(57)【要約】  本発明は、胎膜の破水を検出する方法及び前記方法を実施する装置に関する。特に、胎膜の破水をインビトロで検出する方法は、膣又は子宮頸部分泌物検体内に、アルファ胎児タンパク質（ＡＦＰ）及びインスリン様成長因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ−１）を同時に検索するステップを含む。本発明は、特に、医学分野、具体的には産科分野への応用を見出す。
2013527467.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胎膜の破水をインビボ検出するための方法であり、前記方法は、
膣又は子宮頸部分泌物検体内の、アルファ胎児タンパク質（ＡＦＰ）及びインスリン様成長因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ−１）を同時に検索するステップを含む、方法。
【請求項２】
請求項２に記載の方法であり、前記検索が、少なくとも１つのＡＦＰに対するキャプチャ抗体及び少なくとも１つのＩＧＦＢＰ−１に対するキャプチャ抗体を用いて実施される、方法。
【請求項３】
請求項１又は２のいずれか一項に記載の方法であり、前記検索が、緩衝溶液に希釈された膣又は子宮頸部の検体を用いて実施される、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であり、前記方法が、前記緩衝媒体の前記容量、前記ｐＨ及び前記イオン強度から選択されたパラメータの少なくとも１つを調節することを含み、前記調節が、ＡＦＰとＩＧＦＢＰ−１とに共通である、方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法であり、前記方法が、前記キャプチャ抗体及び／又は前記ラベル化抗体の濃度から選択されたパラメータの少なくとも１つを調節することを含み、前記調節がＡＦＰ及びＩＧＦＢＰ−１に特異的である、方法。
【請求項６】
請求項３乃至５のいずれか一項に記載の方法であり、前記緩衝液のｐＨが５から１０である、方法。
【請求項７】
請求項３乃至５のいずれか一項に記載の方法であり、前記高ＡＦＰ及び高ＩＧＦＢＰ−１キャプチャ抗体が乾燥形である、方法。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか一項に記載の方法であり、前記検索ステップは、少なくとも１つの高ＡＦＰラベル化抗体と少なくとも１つの高ＩＧＦＢＰ−１ラベル化抗体を用いて実施される可視化ステップを含む、方法。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法であり、ＩＧＦＢＰ−１のみを検出する追加のステップが実施される、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であり、前記ＩＧＦＢＰ−１が、１から１０ｎｇ／ｍｌの濃度から検出される、方法。
【請求項１１】
請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法を実施するための装置であり、前記装置は：
サンプルを堆積する領域（１）、
ラベル化高ＩＧＦＢＰ−１抗体及びラベル化高ＡＦＰ抗体を含む領域（２）、
ＡＦＰに対するキャプチャ抗体及びＩＧＦＢＰ−１に対するキャプチャ抗体を含む可視化領域（３）を含む、装置。
【請求項１２】
請求項１１に記載の装置であり、前記堆積領域（１）が、吸収紙又はガラスファイバのいずれかである、装置。
【請求項１３】
請求項１１又は１２のいずれか一項に記載の装置であり、前記可視化領域（３）がニトロセルロース膜である、装置。
【請求項１４】
請求項１１乃至１３のいずれか一項に記載の装置であり、前記領域（２）はガラスファイバ支持体である、装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胎膜破水の検出方法に関し、前記方法を実施する装置に関する。本発明は特に、医学分野、診断分野、特に産科分野での応用に関する。以下の記載では、括弧［］は本明細書の最後に与えられる参考文献を意味する。
【背景技術】
【０００２】
妊娠中の女性は、妊娠を危険にする種々の原因及び／又は事象に遭遇する。胎膜破水はその１つの事象であり、特に胎膜破水が時期尚早の場合にそうである。
【０００３】
胎膜破水の原因は様々である。例えば、腹部への打撲などの直接又は間接的な打撲、循環性事象、性的交渉などである。また、内因性膜脆弱性（コラーゲン不足、栄養失調、喫煙）、双胎妊娠、羊水過多、羊水鏡検査に関連する合併症又は妊娠終了時のラミナリアの挿入が原因となり得る。または、伝染性起源、及び絨毛膜羊膜炎、外陰膣炎や子宮内膜炎に起因する。最後に、６０％のケースが胎膜破水の原因が知られていない。
【０００４】
胎膜破水により、羊水が流れだし、全ての生理学物：細菌、ウイルスなどの侵入への「ドアを開ける」こととなる。これらは、例えば、子宮、胎児などに感染し得る。
【０００５】
さらに、羊水の損失は、胎児の発育に利用されるべき空間を低以下させることとなる。この低下は、破水が無月経２４週の期間の前に起こる場合、流産及び／又は未熟児の誕生を引き起こし、胎児の生命予後を危険にさらすこととなる。２４週後には、幼児の生命予後はなお問題であり、早産及び／又は胎児感染を引き起こす可能性があり、自発的陣痛誘発する結果となり得る。さらに、羊水の減少は、奇形、四肢の萎縮、体の様々な部分の発達異常を起こす可能性がある。
【０００６】
胎膜破水の診断は本質的に臨床的である。これには、羊水の流れの可視化により鏡を用いての検査を含む。この診断試験は、それほど感度が高いものではなく、微小破水を診断するためには適切ではなく、胎膜破水を迅速かつ容易に検出することができず、かつ破水流を識別／可視化し得るのは特に試験実施者の能力に関係するものである。
【０００７】
他の試験もあり、例えば胎膜破水を検出するための、ニトラジン試験又はジアミンオキシダーゼ試験である。
【０００８】
しかしこれらの試験は信頼性が低く、偽陰性結果（結果が偽陰性である患者はそれにより妊娠に対するリスクを持つこととなり、管理及び／又は治療もされない）を導くか、又は偽陽性結果（偽陽性結果を持つ患者は、妊娠リスクはないが、破水した女性と同様に管理されることとなり、特に必要のない陣痛開始のリスクを持つ）を導く。ニトラジン試験（ニトラジンはｐＨ指示薬である）、は多数の原因で干渉され、特に血液、精液、防腐剤又は膣感染により干渉される。ジアミンオキシダーゼ試験は、放射免疫方法に基づく方法を用いるものであり、従って実用的ではない。その感度は８４％から９１％の範囲である。これは特に血液からの干渉により制限される。
【０００９】
インスリン様成長因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ−１）を膣や子宮頸部での特定の抗体を用いて検出する方法に基づく診断試験がまた、開発され市販されている。このタンパク質は、母性血清よりも１００から１０００倍高い濃度で羊水中に存在する（Ｒｕｔａｎｅｎ等の「胎盤のタンパク質の放射免疫方法１２」：健康成人、妊婦及び絨毛性疾患を持つ患者の羊水、臍帯血及び血清中の濃度。「Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１９８２［１］」）。このマーカーを用いる先行技術試験方法の例は、例えば、欧州特許第０５６５５４１号に記載された免疫試験である。しかし、これらの試験は信頼性が低い、というのはこれらは偽陰性結果を与え得るが、これは例えば、ＩＧＦＢＰ−１の羊水液中の低濃度、フック効果、膣及び／又はインビトロでこのタンパク質の分解、又はマトリックス効果などによる。これらはまた、偽陽性結果を与え得るが、これは例えば、羊水流の他の生物媒体から由来するＩＧＦＢＰ−１の残留物、特に血液中又は成熟した際の子宮頸部の脱落膜細胞による。
【００１０】
アルファ−フェトタンパク質（ＡＦＰ）を膣や子宮頸部検体中の特定に抗体を用いて検出する方法に基づく診断試験がまた記載されている。このマーカーを用いる試験の一例はＲｏｃｈｅｌｓｏｎ（Ｒｏｃｈｅｌｓｏｎら、迅速アッセイ：膜の早期破水の診断において可能な応用。「Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １９８３；６２：４１４&#8211;４１８［２］」）による論文に記載されている。
【００１１】
しかし、この試験は信頼性が低いが、これは偽陰性及び偽陽性を与えるからである（無月経未満の３９週での女性で、９３％感度及び９４％特異性）。
【００１２】
従来技術の他の例は、Ｋｉｓｈｉｄａにより記載されている（Ｋｉｓｈｉｄａ等の、早期患者での早期破水の診断：改良ＡＦＰキット使用：ＲＯＭチェック及び／又はニトラジン試験との比較、「Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６９（１９９６）７７−８２）［１２］」）。１６週から３６週の期間の患者集合から、膣検体での感度及び特異性はそれぞれ９６．９％及び９２．９％であった。子宮頸部検体では、感度及び特異性はそれぞれ１００％及び８５．７％であった。従って、他の従来技術と同様に、この試験は、偽陰性及び偽陽性結果を与えるということから信頼性が低い。
【００１３】
それほど効果的ではないその他の破水マーカーも記載されており、例えばヒト絨毛性ゴナドトロピンホルモン（ｈＣＧ）（Ｙｏｕｎｇ−Ｈａｎ  Ｋｉｍ  等の、膜の早期破水の診断医おける膣分泌液ヒト絨毛性ゴナドトロピンホルモン濃度、「Ａｃｔａ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｓｃａｎｄ  ２００５：８４：８０２&#8211;８０５［３］」）、又はプロラクチン（ＰＲＬ）（Ｋｏｎｉｎｃｋｘ  ＰＲ等の、膣液中のプロラクチン濃度：膜破水の新規な方法、「Ｂｒ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎａｅｃｏｌ  １９８１；８８：６０７‐６１０［４］」）である。
【００１４】
従って、これらの従来技術の欠陥、問題及び障害を解消し、胎膜破水を検出する方法、特により優れた正確性及び／又はより優れた特異性を持つ方法であって、かつ費用を節約し胎膜破水の検出を改善することを可能にする方法を見出す必要が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】欧州特許第０５６５５４１号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｒｕｔａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓｙ  ｏｆ  ｐｌａｃｅｎｔａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １２：ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ａｍｎｉｏｔｉｃ  ｆｌｕｉｄ、ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ  ｏｆ  ｈｅａｌｔｈｙ  ａｄｕｌｔｓ、ｐｒｅｇｎａｎｔ  ｗｏｍｅｎ  ａｎｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１９８２．
【非特許文献２】Ｒｏｃｈｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｒａｐｉｄ  ａｓｓａｙ：ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｒｕｐｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １９８３；６２：４１４‐４１８．
【非特許文献３】Ｋｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｒｕｐｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｉｎ  ｐｒｅｔｅｒｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ、ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＡＦＰ  ｋｉｔ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ＲＯＭ−Ｃｈｅｃｋ  ａｎｄ／ｏｒ  ｎｉｔｒａｚｉｎｅ  ｔｅｓｔ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６９（１９９６）７７−８２）．
【非特許文献４】Ｙｏｕｎｇ−Ｈａｎ  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｖａｇｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｂ−ｈｕｍａｎ  ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ  ｌｅｖｅｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｒｕｐｔｕｒｅ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．Ａｃｔａ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｓｃａｎｄ  ２００５：８４：８０２‐８０５．
【非特許文献５】Ｋｏｎｉｎｃｋｘ  ＰＲ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖａｇｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ：  ａ  ｎｅｗ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ  ｒｕｐｔｕｒｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．Ｂｒ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎａｅｃｏｌ１９８１；８８：６０７&#8211;６１０．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の課題は、従来技術のこれらの必要性と欠陥を解消し、胎膜破水のインビトロ検出の方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
特に本発明は、胎膜破水のインビトロ検出の方法であり、前記方法は、膣や子宮頸部検体中で、アルファ−フェロタンパク質（ＡＦＰ）及びインシュリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ−１）を同時に検索するステップを含む。
【００１９】
本発明によれば、ＩＧＦＢＰ−１の検出は、ＩＧＦＢＰ−１と同一であると記載される他のタンパク質の検出と置換することができ、これらには例えば、胎盤アルファミクログロブリン（ＰＡＭＧ−１）、胎盤タンパク質１２、妊娠関連子宮内膜アルファ１グロブリン（アルファ１ＰＥＧ）及び子宮内膜タンパク質１４（ＥＰ１４）である（Ｂｅｌｌ  Ｃ．の、分泌と子宮内膜脱離膜タンパク質：血清タンパク質に関連する母体由来グループの研究及び臨床的意義「Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｖｏｌ．１−３、１２９−１４３．１９８６［１３］」；Ｎａｚｉｍｏｖａ等の、糖尿病の患者でのＰＡＭＧ−１タンパク質結合新スリン様成長因子−１（ソマトメジン−Ｃ）の血液血清濃度、「Ｂｕｌｌｅｔ．Ｅｘｐｅｒｉｍ．Ｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｍｅｄ．１６６／９Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９９３［１４］」）である。
【００２０】
本発明者は、特に、前記２つのマーカーは相補的であり、より高い感度を達成することを可能にする、ということを初めて発見した。特に、本発明者は、アルファフェトタンパク質（ＡＦＰ）とインスリン様成長因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ−１）で表される前記２つのマーカーは有利には、破水検出の特異性及び感度を増加させることができる、ということを初めて発見した。
【００２１】
本発明によれば、用語、膣又は子宮頸部検体とは、例えば、膣分泌又は子宮頸部分泌物を意味し、妊娠女性の膣壁、後膣円蓋、又は子宮頸部から取得される。
【００２２】
本発明によれば、前記検体は当業者に知られる方法で得られ得る。前記検体は、例えば、ピペットを用いてピペッティングすること、又は例えば滅菌綿棒（綿又は合成繊維から作られた綿玉を持つ）を使って膣腔壁をこすることで得られる。それは例えばポリエステルである。
【００２３】
本発明によれば、ＡＦＰ及びＩＧＦＢＰ−１の検索は、例えば抗体の手段による。これらのそれぞれの検出は、例えばモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体及び／又はＡＦＰ又はＩＧＦＢＰ−１へ特異的に結合し得る市販の全ての抗体の手段で実施され得る。
【００２４】
本発明によれば、ＡＦＰに対して向けられる抗体（抗ＡＦＰ抗体）は、例えば抗ＡＦＰ抗体であり、国際公開第２００４／０１３１８０に記載され、Ａｎｔｉｃｏｒｐｓ  ｅｎ  Ｌｉｇｎｅ社により販売される抗体（カタログ番号ＡＢＩＮ９３６２４）、Ａｒｉｓｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社により販売される抗体（ｃｌｏｎｅ１、カタログ番号ＡＢＡＦＰ−０４０１；ｃｌｏｎｅ２、カタログ番号ＡＢＡＦＰ−０４０２；ｃｌｏｎｅ３、カタログ番号ＡＢＡＦＰ−０４０３；ｃｌｏｎｅ４、カタログ番号ＡＢＡＦＰ−０４０４）、又はＨｙｔｅｓｔ社から販売される抗体（ｃｌｏｎｅ５Ｈ７、ｃｌｏｎｅ４Ａ３及びｃｌｏｎｅＸＡ２、カタログ番号４Ｆ１６；ポリクローナル抗体、カタログ番号ＡＢＡＦＰ−０５０１）であり得る。
【００２５】
本発明によれば、前記ＡＦＰに対する抗体は、ラベル化されていてもされていなくてもよい。前記ラベル化は以下説明される。キャプチャに使用する前記抗ＡＦＰ抗体及びラベル化される前記抗ＡＦＰ抗体は、異なるエピトープに対して向けられ、サンドイッチシステムを操作できる。
【００２６】
本発明によれば、抗ＡＦＰ抗体の濃度は、例えば０．１から１００μｇ／ｍｌ又は０．１から１０ｍｇ／ｍｌである。
【００２７】
本発明によれば、抗ＡＦＰ抗体を含む溶液のｐＨは、５から１０、好ましくは６から９である。
【００２８】
本発明によれば、ＩＧＦＢＰ−１に対して向けられる抗体（抗ＩＧＦＢＰ−１抗体）は、例えば次の群：文献Ｒｕｔａｎｅｎ等の「Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １９８８；１５２：２０８［５］」及びＰｅｋｏｎｅｎ等の「Ｊ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  １９８９；１０：３２５−３３７［６］」に記載の抗体、Ｌｅｎｃｏ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から市販されている抗ＩＧＦＢＰ−１抗体（カタログ番号Ｉ−６９５、Ｉ−７４６及びＩ&#8209;８０５）、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社から市販されている抗ＩＧＦＢＰ−１抗体（カタログ番号Ｉ２０３２、ｃｌｏｎｅ３３６２７．１１）、ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃｈ社から市販されている抗体（カタログ番号５３４５−４８５９Ｘ、ｃｌｏｎｅ６３０２（７Ｂ１１）；カタログ番号５３４５−４８０９Ｘ、ｃｌｏｎｅ７Ｂ１０）、Ｈｙｔｅｓｔ社から市販されている抗体（カタログ番号４Ｉ５２；ｃｌｏｎｅ  Ａ８及びｃｌｏｎｅＧ２；カタログ番号４ＩＧ８；ｃｌｏｎｅＧ５Ｆ８及びＣ７Ｂ９）、Ｂｉｏｓｐａｃｉｆｉｃ社から市販されている抗体（カタログ番号Ａ６１４０３；カタログ番号Ａ６１４００；カタログ番号Ａ６１４０２）、及びＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社から市販されている抗体（カタログ番号Ａ６１４０１１３６、Ａ６１４００１３６又はＡ６１４０３１３６）から選択される。
【００２９】
本発明によれば、ＩＧＦＢＰ−１に対して向けられる抗体はラベル化されていても、されていなくてもよい。ラベル化は以下に説明される。有利には、キャプチャのために使用される前記抗ＩＧＦＢＰ−１抗体及びラベル化される前記抗ＩＧＦＢＰ−１抗体は異なるエピトープに対して向けられ得る。
【００３０】
本発明によれば、抗ＩＧＦＢＰ−１抗体の濃度は、０．１から１００μｇ／ｍｌ又は０．１から１０ｍｇ／ｍｌである。
【００３１】
本発明によれば、抗ＩＧＦＢＰ−１抗体を含む溶液のｐＨｈａ５から１０、好ましくは６から９である。
【００３２】
有利には、本発明によれば、それぞれの抗体を含むそれぞれの溶液のそれぞれの抗体の濃度及びｐＨは、ＡＦＰ又はＩＧＦＢＰ−１タンパク質の検出のための検出限界を変更し得る。
【００３３】
本発明によれば、ＡＦＰ又はＩＧＦＢＰ−１に対して向けられる抗体は有利には乾燥形であり得る。
【００３４】
本発明によれば、ＡＦＰ又はＩＦＦＢＰ−１に対して向けられる抗体は、当業者に知られた全ての方法でラベル化され得る。これは例えば、例えばローダミンやフルオレセインイソシアネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光ラベルとしての化学分子、例えばＴＭＢ（又は３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジン）、４−メチルウンベリフェリルホスフェートなどの特異的基質の存在を明らかにする、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼなどの酵素、例えばラテックス又はポリスチレン粒子などの着色ナノ粒子、コロイド金粒子、リポソーム、カーボン又はセレン粒子、例えばランタニド（例えばユーロピウム）を含む蛍光ナノ粒子、又は磁性粒子又は例えばヨー素１２５、１３３又はトリチウムなどの放射活性分子が含まれる。
【００３５】
本発明によれば、前記ラベル化は前記抗体にの特異性に依存し得る。例えば、抗ＩＧＦＢＰ−１抗体は、抗ＡＦＰ抗体のラベルとは異なるラベル化であり得る。有利には、ラベル化での相違が、ラベル化を相違させることで試料中に、ＡＦＰのみ、ＩＧＦＢＰ−１のみ及び／又はＩＧＦＢＰ−１とＡＦＰが存在するかどうかを検出することを可能にすることである。異なるようにラベル化することは、ＡＦＰ及びＩＧＦＢＰ−１を別々に検出することを可能にする。
【００３６】
本発明によれば、前記抗体は、前もって固体支持体に付けておくことが可能である。例えば、ＡＦＰ又はＩＧＦＢＰ−１に対して向けられる抗体は、膜、例えばニトロセルロース膜、マルチウェルプレートの底及び／又は少なくとも１つの抗体を付けることができる当業者に知られた全ての表面に付けられ得る。
【００３７】
本発明によれば、付けられるＡＦＰ又はＩＧＦＢＰ−１へ向けられる抗体の量は有利には、検索される抗体及びタンパク質により調節され得る。例えば、ＡＦＰが検索される場合に、付される抗体の量は、０．１から１００μｇ／ｍｌ又は０．１から１０ｍｇ／ｍｌ；ＩＧＦＢＰ−１が検索される場合には、付される抗体の量は０．１から１００μｇ／ｍｌ又は０．１から１０ｍｇ／ｍｌである。
【００３８】
付される抗体量の制御は、有利には、ＡＦＰ又は及び／又はＩＧＦＢＰ−１の検出限界を調節することを可能とする。事実、付される量が多いほど、検出限界は下がる。
【００３９】
言い換えると、本発明によれば、抗体は、前もって、例えば堆積又は化学結合により支持体に付され得る。
【００４０】
抗体が堆積により付される場合、これらは例えば、上で定めたような抗ＡＦＰ抗体及び抗ＩＧＦＢＰ−１抗体の共通又は別々の表面にスプレーされて堆積され、その後例えばＢｅｅｒ等の「ラテラルフローアッセイのためのセルロースナイトレート膜の品質（ＩＶＤ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｊａｎｕａｒｙ  ２００２．［７］）」に記載される方法により乾燥される。
【００４１】
抗体が化学結合で結合される場合には、例えばＢｅｅｒ等の「ラテラルフローアッセイのためのセルロースナイトレート膜の品質、（ＩＶＤ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｊａｎｕａｒｙ  ２００２．［７］）」に記載される方法により結合される。
【００４２】
本発明によれば、本発明の方法はまた、膣検体又は子宮頸部検体を希釈溶液中に希釈する予備ステップを含み得る。前記希釈溶液は、これらの検体を希釈するための当業者に知られる全ての溶液であり得る。例えば、生理的溶液又は緩衝液である。例えば、５０ｍＭのホウ酸（０２１０２３９１、Ｂｉｏｓｏｌｖｅ）、１％ＢＳＡ（ＡＰ−４５１０−０１、Ｓｅｒａｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、０．０５％トリトンＸ−１００（ｐＨ９．３）を含む溶液であり得る。
【００４３】
本発明によれば、前記希釈溶液のｐＨは５から１０、好ましくは６から９である。
【００４４】
本発明によれば、前記希釈溶液のイオン強度は、１０から１０００ｍＭ、好ましくは５０から２００ｍＭである。
【００４５】
本発明によれば、前記方法は可視化ステップを含み得る。
【００４６】
本発明によれば、前記可視化ステップは、当技術分野の当業者に知られる全ての方法で実施され得る。これには、例えば、放射線免疫方法（ＲＩＡ）、免疫放射線方法（ＩＲＭＡ）、時間分割免蛍光免疫方法、発光免疫方法（ＬＩＡ）又は磁性免疫方法、又は着色粒子（ラテックス、ポリスチレン又はコロイド）を用いた免疫クロマトグラフ方法や免疫濾過方法が含まれる。これらのいくつかの方法は、Ａｎｎｅ  Ｈａｒｗｏｏｄ  Ｐｅｒｕｓｋｉ等の「感染症と生物兵器の検出及び同定のための免疫方法」（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｕｌｙ  ２００３、ｐ．５０６‐５１３［８］）」に記載されている。
【００４７】
本発明によれば、前記可視化は、例えば直接的又は間接的でよい。
【００４８】
前記可視化が間接的又は競争的である場合には、例えば前記のＩＧＦＢＰ−１又はＡＦＰの対するラベル化抗体が使用され得る。
【００４９】
前記可視化が直接的（サンドイッチ型）の場合には、例えば、キャプチャ抗体と、ＩＧＦＢＰ−１に対するラベル化第２抗体を使用、及び前記のキャプチャ抗体とＡＦＰに対するラベル化された第２抗体の使用が可能となる。有利には、前記キャプチャ抗体及びラベル化抗体は、異なるエピトープに向けられており、サンドイッチシステムで使用され得るペアを形成することができる。
【００５０】
前記可視化は好ましくは直接である。
【００５１】
有利には、前記ラベルの信号強度は、前記検体中に存在するＡＦＰ及び／又はＩＧＦＢＰ−１の量及び／又は濃度に依存する。
【００５２】
使用されるラベルに依存して、前記可視化は目視するか又は装置を用いて可視化される。
【００５３】
前記ラベルが前記のような可視着色ラベルである場合には、前記可視化が有利に目視できる。前記ラベルが、例えば前記の放射活性ラベルの場合、前記可視化は、例えば放射活性を測定する装置、例えばガイガー計数管の手段で実施される。
【００５４】
本発明は、有利には、その濃度が０．５から５０ｎｇ／ｍｌ、１から２５ｎｇ／ｍｌ、１から２ｎｇ／ｍｌである場合に、検体中のＡＦＰを検出することを可能にする。
【００５５】
本発明は、有利には、その濃度が２．５から５０ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは５から２５ｎｇ／ｍｌである場合に、検体中のＡＦＰを検出することを可能にする。
【００５６】
本発明においては、ＡＦＰ検出は、前記のように定めた希釈検体中で実施され得る。
【００５７】
本発明においては、ＡＦＰ検出限界の決定は、Ｈｙｔｅｓｔ社から入手の天然ＡＦＰ（参照８Ｆ８）の調製を用いて実施され得る。
【００５８】
本発明は、有利には、濃度が５と５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０と３０ｎｇ／ｍｌの間にある場合に、検体中のＩＧＦＢＰ−１を検出可能とする。
【００５９】
本発明はまた、有利には、濃度が５と３０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５と１０ｎｇ／ｍｌの間にある場合に、検体中のＩＧＦＢＰ−１を検出可能とする。
【００６０】
本発明においては、ＩＧＦＢＰ−１の検出は、前記の希釈検体中で実施することができる。
【００６１】
本発明においては、ＩＧＦＢＰ−１検出限界の決定は、Ｈｙｔｅｓｔ社から入手の天然ＩＧＦＢＰ−１（参照８ＩＧＢ１）の調製を用いて実施され得る。
【００６２】
本発明によれば、本発明の方法は、前記希釈緩衝媒体、前記緩衝媒体のｐＨ、及び前記緩衝媒体のイオン強度の少なくとも１つを調節することを含み、前記調製はＡＦＰ及びＩＧＤＢＰ−１に共通である。
【００６３】
本発明によれば、本発明の方法は、前記キャプチャ抗体及び／又は前記ラベル化抗体の濃度の少なくとも１つを調節することを含み、前記調節がＡＦＰ及びＩＧＦＢＰ−１に特異的である。
【００６４】
ＡＦＰ及びＩＧＦＢＰ−１に特異的な調節と及び／又は共通の調節の組み合わせは、有利には、ＡＦＰ及びＩＧＦＢＰ−１の相補的検出を得ることを可能にする。２つのマーカーの相補性は、例えば時系列的であり；例えばＡＦＰは３５週前には優先的マーカーであり、ＩＧＦＢＰ−１は３７週後に優先的マーカーである。前記相補性はまた、前記マーカーのそれぞれを検出するための性能レベルに関連する。従って、本発明によれば、これらの２つのマーカーのそれぞれの検出限界は、ＡＦＰが最も感度の高いマーカーであり、ＩＧＦＢＰ−１が最も特定的マーカーであるように、及び／又はその逆に調節され得る。
【００６５】
本発明によれば、有利には前記パラメータを、前記マーカーの検出の特異性が同等、即ちそれらは同じ程度の特異性を持つように調節することが可能である。この実施態様では、ＩＧＦＢＰ−１マーカーは統計的に、特に妊娠３７週後に最も感度が高い。
【００６６】
本発明によれば、本発明の方法は、前記２つのマーカーの相補性により有利には、ＩＧＦＢＰ−１が存在しない場合でさえ、有利に、例えば羊水がＩＧＦＢＰ−１の非常に低濃度のＩＧＦＢＰ−１を含むか、Ｒｕｔａｎｅｎ等の文献（子宮頸部／膣分泌内のインスリン様成長因子結合タンパク質−１の測定：ＡＦＰの検出による、胎膜破水の診断でのＲＯＭチェック膜免疫アッセイ「Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、２１４（１９９３）、７３−８１［９］」）に記載されるようなＩＧＦＢＰ−１がインビボ又はインビトロで分解している場合でさえも胎膜破水を検出することを可能にする。
【００６７】
本発明によれば、本発明の方法は有利には、前記２つのマーカーの相補性により、羊水の漏出によるものではなく、子宮頸部の脱落細胞由来のＩＧＦＢＰ−１によるＩＧＦＢＰ−１陽性結果の場合に、破水は不存在との診断を下すことを可能とする。これは、ＩＧＦＢＰ−１とは異り、ＡＦＰが主に胎児起源であり、その結果干渉のリスクを示さないからである。子宮頸部の脱落細胞由来のＩＧＦＢＰ−１の存在はＩＧＦＢＰ−１の価値を制限する；これについて特にＲｕｔａｎｅｎ等の論文「人の子宮間葉系細胞の脱落はインスリン様成長因子結合タンパク質−１の出現に関連する（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．１９９２；７２：２７−３１［１０］）、胎膜破水の診断におけるインスリン様成長因子結合タンパク質−１の迅速ストリップ試験の評価（Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ．２５３；（１９９６）９１−１０１［１１］）」に記載されている。本発明は従って、有利には、偽陽性のリスクを低減させることを可能にする。
【００６８】
本発明によれば、前記方法はまた、ＩＧＦＢＰ−１のみを検出する追加のステップを含み得る。
【００６９】
追加のステップでのＩＧＦＢＰ−１の検出は、ＡＦＰの検出と同時に実施される場合のＩＧＦＢＰ−１の検出よりも高い感度を持って実施され得る。
【００７０】
この実施態様では、前記検出限界は、前記追加のステップで、濃度が１から１０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２から５ｎｇ／ｍｌの場合にＩＧＦＢＰ−１の検出を可能とする。
【００７１】
この実施態様に加えて、ＩＧＦＢＰ−１の検出は、希釈溶液中で可能であり、例えば前記に定めた希釈溶液である。
【００７２】
この実施態様では、ＩＧＦＢＰ−１の検出の手段は前記で説明されており；例えば前記の抗ＩＧＦＢＰ−１抗体であり得る。
【００７３】
本発明によれば、結果が陰性、即ち破水がない場合とは、ＩＧＦＢＰ−１もＡＦＰも検出されない場合であり、かつ結果が陽性、即ち破水がある場合とは、ＧＦＢＰ−１のみが検出されるか又はＡＦＰとの組み合わせでＧＦＢＰ−１が検出される場合である。ＡＦＰのみが検出される場合には、既に示したように、本発明の方法は、ＩＧＦＢＰ−１のみを検出する追加のステップを含み得る。
【００７４】
有利には、この実施態様によると、本発明の方法は、全ての偽陽性結果を除去することができる。加えて、この実施態様での本発明の方法は、有利には、１００％の特異性と８４％を超える感度を得ることを可能にする。
【００７５】
本発明によれば、検体は、妊娠期間中のいかなる時点でも取得され得る。例えば、検体は、１１週と妊娠最終の間、例えば１１から４２週、１５から４１、２０から４０、２５から４０、３０から４０、３５から４０又は３７から４０週の間である。
【００７６】
有利には、確実に結果を得ること、即ち全集団で１００％の感度と特異性を得ることも可能であるが、例外は、その期間が３７から４０週を超える、例えば３９週のＡＦＰ陰性かつＩＧＦＢＰ−１陰性の患者、及びその期間が３７から４０週以下、例えば３９週であってＡＦＰ陽性かつＩＧＦＢＰ−１陰性の患者である。
【００７７】
従って、得られる結果は、追加の臨床試験を必要とせず、胎膜破水がないことが結論することを可能とする。この実施態様では、本発明の方法は、有利には、検出方法の１００％の感度と特異性を得ることが可能とする。
【００７８】
本発明の方法は従って、確認のためのいかなる追加のステップを必要としないで、信頼性の高い結果を得ることが可能となり、かつ胎膜破水があるかどうかを確実に結論することを可能とする。
【００７９】
本発明の方法は従って、有利には、明確に定義された患者について、即ちその期間が無月経の３９週を超えるか未満の集団について、確認のためのなんらの追加のステップを必要とせず、かつ胎膜破水があるかどうかを確実に結論することを可能とする。
【００８０】
本発明はまた、本発明の方法を実施するための例えば免疫クロマトグラフ装置であり、前記装置は：
−  検体を堆積するための領域（１）、
−  ラベル化抗ＩＧＦＢＰ−１抗体及びラベル化抗ＡＦＰ抗体を含む領域（２）、
−  抗ＡＦＰ抗体キャプチャ抗体及び抗ＩＧＦＢＰ−１キャプチャ抗体を含む可視化領域（３）を含む。
【００８１】
本発明によれば、前記堆積領域（１）は、前記検体の適用又は受容に適する領域であり得る。この領域は、当業者に知られる全ての形でよく、例えば容器、吸盤、ウェル、芯又は平坦表面である。
【００８２】
本発明によれば、例えば、領域（１）は、領域（２）又は（３）から可動に及び／又はリンクされ得る。領域（１）が可動の場合、それは例えば検体を取得し領域（２）へ供給するために使用され得る。領域（１）が領域（２）又は（３）にリンクされる場合には、それは、検体を含む容器内に浸漬され得るか及び／又は検体がこの領域に適用され得る。この装置の一例は以下説明される。
【００８３】
有利には、本発明によれば、領域（１）及び（２）は、同じ支持体上に設けられる。
【００８４】
本発明によれば、領域（１）から（３）の材料は同じ又は異なっていてよい。前記材料は、当業者に知られた全ての材料であってよく、例えば、吸収紙、綿、セルロース、ガラスファイバ及びニトロセルロース膜からなる群から選択される。
【００８５】
好ましくは前記堆積領域（１）は吸収紙又がガラスファイバである。
【００８６】
好ましくは、ラベル化抗ＩＧＦＢＰ−１抗体及び抗ＡＦＰ抗体を含む前記領域（２）はガラスファイバである。
【００８７】
好ましくは、前記可視化領域（３）はニトロセルロース膜である。
【００８８】
本発明によれば、前記抗ＡＦＰ又は抗ＩＧＦＢＰ−１キャプチャ抗体は、例えば、前記領域（３）の支持体に直接付されており、例えば化学結合及び／又は前記のような堆積により付される。
【００８９】
本発明によれば、ＡＦＰキャプチャ抗体及びＩＧＦＢＰ−１キャプチャ抗体の付される領域は同じでも異なっていてもよい。好ましくは、ＡＦＰキャプチャ抗体の付される領域は、ＩＧＦＢＰ−１キャプチャ抗体の付される領域とは異なる。それらは、例えば、それぞれ異なるキャプチャ抗体を含む２つの平行バンドであり得る。
【００９０】
本発明によれば、前記種々の領域（１）から（３）は固体支持体に付されることができ、例えば、ラミネートカードに付されたり、及び／又は結果の可視化を可能にする領域（３）のレベルで開口部、及び検体を堆積するための領域（１）のレベルで検体を堆積することができる開口部を含む容器に含まれ得る。この装置に例は以下に示される。
【００９１】
本発明によれば、前記装置はまた吸収領域（４）を含む。本発明によれば、前記吸収領域（４）は当業者に知られる全ての吸収固体支持体であり得る。例えば、これは、吸収可能なブロット紙、スポンジ、綿、軽量フェルト又は合成繊維などである。
【００９２】
有利には、本発明によれば、領域（１）及び（２）の支持体は、その端部の一つで重なっており、領域（２）の他の端部は領域（３）の一つの端部と重なっている。種々の領域（１）から（３）が重なることは、有利には、前記検体が適用され、及び／又は前記領域（１）の自由端部が前記検体に浸漬される場合に、前記検体がキャピラリー作用により前記種々の領域に移動することが可能となる。好ましくは、領域（１）及び（２）は、同じ支持体に設けられる。この装置の例は以下に示される。
【００９３】
好ましくは、吸収領域（４）が前記領域（３）の自由端部に重なる。従って、領域（４）は、前記装置の種々の領域を通じて検体の移動を加速し得る。有利には、領域（４）は、検体の過剰流体を吸収することを可能とする。
【００９４】
本発明によれば、前記種々の領域（１）から（４）は、独立して保護フィルムでカバーされ得る。
これは、例えば、ポリビニルクロリド（ＰＶＣ）などのプラスチックフィルム、又はポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）又はポリ乳酸（ＰＬＡ）などの生分解性フィルムであり得る。
【００９５】
前記フィルムは有利には、本発明の装置の前記種々の領域を独立して保護することを可能にする。
【００９６】
本発明によれば、前記フィルムは、前記領域（１）から（４）の一つを独立してカバーする単一フィルム又は数枚のフィルムであり得る。本発明によれば、前記フィルムは、本発明の装置を部分的にカバーし、それによりある領域はカバーしないことがあり得る。
【００９７】
本発明によれば、前記フィルムは、前記装置の使用の前に除去できるように脱着可能である。本発明によれば、前記フィルムはその表面に説明を含み、有利には前記装置の識別を可能にする。
【００９８】
本発明はまた、本発明の方法を実施するためのキットに関し、前記キットは：
ー  前記の抗ＡＦＰ及び抗ＩＧＦＢＰ−１キャプチャ抗体、
ー  前記のラベル化抗ＡＦＰ及び抗ＩＧＦＢＰ−１抗体を含む。
【００９９】
本発明によれば、前記キットはまた、サンプリング手段、例えば前記のスワブ（綿棒）を含む。
【０１００】
本発明によれば、前記キットはまた、前記のキャプチャ抗体が付され得る固体支持体を含む。
【０１０１】
本発明はまた、本発明による装置の前記の胎膜破水の検出のための使用に関する。
【０１０２】
本発明は、有利には、胎膜破水を、例えばそれがミクロ破水及び／又はマクロ破水などのその大きさに関係なく及び／又はサンプル取得された羊水の容量に関係なく検出することを可能にする。
【０１０３】
本発明は有利には、偽陰性結果及び偽陽性結果を得る可能性を下げることを可能にする。
【０１０４】
加えて、本発明は有利には、妊娠の段階に拘わらず胎膜破水を検出することを可能にする。
【０１０５】
本発明はまた、妊娠の段階、羊水中のＡＦＰ及び／又はＩＧＦＢＰ−１の濃度及び／又は膣内又は子宮頸部検体内に存在する羊水の容量に拘わらず、信頼性に高い検出を可能にする。
【０１０６】
他の利点は、以下の、説明のための図面と実施例を理解することで当業者に明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】図１は、本発明による装置の正面図（Ａ）及び側面図（Ｂ）を示し、ガラスファイバ（１１）で作られた領域（１）、ラベル化抗ＩＧＦＢＰ−１抗体とラベルか抗ＡＦＰ抗体（１２）を含むガラスファイバ（１２）で作られた領域（２）、抗ＡＦＰキャプチャ抗体（１７）と抗ＩＧＦＢＰ−１キャプチャ抗体（１８）を含むニトロセルロースで作られた領域（３）、及び吸収紙（１４）で作られた領域（４）、及びフィルム（１５）（１６）を含む。
【図２】図２は、前記領域（１）のレベルで開口部（２１）と、抗ＡＦＰキャプチャ抗体（２４）と抗ＩＧＦＢＰ−１キャプチャ抗体（２５）を含む前記領域（３）のレベルで開口部（２２）を含む容器（２３）内に含まれる装置を示す。
【実施例】
【０１０８】
実施例１：免疫濾過装置の手段による胎膜破水検出の方法
ＰＢＳ緩衝液中に０．７５ｍｇ／ｍｌに希釈した抗ＡＦＰ抗体（ＡＢＡＦＰ−０４０４、ｃｌｏｎｅ４、Ａｒｉｓｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）及びまたＰＢＳ緩衝液中に０．７５ｍｇ／ｍｌに希釈した抗ＩＧＦＢＰ−１抗体（Ｉ２０３２、ｃｌｏｎｅ３３６２７．１１、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を調製した。
【０１０９】
前記抗体を、試薬分配自動化装置（Ｉｓｏｆｌｏｗ  Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ（登録商標）、Ｉｍａｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）を用いて、ニトロセルロース膜上に平行線形状で堆積し、その後インキュベータで３７℃大気下、湿度３０％未満で制御して乾燥した。前記膜はその後、約１センチメートル幅で２．５センチメートル長さのストリップに切り出した。それぞれのストリップを、プラスチックベースに設けられた吸収支持体上に設ける。前記ベースに適合するプラスチックカバーを前記ベース上に置いて手動圧力で封止する。前記プラスチックカバーは窓開口部を持ち、その表面積は、前記膜の表面積より小さい。前記膜は、前記カバーの窓の開口領域が完全に前記膜の上に設けられるように位置された。前記カバーは、前記膜に圧力をかけるように設計され、及び前記吸収体が、前記装置の種々の要素が前記カバーを閉じている間定められた位置を保つように設計される。
【０１１０】
検体は、無月経２４週妊娠女性から、ポリエステルの綿玉を持つ殺菌綿棒を用いて取得される。
【０１１１】
前記綿玉を、５０ｍＭのホウ酸塩（０２１０２３９１、Ｂｉｏｓｏｌｖｅ）、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ＡＰ−４５１０−０１、Ｓｅｒａｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び０．０５％のトリトンＸ−１００（ｐＨ９．３）を含む抽出溶液の２ｍｌを含む５ｍｌスクリューキャップチューブ（Ｄｕｓｔｃｈｅｒ）内に入れ、３０秒から１分間回転運動により撹拌する。前記綿棒をチューブから取り出す。
【０１１２】
前記抽出溶液をその後前記カバーの窓内に注入する。前記溶液は前記膜を通じて濾過され、前記吸収支持体へ吸収される。前記抽出溶液内に含まれるＡＦＰ及び／又はＩＧＦＢＰ−１それぞれのキャプチャ抗体と結合する。次のステップの間、前記キャプチャ抗体とは異なるパラトープを持ち、かつコロイド金でラベル化された抗ＡＦＰ抗体（ｃｌｏｎｅ３、Ａｒｉｓｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＡＢＡＦＰ−０４０３）及び抗ＩＧＦＢＰ−１抗体（ｃｌｏｎｅ６３０２（７Ｂ１１）、ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃｈ、５３４５−４８５９Ｘ）を含む可視化試薬が、前記キャプチャされたＡＦＰ及び／又はＩＧＦＢＰ−１抗体へ結合する。これにより、試験ライン上に紫色着色が現れる。例えばＰＢＳと１０％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む洗浄溶液で洗浄するステップは、洗浄液を前記窓に注入して前記コロイド粒子の全ての非結合物を除去することで実施される。このＡＦＰ及び／又はＩＧＦＢＰ−１ライン上の紫色着色ラインの存在は、胎膜破水を示す。
【０１１３】
実施例２：  胎膜破水検出のための免疫クロマトグラフ装置
前記ストリップを３０ｃｍｘ９．５ｃｍ（ＣＮＰＣ−ＳＳ１２  Ｒ−０３２／２、ＭＤＩ（登録商標））のラミネートカードから調製し、これは前記ニトロセルロース膜、前記吸収紙及びガラスファイバが組み込まれた接着層でカバーされたプラスチック支持体からなる。
【０１１４】
試薬分配自動装置（Ｉｓｏｆｌｏｗ  Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ、Ｉｍａｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（登録商標））を用いて、ＰＢＳ緩衝液中で４ｍｇ／ｍｌへ希釈されたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体、ＰＢＳ緩衝液中に０．７５ｍｇ／ｍｌへ希釈された抗ＡＦＰ抗体（ＡＢＡＦＰ−０４０４、ｃｌｏｎｅ４、Ａｒｉｓｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、及びＰＢＳ緩衝液中に０．７５ｍｇ／ｍｌに希釈された抗ＩＧＦＢＰ−１抗体（Ｉ２０３２、ｃｌｏｎｅ３３６２７．１１、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））を、２５ｍｍ幅のニトロセルロース膜上（領域（１））、１から２ｍｍ幅の５ｍｍ離れた平行ラインの形状で、０．５μｌ／ｃｍの流速で堆積させる。
【０１１５】
これらの検索手段を堆積した後、これらのカードをインキュベータ中で３７℃で３０分間、湿度３０％未満に制御された大気下で乾燥する。
【０１１６】
共役混合物、即ちラベル化抗体を含む溶液を、抗ＩＧＦＢＰ−１（５３４５−４８５９Ｘ、ｃｌｏｎｅ６３０２（７Ｂ１１）、ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃｈ（登録商標））及び抗（ＡＢＡＦＰ−０４０３、ｃｌｏｎｅ３、Ａｒｉｓｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（登録商標））抗体から調製し、その後ラテックス粒子（ＤＢＫ１０４０ＣＢ、直径０．３９μｍ、Ｄｕｋｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（登録商標））へ、前記供給元の指示書又は続く指示により結合させる。
【０１１７】
前記ラテックス粒子（１５０μｌ）は、１ｍｌのＰＢＳを用いて、１．５ｍｌエッペンドルフ（登録商標）チューブ内で、１４０００回転／分（ｒｐｍ）で３０分間遠心させて、２回洗浄する。最終洗浄ステップで、前記ラテックス粒子を同じ溶液に再懸濁させる。前記ビーズのカルボキシル化部分を５０μｇのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸（ＥＤＣ、Ｅ１７６９、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））を用いて活性化させる。活性化１５分後、前記抗体溶液を前記ラテックス粒子の１０μｇ／ｍｌの割合で添加される。得られる溶液を、２時間室温で、１．５ｍｌチューブに適する回転混合装置で注意深く撹拌する。続いて１４０００回転／分で遠心ステップの後、前記抗体が共役したラテックス粒子を回収することが可能となる。非特異的相互作用を避けるために、前記ペレットを、５０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４（Ｓ７９０７、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））、１％ＢＳＡ（ＡＰ−４５１０−０１、Ｓｅｒａｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標））を含む飽和溶液（ｐＨ７．４）の１ｍｌ中に取り出す。前記溶液を１時間、室温で前記回転混合装置内で撹拌し、３７℃で３０分間インキュベータ内に置かれる。前記溶液は、１４０００回転／分で１５分間最後に遠心される。得られたペレットを同じ飽和溶液に再懸濁させる。
【０１１８】
２５０μｌのＡＦＰ共役（ラベル化抗ＡＦＰ抗体）が補われたＩＧＦＢＰ−１共役（ラベル化抗ＩＧＦＢＰ−１抗体）へ、５０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４（Ｓ７９０７、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））、１ｍｌにつき適量の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ＡＰ−４５１０−０１、Ｓｅｒａｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、２０％スクロース（Ｓ８５０１、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）及び５％のトレハロース（Ｔ９５３１、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））を含む前記飽和溶液の１容量を添加する。得られる混合物を１５分間、室温で、１．５ｍｌチューブに適する回転混合装置で撹拌する。
【０１１９】
従って、前記抗体は、前記ラテックス粒子と結合され、これらはラベル化抗体の実施例に対応する。
【０１２０】
０．１ＭのＢ４Ｎａ２Ｏ７（Ｂ３５４５、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））、１％トリトンＸ−１００（Ｘ−１００、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））の溶液とｐＨ８．４で前処理した、寸法３０ｃｍｘ３．２ｃｍ（＃８９６４、Ａｈｌｓｔｒｏｍ、Ａｒｉｓｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（登録商標）を持つガラスファイバシート（領域（３））上に、前記ラテックスミクロ粒子へ結合された抗体の混合物を、４μｌ／ｃｍの流速でスプレーする。
【０１２１】
ガラスファイバのシートへ共役物の混合物を付することは、同じＩｓｏｆｌｏｗ  Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ（登録商標）装置を前記販売者指示書に従って行う。スプレー後、前記グラスファイバシートは、３７℃で半時間乾燥する。
【０１２２】
前記カードは、前記共役物埋め込みガラスファイバを、前記カードの下部接着部分に、前記ニトロセルロース膜を１から３ｍｍ重ねて前記ガラスファイバシートと共に接着結合させることで組み立てられる。同様に、寸法３０ｃｍｘ４．２ｃｍの高吸収紙（領域（２））（吸収パッド、Ａｈｌｓｔｒｏｍ２２２、ＭＡＰＤＳ−０１００、Ａｒｉｓｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を前記カードの上部に配置し、ニトロセルロース膜と１から３ｍｍ重ねるようにして移動流が形成できるようにする。自己接着性ラベルをその後前記２つのタイプの紙上に配置し、前記ストリップの保護及び識別の機能を持たせる。
【０１２３】
組み立てられた前記カードは切刃（ＧＣＩ−８００、Ｚｅｔａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）又は多切刃装置（回転カッター、Ａｒｉｓｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ）を用いて切断し。４ｍｍ幅の小ストリップとする。ストリップは以下の図で代表される。
【０１２４】
実施例３：  本発明の方法を実施するための装置の使用例
（１）５０ｍＭホウ酸塩（０２１０２３９１、Ｂｉｏｓｏｌｖｅ）、１％ＢＳＡ（ＡＰ−４５１０−０１、Ｓｅｒａｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び０．０５％トリトンＸ−１００（ｐＨ９．３）の溶液２．５ｍｌを、５ｍｌのスクリューキャップチューブへ導入した。
（２）ポリエステル綿玉を持つ殺菌綿棒で検体を取得し、実施例２で記載された装置に堆積した。
（３）得られた装置を前記のスクリューキャップチューブ内に導入した。
（４）結果は移動１０分後に得られた。
【０１２５】
前記試験は、ＡＦＰ及びＩＧＢＦＰ−１に対応する２つのバンドの少なくとも１つが着色する場合には陽性である。
【０１２６】
試験が陽性の場合、前記試験の信憑性は、完全な婦人科検査によりその結果が確認されるか否定されるか検証することができる。
【０１２７】
実施例４：  本発明の方法を実施する装置を用いて実施された、ＡＦＰ及びＩＧＦＢＰ−１のプロテアーゼ安定性の比較
この例では、実施例２で記載された免疫クロマトグラフ装置が変更され、前記ＩＧＦＢＰ−１とＡＦＰ及び分子を検出するためコロイド金でラベル化するシステムを使用する。高ＩＧＦＢＰ−１及び高ＡＦＰ抗体のペアが、本発明の記載中に示される抗体のリストから選択された。
【０１２８】
羊水の２マイクロリットル及び１０マイクロリットルが、それぞれ２．５ミリリットルの抽出溶液を含む２つの別のチューブへ分配される。新鮮な尿２００マイクロリットルをそれぞれ２つのチューブに添加する。前記ストリップは、前記の実施例３で記載された態様に従って、前記抽出溶液内に置かれる。前記抽出溶液を含むチューブはその後３７℃に維持され、２４時間、４８時間及び６日後試験される。羊水検体は、ＡＦＰ及びＩＧＦＢＰ−１につき同じ強度の開始信号（時間Ｔ０で）を生成するように選択された。
【０１２９】
羊水の２マイクロリットルを含むチューブに関しては、インキュベーションの２４時間後、ＩＧＦＢＰ−１信号は大きく減少し、一方ＡＦＰ信号は非常に僅か減少した。インキュベーション２４時間後、ＩＧＦＢＰ−１信号は消失し、一方ＡＦＰ信号強度は２４時間での値と比べて変化しなかった。６日目で、ＡＦＰ信号はなお残り目に見ることができ変化していなかったが、一方ＩＧＦＢＰ−１信号は欠失したままである。
【０１３０】
羊水を１０マイクロリットル含むチューブに関しては、インキュベーション２４時間後、ＩＧＦＢＰ−１及びＡＦＰ信号は変化がなかった。インキュベーション４８時間後、ＩＧＦＢＰ−１信号は減少し、一方ＡＦＰ信号は変化しなかった。６日目で、ＡＦＰ信号はなお変化していなかったが、一方ＩＧＦＢＰ−１信号は非常に減少し、目には痕跡として見ることができた。
【０１３１】
実施例５：  ＡＦＰ／ＩＧＦＢＰ−１組み合わせと、ＩＧＦＢＰ−１のみとの性能レベルの比較
前向き研究を、２０１０年１１月１７日から２０１１年１月１５日まで、患者１０２人のグループで行った。無月経（ＷＡ）の１２週後羊水の流出が疑われるために相談した患者、及び鏡を用いた臨床検査で羊水検査のための生物的試験を実施することが見出された患者の全てが含まれた。子宮出血を呈する患者は含まれていなかった。検体の取得は、膣円蓋に存在する分泌物を、本発明の方法を実施する装置で使用されたポリエステル綿玉（２５−８０６、Ｐｕｒ−Ｗｒａｐｓ（登録商標）Ｐｕｒｉｔａｎ）及びＡＣＴＩＭＰＲＯＭ試験で用いるＡＣＴＩＭ（登録商標）ＰＲＯＭ綿棒（２５−８０６、Ｐｕｒ−Ｗｒａｐｓ（登録商標）Ｐｕｒｉｔａｎ）との綿棒２つで平行に集めることで実施された。
【０１３２】
ＡＣＴＩＭ（登録商標）ＰＲＯＭ（Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ（登録商標）は、人ＩＧＦＢＰ−１に対する２つの抗体を用いる免疫クロマトグラフ試験である。１つはブルーラテックス粒子へ付され、他方はキャプチャラインを形成する前記ストリップの膜上に固定化される。前記綿棒を前記キットの０．５ｍｌの抽出溶液（ウシ血清アルブミン、プロテアーゼインヒビター及び保存剤を含むリン酸緩衝液）に浸漬する。１０秒間激しく撹拌する。前記ストリップは、前記液体の最前線が前記結果領域に到達するまで浸漬し、その後取り出される。読み取りは移動５分後に実施される。
【０１３３】
２つのブルーラインが現れる場合には陽性と判断され、従って、ＩＧＦＢＰ−１が２５μｇ／ｍｌを超えて存在することを示す。
【０１３４】
本発明の方法を実施する装置は、２つの別のライン上にＩＧＦＢＰ−１及びＡＦＰ分子を検出するために、前記ストリップの膜上に固定されたＡＦＰ及びＩＧＦＢＰ−１抗体の、コロイド金でラベル化した抗ＡＦＰ及び抗ＩＧＦＢＰ−１抗体のシステムを使用する、免疫クロマトグラフ試験である。この例では、前記綿棒は１０秒間、１％ＢＳＡ（ＡＰ−４５１０−０１、Ｓｅｒａｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び０．０５％トリトンＸ−１００（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むｐＨ７．４の５０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４（Ｐ４４１７、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の０．５ｍｌを含む、２ｍｌのスクリューキャップチューブ（０１５６１０、Ｄｕｓｔｃｈｅｒ）に浸漬された。この希釈検体は、全てのサンプルが選択されるまで−２０℃で保存された。試験が実施される場合には、本発明の方法を実施する装置が、前記のスクリューキャップチューブ内に導入された。結果は、移動後１０分後に読まれた。
【０１３５】
前記ストリップは、その上に前記ニトロセルロース膜、吸収紙及びガラスファイバが組み立てられた接着層でカバーされたプラスチック支持体からなる寸法３０ｃｍｘ９．５ｃｍのラミネートカード（ＣＮＰＣ−ＳＳ１２  Ｒ−０３２／２、ＭＤＩ（登録商標））から調製された。
【０１３６】
試薬分配自動装置（Ｉｓｏｆｌｏｗ  Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ、Ｉｍａｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（登録商標））を用いて、０．０１５ＭＮａ２ＨＰＯ４（Ｐ４４１７、Ｓｉｇｍａ（登録商標））及び０．１５ＭＮａＣｌ（Ｓ７６５３、Ｓｉｇｍａ（登録商標））を含むｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液中に２ｍｇ／ｍｌに希釈されたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＡＢＧＡＭ−０５００、Ａｒｉｓｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（登録商標））、次のリスト：Ａｎｔｉｃｏｒｐｓ  ｅｎ  Ｌｉｇｎｅ社（ｃａｔａｌｏｇ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢＩＮ９３６２４）、Ａｒｉｓｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社販売の抗体（ｃｌｏｎｅ１、カタログ番号ＡＢＡＦＰ−０４０１；ｃｌｏｎｅ２、カタログ番号ＡＢＡＦＰ−０４０２；ｃｌｏｎｅ３、カタログ番号ＡＢＡＦＰ−０４０３；ｃｌｏｎｅ４、カタログ番号ＡＢＡＦＰ−０４０４）、Ｈｙｔｅｓｔ社販売の抗体（ｃｌｏｎｅ５Ｈ７、ｃｌｏｎｅ４Ａ３及びｃｌｏｎｅＸＡ２、カタログ番号４Ｆ１６；ポリクローナル抗体、カタログ番号ＡＢＡＦＰ−０５０１）から選択され、ＰＢＳ緩衝液中で１ｍｇ／ｍｌに希釈された抗ＡＦＰ抗体と、及び次のリスト：Ｌｅｎｃｏ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社販売の抗ＩＧＦＢＰ−１抗体（カタログ番号Ｉ−６９５、Ｉ−７４６及びＩ−８０５）、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社販売の抗ＩＧＦＢＰ−１抗体（カタログ番号Ｉ２０３２、ｃｌｏｎｅ３３６２７．１１）、及びＨｙｔｅｓｔ社販売の抗体（カタログ番号４Ｉ５２；ｃｌｏｎｅＡ８及びｃｌｏｎｅＧ２；カタログ番号４ＩＧ８；ｃｌｏｎｅＧ５Ｆ８及びｃｌｏｎｅＣ７Ｂ９）を、ＰＢＳ緩衝液に０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した抗体から選択される抗ＩＧＦＢＰ−１抗体とを、ニトロセルロース膜上に、２５ｍｍ幅（領域（１））で、お互いに１から２ｍｍの幅で５ｍｍ離れた平行ラインの形で、１μｌ／ｃｍの流速で堆積させた。
【０１３７】
これらの検索手段の堆積の後、これらのカードは、乾燥させるために、湿度を３０％未満に制御された大気下で３０分間３７℃のインキュベータ内に保持した。
【０１３８】
前記共役混合物、即ちラベル化抗体を含む混合物は、以下の手順で予め金コロイドに結合された、次のリスト：Ｌｅｎｃｏ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社販売の抗ＩＧＦＢＰ−１抗体（カタログ番号Ｉ−６９５、Ｉ−７４６及びＩ−８０５）、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社販売の抗ＩＧＦＢＰ−１抗体（カタログ番号Ｉ２０３２、ｃｌｏｎｅ３３６２７．１１）、ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃｈ社販売の抗体（カタログ番号５３４５−４８５９Ｘ、ｃｌｏｎｅ６３０２（７Ｂ１１）；カタログ番号５３４５−４８０９Ｘ、ｃｌｏｎｅ７Ｂ１０）及びＨｙｔｅｓｔ社販売の抗体（カタログ番号４Ｉ５２；ｃｌｏｎｅＡ８及びｃｌｏｎｅＧ２；カタログ番号４ＩＧ８；ｃｌｏｎｅ５Ｆ８及びｃｌｏｎｅ  Ｃ７Ｂ９）から選択される前記抗ＩＧＦＢＰ−１抗体と、次のリスト：Ａｎｔｉｃｏｒｐｓ  ｅｎ  Ｌｉｇｎｅ社（カタログ番号ＡＢＩＮ９３６２４）、Ａｒｉｓｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社販売の抗体（ｃｌｏｎｅ１、カタログ番号ＡＢＡＦＰ−０４０１；ｃｌｏｎｅ２、カタログ番号ＡＢＡＦＰ−０４０２；ｃｌｏｎｅ３、カタログ番号ＡＢＡＦＰ−０４０３；ｃｌｏｎｅ４、カタログ番号ＡＢＡＦＰ−０４０４）及びＨｙｔｅｓｔ社販売の抗体（ｃｌｏｎｅ５Ｈ７、ｃｌｏｎｅ４Ａ３及びｃｌｏｎｅＸＡ２、カタログ番号４Ｆ１６；ポリクローナル抗体、カタログ番号ＡＢＡＦＰ−０５０１）から選択される前記抗ＡＦＰ抗体から調製される。
【０１３９】
前記金コロイドへの結合手順は：１％塩化金溶液（Ｇ４０２２、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の１ｍｌを１００ｍｌの蒸留水に添加した。水を沸点まで加熱し、１％クエン酸ナトリウム溶液（Ｓ１８０４、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の２．５ｍｌを添加した。前記溶液は無色となりその後紫色となった。１分後、前記溶液を、チェリーレッド色になるまで加熱した。水を沸点まで加熱し、１％塩化金溶液（Ｇ４０２２、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の８．６ｍｌを添加した。前記溶液は暗青色、実質的に黒色となり、その後紫色となり、これを室温まで冷却した。
【０１４０】
最初、前記得られた前記紫色コロイド金溶液の１０ｍｌのｐＨをｐＨ７．８へ、０．２Ｍ炭酸カリウム溶液（２６９６１９、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて調節し、及び次に、前記紫色コロイド金溶液のｐＨを０．２Ｍの炭酸カリウム（２６９６１９、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてｐＨ７．３へ調節した。抗ＩＧＦＢＰ−１の２００μｇを１ｍｌの蒸留水に添加し、その後ｐＨ７．８で紫色コロイド金溶液の１０ｍｌに急激に添加した。抗ＡＦＰの２００μｇを１ｍｌの蒸留水に添加し、その後ｐＨ７．３で紫色コロイド金溶液の１０ｍｌに急激に添加した。これらのチューブを回転撹拌装置（ＳＢ２、Ｓｔｕａｒｔ（登録商標））に２０分間に置いた。１０％ＢＳＡを溶液（ＡＰ−４５１０−０１、Ｓｅｒａｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標））の１ｍｌ及び１０％ＰＥＧ溶液（８１２７５、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））の５０μｌを添加した。前記２つのチューブを、４０００遠心加速度で３０分間遠心した（５８０４、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標））。上澄みを真空ポンプ（１５９６００、Ｂｒａｎｄ（登録商標））を用いて除き、ペレットを、２０ｍＭＴｒｉｓ塩基（２６−１２８−３０９４、Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ  （登録商標））、５０ｍＭＮａＣｌ（Ｓ７６５３、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））、０．２％ＢＳＡ（ＡＰ−４５１０−０１、Ｓｅｒａｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標））、１０％スクロース（Ｓ８５０１、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）及び５％トレハロース（Ｔ９５３１、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））を含む再懸濁緩衝液（ｐＨ８．０）の１ｍｌを用いて取り出した。
【０１４１】
５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４（Ｓ７９０７、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ＡＰ−４５１０−０１、Ｓｅｒａｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、２０％のスクロース（Ｓ８５０１、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）及び５％のトレハロース（Ｔ９５３１、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））を含む飽和溶液の５００μｌを、２５０μｌのＡＦＰ共役物で補われた１５０μｌのＩＧＦＢＰ−１共役物の溶液へ添加した。得られた混合物を室温で１５分間、１．５ｍｌチューブに適合する回転撹拌装置で撹拌した。
【０１４２】
前記抗体をそれにより前記コロイド金粒子に結合し、ラベル化された抗体の例に対応する。金ミクロ粒子に結合した抗体の混合物はその後、０．１ＭのＢ４Ｎａ２Ｏ７溶液（Ｂ３５４５、  Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））、１％トリトンＸ−１００（Ｘ−１００、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））とでｐＨ８．４で前処理された寸法３０ｃｍｘ３．２ｃｍのガラスファイバのシート（＃８９６４、Ａｈｌｓｔｒｏｍ、Ａｒｉｓｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ  ｔｒａｄｅｍａｒｋ））上に、４μｌ／ｃｍの流速でスプレーした（領域（３））。
【０１４３】
この共役物の混合物をガラスファイバシートへ付すことは、類似のＩｓｏｆｌｏｗ  Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ（登録商標）装置を販売者の指示書に従って実施することができる。スプレー後に、ガラスファイバシートを３７度で１時間３０分乾燥させた。
【０１４４】
前記カードは、前記共役物組み込みガラスファイバを前記カードの下部接着部分へ、前記ニトロセルロース膜を１から３ｍｍ重ねて前記ガラスファイバシートと接着結合により組み立てられた。同様に、寸法３０ｃｍｘ４．２ｃｍの高吸収性紙（領域（２））（吸収パッド、Ａｈｌｓｔｒｏｍ２２２、ＭＡＰＤＳ−０１００、Ａｒｉｓｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を、前記カードの上部部分に、前記ニトロセルロース膜と１から３ｍｍ重ねて配置して、移動流を生成させる。自己接着性ラベルをその後前記２つのタイプの紙上に設け、前記ストリップの保護と識別の機能を持たせる。
【０１４５】
前記カードは、切刃（ＧＣＩ−８００、Ｚｅｔａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、又は回転多切刃装置（回転カッター、Ａｒｉｓｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ）を用いて、４ｍｍ幅のストリップに切断した。
【０１４６】
以下表１は、得られた結果の例についての詳細及び産科医による対応する解釈も与える。
【０１４７】
【表１】
2013527467.tif 000003
2013527467.tif 000004
2013527467.tif 000005
2013527467.tif 000006
2013527467.tif 000007
（注）ＷＡ＝無月経週
前記臨床医の解釈は、全記録に基づき妊娠の終了後に与えられたものであり、試験が行われた時の臨床的及び超音波診断データを含むものであるが又、続いて誕生までに生じた事象も含む。破水診断は、咳試験にも拘わらず鏡検査によりなんらの流れも見られなかった場合、超音波診断で流体量が正常値を維持する場合、及び少なくとも４８時間さらに流れに特別の事象がなく帰宅した場合、又は４８時間以内に陣痛が始まる予定の患者について臨床的流れがなく羊膜嚢が明確に見られた場合には、破水診断は行われなかった。前記意見は、流れが示された場合、咳試験で鏡検査が流れを認めた場合及び／又は前記試験に続き４８時間内の陣痛の間を含め羊膜嚢が見られない場合には破水であった。流れが見られなかったが、超音波検査で羊水過小であった患者は（４８時間毎に）注深くモニタされるか、又は４８時間以内に誘発された。破水の診断は、流れが４８時間以内に確実に再発される場合か、誘発された患者について陣痛の間を含めて羊膜嚢が見られない場合になされた。
【０１４８】
試験の信憑性は、この結果を確認又は否定することを可能とする完全な産婦人科の検査により検証される。
【０１４９】
サンプルの２１．６％（１０２の内の２２ケース）が、３つのマーカーの一つと、産婦人科の意見を表す臨床データとの間で不一致が示される。
【０１５０】
以下の表２及び表３は、臨床データの結果の例と臨床医により解釈を示す。
【０１５１】
表２：結果の例を、臨床データと一致していない場合も含めて示す。
【０１５２】
【表２】
2013527467.tif 000008
（注）ＷＡ＝無月経週、ｄ＝日
【０１５３】
表３：表は、臨床分析と一致しない場合も含む。
【表３】
2013527467.tif 000009
（注）ＷＡ＝無月経週、ｄ＝日
以下表４は、本発明の方法で得られた結果を従来技術方法と比較して示す。
【０１５４】
【表４】
2013527467.tif 000010
従って、ＩＧＦＢＰ−１及びＡＦＰの検出を含む本発明の方法は、１００％の特異性を得ることが可能となり、従って全ての偽陽性結果を除去することができ、ＡＦＰ及びＦＢＰ−１が検出される場合には、従来技術装置とは対照的に胎膜の破水が存在することを結論することができる。これは、従来技術試験の偽陽性結果が臨床医及び患者にとって大きな問題を提示するものであり、それにより不要な医学的処置（抗生物質投与、陣痛誘発又は帝王切開のきっかけを生じる恐れがあるからである。
【０１５５】
加えて、本発明によれば、例えば得られた結果がＡＦＰ＋／ＩＧＦＢＰ−１−（臨床医により決定されていないとして）である場合には、５ｎｇ／ｍｌの検出限界を持つＩＧＦＢＰ−１検出の追加のステップを実施することができる。従って、次の表５に示されるように、胎膜の破水検出の感度を増加させることが可能となる。
【０１５６】
【表５】
2013527467.tif 000011
本発明の他の実施態様によれば、ＡＦＰ速度論が考慮される。特に羊水流の濃度が妊娠終期には減少する。従って、ＡＦＰのの検出又は非検出は、サンプルが取得された日付に関連する。特に、サンプルが、無月経の３９週の前又は間／後に取得されたかどうかにより分類された。
【０１５７】
表６は、得られた結果及びサンプルの日付を示す。
【０１５８】
【表６】
2013527467.tif 000012
上で示したように、この実施態様は、本発明の方法を用いて確実に破水が検出されることが示された。
【０１５９】
加えて、この実施態様によると、試験がＡＦＰ／ＩＧＦＢＰ−１について試験された集合は、サンプルがその期間が３９週未満（サブグループ１）の患者からか、又は３９週以上（サブグループ２）の患者からに依存して半分に分けられる。現在の例では、サブグループ１はなんら偽陽性を示さなかった４５患者に対応し、サブグループ２は５人の偽陰性が検出された２４患者に対応する。試験がＡＦＰ＋／ＩＧＦＢＰ−１−であった試験された集合は、その期間が３９週（サブグループ３）未満である患者からのサンプルか、又はその期間が３９週以上（サブグループ４）である患者からのサンプルかどうかにより、分けられた。
【０１６０】
以下の表７に示されるように、本発明の方法は、サブグループ２とサブグループ３に対応する患者を除いた場合には、胎膜破水かそうでないかを１００％の特異性を持って検出することを可能とする。逆に言えば、従来技術の方法は、そのような結果を得ることはできなかった。特に、知られた装置では偽陽性及び偽陰性が得られ、結果が１００％信頼できる患者のサブグループを同定することが可能ではなかった。
【０１６１】
【表７】
2013527467.tif 000013
この例に示されるように、本発明の方法は、胎膜の破水又は非破水についての信頼性の高い結果を得ることを可能とし、有利には補助的試験及び／又は臨床検査で済ますことを可能にする。
【０１６２】
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１１.  Ｒｕｔａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒａｐｉｄ  ｓｔｒｉｐ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｆｏｅｔａｌ  ｒｕｐｔｕｒｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．  Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ．  ２５３；  （１９９６）  ９１−１０１
１２．Ｋｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｒｕｐｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｉｎ  ｐｒｅｔｅｒｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ、  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＡＦＰ  ｋｉｔ：  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ＲＯＭ−Ｃｈｅｃｋ  ａｎｄ／ｏｒ  ｎｉｔｒａｚｉｎｅ  ｔｅｓｔ．  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６９  （１９９６）  ７７−８２
１３．Ｂｅｌｌ  Ｃ．  Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ａｎｄ  ｄｅｃｉｄｕａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  ｓｔｕｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｍａｔｅｒｎａｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｓｅｒｕｍ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．  Ｖｏｌ．  １−３ １２９−１４３．  １９８６．
１４.  Ｎａｚｉｍｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．    Ｂｌｏｏｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  ｏｆ  ＰＡＭＧ−１  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  １  （Ｓｏｍａｔｏｍｅｄｉｎ  Ｃ）  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ．  Ｂｕｌｌｅｔ．  Ｅｘｐｅｒｉｍ．  Ｂｉｏｌ．  ａｎｄ  Ｍｅｄ．  １６６／９  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９９３
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【国際調査報告】
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