(57)【要約】  ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は、ＲＡＮＴＥＳ／ＣＣＬ５、ＭＩＰ−１α／ＣＣＬ３、ＭＩＰ−１β／ＣＣＬ４またはＭＣＰ−１／ＣＣＬ２などの、２種、３種、４種、５種以上のＣＣケモカインと結合する。また、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体の親和性成熟およびヒト化、ならびに連続免疫によるａｎｔｉｋｉｎｅ抗体産生ハイブリドーマ細胞株の生産のための方法も開示される。
2013503192.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも３種の異なるＣＣケモカインと結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、少なくとも１種のＣＣケモカインがＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１βまたはＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳである、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
少なくとも４種の異なるＣＣケモカインと結合する、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２またはＭＣＰ−３と結合しない、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ１４／ＨＣＣ−１、ＣＣＬ１５／ＨＣＣ−２、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣおよびＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ−１からなる群から選択される少なくとも３種の異なるＣＣケモカインと結合する、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ１４／ＨＣＣ−１、ＣＣＬ１５／ＨＣＣ−２、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣおよびＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ−１の少なくとも１つの決定基と結合し、該決定基が該ＣＣ−ケモカインのＣＣ残基と該ケモカインの最後のＣ残基との間に位置する、請求項１に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項６】
ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ１４／ＨＣＣ−１、ＣＣＬ１５／ＨＣＣ−２、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣおよびＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ−１の少なくとも１つの決定基と結合し、該決定基が該ＣＣケモカインのＮループ、３０’ｓループまたは４０’ｓループ中に位置する、請求項１に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項７】
ＣＣケモカインのＣＣ受容体結合残基内の少なくとも１つの決定基と結合する、請求項１に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項８】
結合の対象となるＣＣケモカインの走化活性を中和する、請求項１に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項９】
ハイブリドーマ細胞株３Ｃ１２Ｆ、７Ｄ１Ｇ、７Ｄ１２Ａ、１８Ｖ４Ｆもしくは１８Ｐ７Ｅによって産生されるか、またはハイブリドーマ細胞株３Ｃ１２Ｆ、７Ｄ１Ｇ、７Ｄ１２Ａ、１８Ｖ４Ｆもしくは１８Ｐ７Ｅによって産生される抗体の結合を競合的に遮断する、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
ヒト抗体、ヒト化抗体もしくはキメラヒト−マウス抗体、またはその抗原結合フラグメントである、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ１５／ＨＣＣ−２およびＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ−１からなる群から選択される少なくとも５種のＣＣケモカインと結合し、かつＣＣＬ２／ＭＣＰ−１と実質的に結合しない、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
前記ＣＣケモカインの少なくとも１種のＮループ、３０’ｓループまたは４０’ｓループ中の決定基と結合する、請求項１１に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
配列番号７１の残基１１〜１５（ＣＣＦＳＹ）、残基１７〜２４（ＳＲＱＩＰＱＮＦ）、残基３４〜３５（ＱＣ）または残基５７〜６７（ＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αの少なくとも１つの抗原決定基と結合し；
配列番号７２の残基１１〜１５（ＣＣＦＳＹ）、残基１７〜２４（ＡＲＫＬＰＨＮＦ）、残基３４〜３５（ＬＣ）または残基５７〜６７（ＳＷＶＱＥＹＶＹＤＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１βの少なくとも１つの抗原決定基と結合し；
配列番号７３の残基１０〜１４（ＣＣＦＡＹ）、残基１６〜２３（ＡＲＰＬＰＲＡＨ）、残基３３〜３４（ＫＣ）または残基５６〜６６（ＫＷＶＲＥＹＩＮＳＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳの少なくとも１つの抗原決定基と結合する、請求項１１に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
配列番号３、４、５、８、９、１０、５３、５４、５５、５８、５９および６０からなる群から選択される、ＭＡｂ  ３Ｃ１２Ｆの少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる、請求項１１に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
ＭＡｂ  ３Ｃ１２Ｆを産生するハイブリドーマ細胞株によって、もしくはその継代培養物によって産生されるか、またはハイブリドーマ細胞株３Ｃ１２Ｆによって産生される抗体の結合を競合的に遮断する、請求項１１に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１６】
ヒト抗体、ヒト化抗体もしくはキメラヒト−マウス抗体、またはその抗原結合フラグメントである、請求項１１に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１７】
ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ１４／ＨＣＣ−１およびＣＣＬ１８／ＰＡＲＣからなる群から選択される少なくとも４種のＣＣケモカインと結合し、かつＣＣＬ２／ＭＣＰ−１と実質的に結合しない、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１８】
前記ＣＣケモカインの少なくとも１種のＮループ、３０’ｓループまたは４０’ｓループ中の決定基と結合する、請求項１７に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１９】
配列番号７１の残基１１〜１５（ＣＣＦＳＹ）、残基１７〜２４（ＳＲＱＩＰＱＮＦ）、残基３４〜３５（ＱＣ）または残基５７〜６７（ＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αの少なくとも１つの抗原決定基と結合し；
配列番号７２の残基１１〜１５（ＣＣＦＳＹ）、残基１７〜２４（ＡＲＫＬＰＨＮＦ）、残基３４〜３５（ＬＣ）または残基５７〜６７（ＳＷＶＱＥＹＶＹＤＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１βの少なくとも１つの抗原決定基と結合し；
配列番号７３の残基１０〜１４（ＣＣＦＡＹ）、残基１６〜２３（ＡＲＰＬＰＲＡＨ）、残基３３〜３４（ＫＣ）または残基５６〜６６（ＫＷＶＲＥＹＩＮＳＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳの少なくとも１つの抗原決定基と結合する、請求項１７に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項２０】
配列番号２３、２４、２５、２８、２９または３０からなる群から選択される、ＭＡｂ  ７Ｄ１Ｇの少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる、請求項１７に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２１】
ＭＡｂ  ７Ｄ１Ｇを産生するハイブリドーマ細胞株によって、もしくはその継代培養物によって産生されるか、またはハイブリドーマ細胞株７Ｄ１Ｇによって産生される抗体の結合を競合的に遮断する、請求項１７に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項２２】
ヒト抗体、ヒト化抗体もしくはキメラヒト−マウス抗体、またはその抗原結合フラグメントである、請求項１７に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２３】
ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳおよびＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ−１からなる群から選択される少なくとも４種のＣＣケモカインと結合し、かつＣＣＬ２／ＭＣＰ−１と実質的に結合しない、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２４】
前記ＣＣケモカインの少なくとも１種のＮループ、３０’ｓループまたは４０’ｓループ中の決定基と結合する、請求項２３に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２５】
配列番号７１の残基１１〜１５（ＣＣＦＳＹ）、残基１７〜２４（ＳＲＱＩＰＱＮＦ）、残基３４〜３５（ＱＣ）または残基５７〜６７（ＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αの少なくとも１つの抗原決定基と結合し；
配列番号７２の残基１１〜１５（ＣＣＦＳＹ）、残基１７〜２４（ＡＲＫＬＰＨＮＦ）、残基３４〜３５（ＬＣ）または残基５７〜６７（ＳＷＶＱＥＹＶＹＤＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１βの少なくとも１つの抗原決定基と結合し；
配列番号７３の残基１０〜１４（ＣＣＦＡＹ）、残基１６〜２３（ＡＲＰＬＰＲＡＨ）、残基３３〜３４（ＫＣ）または残基５６〜６６（ＫＷＶＲＥＹＩＮＳＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳの少なくとも１つの抗原決定基と結合する、請求項２３に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項２６】
配列番号１３、１４、１５、１８、１９または２０からなる群から選択される、ＭＡＢ  ７Ｄ１２Ａの少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる、請求項２３に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２７】
ＭＡｂ  ７Ｄ１２Ａを産生するハイブリドーマ細胞株によって、もしくはその継代培養物によって産生されるか、またはハイブリドーマ細胞株７Ｄ１２Ａによって産生される抗体の結合を競合的に遮断する、請求項２３に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項２８】
ヒト抗体、ヒト化抗体もしくはキメラヒト−マウス抗体、またはその抗原結合フラグメントである、請求項２３に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２９】
ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１βおよびＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳからなる群から選択される３種のＣＣケモカインと結合し、かつＣＣＬ２／ＭＣＰ−１と実質的に結合しない、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３０】
前記ＣＣケモカインの少なくとも１種のＮループ、３０’ｓループまたは４０’ｓループ中の決定基と結合する、請求項２９に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３１】
配列番号７１の残基１１〜１５（ＣＣＦＳＹ）、残基１７〜２４（ＳＲＱＩＰＱＮＦ）、残基３４〜３５（ＱＣ）または残基５７〜６７（ＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αの少なくとも１つの抗原決定基と結合し；
配列番号７２の残基１１〜１５（ＣＣＦＳＹ）、残基１７〜２４（ＡＲＫＬＰＨＮＦ）、残基３４〜３５（ＬＣ）または残基５７〜６７（ＳＷＶＱＥＹＶＹＤＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１βの少なくとも１つの抗原決定基と結合し；
配列番号７３の残基１０〜１４（ＣＣＦＡＹ）、残基１６〜２３（ＡＲＰＬＰＲＡＨ）、残基３３〜３４（ＫＣ）または残基５６〜６６（ＫＷＶＲＥＹＩＮＳＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳの少なくとも１つの抗原決定基と結合する、請求項２９に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項３２】
配列番号３３、３４、３５、３８、３９、４０、６３、６４、６５、６８、６９および７０からなる群から選択される、ＭＡｂ  １８Ｖ４Ｆの少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる、請求項２９に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３３】
ＭＡｂ  １８Ｖ４Ｆを産生するハイブリドーマ細胞株によって、もしくはその継代培養物によって産生されるか、またはハイブリドーマ細胞株１８Ｖ４Ｆによって産生される抗体の結合を競合的に遮断する、請求項２９に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項３４】
ヒト抗体、ヒト化抗体もしくはキメラヒト−マウス抗体、またはその抗原結合フラグメントである、請求項２９に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３５】
ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１βおよびＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳからなる群から選択される少なくとも３種のＣＣケモカインと結合し、かつＣＣＬ２／ＭＣＰ−１と実質的に結合しない、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３６】
前記ＣＣケモカインの少なくとも１種のＮループ、３０’ｓループまたは４０’ｓループ中の決定基と結合する、請求項３５に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３７】
配列番号７１の残基１１〜１５（ＣＣＦＳＹ）、残基１７〜２４（ＳＲＱＩＰＱＮＦ）、残基３４〜３５（ＱＣ）または残基５７〜６７（ＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αの少なくとも１つの抗原決定基と結合し；
配列番号７２の残基１１〜１５（ＣＣＦＳＹ）、残基１７〜２４（ＡＲＫＬＰＨＮＦ）、残基３４〜３５（ＬＣ）または残基５７〜６７（ＳＷＶＱＥＹＶＹＤＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１βの少なくとも１つの抗原決定基と結合し；
配列番号７３の残基１０〜１４（ＣＣＦＡＹ）、残基１６〜２３（ＡＲＰＬＰＲＡＨ）、残基３３〜３４（ＫＣ）または残基５６〜６６（ＫＷＶＲＥＹＩＮＳＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳの少なくとも１つの抗原決定基と結合する、請求項３５に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項３８】
配列番号４３、４４、４５、４８、４９および５０からなる群から選択される、ＭＡｂ  １８Ｐ７Ｅの少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる、請求項３５に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３９】
ＭＡｂ  １８Ｐ７Ｅを産生するハイブリドーマ細胞株によって、もしくはその継代培養物によって産生されるか、またはハイブリドーマ細胞株１８Ｐ７Ｅによって産生される抗体の結合を競合的に遮断する、請求項３５に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項４０】
ヒト抗体、ヒト化抗体もしくはキメラヒト−マウス抗体、またはその抗原結合フラグメントである、請求項３５に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４１】
請求項１に記載のモノクローナル抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞株。
【請求項４２】
請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを、担体、賦形剤またはバッファーと組み合わせて含んでなる、組成物。
【請求項４３】
２種以上のＣＣケモカインと結合するａｎｔｉｋｉｎｅ抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を製造するための方法であって、
１種のＣＣケモカインにより哺乳類を連続して免疫すること、
続いて、１種以上の異なるＣＣケモカインにより追加免疫すること、
該哺乳類からハイブリドーマ細胞株を作製すること、および
ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を単離すること
を含んでなる、方法。
【請求項４４】
１種以上のＣＣケモカインによって媒介される疾患、障害または病態を治療するための方法であって、それを必要とする被験体に、請求項１に記載のａｎｔｉｋｉｎｅ抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することを含んでなる、方法。
【請求項４５】
前記疾患、障害または病態が、炎症性疾患、または炎症によって媒介されるかもしくは炎症を伴うものである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記疾患、障害または病態が自己免疫疾患である、請求項４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２００９年８月２８日に出願された米国仮出願第６１／２３８，０１５号に基づく優先権を主張し、この米国仮出願は引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる。
【発明の背景】
【０００２】
発明の属する技術分野
本発明は、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体、すなわち、２種、３種、４種、５種以上のＣＣケモカイン（ＣＣケモカインは、β−ケモカインとしても知られる）と結合する抗体、特に、ＲＡＮＴＥＳ／ＣＣＬ５、ＭＩＰ−１α／ＣＣＬ３、ＭＩＰ−１β／ＣＣＬ４およびＭＣＰ−１／ＣＣＬ２からなる群から選択される少なくとも２種のケモカインと結合する抗体を包含する。単一種のＣＣケモカインとしか結合しない抗体とは違って、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は、同時に２種以上のＣＣケモカインと結合し、それらを検出し、かつ／または中和することによって、ＣＣケモカイン間での機能的冗長性の問題に実際に対処する。本発明の他の態様として、ＣＣケモカインによって媒介される病態、障害または疾患の治療を含む、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体の診断的使用および治療的使用；ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体を産生するハイブリドーマ細胞株および連続免疫によりハイブリドーマを生産するための方法；ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体をヒト化するための方法；ならびに親和性成熟によりａｎｔｉｋｉｎｅ抗体を改良するための方法を含む。
【０００３】
関連技術の説明
ケモカインは、炎症の重要なメディエーターであり、自己免疫疾患の発症に関係している；Viola & Luster, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48: 171-197 (2008)。ケモカインは、炎症または感染の部位において産生され、循環から組織への白血球の遊走を誘導する。ケモカインによって媒介される炎症または免疫学的プロセスを調整するための簡単かつ効果的な方法が長年求められてきた。これらの努力は、多くの異なるケモカインおよびそれらの受容体の機能における冗長性と重複によって困難なものとなっている。例えば、ケモカイン阻害剤は、前臨床動物モデルにおいて自己免疫病態を治療するために使用されてきたが、臨床では自己免疫の徴候の治療についてまだ成功していない。この効力の欠如はケモカインの機能における冗長性が原因である可能性があるということが提唱されてきた。５０種を超える種々のケモカインが同定されており、それらのケモカインは各々、異なる構造特性と機能特性を有している。一部のケモカインの特異性は重複しており、すなわち、それらは同じタイプの受容体と結合し、または同様のタイプの細胞に作用する；Vergunst, et al., Arthritis Rheum. 58: 1931-1939 (2008)。ある特定のケモカインは２以上のタイプのケモカイン受容体と結合し得るため、あるケモカイン受容体は、２以上のタイプのケモカインによって結合される可能性がある。そのため、受容体と結合し、受容体とのケモカインの結合を遮断し、あるいは２種以上のケモカインの活性を中和することが可能な単一薬剤の開発が非常に望ましい。
【０００４】
ケモカインは、走化性サイトカインから名付けられ、免疫細胞の組織への移動を調節する小分泌ペプチドである；Baggiolini, et al., Adv. Immunol. 55:97-179 (1994); Oppenheim et al., Ann. Rev. Immunol. 9:617-648 (1991)。
【０００５】
総てのケモカインは、保存されたシステイン残基間のジスルフィド結合によって安定化されたグリークキー構造を共有している。しかしながら、ケモカインは、これらの保存システイン残基の数および位置に基づき４つの異なるファミリーにさらに割り当てられる。α−ケモカインおよびβ−ケモカインは各々、４つの保存システイン残基を含有する。α−ケモカインの最初の２つのシステインは、単一のアミノ酸によって隔てられており、特徴的なＣＸＣアミノ酸モチーフを形成している。β−ケモカインの最初の２つの保存システインは隣接している。そのため、β−ケモカインはＣＣケモカインとしても知られている。それに対し、リンフォタクチンは、３番目のクラスのＸＣケモカインの唯一のメンバーであり、２番目と４番目の保存システイン残基しか含有していない。フラクタルカインを唯一のメンバーとする４番目のクラスのケモカインは、最初の２つの保存システインを隔てている３つのアミノ酸を有するＣＸＸＸＣまたはＣＸ３Ｃのクラスである。ヒトでは、α−ケモカインは、４番染色体上の遺伝子群によって主にコードされ、β−ケモカインは、１７番染色体上の遺伝子によって主にコードされる。リンフォタクチンは１番染色体上でコードされ、フラクタルカインは１６番染色体上でコードされる。
【０００６】
ケモカインは、勾配を形成し、免疫細胞および他の細胞、例えば、単球、マクロファージ、好塩基球、好酸球、Ｔリンパ球および繊維芽細胞などに対して走化性因子や潜在的増殖シグナルとして働く。ＣＣケモカインは、走化性細胞によって認識される濃度勾配を形成することによって走化性因子特性を示し、また、ＣＣケモカインは、繊維芽細胞および免疫細胞、例えば、単球、マクロファージ、Ｔリンパ球、好塩基球および好酸球などを含む、増殖する特定の細胞種にシグナル伝達をする。ＣＣケモカインを含むケモカインの標的の受容体および細胞は、Viola, et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48:171-197 (2008)によって記載されており、例えば、図１参照。この文献は、ＣＣケモカインの走化性因子機能およびシグナル伝達機能に関するその教示について引用することにより本明細書の一部とされる。
【０００７】
ケモカインは、ケモカインの特定の機能（ケモカイン受容体との結合など）と関連している構造的特徴を共有する。共通の構造としては、１番目のシステイン残基の前にある伸長Ｎ末端セグメント（Ｎ末端ドメイン）、Ｎループ、３１０ヘリックス、β鎖  β１、β２およびβ３、３０’ｓループ、４０’ｓループおよび５０ｓループ；ジスルフィド結合の存在、およびＣ末端α−ヘリックスセグメントが含まれる。
【０００８】
異なるＣＣケモカイン間で保存されたアミノ酸残基または相同のアミノ酸残基を含むこれらおよび他のＣＣケモカイン構造、ならびにＣＣケモカインの溶媒接触可能なアミノ酸残基、部分的に溶媒接触可能なアミノ酸残基、および埋もれたアミノ酸残基は、引用することにより本明細書の一部とされる。Fernandez, et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 42:469-99 (2002)、例えば、図１および図２参照。無傷の未変性ケモカインの埋もれたアミノ酸残基は、ケモカインに対する抗体に接触するエピトープまたは抗原決定基を形成する可能性は低い。それに対して、溶媒または表面に露出したＣＣケモカイン残基は抗体結合に利用されやすい。
【０００９】
ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αのケモカイン受容体結合と関連しているＣＣケモカイン残基としては、配列番号７１の残基１１〜１５（ＣＣＦＳＹ）、残基１７〜２４（ＳＲＱＩＰＱＮＦ）、残基３４〜３５（ＱＣ）および残基５７〜６７（ＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥ）が挙げられ；
ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１βケモカイン受容体結合と関連している残基としては、配列番号７２の残基１１〜１５（ＣＣＦＳＹ）、残基１７〜２４（ＡＲＫＬＰＨＮＦ）、残基３４〜３５（ＬＣ）または残基５７〜６７（ＳＷＶＱＥＹＶＹＤＬＥ）が挙げられ；
ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ結合と関連している残基としては、配列番号７３の残基１０〜１４（ＣＣＦＡＹ）、残基１６〜２３（ＡＲＰＬＰＲＡＨ）、残基３３〜３４（ＫＣ）または残基５６〜６６（ＫＷＶＲＥＹＩＮＳＬＥ）が挙げられ；
ＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ−１結合と関連している残基としては、配列番号８１の残基９〜１３（ＣＣＩＳＹ）、残基１５〜２２（ＰＲＳＩＰＣＳＬ）、残基３２〜３３（ＥＣ）または残基５５〜６５（ＫＱＶＱＶＣＭＲＭＬＫ）が挙げられ；
ＣＣＬ１５／ＨＣＣ−２と関連している残基としては、配列番号７９の残基８〜１２（ＣＣＴＳＹ）、残基１４〜２１（ＳＱＳＩＰＣＳＬ）、残基３１〜３２（ＥＣ）または残基５４〜６４（ＰＧＶＱＤＣＭＫＫＬＫ）が挙げられる。他のＣＣケモカインの対応するアミノ酸残基は、例えば、Fernandez, et al., 同上 (2002)の図１に示されている。
【００１０】
ＣＣケモカインの保存ドメインは、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/において開示されている。この構造データは、最終アクセス２０１０年８月２４日として上記のウェブサイトにおけるタンパク質および保存ドメインデータベース情報を引用することにより本明細書の一部とされる。
【００１１】
ＣＣケモカインクラスのケモカインは、ＣＣケモカイン受容体またはＣＣＲと呼ばれる７回膜貫通型Ｇタンパク質共役受容体と相互作用する、Rossi & Zlotnik, Ann. Rev. Immunol. 18:217-242 (2002)。ケモカインとその受容体との相互作用により、接着分子の活性化が調節され、循環から組織への免疫細胞の漏出および溢出に影響が及ぶ。
【００１２】
ケモカインは、多くの炎症性の病態、障害および疾患ならびに免疫学的な病態、障害および疾患の発症および維持に関係している。これらの病態、障害および疾患には、関節リウマチ、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、乾癬、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病を含む）、血管再狭窄、ループス腎炎、糸球体腎炎、移植拒絶、強皮症、繊維症、喘息（および他の肺の炎症病態）が含まれる。例えば、関節リウマチ、多発性硬化症（ＭＳ）、アテローム性動脈硬化症などを有する患者の罹患組織においてＣＣ−ケモカインのレベルが上昇する。これらの疾患の前臨床動物モデルでは、特有のケモカインを阻害することで病徴を少なくとも部分的に改善することができることが分かっている。例えば、Kasama, et al., J. Clin. Invest. 95: 2868-2876 (1995)では、関節リウマチの齧歯類モデルにおいて、ＭＩＰ−１α／ＣＣＬ３を阻害した抗体の投与により関節炎臨床スコアをおよそ５０％下げることができることが立証された。同様に、Ogata, et al., J. Pathol. 182: 106-114 (1997)では、抗ＭＣＰ−１／ＣＣＬ２抗体により関節腫脹をおよそ３０％軽減させることができることが示された。ＭＩＰ−１α／ＣＣＬ３に対する受容体（ＣＣＲ１およびＣＣＲ５を含む）とＭＣＰ−１／ＣＣＬ２に対する受容体（ＣＣＲ２）は白血球において重複パターンで発現されるため、各ケモカイン単独の個別の阻害剤よりもＭＩＰ−１α／ＣＣＬ３およびＭＣＰ−１／ＣＣＬ２双方の阻害剤が有効であり得る可能性がある。Viola, et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48:171-197 (2008)は、そのようなＣＣケモカインと関連しているかまたはそのようなＣＣケモカインによって媒介される特定のクラスまたはタイプの疾患および障害の開示について引用することにより本明細書の一部とされる、例えば、表１参照。
【００１３】
ケモカイン活性の天然阻害剤は知られており、特定のケモカインと結合するか、または特定のケモカインの活性を妨げる抗体または小分子阻害剤などの特異的な薬剤が開発されている、Fernandez, et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 42: 469-99 (2002)参照。この文献について、そのような阻害剤および薬剤は引用することにより本明細書の一部とされる、例えば、４８２〜４８８頁参照。ワクシニアウイルスおよび関連ポックスウイルスは、ｖＣＣＩと呼ばれる可溶性の３５ｋＤタンパク質（配列番号１１７）を生産し、このタンパク質はケモカインＣＣクラスの複数種のケモカインを結合し阻害する。ケモカインのＣＣクラスは、一般的に、Ｔ細胞および単球を含む白血球に作用する；Smith et al., Virology 236: 316-327 (1997)、Burns et al., J. Biol. Chem. 277: 2785-2789 (2002)。組換えｖＣＣＩは、実験的自己免疫性脳炎；Jones et al., Cytokine 43: 220-228 (2008)および喘息；Dabbagh, et al., J. Immunol. 165: 3418-3422 (2000)を含むいくつかの慢性炎症性疾患モデルにおいて白血球浸潤の減少に効果的であることが明らかになっている。しかしながら、被験体の免疫系にとって異質のウイルスタンパク質様ｖＣＣＩなどの天然物質の使用は、安全性の問題を提起する。ｖＣＣＩなどの物質の投与は望ましくない生理応答または免疫応答を引き起こし、そのような物質は、宿主のクリアランス機構または防御機構によって異物として中和され、除去されまたは破壊され得る。
【００１４】
この点を考慮して、本発明者らは、２種以上のケモカインと特異的に結合し中和することができ、ｖＣＣＩのような分子と関連した危険性がない抗体、とりわけ、ヒト化抗体を作製するための方法の開発に着目した。先行技術のケモカイン阻害剤、例えば、単一種のＣＣケモカインと結合する抗体などには、ＣＣケモカイン受容体の冗長性の問題がある。例えば、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αおよびＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳはそれぞれ、ケモカイン受容体１（ＣＣＲ１）および５（ＣＣＲ５）と結合する、Viola, 同上 (2008)の図１参照。これらのケモカイン受容体とのＣＣＬ３の結合だけを阻害する抗体は、ＣＣＬ５などの他のＣＣケモカインの結合による受容体活性化を妨げない。
【００１５】
本発明者らは、初めに、ケモカイン受容体ＣＣＲ１およびＣＣＲ５の主要なリガンドとなるＣＣケモカインＭＩＰ−１α／ＣＣＬ３、ＭＩＰ−１β／ＣＣＬ４およびＲＡＮＴＥＳ／ＣＣＬ５を対象とした。また、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１もＣＣＲ２のリガンドとして対象とした。Viola, et al., 同上 (2008)の図１により示されるように、これらの受容体は、単球およびＴ細胞だけでなく、他の白血球サブセットでも広く発現される。これらの受容体は、疾患の前臨床動物モデルおよびヒト疾患の両方における多くの炎症性病態に関係している。
【発明の概要】
【００１６】
本発明の一つの態様は、少なくとも２種、３種、４種、５種、６種または７種以上の異なるＣＣケモカインと結合することができる単離されたａｎｔｉｋｉｎｅ抗体またはその抗原結合フラグメントである。ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体の一例は、ケモカイン受容体ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９またはＣＣＲ１０と相互作用する少なくとも１種のＣＣケモカインを含む２種以上のＣＣケモカインと結合することができるものである。別の実施態様では、ａｎｔｉｋｉｎｅは、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２およびＣＣＲ５と相互作用するＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳおよびＣＣＬ２／ＭＣＰ−１の少なくとも２種または３種と結合する。ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体またはａｎｔｉｋｉｎｅ抗体の抗原結合フラグメントの他の例には、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ１４／ＨＣＣ−１、ＣＣＬ１５／ＨＣＣ−２、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣおよびＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ−１からなる群から選択される少なくとも３種の異なるＣＣケモカインと結合するものが含まれる。
【００１７】
結合は、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体と、ＣＣケモカインの少なくとも１種の決定基との接触を介して起こる。例えば、結合は、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体と、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ１４／ＨＣＣ−１、ＣＣＬ１５／ＨＣＣ−２、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣまたはＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ−１の決定基との間で起こり得、その決定基は該ＣＣ−ケモカインのＣＣ残基と該ＣＣケモカインの最後のＣ残基との間に位置する。ＣＣケモカインにおける隣接ＣＣ（システイン−システイン）残基と最後のシステイン残基の位置は、当技術分野で周知であり、配列表に示されるＣＣケモカインの配列において容易に確認し得る。
【００１８】
ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体およびそれらの抗原結合フラグメントはまた、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ１４／ＨＣＣ−１、ＣＣＬ１５／ＨＣＣ−２、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣおよびＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ−１を含むＣＣケモカインの少なくとも１種の決定基と結合することもでき、その決定基は該ＣＣケモカインのＮループ、３０’ｓループまたは４０’ｓループ中に位置する。
【００１９】
また、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は、数種のＣＣケモカインと結合するが他のものとは結合しない能力によっても特徴付けることができる。例えば、あるａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αおよびＣＣＬ４／ＭＩＰ−１βと結合し得るが、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ８／ＭＣＰ−２またはＣＣＬ７／ＭＣＰ−３とは結合し得ない。図中に名前が記載されているケモカインおよび他の生物学的に活性な分子（ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＰＩＦ−１、ＨＣＣ−１、ＨＣＣ−２、ＨＣＣ−４、Ｐａｒｃ、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、エオタキシン、ＭＤＣ、ＥＬＣ、Ｉ−３０９、ＩＬ−８、ＳＤＦまたはフラクタルキンを含む）の一部または総てと結合しないだけでなく、他のケモカインとも結合しない他のものもある。例えば、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２またはＭＣＰ−３の少なくとも１つと結合しないａｎｔｉｋｉｎｅは、本明細書において例示される。
【００２０】
また、ａｎｔｉｋｉｎｅは、ある種の２種以上のＣＣケモカインと結合するが別の種の対応するＣＣケモカインとは結合しない能力によっても特徴付けることができる。例えば、あるａｎｔｉｋｉｎｅは、ヒトＣＣＬ３と結合し得るが、マウスＣＣＬ３とは実質的に結合し得ない。ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体の結合特異性の具体例は図８〜図１２に示されている。
【００２１】
いくつかのａｎｔｉｋｉｎｅ抗体およびそれらの抗原結合フラグメントはまた、ＣＣケモカインと対応する受容体との相互作用も阻害することができる。そのような阻害には、受容体とのケモカインの結合によって活性化される走化性または他の効果を阻害するなどの機能的効果がある可能性がある。
【００２２】
ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は、ＣＣケモカインのＣＣ受容体結合残基内の少なくとも１つの決定基と結合し得る。ＣＣケモカイン受容体結合と関連していると考えられているまたは知られている、受容体が結合するＣＣケモカインのアミノ酸残基およびセグメントは、当技術分野で報告されている。
【００２３】
一般的には、ＣＣケモカインファミリーの受容体結合に関与していると考えられるのは、Ｎ末端、Ｎループ、３０ｓループ、およびジスルフィドの隣の残基およびαヘリックス中である。ケモカインの様々な機能と関連する、ケモカインの特定の構造的特徴の記載は、次の２つの刊行物を引用することにより本明細書の一部とされる。Baysal, et al., Proteins 43(2):150-60 (2001)およびKuloglu, et al., Biochemistry, 40(42):12486-96 (2001)。ＣＣケモカインの提案された機能ドメインについてはNCBI conserved Domain Database CDD 29111参照。
【００２４】
本発明者らは、特異的ａｎｔｉｋｉｎｅモノクローナル抗体３Ｃ１２Ｆ、７Ｄ１Ｇ、７Ｄ１２Ａ、１８Ｖ４Ｆおよび１８Ｐ７Ｅを作製し同定した。これらのａｎｔｉｋｉｎｅは、当技術分野で公知の競合阻害アッセイを使用して、ａｎｔｉｋｉｎｅが認識したＣＣケモカインの１種以上とのこれらのａｎｔｉｋｉｎｅモノクローナル抗体の結合を競合的に遮断する他の抗体または物質を同定するために使用し得る。また、本発明には、競合阻害剤、例えば、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体の結合を阻害する抗体なども包含され、ａｎｔｉｋｉｎｅモノクローナル抗体３Ｃ１２Ｆ、７Ｄ１Ｇ、７Ｄ１２Ａ、１８Ｖ４Ｆおよび１８Ｐ７Ｅを使用してそのような競合阻害剤を検出する方法もまた包含される。
【００２５】
ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラヒト−マウス抗体、マウスまたは他の脊椎動物、鳥類もしくは哺乳類の抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントであってよい。
【００２６】
本発明のａｎｔｉｋｉｎｅ抗体の１つのタイプは、モノクローナル抗体３Ｃ１２Ｆと同一または同様の結合特異性を有し、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ１５／ＨＣＣ−２およびＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ−１からなる群から選択される少なくとも２種、３種、４種または５種のＣＣケモカインと結合することができる。これらは、図８に示されている他のケモカイン（ＨＣＣ−１、ＰＡＲＣまたはＭＣＰ  １、２もしくは３など）を含む他のケモカインとの結合を全く示さないかまたは実質的に示さない可能性がある。このタイプの抗体は、ケモカイン受容体との結合において重要である可能性があるドメインと結合することができ、そのようなドメインには、
ＣＣケモカインのＮループ、３０ｓループもしくは４０’ｓループ中の決定基；
配列番号７１の残基１１〜１５（ＣＣＦＳＹ）、残基１７〜２４（ＳＲＱＩＰＱＮＦ）、残基３４〜３５（ＱＣ）もしくは残基５７〜６７（ＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αの少なくとも１つの抗原決定基；
配列番号７２の残基１１〜１５（ＣＣＦＳＹ）、残基１７〜２４（ＡＲＫＬＰＨＮＦ）、残基３４〜３５（ＬＣ）もしくは残基５７〜６７（ＳＷＶＱＥＹＶＹＤＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１βの少なくとも１つの抗原決定基；
配列番号７３の残基１０〜１４（ＣＣＦＡＹ）、残基１６〜２３（ＡＲＰＬＰＲＡＨ）、残基３３〜３４（ＫＣ）もしくは残基５６〜６６（ＫＷＶＲＥＹＩＮＳＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳの少なくとも１つの抗原決定基；
配列番号８１の残基９〜１３（ＣＣＩＳＹ）、残基１５〜２２（ＰＲＳＩＰＣＳＬ）、残基３２〜３３（ＥＣ）もしくは残基５５〜６５（ＫＱＶＱＶＣＭＲＭＬＫ）内に位置する、ＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ−１の少なくとも１つの抗原決定基；または
配列番号７９の残基８〜１２（ＣＣＴＳＹ）、残基１４〜２１（ＳＱＳＩＰＣＳＬ）、残基３１〜３２（ＥＣ）もしくは残基５４〜６４（ＰＧＶＱＤＣＭＫＫＬＫ）内に位置する、ＣＣＬ１５／ＨＣＣ−２の少なくとも１つの抗原決定基
が含まれる。
【００２７】
この抗体タイプは、配列番号３、４、５、８、９もしくは１０、または配列番号５３、５４、５５、５８、５９もしくは６０からなる群から選択される、ＭＡｂ  ３Ｃ１２Ｆの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、または結合するＣＣケモカインとのＭＡｂ  ３Ｃ１２Ｆの結合を競合的に阻害もしくは遮断し、またはｖＣＣＩとのＲＡＮＴＥＳの結合を遮断する抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含んでなってよい（図２参照）。このタイプのａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は、ＭＡｂ  ３Ｃ１２Ｆの１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つのＣＤＲ、または配列番号３、４、５、８、９および／もしくは１０、または配列番号５３、５４、５５、５８、５９および／もしくは６０の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入または置換されているＣＤＲを含んでよい。よって、ＣＤＲ配列は、ハイブリドーマ細胞株３Ｃ１２Ｆによって、もしくはその継代培養物によって産生される抗体のものと同一であってよく；３Ｃ１２Ｆのａｎｔｉｋｉｎｅ抗体類似体のものと対応していてよく、または結合するＣＣケモカインの２種以上とのＭＡｂ  ３Ｃ１２Ｆの結合を競合的に遮断もしくは阻害するａｎｔｉｋｉｎｅモノクローナル抗体のものと対応していてよい。そのような抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラヒト−マウス抗体、マウス、鳥類もしくは他の脊椎動物の抗体；またはその抗原結合フラグメントの形であってよい。
【００２８】
２番目の抗体タイプは、７Ｄ１Ｇと同様または同一の結合特異性を有し、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ１４／ＨＣＣ−１、ＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ−１およびＣＣＬ１８／ＰＡＲＣからなる群から選択される少なくとも２種、３種、４種、５種または６種のＣＣケモカインと結合する。この抗体タイプは、図１０に示されている他のケモカイン（ＨＣＣ−２、エオタキシンまたはＭＣＰ  １、２、３もしくは４など）などの他のケモカインとの結合を全く示さないかまたは実質的に示さない可能性がある。
【００２９】
この２番目のタイプの抗体は、ケモカインまたはＣＣケモカインの構造決定基と結合することができ、
ＭＡｂ  ７Ｄ１Ｇによって結合されるＣＣケモカインの少なくとも１種のＮループもしくは４０’ｓループ中の決定基；
配列番号７１の残基１１〜１５（ＣＣＦＳＹ）、残基１７〜２４（ＳＲＱＩＰＱＮＦ）、残基３４〜３５（ＱＣ）もしくは残基５７〜６７（ＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αの少なくとも１つの抗原決定基；
配列番号７２の残基１１〜１５（ＣＣＦＳＹ）、残基１７〜２４（ＡＲＫＬＰＨＮＦ）、残基３４〜３５（ＬＣ）もしくは残基５７〜６７（ＳＷＶＱＥＹＶＹＤＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１βの少なくとも１つの抗原決定基；
配列番号７３の残基１０〜１４（ＣＣＦＡＹ）、残基１６〜２３（ＡＲＰＬＰＲＡＨ）、残基３３〜３４（ＫＣ）もしくは残基５６〜６６（ＫＷＶＲＥＹＩＮＳＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳの少なくとも１つの抗原決定基；
配列番号８１の残基９〜１３（ＣＣＩＳＹ）、残基１５〜２２（ＰＲＳＩＰＣＳＬ）、残基３２〜３３（ＥＣ）もしくは残基５５〜６５（ＫＱＶＱＶＣＭＲＭＬＫ）内に位置する、ＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ−１の少なくとも１つの抗原決定基；
配列番号７８の残基８〜１２（ＣＣＦＴＹ）、残基１４〜２１（ＴＹＫＩＰＲＱＲ）、残基３１〜３２（ＱＣ）もしくは残基５４〜６４（ＫＷＶＱＤＹＩＫＤＭＫ）、ＣＣＬ１４／ＨＣＣ−１の少なくとも１つの抗原決定基；または
配列番号８２の残基１０〜１４（ＣＣＬＶＹ）、残基１６〜２３（ＳＷＱＩＰＱＫＦ）、残基３３〜３４（ＱＣ）もしくは残基５６〜６６（ＫＷＶＱＫＹＩＳＤＬＫ）、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣの少なくとも１つの抗原決定基
と結合することが含まれる。
【００３０】
構造上、これらの抗体は、配列番号２３、２４、２５、２８、２９もしくは３０からなる群から選択される、ＭＡｂ  ７Ｄ１Ｇの１つ以上のＣＤＲ、または結合するＣＣケモカインとのＭＡｂ  ７Ｄ１Ｇの結合を競合的に阻害もしくは遮断する抗体由来のＣＤＲを含んでなってよい。このタイプのａｎｔｉｋｉｎｅ抗体の１つの種類は、ＭＡｂ  ７Ｄ１Ｇの１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つのＣＤＲ、または配列番号２３、２４、２５、２８、２９および／もしくは３０の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入または置換されているＣＤＲを含むであろう。よって、ＣＤＲ配列は、ハイブリドーマ細胞株７Ｄ１Ｇによって、もしくはその継代培養物によって産生される抗体のものと同一であってよく；７Ｄ１Ｇのａｎｔｉｋｉｎｅ抗体類似体のものと対応していてよく、または結合するＣＣケモカインの２種以上とのＭＡｂ  ７Ｄ１Ｇの結合を競合的に遮断するか、もしくは阻害するａｎｔｉｋｉｎｅモノクローナル抗体のものと対応していてよい。そのような抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラヒト−マウス抗体、マウス、鳥類もしくは他の脊椎動物の抗体；またはその抗原結合フラグメントの形であってよい。
【００３１】
ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体の３番目のタイプは、７Ｄ１２Ａと同様または同一の結合特異性を有し、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳおよびＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ−１からなる群から選択される少なくとも２種、３種または４種のＣＣケモカインと結合する。これらは、図９に示されている他のケモカイン（ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１など）を含む他のケモカインとの結合を全く示さないかまたは実質的に示さない可能性がある。
【００３２】
そのような抗体産物は、前記ＣＣケモカインの少なくとも１種のＮループまたは４０’ｓループ中の決定基と結合することができ；配列番号７１の残基１１〜１５（ＣＣＦＳＹ）、残基１７〜２４（ＳＲＱＩＰＱＮＦ）、残基３４〜３５（ＱＣ）もしくは残基５７〜６７（ＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αの少なくとも１つの抗原決定基；
配列番号７２の残基１１〜１５（ＣＣＦＳＹ）、残基１７〜２４（ＡＲＫＬＰＨＮＦ）、残基３４〜３５（ＬＣ）もしくは残基５７〜６７（ＳＷＶＱＥＹＶＹＤＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１βの少なくとも１つの抗原決定基；
配列番号７３の残基１０〜１４（ＣＣＦＡＹ）、残基１６〜２３（ＡＲＰＬＰＲＡＨ）、残基３３〜３４（ＫＣ）もしくは残基５６〜６６（ＫＷＶＲＥＹＩＮＳＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳの少なくとも１つの抗原決定基；または
配列番号８１の残基９〜１３（ＣＣＩＳＹ）、残基１５〜２２（ＰＲＳＩＰＣＳＬ）、残基３２〜３３（ＥＣ）もしくは残基５５〜６５（ＫＱＶＱＶＣＭＲＭＬＫ）、ＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ−１の少なくとも１つの抗原決定基と結合し得る。
【００３３】
構造上、これらの３番目のタイプの抗体は、配列番号１３、１４、１５、１８、１９もしくは２０からなる群から選択される、ＭＡｂ  ７Ｄ１２Ａの少なくとも１つのＣＤＲ、または結合するＣＣケモカインとのＭＡｂ  ７Ｄ１２Ａの結合を競合的に阻害する抗体由来の少なくとも１つのＣＤＲを含んでなってよい。このタイプのａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は、ＭＡｂ  ７Ｄ１２Ａの１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つのＣＤＲ、または配列番号１３、１４、１５、１８、１９および／もしくは２０の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入または置換されているＣＤＲを含んでよい。よって、ＣＤＲ配列は、ハイブリドーマ細胞株７Ｄ１２Ａによってもしくはその継代培養物によって産生される抗体のものと同一であってよく；７Ｄ１２Ａのａｎｔｉｋｉｎｅ抗体類似体のものと対応していてよく、または結合するＣＣケモカインの２種以上とのＭＡｂ  ７Ｄ１２Ａの結合を競合的に遮断もしくは阻害するａｎｔｉｋｉｎｅモノクローナル抗体のものと対応していてよい。そのような抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラヒト−マウス抗体、マウス、鳥類もしくは他の脊椎動物の抗体；またはその抗原結合フラグメントの形であってよい。
【００３４】
ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体の４番目のタイプは、１８Ｖ４Ｆと同様または同一の結合特異性を有し、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１βおよびＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳからなる群から選択される少なくとも２種または３種のＣＣケモカインと結合する。これらは、図１１に示されている他のケモカイン（ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１など）を含む他のケモカインとの結合を全く示さないかまたは実質的に示さない可能性がある。そのような抗体産物は、前記ＣＣケモカインの少なくとも１種のＮループまたは４０’ｓループ中の決定基と結合し得；配列番号７１の残基１１〜１５（ＣＣＦＳＹ）、残基１７〜２４（ＳＲＱＩＰＱＮＦ）、残基３４〜３５（ＱＣ）または残基５７〜６７（ＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αの少なくとも１つの抗原決定基；
配列番号７２の残基１１〜１５（ＣＣＦＳＹ）、残基１７〜２４（ＡＲＫＬＰＨＮＦ）、残基３４〜３５（ＬＣ）または残基５７〜６７（ＳＷＶＱＥＹＶＹＤＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１βの少なくとも１つの抗原決定基；
配列番号７３の残基１０〜１４（ＣＣＦＡＹ）、残基１６〜２３（ＡＲＰＬＰＲＡＨ）、残基３３〜３４（ＫＣ）または残基５６〜６６（ＫＷＶＲＥＹＩＮＳＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳの少なくとも１つの抗原決定基と結合し得る。
【００３５】
構造上、この４番目の抗体タイプは、配列番号３３、３４、３５、３８、３９もしくは４０、または配列番号６３、６４、６５、６８、６９もしくは７０からなる群から選択される、ＭＡｂ  １８Ｖ４Ｆの少なくとも１つのＣＤＲ、または結合するＣＣケモカインとのＭＡｂ  １８Ｖ４Ｆの結合を競合的に阻害する抗体由来の少なくとも１つのＣＤＲを含んでなってよい。このタイプのａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は、ＭＡｂ  １８Ｖ４Ｆの１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つのＣＤＲ、または３３、３４、３５、３８、３９および／または４０；または配列番号６３、６４、６５、６８、６９および／もしくは７０の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入または他のアミノ酸残基で置換されているＣＤＲを含んでよい。よって、ＣＤＲ配列は、ハイブリドーマ細胞株１８Ｖ４Ｆによって、もしくはその継代培養物によって産生される抗体のものと同一であってよく；１８Ｖ４Ｆのａｎｔｉｋｉｎｅ抗体類似体のものと対応していてよく、または結合するＣＣケモカインの２種以上とのＭＡｂ  １８Ｖ４Ｆの結合を競合的に遮断もしくは阻害するａｎｔｉｋｉｎｅモノクローナル抗体のものと対応していてよい。そのような抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラヒト−マウス抗体、マウス、鳥類もしくは他の脊椎動物の抗体；またはその抗原結合フラグメントの形であってよい。
【００３６】
ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体の５番目のタイプは、１８Ｐ７Ｅと同様または同一の結合特異性を有し、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１βおよびＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳからなる群から選択される少なくとも２種または３種のＣＣケモカインと結合する。これらは、図１２に示されている他のケモカイン（ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１など）を含む他のケモカインとの結合を全く示さないかまたは実質的に示さない可能性がある。そのような抗体産物は、上述の３種のＣＣケモカインの少なくとも１種のＮループまたは４０’ｓループ中の決定基と結合し得る。
【００３７】
そのような抗体産物は、前記ＣＣケモカインの少なくとも１種のＮループまたは４０’ｓループ中の決定基と結合することができ；
配列番号７１の残基１１〜１５（ＣＣＦＳＹ）、残基１７〜２４（ＳＲＱＩＰＱＮＦ）、残基３４〜３５（ＱＣ）または残基５７〜６７（ＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αの少なくとも１つの抗原決定基；
配列番号７２の残基１１〜１５（ＣＣＦＳＹ）、残基１７〜２４（ＡＲＫＬＰＨＮＦ）、残基３４〜３５（ＬＣ）または残基５７〜６７（ＳＷＶＱＥＹＶＹＤＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１βの少なくとも１つの抗原決定基；
配列番号７３の残基１０〜１４（ＣＣＦＡＹ）、残基１６〜２３（ＡＲＰＬＰＲＡＨ）、残基３３〜３４（ＫＣ）または残基５６〜６６（ＫＷＶＲＥＹＩＮＳＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳの少なくとも１つの抗原決定基
と結合し得る。
【００３８】
構造上、この５番目の抗体タイプは、配列番号４３、４４、４５、４８、４９または５０からなる群から選択される、ＭＡｂ  １８Ｐ７Ｅの少なくとも１つのＣＤＲ、または結合するＣＣケモカインとのＭＡｂ  １８Ｐ７Ｅの結合を競合的に阻害する抗体由来の少なくとも１つのＣＤＲを含んでなってよい。このタイプのａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は、ＭＡｂ  １８Ｐ７Ｅの１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つのＣＤＲ、または配列番号(ID NOS:)４３、４４、４５、４８、４９および／もしくは５０の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入または他のアミノ酸で置換されているＣＤＲを含んでよい。よって、ＣＤＲ配列は、ハイブリドーマ細胞株１８Ｐ７Ｅによって、もしくはその継代培養物によって産生される抗体のものと同一であってよく；１８Ｐ７Ｅのａｎｔｉｋｉｎｅ抗体類似体のものと対応していてよく、または結合するＣＣケモカインの２種、３種以上とのＭＡｂ  １８Ｐ７Ｅの結合を競合的に遮断または阻害するａｎｔｉｋｉｎｅモノクローナル抗体のものと対応していてよい。そのような抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラヒト−マウス抗体、マウス、鳥類もしくは他の脊椎動物の抗体；またはその抗原結合フラグメントの形であってよい。
【００３９】
３Ｃ１２Ｆ、７Ｄ１Ｇ、７Ｄ１２Ａ、１８Ｖ４Ｆ、１８Ｐ７Ｅおよびそれらの類似体、または他のａｎｔｉｋｉｎｅ抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメイン配列（各ＣＤＲの配列を含む）は、抗体模倣体の薬物設計のためのコア構造として、ＣＣケモカイン−受容体結合に干渉する競合阻害剤として、ケモカインまたはＣＣケモカイン抗体に対する抗イディオタイプ抗体を単離または同定するためのリガンドとして、またはＣＣケモカインに対する抗体に対する抗イディオタイプ抗体を誘導する免疫原として使用され得る。そのようなペプチドには、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体のＣＤＲを含んでなる、修飾したまたは安定化させたペプチドまたは立体構造規制ペプチド（環状ペプチドまたはループペプチドなど）が含まれる。抗体のＣＤＲを使用するペプチド設計方法は、当技術分野で公知であり、それらの方法は、Takahashi, et al., Chem. Eur. J. 6(17):3196-3203またはFeng, et al., Cell. Host. Microb. 98(2): 311-316を引用することにより本明細書の一部とされる。これらのＣＤＲには、配列番号３〜５、８〜１０、１３〜１５、１８〜２０、２３〜２５、２８〜３０、３３〜３５、３８〜４０、４３〜４５、４８〜５０、５３〜５５、５８〜６０、６３〜６５および６８〜７０のものならびに親和性成熟によって生成されるこれらのペプチド配列の類似体が含まれる。異なるＣＤＲの組合せを、異なるＣＤＲを含んでなる独立したペプチドの組合せとして、または単一のペプチド産物を構成する２つ以上のＣＤＲペプチド配列のコンジュゲート、ハイブリッドまたは融合物として使用して、ＣＣケモカインの結合もしくは活性を調整もしくは阻害し得るか、ケモカインのダイマー化もしくはマルチマー化を阻害し得るか、または有用な生理応答もしくは免疫学的応答を誘導し得る。
【００４０】
本発明のａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は、以下にさらに詳細に記載されるように、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体またはその抗原結合フラグメントを担体、賦形剤またはバッファーとともに含んでなる組成物として処方し得る。
【００４１】
ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を作製するための方法は、特定のＣＣケモカインにより哺乳類（マウスなど）を連続して免疫すること、続いて、１種以上の異なるＣＣケモカインにより追加免疫すること、次いで、該哺乳類から、例えば、その脾細胞を骨髄腫または不死化Ｂ細胞株と融合することにより、ハイブリドーマ細胞株を作製すること、および２種以上のケモカインまたはＣＣケモカインと結合するａｎｔｉｋｉｎｅ抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を単離することを含む。
【００４２】
１種以上のＣＣケモカインによって媒介される疾患、障害または病態、とりわけ、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体によって認識される少なくとも２種または３種のＣＣケモカインによって媒介される疾患、障害または病態を治療するための方法は、それを必要とする被験体に、そのａｎｔｉｋｉｎｅ抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することを含む。その疾患、障害または病態は、炎症または自己免疫を特徴とするものであってよい。
【００４３】
本発明の他の態様は、図面および以下の実施態様の詳細な説明から明らかとなる。
【発明の具体的説明】
【００４４】
「抗体」とは、所望の生物活性（特定の抗原、エピトープまたは抗原決定基に対する結合能など）を示す限り、単一モノクローナル抗体、ポリエピトープ特異性(polyepitopic specificity)を有する抗体組成物、ならびに抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖおよびＦｖ）を表すと広く解釈されるべきである。この用語には、無傷の抗体、全長抗体または非末端切断型抗体、ならびに抗体フラグメント、および抗体誘導体、抗体変異体および抗体類似体が含まれる。
【００４５】
抗体は、以下に記載されるａｎｔｉｋｉｎｅ抗体を含め、種々のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＹ）、ならびに様々なアイソタイプサブクラス（ヒトＩｇＧサブクラス１、２、３および４またはＩｇＡサブクラス１および２など）を有する場合がある。多価抗体は、多価抗原に対するそれらの親和性を特徴としているといえる。親和性は、同一エピトープの反復を含む抗原との結合を強め、ダイマー構造またはテトラマー構造と特徴付けられたケモカインもある。個々の抗体分子は、抗原結合部位が多くなるほど抗原に対するその抗体の親和性が高くなる。抗体は、様々な脊椎動物から取得または誘導することができ、それらには哺乳類および鳥類のものが含まれる。
【００４６】
本明細書において「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の集団（すなわち、若干存在する可能性がある自然突然変異を除き、その集団を構成する個々の抗体が同一である）から得られた抗体を意味する。モノクローナル抗体は、特異性が高く、単一の抗原部位に対して向けられる。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して向けられた異なる抗体を典型的に含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物に対し、モノクローナル抗体は各々、抗原の単一決定基に対して向けられる。モノクローナル抗体は、それらの特異性に加え、ハイブリドーマ培養によって合成され、他の免疫グロブリンが混入しないという点で有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均質な抗体集団から得られているという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈してはならない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohler & Milstein, Nature, 256:495 (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製してもよいし、または組換えＤＮＡ法によって作製してもよい（例えば、Cabilly, et al.、米国特許第４，８１６，５６７号参照）。
【００４７】
「キメラ抗体」とは、２つの異なる起源のアミノ酸配列を含有する抗体、例えば、特定のエピトープまたは抗原と結合することが分かっているマウス抗体可変セグメントへとスプライシングされる保存されたヒト抗体セグメントを含むものを意味する。重鎖および軽鎖のアミノ酸配列各々の一部は、特定の種由来の抗体または特定のクラスに属する抗体における配列と同一であるかまたは相同であるが、それらの鎖の残りのセグメントは別の種由来の配列と相同であるかまたは同一である。一つの実施態様では、本発明は、軽鎖および重鎖両方の可変領域がある哺乳類種に由来する抗体の可変領域を模倣しており、定常部が別の種に由来する抗体の配列と相同であるキメラ抗体または抗原結合フラグメントを特徴とする。本発明の一つの実施態様では、キメラ抗体は、マウス抗体由来のＣＤＲをヒト抗体のフレームワーク領域にグラフトすることにより作製される。よって、本発明のモノクローナル抗体には、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種由来の抗体または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるかまたは相同であるが、その鎖の残りの部分が別の種由来の抗体または別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるかまたは相同である「キメラ」抗体、ならびにＣＣケモカインに対する結合能を保持する、そのような抗体のフラグメントが含まれる。キメラ抗体の特徴およびそれらを作製するための方法は、Cabilly, et al.、米国特許第４，８１６，５６７号；およびMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)を引用することにより本明細書の一部とされる。
【００４８】
「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、免疫グロブリン分子の軽鎖または重鎖の可変領域の一部を形成する。抗体鎖のこれらの部分は、抗原の特定のエピトープに対する抗体の特異性を決定する領域の一部を形成し、そのエピトープと直接結合し得る抗体分子の部分を形成する。ＣＤＲ３は、抗体を形成する種々のＣＤＲの間で最大の可変性を示す。ＣＤＲは、抗体と、その抗体が認識するエピトープとの接触を媒介する。ＣＤＲ配列を含んでなるかまたはＣＤＲ配列と類似している単離されたペプチドは、さらなる機能活性を示す可能性がある：Polonelli, et al., PLoS One 3:e2371 (2008)。
【００４９】
「ヒト化抗体」とは、ヒト抗体鎖（アクセプター免疫グロブリンまたは抗体と呼ばれる）に実質的に由来する可変領域フレームワーク残基および非ヒト抗体（例えば、マウス）に実質的に由来する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる少なくとも１つの鎖を含んでなる抗体を意味する。ヒト化抗体は、ＣＤＲグラフトに加え、典型的には、親和性を向上させおよび／または免疫原性を低下させるためにさらなる改変が行われる。「ヒト化抗体」は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ抗体である、完全ではないヒト抗体を包含する。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト種、例えば、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類など（ドナー抗体）に由来する超可変領域の残基に置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によって、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基に置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体には見られない残基を含んでなることがある。これらの修飾は、抗体性能をさらに精密化するために行われる。一般的には、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的に総てを含んでなる。その場合、超可変領域の総てまたは実質的に総てが非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、ＦＲの総てまたは実質的に総てがヒト免疫グロブリン配列のものである。また、ヒト化抗体は、所望により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはアミノ酸残基の置換、欠失または付加（すなわち、突然変異）の導入によって改変されている、２種以上のＣＣケモカインと免疫特異的に結合するヒト免疫グロブリンのものも含んでなる。いくつかの実施態様では、ヒト化抗体は誘導体である。そのようなヒト化抗体は、１つ以上の非ヒトＣＤＲにアミノ酸残基の置換、欠失または付加を含んでなる。ヒト化抗体誘導体は、非誘導体ヒト化抗体と比べて、実質的に同じ結合、より良好な結合またはより不良な結合を示す。特定の実施態様では、ＣＤＲの１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのアミノ酸残基が置換、欠失または付加されている（すなわち、突然変異を受けている）。ヒト化抗体を作製するための方法は、欧州特許第ＥＰ２３９，４００号、同第ＥＰ５９２，１０６号および同第ＥＰ５１９，５９６号；国際公開第ＷＯ９１／０９９６７号および同第ＷＯ９３／１７１０５号；米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５３０，１０１号、同第５，５６５，３３２号、同第５，５８５，０８９号、同第５，７６６，８８６号および同第６，４０７，２１３号；ならびにPadlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991)；Studnicka, et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994)；Roguska, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973 (1994)；Tan, et al., , J. Immunol. 169:1119-25 (2002)；Caldas, et al., Protein Eng. 13:353-60 (2000)；Morea, et al., Methods 20:267-79 (2000)；Baca, et al., J. Biol. Chem. 272:10678-84 (1997)；Roguska, et al., Protein Eng. 9:895-904 (1996)；Couto, et al., Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995)；Couto, et al., Cancer Res. 55:1717-22 (1995)；Sandhu, Gene 150:409-10 (1994)；Pedersen, et al., J. Mol. Biol. 235:959-73 (1994)；Jones, et al., Nature 321:522-525 (1986)；Reichmann et al., Nature 332:323-329 (1988)；およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を引用することにより本明細書の一部とされる。
【００５０】
「変異体」または「類似体」抗体とは、本明細書において、親抗体配列における１つ以上のアミノ酸残基の付加、欠失および／または置換によって「親」抗体のアミノ酸配列とアミノ酸配列が異なっている分子を意味する。一つの実施態様では、変異体は、親抗体の１以上の超可変領域において１以上のアミノ酸置換を含んでなる。例えば、変異体は、親抗体の１以上の超可変領域において少なくとも１つの、例えば、約１〜約１０の、好ましくは約２〜約５の置換を含んでなってよい。通常、変異体は、親抗体重鎖または軽鎖の可変ドメイン配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。この配列に関する同一性または相同性は、本明細書においては、配列をアラインさせ必要に応じてギャップを導入し最大配列同一性パーセントを得た後の、親抗体の残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義される。Ｎ末端、Ｃ末端もしくは内部の伸長、欠失または抗体配列への挿入が配列同一性または相同性に影響を及ぼすと解釈してはならない。変異体は、受容体を結合する能力を保持し、好ましくは、親抗体のものより優れた特性を有する。例えば、変異体は、より強い結合親和性、向上した受容体活性化能力などを持ち得る。本明細書において開示される生物活性アッセイにより抗体の形式がその活性に影響を与えることが見い出されたため、そのような特性を解析するためには、例えば、Ｆａｂ型の変異体をＦａｂ型の親抗体とまたは全長型の変異体を全長型の親抗体と比較すべきである。本明細書において特に興味深い変異体抗体は、親抗体と比べて、少なくとも約１０倍、好ましくは少なくとも約２０倍、最も好ましくは少なくとも約５０倍の生物活性の増強を示すものである。
【００５１】
本明細書における「親」抗体は、変異体の調製に使用されるアミノ酸配列によってコードされているものである。好ましくは、親抗体は、１つのヒトフレームワーク領域を有し、ヒト抗体定常領域を有する。例えば、親抗体は、ドナー（マウス）抗体のＣＤＲが組み込まれたヒト抗体であってよい。
【００５２】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され、分離されおよび／または回収されたものである。その自然環境の夾雑成分とは、抗体の診断的使用または治療的使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性溶質または非タンパク質性溶質が含まれ得る。いくつかの実施態様では、抗体は、（１）ローリー法により測定したときに９５重量％を超える抗体、最も好ましくは９９重量％を超えるまで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することによりＮ末端または内部のアミノ酸配列の少なくとも１５の残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クーマシーブルーまたは、好ましくは銀染色を用いた還元条件または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均質になるまで、精製される。抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のin situでの抗体が含まれる。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００５３】
「細胞物質を実質的に含まない」という表現は、抗体または抗体フラグメントが単離されまたは組換え生産された細胞の細胞成分から分離されているその抗体または抗体フラグメントの調製物を含む。よって、細胞物質を実質的に含まない抗体または抗体フラグメントは、異種タンパク質（本明細書では「夾雑タンパク質」とも呼ばれる）が約３０％、２０％、１０％または５％（乾燥重量）未満である抗体または抗体フラグメントの調製物を含む。抗体または抗体フラグメントが組換え生産される場合には、それが培養培地を実質的に含まないこともまた好ましく、すなわち、培養培地はタンパク質調製物の容量の約２０％、１０％または５％未満である。ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体またはその抗体フラグメントが化学合成によって生産される場合には、好ましくは、それは化学的前駆体または他の化学物質を含まずに生産される、すなわち、それはそのタンパク質の合成に関与した化学的前駆体または他の化学物質から分離される。従って、そのような抗体または抗体フラグメント調製物は、対象となる抗体または抗体フラグメント以外の化学的前駆体または化合物が約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量）未満である。一つの実施態様では、本発明の抗体またはそれらのフラグメントは単離されまたは精製される。
【００５４】
「ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体」とは、２種以上のケモカインと結合する上記のような抗体を意味し、好ましくは、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は３種以上のヒトＣＣケモカインと結合する。ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってよく、好ましくは、単離または精製された単一特異性抗体またはモノクローナル抗体である。ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は、哺乳類抗体（マウス抗体またはヒト抗体など）、またはキメラ抗体またはヒト化抗体であってよい。少なくともヒト抗体は、ヒトから、またはトランスジェニック動物またはファージディスプレイプラットフォームから得てよい、Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20(4):450-9 (2008)参照。トランスジェニック動物からヒト抗体を得る手法は、その文献を引用することにより本明細書の一部とされる。ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は、合成抗体、単一ドメイン抗体（ナノボディ（ＶＨＨ）またはラクダ化抗体など）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ、イントラボディおよび抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（本発明のａｎｔｉｋｉｎｅ抗体（３Ｃ１２Ｆなど）に対する抗イディオタイプおよび抗−抗イディオタイプ抗体などを含む）、二重特異性抗体、およびＣＣケモカインの決定基またはエピトープと結合する上記のいずれかのフラグメントであってよい。様々な構造形態の改変抗体は、Antibody Engineering: A Practical Approach, McCafferty, et al. 編, Oxford University Press (1996)を引用することにより本明細書の一部とされる。「ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体」とは、免疫グロブリン分子、および少なくとも１つの抗原結合部位（ＡＢＳ）を含有する、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性なフラグメントを包含する。これらは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＹを含む任意のアイソタイプのものであってよく、抗体を産生する脊椎動物（哺乳類および鳥類など）から誘導してよい。ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は動物（家畜または商業的に飼育された動物、または野生動物または人工飼育された動物など）への投与に適しているが、好ましくは、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体はヒト抗体またはヒト化抗体である。これらの動物には、伴侶動物、例えば、イヌおよびネコ；家畜、例えば、ウシ、ウマ、バッファロー、アジアスイギュウ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、ラマなど；および家禽、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、ハヤブサなどが含まれる。例えば、特定のタイプの動物により発現されるＣＣケモカインに対する抗体を誘導することによりおよび／またはヒト化と類似の抗体工学プロセスにより、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体を生産し非ヒト使用に適合させる方法は、当業者ならば理解するであろう。
【００５５】
ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体またはそれらのフラグメントは、特異的なＣＣケモカインと結合し、他のケモカインまたはポリペプチドとは非特異的に結合しない。ＣＣケモカインまたはＣＣケモカインのフラグメントと免疫特異的に結合するａｎｔｉｋｉｎｅ抗体またはそれらのフラグメントは、他の抗原と交差反応する可能性がある。しかしながら、ＣＣケモカインまたはそのフラグメントと免疫特異的に結合するａｎｔｉｋｉｎｅ抗体またはフラグメントは、他の抗原と交差反応しないものを選択し得る。特異的ＣＣケモカインと免疫特異的に結合するａｎｔｉｋｉｎｅ抗体またはそれらのフラグメントは、例えば、イムノアッセイまたは当業者に公知である他の技術により特定することができる。
【００５６】
「フラグメント」とは、ＣＣケモカインまたはａｎｔｉｋｉｎｅ免疫グロブリンなどの無傷のポリペプチド分子の一部を表す。「フラグメント」は、無傷の成熟ＣＣケモカインの配列または抗体ポリペプチド鎖軽鎖または重鎖の配列などのアミノ酸配列の少なくとも５つ、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、１２０、１３０、１５０、１７５、２００または２５０の連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含んでなるペプチドまたはポリペプチドを包含し得る。ＣＣケモカインの場合、フラグメントは、成熟ケモカインの長さより短い分子の一部（成熟ＣＣケモカインの少なくとも５つの連続したアミノ酸残基、少なくとも１０の連続したアミノ酸残基、少なくとも１５の連続したアミノ酸残基、少なくとも２０の連続したアミノ酸残基、少なくとも２５の連続したアミノ酸残基、少なくとも４０の連続したアミノ酸残基、少なくとも５０の連続したアミノ酸残基、または完全アミノ酸配列までのそれを含まない任意の中間値の連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含んでなるＣＣケモカインフラグメントなど）であろう。ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体の場合、フラグメントには、ＣＣケモカインと特異的に結合し、かつ無傷のａｎｔｉｋｉｎｅ抗体によって結合される少なくとも２種または３種のＣＣケモカインと結合する抗体のＶＨ部分および／またはＶＬ部分の少なくとも５つ、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０の連続したアミノ酸残基、または全長までのそれを含まない連続したアミノ酸残基のアミノ酸を含んでなるペプチドまたはポリペプチドが含まれる。ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体フラグメントは、単鎖フラグメント、例えば、軽鎖または重鎖または軽鎖または重鎖の一部であってよく、また、複数の鎖を有するフラグメント（ＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントなど）も含む。
【００５７】
「親和性成熟抗体」とは、可変領域における１以上の残基のタイプまたは位置を改変することによって増大された結合親和性および／または生物活性を有している抗体である。改変の一例は突然変異であり、その突然変異はＣＤＲまたはフレームワーク領域のいずれかに存在し得る。親和性成熟抗体は、典型的には、単離された抗体または自然抗体またはそのフラグメントより２〜５００倍増大した結合親和性を有するであろう。親和性成熟抗体は、受容体抗原に対してナノモルあるいはピコモルの親和性を有し得る。親和性成熟抗体は、当技術分野で公知の手法によって作製される。Marks, J. D. et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)（この文献は引用することにより本明細書の一部とされる）には、ＶＨおよびＶＬドメインシャッフリングによる親和性成熟について記載されている。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、Barbas, C. F. et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994)、Schier, R. et al. Gene 169:147-155 (1995)、Yelton, D. E. et al. J. Immunol. 155;1994-2004 (1995)、Jackson, J. R. et al. J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)、およびHawkins, R. E. et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)を引用することにより本明細書の一部とされる。
【００５８】
「ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体誘導体」とは、少なくとも２種、３種、４種以上のＣＣケモカインと特異的に結合するａｎｔｉｋｉｎｅ抗体またはＣＣケモカイン結合抗体フラグメントのアミノ酸配列を含んでなり、アミノ酸残基の置換、欠失または付加の導入によって改変されているポリペプチドを意味する。本明細書において「誘導体」とはまた、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質との結合などにより共有結合修飾されているａｎｔｉｋｉｎｅ抗体またはａｎｔｉｋｉｎｅ抗体のフラグメントも意味する。そのようなａｎｔｉｋｉｎｅ抗体誘導体は、当業者に公知の技術を用いた化学修飾によって作製することができ、そのような技術には、限定されるものではないが、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などが含まれる。ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体誘導体は、２種以上のＣＣケモカインと特異的に結合する能力を保持する。
【００５９】
「ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体類似体」とは、公知のａｎｔｉｋｉｎｅ抗体と実質的に同様のアミノ酸配列を含んでなり、公知のａｎｔｉｋｉｎｅ抗体の、２種以上のＣＣケモカインと結合する能力を保持しているポリペプチドを意味する。類似体はまた、１つ、２つ、３つ、５つまたは１０以上の非古典的アミノ酸を含んでもよい。ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体ポリペプチドと同様のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、別のタンパク質との同一性を参照することによりまたはコードポリヌクレオチド配列を参照することにより説明することができ、以下として含む：
（ｉ）公知のａｎｔｉｋｉｎｅ抗体の少なくとも１つの軽鎖または重鎖、または少なくとも１つのＣＤＲのアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｉｉ）本明細書において記載されるａｎｔｉｋｉｎｅ抗体またはａｎｔｉｋｉｎｅ抗体フラグメントをコードするヌクレオチド配列と、ストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされる、少なくとも５つ、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、９０、１００、１２５または少なくとも１５０のアミノ酸残基を含んでなるポリペプチド。温度およびイオン強度の条件によりハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」が決定される。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、Ｔｍ５５℃に相当し、例えば、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％ミルク、ホルムアミドなし；または３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳが挙げられる。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、より高いＴｍ、例えば、４０％ホルムアミド、５×または６×ＳＳＣ使用に相当し、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、最も高いＴｍ、例えば、５０％ホルムアミド、０．１×ＳＳＣに相当する；および
（ｉｉｉ）公知のａｎｔｉｋｉｎｅ抗体またはａｎｔｉｋｉｎｅ抗体フラグメントをコードするヌクレオチド配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド。本明細書において記載されるａｎｔｉｋｉｎｅ抗体またはａｎｔｉｋｉｎｅ抗体フラグメントと同様の構造を有するポリペプチドとは、公知のａｎｔｉｋｉｎｅ抗体またはそのフラグメントと同様の二次構造、三次構造または四次構造を有するポリペプチドを意味する。ポリペプチドおよびタンパク質の構造は、当業者に公知の方法によって決定することができ、そのような方法には、限定されるものではないが、Ｘ線結晶学、核磁気共鳴および結晶電子顕微鏡検査が含まれる。
【００６０】
「超可変領域」とは、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は、重鎖および軽鎖の可変ドメインにおける「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」のアミノ酸残基；Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)および／または重鎖および軽鎖の可変ドメインにおける「超可変ループ」のアミノ酸残基；Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)を含んでなる。「フレームワーク領域」または「ＦＲ」の残基は、本明細書において定義されるような超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。抗体の構造的特徴および抗体構造を決定または解析するための方法は、当業者に周知であり、Kabat, 同上, Chothia, et al., 同上；Deret, et al., Comput. Appl. Biosci. 11(4):435-9 (1995)；Martin, Protein 25(1):130-3 (1996)およびAbhinandan, et al., Mol. Immunol. 45(14):3832-9 (2008)；およびAbhinandan, et al., J. Mol. Biol. 369(3):852-62 (2007)を引用することにより本明細書の一部とされる。
【００６１】
「ＣＣ−ケモカイン」とは、４つの保存されたシステイン残基を含有する走化性サイトカインのファミリー由来のポリペプチドを意味し、それらの保存システイン残基の最初の２つは、例えば、Van Coillie, et al., Cytokine & Growth Factor Rev. 10:61-86 (1999)によって記載されているように隣接している。ＣＣケモカインはまた、β−ケモカインとしても知られている。これらの隣接システイン−システイン（ｃｙｓ−ｃｙｓまたはＣ−Ｃ）残基に基づいて、β−ケモカインは「ＣＣ」ケモカインとして知られており、ここで、「ＣＣ」は隣接システイン残基を示す。ＣＣケモカインの例は、ＣＣＲ１およびＣＣＲ５との結合するものであり、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１βおよびＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳが含まれる。ＣＣケモカインは哺乳類および鳥類に存在する。ヒト型またはマウス型の特定のケモカインに用いられる用語、例えば、ヒトＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αは、別の種における対応する分子、例えば、「マウスＭＩＰ−１α」または「ウシＭＩＰ−１α」を同定するために用いられ得るが、言及されている種における類似している、構造的に同様の分子を意味すると理解されるべきである。哺乳類種および鳥類種の間で類似しているケモカインは、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％、またはこの範囲内の任意の中間値の配列同一性を有し、同じまたは同様の機能的免疫学的活性を示し得る。
【００６２】
脊椎動物ＣＣケモカイン（哺乳類および鳥類のものを含む）の配列は、ＮＣＢＩデータベースを、特に、そのデータベースにおいて最終更新された受託番号（最終アクセス２０１０年８月９日）によって特定される配列に関連して、引用することにより、またFernandez & Lolis, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 42:469 (2002)（この文献は引用することにより本明細書の一部とされる）を引用することにより本明細書の一部とされる。
【００６３】
ヒトケモカインＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ１４／ＨＣＣ−１、ＣＣＬ１５／ＨＣＣ−２、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣおよびＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ−１などのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列の具体的な受託番号を表４に示している。各々は、とりわけ、表４に記載されるカタログ、供給業者またはＮＣＢＩ受託番号を引用することにより本明細書の一部とされる。これらのケモカインは、表４に記載される供給業者から市販されている。
【００６４】
本明細書において「ＣＣケモカイン決定基」とは、抗体の抗原結合残基に接触するＣＣケモカインの部分を意味する。この用語は、ＣＣケモカイン上のａｎｔｉｋｉｎｅ抗体によって認識される通常の線状エピトープだけでなく非線状エピトープを含む立体構造エピトープとの両方を包含する。ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体によって結合されるかまたはその抗原結合アミノ酸残基と直接接触するＣＣケモカインの１以上の部分がその決定基である。ＣＣケモカインの抗原決定基の除去、置換、破壊または変性により、ＣＣケモカインに対するａｎｔｉｋｉｎｅ抗体の結合能は低下または消滅し得る。抗体結合エピトープを決定するための方法は、Ladner, Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 24:1-30 (2007)（この文献は引用することにより本明細書の一部とされる）によって示されているように当技術分野で周知である。ＣＣケモカイン決定基には、ケモカイン受容体（例えば、ＣＣＲ１またはＣＣＲ５）との結合に関与するセグメントまたはドメイン（そのＮループ、β−１鎖、β−２鎖およびβ−３鎖、３０’ｓループ、４０’ｓループおよび５０’ｓループならびにそのＣ末端のヘリックスセグメントなど）が含まれ、これらの決定基は、Fernandez & Lolis, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 42:469 (2002)、Viola, et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48:171およびPakianathan, et al., Biochem. 36(32):9642 (1997)を引用することにより本明細書の一部とされる。
【００６５】
ＣＣケモカイン決定基はまた、病原体由来のタンパク質の結合によっても定義され（ワクシニアウイルスのｖＣＣＩによって結合されるＣＣケモカイン決定基など）、これらの決定基は、Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 103(38):13985-13990 (2006)を引用することにより本明細書の一部とされる。
【００６６】
「結合する」とは、２つの異なる物質間での化学的または物理的な接触または相互作用を意味する。これには、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体と対応する決定基（ＣＣケモカイン分子上のエピトープなど）との間の会合が含まれる。そのような接触または相互作用は、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水結合または他の公知のタイプの分子間結合の１以上によるものであってよい。結合は、２分子間での（例えば、リガンドとその対応する受容体との間での）直接接触、または介在部分を通じての間接接触（リンカーまたは二価もしくは多価部分を介した共有結合または非共有結合など）を含み得る。
【００６７】
「結合親和性」は、抗体と抗原の結合と解離の速度定数間の比率である親和性定数Ｋａによって表される。ＩｇＧ抗体に対する典型的な親和性は１０−５〜１０−９モル／Ｌである。抗体親和性は、当技術分野で公知の多くの種々の技術によって測定され、そのような技術には、平衡透析、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））および結合平衡除外法（ＫｉｎＥｘＡ（登録商標））が含まれる。結合抗原および遊離抗原と抗体親和性の関係は、スキャッチャード方程式、ｒ／ｃ＝Ｋｎ−Ｋｒ（式中、ｒ＝［結合抗原］の［総抗体量］に対する比率、ｃ＝［遊離抗原］、Ｋ＝親和性、ｎ＝１抗体分子当たりの結合部位数（結合価）によって表される。総ての抗体が抗原に対して同じ親和性を有する（例えば、モノクローナル抗体）ならば、ｒに対してｒ／ｃをプロットすると傾き−Ｋ、ｎにほぼ等しいｒ切片の直線が得られる。抗体が異種である（例えば、ポリクローナル）ならば、ｒに対してｒ／ｃをプロットすると曲線が得られ；結合部位の半分が結合している（ｒ＝１）場合には曲線の傾きによって平均親和性を決定することができる。
【００６８】
「ＣＣケモカインと特異的に結合する」という表現は、抗体または抗体フラグメントの特定のＣＣケモカインまたはＣＣケモカインセットとのバックグラウンドを上回る相互作用を表すものであって、他のケモカインとの相互作用を表すものではない。ＣＣケモカインとしては、限定されるものではないが、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１βおよびＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳが含まれ、ＣＣケモカインセグメントまたはドメインの例としては、そのケモカイン受容体結合残基、そのＮループ、β−１鎖、β−２鎖およびβ−３鎖、３０’ｓループ、４０’ｓループおよび５０’ｓループならびにそのＣ末端のヘリックスセグメントが挙げられる。ＣＣケモカインまたはそのドメインまたはセグメントの１つと特異的に結合する抗体は、例えば、当技術分野で公知のイムノアッセイ、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））または他のアッセイにより測定されたときに他の抗原とより低い親和性で結合し得る。例えば、同じ条件下同じ濃度で比較したときに別の抗体または対照抗体と比べて特定のＣＣケモカインと結合する能力が４倍以上のａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は、ＣＣケモカインと特異的に結合すると考えられよう。しかしながら、結合の量または親和性の有意差を立証する他の比較結合基準を用いてよく、これらの基準には、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体について２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍または１０００倍多い結合量、または２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、１００倍または少なくとも１，０００倍高い結合親和性が含まれるであろう。
【００６９】
２種、３種、４種、５種以上のＣＣケモカインと特異的に結合する抗体またはフラグメントは、他の非ケモカイン抗原または非ＣＣケモカインと交差反応する必要はない。ＣＣケモカインまたはそれらのフラグメントと特異的に結合するａｎｔｉｋｉｎｅ抗体またはフラグメントは、イムノアッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅまたは他の当業者に公知の技術により同定することができる。抗体またはそのフラグメントは、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などの実験技術を用いて測定されたときに、任意の交差反応性抗原に対するよりも高い親和性を有するＣＣケモカイン抗原またはそのフラグメントと特異的に結合する。抗体特異性に関する考察については、例えば、Paul, ed., Fundamental Immunology, Second Edition, Raven Press, New York (1989)、３３２〜３３６頁参照。
【００７０】
「阻害濃度」とは、対照と比べてＣＣケモカイン活性を、例えば、５％、１０％、２０％、３０％、５０％、８０％、９０％、９５％、９９％または最大１００％低下させる抗体（ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体またはそのＣＣケモカイン結合フラグメントなど）の濃度を意味する。ＣＣケモカイン活性は、in vivoまたはin vitroで測定することができ、それにはＣＣケモカイン活性（走化性など）のアッセイが含まれる。そのようなアッセイは、カルシウムフラックスまたはインテグリン活性化を含む。ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体またはそのＣＣ−ケモカイン結合フラグメント、ならびに対照抗体（ＣＣケモカインと結合しないものまたは単一種のケモカインと結合するものなど）の調整作用は、in vivo動物モデルでも測定することができ、それには免疫現象（炎症および自己免疫など）のＣＣケモカインによる活性化を測定するものが含まれる。ケモカイン活性の阻害とは、阻害剤の存在下でケモカインの少なくとも１つの活性を、その阻害剤の不在下でのその活性と比べて、相対的に低下させることを意味する。阻害は、例えば、ケモカイン上の活性部位との抗体結合による、またはケモカインの効果的な除去、固体化または不活性をもたらす結合による、ケモカイン活性の拮抗作用または中和を含み得る。「走化性阻害」とは、抗体またはその抗原結合フラグメントの不在下で観察される走化活性と比べての、抗体またはその抗原結合フラグメントの存在下での細胞走化活性の相対量の低下を意味する。特定の細胞種（種々の白血球細胞種を含む）の走化性阻害を測定する周知の方法が利用可能であり、それらの方法は、Chemokine Protocols, Meth. in Mol. Biol. 138 (2000), Humana Press, Eds. AEI Proudfoot, TNC Wells, and CA Powerを引用することにより本明細書の一部とされる。
【００７１】
「単離された」または「精製された」産物または成分は、産物または成分が得られる細胞源または組織源由来の細胞物質または他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、または化学合成される場合には化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。単離または精製された成分、分子または他の物質（ペプチド、ポリペプチド、抗体、ケモカイン、ポリ核酸または細胞を含む）は、その通常の環境または自然環境または固有の環境から取り出された、またはそのような環境から切り離して合成されたものである。単離または精製された産物または成分はまた、望まれていない生物的夾雑物質を含む、または、合成の場合には、その合成と関連している基質または副産物による、関連混合物または成分から物理的にまたは化学的に取り出してよくまたは分離してもよい。精製は、他の成分の１％、５％、１０％、５０％、７５％、９０％、９５％または１００％の除去を含む任意の程度に達してよい。単離は、抗体の場合には、血液または血清からの取り出し、またはモノクローナル抗体では、腹水または組織培養液からの取り出しとなり得る。
【００７２】
「核酸」および「ヌクレオチド配列」とは、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子の組合せまたはハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ分子、およびＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子の類似体を含む。本発明の核酸配列は、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体類似体または変異体の一部をコードし得る。そのような類似体は、例えば、ヌクレオチド類似体を用いて作製することができ、そのようなヌクレオチド類似体には、限定されるものではないが、イノシンまたはトリチル化塩基が含まれる。そのような類似体はまた、分子に有益な特性（例えば、ヌクレアーゼ耐性または細胞膜を通過する能力の向上など）を与える修飾骨格を含んでなるＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子も含んでなることができる。核酸またはヌクレオチド配列は、一本鎖、二本鎖であってよく、一本鎖部分と二本鎖部分の両方を含んでよく、三本鎖部分を含んでよいが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。「単離された」核酸分子は、その核酸分子の自然源に存在する他の核酸分子から分離されたものである。「単離された」核酸分子（ｃＤＮＡ分子など）は、組換え技術によって作製される場合には他の細胞物質または培養培地を実質的に含まず、または化学合成される場合には化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。一つの実施態様では、本発明の抗体またはそれらのフラグメントをコードする核酸分子は、単離または精製される。
【００７３】
本明細書において「宿主細胞」とは、核酸分子でトランスフェクトされた特定の対象細胞だけでなくそのような細胞の後代または潜在的後代も意味する。そのような細胞のその後代は、継代または核酸分子の宿主細胞ゲノムへの組込みにおいて起こり得る突然変異または環境の影響により、核酸分子でトランスフェクトされた親細胞と同一でないことがある。宿主細胞は、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体またはその成分の１つ、例えば、軽鎖または重鎖またはそのフラグメントを組換えにより発現させるために使用してよい。
【００７４】
２つの核酸配列またはアミノ酸配列の「同一性パーセント」を決定するために、最適な比較を目的としてそれらの配列をまずアラインさせる（例えば、第２のアミノ酸配列または核酸配列との最適なアラインメントのために、第１のアミノ酸配列または核酸配列の配列中にギャップを導入することができる）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中のある位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められている場合には、それらの分子はその位置において同一である。２配列間の同一性パーセントは、それらの配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一重複位置の数／位置の総数×１００％）。一つの実施態様では、それらの２つの配列は同じ長さである。２配列間の同一性パーセントの決定は、数学アルゴリズムを使用しても行うことができる。２配列の比較に利用される数学アルゴリズムの好ましい、限定されない例は、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5877 (1993)に記載されているように修飾されたKarlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264-2268 (1990)のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990)のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。本発明の核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得るためには、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、例えば、スコア＝１００、ワード長＝１２に設定されたＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメーターで行うことができる。本発明のタンパク質分子と相同のアミノ酸配列得るためには、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、例えば、スコア＝５０、ワード長＝３に設定されたＸＢＬＡＳＴプログラムパラメーターで行うことができる。比較を目的としてギャップを含むアライメントを得るためには、Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)に記載のとおりＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。あるいは、分子間の距離関係を検出する反復検索を行うために、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使用することもできる（同上）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合には、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。配列の比較に利用される数学アルゴリズムの別の好ましい、限定されない例は、Myers and Miller, CABIOS 4:11-17 (1988)のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列の比較にＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合には、ＰＡＭ１２０ウエイト残基表、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を使用することができる。２配列間の同一性パーセントは、ギャップを許容してまたはギャップを許容せずに、上記のものと同様の技術を用いて決定することができる。同一性パーセントを計算する際には、典型的には、完全な一致のみを計数する。
【００７５】
「保存的変化」とは、実質的に、配座的にまたは抗原的に中立である改変であって、親ペプチドまたは親ポリペプチドまたは天然ペプチドまたは天然ポリペプチドに対して、ペプチドまたはポリペプチドの変異体の三次構造に微小変化をもたらし、または変異体または類似のペプチドまたはポリペプチドの抗原決定基に微小変化をもたらす改変を意味する。ケモカインに関連しては、例えば、親ケモカインの少なくとも１つの機能（走化性の誘導、サイトカインネットワークへの参加あるいは酵素またはサイトカイン産生の誘導、または親ケモカインまたは天然ケモカインの受容体との結合のような機能を含む）を示す能力によって決定される場合、保存的変化は、得られるケモカイン変異体または類似体の特異性および／または親和性に実質的に影響を及ぼさないアミノ酸置換を含む。保存的変化は、抗体、抗体フラグメント（ＣＤＲセグメントを含む）の変異体または類似体に適用される場合、対応する非修飾抗体産物と同じエピトープまたは抗原と結合することが可能な抗体産物を生み出すアミノ酸置換を意味する。Berzofsky, Science 229:932-940 (1985)およびBowie, et al., Science 247:1306-1310 (1990)によって記載されているように、分子の配座的中立性および抗原的中立性を維持するアミノ酸置換の予測は当技術分野の技術の範囲内である。配座的および抗原的中立性を維持する可能性が最も高い置換に関する指針には、以下が含まれる、（ａ）疎水性アミノ酸の置換は、疎水性残基がタンパク質の内部に位置する可能性が高いことから、抗原性に影響を及ぼす可能性が低い、（ｂ）生理化学的に同様のアミノ酸の置換は、置換アミノ酸が天然アミノ酸を構造的に模倣していることから、コンホメーションに影響を及ぼす可能性が低い、および（ｃ）進化的に保存された配列の改変は、そのような保存によりそれらのアミノ酸配列に機能的重要性があることが示唆されるため、コンホメーションに悪影響を及ぼす可能性がある。
【００７６】
「組成物」または「医薬組成物または治療組成物」とは、ＣＣケモカインによって媒介される病態、障害もしくは疾患、またはその少なくとも１つの症状の重篤度を直接もしくは間接的に軽減するか、またはＣＣケモカインによって媒介される病態、障害もしくは疾患、またはその少なくとも１つの症状を治療する、担体、賦形剤、またはａｎｔｉｋｉｎｅ抗体またはそのＣＣ−ケモカイン結合フラグメントまたはその他のフラグメントを含有する溶液の組合せを意味する。「薬学上許容される担体」とは、本発明の分子と適合し、医薬投与に適した、希釈液、溶媒、分散剤、エマルション、脂質二重層、リポソーム、被覆剤、防腐剤（抗菌薬または抗真菌薬を含む）、等張剤、ｐＨ緩衝液および吸収調整剤などのようなあらゆる担体および賦形剤を含む。そのような担体、崩壊剤、賦形剤および薬学上活性な物質の投与に用いる薬剤の使用は、当技術分野で周知であり、Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, Am. Pharm. Assoc. (2000)（この文献は引用することにより本明細書の一部とされる）参照。本発明の医薬組成物は、意図された投与経路（非経口投与、経口投与または局所投与など）との適合性を得るために一般的に処方される。
【００７７】
本発明の治療組成物は、薬学上許容される担体中に本発明の少なくとも１種の抗体または抗体フラグメントを含む。「薬学上許容される担体」とは、慣例的に混合される少なくとも１種の成分であり、有効成分、生物学的製剤または薬物の投与に用いられる。担体は、当技術分野で使用されている任意の医薬品賦形剤および任意の形態の投与用ビヒクルを含んでよい。そのような組成物は、例えば、注射剤、水性懸濁液または溶液、非水性懸濁液または溶液、スプレー剤、固体および液体の経口処方物、蝋膏、ゲル、軟膏、皮内パッチ、クリーム、ローション、錠剤、カプセル剤、持続放出性処方物などであってよい。さらなる賦形剤としては、例えば、着色剤、風味マスキング剤、溶解助剤、懸濁剤、圧縮用薬剤、腸溶コーティング、持続放出助剤などが挙げられ得る。好適な投与形は当業者によって、U.S. FDA CDER Data Standards Manual C-DRG-00201, Version 08によって記載されているもの；またはＦＤＡウェブサイトhttp://www.fda.gov/ForIndustry/DataStandards/StructuredProductLabeling/ucm162038.htm（最終アクセス２０１０年８月９日）に挙げられているものなどの形状から選択することができ、それら双方は引用することにより本明細書の一部とされる。
【００７８】
経口投与される組成物は、固体の担体または賦形剤を含めることができまたは液体またはゲルの調製物として処方してよく、食用または不活性の担体を含めてよく、カプセル剤に封入し、錠剤に圧縮しまたはトローチ剤として処方してよい。経口投与される組成物は、胃内での分解を防ぎ分子の取込みを最適にするために、時限放出性形態またはカプセル形態に調製してよい。
【００７９】
注射用組成物は、当技術分野で周知の方法により処方してよく、注射用組成物には治療分子の滅菌溶液または分散液が包含され得る。そのようなものは、本発明の分子と適合する水、生理食塩水または他の緩衝液などの滅菌希釈液を通常含むであろう。注射用組成物は、単位投与量にまたは単位用量容器（バイアル、アンプルまたはシリンジなど）に調製し得る。
【００８０】
慣例の緩衝液および等張剤を使用してよく、ｐＨは、周知の薬剤（ＨＣｌまたはＮａＯＨなど）または緩衝液を使用して調整してよい。抗微生物薬または静菌薬、キレート化剤（ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡなど）および酸化防止剤および防腐剤を含めてよい。
【００８１】
本発明の治療組成物は、任意の許容される投与経路によって投与してよい（局所的に、粘膜上に、経口によるまたは経腸的にまたは非経口的に投与することを含む）。これらの経路には、限定されるものではないが、局所的、経粘膜的、経口による（口内、舌下を含む）、粘膜による（結膜、鼻腔、洞、尿道、膣、腸、直腸）、経腸的、経皮、皮内、皮下（ｓ．ｃ．）、筋肉内、腹腔内、静脈内（ｉ．ｖ．）、心臓内、関節または骨内による、器官（脳、脊髄、眼、耳、肝臓、脾臓、腎臓、胆嚢、膀胱）内による、骨、軟骨または関節の組織内による、（例えば、鼻腔内、気管内、肺内または気管支内(intrabroncial)）吸入による、経口的、スブッカル(subuccal)経路が含まれる。経路は、当業者によって、U.S. FDA, CDER, Data Standards Manual “Routes of Administration”, CDRG-00301, Version 004に挙げられているものから;またはhttp://www.fda.gov/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/DrugRegistrationandListing/ucm084039.htm（最終アクセス２０１０年８月９日）で入手可能な表２から選択することができ、それらは引用することにより本明細書の一部とされる。
【００８２】
「治療上有効な量」とは、ＣＣケモカインによって媒介される病態、障害もしくは疾患の重篤度を軽減するか、またはＣＣケモカインによって媒介される病態、障害もしくは疾患を治療するのに、その病態、障害もしくは疾患の別の治療法の治療効力を高めるのに、または再発もしくはその病態、障害もしくは疾患、またはその症状の少なくとも１つの重症化を予防するのに十分な治療薬の量を意味する。治療上有効な量は、疾患の発生を遅らせるか、または最小限に抑えるのに十分な治療薬の量を意味し得る。また、治療上有効な量は、疾患の治療または管理において治療的有用性を提供する治療薬の量も意味し得る。さらに、治療上有効な量は、本発明の治療薬に関連して、疾患の治療または管理において治療的有用性を提供する、例えば、疾患を治療または管理するのに足りる治療抗体の治療効力を高めるのに十分な、単独でまたは他の治療法と組み合わせての治療薬の量を意味する。本発明の抗体の量に関連して用いられるその用語は、治療法を総合的に改善し、望ましくない効果を軽減もしくは回避し、または別の治療薬の治療効力を相加的に高めるか、もしくは別の治療薬と相乗作用を示す量を包含し得る。
【００８３】
本明細書において用いられる「被験体」または「患者」とは、ＣＣケモカインを発現する脊椎動物を意味し、そのような脊椎動物には、鳥類および哺乳類（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌまたはネコ）、好ましくはヒトが含まれる。被験体または患者は、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体が認識するＣＣケモカインのＣＣケモカイン活性を調整するａｎｔｉｋｉｎｅ抗体の有効量による治療を必要とする存在である。
【００８４】
「炎症性の病態、障害または疾患」とは、限定されるものではないが、浮腫、発熱、白血球の走化性または遊走、血管の増殖、結合組織の増殖、発赤、局所発熱、滲出、およびRobbins, The Pathological Basis of Disease, 6th edition, Cotran, et al. (eds.),  W.B. Saunders, Co. (1999)、とりわけ、第３章、第７章および第１５章に記載されている他の徴候を含む、明白なまたは定量化可能な生理現象を意味する。ＣＣ−ケモカインに対するａｎｔｉｋｉｎｅ抗体に関連して、この用語は、ＣＣ−ケモカイン（ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１など）もしくは他のケモカインと関連している、またはそれらのケモカインによって直接もしくは間接的に媒介される現象を意味する。
【００８５】
「免疫親和性樹脂」とは、少なくとも１種の免疫学的リガンドまたは受容体が結合される固体基質を意味する。例えば、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は、その抗原結合部位以外の領域を介して樹脂に結合され得ることにより、その抗体は、ＣＣケモカイン上の抗原決定基に結合可能である。同様に、ＣＣケモカインは、樹脂に機能的に結合させることができることから、ＣＣケモカインはａｎｔｉｋｉｎｅ抗体と結合可能である。免疫学的リガンドまたは受容体の固定化に有用な多くの樹脂は、当技術分野で公知であり、免疫親和性樹脂を形成するために慣用される。そのような樹脂は、免疫学的アッセイでまたは精製手法で、特定のリガンドまたは受容体によって結合される成分の解析において有用である。本発明の免疫親和性樹脂を形成するために、そのような任意の樹脂を使用してよい。
【００８６】
本発明者らは、ＣＣケモカインに対する複数種の抗体の投与に関連した先行技術の問題を解決するための手段を追求した。驚くべきことに、本発明者らは、２以上のタイプのＣＣケモカインと結合することができる抗体、すなわち、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体を発見した。これらのａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は、複数種のケモカインの機能の遮断に単一種の抗体しか必要としないことから、炎症性疾患に対しての単一種のケモカインまたは単一種のケモカイン受容体の阻害に改善をもたらす。本発明のａｎｔｉｋｉｎｅ抗体はまた、異なる薬物動態特性を有する２種以上の抗体を投与することの欠点（各抗体に対して不便な別々の投与計画を使用することなど）も回避する。Ａｎｔｉｋｉｎｅは、特異的ケモカイン抗原との結合において効果が低くＦｃ受容体とより結合しやすい複合体を形成し、それゆえ細胞に取り込まれリソソームで分解されるという二重特異性抗体の不都合も回避する。
【００８７】
本明細書において示されているように、本発明者らは、複数種のケモカインによって媒介されるヒトの炎症性の病態、障害および疾患ならびに免疫学的な病態、障害および疾患の治療を単純化することができるいくつかのａｎｔｉｋｉｎｅ抗体を提供している。これらのａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は、親和性成熟および抗体ヒト化などのプロセスにより、一層効果的かつ安全なａｎｔｉｋｉｎｅ抗体を作製するための構造的および機能的プロトタイプとして役立つであろう
【００８８】
ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は、２種以上のＣＣケモカインと結合しそれらの活性を阻害する。ＣＣケモカイン（ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＣＰ−１を含む）を対象にすることにより、本発明者らは、同じまたは異なるケモカイン受容体（ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３およびＣＣＲ５を含む）を活性化する、ケモカインの調整に有用な抗体を同定した。例えば、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳは各々、ケモカイン受容体ＣＣＲ５と結合するため、これらの３種のＣＣケモカインを認識するａｎｔｉｋｉｎｅ抗体により、単一種のＣＣケモカインに対するものに比べてＣＣＲ５活性をより包括的に調整することができる。ＣＣＲ５活性化は、未成熟骨髄樹状細胞、単球、Ｔｈ１、Ｔｒｅｇ、ＮＫおよび形質細胞様樹状細胞を対象とする。同様に、ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＰＩＦ−１およびＨＣＣ−１は各々、ＣＣＲ１と結合し、そのＣＣＲ１活性化は単球、記憶Ｔ細胞およびＮＫ細胞を対象とする。これらのＣＣＲ１結合するケモカインの２種以上と結合するａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は、受容体活性化をより包括的に調整する。さらに、ＭＩＰ−１αおよびＲＡＮＴＥＳの両方に結合し阻害することができる抗体は、ＣＣＲ１およびＣＣＲ５両方の主要なリガンドの２つを効果的に遮断するであろう。よって、本発明者らは、炎症性疾患に関係している単球およびＴ細胞を含む白血球において発現される異なるケモカイン受容体の主要なリガンドを阻害するａｎｔｉｋｉｎｅ抗体を同定した。これらのケモカイン組合せのいずれかの阻害剤は、単一種の受容体における複数種のケモカインの機能または複数種の受容体におけるケモカイン活性の遮断に単一種の抗体しか必要としないことから、炎症性疾患に対しての単一種のケモカインの阻害（または単一種のケモカイン受容体との結合を遮断する抗体）に改善をもたらす。
【００８９】
ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は、結合するケモカインに応じて異なる特異性および機能活性を有する。本発明は、様々なＣＣ−ケモカインと、有利には、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよび／またはＭＣＰ−１の少なくとも２種と特異的に結合するａｎｔｉｋｉｎｅ抗体を提供する。本発明はさらに、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１α；ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１β；ＲＡＮＴＥＳおよびＭＣＰ−１；ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１β；ＭＩＰ−１αおよびＭＣＰ−１；またはＭＩＰ−１βおよびＭＣＰ−１の両方と特異的に結合する抗体を提供する。同様に、本発明は、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよび／またはＭＣＰ−１の３種または４種とだけでなく他の密接に関連するＣＣ−ケモカインとも結合するａｎｔｉｋｉｎｅ抗体を提供する。
【００９０】
ケモカインとの抗体または抗原結合抗体フラグメントの結合は、抗体の抗原結合部位（ＡＢＳ）とケモカインの抗原決定基またはエピトープとのアミノ酸残基間の接触によって起こる。エピトープが、複数の抗原決定基、すなわち、直線的に連続したアミノ酸配列の一部ではない単一アミノ酸またはアミノ酸側基を含んでなる直鎖ペプチド配列または立体構造エピトープであり得ることは周知である。例えば、α−ヘリックスの一面に存在する残基は抗体のＡＢＳに接触し得るが、反対面の残基は接触しない。
【００９１】
本発明の抗体および抗原結合抗体フラグメントは、シグナルペプチドを含まない成熟ＣＣケモカインのＮ末端またはＣ末端の半分と結合し得る。例えば、成熟型のヒトＲＡＮＴＥＳにはシグナルペプチド残基１〜２３が存在しない。よって、そのＮ末端部分は残基１〜３５に及び、そのＣ末端は３６〜６８に及ぶであろう（配列番号７３）。
【００９２】
本発明の抗体および抗原結合抗体フラグメントは、ＣＣケモカインとその受容体との結合に関連しているＣＣケモカイン残基と結合することによりＣＣケモカイン結合を遮断し得る。ＣＣケモカインの提案された機能ドメインについてはNCBI Conserved Domain Database CDD 29111[uid]；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez（最終アクセス２０１０年８月９日）参照。ＣＣケモカインの各々について以下に予測結合部位残基を示す：
ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α  配列番号７１の残基１１〜１５（ＣＣＦＳＹ）、残基１７〜２４（ＳＲＱＩＰＱＮＦ）、残基３４〜３５（ＱＣ）または残基５７〜６７（ＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥ）；
ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β  配列番号７２の残基１１〜１５（ＣＣＦＳＹ）、残基１７〜２４（ＡＲＫＬＰＨＮＦ）、残基３４〜３５（ＬＣ）または残基５７〜６７（ＳＷＶＱＥＹＶＹＤＬＥ）；
ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ  配列番号７３の残基１０〜１４（ＣＣＦＡＹ）、残基１６〜２３（ＡＲＰＬＰＲＡＨ）、残基３３〜３４（ＫＣ）または残基５６〜６６（ＫＷＶＲＥＹＩＮＳＬＥ）。
ＣＣＬ１４／ＨＣＣ−１  配列番号７８の残基８〜１２（ＣＣＦＴＹ）、残基１４〜２１（ＴＹＫＩＰＲＱＲ）、残基３１〜３２（ＱＣ）または残基５４〜６４（ＫＷＶＱＤＹＩＫＤＭＫ）。
ＣＣＬ１５／ＨＣＣ−２  配列番号７９の残基８〜１２（ＣＣＴＳＹ）、残基１４〜２１（ＳＱＳＩＰＣＳＬ）、残基３１〜３２（ＥＣ）または残基５４〜６４（ＰＧＶＱＤＣＭＫＫＬＫ）。
ＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ−１  配列番号８１の残基９〜１３（ＣＣＩＳＹ）、残基１５〜２２（ＰＲＳＩＰＣＳＬ）、残基３２〜３３（ＥＣ）または残基５５〜６５（ＫＱＶＱＶＣＭＲＭＬＫ）。
ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣ  配列番号８２の残基１０〜１４（ＣＣＬＶＹ）、残基１６〜２３（ＳＷＱＩＰＱＫＦ）、残基３３〜３４（ＱＣ）または残基５６〜６６（ＫＷＶＱＫＹＩＳＤＬＫ）。
【００９３】
そのような抗体または抗原結合フラグメントは、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳの少なくとも２種のセグメントだけでなく、該ケモカインとその受容体との結合に関与する他の関連ＣＣ−ケモカインとも結合し得る。Ａｎｔｉｋｉｎｅ（３Ｃ１２Ｆなど）は、ケモカインが結合するウイルスタンパク質（ｖＣＣＩなど）と同じ決定基と結合し得るか、またはそのようなウイルスタンパク質とケモカインとの結合を阻害し得る。
【００９４】
ＣＣ−ケモカインＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよび／またはＭＩＰ−１βに結合するモノクローナル抗体３Ｃ１２Ｆ、７Ｄ１Ｇ、７Ｄ１２Ａ、１８Ｖ４Ｆおよび１８Ｐ７Ｅは、本発明者らによって作製され、特性評価された。これらの抗体は、複数種のＣＣケモカインの活性を同時に調整することができるヒト化抗体の開発のためおよびＣＣケモカインによって媒介される炎症性疾患の治療のために必要な情報（超可変領域ならびに軽鎖および重鎖ＣＤＲの構造情報を含む）を提供する。
【００９５】
上の３種のＭＡｂの超可変配列およびＣＤＲ配列は、３Ｃ１２Ｆについては配列番号２〜５および７〜１０によって示され；ヒト化３Ｃ１２Ｆについては配列番号５２〜５５および５７〜６０によって示され；７Ｄ１２Ａについては配列番号１２〜１５および１７〜２０によって示され；７Ｄ１Ｇについては配列番号２２〜２５および２７〜３０によって示され；１８Ｖ４Ｆについては配列番号３２〜３５および３７〜４０によって示され；ヒト化１８Ｖ４Ｆについては配列番号６２〜６５および６７〜７０によって示され；１８Ｐ７Ｅについては配列番号４２〜４５および４７〜５０によって示される。
【００９６】
特有のａｎｔｉｋｉｎｅ抗体３Ｃ１２Ｆ、７Ｄ１Ｇ、７Ｄ１２Ａ、１８Ｖ４Ｆおよび１８Ｐ７Ｅを特徴とするａｎｔｉｋｉｎｅ抗体の５つの特定のタイプを開示する。加えて、ヒト化型の３Ｃ１２Ｆおよび１８Ｖ４Ｆも開示する。
【００９７】
１番目の抗体タイプは、ハイブリドーマ細胞株３Ｃ１２Ｆまたはその継代培養物によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を特徴とする。このモノクローナル抗体（ＭＡｂ）タイプの典型的な抗体は３Ｃ１２Ｆである。よって、このタイプには、ＭＡｂ  ３Ｃ１２Ｆ、ならびにその類似体および誘導体（親和性成熟のプロセスによってまたはヒト化によって作製される抗体を含む）が含まれる。３Ｃ１２Ｆタイプの抗体は、配列番号２または５２によって示される重鎖可変領域または３Ｃ１２Ｆ重鎖のＣＤＲ１（配列番号３または５３）、ＣＤＲ２（配列番号４または５４）およびＣＤＲ３（配列番号５または５５）の少なくとも１つを含む重鎖を含み得る。そのような抗体は、配列番号７もしくは５７を含んでなるか、または配列番号８もしくは５８のＣＤＲ１、配列番号９もしくは５９のとおりのＣＤＲ２、および配列番号１０もしくは６０によって示されるＣＤＲ３の少なくとも１つを含む軽鎖可変領域を含むことができる。配列番号２〜５および７〜１０は、非ヒト化３Ｃ１２Ｆを表し、一方、配列番号５２〜５５および５７〜６０はヒト化３Ｃ１２Ｆを表す。ヒト化３Ｃ１２Ｆは、配列番号５２によって示される重鎖可変領域または３Ｃ１２Ｆ重鎖のＣＤＲ１（配列番号５３）、ＣＤＲ２（配列番号５４）およびＣＤＲ３（配列番号５５）の少なくとも１つを含む重鎖を含む。そのような抗体は、配列番号５７を含んでなるかまたは配列番号５８のＣＤＲ１、配列番号５９のとおりのＣＤＲ２、および配列番号６０によって示されるＣＤＲ３の少なくとも１つを含む軽鎖可変領域を含むことができる。
【００９８】
２番目の抗体タイプは、ハイブリドーマ細胞株７Ｄ１２Ａまたはその継代培養物によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を特徴とする。このモノクローナル抗体（ＭＡｂ）タイプの典型的な抗体は７Ｄ１２Ａである。よって、このタイプには、ＭＡｂ  ７Ｄ１２Ａ、ならびにその類似体および誘導体（親和性成熟のプロセスによってまたはヒト化によって作製される抗体を含む）が含まれる。７Ｄ１２Ａ抗体タイプの抗体は、配列番号１２によって示される重鎖可変領域または７Ｄ１２Ａ重鎖のＣＤＲ１（配列番号１３）、ＣＤＲ２（配列番号１４）およびＣＤＲ３（配列番号１５）の少なくとも１つを含む重鎖を含み得る。また、そのような抗体は、配列番号１７を含んでなるかまたは配列番号１８のＣＤＲ１、配列番号１９のとおりのＣＤＲ２、および配列番号２０によって示されるＣＤＲ３の少なくとも１つを含む軽鎖可変領域も含み得る。
【００９９】
３番目の抗体タイプは、ハイブリドーマ細胞株７Ｄ１Ｇまたはその継代培養物によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を特徴とする。このモノクローナル抗体（ＭＡｂ）タイプの典型的な抗体は７Ｄ１Ｇである。このタイプには、ＭＡｂ  ７Ｄ１Ｇ、ならびにその類似体および誘導体（親和性成熟のプロセスによってまたはヒト化によって作製される抗体を含む）が含まれる。７Ｄ１Ｇタイプの抗体は、配列番号２２によって示される重鎖可変領域または７Ｄ１Ｇ重鎖のＣＤＲ１（配列番号２３）、ＣＤＲ２（配列番号２４）およびＣＤＲ３（配列番号２５）の少なくとも１つを含む重鎖を含み得る。また、そのような抗体は、配列番号２７を含んでなるかまたは配列番号２８のＣＤＲ１、配列番号２９のとおりのＣＤＲ２、および配列番号３０によって示されるＣＤＲ３の少なくとも１つを含む軽鎖可変領域も含み得る。
【０１００】
４番目の抗体タイプは、ハイブリドーマ細胞株１８Ｖ４Ｆまたはその継代培養物によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を特徴とする。このモノクローナル抗体（ＭＡｂ）タイプの典型的な抗体は１８Ｖ４Ｆである。このタイプには、ＭＡｂ  １８Ｖ４Ｆ、ならびにその類似体および誘導体（親和性成熟のプロセスによってまたはヒト化によって作製される抗体を含む）が含まれる。１８Ｖ４Ｆタイプの抗体は、配列番号３２または６２によって示される重鎖可変領域または１８Ｖ４Ｆ重鎖のＣＤＲ１（配列番号３３または６３）、ＣＤＲ２（配列番号３４または６４）およびＣＤＲ３（配列番号３５または６５）の少なくとも１つを含む重鎖を含み得る。また、そのような抗体は、配列番号３７または６７を含んでなるかまたは配列番号３８または６８のＣＤＲ１、配列番号３９または６９のとおりのＣＤＲ２、および配列番号４０または７０によって示されるＣＤＲ３の少なくとも１つを含む軽鎖可変領域も含み得る。配列番号３２〜３５および３７〜４０は、非ヒト化１８Ｖ４Ｆを表し、一方、配列番号６２〜６５および６７〜７０は、ヒト化１８Ｖ４Ｆを表す。ヒト化１８Ｖ４Ｆは、配列番号６２によって示される重鎖可変領域または１８Ｖ４Ｆ重鎖のＣＤＲ１（配列番号６３）、ＣＤＲ２（配列番号６４）およびＣＤＲ３（配列番号６５）の少なくとも１つを含む重鎖を含む。そのような抗体は、配列番号６７を含んでなるかまたは配列番号６８のＣＤＲ１、配列番号６９のとおりのＣＤＲ２、および配列番号７０によって示されるＣＤＲ３の少なくとも１つを含む軽鎖可変領域を含むことができる。
【０１０１】
５番目の抗体タイプは、ハイブリドーマ細胞株１８Ｐ７Ｅまたはその継代培養物によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を特徴とする。このモノクローナル抗体（ＭＡｂ）タイプの典型的な抗体は１８Ｐ７Ｅである。このタイプには、ＭＡｂ  １８Ｐ７Ｅ、ならびにその類似体および誘導体（親和性成熟のプロセスによってまたはヒト化によって作製される抗体を含む）が含まれる。１８Ｐ７Ｅタイプの抗体は、配列番号４２によって示される重鎖可変領域または１８Ｐ７Ｅ重鎖のＣＤＲ１（配列番号４３）、ＣＤＲ２（配列番号４４）およびＣＤＲ３（配列番号４５）の少なくとも１つを含む重鎖を含み得る。また、そのような抗体は、配列番号４７を含んでなるかまたは配列番号４８のＣＤＲ１、配列番号４９のとおりのＣＤＲ２、および配列番号５０によって示されるＣＤＲ３の少なくとも１つを含む軽鎖可変領域も含み得る。
【０１０２】
上記の、特定のタイプのａｎｔｉｋｉｎｅ抗体に加えて、本発明は、３種、４種、５種以上のＣＣ−ケモカインと結合するａｎｔｉｋｉｎｅ抗体、例えば、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳおよび／または他の関連ＣＣ−ケモカインと結合するａｎｔｉｋｉｎｅ抗体（ＭＡｂ  ３Ｃ１２Ｆおよび上記の他のものなど）を包含する。有利には、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は、特定のＣＣＲと結合する総てのＣＣケモカインに対して作製し得るか、または特定の病態、障害または疾患に関与するＣＣケモカインを対象とし得る。
【０１０３】
ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は、ＣＣケモカインと結合するのに十分な結合親和性を有するであろう。例示的な結合親和性としては、結合するＣＣケモカインに対して１，０００ｎＭ、９００ｎＭ、８００ｎＭ、４００ｎＭ、２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、７５ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ以下が挙げられる。しかしながら、図に示されるように、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は、異なるＣＣケモカインに対しては異なる結合親和性を有し得る。
【０１０４】
適当な結合親和性を有する抗体の選択は、当業者の技術の範囲内である。多くの治療目的には、低親和性を有する抗体と比べて高親和性を有する抗体がより望ましい。例えば、受動的に投与された高親和性抗体は、低親和性抗体と比べてin vivoで抗原をより効率的に除去することが証明されている；抗体の親和性が高くなるほど生じる循環免疫複合体のレベルは低くなり糸球体機能の機能障害は少なくなった；Steward, Antibodies: Their Structure and Function, Taylor and Francis (1984)、表４．５参照。抗体親和性決定方法ならびに低親和性抗体および高親和性抗体の特徴および機能は、その文献を引用することにより本明細書の一部とされる。一方で、抗体の中和力がその親和性に依存するだけでなく、その濃度、結合価および分子構造、ならびに投与される部位にも依存することを踏まえて、一部の用途ではより高い濃度のより低い親和性抗体が望ましいこともある。
【０１０５】
ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体を産生させるために使用される免疫原には、単離されたＣＣ−ケモカイン、天然ＣＣ−ケモカイン、組換えにより発現されたＣＣ−ケモカインまたは化学合成されたＣＣ−ケモカインの、所望によりアジュバントを含む、調製物が含まれ得る。免疫学的応答を増強するために使用される様々なアジュバントとしては、限定されるものではないが、フロイントアジュバント（完全および不完全）、鉱物ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、多価陰イオン、ペプチド、油性乳剤、ジニトロフェノールなど）、ＢＣＧ(Bacille Calmette-Guerin)およびコリネバクテリウム・パルヴム(Corynebacterium parvum)などのヒトアジュバント、または同様の免疫刺激薬が挙げられる。
【０１０６】
ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＣＰ−１タンパク質およびそのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドの配列は公知であり、例えば、利用可能な公開配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋなど）においてまたは表４の受託番号を参照することにより見つけられ得る。特に断りのない限り、これらの配列の関連型は、この出願の出願日直前にこれらのデータベースに登録されているものであろう。加えて、様々なＣＣ−ケモカイン（ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＣＰ−１を含む）の配列は公開されており、例えば、Furutani, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 159:249-255 (1989)（ＭＣＰ−１）、Obaru, et al., J. Biochem. 99:885-894 (1986)（ＭＩＰ−１α）、Lipes, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:9704-9708 (1988)（ＭＩＰ−１β）、Schall, et al., J. Immunol. 141:1018-1025 (1988)（ＲＡＮＴＥＳ）において見つけられ得る。それらの文献各々の開示内容は、引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる。これらのケモカインの一部または総てに対立遺伝子変異体が存在することは周知である。配列番号７１〜７４は、免疫およびＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＣＰ−１に対するａｎｔｉｋｉｎｅ抗体のスクリーニングに使用されるヒト配列を示している。
【０１０７】
ポリクローナル抗体の生産では、ＣＣケモカインの天然タンパク質、またはその合成変異体、またはＣＣケモカイン誘導体または２種以上のＣＣケモカインの組合せの注射により、様々な好適な宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳類）を免疫し得る。例えば、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＣＰ−１の混合物を免疫原として使用して、これらのＣＣケモカインに対する免疫応答を誘導してよい。
【０１０８】
必要に応じて、ＣＣケモカインに対して向けられるポリクローナル抗体分子を、哺乳類から（例えば、血液から）単離し、さらに、周知の技術（免疫グロブリン画分を得るためのプロテインＡクロマトグラフィーおよび２種以上のＣＣケモカインと結合するａｎｔｉｋｉｎｅ抗体を選択するための免疫アフィニティー精製など）により精製することができる。
【０１０９】
多くの用途では、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体をモノクローナル抗体として作製することが好ましい。連続細胞株培養による抗体分子の生産を提供する任意の技術を利用してよい。そのような技術としては、限定されるものではないが、ハイブリドーマ技術（Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975)参照）；トリオーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor, et al., Immunol. Today 4:72 (1983)参照）およびヒトモノクローナル抗体を生産するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Cole et al., In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)参照）が挙げられる。本発明の実施にはヒトモノクローナル抗体を利用してよく、ヒトモノクローナル抗体は、Cote, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030 (1983)によって記載されているようにヒトハイブリドーマを使用して、またはエプスタインバーウイルスでヒトＢ細胞をin vitroで形質転換することによって（Cole, et al. In:  Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)参照）作製し得る。このパラグラフで引用された文献は総て、引用することにより本明細書の一部とされる。
【０１１０】
モノクローナル抗体を生産するためのこれらの従来法の範囲を超えて、本発明者らは、驚くべきことに、抗原原罪の問題（ホスキンス効果）を考慮した連続免疫法により２種以上のＣＣケモカインを認識するａｎｔｉｋｉｎｅ抗体を生産することを発見した。一連の免疫は、得られる抗体の特異性に影響を及ぼすことが見い出された。これらの方法により特定のＣＣケモカインと結合する抗体が生成されることが分かり、そのいくつかはＣＣケモカイン（ＲＡＮＴＥＳ／ＣＣＬ５）とのワクシニアウイルスｖＣＣＩタンパク質の結合を遮断した。
【０１１１】
異なるケモカインによる脊椎動物、好ましくは、マウスの連続免疫は、例えば、適当なアジュバント中の第１のケモカインにより動物を免疫し、数週間後に第２のケモカインにより追加免疫し、最後に第３のケモカインにより再度追加免疫することにより行われる。しかしながら、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は、例えば、異なる組合せで２種、３種、４種以上の異なるケモカインを使用する、複数回の免疫と追加免疫を必要とする方法によって生産され得る。タンパク質を用いたケモカイン免疫およびＤＮＡを用いたケモカイン免疫の両方を行ってよい。ＤＮＡ免疫は、当技術分野で周知であり、Antibodies: A Laboratory Manual (Eds. E. Harlow & D. Lane, 1988)を引用することにより本明細書の一部とされる。ケモカインのポリヌクレオチド配列は当技術分野で周知であり、そのような配列もまた、Yoshie, et al., Adv. Immunol. 78: 57-110 (2001)を引用することにより本明細書の一部とされる。免疫は、ケモカインのアジュバントまたはコンジュゲートおよび担体タンパク質（Antibodies: A Laboratory Manual, Eds. E. Harlow & D. Lane (1988)（この文献は引用することにより本明細書の一部とされる）によって記載されているものなど）を使用して行ってよい。好ましくは、各マウスに約５００μｇ／ｋｇ体重または約１０μｇのケモカインを投与し、好ましいアジュバントは、初回免疫にはフロイントの完全アジュバントであり、以降の追加免疫には不完全フロイントアジュバントである。免疫原として用いる例示的なＣＣケモカインとしては、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１βおよびＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳの少なくとも２種が挙げられる。
【０１１２】
連続免疫の一つの実施態様では、マウスをまず、ＭＩＰ−１αにより免疫し、続いてＲＡＮＴＥＳおよび／またはＭＣＰ−１により追加免疫するか、またはＣＣケモカインＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよび／またはＭＣＰ−１を任意の他の順序により免疫する。マウス血清を、ＥＬＩＳＡによりＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＭＣＰ−１との反応性について検証する。次に、適当な血清応答を示すマウスの脾臓を用いて、ハイブリドーマ産生を進める。
【０１１３】
ハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体は、ＥＬＩＳＡによりＣＣケモカインを認識する能力について、またin vitroでの走化性アッセイまたはｖＣＣＩ／ケモカイン結合アッセイのいずれかにより活性の遮断について検証することができる。この戦略を使用して、複数種のＣＣケモカインに結合しそれらを阻害するいくつかの特異的なモノクローナル抗体が同定された。これらの抗体を「ａｎｔｉｋｉｎｅ」と称した。ハイブリドーマにより産生された抗体はまた、他の機能アッセイでも試験し得る。複数種のＣＣケモカインと反応性を示す抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を、次にクローニングし、抗体生産および精製のために増加させる。抗体結合特異性を決定するためのスクリーニングアッセイは、周知であり、当技術分野で慣行されている。そのようなアッセイの包括的な考察については、Harlow, et al. (Eds.), Antibodies: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, N.Y., Chapter 6 (1988)を参照。最初の同定後、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体に、例えば、親和性成熟のプロセスによってまたはそのＣＤＲもしくはフレームワーク配列の操作によって親和性の増大を行ってよく；またはａｎｔｉｋｉｎｅ抗体をヒト化してよい。ヒト治療法に使用するためには、好ましくは、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は、完全ヒト抗体またはヒト化抗体であり、２、３、４種以上のＣＣケモカインを認識するものであろう。
【０１１４】
一つの実施態様では、所望の特異性を有する抗体のスクリーニング方法としては、限定されるものではないが、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）および当技術分野で公知の他の免疫を媒介する技術が挙げられる。特定の実施態様では、ＣＣ−ケモカインの特定のドメインに対して特異的な抗体の選択は、そのようなドメインを有するＣＣ−ケモカインフラグメントと結合するハイブリドーマを生成することにより容易になる。ＣＣ−ケモカイン内の１以上のドメイン、例えば、ＣＣ−ケモカインファミリータンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント、類似体または相同体の保存されたドメインに対して特異的な抗体もまた本明細書において提供される。
【０１１５】
本発明のａｎｔｉｋｉｎｅ抗体およびそれらのフラグメントは、競合的結合イムノアッセイおよび非競合的結合イムノアッセイにより、ＣＣ−ケモカイン、特に、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１および／または他のケモカインとの特異的結合についてアッセイし得る。イムノアッセイのための周知の手法は、Stites and Terr (Eds.) Basic and Clinical Immunology, 7th ed., (1991)；Maggio (Ed.) Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1980)；Tijan,  Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam (1985)；Harlow and Lane (Eds.) Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988)；Chan (Ed.), Immunoassay: A Practice Guide, Academic Press, Orlando, Fla. (1987)；Price and Newman (Eds.) Principles and Practice of Immunoassays, Stockton Press, N.Y. (1991)；およびNgo (Ed.) (1988) Non-isotopic Immunoassays, Plenum Press, N.Y. (1988)を引用することにより本明細書の一部とされる。
【０１１６】
抗体結合を測定するためのイムノアッセイは、競合的アッセイであってよくまたは非競合的アッセイであってよい。一般的には、抗体に関連して、競合的アッセイは、２抗体間でのリガンド結合の競合を伴う。例えば、標識ＭＣＰ−１を使用して、一方の抗体がもう一方の抗体と、標識ＭＣＰ−１との結合について競合することができるかどうかを評価してよい。そのアッセイは、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）のような標準的なアッセイに基づいてよい。
【０１１７】
あるいは、本発明の抗体およびフラグメントは、基質との結合についての非競合的アッセイにより試験してもよい。例えば、リガンド（例えば、ＭＣＰ−１）がＥＬＩＳＡプレート上に固定化されている標準的なＥＬＩＳＡを使用してよい。試験抗体をリガンドとともにインキュベートし、結合させる。そのプレートを洗浄し、その後は、試験抗体がリガンドに結合されている場合にはその試験抗体に酵素コンジュゲート二次抗体（例えば、マウス抗ヒトＦｃ抗体）が結合する。洗浄後、その酵素の基質を添加し、その酵素と反応させる。一般的には、色の変化によってリガンドと反応する抗体の存在が示される。試験抗体によって認識されるケモカインを識別するために、種々のＣＣ−ケモカインについてＥＬＩＳＡを繰り返してよい。
【０１１８】
イムノアッセイでは、標識されたアッセイ成分を使用する場合が多い。その標識は、様々な形式であってよく、当技術分野で周知の方法によりアッセイの所望の成分と直接または間接的に結合され得るものである。アッセイ成分に対する一般的な標識としては、放射性同位元素（３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃおよび３２Ｐを含む）、蛍光団、化学発光剤および酵素が挙げられる。特定の標識の選択は、要求感度、化合物との結合の容易さ、安定性要件および利用可能な器具類次第であり、当業者ならば容易に判断できる。
【０１１９】
本発明の抗体がＣＣ−ケモカイン活性、特に、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１および／または他のケモカインを阻害するかどうかを評価するためのアッセイは、走化性、細胞内カルシウムの増加などについての公知のアッセイを使用して容易に行うことができる。例えば、限定されるものではないが、ケモカイン走化性アッセイを９６ウェルプラスチックチャンバーで行ってよい。ウェルはフィルターによって２つのコンパートメントに分けられる。そのフィルターは、化学勾配に応じて１つのコンパートメントから次のコンパートメントへの細胞の通過が可能なものである。試験細胞をチャンバーの１つのコンパートメント、培養培地に入れ、例えば、ＣＣ−ケモカインをもう１つのコンパートメントの培養培地に入れる。フィルターを通り抜ける細胞を計数する。他のウェルでは、ＣＣ−ケモカインを試験抗体と混合して、その抗体が細胞遊走を妨げることが可能かどうかを判定する。
【０１２０】
上のスクリーニング手法により同定されたａｎｔｉｋｉｎｅモノクローナル抗体のさらなる抗体操作のために、実施例７に報告されるように、それらの抗体のＤＮＡ配列を決定した。
【０１２１】
本発明のａｎｔｉｋｉｎｅ抗体の親和性は、当技術分野で公知の方法（Raipal, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102:8466-8471 (2005)；Lippow, et al,, Nat. Biotechnol. 25:1171-1176 (2007)；Wu, et al., J. Mol. Biol. 368: 652-665 (2007)；Yang, et al., J. Mol. Biol. 254: 392-403 (1995)；およびHuse, et al., J. Immunol. 149:3903-3913 (1992)（これらの文献各々は、抗体の親和性の成熟または増大のための方法の教示として引用することにより本明細書の一部とされる）によって記載されているものなど）を使用してさらに向上させてよい。本発明のａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は、２００ｎＭ未満、１００ｎＭの親和性を有することができ（例えば、最初に単離されたマウス抗体３Ｃ１２Ｆは、ＭＩＰ−１αに対して４９ｎＭの親和性を有する）、親和性成熟手順の間に４０ｎＭ未満、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭまたは０．１ｎＭであるように増大させることができる。モノクローナル抗体の親和性成熟に有用な手法は、当技術分野で周知であり、Antibody Engineering (Humana Press, 2004) and Phage Display, T. Clackson and H. B. Lowman, editors (Oxford University Press, 2004)を引用することにより本明細書の一部とされる。そのような手法は、キメラ型の上記ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体を用いて始めることができ、そのようなキメラ型抗体は親和性成熟と別にまたは同時にヒト化することができる。その抗体の可変領域は、線状ファージの表面においてＦａｂフラグメントとして発現され得る。突然変異誘発戦略を使用し６つのＣＤＲ内の各残基を変更して、ファージにおいて発現されるＦａｂフラグメントのコンビナトリアルライブラリーを作製し得る。これらを、ケモカイン抗原との結合についてスクリーニングすることができ、親和性の向上について解析することができる。続いて、さらに大きな親和性向上を得るために、好ましいアミノ酸置換を組み合わせることができる。同時に、可変ドメインのフレームワーク領域内の突然変異を解析して、向上した特性を有する配列を見つけることができる。
【０１２２】
上に記載されるように、「変異体」または「類似体」抗体は、親抗体配列における１つ以上のアミノ酸残基の付加、欠失および／または置換によって親抗体のアミノ酸配列とアミノ酸配列が異なっている。一つの実施態様では、変異体は、親抗体の１以上の超可変領域において１以上のアミノ酸置換を含んでなる。
【０１２３】
抗体類似体は、３Ｃ１２Ｆ、７Ｄ１Ｇ、７Ｄ１２Ａ、１８Ｖ４Ｆまたは１８Ｐ７Ｅの重鎖または軽鎖配列のＣＤＲ、超可変またはフレームワーク領域における１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ以上のアミノ酸残基を置換することによって操作し得る。同様に、そのような抗体のアイソタイプは、当技術分野で公知のアイソタイプスイッチ技術によってまたは遺伝子工学手法（ＣＤＲグラフティング、キメラ抗体形成またはヒト化など）によって変更し得る。
【０１２４】
類似体は、３Ｃ１２Ｆ、７Ｄ１Ｇ、７Ｄ１２Ａ、１８Ｖ４Ｆまたは１８Ｐ７Ｅタイプのモノクローナル抗体の親和性成熟プロセスによって作製し得る。類似体は、一般的に、より高い結合親和性またはより広いケモカイン結合プロフィールについて選択され、それらのプロフィールは同時に獲得し得る。例えば、ＥＬＩＳＡまたは他の周知のアッセイによって、親抗体が結合する同じケモカインと結合するかどうかを判定することにより類似体を容易に同定し得る。類似体には、重鎖および軽鎖が、３Ｃ１２Ｆ、７Ｄ１Ｇ、７Ｄ１２Ａ、１８Ｖ４Ｆまたは１８Ｐ７Ｅの対応する重鎖および軽鎖の配列と約９０％、９５％、９９％または１００％配列同一性を共有する変異体が含まれる。３Ｃ１２Ｆ、７Ｄ１Ｇ、７Ｄ１２Ａ、１８Ｖ４Ｆまたは１８Ｐ７Ｅハイブリドーマ細胞株またはそれらの継代培養物によって産生される抗体の親和性成熟変異体を、１，０００ｎＭ、８００ｎＭ、４００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、７５ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭまたは０．１ｎＭ以下の結合親和性を有するように選択することができる。一部の類似体または変異体は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、１０または最大２０のアミノ酸配列修飾（欠失、挿入または置換など）を有し、類似体は、３Ｃ１２Ｆ、７Ｄ１Ｇ、７Ｄ１２Ａ、１８Ｖ４Ｆまたは１８Ｐ７Ｅ抗体の１以上の超可変領域またはＣＤＲに約２つ〜１０のアミノ酸置換を有し得る。
【０１２５】
類似体は、３Ｃ１２Ｆ、７Ｄ１Ｇ、７Ｄ１２Ａ、１８Ｖ４Ｆまたは１８Ｐ７Ｅ重鎖および／または軽鎖可変領域の次のＣＤＲ組合せ：ＣＤＲ１およびＣＤＲ２；ＣＤＲ１およびＣＤＲ３；ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の少なくとも１つを含んでなり、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１の２種以上に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントに相当し得る。
【０１２６】
動物抗原結合可変ドメインがヒト定常ドメインと結合されているキメラ抗体は、当技術分野で周知であり、それらを作製するための方法は、Cabilly et al.、米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison, S. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)；Boulianne, G. L. et al., Nature 312:643-646 (1984)；およびNeuberger, M. S. et al., Nature 314:268-270 (1985)を引用することにより本明細書の一部とされる。
【０１２７】
ヒト定常ドメインのアイソタイプは、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞毒性への関与に合わせてキメラ抗体を作製するように選択され得る（例えば、Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)；Riechmann, L. et al., Nature 332:323-327 (1988)；Love et al., Methods in Enzymology 178:515-527 (1989)；Bindon, et al., J. Exp. Med. 168:127-142 (1988)（これらの文献は引用することにより本明細書の一部とされる）参照。キメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、当技術分野で公知の組換えＤＮＡ技術によって、例えば、ＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号；欧州特許出願第１８４，１８７号；欧州特許出願第１７１，４９６号；欧州特許出願第１７３，４９４号；ＰＣＴ国際公開第ＷＯ８６／０１５３３号；米国特許第４，８１６，５６７号；欧州特許出願第１２５，０２３号；Better et al., Science 240:1041-1043 (1988)に記載されている方法を使用して作製することができる。
【０１２８】
本発明のａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は、公知の手法（Carter, 米国特許第６，７１９，９７１号、Almagro, et al., Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)；Pini, et al., Comb. Chem. High Throughput Screen. 5:503-510 (2002)；およびWu, et al., J. Mol. Biol. 294:151-162 (1999)（これらの文献は引用することにより本明細書の一部とされる）によって開示されているものを含む）によってヒト化し得る。ヒト化では、ドナー動物（マウス）抗体の抗体特異性を有するが、ヒトにおいて免疫原性の低下を示しより優れたエフェクター機能を有する免疫グロブリン分子が生み出される。このプロセスは、既知ａｎｔｉｋｉｎｅ  ＣＤＲ配列を、ヒト抗体の軽鎖および重鎖可変領域フレームワーク配列内へ組み込むことを必要とする。一般的には、ヒト化抗体は、ヒト可変ドメインフレームワーク内にマウスＣＤＲを代入することによって作製される。ヒト可変ドメインフレームワークが、マウスＣＤＲの起源となるマウス可変フレームワークと同じまたは同様のコンホメーションをとるならば、ヒト可変ドメインフレームワークは、結果としてマウスＣＤＲの正確な空間的配向を保持する可能性が最も高くなる。これは、ＣＤＲを得たマウス可変フレームワークドメインと高度な配列同一性を示すフレームワーク配列を有するヒト抗体由来のヒト可変ドメインを得ることにより達成される。重鎖および軽鎖可変フレームワーク領域は、同じまたは異なるヒト抗体配列から得ることができる。そのようなヒト抗体配列は天然に存在するヒト抗体の配列であってよくまたはいくつかのヒト抗体のコンセンサス配列であってよい。Kettleborough, et al., Protein Engineering 4:773-783 (1991)；Kolbinger, et al., Protein Engineering 6:971-980 (1993)およびCarter, et al.、ＷＯ９２／２２６５３参照。
【０１２９】
マウスドナー免疫グロブリンおよび適当なヒトアクセプター免疫グロブリンの相補性決定領域が同定されれば、次の段階は、得られるヒト化抗体の特性を最適にするために、あるとすれば、これらの成分のどの残基を置換すべきかを決定することである。一般的には、マウス残基の導入はヒト体内で抗体がヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を誘発する危険性を増大することから、ヒトアミノ酸残基とマウスのものとの置換は最小限に抑えるべきである。
【０１３０】
ＣＤＲコンホメーションおよび／または抗原との結合に対して考えられるそれらの影響に基づいて、置換に向けてヒト可変領域フレームワークの残基のある特定のアミノ酸が選択される。マウスＣＤＲ領域とヒト可変フレームワーク領域との不自然な並置により不自然な立体構造規制が生じ得る。その立体構造規制は、ある特定のアミノ酸残基の置換によって補正されない限り結合親和性の喪失を導く。
【０１３１】
置換に向けたアミノ酸残基の選択は、１つにはコンピュータモデリングによって判断される。一般的には、免疫グロブリン鎖またはそれらのドメインの解明済みの構造から出発して分子モデルが作製される。モデリングしようとする鎖は、解明済みの三次元構造の鎖またはドメインとアミノ酸配列類似性について比較され、分子モデルの構築のための出発点として最大の配列類似性を示す鎖またはドメインが選択される。モデリングに向けて少なくとも５０％配列同一性を共有する鎖またはドメインが選択され、好ましくは、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上の配列同一性を共有するものがモデリングに向けて選択される。モデリング中の免疫グロブリン鎖またはドメイン内のその時点でのアミノ酸と、出発構造内のアミノ酸との間の差を許容するように、解明済みの出発構造は修正される。修正された構造は、その後、複合免疫グロブリンへとアセンブルされる。最後に、そのモデルは、エネルギー最小化によって、そして総ての原子が互いに適当な距離内にあることおよび結合距離および結合角が化学的に許容される範囲内にあることを確認することによって洗練される。
【０１３２】
置換に向けたアミノ酸残基の選択はまた、１つには、特定の位置にあるアミノ酸の特徴の調査によって、または特定のアミノ酸の置換または突然変異誘発の効果の経験的観察によっても判断され得る。例えば、マウス可変領域フレームワークの残基と選択されたヒト可変領域フレームワークの残基との間であるアミノ酸が異なっている場合、そのアミノ酸が、抗原に直接非共有結合し、ＣＤＲ領域に隣接し、ＣＤＲ領域と別の方法で相互作用し（例えば、コンピュータモデリングによって測定した場合にはＣＤＲ領域から約３〜６Å内に存在する）、またはＶＬ−ＶＨ界面に関与することが合理的に予想されるときには、そのヒトフレームワークのアミノ酸は、通常マウス抗体由来の等価のフレームワークのアミノ酸によって置換されるべきである。
【０１３３】
「抗原に直接非共有結合する」残基には、確立された化学力によって、例えば、水素結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用などによって抗原のアミノ酸と直接相互作用する確率が優れている、フレームワーク領域内の位置にあるアミノ酸が含まれる。
【０１３４】
「ＣＤＲ領域に隣接する」残基には、ヒト化免疫グロブリン鎖の一次配列のＣＤＲの１以上に直接隣接する位置にある、例えば、Kabat--Wu & Kabat, J. Exp. Med. 132:211-250 (1970)によって定義されているＣＤＲ--またはChothia--Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)によって定義されているＣＤＲに直接隣接する位置にある、アミノ酸残基が含まれる。これらのアミノ酸は、特に、ＣＤＲ内のアミノ酸と相互作用し、アクセプターから選択される場合には、ドナーＣＤＲを歪ませ、親和性を低下させる可能性が高い。さらに、隣接するアミノ酸は抗原と直接相互作用する可能性があり（Amit, et al., Science 233:747-753 (1986)（この文献は引用することにより本明細書の一部とされる））、ドナーからのこれらのアミノ酸の選択では、元の抗体における親和性を提供する総ての抗原接触を維持することが望ましいことがある。
【０１３５】
「ＣＤＲ領域と別の方法で相互作用する」残基には、ＣＤＲ領域に影響を及ぼすのに十分な空間的配向にあることが二次構造解析により決定されているものが含まれる。「ＣＤＲ領域と別の方法で相互作用する」残基は、ドナー免疫グロブリンの三次元モデル（例えば、コンピュータで作成されたモデル）を解析することによって同定され得る。典型的には元のドナー抗体の三次元モデルは、ＣＤＲ外のある特定のアミノ酸がＣＤＲに近く、水素結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用などによってＣＤＲ内のアミノ酸と相互作用する確率が優れていることを示す。それらのアミノ酸位置では、アクセプター免疫グロブリンのアミノ酸よりもむしろドナー免疫グロブリンのアミノ酸が選択され得る。この基準によるアミノ酸は、一般的に、ＣＤＲ内の何らかの原子から約３Å内に側鎖原子を有し、確立された化学力（上に挙げたものなど）によってＣＤＲ原子と相互作用することができる原子を含むはずである。
【０１３６】
ＣＤＲ内のアミノ酸と相互作用することが可能なアミノ酸は、さらに別の方法によっても同定され得る。各フレームワークアミノ酸の溶媒接触可能表面積は、２通りに、すなわち：（１）無傷の抗体で、および（２）そのＣＤＲが除去された抗体からなる仮想分子で、算出される。約１０Å２以上のこれらの数値間の有意差により、溶媒に対するフレームワークアミノ酸の接触がＣＤＲによって少なくとも部分的に遮断され、それゆえ、そのアミノ酸がＣＤＲと接触していることが示される。アミノ酸の溶媒接触可能表面積は、当技術分野で公知のアルゴリズム、例えば、Connolly, J. Appl. Cryst. 16:548 (1983)およびLee & Richards, J. Mol. Biol. 55:379 (1971)（これらの文献双方は引用することにより本明細書の一部とされる）を使用して、抗体の三次元モデルに基づいて算出し得る。フレームワークアミノ酸はまた、別のフレームワークアミノ酸のコンホメーションに影響を及ぼしそのアミノ酸が次にＣＤＲと接触することによって、ＣＤＲと間接的に相互作用する場合もある。
【０１３７】
「ＶＬ−ＶＨ界面に関与する」残基または「パッキング残基」には、例えば、Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4592-66 (1985)またはChothia & Lesk, 前掲によって定義されているように、ＶＬとＶＨとの間の界面にある残基が含まれる。一般的には、普通でないパッキング残基がヒトフレームワーク内のものと異なっている場合にはそれらはヒト化抗体において保持されるべきである。
【０１３８】
一般的には、上の基準を満たすアミノ酸の１つ以上が置換される。いくつかの実施態様では、上の基準を満たすアミノ酸の総てまたは大部分が置換される。特定のアミノ酸が上の基準を満たしているかどうかについて若干のあいまいさが存在する場合があり、一方でその特定の置換を有し、もう一方でその特定の置換を有していない代替の変異体免疫グロブリンが生成される。そのように生成された代替の変異体免疫グロブリンは、本明細書において記載されるアッセイのいずれかによって所望の活性について検証することができ、好ましい免疫グロブリンを選択することができる。
【０１３９】
通常、ヒト化抗体におけるＣＤＲ領域は、ドナー抗体の対応するＣＤＲ領域と実質的に同一であり、より通常には同一である。通常は望ましくないが、得られるヒト化免疫グロブリンの結合親和性に認め得るほどに影響を及ぼすことなくＣＤＲ残基の１以上の保存的アミノ酸置換を行うことが可能な場合もある。保存的置換には、ｇｌｙ、ａｌａ；ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ；ａｓｐ、ｇｌｕ；ａｓｎ、ｇｌｎ；ｓｅｒ、ｔｈｒ；ｌｙｓ、ａｒｇ；およびｐｈｅ、ｔｙｒなどの組合せが意図される。
【０１４０】
さらなる置換候補は、その位置にあるヒト免疫グロブリンとしては普通でないまたは「稀」であるアクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。これらのアミノ酸は、マウスドナー抗体の等価位置のアミノ酸またはより典型的なヒト免疫グロブリンの等価位置のアミノ酸で置換されていてよい。例えば、アクセプター免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域内のアミノ酸がその位置としては稀であり、ドナー免疫グロブリンの対応するアミノ酸がヒト免疫グロブリン配列内のその位置として一般的である場合；またはアクセプター免疫グロブリンのアミノ酸がその位置としては稀であり、ドナー免疫グロブリンの対応するアミノ酸もまた他のヒト配列と比べて稀である場合には、置換が望ましいことがある。これらの基準は、ヒトフレームワーク内の典型的でないアミノ酸によって抗体構造が破壊されないことを確実にする助けとなる。さらに、普通でないヒトアクセプターアミノ酸を、たまたまヒト抗体に典型的なドナー抗体由来アミノ酸で置換することにより、ヒト化抗体の免疫原性を低下させ得る。
【０１４１】
本明細書において用いられる「稀」とは、代表的な配列サンプルで約２０％未満、通常には約１０％未満の配列においてその位置に存在するアミノ酸を示し、本明細書において用いられる「一般的」とは、代表的なサンプルで約２５％より多い、通常には約５０％より多い配列において存在するアミノ酸を示す。例えば、総てのヒト軽鎖および重鎖可変領域配列は、それぞれ、相互にとりわけ相同でありかつある特定の重大な位置に同じアミノ酸を有する配列の「サブグループ」に分けられる(Wu & Kabat, 前掲)。ヒトアクセプター配列内のあるアミノ酸がヒト配列の間で「稀」であるかまたは「一般的」であるを決定する際には、多くの場合、アクセプター配列と同じサブグループのヒト配列だけを検討することが好ましいであろう。さらなる置換候補は、Chothia & Lesk, 前掲によって提案されている代替定義によればＣＤＲ領域の一部として同定されるアクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。
【０１４２】
他の置換候補は、稀なまたは普通でないドナーフレームワーク残基に対応するアクセプターフレームワーク残基である。稀なまたは普通でないドナーフレームワーク残基は、その位置においてマウス抗体として（本明細書において定義されるとおりの）稀なまたは普通でないものである。マウス抗体については、Kabatによってサブグループを決定することができ、コンセンサスと異なる残基位置を同定することができる。これらのドナー特異的な差異は、活性を高めるマウス配列内の体細胞突然変異を示している可能性がある。結合に影響を及ぼすと予測される普通でない残基は保持されるが、結合にとって重要でないと予測される残基は置換することができる。
【０１４３】
さらなる置換候補は、アクセプターフレームワーク領域内に存在する非生殖細胞系残基である。例えば、アクセプター抗体鎖（すなわち、ドナー抗体鎖と有意な配列同一性を共有するヒト抗体鎖）を生殖細胞系抗体鎖（同じく、ドナー鎖と有意な配列同一性を共有する）とアラインさせたときに、アクセプター鎖フレームワークと生殖細胞系鎖フレームワークとの間で一致していない残基を、生殖細胞系配列由来の対応する残基で置換することができる。
【０１４４】
上述した具体的なアミノ酸置換の他、ヒト化免疫グロブリンのフレームワーク領域は、それらが得られたヒト抗体のフレームワーク領域と通常は実質的に同一であり、より通常には同一である。当然、フレームワーク領域内のアミノ酸の多くは、抗体の特異性または親和性に対して直接的な寄与をほとんどなさないまたは全くなさない。よって、フレームワーク残基の多くの個々の保存的置換は、得られるヒト化免疫グロブリンの特異性または親和性の認め得るほどの変化を伴わず、許容され得る。よって、一つの実施態様では、ヒト化免疫グロブリンの可変フレームワーク領域は、ヒト可変フレームワーク領域配列またはそのような配列のコンセンサスと少なくとも８５％配列同一性を共有する。別の実施態様では、ヒト化免疫グロブリンの可変フレームワーク領域は、ヒト可変フレームワーク領域配列またはそのような配列のコンセンサスと少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を共有する。しかしながら、一般的には、そのような置換は望ましくない。
【０１４５】
いくつかの実施態様では、ヒト化抗体は、好ましくは、それらが構築されたマウス抗体のものと同等以上の、抗原に対する特異的結合親和性を示す。通常、抗原に対するヒト化抗体の結合親和性の上限は、ドナー免疫グロブリンのものの３倍、４倍または５倍以内である。多くの場合、結合親和性の下限もまたドナー免疫グロブリンのものの３倍、４倍または５倍以内である。また、結合親和性は、置換が存在しないヒト化抗体（例えば、ドナーＣＤＲおよびアクセプターフレームワーク領域を有するが、フレームワーク領域置換が存在しない抗体）のものと比較することができる。そのような場合には、抗体（置換が存在する）の結合は、非置換抗体のものよりも、好ましくは少なくとも２倍〜３倍大きく、または３倍〜４倍大きい。比較を行うために、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）（すなわち、非標識試薬を使用する表面プラズモン共鳴）または競合的結合アッセイによって様々な抗体の活性を測定してよい。
【０１４６】
最初に同定されたケモカインに対する抗体の親和性を高めおよび／または炎症性疾患にも関与し得る他のＣＣ−ケモカインまでケモカイン選択性を広げるために、標準的な親和性成熟技術（Wu, et al., J. Mol. Biol. 350: 126-144 (2005)（この文献は引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されているものなど）を使用し、本明細書において開示されるモノクローナル抗体の配列に基づいて、改変抗体を設計してよい。
【０１４７】
キメラ抗体産物、ヒト化抗体産物または改変抗体産物に対して特定の、クラスまたはアイソタイプまたはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）を選択して、選択したクラスまたはサブクラスに関して周知の特定の機能にその抗体を向けまたは適合させてよい。例えば、ヒトＩｇＧ２を選択して、抗体産物の胎盤の通過を最小限に抑えまたは被験体の免疫系の他の成分とのＦｃ受容体相互作用を最小限に抑えることができ、サブクラスＩｇＧ４を選択して、補体を活性化する抗体産物の能力を最小限に抑えることができる。ＩｇＡアイソタイプを選択して、分泌抗体を生産することができ、ペンタマーＩｇＭ抗体産物を選択して、モノマー抗体と比べて抗体の結合を増大させることができる。抗体分子の様々なクラスおよびサブクラスの機能は、Kuby, Immunology, WH Freeman (1997)を引用することにより本明細書の一部とされる。 
【０１４８】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含んでなり、ここで、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖に存在する。一般的には、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含んでなり、そのリンカーによって、ｓＦｖは、抗原結合のために所望の構造を形成することが可能になる；Pl?ckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)（この文献は引用することにより本明細書の一部とされる）参照。ＣＣケモカインに対して特異的な単鎖抗体は、公知の方法（米国特許第４，９４６，７７８号（この米国特許は引用することにより本明細書の一部とされる）に開示されているものなど）によって作製し得る。
【０１４９】
「ダイアボディー」とは、２つの抗原結合部位を有する小抗体フラグメントを意味し、そのフラグメントは同じポリペプチド鎖（ＶＨおよびＶＬ）において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含んでなる。短すぎて同じ鎖上で２つのドメイン間での対合ができないリンカーを使用することにより、それらのドメインを強制的に別の鎖の相補的ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を作出する。本発明のａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は、ダイアボディーとして処方することができ、そのようなダイアボディーは、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)を引用することにより本明細書の一部とされる手法によって作製することができる。
【０１５０】
「線状抗体」とは、Zapata et al. Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)において記載されている抗体を意味する。簡潔には、これらの抗体は、１対の抗原結合領域を形成するタンデムＦｄセグメントの対（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含んでなる。線状抗体は、二重特異性または単一特異性であり得る。本発明のａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は、Zapata, et al.によって記載されている手法によって作製することができ、それらは引用することにより本明細書の一部とされる。
【０１５１】
ＣＣケモカインまたはそれらの誘導体、フラグメント、類似体または相同体に対して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ効果的な同定を可能にするために、Ｆａｂ発現ライブラリーを他の従来法（Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989)によって開示されておりその文献を引用することにより本明細書の一部とされるものなど）によって構築してよい。
【０１５２】
下に例示される抗体の特異的な部分（それらのＣＤＲ配列およびＣＤＲの一部を含む配列など）を使用して、抗イディオタイプ抗体を作製し得る。これらの抗体は、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体可変セグメントの１種以上のイディオタイプを認識するものであり、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体を同定しまたは精製しまたはその活性を調整するために使用することができる。そのような抗イディオタイプ抗体は、当技術分野で公知の手法によって（抗体可変ペプチド配列を免疫原性担体と結合し反復免疫することによるなど）作製することができる。そのような方法もまた、Cavenaugh, et al., Pharm. Res. 21:1480-1488 (2004)を引用することにより本明細書の一部とされる。
【０１５３】
抗イディオタイプ抗体は、別の抗体の決定基を認識する抗体（標的抗体）である。一般的には、抗イディオタイプ抗体は、標的抗体の抗原結合部位の決定基を認識する。典型的には、標的抗体はモノクローナル抗体である。抗イディオタイプ抗体は、一般的に、標的モノクローナル抗体の供給源と同じ種および遺伝子型の動物（特に、マウス）を標的モノクローナル抗体により免疫することによって調製される。免疫動物は、標的モノクローナル抗体のイディオタイプ決定基に対して免疫応答を示し、標的モノクローナル抗体のイディオタイプ決定基に対する抗体を産生する。免疫動物の抗体産生細胞（脾細胞など）を使用して、抗イディオタイプモノクローナル抗体を生成し得る。さらに、抗抗イディオタイプ抗体を生産するために、抗イディオタイプ抗体を使用して、動物を免疫し得る。これらの免疫動物を使用し、標準的な技術を用いて抗抗イディオタイプモノクローナル抗体を生成し得る。抗抗イディオタイプ抗体は、抗イディオタイプ抗体を調製するのに使用した元の標的モノクローナル抗体と同じエピトープと結合し得る。抗抗イディオタイプ抗体は、元の標的モノクローナル抗体と同じ抗原特異性を有する他のモノクローナル抗体である。
【０１５４】
標的抗体との抗イディオタイプ抗体の結合が標的抗体の関連抗原によって阻害されるならば、そして抗イディオタイプ抗体が標的抗体と同じ特異性を有する抗体応答を誘導するならば、抗イディオタイプ抗体は標的抗体の抗原を模倣している。そのような抗イディオタイプ抗体は、「内部イメージ抗イディオタイプ」であり、それが元の抗原であったかのように抗体応答の誘導が可能である、Bona and Kohler, Anti-idiotypic Antibodies and Internal Image in Monoclonal and Anti-idiotypic Antibodies: Probes for Receptor Structure and Function, Venter J. C., Frasser, C. M., Lindstrom, J. (Eds.), Alan R. Liss, N.Y., pp 141-149 (1984)参照。内部イメージ抗イディオタイプ抗体を組み込んだワクチンは、ウイルス、細菌および寄生生物に対する防御応答を誘導することが明らかになっている；Kennedy, et al. Science 232:220-223 (1986)；McNamara, et al., Science 226:1325-1326 (1985)。内部イメージ抗イディオタイプ抗体はまた、腫瘍関連抗原に対する免疫性を誘導することもが明らかになっている；Raychauhuri, et al., J. Immunol. 137:1743-1749 (1986)；Raychauhuri et al., J. Immunol. 139:3902-3910 (1987)；Bhattacharya-Chatterjee et al., J. Immunol. 139:1354-1360 (1987)；Bhattacharya-Chatterjee, et al., J. Immunol. 141:1398-1403 (1988)。このパラグラフで引用された文献の教示は、引用することにより本明細書の一部とされる。
【０１５５】
ＣＣケモカインに対する抗イディオタイプ抗体は、例えば、ＣＣ−ケモカインまたはＣＣ−ケモカインの少なくとも１つの抗原エピトープを含むそれらの免疫原性部分を含んでなる組成物の免疫原量により動物（マウスなど）を免疫することによって調製してよい。その組成物はまた、好適なアジュバントと、免疫原性を与えるのに必要な任意の担体も含んでよい。上記のように、免疫動物の細胞からＣＣ−ケモカインを認識するモノクローナル抗体を調製してよい。次いで、ＣＣケモカインの共通のエピトープを認識するモノクローナル抗体を選択し使用して、免疫原量の抗ＣＣ−ケモカインモノクローナル抗体を含んでなる組成物を調製する。典型的には、精製されたＣＣ−ケモカインモノクローナルの２５〜２００μｇ用量は、好適なアジュバントにおいて十分であろう。１４〜３０日の投与間隔で２〜６回動物を免疫してよい。典型的には、任意の好適な投与経路（腹腔内、皮下、静脈内またはこれらの組合せなど）によって動物を免疫する。免疫期間中に標準的なイムノアッセイ方法を使用して抗イディオタイプ抗体産生をモニタリングし得る。抗体産生細胞を採取する３日前に、標的モノクローナル抗体と反応する好適な抗体力価を有する動物を、免疫原として使用されるモノクローナル抗体により再び免疫してよい。他の抗体産生細胞を選択してよいが、好ましくは、脾細胞を使用する。上記のように、抗体産生細胞を採取し骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを作製し、好適な抗イディオタイプ抗体を産生する細胞を選択する。抗抗イディオタイプ抗体は、免疫原として抗イディオタイプモノクローナル抗体を使用することにより再度免疫とハイブリドーマ作製を行うことによって産生される。
【０１５６】
上記のように、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体の可変セグメント（ＣＤＲセグメントまたは可変セグメントのペプチドフラグメント（３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２以上の連続したアミノ酸残基を有するフラグメントを含む）など）（とりわけ、ケモカインに対する結合活性を有するものを含む）は、自己免疫疾患の治療的処置に加えて複数の用途（ペプチド系医薬品、ワクチン、抗イディオタイプ抗体製造または免疫原などを含む）に使用し得る。本発明の別の態様は、本発明のポリペプチドに対して、哺乳類において免疫応答を誘導する方法に関し、その方法は、免疫応答を誘導するのに十分なある量のポリペプチド調製物を哺乳類に投与することによる方法である。その量は、動物種、動物の大きさなどによって決まるが、当業者ならば決定することができる。
【０１５７】
本発明はまた、親和性成熟のプロセスを通じてキメラａｎｔｉｋｉｎｅ抗体またはヒト化ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体から誘導された抗体または抗体フラグメントを含む。ＣＤＲ内にアミノ酸置換が確認され得るが、そのようなアミノ酸置換は、ＣＣ−ケモカインに対する抗体の親和性を大きく向上させるものであり、それゆえ、そこに含められている。親和性成熟方法は、例えば、Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6037-6042 (1998)において記載され、Clackson and Loman, Phage Display, Oxford University Press (2004)によって記載されている。それらの文献も各々、引用することにより本明細書の一部とされる。
【０１５８】
抗ＣＣケモカインａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は、（例えば、適当な生理学的サンプル内のＣＣ−ケモカインレベルの測定に用いる、診断方法に用いる、タンパク質のイメージングに用いるなど）ＣＣ−ケモカインの局在性および／または定量化に関する当技術分野で公知の方法に使用し得る。ある特定の実施態様では、ＣＣ−ケモカインに対する抗体、または抗体由来の結合ドメインを含む、それらの誘導体、フラグメント、類似体または相同体を、薬理学上活性な化合物、薬物または治療化合物として利用する。
【０１５９】
抗ＣＣ−ケモカインａｎｔｉｋｉｎｅ抗体（例えば、モノクローナル抗体）を使用して、標準的な技術（アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降など）によりＣＣ−ケモカインを単離することができる。抗ＣＣ−ケモカイン抗体により、細胞からの天然ＣＣ−ケモカインの精製および宿主細胞において発現される組換え生産されたＣＣ−ケモカインの精製を容易にすることができる。さらに、抗ＣＣ−ケモカインｐａｎ−抗体を使用して（例えば、細胞溶解物または細胞上清中の）ＣＣ−ケモカインを検出し、ＣＣ−ケモカインの発現の存在量およびパターンを評価することができる。抗ＣＣ−ケモカインａｎｔｉｋｉｎｅ抗体を診断に使用して臨床試験方法の一部として組織中のタンパク質レベルをモニタリングし、例えば、ある特定の治療計画の効力を判定することができる。抗体を検出可能な物質と結合すること（すなわち、物理的に連結すること）により検出を容易にすることができる。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質が挙げられる。好適な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；好適な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ；好適な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓおよび３Ｈが挙げられる。
【０１６０】
加えて、本発明の抗体を、抗体とコンジュゲートし得る毒素（放射性同位元素、タンパク毒素および化学的毒素など）とコンジュゲートしてよい。そのような毒素としては、限定されるものではないが、鉛−２１２、ビスマス−２１２、アスタチン−２１１、ヨウ素−１３１、スカンジウム−４７、レニウム−１８６、レニウム−１８８、イットリウム−９０、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、臭素−７７、インジウム−１１１、ホウ素−１０、アクチニド、リシン、アドリアマイシン、カリケアマイシン、５−フルオロウラシル、オーリスタチンおよびマイタンシノイドが挙げられる。
【０１６１】
キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体ならびにそれらの抗原結合フラグメントは、典型的には、組換え発現によって生成される。場合によって定常領域と連結されている、ヒト化軽鎖および重鎖可変領域をコードする核酸を発現ベクターに挿入する。軽鎖および重鎖を同じまたは異なる発現ベクターにクローニングすることができる。免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確実にする発現ベクターの制御配列と機能的に連結される。発現制御配列としては、限定されるものではないが、プロモーター（例えば、本来関連するプロモーターまたは異種プロモーター）、シグナル配列、エンハンサーエレメントおよび転写終結配列が挙げられる。好ましくは、発現制御配列は、真核生物宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることが可能なベクターの真核細胞プロモーター系である。一度そのベクターが適当な宿主に組み込まれたら、ヌクレオチド配列の高レベル発現、ならびに交差反応抗体の回収および精製に好適な条件下にその宿主を維持する。
【０１６２】
これらの発現ベクターは、典型的には、宿主生物においてエピソームとしてまたは宿主染色体ＤＮＡの不可欠な部分として複製可能である。一般的には、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にするために選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性またはネオマイシン耐性）を含み、例えば、Itakura, et al.、米国特許第４，７０４，３６２号（この米国特許は引用することにより本明細書の一部とされる）参照。大腸菌(E. coli)は、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ配列）のクローニングに特に有用な１つの原核生物宿主である。使用に適した他の微生物宿主としては、バチルス属（枯草菌(Bacillus subtilus)など）および他の腸内細菌科（サルモネラ属(Salmonella)、セラチア属(Serratia)など）、ならびに様々なシュードモナス属(Pseudomonas)種が挙げられる。これらの原核生物宿主において、宿主細胞と適合する発現制御配列（例えば、複製起点）を典型的に含む発現ベクターも作製することができる。加えて、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系またはファージλ由来のプロモーター系など、いくつもの様々な周知のプロモーターが存在する。それらのプロモーターは、典型的には、場合によってオペレーター配列とともに発現を制御し、転写および翻訳の開始および終結のためにリボソーム結合部位配列などを有する。
【０１６３】
他の微生物（酵母など）もまた発現に有用である。サッカロミセス属(Saccharomyces)が好ましい酵母宿主であり、好適なベクターは、必要に応じて、発現制御配列（例えば、プロモーター）、複製起点、終結配列などを有する。典型的なプロモーターとしては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼおよび他の糖分解酵素が挙げられる。誘導性酵母プロモーターとしては、とりわけ、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソシトクロムＣ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素のプロモーターが挙げられる。
【０１６４】
微生物に加えて、哺乳類組織細胞培養物を用いて、本発明のポリペプチド（例えば、免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチドまたはそれらのフラグメント）を発現させ作製してもよい。Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987)参照。真核生物細胞は、異種タンパク質（例えば、無傷の免疫グロブリン）を分泌可能な複数の好適な宿主細胞株が当技術分野で開発されたため、実際に好ましく、それらにはＣＨＯ細胞株、様々なＣｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、好ましくは骨髄腫細胞株または形質転換Ｂ細胞またはハイブリドーマが含まれる。好ましくは、それらの細胞は非ヒトである。これらの細胞に関する発現ベクターには、発現制御配列（複製起点、プロモーター、およびエンハンサーなど）、Queen et al., Immunol. Rev. 89:49-68 (1986)、および必要なプロセッシング情報部位（リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終結配列など）が含まれ得る。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、サイトメガロウイルスなど由来のプロモーターである。Co, et al., J. Immunol. 148:1149-1154 (1982)参照。上の文献の各々は引用することにより本明細書の一部とされる。
【０１６５】
あるいは、例えば、Deboer, et al.、米国特許第５，７４１，９５７号、Rosen、米国特許第５，３０４，４８９号およびMeade, et al.、米国特許第５，８４９，９９２号（これらの米国特許の各々は引用することにより本明細書の一部とされる）によって記載されているように、トランスジェニック動物のゲノムへ導入し続いてそのトランスジェニック動物の乳汁において発現させるために、抗体コード配列を導入遺伝子に組み込むことができる。好適な導入遺伝子としては、乳腺特異的遺伝子（カゼインまたはβラクトグロブリンなど）のプロモーターおよびエンハンサーと機能的に連結している軽鎖および／または重鎖のコード配列が挙げられる。
【０１６６】
対象となるポリヌクレオチド配列（例えば、重鎖および軽鎖コード配列またはそれらのフラグメントおよび発現制御配列）を含有するベクターは、細胞宿主のタイプに応じた周知の方法によって宿主細胞に移入することができる。例えば、原核細胞では塩化カルシウムトランスフェクションを一般的に利用し、一方、他の細胞宿主ではリン酸カルシウム処理、エレクトロポレーション、リポフェクション、バイオリステック法またはウイルストランスフェクションを使用してよい。哺乳類細胞の形質転換に使用される他の方法には、ポリブレン、プロトプラスト融合、リポソーム、エレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションの使用が含まれる（一般的には、Sambrook, et al.、前掲参照）。トランスジェニック動物の作製では、導入遺伝子を、受精卵母細胞に微量注入することができ、または胚幹細胞のゲノムに組み込むことができ、そのような細胞の核が除核卵母細胞に移入される。これらの方法の総ては、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2nd ed. (1989)を引用することにより本明細書の一部とされる。
【０１６７】
重鎖および軽鎖を別々の発現ベクターにクローニングする場合には、それらのベクターを共トランスフェクトして、無傷の免疫グロブリンの発現および構成を得る。一度発現されると、全抗体、それらのダイマー、個々の軽鎖および重鎖、または他の免疫グロブリン形態は、当技術分野の標準的な手法（硫安沈殿、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ精製、ゲル電気泳動および他の同様の手法（Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982)（この文献は引用することにより本明細書の一部とされる）によって開示されているものを含む）の使用によることを含む）によって精製し得る。製薬用途では、少なくとも９０〜９５％あるいは９８〜９９％の等級または純度および／または均質性(homegeneity)を有する実質的に純粋な免疫グロブリンを使用することが望ましい。
【０１６８】
ケモカイン結合に関与する個々の軽鎖および／または重鎖ＣＤＲを含んでなる、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体のフラグメント、または末端切断型（Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦｖフラグメント、ならびに単一抗体鎖など）を使用して、１種以上のＣＣケモカインに結合させ中和し得る。
【０１６９】
所望の効果を提供するために、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体を化学的に修飾しまたは誘導体化し得る。
【０１７０】
抗体コンジュゲートまたはコンジュゲート抗体は、異種タンパク質とのペプチド結合を介して結合されるａｎｔｉｋｉｎｅ抗体またはそのフラグメントを使用して作製し得る。そのような実施態様では、抗体の抗原結合部分が、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１および／または他の関連ＣＣ−ケモカインに結合する。ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体はまた、エフェクター部分としての酵素、毒素またはサイトカインともコンジュゲートし得る。ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体はまた、付属部分（化学的タグまたは放射線学的タグ、毒素、生物学的に活性な部分またはターゲッティング部分、またはそれらの生物学的半減期または生物学的アベイラビリティーを増加する他の物質（例えば、ポリエチレングリコールまたはアルブミンとのコンジュゲーションによる）など）も含み得またはそのような付属部分とさらにコンジュゲートし得るか、または共有結合により連結し得る。本発明のａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は、Carter and Senter, Cancer J. 14: 154-169 (2008)（この文献は引用することにより本明細書の一部とされる）によって開示されているものなどの付属部分を含み得またはそのような付属部分とコンジュゲートし得る。本発明の抗体および抗体産物は、Antibodies: A Laboratory Manual; Eds. E. Harlow & D. Lane, (1988)（この文献は引用することにより本明細書の一部とされる）によって記載されているものなどの固体基質または免疫親和性樹脂に固定化することができる。
【０１７１】
本発明の抗体および抗体フラグメントのペグ化は、例えば、次の参照文献：Focus on Growth Factors 3:4-10 (1992)；ＥＰ０１５４３１６；およびＥＰ０４０１３８４（これらの各々は引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる）に記載されているように、当技術分野で公知のペグ化反応のいずれかによって行い得る。好ましくは、ペグ化は、反応性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応によって行われる。本発明の抗体および抗体フラグメントのペグ化に好ましい水溶性ポリマーはＰＥＧである。本明細書において「ポリエチレングリコール」とは、他のタンパク質を誘導体化するために使用されてきたＰＥＧのあらゆる型（モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシポリエチレングリコールまたはアリールオキシポリエチレングリコールなど）を包含するものとする。
【０１７２】
本発明のペグ化抗体および抗体フラグメントを調製するための方法は、一般的に、（ａ）その抗体または抗体フラグメントが１以上のＰＥＧ基に付着する条件下で、その抗体または抗体フラグメントをＰＥＧ（ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体など）と反応させる工程、および（ｂ）その反応生成物を得る工程を含む。公知のパラメーターおよび所望の結果に基づいて、最適な反応条件またはアシル化反応を選択することは、当業者には明らかであろう。
【０１７３】
ペグ化抗体および抗体フラグメントは、一般的に、本明細書において記載される抗体および抗体フラグメントの投与により軽減されまたは調整され得る病態を治療するために使用し得る。一般的には、ペグ化抗体および抗体フラグメントは、非ペグ化抗体および抗体フラグメントと比べて、半減期が増加している。ペグ化抗体および抗体フラグメントは、単独で、他の医薬組成物と併用して、または組み合わせて使用し得る。
【０１７４】
本発明の他の実施態様では、抗体またはそれらの抗原結合フラグメントは、当技術分野で認められている技術を使用してアルブミンとコンジュゲートされる。
【０１７５】
本発明の別の実施態様では、抗体またはそれらのフラグメントは、潜在的グリコシル化部位を減少させまたはなくすように修飾される。そのような修飾抗体は、「グリコシル化」抗体と呼ばれることが多い。抗体またはその抗原結合フラグメントの結合親和性を向上させるために、抗体のグリコシル化部位を、例えば、突然変異誘発（例えば、部位特異的突然変異誘発）により改変することができる。「グリコシル化部位」とは、真核細胞によって糖残基の付着位置として認識されるアミノ酸残基を意味する。炭水化物（オリゴ糖など）が付着しているアミノ酸は、典型的には、アスパラギン（Ｎ結合）残基、セリン（Ｏ結合）残基およびトレオニン（Ｏ結合）残基である。抗体または抗原結合フラグメント内の潜在的グリコシル化部位を同定するために、抗体の配列を、例えば、入手可能な公開されているデータベース（the Center for Biological Sequence Analysisにより提供されているウェブサイト（Ｎ結合型グリコシル化部位の予測についてはhttp://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/およびＯ結合型グリコシル化部位の予測についてはhttp://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/を参照のこと）など）を使用することにより調査する。抗体のグリコシル化部位のさらなる改変方法は、米国特許第６，３５０，８６１号および同第５，７１４，３５０号（これらの米国特許は引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されている。
【０１７６】
本発明のさらに別の実施態様では、抗体またはそのフラグメントを、非修飾抗体と比べて少なくとも１つの定常領域によって媒介される生物学的エフェクター機能を低下させるように抗体の定常領域を修飾することによって改変することができる。本発明の抗体がＦｃ受容体との結合の減少を示すようにそれを修飾するために、その抗体の免疫グロブリン定常領域セグメントを、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）相互作用に必要な特定の領域において突然変異させることができる、例えば、Canfield, S. M. and S. L. Morrison,  J. Exp. Med. 173:1483-1491 (1991)；およびLund, J. et al., J. Immunol. 147:2657-266 (1991)（これらの文献総ては引用することにより本明細書の一部とされる）参照。抗体のＦｃＲ結合能の低下によって、ＦｃＲ相互作用による他のエフェクター機能（オプソニン作用および食作用および抗原依存性細胞毒性など）もまた低下し得る。抗体エフェクター機能を増強または低下させるため、また血清の持続性を減少または延長させるための定常領域誘導体は、Carter, P. J., Nat. Rev. Immunol. 6:343-357 (2006)（この文献は引用することにより本明細書の一部とされる）によって記載されている。
【０１７７】
本発明のａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は、医薬組成物（上に記載されているものなど）中に、または貯蔵するため、保存するため、もしくは処置を必要とする被験体に抗体を投与するために使用される組成物に組み込み得る。
【０１７８】
上の治療用途または診断用途で使用するキットは、もう１種のａｎｔｉｋｉｎｅ抗体、陽性または陰性対照抗体、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体によって結合される ＣＣケモカイン、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体によって結合されない対照ケモカイン、ならびに他の薬理学的成分または診断成分およびそのキットの使用に関する使用説明書を含んでよい。
【０１７９】
本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、例えば、（ＣＣ−ケモカインの活性を調整することによる）治療目的に、ＣＣ−ケモカインを検出しまたは定量する診断目的に、そしてＣＣ−ケモカインの精製に有用である。従って、本明細書において記載される目的のいずれかに向けられた本発明の抗体を含んでなるキットもまた、本発明の範囲内である。
【０１８０】
ＣＣケモカイン、特に、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳおよび／またはＭＣＰ−１は、炎症を伴う病状の一因となることが明らかになってきた。ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳおよび／またはＭＣＰ−１は総て、白血球、とりわけ、単球およびＴリンパ球に対して強力な走化活性を有することが明らかになってきた。これらの病状には、Johnson et al., Trends Immunol. 26:268-274 (2005)（この文献は引用することにより本明細書の一部とされる）によって記載されているものが含まれる。
【０１８１】
ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳおよび／またはＭＣＰ−１は、単球およびＴリンパ球に対して強力な走化活性を有する分子である。それらの機能が重複しており、ヒト疾患においてこれらのケモカイン４種総ての発現が増加しているとすれば、２種、３種または４種のＣＣケモカイン分子の遮断は、単一種のＣＣケモカイン単独をただ阻害することよりも強い有益な効果を有すると期待される。よって、本発明の抗体および抗体フラグメントは、これらのケモカインの活性を調整しこれらのケモカインと関連している障害の病理に影響を及ぼすのに有用である。そのようなものとして、これらの抗体およびフラグメントは、ＣＣ−ケモカイン分子の発現と関連している炎症性の病態および病状の治療用の治療組成物に有用である。これらの実施態様では、患者は、例えば、前記疾患または障害の少なくとも１つの徴候または症状を示すことにより、治療すべき疾患の１つを有すると見なされる。本発明の少なくとも１種の抗体またはその抗原結合フラグメントまたは本発明の少なくとも１種の抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなる組成物は、前記疾患または障害の少なくとも１つの症状を軽減するのに十分な量で、またはＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳおよび／またはＭＣＰ−１の少なくとも１つの活性を低下させるのに十分な量で投与される。
【０１８２】
予防および治療可能な障害。本明細書において「ＣＣケモカイン活性が有害である障害」および「ＣＣ−ケモカイン関連障害」とは、障害に罹患している被験体において、ＣＣ−ケモカイン（ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１および他のＣＣ−ケモカインを含む）の存在が、その障害の病理生理学またはその障害に寄与する因子のいずれかに関与しているかまたは関与している疑いがあることが明らかになってきた疾患および他の障害を含むよう意図とされている。よって、ＣＣ−ケモカイン活性が有害である障害は、ＣＣ−ケモカイン活性の阻害により、その障害の症状および／または進行が予防されまたは軽減されると期待される障害である。そのような障害は、例えば、その障害に罹患している被験体の体液中のＣＣ−ケモカインの濃度の増加、例えば、（例えば、抗ＲＡＮＴＥＳ抗体を使用して検出することができる）被験体の血清、血漿、滑液、尿などのＲＡＮＴＥＳ濃度の増加によって明示され得る。ＣＣ−ケモカイン活性が有害である障害には多くの例がある。特定の障害の予防または治療における本発明の抗体および抗体部分の使用については下にさらに論じる。
【０１８３】
関節リウマチ（ＲＡ）は、関節の滑膜表層への白血球（Ｔリンパ球およびＢリンパ球、マクロファージおよび好中球を含む）の流入を特徴としている；Koch, Arthritis Rheum. 52: 710-721 (2005)による総説を参照。ＭＩＰ−１αは、ＲＡ患者の滑液中で高レベルで見い出されており、増加したレベルは疾患の重篤度と相互に関連する。同様に、齧歯類マウスＲＡモデルでも関節炎の関節で高レベルのマウスＭＩＰ−１αが見い出されている。中和抗体によりコラーゲン誘発関節炎モデルでの関節炎スコアはおよそ５０％低下する；Kasama, et al., J. Clin. Invest. 95: 2868-2876 (1995)。
【０１８４】
齧歯類のアジュバント誘発関節炎モデルではＲＡＮＴＥＳのレベルもまた関節で増加している。ＲＡＮＴＥＳに対する抗体により、このモデルにおいて症状が軽減した；Barnes et al., J. Clin. Invest. 101: 2910-2919 (1998)。
【０１８５】
ＭＣＰ−１はまた、ＲＡ患者の滑膜細胞および浸潤白血球によって産生されることも明らかになってきた。ＭＣＰ−１に対する中和抗体により齧歯類関節炎モデルでの臨床スコアも低下した；Ogata, et al., J. Pathol. 182: 106-114 (1997)。
【０１８６】
多発性硬化症（ＭＳ）は、神経の周りのミエリン鞘の崩壊と神経組織への白血球の流入を特徴としている。ＭＳ患者の脳病変で高レベルのケモカイン（ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＣＰ−１を含む）が見い出されている；Sorensen, et al., J. Clin. Invest. 103: 807-815 (1999)。
【０１８７】
実験的自己免疫性脳炎（ＥＡＥ）は、ヒトＭＳを厳密に模倣した疾患モデルである。中和抗体とともに示されているように、ＭＩＰ−１αおよびＭＣＰ−１は病徴の誘導にも再発の発生にも関係していた；Kennedy, et al., J. Neuroimmunol. 92: 98-108 (1998)。
【０１８８】
繊維症には、間質性繊維性組織の増加を特徴とするいかなる病態も含まれる。ＣＣ−ケモカインは繊維形成病態と関連していることが分かっている。例えば、全身性硬化症を有する患者ではＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βのレベルは総て上昇しており、高レベルのＣＣ−ケモカインはこれらの患者における肺繊維症の発症と関連していた；Hasegawa et al., Clin. Exp. Immunol. 117: 159-165 (1999)。
【０１８９】
アテローム性動脈硬化症は、マクロファージの高浸潤による血管の脂質沈着を特徴としている。マウスアテローム性動脈硬化症モデルではＭＣＰ−１ノックアウトマウスはマクロファージおよび脂質沈着の著しい減少を示す；Gu, et al., Mol. Cell 2: 275-281 (1998)。
【０１９０】
喘息患者は、肺において白血球の著しい浸潤がありＣＣ−ケモカインレベルが増加しており、それにより気道過敏性に至る。齧歯類喘息モデルでは、ＭＩＰ−１α、ＭＣＰ−１またはＲＡＮＴＥＳに対する中和抗体により、この疾患に典型的な炎症および／または気道過敏性が軽減した；Lukacs, et al., J. Immunol. 158: 4398-4404 (1997)。
【０１９１】
上の文献において記載されている動物モデルを使用して、関連の病態、障害または疾患の治療におけるａｎｔｉｋｉｎｅ抗体の効力を評価することができ、これらのモデルおよびそれらの使用の方法は上の文献を引用することにより本明細書の一部とされる。
【０１９２】
上で強調した疾患の他にも、多くの他の病態、障害および疾患が１種以上のケモカインの活性と関連していた、これらには、限定されるものではないが、発癌性疾患、炎症性腸疾患、アトピー性皮膚炎、乾癬、卒中、臓器移植、ＣＯＰＤ、糸球体腎炎、ループス腎炎、強皮症、硬変、アルツハイマー病、ＣＨＦ−虚血、冠動脈再狭窄、糖尿病性腎症／神経障害／網膜症、変形性関節症、歯周炎、酵母およびウイルスの感染、ならびに妊娠時調節異常が含まれる。ＣＣケモカインがこれらの病理の一因となる場合、これらの症状の重篤度を軽減するためにａｎｔｉｋｉｎｅ抗体を投与し得る。
【０１９３】
そのような方法は、一般的には、通常は薬学上許容される担体中の、ある量のａｎｔｉｋｉｎｅ抗体を、それを必要とする被験体（動物またはヒトなど）に投与することを含む。ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体またはその末端切断型またはフラグメントの量は、被験体において１種以上のケモカインの活性を阻害するように選択される。同様の方法を、被験体から取り出された生物学的材料（例えば、血液、骨髄、有機組織）においてまたはin vitroで維持された生物学的材料においてex vivoで行い得る。
【０１９４】
ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体を使用して、走化性を遮断し得る。そのような方法は、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体が結合するＣＣケモカインを含有する培地またはこれらのＣＣケモカインを産生する細胞を含有する培地と、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体を混合することまたは接触させることを含む。
【０１９５】
診断アッセイで本発明のａｎｔｉｋｉｎｅ抗体を有益に使用することができる。そのようなアッセイは、ＣＣケモカインに対する既知の特異性を有するａｎｔｉｋｉｎｅ抗体を、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体が結合する少なくとも１種のケモカインを含有すると推測される生体サンプルと接触させ、結合の量を、例えば、複合体形成の測定により、決定することを含む。ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体は、遊離形態または基質に結合された形態で使用し得る。本発明はさらに、サンプル中のＣＣ−ケモカインを検出するためのin vitroイムノアッセイを提供する。
【０１９６】
本発明の抗体および抗体フラグメントを使用し、様々な周知の免疫学的アッセイを使用してサンプル中のＣＣ−ケモカインを検出し得る。前記抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降(immunoprecipitaton)、免疫アフィニティークロマトグラフィー、組織切片の免疫染色、組織サンプルでの電子顕微鏡による免疫金検出などに使用し得る。これらのアッセイおよび他のアッセイについてのプロトコールは、当技術分野で周知であり、十分当業者の理解の範囲内である。
【０１９７】
本発明の抗体および抗体フラグメントを使用するイムノアッセイを使用して、サンプル中のＣＣ−ケモカインの存在および相対量を検出し得る。サンプルには、限定されるものではないが、ホモジナイズされた組織または細胞、光学顕微鏡および電子顕微鏡用の組織学的組織切片、組織または細胞のタンパク質抽出物、ｃｓｆ、関節液、血液、血漿、血清、粘膜分泌物、精液、膣液、涙、唾液、汗、尿、糞便などが含まれ得る。正常サンプルと比べて増加した量のＣＣ−ケモカインの存在が、例えば、病態の存在を表すことがあり、本発明の療法による治療の必要が示され得る。場合によっては、正常サンプルと比べて減少した量のＣＣ−ケモカインが存在することがあり、適当なＣＣ−ケモカインまたはＣＣ−ケモカインを模倣している内部イメージ抗体による治療を使用して、免疫機能を刺激し得る。
【０１９８】
いくつかの実施態様では、イムノアッセイを使用して、ＣＣ−ケモカインの精製の手助けをし得る。例えば、本発明の抗体または抗体フラグメントが基質上に固定化されている免疫親和性樹脂を使用し得る。ＣＣ−ケモカインを含有するサンプルが免疫親和性樹脂に添加され、それらの抗体はその樹脂と結合するが、一方、そのサンプルの他の成分は溶液中に残る。その樹脂を洗浄し、ＣＣ−ケモカインは、その後樹脂から溶出され、実質的に精製され単離される。好ましくは、イムノアッセイに使用される抗体は、本明細書において定義されるように、高い結合親和性を有するものであろう。
【実施例】
【０１９９】
次の実施例により本発明をさらに例示するが、それらの実施例は限定するものと解釈してはならない。本出願を通じて引用される総ての参照文献、特許および公開特許出願の内容、ならびに図面および配列表は、引用することにより本明細書の一部とされる。
【０２００】
実施例１-ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体を産生するハイブリドーマの作製
ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＣＰ−１(PeproTech)が初めに組み込まれているセットから任意の順序で３種のＣＣ−ケモカインによりマウスを連続して免疫した。ＭＡｂ  ３Ｃ１２Ｆを産生したハイブリドーマ融合物３については、ＭＩＰ−１αによりマウスを初回免疫し、続いて、ＲＡＮＴＥＳ、次いで、ＭＣＰ−１、その後、再びＭＣＰ−１により追加免疫を行った。ＭＡｂ  ７Ｄ１２Ａおよび７Ｄ１Ｇを産生したハイブリドーマ融合物７については、ＭＩＰ−１αによりマウスを初回免疫し、続いて、ＭＣＰ−１、次いで、ＲＡＮＴＥＳ、その後、ＭＩＰ−１αおよびＲＡＮＴＥＳの組合せにより追加免疫を行った。ＭＡｂ  １８Ｖ４Ｆおよび１８Ｐ７Ｅを産生したハイブリドーマ融合物１８については、ＭＩＰ−１βによりマウスを初回免疫し、続いて、ＭＩＰ−１α、次いで、ＲＡＮＴＥＳにより追加免疫を行い、その後、ＲＡＮＴＥＳによりもう１度追加免疫を行った。
【０２０１】
各免疫につき、標準的な免疫プロトコールに従って１０μｇタンパク質を使用した、Current Protocols in Immunology, Eds. JE Coligan, et al. (2006), section 2.1参照。初回免疫は完全フロイントアジュバントにより行い、続いて、２種の異なるケモカインの３週間の間隔での追加免疫を不完全フロイントアジュバントにより行った。
【０２０２】
最終追加免疫の１０日後、血清を採取し、Current Protocols in Immunology, 2006, Eds. JE Coligan et al., section 2.4（この文献は引用することにより本明細書の一部とされる）によって記載されているように、ＥＬＩＳＡによりＣＣ−ケモカインＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１およびＭＩＰ−１βとの反応性について試験した。ＭＩＰ−１αについては、ケモカインにより９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを（１μｇ／ｍＬに）コーティングし、１：５０〜１：６４００の希釈範囲の血清とともにインキュベートした。ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１およびＭＩＰ−１βについては、ビオチン化ケモカイン（０．５μｇ／ｍＬ）をストレプトアビジンコーティングプレート(Pierce)に添加し、その後、希釈血清とともにインキュベートした。ケモカインコーティングに結合している抗体を、ＨＲＰコンジュゲート抗マウスＦｃ二次抗体を使用して検出した。
【０２０３】
ＥＬＩＳＡアッセイに用いるケモカインのビオチン化は、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン(Pierce)を使用して行った。ＰＢＳ中のケモカインをおよそ２倍モル過剰のスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンと混合し、室温で３０分間インキュベートした。Ｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒ  ｍｉｎｉ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｕｎｉｔｓ  ｗｉｔｈ  ３，５００ＭＷ  ｃｕｔｏｆｆ(Pierce)を使用したＰＢＳ中で一晩の透析により遊離ビオチン試薬を除去した。
【０２０４】
ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＣＰ−１を使用した初回免疫セットの血清でのＥＬＩＳＡの結果では、ＭＩＰ−１βを直接の免疫原として使用していなかったにもかかわらずＭＩＰ−１βに対する一部の応答を含む様々な応答（表１を参照のこと）を示した。数匹のマウスが３種さらには４種のケモカインに対して応答を示した。これらが、複数種のケモカインと反応する単一種の抗体を探すためのハイブリドーマ融合物の候補であった。下の表１に示されているように、免疫したマウスは複数種のＣＣケモカインと反応するポリクローナル血清を産生した。
【０２０５】
【表１】
2013503192.tif 000003
【０２０６】
ハイブリドーマ融合物を得るために、少なくとも３種の対象ケモカインと著しい血清反応性を示すマウスを選択した；Antibodies: A Laboratory Manual, Eds. E. Harlow & D. Lane (1988), chapter 6参照。
【０２０７】
ハイブリドーマを作出するため、ＮＳ１細胞との融合のための脾臓採取の４日前および３日前に、選択したマウスをＰＢＳ中のケモカイン（各２０μｇ）混合物により追加免疫した。脾臓から、２枚のスライドのフロスト面の間に挟んで押しつぶし、細胞を１０ｍＬ  ＲＰＭＩ中に収集することによって、単一の細胞懸濁液を作製した。細胞を７０μｍナイロン濾過器に通し、１０ｍＬの追加ＲＰＭＩで洗い流し、３００×ｇで５分間ペレット化した。細胞を洗浄し、あと２回遠心分離し、その後、計数した。脾細胞をＮＳ１細胞（ＡＴＣＣ）と５：１  脾臓：ＮＳ１の比率で合わせ、次いで、ペレット化した。ペレット化した細胞に１ｍＬの５０％ＰＥＧをかき混ぜながら１分かけて滴加し、その後、混合物をさらに１分間かき混ぜた。さらに１ｍＬのＲＰＭＩをかき混ぜながら１分かけて添加し、次いで、さらに３ｍＬのＲＰＭＩをかき混ぜながら１分かけて添加し、次いで、さらに１６ｍＬのＲＰＭＩをかき混ぜながら２分かけて添加した。細胞を３００×ｇで１０分間ペレット化し、８００ｍＬのハイブリドーマ選択培地に再懸濁した。細胞を２時間休ませ、次いで、２００μＬ／ウェルで４０の９６ウェルプレート上に塗布した。プレートを３７℃のインキュベーターに入れ、それから８〜１０日にわたって２〜３日おきに、培地容量の半分を除去し交換することにより供給した。あるいは、ＣｌｏｎｅＤｅｔｅｃｔ(Genetix)および４μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ４８８タグ付きＭＩＰ−１αを含有するメチルセルロース系半固形培地ＣｌｏｎｅＭａｔｒｉｘ(Genetix)に融合細胞を懸濁し、シングルウェル１０ｃｍプレート(Genetix)に入れた。
【０２０８】
実施例２-ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体の同定
実施例１で得られたハイブリドーマ上清中の抗体を（上に記載した血清試験と同様の）ＥＬＩＳＡによりＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１およびＭＩＰ−１βを認識するそれらの能力について試験した。最初のハイブリドーマ上清のＥＬＩＳＡ結果を下の表２に示している。２種以上のケモカインと、バックグラウンドに対して少なくとも４倍の反応性を示した融合物ウェルの細胞をさらなる試験のために２４ウェルプレートに増加させた。少なくとも３種のケモカインと反応したウェルの細胞を制限希釈によりまたは少なくとも２倍の連続希釈によりクローニングした。クローンプレート上清を再びＥＬＩＳＡにより試験して、複数種のケモカインに対して反応性を有する抗体を産生した各クローンを同定した。陽性のウェルは、目視検査によりクローン性であると確認された。
【０２０９】
また、半固形培地でコロニーとして増殖させたハイブリドーマを１６日後にＣｌｏｎｅＰｉｘＦＬ(Genetix)を使用して増殖および蛍光ケモカイン結合について解析し、最良のコロニーを９６ウェルプレートに選び入れた。ハイブリドーマクローンの抗体含有上清を４日後、血清解析について上に記載したように、ＥＬＩＳＡによりＭＩＰ−１α（直接コーティングとビオチン化の両方を行う）、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１βとの反応性について解析した。クローン１８Ｖ４Ｆおよび１８Ｐ７Ｅは３種のＣＣ−ケモカイン総てと著しい反応性を示した。これらを連続希釈により再びクローニングしてクローン性を確認し、ＥＬＩＳＡにより再び試験してマルチケモカイン反応性(multi-chemokine reactivity)を示すａｎｔｉｋｉｎｅ抗体の産生を確認した。
【０２１０】
【表２】
2013503192.tif 000004
【０２１１】
実施例３：ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体のケモカイン結合特異性の特性評価
単離されたａｎｔｉｋｉｎｅ抗体のケモカイン結合特異性についてのさらに詳細な解析を、ＭＳＤ（メソスケールディスカバリー(Meso Scale Discovery)）アッセイを使用して行った。これは、抗体スクリーニング中に行われるＥＬＩＳＡアッセイとよく似ているが、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ試薬の電気化学発光検出を利用する。この場合、ケモカインの選択対象によりＭＳＤ  ９６ウェルマルチアレイプレート（ＭＡ２４００）を１μｇ／ｍＬでコーティングする。ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体を３μｇ／ｍＬ（精製された抗体３Ｃ１２Ｆ、７Ｄ１２Ａ、７Ｄ１Ｇ、１８Ｖ４Ｆ）でまたは非定量ハイブリドーマ抗体含有上清（１８Ｐ７Ｅ）として添加し、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗マウス抗体（１μｇ／ｍＬで使用）により検出する。ＭＳＤ  ｓｅｃｔｏｒ  ｉｍａｇｅｒ  ２４００でプレートを読み取る。図面中点線で示されるバックグラウンドレベルは、非反応性タンパク質であるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）との結合に基づくものである。
【０２１２】
実施例４：ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体の機能活性の調査
実施例２で得られた、増加させた融合物ウェルの上清を、対象ケモカインによって媒介される走化性を遮断する能力について試験した。これは、in vitroで、ＣＣＲ２形質転換体（ＭＣＰ−１に対する受容体）またはＣＣＲ５形質転換体（ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１βに対する受容体）を使用して９６ウェルトランスウェルプレート(Millipore)で試験した。各トランスウェルチャンバーの下部ウェルで、７５μＬのケモカイン溶液（２％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ中１０ｎｇ／ｍＬ）を７５μＬのハイブリドーマ上清と混合した。各チャンバーの上部ウェルで、４ｘ１０５細胞を７５μＬの２％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩに添加した。細胞遊走を３７℃で２時間起こし、その後、下部チャンバー中の細胞数を、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒを使用した細胞計数により定量した。次いで、少なくとも２種のケモカインの阻害を示したハイブリドーマウェルの細胞をまた連続希釈によりクローニングした。精製された抗体を様々な濃度で走化性の阻害について同様に試験した。
【０２１３】
走化性アッセイにおいて使用するケモカイン受容体形質転換体は、Ｂａ／Ｆ３細胞（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures - DSMZから入手した）を使用して作製した。Origeneから購入したｃＤＮＡクローンからＰＣＲによりヒトＣＣＲ２およびＣＣＲ５のオープンリーディングフレームを増幅させた（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Eds. Sambrook et al.を参照のこと）。ＰＣＲプライマーは、公開されている配列から設計した。５’プライマーは、開始Ｍｅｔコドンを重複させ、ＸｈｏＩクローニング部位を含めた。３’プライマーは、終止コドンを重複させ、ＸｂａＩクローニング部位を含めた。増幅フラグメントをＸｈｏＩおよびＸｂａＩで消化し、発現プラスミドｐＮＥＦ３８(Running Deer & Allison, Biotechnol Prog 20, 880-889, 2004)の等価部位へ挿入した。Ｂａ／Ｆ３細胞をエレクトロポレーション(Amaxa)により発現プラスミドでトランスフェクトし、Ｇ４１８で選択した。機能的受容体を発現する細胞を、同種のケモカインリガンドに対する走化性を通じて選択し、移動細胞を制限希釈によりクローニングして、安定した細胞クローンを得た。
【０２１４】
実施例５-ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体の同定および特性評価
複数種のＣＣケモカインを認識した５種の独特のモノクローナル抗体を同定し、３Ｃ１２Ｆ、７Ｄ１Ｇ、７Ｄ１２Ａ、１８Ｖ４Ｆおよび１８Ｐ７Ｅとした。それらの抗体のアイソタイプをＩｓｏＳｔｒｉｐｓ(Roche)を使用して決定した。３Ｃ１２Ｆ重鎖は、マウスサブグループＩｇＧ１のメンバーであると決定され、一方、３Ｃ１２Ｆ軽鎖は、マウスκグループのメンバーであると決定された。７Ｄ１Ｇ重鎖は、マウスサブグループＩｇＧ１のメンバーであると決定され、一方、７Ｄ１Ｇ軽鎖は、マウスκグループのメンバーであると決定された。７Ｄ１２Ａ重鎖は、マウスサブグループＩｇＧ１のメンバーであると決定され、一方、７Ｄ１２Ａ軽鎖は、マウスκグループのメンバーであると決定された。１８Ｖ４Ｆ重鎖は、マウスサブグループＩｇＧ２ａのメンバーであると決定され、一方、１８Ｖ４Ｆ軽鎖は、マウスλのメンバーであると決定された。１８Ｐ７Ｅ重鎖は、ＩｇＧ１であると決定され、その軽鎖はまたマウスλであると判明した。
【０２１５】
図１において精製された抗体を使用して示されるように、また、ＥＬＩＳＡにより最初にアッセイしたように（表２ａを参照のこと）、ＭＡｂ  ３Ｃ１２Ｆは、ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１βを認識し、ＲＡＮＴＥＳとのウイルスｖＣＣＩ分子の結合を遮断した（図２）。走化性アッセイでは、３Ｃ１２ＦはＭＩＰ−１αおよびＲＡＮＴＥＳの機能を阻害し、５ｎｇ／ｍＬのケモカインを使用して走化性を誘導した場合にはＩＣ５０値は３〜５μｇ／ｍＬであった（図３）。ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）によれば、ＭＩＰ−１αに対する３Ｃ１２Ｆの親和性は４９ｎＭである。
【０２１６】
抗体７Ｄ１Ｇおよび７Ｄ１２Ａは両方とも、ハイブリドーマ上清をＥＬＩＳＡによりアッセイした場合には、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βを認識した（表２ａ）。これらの同じ抗体はまた、図４および図５によって示されているように、走化性アッセイにおいて両方のケモカインの機能も遮断した。
【０２１７】
抗体１８Ｖ４Ｆおよび１８Ｐ７Ｅは両方とも、ハイブリドーマ上清をＥＬＩＳＡによりアッセイした場合には、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳを認識した（表２ｂ）。同じ抗体はまた、図６および図７によって示されているように、走化性アッセイにおいてケモカインＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１βの機能も（少なくとも部分的に）遮断した。
【０２１８】
数々のケモカインとの精製されたａｎｔｉｋｉｎｅ抗体（または１８Ｐ７Ｅの場合には、クローン性ハイブリドーマの抗体上清）の反応性を解析するためにＭＳＤプラットフォームを使用して、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体３Ｃ１２Ｆが、ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１β、ＭＰＩＦ−１およびＨＣＣ−２をバックグラウンドに対して少なくとも４倍結合することが判明した（図８）。同様に、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体７Ｄ１２Ａは、ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１βおよびＭＰＩＦ−１を結合し（図９）、ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体７Ｄ１Ｇは、ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１β、ＨＣＣ−１、ＭＰＩＦ−１およびＰＡＲＣを結合した（図１０）。ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体１８Ｖ４Ｆおよび１８Ｐ７Ｅは両方とも、ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１βを結合した（図１１および図１２）。
【０２１９】
下の表３に、これらの５種のａｎｔｉｋｉｎｅモノクローナル抗体の結合特異性を要約する。
【０２２０】
【表３】
2013503192.tif 000005
【０２２１】
実施例６：ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体によって結合されるＣＣケモカインに共通している構造の解析
モノクローナル抗体７Ｄ１Ｇ、７Ｄ１２Ａ、３Ｃ１２Ｆ、１８Ｖ４Ｆおよび１８Ｐ７Ｅによって結合される ＣＣ−ケモカインのアミノ酸配列をアラインさせた。図１３に示されているように、本発明のａｎｔｉｋｉｎｅモノクローナル抗体が結合する、相同のまたは高度構造的類似性を有するいくつかの領域が確認された。ＣＣケモカインのこれらの共通のまたは保存されたセグメントの同定により抗体結合が特徴づけられ、それは新規ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体の生産またはスクリーニングのためのコア構造として機能する。
【０２２２】
図１３ａ〜ｄは、各ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体３Ｃ１２Ｆ（図１３ａ）、７Ｄ１２Ａ（図１３ｂ）、７Ｄ１Ｇ（図１３ｃ）、１８Ｖ４Ｆ（図１３ｄ）および１８Ｐ７Ｅ（図１３ｄ）によって結合されるＣＣケモカインのアラインメントを示している。特定のａｎｔｉｋｉｎｅ抗体によって結合されるＣＣケモカインにより共有されている同一のアミノ酸残基に影を付けている。表５によって同様のアミノ酸残基を示しており、例えば、アミノ酸残基アラニン（Ａ）は、グリシン、セリンまたはトレオニンと同様である。
【０２２３】
共有されている同一または同様の残基は、Fernandez, 同上の図１および図２ならびにCzaplewski et al., J. Biol. Chem. 274:16077-84 (1999)（これらの文献双方は引用することにより本明細書の一部とされる）に基づいて、溶媒に露出していない、部分的に溶媒に露出しているまたは完全に溶媒に露出しているとさらに特徴付けられた。
【０２２４】
さらなる解析では、アラインさせた同一の残基または同一＋同様の残基の共有の溶媒露出残基と、ＣＣケモカイン受容体結合と関連しているＣＣケモカイン残基とが関連付けられた。ケモカイン受容体結合部位に関する構造情報および他の構造情報、化学情報または機能情報は、本明細書において記載されるケモカインまたは他の生体分子のエントリー、ＮＣＢＩ  Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ＣＤＤ  ２９１１１［ｕｉｄ］、および下に示されるウェブアドレス（各々、最終アクセス２０１０年８月９日）を引用することにより本明細書の一部とされる。
【０２２５】
ＭＩＰ−１α／ＣＣＬ３（配列番号７１）についての推定受容体結合部位残基および他の構造的特徴は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?INPUT_TYPE=live&SEQUENCE=NP_002974.1において記載されている。
【０２２６】
ＭＩＰ−１β／ＣＣＬ４（配列番号７２）についての推定受容体結合部位残基および他の構造的特徴は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?INPUT_TYPE=live&SEQUENCE=AAH70310.1において記載されている。
【０２２７】
ＲＡＮＴＥＳ／ＣＣＬ５（配列番号７３）についての推定受容体結合部位残基および他の構造的特徴は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?INPUT_TYPE=live&SEQUENCE=P13501.3において記載されている。
【０２２８】
ＭＰＩＦ−１／ＣＣＬ２３（配列番号８１）についての推定受容体結合部位残基および他の構造的特徴は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?INPUT_TYPE=live&SEQUENCE=P55773.2において記載されている。
【０２２９】
ＨＣＣ−１／ＣＣＬ１４（配列番号７８）についての推定受容体結合部位残基および他の構造的特徴は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?INPUT_TYPE=live&SEQUENCE=NP_004157.1において記載されている。
【０２３０】
ＨＣＣ−２／ＣＣＬ１５（配列番号７９）についての推定受容体結合部位残基および他の構造的特徴は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?INPUT_TYPE=live&SEQUENCE=Q16663.2において記載されている。
【０２３１】
ＰＡＲＣ／ＣＣＬ１８（配列番号８２）についての推定受容体結合部位残基および他の構造的特徴は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?INPUT_TYPE=live&SEQUENCE=P55774.1において記載されている。
【０２３２】
ＭＡｂ  ３Ｃ１２Ｆは、図１３ａの相対位置１１、１２、１５、２１、２８、３１、３５、３６、３８、４０、４２、４４、５１、５２、５４、５９および６６にある同一アミノ酸残基Ｃ、Ｃ、Ｙ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、Ｃ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｆ、Ｔ、Ｃ、Ａ、Ｐ、ＶおよびＬを共有するＣＣケモカインを認識する。これらの残基のうち、残基１１、１２、１５、２１、２８、３１、３５、３６、３８、５４および６６は、Fernandez, 同上の図１および図２ならびにCzaplewski, 同上に基づき、部分的にまたは完全に溶媒に露出している。
【０２３３】
加えて、ＭＡｂ  ３Ｃ１２Ｆによって認識されるＣＣケモカインは、図１３ａの位置９、１４、２０、２５、２９、３３、３９、４１、４５、４６、４８および６３にある化学的に同様のアミノ酸残基を共有している。これらの残基のうち、１４、２０、２９、３３、３９、４５、４６および４８にあるものは、溶媒に対して部分的にまたは完全に露出している（図１３ａとFernandez, et al.の図１および図２を比較のこと）。
【０２３４】
この構造解析に基づき、同一および同様の残基１１、１２、１４、１５、２０、２１、２８、２９、３１、３３、３５、３６、３８、３９、４５、４６、４８、５４および６６は、この抗体とそれが認識するＣＣケモカインとの間の結合についての決定基として利用可能な、ＭＡｂ  ３Ｃ１２Ｆによって結合されるＣＣケモカイン分子の共有部分となる。
【０２３５】
これらの共有溶媒露出残基のうち、残基１４、１５、２０、２１および６６は、ＮＣＢＩ  Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ＣＤＤ  ２９１１１によりケモカイン受容体接触残基として特徴付けられた。ＣＣケモカイン受容体の接触残基とのａｎｔｉｋｉｎｅ抗体の結合の遮断は、ＣＣケモカインがその受容体と結合する能力に影響を及ぼしまたは調整するであろう。
【０２３６】
ＭＡｂ  ３Ｃ１２Ｆによって結合されるＣＣケモカインの共有溶媒接触可能残基は、ＣＣケモカイン構造とさらに関連付けられ、ＣＣケモカインの最初のＣＣ残基とβ１鎖との間のＮループに、さらにβ１鎖とβ２鎖との間のＣＣケモカイン３０’ｓループにも見られる。
【０２３７】
ＭＡｂ  ７Ｄ１２Ａは、図１３ｂの相対位置１１、１２、１５、１８、２１、２８、３１、３５、３６、３８、４０、４２、４４、５１、５２、５４、５９および６６にあるアミノ酸残基Ｃ、Ｃ、Ｙ、Ｒ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、Ｃ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｆ、Ｔ、Ｃ、Ａ、Ｐ、ＶおよびＬを有するＣＣケモカインを認識する。これらの残基のうち、残基１１、１２、１５、１８、２１、２８、３１、３５、３６、３８、５４および６６は、Fernandez, 同上の図１および図２ならびにCzaplewski, 同上に基づき、部分的にまたは完全に溶媒に露出している。
【０２３８】
加えて、ＭＡｂ  ７Ｄ１２Ａによって認識されるＣＣケモカインは、図１３ｂの位置９、１４、２０、２５、２９、３３、３９、４１、４５、４６、４８および６３にある同様のアミノ酸残基を共有している。これらの残基のうち、１４、２０、２９、３３、３９、４５、４６および４８にあるものは、溶媒に対して部分的にまたは完全に露出している（図１３ｂとFernandez, et al.の図１および図２を比較のこと）。
【０２３９】
この構造解析に基づき、同一および同様の残基１４、１５、１８、２０、２１、２８、２９、３１、３３、３５、３６、３８、３９、４５、４６、４８、５４および６６は、この抗体とそれが認識するＣＣケモカインとの間の結合についての決定基として利用可能な、ＭＡｂ  ７Ｄ１２Ａによって結合されるＣＣケモカイン分子の共有部分となる。
【０２４０】
これらの残基のうち、残基１４、１５、１８、２０、２１および６６は、ＮＣＢＩ  Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ＣＤＤ  ２９１１１によりケモカイン受容体接触残基として特徴付けられた。これらの残基を含む競合的抗体結合は、ＣＣケモカインがその受容体と結合する能力に影響を及ぼすであろう。ＭＡｂ  ７Ｄ１２Ａによって認識されるＣＣケモカインでは、いくつかの共有溶媒接触可能残基が、ＣＣケモカインの最初のＣＣ残基とβ１鎖との間のＮループに、β１鎖とβ２鎖との間のＣＣケモカイン３０’ｓループに、さらにβ２鎖とβ３鎖との間の４０’ｓループにも見られる。
【０２４１】
ＭＡｂ  ７Ｄ１Ｇは、図１３ｃの相対位置１１、１２、１５、２１、２８、３１、３５、３８、４４、５１、５４および５９にある同一アミノ酸残基Ｃ、Ｃ、Ｙ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、Ｃ、Ｐ、Ｔ、Ｃ、ＰおよびＶを有するＣＣケモカインを認識する。これらの残基のうち、残基１１、１２、１５、２１、２８、３１、３５、３８および５４は、Fernandez, 同上の図１および図２ならびにCzaplewski, 同上に基づき、部分的にまたは完全に溶媒に露出している。
【０２４２】
加えて、ＭＡｂ  ７Ｄ１Ｇによって認識されるＣＣケモカインは、図１３ｃの位置２０、２５、３９〜４１、４５、４６、６３および６６にある同様のアミノ酸残基を共有している。これらの残基のうち、２０、３９、４５、４６および６６にあるものは、溶媒に対して部分的にまたは完全に露出している（図１３ｃとFernandez, et al.の図１および図２を比較のこと）。
【０２４３】
この構造解析に基づき、同一および同様の残基１１、１２、１５、２０、２１、２８、３１、３５、３８、３９、４５、４６、５４および６６は、この抗体とそれが認識するＣＣケモカインとの間の結合についての決定基として利用可能な、ＭＡｂ  ７Ｄ１Ｇによって結合されるＣＣケモカイン分子の共有部分となる。
【０２４４】
これらの共有残基のうち、残基１５、２０、２１、２４および６６は、ＮＣＢＩ  Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ＣＤＤ  ２９１１１によりケモカイン受容体接触残基として特徴付けられた。これらの残基を含む競合的抗体結合は、ＣＣケモカインがその受容体と結合する能力に影響を及ぼすであろう。ＭＡｂ  ７Ｄ１Ｇによって認識されるＣＣケモカインでは、いくつかの共有溶媒接触可能残基が、ＣＣケモカインの最初のＣＣ残基とβ１鎖との間のＮループに、さらにβ２鎖とβ３鎖との間の４０’ｓループにも見られる。
【０２４５】
ＭＡｂ  １８Ｖ４ＦおよびＭＡｂ  １８Ｐ７Ｅは、図１３ｄの相対位置１１、１２、１５、１８、２１、２８、３１、３５、３６、３８、４０、４２、４４、５１、５２、５４、５９および６６にあるアミノ酸残基Ｃ、Ｃ、Ｙ、Ｒ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、Ｃ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｆ、Ｔ、Ｃ、Ａ、Ｐ、ＶおよびＬを有するＣＣケモカインを認識する。これらの残基のうち、残基１１、１２、１５、１８、２１、２８、３１、３５、３６、３８、５４および６６は、Fernandez, 同上の図１および図２ならびにCzaplewski, 同上に基づき、部分的にまたは完全に溶媒に露出している。
【０２４６】
加えて、ＭＡｂ  １８Ｖ４Ｆおよび１８Ｐ７Ｅによって認識されるＣＣケモカインは、図１３ｄの位置９、１４、２０、２５、２９、３３、３９、４１、４５、４６、４８および６３にある同様のアミノ酸残基を共有している。これらの残基のうち、１４、２０、２９、３３、３９、４５、４６および４８にあるものは、溶媒に対して部分的にまたは完全に露出している（図１３ｄとFernandez, et al.の図１および図２を比較のこと）。
【０２４７】
この構造解析に基づき、同一および同様の残基１４、１５、１８、２０、２１、２８、２９、３１、３３、３５、３６、３８、３９、４５、４６、４８、５４および６６は、これらの抗体とそれらが認識するＣＣケモカインとの間の結合についての決定基として利用可能な、ＭＡｂ  １８Ｖ４Ｆおよび１８Ｐ７Ｅによって結合されるＣＣケモカイン分子の共有部分となる。
【０２４８】
これらの残基のうち、残基１４、１５、１８、２０、２１および６６は、ＮＣＢＩ  Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ＣＤＤ  ２９１１１によりケモカイン受容体接触残基として特徴付けられた。これらの残基を含む競合的抗体結合は、ＣＣケモカインがその受容体と結合する能力に影響を及ぼすであろう。ＭＡｂ  １８Ｖ４Ｆおよび１８Ｐ７Ｅによって認識されるＣＣケモカインでは、いくつかの共有溶媒接触可能残基が、ＣＣケモカインの最初のＣＣ残基とβ１鎖との間のＮループに、β１鎖とβ２鎖との間のＣＣケモカイン３０’ｓループに、さらにβ２鎖とβ３鎖との間の４０’ｓループにも見られる。
【０２４９】
実施例７：ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体のポリヌクレオチド配列
ａｎｔｉｋｉｎｅ抗体の可変ドメインの配列を、これらの領域を定常領域にプライマーを用いてＰＣＲ増幅した後に決定した。ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ(Qiagen)を使用して１０７ハイブリドーマ細胞から抽出し、次いで、InvitrogenのスーパースクリプトＩＩＩ逆転写キットを使用して逆転写した。軽鎖または重鎖のいずれかについて、プライマーセットを用いてＰＣＲによりＣＤＲ領域を増幅した(Jones & Bendig, Biotechnology 9, 88-89, 1991)。InvitrogenのＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲクローニングキットを使用して、得られたフラグメントをｐＣＲＩＩプラスミドに挿入し、Ｍ１３プライマーおよびＭ１３ｒｅｖプライマーを用いて配列決定した。モノクローナル抗体３Ｃ１２Ｆ、７Ｄ１Ｇ、７Ｄ１２Ａ、１８Ｖ４Ｆおよび１８Ｐ７Ｅの、軽鎖セグメントおよび重鎖セグメント（ＣＤＲなど）をコードするポリヌクレオチド配列を下に記載する。３Ｃ１２Ｆ重鎖可変領域のＤＮＡコード配列は配列番号１として示され、３Ｃ１２Ｆ重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２として示される。３Ｃ１２Ｆ軽鎖可変領域のＤＮＡコード配列は配列番号６として示され、３Ｃ１２Ｆの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７として示される。さらに、抗体３Ｃ１２ＦのＣＤＲは、配列番号３〜５（重鎖可変領域）および配列番号８〜１０（軽鎖可変領域）として記載される。
【０２５０】
７Ｄ１２Ａ重鎖可変領域のＤＮＡコード配列は配列番号１１として示され、７Ｄ１２Ａ重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１２として示される。７Ｄ１２Ａ軽鎖可変領域のＤＮＡコード配列は配列番号１６として示され、７Ｄ１２Ａの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１７として示される。さらに、抗体７Ｄ１２ＡのＣＤＲは、配列番号１３〜１５（重鎖可変領域）および配列番号１８〜２０（軽鎖可変領域）として記載される。
【０２５１】
７Ｄ１Ｇ重鎖可変領域のＤＮＡコード配列は配列番号２１として示され、７Ｄ１Ｇ重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２２として示される。７Ｄ１Ｇ軽鎖可変領域のＤＮＡコード配列は配列番号２６として示され、７Ｄ１Ｇの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２７として示される。さらに、抗体７Ｄ１ＧのＣＤＲは、配列番号２３〜２５（重鎖可変領域）および配列番号２８〜３０（軽鎖可変領域）として記載される。
【０２５２】
１８Ｖ４Ｆ重鎖可変領域のＤＮＡコード配列は配列番号３１として示され、１８Ｖ４Ｆ重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号３２として示される。１８Ｖ４Ｆ軽鎖可変領域のＤＮＡコード配列は配列番号３６として示され、１８Ｖ４Ｆの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号３７として示される。さらに、抗体１８Ｖ４Ｆの、Chothia and Leskによって定義されているとおりのＣＤＲは、配列番号３３〜３５（重鎖可変領域）および配列番号３８〜４０（軽鎖可変領域）として記載される。
【０２５３】
１８Ｐ７Ｅ重鎖可変領域のＤＮＡコード配列は配列番号４１として示され、１８Ｐ７Ｅ重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４２として示される。１８Ｐ７Ｅ軽鎖可変領域のＤＮＡコード配列は配列番号４６として示され、１８Ｐ７Ｅの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４７として示される。さらに、抗体１８Ｐ７Ｅの、Chothia and Leskによって定義されているとおりのＣＤＲは、配列番号４３〜４５（重鎖可変領域）および配列番号４８〜５０（軽鎖可変領域）として記載される。
【０２５４】
実施例８：モノクローナル抗体３Ｃ１２Ｆのヒト化
抗体ヒト化法は、ヒト免疫原性が低下した分子を生産するように設計される。抗体ヒト化の方法は当業者には周知であり、そのような方法には、Almagro and Frannson, Frontiers Bioscience 13:1619-1633 (2008) によって記載されているものが含まれる。ＣＤＲグラフティング方法 (Jones et al., Nature 321:522-525, 1986；Riechmann, et al., Nature 332:323-327, 1988)を使用して、３Ｃ１２ＦのＣＤＲ配列を、同様のヒト生殖細胞系遺伝子由来の重鎖ＩｇＧ可変領域フレームワーク配列および軽鎖ＩｇＧ可変領域フレームワーク配列に組み込んだ。この場合、齧歯類ＣＤＲ配列は、齧歯類重鎖可変配列および軽鎖可変配列それぞれと最大の同一性を有する選択されたヒト生殖細胞系遺伝子由来の重鎖ＩｇＧ可変領域フレームワーク配列および軽鎖ＩｇＧ可変領域フレームワーク配列に組み込まれた。好適な方法については、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann, et al., Nature 332:323-327 (1988)（これらの文献は引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる）参照。
【０２５５】
３Ｃ１２Ｆのヒト化では、マウス３Ｃ１２Ｆ配列と最大の類似性を共有する重鎖および軽鎖可変部のヒト生殖細胞系配列をヒトフレームワーク配列として使用した。選択された生殖細胞系配列はまた、マウス抗体と高い配列類似性を共有することに加え、再構成抗体配列の採取サンプル中に豊富に含まれていることも分かった。Kabatによって定義されているような相補性決定領域（ＣＤＲ）に存在するマウス残基をヒトフレームワーク配列にグラフティングし、結合に不可欠な残基であり得ることが明らかに示される場合にはそのような追加の残基をマウスアミノ酸に戻した。ヒト化３Ｃ１２Ｆ  ＭＡｂの重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号５１および５６により示される。対応するアミノ酸配列およびＣＤＲは、配列番号５２〜５５および５７〜６０によって確認される。
【０２５６】
実施例９：モノクローナル抗体１８Ｖ４Ｆのヒト化
１８Ｖ４Ｆのヒト化では、３Ｃ１２Ｆのヒト化で使用したものとは異なる戦略を使用した。マウス１８Ｖ４Ｆ抗体のＣＤＲを最も近いヒト生殖細胞系配列にグラフティングする代わりに、それらのＣＤＲを、最も多く存在する重鎖ファミリーＶＨＩＩＩ可変部と最も多く存在するλ軽鎖ファミリーＶＬλＩＩＩ可変部から作製されたコンセンサス配列にグラフティングした。次に、Chothia and Leskによって構造上結合に関連すると定義されているＣＤＲ内残基だけを、最初に、コンセンサスフレームワークにグラフティングした。結合の保持に重要であり得ることが明らかに示される場合にはそのような、Kabatによってより広く定義された追加のＣＤＲ位置、ならびにフレームワーク残基をマウスアミノ酸に戻した。ヒト化１８Ｖ４Ｆ  ＭＡｂの重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号６１および６６により示される。対応するアミノ酸配列およびＣＤＲは、配列番号６２〜６５および６７〜７０によって確認される。
【０２５７】
実施例１０：ヒト化ＭＡｂ  ３Ｃ１２ＦおよびＭＡｂ  １８Ｖ４Ｆの親和性成熟
本発明のａｎｔｉｋｉｎｅモノクローナル抗体の結合親和性は、必要に応じて、例えば、Wu et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 6037-6042（この文献は引用することにより本明細書の一部とされる）によって記載されている親和性成熟により、さらに増大し得る。
【０２５８】
様々なケモカイン（例えば、ＲＡＮＴＥＳ／ＣＣＬ５、ＭＩＰ−１α／ＣＣＬ３およびＭＩＰ−１β／ＣＣＬ４）とのヒト化ＭＡｂ  ３Ｃ１２Ｆおよびヒト化ＭＡｂ  １８Ｖ４Ｆの結合特性を向上させるため、また、より強力な薬剤を生み出すために、部位特異的突然変異誘発戦略をファージディスプレイとともに使用した。ヒト化３Ｃ１２Ｆまたはヒト化１８Ｖ４ＦのＦａｂフラグメントを、まず、Ｍ１３遺伝子ＩＩＩタンパク質との重鎖融合物（ヒト化３Ｃ１２Ｆまたはヒト化１８Ｖ４Ｆ軽鎖それぞれを共発現する）として線状ファージＭ１３の表面に提示させた。次に、ヒト化ＭＡｂ  ３Ｃ１２Ｆまたはヒト化１８Ｖ４Ｆの６つ総てのＣＤＲの各位置を、Sidhu and Weiss (Phage Display, A Practical Approach, Clackson, T. and Lowman, H. B., ed., Oxford University Press, 2004, Chapter 4)のプロトコールを使用して、同時に４〜６つの連続したＣＤＲ残基の系統的な突然変異を行った。場合によっては、定義されたＣＤＲの周囲のアミノ酸が抗原結合に関与する場合にはそのようなアミノ酸も突然変異させた。各抗体につき合計１５のライブラリーを作製した。
【０２５９】
結合選択用の各ライブラリーのために、変異株ヒト化３Ｃ１２Ｆまたはヒト化１８Ｖ４ＦのＦａｂフラグメントを提示させるファージを準備した。Nielsen and Marks (Clackson and Lowman, 同上, Chapter 14)の親和性成熟プロトコールを使用して、ヒト化３Ｃ１２Ｆまたはヒト化１８Ｖ４Ｆのより高い親和性の変異体についてのファージ選択を最大６回行った。簡潔には、結合選択はビオチン化ケモカインを使用して行われ、ストレプトアビジンコーティング磁性ビーズを使用して捕捉し、ヒト化３Ｃ１２Ｆ  Ｆａｂまたはヒト化１８Ｖ４Ｆ  Ｆａｂのより高性能の変異体を同定する。より高い親和性の変異体を、まず、当技術分野で周知の方法（Clackson and Lowmanおよび本書において引用される参照文献を参照のこと）を使用して同定し、次いで、より大きな親和性の向上が得られるように組み合わせる。
【０２６０】
抗体のそれらの標的に対する親和性もまた、当技術分野で公知の他の様々な方法を使用して高めることができる。親和性は、直接突然変異、ファージディスプレイまたは抗体分子をコードする核酸内でのチェーンシャッフリング(chain shuffling)により高めることができる。単一または複数の残基をランダム化して、他の点では同一の抗原抗体部位の集団において、２０総てのアミノ酸またはこれらのサブセットがＣＤＲ内のまたはＣＤＲに隣接する特定の位置において見られるようにすることができる。この目的に有用な方法は、Yang et al., J. Mol. Biol. 254, 392-403(1995)；Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889-896 (1992)；またはLow et al., J. Mol. Biol. 250, 359-368 (1996)を引用することにより本明細書の一部とされる。Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)には、ＶＨおよびＶＬドメインシャッフリングによる親和性成熟について記載されている；ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、Barbas et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA 91:3809-3813 (1994)；Schier et al., Gene, 169:147-155, 1995、Yelton et al., J. Immunol., 155:1994-2004 (1995)；Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-3319 (1995)；およびHawkins et al., J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に記載されており、それらの文献各々も引用することにより本明細書の一部とされる。
【０２６１】
親和性成熟は、ランダム突然変異誘発を使用して行われることもある。特定の位置で行われるアミノ酸置換は、ランダムであってよく、または単純な規則を用いて行ってもよい。例えば、総ての残基をアラニンへと突然変異させることができ、これはアラニンスキャニングと呼ばれる、例えば、ＷＯ９５２３８１３参照。配列に基づく親和性成熟方法もまた抗体の結合親和性を高めるために使用し得る、Ｕ．Ｓ．２００３／０２２２４０Ａ１およびＵ．Ｓ．２００２／１７７１７０Ａ１（これらの文献双方は引用することにより本明細書の一部とされる）参照。他の方法としては、一部または総てのＣＤＲを含む一部または総ての位置内でのオリゴヌクレオチドに基づくアミノ酸突然変異誘発に続いて、Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95, 6037-6042 (1998)によって記載されているように、より高い親和性についてのスクリーニングを実施すること、またはRajpal, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 102:8466-8471 (1996)によって記載されているように、ファージディスプレイを使用したより高い親和性についての選択を実施することが挙げられる。親和性成熟抗体の選択は、抗体またはそのフラグメントを、Siegal, Methods Mol. Biol., 504:351-83 (2009)に記載されているように、酵母細胞の表面にまたはHo, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103:9637-9642 (2006)に記載されているように、哺乳類細胞の表面に、提示させることによっても行うことができる。親和性成熟のプロセスに使用し得る、上の文献に記載されている方法は各々、この実施例において引用された文献を引用することにより本明細書の一部とされる。
【０２６２】
ＣＣケモカインおよび牛痘ウイルス配列の同定
本明細書において開示されるケモカインおよび他の産物の識別は、表４の受託番号を引用することにより本明細書の一部とされる。
【０２６３】
【表４】
2013503192.tif 000006
2013503192.tif 000007
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【０２６４】
【表５】
2013503192.tif 000012
【０２６５】
ハイブリドーマ寄託
ハイブリドーマ細胞株３Ｃ１２Ｆ、７Ｄ１２Ａ、７Ｄ１Ｇ、１８Ｖ４Ｆおよび１８Ｐ７Ｅは、２０１０年８月１２日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）(10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209, USA)に次の受託番号として寄託された：
【０２６６】
【表６】
2013503192.tif 000013
【０２６７】
改変および他の実施態様
記載されているａｎｔｉｋｉｎｅ抗体および組成物、それらの生産および使用の方法についての改変および変形、ならびに本発明の概念は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明を特定の実施態様に関連して記載してきたが、特許請求される本発明がそのような特定の実施態様に限定されるものではないことは理解されるべきである。
【０２６８】
引用による組み込み
本開示によって引用されまたは本開示において言及される、各文献、特許、特許出願または特許公開は、とりわけ、本書の参照文献の引用に関連する特定の対象に関して、引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる。しかしながら、そのような参照文献が背景技術となり引用された文献の精度および適切性に異議を申し立てる権利が留保されるということを認めるものではない。用語の定義に矛盾が生じる場合には、本明細書において示したとおりの用語の定義とする。
【図面の簡単な説明】
【０２６９】
【図１】ＥＬＩＳＡによるケモカインとの精製された３Ｃ１２Ｆの結合を示ず図である。
【図２】３Ｃ１２ＦがＲＡＮＴＥＳ／ＣＣＬ５とのｖＣＣＩの結合を遮断することを示ず図である。
【図３】走化性アッセイにおける精製された３Ｃ１２Ｆの阻害活性力価測定を示ず図である。
【図４】走化性アッセイにおける精製された７Ｄ１２Ａの阻害活性力価測定を示ず図である。
【図５】走化性アッセイにおける精製された７Ｄ１Ｇの阻害活性力価測定を示ず図である。
【図６】走化性アッセイにおける精製された１８Ｖ４Ｆの阻害活性力価測定を示ず図である。
【図７】走化性アッセイにおける精製された１８Ｐ７Ｅの阻害活性力価測定を示ず図である。
【図８】ＭＳＤプラットフォーム使用での３Ｃ１２Ｆのケモカイン結合特異性を示ず図である。
【図９】ＭＳＤプラットフォーム使用での７Ｄ１２Ａのケモカイン結合特異性を示ず図である。
【図１０】ＭＳＤプラットフォーム使用での７Ｄ１Ｇのケモカイン結合特異性を示ず図である。
【図１１】ＭＳＤプラットフォーム使用での１８Ｖ４Ｆのケモカイン結合特異性を示ず図である。
【図１２】ＭＳＤプラットフォーム使用での１８Ｐ７Ｅのケモカイン結合特異性を示ず図である。
【図１３】図１３ａ，ｂ，ｃおよびｄは、５種のａｎｔｉｋｉｎｅ抗体によって認識されるケモカイン配列のアラインメントを示ず図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年5月1日(2012.5.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも３種の異なるＣＣケモカインと結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、少なくとも１種のＣＣケモカインがＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１βまたはＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳである、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
少なくとも３種の異なるＣＣケモカインに対して少なくとも２０ｎＭの結合親和性を有し、少なくとも１種のＣＣケモカインがＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１βまたはＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳである、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
少なくとも４種の異なるＣＣケモカインと結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２またはＭＣＰ−３と結合しない、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ１４／ＨＣＣ−１、ＣＣＬ１５／ＨＣＣ−２、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣおよびＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ−１からなる群から選択される少なくとも３種の異なるＣＣケモカインと結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ１４／ＨＣＣ−１、ＣＣＬ１５／ＨＣＣ−２、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣおよびＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ−１の少なくとも１つの決定基と結合し、該決定基が該ＣＣ−ケモカインのＣＣ残基と該ケモカインの最後のＣ残基との間に位置する、請求項１に記載のモノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項７】
ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ１４／ＨＣＣ−１、ＣＣＬ１５／ＨＣＣ−２、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣおよびＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ−１の少なくとも１つの決定基と結合し、該決定基が該ＣＣケモカインのＮループ、３０’ｓループまたは４０’ｓループ中に位置する、請求項１に記載のモノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項８】
ＣＣケモカインのＣＣ受容体結合残基内の少なくとも１つの決定基と結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項９】
結合の対象となるＣＣケモカインの走化活性を中和する、請求項１に記載のモノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
ハイブリドーマ細胞株３Ｃ１２Ｆ、７Ｄ１Ｇ、７Ｄ１２Ａ、１８Ｖ４Ｆもしくは１８Ｐ７Ｅによって産生されるか、またはハイブリドーマ細胞株３Ｃ１２Ｆ、７Ｄ１Ｇ、７Ｄ１２Ａ、１８Ｖ４Ｆもしくは１８Ｐ７Ｅによって産生される抗体の結合を競合的に遮断する、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
ヒト抗体、ヒト化抗体もしくはキメラヒト−マウス抗体、またはその抗原結合フラグメントである、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ１５／ＨＣＣ−２およびＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ−１からなる群から選択される少なくとも５種のＣＣケモカインと結合し、かつＣＣＬ２／ＭＣＰ−１と実質的に結合しない、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
前記ＣＣケモカインの少なくとも１種のＮループ、３０’ｓループまたは４０’ｓループ中の決定基と結合する、請求項１２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
配列番号７１の残基１１〜１５（ＣＣＦＳＹ）、残基１７〜２４（ＳＲＱＩＰＱＮＦ）、残基３４〜３５（ＱＣ）または残基５７〜６７（ＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αの少なくとも１つの抗原決定基と結合し；
配列番号７２の残基１１〜１５（ＣＣＦＳＹ）、残基１７〜２４（ＡＲＫＬＰＨＮＦ）、残基３４〜３５（ＬＣ）または残基５７〜６７（ＳＷＶＱＥＹＶＹＤＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１βの少なくとも１つの抗原決定基と結合し；
配列番号７３の残基１０〜１４（ＣＣＦＡＹ）、残基１６〜２３（ＡＲＰＬＰＲＡＨ）、残基３３〜３４（ＫＣ）または残基５６〜６６（ＫＷＶＲＥＹＩＮＳＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳの少なくとも１つの抗原決定基と結合する、請求項１２に記載のモノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
配列番号３、４、５、８、９、１０、５３、５４、５５、５８、５９および６０からなる群から選択される、ＭＡｂ  ３Ｃ１２Ｆの少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる、請求項１２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１６】
ＭＡｂ  ３Ｃ１２Ｆを産生するハイブリドーマ細胞株によって、もしくはその継代培養物によって産生されるか、またはハイブリドーマ細胞株３Ｃ１２Ｆによって産生される抗体の結合を競合的に遮断する、請求項１２に記載のモノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１７】
ヒト抗体、ヒト化抗体もしくはキメラヒト−マウス抗体、またはその抗原結合フラグメントである、請求項１２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１８】
ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ１４／ＨＣＣ−１およびＣＣＬ１８／ＰＡＲＣからなる群から選択される少なくとも４種のＣＣケモカインと結合し、かつＣＣＬ２／ＭＣＰ−１と実質的に結合しない、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１９】
前記ＣＣケモカインの少なくとも１種のＮループ、３０’ｓループまたは４０’ｓループ中の決定基と結合する、請求項１８に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２０】
配列番号７１の残基１１〜１５（ＣＣＦＳＹ）、残基１７〜２４（ＳＲＱＩＰＱＮＦ）、残基３４〜３５（ＱＣ）または残基５７〜６７（ＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αの少なくとも１つの抗原決定基と結合し；
配列番号７２の残基１１〜１５（ＣＣＦＳＹ）、残基１７〜２４（ＡＲＫＬＰＨＮＦ）、残基３４〜３５（ＬＣ）または残基５７〜６７（ＳＷＶＱＥＹＶＹＤＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１βの少なくとも１つの抗原決定基と結合し；
配列番号７３の残基１０〜１４（ＣＣＦＡＹ）、残基１６〜２３（ＡＲＰＬＰＲＡＨ）、残基３３〜３４（ＫＣ）または残基５６〜６６（ＫＷＶＲＥＹＩＮＳＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳの少なくとも１つの抗原決定基と結合する、請求項１８に記載のモノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項２１】
配列番号２３、２４、２５、２８、２９または３０からなる群から選択される、ＭＡｂ  ７Ｄ１Ｇの少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる、請求項１８に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２２】
ＭＡｂ  ７Ｄ１Ｇを産生するハイブリドーマ細胞株によって、もしくはその継代培養物によって産生されるか、またはハイブリドーマ細胞株７Ｄ１Ｇによって産生される抗体の結合を競合的に遮断する、請求項１８に記載のモノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項２３】
ヒト抗体、ヒト化抗体もしくはキメラヒト−マウス抗体、またはその抗原結合フラグメントである、請求項１８に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２４】
ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳおよびＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ−１からなる群から選択される少なくとも４種のＣＣケモカインと結合し、かつＣＣＬ２／ＭＣＰ−１と実質的に結合しない、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２５】
前記ＣＣケモカインの少なくとも１種のＮループ、３０’ｓループまたは４０’ｓループ中の決定基と結合する、請求項２４に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２６】
配列番号７１の残基１１〜１５（ＣＣＦＳＹ）、残基１７〜２４（ＳＲＱＩＰＱＮＦ）、残基３４〜３５（ＱＣ）または残基５７〜６７（ＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αの少なくとも１つの抗原決定基と結合し；
配列番号７２の残基１１〜１５（ＣＣＦＳＹ）、残基１７〜２４（ＡＲＫＬＰＨＮＦ）、残基３４〜３５（ＬＣ）または残基５７〜６７（ＳＷＶＱＥＹＶＹＤＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１βの少なくとも１つの抗原決定基と結合し；
配列番号７３の残基１０〜１４（ＣＣＦＡＹ）、残基１６〜２３（ＡＲＰＬＰＲＡＨ）、残基３３〜３４（ＫＣ）または残基５６〜６６（ＫＷＶＲＥＹＩＮＳＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳの少なくとも１つの抗原決定基と結合する、請求項２４に記載のモノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項２７】
配列番号１３、１４、１５、１８、１９または２０からなる群から選択される、ＭＡＢ  ７Ｄ１２Ａの少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる、請求項２４に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２８】
ＭＡｂ  ７Ｄ１２Ａを産生するハイブリドーマ細胞株によって、もしくはその継代培養物によって産生されるか、またはハイブリドーマ細胞株７Ｄ１２Ａによって産生される抗体の結合を競合的に遮断する、請求項２４に記載のモノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項２９】
ヒト抗体、ヒト化抗体もしくはキメラヒト−マウス抗体、またはその抗原結合フラグメントである、請求項２４に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３０】
ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１βおよびＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳからなる群から選択される３種のＣＣケモカインと結合し、かつＣＣＬ２／ＭＣＰ−１と実質的に結合しない、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３１】
前記ＣＣケモカインの少なくとも１種のＮループ、３０’ｓループまたは４０’ｓループ中の決定基と結合する、請求項３０に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３２】
配列番号７１の残基１１〜１５（ＣＣＦＳＹ）、残基１７〜２４（ＳＲＱＩＰＱＮＦ）、残基３４〜３５（ＱＣ）または残基５７〜６７（ＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αの少なくとも１つの抗原決定基と結合し；
配列番号７２の残基１１〜１５（ＣＣＦＳＹ）、残基１７〜２４（ＡＲＫＬＰＨＮＦ）、残基３４〜３５（ＬＣ）または残基５７〜６７（ＳＷＶＱＥＹＶＹＤＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１βの少なくとも１つの抗原決定基と結合し；
配列番号７３の残基１０〜１４（ＣＣＦＡＹ）、残基１６〜２３（ＡＲＰＬＰＲＡＨ）、残基３３〜３４（ＫＣ）または残基５６〜６６（ＫＷＶＲＥＹＩＮＳＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳの少なくとも１つの抗原決定基と結合する、請求項３０に記載のモノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項３３】
配列番号３３、３４、３５、３８、３９、４０、６３、６４、６５、６８、６９および７０からなる群から選択される、ＭＡｂ  １８Ｖ４Ｆの少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる、請求項３０に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３４】
ＭＡｂ  １８Ｖ４Ｆを産生するハイブリドーマ細胞株によって、もしくはその継代培養物によって産生されるか、またはハイブリドーマ細胞株１８Ｖ４Ｆによって産生される抗体の結合を競合的に遮断する、請求項３０に記載のモノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項３５】
ヒト抗体、ヒト化抗体もしくはキメラヒト−マウス抗体、またはその抗原結合フラグメントである、請求項３０に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３６】
ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１βおよびＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳからなる群から選択される少なくとも３種のＣＣケモカインと結合し、かつＣＣＬ２／ＭＣＰ−１と実質的に結合しない、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３７】
前記ＣＣケモカインの少なくとも１種のＮループ、３０’ｓループまたは４０’ｓループ中の決定基と結合する、請求項３６に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３８】
配列番号７１の残基１１〜１５（ＣＣＦＳＹ）、残基１７〜２４（ＳＲＱＩＰＱＮＦ）、残基３４〜３５（ＱＣ）または残基５７〜６７（ＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１αの少なくとも１つの抗原決定基と結合し；
配列番号７２の残基１１〜１５（ＣＣＦＳＹ）、残基１７〜２４（ＡＲＫＬＰＨＮＦ）、残基３４〜３５（ＬＣ）または残基５７〜６７（ＳＷＶＱＥＹＶＹＤＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１βの少なくとも１つの抗原決定基と結合し；
配列番号７３の残基１０〜１４（ＣＣＦＡＹ）、残基１６〜２３（ＡＲＰＬＰＲＡＨ）、残基３３〜３４（ＫＣ）または残基５６〜６６（ＫＷＶＲＥＹＩＮＳＬＥ）内に位置する、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳの少なくとも１つの抗原決定基と結合する、請求項３６に記載のモノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項３９】
配列番号４３、４４、４５、４８、４９および５０からなる群から選択される、ＭＡｂ  １８Ｐ７Ｅの少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる、請求項３６に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４０】
ＭＡｂ  １８Ｐ７Ｅを産生するハイブリドーマ細胞株によって、もしくはその継代培養物によって産生されるか、またはハイブリドーマ細胞株１８Ｐ７Ｅによって産生される抗体の結合を競合的に遮断する、請求項３６に記載のモノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項４１】
ヒト抗体、ヒト化抗体もしくはキメラヒト−マウス抗体、またはその抗原結合フラグメントである、請求項３６に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４２】
請求項１に記載のモノクローナル抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞株。
【請求項４３】
請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを、担体、賦形剤またはバッファーと組み合わせて含んでなる、組成物。
【請求項４４】
請求項１に記載の複数のモノクローナル抗体を含んでなる、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記モノクローナル抗体が少なくとも３種の異なるＣＣケモカインに対して少なくとも２０ｎＭの結合親和性を有し、少なくとも１種のＣＣケモカインがＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１βまたはＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳである、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４６】
１種以上のＣＣケモカインによって媒介される疾患、障害または病態を治療するための方法であって、それを必要とする被験体に、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することを含んでなる、方法。
【請求項４７】
前記疾患、障害または病態が、炎症性疾患、または炎症によって媒介されるかもしくは炎症を伴うものである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記疾患、障害または病態が自己免疫疾患である、請求項４６に記載の方法。
【国際調査報告】
2013503192.tif 000027
2013503192.tif 000028
2013503192.tif 000029