(57)【要約】  本発明は、融合ポリペプチドＨＰＶ抗原を用いたＨＰＶ抗体スクリーニング方法に関し、Ｎ末端のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Glutathione S-transferase, GST）のアミノ酸配列又はその活性断片と、Ｃ末端のシミアンウイルス４０ラージＴ抗原（simian virus 40 large T-antigen）のアミノ酸配列又はその活性断片と、ＨＰＶ ６ Ｌ１抗原、ＨＰＶ １１ Ｌ１抗原、ＨＰＶ １６ Ｌ１抗原、及びＨＰＶ １８ Ｌ１抗原からなる群から選択されたＨＰＶ Ｌ１抗原のアミノ酸配列又はその活性断片とを含む融合ポリペプチド、前記融合ポリペプチドＨＰＶ抗原を用いて試料内のＨＰＶ抗体を検出する方法、並びに前記融合ポリペプチドＨＰＶ抗原を含むビーズアレイ用ＨＰＶ抗体検出キットに関する。本発明を用いると、ＨＰＶ抗体に特異的に結合する活性に影響を及ぼすことなく、組換えＨＰＶ抗原を高純度に分離、精製してビーズアレイ用ビーズに効果的に均一に付着させることができ、高感度及び高精度で試料内のＨＰＶ ６、１１、１６及び１８抗体を複合的に検出することができる。抗体の力価を測定してＨＰＶワクチンの接種時期を決定する際に活用することができ、ワクチン接種後防御期間の測定などに活用することができる。
2013527752.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Glutathione S-transferase, GST）のアミノ酸配列又はその活性断片と、
Ｃ末端のシミアンウイルス４０ラージＴ抗原（simian virus 40 large T-antigen）のアミノ酸配列又はその活性断片と、
ＨＰＶ ６ Ｌ１抗原、ＨＰＶ １１ Ｌ１抗原、ＨＰＶ １６ Ｌ１抗原、及びＨＰＶ １８ Ｌ１抗原からなる群から選択されたＨＰＶ Ｌ１抗原のアミノ酸配列又はその活性断片とを含む融合ポリペプチド。
【請求項２】
前記融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１１〜１４からなる群から選択されたアミノ酸配列である、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
Ｎ末端のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Glutathione S-transferase, GST）のアミノ酸配列又はその活性断片と、
Ｃ末端のシミアンウイルス４０ラージＴ抗原（simian virus 40 large T-antigen）のアミノ酸配列又はその活性断片と、
ＨＰＶ ６ Ｌ１抗原、ＨＰＶ １１ Ｌ１抗原、ＨＰＶ １６ Ｌ１抗原、及びＨＰＶ １８ Ｌ１抗原からなる群から選択されたＨＰＶ Ｌ１抗原のアミノ酸配列又はその活性断片とを含む融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記シミアンウイルス４０ラージＴ抗原のアミノ酸配列又はその活性断片をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１及び配列番号２から構成された二重鎖ポリヌクレオチドをＳａｌＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で切断したものである、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ＨＰＶ ６ Ｌ１抗原のアミノ酸配列又はその活性断片をコードするポリヌクレオチドは、ＨＰＶ ６ゲノムから配列番号３及び配列番号４のプライマーセットを用いて増幅されたポリヌクレオチドをＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ制限酵素で切断したものである、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記ＨＰＶ １１ Ｌ１抗原のアミノ酸配列又はその活性断片をコードするポリヌクレオチドは、ＨＰＶ １１ゲノムから配列番号５及び配列番号６のプライマーセットを用いて増幅されたポリヌクレオチドＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ制限酵素で切断したものである、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記ＨＰＶ １６ Ｌ１抗原のアミノ酸配列又はその活性断片をコードするポリヌクレオチドは、ＨＰＶ １６ゲノムから配列番号７及び配列番号８のプライマーセットを用いて増幅されたポリヌクレオチドＢｇｌＩＩ及びＳａｌＩ制限酵素で切断したものである、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記ＨＰＶ １８ Ｌ１抗原のアミノ酸配列又はその活性断片をコードするポリヌクレオチドは、ＨＰＶ １８ゲノムから配列番号９及び配列番号１０のプライマーセットを用いて増幅されたポリヌクレオチドＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ制限酵素で切断したものである、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項３〜８のいずれかのポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９の発現ベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項１１】
請求項１又は２による融合ポリペプチドをビーズアレイ用ビーズに結合させる段階と、
前記融合ポリペプチドが結合されたビーズを試料と反応させる段階と、
前記試料をマーカー標識された２次抗体と反応させる段階と、
前記２次抗体を蛍光物質が付着した前記マーカーの特異的結合剤と反応させる段階と、
ビーズ由来の蛍光値とマーカーの特異的結合剤由来の蛍光値を測定して試料内のＨＰＶ抗体を検出する段階とを含む試料内ＨＰＶ抗体検出方法。
【請求項１２】
前記ビーズアレイ用ビーズはグルタチオン−カゼイン（Glutathione-casein; GC）ビーズである、請求項１に記載の試料内ＨＰＶ抗体検出方法。
【請求項１３】
前記マーカーはビオチンであり、前記マーカーの特異的結合剤はストレプトアビジンである、請求項１１に記載の試料内ＨＰＶ抗体検出方法。
【請求項１４】
前記蛍光物質は、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド又はフルオレスカミンであることを特徴とする、請求項１に記載の試料内ＨＰＶ抗体検出方法。
【請求項１５】
Ｎ末端のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Glutathione S-transferase, GST）のアミノ酸配列又はその活性断片と、Ｃ末端のシミアンウイルス４０ラージＴ抗原（simian virus 40 large T-antigen）のアミノ酸配列又はその活性断片と、ＨＰＶ ６ Ｌ１抗原、ＨＰＶ １１ Ｌ１抗原、ＨＰＶ １６ Ｌ１抗原、及びＨＰＶ １８ Ｌ１抗原からなる群から選択されたＨＰＶ Ｌ１抗原のアミノ酸配列又はその活性断片とを含む融合ポリペプチドを含むビーズアレイ用ＨＰＶ抗体検出キット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、融合ポリペプチドＨＰＶ抗原を用いたＨＰＶ抗体スクリーニング方法に関し、特にＮ末端のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Glutathione S-transferase, GST）のアミノ酸配列又はその活性断片と、Ｃ末端のシミアンウイルス４０ラージＴ抗原（SV 40 large T-antigen）のアミノ酸配列又はその活性断片と、ＨＰＶ ６ Ｌ１抗原、ＨＰＶ １１ Ｌ１抗原、ＨＰＶ １６ Ｌ１抗原、及びＨＰＶ １８ Ｌ１抗原からなる群から選択されたＨＰＶ Ｌ１抗原のアミノ酸配列又はその活性断片とを含む融合ポリペプチド、前記融合ポリペプチドＨＰＶ抗原を用いて試料内のＨＰＶ抗体を検出する方法、並びに前記融合ポリペプチドＨＰＶ抗原を含むビーズアレイ用ＨＰＶ抗体検出キットに関する。
【０００２】
〔背景技術〕
全世界的に２分に１人の割合で女性が子宮頸癌で死亡する。毎年世界的に発生する子宮頸癌は全世界の女性に２番目に多く発生する癌であり、毎年約５０万人が発病し、特に女性においては乳癌、肺癌に次いで３番目に多い癌死亡の原因である。子宮頸癌の９９％以上においてＨＰＶ（Human Papillomavirus）感染が発見されるが、このＨＰＶは１００種を超え、そのうち３０〜４０種は粘膜組織（mucosal tissue）の感染を引き起こし、低リスクＨＰＶ（low-risk HPV）と発癌性ＨＰＶに分けられる。何よりも重要なのは、子宮頸癌と直接関連のある１５種以上の発癌性ＨＰＶである。この発癌性ＨＰＶのうち１６番、１８番が最も重要であるが、これは全世界的に７０％以上の子宮頸癌において発見される。ほとんどのＨＰＶ感染は通常６カ月から２年以内に自然治癒するが、発癌性ＨＰＶに感染し続けると子宮頸癌に進行することがある。
【０００３】
ＨＰＶの亜型の種類は人種的、地形的、環境的特徴を有するので、ワクチン開発においてはその国固有の亜型の現状を正確に把握しなければならず、韓国で多く発生する亜型を用いた韓国固有のワクチン開発が必要であり、さらにこのワクチン開発にあたっては必ずワクチンの免疫原性（immunity）を測定する技術システムを確立しなければならない。現在開発されているＧａｒｄａｓｉｌ（Ｍｅｒｃｋ社）やＣｅｒｖａｒｉｘ（ＧＳＫ社）などのＨＰＶ予防ワクチン接種後の抗体の維持期間と効能、及びワクチンの投与時期を調査するためには、血清内のこれらＨＰＶ亜型に対して生成された抗体の力価を測定することが何よりも重要である。しかし、このようなワクチンの免疫原性を同時に測定する方法はいまだ確立されていない。
【０００４】
そこで、本発明者らはワクチンの免疫原性を測定するＨＰＶ抗体スクリーニング技術を確立するために努力した結果、ＨＰＶ抗原をＮ末端のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Glutathione S-transferase, GST）のアミノ酸配列又はその活性断片、Ｃ末端のシミアンウイルス４０ラージＴ抗原（simian virus 40 large T-antigen）のアミノ酸配列又はその活性断片と融合することにより、ＨＰＶ抗体に特異的に結合する活性に影響を及ぼすことなく、組換えＨＰＶ抗原を高純度に分離、精製してビーズアレイ用ビーズに効果的に均一に付着させることができ、高感度及び高精度で試料内のＨＰＶ抗体をスクリーニングできることを見出し、本発明を完成した。
【０００５】
〔発明の概要〕
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明は、Ｎ末端のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Glutathione S-transferase, GST）のアミノ酸配列又はその活性断片と、Ｃ末端のシミアンウイルス４０ラージＴ抗原（simian virus 40 large T-antigen）のアミノ酸配列又はその活性断片と、ＨＰＶ ６ Ｌ１抗原、ＨＰＶ １１ Ｌ１抗原、ＨＰＶ １６ Ｌ１抗原、及びＨＰＶ １８ Ｌ１抗原からなる群から選択されたＨＰＶ Ｌ１抗原のアミノ酸配列又はその活性断片とを含む融合ポリペプチドを提供することを目的とする。
【０００６】
また、本発明は、前記融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記発現ベクターで形質転換された形質転換体を提供することを目的とする。
【０００７】
さらに、本発明は、前記融合ポリペプチドをビーズアレイ用ビーズに結合させる段階と、前記融合ポリペプチドが結合されたビーズを試料と反応させる段階と、前記試料をマーカー標識された２次抗体と反応させる段階と、前記２次抗体を蛍光物質が付着した前記マーカーの特異的結合剤と反応させる段階と、ビーズ由来の蛍光値とマーカーの特異的結合剤由来の蛍光値を測定して試料内のＨＰＶ抗体を検出する段階とを含む試料内ＨＰＶ抗体検出方法を提供することを目的とする。さらに、前記融合ポリペプチドを含むビーズアレイ用ＨＰＶ抗体検出キットを提供することを目的とする。
【０００８】
〔課題を解決するための手段〕
本発明は、Ｎ末端のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Glutathione S-transferase, GST）のアミノ酸配列又はその活性断片と、Ｃ末端のシミアンウイルス４０ラージＴ抗原（simian virus 40 large T-antigen）のアミノ酸配列又はその活性断片と、ＨＰＶ ６ Ｌ１抗原、ＨＰＶ １１ Ｌ１抗原、ＨＰＶ １６ Ｌ１抗原、及びＨＰＶ １８ Ｌ１抗原からなる群から選択されたＨＰＶ Ｌ１抗原のアミノ酸配列又はその活性断片とを含む融合ポリペプチドを提供する。
【０００９】
また、本発明は、前記融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記発現ベクターで形質転換された形質転換体を提供する。
【００１０】
さらに、本発明は、前記融合ポリペプチドをビーズアレイ用ビーズに結合させる段階と、前記融合ポリペプチドが結合されたビーズを試料と反応させる段階と、前記試料をマーカー標識された２次抗体と反応させる段階と、前記２次抗体を蛍光物質が付着した前記マーカーの特異的結合剤と反応させる段階と、ビーズ由来の蛍光値とマーカーの特異的結合剤由来の蛍光値を測定して試料内のＨＰＶ抗体を検出する段階とを含む試料内ＨＰＶ抗体検出方法を提供する。さらに、前記融合ポリペプチドを含むビーズアレイ用ＨＰＶ抗体検出キットを提供する。
【００１１】
〔発明の効果〕
本発明を用いると、ＨＰＶ抗体に特異的に結合できる活性に影響を及ぼすことなく、組換えＨＰＶ抗原を高純度に分離、精製してビーズアレイ用ビーズに効果的に均一に付着させることができ、高感度及び高精度で試料内のＨＰＶ ６、１１、１６及び１８抗体を複合的に検出することができる。抗体の力価を測定してＨＰＶワクチンの接種時期を決定する際に活用することができ、ワクチン接種後の防御期間の測定などに活用することができる。
【００１２】
〔図面の簡単な説明〕
〔図１〕ＳＶ４０ラージＴ抗原オリゴマーが発現ベクターｐＧＥＸ ４Ｔ−３内に正確に挿入されていることを確認するために、ＳＶ４０ラージＴ抗原が挿入されたｐＧＥＸ ４Ｔ−３ベクターで形質転換した大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αからプラスミドＤＮＡを分離し、次いで制限酵素ＳａｌＩで切断し、その後１％アガロースゲルにＤＮＡサイズマーカーとＳａｌＩで切断されたｐＧＥＸ ４Ｔ−３を共に電気泳動した状態を示す図である。
【００１３】
〔図２〕ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ ６ Ｌ１ベクターを示す開裂地図である。
【００１４】
〔図３〕ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ １１ Ｌ１ベクターを示す開裂地図である。
【００１５】
〔図４〕ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ １６ Ｌ１ベクターを示す開裂地図である。
【００１６】
〔図５〕ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ １８ Ｌ１ベクターを示す開裂地図である。
【００１７】
〔図６〕組換え菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｇｅｎ−ＸＴＭ／ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ ６ Ｌ１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｇｅｎ−ＸＴＭ／ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ １１ Ｌ１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｇｅｎ−ＸＴＭ／ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ １６ Ｌ１、及びＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｇｅｎ−ＸＴＭ／ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ １８ Ｌ１から発現したＨＰＶ ６ Ｌ１抗原を含む融合ポリペプチド、ＨＰＶ １１ Ｌ１抗原を含む融合ポリペプチド、ＨＰＶ １６ Ｌ１抗原を含む融合ポリペプチド、ＨＰＶ １８ Ｌ１抗原を含む融合ポリペプチドをｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ＧＳＴ抗体を用いてウェスタンブロットした状態を示す図である。
【００１８】
〔図７〕組換え菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｇｅｎ−ＸＴＭ／ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ １６ Ｌ１から発現したＨＰＶ １６ Ｌ１抗原を含む融合ポリペプチドをｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ＨＰＶ １６ Ｌ１抗体を用いてウェスタンブロットした状態を示す図である。
【００１９】
〔図８〕組換え菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｇｅｎ−ＸＴＭ／ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ １８ Ｌ１から発現したＨＰＶ １８ Ｌ１抗原を含む融合ポリペプチドをｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ＨＰＶ １８ Ｌ１抗体を用いてウェスタンブロットした状態を示す図である。
【００２０】
〔図９〕ＨＰＶ １６抗体を希釈してＨＰＶ １６ Ｌ１抗原を用いた標準定量曲線を示す図である。
【００２１】
〔図１０〕ＨＰＶ１８抗体を希釈してＨＰＶ １８ Ｌ１抗原を用いた標準定量曲線を示す図である。
【００２２】
〔図１１〕２価ＨＰＶワクチンとＰｌａｃｅｂｏワクチンを接種したグループを対象に、ワクチン接種後の血液を採取して血清を分離し、その後本発明のＨＰＶ １６ Ｌ１抗原、及びＨＰＶ １８ Ｌ１抗原を用いて実際に血液内のＨＰＶ抗体の量を測定した結果である。
【００２３】
〔発明を実施するための形態〕
一様態において、本発明は、Ｎ末端のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Glutathione S-transferase, GST）のアミノ酸配列又はその活性断片と、Ｃ末端のシミアンウイルス４０ラージＴ抗原（simian virus 40 large T-antigen）のアミノ酸配列又はその活性断片と、ＨＰＶ ６ Ｌ１抗原、ＨＰＶ １１ Ｌ１抗原、ＨＰＶ １６ Ｌ１抗原、及びＨＰＶ １８ Ｌ１抗原からなる群から選択されたＨＰＶ Ｌ１抗原のアミノ酸配列又はその活性断片とを含む融合ポリペプチドを提供する。前記融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１１〜１４からなる群から選択されたアミノ酸配列でもよい。前記活性断片の長さは限定されないが、本発明の具体的な実施例によれば、シミアンウイルス４０ラージＴ抗原活性断片の長さは１１個のアミノ酸である。
【００２４】
ＨＰＶ抗原をＮ末端のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Glutathione S-transferase, GST）のアミノ酸配列又はその活性断片、Ｃ末端のシミアンウイルス４０ラージＴ抗原（simian virus 40 large T-antigen）のアミノ酸配列又はその活性断片と融合することにより、ＨＰＶ抗体に特異的に結合する活性に影響を及ぼすことなく、組換えＨＰＶ抗原を高純度に分離、精製してビーズアレイ用ビーズに効果的に均一に付着させることができ、シミアンウイルス４０ラージＴ抗原により組換えＨＰＶ抗原がビーズに正しく付着したか、付着した量が常に同一か、ＨＰＶ抗原４種間でビーズに付着した程度が均一かなどを判定することができ、高感度及び高精度で試料内のＨＰＶ抗体をスクリーニングすることができる。
【００２５】
また、前記アミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸残基が異なる配列を有するポリペプチドが含まれてもよい。分子の活性を全体的に変化させないタンパク質及びポリペプチドにおけるアミノ酸交換は当該分野で公知である。通常最も多く行われる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙの交換である。また、アミノ酸配列の変異又は修飾により熱、ｐＨなどにおける構造的安定性が向上したタンパク質や、活性が向上したタンパク質が含まれてもよい。
【００２６】
本発明の融合ポリペプチドは、当該分野に公知の化学的ペプチド合成方法で製造することもでき、各領域をコードする遺伝子をＰＣＲ（polymerase chain reaction）による増幅や公知の方法で合成し、その後インフレーム（in frame）で発現ベクターに作動可能に連結してクローニングして発現させることもできる。
【００２７】
他の様態において、本発明は、前記融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記発現ベクターで形質転換された形質転換体を提供する。
【００２８】
前記シミアンウイルス４０ラージＴ抗原のアミノ酸配列又はその活性断片をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１及び配列番号２から構成された二重鎖ポリヌクレオチドをＳａｌＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で切断したものであってもよい。
【００２９】
前記ＨＰＶ ６ Ｌ１抗原のアミノ酸配列又はその活性断片をコードするポリヌクレオチドは、ＨＰＶ ６ゲノムから配列番号３及び配列番号４のプライマーセットを用いて増幅されたポリヌクレオチドをＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ制限酵素で切断したものであってもよい。
【００３０】
前記ＨＰＶ １１ Ｌ１抗原のアミノ酸配列又はその活性断片をコードするポリヌクレオチドは、ＨＰＶ １１ゲノムから配列番号５及び配列番号６のプライマーセットを用いて増幅されたポリヌクレオチドをＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ制限酵素で切断したものであってもよい。
【００３１】
前記ＨＰＶ １６ Ｌ１抗原のアミノ酸配列又はその活性断片をコードするポリヌクレオチドは、ＨＰＶ １６ゲノムから配列番号７及び配列番号８のプライマーセットを用いて増幅されたポリヌクレオチドをＢｇｌＩＩ及びＳａｌＩ制限酵素で切断したものであってもよい。
【００３２】
前記ＨＰＶ １８ Ｌ１抗原のアミノ酸配列又はその活性断片をコードするポリヌクレオチドは、ＨＰＶ １８ゲノムから配列番号９及び配列番号１０のプライマーセットを用いて増幅されたポリヌクレオチドをＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ制限酵素で切断したものであってもよい。
【００３３】
本発明の具体的な実施例において、前記シミアンウイルス４０ラージＴ抗原のアミノ酸配列又はその活性断片をコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩで切断された発現ベクターｐＧＥＸ ４Ｔ−３に挿入してｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３ベクターを製造する段階、前記ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３ベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩで切断してＨＰＶ ６ Ｌ１抗原のアミノ酸配列又はその活性断片をコードするポリヌクレオチドを挿入し、図２に示す開裂地図を有するｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ ６ Ｌ１ベクターを製造する段階、前記ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ ６ Ｌ１ベクターをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｇｅｎ−ＸＴＭに形質転換する段階、及び前記形質転換体からＨＰＶ ６ Ｌ１抗原を含む融合ポリペプチドを得る段階により、ＨＰＶ ６ Ｌ１抗原を含む融合ポリペプチドを製造することができる。
【００３４】
また、本発明の具体的な実施例において、前記シミアンウイルス４０ラージＴ抗原のアミノ酸配列又はその活性断片をコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩで切断された発現ベクターｐＧＥＸ ４Ｔ−３に挿入してｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３ベクターを製造する段階、前記ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３ベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩで切断してＨＰＶ １１ Ｌ１抗原のアミノ酸配列又はその活性断片をコードするポリヌクレオチドを挿入し、図３に示す開裂地図を有するｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ １１ Ｌ１ベクターを製造する段階、前記ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ １１ Ｌ１ベクターをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｇｅｎ−ＸＴＭに形質転換する段階、及び前記形質転換体からＨＰＶ １１ Ｌ１抗原を含む融合ポリペプチドを得る段階により、ＨＰＶ １１ Ｌ１抗原を含む融合ポリペプチドを製造することができる。
【００３５】
さらに、本発明の具体的な実施例において、前記シミアンウイルス４０ラージＴ抗原のアミノ酸配列又はその活性断片をコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩで切断された発現ベクターｐＧＥＸ ４Ｔ−３に挿入してｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３ベクターを製造する段階、前記ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３ベクターを制限酵素ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩで切断してＨＰＶ １６ Ｌ１抗原のアミノ酸配列又はその活性断片をコードするポリヌクレオチドを挿入し、図４に示す開裂地図を有するｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ １６ Ｌ１ベクターを製造する段階、前記ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ １６ Ｌ１ベクターをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｇｅｎ−ＸＴＭに形質転換する段階、及び前記形質転換体からＨＰＶ １６ Ｌ１抗原を含む融合ポリペプチドを得る段階により、ＨＰＶ １６ Ｌ１抗原を含む融合ポリペプチドを製造することができる。
【００３６】
さらに、本発明の具体的な実施例において、前記シミアンウイルス４０ラージＴ抗原のアミノ酸配列又はその活性断片をコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩで切断された発現ベクターｐＧＥＸ ４Ｔ−３に挿入してｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３ベクターを製造する段階、前記ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３ベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩで切断してＨＰＶ １８ Ｌ１抗原のアミノ酸配列又はその活性断片をコードするポリヌクレオチドを挿入し、図５に示す開裂地図を有するｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ １８ Ｌ１ベクターを製造する段階、前記ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ １８ Ｌ１ベクターをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｇｅｎ−ＸＴＭに形質転換する段階、及び前記形質転換体からＨＰＶ １８ Ｌ１抗原を含む融合ポリペプチドを得る段階により、ＨＰＶ １８ Ｌ１抗原を含む融合ポリペプチドを製造することができる。
【００３７】
ＨＰＶ抗原のＮ末端のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Glutathione S-transferase, GST）のアミノ酸配列又はその活性断片、Ｃ末端のシミアンウイルス４０ラージＴ抗原（simian virus 40 large T-antigen）のアミノ酸配列又はその活性断片と融合することにより、組換えＨＰＶ抗原を高純度に分離、精製してビーズアレイ用ビーズに効果的に均一に付着させることができ、シミアンウイルス４０ラージＴ抗原により組換えＨＰＶ抗原がビーズに正しく付着したか、付着した量が常に同一か、ＨＰＶ抗原４種間でビーズに付着した程度が均一かなどを判定することができるが、ＨＰＶ抗体に特異的に結合する抗原性に影響を及ぼさないようにするためには、ＨＰＶ抗原部位の選択、結合方向、結合位置が全て考慮されなければならない。両末端の融合部分の存在により抗原性を示す部位が分子内部に埋没して抗原性が低下することがあるからである。本発明の融合ポリペプチドが試料内のＨＰＶ抗体を高感度及び高精度でスクリーニングできるということは、全く類推できない効果である。
【００３８】
前記ポリヌクレオチド配列は、少なくとも１つの塩基の置換、欠失、挿入、又はそれらの組み合わせにより変異することがある。ヌクレオチド配列を化学的に合成して製造する場合は、当業界で周知の合成法、例えば文献（Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988）に記述された方法を用いることができ、トリエステル、ホスファイト、ホスホルアミド及びＨ−ホスフェート方法、ＰＣＲ、並びにその他オートプライマー方法、固体支持体上のオリゴヌクレオチド合成法などを用いることもできる。
【００３９】
本発明において、「作動可能に連結（operably linked）」とは、一般的機能が行えるように、核酸発現調節配列と目的とするタンパク質又はＲＮＡをコードする核酸配列が機能的に連結（functional linkage）されていることをいう。例えば、プロモーターとタンパク質又はＲＮＡをコードする核酸配列が作動可能に連結されてコード配列の発現に影響を及ぼす。発現ベクターとの作動的連結は当該技術分野で周知の遺伝子組換え技術を用いて製造することができ、部位特異的ＤＮＡ切断及び連結は当該技術分野において一般に知られた酵素などを用いる。
【００４０】
本発明において、「発現ベクター」とは、適当な宿主細胞において目的タンパク質を発現できる組換えベクターであり、遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須の調節要素を含む遺伝子生成物をいう。本発明の発現ベクターは、好ましい発現ベクターが一般に有する要素であるプロモーター、オペレーター、開始コドンなどの発現調節要素を含む。開始コドン及び終止コドンは一般にポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の一部とみなされ、遺伝子生成物が投与された際にその個体で必ず作用しなければならず、コード配列とインフレーム（in frame）でなければならない。ベクターのプロモーターは構成的でもよく、誘導性でもよい。
【００４１】
また、細胞培養液からのタンパク質の分離を促進するために、融合ポリペプチドの排出のためのシグナル配列を含んでもよい。特異的な開始シグナルはまた、挿入された核酸配列の効率的な翻訳に必要とされることもある。これらシグナルは、ＡＴＧ開始コドン及び隣接する配列を含む。ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳調節シグナルが提供されなければならないこともある。これら外因性翻訳調節シグナル及び開始コドンには様々な天然及び合成供給源が用いられる。発現効率は適当な転写又は翻訳エンハンサーの導入により向上する。
【００４２】
発現ベクターは、通常のあらゆる発現ベクターを用いることができる。宿主細胞によってタンパク質の発現量や修飾状態などが異なるので、目的に最も適した宿主細胞を選択して用いればよい。本発明の具体的な実施例において、本発明の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターとして、ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ ６ Ｌ１ベクター、ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ １１ Ｌ１ベクター、ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ １６ Ｌ１ベクター、ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ １８ Ｌ１ベクターを製造した。
【００４３】
前記ベクターが発現される形質転換体を栄養培地で培養すると、有用なタンパク質を大量に製造、分離することができる。培地と培養条件は、宿主細胞に応じて慣用されるものを適宜選択して用いることができる。培養の際は、細胞の生育とタンパク質の大量生産に適するように、温度、培地のｐＨ、培養時間などの条件を適切に調節しなければならない。本発明による発現ベクターで形質転換できる宿主細胞は、原核細胞を含み、ＤＮＡの導入効率が高く、導入されたＤＮＡの発現効率が高い宿主が通常用いられる。細菌、例えばエシェリキア、シュードモナス、バチルス、ストレプトマイセスなどの周知の原核宿主が、用いられる宿主細胞の例である。大腸菌を用いることが好ましい。ペプチドの発現は誘導因子ＩＰＴＧを用いて発現を誘導することができ、誘導時間はタンパク質の量が最大となるように調節することができる。本発明において、組換えにより生産されたペプチドは培地又は細胞分解物から回収することができる。ペプチド発現に用いられた細胞は、凍結・解凍の繰り返し、音波処理、機械的破壊又は細胞分解剤などの様々な物質的又は化学的手段により破壊することができ、通常の生化学的な分離技術による分離、精製することができる（Sambrook et al., Molecular Cloning: A laborarory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Deuscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, Vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA, 1990）。電気泳動、遠心分離、ゲル濾過、沈殿、透析、クロマトグラフィ（イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティークロマトグラフィ、免疫吸着アフィニティークロマトグラフィ、逆相ＨＰＬＣ、ゲル浸透ＨＰＬＣ）、アイソエレクトリックフォーカシング、及びその様々な変形及び複合方法を含むが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
他の態様として、本発明は、前記融合ポリペプチドをビーズアレイ用ビーズに結合させる段階と、前記融合ポリペプチドが結合されたビーズを試料と反応させる段階と、前記試料をマーカー標識された２次抗体と反応させる段階と、前記２次抗体を蛍光物質が付着した前記マーカーの特異的結合剤と反応させる段階と、ビーズ由来の蛍光値とマーカーの特異的結合剤由来の蛍光値を測定して試料内のＨＰＶ抗体を検出する段階とを含む方法を提供する。前記ビーズアレイ用ビーズはグルタチオン−カゼイン（Glutathione-casein; GC）ビーズでもよく、前記マーカーはビオチン、前記マーカーの特異的結合剤はストレプトアビジンでもよく、前記蛍光物質はフルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド又はフルオレスカミンでもよい。前記ビーズアレイは多重ビーズアレイでもよく、本発明の具体的な実施例においてはルミネックス分析法を用いた。
【００４５】
本発明による方法は、Ｎ末端のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Glutathione S-transferase, GST）のアミノ酸配列又はその活性断片と、Ｃ末端のシミアンウイルス４０ラージＴ抗原（simian virus 40 large T-antigen）のアミノ酸配列又はその活性断片と、ＨＰＶ ６ Ｌ１抗原、ＨＰＶ １１ Ｌ１抗原、ＨＰＶ １６ Ｌ１抗原、及びＨＰＶ １８ Ｌ１抗原からなる群から選択されたＨＰＶ Ｌ１抗原のアミノ酸配列又はその活性断片とを含む融合ポリペプチドの組換えＨＰＶ抗原をビーズアレイ用ビーズに結合させる段階を含む。
【００４６】
前記ビーズアレイ用ビーズとしてルミネックスビーズ（Luminex bead）を用いることができる。前記ビーズは多重ビーズアレイ方法に用いられるものであれば特に限定されるものではなく、ビーズにさらにグルタチオン−カゼイン（Glutathione-casein; GC）を結合させたグルタチオン−カゼイン（Glutathione-casein; GC）ビーズを用いることもできる。グルタチオン−カゼインビーズは、当業界で公知の様々な方法で製作することもでき、購入して用いることもできる。本発明の具体的な実施例よれば、Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ（ＮＥＭ）でカゼインのシステイン（cysteine）残基をブロック（blocking）し、その後ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒであるｓｕｌｆｏ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（Ｐ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｈｅｎｙｌ）−ｂｕｔｙｒａｔｅ（ｓｕｌｆｏ−ＳＭＰＢ）を添加してチオール（thiol）基と反応し得るｃａｓｅｉｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｈｅｎｙｌ−ｂｕｔｙｒａｔｅを形成させ、グルタチオン（glutathione）のシステインのチオール残基と反応してグルタチオン−カゼイン（Glutathione-casein; GC）が形成されるようにした。グルタチオン−カゼイン（Glutathione-casein; GC）の末端アミン（terminal amines）とビーズのカルボキシル基（carboxyl groups）を結合させてグルタチオン−カゼインビーズを製作した。
【００４７】
前記多重ビーズアレイ用ビーズは色で１００種類まで区別することができるので、特定色（番号）のビーズに特定抗原を付着させ、様々なビーズセットを混ぜて反応を進め、その後多重ビーズアレイ分析器（例えば、ルミネックス分析器）で各ビーズの色とそのビーズ表面の抗原抗体反応量を同時に測定すると、ＨＰＶ ６ Ｌ１抗体、ＨＰＶ １１ Ｌ１抗体、ＨＰＶ １６ Ｌ１抗体、ＨＰＶ １８ Ｌ１抗体をはじめとする様々な抗体を同時に測定することができる。よって、少量の試料で分析できるだけでなく、１回の実験で数回の実験を代替できるので、時間と労働力が節約される。
【００４８】
また、本発明による方法は、前記融合ポリペプチドが結合されたビーズを試料と反応させる段階を含む。前記試料はＨＰＶにより感染する個体［例えば、人間、家畜（例えば、牛、馬、豚、羊、ヤギ）、ペット（例えば、猫、犬）などの哺乳動物］などを含む個体に由来する。試料は、血清、細胞などのＨＰＶ抗体を含むことができるものであればいかなるものでもよい。融合ポリペプチド抗原は、試料内のＨＰＶ ６ Ｌ１抗体、ＨＰＶ １１ Ｌ１抗体、ＨＰＶ １６ Ｌ１抗体、及びＨＰＶ １８ Ｌ１抗体と抗原抗体反応を起こす。
【００４９】
さらに、本発明は、前記試料をマーカー標識された２次抗体と反応させる段階と、前記２次抗体を蛍光物質が付着した前記マーカーの特異的結合剤と反応させる段階と、ビーズ由来の蛍光値とマーカーの特異的結合剤由来の蛍光値を測定して試料内のＨＰＶ抗体を検出する段階とを含む。前記マーカーはビオチン（biotin）でもよく、マーカーの特異的結合剤はストレプトアビジンでもよい。
【００５０】
前記２次抗体は試料内のＨＰＶ ６ Ｌ１抗体、ＨＰＶ １１ Ｌ１抗体、ＨＰＶ １６ Ｌ１抗体、及びＨＰＶ １８ Ｌ１抗体と特異的に結合し、２次抗体に結合されたビオチンはストレプトアビジン（又は、アビジン）と特異的に結合するので、ストレプトアビジンに結合された蛍光物質から蛍光が発せられる。前記蛍光物質は、例えばフルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド又はフルオレスカミンであるが、これらに限定されるものではなく、当業界で公知の様々な蛍光物質を用いることができる。
【００５１】
ビーズ由来の蛍光値（各ビーズの色）とマーカーの特異的結合剤由来の蛍光値を共に測定して抗原抗体反応量を決定することにより、試料内のＨＰＶ ６ Ｌ１抗体、ＨＰＶ １１ Ｌ１抗体、ＨＰＶ １６ Ｌ１抗体、又はＨＰＶ １８ Ｌ１抗体の有無及び抗体の力価を正確に検出することができる。抗体の力価は蛍光値の判定基準値（cutoff value）を設定して測定する。
【００５２】
本発明の具体的実施例において、前記ＨＰＶ抗原をＮ末端のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Glutathione S-transferase, GST）のアミノ酸配列又はその活性断片、Ｃ末端のシミアンウイルス４０ラージＴ抗原（simian virus 40 large T-antigen）のアミノ酸配列又はその活性断片と融合することにより、ＨＰＶ抗体に特異的に結合する活性に影響を及ぼすことなく、組換えＨＰＶ抗原を高純度に分離、精製してビーズアレイ用ビーズに効果的に均一に付着させることができ、シミアンウイルス４０ラージＴ抗原により組換えＨＰＶ抗原がビーズに正しく付着したか、付着した量が常に同一か、ＨＰＶ抗原４種間でビーズに付着した程度が均一かなどを判定することができ、高感度及び高精度で試料内のＨＰＶ ６ Ｌ１抗体、ＨＰＶ １１ Ｌ１抗体、ＨＰＶ １６ Ｌ１抗体、又はＨＰＶ １８ Ｌ１抗体を含むＨＰＶ抗体をスクリーニングできた。
【００５３】
他の態様として、本発明は、Ｎ末端のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Glutathione S-transferase, GST）のアミノ酸配列又はその活性断片と、Ｃ末端のシミアンウイルス４０ラージＴ抗原（simian virus 40 large T-antigen）のアミノ酸配列又はその活性断片と、ＨＰＶ ６ Ｌ１抗原、ＨＰＶ １１ Ｌ１抗原、ＨＰＶ １６ Ｌ１抗原、及びＨＰＶ １８ Ｌ１抗原からなる群から選択されたＨＰＶ Ｌ１抗原のアミノ酸配列又はその活性断片とを含む融合ポリペプチドを含むビーズアレイ用ＨＰＶ抗体検出キットを提供する。
【００５４】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００５５】
〔実施例〕
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。ただし、下記実施例は本発明を例示するものであり、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
【００５６】
〔実施例１〕
ＳＶ４０がタギングされた変形した発現ベクターの構築
ミクロビーズと融合ポリペプチドの結合を後で確認するために、抗原にＳＶ４０ラージＴ抗原の１１個のアミノ酸がタギングされるようにｐＧＥＸ ４Ｔ−３発現ベクターを変形した。
【００５７】
まず、ＳＶ４０ラージＴ抗原の１１個のアミノ酸配列をコードする配列番号１センスＤＮＡオリゴマー（ＳＶ４０Ｓ）と、その塩基に相補的な配列番号２アンチセンスＤＮＡオリゴマー（ＳＶ４０ＡＳ）をそれぞれ製作した。配列番号１オリゴマーは制限酵素ＳａｌＩ切断部位を、配列番号２オリゴマーは制限酵素ＮｏｔＩ切断部位をそれぞれ含むように合成した。合成した各オリゴマーをアニーリング緩衝液の存在下で９０℃で４分間反応させ、その後７０℃で１０分間、１０℃で２時間反応させた。アニーリングされたＳＶ４０ラージＴ抗原オリゴマーを制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩで切断された発現ベクターｐＧＥＸ ４Ｔ−３に挿入し、Ｔ４ ＤＮＡ連結酵素を用いて室温で３時間連結反応させて連結し、その後大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換させた（参照：Sambrook, J. et al., 1989, Molecular cloning, ａ laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press）。
【００５８】
配列番号１センスＤＮＡオリゴマー（ＳＶ４０Ｓ）：
５’-ＴＣ ＧＡＣ ＡＡＡ ＣＣＴ ＣＣＣ ＡＣＡ ＣＣＴ ＣＣＣ ＣＣＴ ＧＡＡ ＣＣＴ ＧＡＡ ＡＣＡ ＧＣ−３’
配列番号２アンチセンスＤＮＡオリゴマー（ＳＶ４０ＡＳ）：
５’-ＧＧＣＣＧＣ ＴＧＴ ＴＴＣ ＡＧＧ ＴＴＣ ＡＧＧ ＧＧＧ ＡＧＧ ＴＧＴ ＧＧＧ ＡＧＧ ＴＴＴ Ｇ−３’
形質転換体からプラスミドＤＮＡを分離し、次いで制限酵素ＳａｌＩで切断し、その後１％アガロースゲルにＤＮＡサイズマーカーとＳａｌＩで切断されたｐＧＥＸ ４Ｔ−３を共に電気泳動し、ＳＶ４０ラージＴ抗原オリゴマーが発現ベクター内に正確に挿入されていることを再確認した（図１）。前述したように構築されたＳＶ４０ラージＴ抗原をコードするＤＮＡ配列に変形したｐＧＥＸ ４Ｔ−３をｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３と命名した。
【００５９】
〔実施例２〕
ＨＰＶ ６ Ｌ１、ＨＰＶ １１ Ｌ１、ＨＰＶ １６ Ｌ１、及びＨＰＶ １８ Ｌ１遺伝子の発現のための発現ベクターの構築
ドイツから分譲されたｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｆｕｌｌ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ＨＰＶ ６、ＨＰＶ １１、ＨＰＶ １６、及びＨＰＶ １８から得たＬ１遺伝子を発現ベクターに挿入した組換えプラスミド（ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ ６ Ｌ１、ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ １１ Ｌ１、ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ １６ Ｌ１、及びｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ １８ Ｌ１）を下記の通り構築した。
【００６０】
まず、ＨＰＶ ６ Ｌ１、ＨＰＶ １１ Ｌ１、ＨＰＶ １６ Ｌ１、及びＨＰＶ １８ Ｌ１遺伝子を得るためにＨＰＶ ６ Ｌ１遺伝子の塩基配列からＮ−末端アミノ酸配列をコードする配列番号３プライマー（ＨＰＶ ６ Ｌ１Ｆ）（５’末端プライマー）、Ｃ−末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡ塩基に相補的な配列番号４プライマー（ＨＰＶ ６ Ｌ１Ｒ）（３’末端プライマー）、ＨＰＶ １１ Ｌ１遺伝子の塩基配列からＮ−末端アミノ酸配列をコードする配列番号５プライマー（ＨＰＶ １１ Ｌ１Ｆ）（５’末端プライマー）、Ｃ−末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡ塩基に相補的な配列番号６プライマー（ＨＰＶ １１ Ｌ１Ｒ）（３’末端プライマー）、ＨＰＶ １６ Ｌ１遺伝子の塩基配列からＮ−末端アミノ酸配列をコードする配列番号７プライマー（ＨＰＶ １６ Ｌ１Ｆ）（５’末端プライマー）、Ｃ−末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡ塩基に相補的な配列番号８プライマー（ＨＰＶ １６ Ｌ１Ｒ）（３’末端プライマー）、ＨＰＶ １８ Ｌ１遺伝子の塩基配列からＮ−末端アミノ酸配列をコードする配列番号９プライマー（ＨＰＶ １８ Ｌ１Ｆ）（５’末端プライマー）、Ｃ−末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡ塩基に相補的な配列番号１０プライマー（ＨＰＶ １８ Ｌ１Ｒ）（３’末端プライマー）をそれぞれ製作した。
【００６１】
製作したプライマーを用いて各ＨＰＶ Ｌ１遺伝子を増幅した。配列番号３、５、７、９プライマーは制限酵素ＥｃｏＲＩ又はＢｇｌＩＩ切断部位を、配列番号４、６、８、１０プライマーは制限酵素ＳａｌＩ切断部位をそれぞれ含むように合成した。
【００６２】
各ＰＣＲは０．２μｇＨＰＶプラスミドＤＮＡと１０ｐｍｏｌｅの５’−末端プライマー及び３’−末端プライマー、２００μＭ ｄＮＴＰs、１０Ｘ Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ ＤＮＡ重合酵素緩衝液及び２．５ Ｕ Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ ＤＮＡ重合酵素（invitrogen）からなる混合組成液を９５℃で３分間反応させ、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、６８℃で９０秒間の条件で３０回繰り返し、最後に６８℃で５分間反応させた。
【００６３】
配列番号３プライマー（ＨＰＶ ６ Ｌ１Ｆ）：
５’−ＮＮＮＮＮＧＡＡＴＴＣＡＡＴＧＴＧＧＣＧＧＣＣＴＡＧＣＧＡＣＡＧ−３’（ＥｃｏＲＩ切断部位を含む）
配列番号４プライマー（ＨＰＶ ６ Ｌ１Ｒ）：
５’−ＧＣＡＴＧＡＧＴＣＧＡＣＣＣＴＴＴＴＡＧＴＴＴＴＧＧＣＧＣＧＣ−３’（ＳａｌＩ切断部位を含む）
配列番号５プライマー（ＨＰＶ １１ Ｌ１Ｆ）：
５’−ＧＣＡＧＴＣＧＡＡＴＴＣＧＴＧＧＣＧＧＣＣＴＡＧＣＧＡＣＡＧＣＡＣＡ−３’（ＥｃｏＲＩ切断部位を含む）
配列番号６プライマー（ＨＰＶ １１ Ｌ１Ｒ）：
５’−ＮＮＮＮＮＧＴＣＧＡＣＣＴＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＴＡＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＴ−３’（ＳａｌＩ切断部位を含む）
配列番号７プライマー（ＨＰＶ １６ Ｌ１Ｆ）：
５’−ＮＮＮＮＮＡＧＡＴＣＴＡＴＧＣＡＧＧＴＧＡＣＴＴＴＴＡＴＴＴＡＣＡＴＣＣＴＡ−３’（ＢｇｌＩＩ切断部位を含む）
配列番号８プライマー（ＨＰＶ １６ Ｌ１Ｒ）：
５’−ＧＣＡＴＧＡＧＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＴＡＣＧＴＴＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＡＧＣ−３’（ＳａｌＩ切断部位を含む）
配列番号９プライマー（ＨＰＶ １８ Ｌ１Ｆ）：
５’−ＮＮＮＮＮＧＡＡＴＴＣＡＡＴＧＴＧＣＣＴＧＴＡＴＡＣＡＣＧＧＧＴＣＣＴＧ−３’（ＥｃｏＲＩ切断部位を含む）
配列番号１０プライマー（ＨＰＶ １８ Ｌ１Ｒ）：
５’−ＧＣＡＴＧＡＧＴＣＧＡＣＣＴＴＣＣＴＧＧＣＡＣＧＴＡＣＡＣＧＧＡＣ−３’（ＳａｌＩ切断部位を含む）
【００６４】
ＤＮＡサイズマーカー（size marker）と共に１％アガロースゲルに電気泳動し、約１．５ｋｂの位置に各バンドが存在することを確認した。ＰＣＲ済みの反応混合物を１％アガロースゲルに電気泳動し、ＰＣＲを用いて増幅された約１．５ｋｂのＤＮＡ産物をＰＣＲ ｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎＴＭ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Intron, Korea）を用いて精製して回収した。回収されたＨＰＶ ６、ＨＰＶ １１、ＨＰＶ １８ ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで、ＨＰＶ １６ ＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＳａｌＩでそれぞれ切断し、その後遺伝子断片をそれぞれ精製して回収した。精製された遺伝子断片を同じ制限酵素で切断された発現ベクターｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３にそれぞれ挿入し、Ｔ４ ＤＮＡ連結酵素を用いて室温で３時間連結反応させて連結させ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｇｅｎ−ＸＴＭに形質転換させた。（ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ １６ Ｌ１を製作するために、制限酵素ＢｇｌＩＩとＢａｍＨＩはアニーリング配列が同一であるので、ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３をＢａｍＨＩで、ＨＰＶ １６ Ｌ１をＢｇｌＩＩで切断して連結した。）形質転換体からプラスミドＤＮＡを分離し、次いで前記制限酵素で切断し、その後１％アガロースゲルにＤＮＡサイズマーカーと共に電気泳動して各遺伝子が発現ベクター内に正確に挿入されていることを再確認した。前述したように構築されたＨＰＶ ６ Ｌ１遺伝子の発現のために、構築された発現ベクターをｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ ６ Ｌ１と命名し（図２）、ＨＰＶ １１ Ｌ１遺伝子の発現のために構築された発現ベクターをｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ １１ Ｌ１と命名し（図３）、ＨＰＶ １６ Ｌ１遺伝子の発現のために構築された発現ベクターをｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ １６ Ｌ１と命名し（図４）、ＨＰＶ １８ Ｌ１遺伝子の発現のために構築された発現ベクターをｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ １８ Ｌ１と命名した（図５）。
【００６５】
〔実施例３〕
ＨＰＶ ６ Ｌ１、ＨＰＶ １１ Ｌ１、ＨＰＶ １６ Ｌ１、ＨＰＶ １８ Ｌ１を含む融合ポリペプチドの発現と精製
大腸菌に形質転換させた組換え菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｇｅｎ−ＸＴＭ／ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ ６ Ｌ１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｇｅｎ−ＸＴＭ／ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ １１ Ｌ１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｇｅｎ−ＸＴＭ／ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ １６ Ｌ１、及びＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｇｅｎ−ＸＴＭ／ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ １８ Ｌ１からＮ末端にＧＳＴが、Ｃ末端にＳＶ４０が融合されたＨＰＶ ６ Ｌ１抗原、ＨＰＶ １１ Ｌ１抗原、ＨＰＶ １６ Ｌ１抗原、ＨＰＶ １８ Ｌ１抗原にそれぞれ発現させ、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ＧＳＴ抗体、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ＨＰＶ ６ Ｌ１抗体、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ＨＰＶ １１ Ｌ１抗体、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ＨＰＶ １６ Ｌ１抗体、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ＨＰＶ １８ Ｌ１抗体、又はＫＴ３抗体のそれぞれを最初の抗体として用いてウェスタンブロットし、発現の有無を確認した。その結果を図６〜８により確認した。次に、発現されたタンパク質を下記の通り精製した。
【００６６】
組換えプラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｇｅｎ−ＸＴＭ を１００μｇ／μｌアンピシリンが添加されたＬＢ液体培地に接種して３７℃で１６時間培養し、その後５００ｕｌを１００μｇ／μｌアンピシリンが添加されたＬＢ液体培地１００ｍｌに接種して３７℃で培養した。６００ｎｍでの吸光度が約０．４になったとき、ＩＰＴＧ（isopropylβ-D-galactopyranoside）を最終濃度が１．０ｍＭになるように添加し、３時間培養してタンパク質発現を誘導した。６，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して菌体（1.4g/wet weight）を回収し、次いでＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Santa Cruz Biotechnology）が含まれる５ｍｌの超音波処理緩衝液（sonication buffer）（50mM Tris-HCl[pH8.0], 150mM NaCl, 5mM EDTA）に懸濁し、その後最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌ ｌｙｓｏｚｙｍｅを添加して４℃で１時間ｌｙｓｉｓした。超音波で破砕し、次いで１％ｔｒｉｔｏｎ ｘ−１００を添加して４℃で１時間反応させ、１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して大腸菌細胞破片（cell debris）を除去した。次に、前記上澄液をＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ ４Ｂ（GE Healthcare）を用いたアフィニティークロマトグラフィにより最終的に精製した。
【００６７】
〔実施例４〕
精製された融合ポリペプチドをカゼイン（casein）がカップリング（coupling）されたビーズ（bead）に結合
４−１．グルタチオン−カゼイン（ＧＣ）の製造
Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ（ＮＥＭ）でカゼインのシステイン（cysteine）残基をブロック（blocking）し、その後ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒであるｓｕｌｆｏ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（Ｐ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｈｅｎｙｌ）−ｂｕｔｙｒａｔｅ（ｓｕｌｆｏ−ＳＭＰＢ）を添加してチオール（thiol）基と反応し得るｃａｓｅｉｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｈｅｎｙｌ−ｂｕｔｙｒａｔｅを形成させた。ＰＤ１０ ｃｏｌｕｍｎを用いて残余ＮＥＭとｓｕｌｆｏ−ＳＭＰＢを除去し、その後グルタチオン（glutathione）のシステインのチオール残基と反応してグルタチオン−カゼインが形成されるようにした。また、ＰＤ１０ ｃｏｌｕｍｎを用いて残余グルタチオンを除去した。
【００６８】
４−２．ルミネックスビーズ（Luminex bead）とＧＣとの結合
ＧＣの末端アミン（terminal amines）とビーズのカルボキシル基（carboxyl groups）が結合されたグルタチオン−カゼイン（ＧＣ）ビーズを生産するために、１．２５×１０６個のビーズを２００μｌの活性化（activation）緩衝液［0.1mol/L sodium phosphate, pH6.2］で２回洗浄し、その後５０ｍｇ／ｍｌのＮ−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−Ｎ'−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＥＤＣ）とＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ）をそれぞれ２５μｌずつ添加して遮光された室温環境下で２０分間ビーズを活性させた。活性されたビーズは１ｍｌのカップリング緩衝液［2-morpholinoethanesulfonic acid, 50mmol/L, pH5.0］で２回洗浄し、次いで上層を除去し、その後２５０ｍｌの２５０ｍｇ／Ｌ、ＧＣ溶液に懸濁させて遮光し、その後室温で２時間カップリングした。次いで、１ｍｌの洗浄緩衝液［phosphate-buffered saline(PBS), 50mmol/L Tris, 0.5ml/L Tween 20, pH7.4］で２回洗浄し、その後保存液［PBS, pH7.4, containing 1g/L casein and 0.5g/L sodium azide］に入れて４℃で遮光して保管した。
【００６９】
４−３．融合ポリペプチドとＧＣビーズの結合
生産された融合ポリペプチドは１ｇ／Ｌのカゼイン緩衝液［1g/L casein in PBS, pH7.4］で希釈し、その後３０００個のＧＣビーズと室温で遮光して反応させた。１時間後、カゼイン緩衝液で３回洗浄して保管した。
【００７０】
〔実施例５〕
マルチプレックスルミネックス分析
ＨＰＶ １６抗体（Abnova, MAB1616）とＨＰＶ １８抗体（Ab31492）をそれぞれ４，０００〜５００倍に順次希釈してＨＰＶ １６ Ｌ１抗原及びＨＰＶ １８ Ｌ１抗原を用いた標準定量曲線をまず確認した（図９及び図１０）。
【００７１】
その後、２価ＨＰＶワクチン（サーバリックス，ＧＳＫ）とＰｌａｃｅｂｏワクチンを接種したグループを対象に、ワクチン接種３カ月後に血液を採取して血清を分離し、開発されたＨＰＶ １６ Ｌ１抗原及びＨＰＶ １８ Ｌ１抗原を用いて実際に血液内のＨＰＶ抗体の量を測定した。融合ポリペプチドが結合されたビーズ混合液を希釈した血清と９６ウェルプレートで２時間遮光して室温で反応させた。１００μｌカゼイン緩衝液で３回洗浄し、ビオチン（biotin）が結合された２次抗体［goat anti-human IgA, IgM, IgG(H＋L)］を１：１，０００に希釈して３０分間反応させた。最後に発色試薬であるストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリスリン（streptavidin-R-phycoerythrin）を添加して３０分間反応させ、ルミネックス分析器でｍｅｄｉａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ＭＦＩ）を測定した。
【００７２】
その結果を図１１に示す。全１２人（２価ＨＰＶワクチン接種者７人，Ｐｌａｃｅｂｏワクチン接種者５人）を対象に実施し、接種者全員にＨＰＶ １６型に対する抗体が形成されたが、ＨＰＶ １８に対する抗体は７人中５人にのみ検出されたことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】ＳＶ４０ラージＴ抗原オリゴマーが発現ベクターｐＧＥＸ ４Ｔ−３内に正確に挿入されていることを確認するために、ＳＶ４０ラージＴ抗原が挿入されたｐＧＥＸ ４Ｔ−３ベクターで形質転換した大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αからプラスミドＤＮＡを分離し、次いで制限酵素ＳａｌＩで切断し、その後１％アガロースゲルにＤＮＡサイズマーカーとＳａｌＩで切断されたｐＧＥＸ ４Ｔ−３を共に電気泳動した状態を示す図である。
【図２】ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ ６ Ｌ１ベクターを示す開裂地図である。
【図３】ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ １１ Ｌ１ベクターを示す開裂地図である。
【図４】ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ １６ Ｌ１ベクターを示す開裂地図である。
【図５】ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ １８ Ｌ１ベクターを示す開裂地図である。
【図６】組換え菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｇｅｎ−ＸＴＭ／ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ ６ Ｌ１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｇｅｎ−ＸＴＭ／ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ １１ Ｌ１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｇｅｎ−ＸＴＭ／ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ １６ Ｌ１、及びＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｇｅｎ−ＸＴＭ／ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ １８ Ｌ１から発現したＨＰＶ ６ Ｌ１抗原を含む融合ポリペプチド、ＨＰＶ １１ Ｌ１抗原を含む融合ポリペプチド、ＨＰＶ １６ Ｌ１抗原を含む融合ポリペプチド、ＨＰＶ １８ Ｌ１抗原を含む融合ポリペプチドをｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ＧＳＴ抗体を用いてウェスタンブロットした状態を示す図である。
【図７】組換え菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｇｅｎ−ＸＴＭ／ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ １６ Ｌ１から発現したＨＰＶ １６ Ｌ１抗原を含む融合ポリペプチドをｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ＨＰＶ １６ Ｌ１抗体を用いてウェスタンブロットした状態を示す図である。
【図８】組換え菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｇｅｎ−ＸＴＭ／ｍｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＨＰＶ １８ Ｌ１から発現したＨＰＶ １８ Ｌ１抗原を含む融合ポリペプチドをｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ＨＰＶ １８ Ｌ１抗体を用いてウェスタンブロットした状態を示す図である。
【図９】ＨＰＶ １６抗体を希釈してＨＰＶ １６ Ｌ１抗原を用いた標準定量曲線を示す図である。
【図１０】ＨＰＶ１８抗体を希釈してＨＰＶ １８ Ｌ１抗原を用いた標準定量曲線を示す図である。
【図１１】２価ＨＰＶワクチンとＰｌａｃｅｂｏワクチンを接種したグループを対象に、ワクチン接種後の血液を採取して血清を分離し、その後本発明のＨＰＶ １６ Ｌ１抗原、及びＨＰＶ １８ Ｌ１抗原を用いて実際に血液内のＨＰＶ抗体の量を測定した結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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