５９１３９３３｜ｇｂ｜ＥＤＲ３２５５１．１｜（１６５９１３９３３）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  Ａｎｇｏｌａ）ｇｉ｜１６２４１９１１６｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６０６６１７．１｜（１６２４１９１１６）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｆ  ｓｔｒ．Ｌａｎｇｅｌａｎｄ）ｇｉ｜１５３９４０８３０｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１３８９７１２．１｜（１５３９４０８３０）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＳ）ｇｉ｜１５７１６０７４６｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１４５８０６４．１｜（１５７１６０７４６）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｅ２４３７７Ａ）ｇｉ｜１５７１５５６７９｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１４６２４９１．１｜（１５７１５５６７９）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ  ８０８１）ｇｉ｜１２３４４２４９４｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１００６４７２．１｜（１２３４４２４９４）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＪＡ−３−３Ａｂ）ｇｉ｜８６６０５１９１｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿４７３９５４．１｜（８６６０５１９１）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｓｔｒ．４ｂ  Ｆ２３６５）ｇｉ｜４６９０７８６４｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿０１４２５３．１｜（４６９０７８６４）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  Ｖ５８３）ｇｉ｜２９３７５４８４｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿８１４６３８．１｜（２９３７５４８４）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ  ２６０３Ｖ／Ｒ）ｇｉ｜２２５３６２３８｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿６８７０８９．１｜（２２５３６２３８）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ａ  ｓｔｒ．ＡＴＣＣ  １９３９７）ｇｉ｜１５２９２８４８９｜ｇｂ｜ＡＢＳ３３９８９．１｜（１５２９２８４８９）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｅ２４３７７Ａ）ｇｉ｜１５７０７７７０９｜ｇｂ｜ＡＢＶ１７４１７．１｜（１５７０７７７０９）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＳ）ｇｉ｜１５７０６６４２６｜ｇｂ｜ＡＢＶ０５６８１．１｜（１５７０６６４２６）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｆ  ｓｔｒ．Ｌａｎｇｅｌａｎｄ）ｇｉ｜１５２９３６７２６｜ｇｂ｜ＡＢＳ４２２２４．１｜（１５２９３６７２６）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ＣＡ８８−４１２５）ｇｉ｜１４９２９２３１２｜ｇｂ｜ＥＤＭ４２３８６．１｜（１４９２９２３１２）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ  ８０８１）ｇｉ｜１２２０８９４５５｜ｅｍｂ｜ＣＡＬ１２３０３．１｜（１２２０８９４５５）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）ｇｉ｜９２０８４８４０｜ｅｍｂ｜ＣＡＦ０４１２８．１｜（９２０８４８４０）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＪＡ−３−３Ａｂ）ｇｉ｜８６５５３７３３｜ｇｂ｜ＡＢＣ９８６９１．１｜（８６５５３７３３）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ  ＭＲ−１）ｇｉ｜２４３４８０５６｜ｇｂ｜ＡＡＮ５５１８３．１｜ＡＥ０１５６５５＿９（２４３４８０５６）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  Ｖ５８３）ｇｉ｜２９３４２９４４｜ｇｂ｜ＡＡＯ８０７０８．１｜（２９３４２９４４）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｓｔｒ．４ｂ  Ｆ２３６５）ｇｉ｜４６８８１１３３｜ｇｂ｜ＡＡＴ０４４３０．１｜（４６８８１１３３）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｓｔｒ．１／２ａ  Ｆ６８５４）ｇｉ｜４７０９７５８７｜ｒｅｆ｜ＺＰ＿００２３５１１５．１｜（４７０９７５８７）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｓｔｒ．４ｂ  Ｈ７８５８）ｇｉ｜４７０９４２６５｜ｒｅｆ｜ＺＰ＿００２３１９７３．１｜（４７０９４２６５）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｓｔｒ．４ｂ  Ｈ７８５８）ｇｉ｜４７０１７３５５｜ｇｂ｜ＥＡＬ０８１８０．１｜（４７０１７３５５）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｓｔｒ．１／２ａ  Ｆ６８５４）ｇｉ｜４７０１４０３４｜ｇｂ｜ＥＡＬ０５０３９．１｜（４７０１４０３４）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ  ２６０３Ｖ／Ｒ）ｇｉ｜２２５３３０５８｜ｇｂ｜ＡＡＭ９８９６１．１｜ＡＥ０１４１９４＿６（２２５３３０５８）ｐ；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ｂｉｏｖａｒ  Ａｎｔｉｑｕａ  ｓｔｒ．Ｅ１９７９００１）ｇｉ｜１６６００９２７８｜ｒｅｆ｜ＺＰ＿０２２３０１７６．１｜（１６６００９２７８）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ｂｉｏｖａｒ  Ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ  ｓｔｒ．ＩＰ２７５）ｇｉ｜１６５９３８２７２｜ｒｅｆ｜ＺＰ＿０２２２６８３１．１｜（１６５９３８２７２）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ｂｉｏｖａｒ  Ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ  ｓｔｒ．Ｆ１９９１０１６）ｇｉ｜１６５９２７３７４｜ｒｅｆ｜ＺＰ＿０２２２３２０６．１｜（１６５９２７３７４）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  Ａｎｇｏｌａ）ｇｉ｜１６２３５１９３１｜ｇｂ｜ＡＢＸ８５８７９．１｜（１６２３５１９３１）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＩＰ  ３１７５８）ｇｉ｜１５３９４９３６６｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１４００９３８．１｜（１５３９４９３６６）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＩＰ  ３１７５８）ｇｉ｜１５２９６０８６１｜ｇｂ｜ＡＢＳ４８３２２．１｜（１５２９６０８６１）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ＣＡ８８−４１２５）ｇｉ｜１４９３６５８９９｜ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１８８７９３４．１｜（１４９３６５８９９）；アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化）（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＣＦＴ０７３）ｇｉ｜２６２４７５７０｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿７５３６１０．１｜（２６２４７５７０）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（アルコールデヒドロゲナーゼ；アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチ
ル化）（ＥＣ１．２．１．１０）（ａｃｄｈ）；ピルビン酸−ギ酸−リアーゼデアクチバーゼ（ｐｆｌデアクチバーゼ）を含む）（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ａ  ｓｔｒ．ＡＴＣＣ  ３５０２）ｇｉ｜１４８２８７８３２｜ｅｍｂ｜ＣＡＬ８１８９８．１｜（１４８２８７８３２）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）；アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化）（ＡＣＤＨ）；ピルビン酸−ギ酸−リアーゼデアクチバーゼ（ＰＦＬデアクチバーゼ）を含む）ｇｉ｜７１１５２９８０｜ｓｐ｜Ｐ０Ａ９Ｑ７．２｜ＡＤＨＥ＿ＥＣＯＬＩ（７１１５２９８０）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（アルコールデヒドロゲナーゼおよびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、およびピルビン酸−ギ酸−リアーゼデアクチバーゼを含む（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ  ｓｕｂｓｐ．ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃａ  ＳＣＲＩ１０４３）ｇｉ｜５０１２１２５４｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿０５０４２１．１｜（５０１２１２５４）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（アルコールデヒドロゲナーゼおよびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、およびピルビン酸−ギ酸−リアーゼデアクチバーゼを含む（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ  ｓｕｂｓｐ．ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃａ  ＳＣＲＩ１０４３）ｇｉ｜４９６１１７８０｜ｅｍｂ｜ＣＡＧ７５２２９．１｜（４９６１１７８０）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）；アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化）（ＡＣＤＨ）を含む）ｇｉ｜１９８５８６２０｜ｓｐ｜Ｐ３３７４４．３｜ＡＤＨＥ＿ＣＬＯＡＢ（１９８５８６２０）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）；アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化）（ＡＣＤＨ）；ピルビン酸−ギ酸−リアーゼデアクチバーゼ（ＰＦＬデアクチバーゼ）を含む）ｇｉ｜７１１５２６８３｜ｓｐ｜Ｐ０Ａ９Ｑ８．２｜ＡＤＨＥ＿ＥＣＯ５７（７１１５２６８３）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（アルコールデヒドロゲナーゼ；アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化）；ピルビン酸−ギ酸−リアーゼデアクチバーゼを含む（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ６３０）ｇｉ｜１２６６９７９０６｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１０８６８０３．１｜（１２６６９７９０６）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（アルコールデヒドロゲナーゼ；アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化）；ピルビン酸−ギ酸−リアーゼデアクチバーゼを含む（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ６３０）ｇｉ｜１１５２４９３４３｜ｅｍｂ｜ＣＡＪ６７１５６．１｜（１１５２４９３４３）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）およびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化）（ＡＣＤＨ）；ピルビン酸−ギ酸−リアーゼデアクチバーゼ（ＰＦＬデアクチバーゼ）を含む）（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｕｍｏｎｄｉｉ  ＴＴＯ１）ｇｉ｜３７５２６３８８｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿９２９７３２．１｜（３７５２��３８８）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ２（アルコールデヒドロゲナーゼ；アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ）を含む（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ｓｔｒ．Ｍａｎｆｒｅｄｏ）ｇｉ｜１３４２７１１６９｜ｅｍｂ｜ＣＡＭ２９３８１．１｜（１３４２７１１６９）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）およびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化）（ＡＣＤＨ）；ピルビン酸−ギ酸−リアーゼデアクチバーゼ（ＰＦＬデアクチバーゼ）を含む）（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｕｍｏｎｄｉｉ  ＴＴＯ１）ｇｉ｜３６７８５８１９｜ｅｍｂ｜ＣＡＥ１４８７０．１｜（３６７８５８１９）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（アルコールデヒドロゲナーゼおよびピルビン酸−ギ酸−リアーゼデアクチバーゼを含む（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ６３０）ｇｉ｜１２６７００５８６｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１０８９４８３．１｜（１２６７００５８６）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（アルコールデヒドロゲナーゼおよびピルビン酸−ギ酸−リアーゼデアクチバーゼを含む（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ６３０）ｇｉ｜１１５２５２０２３｜ｅｍｂ｜ＣＡＪ６９８５９．１｜（１１５２５２０２３）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ２（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ｓｔｒ．Ｍａｎｆｒｅｄｏ）ｇｉ｜１３９４７２９２３｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１２７６３８．１｜（１３９４７２９２３）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼＥ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  ｓｔｒ．１３）ｇｉ｜１８３１１５１３｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿５６３４４７．１｜（１８３１１５１３）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼＥ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  ｓｔｒ．１３）ｇｉ｜１８１４６１９７｜ｄｂｊ｜ＢＡＢ８２２３７．１｜（１８１４６１９７）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ、ＡＤＨＥ１（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  ８２４）ｇｉ｜１５００４７３９｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿１４９１９９．１｜（１５００４７３９）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ、ＡＤＨＥ１（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  ８２４）ｇｉ｜１４９９４３５１｜ｇｂ｜ＡＡＫ７６７８１．１｜ＡＥ００１４３８＿３４（１４９９４３５１）；アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ２（アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）；アセトアルデヒド／アセチル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤＨ）を含む）ｇｉ｜２４９２７３７｜ｓｐ｜Ｑ２４８０３．１｜ＡＤＨ２＿ＥＮＴＨＩ（２４９２７３７）；アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉ  ｓｔｒ．ＣＴ１８）ｇｉ｜１６７６０１３４｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿４５５７５１．１｜（１６７６０１３４）；およびアルコールデヒドロゲナーゼ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉ）ｇ��｜１６５０２４２８｜ｅｍｂ｜ＣＡＤ０８３８４．１｜（１６５０２４２８））参照されたい。受託番号に関連づけられる各配列は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０２】
乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼおよび発酵性デヒドロゲナーゼ（ｆｅｒｍｅｎｔｉｖｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｎａｓｅ）とも称される）は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてｌｄｈＡによりコードされ、ピルベートからＤ−乳酸へのＮＡＤＨ依存性変換を触媒する。ｌｄｈＡのホモログおよび変異体は公知である。実際には、ＮＣＢＩを通じて入手可能な細菌の乳酸デヒドロゲナーゼは現在のところ１６６４種存在する。例えば、そのようなホモログおよび変異体としては、例えば、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｄ−ＬＤＨ）（発酵性乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）ｇｉ｜１７３０１０２｜ｓｐ｜Ｐ５２６４３．１｜ＬＤＨＤ＿ＥＣＯＬＩ（１７３０１０２）；Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼｇｉ｜１０４９２６５｜ｇｂ｜ＡＡＢ５１７７２．１｜（１０４９２６５）；Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＰＥＣ  Ｏ１）ｇｉ｜１１７６２３６５５｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿８５２５６８．１｜（１１７６２３６５５）；Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＣＦＴ０７３）ｇｉ｜２６２４７６８９｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿７５３７２９．１｜（２６２４７６８９）；Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７  ＥＤＬ９３３）ｇｉ｜１５８０１７４８｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿２８７７６６．１｜（１５８０１７４８）；Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＰＥＣ  Ｏ１）ｇｉ｜１１５５１２７７９｜ｇｂ｜ＡＢＪ００８５４．１｜（１１５５１２７７９）；Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＣＦＴ０７３）ｇｉ｜２６１０８０９１｜ｇｂ｜ＡＡＮ８０２９１．１｜ＡＥ０１６７６０＿１５０（２６１０８０９１）；発酵性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ依存性（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２）ｇｉ｜１６１２９３４１｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿４１５８９８．１｜（１６１２９３４１）；発酵性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ依存性（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＵＴＩ８９）ｇｉ｜９１２１０６４６｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿５４０６３２．１｜（９１２１０６４６）；発酵性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ依存性（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２）ｇｉ｜１７８７６４５｜ｇｂ｜ＡＡＣ７４４６２．１｜（１７８７６４５）；発酵性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ依存性（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０）ｇｉ｜８９１０８２２７｜ｒｅｆ｜ＡＰ＿００２００７．１｜（８９１０８２２７）；発酵性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ依存性（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０）ｇｉ｜１７４２２５９｜ｄｂｊ｜ＢＡＡ１４９９０．１｜（１７４２２５９）；発酵性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ依存性（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＵＴＩ８９）ｇｉ｜９１０７２２２０｜ｇｂ｜ＡＢＥ０７１０１．１｜（９１０７２２２０）；発酵性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ依存性（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７  ＥＤＬ９３３）ｇｉ｜１２５１５３２０｜ｇｂ｜ＡＡＧ５６３８０．１｜ＡＥ００５３６６＿６（１２５１５���２０）；発酵性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７  ｓｔｒ．Ｓａｋａｉ）ｇｉ｜１３３６１４６８｜ｄｂｊ｜ＢＡＢ３５４２５．１｜（１３３６１４６８）；ＣＯＧ１０５２：乳酸デヒドロゲナーゼおよび関連するデヒドロゲナーゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  １０１−１）ｇｉ｜８３５８８５９３｜ｒｅｆ｜ＺＰ＿００９２７２１７．１｜（８３５８８５９３）；ＣＯＧ１０５２：乳酸デヒドロゲナーゼおよび関連するデヒドロゲナーゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ５３６３８）ｇｉ｜７５５１５９８５｜ｒｅｆ｜ＺＰ＿００７３８１０３．１｜（７５５１５９８５）；ＣＯＧ１０５２：乳酸デヒドロゲナーゼおよび関連するデヒドロゲナーゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｅ２２）ｇｉ｜７５２６０１５７｜ｒｅｆ｜ＺＰ＿００７３１４２５．１｜（７５２６０１５７）；ＣＯＧ１０５２：乳酸デヒドロゲナーゼおよび関連するデヒドロゲナーゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｆ１１）ｇｉ｜７５２４２６５６｜ｒｅｆ｜ＺＰ＿００７２６４００．１｜（７５２４２６５６）；ＣＯＧ１０５２：乳酸デヒドロゲナーゼおよび関連するデヒドロゲナーゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｅ１１００１９）ｇｉ｜７５２３７４９１｜ｒｅｆ｜ＺＰ＿００７２１５２４．１｜（７５２３７４９１）；ＣＯＧ１０５２：乳酸デヒドロゲナーゼおよび関連するデヒドロゲナーゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｂ７Ａ）ｇｉ｜７５２３１６０１｜ｒｅｆ｜ＺＰ＿００７１７９５９．１｜（７５２３１６０１）；およびＣＯＧ１０５２：乳酸デヒドロゲナーゼおよび関連するデヒドロゲナーゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｂ１７１）ｇｉ｜７５２１１３０８｜ｒｅｆ｜ＺＰ＿００７１１４０７．１｜（７５２１１３０８）が含まれ、受託番号に関連づけられる各配列は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０３】
膜に結合しＦＡＤを含有する２種の酵素がフマレートとスクシネートの相互変換の触媒作用に関与する；嫌気的成長にはフマル酸レダクターゼが使用され、好気的成長にはコハク酸デヒドロゲナーゼが使用される。フマル酸レダクターゼは、多数のサブユニット（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｆｒｄＡ、Ｂ、およびＣ）を含む。サブユニットのうちの任意の１つを改変することにより、本明細書における所望の活性がもたらされ得る。例えば、ｆｒｄＢ、ｆｒｄＣまたはｆｒｄＢＣをノックアウトすることは本開示の方法において有用である。Ｆｒｄホモログおよび変異体は公知である。例えば、ホモログおよび変異体としては、例えば、フマル酸レダクターゼサブユニットＤ（フマル酸レダクターゼの１３ｋＤａの疎水性タンパク質）ｇｉ｜６７４６３５４３｜ｓｐ｜Ｐ０Ａ８Ｑ３．１｜ＦＲＤＤ＿ＥＣＯＬＩ（６７４６３５４３）；フマル酸レダクターゼサブユニットＣ（フマル酸レダクターゼの１５ｋＤａの疎水性タンパク質）ｇｉ｜１３４６０３７｜ｓｐ｜Ｐ２０９２３．２｜ＦＲＤＣ＿ＰＲＯＶＵ（１３４６０３７）；フマル酸レダクターゼサブユニットＤ（フマル酸レダクターゼの１３ｋＤａの疎水性タンパク質）ｇｉ｜１２０４９９｜ｓｐ｜Ｐ２０９２４．１｜ＦＲＤＤ＿ＰＲＯＶＵ（１２０４９９）；フマル酸レダクターゼサブユニットＣ（フマル酸レダクターゼの１５ｋＤａの疎水性タンパク質）ｇｉ｜６７４６３５３８｜ｓｐ｜Ｐ０Ａ８Ｑ０．１｜ＦＲＤＣ＿ＥＣＯＬＩ（６７４６３５３８）；フマル酸レダクターゼ鉄−硫黄サブユニット（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ｇｉ｜１４５２６４｜ｇｂ｜ＡＡＡ２３４３８．１｜（１４５２６４）；フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニット（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ｇｉ｜１４５２６３｜ｇｂ｜ＡＡＡ２３４３７．１｜（１４５２６３）；フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットｇｉ｜３７５３８２９０｜ｓｐ｜Ｐ１７４１２．３｜ＦＲＤＡ＿ＷＯＬＳＵ（３７５３８２９０）；フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットｇｉ｜１２０４８９｜ｓｐ｜Ｐ００３６３．３｜ＦＲＤＡ＿ＥＣＯＬＩ（１２０４８９）；フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットｇｉ｜１２０４９０｜ｓｐ｜Ｐ２０９２２．１｜ＦＲＤＡ＿ＰＲＯＶＵ（１２０４９０）；フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニット前駆体（フラボシトクロムｃ）（フラボシトクロムｃ３）（Ｆｃｃ３）ｇｉ｜１１９３７００８７｜ｓｐ｜Ｑ０７ＷＵ７．２｜ＦＲＤＡ＿ＳＨＥＦＮ（１１９３７００８７）；フマル酸レダクターゼ鉄−硫黄サブユニットｇｉ｜８１１７５３０８｜ｓｐ｜Ｐ０ＡＣ４７．２｜ＦＲＤＢ＿ＥＣＯＬＩ（８１１７５３０８）；フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニット（フラボシトクロムｃ）（フラボシトクロムｃ３）（Ｆｃｃ３）ｇｉ｜１１９３７００８８｜ｓｐ｜Ｐ０Ｃ２７８．１｜ＦＲＤＡ＿ＳＨＥＦＲ（１１９３７００８８）；Ｆｒｄオペロンの特徴付けられていないタンパク質Ｃ  ｇｉ｜１４０６６３｜ｓｐ｜Ｐ２０９２７．１｜ＹＦＲＣ＿ＰＲＯＶＵ（１４０６６３）；Ｆｒｄオペロンの推測鉄−硫黄サブユニットＡ  ｇｉ｜１４０６６１｜ｓｐ｜Ｐ２０９２５．１｜ＹＦＲＡ＿ＰＲＯ���Ｕ（１４０６６１）；フマル酸レダクターゼ鉄−硫黄サブユニットｇｉ｜１２０４９３｜ｓｐ｜Ｐ２０９２１．２｜ＦＲＤＢ＿ＰＲＯＶＵ（１２０４９３）；フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットｇｉ｜２４９４６１７｜ｓｐ｜Ｏ０６９１３．２｜ＦＲＤＡ＿ＨＥＬＰＹ（２４９４６１７）；フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニット前駆体（鉄（ＩＩＩ）誘導性フラボシトクロムＣ３）（Ｉｆｃ３）ｇｉ｜１３８７８４９９｜ｓｐ｜Ｑ９Ｚ４Ｐ０．１｜ＦＲＤ２＿ＳＨＥＦＮ（１３８７８４９９）；フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットｇｉ｜５４０４１００９｜ｓｐ｜Ｐ６４１７４．１｜ＦＲＤＡ＿ＭＹＣＴＵ（５４０４１００９）；フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットｇｉ｜５４０３７１３２｜ｓｐ｜Ｐ６４１７５．１｜ＦＲＤＡ＿ＭＹＣＢＯ（５４０３７１３２）；フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットｇｉ｜１２２３０１１４｜ｓｐ｜Ｑ９ＺＭＰ０．１｜ＦＲＤＡ＿ＨＥＬＰＪ（１２２３０１１４）；フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットｇｉ｜１１６９７３７｜ｓｐ｜Ｐ４４８９４．１｜ＦＲＤＡ＿ＨＡＥＩＮ（１１６９７３７）；フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニット（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）ｇｉ｜１３１６００５８｜ｅｍｂ｜ＣＡＡ０４２１４．２｜（１３１６００５８）；フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニット前駆体（フラボシトクロムｃ）（ＦＬ  ｃｙｔ）ｇｉ｜２５４５２９４７｜ｓｐ｜Ｐ８３２２３．２｜ＦＲＤＡ＿ＳＨＥＯＮ（２５４５２９４７）；フマル酸レダクターゼ鉄−硫黄サブユニット（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）ｇｉ｜２２８２０００｜ｅｍｂ｜ＣＡＡ０４２１５．１｜（２２８２０００）；およびフマル酸レダクターゼシトクロムｂサブユニット（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）ｇｉ｜２２８１９９８｜ｅｍｂ｜ＣＡＡ０４２１３．１｜（２２８１９９８）が含まれ、受託番号に関連づけられる各配列は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０４】
酢酸キナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてａｃｋＡによりコードされる。ＡｃｋＡは、アセチルｃｏＡからアセテートへの変換に関与する。具体的には、ａｃｋＡは、アセチルホスフェートからアセテートへの変換を触媒する。ＡｃｋＡホモログおよび変異体は公知である。ＮＣＢＩデータベースには、およそ１４５０種のポリペプチドが細菌の酢酸キナーゼとして列挙されている。例えば、そのようなホモログおよび変異体としては、酢酸キナーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２））ｇｉ｜２１２２３７８４｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿６２９５６３．１｜（２１２２３７８４）；酢酸キナーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２））ｇｉ｜６８０８４１７｜ｅｍｂ｜ＣＡＢ７０６５４．１｜（６８０８４１７）；酢酸キナーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｍ１  ＧＡＳ）ｇｉ｜１５６７４３３２｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿２６８５０６．１｜（１５６７４３３２）；酢酸キナーゼ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ  ｓｕｂｓｐ．ｊｅｊｕｎｉ  ＮＣＴＣ  １１１６８）ｇｉ｜１５７９２０３８｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿２８１８６１．１｜（１５７９２０３８）；酢酸キナーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｍ１  ＧＡＳ）ｇｉ｜１３６２１４１６｜ｇｂ｜ＡＡＫ３３２２７．１｜（１３６２１４１６）；酢酸キナーゼ（Ｒｈｏｄｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ  ｂａｌｔｉｃａ  ＳＨ  １）ｇｉ｜３２４７６００９｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿８６９００３．１｜（３２４７６００９）；酢酸キナーゼ（Ｒｈｏｄｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ  ｂａｌｔｉｃａ  ＳＨ  １）ｇｉ｜３２４７２０４５｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿８６５０３９．１｜（３２４７２０４５）；酢酸キナーゼ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ  ｓｕｂｓｐ．ｊｅｊｕｎｉ  ＮＣＴＣ  １１１６８）ｇｉ｜１１２３６００３４｜ｅｍｂ｜ＣＡＬ３４８２６．１｜（１１２３６００３４）；酢酸キナーゼ（Ｒｈｏｄｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ  ｂａｌｔｉｃａ  ＳＨ  １）ｇｉ｜３２４４６５５３｜ｅｍｂ｜ＣＡＤ７６３８８．１｜（３２４４６５５３）；酢酸キナーゼ（Ｒｈｏｄｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ  ｂａｌｔｉｃａ  ＳＨ  １）ｇｉ｜３２３９７４１７｜ｅｍｂ｜ＣＡＤ７２７２３．１｜（３２３９７４１７）；ＡｃｋＡ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ  ＤＳＭ  ５５５）ｇｉ｜１５３９５４０１６｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１３９４７８１．１｜（１５３９５４０１６）；酢酸キナーゼ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＮＣＣ２７０５）ｇｉ｜２３４６５５４０｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿６９６１４３．１｜（２３４６５５４０）；ＡｃｋＡ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ  ＤＳＭ  ５５５）ｇｉ｜１４６３４６８９７｜ｇｂ｜ＥＤＫ３３４３３．１｜（１４６３４６８９７）；酢酸キナーゼ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）ｇｉ｜３８２００８７５｜ｅｍｂ｜ＣＡＥ５０５８０．１｜（３８２００８７５）；酢酸キナーゼ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＮＣＣ２７０５）ｇｉ｜２３３２６２０３｜ｇｂ｜ＡＡＮ２４７７９．１｜（２３３２６２０３）；酢酸キナーゼ（Ａｃｅｔｏｋｉｎａｓｅ）ｇｉ｜６７４６２０８９｜��ｐ｜Ｐ０Ａ６Ａ３．１｜ＡＣＫＡ＿ＥＣＯＬＩ（６７４６２０８９）；およびＡｃｋＡ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＤＳＭ  １３）ｇｉ｜５２３４９３１５｜ｇｂ｜ＡＡＵ４１９４９．１｜（５２３４９３１５）が含まれ、そのような受託番号に関連づけられる配列が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０５】
リン酸アセチルトランスフェラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてｐｔａによりコードされる。ＰＴＡは、アセテートからアセチルＣｏＡへの変換に関与する。具体的には、ＰＴＡは、アセチルｃｏＡからアセチル−リン酸への変換を触媒する。ＰＴＡのホモログおよび変異体は公知である。ＮＣＢＩ上で利用可能な細菌のリン酸アセチルトランスフェラーゼはおよそ１０７５種存在する。例えば、そのようなホモログおよび変異体としては、リン酸アセチルトランスフェラーゼＰｔａ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｆｅｌｉｓ  ＵＲＲＷＸＣａｌ２）ｇｉ｜６７００４０２１｜ｇｂ｜ＡＡＹ６０９４７．１｜（６７００４０２１）；リン酸アセチルトランスフェラーゼ（Ｂｕｃｈｎｅｒａ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ  ｓｔｒ．Ｃｃ（Ｃｉｎａｒａ  ｃｅｄｒｉ））ｇｉ｜１１６２５６９１０｜ｇｂ｜ＡＢＪ９０５９２．１｜（１１６２５６９１０）；ｐｔａ（Ｂｕｃｈｎｅｒａ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ  ｓｔｒ．Ｃｃ（Ｃｉｎａｒａ  ｃｅｄｒｉ））ｇｉ｜１１６５１５０５６｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿８０２６８５．１｜（１１６５１５０５６）；ｐｔａ（Ｗｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈｉａ  ｇｌｏｓｓｉｎｉｄｉａ  ｅｎｄｏｓｙｍｂｉｏｎｔ  ｏｆ  Ｇｌｏｓｓｉｎａ  ｂｒｅｖｉｐａｌｐｉｓ）ｇｉ｜２５１６６１３５｜ｄｂｊ｜ＢＡＣ２４３２６．１｜（２５１６６１３５）；Ｐｔａ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ  ｓｕｂｓｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ  ｓｔｒ．Ｐｍ７０）ｇｉ｜１２７２０９９３｜ｇｂ｜ＡＡＫ０２７８９．１｜（１２７２０９９３）；Ｐｔａ（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ）ｇｉ｜２５９８９７２０｜ｇｂ｜ＡＡＮ７５０２４．１｜（２５９８９７２０）；ｐｔａ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ  ｓｅｒｏｖａｒ  ６ｂ  ｓｔｒ．ＳＬＣＣ５３３４）ｇｉ｜１１６７４２４１８｜ｅｍｂ｜ＣＡＫ２１５４２．１｜（１１６７４２４１８）；Ｐｔａ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｋ−１０）ｇｉ｜４１３９８８１６｜ｇｂ｜ＡＡＳ０６４３５．１｜（４１３９８８１６）；リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａ）（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  Ｂ３１）ｇｉ｜１５５９４９３４｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿２１２７２３．１｜（１５５９４９３４）；リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａ）（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  Ｂ３１）ｇｉ｜２６８８５０８｜ｇｂ｜ＡＡＢ９１５１８．１｜（２６８８５０８）；リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａ）（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｒｄ  ＫＷ２０）ｇｉ｜１５７４１３１｜ｇｂ｜ＡＡＣ２２８５７．１｜（１５７４１３１）；リン酸アセチルトランスフェラーゼ  Ｐｔａ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｂｅｌｌｉｉ  ＲＭＬ３６９−Ｃ）ｇｉ｜９１２０６０２６｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿５３８３８１．１｜（９１２０６０２６）；リン酸アセチルトランスフェラーゼ  Ｐｔａ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｂｅｌｌｉｉ  ＲＭＬ３６９−Ｃ）ｇｉ｜９１２０６０２５｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿５３８３８０．１｜（９１２０６０２５）；リン酸アセチルトランスフェラーゼｐｔａ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｆ１１）ｇｉ｜１４８７２０１３１｜ｇｂ｜ＡＢＲ０４７５６．１｜（１４８７２０１３１）；リン酸アセチルトランスフェラーゼｐｔａ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｓｔｒ．Ｈａａｒｌｅｍ）ｇｉ｜１３４１４８８８６｜ｇｂ｜ＥＢＡ４０９３１．１｜（１３４１４８８８６）；リン酸アセチルトランスフェラーゼｐｔａ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｃ）ｇｉ｜１２４５９９８１９｜ｇｂ｜ＥＡＹ５８８２９．１｜（１２４５９９８１９）；リン酸アセチルトランスフェラーゼＰｔａ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｂｅｌｌｉｉ  ＲＭＬ３６９−Ｃ）ｇｉ｜９１０６９５７０｜ｇｂ｜ＡＢＥ０５２９２．１｜（９１０６９５７０）；リン酸アセチルトランスフェラーゼｐｔａ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｂｅｌｌｉｉ  ＲＭＬ３６９−Ｃ）ｇｉ｜９１０６９５６９｜ｇｂ｜ＡＢＥ０５２９１．１｜（９１０６９５６９）；リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａ）（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｐａｌｌｉｄｕｍ  ｓｔｒ．Ｎｉｃｈｏｌｓ）ｇｉ｜１５６３９０８８｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿２１８５３４．１｜（１５６３９０８８）；およびリン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａ）（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｐａｌｌｉｄｕｍ  ｓｔｒ．Ｎｉｃｈｏｌｓ）ｇｉ｜３３２２３５６｜ｇｂ｜ＡＡＣ６５０９０．１｜（３３２２３５６）が含まれ、受託番号に関連づけられる各配列は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０６】
ピルビン酸−ギ酸リアーゼ（ギ酸アセチルトランスフェラーゼ）は、ピルベートからアセチル−ｃｏＡおよびホルメートへの変換を触媒する酵素である。これは、ｐｆｌ−活性化酵素により、嫌気条件下で有機遊離基の発生により誘導され、リン酸制限の間に著しく減少する。ギ酸アセチルトランスフェラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてｐｆｌＢによりコードされる。ＰＦＬＢのホモログおよび変異体は公知である。例えば、そのようなホモログおよび変異体としては、例えば、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（ピルビン酸ギ酸−リアーゼ１）ｇｉ｜１２９８７９｜ｓｐ｜Ｐ０９３７３．２｜ＰＦＬＢ＿ＥＣＯＬＩ（１２９８７９）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ＣＯ９２）ｇｉ｜１６１２１６６３｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿４０４９７６．１｜（１６１２１６６３）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＩＰ  ３２９５３）ｇｉ｜５１５９５７４８｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿０６９９３９．１｜（５１５９５７４８）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ｂｉｏｖａｒ  Ｍｉｃｒｏｔｕｓ  ｓｔｒ．９１００１）ｇｉ｜４５４４１０３７｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿９９２５７６．１｜（４５４４１０３７）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ＣＯ９２）ｇｉ｜１１５３４７１４２｜ｅｍｂ｜ＣＡＬ２００３５．１｜（１１５３４７１４２）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ｂｉｏｖａｒ  Ｍｉｃｒｏｔｕｓ  ｓｔｒ．９１００１）ｇｉ｜４５４３５８９６｜ｇｂ｜ＡＡＳ６１４５３．１｜（４５４３５８９６）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＩＰ  ３２９５３）ｇｉ｜５１５８９０３０｜ｅｍｂ｜ＣＡＨ２０６４８．１｜（５１５８９０３０）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉ  ｓｔｒ．ＣＴ１８）ｇｉ｜１６７５９８４３｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿４５５４６０．１｜（１６７５９８４３）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ  ｓｔｒ．ＡＴＣＣ  ９１５０）ｇｉ｜５６４１３９７７｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿１５１０５２．１｜（５６４１３９７７）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉ）ｇｉ｜１６５０２１３６｜ｅｍｂ｜ＣＡＤ０５３７３．１｜（１６５０２１３６）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ  ｓｔｒ．ＡＴＣＣ  ９１５０）ｇｉ｜５６１２８２３４｜ｇｂ｜ＡＡＶ７７７４０．１｜（５６１２８２３４）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ  Ｓｄ１９７）ｇｉ｜８２７７７５７７｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿４０３９２６．１｜（８２７７７５７７）；ギ酸アセチルトラン���フェラーゼ１（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ２ａ  ｓｔｒ．２４５７Ｔ）ｇｉ｜３００６２４３８｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿８３６６０９．１｜（３００６２４３８）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ２ａ  ｓｔｒ．２４５７Ｔ）ｇｉ｜３００４０６８４｜ｇｂ｜ＡＡＰ１６４１５．１｜（３００４０６８４）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ５  ｓｔｒ．８４０１）ｇｉ｜１１０６１４４５９｜ｇｂ｜ＡＢＦ０３１２６．１｜（１１０６１４４５９）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ  Ｓｄ１９７）ｇｉ｜８１２４１７２５｜ｇｂ｜ＡＢＢ６２４３５．１｜（８１２４１７２５）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７  ＥＤＬ９３３）ｇｉ｜１２５１４０６６｜ｇｂ｜ＡＡＧ５５３８８．１｜ＡＥ００５２７９＿８（１２５１４０６６）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ＫＩＭ）ｇｉ｜２２１２６６６８｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿６７００９１．１｜（２２１２６６６８）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ  Ａ９０９）ｇｉ｜７６７８７６６７｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿３３０３３５．１｜（７６７８７６６７）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ＫＩＭ）ｇｉ｜２１９５９６８３｜ｇｂ｜ＡＡＭ８６３４２．１｜ＡＥ０１３８８２＿３（２１９５９６８３）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ  Ａ９０９）ｇｉ｜７６５６２７２４｜ｇｂ｜ＡＢＡ４５３０８．１｜（７６５６２７２４）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ  ８０８１）ｇｉ｜１２３４４１８４４｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１００５８２７．１｜（１２３４４１８４４）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ５  ｓｔｒ．８４０１）ｇｉ｜１１０８０４９１１｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿６８８４３１．１｜（１１０８０４９１１）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＵＴＩ８９）ｇｉ｜９１２１０００４｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿５３９９９０．１｜（９１２１０００４）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ  Ｓｂ２２７）ｇｉ｜８２５４４６４１｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿４０８５８８．１｜（８２５４４６４１）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ  Ｓｓ０４６）ｇｉ｜７４３１１４５９｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿３０９８７８．１｜（７４３１１４５９）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｓｕｂｓｐ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＭＧＨ  ７８５７８）ｇｉ｜１５２９６９４８８｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１３３４５９７．１｜（１５２９６９４８８）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２）ｇｉ｜２９１４２３８４��ｒｅｆ｜ＮＰ＿８０５７２６．１｜（２９１４２３８４）ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ２ａ  ｓｔｒ．３０１）ｇｉ｜２４１１２３１１｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿７０６８２１．１｜（２４１１２３１１）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７  ＥＤＬ９３３）ｇｉ｜１５８００７６４｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿２８６７７８．１｜（１５８００７６４）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｓｕｂｓｐ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＭＧＨ  ７８５７８）ｇｉ｜１５０９５４３３７｜ｇｂ｜ＡＢＲ７６３６７．１｜（１５０９５４３３７）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ＣＡ８８−４１２５）ｇｉ｜１４９３６６６４０｜ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１８８８６７４．１｜（１４９３６６６４０）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ＣＡ８８−４１２５）ｇｉ｜１４９２９１０１４｜ｇｂ｜ＥＤＭ４１０８９．１｜（１４９２９１０１４）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ  ８０８１）ｇｉ｜１２２０８８８０５｜ｅｍｂ｜ＣＡＬ１１６１１．１｜（１２２０８８８０５）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ  Ｓｓ０４６）ｇｉ｜７３８５４９３６｜ｇｂ｜ＡＡＺ８７６４３．１｜（７３８５４９３６）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＵＴＩ８９）ｇｉ｜９１０７１５７８｜ｇｂ｜ＡＢＥ０６４５９．１｜（９１０７１５７８）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２）ｇｉ｜２９１３８０１４｜ｇｂ｜ＡＡＯ６９５７５．１｜（２９１３８０１４）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ  Ｓｂ２２７）ｇｉ｜８１２４６０５２｜ｇｂ｜ＡＢＢ６６７６０．１｜（８１２４６０５２）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ２ａ  ｓｔｒ．３０１）ｇｉ｜２４０５１１６９｜ｇｂ｜ＡＡＮ４２５２８．１｜（２４０５１１６９）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７  ｓｔｒ．Ｓａｋａｉ）ｇｉ｜１３３６０４４５｜ｄｂｊ｜ＢＡＢ３４４０９．１｜（１３３６０４４５）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ１（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７  ｓｔｒ．Ｓａｋａｉ）ｇｉ｜１５８３０２４０｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿３０９０１３．１｜（１５８３０２４０）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼＩ（ピルビン酸ギ酸−リアーゼ１）（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｕｍｏｎｄｉｉ  ＴＴＯ１）ｇｉ｜３６７８４９８６｜ｅｍｂ｜ＣＡＥ１３９０６．１｜（３６７８４９８６）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼＩ（ピルビン酸ギ酸−リアーゼ１）（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｕｍｏｎｄｉｉ  ＴＴＯ１）ｇｉ｜３７５２５５５８｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿９２８９０２．１｜（３７５２５５５８）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ  Ｍｕ５０）ｇｉ｜１４２４５９９３｜ｄｂｊ｜ＢＡＢ５６３８８．１｜（１４２４５９９３）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ  Ｍｕ５０）ｇｉ｜１５９２３２１６｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿３７０７５０．１｜（１５９２３２１６）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（ピルビン酸ギ酸リアーゼ）ｇｉ｜８１７０６３６６｜ｓｐ｜Ｑ７Ａ７Ｘ６．１｜ＰＦＬＢ＿ＳＴＡＡＮ（８１７０６３６６）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（ピルビン酸ギ酸リアーゼ）ｇｉ｜８１７８２２８７｜ｓｐ｜Ｑ９９ＷＺ７．１｜ＰＦＬＢ＿ＳＴＡＡＭ（８１７８２２８７）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（ピルビン酸ギ酸リアーゼ）ｇｉ｜８１７０４７２６｜ｓｐ｜Ｑ７Ａ１Ｗ９．１｜ＰＦＬＢ＿ＳＴＡＡＷ（８１７０４７２６）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ  Ｍｕ３）ｇｉ｜１５６７２０６９１｜ｄｂｊ｜ＢＡＦ７７１０８．１｜（１５６７２０６９１）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ  ｓｕｂｓｐ．ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃａ  ＳＣＲＩ１０４３）ｇｉ｜５０１２１５２１｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿０５０６８８．１｜（５０１２１５２１）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ  ｓｕｂｓｐ．ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃａ  ＳＣＲＩ１０４３）ｇｉ｜４９６１２０４７｜ｅｍｂ｜ＣＡＧ７５４９６．１｜（４９６１２０４７）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ  ｓｔｒ．Ｎｅｗｍａｎ）ｇｉ｜１５０３７３１７４｜ｄｂｊ｜ＢＡＦ６６４３４．１｜（１５０３７３１７４）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ  ＭＲ−１）ｇｉ｜２４３７４４３９｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿７１８４８２．１｜（２４３７４４３９）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ  ＭＲ−１）ｇｉ｜２４３４９０１５｜ｇｂ｜ＡＡＮ
５５９２６．１｜ＡＥ０１５７３０＿３（２４３４９０１５）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｓｅｒｏｖａｒ  ３  ｓｔｒ．ＪＬ０３）ｇｉ｜１６５９７６４６１｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６５２０５４．１｜（１６５９７６４６１）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｓｅｒｏｖａｒ  ３  ｓｔｒ．ＪＬ０３）ｇｉ｜１６５８７６５６２｜ｇｂ｜ＡＢＹ６９６１０．１｜（１６５８７６５６２）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２）ｇｉ｜２１２０３３６５｜ｄｂｊ｜ＢＡＢ９４０６６．１｜（２１２０３３６５）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ  Ｎ３１５）ｇｉ｜１３７００１４１｜ｄｂｊ｜ＢＡＢ４１４４０．１｜（１３７００１４１）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ  ｓｔｒ．Ｎｅｗｍａｎ）ｇｉ｜１５１２２０３７４｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１３３１１９７．１｜（１５１２２０３７４）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ  Ｍｕ３）ｇｉ｜１５６９７８５５６｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１４４０８１５．１｜（１５６９７８５５６）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＪＡ−２−３Ｂ’ａ（２−１３））ｇｉ｜８６６０７７４４｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿４７６５０６．１｜（８６６０７７４４）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＪＡ−３−３Ａｂ）ｇｉ｜８６６０５１９５｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿４７３９５８．１｜（８６６０５１９５）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｄ３９）ｇｉ｜１１６５１７１８８｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿８１５９２８．１｜（１１６５１７１８８）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＪＡ−２−３Ｂ’ａ（２−１３））ｇｉ｜８６５５６２８６｜ｇｂ｜ＡＢＤ０１２４３．１｜（８６５５６２８６）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＪＡ−３−３Ａｂ）ｇｉ｜８６５５３７３７｜ｇｂ｜ＡＢＣ９８６９５．１｜（８６５５３７３７）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｏｖｙｉ  ＮＴ）ｇｉ｜１１８１３４９０８｜ｇｂ｜ＡＢＫ６１９５２．１｜（１１８１３４９０８）；ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＲＳＡ２５２）ｇｉ｜４９４８２４５８｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿０３９６８２．１｜（４９４８２４５８）；およびギ酸アセチルトランスフェラーゼ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＲＳＡ２５２）ｇｉ｜４９２４０５８７｜ｅｍｂ｜ＣＡＧ３９２４４．１｜（４９２４０５８７）が含まれ、受託番号に関連づけられる各配列は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０７】
アルファイソプロピルリンゴ酸シンターゼ（ＥＣ２．３．３．１３、時には２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ、アルファ−ＩＰＭシンターゼと称される）は、アセチルＣｏＡのアセチル基と３−メチル−２−オキソブタノエート（２−オキソイソバレレート）の縮合を触媒して、３−カルボキシ−３−ヒドロキシ−４−メチルペンタノエート（２−イソプロピルマレート）を形成する。アルファイソプロピルリンゴ酸シンターゼは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてｌｅｕＡによりコードされる。ＬｅｕＡのホモログおよび変異体は公知である。例えば、そのようなホモログおよび変異体としては、例えば、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ｇｉ｜４５２３８２｜ｅｍｂ｜ＣＡＡ５０２９５．１｜（４５２３８２）；２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２）ｇｉ｜１６１２８０６８｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿４１４６１６．１｜（１６１２８０６８）；２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２）ｇｉ｜１７８６２６１｜ｇｂ｜ＡＡＣ７３１８５．１｜（１７８６２６１）；２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ｇｉ｜１５２３７１９４｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿１９７６９２．１｜（１５２３７１９４）；２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ｇｉ｜４２５６２１４９｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿１７３２８５．２｜（４２５６２１４９）；２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ｇｉ｜１５２２１１２５｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿１７７５４４．１｜（１５２２１１２５）；２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２））ｇｉ｜３２１４１１７３｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿７３３５７５．１｜（３２１４１１７３）；２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（Ｒｈｏｄｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ  ｂａｌｔｉｃａ  ＳＨ  １）ｇｉ｜３２４７７６９２｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿８７０６８６．１｜（３２４７７６９２）；２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（Ｒｈｏｄｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ  ｂａｌｔｉｃａ  ＳＨ  １）ｇｉ｜３２４４８２４６｜ｅｍｂ｜ＣＡＤ７７７６３．１｜（３２４４８２４６）；２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ  ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−８３５）ｇｉ｜１６６２４１４３２｜ｇｂ｜ＥＤＲ５３４０４．１｜（１６６２４１４３２）；２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ  ＡＴＣＣ  ２３７７９）ｇｉ｜１５９９００９５９｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１５４７２０６．１｜（１５９９００９５９）；２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｈｉｂａｅ  ＤＦＬ  １２）ｇｉ｜１５９０４３１４９｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１５３１９４３．１｜（１５９０４３１４９）；２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ  ａｒｅｎｉｃｏｌａ  ＣＮＳ−２０５）ｇｉ｜１５９０３５９３３｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１５３５１８６．１｜（１５９０３５９３３）；２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ  ＮＣＰＰＢ  ３８２）ｇｉ｜１４８２７２７５７｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１２２２３１８．１｜（１４８２７２７５７）；２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｂ）ｇｉ｜１２４５３０６４３｜ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１７０１２２７．１｜（１２４５３０６４３）；２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｃ  ｓｔｒ．ＡＴＣＣ  ８７３９）ｇｉ｜１２４４９９０６７｜ｇｂ｜ＥＡＹ４６５６３．１｜（１２４４９９０６７）；２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  Ｔｏｈａｍａ  Ｉ）ｇｉ｜３３５９１３８６｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿８７９０３０．１｜（３３５９１３８６）；２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｂａｃｔｅｒ  ｎｅｃｅｓｓａｒｉｕｓ  ＳＴＩＲ１）ｇｉ｜１６４５６４０６３｜ｒｅｆ｜ＺＰ＿０２２０９８８０．１｜（１６４５６４０６３）；２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｂａｃｔｅｒ  ｎｅｃｅｓｓａｒｉｕｓ  ＳＴＩＲ１）ｇｉ｜１６４５０６７８９｜ｇｂ｜ＥＤＱ９４９９０．１｜（１６４５０６７８９）；および２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ  ＫＢＡＢ４）ｇｉ｜１６３９３９３１３｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６４４１９７．１｜（１６３９３９３１３）が含まれ、受託番号に関連づけられる配列はいずれも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０８】
ＢＣＡＡアミノトランスフェラーゼは、分枝鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）の形成を触媒する。いくつものそのようなアミノトランスフェラーゼが公知であり、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｉｌｖＥにより例示される。例示的なホモログおよび変異体としては、以下の受託番号で示される配列が含まれる：ｉｌｖＥ（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＣＣ  ７８０６）ｇｉ｜１５９０２６７５６｜ｅｍｂ｜ＣＡＯ８６６３７．１｜（１５９０２６７５６）；ＩｌｖＥ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ｇｉ｜８７１１７９６２｜ｇｂ｜ＡＢＤ２０２８８．１｜（８７１１７９６２）；ＩｌｖＥ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ｇｉ｜８７１１７９６０｜ｇｂ｜ＡＢＤ２０２８７．１｜（８７１１７９６０）；ＩｌｖＥ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ｇｉ｜８７１１７９５８｜ｇｂ｜ＡＢＤ２０２８６．１｜（８７１１７９５８）；ＩｌｖＥ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ｇｉ｜８７１１７９５６｜ｇｂ｜ＡＢＤ２０２８５．１｜（８７１１７９５６）；ＩｌｖＥ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ｇｉ｜８７１１７９５４｜ｇｂ｜ＡＢＤ２０２８４．１｜（８７１１７９５４）；ＩｌｖＥ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ｇｉ｜８７１１７９５２｜ｇｂ｜ＡＢＤ２０２８３．１｜（８７１１７９５２）；ＩｌｖＥ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ｇｉ｜８７１１７９５０｜ｇｂ｜ＡＢＤ２０２８２．１｜（８７１１７９５０）；ＩｌｖＥ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ｇｉ｜８７１１７９４８｜ｇｂ｜ＡＢＤ２０２８１．１｜（８７１１７９４８）；ＩｌｖＥ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ｇｉ｜８７１１７９４６｜ｇｂ｜ＡＢＤ２０２８０．１｜（８７１１７９４６）；ＩｌｖＥ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ｇｉ｜８７１１７９４４｜ｇｂ｜ＡＢＤ２０２７９．１｜（８７１１７９４４）；ＩｌｖＥ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ｇｉ｜８７１１７９４２｜ｇｂ｜ＡＢＤ２０２７８．１｜（８７１１７９４２）；ＩｌｖＥ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ｇｉ｜８７１１７９４０｜ｇｂ｜ＡＢＤ２０２７７．１｜（８７１１７９４０）；ＩｌｖＥ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ｇｉ｜８７１１７９３８｜ｇｂ｜ＡＢＤ２０２７６．１｜（８７１１７９３８）；ＩｌｖＥ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）ｇｉ｜８７１１７９３６｜ｇｂ｜ＡＢＤ２０２７５．１｜（８７１１７９３６）；ＩｌｖＥ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）ｇｉ｜８７１１７９３４｜ｇｂ｜ＡＢＤ２０２７４．１｜（８７１１７９３４）；ＩｌｖＥ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）ｇｉ｜８７１１７９３２｜ｇｂ｜ＡＢＤ２０２７３．１｜（８７１１７９３２）；ＩｌｖＥ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）ｇｉ｜８７１１７９３０｜ｇｂ｜ＡＢＤ２０２７２．１｜（８７１１７９３０）；およびＩｌｖＥ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）ｇｉ｜８７１１７９２８｜ｇｂ｜ＡＢＤ２０２７１．１｜（８７１１７９２８）、受託番号に関連づけられる各配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０９】
チロシンアミノトランスフェラーゼは、ジカルボキシルアミノ酸基質および芳香族アミノ酸基質の両方のアミノ基転移を触媒する。Ｅ．ｃｏｌｉのチロシンアミノトランスフェラーゼは、遺伝子ｔｙｒＢによりコードされる。ＴｙｒＢのホモログおよび変異体は公知である。例えば、そのようなホモログおよび変異体としては、ｔｙｒＢ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｔｒｉｉ）ｇｉ｜１６３８５７０９３｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６３１３９１．１｜（１６３８５７０９３）；ｔｙｒＢ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｔｒｉｉ）ｇｉ｜１６３２６０８２１｜ｅｍｂ｜ＣＡＰ４３１２３．１｜（１６３２６０８２１）；アミノトランスフェラーゼｇｉ｜５５１８４４｜ｇｂ｜ＡＡＡ２４７０４．１｜（５５１８４４）；アミノトランスフェラーゼ（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＢＴＡｉ１）ｇｉ｜１４６４０４３８７｜ｇｂ｜ＡＢＱ３２８９３．１｜（１４６４０４３８７）；チロシンアミノトランスフェラーゼＴｙｒＢ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）ｇｉ｜４７７５５７４｜ｅｍｂ｜ＣＡＢ４０９７３．２｜（４７７５５７４）；チロシンアミノトランスフェラーゼ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＬＴ２）ｇｉ｜１６４２２８０６｜ｇｂ｜ＡＡＬ２３０７２．１｜（１６４２２８０６）；およびチロシンアミノトランスフェラーゼｇｉ｜１４８０８５｜ｇｂ｜ＡＡＡ２４７０３．１｜（１４８０８５）が含まれ、その各配列は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１０】
ピルビン酸オキシダーゼは、ピルベートのアセテートおよびＣＯ２への変換を触媒する。Ｅ．ｃｏｌｉでは、ピルビン酸オキシダーゼは、ｐｏｘＢによりコードされる。ＰｏｘＢおよびそのホモログおよび変異体としては、例えば、ピルビン酸オキシダーゼ；ＰｏｘＢ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ｇｉ｜６８５１２８｜ｇｂ｜ＡＡＢ３１１８０．１｜｜ｂｂｍ｜３４８４５１｜ｂｂｓ｜１５４７１６（６８５１２８）；ＰｏｘＢ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ｇｉ｜３２８１５８２０｜ｇｂ｜ＡＡＰ８８２９３．１｜（３２８１５８２０）；ｐｏｘＢ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ｇｉ｜２５２６９１６９｜ｅｍｂ｜ＣＡＤ５７４８６．１｜（２５２６９１６９）；ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉ）ｇｉ｜１６５０２１０１｜ｅｍｂ｜ＣＡＤ０５３３７．１｜（１６５０２１０１）；ピルビン酸オキシダーゼ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ｇｉ｜４１６９１７０２｜ｇｂ｜ＡＡＳ１０１５６．１｜（４１６９１７０２）；ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）ｇｉ｜２０２５７１６７｜ｇｂ｜ＡＡＭ１２３５２．１｜（２０２５７１６７）；ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ＫＩＭ）ｇｉ｜２２１２６６９８｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿６７０１２１．１｜（２２１２６６９８）；ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（シトクロム）（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ｂｉｏｖａｒ  Ａｎｔｉｑｕａ  ｓｔｒ．Ｂ４２００３００４）ｇｉ｜１６６２１１２４０｜ｒｅｆ｜ＺＰ＿０２２３７２７５．１｜（１６６２１１２４０）；ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（シトクロム）（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ｂｉｏｖａｒ  Ａｎｔｉｑｕａ  ｓｔｒ．Ｂ４２００３００４）ｇｉ｜１６６２０７０１１｜ｇｂ｜ＥＤＲ５１４９１．１｜（１６６２０７０１１）；ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｔｏｍａｔｏ  ｓｔｒ．ＤＣ３０００）ｇｉ｜２８８６９７０３｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿７９２３２２．１｜（２８８６９７０３）；ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＬＴ２）ｇｉ｜１６７６４２９７｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿４５９９１２．１｜（１６７６４２９７）；ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉ  ｓｔｒ．ＣＴ１８）ｇｉ｜１６７５９８０８｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿４５５４２５．１｜（１６７５９８０８）；ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（シトクロム）（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ  Ｄｕｇｗａｙ  ５Ｊ１０８−１１１）ｇｉ｜１５４７０６１１０｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１４２４１３２．１｜（１５４７０６１１０）；ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ  ＮＣＰＰＢ  ３８２）ｇｉ｜１４８２７３３１２｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１２２２８７３．１｜（１４８２７３３１２）；ピルビン酸オキシダーゼ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＦＭ）ｇｉ｜５８３３８２１３｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿１９４７９８．１｜（５８３３８２１３）；およびピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ＣＯ９２）ｇｉ｜１６１２１６３８｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿４０４９５１．１｜（１６１２１６３８）が含まれ、各受託番号の配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１１】
Ｌ−トレオニン３−デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１０３）は、Ｌ−トレオニンのＬ−２−アミノ−３−オキソブタノエートへの変換を触媒する。遺伝子ｔｄｈがＬ−トレオニン３−デヒドロゲナーゼをコードする。ＮＣＢＩにおいて認識されている細菌生物由来のＬ−トレオニン３−デヒドロゲナーゼはおよそ７００種存在する。ｔｄｈの種々のホモログおよび変異体としては、例えば、Ｌ−トレオニン３−デヒドロゲナーゼｇｉ｜１３５５６０｜ｓｐ｜Ｐ０７９１３．１｜ＴＤＨ＿ＥＣＯＬＩ（１３５５６０）；Ｌ−トレオニン３−デヒドロゲナーゼｇｉ｜１６６２２７８５４｜ｓｐ｜Ａ４ＴＳＣ６．１｜ＴＤＨ＿ＹＥＲＰＰ（１６６２２７８５４）；Ｌ−トレオニン３−デヒドロゲナーゼｇｉ｜１６６２２７８５３｜ｓｐ｜Ａ１ＪＨＸ８．１｜ＴＤＨ＿ＹＥＲＥ８（１６６２２７８５３）；Ｌ−トレオニン３−デヒドロゲナーゼｇｉ｜１６６２２７８５２｜ｓｐ｜Ａ６ＵＢＭ６．１｜ＴＤＨ＿ＳＩＮＭＷ（１６６２２７８５２）；Ｌ−トレオニン３−デヒドロゲナーゼｇｉ｜１６６２２７８５１｜ｓｐ｜Ａ１ＲＥ０７．１｜ＴＤＨ＿ＳＨＥＳＷ（１６６２２７８５１）；Ｌ−トレオニン３−デヒドロゲナーゼｇｉ｜１６６２２７８５０｜ｓｐ｜Ａ０Ｌ２Ｑ３．１｜ＴＤＨ＿ＳＨＥＳＡ（１６６２２７８５０）；Ｌ−トレオニン３−デヒドロゲナーゼｇｉ｜１６６２２７８４９｜ｓｐ｜Ａ４ＹＣＣ５．１｜ＴＤＨ＿ＳＨＥＰＣ（１６６２２７８４９）；Ｌ−トレオニン３−デヒドロゲナーゼｇｉ｜１６６２２７８４８｜ｓｐ｜Ａ３ＱＪＣ８．１｜ＴＤＨ＿ＳＨＥＬＰ（１６６２２７８４８）；Ｌ−トレオニン３−デヒドロゲナーゼｇｉ｜１６６２２７８４７｜ｓｐ｜Ａ６ＷＵＧ６．１｜ＴＤＨ＿ＳＨＥＢ８（１６６２２７８４７）；Ｌ−トレオニン３−デヒドロゲナーゼｇｉ｜１６６２２７８４６｜ｓｐ｜Ａ３ＣＹＮ０．１｜ＴＤＨ＿ＳＨＥＢ５（１６６２２７８４６）；Ｌ−トレオニン３−デヒドロゲナーゼｇｉ｜１６６２２７８４５｜ｓｐ｜Ａ１Ｓ１Ｑ３．１｜ＴＤＨ＿ＳＨＥＡＭ（１６６２２７８４５）；Ｌ−トレオニン３−デヒドロゲナーゼｇｉ｜１６６２２７８４４｜ｓｐ｜Ａ４ＦＮＤ４．１｜ＴＤＨ＿ＳＡＣＥＮ（１６６２２７８４４）；Ｌ−トレオニン３−デヒドロゲナーゼｇｉ｜１６６２２７８４３｜ｓｐ｜Ａ１ＳＶＷ５．１｜ＴＤＨ＿ＰＳＹＩＮ（１６６２２７８４３）；Ｌ−トレオニン３−デヒドロゲナーゼｇｉ｜１６６２２７８４２｜ｓｐ｜Ａ５ＩＧＫ７．１｜ＴＤＨ＿ＬＥＧＰＣ（１６６２２７８４２）；Ｌ−トレオニン３−デヒドロゲナーゼｇｉ｜１６６２２７８４１｜ｓｐ｜Ａ６ＴＦＬ２．１｜ＴＤＨ＿ＫＬＥＰ７（１６６２２７８４１）；Ｌ−トレオニン３−デヒドロゲナーゼｇｉ｜１６６２２７８４０｜ｓｐ｜Ａ４ＩＺ９２．１｜ＴＤＨ＿ＦＲＡＴＷ（１６６２２７８４０）；Ｌ−トレオニン３−デヒドロゲナーゼｇｉ｜１６６２２７８３９｜ｓｐ｜Ａ０Ｑ５Ｋ３．１｜ＴＤＨ＿ＦＲＡＴＮ（１６６２２７８３９）；Ｌ−トレオニン３−デヒドロゲナーゼｇｉ｜１６６２２７８３８｜ｓｐ｜Ａ７ＮＤＭ９．１｜ＴＤＨ＿ＦＲＡＴＦ（１６６２２７８３８）；Ｌ−トレオニン３−デヒドロゲナーゼｇｉ｜１６６２２７８３７｜ｓｐ｜Ａ７ＭＩＤ０．１｜ＴＤＨ＿ＥＮＴＳ８（１６６２２７８３７）；およびＬ−トレオニン３−デヒドロゲナーゼｇｉ｜１６６２２７８３６｜ｓｐ｜Ａ１ＡＨＦ３．１｜ＴＤＨ＿ＥＣＯＫ１（１６６２２７８３６）が含まれ、各受託番号に関連づけられる配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１２】
アセトヒドロキシ酸シンターゼ（例えば、ｉｌｖＨ）およびアセト乳酸シンターゼ（例えば、ａｌｓＳ、ｉｌｖＢ、ｉｌｖＩ）は、分岐鎖アミノ酸（バリン、ロイシン、およびイソロイシン）の合成を触媒する。Ｅ．ｃｏｌｉではＩｌｖＨがアセトヒドロキシ酸シンターゼをコードする（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、アセトヒドロキシ酸シンターゼＡＨＡＳ  ＩＩＩ（ＩｌｖＨ）（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ｇｉ｜４０８４６｜ｅｍｂ｜ＣＡＡ３８８５５．１｜（４０８４６）を参照されたい。配列番号４５および配列番号４６も参照されたい）。ｉｌｖＨを含むホモログおよび変異体ならびにオペロンは公知であり、それらとしては、例えば、ｉｌｖＨ（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＣＣ  ７８０６）ｇｉ｜１５９０２６９０８｜ｅｍｂ｜ＣＡＯ８９１５９．１｜（１５９０２６９０８）；ＩｌｖＨ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＦＺＢ４２）ｇｉ｜１５４６８６９６６｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１４２２１２７．１｜（１５４６８６９６６）；ＩｌｖＨ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＦＺＢ４２）ｇｉ｜１５４３５２８１７｜ｇｂ｜ＡＢＳ７４８９６．１｜（１５４３５２８１７）；ＩｌｖＨ（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａ）ｇｉ｜１３１０５４１４０｜ｇｂ｜ＡＢＯ３２７８７．１｜（１３１０５４１４０）；ＩｌｖＨ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ｇｉ｜７６３１１２４｜ｇｂ｜ＡＡＦ６５１７７．１｜ＡＦ１１７２２７＿２（７６３１１２４）、ｉｌｖＮ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）ｇｉ｜１６４１４６０６｜ｅｍｂ｜ＣＡＣ９７３２２．１｜（１６４１４６０６）；ｉｌｖＮ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ｇｉ｜１６４１１４３８｜ｅｍｂ｜ＣＡＤ０００６３．１｜（１６４１１４３８）；アセトヒドロキシ酸シンターゼ（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）ｇｉ｜４０８９３９｜ｇｂ｜ＡＡＡ２３０４８．１｜（４０８９３９）；アセトヒドロキシ酸シンターゼＩ、小サブユニット（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉ）ｇｉ｜１６５０４８３０｜ｅｍｂ｜ＣＡＤ０３１９９．１｜（１６５０４８３０）；アセトヒドロキシ酸シンターゼ、小サブユニット（Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ  ｗｈｉｐｐｌｅｉ  ＴＷ０８／２７）ｇｉ｜２８５７２７１４｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿７８９４９４．１｜（２８５７２７１４）；アセトヒドロキシ酸シンターゼ、小サブユニット（Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ  ｗｈｉｐｐｌｅｉ  ＴＷ０８／２７）ｇｉ｜２８４１０８４６｜ｅｍｂ｜ＣＡＤ６７２３２．１｜（２８４１０８４６）；アセトヒドロキシ酸シンターゼＩ、小サブユニット（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ  ｓｔｒ．ＡＴＣＣ  ９１５０）ｇｉ｜５６１２９９３３｜ｇｂ｜ＡＡＶ７９４３９．１｜（５６１２９９３３）；アセトヒドロキシ酸シンターゼ小サブユニット；アセトヒドロキシ酸シンターゼ、小サブユニットｇｉ｜５５１７７９｜ｇｂ｜ＡＡＡ６２４３０．１｜（５５１７７９）；��セトヒドロキシ酸シンターゼＩ、小サブユニット（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２）ｇｉ｜２９１３９６５０｜ｇｂ｜ＡＡＯ７１２１６．１｜（２９１３９６５０）；アセトヒドロキシ酸シンターゼ小サブユニット（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）ｇｉ｜５７３３１１６｜ｇｂ｜ＡＡＤ４９４３２．１｜ＡＦ１７５５２６＿１（５７３３１１６）；アセトヒドロキシ酸シンターゼ大サブユニット；およびアセトヒドロキシ酸シンターゼ、大サブユニットｇｉ｜４００３３４｜ｇｂ｜ＡＡＡ６２４２９．１｜（４００３３４）が含まれ、受託番号に関連づけられる配列は、参照により本明細書に組み込まれる。アセト乳酸シンターゼ遺伝子としては、ａｌｓＳおよびｉｌｖＩが含まれる。ｉｌｖＩおよびａｌｓＳのホモログは公知であり、それらとしては、例えば、アセト乳酸シンターゼ小サブユニット（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＮＣＣ２７０５）ｇｉ｜２３３２５４８９｜ｇｂ｜ＡＡＮ２４１３７．１｜（２３３２５４８９）；アセト乳酸シンターゼ小サブユニット（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ｇｉ｜１９９１８９３３｜ｇｂ｜ＡＡＬ９９３５７．１｜（１９９１８９３３）；アセト乳酸シンターゼ（Ａｚｏａｒｃｕｓ  ｓｐ．ＢＨ７２）ｇｉ｜１１９６７１１７８｜ｅｍｂ｜ＣＡＬ９５０９１．１｜（１１９６７１１７８）；アセト乳酸シンターゼ小サブユニット（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）ｇｉ｜３８１９９９５４｜ｅｍｂ｜ＣＡＥ４９６２２．１｜（３８１９９９５４）；アセト乳酸シンターゼ（Ａｚｏａｒｃｕｓ  ｓｐ．ＢＨ７２）ｇｉ｜１１９６６９７３９｜ｅｍｂ｜ＣＡＬ９３６５２．１｜（１１９６６９７３９）；アセト乳酸シンターゼ小サブユニット（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｅｉｋｅｉｕｍ  Ｋ４１１）ｇｉ｜６８２６３９８１｜ｅｍｂ｜ＣＡＩ３７４６９．１｜（６８２６３９８１）；アセト乳酸シンターゼ小サブユニット（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｇｉ｜１７７００６７｜ｅｍｂ｜ＣＡＡ９９５６２．１｜（１７７００６７）；アセト乳酸シンターゼアイソザイム１小サブユニット（ＡＨＡＳ−Ｉ）（アセトヒドロキシ酸シンターゼＩ小サブユニット）（ＡＬＳ−Ｉ）ｇｉ｜８３３０９００６｜ｓｐ｜Ｐ０ＡＤＦ８．１｜ＩＬＶＮ＿ＥＣＯＬＩ（８３３０９００６）；アセト乳酸シンターゼ大サブユニット（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ｇｉ｜１９９１８９３２｜ｇｂ｜ＡＡＬ９９３５６．１｜（１９９１８９３２）；およびアセト乳酸シンターゼ、小サブユニット（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  ＭＢ４）ｇｉ｜２０８０６５５６｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿６２１７２７．１｜（２０８０６５５６）が含まれ、受託番号に関連づけられる配列は、参照により本明細書に組み込まれる。ＮＣＢＩには、ｉｌｖＢのホモログおよび変異体がおよそ１１２０種列挙されている。
【０１１３】
アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼは、イソロイシンおよびバリンの生合成の平行経路における第２の酵素である。Ｅ．ｃｏｌｉではＩｌｖＣがアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする（例えば、配列番号４７および配列番号４８を参照されたい）。ｉｌｖＣのホモログおよび変異体は公知であり、それらとしては、例えば、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ  ９７２ｈ−）ｇｉ｜１６２３１２３１７｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿００１０１８８４５．２｜（１６２３１２３１７）；アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ｇｉ｜３１１６１４２｜ｅｍｂ｜ＣＡＡ１８８９１．１｜（３１１６１４２）；アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＪＭ７８９）ｇｉ｜１５１９４０８７９｜ｇｂ｜ＥＤＮ５９２６１．１｜（１５１９４０８７９）；Ｉｌｖ５ｐ：アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｇｉ｜６０９４０３｜ｇｂ｜ＡＡＢ６７７５３．１｜（６０９４０３）；ＡＣＬ１９８Ｗｐ（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ  ＡＴＣＣ  １０８９５）ｇｉ｜４５１８５４９０｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿９８３２０６．１｜（４５１８５４９０）；ＡＣＬ１９８Ｗｐ（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ  ＡＴＣＣ  １０８９５）ｇｉ｜４４９８１２０８｜ｇｂ｜ＡＡＳ５１０３０．１｜（４４９８１２０８）；アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ；Ｉｌｖ５ｘ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｇｉ｜９５７２３８｜ｇｂ｜ＡＡＢ３３５７９．１｜｜ｂｂｍ｜３６９０６８｜ｂｂｓ｜１６５４０６（９５７２３８）；アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ；Ｉｌｖ５ｇ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｇｉ｜９５７２３６｜ｇｂ｜ＡＡＢ３３５７８．１｜｜ｂｂｍ｜３６９０６４｜ｂｂｓ｜１６５４０５（９５７２３６）；およびケトール酸レダクトイソメラーゼ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ｇｉ｜２６９６６５４｜ｄｂｊ｜ＢＡＡ２４０００．１｜（２６９６６５４）が含まれ、受託番号に関連づけられる各配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１４】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼは、イソロイシンおよびバリンの生合成における第４のステップ、２，３−ジヒドロキシ−イソ吉草酸（ｉｓｏｖａｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）のアルファ−ケトイソ吉草酸への脱水を触媒する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＩｌｖＤ（配列番号４９および配列番号５０を参照されたい）およびｉｌｖ３は、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼのホモログおよび変異体は公知であり、それらとしては、例えば、ＩｌｖＤ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）ｇｉ｜２１０４５９４｜ｅｍｂ｜ＣＡＢ０８７９８．１｜（２１０４５９４）；ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ  ｗｈｉｐｐｌｅｉ  ＴＷ０８／２７）ｇｉ｜２８４１０８４８｜ｅｍｂ｜ＣＡＤ６７２３４．１｜（２８４１０８４８）；ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）ｇｉ｜１３０９３８３７｜ｅｍｂ｜ＣＡＣ３２１４０．１｜（１３０９３８３７）；ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（Ｒｈｏｄｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ  ｂａｌｔｉｃａ  ＳＨ  １）ｇｉ｜３２４４７８７１｜ｅｍｂ｜ＣＡＤ７７３８９．１｜（３２４４７８７１）；および推定ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＲＳＡ２５２）ｇｉ｜４９２４２４０８｜ｅｍｂ｜ＣＡＧ４１１２１．１｜（４９２４２４０８）が含まれ、受託番号に関連づけられる各配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１５】
２−ケト酸デカルボキシラーゼは、２−ケト酸の、それぞれのアルデヒドへの変換を触媒する。例えば、２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼは、２−ケトイソバレレートのイソブチルアルデヒドへの変換を触媒する。いくつもの２−ケト酸デカルボキシラーゼが公知であり、ｐｄｃ遺伝子、ｐｄｃ１遺伝子、ｐｄｃ５遺伝子、ｐｄｃ６遺伝子、ａｒｏ１０遺伝子、ｔｈＩ３遺伝子、ｋｄｃＡ遺伝子およびｋｉｖｄ遺伝子によって例示される。２−ケト酸をそれぞれのアルデヒドに変換するために有用な例示的なホモログおよび変異体は、以下の受託番号で示される配列および同定された酵素活性を含む：ｇｉ｜４４９２１６１７｜ｇｂ｜ＡＡＳ４９１６６．１｜分岐鎖アルファ−ケト酸デカルボキシラーゼ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）；ｇｉ｜１５００４７２９｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿１４９１８９．１｜ピルビン酸デカルボキシラーゼ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  ８２４）；ｇｉ｜８２７４９８９８｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿４１５６３９．１｜推測ピルビン酸デカルボキシラーゼ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＲＦ１２２）；ｇｉ｜７７９６１２１７｜ｒｅｆ｜ＺＰ＿００８２５０６０．１｜ＣＯＧ３９６１：ピルビン酸デカルボキシラーゼおよび関連するチアミンピロリン酸要求酵素（ｔｈｉａｍｉｎｅ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ）（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｍｏｌｌａｒｅｔｉｉ  ＡＴＣＣ  ４３９６９）；ｇｉ｜７１０６５４１８｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿２６４１４５．１｜推定ピルビン酸デカルボキシラーゼ（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｒｃｔｉｃｕｓ  ２７３−４）；ｇｉ｜１６７６１３３１｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿４５６９４８．１｜推定デカルボキシラーゼ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉ  ｓｔｒ．ＣＴ１８）；ｇｉ｜９３００５７９２｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿５８０２２９．１｜ピルビン酸デカルボキシラーゼ（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｙｏｈａｌｏｌｅｎｔｉｓ  Ｋ５）；ｇｉ｜２３１２９０１６｜ｒｅｆ｜ＺＰ＿００１１０８５０．１｜ＣＯＧ３９６１：ピルビン酸デカルボキシラーゼおよび関連するチアミンピロリン酸要求酵素（Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  ＰＣＣ  ７３１０２）；ｇｉ｜１６４１７０６０｜ｇｂ｜ＡＡＬ１８５５７．１｜ＡＦ３５４２９７＿１ピルビン酸デカルボキシラーゼ（Ｓａｒｃｉｎａ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌｉ）；ｇｉ｜１５６０７９９３｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿２１５３６８．１｜推測ピルビン酸デカルボキシラーゼまたはインドール−３−ピルビン酸デカルボキシラーゼｐｄｃ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖ）；ｇｉ｜４１４０６８８１｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿９５９７１７．１｜ｐｄｃ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｋ−１０）；ｇｉ｜９１７７９９６８｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿５５５１７６．１｜推定ピルビン酸デカルボキシラーゼ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ  ＬＢ４００）；ｇｉ｜１５８２８１６１｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿３０２４２４．１｜ピルビン酸（またはインドールピルビン���）デカルボキシラーゼ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ  ＴＮ）；ｇｉ｜１１８６１６１７４｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿９０４５０６．１｜ピルビン酸デカルボキシラーゼまたはインドール−３−ピルビン酸デカルボキシラーゼＰｄｃ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒａｎｓ  Ａｇｙ９９）；ｇｉ｜６７９８９６６０｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿００１０１８１８５．１｜ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＳＰＡＣ３Ｈ８．０１（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ  ９７２ｈ−）；ｇｉ｜２１６６６０１１｜ｇｂ｜ＡＡＭ７３５４０．１｜ＡＦ２８２８４７＿１ピルビン酸デカルボキシラーゼＰｄｃＢ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）；ｇｉ｜６９２９１１３０｜ｒｅｆ｜ＺＰ＿００６１９１６１．１｜ピルビン酸デカルボキシラーゼ：ピルビン酸デカルボキシラーゼ（Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ  ＳＲＳ３０２１６）；ｇｉ｜６６３６３０２２｜ｒｅｆ｜ＸＰ＿６２８４７７．１｜ピルビン酸デカルボキシラーゼ（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ  Ｉｏｗａ  ＩＩ）；ｇｉ｜７０９８１３９８｜ｒｅｆ｜ＸＰ＿７３１４８１．１｜ピルビン酸デカルボキシラーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ  Ａｆ２９３）；ｇｉ｜１２１７０４２７４｜ｒｅｆ｜ＸＰ＿００１２７０４０１．１｜ピルビン酸デカルボキシラーゼ、推定（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ  ＮＲＲＬ１）；ｇｉ｜１１９４６７０８９｜ｒｅｆ｜ＸＰ＿００１２５７３５１．１｜ピルビン酸デカルボキシラーゼ、推定（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ  ＮＲＲＬ１８１）；ｇｉ｜２６５５４１４３｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿７５８０７７．１｜ピルビン酸デカルボキシラーゼ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｅｎｅｔｒａｎｓ  ＨＦ−２）；ｇｉ｜２１６６６００９｜ｇｂ｜ＡＡＭ７３５３９．１｜ＡＦ２８２８４６＿１ピルビン酸デカルボキシラーゼＰｄｃＡ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）。
【０１１６】
アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈ）は、アミノ酸異化の最終的なステップである、アルデヒドから長鎖または複雑なアルコールへの変換を触媒する。種々のａｄｈ遺伝子が当技術分野で公知である。本明細書で示されている通り、ａｄｈ１のホモログおよび変異体としては、例えば、ａｄｈ２、ａｄｈ３、ａｄｈ４、ａｄｈ５、ａｄｈ６およびｓｆａ１が含まれる（例えば、ＳＦＡ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｇｉ｜２８８５９１｜ｅｍｂ｜ＣＡＡ４８１６１．１｜（２８８５９１）を参照されたい；受託番号に関連づけられる配列は、参照により本明細書に組み込まれ、配列番号４０および配列番号４１も参照されたい）。
【０１１７】
シトラマル酸シンターゼは、ピルビン酸と酢酸の縮合を触媒する。例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（配列番号６１および配列番号６２）またはＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ（配列番号７３および配列番号７４）ではＣｉｍＡがシトラマル酸シンターゼをコードする。ホモログおよび変異体が公知であり、それらとしては、例えば、シトラマル酸シンターゼ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｂｉｆｌｅｘａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｐａｔｏｃ）ｇｉ｜１１６６６４６８７｜ｇｂ｜ＡＢＫ１３７５７．１｜（１１６６６４６８７）；シトラマル酸シンターゼ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｂｉｆｌｅｘａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｍｏｎｔｅｒａｌｅｒｉｏ）ｇｉ｜１１６６６４６８５｜ｇｂ｜ＡＢＫ１３７５６．１｜（１１６６６４６８５）；シトラマル酸シンターゼ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｈｅｂｄｏｍａｄｉｓ）ｇｉ｜１１６６６４６８３｜ｇｂ｜ＡＢＫ１３７５５．１｜（１１６６６４６８３）；シトラマル酸シンターゼ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｐｏｍｏｎａ）ｇｉ｜１１６６６４６８１｜ｇｂ｜ＡＢＫ１３７５４．１｜（１１６６６４６８１）；シトラマル酸シンターゼ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ａｕｓｔｒａｌｉｓ）ｇｉ｜１１６６６４６７９｜ｇｂ｜ＡＢＫ１３７５３．１｜（１１６６６４６７９）；シトラマル酸シンターゼ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ａｕｔｕｍｎａｌｉｓ）ｇｉ｜１１６６６４６７７｜ｇｂ｜ＡＢＫ１３７５２．１｜（１１６６６４６７７）；シトラマル酸シンターゼ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）ｇｉ｜１１６６６４６７５｜ｇｂ｜ＡＢＫ１３７５１．１｜（１１６６６４６７５）；シトラマル酸シンターゼ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｃａｎｉｃｏｌａ）ｇｉ｜１１６６６４６７３｜ｇｂ｜ＡＢＫ１３７５０．１｜（１１６６６４６７３）；シトラマル酸シンターゼ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｌａｉ）ｇｉ｜１１６６６４６７１｜ｇｂ｜ＡＢＫ１３７４９．１｜（１１６６６４６７１）；ＣｉｍＡ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｍｅｙｅｒｉ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｓｅｍａｒａｎｇａ）ｇｉ｜１１９７２０９８７｜ｇｂ｜ＡＢＬ９８０３１．１｜（１１９７２０９８７）；（Ｒ）−シトラマル酸シンターゼｇｉ｜２４９２７９５｜ｓｐ｜Ｑ５８７８７．１｜ＣＩＭＡ＿ＭＥＴＪＡ（２４９２７９５）；（Ｒ）−シトラマル酸シンターゼｇｉ｜２２０９５５４７｜ｓｐ｜Ｐ５８９６６．１｜ＣＩＭＡ＿ＭＥＴＭＡ（２２０９５５４７）；（Ｒ）−シトラマル酸シンターゼｇｉ｜２２００１５５４｜ｓｐ｜Ｑ８ＴＪＪ１．１｜ＣＩＭＡ＿ＭＥＴＡＣ（２２００１５５４）；（Ｒ）−シトラマル酸シンターゼｇｉ｜２２００１５５３｜ｓｐ｜Ｏ２６８１９．１｜ＣＩＭＡ＿ＭＥＴＴＨ（２２００１５５３）；（Ｒ）−シトラマル酸シンターゼｇｉ｜２２００１５５５｜ｓｐ｜Ｑ８ＴＹＢ１．１｜ＣＩＭＡ＿ＭＥＴＫＡ（２２００１５５５）；（Ｒ）−シトラマル酸��ンターゼ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２）ｇｉ｜４５３５８５８１｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿９８８１３８．１｜（４５３５８５８１）；（Ｒ）−シトラマル酸シンターゼ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２）ｇｉ｜４４９２１３３９｜ｅｍｂ｜ＣＡＦ３０５７４．１｜（４４９２１３３９）；および（Ｒ）−シトラマル酸シンターゼ（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｋｕｅｎｅｎｉａ  ｓｔｕｔｔｇａｒｔｉｅｎｓｉｓ）ｇｉ｜９１２０３５４１｜ｅｍｂ｜ＣＡＪ７１１９４．１｜（９１２０３５４１）の類似物が含まれ、前述の受託番号に関連づけられる各配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１８】
本発明のデアミナーゼとしては、例えば、アスパラギン酸アンモニアリアーゼ（４．３．１．１）、Ｌ−セリンアンモニアリアーゼ（Ｅ．Ｃ．４．３．１．１７）、Ｄ−セリンアンモニアリアーゼ（４．３．１．１８）、トレオニンアンモニアリアーゼ（Ｅ．Ｃ．４．３．１．１９）、チロシンアンモニアリアーゼ（Ｅ．Ｃ．４．３．１．２３）、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（Ｅ．Ｃ．４．３．１．２４）、およびフェニルアラニン／チロシンアンモニアリアーゼ（Ｅ．Ｃ．４．３．１．２５）が含まれる。ホモログおよび変異体が公知であり、それらとしては、例えば、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｒｕｅｇｅｒｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｔｈｉｏａｌｋａｌｉｖｉｂｒｉｏ、Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａなどから単離されたホモログおよび変異体が含まれる。特定の実施形態では、デアミナーゼ遺伝子はｓｄａＢである。Ｅ．ｃｏｌｉのｓｄａＢ遺伝子のヌクレオチド配列およびその対応するアミノ酸配列は、配列番号１１７および配列番号１１８に記載されている。
【０１１９】
本発明のデヒドロゲナーゼとしては、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）（Ｅ．Ｃ．１．４．１．２およびＥ．Ｃ．１．４．１．４）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）（Ｅ．Ｃ．１．４．１．３）、バリンデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．４．１．８）、ロイシンデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．４．１．９）、および／またはフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．４．１．２０）が含まれる。特定の実施形態では、ロイシンデヒドロゲナーゼはＬｅｕＤＨであり、それはＴｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ由来であってよい（配列番号１１９および配列番号１２０）。追加的なホモログおよび変異体は当技術分野で周知である。
【０１２０】
本発明のトランスアミナーゼとしては、例えば、Ｌ−α−トランスアミナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．Ｘ、Ｘは任意の数である）が含まれる。ある特定の実施形態では、Ｌ−α−トランスアミナーゼは、Ｌ−アスパラギン酸トランスアミナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．１）、Ｌ−アラニントランスアミナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．１２およびＥ．Ｃ．２．６．１．４７）、Ｌ−アスパラギントランスアミナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．１４）、またはグリシントランスアミナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．３５）である。特定の実施形態では、Ｌ−アスパラギン酸トランスアミナーゼはＡｖｔＡである。ＡｖｔＡ遺伝子は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ、またはＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ由来であってよい。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＡｖｔＡのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は配列番号１２１および配列番号１２２として提供されている。
【０１２１】
一実施形態では、本開示の微生物は、ｒｒｎＢＴ１４ＤｌａｃＺＷＪ１６  ｈｓｄＲ５１４  ＤａｒａＢＡＤＡＨ３３  ＤｒｈａＢＡＤＬＤ７８（ｌａｃＩｑを供給するためにＸＬ−１  ｂｌｕｅから形質導入されたＦ’を有する）、ΔａｄｈＥ、ΔｌｄｈＡ、ΔｆｒｄＢＣ、Δｆｎｒ、ΔｐｔａおよびΔｐｆｌＢを含み、プラスミドｐＳＡ５５およびｐＳＡ６９を含有するＥ．ｃｏｌｉと特徴付けることができ、プラスミドｐＳＡ５５は、ｐＬｌａｃＯ１およびアンピシリン耐性遺伝子の制御下にある、ｋｉｖｄ遺伝子（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、配列番号３１および配列番号３２）およびａｄｈ２遺伝子（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、配列番号４１および４２））を有するＣｏｌＥ１起点由来プラスミドであり、プラスミドｐＳＡ６９は、ｐＬｌａｃＯ１およびカナマイシン耐性遺伝子の制御下にある、ａｌｓＳ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ；配列番号８５および配列番号８６）、ｉｌｖＣ遺伝子（Ｅ．ｃｏｌｉ；配列番号４７および配列番号４８）およびｉｌｖＤ遺伝子（Ｅ．ｃｏｌｉ；配列番号４９および配列番号５０）を有するｐ１５Ａ起点由来プラスミドである。
【０１２２】
別の実施形態では、本開示の微生物は、ｒｒｎＢＴ１４ＤｌａｃＺＷＪ１６  ｈｓｄＲ５１４  ＤａｒａＢＡＤＡＨ３３  ＤｒｈａＢＡＤＬＤ７８（ｌａｃＩｑを供給するためにＸＬ−１  ｂｌｕｅから形質導入されたＦ’を有する）、ΔｍｅｔＡ、Δｔｄｈ、ΔｉｌｖＢ、ΔｉｌｖＩおよびΔａｄｈＥを含み、プラスミドｐＣＳ４９、ｐＳＡ６２およびｐＳＡ５５Ｉを伴うＥ．ｃｏｌｉと特徴付けることができ、プラスミドｐＳＡ５５Ｉは、ｐＬｌａｃＯ１およびアンピシリン耐性遺伝子の制御下にあり、アンピシリン耐性遺伝子の後にｌａｃＩを伴う、ｋｉｖｄ遺伝子（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）およびａｄｈ２遺伝子（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を有するＣｏｌＥ１起点由来プラスミドを含み、プラスミドｐＳＡ６２は、ｐＬｌａｃＯ１およびカナマイシン耐性遺伝子の制御下にあるｉｌｖＡ遺伝子（Ｅ．ｃｏｌｉ；配列番号５１および配列番号５２）およびｌｅｕＡＢＣＤ（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子（ｌｅｕＡ、ｌｅｕＢ、ｌｅｕＣおよびｌｅｕＤの個々のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は配列番号５３〜配列番号６０、および配列番号７５〜８０として提供されている）を有するｐ１５Ａ起点由来プラスミドであり、プラスミドｐＣＳ４９は、ｐＬｌａｃＯ１およびスペクチノマイシン耐性遺伝子の制御下にあるｔｈｒＡ（ｆｂｒ）ＢＣ（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子を有するｐＳＣ１０１＊起点由来プラスミドである。
【０１２３】
多数の異なる生物由来の配列を含むデータベースを検索する際には、アミノ酸配列を比較することが典型的である。アミノ酸配列を用いたデータベースの検索は、当技術分野で公知のｂｌａｓｔｐ以外のアルゴリズムによって評価することができる。例えば、ポリペプチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるＦＡＳＴＡを使用して比較することができる。ＦＡＳＴＡにより、クエリ配列と検索配列の間の最良のオーバーラップ領域のアラインメントおよび％配列同一性がもたらされる（Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９０年）、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １８３巻：６３〜９８頁、これにより、参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、アミノ酸配列間の％配列同一性は、これにより、参照により本明細書に組み込まれるＧＣＧバージョン６．１において提供されるＦＡＳＴＡを、その初期状態のパラメータ（ワードサイズ（ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ）２およびＰＡＭ２５０スコアリング行列）で使用して決定することができる。
【０１２４】
さまざまな微生物を、例えば、種々の化学的実体の生成に適した組換え代謝経路を含むように改変することができることが理解される。種々の微生物が、本明細書において提供される組換え微生物において使用するために適した標的酵素をコードする遺伝物質の「供給源」としての機能を果たし得ることも理解される。「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」という用語は、古細菌、細菌およびユーカリアのドメイン由来の原核微生物種および真核微生物種を含み、真核微生物種は酵母および糸状菌、原生生物、藻類、または高等原生生物を含む。「微生物細胞」および「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」という用語は、微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）という用語と互換的に使用される。
【０１２５】
「原核生物」という用語は当技術分野において認められており、核または他の細胞小器官を含有する細胞を指す。原核生物は、一般に、２つのドメイン、細菌および古細菌のうちの１つに分類される。古細菌ドメインの生物と細菌ドメインの生物の間の決定的な差異は、１６ＳリボソームＲＮＡにおけるヌクレオチド塩基配列の基本的な差異に基づく。
【０１２６】
「古細菌」という用語は、一般には、普通でない環境において見いだされ、残りの原核生物とは、リボソームタンパク質の数および細胞壁におけるムラミン酸の欠如を含むいくつかの基準により区別されるメンドシクテス門の生物のカテゴリー化を指す。ｓｓｒＲＮＡ解析に基づいて、古細菌は、２つの系統学的に別個の群：クレンアーケオタ門およびユリアーケオタ門からなる。それらの生理機能に基づいて、古細菌は、３種：メタン生成菌（メタンを生成する原核生物）；高度好塩菌（非常に高塩（（ＮａＣｌ）濃度で生存する原核生物）；および高度（超）好熱菌（非常に高温で生存する原核生物）に組織化され得る。古細菌を細菌と区別する統一的な古細菌の特徴（すなわち、細胞壁にムレインがないこと、エステル連結膜脂質など）に加えて、これらの原核生物は、それらを特定の生息地に適合させる独特の構造的属性または生化学的属性を示す。クレンアーケオタ門は、主に超好熱性硫黄依存性原核生物からなり、ユリアーケオタ門は、メタン生成菌および高度好塩菌を含有する。
【０１２７】
「細菌」または「真正細菌」とは、原核生物のドメインを指す。細菌としては以下の少なくとも１１種の別個の群が含まれる：（１）グラム陽性（ｇｒａｍ＋）細菌、これには２つの主要な細区分：（１）高Ｇ＋Ｃ群（放線菌類、マイコバクテリア、ミクロコッカス、およびその他）（２）低Ｇ＋Ｃ群（バチルス、クロストリジア、ラクトバチルス、ブドウ球菌、連鎖球菌、マイコプラズマ）が存在する；（２）プロテオバクテリア、例えば、紫色光合成＋非光合成グラム陰性細菌（大多数の「一般的な」グラム陰性細菌を含む）；（３）シアノバクテリア、例えば、酸素発生型光合成生物；（４）スピロヘータおよび関連する種；（５）プランクトミセス；（６）バクテロイデス、フラボバクテリア；（７）クラミジア；（８）緑色硫黄細菌；（９）緑色非硫黄細菌（嫌気性光合成生物も）；（１０）放射線抵抗性の小球菌および類縁体；（１１）サーモトガおよびＴｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ。
【０１２８】
「グラム陰性細菌」は、球菌、非腸内桿菌、および腸内桿菌を含む。グラム陰性細菌の属としては、例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、およびＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍが含まれる。
【０１２９】
「グラム陽性細菌」は、球菌、非胞子形成桿菌、および胞子形成桿菌を含む。グラム陽性細菌の属としては、例えば、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが含まれる。
【０１３０】
「組換え微生物」および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書では互換的に使用され、内在性ポリヌクレオチドを発現または過剰発現するように、または非内在性配列、例えば、ベクター内に含まれる配列などを発現するように遺伝子改変された微生物、または内在性遺伝子の発現が低下している微生物を指す。一般には、ポリヌクレオチドは、上記の所望の代謝産物を生成するための代謝経路に関与する標的酵素をコードする。したがって、本明細書に記載の組換え微生物は、親の微生物によって以前発現または過剰発現されていなかった標的酵素を発現または過剰発現するように遺伝子操作されている。「組換え微生物」および「組換え宿主細胞」という用語は、特定の組換え微生物だけでなく、そのような微生物の後代または潜在的な後代も指すことが理解される。
【０１３１】
「親の微生物」とは、組換え微生物を作製するために用いる細胞を指す。「親の微生物」という用語は、天然に存在する細胞、すなわち、遺伝子改変されていない「野生型」細胞を説明する。「親の微生物」という用語は、遺伝子改変されているが、標的酵素、例えば、所望の代謝産物を生成するための生合成経路に関与する酵素を発現または過剰発現しない細胞も説明する。例えば、野生型微生物は、チオラーゼなどの第１の標的酵素を発現または過剰発現するように遺伝子改変することができる。この微生物は、第２の標的酵素、例えば、ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼを発現または過剰発現するように改変された微生物の作製において親の微生物としての機能を果たし得る。今度は、例えば、チオラーゼおよびヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼを発現または過剰発現するように改変された微生物を、第３の標的酵素、例えば、クロトナーゼを発現または過剰発現するように改変することができる。したがって、親の微生物は、連続的な遺伝子改変事象の参照細胞として機能する。各改変事象は、参照細胞に核酸分子を導入することによって実現することができる。導入により、標的酵素の発現または過剰発現が容易になる。「容易になる」という用語は、例えば、親の微生物におけるプロモーター配列の遺伝子改変により、標的酵素をコードする内在性ポリヌクレオチドが活性化されることを含むことが理解される。さらに、「容易になる」という用語は、親の微生物に標的酵素をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することを含むことが理解される。
【０１３２】
別の実施形態では、適切な炭素基質を、例えば、１−プロパノール、イソブタノール、１−ブタノール、２−メチル１−ブタノール、３−メチル１−ブタノールまたは２−フェニルエタノールに変換する組換え微生物を作出する方法が提供される。該方法は、例えば、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（例えば、ｉｌｖＩＨオペロン）、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（例えば、ｉｌｖＣ）、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（例えば、ｉｌｖＤ）、２−ケト酸デカルボキシラーゼ（例えば、ＰＤＣ６、ＡＲＯ１０、ＴＨＩ３、ｋｉｖｄ、またはｐｄｃ）、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（例えば、ｌｅｕＡ）、ベータ−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（例えば、ｌｅｕＢ）、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ（例えば、ｌｅｕＣＤオペロン）、トレオニンデヒドラターゼ（例えば、ｉｌｖＡ）、アルファ−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（例えば、ｃｉｍＡ）、ベータ−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（例えば、ｌｅｕＢ）、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ（例えば、ｌｅｕＣＤオペロン）、トレオニンデヒドラターゼ（例えば、ｉｌｖＡ）、アセト乳酸シンターゼ（例えば、ｉｌｖＭＧまたはｉｌｖＮＢ）、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（例えば、ｉｌｖＣ）、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（例えば、ｉｌｖＤ）、ベータ−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（例えば、ｌｅｕＢ）、コリスミ酸ムターゼＰ／プレフェナートデヒドラターゼ（例えば、ｐｈｅＡ、例えば、配列番号８１および配列番号８２で示されるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列など）、コリスミ酸ムターゼＴ／プレフェナートデヒドロゲナーゼ（例えば、ｔｙｒＡ、例えば、配列番号８３および配列番号８４で示されるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列など））、２−ケト酸デカルボキシラーゼ（例えば、ｋｉｖｄ、ＰＤＣ６、またはＴＨＩ３）、およびアルコール脱水素酵素活性を含むポリペプチドをコードする１つまたは複数の組換えポリヌクレオチドを用いて微生物を形質転換することを含む。ホモログ、変異体、断片、関連する融合タンパク質、またはそれらの機能的等価物を含む代謝産物を発生させるために有用な酵素をコードするポリヌクレオチドが、細菌細胞または酵母細胞などの適切な宿主細胞におけるそのようなポリペプチドの発現を導く組換え核酸分子に使用される。コードされるポリヌクレオチドの活性を変更しない配列の付加、例えば、非機能性配列または非コード配列の付加などは、基本的な核酸の保存された変形であることが理解される。酵素の「活性」とは、代謝産物をもたらす反応を触媒するその能力、すなわち、「機能」する能力の測定値であり、反応の代謝産物が生成する速度として表すことができる。例えば、酵素活性は、時間の単位当たりまたは酵素の単位当たり（例えば、濃度または重量）の、生成した代謝産物の量として、または親和性または解離定数を単位として示すことができる。特定の実施形態では、該方法は、ｇｌｎＡ、ｇｄｈＡ、ｌｓｒＡ、ｌｕｘＳまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子の発現をノックアウトすることも含む。
【０１３３】
さらに別の実施形態では、適切な炭素基質を、例えば、アジピン酸、ガンマ−アミノ酪酸（ａｍｉｎｏｂｕｙｔｒｉｃ  ａｃｉｄ）に変換する組換え微生物を生成する方法が提供される。該方法は、１つまたは複数の組換えポリヌクレオチドを用いて微生物を形質転換することを含む。該方法は、ある特定の実施形態では、ｇｌｎＡ、ｇｄｈＡ、ｌｓｒＡ、ｌｕｘＳまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子の発現をノックアウトすることも含み得る。
【０１３４】
「タンパク質」または「ポリペプチド」という用語は、本明細書では互換的に使用され、ペプチド結合と称される化学的な結合によって連結した、１つまたは複数のアミノ酸と称される化学的構成要素の鎖を含む。「酵素」とは、完全に、または大部分が、おおよそ具体的には、１つまたは複数の化学的反応または生化学的反応を触媒または促進するタンパク質で構成される任意の物質を意味する。「酵素」という用語は、触媒性ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）も指す場合がある。「ネイティブな」または「野生型」タンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、遺伝子、または細胞とは、天然に存在するタンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、遺伝子、または細胞を意味する。
【０１３５】
上記のポリヌクレオチドは「遺伝子」を含むこと、および上記の核酸分子は「ベクター」または「プラスミド」を含むことが理解される。例えば、ケトチオラーゼをコードするポリヌクレオチドは、ａｔｏＢ遺伝子もしくはそのホモログ、またはｆａｄＡ遺伝子もしくはそのホモログによりコードされ得る。したがって、「構造遺伝子」とも称される「遺伝子」という用語は、１つまたは複数のタンパク質または酵素の全部または一部を含む特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを指し、例えば遺伝子を発現させる条件を決定する、プロモーター配列などの調節性（転写されない）ＤＮＡ配列を含んでもよい。遺伝子の転写領域は、イントロン、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、および３’−ＵＴＲ、ならびにコード配列を含む非翻訳領域を含んでよい。「核酸」または「組換え核酸」という用語は、ポリヌクレオチド、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、および適切な場合にはリボ核酸（ＲＮＡ）などを指す。「発現」という用語は、遺伝子配列に関しては、遺伝子の転写、および必要に応じて、生じたｍＲＮＡ転写物のタンパク質への翻訳を指す。したがって、文脈から明らかになる通り、タンパク質の発現は、オープンリーディングフレーム配列が転写され、翻訳されることによってもたらされる。
【０１３６】
「オペロン」という用語は、共通のプロモーターにより単一の転写単位として転写される２種以上の遺伝子を指す。いくつかの実施形態では、オペロンを含む遺伝子は連続した遺伝子である。共通のプロモーターを改変することによりオペロン全体の転写を改変する（すなわち、増加させる、減少させる、または排除する）ことができることが理解される。あるいは、オペロン内の任意の遺伝子または遺伝子の組み合わせを改変して、コードされるポリペプチドの機能または活性を変更することができる。改変の結果、コードされるポリペプチドの活性を増大させることができる。さらに、改変により、コードされるポリペプチドに新規の活性を与えることができる。例示的な新規の活性は、代替基質の使用および／または代替環境条件において機能する能力を含む。
【０１３７】
「ベクター」は、生物、細胞、または細胞構成要素の間で核酸を伝播および／または伝達することができる任意の手段である。ベクターとしては、「エピソーム」である、すなわち自律的に複製する、または宿主細胞に染色体に組み込まれ得るウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、プラスミド、ファージミド、トランスポゾン、および人工染色体、例えば、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（細菌人工染色体）、およびＰＬＡＣ（植物人工染色体）などが含まれる。ベクターは、天然ではエピソームではない裸のＲＮＡポリヌクレオチド、裸のＤＮＡポリヌクレオチド、同じ鎖内のＤＮＡおよびＲＮＡの両方で構成されるポリヌクレオチド、ポリリシンとコンジュゲートしたＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチドとコンジュゲートしたＤＮＡまたはＲＮＡ、リポソームとコンジュゲートしたＤＮＡなどであってよい、または上記のポリヌクレオチド構築物のうちの１つまたは複数を含む生物、例えば、アグロバクテリウムまたは細菌などであってよい。
【０１３８】
「形質転換」とは、ベクターを宿主細胞に導入するプロセスを指す。形質転換（または形質導入、またはトランスフェクション）は、電気穿孔、マイクロインジェクション、微粒子銃（または粒子衝撃媒介性送達）、またはアグロバクテリウム媒介性形質転換を含むいくつもの手段のうちの任意の１つによって実現することができる。
【０１３９】
当業者には、遺伝暗号の縮退性に起因して、ヌクレオチド配列が異なる種々のＤＮＡ化合物が、本開示の所与のアミノ酸配列をコードするために使用され得ることが理解されるであろう。上記の生合成酵素をコードするネイティブなＤＮＡ配列は、ただ単に本開示の実施形態を例示するために本明細書において参照されており、本開示は、本開示の方法において利用される酵素のポリペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列をコードする任意の配列のＤＮＡ化合物を含む。同様に、ポリペプチドは、一般には、所望の活性を損失または著しく損失することなく、そのアミノ酸配列において１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、および挿入を許容し得る。本開示は、代替のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、本明細書において示されているＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列は、ただ単に本開示の複数の実施形態を例示するものである。
【０１４０】
本開示は、下により詳細に記載されている、１つまたは複数の標的酵素をコードする、組換えＤＮＡ発現ベクターまたはプラスミドの形態の核酸分子を提供する。一般に、そのようなベクターは、宿主微生物の細胞質において複製することができるか、または宿主微生物の染色体ＤＮＡに組み込むことができる。いずれの場合も、ベクターは安定ベクター（すなわち、ベクターは、たとえ選択圧力のみを伴うとしても、多くの細胞分裂を越えて存在するままである）であってよい、または一過性ベクター（すなわち、ベクターは、細胞分裂の数が増えるにつれて宿主微生物から徐々に失われる）であってよい。本開示は、ＤＮＡ分子を、単離され（すなわち、純粋ではないが、天然では見いだされない存在量／または濃度で調製物中に存在する）、精製された（すなわち、混入材料を実質的に含まない、または天然で対応するＤＮＡが一緒に見いだされる材料を実質的に含まない）形態で提供する。
【０１４１】
本明細書では、アルコール（例えば、１−プロパノール、イソブタノール、１−ブタノール、２−メチル１−ブタノール、３−メチル１−ブタノールまたは２−フェニルエタノールなど）、アセトアルデヒド、アセテート、イソブチルアルデヒド、イソ酪酸、ｎ−ブチルアルデヒド、ｎ−酪酸、２−メチル−１−ブチルアルデヒド、２−メチル−１−酪酸、３−メチル−１−ブチルアルデヒド、３−メチル−１−酪酸、アンモニア、アンモニウム、グルタミン酸、トレオニン、メチオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、２−メチル−１，４−ブタンジオール、２−メチル−１，４−ブタンジアミン、イソブテン、イタコネート、アセトイン、アセトン、イソブテン、１，５−ジアミノペンタン、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、シキミ酸、メバロネート、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、イソプレノイド、脂肪酸、ホモアラニン、４−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、アジピン酸、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸、テトラヒドロフラン、３−メチル−テトラヒドロフラン、ガンマ−ブチロラクトン、ピロリジノン、ｎ−メチルピロリドン、アスパラギン酸、リシン、カダベリン、２−ケトアジピン酸、および／またはＳ−アデノシル−メチオニン（ＳＡＭ）などの生合成に関与する生合成遺伝子のうちの１つまたは複数を異種発現させるための方法および該方法において有用な組換えＤＮＡ発現ベクターが提供される。したがって、そのような核酸を含む組換え発現ベクターは本開示の範囲内に含まれる。「発現ベクター」という用語は、宿主微生物または無細胞の転写および翻訳系に導入することができる核酸を指す。発現ベクターは、染色体ＤＮＡ一部として、または微生物内もしくは任意の細胞区画内の他のＤＮＡ、例えば、細胞質内の複製性ベクターなどの一部としてのいずれにせよ、微生物内に恒久的にまたは一過性に維持することができる。発現ベクターはまた、一般に微生物または細胞抽出物においてポリペプチドに翻訳されるＲＮＡの発現を駆動するプロモーターも含む。ＲＮＡのタンパク質への効率的な翻訳のために、発現ベクターは、一般には、発現される遺伝子のコード配列の開始コドンの上流に位置するリボソーム結合部位配列も含有する。他のエレメント、例えば、エンハンサー、分泌シグナル配列、転写終結配列、およびベクターを含有する宿主微生物を同定および／または選択することができる１つまたは複数のマーカー遺伝子なども発現ベクターに存在してよい。選択可能マーカー、すなわち、抗生物質耐性または感度を付与する遺伝子を使用し、形質転換された細胞に、細胞を適切な選択培地で成長させた際に選択可能な表現型を付与する。
【０１４２】
発現ベクターの種々の構成要素は、ベクターおよびベクターが複製することまたは発現を駆動することが意図された宿主細胞（複数可）の意図された使用に応じて広範に変動し得る。Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、および他の一般に使用される細胞における遺伝子の発現およびベクターの維持に適した発現ベクターの構成要素は広く公知であり、市販されている。例えば、本開示の発現ベクターに含むための適切なプロモーターとしては、真核宿主微生物または原核宿主微生物において機能するプロモーターが含まれる。プロモーターは、宿主微生物の成長に対して発現の調節を可能にする、または化学的または物理的な刺激に応答して遺伝子の発現をオンまたはオフにする調節配列を含んでよい。Ｅ．ｃｏｌｉおよび特定の他の細菌宿主細胞について、生合成酵素、抗生物質耐性付与酵素、およびファージタンパク質の遺伝子に由来するプロモーターを使用することができ、それらとしては、例えば、ガラクトースプロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター、マルトースプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ベータ−ラクタマーゼ（ｂｌａ）プロモーター、バクテリオファージラムダＰＬプロモーター、およびＴ５プロモーターが含まれる。さらに、ｔａｃプロモーター（米国特許第４，５５１，４３３号）などの合成プロモーターも使用することができる。Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターについては、Ｅ．ｃｏｌｉ複製開始点、例えば、ｐＵＣ、ｐ１Ｐ、ｐ１、およびｐＢＲなどを含むことが有用である。
【０１４３】
したがって、組換え発現ベクターは、少なくとも１つの発現系を含有し、そして、その発現系は、適合性宿主細胞におけるコード配列の発現に影響を及ぼすように作動するプロモーターおよび場合によって終結配列に作動可能に連結したＰＫＳおよび／または他の生合成遺伝子のコード配列の少なくとも一部分で構成される。宿主細胞は、本開示の組換えＤＮＡ発現ベクターを用いて、発現系配列を染色体外エレメントとしてか、または染色体に組み込こんで含有するように形質転換によって改変する。
【０１４４】
本開示の核酸は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、あるいは鋳型としてゲノムＤＮＡ、および適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、標準のＰＣＲ増幅技法および下の実施例の節に記載されている手順に従って増幅することができる。そのように増幅された核酸は、適切なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列解析によって特徴付けることができる。さらに、ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準の合成法によって、例えば、自動ＤＮＡ合成機を使用して調製することができる。
【０１４５】
本明細書に記載の酵素と相同なポリペプチドをコードする単離された核酸分子を、１つまたは複数のアミノ酸の置換、付加または欠失がコードされるタンパク質に導入されるように、特定のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に１つまたは複数のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入することにより創出することができることも理解される。突然変異は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの標準の技法によってポリヌクレオチドに導入することができる。非保存的アミノ酸置換（上記を参照されたい）を行うことが望ましい位置とは対照的に、一部の位置では、保存的アミノ酸置換を行うことが好ましい。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基と交換されたものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。
【０１４６】
別の実施形態では、例えば、アルコール（例えば、１−プロパノール、イソブタノール、１−ブタノール、２−メチル１−ブタノール、３−メチル１−ブタノールまたは２−フェニルエタノールなど）、アセトアルデヒド、アセテート、イソブチルアルデヒド、イソ酪酸、ｎ−ブチルアルデヒド、ｎ−酪酸、２−メチル−１−ブチルアルデヒド、２−メチル−１−酪酸、３−メチル−１−ブチルアルデヒド、３−メチル−１−酪酸、アンモニア、アンモニウム、グルタミン酸、トレオニン、メチオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、２−メチル−１，４−ブタンジオール、２−メチル−１，４−ブタンジアミン、イソブテン、イタコネート、アセトイン、アセトン、イソブテン、１，５−ジアミノペンタン、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、シキミ酸、メバロネート、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、イソプレノイド、脂肪酸、ホモアラニン、４−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、アジピン酸、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸、テトラヒドロフラン、３−メチル−テトラヒドロフラン、ガンマ−ブチロラクトン、ピロリジノン、ｎ−メチルピロリドン、アスパラギン酸、リシン、カダベリン、２−ケトアジピン酸、および／またはＳ−アデノシル−メチオニン（ＳＡＭ）などを生成するための方法が提供される。該方法は、本明細書において提供される組換え微生物を適切な基質（例えば、窒素に富むバイオマス）の存在下、基質をアルコール（例えば、１−プロパノール、イソブタノール、１−ブタノール、２−メチル１−ブタノール、３−メチル１−ブタノールまたは２−フェニルエタノールなど）、アセトアルデヒド、アセテート、イソブチルアルデヒド、イソ酪酸、ｎ−ブチルアルデヒド、ｎ−酪酸、２−メチル−１−ブチルアルデヒド、２−メチル−１−酪酸、３−メチル−１−ブチルアルデヒド、３−メチル−１−酪酸、アンモニア、アンモニウム、グルタミン酸、トレオニン、メチオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、２−メチル−１，４−ブタンジオール、２−メチル−１，４−ブタンジアミン、イソブテン、イタコネート、アセトイン、アセトン、イソブテン、１，５−ジアミノペンタン、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、シキミ酸、メバロネート、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、イソプレノイド、脂肪酸、ホモアラニン、４−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、アジピン酸、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸、テトラヒドロフラン、３−メチル−テトラヒドロフラン、ガンマ−ブチロラクトン、ピロリジノン、ｎ−メチルピロリドン、アスパラギン酸、リシン、カダベリン、２−ケトアジピン酸、および／またはＳ−アデノシル−メチオニン（ＳＡＭ）などに変換するために適した条件下で培養することを含む。該方法は、藻類の脂質からバイオディーゼルを生成することを含む、より大きな生成系の一部としてバイオリアクター系内の組換え微生物を含んでよい。本明細書において提供される微生物により生成される生成物は、当業者に公知の任意の方法によって検出することができる。本明細書において提供される組換え微生物の成長および維持に適した培養条件は下記の実施例に記載されている。当業者には、そのような条件は、各微生物の要件に適応させるために改変することができることが理解されよう。
【０１４７】
以前考察されている通り、ベクターの使用、プロモーターおよび多くの他の関連性のある題目を含む本明細書において有用な分子生物学的技法が記載されている一般的なテキストとしては、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１５２巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）（「Ｂｅｒｇｅｒ」）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．（１９９９年中に捕捉された）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）が含まれる。当業者を、例えば、本開示の相同核酸を生成するための、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβ−レプリカーゼ増幅および他のＲＮＡポリメラーゼ媒介性技法（例えば、ＮＡＳＢＡ）を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅方法に導くために十分なプロトコールの例は、Ｂｅｒｇｅｒ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、およびＡｕｓｕｂｅｌにおいて、ならびにＭｕｌｌｉｓら（１９８７年）米国特許第４，６８３，２０２号；Ｉｎｎｉｓら編（１９９０年）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）（「Ｉｎｎｉｓ」）；Ａｒｎｈｅｉｍ  ＆  Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（１９９０年１０月１日）Ｃ＆ＥＮ  ３６〜４７頁；Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ＮＩＨ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１年）３巻：８１〜９４頁；Ｋｗｏｈら（１９８９年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６巻：１１７３頁；Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７巻：１８７４頁；Ｌｏｍｅｌｌら（１９８９年）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ  ３５巻：１８２６頁；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１巻：１０７７〜１０８０頁；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ（１９９０年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８巻：２９１〜２９４頁；ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ（１９８９年）Ｇｅｎｅ  ４：５６０；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら（１９９０年）Ｇｅｎｅ  ８９：１１７；およびＳｏｏｋｎａｎａｎおよびＭａｌｅｋ（１９９５年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３巻：５６３〜５６４頁において見いだされる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増幅された核酸をクローニングするための改善された方法は、Ｗａｌｌａｃｅら、米国特許第５，４２６，０３９号に記載されている。大きな核酸をＰＣＲによって増幅するための改善された方法は、Ｃｈｅｎｇら（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ  ３６９巻：６８４〜６８５頁およびそこに引用されている参考文献に要約されており、それによると最大４０ｋｂのＰＣＲアンプリコンが発生する。当業者は、基本的にいかなるＲＮＡも、逆転写酵素およびポリメラーゼを使用して、制限消化、ＰＣＲ増大および配列決定のために適した二本鎖ＤＮＡに変換することができることを理解されたい。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＢｅｒｇｅｒ、全て上記を参照されたい。
【０１４８】
適切な培養条件とは、宿主微生物による、すなわち、微生物の代謝的作用による化合物の生成を可能にする培地のｐＨ、イオン強度、栄養素含有量などの条件；温度；酸素／ＣＯ２／窒素の含有量；湿度；および他の培養条件である。宿主細胞としての機能を果たし得る微生物に対する適切な培養条件は周知である。
【０１４９】
２−ケト酸からアルコールを合成するために有用な方法、ベクターおよびポリヌクレオチドは、例えば、米国特許出願公開第２０１００２２１８００号および同第２０１００２０９９８６号、同第２００９００８１７４６号において開示されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、タンパク質性バイオマスから種々の有用な中間体を発生させる方法を提供し、これらの中間体は、その後、種々のアルコールおよび化学組成物に代謝され得る。
【０１５０】
本開示の組換え微生物を、下記の通りタンパク質性バイオマスなどの窒素含有バイオマスを種々の中間体に変換するように改変することができ、これらの中間体が今度は、追加的な化学物質および／またはバイオ燃料に変換され得る：
セリン、グリシン、アラニン、システイン＝＝＝＞ピルベート；
グルタミン酸、グルタミン、プロリン、アルギニン＝＝＝＝＞２−ＫＧ（２−ケトグルタレート）；
アスパラギン酸、アスパラギン＝＝＝＞ＯＡＡ（オキサロアセテート）；
トレオニン＝＝＝＞２−ＫＢ（２−ケトブチレート）；
バリン＝＝＝＞２−ＫＩＶ（２−ケトイソバレレート）；
ロイシン＝＝＝＝＞２−ＫＩＣ（２−ケトイソカプロエート）；および
イソロイシン＝＝＝＞２−ＫＭＶ（２−ケト−３−メチルバレレート）。
【０１５１】
バイオマスから上記の中間体を経由して生成した生成物は、組換え微生物または野生型微生物によって以下の通りさらに代謝され得る：
ピルベートが、エタノール、アセテート、アセトアルデヒド、イソブタノール、イソブチルアルデヒド、ｎ−ブタノール、ｎ−ブチルアルデヒド、２，３−ブタンジオール、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、芳香族物質（トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、シキミ酸）、ＰＨＢ（ポリヒドロキシブチレート）、メバロネート、イソプレノイド、脂肪酸および下に列挙されている全ての化学物質（他の中間体由来）に；
２−ＫＧ（２−ケトグルタレート）が、ＧＡＢＡ（４−アミノ酪酸）、グルタミン酸、スクシネート、リンゴ酸に；
ＯＡＡ（オキサロアセテート）が、アスパラギン酸、リシン、カダベリン、２−ケトアジピン酸、トレオニン、メチオニン、ＳＡＭ（Ｓ−アデノシルメチオニン）に；
２−ＫＢ（２−ケトブチレート）が、２−メチル−１−ブタノール、２−メチル−１−ブチルアルデヒド、イソロイシン、ホモアラニンに；
２−ＫＩＶ（２−ケトイソバレレート）が、イソブタノール、イソブチルアルデヒド、３−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブチルアルデヒド、バリンに；
２−ＫＩＣ（２−ケトイソカプロエート）が、３−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブチルアルデヒド、ロイシンに；および
２−ＫＭＶ（２−ケト−３−メチルバレレート）が、２−メチル−１−ブタノール、２−メチル−１−ブチルアルデヒド、イソロイシンに。
【０１５２】
本開示は以下の実施例に例示されており、これは、例示のために提供され、限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１５３】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの多用性が実証されているので、これを工学的操作の宿主生物として選択した。藻類のアミノ酸の利用についてのＥ．ｃｏｌｉの効率を試験するために、細胞を酵母抽出物または２０種のアミノ酸の混合物中で成長させ、それを用いて藻類抽出物をシミュレートした。予想通り、Ｅ．ｃｏｌｉはこれらの富栄養培地でよく成長した。しかし、アミノ酸の利用は、おそらくアミノ酸の不均衡および分枝鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）の分解経路の欠如に起因して、不完全であった。野生型Ｅ．ｃｏｌｉは４種のアミノ酸（Ａｌａ、Ａｓｐ、ＰｒｏおよびＧｌｎ）のみを個々に、コロニーを形成するための唯一の炭素源として利用することができた。イソブタノール合成経路（ａｌｓＳ遺伝子、ｉｌｖＣ遺伝子、ｉｌｖＤ遺伝子、ＫｉｖＤ遺伝子およびＡｄｈＡ遺伝子の過剰発現）をＥ．ｃｏｌｉに導入した場合、細胞は、Ｍ９塩を補充した４％酵母抽出物を含有する培地からイソブタノールを０．１７ｇ／Ｌのみ生成することができ（下記の表４）、これは理論収量の２．３％を示す。
【０１５４】
【表４−１】
2013544516.tif 000009
【０１５５】
【表４−２】
2013544516.tif 000010
アミノ酸の利用を改善するために、一連の化学的突然変異誘発を実施し、その後、単一のアミノ酸または多数のアミノ酸のいずれかで成長させた。突然変異誘発、富化、および選択の複数ラウンドの後、１３種に至るまでのアミノ酸を個々に唯一の炭素源として利用することができる株（ＹＨ１９）を得た。この株は、イソブタノール経路遺伝子の存在下で、同じ経路遺伝子を有する野生型宿主と比較して高量のイソブタノールを生成することができた。アミノ酸の利用をさらに改善するために、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて個々のアミノ酸の分解遺伝子を過剰発現させることにより、炭素フラックス駆動性手法を使用した。しかし、この手法では、おそらく炭素および窒素のフラックスを制御する種々の制御機構が原因で、小さな成功しか実現されなかった（図６Ａおよび６Ｂ）。
【０１５６】
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるネイティブな調節および競合する経路を非活性化してアミノ酸から高級アルコールをよりよく生成させることを可能にするために、さらなる遺伝子操作を実施した。炭素および窒素の代謝に対する潜在的な影響に基づいて標的遺伝子２０種を選択してノックアウトし、生成の改善についてスクリーニングした（図２Ａ）。これらのノックアウト株の中で、クオラムセンシング陰性突然変異体であるΔｌｓｒＡおよびΔｌｕｘＳがイソブタノール経路の存在下で生成の増加を示した（図２Ａ）。ＬｕｘＳはオートインデューサー−２（ＡＩ−２）シンターゼであり、ＬｓｒＡは、ＡＩ−２輸送体（ＬｓｒＡＢＣＤ）のサブユニットの１つである。この輸送体は、定常期への移行中の細胞外ＡＩ−２の再取り込みに関与する。ＹＨ１９からＬｕｘＳまたはＡＩ−２輸送体サブユニットをコードする遺伝子を欠失させることにより、バイオ燃料の生成が増加した（図２Ｂおよび２Ｃ）。ＡＩ−２の取り込みはグルコースによって阻害されるので、予測通り、グルコース培地ではこれらの欠失の影響はなかった。この欠失では、イソブタノール経路を有さない細胞においても有意な表現型は示されなかった。これらの結果は、後期成長期におけるＡＩ−２の再取り込みが、炭素および窒素の調節に関与する可能性があることを示唆している。アミノ酸の利用および燃料の生成におけるＡＩ−２系の役割は依然として特徴付けられていない。
【０１５７】
炭素フラックス駆動性戦略では限られた成功しか実現しなかったので、クオラムセンシングの非活性化に加えて、窒素中心の戦略について調査した。この戦略では、熱力学的勾配を所望の方向に駆動するために、炭素化合物の代わりにアンモニアの分泌を用いた。アンモニアの再取り込みを遮断するために、２種のアンモニウム同化遺伝子、ｇｄｈＡおよびｇｌｎＡを欠失させて、窒素フラックスを脱アミノ化に向けて駆動した。この手法では、分解中にアンモニアを直接発生するいくつかのアミノ酸（Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、ＡｒｇおよびＧｌｎ）の分解が改善された（図３Ａ）。実際に、ｇｄｈＡおよびｇｌｎＡの欠失により、イソブタノール経路の存在下でアルコールの生成が増加した（表４）。しかし、他のアミノ酸（Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ）はアミノ基転移を介して分解され、アミノ基が２−ケトグルタレートに転移してグルタミン酸が形成される（図３Ｂ）。さらに、一部のアミノ酸の炭素骨格は、脱アミノ化または還元後にグルタミン酸に直接に変換される（ＧｌｎおよびＰｒｏ）（図３Ａ）。グルタミン酸のアミノ基はさらにＢＣＡＡに再分布する。実際に、細菌培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）の過程中、アミノ基転移の結果としてグルタミン酸およびＢＣＡＡが培地中に蓄積した。アミノ酸のこれらの群は、細胞において、還元された窒素を細胞の内部に保持するための窒素貯蔵器としての機能を果たすと思われる。
【０１５８】
細胞内の窒素貯蔵器を流出させるために、いくつかのアミノ基転移／脱アミノ化サイクルを設計した。第１に、ＩｌｖＥおよびＬｅｕＤＨにより、グルタミン酸プール（Ａｓｐ、およびＡｌａと一緒に）を流出させて、ＬｅｕおよびＩｌｅを経由してアンモニアを排出するサイクル（図３Ｃ）を形成する。第２に、ＩｌｖＥ、ＡｖｔＡ、ＤａｄＸおよびＤａｄＡにより、グルタミン酸プールを流出させて、Ｖａｌ、Ｌ−Ａｌａ、およびＤ−Ａｌａを経由してアンモニアにする別のサイクルを形成する（図３Ｄ）。最後に、ＳｅｒＣ、ＳｅｒＢ、ＳｄａＢ、ＰｐｓＡ、Ｅｎｏ、およびＧｐｍＡにより、Ｓｅｒを経由してアンモニアを流出させるための第３のサイクルを形成する（図３Ｅ））。遺伝子ｉｌｖＡ（図３Ａ）、ｉｌｖＥ（図３Ｃ）およびｓｄａＢ（図３Ｅ）は、Ｔｈｒ、ＧｌｕおよびＳｅｒが枯渇している時は過剰発現される必要はなく、これは定常期への移行付近で起こる。したがって、これらの遺伝子は、σ７０依存性プロモーターであり、定常期では、定常期におけるコアポリメラーゼ結合を支配するσｓと競合するので完全には機能しないｒｒｎＢプロモーターにより発現される。この戦略により、バイオ燃料（イソブタノール、２ＭＢ、３ＭＢ）の収量が４．０ｇ／Ｌ、理論収量の５５．７％まで首尾よく増加した（表４；図１０）。
【０１５９】
残りのアミノ酸（ｒＡＡ）は、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、および３つの芳香族アミノ酸を含む。ｒＡＡを分解するための代謝条件は、１４種の燃料に変換できるアミノ酸（ｆｃＡＡ）と比較して全く異なる。したがって、ｒＡＡを変換するためには別の戦略を用いることが有益であろう。この第２の戦略は、ｒＡＡを、２０種のアミノ酸全てを含有するタンパク質に再分布させ、次いでタンパク質バイオマスの流れに戻して再利用することを伴う。これを行うために、ｒＡＡをＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓなどの生物を成長させるための炭素源および窒素源として使用する。この細菌の成長プロセスにより、ｒＡＡが２０種のアミノ酸全てに変換され、アンモニアおよびメタンチオールが発生し、それをプロセス後の藻類の成長を支持するためのＮ供給源およびＳ供給源として再利用することができる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓを成長させるために６種のｒＡＡを用いた理論収量は４１．４％であり、これは７７．９％のｆｃＡＡを含有する（表８）。したがって、第１の生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）により１４種のアミノ酸が燃料に変換され、第２の生物（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、またはＢａｃｉｌｌｕｓ）によりｒＡＡが変換されて１４種のｆｃＡＡに戻る。二段階変換の使用には、２つのプロセスに必要な通気量が異なるので、利点がある。さらに、ｒＡＡの一部を、化学的フィードストックとして、または他の適用のために使用することができる。プロセスを２つに分けることにより、柔軟性が増す。
【０１６０】
藻類の最小脂質含有量は約１０％であり、この筋書きを用いて、プロセスの完全な質量流量をマッピングした（図４Ａ）。そのようなタンパク質に富む種の藻類のバイオマス生産性に基づいて６００億ガロンのバイオ燃料を生成するために必要な開放池の最小サイズ（図４Ａ）は約２１，４２０平方キロメートルであり、米国の農地の１．６％と等しい。高タンパク質のネイティブな藻類種を使用することができるので、これらの生物は地方の塩度、温度、およびｐＨに順化し、閉鎖フォトバイオリアクターを必要としない。この筋書きでは、窒素５千６３０万トン、および硫黄２１０万トンが藻類の成長のために再利用される。生物変換および燃料の燃焼の間に生成される炭素は、最終的に藻類種により再補足される。
【０１６１】
植物プロセスの筋書きについての算出：
１）植物プロセスによりエタノール６００億ガロンを生成するために必要な肥料−Ｎ＝９４０万トン。
【０１６２】
６００億（エタノールのガロン数）×３．７８５（１ガロン当たりのリットル数）×０．７８９（１リットル当たりのｋｇ数（エタノール密度））＝植物による筋書きによって生成するエタノール１７９１．８億キログラム。
【０１６３】
１７９１．８億（エタノールのキログラム数］を０．５（グルコース１グラム当たりのエタノールのグラム数（または５０％収量））で割り、次いで、６０％（トウモロコシのグルコース収率）で割る＝必要なトウモロコシ５９７２．７億キログラム。
【０１６４】
肥料投入量を算出するために、５９７２．７３億（トウモロコシのキログラム数）に９．８％（トウモロコシのタンパク質含有量）を掛け、次いで１６％（タンパク質中の窒素の重量百分率）を掛ける。この最終的な掛け算により窒素９．４×１０９キログラムが得られ、これは、９４０万トンと等しい。
【０１６５】
２）９４０万トンの肥料−Ｎを生成するためのエネルギー費＝５３６×１０１２キロジュール。
【０１６６】
９．４×１０９（窒素のキログラム数）×５７（１キログラムの肥料−Ｎを生成するために必要なメガジュール数）＝５３６×１０１２キロジュール。
【０１６７】
３）エタノールのエネルギー含有量に対するエタノールを生成するための肥料−Ｎのエネルギー投入量の比率＝１１．２％。
【０１６８】
エタノールのエネルギー含有量は、６００億（エタノールのガロン数）×７９．９（ガロン数当たりのメガジュール数（エタノール加熱値が低い））と等しく、これは４，７９４×１０１２（キロジュール）になる。５３６×１０１２（肥料合成のために必要なキロジュール数）÷この数＝１１．２％。
【０１６９】
今日のエタノール生成の肥料−Ｎのエネルギー投入量は別の方法で算出される。肥料−Ｎのエネルギー費を５７ＭＪ／Ｋｇとして算出し、Ｎの適用率は１５０ｋｇ／ｈａである。これにより、肥料−Ｎのエネルギー費は８，５５０ＭＪ／ｈａになる。土地面積当たりのエタノールエネルギー収率を７３，４２４ＭＪ／ｈａとして算出する。したがって、エタノールのエネルギー含有量に対するエタノール生成の肥料−Ｎのエネルギー投入量の比率は１１．６４％である。この数は、我々による上記の算出と比較してわずかに高く、我々の仮定が妥当であることが確認される。
【０１７０】
４）植物プロセスによってエタノール６００億ガロンが生成する場合に蓄積するＮに富むバイオマス＝１億６４００万トンのＤＤＧＳ。
【０１７１】
６００億（エタノールのガロン数）×２．７３（エタノール１ガロン当たりに生成されるＤＤＧＳのキログラム数）＝１億６４００万トンのＤＤＧＳ。
【０１７２】
５）潜在的な米国における年間のＤＤＧＳ市場に対するＮに富むバイオマス１億６４００万トンの比率＝３９０％。
【０１７３】
１億６４００万（ＤＤＧＳのトン数）÷４２００万（ＤＤＧＳのトン数（潜在的な米国における年間のＤＤＧＳ市場））＝３９０％。
【０１７４】
６）潜在的な米国における年間のＤＤＧＳ市場を満たすための年間のエタノール生産量＝１５４億ガロン。
【０１７５】
６００億（年間のエタノールのガロン数）÷３９０％＝米国におけるＤＤＧＳ市場を満たすためのエタノール１５４億ガロン。
【０１７６】
７）米国における年間の燃料消費に対する１５４億ガロンのエタノールの百分率＝７．７％。
【０１７７】
１５４億（エタノールのガロン数）÷２，０００億（ガロン（米国における年間の燃料消費））＝７．７％。
【０１７８】
窒素の再利用を伴わない藻類プロセスの筋書きの算出（脂質含有量は３０％である）。
【０１７９】
８）藻類プロセスによってバイオディーゼル６００億ガロンを生成するために必要な肥料−Ｎ＝３５５０万トン。
【０１８０】
６００億（バイオディーゼルのガロン数）×３．７８５（１ガロン当たりのリットル数）×０．８８（１リットル当たりのキログラム数（バイオディーゼルの密度））＝バイオディーゼル１９９８．４８億キログラム。
【０１８１】
１９９８．４８億（バイオディーゼルのキログラム数）÷９０％（脂質のバイオディーゼルへの変換率）＝２２２．１（脂質のキログラム数）。窒素ストレス条件下では、脂質とタンパク質はどちらも、それぞれ藻類バイオマスの３０重量％を構成し、したがって、タンパク質２２２．１キログラムになる。
【０１８２】
２，２２１億（タンパク質のキログラム数）×１６％（タンパク質中の窒素の重量百分率）＝窒素３５５億キログラムであり、これは、３５５０万トンと等しい。
【０１８３】
９）３５５０万トンの肥料−Ｎを生成するエネルギー費＝２，０２４×１０１２キロジュール。
【０１８４】
３５５億（窒素のキログラム数）×５７（１キログラムの肥料−Ｎを生成するために必要なメガジュール数）＝２，０２４×１０１２キロジュール。
【０１８５】
１０）バイオディーゼルのエネルギー含有量に対するバイオディーゼルを生成するための肥料−Ｎのエネルギー投入量の比率＝２５．８％。
【０１８６】
バイオディーゼルのエネルギー含有量は、６００億（バイオディーゼルのガロン数）×１３０．７（ガロン数当たりのメガジュール数（低バイオディーゼル加熱値））と等しく、これは、７，８４２×１０１２（キロジュール）になる。２，０２４×１０１２（肥料合成のために必要なキロジュール数）÷この数＝２５．８％。
【０１８７】
１１）藻類プロセスによってバイオディーゼル６００億ガロンが生成する場合に蓄積されるＮに富むバイオマス＝５億８９００万トンのＤＤＧＳ。
【０１８８】
６００億（バイオディーゼルのガロン数）に３．７８５（１ガロン当たりのリットル数）を掛け、次いで９０％（脂質のバイオディーゼルへの変換率）で割ると、脂質２５２．３リットルになる。２５２．３（脂質のリットル数）を３０％（バイオマスの脂質含有量の百分率）で割り、次いで、７０％（バイオマスの窒素に富む含有量の百分率）を掛けると、５，８９０億キログラムまたは５億８９００万トンのＤＤＧＳになる。
【０１８９】
１２）潜在的な米国における年間のＤＤＧＳ市場に対するＮに富むバイオマス５億８９００万トンの比率＝１，４０２％。
【０１９０】
５億８９００万（ＤＤＧＳのトン数）÷４２００万（ＤＤＧＳのトン数（潜在的な米国における年間のＤＤＧＳ市場）］＝１，４０２％。
【０１９１】
１３）潜在的な米国における年間のＤＤＧＳ市場を満たすための年間のバイオディーゼルの生産量＝４３億ガロン。
【０１９２】
６００億（年間のバイオディーゼルのガロン数）÷１，４０２％＝米国におけるＤＤＧＳ市場を満たすためのバイオディーゼル４３億ガロン。
【０１９３】
１４）米国における年間の燃料消費に対するバイオディーゼル４３億ガロンの百分率＝２．１％。
【０１９４】
４３億［バイオディーゼルのガロン数］÷２，０００億（ガロン（米国における年間の燃料消費））＝２．１％。
【０１９５】
１５）バイオ燃料６００億ガロンを生成するために必要な開放池の最小サイズ＝２１，４２０平方キロメートル。
【０１９６】
２億５百万［トン（バイオ燃料６００億ガロンを生成するために必要な炭素）］÷５２．４４３％（バイオマスの炭素含有量の百分率）＝１年当たりバイオマス３億９１００万トン。３億９１００万（１年当たりのバイオマスのトン数）÷５０（１日当たり平方メートル当たりのグラム数（開放池における藻類のバイオマス生産性）（２））により面積が得られ、それに日から年へ、グラムから百万トンへ、および平方メートルから平方キロメートルへの変換を掛けると、２１，４２０平方キロメートルになる。
【０１９７】
１６）カリフォルニアの百分率は２１，４２０平方キロメートル＝１．６％と等しい。
【０１９８】
２１，４２０（平方キロメートル）÷１．３（百万平方キロメートル）（米国の作付け地全体の面積）＝１．６％。
【０１９９】
制限酵素およびＡｎｔａｒｃｔｉｃホスファターゼはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手した。ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼはＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手した。急速ＤＮＡライゲーションキットはＲｏｃｈｅから入手した。酵母抽出物はＢＤから入手した。アミノ酸、２−ケトブチレート、２−ケトイソバレレート、２−ケトバレレート、２−ケト−３−メチル−バレレートおよび２−ケト−４−メチル−ペンタノエートはＳｉｇｍａから入手した。オリゴヌクレオチドはＩＤＴから入手した。アミノ酸標準物質（０．２５ｎｍｏｌ／μＬ）およびオルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）はＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した。
【０２００】
ＪＣＬ１６株は、ｌａｃＩｑを供給するためにＸＬ−１ｂｌｕｅから形質導入されたＦ’を有するＢＷ２５１１３（ｒｒｎＢＴ１４  ΔｌａｃＺＷＪ１６  ｈｓｄＲ５１４  ΔａｒａＢＡＤＡＨ３３  ΔｒｈａＢＡＤＬＤ７８）誘導体である。Ｋｅｉｏコレクション株２０種を、図２Ａに示されている通り使用した。Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）によるゲノムワイドなランダム突然変異誘発を用いて、ｎＢＣＡＡから高級アルコールを生成することができる株を得た。ＮＴＧ処理の各ラウンド後に、突然変異を、１種のｎＢＣＡＡを唯一の炭素源として含有する寒天プレート上での成長についてスクリーニングした。さらに、ポリペプチドに組み込まれるので細胞に対して部分的に毒性である、Ｌ−バリン類似体であるＤＬ−ノルバリンを加えた（２ｇ／Ｌ）。一部の突然変異体株は、ポリペプチドを生合成するために、Ｌ−バリンを過剰生成して類似体に打ち勝つことにより、そのような攻撃を切り抜けることができた。Ｌ−バリンの前駆体である２−ケト−イソバレレート（ＫＩＶ）は、イソブタノール生成の前駆体でもあり、特定のノルバリン耐性株は、イソブタノール経路遺伝子の存在下で、野生型株と比較して高濃度のイソブタノールを生成する能力を有する可能性がある。ＮＴＧ突然変異誘発およびスクリーニングの複数ラウンドの後に、株ＹＨ１９が得られた。特定の遺伝子欠失（例えば、ΔｌｕｘＳ、ΔｌｓｒＡ、ΔｌｓｒＤ、ΔｌｓｒＢ、ΔｇｌｎＡ、ΔｇｄｈＡ、ΔｉｌｖＥなど）を有する株ＹＨ１９誘導体を、Ｐ１形質導入によって創出した。ΔｇｌｎＡとΔｇｄｈＡの両方を含有する株は、成長するための唯一の窒素源としてアミノ酸を使用することができるが、アンモニウム塩を使用することはできない。Ｋｅｉｏコレクションからファージを調製した。プラスミドｐＣＰ２０を、カナマイシン耐性マーカーを除去するために適切な欠失を含有する単一のコロニーに導入し、形質転換した。
【０２０１】
使用したプラスミドの一覧が表５に示されている。プラスミドの構築は下記の通りであり、使用したプライマーは表６に列挙されている。
【０２０２】
【表５−１】
2013544516.tif 000011
【０２０３】
【表５−２】
2013544516.tif 000012
【０２０４】
【表６−１】
2013544516.tif 000013
【０２０５】
【表６−２】
2013544516.tif 000014
ｐＹＸ４１をクローニングするために、プライマーＹＸ２７８（配列番号９７）およびＹＸ２７９（配列番号９８）を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２のゲノムＤＮＡ由来のｙｑｈＤを増幅した。ＰＣＲ産物を、ＳｐｈＩを用いて消化し、同じ酵素を用いて消化したｐＳＡ６５にクローニングした。適切な配向を有するコロニーを選択し、配列決定により検証した。
【０２０６】
ｐＹＸ４５をクローニングするために、プライマーＹＸ３４０（配列番号１１２）およびＹＸ３４１（配列番号１１３）を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２のゲノムＤＮＡ由来のｄａｄＸを増幅した。ＰＣＲ産物を、ＸｂａＩおよびＡｖｒＩＩを用いて消化し、同じ酵素を用いて消化したｐＹＸ４１にクローニングした。適切なコロニーを選択し、配列決定により検証した。ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩに対する制限部位を、プライマーＹＸ３４１（配列番号１１３）によりｐＹＸ４５に導入した。
【０２０７】
プライマーＹＸ３４２（配列番号１１４）およびＹＸ２８３（配列番号９９）を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２のゲノムＤＮＡ由来のｄａｄＡを増幅した。ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩを用いて消化し、同じ酵素を用いて消化したｐＹＸ４５にクローニングした。適切なコロニーを選択し、配列決定により検証し、ｐＹＸ４６を創出した。クローニングの結果として、ｐＹＸ４６ではＴ１ターミネーターが欠失した。プライマーＹＸ３４４（配列番号１１５）およびＹＸ３４５（配列番号１１６）を使用して、ｐＹＸ４５由来のＴ１ターミネーターおよびＣｏｌＥ１を増幅した。このＰＣＲ産物を、ＳｐｅＩおよびＳａｌＩを用いて消化し、同じ酵素を用いて消化したｐＹＸ４６にクローニングした。適切なコロニーを選択し、配列決定により検証し、ｐＹＸ４７を創出した。
【０２０８】
ｐＹＸ５１をクローニングするために、プライマーＹＸＨ０１（配列番号１２４）およびＹＸＨ０２（配列番号１２５）を使用して、Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓのゲノムＤＮＡ由来のｌｅｕＤＨを増幅した。ＰＣＲ産物を、Ａｃｃ６５ＩおよびＳａｌＩを用いて消化し、同じ酵素を用いて消化した空のプラスミドｐＹＫ（ｐＳＡ４０の誘導体）にクローニングした。適切なコロニーを選択し、配列決定により検証した。
【０２０９】
ｐＹＸ５２をクローニングするために、プライマーＹＸ２７４（配列番号９５）およびＹＸ２７５（配列番号９６）を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２のゲノムＤＮＡ由来のａｖｔＡを増幅した。ＰＣＲ産物を、ＳａｌＩおよびＰｓｔＩを用いて消化し、同じ酵素を用いて消化したｐＹＸ５１にクローニングした。適切なコロニーを選択し、配列決定により検証した。
【０２１０】
ｐＹＸ５４をクローニングするために、プライマーＹＸ３４６（配列番号１１７）およびＹＸ３４７（配列番号１１８）を使用して、ｐＹＸ５２由来のｐＬｌａｃ０１：ｌｅｕＤＨ−ａｖｔＡを増幅した。ＰＣＲ産物を、ＳａｃＩおよびＳｐｅＩを用いて消化し、同じ酵素を用いて消化したｐＫＳ１０３にクローニングした。適切なコロニーを選択し、配列決定により検証した。
【０２１１】
ｐＹＸ６０をクローニングするために、プライマーＹＸ２８４（配列番号１００）およびＹＸ２８５（配列番号１０１）を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２のゲノムＤＮＡ由来のｉｌｖＥを増幅した。ＰＣＲ産物を、Ａｃｃ６５ＩおよびＮｓｉＩを用いて消化し、同じ酵素を用いて消化したｐＳＡ７４’にクローニングした。適切なコロニーを選択し、配列決定により検証した。
【０２１２】
ｐＹＸ６１をクローニングするために、プライマーＹＸ３２６（配列番号１１０）およびＹＸ３２７（配列番号１１１）を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２のゲノムＤＮＡ由来のｉｌｖＡを増幅した。ＰＣＲ産物を、ＮｓｉＩおよびＰｓｔＩを用いて消化し、同じ酵素を用いて消化したｐＹＸ６０にクローニングした。適切なコロニーを選択し、配列決定により検証した。
【０２１３】
ｐＹＸ６２をクローニングするために、プライマーＹＸ２８８（配列番号１０２）およびＹＸ２８９（配列番号１０３）を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２のゲノムＤＮＡ由来のｔｄｃＢを増幅した。ＰＣＲ産物を、ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、同じ酵素を用いて消化したｐＹＸ６１にクローニングした。適切なコロニーを選択し、配列決定により検証した。ＸｂａＩおよびＥａｇＩに対する制限部位をプライマーＹＸ２８９（配列番号１０３）によりｐＹＸ６１に導入した。
【０２１４】
ｐＹＸ６４をクローニングするために、プライマーＹＸ２９０（配列番号１０４）およびＹＸ２９１（配列番号１０５）を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２のゲノムＤＮＡ由来のｔｄｃＧを増幅し、プライマーＹＸ２９２（配列番号１０６）およびＹＸ２９３（配列番号１０７）を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２のゲノムＤＮＡ由来のｓｄａＢを増幅した。ｔｄｃＧを含有するＰＣＲ断片を、ＸｂａＩおよびＥａｇＩを用いて消化し、ｓｄａＢを含有するＰＣＲ断片を、ＥａｇＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化した。２つの消化された断片を、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化したｐＹＸ６２にクローニングした。適切なコロニーを選択し、配列決定により検証した。
【０２１５】
ｐＹＸ６７をクローニングするために、プライマーＹＸ２９４（配列番号１０８）およびＹＸ２９５（配列番号１０９）を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２のゲノムＤＮＡ由来のｒｒｎＢプロモーターを増幅した。ＰＣＲ産物を、ＸｈｏＩおよびＡｃｃ６５Ｉを用いて消化し、同じ酵素を用いて消化したｐＹＸ６４にクローニングした。適切なコロニーを選択し、配列決定により検証した。
【０２１６】
ｐＹＸ６８をクローニングするために、プライマーＹＸ３８２（配列番号１２１）およびＹＸ２９３（配列番号１０７）を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２のゲノムＤＮＡ由来のｓｄａＢを増幅した。ＰＣＲ産物を、ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、同じ酵素を用いて消化したｐＹＸ６７（ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩを用いてｐＹＸ６７を消化することにより、ｐＹＸ６７からｔｄｃＢ、ｔｄｃＧおよびｓｄａＢが除去された）にクローニングした。適切なコロニーを選択し、配列決定により検証した。
【０２１７】
ｐＹＸ７５をクローニングするために、プライマーＹＸ３５５（配列番号１１９）およびＹＸ３５６（配列番号１２０）を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２のゲノムＤＮＡ由来のｉｌｖＡを増幅した。ＰＣＲ産物を、Ａｃｃ６５ＩおよびＰｓｔＩを用いて消化し、同じ酵素を用いて消化したｐＹＸ６４（Ａｃｃ６５ＩおよびＰｓｔＩを用いてｐＹＸ６４を消化することにより、ｐＹＸ６４からｉｌｖＥおよびｉｌｖＡが除去された）にクローニングした。適切なコロニーを選択し、配列決定により検証した。
【０２１８】
ｐＹＸ７９をクローニングするために、プライマーＹＸ３８２（配列番号１２１）およびＹＸ２９３（配列番号１０７）を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２のゲノムＤＮＡ由来のｓｄａＢを増幅した。ＰＣＲ産物を、ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、同じ酵素を用いて消化したｐＹＸ７５（ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩを用いてｐＹＸ７５を消化することにより、ｐＹＸ７５からｔｄｃＢ、ｔｄｃＧおよびｓｄａＢが除去された）にクローニングした。適切なコロニーを選択し、配列決定により検証した。
【０２１９】
ｐＹＸ９０をクローニングするために、プライマーＹＸ３９７（配列番号１２２）およびＹＸ３９８（配列番号１２３）を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２のゲノムＤＮＡ由来のａｖｔＡを増幅した。ＰＣＲ産物を、ＭｌｕＩを用いて消化し、同じ酵素を用いて消化したｐＫＳ１０３にクローニングした。適切な配向を有するコロニーを選択し、配列決定により検証した。
【０２２０】
ｐＹＸ９７をクローニングするために、３つの断片を作製した。プラスミドｐＹＸ５１を、Ａｃｃ６５ＩおよびＳａｌＩを用いて消化して、ｌｅｕＤＨを含有する断片を得た。プライマーＹＸＨ０３（配列番号１２６）およびＹＸＨ０４（配列番号１２７）を使用して、ｐＹＸ４１由来のｋｉｖＤおよびｙｑｈＤを増幅し、ＰＣＲ断片を、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化した。プラスミドｐＳＡ４０を、Ａｃｃ６５ＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化した。上記の３つの断片を一緒にライゲーションしてプラスミドを創出した。次いで、そのプラスミドを、ＡａｔＩＩおよびＳｐｅＩを用いて消化し、ｌｅｕＤＨ、ｋｉｖＤ、ｙｑｈＤおよびＣｏ１Ｅ１を含有する断片を、同じ酵素を用いて消化したｐＳＡ５５Ｉにクローニングし、ｐＹＸ９７を創出した。適切なコロニーを選択し、配列決定により検証した。
【０２２１】
ｐＫＳ１０３をクローニングするために、ｐＳＡ６９のＫａｎ耐性カセットを、ＡａｔＩＩ酵素およびＳａｃＩ酵素による消化により除去した。ｐＳＡ６９の残りの部分を、同じ酵素を用いて消化したスペクチノマイシンカセットを用いてライゲーションした。適切なコロニーを選択し、配列決定により検証した。
【０２２２】
別段の指定のない限り、４０ｇ／ＬのＢＤ  ｂａｃｔｏ（商標）酵母抽出物（２１．６４ｇ／Ｌのアミノ酸、４．４８ｇ／Ｌの灰分、３．０５ｇ／Ｌの種々の塩、１．２４ｇ／ＬのＨ２Ｏならびに６．５３ｇ／ＬのＥ．ｃｏｌｉにより分解されない炭水化物を含有する）を含有する１×改変Ｍ９塩（水１リットル当たり３１．５ｇ／ＬのＮａＨＰＯ４、１５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１２０ｍｇ／ＬのＭｇＳＯ４、１１ｍｇ／ＬのＣａＣｌ２および１０ｍｇ／ＬのビタミンＢ１）を、細胞を成長させるために使用した。アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍｌ）およびスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を必要に応じて加えた。培地３ｍｌを含有する試験管における前培養を、回転式振とう機（２５０ｒ．ｐ．ｍ．）において、３７℃で一晩実施した。一晩培養物を、２５０ｍｌのねじ口三角フラスコ中の新鮮培地２０ｍｌに１：１００希釈した。細胞を２時間３７℃で成長させた後、０．１ｍＭのイソプロピル−β−ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加えた。培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）を、回転式振とう機（２５０ｒ．ｐ．ｍ．）において３７℃で実施した。ある場合では、二相発酵を（Ｃｏｎｎｏｒら、２０１０年、Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ８６巻：１１５５〜１１６４頁）に記載の通り実施して、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの細胞に対する生成物の毒性の影響を低下させた。図８において使用するバイオマスを得るために、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓを、ＬＢ培地で成長させた。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ（ＡＴＣＣ  １３４８２）、Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ  ５０１６１）、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ（ＵＴＥＸ  ＬＢ２３４０）およびＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｅｓ  ＰＣＣ７９４２を、それぞれＡＴＣＣ培地５、ＡＴＣＣ培地１４９５、ＵＴＥＸスピルリナ培地およびＢＧ−１１培地で成長させた。回収後、一部のバイオマスを、ミニビードビーター（ｍｉｎｉ  ｂｅａｄｂｅａｔｅｒ）で１分間、または熱い０．５ＮのＮａＯＨで３０分間処理して、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイによって濃度を測定するためにタンパク質を放出させた。タンパク質バイオマスの残りを、６０℃または８０〜１００℃の水中で１０〜２０分加熱し、その後一晩５０℃でプロテアーゼ加水分解することにより、加水分解した。プロテアーゼの量はバイオマスの乾燥重量（０．３〜０．９ｍｇ／ｍｌ）の１〜３％であった。プロテアーゼ処理の前後の遊離のアミン基の濃度をＮｉｎｈｙｄｒｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）によって測定した。次いで、プロテアーゼ処理したタンパク質バイオマスを全て、培地を調製するために濾過した。ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー−水素炎イオン化検出器（ＧＣ−ＦＩＤ）および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して、基質および生成物を分析した。
【０２２３】
我々の株によって生成されたアルコール化合物を、以前に記載されている通り（Ａｔｓｕｍｉら、２００８年、Ｎａｔｕｒｅ  ４５１巻：８６〜８９頁およびＣｏｎｎｏｒら、２０１０年、Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ８６巻：１１５５〜１１６４頁）ＧＣ−ＭＳによって同定し、ＧＣ−ＦＩＤによって数量化した。アルコール化合物の分離をＤＢ−ＦＦＡＰキャピラリーカラム（３０ｍ、内径０．３２ｍｍ、薄膜の厚さ０．２５μｍ；Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって行った。ＧＣ乾燥器の温度は、最初４０℃で２分間保持し、１分当たり５℃の勾配で４５℃まで上昇させ、４分間保持した。次いで、１分当たり１５℃の勾配で２３０℃まで上昇させ、４分間保持した。担体ガスとしてヘリウムを入口圧力１４ｐ．ｓ．ｉ．で使用した。注射器および検出器を２２５℃で維持した。試料０．５μｌを注射した。１−プロパノールを内部標準として使用した。
【０２２４】
アミノ酸（Ｌ−プロリン以外）を、ＺＯＲＢＡＸ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＡＡＡカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、ＯＰＡ（オルトフタルアルデヒド）誘導体化法を用いて数量化した。Ｌ−プロリンは、ＦＭＯＣ（９−フルオレニルメチルクロロホルメート）を用いて誘導体化した。誘導体化されたアミノ酸を、ＨＰＬＣのＰＤＡ検出器（３３８ｎｍ、２６２ｎｍ（Ｌ−Ｐｒｏ））を使用して分析した。
【０２２５】
バイオ燃料の生成の理論収量を算出するために、生成に関与する個々の代謝産物の物質収支衡を以下の通り示すことができる：Ｓｖ＝Ｂ、ここでＳは化学量論的行列であり、各列はネットワーク内の反応に対応し、各行は特定の反応における各代謝産物の化学量論的係数を含有する。ベクトルｖは、各反応およびそれらの生成物についてのモル濃度フラックスを含有し、Ｂは、各代謝産物の蓄積／枯渇比を含有する。Ｓは、中心的な炭素代謝、アミノ酸の生合成、アミノ酸の分解、バイオ燃料の生成および生成物の移出の経路からなる代謝ネットワークを示すように構築し、Ｂは、一定のアミノ酸の流入があるが、定常状態である系を示すために、それらの移入フラックスの負数と等しいアミノ酸に対応する行を除いたゼロの列ベクトルになる。Ｓは、代謝産物より多くの反応を含有する（行より列が多い）ので、決定し、したがって、解を見いだすために最適化することができる。バイオ燃料を生成するための系を最適化するために、目的関数を分（ｆｖ）と定義し、ここでｆは、目的関数における各フラックスの係数を含有する行ベクターである。最大質量収量のバイオ燃料が望まれるので、ｆは、最適化されているバイオ燃料の移出反応に対応する係数を除いた全てのゼロに割り当てられ、その場合、対応するバイオ燃料の分子量の負数に割り当てられる。この線形最適化問題を定義し、系についての最適なモル濃度フラックス分布を出力するＭＡＴＬＡＢ関数「ｌｉｎｐｒｏｇ」への入力として使用した。さらに、不可逆的であることが公知である反応の下限はゼロであるが、他の反応は全て下限が−２００である。アミノ酸の分解経路および高級アルコールの生合成経路が図９Ａおよび表７に要約されている。
【０２２６】
表７：アミノ酸の分解経路
Ｌ−アラニン＋ユビキノン→ユビキノール＋アンモニア＋ピルベート
Ｌ−バリン＋ピルベート→Ｌ−アラニン＋２−ケトイソバレレート
Ｌ−ロイシン＋ＮＡＤ＋→アンモニア＋ＮＡＤＨ＋２−ケトイソカプロエート（過剰発現したＬｅｕＤＨを通じて）
Ｌ−イソロイシン＋ＮＡＤ＋→アンモニア＋ＮＡＤＨ＋２−ケト−３−メチル−バレレート（過剰発現したＬｅｕＤＨを通じて）
Ｌ−セリン→Ｈ＋＋アンモニア＋ピルベート
Ｌ−プロリン＋ＦＡＤ＋２Ｈ２Ｏ＋ＮＡＤ＋→ＦＡＤＨ２＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋＋Ｌ−グルタミン酸
Ｌ−グルタミン酸＋オキサロアセテート→Ｌ−アスパラギン酸＋２−ケトグルタレート
Ｌ−アスパラギン酸→Ｈ＋＋アンモニア＋フマレート
Ｌ−システイン＋Ｈ２Ｏ→アンモニア＋Ｈ２Ｓ＋Ｈ＋＋ピルベート
Ｌ−アルギニン＋サクシニル−ＣｏＡ＋４Ｈ２Ｏ＋２−オキソグルタレート＋ＮＡＤ→ＣｏＡ＋３Ｈ＋＋ＣＯ２＋２アンモニア＋２Ｌ−グルタミン酸＋ＮＡＤＨ＋スクシネート
Ｌ−グルタミン＋Ｈ２Ｏ→アンモニア＋Ｈ＋＋Ｌ−グルタミン酸
Ｌ−アスパラギン＋Ｈ２Ｏ→アンモニア＋Ｈ＋＋Ｌ−アスパラギン酸
Ｌ−トレオニン→アンモニア＋Ｈ＋＋２−ケトブチレート
グリシン＋５，１０メチレン−ＴＨＦ＋Ｈ２Ｏ→Ｌ−セリン＋テトラヒドロフォレート＋２Ｈ＋
グリシン＋テトラヒドロフォレート＋Ｈ＋＋ＮＡＤ＋→アンモニア＋ＣＯ２＋ＮＡＤＨ＋５，１０メチレン−ＴＨＦ
Ｌ−フェニルアラニン＋Ｈ＋＋Ｏ２＋ＮＡＤＨ→Ｌ−Ｔｒｙｒｏｓｉｎｅ［チロシン？］＋ＮＡＤ＋＋Ｈ２Ｏ
Ｌ−チロシン＋２Ｏ２＋Ｈ２Ｏ＋サクシニル−ＣｏＡ＋２−オキソグルタレート→フマレート＋Ｌ−グルタミン酸＋ＣＯ２＋２Ｈ＋＋２アセチル−ＣｏＡ＋スクシネート
Ｌ−トリプトファン＋３Ｏ２＋３Ｈ２Ｏ＋ＮＡＤＨ＋ＣｏＡ→ホルメート＋アラニン＋ＮＡＤ＋＋ＣＯ２＋スクシネート＋アンモニア＋３Ｈ＋＋アセチルＣｏＡ
Ｌ−ヒスチジン＋４Ｈ２Ｏ→Ｌ−グルタミン酸＋ホルメート＋２アンモニア＋２Ｈ＋
Ｌ−メチオニン＋Ｈ２Ｏ→２−ケトブチレート＋メタンチオール＋アンモニア＋Ｈ＋
Ｌ−リシン＋Ｏ２＋オキソグルタレート＋ＮＡＤＰ＋＋ＮＡＤ＋＋ＡＴＰ＋２ＣｏＡ＋ＦＡＤ＋Ｈ２Ｏ［Ｈ２Ｏ？］→２ＣＯ２＋アンモニア＋Ｌ−グルタミン酸＋ＮＡＤＰＨ＋ＮＡＤＨ＋２Ｈ＋＋ＦＡＤＨ２＋ＡＤＰ＋Ｐｉ＋２アセチル−ＣｏＡ。
【０２２７】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓによる、６種のｒＡＡを２０種のＡＡに戻す変換の理論収量を算出するために、上記の戦略を用いたが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ代謝ネットワークに適用した。このネットワークは、中心的な炭素の代謝、アミノ酸の生合成、アミノ酸の分解およびバイオマスの産出反応の経路からなる。単純にするために、アミノ酸の合成のエネルギー必要量に加えて、バイオマスを形成するための追加的なエネルギー必要量は課さなかった。バイオマス反応は、アミノ酸の消費反応からなり、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓバイオマスにおけるアミノ酸のモル比として化学量論的係数を伴った。この場合、ｆ行列は、−１の値が与えられるバイオマス反応に対応する係数を除いて全てゼロである。
【０２２８】
全体的なプロセス設計を通した理論的なフラックスを算出するために、図４Ａに示されている通り、各ユニットをそれぞれ独立に考慮する。詳細な算出を必要とする４つの主要なサブユニットが存在し、それらが以下に示されている：
【０２２９】
【化１】
2013544516.tif 000015
処理される藻類バイオマスを、脂質（Ｃ１９Ｈ３４Ｏ２）およびタンパク質（ペプチジルアミノ酸当たりの平均的な組成Ｃ４．５１Ｎ１．２４Ｏ１．４９Ｓ０．０２Ｈ７．１０）からなり、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｏｂｌｉｑｕｕｓ由来のアミノ酸組成を有すると仮定する（表５）。
【０２３０】
【表８】
2013544516.tif 000016
Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ由来の藻類バイオマスは、１０〜１７％の炭水化物も含有するが、これらの炭水化物は、前処理後に糖に分解することができ、一般的なＥ．ｃｏｌｉによる発酵の基質になる。簡単にするために、算出の間、Ｎに富むバイオマスは全てタンパク質であると仮定した。この主旨で、バイオマスのモル組成を以下の通り算出した：
【０２３１】
【数１】
2013544516.tif 000017
これらの数字およびデータを使用して、加水分解ユニットに入れられた池からのアミノ酸のモルフラックスを算出することができる。さらに、脂質フラックスを用いて、生成したバイオディーゼルの量を算出した。脂質のバイオディーゼルへの変換の効率を１００％とした。
【０２３２】
Ｎに富むバイオマスの加水分解
このユニットでは、タンパク質（ペプチジルアミノ酸）を遊離アミノ酸または小さなペプチドに加水分解する。算出において、開放池の藻類バイオマスにおけるタンパク質とバイオリアクター２から再利用されるタンパク質の合計を示す。
【０２３３】
Ｅ．ｃｏｌｉによる発酵（１４種のＡＡを高級アルコールに）
このユニットでは、加水分解ユニットの産出を利用し、高級アルコールの最大理論収量の算出を「理論的な生成収量」に記載の通り実施する。各産出フラックスを、図中のその対応する流れに分離した。
【０２３４】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓによるバイオマスの発生
このユニットでは、バイオリアクター１のアミノ酸の産出を利用し（６種のｒＡＡ）、タンパク質バイオマスの最大理論収量の算出を「理論的な生成収量」に記載の通り実施する。このプロセスにおける炭素フラックスはプロセス２における炭素フラックスの１０％未満であった。このプロセスの効率は、全体的な効率に対して有意に影響しない。単純にするために、アミノ酸の合成のエネルギー必要量に加えて、細胞にバイオマスを生成するためのエネルギー必要量は課さなかった。
【０２３５】
各単位を数学的に定義して、バイオマス１モル（１０％の脂質）を処理した場合の各流れを通るフラックスを算出した。プロセスは、流れを再利用することを含有するので、反復的な算出を用いた。反復的なプロセスは、バイオリアクター２から再利用する流れが空であると仮定して開始し、算出１、２、３および４を順番に進めた。各ユニットについてフラックスを算出した後、再利用の流れを通るフラックスを考慮し、ユニット２、３および４についての値を再算出した。このプロセスを、各流れを通るフラックスが収束するまで（およそ６反復）繰り返した。全ての値を、各化合物の分子式および各要素の分子量を使用することによって基本的な質量フラックスに変換した。体積での年間の燃料の生成についてプロセスをスケールアップするために、次式を使用した：
【０２３６】
【数２】
2013544516.tif 000018
Ｃは、スケーリングする前のプロセスにおける特定の流れを通る炭素フラックスを示すために用いられ、ＭＷは下付き文字の流れの分子量を示し、ＣＷは下付き文字の流れの炭素原子のモル重量を示し、ρは密度を示す。この式を使用して、決定された必要な炭素フラックスと等しい総バイオマス炭素を得るために炭素の総質量必要量を決定し、全ての流れを同じ因子によってスケーリングした。得られたフローシートは、所望の量の燃料（図４Ａでは６００億ガロン）の生成を示す。
【０２３７】
我々の系における藻類の成長に最適な脂質含有量を算出するために、以下の変数を定義する：
α＝脂質バイオマス１グラム当たりの炭素のグラム数＝０．７７５２
β＝タンパク質バイオマス１グラム当たりの炭素のグラム数＝０．５２４４
ρ＝Ｅ．ｃｏｌｉに供給されたタンパク質における炭素の質量当たりの生成されたアルコールにおける炭素の最大質量＝０．４６
Ｙ０＝Ｙ−バイオマス生産性の相関の切片＝９２．４６（図４Ｂ参照）
κ＝バイオマス生産性の相関の指数関数的係数＝０．０４２５（図４Ｂ参照）
ε＝プロセスが作動する最大収量の％
Ｙ＝バイオマス生産性
Ｘ＝藻類バイオマスにおける％脂質。
【０２３８】
これらの変数を使用して、バイオ燃料中の炭素の生産性（図４）を、
【０２３９】
【数３】
2013544516.tif 000019
と表すことができる。
【０２４０】
総バイオマス生成を、脂質の百分率指数関数であると仮定すると、
【０２４１】
【数４】
2013544516.tif 000020
これは、Ｃ燃料が最大になるＸの値が、
【０２４２】
【数５】
2013544516.tif 000021
で生じることを意味し、したがって、
【０２４３】
【数６】
2013544516.tif 000022
である。
【０２４４】
変数をそれらの対応する値に代入し、εに応じてＸ最適を分析した後、アルコール収量が理論収量の６１％より高かった場合は、脂質含有量を最小に保つべきであると決定された。
【０２４５】
バイオ燃料中の炭素の生産性を、上記の開示された方法を組み込まずに算出するために、以下の表現を導出した：
Ｃ燃料＝ＹＸα／１００。
【０２４６】
バイオマス生産性のデータを組み入れたプロットはＹ＝Ｙ０ｅ−ｋｘを用い、一定のバイオマス生産性を仮定するプロットはＹ＝Ｙ０を用いる。図４Ａでは脂質含有量を１０％と設定した。
【０２４７】
実施において、タンパク質から燃料への変換は、理論収量の１００％には到達しない。この不足を説明するために、実際に実現されるタンパク質から燃料への変換の％理論収量に応じた最適な脂質含有量を算出し、脂質から燃料への変換は理論収量に保った（図４Ｄ）。結果は、最適な燃料の生産性を実現するためには、タンパク質から高級アルコールへの収量が理論値の３８％を超える限りは、脂質含有量は１０％未満（藻類における最小の脂質含有量）であってよいことを示している。本開示の方法および系により、理論最大値の５０％を超えるタンパク質から高級アルコールへの収量が実現されることに留意されたい（表４）。この結果は、現行の、理論値を下回るタンパク質から燃料への変換収量においてさえ脂質の生成は必要ないことを示唆している。
【０２４８】
このタンパク質から燃料への変換技術では、他のプロセス、例えば、ＣＯ２の燃料への直接変換、セルロース系のアルコール発酵、または任意の他の工業的な細胞全体でのバイオ反応などで生成したＮに富む単細胞バイオマスも利用することができる。高級アルコール生成に加えて、エタノール、または他の燃料および化学物質を生成するためにもタンパク質の変換スキームを利用し、したがって、最終的に石油と交換する経路をもたらすことができる。
【０２４９】
いくつもの本発明の実施形態が記載されている。それにもかかわらず、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく種々の改変を行うことができることが理解されよう。したがって、他の実施形態は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【図１Ａ】
2013544516.tif 000023
【図１Ｂ】
2013544516.tif 000024
【図１Ｃ】
2013544516.tif 000025
【図１Ｄ】
2013544516.tif 000026
【図１Ｅ】
2013544516.tif 000027
【図２Ａ】
2013544516.tif 000028
【図２Ｂ】
2013544516.tif 000029
【図２Ｃ】
2013544516.tif 000030
【図３】
2013544516.tif 000031
【図４−１】
2013544516.tif 000032
【図４−２】
2013544516.tif 000033
【図４−３】
2013544516.tif 000034
【図５】
2013544516.tif 000035
【図６Ａ】
2013544516.tif 000036
【図６Ｂ】
2013544516.tif 000037
【図７】
2013544516.tif 000038
【図８】
2013544516.tif 000039
【図９】
2013544516.tif 000040
【図１０】
2013544516.tif 000041
【図１１Ａ】
2013544516.tif 000042
【図１１Ｂ】
2013544516.tif 000043
【図１１Ｃ】
2013544516.tif 000044
【配列表】
2013544516000001.app
【国際調査報告】
2013544516.tif 000045
2013544516.tif 000046
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