(57)【要約】  本発明は、種子の殻、脱油ケーキ、および粗グリセロール共生成物ストリームの価値付加と統合された、天日乾燥されたジャトロファクルカスの種子鞘全体からの脂肪酸メチルエステル（バイオディーゼル）の調製のためのより単純で、よりエネルギー効率の良い方法を提供する。より具体的には、本発明は、蒸留による過剰なメタノールの回収の必要性なく実施する方法、メチルエステルの精製のための対費用効果の高い樹脂処理、ならびに効率的で対費用効果の高い方法での高密度エネルギーブリケットおよびポリヒドロキシアルカノエート生分解性ポリマーの調製のための共ストリームの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遊離脂肪酸（ＦＦＡ）１．０６％を含むジャトロファの被包された種子からのジャトロファメチルエステル（ＪＭＥ）および副産物の調製のための統合的な方法であって、
（ｉ）殻取り機において被包されたジャトロファの種子から機械的に殻を取り、ジャトロファの殻およびジャトロファの種子を得る工程、
（ｉｉ）搾油機を使用して、工程（ｉ）において得られたジャトロファの種子から、ジャトロファ油と、窒素４〜６％を有するジャトロファ油ケーキと、廃油スラッジとを排出する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において得られたジャトロファ油を塩基によって中和する工程、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において得られた中和したジャトロファ油の一部を１０〜２０分間、攪拌しながら、アルコールおよび塩基でエステル交換して、粗グリセロール層ＧＬ１と粗ジャトロファメチルエステル（ＪＭＥ）を分離する工程、
（ｖ）工程（ｉｖ）において得られた粗ＪＭＥを純グリセロール層によって３回洗浄して、メタノールとＫＯＨとを含む３つの不純なグリセロール層、ＧＬ２、ＧＬ３、およびＧＬ４を分離して、グリセロール洗浄ＪＭＥ−Ｇ3Ｗを得る工程、
（ｖｉ）工程（ｖ）において得られたＪＭＥ−Ｇ3Ｗを精製して、アルカリ金属不純物を除去する工程、
（ｖｉｉ）工程（ｉｖ）および（ｖ）において得られたグリセロール層ＧＬ５（ＧＬ１＋ＧＬ２＋ＧＬ３）によって、工程（ｉｉｉ）において得られた残りの中和した油の部分を処理して、ＪＭＥとグリセロール層ＧＬ６とを得る工程、
（ｖｉｉｉ）工程（ｖｉｉ）において得られたＪＭＥとグリセロール層ＧＬ６を分離する工程、
（ｉｘ）メタノールを取り除くため、中和した油の残りの部分によって、工程（ｖｉｉｉ）において得られたグリセロール層ＧＬ６を処理して、ＪＭＥとグリセロール層ＧＬ７とを得る工程、
（ｘ）工程（ｉｘ）において得られたＪＭＥとグリセロール層ＧＬ７を分離する工程、
（ｘｉ）ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の生成のためまたは硫酸によるアルカリの中和のために、工程ｘ）において得られたグリセロール層ＧＬ７を直接使用して、純グリセロールと底部残留物ＧＬ８とを得る工程、
（ｘｉｉ）工程（ｖｉ）において得られたＪＭＥ−Ｇ3Ｗと工程（ｖｉｉｉ）および（ｘ）において得られたＪＭＥとを組み合わせて、組合せメチルエステルを得る工程、および
（ｘｉｉｉ）工程（ｘｉｉ）において得られた組合たメチルエステルをＫＯＨメタノール溶液でエステル交換して、総グリセロール０．０８８％および遊離グリセロール０．００５％を有する純粋なジャトロファメチルエステル（バイオディーゼル）を生成する工程
を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の副産物の調製のための統合的な方法であって、
ａ）請求項１に記載の工程（ｉｉ）において得られた廃油スラッジを添加して、ブリケット製造機において請求項１に記載の工程（ｉ）において得られたジャトロファの殻をブリケット化して、副産物として密度１．０５〜１．１０ｇ／ｃｍ3のジャトロファのブリケットを得る工程；
ｂ）請求項１に記載の工程（ｉｉ）において得られた窒素４〜６％を有するジャトロファ油ケーキをＨ3ＰＯ4、Ｈ2ＳＯ4で加水分解して、副産物としてジャトロファ油ケーキ加水分解物（ＪＯＣＨ）を得る工程
を含む方法。
【請求項３】
請求項１に記載の副産物ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の調製のための統合的な方法であって、
Ｉ．請求項１の工程（ｘｉ）において得られた底部残留物ＧＬ８もしくは請求項１の工程（ｘ）において得られたＧＬ７、またはそれらの組合せ２〜１０％（ｗ／ｖ）を含む成長兼生成培地中へ、土壌細菌ＭＴＣＣ５３４３または海洋性細菌ＭＴＣＣ５３４５、より好ましくは海洋性細菌ＭＴＣＣ５３４５種子の培養物１〜１０％を接種し、２５〜４０℃の範囲の温度で、ｐＨ７．０〜８．０で、２４〜９６時間の期間インキュベートして、発酵させる工程；
ＩＩ．発酵物の遠心分離によって細胞を採取して、ペレットを得る工程；
ＩＩＩ．ペレットの遠心分離によって固形ポリマーを回収する工程；
ＩＶ．水およびメタノールによって固形ポリマーを洗浄して、ＰＨＡを得る工程；
Ｖ．クロロホルムにＰＨＡ０．５〜５％を溶解して、ＰＨＡ膜を得る工程
を含む方法。
【請求項４】
種子が被包されている場合、天日乾燥された種子鞘全体が特性を保持することを増強し、油は０．５〜２．０％の遊離脂肪酸含有量を有するだけであり、それによってメチルエステルの収率を増加させることを特徴とする、請求項１の工程（ｉ）に記載の方法。
【請求項５】
殻取りを、（ｉ）種子を損傷せずに、静止表面との摩擦によって開殻を破砕する回転ドラムからなる鞘破砕機と、（ｉｉ）種子を殻から分離し、殻と反対の方向へ動かすように種子を方向付ける、傾斜している振動ふるいと、（ｉｉｉ）殻の中の種子を失うことなく、別に収集される殻を吹き飛ばす送風機を使用することとを含む、特別に設計された殻取り機において行う、請求項１の工程（ｉ）に記載の方法。
【請求項６】
使用される塩基は、水酸化カリウムおよび水酸化ナトリウムからなる群から選択される、請求項１の工程（ｉｖ）に記載の方法。
【請求項７】
アルコールは、メタノールおよびエタノールからなる群から選択される、請求項１の工程（ｉｖ）に記載の方法。
【請求項８】
ＪＭＥ−Ｇ3Ｗ層を、マクロポーラスカチオン交換樹脂を使用することによって精製して、アルカリ金属不純物を除去する、請求項１の工程（ｖｉ）に記載の方法。
【請求項９】
スチレン−ジビニルベンゼンコポリマーと硫酸とを使用することによって、マクロポーラスカチオン交換樹脂を調製する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
細孔形成剤としてセチルアルコールを使用するスチレンの懸濁重合によって、スチレン−ジビニルベンゼンコポリマーを調製する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
樹脂処理されたＪＭＥ−Ｇ3Ｗ層は、最大［Ｎａ+］および［Ｋ+］不純物レベル１５〜３０ｐｐｍないし＜０．５ｐｐｍと、メタノール不純物レベル０．４〜０．６％（ｗ／ｗ）と、水分レベル５００〜１５００ｐｐｍと、総グリセロール含有量０．２〜０．３％（ｗ／ｗ）と、低級遊離脂肪酸含有量０．１５％〜０．２５％（ｗ／ｗ）とを有する、請求項１の工程（ｖ）に記載の方法。
【請求項１２】
底部残留物は、主として固体およびさらに蒸留可能な溶媒／生成物の観点から価値のない自由液体からなる、成功したサイクルの後に残される残留物と定義される、請求項１の工程（ｘｉ）に記載の方法。
【請求項１３】
ブリケット化を、（ｉ）傾斜したスクリューフィーダーと、（ｉｉ）攪拌器および添加剤を供給する開口部の付いた混合デバイスと、（ｉｉｉ）ブリケットを成形するためのダイおよび圧縮のための高圧を生成する油圧装置からなる圧縮システムと、（ｉｖ）形成されたブリケットを冷却するためのブリケット運搬システムとを含む、ブリケット製造機において行った、請求項２の工程（ａ）に記載の方法。
【請求項１４】
得られた殻は、バルク密度０．０８ｇ／ｃｍ3と発熱量３７００ｋｃａｌ／ｋｇとを有していた、請求項１の工程（ｉ）に記載の方法。
【請求項１５】
成長培地は、キングＢ培地、ゾーベル海洋性培地、ならびにＧＬ７およびＧＬ８による脱油ジャトロファ油ケーキ加水分解物（ＪＯＣＨ）からなる群から選択される、請求項３の工程（Ｉ）に記載の方法。
【請求項１６】
細胞乾燥重量に対するＰＨＡの収率は、６９％〜７７％の範囲内であった、請求項３に記載の方法。
【請求項１７】
得られたＰＨＡは、標準ＰＨＡのＮＭＲプロファイルに一致し、ＤＳＣによる融点が、１６６．２℃であり、ＧＰＣデータが、Ｍw、Ｍn、およびＭw／Ｍn（多分散度指数）値、それぞれ３５９９０、２４５８３、および１．４６を示した、請求項３に記載の方法。
【請求項１８】
上記工程は、多様なトリグリセリド油に等しく適用しうる、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
技術分野
本発明は、種子鞘全体からのジャトロファメチルエステルの調製の改良された、統合的な方法に関する。より具体的には、本発明は、蒸留による過剰なメタノールの回収の必要性なく実施する方法、メチルエステルの精製のための対費用効果の高い樹脂処理、ならびに効率的で対費用効果の高い方法での高密度エネルギーブリケットおよびポリヒドロキシアルカノエート生分解性ポリマーの調製のための共ストリームの使用に関する。
【０００２】
背景技術
ガソリンおよびディーゼルエンジンでの使用のためのジャトロファクルカス油に関するオーストラリア特許第ＡＵ−Ａ−１５４４８／８３号（有宏化学工業株式会社に譲渡された）を参照することができる。この先駆的な取り組みは、ジャトロファ油の利点を明らかにしたが、粗油の粘性が高すぎるために、今日のディーゼルエンジンにおいて大幅な割合で使用できないことは、当業者によく知られている。
【０００３】
酸によって触媒されるエステル化法およびアルカリによって触媒されるエステル交換法の組合せにより脂肪酸アルキルエステルを生成する関連方法を開示している、Ｈａａｓらによる米国特許第６，３９９，８００号およびＢｒｕｎｎｅｒらによる米国特許出願第２００４／０１０２６４０Ａ１号を参照することができる。本出願の主題である発明のいずれについても、言及されていない。
【０００４】
硫酸触媒とパラトルエンスルホン酸触媒とを使用して、動物性脂肪を含む種々のトリグリセリドからメチルエステルを得る、ドイツ特許出願第ＤＥ１０２，４３，７００Ａ１号も、参照することができる。本出願の主題について、言及されていない。
【０００５】
種子全体からのジャトロファメチルエステルの生成の統合的な方法が、副産物の回収と統合されて、開示されている、Ｇｈｏｓｈらによる特許出願（米国特許出願第１１／００２３９号；ＰＣＴ／ＩＮ０４／００３２９および添付の国内段階出願）を参照することができる。種子全体から排出される粗油を、ＮａＯＨによって中和して、遊離脂肪酸含有量を減らし、次に、トリグリセリド１モルにつきメタノール３モルという理論上の必要量に対して、トリグリセリド油１モルにつきメタノール５．０〜５．５モルによって、ＫＯＨメタノール溶液でエステル交換する。その後で、メチルエステルを、純グリセロール（メチルエステル１００ｋｇにつき４〜５ｋｇ）による洗浄を通じて精製し、次いで水で洗浄して、純度＞９８％で、ＥＮ１４２１４およびＡＳＴＭ規格による全ての要求を満たす生成物を得る。粗グリセロール層を蒸留してメタノールを回収し、次に、酸性化してＫ2ＳＯ4および石鹸様の物質を回収し、その後で、もう一度、蒸留させて、廃棄物として少量の底部残留物を残して、純粋な形態でグリセロールを回収する。この方法の１つ弱点は、油の全てがメチルエステルの形態で回収されるわけではなく、わずかな部分が、遊離脂肪酸含有量に比例して形成される石鹸に変換されることであり、したがって、油の遊離脂肪酸含有量をできるだけ低く維持することが不可避である。原料としての種子鞘全体の使用についても、メチルエステルを精製する水を必要としないいかなる方法についても、粗グリセロールからのポリヒドロキシアルカノエートの生成のためのいかなる方法についても、言及されていない。
【０００６】
上に引用された参考文献において、Ｇｈｏｓｈらによって開示された方法により調製された、そのままのメチルエステルによって運転されたＣクラスのメルセデス車の性能を述べている、Ｓ．Ｍａｎｄｐｅ、Ｓ．Ｋａｄｌａｓｋａｒ、Ｗ．ＤｅｇｅｎおよびＳ．Ｋｅｐｐｅｌｅｒによる「Ｏｎ  Ｒｏａｄ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｒａｉｌ  Ｄｉｅｓｅｌ  Ｖｅｈｉｃｌｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｊａｔｒｏｐｈａ  ｃｕｒｃａｓ  Ｐｌａｎｔ」と題された論文（ＳＡＥＩＮＤＩＡ会議２００５の予稿集、２００５−２５−３５６）を参照することができる。
【０００７】
同一のまたは異なる原料を使用して、様々な機関によって調製された世界中のメチルエステルについて評価した、「Ｌｏｃａｌ  ａｎｄ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ」と題されたヨーロッパのプロジェクト（Ａｌｔｅｎｅｒ  Ｃｏｎｔｒａｃｔ  Ｎｏ．４．１０３０／Ｃ／０２−０２２；ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｆｅｄａｒｅｎｅ．ｏｒｇ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｃｏｎｔｒａｃｔ／ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ／ｈｏｍｅ．ｈｔｍ；Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｏｒ−ＥＲＥＮ；Ｒｅｐｏｒｔ  ｃｏｕｒｔｅｓｙ  Ａｕｓｔｒｉａｎ  Ｂｉｏｆｕｅｌｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｅ．Ｖ．−Ｃｏ−ｃｏｎｔｒａｃｔｏｒ）を参照することができる。Ｇｈｏｓｈらの発明（ＰＣＴ／ＩＮ０４／００３２９、米国特許出願第１１／００２３９号）の方法により調製されたジャトロファメチルエステル（ＪＭＥ−０５−７２８）は、引き出されるパワー、燃費、および長期性能に関して、最高のエンジン性能を示した。
【０００８】
ジャトロファクルカスがバイオディーゼルの適切な供給源として保持する有望性について述べている、Ｄ．Ｆａｉｒｌｅｓｓによる「Ｂｉｏｆｕｅｌ−Ｔｈｅ  ｌｉｔｔｌｅ  ｓｈｒｕｂ  ｔｈａｔ  ｃｏｕｌｄ−ｍａｙ  ｂｅ」（Ｎａｔｕｒｅ、４４９号、２００７、６５２〜６５５頁）を参照することができる。
【０００９】
燃料供給源としてのバイオマスペレットの将来性および所望の規格を詳細に説明している、ＩＥＡ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ  Ｔａｓｋ４０のリポート（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｉｔｙ．ｎｏｒｔｈｂａｙ．ｏｎ．ｃａ／ｂｕｓｉｎｅｓｓ／ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｓ／ｗｏｏｄＰｅｌｌｅｔｓ／Ｇｌｏｂａｌ％２０ｗｏｏｄ％２０ｐｅｌｌｅｔｓ％２０ｍａｒｋｅｔ％２０ａｎｄ％２０ｉｎｄｕｓｔｒｙ％２０Ｎｏｖ％２００７％２０ｒｅｐｏｒｔ．ｐｄｆ）を参照することができる。
【００１０】
種子の分離後に、ジャトロファクルカスの種子鞘全体からブリケットを作る可能性を述べている、Ｇｈｏｓｈらによる「Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｊａｔｒｏｐｈａ  Ｍｅｔｈｙｌ  Ｅｓｔｅｒ（Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ）  ｉｎ  Ｉｎｄｉａ」と題された論文（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｔｕｄ．（Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ、Ｕ．Ｋ．）−ｓｐｅｃｉａｌ  ｉｓｓｕｅ  ｏｎ  Ｉｎｄｉａ’ｓ  ｆｕｔｕｒｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｏｐｔｉｏｎｓ、２００７、６４号、６５９〜６７４頁）も、参照することができる。しかし、このようなブリケットを作るいかなる方法についての言及も、それらの規格についての言及もない。
【００１１】
バイオディーゼルの精製の様々な方法が記載されている、Ｍ．ＢｅｒｒｉｏｓおよびＲ．Ｌ．Ｓｋｅｌｔｏｎによる「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ」と題された論文（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２００８、４５９〜４６５頁）を参照することができる。特に、相対評価が、水洗浄、イオン交換樹脂の使用、および吸着剤としてのケイ酸マグネシウムの使用について行われた。
【００１２】
水を必要としない方法とする蒸留法による菜種油のメチルエステルの生成の方法を開示している、Ｇｒｏｓｓらによるドイツ特許第ＤＥ４３０１６８６Ｃ１号を参照することができる。
【００１３】
孔径０．６、０．２、および０．１μｍのセラミック膜を、水を必要としない方法を通じて、残留石鹸および遊離グリセロールを除去しようとして使用した、Ｗａｎｇらによる「Ｒｅｆｉｎｉｎｇ  ｏｆ  ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ  ｂｙ  ｃｅｒａｍｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ」と題された論文（Ｆｕｅｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｒｔｉｃｌｅ  ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ、２００８年１２月２０日）を参照することができる。
【００１４】
水分、メタノールおよびグリセロールを除去するための１つの方法、ならびに樹脂上で、触媒の主としてナトリウム（Ｎａ+）を水素（Ｈ+）と交換する、触媒、塩、および石鹸のイオン交換のためのもう１つの方法という２つの方法において使用できる樹脂ＰＤ２０６［Ｐｕｒｏｌｉｔｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏｔｅ／Ｐｕｒｏｌｉｔｅ  ＰＤ−２０６  Ｇｕｉｄｅ］について言及している、Ｐｕｒｏｌｉｔｅのウエブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｅｓｍｏｐａｒｔｓ．ｃｏｍ／ｆｉｌｔｅｒｓ／ｐｕｒｏｌｉｔｅ／ＨＢＤ−Ｐｕｒｏｌｉｔｅ％２０Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．ｐｄｆ）を参照することができる。バイオディーゼルからの水、メタノール、およびグリセロールを吸着した後、樹脂の体積は、樹脂の乾燥体積の２倍に増大することが報告されている。さらに、最初の再生においてビーズ破損に起因する推定１０％の磨耗がある。ビーズ破損および官能基の損失は、ＰＤ２０６が再生できる回数を決定する限定要因であり、現在、２〜４回の再生後にＰＤ２０６を取り替える必要がある。メチルエステル中の不純物の負荷が、最低限である場合に限って、樹脂の使用が実行可能であると言えば十分であろう。
【００１５】
メチルエステルの精製および粗グリセロール層の使用が開示されている、Ｂａｍらによる米国特許第５，４２４，４６７号を参照することができる。グリセロール層の中のモノグリセリドおよびジグリセリド不純物を、追加量のメタノールとの反応により、所望のメチルエステルに変換することができることが、そこには述べられている。グリセロール層の中のメタノールは、蒸留によって回収される。本発明において開示されているトリグリセリド油とのさらなる反応の方法を通じてのメタノールの回収については、言及されていない。
【００１６】
非常に少量の純グリセロール（メチルエステル１００ｋｇにつき約３ｋｇ）を使用して、粗メチルエステルを洗浄する効率的な方法が提供され、その方法は、メチルエステル中の残留不純物を、粗グリセロール層の中で濃縮しながら、最小限に抑える、Ｇｈｏｓｈらによる特許出願（米国特許出願第１１／００２３９号、ＰＣＴ／ＩＮ０４／００３２９）について、もう一度、参照する。その結果、メチルエステルからメタノールを回収する必要はないが、グリセロール層からのこのような回収は、蒸留によって行われる。メタノールの報告された回収率は、使用された過剰メタノールの約７０〜８０％である。グリセロール層からメタノールを回収するいかなるその他の可能な方法についても、言及されておらず、共生成物ストリームからポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を作ることについても、言及されていない。
【００１７】
特許出願第ＷＯ／２００６／０８４０４８号は、一般的には、バイオディーゼル燃料に関するものであり、より詳細には、伝統的なエステル交換法によって生成された廃グリセロールを、バイオディーゼル燃料の混和性で、可燃性の成分へ変換するための方法に関する。
【００１８】
グリセロールに由来する様々な生成物、例えば、プロピレングリコール、１，２−プロパンジオール、石鹸、薬、爆発物、洗剤、化粧品、ジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）、アクロレイン、エピクロロヒドリン、合成ガス燃料、グリセロールカルボナート、不凍剤、ポリマーへの触媒変換等が、記載されている、Ｍ．Ｐａｇｌｉａｒｏらによる「Ｆｒｏｍ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｔｏ  ｖａｌｕｅ−ａｄｄｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ」と題された論文（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．（２００７）、４６号、４４３４〜４４４０頁）を参照することができる。しかし、バイオポリマー（ＰＨＡ）の生成についての言及はない。
【００１９】
バイオディーゼルプロセスの粗グリセロール副産物からメタノールを生成する方法を開示している、Ｇｏｅｔｓｃｈらによる米国特許第７，３８８，０３４号を参照することができる。
【００２０】
「Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、１＆２巻、Ａ．ＳｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌおよびＲ．Ｈ．Ｍａｒｃｈｅｓｓａｕｌｔ、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧａＡ（２００５）、ならびに、その中のＰＨＡの調製および特性に関する多数の先行技術を引用している参考文献を参照することができる。本発明に関するＰＨＡ生成のアプローチについては、言及されていない。
【００２１】
シュードモナスプチダＫＴ２４４２の組換え株の成長を、Ｅ２培地にグルコース（２％）、フルクトース（２％）、およびグリセロール（４％）のような様々な炭水化物を使用して研究し、同様のモノマー組成を有するＰＨＡを生成した、「Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４２  ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ  ｏｎ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｓ  ｐｏｌｙ（３−ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅｓ）  ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｓａｔｕｒａｔｅｄ  ａｎｄ  ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｍｏｎｏｍｅｒｓ」と題されたＧ．Ｎ．Ｍ．Ｈｕｉｊｂｅｒｔｓらによる論文（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９２年２月、５８巻、２版、５３６〜５４４頁）を参照することができる。ＰＨＡの収率は、細胞乾燥重量について２０．５％（ｗ／ｗ）であった。
【００２２】
「Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ）ｓ  ｆｒｏｍ  ｗａｓｔｅ  ｅｄｉｂｌｅ  ｏｉｌｓ」と題されたＴａｎｉｇｕｃｈｉらによる論文（Ｇｒｅｅｎ  Ｃｈｅｍ．２００３、５号、５４５〜５４８頁）を参照することができる。論文は、パーム、およびラードが使用された場合、細胞乾燥重量について最大のＰＨＡの収率８３％になった、２段階の発酵過程（培養物の成長のための１段階およびポリヒドロキシアルカノエートの生成のためのもう１段階）における、ラルストニアユートロファによって得られた結果を記載している。生成培地は、無機栄養素／微量栄養素も含んでいた、成長培地は、高価である普通ブイヨンを含んでいた。
【００２３】
シュードモナスオレオボランスおよびシュードモナスコルガータを、２段階の発酵過程において、濃度１％〜５％で、グリセロールと、脂肪酸石鹸と、残留脂肪酸メチルエステルとを含む、大豆ベースのバイオディーゼル生成ストリームの共生成物ストリーム（ＣＳＢＰ）からのＰＨＡ生成のために使用した、「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｏｌｙ（ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ）  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ  ｃｏ−ｐｒｏｄｕｃｔ  ｓｔｒｅａｍ．」と題されたＲ．Ｄ．Ａｓｈｂｙらによる研究論文（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、２００４、１２巻、１０５〜１１２頁）を参照することができる。アルカリ性共生成物ストリーム（ｐＨ１３）は、基質として使用する前に１ＮのＨＣｌによってｐＨ７に中和した。細菌は最初に、ペプトンを含むいくつかの高価な成分を含むルーリア−ベルターニ（ＬＢ）培地中で成長させ、その後で、中和した共生成物ストリームと追加の栄養素／微量栄養素とを含む生成培地中へ移した。ポリマー細胞の生産性は、シュードモナスコルガータについて細胞乾燥重量（ＣＤＷ）の４２％だけであったが、グリセロールについてのポリマー収率は、最適化された条件でさえも、＜５％であった。このような条件は、高価な栄養素に富む特別な培地の使用を含む。
【００２４】
これらの細菌によるポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）の生成を、カゼインペプトンまたはカザミノ酸と組み合わせたグリセロールを含む培地において行った、「Ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ  ｂｙ  Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｏｄｅｓｉａｎｕｍ  ａｎｄ  Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ｉｎ  ｍｅｄｉａ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ａｎｄ  ｃａｓｅｉｎ  ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ」と題されたＥ．Ｊ．ＢｏｒｍａｎｎおよびＭ．Ｒｏｔｈ．による研究論文（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９９、２１巻、１０５９〜１０６３頁）を参照することができる。グリセロールは、濃度２．５％、５％、および７．５％で使用した。ポリマーの収率は、グリセロールについて１７％（ｗ／ｗ）であると報告されたが、細胞乾燥重量のパーセンテージとしてのポリマー含有量は、３９±６％であった。
【００２５】
ポリヒドロキシアルカノエートを、好浸透圧性生物によって、肉および骨粉で補充した、ホエー加水分解物（０．５５％）およびグリセロール液体相（１．６％）から得た「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ｗａｓｔｅ  ａｎｄ  ｓｕｒｐｌｕｓ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ」と題されたＫｏｌｌｅｒ  Ｍ．らによる研究論文（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２００５、６巻、５６１〜５６５頁）を参照することができる。グリセロールについてのＰＨＡの収率は２３％であり、ポリマーは、分子量２５３ｋＤａならびに１２８℃および１３９℃での融解吸熱を有していた。
【００２６】
バイオディーゼル製造過程の後に放出されるグリセロール含有廃棄物からの水素およびエタノールの生化学的な生成を記載している、Ｉｔｏらによる論文（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２００５、１００号、２６０〜２６５頁）を参照することができる。生化学活性が、廃棄物中の高い塩含有量の存在に起因して、純グリセロールによるよりも、非常に低いことが報告されている。
【００２７】
対費用効果の高い方法が、バイオディーゼル共生成物ストリームからのＰＨＡの生成のために開示されてこなかったことは、先行技術から明白であり、高価な共栄養素および厄介な２段階プロセスの使用によってすら、細胞乾燥重量についてのＰＨＡの収率は、一般的に＜５０％であると報告されている。先行技術は、グリセロール含有廃棄物を使用する試みが、塩の高レベルの存在のせいである、純グリセロールよりも、非常に低い生化学的生産性を引き起こしたことも、我々に教示する。本発明は、これらの基本的な制限の全てを克服し、ジャトロファの種子鞘全体から出発するメチルエステルプロセスのグリセロール共生成物ストリームからＰＨＡを生成する、新規の、単純化された、対費用効果の高い方法を発展させることを探求する。（ｉ）問題のある廃棄物、特に、グリセロール蒸留過程の油および底部残留物の機械的な排出の間に生成される油スラッジの最良の使用、（ｉｉ）粗グリセロール層からのメタノールの蒸留に対する代替策ならびに（ｉｉｉ）グリセロール洗浄されたメチルエステルの対費用効果の高い樹脂処理などの方法における、いくつかのその他の関連する改良点も、本発明の一部を形成する。
【００２８】
発明の目的
本発明の主要な目的は、ジャトロファクルカスの種子全体からの脂肪酸メチルエステル（バイオディーゼル）の調製のための改良された、統合的な方法を提供することである。
【００２９】
本発明の別の目的は、最小のエネルギー入力および流出物放出ゼロでバイオディーゼルを生成することである。
【００３０】
別の目的は、０．５８モル当量の過剰のメタノールの９０％およびエステル交換の過程において使用されるＫＯＨ触媒のほとんど全てが、先行技術において開示されているグリセロール洗浄の過程を通じて、グリセロール層に閉じ込められることを示すことである。
【００３１】
別の目的は、カリウムおよびナトリウムイオンは、グリセロール洗浄の後にメチルエステル層中に微量しか存在しないから、イオン交換樹脂による処理を通じてこれらのカチオンの残留量を除去し、それによって規定された要求するレベルまでそれらの濃度を引き下げることが、実用的であり得ることを示すことである。
【００３２】
別の目的は、メタノールの回収のためのメタノールの蒸留の必要性なしで実施することである。
【００３３】
別の目的は、追加量のトリグリセリド油との連続反応を通じて、グリセロール層中のメタノールの７０〜９０％を取り除くことである。
【００３４】
別の目的は、対費用効果の高い方法で、生分解性ポリヒドロキシアルカノエートポリマーの微生物合成のための成長および生成培地中で、炭素および栄養素の供給源として、メタノールを取り除いた後で、粗グリセロールを使用することである。
【００３５】
別の目的は、成長培地中でアミノ酸およびその他の栄養素の供給源としてジャトロファの種子から油を排出した後で得られるケーキを使用し、それによってキングＢ培地およびゾーベル海洋性培地などの高価な培地なしで実施することである。
【００３６】
別の目的は、油ケーキ中に存在することが示されているホルボールエステルおよびクルシンなどの有毒な不純物が、本発明の方法におけるＰＨＡ生成を妨害しないことを示すことである。
【００３７】
別の目的は、標準ＰＨＡと同様の物理化学特性を有するＰＨＡポリマーの効率的な生成を実証することである。
【００３８】
別の目的は、アラビア海からの海洋性細菌分離物（ハロモナスヒドロテルマリス（Halomonas hydrothermalis）との配列類似性９９．６３％）が、その他のいかなる栄養素／微量栄養素も使用せず、散布、ｐＨ調整、温度調節等などのその他のいかなる介入もなく、アルカリ性粗グリセロール層および脱油ジャトロファケーキに由来する加水分解物を含む培地中へ、培養物を直接接種することによって、細胞乾燥重量についてＰＨＡの収率７５％になったことを示すことである。
【００３９】
別の目的は、最も単純で最も安価な方法で、および可能な最短の時間で、このようなＰＨＡ生成を達成することである。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明のためのジャトロファクルカスの種子鞘全体からのメチルエステルおよび関連生成物の調製の概略図。
【図２】粗グリセロール層中のメタノールの評価のために使用された、グリセロール中のメタノール含有量の較正プロットを示す図（実施例５〜８、そのうち実施例８は、分析的方法論を記載している）。
【図３】メチルエステル中のメタノール含有量の較正プロットを示す図（実施例５〜８、そのうち実施例８は、分析的方法論を記載している）。
【図４】メチルエステル中の微量のナトリウムのための較正プロットを示す図（実施例７および１０、後者は、分析的方法論を記載している）。
【図５】メチルエステル中の微量のカリウムのための較正プロットを示す図（実施例７および１０、後者は、分析的方法論を記載している）。
【図６】実施例１２．１の方法により生成されたＰＨＡの示差走査熱量測定のプロファイルを示す図。
【図７】実施例１３．３の方法により生成されたＰＨＡの示差走査熱量測定のプロファイルを示す図。
【００４１】
発明の概要
したがって、本発明は、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）１．０６％を含むジャトロファの被包された種子からのジャトロファメチルエステル（ＪＭＥ）および副産物の調製のための統合的な方法を提供し、この方法は以下の工程を含む：
（ｉ）殻取り機において被包されたジャトロファの種子から機械的に殻を取り、ジャトロファの殻およびジャトロファの種子を得る工程、
（ｉｉ）搾油機を使用して、工程（ｉ）において得られたジャトロファの種子から、ジャトロファ油と、窒素４〜６％を有するジャトロファ油ケーキと、廃油スラッジとを排出する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において得られたジャトロファ油を塩基によって中和する工程、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において得られた中和したジャトロファ油の一部を１０〜２０分間、攪拌しながら、アルコールおよび塩基でエステル交換して、粗グリセロール層ＧＬ１と粗ジャトロファメチルエステル（ＪＭＥ）を分離する工程、
（ｖ）工程（ｉｖ）において得られた粗ＪＭＥを純グリセロール層によって３回洗浄して、メタノールとＫＯＨとを含む３つの不純なグリセロール層、ＧＬ２、ＧＬ３、およびＧＬ４を分離して、グリセロール洗浄ＪＭＥ−Ｇ3Ｗを得る工程、
（ｖｉ）工程（ｖ）において得られたＪＭＥ−Ｇ3Ｗを精製して、アルカリ金属不純物を除去する工程、
（ｖｉｉ）工程（ｉｖ）および（ｖ）において得られたグリセロール層ＧＬ５（ＧＬ１＋ＧＬ２＋ＧＬ３）によって、工程（ｉｉｉ）において得られた残りの中和した油の部分を処理して、ＪＭＥとグリセロール層ＧＬ６とを得る工程、
（ｖｉｉｉ）工程（ｖｉｉ）において得られたＪＭＥとグリセロール層ＧＬ６を分離する工程、
（ｉｘ）メタノールを取り除くため、中和した油の残りの部分によって、工程（ｖｉｉｉ）において得られたグリセロール層ＧＬ６を処理して、ＪＭＥとグリセロール層ＧＬ７とを得る工程、
（ｘ）工程（ｉｘ）において得られたＪＭＥとグリセロール層ＧＬ７を分離する工程、
（ｘｉ）ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の生成のためまたは硫酸によるアルカリの中和のために、工程ｘ）において得られたグリセロール層ＧＬ７を直接使用して、純グリセロールと底部残留物ＧＬ８とを得る工程、
（ｘｉｉ）工程（ｖｉ）において得られたＪＭＥ−Ｇ3Ｗと工程（ｖｉｉｉ）および（ｘ）において得られたＪＭＥとを組み合わせて、組合せメチルエステルを得る工程、および
（ｘｉｉｉ）工程（ｘｉｉ）において得られた組合たメチルエステルをＫＯＨメタノール溶液でエステル交換して、総グリセロール０．０８８％および遊離グリセロール０．００５％を有する純粋なジャトロファメチルエステル（バイオディーゼル）を生成する工程。
【００４２】
本発明の１つの実施形態において、本発明は副産物の調製のための統合的な方法を提供し、前記方法は以下の工程を含む
ａ．工程（ｉｉ）において得られた廃油スラッジを添加して、ブリケット製造機において工程（ｉ）において得られたジャトロファの殻をブリケット化して、副産物として密度１．０５〜１．１０ｇ／ｃｍ3のジャトロファのブリケットを得る工程；
ｂ．工程（ｉｉ）において得られた窒素４〜６％を有するジャトロファ油ケーキをＨ3ＰＯ4、Ｈ2ＳＯ4で加水分解して、副産物としてジャトロファ油ケーキ加水分解物（ＪＯＣＨ）を得る工程。
【００４３】
本発明の別の実施形態において、本発明は、副産物ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の調製のための統合的な方法を提供し、前記方法は以下の工程を含む：
Ｉ．底部残留物ＧＬ８もしくはＧＬ７、またはそれらの組合せ２〜１０％（ｗ／ｖ）を含む成長兼生成培地中へ、土壌細菌ＭＴＣＣ５３４３または海洋性細菌ＭＴＣＣ５３４５、より好ましくは海洋性細菌ＭＴＣＣ５３４５種子の培養物１〜１０％を接種し、２５〜４０℃の範囲の温度で、ｐＨ７．０〜８．０で、２４〜９６時間の期間インキュベートして、発酵させる工程；
ＩＩ．発酵物の遠心分離によって細胞を採取して、ペレットを得る工程；
ＩＩＩ．ペレットの遠心分離によって固形ポリマーを回収する工程；
ＩＶ．水およびメタノールによって固形ポリマーを洗浄して、ＰＨＡを得る工程；
Ｖ．クロロホルムにＰＨＡ０．５〜５％を溶解して、ＰＨＡ膜を得る工程。
【００４４】
本発明のさらに別の実施形態において、種子が被包されている場合、天日乾燥された種子鞘全体が特性を保持することを増強し、油は０．５〜２．０％の遊離脂肪酸含有量を有するだけであり、それによってメチルエステルの収率を増加させる。
【００４５】
本発明のさらに別の実施形態において、殻取りを、（ｉ）種子を損傷せずに、静止表面との摩擦によって開殻を破砕する回転ドラムからなる鞘破砕機と、（ｉｉ）種子を殻から分離し、殻と反対の方向へ動かすように種子を方向付ける、傾斜している振動ふるいと、（ｉｉｉ）殻の中の種子を失うことなく、別に収集される殻を吹き飛ばす送風機を使用することとを含む、特別に設計された殻取り機において行う。
【００４６】
本発明のさらに別の実施形態において、塩基は、水酸化カリウムまたは水酸化ナトリウムからなる群から選択され、より好ましくは水酸化カリウムである。
【００４７】
本発明のさらに別の実施形態において、アルコールは、メタノールまたはエタノールからなる群から選択され、より好ましくはメタノールである。
【００４８】
本発明のさらに別の実施形態において、ＪＭＥ−Ｇ3Ｗ層を、マクロポーラスカチオン交換樹脂を使用することによって精製して、アルカリ金属不純物を除去する。
【００４９】
本発明のさらに別の実施形態において、マクロポーラスカチオン交換樹脂は、スチレン−ジビニルベンゼンコポリマーと硫酸とを使用することによって調製される。
【００５０】
本発明のさらに別の実施形態において、スチレン−ジビニルベンゼンコポリマーと硫酸とを使用することによって、マクロポーラスカチオン交換樹脂を調製する。
【００５１】
本発明のさらに別の実施形態において、樹脂処理されたＪＭＥ−Ｇ3Ｗ層は、最大［Ｎａ+］および［Ｋ+］不純物レベル１５〜３０ｐｐｍないし＜０．５ｐｐｍと、メタノール不純物レベル０．４〜０．６％（ｗ／ｗ）と、水分レベル５００〜１５００ｐｐｍと、総グリセロール含有量０．２〜０．３％（ｗ／ｗ）と、低級遊離脂肪酸含有量０．１５％〜０．２５％（ｗ／ｗ）とを有する。
【００５２】
本発明のさらに別の実施形態において、底部残留物は、主として固体およびさらに蒸留可能な溶媒／生成物の観点から価値のない自由液体からなる、成功したサイクルの後に残される残留物と定義される。
【００５３】
本発明のさらに別の実施形態において、ブリケット化を、（ｉ）傾斜したスクリューフィーダーと、（ｉｉ）攪拌器および添加剤を供給する開口部の付いた混合デバイスと、（ｉｉｉ）ブリケットを成形するためのダイおよび圧縮のための高圧を生成する油圧装置からなる圧縮システムと、（ｉｖ）形成されたブリケットを冷却するためのブリケット運搬システムとを含む、ブリケット製造機において行った。
【００５４】
本発明のさらに別の実施形態において、得られた殻は、バルク密度０．０８ｇ／ｃｍ3と発熱量３７００ｋｃａｌ／ｋｇとを有していた。
【００５５】
本発明のさらに別の実施形態において、成長培地は、キングＢ培地、ゾーベル海洋性培地、ならびにＧＬ７およびＧＬ８による脱油ジャトロファ油ケーキ加水分解物（ＪＯＣＨ）からなる群から選択される。
【００５６】
本発明のさらに別の実施形態において、細胞乾燥重量に対するＰＨＡの収率は、６９％〜７７％の範囲内であった。
【００５７】
本発明のさらに別の実施形態において、得られたＰＨＡは、標準ＰＨＡのＮＭＲプロファイルに一致し、ＤＳＣによる融点は、１６６．２℃であり、ＧＰＣデータは、Ｍw、Ｍn、およびＭw／Ｍn（多分散度指数）値、それぞれ３５９９０、２４５８３、および１．４６を示した。
【００５８】
本発明のさらに別の実施形態において、上記工程は、多様なトリグリセリド油に等しく適用しうる。
【００５９】
発明の詳細な説明
本発明の目的は、単純な単位操作を使用して、分散化された生成に最大の注意を払って、ジャトロファメチルエステルの生成の方法において全面的な改良をもたらすことである。伝統的に、農家は、乾燥された果実全体から殻を取るが、これは、殻の不使用をもたらし、したがって、種子だけで、果実の殻を取ることに伴う人件費に加えてコストの全てを背負わねばならないので、種子の価格はより高い。本発明の過程で、殻は、清潔に保つことに加えて、油種子の特徴を保存する保護の第２の層を提供するので、種子を被包されたままにすることも有利であることがわかった。過剰遊離脂肪酸は、メチルエステルの収率の低下をもたらし、中和により排除しなければならないから、これは、メチルエステルが塩基触媒作用を通じて得られる場合、特に重要である。したがって、種子が無傷で得られ、清潔に殻から分離され、このような種子をすぐ後で使い切る方法で、天日乾燥された鞘から機械的に殻を取ることができる機械を考案することは、不可避である。さらに、殻は、現在、単一点で収集されているから、バルク密度わずかに０．０８ｇ／ｃｍ3と発熱量３７００ｋｃａｌ／ｋｇとを有するこれらの殻を、運搬しやすいようにブリケット化することができ、農村の人々が薪またはより高価な代替物よりむしろ直接にそれらを使用できることを確実にする強い動機づけがある。空の殻を、高エネルギー密度を提供する頑強なブリケットにする、圧縮の所望のレベルを許容する適切な方法が考案されることを確実にする動機づけが再びある。これらの操作は両方とも、種子からの油の機械的な排出の間に生成される少量の廃油を有効に使用し、また、脱油ケーキのごく一部分を使用して、所望の規格のように密度１．０５〜１．１５ｇ／ｃｍ3と発熱量約４０００ｋｃａｌ／ｋｇとを有するブリケットを生成する本発明において、成功裏に開示されている。
【００６０】
最も優れた先行技術は、ジャトロファメチルエステルのエステル交換およびポストエステル交換の非常に効率的な方法を開示し、メタノールの使用も比較的低い（ほんの０．５５〜０．７５モル当量の過剰）が、それにもかかわらず、このメタノールは、できるだけ最大程度まで回収されることが重要である。先行技術において開示されている、メチルエステルを精製するためのグリセロール洗浄の過程は、メチルエステル中にほとんどメタノールを残さず、その代わり、メタノールは、グリセロール層中に９０〜９５％程度まで閉じ込められる。グリセロール洗浄後のメチルエステルも、本発明の過程におけるイオンクロマトグラフィー測定を通じて確認されたように極端に低いレベルの残留アルカリ触媒しか含まないので、メチルエステルの水洗浄がそもそも必要かどうかについての問題も生じる。その代わり、イオン交換樹脂の使用に基づく乾燥方法が開示されている。本方法を独創的にするものは、樹脂上の負荷が極端に低く、したがって、メチルエステルのかなりの量が、再生なしに、小さい床体積の樹脂によって処理されることができるという事実である。
【００６１】
粗グリセロール層に関して、その最も効果的な使用において、可能な最高のレベル単純化が何であるかについての問題が生じる。本発明において開示されているように、グリセロール層中の過剰メタノールが、単純な手段によって除去できる場合、そのときは、残りの塊を、単純で対費用効果の高い方法で、直接、ポリヒドロキシアルカノエートの調製のために使用できる。冷却装置が提供されなければかなりの損失を伴う、グリセロール層からのメタノールの蒸留が、唯一の選択枝かどうかについての問題が、その後、我々の頭に浮かんだ。本発明において開示されているように、ジャトロファ油の新鮮なロット中へのメタノールの逆の取り込みは、メタノール８０〜９５％が、このようにして有利に使用できる限りにおいて、実行可能である。これは、グリセロール層も、部分的に活性なアルカリ触媒（ＫＯＨ）を含み、したがって、いったん新鮮な油を加え、適切な攪拌を行うと、ある程度のメチルエステル形成を促進する全ての成分を有するためである。しかし、メタノールおよび触媒の量は、完全なメチルエステルを実現するには十分でなく、この工程に続いて、＜０．１５％（ｗ／ｗ）の総グリセロールによって、このような純粋なエステルが生成されることを可能する第２の操作を行う。正味の結果は、メタノールが枯渇したグリセロール層の実現、および、いかなる蒸留工程もなく、メチルエステルの質に関していかなる妥協もしない方法で、回収不可能な形態の過剰メタノールの全体的な必要量が、＜０．１５モル当量であるような第２の工程におけるメタノール使用の削減である。
【００６２】
メタノールを除去すると、グリセロール層は、本発明の過程において分離される海洋性細菌の培養物による、ポリヒドロキシアルカノエートの効率的で対費用効果の高い生成のための栄養素の優秀な供給源であることが実証される。熱リン酸／硫酸による反応抽出を通じて得られたジャトロファ脱油ケーキから生成される加水分解物は、粗グリセロールに対する理想的な相補パートナーであることを示し、両者は協力して、いかなる意図的な温度調節もしないで、海洋性細菌の培養物によるＰＨＡ生成のために必要とされる栄養素を提供する。両者はともに、ある程度までお互いに（酸−塩基）中和することも助け、それによって中和のコストを押し下げる。通常の２段階の方法をまとめて単一工程にすること、炭素および窒素に加えて、加水分解物およびグリセロール層から、必須のリン酸緩衝液と必須元素とを引き出すことによって、全ての栄養素／微量栄養素が全くなしに実施することなどのいくつかの追加の発明がある。このようなプラントが農地の近くに建設される、分散化された操作において、採取可能なバイオマスの回収の後の上澄みは、土壌滴下施肥法のために農地に直接放出されることができるか、または葉面散布として使用することさえできる。
【００６３】
グリセロール層の大部分は、このようにして使用することができるが、グリセロール層のわずかな部分は、重大な意味を持つグリセロール洗浄工程のために必須である純グリセロール（メチルエステル１００ｋｇにつきグリセロール２〜４ｋｇ）を回収するために必要とされる。グリセロール回収の後に残る底部残留物が、土壌細菌の培養物によるＰＨＡ生成のための等しく効果的な栄養素およびプロモーターであり、生成の効率が、純グリセロールよりもほぼ２倍高いことが、さらに実証される。したがって、問題のある廃棄物は、栄養素の理想的な供給源であることがわかり得る。この方法によって得られたＰＨＡは、１．４６という低い多分散度指数を有するが、標準ＰＨＡと同様のＮＭＲパターンを示す。
【００６４】
底部残留物も、残りの粗グリセロールと組み合わせて使用して、それによって２つの別々の操作の必要性を回避し、この組成物の中にＭＴＣＣ５３４５を使用することができる。
【００６５】
ともに行われるこれらの発明の全ては、共生成物ストリームの有利な使用によるジャトロファクルカスの天日乾燥された種子鞘全体からのメチルエステルの生成の改良された、統合的な方法をもたらす。本発明の統合的な模式図を、図１に示す。
【００６６】
発明の特徴：
（ｉ）種子鞘全体が、遊離脂肪酸含有量に関して、殻を取った種子より良好な油の質を維持するのに役立つことを証明すること。
【００６７】
（ｉｉ）機械的な排出の過程の間に不可避的に生成され、処分の問題を引き起こす、スラッジの形態の少量の廃油を使用して、ブリケットの発熱量にも加えて、空の殻からより高密度で、より強いブリケットを生成すること。
【００６８】
（ｉｉｉ）脱油ケーキの一部が、殻のみによって得られるよりも良好なブリケットを作るために使用できることをさらに認識すること。
【００６９】
（ｉｖ）部分的に活性な触媒を含むグリセロール層およびエステル交換のための過剰メタノールを、２つの段階において精製されたジャトロファ油の追加量と反応させて、このメタノールの７０〜９０％を取り除くこと。次に、油／メチルエステル混合物を、未反応のおよび部分的に反応した油が完全にメチルエステルに変換するように、アルカリおよびメタノールとさらに反応させ、グリセロール層からメタノールを取り除いて、続いて完全な生成物へエステル交換をするこの循環を、連続して繰り返し、粗グリセロール層からのメタノール蒸留なしで実施すること。
【００７０】
（ｖ）グリセロール洗浄の過程が、メチルエステル層から、費やされた触媒のほとんど全てを除去することを確認し、その後で、大量のメチルエステルを、樹脂の最小床体積によって処理することができることを確実にしながら、グリセロール洗浄されたメチルエステル層をカチオン交換樹脂処理させて、水洗浄を必要としないでナトリウムおよびカリウムの不純物の所望のサブｐｐｍレベルを達成することが、魅力的な提案であり得ることを認識すること。
【００７１】
（ｖｉ）メタノールが枯渇した粗グリセロール層を体積比１：３に分割し、先行技術において記載されているように、グリセロール洗浄のための次のバッチにおいて再利用できるように、後処理後のより少量の画分から蒸留されたグリセロールを回収すること。
【００７２】
（ｖｉｉ）炭素供給源としての純グリセロールによるより有利な方法において、１の底部残留物からＰＨＡを生成することを可能にする土壌からの細菌ＭＴＣＣ５３４３を分離し、それによって、問題のある廃棄物をＰＨＡ生成のため有用な原料に変換すること。
【００７３】
（ｖｉｉｉ）海洋性細菌のスクリーニングの過程を通じて、細胞乾燥重量について収率７５〜８０％の収率を有するＰＨＡの生成をもたらす発酵過程における唯一の栄養素として、ジャトロファ脱油ケーキの加水分解物とともに、直接、より大きな体積の粗グリセロール層を効率的に使用する強力な分離物（ＭＴＣＣ５３４５）を識別すること。さらに、ＰＨＡ生成の従来の方法において、別々に行われる成長および生成の工程を、単一の操作に組み合わせ、それによって方法を単純化すること。その上さらに、１からの底部残留物をグリセロール層のより大きな画分に加え、得られた塊をＭＴＣＣ５３４５によって発酵させること。また、２８〜３８℃にわたる温度の変動に対する、方法の許容範囲を実証した後で、温度調節の必要性なしに実施すること。
【００７４】
（ｉｘ）発酵過程において使用される脱油ケーキの加水分解物を調製するとき、リン酸を使用し、その後で、得られた塩がＰＨＡ生成を邪魔する代わりに援助するように、アルカリ性グリセロール層それ自体、および必要であれば追加のＫＯＨ／Ｍｇ（ＯＨ）2によって、酸抽出物を中和することが有利であることを認識すること。
【００７５】
以下の実施例は、例証として示しており、発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。
【００７６】
実施例１
３ヶ月の天日乾燥ジャトロファ種子鞘５０ｋｇ入りの麻袋を切り開いたところ、ほとんどの鞘は無傷であったが、いくつかの鞘は壊れ、種子が出てきていることがわかった。無作為に収集したこのような種子５０〜１００ｇを、砕いて粉末にし、ｎ−ヘキサンを使用するソックスレー抽出のために、２５ｇ取り出した。また、種子を、無作為に試料採取した無傷の鞘から除去し、同様に抽出した。被包した種子は、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）含有量１．０６％を示したが、一方、露出した種子は、ＦＦＡ含有量３．６８％（ｗ／ｗ）を有するがことがわかった。別の袋を開いて、試料採取を上記のように行った。露出した種子および被包した種子は、それぞれＦＦＡ値２．４６％と１．０９％を示した、すなわち、２つの観察は同様であり、種子鞘全体のほうが油を良く保存することを示唆した。アルカリ触媒によるエステル交換の先行技術にあるように、ＦＦＡがより高いとメチルエステルの収率が減少するため、この実施例は、種子を被包した形態のままとし、メチルエステルの作製直前に種子の殻を取るほうが良いことを、我々に教示している。
【００７７】
実施例２
上記の実施例１の種子鞘全体から、特別に設計された機械で機械的に殻を取った。毎時１トン（ＴＰＨ鞘）の機械は、（ａ）種子を損傷せずに、静止表面との摩擦によって開殻を破砕する回転ドラムからなる鞘破砕機と、（ｂ）種子を殻から分離し、殻と反対の方向へ動かすように種子を方向付ける、傾斜している振動ふるいと、（ｉｉｉ）殻の中の種子を失わずに、別に収集される殻を吹き飛ばす送風機とを含んでいる。殻は、特別に設計された機械でブリケット化したが、一方、油は、種子全体から機械的に排出した。ブリケットは、（ａ）傾斜したスクリューフィーダーと、（ｂ）攪拌器および添加剤を供給する開口部の付いた混合デバイスと、（ｃ）ブリケットを成形するためのダイおよび圧縮のための高圧を生成する油圧装置からなる圧縮システムと、（ｄ）形成されたブリケットを冷却もするためのブリケット運搬システムとを含む、０．５ＴＰＨブリケット製造機で作った。ブリケットは壊れやすいが、殻の中への油の機械的な排出の過程において生成される廃油スラッジを加えると、ブリケットは、より頑強になり、密度１．０７〜１．１５ｇ／ｃｍ3と、油のこのような添加なしに空の殻について記録された３７００ｋｃａｌ／ｋｇより高い発熱量とを有することがわかった。得られたブリケットは、直径６ｃｍおよび長さ１４ｃｍの寸法を有した。
【００７８】
実施例３
上記の実施例２と同様に排出されたジャトロファ油を、ＮａＯＨ水溶液によって中和して、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）含有量を０．１２％（ｗ／ｗ）まで低下させた。ＭｅＯＨ６４．５ｇ（１．５８モル当量）およびＫＯＨ８．３３ｇをともに採取し、丸底フラスコ中の中和したジャトロファ油３７０ｇに加え、含有物を、オーバーヘッド攪拌器によって室温で１５分間、攪拌して、エステル交換をもたらした。重量６３．８７ｇの粗グリセロール層を分離して、次に、メチルエステル層を、純グリセロール５．５３ｇ、５．７６ｇ、および５．５６ｇによって連続して３回洗浄し、これらの洗浄は、（不純物としてのメタノールおよびＫＯＨとともに）グリセロール、それぞれ１１．６９ｇ、７．１０ｇ、および６．２９ｇを生成した。工程２において、粗グリセロールおよび最初の２つの洗浄物を組み合わせて、メタノール１６．０１ｇを含む組み合わされた層を、２時間、１００〜３００ｒｐｍの継続的な攪拌下（パドル型ピッチ翼攪拌器）で、中和したジャトロファ油３００ｇと再び反応させた。２つの層を再び分離して、グリセロール層を、２時間、活発なオーバーヘッド攪拌下で、追加の中和した油７０ｇによって、さらにもう一度処理した。費やしたグリセロール層は、メタノール３．１５ｇを含んでおり、すなわち、この方法によりグリセロール層中のメタノールの８０．３％を取り除くことができた。工程２において得られた粗メチルエステル層を、追加量のＫＯＨメタノール溶液（ＭｅＯＨ６３．６ｇおよびＫＯＨ８．２ｇ）によって処理し、その後で、工程１のようにグリセロールによって洗浄し、続いて水洗浄した。総グリセロールおよび遊離グリセロールの値は、それぞれ０．１０％（ｗ／ｗ）および０．０１％（ｗ／ｗ）であったが、両方の工程からの組み合わされたメチルエステルの収量は、７１０ｇ（採取したすべての中和した油に対して収率９５．９％）であった。工程２において得たグリセロール層は、同様の方法で、中和した油によって処理して、メタノールを除去することができる。この実施例は、粗グリセロール層からメタノールを取り除く方法およびそれによってメタノールの蒸留なしで実施することを、我々に教示する。
【００７９】
実施例４
実施例３の実験を、パイロットプラントにおいて千倍の規模に拡大した。中和した油７４０ｋｇを採取した。油の半分を、図１の反応器ＩＩにおいて１５分間、室温での攪拌下で、ＫＯＨメタノール溶液［ＫＯＨ（純度７８．８％）８．３３ｋｇ；メタノール６４．５ｋｇ（１．５８モル当量）］との反応により、単一の工程においてエステル交換した。グリセロール層（ＧＬ１）を分離し、これは７９．５５ｋｇの重量であった。次に、メチルエステル層（粗ＪＭＥ）を、グリセロール各５．５５ｋｇによって、３回処理し、グリセロール層を、各回分離して、最終の分離を、超遠心分離機を使用して行った。分離したグリセロール洗浄層は、それぞれ、１１．２８ｋｇ（ＧＬ２）、８．０６ｋｇ（ＧＬ３）、および６．１１ｋｇ（ＧＬ４）の重量であった。この段階までのメタノール、ＫＯＨおよび全部のＫのバランスを、下記の表１に示す。採取した過剰メタノールの８９．３％が、最終的にグリセロール層（ＧＬ１〜ＧＬ４）中にあり、したがって、本発明の方法によって、蒸留に頼ることなく、グリセロール層からこの過剰メタノールを回収する良い機会があることが、データからわかる。その後で、グリセロール洗浄されたメチルエステル層の一部（ＪＭＥ−Ｇ3Ｗと表される）を、イオン交換樹脂によって処理して、下に記載のように残留アルカリを排除するが、残りの部分を、先行技術のように処理して、総グリセロール０．１２％および遊離グリセロール０．０１％を有する純粋なメチルエステルを得た。
【表１】
2013503960.tif 000002
【００８０】
上記のグリセロール層ＧＬ１、ＧＬ２、およびＧＬ３を組み合わせ（ＧＬ５と表す）、総重量は、９８．８９ｋｇであった。次に、これを実施例３の中和したジャトロファ油の追加の３００ｋｇとともに採取し、含有物を、図１の反応器Ｉにおいて、２時間、室温で激しく攪拌した。２つの層を分離し、粗メチルエステルを、さらなるエステル交換のために反応器ＩＩへデカントした。反応器中のグリセロール層（ＧＬ６）を、実施例３から精製したジャトロファ油の残り７０ｋｇと、もう一度、反応させ、２つの層を分離し、メチルエステル層を、上からデカントし、粗メチルエステルの最初のロットをすでに含む反応器ＩＩへ加えた。下記の表２からわかるように、得られたグリセロール層（ＧＬ７）の分析は、ＧＬ５中のメタノールの７１．３％が、油の２つのロットによる処理によって、取り除かれたことを示した。その後で、粗メチルエステルの組み合せた層を、反応器ＩＩにおいてＫＯＨメタノール溶液［ＫＯＨ（純度７８．８％）８．３３ｋｇ；メタノール６４．５ｋｇ（１．５８モル当量）］によって、もう一度、処理し、グリセロール洗浄し、続いて水洗浄して、総グリセロール０．０８８％および遊離グリセロール０．００５％を有する純粋なメチルエステルを得た。洗浄物とともに粗グリセロールを、上記で行ったように、油によって、もう一度、処理して、メタノールを取り除くことができる。実施例は、粗グリセロールからメタノールを取り除く方法が、規模の拡大になじむことを、我々に教示する。さらに、表２のデータは、グリセロール層中のわずかなＫＯＨも取り除かれることを、我々にさらに教示する。
【表２】
2013503960.tif 000003
【００８１】
上記の実施例において、ＧＬ５との反応後に得られた粗メチルエステルを、メタノール１．５８モル当量によって、もう一度、処理したが、下記の実施例６において実証されるように、粗メチルエステル層によって取り除かれるメタノールを差し引いて、中和した油に対して全１．５８モル比のメタノールを維持できることが、注目されるであろう。
【００８２】
実施例５
ＪＯＣＨを以下のように調製した：実施例３および４のように、種子全体から機械的に油を排出した後で得られた、窒素４〜６％を有するジャトロファ油ケーキ１００ｇを、三角フラスコ中に採取し、８ＮのＨ3ＰＯ4と２ＮのＨ2ＳＯ4との混合物を含む酸性溶液３５０ｍＬを加えた。フラスコ（キャップなし）を、５時間１００℃で熱板上に保持した。その後で、それを室温まで冷却した。次に、懸濁液を、ＫＯＨ１４８ｇを含む溶液３３０ｍＬによって中和し（中和は、アルカリ性のＧＬ７によって行なってもよい。）、その中に、固体のＭｇ（ＯＨ）2１９．１ｇも加えた。これを行って、緩衝作用を有し、また加水分解物の栄養価に寄与する塩を得た。その後で、含有物を、ブフナー漏斗（ワットマン濾紙４０番）上で真空濾過した。ｐＨを５．５〜８．５の範囲に調整した。加水分解物中の炭素の含有量は、２．３１％（ｗ／ｖ）であり、結合窒素含有量は、０．４８％（ｗ／ｖ）であった。Ｎ４〜６％（ｗ／ｗ）を有するジャトロファ油ケーキを、Ｈ3ＰＯ4／Ｈ2ＳＯ4の熱酸性水溶液によって処理した。
【００８３】
実施例６
ＧＬ４による油の第２のロットの後処理を除いて、実施例４の実験を繰り返し、およそ３７０ｋｇに等しい組み合せた層を、前のようにＫＯＨ８．３３ｋｇと反応させたが、実施例４において使用した６４．５ｋｇの代わりに、メタノール５０．５７ｋｇのみと反応させ、その結果、メタノールの総量、すなわち、ＧＬ４から取り除いたメタノール＋加えたメタノールは、３７０ｋｇの最初のロットのために使用したおよそ６４．５ｋｇ（１．５８モル当量）に等しい。第１の工程において、総グリセロール０．０７５％と遊離グリセロール０．０１％とを有するメチルエステル３４４．８ｋｇを得て、次の段階において、総グリセロール０．１７％と遊離グリセロール０．０２％とを有するメチルエステル３３９ｋｇを得た。この実施例は、メタノール蒸留を回避することによる利益に加えて、メタノール使用の実際の削減を、我々に教示する。メタノールは、粗グリセロール層から、もう一度、回収され得るので、メタノールの正味の使用は、蒸留によるいかなる回収もしないで、メチルエステルについて１．２２当量であり、結局、生成した精製メチルエステル１００ｋｇにつき回収不能のメタノール２．６６ｋｇとなる。
【００８４】
実施例７
上記の実施例４からわかるように、メチルエステル層のグリセロール洗浄は、ＫＯＨ触媒を非常に効率的に除去する。したがって、水洗浄を不要にしうるイオン交換法による微量の残留アルカリ金属不純物を除去することは、有利であろう。
【００８５】
１．マクロポーラスカチオンイオン交換樹脂の調製：ポーラス構造を有するスチレン−ジビニルベンゼン（スチレン−ＤＶＢ）コポリマーを、細孔形成剤としてセチルアルコールを使用する懸濁重合によって調製した。共重合プロセスを、可変メカニカル攪拌器、温度計、および還流冷却器を取り付けた１Ｌの三口丸底フラスコにおいて行った。開始剤（過酸化ベンゾイル；モノマー１重量％）とともに、スチレン６６ｍｌと、ＤＶＢ１８．５ｍｌと、セチルアルコール（７０ｇ）とを含むモノマー相を、懸濁媒の水溶液を入れた反応器へ注ぎ入れた。合成において使用した懸濁剤は、水４２０ｍｌ中のヒドロキシエチルセルロース（０．６ｇ）、リグノスルホン酸ナトリウム（０．６ｇ）、および塩化カルシウム（５．３ｇ）であった。重合を、３時間、８０±５℃で行い、さらに３時間、９０±５℃で行った。コポリマーを、ビーズの形態で得た。次に、これらビーズを分離し、洗浄し、乾燥し、溶媒抽出して、細孔形成剤を除去した。上記の合成コポリマービーズを、スルホン化して、コポリマーマトリックスに−ＳＯ3-Ｈ+基を導入した。スルホン化に使用した硫酸に対するコポリマーの体積比は、１：７であった。反応を１０時間、９５±５℃で行った。ｐ−ニトロフェノール吸着法による表面積は、１０４．３ｍ2／ｇであることがわかった。動的条件下のカチオンイオン交換容量は、１．８〜２．１ｍｅｑ／ｍｌであり、静的条件下で４．５〜５．０ｍｅｑ／ｇであった。
【００８６】
２．粗ジャトロファメチルエステルの精製：マクロポーラス樹脂を、内径４．６ｃｍおよび高さ１１０ｃｍのガラスカラム中へ投入した。カラムは、底にグラスウール栓付きの止水栓および上部にＢ−２４ジョイントを有していた。樹脂床の高さは、６５ｃｍであり、樹脂床体積は、１．０８Ｌであった。樹脂床は、メタノールを通過させることによって、水分がないようにした。実施例３のグリセロール洗浄したメチルエステル層（ＪＭＥ−Ｇ3Ｗ）を、供給流量５床体積／時で樹脂床上を通過させた。流出画分を１０Ｌずつ別々に収集して、得られた結果を、下記の表３に示す。［Ｎａ+］および［Ｋ+］のレベルは、メチルエステルのための標準規格を満たす、２１．３７ｍｇ／Ｌから０．４２ｍｇ／Ｌまで減少したことがわかる。水分およびメタノールは両方とも、乾燥空気による散布により、排除することができる。樹脂を通過させた後より多量のＭｅＯＨを有するメチルエステルの最初の１０Ｌを、エステル交換法において再循環させることができる。先行技術において報告されているその他の吸着剤を、別のカラムへ追加的に採取し、アルカリ金属イオンに加えて、その他の不純物を減少させることができる。
【表３】
2013503960.tif 000004
【００８７】
実施例８：実施例５〜７の実験のためのメチルエステルおよび粗グリセロール層中のメタノールの評価
標準物質を、それ自体以下のように調製した原液（１０．０％ｗ／ｗ）の段階希釈を使用して調製した。ＫＯＨ１８ｇおよびＭｅＯＨ５０ｇを、共栓付きフラスコに加えた。ＫＯＨメタノール溶液１３．７６ｇを、グリセロールによって１００ｇまで希釈した（Ａ）。その後で、（Ａ）の１０ｇを、グリセロールによって１００ｇまで希釈した（Ｂ）。次に、原液を水によって希釈して、標準溶液を得た。試料の調製のために、試料１．０ｇおよび０．１３Ｎの氷酢酸１．０ｍＬを共栓付きフラスコに採取し、再蒸留水によって１００．０ｇまで希釈した。
【００８８】
メタノール含有物のＧＣ−ＭＳ分析を、ヘッドスペース分析器（ＡＯＣ５０００自動注入器）の付いた島津ＱＰ２０１０ガスクロマトグラフ質量分光計を使用して、実施した。ＨＰ  ＰＬＯＴ  Ｕ融解シリカキャピラリーカラム（ＩＤ０．５３ｍｍ×長さ３０ｍ×膜厚２０μｍ）を、（流量１ｍＬ／分で）キャリアガスとしてのヘリウムとともに使用した。カラム温度を、１０分間、１００℃に保持した（定温）。質量分光計を、電子イオン化エネルギー７０ｅＶで操作した。１ｍｌの試料／標準物質を、機密性の密閉ガラスバイアル瓶に保持し、自動注入器に保持した。試料を６５０℃に加熱し、インキュベーター中で５分間、回転させた。ガス２５０μｌを、１５０℃でスプリット−スプリットレス注入器に注入した。３つの標準物質について引いた較正プロットは、回帰係数（Ｒ2）が０．９９９８であった（図２）。同様の較正プロットを、メチルエステル中のＭｅＯＨに関して作った（図３）。
【００８９】
実施例９：実施例５〜７の実験のための粗グリセロール層およびメチルエステル中の全Ｋならびにアルカリ度の評価
水溶性試料について、既知重量の試料を溶解して、水溶液の一定の体積を得た一方、不溶性試料について、既知重量の試料を、既知体積の蒸留水によって洗浄して、水中へ水酸化カリウム／塩を抽出した。次に、これらの試料を、正当な較正の後で、全Ｋについて炎光光度計によって分析した。アルカリ度を、酸塩基滴定をにより評価した（表３）。
【００９０】
実施例１０：実施例４〜７の実験のためのイオン交換クロマトグラフィーを使用する、ジャトロファメチルエステル中の微量のＫおよびＮａの評価
バイオディーゼル水洗浄物中のナトリウムおよびカリウムカチオンの濃度を、Ｉｏｎ  Ｐａｃ  ＣＳ１２（２ｍｍ）分析カラムおよび流量０．２５ｍＬ／分で溶離剤として２０ｍＭメタンスルホン酸を使用して、電気電導度検出器によるイオン交換クロマトグラフィーによって測定した。ＮａＣｌとＫＢｒとの混合物を含む標準溶液（それぞれ０．１、０．２、０．５、および１．０ｐｐｍ）を使用して、定量化を行った。相対標準偏差、相関係数、および勾配は、それぞれ、（ナトリウムについて１．０１９１、１．００００、および０．７３１３、ならびにカリウムについて０．６６０５、１．００００、および０．５３４１）であった。ナトリウムおよびカリウムについての較正プロット、ならびに試料のクロマトグラフィーを、図４および図５に示す。
【００９１】
実施例１１
実施例４の廃グリセロール層、ＧＬ７を、２つの部分に分割した。１つの部分を、硫酸によるアルカリの中和のために採取し、続いて、先行技術の方法のように、石鹸様の物質およびＫ2ＳＯ4の分離を行った。次に、精製したグリセロール層を、メチルエステル層の洗浄の目的のために必要とされるのと同量のグリセロールを回収するために、蒸留した。暗褐色を有する底部残留物（ＧＬ８と表される）を、下の実施例１２に記載しているように、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の微生物生成のための栄養素供給源として使用した。ＧＬ７のより大きい画分を、下の実施例１３に記載しているように、直接、ＰＨＡの調製のために使用した。Ｈ3ＰＯ4／Ｈ2ＳＯ4の熱酸性水溶液によって、Ｎ４〜６％（ｗ／ｗ）を有するジャトロファ油ケーキを処理し、その後で、粗グリセロール層、水酸化カリウム、および水酸化マグネシウムなどのアルカリ性材料によって適切にｐＨを調整することによって、ジャトロファ油ケーキ加水分解物（ＪＯＣＨ）を抽出して、緩衝作用を有し、加水分解物の栄養価にも寄与する塩を得た。グラム不定細菌、グラム陽性細菌（バシリウス属、アゾトバクター属）、およびグラム陰性細菌（シュードモナス属；ハロモナス属）を、土壌および海洋環境から分離し、ＰＨＡ生成のためのスクリーニングを行った。
【００９２】
実施例１２
実施例１２．１：
インドの土壌からの３０の土壌細菌の分離物を、ＰＨＡ生成のため研究室においてスクリーニングした。細菌ＭＴＣＣ５３４３は、最も効率的な１つであるとわかり、本発明において使用した。蒸留水１リットルに溶解した、ペプトン２０ｇと、グリセロール１５ｇと、リン酸水素二カリウム１．５ｇと、硫酸マグネシウム１．５ｇとを含む、キングＢ成長培地１００ｍｌを調製した。次に、培地を、２０分間、１２１℃で、オートクレーブにかけた。種子培養物１ｍｌを、上記の培地中に接種して、シェーカー中で３５±２℃で４８時間インキュベートした。次に、培養物を、遠心分離によって採取した。上記の実施例１１のＧＬ８  ２％（ｗ／ｖ）と、（ＮＨ4）ＳＯ4  ０．０５ｇと、ＭｇＳＯ4．７Ｈ2Ｏ  ０．０４ｇと、Ｎａ2ＨＰＯ4．１２Ｈ2Ｏ  ０．９６５ｇと、ＫＨ2ＰＯ4  ０．２６５ｇとを含む、生成培地１００ｍｌを調製して、次に、蒸留水中に微量栄養素、ＦｅＳＯ4．７Ｈ2Ｏ（２．７８ｇ／ｌ）と、ＭｎＣｌ2．４Ｈ2Ｏ（１．９８ｇ／ｌ）と、ＣｏＳＯ4.７Ｈ2Ｏ（２．８１ｇ／ｌ）と、ＣａＣｌ2．２Ｈ2Ｏ（１．４７ｇ／ｌ）と、ＣｕＣｌ2．２Ｈ2Ｏ（０．１７ｇ／ｌ）と、ＺｎＳＯ4．７Ｈ2Ｏ（０．２９ｇ／ｌ）とを含む、微量栄養素原液０．１ｍＬを培地へ加えた。次に、培地を、２０分間、１２１℃で、オートクレーブした。次に、成長培地から得た採取した培養物を、生成培地に接種して、３５±５℃で９６時間、シェーカー（１２０ｒｐｍ）上でインキュベートした。細胞を遠心分離によって採取し、得られたペレットを、オーブン乾燥して、細胞乾燥重量０．３８ｇを得た。次に、ペレットを、１５分間ヒポクロリット（塩素４〜６％）溶液によって処理し、細胞を温浸した。固形ポリマーを、遠心分離によって回収した。次に、固形ポリマーを水およびメタノールによって連続して洗浄し、付着している不純物を回収し、細胞乾燥重量７１．０５％に等しい、ＰＨＡ０．２７ｇを得た。
【００９３】
これらの結果は、大豆ベースのバイオディーゼルプロセスの共生成物ストリームを使用する場合、ＰＨＡ蓄積は、細胞乾燥重量の４２％であることがわかった、先行技術におけるＡｓｈｂｙらの結果に匹敵するであろう。
【００９４】
ＧＬ８  ２％（ｗ／ｗ）の代わりに、生成培地中の純グリセロール２％（ｗ／ｗ）によって、上記の実験を繰り返した。下記の表４からわかるように、細胞乾燥重量についてのＰＨＡの収率は、ＧＬ８による７１．１％と比較して、純グリセロールによると、わずかに５２．６％だった。ＰＨＡ生成のための炭素使用効率は、グリセロールおよびＧＬ８について、それぞれ１１．４５％および２０．８％であった。
【表４】
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【００９５】
別の方法では処理することが難しい、実施例１１の底部残留物は、おそらく不純物がＰＨＡ生成のためのプロモーターとして作用するので、純グリセロールによるものより効率的にＰＨＡを生じる。ＧＬ７およびＧＬ８の中の金属不純物の詳細を、下記の表５に示す。
【表５】
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【００９６】
ＧＬ８から得られたポリヒドロキシアルカノエートの特性分析：
ＧＬ８を使用して得られたＰＨＡは、ＭwおよびＭn値がそれぞれ３５９９０および２４５８３で、多分散度指数（Ｍw／Ｍn）１．４６４０を有することがわかった。プロトンおよび13Ｃ  ＮＭＲは、（Ｓｉｇｍａからの）標準ＰＨＡと一致した。しかし、ＤＳＣによる融点は、標準ＰＨＡについて１４６．９℃（ブロード）の値と比較して、１６６．２℃（ナロー）であった（図６）（ポリマーの物理的性質に関する上記のデータの全ては、Ｓｏｌｖａｙ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ  Ｉｎｄｉａ  Ｐｒｉｖａｔｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄの厚意による）。本発明のポリマーから作った膜を、負荷容量について測定した。負荷容量は、直径４０．５ｍｍおよび厚さ０．０５ｍｍの膜について７〜８ｐｓｉであることがわかった。膜は、さらに、カプセル、小袋に変換することができ、ヒートシーリングになじむ。これらの膜を、湿った庭園土壌に埋めたとき、５０日後に生分解の兆候を示した。より強靭な膜を、膜厚を増すか、または本発明のＰＨＡをポリメタクリル酸メチルと混合することによって、作ることができる。
【００９７】
実施例１２．２
生成培地における以下の変化を除いて、実施例１２．１の実験を、同一の方法で繰り返した：（ｉ）ＧＬ８  ２％を、ＧＬ７  ２％で置き換え、培地のｐＨを、培養物の接種に先立って８５％のＨ3ＰＯ4によって中和させ、（ＧＬ７の添加後の培地を散布して、ＧＬ７中の残留メタノールを排除し（別にことわらない限り、どこでＧＬ７を使用しても、このような散布を採用したことに注目されたい）、（ｉｉ）実施例１２．１の生成培地に加えたＮａ2ＨＰＯ4．１２Ｈ2ＯおよびＫＨ2ＰＯ4を除いた。ＰＨＡ含有量は、ＧＬ８についての７１．１％と比較して、細胞乾燥重量の４９．３％（ｗ／ｗ）であることがわかった。したがって、ＭＴＣＣ−５３４３培養物は、粗グリセロールの画分の組成物において変動がある場合、同じように反応しないであろう。
【００９８】
実施例１２．３
キングＢ培地は高額であり、さらに培地はペプトンとグリセロールとを含むので、キングＢ成長培地を、アミノ酸として窒素を与えるジャトロファ油ケーキ加水分解物（ＪＯＣＨ）１０％（ｖ／ｖ）およびグリセロールを与えるＧＬ７  ２％（ｗ／ｗ）で置き換えたことを除いて、実施例１２．１の実験を、同一の方法で繰り返した。しかし、上記の成長培地で成長した培養物を、実施例１２．２の生成培地中に接種した場合、ＰＨＡの収率は、細胞乾燥重量の２８．２％（ｗ／ｗ）までさらに減少したことがわかった。
【００９９】
キングＢ培地を、バイオディーゼルプロセス自体の副産物に由来する、より対費用効果の高い培地で置き換えることが原理的にできるにしても、置換は、ＭＴＣＣ-５３４３の場合、細胞乾燥重量に対するＰＨＡの収率に悪影響を及ぼす。
【０１００】
実施例１３
実施例１３．１
ハロモナスヒドロテルマリスとの配列相同性が９９．６３％である、インド、グジャラートのベラーバル海岸、Ａａｄｒｉ（緯度２０°５７．５８４’、経度７０°１６．７５９’）から分離した海洋性細菌（ＭＴＣＣ５３４５）を使用して、実施例１２．２の実験を繰り返した。この細菌を、６０の海洋性細菌からスクリーニングし、より多量のＰＨＡを生じることがわかった。キングＢ成長培地を、ｐＨ７．６±０．２に維持した培地１リットルに、ペプトン５．０ｇと、酵母エキス１．０ｇと、クエン酸第二鉄０．１ｇと、塩化ナトリウム１９．４５ｇと、塩化マグネシウム８．８ｇと、硫酸ナトリウム３．２４ｇと、塩化カルシウム１．８ｇと、塩化カリウム０．５５ｇと、炭酸水素ナトリウム０．１６ｇと、臭化カリウム０．０８ｇと、塩化ストロンチウム３４．０ｍｇと、ホウ酸２２．０ｍｇと、ケイ酸ナトリウム４．０ｍｇと、フッ化ナトリウム２．４ｍｇと、硝酸アンモニウム１．６ｍｇと、リン酸二ナトリウム８．０ｍｇを含む、ゾーベル海洋性培地で置換した。海洋性細菌を、この培養液中で培養して、Ｏ．Ｄ．が１．７〜１．９である種子培養物を得た。遠心分離したバイオマスを、実施例１２．２と同じ生成培地に接種した。細胞乾燥重量に対するＰＨＡの収率は、７１．２％（ｗ／ｗ）であった。
【０１０１】
ＰＨＡ生成のためのＧＬ７の使用は、土壌から分離したＭＴＣＣ５３４３よりも、本発明の過程において分離した海洋性細菌ＭＴＣＣ５３４５で、より効果的であることがわかった。
【０１０２】
実施例１３．２
ゾーベル海洋性成長培地を、ＪＯＣＨ  １０％（ｖ／ｖ）およびＧＬ７  ２％（ｗ／ｖ）で置き換えたことを除いて、海洋性細菌（ＭＴＣＣ５３４５）による実施例１３．１の実験を繰り返した。細胞乾燥重量についてのＰＨＡの収率は、６９．８％（ｗ／ｗ）、すなわち、上記の実施例１３．１とほぼ同一であった。最終的にＰＨＡにある、培地の炭素パーセントは、１１．３０％（ｗ／ｗ）であった。実験データの詳細を、下記の表６に示す。
【表６】
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【０１０３】
実施例１３．３
海洋性細菌（ＭＴＣＣ５３４５）による実施例１３．２の実験を、以下の単純化によって繰り返した：（ｉ）成長および生成の段階を組み合わせて単一の段階にした、（ｉｉ）ＧＬ７およびＪＯＣＨの他、いかなる他の栄養素／微量栄養素も与えなかった、（ｉｉｉ）ｐＨを、ＧＬ７とＪＯＣＨとの間の内部中和により自己調整させた（７．７になった。）、このように、ｐＨについて意図的な調整をしなかった、（ｉｖ）ＧＬ７中のメタノールの除去のために、散布を行わず、夜／早朝の２８℃から昼間の３７℃まで変化する周囲温度の条件下で、インキュベーションを行った。種子培養物１〜１０％（ｖ／ｖ）を、工程（ｘｉｉｉ）の粗グリセロール２〜１０％（ｗ／ｖ）と実施例３で調製したジャトロファ油ケーキ加水分解物５〜２０％（ｖ／ｖ）とを含む、成長兼生成培地１００ｍＬへ直接接種した。下記の表７からわかるように、ＰＨＡ生成は、細胞乾燥重量について７５．１％（ｗ／ｗ）であった。ＰＨＡの絶対重量は、実施例１３．２におけるより８９％高かったが、インキュベーションの９６時間後、最終的にＰＨＡにある、培地中の炭素のパーセンテージも１８．８％で、より高かった。精製したＰＨＡのＤＳＣ融点は、１７２℃であった（図７）。したがって、より高い対費用効果（ジャトロファメチルエステルプロセスのＧＬ７およびＪＯＣＨ共生成物ストリームによってのみ与えられる栄養素；エネルギーの節約）とともに手順の単純化（ＧＬ７の後処理の完全な回避；単一段階の発酵；時間の節約；周囲条件処理）が、同時にＰＨＡ生成の効率を高めながら、この実施例により実証されている。
【表７】
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【０１０４】
実施例１３．４
実施例１３．３の実験を、シェーカー中に周囲条件下で放置した、５Ｌフラスコに採取した発酵培養液４Ｌによって行った。９６時間後採取した湿潤バイオマスは３９ｇの重さがあり、乾燥したバイオマスの収量は５．５７ｇであり、ＰＨＡの収量は４．３ｇ（細胞乾燥重量についてのＰＨＡ７７％）であった。
【０１０５】
実施例１３．５
ＧＬ７  ２ｇを、ＧＬ７とＧＬ８との９：１の混合物２ｇで置き換え、インキュベーション時間が１週間であったことを除いて、実施例１３．３の実験を繰り返した。採取した乾燥バイオマスの収量は０．６１５ｇであったが、ＰＨＡの収量は０．４２５ｇであり、すなわち、ＰＨＡの収率は細胞乾燥重量に対して６９％（ｗ／ｗ）および培地中の炭素含有量に対して３０．２％であった。
【０１０６】
実施例１３．６
実施例１１〜１３．５から得られたＰＨＡ試料のいくつかを、クロロホルムに溶解し、清潔な、乾燥した、ガラス皿上に投入することによって、膜を作製し、クロロホルムをゆっくり蒸発させた。クロロホルム（ｗ／ｖ）にＰＨＡ０．５％〜５％を溶解させることによって、ＰＨＡ膜を調製した。膜を風乾した；完全な蒸発が膜の形成をもたらした。膜厚は、マイクロメータによって測定したときに０．０１６〜０．２８ｍｍであった。湿った庭園土壌中に埋めた膜は、５０日後に生分解したことがわかった。
【０１０７】
発明の利点
１．効率的で対費用効果の高い方法での、高密度エネルギーブリケットおよびポリヒドロキシアルカノエート生分解性ポリマーの調製のための共ストリームの使用。
【０１０８】
２．メチルエステルを精製するためのグリセロール洗浄の過程は、メチルエステル中にほとんどメタノールを残さず、その代わり、メタノールは、グリセロール層中に９０〜９５％程度まで閉じ込められる。
【０１０９】
かなりの量のメチルエステルは、再生なしに、小さい床体積の樹脂によって処理することができる。
【国際調査報告】
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