(57)【要約】  多発性硬化症をもつ対象におけるインターフェロンベータ（ＩＦＮ‐β）治療の有効性を決定する方法が提供される。その方法の１つの工程は、対象から生体試料を採取することを含むことができる。生体試料の採取後、少なくとも１つのインターフェロン調節遺伝子（ＩＲＧ）および／またはその変異体の発現レベルを決定することができる。少なくとも１つのＩＲＧおよび／またはその変異体の発現の、対照と比較した増加または減少が、その対象がＩＦＮ‐β治療に反応不良であろうことを示しうる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多発性硬化症（ＭＳ）をもつ対象におけるインターフェロンベータ（ＩＦＮ‐β）治療の有効性を決定する方法であって、該方法は、
対象から生体試料を採取する工程；および
少なくとも１つのインターフェロン調節遺伝子（ＩＲＧ）および／またはその変異体の発現レベルを決定する工程を含み、
そこにおいて、対照と比較した、少なくとも１つのＩＲＧおよび／またはその変異体の発現の増加または減少が、該対象がＩＦＮ‐β治療に反応不良であろうことを示す方法。
【請求項２】
前記生体試料が全血を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記全血試料からＲＮＡを単離することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記生体試料を採取する前にＩＦＮ‐βの投与量を前記対象に投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＩＦＮ‐β投与量の投与後約１２時間以内に前記生体試料を採取することをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＭＳを治療するのに使用することができる薬剤をスクリーニングする方法であって、
ＩＦＮ‐β治療に反応不良な者であるＭＳをもつ対象から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団を提供する工程；
前記ＰＢＭＣに薬剤を投与する工程；および
１つ以上のＰＢＭＣにおける少なくとも１つのＩＲＧおよび／またはその変異体の発現レベルを決定する工程を含む方法。
【請求項７】
対照と比較した、前記少なくとも１つのＩＲＧおよび／またはその変異体の発現の増加または減少が、前記薬剤がＭＳ治療用の候補ではないことを示す、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＭＳをもつ対象を治療する方法であって、
対象から生体試料を採取する工程；
少なくとも１つのＩＲＧおよび／またはその変異体の発現レベルを決定する工程；および
１つ以上の前記少なくとも１つのＩＲＧおよび／またはその変異体の発現が、対照と比較して増加または減少している場合、ＩＦＮ‐βに加えて、少なくとも１つの薬剤の治療上有効な量を前記対象に投与する工程を含む方法。
【請求項９】
前記生体試料が全血を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記全血試料からＲＮＡを単離することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記生体試料を採取する前にＩＦＮ‐βの投与量を前記対象に投与することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＩＦＮ‐β投与量の投与後約１２時間以内に前記生体試料を採取することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＭＳをもつ対象を治療する方法であって、
対象から生体試料を採取する工程；
少なくとも１つのＩＲＧおよび／またはその変異体の発現レベルを決定する工程；および
前記少なくとも１つのＩＲＧおよび／またはその変異体の発現が、対照と比較して増加または減少している場合、前記対象にナタリズマブの治療上有効な量を投与する工程を含む方法。
【請求項１４】
前記生体試料が全血を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記全血試料からＲＮＡを単離することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、２０１０年６月１８日に出願された米国特許仮出願第６１／３５６，２６５号に基づく優先権を主張するものであり、該仮出願は、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、一般には、多発性硬化症（ＭＳ）をもつ対象における治療反応を予測する方法に関し、より具体的には、差異的に発現された遺伝子マーカーに基づいて、ＭＳをもつ対象におけるＩＦＮ‐β治療に対する反応を予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
多発性硬化症（ＭＳ）は、中枢神経系の炎症性疾患である。ゲノムワイド関連研究により、ＭＳ疾患感受性に免疫系遺伝子が関与するとされており、それはＭＳ発症における免疫機序の役割に一致する。Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の生体利用性の増加は、多様な自己免疫障害の感受性または重症度に関与している。Ｉ型ＩＦＮ調節遺伝子（ＩＲＧ）の発現の増加は、約５０％の未治療のＭＳ患者で検出され、このことは、自然免疫が増加した患者の小集団（ｓｕｂｓｅｔ）を示すものとして解釈されている。
【０００４】
Ｉ型およびＩＩ型ＩＦＮは、重複して一連のＩＲＧを調節する。Ｉ型ＩＦＮは、主要な自然免疫を媒介するものである一方で、ＩＩ型ＩＦＮは、自然免疫および獲得免疫の両方に関与する。ＩＦＮ‐γのＭＳ用治療薬としての治験は、不成功であったが、Ｉ型ＩＦＮの治験は継続され、幾つかの組み換えインターフェロンベータ（ＩＦＮ‐β）製品がＭＳ用に認可されている。それらの試験では、ＩＦＮ‐βは、再発率を３０％減少し、磁気共鳴画像法によって可視化される脳病変形成を阻害した。しかし、臨床反応は個人の間で大きく異なり、その作用機序は依然としてはっきりしない。
【０００５】
第三相試験の１つの事後データ分析では、約２０％のＩＦＮ‐β受容者が、反応不良な者（ＰＲ）として特定された。近年、反応不良状態は、薬理学的（すなわちＩＦＮ‐β中和抗体産生に関係した）、または薬薬理ゲノミクス的（ＩＦＮ‐β受容体もしくはシグナル伝達構成要素における遺伝的変異に関連した）に分類されている。これらの患者に共通するのは、ＩＦＮ‐β生体利用性の減少である。この機序の明瞭さにもかかわらず、そのような患者はＰＲの少数である。三番目の最大のカテゴリーでは、ＩＦＮ‐βに対するＰＲは、ＩＦＮ‐β反応の特性に関係する可能性があり、患者の小集団（ｓｕｂｓｅｔ）におけるＭＳの発症機序に関して情報を提供しうる。各候補遺伝子のマイクロアレイに基づいた横断的発現分析および研究は、この考えを支持する。
【０００６】
しかし、臨床変数および放射線学的な変数のすべては、疾患の転帰を、特に初期のＭＳにおいて、予測する能力に限界があった。疾患の転帰の予想におけるこの不確実さは、積極的治療が必要なＭＳ患者が治療を受けない一方で、他の患者が不必要に治療され、結果として正当な理論的根拠なしに副作用の危険に曝されることを意味する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、一般には、多発性硬化症（ＭＳ）をもつ対象における治療反応を予測する方法に関し、より具体的には、差異的に発現された遺伝子マーカーに基づいて、ＭＳをもつ対象におけるインターフェロンベータ（ＩＦＮ‐β）治療に対する反応を予測する方法に関する。本発明の１つの態様によれば、ＭＳをもつ対象におけるＩＦＮ‐β治療の有効性を決定する方法が提供される。その方法の１つの工程は、対象から生体試料を採取することを含むことができる。生体試料の採取後、少なくとも１つのインターフェロン調節遺伝子（ＩＲＧ）またはその変異体の発現レベルを決定することができる。対照と比較した、少なくとも１つのＩＲＧまたはその変異体の発現の増加または減少が、その対象がＩＦＮ‐β治療に反応不良であろうことを示しうる。
【０００８】
本発明の別の態様によれば、ＭＳを治療するのに使用することができる薬剤をスクリーニングする方法が提供される。該方法の１つの工程は、ＩＦＮ‐β治療に反応不良な者であるＭＳをもつ対象から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団を準備することを含むことができる。次に、薬剤をＰＢＭＣに投与することができる。次に、少なくとも１つのＩＲＧまたはその変異体の発現レベルを、１つ以上のＰＢＭＣにおいて決定することができる。
【０００９】
本発明の別の態様によれば、ＭＳをもつ対象を治療する方法が提供される。その方法の１つの工程は、対象から生体試料を採取することを含むことができる。生体試料の採取後、少なくとも１つのＩＲＧまたはその変異体の発現レベルを決定することができる。１つ以上の少なくとも１つのＩＲＧまたはその変異体の発現が対照と比較して増加または減少している場合、対象に治療上有効な量の少なくとも１つのＩＦＮ‐β以外の薬剤を投与することができる。
【００１０】
本発明の別の態様によれば、ＭＳをもつ対象を治療する方法が提供される。その方法の１つの工程は、対象から生体試料を採取することを含むことができる。生体試料の採取後、少なくとも１つのＩＲＧまたはその変異体の発現レベルを決定することができる。少なくとも１つのＩＲＧおよび／またはその変異体の発現が、対照と比較して増加または減少している場合、対象に治療上有効な量のナタリズマブを投与することができる。
【００１１】
本発明の前述および他の特徴は、本発明が関係する当業者にとって、添付の図面を参照して以下の説明を読むことで明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明の１つの態様に従って、多発性硬化症（ＭＳ）をもつ対象におけるインターフェロンベータ（ＩＦＮ‐β）治療の有効性を決定する方法を説明する流れ図である。
【図２】図２は、本発明の別の態様に従って、ＭＳを治療するのに使用することができる薬剤をスクリーニングする方法を説明する流れ図である。
【図３】図３は、本発明の別の態様に従って、ＭＳをもつ対象を治療する方法を説明する流れ図である。
【図４】図４は、マクロアレイと対比したリアルタイム定量ＰＣＲによって計算されるＯＡＳＬに関する誘導比率（ＩＲ）間の補正を示す散布図である（ＸおよびＹ軸は、ｌｏｇ２目盛りで示される）。
【図５】図５は、初回ＩＦＮ‐β注射時のインターフェロン調節遺伝子（ＩＲＧ）の数を示すプロットである。バーは、初回ＩＦＮ‐β注射時の個々の対象を表わす。バーの高さは、ＩＲ≧２．０であるＩＲＧの数を示す。治療反応不良の患者には、陰影をつけている。
【図６】図６は、８５名の患者のベースライン（ｘ軸）および６ヶ月（ｙ軸）時のＩＦＮ‐β分子反応に関する一連の散布図を示す。対象の各々について、２つの時点における１６６の各遺伝子のＩＲを示す。２つ時点の間の分子反応のばらつきは、各プロットにおける対角線からのずれによって示される。
【図７】図７は、２４ヶ月にわたって一貫した反応を示す１０名の患者各々に関する一連の散布図である。ベースライン、６ヶ月、および２４ヶ月時のマクロアレイデータのある、１０名のＭＳ患者（５名の反応良好な者および５名の反応不良なもの）を、無作為に選んで２年にわたる反応の一貫性を検証した。初めの３つの列は、治療に反応不良な患者であり、後ろの３つの列は、治療に反応良好な患者である。１列目および４列目は、ベースラインおよび６ヶ月時の反応を比較する。２列目および５列目は、６ヶ月および２４ヶ月時の反応を比較する。３列目および６列目は、ベースラインおよび２４ヶ月時の反応を比較する。
【図８Ａ】図８Ａは、初回ＩＦＮ‐β注射時に反応不良な患者における増大したＩＲＧ反応を示す一連のヒストグラム（ヒストグラムは、反応良好群の全患者および反応不良群の全患者における全遺伝子についてプロットする）である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、６ヶ月ＩＦＮ‐β注射時に反応不良な患者における増大したＩＲＧ反応を示す一連のヒストグラム（ヒストグラムは、反応良好群の全患者および反応不良群の全患者における全遺伝子についてプロットする）である。
【図９】図９は、ベースラインＴ２病変容積（ＬＶ）、ベースライン時の最良の２５のＩＲＧ、およびベースラインＴ２病変容積＋最良の２５のＩＲＧに関するＲＯＣ曲線を示すプロットである。ＲＯＣ曲線は、ベースラインにおいて測定される２５のＩＲＧの、６ヶ月後に測定される不良反応を予測する能力を検証し、その予測能力をベースラインＴ２病変容積と比較する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本出願で使用する全ての科学用語および専門用語は、別段の定めがない限り、当該技術分野において一般的に使用される意味を有する。本明細書において提供される定義は、本明細書でしばしば使用されるある特定の用語の理解を促進しようとするものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００１４】
本発明の文脈において、「対照」または「対照試料」という用語は、参照としての役割を果たす任意の対象試料または単離された試料を指すことができる。
【００１５】
本明細書において使用する場合、「ｍＲＮＡ」という用語は、遺伝子の転写産物を指すことができる。転写産物としては、翻訳される状態、ならびに／または転写プロセスのさまざまな段階（例えばスプライシングおよび分解）にある成熟したｍＲＮＡなどのＲＮＡを挙げることができる。
【００１６】
本明細書において使用する場合、「核酸」または「核酸分子」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド鎖を指すことができ、天然のヌクレオチドと同様の方法で機能する自然のヌクレオチドの公知の類似体を包含することができる。
【００１７】
本明細書において使用する場合、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、１つ以上のアミノ酸サブユニットを含む分子を指すことができる。ポリペプチドは、タンパク質全体であることもあり、またはオリゴペプチドもしくはオリゴペプチドなどのタンパク質の断片でもありうる。また、ポリペプチドは、メチル化またはアセチル化などのアミノ酸サブユニットに対する改変を含みうる。
【００１８】
本明細書において使用する場合、「プローブ」という用語は、１つ以上の種類の化学結合、通常は相補的塩基対合を通して相補的な配列の標的核酸に結合することができるオリゴヌクレオチドを指すことができる。例えば、オリゴヌクレオチドプローブは、自然の（すなわち、Ａ、Ｇ、ＣもしくはＴ）または修飾塩基（例えば７デアザグアノシン、イノシンなど）を含みうる。くわえて、オリゴヌクレオチドプローブ中の塩基は、ハイブリダイゼーションを妨げない限り、ホスホジエステル結合以外の結合によって連結されうる。
【００１９】
本明細書において使用する場合、「定量する」という用語は、遺伝子の転写レベルを定量するという文脈において、絶対的または相対的定量を指すことができる。絶対的な定量は、１つ以上の標的核酸（例えば対照核酸）の既知濃度の包含、および未知ハイブリダイゼーション強度を、既知の標的核酸に（例えば標準曲線の作製を通して）参照することによって達成されうる。あるいは、相対的な定量は、２つ以上の遺伝子間または２つ以上の処理間のハイブリダイゼーションシグナルを比較をして、ハイブリダイゼーション強度、および遠まわしには転写レベルにおける変化を定量することによって達成できる。
【００２０】
本明細書において使用する場合、「相対的な遺伝子発現」、または遺伝子に関して「相対的な発現」という用語は、異なる細胞または組織タイプにおける同一の遺伝子発現生成物、通常はｍＲＮＡの相対的な存在量を指すことができる。
【００２１】
本明細書において使用する場合、「対象」という用語は、限定されないが、ヒトおよびヒト以外の動物（例えば、げっ歯類、節足動物、昆虫、魚類）、ヒト以外の霊長類、羊、ウシ、反芻動物、ウサギ、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、鳥類など）を含む任意の動物を指すことができ、対象は特定の診断および／または治療適用の受容者であることができる。
【００２２】
本明細書において使用する場合、「生体試料」という用語は、対象またはその構成要素から得られる身体試料を指すことができる。例えば、身体試料は「臨床試料」、すなわち、対象に由来する試料を含むことができる。そのような試料としては、細胞を含むことも含まないこともある末梢体液、例えば血液、尿、血漿、粘液、膵液胆汁、上澄み液、および血清；組織または細針生検試料；ならびに診断、治療、および／または転帰の既往歴が知られている保存試料が挙げられるが、これらに限定されない。また、身体試料は、組織学的な目的から採取された凍結切片などの組織の切片も含みうる。「生体試料」という用語はまた、身体試料を加工することによって生成された任意の物質を包含することができる。生成された物質としては、生体試料から単離される細胞（もしくはその後代細胞）、試料から抽出したタンパク質、および／または核酸分子が挙げられるが、これらに限定されない。生体試料の加工は、１つ以上のろ過、蒸留、抽出、濃縮、固定、妨害成分の不活化、試薬の添加などを含みうる。
【００２３】
本明細書において使用する場合、「インターフェロン調節遺伝子」または「ＩＲＧ」という用語は、ＩＦＮ‐βなどの少なくとも１つのインターフェロンに曝した際に、その発現が対照と比較して増加または減少する任意の遺伝子またはその変異体を指すことができる。ＩＲＧとしては、例えば表１に列挙されているもの、および当該技術分野において公知である他のもの（例えばＳａｍａｒａｊｉｗａ，  Ｓ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３７：Ｄ８５２−Ｄ８５７，  Ｊａｎ．  ２００９を参照されたい）を挙げることができる。
【００２４】
本明細書において使用する場合、「変異体」という用語は、ＩＲＧに関連して使用するとき、ＩＲＧヌクレオチ配列における任意の改変を指すことができ、エクソン、イントロン、および非翻訳配列を含むコーディングまたは非コーディング領域で生じる変異を含む。変異は、単一ヌクレオチド置換、１つ以上のヌクレオチドの削除、および１つ以上のヌクレオチドの挿入を含むことができる。ＩＲＧ変異体の例は、当該技術分野において公知である（例えば、Ｖｏｓｓｌａｍｂｅｒ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．、「多発性硬化症におけるインターフェロン調節遺伝子５遺伝子変異体、ならびにインターフェロンβ治療の薬理学的および臨床学的成果（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  ５  ｇｅｎｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎβ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）」、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２０１１年４月７日、オンラインにて発表；ならびにＢａｒａｎｚｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  １５：７６７，  ２００９を参照されたい）。
【００２５】
本発明は、一般には、多発性硬化症（ＭＳ）をもつ対象における治療反応を予測する方法に関し、より具体的には、差異的に発現された遺伝子マーカーに基づいて、ＭＳをもつ対象におけるインターフェロンベータ（ＩＦＮ‐β）治療に対する反応を予測する方法に関する。本発明は、インターフェロン調節遺伝子（ＩＲＧ）の発現が、定性的（すなわち、調節されるＩＲＧが何であるか）および定量的（すなわち、調節されるＩＲＧの数、および誘導または抑制の度合い）に、ＭＳをもつ対象の小集団（ｓｕｂｓｅｔ）において異なるという発見に基づいている。特に、予想外の発見であったのは、反応不良な者として分類されていたＭＳをもつ対象が、初回および６ヶ月時ＩＦＮ‐β注射の後に、著しく増大した分子反応（すなわち、遺伝子発現の増加および減少）を示したことであった。この発見に基づいて、本発明は、ＭＳをもつ対象におけるＩＦＮ‐β治療の有効性を決定する方法、ＭＳをもつ対象がＩＦＮ‐β以外の治療薬で治療されるべきかどうかを決定する方法、ＭＳを治療するのに使用することができる薬剤をスクリーニングする方法、およびＭＳをもつ対象を治療する方法を提供する。
【００２６】
ＭＳ発症の機序に関する提案は、獲得免疫、特にミエリンを構成する物質に対して向けられた免疫反応に注目してきた。上記で述べたように予想外にも、反応不良な者たる状態に向かう運命にあったＩＦＮ‐β受容者は、すでに高いレベルの疾患活動を有し、病気に苦しんでいることが発見された。理論に拘束される訳ではないが、Ｉ型ＩＦＮに対する反応の増加は、ＭＳをもつ対象の小集団（ｓｕｂｓｅｔ）の（すなわち、反応不良な者）における自己免疫発症を押し進める自然免疫プロセスに伴って起こると考えられる。よって、Ｉ型ＩＦＮ経路内か、または間接的にＩＲＧの発現レベルに影響するかのいずれかの、自然免疫における差異は、反応不良な者における疾患の重症度の増強の決定要因であると考えられる。
【００２７】
図１は、本発明の１つの態様に従って、ＭＳをもつ対象におけるＩＦＮ‐β治療の有効性を決定する方法１０を説明する流れ図である。方法１０は、ＭＳをもつ対象から生体試料を採取する工程（工程１２）；生体試料から少なくとも１つの核酸を単離する工程（工程１４）；少なくとも１つのＩＲＧおよび／またはその変異体の発現レベルを決定する工程（工程１６）；および測定された遺伝子発現レベルを分析し、対象がＩＦＮ‐β治療に対して反応不良であろうかどうか決定する工程（工程１８）を含むことができる。随意に、方法１０は、生体試料を採取する前に、ＩＦＮ‐βの投与量を、ＭＳをもつ対象に投与することを含むことができる（工程２０）。
【００２８】
「多発性硬化症」または「ＭＳ」という用語は、本明細書において使用する場合、脳および脊髄の軸索のまわりにある脂肪質の髄鞘が損傷を受け、脱髄および瘢痕化が生じる疾患を含むことができる。ＭＳは多くのサブタイプを含むことができ、対象はいずれか１つを罹患しうる。ＭＳサブタイプとしては、例えば、良性ＭＳ、休止（ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ）再発寛解型ＭＳ、活動性（ａｃｔｉｖｅ）再発寛解型ＭＳ、一次進行型ＭＳ、および二次進行型ＭＳが挙げられる。再発寛解型ＭＳは、特徴がはっきりした急性の発作と、発作と発作の間に完全または部分的な回復が有って疾患の進行がないことを特徴とするＭＳの臨床経過を含むことができる。一次進行型ＭＳは、初期に寛解なしに進行する形で症状を呈するＭＳの臨床経過を含むことができる。二次進行型ＭＳは、初期には再発寛解を経て、その後、一時的な再発および軽度の寛解を伴いながら、さまざまな進行の速さで進行性になるＭＳの臨床経過を含むことができる。進行性再発性ＭＳは、発症から進行性で、再発によって時折中断されるＭＳの臨床経過を含むことができる。典型的には、再発直後にかなり回復するが、再発と再発の間に疾患進行が徐々に悪くなることがある。
【００２９】
図１を参照して、少なくとも１つの生体試料を、ＭＳをもつ対象から工程１２において採取することができる。「生体試料」という用語は、本明細書において広い意味において使用され、対象に由来する任意の臨床試料を含むことができる。生体試料としては、例えば、末梢体液、組織または細針生検試料；ならびに診断、治療、および／または転帰の既往歴が知られている保存試料が挙げられるが、これらに限定されない。また、生体試料は、組織学的な目的から採取された凍結切片などの組織の切片、および試料を加工することによって生成された任意の物質を含みうる。本発明１つの例では、生体試料は、注射針を使用して、ＭＳをもつ対象の静脈から採取した全血試料を含むことができる。
【００３０】
工程１４において、少なくとも１つの核酸を、生体試料から単離することができる。核酸は、多くの公知の方法のいずれかに従って生体試料から単離することができる。遺伝子のコピー数の変化が検出されることになっている場合、ゲノムＤＮＡが単離されることを当業者なら理解するであろう。遺伝子発現レベルの検出が望まれるとき、ＲＮＡ（すなわち、ｍＲＮＡ）を単離することができる。ｍＲＮＡなどの核酸を単離する方法は、当業者に周知である（例えば「生化学および分子生物学における実験技法：核酸プローブとのハイブリダイゼ―ション、第Ｉ部、核酸調製の理論（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｐａｒｔ  Ｉ．  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）」、Ｐ．  Ｔｉｊｓｓｅｎ，  ｅｄ．  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、  Ｎ．Ｙ．  （１９９３）の第３章を参照されたい）。
【００３１】
本発明の１つの例では、ＲＮＡは、ＰＡＸＧＥＮＥ  ＲＮＡ血液抽出キット（ＰＲＥＡＮＡＬＹＴＩＸ、スイス）などの市販のキットを使用して全血試料から生体外で単離することができる。簡潔に言えば、少なくとも１つの全血試料を、ＭＳをもつ対象から採取し、次いで試験管（例えばＲＮａｓｅを含まないチューブ）に集めることができる。精製は遠心分離工程で始まり、チューブに細胞を沈殿させる。次に、ペレットを、洗浄、懸濁し、最適化されたバッファー（プロテイナーゼＫと共に）中でインキュベーションし、タンパク質の消化を促進することができる。遠心分離工程をさらに実施し、細胞溶解物を均一にし、余剰の細胞残屑を除去することができる。次に、フロースルー画分の上澄みを、新しい微小遠心管に移すことができる。次に、エタノールを加えて結合条件を調整し、続いて溶解物をスピンカラムに加えることができる。短時間の遠心分離の間、ＲＮＡは、スピンカラムの膜に選択的に結合することができ、一方で不純物は通り抜ける。次に、残っている不純物を、数回の効率的な洗浄工程で除去することができる。第一および第二洗浄工程の間、例えば、膜をＤＮａｓｅ  Ｉで処理し、結合した微量のＤＮＡを除去しうる。洗浄工程後、ＲＮＡは、溶出バッファーで溶出され、熱変性されうる。次に、ＲＮＡの質および量は、（例えば、スペクトロスコピーによって）評価することができ、アガロースゲル電気泳動によってさらに視覚化される。
【００３２】
工程１６において、少なくとも１つのＩＲＧおよび／またはその変異体の発現レベルを、生体試料から単離された核酸から決定することができる。本発明の１つの例では、表１に列挙されている、少なくとも１つのＩＲＧおよび／またはその変異体の発現レベル（例えば約４つのＩＲＧおよび／またはその変異体）を、生体試料から単離された核酸から決定することができる。本発明の別の例では、表３に列挙されている、少なくとも１つのＩＲＧおよび／またはその変異体の発現レベル（例えば約４つのＩＲＧおよび／またはその変異体）を、生体試料から単離された核酸から決定することができる。１つの遺伝子または複数の遺伝子発現レベル（およびそれによる転写レベル）の測定には、１つの遺伝子または複数の遺伝子のｍＲＮＡ転写産物を含む核酸試料、またはｍＲＮＡ転写産物に由来する核酸を提供することが望ましいことを当業者なら理解するであろう。本明細書において使用する場合、ｍＲＮＡ転写産物に由来する核酸は、その合成についてｍＲＮＡ転写産物（またはその部分配列）が最終的に鋳型としての役割を果たす核酸を含むことができる。よって、ｍＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡ、ｃＤＮＡから転写されるＲＮＡ、ｃＤＮＡから増幅されるＤＮＡ、増幅されたＤＮＡから転写されるＲＮＡなどが、ｍＲＮＡ転写産物から生成されることができ、そのような派生生成物の検出は、試料中の元の転写産物の存在および／または豊かさの指標となりうる。
【００３３】
遺伝子発現レベルおよび／または活性を検出する方法は、当該技術分野において公知である。ＲＮＡを検出する方法の非限定的な例としては、例えば、ノーザンブロット分析、ＲＴ‐ＰＣＲ、ＲＮＡインサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡプローブを使用して試料中に存在するＲＮＡ分子をハイブリダイゼーションする）、インサイチュＲＴ‐ＰＣＲ、およびオリゴヌクレオチドマイクロアレイ（例えば、試料に由来するポリヌクレオチド配列の、基質の結合したオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによる）を挙げることができる。
【００３４】
本発明の１つの例では、マクロアレイが使用され、少なくとも１つのＩＲＧおよび／またはその変異体の発現レベルを検出することができる。マクロアレイは、検出されるべき発現された核酸に特異的にハイブリダイゼーションする多くのテストプローブ、および、随意に１つ以上の対照プローブを含むことができることを当業者なら理解するであろう。テストプローブは、サイズに幅があり（例えば、約５〜５０ヌクレオチド）、その発現が検出されることが望まれる遺伝子の特定の部分配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを含むことができる。よって、テストプローブは、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションすることができうる。マクロアレイの一部として含まれうる対照プローブとしては、例えば、正規化対照、発現レベル対照、およびミスマッチ対照を挙げることができる。
【００３５】
本発明の別の例では、実施例２（下記）に記載のマクロアレイが使用され、表１に列挙されている、少なくとも約４の遺伝子の発現レベルを検出することができる。少なくとも約４つの遺伝子（例えば、４つの遺伝子）の発現レベルを検出することは、幾つかの理由から有利でありうる。定量的テスト（例えば、ｑＰＣＲ）を行うには、例えば、多重アレイでの限られた数の遺伝子の選択が、多重アレイにおける実用的な理由（例えば、容積および必要な試薬の数など）から有用でありうる。くわえて、少なくとも約４つの遺伝子の選択が行われ、本発明のランダムフォレストモデルを使用して判別能（すなわちＲＯＣ曲線下面積）を最適化することができる。
【００３６】
マクロアレイを含むＩＲＧは、約１６６のヒトｃＤＮＡによって提示されうる。簡潔に言えば、マクロアレイ膜上へのＤＮＡスポッティング、プローブ標識、およびハイブリダイゼーションに関するプロトコールは、約５μｇの全ＲＮＡを全血から生体外で単離することによって始めることができる。次に、ｃＤＮＡプローブは、３２Ｐ  ｄＣＴＰの存在下でＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  ＩＩ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、カールズバッド、カリフォルニア州）を使用した逆転写によって生成することができる。残りのＲＮＡは、約７０℃で約２０分間アルカリ処理によって加水分解し、その後ｃＤＮＡはＧ５０カラム（ＧＥヘルスケア社、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ‐ｓｈｉｒｅ、英国）を使用して精製することができる。次に、プローブを、約１０ミリリットルのハイブリダイゼーションバッファー中でマクロアレイ膜に一晩ハイブリダイゼーションし、続いて低ストリンジェンシーバッファーおよび高ストリンジェンシーバッファーで洗浄することができる。次に、マクロアレイを、増感蛍光スクリーンに約２日間曝し、続いてＳＴＯＲＭＩＭＡＧＥＲ（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＤＹＮＡＭＩＣＳ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、カリフォルニア州）でスキャンすることができる。
【００３７】
先行技術の方法は、高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて、ＩＦＮ‐βによって調節される遺伝子を特徴付けることが非常に多い。そのような方法は、新規のＩＦＮ‐β調節遺伝子を同定するのには有用でありうるが、結果を定量することは容易ではないので、その技法は、長期的、差異的なＩＲＧ調節の分析にはあまり適していない。先行技術の高密度マイクロアレイと違って、本発明のマクロアレイは、他の疾患指標（例えば、Ｃ型肝炎ウイルスに対するＩＦＮ‐α治療）用のマクロアレイを実証し、再現可能で、感度が高く、定量的であることが確認されたこれまでのマイクロアレイ実験（例えば、Ｓｃｈｌａａｋ，  Ｊ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７：４９４２８−４９４３７，  ２００２；およびＲａｎｉ，  Ｍ．Ｒ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  １１８２：５８−６８，  ２００９を参照のこと）から選択された約１６６のＩＲＧを含むことができる。有利には、本発明のマクロアレイによって検出可能な比較的少数の遺伝子は、ＩＦＮ‐β調節遺伝子発現を評価するための集中的、定量的アッセイを提供する。
【００３８】
工程１８において、測定された遺伝子発現レベルを分析し、ＩＦＮ‐β治療の有効性を決定することができる。例えば、遺伝子発現の測定レベルを、対照（例えば、１つ以上のＭＳの無い対象）の遺伝子発現レベルと比較することができる。本発明の１つの例では、表１に列挙されている、少なくとも約４つの遺伝子および／またはその変異体の発現レベルの、対照と比較しての増加または減少が、対象がＩＦＮ‐β治療に反応不良であろうことを示しうる。遺伝子発現のレベルの増加または減少を示現することに加えて、反応不良な者はまた、治療にもかかわらず断続的な神経機能の低下を示す可能性がある。ＭＳをもつ対象おける神経機能の低下を評価する方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、定量的ＭＲＩ分析、総合障害度評価尺度（Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ  Ｓｔａｔｕｓ  Ｓｃａｌｅ（ＥＤＳＳ））（例えば、少なくとも約０．５のＥＤＳＳスコアの増加が神経機能の低下の指標となりうる）、および多発性硬化症機能複合評価（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）を挙げることができる。
【００３９】
本発明の別の例では、以下の遺伝子および／またはその変異体の少なくとも１つ（例えば、約４つ）の発現レベルの（対照と比較した）増加または減少が、対象がＩＦＮ‐β治療に対して反応不良であろうことを示しうる：
２‐５ＯＡＳ；アダプチン；Ａｋｔ‐２；ＡＰＯＬ３；ＡＴＦ２；Ｂａｄ；Ｂｃｌ‐２；ＢＳＴ２；Ｃ１‐ＩＮＨ；Ｃ１ｏｒｆ２９；Ｃ１ｒ；Ｃ１Ｓ；カスパーゼ１；カスパーゼ７；カスパーゼ９；ＣＣＲ１；ＣＤ３ｅ；ＣＥＡＣＡＭ；ｃ‐ｍｙｃ；ＣＯＭＴ；ＣＲＥＢ；ＣＸＣＬ１１；ＣＸＣＲ４；ＣＹＢ５６；ＤＤＸ１７；Ｄｅｆ‐ａ３；エラスターゼ２；Ｆａｓ‐Ｌ；ＦＫ５０６；ＦＬＪ２００３５；Ｇ１Ｐ３；Ｇａｄｄ４５；ＧＡＴＡ３；ＧＢＰ２；ＨＬＡＤＰ；ＨＬＡＤＲＡ；Ｈｏｕ；ＨＰＡＳＴ；Ｈｓｆ１；Ｈｓｐ９０；ＩＤＯ；ＩＦＩ１６；ＩＦＩ１７；ＩＦＮ‐４４；ＩＦＩ６０；ＩＦＩＴ１；ＩＦＩＴ２；ＩＦＩＴ５；ＩＦＩＴＭ２；ＩＦＩＴＭ３；ＩＦＮ‐１７；ＩＦＮＡＲ１；ＩＦＮＡＲ２；ＩＦＮＧＲ１；ＩＦＮＧＲ２；ＩＬ１５；ＩＬ１８  ＢＰ；ＩＬ１ＲＮ；ＩＬ２；ＩＬ２Ｒｇ；ＩＬ６；Ｉｎｔ‐６；ＩＰ‐１０；ＩＲＦ２；ＩＳＧ１５‐Ｌ；ＩＳＧ２０；ＩＳＧＦ３ｇ；Ｌ１ＣＡＭ；ＭＡＰ２Ｋ３；ＭＡＰ２Ｋ４；ＭＡＰ３Ｋ１４；ＭＡＰ３Ｋ３；ＭＡＰ３Ｋ４；ＭＡＰ３Ｋ７；ＭＡＰ４Ｋ１；ＭＡＰＫ１３；ＭＡＰＫ７；Ｍｅｔ‐ｏｎｃｏ；ＭＭＰ‐１；ＭＭＰ‐９；ＭＴ１Ｈ；ＭＴ１Ｘ；ＭＴ２Ａ；ＭＸ１；ＮＦ‐ＩＬ‐６；ＮＦκＢ；ＮＭＩ；ＮＴ５ｅ；ＯＡＳＬ；Ｐ４ＨＡ１；ｐ５３；ｐ５７Ｋｉｐ２；ＰＡＩ‐１；ＰＤＫ１；ＰＤＫ２；ＰＩ３Ｋ；ＰＫＲ；プレクチン；ＰＬＳＣＲ１；ＰＳＭＢ９；ＲＣＮＩ；ＲＧＳ２；ＲＨＯ  ＧＤＰ；ＲＩＧ‐１；セルピン；ＳＮＮ；ＳＯＣＳ‐１；ＳＴＡＴ１；ＳＴＡＴ２；ＳＴＡＴ４；ＴＦＥＣ；ＴＧＦｂＲ２；ＴＧＦｂＲ３；ＴＩＭＰ‐１；ＴＮＦ‐α；ＴＮＦＡＩＰ６；ＴＯＲ１Ｂ；ＴＲＡＩＬ；ＵＢＥ２Ｌ６；ＵＳＰ１８；ＶｅｇＦＣ；ビペリン（Ｖｉｐｅｒｉｎ）；およびＷＡＲＳ。
【００４０】
本発明の別の例では、以下の遺伝子および／またはその変異体の少なくとも１つ（例えば、約４つ）の発現レベルの（対照と比較した）増加または減少が、対象がＩＦＮ‐β治療に対して反応不良であろうことを示しうる：ＴＲＡＩＬ；ＲＩＧ‐１；２‐５ＯＡＳ；ＳＴＡＴ１；ＰＩ３‐キナーゼ；ＩＬ‐１５；ＩＰ‐１０；ＭＭＰ‐１；Ｐ４ＨＡ１；カスパーゼ７；ＰＤＫ２；ＡＴＦ‐２；ＴＮＦ‐α；ＲＧＳ２；ＳＮＮ；ｈｓｐ９０；ｃ‐ｍｙｃ；Ａ１‐ＡＴ；ＨＬＡ‐ＤＲＡ；ＣＯＭＴ；ＮＦκＢ；ＨＬＡ‐ＤＰ；ＴＩＭＰ‐１；ＣＸＣＲ４；およびＩＬ‐２。
【００４１】
本発明の別の例では、以下の遺伝子および／またはその変異体の少なくとも１つ（例えば、約４つ）の発現レベルの（対照と比較した）増加が、対象がＩＦＮ‐β治療に対して反応不良であろうことを示しうる：ＴＲＡＩＬ；ＲＩＧ‐１；２‐５ＯＡＳ；ＳＴＡＴ１；ＰＩ３‐キナーゼ；ＩＬ‐１５；ＩＰ‐１０；ＭＭＰ‐１；Ｐ４ＨＡ１；カスパーゼ７；ＰＤＫ２；ＡＴＦ‐２；ＴＮＦ‐α；およびＲＧＳ２。
【００４２】
本発明の別の例では、以下の遺伝子および／またはその変異体の少なくとも１つ（例えば、約４つ）の発現レベルの（対照と比較した）減少が、対象がＩＦＮ‐β治療に対して反応不良であろうことを示しうる：ＳＮＮ；ｈｓｐ９０；ｃ‐ｍｙｃ；Ａ１‐ＡＴ；ＨＬＡ‐ＤＲＡ；ＣＯＭＴ；ＮＦκＢ；ＨＬＡ‐ＤＰ；ＴＩＭＰ‐１；ＣＸＣＲ４；およびＩＬ‐２。
【００４３】
本発明の別の態様は、ＭＳをもつ対象がＩＦＮ‐β以外の治療薬で治療されるべきか否かを決定することを含むことができる。例えば、ＭＳをもつ対象が、少なくとも１つのＩＲＧおよび／またはその変異体（例えば表１に列挙された少なくとも約４つの遺伝子）の発現レベルが、対照と比較して増加または減少しているとき、その対象をＩＦＮ‐β以外の治療薬で治療することができる。ＩＦＮ‐β以外のＭＳ治療は、当該技術分野において公知であり、例えば、酢酸グラチラマー、ミトキサントロン、およびナタリズマブ、ならびに代替療法（例えばビタミンＤ）を挙げることができる。他のＭＳ治療としては、アレムツズマブ、ダクリズマブ、イノシン、ＢＧ０００１２、フィンゴリモド、ラキニモド、およびニューロバクス（ＮＥＵＲＯＶＡＸ）などの現在のところＭＳ治療の臨床研究下にあるものを挙げることができる。以下に、本発明に従って、ＭＳをもつ対象を治療する方法をより詳細に記載する。
【００４４】
工程２０において、方法１０は、生体試料を採取する前に、ＭＳをもつ対象にＩＦＮ‐βの投与量を投与することを随意に含むことができる。ＩＦＮ‐βの投与量は、単一製剤として送達されることができ、それは遺伝子発現測定（すなわち、工程１６における）でのノイズを減らしうる。ＭＳをもつ対象に投与することができる投与量のＩＦＮ‐βとしては、例えば、ＩＦＮ‐β１ａ（例えば、ＡＶＯＮＥＸ、ＲＥＢＩＦ）およびＩＦＮ‐β１ｂ（例えば、ＢＥＴＡＳＥＲＯＮ、ＥＸＴＡＶＩＡ）が挙げられる。ＩＦＮ‐βの投与量は、血管内注射などの任意の公知の経路を通して投与することができる。
【００４５】
対象へのＩＦＮ‐β投与量の投与に続いて、少なくとも１つの生体試料を、採取することができる（上記）。生体試料を、１つ以上の時点で採取することができる。例えば、全血試料を、ＭＳをもつ対象からＩＦＮ‐β投与量の投与の約１２時間後に採取することができる。ＩＦＮ‐βのさらなる投与量を、初回ＩＦＮ‐β投与に続いて対象に投与することができることが理解されるべきである。例えば、初回ＩＦＮ‐βの投与量を対象に投与し、続いて初回投与後約１２時間後に生体試料を集め、次に約６ヶ月時に第二のＩＦＮ‐βの投与、同様にそれに続いて生体試料を集める。生体試料を採取した後、少なくとも１つの核酸を、試料から単離することができる（上記）。やはり上記で記載されたように、少なくとも１つのＩＲＧおよび／またはその変異体の発現のレベルが、例えば、マクロアレイを使用して決定される。
【００４６】
少なくとも１つのＩＲＧおよび／またはその変異体の発現レベルが決定されると、発現レベルを分析することができる（上記）。例えば、遺伝子発現の測定されたレベルを、対照の遺伝子発現レベルと比較することができる。対照は、１つ以上のＭＳをもたない対象から単離するか、ＩＦＮ‐βで治療されたことのない対象から採取するか、またはＩＦＮ‐βでの治療前に対象から取ることができる。例えば、表１に列挙されている、少なくとも約４つの遺伝子おいて、測定された遺伝子発現のレベルが、（対照と比較して）増加または減少している場合、対象はＩＦＮ‐β治療に対して反応不良でありうる。
【００４７】
ＩＦＮ‐βは、ＭＳに対する最も一般的に使用される疾患修飾性治療であるにもかかわらず、その作用機序はよく分かっておらず、個人に合わせた治療の指針となることができる生物学的マーカーはない。ＭＳをもつ対象におけるＩＦＮ‐β注射に対する増大した分子反応が、自然免疫応答が発病を押し進める対象の小集団（ｓｕｂｓｅｔ）に対するマーカーであるという発見に基づいて、本発明は、ＩＦＮ‐β治療に対して反応不良な者たる状態に運命付けられた少数の対象を特定する方法１０を、有利に提供する。それにより、以下でより詳細に述べるように、本発明は、ＭＳをもつ個々の対象に合わせて疾患修飾性治療を調整することができる。
【００４８】
図２は、ＭＳを治療するのに使用することができる薬剤をスクリーニングする方法３０を含む本発明の別の態様を説明する。方法３０は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団をＭＳをもつ対象から準備する工程（工程３２）；薬剤をＰＢＭＣに投与する工程（工程３４）；少なくとも１つの核酸をＰＢＭＣから単離する工程（工程３６）；少なくとも１つのＩＲＧおよび／またはその変異体の遺伝子発現レベルを決定する工程（工程３８）；および測定された遺伝子発現レベルを分析する工程（工程４０）を含むことができる。
【００４９】
工程３２において、ＰＢＭＣの集団は、ＭＳを有し、ＩＦＮ‐β治療に対して反応不良な者である対象から採取することができる。対象が反応不良な者であるか否かの決定は、上記の方法１０に従って行うことができる。例えば、少なくとも１つのＩＲＧおよび／またはその変異体（例えば、表１に列挙された約４つの遺伝子）の発現レベルが対照と比較して増加または減少している、ＭＳをもつ対象は、反応不良な者として特徴付けられうる。当業者なら、ＰＢＭＣを単離する方法が幾つかあることを理解するであろう。例えば、ＰＢＭＣを、全血試料からさまざまな密度勾配遠心分離手順を使用して単離することができる。典型的には、抗凝固処理全血を、分離媒質の上に重ね、次に遠心分離することができる。遠心分離工程の終了時に、数重の層を視覚的に観察することができ、（上から下へ）血漿／血小板；ＰＢＭＣ；分離媒質；および赤血球／顆粒球である。ＰＢＭＣ層を取り出し、洗浄し、不純物（例えば、赤血球）を取り除くことができる。洗浄後、細胞タイプおよび細胞の生存を、当該技術分野において公知の方法を使用して確認することができる。次に、ＰＢＭＣを、実質的にコンフルエントな細胞層を増進するのに十分な期間および条件下において生体外で培養することができる。
【００５０】
工程３４において、少なくとも１つの薬剤をＰＢＭＣの集団に投与することができる。ＰＢＭＣの集団に投与されうる薬剤は、ＭＳ治療用の候補でありうる任意の生体部分（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｏｉｅｔｙ）、化合物、または薬物を含むことができる。そのような薬剤としては、例えば、生物製剤、医薬化合物、ポリペプチド、タンパク質、核酸、および低分子を挙げることができる。
【００５１】
工程３６において、少なくとも１つの核酸を、ＰＢＭＣの集団から単離することができる。核酸を細胞集団から単離する方法は、当該技術分野において公知である。例えば、ＲＮＡは、ＰＢＭＣの集団から公知のＲＮＡ抽出アッセイを使用して単離することができる。
【００５２】
上記のように、少なくとも１つのＩＲＧおよび／またはその変異体（例えば、表１に列挙された約４つの遺伝子）発現のレベルを、工程３８において決定することができる。例えば、マクロアレイを使用し、遺伝子発現レベルを検出することができる。
【００５３】
少なくとも１つのＩＲＧおよび／またはその変異体（例えば、表１に列挙された約４つの遺伝子）の発現のレベルが決定されると、測定された発現レベルを、工程４０において分析することができる（上記）。例えば、遺伝子発現の測定レベルを、対照の遺伝子発現レベルと比較することができる。遺伝子発現の測定レベルが、（対照と比較して）増加または減少している場合、投与された薬剤は、ＭＳ治療用の候補ではありうることはない。逆に、遺伝子発現のレベルが、（対照と比較して）増加または減少していない場合、投与された薬剤は、ＭＳ治療用の候補でありうる。
【００５４】
図３は、ＭＳをもつ対象を治療する方法５０を含む本発明の別の態様を説明する。方法５０は、ＭＳをもつ対象から生体試料を採取する工程（工程５２）；生体試料から少なくとも１つの核酸を単離する工程（工程５４）；少なくとも１つのＩＲＧおよび／またはその変異体の発現レベルを決定する工程（工程５６）；測定された遺伝子発現レベルを分析する工程（工程５８）；および少なくとも１つの薬剤を対象に投与する工程（工程６０）を含むことができる。随意に、方法５０は、生体試料を採取する前に、ＩＦＮ‐βの投与量をＭＳをもつ対象に投与することを含むことができる（工程６２）。
【００５５】
工程５２において、少なくとも１つの生体試料を、ＭＳをもつ対象から採取することができる。上記のように、例えば、生体試料は注射針を使用して対象の静脈から採取した全血試料を含むことができる。
【００５６】
工程５４において、少なくとも１つの核酸を、生体試料から単離することができる（上記）。例えば、ＲＮＡは、全血試料からＰＡＸＧＥＮＥ  ＲＮＡ血液抽出キットを使用して単離することができる。
【００５７】
次に、少なくとも１つのＩＲＧおよび／またはその変異体の発現のレベルを、工程５６で決定することができる。上記のように、例えば、ハイブリダイゼーションされたマクロアレイを使用して、表１に列挙されている、少なくとも約４つの遺伝子における遺伝子発現レベルを検出することができる。
【００５８】
少なくとも１つのＩＲＧおよび／またはその変異体の発現レベルが決定されると、測定された遺伝子発現レベルを、工程５８において分析することができる（上記）。例えば、遺伝子発現の測定レベルを、対照の遺伝子発現レベルと比較することができる。遺伝子発現の測定レベルが、（対照と比較して）増加または減少している場合、対象は、ＩＦＮ‐β治療に対して反応不良な者でありうる。逆に、遺伝子発現のレベルが、（対照と比較して）増加または減少していない場合、対象は、ＩＦＮ‐β治療の候補対象者でありうる。
【００５９】
工程６０において、少なくとも１つの薬剤の治療上有効な量を、対象に投与することができる。対象に投与される特定の薬剤は、対象のそれまでに決定された反応者たる状態に依存することになるであろう。例えば、対象が反応不良な者である場合、ナタリズマブなどのＩＦＮ‐β以外の薬剤の治療上有効な量を、対象に投与することができる。逆に、対象が反応不良な者である場合、ＩＦＮ‐βなどの薬剤の治療上有効な量を、対象に投与することができる。治療のタイプ、投与量、スケジュール、および治療の継続期間は、病状の重症度および／または対象の予後に応じて変えることができることが理解されよう。当業者は、投与量、スケジュール、および治療の継続期間とともに治療のタイプを調整することができる。方法５０は、ＭＳをもつ対象を不要な薬剤に曝すことなく治療するための投薬計画を有利に提供し、そしてそれは、医療制度にとって不要なコストを省くという点で非常に有益でありうる。
【００６０】
また、方法５０は、工程６２における生体試料（上記で論じたように）を採取する前に、ＩＦＮ‐βの投与量をＭＳをもつ対象に投与する工程を随意に含むことができることが理解されよう。
【００６１】
さらに、本発明は、方法１０、３０、および５０の一部として、タンパク質またはポリペプチド単離および検出技法を代替的に含むことができることが理解されよう。例えば、公知の技法が使用されて、本発明のＩＲＧおよび／またはその変異体によってコーディングされるタンパク質、ポリペプチド、および／またはその変異体を単離および検出することができる。そうするには、生体試料を、ＭＳをもつ対象から採取することができる（上記）。次に、生体試料を、本発明のＩＲＧおよび／またはその変異体によってコーディングされるタンパク質、ポリペプチド、および／またはその変異体を単離する公知の技法に供することができる。例えば、タンパク質精製プロトコール（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９６）を参照されたい。次に、単離したタンパク質、ポリペプチド、および／またはその変異体は、タンパク質マイクロアレイ、免疫染色、免疫沈降、電気泳動（例えば、２Ｄまたは３Ｄ）、ウェスタンブロット、分光測定、およびＢＣＡアッセイなどの公知の技法の１つまたは組み合わせを使用して検出することができる。タンパク質、ポリペプチド、および／またはその変異体の検出に続いて、タンパク質、ポリペプチド、および／またはその変異体レベルを分析することができる。タンパク質、ポリペプチド、および／またはその変異体のレベルが、（対照試料と比較して）増加または減少している場合、その対象は、ＩＦＮ‐β治療に対して反応不良な者でありうる。逆に、タンパク質、ポリペプチド、および／またはその変異体のレベルが、（対照試料と比較して）増加または減少していない場合、その対象は、ＩＦＮ‐β治療の候補対象者でありうる。
【００６２】
以下の実施例は、例示の目的のためにすぎず、本明細書に添付されている請求項の範囲を限定することを意図しない。
【実施例１】
【００６３】
方法
臨床プロトコール
クリーブランドクリニック（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃ（ＣＣ））治験審査委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ）は、本試験を認可した。全対象に書面の同意書を提供した。対象は、最初のエピソードからなる症候群（ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＣＩＳ）または再発寛解型ＭＳを有し、筋肉内ＩＦＮ‐β‐１ａ治療を開始し、それまでは治療未経験者であり、ＣＣ  ＭＳセンターで追跡調査を受ける場合に参加可能であった。９９名の対象が参加した。患者は各々、ベースライン、６、１２、および２４ヶ月時に検査を受けた。３および１８ヶ月時には、患者に電話で連絡して、治療コンプライアンスを評価し副作用を確認した。ベースライン受診、６、および２４ヶ月時には、ＩＦＮ‐β注射の直前および正確に１２時間後に、臨床研究ユニットでＩＲＧ分析用に血液が採取され、病変および脳萎縮の定量的評価のため、患者は標準化脳ＭＲＩスキャンを受けた。毎回の受診で、患者は、Ｋｕｒｔｚｋｅ総合障害評価尺度（Ｋｕｒｔｚｋｅ  Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ  Ｓｃａｌｅ  Ｓｃｏｒｅ）（Ｋｕｒｔｚｋｅ，  Ｊ．Ｆ．，  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ３３：１４４４  １４５２，  １９８３）、多発性硬化症機能複合評価スコア（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ｓｃｏｒｅ）（Ｒｕｄｉｃｋ，  Ｒ．Ａ．    ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｕｌｔ．  Ｓｃｌｅｒ．  ８：３５９−３６５，  ２００２）、および再発または併発する疾病の既往歴を判定するのに神経学的検査を受け、また患者は構造的質問票（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ）をわたされ、インフルエンザ様症状、筋肉痛、悪寒、疲労、頭痛、および体力喪失を明らかにした。６および２４ヶ月時には、血清をＩＦＮ中和抗体について検査した。
【００６４】
ＭＲＩ分析
ＭＲＩで得られるものは、標準的な投与量ガドリニウム（０．１ｍｍｏｌ／ｋｇ）の注入前および注入後に得た、Ｔ２強調水抑制反転回復法（ＦＬＡＩＲ）画像、Ｔ２強調およびプロトン密度強調デュアルエコー（ｄｕａｌ  ｅｃｈｏ）高速スピンエコー画像、およびＴ１強調スピンエコー画像を含んだ。自家開発ソフトウェアを使用して、画像を分析し、脳実質分画（ＢＰＦ）、Ｔ２病変容積、Ｔ１低強度病変容積、ガドリニウム増強病変容積および数、新しいＴ２病変の数、および拡大Ｔ２病変の数を求めた。完全に自動化されたセグメンテーションソフトウェアを使用して、ＦＬＡＩＲ画像からＢＰＦを計算した（Ｒｕｄｉｃｋ，  Ｒ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．  ９３：８−１４，  １９９９）。病変分析方法の詳細は、以前に記載されている（Ｃｏｈｅｎ，  Ｊ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｕｌｔ．  Ｓｃｌｅｒ．  １４：３７０  ３８２，  ２００８）。簡潔に言えば、Ｔ２高強度病変を、自動的にＦＬＡＩＲとＴ２／ＰＤ画像に分割し、対話型ソフトウェアを使用して視覚的に確認して、誤って分類された病変を補正する。６ヶ月時追跡調査画像は、ベースラインに対して記録され、強度が正規化された。ベースラインＴ２病変マスクを、共に記録した６ヶ月時画像に適用し、持続性の病変を特定する。次に、ベースライン画像を記録された正規化６ヶ月時画像から差し引いて、６ヶ月時の新しい拡大Ｔ２病変を自動的に特定した。対話型ソフトウェアを使用して、新しい拡大Ｔ２病変を視覚的に確認し、最終結果を得た。
【００６５】
ＲＮＡ単離
血液からＰＡＸＧＥＮＥ  ＲＮＡ血液抽出キット（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ、スイス）を使用して製造者の取扱説明書の通りに、生体外でＲＮＡを抽出し、エタノール沈殿によって濃縮した。ＲＮＡの質および量を、分光光度法（２８０／２６０ｎｍの吸光度比）、およびさらにアガロースゲル電気泳動で視覚化することによって評価した。ＲＮＡ試料を、−８０℃で保存した。
【００６６】
マクロアレイを使用して分析した遺伝子
ｃＤＮＡマクロアレイ分析についての詳しい手法は、記載のように実行した（Ｓｃｈｌａａｋ，  Ｊ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７，  ４９４２８−４９４３７，  ２００２；  Ｒａｎｉ，  Ｍ．Ｒ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  １１８２：５８−６８，  ２００９）。特注マクロアレイ上のＩＲＧを、Ｕｎｉｇｅｎｅデータベースから選択した１６６のヒトｃＤＮＡによって示した。マクロアレイ上の全遺伝子の名称のリストを、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号とともに、表１に示す。
【００６７】
表１：特注マクロアレイ用に選択した１６６の１型インターフェロン応答遺伝子の名称およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号
【００６８】
【表１】
2013534419.tif 000003
【００６９】
これらのＩ型ＩＦＮ  ＩＲＧは、ＩＦＮ‐αまたはＩＦＮ‐βのいずれかで処置した線維肉腫、上皮または内皮細胞系のマイクロアレイ分析によって同定された（Ｓｃｈｌａａｋ，  Ｊ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７，  ４９４２８−４９４３７，  ２００２；  Ｒａｎｉ，  Ｍ．Ｒ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  １１８２：５８−６８，  ２００９）。遺伝子のすべては、公知のＩＲＧであった。
【００７０】
膜上のＤＮＡスポッティング、プローブ標識およびハイブリダイゼーションのプロトコールは、以下のように、変形とともに、以前に記載されている（Ｓｃｈｌａａｋ，  Ｊ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７，  ４９４２８−４９４３７，  ２００２；  Ｒａｎｉ，  Ｍ．Ｒ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  １１８２：５８−６８，  ２００９）。血液から生体外で単離した全ＲＮＡの５μｇを使用して、３２Ｐ  ｄＣＴＰの存在下でＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  ＩＩ（インビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州）を用いて逆転写することによって放射性標識ｃＤＮＡプローブを作製した。残りのＲＮＡを７０℃で２０分間アルカリ処理によって加水分解し、その後、Ｇ５０カラム（ＧＥヘルスケア社、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ‐ｓｈｉｒｅ、英国）を使用してｃＤＮＡを精製した。マクロアレイおよび放射性ｃＤＮＡのハイブリダイゼーションの調製は、以前に記載されているように行った（Ｓｃｈｌａａｋ，  Ｊ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７，  ４９４２８−４９４３７，  ２００２；  Ｒａｎｉ，  Ｍ．Ｒ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  １１８２：５８−６８，  ２００９）。膜に結合した放射能を定量し、ＩＳＧのＩＲの計算に使用した。
【００７１】
ばらつきを最小限にするために、ベースライン（０ヶ月時）および６ヶ月時の各患者の試料を、単一バッチ（ｓｉｎｇｌｅ  ｂａｔｃｈ）実験（計４つの膜）で処理した。
【００７２】
５つの遺伝子：ＯＡＳＬ（アクセッション番号ＮＭ００３７３３）；ＴＲＡＩＬ（Ｕ３７５１８）；ＩＦＩ４４（Ｄ２８９１５）；ＨＬＡＤＲＡ（Ｊ００１９４）；およびＴＩＭＰ‐１（Ｍ５９９０６）について、リアルタイム定量ＰＣＲを使用して、特注ｃＤＮＡマクロアレイを使用して出した誘導比率（ＩＲ）が正しいことを確認した。ＯＡＳＬ、ＴＲＡＩＬ、ＩＦＩ４４、ＨＬＡＤＲＡ、およびＴＩＭＰ‐１について、ｒｔ‐ＰＣＲとマクロアレイデータとの相関のスピアマン相関係数は、それぞれ、０．９２、０．７５、０．３６、０．７２、および０．５４であった。図４は、ＯＡＳＬについて得られたＩＲおよび相関を示す。
【００７３】
統計的な分析
ＩＦＮ‐βに対する反応不良は、６ヶ月受診時でのＭＲＩをベースラインと比較した定量的ＭＲＩ分析に基づいた。反応不良は、≧３の新しい病変の発生として定義された。反応良好群とＰＲ群のベースライン特徴の違いは、ｔ検定またはフィッシャーの直接確率検定を必要に応じて使用して比較した。ポワソン回帰を使用して、群の違いをベースライン注射時にＩＲが≧２．０である誘導されたＩＲＧの数で検証した。６ヶ月時と比較して最初の注射時のＩＲを変換したピアソンの相関係数のｌｏｇ２を、８５名の患者について計算した。ベースライン、６ヶ月、および２４ヶ月時のペアワイズ相関を、無作為に選んだ１０名の患者について計算した。
【００７４】
ＩＲを変換したｌｏｇ２の母集団およびベースラインＭＲＩを修正した最小二乗平均（ＬＳ平均）を計算し、ＡＮＣＯＶＡによって反応群の間で比較した。共変量は、年齢、性別、ガドリニウム増強病変の存在、およびＴ２容積である。ＩＦＮ−βに対する反応の大きさの全体的な分布に関して群が異なるか否かを調べるために、１６６のＩＲＧのＬＳ平均の密度プロットを群について作成し、ベースラインおよび６ヶ月時ＩＲを治療に反応した者の状態と比較した。ＰＲにおいてより大きい反応を示す（ＬＳ平均：上方制御された遺伝子ではＰＲ＞ＧＲ、または下方制御された遺伝子ではＰＲ＜ＧＲ）遺伝子の確率を、二項確率検定を用いて確率≦０．５の帰無仮説を仮定してテスト（片側）した。
【００７５】
ＩＲＧがＰＲとＧＲを区別しうるか否かをさらに調べるために、不良とＧＲを最も良く区別するベースライン時のＩＲＧを以下のように特定した。まず最初に、単変量的に異なるＩＲＧを選択し、次にランダムフォレスト法（ｒａｎｄｏｍ  ｆｏｒｅｓｔ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を使用して遺伝子を選択し、予測モデルを立てた。１０００のランダムフォレストシュミレーション（ｒａｎｄｏｍ  ｆｏｒｅｓｔ  ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ）から得られた変数重要度のモンテカルロのランク推定の和（ｓｕｍ‐ｏｆ‐ｒａｎｋ  ｅｓｔｉｍａｔｅ）のランクに基づいて、最も良い２５のＩＲＧを選択した。患者をその正しい反応群に分類することにおけるこれらの２５の遺伝子に基づく推定ＲＯＣ曲線を、予測モデルにおけるベースラインＴ２容積の有り無しで比較した。
【００７６】
結果
調査対象
９９名の対象が長期間にわたる試験に加わった。８５名がプロトコールに残り、筋肉内ＩＦＮ‐β‐１ａを少なくとも６ヶ月間受け続けた。予定の６ヶ月時マクロアレイ分析を完了しなかった１４名の患者のうち、１２名がＩＦＮ‐β‐１ａを中断し、他の２名では試料ハイブリダイゼーションが初回または６ヶ月時注射のいずれかで不成功であった。最初の６ヶ月の試験を終えた８５名の患者と、終えなかった１４名との間に、ベースラインの母集団および疾患特徴に著しい違いはなかった（データ示さず）。他の分析すべてについて、最初の６ヶ月を終えた８５名の患者のみが含まれた。これらの８５名中、３２％が複数の脳ＭＲＩ病変のある最初のエピソードからなる症候群（ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ）を有し、６８％が再発寛解型ＭＳを有した。平均年齢は３５．７歳、平均ＭＳ罹病期間は２．４年、６５％が女性、９１％が白人であった。６ヶ月時点で、所定のＭＲＩ定義に基づいて１５名（１８％）の試験対象がＰＲに分類された。表２に、ＰＲ、ＧＲおよび全集団に関するベースライン特徴を列挙する。
【００７７】
表２：ＩＦＮ‐β治療に対して反応良好な患者と反応不良な患者とのベースライン特徴の比較＊
【００７８】
【表２】
2013534419.tif 000004
【００７９】
＊特に指示のない限り、全ての値は平均値±ＳＤである。
ＣＩＳ＝最初のエピソードからなる症候群（ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；
ＲＲＭＳ＝再発寛解型多発性硬化症；
ＥＤＳＳ＝総合障害度評価尺度（Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ  Ｓｃａｌｅ  Ｓｃｏｒｅ）；
ＭＳＦＣ＝多発性硬化症機能複合評価（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）；
Ｇａｄ＝ガドリニウム；
ＢＨ＝低信号病巣（ｂｌａｃｋ  ｈｏｌｅ）；
ＢＰＦ＝脳実質分画（ｂｒａｉｎ  ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）
【００８０】
ＰＲがより高い比率でガドリニウム増強病変をベースライン時に有し、よりＴ２病変容積がより大きかったことを除いて、ベースライン時に２つの群は全特徴において類似していた。
【００８１】
初回注射に対するＩＲＧ反応および経時安定性
ＩＲ＞２．０と定義されたＩＲＧの誘導は、ＩＦＮ‐β注射を受けていない健康な対象でアッセイした際、１２または２４時間隔てたアッセイにおいて１．５倍を超えて変化したＩＲＧを示さなかった。初回ＩＦＮ‐β注射時に誘導されたＩＲＧの数は、７から１３５と患者によって異なり、ＩＦＮ‐β反応者状態と誘導された遺伝子の数との間に関連はなかった（Ｐ＝０．７６）（図５）。同様に、初回ＩＦＮ‐β注射に対する反応のパターンは、患者によって大きく異なった（Ｒａｎｉ，  Ｍ．Ｒ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  １１８２：５８−６８，  ２００９）。
【００８２】
初回ＩＦＮ‐β‐１ａ注射後のＩＲＧ反応のパターンおよび大きさにおける個人間の大きなばらつきにもかかわらず、対象の各々に関して反応は長期間にわたって安定していた。図６は、８５名の全患者について６ヶ月時のＩＲ（ｙ軸）に対してプロットした初回注射時のＩＲ（ｘ軸）を示す。ＩＦＮ‐β注射に対する分子反応は、ほぼすべての患者で非常に安定であった。例外が３つあり、対象７（最上列、左から７番目）および対象２５（第３列、左から１番目）はベースライン投与時にウイルス感染を患っていたので、高い注射前ＩＲＧ発現レベルのために初回注射時に、ＩＲＧ誘導はほとんどまたは全くなかった。両対象は、６ヶ月時ＩＦＮ‐β注射には反応した。対象２１（第２列、左から９番目）では、ＩＦＮ‐βに対する高い力価の中和抗体が生じ、６ヶ月時に検出された。対象２１は、初回ＩＦＮ‐β注射に活発に反応したが、６ヶ月時は最小限であった。その他の対象の中和抗体試験はすべて、６ヶ月時に陰性であった。
【００８３】
その３名の対象を除いて、個々の患者で、初回注射時のＩＲは６ヶ月時のＩＲと強く相関した（ピアソンの相関係数平均値（±ＳＤ）＝０．８１±０．１１）。６７名のＧＲ患者（対象７、２１、２５を除く）の平均の０．８１±０．１１に比べて、１５名のＰＲ対象の平均相関係数（試験番号１、４、１２、１４、１８、４０、４９、５７、６２、６５、６６、７０、８７、９１、および９２）は、０．８１±０．１０であった。
【００８４】
無作為に選択した１０名の患者（ＰＲ５名およびＧＲ５名）について、ＩＲＧ分析を２４ヶ月時に繰り返した（図７）。これらの１０名の対象について、ベースラインと６ヶ月時との間（ｒ＝０．８６）、６ヶ月時と２４ヶ月時との間（ｒ＝０．８２）、およびベースラインと２４ヶ月時（ｒ＝０．８５）との間で、ＩＲは強く相関していた。相関係数は、５名のＰＲおよび５名のＧＲで類似していた。
【００８５】
これらの結果は、ＰＲ状態がＩＦＮ‐βに対する分子反応の大きさ（図５）または時間にともなうＩＦＮ‐βに対する分子反応の衰退（図６〜７）のいずれによるものでありえないことを示唆していた。
【００８６】
ＩＦＮ‐β反応良好者に対比したＩＦＮ‐β反応不良者におけるＩＲＧ反応
ＩＦＮ‐βの生物学的作用は、ＩＲＧタンパク質生成物の作用よって説明される（Ｂｏｒｄｅｎ，  Ｅ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  ６：９７５−９９０，  ２００７）。我々は、有害な炎症性遺伝子産物の誘導（Ｗａｎｄｉｎｇｅｒ，  Ｋ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  ５０：３４９−３５７，  ２００１）または有益な遺伝子の発現の選択的不全（Ｗａｎｄｉｎｇｅｒ，  Ｋ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ  ３６１：２０３６−２０４３，  ２００３）のいずれかを明らかにすることによって、ＩＦＮ‐βに対する分子反応の特徴がＰＲ状態を説明しうるか否かについて取り組んだ。年齢、性別、ガドリニウム増強ＭＲＩ病変の存在、およびベースラインＴ２病変容積について修正した我々のマクロアレイアッセイを構成する１６６遺伝子（表１）の単変量解析において、平均ＩＲは、１７の遺伝子についてＰＲとＧＲ群の間で異なる反応を指し示した（Ｐ＜０．０５）。予想外にも、１７遺伝子すべてについて、誘導または抑制いずれかの反応は、反応不良な患者でより大きく、そのような患者での増大したＩＦＮ‐β分子反応を示唆していた。この仮説を２つの群における全体的なＩＲ頻度の分析によって確認した（図８Ａ〜Ｂ）。図は、初回（図８Ａ）および６ヶ月時（図８Ｂ）ＩＦＮ‐β注射における全患者の全ＩＲＧについてのＩＲ頻度を示す。初回注射では、１１９の上方制御された遺伝子のうち、８９遺伝子でＰＲの最小二乗平均ＩＲが、ＧＲの最小二乗平均ＩＲより高かった。４７の抑制された遺伝子のうち、３４遺伝子でＰＲのＩＲが、ＧＲより低かった。よって、１６６遺伝子中１２３で増大したＩＦＮ‐βに対する反応が、反応不良な者に存在した（ｐ＜０．００１）。６ヶ月時注射では（図８Ｂ）、増大したＩＦＮ‐βに対する反応が、１６６遺伝子中１２０で起こった（ｐ＜０．００１）。
【００８７】
ランダムフォレスト選択を使用して、我々は反応不良または反応良好状態に最も強く関連するＩＲＧを特定した。ランダムフォレスト法は、各因子（この場合は各ＩＲＧ）を選択する際に各変数の重要度を考慮する非パラメータのアンサンブル識別器（ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）、変数間の複雑な相互作用および非線形依存関係に感度が高い。したがって、我々は、変数選択および分類にランダムフォレストを使用することを選んだ。表３は、ベースラインＩＲが最も良く反応の状態を予測した、特定された２５の遺伝子を列挙する。
【００８８】
表３：反応者の状態を最も良く予測した、特注マクロアレイ上の２５インターフェロン応答遺伝子の誘導比率
【００８９】
【表３】
2013534419.tif 000005
【００９０】
初回ＩＦＮ‐β注射に応答して、２５のＩＲＧうち、１４が上方制御され、１１のＩＲＧが抑制された。これらの２５のＩＲＧを予測モデルに合わせ、それを使用してＲＯＣ曲線を作り、その予測力を測定した（図９）。初回ＩＦＮ‐β注射時の２５のＩＲＧモデルの予測力を、ベースライン（ＩＦＮ‐β治療前）Ｔ２病変容積の予測力と比較した。また、ベースラインＴ２病変容積および２５のＩＲＧに関するＩＲを合わせた予測モデルを構築した。濃度曲線下面積は、Ｔ２病変容積のみに関して０．７６、ＩＲＧモデルに関して０．８２、ＩＲＧと合わせたＴ２病変容積に関して０．８５であり、初回ＩＦＮ‐β注射後の差異的なＩＲＧ誘導が、ＭＲＩを使用して６ヶ月時に測定した反応状態の強力な予測因子であることを示した。該曲線は、ベースラインＩＲＧモデルのほうが、ベースラインＭＲＩ脳スキャンよりも６ヶ月時ＭＲＩ結果を強力に予測したことを示す。
【実施例２】
【００９１】
マクロアレイ膜のスポッティング
スポッティングに使用する実験台エリア全体をしっかりと拭き、スポッティングを妨げうる余分なちりを除く。次に、スポッティング領域を３ＭＭ紙で覆い、レプリケーターのピンをＶＰ１１０ピン（ｐｉｎ）洗浄溶液（１２０ｍＬのｄＨ２Ｏに３０ｍＬの溶液）の入ったタッパーウェア（Ｔｕｐｐｅｒｗａｒｅ）容器にセットする。ピンはおよそ半分、洗浄溶液に浸かっていなければならない。ピンを「浸している」間、実験に供給するのに十分なＨｙｂｏｎｄ‐Ｎ＋メンブレンを切る。例えば、手袋をはめて、物差しを使用して、ｈｙｂｏｎｄ紙の保護に使用されている紙層に７４ｍｍ×１１５ｍｍの長方形を印付けする。手や腕で紙および膜に過大な圧力をかけないように確認し、膜となるものの中心を紙でカバーしながら出来るだけ接触がないようにする。また、膜が紙のカバー内で滑らないことを確認し、きれいな外科用メスおよび物差し、またはきれいなはさみを使用して印付けした線に沿って切る。
【００９２】
次に、二端を切り取り、鉛筆を使用して膜の端に識別番号を小さく印付けすることによって、各膜をｎａｌｇ‐ｎｕｎｃトレイに合わせる。膜をスポットしているときに端が丸くならないように、トレイに紙を置く際には紙のアーチは上方向でなければならない。トレイに置くために膜の端を切り取る必要がある場合、上部は実験が完了した時点でホスフォイメージャーカセットでの位置合わせに使用するので、底部を切り取るのが最も良い。
【００９３】
ピンを洗浄溶液に７〜１０時間浸し、ＶＰ５２２リント‐フリー（ｌｉｎｔ  ｆｒｅｅ）ブロッティング紙にブロットし、５数える間そのまま静置する。ピンをｄＨ２Ｏに７〜１０時間浸し、再度ブロットし、５数える間そのまま静置する。この最後に工程をｄＨ２Ｏの別の槽（ｔｕｂ）で繰り返し、次にピンを７〜１０時間イソプロパノールに浸し、ブロットし、空気乾燥させる。その間、ＤＮＡ  ９６‐ウェルプレートを−２０℃から取り出して溶解させる。
【００９４】
ピンが乾燥し、ＤＮＡが完全に溶けたら、各ＤＮＡ９６ウェルプレートを、対応して番号を付けられたライブラリー複製装置（ｃｏｐｉｅｒ）の内部に置く。ピンを対応するＤＮＡに置き、ピンをスポッティングに向けて「プライム（ｐｒｉｍｅ）」するために、リントフリーブロティング紙にスポットし、ピンを９６ウェルプレートに戻して置く。記録装置を膜の１枚がはいったトレイの上に置き、次にピンをＤＮＡから外し、合わせピンをレプリケータートレイの合わせ穴の第一列の一番目の穴にそっとセットすることによって膜をスポットする。ピンを５つ数える間、膜にそのまま静置した後、それを外してＤＮＡプレートに戻す。
【００９５】
第一列の二番目および三番目の穴について先の工程を繰り返し、次に第二のＤＮＡトレイに換えてピンをプライムする。第二列の合わせ穴の１〜３番目の穴を使用して、先の２つの工程を繰り返す。第三のＤＮＡのトレイに換えて、そのピンをプライムする。同じようにして、第三列の合わせ穴の１〜３番目の穴を使用して、前述の工程を繰り返す。すでに完了しているプライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）を省いて、残りの膜について前述の工程を行う。膜の全部を空気乾燥させ、翌日の変性までそれらを２枚の３ＭＭ紙の間に保存し、保管前にピンを再度洗浄する。
【００９６】
マクロアレイ実験に使用するＲＮＡ３２Ｐ標識
５μｇのＲＮＡを１０μＬのＭＩＬＬＩ  Ｑ滅菌水に加える（最終容積１０μＬ）。次に、６μＬのＴ２３ＡＣＧアンカー（ａｎｃｈｏｒｅｄ）プライマ−ミックス（１００ｐｍｏｌ／μＬ）を加え、静かにしかし完全に混ぜる。Ｔ２３ＡＣＧアンカープライマ−ミックス（１反応当たり）を作るには：プライマ−（３μＬ）；ｄＮＴＰ（１．５μＬ）、およびｄＣＴＰ（４０μＭ）（１．５μＬ）。ｄＮＴＰについては、各１０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰを等量混ぜる。次に、１０分間７２℃でインキュベーションする。氷で２分間冷やす。遠沈して濃縮する。インキュベーションの間に、以下のハイブリダイゼーションミックス（１反応当たり）：５×逆転写酵素（５μＬ）；０．１Ｍ  ＤＤＴ（３μＬ）；ＲＮＡｓｅ阻害剤（１μＬ）；および３２Ｐ  ｄＣＴＰ（２μＬ）を作る。
【００９７】
１０分が経過して試料を冷やして遠沈した後、１１μＬのハイブリダイゼーションミックスを各反応に加え、４２℃で２分間インキュベーションする。次に、１．５μＬのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（２００Ｕ／μＬ）を各反応に加え、静かに混ぜる。２時間４２℃インキュベーションする。この間は、前日（例えば１２〜２４時間前）にスポットしたマクロアレイ膜上のＤＮＡを変性させるのに適した時間である。変性バッファー（ＤＢ）を大きいタッパーウェア（Ｔｕｐｐｅｒｗａｒｅ）容器に注ぐ。膜が重ならないように浸されているのを確認しながら、膜（ＤＮＡ面を上にする）をバッファーに置く。膜をＤＢ中に１０分間置く。１０分後、上記と同様の注意をしながら膜をｄＨ２Ｏ槽に移す。箱を、楕円振盪装置（ｅｌｌｉｐｔｉｃａｌ  ｓｈａｋｅｒ）に低速度で１０分間置く。膜を〜６００ｍＬの中和バッファー（ＮＢ）に移し、同じ振盪装置にさらに１０分間置く。膜をｄＨ２Ｏに移し、１０分間振盪し、膜からＮＢを洗い流す。膜を３ＭＭ紙上で空気乾燥させる。乾燥したら、膜をハイブリダイゼーションまで２枚の３ＭＭ紙の間に保存する。
【００９８】
４２℃での２時間が終了したら、ＲＮＡを加水分化するために、１５ｍＬの０．１Ｍ  滅菌ろ過済みＮａＯＨを加え、チューブを７０℃で２０分間インキュベーションする。２０分後、１５μＬの０．１Ｍ  滅菌ろ過済みＨＣｌを加え、反応を中和した。Ｇ５０カラムを短くボルテックスすることによって調製し、底を折り取って、冷蔵室の遠心分離機または実験室ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）冷蔵微量遠心機で１分間３０００ｒｐｍで遠心する。樹脂をかき乱さないように、カラムを新しいエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チューブに注意深く置く。３２Ｐ標識ｃＤＮＡを、樹脂（６０μＬ）に直接ゆっくりと加える。
【００９９】
次に、同じ遠心分離機でカラムを３０００ｒｐｍで２分間遠心し、カラムをエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）から取り外す。試料がピンク色であるのは余分な放射性同位体の不完全な除去を示しているので、ピンク色でないことを確認しながら、フロースルーを軽くはじいて混ぜる。試料容積が大きく変わっている場合、または放射能溶出前に、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を交換しなかった場合、マイクロコン（ＭＩＣＲＯＣＯＮ）遠心ろ過器（ミリポア（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、マサチューセッツ州）を使用して注意深く試料を濃縮することができる。これは、容積に大きな違いがある場合（＞１００μＬ違いまたは適当と思われるとき）のみ必要である。各チューブのフロースルーの１μＬを、２ｍＬのシンチレーション液が入った、対応するシンチレーションバイアル（放射性の固形廃棄物のそばでリピペット（ｒｅｐｉｐｅｔｔｅ）から得た）に加える（単に放射能を含むチップ全体を入れる）。蓋をし、各シンチレーションバイアルをボルテックスして混ぜる。
【０１００】
シンチレーション読み取り装置において、プログラム６スライドを使用し、実行する（メインメニュー＞自動計測（ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ）：選択（ｓｅｌｅｃｔ））。シンチレーション読み取りの整合性を確認し、許容可能なら、次に５０μＬのＣＯＴ‐１  ＤＮＡ（１μｇ／μＬ）および５μＬのＰｏｌｙ‐Ａ  ＤＮＡ（２μｇ／Ｌ）を加える。次に、次の混合物を調製する：４×ＳＳＣ（４４μＬのろ過した１０×ＳＳＣ）；ｄｄＨ２Ｏ（４５μＬ）；および０．１％ＳＤＳ（１μＬのろ過した１０％ＳＤＳ）。９０μＬの混合物を各チューブに加え、ボルテックスし、滴を遠心で落とし、ＤＮＡを変性させるために加熱ブロックで９５℃にて５分間インキュベーションし、６５℃で２時間ハイブリダイゼーションさせる。
【０１０１】
この間は、膜を調製するのに適した時間である。膜の調製には、まず初めに膜を水に浸し、丸めた内側にＤＮＡがくるように丸める。対応する予め暖めたハイブリダイゼーション瓶に加える。１０ｍＬの６５℃のＣＨＵＲＣＨバッファーを加え、気泡が膜の下にはいって、それにより膜が乾ききるのが進むのを避けるようにバッファーを膜にゆっくりと流す。ハイブリダイゼーションミックスが準備されるまで、反応物を、回転しているハイブリダイゼーションオーブン中に置く。２００μＬの適切なハイブリダイゼーションミックスを各チューブに加え、直ちにハイブリダイゼーションオーブンに戻し、一晩インキュベーションする。
【０１０２】
１Ｌの洗浄溶液１および３、２Ｌの洗浄溶液２を調製し、水浴中で６５℃に予め暖める。膜を１６〜２４時間ハイブリダイゼーションしたら、ハイブリダイゼーションオーブンからビンを２つ同時に取り出し、ハイブリダイゼーションミックスを大きい放射性廃棄物ビーカーに注ぐ（このビーカーは、廃棄物の一時的な保存にのみ使用され、全廃棄物は、１０Ｌ容の放射線安全支給（ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｓａｆｅｔｙ  ｉｓｓｕｅｄ）廃棄物つぼ（ｊｕｇ）に移し、廃棄物記録用紙に適切に記録される）、約５０〜１００ｍＬの洗浄溶液１を加え、瓶に再び蓋をし、膜を振って洗い流し、洗い流し液を注ぎ出して、瓶の１／４〜１／３の洗浄溶液１を加え、しっかりと蓋をした瓶をハイブリダイゼーションオーブンに戻し、１５分間インキュベーションする。それが終わった後、バッファーを破棄し、同量の洗浄溶液２を加えて１５分間インキュベーションし、溶液３を使用して洗浄工程を繰り返す。
【０１０３】
この洗浄が終了したら、振ることによって、膜を瓶の首の上方に移動させる。ピンセットを使って膜を、ＤＮＡ面を上にして清潔なタッパーウェア（Ｔｕｐｐｅｒｗａｒｅ）のｄＨ２Ｏに取り出し、ＳＤＳを洗い流す。１枚の３ＭＭ紙の上で膜をさっと拭い取って乾燥し、膜を２枚のサランラップ（登録商標）（ｓａｒａｎ  ｗｒａｐ）の間にできるだけ四角に（ｓｑｕａｒｅｌｙ）並べる。膜を並べるのに、ガイドとしての線が付いた紙を１枚使用することが有用であり、２対のピンセットを使用することも同様である。膜をホスフォイメージャーカセットに約３日間曝す（下記を参照されたい）。膜をフィルムカセットに移し、膜の各セットについてデータのハードコピーを作製する。
【０１０４】
マクロアレイデータのキャプチャー
ホスフォイメージャーカセットのスクリーンを膜に２〜３日間曝した後、結果として生じた画像を、ＳＴＯＲＭホスフォイメージャーを使用してスキャンし、結果として生じた．ｇｅｌファイルをＲａｎｓｏｓｈａｒｅｄ上のマクロアレイ（ＭＡＣＲＯＡＲＲＡＹ）ファルダに保存する。スキャンを終了し、ファイルを保存したら、ＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴでそのファイルを開き、データをキャプチャーする。「好み（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」プルダウンメインメニューで好みの設定（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｅｔｔｉｎｇ）をチェックすることによって始める。「Ｇｒｉｄ  Ｃｏｌｕｍｎ  Ｍａｊｏｒ」をチェックすべきではなく；「容積レポート設定（ｖｏｌｕｍｅ  ｒｅｐｏｒｔ  ｓｅｔｔｉｎｇ）」下において、作成された容積レポート（ｒｅｐｏｒｔ）について、「名前（ｎａｍｅ）」および「ｓｕｍ  ａｂｏｖｅ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ」のみを選択すべきであり；初期設定背景修正は、「局所中央値（ｌｏｃａｌ  ｍｅｄｉａｎ）」に設定すべきである。
【０１０５】
次に、「グレースケール色調整（Ｇｒａｙ  ｓｃａｌｅ  ｃｏｌｏｒ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）」をプルダウン「ビュー（ｖｉｅｗ）」メニューから選択する。全スポットが見えるようになるまで色を調整するが、過剰に曝露しない‐全スポットを隣接するスポットから独立したままにする。「対象（ｏｂｊｅｃｔ）」プルダウンメニューから「グリッド（ｇｒｉｄ）」を選択する。開いたウィンドウに、２４行３６列を入力する。グリッドの区分（ｓｅｃｔｉｏｎ）につき、１つのスポットを中心に置くことを確認しながら膜の１つにグリッドを描く。膜がきちんと位置合わせされていない場合、矢印キーまたは回転ツール（ｒｏｔａｔｉｏｎ  ｔｏｏｌ）＋シフトキーを使用してグリッド全体を回転することによって、微調整を行うことができる。
【０１０６】
全スポットを中心に置いたら、「分析（ａｎａｌｙｓｉｓ）」プルダウンメニューから「背景修正（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）」を選択する。「局所中央値（Ｌｏｃａｌ  Ｍｅｄｉａｎ）」を選択して、ウィンドウを閉じる。「分析（ａｎａｌｙｓｉｓ）」メニュー下で、「容量レポート設定（Ｖｏｌｕｍｅ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｓｅｔｔｉｎｇｓ）」を選択して、「名前（Ｎａｍｅ）」および「Ｓｕｍ  ａｂｏｖｅ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ」のみをチェックする。「分析（ａｎａｌｙｓｉｓ）」下で、「容量レポート（Ｖｏｌｕｍｅ  Ｒｅｐｏｒｔ）」を選択する。「表示（ｄｉｓｐｌａｙ）」レポート（ｒｅｐｏｒｔ）を選択する。開いているウィンドウを閉じ、マイクロソフトエクセル（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ）でファイルを開くことを尋ねて現れるウィンドウではい（ｙｅｓ）を選択する。エクセルに入ったら、列タイトル‐名前およびｓｕｍ  ａｂｏｖｅ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄをクリアする。「ファイル（Ｆｉｌｅ）」下で「名前を付けて保存（ｓａｖｅ  ｃｏｐｙ  ａｓ」を選択し、＊．ｃｖｓ（コンマ（ｃｏｍｍａ）で区切る）フォーマットでコピーを適切なサブフォルダに保存する。矢印キーを使用して、次の膜の上にグリッドをシフトする。残りの膜すべてについて、前述の工程を繰り返す。全データをキャプチャーしたら、＊．ｇｅｌファイルのコピーを＊．ｔｉｆｆフォーマットで保存する。フォトショップエディター（Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  Ｅｄｉｔｏｒ）で＊．ＴＩＦＦファイルを開き、＊．ＴＩＦＦファイル中の各膜のそれぞれの＊．ＪＰＥＧを保存する。
【０１０７】
本発明の上記説明から、当業者なら改良、変更、および修正を把握するであろう。そのような改良、変更および修正は、当業者の技能範囲内であり、添付の請求項によって保護されることを意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図４】
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【国際調査報告】
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