(57)【要約】本発明は、イムノアッセイのようなアッセイを実行するための方法およびキットに関する。アッセイは、２つの異なる種の磁気ビーズを用いることによって、実行される。【選択図】図１
2013534304.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）試料溶液、捕獲群を保有する磁気捕獲ビーズおよび検出群を保有する磁気検出ビーズを提供すること；
ｂ）捕獲ビーズおよび検出ビーズとともに試料溶液をインキュベートすること、ここで、インキュベーション時間の少なくとも一部の間に磁場が適用される；
ｃ）少なくとも１の捕獲ビーズおよび少なくとも１の検出ビーズに直接的または間接的に結合する分析物の存在を検出すること
による、分析物の検出方法。
【請求項２】
捕獲群および検出群が抗体であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ｂ）が、
ｂ１）分析物が検出ビーズと結合するように、試料溶液を検出ビーズとともにインキュベートすること、
ｂ２）ｂ１）の混合物から検出ビーズを除去し、結合した分析物を含む検出ビーズを捕獲ビーズとともにインキュベートすること、ここで、インキュベーション時間の少なくとも一部の間に磁場が適用される
ことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程ｂ）において、捕獲ビーズおよび検出ビーズが、試料溶液とともに同時にインキュベートされることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
工程ａ）において、２種以上の磁気捕獲ビーズが使用され、ここで、各種の磁気捕獲ビーズは、別の分析物と結合することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
磁場が、磁気装置を試料溶液中に沈めることによって適用されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
工程ｃ）が、フローサイトメトリー分析によって行われることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
捕獲ビーズが、２つの異なる蛍光色素によって標識された強磁性ビーズであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
捕獲群を保有する磁気捕獲ビーズおよび検出群を保有する磁気検出ビーズを含み、ここで、捕獲群および検出群は、同一の分析物に直接的または間接的に結合可能である、少なくとも１のセットを含むキット。
【請求項１０】
キットが、捕獲群を保有する磁気捕獲ビーズおよび検出群を保有する磁気検出ビーズを含む２以上のセットを含み、ここで、異なるセットの捕獲群および検出群は、異なる分析物に直接的または間接的に結合することを特徴とする、請求項９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イムノアッセイのようなアッセイを実行するため方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
イムノアッセイは、測定し得る生産物（Ａｇ−Ａｂ）を与えるための分析物または抗原（Ａｇ）に選択的な抗体（Ａｂ）との反応に基づく。
放射活性、酵素、蛍光、発光およびリン光を含む複数種の標識が、イムノアッセイに用いられてきた。
１または２以上の他の分子を含む生物試料におけるＤＮＡ、ＲＮＡ、代謝産物およびタンパク質などこれらに限定されない複数の特定の分析物の存在および濃度を、いわゆるマルチプレックスマイクロアレイ技法を用いることにより、単一の実験中に決定することができる。
【０００３】
マルチプレックスイムノアッセイを実行するための技法の１つは、２つの異なる蛍光色素で色分けされたビーズをベースにしたＬｕｍｉｎｅｘ  ｘＭＡＰ（登録商標）技術である。
これら蛍光色素の異なる濃度の組み合わせは、１００種より多数の異なるビーズとなる。第三の蛍光色素は、レポーターとして用い得る。レポーター蛍光は、ビーズ表面における陽性反応の指標である。
【０００４】
Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｘＭＡＰ（登録商標）技術を用いて、マルチプレックス様式でサンドイッチイムノアッセイを実行するために、分析物特異的な捕獲抗体を、蛍光標識されたビーズの１種と共役させる。抗体と共役したビーズによって捕獲される分析物は、二次抗体によって検出することができる。ここで、二次抗体は、直接的または間接的に検出シグナルを産生する。結果として、この種のマルチプレックスアッセイの形式とともに、複数の従来型ＥＬＩＳＡアッセイを１つのウェルで並行して行うことができる。
【発明の概要】
【０００５】
Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｘＭＡＰ（登録商標）技術を利用するサンドイッチイムノアッセイの典型的なプロトコルは、検出抗体の結合のために実行される長時間のインキュベーション工程によって、４時間以上の作業時間を要する。
結果的に、時間を節約してより早く重要な結果を得るために、より短いインキュベーション時間とともに、全体的により短いプロトコルについての明確なニーズが存在する。
【０００６】
本発明の簡単な説明
分析物特異的な捕獲抗体または捕獲群が、磁気ビーズと共役するだけではなく、検出抗体または検出群が磁気ビーズと共役する場合にも、ビーズをベースにしたアッセイの作業時間は、著しく減少し得ることがわかった。
（磁気ビーズと共役した）捕獲抗体、試料溶液および（磁気ビーズと共役した）検出抗体をインキュベーションするときに磁場を適用すると、抗体の分析物への結合が加速するため、作業時間が減少する。
【０００７】
本発明は結果的に、以下によって分析物を検出する方法に関する：
ａ）試料溶液、捕獲群を保有する磁気捕獲ビーズ、および検出群を保有する磁気検出ビーズを提供すること、ここで、必ずではないが、典型的には捕獲群および検出群は、同じ分析物に結合することが可能である；
ｂ）捕獲ビーズおよび検出ビーズとともに試料溶液をインキュベーションすること、ここで、少なくともインキュベーション時間の一部の間に、磁場が適用される；
ｃ）直接的にまたは間接的に少なくとも１の捕獲ビーズおよび少なくとも１の検出ビーズに結合する分析物の存在を検出すること。
【０００８】
好ましい態様において、捕獲群および検出群は、抗体である。
一態様において、工程ｂ）は以下によって実行される：
ｂ１）分析物が検出ビーズに結合するように試料溶液を検出ビーズとともにインキュベーションすること
ｂ２）ｂ１）の混合物から検出ビーズを除去し、結合した分析物を含む検出ビーズを捕獲ビーズとともにインキュベーションすること、ここで、少なくともインキュベーション時間の一部の間に、磁場が適用される。
【０００９】
好ましい態様において、工程ｂ）において捕獲ビーズおよび検出ビーズは、試料溶液とともに同時にインキュベートされる。同時とは、捕獲ビーズおよび検出ビーズの両方が、試料溶液といっしょにインキュベーションされることを意味する。典型的には、同時インキュベーションのために、捕獲ビーズおよび検出ビーズは、せいぜい５〜１０分の時間範囲内で試料溶液に加えられる。
別の態様において、工程ａ）において２種以上の磁気捕獲ビーズが用いられる。ここで、各種の磁気捕獲ビーズは、別の分析物に結合する。
別の好ましい態様において、試料溶液中に磁気棒を沈めて、磁場が適用される。
別の好ましい態様において、工程ｃ）は、フローサイトメトリー分析で行われる。
一態様において、捕獲ビーズは、２つの異なる蛍光色素で標識化された強磁性ビーズである。
【００１０】
本発明は、捕獲群を保有する磁気捕獲ビーズおよび検出群を保有する磁気検出ビーズを含むセットを少なくとも含む、キットにも関する。ここで、捕獲群および検出群は、直接的または間接的に同じ分析物に結合することが可能である。
好ましい態様において、キットは、捕獲群を保有する磁気捕獲ビーズおよび検出群を保有する磁気検出ビーズを含む２以上のセットを含む。ここで、異なるセットの捕獲群および検出群は、直接的または間接的に異なる分析物に結合する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明による方法が、どのように実行され得るかの一つの可能性を模式的に示す。分析物特異的な抗体でコーティングされた検出ビーズ、例えば磁気および蛍光ナノビーズ（nanoBeads）（２５ｎｍ）は、典型的には＜１時間で試料溶液とともにインキュベートされる。その後、検出ビーズは磁気ビーズハンドラーで収集され、同様に分析物特異的な抗体でコーティングされている磁気捕獲ビーズ（６．５μｍ）とともに第二の溶液へ移動される。（検出ビーズにすでに結合している）分析物の捕獲ビーズへの結合は、磁気的に補助され、１０分以下で行われる。読み出しの工程は、示されていない。
【図２】図２は、例２によるＨｅｒ２検出の曲線を示す。
【図３】図３は、例３による５つのＲＴＫのマルチプレックス検出の結果を示す。
【図４】図４は、磁場の適用の有りまたは無しにおけるアッセイ実行の比較を示す。詳細は、例４で見つけることができる。
【００１２】
本発明の詳細な説明
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、特定の組成物または処理工程に限定されず、それ自体変わり得るものであることが理解される。本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられるように、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈が明示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「a ligand」の言及は複数のリガンドを包含し、「an antibody」の言及は複数の抗体などを包含する。
【００１３】
定義されない限り、本明細書で用いられるすべての技術的および科学的な用語は、本発明の分野の当業者が一般に理解する同一の意味を有する。本明細書に記載するように、以下の用語は本発明の目的のために定義される。
ビーズをベースにしたアッセイは、試料中の分析物の存在を検出または測定するためのアッセイである。ここで、試料は、捕獲群または検出群を保有する少なくとも１種のビーズとともにインキュベートされる。
【００１４】
本明細書で用いられるように、そして他に記載されていない限り、「分析物」の用語は、分析の目標またはポイントとして決められた物質、化合物、または組成物を指定し、試料または標本におけるその存在、非存在、量、または濃度が検出または決定されることを意味する。それは限定されることなく、核酸などの分子化合物および関連する化合物（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチドまたはそれらのアナログ、ＰＣＲ産物、ゲノムＤＮＡ、バクテリア人工染色体、プラスミドなど）、タンパク質および関連する化合物（例えば、ポリペプチド、モノクローナル抗体、受容体、転写因子など）、抗原、リガンド、ハプテン、炭水化物および関連する化合物（例えば、ポリサッカリド、オリゴサッカリドなど）、代謝産物、細胞小器官、インタクトな細胞などを含む。
【００１５】
本明細書で用いられるように、そして他に記載されていない限り、「試料」の用語は、標的「分析物」を含む、任意の組成物または混合物を言及する。試料は、生物学的起源または他の起源であってよい。生物学的起源は、植物および動物の細胞、組織および器官などの真核生物および原核生物の起源を含む。試料は、希釈剤、緩衝剤、界面活性剤、および標的分析物と混合して見つかる混入する種、細片などを含んでいてもよい。
【００１６】
本明細書で用いられるように、そして他に記載されていない限り、「捕獲群」の用語は、試料の一部である「分析物」と特異的に相互作用することが可能な剤、または分析物と特異的に相互作用することが可能な干渉物質を指定する。分析物への高度な特異性および親和性を有する任意の剤、または干渉物質は、捕獲群として用いることができる。例えば、特異的な受容体またはリガンドは目的のために用いることができ、かかる捕獲群は、十分に本発明の範囲内にある。それは限定されることなく、核酸などの分子化合物および関連する化合物（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチドまたはそれらのアナログ、ＰＣＲ産物、ゲノムＤＮＡ、バクテリア人工染色体、プラスミドなど）、タンパク質および関連する化合物（例えば、ポリペプチド、モノクローナル抗体、受容体、転写因子など）、抗原、リガンド、ハプテン、炭水化物および関連する化合物（例えば、ポリサッカリド、オリゴサッカリドなど）、代謝産物、細胞小器官、インタクトな細胞などを含む。
【００１７】
１または２以上の捕獲群を保有するビーズは、捕獲ビーズと呼ばれる。「１または２以上の捕獲群を保有するビーズ」は、１または２以上の捕獲群がビーズに接合されていることを意味する。捕獲ビーズは、１または２以上の検出標識を保有するかもしれない、および／またはサイズがコードされているかもしれない。
【００１８】
本明細書で用いられるように、「接合された」の用語は、安定した付着を言及し、典型的には化学的相互作用によるものであり、イオン結合および／または共有結合を含む。接合のうち、手段は、ストレプトアビジンまたはアビジンのビオチンへの相互作用；疎水性相互作用；２つの極性表面間またはオリゴ／ポリエチレングリコール間の「ぬれ（wetting）」会合などの分極相互作用；アミド結合、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、または架橋剤によるものなどの共有結合の形成を意味する。
【００１９】
本明細書で用いられるように、そして他に記載されていない限り、「検出群」の用語は、試料の一部である「分析物」と特異的に相互作用することが可能な剤、または分析物と特異的に相互作用することが可能な干渉物質を指定する。分析物への高度な特異性および親和性を有する任意の剤、または干渉物質は、検出群として用いることができる。例えば、特異的な受容体またはリガンドは目的のために用いることができ、かかる検出群は、十分に本発明の範囲内にある。それは限定されることなく、核酸などの分子化合物および関連する化合物（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチドまたはそれらのアナログ、ＰＣＲ産物、ゲノムＤＮＡ、バクテリア人工染色体、プラスミドなど）、タンパク質および関連する化合物（例えば、ポリペプチド、モノクローナル抗体、受容体、転写因子など）、抗原、リガンド、ハプテン、炭水化物および関連する化合物（例えば、ポリサッカリド、オリゴサッカリドなど）、代謝産物、細胞小器官、インタクトな細胞などを含む。
【００２０】
本明細書で用いられるように、「標識」の用語は、分光分析の、蛍光分析の、光化学的、生化学的、免役化学的、酵素学的、化学的または他の物理的な手段によって、検出可能な組成物を言及する。例えば、有用な標識は、限定されることなく、発光性分子（例えば、蛍光剤、リン光剤、化学発光剤、生物発光剤など）、着色分子、反応によって色を産生する分子、酵素、磁気ビーズ、特異的に結合可能なリガンド、音響共振によって検出可能な微小気泡、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンおよびタンパク質または、例えばペプチド中へ放射性標識を取り込むことによって検出可能にさせる、または抗原に特異的に反応性のある抗体を検出するために用いられる他の実体などを含む。
【００２１】
本明細書で用いられるように、分析物と「特異的な相互作用」をすることは、例えば、ポリペプチドおよび他の生物製剤の不均一な集団における分析物の存在の決定要因である結合反応を言及する。したがって、標的に特異的な構成成分が分析物に結合する場合、それはその特定の分析物に複合体の混合物から優先的に結合する。例えば、それは少なくとも２回バックグラウンドに、一般的には１０〜１００回バックグラウンドに結合することができ、他のタンパク質または試料中の構成成分に対して重要な量では実質的には結合しない。
【００２２】
本明細書で用いられるように、そして他に記載されていない限り、１または２以上の検出群を保有するビーズは、「検出ビーズ」と呼ばれる。「１または２以上の検出群を保有するビーズ」は、１または２以上の検出群がビーズに接合されていることを意味する。
本発明によると、検出ビーズは検出可能な応答を産生する手段も含む。典型的に検出可能な応答は、１または２以上の標識によって産生される。検出可能な応答は、特異的なサイズの検出ビーズによっても産生させることができる。それは、１または２以上の標識をコードする検出ビーズを用いることの代わりに、または用いることに加えて、本発明によると、当業者はサイズがコードされたビーズも用いることができることを意味する。
【００２３】
本明細書で用いられる「検出可能な応答」の用語は、観察によって、または計測手段によって直接的または間接的に検出可能なシグナルの出現または変化を言及する。
典型的には、検出可能な応答は、例えば、シグナルの出現であって、フルオロフォアが本質的に蛍光性であり、金属イオンまたは生物学的化合物に結合した際にシグナルの変化を生じない。代替的に、検出可能な応答は、波長分布パターンあるいは吸光度または蛍光の強度における変化、または光散乱、蛍光寿命、蛍光偏光、または上記パラメーターの組み合わせにおける変化を結果として生ずる、光学的応答である。他の検出可能な応答は、例えば、ビーズサイズ、化学発光、リン光、放射性同位体からの放射線、磁力、インピーダンスおよび電子密度が含まれる。
【００２４】
本発明は、１種の磁気ビーズだけではなく、２つの異なる種の磁気ビーズを用いることによるビーズをベースにしたアッセイにおいて、１または２以上の分析物を検出する方法に関する。
【００２５】
この原理は、以下のような多くの異なるアッセイ形式に適用され得る。
−  イムノアッセイ、例えば、サンドイッチイムノアッセイ
−  タンパク質−タンパク質相互作用をベースにしたアッセイ
−  キナーゼアッセイのような酵素反応をベースにしたアッセイ
−  ＤＮＡ−ＤＮＡ相互作用、ＤＮＡ−ＲＮＡ相互作用、ＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用のような核酸間の相互作用をベースにしたアッセイ
−  ＤＮＡ−タンパク質相互作用をベースにしたアッセイ
−  ペプチド−タンパク質相互作用またはペプチド−ペプチド相互作用をベースにしたアッセイ
−  グリカン−タンパク質相互作用をベースにしたアッセイ
−  代謝産物−タンパク質相互作用をベースにしたアッセイ
−  代謝産物−ＤＮＡ相互作用をベースにしたアッセイ
−  代謝産物−ＲＮＡ相互作用をベースにしたアッセイ
【００２６】
すべての場合において、分析物は定性的または定量的に、好ましくは定量的に、捕獲ビーズおよび検出ビーズを用いて検出または測定され、これらはともに直接的または干渉物質を介して間接的に、分析物の異なる部分または異なるエピトープではなく、分析物に結合可能である。
分析されるタンパク質（分析物）が、最小で２つの異なるタンパク質からなるタンパク質複合体の部分である場合には、分析されるタンパク質複合体のタンパク質の１つは、捕獲ビーズに固定化された対応する捕獲群（例えば、抗体）によって捕えられる。タンパク質（分析物）の検出は、同一のまたはタンパク質複合体の他のタンパク質の１つに対して向けられた検出群を保有する、検出ビーズとのインキュベーションを介して行われてもよい。
【００２７】
マイクロタイタープレートのように、典型的には捕獲群が固形支持体上に固定化された平面的アッセイに対して、本発明による方法は、アッセイのすべての構成成分が液体中で可溶または懸濁のいずれかである、懸濁アッセイに関する。これは、平面的アッセイに対して、全く異なる結合動力学を結果として生じる。本発明の方法を用いることによって、磁気ビーズを用いない、または１種の磁気ビーズのみを用いる既知の懸濁アッセイと比較して少なくとも２／３の時間に、好ましくは、磁気ビーズを用いない、または１種の磁気ビーズのみを用いる既知の懸濁アッセイと比較して１／２に、懸濁アッセイの作業時間を著しく減少し得ることがわかった。
【００２８】
本発明の方法によると、インキュベーション時間の少なくとも一部で磁場を適用しながら、試料は検出ビーズおよび捕獲ビーズとともにインキュベートされる。
インキュベーションは、同時に捕獲ビーズおよび検出ビーズの両方と実行することができる。
【００２９】
一態様において、試料は最初に、検出ビーズまたは捕獲ビーズのいずれか、好ましくは検出ビーズを意味する１種のビーズとともに、磁場の適用なしにインキュベートされる。この最初のインキュベーションは、分析物が第１種のビーズと相互作用および結合することを可能とし、続く記載において、検出ビーズは第１種のビーズとして選択される。
【００３０】
その後、分析物に結合した検出ビーズは、例えば、ろ過または好ましくは磁場の適用によって、混合物から除去される。ビーズは、未結合の試料構成成分を除去するために、任意に洗浄することができる。検出ビーズは、その後捕獲ビーズとともにインキュベーションされる。ここで、インキュベーション時間の少なくとも一部で磁場が適用される。磁場を適用し、したがって２種の磁気ビーズの間に空間的近接を作り出すことは、相互作用を作り出すのに必要な時間を速め、結果的に分析物と捕獲ビーズとの結合を速める。
【００３１】
試料を捕獲ビーズおよび検出ビーズと同時にインキュベートすることが可能であり、相互作用を作り出すのに必要な時間を速め、結果的に分析物と２種のビーズとの結合を速めることもわかった。
捕獲ビーズおよび／または検出ビーズおよび／または分析物と結合した捕獲ビーズおよび／または分析物と結合した検出ビーズおよび／または捕獲ビーズおよび検出ビーズと結合した分析物を含むビーズ混合物は、インキュベーション混合物から、例えばろ過または好ましくは磁場の適用によって、除去することができる。
【００３２】
ビーズ混合物は、１回または複数回、１つのまたは異なる緩衝液で任意に洗浄することができる。本発明において使用に適切な洗浄緩衝液は、例えば、トリスをベースにした緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ＭＥＳ、ＭＯＰＳまたはＨＥＰＥＳ、好ましくはトリスをベースにした、リン酸緩衝液を含む水溶液である。洗浄緩衝液は、ＮａＣｌ、ＫＣｌなどの塩を含んでもよく、ＮａＣｌが好ましい。洗浄緩衝液のｐＨは、典型的にはｐＨ６とｐＨ８との間であり、ｐＨ７．２と７．５との間が好ましい。洗浄緩衝液は、例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１００またはＢｒｉｊの界面活性剤のような添加剤を、（重量で）０．０１〜１％、好ましくは０．０１〜０．１％の範囲の濃度において含んでもよく、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０が好ましい。緩衝液は、磁気ビーズを破壊しない濃度においてエタノールまたはＤＭＳＯのような溶媒を含んでもよい。
【００３３】
検出ビーズが検出可能なシグナルまたは応答を直接的に与えない場合、次にビーズ混合物は、検出可能な応答を誘発する試薬とともにインキュベートされる。
その後ビーズ混合物は、分析物の存在を検出および／または測定するために分析される。読み出しは、フローサイトメトリーによって、顕微鏡において、酵素学的にＥＬＩＳＡリーダーにおいて、またはインピーダンスによって典型的には行われ、好ましくはフローサイトメトリーによって行われる。
【００３４】
好ましい態様において、それぞれ捕獲ビーズおよび検出ビーズに結合した捕獲群および検出群は、分析物の異なるエピトープに結合する２つの異なる種の抗体である。好ましい態様において、捕獲ビーズは興味のある分析物、すなわち試料中で検出される分析物に特異的に結合する抗体を含む。他の有用な捕獲群は、興味のある分析物が親和性を有する、すなわちそれが結合する分子である。好ましい態様において、検出ビーズは、興味のある分析物に特異的に結合する抗体を含む。捕獲群として有用である、本明細書において同定される抗体が、検出群として有用であることも理解され、逆もまた同様である。検出抗体および捕獲抗体は、捕獲抗体の結合が、検出抗体の結合に干渉されない方法で選択される必要がある。
【００３５】
結果的に、好ましくは、本発明は捕獲ビーズの捕獲群と同一の分析物に結合する検出群を含む検出ビーズを提供することによって、分析物の非オーバーラップエピトープではあるが、捕獲群および検出群の両方が同一の分析物に結合することを可能とする。
抗体が好ましい検出群および捕獲群であることから、結果的に、一側面において、本発明は試料中の分析物を検出する方法を提供し、その方法は以下の工程を含む。
−  試料を分析物に特異的に結合する一次抗体を保有する検出ビーズに接触させることによって、一次抗体／分析物複合体を形成すること
−  一次抗体／分析物複合体を、分析物に特異的に結合する二次抗体を保有する捕獲ビーズに接触させること、ここで、インキュベーション時間の少なくとも一部で磁場が適用されることによって、一次抗体／分析物／二次抗体複合体を形成すること
−  検出ビーズによって直接的または間接的に産生される検出シグナルを検出することによって、試料中の分析物を検出すること
【００３６】
検出ビーズは、多様な標識を含んでいてもよい。好ましくは、ビーズおよび／または捕獲群は、１または２以上の検出可能な標識を保有する。好ましい標識は、蛍光色素である。好ましくは、検出ビーズの検出群は、蛍光色素で標識化された抗体である。いくつかの態様において、蛍光色素はフィコエリトリンである。
捕獲ビーズは、好ましくは、磁気および蛍光ビーズである。いくつかの態様において、捕獲ビーズは、強磁性ビーズである。いくつかの態様において、捕獲ビーズは、１または２以上の異なる蛍光標識を有する強磁性蛍光ビーズである。いくつかの態様において、捕獲ビーズは磁気Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ビーズである。
【００３７】
典型的には、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ビーズを用いる場合、各ビーズセットは、特定の分析物特異的な試薬でコーティングされ、試料からの特異的な分析物の捕獲および検出を可能とする。Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）コンパクトアナライザー内で、レーザーは各ビーズを同定する内部色素、およびアッセイ中に捕獲される任意のレポーター色素を励起する。各ビーズのセット上で多くの読み出しがなされ、さらに結果が検証される。このようにして、ｘＭＡＰ（登録商標）技術は、迅速かつ正確に、単一の試料内で最大で１００のユニークなアッセイのマルチプレックス化を可能とする。
【００３８】
検出
いくつかの態様において、本発明は、分析物の、例えば試料中の抗原の高感度の検出および定量のための標識を含む方法および組成物を提供する。本発明のいくつかの態様において、検出群または検出ビーズは標識を含む。本発明のいくつかの態様において、検出ビーズは検出シグナルを産生する。本発明のいくつかの態様において、検出群は標識を含む抗体である。本発明のいくつかの態様において、検出群は検出シグナルを産生する抗体である。
【００３９】
二次抗体などの本発明のシグナル産生検出群は、それ自体が検出可能である化合物または「標識」を含むか、もしくは検出可能な産物または検出可能なシグナルを産生するために１または２以上の追加の化合物と反応してもよい。シグナル産生化合物の例は、色素原、放射性同位元素、化学発光化合物（例えば、アクリジニウム）、粒子（可視または蛍光）、核酸、錯化剤、または酵素などの触媒（例えば、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼおよびリボヌクレアーゼ）を含む。
【００４０】
（１）蛍光成分
好ましい標識は、蛍光成分であり、蛍光色素とも言及される。
いくつかの態様において、蛍光成分は検出ビーズまたは検出群に付着する。本発明の組成物および方法は、高度な蛍光成分を利用してもよく、ここで、蛍光成分は、その成分の励起波長においてレーザーを放射する光によって刺激された場合、光子を放出することが可能である。
【００４１】
いくつかの態様において、蛍光成分は少なくとも平均で１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の蛍光実体、例えば蛍光分子を含む。いくつかの態様において、成分は複数の蛍光実体、例えば、約２〜４、２〜５、２〜６、２〜７、２〜８、２〜９、２〜１０、または３〜５、３〜６、３〜７、３〜８、３〜９、または３〜１０の蛍光実体を含む。
【００４２】
いくつかの態様において、成分は１つの蛍光実体を含む。
蛍光成分によって産生される蛍光は、分析物の存在、非存在または濃度に依存する。適切な蛍光成分の例は、ローダミン１１０、ロードル（rhodol）、クマリンまたはフルオレセイン化合物を含む。
【００４３】
本発明のいくつかの態様において、蛍光実体は蛍光色素分子である。蛍光成分として使用される有用な蛍光色素の非包括的なリストを以下に示す：ビマン（Bimane）、ダポキシル（Dapoxyl）、ジメチルアミノクマリン−４−酢酸、マリーナブルー（Marina blue）、８−アニリノナフタレン−１−スルホン酸、カスケードブルー（Cascade blue）、 Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、カスケードブルー、カスケードイエロー（Cascade yellow）、パシフィックブルー（Pacific blue）、ＰｙＭＰＯ、Ａｌｅｘａ  ４３０、Ａｔｔｏ−４２５、ＮＢＤ、Ａｌｅｘａ  ４８８、フルオレセイン（Fluorescein）、オレゴングリーン４８８（Oregon Green 488）、  Ａｔｔｏ  ４９５、Ｃｙ２、ＤＹ−４８０−ＸＬ、ＤＹ−４８５−ＸＬ、ＤＹ−４９０−ＸＬ、ＤＹ−５００−ＸＬ、ＤＹ−５２０−ＸＬ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、６−ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、ローダミン６Ｇ（Rhodamine 6G）、Ａｔｔｏ−５２０、Ｃｙ３Ｂ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ、Ｂ−フィコエリトリン（B-phycoerythrin）、Ｒ−フィコエリトリン（R-phycoerythrin）、アロフィコシアニン（Allophycocyanin）、 ＰＢＸＬ−Ｉ、ＰＢＸＬ−３、Ａｔｔｏ  ４２５、Ａｔｔｏ  ４９５、Ａｔｔｏ  ５２０、Ａｔｔｏ  ５６０、Ａｔｔｏ  ５９０、Ａｔｔｏ  ６１０、Ａｔｔｏ  ６５５、Ａｔｔｏ  ６８０、ＤＹ−４９５／５、ＤＹ−４９５／６、ＤＹ−４９５Ｘ／５、ＤＹ−４９５Ｘ／６、ＤＹ−  ５０５／５、ＤＹ−５０５／６、ＤＹ−５０５Ｘ／５、ＤＹ−５０５Ｘ／６、ＤＹ−５５０、ＤＹ−５５５、ＤＹ−６１０、ＤＹ−６１５、ＤＹ−６３０、ＤＹ−６３１、ＤＹ−６３３、ＤＹ−６３５、ＤＹ−６３６、ＤＹ−６５０、ＤＹ−６５１、ＤＹＱ−６６０、ＤＹＱ−６６１、ＤＹ−６７５、ＤＹ−６７６、ＤＹ−６８０、ＤＹ−６８１、ＤＹ−７００、ＤＹ−７０１、ＤＹ−７３０、ＤＹ−７３１、ＤＹ−７５０、ＤＹ−７５１、ＤＹ−７７６、ＤＹ−７８０−ＯＨ、ＤＹ−７８０−Ｐ、ＤＹ−７８１、ＤＹ−７８２、ＥＶＯｂｌｕｅ−１０、およびＥＶＯｂｌｕｅ−３０。
【００４４】
これら個別の色素の１つ、またはそれらの組み合わせのどちらかが、蛍光成分として使用されてもよい。これら色素の詳細な特性評価は、US2006/0078998およびUS2008/0064113において見つけることができ、それらの全体を参照して本明細書に組み込まれる。
【００４５】
いくつかの態様において、蛍光実体は、第一の種および第二の種の色素分子を含み、例えば、第一の種および第二の種の色素分子が、異なる発光スペクトルを有する。第二の種に対する第一の種の色素分子数の比は、例えば、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３または１：４であってもよい。結合パートナーは、例えば、ポリペプチドであってもよい。
好ましい蛍光色素は、Ｒ−フィコエリトリンである。
【００４６】
本発明のいくつかの態様において、蛍光実体は量子ドットである。したがって、いくつかの態様において、試料中の分析物を検出するために用いる蛍光標識成分は、量子ドットである。半導体ナノ結晶または人工原子としても知られる量子ドット（ＱＤ）は、１００〜１０００の範囲の電子を含み、２〜１０ｎｍまでの範囲の半導体結晶である。いくつかのＱＤは、直径で１０〜２０ｎｍの間となり得る。ＱＤは、高量子収率を有するため、光学的応用に特に有用である。
【００４７】
ＱＤはフルオロフォアであり、伝統的なフルオロフォアの励起状態であるが、最大で２００ナノセカンドの非常に長い寿命を有すると考えられる励起子を形成することによって蛍光を発する。
この特徴は、ＱＤに低い光退色を提供する。ＱＤのエネルギーレベルは、ＱＤのサイズおよび形状、ならびにＱＤのポテンシャルの深さを変化させることによって、調節することができる。
【００４８】
ＱＤは、マレイミドエステルカップリング反応を通じて直接ストレプトアビジンに、またはマレイミド−チオールカップリング反応を通じて抗体にカップリングさせることができる。これは、表面に共有結合で付着した生体分子を伴う材料を産出し、高度に特異的活性のある接合体を生み出す。いくつかの態様において、検出されるタンパク質は１の量子ドットで標識化される。いくつかの態様において、量子ドットは直径が１０〜２０ｎｍの間である。他の態様において、量子ドットは直径が２〜１０ｎｍの間である。
【００４９】
当業者は、多くの戦略および多様な適切な手段が、蛍光成分、または蛍光成分を作り上げる蛍光実体の、検出群または検出ビーズへの付着に用いることができることを認識するであろう。標識は、標識と標的との非特異的または特異的な相互作用を利用する方法を含む、既知の手段によって付着してもよい。標識は、検出群および／または検出ビーズへ付着するかもしれない。好ましくは、それは検出ビーズに付着する。
標識化は、直接的に、または結合パートナーを通じて達成することができる。
【００５０】
ビーズ
本発明における使用のためのビーズは、幅広く変化する。ビーズは、多孔性または非多孔性であり得る。それは対照的な形状または不規則な形状であり得る。ビーズは、セラミック、ガラス、金属酸化物のような他の無機材料、金属、有機ポリマー材料、またはそれらの組み合わせを含む、多様な材料から作ることができる。
【００５１】
本発明において、捕獲ビーズまたは検出ビーズとして用いられるビーズは、磁気ビーズである。好ましい磁気ビーズは、常磁性、超常磁性、フェリ磁性または強磁性のビーズである。磁気ビーズは、典型的には磁気イオン酸化物、磁赤鉄鉱、磁鉄鉱、またはマンガン亜鉛フェライトなどの磁気酸化物粒子を含む。磁気材料は、磁鉄鉱（混合酸化物）、赤鉄鉱（酸化鉄）、亜クロム酸塩（鉄およびクロムの塩）などの常磁性特性を有する鉱物酸化物の微細粒子、および永久磁石または電磁石によって引き付けられる他のすべての材料で構成されてもよい。
【００５２】
四酸化三鉄（Ｆｅ３Ｏ４）、γ−三二酸化物（γ−Ｆｅ２Ｏ３）、ＭｎＦｎ−フェライト、ＮｉＺｎ−フェライト、ＹＦｅ−ガーネット、ＧａＦｅ−ガーネット、Ｂａ−フェライト、およびＳｒ−フェライトなどのフェライト；鉄、マンガン、コバルト、ニッケル、およびクロムなどの金属；鉄、マンガン、コバルト、ニッケルなどの合金も、それに限定されることなく、使用することができる。その入手可能性および低費用のため、好ましい材料は磁鉄鉱である。異なるサイズの粒子として、または水性の安定化した懸濁液として供給される。
【００５３】
本発明による磁気ビーズは、典型的には、少なくとも１のコーティング、例えば、シリカコーティング、Ａｌ２Ｏ３、二酸化チタン、二酸化ジルコニウムのような１または２以上の他の金属酸化物でのコーティング、または有機ポリマーコーティング、例えば、ポリスチロール、ポリメタクリレート、ポリビニルアルコール、ポリシロキサンで作られたコーティング、またはデキストランもしくはキトサンのような天然材料で作られたコーティングによって部分的にまたは全体的に覆われている磁気コアを有する。検出または捕獲の群または標識のカップリングのため、ビーズは反応基、荷電群または他の官能基で修飾することができる。
【００５４】
セラミックス、グラス、金属酸化物のような他の無機材料、金属、有機ポリマー材料を含む非磁気材料、またはそれらの組み合わせで作られ、１または２以上の磁気粒子が組み込まれている磁気ビーズを用いることも可能である。
【００５５】
好ましくは、捕獲ビーズは、磁気ポリスチレンビーズである。捕獲ビーズの直径は、典型的には０．５μｍ〜５０μｍであり、好ましくは１〜１０μｍである。
好ましくは、捕獲ビーズはＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ビーズであり、例えば、直径が６．５μｍのポリスチレンベースの磁気ビーズである。この技術は、さらに米国特許第6,268,222号に記載され、それらの全体を参照して本明細書に組み込まれる。
【００５６】
検出ビーズおよび捕獲ビーズは、同一または異なる直径を有していてもよい。それらは、同一または異なる材料も含んでよい。
典型的には、捕獲ビーズは、検出ビーズより大きな直径を有する。
典型的には、検出ビーズは、１ｎｍ〜１μｍの直径を有する。好ましくは、検出ビーズは２０〜５０ｎｍ、最も好ましくは、約２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５ｎｍの直径を有する。
【００５７】
好ましくは、検出ビーズは２以上の標識を保有する。標識および検出群は、例えば、−ＣＯＯＨのような反応基、アミン、エポキシまたは活性化エステル官能基を通して、またはアビジン／ビオチン結合系のような結合系を通して、ビーズへ付着または接合させることができる。標識は、検出ビーズの検出群へ付着させることもできる。
典型的には、検出ビーズは、１または２以上の検出群および２以上の標識を保有する。
典型的には、本発明によるアッセイに使用される検出ビーズの量は、捕獲ビーズの量よりも大きい。
【００５８】
アッセイの実行
本発明の方法を実行するために、試料溶液、すなわち分析される試料を含む溶液を提供する必要がある。典型的には、試料溶液は水性溶液である。それは、トリスベースの緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳのような緩衝液も含み、好ましくはトリスベースの緩衝液である。試料溶液は、ＮａＣｌ、ＫＣｌなどの塩も含み、好ましくはＮａＣｌである。試料溶液のｐＨは、典型的にはｐＨ６〜ｐＨ８であり、好ましくはｐＨ７．２〜７．５である。試料溶液は、界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１００またはＢｒｉｊのような添加物も含んでよく、好ましくはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０であり、０．０１〜１％（重量当たり）の濃度であり、好ましくは０．０１〜０．１％である。試料溶液は、タンパク質、例えば、ゼラチン、ＢＳＡのような添加物を０．０１〜２％（重量当たり）の濃度で含んでもよく、好ましくは０．１〜１．５％である。試料溶液は、エタノール、ＤＭＳＯのような溶液を、磁気ビーズを破壊しない濃度で含んでもよい。
【００５９】
追加のアッセイ構成成分は、捕獲群を保有する磁気捕獲ビーズおよび検出群を保有する磁気検出ビーズである。
試料溶液は、その後捕獲ビーズおよび検出ビーズとともにインキュベートされ、ここで、少なくともインキュベーション時間の一部の間に、磁場が適用される。
【００６０】
好ましくは、両種のビーズは、試料溶液へ同時に加えられる。しかしながら、連続的なインキュベーションを実行することも可能である。それは、捕獲ビーズまたは検出ビーズのいずれかの１種のビーズが、試料溶液とプレインキュベートされることを意味する。プレインキュベーション後、第二の種のビーズが加えられる。
【００６１】
両ビーズが同時に加えられる場合、２種のビーズの試料溶液とのインキュベーションは、典型的には約５分〜１時間かかり、好ましくは約５分〜１５分である。ここで、少なくともインキュベーション時間の一部の間に、磁場が適用される。２種のビーズが溶液とともにインキュベートされた場合、磁場は全時間の間に適用され得る。好ましくは、磁場はインキュベーション時間の一部の間のみに適用される。最も好ましくは、磁場は連続的にまたは周期的に適用される。それは、磁場が２〜１０回、好ましくは３〜５回、インキュベーションの間に適用されることを意味する。磁場を止めている時間の間、必要に応じて試料を混合または振盪することができる。
【００６２】
連続的インキュベーションを実行する場合、試料溶液の第一の種のビーズとのプレインキュベーションは、典型的には約１０分〜２時間かかる。プレインキュベーションは、試料溶液およびビーズを、例えば振盪によって徹底的に混合することによって補助することができる。
【００６３】
好ましい態様において、１種のビーズとのプレインキュベーション後、これらビーズは、例えばろ過によって、または磁場の適用によって、試料溶液から単離される。試料溶液によっては、必要に応じて、ビーズから試料中の非結合残留物を除去するため、ビーズは１または複数の洗浄緩衝液で、１または複数の回数洗浄することができる。
その後、単離したビーズは、新たなインキュベーション溶液中で第二の種のビーズとともにインキュベートされる。インキュベーション溶液は、典型的には水性溶液であり、試料溶液として同一の構成成分（緩衝液、塩など）を含んでもよい。
【００６４】
２種のビーズの第二のインキュベーションは、典型的には約５分〜１時間かかり、好ましくは約５分〜１５分である。ここで、少なくともインキュベーション時間の一部の間に、磁場が適用される。好ましくは、２種のビーズがともにインキュベートされる場合に、磁場は全時間の間に適用される。
１のアッセイにおいて２種の磁気ビーズを用いることによって、および２種のビーズがともにインキュベートされるときに少なくともその時間の一部の間に磁場を適用することによって、インキュベーション時間を著しく減少し得ることがわかった。
【００６５】
磁場の適用は、例えば、溶液中のすべての磁気ビーズを、インキュベーションが行われる片面または容器の底部へ移動させる外部の磁場を適用することによって、実現することができる。磁気棒のような磁気装置、例えば磁気ビーズハンドラーを、すべての磁気ビーズがその装置で収集されるように、インキュベーション溶液中へ沈めることによっても行うことができる。適切な装置は、例えばkingfisher（登録商標）（Thermo Fisher Scientific）である。
すべてのインキュベーション工程は、典型的には室温で実行される。
【００６６】
試料溶液をより小さな種のビーズ、すなわち典型的には検出ビーズとともに最初にインキュベートする場合には、連続的インキュベーションで実行するときにプレインキュベーション工程のインキュベーション時間を減少し得ることがさらにわかった。
結果として、連続的インキュベーションの好ましい態様において、最初の工程において、分析物が検出ビーズへ結合するように、試料溶液は検出ビーズとともにインキュベートされる。分析物に結合した検出ビーズを混合物から除去した後に、それらは捕獲ビーズとともにインキュベートされる。ここで、少なくともインキュベーション時間の一部の間に、磁場が適用される。
【００６７】
ビーズベースのアッセイの当業者は、試料溶液またはインキュベーション溶液に加える捕獲ビーズおよび検出ビーズの適切な量を容易に決定することができる。
試料中に存在するすべての分析物が、捕獲ビーズに結合できることを確認するように、捕獲ビーズは過度に加えられる必要がある。
【００６８】
磁気検出ビーズの理想的な濃度は、実験的に決定しなければならない。濃度は、ビーズに固定化された検出群の特性、例えば親和性に依存する。ビーズの数／量は、その目的のために用量設定される必要がある。一般的に、最適なシグナル・ノイズ比に達する場合にビーズの最適濃度が決定される。磁気検出ビーズの適用のための典型的な濃度は、１．２５μｇビーズ／ｍｌアッセイ量である。
インキュベーション後、ビーズは１または複数の洗浄緩衝液で、１または複数の回数任意に洗浄することができるが、典型的には洗浄工程は必要ではない。
【００６９】
本発明の一態様において、本発明の方法は、マルチプレックスアッセイの形式で実行される。それは、本方法が１つだけではなく、２以上の、典型的には２と５００との間であり、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の異なる分析物の検出に関する。アッセイは、１の分析物の検出のために以前に記載された同じ方法で実行され、違いは使用されるビーズの種類である。
使用される検出ビーズが、検出されるすべての分析物に結合可能である検出群を保有する場合、１種の検出ビーズを用いることで十分である。それでもなお、２種以上の検出ビーズを用いることも可能である。ここで、異なる種の検出ビーズは、異なる分析物に結合可能な異なる検出群を保有する。検出ビーズの標識は、同一または異なってもよい。好ましくは、すべての検出ビーズは１つのアッセイにおいて、単一のまたはマルチプレックスのアッセイのいずれかで、同一の標識を保有する。
【００７０】
マルチプレックスアッセイの形式において、異なる種の捕獲ビーズが使用される。典型的には、各種の捕獲ビーズは、１種の分析物が１種の捕獲ビーズと結合し、別の種の分析物が別の種の捕獲ビーズと結合するインキュベーションを実行させるように、１種の分析物に結合することができる。前述のとおり、異なる分析物に結合した検出ビーズは、同一または異なってもよい。
最終工程において、少なくとも１種の捕獲ビーズおよび少なくとも１種の検出ビーズに結合した分析物の存在が、検出される。
【００７１】
好ましくは、検出は定量的に行われる。
検出は、非結合ビーズと、少なくとも１の捕獲ビーズおよび少なくとも１の検出ビーズに結合した分析物とを区別可能な任意の検出器において実行することができる。検出器の種は、検出されるべき標識の種に依存する。特にマルチプレックスアッセイの形式のため、異なる分析物への親和性を有する異なる捕獲ビーズを区別することができるように、検出ビーズだけではなく、捕獲ビーズも標識される。
【００７２】
好ましい態様において、検出はＬｕｍｉｎｅｘ ｘＭＡＰ（登録商標）技術に適切な検出器において行われる。それは、この検出器が２つの異なる蛍光色素で標識された捕獲ビーズ、および第三の蛍光色素、例えばフィコエリトリンで標識された検出ビーズを検出可能であることを意味する。検出ビーズの蛍光は、分析物の捕獲ビーズおよび検出ビーズへの結合の指標である。
非常に好ましい態様において、検出はフローサイトメトリーによって行われる。
【００７３】
本発明はまた、捕獲群を保有する磁気捕獲ビーズおよび検出群を保有する磁気検出ビーズを含むセットを少なくとも含むキットに関する。ここで、捕獲群および検出群は、同一の分析物に直接的または間接的に結合可能である。キットはまた、標準、溶解緩衝液または内部コントロールのための試薬のような追加の構成成分を含んでもよい。
一態様において、キットは捕獲群を保有する磁気捕獲ビーズおよび検出群を保有する磁気検出ビーズを含む、２以上のセットを含む。ここで、異なるセットの捕獲群および検出群は、異なる分析物に結合する。このキットは、マルチプレックスアッセイの実行に適切である。
【００７４】
本発明によるキットおよび方法は、操作が容易な、自動化することができる、およびマルチプレックスの形式において実行することができるアッセイ形式における分析物検出の可能性を提供する。分析物の感受性は、捕獲ビーズのみが磁気ビーズである既知のアッセイ形式と少なくとも同等である。
上記および下記に引用されるすべての出願、特許、および公報、ならびに２０１０年７月２３日に提出した欧州出願EP10007645.4は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００７５】
例
１）連続的インキュベーションのための作業手順
分析物特異的抗体でコーティングされる検出ビーズ、例えば磁気および蛍光ナノビーズ（nanoBeads）（２５ｎｍ）は、試料溶液とともに典型的には＜１時間でインキュベートされる。その後検出ビーズは、例えば磁気ビーズハンドラーで収集され、分析物特異的な抗体でコーティングされた磁気捕獲ビーズ（６．５μｍ）とともに第二の溶液へ移される。（検出ビーズにすでに結合している）分析物の捕獲ビーズへの結合は、磁気的に補助され、１０分未満で行われる。後に検出／読み出しを、例えばフローサイトメトリーによって実行することができる。
【００７６】
２）Ｈｅｒ２の検出
Ｈｅｒ２は、２５ｎｍの直径を有し、抗Ｈｅｒ２抗体でコーティングされた、１２．５ｎｇの磁気および蛍光磁気ビーズとともに異なる濃度（１００００、２５００、６２５、１５６、３９、１０および２．４ｐｇ／ｍＬ）で１時間インキュベートされる。その後ビーズは、６．５μｍの直径を有し、別の抗Ｈｅｒ２抗体でコーティングされた、１０００の磁気Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ビーズへ移され、１０分間インキュベートされる。
最後に、結合したＨｅｒ２は、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）リーダーにおいて定量化される。
図２は、Ｈｅｒ２検出の曲線を示す。
【００７７】
３）５ＲＴＫ（受容体チロシンキナーゼ）のマルチプレックス検出
ＲＴＫは、１２．５ｎｇの磁気および蛍光ナノビーズ（各ＲＴＫに対する抗体を有する５つの異なる集団）とともに異なる濃度で１時間インキュベートした。その後ナノビーズは、別の抗ＲＴＫ特異的抗体でコーティングされ、色素で色分けされたＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ビーズへ移され（５つの集団および各集団の１０００のビーズも）、１０分間インキュベートされる。最終的に、結合したＲＴＫは、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）リーダーで定量化される。
【００７８】
本検出結果は、次の表および図３に見つけることができる。
【表１】
2013534304.tif 000003
【００７９】
４）磁気ナノビーズ／マイクロビーズアッセイにおける磁力の影響
Ｈｅｒ２は、２５ｎｍの直径を有し、抗Ｈｅｒ２抗体でコーティングされた、１２．５ｎｇの磁気および蛍光磁気ビーズおよび６．５μｍの直径を有し、別の抗Ｈｅｒ２抗体でコーティングされた、磁気Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ビーズとともに、異なる濃度（２０００、１０００、５００、２５０、１２５、６２および３１ｐｇ／ｍＬ）で２０分間インキュベートされる。インキュベーションの間、ビーズは磁力によって緊密に接触する。同一のアッセイもまた、磁力なしで実行される。アッセイにおいて磁力が適用されない場合、低シグナルが得られるか、またはシグナルが得られない。そのため、増加したアッセイ速度は、明らかに磁力に帰する。本実験の結果を、図４に示す。
【図１】
2013534304.tif 000004
【図２】
2013534304.tif 000005
【図３】
2013534304.tif 000006
【図４】
2013534304.tif 000007
【国際調査報告】
2013534304.tif 000008
2013534304.tif 000009