(57)【要約】  エリスロポエチン（ＥＰＯ）、特に高純度形態の所定の組成のグリコフォームを有する、すなわち、多量のＯ−グリコシル化ＥＰＯアイソフォームを有する、組換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）の製造法を提供する。
2013505276.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコシル化エリスロポエチン（ＥＰＯ）アイソフォームを複雑なタンパク質混合物から精製する方法であって、逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーステップにより隔てられたアニオン交換クロマトグラフィーステップおよびカチオン交換クロマトグラフィーステップを含む、方法。
【請求項２】
以下のステップ：
（ａ）捕捉ステップとしてのアフィニティークロマトグラフィーステップ；
（ｂ）アニオン交換クロマトグラフィーステップ；
（ｃ）逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーステップ；
（ｄ）カチオン交換クロマトグラフィーステップ
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
以下のステップ：
（ｅ）サイズ排除クロマトグラフィーステップ
をさらに含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
１以上のクロマトグラフィーステップにおけるＥＰＯの溶出を段階または勾配溶出により実施する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
アニオン交換クロマトグラフィーステップを、ジエチルアミノエチル基（ＤＥＡＥ）、第４級アミノエチル基（ＱＡＥ）、第４級アンモニウム基（Ｑ）、ジメチルアミノエチル基（ＤＭＡＥ）および／またはトリメチルアミノエチル基（ＴＭＡＥ）を官能基として含むアニオン交換樹脂または膜を用いて実施する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
アニオン交換クロマトグラフィーステップを、市販のＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて実施する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーステップが逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＲＰ−ＨＰＬＣを、メチル基、ブチル基、フェニル基、プロピル基および／またはオクチル基を官能基として含む樹脂を用いて実施する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ＲＰ−ＨＰＬＣを、市販のＣ４逆相クロマトグラフィー材料を用いて実施する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
カチオン交換クロマトグラフィーステップを、スルホプロピルカチオン交換材料を含む樹脂を用いて実施する、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
カチオン交換クロマトグラフィーステップを、市販のＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｓを用いて実施する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
アフィニティークロマトグラフィーステップを、色素クロマトグラフィー樹脂を用いて実施する請求項２から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
アフィニティークロマトグラフィーステップを、市販のＢｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて実施する、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
サイズ排除クロマトグラフィーステップを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、およびＢｉｏ−Ｇｅｌの群から選択されるゲルろ過媒体を用いて実施する、請求項３から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
サイズ排除クロマトグラフィーステップを、市販のＳｕｐｅｒｄｅｘ−Ｓ２００を用いて実施する、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
アニオン交換クロマトグラフィーを使用して、ＥＰＯアイソフォームを選択する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
約７．０のｐＨの２０ｍＭのトリス−ＨＣｌを含む緩衝液中、０〜２００ｍＭのＮａＣｌの線形塩勾配を使用する、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
逆相クロマトグラフィーステップを使用して、Ｏ−グリコシル化ＥＰＯを選択する、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＥＰＯを有機溶媒の直線勾配で溶出する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
０〜７０％の水中アセトニトリルの直線勾配を使用し、溶媒が約０．１％のＴＦＡを含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
アセトニトリルおよび約０．１％の水中ＴＦＡを含む溶媒でのＥＰＯのアイソクラティック溶出を使用する、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
１以上のクロマトグラフィーステップの前に、限外ろ過ステップ、および場合によって最終ステップとしてナノろ過ステップを含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
以下のステップ
（ａ）捕捉ステップとしてのアフィニティークロマトグラフィーステップ；
（ｂ）アニオン交換クロマトグラフィーステップ；
（ｃ）逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーステップ；
（ｄ）カチオン交換クロマトグラフィーステップ；
（ｅ）サイズ排除クロマトグラフィーステップ；
（ｆ）ナノろ過ステップ；ならびに
（ｇ）ステップ（ａ）、（ｂ）および／または（ｅ）の前の限外ろ過ステップ
を含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ＥＰＯがヒト組換えＥＰＯである、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ＥＰＯが、ＣＨＯ細胞で産生されるヒト組換えＥＰＯである、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１から２５のいずれかの方法により精製されるグリコシル化ＥＰＯアイソフォームの調製物。
【請求項２７】
ＥＰＯがヒト組換えＥＰＯである、請求項２６記載の調製物。
【請求項２８】
非Ｏ−グリコシル化ＥＰＯアイソフォームを実質的に含まない、請求項２６または２７記載の調製物。
【請求項２９】
請求項２７から２９のいずれか一項に記載のＥＰＯ調製物を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、特に、高純度形態のグリコフォームの所定の組成、すなわち多量のＯ−グリコシル化ＥＰＯアイソフォームを有する組換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）を製造するための手順に関する。これは、クロマトグラフィーステップの特定の組み合わせを用いることによって達成される。
【背景技術】
【０００２】
エリスロポエチンは、赤血球前駆細胞の増殖および分化ならびに循環する赤血球の生理学的レベルの維持を調節する主なホルモンである。胎児では、ＥＰＯは主に肝臓で産生され、その産生の約９０％は出生後に腎臓に切り替わる。ＥＰＯレベルが慢性または急性腎不全のために低下する場合は、ＥＰＯを外部から投与して増大する貧血を防止しなければならない。治療活性なヒトエリスロポエチンは、ＥＰＯ遺伝子およびその齧歯類細胞における発現が発見されて以来、利用可能である。天然のヒトエリスロポエチンは、７番染色体上の遺伝子７ｑ１１−ｑ２２によりコード化される（Ｌａｗら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３（１９８６），６９２０−６９２４）。組換えヒトＥＰＯは、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）が慢性腎不全に関連する貧血の治療でのその使用について認可した１９８９年に市場に参入した。これは、薬剤として使用される他の組換え糖タンパク質についても当てはまることだが、ＥＰＯのグリコシル化パターンは、糖タンパク質のバイオアベイラビリティー、生理活性、および免疫原性に対して顕著な影響を及ぼす。ｒｈＥＰＯの産生に関しては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）およびベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ−２１）宿主細胞が発現系として重要な役割を果たし、したがって十分に研究されている（Ｓａｓａｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（１９８７），１２０５９−１２０７６；Ｔａｋｅｕｃｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３（１９８８），３６５７−３６６３３；Ｎｉｍｔｚら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１３（１９９３），３９−５６；Ｔｓｕｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７（１９８８），５６４６−５６５４）。これらの細胞系がヒトグリコフォームともっともよく似ているグリコフォームを産生することは十分に立証されている。糖質が糖タンパク質ターゲティングおよびクリアランスで重要な役割を果たすことも周知である（Ｄｒｉｃｋａｍｅｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９（１００３），２３７−２６４；Ｈｅｌｅｎｉｕｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１（２００１），２３６４−２３６９）。最近、ダーベポエチンアルファ（ＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標））と呼ばれる２つの特別なＮ−グリコシル化部位を有する新規形態のエリスロポエチンが欧州医薬品審査庁（ＥＭＥＡ）およびＦＤＡにより承認された。
【０００３】
ヒトＥＰＯ遺伝子は、２７のアミノ酸シグナルペプチドおよび１８３９６ダルトンの算出分子量を有する１６６のアミノ酸タンパク質をコード化する。成熟タンパク質は、通常、１つのアミノ酸Ｎ末端欠失を有し、１６５アミノ酸の長さである。シグナル配列はペプチドを適切なグリコシル化に関与する細胞内コンパートメントに向かわせ、３つのＮ−グリカンおよび１つのＯ−グリカンを有する成熟タンパク質をもたらす。全分子量の約４０％を構成する糖部分は、インビボのＥＰＯの完全な生物活性に必須である。いくつかの研究は、末端シアル酸残基の数がインビボ半減期に対してプラスの効果を及ぼすが、インビトロ活性、すなわち受容体に対する結合は、非グリコシル化形態または部分グリコシル化形態で最高であることを示した（Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ａｎｄ  Ｋｏｂａｔａ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １（１９９１），３３７−３４６）。シアリル化の程度は半減期と正比例し、この場合、シアル酸がほとんどないアイソフォームは、生物からはるかに速く除去され、したがって低活性を示す。これに関連して、Ｒｕｓｈら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６７（１９９５），１４４２−１４５２）は、エリスロポエチンのシアル酸残基のＯ−アセチル化および循環時間の増加に対するそれらの効果を記載し、このことは、シアル酸残基の高度のＯ−アセチル化は、肝クリアランスを減少させることにより、循環時間を増加させることを示す。
【０００４】
典型的には、哺乳動物細胞、特にＣＨＯ細胞における組換え発現によって得られるＥＰＯ調製物は、Ｏ−グリカンがなく、したがって１分子あたり２以上のシアル酸残基の可能性をゆるめるＥＰＯアイソフォームを５０％まで含む。したがって、そのような欠陥、非Ｏ−グリコシル化アイソフォームが実質的にないＥＰＯ調製物、およびそれを提供する方法を提供することが望ましい。
【０００５】
科学文献および特許文献から公知のＥＰＯの単離／精製法は、種々のクロマトグラフィーステップを含む。最も一般的に使用されるのは、アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）および逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）である。他のクロマトグラフィー法、たとえばハイドロキシアパタイト、疎水性相互作用（ＨＩＣ）、カチオン交換（ＣＥＸ）、アフィニティー（すなわち免疫親和性または色素リガンド）およびサイズ排除（ゲルろ過）（ＳＥＣ）クロマトグラフィーも用いられる。いくつかの中間ステップ、たとえば濃縮、ダイアフィルトレーション、限外ろ過、透析、エタノール、塩などでの沈殿も一般的である。
ＥＰ２０５５６４は、カチオン交換クロマトグラフィーステップを用い、続いてその後にＲＰ−ＨＰＬＣを行うＥＰＯの精製を記載している。
ＥＰ２２８４５２およびＵＳ４，６６７，０１６は、アニオン交換体、続いてＲＰクロマトグラフィーおよびゲルクロマトグラフィーを行うＥＰＯ精製を記載した。
ＥＰ４２８２６７は、ＲＰクロマトグラフィー後にさらにアニオン交換体による（特に酸性）アイソフォームの単離を取り扱うＥＰ２２８４５２による方法の改善を記載している。
ＥＰ１３９４１７９は、色素アフィニティークロマトグラフィー、ＨＩＣ、ハイドロキシアパタイト、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびアニオン交換体を含む精製プロセスを記載している。
ＥＰ１４２８８７８は、捕捉ステップとしての第１アニオン交換クロマトグラフィーステップおよび任意の酸性洗浄ステップ、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および第２のアニオン交換クロマトグラフィーステップと酸性洗浄ステップを用いることによる、高シアリル化ＥＰＯアイソフォームの精製法を記載している。
ＷＯ９９／２８３４６は、炭水化物構造中のＮ−アセチル−ラクトサミン単位および／または四分岐型（ｔｅｔｒａ−ａｎｔｅｎｎａｒｙ）分枝に関する高度のＥＰＯ精製を記載している。精製プロセスは、細胞培養上清で始め、アフィニティークロマトグラフィーによる捕捉、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトおよび逆相クロマトグラフィーによる精製を行う。
ＷＯ０３／０４５９９６、細胞培地からｒｈＥＰＯを回収し、精製する方法であって、とりわけ、アニオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーのステップを含む方法を記載している。
ＷＯ０３／０８０８５２は、ＥＰＯを産生するためのプロセスであって、少なくとも色素アフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーおよびアニオン交換クロマトグラフィーを含み、場合によってゲルろ過クロマトグラフィーをさらに含むプロセスを記載した。
Ｍｉｙａｋｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２５２（１９７７），５５５８−５５６４は、イオン交換クロマトグラフィー、エタノール沈殿、ゲルろ過および吸着クロマトグラフィーを含む７ステップ手順による尿ＥＰＯの精製を記載している。
Ｂｒｏｕｄｙら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２６５（１９８８），３２９−３３６は、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ  Ｂｌｕｅクロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーによりＥＰＯを精製するために、トランスフェクトされたＢＨＫ細胞系を使用した。
Ｇｏｋａｎａら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ７９１（１９９７），１０９−１１８は、免疫親和性によるＥＰＯの以前の精製の後のＤＥＡＥクロマトグラフィーによる組換えヒトＥＰＯアイソフォームの分離を記載している。ＥＰＯアイソフォームの分離は、それらの異なるｐＩに基づく。
Ｇｏｔｏら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６（１９８８），６７−７１  は、免疫親和性、ゲルクロマトグラフィーおよびハイドロキシアパタイトによるＥＰＯの精製を記載している。
Ｈｏｋｋｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２８（１９９５），９８１−１００８は、Ｎ−グリカンおよびＯ−グリカンの個別分析のためのＰＮＧａｓｅ処理を含むＥＰＯのグリカン分析を記載している。
Ｋｉｓｈｉｎｏ  ａｎｄ  Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ６９９（１９９７），３７１−３８１は、末端ＲＰクロマトグラフィーを用いて尿からＥＰＯを精製することを含む糖タンパク質分析の方法を概説している。
Ｎｉｍｔｚら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１３（１９９３），３９−５６は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ消化を含むＥＰＯグリコシル化の分析を記載し、これは、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞で発現され、ＢＨＫ細胞から得られる組換えヒトＥＰＯが６０％しかＯ−グリコシル化されていないことを示している。
Ｑｕｅｌｌｅら、Ｂｌｏｏｄ  ７４（１９８９），６５２−６５７は、昆虫細胞からのＥＰＯの精製を記載し、この場合、精製プロセスは、アニオン交換クロマトグラフィーおよびＲＰ−ＨＰＬＣおよびその後のレクチンアフィニティークロマトグラフィーを含む。
Ｓａｓａｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（１９８７），１２０５９−１２０７６およびＳａｓａｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７（１９８８）８６１８−８６２６は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現され、ＣＨＯ細胞から得られる組換えヒトＥＰＯの炭水化物構造の分析を記載している。ＥＰＯは、他の方法のなかでもＲＰ−ＨＰＬＣにより精製された。
Ｓｋｉｂｅｌｌら、Ｂｌｏｏｄ  ９８（２００１），３６２６−３６３４は、組換えＥＰＯと比較して、ヒト血清由来のＥＰＯのグリカン構造の調査を記載し、Ｏ−グリコシル化が血液中を循環するＥＰＯでも起こることを示す。
Ｓｙｔｋｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｄｏｎａｈｕｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（１９８７），１１６１−１１６６は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の助けを借りて（中和により間接的に）決定されるＥＰＯ受容体結合部位を決定した。表ＩＩから、ＥＰＯアミノ酸配列１１１〜１２９に対するｍＡｂは、最強の中和効果を示すことがわかり、このことは、Ｓｅｒ１２６に位置するＯ−グリカンが受容体結合に関与し得ることを意味する。
【０００６】
したがって、ＥＰＯのグリコシル化の重要性は公知であるが、前記文書はいずれも、（ｉ）非Ｏ−グリコシル化アイソフォームが実質的になく、（ｉｉ）医薬品等級まで精製され、（ｉｉｉ）ウイルスの混在がなく、そして（ｉｖ）大規模製造できる、ＥＰＯ調製物を提供する方法を開示していない。この技術的問題は、特許請求の範囲で特徴付けられ、以下でさらに詳細に記載される実施形態により解決される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、組換え細胞由来の細胞培地からヒトエリスロポエチン（ｒｈＥＰＯ）を回収し、精製するための方法であって、逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーステップ、好ましくはＲＰ−ＨＰＬＣおよびその後のカチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーステップを含む方法を提供し、この場合、ＲＰ−ＨＰＬＣステップは、好ましくはアニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーステップの後に行う。
【０００８】
本発明の方法にしたがって精製された組換えヒトエリスロポエチン（ｒｈＥＰＯ）は、ＥＰＯのＮ−およびＯ−グリコシル化状態を特徴付けるために、いくつかの分析手順に付されてきた。背景の部分で記載するように、ＥＰＯは、Ｓ１２６に１つのＯ−グリコシル化部位、およびＮ２４、Ｎ３８、およびＮ８３に３つのＮ−グリコシル化部位を有する。本発明のＥＰＯ調製物の全体的なグリコシル化パターンは、国際ＢＲＰ標準、および参考商品で見出されるものとかなり類似していることが判明した。しかし、Ｏ結合オリゴ糖に関して、ＢＲＰ標準との比較において、ＥＰＯの非グリコシル化形の相対量は、もしあったとしても著しく低いことが観察された。このことは、他の商品と比較して、本発明のＥＰＯ調製物が改善されていることを意味し得る。
【０００９】
理論により拘束されることを意図しないが、全Ｏ−糖鎖がかけているという事実により、ＨＰＬＣにおいてＯ−脱グリコシル化（Ｄｅｓ−Ｏ）ＥＰＯの実質的に選択的な分離が機能すると考えられる。Ｎ−グリカンの場合、差異は、あるとしてもそれほど顕著ではない。ここで、偶発的アンテナのみが欠損しているが、全グリカンはほとんど欠損してない。Ｎ−グリカンが欠失したアイソフォーム（グリカンあたり４つのシアル酸がない）はアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）ステップですでに強力に排除さられている。Ｏ鎖がない場合、通常は糖鎖により保護されている疎水性パッチ（約ａａ１２１−１３０）が露出する。実際、Ｏ−グリコシル化部位を更に詳しく調べてみると、セリン１２６のまわりに疎水性アミノ酸の濃密な蓄積が見られる。４つのアラニンがセリン１２６を直接取り囲み、そして３つのプロリン（１２１、１２２、１２９）は顕著な疎水性領域を規定する。加えて、ロイシン１３０も疎水性であり、この効果に貢献する。ＥＰＯにおける前記のさらなる疎水性部位は、ＨＰＬＣカラムのＣ４マトリックスに対する全体的な結合力を増強する。したがって、Ｄｅｓ−Ｏ形態は、後の時点で溶出する。
【００１０】
本発明の特に好ましい実施形態では、原薬として好適な純粋な形態でＥＰＯを精製するための５カラムクロマトグラフィープロセスを提供し、このプロセスは：
（ａ）ＥＰＯ含有溶液を捕捉し、濃縮し、そして潜在的な夾雑物の大幅な減少をもたらすための色素アフィニティークロマトグラフィー；
（ｂ）ＥＰＯの酸性アイソフォームの濃縮、夾雑物（例えば、ＤＮＡ、ＨＣＰ）のさらなる除去、および第１カラムから浸出した可能性のある任意の色素リガンドの除去のためのアニオン交換クロマトグラフィー；
（ｃ）Ｓｅｒ１２６残基でグリコシル化されないＥＰＯ分子を除去するため、および夾雑物を除去するための条件下でのＲＰ−ＨＰＬＣ；
（ｄ）ＲＰ−ＨＰＬＣ溶媒および凝集種を除去するため、緩衝液を交換するため、およびＥＰＯフラクションを濃縮するためのカチオン交換クロマトグラフィー；ならびに
（ｅ）残存する可能性のある凝集物および他の夾雑物を除去するために用いられる最終クロマトグラフィーステップとしてのサイズ排除クロマトグラフィー
を含む。
【００１１】
さらに、２つの特定のウイルス除去／不活性化ステップがＥＰＯ製造プロセスに含まれる。まず、ＲＰ−ＨＰＬＣステップ後に、溶出液を酸性アセトニトリル：水＋０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ混合物中、６０〜１８分間２２±３℃で保持する。第２に、ナノろ過ステップを最終クロマトフィーステップ後に行うこととし、原薬のウイルス安全性を増大させる。加えて、アニオン交換クロマトグラフィーも、ウイルスの除去のための有効なステップであることが証明されている。結果として得られるＥＰＯ原薬は、例えば蠕動ポンプを用いて２５０ｍｌまたは３０ｍｌ体積のバルク原薬貯蔵容器中に分注することができ、−７０℃以下で貯蔵することができる。
【００１２】
したがって、本発明の方法は、ＥＰＯのプロフィール依存性製造および高品質の非常に均一な製品を提供する。さらに、本発明は、高純度で所望のＯ−グリコシル化ＥＰＯアイソフォームプロフィールを有する、生物活性なＥＰＯの大規模調製を可能にする。
【００１３】
ＥＰＯ純度は、ＨＰＬＣおよびゲル電気泳動により測定して、全タンパク質の少なくとも９９％を越え、有利には全タンパク質の９９．９％を越える純度に達することによって高い。さらに、感染の危険性を減少させることにより、ウイルスなどによる汚染の危険性、したがって生成物の臨床的安全性を改善する。これに関連して、精製プロセスにおける次のステップに移る間にＥＰＯ試料を溶出させ、貯蔵するためにＲＰ−ＨＰＬＣおよび有機溶媒を使用する有利な副次的効果は、例えば疎水性相互作用またはイオン交換クロマトグラフィーなどの他の方法で使用される他の溶媒中で生き残ったままであり得るウイルスの不活性化にある。
【００１４】
これに関連して、当業者は、本発明の１つの本質的な特徴がＲＰ−ＨＰＬＣの性能およびその後のＣＥＸクロマトグラフィーステップから構成され、一方、他のクロマトグラフィーステップのいずれも変更することができるか、完全に省略することができることを理解するであろう。これは、ＡＥＸステップにも当てはまり、このステップは、好ましくは本発明の方法に組み入れられるが、異なる精製ステップにより置換することもでき、更には、適用されるＥＰＯ試料に応じて、および／またはＯ−グリコシル化される一方で例えば異種もしくは低シアリル化されたＥＰＯ調製物を提供することが望ましい場合、省略することもできる。
【００１５】
本発明の方法にしたがって単離されるＥＰＯのＯ−グリコシル化はＢＲＰ標準よりも完全であったという事実は、ＥＰＯ調製物の半減期が大幅に改善され得ることを示す。したがって、本発明のＥＰＯ調製物のインビボ半減期は、従来の商業的に入手可能であった組換えＥＰＯ生成物に比較して、改善されていないとしも、少なくとも類似していると予想することが賢明である。これはまた、薬物動態学的特性および薬力学的特性がさもなければ市場製品と類似しているであろうことも意味する。本発明の方法にしたがって得られるＥＰＯは、したがって、ヒト医薬への使用に特に好適である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
特許または出願書類は、カラーおよび／または１以上の写真で作製された１以上の図面を含み得る。カラー図面および／または写真を含むこの特許または特許出願公開の写しは、欧州特許庁または米国特許商標局により、請求と必要な料金の支払いに応じて提供され得る。
【図１】高シアリル化およびＯ−グリコシル化ＥＰＯアイソフォームの特定の混合物の単離のための精製手順のスキーム。個々の精製ステップの重要性および意図される目的は明細書で更に説明される。
【図２】ＰＮＧａｓｅで消化した後のＨＰＬＣフラクションのクーマシー染色された１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真。スロットごとに５μｇのタンパク質をロードした。ＭＷ：分子量マーカー；ＢＲＰ：ＢＲＰ標準バッチ１（＝生物学的参考調製物＝エポエチンアルファおよびベータの混合物）；１＝アニオン交換クロマトグラフィー後（ＡＥＸプール）およびＲＰ−ＨＰＬＣステップに付す前のＥＰＯ試料；２〜１０＝ＡＥＸプールをＲＰ−ＨＰＬＣに付し、実施例に記載する様な溶媒の直線勾配の適用後に得られるＥＰＯ溶出液フラクションの試料；表６も参照。各ＥＰＯバッチは、全てのＮ−グリカンを除去するが、もし存在するならば、結合したＯ−グリカンを残すポリペプチドＮ−グリコシダーゼ（ＰＮＧａｓｅ）で消化した後に示す。下側の細いバンドは非Ｏ−グリコシル化（Ｄｅｓ−Ｏ）形態である。酵素自体は、ゲルの中央でトレースバンドとしてゲル中で検出される可能性もある。左のレーンは、ＢＲＰ標準を示し、その次のレーンはカラム適用（ＢＲＰ標準のようなＤｅｓ−Ｏ形態を含む）を示し、続いて勾配溶出の９のフラクションがある。最初の５つのフラクションは明らかにＤｅｓ−Ｏ形態がなく、Ｄｅｓ−Ｏ形態は最後の３〜４フラクションに主に存在することがわかり、このことから、Ｄｅｓ−Ｏアイソフォームはクロマトグラフィー材料に結合したままであり、後の時点でカラムから溶出されることが確認される。プール基準はＤｅｓ−Ｏアイソフォームの残存率を調節する。
【図３】クーマシー染色された１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真。ＭＷ：分子量マーカー；１〜４＝実施例で説明する方法によって得られるＥＰＯ調製物；５＋６＝ＢＲＰ標準バッチ１（＝生物学的参考調製物＝エポエチンアルファおよびベータの混合物）；７＝ブランク。各ＥＰＯバッチを、ＰＮＧａｓｅでの消化前（１、３、５）および消化後（２、４、６）に示す。酵素自体はまた、ゲル中でトレースバンドとして検出され得る。ＢＲＰ標準は消化後に二重バンドを示す。下側の細い方のバンドは非Ｏ−グリコシル化（Ｄｅｓ−Ｏ）形である。本発明の方法にしたがって得られるＥＰＯ調製物は、明らかに下側のバンドがないことがわかり、このことからＤｅｓ−Ｏ形態はＨＰＬＣステップ中に除去されたことが確認される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、あったとしてもごくわずかな非Ｏ−グリコシル化アイソフォームしか含まず、実質的に凝集物のない改善されたＥＰＯ調製物の単離および精製法を提供する。この目的は、適切な条件下での逆相（ＲＰ）−高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびその後にカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）ステップを適用することによって、非Ｏ−グリコシル化ＥＰＯアイソフォームの含量を減少させることにより達成される。さらに詳細には、本発明は、グリコシル化エリスロポエチン（ＥＰＯ）アイソフォームを複雑なタンパク質混合物から精製する方法に関し、この方法は、アニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーステップおよびカチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーステップを含み、これらは逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーステップによって隔てられている。
【００１８】
「アイソフォーム」という用語は、本明細書中で用いられる場合、同じアミノ酸配列を有するが、例えば分画電気泳動（ＩＥＦ）ゲルにより明らかになるように異なる等電点または例えばキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）により明らかになるように異なる電荷数を有する糖タンパク質を含む糖タンパク質調製物／フラクションを指す。これらの差異は、グリコシル化パターンにおける不均一性を反映する。個々のＥＰＯ分子は、結合したグリコシル基、シアリル基、およびアセチル基の程度、複雑さ、性質、分岐性および順序に関して異なり得る。リン酸塩および硫酸塩などの荷電した無機基でさえも、特定のアイソフォームの性質に貢献し得る。したがって、本発明による糖タンパク質アイソフォームは、それらの異なる等電点およびそれらの同じアミノ酸配列によって定義され、したがって、各アイソフォームは実際に、厳密な化学的意味で複数の異なるＥＰＯ分子を含む。
【００１９】
本発明の方法によれば、アニオン交換クロマトグラフィーを好ましくは使用して、ＥＰＯアイソフォーム、特に高シアリル化酸性ＥＰＯアイソフォームを選択する；図１も参照。本発明によれば、ＥＰＯの「酸性アイソフォーム」は、高度または高含有量のグリコシル基、好ましくはシアリル基を有し、したがって、低（酸）ｐＩで現れるアイソフォームを含む。組換えヒトＥＰＯは、ＩＥＦにより細胞培養上清から分析する場合、ｐＩ３〜９の範囲にわたって最大１４までの異なるアイソフォームの幅広い等電点（ｐＩ）アイソフォームプロフィールを示す（Ｇｏｋａｎａら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．７９１（１９９７），１０９−１１８）。ＥＰＯアイソフォームは、主に、様々な数の負に荷電した末端シアル酸残基を有する様々なグリコシル含量のために生じる。より多くのシアル酸残基を有し、したがってより酸性のｐＩを有するＥＰＯ形態はより高い生物活性および治療的価値のものであることが知られている。なぜなら、グリコ構造上の末端シアル酸残基はＥＰＯがアシアロ受容体経路によりインビボで迅速なクリアランスをされないよう防止するからである。
【００２０】
アニオン交換クロマトグラフィーステップは、ジエチルアミノエチル基（ＤＥＡＥ）、第４級アミノエチル基（ＱＡＥ）、第４級アンモニウム基（Ｑ）、ジメチルアミノエチル基（ＤＭＡＥ）および／またはトリメチルアミノエチル基（ＴＭＡＥ）を官能基として含むアニオン交換樹脂または膜を用いて実施することができる。アニオン交換材料の例は、Ｄｏｗ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐａｎｙから入手可能なＤｏｗｅｘ（登録商標）１、ＡＧ（登録商標）（例えば、タイプ１、２、４）、Ｂｉｏ−Ｒｅｘ（登録商標）５、ＤＥＡＥ  Ｂｉｏ−Ｇｅｌ１、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（登録商標）ＤＥＡＥ（全てＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能）、Ｅｉｃｈｒｏｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．から入手可能なアニオン交換樹脂タイプ１、Ｓｏｕｒｃｅ  Ｑ、ＡＮＸ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（例えば、タイプＣＬ−６Ｂ、ＦＦ）、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｃａｐｔｏ  Ｑ、Ｃａｐｔｏ  Ｓ（全て  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手可能）、ＡＸ−３００（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒから入手可能）、Ａｓａｈｉｐａｋ  ＥＳ−５０２Ｃ、ＡＸｐａｋ  ＷＡ（例えば、タイプ６２４、Ｇ）、ＩＥＣ  ＤＥＡＥ（全てＳｈｏｋｏ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｉｎｃ．から入手可能）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲＡ−９６、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＤＥＡＥ、ＴＳＫｇｅｌ  ＤＥＡＥ（全てＴｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＧｍｂＨから入手可能）、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能）である。本発明の方法の好ましい実施形態では、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いてアニオン交換クロマトグラフィーステップを実施する；実施例も参照。記載する様に、低シアリル化塩基性ＥＰＯアイソフォームの枯渇および高シアリル化酸性ＥＰＯアイソフォームの選択は、それぞれ、好ましくは、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌを含む緩衝液（ｐＨ約７．０）中、０〜２００ｍＭのＮａＣｌの線形塩勾配で実施する。
【００２１】
さらに、本発明の方法によれば、逆相クロマトグラフィーステップを用いてＯ−グリコシル化ＥＰＯアイソフォームを選択する。実施例で示すように、そのようなＥＰＯアイソフォームを、有機溶媒の直線勾配（好ましくは０〜７０％の水中アセトニトリル（約０．１％のＴＦＡを含む））で溶出することができる。加えて、またはその代わりに、アセトニトリルおよび約０．１％の水中ＴＦＡを含む溶媒でのＥＰＯのアイソクラティック溶出を使用する。逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーを実施するための手段および方法は、当業者に周知である；前出の背景の部分で記載した従来技術も参照。好ましくは、ＲＰクロマトグラフィーステップは逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を含む。典型的には、ＲＰ−ＨＰＬＣは、メチル基、ブチル基、フェニル基、プロピル基および／またはオクチル基を官能基として含む樹脂を用いて実施する。本発明の方法の好ましい実施形態では、ＲＰ−ＨＰＬＣは、市販のＣ４逆相クロマトグラフィー材料を用いて実施する。逆相材料の例は：Ｖｙｄａｃ  ２１４ＴＰＢ１０１５、Ｃ４（Ｇｒａｃｅ  Ｄａｖｉｓｏｎから入手可能）；Ｄａｉｓｏｐａｋ  ＳＰ−３００−１５−Ｃ４−ＢＩＯ（ＤＡＩＳＯ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍ．ＧｍｂＨから入手可能）；ＹＭＣ  Ｇｅｌ  Ｂｕｔｙｌ  Ｓｐｈａｒｉｓｃｈ  Ｃ４、１５μ、３００Ａ（ＹＭＣ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨから入手可能）；  Ｊｕｐｉｔｅｒ  １５μ、Ｃ４、３００Ａ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘから入手可能）である。
最も好ましくは、その表面がＣ４−アルキル鎖を有するシリカゲル粒子から構成されるＶｙｄａｃ  Ｃ４（Ｖｙｄａｃ）を使用する。ＥＰＯのタンパク質性不純物からの分離は、疎水性相互作用の強度の差に基づく。溶出は、希トリフルオロ酢酸の存在下で水中アセトニトリル勾配で実施する。通常、「ＥＰＯピーク」の一部は、分別によりカットオフされなければならない。例えば、多くの約９または１０のＥＰＯを含む溶出液フラクションにおいて、典型的には全ＥＰＯピークの４０％を構成し得る最後の１〜４試料を捨てなければならず、一方、残りの溶出液プールを次のステップでさらに精製する；図２も参照。
【００２２】
本発明によれば、分取ＲＰ−ＨＰＬＣは、通常、＞１０ｂａｒの高圧（３０〜４０ｂａｒまでの分取スケールで）および小ビーズ（５〜１０μｍ）、通常はシリカゲルで実施し、これによってより良好な分解能に至る。好ましくは、ＴＦＡで酸性化された溶媒のｐＨは約２である。低アセトニトリル濃度（例えば、１０％または純水）および増大するアセトニトリル濃度勾配でＡＥＸ溶出液を適用すると、ＥＰＯアイソフォームが溶出されるであろう。
【００２３】
これに関連して、ＲＰ−ＨＰＬＣは、本発明の方法にしたがって用いられる場合、低圧（中圧法とも呼ばれ、＜１０ｂａｒ、通常は３〜５ｂａｒ）で実施される通常のＲＰクロマトグラフィー（ＲＰＣ）と実質的に異なる。例えば、ＲＰＣは、典型的には、国際出願第ＷＯ０３／０４５９９６号（ＲＰ−Ｓｏｕｒｃｅ ３０）で記載されるように１５μビーズまたは３０μビーズで実施される。さらに、ＨＰＬＣにおいてと同様に有機溶媒を用いることができるが、ＷＯ０３／０４５９９６におけるＲＰＣステップは、試料中、０．２４Ｍの硫酸アンモニウムを用いた硫酸アンモニウム沈殿に続いて開始し、これは、ＨＰＬＣには好ましくないが、典型的には溶出のために減少する塩勾配が適用されるＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）には非常に好適である。したがって、国際出願第ＷＯ０３／０４５９９６号に記載されるようなＲＰＣは、十分な水性溶媒系、すなわち、トリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７）中で実施される。なぜなら、今まで有機溶媒の迅速な分離およびＥＰＯ調製物内の凝集物の形成／ドラッギングを回避するために適切な方法は記載されていないからである。しかし、有機溶媒を使用するＨＰＬＣステップの施行は、例えば、ＲＰＣで用いられるより大きなビーズ粒子やあまり厳しくない分離条件のためにＥＰＯアイソフォームの効率の低い分離を代償にしてなされる。いずれにしても、ＲＰ−ＨＰＬＣの分離性能は、ＲＰＣよりも優れている。
【００２４】
精製スキームの有効性のさらに重要な点は、カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を第３ステップで、ＨＰＬＣの直後に実施することである。このステップは適用方式に関して新規である。ＲＰクロマトグラフィー後、ＥＰＯを直ちに緩衝液交換に付さなければならない。というのも、これは酸性アセトニトリル中で安定でない、すなわち、時間および温度の増加に伴い凝集物が徐々に形成されるからである。さらに、最終ポリッシングステップとして用いられるその後のゲルクロマトグラフィーに関して、試料体積は非常に小さくなければならない。すなわちＲＰプール中のＥＰＯ濃度を強力に増加させなければならない。一方、ＲＰ−ＨＰＬＣプールは、Ｄｅｓ−Ｏ形態の分離に必要とされる比較的平坦な勾配のためにかなり大きな体積を有する。一般的であるがかなり時間のかかる方法である、標準的限外ろ過／ダイアフィルトレーションステップを用いる代わりに、本発明にしたがって選択された材料（Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  Ｓ）でのＣＥＸクロマトグラフィーステップが開発された。このＣＥＸクロマトグラフィーは、特に高い流速を可能にし、高濃度での酸性アセトニトリルに対して耐容性である。酸性環境中では正に荷電しているという事実のために、ＥＰＯは強力なバインダーであり、非常に急な勾配で、小体積で、所望の緩衝液中高濃度にて溶出される。驚くべきことに、ＣＥＸクロマトグラフィーはまた、アセトニトリル中で必然的に形成されるＥＰＯ凝集物の分離につながる。なぜなら、ＥＰＯ凝集物は溶出されず、カラム上に残留し、その後ＣＩＰ溶液で再生物中に溶出されることがわかったからである。したがって、本発明によれば、カチオン交換クロマトグラフィーステップをＲＰクロマトグラフィー、特に緩衝液交換、ＥＰＯの濃縮およびＥＰＯ凝集物の除去のためのＲＰ−ＨＰＬＣの後に用いる；図１も参照。
【００２５】
異なる種類のカチオン交換材料も異なる名称で、多数の企業から入手可能である。例えば、Ｂｉｏ−Ｒｅｘ（登録商標）（例えば、タイプ７０）、Ｃｈｅｌｅｘ（登録商標）（例えば、タイプ１００）、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（登録商標）（例えば、タイプＣＭ、Ｈｉｇｈ  Ｓ、２５Ｓ）、ＡＧ（登録商標）（例えば、タイプ５０Ｗ、ＭＰ）（すべてＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能）；ＷＣＸ２（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎから入手可能）、Ｄｏｗｅｘ（登録商標）ＭＡＣ−３（Ｄｏｗ  ｃｈｅｍｉｃａｌ社から入手可能）、Ｍｕｓｔａｎｇ  ＣおよびＭｕｓｔａｎｇ  Ｓ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能）、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ＣＭ（例えば、タイプ２３、５２）、ｈｙｐｅｒ−Ｄ、ＰａｒｔｉＳｐｈｅｒｅ（Ｗｈａｔｍａｎ  ｐｌｃ．から入手可能）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲＣ（例えば、タイプ７６、７４７、７４８）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＧＴ７３、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）（例えば、タイプＳＰ、ＣＭ、６５０Ｍ）（全てＴｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＧｍｂＨから入手可能）、ＣＭ１５００およびＣＭ３０００（ＢｉｏＣｈｒｏｍ  Ｌａｂｓから入手可能）、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手可能）、Ｐｏｒｏｕｓ樹脂（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能）、Ａｓａｈｉｐａｋ  ＥＳ（例えば、タイプ５０２Ｃ）、ＣＸｐａｋ  Ｐ、ＩＥＣ  ＣＭ（例えば、タイプ８２５、２８２５、５０２５、ＬＧ）、ＩＥＣ  ＳＰ（例えば、タイプ４２０Ｎ、８２５）、ＩＥＣ  ＱＡ（例えば、タイプＬＧ、８２５）（Ｓｈｏｋｏ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｉｎｃ．から入手可能）、５０Ｗカチオン交換樹脂（Ｅｉｃｈｒｏｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．から入手可能）。好ましくは、カチオン交換材料は、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｓまたは２５Ｓ、ＭａｃｒｏＣａｐ  ＳＰ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＳＰ６５０Ｍ、Ｓｏｕｒｃｅ  Ｓ、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、またはＰＯＬＹＣＡＴ  Ａなどの強力なカチオン交換材料である。一実施形態では、カチオン交換材料はスルホプロピルカチオン交換材料である。本発明の方法の好ましい実施形態では、カチオン交換クロマトグラフィーステップはＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｓで実施する；実施例も参照。
【００２６】
本発明の方法の好ましい実施形態では、前記クロマトグラフィーステップの前にアフィニティークロマトグラフィーステップを捕捉ステップとして行う。通常、アフィニティークロマトグラフィーステップは、色素クロマトグラフィー樹脂、例えば市販のＢｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅで実施する；実施例も参照。好ましくは、本発明の方法におけるクロマトグラフィーステップは以下の順序で実施する：
（ａ）捕捉ステップとしてのアフィニティークロマトグラフィーステップ；
（ｂ）アニオン交換クロマトグラフィーステップ；
（ｃ）逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーステップ；および
（ｄ）カチオン交換クロマトグラフィーステップ；図１および実施例も参照。
第１ステップにおいて、色素クロマトグラフィーは主にプロテアーゼによる汚染を除去する。青色トリアジン色素、例えばＣｉｂａｃｈｒｏｎ（登録商標）ブルーが色素として好ましく用いられる。他のトリアジン色素も好適である。色素クロマトグラフィーの支持材料は重要ではないが、多糖ベースの支持材料、例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、好ましくはＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを好ましく使用する。本発明による高シアリル化およびＯ−グリコシル化ＥＰＯアイソフォームの濃縮は、その後のクロマトグラフィーステップで実施される；図１も参照。
【００２７】
本発明の方法の好ましい実施形態では、１以上のクロマトグラフィーステップでのＥＰＯの溶出は、段階または勾配溶出により実施する。「段階溶出」および「段階溶出法」という用語は、本出願では交換可能に使用され、溶出、すなわち結合した化合物の材料からの溶解を引き起こす物質の濃度を、一度に、すなわち１つの値／レベルから次の値／レベルへ上昇または降下させる方法を意味する。この「段階溶出」において、１以上の条件、例えばｐＨ、イオン強度、塩の濃度、有機化合物の濃度、および／またはクロマトグラフィーの流れを、同時に、第１の値、例えば出発値から、第２の値、例えば最終値まで変化させる。これは、確実に線形若しくは非線形である変化に対して、条件を徐々に、すなわち段階的に変化させることを意味する。「段階溶出法」において、新しいフラクションを、イオン強度または有機溶媒含有量のそれぞれの増加後に集める。このフラクションは、それぞれイオン強度および疎水性が対応して増加した、イオン交換材料から回収された化合物を含む。それぞれの増加の後、溶出方法における次のステップを実施するまで、その条件を維持する。典型的には、大規模製造では、可能な場合はいつでも、勾配溶出を段階またはアイソクラティック溶出に変更する。
【００２８】
これに関連して、本発明の方法にしたがって実施されるクロマトグラフィーステップのいずれも、勾配またはアイソクラティック方式のいずれかで実施することができる；概説に関しては、例えば、Ｓｃｈｅｌｌｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｒｒ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．１１０９（２００６），２５３−２６６を参照。特に、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびアニオンクロマトグラフィー（ＡＥＸ）ステップに関して直線勾配をアイソクラティック溶出に変更することが想定される。したがって、本発明の方法の一実施形態では、ＲＰおよび／またはＡＥＸステップをアイソクラティック溶出により実施する。
【００２９】
本発明の方法のさらなるクロマトグラフィーステップにおいて、潜在的な二量体、高凝集物および望ましくない小分子、例えばプロセスに関連する不純物を除去し、適切な場合、最終処方の緩衝液交換も実施するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって、カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）から得られるＥＰＯ調製物をポリッシュする。典型的には、サイズ排除クロマトグラフィーステップは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ、ＴｏｙｏｐｅａｒｌおよびＢｉｏ−Ｇｅｌの群から選択されるゲルろ過媒体を用いて実施する。好ましくは、サイズ排除クロマトグラフィーステップは、市販のＳｕｐｅｒｄｅｘ−Ｓ２００で実施する；実施例も参照。
【００３０】
ＣＥＸクロマトグラフィー後に得られるＥＰＯ調製物の高い生成物濃度を達成するために、溶出液を好ましくはゲルろ過（ＳＥＣ）の前にさらに濃縮する。これは、通常、５〜１０ｋＤａのＵＦ膜を用いた限外ろ過ステップにより実施し、１ｍｌあたり約５〜２０ｍｇのＥＰＯを含む約１０倍に濃縮されたＵＦ残余分をもたらし、ＳＥＣプールを得る；実施例も参照。
【００３１】
潜在的なウイルス混在を除去するために、さらなるデッドエンドウイルス−ろ過ステップを本発明の方法で実施する。このろ過は、１５ｎｍもの小さな粒子を除去するために設計された特別な膜、例えばＰｌａｎｏｖａ  １５Ｎ（Ａｓａｈｉ）で実施する。別のデッドエンドナノろ過ユニットは、ＰＡＬＬ  Ｕｌｔｉｐｏｒ  ＶＦ  Ｇｒａｄｅ  ＤＶ２０またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ  ＮＦＰカートリッジまたはカプセルである。特に、小さな無エンベロープ型ウイルス（例えば、パルボウイルス）に関して、ウイルス除去または不活性化の他の手段はほとんどない。除菌されたＳＥＣプールを好適な膜を有するデッドエンドフィルターに通し、濾液は最終バルク原薬に相当する。あるいは、ナノろ過をＵＦ濃縮とサイズ排除クロマトグラフィーとの間に挿入することができる。したがって、本発明の方法は、１以上のクロマトグラフィーステップの前に、限外ろ過ステップ、および場合によってナノろ過ステップを含んでもよい（後者は、好ましくは最終ステップとして）；図１も参照。
【００３２】
特に好ましい実施形態では、本発明の方法は以下のステップ
（ａ）捕捉ステップとしてのアフィニティークロマトグラフィーステップ；
（ｂ）アニオン交換クロマトグラフィーステップ；
（ｃ）逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーステップ；
（ｄ）カチオン交換クロマトグラフィーステップ；
（ｅ）サイズ排除クロマトグラフィーステップ；
（ｆ）ナノろ過ステップ；および
（ｇ）ステップ（ａ）、（ｂ）および／または（ｅ）の前の限外ろ過ステップ
を含む。
【００３３】
異なるフラクションの含有量は、インプロセス管理としてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定することができ、選択されたフラクションを必要に応じて合するかまたは廃棄する；例えば、ＲＰ−ＨＰＬＣステップからのＥＰＯ溶出の制御については図２を参照。
【００３４】
好ましい実施形態では、本発明の方法にしたがって精製されるＥＰＯはヒト組換えＥＰＯである。したがって、ＥＰＯ分子は、好ましくは、ＥＰＯコード化遺伝子の発現を宿主細胞において誘導することにより提供される。「宿主細胞」は、そのゲノムが活性なＥＰＯ遺伝子を含む動物またはヒト細胞と理解され、このＥＰＯ遺伝子は無血清培地における細胞の培養中に転写され、翻訳される。ＥＰＯ遺伝子は、この宿主細胞中に、外来遺伝子として、好ましくは調節エレメントとともに導入することができるか（例えば、欧州特許出願第ＥＰ−Ｂ０１４８６０５号および第ＥＰ−Ｂ０２０９号参照）、宿主細胞中に活性な内在性遺伝子としてすでに存在している可能性があるか、または内因性非活性遺伝子として活性化されるようになり得る。そのような内因性遺伝子の活性化は、例えば、相同的組換えによりゲノム中に調節エレメントを特異的に導入することによって達成することができる。国際出願第ＷＯ９１／０９９５５号および第ＷＯ９３／０９２２２号はそのような方法の例を記載する。
【００３５】
哺乳動物細胞を通常、宿主細胞として使用する。外因性ヒトＥＰＯ遺伝子を導入する場合、例えば、ＣＨＯまたはＢＨＫ細胞を宿主細胞として用いることができる。内因性ＥＰＯ遺伝子を発現に用いる場合、腎臓、肝臓またはリンパ細胞などのヒト細胞を使用することが好都合である。好ましくは、ＥＰＯは、ＣＨＯ細胞において産生されるヒト組換えＥＰＯである。ＣＨＯにおけるＥＰＯの組換え産生は、通常、ウシ胎仔血清および場合によってウシインシュリンを培地に添加して実施する。その結果として、この方法で産生されるＥＰＯ調製物には、ウイルスまたはＴＳＥ誘発剤に感染する潜在的な危険性がある。というのも、少なくとも微量のそのような動物由来の作用物質を精製後でさえも含み得るからである。ＥＰＯ遺伝子を含む組換えＣＨＯ細胞の無血清培養は、最先端技術の方法を使用して実施することができることが知られている；例えば、欧州特許出願第ＥＰ１３９４１７９号、第ＥＰ０５１３７３８号および第ＥＰ０２６７６７８号、ならびに一般的な形態では、Ｋａｗａｍｏｔｏら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３０（１９８３）４４５−４５３、Ｋｏｗａｒ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｅｋ，，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ４２１（１９８６），２７７−２９２、Ｂａｖｉｓｔｅｒ，Ｅｘｐｃｏｌｏｇｙ  ２７１（１９８１），４５−５１、欧州特許出願第ＥＰ０２４８６５６号、第ＥＰ０４８１７９１号、第ＥＰ０３０７２４７号、第ＥＰ０３４３６３５号および国際出願第ＷＯ８８／００９６７号（その開示内容は参照することにより本明細書中に組み込まれる）を参照。類似活性を有し、ＥＰＯ産生宿主細胞を培養した後に産生されるＥＰＯの誘導体およびフラグメントも、本発明によるプロセスに従って純粋な形態で産生することができる。ヒトＥＰＯのＤＮＡおよびタンパク質配列は、例えば欧州特許出願第ＥＰ０２０５５６４号および第ＥＰ０２０９５３９号に記載されている。
【００３６】
ＥＰＯを産生するために、ＥＰＯ遺伝子を含む宿主細胞を、低体積の培養中で継代させることにより、天然原由来のタンパク質がない培地に適応させることができる。適応させた細胞を、場合によって低温保存し、必要に応じて確立された細胞バンクから取得し、例えば欧州特許出願第ＥＰ１３９４１７９号に記載されているようにして無血清培地中で増殖させる。精製のために、宿主細胞の無細胞培養上清を好ましくは単離し、ろ過後に本発明による精製プロセスに付す。精製プロセスを実施する前に、必要ならばさらなるろ過を実施して、混濁または細片の分離および／または限外ろ過による濃縮を実施することが可能である。
【００３７】
さらなる態様では、本発明は、前述のような、好ましくは実施例で記載する様にして実施される本発明の方法により精製されるグリコシル化ＥＰＯアイソフォームの調製物に関する。典型的には、ＥＰＯはヒト組換えＥＰＯである。有利には、本発明のＥＰＯ調製物は非Ｏ−グリコシル化ＥＰＯアイソフォームを実質的に含まない。「実質的に非Ｏ−グリコシル化ＥＰＯアイソフォームを含まない」という用語は、本発明のＥＰＯ調製物が、典型的には１０％未満の非Ｏ−グリコシル化ＥＰＯアイソフォーム、好ましくは５％未満、そして有利には１％未満の非Ｏ−グリコシル化ＥＰＯアイソフォームを含むことを意味する。言い換えれば、本発明のＥＰＯ調製物は、典型的には少なくとも９０％のＯ−グリコシル化ＥＰＯアイソフォーム、好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９９％のＯ−グリコシル化ＥＰＯアイソフォームを含み、これにより本発明のＥＰＯ調製物を、例えば、図２および図３で示されるようなＳＤＳ  ｐａｇｅによるなど、当該技術分野で公知の方法にしたがって精製されたＥＰＯ調製物から区別することができる。グリコシル化状態を特徴付けるための主な分析技術は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳおよびＨＰＡＥＣ−ＰＡＤである。試料を特徴付けるための他の技術は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＩＥＦ、ＵＶ、ＣＤ、蛍光分光法およびＮＭＲを含んでいた。例えば、ＥＰＯのＯ−グリコシル化調製物の定量は、Ｅｕｒ．Ｐｈａｒｍ．の研究論文にしたがってＲＰ−ＨＰＬＣ  Ｃ４−相を通してペプチド混合物を分離した後にＥＰＯ分子のトリプシンペプチドのＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ分析により実施することができる。Ｓｅｒ−１２６部分を含む非グリコシル化トリプシンペプチドは１４６６．６の質量を有し、一方、ＧａｌＮＡｃ部分（Ｈｅｘ−ＮＡｃ）を有する対応するペプチドは、２０３（ｍ／ｚ＝１６６９）の質量増加を有するべきであり、Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ（Ｈｅｘ−ＮＡｃ−Ｈｅｘ）誘導体はｍ／ｚ＝１８３０の質量に相当する３６５の増加質量を有するべきである。ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ分析を用いて本発明の範囲内で実施される対応する実験により、標準的ＥＰＯ調製物中に存在する約１５％の非Ｏグリコシル化アイソフォームと比較して、実質的にＥＰＯタンパク質のＯ−グリコシル化形態だけを検出できる点で、ポリペプチド−Ｎグリコシダーゼ（ＰＮＧａｓｅ）によるＮ−グリカンの放出後のＥＰＯ調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを確認した。
【００３８】
これに関連して、ＥＰＯ比活性の最小値は、典型的には１００，０００ＩＵ／ｍｇ（糖タンパク質）である。一実施形態では、本発明のＥＰＯ調製物は＞１１０，０００ＩＵ／ｍｇの活性を有し、これは高シアリル化ＥＰＯアイソフォームの濃縮により達成することができる。
【００３９】
したがって、本発明のＥＰＯ調製物は、治療用途に特に適している。したがって、本発明はまた、前記定義の本発明のＥＰＯ調製物を含む医薬組成物にも関する。この文脈で、本発明はまた、医薬組成物を製造するためのプロセスにも関し、このプロセスは、前記定義のグリコアイソフォーム混合物の形態でＥＰＯを調製し、単離し、そしてこのように調製され、単離されたＥＰＯの薬学的に許容される担体との混合物を提供することを含む。一実施形態では、本発明は、安定剤としてトリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタンを含み（しかも処方はアミノ酸またはヒト血清アルブミンを含まない）、最も好ましくはｐＨ緩衝剤としてリン酸ナトリウム緩衝液、安定剤としてトリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタンを１０〜２００ｍＭの量で、および／またはＮａＣｌを２０〜１５０ｍＭの量で、ならびに薬学的な量の精製されたＥＰＯを含む、安定な製剤処方に関する。本発明のＥＰＯ処方のさらなる実施形態については、欧州特許出願第ＥＰ１５３７８７６号（その開示内容は、参照することにより本明細書中に組み込まれる）を参照。本発明の医薬組成物は、少なくとも無菌であり、そして無発熱物質であるとして特徴付けられる。本明細書中で用いられる場合、「医薬組成物」は、ヒトおよび獣医学用途の処方を含む。本発明の医薬組成物の調製法は、当業者の技術範囲内であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１７ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９８５）および最新版Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０００）ｂｙ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＩＳＢＮ  ０−６８３−３０６４７２（両文書の全開示は、参照することにより本明細書中に組み込まれる）に記載されているとおりである。
【００４０】
これらおよび他の実施形態は、本発明の記載および実施例により開示され、含まれる。本発明にしたがって用いられる材料、方法、使用および化合物のいずれか１つに関するさらなる文献は、公立図書館およびデータベースから検索することができる。例えば、公開データベース「Ｍｅｄｌｉｎｅ」を利用することができ、これは全米バイオテクノロジー情報センターおよび／または国立衛生研究所の国立医学図書館により主催されている。さらなるデータベースおよびウェブアドレス、例えば欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ）（欧州分子生物学研究所（ＥＭＢＬ）の一部）のものなどは当業者に公知であり、インターネット検索エンジンを用いて入手することもできる。バイオテクノロジーにおける特許情報ならびに遡及検索およびカレントアウェアネスに有用な関連する特許情報源の調査の概要は、Ｂｅｒｋｓ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １２（１９９４），３５２−３６４に記載されている。
【００４１】
前記開示は、本発明を一般に記載する。特に明記しない限り、本明細書中で用いられる用語は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（オックスフォード大学出版部、１９９７年、２０００年改訂、２００３年再版、ＩＳＢＮ０１９８５０６７３２）で記載されているような定義のものである。いくつかの文書が本明細書本文全体にわたって引用される。全ての引用文献（本出願全体にわたって引用される文献参照、交付済特許、公開特許出願、および製造業者の仕様書、使用説明書などを含む）の内容は、参照することにより明らかに本明細書中に組み込まれるが；引用される文書が実際に本発明の先行技術であるということを意味するものではない。
【００４２】
本明細書中で説明の目的のみで提供され、本発明の範囲を制限することを意図しない以下の具体的な実施例を参照することにより、さらに完全な理解を得ることができる。特に、実施例は、本発明の好ましい実施形態に関する。
【実施例】
【００４３】
特に別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当該技術分野（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術、タンパク質化学および生化学）において通常の技術を有する者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。分子、遺伝子および生化学的方法（一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）４ｔｈ  Ｅｄ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．および標題Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙの完全版（参照することにより本明細書中に組み込まれる）を参照）ならびに化学的方法の標準的技術が用いられる。
【００４４】
出発材料
ＥＰＯタンパク質を含む培地を、当該技術分野で記載されるように、増幅されたヒトＥＰＯ遺伝子を含む形質転換されたチャイニーズハムスター卵巣細胞系（ＣＨＯ  ｄｈｆｒ−）の大規模な灌流培養により産生する；例えば、前述の文献を参照。培地中のＥＰＯタンパク質濃度は、細胞の成長に関連する。実際には、生成物発現レベル（ｍｇ／体積）は達成される最大細胞数により制限される。したがって、長期の培養期間にわたって高密度細胞培養を可能にする連続灌流培養系を用いて産生を最大にする。灌流を所定の細胞密度で開始し、灌流速度は、細胞数に対して速度を手動で調節して、所定の範囲内に維持される。細胞保持は、音響沈殿槽、ろ過または遠心分離などの標準的手順により達成される。灌流液収穫物を冷却された温度で数回にわけて集める。全体的な方法は、典型的には数週間の灌流培養からなり、５〜１０の収穫物を得る。灌流液中の残存細胞および細片を灌流液収穫物から深層ろ過により除去し、そしてタンパク質を好ましくは３０ｋＤａの分子量カットオフの接線流限外ろ過により濃縮する。濃縮物をアリコートに分け、そして全収穫物が集められるまで−７０℃以下の温度で貯蔵する。濃縮された収穫物をフリーザーから取り出し、そして凍結−解凍ユニット中に入れる。プールされ、解凍された収穫物を、０．４５μｍの深層フィルターに通してろ過することにより清澄化する。解凍後の全ての下流精製ステップは、周囲温度（１７〜２５℃）で実施する。
緩衝液および溶液の組成
各精製ステップ用の緩衝液溶液を下記表１に記載する。
【００４５】
【表１】
2013505276.tif 000003
緩衝液組成
【００４６】
【表１−１】
2013505276.tif 000004
表１（続き）：緩衝液組成
【００４７】
５つのその後のカラムクロマトグラフィープロセスを用いて、それぞれのプールされた濃縮物を精製して、治療等級の高シアリル化およびＯ−グリコシル化ＥＰＯのバッチを得る；図１も参照。
【実施例１】
【００４８】
Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦを用いたアフィニティークロマトグラフィーによるＥＰＯの捕捉および潜在的な夾雑物の低減
Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦは、色素Ｃｉｂａｃｒｏｎ  Ｂｌｕｅと共有結合したアガロース樹脂であり、培養収穫物に含まれる夾雑物の存在下でＥＰＯと優先的を結合するために用いられる。生成物ストリームを、表２で規定するように、アフィニティークロマトグラフィーによりまず精製する。
【００４９】
【表２】
2013505276.tif 000005
Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーの性能に関するパラメータ
【００５０】
カラムにＢｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦ樹脂を充填する。充填後、カラムは理論段および非対称因子について検定する。カラムを０．５ＭのＮａＯＨで１時間殺菌し、次いで注射用水（ＷＦＩ）ですすぐ。ローディングの前に、カラムを２０ｍＭのトリス．ＨＣｌ、１．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５で平衡化し、続いて２０ｍＭのトリス．ＨＣｌ、ｐＨ７．５で平衡化する。試料をカラム上にロードし、カラムを２０ｍＭのトリス．ＨＣｌ、ｐＨ７．５で洗浄する。２０ｍＭのトリス．ＨＣｌ、１．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５を用いて試料を溶出させる。プレピークと主ピークとの間の最小ＯＤが０．１５以上となった後に、試料収集を開始する。ＯＤが０．１５以下となったら収集を停止する。溶出液を滅菌使い捨てバッグ中に集める。
【００５１】
溶出後、カラムをＷＦＩですすぎ、次いで５Ｍの尿素で洗浄することによりストリップする。ＷＦＩでさらに洗浄した後、カラムを０．５ＭのＮａＯＨで殺菌する。カラムをＷＦＩですすぎ、０．０１ＭのＮａＯＨ中で貯蔵する。
【００５２】
クロマトグラフィー樹脂に関するさらなる情報は、製造業者のレギュラトリーサポートファイル（Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｆｉｌｅ）で提供されている。
【実施例２】
【００５３】
ダイアフィルトレーションによるＥＰＯの濃縮
溶出液を限外ろ過により濃縮し、接線流ろ過ユニットで１０ｋＤａカットオフ膜を使用してダイアフィルトレーションする；表３を参照。
【００５４】
【表３】
2013505276.tif 000006
ダイアフィルトレーションの性能のパラメータ
【００５５】
規格化水透過性試験（ＮＷＰ）を実施した後、フィルターユニットを使用する。フィルターユニットを１ＭのＮａＯＨで少なくとも１時間殺菌し、次いでＷＦＩで洗浄する。洗浄後、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０を用いてフィルターユニットを平衡化する。試料を次いでロードし、１ｂａｒ以下の膜貫通圧力でろ過する。ダイアフィルトレーションは、透過物の伝導率が２．５ｍＳ／ｃｍ未満になったら停止する。
【実施例３】
【００５６】
ＥＰＯの酸性アイソフォームの濃縮およびＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰでのアニオン交換クロマトグラフィーによる夾雑物のさらなる除去
Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ樹脂でのアニオン交換クロマトグラフィーを、ＥＰＯの酸性アイソフォームの濃縮、夾雑物（例えば、ＤＮＡ、ＨＣＰ）のさらなる除去および第１カラムから浸出し得る任意の色素リガンドの除去のために使用する。加えて、アニオン交換クロマトグラフィーは、外来性ウイルス除去のための有効なステップである。したがって、ダイアフィルトレーション液を表４に明記するようにしてアニオン交換クロマトグラフィーにより処理し、続いてＱ溶出液フラクションおよびフラクションプールの０．２μｍろ過を行う。
【００５７】
【表４】
2013505276.tif 000007
性能アニオン交換クロマトグラフィーのパラメータ
【００５８】
カラムにＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ樹脂を充填する。充填後、カラムを理論段および非対称因子について検定する。カラムをＷＦＩですすぎ、そして次に１ＭのＮａＯＨで１時間殺菌する。殺菌後、カラムをＷＦＩですすぐ。ローディング前に、カラムを２０ｍＭのトリス．ＨＣｌ、１．０ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０で平衡化し、続いて２０ｍＭのトリス．ＨＣｌ、ｐＨ７．０．で平衡化する。試料をカラム上にロードし、カラムを２０ｍＭのトリス．ＨＣｌ、ｐＨ７．０で洗浄する。２０ｍＭのトリス．ＨＣｌ、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０を用いて直線勾配で、試料を溶出させる。ＥＰＯを直線勾配によりフラクションとして集める。コアフラクションは負の勾配（ＵＶ）の最大ピークの約８５％〜９５％から始まり、ＵＶ値が最大ピークの約２５％まで減少したら停止する。
【００５９】
各アニオン交換クロマトグラフィー溶出液フラクションを、０．２μｍのフィルターユニットを用いてろ過する。フラクションを２２±３℃で保持した後、インプロセス試験を実施しつつ、２０時間まで滅菌使い捨てバッグ中でプールする（保持ステップＩ）。所望のアイソフォーム分布規格を達成するために、選択されたフラクションを合する必要がある。どのフラクションをプールするかを決定するために、フラクションの小規模試料を調製し、そしてキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）により分析する。所望のアイソフォーム分布プロフィールに最も接近するフラクションの組み合わせを好ましくは選択し、これらのフラクションをさらなる精製のためにプールする。
【００６０】
使用の間、２０ｍＭのトリス．ＨＣｌ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０ですすぎ、続いてＷＦＩで洗浄することにより樹脂を再生する。カラムを次いで１ＭのＮａＯＨで１時間殺菌し、そしてＷＦＩで洗浄する。カラムを０．０１ＭのＮａＯＨ中で貯蔵する。
【００６１】
クロマトグラフィー樹脂に関するさらなる情報は、製造業者のレギュラトリーサポートファイル（Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｆｉｌｅ）で提供されている。
【実施例４】
【００６２】
Ｓｅｒ１２６残基でグリコシル化されないＥＰＯ分子の排除およびＣ４樹脂を用いるＲＰ−ＨＰＬＣによる夾雑物の除去
Ｃ４樹脂を用いるＲＰ−ＨＰＬＣは、疎水性に基づいてＥＰＯを潜在的な夾雑物から分離し、そして所望により、Ｓｅｒ１２６残基でグリコシル化されないＥＰＯ分子の量を減少させることもできる。加えて、このステップは第１カラムから浸出した可能性のある残存色素リガンドを除去する。ろ過されたアニオン交換クロマトグラフィーフラクションプールを、表５に明記するようにして、逆相クロマトグラフィーにより精製する。
【００６３】
【表５】
2013505276.tif 000008
ＲＰ−ＨＰＬＣの性能についてのパラメータ
【００６４】
カラムにＣ４樹脂を充填する。カラムをＷＦＩ中０．１％（ｖ／ｖ）のＴＦＡで平衡化する。使用前に、段数および非対称因子を決定することにより、カラム性能を規定する。試料をカラム上にロードし、次いで表１および６に記載する直線勾配を用いて溶出させる。２８０ｎｍでの吸収が０．０１ＡＵに達したら溶出液を集め、そして吸収が負の勾配上の最大ピークの４０％〜４５％まで減少したら停止する。溶出液をガラスビン中に集める。
【００６５】
記載するように、勾配は水／ＴＦＡ０．１％（溶媒Ａ）および水３０％／アセトニトリル７０％（ｖ／ｖ）／ＴＦＡ０．１％（溶媒Ｂ）により形成される。特に、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ溶出液の解凍されたフラクションのプールを試料として使用し、０．２μｍのフィルターを通してろ過する。カラムを２カラム体積（ＣＶ）のＭｉｌｌｉ−Ｑ水ですすぎ、４ＣＶの溶媒Ａで平衡化した後、試料をカラム上にロードし、勾配を表６にしたがって適用する。
【００６６】
【表６】
2013505276.tif 000009
ＲＰ−ＨＰＬＣの性能についての勾配
【００６７】
溶出液を５０ｍｌのフラクション中に集め、これを−２０℃で貯蔵する。
【００６８】
使用の間、樹脂を再生し、理論段および非対称因子を測定することにより、カラムを
検定する。最初に、７０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルから１００％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル勾配を使用してカラムを洗浄する。カラムを次いで１００％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルで洗浄する。１００％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルから６０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルの勾配で洗浄することにより、アセトニトリル濃度を減少させ、カラムを次いで６０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル中で貯蔵する。
【００６９】
クロマトグラフィー樹脂に関するさらなる情報は、製造業者のレギュラトリーサポートファイル（Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ  Ｖｙｄａｃ  Ｃ４  Ｒｅｓｉｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｆｉｌｅ）で提供されている。
【実施例５】
【００７０】
アセトニトリル／ＴＦＡ中ＥＰＯのインキュベーションによるウイルス不活性化
ＲＰ−ＨＰＬＣステップ後に、溶出液を６０〜１８０分間、２２±３℃で保持する。溶出液中のアセトニトリル濃度は約４１％（ｖ／ｖ）であり、ＴＦＡ濃度は約０．１％（ｖ／ｖ）である。プロセスのこの段階中、保持温度および保持時間を制御する。
【実施例６】
【００７１】
ＭａｃｒｏＰｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｓを用いたカチオン交換クロマトグラフィーによるＲＰ−ＨＰＬＣ溶媒および凝集したＥＰＯ種の除去
ＭａｃｒｏＰｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｓ樹脂を使用したカチオン交換クロマトグラフィーを用いて、ＲＰ−ＨＰＬＣ溶媒および凝集した種を除去し、緩衝液をかなり短時間で交換する。表７で明記するように、ＲＰ−ＨＰＬＣ溶出液をカチオン交換クロマトグラフィーによって処理し、続いてＭａｃｒｏＰｒｅｐ溶出液の０．２μｍろ過を行う。
【００７２】
【表７】
2013505276.tif 000010
カチオン交換クロマトグラフィーを実施するためのパラメータ
【００７３】
カラムにＭａｃｒｏＰｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｓ樹脂を充填する。充填後、カラムを理論段および非対称因子について検定する。カラムをＷＦＩですすぎ、次いで１ＭのＮａＯＨで少なくとも１時間殺菌する。殺菌後、カラムをＷＦＩですすぐ。ローディングの前に、カラムを１００ｍＭのグリシン．ＨＣｌ、ｐＨ２．０でプレ平衡化し、次いで２０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．０で平衡化する。試料をカラム上にロードし、カラムを２０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．０で洗浄する。表１に記載する急勾配を用いて試料を溶出させる。２８０ｎｍでの吸収が０．０３ＡＵに達したら溶出液を集め、吸収が０．０３ＡＵに達したら停止する。溶出液を滅菌使い捨てバッグ中で貯蔵する。カチオン交換クロマトグラフィー溶出液を、さらなる精製前および／または２２±３℃で滅菌使い捨てバッグ中２０時間までの保持時間を開始する前に、０．２μｍのフィルターユニットを用いてろ過する。
【００７４】
使用の間、樹脂を再生する。カラムを１０ｍＭのＮａＰＯ４、１．０ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２で洗浄し、次いでＷＦＩですすぐ。ＥＰＯ凝集物は再生物中に溶出する。カラムを１ＭのＮａＯＨで少なくとも１時間殺菌し、ＷＦＩですすぐ。カラムを０．０１ＭのＮａＯＨ中で貯蔵する。
【００７５】
樹脂に関する更なる情報は、製造業者のレギュラトリーサポートファイル（Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ  ＢｉｏＲａｄ  ＭａｃｒｏＰｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｓ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｆｉｌｅ）で提供されている。
【実施例７】
【００７６】
限外ろ過
場合によって、ろ過されたカチオン交換クロマトグラフィー溶出液を、１０ｋＤａカットオフの接線流ろ過ユニットを用いる限外ろ過によりさらに濃縮して、所望の体積減少を達成する。ろ過ステップに関する情報を表８に記載する。
【００７７】
【表８】
2013505276.tif 000011
限外ろ過を実施するためのパラメータ
【００７８】
フィルターユニットを１ＭのＮａＯＨで殺菌し、次いでＷＦＩで洗浄する。洗浄後、１０ｍＭのＮａＰＯ４、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２の緩衝液を用いてフィルターユニットを平衡化させる。試料を次いでロードし、次いで２２±３℃、０．７〜１．１ｂａｒのフィード圧でろ過する。残余分を滅菌使い捨てバッグ中に集める。
【実施例８】
【００７９】
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００  Ｐｒｅｐ  Ｇｒａｄｅを用いたサイズ排除クロマトグラフィーによる任意の残存ＥＰＯ凝集物および他の夾雑物の除去
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅサイズ排除クロマトグラフィーは最終（ポリッシング）クロマトグラフィーステップであり、これを用い、残っている可能性のあるいかなる凝集物も除去し、原薬バルク溶液を処方する。限外ろ過（実施例７）後の濃縮物またはＣＥＸクロマトグラフィー（実施例６）後の溶出液を、表９に明記するようにしてサイズ排除クロマトグラフィーにより処理し、続いて実施例９に記載するようにＳＥ−ＨＰＬＣ溶出液の０．２μｍろ過を行う。
【００８０】
【表９】
2013505276.tif 000012
サイズ排除クロマトグラフィーを実施するためのパラメータ
【００８１】
カラムにＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅ樹脂を充填する。充填後、カラムを理論段および非対称因子について検定する。カラムを０．５ＭのＮａＯＨで１時間殺菌し、次いでＷＦＩですすぐ。ローディングの前に、カラムを１００ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ７．２でプレ平衡化し、次いで１０ｍＭのＮａＰＯ４、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２で平衡化する。試料をカラム上にロードし、２８０ｎｍでの吸収が０．０１ＡＵを越えて増加したら溶出液を集め、そして吸収が０．０１ＡＵに達したら停止する。溶出液を滅菌使い捨てバッグ中に集める。サイズ排除クロマトグラフィー溶出液を、０．２μｍのフィルターを用いてさらなる処理の前に滅菌使い捨てバッグ中にろ過する。
【００８２】
使用後、カラムをＷＦＩで洗浄する。次いで０．５〜１ＭのＮａＯＨ（０．６ＣＶ）を用いて１時間カラムを殺菌し、０．０１ＭのＮａＯＨ中で保存する。
【００８３】
樹脂に関するさらなる情報は、製造業者のレギュラトリーサポートファイル（Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｆｉｌｅ）で提供されている。
【実施例９】
【００８４】
ナノろ過によるＥＰＯ調製物からのウイルス除去
最後に、１５ｎｍナノろ過ステップを精製プロセスに含めて、原薬のウイルス安全性を増大させる。溶出液からウイルス外来性因子を除去する働きをするＰｌａｎｏｖａ  １５Ｎフィルターを用いて、サイズ排除クロマトグラフィー溶出濾液をナノろ過する。１５０ｍｌの１０ｍＭ  ＮａＰＯ４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２でフラッシュすることにより、ナノフィルターユニットを調製する。０．２μｍろ過されたサイズ排除クロマトグラフィー溶出液をナノフィルターにポンプで通し、そして濾液を滅菌使い捨てバッグ中にプールする。
【実施例１０】
【００８５】
充填、貯蔵および輸送
充填プロセスは、ＥＰＯ原薬製造プロセスの最終ステップである。最終容器を滅菌し、そして発熱物質を除去した後に充填する。ナノろ過されたフラクションを、蠕動ポンプを用いて３０ｍｌ容積のサイズのバルク原薬貯蔵容器中に分注する。この操作を周囲温度の充填室中のラミナーフローフード（局所的保護）中で実施する。最終生成物の貯蔵は、７０℃にて、例えばテフロンコーティングされたＰＰチューブ中で行うことができる。原薬を薬剤製品製造場所に移すことができ、バルク原薬の温度を輸送の間、ドライアイスを用いて−７０℃未満に維持する。
【図１】
2013505276.tif 000013
【図２】
2013505276.tif 000014
【図３】
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【国際調査報告】
2013505276.tif 000016
2013505276.tif 000017
2013505276.tif 000018