(57)【要約】有機ターゲットとの選択的相互作用が可能であるタンパク質構造が提供される。タンパク質構造は、有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である組換え融合タンパク質を反復構造単位として含むポリマーである。融合タンパク質は部分Ｂ、ＲＥＰ及びＣＴ、及び任意でＮＴを含んでいる。Ｂは３０アミノ酸残基を超える非スピドロイン部分であり、有機ターゲットとの選択的相互作用の能力を提供する。ＲＥＰは７０から３００アミノ酸残基からなる部分で、クモ糸タンパク質の反復断片に由来する。ＣＴは７０から１２０アミノ酸残基からなる部分で、クモ糸タンパク質のＣ末端断片に由来する。ＮＴは１００から１６０アミノ酸残基からなる任意の部分で、クモ糸タンパク質のＮ末端断片に由来する。融合タンパク質とそのタンパク質構造は親和性培地及び細胞足場材料として有用である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリン及び免疫グロブリン又はその誘導体を含む分子からなる群から選択される有機ターゲットと選択的相互作用が可能なタンパク質構造であって、前記タンパク質構造が、反復構造単位として、有機ターゲットと選択的相互作用が可能である、部分Ｂ、ＲＥＰ及びＣＴを含む組換え融合タンパク質を含むポリマーであり、
Ｂは３０アミノ酸残基を超える非スピドロイン部分であり、有機ターゲットとの相互作用の能力を提供し、Ｂ部分が、ブドウ球菌プロテインＡに由来するＺドメイン、ブドウ球菌プロテインＡ及びそのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣドメイン；及びこれらのアミノ酸配列の何れかに対して少なくとも７０％の同一性を有するタンパク質断片から選択され；
ＲＥＰは７０から３００アミノ酸残基からなる部分で、クモ糸タンパク質の反復断片に由来し；及び
ＣＴは７０から１２０アミノ酸残基からなる部分で、クモ糸タンパク質のＣ末端断片に由来するタンパク質構造。
【請求項２】
Ｂ部分が、ブドウ球菌プロテインＡに由来するＺドメイン、及びブドウ球菌プロテインＡに由来するＺドメインに対して少なくとも７０％の同一性を有するタンパク質断片からなる群から選択される、請求項１に記載のタンパク質構造。
【請求項３】
有機ターゲットと選択的相互作用が可能なタンパク質構造であって、前記タンパク質構造が、反復構造単位として、有機ターゲットと選択的相互作用が可能であり、部分Ｂ、ＲＥＰ及びＣＴ、及び任意でＮＴを含む組換え融合タンパク質を含むポリマーであり、
Ｂは３０アミノ酸残基を超える非スピドロイン部分であり、有機ターゲットとの選択的相互作用の能力を提供し；
ＲＥＰは７０から３００アミノ酸残基からなる部分で、クモ糸タンパク質の反復断片に由来し；及び
ＣＴは７０から１２０アミノ酸残基からなる部分で、クモ糸タンパク質のＣ末端断片に由来し；及び
ＮＴは１００から１６０アミノ酸残基からなる部分で、クモ糸タンパク質のＮ末端断片に由来するタンパク質構造。
【請求項４】
前記組換え融合タンパク質が式
Ｂｘ−ＲＥＰ−Ｂｙ−ＣＴ−Ｂｚ及びＢｘ−ＣＴ−Ｂｙ−ＲＥＰ−Ｂｚにより定められるタンパク質の群から選択され、
ｘ、ｙ及びｚは０から５の整数であり；
かつｘ＋ｙ＋ｚ≧１
である請求項３に記載のタンパク質構造。
【請求項５】
前記組換え融合タンパク質が式
Ｂｘ−ＲＥＰ−ＣＴ、Ｂｘ−ＣＴ−ＲＥＰ、ＲＥＰ−ＣＴ−Ｂｚ及びＣＴ−ＲＥＰ−Ｂｚにより定められるタンパク質の群から選択され、
ｘ及びｚは１から５の整数である
請求項４に記載のタンパク質構造。
【請求項６】
前記組換え融合タンパク質が式
Ｂ−ＲＥＰ−ＣＴ、Ｂ−ＣＴ−ＲＥＰ、ＲＥＰ−ＣＴ−Ｂ及びＣＴ−ＲＥＰ−Ｂにより定められるタンパク質の群から選択される、請求項５に記載のタンパク質構造。
【請求項７】
Ｂ部分が、配列番号６から１０の何れかに３０％未満の同一性を有する、請求項１から６の何れかに記載のタンパク質構造。
【請求項８】
有機ターゲットが、免疫グロブリン及び免疫グロブリン又はその誘導体を含む分子からなる群から選択される、請求項３から７の何れか一項に記載のタンパク質構造。
【請求項９】
免疫グロブリンがヒト由来の免疫グロブリンのサブクラスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩＧＭから選択される、請求項８に記載のタンパク質構造。
【請求項１０】
Ｂ部分が、ブドウ球菌プロテインＡに由来するＺドメイン、ブドウ球菌プロテインＡに由来するＺドメイン、及びそのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣドメイン、連鎖球菌プロテインＧ、及びそのＣ１、Ｃ２及びＣ３ドメイン；及びこれらのアミノ酸配列の何れかに対して少なくとも７０％の同一性を有するタンパク質断片からなる群から選択される、請求項３から９の何れか一項に記載のタンパク質構造。
【請求項１１】
Ｂ部分が、ブドウ球菌プロテインＡに由来するＺドメイン、ブドウ球菌プロテインＡのＢドメイン、及び連鎖球菌プロテインＧのＣ２ドメイン；及びこれらのアミノ酸配列の何れかに対して少なくとも７０％の同一性を有するタンパク質断片からなる群から選択される、請求項１０に記載のタンパク質構造。
【請求項１２】
Ｂ部分が、ブドウ球菌プロテインＡに由来するＺドメイン、及び連鎖球菌プロテインＧのＣ２ドメインからなる群から選択される、請求項１１に記載のタンパク質構造。
【請求項１３】
有機ターゲットが、アルブミン及びアルブミン又はその誘導体を含む分子からなる群から選択される、請求項３から７の何れか一項に記載のタンパク質構造。
【請求項１４】
Ｂ部分が、連鎖球菌プロテインＧ、連鎖球菌プロテインＧのアルブミン結合ドメイン、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ由来のＧＡモジュール；及びこれらのアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも７０％の同一性を有するタンパク質断片からなる群から選択される、請求項１３に記載のタンパク質構造。
【請求項１５】
Ｂ部分が、連鎖球菌プロテインＧのアルブミン結合ドメイン、及びこれに対して少なくとも７０％の同一性を有するタンパク質断片を含む、請求項１３から１４に記載のタンパク質構造。
【請求項１６】
Ｂ部分が、連鎖球菌プロテインＧのアルブミン結合ドメインである、請求項１５に記載のタンパク質構造。
【請求項１７】
有機ターゲットが、ビオチン及びビオチン又はその誘導体を含む分子からなる群から選択される、請求項３から７の何れか一項に記載のタンパク質構造。
【請求項１８】
Ｂ部分が、ストレプトアビジン、単量体ストレプトアビジン（Ｍ４）；及びこれらのアミノ酸配列の何れかに対して少なくとも７０％の同一性を有するタンパク質断片からなる群から選択される、請求項１７に記載のタンパク質構造。
【請求項１９】
Ｂ部分が、単量体ストレプトアビジン（Ｍ４）である、請求項１８に記載のタンパク質構造。
【請求項２０】
前記タンパク質構造が少なくとも２次元で少なくとも０．１μｍの大きさを有する、請求項１から１９の何れかに記載のタンパク質構造。
【請求項２１】
前記タンパク質構造が、繊維、薄膜、発泡体、網、メッシュ、球及びカプセルからなる群から選択される物理的形態である、請求項１から２０の何れかに記載のタンパク質構造。
【請求項２２】
ＲＥＰ部分がＬ（ＡＧ）ｎＬ、Ｌ（ＡＧ）ｎＡＬ、Ｌ（ＧＡ）ｎＬ、Ｌ（ＧＡ）ｎＧＬの群から選択され、
ｎは２から１０の整数であり；
各個々のＡセグメントは８から１８アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、アミノ酸残基の０から３はＡｌａではなく、残りのアミノ酸残基がＡｌａであり；
各個々のＧセグメントは１２から３０アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、少なくとも４０％のアミノ酸残基がＧｌｙであり；
各個々のＬセグメントは、０から２０アミノ酸残基のリンカーアミノ酸配列である、
請求項１から２１の何れかに記載のタンパク質構造。
【請求項２３】
ＣＴ部分が、配列番号９に対して少なくとも５０％の同一性、又は配列番号７に対して少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１から２２の何れかに記載のタンパク質構造。
【請求項２４】
ＣＴ部分が、配列番号９に対して少なくとも５０％の同一性、又は配列番号７に対して少なくとも８０％の同一性を有する、請求項２３に記載のタンパク質構造。
【請求項２５】
ＮＴ部分が、配列番号８に対して少なくとも５０％の同一性、又は配列番号６に対して少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１から２４の何れかに記載のタンパク質構造。
【請求項２６】
ＮＴ部分が、配列番号８に対して少なくとも５０％の同一性、及び配列番号６に対して少なくとも８０％の同一性を有する、請求項２５に記載のタンパク質構造。
【請求項２７】
融合タンパク質がオリゴペプチド細胞結合モチーフを含む、請求項１から２６の何れかに記載のタンパク質構造。
【請求項２８】
融合タンパク質が、配列番号１４、１６、１８、２２、２４、及び２６、及びこれらの配列の何れかに対して少なくとも８０％の同一性を有するタンパク質からなる群から選択される、請求項１から２７の何れかに記載のタンパク質構造。
【請求項２９】
（ａ）請求項１から２８の何れか一項に記載の融合タンパク質を提供し；
（ｂ）融合タンパク質を組換え融合タンパク質を含むポリマーの形成を達成するための条件にさらす工程を含み、有機ターゲットに対する結合活性を示す、請求項１から２８の何れか一項に記載のタンパク質構造を提供する方法。
【請求項３０】
有機ターゲットの固定化のための親和性培地であって、該親和性培地が請求項１から２８の何れか一項に記載の融合タンパク質を含み、そのＢ部分が有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である親和性培地。
【請求項３１】
前記親和性培地が請求項１から２８の何れか一項に記載のタンパク質構造を含み、該タンパク質構造が組換え融合タンパク質を含むポリマーである請求項３０に記載の親和性培地。
【請求項３２】
前記タンパク質構造が請求項８から１９の何れか一項に記載される、請求項３１に記載の親和性培地。
【請求項３３】
前記有機ターゲットを更に含み、Ｂ部分が該有機ターゲットと選択的相互作用が可能であり該有機ターゲットに結合する、請求項３０から３２の何れか一項に記載される親和性培地。
【請求項３４】
前記有機ターゲットが第二有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である、請求項３３に記載の親和性培地。
【請求項３５】
前記タンパク質構造が薄膜の物理的形態である、請求項３１から３４の何れか一項に記載の親和性培地。
【請求項３６】
細胞表面に存在する有機ターゲットを有する細胞の培養のための細胞足場材料であって、該細胞足場材料が請求項１から２８の何れか一項に記載のタンパク質構造を含む細胞足場材料。
【請求項３７】
Ｂ部分が、細胞表面上に存在する有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である、請求項３６に記載の細胞足場材料。
【請求項３８】
前記細胞足場材料が中間体有機ターゲットを更に含み、Ｂ部分が、前記中間体有機ターゲットとの選択的相互作用が可能であり前記中間体有機ターゲットに結合し、かつ前記中間体有機ターゲットが細胞表面に存在する有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である、請求項３６に記載の細胞足場材料。
【請求項３９】
前記タンパク質構造が請求項８から１９の何れか一項に記載される、請求項３８に記載の細胞足場材料。
【請求項４０】
前記タンパク質構造が薄膜の物理的形態である、請求項３６から４０の何れか一項に記載の細胞足場材料。
【請求項４１】
請求項３６から４０の何れか一項に記載の細胞と細胞足場材料の組み合わせ。
【請求項４２】
サンプルからの有機ターゲットの分離における請求項１から２８の何れか一項に記載のタンパク質構造の使用。
【請求項４３】
細胞の培養における請求項１から２８の何れか一項に記載のタンパク質構造の使用。
【請求項４４】
有機ターゲットを含むサンプルを提供し；
前記親和性培地が有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である、請求項３０から３５の何れか一項に記載の親和性培地を提供し；
前記親和性培地を、親和性培地と有機ターゲット間の結合を達成するのに適した条件下で前記サンプルと接触させ；及び
非結合サンプルを除去する
工程を含む、サンプルからの有機ターゲットの分離のための方法。
【請求項４５】
第一有機ターゲットと第二有機ターゲット間の結合を達成するために適した条件下で、第一の有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である、第二の有機ターゲットと、前記親和性培地及び固定化有機ターゲットを接触させる工程を更に含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
親和性培地と有機ターゲット間の結合を達成するために、前記親和性培地と前記サンプルを接触させると、親和性培地中の融合タンパク質が、請求項１から２８の何れか一項に記載のタンパク質構造として存在する、請求項４４又は４５の何れか一項に記載の方法。
【請求項４７】
親和性培地と有機ターゲットの間の結合を達成するために、前記親和性培地と前記サンプルを接触させると、親和性培地中の融合タンパク質が溶解して存在し、有機ターゲットに結合した融合タンパク質の複合体に、請求項１から２８の何れか一項に記載の融合タンパク質構造を形成させる、請求項４４又は４５の何れか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記親和性培地上で固定化ターゲットの存在を検出し、かつ任意で定量する工程を更に含む、請求項４４から４７の何れか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記親和性培地から有機ターゲットを放出し、及び回収する工程を更に含む、請求項４４から４８の何れか一項に記載の方法。
【請求項５０】
化学的処理及び／又は滅菌加熱処理により親和性培地を再生する最終工程を更に含む、請求項４４から４９の何れか一項に記載の方法。
【請求項５１】
化学的処理がＮａＯＨ及び／又は尿素による処理を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
目的の細胞を含むサンプルを提供し；
前記サンプルを請求項３６から４０の何れか一項に記載の細胞足場材料に適用し、前記細胞足場材料が細胞表面に存在する有機ターゲットとの選択的相互作用が可能であり；
前記細胞を、細胞表面の有機ターゲットと前記細胞足場材料との間の結合により、前記細胞足場材料に対して固定化させる、
細胞を固定化するための方法。
【請求項５３】
請求項５２に記載の細胞足場材料に目的の細胞を固定化し；及び
それに適用された細胞を有する前記細胞足場材料を細胞培養に適した条件下で維持することを含む細胞を培養するための方法。
【請求項５４】
前記タンパク質構造が薄膜、繊維又は発泡体の物理的形態である、請求項４４から５３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５５】
有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である、請求項１から２８の何れか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項５６】
請求項５５に記載の融合タンパク質をコードする単離されたポリ核酸。
【請求項５７】
請求項２８に記載の融合タンパク質をコードする核酸からなる群、及び配列番号１５、１７、１９、２３、２５及び２７からなる群から選択される、請求項５６に記載の単離されたポリ核酸。
【請求項５８】
ａ）適切な宿主において、請求項１から２８の何れか一項に記載の融合タンパク質を発現し：及び
ｂ）融合タンパク質を含む混合物を得て、任意で融合タンパク質を単離する工程を含む、融合タンパク質を生産する方法。
【請求項５９】
タンパク質構造が組換え融合タンパク質を含むポリマーであり、有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である該タンパク質構造の生産のための、請求項１から２８の何れか一項に記載の組換え融合タンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は組換え融合タンパク質の分野、より具体的にはクモ糸タンパク質（スピドロイン）に由来する部分を含む融合タンパク質に関する。本発明は、スピドロインに由来する部分を含む組換え融合タンパク質を含むポリマーであるタンパク質構造を提供する方法を与える。また、有機ターゲットに結合するための新規なタンパク質構造を与える。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
応用タンパク質化学において、活性、典型的には生物活性ペプチドを、活性に関連する部位、典型的には有機ターゲット、例えば、核酸、タンパク質、タンパク質の複合体、タンパク質及び／又は脂質及び／又は糖質及び／又は核酸などに対していかに調製又は提示するかは一般的な問題である。最も簡単な解決策は、生物活性ペプチド又はタンパク質の水溶液を提供することである。しかしながら、多くの適用が所望の目標を達成するために幾つかの更なる手段を要求する。例えば、ペプチド／タンパク質は、脂質混合物と会合するか又は支持構造体に化学的に固定化されてもよい。
【０００３】
支持構造体に固定化されたペプチド／タンパク質の適用は、バイオプロセス、クロマトグラフィー、細胞捕獲及び培養、アクティブ・フィルタ、及び診断などの調製用及び分析的分離操作が含まれる。細胞外マトリックスタンパク質に基づく構造体、例えばコラーゲンは、欧州特許第７０４５３２号及び欧州特許第９８５７３２号に開示されている。
【０００４】
また、支持する構造体にクモ糸タンパク質を使用することが提案されている。クモ糸タンパク質は、強度と弾性の組み合わせにより、並外れた靭性と伸展性を獲得している天然の高性能ポリマーである。クモは異なる機械的性質と機能を有する様々なタイプの糸を産生する最大７つの異なる腺を持っている。大瓶状腺（ｍａｊｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｇｌａｎｄ）により生産されるしおり糸は最も強靱な繊維である。それは２つの主要なポリペプチドからなり、これらはほとんどの場合大瓶状腺スピドロイン（ＭａＳｐ）１および２と称され、例えばニワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）においてはＡＤＦ−３及びＡＤＦ−４と称される。これらのタンパク質は、２００から７２０ｋＤａの範囲の分子量を有する。クモのしおり糸タンパク質、又はＭａＳｐは３つの成分を有する；非反復Ｎ末端ドメイン、多くの反復ｐｏｌｙ−Ａｌａ／Ｇｌｙセグメントからなる中央領域、及び非反復Ｃ末端ドメイン。一般に、反復領域は糸の繊維で分子間接触を形成すると考えられているが、末端ドメインの正確な機能は良く分かっていない。繊維形成を伴う会合において、反復領域はランダムコイルとαヘリックス構造からβシート構造への構造変換を受ける。スピドロインのＣ末端領域はクモの種と糸のタイプ間にて一般的に保存されている。
【０００５】
国際公開第０７／０７８２３９号とStark, M. et al., Biomacromolecules 8: 1695-1701, (2007)は、ＡｌａとＧｌｙの高含量を持つ反復性断片とタンパク質のＣ末端断片、並びにクモ糸タンパク質を含む可溶性融合タンパク質からなる微小クモ糸タンパク質を開示している。クモ糸タンパク質の繊維はその融合パートナーからのクモ糸タンパク質の遊離の際に自発的に得られる。
【０００６】
Rising, A. et al., CMLS 68(2): 169-184 (2010)はクモ糸タンパク質の生産における進展を総説している。
【０００７】
米国特許出願公開第２００９／０２６３４３０号は酵素β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅの微小クモ糸タンパク質の膜に対する化学的結合を開示している。しかし、化学的結合はタンパク質の安定性及び／又は機能において好ましくない条件を必要とし得る。クモ糸タンパク質の反復領域に由来するセグメントの複数の反復は、ＲＧＤ細胞結合セグメント(Bini, E et al., Biomacromolecules 7:3139-3145 (2006))及び／又はＲ５ペプチド (Wong Po Foo, C et al., Proc Natl Acad Sci 103 (25): 9428-9433 (2006))又はミネラル化（ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）に関与する別のタンパク質セグメント（Huang, J et al., Biomaterials 28: 2358-2367 (2007)；国際公開第２００６／０７６７１１号）を含むように設計されている。これらの先行技術文献では、膜は有機溶媒変性ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）中に融合タンパク質を可溶化し、乾燥することにより形成されている。
【０００８】
米国特許出願公開第２００５／２６１４７９ Ａ１号は、糸タンパク質繊維又は他のポリマー構造を形成することなく、複合体混合物からの個々の糸タンパク質の磁気親和性分離を含む、親和性タグを持つ組換え糸タンパク質の精製のための方法を開示している。
【０００９】
既知の支持構造と関連技術は、例えば経済性、効率性、安定性、再生能力、生物活性及び生体適合性に関していくつかの欠点を持っている。
【発明の概要】
【００１０】
有機ターゲットとの選択的相互作用が可能な新規なタンパク質構造を提供することを本発明の目的とする。
【００１１】
有機ターゲットとの選択的相互作用が可能なタンパク質構造を提供することも本発明の目的であって、２次構造に予測できない影響をもち及び／又はそのタンパク質構造に残り得るであろう過酷な溶媒（ｈａｒｓｈ ｓｏｌｖｅｎｔｓ）を用いることなく形成されることを特徴とする。
【００１２】
有機ターゲットとの選択的相互作用が可能な安定なタンパク質構造を提供することは本発明の一つの目的であって、そのタンパク質構造は、例えば化学的処理により、使用後に容易に再生可能である。
【００１３】
生体適合性で細胞培養及び移植組織として適している安定なタンパク質構造を提供することは本発明の別の目的である。
【００１４】
有機ターゲットとの選択的相互作用が可能な高密度の等間隔の機能性を持つタンパク質構造を提供することは本発明のさらに別の目的である。
【００１５】
何ヶ月間も４℃又は室温での貯蔵の際にその選択的結合能を維持するタンパク質構造を提供することは本発明の更なる目的である。
【００１６】
オートクレーブ可能、即ち加熱処理後にその選択的結合能を維持するタンパク質構造を提供することも本発明の目的である。
【００１７】
これらの目的及び以下の開示から自明であろう他の目的のために、本発明は第一態様に従って、融合タンパク質と、反復構造単位として本請求項に記載の融合タンパク質を含むポリマーからなるタンパク質構造を提供する。
【００１８】
関連する態様に従って、本発明は融合タンパク質をコードする単離されたポリ核酸及び本請求項に記載の融合タンパク質を生産する方法を提供する。
【００１９】
別の態様に従って、本発明は本請求項に記載のタンパク質構造を提供するための方法を提供する。
【００２０】
更なる態様に従って、本発明は本請求項に記載の親和性培地を提供する。
【００２１】
一態様に従って、本発明は本請求項に記載の細胞足場材料を提供する。関連する態様に従って、本発明はまた細胞と本請求項に記載の細胞足場材料の組み合わせを提供する。
【００２２】
一態様に従って、本発明は本請求項に記載のタンパク質構造及び融合タンパク質の新規な使用を提供する。
【００２３】
別の態様に従って、本発明は本請求項に記載のサンプルからの有機ターゲットの分離の方法を提供する。
【００２４】
更なる態様に従って、本発明は本請求項に記載の細胞の固定化及び任意で培養の方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、スピドロインＣ末端ドメインの配列アラインメントを示す。
【図２】図２は、スピドロインＮ末端ドメインの配列アラインメントを示す。
【図３】図３は、Ｚドメインを含む融合タンパク質の巨視的な繊維を示す。
【図４】図４は、Ｚドメインを含む融合タンパク質の精製及び分析からのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図５】図５は、融合タンパク質のＺドメインの機能性を示す融合タンパク質で作られた繊維とコントロール繊維を示す。
【図６】図６は、組織培養プレートの底での融合タンパク質で作られた成形膜の部分を示す。
【図７−１２】図７−１２は、融合タンパク質構造のＺドメインの機能性を示す非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図１３−１５】図１３−１５は、市販のプロテインＡマトリックスに比べた融合タンパク質構造のＺドメインのＩｇＧ結合能を示す非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図１６−１７】図１６−１７は、市販のプロテインＡマトリックスに比べた融合タンパク質構造の定置洗浄（Ｃｌｅａｎｉｎｇ Ｉｎ Ｐｌａｃｅ）（ＣＩＰ）手順の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図１８】図１８は、ビオチン化Ａｔｔｏ−５６５に浸したタンパク質膜からの蛍光強度を示す。
【図１９】図１９は、融合タンパク質膜に結合の際のビオチン化Ａｔｔｏ−５６５の異なる濃度に対する蛍光強度値のグラフと線形フィットを示す。
【図２０】図２０は、融合タンパク質で作られた膜又はコントロールによるビオチン化Ａｔｔｏ−５６５の添加前（−）と後（＋）の蛍光強度のグラフを示す。
【図２１】図２１は、溶液でビオチン化ＨＲＰ無しでの触媒作用における標準曲線と得られた反応速度の線形フィットを示すグラフである。
【図２２】図２２は、コントロールに比べて融合タンパク質膜に固定化されたビオチン化ＨＲＰによる触媒作用における反応速度を示すグラフである。
【図２３】図２３は、可溶化した融合タンパク質構造の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図２４−２６】図２４−２６は、Ｚドメインを含む融合タンパク質膜へのＩｇＧ−ＨＲＰの結合を示すグラフを示す。
【図２７】図２７は、Ｚドメインを含む融合タンパク質膜へのＩｇＧ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３の結合を示すグラフを示す。
【図２８】図２８は、オートクレーブ後の融合タンパク質構造のＺドメインの機能性を示す非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図２９】図２９は、Ｚドメインを含む融合タンパク質のプロテアーゼ３Ｃ処理からの開裂生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図３０】図３０は、有機ターゲット（ＩｇＧ）の存在下で形成される融合タンパク質構造中のＺドメインの機能性を示す非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図３１−３２】図３１−３２は、融合タンパク質構造のＡｂｄドメインの機能性を示す非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図３３−３４】図３３−３４は、融合タンパク質構造のＣ２ドメインの機能性を示す非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【００２６】
2013544508.tif 000003
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な記述
本発明は、有機ターゲットとの選択的相互作用が可能な固体タンパク質構造が、反復構造単位として組換え融合タンパク質のポリマーの形態で調製できるする見識に一般的に基づいている。融合タンパク質は、有機ターゲットとの選択的相互作用が可能な３０アミノ酸残基以上の少なくとも一の非スピドロイン部分と、クモ糸タンパク質の少なくとも反復性のＣ末端断片に対応する部分を含んでいる。驚くべきことに、クモ糸タンパク質に由来する部分は、構造的に再配置するために誘導することができ、その結果、ポリマー性の固体構造を形成するが、非スピドロイン部分は構造的に再配置されず、その所望の構造と機能、即ち、有機ターゲットと選択的相互作用する能力を維持する。タンパク質構造は、化学的結合工程又は変性法による工程無しで得ることができ、これは、特に機能がその部分の２次構造に依存しているときに、その部分の維持された機能性を持つ融合タンパク質を得る手順を促進し、かつその可能性を向上する。これらの融合タンパク質ポリマーの形成は厳しく管理され、この見識は、更なる新規タンパク質構造、タンパク質構造を作り出す方法、及び様々な応用と方法におけるタンパク質構造の用途へと発展している。
【００２８】
従って、本発明による融合タンパク質は、所望の選択的相互作用活性と、生理学的条件下でタンパク質構造に用いられる内部の固体支持体活性の両方を与える。スピドロイン部分がポリマー性の固体構造を形成するために構造的に再配置されるときに、非スピドロイン部分はスピドロイン部分に共有結合しているが、融合タンパク質の結合活性が維持されていることは驚くべきこととして考慮されねばならない。実際、選択的相互作用活性を与えるその部分の熱及び／又は化学的安定性及び／又は結合活性は、本発明の融合タンパク質構造に組み込まれるときに増大し得る。タンパク質構造はまた、有機ターゲットに対する選択的相互作用活性の予測可能な高い密度を提供する。全ての発現タンパク質部分は固体支持体に結合しているため、選択的相互作用活性を持つ有用なタンパク質部分の損失は最小化される。
【００２９】
本発明による融合タンパク質から形成されるポリマーは固体構造であり、それらの物理特性において、特に高強度、弾力性と軽量化の有用な組み合わせにおいて有用である。特に有用な特徴は、融合タンパク質のスピドロイン由来部分は、生化学的に堅牢であり、例えば酸、塩基又はカオトロピック剤による再生に適しており、かつ加熱滅菌、例えば１２０℃で２０分のオートクレーブに適している。ポリマーはまた、細胞接着および増殖を支援するその能力において有用である。しおり糸に由来する特性は、医療又は技術的目的において新しい材料の開発において魅力的である。特に、本発明によるタンパク質構造は、クロマトグラフィー、細胞捕獲、選択及び培養、アクティブ・フィルタ、及び診断などの調整的かつ分析的分離操作において有用である。本発明によるタンパク質構造はまた、移植片などの医療機器、及び、創傷閉鎖システム、バンドエイド、縫合糸、創傷包帯などの医療用品、及び細胞固定化のための足場、細胞培養、組織工学及び誘導細胞の再生において有用である。
【００３０】
本発明は、有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である組換え融合タンパク質を提供し、その融合タンパク質はＢ、ＲＥＰ、及びＣＴ部分、及び任意でＮＴ部分を含んでいる。本発明はまた、有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である組換え融合タンパク質を提供し、該タンパク質構造は、本発明による組換え融合タンパク質を含み、かつ任意で該タンパク質からなり、即ち、Ｂ、ＲＥＰ、及びＣＴ部分、及び任意でＮＴ部分を含み、かつ任意で該タンパク質からなる。
【００３１】
実施例の融合タンパク質のＲＥＰとＣＴ部分は必然的に特定のタンパク質、例えばユープロステノプス オーストラリス（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）由来の主要スピドロイン１（ＭａＳｐ１）に関するが、本開示は本発明による融合タンパク質構造を生産する目的において任意の構造的に類似する部分に対して適用可能であると考えられる。更に、実施例の融合タンパク質の選択的相互作用活性を提供するＢ部分は必然的に特定のタンパク質部分、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ及びストレプトアビジンに由来する部分に関するが、本開示は本発明による融合タンパク質構造を生産する目的において、任意の構造的及び／又は機能的に類似するＢ部分に対して適用可能であると考えられる。
【００３２】
本発明による特定の融合タンパク質は、式Ｂｘ−ＲＥＰ−Ｂｙ−ＣＴ−Ｂｚ及びＢｘ−ＣＴ−Ｂｙ−ＲＥＰ−Ｂｚにより定義され、ここでｘ、ｙ、ｚは０から５の整数；ｘ＋ｙ＋ｚ≧１であり、融合タンパク質のどちらかの端又は融合タンパク質の任意の２つのタンパク質部分の間に一つのＮＴ部分を任意で更に含有する。もし、ｘ＋ｙ＋ｚ＞１である場合、もし２つ以上のＢ部分がある場合、それらは同一であるか又は異なっても良い。２つ以上のＢ部分が同じ有機ターゲット又は異なる有機ターゲットと選択的相互作用の能力を有し得る。２つ以上のＢ部分が実質的に同一であり、各々が同一の有機ターゲットとの選択的相互作用の能力を有するのが好ましい。
【００３３】
本発明による融合タンパク質は、ｘ、ｙ及びｚは０から２の整数、好ましくは０から１の整数である。本発明による所定の好ましい融合タンパク質では、ｙ＝０。より好ましい特定の融合タンパク質では、ｙ＝０でｘ又はｚの何れかが０、即ち、融合タンパク質は式Ｂｘ−ＲＥＰ−ＣＴ，Ｂｘ−ＣＴ−ＲＥＰ，ＲＥＰ−ＣＴ−Ｂｚ及びＣＴ−ＲＥＰ−Ｂｚで定義され、ここでｘとｚは１から５の整数である。本発明による融合タンパク質は、ｙ＝０で、ｘ及びｚは０から１の整数；及びｘ＋ｚ＝１である。従って、本発明による所定の好ましい融合タンパク質は、式Ｂ−ＲＥＰ−ＣＴ，Ｂ−ＣＴ−ＲＥＰ，ＲＥＰ−ＣＴ−Ｂ及びＣＴ−ＲＥＰ−Ｂにより定義される。本発明による好ましい融合タンパク質では、任意のＮＴ部分が無い。
【００３４】
用語「融合タンパク質」は、ここでは、組換え核酸、すなわち、通常は一緒に生じるであろう二つ以上の核酸を組み合わせることにより人工的に創られる、ＤＮＡ又はＲＮＡからの発現により作成されるタンパク質を意味する（遺伝子操作）。本発明による融合タンパク質は、組み合えタンパク質であり、従って、天然に生じるタンパク質に同一ではない。特に、野生型スピドロインは、上記に定めた組換え核酸から発現されないため、本発明による融合タンパク質ではない。結合された核酸配列は、特定の機能的特性を持つ異なるタンパク質、部分的なタンパク質又はポリペプチドをコードしている。得られる融合タンパク質、又は組換え融合タンパク質は、もとのタンパク質、部分的タンパク質又はポリペプチドの各々から由来した機能特性を持つ単一タンパク質である。更に、本発明及び対応する遺伝子による融合タンパク質は、キメラであり、すなわち、タンパク質／遺伝子部分は、少なくとも２つの異なる種に由来する。ＲＥＰとＣＴ部分、並びに任意でＮＴ部分は全てクモ糸タンパク質から由来する。誤解を避けるために、本発明によるＢ部分は非スピドロインタンパク質又はポリペプチドであり、即ちクモ糸タンパク質に由来しない。特に、本発明によるＢ部分は、スパイダーシルクタンパク質のＣ末端断片、反復性断片、又はＮ末端断片からは由来しない。
【００３５】
融合タンパク質は、典型的には１７０から２０００アミノ酸残基、例えば１７０から１０００アミノ酸残基、例えば１７０から６００アミノ酸残基、例えば１７０から５００アミノ酸残基、例えば１７０から４００アミノ酸残基からなる。クモ糸タンパク質断片を含む長いタンパク質が、可溶化及び重合のための過酷な溶剤の使用を必要とする非晶質の凝集体を形成する傾向があるので、小さいサイズが有利である。組換え融合タンパク質は、特にクモ糸タンパク質が一以上のＢ部分である場合において及び／又はそれがＮＴ部分を含むとき、２０００残基以上を含み得る。
【００３６】
用語「スピドロイン」及び「クモ糸タンパク質」は、本記述を通して同義に用いられ、全ての既知のクモ糸タンパク質を包含し、典型的には「ＭａＳｐ」、ニワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）の場合「ＡＤＦ」と略される大瓶状腺クモ糸タンパク質を含む。これらの大瓶状腺クモ糸タンパク質は一般に１と２の２つのタイプがある。これらの用語は、既知のクモ糸タンパク質に対して高度の同一性及び／又は類似性を持つ非天然タンパク質を包含する。
【００３７】
その結果、用語「非スピドロイン」はクモ糸タンパク質から由来しないタンパク質、即ちクモ糸タンパク質に対して程度（又は全く）同一性及び／又は類似性を持たないタンパク質を意味する。
【００３８】
本発明によるタンパク質構造は、有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である。この能力は本発明による融合タンパク質にあり、より具体的には融合タンパク質のＢ部分にある。ＲＥＰとＣＴ部分、並びに任意でＮＴ部分の、有機分子との任意の相互作用は、「有機ターゲットとの選択的相互作用が可能」なる語句により包含されない。誤解を避けるために、「有機ターゲットとの選択的相互作用が可能」なる語句は、ＲＥＰとＣＴ部分、並びに任意でＮＴ部分の関与する相互作用に依存する本発明による融合タンパク質の二量体化、オリゴマー化または重合を包含していない。
【００３９】
「有機ターゲット」なる用語は、当業者により無機分子と伝統的に考えられるもの、例えばカーボネート、炭素の単純酸化物、シアン、ダイヤモンド及びグラファイトの例外を除いて、炭素を含む全化学分子を包含する。誤解を避けるために、例えば、シリカ及び塩化カルシウムのような無機分子、塩およびイオンは、有機ではない。有機ターゲットは、有機分子、例えば細胞表面上の受容体複合体を含むか又はからなる複合体であり得る。有機ターゲットは、共有結合又は他の型の会合により結合され得る、一つ以上の有機分子の種類のモノマー、ダイマー、オリゴマーまたはポリマーであり得る。もちろん単に単一有機分子であっても良い。本発明による好ましい有機ターゲットは、限定されないが、核酸、タンパク質及びポリペプチド、脂質及び炭水化物、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。本発明による好ましい有機ターゲットは、限定されないが、免疫グロブリン、免疫グロブリン分子またはその誘導体を含む分子、アルブミン、アルブミンまたはその誘導体含む分子、ビオチン、ビオチンまたはその誘導体またはその類似体を含む分子を包含する。
【００４０】
本発明の関連において、例えば本発明による融合タンパク質のＢ部分などのリガンドとそのターゲットとの「特異的」又は「選択的」相互作用とは、特異的及び非特異的相互作用間又は選択的及び非選択的相互作用間の違いが有意義になるようなものである相互作用を意味する。２つのタンパク質間の相互作用はときには解離定数により測定される。解離定数は２つの分子間の結合（又は親和性）の強度を記述する。典型的には、抗体とその抗原の間の解離定数は１０−７から１０−１１Ｍである。しかし、高い特異性は必ずしも高い親和性を必要としない。そのカウンターパートに対して低親和性（モルの範囲内で）を持つ分子は、はるかに高い親和性を有する分子と同程度に特異的であることが示されている。本発明の場合、特異的又は選択的相互作用とは、天然に生じるか又は処理された生物学的又は生化学的液体のサンプル中で他のタンパク質が存在する所定の条件下で、特定の方法が、特定のタンパク質、標的タンパク質又はその断片の存在及び／又は量を決定するために用いることができる範囲を指す。言い換えれば、特異性又は選択性は、関連するタンパク質を区別する能力である。特異的及び選択的とは時には本記述において同義的に用いられる。
【００４１】
本発明による融合タンパク質はまた、一以上のリンカーペプチドを含む。リンカーペプチドは、融合タンパク質の任意の部分間、例えばＣＴ部分とＲＥＰ部分間、２つのＢ部分間、Ｂ部分とＣＴ部分間、及びＢ部分とＲＥＰ部分間に配置され得るか又は融合タンパク質の何れかの末端に配置され得る。融合タンパク質が２つ以上のＢ部分を含有する場合、リンカーペプチドはまた２つのＢ部分との間に配置され得る。リンカーは、融合タンパク質の機能単位の間にスペーサーを提供することができるが、融合タンパク質の同定及び精製のためのハンドル、例えばＨｉｓ及び／又はＴｒｘタグ、を構成し得る。融合タンパク質が、融合タンパク質の同定と精製のために２つ以上のリンカーペプチドを含む場合、それらはスペーサー配列、例えば、Ｈｉｓ６−スペーサー−Ｈｉｓ６−、などのスペーサー配列により隔てられているのが望まれる。リンカーはまた、シグナル認識粒子などのシグナルペプチドをも構成し得、それは融合タンパク質を膜へと導き、及び／又は宿主細胞から周囲の培地への融合タンパク質の分泌を引き起こす、融合タンパク質はまた、そのアミノ酸配列中に、リンカー及び／又は他の関連部分、典型的にはＢ部分又は部分（複数）の切断及び除去を可能にする、開裂部位を含み得る。様々な開裂部位が、例えば、化学試薬、例えばＣＮＢｒによるＭｅｔ残基の後ろの開裂部位、及びヒドロキシルアミンによるＡｓｎ−Ｇｌｙ残基間の開裂部位、トロンビン又はプロテアーゼ３Ｃなどのプロテアーゼの開裂部位、及びインテイン自己スプライシング配列などの自己スプライシング配列が、当業者に知られている。
【００４２】
ＲＥＰ、ＣＴ及びＢ部分は、互いに直接または間接的に連結されている。直接的結合は、リンカーなどの介在配列の無い、部分間の直接共有結合を意味する。間接的な結合はまた、部分が共有結合で結合されているが、リンカー及び／又は一以上の更なる部分、例えばＮＴ部分などの介在配列があることを意味する。
【００４３】
Ｂ部分又は部分（複数）は、融合タンパク質の内部的に又は何れかの末端に配置され得、即ちＣ末端に配置されるか又はＮ末端に配置される。Ｂ部分又は部分（複数）は、融合タンパク質のＮ末端に配置されることが好まれる。仮に融合タンパク質が、融合タンパク質の同定と精製のために一つ以上のリンカー、例えばＨｉｓ又はＴｒｘタグを含む場合、融合タンパク質のＮ末端に配置されることが好まれる。
【００４４】
好ましい融合タンパク質は、Ｎ末端にＢ部分が配置された形態を有し、１から３０アミノ酸残基、例えば１から１０アミノ酸残基のリンカーペプチドによって、Ｃ末端に配置されたＲＥＰ部分とＣＴ部分へ結合している。リンカーペプチドは開裂部位を含み得る。任意で、融合タンパク質はＮ末端又はＣ末端に、Ｈｉｓタグ、及び開裂部位などの精製タグを含み得るリンカーペプチドを有する。
【００４５】
その他の好ましい融合タンパク質は、Ｃ末端に配置されたＲＥＰ部分とＣＴ部分へ直接結合したＢ部分をＮ末端に配置した形態を有する。任意で、融合タンパク質はＮ末端又はＣ末端に、Ｈｉｓタグ、及び開裂部位などの精製タグを含み得るリンカーペプチドを有する。
【００４６】
本発明によるタンパク質構造は、本発明による組換え融合タンパク質を反復構造単位として含むポリマーであり、それは整列した複数の融合タンパク質、典型的には１００融合タンパク質単位を軽く超える、例えば１０００融合タンパク質単位又はそれ以上を含むことを意味する。任意で、ポリマーは更なる反復構造単位として、Ｂ部分の無い相補性タンパク質、好ましくはクモ糸に由来するタンパク質を含み得る。このことは、融合タンパク質のＢ部分が、大きい及び／又は嵩高い場合に有利であり得る。これらの相補性タンパク質は、典型的にはＲＥＰ部分とＣＴ部分、及び任意でＮＴ部分を含む。本発明による好ましい相補性タンパク質は、Ｂ部分が欠失した本明細書に記載の構造の何れかを持つことができる。相補性融合タンパク質は、Ｂ部分が欠失した融合タンパク質に実質的に同一であることが望ましい。しかしながら、本発明によるタンパク質構造は、反復構造単位として本発明による組換え融合タンパク質からなるポリマーであること、即ち本発明によるタンパク質構造は本発明による組換え融合タンパク質のポリマーであることが望ましい。
【００４７】
ポリマーの融合単位の規模は、タンパク質構造が有意な大きさを得たことを意味する。好ましい実施態様にて、タンパク質構造は少なくとも２次元で少なくとも０．１μｍの大きさを有する。従って、本明細書で使用する「タンパク質構造」なる用語は、少なくとも０．１μｍの厚さの融合タンパク質ポリマー、好ましくはヒトの目に見える、即ち少なくとも１μｍの厚さを持つ巨視的ポリマーを指す。「タンパク質構造」なる用語は、構造をとらない凝集体又は沈殿を包含しない。融合タンパク質のモノマーは水溶性であるが、本発明に係るタンパク質構造は、固体構造、即ち水に溶けない。タンパク質構造は、本発明に係る組換え融合タンパク質のモノマーを反復構造単位として含有するポリマーである。
【００４８】
本発明に係るタンパク質構造は、繊維、薄膜、発泡体、網、メッシュ、球及びカプセルからなる群から選択される物理的形態であることが望ましい。
【００４９】
本発明に係るタンパク質構造は、少なくとも０．１μｍ、好ましくは少なくとも１μｍの厚さの繊維又は薄膜であることが望ましい。繊維又は薄膜は、１−４００μｍ、好ましくは６０−１２０μｍの範囲の厚さを持つことが望ましい。繊維又は薄膜は、０．５−３００ｃｍ、好ましくは１−１００ｃｍの範囲の長さを有することが望ましい。他の好ましい範囲は０．５−３０ｃｍ及び１−２０ｃｍである。繊維は物理的操作中に無傷のままである能力を有し、即ち、紡績製織、撚糸、かぎ針編み及び同様の手順で用いることができる。薄膜は、可干渉性で、固体構造、例えばマイクロタイタープレートのプラスチックへ付着するという点で有利である。薄膜のこの特性は、洗浄と再生手順を容易にし、分離の目的に非常に有用である。特に有用なタンパク質構造は、薄膜または繊維であり、Ｂ部分はブドウ球菌プロテインＡに由来するＺドメイン又はそれに対して少なくとも７０％同一性を有するタンパク質断片であり、例えば実施例１−６を参照。
【００５０】
また、本発明に係るタンパク質構造は、１ＭＰａを超えた、好ましくは２ＭＰａを超えた、より好ましくは１０ＭＰａ以上の引張強度を有することが好ましい。本発明に係るタンパク質構造は、１００ＭＰａを超えた、より好ましくは２００ＭＰａ以上の引張強度を有することが好ましい。
【００５１】
ＲＥＰ部分は７０から３００アミノ酸残基を含むタンパク質断片で、クモ糸タンパク質の反復断片から由来する。ＲＥＰ部分は、アラニンリッチストレッチとグリシンリッチストレッチを交互に反復特性を有することを意味する。ＲＥＰ部分は、一般に、７０を上回る、例えば１４０を上回り、かつ３００未満、好ましくは２４０未満、例えば２００のアミノ酸残基を含み、下記により詳細に説明されるように、それ自身を幾つかのＬ（リンカー）セグメント、Ａ（アラニンリッチ）セグメント及びＧ（グリシンリッチ）セグメントに分割することができる。典型的には、前記リンカーセグメントは任意であって、ＲＥＰ部分の末端に位置しており、一方残りのセグメントは順にアラニンリッチ及びグリシンリッチである。従って、ＲＥＰ部分は一般的に以下の構造のどちらかを有することができ、ここでｎは整数である。
Ｌ（ＡＧ）ｎＬ，例えばＬＡ１Ｇ１Ａ２Ｇ２Ａ３Ｇ３Ａ４Ｇ４Ａ５Ｇ５Ｌ；
Ｌ（ＡＧ）ｎＡＬ，例えばＬＡ１Ｇ１Ａ２Ｇ２Ａ３Ｇ３Ａ４Ｇ４Ａ５Ｇ５Ａ６Ｌ；
Ｌ（ＧＡ）ｎＬ，例えばＬＧ１Ａ１Ｇ２Ａ２Ｇ３Ａ３Ｇ４Ａ４Ｇ５Ａ５Ｌ；又は
Ｌ（ＧＡ）ｎＧＬ，例えばＬＧ１Ａ１Ｇ２Ａ２Ｇ３Ａ３Ｇ４Ａ４Ｇ５Ａ５Ｇ６Ｌ．
当然、アラニンリッチセグメント又はグリシンリッチセグメントは、Ｎ末端またはＣ末端のリンカーセグメントに隣接しているかどうかは重要ではないということになる。ｎは２から１０の整数、好ましくは２から８、好ましくは４から８、より好まれるのは４から６であり、すなわちｎ＝４、ｎ＝５、又はｎ＝６である。
【００５２】
好ましい実施態様では、本発明によるＲＥＰ部分のアラニン含有量は、２０％を超え、好ましくは２５％を超え、より好ましくは３０％を超え、かつ５０％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは３５％未満である。アラニンの高い含有量は、硬く、及び／又は強力な、及び／又はより少ない伸展性構造を提供することが想定されるので、このことは有利である。
【００５３】
所定の実施態様において、ＲＥＰ部分はプロリン残基を欠いており、すなわち、ＲＥＰ部分にはＰｒｏ残基は無い。
【００５４】
次に、本発明によるＲＥＰ部分を構成するセグメントに目を向けると、各々のセグメントは個別であり、すなわち、特定のＲＥＰ部分の任意の２つのＡセグメント、任意の２つのＧセグメント、又は任意の２つのＬセグメントは同一であるか又は同一でない場合がある。従って、セグメントの各タイプが特定のＲＥＰ部分内で同一であることは、本発明の一般的特徴ではない。むしろ、以下の開示は、個々のセグメントを設計し、ＲＥＰ部分にそれらを集める方法のガイドラインを当業者に提供し、そのことにより、それはクモ糸タンパク質の反復断片に由来すると考えられ、かつ、それは本発明に係る機能性融合タンパク質の一部の構成要素となる。
【００５５】
各個々のＡ断片は、８から１８アミノ酸残基を有するアミノ酸配列である。個々のＡセグメントは１３から１５アミノ酸残基を含有することが好ましい。また、Ａセグメントの大半、又は２つ以上が、１３から１５個のアミノ酸残基を含有し、そしてＡセグメントの少数、例えば１つ又は２つが、８から１８アミノ酸残基、例えば８から１２、又は１６から１８アミノ酸残基を含有することが可能である。これらのアミノ酸残基の大部分はアラニン残基である。より具体的には、アミノ酸残基の０から３はアラニン残基ではなく、残りのアミノ酸残基がアラニン残基である。従って、各個別のＡセグメントの全てのアミノ酸残基は、例外なく、又は１つ、２つ又は３つのアミノ酸残基が任意のアミノ酸であって良い例外を除き、アラニン残基である。アラニン置換アミノ酸は天然のアミノ酸であり、好ましくは、セリン、グルタミン酸、システイン、及びグリシン、より好ましくはセリンから個別に選択される。もちろん、一以上のＡセグメントが全てアラニンセグメントであり、一方、残りのＡセグメントが１から３の非アラニン残基、例えばセリン、グルタミン酸、システイン又はグリシンなどを含有することは可能である。
【００５６】
好ましい実施態様において、各Ａセグメントは、上に開示されたように１０から１５のアラニン残基、及び０から３の非アラニン残基を含む、１３から１５のアミノ酸残基を含む。より好ましい実施態様において、各Ａセグメントは、上に開示されたように１２から１５のアラニン残基、及び０から１の非アラニン残基を含む、１３から１５のアミノ酸残基を含む。
【００５７】
各個々のＡセグメントは、配列番号１０のアミノ酸残基７−１９，４３−５６，７１−８３，１０７−１２０，１３５−１４７，１７１−１８３，１９８−２１１，２３５−２４８，２６６−２７９，２９４−３０６，３３０−３４２，３５７−３７０，３９４−４０６，４２１−４３４，４５８−４７０，４８９−５０２，５１７−５２９，５５３−５６６，５８１−５９４，６１８−６３０，６４８−６６１，６７６−６８８，７１２−７２５，７４０−７５２，７７６−７８９，８０４−８１６，８４０−８５３，８６８−８８０，９０４−９１７，９３２−９４５，９６９−９８１，９９９−１０１３，１０２８−１０４２及び１０６０−１０７３の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有する。この群の各配列は、ユープロステノプス オーストラリス（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）ＭａＳｐ１タンパク質の天然に生じる配列のセグメントに対応し、これは対応するｃＤＮＡのクローニングから推定される。国際公開第２００７／０７８２３９号を参照。あるいは、各個々のＡセグメントは、配列番号３のアミノ酸残基１４３−１５２，１７４−１８６，２０４−２１８，２３３−２４７及び２６５−２７８の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有する。この群の各配列は、発現された、非天然クモ糸タンパク質のセグメントに対応し、そのタンパク質は適切な条件下で絹構造を形成する能力を有する。従って、本発明による所定の実施態様において、各個々のＡセグメントは、上述のアミノ酸セグメントから選択されたアミノ酸配列に対して同一である。いかなる特定の理論に束縛されることを望むことなく、本発明によるＡセグメントは、らせん構造又はβシートを形成することが想定される。
【００５８】
用語「％同一性」は、本明細書と添付された特許請求の範囲の全体を通して使用されるように、以下のように計算される。クエリ配列は、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズムを使用して、標的配列にアラインされる（Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J., Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680 (1994)）。比較は、整列された配列の最短に対応するウィンドウを介して行われる。各位置でアミノ酸配列が比較され、標的配列において同一対応を有するクエリ配列における位置の割合いが、％同一性として報告される。
【００５９】
「％類似性」は、本明細書と添付された特許請求の範囲の全体を通して使用されるように、疎水性残基のＡｌａ，Ｖａｌ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｔｒｐ，Ｍｅｔ及びＣｙｓは類似し；塩基残基のＬｙｓ，Ａｒｇ及びＨｉｓは類似し、；酸性残基のＧｌｕとＡｓｐは類似し；親水性残基、無電荷残基のＧｌｎ，Ａｓｎ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ及びＴｙｒは類似していることを例外として、「％同一性」について説明されるように計算される。残りの天然アミノ酸のＧｌｙはこれに関連する他の何れのアミノ酸に対して似ていない。
【００６０】
この説明全体を通して、本発明による他の代わりの実施態様は、明記された同一性の割合の代わりに、対応する類似の割合を実行する。別の代わりの実施態様は、明記された同一性の割合並びに、各配列について好ましい同一性の割合の群から選択された、その他のより高い割合の類似性を実行する。例えば、配列はその他の配列に７０％類似している可能性があり；又はそれはその他の配列に７０％同一であり得；又はそれはその他の配列に７０％同一で９０％類似であり得る。
【００６１】
更に、実験データから、各個々のＧセグメントは１２から３０アミノ酸残基のアミノ酸配列であることが結論付けられている。個々のＧセグメントは１４から２３アミノ酸残基から成ることが好ましい。各Ｇセグメントの少なくとも４０％のアミノ酸残基はグリシン残基である。典型的には、各個々のＧセグメントのグリシン含量は、４０から６０％の範囲にある。
【００６２】
各個々のＧセグメントは、配列番号１０のアミノ酸残基２０−４２，５７−７０，８４−１０６，１２１−１３４，１４８−１７０，１８４−１９７，２１２−２３４，２４９−２６５，２８０−２９３，３０７−３２９，３４３−３５６，３７１−３９３，４０７−４２０，４３５−４５７，４７１−４８８，５０３−５１６，５３０−５５２，５６７−５８０，５９５−６１７，６３１−６４７，６６２−６７５，６８９−７１１，７２６−７３９，７５３−７７５，７９０−８０３，８１７−８３９，８５４−８６７，８８１−９０３，９１８−９３１，９４６−９６８，９８２−９９８，１０１４−１０２７，１０４３−１０５９及び１０７４−１０９２の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有する。この群の各配列は、ユープロステノプス オーストラリス（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）ＭａＳｐ１タンパク質の天然に生じる配列のセグメントに対応し、これは対応するｃＤＮＡのクローニングから推定される。国際公開第２００７／０７８２３９号を参照。あるいは、各個々のＧセグメントは、配列番号３のアミノ酸残基１５３−１７３，１８７−２０３，２１９−２３２，２４８−２６４及び２７９−２９６の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有する。この群の各配列は、発現された、非天然クモ糸タンパク質のセグメントに対応し、そのタンパク質は適切な条件下で絹構造を形成する能力を有する。従って、本発明による所定の実施態様において、各個々のＧセグメントは、上述のアミノ酸セグメントから選択されたアミノ酸配列に対して同一である。
【００６３】
所定の実施態様において、本発明による各Ｇセグメントのアミノ酸残基は、−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−ではない。
【００６４】
本発明によれば、Ｇセグメント３つのサブタイプがある。この分類は、ユープロステノプス オーストラリス（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）ＭａＳｐ１タンパク質配列（国際公開第２００７／０７８２３９号）の注意深い解析に基づいており、その情報は、新規な非天然スパイダーシルクタンパク質の構築において用いられ検証されている。
【００６５】
本発明によるＧセグメントの第一のサブタイプは、アミノ酸の一文字コンセンサス配列ＧＱＧ（Ｇ／Ｓ）ＱＧＧ（Ｑ／Ｙ）ＧＧ （Ｌ／Ｑ）ＧＱＧＧＹＧＱＧＡ ＧＳＳ（配列番号１１）により表わされる。この第一の、そして一般的に最長のＧセグメントサブタイプは、典型的には、２３アミノ酸残基を含むが、わずか１７アミノ酸残基しか含まない場合もあり、荷電残基を欠損するか又は一つの荷電残基を含む。従って、この第一のＧセグメントサブタイプは、１７から２３アミノ酸残基を含むことが望まれるが、わずか１２又は３０ものアミノ酸残基を含み得ることが意図されている。いかなる特定の理論に束縛されることを望むことなく、このサブタイプは、コイル構造又は３１−ヘリックス構造を形成することが想定される。この第一のサブタイプの代表的なＧセグメントは、アミノ酸配列１０のアミノ酸残基２０−４２，８４−１０６，１４８−１７０，２１２−２３４，３０７−３２９，３７１−３９３，４３５−４５７，５３０−５５２，５９５−６１７，６８９−７１１，７５３−７７５，８１７−８３９，８８１−９０３，９４６−９６８，１０４３−１０５９及び１０７４−１０９２である。所定の実施態様において、本発明によるこの第一のサブタイプの各Ｇセグメントの最初の２つのアミノ酸残基は、−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−ではない。
【００６６】
本発明によるＧセグメントの第ニのサブタイプは、アミノ酸の一文字コンセンサス配列ＧＱＧＧＱＧＱＧ（Ｇ／Ｒ）Ｙ ＧＱＧ（Ａ／Ｓ）Ｇ（Ｓ／Ｇ）Ｓ（配列番号１２）により表わされる。この第二の、一般には中規模の、Ｇセグメントサブタイプは、典型的には１７アミノ酸残基を含み、荷電残基を欠損するか又は一つの荷電残基を含む。この第二のＧセグメントサブタイプは、１４から２０アミノ酸残基を含むことが望まれるが、わずか１２又は３０ものアミノ酸残基を含み得ることが意図されている。いかなる特定の理論に束縛されることを望むことなく、このサブタイプは、コイル構造を形成することが想定される。この第二のサブタイプはの代表的なＧセグメントは、配列番号１０のアミノ酸残基２４９−２６５，４７１−４８８，６３１−６４７及び９８２−９９８、及び配列番号３のアミノ酸残基１８７−２０３である。
【００６７】
本発明によるＧセグメントの第三のサブタイプは、アミノ酸の一文字コンセンサス配列Ｇ（Ｒ／Ｑ）ＧＱＧ（Ｇ／Ｒ）ＹＧＱＧ （Ａ／Ｓ／Ｖ）ＧＧＮ（配列番号１３）により表わされる。この第三のＧセグメントサブタイプは、典型的には１４アミノ酸残基を含み、一般的には本発明によるＧセグメントサブタイプの最短である。この第三のＧセグメントサブタイプは、１２から１７アミノ酸残基を含むことが望まれるが、２３ものアミノ酸残基を含み得ることが意図されている。いかなる特定の理論に束縛されることを望むことなく、このサブタイプは、ターン構造を形成することが想定される。この第一のサブタイプの代表的なＧセグメントは、アミノ酸配列１０のアミノ酸残基５７−７０，１２１−１３４，１８４−１９７，２８０−２９３，３４３−３５６，４０７−４２０，５０３−５１６，５６７−５８０，６６２−６７５，７２６−７３９，７９０−８０３，８５４−８６７，９１８−９３１，１０１４−１０２７；及び配列番号３のアミノ酸残基２１９−２３２である。
【００６８】
従って、好ましい実施態様において、各個々のＧセグメントは、配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号１３から選択されたアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の同一性を有する。
【００６９】
ＲＥＰ部分のＡセグメントとＧセグメントの交互配列の好ましい実施態様において、全ての第二のＧセグメントは第一のサブタイプであり、一方残りのＧセグメントは第三のサブタイプ、例えば、．．．Ａ１Ｇ短いＡ２Ｇ長いＡ３Ｇ短いＡ４Ｇ長いＡ５Ｇ短い．．．である。ＲＥＰ部分のその他の好ましい実施態様において、第二のサブタイプの一つのＧセグメントが、挿入、例えば．．．Ａ１Ｇ短いＡ２Ｇ長いＡ３Ｇ中間Ａ４Ｇ短いＡ５Ｇ長い．．．を介して規則的にＧセグメントを中断する。
【００７０】
各個々のＬセグメントは、任意のリンカーアミノ酸配列を表わし、０から２０アミノ酸残基、例えば０から１０アミノ酸残基を包含しうる。このセグメントは任意であって、クモ糸タンパク質にとって機能的に重要ではないが、その存在は完全に機能的なクモ糸タンパク質をさらに可能とし、本発明によるタンパク質構造を形成する。また、ユープロステノプス オーストラリス（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）由来のＭａＳｐ１タンパク質の推定アミノ酸配列の反復部分（配列番号１０）に存在するリンカーアミノ酸配列もある。特に、リンカーセグメントのアミノ酸配列は、記載されたＡセグメント又はＧセグメントの何れかに似ている可能性があるが、一般的には、本明細書で定義されるような基準を満たすには十分でない。
【００７１】
国際公開第２００７／０７８２３９号に示されるように、ＲＥＰ部分のＣ末端部分に配置されたリンカーセグメントは、アミノ酸の１文字コンセンサス配列ＡＳＡＳＡＡＡＳＡＡＳＴＶＡＮＳＶＳ及びＡＳＡＡＳＡＡＡにより表わされ、それらはアラニンに富んでいる。実は、第二の配列は本発明によるＡセグメントであると考えることができ、一方、第一の配列は本発明によるＡセグメントに高度な類似性を有する。本発明によるリンカーセグメントのその他の例では、１文字アミノ酸配列ＧＳＡＭＧＱＧＳを有し、グリシンに富み、本発明によるＧセグメントに高度な類似性を有する。リンカーセグメントのその他の例はＳＡＳＡＧである。
【００７２】
代表的なＬセグメントは、配列番号１０のアミノ酸残基１−６及び１０９３−１１１０；配列番号３のアミノ酸残基１３８−１４２であるが、当業者は、これらのセグメントについて多くの適切な代替アミノ酸配列があることを容易に認識するであろう。本発明によるＲＥＰ部分の一実施態様において、Ｌセグメントの一つは０アミノ酸を含む、すなわちＬセグメントの一つを欠いている。本発明によるＲＥＰ部分のその他の実施態様において、両方のＬセグメントが０アミノ酸を含む、すなわち両方のＬセグメントの一つを欠いている。従って、本発明によるＲＥＰ部分のこれらの実施態様は、以下のように模式的に表わすことができる；（ＡＧ）ｎＬ，（ＡＧ）ｎＡＬ，（ＧＡ）ｎＬ，（ＧＡ）ｎＧＬ；Ｌ（ＡＧ）ｎ，Ｌ（ＡＧ）ｎＡ，Ｌ（ＧＡ）ｎ，Ｌ（ＧＡ）ｎＧ；及び（ＡＧ）ｎ，（ＡＧ）ｎＡ，（ＧＡ）ｎ，（ＧＡ）ｎＧ．任意のこれらのＲＥＰ部分は、以下に定められるように、任意のＣＴ部分との使用に適している。
【００７３】
ＣＴ部分は７０から１２０アミノ酸残基を含むタンパク質断片で、クモ糸タンパク質のＣ末端断片から由来する。「に由来する」なる表現は、本発明によるＣＴ部分の関連において、クモ糸タンパク質のＣ末端アミノ酸配列に高度の類似性を有することを意味する。図１に示されるように、このアミノ酸配列はＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２を含む、様々な種及びスパイダーシルクタンパク質のあいだで良く保存されている。ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２のＣ末端領域のコンセンサス配列は、配列番号９として提供される。図１において、以下のＭａＳｐタンパク質がアラインされ、必要に応じＧｅｎＢａｎｋの受託エントリーで表示されている。
【００７４】
2013544508.tif 000004
2013544508.tif 000005
【００７５】
ＣＴ部分が完全には欠失していない限り、本発明によるクモ糸タンパク質において、どの特異的ＣＴ部分が存在するかは重大ではない。従って、本発明によるＣＴ部分は、図１及び表１に示されたアミノ酸配列又は高度な類似性を持つ配列の何れかから選択することができる。様々なＣ末端配列が、本発明によるスパイダーシルクタンパク質に使用することができる。
【００７６】
本発明によるＣＴ断片の配列は、図１のアミノ酸配列に基づいて、コンセンサスアミノ酸配列の配列番号９に対して、少なくとも５０％同一性、好ましくは少なくとも６０％同一性、より好ましくは少なくとも６５％の同一性、又は実に少なくとも７０％の同一性を有する。
【００７７】
本発明による代表的なＣＴ部分は、ユープロステノプス オーストラリス（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）配列の配列番号７である。従って、本発明による好ましい態様によれば、ＣＴ部分は、配列番号７又は図１及び表１の個々の何れかのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有する。本発明の好ましい実施態様において、ＣＴ部分は配列番号７又は図１及び表１の個々の何れかのアミノ酸配列に対して同一である。
【００７８】
ＣＴ部分は７０から１２０アミノ酸残基からなる。ＣＴ部分は、少なくとも７０，又は８０を上回る、好ましくは９０を上回るアミノ酸残基を含むことが望まれる。また、ＣＴ部分は、多くても１２０、又は１１０未満のアミノ酸残基を含むことが望まれる。典型的なＣＴ部分は約１００アミノ酸残基を含む。
【００７９】
ＮＴ部分は１００から１６０アミノ酸残基を含むタンパク質断片で、クモ糸タンパク質のＮ末端断片に由来する。「に由来する」なる表現は、本発明によるＮＴ部分の関連において、クモ糸タンパク質のＮ末端アミノ酸配列に高度の類似性を有することを意味する。図２に示されるように、このアミノ酸配列はＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２を含む、様々な種及びスパイダーシルクタンパク質のあいだで良く保存されている。図２において、以下のスピドロインＮＴ部分がアラインされ、必要に応じＧｅｎＢａｎｋの受託エントリーで表示されている。
【００８０】
2013544508.tif 000006
【００８１】
Ｎ末端部分に対応する部分のみが、シグナルペプチドを除いて、各配列について示されている。ＮｃフラッグとＮｌｍフラッグが、Rising A. et al. Biomacromolecules 7, 3120-3124 (2006)に従って翻訳され編集された。
【００８２】
本発明によるクモ糸タンパク質において、どの特定のＮＴ部分が存在しているかは重大ではない。従って、本発明によるＮＴ部分は、図２に示されたアミノ酸配列又は高度な類似性を持つ配列の何れかから選択することができる。様々なＮ末端配列を、本発明によるクモ糸タンパク質に使用することができる。図２の相同配列に基づいて、以下の配列が、コンセンサスＮＴアミノ酸配列を構成する：ＱＡＮＴＰＷＳＳＰＮＬＡＤＡＦＩＮＳＦ（Ｍ／Ｌ）ＳＡ（Ａ／Ｉ）ＳＳＳＧＡＦＳＡＤＱＬＤＤＭＳＴＩＧ（Ｄ／Ｎ／Ｑ）ＴＬＭＳＡＭＤ（Ｎ／Ｓ／Ｋ）ＭＧＲＳＧ（Ｋ／Ｒ）ＳＴＫＳＫＬＱＡＬＮＭＡＦＡＳＳＭＡＥＩＡＡＡＥＳＧＧ（Ｇ／Ｑ）ＳＶＧＶＫＴＮＡＩＳＤＡＬＳＳＡＦＹＱＴＴＧＳＶＮＰＱＦＶ（Ｎ／Ｓ）ＥＩＲＳＬＩ（Ｇ／Ｎ）Ｍ（Ｆ／Ｌ）（Ａ／Ｓ）ＱＡＳＡＮＥＶ（配列番号８）。
【００８３】
好ましい実施態様において、本発明によるＮＴ断片の配列は、図２のアミノ酸配列に基づいて、コンセンサスアミノ酸配列の配列番号８に対して、少なくとも５０％同一性、好ましくは少なくとも６０％同一性を有する。好ましい実施態様において、本発明によるＮＴ部分の配列は、コンセンサスアミノ酸配列の配列番号８に対して、少なくとも６５％同一性、好ましくは少なくとも７０％同一性を有する。好ましい実施態様において、本発明によるＮＴ部分は、コンセンサスアミノ酸配列の配列番号８に対して、更に７０％、好ましくは８０％の類似性を有する。
【００８４】
本発明による代表的なＮＴ部分は、ユープロステノプス オーストラリス（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）配列の配列番号６である。本発明の好ましい実施態様によれば、ＮＴ部分は、配列番号６又は図１の個々の何れかのアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％の同一性を有する。本発明の好ましい実施態様において、ＮＴ部分は、配列番号６又は図２の個々の何れかのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有する。本発明の好ましい実施態様において、ＮＴ部分は配列番号６又は図１の個々の何れかのアミノ酸配列に対して、特にＥａ ＭａＳｐ１に対して同一である。
【００８５】
ＮＴ部分は１００から１６０アミノ酸残基を含む。ＮＴ部分は、少なくとも１００，又は１１０を上回る、好ましくは１２０を上回るアミノ酸残基を含むことが望まれる。また、ＮＴ部分は、多くても１６０、又は１４０未満のアミノ酸残基を含むことが望まれる。典型的なＮＴ部分は約１３０から１４０アミノ酸残基を含む。
【００８６】
Ｂ部分は、３０アミノ酸残基以上を含むタンパク質又はポリペプチド断片である。Ｂ部分は、好ましくは４０アミノ酸残基以上、例えば５０アミノ酸残基以上を含んでいる。Ｂ部分は、好ましくは５００アミノ酸残基未満、例えば２００アミノ酸残基未満、より好ましくは１００アミノ酸残基未満、例えば１００アミノ酸残基未満を含んでいる。それは有機ターゲットと選択的相互作用することができ、有機ターゲットと選択的相互作用する能力を与えるのは融合タンパク質のＢ部分である。
【００８７】
Ｂ部分は非スピドロイン部分である。このことは、それがクモ糸タンパク質から由来しない、即ちクモ糸タンパク質に対して低程度の同一性及び／又は類似性を持つか、或いは全く同一性及び／又は類似性を持たないことを意味する。本発明によるＢ部分の配列は、ここで開示されたスピドロインアミノ酸配列の何れか、特に配列番号６から１０の何れかに対して、３０％未満の同一性、例えば２０％未満の同一性、好ましくは１０％未満の同一性を有する。
【００８８】
Ｂ部分を選択することは当業者の能力の範囲内と見なされる。にもかかわらず、Ｂ部分として有用であると証明され得る親和性リガンドの例、並びに検出及び／又は定量化のための形態と条件の例が説明の目的で下に与えられる。
【００８９】
親和性リガンドの選択に必要とされる生物分子の多様性は、複数の可能性のある足場分子の一つの組み合わせ操作により生成することができ、次いで、特異的及び／又は選択的親和性リガンドが適切な選択プラットフォームを用いて選択される。有機ターゲットに対する親和性リガンドを生成するために有用なそのような構造の非限定的な例として、ブドウ球菌タンパク質およびそれらのドメイン及びＺドメイン等のこれらのドメインの誘導体(Nord K et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15:772-777)；リポカリン(Beste G et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:1898-1903)；アンキリンリピートドメイン(Binz HK et al. (2003) J. Mol. Biol. 332:489-503)；セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）(Smith GP et al. (1998) J. Mol. Biol. 277:317-332; Lehtioe J et al. (2000) Proteins 41:316-322)；γクリスタリン（Fiedler U and Rudolph R，国際公開第０１／０４１４４号）；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Peelle B et al. (2001) Chem. Biol. 8:521-534）；ヒトの細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４）（Hufton SE et al. (2000) FEBS Lett. 475:225-231; Irving RA et al. (2001) J. Immunol. Meth. 248:31-45)；ノッティン（ｋｎｏｔｔｉｎ）タンパク質などのプロテアーゼ阻害剤、（Wentzel A et al. (2001) J. Bacteriol. 183:7273-7284; Baggio R et al. (2002) J. Mol. Recognit. 15:126-134）及びクニッツドメイン（Roberts BL et al. (1992) Gene 121:9-15; Dennis MS and Lazarus RA (1994) J. Biol. Chem. 269:22137-22144)；ＰＤＺドメイン(Schneider S et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17:170-175)；オレドキシンなどペプチドアプタマー（Lu Z et al. (1995) Biotechnology 13:366-372; Klevenz B et al. (2002) Cell. Mol. Life Sci. 59:1993-1998)；ブドウ球菌ヌクレアーゼ(Norman TC et al. (1999) Science 285:591-595)；テンダミスタット(McConell SJ and Hoess RH (1995) J. Mol. Biol. 250:460-479; Li R et al. (2003) Protein Eng. 16:65-72)；フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインに基づくトリネクチン(Koide A et al. (1998) J. Mol. Biol. 284:1141-1151; Xu L et al. (2002) Chem. Biol. 9:933-942)；及び亜鉛フィンガー(Bianchi E et al. (1995) J. Mol. Biol. 247:154-160; Klug A (1999) J. Mol. Biol. 293:215-218; Segal DJ et al. (2003) Biochemistry 42:2137-2148)があげられる。
【００９０】
上記の例は、新規の結合特異性の生成に使用される単一のランダム化されたループを提示する足場タンパク質、タンパク質表面から突出する側鎖が、新規の結合特異性を生成するためのランダム化される剛性の二次構造を有するタンパク質の足場、及び新規結合特異性の生成のために使用される非連続的な超可変ループ領域を示す足場を含む。
【００９１】
オリゴヌクレオチドはまた親和性リガンドとして使用することができる。アプタマーもしくはデコイと呼ばれる一本鎖核酸は、明確に定義された三次元構造にフォールドし、高い親和性と特異性でそれらのターゲットに結合する。(Ellington AD and Szostak JW (1990) Nature 346:818-822; Brody EN and Gold L (2000) J. Biotechnol. 74:5-13; Mayer G and Jenne A (2004) BioDrugs 18:351-359)。オリゴヌクレオチドリガンドは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかとすることができ、ターゲット分子のクラスの広い範囲に結合することができる。
【００９２】
上述の足場構造体の任意の変異体のプールからの所望の親和性リガンドの選択において、多くの選択プラットフォームが、選択した標的タンパク質に対する特異的新規リガンドの単離のために利用することができる。選択プラットフォームは、限定されないが、ファージディスプレイ(Smith GP (1985) Science 228:1315-1317)，リボソームディスプレイ(Hanes J and Plueckthun A (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:4937-4942)，酵母２−ハイブリッド系(Fields S and Song O (1989) Nature 340:245-246)，酵母ディスプレイ(Gai SA and Wittrup KD (2007) Curr Opin Struct Biol 17:467-473)，ｍＲＮＡディスプレイ(Roberts RW and Szostak JW (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:12297-12302)，細菌ディスプレイ(Daugherty PS (2007) Curr Opin Struct Biol 17:474-480, Kronqvist N et al. (2008) Protein Eng Des Sel 1-9, Harvey BR et al. (2004) PNAS 101(25):913-9198)，マイクロビーズディスプレイ(Nord O et al. (2003) J Biotechnol 106:1-13, 国際公開第０１／０５８０８号），ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）(Tuerk C and Gold L (1990) Science 249:505-510)およびタンパク質断片相補アッセイ（ＰＣＡ）(Remy I and Michnick SW (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:5394-5399)を含む。免疫グロブリン、アルブミン、又は他の有機ターゲットに対する親和性を持つＢ部分の好ましい群は、細菌レセプチンドメイン又はその誘導体である。
【００９３】
Ｂ部分の好ましい群は、免疫グロブリン及び免疫グロブリン又はその誘導体を含む分子と選択的相互作用することができる。免疫グロブリンサブクラスの好ましい群は、ブドウ球菌プロテインＡに由来するＺドメインによって認識されるサブクラスである。即ち、ヒト由来のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＭ、ウサギと牛由来の全Ｉｇサブクラス、モルモット由来のＩｇＧ１とＩｇＧ２、及びマウス由来のＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ，ＩｇＧ２ｂ，ＩｇＧ３及びＩｇＭ（Hober, S. et al., J. Chromatogr B. 848:40-47 (2007)を参照）、より好ましくはヒト由来の免疫グロブリンサブクラスのＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ４，ＩｇＡ及びＩｇＭである。免疫グロブリンサブクラスの別の好ましい群は、Ｃ２ドメイン連鎖球菌プロテインＧによって認識されるサブクラス、即ち、ＩｇＧ３を含む全ヒトサブクラス、及びマウス、ウサギ及び羊を含む数種の動物由来のＩｇＧである。
【００９４】
好ましいＢ部分の一群は、ブドウ球菌プロテインＡに由来するＺドメイン、ブドウ球菌タンパク質およびそのドメイン、好ましくはＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣドメイン、連鎖球菌プロテインＧ及びそのドメイン、好ましくはＣ１、Ｃ２及びＣ３ドメイン；及びこれらのアミノ酸配列のいずれかに対して、少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも８０％の同一性、又は少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質断片からなる群から選択される。好ましくは、Ｂ部分は、ブドウ球菌プロテインＡに由来するＺドメイン、ブドウ球菌タンパク質のＢドメイン、及び連鎖球菌プロテインＧのＣ２ドメイン；及びこれらのアミノ酸配列のいずれかに対して、少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも８０％の同一性、又は少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質断片からなる群から選択される。好ましくは、Ｂ部分は、ブドウ球菌プロテインＡに由来するＺドメイン、及びこのアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも８０％の同一性、又は少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質断片からなる群から選択される。Ｂ部分はブドウ球菌プロテインＡに由来するＺドメインおよび連鎖球菌プロテインＧのＣ２ドメインからなる群から選択されるのが望ましい。例えば実施例１−６及び８を参照。免疫グロブリンに対する親和性を持つＢ部分の好ましい群は、細菌レセプチンドメイン又はその誘導体である。
【００９５】
好ましいＢ部分の別の群は、アルブミン及びアルブミン又はその誘導体を含む分子と選択的相互作用することができる。アルブミンに対する親和性を持つＢ部分の好ましい群は、細菌レセプチンドメイン又はその誘導体である。好ましいＢ部分は、連鎖球菌プロテインＧ、連鎖球菌プロテインＧのアルブミン結合ドメイン、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ由来のＧＡモジュール；及びこれらのアミノ酸配列のいずれかに対して、少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも８０％の同一性、又は少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質断片からなる群から選択される。好ましくは、Ｂ部分は、連鎖球菌プロテインＧのアルブミン結合ドメイン、及びこのアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも８０％の同一性、又は少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質断片からなる群から選択される。Ｂ部分は連鎖球菌プロテインＧのアルブミン結合ドメインであることが望ましい。例えば実施例７を参照。
【００９６】
好ましいＢ部分の更なる群は、ビオチン及びビオチン又はその誘導体又はその類似体を含む分子と選択的相互作用が可能である。好ましいＢ部分は、ストレプトアビジン、単量体ストレプトアビジン（Ｍ４）；及びこれらのアミノ酸配列のいずれかに対して、少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも８０％の同一性、又は少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質断片からなる群から選択される。Ｂ部分は単量体ストレプトアビジン（Ｍ４）であることが望ましく、例えば実施例１０−１２を参照。
【００９７】
本発明に係る具体的な融合タンパク質およびタンパク質構造は実施例に与えられる。これらの好ましい融合タンパク質は配列番号１４，１６，１８，２２，２４及び２６からなる群を形成する。更なる好ましい融合タンパク質は、これらのアミノ酸配列の何れかに対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有している。
【００９８】
本発明は、本発明による融合タンパク質をコードする単離されたポリ核酸を更に提供する。特に、具体的なポリ核酸が実施例及び付加配列リスト、例えば配列番号１５，１７，１９，２３，２５及び２７に与えられる。さらに好ましいポリ核酸は、配列番号１４，１６，１８，２２，２４及び２６の何れかに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一性を有する融合タンパク質をコードする。
【００９９】
本発明に係るポリ核酸は、本発明の融合タンパク質を産生するのに有用である。本発明は、融合タンパク質の生産方法を提供する。第一の工程は、本発明に係る融合タンパク質を適切な宿主で発現することを含む。適切な宿主は、当業者に周知であり、例えば、細菌細胞及び真核細胞、例えば、酵母、昆虫細胞株及び哺乳動物細胞株などを含む。典型的には、この工程は、大腸菌中で融合タンパク質をコードするポリ核酸分子の発現を含む。
【０１００】
第二の方法の工程では、融合タンパク質を含有する混合物を得ることを含む。混合物は、例えば、宿主細胞を溶解又は機械的に破壊することによって得ることができる。融合タンパク質が宿主細胞によって分泌される場合に、混合物はまた、細胞培養培地を収集することによって得ることができる。このようにして得られたタンパク質は、標準的な手順を用いて単離することができる。必要であれば、この混合物を遠心分離にかけて、適切な画分（沈殿物又は上清）を収集することができる。融合タンパク質を含有する混合物はまた、分離させるために、ゲルろ過クロマトグラフィー、例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー、透析法、相分離又は濾過に供することができる。任意で、リポ多糖及び他の発熱物質がこの段階で積極的に除去される。必要ならば、リンカーペプチドは、この工程で切断することによって除去することができる。
【０１０１】
本発明によるタンパク質構造は、適切な条件下で、本発明に係る融合タンパク質から自発的に構築され、ポリマーへの集合は、剪断力の存在、及び／又は２つの異なる相の間、例えば固体と液体相との間、空気と液相との間の界面、又は疎水性／親水性界面、例えば、鉱物油−水界面によって促進される。得られた界面の存在は、界面において又は界面周囲の領域における重合を刺激し、その領域は前記重合が前記界面又は前記界面領域で開始するように、液体培地に広がっている。種々のタンパク質構造が、構築の最中に条件を適合させることにより生成することができる。例えば、その構築を軽く左右に振られる容器中で生じさせる場合、繊維が、空気−水界面に形成される。混合物を静置する場合、薄膜が空気−水界面に形成される。混合物を蒸発させる場合、薄膜は容器の底部に形成される。油が水性混合物に添加される場合、静置した場合又は振った場合に、薄膜が、油−水界面に形成される。この混合物を例えば空気のバブリング又は泡立てにより発泡させる場合、発泡体は安定し、乾燥させた場合に固化する。
【０１０２】
従って、本発明は、有機ターゲットに対する結合親和性を示すタンパク質構造を与えるための方法を提供する。第一の方法工程にて、本発明による組換え融合タンパク質が与えられる。融合タンパク質は、本発明によるポリ核酸から、適切な宿主中でそれを発現させることにより与えられ得る。第二の方法工程にて、融合タンパク質は組換え融合タンパク質を含むポリマーの形成を達成するための条件にさらされる。特に、自発的に構築されたタンパク質構造はヘキサフルオロイソプロパノールに可溶化することができるが、可溶化された融合タンパク質は、その後自発的に、例えば繊維に、再構築できない。
【０１０３】
タンパク質構造は、有機ターゲットの固定化用の親和性培地の一部として有用であり、ここでＢ部分は有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である。サンプル、例えば生物学的サンプルは、生物学的サンプルに存在する有機ターゲットに結合することができる本発明による融合タンパク質又はタンパク質構造に適用することができ、その融合タンパク質又はタンパク質構造はその後サンプルからの有機ターゲットの分離に有用である。生物学的サンプル、例えば被験体から除去された血液、血清又は血漿などは、有機ターゲットの検出、分離及び／又は定量化を受ける。
【０１０４】
従って本発明はサンプルからの有機ターゲットの分離のための方法を与える。サンプル、例えば、有機ターゲットを含む血液、血清又は血漿が与えられる。生物学的サンプルは、前に得られた試料である場合がある。もし以前に得たサンプルを方法で用いる場合、本方法の工程はヒト又は動物の体で実施されない。
【０１０５】
本発明による親和性培地は、本発明による融合タンパク質又はタンパク質構造を含んで与えられる。所定の実施態様にて、親和性培地は、本発明による融合タンパク質又はタンパク質構造を含有している。親和性培地は、本発明による融合タンパク質のＢ部分を用いて、有機ターゲットと選択的相互作用することができる。親和性培地は、親和性培地と有機ターゲット間の結合を達成するのに適した条件下でサンプルと接触される。結合しないサンプルは、親和性培地と有機ターゲット間の選択的結合を維持するのに適した条件下で除去される。本方法は親和性培地、特に本発明による融合タンパク質に固定化した有機ターゲットを生じる。
【０１０６】
本発明による好ましい方法にて、親和性培地中の融合タンパク質は、親和性培地と有機ターゲット間の結合を達成するために親和性培地とサンプルを接触させると、本発明によるタンパク質構造として存在する。
【０１０７】
この点において特に有用なタンパク質構造は、薄膜または繊維であり、Ｂ部分はブドウ球菌プロテインＡに由来するＺドメイン又はそれに対して少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも８０％の同一性、又は少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質断片であり、例えば実施例１−６を参照。薄膜は、固体構造、例えばマイクロタイタープレートのプラスチックへ付着するという点で有利である。薄膜のこの特性は、洗浄と再生手順を容易にし、分離の目的に非常に有用である。
【０１０８】
Ｚドメインのアルカリ安定性は、本発明によるタンパク質構造中で本発明による融合タンパク質の部分であるときに更に拡張することができることが驚くべきことに観察されている。この特性は洗浄及び再生目的に非常に有用であり得、例えば高濃度のＮａＯＨ、例えば０．１Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ又は１Ｍ以上、例えば２Ｍを許容し、及び／又は高濃度の尿素、例えば６〜８Ｍを許容する。この化学的安定性はまた、アフィニティー精製のためのＺドメインの使用の反復サイクルを可能にするために有用であり得る。このアルカリ安定性は、Ｚドメインの安定化変異体を利用することによって更に増加させることができる。更に、Ｚドメインを含む本発明による融合タンパク質は熱に安定であることが有利に示されている。このことは結合活性を維持して熱による滅菌を可能とする。
【０１０９】
Ｚドメインを含む従来の親和性マトリックスの既知の問題は、親和性マトリックスからのＺドメインの漏出である。ペプチド結合によるＺドメインの本発明の融合タンパク質への安定した導入のため、本発明のタンパク質構造からのＺドメインの望ましくない漏出は低いか又は存在しないことが考慮される。本発明による融合タンパク質の別の利点は、得られたタンパク質構造が高密度のＺドメイン（又は他のＢ部分）を有することである。この高密度が高い結合能を与えることが熟慮される。要するに、融合タンパク質のこれらの特性は様々なＢ部分に対して、特に生産に無駄のないタンパク質Ｚを用いる親和性精製に非常に魅力的である。またこれらの特性は、従来のゲルビーズアフィニティーカラム、例えば濾過様形式よりも他の形式において有用である。
【０１１０】
固定化有機ターゲットは第二の有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である。本方法は次いで、第一有機ターゲットと第二有機ターゲット間の選択的相互作用を達成するために適した条件下で、第一の有機ターゲットとの選択的相互作用を可能とする、前記親和性培地と固定化有機ターゲットを第二の有機ターゲットと接触させる工程を更に含む。
【０１１１】
固定化有機ターゲットは検出可能であるか及び／又は定量可能である。有機ターゲットの検出及び／又は定量化は、様々な生物学的又は非生物学的相互作用に基づくアッセイにおける結合試薬の検出及び／又は定量のための当業者に既知の任意の方法で達成され得る。有機ターゲットは様々なマーカーでそれ自身が標識され得るか、或いは、検出、可視化及び／又は定量化を可能にる２次標識親和性リガンドにより同様に検出され得る。これは、当業者に既知の多くの技術の任意の一以上を使用して、任意の過度の実験を包含せずに、有機ターゲット又は任意の２次親和性リガンドに結合され得る多数の標識の任意の一以上を用いて達成することができる。有機ターゲットおよび／または二次親和性リガンドに結合させることができる標識の非限定的な例は、蛍光色素または金属（例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、カミン）、発色色素（例えば、ロドプシン）、化学発光化合物（例えば、腔、イミダゾール）及び生物発光タンパク質（例えば、ルシフェリン、ルシフェラーゼ）、ハプテン（例えば、ビオチン）が挙げられる。様々な他の有用な蛍光剤と発色が、Stryer L (1968) Science 162:526-533 and Brand L and Gohlke JR (1972) Annu. Rev. Biochem. 41:843-868に記載されている。有機ターゲットおよび／または二次親和性リガンドはまた、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ラクタマーゼ）、放射性同位元素（例えば３Ｈ，１４Ｃ，３２Ｐ，３５Ｓ又は１２５Ｉ）及び粒子（例えば金）で標識することができる。本開示の関連において、「粒子」とは分子の標識に適した金属粒子などの粒子を指す。更に、親和性リガンドは、蛍光半導体ナノ結晶（量子ドット）で標識することができる。量子ドットは、優れた量子収率を有し、有機蛍光色素に比べて光安定であり、したがって、より容易に検出される(Chan et al. (2002) Curr Opi Biotech. 13: 40-46)。異なるタイプの標識が、様々な化学、例えばアミン反応又はチオール反応を用いて有機ターゲット又は２次親和性リガンドに結合することができる。しかし、アミンとチオール以外の他の反応基、例えば、アルデヒド、カルボン酸およびグルタミンを用いることができる。
【０１１２】
検出及び／又は定量化が２次有機ターゲット又は２次親和性リガンドへの曝露を含む場合には、親和性培地は非結合親和性リガンドを除去するためにバッファーでもう一度洗浄される。例として、２次親和性リガンドは抗体又は断片又はその誘導体であり得る。その後、有機ターゲットは従来の方法で検出及び／又は定量化することができる。２次親和性リガンドに対する結合特性は変わることがあるが、当業者は日常の実験による各々の決定について、操作的で最適なアッセイ条件を決定することができるべきである。
【０１１３】
標識分子の検出、局在化および／または定量は、例えば光学顕微鏡又は免疫蛍光顕微鏡などの可視化技術を含んでも良い。他の方法は、フローサイトメトリー又は発光測定を介した検出を含むことができる。標識の可視化の方法としては、限定されるものではないが、蛍光、発光測定および／または酵素的技術を含むことができる。蛍光は、特定の波長の光に蛍光標識を露光し、その後、特定の波長領域で放射された光を検出及び／又は定量化することによって検出及び／又は定量化される。発光タグ付けされた分子の存在は、化学反応の最中に生じた発光により検出及び／又は定量化され得る。酵素反応の検出は、化学反応から生じるサンプル中の色ずれによるものである。当業者は、様々な異なるプロトコルが適切な検出及び／又は定量化するために変更可能であることを認識している。
【０１１４】
有機ターゲットの検出及び／又は定量化のための一つの利用可能な方法は、それ或いは２次親和性リガンドを、後に酵素免疫測定法（例えば、ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡなど）で検出及び／又は定量化可能である酵素に結合させることによる。そうした技術は十分に確立されており、その実現には当業者に不当な困難を提示しない。そうした方法において、生物学的サンプルは、有機標的に結合する本発明に係るタンパク質構造と接触させられ、その後酵素的に標識された二次親和性リガンドで検出及び／又は定量化される。この後、適切な基質を適切な緩衝液中で酵素標識と反応させ化学的部分を生成し、それは例えば分光光度計、蛍光光度計、ルミノメーターを使用するか又は視覚的な手段により検出及び／又は定量化される。
【０１１５】
有機ターゲット又は二次親和性リガンドは、検出及び／又は定量化を可能にするために放射性同位体で標識することができる。本開示の適切な放射性標識の非限定的な例は、３Ｈ，１４Ｃ，３２Ｐ，３５Ｓ又は１２５Ｉである。標識した親和性リガンドの特異的活性は、放射性標識の半減期、同位体の純度、及びどのように標識が親和性リガンドに組み込まれているのかに依存する。親和性リガンドは、好ましくは、周知の技術を用いて標識される(Wensel TG and Meares CF (1983) in: Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy (Burchiel SW and Rhodes BA eds.) Elsevier, New York, pp 185-196)。このように放射性標識された親和性リガンドは、放射能の検出による有機ターゲットを視覚化するために使用することができる。放射性核種のスキャニングは、例えばガンマカメラ、磁気共鳴分光法、放射トモグラフィー、ガンマ／ベータカウンター、シンチレーションカウンター及びラジオグラフ（ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｅｓ）で行うことができる。
【０１１６】
従って、サンプルは、有機ターゲットの検出、分離及び／又は定量化のためのタンパク質構造に適用することができる。この手順は有機ターゲットの検出を可能にするだけでなく、その分布とその発現の相対的水準を更に示し得る。任意で、有機ターゲットは親和性培地から遊離され回収することができる。従って、本用途は有機ターゲットが固定化されている親和性培地上での親和性精製を含んでも良い。タンパク質構造は、カラム又はウェルプレート（例えば、９６ウェルプレートなど）中又は磁気ビーズ、アガロースビーズ又はセファロースビーズに例えば配置されても良い。更に、本用途は、例えばデキストランマトリックスを用いる水溶性マトリックス上でのタンパク質構造の使用、又は、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ機器などの表面プラズモン共鳴装置での使用を含んでも良く、その分析は、例えば固定化された有機ターゲット又は数多くの潜在的な親和性リガンド対する親和性をモニタリングすることを含んでもよい。
【０１１７】
本発明に係るタンパク質構造は、酸、塩基及びカオトロピック剤を含む様々な洗浄剤で洗浄し、再生することができる。特に有用な洗浄剤は、例えば、０．１、０．５、１ＭのＮａＯＨのよう水酸化ナトリウム又は例えば６−８Ｍ尿素などの尿素を含む。本発明に係るタンパク質構造は、驚くべきことに、化学処理及び／又は滅菌加熱処理に対して耐性であるため、本タンパク質構造の使用を伴う本発明による方法は、タンパク質構造の再生の最終工程を含み得る。本方法は、好ましくは、化学的処理及び／又は滅菌熱処理による親和性培地の再生の最終工程を含む。化学的処理は例えば、０．１、０．５、１ＭのＮａＯＨのよう水酸化ナトリウム又は例えば６−８Ｍ尿素などの尿素による処理を含む。
【０１１８】
本発明に係る融合タンパク質はまた、融合タンパク質を重合させ、例えば、薄膜、発泡体又は繊維などのタンパク質構造を形成することができるようにする前に、溶液中の有機ターゲットに結合させることができる。そのようなスピドロイン由来部分（例えばＲＥＰ−ＣＴ）及びＢ部分を組み込んだ対応する融合タンパク質は両方とも、夾雑タンパク質の存在下においてさえも、材料中に感知できるほどの夾雑物が取り込まれることなく、固体構造に重合し、その機能性（Ｂ）部位はそれらの期待される結合特性を保持する。従って、Ｂ部分の結合特性は周囲の溶液由来の化合物又は細胞を捕捉し、その捕捉された化合物又は細胞を本発明によるタンパク質構造の中に組み込むために用いることができる。
【０１１９】
従って、本発明による別の好ましい方法にて、親和性培地中の融合タンパク質は、親和性培地と有機ターゲット間の結合を達成するために親和性培地とサンプルを接触させると溶液中に存在する。有機ターゲットに結合した融合タンパク質の複合体は、その後、本発明による融合タンパク質を形成させられる。
【０１２０】
この方法は、その目的が、溶液から特定の分子や細胞を「取り出す」こと、例えば標的タンパク質が分泌されるときに、大規模な真核細胞生産系の培地から標的分子を得ることであるときに特に有用である。スピドロイン由来部分による標的分子の結合と固体構造の形成を生理学的条件下で行うことができるため、及びスピドロイン由来部分が細胞適合性（ｃｙｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）であるゆえ、本方法は、継続的な生産工程に対して繰り返し適用することができる。
【０１２１】
本発明によるタンパク質構造はまた細胞の分離、固定化、及び／又は培養に有用である。この点で特に有用なタンパク質構造は、薄膜、繊維又は発泡体である。例えば実施例１４と２３を参照。薄膜は、固体構造、例えばマイクロタイタープレートのプラスチックへ付着するという点で有利である。薄膜のこの特性は、洗浄と再生手順を容易にし、分離の目的に非常に有用である。
【０１２２】
従って、本発明は、細胞表面上に存在する有機ターゲットを有する細胞の培養のための細胞足場材料を提供する。細胞足場材料は、本発明に係るタンパク質構造を含んでいる。所定の実施態様にて、細胞足場材料は、本発明によるタンパク質構造からなる。
【０１２３】
本発明の融合タンパク質を含む、及び任意で該タンパク質からなるポリマーを含む細胞足場材料は、様々な異なる環境設定下で、細胞、好ましくは真核細胞のの培養のために有益な環境を提供することが本発明者らによって見いだされている。更に、この環境は、それ以外の場合には非常に難しい、実験室で培養するには非常に費用がかかるか又は不可能でさえある細胞の培養の確立及び、組織工学及び／又は移植に有用な材料を含有する細胞の樹立について可能としている。
【０１２４】
本発明はまた、細胞、好ましくは真核細胞と本発明による細胞足場材料の組み合わせを提供する。本発明によるそうした組み合わせは、様々な異なる形態において提示され得、かつ特定の状況の必要性に合わせて調整され得る。例えば、本発明の組み合わせは、損傷又は疾患組織での細胞の置換のための細胞含有移植片として有用であり得ることを意図している。
【０１２５】
細胞足場材料は、直接的または間接的に細胞を捕捉するために利用することができる。直接捕捉において、Ｂ部分は、細胞表面上に存在する有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である。あるいは、Ｂ部分は、中間体有機ターゲットと選択的相互作用が可能で、中間体有機ターゲットに結合し、その中間体有機ターゲットは、細胞表面上に存在する有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である。従って、間接的な捕捉において、細胞足場材料は、中間体有機ターゲットを更に含んでおり、Ｂ部分は、選択的相互作用が可能であり、該中間体有機ターゲットに結合される。中間体有機ターゲットは、同様に、細胞表面上に存在する有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である。
【０１２６】
本明細書に開示される細胞足場材料の一実施態様において、融合タンパク質は、さらに、オリゴペプチド細胞結合モチーフを含んでいる。特定の状況で特定の細胞の培養に関連して、オリゴペプチド細胞結合モチーフの存在は、細胞生存率を改善するか又は維持することが観察されており、クモ糸タンパク質の一部として、細胞足場材料へのそのようなモチーフの包含は更なる利点を提供すると考えられる。細胞結合モチーフは、少なくとも１つのペプチド結合を介して融合タンパク質の残りの部分に結合されたオリゴペプチドである。例えば、融合タンパク質の残りのＮ末端又はＣ末端、又はクモ糸タンパク質の残りの部分のアミノ酸配列内の任意の位置に結合され得る。オリゴペプチド細胞結合モチーフの選択に関して、当業者は、いくつかの選択肢を知っている。該オリゴペプチドは、例えば、ＲＧＤ、ＩＫＶＡＶ、ＹＩＧＳＲ、ＥＰＤＩＭ及びＮＫＤＩＬからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得る。ＲＧＤ、ＩＫＶＡＶ及びＹＩＧＳＲは、一般的な細胞結合モチーフであり、一方ＥＰＤＩＭとＮＫＤＩＬはケラチノサイトの栽培との関連で特に有用であるケラチノサイト固有のモチーフとして知られている。他の有用な細胞結合モチーフは、トロポエラスチンからのＧＲＫＲＫ、ＫＹＧＡＡＳＩＫＶＡＶＳＡＤＲ（ラミニン由来）、ＮＧＥＰＲＧＤＴＹＲＡＹ（骨シアロタンパク由来）、ＰＱＶＴＲＧＤＶＦＴＭＰ（ビトロネクチン由来）、およびＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳ（フィブロネクチン由来）を含む。クモ糸タンパク質の残りの部分へのオリゴペプチド細胞結合モチーフの結合は、標準的遺伝子工学又は化学結合技術を用いて当業者によって容易に達成される。従って、幾つかの実施態様において、細胞結合モチーフは、遺伝子工学、すなわち、融合タンパク質をコードする核酸と細胞結合モチーフとの間の遺伝子融合の一部を形成することを介して導入される。そうした実施態様のさらなる有益な特徴として、細胞結合モチーフは、細胞足場材料を構成するポリマー中で融合タンパク質の単量体に対して１：１の比率で存在するであろう。
【０１２７】
本明細書に記載の方法または組合せで使用される細胞足場材料中のポリマーは、様々な物理的形態をとることができ、特定の物理的形態の用途は、異なる特定の状況において更なる利点を供与することができる。例えば、本方法または組合せの実施態様において、細胞足場材料は、薄膜、発泡体、繊維及び繊維メッシュからなる群から選択される物理的形態である。
【０１２８】
従って、本発明は、細胞の固定化のための方法を提供する。サンプル、例えば関心のある含む細胞を含有する血液などの生体試料が提供される。生物学的サンプルは、前に得られた試料である場合がある。もし以前に得たサンプルを方法で用いる場合、本方法の工程はヒト又は動物の体で実施されない。
【０１２９】
サンプルは、細胞足場材料および目的の細胞の表面に存在する有機ターゲットとの間の選択的相互作用を可能にする適切な条件下で、本発明に係る細胞足場材料に対して適用される。細胞は、細胞表面の有機ターゲットと前記細胞足場材料との間の結合により、前記細胞足場材料に対して固定化される。結合しないサンプルは、細胞足場材料と有機ターゲット間の選択的結合を維持するのに適した条件下で除去される。本方法は細胞足場材料、特に本発明によるタンパク質の構造に固定化されるた有機ターゲットを提示する細胞を生じる。
【０１３０】
前述に定められたように、細胞足場材料は、直接的または間接的に細胞を捕捉するために利用することができる。直接捕捉において、Ｂ部分は、細胞表面上に存在する有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である。あるいは、Ｂ部分は、中間体有機ターゲットと選択的相互作用が可能で、中間体有機ターゲットに結合し、その中間体有機ターゲットは、細胞表面上に存在する有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である。従って、間接的な捕捉において、細胞足場材料は、中間体有機ターゲットを更に含んでおり、Ｂ部分は、選択的相互作用が可能であり、該中間体有機ターゲットに結合される。中間体有機ターゲットは、同様に、細胞表面上に存在する有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である。
【０１３１】
捕捉方法に関わらず、捕捉された細胞は、細胞足場材料から細胞捕獲に関与する部分を解放するために、融合タンパク質の切断により融合タンパク質から放出されてもよい。上述のように、融合タンパク質は、そのアミノ酸配列中に、関連部分、典型的にはＢ部分又は細胞結合モチーフの切断及び除去を可能にする、開裂部位を含み得る。様々な開裂部位が、例えば、化学試薬、例えばＣＮＢｒによるＭｅｔ残基の後ろの開裂部位、及びヒドロキシルアミンによるＡｓｎ−Ｇｌｙ残基間の開裂部位、トロンビン又はプロテアーゼ３Ｃなどのプロテアーゼの開裂部位、及びインテイン自己スプライシング配列などの自己スプライシング配列が、当業者に知られている。
【０１３２】
また、本発明は、細胞の培養の方法を提供する。目的の細胞は、上記に開示された方法を用いて細胞骨格材料に固定されている。細胞足場材料及び固定化細胞の組合せは、細胞培養に適した条件下で維持される。
【０１３３】
本発明の関連において、細胞の「培養」、「細胞培養」等の用語は、例えば、それらが、細胞が分裂及び／又は増殖した状況、細胞が、その自然環境に存在する場合、細胞型によって提示される少なくとも一つの機能特性を保持した分化状態に維持される状況、及び幹細胞が未分化状態で維持される状況を包含するように、広義に解釈されるべきである。
【０１３４】
本発明は、以下の非限定的実施例により、以下に更に説明されるであろう。
【実施例】
【０１３５】
実施例１  −  ＩｇＧ結合融合タンパク質のクローニング、発現および繊維形成
融合タンパク質の概念を証明するために、Ｒｅｐ４ＣＴタンパク質（４回の内部反復とＣＴ部分を持つＲＥＰ部分）がＺタンパク質ドメイン（Ｂ部分）との融合物で生成された。Ｚドメインは、ブドウ球菌タンパク質の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）結合ドメインＢの改変版であり、ＩｇＧの結晶化（Ｆｃ）領域断片に結合する５８アミノ酸長の三重らせんモチーフである。我々の目標は、Ｒｅｐ４ＣＴ（Ｈｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴを示す；配列番号１４）に融合したＺドメインからなる融合タンパク質から、例えば、繊維、薄膜および膜などの構造体を作成し、かつドメインＺのＩｇＧ結合能力、並びにＲｅｐ４ＣＴの特性を形成する構造をなお保持するすることが可能であるかどうかを探索することであった。そのために、Ｒｅｐ４ＣＴのＮ末端Ｚドメインからなる融合タンパク質をクローニングした。
【０１３６】
クローニング
Ｈｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ融合タンパク質（配列番号：１４−１５）をコードする遺伝子を以下のように構築した。プライマーは、そのようなＺ配列を含むベクターからドメインＺのＰＣＲ断片を生成するために設計された。また、プライマーはＺとＲｅｐ４ＣＴ間のプロテアーゼ３Ｃ切断（ＬＥＡＬＦＱＧＰ、ＱＧを示す）の認識部位を含んでいた。得られたＰＣＲ生成物は、その後、標的ベクター（カナマイシン耐性遺伝子を有するｐＴ７Ｈｉｓ６ＴｒｘＨｉｓ６ＱＧＲｅｐ４ＣＴを示す）のように、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで処理した。ターゲットベクターの制限切断に際し、ＴｒｘＨｉｓ６ＱＧ部分が切断された。切断されたＰＣＲ断片と目標ベクターを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて互いに連結し、そして、得られた正しく連結されたベクター（ｐＴ７Ｈｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ）は、カナマイシン（７０μｇの／ｍｌ）を補充した寒天プレート上に増殖させた化学形質転換受容性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換された。コロニーをその後採取し、正しい挿入のためにＰＣＲ検査をし、その後、標的ベクター中にＺＱＧが挿入されたＤＮＡ配列を確認するために配列決定した。
【０１３７】
産生
ｐＴ７Ｈｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴベクターを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、カナマイシン（７０μｇの／ｍｌ）を補充したルリア−ベルターニ培地（全６リットル）で、３０℃で１−１．５のＯＤ６００値まで増殖させ、次に、３００μＭのＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）でＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ発現を誘導し、約２時間、２０℃でさらにインキュベートした。次に、細胞を４７００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により回収し、得られた細胞ペレットを、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中に溶解した。
【０１３８】
精製
２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中に溶解させた細胞ペレットは、細菌細胞を溶解するために、リゾチームおよびＤＮアーゼＩが補充され、細胞溶解物を３０分間１５０００回転の遠心後に回収した。次に、回収した細胞溶解物を分割し、合計４つのキレートセファロースファーストフローＺｎ２＋カラムにロードし、Ｈｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ蛋白質がＨｉｓ６をタグを介してカラムマトリックスに結合するように保った。洗浄後、結合したタンパク質を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／３００ｍＭイミダゾール（ｐＨ８．０）で溶出した。プールされた溶出画分は、Ａ２８０の測定によると２７ｍｇのＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴタンパク質が含まれていた。次に、プールされた溶出液を２等分し（各１３．５ｍｇのＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ）、最初の半分は、一晩２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）の５リットルに対して透析し、１．０７ｍｇ／ｍｌに濃縮され、最終的に繊維を形成させた。図３は、巨視的Ｈｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ繊維を示す。この融合タンパク質（配列番号１４）からの繊維の形成は、Ｚドメイン（Ｂ部分）がＲｅｐ４ＣＴ（ＲＥＰとＣＴ部分）の繊維成形特性と干渉しないことを示している。プロテアーゼ３Ｃによる切断の前にＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴタンパク質の量は、透析および濃縮後に１０ｍｇであった（図４）。
【０１３９】
溶出プールの２番目の半分は１．３４ｍｇのプロテアーゼ３Ｃで切断し、１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を補充し、Ｒｅｐ４ＣＴからＨｉｓ６Ｚを分離した。切断は、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）に対する透析で一晩実施し、この後、タンパク質溶液を、ニッケル−ＮＴＡアガロースカラムを通過させ、Ｒｅｐ４ＣＴを含有する画分を通過する流量は回収され、０．７９ｍｇ／ｍｌに濃縮され、繊維を形成させた。切断後のＲｅｐ４ＣＴの最終量は６ｍｇであった（図４）。
【０１４０】
図４は融合タンパク質Ｈｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ（配列番号１４）と続くプロテアーゼ３Ｃ切断生成物のＲｅｐ４ＣＴ（配列番号１４の残基８１から３３９）の精製からのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。ゲルは以下の順番でロードされた。
（１）Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ
（２）細胞溶解物
（３）キレートセファロースファーストフローＺｎ２＋カラムにロードした細胞溶解物からからのフロー
（４）キレートセファロースファーストフローＺｎ２＋カラムからのＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴの溶出プール
（５）プロテアーゼ３Ｃで切断されたＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ
（６）Ｎｉ−ＮＴＡアガロースカラムにロードされた切断されたＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴのフロースルー
（７）２０ｍＭのＴｒｉｓ／５００ｍＭイミダゾール（ｐＨ８．０）を５ｍｌによるＮｉ−ＮＴＡアガロースカラムの再生。
Ｈｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ３ＣＴ、Ｈｉｓ６Ｚ、Ｒｅｐ４ＣＴ及びプロテアーゼ３Ｃの分子量はそれぞれ３２ｋＤａ、９ｋＤａ、２３ｋＤａ、３０ｋＤａである。
【０１４１】
Ｒｅｐ４ＣＴが別のタンパク質、即ちＩｇＧに対する結合親和性を有する５８アミノ酸長のＺドメインに融合されているが、Ｈｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ（配列番号１４）の巨視的な繊維を得ることができたという事実は、Ｚドメイン（配列番号１４の残基１３−７０）に融合しているにもかかわらず、Ｒｅｐ４ＣＴがなおその繊維形成特性を保持していることを示している。さらに融合タンパク質のＺドメインはＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴに対する良好な溶解性を与えるように思われる。
【０１４２】
実施例２  −  融合蛋白質繊維へのビオチン化ＩｇＧの結合
融合タンパク質の概念を更に証明するために、融合タンパク質構造におけるＢ部分が有機ターゲットと選択的に相互作用の能力を保持しているかどうかを研究した。この研究では、融合タンパク質Ｈｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ（配列番号１４）の繊維のＺドメイン（Ｂ部分）のＩｇＧに対する結合能力を評価した。ビオチン化ウサギＩｇＧの溶液を、Ｈｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ繊維とともにインキュベートし、この後、同じ繊維をストレプトアビジン官能化ビーズとともに溶液中でインキュベートし、続いてその繊維を光学顕微鏡で可視化した。ウサギで作成されたＩｇＧを用いる選択は、ウサギ由来のＩｇＧがＺドメインに非常に強い親和性で結合するという事実に頼っている。
【０１４３】
実施例１に記載したように調製した約５０ｍｍ長のＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ繊維を、１×ＰＢＳ／０．５％ウシ血清アルブミンを５０μｌ、及びウサギ（抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、マウス吸着、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ）で産生された０．５ｍｇ／ｍｌのビオチン化ＩｇＧを１０μｌ含有する結合溶液中に浸漬し、軽く振とうしながら室温で７５分間インキュベートした。上清を捨てて、繊維を６０μｌの１×ＰＢＳ／０．０７％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。次に、繊維を１×ＰＢＳ／０．５％ウシ血清アルブミンを４０μｌと１０ｍｇ／ｍｌのダイナビーズＭ−２８０ストレプトアビジン（Ｄｙｎａｌ ＡＳ）を２０μｌ含む溶液に浸漬し、再び軽く振とうしながら室温で７５分間インキュベートした。上清を捨てて、繊維を６０μｌの１×ＰＢＳ／０．０７％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。
【０１４４】
繊維に対するダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）の非特異的結合の指標を得るべく、他のＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ繊維を、ビオチン化ＩｇＧとの事前のインキュベーションなしで、上述したようにダイナビーズ溶液にのみ浸漬した。Ｈｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴについて上述したのと同じ手順をＲｅｐ４ＣＴタイプの繊維と行い、すべての繊維を固定した５００倍の倍率によりＵＳＢ顕微鏡で可視化した。
【０１４５】
図５は、ビオチン化ウサギＩｇＧ、その後のストレプトアビジン官能ダイナビーズの結合後のＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ及びＲｅｐ４ＣＴ繊維の可視化である。パネル（Ａ、Ｂ）は、最初にビオチン化ＩｇＧ抗体（ウサギで生産）とインキュベートし、続いてダイナビーズＭ−２８０ストレプトアビジン（φ２．８μｍ）とインキュベーションしたＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ繊維の、繊維に沿った異なる位置で撮影された２つの代表的な写真を示す。パネル（Ｃ、Ｄ）は、事前にＩｇＧとインキュベーションすることなく、ダイナビーズＭ−２８０ストレプトアビジン溶液に浸漬されただけの別のＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ繊維の２つの代表的な写真を示す。Ｒｅｐ４ＣＴ繊維の対応する写真は、パネル（Ｅ、Ｆ）及び（Ｇ、Ｈ）にそれぞれ示されている。すべての写真は、ＵＳＢ顕微鏡で固定した５００倍の倍率で撮影し、ダイナビーズは暗い灰色の点として写真に現れている。
【０１４６】
図５において、これらの写真の両方ともビオチン化ＩｇＧにさらされ、続いてストレプトアビジン官能ダイナビーズにさらされたＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ繊維を示しており、ダイナビーズは、パネルのＡとＢにおいてほとんど唯一見られているように思われる。この結果は、融合タンパク質中のＺドメインのかなりの割合は、繊維形成後Ｈｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴでのＩｇＧ結合能を保持していることを意味する。
【０１４７】
実施例３  −  融合タンパク質繊維と薄膜に対する純粋な血清ＩｇＧの結合
有機ターゲットとの選択的相互作用の融合タンパク質構造におけるＢ部分の能力を更に探索するために、融合タンパク質Ｈｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ（配列番号１４）のＺドメインのＩｇＧに結合する能力を試験した。この融合タンパク質の繊維と薄膜を精製したＩｇＧ及び血清からのＩｇＧの結合について用い、その後溶出し続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ここでＩｇＧは非還元条件下で〜１４６ｋＤａとして現れている。血清は、血液凝固後の残液相であり、血清の２つの主な成分は、アルブミンおよびＩｇＧである。ウサギ血清においては、例えば、ＩｇＧの濃度は５−１０ｍｇ／ｍｌであり、アルブミンのそれはもっと高い。精製ＩｇＧ及び血清は両方ともウサギ起源のものであった。
【０１４８】
Ｈｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４Ｃの薄膜は、２４ウェル組織培養プレートの各ウェルの底部で、タンパク質溶液１００μｌ（０．９６ｍｇ／ｍｌ）を室温で一晩空気乾燥することにより調製した。鋳造された薄膜は、その後１８日間＋４℃で保存し、２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）に浸漬させて「Ｔ薄膜」と称したか、又は液体に浸漬させずに「Ａ薄膜」と称した。図６は、親水性の２４ウェル組織培養プレートのウェルの底で鋳造されたＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ薄膜の一部を示す。画像をとるために、倒立光学顕微鏡を２倍の倍率で用いた。実施例１に記載したように融合タンパク質の繊維を製造し、使用するまで４℃で２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中に保存した。
【０１４９】
二つの平行する実験のセットアップを行った。最初のセットアップでは、Ｈｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴで作られたＴ薄膜、Ａ薄膜、及び繊維の三つぞろいは、５０μｇの／ｍｌの精製ウサギＩｇＧ（プールされたウサギ血清から精製、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）の５００μｌの中に軽く振とうしながら室温で１時間、浸漬した。別のセットアップでは、Ｈｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴの薄膜と繊維の同じタイプの三つぞろいは、かわりに加熱で不活性化し遠心したウサギ血清（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）の５回希釈の５００μｌに、同様に穏やかに振とうしながら室温で１時間浸漬した。上清は全ての繊維および薄膜から廃棄され、５００μｌの２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）中で３回洗浄した。精製したＩｇＧ又は血清に由来する結合したＩｇＧを、０．５Ｍの酢酸／１Ｍの尿素／１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ２．７）の５００μｌ中で３０分間のインキュベーションにより溶出した。Ｈｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ繊維とＡ薄膜について上述したのと同じ手順を、コントロールとしてＨｉｓ６ＴｒｘＨｉｓ６ＱＧＲｅｐ４ＣＴ及びＲｅｐ４ＣＴの薄膜と繊維についても実施した。溶出した画分を、非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図７−９）。
【０１５０】
図７は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。溶出画分は、次のようにレーンにロードされた：
（１−３）ウサギＩｇＧとインキュベートしたＨｉｓ６ＴｒｘＨｉｓ６ＱＧＲｅｐ４ＣＴ，  Ａ薄膜。
（４−６）ウサギ血清とインキュベートしたＨｉｓ６ＴｒｘＨｉｓ６ＱＧＲｅｐ４ＣＴ，Ａ薄膜。
（７−８）ウサギＩｇＧとインキュベートしたＨｉｓ６ＴｒｘＨｉｓ６ＱＧＲｅｐ４ＣＴ，繊維。
（９）Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ
（１０−１１）ウサギ血清とインキュベートしたＨｉｓ６ＴｒｘＨｉｓ６ＱＧＲｅｐ４ＣＴ，繊維。
（１２−１４）ウサギＩｇＧとインキュベートしたＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ，Ｔ薄膜。
（１５−１７）ウサギ血清とインキュベートしたＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ，Ｔ薄膜。
【０１５１】
図８は、別の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。溶出画分は以下に従ってロードされた：
（１−３）ウサギＩｇＧとインキュベートしたＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ，Ａ薄膜。
（４−６）ウサギ血清とインキュベートしたＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ，Ａ薄膜。
（７−９）ウサギＩｇＧとインキュベートしたＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ，繊維。
（１０）Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ
（１１−１３）ウサギ血清とインキュベートしたＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ，繊維。
（１４−１６）ウサギＩｇＧとインキュベートしたＲｅｐ４ＣＴ，Ａ薄膜。
【０１５２】
図９は、追加の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。溶出画分は以下に従ってロードされた：
（１−３）ウサギ血清とインキュベートしたＲｅｐ４ＣＴ，Ａ薄膜。
（４−６）ウサギＩｇＧとインキュベートしたＲｅｐ４ＣＴ，繊維。
（７）Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ
（８−１０）ウサギ血清とインキュベートしたＲｅｐ４ＣＴ，繊維。
（１１）インキュベーションに用いられた精製されたウサギＩｇＧ（５０μｇ／ｍｌ）。
（１２）インキュベーションに用いられたウサギ血清（１：５０希釈）。
【０１５３】
図７−９の結果は、全ての種類のＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴマトリックス、即ち薄膜（Ａ型とＴ型の両方）と繊維は、Ｚドメインを介して（精製されたか又は血清由来の）ＩｇＧに結合する能力を持っていることを示している。さらに、ウサギ血清に曝されたＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴマトリクスは、ＩｇＧ以外では血清画分の他の何にも結合していないように見える。用いた他の２つのタンパク質変異体のマトリックス（即ちＨｉｓ６ＴｒｘＨｉｓ６ＱＧＲｅｐ４ＣＴ及びＲｅｐ４ＣＴ）は、血清に曝されたＲｅｐ４ＣＴの繊維を除いて、何かに結合するようには全くみえず、ＩｇＧ（〜１４６ｋＤａ）及びアルブミン（〜７０ｋＤａ）の領域内に弱いバンドを示している。融合タンパク質Ｈｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ（配列番号１４）内のＺドメインのＩｇＧ結合能力を評価するこのアプローチは、Ｚドメインが融合タンパク質の繊維および薄膜の両方のバージョンで活性であることを強く示している。ＩｇＧ以外のウサギ血清の他の画分ではＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴに対する結合は観察されていない。
【０１５４】
実施例４  −  融合タンパク質繊維と薄膜に対する純粋な血清ＩｇＧの結合の再現性
融合タンパク質Ｈｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ（配列番号１４）の薄膜及び繊維に対するＩｇＧ結合の再現性を探求するため、実施例３における実験を再度実施した。実施例３で用いられたＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ，Ｈｉｓ６ＴｒｘＨｉｓ６ＱＧＲｅｐ４ＣＴ及びＲｅｐ４ＣＴと同じ繊維と薄膜を再び使用した。全ての繊維と薄膜の材料は、前回の実験が実施された後で、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）に４℃で７０日間浸漬させた。実験は実施例３に記載のように行った。溶出した画分を、非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図１０−１２）。
【０１５５】
図１０は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。溶出画分は以下に従ってロードされた：
（１−３）ウサギＩｇＧとインキュベートしたＨｉｓ６ＴｒｘＨｉｓ６ＱＧＲｅｐ４ＣＴ，  Ａ薄膜。
（４−６）ウサギ血清とインキュベートしたＨｉｓ６ＴｒｘＨｉｓ６ＱＧＲｅｐ４ＣＴ，Ａ薄膜。
（７−８）ウサギＩｇＧとインキュベートしたＨｉｓ６ＴｒｘＨｉｓ６ＱＧＲｅｐ４ＣＴ，  繊維。
（９）Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ
（１０−１１）ウサギ血清とインキュベートしたＨｉｓ６ＴｒｘＨｉｓ６ＱＧＲｅｐ４ＣＴ，繊維。
（１２−１４）ウサギＩｇＧとインキュベートしたＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ，Ｔ薄膜。
（１５−１７）ウサギ血清とインキュベートしたＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ，Ｔ薄膜。
【０１５６】
図１１は、別の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。溶出画分は以下に従ってロードされた：
（１−３）ウサギＩｇＧとインキュベートしたＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ，Ａ薄膜。
（４−６）ウサギ血清とインキュベートしたＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ，Ａ薄膜。
（７−９）ウサギＩｇＧとインキュベートしたＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ，繊維。
（１０）Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ
（１１−１３）ウサギ血清とインキュベートしたＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ，繊維。
（１４−１６）ウサギＩｇＧとインキュベートしたＲｅｐ４ＣＴ，Ａ薄膜。
【０１５７】
図１２は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。溶出画分は以下に従ってロードされた：
（１−３）ウサギ血清とインキュベートしたＲｅｐ４ＣＴ，タイプＡの薄膜。
（４−６）ウサギＩｇＧとインキュベートしたＲｅｐ４ＣＴ，繊維。
（７）Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ
（８−１０）ウサギ血清とインキュベートしたＲｅｐ４ＣＴ，繊維。
（１１）空のウエル。
（１２）インキュベーションに用いられた精製されたウサギＩｇＧ（５０μｇ／ｍｌ）。
（１３）インキュベーションに用いられたウサギ血清（１：５０希釈）。
【０１５８】
全３つのタンパク質マトリックスのＩｇＧ結合パターン（即ち、Ｈｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ，Ｈｉｓ６ＴｒｘＨｉｓ６ＱＧＲｅｐ４ＣＴ及びＲｅｐ４ＣＴ）は実施例３で観察されたものに対応するが、アルブミン（〜７０ｋＤａ）に対応するやや弱いバンドがウサギ血清でインキュベートしたＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ繊維について見られた。この最初のＩｇＧ結合再現性試験は、Ｈｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴの繊維および薄膜の両方とも、精製及び血清ＩｇＧの結合と溶出について少なくとも２回用いることができることを示している。再現性の更なる試験は実施例１９で報告される。
【０１５９】
実施例５  −  融合タンパク質マトリックス及び市販のプロテインＡマトリックスに対するＩｇＧ結合
Ｈｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ融合タンパク質構造のＩｇＧ結合能は、市販で入手可能なプロテインＡマトリックスと比較して評価した（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。Ｈｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ（配列番号１４）の繊維および膜をスピンカラム内部に調製した。プロテインＡマトリックスはまた、マトリックスに結合したプロテインＡ分子の総数がＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ薄膜内のＺ分子の総数に等しくなるようにスピンカラムに添加された。Ｈｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴの薄膜と繊維、並びにプロテインＡマトリックスに対する精製ＩｇＧと血清由来ＩｇＧの結合を生じさせ、その後溶出し、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【０１６０】
Ｈｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴの薄膜はスピンカラム内部のポリエチレンフリットの下部で、１００μｌのタンパク質溶液（１．０５ｍｇ／ｍｌ）を室温で３日間空気乾燥することにより調製し、薄膜あたり総計３×１０−９モルのＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴを与えた。また、Ｈｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴの繊維を、同じタイプのスピンカラムの内側のフリット上に配置した。同じ手順を、Ｒｅｐ４ＣＴの薄膜と繊維に対して実施し、ここでは薄膜は膜あたり総計４×１０−９モルのＲｅｐ４ＣＴを含有していた。市販のプロテインＡマトリックスに対しては、３×１０−９モルのプロテインＡに対応する排液マトリックス体積がスピンカラムごとにフリットに移され、そのマトリックスは１×５００μｌプラス２×１５０μｌの脱イオン水を用いて、１．５分間の４００ｒｃｆでのスピンカラムの遠心分離により洗浄した。
【０１６１】
二つの平行実験のセットアップが、Ｈｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ及びＲｅｐ４ＣＴの繊維と薄膜について、並びにプロテインＡマトリックスで実施された。第一のセットアップにおいて、すべての３つの異なるマトリックスの重複を５０μｇ／ｍｌの精製ＩｇＧ（ウサギ血清から精製ＩｇＧ、Ｓｉｇｍａ）の５００μｌに室温で１時間浸漬させた。他のセットアップにおいて、すべての３つの異なるマトリックスの重複はそのかわりに遠心分離したウサギ血清（正常ウサギ血清、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の５倍希釈の５００μｌ中にやはり室温で１時間浸漬させた。
【０１６２】
上清は単純なペッティングにより全ての繊維と薄膜から捨てられ、プロテインＡマトリックスに対しては遠心分離（４００ｒｃｆ、１．５分）により捨てられ、その後５００μｌの２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）で３回洗浄した。精製したＩｇＧ又は血清に由来する結合したＩｇＧを、０．５Ｍの酢酸／１Ｍの尿素／１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ２．７）の５００μｌ中で３０分間のインキュベーションにより溶出した。溶出画分を非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し（図１３−１５）、実行１からきたものとして示す。溶出後直ちに、全マトリックスを３×５００μｌの２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）で洗浄し、その後、ＩｇＧ結合の再現性を評価するために説明した実験をもう一回繰り返した。反復実験からの溶出画分を実行２からきたものとして示す。記：非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件下で、ＩｇＧの分子量は１４６ｋＤａ程度である。
【０１６３】
図１３は、実行１からの溶出画分の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示し、以下に従ってロードされた：
（１）インキュベーションに用いられた精製されたウサギＩｇＧ（５０μｇ／ｍｌ）。
（２）インキュベーションに用いられたウサギ血清（１：５０希釈）。
（３−４）ウサギＩｇＧとインキュベートしたＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ，薄膜。
（５−６）ウサギ血清とインキュベートしたＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ，薄膜。
（７−８）ウサギＩｇＧとインキュベートしたＲｅｐ４ＣＴ，薄膜。
（９）Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ
（１０−１１）ウサギ血清とインキュベートしたＲｅｐ４ＣＴ，薄膜。
（１２−１３）ウサギＩｇＧとインキュベートしたプロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂマトリックス。
（１４−１５）ウサギ血清とインキュベートしたプロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂマトリックス。
（１６−１７）ウサギＩｇＧとインキュベートしたＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ，繊維。
【０１６４】
図１４は、実行１及び実行２の両方からの溶出画分の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示し、以下に従ってロードされた：
（１−２）ウサギ血清とインキュベートしたＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ，繊維、実行１。
（３−４）ウサギＩｇＧとインキュベートしたＲｅｐ４ＣＴ，繊維の重複、実行１。
（５−６）ウサギ血清とインキュベートしたＲｅｐ４ＣＴ，繊維の重複、実行１。
（７）Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ
（８）インキュベーションに用いられた精製されたウサギＩｇＧ（５０μｇ／ｍｌ）。
（９）インキュベーションに用いられたウサギ血清（１：５０希釈）。
（１０−１１）ウサギＩｇＧとインキュベートしたＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ，薄膜、実行２。
（１２−１３）ウサギ血清とインキュベートしたＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ，薄膜、実行２。
（１４−１５）ウサギＩｇＧとインキュベートしたＲｅｐ４ＣＴ，薄膜、実行２。
（１６−１７）ウサギ血清とインキュベートしたＲｅｐ４ＣＴ，薄膜、実行２。
【０１６５】
図１５は、溶出画分の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示し、全ては実行２からきたもので、以下に従ってロードされた：
（１−２）ウサギＩｇＧとインキュベートしたプロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂマトリックス。
（３−４）ウサギ血清とインキュベートしたプロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂマトリックス。
（５−６）ウサギＩｇＧとインキュベートしたＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ，繊維。
（７）Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ
（８−９）ウサギ血清とインキュベートしたＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ，繊維。
（１０−１１）ウサギＩｇＧとインキュベートしたＲｅｐ４ＣＴ，繊維。
（１２−１３）ウサギ血清とインキュベートしたＲｅｐ４ＣＴ，繊維。
【０１６６】
図１３−１５の結果は、マトリクスは選択的に血清からのＩｇＧを結合することを示している。全タイプのＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴマトリックス、例えば薄膜と繊維のＩｇＧ結合能は市販のプロテインＡマトリックスと同じ範囲にある。市販のプロテインＡマトリックスと老幼に、融合タンパク質の構造は結合能を維持することで再生可能である。
【０１６７】
実施例６  −  融合タンパク質マトリックス及び市販のプロテインＡマトリックスの定置洗浄（Ｃｌｅａｎｉｎｇ Ｉｎ Ｐｌａｃｅ）（ＣＩＰ）
沈殿または変性した物質が、溶出後に、Ｈｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ（配列番号１４）及びＲｅｐ４ＣＴからなるタンパク質の構造と市販のプロテインＡマトリックス（プロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に付着したままであるかどうかを評価するために、８Ｍの尿素による定置洗浄（ＣＩＰ）が、実施例４−５の実験で使用されたウサギ血清に曝された全てのマトリックスに対して実施された。
【０１６８】
実施例４と実施例５からのＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴとＲｅｐ４ＣＴからなる繊維と薄膜、及び実施例５からの市販のプロテインＡマトリックスは、全て以前にウサギ血清に対して曝されており、上清の除去の前に８Ｍの尿素の２００μｌに室温で２０分間浸し、続いて非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥの尿素画分が分析された（図１６−１７）。
【０１６９】
図１６は、ウサギ血清に２回曝されたマトリックスの８Ｍの尿素による定置洗浄からの非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。ゲルは以下に従ってロードされた：
（１）ウサギ血清（１：５０希釈）。
（２）空のウエル。
（３−５）実施例４からのＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ，Ｔ薄膜。
（６−８）実施例４からのＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ，Ａ薄膜。
（９）Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ
（１０−１２）実施例４からのＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ，薄膜。
（１３−１５）実施例４からのＲｅｐ４ＣＴ，Ａ薄膜。
（１６−１５）実施例４からのＲｅｐ４ＣＴ，繊維。
（１７）空のウエル。
【０１７０】
図１７は、ウサギ血清に２回曝されたマトリックスの８Ｍの尿素による定置洗浄からの２回目の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。ゲルは以下に従ってロードされた：
（１）ウサギ血清（１：５０希釈）。
（２）空のウエル。
（３−４）実施例４からのＲｅｐ４ＣＴ，繊維。
（５−６）実施例５からのＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ，薄膜。
（７）実施例５からのＲｅｐ４ＣＴ，薄膜。
（８）Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ
（９）実施例５からのＲｅｐ４ＣＴ，薄膜。
（１０−１１）実施例５からのＨｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ，繊維。
（１２−１３）実施例５からのＲｅｐ４ＣＴ，繊維。
（１４−１５）実施例５からのプロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂマトリックス。
（１６−１７）空のウエル。
【０１７１】
図１６−１７の結果は、ほんの少量の沈殿又は変性物質が、溶出又は洗浄後の融合タンパク質の構造に付着したままであることを示している。特に、ほんの少量の沈殿又は変性物質が、市販のプロテインＡマトリックスと同じ範囲で、Ｈｉｓ６ＺＱＧＲｅｐ４ＣＴ融合タンパク質の薄膜に付着したままである。
【０１７２】
実施例７  −  アルブミン結合融合タンパク質のクローニング、発現および繊維形成
融合タンパク質の概念を更に証明するために、Ｒｅｐ４ＣＴが連鎖球菌プロテインＧ由来のアルブミン結合ドメイン（Ａｂｄ）との融合で生成された。Ａｂｄはアルブミンと結合する５ｋＤａの三重らせんモチーフである。そのために、Ｒｅｐ４ＣＴのＮ末端のＡｂｄドメイン（Ｈｉｓ６ＡｂｄＱＧＲｅｐ４ＣＴと称す）からなる融合タンパク質をクローニングした（配列番号１６−１７）。
【０１７３】
クローニング
プライマーは、そのような配列を含むベクターからＡｂｄのＰＣＲ断片を生成するために設計された。また、プライマーはＡｂｄとＲｅｐ４ＣＴ間にＧＱと表されるプロテアーゼ３Ｃ切断部位を含んでいた。得られたＰＣＲ生成物は、標的ベクターと同様に、その後制限エンドヌクレアーゼ ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで処理しされ、（カナマイシン耐性遺伝子を有する）ｐＴ７Ｈｉｓ６ＴｒｘＨｉｓ６ＱＧＲｅｐ４ＣＴを示した。ターゲットベクターの制限切断に際し、ＴｒｘＨｉｓ６ＱＧ部分が切断された。切断されたＰＣＲ断片と目標ベクターを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて互いに連結し、そして、得られた正しく連結されたベクター（ｐＴ７Ｈｉｓ６ＡｂｄＱＧＲｅｐ４ＣＴ）は、カナマイシンを補充した寒天プレート上に増殖させた化学形質転換受容性Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換された。コロニーをその後採取し、正しい挿入のためにＰＣＲ検査をし、その後また配列決定した。
【０１７４】
産生
ｐＴ７Ｈｉｓ６ＡｂｄＱＧＲｅｐ４ＣＴベクターを有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、カナマイシンを補充したルリア−ベルターニ培地（全６リットル）で、３０℃で１−１．５のＯＤ６００値まで増殖させ、次に、ＩＰＴＧでＨｉｓ６ＡｂｄＱＧＲｅｐ４ＣＴ発現を誘導し、約２時間、２０℃でさらにインキュベートした。次に、細胞を遠心分離により回収し、得られた細胞ペレットを、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中に溶解した。
【０１７５】
精製
２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中に溶解した細胞ペレットに、細菌細胞を完全に溶解するためにリゾチームとＤＮａｓｅＩを補充し、１５０００ｒｐｍでの遠心分離後に上清を回収した。次に、回収した上清をニッケルＩＭＡＣカラムまたはキレートセファロースファストフローＺＮカラムにロードし、Ｈｉｓ６タグを介してＨｉｓ６ＡｂｄＱＧＲｅｐ４ＣＴタンパク質がマトリックスに結合するように保った。洗浄後、結合したタンパク質を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／３００ｍＭイミダゾール（ｐＨ８．０）で溶出した。Ｈｉｓ６ＡｂｄＱＧＲｅｐ４ＣＴ（配列番号１６）を含有するプールされた溶出画分を２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）の５リットルに対して透析し、濃縮し、４ｍｇの最終量のタンパク質が得られた。
【０１７６】
繊維と薄膜の形成
精製された、可溶性Ａｂｄ−Ｒｅｐ４ＣＴタンパク質から、繊維と薄膜の両方とも０．８７ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で首尾良く作成された。
【０１７７】
Ｒｅｐ４ＣＴは別のタンパク質、つまりアルブミン結合ドメイン（Ａｂｄ）に融合していたもののＡｂｄ−Ｒｅｐ４ＣＴの巨視的な繊維と薄膜が得られたという事実は、Ａｂｄドメインに融合しているにも関わらず、Ｒｅｐ４ＣＴはその繊維形成特性を保持することを実証している。次に、本目的は、ＡｂｄドメインはＲｅｐ４ＣＴに融合したときにそのアルブミン結合能を保持していたかどうかを明らかにすることであった。実施例２４と２５を参照。
【０１７８】
実施例８  −  ＩｇＧ結合融合タンパク質のクローニング、発現および繊維形成
融合タンパク質の概念を更に証明するために、Ｒｅｐ４ＣＴは連鎖球菌プロテインＧからのＩｇＧ結合ドメインＣ２との融合で生産された。Ｃ２は、５５個のアミノ酸を含み、その構造は、シートの一方の面を横切って横たわっているα−ヘリックスを有する４本鎖の混合逆平行／平行β−シートを形成するために結合している２つのβ−ヘアピンで構成されている。そのために、Ｒｅｐ４ＣＴのＮ末端のＣ２ドメイン（Ｈｉｓ６Ｃ２ＱＧＲｅｐ４ＣＴと称す）からなる融合タンパク質をクローニングした（配列番号１８−１９）。
【０１７９】
クローニング
プライマーは、そのような配列を含むベクターからＣ２のＰＣＲ断片を生成するために設計された。また、プライマーはＣ２とＲｅｐ４ＣＴ間にＧＱと表されるプロテアーゼ３Ｃ切断部位を含んでいた。得られたＰＣＲ生成物は、標的ベクターと同様に、その後制限エンドヌクレアーゼ ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで処理しされ、（カナマイシン耐性遺伝子を有する）ｐＴ７Ｈｉｓ６ＴｒｘＨｉｓ６ＱＧＲｅｐ４ＣＴを示した。ターゲットベクターの制限切断に際し、ＴｒｘＨｉｓ６ＱＧ部分が切断された。切断されたＰＣＲ断片と目標ベクターを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて互いに連結し、そして、得られた正しく連結されたベクター（ｐＴ７Ｈｉｓ６Ｃ２ＱＧＲｅｐ４ＣＴ）は、カナマイシンを補充した寒天プレート上に増殖させた化学形質転換受容性Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換された。コロニーをその後採取し、正しい挿入のためにＰＣＲ検査をし、その後また配列決定した。
【０１８０】
産生
ｐＴ７Ｈｉｓ６Ｃ２ＱＧＲｅｐ４ＣＴベクターを有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、カナマイシンを補充したルリア−ベルターニ培地（全６リットル）で、３０℃で１−１．５のＯＤ６００値まで増殖させ、次に、ＩＰＴＧでＨｉｓ６Ｃ２ＱＧＲｅｐ４ＣＴ発現を誘導し、約２時間、２０℃でさらにインキュベートした。次に、細胞を遠心分離により回収し、得られた細胞ペレットを、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中に溶解した。
【０１８１】
精製
２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中に溶解した細胞ペレットに、細菌細胞を完全に溶解するためにリゾチームとＤＮａｓｅＩを補充し、１５０００ｒｐｍでの遠心分離後に上清を回収した。次に、回収した上清をニッケルＩＭＡＣカラムにロードし、Ｈｉｓ６タグを介してＨｉｓ６Ｃ２ＱＧＲｅｐ４ＣＴタンパク質がマトリックスに結合するように保った。洗浄後、結合したタンパク質を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／３００ｍＭイミダゾール（ｐＨ８．０）で溶出した。Ｈｉｓ６Ｃ２ＱＧＲｅｐ４ＣＴを含有するプールされた溶出画分を２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）の５リットルに対して透析し、濃縮し、６ｍｇの最終量のタンパク質が得られた。
【０１８２】
繊維と薄膜の形成
精製された、可溶性Ｃ２−Ｒｅｐ４ＣＴタンパク質から、繊維と薄膜の両方とも０．８７ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で首尾良く作成された。Ｒｅｐ４ＣＴは別のタンパク質、つまりＩｇＧ結合ドメインＣ２に融合していたもののＣ２−Ｒｅｐ４ＣＴの巨視的な繊維と薄膜が得られたという事実は、Ｃ２ドメインに融合しているにも関わらず、Ｒｅｐ４ＣＴはその繊維形成特性を保持することを実証している。次に、本目的は、Ｃ２ドメインはＲｅｐ４ＣＴに融合したときにそのＩｇＧ結合能を保持していたかどうかを明らかにすることであった。実施例２６と２７を参照。
【０１８３】
実施例９  −  ビオチン結合融合タンパク質のクローニング、発現および薄膜と繊維の形成
ストレプトアビジンは、モノマーあたり一つの結合部位を有する４つの同一の単量体の四量体である。それはビオチン（ビタミンＨ）に高い親和性を示し、解離定数Ｋｄは〜１０−１５Ｍに達し、これを本質的に不可逆的結合事象とならしめている。ストレプトアビジンはまた、プロテアーゼの存在下、高温で、および変性剤、及び極端なｐＨ値で、高い安定性を示す(Wilchek, M. et al., Anal. Biochem. 171: 1-32 (1988))。従って、この相互作用は、タンパク質の標識化、分離およびターゲティングを含む多くの用途において魅力的である。実際には、ビオチン化は、今日では、攻撃するいくつかの反応性有機分子のうちの一つを収容し、異なる生体分子、例えばタンパク質及びＤＮＡに対してビオチンを架橋するビオチン化されたリンカー分子を利用して容易である。しかし、ストレプトアビジンでコーティングされた高密度機能性表面の生産は達成することが困難であることが判明しており、例えば表４を参照。結合における可逆性が不可欠である（精製中などの）用途での結合力を低減させ、かつ首尾良く大腸菌で可溶性タンパク質を発現できるように、ストレプトアビジンの単量体変異体、Ｍ４が開発された(Wu. S.-C. et al., Protein Expres. Purif. 46, 268-273 (2006))。野生型四量体ストレプトアビジンの単量体に比べて、Ｍ４は４アミノ酸置換（Ｖ５５Ｔ、Ｔ７６Ｒ、Ｌ１０９Ｔ及びＶ１２５Ｒ）を有し、これは、活性な単量体の形にＭ４を保っている。
【０１８４】
Ｍ４は、組換え技術により、Ｎ末端又はＣ末端がＲｅｐ４ＣＴ（配列番号２０−２１）に融合していた。得られたタンパク質とそれをコードする遺伝子はＭ４Ｒｅｐ４ＣＴ（配列番号２２−２３），ｍｏｄＭ４Ｒｅｐ４ＣＴ（配列番号２４−２５）及びＲｅｐ４ＣＴＭ４（配列番号２６−２７）とそれぞれ命名された。Ｍ４Ｒｅｐ４ＣＴとｍｏｄＭ４Ｒｅｐ４ＣＴの違いはＭ４とＲｅｐ４ＣＴ間のリンカー領域内のＧｌｙのＡｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇへの置換である。全てのタンパク質は切断されたＨｉｓ６−Ｔｒｘ−Ｈｉｓ６に融合して発現され、精製中に除去された。
【０１８５】
全てのタンパク質の生産と精製は、Stark, M. et al., Biomacromolecules 8, 1695-1701 (2007)及びHedhammar M. et al., Biochemistry 47, 3407-3417 (2008）に記載されるように本質的に実施された。Ｒｅｐ４ＣＴＭ４，Ｍ４Ｒｅｐ４ＣＴ及びｍｏｄＭ４Ｒｅｐ４ＣＴのタンパク質の濃度は５３８６０Ｍ−１ｃｍ−１のモル吸光係数を使用して２８０ｎｍで測定した。精製されたタンパク質サンプルを還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、タンパク質の純度は、クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０によるゲルの染色後に決定した。全ての精製されたタンパク質の理論分子量および他の関連する物理的性質を表３に示す。
【０１８６】
2013544508.tif 000007
【０１８７】
Ｒｅｐ４ＣＴＭ４，Ｍ４Ｒｅｐ４ＣＴ及びｍｏｄＭ４Ｒｅｐ４ＣＴ融合タンパク質の各々から、薄膜と繊維の両方が形成された。これらの結果は、Ｒｅｐ４ＣＴはＭ４に融合されたものの、固体構造に自己会合する能力を保持していることを確認する。このことはまた、異なる長さのリンカーを用いて、Ｍ４がＲｅｐ４ＣＴに融合している繊維と薄膜を得ることが可能であることを確認する。
【０１８８】
実施例１０  −  融合タンパク質繊維と薄膜に対するビオチン含有ターゲットの結合
（Ａ）Ｒｅｐ４ＣＴＭ４薄膜に対するビオチン化Ａｔｔｏ−５６５の結合。
Ｒｅｐ４ＣＴＭ４（配列番号２６）及びＲｅｐ４ＣＴ（配列番号２０，コントロール）は、透明または黒色９６ウェルマイクロタイタープレート中のウェルの底部において室温で２５μｌのタンパク質溶液を乾燥させることにより薄膜を形成させた。プレートは使用前に１〜２週間室温で保存した。ウェルは、非特異的結合を回避するために室温で１時間以上、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１％のＢＳＡの１００μｌとともにインキュベートした。バックグラウンドの値は、ビオチン化Ａｔｔｏ−５６５の添加前に、５０μｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のＲｅｐ４ＣＴ又はＲｅｐ４ＣＴＭ４の各タンパク質の薄膜を含むウェル内の蛍光強度を測定して得られた。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１％ＢＳＡに溶解したビオチン化Ａｔｔｏ−５６５（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の８０μＭ溶液を５０μｌとともにウェルをさらに培養した。混合物を２〜３時間室温で放置した後に、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）を含むＰＢＳで２回及びＰＢＳで１回洗浄した。生じた蛍光強度は、Ｔｅｃａｎ ＩｎｆｉｎｉｔｅのＭ２００マイクロプレートリーダーにおいてウェルに５０μｌのＰＢＳを追加した後に記録された（λｅｘ＝５６５ｎｍ，λｅｍ＝５９０ｎｍ）。
【０１８９】
希釈系列をＰＢＳで調製し、異なる濃度のビオチン化Ａｔｔｏ−５６５のサンプル５０μｌを各々の膜を含むウェルに三連で添加し、その後ウェルからの蛍光強度を記録した。
図１８において、ビオチン化Ａｔｔｏ−５６５に浸漬させて洗浄後にタンパク質の薄膜からの蛍光強度をニコンのＥｃｌｉｐｓｅのＴｉ−Ｓ蛍光顕微鏡を用いて２培の拡大で観察する（λｅｘ＝５０９−５５０ｎｍ及びλｅｍ＝５７０−６１４ｎｍ）。ビオチン化Ａｔｔｏ−５６５の添加後のＲｅｐ４ＣＴＭ４薄膜（パネルＡ）とＲｅｐ４ＣＴ薄膜（パネルＢ）の間の蛍光強度の違いは明白である。
【０１９０】
Ｒｅｐ４ＣＴＭ４薄膜に対するビオチン化Ａｔｔｏ−５６５の総量を確立するために、ビオチン化Ａｔｔｏ−５６５の既知量の希釈系列を用いて蛍光強度を記録した。このようにして、既知量（モル）のビオチン化Ａｔｔｏ−５６５を含むサンプルからの蛍光強度（Ｒｅｐ４ＣＴＭ４を含むウェルに、三連で）を標準曲線を得るために使用した。バックグラウンド値に対応する得られた蛍光強度の値（ビオチン化Ａｔｔｏ−５６５を含まないＲｅｐ４ＣＴＭ４薄膜）及びウェルに添加したビオチン化Ａｔｔｏ−５６５の３つの濃度に相関するデータ点を図１９のグラフに示す。図１９のグラフ下の表は、同じビオチン化アＡｔｔｏ−５６５濃度を持つｎ＝３のウェル中の測定からの標準偏差とともに、蛍光強度値に対する線形回帰から取得した値を示す。
【０１９１】
Ｒｅｐ４ＣＴＭ４の薄膜に対するビオチン化Ａｔｔｏ−５６５の結合実験から得られた蛍光強度値から出発して（図２０）、これらの値が得られた蛍光強度に対応するビオチン化Ａｔｔｏ−５６５のモル量を計算するために使用された。得られた蛍光値を、図２０に、Ｒｅｐ４ＣＴ（Ａ）とＲｅｐ４ＣＴＭ４（Ｂ）の薄膜を含むウェルに対するビオチン化Ａｔｔｏ−５６５の添加前（−）と後（＋）の値を表示するパネルＡ及びＢによりプロットする。パネルＣは、Ｒｅｐ４ＣＴ又はＲｅｐ４ＣＴＭ４の薄膜に対するビオチン化Ａｔｔｏ−５６５の添加後に生じた蛍光強度の比較を示す。Ｒｅｐ４ＣＴ薄膜については前の値と後の値の間で有意な違いは無かった（ｎｓ）（パネルＡ）。Ｒｅｐ４ＣＴＭ４を含むビオチン化Ａｔｔｏ−５６５の添加前と後の有意な違い（パネルＢ；Ｐ＜０．０１）及びタンパク質間の有意な違い（パネルＣ；Ｐ＜０．０００１）は統計試験により確認された。図２０中のバーは、ｎ＝１０の薄膜の蛍光強度値の間の標準偏差を示している。
【０１９２】
結合実験から得られたビオチン化フルオロフォア／表面積の比率を計算した。およそ２８ｍｍ２、２．１ｐｍｏｌのビオチン化Ａｔｔｏ−５６５の表面積がＲｅｐ４ＣＴＭ４薄膜に結合していた。これは０．０７３ｐｍｏｌ／ｍｍ２の結合ビオチン／表面積をもたらす（表５）。
【０１９３】
（Ｂ）Ｒｅｐ４ＣＴＭ４薄膜に対するビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の結合
比較的高い安定性と非発色基質および過酸化物の変換における発色生成物の生産に起因して、ＨＲＰは、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット及び免疫組織化学などの用途で、一般に二次抗体または結合分子（例えば、ビオチン）に結合されて使用される。Ｒｅｐ４ＣＴＭ４（配列番号２６）及びＲｅｐ４ＣＴ（配列番号２０；コントロール）からなる薄膜に対するビオチン化ＨＲＰの全結合量を確率するために、ビオチン化ＨＲＰをそれぞれの薄膜に結合させた。生成物の形成の速度は、基質の既知量を用いて５７０ｎｍで記録した。生成物のレゾルフィンに対するモル吸光係数はメーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から入手し、５４０００ｃｍ−１Ｍ−１と定められた。
【０１９４】
Ｒｅｐ４ＣＴＭ４とＲｅｐ４ＣＴのタンパク質溶液（２５μｌ）を透明な９６ウェルマイクロタイタープレート内のウェルの底で完全に乾燥させ、こうして薄膜を形成した。ウェルはＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１％のＢＳＡの１００μｌとともに１時間以上インキュベートし、その後ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１％のＢＳＡ中の０．３ｍｇ／ｍｌのビオチン化ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）の５０μｌとともに１時間以上インキュベートした。続いてウェルをＰＢＳ−Ｔで２回、ＰＢＳで１回洗浄した。反応は０．２％ＢＳＡ，２８ｍＭＮａＣｌ，０．５４ｍＭ ＫＣｌ，０．３ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，４２ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．４）に溶解した２ｍＭの過酸化水素を含む５０μＭのＡｍｐｌｅｘ ｒｅｄ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を室温にて添加することにより開始した。速度論的測定はＴｅｃａｎ ＩｎｆｉｎｉｔｅのＭ２００マイクロプレートリーダーで行った。
【０１９５】
ビオチン化ＨＲＰ（溶液中に遊離）の既知量が、薄膜におけるビオチン化ＨＲＰによる測定の場合と同様の速度を生じるＨＲＰの量を確立するために使用された。５０μＭのＡｍｐｌｅｘ ｒｅｄ及び２ｍＭの過酸化水素の溶液（ｐＨ７．４）中で、ビオチン化ＨＲＰ無しによる触媒反応で、生成物のレゾルフィンに対して得られた反応速度を図２１のグラフに示す。データポイントは、同じ濃度でのビオチン化ＨＲＰによる三連の測定値に相関する。図２１のグラフ下の表は、データに対する線形回帰から得られた値を示す。図２１のグラフのバーは、同じ濃度のビオチン化ＨＲＰによるｎ＝３のウェルの測定値からの標準偏差を示す。図２１の得られた標準曲線と勾配が、融合タンパク質膜に結合させたビオチン化ＨＲＰ量の算出に用いられた。
【０１９６】
融合タンパク質の薄膜及びコントロールの薄膜がビオチン化ＨＲＰとインキュベートされるウェル内での５０μＭのＡｍｐｌｅｘ ｒｅｄと２ｍＭのＨ２Ｏ２の触媒反応における反応速度を図２２に示す。図２１と２２における反応速度は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより提供された吸光係数を用いて計算された（５４ ０００ｃｍ−１Ｍ−１）、分あたりのμＭ単位でのレゾルフィンの形成として表される。バーは、ｎ＝８ウェルで測定された反応についての標準偏差を示している。図２２は、Ｒｅｐ４ＣＴＭ４でコーティングされたウェルとコントロールであるＲｅｐ４ＣＴでコーティングされたウェルの間の生成物形成（それゆえ結合したビオチン化ＨＲＰ）の速度の有意な違いを示している。０．２ｐｍｏｌ ＨＲＰ／ｍｍ２がＲｅｐ４ＣＴＭ４薄膜に結合することが決定された（表５）。
【０１９７】
（Ｃ）市販製品との比較
ストレプトアビジンでコーティングされた高密度機能性表面の生産は達成することが困難であることが判明している。市販のプレートのビオチン結合能が表４に記載される。
2013544508.tif 000008
【０１９８】
実施例１０Ａでビオチン化Ａｔｔｏ−５６５及び実施例１０Ｂでのビオチン化ＨＲＰによる結合実験から得られたビオチン化フルオロフォア／表面積の比率が表５に要約される。Ｒｅｐ４ＣＴＭ４（配列番号２６）の薄膜上における２つの異なるビオチン化分子の密度は０．０７３−０．２ｐｍｏｌ／ｍｍ２である。
【０１９９】
2013544508.tif 000009
【０２００】
表４−５の結果は、ビオチンが小さな（フルオロフォア）または大きな（タンパク質）分子に結合されているかどうかに関わらず、Ｍ４部分との融合タンパク質からなる薄膜は、商業的な代替物と同じ範囲のビオチン結合密度を提供することを示している。
【０２０１】
統計
ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ４．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）をデータの統計分析のために使用した。実施例１０Ａにおいて、ノンパラメトリック対ウィルコクソン検定が、Ｒｅｐ４ＣＴ又はＲｅｐ４ＣＴＭ４の何れかから形成される薄膜に対するビオチン化Ａｔｔｏ−５６５の添加前と後での蛍光値の比較に用いられた。更に、ノンパラメトリック不対マンホイットニーＵ検定が、Ｒｅｐ４ＣＴ又はＲｅｐ４ＣＴＭ４の薄膜を用いるビオチン化Ａｔｔｏ−５６５のインキュベーション後におけるウェル内の蛍光強度を比較するために、また実施例１０Ｂでビオチン化ＨＲＰとインキュベートされた薄膜上での測定から得られた［レゾルフィン］／分の値の比較のために用いられた。Ｐ値＜０．０５を有意とみなした。
【０２０２】
実施例１１  −  融合タンパク質の繊維と薄膜に対するビオチン化抗体と二次抗体の結合
Ｒｅｐ４ＣＴ（配列番号２０，コントロール）及びｍｏｄＭ４Ｒｅｐ４ＣＴ（配列番号２４）の薄膜と繊維がウサギ起源のビオチン化抗体に対する結合能について試験された。薄膜は、８ｘ１又は１２Ｘ１ウェルストリップ（９６ウェルマイクロプレートのフォーマットと同じ大きさののウェル）に形成されている。
【０２０３】
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１％のＢＳＡによる薄膜と繊維のプレインキュベーション後に、ビオチン化抗体（ウサギ）はタンパク質構造（薄膜／繊維）と１時間以上インキュベートされ、その後１２５Ｉで放射活性標識された二次抗ウサギ抗体が添加される。薄膜と繊維を洗浄する。ガンマ線の検出は、ガンマカウンターで個々の薄膜又は個々の繊維上で行われる。１２５Ｉ−標識抗体の既知量の希釈系列が調製され、標準曲線を得るために放射能が測定され、それから融合タンパク質薄膜と繊維に対する結合ビオチン化抗体の量を計算することができる。
【０２０４】
実施例１２  −  融合タンパク質の純粋な薄膜の調製
薄膜は１０〜２０μＭの濃度で２５μｌのＲｅｐＣＴ４Ｍ４（配列番号２６）を使用して鋳造された。１００μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）を、１時間ウェル中で薄膜とインキュベートした。この溶液を除去し、５０μｌのヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）が添加され、薄膜を破壊し、タンパク質を可溶化させた。更なる薄膜に対して、事前にＰＢＳで洗浄することなく、同量のＨＦＩＰが添加された。ＨＦＩＰは、３．５時間、４つの薄膜上で作用させ、生じた透明なＨＦＩＰ溶液を５０μｌの２０％ＳＤＳを含むエッッペンドルフチューブに移した。チューブ中の水を蒸発させ、残った含量を１０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）の６０μｌ中に溶解し、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。
【０２０５】
その結果を図２３に示す。レーン１はＳｐｅｃｔｒａＴＭ Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）のタンパク質に相当する。数字はタンパク質の大きさに対応する。レーン２はＨＦＩＰを添加する前にＰＢＳに浸漬していない精製されたＲｅｐ４ＣＴＭ４の薄膜に対応する。レーン３はＰＢＳに１時間浸漬させてその後この溶液を除去しその後ＨＦＩＰを添加したＲｅｐ４ＣＴＭ４の薄膜に対応する。
【０２０６】
幾つかのタンパク質はＲｅｐ４ＣＴＭ４タンパク質とともに共精製されるが（レーン２、図２３）、１００μｌのＰＢＳで１時間インキュベーションして汚染タンパク質を溶解し、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより判断されるようにＲｅｐ４ＣＴＭ４タンパク質のみからなる薄膜を残した（レーン３、図２３）。従って、最も汚染されたタンパク質がそのような重合法により除去され、そして融合タンパク質からなるタンパク質構造内の残りの任意の不純物は水性緩衝液で穏やかに洗浄することによって容易に除去することができる。
【０２０７】
実施例１３  −  溶液中の有機ターゲットの捕捉
ＺＲｅｐ４ＣＴタンパク質の溶液（〜１ｍｇ／ｍｌ）を、血清からなるサンプルに添加し、サンプル中のＩｇＧ分子を溶液中で融合タンパク質のＺ部分に結合させる。混合物を疎水性／親水性界面に曝し、融合タンパク質／ＩｇＧ複合体のＲｅｐ４ＣＴ部分が薄膜又は発泡体を形成するようにし、溶液中の他の血清タンパク質を残して、固体構造上でＩｇＧを捕捉する。
【０２０８】
別法として、混合物を固体支持体上で乾燥させ、固定化したＩｇＧによる薄膜を形成する。この薄膜をＰＢＳなどの緩衝液で洗浄して溶解し、汚染タンパク質を除去する。
【０２０９】
あるいは、疎水性−親水性の界面を提供することで繊維が形成され、その混合物にせん断力を施す。融合タンパク質／ＩｇＧ複合体のＲｅｐ４ＣＴ部分は巨視的繊維に重合化し、溶液中には他のタンパク質を残す。
【０２１０】
形成される固体構造（薄膜、発泡体又は繊維）が収集され、ＩｇＧは適切な溶出緩衝液中で（例えばｐＨを２．７に下げることにより）回収することができる。溶出タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで同定される。実施例２２も参照。
【０２１１】
実施例１４  −  細胞捕獲のための融合タンパク質の足場
（Ａ）眼の前房内の非付着細胞のインビボ試験
ＺＲｅｐ４ＣＴ繊維／薄膜／発泡体をＣＤ４５又はＣＤ３４に対するＩｇＧとともにインキュベートさせる。白血球がＣＤ４５に対するＩｇＧによりＺＲｅｐ４ＣＴ足場に対して捕捉され、肥満細胞がＣＤ３４に対するＩｇＧによりＺＲｅｐ４ＣＴ足場で捕捉される。細胞を足場の上に固定化されるようにする。細胞と融合タンパク質足場をネイキッドマウスの前眼房内に移植する。細胞は、目の窓を通して、インビボで検査される。
【０２１２】
（Ｂ）非接着細胞のインビボ試験
肥満細胞と白血球をそれぞれＣＤ３４とＣＤ４５に対するＩｇＧとともにＺＲｅｐ４ＣＴ足場上で成長させ、次いでインビボで監視する。一部の細胞は、発達中の段階で、例えばクラスタで成長できる神経幹細胞など非接着性である。神経クラスターにおいて、細胞は、非分化型を保っている。神経幹細胞は、神経幹細胞上の細胞受容体に対するＩｇＧとＺＲｅｐ４ＣＴ足場上のクラスタ−で成長する。
【０２１３】
（Ｃ）特定細胞の選択
ＺＲｅｐ４ＣＴ足場（薄膜／発泡体／繊維）が特定の抗体による細胞の選択に用いられる。肥満細胞は、２つの工程手順で選択される。工程１：ＣＤ３４に対するＩｇＧによるＺＲｅｐ４ＣＴ足場に対する細胞の結合。工程２：Ｃ−ｋｉｔ受容体に対するＩｇＧによるＺＲｅｐ４ＣＴ足場上での肥満細胞の選択。
【０２１４】
（Ｄ）ＺＲｅｐ４ＣＴ上で成長する真核細胞におけるタンパク質の生産。
タンパク質の生産のために使用される多くの細胞が、非接着細胞株に由来する。しかし、付着細胞を用いるときには、物理的分離が促進されるので、多くの方法で大規模な生産が容易である。細胞受容体に対するＩｇＧによるＺＲｅｐ４ＣＴ足場の使用により、非接着細胞の成長は接着様式でなされ得る。
【０２１５】
実施例１５  −  Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴに対するＩｇＧ結合における尿素処理の影響の調査
ＩｇＧ結合におけるＺ−Ｒｅｐ４ＣＴ薄膜と繊維の尿素処理の影響をここで評価した。Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴの薄膜と繊維をウサギ血清からのＩｇＧの結合の前に尿素で処理した。結合したＩｇＧを溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０２１６】
実施例６でウサギ血清からのＩｇＧに結合することが観察され、８Ｍの尿素で処理された（２００μｌの８Ｍ尿素、２０分、室温）Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴの繊維と薄膜を、５００μｌのウサギ血清（１：５希釈）とともに室温で１時間インキュベートした。Ｒｅｐ４ＣＴ（配列番号２０）の薄膜と繊維がコントロール材料として使用され、同じ方法で処理された。６００μｌのＰＢＳで３回洗浄した後、結合したＩｇＧを、溶出緩衝液（０．５Ｍ酢酸、１Ｍ尿素、１００ｍＭのＮａＣｌ）で約２．７までｐＨを下げることによって５００μｌで溶出し、その後溶出画分を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（非表示）。
【０２１７】
Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴの薄膜と繊維は８Ｍの尿素による処理の後でＩｇＧに対するその結合能を保持していることが結論された。Ｒｅｐ４ＣＴのコントロールの薄膜と繊維はＩｇＧの結合を全く示さなかった。
【０２１８】
実施例１６  −  Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴに対するＩｇＧ結合におけるＮａＯＨ処理の影響の調査
洗浄条件に対する耐久性を更に評価するため、ＩｇＧ結合におけるＺ−Ｒｅｐ４ＣＴ（配列番号１４）の薄膜と繊維のＮａＯＨ処理の影響が評価された。実施例６でウサギ血清からのＩｇＧに結合することが観察され、８Ｍの尿素で処理された（２００μｌの８Ｍ尿素、２０分、室温）実施例４及び５からのＺ−Ｒｅｐ４ＣＴの繊維と薄膜を１ＭのＮａＯＨで更に処理した（５００μｌの１ＭのＮａＯＨ、２０分、室温）。Ｒｅｐ４ＣＴ（配列番号２０）の薄膜と繊維がコントロール材料として使用され、同じ方法で処理された。ＮａＯＨ処理の後、薄膜と繊維は５００μｌのウサギ血清（１：５希釈）とともに室温で１時間インキュベートした。６００μｌのＰＢＳで３回洗浄した後、結合したＩｇＧを、溶出緩衝液（０．５Ｍ酢酸、１Ｍ尿素、１００ｍＭのＮａＣｌ）で約２．７までｐＨを下げることによって５００μｌで溶出し、その後溶出画分を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（非表示）。
【０２１９】
Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴの薄膜と繊維は１ＭのＮａＯＨによる処理の後でＩｇＧに対するその結合能を保持していることが結論された。Ｒｅｐ４ＣＴのコントロールの薄膜と繊維はＩｇＧの結合を全く示さなかった。
【０２２０】
実施例１７  −  Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴ薄膜に対するＩｇＧ−ＨＲＰ結合の定量化
（Ａ）Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴ薄膜に対するＩｇＧ−ＨＲＰ結合
Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴに対するＩｇＧの結合を定量化するため、ＩｇＧにコンジュゲートした西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（ＩｇＧ−ＨＲＰ）をＺ−Ｒｅｐ４ＣＴ薄膜に結合させた。Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴ（配列番号１４）及びＲｅｐ４ＣＴ（コントロール，配列番号２０）の薄膜が異なる濃度（０．０１１−８９０ｐｍｏｌｅｓ）で９６ウェルプレート中に鋳造された。薄膜を室温で１時間、１００μｌの１％ＢＳＡでブロックした。次いで、薄膜を５０μｌのＩｇＧ−ＨＲＰ（すなわち、３４ｐｍｏｌのＩｇＧ−ＨＲＰ、ウサギ起源のＩｇＧ）中で室温で１時間インキュベートし、その薄膜を１００μｌの０．０５％のＴｗｅｅｎで２回洗浄し、１００μｌのＰＢＳで最終洗浄を行った。薄膜に対して結合したＩｇＧ−ＨＲＰを測定するために、５０μＭ Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ／２ｍＭ Ｈ２Ｏの５０μｌが一度に一つの薄膜に添加され、Ｔｅｃａｎ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒで３分間５７０ｎｍで吸光度をモニタリングした。可溶性ＩｇＧ−ＨＲＰの希釈系列（０．０５−０．５ｐｍｏｌｅ）もまた薄膜のと同型のプレート中で、１００μｌの１％ウシ用血清アルブミン（ＢＳＡ）により１時間ウェルをブロックすることによって測定され、その後２０μｌの水溶性のＩｇＧ−ＨＲＰ、２０μｌの１２５μＭのＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ及び１０μｌの９．７９ｍＭのＨ２Ｏ２を添加した。三連の測定を薄膜および希釈系列に対して行った。
【０２２１】
線形回帰フィットが、個々の測定に対してテカンソフトウェアを使用して作成され、時間に対する５７０ｎｍでの吸光度の生データプロットの線形領域（Ａｂｓ５７０／ｍｉｎ）に相当する。その勾配は、無職の基質から色付きの生成物へのＨＲＰの変換速度に対応し、結合したＩｇＧ−ＨＲＰ分子の数に比例する。
【０２２２】
各個々の三つ組において、結合したＩｇＧ抗体−ＨＲＰ（ピコモル）の量の平均値と標準偏差を算出した。図２４Ａは、異なるタンパク質濃度のＺ−Ｒｅｐ４ＣＴ及びＲｅｐ４ＣＴの薄膜に結合したＩｇＧ−ＨＲＰの量を示し、図２４ＢはＩｇＧ−ＨＲＰに結合した異なるタンパク質濃度の薄膜におけるＺ−Ｒｅｐ４ＣＴ及びＲｅｐ４ＣＴの画分を示す。
【０２２３】
１．１ｐｍｏｌｅのタンパク質又はそれ以上を含有する薄膜において、Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴの薄膜は対応するＲｅｐ４ＣＴコントロール薄膜よりも有意に多くＩｇＧ−ＨＲＰに結合する。ＩｇＧ−ＨＲＰに結合したこれらの薄膜中のＺ−Ｒｅｐ４ＣＴ分子の画分はおよそ〜７％未満である。
【０２２４】
（Ｂ）ＮａＯＨ処理後のＺ−Ｒｅｐ４ＣＴ薄膜に対するＩｇＧ−ＨＲＰ結合
Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴの薄膜に結合したＩｇＧにおけるＮａＯＨ処理の影響を調べるために、ＩｇＧ−ＨＲＰをＮａＯＨ処理した薄膜に結合させ、結合したＩｇＧ−ＨＲＰの量が検出された。
【０２２５】
実施例１７（Ａ）のＩｇＧ−ＨＲＰを結合したＺ−Ｒｅｐ４ＣＴ（配列番号１４；１．１−８９０ｐｍｏｌｅ）及びＲｅｐ４ＣＴ（配列番号２０，１０８ｐｍｏｌｅ）の薄膜を、結合したＩｇＧ−ＨＲＰを除去するために、１００μｌの溶出緩衝液（ｐＨ２．７）で１時間室温でインキュベートした。次に、薄膜を１００μｌの１ＭのＮａＯＨで２０〜３０分間室温でインキュベートし、その後１５０μｌのＰＢＳで２回洗浄した。薄膜を含むウェルは１％のＢＳＡでブロックされ、ＩｇＧ−ＨＲＰ（３４ｐｍｏｌ）でインキュベートし、３回洗浄し、５０μＭのＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ／２ｍＭ Ｈ２Ｏ２を添加し、続いて上記（Ａ）に示したように５７０ｎｍで吸光度をモニタリングした。各個々の三つ組において、結合したＩｇＧ抗体−ＨＲＰ（ピコモル）の量の平均値と標準偏差を算出した。
【０２２６】
図２５Ａは、異なるタンパク質濃度のＺ−Ｒｅｐ４ＣＴ及びＲｅｐ４ＣＴの薄膜に結合したＩｇＧ−ＨＲＰの量を示し、図２５ＢはＩｇＧ−ＨＲＰに結合した異なるタンパク質濃度の薄膜におけるＺ−Ｒｅｐ４ＣＴ及びＲｅｐ４ＣＴの画分を示す。図２６はＮａＯＨ処理の前後において、Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴ及びＲｅｐ４ＣＴの薄膜に対しての結合したＩｇＧ−ＨＲＰの量を可視化している。
【０２２７】
１０８ｐｍｏｌｅのＺ−Ｒｅｐ４ＣＴの薄膜は対応するＲｅｐ４ＣＴの薄膜よりも有意に多い結合を示し、ＮａＯＨ処理した薄膜に対するＩｇＧ−ＨＲＰのＺ−Ｒｅｐ４ＣＴ結合の量は、薄膜のタンパク質濃度が増加するにつれて増加する傾向を示している。Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴ薄膜に対するＩｇＧ−ＨＲＰの量は、未処理の薄膜に比べて、過酷な１ＭのＮａＯＨ処理によっておよそ２〜４培減少する。
【０２２８】
実施例１８  −  Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴ薄膜に対するＩｇＧ−フルオロフォア結合の定量化
フルオロフォアにコンジュゲートしたＩｇＧの結合が、異なる量のタンパク質を含むＺ−Ｒｅｐ４ＣＴ及びＲｅｐ４ＣＴの薄膜に対して行われた。
【０２２９】
Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴ（配列番号１４）及びＲｅｐ４ＣＴ（コントロール，配列番号２０）の薄膜が異なる濃度（０．０１１−８９０ｐｍｏｌｅｓ）で調製され実施例１７に示したようにブロックされた。次いで、薄膜を５０μｌのＩｇＧ−フルオロフォア（１００ｐｍｏｌのＩｇＧ−フルオロフォア、ウサギ起源のＩｇＧ、フルオロフォア：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３）中で室温で１時間インキュベートし、その薄膜を１００μｌの０．０５％のＴｗｅｅｎで２回洗浄し、１００μｌのＰＢＳで最終洗浄を行った。傾向測定の前に、１００μｌのＰＢＳを各薄膜に対して添加した。
【０２３０】
可溶性ＩｇＧ−フルオロフォアの希釈系列（０−１ｐｍｏｌｅ）もまた薄膜のと同型のプレート中で、１００μｌの１％ウシ用血清アルブミン（ＢＳＡ）により１時間ウェルをブロックすることによって測定され、その後１００μｌの水溶性のＩｇＧ−フルオロフォアが添加された。蛍光を薄膜について三つ組として測定し、希釈系列はＴｅｃａｎ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ機器上で測定された（励起：６３２ｎｍ、発光：６６０ｎｍ、ゲイン：２００）。
【０２３１】
各個々の三つ組に対して、結合したＩｇＧ−フルオロフォアの平均値と標準偏差（ｐｍｏｌ）が、０．０１１−５５ｐｍｏｌのタンパク質を含む薄膜に対して計算された（図２７Ａ）。ＩｇＧ−フルオロフォアに結合するＺ−Ｒｅｐ４ＣＴ及びＲｅｐ４ＣＴ分子の画分もまた計算された（図２７Ｂ）。
【０２３２】
Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴ薄膜に対するＩｇＧ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３の結合は対応するＲｅｐ４ＣＴコントロール薄膜よりも有意に多いと結論づけることができる。０．０１１−１１ｐｍｏｌのＺ−Ｒｅｐ４ＣＴの薄膜の間においてＩｇＧ−フルオロフォア結合の有意な違いは観察されず、このことはこの波長でのＺ−Ｒｅｐ４ＣＴの薄膜だけの自己蛍光に起因しているようには見えない（データ非表示）。５５ｐｍｏｌ以上のタンパク質を含有するＺ−Ｒｅｐ４ＣＴ薄膜に対するＩｇＧ−フルオロフォアの結合はいかなる信頼ある方法でも計算することはできず、それはこれらに由来する蛍光シグナルが校正曲線の外側であったためである。
【０２３３】
Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴ薄膜による結合ＩｇＧ−フルオロフォアの量を実施例１７のＩｇＧ−ＨＲＰの対応する量と比較することにより、Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴはＩｇＧ−ＨＲＰよりも多くのＩｇＧ−フルオロフォアに結合するように見え（例えば５５ｐｍｏｌの薄膜と１．１ｐｍｏｌの薄膜に対してそれぞれ〜４培及び〜６培の違い）、これはフルオロフォアとＨＲＰの間の大きさの違いに起因する可能性がある。更に、ＩｇＧ−フルオロフォアに結合するＺ−Ｒｅｐ４ＣＴ分子の画分もまた、ＩｇＧ−ＨＲＰ結合のものと比べて増加したように見える。
【０２３４】
実施例１９  −  ヒト血漿からのＩｇＧのＺ−Ｒｅｐ４ＣＴ薄膜への結合
この実験において、Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴ（配列番号１４）の３つの薄膜が実施例３で示したように調製された。全ての薄膜が、鋳造後に、保管の最中にいかなる液体にも浸漬されることなく＋４℃で８ヶ月間保管された。各Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴ薄膜を５００μｌのヒト血漿（１：５希釈）と共に室温で１時間インキュベートした。６００μｌのＰＢＳで３回洗浄した後、結合したＩｇＧを、溶出緩衝液（０．５Ｍ酢酸、１Ｍ尿素、１００ｍＭのＮａＣｌ）で約２．７までｐＨを下げることによって５００μｌで溶出し、その後溶出画分を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（非表示）。Ｒｅｐ４ＣＴ（配列番号２０）の薄膜がコントロール材料として使用され、同じ方法で処理された。
【０２３５】
ゲルから、ＩｇＧ（〜１４６ｋＤａ）はＺ−Ｒｅｐ４ＣＴ薄膜からの溶出画分にあるように見えることが自明であり、Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴの薄膜は、いかなる液体にも浸漬されることのない＋４℃での８ヶ月の保管後に、ヒト血漿からのＩｇＧに結合する能力を保持していることを示している。Ｒｅｐ４ＣＴのコントロール薄膜は、溶出画分で少しもＩｇＧを示さない。これらの知見は、本発明による構造を使用するときに、実施例４で報告された実験再現性の観察を拡張し、またそのタンパク質構造がヒトＩｇＧに結合することができることを示している。
【０２３６】
実施例２０  −  ヒト血漿からのＩｇＧのオートクレーブ処理したＺ−Ｒｅｐ４ＣＴ繊維への結合
オートクレーブ処理により滅菌後のＩｇＧに結合するＺ−Ｒｅｐ４ＣＴの能力が調査された。Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴ繊維のオートクレーブ処理後に、繊維をヒト血漿からのＩｇＧに結合させた。オートクレーブ処理した繊維のＩｇＧ結合をオートクレーブ処理してない繊維のそれと比較した。
【０２３７】
２つのほぼ等しい大きさのＺ−Ｒｅｐ４ＣＴ（配列番号１４）繊維を２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）を含有する２本のチューブに移した。次に繊維の一つを１２１℃で２０分間オートクレーブ処理した。２つのＲｅｐ４ＣＴ（配列番号２０）繊維がコントロール材料として使用され同じ方法で処理された。
【０２３８】
繊維を５００μｌのヒト血漿（１：５希釈）と共に室温で１時間インキュベートした。６００μｌのＰＢＳで３回洗浄した後、結合したＩｇＧを、溶出緩衝液（０．５Ｍ酢酸、１Ｍ尿素、１００ｍＭのＮａＣｌ）で約２．７までｐＨを下げることによって５００μｌで溶出し、その後溶出画分を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図２８）。
【０２３９】
図２８に示すゲルは以下に従ってロードされた：
（１）１．４μｌロードされたヒト血漿（１：５）
（２）１４μｌロードされたＺ−Ｒｅｐ４ＣＴ、オートクレーブしてない繊維
（３）１４μｌロードされたＺ−Ｒｅｐ４ＣＴ、オートクレーブした繊維
（４）１４μｌロードされたＲｅｐ４ＣＴ、オートクレーブしてない繊維
（５）１４μｌロードされたＲｅｐ４ＣＴ、オートクレーブした繊維
（６）分子量マーカー。
【０２４０】
オートクレーブしていない及びオートクレーブしたＺ−Ｒｅｐ４ＣＴ繊維の両方とも１４６ｋＤａ周辺に明らかなＩｇＧのバンドを示している。これらのＩｇＧのバンドの強度には明らかな差がなく、オートクレーブ処理は、ＩｇＧ結合能力にほとんど影響を及ぼさないことを示唆している。オートクレーブしていない及びオートクレーブしたＲｅｐ４ＣＴの繊維のどちらも溶出画分にＩｇＧを示していない。全ての繊維は、付加的な、もっと弱い、アルブミンのバンド（〜５０−６０ｋＤａ）を示している。
【０２４１】
実施例２１  −  Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴ繊維のプロテアーゼ３Ｃ切断
Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴタンパク質（全タンパク質構造はＨｉｓ６−Ｚ−ＬＥＡＬＦＱＧＰ−Ｒｅｐ４ＣＴ；配列番号１４）はプロテアーゼ３Ｃ認識部位（ＬＥＡＬＦＱＧＰ，アミノ酸ＱとＧの間でのプロテアーゼ３Ｃ切断）をＺドメインとＲｅｐ４ＣＴの間に含んでいる。
【０２４２】
任意の大きさのＺ−Ｒｅｐ４ＣＴ繊維をエッペンドルフチューブに移し、プロテアーゼによる切断が９．６μｇのプロテアーゼ３Ｃと０．３５μｌの１ＭのＤＴＴを総体積が３５０μｌまで添加することによって開始された。切断は＋４℃で２４時間進行させ、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用にサンプルを切断上清から抜き取った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用にサンプルを切断上清から抜き取って、別に２４時間切断を進行させた（＋４℃）。次いで２つの抜き取られたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図２９）。
【０２４３】
図２９に示すゲルは以下に従ってロードされた：
（１）分子量マーカー
（２）プロテアーゼ３Ｃで２４時間切断されたＺ−Ｒｅｐ４ＣＴ繊維の上清
（３）プロテアーゼ３Ｃで４８時間切断されたＺ−Ｒｅｐ４ＣＴ繊維の上清。
図２９から、プロテアーゼ３ＣによるＺ−Ｒｅｐ４ＣＴ繊維の切断後の上清の両方が２つの異なるバンドを含んでいたことが見て取れる。第一のバンドは、わずかに３５ｋＤａ未満であり、プロテアーゼ３Ｃ（〜３１ｋＤａ）に対応し、第二のバンドは１０ｋＤａの真上に位置していた。プロテアーゼ３ＣによるＺ−Ｒｅｐ４ＣＴの切断は、（ｉ）Ｈｉｓ６−Ｚ−ＬＥＡＬＦＱ（〜９ｋＤａ）及び（ｉｉ）ＧＰ−Ｒｅｐ４ＣＴ（〜２３ｋＤａ）に対応する２つのオリゴペプチドセグメントを生成するため、第二のバンドは切断されたＨＺフラグメント（９ｋＤａ）に対応する。従って、プロテアーゼ３Ｃによる切断部位はＺ−Ｒｅｐ４ＣＴ繊維の切断に対して得ることができ、それゆえ、ＨＺ部分は除去することができる。
【０２４４】
実施例２２  −  ＩｇＧの存在下での可溶性Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴの繊維形成
溶性Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴをＩｇＧと混合すると、Ｚドメインに対するＩｇＧ結合の動力学はＺ−Ｒｅｐ４ＣＴ繊維の形成よりも早くなるはずである。Ｚドメインの大半がＩｇＧで占有されている場合の繊維を形成する可能性が研究された。
【０２４５】
ＩｇＧの存在下での繊維の形成
Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴ（配列番号１４）の精製が前述と同様に行われ、精製されたタンパク質溶液は２．２ｍｇ／ｍｌまで濃縮された。繊維の形成は４つの異なる条件で行われ、全て、総繊維形成体積は３ｍｌで、７１ｎｍｏｌの可溶性Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴタンパク質を含んでいた。第一条件はＺ−Ｒｅｐ４ＣＴのみ含んでおり；第二条件は精製されたウサギＩｇＧを混合したＺ−Ｒｅｐ４ＣＴであり（ＩｇＧに比べて８培超のＺ−Ｒｅｐ４ＣＴ）；第三条件はウサギ血清を混合したＺ−Ｒｅｐ４ＣＴであり（Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴに比べて〜１．５培超の血清ＩｇＧ）；及び第四条件はウサギ血清を混合したＺ−Ｒｅｐ４ＣＴであった（血清ＩｇＧに比べて〜７倍超のＺ−Ｒｅｐ４ＣＴ）。繊維の形成は室温で３日間進行させた。
【０２４６】
繊維形成の３日後に、条件１、２及び４に対して繊維が形成された。条件４の形成された繊維に加えて、かなりの量のＺ−Ｒｅｐ４ＣＴタンパク質凝集体もまた形成された。条件３においては繊維又は凝集体は全く目視できなかった。
【０２４７】
これからの一つの結論は、数多くの他の生物分子の存在が、個々のＲｅｐ４ＣＴ分子がお互いに相互作用することを遮蔽する場合に、繊維の形成が損なわれるということであろう。このことの別の態様は、条件３の場合でありうるように、非常に多くのＩｇＧが存在する場合、Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴ中の多くのＺドメインがＩｇＧと結合し、ＩｇＧと結合したＺ−Ｒｅｐ４ＣＴの大きな画分が繊維の形成を妨げ得るということであろう。
【０２４８】
Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴ繊維からの結合したＩｇＧの除去
条件１、２及び４で作成された薄膜は、条件４からの凝集体と一緒に回収され、２０ｍＭのトリス（ｐＨ８）で洗浄される。次に、全ての繊維と凝集体は等しい半分に分割され、一つの半分はｐＨを下げることによる結合ＩｇＧの溶出用であり、他の半分はプロテアーゼ３Ｃによる切断用である。
【０２４９】
繊維と凝集体の第一の群はエッペンドルフチュウーブへ移され、１４４μｌの溶出緩衝液（０．５Ｍ酢酸、１Ｍ尿素、１００ｍＭのＮａＣｌ）、ｐＨ２．７が各チューブに添加された。ＩｇＧの溶出を室温で３０分間進行させ、その後溶出上清を回収しＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した（図３０）。
【０２５０】
繊維と凝集体の第二の群に対して、ＤＴＴを含有する１４４μｌのプロテアーゼ３Ｃ（即ち１１０μｇのプロテアーゼ３Ｃ）が添加された。プロテアーゼ３Ｃによる切断を＋４℃で一晩進行させ、その後切断上清を回収しＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した（図３０）。
【０２５１】
図３０は、Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴ繊維から除去されたＩｇＧと可溶性Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴとＩｇＧを混合することにより形成された凝集体の非還元ＳＤＳーＰＡＧＥゲルを示す。ゲルは以下に従ってロードされた：
（１）精製された可溶性Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴ（２．２ｍｇ／ｍｌ）
（２）Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴ繊維の低ｐＨ溶出（条件１）
（３）Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴ繊維の低ｐＨ溶出（条件２）
（４）Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴ繊維の低ｐＨ溶出（条件４）
（５）Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴ凝集体の低ｐＨ溶出（条件４）
（６）分子量マーカー
（７）Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴ繊維のプロテアーゼ３Ｃによる切断（条件１）
（８）Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴ繊維のプロテアーゼ３Ｃによる切断（条件２）
（９）Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴ繊維のプロテアーゼ３Ｃによる切断（条件４）
（１０）Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴ凝集体のプロテアーゼ３Ｃによる切断（条件４）
［記：Ｈｉｓ６Ｚ、プロテアーゼ３Ｃ及びウサギＩｇＧの分子量はそれぞれ９，３０及び〜１４６ｋＤａである。］
【０２５２】
図３０から、どの条件下で形成されたかにかかわらず、ＩｇＧは全ての試験された繊維と凝集体から回収されることが自明である。実施例１３も参照。
【０２５３】
実施例２３  −  抗体結合を用いたＺ−Ｒｅｐ４ＣＴへのリンパ球の捕捉
ＩｇＧのＦｃ部分に結合するために、Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴマトリックス、例えば繊維と薄膜を用いることは、捕捉されたＩｇＧが特異的に指向するものの更なる結合の可能性を開く。一つの魅力的な考え方は、細胞親和性リガンドとして、Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴマトリックス上で捕捉したＩｇＧを用いて、多くの異なる細胞型を含む生物学的サンプルからある種の細胞型を単離することであろう。この細胞捕捉アプローチを試験するために、Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴ繊維と薄膜を、ヒトＴリンパ球の細胞表面でＣＤ３分子に特異的に指向したＩｇＧに結合させた。捕捉された細胞を、蛍光顕微鏡によって分析した。
【０２５４】
Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴ（配列番号１４）のタンパク質の発現および精製は、前述したように行った。精製されたタンパク質は、約１ｍｇ／ｍｌに濃縮し、この後繊維および薄膜を前述した手順に従って作成した（薄膜は２４ウェルの組織培養プレート中で作成された）。更に、Ｒｅｐ４ＣＴ（配列番号２０）コントロール繊維および薄膜を約１ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液から同様にして調製した。
【０２５５】
マトリックス上でヒトリンパ球のＣＤ３分子に指向したＩｇＧを捕捉するため、繊維と薄膜をフルオロフォアがコンジュゲートした抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ（ヒトＣＤ３抗原に対するマウスモノクローナルＩｇＧ２ａ、ラベリング：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８）の１：２０希釈ｎｏ１５０μｌに室温で１時間浸漬させた。繊維と薄膜は３００μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、その後それらを倒立ニコンエクリプスＴｉの蛍光顕微鏡（４５５から４９０ｎｍで励起、５００から５４０ｎｍで検出）でＩｇＧ結合について分析した。Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴの繊維と薄膜は両方ともＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８にコンジュゲートしたＩｇＧ抗体を結合し、従ってＺ−Ｒｅｐ４ＣＴのＺドメインがＩｇＧに結合する能力を確認している。ＩｇＧに曝露していないＺ−Ｒｅｐ４ＣＴマトリックスはこの選択された領域で蛍光シグナルを示さず、Ｒｅｐ４ＣＴのコントロールの繊維と薄膜はＩｇＧに曝露した場合でさえも蛍光を示さない。
【０２５６】
単核細胞（即ち、リンパ球と単球）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配分離培地中で室温での勾配遠心分離により（３０分、４００×ｇ）新たに収集したヒト末梢血から分離した；。遠心分離後に単核細胞画分を回収し、ＰＢＳで２回洗浄し、その後細胞を２０ｍｌのＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ培地に再懸濁した。単球枯渇は、Ｔ−７５組織培養フラスコに細胞懸濁液を転送し、続いて３７℃で９０分間インキュベートすることによって達成された。単球枯渇後に、懸濁液中の細胞は回収され、リンパ球の総数は１１×１０６と数えられた。
【０２５７】
リンパ球をＺ−Ｒｅｐ４ＣＴ（配列番号１４）マトリックスに結合させるために、リンパ球（１ｍｌ，〜０．３７×１０６細胞／ｍｌ）が繊維と薄膜に適用され、続いて＋４℃で３０分間インキュベートした（穏やかに揺らしながら）。次に、繊維と薄膜はＰＢＳ／２％ＦＣＳ（ｐＨ７．４）の３ｍｌで３回洗浄した。結合した細胞は、４℃で１５分間、２％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）に固定された。細胞核は、２００μｌのＤＡＰＩ（１μｇ／ｍｌ）染色溶液中に、室温で５分間、結合した細胞を有する繊維および薄膜を浸漬することによって染色し、その後３００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。３００μｌの体積のＰＢＳが各繊維と薄膜に添加され、その後倒立ニコンエクリプスＴｉ機器（３８０から３９５ｎｍで励起、４１５から４７５ｎｍで検出）を用いる蛍光顕微鏡分析した。
【０２５８】
Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴ繊維の写真（非表示）は、抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧ抗体に曝されていない繊維に対していくつか結合したリンパ球を示しているが、一方、ＩｇＧに曝されている繊維はより多くのリンパ球に結合しているように見える。Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴ薄膜の場合、ＩｇＧに曝された薄膜のみならずＩｇＧに曝されていない薄膜においても染色された細胞が明らかに目に見える。しかし、薄膜においてもまた、細胞の結合前に抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧに曝された薄膜は細胞の結合前にＩｇＧに曝されていない薄膜よりもより多くの細胞が結合しているように見える。更に、Ｒｅｐ４ＣＴ（配列番号２０）のコントロールの繊維と薄膜は全くリンパ球の結合を示していない。
【０２５９】
この実験において、蛍光顕微鏡によって、Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴの繊維と薄膜は、Ｒｅｐ４ＣＴのものとは対照的に、蛍光標識されたＩｇＧ抗体、つまりマウス抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧに結合する能力を有することが示されている。更に、Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴ繊維と薄膜の両方とも、ヒトＴリンパ球を特異的に認識するＩｇＧ抗体を保有するか又は保有しないに関わらず、リンパ球に結合する能力を有する。これは、Ｚドメイン自体がヒトリンパ球のための多少の親和性を有することを示唆し得る。しかし、Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴマトリックスに対する結合細胞の数は、細胞結合の前にＩｇＧでコーティングたときにわずかに増加しているように見える。結合した細胞がＴ型のリンパ球であるかどうかを知ることができるように、他の型のリンパ球（例えば、Ｂリンパ球およびＮＫ細胞）からＴリンパ球を区別するために、ヒトＣＤ３分子に指向した二次抗体を適用することが必要である。
【０２６０】
実施例２４  −  ヒト血漿からのアルブミンのＡｂｄ−Ｒｅｐ４ＣＴ薄膜への結合
薄膜中でのＡｂｄドメイン（配列番号１６の残基１３から５８）の接近性、及びＡｂｄ−Ｒｅｐ４ＣＴ薄膜のアルブミン結合する能力を評価するために、ヒト血漿をアルブミン源として使用した。結合したアルブミンを溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０２６１】
実施例７で調製したＡｂｄ−Ｒｅｐ４ＣＴ（配列番号１６）の６つの薄膜を、５００μｌのヒト血漿（１：５希釈）とともに室温で１時間インキュベートした。６００μｌのＰＢＳで３回洗浄した後、結合したアルブミンを、溶出緩衝液（０．５Ｍ酢酸、１Ｍ尿素、１００ｍＭのＮａＣｌ）で約２．７までｐＨを下げることによって５００μｌで溶出し、その後溶出画分を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図３１）。また実施例７で調製されたＲｅｐ４ＣＴ（配列番号２０）の薄膜がコントロール材料として使用され、同じ方法で処理された。
【０２６２】
図３１に示すゲルは以下に従ってロードされた：
（１）０．７μｌロードされたヒト血漿（１：５０）
（２−７）１４μｌロードされたＡｂｄ−Ｒｅｐ４ＣＴ、薄膜の六つ組（Ｈｅｘａｐｌｉｃａｔｅ）
（８）１４μｌロードされたヒト血漿とインキュベートした空のウェル
（９）分子量マーカー
（１０−１２）１４μｌロードされたＲｅｐ４ＣＴ、薄膜の三つ組。
【０２６３】
Ａｂｄ−Ｒｅｐ４ＣＴの全６つの薄膜はヒト血漿からのアルブミンに結合している（レーン２−７）。これらのＡｂｄ−Ｒｅｐ４ＣＴ薄膜の溶出画分において単一のアルブミンのバンド（〜６０ｋＤａ）のみが現れるため、それらはヒト血漿からはいかなるものにも非特異的には結合しないように見える。Ｒｅｐ４ＣＴの薄膜は、溶出画分で少しもアルブミンを示していない（レーン１０−１２）。
【０２６４】
薄膜の安定性を調べるために、以前に一回使用され、ＰＢＳで２９日間保管（＋４℃）されていたＡｂｄ−Ｒｅｐ４ＣＴ薄膜のアルブミン結合能を再び試験した。Ａｂｄ−Ｒｅｐ４ＣＴの６つの繊維を５００μｌのヒト血漿（１：５希釈）と共に室温で１時間インキュベートした。６００μｌのＰＢＳで３回洗浄した後、結合したアルブミンを、溶出緩衝液（０．５Ｍ酢酸、１Ｍ尿素、１００ｍＭのＮａＣｌ）で約２．７までｐＨを下げることによって５００μｌで溶出し、その後溶出画分を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（非表示）。Ｒｅｐ４ＣＴの薄膜がコントロール材料として使用され、同じ方法で処理された。
【０２６５】
Ａｂｄ−Ｒｅｐ４ＣＴの全６つの薄膜はＰＢＳで２９日間保存した後、ヒト血漿からのアルブミンに結合する能力を保持していた。Ｒｅｐ４ＣＴの薄膜は、溶出画分で少しもアルブミンを示さなかった。
【０２６６】
実施例２５  −  Ａｂｄ−Ｒｅｐ４ＣＴ薄膜の洗浄
（Ａ）Ａｂｄ−Ｒｅｐ４ＣＴ薄膜の尿素処理
Ａｂｄ−Ｒｅｐ４ＣＴ（配列番号１６）の薄膜（合計６つの薄膜、以前実施例２４で使用）を室温で２０分間８Ｍの尿素を５００μｌとともにインキュベートし、その後それらを６００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。次に繊維を５００μｌのヒト血漿（１：５希釈）中で室温で１時間インキュベートした。６００μｌのＰＢＳで３回洗浄した後、結合したアルブミンを、溶出緩衝液（即ち、０．５Ｍ酢酸、１Ｍ尿素、１００ｍＭのＮａＣｌ）で約２．７までｐＨを下げることによって５００μｌで溶出し、その後溶出画分を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（非表示）。Ａｂｄ−Ｒｅｐ４ＣＴの全６つの薄膜は８Ｍの尿素で処理した後、ヒト血漿からのアルブミンになお結合できる。
【０２６７】
（Ｂ）Ａｂｄ−Ｒｅｐ４ＣＴ繊維と薄膜のＮａＯＨ処理
Ａｂｄ−Ｒｅｐ４ＣＴ（配列番号１６）の６つの薄膜を、最初に５００μｌのヒト血漿（１：５希釈）中で室温で１時間インキュベートした。６００μｌのＰＢＳで３回洗浄した後、結合したアルブミンを、溶出緩衝液（０．５Ｍ酢酸、１Ｍ尿素、１００ｍＭのＮａＣｌ）で約２．７までｐＨを下げることによって５００μｌで溶出し、その後溶出画分を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。同じ手順をＲｅｐ４ＣＴ（配列番号２０）コントロール薄膜に実施した。
【０２６８】
ＮａＯＨによる処理において、Ａｂｄ−Ｒｅｐ４ＣＴ（配列番号１６）薄膜の３つのセットの三つ組を用いた：（ｉ）８Ｍの尿素で以前に処理された薄膜（上の（Ａ）を参照）を１ＭのＮａＯＨで処理し、その後アルブミンに結合させる；（ｉｉ）以前に未使用の薄膜を１ＭのＮａＯＨで処理し、その後アルブミンに結合させる；（ｉｉｉ）以前に未使用の薄膜をアルブミン結合について分析だけ行う。アルブミンの結合について上で使用されるＡｂｄ−Ｒｅｐ４ＣＴ繊維は、１ＭのＮａＯＨで処理され、その後再びアルブミンに結合させる。
【０２６９】
ＮａＯＨによる処理において、Ａｂｄ−Ｒｅｐ４ＣＴの繊維と薄膜［薄膜セット（ｉ）と（ｉｉ）］は室温で〜２０分間、５００μｌの１ＭのＮａＯＨとインキュベートし、その後、それらを６００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。次に繊維と全３セットの薄膜を５００μｌのヒト血漿（１：５希釈）中で室温で１時間インキュベートした。６００μｌのＰＢＳで３回洗浄した後、結合したアルブミンを、溶出緩衝液（０．５Ｍ酢酸、１Ｍ尿素、１００ｍＭのＮａＣｌ）で約２．７までｐＨを下げることによって５００μｌで溶出し、その後溶出画分を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図３２）。
【０２７０】
図３２のゲルは以下に従ってロードされた：
（１）１．４μｌロードされたヒト血漿（１：５）
（２−３，５）８Ｍの尿素と１ＭのＮａＯＨで処理され、アルブミン結合させて、１４μｌロードされたＡｂｄ−Ｒｅｐ４ＣＴ薄膜の三つ組。
（４）分子量マーカー
（６−８）アルブミン結合の前に未処理であって１４μｌロードされたＡｂｄ−Ｒｅｐ４ＣＴ薄膜の三つ組。
（９−１１）アルブミン結合の前に１ＭのＮａＯＨで処理され、１４μｌロードされたＡｂｄ−Ｒｅｐ４ＣＴ薄膜の三つ組。
（１２）アルブミン結合の前に未処理であって１４μｌロードされたＡｂｄ−Ｒｅｐ４ＣＴ繊維。
（１３）アルブミン結合の前に１ＭのＮａＯＨで処理され、１４μｌロードされたＡｂｄ−Ｒｅｐ４ＣＴ繊維。
（１４）アルブミン結合の前に未処理であって１４μｌロードされたＲｅｐ４ＣＴ繊維。
【０２７１】
Ａｂｄ−Ｒｅｐ４ＣＴ繊維は１ＭのＮａＯＨによる処理の前と後の両方で明らかにアルブミン（〜６０ｋＤａ）に結合するが（それぞれレーン１２と１３）、一方対応する未処理のＲｅｐ４ＣＴ繊維は少しもアルブミン結合を示さなない（レーン１４）。全てのＡｂｄ−Ｒｅｐ４ＣＴ薄膜は、アルブミン結合の前に、１ＭのＮａＯＨにより処理されない薄膜と処理された薄膜の間で、バンド強度に明らかな相違は示していない（それぞれレーン６−８及びレーン９−１１）。更に、アルブミン結合の前に、８Ｍの尿素と１ＭのＮａＯＨの両方で処理された薄膜は、別の２組の薄膜と比較して、溶出アルブミンのバンド（レーン２、３、及び５）の強度に減少を示している。
【０２７２】
実施例２６  −  ウサギ及びマウスＩｇＧのＣ２−Ｒｅｐ４ＣＴ薄膜と繊維に対する結合
Ｃ２−Ｒｅｐ４ＣＴ繊維と薄膜のＣ２ドメイン（配列番号１８の残基１３−６７）の接近性は以下のように分析される。室温で１時間、Ｃ２−Ｒｅｐ４ＣＴ（配列番号１８）の２つの薄膜と一つの繊維を５００μｌのウサギ血清（１：５希釈）とインキュベートし、一方Ｃ２−Ｒｅｐ４ＣＴ（配列番号１８）の別の２つの薄膜と一つの繊維を〜５０μｇ／ｍｌのマウスＩｇＧ１（モノクローナル抗ウサギ免疫グロブリン、マウスＩｇＧ１アイソタイプ、マウス腹水）の５００μｌとともにインキュベートした。６００μｌのＰＢＳで３回洗浄した後、結合したＩｇＧを、溶出緩衝液（０．５Ｍ酢酸、１Ｍ尿素、１００ｍＭのＮａＣｌ）で約２．７までｐＨを下げることによって５００μｌで溶出し、その後溶出画分を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図３３）。Ｒｅｐ４ＣＴ（配列番号２０）の薄膜と繊維がコントロール材料として使用され、同じ方法で処理された。
【０２７３】
図３３のゲルは以下に従ってロードされた：
（１）マウス腹水（ＩｇＧ１のアイソタイプ）
（２）ウサギ血清（１：５０）
（３−４）Ｃ２−Ｒｅｐ４ＣＴ、薄膜、マウスＩｇＧ１の二つ組
（５、７）Ｃ２−Ｒｅｐ４ＣＴ、薄膜、ウサギ血清の二つ組
（６）分子量マーカー
（８）Ｃ２−Ｒｅｐ４ＣＴ、繊維、マウスＩｇＧ１
（９）Ｃ２−Ｒｅｐ４ＣＴ、繊維、ウサギ血清
（１０−１１）Ｒｅｐ４ＣＴ、薄膜、マウスＩｇＧ１の二つ組
（１２）Ｒｅｐ４ＣＴ、薄膜、ウサギ血清
（１３）Ｒｅｐ４ＣＴ、繊維、ウサギ血清
（１４）Ｒｅｐ４ＣＴ、繊維、マウスＩｇＧ１
［記：非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件下で、ウサギＩｇＧは〜１４６ｋＤａでマウスＩｇＧは〜１６０ｋＤａである。］
【０２７４】
腹水からのマウスＩｇＧ１のＣ２−Ｒｅｐ４ＣＴ薄膜に対する結合はＳＤＳ−ＰＡＧＥの溶出画分に検出可能なＩｇＧのバンドを与えなかったが（レーン３−４）、Ｃ２−Ｒｅｐ４ＣＴ繊維はマウスＩｇＧ１と結合したように見える（レーン８、マウスＩｇＧは〜１６０ｋＤａである）。しかし、Ｃ２−Ｒｅｐ４ＣＴの薄膜（レーン５及び７）と繊維（レーン９）はウサギ血清からのＩｇＧの結合を示している。マウスＩｇＧ１の起源がここでが腹水の形態にあるので、この液体中で何かがどういうわけか薄膜におけるＣ２とＩｇＧ１の間の結合を乱している事例である可能性がある。Ｒｅｐ４ＣＴのコントロールの薄膜と繊維は、溶出画分で少しもＩｇＧを示さなかった（レーン１０−１４）。
【０２７５】
実施例２７−ヒト血漿からのＩｇＧのＣ２−Ｒｅｐ４ＣＴ薄膜への結合
Ｃ２−Ｒｅｐ４ＣＴのＩｇＧに結合する能力をさらに調べるため、Ｃ２−Ｒｅｐ４ＣＴ（配列番号１８），Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴ（配列番号１４）及びＲｅｐ４ＣＴ（配列番号２０）の各々の２つの薄膜を、ヒト血漿（１：５希釈）の５００μｌとともに室温で１時間インキュベートした。６００μｌのＰＢＳで３回洗浄した後、結合したＩｇＧを、溶出緩衝液（０．５Ｍ酢酸、１Ｍ尿素、１００ｍＭのＮａＣｌ）で約２．７までｐＨを下げることによって５００μｌで溶出し、その後溶出画分を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図３４）。
【０２７６】
図３４のゲルは以下に従ってロードされた：
（１）１．４μｌロードされたヒト血漿（１：５）
（２）分子量マーカー
（３−４）１４μｌロードされたＣ２−Ｒｅｐ４ＣＴ、薄膜の二つ組。
（５−６）１４μｌロードされたＺ−Ｒｅｐ４ＣＴ、薄膜のニつ組。
（７−８）１４μｌロードされたＲｅｐ４ＣＴ、薄膜のニつ組。
【０２７７】
図３４において、Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴ薄膜はヒト血漿からのＩｇＧに明らかに結合していることが見てとれる（レーン５−６）。Ｃ２−Ｒｅｐ４ＣＴ薄膜はまた、溶出画分（レーン３−４）に弱いＩｇＧのバンドを示す。Ｒｅｐ４ＣＴのコントロール薄膜はヒト血漿からのアルブミンに結合しないことを示している（レーン７−８）。
【０２７８】
実施例２８  −  ＡＴＲ−ＦＴＩＲを用いたＺ−Ｒｅｐ４ＣＴ及びＲｅｐ４ＣＴの繊維と薄膜の二次構造の比較
Ｚドメインの二次構造はその活性なコンフォーメーションにおいてαヘリックスであり、一方Ｒｅｐ４ＣＴの二次構造は主にβシート型である。Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴ繊維と薄膜のＺドメインが正しくフォールドした場合、Ｒｅｐ４ＣＴ薄膜と繊維のと比較してそれらのマトリックスに高いαヘリックス含量を期待することができよう。二次構造の違いを調べるために、Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴとＲｅｐ４ＣＴの繊維と薄膜を分光学的方法である減衰全反射型フーリエ変換赤外分光光度計（ＡＴＲ−ＦＴＩＲ）により分析し、それによりβシート構造（バンド位置：１６２３−１６４１，１６７４−１６９５ｃｍ−１）からαヘリックス（バンド位置：１６４８−１６５７ｃｍ−１）を識別することが可能である。
【０２７９】
Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴ（配列番号１４）の一つの薄膜及びＲｅｐ４ＣＴ（配列番号２０）の一つを、１５μｌのタンパク質溶液を室温で一晩空気乾燥させることにより作成した。Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴとＲｅｐ４ＣＴについて繊維が作成され、その後張力下で、室温で〜３０分間空気乾燥した。ＡＴＲ−ＦＴＩＲは、その後、ＢｒｕｋｅｒのプラチナＡＴＲユニットを用いて記録した。繊維と薄膜の両方のＩＲスペクトル（非表示）は、Ｚ−Ｒｅｐ４ＣＴがＲｅｐ４ＣＴよりも高いαヘリックス含量を有することを示し、これは正しくフォールドしたＺドメインの存在を示している。このことは、本発明によるＺ−Ｒｅｐ４ＣＴ構造中のＺドメインの維持された機能に合致しており、例えば実施例２−５、１７−１９及び２２−２３を参照。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２３】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【配列表】
2013544508000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年12月14日(2012.12.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩｇＧの結晶化可能断片（Ｆｃ）領域及びＩｇＧ又はその誘導体を含む分子からなる群から選択される有機ターゲットと選択的相互作用が可能なタンパク質構造であって、前記タンパク質構造が、反復構造単位として、有機ターゲットと選択的相互作用が可能である、部分Ｂ、ＲＥＰ及びＣＴを含む組換え融合タンパク質を含むポリマーであり、該ポリマーが１００を超える融合タンパク質構造単位を含んでおり、
Ｂは３０アミノ酸残基を超える非スピドロイン部分であり、有機ターゲットとの相互作用の能力を提供し、Ｂ部分が、ブドウ球菌プロテインＡのＺドメイン、ブドウ球菌プロテインＡ及びそのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣドメイン；及びこれらのアミノ酸配列の何れかに対して少なくとも７０％の同一性を有するタンパク質断片から選択され；
ＲＥＰ及びＣＴ部分がポリマーを形成する能力を提供し；
ＲＥＰは、Ｌ（ＡＧ）ｎＬ、Ｌ（ＡＧ）ｎＡＬ、Ｌ（ＧＡ）ｎＬ、Ｌ（ＧＡ）ｎＧＬからなる群から選択される、７０から３００アミノ酸残基の部分であり、
ｎは２から１０の整数であり；
各個々のＡセグメントは８から１８アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、アミノ酸残基の０から３はＡｌａではなく、残りのアミノ酸残基がＡｌａであり；
各個々のＧセグメントは１２から３０アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、少なくとも４０％のアミノ酸残基がＧｌｙであり；及び
各個々のＬセグメントは、０から２０アミノ酸残基のリンカーアミノ酸配列であり；及び
ＣＴが７０から１２０アミノ酸残基の部分であり、配列番号９に少なくとも５０％の同一性、又は配列番号７に少なくとも８０％の同一性を有するタンパク質構造。
【請求項２】
Ｂ部分が、ブドウ球菌プロテインＡのＺドメイン、ブドウ球菌プロテインＡのＢドメイン、及びこれらのアミノ酸配列の何れかに対して少なくとも７０％の同一性を有するタンパク質断片からなる群から選択される、請求項１に記載のタンパク質構造。
【請求項３】
Ｂ部分が、ブドウ球菌プロテインＡのＺドメイン、及びブドウ球菌プロテインＡのＺドメインに対して少なくとも７０％の同一性を有するタンパク質断片からなる群から選択される、請求項２に記載のタンパク質構造。
【請求項４】
Ｂ部分が、ブドウ球菌プロテインＡのＺドメインである、請求項３に記載のタンパク質構造。
【請求項５】
前記組換え融合タンパク質が式
Ｂｘ−ＲＥＰ−Ｂｙ−ＣＴ−Ｂｚ及びＢｘ−ＣＴ−Ｂｙ−ＲＥＰ−Ｂｚにより定められるタンパク質の群から選択され、
ｘ、ｙ及びｚは０から５の整数であり；
かつｘ＋ｙ＋ｚ≧１である請求項４に記載のタンパク質構造。
【請求項６】
前記組換え融合タンパク質が式
Ｂｘ−ＲＥＰ−ＣＴ、Ｂｘ−ＣＴ−ＲＥＰ、ＲＥＰ−ＣＴ−Ｂｚ及びＣＴ−ＲＥＰ−Ｂｚにより定められるタンパク質の群から選択され、
ｘ及びｚは１から５の整数である、請求項５に記載のタンパク質構造。
【請求項７】
前記組換え融合タンパク質が式
Ｂ−ＲＥＰ−ＣＴ、Ｂ−ＣＴ−ＲＥＰ、ＲＥＰ−ＣＴ−Ｂ及びＣＴ−ＲＥＰ−Ｂにより定められるタンパク質の群から選択される、請求項６に記載のタンパク質構造。
【請求項８】
Ｂ部分が、配列番号６から１０の何れかに対して３０％未満の同一性を有する、請求項１から７の何れかに記載のタンパク質構造。  
【請求項９】
前記タンパク質構造が少なくとも２次元で少なくとも０．１μｍの大きさを有する、請求項１から８の何れかに記載のタンパク質構造。
【請求項１０】
前記タンパク質構造が、繊維、薄膜、発泡体、網、メッシュ、球及びカプセルからなる群から選択される物理的形態である、請求項１から９の何れかに記載のタンパク質構造。
【請求項１１】
ＣＴ部分が、配列番号９に対して少なくとも５０％の同一性と配列番号７に対して少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１から１０の何れかに記載のタンパク質構造。
【請求項１２】
ＣＴ部分が、配列番号７に対して少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１から１０の何れかに記載のタンパク質構造。
【請求項１３】
ＣＴ部分が配列番号７である、請求項１２に記載のタンパク質構造。
【請求項１４】
融合タンパク質が、配列番号１４、及び配列番号１４に対して少なくとも８０％の同一性を有するタンパク質からなる群から選択される、請求項１から１３の何れかに記載のタンパク質構造。
【請求項１５】
（ａ）請求項１から１４の何れか一項に記載の組換え融合タンパク質を提供し；
（ｂ）融合タンパク質を、組換え融合タンパク質を含むポリマーの形成を達成するための条件にさらす工程を含み、ＩｇＧの結晶化可能断片（Ｆｃ）領域及びＩｇＧ又はその誘導体を含む分子からなる群から選択される有機ターゲットに対する結合活性を示す、請求項１から１４の何れか一項に記載のタンパク質構造を提供するための方法。
【請求項１６】
ＩｇＧの結晶化可能断片（Ｆｃ）領域及びＩｇＧ又はその誘導体を含む分子からなる群から選択される有機ターゲットの固定化のための親和性培地であって、該親和性培地が請求項１から１４の何れか一項に記載の融合タンパク質を含み、Ｂ部分が、有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である親和性培地。
【請求項１７】
前記親和性培地が請求項１から１４の何れか一項に記載のタンパク質構造を含み、該タンパク質構造が組換え融合タンパク質を含むポリマーである、請求項１６に記載の親和性培地。
【請求項１８】
前記有機ターゲットを更に含み、Ｂ部分が前記有機ターゲットと選択的相互作用が可能であり該有機ターゲットに結合する、請求項１６又は１７の何れか一項に記載される親和性培地。
【請求項１９】
前記有機ターゲットが第二有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である、請求項１８に記載の親和性培地。
【請求項２０】
前記タンパク質構造が薄膜の物理的形態である、請求項１７から１９の何れか一項に記載の親和性培地。
【請求項２１】
細胞表面に存在する有機ターゲットを有する細胞の培養のための細胞足場材料であって、前記細胞足場材料が請求項１から１４の何れか一項に記載のタンパク質構造を含み、前記細胞足場材料が、ＩｇＧの結晶化可能断片（Ｆｃ）領域及びＩｇＧ又はその誘導体を含む分子からなる群から選択される中間体有機ターゲットを更に含み、Ｂ部分が、前記中間体有機ターゲットとの選択的相互作用が可能であり前記中間体有機ターゲットに結合し、前記中間体有機ターゲットが細胞表面に存在する有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である細胞足場材料。
【請求項２２】
前記タンパク質構造が薄膜の物理的形態である、請求項２１に記載の細胞足場材料。
【請求項２３】
請求項２１又は２２の何れか一項に記載の細胞足場材料と細胞との組み合わせ。
【請求項２４】
サンプルからのＩｇＧの結晶化可能断片（Ｆｃ）領域及びＩｇＧ又はその誘導体を含む分子からなる群から選択される有機ターゲットの分離における請求項１から１４の何れか一項に記載のタンパク質構造の使用。
【請求項２５】
細胞の培養における請求項１から１４の何れか一項に記載のタンパク質構造の使用。
【請求項２６】
有機ターゲットを含むサンプルを提供し；
前記親和性培地が有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である、請求項１６から２０の何れか一項に記載の親和性培地を提供し；
前記親和性培地を、親和性培地と有機ターゲット間の結合を達成するのに適した条件下で前記サンプルと接触させ；及び
非結合サンプルを除去する工程を含む、サンプルからのＩｇＧの結晶化可能断片（Ｆｃ）領域及びＩｇＧ又はその誘導体を含む分子からなる群から選択される有機ターゲットの分離のための方法。
【請求項２７】
第一有機ターゲットと第二有機ターゲット間の結合を達成するために適した条件下で、第一の有機ターゲットとの選択的相互作用が可能である、第二の有機ターゲットと、前記親和性培地及び固定化有機ターゲットを接触させる工程を更に含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
親和性培地と有機ターゲット間の結合を達成するために前記親和性培地と前記サンプルを接触させると、親和性培地中の融合タンパク質が、請求項１から１４の何れか一項に記載のタンパク質構造として存在する、請求項２６又は２７の何れか一項に記載の方法。
【請求項２９】
親和性培地と有機ターゲットの間の結合を達成するために前記親和性培地と前記サンプルを接触させると、親和性培地中の融合タンパク質が溶解して存在し、有機ターゲットに結合した融合タンパク質の複合体に、請求項１から１４の何れか一項に記載の融合タンパク質構造を形成させる、請求項２６又は２７の何れか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記親和性培地上で固定化ターゲットの存在を検出し、かつ任意で定量する工程を更に含む、請求項２６から２９の何れか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記親和性培地から有機ターゲットを放出し、及び回収する工程を更に含む、請求項２６から３０の何れか一項に記載の方法。
【請求項３２】
化学的処理及び／又は滅菌加熱処理により親和性培地を再生する最終工程を更に含む、請求項２６から３１の何れか一項に記載の方法。
【請求項３３】
化学的処理がＮａＯＨ及び／又は尿素による処理を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
目的の細胞を含むサンプルを提供し；
前記サンプルを請求項２１又は２２の何れか一項に記載の細胞足場材料に適用し、前記細胞足場材料が細胞表面に存在する有機ターゲットとの選択的相互作用が可能であり；
前記細胞を、細胞表面の有機ターゲットと前記細胞足場材料との間の結合により、前記細胞足場材料に対して固定化させることを含む、細胞を固定化するための方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の細胞足場材料に目的の細胞を固定化し
それに適用された細胞を有する前記細胞足場材料を細胞培養に適した条件下で維持することを含む、細胞を培養するための方法。
【請求項３６】
前記タンパク質構造が薄膜、繊維又は発泡体の物理的形態である、請求項２６から３５の何れか一項に記載の方法。
【請求項３７】
配列番号１４からなる組換え融合タンパク質。
【請求項３８】
請求項３７に記載の融合タンパク質及び配列番号１５をコードする核酸からなる群から選択される、単離されたポリ核酸。
【請求項３９】
ａ）適切な宿主において、請求項３７に記載の融合タンパク質を発現し：及び
ｂ）融合タンパク質を含む混合物を得て、任意で融合タンパク質を単離する工程を含む、融合タンパク質を生産する方法。
【請求項４０】
タンパク質構造が組換え融合タンパク質を含むポリマーであり、ＩｇＧの結晶化可能断片（Ｆｃ）領域及びＩｇＧ又はその誘導体を含む分子からなる群から選択される有機ターゲットと選択的相互作用が可能な該タンパク質構造の生成のための、請求項１から１４の何れか一項に記載の組換え融合タンパク質の使用。
【国際調査報告】
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