(57)【要約】逆転写酵素および／またはプロテアーゼと関連する出現頻度の低い１以上のＨＩＶ配列バリアントを検出するための、下記の段階を含む方法を記載する：（ａ）ＨＩＶ試料集団中の複数のＲＮＡ分子からｃＤＮＡ種を生成させ；（ｂ）これらのｃＤＮＡ種から複数の第１アンプリコンを増幅させ、その際、それぞれの第１アンプリコンはクレイドＡ、クレイドＢ、クレイドＣ、クレイドＤ、クレイドＦ、およびクレイドＧを含むＨＩＶクレイドからアンプリコンを生成しうる核酸プライマー対を用いて増幅され；（ｃ）第１アンプリコンの増幅コピーをクローン増幅させて、複数の第２アンプリコンを生成させ；（ｄ）第２アンプリコンの核酸配列組成を決定し；そして（ｅ）第２アンプリコンの核酸配列組成における１以上の配列バリアントを検出する。【選択図】図２
2013545441.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
逆転写酵素および／またはプロテアーゼと関連する出現頻度の低い１以上のＨＩＶ配列バリアントを検出するための、下記の段階を含む方法：
（ａ）ＨＩＶ試料集団中の複数のＲＮＡ分子からｃＤＮＡ種を生成させ；
（ｂ）これらのｃＤＮＡ種から複数の第１アンプリコンを増幅させて、第１アンプリコンの増幅コピーを作成し、その際、それぞれの第１アンプリコンはクレイドＡ、クレイドＢ、クレイドＣ、クレイドＤ、クレイドＦ、およびクレイドＧを含むＨＩＶクレイドからアンプリコンを生成しうる核酸プライマー対を用いて増幅され；
（ｃ）第１アンプリコンの増幅コピーをクローン増幅させて、複数の第２アンプリコンを生成させ；
（ｄ）第２アンプリコンの核酸配列組成を決定し；そして
（ｅ）第２アンプリコンの核酸配列組成における１以上の配列バリアントを検出する。
【請求項２】
さらに、
（ｆ）検出した配列バリアントとＨＩＶ逆転写酵素またはプロテアーゼと関連する変異との相関性を求める
段階を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＨＩＶ逆転写酵素またはプロテアーゼと関連する変異が、ある阻害剤に対する耐性と関連することが分かっている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
核酸プライマー対は、クレイドＡ、クレイドＢ、クレイドＣ、クレイドＤ、クレイドＦ、およびクレイドＧからなる群から選択される２つのクレイドの組換え体を含む組換えＨＩＶクレイドからアンプリコンを生成することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
複数のアンプリコンが６つのアンプリコンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記６つのアンプリコンを増幅させるためのプライマー対が、Ｔｉ１３Ｆ  ＭｕｌｔｉプライマーとＴｉ１Ｒ  Ｍｕｌｔｉプライマー；Ｔｉ２Ｆ  Ｍｕｌｔｉ  Ｄ−２プライマーとＴｉ２Ｒ  Ｍｕｌｔｉ  Ｅ−２プライマー；Ｔｉ１３Ｆ  ＭｕｌｔｉプライマーとＴｉ３Ｒ  Ｍｕｌｔｉ  Ｂプライマー；Ｔｉ４Ｆ  Ｍｕｌｔｉ  Ｄ２プライマーとＴｉ４Ｒ  Ｍｕｌｔｉ  Ｂプライマー；Ｔｉ５Ｆ  ＭｕｌｔｉプライマーとＴｉ５Ｒ  Ｍｕｌｔｉ  Ｂプライマー；およびＴｉ６Ｆ  ＭｕｌｔｉプライマーとＴｉ６Ｒ  Ｍｕｌｔｉプライマーを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記６つのアンプリコンが、ＨＩＶの逆転写酵素およびプロテアーゼと関連する領域の完全適用範囲を備えている、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記６つのアンプリコンが、ＨＩＶの逆転写酵素およびプロテアーゼと関連する領域の少なくとも二重の適用範囲を備えている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
複数のアンプリコンが４つのアンプリコンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記４つのアンプリコンを増幅させるためのプライマー対が、Ｔｉ１３Ｆ  ＭｕｌｔｉプライマーとＴｉ３Ｒ  Ｍｕｌｔｉ  Ｂプライマー；Ｔｉ４Ｆ  Ｍｕｌｔｉ  ＡプライマーとＴｉ５Ｒプライマー；Ｔｉ５ＦｎプライマーとＴｉ２Ｒプライマー；およびＴｉ６Ｆ  ＭｕｌｔｉプライマーとＴｉ６Ｒ  Ｍｕｌｔｉプライマーを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記４つのアンプリコンが、ＨＩＶの逆転写酵素およびプロテアーゼと関連する領域の完全適用範囲を備えている、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
検出した配列バリアントがＨＩＶウイルス集団において１％以下の頻度で生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の第１アンプリコンを増幅させるために用いる複数の核酸プライマー対を含む、逆転写酵素および／またはプロテアーゼの領域と関連する１以上のＨＩＶ配列バリアントを検出するためのキット。
【請求項１４】
１以上のプライマー対が、Ｔｉ１３Ｆ  ＭｕｌｔｉプライマーとＴｉ１Ｒ  Ｍｕｌｔｉプライマー；Ｔｉ２Ｆ  Ｍｕｌｔｉ  Ｄ−２プライマーとＴｉ２Ｒ  Ｍｕｌｔｉ  Ｅ−２プライマー；Ｔｉ１３Ｆ  ＭｕｌｔｉプライマーとＴｉ３Ｒ  Ｍｕｌｔｉ  Ｂプライマー；Ｔｉ４Ｆ  Ｍｕｌｔｉ  Ｄ２プライマーとＴｉ４Ｒ  Ｍｕｌｔｉ  Ｂプライマー；Ｔｉ５Ｆ  ＭｕｌｔｉプライマーとＴｉ５Ｒ  Ｍｕｌｔｉ  Ｂプライマー；Ｔｉ６Ｆ  ＭｕｌｔｉプライマーとＴｉ６Ｒ  Ｍｕｌｔｉプライマーからなる群から選択される、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
１以上のプライマー対が、Ｔｉ１３Ｆ  ＭｕｌｔｉプライマーとＴｉ３Ｒ  Ｍｕｌｔｉ  Ｂプライマー；Ｔｉ４Ｆ  Ｍｕｌｔｉ  ＡプライマーとＴｉ５Ｒプライマー；Ｔｉ５ＦｎプライマーとＴｉ２Ｒプライマー；およびＴｉ６Ｆ  ＭｕｌｔｉプライマーとＴｉ６Ｒ  Ｍｕｌｔｉプライマーからなる群から選択される、請求項１３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＩＶ−１と関連する配列バリアント、特にＨＩＶクレイドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、およびＧ、ならびにそれの関連組換え体におけるものを検出および分析するための方法、試薬およびシステムを提供する。本明細書中で用いる用語“クレイド(clade)”は、一般に当業者が理解しているものと同じ意味をもち、特定の地域に一般にみられる遺伝学的に別個のサブグループのＨＩＶ−１ウイルスを表わす。たとえば、欧州におけるＨＩＶ−１感染症の約７５％はＨＩＶ−Ｂ（すなわち、クレイドＢ）感染症であり、約２５％はＨＩＶ−Ａ、ＨＩＶ−Ｃ、および他のクレイドグループからなる。
【０００２】
バリアントは、標的ポリヌクレオチドの集団において、一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入／欠失(insertion/deletion)バリアント（“ｉｎｄｅｌ”と呼ばれる）および対立遺伝子頻度を並行して含むことができる。本発明はまた、既知および未知の両方の配列の変異および多型を同定するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により複製した核酸を並行ピロリン酸配列決定によって調べる方法に関する。本発明は、ＨＩＶの特定の特徴または機能と関連するＨＩＶ  ＲＮＡまたはそれの相補的ＤＮＡの特定の領域および／または一連のオーバーラップ領域、たとえば、ＨＩＶが宿主細胞中へ組み込むための調製物中でウイルスＲＮＡを二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に転写する能力、およびウイルスポリタンパク質を適正に組み立て／成熟させて感染性ビリオンを産生する能力とそれぞれ関連する、逆転写酵素（ＲＴ）およびプロテアーゼ（Ｐｒｏｔ）領域を増幅するように特別に設計した、核酸プライマーの使用を伴う。また、それらのプライマーの標的部位は変異率が低く、バリアントを含む疑いのある標的ＨＩＶ核酸集団（偽種(quasispecies)とも呼ばれる）の核酸を着実に増幅して個々のアンプリコンを生成することができる。数千の個々のＨＩＶアンプリコンを多量に並行して有効かつ高い経費効率で配列決定して、アンプリコン集団にみられる配列バリアントの分布を作成し、これによって従来用いられている方法より大きな検出感度を得ることができる。
【背景技術】
【０００３】
ヒト免疫不全ウイルス（一般にＨＩＶと呼ばれる）は、処置のためのきわめて多数の化合物が承認されたけれども依然として世界的に重大な問題である。過誤を生じやすいウイルス逆転写酵素の性質および高いウイルスターンオーバー（ｔ１／２＝１〜３日）のため、ＨＩＶゲノムはきわめて速やかに変異する。それの９．７Ｋｂゲノムの複製に際して変異率が高いので、‘偽種’の形成によって動的関係で存在する多数の異なる変異体が生じる。
【０００４】
ＨＩＶ  ＲＴ遺伝子コード配列はｐｏｌ領域の５’末端に近接した位置にあり、ゲノム内でＰｒｏｔおよびＲＮａｓｅ領域により囲まれている−前者は、ｇａｇ遺伝子のｐ６タンパク質の３’末端から始まる、部分的にオーバーラップした読み枠をもつ。ＲＴタンパク質は４４０個のアミノ酸（５１ｋＤａ）によりコードされ、その主機能はそれと５６０個のアミノ酸（６６ｋＤａ）によりコードされるＲＴ／ＲＮａｓｅ  Ｈポリタンパク質とのヘテロ二量体としての組合わせから生じる。それは３つの主要な酵素機能を含む：１）ゲノムＲＮＡに対して相補的なＤＮＡ鎖を重合する、２）親ＲＮＡ鎖を分解して、その酵素の逆転写活性により作成されたこの相補的ＤＮＡを残す、および３）ポリメラーゼ活性により第１鎖に対して相補的な第２鎖を生成し、こうしてｄｓＤＮＡプロウイルスを産生する(Lu, et al., J. Biol. Chem. 279 (2004) 54529-54532；それを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する)。
【０００５】
ＨＩＶ−１のいずれかのウイルスゲノムに対するプライマー設計における重大な難点のひとつは、この酵素の忠実度(fidelity)が低いことに起因し、このためウイルスＲＮＡからｄｓＤＮＡへの１回のＲＴ変換内ですら高い変異頻度が生じる。文献は、ＨＩＶ−１  ＲＴが一本のＤＮＡ鎖を重合する際に１／２０００〜１／４０００の誤置換頻度を引き起こすことを指摘している。第１鎖および第２鎖が連続重合されるため、これらの過誤率は各ＨＩＶ−１ゲノム変換につき１ラウンドの複製当たり合計５〜１０の変異に等しくなる可能性がある(Preston, et al., Science 242 (1988) 1168-1171)。この変異ｄｓＤＮＡウイルスゲノムは次いで宿主生物の染色体に組み込まれて、感染およびその後の他の宿主細胞内への組込みのために一緒に複製される。逆転写酵素の機能に向けた薬物は、ウイルス伝播を低減するための卓越した目標であり、したがってＦＤＡは２クラスに該当する薬物を承認している：ヌクレオシド/ヌクレオチド類似体逆転写酵素阻害剤(nucleoside/nucleotide analog reverse transcriptase inhibitor)（ＮＲＴＩ／ＮｔＲＴＩ）および非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤(non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor)（ＮＮＲＴＩ）；これらは両方とも逆転写酵素を標的とするが、異なる様式でそれを行なう。
【０００６】
ＮＲＴＩクラスの抗レトロウイルス薬は、ＲＮＡおよびＤＮＡのヌクレオチド構築ブロックの構造類似体からなる。ウイルスＤＮＡ中に取り込まれると、これらの欠損ヌクレオチド類似体は次のヌクレオチドとの新たな３’→５’ホスホジエステル結合の形成を阻止して、鎖合成を早期に終止させ、ウイルス複製を効果的に阻害する(Zapor, M.J. et al., Pyschosomatics 45 (2004) 524-535)。ＮＲＴＩ類は一般に耐容性が良好であるが、なお若干の合併症を伴う可能性がある。これらの合併症には下記のものが含まれる：ミトコンドリア毒性（末梢神経障害が指標となる(Moyle, G.J. et al., Drug Saf 6 (1998) 481-494; Simpson, D.M. et al, J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 9 (1995) 153-161)、筋障害(Gold, R. et al., N. Engl. J. Med. 323 (1990) 994; de la Asuncion, J.G. et al., J. Clin. Invest. 102 (1998) 4-9)、乳酸性アシドーシス(Carr, A. Clin. Infect. Dis. 36, Suppl. 2 (2003) S96-S100)、および末梢脂肪栄養障害(Carr, A. et al., AIDS 14 (2000) F25-32)、造血毒性（貧血症、好中球減少症または血小板減少症として顕性になる; Gallicchio, V.S. et al., Int. J. Immunopharmacol. 15 (1993) 263-268)、聴器毒性(Simdon, J. Clin. Infect. Dis. 32 (2001) 1623-1627)、ならびに多数の有害な薬物相互作用。
【０００７】
ジドブジン(Zidovudine)、すなわち一般にＡＺＴまたはＲｅｔｒｏｖｉｒ（登録商標）と呼ばれるものは、ＦＤＡからの承認を得た最初のＮＲＴＩ薬であった。この薬物は一般に他の抗レトロウイルス薬（たとえば、高活性抗レトロウイルス治療(highly active antiretroviral treatment)（ＨＡＡＲＴ）計画に用いられるもの）と組み合わせられ、ウイルスが母親から子供へ伝播されるのを阻止するためにも用いられる。ジドブジンの毒性および副作用は他のＮＲＴＩ類と類似し、それらのうち最も一般的なものは血液毒性である。本明細書中に列記したものではなく、他の多数の承認されたヌクレオシド類似薬物がある（ジドブジンはチミジン類似体である）：アバカビル(Abacavir)（Ｚｉａｇｅｎ（登録商標））、すなわちＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅにより販売されるグアノシン類似体、ジダノシン(Didanosine)（Ｖｉｄｅｘ（登録商標））、すなわちＢｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂにより販売されるアデノシン類似体、およびエムトリシタビン(Emtricitabine)（Ｅｍｔｒｉｖａ（登録商標））、すなわちＧｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓにより販売されるシトシン類似体。現在までにＦＤＡにより承認された唯一のヌクレオチドＲＴ阻害剤は、Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓにより販売されるフマル酸テノホビルジソプロキシル(tenofovir disoproxil fumarate)としても知られる薬物Ｖｉｒｅａｄ（登録商標）、すなわちアデノシン５’−一リン酸類似体である。
【０００８】
ＮＲＴＩ類はＨＩＶゲノム内への取り込みに対して競合するヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体であるが、ＮＮＲＴＩ類はその酵素に直接かつ非競合的に結合することにより相補的ＤＮＡの伸長をブロックする。これは、タンパク質の活性部位のコンホメーションを変化させてヌクレオシド結合に対する親和性を低下させる作用をする。ＮＮＲＴＩ類は、活性になってＨＩＶ−１を阻害するために細胞内リン酸化を必要としない。ＮＮＲＴＩ類はそれらの抗ウイルス力価および耐容性によってＨＡＡＲＴ計画の好ましい成分となり、毒性およびウイルス交差耐性はＮＲＴＩ類とオーバーラップしない(Zapor et al., Pyschosomatics 45 (2004) 524-535)。一般的な副作用には、軽度の発疹(Scott, L.J. et al., Drugs 2 (2000) 373-407)、肝酵素レベルの上昇(Dieterich, D.T. et al, Clin. Infect. Dis. 38, Suppl. 2 (2004) S80-89)、および脂肪再分布(Adkins, J.C. et al., Drugs 56 (1998) 1055-1066)が含まれる。処置に一般に使用されるＮＮＲＴＩ類には下記のものが含まれるが、それらに限定されない：エファビレンツ(Efavirenz)（Ｓｕｓｔｉｖａ（登録商標）／Ｓｔｏｃｒｉｎ（登録商標））、ネビラピン(Nevirapine)（Ｖｉｒａｍｕｎｅ（登録商標））、およびエトラビリン(Etravirine)（Ｉｎｔｅｌｅｎｃｅ（登録商標））。
【０００９】
プロテアーゼ遺伝子のコード領域は、ＲＴ遺伝子のすぐ上流に位置する。この遺伝子は、他と対合してホモ二量体として機能する９９アミノ酸のモノマーをコードする。生成するアスパルチルプロテアーゼホモ二量体は、ＨＩＶ−１ウイルスの組立てに必要なＧａｇおよびＧａｇ−Ｐｏｌタンパク質の開裂に関与する。これらの前駆ポリタンパク質の開裂は、宿主の表面で、それらが細胞から放出されるのと近接した時点で起きる。成熟、すなわちＨＩＶ−１ポリタンパク質のｇａｇ、ｇａｇ−ｐｏｌおよびｎｅｆ領域の開裂は、複製したビリオンの生存に必須である。プロテアーゼはウイルスＲＮＡ変換に際して逆転写酵素により複製されるので、それはそれのヌクレオチド配列内に自然に変異を生じるであろう。ある変異は機能の喪失を生じる可能性があるが、他は機能を維持することができ、プロテアーゼ阻害剤耐性に関与する。その後、複製した世代全体にわたってこれらの変異体が選択されるため、個体を適切に処置することおよび有効なＨＡＡＲＴカクテルを得ることがよりいっそう困難になる。プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）は、プロテアーゼホモ二量体の触媒部位に結合する卓越した薬物クラスである。これらの薬物は、それらのタンパク質の三次元構造の解析により得られた情報から特別に工学的に作成された。ＰＩ類はそれぞれこの触媒部位に対して競合し、ウイルスの生存および感染全般に必須であるＧａｇおよびＧａｇ−Ｐｏｌポリタンパク質をプロテアーゼが受け入れるのを阻止する。ＰＩ類はこれらのウイルスタンパク質が細胞から放出される直前にそれらの活性化を阻止するように工学的に作成されているので、ＮＲＴＩ／ＮＮＲＴＩクラスの療法剤のようにウイルスのライフサイクルを阻止するよりも、むしろ終結させる。したがってＰＩ類はウイルスを“殺す”のではなく、感染した個体のウイルス負荷を低下させ、宿主Ｔ細胞に対する感染の攻撃を遅らせる。ＰＩ類の若干例には下記のものが含まれるが、それらに限定されない：アンプレナビル(Amprenavir)（Ａｇｅｎｅｒａｓｅ（登録商標））、アタザナビル(Atazanavir)（Ｒｅｙａｔａｚ（登録商標））、リトナビル(Ritonavir)（Ｎｏｒｖｉｒ（登録商標））、およびロピナビル／リトナビル(Lopinavir/ritonavir)（Ｋａｌｅｔｒａ（登録商標））。
【００１０】
現在のＨＩＶ薬物耐性アッセイは、一般に集団アッセイとして実施されており(Kuritzkes, D R. et al., J. Infect. Dis. 203 (2011) 146-148; Van Laethem, K. et al., J. Virol. Methods 153 (2008) 176-181; Paar, C. et al., J. Clin. Microbiol. 49 2697-2699)、これらは、それらの性質によって、各ウイルス株のクローン分離に基づくアッセイより感度が低い。しかし、以前に用いられていたクローン分析アッセイは著しく労力を要し、高感度を達成するためには各対象からの数千の細胞クローンを個別に検査する必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Lu, et al., J. Biol. Chem. 279 (2004) 54529-54532
【非特許文献２】Preston, et al., Science 242 (1988) 1168-1171
【非特許文献３】Zapor, M.J. et al., Pyschosomatics 45 (2004) 524-535
【非特許文献４】Moyle, G.J. et al., Drug Saf 6 (1998) 481-494
【非特許文献５】Simpson, D.M. et al, J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 9 (1995) 153-161
【非特許文献６】Gold, R. et al., N. Engl. J. Med. 323 (1990) 994
【非特許文献７】de la Asuncion, J.G. et al., J. Clin. Invest. 102 (1998) 4-9
【非特許文献８】Carr, A. Clin. Infect. Dis. 36, Suppl. 2 (2003) S96-S100
【非特許文献９】Carr, A. et al., AIDS 14 (2000) F25-32
【非特許文献１０】Gallicchio, V.S. et al., Int. J. Immunopharmacol. 15 (1993) 263-268
【非特許文献１１】Simdon, J. Clin. Infect. Dis. 32 (2001) 1623-1627
【非特許文献１２】Scott, L.J. et al., Drugs 2 (2000) 373-407
【非特許文献１３】Dieterich, D.T. et al, Clin. Infect. Dis. 38, Suppl. 2 (2004) S80-89
【非特許文献１４】Adkins, J.C. et al., Drugs 56 (1998) 1055-1066
【非特許文献１５】Kuritzkes, D R. et al., J. Infect. Dis. 203 (2011) 146-148
【非特許文献１６】Van Laethem, K. et al., J. Virol. Methods 153 (2008) 176-181
【非特許文献１７】Paar, C. et al., J. Clin. Microbiol. 49 2697-2699
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
４５４  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｌａｔｆｏｒｍにより得られる長い読み長さは、１回の配列決定行程で多数の対象からの数千のクローン読みを作成するのに理想的に適している。したがって、配列に基づくＨＩＶ逆転写酵素およびプロテアーゼ阻害剤耐性決定アッセイ（この場合、クローン配列は、労働集約的なクローニング段階なしに、ウイルスＲＮＡ偽種から直接に得られる）によるこれらの変異の効率的な検出はきわめて望ましく、早期検出によって疾患および処置の可能性を知ることにおいて実質的な前進を可能にする。さらに、“多量並列(Massively Parallel)”処理と呼ぶことができるものを可能にしたハイスループット配列決定法の態様は、以前の配列決定法より実質的にいっそう強力な分析、感度、および処理量の特性をもつ。たとえば、本明細書に記載する発明のＨＩＶ特異的プライマーを用いるハイスループット配列決定法は、集団中の対立遺伝子バリアントの１％以下の頻度を含めた存在量の低い対立遺伝子を検出する感度を達成できる。前記のように、これはＨＩＶバリアントの検出に関して重要であり、高感度は重要な早期検出機構を提供し、これが療法上の実質的な有益性をもたらす。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の態様は、核酸の配列決定に関する。より具体的には、本発明の態様は、ハイスループット配列決定法を用いて配列バリアントを検出するための方法およびシステムに関する。
【００１４】
逆転写酵素および／またはプロテアーゼと関連する出現頻度の低い１以上のＨＩＶ配列バリアントを検出するための、下記の段階を含む方法を記載する：（ａ）ＨＩＶ試料集団中の複数のＲＮＡ分子からｃＤＮＡ種を生成させ；（ｂ）これらのｃＤＮＡ種から複数の第１アンプリコンを増幅させ、その際、それぞれの第１アンプリコンはクレイドＡ、クレイドＢ、クレイドＣ、クレイドＤ、クレイドＦ、およびクレイドＧを含むＨＩＶクレイドからアンプリコンを生成しうる核酸プライマー対を用いて増幅され；（ｃ）第１アンプリコンの増幅コピーをクローン増幅させて、複数の第２アンプリコンを生成させ；（ｄ）第２アンプリコンの核酸配列組成を決定し；そして（ｅ）第２アンプリコンの核酸配列組成における１以上の配列バリアントを検出する。
【００１５】
上記の態様および実施形態は必ずしも包括的または相互排他的ではなく、それらが同一または異なる態様または実施形態と関連して提示されたとしても、矛盾せずかつ他の点において可能ないずれかの様式で組み合わせることができる。１つの態様または実施形態の記載は、他の態様および／または実施形態に関して限定することを意図したものではない。同様に、本明細書の他の箇所に記載したいずれか１以上の機能、段階、操作または手法を、別の実施形態において、概要に記載したいずれか１以上の機能、段階、操作または手法と組み合わせることができる。したがって、上記の態様および実施形態は限定ではなく例示である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
前記およびさらに他の特徴は、添付の図面と併せると以下の詳細な記述からより明確に認識されるであろう。図面において、同様な参照番号は同様な構造、要素または方法段階を示し、参照番号の最も左の数字はその参照要素が最初に現われる図の番号を示す（たとえば、要素１６０は最初に図１に現われる）。ただし、これらの取決めはすべて、限定さではなく代表または例示のためのものである。
【図１】図１は、コンピューター制御下にある配列決定機器の１態様および反応支持体の機能ブロック図である。
【図２】図２は、ＨＩＶ逆転写酵素およびプロテアーゼ領域に対する６つのアンプリコンの位置関係の態様の略図例である。
【図３】図３は、ＨＩＶ逆転写酵素およびプロテアーゼ領域に対する４つのアンプリコンの位置関係の態様の略図例である。
【図４Ａ】図４Ａは、図２の６アンプリコン方式により得られるＨＩＶ逆転写酵素およびプロテアーゼ領域の適用範囲(coverage)の１態様の略図例である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、図３の４アンプリコン方式により得られるＨＩＶ逆転写酵素およびプロテアーゼ領域の適用範囲の１態様の略図例である。
【図５】図５は、図２の６アンプリコン方式により得られる、既知バリアントの検出頻度に対する多数クレイドからの試料の関連を提供するソフトウェアインターフェースの１態様の略図例である。
【図６】図６は、図３の４アンプリコン方式により得られる、既知バリアントの検出頻度に対する多数クレイドからの試料の関連を提供するソフトウェアインターフェースの１態様の略図例である。
【図７】図７は、図２の６アンプリコン方式を用いて検出したＫ６５Ｒ逆転写酵素変異の１態様の略図例である。図７には、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  １６−１８、１８、１９−２０、２１、２０、１９−２０、１９−２０、２２−２３、２４、２０、１９−２０、および２５を出現順に開示する。
【図８】図８は、薬物耐性または感受性バリアントを検出するＨＩＶ−１アンプリコン配列データを作成するためのワークフローの１態様の略図例である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
より詳細に以下に記載するように、本明細書に記載する発明は、クレイドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、およびＧにおけるＨＩＶバリアントを１回の配列決定アッセイで同時に検出するように設計された標的特異的配列またはプライマー種を使用するための、ならびにそれらのプライマーを逆転写酵素およびプロテアーゼ領域におけるＨＩＶ配列バリアントの高感度検出に使用するための、システムおよび方法を含む。
【００１８】
ａ．全般
用語“フローグラム(flowgram)”は、一般的に、ＳＢＳ法、特にピロホスフェートに基づく配列決定法（“ピロ配列決定法(pyrosequencig)”とも呼ばれる）により作成した配列データの図形表現を表わし、より具体的には“ピログラム(pyrogram)”と呼ぶことができる。
【００１９】
本明細書中で用いる用語“読み”または“配列の読み”は、一般的に、１つの核酸鋳型分子から、またはその鋳型核酸分子の実質的に同一である複数のコピーの集団から得られる、全配列データを表わす。
【００２０】
本明細書中で用いる用語“行程(run)”または“配列決定行程”は、一般的に、１以上の核酸鋳型分子の配列決定操作で実施される一連の配列決定反応を表わす。
本明細書中で用いる用語“フロー”は、一般的に、一般的に鋳型核酸分子を含む流体溶液を反応環境へ導入する反復プロセスの一部である単一サイクルを表わし、その際、その溶液は、新生分子に付加するためのヌクレオチド種、あるいは他の試薬、たとえば配列決定プロセスに使用できるかまたは前のヌクレオチド種のフローからのキャリーオーバーまたはノイズ効果を低減するために使用できる緩衝液、洗浄溶液または酵素を含有することができる。
【００２１】
本明細書中で用いる用語“フローサイクル”は、一般的に、連続した一連のフローを表わし、その際、ヌクレオチド種を含む流体はそのサイクル中で１回流される（すなわち、フローサイクルはＴ、Ａ、Ｃ、Ｇヌクレオチド種を順に連続添加することを含むことができるが、他の配列組合わせもこの定義の一部とみなされる）。一般に、フローサイクルはサイクル間で同じシーケンスのフローを伴う反復サイクルである。
【００２２】
本明細書中で用いる用語“読み長さ”は、一般的に、信頼性をもって配列決定できる鋳型分子の長さの上限を表わす。あるシステムおよび／またはプロセスの読み長さに関与する多数の要因があり、それには鋳型核酸分子中のＧＣ含有度が含まれるが、これに限定されない。
【００２３】
本明細書中で用いる用語“検査フラグメント(test fragment)”または“ＴＦ”は、一般的に、品質管理、検量、または関連する他の目的で使用できる既知の配列組成をもつ核酸エレメントを表わす。
【００２４】
本明細書中で用いる用語“プライマー”は、一般的に、ある核酸鎖に対して相補的なプライマー伸長生成物の合成が適宜な緩衝液中で適切な温度において誘導される条件下で、ＤＮＡ合成の開始点として作用するオリゴヌクレオチドを表わす。プライマーは、好ましくは一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。
【００２５】
本明細書中で用いる用語“新生(nascent)分子”は、一般的に、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼにより鋳型分子中の対応するヌクレオチド種に対して相補的なヌクレオチド種の取込みによって伸長されるＤＮＡ鎖を表わす。
【００２６】
本明細書中で用いる用語“鋳型核酸”、“鋳型分子”、“標的核酸”、または“標的分子”は、一般的に、配列決定反応の対象である核酸分子を表わし、それから配列のデータまたは情報が作成される。
【００２７】
本明細書中で用いる用語“ヌクレオチド種”は、一般的に、新生核酸分子に一般に取り込まれるプリン類（アデニン、グアニン）およびピリミジン類（シトシン、ウラシル、チミン）を含めた核酸モノマーの種類を表わす。“天然”ヌクレオチド種には、たとえばアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、およびチミンが含まれる。上記の天然ヌクレオチド種の修飾形には、限定ではなく、ヒポキサンチン、キサンチン、７−メチルグアニン、５，６−ジヒドロウラシル、および５−メチルシトシンが含まれる。
【００２８】
本明細書中で用いる用語“モノマー反復配列”または“ホモポリマー”は、一般的に、同じヌクレオチド種を含む２以上の配列位置（すなわち、反復ヌクレオチド種）を表わす。
【００２９】
本明細書中で用いる用語“均一伸長”は、一般的に、実質的に同一である鋳型分子の集団の各メンバーがその反応において同じ伸長段階を均一に行なう、伸長反応の関係または期を表わす。
【００３０】
本明細書中で用いる用語“完成効率”は、一般的に、そのフローに際して適正に伸長した新生分子のパーセントを表わす。
本明細書中で用いる用語“不完全伸長率”は、一般的に、すべての新生分子の数に対する適正に伸長できなかった新生分子の数の比率を表わす。
【００３１】
本明細書中で用いる用語“ゲノムライブラリー”または“ショットガンライブラリー”は、一般的に、生物または個体の全ゲノム（すなわち、ゲノムの全領域）に由来する、および／または全ゲノムを提示する、分子集合体を表わす。
【００３２】
本明細書中で用いる用語“アンプリコン”は、一般的に、選択された増幅生成物、たとえばポリメラーゼ連鎖反応法またはリガーゼ連鎖反応法から生成したものを表わす。
本明細書中で用いる用語“バリアント”または“対立遺伝子”は、一般的に、類似するけれども互いにある程度の相異をもつ配列組成をそれぞれコードする複数の種のうちの１つを表わす。この相異には、当業者に既知のいずれかのタイプの変異を含めることができ、これには多型、たとえば一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入または欠失（挿入／欠失事象の組合わせは“ｉｎｄｅｌ”とも呼ばれる）、反復配列（縦列反復配列とも呼ばれる）数の差、および構造変異が含まれるが、これらに限定されない。
【００３３】
本明細書中で用いる用語“対立遺伝子頻度(allele frequency, allelic frequency)”は、一般的に、ある集団の全バリアントのうち特定のバリアントからなる割合を表わす。
本明細書中で用いる用語“鍵配列”または“鍵エレメント”は、一般的に、鋳型核酸分子に既知のロケーションで会合した（すなわち、一般にライゲートしたアダプターエレメント中に含まれる）既知の配列組成を含む核酸配列エレメント（一般に、約４つの配列位置のもの、すなわちＴＧＡＣ、または他の組合わせのヌクレオチド種）を表わし、それは鋳型分子から作成される配列データに対する品質管理基準として用いられる。配列データが適正なロケーションにおける鍵エレメントと関連する既知の配列組成を含むならば、その配列データは品質管理に合格する。
【００３４】
本明細書中で用いる用語“キーパス”または“キーパスウェル(keypass well)”は、一般的に、既知の配列組成をもつ全長核酸検査配列（すなわち、前記で述べた“検査フラグメント”または“ＴＦ”）の反応ウェルにおける配列決定を表わす；その際、ＴＦ配列および／または鍵配列（ＴＦに会合した、または標的核酸に会合したアダプター中の）に由来する配列の精度を、ＴＦおよび／または鍵の既知の配列組成と比較し、その配列決定の精度の尺度として、また品質管理のために用いる。典型的な態様において、配列決定行程におけるウェルの総数のうちのある割合がキーパスウェルであり、それらはある態様において、分散した領域にあってもよい。
【００３５】
本明細書中で用いる用語“平滑末端”は、当業者の理解と一致して解釈され、一般的に、一対の相補的ヌクレオチド塩基種で終わる末端をもつ線状二本鎖核酸分子を表わし、その際、一対の平滑末端は一般に相互ライゲーションに適合する。
【００３６】
本明細書中で用いる用語“粘着末端(sticky end)”または“オーバーハング”は、一般的に、当業者の理解と一致して解釈され、一般的に、その分子の一方の鎖の末端に１以上の非対合ヌクレオチド種をもつ線状二本鎖核酸分子を表わし、その際、非対合ヌクレオチド種はいずれか一方の鎖上に存在し、単一の塩基位置または複数の塩基位置を含む（時には“付着末端(cohesive end)”とも呼ばれる）。
【００３７】
本明細書中で用いる用語“ＳＰＲＩ”は、当業者の理解と一致して解釈され、一般的に、特許技術“固相可逆固定化(Solid Phase Reversible Immobilization)”を表わし、その場合、標的核酸は特定の緩衝条件下にビーズの存在下で選択的に沈降し、その際、それらのビーズはしばしばカルボキシル化されており、かつ常磁性である。沈降した標的核酸はビーズに固定化され、オペレーターの要望に従って溶離により分離されるまで結合を維持する(DeAngelis, M.M. et al., Nucleic Acids Res. 23 (1995) 4742-4743)。
【００３８】
本明細書中で用いる用語“カルボキシル化された”は、当業者の理解と一致して解釈され、一般的に、微粒子などの材料を少なくとも１つのカルボキシル基の付加により修飾することを表わす。カルボキシル基はＣＯＯＨまたはＣＯＯ−である。
【００３９】
本明細書中で用いる用語“常磁性”は、当業者の理解と一致して解釈され、一般的に材料の特性を表わし、その材料の磁性は外部印加磁界の存在下でのみ発生し、その外部印加磁界が除かれると磁化は全く維持されない。
【００４０】
本明細書中で用いる用語“ビーズ”または“ビーズ支持体”は、一般的に、いずれか好都合なサイズの不規則または規則的な形状のいずれかのタイプの固相粒子を表わし、それらはたとえば下記の多数の既知材料から作成される：セルロース、セルロース誘導体、アクリル樹脂、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ビニルとアクリルアミドのコポリマー、ジビニルベンゼンなどで架橋したポリスチレン(たとえば、Merrifield, Biochemistry 3 (1964) 1385-1390に記載されるもの)、ポリアクリルアミド、ラテックスゲル、ポリスチレン、デキストラン、ゴム、シリコン、プラスチック、ニトロセルロース、天然スポンジ、シリカゲル、制御ポアガラス、金属、架橋デキストラン(たとえば、Sephadex（商標）)、アガロースゲル(Sepharose（商標）)、および当業者に既知の他の固相ビーズ支持体。
【００４１】
本明細書中で用いる用語“反応環境”は、一般的に、反応を行なうことができるある体積の空間を表わし、一般にそこに反応体を少なくとも一時的に収容または拘束して、少なくとも１種類の反応生成物を検出することができる。反応環境の例にはキュベット、チューブ、ボトル、および平面または非平面支持体上の１以上の窪み、ウェル、またはチャンバーが含まれるが、これらに限定されない。
【００４２】
本明細書中で用いる用語“仮想ターミネーター”は、一般的に、反応速度を実質的に低下させるターミネーターを表わし、その際、反応を停止させるための追加段階、たとえば反応体の除去を採用してもよい。
【００４３】
試料の調製および処理、配列データの作成、および配列データの分析と関連するシステムおよび方法の若干の代表的態様を一般的に以下に記載する；それらの一部または全部を本明細書に記載する発明の態様について使用できる。特に、鋳型核酸分子の調製、鋳型分子の増幅、標的特異的アンプリコンおよび／またはゲノムライブラリーの作成のためのシステムおよび方法、配列決定の方法および機器装備、ならびにコンピューターシステムの代表的態様を記載する。
【００４４】
一般的態様において、実験試料または診断試料に由来する核酸分子を、それの原形態から調製および処理して、ハイスループット配列決定に適した鋳型分子にすべきである。その処理法は適用毎に異なる可能性があり、その結果、多様な特性を含む鋳型分子が得られる。たとえば、ハイスループット配列決定のある態様において、少なくとも特定の配列決定によりそれについて精確に配列データを得ることができる長さに匹敵する配列または読み長さをもつ鋳型分子を作成することが好ましい。この例において、長さには約２５〜３０塩基、約５０〜１００塩基、約２００〜３００塩基、約３５０〜５００塩基、約５００〜１０００塩基の範囲、１０００塩基より大、または特定の配列決定適用に適した他のいずれかの長さを含めることができる。ある態様において、試料、たとえばゲノム試料に由来する核酸を、当業者に既知である多数の方法を用いてフラグメント化する。好ましい態様において、核酸をランダムにフラグメント化する（すなわち、特定の配列または領域を選択しない）方法には、噴霧(nebulization)法または音波処理法と呼ばれるものを含めることができる。しかし、他のフラグメント化法、たとえば制限エンドヌクレアーゼを用いる消化をフラグメント化の目的に使用できることは認識されるであろう。同様にこの例において、ある処理法は、希望する長さの核酸フラグメントを選択的に単離するために当技術分野で既知のサイズ選択法を使用できる。
【００４５】
同様に、ある態様において、追加の機能エレメントをそれぞれの鋳型核酸分子と関連づけることが好ましい。それらのエレメントは多様な機能のために使用でき、下記を含むが、それらに限定されない：増幅および／または配列決定法のためのプライマー、品質管理エレメント（すなわち、たとえば鍵エレメントまたは他のタイプの品質管理エレメント）、原試料または患者などとの種々の関連性をエンコードするユニーク識別子（多重識別子(multiplex identifier)または“ＭＩＤ”とも呼ばれる）、あるいは他の機能エレメント。
【００４６】
たとえば、本発明のある態様は、既知の識別可能な配列組成をもつ１以上の態様のＭＩＤエレメントを試料と関連づけ、それらの態様のＭＩＤエレメントを関連づけた試料に由来する鋳型核酸分子とカップリングさせることを含む。ＭＩＤカップリングした、多数の異なる試料に由来する鋳型核酸分子をプールして、単一の“多重”試料または組成物にし、次いでそれを効率的に処理して、ＭＩＤカップリングした鋳型核酸分子それぞれについての配列データを作成することができる。鋳型核酸分子それぞれについての配列データをデコンボルーションして、カップリングしたＭＩＤエレメントの配列組成を同定し、原試料との関連性を同定する。この例において、多重組成物は約３８４の試料からの代表、約９６の試料、約５０の試料、約２０の試料、約１６の試料、約１２の試料、約１０の試料、または他の数の試料を含むことができる。各試料を、研究に関して、種々の実験条件、処理、種、または個体と関連づけることができる。同様に各試料を、診断に関して、種々の組織、細胞、個体、条件、薬物、または他の処理と関連づけることができる。前記に挙げた試料の数は代表例を示す目的で提示され、したがって限定とみなすべきではないことは、当業者に認識されるであろう。
【００４７】
好ましい態様において、各ＭＩＤエレメントの配列組成は容易に同定でき、配列決定プロセスで導入される過誤を生じにくい。ＭＩＤエレメントのある態様は、自然界に存在する配列との配列類似性が最小であるユニーク配列組成の核酸種を含む。あるいは、ＭＩＤエレメントの態様は、自然界に存在する配列とのある程度の配列類似性を含むことができる。
【００４８】
同様に、好ましい態様において、鋳型核酸分子のある特徴および／または鋳型核酸分子にカップリングしたアダプターエレメントと対比して、各ＭＩＤエレメントの位置が分かっている。各ＭＩＤエレメントの位置が分かっていることは、配列データ中にＭＩＤエレメントを見出して、ＭＩＤ配列組成を過誤の可能性について解釈し、その後、原試料と関連づけるために有用である。
【００４９】
たとえば、ＭＩＤエレメントに対する位置関係の手掛かりとして有用なある特徴には、鋳型分子の長さ（すなわち、ＭＩＤエレメントは５’または３’末端からどのくらいの配列位置にあるかが分かっている）、ＭＩＤエレメントに隣接した位置にある認識可能な配列マーカー、たとえば鍵エレメントおよび／または１以上のプライマーエレメントが含まれるが、これらに限定されない。この例において、鍵エレメントおよびプライマーエレメントは一般に既知の配列組成を含み、これは一般に多重組成物において試料毎に変動せず、ＭＩＤエレメントを探索するための位置基準として使用できる。アプリケーション１３５により実装される分析アルゴリズムをコンピューター１３０で実行し、それぞれのＭＩＤカップリングした鋳型について作成された配列データを分析して、より容易に認識できる鍵エレメントおよび／またはプライマーエレメントを同定し、それらの位置から外挿して、ＭＩＤエレメントの配列を含むと推定される配列領域を同定することができる。アプリケーション１３５は、次いでこの推定領域およびおそらくそのフランキング領域内のある距離離れた領域の配列組成を処理して、ＭＩＤエレメントおよびそれの配列組成を確実に同定することができる。
【００５０】
前記の機能エレメントの一部または全部を組み合わせてアダプターエレメントにし、これらをある処理段階でヌクレオチド配列にカップリングさせることができる。たとえば、ある態様は、プライミング配列エレメント、あるいは増幅および／または配列決定に用いたプライマー配列に対して相補的な配列組成を含む領域を、会合させることができる。さらに、これらの同じエレメントを、“鎖選択”と呼ぶことができるものおよび固相支持体への核酸分子の固定化のために使用できる。ある態様において、２セットのプライミング配列領域（以後、プライミング配列Ａおよびプライミング配列Ｂと呼ぶ）を鎖選択に使用でき、その際、１コピーのプライミング配列Ａおよび１コピーのプライミング配列Ｂをもつ一本鎖のみを選択し、調製試料として含める。別態様において、アダプターエレメントのデザイン特徴により鎖選択の必要性が除かれる。これらの同じプライミング配列領域を増幅および固定化のための方法に使用でき、その際、たとえばプライミング配列Ｂを固体支持体上に固定化し、それから増幅生成物を延長させることができる。
【００５１】
フラグメント化、鎖選択、ならびに機能エレメントおよびアダプターの付加のための試料処理の他の例は、U.S. Patent Application Serial No. 10/767,894, タイトル“Method for preparing single-stranded DNA libraries”, 2004年1月28日出願; U.S. Patent Application Serial No. 12/156,242, タイトル“System and Method for Identification of Individual Samples from a Multiplex Mixture”, 2008年5月29日出願;およびU.S. Patent Application Serial No. 12/380,139, タイトル“System and Method for Improved Processing of Nucleic Acids for Production of Sequencable Libraries”, 2009年2月23日出願に記載されており、これらのそれぞれを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する。
【００５２】
鋳型核酸分子の増幅を実施して実質的に同一であるコピーの集団を作成するためのシステムおよび方法の種々の例を記載する。ＳＢＳのある態様において、１以上のヌクレオチド種を鋳型分子のコピーと関連するそれぞれの新生分子に取り込ませる際に、それぞれの核酸エレメントの多数コピーを生成させてより強い信号を発生させるのが望ましいことは当業者に認識されるであろう。核酸分子のコピーを作成するための当技術分野で既知の手法が多数ある；たとえば、細菌ベクターと呼ばれるものを用いる増幅、“ローリングサークル(Rolling Circle)”増幅（前記で援用したU.S. Patent No. 6,274,320および7,211,390に記載）およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法；これらの各手法を本明細書に記載する発明に使用するものとして適用できる。ハイスループット適用に特に適したＰＣＲ法のひとつには、エマルジョンＰＣＲ法（ｅｍＰＣＲ（商標）法とも呼ばれる）が含まれる。
【００５３】
エマルジョンＰＣＲ法の代表的態様には、２つの非混和性物質の安定なエマルジョンを形成して、その内部で反応を行なうことができる水性液滴を形成することが含まれる。特に、ＰＣＲ法に使用するのに適したエマルジョンの水性液滴は、液滴として懸濁または分散した第１流体、たとえば水を基礎とする流体（不連続相とも呼ばれる）を、一般的にあるタイプの油を含む他の流体、たとえば疎水性流体（連続相とも呼ばれる）内に含むことができる。使用できる油の例には鉱油、シリコーンを基礎とする油、またはフッ素化油が含まれるが、これらに限定されない。
【００５４】
さらに、あるエマルジョンの態様は、エマルジョンを安定化する作用をもつ界面活性剤を使用でき、これはＰＣＲなど特定の処理法に特に有用な可能性がある。界面活性剤のある態様には、１種類以上のシリコーンまたはフッ素化界面活性剤を含めることができる。たとえば、１種類以上の非イオン界面活性剤を使用でき、これには下記のものが含まれるが、これらに限定されない：ソルビタンモノオレエート（Ｓｐａｎ（商標）８０とも呼ばれる）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ（商標）８０とも呼ばれる）、またはある好ましい態様において、ジメチコーンコポリオール(dimethicone copolyol)（Ａｂｉｌ（登録商標）  ＥＭ９０とも呼ばれる）、ポリシロキサン、ポリアルキルポリエーテルコポリマー、ポレグリセロールエステル、ポロキサマー(poloxamer)類、およびＰＶＰ／ヘキサデカンコポリマー（Ｕｎｉｍｅｒ  Ｕ−１５１とも呼ばれる）、あるいはより好ましい態様において、シクロペンタシロキサン中の高分子量シリコーンポリエーテル（ＤＣ  ５２２５Ｃとも呼ばれ、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇから入手できる）。
【００５５】
エマルジョンの液滴は、コンパートメント、マイクロカプセル、マイクロリアクター、微小環境、または関連技術分野で一般に用いられている他の名称で呼ぶこともできる。水性液滴のサイズは、エマルジョンの成分または組成物の組成、それに含有される含量、および用いる調製法に応じて、広範に及ぶ可能性がある。前記エマルジョンは、内部でＰＣＲなどの化学反応を行なうことができる微小環境を形成する。たとえば、希望するＰＣＲ反応を実施するのに必要な鋳型核酸およびすべての試薬をエマルジョンの液滴内に封入し、化学的に隔離することができる。ある態様において、追加の界面活性剤または他の安定剤を用いて前記の液滴の安定性をさらに増進することができる。液滴を用いてＰＣＲ法に典型的なサーモサイクリング操作を実施して、封入された核酸鋳型を増幅し、鋳型核酸の実質的に同一である多数のコピーを含む集団を作成することができる。ある態様において、液滴内の集団を“クローン単離した”、“コンパートメント化した”、“封鎖した”、“封入した”、または“局在化した”集団と呼ぶことができる。同様に、この例において、前記の液滴の一部または全部はさらに、鋳型および鋳型の増幅コピー、鋳型に対して相補的な増幅コピー、またはその組合わせを付着させるための、固体支持体、たとえばビーズを封入することができる。さらに、固体支持体を他のタイプの核酸、試薬、標識、または他の関係分子が付着できるようにすることができる。
【００５６】
エマルジョンを破壊してビーズを回収した後、一般的態様において、それに固定化した鋳型核酸分子の増幅に成功した実質的に同一であるコピーの集団を含むビーズを“富化”することが望ましい。たとえば、“ＤＮＡ陽性”ビーズを富化するための方法は、固定化された増幅コピーの遊離末端領域（一般にアダプター配列中にある）にプライマー種をハイブリダイズさせ、そのプライマーをポリメラーゼ仲介延長反応により延長させ、そのプライマーを富化用支持体、たとえば磁性ビーズまたはセファロースビーズに結合させることを含むことができる。それらのビーズを含む溶液に、選択的条件、たとえば磁界または遠心を適用することができ、その際、富化用ビーズはその選択的条件に応答し、“ＤＮＡ陰性”ビーズ（すなわち、固定化されたコピーを全くまたはわずかしか含まない）から分離される。
【００５７】
本明細書に記載する発明に有用なエマルジョンの態様は、前記の化学反応を多量に並行して実施できるきわめて高い密度の液滴またはマイクロカプセルを含むことができる。増幅に用いるエマルジョンおよび配列決定用としてのそれらの使用の他の例は、U.S. Patent No. 7,638,276; 7,622,280; 7,842,457; 7,927,797; および8,012,690、ならびにU.S. Patent Application Serial No 13/033,240に記載されており、これらのそれぞれを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する。
【００５８】
時にはウルトラディープ配列決定(Ultra-Deep Sequencing)と呼ばれる配列決定用の標的特異的アンプリコンを生成する態様も、標的核酸を含む試料から選択した標的領域（単数または複数）を増幅するための特異的核酸プライマーのセットの使用を含む本明細書に記載する発明に使用できる。さらに、試料は、研究または診断用途と関連する配列組成を含む配列バリアントを含有することが分かっているかまたはその疑いがある核酸分子の集団を含むことができ、その際、それらのプライマーを用いて試料中の配列バリアントを増幅させ、その分布を洞察することができる。たとえば、核酸試料中の多数の対立遺伝子の特異的増幅および配列決定により配列バリアントを同定するための方法を実施することができる。目的領域または核酸集団に共通のセグメントを囲む領域を増幅するように設計したＰＣＲプライマー対により、核酸をまず増幅させる。ＰＣＲ反応の各生成物（第１アンプリコン）を、次いで別個の反応器、たとえば前記のエマルジョンに基づく反応器内でさらに個別に増幅させる。それぞれ第１アンプリコン集団の１メンバーに由来する生成アンプリコン（本明細書中で第２アンプリコンと呼ぶ）を配列決定し、この配列集合体を用いて、存在する１以上のバリアントの対立遺伝子頻度を決定する。重要なことは、この方法は存在するバリアントを予め知る必要がなく、一般に核酸分子の集団中に＜１％の頻度で存在するバリアントを同定できることである。
【００５９】
前記の標的特異的な増幅および配列決定法の幾つかの利点には、これまで達成されたものより高いレベルの感度が含まれ、これは鋳型核酸分子の混合集団を含む方式に特に有用である。さらに、ハイスループット配列決定機器装備を用いる態様、たとえば４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより提供されるＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅ（登録商標）アレイ（時にはＰＴＰ（商標）プレートまたはアレイとも呼ばれる）のウェルと呼ばれるものを用いる態様において、前記方法を用いて行程または実験当たり１００，０００以上、３００，０００，以上、５００，０００、または１，０００，０００以上の核酸領域について配列組成を作成することができ、これは少なくとも一部は利用者の好み、たとえばガスケットなどの使用により可能になる列構成に依存する。同様に、前記方法は、試料中に存在する対立遺伝子バリアントの１％以下である可能性がある低い存在度の対立遺伝子を検出する感度を提供する。前記方法の他の利点には、分析した領域の配列を含むデータが作成されることが含まれる。重要なことは、分析される遺伝子座の配列の予備知識をもつ必要がないことである。
【００６０】
配列決定のための標的特異的アンプリコンの他の例は、U.S. Patent Application Serial No. 11/104,781, タイトル“Methods for determining sequence variants using ultra-deep sequencing”, 2005年4月12日出願; PCT Patent Application Serial No. US 2008/003424, タイトル“System and Method for Detection of HIV Drug Resistant Variants”, 2008年3月14日出願;およびU.S. Patent No. 7,888,034, タイトル“System and Method for Detection of HIV Tropism Variants”, 2009年6月17日出願に記載されており、これらのそれぞれを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する。
【００６１】
さらに、配列決定の態様には、サンガー(Sanger)型手法、すなわち一般にハイブリダイゼーションによる配列決定（Sequencing by Hybridization）（ＳＢＨ）、ライゲーションによる配列決定(Sequencing by Ligation)（ＳＢＬ）、または取込みによる配列決定(Sequencing by Incorporation)（ＳＢＩ）と呼ばれる手法を含めることができる。配列決定には、ポロニー配列決定法(polony sequencing technique)と呼ばれるもの；ナノポア、導波、および他の単分子検出法；または可逆ターミネーター法も含めることができる。前記のように、好ましい手法には、合成による配列決定(Sequencing by Synthesis)法を含めることができる。たとえば、あるＳＢＳ態様は、核酸鋳型の実質的に同一であるコピーの集団を配列決定するものであり、一般的に、試料鋳型分子の予め定めた相補的位置にアニールするように設計された１以上のオリゴヌクレオチドプライマー、または鋳型分子に結合した１以上のアダプターを用いる。このプライマー／鋳型複合体に、核酸ポリメラーゼ酵素の存在下でヌクレオチド種が提示される。そのヌクレオチド種が、試料鋳型分子上でオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端のすぐ隣の配列位置に対応する核酸種に対して相補的であれば、ポリメラーゼがそのヌクレオチド種でプライマーを延長するであろう。あるいは、ある態様において、プライマー／鋳型複合体に複数の関係ヌクレオチド種（一般に、Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴ）が一度に提示され、試料鋳型分子上でオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端のすぐ隣の配列位置の対応する配列に対して相補的なヌクレオチド種が取り込まれる。上記のいずれの態様においても、それ以上の延長を阻止するためにヌクレオチド種を化学的にブロックする（たとえば、３’−Ｏ位置において）ことができ、それは次のラウンドの合成の前に脱ブロックする必要がある。ヌクレオチド種を新生分子の末端に付加するプロセスは、プライマーの末端への付加について前記に述べたものと実質的に同じであることも認識されるであろう。
【００６２】
前記のように、ヌクレオチド種の取込みは当技術分野で既知の多様な方法により、たとえば光を発生する酵素反応プロセスを用いてピロホスフェート（ＰＰｉ）の放出を検出することにより、またはＨ＋放出の検出およびｐＨ変化の測定により（例は、U.S. Patent No. 6,210,891; 6,258,568;および6,828,100に記載されており、これらのそれぞれを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する）、あるいはヌクレオチドに結合した検出可能な標識により検出できる。検出可能な標識の若干例には質量タグおよび蛍光標識または化学発光標識が含まれるが、これらに限定されない。代表的態様において、取り込まれなかったヌクレオチドを、たとえば洗浄により除去する。さらに、ある態様において、取り込まれなかったヌクレオチドに、酵素分解、たとえばアピラーゼまたはピロホスファターゼ酵素を用いる分解を施すことができる；U.S. Patent Application Serial No. 12/215,455, タイトル“System and Method for Adaptive Reagent Control in Nucleic Acid Sequencing”, 2008年6月27日出願;および12/322,284, タイトル“System and Method for Improved Signal Detection in Nucleic Acid Sequencing”, 2009年1月29日出願に記載；これらのそれぞれを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する。
【００６３】
検出可能な標識を用いる態様において、それらは一般に、次の合成サイクルの前に不活性化されなければならないであろう（たとえば、化学的開裂または光漂白により）。鋳型／ポリメラーゼ複合体における次の配列位置を、次いで前記のように他のヌクレオチド種または複数の関係ヌクレオチド種で照会することができる。ヌクレオチド付加、延長、信号取得、および洗浄の反復サイクルにより、鋳型鎖のヌクレオチド配列を決定できる。信頼できる検出に十分なほど強い信号を達成するために、この例を継続して、実質的に同一である多数の鋳型分子または集団（たとえば、１０３、１０４、１０５、１０６または１０７の分子）をいずれか１つの配列決定反応において一般に同時に分析する。
【００６４】
さらに、ある態様において、“対合末端(paired-end)”配列決定方式と呼ぶことができるものを用いることにより、配列決定プロセスの読み長さ性能および質を改善することが有利であろう。たとえば、ある態様の配列決定法は、高品質で信頼性のある読みを得ることができる分子の全長に制限がある。言い換えると、採用する配列決定法の態様によっては、信頼性のある読み長さについての配列位置の総数が２５、５０、１００、または５００塩基を超えない可能性がある。対合末端配列決定方式は、各末端が中央でリンカー配列により連結した元の鋳型核酸分子のフラグメントを含む分子の各末端（時には“タグ”末端と呼ばれる）を個別に配列決定することによって、信頼性のある読み長さを延長する。それらの鋳型フラグメントの元の位置関係は分かっているので、配列読みから得られるデータを再結合して、より長い高品質の読み長さをもつ単一の読みにすることができる。対合末端配列決定態様の他の例は、U.S. Patent No. 7,601,499, タイトル“Paired end sequencing”;およびU.S. Patent Application Serial No. 12/322,119, タイトル“Paired end sequencing”, 2009年1月28日出願に記載されており、これらのそれぞれを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する。
【００６５】
ＳＢＳ装置の幾つかの例は前記方法の一部または全部を実装することができ、１以上の検出デバイス、たとえば電荷結合デバイス（すなわち、ＣＣＤカメラ）もしくは光学的検出のための共焦点型構築物、イオンもしくは化学物質の検出のための構築物についてのイオン感受性電界効果トランジスター(Ion-Sensitive Field Effect Transistor)（“ＩＳＦＥＴ”とも呼ばれる）もしくは化学物質感受性電界効果トランジスター(Chemical-Sensitive Field Effect Transistor)（“ＣｈｅｍＦＥＴ”とも呼ばれる）、ミクロ流体素子チャンバーもしくはフローセル、反応支持体、および／またはポンプおよび流動弁を含むことができる。ピロホスフェートに基づく配列決定法の例をとれば、ある態様の装置は、発生するバックグラウンドノイズのレベルが本来低い化学発光検出方式を採用できる。
【００６６】
ある態様において、配列決定のための反応支持体には、平面支持体、たとえばスライド型支持体、ＩＳＦＥＴ検出素子を収容したウェル型構造物を含む半導体チップ、またはある態様においてウェル型構造物を含むことができる導波管型反応支持体を含めることができる。さらに、反応支持体には、前記のように４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手できるＰＴＰ（商標）アレイと呼ばれるものを含めることができ、これは実質的に同一である鋳型分子の集団をそれぞれが保持できるようにした無数のきわめて小さなウェルを生成するように酸エッチングされた光ファイバーフェースプレートから形成される（すなわち、ある好ましい態様は、約３３０万個のウェルを７０×７５ｍｍのＰＴＰ（商標）アレイ上に３５μｍのウェル間ピッチで含む）。ある態様において、実質的に同一である鋳型分子の各集団をそれぞれ、固体支持体、たとえばビーズ上に配置することができ、それらをそれぞれ上記のウェルのひとつに配置することができる。たとえば、ある装置は、流体試薬をＰＴＰプレートホルダーへ供給するための試薬送達素子、およびＰＴＰプレート上の各ウェルから放射される光の光子を収集できるようにしたＣＣＤ型検出デバイスを含むことができる。改善された信号認識のための特徴を含む反応支持体の例は、U.S. Patent No. 7,682,816, タイトル“THIN-FILM COATED MICROWELL ARRAYS AND METHODS OF MAKING SAME”, 2005年8月30日出願に記載されており、これを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する。ＳＢＳタイプの配列決定およびピロホスフェート配列決定を実施するための装置および方法の他の例は、U.S. Patent No. 7,323,305および7,575,865に記載されており、これらは両方とも前記で援用したものである。
【００６７】
さらに、１以上の試料調製プロセス、たとえば前記のｅｍＰＣＲ（商標）プロセスを自動化するシステムおよび方法を採用できる。たとえば、自動化システムを用いて、ｅｍＰＣＲ処理のためのエマルジョンを調製し、ＰＣＲサーモサイクリング操作を実施し、作成に成功した配列決定用の核酸分子集団を富化するための、有効な解決策を得ることができる。自動化された試料調製システムの例は、U.S. Patent No. 7,927,797;およびUS Patent Application Serial No 13/045,210に記載されており、これらを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する。
【００６８】
また、本明細書に記載する発明のシステムおよび方法は、コンピューターシステムで実行するために記憶させたコンピューター可読媒体を用いるある設計、分析、または他の操作の実装を含むことができる。たとえば、ＳＢＳシステムおよび方法を用いて検出した信号の処理および／または作成したデータの分析のための幾つかの態様であって、処理および分析の態様をコンピューターシステムに実装できるものを以下に詳細に記載する。
【００６９】
本明細書に記載する発明に使用するための代表的態様は、いずれかのタイプのコンピュータープラットホーム、たとえばワークステーション、パーソナルコンピューター、サーバー、または他のいずれかの現在もしくは将来のコンピューターを含むことができる。ただし、本明細書に記載する上記コンピュータープラットホームは本発明の特殊な操作を実施するために特別に構築されたものであり、汎用コンピューターとはみなされないことは、当業者に認識されるであろう。コンピューターは一般に、既知の構成素子、たとえばプロセッサー、オペレーティングシステム、システムメモリー、メモリー記憶デバイス、入出力コントラー、入出力デバイス、およびディスプレーデバイスを含む。可能なコンピューターの構築物および構成素子が多数あり、キャッシュメモリー、データバックアップユニット、および他の多数のデバイスも含まれることも当業者に認識されるであろう。
【００７０】
ディスプレーデバイスには、視覚情報を提供するディスプレーデバイスを含めることができ、この情報は一般にピクセルのアレイとして論理的および／または物理的に組織化できる。インターフェースコントローラーも含めることができ、これは入出力インターフェースを提供するための多様な既知または将来のソフトウェアプログラムのいずれかを含むことができる。たとえば、インターフェースには、１以上の図形表現をユーザーに提供する、一般に“図形ユーザーインターフェース(Graphical User Interface)”と呼ばれるもの（しばしばＧＵＩと呼ばれる）を含めることができる。インターフェースは一般に、当業者に既知の選択または入力の手段を用いたユーザー入力を受理できるようになっている。
【００７１】
同じまたは別の態様において、コンピューターのアプリケーションは、“コマンドラインインターフェース(command line interface)”と呼ばれるもの（しばしばＣＬＩと呼ばれる）を含むインターフェースを使用できる。ＣＬＩは一般に、アプリケーションとユーザーの間にテキストに基づく対話を提供する。一般に、コマンドラインインターフェースはディスプレーデバイスによりテキストのラインとして出力を提示し、かつ入力を受理する。たとえば、ある実装は、“シェル”と呼ばれるもの、たとえば当業者に既知のＵｎｉｘ  Ｓｈｅｌｌ、またはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ．ＮＥＴフレームワークなどのオブジェクト指向型プログラミングアーキテクチャーを用いるＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ  Ｐｏｗｅｒｓｈｅｌｌを含むことができる。
【００７２】
インターフェースが１以上のＧＵＩ、ＣＬＩまたはその組合わせを含むことができるのは当業者に認識されるであろう。
プロセッサーには、市販のプロセッサー、たとえばＩｎｔｅｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のＣｅｌｅｒｏｎ（登録商標）、Ｃｏｒｅ（商標）またはＰｅｎｔｉｕｍ（登録商標）プロセッサー、Ｓｕｎ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ製のＳＰＡＲＣ（登録商標）プロセッサー、ＡＭＤ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のＡｔｈｌｏｎ（商標）、Ｓｅｍｐｒｏｎ（商標）、Ｐｈｅｎｏｍ（商標）またはＯｐｔｅｒｏｎ（商標）プロセッサーを含めることができ、あるいはそれは入手できるかまたは入手できるようになるであろう他のプロセッサーのひとつであってもよい。プロセッサーのある態様には、マルチコアプロセッサーと呼ばれるもの、および／または単一もしくは多重コア構成の並列処理技術を採用できるようにしたものを含めることができる。たとえば、マルチコアアーキテクチャーは一般に２以上のプロセッサー“実行コア(execution core)”を含む。この例において、それぞれの実行コアは、多重スレッド(thread)の並列実行を可能にする独立したプロセッサーとして動作することができる。さらに、プロセッサーを、一般に３２または６４ビットアーキテクチャーと呼ばれるもの、あるいは現在既知であるかまたは将来開発される可能性のある他のアーキテクチャー構成物に構成できることは当業者に認識されるであろう。
【００７３】
プロセッサーは一般にオペレーションシステムを実行し、それはたとえば下記のものであってもよい：Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）型オペレーティングシステム（たとえば、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ＸＰ、Ｗｉｎｄｏｗｓ  Ｖｉｓｔａ（登録商標）、またはＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）＿７）；Ａｐｐｌｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．からのＭａｃ  ＯＳ  Ｘオペレーティングシステム（たとえば、Ｍａｃ  ＯＳ  Ｘ  ｖｌ０．６“Ｓｎｏｗ  Ｌｅｏｐａｒｄ”オペレーティングシステム）；多数の業者またはオープンソースと呼ばれるものから入手できるＵｎｉｘ（登録商標）またはＬｉｎｕｘ型のオペレーティングシステム；他のまたは将来のオペレーティングシステム；あるいはそのいずれかの組合わせ。オペレーティングシステムは周知の様式でファームウェアおよびハードウェアとインターフェース構築し、多様なプログラミング言語で書かれる可能性のある各種コンピュータープログラムの機能をプロセッサーが組み合わせて実行するのを容易にする。オペレーティングシステムは、一般にプロセッサーと協調して、コンピューターの他の構成素子の機能を組み合わせて実行する。オペレーティングシステムは、スケジューリング、入出力制御、ファイルおよびデータの管理、メモリー管理、ならびに通信制御および関連のサービスも提供し、これらはすべて既知の技術に従う。
【００７４】
システムメモリーには、多様な既知または将来のメモリー記憶デバイスをいずれも含めることができる。例には、一般的に入手できるいずれかのランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）、磁気媒体、たとえば常駐ハードディスクまたはテープ、光学媒体、たとえば読出しおよび書込み用コンパクトディスク、あるいは他のメモリー記憶デバイスを含めることができる。メモリー記憶デバイスには、多様な既知または将来のデバイスをいずれも含めることができ、これにはコンパクトディスクドライブ、テープドライブ、着脱式ハードディスクドライブ、ＵＳＢもしくはフラッシュドライブ、またはディスケッテドライブが含まれる。そのようなタイプのメモリー記憶デバイスは一般に、プログラム記憶媒体（示していない）、たとえばそれぞれコンパクトディスク、磁気テープ、着脱式ハードディスク、ＵＳＢもしくはフラッシュドライブ、またはフロッピーディスケッテから読み出し、および／またはそれらに書き込む。これらのプログラム記憶媒体、あるいは現在用いられているかまたは将来開発される可能性のある他のものはいずれも、コンピュータープログラムプロダクトとみなすことができる。認識されるように、これらのプログラム記憶媒体は一般にコンピューターソフトウェアプログラムおよび／またはデータを記憶する。コンピューター制御論理とも呼ばれるコンピューターソフトウェアプログラムは、一般にメモリー記憶デバイスと併せて用いられるシステムメモリーおよび／またはプログラム記憶デバイスに記憶される。
【００７５】
ある態様において、制御論理（プログラムコードを含むコンピューターソフトウェアプログラム）がそれに記憶されたコンピューター使用可能媒体を含む、コンピュータープログラムプロダクトを記載する。制御論理は、プロセッサーにより実行されると、プロセッサーに本明細書に記載する機能を行なわせる。他の態様において、ある機能は、たとえばハードウェア状態機械を用いて、主にハードウェアに実装される。本明細書に記載する機能を行なうようなハードウェア状態機械の実装は、当業者に自明であろう。
【００７６】
入出力コントローラーには、ヒトまたは機械のいずれであっても、ローカルまたはリモートのいずれであっても、ユーザーからの情報を受理して処理するための多様な既知のデバイスを含めることができる。そのようなデバイスには、たとえばモデムカード、ワイヤレスカード、ネットワークインターフェースカード、サウンドカード、または多様な既知の入力デバイスのいずれかのための他のタイプのコントローラーが含まれる。出力コントローラーには、ヒトまたは機械のいずれであっても、ローカルまたはリモートのいずれであっても、ユーザーに情報を提示する多様な既知のディスプレーデバイスのためのコントローラーを含めることができる。本明細書に記載する態様において、コンピューターの機能素子はシステムバスを介して相互に通信する。ある態様のコンピューターは、ネットワークまたは他のタイプの遠隔通信を用いて、ある機能素子と通信することができる。
【００７７】
当業者に自明のとおり、機器制御および／またはデータ処理アプリケーションをソフトウェアに実装すれば、システムメモリーおよび／またはメモリー記憶デバイスにロードし、それから実行することができる。機器制御および／またはデータ処理アプリケーションの全部または一部が、メモリー記憶デバイスの読出し専用メモリーまたはそれに類するデバイス中にあってもよく、それらのデバイスは機器制御および／またはデータ処理アプリケーションを入出力コントローラーによって最初にロードする必要がない。機器制御および／またはデータ処理アプリケーションあるいはその一部を、プロセッサーによって既知の方法で、実行に有利なようにシステムメモリーもしくはキャッシュメモリーまたは両方にロードしてもよいことは、当業者に理解されるであろう。
【００７８】
また、コンピューターは、システムメモリーに記憶された１以上のライブラリーファイル、実験データファイル、およびインターネットクライアントを含むことができる。たとえば実験データは、１以上の実験またはアッセイに関係するデータ、たとえば１以上のＳＢＳ実験または方法と関連する検出信号値または他の数値を含むことができる。さらに、インターネットクライアントは他のコンピューター上のリモートサービスにネットワークを用いてアクセスできるようにされたアプリケーションを含むことができ、たとえば一般に“ウェブブラウザー”と呼ばれるものを含むことができる。この例において、ある一般的に用いられるウェブブラウザーには、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手できるＭｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｉｎｔｅｒｎｅｔ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ８、Ｍｏｚｉｌｌａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＭｏｚｉｌｌａ  Ｆｉｒｅｆｏｘ（登録商標）３．６、Ａｐｐｌｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．からのＳａｆａｒｉ  ４、Ｇｏｏｇｌｅ（商標）  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＧｏｏｇｌｅ  Ｃｈｒｏｍｅ、あるいは当技術分野で現在知られているかまたは将来開発される可能性のある他のタイプのウェブブラウザーが含まれる。同様に、同じまたは他の態様において、インターネットクライアントは、ネットワークを介してリモート情報にアクセスできるように特殊化されたソフトウェアアプリケーション、たとえば生物学的アプリケーション用のデータ処理アプリケーションを含むことができ、あるいはその構成素子であってもよい。
【００７９】
ネットワークには、当業者に周知の多種多様なタイプのネットワークのうちの１以上を含めることができる。たとえば、ネットワークには、一般にＴＣＰ／ＩＰプロトコルスイートと呼ばれるものを通信に用いるローカルエリアネットワークまたは広域ネットワークを含めることができる。ネットワークには、一般にインターネットと呼ばれる世界的な相互結合コンピューターネットワークのシステムを含むネットワークを含めることができ、あるいはイントラネットアーキテクチャーも含めることができる。ネットワーク接続環境にある若干のユーザーが、ハードウェアおよび／またはソフトウェアシステムへの、あるいはそれらからの情報トラフィックを制御するために、一般に“ファイアウォール（ｆｉｒｅｗａｌｌ）”（時にはパケットフィルター(Packet Filter)またはボーダープロテクションデバイス(Border Protection Devices)とも呼ばれる）と呼ばれるものを利用するのを好むことも当業者に認識されるであろう。たとえば、ファイアウォールはハードウェアもしくはソフトウェア素子またはその何らかの組合わせを含むことができ、一般にユーザー、たとえばネットワーク管理者などが導入したセキュリティーポリシーを実施するように設計されている。
【００８０】
ｂ．本明細書に記載する発明の態様
前記のように、本発明の態様は、試料に由来するクレイドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、およびＧ、または多数クレイドの組換え体からＨＩＶ逆転写酵素およびプロテアーゼ配列バリアントを検出し、そのバリアント配列組成を薬物耐性および／または感受性タイプと関連づけることによりＨＩＶ逆転写酵素およびプロテアーゼ機能を標的とする薬物に対する耐性および／または感受性の相関性を検出する方法に関する。さらに本発明の態様は、個々の試料の同時検出のために、複数の試料を組み合わせて組合わせプールにして配列決定し、クレイドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、およびＧ、またはその組換え体からのバリアントを並行して検出する、多重配列決定アッセイに関する；その際、各試料に多重識別子配列（ＭＩＤ）を割り当てて、同定したバリアントを試料と関連づける。試料が一般に単一クレイドまたは２以上のクレイド間の組換え体に由来してもよいことは当業者に認識されるであろう。さらに、相関性には、検出したバリアントと薬物耐性および／または感受性と関連することが分かっている変異との相関性の診断、ならびに検出したバリアントと試料の薬物耐性および／または感受性表現型との相関性の新知見を含めることができるのは理解されるであろう。
【００８１】
本発明の態様は、薬物耐性および／または感受性タイプと関連することが分かっているＨＩＶ逆転写酵素およびプロテアーゼの領域を標的とする２段階ＰＣＲ法（すなわち、前記の第１および第２アンプリコンの生成）を含み、これを数千のウイルス粒子からの配列情報が並行して得られる配列決定法と連携させ、これにより、出現するＨＩＶ逆転写酵素およびプロテアーゼのタイプを（それらのタイプと検出した試料中のバリアントの配列組成の関連性に基づいて）、それらのタイプが試料中に低頻度で出現する場合ですら同定できる。事実、本発明の態様は、ＨＩＶウイルス粒子を非−化学量論的な対立遺伝子量で含有する試料中に存在する配列バリアント、たとえば５０％以上、５０％未満、２５％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満で存在するＨＩＶ逆転写酵素およびプロテアーゼバリアントを検出できる。上記の態様は、迅速で信頼性のある、かつ経費効率の良い方法で、そのような同定を行なうことができる。
【００８２】
代表的な配列決定の態様において、１以上のプロセス段階を自動化する１以上の機器素子を使用できる。たとえば、ある配列決定法の態様は、一部または全部の段階を自動化して実施する機器装備を用いて実行できる。図１は、配列決定機器１００の図例を示し、これは、光信号を捕獲する必要がある配列決定プロセスのために、一般に、反応支持体１０５で行なわれる配列決定反応の実行およびデータ捕捉のための光学サブシステムおよび流体素子サブシステムを含む。しかし、他のモードのデータ捕獲（すなわち、ｐＨ、温度、電気化学など）を必要とする配列決定法についてはそのモードのデータ捕獲のための当業者に既知のサブシステムを採用できることは認識されるであろう。たとえば、鋳型分子の試料をユーザー１０１または何らかの自動化態様により反応支持体１０５に装填し、次いで配列決定機器１００を用いて多量に並行して配列決定して、それぞれの鋳型分子の配列組成を示す配列データを得ることができる。重要なことは、ユーザー１０１には独立した研究者、技術者、臨床医、大学、または企業体を含むいかなるユーザーも含めることができ、これらに限定されないことである。
【００８３】
ある態様において、機器１００を用いる配列決定に必要な調製の一部または全部を実施するように構成された試料調製機器１８０を用いて、試料を任意に全自動化または部分自動化様式での配列決定用に調製できる。試料調製機器１８０は説明のために提示され、個々の配列決定アッセイに必要な試料調製と関連する段階の一部または全部を実施するようにそれぞれ設計された１以上の機器を表わすことができるのは、当業者に認識されるであろう。試料調製機器の例には、ロボット式プラットホーム、たとえばＨａｍｉｌｔｏｎ  Ｒｏｂｏｔｉｃｓ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、またはＣａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手できるものを含めることができる。
【００８４】
さらに、図１に示すように、配列決定機器１００は１以上の外部コンピューター構成素子、たとえばコンピューター１３０に作動可能な状態で連携していてもよく、これはたとえばシステムソフトウェアまたはファームウェア、たとえばアプリケーション１３５を実行でき、これは１以上の機器、たとえば配列決定機器１００または試料調製機器１８０の指示制御、および／またはデータ分析機能を提供できる。コンピューター１３０はさらに他のコンピューターまたはサーバーにネットワーク１５０を介して作動可能な状態で接続していてもよく、これは機器システムを遠隔操作でき、大量のデータを記憶および処理が可能なシステムに輸出することができる。この例において、配列決定機器１００および／またはコンピューター１３０は、前記に一般的に記載した態様の構成素子および特徴の一部または全部を含むことができる。
【００８５】
本発明の１観点において、標的特異的プライマーは、クレイドＡ（＞５００配列）、Ｂ（＞１０００配列）、Ｃ（＞４０００配列）、Ｄ（＞８００配列）、およびＦ／Ｇ（約３００配列）に由来するＨＩＶ配列のアラインメントから設計され、前記の配列決定アプリケーションに直接使用するためにきわめて低いバイアスでアンプリコンを生成するように設計されたた。既知ＨＩＶ配列のアラインメントは、当業者に既知の方法を用いて実施できる。たとえば、多数の配列アラインメント方法、アルゴリズムおよびアプリケーションが当技術分野で得られ、これには下記のものが含まれるが、これらに限定されない：Smith-Watermanアルゴリズム(Smith, T.F. and Waterman, M.S. 147 (1981) J. Mol. Biol. 195-197)、ＢＬＡＳＴアルゴリズム(Altschul, S.F., et al., J. Mol. Biol. 215 (1990) 403-410)、およびＣｌｕｓｔａｌ(Thompson, J.D., et al., Nucl. Acids Res. 25 (1997) 4876-4882)。配列をアラインさせて単一配列にすることにより、ＨＩＶ配列集団の最も頻度の高い配列組成のコンセンサス配列が得られる。またこの例では、ソフトウェアアプリケーションにより、ＨＩＶ型別のための目的領域およびプライマー配列に対する標的領域を、このアラインさせたコンセンサス配列に対してプロットすることができる。目的領域には、変異を生じやすく、ＨＩＶ阻害剤耐性に関与する可能性があることが分かっている領域が含まれる。次いで、このコンセンサス配列のうち既知の変異感受性領域より保存度が大きい（すなわち、変異する可能性がより少ない）領域に対するプライマーセットを設計することができる。また、プライマー設計には、追加の考慮事項、たとえば増幅生成物の配列組成を決定するために採用する配列決定技術の読み長さ性能に関して得られる増幅生成物の長さが含まれる。低い変異率をもつ標的配列領域をプライマー設計のための標的とする利点には、プライマーを結合できないようにする標的領域変異のため失敗する実質的リスクなしに、設計されたプライマーは信頼性をもって使用できることが含まれる。
【００８６】
重要なことは、本発明のプライマーは各プライマーセットが多重のＨＩＶクレイドからアンプリコンを生成するように設計されることであり、具体的には各プライマーセットはＨＩＶクレイドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、およびＧ、ならびに２以上のクレイドの関連組換え体からアンプリコンを生成するであろう。事実、本発明はクレイド間で起きる組換え事象の検出に特に有用である。たとえば、本発明のプライマーはクレイドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、およびＧの群内の特定のクレイドに対して選択的ではないので、少なくとも２つの異なるクレイドに由来する組換えバリアントが増幅され、前記方法に従って配列決定されるであろう；これは、少なくとも一部は、本発明の配列決定法はクレイドに由来する配列エレメントが組み換えられる“破断点”に対して感受性ではないという事実による。したがって、クレイド特異的な配列シグネチャーとの関連以外の先験情報は必要ないので、得られる配列データを分析して組換え事象を同定することができる。
【００８７】
さらに、コンセンサス配列の“保存された”領域とみなすことができる範囲内の特定位置はそれらの組成がなお変動性であって“縮重”位置とみなされることは、当業者に認識される。ある好ましい態様において、プライマー設計に用いるパラメーターには、コンセンサス配列を決定するために用いる多重配列アラインメントに際して、ある位置のヌクレオチド種が９８％未満の頻度である場合、プライマー組成中のその位置の縮重塩基を置換することが含まれる。さらに、結合標的領域およびプライマー組成の選択に影響を与える他のパラメーターには、２つのオルタナティブヌクレオチド種のみをもつものに縮重位置を制限し、かつ２つを超えない縮重位置にプライマー組成を制限して、プライマー反復(iteration)数を最小限に維持することにより、増幅反応におけるプライマー二量体形成のリスクを減らし、また十分な量の増幅生成物が生成する可能性を高めることが含まれる（それぞれの縮重位置は、それぞれがオルタナティブヌクレオチド種のひとつを含む少なくとも２つの反復を必要とする）。ある態様において、縮重位置をプライマー組成の最後の５つの配列位置に制限することも望ましい（すなわち、フォワードプライマーの３’末端、およびリバースプライマーの５’末端）；この最後の５つの位置は高度に保存されていることが結合効率にとって有利だからである。たとえば、縮重配列位置は一般に少なくとも２つの異なるヌクレオチド種をもち、それらはその位置にオルタナティブ配列組成として現われる。本明細書に記載する発明において、２つを超えるヌクレオチドを提示する縮重ヌクレオチドはプライマー設計に取り込まれなかった（すなわち、３または４つのヌクレオチドを提示する可能性のあるＨ、Ｂ、ＶまたはＮｓを用いなかった）；これもまた、十分な量の増幅生成物が生成する可能性を高める。縮重塩基は当業者に周知であり、多様なタイプの縮重が、そのタイプと関連するオルタナティブヌクレオチド組成を表わすＩＵＰＡＣ記号により示される。たとえば、ＩＵＰＡＣ記号Ｒはプリン塩基（すなわち、ＡおよびＧ）がオルタナティブの可能性をもつことを表わす。
【００８８】
本発明の１態様は、ハイスループット配列決定に適した６つのアンプリコンを生成するように設計された下記のプライマー種を含む：
【００８９】
【化１−１】
2013545441.tif 000003
【００９０】
【化１−２】
2013545441.tif 000004
【００９１】
図２は、上記に説明したプライマーから生成したＨＩＶ逆転写酵素およびプロテアーゼ領域に対する６つのアンプリコンの相対位置の図例を示す。図２において、アンプリコン２０５、２１５、２２５、２３５、２４５および２５５はプロテアーゼ／逆転写酵素領域２００上に広がる交差した関係で配置されているが、図２に説明したアンプリコンの厳密な関係は代表例を示す目的で提示したものであって限定とみなすべきではないことは認識されるであろう。さらに、上記に開示したプライマーのサブセットを用いて、ウイルスＲＮＡから１以上のｃＤＮＡ生成物を作成できる。
【００９２】
下記の表１は、本発明の上記６アンプリコン発明のプライマーから作成した生成アンプリコンとおおよそのアンプリコン長さ（すなわち、アンプリコンの長さは個々のアンプリコン種の変異の程度およびタイプに基づいて変動する可能性がある）の関係の例を示す。アンプリコンの長さには本明細書に記載するアダプターエレメントの一部または全部が含まれる可能性があることも認識されるであろう。
【００９３】
【表１】
2013545441.tif 000005
【００９４】
前記の６アンプリコン法のより詳細な適用範囲を図４Ａにも示す；これは配列の“フィンガープリント”の図形表現を提示し、それらのアンプリコンがＨＩＶ逆転写酵素／プロテアーゼ領域の完全な適用範囲を提供することを示す。
【００９５】
本発明の第２態様は、ハイスループット配列決定に適した４つのアンプリコンを生成するように設計された下記のプライマー種を含む（“＊”で示したプライマーは前記の第１態様にも存在するが、第１態様とは異なるエレメント、たとえばＭＩＤエレメント、増幅／配列決定用プライマー配列などが含まれてもよい）。
【００９６】
【化２−１】
2013545441.tif 000006
【００９７】
【化２−２】
2013545441.tif 000007
【００９８】
第２態様には、ウイルスＲＮＡから１以上のｃＤＮＡ生成物を作成するための下記のプライマーも使用できる。あるいは上記に開示したアンプリコンプライマーのサブセットを使用できる。ＨＸＢ２およびおよび位置情報がＨＸＢ２基準ゲノム（ＨＸＢ２  ＨＩＶ株に由来する）を表わすことも分かるであろう。
【００９９】
【化３】
2013545441.tif 000008
【０１００】
図３は、上記に説明したプライマーから生成した４つのアンプリコンの相対位置の図例を示す。図３において、アンプリコン２２５、３１５、３２５および２５５はプロテアーゼ／逆転写酵素領域３００上に広がる交差した関係で配置されている（ＨＸＢ２基準目盛を使用）が、アンプリコン２２５および２５５は前記の６アンプリコン法と共通であること、ならびに図３に説明したアンプリコンの厳密な関係は代表例を示す目的で提示したものであって限定とみなすべきではないことは認識されるであろう。さらに、上記に開示したプライマーのサブセットを用いて、ウイルスＲＮＡから１以上のｃＤＮＡ生成物を作成できる。上記に示したＲＴＰ４Ｒ  ｃＤＮＡプライマーはｃＤＮＡプライマー部位３５０にアニールし、ＲＴＰ５Ｒ  ｃＤＮＡプライマーはｃＤＮＡプライマー部位３６０に結合する。
【０１０１】
下記の表２は、本発明の上記４アンプリコン発明のプライマーから作成した生成アンプリコンとおおよそのアンプリコン長さ（すなわち、アンプリコンの長さは個々のアンプリコン種の変異の程度およびタイプに基づいて変動する可能性がある）の関係の例を示す。この場合も、アンプリコンの長さには本明細書に記載するアダプターエレメントの一部または全部が含まれる可能性があることも認識されるであろう；この場合、たとえば表２のアンプリコン２２５および２５５は、表１に記載したアンプリコン２２５および２５５より２０塩基対長く、これは異なるエレメント、たとえば本明細書の他の箇所に記載した種々の目的で付加したＭＩＤ配列または他のエレメントに起因する可能性がある。
【０１０２】
【表２】
2013545441.tif 000009
【０１０３】
前記の４アンプリコン法のより詳細な適用範囲を図４Ｂにも示す；これは配列の“フィンガープリント”の図形表現を提示し、それらのアンプリコンがＨＩＶ逆転写酵素／プロテアーゼ領域の完全な適用範囲を備えていることを示す。
【０１０４】
プライマーセットについてある程度の配列組成変動性があること、および開示したプライマー配列に対して９０％以上の相同性は本明細書に記載する発明の範囲内とみなされることは、当業者に認識されるであろう。たとえば、前記プライマーセットについての標的領域はわずかにシフトする可能性があり、したがってプライマー配列組成の若干の相異が予想される。また、コンセンサス配列に対する改良がなされる可能性があり、あるいは特定の位置における新たな配列縮重が見出された結果として標的領域の配列組成がわずかに変化する可能性があり、同様にプライマー配列組成に若干の変異が予想される。
【０１０５】
本発明のある態様において、たとえば６アンプリコン法に示されるように、逆転写酵素およびプロテアーゼ領域の適用範囲がオーバーラップしたアンプリコン生成物を生成することが有利であり、これにより少なくとも“二重適用範囲”が得られ、これは品質管理における実質的有益性、およびアンプリコン生成物のうちのいずれかが適正に増幅できない場合または他の何らかのタイプの実験アーチファクトを生じた場合の余剰性を提供できる。代表的態様において、希望するアンプリコンと関連するプライマー組合わせを用いて各アンプリコンを個別の反応で作成する。さらに、ある態様において、アンプリコンはＰＣＲなどの増幅技術で信頼性をもって調製できる長さ（すなわち、誤増幅率が低いなど）より長く、したがって各アンプリコンは同じプライマー組合わせを用いる２回の増幅から得られる生成物であってもよい。この例において、生成物は一般にある程度のオーバーラップをもち、これもアンプリコン生成物の組立ておよび品質管理に役立つ。
【０１０６】
ある態様において、個々のアンプリコンからの第２ラウンドの増幅のために用いられるもうひとつの一般的プライマーを含むアダプターエレメントを、処理中にアンプリコンの各末端にライゲートさせて、クローンコピーの集団を生成させる（すなわち、第２アンプリコンを作成する）。アダプターが本明細書の他の箇所に記載する他のエレメント、たとえば品質管理エレメント、他のプライマー、たとえば配列決定用プライマーおよび／または増幅用プライマー（または増幅用および配列決定用の両方のプライマーとして機能できるようにした単一プライマー）、ユニーク識別子エレメント（すなわち、前記のＭＩＤエレメント）なども含むことができるのは認識されるであろう。同様に、ある態様において、前記の標的特異的プライマーを、後続プロセス段階に使用できる１以上の他のエレメントと組み合わせることができる。たとえば、一本鎖核酸分子が一方の末端に追加の配列エレメントに隣接して標的特異的プライマー配列を含むことができる。この標的特異的プライマーは標的領域にハイブリダイズし、他のエレメントはそれらの配列組成が標的領域の隣のフランキング配列に対して非相補性であるため懸垂した状態になり、この場合、増幅生成物は目的領域のコピーおよび追加の配列エレメントを含む。
【０１０７】
本発明のある態様において、第１鎖ｃＤＮＡはＨＩＶ  ＲＮＡから標的特異的プライマーまたは特異的ｃＤＮＡプライマーを用いて作成される。１態様において、第１鎖ｃＤＮＡは、前記の配列決定用アダプター(sequencing adaptor)（時にはＳＡＤと呼ばれる）を含まない単一プライマーを用いて作成することができる。次いで、標的特異的プライマー／プロセシングエレメント方式を用いて“第１”アンプリコンを生成させる。こうして得られるアンプリコンは必要なプロセシングエレメントがプライマーに会合しているため、それらを含む。
【０１０８】
同様に、ある態様において、前記のエマルジョンに基づくＰＣＲ増幅方式を用いて第２ラウンドの増幅を行ない、これにより、一般にビーズ支持体上に固定化された“第２”アンプリコンのクローン集団が得られ、この支持体は第２アンプリコンを効果的に捕捉して、エマルジョンが破壊された際に拡散するのを阻止する。一般に、本明細書の他の箇所に記載するように、次いで数千の第２アンプリコンを並行して配列決定する。たとえば、固定化された第２アンプリコン集団を含むビーズを反応支持体１０５に装填し、配列決定機器１００を用いて処理する；これは＞１０００クローンの読みを各試料から作成し、その配列データを処理のためにコンピューター１３０へ出力する。コンピューター１３０は特殊化されたソフトウェア（たとえば、アプリケーション１３５）を実行して、試料に由来する１％以下の存在度で生じるバリアントを含めたバリアントを同定する。
【０１０９】
同一または異なる態様のソフトウェアアプリケーションにより配列データをさらに分析して、それぞれの読みからの情報をＨＩＶタイプと関連する既知のハプロタイプと関連づけることもできる；その際、個々の読みからの配列データはコンセンサス配列に由来する変異を含んでもよく、含まなくてもよい。本明細書中で用いる用語“ハプロタイプ”は一般的に、一緒に伝播されるかまたは統計的に関連性をもつ、ある核酸配列と関連する対立遺伝子の組合わせを表わし、これはＨＩＶの場合はＨＩＶ  ＲＮＡ配列を含む。１以上の特殊化されたデータ構造物、たとえばハプロタイプおよび／または逆転写酵素／プロテアーゼ関連情報を記憶した１以上のデータベースの使用をこの関連づけに含めることができるのは、当業者に認識されるであろう。このソフトウェアアプリケーションはデータ構造物を含むかあるいは既知の方法でそれと通信して、データ構造物から情報を引き出し、および／またはそれに新たな情報を供給することができる。
【０１１０】
図５は、６アンプリコン方式により得られる配列データから作成したアプリケーション１３５の出力の図例を示し、これはインターフェース５００を含み、既知バリアント５０３と試料５０５の比較を含む。図５の図において、試料５０５は各試料と関連するクレイドまたは組換えクレイドの指標を提示し、セル５０７は各バリアントについてバリアント５０３の検出頻度の尺度を提示する。たとえばインターフェース５００は、クレイドＡ、Ｂ、Ｃ、および組換えクレイドＡＥが試料５０５と関連しており、その際、最も右の欄において、試料ＷＷＲＢ３５０がクレイドＨと関連し、バリアントＮＮＲＴＩ＿Ｓｔａｎｆｏｒｄ＿Ｌ１００Ｖ＿１がこのウイルス集団中に０．３９％の頻度で検出されたことを指摘する。
【０１１１】
同様に、図６は、４アンプリコン方式により得られる配列データから作成したアプリケーション１３５の出力の図例を示し、これはインターフェース６００を含み、既知バリアント６０３と試料６０５の比較を含む。図６の図において、試料６０５は各試料と関連するクレイドまたは組換えクレイドの指標を提示し、セル６０７は各バリアントについてのバリアント６０３の検出頻度の尺度を提示する。たとえば、インターフェース６００は、クレイドＢ、Ｃ、およびＧ、ならびに組換えクレイドＡＥ、ＡＧおよびＢＧが試料６０５と関連しており、その際、最も左の欄において、試料ＡＬＰ１がクレイドＧと関連し、バリアントＮＮＲＴＩ＿Ｖ１Ｏ６Ａ（３）がこのウイルス集団中に１．６６％の頻度で検出されたことを指摘する。
【０１１２】
さらに、図７は、６アンプリコン方式により得られる配列データから作成したアプリケーション１３５の出力の図例を示し、これは未知バリアントまたは未知の可能性があるバリアントの検出を表わすインターフェース７００を含む。インターフェース７００は、それぞれが個々のＨＩＶ  ＲＮＡ分子に由来する単一の読みを表わす複数の配列７０５とアラインメントしたコンセンサス配列７０３の視覚表現をユーザー１０１に提供する多重ペインを含む。インターフェース７００はコンセンサス配列７０３と配列組成が異なる塩基コール７１０も同定し、その際、そのような同定は、関連技術分野で既知である、異なる色、太字、イタリックまたは他の視覚表現手段による塩基コール７１０の強調を含むことができる。インターフェース７００は、試料中に検出した変異のレベル７２０を基準配列７０３中の塩基位置により視覚表現すること、およびそれらの塩基位置における配列読み数７３０の表現も、ユーザー１０１に提供する。図７の例において、試料中に１％以下の頻度で出現するるバリアントが、クローン読みの検査によって容易に測定される。
【０１１３】
上記のように、多数の核酸を並行して配列決定する方法は、本明細書に記載する発明に必要な感度を備えている。たとえば、二項統計学(binomial statistics)に基づいて、完全装填した６０ｍｍ×６０ｍｍ  ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅについて９５％信頼度での検出下限（すなわち１事象）（２×１０６の高品質塩基、２００，０００×１００塩基の読みからなる）は少なくとも０．００２％の対立遺伝子頻度をもつ集団についてであり、９９％信頼度では少なくとも０．００３％  ９の対立遺伝子頻度をもつ集団についてである（７０×７５ｍｍ  ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅを前記に従って使用でき、これによればさらに多数の読みが可能であり、したがって感度が増大することも認識されるであろう）。比較として、ピロホスフェートに基づく配列決定によるＳＮＰ検出は、最少頻出対立遺伝子が集団中に１０％以上存在する場合に限って、四倍体ゲノム上の分離した対立遺伝子状態の検出を報告している(Rickert et al., BioTechniques 32 (2002) 592-603)。一般的な蛍光ＤＮＡ配列決定はよりさらに感度が低く、５０／５０（すなわち５０％）ヘテロ接合体対立遺伝子の解像に支障がある(Ahmadian et al., Anal. BioChem. 280 (2000) 103-110)。
【０１１４】
表３は、一定数Ｎ（＝１００）の配列決定されたアンプリコンについて、全集団中のＳＮＰの出現率に基づいてゼロまたは１以上の事象の検出確率を示す。“＊”は出現率が５．０％である場合に少なくとも１事象を検出できない確率３．７％を示す；同様に、“＊＊”は出現率が７％である場合に１以上の事象を検出できない確率０．６％％を表わす。
【０１１５】
したがってこの表は、５％のレベルで存在するＳＮＰを検出する信頼レベルが９５％以上であり、同様に、７％のレベルで存在するＳＮＰを検出する信頼度は９９％以上であることを示す。
【０１１６】
【表３】
2013545441.tif 000010
【０１１７】
当然、多重分析は検出の深さより大きな適用能をもち、表３は単一のＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅアレイ上で同時にスクリーニングできるＳＮＰの数を９５％および９９％の信頼度で検出できる最小の対立遺伝子頻度について示す。
【０１１８】
【表４】
2013545441.tif 000011
【０１１９】
ＲＮＡ試料を定量するのが実用的でない場合、血漿の元のウイルス負荷が１００，０００コピー／ｍｌであれば、少なくとも１４０μｌの血漿についてＲＮＡ抽出を実施して最大６０μｌの総溶出液にすることができる。これより低いウイルス負荷については、それに応じて血漿の量を調節し、ウイルスを２０，６００ｒｐｍ、４℃で１時間３０分、ペレット化する。抽出操作に十分な上清を除去して１４０μｌの濃縮液を残す。ＰＣＲを設定し、数試料について二重反応物を配列決定して、低頻度バリアントの着実な検出を立証する。
【０１２０】
次いで、図８の例に示すのは、ＨＩＶ  ＲＮＡ試料を調製し、６アンプリコン方式で配列決定する方法である。最初に、段階８０５に示すように、ＨＩＶ試料集団からＲＮＡ試料を処理してｃＤＮＡ鋳型を作成する。試料からのｃＤＮＡの作成は、下記の操作を用いて実施できる：
９６ウェルプレートをクーラーに入れ、１２．５μｌのＲＮＡおよび０．５μｌのｃＤＮＡプライマー（４μΜ）を各ウェルに添加した。プレートを６５℃で１０分間インキュベートし、次いで直ちに氷に乗せた。
【０１２１】
下記の成分を含有する逆転写酵素（ＲＴ）ミックスを調製し、多数のチューブ用にスケールアップした：
・Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  ＲＴｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（反応緩衝液）（Ｒｏｃｈｅから入手できる）−  ４μｌ
・Ｐｒｏｔｅｃｔｏｒ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（阻害剤）（Ｒｏｃｈｅから入手できる）−  ０．５μｌ
・１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス  −  ２μｌ
・Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（逆転写酵素）（Ｒｏｃｈｅから入手できる）−  ０．５μｌ
ＲＴミックスを短時間、ボルテックス処理し、それをＲＮＡ試料に添加するまで氷上に保持した。各ウェルに７μｌのＲＴミックスを添加した。プレートを密閉し、短時間遠心し、次いでサーモサイクラーに装入し、下記のｃＤＮＡプログラムに従って作動させた：５０℃で６０分間、８５℃で５分間、および４℃で不定期間。その後、ウェル当たり１μｌのＲＮＡｓｅ  Ｈ（Ｒｏｃｈｅから入手できる）を添加し、プレートを３７℃のサーモサイクラーブロック（加熱した蓋を５０℃以上に設定）に戻して２０分間おく。このｃＤＮＡを−８０℃で保存するか、あるいは直ちにアンプリコン作成に使用する。
【０１２２】
続いて、段階８１０に示すように、段階８０５で作成したｃＤＮＡ鋳型に由来する標的領域を、領域特異的プライマー対を用いて下記の操作により増幅する。下記の１３×ミックスで１つの９６ウェルプレートに十分である（６アンプリコン、１０試料＋２対照）。この方法を必要に応じてスケールアップまたはスケールダウンすることができる。６本の１．５ｍｌ遠心チューブに下記のラベルを付けた：“Ｍｕｌｔｉ  ＲＴＰＲ１”、“Ｍｕｌｔｉ  ＲＴＰＲ２”、“Ｍｕｌｔｉ  ＲＴＰＲ３”、“Ｍｕｌｔｉ  ＲＴＰＲ４”、“Ｍｕｌｔｉ  ＲＴＰＲ５”、“Ｍｕｌｔｉ  ＲＴＰＲ６”、“”。これらのラベルは下記のアンプリコン／プライマーのセットを表わす：
【０１２３】
【化４】
2013545441.tif 000012
【０１２４】
（注釈：上記の標的特異的プライマー配列のほかに、下記のプライマーは下記のエレメントを含む：フォワードおよびリバースプライマーに特異的なＳＡＤ配列；ならびに鍵エレメント＝ＴＣＡＧ）
【０１２５】
【化５】
2013545441.tif 000013
【０１２６】
多重識別子（ＭＩＤ）が実験に必要な場合、各セットのアンプリコンについて対応するＭＩＤプライマーを付加した。ＭＩＤ１を用いる場合、プライマーセットＡのすべてのプライマーがフォワードおよびリバース両方向のプライマーに合成により取り込まれたＭＩＤ１をもっていた。ＭＩＤ配列は１０塩基対の長さであり、理想的には配列アダプター配列の後、標的プライマー配列の直前でプライマーに挿入される。
【０１２７】
各チューブ内で、プライマーセットを用いて下記のラベルにより示されるＰＣＲマスターミックスを調製した：
【０１２８】
【表５】
2013545441.tif 000014
【０１２９】
第１横列の各ウェルに、２２μｌの“Ｍｕｌｔｉ  ＲＴＰＲ１”  ＰＣＲマスターミックスを添加した。同様に、２２μｌの“Ｍｕｌｔｉ  ＲＴＰＲ２”  ＰＣＲマスターミックスを第２横列の各ウェルに、２２μｌの“Ｍｕｌｔｉ  ＲＴＰＲ３”  ＰＣＲマスターミックスを第３横列の各ウェルに、２２μｌの“Ｍｕｌｔｉ  ＲＴＰＲ４”  ＰＣＲマスターミックスを第４横列の各ウェルに、２２μｌの“Ｍｕｌｔｉ  ＲＴＰＲ５”  ＰＣＲマスターミックスを第５横列の各ウェルに、２２μｌの“Ｍｕｌｔｉ  ＲＴＰＲ６”  ＰＣＲマスターミックスを第６横列の各ウェルに添加した。これらのウェルのそれぞれに、３μｌのｃＤＮＡを添加し（縦列当たり１試料）、その際、縦列１１の陽性対照は既知のｃＤＮＡ試料であり、縦列１２の陰性対照はｃＤＮＡ合成からの水対照である。プレートをプレートシールで覆い、次いで９００×ｇで３０秒間、遠心処理した。プレートをサーモサイクラーブロックに装入し、下記のｃＤＮＡプログラムに従って作動させた：９５℃で３分間；続いて９５℃で３０秒間、５５℃で２０秒間、そして７２℃で４５秒間、合計４０サイクル；次いで７２℃で８分間、次いで４℃に不定期間保持。プレートを直ちに使用しない場合、同日処理についてはそれを氷上に、または−２０℃で保存した。
【０１３０】
段階８１０で作成したアンプリコンを、ある態様において、次いで段階８１３に示すように、当技術分野で既知の固相可逆固定化(Solid Phase Reversible Immobilization)（ＳＰＲＩとも呼ばれる）またはサイズ選択のためのゲル切断法を用いて清浄化または精製することができる。たとえば、アンプリコンの精製は、下記の方法を用いて実施できる：
プレートを９００×ｇで３０秒間遠心した。８チャネル  マルチピペッターを用いて、９６ウェル丸底ＰＰプレート（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手できる）の縦列１〜１１の各ウェルに、２２．５μｌの分子グレード水(molecular grade water)を添加した。ＰＣＲ生成物（２２．５μｌ）をＰＣＲプレートから丸底ＰＰプレートの各ウェルへ、２プレートそれぞれについて同じ配置を維持しながら移した。各ウェルに７２μｌのＳＰＲＩビーズを添加し、ＳＰＲＩビーズ／ＰＣＲ混合物が均一になるまで少なくとも１２回の上下ピペッティングによって十分に混合した。プレートを上清が透明になるまで室温で１０分間インキュベートし、次いでプレートを９６ウェル磁気リングスタンド（Ａｍｂｉｏｎ，  Ｉｎｃ．から入手できる）に乗せ、室温で５分間インキュベートした。
【０１３１】
プレートがなお磁気リングスタンド上にある状態で、ビーズを乱さずに上清を分離し、次いで廃棄した。ＰＰプレートを次いで磁気リングスタンドから取り出し、調製したばかりの７０％エタノール２００μｌを添加した後、プレートを磁気リングスタンドへ戻した。この溶液を撹拌し、ＰＰプレートを磁気リングスタンド上方で約１０回、タッピング／揺動することによりペレットを分散させ、次いでプレートを磁気リングスタンドへ戻して１分間インキュベートした。
【０１３２】
プレートがなお磁気リングスタンド上にある状態で、ビーズを乱さずに上清を分離して廃棄した。調製したばかりの７０％エタノールの添加、混合および上清除去の段階を繰り返し、次いでＰＰプレート／磁気リングスタンドを一緒に、すべてのペレットが完全に乾燥するまで（１０〜２０分間）、４０℃に設定した加熱ブロックに乗せておいた。各ウェルに１０μｌの１×ＴＥ（ｐＨ７．６±０．１）を添加した。すべてのペレットが分散するまでＰＰプレートを磁気リングスタンド上で前記と同じ前後／旋回運動でタッピングした。ＰＰプレートを再び磁気リングスタンドに乗せて２分間インキュベートした。各ウェルからの上清を新たな９６ウェル（黄色）プレートへ移した後、プレートをプレートシールで覆って−２０℃で保存した。
【０１３３】
１以上の態様において、アンプリコンを定量することも有利であろう。この例において、下記の方法を用いてアンプリコンの定量を実施できる：当技術分野で既知の方法を用いて、１μｌのアンプリコンをＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）試薬で定量した。５ｎｇ／μｌ以下と定量されたアンプリコンをいずれも、さらに２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｉｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手できる）で評価した。それぞれの精製アンプリコン（１μｌ）をＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ＤＮＡチップに装填し、ＤＮＡ−１０００シリーズＩＩアッセイを行なった。予想サイズのバンドが存在し、プライマー二量体が３：１以下のモル比であることが明らかな場合、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ定量を用い、続いてアンプリコンをプールした。他方、予想サイズのバンドが存在し、プライマー二量体が３：１を超えるモル比であることが明らかな場合、ＳＰＲＩおよびＰｉｃｏＧｒｅｅｎ定量を繰り返し、続いてＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ分析を行なって、プライマー二量体の除去を確認した。
【０１３４】
陰性ＰＣＲ対照反応物（１μｌ）をＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒで分析した。プライマー二量体以外のバンドはみられなかった。
次に、段階８１５に示すように、アンプリコンからの核酸鎖を選択し、本明細書の他の箇所に記載したようにエマルジョン液滴に導入し、増幅させた。ある態様において、試料当たり２つのエマルジョンを用意してもよい：１つはＡｍｐｌｉｃｏｎ  Ａキットを用い、１つはＡｍｐｌｉｃｏｎ  Ｂキットを用い、両方とも４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手できる。異なる態様において異なる数のエマルジョンおよび／または異なるキットを使用できることは認識されるであろう。最終ミックスのためのアンプリコンを下記の方法により選択できる：各試料につき６つのアンプリコンを作成し、それらをそれぞれ等モル量でｅｍＰＣＲ反応用に混合した。必ずしもすべてのアンプリコンが等しい効率で作成されるわけではないので、場合によりきわめて少量のアンプリコンが作成され、代わりに多量のプライマー二量体が存在する可能性がある。最適な配列決定結果を達成するためには、あるアンプリコンの質が標準以下であった場合でも、各試料につき良好と定量された比較的純粋な（後記を参照）アンプリコンのみを最終ミックスに用いることが重要である。種々のアンプリコン間にかなりのオーバーラップがあるため、その試料の完全適用範囲を得るために必ずしも６つすべてのアンプリコンが必要なわけではないので、これが可能である。６つの高品質アンプリコンのセットが得られなかった場合、各試料につき最終ミックス用のアンプリコンを選択するための下記の規則に従った：そのアンプリコンがＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒで定量可能なバンドと認められなかった場合、それを６．２の最終アンプリコンミックスに用いなかった。プライマー二量体とアンプリコンのモル比が３：１以上であった場合、それを最終アンプリコンミックスに用いなかった。この測定は、６．１においてＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒアッセイでさらに定量した低濃度アンプリコンについて実施できるにすぎなかった。
【０１３５】
同様に段階８１５の一部として、ｅｍＰＣＲに用いるためにアンプリコンの混合および希釈のための下記の方法を採用できる：
特定の試料に由来する６つのアンプリコンそれぞれについて濃度（分子／μｌ）を下記の方程式により計算した：
【０１３６】
【数１】
2013545441.tif 000015
【０１３７】
１０９分子／μｌの濃度で６つのアンプリコンそれぞれの希釈を行なった：
１μｌのアンプリコン溶液に下記の体積の１×ＴＥを添加した：
【０１３８】
【数２】
2013545441.tif 000016
【０１３９】
等体積の６つの各アンプリコン希釈液、たとえば１０μｌを混合した。いずれかのアンプリコンが無い場合、オーバーラップするアンプリコンの体積を段階４０５に指針に従って増加させた。
【０１４０】
さらに、１０９分子／μｌの溶液１μｌを４９９μｌのｌ×ＴＥに添加することにより混合アンプリコンを２×ｌ０６分子／μｌに希釈し、この最終希釈液（２×ｌ０６分子／μｌ）を−２０℃で０．５ｍｌのＯ−リングキャップ付きチューブ内に保存した。
【０１４１】
増幅後、段階８２０に示すようにエマルジョンを破壊し、固定化核酸の増幅集団を含むビーズを富化した。たとえば、本明細書の他の箇所に記載したようにＤＮＡ含有ビーズを富化することができる。
【０１４２】
この富化したビーズを次いで段階８３０に示すように配列決定した。ある態様において、各試料を本明細書の他の箇所に記載したように配列決定する。たとえば、プールしたＭＩＤ含有アンプリコンについて、配列決定のために富化および処理した後、合わせたエマルジョンから、４列ガスケットを備えた７０×７５金属沈着ＰＴＰ上の列当たり７９０，０００のビーズ（陽性対照試料を含む）を装填し、ＧＳ−ＦＬＸ機器（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手できる）で配列決定する。
【０１４３】
ＧＳ−ＦＬＸ  Ｔｉｔａｎｉｕｍシリーズ配列決定機器は３つの主アセンブリーを含む：流体素子サブシステム、光ファイバースライドカートリッジ／フローチャンバー、およびイメージングサブシステム。試薬導入ライン、多重弁マニホールド、および蠕動ポンプが流体素子サブシステムの一部を形成する。個々の試薬を適宜な試薬導入ラインに接続し、これにより試薬を一度に１試薬ずつ、前プログラミングした流速および期間でフローチャンバー内へ送達できる。光ファイバースライドカートリッジ／フローチャンバーは、スライドのエッチングした側とフローチャンバー天井の間に２５０μｍの空間をもつ。フローチャンバーは、試薬および光ファイバースライドの温度制御手段ならびに遮光ハウジングも含んでいた。スライドの研磨した（エッチングしていない）側をイメージングシステムと直接接触させる。
【０１４４】
光ファイバースライドウェルへの配列決定用試薬の循環送達、およびウェルからの配列決定反応副生物の洗浄除去は、前プログラミングした流体素子システムの操作により達成される。このプログラムは一般にインターフェース制御言語(Interface Control Language)（ＩＣＬ）スクリプトの形で書き込まれ、試薬名（洗浄剤、ｄＡＴＰαＳ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、およびＰＰｉ標準品）、流速、および各スクリプト段階の期間を特定する。たとえば、可能な１態様において、すべての試薬について、約１ｃｍ／秒のフローチャンバー内−線速度で、流速を４ｍＬ／分に設定できる。配列決定試薬のフロー順序を組織化してカーネル(kernel)にすることができ、その際、第１カーネルはＰＰｉフロー（２１秒間）、続いて１４秒間の基質(substrate)フロー、２８秒間のアピラーゼ洗浄、および２１秒間の基質フローを含む。最初のＰＰｉフローに続いて、２１サイクルのｄＮＴＰフロー（ｄＣ−基質−アピラーゼ洗浄−基質  ｄＡ−基質−アピラーゼ洗浄−基質−ｄＧ−基質−アピラーゼ洗浄−基質−ｄＴ−基質−アピラーゼ洗浄−基質）を行ない、その際、各ｄＮＴＰフローは４つの個々のカーネルからなる。各カーネルは８４秒間の長さである（ｄＮＴＰ−２１秒間、基質フロー−１４秒間、アピラーゼ洗浄−２８秒間、基質フロー−２１秒間）；２１秒後および６３秒後にイメージを取得する。２１サイクルのｄＮＴＰフローの後、ＰＰｉカーネルを導入し、次いでもう一度２１サイクルのｄＮＴＰフローを行なう。配列決定行程の終了に続いて、第３のＰＰｉカーネルを導入する。全行程時間は一般に２４４分間である。この行程を完了するのに必要な試薬体積は下記のとおりである：５００ｍＬの各洗浄溶液、１００ｍＬの各ヌクレオチド溶液。この行程期間中、すべての試薬を室温に保持する。フローチャンバーおよびフローチャンバー入口配管の温度を３０℃に制御し、フローチャンバーに入るすべての試薬を３０℃に予熱する。
【０１４５】
続いて、出力配列データを段階８４０に示すように分析する。ある態様において、高品質を得るためにフィルタリングしたフローグラムデータを含むＳＦＦファイルを、特殊なアンプリコンソフトウェアにより処理し、そのデータを分析する。
【０１４６】
前記に述べた段階は説明のためのものにすぎず、限定ではないこと、さらにこれらの段階の一部または全部を異なる態様において種々の組合わせで使用できることは理解されるであろう。たとえば、他のＨＩＶ特徴／領域について調べるために、前記に述べた方法に用いるプライマーを追加のプライマーセットと組み合わせて、より総合的な診断または療法有益性を得ることができる。この例において、そのような組合わせはプレート上に“ドライダウン(dried down)”状態で供給でき、前記の逆転写酵素／プロテアーゼプライマー、ならびにＨＩＶ薬物耐性または指向性領域の検出のためのプライマーの一部または全部、ならびに他のいずれかの目的領域を含むことができる。他の例は、PCT Application Serial No US 2008/003424,タイトル“System and Method for Detection of HIV Drug Resistant Variants”, 2008年3月14日出願;および／またはUS Patent Application Serial No 12/456,528,タイトル“System and Method for Detection of HIV Tropism Variants”, 2009年6月17日出願に記載されており、これらを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する。
【符号の説明】
【０１４７】
１００  配列決定機器
１０１  ユーザー
１０５  反応支持体
１３０  コンピューター
１３５  アプリケーション
１５０  ネットワーク
１８０  試料調製機器
２００、３００  ＨＩＶ逆転写酵素／プロテアーゼ領域
２０５、２１５、２２５、２３５、２４５、２５５、３１５、３２５  アンプリコン
３５０、３６０  ｃＤＮＡプライマー部位
５００，６００、７００  インターフェース
５０３，６０３  既知バリアント
５０５，６０５  試料
５０７，６０７  セル
７０３  コンセンサス配列（基準配列）
７０５  配列
７１０  塩基コール
７２０  変異率
７３０  配列読み数
８００  開始
８０３  試料装入
８０５  ｃＤＮＡ合成
８１０  アンプリコン作成
８１３  アンプリコン精製
８１５  エマルジョンへの導入
８２０  エマルジョン破壊および富化
８３０  配列決定
８４０  配列データの分析
８９９  終了
【図１】
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【図８】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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