(57)【要約】  細胞培養用の多糖マイクロキャリアは、（ｉ）ｐＨ７で中性または負の電荷を有する架橋した多糖マイクロキャリア基部、および（ｉｉ）その基部に結合したポリペプチドを含む。そのポリペプチドは、ＲＧＤなどの細胞接着性配列を含有してもよい。そのようなマイクロキャリアにより培養された細胞は、そのマイクロキャリアに対してペプチド特異的結合を示す。
2013534404.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養のためのマイクロキャリアであって、
ｐＨ７で中性または負に帯電した架橋した多糖ヒドロゲルマイクロキャリア基部、および
前記基部に結合したポリペプチド、
を有してなるマイクロキャリア。
【請求項２】
前記中性または負に帯電した架橋した多糖ヒドロゲルマイクロキャリア基部がカルボン酸官能基を含むことを特徴とする請求項１記載のマイクロキャリア。
【請求項３】
前記マイクロキャリア基部が、モノアミンのカルボン酸官能基との反応生成物を含むことを特徴とする請求項２記載のマイクロキャリア。
【請求項４】
前記マイクロキャリア基部がデキストランを含むことを特徴とする請求項１から３いずれか１項記載のマイクロキャリア。
【請求項５】
前記ポリペプチドがＲＧＤのアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１から４いずれか１項記載のマイクロキャリア。
【請求項６】
３０ｍｌ／ｇと５０ｍｌ／ｇの間の水潤度を有することを特徴とする請求項１から５いずれか１項記載のマイクロキャリア。
【請求項７】
前記マイクロキャリア基部が、ペンダントカルボン酸基を有する多糖ヒドロゲルのモノアミンとの反応により生成され、前記多糖ヒドロゲルが、前記ポリペプチドとの結合前に、前記基部のグラム当たり１．５ミリ当量のカルボン酸基と前記基部のグラム当たり５ミリ当量のカルボン酸基の間のペンダントカルボン酸基を有することを特徴とする請求項１から６いずれか１項記載のマイクロキャリア。
【請求項８】
請求項１から７いずれか１項記載の細胞培養のためのマイクロキャリアを形成する方法であって、ペンダントカルボン酸官能基を有する、正味で中性から負に帯電した多糖ヒドロゲルマイクロキャリア基部を提供し、該マイクロキャリア基部のカルボン酸基に合成ポリペプチドを結合させて、前記マイクロキャリアを形成する各工程を有してなる方法。
【請求項９】
前記カルボン酸官能基の少なくともいくつかをモノアミンでブロッキングして、アミドを形成する工程をさらに含むことを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記カルボン酸官能基の全てまたは実質的に全てがブロッキングされ、前記カルボン酸官能基の前記モノアミンによるブロッキングによって、１０と７０の間の平衡含水量を有するマイクロキャリアが生成されることを特徴とする請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の説明】
【０００１】
本出願は、米国法典第３５編第１１９条の下で２０１０年２月２６日に出願された欧州特許出願第１０３０５２０３．１号の優先権の恩恵を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、細胞培養用のマイクロキャリアに関し、より詳しくは、合成の既知組成のマイクロキャリアに関する。
【０００３】
配列リスト
本出願は、１ｋｂのサイズを有し、２０１０年８月１９日に作成された「SP10-045_SEQ_LISTST25.txt」という名称のテキストファイルとして米国特許商標庁にＥＦＳ−Ｗｅｂを通じて電子的に提出された配列リストを含む。配列リストの電子出願により、電子的に提出された配列リストは、３７  ＣＦＲ§１．８２１（ｃ）により要求される紙のコピーおよび§１．８２１（ｃ）により要求されるＣＲＦの両方として働く。配列リストに含まれる情報がここに引用される。
【背景技術】
【０００４】
マイクロキャリアは、大規模細胞培養のための選択肢を提供する。マイクロキャリアは、典型的に細胞培養培地中で撹拌され、細胞が増殖するための非常に大きい表面面積比(surface to area ratio)を提供する。マイクロキャリアは、従来の器具と比較してかなり高い、培養容積当たりの細胞収率を提供できる。
【０００５】
足場依存性細胞について、正に帯電した表面を有するマイクロキャリアが、優れた接着および増殖を提供することが示されてきた。しかしながら、細胞の収穫は、接着の丈夫さに比例して難しいであろうし、一般に、細胞に有害な影響があるであろう厳しいプロテアーゼ処理を必要とする。その上、そのようなマイクロキャリアは、細胞の損失および撹拌培養において再現性のないことを被り得る。マイクロキャリアの毒性および栄養吸収が、これらの難点の原因として特定されてきた。さらに、良好な細胞付着および増殖を達成するために、電荷密度を最適化すべである。これらの問題は、マイクロキャリアを被覆すること、電荷を減少させるために一連の化学的または物理的工程により処理すること、カルボキシルメチルセルロースを加えること、または血清中にビーズを浸漬することによって、ある程度は克服されてきた。キャリアのそのような前処理は、成功しているけれども、時間がかかり、ばらつきが生じる。
【０００６】
いくつかのマイクロキャリアは、表面電荷密度を大規模に調整せずに、適切な接着を可能にするように設計されてきた。例えば、マイクロキャリアは、表面に特定のポリペプチド配列を与えるように調製されてきた。このポリペプチドは、細胞の接着受容体と特異的に相互作用するように構成されている。そのようなマイクロキャリアの例としては、デキストランビーズまたはポリスチレンビーズに結合したゼラチンまたはコラーゲンが挙げられる。そのようなマイクロキャリアは、様々な利点を持つけれども、動物由来材料から製造されており、例えば、病原性タンパク質またはウイルスによる異種汚染の虞のために、細胞療法専用の細胞を培養するのには適していない。
【０００７】
この課題を解決するために、組換えタンパク質またはポリペプチドが合成され、マイクロキャリア上に被覆されてきた。そのようなマイクロキャリアには、動物由来成分を含まないという利点があるが、それらには欠点がいくつかあるであろう。例えば、いくつかのマイクロキャリアは、細胞と結合するだけでなく、細胞を活性化させることが示されてきた。このことは、細胞表面と細胞骨格タンパク質が再配列され、特異的遺伝子が誘発されて、拡散と増殖をもたらすことを意味する。多能性幹細胞などの細胞を培養する場合、そのような活性化は望ましくないであろう。その上、これらのビーズのいくつかとの細胞の接着レベルは、特に、無血清既知組成培地が使用される場合、いくつかの足場依存性細胞の健全な培養のためには十分に高くはないであろう。無血清培地が使用される場合、マイクロキャリアの表面に結合し、それゆえ、細胞の結合を促進させることができる接着性細胞をその培地は提供しない。血清の不在は、特に、胚幹細胞を含む特定の幹細胞などの、細胞外マトリクスをほとんど産生しない細胞を使用した場合、問題を提示する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
かなりたくさんの正に帯電したマイクロキャリアが、足場依存性細胞の培養に使用するために入手でき、そのうちのいくつかは関連タンパク質または組換えポリペプチドを含有する。これらのマイクロキャリアは、多くの条件下で多くの細胞を培養するのに効果的であることが実証されてきた。しかしながら、これらのマイクロキャリアには上述した欠点がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
中でも、本開示は、足場依存性細胞の健全かつ選択的な結合を提供するであろう、合成の既知組成マイクロキャリアを記載する。このマイクロキャリアは、中性または負に帯電した表面（ｐＨ６〜８で）を有する膨潤性の架橋多糖マイクロキャリア基部(base)を含む。理論により拘束することを意図するものではないが、負に帯電した表面は、特に血清の不在下で、ヒドロゲル材料に関する細胞の接着を阻止すると考えられる。ここに記載されたマイクロキャリアは、細胞接着を取り持つために表面に結合した(conjugated to)ＲＧＤアミノ酸配列を含有するポリペプチドも含む。ここに記載したように、そのようなマイクロキャリアは、非選択的結合がほとんどまたは全くなく、ポリペプチドを介して、細胞の選択的接着を可能にする。したがって、ここに記載されたマイクロキャリアは、制御された様式で足場依存性細胞を培養するために使用してよい。このマイクロキャリアは、正味で中性または負の電荷を有し、またいくつかの実施の形態において、正の電荷を全く有さないにもかかわらず、スピナーフラスコ内で培養を支援するのに十分な強度の細胞付着を提供する。そのようなマイクロキャリアは、キャリアに対する非選択的結合がないために、ヒト胚幹細胞を含む多能性幹細胞の培養および維持にとって有用であるはずである。
【００１０】
様々な実施の形態において、マイクロキャリアは、デキストランビーズなどの、カルボン酸基を含有する架橋した多糖マイクロキャリアに適切なポリペプチドをグラフトさせることによって調製される。残りの非ペプチド結合カルボン酸基、またはその一部は、エタノールアミンなどの低分子量モノアミンによる誘導体化によってブロックされるであろう。そのようなブロッキングにより、高親水性のカルボン酸基がそれほど親水性ではないアミド基に転化され、それによって、マイクロキャリアの親水性が減少し、それゆえ、平衡含水量が変わる。その結果、ブロッキングにより、ヒドロゲルマイクロキャリア材料の剛性が変わる。すなわち、含水量が減少すると、マイクロキャリアの剛性が増加する。したがって、マイクロキャリアの剛性および湿潤性は、架橋密度を調整する必要なく、細胞挙動に影響を与えるように所望に容易に調節できる。それゆえ、剛性は、マイクロキャリア基部が製造された後（架橋密度が固定された後）に改良されるであろう。
【００１１】
ここに記載されたマイクロキャリアまたは方法の１つ以上の実施の形態は、従来のマイクロキャリア、マイクロキャリアを調製する方法、またはマイクロキャリアで細胞を培養する方法に勝る１つ以上の利点を提供する。例えば、ここに記載されたマイクロキャリアは、動物由来材料がなく、これにより、病原体汚染の虞が限られる。このことは、培養される細胞が細胞治療専用である場合、特に該当する。マイクロキャリアは、モノリスであり、被覆されてなくてよく、それゆえ、剥離しがちではない。細胞は、穏やかなトリプシン処理または細胞に悪影響を与えない代わりの溶液を使用して、ここに記載された多くのマイクロキャリアから容易に収穫できる。マイクロキャリア基部への非特異的結合が低レベルであるために、マイクロキャリアにグラフトされたポリペプチドに対する受容体結合による生物選択的な細胞付着が生じ得る。そのような高度に生物選択的な付着は、初代細胞、肝細胞、および胚幹細胞を含む幹細胞などの他の細胞を培養するのに有益であろう。マイクロキャリアの剛性および湿潤性の容易な調整に加え、ポリペプチド密度が、マイクロキャリア基部のカルボン酸基の誘導体化によって調整できる。多くの実施の形態において、マイクロキャリアは、例えば、ポリスチレン系マイクロキャリアと比較して透明性かせ高く、付着した細胞の顕微鏡観察が容易になる。これらと他の利点は、添付の図面と共に読んだときに、以下の詳細な説明から容易に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、化学的に架橋したデキストランビーズ上で行われるペプチド結合およびブロッキング反応を示す図である。便宜上、グラフトされたペプチドが１つのみと、アミド基（ブロッキング工程から生じる）がいくつか示されている。
【図２】図２は、結合したペプチドの定量化に使用されるカルボキシメチルデキストランビーズに結合したビトロネクチンペプチドおよびローダミン標識ペプチドの両方の理想化構造を示す図である。
【図３】図３は、グラフトされたペプチドの良好な均一性を示すビーズの蛍光図である。
【図４】図４は、結合工程に使用されるビトロネクチンペプチドおよび濃度の関数としてのビトロネクチンペプチド／ローダミン標識ペプチド結合ビーズからの蛍光データを示すグラフである。
【図５】図５は、結合工程に使用されるビトロネクチンペプチドおよび濃度の関数としてのビトロネクチンペプチド／ローダミン標識ペプチド結合ビーズに関するＢＣＡアッセイ結果を示すグラフである。
【図６】図６は、結合に使用したビトロネクチンペプチド濃度の関数としての、播種から２時間後のビトロネクチンペプチドがグラフトされたカルボキシメチルデキストランビーズに接着した目に見えるＨＴ１０８０細胞の数を表すグラフである。
【図７】図７は、播種から２時間後のビトロネクチンペプチドがグラフトされたカルボキシメチルデキストランビーズに接着したＨＴ１０８０細胞の位相差顕微鏡画像である。
【図８】図８は、ＲＧＥポリペプチド（Ａ）またはビトロネクチンポリペプチド（Ｂ）いずれかがグラフトされたカルボキシメチルデキストランビーズと共にインキュベーションされた後のＨＴ１０８０細胞の位相差顕微鏡画像である。細胞接着は、ビトロネクチンペプチドにグラフトされたビーズ上のみで観察される。
【図９】図９Ａ〜Ｆは、Ｃｙｔｏｄｅｘ（商標）（GE HEALTHCARE BIO-SCIENCES AB LTD）マイクロキャリア上、およびビトロネクチンがグラフトされたカルボキシメチルデキストランビーズ上の、撹拌培養におけるＨＴ１０８０細胞接着および増殖を示す一連の位相差顕微鏡画像である。これらの画像は、ビーズ上への播種から２時間後、２４時間後および５日後の細胞を表す。
【図１０】図１０Ａ〜Ｃは、ＨＴ１０８０細胞と共にインキュベーションした後の様々なカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）マイクロキャリアビーズの位相差顕微鏡画像である。Ａ：グラフトされたビトロネクチンポリペプチドを含まない未処理ＣＭＤマイクロキャリア；Ｂ：グラフトされたビトロネクチンポリペプチドを含まない、エタノールアミンでブロッキングされたＣＭＤ（ＥＡ−ＣＭＤ）マイクロキャリア；Ｃ：グラフトされたビトロネクチンポリペプチドを含む、エタノールアミンでブロッキングされたＣＭＤビーズ。
【図１１】図１１は、ビトロネクチンペプチドがグラフトされたカルボキシメチルデキストランビーズ上での撹拌培養における増殖の５日後に飽和密度に到達したＨＴ１０８０細胞の位相差顕微鏡画像である。
【図１２】図１２は、様々なタイプのマイクロキャリア上での撹拌培養における５日後のＨＴ１０８０細胞増殖を比較する棒グラフである。最終的な細胞数が、ＳｏｌｏＨｉｌｌ  ｐｒｏｎｅｃｔｉｎ（登録商標）Ｆマイクロキャリア上で測定した増殖であると報告された。
【図１３】図１３Ａ〜Ｄは、ペプチドがグラフトされたカルボキシメチルデキストランマイクロキャリア上のＮＵＬＬＩ  ＳＣＣ細胞接着を示す一連の位相差顕微鏡画像である。パネルＡは、ビトロネクチンペプチドがグラフトされたカルボキシメチルデキストランビーズ上の播種から２４時間後の細胞群体の配分の均質性を示す。パネルＢは、「ＳｏｌｏＨｉｌｌ  ｐｒｏｎｅｃｔｉｎ」Ｆマイクロキャリア上において同じ条件でインキュベーションされた細胞の形態を示し、非接着性胚体様構造の優先的な形成が矢印により示されている。パネルＣは、ビトロネクチンペプチドがグラフトされたマイクロキャリア上の細胞群体の形成を示す接写である。パネルＤは、ＲＧＥペプチドがグラフトされたビーズ上に接着のないことおよび非接着性胚体様構造の形成を示す。
【図１４】図１４Ａ〜Ｅは、無血清条件下、および１０μＭのＹ２７６３２  ＲＯＣＫキナーゼ阻害因子の存在下での、ペプチドがグラフトされたカルボキシメチルデキストランマイクロキャリア上のＥＳ−Ｄ３マウス多能性胚幹細胞を示す一連の位相差顕微鏡画像である。ＡおよびＢは、１０μＭのＹ２７６３２が添加されたｍＴｅＳＲ１培地中のＣＭＤ−ＶＮビーズ上で２４時間および４８時間での細胞接着を示す。ＣおよびＤは、１０μＭのＹ２７６３２が添加されたｍＴｅＳＲ培地中の、それぞれ、２４時間後および４８時間後の「Ｃｙｔｏｄｅｘ」３マイクロキャリア上のＥＳ−Ｄ３細胞接着を示す。Ｅは、実験に終わりに行われた細胞抽出物におけるアルカリホスファターゼ活性に対応する。陰性対照は、ＳＴＯマウス線維芽細胞について行った。
【図１５】図１５は、播種から５日後のペプチドがグラフトされたカルボキシメチルデキストランマイクロキャリア上のＢＧ０１Ｖ細胞接着を示す顕微鏡画像である。
【図１６】図１６は、ＢＧ０１Ｖ細胞を「Ｃｙｔｏｄｅｘ」３マイクロキャリアと共にインキュベーションしたときの浮遊する胚体形態を示す顕微鏡画像である（比較例として）。
【図１７】図１７は、ペプチドがグラフトされたカルボキシメチルデキストランマイクロキャリア（ＣＭＤ−ＶＮ）および比較例としての「Ｃｙｔｏｄｅｘ」３上で行った培養から２日後と５日後のＢＧ０１Ｖ細胞の定量化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
説明図面は、必ずしも同じ縮尺で描かれていない。図面に使用された同様の数字は、同様の構成要素、工程などを称する。しかしながら、所定の図面におけるある構成要素を称するためのある数の使用は、同じ数が付された別の図面における構成要素を制限することは意図されていないことが理解されよう。その上、構成要素を称するための異なる数の使用は、異なる数がふられた構成要素が同じまたは同様であり得ないことを示すことは意図されていない。
【００１４】
以下の詳細な説明において、その一部を形成し、装置、システムおよび方法のいくつかの特別な実施の形態が実例としてその中に示されている添付の図面を参照する。本開示の範囲または精神から逸脱せずに、他の実施の形態が考えられ、実施してもよいことが理解されよう。したがって、以下の詳細な説明は、制限の意味で解釈すべきではない。
【００１５】
ここに使用された科学用語および技術用語の全ては、別記しない限り、当該技術分野において一般に使用される意味を有する。ここに提供される定義は、ここに頻繁に使用される特定の用語の理解を容易にするためであって、本開示の範囲を制限することを意図したものではない。
【００１６】
本明細書および添付の特許請求の範囲に使用されるように、単数形は、内容が他に明白に示していない限り、複数の対象を有する実施の形態も包含する。本明細書および添付の特許請求の範囲に使用されるように、「または」という用語は、内容が他の明白に示していない限り、「および／または」を含む意味で一般に使用されている。
【００１７】
ここに用いたように、「有する(have, having)」、「含む(include, including, comprise, comprising)」などは、範囲を設定しない意味で使用され、一般に、「含むがそれに限定されない」を意味する。「から実質的になる」、「からなる」などどは、「含む」などに含まれることが理解されよう。
【００１８】
ここに用いたように、目的物または化合物を「提供する」とは、その目的物または化合物を使用する、製造するまたは他の様式で得ることを意味する。
【００１９】
ポリペプチドは、１文字のアミノ酸コードにより、また３文字のアミノ酸コードにより、ここに称される。これらのコードは、交換可能に使用してよい。
【００２０】
ここに用いたように、「ペプチド」および「ポリペプチド」は、化学的に合成されても、または組換えにより誘導されてもよいが、動物源からの全タンパク質として単離されていないアミノ酸配列を意味する。本開示の目的に関して、ペプチドおよびポリペプチドは全タンパク質ではない。ペプチドおよびポリペプチドは、タンパク質の断片であるアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、ペプチドおよびポリペプチドは、ＲＧＤなどの細胞接着性配列として知られている配列を含んでもよい。ポリペプチドは、アミノ酸の長さが３から３０までなどの、任意の適切な長さのものであってよい。ポリペプチドは、例えば、エクソペプチダーゼによりそれらが分解されるのを防ぐためにアセチル化（例えば、Ａｃ−ＬｙｓＧｌｙＧｌｙ）またはアミド化（例えば、ＳｅｒＬｙｓＳｅｒ−ＮＨ2）されていてもよい。これらの修飾は、配列が開示されたときに検討されることが理解されよう。
【００２１】
ここに用いたように、「マイクロキャリア」は、細胞を培養するために使用され、細胞がそこに付着するであろう小さな別個の粒子を意味する。マイクロキャリアは、ロッド、球体などのどのような適切な形状にあってもよく、多孔質であっても、非多孔質であってもよい。
【００２２】
「マイクロキャリア基部」は、ここに用いたように、ポリペプチドが結合するであろう高分子マイクロキャリアを意味する。
【００２３】
ここに用いたように、「多糖」は、単糖単位が連結した主鎖を有するポリマーを意味する。多糖のペンダント部分が、天然の単糖に対して所望のように置換されていてもよいことが理解されよう。多糖は、非単糖架橋剤（例えば、二官能性以上のモノマーまたはオリゴマー）から生じた架橋成分などの、単糖から生じたものではない、または単糖に由来するものではない成分を含んでもよい。場合によっては、多糖は、単糖またはオリゴ糖から生じた化合物を介して架橋されてもよい。
【００２４】
ここに用いたように、「ヒドロゲル」は、その乾燥質量の３０％以上の量の水を吸収できるポリマーを意味する。多くの実施の形態において、ヒドロゲルは、その乾燥質量の１００％以上の量の水を吸収できる。ヒドロゲルポリマーが吸収できる水の量は、ポリマーが架橋される程度に応じて様々であろうことが理解されよう。この場合、架橋の程度が大きいと、吸水または膨潤が少なくなることが多い。
【００２５】
ここに用いたように、「平衡含水量」は、多糖などの高分子材料の吸水特徴を称し、式１：
式１：  ＥＷＣ（％）＝［（Ｗゲル−Ｗ乾燥）／（Ｗゲル）］×１００
により示されるような平衡含水量（ＥＷＣ）により定義され、測定される。
【００２６】
本開示は、特に、細胞を培養するための合成マイクロキャリアを記載する。このマイクロキャリアは、架橋済み多糖基部のカルボン酸官能基にポリペプチドを結合させることにより形成してもよい。このカルボン酸官能基の少なくとも一部分は、低分子量モノアミンによる誘導体化によってブロックされてもよい。結果として得られたマイクロキャリアは、中性または負に帯電した表面を有し、培養において細胞とのポリペプチド選択的結合を提供する。
【００２７】
１．  マイクロキャリア
マイクロキャリアは、ここに記載するように、マイクロキャリア基部およびその基部に結合したポリペプチドを含む。マイクロキャリア基部は、ｐＨ６と８の間などの、細胞培養中に一般にあるｐＨレベルで中性または負に帯電した表面を有する架橋済み多糖である。多くの実施の形態において、この基部は、そのようなｐＨ条件下で正に帯電した部分を含まない。
【００２８】
一般に、マイクロキャリアが、周囲の培地からのマイクロキャリアの分離を容易にするためにそれらが懸濁されるべき細胞培養培地よりもわずかに高い密度を有することが好ましい。様々な実施の形態において、マイクロキャリアは、立方センチメートル当たり約１．０１から１．１０グラムの密度を有する。そのような密度を有するマイクロキャリアは、おだやかな撹拌により、細胞培養培地中で懸濁状態に容易に維持されるはずである。
【００２９】
その上、全てでなくともほとんどのマイクロキャリアがおだやかな撹拌によって懸濁できることを確実にするために、マイクロキャリアのサイズのばらつきが小さいことが好ましい。一例として、マイクロキャリアの幾何学系分布は約１と約１．４の間であってよい。マイクロキャリアは、どのような適切なサイズのものであってもよい。例えば、マイクロキャリアは、約２０マイクロメートルと１０００マイクロメートルの間の直径を有してもよい。そのような直径を有する球体マイクロキャリアは、マイクロキャリア当たり数百から数千の細胞の付着を支援することができる。
【００３０】
Ａ．  マイクロキャリア基部
基部を形成するために、どのような適切な架橋済み多糖を使用してもよい。例えば、アガロースビーズ、デンプンビーズ、デキストランビーズ、セルロースビーズ、またはポリグルコースビーズが、マイクロキャリア基部を形成するように働くであろう。より一般的には、ほとんど任意のヒドロゲル形成多糖を使用してもよい。カルボン酸基は、表面に負の電荷（細胞培養ｐＨで）を提供し、例えば、以下に記載するような、ポリペプチドの結合のための部分を提供するために、例えば、以下に記載するような、どのような適切な誘導体化反応により導入してもよい。いくつかの実施の形態において、カルボン酸ペンダント部分を有する多糖を、さらに誘導体化せずに使用してもよい。例えば、アルギン酸（アルギネートとも呼ばれる）は、カルボン酸基を天然に含有するゲル形成多糖である。
【００３１】
マイクロキャリア基部を形成するためのビーズまたは他の粒子を調製するのに、どのような適切な方法を使用してもよい。例えば、架橋済み多糖ビーズまたは粒子は、例えば、（ｉ）１９６１年１０月３日にFlodin等に発行された米国特許第３００２８２３号明細書、Process of separating materials having different molecular wights and dimensions、または（ｉｉ）１９６５年９月２８日にFlodinに発行された米国特許第３２０８９９４号明細書、Process for preparing hydrophilic copolymerization and product obtained therebyに記載されたように調製してもよい。次いで、粒子を、例えば、以下に記載するように、カルボン酸基で誘導体化して、マイクロキャリア基部を形成してもよい。
【００３２】
もちろん、多糖の架橋は、化学的または物理的などの、どのような適切な様式で行ってもよい。架橋が共有結合性であることが好ましい。ほとんど任意の公知の架橋剤または将来開発される架橋剤を使用してもよい。適切な架橋剤のいくつかの例としては、ジビニルスルホンおよび他の架橋ビニル化合物；エピクロロヒドリンおよびエピブロモヒドリンなどのエピハロヒドリン；エポキシド、ビスエポキシドおよびトリスエポキシドが挙げられる。例えば、１９９２年８月４日にHjertenおよびLiaoに発行された米国特許第５１３５６５０号明細書、Chromatogrphy stationary phase material for high performance liquid chromatographyを参照のこと。
【００３３】
架橋済みデキストランビーズを形成するための適切な方法が、１９８８年１２月２７日にPeska等に発行された米国特許第４７９４１７７号明細書、Method for the production of bead dextran materials for gel chromatographyに記載されている。もちろん、多数の適切なゲル形成架橋済み多糖ビーズを、GE Healthcare Bio-Sciences、Sigma-Aldrich、DowおよびAqulonなどの民間の供給メーカーから購入してもよい。GE Healthcare Bio-SciencesからのＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）ビーズが、使用してよい適切なデキストランビーズの一例である。
【００３４】
ビーズまたは粒子がペンダントカルボン酸官能基を含有しない限り、そのビーズまたは粒子は、そのような基を含むように誘導体化されてもよい。カルボン酸官能基を有するマイクロキャリア基部を形成するために、どのような適切な方法を使用して、粒子を誘導体化してもよい。多糖主鎖にカルボン酸官能性を導入するためのいくつかの方法としては、クロロ酢酸、クロロプロピオン酸、ブロモヘキサン酸、無水コハク酸、無水グルタル酸、無水マレイン酸、無水シトラコン酸などが挙げられる。
【００３５】
カルボン酸官能基を有するマイクロキャリア基部の例としては、カルボキシメチル化デキストランビーズ（例えば、GE Healthcare Bio-SciencesからのＣＭ「Ｓｅｐｈａｄｅｘ」ビーズ）、スクシニル化デキストランビーズなどが挙げられる。
【００３６】
様々な実施の形態において、ペプチドのグラフト化の前のカルボン酸基の含有量は、４ミリ当量／ｇと５ミリ当量／ｇの間などの約１．５ミリ当量／ｇと約５ミリ当量／ｇの間である。
【００３７】
中性ｐＨでの水中におけるペプチドによる誘導体化前のマイクロキャリア材料の水潤度は、多くの実施の形態において、３０ｍｌ／ｇと５０ｍｌ／ｇの間などの１０ｍｌ／ｇ超である。「水潤度」という用語は、乾燥質量１ｇにより吸収できるグラム数で表される水の量を意味することが意図されている。
【００３８】
選択される多糖および架橋剤、並びに存在するカルボン酸官能基の相対量、および密度は、水潤度または平衡含水量（ＥＷＣ）などの、結果として得られるマイクロキャリアの所望の性質に影響するであろうことが理解されよう。例えば、多糖の親水性の程度が高いほど、カルボン酸の誘導体化の密度が高いほど、架橋の程度が低いほど、水潤度が高くなり、平衡含水量が高くなる傾向にある。それゆえ、マイクロキャリア基部の水潤度およびＥＷＣは、適切な多糖、架橋剤を選択し、ＣＯＯＨ誘導体化を調整することによって、調節することができる。
【００３９】
理論により拘束することを意図するものではないが、高分子マイクロキャリアのＥＷＣは、培養においてマイクロキャリアが支援できる細胞のタイプを決定する上で重要な変数であろう。マイクロキャリアの剛性および膨潤力は、特定の細胞がよく増殖する環境を模倣してよい。同時係属の特許出願である（ｉ）２００９年７月３０日に公開された、Fadeev等の米国特許出願公開第２００９／０１９１６２７号明細書、Synthetic surfaces for culturing cells in chemically defined media、および（ｉｉ）２００９年７月３０日に公開された、Fadeev等の米国特許出願公開第２００９／０１９１６３２号明細書、Swellable (meth)acrylate surfaces for culturing cells in chemically defined mediaに示されるように、約５％と約７０％の間のＥＷＣを有する膨潤性表面が、少なくとも５継代に亘り未分化状態でヒト胚幹細胞を培養するのに適していた。したがって、様々な実施の形態において、ここに記載されたマイクロキャリアは、約５％と約７０％の間のＥＷＣを有する。様々な実施の形態において、蒸留された脱イオン水中のマイクロキャリアのＥＷＣは、５％と７０％の間、５％と６０％の間、５％と５０％の間、５％と４０％の間、５％と３５％の間、１０％と７０％の間、１０％と５０％の間、１０％と４０％の間、５％と３５％の間、１０％と３５％の間、または１５％と３５％の間の水である。
【００４０】
以下にさらに議論するように、１つ以上のポリペプチドをマイクロキャリアに結合させてよく、これにより、マイクロキャリアのＥＷＣが影響を受けるであろう（典型的に、ＥＷＣが増加する）。マイクロキャリアに結合するポリペプチドの量は、様々である傾向にあり、マイクロキャリアのサイズ（例えば、直径）に依存して変わり得る。したがって、標準プロトコルにしたがって調製された、ポリペプチドの結合したマイクロキャリアのＥＷＣは、様々であってよい。再現性の目的に関して、ポリペプチドとの結合の前に、マイクロキャリアのＥＷＣを測定することが望ましいであろう。これに関して、いくつかの実施の形態において、マイクロキャリアにポリペプチドを結合させた後、マイクロキャリア−ポリペプチド複合体の実施の形態のＥＷＣは、水中で約１０％と約４０％の間であってよい。
【００４１】
もちろん、ここに記載されたマイクロキャリアは、どのような適切なＥＷＣを有してもよい。様々な実施の形態において、マイクロキャリアのＥＷＣは、１００％超であり、いくつかの実施の形態において、４００％超であってよい。
【００４２】
Ｂ．  高分子マイクロキャリア基部へのポリペプチドの結合
マイクロキャリア基部にどのような適切なポリペプチドを結合させてもよい。ポリペプチドが、例えば、マイクロキャリア基部の自由なカルボキシル基を通じて、マイクロキャリア基部に結合できるアミノ酸を含むことが好ましい。一例として、カルボン酸基を通じてマイクロキャリア基部に結合する目的のために、例えば、アミド結合の形成を通じて、求核付加反応を可能にする官能性を有する任意の天然または生体模倣アミノ酸をポリペプチドに含ませてもよい。リシン、ホモリシン、オルニチン、ジアミノプロピオン酸、およびジアミノブタン酸が、マイクロキャリアのカルボキシル基に結合するための適切な性質を有するアミノ酸の例である。その上、Ｎ末端アミンがキャッピングされていない場合、前記カルボキシル基に結合するために、ポリペプチドのＮ末端アルファアミンを使用してもよい。様々な実施の形態において、マイクロキャリアと結合するポリペプチドのアミノ酸は、そのポリペプチドのカルボキシ末端位置またはアミノ末端位置にある。
【００４３】
数多くの実施の形態において、ポリペプチド、またはその一部分は、細胞接着活性を有する、すなわち、ポリペプチドがマイクロキャリア基部に結合されるときに、ポリペプチドは、細胞を、ペプチド含有マイクロキャリアの表面に接着させる。一例として、ポリペプチドは、インテグリン類からのタンパク質により認識される、または細胞接着を維持することのできる細胞分子との相互作用をもたらす、アミノ酸配列、またはその細胞接着部分を含んでよい。例えば、ポリペプチドは、コラーゲン、ケラチン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ＢＳＰなど、またはそれらの一部分に由来のアミノ酸配列を含んでよい。様々な実施の形態において、ポリペプチドは、ＡｒｇＧｌｙＡｓｐ（ＲＧＤ）のアミノ酸配列を含む。
【００４４】
ここに記載されたマイクロキャリア基部は、任意の適切な接着性ポリペプチドまたはポリペプチドの組合せが結合されるであろう合成表面を提供し、未知の成分を有する生物学的基質または血清の代わりを提供する。現行の細胞培養の慣行では、いくつかの細胞タイプには、細胞が表面に接着し、持続可能に培養されるための培養表面上の生物学的ポリペプチドまたはペプチドの組合せの存在が必要であることが知られている。例えば、ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ肝細胞は、血清の存在下でプラスチック製培養物品に付着できる。血清は、プラスチック製培養物品に付着して、特定の細胞が付着できる表面を提供できるポリペプチドを提供できることも知られている。しかしながら、生物学的に由来する物質および血清は、未知の成分を含有する。細胞付着を生じる血清または生物学的由来の基質の特定の成分または成分（ペプチド）の組合せが公知である細胞について、それらの公知のポリペプチドは、ここに記載されたように合成し、マイクロキャリアに施すことができ、細胞を、未知の起源または組成の成分がない、または非常にわずかしかない合成表面上で培養することができる。
【００４５】
ここに議論されるポリペプチドのいずれについても、保存性アミノ酸が、特異的に同定されたまたは公知のアミノ酸と置換されてもよいことが理解されるであろう。「保存性アミノ酸」は、ここに用いたように、第２のアミノ酸と機能的に類似のアミノ酸を称する。そのようなアミノ酸は、よく知られた技法にしたがってポリペプチドの構造または機能に対する障害が最少で、ポリペプチドにおいて互いに置換されてもよい。以下の５つの群の各々が、互いに同類置換基であるアミノ酸を含有する：脂肪族：グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｌ）；芳香族：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；硫黄含有：メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）；塩基性：アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；酸性：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）。
【００４６】
ポリペプチドからマイクロキャリアの表面までの距離を増加させるために、繰返しポリ（エチレングリコール）リンカーまたは任意の他の適切なリンカーなどのリンカーまたはスペーサを使用してもよい。リンカーは、任意の適切な長さのものであってもよい。例えば、リンカーが繰返しポリ（エチレングリコール）リンカーである場合、そのリンカーは、２と１０の間の繰返しエチレングリコール単位を含んでよい。いくつかの実施の形態において、リンカーは、約４の繰返しエチレングリコール単位を有する繰返しポリ（エチレングリコール）リンカーである。ポリペプチドの全て、いくつかがリンカーを通じてマイクロキャリア基部に結合されていても、全くリンカーを通じて結合していなくてもよい。使用してよい他の可能性のあるリンカーとしては、ポリ（グリシン）またはポリ（β−アラニン）などのポリペプチドリンカーが挙げられる。
【００４７】
ポリペプチドは、任意の密度で、好ましくは未分化幹細胞または他の細胞タイプの培養を支援するのに適した密度で、マイクロキャリアに結合されてもよい。ポリペプチドは、マイクロキャリアの表面のｍｍ2当たり約１ピコモルと約５０ピコモルの間の密度でマイクロキャリア基部に結合されてもよい。例えば、ポリペプチドは、マイクロキャリアの表面の５ピコモル／ｍｍ2超、６ピコモル／ｍｍ2超、７ピコモル／ｍｍ2超、８ピコモル／ｍｍ2超、９ピコモル／ｍｍ2超、１０ピコモル／ｍｍ2超、１２ピコモル／ｍｍ2超、１５ピコモル／ｍｍ2超、または２０ピコモル／ｍｍ2超の密度で存在してもよい。存在するポリペプチドの量は、マイクロキャリア基部の組成（例えば、ペンダントカルボン酸基の密度）、マイクロキャリア基部のサイズおよびポリペプチド自体の性質に応じて様々であり得ることが理解されよう。いくつかの検出されるポリペプチドがマイクロキャリアの内部でグラフトされているかもしれないので、ポリペプチドの表面密度を決定することが難しいかもしれないこともさらに理解されよう。しかしながら、全体のポリペプチド密度が、乾燥マイクロキャリアのミリグラム当たり１０ナノモルから５００ナノモルの範囲、例えば、約５０ナノモルのポリペプチド／ｍｇの乾燥マイクロキャリアと約１００ナノモルのポリペプチド／ｍｇの乾燥マイクロキャリアの間の範囲にある場合、無血清条件下で良好な細胞付着を達成できることが判明した。
【００４８】
ポリペプチドは、どのような適切な技法によって重合マイクロキャリアに結合させてもよい。ポリペプチドは、アミノ末端アミノ酸、カルボキシ末端アミノ酸、または内部アミノ酸を通じて、重合マイクロキャリアに結合させてもよい。１つの適切な技法は、当該技術分野に一般に公知のように、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）化学反応を含む。ＥＤＣとＮＨＳまたはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）は、マイクロキャリア基部のカルボキシル基と反応して、アミン反応性ＮＨＳエステルを形成できる。ＥＤＣはマイクロキャリア基部のカルボキシル基と反応して、加水分解を受けやすいアミン反応性Ｏ−アシルイソウレア中間体を生成する。ＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳの添加は、アミン反応性Ｏ−アシルイソウレア中間体をアミン反応性ＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳエステルに転化することによって、その中間体を安定化し、二工程手法を可能にする。マイクロキャリア基部の活性化後、次いで、ポリペプチドを加え、ポリペプチドの末端アミンがアミン反応性エステルと反応して、安定なアミド結合を形成し、それゆえ、ポリペプチドをマイクロキャリア基部に結合させることができる。ポリペプチドをマイクロキャリアに結合させるためにＥＤＣ／ＮＨＳ化学反応が利用される場合、Ｎ末端アミノ酸は、リシン、オルニチン、ジアミノブタン酸、またはジアミノプロピオン酸などのアミン含有アミノ酸であることが好ましい。もちろん、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、ヒドロキシルなどのどのような許容される求核試薬を利用してもよい。
【００４９】
ＥＤＣ／ＮＨＳ化学反応により、ポリペプチドのマイクロキャリアへの架橋長さがゼロになる。末端アミンを有するポリ（エチレングリコール）リンカー（例えば、Quanta BioDesign, Ltdから入手できる）などのリンカーまたはスペーサをポリペプチドのＮ末端アミノ酸に加えてもよい。そのＮ末端アミノ酸にリンカーを加える場合、そのリンカーはＮ−ＰＧ−アミド−ＰＥＧX−酸であることが好ましく、式中、ＰＧは、Ｆｍｏｃ基、ＢＯＣ基、ＣＢＺ基またはペプチド合成を受けやすい任意の他の基などの保護基であり、Ｘが２、４、６、８、１２、２４または利用してよい任意の数の他の別個のＰＥＧである。いくつかの実施の形態において、アミノ酸は、ポリペプチドの細胞結合領域をマイクロキャリアの表面から離れて突出させるためのリンカーとして働くであろう。
【００５０】
様々な実施の形態において、ポリペプチドを結合させるために、溶液、懸濁液などの１μＭ〜２５００μＭのポリペプチド流体組成物が活性化マイクロキャリアと接触させられる。例えば、ポリペプチド濃度は、約１００μＭと約２０００μＭの間、約５００μＭと約１５００μＭの間、または約１０００μＭであってよい。ポリペプチド組成物の容積および濃度は、マイクロキャリアに結合されるポリペプチドの所望の密度を達成するために、変えてもよいことが理解されよう。
【００５１】
ポリペプチドは、環化されていても、環状部分を含んでもよい。環状ポリペプチドを形成するどのような適切な方法を使用してもよい。例えば、適切なアミノ酸側鎖の自由なアミノ官能基および適切なアミノ酸側鎖の自由なカルボキシル基を環化させることによって、アミド結合を形成してもよい。また、ペプチド配列における適切なアミノ酸の側鎖の自由なスルフヒドリル基の間でジスルフィド結合を形成してもよい。どのような適切な技法を利用して、環状ポリペプチド（またはその部分）を形成してもよい。一例として、例えば、国際公開第１９８９／００５１５０号パンフレットに記載されている方法を利用して、環状ポリペプチドを形成してもよい。ポリペプチドがカルボキシ末端とアミノ末端との間にアミド結合を有する頭−尾環状ポリペプチドを利用してもよい。ジスルフィド結合の代替物は、例えば、Koide et al, 1993, Chem. Pharm. Bull. 41(3):502-6；Koide et al.,1993, Chem. Pharm. Bull. 41(9):1596-1600；またはBesse and Moroder, 1997, Journal of Peptide Science, vol. 3, 442-453に記載されているような、２つのセレノシステインまたは混合セレン化物／硫化物結合を使用してジセレニド結合であろう。
【００５２】
ポリペプチドは、当該技術分野に公知のように合成しても（あるいは、分子生物学技法により産生しても）またはAmerican Peptide Company、CEM Corporation、またはGenScript Corporationなどの民間の供給メーカーから得てもよい。リンカーは、当該技術分野に公知のように合成しても、またはQuanta BioDesign, Ltd.から得られる個別のポリエチレングリコール（ｄＰＥＧ）リンカーなどの、民間の供給メーカーから得てもよい。
【００５３】
様々な実施の形態において、ポリペプチドは、Ac-Lys-Gly-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe-Thr-Met-Pro-NH2（配列番号１）またはAc-Lys-Gly-Gly-Asn-Gly-Glu-Pro-Arg-Gly-Asp-Thr-Tyr-Arg-Ala-Tyr-NH2（配列番号２）の配列を含む。もちろん、どのようなポリペプチドを使用してもよく、特にArg-Gly-Asp配列を含有するポリペプチドを使用してもよい。
【００５４】
Ｃ．  誘導体化によるカルボキシル基のブロッキング
マイクロキャリア基部にポリペプチドをグラフトさせた後、基部の残りの未結合のカルボン酸官能基（またはその一部分）をブロッキングしてもよい。例えば、カルボン酸基は、モノアミンの誘導体化によってブロッキングしてもよい。そのようなブロッキングにより、高親水性のカルボン酸基がそれほど親水性ではないアミド基に転化され。これにより、マイクロキャリアの親水性が減少し、それゆえ、マイクロキャリアの水潤度とＥＷＣが変わる。その結果、ブロッキングにより、ヒドロゲルマイクロキャリア材料の剛性が変わる。すなわち、含水量を減少させることによって、マイクロキャリアの剛性が増加する。したがって、マイクロキャリアの剛性および膨潤性は、架橋密度を調節する必要なく、細胞の挙動に影響を与えるために、所望のように容易に調整できる。それゆえ、剛性は、マイクロキャリア基部が製造された後（架橋密度が固定された後）に変更してもよい。
【００５５】
マイクロキャリア基部にペプチドをグラフトさせるためにＥＤＣ／ＮＨＳ化学反応を使用する場合、マイクロキャリア基部の過剰の活性化エステル（ペンダントＣＯＯＨ部分から生じる）をモノアミンブロッキングにより容易に不活性化させて、その結果アミドを生成することができる。もちろん、誘導体化によるブロッキングは、どのような適切な様式で行ってもよい。
【００５６】
カルボン酸基をブロッキングするために、どのような適切な低分子量モノアミンを使用してもよい。使用してよい適切なモノアミンの例としては、アンモニア、ヒドロキシルアミン、メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン、メトキシエチルアミン、ｎ−プロピルアミン、イソプロピルアミン、ヒドロキシプロピルアミン、ブチルアミン、ｔｅｒｔ−ブチルアミン、ｓｅｃ−ブチルアミンなどが挙げられる。選択されたモノアミンは、マイクロキャリアの水潤度およびＥＷＣへの影響を有し、それゆえ、所望の性質に基づいて、予め選択してもよい。
【００５７】
過剰なモノアミンとの反応によるカルボン酸基のブロッキングにより、典型的に、カルボン酸基の数が約２分の１から約４分の１に減少する。ブロッキング中の加水分解のために、完全なブロッキングは一般に達成されない。したがって、マイクロキャリアの表面（ポリペプチドを考慮しない）は、わずかに負（生理学的な細胞培養ｐＨで）のままである傾向にある。しかしながら、ブロッキングの効率を所望のように増減させるために、ブロッキング条件を調節してもよい。
【００５８】
ブロッキング後、マイクロキャリアの表面（おそらく結合したポリペプチドの部分は除いて）は、細胞培養ｐＨで正の電荷を含まず、中性または負に帯電しているであろう。理論により拘束することを意図するものではないが、負の電荷、または少なくとも正の電荷のないことにより、表面から細胞がはじかれるであろうと考えられる。これにより、結合したポリペプチドと細胞受容体との間の生物特異的相互作用によって、細胞とマイクロキャリアとの間の相互作用が促進されるように、マイクロキャリア基部表面への培養細胞の非特異的結合が減少するか最少になるであろう。非特異的結合が減少することにより、相互作用を調節することができ、これにより、細胞分化またはその欠乏などの結果の再現性をよくすることができる。
【００５９】
２．  細胞培養物品
ここに記載されたマイクロキャリアは任意の適切な細胞培養システムに使用してもよい。典型的に、マイクロキャリアおよび細胞培養培地が、適切な細胞培養物品内に入れられ、培地中でマイクロキャリアが撹拌または混合される。適切な細胞培養物品としては、ＷＡＶＥ  ＢＩＯＲＥＡＣＴＯＲ（登録商標）（Invitrogen）などのバイオリアクタ、６，１２，９６，３８４，および１５３６ウェルプレートなどのシングルおよびマルチウェルプレート、瓶、ペトリ皿、フラスコ、多層フラスコ、ビーカー、プレート、ローラーボトル、管、袋、膜、カップ、スピナーボトル、潅流チャンバ、バイオリアクタ、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）培養チャンバ（Corning Incorporated）および発酵槽が挙げられる。
【００６０】
３．  結合ポリペプチドを含有するマイクロキャリアを有する培地中での細胞のインキュベーション
上述した結合したポリペプチドを含有する培地を収容する細胞培養物品に細胞を播種してもよい。細胞はどのような細胞タイプのものであってもよい。例えば、細胞は、結合組織細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、骨格筋または平滑筋細胞、心筋細胞、腸細胞、腎細胞、または他の器官からの細胞、幹細胞、島細胞、血管細胞、リンパ球、癌細胞、初代細胞、細胞株などであってよい。細胞は、哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞であってよいが、細菌、酵母、または植物細胞などの非哺乳類細胞であってもよい。
【００６１】
数多くの実施の形態において、前記細胞は、当該技術分野に一般に理解されるように、連続的に分裂する能力（自己再生）を有し、様々な範囲の特化細胞に分化することのできる細胞と称される幹細胞である。いくつかの実施の形態において、対象の臓器または組織から単離されるであろう幹細胞は多能性(multipotent)、全能性、または多能性(pluripotent)幹細胞である。そのような細胞は、完全に分化されたすなわち成熟した細胞タイプを生じることができる。幹細胞は、自家であろうとなかろうと、骨髄由来幹細胞、神経幹細胞、または胚幹細胞であってよい。幹細胞はネスチン陽性であってよい。幹細胞は造血幹細胞であってよい。幹細胞は、内皮および脂肪組織、臍帯血、肝臓、脳または他の器官から由来の多系統細胞であってよい。様々な実施の形態において、幹細胞は、哺乳類から単離された多能性胚幹細胞などの多能性幹細胞である。適切な哺乳類としては、ネズミまたはラットなどの齧歯類、ヒトおよび非ヒト霊長類を含む霊長類が挙げられるであろう。様々な実施の形態において、ポリペプチドが結合したマイクロキャリアは、５以上の継代、７以上の継代、または１０以上の継代に亘る胚幹細胞の未分化細胞を支援する。典型的に、幹細胞は、約７５％の培養密度に到達した後、新たな表面に継代される。細胞が７５％の培養密度に到達するのにかかる時間は、培地、播種密度および当該技術分野に公知の他の要因に依存する。
【００６２】
ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）は、未分化状態で培養において連続的に増殖する能力を有するので、ここに記載されたマイクロキャリアに使用するためのｈＥＳＣは、株化細胞から得てもよい。株化されたヒト胚幹細胞の例としては、以下に限られないが、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３またはＨ１４（ウィスコンシン大学により設立されたWiCellから入手できる）（Thompson (1998) Science 282:1145）；ｈＥＳＢＧＮ−０１、ｈＥＳＢＧＮ−０２、ｈＥＳＢＧＮ−０３（ジョージア州、アセンズ所在のBresaGen,Inc.）；ＨＥＳ−１、ＨＥＳ−２、ＨＥＳ−３、ＨＥＳ−４、ＨＥＳ−５、ＨＥＳ−６（シンガポール国、ES Cell International, Inc.から）；ＨＳＦ−１、ＨＳＦ−６（カリフォルニア大学サンフランシスコ校から）；Ｉ３，Ｉ３．２、Ｉ３．３、Ｉ４、Ｉ６、Ｉ６．２、Ｊ３、Ｊ３．２（イスラエル国、ハイファ市所在のTechnion-Israel Institute of Technologyで由来された）；ＵＣＳＦ−１およびＵＣＳＦ−２（Genbacev et al., Fertil. Steril. 83(5):1517-29, 2005）；系統ＨＵＥＳ１−１７（Cowan et al., NEJM 350(13):1353-56, 2004）；および系統ＡＣＴ−１４（Klimanskaya et al., Lancet, 365(9471):1636-41, 2005）が挙げられる。胚幹細胞は、初代胚組織から直接得てもよい。典型的に、これは、そうでなければ廃棄されるであろう、胚盤胞段階での冷凍インビトロ受精卵を使用して行われる。
【００６３】
多能性幹細胞の他の供給源としては、人工霊長類多能性（ｉＰＳ）幹細胞を含む。ｉＰＳ細胞は、例えば、１つ以上のベクターによるトランスフェクションによって、遺伝子操作され、よってｈＥＳＣなどの多能性幹細胞の表現型を得るためにリプログラムされた、ヒトなどの若年または成人哺乳類から得られた細胞を称する。これらのリプログラムされた細胞により得られる表現型の特徴としては、胚盤胞から単離された幹細胞に似た形態並びに胚盤胞由来の胚幹細胞に似た表面抗原発現、遺伝子発現およびテロメラーゼ活性が挙げられる。ｉＰＳ細胞は、典型的に、外胚葉、内胚葉および中胚葉の一次胚葉の各々から少なくとも１つの細胞タイプに分化する能力を有する。ｈＥＳＣなどのｉＰＳ細胞は、免疫不全マウス、例えば、ＳＣＩＤマウスに注入した場合、奇形腫も形成する（Takahashi et al., (2007) Cell 131(5):861; Yu et al., (2007) Science318:5858）。
【００６４】
幹細胞を未分化状態に維持するために、マイクロキャリアの表面に取り付けられたポリペプチドに対する選択的な付着を得ながら、マイクロキャリアの表面との細胞の非特異的相互作用または付着を最少にすることが望ましいであろう。ポリペプチドが結合していないマイクロキャリアの表面に幹細胞が付着する能力を、ポリペプチドを結合させる前に試験して、マイクロキャリアが幹細胞の非特異的相互作用または付着をほとんどまたは全く与えないか否かを判定してもよい。適切なマイクロキャリアが一度選択されたら、細胞を、マイクロキャリアを含有する培地中に播種してもよい。
【００６５】
細胞を播種する前に、細胞を収穫し、細胞が、一度播種されたらその中で培養されるべき増殖培地などの適切な培地中で懸濁させてもよい。例えば、細胞は、血清含有培地、ならし培地、または既知組成培地内に懸濁され、培養されてもよい。ここに用いたように、「既知組成培地」は、未知の組成の成分を含有しない細胞培養培地を意味する。既知組成細胞培養培地は、様々な実施の形態において、未知の組成のタンパク質も、加水分解物も、ペプチドも含有しない。いくつかの実施の形態において、既知組成培地は、組換え成長ホルモンなどの、既知の組成のポリペプチドまたはタンパク質を含有する。既知組成培地の全ての成分は公知の化学構造を有するので、培養条件における変動性およびそれゆえの細胞応答における変動性は減少させられ、再現性を増加させることができる。その上、汚染の可能性が減少する。さらに、拡大させることが、少なくとも一部は、上述した要因のために、より容易になる。既知組成細胞培養培地は、胚幹細胞の成長および増殖から特別に配合された完全に無血清のフィーダー細胞不要の培地であるＳＴＥＭＰＲＯとしてInvitrogen（カリフォルニア州９２００８、カールズバッド、ＰＯ  Ｂｏｘ６４８２、１６００ファラデー通り所在のInvitrogen Corporation）から、ＸｉｖｉｖｏとしてLonzaから、またヒト胚幹細胞のためのｍＴｅＳＲ１（商標）維持培地としてStem Cell Technologies, Inc.から市販されている。
【００６６】
細胞が、ポリペプチドに結合したマイクロキャリアと共にインキュベーションされる培地に、１種類以上の増殖因子または他の因子を加えてもよい。それらの因子は、細胞の増殖、接着、自己再生、分化などを促進させるであろう。培地に加えてもまたは含ませてもよい因子の例としては、筋肉形態形成因子（ＭＭＰ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン、神経成長因子（ＮＧＦ）、エリスロポイエチン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、アクチビンＡなどのアクチビンＡ（ＡＣＴ）、造血成長因子、レチノイン酸（ＲＡ）、インターフェロン、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）などの線維芽細胞増殖因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ペプチド性細胞増殖因子、ヘパリン結合成長因子（ＨＢＧＦ）、肝細胞増殖因子、腫瘍壊死因子、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）ＩおよびＩＩ、トランスフォーミング増殖因子−β１（ＴＧＦβ１）などのトランスフォーミング増殖因子、およびコロニー刺激因子が挙げられる。
【００６７】
細胞はどのような適切な濃度で播種してもよい。典型的に、細胞は、マイクロキャリアの約１０，０００細胞／ｃｍ2から約５００，０００細胞／ｃｍ2で播種される。例えば、細胞は、基体の約５０，０００細胞／ｃｍ2から約１５０，０００細胞／ｃｍ2で播種してもよい。しかしながら、それより高いまたは低い濃度も容易に使用されるであろう。インキュベーション時間および温度、ＣＯ2とＯ2レベル、増殖培地などの条件は、培養されている細胞の性質に依存し、容易に変更することができる。細胞がマイクロキャリアと共に培養される時間の量は、望ましい細胞応答に応じて様々であろう。
【００６８】
培養された細胞は、（ｉ）治験研究に使用するため、または治療用途を開発するため、既知組成培地中の合成表面で培養される未分化幹細胞を十分な量で得る、（ｉｉ）培養される細胞の治験研究のため、（ｉｉｉ）治療用途を開発するため、（ｉｖ）治療目的のため、（ｖ）例えば、ｃＤＮＡライブラリを作成することによって、遺伝子発現を研究するため、（ｖｉ）薬物の研究および毒性スクリーニングのため、および（ｖｉｉ）などを含むどのような適切な目的に使用してもよい。
【００６９】
細胞が未分化であるか否かを判定する適切な様式の１つは、ＯＣＴ４マーカーの存在を判定することである。様々な実施の形態において、５、７、または１０以上の継代に亘りここに記載されたマイクロキャリア上で培養された未分化幹細胞は、分化される能力を維持する。
【００７０】
態様（１）において、細胞培養のためのマイクロキャリアであって、ｐＨ７で中性または負の電荷を有する架橋した多糖ヒドロゲルマイクロキャリア基部；および基部に結合したポリペプチドを有してなるマイクロキャリアが提供される。態様（２）において、マイクロキャリアが中性または負に帯電した架橋した多糖ヒドロゲルマイクロキャリア基部；および基部に結合した細胞付着ポリペプチドから実質的になる、態様１によるマイクロキャリアが提供される。ある態様（３）において、中性または負に帯電した架橋した多糖ヒドロゲルマイクロキャリア基部がカルボン酸官能基を含む、態様１または２によるマイクロキャリアが提供される。態様（４）において、マイクロキャリア基部が、モノアミンのカルボン酸官能基との反応生成物を含む、態様３によるマイクロキャリアが提供される。態様（５）において、マイクロキャリア基部がデキストランを含む、態様１〜４のいずれかによるマイクロキャリアが提供される。態様（６）において、細胞付着ポリペプチドがＲＧＤのアミノ酸配列を含む、態様１〜５のいずれかによるマイクロキャリアが提供される。態様（７）において、合成細胞付着ポリペプチドが、ＢＳＰポリペプチド、ビトロネクチンポリペプチド、およびフィブロネクチンポリペプチドからなる群より選択される、態様１〜５のいずれかによるマイクロキャリアが提供される。態様（８）において、マイクロキャリアが３０ｍｌ／ｇと５０ｍｌ／ｇの間の水潤度を有する、態様１〜７のいずれかによるマイクロキャリアが提供される。態様（９）において、マイクロキャリア基部が、ペンダントカルボン酸基を有する多糖ヒドロゲルのモノアミンとの反応により生成され、多糖ヒドロゲルが、ポリペプチドとの結合前に、基部のグラム当たり１．５ミリ当量のカルボン酸基と基部のグラム当たり５ミリ当量のカルボン酸基の間のペンダントカルボン酸基を有する、態様１〜８のいずれかによるマイクロキャリアが提供される。
【００７１】
態様（１０）において、細胞培養マイクロキャリアを形成する方法であって、ペンダントカルボン酸官能基を有する正味で中性または負に帯電した多糖ヒドロゲルマイクロキャリア基部を提供し；マイクロキャリア基部のカルボン酸基に合成ポリペプチドを結合させて、マイクロキャリアを形成する各工程を有してなる方法が提供される。態様（１１）において、マイクロキャリア基部が、ポリペプチドとの結合前に、基部のグラム当たり１．５ミリ当量のカルボン酸基と基部のグラム当たり５ミリ当量のカルボン酸基の間のペンダントカルボン酸基を有する、態様１０による方法が提供される。態様（１２）において、カルボン酸官能基の少なくともいくらかをモノアミンでブロッキングして、アミドを形成する工程をさらに含む、態様１０による方法が提供される。態様（１３）において、モノアミンが、アンモニア、ヒドロキシルアミン、メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン、メトキシエチルアミン、ｎ−プロピルアミン、イソプロピルアミン、ヒドロキシプロピルアミン、ブチルアミン、ｔｅｒｔ−ブチルアミン、およびｓｅｃ−ブチルアミンからなる群より選択される、態様１２による方法が提供される。態様（１４）において、カルボン酸基の全てまたは実質的に全てがブロッキングされる、態様１２による方法が提供される。態様（１５）において、カルボン酸官能基をモノアミンでブロッキングする工程により、１０と７０の間の平衡含水量を有するマイクロキャリアが製造される、態様１２による方法が提供される。態様（１６）において、マイクロキャリア基部がデキストランを含む、態様１０〜１５いずれかによる方法が提供される。態様（１７）において、合成ポリペプチドがＲＧＤのアミノ酸配列を含む、態様１０〜１６いずれかによる方法が提供される。態様（１８）において、合成ポリペプチドが、ＢＳＰポリペプチド、ビトロネクチンポリペプチド、およびフィブロネクチンポリペプチドからなる群より選択される、態様１０〜１６いずれかによる方法が提供される。態様（１９）において、細胞を培養する方法において、細胞を、マイクロキャリアを有する細胞培養培地と接触させる工程であって、マイクロキャリアが、（ｉ）中性または負に帯電した多糖ヒドロゲルマイクロキャリア基部、および基部に結合したポリペプチドを含み、ポリペプチドがＲＧＤのアミノ酸配列を含む工程；および培地内で細胞を培養する工程を有してなる方法が提供される。態様（２０）において、細胞が幹細胞であり、培地が既知組成培地である、態様１９の方法が提供される。
【００７２】
以下において、先に論じたマイクロキャリアおよび方法の様々な実施の形態を記載する非限定的実施例が提示される。
【実施例】
【００７３】
実施例１：デキストランビーズへのビトロネクチン（ＶＮ）の結合
１００ミリグラムの乾燥したカルボキシメチル化デキストランビーズ、ＣＭ−「Ｓｅｐｈａｄｅｘ」Ｃ−５０ビーズ（GE Healthcareから得られる［ＣＡＳ番号９０４７−０８−］）をプラスチック管内に秤量し、１０ミリリットルの２００ｍＭのＥＤＣおよび５０ｍＭのＮＨＳの水溶液中に懸濁させた。懸濁液を３０分間に亘り放置して、ビーズを膨潤させ、カルボン酸基を活性化させた。次いで、活性化したマイクロキャリアを遠心分離によって収集し、１０ｍｌの脱イオン水で３回濯いだ。濯ぎ後、それらを、American Peptide Company, Inc.から入手できるビトロネクチンペプチド（Ac-Lys-Gly-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe-Thr-Met-Pro-NH2、配列番号１）（カタログ番号：３４１５８７）を６１．２ｍｇ含有するｐＨ９．２のホウ酸緩衝液１５ｍｌ中に再度懸濁させ、２時間に亘り放置して反応させた。
【００７４】
反応スキームの総括が図１に示されており、この図は、水中でＥＤＣ／ＮＨＳと、ＶＮ−ペプチド／ｐＨ９．２のホウ酸塩と反応させられ（１）、その後エタノールアミンブロッキングが行われて（２）ペプチド結合され、ブロッキングされたビーズに到達した説明のカルボキシル化ビーズを示している。
【００７５】
ペプチド結合マイクロキャリアを遠心分離によって収集し、１０ｍｌのｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。最後に、過剰の活性化エステルを、６０分間に亘りｐＨ８．４の１０ｍｌの１Ｍのエタノールアミンによるブロッキングによって不活性化した。ペプチドがグラフトされ、ブロッキングされたマイクロキャリア（ＣＭＤ−ＶＮと記す）を収集し、ＰＢＳで３回濯いだ。過剰のＰＢＳの除去後、マイクロキャリアを７０：３０％ｖ／ｖのエタノール／水で２回濯ぎ、細胞培養前にこのエタノール／水溶液中に貯蔵した。
【００７６】
実施例２：デキストランビーズへのローダミン標識ペプチドの結合
ローダミン標識蛍光ペプチド（米国、カリフォルニア州所在のAmerican Peptide Company Inc.からの、アミノ酸配列5/6TAMRA-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ile-Ile-Lys-NH2、配列番号３を有する参照番号３４７６７８）を実施例１からのビトロネクチンペプチドと混合したことを除いて、実施例１に記載されたのと同じ手法を再現した。手短に言えば、結合工程について、１５３マイクロリットルの１ｍＭのローダミン標識ペプチドを、６１．２ｍｇのビトロネクチンペプチドを含有する１５ｍｌのホウ酸緩衝液に加えたことを除いて、マイクロキャリアの活性化を実施例１に記載したように行った。ブロッキング工程は、実施例１におけるように行った。結果として得られたビーズの概略図が図２に示されている。
【００７７】
ＶＮおよびローダミン標識ペプチドの結合はうまく働き、活性化を省略したときに、ペプチドの非特異的吸着は生じなかった（データは示さず）。
【００７８】
図３は、蛍光標識ビーズを示す顕微鏡画像であり、グラフトされたペプチドの良好な均一性が観察される。
【００７９】
ローダミン標識ペプチドは、結合が予測されたように達成できる（図３参照）ことを示すためだけでなく、結合に使用されるペプチドの濃度とビーズにグラフトされたペプチドの量との間に存在する関係を確立するためにも、使用された。その結果が図４に示されている。
【００８０】
図４に示された結果を生成するために、ブロッキングし、ＰＢＳで濯ぎ、遠心分離により過剰のＰＢＳを除去した後、実施例１に記載したようには、エタノール／水混合物中に蛍光ペプチド結合ビーズは懸濁させなかった。代わりに、１００マイクロリットルの膨潤ビーズを９６ウェルプレート（Invitrogen）の３つのウェル内に入れた。BioTekからのＳｙｎｅｒｇｙ（商標）４プレート読取機を使用して、蛍光を測定した。使用した構成が下記に与えられている。
【表１】
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【００８１】
実施例３：デキストランビーズーのＲＧＥペプチドの結合（陰性対照）
実施例１からのビトロネクチンペプチドの代わりに、ＲＧＥ−ペプチド（米国、カリフォルニア州所在のAmerican Peptide Company Inc.からの、アミノ酸配列Ac-Gly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro-Ile-Ile-Lys-NH2、配列番号４を有する参照番号３４８４５４（ＩＤ＃ＲＧＥ））を使用したことを除いて、実施例１に記載されたのと同じ手法を再現した。ＲＧＥコアを含有するペプチドがグラフトされたこれらのマイクロキャリアは、ＣＭＤ−ＲＧＥと記され、陰性対照として使用した。得られたＲＧＥ官能基マイクロキャリアは、陰性対照について予測されたように、細胞付着を支援せず、ＶＮペプチド結合マイクロキャリア上の接着は主に、ペプチド特異的接着によることを示した（図８参照）。細胞培養条件が、実施例５において以下により詳しく記載されている。
【００８２】
実施例４：グラフトされたペプチドの定量化
ＢＣＡアッセイキット（仏国、モンリュソン所在のInterchim S.A.）からのビシンコニン酸（ＢＣＡ）混合試薬を、８００マイクロリットルの試薬Ｂを４０ｍｌの試薬Ａに加え、混合することによって調製した。
【００８３】
ブロッキングし、ＰＢＳで濯ぎ、遠心分離により過剰のＰＢＳを除去した後、ビーズをエタノール／水混合物中に再度懸濁させなかったことを除いて、マイクロキャリアを実施例１に記載したように調製した。代わりに、５００マイクロリットルの膨潤ビーズをガラスバイアルに入れた。次いで、４ｍｌのＢＣＡ混合試薬を加え、３０分毎に軽く振盪しなから、２時間に亘り放置した。
【００８４】
マイクロキャリアを遠心分離により除去し、上清を収集した。２２５マイクロリットルの上清を９６ウェルプレート（Invitrogen）の３つのウェル内に加え（三重に）、プレート読取機を使用して、５６２ｎｍでの吸光度を測定した。
【００８５】
「ブランク」は、未修飾のＣＭ−「Ｓｅｐｈａｄｅｘ」Ｃ−５０ビーズ上で測定した吸光度に対応する。
【００８６】
図５は、結合工程に使用したビトロネクチンペプチドの濃度の関数としての吸光度を示す。
【００８７】
図４および５の両方に示されるように、マイクロキャリアへのポリペプチドのグラフトが達成された。
【００８８】
実施例５：ＨＴ１０８０細胞を使用した細胞接着アッセイ
接着アッセイについて、５ｍｇのＶＮペプチドがグラフトされたマイクロキャリアをＤ−ＰＢＳ中で洗浄し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で飽和させ、無血清培地中に再度懸濁させ、２４ウェルのマルチウェルｕｌｔｒａｌｏｗ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ（ＵＬＡ）プレートに移した。
【００８９】
ＨＴ１０８０ヒト線維肉腫細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−１２１）を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質を添加したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（Gibsco）内で増殖させた。細胞を、５％のＣＯ2を含む湿った雰囲気内において３７℃のインキュベータ内に保持した。細胞を、飽和密度に到達する前に、トリプシン処理によって、必要に応じて分割した。
【００９０】
ＨＴ１０８０細胞をトリプシン処理し、洗浄し、計数し、無血清培地中の３００，０００の細胞を、先に調製したビーズと混合した。プレートを３７℃で２時間に亘りインキュベーションし、位相差顕微鏡を使用して、細胞接着を観察した。定量化が必要になったときに、調製品をＰＢＳ中３．７％のホルムアルデヒドを使用して固定化し、キャリアに接着した細胞の画像を得た。画像化されたキャリアの数とキャリアに接着した目に見える細胞の数を決定し、ビーズ当たりの細胞の数を計算した。結果が図６に示されており、この図は、細胞／ビーズの数が、ＶＮペプチドの濃度が増加するにつれて、増加したことを示している。蛍光およびＢＣＡアッセイにより決定された（それぞれ、図４および図５を参照のこと）マイクロキャリアにグラフトされたペプチドの量と、マイクロキャリアに付着した細胞の量との間にかなり良好な関係が存在することは注目に値する。
【００９１】
ＶＮ−ＣＭＤマイクロキャリアに接着したＨＴ１０８０細胞の代表的な画像が図７に示されており、これは、播種から２時間後に撮影した位相差顕微鏡画像である。実施例３に関して先に手短に議論したように、ＲＧＥポリペプチドがグラフトされたＣＭＤマイクロキャリア（ＣＭＤ−ＲＧＥ）上には、ＨＴ１０８０細胞の接着は観察されなかったが、ＣＭＤ−ＶＮマイクロキャリア上には観察され、細胞結合はペプチド特異的であり、マイクロキャリア基部への非特異的結合はほとんどから全く生じないことを示唆している（図８参照）。
【００９２】
足場依存性ＨＴ１０８０細胞のＣＭＤ−ＶＮマイクロキャリア上に結合し増殖する能力を「Ｃｙｔｏｄｅｘ」１マイクロキャリア（GE Healthcare Biosciences AB Ltd.）と比較した。後者のマイクロキャリアは、正に帯電しており、足場依存性細胞の非特異的結合を支援すると考えられる。「Ｃｙｔｏｄｅｘ」１ビーズの培養条件は、「Ｃｙｔｏｄｅｘ」１ビーズをＣＭＤ−ＶＮマイクロキャリアの代わりに使用したことを除いて、ＣＭＤ−ＶＮマイクロキャリアに関して上述したようなものであり、実験は、撹拌条件下でスピナーフラスコ内で行った。図９に示されるように、ＨＴ１０８０細胞は、「Ｃｙｔｏｄｅｘ」１ビーズと同様に、またはそれより良好に、ＣＭＤ−ＶＮマイクロキャリア上に接着し、増殖した。図９の位相差画像は、マイクロキャリア上に細胞を播種したから２時間後、２４時間後、および５日後に撮影した。
【００９３】
足場依存性ＨＴ１０８０細胞の付着がペプチド特異的または生物特異的であったという論点を支持するために、細胞の、未処理のカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）ビーズまたはＶＮペプチドが結合していないエタノールアミンブロッキングされたＣＤＭビーズに接着する能力を、ＶＮペプチドがグラフトされたブロッキングされたＣＭＤビーズと比較した。これらのビーズは、上述したように調節した。手短に言えば、５ｍｇのビーズを、ＰＢＳ１％のＢＳＡ中で１時間に亘りインキュベーションし、ＰＢＳで２回洗浄し、無血清ＩＭＤＭ中に再度懸濁させた。ＨＴ１０８０細胞をトリプシン処理によって培養プレートから収集し、細胞を洗浄し、計数し、５×１０5の細胞を、２４ウェルプレートからの１つのウェル内で調製したビーズと混合した。細胞を３７℃で１時間に亘りインキュベーションし、次いで、培地を３．７％のホルムアルデヒドで調節することによって固定化した。ビーズを洗浄して、結合していない細胞を除去し、代表的な写真を撮影した。得られた結果が図１０に示されている。図１０に示されるように、ＶＮペプチドがＣＭＤビーズに結合した場合（パネルＣ、ＣＭＤ−ＶＮ）のみに細胞接着が観察され、未処理のビーズ（パネルＡ、ＣＭＤ）や、ＶＮペプチドがグラフトされていないエタノールアミンブロッキングされたビーズ（パネルＢ、ＥＡ−ＣＭＤ）は、試験した条件において細胞接着は支持しない。それゆえ、結合は、ペプチド特異的であるようである。これらの結果も、足場依存性細胞は、中性または負に帯電したヒドロゲルマイクロキャリアに、仮にそうであったとしても、十分には結合しないという論点を支持する。
【００９４】
撹拌培養条件下でＨＴ１０８０細胞がＣＭＤ−ＶＮマイクロキャリア上に結合したまま増殖する能力も調査した。手短に言えば、１００ｍｇのペプチドがグラフトされたマイクロキャリア、または市販のマイクロキャリア（「Ｃｙｔｏｄｅｘ」１、「Ｃｙｔｏｄｅｘ」３、SoloHillのｐｒｏｎｅｃｔｉｎ（登録商標）Ｆ）をＤ−ＰＢＳ中で洗浄し、培地中に再懸濁させ、１２５ｍｌのスピナーフラスコ（Corning, Inc.）に移した。ＨＴ１０８０細胞をトリプシン処理し、計数し、２，５００，０００の細胞を、先に調製したビーズと混合した。撹拌しない１０ｍｌの最終培地容積中での最初の２時間の接着期間後、培地の容積を３０ｍｌに調節し、１時間毎に１５分間の撹拌を設定した。サンプルを毎日収集し、位相差顕微鏡によって評価した。ＣＭＤ−ＶＮマイクロキャリアに関する撹拌培養における５日後に飽和密度に到達したＨＴ１０８０細胞を示す位相差画像が図１１に示されている。
【００９５】
ＨＴ１０８０細胞が様々な異なるマイクロキャリア上で増殖する能力も撹拌条件下で調査した。「Ｃｙｔｏｄｅｘ」１ビーズおよびＣＭＤ−ＶＮマイクロキャリアに加え、ＨＴ１０８０細胞を、「Ｃｙｔｏｄｅｘ」３ビーズ（GE Healthcare Biosciences AB Ltd.）および「Ｐｒｏｎｅｃｔｉｎ」Ｆマイクロキャリア（SoloHill Engineering, Inc.）上で培養した。「Ｃｙｔｏｄｅｘ」３ビーズはコラーゲンで被覆されたビーズであり、「Ｐｒｏｎｅｃｔｉｎ」Ｆ（ＰｒｏＦ）マイクロキャリアは、組換えフィブロネクチンがグラフトされた正に帯電したポリスチレンマイクロキャリアを含む。細胞増殖について、１００ｍｇのペプチドがグラフトしたマイクロキャリア、または市販のマイクロキャリア（「Ｃｙｔｏｄｅｘ」１、「Ｃｙｔｏｄｅｘ」３、SoloHillの「Ｐｒｏｎｅｃｔｉｎ」Ｆ）をＤ−ＰＢＳ中で洗浄し、培地中で再懸濁し、１２５ｍｌのスピナーフラスコ（Corning, Inc.）に移した。細胞の播種と培養を上述したように行った。４から５日後、細胞担持キャリアを遠心分離により収集し、ＰＢＳ緩衝液中で洗浄し、細胞をトリプシン処理によって収穫した。生存細胞の数を、トリパンブルー色素排除試験後にＭａｌａｓｓｅｚ  ｃｅｌｌによる計数によって決定した。結果が図１２に示されており、最終的な細胞数が、ＰｒｏＦマイクロキャリア上で測定された増殖と報告されている。図１２に示されるように、足場依存性ＨＴ１０８０細胞は、「Ｃｙｔｏｄｅｘ」１、「Ｃｙｔｏｄｅｘ」３、およびＰｒｏＦマイクロキャリア上よりも、ＣＭＤ−ＶＮマイクロキャリア上でよりよく増殖した。
【００９６】
ここに提示された結果は、ＣＭＤ−ＶＮマイクロキャリアなどの、接着性ペプチドが結合した中性または負に帯電した表面を有する多糖系ヒドロゲルマイクロキャリアは、無血清条件においてペプチド特異的様式で、ＨＴ１０８０細胞などの足場依存性細胞の付着と増殖を支援できることを示す。細胞のそのようなマイクロキャリアへの結合は、撹拌条件下での培養を支援するのに十分である。さらに、正味で中性から負の帯電と非特異的結合のないことにもかかわらず、細胞は、他の市販のマイクロキャリアよりも、そのようなマイクロキャリア上によりよく付着し、増殖するようである。
【００９７】
実施例６：Ｎｕｌｌｉ−ＳＣＣ１細胞を使用した細胞接着アッセイ
接着アッセイについて、５ｍｇのＲＧＥペプチド結合マイクロキャリア（陰性対照）、ＶＮペプチドがグラフトしたマイクロキャリアまたはSoloHill「Ｐｒｏｎｅｃｔｉｎ」ＦマイクロキャリアをＤ−ＰＢＳ中で洗浄し、ＢＳＡで飽和させ、無血清培地中に再懸濁させ、２４ウェルのマルチウェルＵＬＡプレートに移した。
【００９８】
ＮＵＬＬＩ−ＳＣＣ１ネズミ奇形癌細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１５６６）を、１０％のＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質が添加されたＩＭＤＭ培地（Gibco）中で増殖させた。細胞をゼラチン被覆プレート上で増殖させ、５％のＣＯ2を含む湿った雰囲気内において３７℃に維持した。増殖培地を一日おきに交換し、飽和密度に到達する前に、細胞をトリプシン処理によって必要に応じて分割した。
【００９９】
ＮＵＬＬＩ−ＳＣＣ１細胞をトリプシン処理し、計数し、５００，０００の細胞を、先に調製したビーズと混合し、ＭＴｅＳＲ無血清培地中でインキュベーションした。２時間後に、初期接着を観察した。次いで、プレートを３７℃でさらに１６時間インキュベーションし、位相差顕微鏡（図１３参照）を使用して、この時間後に細胞接着を再度観察した。
【０１００】
図１３のパネルＡに示されるように、ビトロネクチンペプチドがグラフトされたカルボキシメチルデキストランビーズ上に播種してから２４時間後に、細胞群体の均一性が再分割する。図１３のパネルＢに示されるように、同じ条件下であるが、SoloHillの「Ｐｒｏｎｅｃｔｉｎ」Ｆマイクロキャリア上でインキュベーションした細胞の形態が、矢印により示される非付着性胚体様構造を優先的に形成する。図１３のパネルＣは、ビトロネクチンペプチドがグラフトしたマイクロキャリア上の細胞群体の形成を示す拡大画像を示す。図１３のパネルＤは、ＲＧＥペプチドがグラフトしたビーズ上に接着のないことおよび非接着性胚体様構造の形成を示す。
【０１０１】
予測されるように、ＲＧＥペプチド結合マイクロキャリアは、細胞接着は支援せず、懸濁された胚体様凝集体のみが観察された。豊富なＲＧＤペプチド被覆にもかかわらず、SoloHillの「Ｐｒｏｎｅｃｔｉｎ」Ｆマイクロキャリアは、不十分な細胞付着を示し、固定された胚体様構造のみが観察された。反対に、実施例１にしたがって調製されたマイクロキャリアについては、広がった群体が得られた。
【０１０２】
実施例７：多能性マウス胚幹細胞の４８時間の接着
長期の接着アッセイについて、５ｍｇのＶＮペプチドがグラフトしたマイクロキャリアまたは「Ｃｙｔｏｄｅｘ」３マイクロキャリアをＤ−ＰＢＳ中で洗浄し、無血清培地（ｍＴｅＳＲ、StemCell Technologies）内に再懸濁させ、２４ウェルのマルチウェルＵＬＡプレートに移した。
【０１０３】
ＥＳ−Ｄ３多能性マウス胚幹細胞（ＡＣＴＴ＃ＣＲＬ−１１６３２）を、ＡＴＣＣが推奨するように、１５％のＦＢＳおよび０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノールを添加したＤＭＥＭ培地中で増殖させた。細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ被覆プレート上で慣習的に増殖させ、トリプシン処理し、飽和密度に到達する前に希釈した。
【０１０４】
ＥＳ−Ｄ３細胞をトリプシン処理し、洗浄し、計数した。１×１０6の細胞をｍＴｅＳＲ無血清培地中に再懸濁させ、先に調製したビーズと混合し、各ウェルに１０μＭのＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤（Sigma参照番号Ｙ−０５０３）を加えて、細胞／細胞の接触を阻害し、過剰なマイクロキャリアの凝集を防いだ。プレートを３７℃で４８時間に亘りインキュベーションし、位相差顕微鏡（図１４参照）を使用して、２４時間後と４８時間後に細胞接着を観察した。多能性マウス胚幹細胞は、試験したマイクロキャリアにうまく接着することができる。撹拌しないにもかかわらず、マイクロキャリアが凝集を形成する傾向は制限されることが観察される。
【０１０５】
多能性胚幹細胞による特異的に発現される酵素であるアルカリホスファターゼの活性を測定することによって、実験の終わりに細胞多能性を調査した。得られた結果は、細胞多能性が、陽性対照（「Ｃｙｔｏｄｅｘ」３）に観察されるものに匹敵する様式で予測されるように、維持されることを示す。ＡＴＣＣが推奨するようにＴＣＴ上で増殖させたＳＴＯマウス線維芽細胞（ＡＣＴＴ＃ＣＲＬ−１５０３）を陰性対照として使用し、予測されるように、細胞は、多能性ではなく、アルカリホスファターゼを発現しない。
【０１０６】
しかしながら、その結果は、ここに記載されたマイクロキャリアが、ヒト胚幹細胞などの多能性幹細胞の培養を支援するという示唆を支持する。
【０１０７】
実施例８：ヒト胚幹細胞の接着と増殖
ＢＧ０１Ｖ／ｈＯＧ細胞（Invitrogen）を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ被覆ＴＣＴ７５フラスコ（Corning）上で５０μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（StemCell Technologies）を含有する無血清ｍＴｅＲＳ培地内で維持した。毎日の培地の交換を、培養してから最初の４８時間後に開始した。細胞を、コラゲナーゼＩＶ（Invitrogen）および機械的スクレーピングを使用して５から６日毎に継代させた。
【０１０８】
アッセイについて、凝集群体を収穫し、新たなｍＴｅＳＲ１無血清培地中に再懸濁させた。細胞を、上述したように調製した、ＶＮペプチドがグラフトしたＣＭＤマイクロキャリア、または比較例としてのGE Healthcareから得られる「Ｃｙｔｏｄｅｘ」３マイクロキャリアを含有する２４ウェルのコーニング超低付着マイクロプレートに播種した（ｃｍ2当たり１．５×１０5の細胞）。容積を培地で６００マイクロリットルに調節した。細胞を、撹拌せずに４８時間に亘りマイクロキャリアに付着させた。播種から２日後、細胞の付着と増殖を、Ｚｉｅｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ２００Ｍ倒立顕微鏡を使用して評価した。定量分析も以下のように行った。培地を除去し、ビーズをウェル内でＤ−ＰＢＳ（２×３ｍｌ）により洗浄した。Ｄ−ＰＢＳを除去し、２００マイクロリットルのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬（Promega）と置き換えた。マイクロプレートを室温で１０分間に亘り振盪器内に配置し、発光を測定した。細胞増殖アッセイについて、同じ播種プロトコルを使用し、細胞を、細胞増殖の過程に亘り静止条件に維持した。細胞の付着から４８時間後、細胞とビーズが沈降した後、培地を毎日交換した。５日後、細胞の増殖および細胞の定量を、上述したのと同じ方法を使用して評価した。
【０１０９】
図１５に示されるように、ＣＭＤ−ＶＮビーズ上でのＢＧ０１Ｖ／ｈＯＧ細胞群体の良好な増殖を観察することができる。「Ｃｙｔｏｄｅｘ」３ビーズ上では、細胞は、接着することができず、代わりに、図１６に示されるような浮遊する胚体を形成した。ＣＭＤ−ＶＮおよび「Ｃｙｔｏｄｅｘ」３のマイクロキャリア上で行った培養の２日後と５日後のＢＧ０１Ｖ細胞の定量化のグラフである図１７に示されるように、細胞は、特に培養の５日後に、「Ｃｙｔｏｄｅｘ」３ビーズ上よりも、ＣＭＤ−ＶＮマイクロキャリア上におけるほうが、著しく良好に維持され、増殖した。
【０１１０】
それゆえ、細胞を培養するための合成多糖マイクロキャリアの実施の形態が開示されている。当業者には、ここに記載されたマイクロキャリアおよび方法を、開示されたもの以外の実施の形態により実施できることが認識されよう。開示された実施の形態は、制限ではなく、説明の目的のために提示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図９】
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【図１３】
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【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年7月3日(2013.7.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2013534404000001.app
【国際調査報告】
2013534404.tif 000023
2013534404.tif 000024
2013534404.tif 000025