(57)【要約】主として２Ｓキャノーラタンパク質からなり、改善された溶解特性を有する新規なキャノーラタンパク質生成物は、２Ｓキャノーラタンパク質の割合が増加し、７Ｓキャノーラタンパク質の割合が減少しており、約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．未満のタンパク質含量を有する。新規なキャノーラタンパク質単離物は、キャノーラタンパク質のミセルの形成および沈殿による上澄み水溶液を加熱処理または等電沈殿させて、７Ｓタンパク質の沈殿をもたらし、これを沈降させて除去することによって形成する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥重量基準（ｄ．ｂ．）で約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）未満のタンパク質含量を有し、単離物中に存在するキャノーラタンパク質の少なくとも約８５ｗｔ％の２Ｓキャノーラタンパク質および約１５ｗｔ％未満の７Ｓキャノーラタンパク質を含む、キャノーラタンパク質生成物。
【請求項２】
前記単離物が、前記単離物中に存在するキャノーラタンパク質の少なくとも約９０ｗｔ％の２Ｓキャノーラタンパク質および約１０ｗｔ％未満の７Ｓキャノーラタンパク質を含む、請求項１に記載のキャノーラタンパク質生成物。
【請求項３】
少なくとも約６０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有する、請求項１に記載のキャノーラタンパク質生成物。
【請求項４】
キャノーラタンパク質のミセルの形成による上澄み水溶液、部分的に濃縮された上澄み液または完全に濃縮された上澄み液の加熱処理、沈殿の除去、および残留する溶液の乾燥により得られる、請求項１に記載のキャノーラタンパク質生成物。
【請求項５】
キャノーラタンパク質のミセルの形成による上澄み水溶液、部分的に濃縮された上澄み液、または完全に濃縮された上澄み液の等電沈殿、沈殿の除去、および残留する溶液の乾燥により得られる、請求項１に記載のキャノーラタンパク質生成物。
【請求項６】
２Ｓキャノーラタンパク質の割合が増加しているキャノーラタンパク質生成物の調製方法であって、
（ａ）主として２Ｓタンパク質からなる、２Ｓおよび７Ｓタンパク質の水溶液を用意するステップと、
（ｂ）前記水溶液を加熱処理して、７Ｓキャノーラタンパク質を沈殿させるステップと、
（ｃ）前記水溶液から分解した７Ｓタンパク質を除去するステップと、
（ｄ）約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．未満のタンパク質含量を有し、２Ｓキャノーラタンパク質の割合が増加しているキャノーラタンパク質生成物を回収するステップと
を含む方法。
【請求項７】
前記加熱処理ステップを、前記水溶液中に存在する７Ｓキャノーラタンパク質の少なくとも約５０ｗｔ％を分解するのに十分な温度および時間条件下で行う、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記加熱処理ステップが、前記水溶液中に存在する７Ｓキャノーラタンパク質の少なくとも７５％、７Ｓキャノーラタンパク質を分解する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記水溶液を約７５°〜約９５℃の温度で約５〜約１５分間、加熱することにより、前記加熱処理ステップを行う、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
２Ｓおよび７Ｓキャノーラタンパク質の前記水溶液が、キャノーラタンパク質のミセル形成および沈殿による上澄み液、部分濃縮上澄み液または濃縮上澄み液である、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
キャノーラタンパク質の前記ミセル形成を、
（ａ）少なくとも約５℃の温度でキャノーラ油糧種子粗粉を抽出して、前記キャノーラ油糧種子粗粉中のタンパク質を可溶化し、タンパク質水溶液を形成するステップと、
（ｂ）前記タンパク質水溶液を残留油糧種子粗粉から分離するステップと、
（ｃ）選択的膜技術によってイオン強度を実質的に一定に維持しながら、前記タンパク質水溶液の濃度を少なくとも約２００ｇ／Ｌに増加させて、濃縮タンパク質溶液を得るステップと、
（ｄ）前記濃縮タンパク質溶液を、約１５℃未満の温度の冷水中に希釈して、前記タンパク質のミセルを形成するステップと、
（ｅ）沈降したタンパク質ミセル塊から上澄み液を分離するステップと
によって行う、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記加熱処理の前に、前記上澄み液を約１００〜約４００ｇ／Ｌのタンパク質濃度に濃縮する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記上澄み液を約２００〜約３００ｇ／Ｌのタンパク質濃度に濃縮する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記濃縮ステップを、約３０００〜約１０００００ダルトンの分画分子量を有する膜を使用した限外濾過によって行う、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記加熱処理ステップの前に、限外濾過によって得られた前記濃縮上澄み液を透析濾過に供する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記透析濾過ステップを、約３０００〜約１０００００ダルトンの分画分子量を有する膜を使用して、約２〜約２０倍容、好ましくは約５〜約１０倍容の水を使用して行う、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記キャノーラタンパク質単離物が、少なくとも約６０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項１８】
２Ｓキャノーラタンパク質の割合が増加しているキャノーラタンパク質生成物の調製方法であって、
（ａ）主として２Ｓタンパク質からなる、２Ｓおよび７Ｓタンパク質の水溶液を用意するステップと、
（ｂ）前記水溶液から７Ｓタンパク質を等電沈殿させるステップと、
（ｃ）前記水溶液から沈殿した７Ｓタンパク質を除去するステップと、
（ｄ）約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．未満のタンパク質含量を有し、前記２Ｓおよび７Ｓタンパク質の水溶液と比較して、２Ｓキャノーラタンパク質の割合が増加しているキャノーラタンパク質生成物を回収するステップと
を含む方法。
【請求項１９】
前記等電沈殿を、前記水溶液中に存在する７Ｓキャノーラタンパク質の少なくとも約５０ｗｔ％を沈殿させるのに十分なｐＨおよび塩条件下で行う、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記等電沈殿を、前記水溶液中に存在する７Ｓキャノーラタンパク質の少なくとも約７５ｗｔ％を沈殿させるのに十分なｐＨおよび塩条件下で行う、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記等電沈殿を、
（ｉ）前記水溶液に塩を加えて少なくとも約０．３ｍＳの導電率にするステップと、
（ｉｉ）前記塩を加えた水溶液のｐＨを約２．０〜約４．０の値に調整するステップと
により行う、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記導電率が、約１０〜約２０ｍＳであり、前記ｐＨが約３．０〜約３．５である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記２Ｓおよび７Ｓキャノーラタンパク質の水溶液が、キャノーラタンパク質のミセルの形成および沈殿による上澄み液、部分的に濃縮された上澄み液または濃縮された上澄み液である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記キャノーラタンパク質のミセルの形成を、
（ａ）少なくとも約５℃の温度でキャノーラ油糧種子粗粉を抽出して、前記キャノーラ油糧種子粗粉中のタンパク質を可溶化して、タンパク質水溶液を形成するステップと、
（ｂ）前記タンパク質水溶液を残留油糧種子粗粉から分離するステップと、
（ｃ）選択的膜技術によってイオン強度を実質的に一定に維持しながら、前記タンパク質水溶液の濃度を少なくとも約２００ｇ／Ｌに増加させて、濃縮タンパク質溶液を得るステップと、
（ｄ）前記濃縮タンパク質溶液を、約１５℃未満の温度の冷水中に入れて希釈して、前記タンパク質のミセルを形成するステップと、
（ｅ）沈降したタンパク質ミセル塊から上澄み液を分離するステップと
によって行う、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記等電沈殿の前に、前記上澄み液を約１００〜約３００ｇ／Ｌのタンパク質濃度に濃縮する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記上澄み液を約２００〜約３００ｇ／Ｌのタンパク質濃度に濃縮する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記濃縮ステップを、約３０００〜約１０００００ダルトンの分画分子量を有する少なくとも１つの膜を使用した限外濾過によって行う、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記等電沈殿の前に、限外濾過によって得られた前記濃縮上澄み液を透析濾過に供する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記透析濾過ステップを、約３０００〜約１０００００ダルトンの分画分子量を有する少なくとも１つの膜を使用して、約２〜約２０倍容、好ましくは約５〜約１０倍容の水、食塩水または酸性水を使用して行う、請求項１６に記載の方法。
【請求項３０】
（ｅ）前記キャノーラタンパク質生成物を、水性飲料組成物として処方するステップをさらに含む、請求項６または１８に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１に記載のキャノーラタンパク質生成物の水溶液。
【請求項３２】
キャノーラタンパク質生成物で強化した飲料である、請求項３１に記載の水溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、キャノーラタンパク質生成物の製造、ならびにソフトドリンクおよびスポーツドリンクを含む水溶液におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれた、同時係属の２００５年１月２１日出願の米国特許出願第11/038,086号（米国特許出願公開第2005-0181112号およびWO2005/067729）および２００８年６月２０日出願の米国特許出願第12/213,500号（米国特許出願公開第2008-0299282号およびWO2009/152621）には、上澄み液の加熱処理または等電沈殿による、乾燥重量基準（ｄ．ｂ．）で少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物の製造が記載されており、この上澄み液をキャノーラタンパク質ミセル塊の析出物から部分的に濃縮または濃縮して、上澄み液からキャノーラ７Ｓタンパク質を沈殿させることができる。沈殿したキャノーラ７Ｓタンパク質の除去の後、処理した上澄み液を乾燥する。
【０００３】
このようにして形成されたキャノーラタンパク質単離物は、未処理上澄み液と比較して２Ｓタンパク質含量が増加しており、未処理上澄み液から直接得られるキャノーラタンパク質単離物よりも水溶液中で優れた特性を示す。種々のｐＨ値における等しいまたはより大きい溶解度に加えて、上記特許出願で提供される２Ｓ強化キャノーラタンパク質単離物（２Ｓ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｃａｎｏｌａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓｏｌａｔｅ）は、ソフトドリンクおよびスポーツドリンクに溶液の透明度の向上をもたらし、ソフトドリンクおよびスポーツドリンクなどの酸性飲料を含む、透明なタンパク質強化飲料（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒｔｉｆｉｅｄ  ｂｅｖｅｒａｇｅ）を提供することができる。
【０００４】
キャノーラは、菜種またはアブラナとしても知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／０１８１１１２号
【特許文献２】国際公開第２００５／０６７７２９号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００８／０２９９２８２号
【特許文献４】国際公開第２００９／１５２６２１号
【発明の概要】
【０００６】
上記米国特許出願第11/038,086号および第12/213,500号に記載されている手順を、２Ｓ強化キャノーラタンパク質生成物が、濃縮物であるとみなされる濃度である、少なくとも約６０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．などの約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．未満を含有し、したがって単離物ではないような方法で行うと、同様に広範囲のｐＨ値にわたって完全に可溶性であり、ソフトドリンクおよびスポーツドリンクなどの酸性飲料を含む、透明なタンパク質強化飲料を提供できるキャノーラタンパク質生成物が得られることが今や分かった。
【０００７】
この結果は、上澄み液に行う透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）ステップを省略する、もしくは減少させることにより、または上澄み液に行う限外濾過ステップを早く停止することにより、本明細書において達成され、その結果、これらのステップ中に除去される混入物は少なくなり、したがって、単離物よりも純度が低いキャノーラタンパク質生成物が得られる。
【０００８】
本発明の一態様によると、２Ｓキャノーラタンパク質の割合が増加しているキャノーラタンパク質生成物の調製方法であって、
（ａ）主として２Ｓタンパク質からなる、２Ｓおよび７Ｓタンパク質の水溶液を用意するステップと、
（ｂ）水溶液を加熱処理して、７Ｓキャノーラタンパク質を沈殿させるステップと、
（ｃ）水溶液から、沈殿した７Ｓタンパク質を除去するステップと、
（ｄ）約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．未満のタンパク質含量を有し、２Ｓキャノーラタンパク質の割合が増加しているキャノーラタンパク質生成物を回収するステップと
を含む方法を提供する。
【０００９】
本発明の別の態様によると、２Ｓキャノーラタンパク質の割合が増加しているキャノーラタンパク質生成物の調製方法であって、
（ａ）主として２Ｓタンパク質からなる、２Ｓおよび７Ｓタンパク質の水溶液を用意するステップと、
（ｂ）水溶液から、７Ｓタンパク質を等電沈殿させるステップと、
（ｃ）水溶液から、沈殿した７Ｓタンパク質を除去するステップと、
（ｄ）約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．未満のタンパク質含量を有し、２Ｓおよび７Ｓタンパク質の水溶液と比較して、２Ｓキャノーラタンパク質の割合が増加しているキャノーラタンパク質生成物を回収するステップと
を含む方法を提供する。
【００１０】
本明細書で製造するキャノーラタンパク質生成物は、少なくとも約８５ｗｔ％の２Ｓキャノーラタンパク質および約１５ｗｔ％未満の７Ｓキャノーラタンパク質、好ましくは少なくとも約９０ｗｔ％の２Ｓキャノーラタンパク質および約１０ｗｔ％未満の７Ｓキャノーラタンパク質、より好ましくは可能な限り高い割合の２Ｓタンパク質を含む。上記のように、このようなキャノーラタンパク質生成物は、以下でより詳細に説明する上澄み液、部分濃縮上澄み液および濃縮上澄み液の加熱処理または等電沈殿によって得られる。上澄み液、部分濃縮上澄み液および濃縮上澄み液の加熱処理または等電沈殿により、７Ｓタンパク質の沈殿がもたらされ、これは遠心分離または濾過などの任意の好都合な手段によって、処理した上澄み液から除去することができる。２Ｓタンパク質は処理によって影響されないので、処理は、７Ｓタンパク質の割合を減少させることによって、存在する２Ｓタンパク質の割合を増加させる。
【００１１】
キャノーラタンパク質生成物は、一般的に約ｐＨ２〜約ｐＨ７．５、好ましくは約ｐＨ２〜約ｐＨ４の広範囲のｐＨ値にわたって、水溶液に可溶性であり、一般的に、主として２Ｓタンパク質からなり、調製の同じ実験条件下でのキャノーラタンパク質のミセルの形成および沈殿による上澄み液から直接得られるキャノーラタンパク質生成物と等しいまたはより高い溶解度を有している。さらに、市販のものなどの、炭酸および非炭酸両方のソフトドリンクおよびスポーツドリンクを含み、炭酸および非炭酸両方のスポーツエネルギードリンクを含む、ソフトドリンク中のキャノーラタンパク質生成物の水溶液は、主として２Ｓタンパク質からなり、調製の同じ条件下でのキャノーラタンパク質のミセルの形成および沈殿による上澄み液から直接得られるキャノーラタンパク質生成物から製造されるそのような水溶液よりも高い透明度を有する。
【００１２】
ソフトドリンクおよびスポーツドリンク中の溶液を含む、水溶液中のキャノーラタンパク質生成物の濃度は、溶液の所期の使用に応じて変えることができる。一般に、タンパク質濃度は、約０．１〜約３０ｗｔ％、好ましくは約１〜約５ｗｔ％で変えることができる。
【００１３】
本明細書で提供するキャノーラタンパク質生成物は、酸性媒体のタンパク質強化（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に適しているだけでなく、それだけに限定されないが、加工食品および飲料のタンパク質強化、油の乳化、焼き物における素地形成剤（ｂｏｄｙ  ｆｏｒｍｅｒ）、ならびに気体を捕捉する製品中の発泡剤などの、多種多様なタンパク質製品の従来の用途に使用することができる。さらに、キャノーラタンパク質生成物は、肉類似物（ｍｅａｔ  ａｎａｌｏｇ）において有用なタンパク質繊維を形成することができ、卵白をつなぎとして使用する場合に、食品中の卵白代用品または増量剤として使用することができる。キャノーラタンパク質生成物は、栄養補助食品に使用することもできる。キャノーラタンパク質生成物の他の用途は、ペットフード、動物飼料、工業および化粧用途、ならびにパーソナルケア製品にある。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の概略説明
従って、本発明は、上記の飲料だけでなく、ジュース、アルコール飲料、コーヒー系飲料および乳飲料（ｄａｉｒｙ−ｂａｓｅｄ  ｂｅｖｅｒａｇｅ）などの他の飲料も含む、本明細書で提供するキャノーラタンパク質生成物の水溶液を含む。
【００１５】
キャノーラタンパク質生成物を提供するプロセスの最初のステップは、キャノーラ油糧種子粗粉からタンパク質性物質（ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ  ｍａｔｅｒｉａｌ）を可溶化させることを含む。キャノーラ油糧種子粗粉から回収したタンパク質性物質は、キャノーラ種子中に天然に存在するタンパク質であってよく、またはそのタンパク質性物質は、遺伝子操作によって改変されているが、天然のタンパク質の特徴的な疎水性および極性の特性を有しているタンパク質であってもよい。キャノーラ粗粉は、例えば高温ヘキサン抽出法または冷オイル押出法によって得られる、異なるレベルの非変性タンパク質を有するキャノーラ油糧種子から、キャノーラ油を除去することによって得られる任意のキャノーラ粗粉であってよい。キャノーラ油糧種子からのキャノーラ油の除去は、通常、本明細書に記載のキャノーラタンパク質生成物の回収手順とは別の操作として行われる。
【００１６】
塩の存在が、油糧種子粗粉からの可溶性タンパク質の除去を増大させるので、タンパク質可溶化は食品グレードの塩溶液を使用することによって最も効率的に行われる。キャノーラタンパク質単離物を食品以外へ使用するつもりである場合、非食品グレードの化学製品を使用することができる。塩化カリウムなどの他の塩を使用することができるが、塩は通常塩化ナトリウムである。塩溶液は、かなりの量のタンパク質の可溶化が行われるのを可能にするため、少なくとも約０．０５、好ましくは少なくとも約０．１０のイオン強度を有する。塩溶液のイオン強度が増加するにつれて、油糧種子粗粉中のタンパク質の可溶化の程度は、最大値に達するまで最初は増加する。その後のイオン強度の増加は、可溶化される全体のタンパク質を増加させない。最大のタンパク質可溶化をもたらす食品グレードの塩溶液のイオン強度は、当該塩および選択した油糧種子粗粉に応じて変わる。
【００１７】
イオン強度の増加に伴ってタンパク質の沈殿に要する希釈度がより大きくなることを考慮して、約０．８未満のイオン強度値、より好ましくは約０．１〜約０．１５の値を用いることが通常好ましい。
【００１８】
回分プロセスでは、タンパク質の塩可溶化を、約５℃〜約７５℃の温度で、通常約１０〜約６０分である可溶化時間を短縮するために、好ましくは攪拌を伴って行う。全体として高い製品収率を得るために、油糧種子粗粉から実質的に可能な限り多くのタンパク質を抽出するように可溶化を行うことが好ましい。
【００１９】
この温度より低いと可溶化が実際的でないくらい遅くなるので、約５℃の下限温度を選択し、一方で存在するタンパク質のいくらかの変性温度のため約７５℃の好ましい上限温度を選択する。
【００２０】
連続プロセスでは、キャノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の抽出を、キャノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の連続的抽出を行うのに調和した任意の方法で行う。一実施形態では、キャノーラ油糧種子粗粉を食品グレードの塩溶液と連続的に混合し、その混合物を、ある長さを有するパイプまたは導管を通して、本明細書に記載のパラメータによる所望の抽出を行うのに十分な滞留時間をもたらす流速で輸送する。このような連続的手順では、塩可溶化ステップは、好ましくはキャノーラ油糧種子粗粉から実質的に可能な限り多くのタンパク質を抽出するように可溶化を行うために、迅速に、約１０分までの時間で行う。連続的手順での可溶化は、約１０℃と約７５℃との間、好ましくは約１５℃と約３５℃との間の温度で行う。
【００２１】
食品グレードの塩水溶液は、一般的に約５〜約６．８、好ましくは約５．３〜約６．２のｐＨを有し、この塩溶液のｐＨは、抽出ステップで使用するために、必要に応じて、任意の好都合な酸、通常は塩酸、またはアルカリ、通常は水酸化ナトリウムを使用することによって、約５〜約６．８の範囲内の任意の所望の値に調整することができる。
【００２２】
可溶化ステップ中の食品グレードの塩溶液中の油糧種子粗粉の濃度は、広範囲で変えられる。典型的な濃度値は、約５〜約１５％ｗ／ｖである。
【００２３】
塩水溶液によるタンパク質抽出ステップは、キャノーラ粗粉中に存在しうる脂肪を可溶化する追加的な効果を有し、それによって脂肪が水相中に存在するという結果になる。
【００２４】
抽出ステップから得られたタンパク質溶液は、一般的に約５〜約４０ｇ／Ｌ、好ましくは約１０〜約３０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。
【００２５】
塩水溶液は、酸化防止剤を含むことができる。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの任意の好都合な酸化防止剤とすることができる。使用する酸化防止剤の量は、溶液の約０．０１〜約１ｗｔ％で変えることができ、好ましくは約０．０５ｗｔ％である。酸化防止剤は、タンパク質溶液中のフェノール類の酸化を抑制するのに役立つ。
【００２６】
次いで、抽出ステップから得られた水相を、デカンター型遠心分離機の使用に続いて、ディスク型遠心分離および／または濾過によって残留する粗粉を除去することによるなどの任意の好都合な方法で、残留するキャノーラ粗粉から分離することができる。分離した残留粗粉は処分するために乾燥することができる。
【００２７】
キャノーラタンパク質溶液から回収したキャノーラタンパク質生成物の色は、分離したタンパク質水溶液と、粉末活性炭または他の色素吸着剤を混合し、引き続いて濾過により好都合に吸着剤を除去してタンパク質溶液を得ることによって、明色およびより弱い黄色の観点から、改善することができる。色素の除去にキャノーラタンパク質溶液の透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を使用することもできる。
【００２８】
このような色素除去ステップは、任意の適当な色素吸着剤を使用して、一般的に分離したタンパク質水溶液の周囲温度で、任意の好都合な条件下で行うことができる。粉末活性炭は、約０．０２５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．０５％〜約２％ｗ／ｖの量を使用する。
【００２９】
本譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれた、米国特許第5,844,086号および第6,005,076号に記載のように、キャノーラ種子粗粉がかなりの量の脂肪を含んでいる場合、分離したタンパク質水溶液および以下に述べる濃縮タンパク質水溶液に、上記特許に記載の脱脂ステップまたは任意の他の好都合な脱脂手順を行うことができる。色改善ステップを行う場合、このステップは第１脱脂ステップの後に行うことができる。
【００３０】
水のみの使用では、塩水溶液よりも油糧種子粗粉からのタンパク質の抽出が少ない傾向があるが、塩水溶液による油糧種子粗粉の抽出の代替法として水のみを使用して抽出を行うことができる。このような代替法を使用する場合、以下で説明する濃縮ステップ中にタンパク質を溶液中に維持するために、残留油糧種子粗粉からの分離後に、上記の濃度で塩をタンパク質溶液に添加することができる。第１脂肪除去ステップを行う場合、塩は一般的にこのような操作の完了後に添加する。
【００３１】
別の代替手順は、一般的に約９．９までの、約６．８を超える比較的高いｐＨ値で、食品グレードの塩溶液により油糧種子粗粉を抽出するというものである。食品グレードの塩溶液のｐＨは、水酸化ナトリウム水溶液などの任意の好都合な食品グレードのアルカリを使用することによって、所望のアルカリ性値に調整することができる。あるいは、油糧種子粗粉は、一般的に約ｐＨ３までの、約ｐＨ５未満の比較的低いｐＨで、塩溶液により抽出することができる。このような代替法を使用する場合、油糧種子粗粉の抽出ステップから得られた水相は、デカンター型遠心分離に続いて、ディスク型遠心分離および／または濾過を使用して残留する粗粉を除去することによるなどの任意の好都合な方法で、残留するキャノーラ粗粉から分離する。分離した残留粗粉は処分するために乾燥することができる。
【００３２】
次いで、高ｐＨまたは低ｐＨ抽出ステップから得られたタンパク質水溶液を、以下に述べるさらなる処理の前に、上記のように、約５〜約６．８、好ましくは約５．３〜約６．２の範囲にｐＨ調整する。このようなｐＨ調整は、必要に応じて、任意の好都合な塩酸などの酸または水酸化ナトリウムなどのアルカリを使用して行うことができる。
【００３３】
タンパク質水溶液を濃縮してそのタンパク質濃度を増加させると同時に、そのイオン強度を実質的に一定に維持する。このような濃縮は、一般的に少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも約２００ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも約２５０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する濃縮タンパク質溶液を得るように行う。
【００３４】
濃縮ステップは、異なる膜材料および構造を考慮して、約３０００〜約１０００００ダルトン、好ましくは約５０００〜約１００００ダルトンなどの適当な分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｕｔ−ｏｆｆ）を有し、連続操作の場合には、タンパク質水溶液が膜を通過する際に所望の濃縮度が可能になるような寸法にする、中空繊維膜またはスパイラル膜（ｓｐｉｒａｌ−ｗｏｕｎｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）などの膜を使用した、限外濾過または透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）などの任意の好都合な選択的膜技術を使用するなど、回分操作または連続操作に調和した任意の好都合な方法で行うことができる。
【００３５】
周知のように、限外濾過および同様の選択的膜技術は、低分子量の種が膜を通過するのを許すと同時に、高分子量の種が膜を通過するのを阻止する。低分子量の種には、食品グレードの塩のイオン種だけでなく、炭水化物、色素および抗栄養因子（ａｎｔｉ−ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｆａｃｔｏｒｓ）などの供給源材料から抽出された低分子量物質、ならびに任意の低分子量形タンパク質も含まれる。膜の分画分子量は、通常、異なる膜材料および構造を考慮して、かなりの割合のタンパク質を溶液中に確実に保持すると同時に、汚染物質が通過するのを許すよう選択する。
【００３６】
次いで、濃縮タンパク質溶液を、抽出溶液と同じモル濃度およびｐＨの塩水溶液を使用して、透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）ステップに供することができる。このような透析濾過は、約２〜約２０倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）の透析濾過溶液、好ましくは約５〜約１０倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）の透析濾過溶液を使用して行うことができる。透析濾過操作では、膜を通して透過液（ｐｅｒｍｅａｔｅ）を通過させることにより、タンパク質水溶液からさらなる量の汚染物質を除去する。透析濾過操作は、さらなる有意の量の汚染物質および目に見える色が透過液中に存在しなくなるまで行うことができる。このような透析濾過は、濃縮ステップ用のものと同じ膜を使用して行うことができる。しかしながら、所望であれば、透析濾過ステップは、異なる膜材料および構造を考慮して、約３０００〜約１０００００ダルトン、好ましくは約５０００〜約１００００ダルトンの範囲の分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｕｔ−ｏｆｆ）を有する膜などの、異なる分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｕｔ−ｏｆｆ）を有する分離膜を使用して行うことができる。
【００３７】
透析濾過ステップの少なくとも一部の間で、酸化防止剤を透析濾過媒体中に存在させることができる。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの任意の好都合な酸化防止剤であってよい。透析濾過媒体中で使用する酸化防止剤の量は、使用する物質に依存し、約０．０１〜約１ｗｔ％で変えることができ、好ましくは約０．０５ｗｔ％である。酸化防止剤は、キャノーラタンパク質単離物の濃縮溶液中に存在するフェノール類の酸化を抑制するのに役立つ。
【００３８】
濃縮ステップおよび透析濾過ステップは、任意の好都合な温度、一般的には約２０°〜約６０℃、好ましくは約２０〜約３０℃で、所望の程度の濃縮を行うための時間行うことができる。使用する温度および他の条件は、ある程度、濃縮を行うために使用する膜装置および溶液の所望のタンパク質濃度に依存する。
【００３９】
濃縮され、場合により透析濾過された（ｄｉａｆｉｌｔｅｒｅｄ）タンパク質溶液は、必要に応じて、米国特許第5,844,086号および第6,005,076号に記載のようにさらなる脱脂操作に供することができる。
【００４０】
濃縮され、場合により透析濾過されたタンパク質溶液は、上記色除去操作の代替として、ある色除去操作に供することができる。本明細書では、粒状活性炭（ＧＡＣ）と同様に粉末活性炭も使用することができる。色吸着剤として使用することができる他の物質は、ポリビニルピロリドンである。
【００４１】
色吸着剤処理ステップは、任意の好都合な条件下、一般的には濃縮され、場合により透析濾過されたキャノーラタンパク質溶液の周囲温度で行うことができる。粉末活性炭は、約０．０２５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．０５％〜約２％ｗ／ｖの量を使用することができる。ポリビニルピロリドンを色吸着剤として使用する場合、約０．５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約２％〜約３％ｗ／ｖの量を使用することができる。色吸着剤は、濾過などの任意の好都合な手段によって、キャノーラタンパク質溶液から除去することができる。
【００４２】
任意選択の色除去ステップから得られた、濃縮され、場合により透析濾過されたタンパク質溶液は、微生物負荷（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｌｏａｄ）を減少させるために、低温殺菌に供することができる。このような低温殺菌は、任意の所望の低温殺菌条件下で行うことができる。一般に、濃縮され、場合により透析濾過されたタンパク質溶液を、約５５°〜約７０℃、好ましくは約６０°〜約６５℃の温度で、約１０〜約１５分間、好ましくは約１０分間加熱する。次いで、低温殺菌した濃縮タンパク質溶液を、以下に説明するさらなる処理のために、好ましくは約２５°〜約４０℃の温度に冷却することができる。
【００４３】
濃縮ステップおよび任意選択の透析濾過ステップで使用する温度、ならびに低温殺菌ステップを行うかどうかに応じて、濃縮タンパク質溶液を、少なくとも約２０°で約６０℃まで、好ましくは約２５°〜約４０℃の温度に加温し、濃縮タンパク質溶液の粘度を減少させ、引き続く希釈ステップおよびミセル形成の実行を容易にすることができる。濃縮タンパク質溶液は、それを超えると冷水による希釈時にミセル形成が起こらない温度を超えて加熱すべきではない。
【００４４】
次いで、濃縮ステップ、ならびに任意選択の透析濾過ステップ、任意選択の色除去ステップ、任意選択の低温殺菌ステップおよび任意選択の脱脂ステップから得られた濃縮タンパク質溶液を、その濃縮タンパク質溶液を所望の希釈度を得るのに必要な容積を有する冷水と混合することによって希釈してミセル形成を行う。ミセル経路（ｍｉｃｅｌｌｅ  ｒｏｕｔｅ）によって得ようとするキャノーラタンパク質の割合および上澄み液からの割合に応じて、濃縮タンパク質溶液の希釈度を変えることができる。一般に、より低い希釈レベルでは、より高い割合のキャノーラタンパク質が水相中に残留する。
【００４５】
ミセル経路によって最も高い割合のタンパク質を得ることが望まれる場合、濃縮タンパク質溶液を約５倍（ｆｏｌｄ）〜約２５倍（ｆｏｌｄ）、好ましくは約１０倍（ｆｏｌｄ）〜約２０倍（ｆｏｌｄ）で希釈する。
【００４６】
濃縮タンパク質溶液と混合する冷水は、約１５℃未満、一般的に約１°〜約１５℃、好ましくは約１０℃未満の温度を有するが、その理由は、使用する希釈倍率（ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）でこれらのより冷たい温度で、改善された収率のタンパク質ミセル塊形状のタンパク質単離物が得られるからである。
【００４７】
回分操作では、濃縮タンパク質溶液のバッチを、上記のように所望の容積を有する冷水の静止体（ｓｔａｔｉｃ  ｂｏｄｙ）に添加する。濃縮タンパク質溶液の希釈および結果として生じるイオン強度の減少は、ミセル形状の離散したタンパク質小滴の形態を取る高度に会合したタンパク質分子の雲様塊の形成を引き起こす。回分式手順では、タンパク質のミセルは、冷水体（ｂｏｄｙ  ｏｆ  ｃｈｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ）中に沈降させることにより、凝集、合体して濃密な、非晶質で粘着性のグルテン様タンパク質ミセル塊（ＰＭＭ）を形成する。沈降は、遠心分離などによって促進することができる。このように誘導された沈降により、タンパク質ミセル塊の液体含量が減少し、それにより、水分含量は一般的に全ミセル塊の約７０重量％〜約９５重量％から、一般的に約５０重量％〜約８０重量％の値に減少する。このようにしてミセル塊の水分含量が減少すると、ミセル塊の吸蔵塩含量、結果として乾燥単離物の塩含量も減少させる。
【００４８】
あるいは、濃縮タンパク質溶液をＴ字型パイプの一方の入口に連続的に通すと同時に、希釈水をＴ字型パイプの他方の入口に供給して、パイプ中で混合させることによって、希釈操作を連続的に行うことができる。希釈水は、濃縮タンパク質溶液の所望の希釈度を達成するのに十分な速度で、Ｔ字型パイプ中に供給する。
【００４９】
濃縮タンパク質溶液および希釈水のパイプ中での混合により、タンパク質のミセルの形成が開始され、混合物はＴ字型パイプの出口から沈降容器中へ連続的に供給され、満杯になったときに、この沈降容器から上澄み液をあふれさせる。混合物は、好ましくは、液体内の乱流を最小化するように、沈降容器中の液体中に供給する。
【００５０】
連続手順では、タンパク質のミセルは、沈降容器中に沈降させることにより、凝集、合体して濃密な、非晶質で粘着性のグルテン様タンパク質ミセル塊（ＰＭＭ）を形成し、所望の量のＰＭＭが沈降容器の底に蓄積するまでこの手順を続け、その後すぐに（ｗｈｅｒｅｕｐｏｎ）蓄積したＰＭＭを沈降容器から取り出す。沈殿による沈降の代わりに、遠心分離によってＰＭＭを連続的に分離することができる。
【００５１】
少なくとも約２００ｇ／Ｌの好ましいタンパク質含量へのタンパク質溶液の濃縮に関するプロセスのパラメータの組み合わせ、および約１０〜約２０の希釈倍率（ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）の使用により、上記米国特許で論じた既知の従来技術のタンパク質単離物形成手順のいずれを使用して達成されるよりも、元の粗粉抽出物からのタンパク質ミセル塊形状のタンパク質回収に関して、より高い収率、多くの場合有意に高い収率が得られ、しかもタンパク質含量に関してずっと高い純度の単離物が得られる。
【００５２】
回分プロセスと比較して、キャノーラタンパク質単離物の回収のために連続プロセスを利用することにより、同じレベルのタンパク質抽出に関して、最初のタンパク質抽出ステップの時間が著しく短縮され、かつ抽出ステップにおいて、著しく高い温度を使用することができる。さらに、連続操作では、回分手順よりも汚染の機会が少なく、より高い製品品質が得られ、より小型の装置でプロセスを行うことができる。
【００５３】
沈降したキャノーラタンパク質単離物は、沈降した塊からの残留水相のデカンテーションまたは遠心分離などによって、残留水相または上澄み液から分離する。ＰＭＭは、湿った形態で使用することも、または噴霧乾燥もしくは凍結乾燥などの任意の好都合な技術により乾燥させて乾燥形態にすることもできる。乾燥ＰＭＭは、約９０ｗｔ％を超えるタンパク質、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％タンパク質（Ｎ×６．２５として計算）の高いタンパク質含量を有し、実質的に変性していない（示差走査熱量測定により測定）。必要に応じて米国特許第5,844,086号および第6,005,076号の手順を使用した場合、脂肪性油糧種子粗粉から単離した乾燥ＰＭＭも残留脂肪含量が低く、それは約１ｗｔ％未満になり得る。
【００５４】
本譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれた、米国特許第7,662,922号（WO03/088760）に記載のように、ＰＭＭは、主として、約６０〜約９８ｗｔ％の７Ｓタンパク質、約１〜約１５ｗｔ％の１２Ｓタンパク質および０〜約２５ｗｔ％の２Ｓタンパク質のタンパク質成分含量を有する、７Ｓキャノーラタンパク質からなる。
【００５５】
ＰＭＭ形成および沈降ステップからの上澄み液は、希釈ステップでは沈殿しない、かなりの量のキャノーラタンパク質を含み、これを処理してキャノーラタンパク質生成物を回収する。上記米国特許第7,662,922号に記載のように、上澄み液から得られるキャノーラタンパク質生成物は、約６０〜約９５ｗｔ％の２Ｓタンパク質、約５〜約４０ｗｔ％の７Ｓタンパク質および０〜約５ｗｔ％の１２Ｓタンパク質のタンパク質成分含量を有する、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなる。
【００５６】
上澄み液は、濃縮して、そのタンパク質濃度を増加させる。このような濃縮は、タンパク質供給源材料から抽出された塩および他の非タンパク質性低分子量物質（ｎｏｎ−ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ  ｌｏｗ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｅｒｉａｌ）を含む低分子量種が膜を通過するのを可能にすると同時に、キャノーラタンパク質を溶液中に保持する適当な分画分子量を有する膜を使用する、限外濾過などの任意の好都合な選択的膜技術を使用して行う。異なる膜材料および構造を考慮して、約３０００〜約１０００００ダルトン、好ましくは約５０００〜約１００００ダルトンの分画分子量を有する限外濾過膜を使用することができる。このような上澄み液の濃縮は、乾燥してタンパク質を回収するのに必要な液体の容積も減少させる。上澄み液は、一般的に、乾燥の前に、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは約１００〜約３００ｇ／Ｌ、より好ましくは約２００〜約３００ｇ／Ｌのタンパク質濃度まで濃縮する。このような濃縮操作は、タンパク質溶液濃縮ステップに関して上記したように、回分様式または連続操作で行うことができる。
【００５７】
次いで、濃縮上澄み液を、水、食塩水または酸性水を使用して、透析濾過ステップに供することができる。このような透析濾過は、約２〜約２０倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）の透析濾過溶液、好ましくは約５〜約１０倍容（ｖｏｌｕｍｅｓ）の透析濾過溶液を使用して行うことができる。透析濾過操作では、膜を通して透過液（ｐｅｒｍｅａｔｅ）を通過させることにより、上澄み水溶液からさらなる量の汚染物質を除去する。透析濾過操作は、さらなる有意の量の汚染物質および目に見える色が透過液中に存在しなくなるまで行うことができる。このような透析濾過は、濃縮ステップ用のものと同じ膜を使用して行うことができる。しかし、所望であれば、透析濾過は、異なる膜材料および構造を考慮して、約３０００〜約１０００００ダルトン、好ましくは約５０００〜約１００００ダルトンの範囲の分画分子量を有する膜などの分離膜を使用して行うことができる。
【００５８】
９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．未満のタンパク質を含有するキャノーラタンパク質生成物を製造するため、上澄み液に行う上記濃縮および／または透析濾過ステップは、透析濾過ステップを省略するもしくは減少させる、および／または限外濾過ステップを早く停止するなどにより、回収したキャノーラタンパク質生成物が少なくとも約６０ｗｔ％タンパク質（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．などの９０ｗｔ％タンパク質未満のタンパク質含量を有するように、上澄み液から除去する混入物が少なくなるよう操作する。
【００５９】
透析濾過ステップの少なくとも一部の間で、酸化防止剤を透析濾過媒体中に存在させることができる。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの任意の好都合な酸化防止剤であってよい。透析濾過媒体中で使用する酸化防止剤の量は、使用する物質に依存し、約０．０１〜約１ｗｔ％で変えることができ、好ましくは約０．０５ｗｔ％である。酸化防止剤は、キャノーラタンパク質単離物の濃縮溶液中に存在するフェノール類の酸化を抑制するのに役立つ。
【００６０】
濃縮され、場合により透析濾過されたタンパク質溶液は、ある色除去操作に供することができる。本明細書では、粒状活性炭（ＧＡＣ）と同様に粉末活性炭も使用することができる。色吸着剤として使用することができる他の物質は、ポリビニルピロリドンである。
【００６１】
色吸着剤処理ステップは、任意の好都合な条件下、一般的にはキャノーラタンパク質溶液の周囲温度で行うことができる。粉末活性炭は、約０．０２５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．０５％〜約２％ｗ／ｖの量を使用することができる。ポリビニルピロリドンを色吸着剤として使用する場合、約０．５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約２％〜約３％ｗ／ｖの量を使用することができる。色吸着剤は、濾過などの任意の好都合な手段によって、キャノーラタンパク質溶液から除去することができる。
【００６２】
本発明の一態様によると、濃縮され、場合により透析濾過された上澄み液は、任意選択の色除去操作の後、加熱処理しまたは等電沈殿に供し、得られた沈殿した７Ｓタンパク質の除去によって溶液中に存在する７Ｓタンパク質の量を減少させ、それによって濃縮上澄み液中に存在するキャノーラタンパク質中の２Ｓタンパク質の割合を増加させる。
【００６３】
このような加熱処理は、濃縮上澄み液中に存在する７Ｓの割合を減少させる、好ましくは７Ｓタンパク質の割合をかなりの程度、減少させるのに十分な温度および時間プロファイルを用いて行うことができる。一般に、上澄み液の７Ｓタンパク質含量を、加熱処理によって、少なくとも約５０ｗｔ％、好ましくは少なくとも約７５ｗｔ％減少させる。一般に、加熱処理は、約７０°〜約１２０℃、好ましくは約７５°〜約１０５℃の温度で、約１秒〜約３０分間、好ましくは約５〜約１５分間行うことができる。
【００６４】
濃縮され、加熱処理された上澄み液は、乾燥の前に、乾燥製品の所期の使用に対応したｐＨに酸性化することができる。一般的には、ｐＨは約２〜約５、好ましくは約２．５〜約４のｐＨまで低下させる。
【００６５】
沈殿した７Ｓタンパク質の除去の後で、濃縮され、加熱処理された上澄み液を噴霧乾燥または凍結乾燥などの任意の好都合な技術によって乾燥形態に乾燥させて、本発明によるキャノーラタンパク質生成物を得ることができる。このようなキャノーラタンパク質生成物は、乾燥重量基準で約９０ｗｔ％未満、好ましくは少なくとも約７０ｗｔ％タンパク質（Ｎ×６．２５として計算）のタンパク質含量を有し、実質的に変性していないと予測される。
【００６６】
このようなキャノーラタンパク質生成物は、高い割合の２Ｓタンパク質、好ましくは生成物中のキャノーラタンパク質の少なくとも９０ｗｔ％、最も好ましくは少なくとも約９５ｗｔ％を含む。生成物中に一定割合の７Ｓタンパク質も存在する。
【００６７】
あるいは、上記の濃縮ステップおよび透析濾過ステップの前に、７Ｓタンパク質を沈殿させるための上澄み液の加熱処理を上澄み液に対して行うことができる。沈殿した７Ｓタンパク質の除去の後で、上澄み液を濃縮し、場合により透析濾過し、場合により色除去操作にかけ、乾燥させて本発明によるキャノーラタンパク質生成物を得る。
【００６８】
さらなる代替法として、上澄み液を最初に任意の好都合なレベルまで部分的に濃縮することができる。次いで、部分濃縮上澄み液を、７Ｓタンパク質を沈殿させるための加熱処理に供する。沈殿した７Ｓタンパク質の除去の後で、上澄み液を、一般的に約５０〜約３００ｇ／Ｌ、好ましくは約２００〜約３００ｇ／Ｌの濃度までさらに濃縮し、場合により透析濾過し、場合により色除去操作にかけ、乾燥させて本発明によるキャノーラタンパク質生成物を得る。
【００６９】
沈殿した７Ｓタンパク質は、遠心分離もしくは濾過、またはこれらの組み合わせなどの任意の好都合な手段によって、上澄み液、部分濃縮上澄み液または濃縮上澄み液から除去する。
【００７０】
沈殿した７Ｓタンパク質の除去の後で、加熱処理された上澄み液、または加熱処理された部分濃縮上澄み液を、乾燥の前に、上記のように、濃縮もしくは透析濾過の間または後の任意の時点で酸性化し、キャノーラタンパク質生成物を回収することができる。酸性飲料で使用するために、乾燥単離物の所期の使用に対応したｐＨ、一般的には約２〜約５、好ましくは約２．５〜約４まで低下させたｐＨにするように、このような酸性化を行うことができる。
【００７１】
本発明の別の実施形態では、ミセルの形成および沈殿による上澄み液を、等電沈殿に供して、本発明の新規なキャノーラタンパク質生成物を形成する。等電沈殿の前に、加熱処理に関して上記のように、上澄み液を最初に濃縮または部分的に濃縮することができる。
【００７２】
このような等電沈殿手順では、塩として、塩化カリウムなどの他の塩も使用できるが、通常は塩化ナトリウムを、上澄み液、部分濃縮上澄み液または濃縮上澄み液に最初に添加し、少なくとも約０．３ｍＳ、好ましくは約１０〜約２０ｍＳの導電率を有する塩添加溶液（ｓａｌｉｎａｔｅｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得る。
【００７３】
塩添加上澄み液（ｓａｌｉｎａｔｅｄ  ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）のｐＨを、７Ｓタンパク質の等電沈殿をもたらす値、一般的に約２．０〜約４．０、好ましくは約３．０〜約３．５のｐＨに調整する。７Ｓタンパク質の等電沈殿は、広い温度範囲にわたって、一般的に約５℃〜約７０℃、好ましくは約１０℃〜約４０℃で行うことができる。沈殿した７Ｓタンパク質は、遠心分離もしくは濾過、またはこれらの組み合わせなどの任意の好都合な手段によって、等電沈殿させた上澄み液から除去する。
【００７４】
次いで、等電沈殿させた上澄み液は、まだ濃縮していない場合、加熱処理ステップに関して上記のように濃縮し、透析濾過して塩を除去し、その後、濃縮され、透析濾過された上澄み液を乾燥させて本発明のキャノーラタンパク質生成物を形成する。噴霧乾燥または凍結乾燥などの任意の好都合な技術によって乾燥形態に乾燥させて、約９０ｗｔ％タンパク質（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．未満の本発明によるキャノーラタンパク質生成物を得る前に、濃縮され、透析濾過された上澄み液を、上記のように、濾過して残留粒子を除去し、任意選択の色除去ステップに供することができる。
【００７５】
本明細書で製造するキャノーラタンパク質生成物は、酸性水性環境に可溶性であり、生成物を炭酸および非炭酸両方の飲料に組み込むのに理想的にし、これらの飲料にタンパク質強化（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）をもたらす。このような飲料は、約２．５〜約５にわたる広範囲の酸性ｐＨ値を有する。本明細書で提供するキャノーラタンパク質生成物は、このような飲料にタンパク質強化をもたらすための任意の好都合な量で、例えば、１人前当たり少なくとも約５ｇのキャノーラタンパク質生成物を、このような飲料に添加することができる。添加されたキャノーラタンパク質生成物は飲料に溶解し、熱処理によって飲料の不透明度は増加しない。キャノーラタンパク質生成物は、水へ溶解させることにより飲料を再構成する（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）前に、乾燥飲料とブレンドすることができる。場合により、飲料中に存在する成分が、本発明の組成物が飲料中に溶解したままでいる能力に悪影響を与え得る場合には、本発明の組成物を許容するための飲料の通常の配合への修正が必要となり得る。
【実施例】
【００７６】
例
例１：
この例は、本発明の一実施形態による９０ｗｔ％タンパク質乾燥重量未満のキャノーラタンパク質生成物の製造を説明する。
【００７７】
キャノーラ粗粉「ａ」ｋｇを、周囲温度で「ｃ」Ｍ  ＮａＣｌ溶液「ｂ」Ｌに添加し、３０分間攪拌してタンパク質水溶液を得た。残留するキャノーラ粗粉を除去し、得られたタンパク質溶液を遠心分離により部分的に清澄化して、「ｅ」重量％のタンパク質含量を有する部分的に清澄化されたタンパク質溶液「ｄ」Ｌを製造した。次いで、部分的に清澄化されたタンパク質溶液を濾過してさらに清澄化し、「ｇ」重量のタンパク質含量を有する容積「ｆ」の溶液を得た。
【００７８】
タンパク質抽出溶液の一定分量「ｈ」Ｌを、「ｊ」ダルトンの分画分子量を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜で濃縮して容積を「ｉ」Ｌに減少させた。次いで、この保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を６０℃で１分間、低温殺菌した。得られた低温殺菌した濃縮タンパク質溶液は、「ｋ」重量％のタンパク質含量を有していた。
【００７９】
「ｌ」℃の濃縮された溶液を、「ｎ」℃の温度の冷ＲＯ水中に入れて「ｍ」に希釈した。直ちに白色の雲状物が形成し、これを沈降させた。上部の希釈水を除去し、沈殿した、粘性の、粘着性塊（ＰＭＭ）を、遠心分離によって、濾過したタンパク質溶液の「ｏ」ｗｔ％の収率で回収し、乾燥させた。乾燥ＰＭＭタンパク質は、「ｐ」ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有することが分かった。この生成物に「ｑ」Ｃ３００という名称を与えた。
【００８０】
次いで、上澄み液に上記加熱処理を行った。
【００８１】
上澄み液「ｒ」Ｌを８０℃で１０分間加熱し、次いで、遠心分離して沈殿したタンパク質を除去した。加熱処理し遠心分離した上澄み液を、「ｔ」ダルトンの分画分子量を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を使用して限外濾過によって容積を「ｓ」Ｌに減少させ、次いで、濃縮液（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）を、同じ膜で、塩化ナトリウムにより１ｍＳの導電率に調整した水「ｕ」Ｌにより、透析濾過した。透析濾過した濃縮液は、「ｖ」重量％のタンパク質を含有していた。上澄み液から回収した追加のタンパク質と合わせて、濾過したタンパク質溶液の全体のタンパク質回収率は、「ｗ」ｗｔ％であった。濃縮液の一部「ｘ」Ｌを、ＨＣｌによってｐＨ３に調整し、ｐＨ３、「ｚ」ＢＶ／時間の速度で「ｙ」Ｌのベッド体積の粒状活性炭に通すことにより、減色ステップに供した。次いで、減色し、「ａｂ」重量％のタンパク質含量を有するＧＡＣ処理溶液「ａａ」Ｌを、噴霧乾燥した。この生成物に「ｓ」Ｃ２００ＨＳＣという名称を与え、この生成物は「ａｃ」ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有していた。１つの実験についてのパラメータ「ａ」〜「ａｃ」を以下の表Ｉに示す。
例２：
この例は、本発明の別の実施形態による９０重量％タンパク質未満の新規なキャノーラタンパク質生成物の製造を説明する。
【００８２】
キャノーラ粗粉「ａ」ｋｇを、周囲温度で「ｃ」Ｍ  ＮａＣｌ溶液「ｂ」Ｌに添加し、３０分間攪拌してタンパク質水溶液を得た。残留するキャノーラ粗粉を除去し、得られたタンパク質溶液を遠心分離により部分的に清澄化して、「ｅ」重量％のタンパク質含量を有する部分的に清澄化されたタンパク質溶液「ｄ」Ｌを製造した。次いで、部分的に清澄化されたタンパク質溶液を濾過してさらに清澄化し、「ｇ」重量のタンパク質含量を有する容積「ｆ」の溶液を得た。
【００８３】
タンパク質抽出溶液の一定分量「ｈ」Ｌを、「ｊ」ダルトンの分画分子量を有するポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）膜で濃縮して容積を「ｉ」Ｌに減少させた。次いで、この保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を６０℃で１０分間低温殺菌した。得られた低温殺菌した濃縮タンパク質溶液は、「ｋ」重量％のタンパク質含量を有していた。
【００８４】
「ｌ」℃の濃縮された溶液を、「ｎ」℃の温度の冷ＲＯ水中に入れて「ｍ」に希釈した。直ちに白色の雲状物が形成し、これを沈降させた。上部の希釈水を除去し、沈殿した、粘性の、粘着性塊（ＰＭＭ）を、遠心分離によって、濾過したタンパク質溶液の「ｏ」ｗｔ％の収率で回収し、噴霧乾燥した。乾燥ＰＭＭ由来タンパク質は、「ｐ」ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有することが分かった。この生成物に「ｑ」Ｃ３００という名称を与えた。
【００８５】
次いで、上澄み液に本明細書に記載の加熱処理を行った。
【００８６】
上澄み液「ｒ」Ｌを、「ｔ」ダルトンの分画分子量を有するポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）膜を使用して限外濾過によって容積を「ｓ」Ｌに減少させた。濃縮液（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）は「ｕ」重量ｗｔ％のタンパク質を含有していた。上澄み液から回収した追加のタンパク質と合わせて、濾過したタンパク質溶液の全体のタンパク質回収率は、「ｖ」ｗｔ％であった。次いで、濃縮液を８５℃で１０分間加熱し、その後、清澄化のためにさらなる遠心分離ステップに供した。得られた「ｘ」重量％のタンパク質含量を有する濃縮液（ｃｅｎｔｒａｔｅ）「ｗ」Ｌを、「ｚ」ＢＶ／時間の速度で「ｙ」ＬのＢＶの吸着樹脂に通すことにより、減色ステップに供した。次いで、減色し、「ａｂ」重量％のタンパク質含量を有する樹脂処理溶液「ａａ」Ｌを、噴霧乾燥した。この生成物に「ｓ」Ｃ２００ＨＲという名称を与え、この生成物は「ａｃ」ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有していた。
【００８７】
例１および例２についてのパラメータ「ａ」〜「ａｃ」を以下の表Ｉに示す。
【００８８】
【表１】
2013505004.tif 000002
【００８９】
例３：
この例は、本発明の別の実施形態による９０重量％タンパク質未満の新規なキャノーラタンパク質生成物の製造を説明する。
【００９０】
キャノーラ粗粉「ａ」ｋｇを、周囲温度で「ｃ」Ｍ  ＮａＣｌ溶液「ｂ」Ｌに添加し、３０分間攪拌してタンパク質水溶液を得た。残留するキャノーラ粗粉を除去し、得られたタンパク質溶液を遠心分離により部分的に清澄化して、「ｅ」重量％のタンパク質含量を有する部分的に清澄化されたタンパク質溶液「ｄ」Ｌを製造した。次いで、部分的に清澄化されたタンパク質溶液を濾過してさらに清澄化し、「ｇ」重量のタンパク質含量を有する容積「ｆ」の溶液を得た。
【００９１】
タンパク質抽出溶液の一定分量「ｈ」Ｌを、「ｊ」ダルトンの分画分子量を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜で濃縮して容積を「ｉ」Ｌに減少させた。次いで、この保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を６０℃で１分間低温殺菌した。得られた低温殺菌した濃縮タンパク質溶液は、「ｋ」重量％のタンパク質含量を有していた。
【００９２】
「ｌ」℃の濃縮された溶液を、「ｎ」℃の温度の冷ＲＯ水中に入れて「ｍ」に希釈した。直ちに白色の雲状物が形成し、これを沈降させた。上部の希釈水を除去し、沈殿した、粘性の、粘着性塊（ＰＭＭ）を、遠心分離によって、濾過したタンパク質溶液の「ｏ」ｗｔ％の収率で回収し、噴霧乾燥した。乾燥ＰＭＭ由来タンパク質は、「ｐ」ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有することが分かった。この生成物に「ｑ」Ｃ３００という名称を与えた。
【００９３】
次いで、上澄み液に本明細書に記載の等電沈殿ステップを行った。
【００９４】
上澄み液「ｒ」Ｌを、塩化ナトリウムの添加によって、約「ｓ」ｍｓの導電率に調整した。次いで、得られた溶液を、ＨＣｌの添加によって「ｔ」のｐＨに酸性化し、７Ｓタンパク質の沈殿を得た。次いで、酸性化した溶液を遠心分離および濾過により清澄化して、「ｖ」のタンパク質含量を有する溶液「ｕ」Ｌを得た。次いで、清澄化したタンパク質溶液を、「ｗ」ダルトンの分画分子量を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を使用して限外濾過によって濃縮した。次いで、濃縮溶液を、「ｘ」Ｌの容積のｐＨ３のＲＯ水により透析濾過した。透析濾過した溶液は、「ｙ」重量％のタンパク質を含有していた。上澄み液から回収した追加のタンパク質と合わせて、濾過したタンパク質溶液の全体のタンパク質回収率は、「ｚ」ｗｔ％であった。保持液の一定分量「ａａ」Ｌを、「ａｃ」ＢＶ／時間の速度で「ａｂ」ＬのＢＶの粒状活性炭に通すことにより、減色ステップに供した。次いで、減色し、「ａｅ」重量％のタンパク質含量を有する炭処理溶液「ａｄ」Ｌを、仕上濾過し（ｐｏｌｉｓｈ  ｆｉｌｔｅｒｅｄ）、噴霧乾燥した。この生成物に「ｑ」Ｃ２００ＩＳＣという名称を与え、この生成物は「ａｆ」ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有していた。例３についてのパラメータ「ａ」〜「ａｆ」を以下の表ＩＩに示す。
【００９５】
【表２】
2013505004.tif 000003
【００９６】
例４：
この例は、例１、２および３で製造した上澄み液由来キャノーラタンパク質生成物についてのｐＨ３での液体サンプルの色および透明度を示す。
【００９７】
乾燥キャノーラタンパク質単離物サンプルＢＷ−ＳＤ０６２−Ａ１２−０６Ａと共に、例１、２および３でそれぞれ製造した乾燥キャノーラタンパク質サンプルＢＷ−ＳＤ０７６−Ｉ２４−０７Ａ、ＢＷ−ＳＤ０６２−Ａ１２−０６ＡおよびＢＷ−ＳＤ０８７−Ｌ０３−０７Ａを、その自然なｐＨで３．２ｗ／ｖ％のタンパク質含量を有する水溶液に調製した。十分に可溶化するまで溶液を混合し、次いで、ＨｕｎｔｅｒＬａｂ  ＣｏｌｏｒＱｕｅｓｔ  ＸＥ機器で色および透明度について分析した。得られた結果を以下の表ＩＩＩに示す。
【００９８】
【表３】
2013505004.tif 000004
【００９９】
表ＩＩＩから分かるように、キャノーラタンパク質単離物と比較すると、例１、例２および例３で製造した生成物の色および透明度の値は非常に類似している。３つのキャノーラタンパク質生成物は、キャノーラタンパク質単離物よりも高いＬ＊値を有しており、これは、より白い色を示している。２つのキャノーラタンパク質生成物についてのａ＊値の読みは、単離物よりも色が赤でない溶液であることを証明している一方で、ｂ＊値は、１つの溶液が単離物よりもわずかにより黄色であり、１つの溶液が単離物よりもわずかに黄色でないことを示している。ヘイズ値（ｈａｚｅ  ｖａｌｕｅ）は、生成物全てで非常に低く、これはこれらの生成物が全て可溶化した場合に非常に透明であることを示している。
【０１００】
これらの色および透明度の知見は、９０ｗｔ％タンパク質（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．未満を有する例１、２および３で製造したキャノーラタンパク質生成物が、キャノーラタンパク質単離物と非常に匹敵し、キャノーラタンパク質単離物と同様の食品および飲料用途での使用に適していると結論づけることを可能にする。
開示の概要
本開示を要約すると、米国特許出願第11/038,086号および第12/213,500号で製造される２Ｓが主であるキャノーラタンパク質単離物に匹敵する水溶液中における特性を有する、２Ｓが主であるキャノーラタンパク質生成物を製造する。本発明の範囲内で、改変が可能である。
【手続補正書】
【提出日】平成24年5月23日(2012.5.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥重量基準（ｄ．ｂ．）で９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）未満、好ましくは少なくとも６０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有し、単離物中に存在するキャノーラタンパク質の少なくとも８５ｗｔ％の２Ｓキャノーラタンパク質および１５ｗｔ％未満の７Ｓキャノーラタンパク質、好ましくは単離物中に存在するキャノーラタンパク質の少なくとも９０ｗｔ％の２Ｓキャノーラタンパク質および１０ｗｔ％未満の７Ｓキャノーラタンパク質を含む、キャノーラタンパク質生成物。
【請求項２】
（ａ）キャノーラタンパク質のミセルの形成による上澄み水溶液、部分的に濃縮された上澄み液または完全に濃縮された上澄み液の加熱処理、沈殿の除去、および残留する溶液の乾燥、または
（ｂ）キャノーラタンパク質のミセルの形成による上澄み水溶液、部分的に濃縮された上澄み液、または完全に濃縮された上澄み液の等電沈殿、沈殿の除去、および残留する溶液の乾燥により得られる、請求項１に記載のキャノーラタンパク質生成物。
【請求項３】
２Ｓキャノーラタンパク質の割合が増加しているキャノーラタンパク質生成物の調製方法であって、
（ａ）主として２Ｓタンパク質を含む、２Ｓおよび７Ｓタンパク質の水溶液を用意するステップと、
（ｂ）前記水溶液を加熱処理して、７Ｓキャノーラタンパク質を沈殿させるステップ、または水溶液から７Ｓキャノーラタンパク質を等電沈殿させるステップと、
（ｃ）前記水溶液から沈殿した７Ｓタンパク質を除去するステップと、
（ｄ）９０ｗｔ％未満、好ましくは少なくとも６０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有し、２Ｓキャノーラタンパク質の割合が増加しているキャノーラタンパク質生成物を回収するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
（ａ）前記加熱処理ステップを、前記水溶液中に存在する７Ｓキャノーラタンパク質の少なくとも５０ｗｔ％、好ましくは少なくとも７５ｗｔ％を沈殿させるのに十分な加熱処理の温度および時間条件下で行う、または
（ｂ）等電沈殿ステップを、前記水溶液中に存在する７Ｓキャノーラタンパク質の少なくとも５０ｗｔ％、好ましくは少なくとも７５ｗｔ％を沈殿させるのに十分な等電沈殿のｐＨおよび塩条件下で行うことを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記水溶液を７０℃〜１２０℃の温度で１秒〜３０分間、好ましくは７５℃〜１０５℃の温度で５〜１５分間、加熱することにより、前記加熱処理ステップを行うことを特徴とする、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記等電沈殿を、
（ｉ）前記水溶液に塩を加えて少なくとも０．３ｍＳ、好ましくは１０〜２０ｍＳの導電率にするステップと、
（ｉｉ）前記塩を加えた水溶液のｐＨを２．０〜４．０、好ましくは３．０〜３．５の値に調整するステップと
により行うことを特徴とする、請求項３または４に記載の方法。
【請求項７】
前記２Ｓおよび７Ｓキャノーラタンパク質の水溶液が、キャノーラタンパク質のミセルの形成および沈殿による上澄み液、部分的に濃縮された上澄み液または濃縮された上澄み液であることを特徴とする、請求項３〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記キャノーラタンパク質のミセルの形成を、
（ａ）少なくとも５℃の温度でキャノーラ油糧種子粗粉を抽出して、前記キャノーラ油糧種子粗粉中のタンパク質を可溶化して、タンパク質水溶液を形成するステップと、
（ｂ）前記タンパク質水溶液を残留油糧種子粗粉から分離するステップと、
（ｃ）選択的膜技術によってイオン強度を実質的に一定に維持しながら、前記タンパク質水溶液の濃度を少なくとも２００ｇ／Ｌに増加させて、濃縮タンパク質溶液を得るステップと、
（ｄ）前記濃縮タンパク質溶液を、１５℃未満の温度の冷水中に入れて希釈して、タンパク質のミセルを形成するステップと、
（ｅ）沈降したタンパク質ミセル塊から上澄み液を分離するステップと
によって行うことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記加熱処理または前記等電沈殿の前に、前記上澄み液を１００〜４００ｇ／Ｌ、好ましくは２００〜３００ｇ／Ｌのタンパク質濃度に濃縮することを特徴とする、請求項３〜８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記濃縮ステップを、３０００〜１０００００ダルトンの分画分子量を有する膜を使用した限外濾過によって行うことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記加熱処理ステップまたは前記等電沈殿ステップの前に、限外濾過によって得られた前記濃縮上澄み液を透析濾過に供することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記透析濾過ステップを、３０００〜１０００００ダルトンの分画分子量を有する膜を使用して、２〜２０倍容、好ましくは５〜１０倍容の水を使用して行うことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（ｅ）前記キャノーラタンパク質生成物を、水性飲料組成物として処方するステップをさらに含む、請求項３〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
好ましくは、キャノーラタンパク質生成物で強化した飲料である、請求項１または２に記載のキャノーラタンパク質生成物の水溶液。
【国際調査報告】
2013505004.tif 000005
2013505004.tif 000006
2013505004.tif 000007