(57)【要約】   本発明は、試料の少なくとも１つの発光ナノエミッタの空間位置を算出するための光学測定方法および光学機器を提供し、本方法は、トポロジー群の異なる少なくとも２つの一連の小規模な配光分布を試料に照射すること、試料の前記少なくとも１つの発光ナノエミッタが再放出した光を検出すること、検出光に基づいて各々の配光分布に対して少なくとも１つの光学画像を生成すること、および光学画像をアルゴリズム解析して、前記少なくとも１つの発光ナノエミッタの位置に関する情報を得ることを含む。本発明はさらに、複数の点光源の空間位置を算出するための光学測定方法および光学機器にも関し、本方法は、複数の点光源から放出された光を検出すること、検出された光を複数の検出器に対して分離し、同時または連続的に検出すること、点光源から放出された光を均衡して、前記点光源の空間位置に応じて特定の検出器に誘導すること、検出光にに基づいて光学画像を生成すること、および光学画像をアルゴリズム解析して、複数の点光源の位置に関する情報を得ることを含む。【選択図】４ｄ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料の少なくとも１つの発光ナノエミッタの空間位置を算出するための光学測定方法であって、
トポロジー群の異なる少なくとも２つの一連の小規模な配光分布を試料に照射すること、
前記試料の前記少なくとも１つの発光ナノエミッタが再放出する光を検出すること、
前記検出光から、少なくとも１つの光学画像を各々の配光分布に対して生成すること、および
光学画像をアルゴリズム解析して、前記少なくとも１つの発光ナノエミッタの位置情報を得ること
を含む、方法。
【請求項２】
前記２つの小規模な配光分布は、前記試料の同一位置にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
トポロジー群の異なる前記少なくとも２つの小規模な配光分布は、規則波と特異波との間、または２つの特異波の間の干渉によって形成され、前記少なくとも２つの分布間の空間的相違は、以下のパラメータ：
ａ）前記規則波のパラメータのうちの少なくとも１つ、
ｂ）少なくとも１つの特異波の少なくとも１つのパラメータおよび
ｃ）前記規則波と前記特異波との間または２つの特異波の間の位相差
のうちの少なくとも１つを変化させることによって形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
入射光波から、規則波および特異波を含む２つの同一位置にある光波を形成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
入射規則波を２つの規則波に分離して、別々の幾何学的光路に沿わせること、
前記規則光波のうちの少なくとも１つを特異光波に変換すること、および
形成された２つの出射光波を融合すること
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記規則波および／または特異波の相対的振幅を制御するステップ、
所定のシーケンスで、偏光および／または入射光波の位相状態または規則波および特異波を形成する結晶サブモジュールの入射光波または出射光波の位相状態を制御するステップ、
前記特異波または規則波の形状を制御するステップ、および
光波の配光分布の中心位置を互いに揃えるステップ
のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記配光分布の重なりから出射する偏光を、静的または動的に形状を加工して、前記小規模な配光分布の形状およびサイズに対するベクトル効果を緩和することをさらに含み、前記ベクトル効果は、円偏光、放射偏光、または方位偏光のように対称に回転する静的偏光状態および／または動的偏光状態を供給して、出射偏光の形状を加工することによって光学画像を生成するための開口数の高いレンズによって生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも２つの配光分布は、マルチモードレーザーの様々なモードの強度を制御することによって形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
再放出光の平均波長λよりも実質的に小さいサイズの領域が前記試料内にあり、該領域では、前記トポロジー群の異なる少なくとも２つの小規模な配光分布の強度を数学的に特別に組み合わせた値は、前記領域に含まれる前記配光分布部分の横方向の位置に対して正であり、前記特別な数学的組み合わせは、前記領域以外の配光分布のその他の全部分でゼロに近い、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つのナノエミッタは、蛍光色素分子であり、該蛍光色素分子の一連の蛍光光度は、トポロジー群の異なる一連の小規模な配光分布が前記蛍光色素分子に係る入射強度によって異なり、これによって、前記蛍光色素分子の空間位置が特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ナノエミッタのうちの少なくとも２つは、異なる空間位置にある蛍光色素分子であり、各々の蛍光色素分子は、一連の蛍光光度を有し、この光の強度は、トポロジー群の異なる一連の小規模な配光分布が少なくとも２つの蛍光色素分子に係る入射強度によって異なり、これによって、少なくとも２つの蛍光色素分子の空間位置が特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
再放出光の平均波長よりも実質的に小さいサイズの領域が試料内に存在し、該領域では、前記トポロジー群の異なる一連の小規模な配光分布を数学的に組み合わせた複数のものを比較することを利用して、
ａ）単一の発光ナノエミッタ、
ｂ）複数の同一位置の発光ナノエミッタ、および
ｃ）互いに距離を置いて位置する複数の発光ナノエミッタ
のうちの少なくとも１つを区別し、これによって、発光ナノエミッタ間の距離が算出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
一連の前記少なくとも２つの配光分布および／または一連の前記少なくとも２つの配光分布の位置を、測定データまたは外部情報に応じて変化させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
トポロジーの異なる配光分布の照射は、円錐回折によって行われ、前記円錐回折を行う少なくとも１つの円錐形結晶の入射および出射の偏光状態を変化させることによって修正される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１つの発光ナノエミッタの測定した空間位置は、前記少なくとも１つの発光ナノエミッタの横方向の位置である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
複数の点光源の空間位置を算出するための光学測定方法であって、
複数の点光源から放出される光を検出すること、および
放出された光を複数の検出器に対して分離して、同時または連続的に検出すること
点光源から放出され、前記点光源の空間位置によって異なる特定の検出器に向けて導かれる光を、均衡すること、および
前記検出光から光学画像を生成すること、および
前記光学画像をアルゴリズムで解析して、複数の点光源の位置情報を得ること、
を含む方法。
【請求項１７】
前記測定した空間位置は、各々の点光源の縦方向の位置である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記再放出光は、各々の点光源の縦方向の位置に応じて、または各々の点光源が放出する波長に応じて分離される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記再放出光の前記分離は、複数の検出チャネルに対して、対物レンズの焦点面に位置決めされた光源から出射するコリメートされた再放出光を、前記焦点面の手前または背後にある前記点光源から出射するコリメートされていない再放出光から分離するように実行される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記測定データまたは外部情報に応じて、前記検出チャネルの前記パラメータを変化させることをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
ほぼ平行な光ビームであって、収束角または発散角が前記平行光とは異なり、前記角度の値は、各々の点光源の縦方向の位置によって異なる光ビームを、前記放出光の各々の点光源から生成するステップ、
偏光が直交し幾何学形状が異なる同一位置の２つの光波である１つの規則波およびもう１つの特異波であって、前記規則波と前記特異波との間のエネルギー比が、前記光ビームの前記収束角もしくは発散角ならびに点光源の縦方向の位置によって異なる２つの光波を、入射光波から生成するステップ、および
前記規則波および前記特異波の偏光状態、またはこの幾何学形状に基づいて、前記規則波および前記特異波を分離することができる偏光または幾何学形状を修正するステップ
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
複数の光源から放出される光度を、偏光ビームスプリッタを使用して、偏光が直交する複数の独立したチャネルに分離すること、および
各々のチャネの光度を融合し、前記偏光の縦方向の位置の依存性または前記光度の幾何学的光路が、前記融合光内で維持されるようにすること
を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
特定の縦方向の位置に置かれたナノエミッタの点光源を集光すること、および
前記縦方向の位置の前後に位置決めされた光源を散乱させて、各々の点光源の前記縦方向の位置に応じて前記配光分布が集光時とは異なるようにすることを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
偏光の異なる２つの光波であって、偏光の異なる波同士の間のエネルギー比が、焦点の空間分布およびナノエミッタの縦方向の位置によって異なる２つの光波を、入射光波から生成すること、および
前記規則波および前記特異波の偏光状態または幾何学形状に基づいて、前記規則波および特異波を分離すること
を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
各々の点光源は、前記試料の１つ以上のナノエミッタに対応し、前記方法は、入射光によって前記ナノエミッタを照明することからなる予備ステップを含み、前記放出光の検出は、前記ナノエミッタから再放出される光を検出することからなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの光学画像は、共焦点顕微鏡のような顕微鏡の光学器械を用いて生成され、前記再放出光の前記検出は、顕微鏡対物レンズの焦点面内に限定されることが好ましい、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
試料上に位置決めされた少なくとも１つの発光ナノエミッタの空間位置を算出する光学測定装置であって、
トポロジー群の異なる一連の少なくとも２つの小規模な配光分布を前記試料に照射するためのプロジェクタ、
前記試料の前記少なくとも１つの発光ナノエミッタが再放出した光を検出するように適応した検出手段、
前記検出光から、各々の配光分布に対して少なくとも１つの光学画像を生成するように適応した画像生成手段、および
光学画像のコンピュータ解析を実行して、前記少なくとも１つの発光ナノエミッタの位置情報を得るためのアナライザ
を備える装置。
【請求項２８】
前記プロジェクタは、２つの小規模な配光分布を前記試料に対して同一位置にするように構成される、請求項２７に記載の装置。
【請求項２９】
前記プロジェクタは、規則波と特異波との間または２つの特異波の間の干渉によって、前記少なくとも２つの配光分布を形成するように構成され、以下のパラメータ：
ａ）前記規則波のパラメータのうちの少なくとも１つ、
ｂ）少なくとも１つの特異波の少なくとも１つのパラメータおよび
ｃ）前記規則波と前記特異波との位相差または２つの特異波の位相差、
のうちの少なくとも１つを変化させることによって、前記少なくとも２つの分布間に空間差を形成するように構成される、請求項２７に記載の装置。
【請求項３０】
光源に対して光学的に相互作用し、
ａ）入射光波から、１つの規則波および１つの特異波を含む２つの同一位置の光波を形成する結晶サブモジュールであって、薄型の２軸結晶および／または１軸結晶を備える結晶サブモジュール、
ｂ）入射規則波を、別々の幾何学的光路に沿う２つの規則波に分離するように適応した光学サブモジュールであって、再放出光の平均波長よりも小さいステップのネットワークと、薄型の２軸結晶または１軸結晶とを備える変換器を使用して、前記規則光波のうちの１つを特異光波にするように構成された光学サブモジュールにおいて、形成された２つの出射光波を融合するように設計された光学サブモジュール、
ｃ）規則波および特異波の相対的振幅を制御し、好ましくは、波の配光分布の中心位置を互いに並進移動させる部分偏光子、
ｄ）前記振幅、偏光または位相を光学的に制御する光学制御サブモジュールであって、前記結晶サブモジュールへ入射する光波または前記結晶サブモジュールから出射する光波の偏光状態および／または位相状態を、所定の順序で制御するための、少なくとも１つの制御可能または調整可能な光学制御サブモジュール、
ｅ）前記規則波または特異波の波形状を制御するための、少なくとも１つの調整可能な光学素子を備えるサブ制御モジュール、
ｆ）偏光検光子、および
ｇ）前記分布の重なりから出射する偏光の形状を加工する静的または動的なサブモジュールであって、各々の小規模な配光分布の形状およびサイズに対するベクトル効果を緩和することができ、前記ベクトル効果は、円偏光、放射偏光、または方位偏光のように対称に回転する静的偏光状態および／または動的偏光状態を供給して出射偏光の形状を加工することによって、光学画像手段を生成する開口数の高い対物レンズによって生じる、サブモジュール
のうちの少なくとも１つを備える、請求項２７に記載の装置。
【請求項３１】
マルチモードレーザーであって、前記レーザーモードの強度を制御でき、トポロジー群の異なる少なくとも２つの小規模な配光分布は、様々なレーザーモードの強度を制御することによって形成されるマルチモードレーザーをさらに備える、請求項２７に記載の光学装置。
【請求項３２】
再放出光の平均波長λよりも実質的に小さいサイズの領域が試料内に存在し、該領域では、照明手段によって形成されるトポロジー群の異なる前記少なくとも２つの小規模な配光分布の強度を数学的に特別に組み合わせた値は、前記領域内に含まれる横方向の位置に対して正であり、前記特別な数学的組み合わせは、前記領域以外の配光分布のその他の全部分で、ゼロに近い、請求項２７に記載の光学装置。
【請求項３３】
少なくとも１つのナノエミッタは、蛍光色素分子であり、該蛍光色素分子の一連の蛍光光度は、トポロジー群の異なる一連の小規模な配光分布が前記蛍光色素分子に係る入射強度によって異なり、これによって、前記蛍光色素分子の空間位置が特徴付けられる、請求項２７に記載の装置。
【請求項３４】
ナノエミッタのうちの少なくとも２つは、異なる空間位置にある蛍光色素分子であり、各々の蛍光色素分子は、一連の蛍光光度を有し、前記光度は、トポロジー群の異なる一連の小規模な配光分布が前記少なくとも２つの蛍光色素分子に係る入射強度によって異なり、これによって、少なくとも２つの蛍光色素分子の空間位置が特徴付けられる、請求項２７に記載の装置。
【請求項３５】
放出光の平均波長よりも実質的に小さいサイズの領域が試料内に位置し、前記トポロジー群の異なる一連の小規模な配光分布を数学的に組み合わせた複数のものを比較するための比較器を備えて、
ａ）単一の発光ナノエミッタ、
ｂ）複数の同一位置の発光ナノエミッタ、および
ｃ）互いに距離を置いて位置する複数の発光ナノマーカー
のうちの少なくとも１つを区別し、これによって、発光ナノマーカー間の距離が算出される、請求項２７に記載の装置。
【請求項３６】
前記プロジェクタは、一連の前記少なくとも２つの配光分布および／または一連の前記少なくとも２つの配光分布の位置を、測定データまたは外部情報に応じて変化させるように構成される、請求項２７に記載の装置。
【請求項３７】
前記プロジェクタは、円錐回折を行う少なくとも１つの円錐形結晶と、前記少なくとも１つの円錐形結晶の入射および出射の偏光状態を変化させるための調整器と、を備える、請求項２７に記載の装置。
【請求項３８】
前記少なくとも１つの発光ナノエミッタの横方向の位置を測定するように構成される、請求項２７に記載の装置。
【請求項３９】
複数の点光源の空間位置を算出するための光学測定装置であって、
複数の点光源から放出される光を検出するように適応した検出手段、および
前記放出光を複数のセンサに対して分離して、同時または連続的に検出するためのセパレータであって、点光源が再放出する光を均衡して、前記点光源の空間位置によって異なる特定の検出器に向けて導く、セパレータ、および
前記検出光から光学画像を生成するための画像生成手段、および
光学画像のコンピュータ解析を実行して、複数の点光源の位置情報を得るためのアナライザ
を備える光学測定装置。
【請求項４０】
各々の点光源の縦方向の位置を測定するように構成される、請求項３９に記載の装置。
【請求項４１】
前記セパレータは、各々の点光源の縦方向の位置に応じて、または各々の点光源から放出される波長に応じて再放出される光を分割するように構成される、請求項３９に記載の装置。
【請求項４２】
前記セパレータは、複数の検出チャネルに対して、対物レンズの焦点面に位置決めされた点光源から出射するコリメートされた放出光を、焦点面の手前または背後にある点光源から出射するコリメートされていない放出光から分離するように構成される、請求項３９に記載の装置。
【請求項４３】
測定データまたは外部に基づいて前記検出チャネルのパラメータを変化させるための調整器をさらに備える、請求項３９に記載の装置。
【請求項４４】
小量の光の中に置かれた複数の点光源から来る光度を、各々の点光源の縦方向の位置に応じて、別々の検出器に、および／または同じ検出器の別々の幾何学的位置に誘導するための誘導器を備える、請求項３９に記載の装置。
【請求項４５】
光学補助を介して、顕微鏡対物レンズおよびサブ検出モジュールと相互作用し、この両者を互いに相互作用させる少なくとも１つのサブモジュールを備える、請求項３９に記載の装置。
【請求項４６】
ａ）ほぼ平行な光ビームであって、収束角または発散角が前記平行光とは異なり、前記角度の値が、各々の点光源の縦方向の位置に応じて異なる光ビームを、各々の点光源から形成するための光学ビーム生成器、
ｂ）結晶サブモジュール、または結晶サブモジュールのカスケードであって、各々の結晶サブモジュールは、２軸結晶もしくは１軸結晶またはこのアセンブリ、ならびに補助光学器械のうちの少なくとも１つを備え、偏光が直交し幾何学形状が異なる同一位置の２つの光波である１つの規則波およびもう１つの特異波であって、規則波と特異波との間のエネルギー比がビームの収束角または発散角によって異なり、それによって、発光する点光源の縦方向の位置によっても異なる２つの光波を、入射光波から形成するように適応した、結晶サブモジュール、および／または
ｃ）規則波および特異波の偏光状態、またはこの幾何学形状に基づいて、規則波および特異波を分離することができる偏光または幾何学形状を修正するための偏光調整器
を備える、請求項３９に記載の光学装置。
【請求項４７】
複数の点光源の光度を、縦方向超解像モジュールの前で、偏光が直交する２つの独立したチャネルに分離するように構成された偏光ビームスプリッタ、および
縦方向超解像モジュールの出射する光度を融合し、各々のチャネルで、偏光の縦方向の位置またはラインの光度の幾何学的チャネルの依存性が、前記融合光内で維持されるようにする手段
を備える、請求項３９に記載の装置。
【請求項４８】
ａ）所定の縦方向の位置に置かれた再放出光からの点光源を集光して、前記縦方向の位置の前後に位置決めされた光源をわずかに散乱させて、各々の点光源の縦方向の位置に応じて配光分布が集光時とは異なるようにするための光学集光器、
ｂ）偏光を空間的に変化させる偏光子であって、厚さを変更できる少なくとも１つの１軸結晶、再放出光の平均波長よりも低い段階のネットワークおよび／または位相板を有し、偏光の異なる２つの光波であって、偏光の異なる波同士の間のエネルギー比が焦点の空間分布によって異なり、該空間分布を介して、発光する点光源の縦方向の位置によっても異なる２つの光波を、入射光波から形成する偏光子、および／または
ｃ）規則波および特異波の偏光状態またはその幾何学形状に基づいて、規則波および特異波を分離するように構成された偏光器または幾何学形状形成器
をさらに備える、請求項３９に記載の装置。
【請求項４９】
各々の点光源は、前記試料の１つ以上のナノエミッタに対応し、前記装置は、入射光によってナノエミッタを照明できる照明器をさらに備え、前記検出器は、ナノエミッタから再放出される光を検出するように適応される、請求項３９に記載の装置。
【請求項５０】
試料の少なくとも１つのナノエミッタの空間位置を算出する光学測定機器であって、
共焦点顕微鏡、
請求項２７に記載の測定装置、および／または請求項３９に記載の測定装置
を備える光学測定機器。
【請求項５１】
試料の少なくとも１つの発光ナノエミッタの空間位置を算出する光学測定方法であって、
前記試料内の少なくとも１つのナノエミッタの横方向の位置を算出するための請求項１に記載の測定方法、および
前記試料の少なくとも１つのナノエミッタの縦方向の位置を測定するための請求項１５に記載の測定方法
を含む光学測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学測定方法および光学測定装置に関する。本発明の用途は、特に顕微鏡法、例えば生物学分野および光学的観察から得られる生物情報の取得に見出される。
【背景技術】
【０００２】
顕微鏡とは、一般に肉眼で見るには小さすぎる物体を見る、解析するまたは測定するのに使用される光学機器である。
【０００３】
本明細書では、生命科学のあらゆる生物学的実体を記載するのに「生物学の」（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）という用語を用いるが、これはその母体が人間、動物または植物であるか、あるいはその観察、研究、診断または治療の目的が何であるかを問わない。この用語には、記載する技術の医学的な使用も含まれる。  顕微鏡法は、例えば、生物学的実体（物体）およびその動作を観察し、研究し、測定するために、生物学分野で使用されるものである。
【０００４】
通常の定義は、光回折限界、レイリー基準、エアリーディスクならびにその半径および直径に対して用いられる。本発明の内容では、超解像、超解像した、超解像イメージングおよび超解像顕微鏡法という用語を使用して、光回折限界よりも高い解像度でのデータ取得、光学イメージングおよび顕微鏡法について記載する。通常の定義は、 蛍光および蛍光色素分子に対して使用される。
【０００５】
ここで、生物学分野での顕微鏡法１００の模範を示す図である図１を参照する。
【０００６】
顕微鏡法は、顕微鏡１０を使用して行う、図示していない光源を介した生体試料１１への照明、および視覚による観察または検出モジュール１２のいずれかを用いて行う、試料から放出された光の時間依存測定からなる方法である。生物学における試料は、異なる位置に置かれた１つまたは複数の異なる生物学的実体１３および１４を含むものである。このような物体の例には、とりわけ細胞、ウイルス、タンパク質およびＤＮＡの断片がある。 
【０００７】
蛍光顕微鏡法は、顕微鏡法の変形例の１つであり、多くの生物学の適用において他の顕微鏡法技術に取って代わったものである。蛍光顕微鏡とは、蛍光現象を反射および吸収などの他の手段の代わりまたはこの手段に加えて利用して、有機成分または無機成分の特性を研究するのに使用される光学顕微鏡である。
【０００８】
再度図１を参照し、蛍光顕微鏡について説明する。蛍光顕微鏡法では、１つの蛍光光子の物理的現象に基づいて起こる極小の点光源１５から１８である蛍光色素分子を、所定の生体１３および１４の特定の位置に設定する。生体１３および１４自体が放出する光を観察する代わりに、蛍光色素分子が放出する光を観察する。
【０００９】
試料は、蛍光色素分子に吸収される波長または特定の波長の光に照明され、それによってより高い様々な波長の光が放出される。照明光は、分光フィルタを使用することで、放出される低い方の蛍光から分離される。
【００１０】
蛍光色素分子は、生体を可視化するための重要な道具になっている。２００ｎｍの分解能を越える細部を含む生物活動および生物情報が、蛍光顕微鏡法を用いて体系的に観察、測定される。この分解能限界は、レイリー基準によるものであり、この基準は、最良の場合、特別に設計されたシステム（系）では２００ｎｍに達する。以下に説明する超解像技術が出現するまでの長い間、蛍光顕微鏡法をはじめとする光学技術では、約２００ｎｍであるレイリー基準よりも小さい細部を可視化することは不可能であると考えられていた。
【００１１】
しかし、生体試料内では、２００ｎｍよりも小さい規模でこれ以外の基本的な生物活動も起きている。このレベルの空間分解能では、重要な現象を観察することができる。具体的には、細胞内規模での生物学的過程、細胞情報の転送、タンパク質のフォールティングおよびアンフォールディングならびにＤＮＡおよびＲＮＡの変化である。例えば、この細胞内情報の測定により、生物活動の理解に新たな道が開かれ、研究の経過観察および医学的診断に対する理解が深まることになる。
【００１２】
蛍光顕微鏡法の主な実施態様は、文献に詳細に記載されているように、共焦点顕微鏡であり、この共焦点顕微鏡は、走査機能または回転ディスクを備える顕微鏡、および広視野イメージングの顕微鏡に使用されることが多い。
【００１３】
次に、先行技術の共焦点蛍光顕微鏡２００を簡易化した図である図２を参照する。
【００１４】
図２の共焦点蛍光顕微鏡は、光学機器である。その主要ハードウェア部品を図２に示す。この部品は、
光源２０、
図示していない光学機械フレーム、
立体フィルタ２１、
顕微鏡対物レンズ２２、および
検出アセンブリ２３、
図示していない処理ユニット
を備える。
【００１５】
アーク灯またはレーザーであってよい光源２０は、蛍光に必要な光エネルギーを形成する。
【００１６】
図示していない光学機械光学機械フレームは、あらゆる光学部品および補助光学器械の基盤であり、位置調整能力を備えている。光学機械フレーム光学機械フレームは、図示していない光学素子も備えており、この光学素子は、ビーム形状を加工する能力があり、顕微鏡対物レンズを用いてビームの焦点を最小サイズにすることができる。
【００１７】
光学機械フレームは、走査型共焦点蛍光顕微鏡の場合、図示していない空間走査機構または角度走査機構も備えて、被測定物体に対する点光源の位置を変更する。
【００１８】
また、走査機構は、
例えば並進プレートを使用して、物体を機械的に並進運動させること、
例えば一連のガルバノミラーもしくは音響光学式並進器を使用して、物体へ照射されるビームを光学的に走査すること、または機械的もしくは光学的なこれらの並進運動手段を組み合わせたものを使用すること
が可能である。
【００１９】
走査型共焦点蛍光では、情報は、走査機構を使用して点ごとに収集される。
【００２０】
回転ディスクタイプの共焦点蛍光顕微鏡では、複数のピンホールを有する回転ディスクも備えることができ、これによって複数の点を同時に照射することが可能になる。共焦点蛍光顕微鏡の回転ディスクでは、ピンホールに対応する一連の点が常時取得され、ディスクが回転することによって、特定の縦方向の位置に対して試料の表面全体を走査することができる。
【００２１】
立体フィルタ２１は、様々に異なる光信号を誘導し、発光による蛍光信号の混入を回避する。立体フィルタは、励起フィルタ２１０、ダイクロイックミラー２１１、および発光フィルタ２１２で構成される。フィルタおよびダイクロイックミラーは、励起の波長および蛍光色素分子の発光スペクトルの特徴に応じて選択される。
【００２２】
顕微鏡対物レンズ２２は、光源が形成した光をレンズ２４の焦点面で集光して、小サイズの配光分布パターンを形成し、最適な配光分布は、エアリーディスクからなる。顕微鏡対物レンズ２２は、蛍光色素分子が放出して反射する蛍光も集光する。
【００２３】
走査型共焦点蛍光の場合、システムをデスキャンできる、すなわち、反射光は、走査機構を通過して、走査によって生じる並進運動を補償することができる。
【００２４】
検出レンズ２５は、検出器２６の像面に、レンズ２４の焦点面を拡大した像を形成する。
【００２５】
共焦点ピンホール２７は、理論的には検出器２６の像面に配置される。ほとんどの実際のシステムでは、共焦点ピンホール２７は、図示していない中間結像面に配置され、検出器２６の像面上に再び結像される。
【００２６】
検出器アセンブリ２３は、全体的な照明量の蛍光度を検出し、これをデジタル信号に変換する。走査型共焦点顕微鏡の場合、検出アセンブリは、ＰＭＴまたはＳＰＡＤなどの単一素子の検出器を備える。回転ディスクを使用する共焦点顕微鏡の場合、検出アセンブリは、ＣＣＤ、ＥＭＣＣＤ、ＣＭＯＳまたはＳＰＡＤのマトリクスなど、検出素子のマトリクスで構成される。
【００２７】
光源からダイクロイックフィルタまでに取り付けられる部品はすべて、照明路２０１である。
【００２８】
検出チャネル２０２は、ダイクロイックフィルタから検出器のアセンブリまでに取り付けられる全部品を表す。
【００２９】
共焦点顕微鏡の基本光学プロセスを、以下の６ステップ：
・  解析分量に光を照射する
・  蛍光色素分子によって蛍光を放出する
・  蛍光色素分子を焦点面に結像させる
・  解析した光を共焦点ピンホールによって焦点面に限定する
・  解析した光を光電検出器によって一体にする
・  測定した強度を画像の画素値として表示する
に分けることができる。
【００３０】
蛍光顕微鏡は、Ｎｉｋｏｎ、Ｚｅｉｓｓ、ＬｅｉｃａおよびＯｌｙｍｐｕｓなど、数社のメーカーから入手可能である。蛍光顕微鏡は、蛍光に適した標準の顕微鏡でもよいし、蛍光用に特別に最適化した顕微鏡でもよい。現代の顕微鏡は、同じプラットフォームおよびほとんどの光学機械部品を使用する多くの様々な方式で動作することができる多用途機器であり、この方式には蛍光方式などがあるが、これに限定されない。ほとんどの蛍光顕微鏡は、最小限の修正でいくつかの追加機能を実行できる、オープンプラットフォームとして開発されている。その他の蛍光顕微鏡は、医学的診断または調剤など、特殊な作業に適応された専用の機器である。
【００３１】
新しい光学方法である超解像方法は、レイリー基準を下回る蛍光色素分子を区別することができる。これらの方法は、複数の企業、研究所および研究者によって開発されており、これらの方法、超解像顕微鏡を用いる機器のいくつかは市販されている。超解像法のいくつかの比較解析に関する文献が最近発行され、Ｒｉｃａｒｄｏ  ＨｅｎｒｉｑｕｅｓおよびＭｒ  Ｍｕｓａ  Ｍｈｌａｎｇａ著作「ＰＡＬＭ  ＡＮＤ  ＳＴＯＲＭ：Ｗｈａｔ  ｈｉｄｅｓ  ｂｅｙｏｎｄ  Ｒａｙｌｅｉｇｈ  ｌｉｍｉｔ？（ＰＡＬＭおよびＳＴＯＲＭ：レイリー基準の背後に何が隠されているか）」［１］や、Ｋｅｌｌｙ  ＲａｅＣｈｉ著作「Ｓｕｐｅｒｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ｂｒｅａｋｉｎｇ  ｌｉｍｉｔｓ（超解像顕微鏡法：限界の崩壊）」［２］がある。
【００３２】
Ｚｅｉｓｓ社のウェブサイト［３］、およびＮｉｋｏｎ社のウェブサイト［４］には、超解像に関する最新の文献が掲載されている。
【００３３】
様々な既存の顕微鏡法および超解像を組み入れていない既存の顕微鏡では、最大で光回折限界までの顕微鏡観察が可能である。これでは、その使用分野は、限定された適用例に縮小される。 
【００３４】
新規な超解像技術では、分解能限界を超える情報を得ることができる。あらゆる既存の超解像技術の主な問題は、横方向の分解能、縦方向の分解能、速度、生体内の光毒性に必要な光度、様々な物体を測定する能力に関して現れる性能範囲が極めて限られている点である。
【００３５】
さらに、ほとんどの方法および機器が提供できるのは、 良好な横方向の分解能か縦方向の分解能のいずれかの超解像であり、両方を提供できるものは稀である。
【００３６】
さらに、これらの機器はすべて複雑であり、高度なスキルを持つオペレータを必要とする。 
【００３７】
さらに、 これらの機器は、機器によっては、フィールドの深さが浅いことや、細胞に危険となるきわめて高い光度が必要であるなど、操作上の厳しい限界があるために、全体的に生物標本のわずかな部分しか観察できない。
【００３８】
超解像の方法および機器に伴うもう１つの問題は、ほとんどの機器が照明分量内で単一の蛍光色素分子の特性を回復することはできるが、複数の蛍光色素分子の存在を同時に認識してその特性を測定することはできないという点である。
【００３９】
超解像の方法および機器に伴うさらに別の問題は、これらの方法および機器が、使用者には標準の顕微鏡または共焦点顕微鏡に取って代わることのできる一般的な道具として見られ、認識されている点である。しかし、超解像の方法および機器には、簡素性、堅剛性、使いやすさ、および標準の顕微鏡の競争価格が欠けており、これが研究道具または一般的な診断道具としての使用を妨げている。
【００４０】
既存の超解像の方法および道具に伴うもう１つの問題は、これらの方法および道具のほとんどが、標準の顕微鏡に取って代わるように設計された独立型機器として設計されている点である。このような手法では、既存の機器を入れ替える必要があり、長年にわたって開発されてきた顕微鏡法のプラットフォームに関するあらゆるシステムや装置、あらゆる知識およびノウハウの刷新が必要である。
【００４１】
蛍光顕微鏡法および超解像のほとんどの方法および機器に伴うもう１つの問題は、これらの方法および道具が、画像取得の模範に基づいて設計されており、基本情報の実体は、２次元または３次元の１つ（または複数）の画像、あるいは１つ（または複数）のＲＯＩ（Ｒｅｇｉｏｎ  Ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、関心領域）である点である。本発明内で後に記載するアルゴリズム法、体系的方法および超解像法は、これらの固有の柔軟性により、新たな取得法の開発を可能にするものである。動的かつ選択的なこれらの取得手順は、最適化した連続取得および相互作用的かつ異なる処理によって定義される。これらの取得手順によって、１つ以上の蛍光物体の形状、立体構造および動作に基づく基準によって定義された有益情報を、別々にまたは互いさらに洗練して最適化することができる。
【００４２】
そのため、蛍光色素分子の特性を高精度で測定できる超解像の方法および道具ならびにアルゴリズム法を提供する差し迫った必要性が依然としてある。同じ被照明分量内に配置された複数の蛍光色素分子の存在を検出し、定量する方法および道具を提供することも必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００４３】
【非特許文献１】Ｒｉｃａｒｄｏ  Ｈｅｎｒｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ｍｒ  Ｍｕｓａ  Ｍｈｌａｎｇａ，  ｅｎｔｉｔｌｅｄ  ”ＰＡＬＭ  ａｎｄ  ＳＴＯＲＭ：  Ｗｈａｔ  ｈｉｄｅｓ  ｂｅｙｏｎｄ  ｔｈｅ  Ｒａｙｌｅｉｇｈ  ｌｉｍｉｔ？”
【非特許文献２】Ａｒｔｉｃｌｅ  ｗｒｉｔｔｅｎ  ｂｙ  Ｋｅｌｌｙ  Ｒａｅ  Ｃｈｉ  ｃａｌｌｅｄ  ”Ｓｕｐｅｒ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：  ｂｒｅａｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｌｉｍｉｔｓ”
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００４４】
本発明の少なくとも１つの実施形態の１つの目的は、蛍光顕微鏡法による超解像技術を、生物学およびさらに全般的には生命科学、またこれに加えて薬理学、医学および診断に対して提供し、これによって先行技術による装置の欠点を克服することである。
【００４５】
本発明の少なくとも１つの実施形態の目的の１つは、蛍光顕微鏡法による超解像技術を生物分野に提供して、蛍光色素分子の特性を高精度で測定することができ、同じ被照明分量内にある複数の蛍光色素分子の特性を認識・測定することができる光学系を達成することである。
【００４６】
本発明の少なくとも１つの実施形態のもう１つの目的は、蛍光顕微鏡法による超解像技術を生物分野に提供して、蛍光色素分子の特性を高精度で測定することである。
【００４７】
本発明の少なくとも１つの実施形態のもう１つの目的は、同じ被照明分量内にある複数の蛍光色素分子の特性を高精度で取得・測定する蛍光顕微鏡法による超解像技術を生物分野に提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００４８】
この目的のため、本発明の第１の態様は、試料の少なくとも１つの発光ナノエミッタの空間位置を算出するための光学測定方法であって、
トポロジー群の異なる少なくとも２つの一連の配光分布を試料に照射すること、
前記少なくとも１つの発光ナノエミッタが試料から再放出する光を検出すること、
検出光から、少なくとも１つの光学画像を各々の配光分布に対して生成すること、および
光学画像をアルゴリズムによって解析して、前記少なくとも１つの発光ナノエミッタの位置情報を得ること
を含む、方法を提供する。
【００４９】
検出には、平均波長λで反射光を検出することが含まれてよい。反射光は、開口数の高い対物レンズで集光されることができる。両分布とも、小規模とすることができる。
【００５０】
複数の分布は、時系列に生成されるか、あるいは同時に形成されてよい。
【００５１】
一実施形態によれば、２つの小規模な配光分布は、試料上の同一位置にある。
【００５２】
１つの実施形態によれば、トポロジー群の異なる前記少なくとも２つの小規模な配光分布は、規則波と特異波との間、または２つの特異波の間の干渉によって形成され、前記少なくとも２つの分布間の空間的相違は、以下のパラメータ：
ａ）規則波のパラメータのうちの少なくとも１つ、
ｂ）少なくとも１つの特異波の少なくとも１つのパラメータおよび
ｃ）規則波と特異波との間または２つの特異波の間の位相差
のうちの少なくとも１つを変化させることによって形成される。
【００５３】
様々なパラメータには、例えば振幅、位相、偏光、コヒーレンスが含まれてよい。
【００５４】
１つの実施形態によれば、本方法は、入射光波から、同一位置にある２つの光波、つまり１つの規則波および１つの特異波を形成することを含む。
【００５５】
１つの実施形態によれば、本方法は、さらに、入射する１つの規則波を２つの規則波に分離して、別々の幾何学的光路に沿わせること；規則光波のうちの少なくとも１つを特異光波に変換すること、および形成された２つの出射光波を融合することを含む。
【００５６】
１つの実施形態によれば、本方法は、さらに、
規則波および／または特異波の相対的振幅を制御するステップ、
所定の順序に従って、偏光および／または入射光波の位相状態または規則波および特異波を形成する結晶サブモジュールからの出射光波の位相状態を制御するステップ、特異波または規則波の形状を制御するステップ、および
光波の配光分布の中心位置を互いに揃えるステップ
のうちの少なくとも１つを含む。
【００５７】
１つの実施形態によれば、本方法は、さらに、前記重なった配光分布から出射する偏光を、静的または動的に形成することを含み、これによって、前記小規模な配光分布の形状およびサイズに対するベクトル効果を緩和することができ、このベクトル効果は、円偏光、放射偏光、または方位偏光のように対称に回転する静的偏光状態および／または動的偏光状態を供給して出射偏光の形状を加工することによって、光学画像を生成するのに使用される開口数の高いレンズによって生じる。
【００５８】
１つの実施形態によれば前記少なくとも２つの配光分布は、マルチモードレーザーの様々なモードの強度を制御することによって形成される。
【００５９】
１つの実施形態によれば、反射光の平均波長lよりも実質的に小さいサイズの領域が試料内に存在し、この領域では、前記少なくとも２つのトポロジー群の異なる小規模な配光分布の強度を数学的に特別に組み合わせた値は、前記領域に含まれる前記配光分布部分の横方向の位置に対して正であり、前記特別な数学的組み合わせは、前記領域以外の配光分布のその他の全部分で、ゼロに近い。
【００６０】
１つの実施形態によれば、少なくとも１つのナノエミッタは、蛍光色素分子であり、この蛍光色素分子の一連の蛍光光度は、トポロジー群の異なる一連の小規模な配光分布が前記蛍光色素分子に係る入射強度によって異なり、これによって、前記蛍光色素分子の空間位置が特徴付けられる。
【００６１】
もう１つの実施形態によれば、ナノエミッタのうちの少なくとも２つは、異なる空間位置にある蛍光色素分子であり、各々の蛍光色素分子は、光を放出し、この光の強度は、トポロジー群の異なる一連の小規模な配光分布が前記少なくとも２つの蛍光色素分子に係る入射強度によって異なり、これによって、少なくとも２つの蛍光色素分子の空間位置が特徴付けられる。
【００６２】
１つの実施形態によれば、反射光の波長lよりも実質的に小さいサイズの領域が試料内に存在し、この領域では、前記トポロジー群の異なる一連の小規模な配光分布を数学的に組み合わせた複数のものを比較すると、
ａ）単一の発光ナノエミッタ、
ｂ）複数の同一位置の発光ナノエミッタ、および
ｃ）互いに距離を置いて位置する複数の発光ナノエミッタ
のうちの少なくとも１つを区別し、これによって、発光ナノエミッタ間の距離が算出されることができる。
【００６３】
１つの実施形態によれば、本方法は、さらに、一連の前記少なくとも２つの配光分布および／または一連の前記少なくとも２つの配光分布の位置を、測定データまたは外部情報に応じて変化させることを含む。
【００６４】
１つの実施形態によれば、トポロジーの異なる配光分布の照射は、円錐回折によって形成され、円錐回折効果を生み出す少なくとも１つの結晶の入射および出射の偏光状態を変化させることによって修正される。
【００６５】
１つの実施形態によれば、少なくとも１つの測定した発光ナノエミッタの空間位置は、前記少なくとも１つの発光ナノエミッタの横方向の位置である。
【００６６】
本発明の第２の態様では、複数の点光源の空間位置を算出するための光学測定方法であって、複数の点光源から放出される光を検出すること；放出された光を複数のセンサに対して分離して、同時または連続的に検出すること；点光源から放出され、前記点光源の空間位置によって異なる特定の検出器に誘導される光を、均衡すること；検出光から光学画像を生成すること；および光学画像をアルゴリズムで解析して、複数の点光源の位置情報を得ること、を含む方法を提供する。
【００６７】
１つの実施形態によれば、各々の点光源は、複数のナノエミッタのうちの１つ以上に対応し、本方法は、入射光によって試料のナノエミッタを照明して、ナノエミッタから再放出される光を検出し、ナノエミッタの位置を特定することからなる予備ステップを含む。
【００６８】
一実施形態によれば、測定した空間位置は、各々の点光源または発光ナノエミッタの縦方向の位置である。
【００６９】
１つの実施形態によれば、放出光は、各々の点光源または発光ナノエミッタの縦方向の位置に応じて、または各々の点光源またはナノエミッタが放出する波長に応じて分離される。
【００７０】
一実施形態によれば、放出光の分離は、レンズの焦点面に位置決めされた光源から出射するコリメートされた放出光を、焦点面の手前または背後にある点光源から出射するコリメートされていない放出光から分離するように、複数の検出チャネルで行われる。
【００７１】
１つの実施形態によれば、本方法は、さらに、測定データまたは外部情報に基づいて、検出チャネルのパラメータを変化させることを含む。
【００７２】
１つの実施形態によれば、本方法は、さらに、
ほぼ平行な光ビームであって、収束角または発散角が平行光とは異なり、この角度値は、各々の点光源の縦方向の位置に応じて異なる光ビームを、各々の点光源から生成するステップ、
偏光が直交し幾何学形状が異なる同一位置の２つの光波である１つの規則波および１つの特異波であって、規則波と特異波との間のエネルギー比が、光ビームの収束角または発散角によって異なり、それによって点光源の縦方向の位置によっても異なる２つの光波を、入射光波から生成するステップ、
規則波および特異波の偏光状態、またはこの幾何学形状に基づいて、規則波および特異波を分離するのに適した偏光または幾何学形状を変更するステップ
のうちの少なくとも１つを含む。
【００７３】
１つの実施形態によれば、本法は、さらに、複数の光源から再放出される光度を、偏光ビームスプリッタを使用して、偏光が直交する複数の独立したチャネルに分離すること、および
各々のチャネルから出射する光度を融合し、偏光の縦方向の位置の長さまたは光の中の光度の管形状が、融合によって維持されるようにすること
を含む。
【００７４】
１つの実施形態によれば、本法は、さらに、特定の縦方向の位置に位置決めされた点光源を集光すること、および前記縦方向の位置の前後に位置決めされた光源を散乱させて、各々の点光源の縦方向の位置に応じて配光分布が集光時とは異なるようにすることを含む。
【００７５】
１つの実施形態によれば、本法は、さらに、偏光の異なる２つの光波であって、偏光の異なる波同士の間のエネルギー比が、焦点の空間分布によって異なり、この空間分布を介して点光源の縦方向の位置によっても異なる２つの光波を、入射光波から生成すること、および規則波および特異波の偏光状態またはこの幾何学形状に基づいて、規則波および特異波を分離することを含む。
【００７６】
１つの実施形態によれば、放出光または再放出光の検出は、顕微鏡対物レンズの焦点面内に限定される。１つの実施形態によれば、前記少なくとも光学画像は、例えば共焦点顕微鏡のような光学顕微鏡を使用して生成される。
【００７７】
本発明の第３の態様では、試料上に位置決めされた少なくとも１つの発光ナノエミッタの空間位置を算出する光学測定装置であって、
トポロジー群の異なる一連の少なくとも２つの小規模な配光分布を試料に照射するように適応した照射手段、
試料の前記少なくとも１つの発光ナノエミッタによって反射光を検出するように適応した検出手段、
検出光から、各々の配光分布に対して少なくとも１つの光学画像を生成するように適応した生成手段、および
光学画像のコンピュータ解析を実行して、前記少なくとも１つの発光ナノエミッタの位置情報を得ることができる解析手段
を備える装置を提供する。
【００７８】
一実施形態によれば、照射手段は、両方の小規模な配光分布を試料に対して同一位置にするように構成される。
【００７９】
１つの実施形態によれば、照射手段は、規則波と特異波との間または２つの特異波の間の干渉によって、前記少なくとも２つの配光分布を形成するように、また、以下のパラメータ：
ａ）規則波のパラメータのうちの少なくとも１つ、
ｂ）少なくとも１つの特異波の少なくとも１つのパラメータおよび
ｃ）規則波と特異波との位相差または２つの特異波の位相差
のうちの少なくとも１つを変化させることによって、前記少なくとも２つの分布間に空間差を形成するように適応される。
【００８０】
１つの実施形態によれば、本装置は、入射光波から、２つの同一位置の光波つまり１つの規則波および１つの特異波を形成する結晶サブモジュールであって、薄型の２軸結晶および／または１軸結晶を備える前記サブモジュールレンズを備える。
【００８１】
１つの実施形態によれば、本装置は、入射規則波を、別々の幾何学的光路に沿う２つの規則波に分離するように適応した光学サブモジュールであって、サブ波長格子であって、格子段階が反射光の平均波長よりも小さい少なくとも１つのサブ波長格子、および薄型の２軸結晶または１軸結晶を備える処理手段を使用して、規則光波のうちの少なくとも１つを特異光波に変換するように構成されたサブモジュールを備える装置において、光学モジュールは、形成された２つの出射光波を合成するように設計される、装置。
【００８２】
１つの実施形態によれば、本装置は、規則波および特異波の相対的振幅を制御し、任意に、波の配光分布の中心位置を互いに並進運動させるように適応した部分偏光子を備える。
【００８３】
１つの実施形態によれば、本装置は、振幅、偏光または位相を光学的に制御するサブモジュールであって、サブモジュールレンズの入射光波または出射光波の偏光状態および／または位相状態を、所定の順序で制御することができる、少なくとも１つの制御可能または調整可能な光学素子を備えるサブモジュールを備える。
【００８４】
１つの実施形態によれば、本装置は、規則波または特異波の形状を制御できる少なくとも１つの調整可能な光学素子からなる、制御サブモジュールを備える。
【００８５】
１つの実施形態によれば、本装置は、偏光検光子および／または前記配光分布から出射する偏光の形状を加工する静的または動的なサブモジュールであって、各々の小規模な配光分布の形状およびサイズに対するベクトル効果を緩和することができ、このベクトル効果は、光学画像を生成し、円偏光、放射偏光、または方位偏光のように対称に回転する静的偏光状態および／または動的偏光状態を供給して出射偏光の形状を加工するのに使用される開口数の高いレンズによって生じる、サブモジュールを備える。
【００８６】
もう１つの実施形態では、本装置は、マルチモードレーザーであって、レーザーモードの強度を制御でき、トポロジー群の異なる少なくとも２つの小規模な配光分布は、様々なレーザーモードの強度を制御することによって形成されるマルチモードレーザーを備える。
【００８７】
１つの実施形態によれば、反射光の平均波長lよりも実質的に小さいサイズの領域が試料内に存在し、この領域では、照明手段によって形成されるトポロジー群の異なる前記少なくとも２つの小規模な配光分布の強度を数学的に特別に組み合わせた値は、前記領域内に含まれる横方向の位置に対して正であり、前記特別な数学的組み合わせは、前記領域以外の配光分布のその他の全部分で、ゼロに近い。
【００８８】
１つの実施形態によれば、少なくとも１つのナノエミッタは、蛍光色素分子であり、この蛍光色素分子の一連の蛍光光度は、トポロジー群の異なる一連の小規模な配光分布が前記蛍光色素分子に係る入射強度によって異なり、これによって、前記蛍光色素分子の空間位置が特徴付けられる。
【００８９】
１つの実施形態によれば、ナノエミッタのうちの少なくとも２つは、異なる空間位置にある蛍光色素分子であり、各々の蛍光色素分子は、一連の蛍光光度を有し、この光度は、トポロジー群の異なる一連の小規模な配光分布が前記少なくとも２つの蛍光色素分子に係る入射強度によって異なり、これによって、少なくとも２つの蛍光色素分子の空間位置が特徴付けられる。
【００９０】
１つの実施形態によれば、放出光の波長lよりも実質的に小さいサイズの領域が試料内に存在し、前記トポロジー群の異なる一連の小規模な配光分布を数学的に組み合わせた複数のものを比較する比較器をさらに備えて、
ａ）単一の発光ナノエミッタ、
ｂ）複数の同一位置の発光ナノエミッタ、および
ｃ）互いに距離を置いて位置する複数のナノ標識光
のうちの少なくとも１つを区別し、これによって、ナノ標識光間の距離が算出される、。
【００９１】
１つの実施形態によれば、照射手段は、前記少なくとも２つの一連の配光分布および／または前記少なくとも２つの配光分布の位置を、測定データまたは外部情報に応じて変化させるように構成される。
【００９２】
１つの実施形態によれば、照射手段は、円錐回折を行う少なくとも１つの円錐形結晶、および前記少なくとも１つの円錐形結晶の入射および出射の偏光状態を変化させる手段を備える。
【００９３】
一実施形態によれば、前記少なくとも１つの発光ナノエミッタの横方向の位置を測定するように構成される。
【００９４】
第４の態様によれば、本発明は、複数の点光源の空間位置を算出するための光学測定装置であって、
複数の点光源から放出される光を検出するように適応した検出手段、および
反射光を複数のセンサに対して分離して、同時または連続的に検出するための分離手段であって、発光ナノエミッタが再放出する光を均衡して、前記発光ナノエミッタの空間位置によって異なる特定の検出器に誘導する、分離手段、および
検出光から光学画像を生成するのに適した画像生成手段、および
光学画像のコンピュータ解析を実行して、複数の点光源の位置情報を得ることができる解析手段
を備える装置を提供する。
【００９５】
１つの実施形態によれば、本装置は、各々の点光源の縦方向の位置を測定するように構成される。
【００９６】
１つの実施形態によれば、１つの点光源が、試料の１つ以上のナノエミッタを含み、本装置は、試料のナノエミッタを入射光によって照明するように適応した照明手段、およびナノエミッタが再放出した光を検出してナノエミッタの位置を特定するように適応した検出手段を備える。
【００９７】
例えば、蛍光色素分子は、ナノエミッタとすることができる。
【００９８】
１つの実施形態では、分離手段は、各々の点光源の縦方向の位置に応じて、または各々の点光源が再放出する波長に応じて、反射光を分離するように構成される。
【００９９】
１つの実施形態では、分離手段は、複数の検出チャネルに対して、レンズの焦点面に位置決めされた点光源から出射するコリメートされた反射光を、焦点面の手前または背後にある点光源から出射するコリメートされていない放出光から分離するように構成される。
【０１００】
１つの実施形態によれば、本装置は、さらに、測定データまたは外部に基づいて検出チャネルのパラメータを変化させる変化手段を備える。
【０１０１】
１つの実施形態によれば、本装置は、さらに、小量の光の中に位置する放出光の複数の点光源から来る光度を、各々の点光源の縦方向の位置に応じて、別々の検出器、および／または同じ検出器の別々の位置に誘導することができる誘導手段を備える。
【０１０２】
１つの実施形態によれば本装置は、さらに、補助光学器械を介して顕微鏡対物レンズおよびサブ検出ユニットと相互作用し、この両者を互いに相互作用させるサブモジュールを備える。
【０１０３】
１つの実施形態によれば、本装置は、ほぼ平行な光ビームであって、収束角または発散角が平行光とは異なり、この角度値が、各々の点光源の縦方向の位置に応じて異なる光ビームを、放出光の各々の点光源から形成するように適応した光学手段を備える。
【０１０４】
１つの実施形態によれば、本装置は、結晶サブモジュール、または結晶サブモジュールのカスケードであって、各々の結晶サブモジュールは、２軸結晶および／または１軸結晶、および補助光学器械からなり、前記結晶サブモジュールは、偏光が直交し幾何学形状が異なる同一位置の２つの光波である１つの規則波および１つの特異波であって、規則波と特異波との間のエネルギー比がビームの収束角または発散角によって異なり、それによって、発光する点光源の縦方向の位置によっても異なる２つの光波を、入射光波から形成するように適応した、結晶サブモジュールを備える。
【０１０５】
１つの実施形態によれば、本装置は、規則波および特異波の偏光状態、またはこの幾何学形状に基づいて、規則波および特異波を分離するのに適した偏光または幾何学形状を変更するための手段を備える。
【０１０６】
１つの実施形態によれば、本装置は、
放出光の複数の点光源の光度の偏光を分離するビームスプリッタであって、偏光が直交する２つの独立したチャネルに分離できる、縦方向超解像モジュールの一部であるビームスプリッタ、および縦方向超解像モジュールの各々のチャネルから出射する光度を融合し、偏光の光度の縦方向の位置または幾何学的チャネルが、融合によって維持されるようにする手段を有する。
【０１０７】
１つの実施形態によれば、本装置は、所定の縦方向の位置に位置決めされた再放出光の点光源を集光することができ、前記縦方向の位置の前後に位置決めされた再放出光の点光源をわずかに散乱させて、各々の点光源の縦方向の位置に応じて配光分布が集光時とは異なるようにすることができる光学手段を備える。
【０１０８】
１つの実施形態によれば、本装置は、偏光を空間的に変化させる手段であって、厚さを変更できる少なくとも１つの１軸結晶、反射光および／または位相波長板の平均波長よりも低い段階のサブ波長格子を有し、偏光の異なる２つの光波であって、偏光の異なる波同士の間のエネルギー比が焦点の空間分布によって異なり、この空間分布を介して発光する点光源の縦方向の位置によっても異なる２つの光波を、入射光波から形成する手段を備える。
【０１０９】
１つの実施形態によれば、本装置は、規則波および特異波の偏光状態またはその幾何学形状に基づいて、規則波および特異波を分離できる偏光手段または立体形成手段を備える。
【０１１０】
第５の態様では、本発明は、試料の少なくとも１つの発光ナノエミッタの空間位置を算出する光学測定器であって、例えば共焦点顕微鏡などの顕微鏡、本発明の第３の態様の１つの実施形態による測定装置、および／または本発明の第４の態様の１つの実施形態による測定装置を備える光学測定器を提供する。
【０１１１】
第６の態様では、本発明は、試料の少なくとも１つの発光ナノエミッタの空間位置を算出する光学測定方法であって、試料内の少なくとも１つのナノエミッタの横方向の位置を算出するための本発明の第１の態様の実施形態による測定方法、および試料の少なくとも１つのナノエミッタの縦方向の位置を測定するための本発明の第２の態様の実施形態による測定方法を含む、光学測定方法を提供する。
【０１１２】
もう１つの態様では、本発明は、トポロジー群の少なくとも２つの小規模な配光分布を試料に対して連続的に照射することからなる光学測定方法を提供する。
【０１１３】
もう１つの態様では、本発明は、トポロジー群の異なる少なくとも２つの小規模な配光分布を試料に対して連続的に照射するためのプロジェクタで光学測定を行うための機器を提供する。
【０１１４】
もう１つの態様では、本発明は、空間的に互いに離れた少なくとも２つの配光分布であって、前記分布の各々の直径は、試料からの放出光の平均波長の１．５倍未満であり、前記分布の強度を合わせたものが、サイズが前記平均波長の半分未満である局所的な特徴を形成する配光分布を連続的に形成するように構成される、光学系を提供する。
【０１１５】
もう１つの態様では、本発明は、光学機器および被照明測定領域を有する光学系であって、光学機器は、空間的に互いに離れた少なくとも２つの配光分布を連続的に形成するように構成され、この分布の一方またはもう一方に対して強度がゼロである点をすべて含む測定領域内に一連の点を規定し、前記一連の点のうちの測定点に近い領域に位置する点は、測定領域の半径の半分未満または半分に等しい、光学系を提供する。
【０１１６】
もう１つの態様では、本発明は、光学装置および被照明測定領域を有する光学系であって、光学装置は、空間的に互いに離れた少なくとも２つの配光分布を連続的に形成するように構成され、この分布の一方または他方に対して強度がゼロである点および局所的な強度が最大である点をすべて含む被照明領域内に一連の点を規定し、前記一連の点のうちの１点の近くに位置する点は、測定領域の直径の１／６未満または１／６に等しい、光学系を提供する。
【０１１７】
もう１つの態様では、本発明は、光学機器、および測定領域の中心を通るラインを有する小規模な測定領域であって、光学機器は、空間的に異なる配光分布を形成するように構成され、ライン沿いの強度同士のエネルギー比は、最大、最小、さらにもう１回最大になる、光学機器を提供する。
【０１１８】
もう１つの態様では、本発明は、光学装置を備える横方向超解像モジュールであって、光学装置は、放出される平均波長λの１．５倍よりも直径が小さい空間的に異なる少なくとも２つの光点を連続的に形成するように適応され、前記光点の強度を合わせて波長lの４０％未満のサイズである局所的な細部を形成する、横方向超解像モジュールを提供する。
【０１１９】
少なくとも１つの実施形態の目的は、新規な装置、つまり横方向超解像モジュールであって、直径が波長λの１．５倍未満である点が空間的に異なる少なくとも２つの光点を形成するように適応され、前記光点の強度を合わせた局所的な特徴が、波長λの４０％よりも小さい光学装置を備える、横方向超解像モジュールを提供することである。
【０１２０】
もう１つの目的は、縦方向超解像モジュールと称する視覚系であって、点光源の縦方向の位置によって異なる点光源から出射する光ビームの、幾何学形状、幾何学形状と偏光、または偏光のうちの少なくとも１つを変更するように構成された視覚系を提供することである。
【０１２１】
少なくとも１つの実施形態のもう１つの目的は、蛍光顕微鏡法のための超解像系であって、顕微鏡の光路に組み込まれた横方向超解像モジュールを備え、小規模な配光分布内の横方向の様々な位置に位置決めされた複数の蛍光色素分子からなる試料に、波長サイズがほぼ半分である空間的に異なる一連の光点を照射し、各々の蛍光色素分子は、蛍光色素分子への入射光に線形的または非線形的に依存する一連の蛍光光度で蛍光を発し、蛍光色素分子の横方向の位置を特徴付ける、超解像系を提供することである。
【０１２２】
少なくとも１つの実施形態のもう１つの目的は、蛍光顕微鏡法のための超解像系であって、顕微鏡の検出路に組み込まれた縦方向超解像モジュールを備え、少量の被照明領域に置かれた複数の点光源から出射する光度が、別々の検出器または同じ検出器の異なる立体位置またはこの両方を合わせたものに分離される、超解像系を提供することである。
【０１２３】
少なくとも１つの実施形態のもう１つの目的は、蛍光顕微鏡法のための超解像系であって、顕微鏡の照明路に組み込まれた横方向超解像モジュール、および／または前記超解像蛍光顕微鏡のための検出回路内にある顕微鏡の検出路に組み込まれた縦方向超解像モジュールを備える、超解像系を提供することである。
【０１２４】
本発明のいくつかの実施形態は、新規かつ補足的な２つの光学超解像モジュールであって、本明細書では横方向超解像モジュールおよび縦方向超解像モジュールと称するモジュールに基づく新規な技術を提供する。横方向超解像モジュールは、主に新たな横方向の解像を提供し、縦方向超解像モジュールは、主に新たな縦方向の解像を提供する。単一のモジュールを使用する 実施形態を実装することもできる。いずれの光学モジュールも、適切なアルゴリズムおよび改良型検出モジュールをもって完全となる。モジュールは、既存の蛍光顕微鏡に組み込まれることができる。このようにする代わりに、３次元の超解像系を対象として最適化した専用の蛍光顕微鏡を開発することができる。
【０１２５】
本発明の実施形態による超解像の方法および装置は、従来の技術および先行技術の設計とは大きく異なり、そのため、蛍光色素分子のディスクリプタを高精度で測定でき、同じ被照明分量内に置かれたいくつかの蛍光色素分子のディスクリプタを認識し測定できる超解像系の技術および装置を達成するために開発した装置を提供する。
【０１２６】
本発明は、図面とともに説明される以下の本発明の好適な実施形態の詳細な説明から、よりよく理解されるであろう。
【０１２７】
本発明のその他の目的および利点は、 読者にとって明らかになり、これらの目的および利点は、本発明の一部であると考える。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
次に、本発明をよりよく理解できるように、以下の図面を参照して特定の好適な実施形態と結びつけて本発明を説明していく。
【０１２９】
次に詳細な図面を特に参照するにあたり、表記した符号は、例として、本発明の好適な実施形態の考察を説明するために示したものであり、最も有益な説明と思われるもの、および本発明の原理および概念の局面を理解しやすいと思われるものを提供するためだけに示すものであることを強調しておく。この点に関して、本発明の基本的理解に必要である以上に本発明の構造的詳細を示す試みは一切しておらず、図面を用いた説明は、本発明のいくつかの形態が実際にどのように実施できるのかを当業者に明らかにするものである。
【０１３０】
【図１】先行技術の共焦点蛍光顕微鏡の概略斜視図である。
【図２】本発明の実施形態に係る超解像の蛍光顕微鏡法の概略図である。
【図３】本発明の実施形態に係る円錐型回折モジュールの組み立てを示す簡易概略図である。
【図４】共焦点顕微鏡法および方法論を用いる２つの測定模範の概略図である。
【図５】顕微鏡法プラットフォームＳＲＣＤＰを用いた測定方法の好適な実施態様の概略図である。
【図６】本発明の実施形態に係る横方向超解像モジュールの簡易概略図である。
【図７】偏光子の入射偏光および出射偏光に係る円錐型回折モジュールの配光分布表であり、円錐回折パラメータρｏのいくつかの値を示す図である。この配光分布は、ＭＭｒｅｓｅａｒｃｈ社のソフトウェアを使用して計算したものである。
【図８】本発明の実施形態に係る縦方向超解像モジュールを示す簡易概略図である。
【図９】本発明の実施形態に係る蛍光色素分子データの超解像アルゴリズム方法を示す簡易概略図である。
【図１０】ディスクリプタρの計算を示す簡易概略図である。
【図１１】プラットフォームＳＲＣＤＰの制御モジュールを示す簡易概略図である。
【０１３１】
全図面を通して、同じ参照符号は同じ部分を指す。
【発明を実施するための形態】
【０１３２】
位相および偏光、偏光測定、ストークスパラメータならびにストークスパラメータの測定技術を説明するのに通常の定義が使用される。
【０１３３】
配光分布の中心またはセントロイドは、強度の重心である。配光分布の直径は、特異波の中心がゼロであることを考慮せずに、規則波と特異波の両方の強度が最初にゼロであるときの直径である。２つの配光分布は、その中心が一致している場合または固定された所定の空間値の分だけ離れている場合は、同一位置にある。
【０１３４】
本明細書では、基本のメートル法として発光波長を使用する。
【０１３５】
本明細書では、通常の定義を以下の光学要素に対して使用する：光を伝送する、屈折するまたは反射するあらゆる光学手段を含めるように定義を拡大したレンズ、補助光学器械（他の２つの光学サブモジュールまたは光学モジュール間の幾何学パラメータまたは位相および／もしくは偏光のパラメータのいずれかを相互作用させ、調整するための光学サブモジュール）、偏光子、検光子、位相差板、偏光ビームスプリッタおよび非偏光ビームスプリッタ、偏光ビームコンバイナおよび非偏光ビームコンバイナ。
【０１３６】
本明細書において、部分偏光子とは、２つの直線偏光（線二色性）または２つの円偏光（円二色性）に対する吸収が異なる部品またはモジュールを意味する。
【０１３７】
偏光または位相の動的なサブモジュールに言及して、偏光または位相が時間の経過とともに、制御された方法で離散的または継続的に変化する光学手段について説明する。
【０１３８】
これらの偏光または位相の動的なサブモジュールは、以下のものを含むがこれに限定されない：軸周りを回転する波長板、液晶技術に基づくライトバルブ、ポッケルスセルやケルセルとしても知られる電気光学装置、共振型電気光学装置、ファラデーセルとしても知られる磁気光学装置、音響光学装置もしくは弾性光学装置またはこれらの手段を任意に組み合わせたもの。
【０１３９】
「セントロイドアルゴリズム」について言及して、セントロイドおよび場合によっては配光分布の幅（ＦＷＨＭ、全幅半値）を測定するための標準的な手順について説明する。このアルゴリズムに関しては、１９７８年の文献Ｌｉｎｄｅｇｒｅｎ［５］など、多くの文献が出版されている。
【０１４０】
このアルゴリズムの起源は、天文学および天文測定学であり、このアルゴリズムによって星の位置を高精度で測定することが可能になった。現在このアルゴリズムは、生物分野の超解像を含め、光学機器を扱う分野全体で使用されている。
【０１４１】
本明細書では、以下の光学電子部品に対して通常の定義が使用される：光電検出器、ＣＣＤ、ＥＭＣＣＤ、ＣＭＯＳ、ＳＰＡＤ（単一光子アバランシェダイオード）およびＳＰＡＤマトリクス。
【０１４２】
本明細書では、以下の用語を使用する：
・  光度の空間分布を表す光学画像、
・  光学画像によって特定の瞬間に検出面に作成されたＣＣＤの電荷の空間分布、ＣＭＯＳに対する電流の空間分布またはＳＰＡＤに対するイベントの空間分布を記述するための電子画像、
・  電子画像を変換して作成した数字のマトリクスを記述するためのデジタル画像。
【０１４３】
本文の読解および理解を簡易にするため、ＰＭＴまたはＳＰＡＤなどの単一画素検出器の出力に対する画像用語を使用し、これを単一画素からなる画像と考える。
【０１４４】
曖昧さが存在しない場合、または３種類の画像を区別する必要がない場合、一般の簡易な画像用語を使用する。
【０１４５】
本明細書で説明する画像は、縮小像であり、典型的には直径が５未満である低数のエアリーディスク径、および／または低数の画素で、典型的には４×４から３２×３２の画素と実質的に等しいサイズの画像であるであると特徴付けてよい。
【０１４６】
デジタル画像Ａｊにおいて、添字ｍおよびｎは、画素指数を表し、画素の原点は、これ以降の段落で定義する解析分量の中心を照射する箇所として選択される。
【０１４７】
本明細書では、ＣＣＤ、ＥＭＣＣＤおよびＣＭＯＳなどのマトリクス検出器に使用される専門用語を使用して画像を示した。ＳＰＡＤおよびＳＰＡＤアレイの場合、測定結果は、光子が与える影響を時系列に並べたリストであり、各々の光子が影響を与えた時間および位置を詳細に示すものである。本明細書の説明を簡易にするため、 この事例を画像の定義に含める。
【０１４８】
偏光測定およびストークスベクトル
偏光測定とは、入射光の偏光状態を測定することを指す。入射光の偏光状態は、１８５２年にジョージ・ガブリエル・ストークスが導入した一連の値であるストークスパラメータを用いて説明することができ、これは光学分野で使用される。
【０１４９】
当業者に公知の補足的技術情報 
本章では、本発明に必要で当業者に公知の一連の技術要素を取り上げる。
【０１５０】
デカルト座標および極座標 
点ρ、θの極座標は、次式を用いてデカルト座標ｘ、ｙから導かれる：
【数１】
2013545127.tif 000003
【０１５１】
極座標における電場および角度モード
ある合成電場ベクトルがＥ（ρ、θ）であり、極座標で記述すると（ρ、θ）であるとすれば、この電場は、実際の振幅Ａ（ρ、θ）、実際の位相φ（ρ、θ）および偏光の単位ベクトルｕ（ｒ、θ）を用いて次式で表すことができる：
【数２】
2013545127.tif 000004
【０１５２】
光学分野では、電場成分、すなわち直交座標モード、デカルト座標モードまたは極座標モードでの振幅、位相および偏光を分解することが通例である。
【０１５３】
ガウスモード、エルミートガウスモードおよびラゲールガウスモードなどの直交極座標モードでの多くの分解が、当業者に知られている。
【０１５４】
本明細書では、電場の振幅を次式の超幾何ガウス（Ｈｙｐｅｒｇｅｏｍｅｔｒｉｃ−Ｇａｕｓｓｉａｎｍｏｄｅｓ、ＨｙＧＧ）で分解する方法を主に使用する：
【数３】
2013545127.tif 000005
【０１５５】
2013545127.tif 000006
【０１５６】
特異波
特異波は、中心の強度がゼロであり、方位角位相が２πの倍数分変動する。光学分野におけるこの研究テーマは、１９７４年にＪ．Ｆ ＮｙｅおよびＭ．Ｂｅｒｒｙによる重要文献［６］が最初であり、現在は「特異光学（ｓｉｎｇｕｌａｒ  ｏｐｔｉｃｓ）」として知られている。規則波 および特異波の例を以下に説明する。
【０１５７】
トポロジーおよび小規模な配光分布
以下に定義する小規模（コンパクト）であることの条件のうちの１つを満たせば、点光源の配光分布は小規模と考えられ、以下は、二者択一で非排他的な２つの条件である：
エアリー半径の１．７５倍未満の半径の円にエネルギーの７５％超が含まれる、あるいは
強度ゼロのラインで規定されエネルギーの６５％超を含む光の範囲が、エアリー半径の２倍未満の半径の円内にある。
【０１５８】
トポロジーの異なる点状の配光分布の様々な群を以下のように区別する：
光学分野で通常定義される規則分布。
2013545127.tif 000007
【０１５９】
２つの小規模な配光分布は、以下の条件のうち任意の少なくとも１つを満たせば、異なるトポロジー群とみなされる：
一方が規則的、他方が特異的であり、一方が点光源、他方がリング光源である。
２つの異なる配光分布の振幅の方位角次数が異なる。
２つの異なる配光分布の振幅の偏光または位相の方位角次数が異なる。
【０１６０】
あるいは、特定の分量に照射された２つの配光分布は、一緒に照射された面積の相当な部分で勾配が逆方向であれば、トポロジーが異なると考える。
【０１６１】
蛍光色素分子は、回折限界よりも実質的に小さいサイズの発光ナノエミッタである点光源群として最もよく知られた例である。ナノエミッタとは、物体に付着した小さな二次発光体であり、波長の一部分よりも遙かに小さく、典型的には波長の５分の１よりも小さいサイズだがこれに限定されない。発光ナノエミッタは、入射エネルギーを吸収し、入射光と同じ波長または異なる波長で再度光を放出する。ナノエミッタが放出する光は、コヒーレント、部分的にコヒーレントまたは吸収光とインコヒーレントであってよい。ナノエミッタの主な例は、蛍光色素分子およびナノ粒子だが、その他多数の素子も含まれる。
【０１６２】
本発明の内容におけるナノ発光体の定義は、以下の２つの条件によって決定される：
点光源の二次発光体を形成すること、
および生物学的実体または有機実体に対して発光体を所定位置に置くこと。
【０１６３】
ナノエミッタを形成できる物理的機構は多数あり、この機構には、吸収、散乱または反射、蛍光、放出抑制［７］、光活性化現象［８、９］、２つ以上の光子の蛍光［１０］、もしくは非弾性散乱、ラマン散乱、または当業者に公知のその他の物理的機構が含まれるがこれに限定されない。発光ナノエミッタによる電磁波の放出を説明するのに、光の放出という用語を使用し、この光は、コヒーレント、インコヒーレントまたは部分的にコヒーレントである。
【０１６４】
生物学的実体または有機実体に付着する吸収性または反射性の散乱粒子を含めて、ナノエミッタの定義を拡大する。散乱粒子、拡散粒子、反射粒子または吸収粒子が電磁場に対して起こす行動を、バビネの原理に従って、粒子から出射する補助的な二次フィールドで、入射電磁場に重なるフィールドの逆位相を用いて形成するように、吸収粒子に対して実際に説明することができる。
【０１６５】
本特許明細書では、一連の情報を表すための単一の蛍光色素分子のディスクリプタに言及して、特定の瞬間の点光源としての蛍光色素分子を説明する。ナノエミッタは点光源と考えられ、ナノエミッタを表す情報はすべて、限定数のパラメータを含み、そのパラメータとはすなわち、ナノエミッタの空間内の位置、ナノエミッタの強度、ナノエミッタの強度のスペクトル特性、コヒーレンス、入射光の機能として蛍光色素分子が放出する光の位相および偏光である。
【０１６６】
しかしながら、 ほとんどの場合、および本発明の記載では、ディスクリプタという名称を用いる場合は、蛍光色素分子のディスクリプタのサブセットを指し、このサブセットには、例えば発光スペクトルで区別される発光ナノエミッタのいくつかの個体が同じ試料内にあるときの蛍光色素分子の幾何学的位置、蛍光色素分子の強度、および蛍光色素分子の種類が含まれる。明細書内で用いるこのような簡易化によって、本発明の範囲が変化することはなく、本発明は、 発光ナノエミッタのディスクリプタすべてをその範囲内に含める。
【０１６７】
本発明の内容を理解しやすくするため、 以下の説明では最も簡易な事例のみに言及し、この事例でのナノエミッタは蛍光色素分子であり、物理的な相互作用は、１つの光子を有する蛍光である。しかしながら、本明細書は、根底にある物理的現象がいかなるものであっても、以前に言及したまたは当業者に公知のあらゆる発光ナノエミッタに適用できる方法および概念の一般的記載を簡易化した説明であると解釈されるべきである。
【０１６８】
注目すべきは、ナノエミッタは、入射強度の空間分布全体に影響を及ぼすことなく、正確に３次元の位置で入射光度またはフィールドをサンプリングする点である。本明細書では、この注目すべき特性を発光ナノエミッタのサンプリング能力という。
【０１６９】
再度図１を参照する。特定の生体１６および１９ならびに１７および１８に位置する蛍光色素分子をすべて、「明るい生体」と称し、これらは、アルフレッド・コージブスキーが一般意味論［１１］で定義した意味での生物体の地図を表す。しかしながら、説明を簡易化するために、一切の曖昧さが生じ得ない場合は、この生体を光を発する生体として呼ぶことが通例である。
【０１７０】
光を発する生体は、その生体に関する情報を含んでおり、その情報とは主に、例えば細胞を２つに分割する場合の時空間情報、時間に対するこの生体の位置および向き、ならびに形態学的情報である。
【０１７１】
根本的情報、一般意味論の専門用語でいうところの地図は、 蛍光色素分子の一連のディスクリプタおよび時間に沿ったその変化である。生体情報および幾何学情報 は、この根本的情報から推定されるものにすぎない。
【０１７２】
測定系は、蛍光色素分子のディスクリプタの変化、測定した地図を計算する。 
【０１７３】
測定したこの地図は、ノイズ、測定条件、システムの限界または測定の不確かさが原因で、もとの地図とは異なるものである。 
【０１７４】
この情報地図は、後に様々なレベルの抽象化に発展させることができる。 
【０１７５】
したがって、基本レベルである地図は、蛍光色素分子の一連のディスクリプタの変化を含み、この情報は、例えば、蛍光色素分子およびそのディスクリプタのリストとして構築されてよい。
【０１７６】
直接的な測定の結果を示すこの抽象化レベルは、一見して生物情報を含んでいないように見えるが、光の点によって描かれる物理的な測定の結果であり、標識した任意の実体を表すこともできる。
【０１７７】
幾何学的抽象化レベルである第２のレベルでは、ナノエミッタを 幾何学的物体の形態に構築する。
【０１７８】
このレベルでは、発光物体およびその位置や向きなどの動的特性またはその形態についての描写が含まれる。 
【０１７９】
このレベルでは、情報は依然として物理的なものであり、一連の物体を描写する幾何学情報である。
【０１８０】
幾何学情報は、測定した地図および潜在的にはシステムに無関係の補助的情報を、光スポットと物体との関係に対して使用する。
【０１８１】
生物的抽象化レベルによって、測定した物体とその生物学的実体との構成上の関係を通して、生物学的事実をある程度理解することが可能になる。 
【０１８２】
これには、生体に関する一連の情報、主に位置およびその動作、その形状ならびに形態が含まれる。
【０１８３】
生物情報は、 測定した地図および幾何学情報ならびに潜在的には光学系に無関係の補助的情報を、光スポットと生物学的実体を含む物体との関係に対して使用する。
【０１８４】
このレベルでは、試料の生物的機能性に関する数々の結論を得ることができる。 
【０１８５】
円錐屈折とは、１８３２年にハミルトンが予測し［１２］、２ヶ月後にロイドが実験で確認した［１３、１４］光学現象である。
【０１８６】
円錐屈折は、２軸結晶の光軸方向に入射した光ビームの伝搬を描くものである。
【０１８７】
ハミルトンは、光が光線からなる中空の円錐形で出射することを予測した。 
【０１８８】
円錐屈折は、科学の歴史において重要な段階であり、電磁波の理論を証明する役割を果たした。
【０１８９】
２０世紀末の数年に再び 円錐屈折への関心が高まり、ベリー（Ｂｅｒｒｙ）らが学説を完成させ［１５］、［１６、１７］、２００９年に実験で証明された［１８］。
【０１９０】
ここで、ベリーの理論、専門用語および定義について見ていくが、これには物理的作用の名前の変更も含まれ、この点からさらに厳密な円錐回折という用語を使用する。
【０１９１】
円錐回折は、理論的かつ実験的に著しい関心を呼んだが、「現実的な用途は一切発見されなかった」［１９］。
【０１９２】
歴史的に、円錐回折は、２軸結晶で観察されたものである。
【０１９３】
無機質または有機質の２軸結晶を説明するために円錐形結晶に言及して、円錐回折の現象について記載する。
【０１９４】
２軸結晶の非限定的な例のなかには、アラレ石、ＫＴＰ、ＫＴＡ、ＬＢＯ、ＫＮｂ０３、ＭＤＴ、ＹＣＯＢ、ＢＩＢＯ、ＤＡＳＴ、ＰＯＭ、ＮＰＰ、ＬＡＰ、およびＬｉＩｎＳ２  ＬｉＩｎＳｅ２がある。
【０１９５】
他に、本質的により弱い円錐回折効果を形成する効果または短い光路に沿って円錐回折を形成する効果が存在する。これらの効果には、ポリマー、液晶および外部から誘導された複屈折効果が含まれる。ポリマーには、延伸ポリマーシートおよびカスケード重合［２０］などが含まれるがこれに限定されず、液晶には、サーモトロピック２軸性ネマチック相［２１］などが含まれるがこれに限定されず、誘導された複屈折の外部効果には、電気光学効果を形成する電場を中心対称性ではない立方晶系結晶に印加すること［２２］、および光弾性変調器、［２３］などが含まれるがこれに限定されない。
【０１９６】
次に、本発明の実施形態に係る円錐型回折モジュール３００の構成の簡易概略図である図３を参照する。
【０１９７】
入射光３０は、平行であると仮定するが、単純な光学手段を用いて他の状態に適応させてもよい。構成自体は、第１のレンズ３１、円錐形結晶３２および光学レンズ３３を備える。２つの第１のレンズ ３１および３３は、倍率１倍のケプラー望遠鏡の形態で構成されることが好ましい。以下にＵｏで表記する像空間内の第１のレンズ３１の開口数は、以下に定義する円錐半径を介して円錐（回折）効果のパラメータを決定するものである。第１のレンズ３１の焦点面には円錐の結像面３５が配置され、前述の部分偏光子部２９も加えられてよい。焦点レンズ３６は、最終光スポットの規模を決定する。焦点レンズは、外部の顕微鏡対物レンズであってもよいし、または本発明のもう１つの実施形態で実施されるように、第２のレンズ３３と一体化したものであってもよい。試料に照射される光の分布は、ベクトル効果を無視した状態の一次近似では、像面内の配光分布が縮小した像である。ベクトル効果の影響については以下で考察する。縮尺比率は、顕微鏡対物レンズに対してその倍率によって決定される。
【０１９８】
円錐の結像面での空間変数をＲとし、波のベクトルをＵとし、これらを円筒座標ではＲ，θＲおよびＵ，θＵと表し、光の波長をλとする。
【０１９９】
円錐形結晶３２から出射する電場の挙動は、単一のパラメータである円錐半径Ｒ０によって全体的に特徴付けられる。この円錐半径は、［ベリー、２００４年］で定義されたように、結晶の材料および幾何学的特徴によって異なる。
【０２００】
配光分布について以下で説明するために、標準のパラメータをスカラー回折理論の限界に取り入れて、顕微鏡対物レンズの円錐の結像面と焦点との両方で有効になるようにする。
【０２０１】
円筒座標でρ，θＲおよびｕ，θＵと表される、正規化した半径位置ρ、正規化した波数ベクトルｕ、正規化した円錐半径ρ０は、次式から得られる。
【数４】
2013545127.tif 000008
Ｕ０は、システムの開口数である。
【０２０２】
ρ０＜２の場合、ここでは薄型の円錐形結晶を指し、ρ０＜１の場合、ここでは線形で薄型の円錐形結晶の形状を指し、ρ０＜０．５の場合、薄型で正弦曲線の円錐形結晶を指す。
【０２０３】
薄型円錐の結晶から出射する波は、正規化座標ではＥ（ρ，θＲ）と表され、２つの波を積層して構成され、この２波は、本明細書では規則波である基本波ＥＦ（ρ）、および特異波である渦波ＥＶ（ρ，θＲ）を指す。この２波は、互いにコヒーレントであり、同一位置にあり、円偏光であり、キラリティが逆方向である。
【数５】
2013545127.tif 000009
【０２０４】
この式において、ＥＦ（ρ）は、基本的なスカラー振幅であり、ＦＶ（ρ）は、渦が縮小したスカラーの大きさであり、両者は次式から得られる。
【数６】
2013545127.tif 000010
【０２０５】
薄型で線形の円錐形結晶の場合、基本波は、エアリーディスクによって近似されることができ、渦波は、次式で表される線形の渦に近似されることができる。
【数７】
2013545127.tif 000011
【０２０６】
部分偏光子２９の動作が、パラメータαを用いた渦波のスケーリングであると仮定すると、ストークスパラメータを上記の式から推定することができる。
【数８】
2013545127.tif 000012
【０２０７】
発光体の送信の波長または反射の波長で、各々の次元でのサイズが３波長よりも小さい分量に位置する１２個未満の発光体のような一連の発光点を説明するために、「スパースオブジェクト（ｓｐａｒｓｅ  ｏｂｊｅｃｔ）」という用語を使用する。スパースオブジェクトを含むサイズが３波長未満の分量は、縮小サイズの解析分量を指す。
【０２０８】
次に、共焦点顕微鏡における量的閉じ込めの概念を示す簡易図である図４ａから図４ｃを参照する。
【０２０９】
量的閉じ込めの機能は、３つのいずれの空間次元においても、試料の観察領域を可能な限り小さい分量の解析分量に限定することである。量的閉じ込めの機能は、２つの効果を組み合わせることによって解析分量を限定するものである。その効果とは、小さい面積、理想的にはエアリースポット５０のサイズの面積に照射された光を閉じ込めること、および図２の共焦点ピンホール２８によって焦点のずれた光を取り除くことである。この２つの効果を重ね合わせると、小さい分量の解析分量６０ができる。この分量は、システムが検出する基本細胞のサイズを決定するものである。 
【０２１０】
５３から５９の 複数の蛍光色素分子からなるスパースオブジェクト５１について考える。試験的分量６０内に位置決めした５３から５５までの蛍光色素分子は、これらのみが光源によって励起されると同時に、この蛍光色素分子によって放出される光子は検出器モジュールに到達する。照明する円錐部５６および５７内にはない蛍光色素分子は、入射光に照明されない。図２の共焦点ピンホール２８の共役面にある蛍光色素分子５８および５９によって放出される光は、ほぼ全体的に図２の共焦点ピンホール２８によって遮断される。
【０２１１】
図４ｃのシステムに、２つの異なるデカルト座標を定義する。
符号「ｉ」：符号「ｉ」を付した軸は、解析分量６１の中心を中心とする基準デカルト座標系を表す。
符号「ａ」：符号「ａ」を付した軸は、離散点６２と考えるナノエミッタ上の各々の発光ナノエミッタに対する基準デカルト座標系を表す。後述するＰＳＩＴ方法を用いる場合、試料に渦が照射されれば、渦の中心を一般に解析分量の中心と定義する。
【０２１２】
共焦点顕微鏡は、前述の量的閉じ込めを用いて解析分量を制限する。量的閉じ込めは、２つの効果を組み合わせることによって得られる。その効果とは、小さい面積、理想的にはエアリースポット５０のサイズの面積に照射された光を閉じ込めること、および共焦点ピンホール４１によって焦点のずれた光を取り除くことである。この２つの効果を重ね合わせると、小さい分量の解析分量６０ができる。この分量は、光学系が検出する基本細胞のサイズを決定するものである。 
【０２１３】
本発明の少なくとも１つの実施形態では、（本特許明細書に記載した）技術の基本的光学モジュールを作製するのに円錐回折を使用する。しかしながら、円錐回折に基づくモジュールを他の光学的概念に基づくモジュールで代用する代替実施態様で、同じ機能性を提供することが可能である。これらは、本発明の範囲内である。代替の光学的概念には、１軸結晶、サブ波長格子、構造化されたレーザーモード、ホログラフィック部品およびその他の当業者に公知の技術などがあるが、これに限定されない。
【０２１４】
これらの概念、技術ならびに光学機器および光電子機器 は、当業者に公知のものであり、このような光学手段はいずれも多数の出版物に記載され、例えばＤ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎが執筆した書籍「Ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  Ｌｉｇｈｔ」［２５］、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ」［２６］、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｏｐｔｉｃｓ」［２７］およびその他の当業者に公知の多くの出版物がある。
【０２１５】
頭字語 頭字語
本明細書では、本発明の好適な実施態様に対して特異的なプラットフォーム、モジュールおよび光学系の名称として、「Ｓｕｐｅｒ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  Ｃｏｎｉｃａｌ  Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ（円錐回折を用いた超解像）」の頭字語ＳＲＣＤを使用する。
【０２１６】
本明細書では、「Ｐｒｏｊｅｃｔｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｖａｒｉｏｕｓ  Ｔｏｐｏｌｏｇｉｅｓ（様々なトポロジーの一連の照射強度）」の頭字語ＰＳＩＴを使用する。
【０２１７】
本明細書では、「Ｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｅｍａｐｈｏｒｅ（位置依存光学セマフォ）」の頭字語ＰＤＯＳを使用する。
【０２１８】
ＳＲＣＤＰプラットフォーム、つまり「円錐回折を用いた超解像プラットフォーム」は、測定方法論を実施し、円錐回折に基づく光学モジュールを使用する顕微鏡法用のプラットフォームである。
【０２１９】
ＳＲＣＤＰプラットフォームは、測定方法論の好適な実施態様である。本明細書では、本発明の好適な実施態様に対するＰＳＩＴ方法を実施する光学モジュールの名称として、頭字語ＬａｔＳＲＣＳを使用する。
【０２２０】
本明細書では、本発明のＰＤＯＳ方法の好適な実施態様を実施する光学モジュールの名称として、頭字語ＬｏｎｇＳＲＣＳを使用する。
【０２２１】
本発明のいくつかの実施形態には、新規な測定方法論、つまり本測定方法論、ならびに体系的アルゴリズム方法、ハードウェアツール、ソフトウェアツールならびにこれを実施するためのアルゴリズムからなる一連の整合性を持つものが含まれる。
【０２２２】
実施形態に係る測定方法論によって、ナノサイズの光学データおよび超解像の像を取得することができる。本測定方法論は、原則的に、蛍光色素分子で標識した超解像生体試料データの測定に使用されるものだが、これに限らない。
【０２２３】
本測定方法論は、以下に記載する様々な測定方法およびアルゴリズム処理方法を用いて実施されることができる。とりわけ、本測定方法論は、以下のように称する２つの新規な測定方法：
ＰＳＩＴ、「様々なトポロジーの一連の照射強度」
および
ＰＤＯＳ、「位置依存光学セマフォ」
を同時にまたは別々に用いて実施されることができる。
【０２２４】
本発明のいくつかの実施形態は、ＰＳＩＴ測定方法およびＰＤＯＳ測定方法を用いる測定方法論を実施するシステム（顕微鏡法に対するプラットフォーム）にも関する。このシステム、ＳＲＣＤＰプラットフォーム、つまり「円錐回折に基づく超解像プラットフォーム」は、本測定方法論の好適な実施態様である。
【０２２５】
ＳＲＣＤＰプラットフォームは、主に、顕微鏡に搭載された２つのハードウェアモジュールである新規かつ補足的な２つの光学モジュール、つまり光学モジュールＬａｔＳＲＣＳとＬｏｎｇＳＲＣＳ、および超解像した試料の情報を再構築するアルゴリズムモジュールＳＲＣＤＡを備える。
【０２２６】
さらに、 ＳＲＣＤＰプラットフォームは、改良型検出モジュール、システムの制御モジュール、およびソフトウェア基盤を有する。
【０２２７】
本測定方法論は、ＰＳＩＴ方法とＰＤＯＳ方法の両測定方法を使用することからなる。しかしながら、用途によっては両方法を使用する必要のないものがあり、その場合は、本発明の範囲内である簡易化した本測定方法論に言及する。
【０２２８】
本発明のいくつかの実施形態は、蛍光色素分子分布および蛍光色素分子を測定し、蛍光色素分子を２次元または３次元でモニタリングするための本測定方法論を使用する方法にも関する。
【０２２９】
さらに、本発明の特定の実施形態は、本方法論ならびにＰＳＩＴ方法およびＰＤＯＳ方法、ＳＲＣＤプラットフォーム、光学モジュールＬａｔＳＲＣＳおよびＬｏｎｇＳＲＣＳならびにＳＲＣＤＡアルゴリズムの多数の実施変形例に関する。
【０２３０】
Ｍｉｎｓｋｙ［２４］が記載し、上記で説明した共焦点顕微鏡の機能性は、３つの空間的次元において、試料の観察領域を可能な限り小さいサイズの解析分量となる分量に限定することである。
【０２３１】
当然の結果として、共焦点蛍光顕微鏡では、読み出された情報は、単一の実体と考える解析分量全体に対する単一強度の値である。さらに明確に言うならば、解析分量内の蛍光色素分子の位置に関する詳細情報は、先験的に共焦点顕微鏡では入手不可能なものである。被照明分量内での一層の区別を可能にするような新たな光学情報を生み出すことはできないというのが、一般的な見解であった。
【０２３２】
次に、本発明の少なくとも１つの実施形態に係る測定方法論の模範を示す簡易な概念の図である図４ｄを参照する。本方法論の模範は、図４ａで概略的に示した蛍光共焦点顕微鏡の模範よりも遙かに目標の高いものである。
【０２３３】
図４ｄでは、顕微鏡対物レンズ２２の焦点面に試験的分量６０が設けられている。この試験的分量には、５３から５９のいくつかの蛍光色素分子からなるスパースオブジェクト５１が含まれる。本方法を実施するシステムの結果は、再構築されたスパースオブジェクト６３、蛍光色素分子のリストおよびその特性リスト６４である。
【０２３４】
本発明の少なくとも１つの実施形態に係る方法を実施するシステムでは、共焦点顕微鏡法の寸法とほぼ同じ寸法である発光性の分量内で、いくつかの蛍光色素分子の特性を個別にかつ正確に回収することができる。この目的を達成するため、本発明のいくつかの実施形態に係る方法論は、時間と空間の両分野で、各々の被照明分量に対して大量の情報を光学的に形成するように設計される。
【０２３５】
本発明の一実施形態に係る本測定方法論の最新のプロセスは、５つの光学ステップ、１つの光電子検出ステップおよびアルゴリズムステップからなる７ステップに分割することができる。
【０２３６】
光学ステップ：
・  トポロジーの異なる一連の小規模な配光分布を解析分量に照射する
・  蛍光色素分子によって蛍光を放出する
・  蛍光色素分子を焦点面上にイメージングする
・  検出された反射光をいくつかの独立したチャネルに同時かつ／または連続的に分離する
・  任意に、解析光の焦点面内に限定する
【０２３７】
検出ステップ
点状またはマトリクス状の１つ以上の光検出器によって光度を検出する
【０２３８】
アルゴリズムステップ：
・  検出された一連の像から、スパースオブジェクトを構成する蛍光色素分子のリスト、およびその特性を再構築する
【０２３９】
本発明のもう１つの実施形態によれば、本測定方法論は、第１の光学ステップまたは第４の光学ステップのいずれかを省略して、前述の光学ステップを実施することからなる。
【０２４０】
本方法論を実施する合成光学プロセスは、一連の照明および／またはチャネルの機能性および／または一連の照明の位置を測定データまたは外部情報に応じて変更することによって、システムの制御モジュールが制御する一連の光学測定プロセスを実行することを含む。本発明の一実施形態による方法論を実施する合成光学プロセスの一例を以下に詳述する。中間結果、生の情報は、検出ステップ終了時に得られる。
【０２４１】
生の情報は、一連の像Ａｏｐ（ｍ，ｎ）を含み、ｏは配光分布を表し、ｐは検出チャネルから得た像を表す。
【０２４２】
共焦点顕微鏡と同じように、測定プロセスでは、遙かに大きい物体内の小さい分量を解析する。したがって、共焦点顕微鏡のモジュールに似た追加のモジュールであって、走査プロセス、表面および／または３次元の物体の点データを統合し、解析し、可視化するソフトウェアモジュールを含むモジュールを追加する必要がある。 
【０２４３】
本発明の一実施形態による測定方法ＰＳＩＴは、トポロジーの異なる一連の配光分布を解析分量に照射する。
【０２４４】
本測定ＰＳＩＴ方法は、以下の機能を実行する：
・  トポロジー群の異なる一連の小規模な配光分布を試料に照射する。
・  各々の小規模な配光分布に対して：
−  試料の蛍光色素分子によって発光する。
−  光学顕微鏡を用いて、光学画像を作成する。光検出器で光学画像を取得し、デジタル像を作成する。
【０２４５】
さらに詳細には、次の点に注意されたい：
一連の伝送は、トポロジー群の異なる少なくとも２つの点状配光分布からなる。
一連の伝送は、発光ナノエミッタと称する蛍光色素分子で標識した生体試料に照射される。
【０２４６】
各々の発光ナノエミッタから出射する放出光は、各々の発光ナノエミッタに対して、インコヒーレントの場合に強度に依存するか、またはコヒーレントの場合に電磁場に依存し、上記で考察したナノエミッタの前記サンプリング特性を有する発光ナノエミッタの３次元空間位置に入射する。
【０２４７】
試料に照射された連続放出の各々の配光分布パターンに対して、光学画像が形成される。一連の伝送のすべての配光分布に対応する一連の画像を、画像シーケンスと称する。
【０２４８】
この実施形態に係る ＰＳＩＴ方法により、主に横方向の情報、すなわち各々の蛍光色素分子の横方向の位置を取得することができる。
【０２４９】
好適な実施形態では、ＰＳＩＴ方法は、円錐回折によって形成され入射および出射の偏光状態が変化することによって修正される、トポロジーの異なる配光分布を照射することによって実施される。
【０２５０】
本発明の一実施形態によるＰＤＯＳ方法には、蛍光色素分子によって少なくとも２つの検出器の間に再放出された光を「光学セマフォ」で分布させることが含まれる。
【０２５１】
理想的には、光学セマフォの機能は、異なる領域にある異なる検出器に試験的分量を分離することである。実際には、光学セマフォは、発光ナノエミッタの空間位置および様々な検出器の様々な位置に応じて、各々の検出器に対して、発光ナノエミッタが放出した光の送出機能を生み出す。
【０２５２】
好適な実施形態では、ＰＤＯＳ方法は、焦点面内または焦点面を超えて存在する蛍光色素分子から出射する非コリメート光から、レンズの焦点面に位置する蛍光色素分子から出射するコリメート光を様々な検出器に分離するために実施される。
【０２５３】
その好適な実施形態におけるＰＤＯＳ方法により、実質的に縦方向の情報、すなわち各々の蛍光色素分子の縦方向の位置を取得することができる。
【０２５４】
数学的には、本発明のいくつかの実施形態による方法は、空間内の蛍光色素分子の空間分布を、一連の画像からなる未処理情報に変換する送出機能を提供するものである。アルゴリズムは、逆の動作を実行する。すなわちアルゴリズムは、未処理情報内の一連の画像から空間内の蛍光色素分子の空間分布を再構築する。
【０２５５】
数学的な面では、このアルゴリズムは、逆問題またはパラメータ推定を解決する。モデル式が知られており、スパースオブジェクト内の蛍光色素分子の数は、先験的に限られている。よって、逆問題およびパラメータ推定を解決するための当業者に公知の数学的手法をすべて使用することができる。本発明の一実施形態による測定方法論に対して特別に適応させたアルゴリズムの一例を後述する。
【０２５６】
さらに、象徴的価値のために、 互いにわずかな距離を置いて位置する２点を区別する問題に対する新たな解決法を取り上げる。Ｌｏｒｄ  Ｒａｙｌｅｉｇｈが研究したこの問題は、多くの光学分野における解決基準の基本である。
【０２５７】
そのため、発明の詳細な記載がよりよく理解されるように、また技術への貢献がよりよく評価されるように、発明の特徴を広範囲にわたって記載してきた。本発明のさらに他の多くの特徴を以下に説明する。
【０２５８】
本発明の一実施形態による方法の好適な実施態様は、ハードウェアのプラットフォームおよびアルゴリズムであり、これは、図５に示すＳＲＣＤＰプラットフォーム５００のことである。
【０２５９】
ＳＲＣＤＰプラットフォーム５００は、前述のＰＳＩＴ方法とＰＤＯＳ方法の２つを組み合わせることによって本発明の一実施形態による方法を実施する。
【０２６０】
図５のプラットフォームＳＲＣＤＰは、複数の蛍光色素分子を含む生体試料１１を観察する。ＳＲＣＤＰプラットフォームによる生体試料の観察結果は、観察した試料を表す超解像情報を取得したものである。
【０２６１】
図５のプラットフォームＳＲＣＤＰ５００は、主に、
そのハードウェア部分に、以下のものを備える：
・  前述の共焦点顕微鏡と同様の適応したまたは最適化した共焦点顕微鏡であって、前述したような適切な部品をすべて有する共焦点顕微鏡２００。
・  標準の顕微鏡に搭載した、２つの新規かつ補足的な光学モジュール。
この２つの新規な光学モジュールは、光学モジュールＬａｔＳＲＣＳ７００およびＬｏｎｇＳＲＣＳ８００であり、これについては、図６および図８をそれぞれ参照してのちに詳述する。
光学モジュール７００ＬａｔＳＲＣＳは、本発明の一実施形態によるＰＳＩＴ方法を実施するのに必要な照明ステップを実施する。
光学モジュールＬｏｎｇＳＲＣＳ８００は、本発明の一実施形態によるＰＤＯＳ方法の複数の出射画像の状態で光度を分布するステップを実施する。
・  図８を参照して説明していくアルゴリズムモジュールＳＲＣＤＡ６００は、プラットフォームＳＲＣＤＰが作成した画像から生体試料の超解像情報を再構築することができる。
・  その他の補助的素子であって、プラットフォームの作製に必要な、コンピュータ６６およびソフトウェア６７などの素子。
【０２６２】
ＰＳＩＴ方法を実施する光学モジュールＬａｔＳＲＣＳ
図６を参照して、本発明の一実施形態による光学モジュール、光学モジュールＬａｔＳＲＣＳ７００、およびその顕微鏡法における特定の機能を説明する。
【０２６３】
この実施形態に係る光学モジュールＬａｔＳＲＣＳ７００は、試料内の複数の蛍光色素分子にトポロジーの異なる一連の小規模な配光分布を照射する光学モジュールである。各々の蛍光色素分子は、蛍光色素分子への入射強度に応じた一連の蛍光灯強度で蛍光を発し、蛍光色素分子の横方向の位置を特徴づける。ほとんどの実施形態では、トポロジーの異なる小規模な配光分布は、定常波と特異波との間で振幅および位相が変化する干渉によって形成される。好適な実施形態では、規則波および特異波は、薄型の円錐形結晶によって形成される。
【０２６４】
光学モジュールＬａｔＳＲＣＳ７００は、共焦点顕微鏡２００の照明路に位置し、共焦点顕微鏡対物レンズ２００を用いてトポロジーの異なる一連の小規模な配光分布を試料１１に照射する。円錐回折を用いる好適な実施形態では、試料１１上の特定位置での入射強度は、各々の配光分布パターンに対して、ストークスパラメータの特定の組み合わせに比例する。
【０２６５】
光学モジュールＬａｔＳＲＣＳ７００、は、蛍光色素分子に対して特有の前述した固有の特徴を使用し、蛍光色素分子は、（蛍光色素分子の）正確な位置に入射する光度をサンプリングし、入射光に応じて蛍光灯を再放出する。注目すべきは、 測定した情報は、小規模な配光分布内の蛍光色素分子の位置に直接関係し、ストークスパラメータに中継されるという点である。この 情報は、蛍光色素分子の機能性、つまり光を吸収して再放出する能力によって硬直化され、光学連鎖が破壊される。この情報は、出射光分布として蛍光に保有され、検出アセンブリ６５によって回収されることができる。
【０２６６】
入射光が、トポロジーの異なる一連の小規模な配光分布に応じて時間とともに変化する場合、再放出された蛍光の強度は、同じ割合で変化する。再放出された一連の蛍光は、トポロジーの異なる一連の小規模な配光分布に比例する。この情報から、以下で説明するように、蛍光色素分子の位置を読み出すことが可能になる。
【０２６７】
本発明の実施形態によるＰＳＩＴ方法は、トポロジーの異なる一連の小規模な配光分布を顕微鏡で照射し、蛍光色素分子と相互作用し、顕微鏡の対物レンズ２２で反射光を集光し、改良型検出アセンブリ６５で蛍光を検出し、適切なアルゴリズムで情報を解析するものである。いくつかの実施形態では、改良型検出アセンブリ６５は、単一の検出器を備え、時間に応じた全体的な強度のみを回収するのに対し、他の実施形態では、改良型検出アセンブリは、小さい画素エリアを備え、蛍光灯の空間分布も回収する。複数の画像からなる読み出された情報をすべて、横方向の超解像画像と称する。
【０２６８】
好適な実施形態では、被照明分量内に位置する蛍光色素分子が特定の横方向の超解像画像に及ぼす作用は、蛍光色素分子の位置での入射光のストークスパラメータの特定の組み合わせに比例する。
【０２６９】
横方向の超解像画像、つまりトポロジーの異なる小規模な配光分布によって作成された情報は、新規なものでありかつ先行技術にはみられなかったものである。この新規な情報により、蛍光色素分子の位置の精度が向上し、被照明分量内にある蛍光色素分子の数を定量し、同じ分量内にある複数の蛍光色素分子を区別することができる。
【０２７０】
次に、本発明の実施形態に係る光学モジュールＬａｔＳＲＣＳ７００の簡易概略図である図６を参照する。
【０２７１】
図６は、光学モジュールＬａｔＳＲＣＳ７００を示し、この光学モジュールは、図３の円錐回折モジュールの部品をすべて有し、この部品は、円錐回折モジュールと同じように実装される。他の条件は補助光学器械を使用することで適応させることができるが、走査型共焦点顕微鏡の光源の光学器械は、無限の組み合わせがあると仮定される。光源から入る入射光３０は平行である。光学モジュール７００は、それ自体が、第１のレンズ３１、円錐形結晶３２、および第２のレンズ３３を備え、前述の部分偏光子２９を加えてもよい。２つの第１のレンズ ３１および３３は、倍率１のケプラー望遠鏡の形態で構成されることが好ましく、円錐の結像面、３５は、レンズ３１および３３の共通焦点面に置かれる。第１のレンズ３１の開口数は、以下に定義する正規化した円錐半径を介して、円錐回折効果のパラメータを決定する。第２の対物レンズ３３は、光の平行性を復元して、これを顕微鏡内に投入する。第２の対物レンズは、さらに、偏光制御サブモジュール７１を備え、例えば、回転１／４波長板、１対の液晶ライトバルブもしくはポッケルスセル７２ならびに検光子７３などを有する。ストークスパラメータの情報は、空間的に異なる一連の配光分布を介して連続情報に変換され、前述したような連続情報を保有することができる。
【０２７２】
図７ａを参照すると、この図は、正規化した円錐パラメータρ０が０．３８８である円錐形結晶を介して形成された配光分布を示し、この配光分布は、入射および出射で異なる偏光状態に対して、スカラー近似により計算されている。これらの配光分布は、ＭＭｒｅｓｅａｒｃｈ社のソフトウェアＤｉｆｆｒａｃｔを使用して計算されたものである。これらの配光分布は、ベクトル効果から円錐屈折（回折）を分離するために、対物レンズの焦点ではなくイメージングの中間面で計算されたものである。（入射および出射の）偏光状態は、直線偏光の場合の偏光角度および円偏光の場合の偏光のキラリティが特徴である。
【０２７３】
図７ｂを参照すると、この図は、正規化した円錐パラメータρ０が０．８１８である円錐形結晶を介して形成された配光分布を示し、この配光分布は、入射および出射で異なる偏光状態に対して、スカラー近似により計算されている。これらの配光分布は、ＭＭｒｅｓｅａｒｃｈ社のソフトウェアＤｉｆｆｒａｃｔを使用して計算されたものである。これらの配光分布は、ベクトル効果から円錐屈折（回折）を分離するために、対物レンズの焦点ではなくイメージングの中間面で計算されたものである。（入射および出射の）偏光状態は、直線偏光の場合の偏光角度および円偏光の場合の偏光のキラリティが特徴である。
【０２７４】
主に、以下の配光分布に注意する：
・  基本配光分布：平行な円偏光子同士の間で得られる図７ａ００および図７ａ１１であり、エアリー分布に近い分布。
・  渦配光分布：交差円偏光子同士の間で得られる図７ａ０１および図７ａ１０。
・  「三日月」分布と呼ぶ分布；副図７ａ０、２−５、７ａ１、２−５、７ａ２−５、０および７ａ２−５、１は、円偏光子と角度が変化する直線偏光子との間で得られる。この分布は非対称であり、軸は直線偏光子の軸に沿って回転する。
・  「半月」分布と呼ぶ分布；副図７ａ４２、７ａ３５、７ａ２４および７ａ５３は、２つの交差偏光子の間で得られ、この分布は対称である。
・  より複雑な配光分布、図７ｂであり、０．５よりも大きい正規化した円錐パラメータρ０の結晶に対する分布。
・  結晶間に静的または動的な偏光素子がある２つ（または２つ以上）の結晶が急峻な円錐形結晶（図示せず）を使用して、さらに別の配光分布を作成する。
【０２７５】
冗長性およびランダム位相の変化
図７に描いた基礎配光分布は、いくつかの方法で得られる。さらに、 その方法のうちのいくつかを、他の基礎配光分布の線形的組み合わせとして得ることができ、例えば渦分布は、任意の２つの直交する「半月」配光分布を合わせたものから得ることができる。
【０２７６】
この冗長性により、生体の多くの測定プロセスに必然的に存在するランダム位相の誤りをある程度平均化することができる。これによって、本発明の実施形態の測定方法論およびその適用性の確実性が強化される。
【０２７７】
新規な配光分布は、基礎配光分布の数学的な組み合わせとして得ることもできる。４つのストークス分布を算術演算で組み合わせて計算した 「偽渦」の配光分布は、原点の勾配が激しいという特徴を有する。
【０２７８】
ＰＳＩＴ方法は、元々は横方向の超解像ができるように設計されたものであったが、ＰＳＩＴ方法は、蛍光色素分子の縦方向（長手方向）の位置を得るのに使用することもできる。実際、いくつかの基礎配光分布は、蛍光色素分子の縦方向の位置の変化から（合理的な限度内で）比較的影響を受けないが、他の分布はかなり影響を受けやすい。一連の小規模な配光分布は、縦方向の位置に依存しないものと依存するものがあり、蛍光色素分子の縦方向の位置を明らかにする。
【０２７９】
さらに、蛍光色素分子の縦方向の位置に強く依存する配光分布に対して、縦方向に互いにわずかにずれている一連の基礎配光分布を試料に照射することができ、これによって縦方向の情報を含む一連の画像ができる。
【０２８０】
さらに、 いくつかのさらに複雑な基礎配光分布は、さらに複雑な波の重なりで構成され、縦方向に強く依存して存在し、例えば、Ｚｈａｎｇが記載した「３次元ダークスポット」［２８］は、光を発する球体で３次元に囲まれたブラックスポットを形成する。これらの「３次元ダークスポット 」は、ラゲールガウス関数の重畳で構成され、この関数は、Ｚｈａｎｇが提案したように、ホログラムまたは位相板を使用するか、または本発明者が提案するように、１軸結晶または円錐形結晶を使用して、レーザー空洞の中で達成されることができる。本測定方法論のこれらの変形例はすべて、本発明の一部と考えられる。
【０２８１】
しかし本発明者は、好適な実施態様で、横方向の測定および縦方向の測定を、離れているが補足関係にある２つの光学モジュールに分けて、各々のモジュールの複雑性を軽減することを選択した。
【０２８２】
ベクトル効果
これまで展開した理論は、顕微鏡３５の結像面内の配光分布を説明するものである。試料に照射された光の分布は、幾何学的イメージングの理論によれば、像面内の配光分布を縮小した画像である。
【０２８３】
しかしながら、文献で大々的に記載されているように、開口数の高い対物レンズの場合、幾何学的イメージングの理論は適確ではなく、ベクトル効果を考慮しなければならない。これらの効果は、本質的に、縦方向に偏光成分が存在することで起こる。 
【０２８４】
再度図６を参照すると、ベクトル効果を緩和するためには、不変の最終的な検光子を維持し、不変または可変の追加素子、つまり出射の偏光を適応させるサブモジュール７４を加えて出射の偏光を制御することが有利である可能性がある。円が対称である出力偏光であれば、ベクトル効果が大幅に低減されることを発見した。このような偏光は、円形、放出状または方位角のものとすることができる。円偏光の場合、出力偏光を適応させるサブモジュール７４は、単純に１／４波長位相差板である。この場合、縦方向の偏光素子は、渦が対称であり、ストークスパラメータの形状にわずかな変更を加えるだけで、開口数の高い顕微鏡対物レンズに対してでも、システムに問題なく組み入れられる。
【０２８５】
このようにする代わりに、出射偏光を適応させるサブモジュール７４は、可変的なものでもよく、小規模な配光分布の各々のトポロジーおよび対称性に適応させてもよい。
【０２８６】
ＰＤＯＳ方法を実施する光学モジュール ＬｏｎｇＳＲＣＳ
以下に、光学モジュールＬｏｎｇＳＲＣＳについてさらに詳細に説明する。
【０２８７】
本発明の一実施形態による縦方向の超解像系は、わずかな被照明分量内にある複数の点光源の入射光度を、各々の点光源の空間位置に応じて、別々の検出器または同じ検出器の異なる立体位置またはこの両方を合わせたものに誘導する。
【０２８８】
さらに単純な言葉で言うならば、縦方向の 点Ａに位置する蛍光色素分子が放出する強度は、縦方向の 点Ｂに位置する蛍光色素分子が放出する強度からは物理的に離れる。
【０２８９】
本発明の一実施形態による光学モジュールＬｏｎｇＳＲＣＳにより、分量をスライス状に分離することができ、被照明分量の様々なスライス片は、様々な一連の検出器上で物理的に別々に離れる。
【０２９０】
以下で説明する好適な実施形態では、光学モジュールＬｏｎｇＳＲＣＳは、被照明分量を少なくとも３つの隣接するスライス片に分離し、一連の独立した改良型検出器上で真ん中のスライス片を他の２つのスライス片から離し、同じ一連の改良型検出器上で残りの２つのスライス片の間に空間差異を形成する。
【０２９１】
次に、 本発明の実施形態に係る光学モジュールＬｏｎｇＳＲＣＳ８００の簡易概略図である図８を参照する。
【０２９２】
光学モジュールＬｏｎｇＳＲＣＳは、わずかな光量にある複数の点光源の入射光度を、各々の点光源の縦方向の位置に応じて、別々の検出器または同じ検出器の異なる立体位置またはこの両方を合わせたものに誘導する。
【０２９３】
好適な実施形態では、この光学モジュールは、縦方向の位置に応じて、８０、８０’または８０”で示す蛍光色素分子に対して動作する。この光学モジュールは、第１のコリメーションレンズ８１を備え、このレンズは、いくつかの実施形態では、顕微鏡対物レンズ４で構成されてよい。
【０２９４】
蛍光色素分子８０は、コリメーションレンズ８２の焦点面に位置し、コリメーションレンズ８１から出射する蛍光色素分子８０から出る光は、コリメートされる（平行にされる）。
【０２９５】
蛍光色素分子８０’および８０”は、コリメーションレンズ８２の焦点面の前と後ろに距離±Δｚを隔てて置かれ、コリメーションレンズ８１から出射する蛍光色素分子８０’または８０”から出る光は、収束または発散する。
【０２９６】
光学モジュールＬｏｎｇＳＲＣＳは、横変位の偏光ビームスプリッタ８３の形態である、図８に示す偏光ビームセパレータを有する。偏光ビームスプリッタは、偏向していないと思われる入射光を、直交する直線偏光を含む２つの偏光チャネル８４および８５に分割する。このシステムは、入ってくる光がすでに偏光であるか、または偏光されていない光のために入射光度の半分を失うことを犠牲にすれば、２つではなく単一の偏光チャネルを使用することで簡易化できる。
【０２９７】
２つの１／４波長板８６および８７は、各々のチャネルに対して、直線偏光を円偏光に変換する。
【０２９８】
チャネル８８および８９のそれぞれには、円錐形結晶が置かれる。各々のチャネルでは、 図３に記載したように、円錐回折の構成の主要対物レンズ３１として機能する円錐回折構成がコリメーターレンズ８１、ならびに円錐形結晶８８および８９で構成される。円錐回折パターンは、続いて第２のレンズ３３をもって完全となる。
【０２９９】
コリメーションレンズ８２の焦点面に位置する蛍光色素分子８０の場合、コリメーターレンズ８１から出射する光は、前述したようにコリメートされる。円錐回折の構成を参照すると、像空間におけるコリメーションレンズ８１の開口数および（それによって）正規化した円錐半径はゼロであるため、蛍光色素分子８０からビームに及ぶ円錐回折の効果はゼロである。したがって、円錐形結晶は、蛍光色素分子が放出した蛍光灯の幾何学形状もその偏光も変更することはなく、キラリティが同じである円形のままである。
【０３００】
コリメーションレンズ８２の焦点面に位置していない蛍光色素分子８０’または８０”の場合、光は発散または収束する。再度前述の円錐回折の構成を参照すると、コリメーションレンズ８１の像面の開口数は、円錐回折の構成の第１のレンズ３１と等しく、ゼロではない。プラスまたはマイナスの所与のデフォーカス値が±Δｚの場合、円錐結晶から出射されるほとんどの光は渦波であり、この渦波の形状は渦で、キラリティが逆である。
【０３０１】
各々のチャネルに位置する円錐回折の構成の機能性は、収束光または発散光に対する光の円偏光のキラリティを逆にすることによって、収束光または発散光とコリメート光とを区別することである。
【０３０２】
他の２つの１／４波長板９０および９１は、各々のチャネルから出射する円偏光を直線偏光に変換する。各々のチャネルに対して、結晶が除去された場合に位相差板から出射されたであろう直線偏光をコリメーションの偏光と呼ぶ。
【０３０３】
光学モジュールＬｏｎｇＳＲＣＳは、横方向に分離する４口のコンバイナ／セパレータ９２として、図８に示すような４口のコンバイナ／セパレータを備える。この光学モジュールは、各々のチャネルに対して２つの偏光を分離し、２つのコリメートされた偏光を同じ光路、つまりコリメーション光路９３で融合し、（コリメートされた偏光に）直交する偏光を別の光路、つまり非コリメート光路９４で融合する。１／４波長板８６、８７、９０および９１の軸方向は、適正に決定しなければならない。合わさったビームは、元は偏向していないビームから来ているため、干渉しない。
【０３０４】
コリメーション光路に入る入射光は、円錐回折の構成の第２のレンズ３２として機能するコリメーション光路９５の焦点レンズを使用して、コリメーション検出器９６で集光される。
【０３０５】
非コリメーション光路では、別のレンズ ９７が挿入され、この別のレンズ９７は、コリメーションレンズ８１とともに新たなレンズ系９８を作り出し、この新たなレンズの焦点面９９は、コリメーションレンズ８２の焦点面とは異なる位置、つまり蛍光色素分子８０’の位置に位置する。別の １／４波長板１００が、１／４波長板９０または９１が起こす作用を取り消し、各々の偏光チャネルから入ってくるビームを反射時に円偏光に変換し、この円偏光は、円錐結晶８８または８９を出た後に偏光される。
【０３０６】
コリメートされない道には、別の円錐形結晶１０１が第３の円錐回折構成（補助的な円錐回折構成）としてレンズ光学系９８とともに追加され、円錐回折構成３１の第１のレンズとして作用する。
【０３０７】
蛍光色素分子８０’は、コリメーションレンズ８２の焦点面の前に、距離Δｚを隔てて位置しているが、レンズ光学系９８に対しては焦点面９９に位置している。蛍光色素分子８０’から来る光は、光が通過した偏光チャネル応じて、コリメーションレンズ８１で構成される円錐回折構成のうちの１つ、および円錐形結晶８８または８９のうちの１つによって、すでに渦に変換されていたものである。蛍光色素分子８０から来る光は、レンズ系、９８から出る際に、追加のレンズ９７の後ろでコリメートさる。
【０３０８】
新規な円錐回折構成を参照すると、像空間にあるレンズ系の開口数、および正規化した円錐半径は、蛍光色素分子８０’に対してゼロであり、補助的回折構成が、蛍光色素分子８０から出射されるビームに及ぼす円錐回折効果はゼロである。したがって、円錐形結晶は、蛍光色素分子が放出する蛍光の幾何学形状を変化させることはない。蛍光色素分子８０’から来る光は、円錐形結晶９８の前後で渦である。
【０３０９】
蛍光色素分子８０”は、コリメーションレンズ８２の焦点面の後ろに、レンズ系９８に対して距離Δｚを隔てて置かれ、集光位置９９からは距離−２Δｚを隔てて置かれ、蛍光色素分子８０”から来る光は、レンズ系、９８から出る際にフロントレンズ、９７の後ろで合流する。蛍光色素分子８０”から来る光は、光が通過した偏光チャネル応じて、コリメーションレンズ８１で構成される円錐回折構成のうちの１つ、および円錐形結晶８８または８９のいずれか１つによって、すでに渦に変換されていたものである。円錐形結晶１０１は、蛍光色素分子８０”から来る光を変化させ、および、材料に関連するパラメータ、すなわち円錐形結晶のサイズおよび向きについて、エアリーディスクとはわずかに異なる規則波に戻す。
【０３１０】
非コリメート光路の対物レンズ１０２は、規則波１０４であって蛍光色素分子８０’ではなく特異波である蛍光色素分子８０”を含む面を、画素化した検出アセンブリ１０３で焦点を合わせるように適応される。蛍光色素分子８０”のような面１０４に位置する蛍光色素分子から出射する入射光は、完全に焦点が合わされ、画素化された検出器１０３の中心に位置する。面９９に位置する蛍光色素分子から出射する入射光は、渦であるため、中心がゼロである外側の円に集光される。中心の強度と検出器の外部の強度とを別々に記録することによって、入射光面１０４と９９との間をわずかに重なった状態で分離することができる。さらに、対物レンズが検出器の面１０４で焦点を合わせるように計算されているため、蛍光色素分子８０のように面１０４に位置する蛍光色素分子は、わずかに位置がずれている。これによって、中心の渦の強度をさらに上げて重複を低減することで、光学モジュールＬｏｎｇＳＲＣＳの効果が改善される。
【０３１１】
光学モジュールＬｏｎｇＳＲＣＳ８００の好適な実施形態をこのように簡易に説明することで、当業者に公知の変更を通して設計を変更して、多くの変形例および適応例が可能になる。この変更には、結晶の材料および方向、偏光部品の選択、偏光軸、カスケード素子、センサ数の選択または蛍光色素分子８０’および８０”の役割の入れ替えなどがあるが、これに限定されない。さらに、モジュールは、理想的には、一連の一体化したサブセットあるいはまた単一の一体化したユニットとして構成されるように調整される。
【０３１２】
ＰＤＯＳ方法および横方向の測定
ＰＤＯＳ方法は、元は縦方向の超解像ができるように設計されたものだが、ＰＤＯＳ方法は、蛍光色素分子の横方向の位置の測定にも使用できる。実際、基礎配光分布は、蛍光色素分子の横方向の位置の変化にも影響を受けやすい。試料の面に対する光の照射が不可能な場合、 ＰＤＯＳ方法の代わりにＰＳＩＴ方法を用いて超解像測定を実施してもよい。
【０３１３】
本測定方法論のこれらの変形例はすべて、本発明の範囲内である。しかし、本発明者は、好適な実施態様で、横方向の測定を縦方向の測定から分離して、離れて別々だが補足関係にある２つの光学モジュールに分けて、各々のアドオン（追加装置）の複雑性を軽減することを選択した。
【０３１４】
検出モジュール
本測定方法論の可能性を考えると、作成された情報を検出して復元できるさらに複雑な検出モジュールが必要であるという結論に至る。走査型共焦点顕微鏡法では、検出器は、ＰＭＴまたはＳＰＡＤとしての単一の素子で構成される検出器である。検出器の取得時間は、走査機構によって決まる。
【０３１５】
本測定方法論は、いくつかの実施形態では、１つではなく２つの検出モジュール、つまり基本検出モジュールおよび渦検出モジュールを必要とする。さらに、本測定方法論は、いくつかの実施形態では、各々の被照明分量に対して、連続信号の識別・定量に必要であるために、画素時間よりも早いレートで、典型的には１６×１６の小さい空間格子に光学情報を取得する必要がある。
【０３１６】
改良型検出モジュール６５は、少画素数の小型検出器を用いて使用されることができる。このようなモジュールは、適切な技術がないために１０年や２０年前には不可能であっただろう。今日、少画素数、高速、少ノイズを特徴とする小型検出器が、いくつかの技術を基盤として利用でき、３２×３２など少画素数のＳＰＡＤアレイが、近年最大１ＭＨｚの取得レートで登場している。改良型検出モジュール６５は、ＣＣＤ、ＥＭＣＣＤまたはＣＭＯＳセンサを用いて使用されることができる。少画素数のＣＣＤセンサ、ＣＭＯＳセンサおよびＥＭＣＣＤセンサが存在する、またはこれを特別に設計することができる。さらに、 ＣＣＤセンサ、ＣＭＯＳセンサ、ＥＭＣＣＤセンサは、関心領域の特性、多くの検出器で利用可能なサブウインドウまたは「ビニング」の特性を利用して使用されることができる。
【０３１７】
本明細書で用いる空間・時間情報は、各々の蛍光光子の位置およびこの蛍光光子が及ぼす効果の時間である。実際のシステムでは、空間・時間情報は、検出器のノイズによって損なわれ、これによって不正確な光子が形成され、不十分な検出によって、検出されていない光子が形成され、これによって性能が低下する。ＳＰＡＤアレイでは、各々の光子に対して、この光子を検出した画素および効果時間が受け取られ、すなわち完全な空間／時間情報が入手可能になる。ＣＣＤセンサ、ＣＭＯＳセンサまたはＥＭＣＣＤセンサの場合、複数のフレームを取得して、空間・時間情報を近似する必要がある。
【０３１８】
いくつかの実施態様では、 別々の検出器について言及する。多くの場合、センサは、物理的に離れているか、または単一の検出器の異なるエリアで構成されるか、またはこの２つの場合を組み合わせたものといずれかとすることができる。
【０３１９】
ＳＲＣＤＡアルゴリズム
前述したように、ＳＲＣＤＡアルゴリズムは、当業者に公知の逆問題方法またはパラメータ推定方法を使用して実行されることができる。
【０３２０】
１つの実施形態によるアルゴリズムで、一連のディスクリプタに基づく本測定方法論に特有のアルゴリズムも取り上げる。
【０３２１】
次に、本発明の実施形態に係る蛍光色素分子データを超解像するアルゴリズム方法９００の簡易概略図である図９を参照する。
【０３２２】
図９に示したアルゴリズムの手順では、蛍光色素分子の数を定量し、各々の蛍光色素分子の特性を読み出し、各々の出力パラメータの精度を定量する。
【０３２３】
前処理手順 １１１は、一連の超解像画像１１２内で空間時間情報１１０を再構成する。これは、フィルタバンク手順を用いて行うことができる。そのため、この一連のデータは、典型的には１６×１６画素の小画像からなる短い連なりである。 
前処理手順は、約数千の少数の空間時間素子に適用され、既存のハードウェアを用いてリアルタイムで実行される。
【０３２４】
ディスクリプタの手順１１３、つまり主要な計算ステップは、各画像から一連のディスクリプタ１１４、およびその統計的有意性を作成する。ディスクリプタには、各画像の強度、画像内の配光分布の有無およびその規則分布または渦分布などの特徴、その重心、ならびにその一次以上のモーメントが含まれるが、これに限定されない。
【０３２５】
第３のステップは、フィルタリング演算１１５であり、このステップでは、統計学的に関連するディスクリプタのみが保持される。
【０３２６】
分類演算 １１６は、最後のアルゴリズムステップである。このアルゴリズムは、一連のディスクリプタ１１４および知識ベース１１７に基づいて、単一の蛍光色素分子、縦方向または横方向に分かれた２つの蛍光色素分子および３つ以上の蛍光色素分子など、異なる測定事例を識別することができる。
【０３２７】
作成される情報量によって、蛍光顕微鏡法で不明瞭であった多くの事例が明確に特定される点に注意されたい。例えば、後にさらに詳述するように、単一の蛍光色素分子は、長い条件リストを満たさなければならず、複数の蛍光色素分子の事例と混合されることはない。縦方向に分かれた２つの蛍光色素分子は、独立した一連のディスクリプタを作成し、横方向に分かれた２つの蛍光色素分子は、少なくとも１つのディスクリプタでは単一の蛍光色素分子とは明らかに異なるものになる。
【０３２８】
測定方法論を実施する合成光学プロセスの アルゴリズム
本発明の少なくとも１つの実施形態による合成光学プロセスは、ディスクリプタのアルゴリズムの論理的補数である。実際に、ディスクリプタの計算手順を実行すると、画像の追加で測定性能が改善される結果を導くことができる。顕微鏡法プラットフォームＳＲＣＤＰにより、ＰＳＩＴ方法またはＰＤＯＳ方法の一連の配光分布から、１つ以上の追加画像を取得することができる。
【０３２９】
以下に一例を説明する。 
【０３３０】
ＰＳＩＴ方法を用いた点の位置測定
ＰＳＩＴ方法は、蛍光色素分子の位置を高精度で測定する技術として使用されることができる。この測定には、前述したディスクリプタのアルゴリズムを使用できる。
【０３３１】
デカルト座標のｘ、ｙおよび極座標の（ρ，θ）の位置に蛍光色素分子が位置していると考える。基本波で構成される一連の照明、および直交軸に沿って並んだ２つのいわゆる「半月」分布を蛍光色素分子に照射する。
【０３３２】
前処理手順で以下の２つの画像を作成する：
シーケンスの３画像の和で構成される「トップハット（ｔｏｐ  ｈａｔ）」画像、および２つの半月画像の和で構成される渦画像。
【０３３３】
第１のディスクリプタが、画像「トップハット」の重心のアルゴリズムを用いて計算されるデカルト位置である。
【０３３４】
図１０を参照すると、半径位置ρは、パラメータρａ、を測定することによって一義的に測定することができ、このパラメータは、渦波Ｉｖに照明された蛍光色素分子が放出した正規化強度と、基本波ＩＦに照明された蛍光色素分子が放出した正規化強度との間の強度比のアークタンジェントを、因子πで正規化したものに等しい。実際、
・  基本波に照明された蛍光色素分子が放出した正規化強度は、基本波の中心での１からエアリー半径での０まで変化する。
・  渦波に照明された蛍光色素分子が放出した正規化強度は、渦の中心での０から渦の最大の１まで変化し、エアリー半径よりもわずかに大きい値に向かう０に達する。比のアークタンジェントは、単調関数である。
【０３３５】
方位角位置は、第１の半月分布ＩＨに照射された蛍光色素分子が放出する全体強度と、第２の半月分布Ｉｖｅに照射された蛍光色素分子が放出する全体強度との強度比を測定することによって測定できる。この２つの強度の比は、タンジェント二乗の法則であり、両方とも測定するのは冗長である。
【数９】
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【０３３６】
この冗長性は、観察した物体を単一の点として定量し、試料内に潜在的に存在する他の物体から分離するための手段である。 
【０３３７】
高次元空間での表現：デカルト極座標表現；この結果は一般化することができる。本明細書では、デカルト座標表現と極座標表現を合わせた新たな平面表現をすべて紹介する。この表示を、デカルト極座標表現と名付けた。平面上の１点を、ｘ、ｙ、ρ、θの４つで表現する。この表現は、比ユークリッドであり、冗長である。同様の空間表現は、必要な変更を施して定義できる。 
【０３３８】
一見してこの表現は、必要ないように見える。つまり、これよりも 遙かに単純な現実に対して著しく複雑である。平面上の１点の位置は、このようにする代わりに、デカルト座標のｘとｙを用いるか、または極座標のρとθを用いるかのいずれかで表現できることはよく知られている。
【０３３９】
高次元空間での表現：ピタゴラスの空間
本明細書では、デカルト極座標表現の簡易バージョンのみを詳述し、このバージョンでは、１点を座標ｘ、ｙおよびρで表現する。この空間をピタゴラスの空間と称する。 
【０３４０】
立体面積を幾何学の構成方程式ρ２＝ｘ２＋ｙ２を満たす３次元空間にある２次元の面と定義し、ｘ、ｙおよびρを同時に測定する測定系を、前段落で記載したような測定系に、同じデータに対するセントロイドアルゴリズムを合わせたものとして仮定する。ピタゴラスの空間内の立体表面上に、１点を物理的に配置する。２つ以上の物理的な点の事例を考えてみる。測定する２点の重心は、立体表面の外側にあり、このエリアの外側に１点を作成する。この表現は、決定論アルゴリズムの数学的に形式化し、一般化して、隔離した点の事例を前述した点の集合の事例から分離するためのものである。
【０３４１】
２点の識別および測定：新たな解像基準
次に、極座標でρ，θおよびρ，−θの位置の中心を境に対称に位置する２つの蛍光色素分子を考える。前段落に記載したシステムを使用する。 
【０３４２】
３つのディスクリプタにより、以下の結果になる：
・  セントロイドは、配光分布のセントロイドを測定し、これが原点になる。
・  識別子ρは、２つの蛍光色素分子の共通の半径値を測定する。
・  半月の場合にθと−θとの間に縮退を含むディスクリプタθは、値θを測定する。
【０３４３】
前述したように、ディスクリプタρの値がゼロでなければ、検証した事例は１点ではなく２点以上であることがわかる。さらに、ディスクリプタρおよびθによって、レイリー基準で定義される分解能よりも遙かに高に分解能で２点の特徴を測定することができる。さらに、 組み合わせたプロセスを用いると、この事例を３点以上の大半の事例から分離することが可能になる。さらに別の配光分布、つまりθ度傾斜した半月分布を試料に照射することができ、２点が存在するという仮定は、この画像結果に基づいて確認されるか無効にされる。実際、測定したエネルギーは、２点、１ラインまたはθ度の方向に並んだ一連の点に対してゼロになる。 
【０３４４】
制御モジュール
図１１を参照すると、本発明の好適な実施形態で、本発明はさらに、プラットフォームＳＲＣＤＰ５００に組み込まれた様々な制御素子について記載する。
【０３４５】
制御モジュール１１００は、体系的な制御手順１１０１を用いて、プラットフォームＳＲＣＤＰ５００の光学パラメータ、改良型検出モジュール６５の電子パラメータ、およびアルゴリズム手順ＳＲＣＤＡ、６００の数学パラメータをモニタリングし修正して、システムまたはユーザが定義する基準に従って出射情報を最適化する。制御は、プラットフォーム、６００、８００および９００の様々な素子の制御系１１０２、１１０３および１１０４を変更することによって達成される。制御系１１００は、コンピュータ基盤によって中継される外部情報１１０５も、利用可能であれば使用する。
【０３４６】
本測定方法論の代替実施態様
ＰＳＩＴ方法の１つの実施形態では、規則波および特異波は、入射規則波が円錐形結晶３２の代わりに１軸結晶を介して伝搬することによって形成される。
【０３４７】
ＰＳＩＴ方法のもう１つの実施形態では、規則波および特異波は、フーリエ面に、位相板（螺旋位相版など）の光学系またはサブ波長格子を配置するか、あるいは適切なホログラフィック光学素子を配置することによって形成される。
【０３４８】
ＰＳＩＴ方法のもう１つの実施形態では、図示していない厚い点に、試料の照明は、少なくとも２つの合成した一連の小規模な配光分布を含み、合成した小規模な配光分布はそれぞれ、それ自体が同時に照射される少なくとも２つの単純で小規模な配光分布で構成される。前記少なくとも２つの単純で小規模な配光分布は、互いに光学的にコヒーレント、部分的にコヒーレントまたはインコヒーレントであり、前記少なくとも２つの単純で小規模な配光分布は、異なる空間位置に位置し、前記少なくとも２つの単純で小規模な配光分布は、その配光分布の横方向の中心の位置、縦方向の中心の位置、偏光、振幅または位相などの特徴のうちの少なくとも１つが異なる。単純で小規模な配光分布はすべて、トポロジー群の異なる小規模な配光分布を含む。
【０３４９】
図示していないＰＳＩＴ方法のもう１つの実施形態では、小規模な配光分布は、マルチモードレーザーの異なるモードで形成され、一連の小規模な配光分布は、モードを連続的に作成するか、またはその代わりに、モード間のエネルギーのバランスを制御することによって形成される。
【０３５０】
図示していないＰＳＩＴ方法のもう１つの実施形態では、規則波と特異波との関係は、動的に変化する。
【０３５１】
図示していないＰＳＩＴ方法のもう１つの実施形態では、規則波および特異波は、入射ビームを（少なくとも）２つの光路に物理的に分離することによって形成され、１つの光路での規則ビームから特異ビームへの変換は、位相板もしくは螺旋位相板、ホログラフィック光学素子、サブ波長格子、１軸結晶もしくは２軸結晶などの公知の手段またはこれらを組み合わせたものによって実現され、２つのビームはビームコンバイナを用いて再び合成され、単一のビームになる。この実施形態では、小規模な配光分布の区別は、合成したビームまたは各々のビームのいずれかに対して、分離後および再合成前に別々に行うことができる。
【０３５２】
ＰＳＩＴ方法のもう１つの実施形態では、図示していない動的モニタリング系は、小規模な配光分布もしくは小規模な配光分布のシーケンスを高精度で空間に移動させることができる制御可能なミラー、電気光学装置もしくは音響光学装置または圧電アクチュエーターなどの手段を備えるが、これに限定されない。動的モニタリングシステムでは、小規模な配光分布の位置および順序は、少なくとも１つの特定のターゲットを追跡するように動的に制御される。
【０３５３】
ＰＳＩＴ方法のもう１つの実施形態では、図示していない黒の蛍光色素分子、小規模な配光分布または小規模な配光分布を数学的に組み合わせたものは、小規模な配光分布の中心で強度がゼロになるように構成される。このシステムは、小規模な配光分布を空間内に移動させるように適応した手段を備え、これらの手段は、時間に応じて蛍光色素分子を追跡し、蛍光色素分子をその配光分布の中心に配置するために使用される。蛍光色素分子が動くことなく小規模な配光分布の中心に配置されると、その位置は、蛍光色素分子から出射する蛍光がなくとも高精度で測定され、これによって退色作用が実質的に低減される。蛍光色素分子の動きは、小規模な配光分布の位置が適切に動くことによって補償され、放出される少量の蛍光灯を用いて蛍光色素分子が追跡される。
【０３５４】
ＰＳＩＴ方法のもう１つの実施形態では、図示していない動的シーケンスの選択に関して、システムは、配置の仮説または第１の一連の測定値に基づいて、小規模な配光分布の最適なシーケンスを決定する。
【０３５５】
ＰＳＩＴ方法のもう１つの実施形態では、図示していないシーケンスの選択および小規模な配光分布の動的配置に関して、システムは、小規模な配光分布もしくは小規模な配光分布を組み合わせたものを高精度で空間に移動させることができる制御可能なミラー、電気光学装置もしくは音響光学装置または圧電アクチュエーターなどの手段を備えるが、これに限定されない。システムは、配置の仮説または第１の一連の測定値に基づいて、小規模な配光分布の最適なシーケンスおよび位置を決定する。
【０３５６】
ＰＳＩＴ方法のもう１つの実施形態では、三角形分割のＰＳＩＴ方法、前述したＰＳＩＴ方法の２つ以上の測定プロセスは、照射軸の異なる同じ試料で実行される。２つの測定間で横方向の位置が変化することにより、発光ナノエミッタの縦方向の位置を測定することができる。
【０３５７】
ＰＳＩＴ方法のもう１つの実施形態では、平行にするＰＳＩＴ方法で、光は、マイクロレンズアレイ、またはその他の当業者に公知の光学手段に入射し、これによって一連の配光分布を平行にすることができ、これらの配光分布は、光学モジュールによって修正されて、多数の離散点に対してＰＳＩＴ方法が同時に実行される。
【０３５８】
ＰＳＩＴ方法のもう１つの実施形態では、マルチスペクトルのＰＳＩＴ方法（図示せず）で、試料は、連続的または同時に、少なくとも２つの一連の照明によって照明され、各々のシーケンスが異なる波長で光を試料に照射する。
【０３５９】
図示していない ＰＤＯＳ方法のもう１つの実施形態では、縦方向の位置に応じて異なる点光源から来る光の誘導は、焦点面で行われる。これは、横方向の位置によって異なる偏光特性を有する素子を用いて実行される。設定面に対して縦方向に配置された点から入ってくる光は、所定位置に入射し、 特別な偏光特性を持ち、縦方向の（および横方向の）異なる位置にある点からの入射光は、異なる偏光特徴を有する焦点面上の他の位置に入射する。
【０３６０】
本発明の使用方法および利用方法についてのさらに踏み込んだ考察に関しては、上記の説明文から明らかでなるはずである。したがって、使用形態および動作形態に関する考察は一切記載しない。 
【０３６１】
この点に関して、本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前提として、本発明は、以下の説明文に記載の要素または図面に示した要素の詳細な構成および編成に対する適用例に限定されるものではないことは自明である。本発明は、他の実施形態も可能であり、様々な方法で実施し、実行することができる。さらに、本明細書で使用した用語および専門用語は、説明を目的とするものであって、限定するものではないことは自明である。 
【０３６２】
本明細書に引用した参照文献は、本発明に適用できる多くの原理を教示するものである。したがって、 これらの出版物の全内容を参照によって本明細書に組み入れ、必要に応じて追加または代替の特徴および／または技術情報を教示するものとして組み入れる。
【０３６３】
記載した本発明の実施形態は、蛍光共焦点顕微鏡に組み込まれることができる。本発明の実施形態による超解像系は、既存の顕微鏡法に加わる、またはこれに取って代わる新規な測定方法である。しかしながら、本発明の実施形態による超解像系は、他の顕微鏡法プラットフォームに同じように搭載されてもよい。例として記載したこれらの顕微鏡法プラットフォームには、広視野顕微鏡、明視野顕微鏡、暗視野顕微鏡、偏光顕微鏡、位相差顕微鏡、微分干渉顕微鏡、ステレオ顕微鏡、ラマン顕微鏡、ライブセルイメージング、細胞選別、細胞運動などの特定のタスク専用の顕微鏡、または例えば［４］に記載されているようなその他の任意の光学顕微鏡法用の器械などがあるが、これに限定されない。
【０３６４】
本発明は、本発明の適用が、本明細書に記載した説明文または図面に示した内容に記載の詳細に限定されるものではないと理解されるべきである。本発明は、他の実施形態も可能であり、様々な方法で実施し、実行することができる。当業者は、添付の特許請求の範囲に定義した本発明の範囲を逸脱しないかぎり、上記に記載したような本発明の実施形態に様々な修正および変更を適用してよいことを容易に理解するであろう。
【０３６５】
参照文献
付加的な参照文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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